(57)【要約】  ポリアニオン性多糖類及びキトサンのオリゴ糖誘導体からなるポリカチオン性多糖類の混合物を有する組成物について述べる。本発明の組成物において、上記の混合物は、酸性の多糖類及びキトサン誘導体との間にイオン複合体が形成されるにもかかわらず、水性環境下で溶解性を有することが証明された。また、この組成物は、使用される多糖類が相対的に低い平均分子量を有するにもかかわらず、粘性及び粘弾性において予期せぬ増加を示すという有意なレオロジー的挙動を示す。この溶解性及びレオロジー的挙動により、生物医学的観点からみると、本発明の組成物が特に有利となるものであり、特に、関節病態及び眼科手術の分野において特に粘性補給源として有利である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともひとつのアニオン性多糖類と少なくともひとつのキトサンのオリゴ糖誘導体との混合物の水溶液を有する多糖類組成物であって、
前記のキトサン誘導体は、少なくとも４０％の誘導体化率を有し、
前記水溶液は、少なくとも５０ｍＭであって１７５ｍＭを超えないイオン強度と、少なくとも７のｐＨとを有することを特徴とする多糖類組成物。
【請求項２】
前記イオン強度は、１５０ｍＭであることを特徴とする請求項１に記載の多糖類組成物。
【請求項３】
前記イオン強度は、前記水溶液において、０．０５Ｍ〜０．１７５Ｍの範囲の濃度を得るように、ＮａＣｌを添加することにより、得られることを特徴とする請求項１に記載の多糖類組成物。
【請求項４】
前記イオン強度は、前記水溶液において、０．１５Ｍの範囲の濃度を得るように、ＮａＣｌを添加することにより、得られることを特徴とする請求項２に記載の多糖類組成物。
【請求項５】
前記の少なくともひとつのアニオン性多糖類と少なくともひとつのキトサンのオリゴ糖誘導体との混合物において、前記アニオン性多糖類及び前記キトサンのオリゴ糖誘導体は、キトサンのオリゴ糖誘導体に対するアニオン性多糖類の重量比で１０：１〜１：１の範囲であることを特徴とする請求項１に記載の多糖類組成物。
【請求項６】
前記の少なくともひとつのアニオン性多糖類と少なくともひとつのキトサンのオリゴ糖誘導体との混合物において、前記アニオン性多糖類及び前記キトサンのオリゴ糖誘導体は、キトサンのオリゴ糖誘導体に対するアニオン性多糖類の重量比で３：１〜１：１の範囲であることを特徴とする請求項５に記載の多糖類組成物。
【請求項７】
前記の少なくともひとつのアニオン性多糖類と少なくともひとつのキトサンのオリゴ糖誘導体との混合物の水溶液は、１．５％（ｗ／ｖ）〜３％（ｗ／ｖ）の範囲のポリマーの全濃度を有することを特徴とする請求項１に記載の多糖類組成物。
【請求項８】
前記の少なくともひとつのアニオン性多糖類と少なくともひとつのキトサンのオリゴ糖誘導体との混合物の水溶液は、７〜８の範囲のｐＨを有することを特徴とする請求項１に記載の多糖類組成物。
【請求項９】
前記の少なくともひとつのアニオン性多糖類と少なくともひとつのキトサンのオリゴ糖誘導体との混合物の水溶液は、非イオン性溶質をさらに添加することにより得られる、２５０〜３５０ｍＭの範囲のオスモル濃度を有することを特徴とする請求項１に記載の多糖類組成物。
【請求項１０】
前記非イオン性溶質は、マンニトールであることを特徴とする請求項６に記載の多糖類組成物。
【請求項１１】
前記キトサンの置換度は、５０％〜８０％の範囲であることを特徴とする請求項１に記載の多糖類組成物。
【請求項１２】
前記キトサンの置換度は、７０％であることを特徴とする請求項１１に記載の多糖類組成物。
【請求項１３】
前記キトサンのオリゴ糖誘導体は、キトサンを、２〜４のグリコシド単位を有するオリゴ糖で誘導体化して得られることを特徴とする請求項１に記載の多糖類組成物。
【請求項１４】
前記オリゴ糖は、ラクトース、セロビオース、セロトリオース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、チトビオース、チトトリオース、メリビオースからなる群から選択されることを特徴とする請求項１３に記載の多糖類組成物。
【請求項１５】
前記オリゴ糖は、ラクトースであることを特徴とする請求項１４に記載の多糖類組成物。
【請求項１６】
前記キトサンは、１，５００ｋＤａ以下の平均分子量を有することを特徴とする請求項１３乃至１５のいずれか一項に記載の多糖類組成物。
【請求項１７】
前記キトサンは、４００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａの平均分子量を有することを特徴とする請求項１６に記載の多糖類組成物。
【請求項１８】
前記アニオン性多糖類は、カルボキシル化又は硫酸化された多糖類であることを特徴とする請求項１に記載の多糖類組成物。
【請求項１９】
前記のカルボキシル化された多糖類は、ヒアルロン酸、アルギン酸塩、ペクチン、カルボキシメチルセルロース、キサンタンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１８に記載の多糖類組成物。
【請求項２０】
前記のカルボキシル化された多糖類は、ヒアルロン酸であることを特徴とする請求項１９に記載の多糖類組成物。
【請求項２１】
前記の硫酸化された多糖類は、カラギーナン、アガロース硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、硫酸化デンプン、ヘパリン、ヘパラン硫酸からなる群から選択されることを特徴とする請求項１８に記載の多糖類組成物。
【請求項２２】
前記アニオン性多糖類は、１，５００ｋＤａ以下の平均分子量を有することを特徴とする請求項１８乃至２１のいずれか一項に記載の多糖類組成物。
【請求項２３】
前記アニオン性多糖類は、１００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａの平均分子量を有することを特徴とする請求項２２に記載の多糖類組成物。
【請求項２４】
前記アニオン性多糖類は、９００ｋＤａの平均分子量を有することを特徴とする請求項２３に記載の多糖類組成物。
【請求項２５】
生物医学分野に適用するための、ヒト又は非ヒト哺乳類への投与用に許容な製品を製造するための、請求項１乃至２４のいずれか一項に記載の多糖類組成物の使用。
【請求項２６】
前記適用は、炎症性及び／又は外傷性骨関節病態を処置するための粘性補給源であることを特徴とする請求項２５に記載の多糖類組成物の使用。
【請求項２７】
前記骨関節病態は、骨関節炎、変形性関節症、半月板断裂、靱帯断裂からなる群から選択されることを特徴とする請求項２６に記載の多糖類組成物の使用。
【請求項２８】
前記投与は、関節内経由によるものであることを特徴とする請求項２６又は２７に記載の多糖類組成物の使用。
【請求項２９】
前記適用は、眼科手術用であることを特徴とする請求項２５に記載の多糖類組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アニオン性及びポリカチオン性多糖類からなる多糖類の混合物を有し、適当な物理−化学的特徴、特に高粘性及び粘弾性を有する組成物、並びにその生物医学的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
多糖類は、その高い生体適合性と独特の物理−化学的特性、特にその水溶液の粘性挙動に関し、かなりの適用可能な興味あるバイオポリマーとして知られており、そのレオロジー的挙動は、その分子量と主として関連することも知られている。これらのバイオポリマーのうち、ヒアルロン酸は、適用の観点から、最も興味ある生体適合性ポリマーであって、生物医学の分野で最も広く使用されている。その理由は、その水溶液が、興味深い粘性及び粘弾性特性を示す独特のレオロジー的挙動を有するためである。この多糖類は、グルクロン酸とＮ−アセチル−グルコサミンとからなる二糖の繰り返し単位を有することが知られている。この多糖の並びにおいてウロン酸単位が存在することから、ヒアルロン酸は、生理的ｐＨ（つまり、７．４）においてネットの負電荷を有し、従って、ポリアニオンである。化粧品分野及び医薬品分野又は薬物送達システムにおいて、その特徴（つまり、粘性及び粘弾性）のため、幅広い用途が見出されている。特に、眼科手術や骨関節病態に幅広い適用例が見出されており、ここで、ヒアルロン酸は、上記の物理−化学的特性の恩恵による滑液の粘性補給源（ｖｉｓｃｏｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）に広範に使用されている。事実、高分子量のヒアルロン酸（２，０００ｋＤａ以上）の濃厚溶液（１〜２％）は、高い粘性とともに優れた粘弾性特性を有する。斯かる特性により、ヒアルロン酸は、炎症性であっても外傷性であっても、関節病態の処置に特に優れる。その理由は、関節自体の十分な機能性を提供し及び／又は回復し得るためである。骨関節領域におけるヒアルロン酸の適用例に関する好適な処方は、関節内経由で投与される注射可能なヒアルロン酸溶液としてのものである；この様式において、その独特のレオロジー的特性（つまり、粘性及び粘弾性）は、関節に対する「機械的な」機能性を回復する目的のために完全に使用され得る。
【０００３】
しかしながら、分解及び低分子量のポリマーの形成及び／又は高い多分散性を阻害すると同時に、少なくとも２，０００ｋＤａの高分子量のヒアルロン酸を取得し精製することは、上記の処理に使用するための調製の全体的なコストに重い負荷をかける、複雑で高価な製造工程を必要とする。この問題を克服するため、低分子量、すなわち、安価なヒアルロン酸溶液の粘性の可能性について、かなりの興味が向けられており、低い価値が付加された適用例（例えば、化粧品分野）に通常使用される製造不良に、かなりの経済的利益を有するものとして使用を可能とするものである。このことは、低分子量のヒアルロン酸のレオロジー的挙動を向上／増加することを目的として、ヒアルロン酸誘導体、特に種々の架橋剤で架橋された誘導体に関する進展した研究をもたらしている。
【０００４】
また、その他の多糖類は、水の溶液／懸濁液の粘性特性のため、幅広い用途が見出されている。豊富であり比較的低コストであることで医薬品及び食品工業の両方で最も利用されているものとしては、アルギン酸塩及びキトサンが挙げられる。
【０００５】
キトサンは、クラスタシィアンの外骨格の主成分であるキチンの化学的脱アセチル化により得られる天然で広く利用可能な多糖類である。キトサンは、主として、Ｎ−アセチル−グルコサミン単位で散在されたグルコサミン単位からなり、残りは、キチン処理に由来する。この多糖類は、有機酸又は無機酸を添加することによりｐＨが５以下となるまで、水に溶解しない。ｐＨを下げると、グルコサミン残基のアミン基がプロトン化し、系に溶解性を与える。その幅広い用途に関連して、キトサンは、適用目的に有用な、その特性、特に粘性及び水に対する溶解性を向上させる目的で、化学的態様を含む最も研究された多糖類のひとつとなってきた。過去数年来、ポリマー鎖の化学的改変により、種々のキトサン誘導体が得られてきた。これらの改変に関し、グルコサミン単位のアミン残基の反応が通常使用される。特に、側鎖として糖類単位（単糖及びオリゴ糖）を付加することにより、ポリマーの分解という次なる問題を伴う酸へとｐＨを低下させる必要なく、水溶性のキトサン誘導体を得ることが可能となる。
【０００６】
特許文献１（Ｈａｌｌ，Ｌ．Ｄ．及びＹａｌｐａｎｉ，Ｍ．）は、これらの誘導体の合成について、最初に述べており、非酸性水系環境での溶解性についても、述べている。
【０００７】
特許文献２（Ｈｏｕｓｅ，Ｒ．Ｆ．）においては、水溶液の粘性を増加させるために、溶液又は分散液のいずれかとして、その他のポリマー系と組み合わされてはいないものの、特許文献１で述べられているものと同様の様式で改変されたキトサンが使用されている。
【０００８】
特許文献３（Ｎｏｒｄｑｕｉｓｔ，Ｒ．Ｅ．ら）においては、単糖又はオリゴ糖で改変されたキトサンを用いて調製された生体材料が、増感物質と組み合わせたレーザーシステムの使用に基づく免疫療法処置における免疫アジュバントとして使用されている。
【０００９】
物理−化学的特性を向上させる目的、すなわち、これらの多糖類、特にヒアルロン酸、ヒアルロン酸及びキトサンを組み合わせて得た組成物の粘性及び／又は粘弾性についても述べられている。
【００１０】
特許文献４（Ｃｈｏ，Ｋ．ら）においては、向上された物理−化学的特性、特に、向上された粘弾性を有するヒアルロン酸を得る目的で、グリコールに適当なアミン基を導入することで得たアミド基により、本質的にＰＥＧ又はＰｌｕｒｏｎｉｃのグリコールポリマーに架橋されたヒアルロン酸の誘導体を調製している。また、特定の例において、第二の多糖類、つまり、低分子量（最大５ｋＤａ）のキトサンに架橋されたヒアルロン酸誘導体についても述べている。この架橋反応には、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシサクシニミド）の存在下、ＥＤＣ（Ｎ−［３−ジメチルアミノプロピル］−Ｎ’−エチルカルボジイミドクロライド）などの縮合剤を使用する。この架橋されたヒアルロン酸誘導体は、高い粘弾性を有し、これらの物理−化学的特徴を有するヒアルロン酸の種々の用途に適しており、関節病態の処置用の粘性補給源への使用が含まれる。上記の特許出願で同定された処理により、２つの多糖類を組み合わせており、対に帯電した２つの多糖類間のイオン型の結合性相互作用ではなく、共有結合により、これらを向上させると同時に、その物理−化学的特性を利用する。
【００１１】
注目すべきように、キトサンのポリカチオン性の性質は、他の多糖類との適合性を困難とし、特に、ヒアルロン酸などのポリアニオン性との適合性を困難とする。この点、ヒアルロン酸（ポリアニオン性）の水溶液と、キトサン（ポリカチオン性）の水溶液との組合せは、不溶性の液滴形成（ｃｏａｃｅｒｖａｔｅ）の瞬間的な形成を可能とする。このことは、水性環境において、一方の正電荷と他方の負電荷との強力な相互作用が確立するという事実に起因する。２つの多糖類の沈殿／液滴形成は、注入可能な組成物としての種々の処方を妨げる。この塩基性の多糖類と酸性の多糖類との液滴形成の工程は、周知であって、文献に広く述べられている。例えば、特許文献５（Ｓｅｖｅｒｉａｎ，Ｄ．ら）キトサン及び側鎖に負の電荷を有する多糖類であるキサンタンの液滴形成について述べており、不溶性のハイドロゲルを得るのに使用される。
【００１２】
キトサンをより水溶性とする目的で、特許文献６（Ｎｏｒｄｑｕｉｓｔ，Ｒ．Ｅ．，Ｃａｒｕｂｅｌｌｉ，Ｒ．）は、キトサンの単糖及び／又はオリゴ糖で糖化された誘導体を一般的に提供するとともに、この発明の目的に好適な誘導体としてこれらのガラクトース誘導体について述べている。しかしながら、後者のタイプの反応において、ガラクトースは、不可逆的に改変されて、ガラクチトールを与える。これらの誘導体の溶液は、粘性を有する手術（ｖｉｓｃｏｓｕｒｇｅｒｙ）、特に眼科の粘性を有する手術に必要な特徴を有する。これらの特徴は、２５０〜３５０ｍＭの生理的なオスモル濃度と、５．５〜７．５のｐＨとを有する。また、ヒアルロン酸などの粘性を有する手術に使用可能な他の材料と混合された上記の材料を組み合わせた用途についても提供する。しかしながら、斯かる混合物は、形成されず、言及したアニオン性ポリマーとカチオン性ポリマーとの間の相互的な適合性の公知の問題ではない。従って、上記の混合物に必要な条件は、液滴形成又は可能な相分離を生じさせず、混合物が分子的に分散された溶液の条件の不可逆的な喪失、及び上記の組成物のレオロジー的特徴の改変について、言及していない。
【００１３】
特許文献７（Ｗｈｉｔｅ，Ｂ．Ｊ．ら）は、塩基性多糖類と非架橋のアニオン性多糖類の水溶性架橋誘導体を有する組成物からなるハイドロゲルの調製について述べている。特に、このハイドロゲルは、ヒアルロン酸を、架橋されたＮ−カルボキシメチル、Ｏ−カルボキシメチル、Ｏ−ヒドロキシメチルキトサン誘導体と、又は部分的にアセチル化されたキトサンと混合することにより得られる。これらのキトサン誘導体は、本願発明者らによると、鎖に種々の正電荷を有さず且つイオン複合体の形成を阻止するｐＨ条件下で溶解化されるので、ヒアルロン酸と水溶液中で混合可能である。この様式において、ポリアニオンとの液滴形成は、ポリマーの一方の電荷を完全に除去又は補完することにより、回避される。従って、これらは、ポリアニオン／中性の多糖類又はポリアニオン又は多両性電解質の溶液である。
【００１４】
しかしながら、適当な物理的−化学的特徴を有する組成物を得るために互いに混合された異なる電荷のものであっても低分子量又は比較的低分子量の多糖類を使用する可能性は、高い粘性／粘弾性の多糖類溶液に関して、生物医学分野において大きな適用的興味及び複数の適用例の観点から、未だ追求されるべき目的である。この点、多くの公知の適用例に適当な物理的−化学的特徴を有する多糖類溶液を調製する新規の技術的解決法が、未だ精力的に探索されている。
【特許文献１】米国特許第４，４２４，３４６号明細書
【特許文献２】米国特許第６，２７７，７９２号明細書
【特許文献３】米国特許第５，７４７，４７５号明細書
【特許文献４】国際公開第２００４／０２２６０３号パンフレット
【特許文献５】米国特許第５，６２０，７０６号明細書
【特許文献６】米国特許第６，７５６，３６３号明細書
【特許文献７】国際公開第２００５／０６１６１１号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
従って、本発明の第一の目的は、眼科手術などの生物医学領域における粘性及び／又は粘弾性溶液用のその他の公知の適用例を排除することなく、少なくとも炎症性及び外傷性の関節病態の粘性補給の処置の適用例のための適当な粘性／粘弾性を有する多糖類水溶液を調製することである。
【００１６】
本発明の第二の目的は、物理的−化学的特徴を向上させつつコストに有意な影響を与える複雑な化学的手法に多糖類を付することなく、市販且つ安価な多糖類、従って、低分子量又は比較的低分子量の多糖類を有する組成物を調製することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記の目的を満たすため、本願発明者らは、アニオン性多糖類と物理的に混合した際、適当な条件下で、不溶性の液滴形成を生じることなく、両方の多糖類の水溶液を与える、塩基性多糖類の適当な誘導体を同定した。
【００１８】
実行される目的は、アニオン性多糖類及びキトサンのオリゴ糖誘導体で達成される。さらに、同定された条件は、改変されたポリカチオン性多糖類及びポリアニオン性多糖類の溶解性混合物を得るように一般的に適用される。
【００１９】
驚くべきことに、ポリアニオン性多糖類及びポリカチオン性多糖類誘導体の物理的な混合物が水性環境において水溶性である組成物を生じさせるとともに、この組成物は、キトサンのオリゴ糖誘導体を添加した後のポリアニオン溶液の粘度のかなりの増加を示す。
【００２０】
従って、本発明は、少なくともひとつのアニオン性多糖類及び少なくともひとつのキトサンのオリゴ糖誘導体の混合物の水溶液を有する多糖類組成物を提供し、上記のキトサン誘導体は、少なくとも４０％の誘導体化率を有し、上記の水溶液は、少なくとも５０ｍＭで１７５ｍＭを上回らないイオン強度を有し、且つ少なくとも７のｐＨを有する。
【００２１】
また、本発明は、生物医学分野における多糖類混合物の上記の組成物の使用を提供し、骨関節病態の処理用の関節内への粘性補給源への、及び眼科手術への使用を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の多糖類組成物の目的及び利点は、下記の詳細な記載からより良好に理解されるであろう。ここで、本発明の非限定的な例示として、組成物の数次の例及びその物理的−化学的特徴について述べる。
【００２３】
高くない平均分子量の多糖類から出発して、複雑な化学的操作を行うことなく、例えばヒアルロン酸などのポリアニオン性多糖類の水性環境における、多糖類の種々の公知の使用、特に排他的ではなく関節の粘性補給源に適した粘性及び／又は粘弾性を有する組成物を得る目的で、本願発明者らは、キトサンのオリゴ糖誘導体を用いることにより可能な解決法を達成し得ることを見出した。
【００２４】
この目的は、酸性多糖類及び塩基性多糖類の誘導体の混合物を有する組成物、すなわち、少なくともひとつのアニオン性多糖類と少なくともひとつのキトサンのオリゴ糖誘導体との混合物の水溶液を有する多糖類組成物で達成可能であり、このポリカチオン性多糖類誘導体は、少なくとも４０％の誘導体化率を有し、上記の水溶液は、少なくとも５０ｍＭで１７５ｍＭを超えないイオン強度と、少なくとも７のｐＨとを有する。本発明の多糖類混合物の水溶液を得るため、上記のアニオン性多糖類及びキトサンの誘導体は、オリゴ糖誘導体に対するポリアニオンの重量比で１０：１（ポリアニオン：キトサン誘導体）〜１：１の範囲内である。本発明の目的のため、多糖類間の好ましい重量比は、特に、３：１〜１：１の範囲であり、一方、溶液のポリマー濃度は、１．５％ｗ／ｖ（ｇ／ｍＬ）〜３％ｗ／ｖ（ｇ／ｍＬ）である。
【００２５】
例えば反応性アミノ化反応によりラクトース単位を挿入することによる、糖類の側鎖を用いたキトサンの誘導体化は、公知であって、特許文献１に述べられている；また、この誘導体は、水に対してこの塩基性多糖類のより高い溶解度を可能とすることも知られている。当業者に公知のキトサンは、１〜４のグリコシド単位を有するオリゴ糖を還元する反応性アミノ化反応により、誘導体化され得る。特に、本発明の目的のため、このオリゴ糖は、２〜４のグリコシド単位を有し、ラクトース、セロビオース、セロトリオース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、チトビオース（ｃｈｉｔｏｂｉｏｓｅ）、キトトリオース、メリビオースからなる群から好ましく選択される。
【００２６】
上記のオリゴ糖誘導体を製造するのに使用し得るキトサンの平均分子量（以下、Ｍｗと称する。）は、１，５００ｋＤａ以下であってもよく、好ましくは、４００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａの範囲である。また、本発明の目的のため、キトサンのアミン基の上記オリゴ糖を用いた置換度は、４０〜４５％（〜４５％）を超える必要がある。好ましくは、キトサンのアミン基のオリゴ糖による置換度は、５０〜８０％の範囲であってもよく、より好ましくは７０％である。
【００２７】
キトサンのオリゴ糖誘導体の調製方法は、公知であって、シアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下、酢酸（ｐＨ４．５）及びメタノール中にキトサンを有する溶液を、ラクトースなどの還元糖と反応させることを有する。キトサンのアミン基とラクトースのアルデヒド基との間の相互作用により、シッフ塩基として公知の不安定な中間体が形成する。これを、水素化ホウ素の存在下、還元して、安定な第二級アミンを形成する。
【００２８】
ポリアニオン性多糖類について、本発明の多糖類混合物の組成物は、カルボキシル化されたアニオン性多糖類（例えば、ヒアルロン酸、アルギン酸塩、ペクチン酸塩、カルボキシメチルセルロース、キサンタン及びその他の微生物由来のカルボキシル化された多糖類）及び硫酸物（カラギーナン、アガロース硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、硫酸化デンプン、ヘパリン、ヘパラン硫酸）を用いて、取得可能である。本発明の組成物に関し、酸性多糖類は、ヒアルロン酸、アルギン酸塩、ペクチン酸塩、カルボン酸塩に関してカルボキシメチルセルロース、カラギーナン、硫酸物に関してアガロース硫酸からなる群から好ましく選択される。ポリアニオンの平均分子量（Ｍｗ）は、１，５００ｋＤａに達してもよく、好ましくは、１００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａであり；より好ましくは約９００ｋＤａの平均分子量を有するものが利用される。
【００２９】
本発明の目的に関し、キトサン誘導体及びポリアニオンの混合物は、３％ｗ／ｖ（ｇ／ｍＬ）以下のポリマーの全濃度を有してもよい。好ましくは、このポリマーの全濃度は、１．５％ｗ／ｖ（ｇ／ｍＬ）〜３％ｗ／ｖ（ｇ／ｍＬ）の範囲である。
【００３０】
一般的に、溶液における上記の２つの異なるポリマーの適合性は、少なくとも５０ｍＭのイオン強度を生じ得る支持塩の存在下、ｐＨ７．４を可能とし、好ましくは、１０：１（ポリアニオン：キトサン誘導体）〜１：１（ポリアニオン：キトサン誘導体）であり、より好ましくは３：１（ポリアニオン：キトサン誘導体）〜１：１（ポリアニオン：キトサン誘導体）である。
【００３１】
従って、本発明によると、混合物が水において溶液を形成するように、２つのポリマー溶液を混合するのに適用される条件は、ｐＨ７〜８であり、好ましくは生理的ｐＨである７．４の近辺及び適当なイオン強度である。特に、十分なイオン強度［イオン強度＝１／２（Σｉｃｉｚｉ２）であって、ここで、ｃｉは、ｉ番目のイオン種の濃度であり、ｚｉは、その電荷の絶対値である］を得る目的で、本発明の混合物を有する組成物は、ポリマーの全濃度が１．５％〜３％である場合、簡単な支持塩、好ましくはＮａＣｌであって、０．０５Ｍ（イオン強度５０ｍＭ）〜０．１７５Ｍ（イオン強度＝１７５ｍＭ）の濃度を有する。好ましくは、支持塩の濃度は、３％以下のポリマーの全濃度を有する溶液に関して、０．１５Ｍ（イオン強度＝１５０ｍＭ）である。支持塩及び多糖類の溶液と同様に、少量の緩衝液を添加してもよい。好ましくは、Ｈｅｐｅｓ（（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）ナトリウム塩）を１０ｍＭの濃度で系に添加して、一定の値のｐＨ、好ましくは７〜８、より好ましくは７．４に系を保持する。
【００３２】
また、この組成物の生物医学用途のため、本発明の多糖類混合物の水溶液に関して、非イオン性溶質を可能にさらに添加することにより、２５０〜３５０ｍＭのオスモル濃度を確保すべきである。使用可能な好ましい非イオン性溶質は、マンニトールである。
【００３３】
いくつかのキトサンのオリゴ糖誘導体の合成、及び本発明の多糖類の混合物を有する組成物を調製する例について、非限定的に示すことにより、以下に述べる。
【００３４】
例１
キトサンのラクトース誘導体（いわゆる、キトラック（ｃｈｉｔｌａｃ））の合成
キトサン（１．５ｇ、アセチル化度１１％）を、メタノール（５５ｍＬ）及び１％の酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）（５５ｍＬ）を有する溶液１１０ｍＬに溶解する。ラクトース（２．２ｇ）及びシアン水素化ホウ素ナトリウム（９００ｍｇ）を含有するメタノール（３０ｍＬ）及び１％の酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）（３０ｍＬ）を有する溶液６０ｍＬを添加する。この混合物を、２４時間、攪拌下で載置し、透析チューブ（カットオフ：１２０００Ｄａ）に導入し、伝導度が４℃において４μＳとなるまで、０．１ＭのＮａＣｌ（２倍量（ｃｈａｎｇｅ））及び脱イオン水に対して透析する。最終的に、溶液を、ミリポア社製０．４５μｍのフィルターで濾過し、凍結乾燥する。
【００３５】
例２
キトサンのセロビオース誘導体（以下、いわゆるキトセル（ｃｈｉｔｃｅｌｌ）と称する。）の合成
キトサン（１．５ｇ、アセチル化度１１％）を、メタノール（５５ｍＬ）及び１％の酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）（５５ｍＬ）を有する溶液１１０ｍＬに溶解する。セロビオース（２．２ｇ）及びシアン水素化ホウ素ナトリウム（９００ｍｇ）を含有するメタノール（３０ｍＬ）及び１％の酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）（３０ｍＬ）を有する溶液６０ｍＬを添加する。この混合物を、２４時間、攪拌下で載置し、透析チューブ（カットオフ：１２０００Ｄａ）に導入し、伝導度が４℃において４μＳとなるまで、０．１ＭのＮａＣｌ（２倍量（ｃｈａｎｇｅ））及び脱イオン水に対して透析する。最終的に、溶液を、ミリポア社製０．４５μｍのフィルターで濾過し、凍結乾燥する。
【００３６】
例３
キトサンのマルトトリオース誘導体（以下、いわゆるキトマル３（ｃｈｉｔｍａｌ３）と称する。）の合成
キトサン（３００ｍｇ、アセチル化度１１％）を、メタノール（１１ｍＬ）及び１％の酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）（１１ｍＬ）を有する溶液２２ｍＬに溶解する。マルトトリオース（６５０ｍｇ）及びシアン水素化ホウ素ナトリウム（１８０ｍｇ）を含有するメタノール（６ｍＬ）及び１％の酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）（６ｍＬ）を有する溶液１２ｍＬを添加する。この混合物を、２４時間、攪拌下で載置し、透析チューブ（カットオフ：１２０００Ｄａ）に導入し、伝導度が４℃において４μＳとなるまで、０．１ＭのＮａＣｌ（２倍量（ｃｈａｎｇｅ））及び脱イオン水に対して透析する。最終的に、溶液を、ミリポア社製０．４５μｍのフィルターで濾過し、凍結乾燥する。
【００３７】
下記の多糖類混合物の例は、上記のキトサン誘導体及び種々の平均分子量のポリアニオン性多糖類を用いて得られる。
【００３８】
例４
低いＭｗのヒアルロン酸：キトラックの３：１ｗ／ｗの混合物であって、ポリマーの全濃度２％ｗ／ｖ（ｇ／ｍＬ）のもの
０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）を含有するヒアルロン酸（６００ｍｇ、Ｍｗ〜１６０，０００）の溶液２０ｍＬを調製する。０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）を含有するキトラック（２００ｍｇ、Ｍｗ〜１．５×１０６、例１のもの）の溶液２０ｍＬを調製する。この２つの溶液を、マグネティックロッドスターラー（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｏｄ  ｓｔｉｒｒｅｒ）で混合し、１．５％のヒアルロン酸及び０．５％のキトラック（ポリマーの全濃度２％）を含有する、澄明で沈殿物及び／又は液滴形成のない４０ｍＬの溶液を得る。
【００３９】
例５
低いＭｗのヒアルロン酸：キトラックの３：１ｗ／ｗの混合物であって、ポリマーの全濃度２％ｗ／ｖ（ｇ／ｍＬ）のもの
０．１ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）を含有するヒアルロン酸（６００ｍｇ、Ｍｗ〜１６０，０００）の溶液２０ｍＬを調製する。０．１ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）を含有するキトラック（２００ｍｇ、Ｍｗ〜１．５×１０６、例１のもの）の溶液２０ｍＬを調製する。この２つの溶液を、マグネティックロッドスターラーで混合し、１．５％のヒアルロン酸及び０．５％のキトラック（ポリマーの全濃度２％）を含有する、澄明で沈殿物及び／又は液滴形成のない４０ｍＬの溶液を得る。
【００４０】
例６
低いＭｗのヒアルロン酸：キトラックの３：１ｗ／ｗの混合物であって、ポリマーの全濃度２％ｗ／ｖ（ｇ／ｍＬ）のもの
０．０５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）を含有するヒアルロン酸（６００ｍｇ、Ｍｗ〜１６０，０００）の溶液２０ｍＬを調製する。０．０５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）を含有するキトラック（２００ｍｇ、Ｍｗ〜１．５×１０６、例１のもの）の溶液２０ｍＬを調製する。この２つの溶液を、マグネティックスターラーで混合し、１．５％のヒアルロン酸及び０．５％のキトラック（ポリマーの全濃度２％）を含有する、澄明で沈殿物及び／又は液滴形成のない４０ｍＬの溶液を得る。
【００４１】
例７
低いＭｗのヒアルロン酸：キトラックの３：１ｗ／ｗの混合物であって、ポリマーの全濃度２％ｗ／ｖ（ｇ／ｍＬ）のもの
０．０２５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）を含有するヒアルロン酸（６００ｍｇ、Ｍｗ〜１６０，０００）の溶液２０ｍＬを調製する。０．０２５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）を含有するキトラック（２００ｍｇ、Ｍｗ〜１．５×１０６、例１のもの）の溶液２０ｍＬを調製する。この２つの溶液を、マグネティックスターラーで混合し、１．５％のヒアルロン酸及び０．５％のキトラック（ポリマーの全濃度２％）を含有する４０ｍＬの溶液を得る。なお、液滴形成が観察される。
【００４２】
例８
低いＭｗのヒアルロン酸：キトラックの１：１ｗ／ｗの混合物であって、ポリマーの全濃度１．５％ｗ／ｖ（ｇ／ｍＬ）のもの
０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）を含有するヒアルロン酸（３００ｍｇ、Ｍｗ〜１６０，０００）の溶液２０ｍＬを調製する。０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）を含有するキトラック（３００ｍｇ、Ｍｗ〜１．５×１０６、例１のもの）の溶液２０ｍＬを調製する。この２つの溶液を、マグネティックスターラーで混合し、０．７５％のヒアルロン酸及び０．７５％のキトラック（ポリマーの全濃度１．５％）を含有する、澄明で沈殿物及び／又は液滴形成のない４０ｍＬの溶液を得る。
【００４３】
例９
カルボキシメチルセルロース：キトラックの１：１ｗ／ｗの混合物であって、ポリマーの全濃度１．５％ｗ／ｖ（ｇ／ｍＬ）のもの
０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）を含有するカルボキシメチルセルロース（３００ｍｇ、Ｍｗ〜２７０，０００、ｄ．ｓ．０．９）の溶液２０ｍＬを調製する。０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）を含有するキトラック（３００ｍｇ、Ｍｗ〜１．５×１０６、例１のもの）の溶液２０ｍＬを調製する。この２つの溶液を、マグネティックスターラーで混合し、０．７５％のカルボキシメチルセルロース及び０．７５％のキトラック（ポリマーの全濃度１．５％）を含有する、澄明で沈殿物及び／又は液滴形成のない４０ｍＬの溶液を得る。
【００４４】
例１０
アルギン酸塩：キトラックの１：１ｗ／ｗの混合物であって、ポリマーの全濃度１．５％ｗ／ｖ（ｇ／ｍＬ）のもの
０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）を含有するアルギン酸塩（３００ｍｇ、Ｍｗ〜１３０，０００）の溶液２０ｍＬを調製する。０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）を含有するキトラック（３００ｍｇ、Ｍｗ〜１．５×１０６、例１のもの）の溶液２０ｍＬを調製する。この２つの溶液を、マグネティックスターラーで混合し、０．７５％のアルギン酸塩及び０．７５％のキトラック（ポリマーの全濃度１．５％）を含有する、澄明で沈殿物及び／又は液滴形成のない４０ｍＬの溶液を得る。
【００４５】
例１１
アガロース硫酸：キトラックの１：１ｗ／ｗの混合物であって、ポリマーの全濃度１．５％ｗ／ｖ（ｇ／ｍＬ）のもの
０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）を含有するアガロース硫酸（３００ｍｇ、低ゲル化点）の溶液２０ｍＬを調製する。０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）を含有するキトラック（３００ｍｇ、Ｍｗ〜１．５×１０６、例１のもの）の溶液２０ｍＬを調製し、上記の溶液として同温度で保持する。この２つの溶液を、熱条件（〜５０℃）下、マグネティックスターラーで混合し、０．７５％のアガロース硫酸及び０．７５％のキトラック（ポリマーの全濃度１．５％）を含有する、澄明で沈殿物及び／又は液滴形成のない４０ｍＬの溶液を得る。
【００４６】
例１２
κ−カラギーナン：キトラックの１：１ｗ／ｗの混合物であって、ポリマーの全濃度１．５％ｗ／ｖ（ｇ／ｍＬ）のもの
０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）を含有するκ−カラギーナン（３００ｍｇ、Ｍｗ〜２７０，０００）の溶液２０ｍＬを調製する。０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）を含有するキトラック（３００ｍｇ、Ｍｗ〜１．５×１０６、例１のもの）の溶液２０ｍＬを調製する。この２つの溶液を、マグネティックスターラーで混合し、０．７５％のκ−カラギーナン及び０．７５％のキトラック（ポリマーの全濃度１．５％）を含有する、沈殿物のない４０ｍＬの溶液を得る。
【００４７】
例１３
低いＭｗのヒアルロン酸：キトラックの１：１ｗ／ｗの混合物であって、脱イオン中でのポリマーの全濃度１．５％ｗ／ｖ（ｇ／ｍＬ）のもの
脱イオン水中でヒアルロン酸（３００ｍｇ、Ｍｗ〜１６０，０００）の溶液２０ｍＬを調製する。脱イオン水中でキトラック（３００ｍｇ、Ｍｗ〜１．５×１０６、例１のもの）の溶液２０ｍＬを調製する。この２つの溶液を、マグネティックスターラーで混合し、０．７５％のヒアルロン酸及び０．７５％のキトラック（ポリマーの全濃度１．５％）を含有する４０ｍＬの溶液を得る。なお、上記の２つの多糖類間で液滴形成／沈殿物の形成が観察される。
【００４８】
例１４
低いＭｗのヒアルロン酸：キトラックの１：１ｗ／ｗの混合物であって、支持塩を有さず、ポリマーの全濃度１．５％ｗ／ｖ（ｇ／ｍＬ）のｐＨ７．４のもの
１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）を含有するヒアルロン酸（３００ｍｇ、Ｍｗ〜１６０，０００）の溶液２０ｍＬを調製する。１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）を含有するキトラック（３００ｍｇ、Ｍｗ〜１．５×１０６、例１のもの）の溶液２０ｍＬを調製する。この２つの溶液を、マグネティックスターラーで混合し、０．７５％のヒアルロン酸及び０．７５％のキトラック（ポリマーの全濃度１．５％）を含有する４０ｍＬの溶液を得る。なお、上記の２つの多糖類間で液滴形成／沈殿物の形成が観察される。
【００４９】
例１５
低いＭｗのヒアルロン酸：ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）の１：１ｗ／ｗの混合物であって、ポリマーの全濃度１．５％ｗ／ｖ（ｇ／ｍＬ）のもの
０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）を含有するヒアルロン酸（３００ｍｇ、Ｍｗ〜１６０，０００）の溶液２０ｍＬを調製する。０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）を含有するポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）（３００ｍｇ、Ｍｗ〜２０，０００）の溶液２０ｍＬを調製する。この２つの溶液を、マグネティックスターラーで混合し、０．７５％のヒアルロン酸及び０．７５％のＰＬＬ（ポリマーの全濃度１．５％）を含有する４０ｍＬの溶液を得る。なお、上記の２つの多糖類間で液滴形成／沈殿物の形成が観察される。
【００５０】
例１６
ローダミンを用いたアルギン酸塩の標識化
毎約１５００個のうち、アルギン酸塩の１個のウロン酸基を標識するのに十分な１２３  ローダミン（１２３  Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）の一定量を、１０％のエタノール、Ｎ−ヒドロキシサクシニミド（ＮＨＳ）及び１−エチル−２−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）（［ＥＤＣ］／［ＵＲアルギン酸塩］のモル比＝１．５、［ＮＨＳ］／［ＥＤＣ］のモル比＝１）を含有するモルフォリノエタン硫酸（ＭＥＳ、１００ｍＬ）の緩衝液中にアルギン酸塩（３００ｍｇ、Ｍｗ〜１３０，０００）を有する溶液に添加する。この溶液を、暗下且つ攪拌下で２４時間保持し、４℃における伝導度が４μＳとなるまで、０．０５ＭのＮａＨＣＯ３（３倍量（ｃｈａｎｇｅ））及び脱イオン水に対して透析する。最終的に、溶液を、ミリポア社製０．４５μｍのフィルターで濾過し、凍結乾燥する。
【００５１】
例１７
フルオレセインを用いたキトラックの標識化
毎約２０００個のうち、１個のアミン基を改変するのに十分なフルオレセインイソチオシアネートの一定量を、０．５ＭのＮａＨＣＯ３（６５ｍＬ）中にキトラック（２００ｍｇ、Ｍｗ〜１．５×１０６、例１のもの）を有する溶液に添加する。この溶液を、暗下且つ攪拌下で２４時間保持し、４℃における伝導度が４μＳとなるまで、０．０５ＭのＮａＨＣＯ３（３倍量（ｃｈａｎｇｅ））及び脱イオン水に対して透析する。最終的に、溶液を、ミリポア社製０．４５μｍのフィルターで濾過し、凍結乾燥する。
【００５２】
例１８
アルギン酸塩：キトラックの１：１ｗ／ｗの混合物であって、ポリマーの全濃度０．１５％ｗ／ｖ（ｇ／ｍＬ）のもの
０．０１５ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）を含有する、ローダミンで標識したアルギン酸塩（１５ｍｇ、Ｍｗ〜１３０，０００、例１６のもの）の溶液１０ｍＬを調製する。０．０１５ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）を含有するフルオレセインで標識したキトラック（１５ｍｇ、Ｍｗ〜１．５×１０６、例１７のもの）の溶液１０ｍＬを調製する。この２つの溶液を、マグネティックスターラーで混合し、０．０７５％のローダミンで標識したアルギン酸塩及び０．０７５％のフルオレセインで標識したキトラック（ポリマーの全濃度０．１５％）を含有する、澄明で沈殿物及び／又は液滴形成のない２０ｍＬの溶液を得る。
【００５３】
例１９
高いＭｗのヒアルロン酸：キトラックの３：１ｗ／ｗの混合物であって、ポリマーの全濃度２％ｗ／ｖ（ｇ／ｍＬ）のもの
０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）を含有するヒアルロン酸（６００ｍｇ、Ｍｗ約８〜９×１０５）の溶液２０ｍＬを調製する。０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）を含有するキトラック（２００ｍｇ、Ｍｗ〜１．５×１０６、例１のもの）の溶液２０ｍＬを調製する。この２つの溶液を、マグネティックスターラーで混合し、１．５％のヒアルロン酸及び０．５％のキトラック（ポリマーの全濃度２％）を含有する、澄明で沈殿物及び／又は液滴形成のない４０ｍＬの溶液を得る。
【００５４】
例２０
アルギン酸塩：キトラックの３：１ｗ／ｗの混合物であって、ポリマーの全濃度２％ｗ／ｖ（ｇ／ｍＬ）のもの
０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）を含有するアルギン酸塩（６００ｍｇ、Ｍｗ〜１３０，０００）の溶液２０ｍＬを調製する。０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）を含有するキトラック（２００ｍｇ、Ｍｗ〜１．５×１０６、例１のもの）の溶液２０ｍＬを調製する。この２つの溶液を、マグネティックスターラーで混合し、１．５％のアルギン酸塩及び０．５％のキトラック（ポリマーの全濃度２％）を含有する、澄明で沈殿物及び／又は液滴形成のない４０ｍＬの溶液を得る。
【００５５】
例２１
ヒアルロン酸：キトラックの１：１ｗ／ｗの混合物であって、ポリマーの全濃度３％ｗ／ｖ（ｇ／ｍＬ）のもの
０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）を含有するヒアルロン酸（６００ｍｇ、Ｍｗ〜２４０，０００）の溶液２０ｍＬを調製する。０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）を含有するキトラック（６００ｍｇ、Ｍｗ〜１．５×１０６、例１のもの）の溶液２０ｍＬを調製する。この２つの溶液を、マグネティックスターラーで混合し、１．５％のヒアルロン酸及び１．５％のキトラック（ポリマーの全濃度３％）を含有する、澄明で沈殿物及び／又は液滴形成のない４０ｍＬの溶液を得る。
【００５６】
例２２
ヒアルロン酸：キトサン誘導体（キトラック；キトセル；キトマル３（ｃｈｉｔｍａｌ３））の１：１ｗ／ｗの混合物
０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）を含有するヒアルロン酸（３００ｍｇ、Ｍｗ〜１６０，０００）の溶液２０ｍＬを調製する。０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）を含有するキトラック（３００ｍｇ、Ｍｗ〜１．５×１０６、例１のもの）の溶液２０ｍＬを調製する。この２つの溶液を、マグネティックスターラーで混合し、０．７５％のヒアルロン酸及び０．７５％のキトラック（ポリマーの全濃度１．５％）を含有する、澄明で沈殿物及び／又は液滴形成のない４０ｍＬの溶液を得る。
【００５７】
同じ方法を用いて、ヒアルロン酸とキトセル（例２）との混合物、及びヒアルロン酸とキトマル３（例３）との混合物を調製して、０．７５％のヒアルロン酸及び０．７５％のキトセル又はキトマル３（ポリマーの全濃度１．５％）を含有する、澄明で沈殿物及び／又は液滴形成のない４０ｍＬの溶液を得る。
【００５８】
単一のアニオン性多糖類及びキトサン誘導体成分と比較した、例４〜２２の多糖類混合物の物理−化学的特徴
ａ）多糖類混合物の溶解性に対するイオン強度の影響
イオン強度の変化によって誘導される本発明の多糖類混合物の溶解性に対する影響を評価するため、上記の例４〜７の通り調製したヒアルロン酸及びキトサン誘導体（キトラック）を含有する混合物の溶液について、λ＝６００ｎｍにおける透過率（Ｔ）を測定した。図１が強調するように、ポリアニオン及び改変されたキトサンの混合物の水溶性は、例えば、２％のポリマーの全濃度の存在下、及び０．０５Ｍ以上の支持塩濃度で確保される。特に、この図は、二成分ポリマー溶液の透過率（６００ｎｍで測定）の、個々の多糖類の透過率に対する比率を与えている。１と同一又はこれに近づく透過率は、二成分ポリマー溶液における液滴形成又は沈殿物が存在しないことを示す。逆に、この混合物における塩が０．０５Ｍ未満の値に低下すると、透過率の有意な減少を伴う液滴形成が観察される。
【００５９】
ｂ）異なるアニオン性多糖類及びキトサン誘導体（キトラック）の１：１ｗ／ｗの混合物
アニオン性多糖類の種類が変化することにより誘導される、本発明の多糖類−改変されたキトサンを含有する混合物の溶解性に対する影響を評価するため、上記の例８〜１２の通り調製した、ヒアルロン酸、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、アガロース硫酸及びカラギーナンから選択されたアニオン性多糖類と、キトサン誘導体（キトラック）とを含有する溶液の高いｗ／ｗ比、すなわち１：１の溶液について、λ＝６００ｎｍにおける透過率（Ｔ）を測定した。図２が示すように、多糖類混合物の溶解性は、２つのポリマーの重量比が１：１でありポリマーの全濃度が１．５％であるときであっても、確保される。カルボキシル化されており又は硫酸化されていても、異なるポリアニオンの系の溶解性を保持することにより、混合は達成され得る。
【００６０】
ｃ）ポリアニオン性多糖類及びキトサン誘導体（キトラック；キトセル；キトマル３）の１：１ｗ／ｗの混合物
上記の通り測定した本発明の多糖類組成物の溶解性は、例２２で調製した二成分混合物が同じＴ／Ｔ０値を有するので、キトサン誘導体の種類によって影響されないことが証明されている。この点、図３ａは、ポリアニオン及び多糖類で改変されたキトサンを有するポリマー溶液の調製する能力が、後者の化学的性質に影響を与えないことを示している。二糖であるセロビオース（キトセル）又は三糖であるマルトトリオース（キトマル３）に置き換えることにより、ラクトース（キトセル）に対して、液滴形成の有意な形成はない。
【００６１】
適当な条件下で溶液を得るようにポリアニオンをキトサンのオリゴ糖誘導体と混合する実現可能性は、３つの因子に本質的に起因する。第一は、カチオン性多糖類を導入されるオリゴ糖の側鎖により生じる立体障害である。これらは、アニオン性多糖類の接近を妨害し、鎖の長い束を通じた２つのポリマー系のカップリングを阻害する。この効果を、図３ｂに示す。
【００６２】
また、生理的ｐＨ、好ましくはｐＨ７．４を使用することで、カチオン性多糖類であるキトラックの電荷が減少し、多糖類の側鎖のおかげで良好な水溶性を保持する。最終的に、支持塩、好ましくは塩化ナトリウムの存在により、２つのポリマーの電荷が防御され、液滴形成／沈殿を回避するように２つのポリマー間の静電的相互作用を制限する。これらの３つの因子を組み合わせることにより、ポリアニオン／オリゴ糖で改変されたキトサンの溶液が得られる。この点、図４から推測されるように、脱イオン水中（ｐＨ〜５．５）でのヒアルロン酸及びキトラックのポリマー混合物の形成は、上記の立体的因子が存在するにもかかわらず、実現可能ではない。支持塩の存在なく、生理的ｐＨ（７．４）を使用することで、取得されるべき真の溶液は得られない。最終的に、キトラックとは異なるポリカチオン、例えば、支持塩の存在下、生理的ｐＨで溶解性を有するポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）を使用することは、ポリアニオンが存在しても、取得されるべき溶液を得ることはできない（図４）。
【００６３】
しかしながら、液滴形成が存在しないことは、ポリカチオン、例えば、キトラック上の正電荷と、ポリアニオン、例えば、ヒアルロン酸又はアルギン酸塩上の負電荷との相互作用がないことを意味するものではない。逆に、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）実験では、これらの本質的に静電的（クーロン）な相互作用が存在することを示している（図５）。この実験において、ポリアニオン（アルギン酸塩）は、ローダミンで標識され、ポリカチオン（キトラック）は、フルオレセインで標識された。これらの２つの多糖類上の対となる荷電間の相互作用がなく混合が行われたと仮定すれば、混合物の蛍光発光スペクトルは、別々に記録された２つのスペクトルの強度の合計に対応する。逆に、アニオン性及びカチオン性の多糖類の二成分溶液のスペクトルが、別々に取得した２つのポリマーのスペクトルの合計よりも低く見出されるとすれば、このことは、２つのポリマー間で非常に強く短い範囲（５ｎｍのオーダーの長さ）の相互作用が確立していることを示す（蛍光クエンチング）。典型的には、イオン的相互作用は、この距離の範囲内である。図５は、アルギン酸塩及びキトラックの二成分溶液の発光スペクトルが、別々に試験した２つのポリマーの発光スペクトル強度の合計よりも低い強度を有することを示しており、このことは、キトラックの正電荷と、アルギン酸塩の負電荷との間にイオン的相互作用が存在していることを示す。この意味において、本発明の組成物は、溶解性混合物を形成するようにイオン的相互作用を行うため、鎖上に対となる電荷を有することを特徴とするアニオン性及びカチオン性の多糖類の溶液を調製することが可能である。ポリアニオン／中性の多糖類溶液について述べる特許文献７とは異なり、本発明は、溶液でも安定である複合体を形成するように相互作用するポリアニオン及びポリカチオンの両方を含有する溶液に関する。
【００６４】
この点、図６は、「大規模」の組織化を起こすことなく、溶液中の複合体間の同一性（ｅｑｕａｌｉｔｙ）及び絶対粘度を予測するいわゆるコックスメルツ則が、例１９のヒアルロン酸及びキトラックを含有する二成分溶液に適用され得ることを示す。反対に、ゲル又はマイクロゲルの存在は、レオメーターで測定した複合的及び絶対的な２つの粘度の同一性の欠如により示される上記の法則から偏差を生じる。
【００６５】
ポリアニオン及びオリゴ糖で改変されたキトサンの間の溶解性の複合体の形成は、１，５００ｋＤａ以下で可変な平均分子量を有するカルボキシル化又は硫酸化された多糖類で生じ得る。
【００６６】
また、オリゴ糖で改変されたキトサン上の正電荷とアニオン性多糖類（例えば、ヒアルロン酸又はアルギン酸塩）上の負電荷との間の相互作用の存在により、別々に取得した多糖類のポリマー溶液と比較して、アニオン性及びカチオン性の混合物のポリマー溶液の粘度が予期せず増加する。特に、ポリアニオン及びオリゴ糖で改変されたキトサンのポリマーの混合物の水溶液の粘度は、混合物の個々の成分であるポリマーの水溶液の粘度の合計よりも大きいことがわかる。図７、８、９及び１０は、ポリアニオン及び改変されたキトサンが異なるｗ／ｗ比である異なるポリマーで得たこの相乗効果を明確に示している。
【００６７】
また、組成物は、図１１から推測されるように、粘弾性特性において疑うべきもない向上性を示す。事実、図１１ｂに示した例１９のヒアルロン酸及びキトラックの二成分溶液の粘弾性スペクトルが示すように、第二の多糖類が、ヒアルロン酸の粘弾性により有意に阻害されないばかりでなく、むしろ、ヒアルロン酸単独の溶液と比較して（図１１ａ）、Ｇ’及びＧ’’が互いに交叉する箇所における周波数の値が低下しており、すなわち、この系が粘度よりも高い弾性を示す特性を示し始める周波数が低下する。この効果は、多糖類の公知の適用において高度に望ましいものであり、特に、骨関節炎、変形性関節症、半月板断裂、靱帯断裂などの炎症性及び／又は外傷性を基礎とした骨関節病態の処置における粘性補給源において、高度に望ましいものである。本発明の目的のため、本発明の組成物は、ヒト又は非ヒト哺乳類への投与用に許容な製品の調製のための適当な賦形剤又は希釈剤と単独又は組み合わせて、用いられてもよい。上記の骨関節病態を処置するため、この製品は、公知の関節内経路で投与されてもよい。また、同様の理由のため、上記の組成物は、眼科手術に使用されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】ヒアルロン酸と、ラクトースで改変されたキトサン（以下、キトラック（Ｃｈｉｔｏｌａｃ）と称する。）とを含有する溶液の透過率（λ＝６００ｎｍ）と、個々のポリマーの溶液の透過率（Ｔ０）との関係であって、Ａ）（例４）ＮａＣｌ０．１５Ｍ、Ｈｅｐｅｓ１０ｍＭ（ｐＨ７．４）；Ｂ）（例５）ＮａＣｌ０．１Ｍ、Ｈｅｐｅｓ１０ｍＭ（ｐＨ７．４）；Ｃ）（例６）ＮａＣｌ０．０５Ｍ、Ｈｅｐｅｓ１０ｍＭ（ｐＨ７．４）；Ｄ）（例７）ＮａＣｌ０．０２５Ｍ、Ｈｅｐｅｓ１０ｍＭ（ｐＨ７．４）；の各条件における関係。ポリマーの全濃度：２％、キトラックに対するヒアルロン酸の重量比＝３：１。全ての溶液において、オスモル濃度は、非イオン性溶質であるマンニトールを添加することにより、３００ｍＭに保持した。２５℃において、ＣａｒｙＥ４のＵＶ−可視光分光光度計により、測定を行った。
【図２】二成分の多糖類混合物（キトラック／ポリアニオン）の透過率（λ＝６００ｎｍ）と、Ａ）（例８）ヒアルロン酸；Ｂ）（例９）カルボキシメチルセルロース；Ｃ）（例１０）アルギン酸塩；Ｄ）（例１１）アガロース硫酸；Ｅ）（例１２）カラギーナンのバイオポリマーに関する透過率（Ｔ０）との関係。条件：ＮａＣｌ０．１５Ｍ、Ｈｅｐｅｓ１０ｍＭ（ｐＨ７．４）。ポリマーの全濃度：１．５％、キトラックに対するヒアルロン酸の重量比＝１：１。Ｄ）の場合（例１１）、約５０℃で混合を行った。測定は、図１で言及の通り行った。
【図３ａ】二成分の多糖類混合物（例１、２及び３のヒアルロン酸／キトサン誘導体）の透過率（λ＝６００ｎｍ）と、キトラック（反応性アミノ化によりラクトースを用いて改変されたキトサン；例１）、キトセル（Ｃｈｉｔｃｅｌｌ）（反応性アミノ化によりセロビオースを用いて改変されたキトサン；例２）及びキトマル３（反応性アミノ化によりマルトトリオースを用いて改変されたキトサン；例３）の各誘導体に関する個々のポリマーの透過率（Ｔ０）との関係。条件：ＮａＣｌ０．１５Ｍ、Ｈｅｐｅｓ１０ｍＭ（ｐＨ７．４）。ポリマーの全濃度：１．５％、改変されたキトサンに対するヒアルロン酸の重量比＝１：１。測定は、図１で言及の通り行った。
【図３ｂ】このスキームは、ポリアニオンとポリカチオンとの間の液滴形成、又はそれらの溶液の形成を示す。
【図４】二成分多糖類混合物の透過率（λ＝６００ｎｍ）と、個々のポリマーの溶液の透過率（Ｔ０）との関係であって、Ａ）（例１３）ヒアルロン酸／キトラックを脱イオン水（ｐＨ〜５．５）中に有する場合；Ｂ）（例１４）ヒアルロン酸／キトラックをＨｅｐｅｓ１０ｍＭ（ｐＨ７．４）中に有する場合；Ｃ）（例８）ヒアルロン酸／キトラックをＮａＣｌ０．１５Ｍ、Ｈｅｐｅｓ１０ｍＭ（ｐＨ７．４）中に有する場合；Ｄ）（例１５）ヒアルロン酸／ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）をＮａＣｌ０．１５Ｍ、Ｈｅｐｅｓ１０ｍＭ（ｐＨ７．４）中に有する場合；の各条件における関係。ポリマーの全濃度：１．５％、ポリカチオンに対するヒアルロン酸の重量比＝１：１。測定は、図１で言及の通り行った。
【図５】ローダミンで標識したアルギン酸塩（例１６）（０．７５ｇ／Ｌ）（−−）、ふたつの状態の寄与の理論的和算（●●●）と比較した、フルオレセインで標識したキトサン（例１７）（０．７５ｇ／Ｌ）（●−●）の発光スペクトル、及びローダミンで標識したアルギン酸塩及びフルオレセインで標識したキトサンの混合物（ポリマーの全濃度０．１５ｇ／Ｌ、２つの多糖類の質量比＝１：１、条件：ＮａＣｌ０．０１５Ｍ、Ｈｅｐｅｓ１ｍＭ（ｐＨ７．４））の発光スペクトル（例１８）（−）。励起波長４５０ｎｍ。装置の設定：走査速度５０ｎｍ／分、発光スリット４．５ｎｍ、励起スリット４．５ｎｍ。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社のＬＳ５０Ｂ蛍光分光光度計により、２５℃で測定を行った。
【図６】ヒアルロン酸（約８〜９×１０５Ｍｗ）及びキトラックの二成分溶液のコックスメルツ則の適用（例１９）。凡例：（■）変形速度（γ’）の関数としての粘度、（△）角速度（ω）の関数としての複素粘度（η＊）。ポリマーの全濃度２％、キトラックに対するヒアルロン酸の重量比＝３：１（ヒアルロン酸１．５％及びキトラック０．５％）。コーンプレート（５０ｍｍ半径、角度１°）を有するＳｔｒｅｓｓＴｅｃｈのレオメーター（Ｒｅｏｌｏｇｉｃａ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＡＢ、２２３６３、Ｌｕｎｄ、スウェーデン）により、２５℃において測定を行った。
【図７】（▼）ヒアルロン酸（〜１６０，０００Ｍｗ）及びキトラックを含有する溶液の粘度（例４）。ポリマーの全濃度２％、キトラックに対するヒアルロン酸の重量比＝３：１（ヒアルロン酸１．５％及びキトラック０．５％）。（○）ヒアルロン酸溶液（〜１６０，０００Ｍｗ）の濃度１．５％における粘度。（■）キトラック溶液の濃度０．５％における粘度。条件：ＮａＣｌ０．１５Ｍ、Ｈｅｐｅｓ１０ｍＭ（ｐＨ７．４）、２５℃。上記の図６と同様に測定を行った。
【図８】（▼）ヒアルロン酸（約８〜９×１０５Ｍｗ）及びキトラックを含有する溶液の粘度（例１９）。ポリマーの全濃度２％、キトラックに対するヒアルロン酸の重量比＝３：１（ヒアルロン酸１．５％及びキトラック０．５％）。（○）ヒアルロン酸溶液（〜８〜９×１０５Ｍｗ）の濃度１．５％における粘度。（■）キトラック溶液の濃度０．５％における粘度。条件：ＮａＣｌ０．１５Ｍ、Ｈｅｐｅｓ１０ｍＭ（ｐＨ７．４）、２５℃。上記の図６と同様に測定を行った。
【図９】（▼）アルギン酸塩（〜１３０，０００Ｍｗ）及びキトラックを含有する溶液の粘度（例２０）。ポリマーの全濃度２％、キトラックに対するアルギン酸塩の重量比＝３：１（アルギン酸塩１．５％及びキトラック０．５％）。（○）アルギン酸塩溶液（〜１３０，０００Ｍｗ）の濃度１．５％における粘度。（■）キトラック溶液の濃度０．５％における粘度。条件：ＮａＣｌ０．１５Ｍ、Ｈｅｐｅｓ１０ｍＭ（ｐＨ７．４）、２５℃。上記の図６と同様に測定を行った。
【図１０】（▼）ヒアルロン酸（約〜２５０，０００Ｍｗ）及びキトラックを含有する溶液の粘度（例２１）。ポリマーの全濃度３％、キトラックに対するヒアルロン酸の重量比＝１：１（ヒアルロン酸１．５％及びキトラック１．５％）。（○）ヒアルロン酸溶液（〜２５０，０００Ｍｗ）の濃度１．５％における粘度。（■）キトラック溶液の濃度１．５％における粘度。条件：ＮａＣｌ０．１５Ｍ、Ｈｅｐｅｓ１０ｍＭ（ｐＨ７．４）、２５℃。上記の図６と同様に測定を行った。
【図１１ａ】ヒアルロン酸溶液（〜８〜９×１０５Ｍｗ）（１．５％）の粘弾性スペクトル（例１９）。ポリマーの全濃度２％、キトラックに対するヒアルロン酸の重量比＝３：１（ヒアルロン酸１．５％及びキトラック０．５％）。条件：ＮａＣｌ０．１５Ｍ、Ｈｅｐｅｓ１０ｍＭ（ｐＨ７．４）、２５℃。凡例：（■）＝Ｇ’、（○）＝Ｇ’’、（▲）＝η＊。コーンプレート（５０ｎｍビーム、アパーチャ１°）を有するＳｔｒｅｓｓＴｅｃｈのレオメーター（Ｒｅｏｌｏｇｉｃａ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＡＢ、２２３６３、Ｌｕｎｄ、スウェーデン）により、２５℃において、０．０１〜３０Ｈｚの周波数で測定を行った。
【図１１ｂ】ヒアルロン酸及びキトラックの二成分溶液の粘弾性スペクトル（例１９）。ポリマーの全濃度２％、キトラックに対するヒアルロン酸の重量比＝３：１（ヒアルロン酸１．５％及びキトラック０．５％）。条件：ＮａＣｌ０．１５Ｍ、Ｈｅｐｅｓ１０ｍＭ（ｐＨ７．４）、２５℃。凡例：（■）＝Ｇ’、（○）＝Ｇ’’、（▲）＝η＊。コーンプレート（５０ｎｍビーム、アパーチャ１°）を有するＳｔｒｅｓｓＴｅｃｈのレオメーター（Ｒｅｏｌｏｇｉｃａ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＡＢ、２２３６３、Ｌｕｎｄ、スウェーデン）により、２５℃において、０．０１〜３０Ｈｚの周波数で測定を行った。
【図８】
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【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【国際調査報告】
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