(57)【要約】【課題】  本発明はＤＫＫ２およびそれを含む組成物を使用する血管新生刺激法に関する。本発明のＤＫＫ２タンパク質により、ＨＵＶＥＣにおける管形成の刺激的活性、動脈輪組織における新芽形成の促進的活性、およびマウス胎仔における血管発生の促進的活性が見られた。したがって、ＤＫＫ２タンパク質は虚血性疾患を治療および予防する治療的または機能的健康食品として使用可能である。
2009538295.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のＤＫＫ２タンパク質またはＤＫＫ２タンパク質コードＤＮＡを哺乳動物の血管非形成組織に投与する工程を含む哺乳動物における血管新生刺激法。
【請求項２】
前記血管非形成組織が虚血性疾患による損傷後の新たに形成された皮膚組織、筋肉組織および結合組織である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記虚血性疾患が火傷、乾癬、潰瘍、虚血、心筋梗塞、狭心症、脳梗塞または脳出血である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡがウイルスベクターまたは非ウイルスベクターにより投与される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ウイルスベクターがアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたは単純ヘルペスウイルスベクターである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記非ウイルスベクターが動物細胞において発現可能なプラスミドである請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ＤＫＫ２タンパク質が配列番号：１によって表される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＤＮＡが配列番号：２によって表される請求項１に記載の方法。
【請求項９】
虚血性疾患の治療または予防に使用する医薬品を製造するためのＤＫＫ２タンパク質またはＤＫＫ２タンパク質コードＤＮＡの使用。
【請求項１０】
虚血性疾患を治療および予防するための有効成分としてＤＫＫ２タンパク質またはＤＫＫ２タンパク質コードＤＮＡを含む医薬組成物。
【請求項１１】
前記ＤＫＫ２タンパク質が配列番号１によって表される請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記ＤＮＡが配列番号２によって表される請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記虚血性疾患が火傷、乾癬、潰瘍、虚血、心筋梗塞、狭心症、脳梗塞または脳出血である請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１４】
治療有効量のＤＫＫ２タンパク質またはＤＫＫ２タンパク質コードＤＮＡを虚血性疾患に罹患した哺乳動物に投与する工程を含む、虚血性疾患の治療または予防法。
【請求項１５】
虚血性疾患を予防または緩和する有効成分としてＤＫＫ２タンパク質またはＤＫＫ２タンパク質コードＤＮＡを含む健康食品。
【請求項１６】
前記健康食品が丸薬、粉末、顆粒、錠剤、チューイングタブレット、カプセルまたは飲料タイプとして提供される請求項１５記載の健康食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＤＫＫ２タンパク質およびそれを含む組成物を使用する血管新生刺激法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生は新たな毛細血管を形成する過程である。この過程は正常な生物学的状況下ではほとんど起こらないが、常に胚発生、黄体形成および創傷治癒に伴っている。特に、血管新生は腫瘍転移において重要な役割を担う（Folkman JおよびKlagsburn M, Science, 235(4787), pp.442-447, 1987）。
【０００３】
血管新生手法は４工程からなる。すなわち、第１工程は血管新生因子を刺激することで起こるタンパク質分解酵素の活性による毛細血管基底膜の解離であり、第２工程は血管内皮細胞の移動および増殖であり、第３工程は血管内皮細胞の分化に起因する毛細血管形成であり、第４工程は新たな毛細血管の再構築である。
【０００４】
血管新生過程は多様な刺激因子および阻害因子、例えば増殖因子、サイトカイン、脂質代謝物質、止血タンパク質の特発性フラグメント等により調節されることが報告されている（Folkman J, Nat. Med., 1(1), pp.27-31, 1995）。血管新生刺激因子は数種のタイプ、例えば主に、細胞成長誘導因子、免疫活性を持つサイトカイン、ホルモンおよび脂質生成物等に分類することが可能である（Bussolino Fら、Trends. Biochem. Sci., 22(7), pp.251-256, 1997）。
【０００５】
しかし、刺激因子は血管内皮細胞のみならず他の隣接細胞にも作用することから、臨床用途に適用される様々な問題を抱えている（Malecki Mら、Gene Ther., Supple 1, pp.S159-169, 2005）。
【０００６】
したがって、近年の研究によって、血管内皮細胞のみに作用し、特に血管新生に関与している重要な遺伝子を基礎付けること、および血管新生を必要とする様々な疾患を遺伝子により治療する新たな方法をつくることに注力されてきた。しかし現在、依然として満足のいく成果は挙げられていない。
【０００７】
治療的血管新生とは、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、胎生期内皮細胞遺伝子座‐１（Ｄｅｌ‐１）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ‐ＥＧＦ）、アンジオポエチン、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）および上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）等の血管新生因子、あるいはこれらをコードする遺伝子を投与することで側副血管の形成を促して虚血性疾患を治療する方法であり、それは経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）および冠動脈バイパス術（ＣＡＢＧ）法に供され得ない重篤な虚血性疾患の新たな治療法として注目されている（Kim D.KおよびKwon H.C., The journal of endocrinology, 16(3), pp.328-338, 2001）。
【０００８】
Ｗｎｔタンパク質の抑制タンパク質であるＤＫＫ２はＷｎｔのシグナル伝達経路の阻害因子または刺激因子として作用すると報告されている（Wu Wら、Cwrr. Biol., 10(24), pp.1611-1614, 2000）。ＤＫＫ２は特異性システインを多く含むドメインを２つ有し、多様な長さの結合領域に分割される。特にディコップ（Dickkopf）ファミリーに属するタンパク質はファミリーメンバーならびに１０種のシステインの間でシステイン‐２領域を高度に保持している（Krupnik VEら、Gene, 238(2), pp.301-313, 1999）。ＤＫＫ２は破骨細胞の分化に深く関連していることが報告されている（Li Xら、Nat. Genet., 37(9), pp.945-952, 2005）。
【０００９】
しかし、上記の引用文献のいずれにおいても、血管新生に与えるＤＫＫ２の刺激的活性の効果について、報告または開示されておらず、その引用文献の開示は参照により本明細書に援用される。
【非特許文献１】Folkman JおよびKlagsburn M, Science, 235(4787), pp.442-447, 1987
【非特許文献２】Folkman J, Nat. Med., 1(1), pp.27-31, 1995
【非特許文献３】Bussolino Fら、Trends. Biochem. Sci., 22(7), pp.251-256, 1997
【非特許文献４】Malecki Mら、Gene Ther., Supple 1, pp.S159-169, 2005）
【非特許文献５】Kim D.KおよびKwon H.C., The journal of endocrinology, 16(3), pp.328-338, 2001）
【非特許文献６】Wu Wら、Cwrr. Biol., 10(24), pp.1611-1614, 2000）
【非特許文献７】Krupnik VEら、Gene, 238(2), pp.301-313, 1999
【非特許文献８】Li Xら、Nat. Genet., 37(9), pp.945-952, 2005
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本発明の発明者らは内皮細胞における数種の分化制御遺伝子および血管新生を刺激するための新たに有効な方法を見出すために集中的に研究を重ね、遂に、ＤＫＫ２が血管新生に対する強力な刺激効果を示し、よって該タンパク質が虚血性疾患の治療および予防に有用である可能性があることを発見した。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明にしたがって、本発明は哺乳動物の血管非形成組織に有効量のＤＫＫ２タンパク質またはＤＫＫ２タンパク質コードＤＮＡを投与する工程を含む、哺乳動物における血管新生刺激法を提供する。
【００１２】
本明細書に開示した用語「哺乳動物の血管非形成組織」は、哺乳動物の虚血性疾患による損傷後の新たに形成された皮膚組織、筋肉組織および結合組織を含む。
【００１３】
本明細書に開示した用語「虚血性疾患」は火傷、乾癬、潰瘍、虚血、心筋梗塞、狭心症、脳梗塞または脳出血を含む。
【００１４】
本明細書に開示した用語「ＤＫＫ２タンパク質コードＤＮＡ」はウイルスベクターまたは非ウイルスベクターにより哺乳動物に投与される。
【００１５】
本明細書に開示した用語「非ウイルスベクター」は動物細胞において発現可能なプラスミドを含む。
【００１６】
本明細書に開示した用語「ウイルスベクター」はアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたは単純ヘルペスウイルスベクターを含む。
【００１７】
本発明の別の目的は、虚血性疾患を治療および予防する有効量で、有効成分としてＤＫＫ２タンパク質またはＤＫＫ２タンパク質コードＤＮＡを含む医薬組成物を提供することである。
【００１８】
本発明の他の目的は、虚血性疾患の治療または予防に使用する医薬品を製造するためのＤＫＫ２タンパク質またはＤＫＫ２タンパク質コードＤＮＡの使用を提供することである。
【００１９】
本発明の他の目的は、治療有効量のＤＫＫ２タンパク質またはＤＫＫ２タンパク質コードＤＮＡを血管新生に起因する疾患に罹患した哺乳動物に投与する工程を含む、虚血性疾患の治療法または予防法を提供することである。
【００２０】
また、本発明の別の目的は、虚血性疾患を予防および緩和する有効量で、有効成分としてＤＫＫ２タンパク質またはＤＫＫ２タンパク質コードＤＮＡを含む健康補助食品組成物を提供することである。
【００２１】
本明細書に開示した用語「ＤＫＫ２タンパク質」は配列番号：１によって表されるアミノ酸を含む。
【００２２】
本明細書に開示した用語「ＤＫＫ２タンパク質コードＤＮＡ」は配列番号：２によって表される遺伝子を含む。
【００２３】
上述のＤＫＫ２配列は哺乳動物のＤＫＫ２配列に限定するものではないが、哺乳動物のすべてのＤＫＫ２を含む。
【００２４】
上述のＤＫＫ２タンパク質は哺乳動物の組織から単離したＤＫＫ２タンパク質または組み換えＤＫＫ２タンパク質を含む。
【００２５】
本発明のＤＫＫ２タンパク質またはＤＫＫ２タンパク質コードＤＮＡは以下の好ましい実施態様にしたがって調製してよい。
【００２６】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００２７】
本発明では、上述のＤＫＫ２タンパク質およびそれをコードする遺伝子は以下の手法により調製可能である。ＨＵＶＥＣから精製した全ＲＮＡを逆転写し、相補的ＤＮＡを得る；テンプレートとして得られた相補的ＤＮＡ、ならびにＤＫＫ２プライマー、好ましくは配列番号：５および配列番号：６によって表されるＤＫＫ２プライマーを使用してＰＣＲを行い、増幅ＤＫＫ２遺伝子を得る。
【００２８】
上述のＤＫＫ２タンパク質は以下のプロセスにより得ることが可能であり、例えば、上述の工程で調製したＤＫＫ２遺伝子を制限酵素で処理し、プラスミドへクローン化し、発現細胞系でクローン化して形質転換する可能性のあるプラスミドを得る；形質転換した細胞を選択し、培地中の分泌されたＤＫＫ２タンパク質をカラムにて精製する；あるいは上述の工程で調製したＤＫＫ２遺伝子をベクター、好ましくはレンチウイルスベクターに誘導し、培地中で培養し、培地中の分泌されたＤＫＫ２タンパク質をカラムにて精製する。
【００２９】
上述の工程で調製したＤＫＫ２誘導細胞系およびＤＫＫ２遺伝子では、ＨＵＶＥＣにおける管形成の刺激的活性、動脈輪組織における新芽形成の促進的活性、およびマウス胎仔における血管発生の促進的活性が見られる。また、全長ＤＫＫ２のみならずＤＫＫ２のフラグメントでも互いに類似した血管新生の刺激的活性が見られる。
【００３０】
本発明の別の目的は、虚血性疾患を治療および予防する有効量で、有効成分として上述の方法から調製したＤＫＫ２タンパク質またはＤＫＫ２タンパク質コードＤＮＡを含む医薬組成物を提供することである。
【００３１】
本発明の他の目的は、虚血性疾患の治療および予防に使用される医薬品を製造するため、上述の方法から調製したＤＫＫ２タンパク質またはＤＫＫ２タンパク質コードＤＮＡの使用を提供することである。
【００３２】
本発明の他の目的は、上述の方法から調製した治療有効量のＤＫＫ２タンパク質またはＤＫＫ２タンパク質コードＤＮＡを虚血性疾患に罹患した哺乳動物に投与する工程を含む、虚血性疾患の治療法または予防法を提供することである。
【００３３】
虚血性疾患を治療するための本発明の組成物は上述のＤＫＫ２タンパク質またはそれをコードするＤＮＡを、組成物の総重量に対して０．１〜５０重量%で含んでよい。
【００３４】
本発明の組成物はまた、当技術分野で周知の使用法にしたがって通常の担体、アジュバントまたは希釈剤を含んでよい。該担体は使用および適用法にしたがった適当な物質として使用することが好ましいが、限定されない。適当な希釈剤はRemington's Pharmaceutical Science（Mack Publishing co, Easton PA）の記述に一覧にしてある。
【００３５】
以下、次に述べる製剤法および賦形剤は単に例示であり、本発明を決して限定するものではない。
【００３６】
本発明にしたがった組成物は、医薬的に許容される担体、アジュバントまたは希釈剤、例えばラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム(acacia rubber)、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱油を含む医薬組成物として提供することが可能である。製剤はまた、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、浸潤剤、着香料、乳化剤、保存料等を含んでよい。本発明の組成物は、当技術分野で周知の任意の手法を採用して患者に投与した後、有効成分が即時に、持続的に、あるいは遅延して放出するように製剤化してよい。
【００３７】
例えば、本発明の組成物は注射剤を生産するために一般的に使用される油、プロピレングリコールまたは他の溶媒中に溶解することが可能である 。担体の好適な例として、生理食塩水、ポリエチレングリコール、エタノール、植物油、ミリスチン酸イソプロピル等が挙げられるが、これらに限定されない。局所投与としては、本発明の組成物は軟膏およびクリームの形態で製剤化が可能である。
【００３８】
本組成物を含有する医薬製剤は経口投薬形態（粉末、錠剤、カプセル、ソフトカプセル、水性薬剤、シロップ、エリキシル丸薬、粉末、分包、顆粒）、または局所用製剤（クリーム、軟膏、ローション、ゲル、バルム剤、パッチ、ペースト、スプレー液、エアロゾル等）、または注射用製剤（溶液、懸濁液、乳濁液）などの任意の形態で調製してよい。
【００３９】
例えば、本発明の組成物は注射剤を生産するために一般的に使用される油、プロピレングリコールまたは他の溶媒中に溶解することが可能である。注射剤中の基剤または担体の好適な例として、生理食塩水、無機塩もしくはこれらの混合物など多様な塩混合物；マンイトール、ラクトース、デキストラン等の糖類溶液；グリシン、アルギニン等のアミノ酸；ポリエチレングリコール、エタノール、植物油、ミリスチン酸イソプロピル、有機酸溶液、塩類溶液、またはこれらの混合物等が挙げられるが、これらに限定されない。溶液、懸濁液、コロイド溶液等の適当な製剤を製造するため、本発明の注射用製剤は、注射の際の通常の添加剤、例えば浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、植物油、レシチン、非イオン性界面活性剤などの界面活性剤を上述の基剤に添加して調製してよい。本発明の組成物が固体である場合、in situで遺伝子治療に使用する前に滅菌済基剤に組成物を溶解し、本発明の組成物が液体であれば特別な処理はせず、直接使用してよい。
【００４０】
局所投与では、本発明の組成物は軟膏およびクリームの形態で製剤化することが可能である。
【００４１】
医薬剤形である本発明の組成物はその医薬的に許容される塩の形態で使用してよく、単独で、あるいは適当な結合体の形態でも、また他の医薬的な有効成分と組み合わせて使用してもよい。
【００４２】
罹患部位に投与される本明細書で開示したＤＫＫ２タンパク質コードＤＮＡは、ベクター、例えばアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクターまたは哺乳動物細胞で発現したプラスミドの挿入形態で使用してよい。
【００４３】
本発明の望ましい用量は被検体の状態および体重、重症度、薬物形態、投与の経路および期間により変化し、当業者が選択してよい。しかし望ましい効果を得るために、本発明の発明タンパク質またはＤＮＡを体重／日で０．００１〜１００mg/kg、好ましくは０．１〜１００mg/kgの範囲の量で投与することが一般的に推奨される。投与量は１日当たり１回または数回に分けて投与してよい。
【００４４】
本発明のさらに別の目的は、虚血性疾患を予防および緩和するために、有効成分としてＤＫＫ２タンパク質またはＤＫＫ２タンパク質コードＤＮＡを含む健康補助食品を提供することである。
【００４５】
ここで上述した組成物は食品、添加物または飲料に添加することが可能であり、食品または飲料中の上記タンパク質またはＤＮＡの量は概して健康補助食品組成物の食品総重量に対して約０．０１〜９５w%、好ましくは１〜８０w%の範囲でよい。
【００４６】
本発明は、哺乳動物における虚血性疾患を予防および緩和するためのＤＫＫ２タンパク質またはＤＫＫ２タンパク質コードＤＮＡを含む健康補助飲料の組成物を提供する。
【００４７】
健康補助食品を開発するため、本発明の上述のＤＫＫ２タンパク質またはＤＫＫ２タンパク質コードＤＮＡを含む添加可能（addable）食品の例には、様々な食品、飲料、ガム、ビタミン複合体、健康改善食品等が挙げられ、粉末、顆粒、錠剤、チューイングタブレット、カプセルまたは飲料等として使用可能である。
【００４８】
本発明の発明組成物には毒性も有害作用もなく、したがって安全に使用できる。
【００４９】
ここで上述した組成物は食品、添加物または飲料に添加することが可能であり、食品または飲料中の上記ＤＫＫ２タンパク質またはＤＫＫ２タンパク質コードＤＮＡの量は概して健康食品組成物の食品総重量に対して約０．０１〜８０w/w%、好ましくは０．０１〜１５w/w%、また健康補助飲料組成物１００ml中の割合では０．０２〜５g、好ましくは０．３〜１gの範囲でよい。
【００５０】
本発明の健康補助飲料組成物が、必須成分として上述のＤＫＫ２タンパク質またはＤＫＫ２タンパク質コードＤＮＡを、示された割合で含有するのであれば、他の液体成分を特に限定せず、その他の成分は様々な脱臭剤または通常の飲料などの天然炭水化物等とすることが可能である。上述の天然炭水化物の例として、グルコース、フルクトース等の単糖；マルトース、スクロース等の二糖；デキストリン、シクロデキストリンなどの通常の糖；ならびにキシリトールおよびエリスリトール等の糖アルコールが挙げられる。上述のもの以外の脱臭剤として、タウマチン（taumatin）などの天然脱臭剤；レバウジオシドＡ、グリシルリジン等のステビアエキス；サッカリン、アスパルテーム等の合成脱臭剤が好都合に有用である。上述の天然炭水化物の量は概して、本飲料組成物１００ml中の割合で約１〜２０g、好ましくは５〜１２gの範囲である。
【００５１】
前述の組成物以外の成分は様々な栄養素、ビタミン、ミネラルまたは電解質、合成着香料、チーズチョコレート等の場合の着色料および改良剤、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護コロイド状接着剤、ｐＨ調整剤、安定剤、保存剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭化剤等である。上述のもの以外の成分は天然フルーツジュース、果汁飲料および野菜ジュースを調製するための果汁でもよく、該成分は単独で、あるいは組み合わせて使用可能である。該成分の割合はさほど重要ではないが概して本組成物１００w/w%当たり約０〜２０w/w%の範囲である。ここで前述したエキスを含む添加可能食品の例として、様々な食品、飲料、ガム、ビタミン複合体、健康改善食品等が挙げられる。
【００５２】
本発明の組成物はまた、１種以上の、クエン酸、フマル酸、アジピン酸、乳酸、リンゴ酸などの有機酸；リン酸、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、酸性ピロリン酸塩、ポリリン酸塩などのリン酸塩；ポリフェノール、カテキン、α‐トコフェロール、ローズマリーエキス、ビタミンＣ、緑茶エキス、甘草エキス、キトサン、タンニン酸、フィチン酸等の天然抗酸化物質等を含んでよい。
【００５３】
上述した本発明のＤＫＫ２タンパク質またはＤＫＫ２タンパク質コードＤＮＡは２０〜９０%の高濃度の液体、粉末または顆粒タイプであってよい。
【００５４】
同様に、上述したＤＫＫ２タンパク質またはＤＫＫ２タンパク質コードＤＮＡはまた、１種以上のラクトース、カゼイン、デキストロース、グルコース、スクロースおよびソルビトールを含むことが可能である。
【００５５】
本発明の発明ＤＫＫ２タンパク質またはＤＮＡ２タンパク質コードＤＮＡには毒性も有害作用もなく、したがって安全に使用できる。
【００５６】
本発明の精神または範囲から逸脱することなく、本発明の組成物、使用および調製において様々に修正および変更が可能であることは当業者には明白であろう。
【発明の効果】
【００５７】
本発明に記述しているとおり、ＤＫＫ２タンパク質またはＤＫＫ２タンパク質コードＤＮＡにより、ＨＵＶＥＣにおける管形成の刺激的活性、動脈輪組織における新芽形成の促進的活性、およびマウス胎仔における血管発生の促進的活性が見られた。したがってそれは、虚血性疾患を治療および予防するための治療法または機能的健康食品として使用することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５８】
本発明の精神と範囲から逸脱することなく、本発明の組成物、使用および調製において様々に修正および変更が可能であることは当業者には明白であろう。
【００５９】
本発明を以下の例によりさらに具体的に説明する。しかし、当然のことながら、本発明はこれらの例に限定されない。
【実施例】
【００６０】
以下の参考例および実験例は、その範囲を限定せずに本発明をさらに説明することを目的とするものである。
【００６１】
（参考例１）
ＨＵＶＥＣの培養
以下のプロセスにしたがってＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）をYonsei University Hospitalの婦人科から入手した臍帯から単離した。臍帯バッファー（０．２%グルコースリン酸緩衝生理食塩水）で静脈を洗浄した後、５mlの０．２%Ｉ型コラゲナーゼ（Sigma- Aldrich Co., MO、ＵＳＡ）を静脈に添加し、該静脈を３７℃で５分間静置した。室温で２０mlの臍帯バッファーを静脈に添加した後、反対端から分離した静脈細胞を回収した。再度臍帯バッファーを静脈に添加し、３７℃で反応させた。回収したヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を洗浄し、０．１%ゼラチンでコートされた組織培養用Ｔ７５フラスコに注いだ。５%Ｃｏ２培養用インキュベーター内で、３７℃、ＥＧＭ（商標)−２完全培地（Cambrex, MD、ＵＳＡ）中で細胞を培養し、細胞が集密的な段階に入ったとき、細胞をトリプシン‐ＥＤＴＡ溶液から分離した。上記のプロセスから得た第３〜４継代細胞を実験に使用した。
【００６２】
（参考例２）
レンチウイルスベクターを使用したＤＫＫ２調節細胞系の調製
レンチウイルスを使用してクローン化プラスミドをウイルス産生細胞系に形質転換することにより調製したＤＫＫ２の過剰発現細胞系および抑制細胞系から得たＤＫＫ２組み換えウイルスをMacrogen Inc（大韓民国）から購入した。参考例２で調製したＨＵＶＥＣへのＤＫＫ２ウイルスの添加から４８時間後に、細胞から単離したＲＮＡを逆転写および重合し、以下のようにＤＫＫ２ｍＲＮＡの発現期を確認した：TRIzol試薬（Invitrogen、ＵＳＡ）を使用して全ＲＮＡを単離し、オリゴ（ｄＴ）プライマーを使用して逆転写に対して行い、逆転写酵素（Stratagen、ＵＳＡ）を使用して以下のＰＣＲサイクルを３０回反復した；ポリメラーゼ（Stratagen、ＵＳＡ）を使用した９４℃で５分間の前変性、９４℃で３０秒間の変性、プライマーを使用した５０℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で３０秒間の伸長。
【００６３】
図３に示すとおり、結果からＤＫＫ２の過剰発現細胞系および抑制細胞系が十分に生成されたことが明らかに示される。
【００６４】
（参考例３）
ＤＫＫ２トランスジェニックマウスの調製
血管内皮細胞のみで活性化されたＴｉｅ２転写調節領域を使用してＤＫＫ２過剰発現マウスを調製し、インビボでの血管新生に与えるＤＫＫ２遺伝子の効果を決定した（Schlaeger TMら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94(7). pp.3058-3063, 1997）。図６に示すとおり、配列番号：４によって表されるマウスＤＫＫ２遺伝子をHindIIIおよびNotI（NEB, 英国）で処理し、Pspベクター（Clontech、ＵＳＡ）にクローン化した。クローン化プラスミドをSalI（NEB, 英国）で処理し、ＤＮＡフラグメントを調製し、調製したＤＮＡフラグメントを、ゴナドトロピン放出ホルモン（Sigma、ＵＳＡ）により排卵が刺激されていたマウス（C57BL6, Orient Inc、大韓民国）から単離した卵子へ注入し、形質導入を誘導し、その後ＤＫＫ２トランスジェニック卵子を、受精後に代理母マウスに移植した。受精第２１日目後に出生したマウスの尾を切断し、プロテアーゼＫ（Sigma、ＵＳＡ）で処理し、ＤＮＡを単離し、単離したＤＮＡを、配列番号：７および配列番号：８によって表されるＤＫＫ２プライマーを使用してＰＣＲ［（９４℃で５分間の前変性、９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリングおよび７２℃で３０秒間の伸長）×３０サイクル、ならびに７２℃で１０分間の後伸長］で増幅した（図７参照）。
【００６５】
実験例１．ヒト臍帯静脈内皮細胞の分化中のＤＫＫ２発現スペクトル
２５０μlのマトリゲル（Collaborative Biomedical Products、ＵＳＡ；密度：１０mgタンパク質/ml）を直径１６nmのウェルプレートに添加し、３７℃で３０分間、重合を行った。参考例１で調製したＨＵＶＥＣを、２０%（v/v）のウシ胎仔血清（FBS, Hyclone、ＵＳＡ）、１００単位/mlのペニシリン（Invitrogen、ＵＳＡ）、１０μg/mlのストレプトマイシン（Invitrogen、ＵＳＡ）、３ng/mlのｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子；Upstate Biotechnology、ＵＳＡ）および５単位/mlのヘパリン（Sigma、ＵＳＡ）を含有するＭ１９９成長培地（Invitrogen、ＵＳＡ）で培養し、そこへトリプシンを添加し、培養細胞を得た。細胞を成長培地に懸濁し、２×１０５細胞個／ウェルの濃度でマトリゲル層に広げ、細胞分化を誘導した（図１参照）。
【００６６】
図１に示すとおり、分化は３つのステップからなる；第１ステップは対照群として使用される分化の開始であり、第２ステップは細胞移行に起因する血管様構造の形成であり、第３ステップは血管様構造形成の完成である。
【００６７】
TRIZOL溶液（Invitrogen、ＵＳＡ）により各ステップにおける細胞からＲＮＡを単離した後、単離したＲＮＡを、配列番号：５および配列番号：６によって表されるプライマーを用いて逆転写し、ならびに参考例３に開示したプロセスにしたがって増幅した（図２参照）。
【００６８】
図２に示すとおり、結果から管形成中にＤＫＫ２遺伝子の発現が増加したことが明らかに示される。ＤＫＫ２は管形成の正の調節因子であることが確認された。
【００６９】
実験例２．ヒト臍帯静脈内皮細胞の管形成に及ぼすＤＫＫ２の効果
２５０μlのマトリゲル（Collaborative Biomedical Products、ＵＳＡ；密度：１０mgタンパク質/ml）を直径１６nmのウェルプレートに添加し、３７℃で３０分間、重合を行った。参考例１で調製したＨＵＶＥＣを、２０%（v/v）のウシ胎仔血清（FBS, Hyclone、ＵＳＡ）、１００単位/mlのペニシリン（Invitrogen、ＵＳＡ）、１０μg/mlのストレプトマイシン（Invitrogen、ＵＳＡ）、３ng/mlのｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子；Upstate Biotechnology、ＵＳＡ）および５単位/mlのヘパリン（Sigma、ＵＳＡ）を含有するＭ１９９成長培地（Invitrogen、ＵＳＡ）で培養し、そこへトリプシンを添加し、培養細胞を得た。細胞を成長培地に懸濁し、２×１０５細胞個／ウェルの濃度でマトリゲル層に広げ、細胞分化を誘導した（図４参照）。それに対して５０ng/mlおよび１００ng/mlのＤＫＫ２を処理し、次いで細胞を２０時間培養した。管形成率を光学顕微鏡法（ZEISS、ドイツ）で測定し、ＤＫＫ２で処理していない群を負の対照群と見なした。
【００７０】
図４に示すとおり、結果から、管形成がＤＫＫ２の発現細胞系で誘導されたがＤＫＫ２の抑制細胞系では減少したことが明らかに示される。
【００７１】
実験例３．β‐カテニンに及ぼすＤＫＫ２の安定化効果
参考例２で調製したレンチウイルス系を使用したＤＫＫ２の過剰発現細胞系を２４時間培養した。培地を２０%（v/v）のウシ胎仔血清（FBS, Hyclone、ＵＳＡ）、１００単位/mlのペニシリン（Invitrogen、ＵＳＡ）、１０μg/mlのストレプトマイシン（Invitrogen、ＵＳＡ）、３ng/mlのｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子；Upstate Biotechnology、ＵＳＡ）および５単位/mlのヘパリン（Sigma、ＵＳＡ）を含有するＭ１９９成長培地（Invitrogen、ＵＳＡ）に交換し、そこへ２００ng/mlのsFrizzle（BD bioscience、ＵＳＡ）をＷｎｔ分泌阻害物質として添加した。２４時間培養した後、それに対してトリプシンを処理し、培養細胞を得た。１００mMのＴｒｉｓ／Ｃｌ、５mMのＥＤＴＡ、５０mMのベータ‐グリセロリン酸、５０mMのＮａＦ、１００μMのＮａ３ＶＯ４、１mMのＰＭＳＦ、０．５%のＮＰ‐４０および１%のトリトンＸ‐１００を含有する溶解バッファーを使用して細胞からＤＮＡを分離した。分離したＤＮＡの発現レベルは、β‐カテニン（Upstate Biotechnology、ＵＳＡ）の抗体を使用してウエスタンブロット試験により確認された。
【００７２】
図５に示すとおり、ＤＫＫ２によりβ‐カテニンタンパク質の発現レベルは、対照群（ｅＧＦＰ）と比較して有意に増加し、Ｗｎｔリプレッサー（ｓＦｚ）で処理したにもかかわらず増加レベルは減少しなかった。したがって、Ｗｎｔシグナル以外のβ‐カテニンタンパク質の発現レベルを制御することでＤＫＫ２は血管新生を刺激することが確認された。
【００７３】
実験例４．ＤＫＫ２トランスジェニックマウスの大動脈由来内皮細胞の新芽形成に及ぼすＤＫＫ２の効果
参考例３で調製したＤＫＫ２トランスジェニックマウスおよび６週齢正常マウスの背部から単離した大動脈を１mmのサイズに切断し、動脈輪組織を、１１０μlのマトリゲルでコートした４８ウェルプレートにのせた。ウェルを４０μlのマトリゲルで再度封入し、ＨＵＶＥＣ培地（SFM, Invitrogen、ＵＳＡ）を、各ウェルの最終体積が２００μlになるように各ウェルに添加した。５日後、各輪から形成された新芽数を計数し、ＤＫＫ２トランスジェニックマウス群の新芽の割合を対照マウス群と比較した（図８参照）。以下の基準にしたがって新芽を５群に分け、新芽の割合をスコア化した；５群すべてに新芽が形成されていれば５ポイントと定め、全体に新芽が形成されていなければ０ポイントと定めた。
【００７４】
図８で分かるように、結果からＤＫＫ２トランスジェニックマウスの動脈輪組織の新芽形成が正常マウスと比較して有意に増加したことが明らかに示される。
【００７５】
実験例５．ＤＫＫ２トランスジェニックマウス胎仔の血管発生に及ぼすＤＫＫ２の効果
妊娠第９〜１０日目の正常マウスおよびＤＫＫ２トランスジェニックマウスから取り出した胎仔を４％パラホルムアルデヒドで１日固定し、血管内皮細胞でのみ特異的に発現するフォンヴィレブランド因子（Ｖｗｆ）（Chemicon、ＵＳＡ）の抗体で染色し、文献（Sadler J. E., J. Thromb. Haemost., 3(8), ppl702-1709, 2005）に開示した方法で血管発生を観察した。
【００７６】
図９で分かるように、結果から血管新生および血管発生が全体的に、正常マウス対照と比較してＤＫＫ２トランスジェニックマウス胎仔で増加したことが明らかに示される。
【００７７】
胎仔の血管新生に対するＤＫＫ２の効果を検証するため、上述のプロセスで調製した胎仔の頭部毛管網、下行大動脈および部分的血管を高倍率で判定した。
【００７８】
図１０および１１に示すとおり、結果からＤＫＫ２トランスジェニックマウス胎仔の頭部毛管網および部分的血管および肥大下行大動脈の増殖が有意に促進されたことが明らかに示される。
【００７９】
以下に処方および賦形剤の種類を記述するが、本発明はそれらに限定されない。調製の代表例を以下に記述した。
【００８０】
注射剤の調製
ＤＫＫ２タンパク質１００mg
メタ重亜硫酸ナトリウム３．０mg
メチルパラベン０．８mg
プロピルパラベン０．１mg
注射適量の蒸留水
活性成分を溶解し、ｐＨを約７．５に調節し、次いで２mlのアンプルに全成分を充填し、通常の注射剤調製法で滅菌し、注射製剤を調製した。
【００８１】
粉末の調製
ＤＫＫ２タンパク質５００mg
コーンスターチ１００mg
ラクトース１００mg
タルク１０mg
上記成分を混合し、封入パッケージに充填し、粉末製剤を調製した。
【００８２】
錠剤の調製
ＤＫＫ２タンパク質２００mg
コーンスターチ１００mg
ラクトース１００mg
適量のステアリン酸マグネシウム
上記成分を混合し、打錠し（entabletting）、錠剤製剤を調製した。
【００８３】
カプセルの調製
ＤＫＫ２タンパク質１００mg
ラクトース５０mg
コーンスターチ５０mg
タルク２mg
適量のステアリン酸マグネシウム
上記成分を混合し、通常のゼラチン調製法でゼラチンカプセルに充填し、錠剤製剤を調製した。
【００８４】
液体の調製
ＤＫＫ２タンパク質１０００mg
砂糖２０g
多糖２０g
レモン香料２０g
活性成分を溶解し、１０００mlのアンプルに全成分を充填し、通常の液体調製法で滅菌し、液体製剤を調製した。
【００８５】
健康食品の調製
ＤＫＫ２タンパク質１０００mg
適量のビタミン混合物
ビタミンＡアセテート７０mg
ビタミンＥ１．０mg
ビタミンＢ１０．１３mg
ビタミンＢ２０．１５mg
ビタミンＢ６０．５mg
ビタミンＢ１２０．２mg
ビタミンＣ１０mg
ビオチン１０mg
ニコチン酸アミド１．７mg
葉酸５０mg
パントテン酸カルシウム０．５mg
適量のミネラル混合物
硫酸第一鉄１．７５mg
酸化亜鉛０．８２mg
炭酸マグネシウム２５．３mg
リン酸一カリウム１５mg
リン酸二カルシウム５５mg
クエン酸カリウム９０mg
炭酸カルシウム１００mg
塩化マグネシウム２４．８mg
上述のビタミンおよびミネラル混合物は様々な方法で変更可能である。このような変更例は本発明の精神および範囲から逸脱するものではないとみなすべきである。
【００８６】
健康飲料の調製
ＤＫＫ２タンパク質１０００mg
クエン酸１０００mg
オリゴ糖１００g
アンズ濃縮液２g
タウリン1g
蒸留水９００ml
活性成分を溶解し、混合し、８５℃で１時間攪拌し、ろ過し、次いで１０００mlのアンプルに全成分を充填し、通常の健康飲料調製法で滅菌し、健康飲料製剤を調製した。
【００８７】
本発明がこのように記述されていることから、本発明は様々な方法で変更可能であることは明らかであろう。このような変更例は本発明の精神および範囲から逸脱するものではないとみなされ、当業者に明白であるとされるこのような改変はすべて、以下の請求項の範囲内に包含されるように意図されている。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明に記述されたとおり、ＤＫＫ2により、ＨＵＶＥＣにおける管形成の刺激的活性、動脈輪組織における新芽形成の促進的活性、およびマウス胎仔における血管発生の促進的活性が見られた。したがって、ＤＫＫ2は虚血性疾患を治療および予防する治療的または機能的健康食品として使用可能である。
【００８９】
(配列リスト)
配列番号：１はヒトＤＫＫ２のアミノ酸配列、配列番号：２はヒトＤＫＫ２のＤＮＡ配列、配列番号：３はマウスＤＫＫ２のアミノ酸配列、配列番号：４はマウスＤＫＫ２のＤＮＡ配列、配列番号：５はヒトＤＫＫ２のフォワードプライマー配列、配列番号：６はヒトＤＫＫ２のリバースプライマー配列、配列番号：７はマウスＤＫＫ２のフォワードプライマー配列、配列番号：８はマウスＤＫＫ２のリバースプライマー配列である。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
上述の、および他の目的、特徴ならびに本発明の他の利点は、添付図面と共に記述された以下の詳細な説明からさらに明確に理解されるであろう；
【図１】マトリゲル上のＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）の分化形状を示す。左よりステップ１、ステップ２、ステップ３を示す。
【図２】ＨＵＶＥＣの分化におけるＤＫＫ２遺伝子の発現を示す。左よりステップ１、ステップ２、ステップ３を示す。
【図３】レンチウイルスを使用し、ＤＫＫ２発現細胞系およびＤＫＫ２抑制細胞系を産生した結果を示す。左は対照とＤＫＫ２過剰発現細胞系、右は対照とＤＫＫ２抑制細胞系を示す。
【図４】ＤＫＫ２発現および抑制細胞系における管形成を比較した結果を示す。上は対照とＤＫＫ２過剰発現細胞系、下は対照とＤＫＫ２抑制細胞系を示す。
【図５】Ｗｎｔシグナルと異なるＤＫＫ２での処置によりβ‐カテニンタンパク質を増加させた結果を示す。上はβ‐カテニン、下はアクチンを示す。
【図６】ＤＫＫ２トランスジェニックマウスを産生するためのベクター図を示す。Tie2  promoterはＴｉｅ２プロモーター、Tie2  enhancerはＴｉｅ２エンハンサーである。
【図７】ＤＮＡ増幅によりＤＫＫ２トランスジェニックマウスを確認したことを示す。
【図８】ＤＫＫ２トランスジェニックマウス大動脈からの内皮細胞出芽の誘導を示す。左は正常マウスとＤＫＫ２トランスジェニックマウス、右は縦軸は新芽形成スコア、横軸は正常マウスとＤＫＫ２トランスジェニックマウスを示す。
【図９】血管特異性タンパク質であるｖＷＦ抗体を使用した正常マウスおよびＤＫＫ２トランスジェニックマウス胎仔での血管発生を示す。右は常マウス、左はＤＫＫ２トランスジェニックマウスを示す。
【図１０】正常マウスおよびＤＫＫ２トランスジェニックマウス胎仔の頭部における血管新生を比較した結果を示す。右は正常マウス、左はＤＫＫ２トランスジェニックマウスを示す。
【図１１】正常マウスおよびＤＫＫ２トランスジェニックマウス胎仔における下行大動脈および部分的血管の増殖を示す。左は正常マウス、右はＤＫＫ２トランスジェニックマウス、ＤＡは下行大動脈、ＳＶは部分的血管を示す。
2009538295.tif 000003
【図１】
2009538295.tif 000004
【図２】
2009538295.tif 000005
【図３】
2009538295.tif 000006
【図４】
2009538295.tif 000007
【図５】
2009538295.tif 000008
【図６】
2009538295.tif 000009
【図７】
2009538295.tif 000010
【図８】
2009538295.tif 000011
【図９】
2009538295.tif 000012
【図１０】
2009538295.tif 000013
【図１１】
2009538295.tif 000014
【配列表】
2009538295000001.app
【国際調査報告】
2009538295.tif 000015
2009538295.tif 000016
2009538295.tif 000017
2009538295.tif 000018