(57)【要約】本発明はセルヴィマイシン半エステルの分解方法に関する。本発明の目的は、活性は低いが大量に生成するセルヴィマイシンエステル類を、発酵による調製において少量成分として生じる高活性セルヴィマイシンＫに簡単な方法で転化することにある。この目的は、セルヴィマイシンのマロン酸ジメチル又はマロン酸モノメチルとのエステルから非エステル化セルヴィマイシンを調製する方法において、少なくとも一種のエステル分解酵素を２０℃〜７５℃、好ましくは４０〜７６℃、ｐＨ５．０〜１０．０、好ましくは６．０〜９．０において０．１時間〜４８時間セルヴィマイシンのマロン酸エステルに作用させることにより達成される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルヴィマイシンのマロン酸ジメチル又はマロン酸モノメチルとのエステルから非エステル化セルヴィマイシンを調製する方法において、少なくとも一種のエステル分解酵素を２０℃〜７５℃、好ましくは４０〜７６℃、ｐＨ５．０〜１０．０、好ましくは６．０〜９．０において０．１時間〜４８時間セルヴィマイシンのマロン酸エステルに作用させることを特徴とする方法。
【請求項２】
酵素によるエステル分解において濃度０．１％〜５．０％、好ましくは０．５％〜２．０％の非酵素活性タンパク質が存在することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
非酵素活性タンパク質としてアルブミン、例えばウシアルブミンを使用することを特徴とする、請求項１及び２に記載の方法。
【請求項４】
半エステル・セルヴィマイシンＣ及び／又はセルヴィマイシンＤ及び／又はセルヴィマイシンＣのメチルエステルを使用することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
反応は懸濁液中１以上の固相で行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
水相の他に水と相溶する溶剤が存在することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
水相の他に水と相溶しない溶剤、好ましくはヘキサン又はオクタンを使用することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
エステラーゼを使用することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ブタ肝臓エステラーゼ又はウマ肝臓エステラーゼ等の哺乳動物の肝臓に由来するエステラーゼを使用することを特徴とする、請求項１及び６に記載の方法。
【請求項１０】
リパーゼを使用することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
シュードモナス属の微生物、好ましくはシュードモナス・フルオレッセンスに由来するリパーゼを使用することを特徴とする、請求項１及び１０に記載の方法。
【請求項１２】
リゾムコール属の糸状菌、特にリゾムコール・ミーヘイ又はリゾムコール・ジャバニクスに由来するリパーゼを使用することを特徴とする、請求項１及び１０に記載の方法。
【請求項１３】
ムコール属の糸状菌、特にムコール・ミーヘイに由来するリパーゼを使用することを特徴とする、請求項１及び１０に記載の方法。
【請求項１４】
リゾプス属の糸状菌、好ましくはリゾプス・ニベウス、リゾプス・アルヒズス、リゾプス・ジャパニカス、リゾプス・デレマール又はリゾプス・リゾポジフォルミスに由来するリパーゼを使用することを特徴とする、請求項１及び１０に記載の方法。
【請求項１５】
カンジダ属の糸状菌、好ましくはカンジダ・シリンドラセアに由来するリパーゼを使用することを特徴とする、請求項１及び１０に記載の方法。
【請求項１６】
アスペルギルス属の糸状菌、好ましくはアスペルギルス・ニガーに由来するリパーゼを使用することを特徴とする、請求項１及び１０に記載の方法。
【請求項１７】
フミコラ・ラヌジノーサに由来するリパーゼを使用することを特徴とする、請求項１及び１０に記載の方法。
【請求項１８】
サッカロマイセス・セレビシエ等の微生物を乾燥粉末の形態で使用することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
プロテアーゼを使用することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
∀−キモトリプシンを使用することを特徴とする、請求項１及び１９に記載の方法。
【請求項２１】
スブチリシン、アルカラーゼ、ストレプトマイセス・ハイグロスコピクス由来のコバルト中心メタロプロテアーゼＭＯ２等の微生物プロテナーゼ及びプロテイナーゼ、又はプロナーゼを使用することを特徴とする、請求項１及び１９に記載の方法。
【請求項２２】
パパイン等の植物性プロテアーゼを使用することを特徴とする、請求項１及び１９に記載の方法。
【請求項２３】
ストレプトマイセス属、好ましくはストレプトマイセス・テンダエ種の微生物、特に好ましくはストレプトマイセスｓｐ．（ＤＳＭ１３０５９）に由来するエステル分解酵素を使用することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記エステル分解酵素が固定化された形態で存在することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記酵素は化学的に架橋された酵素の形態で使用されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記エステル分解酵素は固相に結合されて存在することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
固相として陰イオン交換体、好ましくはＱセファロース又はＤＥＡＥセファロースを使用することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
陰イオン交換膜を使用することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
セルヴィマイシンのマロン酸メチルエステル半エステル又はセルヴィマイシンのマロン酸ジメチル半エステルは陰イオン交換体に結合されて反応に使用されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
セルヴィマイシンのマロン酸メチルエステル半エステル又はセルヴィマイシンのマロン酸ジメチル半エステルは、３〜１６炭素原子の鎖を有するスペーサーを介して固相に共有結合されて反応に使用されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
反応器としてカットオフ範囲が０．１ｋＤ〜１ｋＤの限外濾過装置を使用することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
反応器としてカットオフ範囲が１．０ｋＤ〜３０ｋＤの限外濾過装置を使用することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
固相としてタンパク質に対する吸着性を有する化合物を使用することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
固相としてナノ構造化された多孔質ガラスを使用することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
固相としてゼオライト又はデキストラン等の超分子化合物を使用することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
反応試料の伝導度が１０ｍＳ未満であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
反応中のｐＨを一定に制御することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
金属の２価又は３価の陽イオンが１０ｍＭ超の濃度で存在することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
界面活性剤が存在することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
発酵器（反応器）でストレプトマイセスｓｐ．（ＤＳＭ１３０５９）又はストレプトマイセス・テンダエのセルヴィマイシン生成株を用いて発酵させる際に、発酵中又は発酵の最終段階で培養液にエステル分解酵素を添加することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
セルヴィマイシンを含む無細胞培養液にエステル分解酵素を添加することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
反応溶液を無菌濾過することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はセルヴィマイシン半エステルの分解方法に関し、抗生物質をより効果的に調製することにより感染症を制圧し、ひいては人々の健康維持に貢献しようとするものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、ドイツのみならずヨーロッパにおける近隣諸国、更には世界中でも、耐性菌の発生頻度及びその種類が急増している。従来使用して効果的であった抗生物質が、次第に病原菌に対して効力を失いつつある。従って、耐性病原菌に対して効果のある新しい抗生物質が強く求められている。バンコマイシン耐性菌については、懸念されていたことであるが、腸球菌からブドウ球菌への種間転移が、２００２年にアメリカ合衆国で初めて確認された。
【０００３】
セルヴィマイシンは、液体培地でストレプトマイセスｓｐ．（ＤＳＺＭドイツ微生物細胞培養保存機関（ＤＳＭＺ）（ブラウンシュワイク、マッシェルオーダー・ウェーク１）にＤＳＭ１３０５９として寄託）の発酵時に生成する抗生物質群である（ヘロルドＫ、シューＺ、ゴルミックＦＡ、グレーフェＵ、ヘットウェックＣ（２００４）、「セルヴィマイシンＣ（特殊なジメチルマロニル部分を有する芳香族ポリケチド抗生物質）の生合成」；Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．７，２４１１−２４１４；及びヘロルドＫ（２００５）、「特殊な芳香族ポリケチドの化合物としての構造、作用及び生合成に関する研究」、イェーナ・フリードリヒ・シラー大学生物薬剤学博士論文、２００５年１月１７日防衛の日）。
【０００４】
セルヴィマイシンはポリケチド系抗生剤に属し、しばしば単環又は多環サッカライド鎖に結合したポリケチド・アグリコンに由来する。
セルヴィマイシンの少量成分であるセルヴィマイシンＫ（ＨＫＩ１０３１１１２９とも呼ばれる）は、多剤耐性ブドウ球菌及びバンコマイシン耐性エンテロコッカス・フェーカリス菌に対して特に強い抗生作用を有することが判明している。
【０００５】
従ってセルヴィマイシンＫは耐性病原菌を制圧するための効果的な抗生物質の候補として有力である。セルヴィマイシンＫは黄橙色の無定形物質で、実験式はＣ５６Ｈ７５ＮａＮＯ２２、モル質量１，１３６．４６７８ｇ／ｍｏｌである。セルヴィマイシンＫは、糖としてのジサッカライド基と、末端ＯＨ基を有する非エステル化テトラサッカライド基が結合したポリケチド・アグリコンからなる。セルヴィマイシンＫは他の多くのセルヴィマイシン類と異なり、メチル化マロン酸エステル基を含有しない。１８０Ｌの培養濾液から１３ｍｇ製出されている。
【０００６】
セルヴィマイシンＫを取得するには、発酵成分を酢酸エチルで抽出し、抽出物を液相から分離し、無水硫酸ナトリウムで脱水し、更に乾燥固化する。
油性残渣を少量のクロロホルムに溶解し、溶液を濾過し、２０倍容積のヘキサンを添加して目的物を析出させる。
その後の精製は、メタノールを溶離剤に用いたセファデックスＬＨ−２０によるゲル浸透クロマトグラフィーによって行う。抗生作用が認められる薬剤画分を真空乾燥する。仕上げ精製は、クロロホルム・メタノール勾配を用いたシリカゲルクロマトグラフィーで行う。
セルヴィマイシンＫからなる黄色画分を乾燥する。
【０００７】
培養液中には少量成分セルヴィマイシンＫと並んで、他の効果の低いセルヴィマイシン類が濃度約１．０ｇ／Ｌから非常に高濃度まで存在する。
これにはセルヴィマイシンＡ及びセルヴィマイシンＣが含まれるが、これらは既にアルタミラマイシン２及びアルタミラマイシン１と命名され（グロースＩ、シュレーゲルＢ、クラインヴェヒターＰ、グレーフェＵ、ヘルトルＡ、ペルナーＡ、ヒリガーＭ、メルマンＵ、「ストレプトマイセスｓｐ．（ＤＳＭ１３０５９）の培養によって得られるグラム陽性菌に対して強い活性を示す新しい抗生アルタミラマイシン」）、新しい抗生物質として特許された（ＤＥ１００６５６０６（２００２−０６−２７））。
主成分であるアルタミラマイシン１（セルヴィマイシンＣ）は、アグリコンに酸アミド官能基を有しており、これはセルヴィマイシンＤにもセルヴィマイシンＫにも存在する。更に、セルヴィマイシンＣはテトラサッカライドのＯＨ基がジカルボン酸、即ちマロン酸ジメチルによりエステル化され、セルヴィマイシンＤはマロン酸メチルによりエステル化されている。これはジメチル化マロン酸の半エステルをなしている。成分のセルヴィマイシンＣメチルエステルは、ジメチル化マロン酸のジエステルである。第２の酸官能基はメタノールでエステル化されている。１８０Ｌの培養濾液からセルヴィマイシンＣ１.６ｇとセルヴィマイシンＤ１.０ｇが単離している（ヘロルドＫ（２００５））。
【０００８】
【特許文献１】ＤＥ１００６５６０６
【０００９】
比較的大量に生成するセルヴィマイシンＣ、ＤとセルヴィマイシンＣメチルエステルは、それらの構造的類似性のために、サッカライド側基とマロニル基のエステル結合の分解によりセルヴィマイシンＫを経済的に調製するための出発物質となる。これらはすべてアグリコンに酸アミド基を含有しており、セルヴィマイシンＫとの違いは、テトラサッカライド側基のＯＨ基にメチル化マロニル基が存在することだけである。
【００１０】
ジカルボン酸、特に置換マロン酸エステルからジエステルを化学的に加水分解する際に、エステル基が半エステルとして生成し比較的容易に取得されるのに対し、第２のエステル基は非常に安定していることは以前から知られていた。
マロン酸の全エステルの生成が困難な理由はおそらく、生成する半エステルの遊離カルボキシル基の負電荷が高いことと関連している。ジカルボン酸で半エステルを生成するアルコール成分の分解は通常アルカリ条件下で実施される（Ｈ．Ｇ．Ｏ.ベッカー他：有機化学基礎実験７．１．４．３カルボン酸誘導体の加水分解、ヨハン・アンブロシウス・バルス出版ハイデルベルク、ライプチヒ、第２０版、１９９６）。
【００１１】
このことは、エステル分解作用を有する酵素、例えばエステラーゼ、プロテアーゼ及びリパーゼを用いてエステル分解を実施する場合にも当てはまる。この場合もジエステルのモノエステルへの分解は比較的容易に行われるのに対し、第２エステル基は取得できないことが多く、半エステルが生成しやすい。
反応は立体特異的であるため、プロキラルな置換モノアルキルマロン酸ジエステルから主として半エステルエナンチオマーが生成する。ジエステルの分解は、文献のデータによると、例えばｐＨ７で２４時間行うと非常に高収率である。酵素としては、例えばブタ肝臓エステラーゼ（ＥＣ３．１．１．１）が提案されている（イリウチジマＫ、ハセガワＫ、ツチハシＧ（１９８２）。Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４６、１９０７；ＪＰ０４０８２８６３Ａ２；ハイデルＨ、フットナーＧ、フォーゲルＲ、ヘルムヒェンＧ（１９９４）、「合成のためのネオペンタン構造を有する新規キラルビルディングブロック、Ｒ−ＣＨ３Ｃ（ＣＨ２ＯＳＯ２ＣＦ３）（ＣＨ２Ｃｌ）（ＣＨ２Ｂｒ）の化学的酵素法による調製」、Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．１２７，２７１−２７４）。
【００１２】
ブタ肝臓エステラーゼを用いてマロン酸アリールとマロン酸アルキルの混合物を分解する際、水相に５０％又は２５％のジメチルスルホキシドを添加することによって分解率が向上した。ブタ肝臓エステラーゼの代わりに∀−キモトリプシンを使用すると、反応が非常に低速であるか、又は反応が生じなかった（ビョークリング（Bjoerkling）Ｆ、ボウテリェ（Boutelje）Ｊ、ガーテンベックＫ、フルトＫ、ノリンＴ（１９８２）テトラヘドロン・レター２６、４９５７；ビョークリング（Bjoerkling）Ｆ、ボウテリェ（Boutelje）Ｊ、ガーテンベックＫ、フルトＫ、ノリンＴ、ツムリク（Szmulik）Ｐ（１９８５）テトラヘドロン・レター４１、１３４７；グートマンＡＣ、シャピロＭ、ボルタンスキＡ（１９９２）、「有機溶媒におけるマロン酸のキラル一置換ジエステル及び半エステル混合物の酵素触媒的生成」、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５７，１０６３−１０６５）。
【００１３】
反応はリン酸バッファーの水媒体でもｐＨ８で実施できる（シュナイダーＭ、エンゲルＮ、ベンズマンＨ（１９８４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２３，６６）。メタノール（１０％ｖ／ｖ）を添加すると収率は増加したが、反応の立体選択性は低下した。ジメチルスルホキシドの存在下で反応速度は遅くなった（リューテンＭ、ミュラーＳ、ヘルツォークＢ、ケーゼＲ（１９８７）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ７０、１２５０）。
【００１４】
セルヴィマイシンＫを得る目的で、中性並びにアルカリ性又は酸性ｐＨ範囲で化学的加水分解によりセルヴィマイシンＣ、セルヴィマイシンＣメチルエステル又はセルヴィマイシンＤのマロン酸基を分解する実験は、これまで成功しなかった。極端なｐＨ条件下では、セルヴィマイシンの分解生成物は非常に少なかった。アルカリ性ｐＨ又は酸性ｐＨでの加水分解の際にセルヴィマイシン分子の基本構造が破壊されると思われる。
【００１５】
文献に記載されている置換マロン酸エステルの酵素による変換は、これまですべて非常に単純な構造のマロン酸エステルで実施された。その際、常に例外なく使用したマロン酸誘導体の半エステルが生成した。
両エステル結合の分解による置換マロン酸の調製も、アルコール成分の取得も従来報告されていない。なぜならば、置換マロン酸もアルコール成分も原則として直接合成されるからである。これまで天然物質からそれらのマロニル半エステルを分解することによって複雑なアルコール成分を取得することも、セルヴィマイシンＣ（アルタミラマイシン１と同一）、セルヴィマイシンＤ及びセルヴィマイシンＣメチルエステルをエステル分解酵素を触媒としてセルヴィマイシンＫに変換することも報告されていない。
エステルの分解に際しては、例外なく反応液中に熱力学的平衡が生じるが、その達成には極めて時間を要する場合がある。それぞれのエステル結合に触媒作用を有する酵素を添加すると、平衡の達成速度を加速できるので有利である。
原則として急速に生成されるエステルは急速に分解されると言うことができる。この原則に従えば、セルヴィマイシンエステルのように極めて複雑なエステルは速度論的には非常に安定しているか、酵素分解可能でないか、又は極く低速でしか酵素分解しない。このことはメチル化マロン酸との第２エステル結合には更によく該当する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の課題は、活性は低いが大量に生成するセルヴィマイシンエステル類を、発酵による調製において少量成分として生じる高活性セルヴィマイシンＫに簡単な方法で転化することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記の課題は本発明により請求項１記載の方法によって解決される。有利な構成形態が従属請求項に記載されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の本質は、適切な構造を有する主成分、例えばセルヴィマイシンのマロン酸ジメチル−マロン酸メチルモノエステル及びセルヴィマイシンのマロン酸ジメチルジエステルを、２０℃〜７５℃、好ましくは３０〜６０℃、ｐＨ５．０〜１０．０、好ましくは６．５〜９．０において０．１時間〜数週間反応器内でエステル分解活性を有する酵素と処理して反応させ、抽出物として得ることである。
【００１９】
驚くべきことに、アグリコンに酸アミド基が存在するか（セルヴィマイシンＣ（アルタミラマイシン１）、セルヴィマイシンＤ、セルヴィマイシンＪ、セルヴィマイシンＣメチルエステル等）、又は酸アミド基のアミノ基がメチル基によって置換されているか（セルヴィマイシンＡ（アルタミラマイシン２）、セルヴィマイシンＢ、セルヴィマイシンＬ、セルヴィマイシンＡメチルエステル等）に関わりなく反応が起きることが判明した。
【００２０】
更に驚くべきことに、非酵素活性タンパク質、例えば血清アルブミンが濃度０．１％〜５％、好ましくは０．５％〜２％存在すると、セルヴィマイシン半エステルからのセルヴィマイシンＫの生成が非常に促進され、分解反応が検出可能となることが判明した。
【００２１】
エステル分解酵素として狭義のエステラーゼの他、プロテアーゼ及びリパーゼも使用できる。例えば反応の触媒に、ムコール属、リゾムコール属、リゾプス属、カンジダ属、アスペルギルス属の糸状菌由来、フミコラ・ラヌジノーサ属由来又はプソイドモナスフルオレセンズ属由来のリパーゼを使用すると効果的である。本発明においては、ブタ肝臓エステラーゼ又は微生物由来のプロテアーゼ、例えばストレプトマイセス・グリセウス由来のプロナーゼ、ストレプトマイセス・ハイグロスコピクス（ＤＤ２６３３０１）由来のコバルト金属プロテアーゼＭＯ２、スブチリシン、アルカラーゼ、並びにセルヴィマイシンを生成するストレプトマイセスｓｐ．（ＤＳＭ１３０５９）及びストレプトマイセス・テンダエ種から生成されるエステラーゼ、更にまたパパイン等の植物から得られるプロテアーゼを使用する。
【００２２】
更に驚くべきことに、界面活性剤を添加すると抽出物の収率が増大することも判明した。例えばリゾプス・ニベウス由来のリパーゼを使用した実験で、ＴｒｉｔｏｎＸ１００を添加すると、添加していない試料に比べ収率が１０％から２０％に増加した。
【００２３】
本発明による反応は均一相でも不均一相でも生ずる。この場合「相」とは液相を意味する。この液体環境としては、伝導度が１０ｍＳ未満の緩衝液を含む反応水溶液が挙げられる。この溶液は更に水溶性溶剤、例えばメタノール若しくはその他の低級アルコール、又はジメチルホルムアミド若しくはジメチルスルホキシドを含有することができる。溶剤を添加することによってセルヴィマイシン抽出物の溶解性が向上するので、より高濃度のセルヴィマイシンを反応に使用できる。
【００２４】
更に第２の液相として、水と相溶しない溶剤を使用すると収率が上昇することが分かった。第２の非水相は、例えばヘキサンやオクタンであってよい。
【００２５】
本発明においては、固相の存在下でも反応が起きる。一実施形態において固相はイオン交換体、好ましくはＱセファロース又はＤＥＡＥセルロースである。この方法は、ｐＨの急激な変動が回避されるため好ましい。反応の際に遊離したメチル化マロン酸が交換体に保持されるため、平衡が維持されるものと推測される。更にアルカリ性に調整された陰イオン交換体は遊離したプロトンも中性化するので、ｐＨの変動が回避され得る。
【００２６】
他の方法においては、セルヴィマイシンのマロン酸メチルエステル又はマロン酸ジメチル半エステルは、３〜１６炭素原子の鎖を有するスペーサーを介して固相に共有結合されて反応に使用される。使用する固相は、ヒドロキシル基を担持する表面がアミノプロピルトリエチルオキシシランで被覆され、カルボジイミド法によりアミノ基を介してセルヴィマイシン半エステルが共有結合されて存在することが好ましい。
【００２７】
別の構成では反応中に反応系から、モノメチル化マロン酸（モル質量１１９．１ｇ/ｍｏｌ）やジメチル化マロン酸（モル質量１３４．１ｇ/ｍｏｌ）の比較的小さいマロン酸種が、膜又は他の浸透バリアーを通過する限外濾過（カットオフ：１ｋＤ以下）によって常時得られるが、エステル分解酵素はこれを通過できない。酵素のモル質量は一般に３０〜６０ｋＤである。この方法は自体公知の限外濾過装置で実施される。浸透バリアーとしては、膜モジュール又は中空繊維モジュールを使用する。最大２ａｔｍの圧力による加圧循環によって浸透バリアーを通る透過流が生じ、この透過流は小さい反応生成物を伴うので、結果として希釈される。圧力は、セルヴィマイシン抽出物が少量だけ透過するように選択される。
【００２８】
他の方法においては、酵素をほぼ固定化するために、好ましくは膜モジュール又は中空繊維として配置された浸透バリアーを利用する。この技術においてはバリアーのカットオフは１ｋＤ〜３０ｋＤの範囲で選択される。この種の実施形態では抽出物も反応生成物も比較的急速に浸透バリアーを透過して酵素と接触し合う。他の実施形態においてはセルヴィマイシンＣ及びＤのエステルを反応物と合流する前に、又は合流中にも陰イオン交換体に結合させ、溶解状態のエステラーゼをマロン酸のカルボキシル基を介してイオン交換体に結合したセルヴィマイシンＣ及びＤに作用させる。ここでも陰イオン交換体としてＱセファロース又はＤＥＡＥセファロースを使用することが好ましい。陰イオン交換体とセルヴィマイシンＣの半エステル及びセルヴィマイシンＤの半エステルとを結合させることによって、陰イオン交換体／セルヴィマイシン複合体が生じることで、セルヴィマイシンエステルはエステル分解酵素の作用に好都合な立体的位置を占めることになり、分解率が向上する。分解により生成したメチル化マロン酸は交換体に留まる。
【００２９】
更なる実施形態においては、複合体の生成をエステル分解の前に独立の１工程で行うことができる。しかしこの場合の短所は、セルヴィマイシンＣのメチルエステルが結合されず、反応に関与しないことである。
【００３０】
更なる実施形態においては、陰イオン交換体とセルヴィマイシンエステルが反応器において合流した後に酵素が添加される。セルヴィマイシンのメチルエステルは半エステルとして、陰イオン交換体に結合しないものも含め急速且つ定量的にセルヴィマイシンＣに分解されるので、ロスは生じない。
【００３１】
更に、セルヴィマイシンエステルとの１：１複合体を生成するのに必要な量より少量のイオン交換体を使用しても、エステル分解酵素を添加した後に所望のエステル分解に至ることが見い出された。
本発明において、生成されたセルヴィマイシンＫは例外なく液相に移行する一方、生成されたマロン酸メチル及びマロン酸ジメチルは交換体に留まる。
【００３２】
驚くべきことに、エステル分解酵素が固相に結合すると、反応平衡が反応生成物に有利に移動することも判明した。この種の実施形態においては、抽出物と反応物は固定化された酵素に接触通過し、生成したマロン酸は陰イオン交換体に結合される。従って、低いイオン強度で反応系から回収可能となる。固相担体として多孔質ガラス等の吸着体や、ゼオライトやデキストラン等の超分子化合物を使用する。
【００３３】
更に超分子化合物は、生成するメチル化マロン酸をナノ細孔で捕捉することにより、平衡をより有利な方向へ移動させることができ、更に反応条件を立体的に有利とする。
また、化学的に架橋された又は固定化されたエステル分解酵素は、反応の平衡又は速度に影響するだけでなく、回収可能で複数回使用できるという大きな利点を有する。また、本発明においては、２価又は３価の陽イオン、例えばＭｇ＋＋、Ｍｎ＋＋、Ｚｎ＋＋、Ｆｅ＋＋＋又はＡｌ＋＋＋を１０ｍＭを越える濃度で添加することにより、反応の平衡又は反応速度を生成側に有利にシフトさせることができ、これによりセルヴィマイシンＫの生成が促進される。この場合、通常遊離マロン酸の難溶性塩が生成するので、平衡系から除去される。
【００３４】
本発明に係る方法は、セルヴィマイシン生成微生物であるストレプトマイセス・テンダエ種、即ちストレプトマイセスｓｐ．（ＤＳＭ１３０５９）で発酵を実施することも包含する。エステル分解酵素を、好ましくは発酵の遅い段階で添加することにより、発酵プロセス中にセルヴィマイシンエステルのセルヴィマイシンＫへの転化が達成される。
【００３５】
他の実施形態においては、発酵における無細胞培養液をエステル分解酵素で処理する。長期的に安定な試料を得るために、反応溶液を無菌濾過することにより、生きている微生物が反応に及ぼす悪影響を排除する。
【００３６】
実施例１
ｐＨ８．５の０．１Ｍリン酸緩衝液１ｍＬに、メタノール０．５ｍＬ中にセルヴィマイシンＣ２ｍｇを含有するセルヴィマイシンＣメタノール溶液４０μＬを添加混合する。この混合物の４０μＬをｐＨ８．５の０．１Ｍリン酸緩衝液１ｍＬに添加する。得られた混合物と、水０．５ｍＬ中に次に記載する比活性２．６Ｕ／ｇのリパーゼ（Ｆｌｕｋａ）２ｍｇを含むリパーゼ溶液４０μＬとを混合する。０．１Ｍ  ＮａＯＨを添加してｐＨをモニターしｐＨを一定に維持しながら、４０℃で５０時間培養する。ＨＰＬＣ法を用いて試料中のセルヴィマイシンＫの含量が０ｍｇ／Ｌから６．９ｍｇ／Ｌに上昇したことが確認された一方、セルヴィマイシンＣの濃度は４０ｍｇ／Ｌから約３４ｍｇ／Ｌに下降した。
標準試料を用いたＨＰＬＣ法により水相のセルヴィマイシンの濃度を決定する。
【００３７】
セルヴィマイシンを同定するためのＨＰＬＣパラメータ
ＨＰＬＣ      Ｊａｓｃｏ社の低圧勾配装置
検出器 ダイオードアレー
カラム        ＰｒｏｎｔｏＳＩＬ  １２０−５−Ｃ１８−ａｃｅ−ＥＰＳ５μｍ，２５０ｘ４ｍｍ
カラム前段カートリッジ      ＰｒｏｎｔｏＳＩＬ  １２０−５−Ｃ１８−ａｃｅ−ＥＰＳ５μｍ，２０ｘ４ｍｍ
カラム温度    ２５℃
移動相 ＡＣＮ：ＴＦＡ（０．１％）勾配
０分−５０％ＡＣＮ：５０％ＴＦＡ
２０分−１００％ＡＣＮ
３０分−１００％ＡＣＮ
３０．５分−５０％ＡＣＮ：５０％ＴＦＡ
３５分−５０％ＡＣＮ：５０％ＴＦＡ
流速   １ｍＬ／ｍｉｎ
注入量 ２０μＬ
【００３８】
実施例２
別の実験において調製した０.５％ウシ血清アルブミンを含有するｐＨ７．０３の０．０１Ｍリン酸緩衝液５ｍＬに、メタノール１ｍＬ中にセルヴィマイシンＣ２０ｍｇを含有するセルヴィマイシンＣメタノール溶液２５０μＬを添加混合した。次いでこれに、ｐＨ７．０３の０．０１Ｍリン酸緩液１ｍＬ当たり１０ｍｇエステラーゼを含有したｐＨ７．０３の０．０１Ｍリン酸緩衝エステラーゼ溶液（ウマ肝臓由来エステラーゼ）０.５ｍＬを攪拌しつつ添加した。この混合物を３７℃で２４時間培養した。
培養混合物から０．１ｍＬを取り出し、ＨＰＬＣによりセルヴィマイシンＫを検出した。ＨＰＬＣ（シマヅ）にＰｒｏｔｏＳＩＬ  ａｃｅ−ＥＰＳ１２０−５−Ｃ１８カラム（２５０ｘ４ｍｍ）を用い、アセトニトリル−０．１％（勾配）トリフルオロ酢酸により分離した。セルヴィマイシンＫのピークを、電子スプレーイオン源及びイオントラップ型分析器を有する質量分光計（ベントロープ質量分光計、フィニガンＬＣＱ、フィニガン、ブレーメン）にて解析した。Ｍ１１１３にセルヴィマイシンＫに特異的な質量ピークが検出された。採取試料を定量的に評価した結果、セルヴィマイシンＫの含量は１１４ｍｇ／Ｌであった。この量は収率１８％に相当する（表１参照）。
【００３９】
実施例３
種々のエステラーゼ及びリパーゼによるセルヴィマイシンＣの分解
凍結乾燥酵素２ｍｇをｐＨ８．５の０．０２Ｍリン酸緩衝液に溶解させた（酵素溶液）。リン酸緩衝液１ｍＬに、セルヴィマイシンメタノール溶液４０μＬと酵素溶液２０μＬを添加した。４０ｍｇ／Ｌセルヴィマイシンを用いて、右欄のセルヴィマイシンＫの濃度をを決定した（表２参照）。
【００４０】
実施例４
セルヴィマイシンＣ６４０μｇ／ｍＬ及び０.００５Ｍリン酸緩衝液で平衡化したＱセファロース１ｇをメタノールに添加した。このメタノール溶液１．０ｍＬとｐＨ８．５の０．００５Ｍリン酸緩衝液１０ｍＬを混合した。セルヴィマイシンＣがイオン交換体に結合した後、遠心分離機で清澄な上清を除去し、リゾムコール・ミーヘイに由来する比活性０．５１Ｕ／ｍｇのリパーゼ（Ｆｌｕｋａ）２ｍｇを含有するリパーゼ溶液５ｍＬをイオン交換体に添加した。得られた懸濁液を攪拌しながら４０℃で５０時間培養した。約１５％のセルヴィマイシンＣがセルヴィマイシンＫに転化した。生成したセルヴィマイシンＫは水性の上清中に存在する。
エチルアセテートを用いた自体公知の抽出法で試料を抽出し、抽出物を水相から分離し、無水硫酸ナトリウムで脱水し、更に乾燥固化する。油性残渣を少量のクロロホルムに溶解し、溶液を濾過し、２０倍容積のヘキサンを添加して粗生成物を析出させる。その後の精製は、クロロホルム・メタノール（勾配有）を用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって行う。セルヴィマイシンＫからなる黄色画分を乾燥する。
【手続補正書】
【提出日】平成20年1月21日(2008.1.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルヴィマイシンのマロン酸ジメチル又はマロン酸モノメチルとのエステルから非エステル化セルヴィマイシンを少なくとも一種のエステラーゼの存在下で調製する方法において、前記エステラーゼを２０℃〜７５℃、ｐＨ５．０〜１０．０、４０〜７６℃及びｐＨ６．０〜９．０において０．１時間〜４８時間セルヴィマイシンのマロン酸エステルに作用させ、前記酵素によるエステル分解において濃度０．１％〜５．０％の非酵素活性タンパク質が存在することを特徴とする方法。
【請求項２】
非酵素活性タンパク質としてアルブミンを使用することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アルブミンはウシアルブミンであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
セルヴィマイシンマロン酸エステル・セルヴィマイシンＣ及び／又はセルヴィマイシンＤ及び／又はセルヴィマイシンＣのメチルエステルを特徴とする、先の請求項の一以上に記載の方法。
【請求項５】
セルヴィマイシンのマロン酸ジメチル又はマロン酸モノメチルとのエステルから非エステル化セルヴィマイシンを少なくとも一種のエステラーゼの存在下で調製する方法において、哺乳動物の肝臓由来のエステラーゼを２０℃〜７５℃、ｐＨ５．０〜１０．０、４０〜７６℃及びｐＨ６．０〜９．０において０．１時間〜４８時間セルヴィマイシンのマロン酸エステルに作用させることを特徴とする方法。
【請求項６】
前記酵素によるエステル分解において濃度０．１％〜５．０％の非酵素活性タンパク質が存在することを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項７】
前記エステラーゼはブタ肝臓エステラーゼ又はウマ肝臓エステラーゼであることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項８】
セルヴィマイシンのマロン酸ジメチル又はマロン酸モノメチルとのエステルから非エステル化セルヴィマイシンを少なくとも一種のリパーゼの存在下で調製する方法において、シュードモナス属に由来するリパーゼを２０℃〜７５℃、ｐＨ５．０〜１０．０、４０〜７６℃及びｐＨ６．０〜９．０において０．１時間〜４８時間セルヴィマイシンのマロン酸エステルに作用させることを特徴とする方法。
【請求項９】
前記酵素によるエステル分解において濃度０．１％〜５．０％の非酵素活性タンパク質が存在することを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記リパーゼは、シュードモナス・フルオレッセンス、ストレプトマイセス・テンダエ又はストレプトマイセスｓｐ．（ＤＳＭ１３０５９）に由来するリパーゼであることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
セルヴィマイシンのマロン酸ジメチル又はマロン酸モノメチルとのエステルから非エステル化セルヴィマイシンを少なくとも一種のリパーゼの存在下で調製する方法において、リゾムコール属に由来するリパーゼを２０℃〜７５℃、ｐＨ５．０〜１０．０、４０〜７６℃及びｐＨ６．０〜９．０において０．１時間〜４８時間セルヴィマイシンのマロン酸エステルに作用させることを特徴とする方法。
【請求項１２】
前記酵素によるエステル分解において濃度０．１％〜５．０％の非酵素活性タンパク質が存在することを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記リパーゼは、リゾムコール・ミーヘイ又はリゾムコール・ジャバニクスに由来するリパーゼであることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
セルヴィマイシンのマロン酸ジメチル又はマロン酸モノメチルとのエステルから非エステル化セルヴィマイシンを少なくとも一種のリパーゼの存在下で調製する方法において、ムコール属に由来するリパーゼを２０℃〜７５℃、ｐＨ５．０〜１０．０、４０〜７６℃及びｐＨ６．０〜９．０において０．１時間〜４８時間セルヴィマイシンのマロン酸エステルに作用させることを特徴とする方法。
【請求項１５】
前記酵素によるエステル分解において濃度０．１％〜５．０％の非酵素活性タンパク質が存在することを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記リパーゼは、ムコール・ミーヘイに由来するリパーゼであることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
セルヴィマイシンのマロン酸ジメチル又はマロン酸モノメチルとのエステルから非エステル化セルヴィマイシンを少なくとも一種のリパーゼの存在下で調製する方法において、リゾプス属に由来するリパーゼを２０℃〜７５℃、ｐＨ５．０〜１０．０、４０〜７６℃及びｐＨ６．０〜９．０において０．１時間〜４８時間セルヴィマイシンのマロン酸エステルに作用させることを特徴とする方法。
【請求項１８】
前記酵素によるエステル分解において濃度０．１％〜５．０％の非酵素活性タンパク質が存在することを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記リパーゼは、リゾプス・ニベウス、リゾプス・アルヒズス、リゾプス・ジャパニカス、リゾプス・デレマール又はリゾプス・リゾポジフォルミスに由来するリパーゼであることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
セルヴィマイシンのマロン酸ジメチル又はマロン酸モノメチルとのエステルから非エステル化セルヴィマイシンを少なくとも一種のリパーゼの存在下で調製する方法において、カンジダ属に由来するリパーゼを２０℃〜７５℃、ｐＨ５．０〜１０．０、４０〜７６℃及びｐＨ６．０〜９．０において０．１時間〜４８時間セルヴィマイシンのマロン酸エステルに作用させることを特徴とする方法。
【請求項２１】
前記酵素によるエステル分解において濃度０．１％〜５．０％の非酵素活性タンパク質が存在することを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記リパーゼは、カンジダ・シリンドラセアに由来するリパーゼであることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
セルヴィマイシンのマロン酸ジメチル又はマロン酸モノメチルとのエステルから非エステル化セルヴィマイシンを少なくとも一種のリパーゼの存在下で調製する方法において、アスペルギルス属に由来するリパーゼを２０℃〜７５℃、ｐＨ５．０〜１０．０、４０〜７６℃及びｐＨ６．０〜９．０において０．１時間〜４８時間セルヴィマイシンのマロン酸エステルに作用させることを特徴とする方法。
【請求項２４】
前記酵素によるエステル分解において濃度０．１％〜５．０％の非酵素活性タンパク質が存在することを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記リパーゼは、アスペルギルス・ニガーに由来するリパーゼであることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
セルヴィマイシンのマロン酸ジメチル又はマロン酸モノメチルとのエステルから非エステル化セルヴィマイシンを少なくとも一種のリパーゼの存在下で調製する方法において、フミコラ・ラヌジノーサに由来するリパーゼを２０℃〜７５℃、ｐＨ５．０〜１０．０、４０〜７６℃及びｐＨ６．０〜９．０において０．１時間〜４８時間セルヴィマイシンのマロン酸エステルに作用させることを特徴とする方法。
【請求項２７】
前記酵素によるエステル分解において濃度０．１％〜５．０％の非酵素活性タンパク質が存在することを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
α−キモトリプシン、スブチリシン、アルカラーゼ、若しくはストレプトマイセス・ハイグロスコピクス由来のコバルト中心メタロプロテアーゼＭＯ２であるプロテナーゼ又はプロテイナーゼ、プロナーゼ又はパパインを追加使用することを特徴とする、先の請求項の一以上に記載の方法。
【請求項２９】
前記エステル分解酵素が固定化された形態で存在することを特徴とする、請求項１、５、８、１１、１４、１７、２０、２３又は２６に記載の方法。
【請求項３０】
エステル分解酵素が固相に結合されて存在することを特徴とする、請求項１、５、８、１１、１４、１７、２０、２３又は２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記固相は、Ｑセファロース又はＤＥＡＥセファロースである陰イオン交換体であることを特徴とする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記反応は懸濁液中１以上の固相で行われることを特徴とする、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
水相の他に水と相溶する溶剤、又はヘキサン若しくはオクタンである水と相溶しない溶剤を使用することを特徴とする、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記エステル分解酵素は化学的に架橋された酵素の形態で使用されることを特徴とする、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３５】
セルヴィマイシンのマロン酸メチルエステル半エステル又はセルヴィマイシンのマロン酸ジメチル半エステルは陰イオン交換体に結合されて反応に使用されることを特徴とする、請求項１、５、８、１１、１４、１７、２０、２３又は２６に記載の方法。
【請求項３６】
セルヴィマイシンのマロン酸メチルエステル半エステル又はセルヴィマイシンのマロン酸ジメチル半エステルは、３〜１６個の炭素原子の鎖を有するスペーサーを介して固相に共有結合されて反応に使用されることを特徴とする、請求項１、５、８、１１、１４、１７、２０、２３又は２６に記載の方法。
【請求項３７】
反応器としてカットオフ範囲が０．１ｋＤ〜１ｋＤ又は１．０ｋＤ〜３０ｋＤの限外濾過装置を使用することを特徴とする、請求項１、５、８、１１、１４、１７、２０、２３又は２６に記載の方法。
【請求項３８】
固相としてタンパク質に対する吸着性を有する化合物を使用することを特徴とする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３９】
固相としてナノ構造化された多孔質ガラス又はゼオライト若しくはデキストランである超分子化合物を使用することを特徴とする、請求項３０に記載の方法。
【請求項４０】
反応試料の伝導度が１０ｍＳ未満であり、界面活性剤及び１０ｍＭ超の濃度の金属の２価又は３価の陽イオンが存在し、且つｐＨが一定に維持されることを特徴とする、請求項１、５、８、１１、１４、１７、２０、２３又は２６に記載の方法。
【請求項４１】
発酵器（反応器）でストレプトマイセスｓｐ．（ＤＳＭ１３０５９）又はストレプトマイセス・テンダエのセルヴィマイシン生成株を用いて発酵させる際に、発酵中又は発酵の最終段階で培養液にエステル分解酵素を添加する、請求項１、５、８、１１、１４、１７、２０、２３又は２６に記載の方法。
【請求項４２】
セルヴィマイシンを含み、無菌濾過した無細胞培養液にエステル分解酵素を添加する、請求項１、５、８、１１、１４、１７、２０、２３又は２６に記載の方法。
【国際調査報告】
2009514538.tif 000002
2009514538.tif 000003