(57)【要約】  本発明は、哺乳動物（たとえばマウスおよびヒト）レグマインならびにその新規なレグマインスプライス変異体、ＺＢ−Ｉに関連する単離精製されたポリヌクレオチド、ポリペプチド、ならびに抗体を提供する。本発明はさらに、細胞または細胞集団、たとえば単球、マクロファージ、泡沫細胞、血管内皮細胞、腎臓近位尿細管細胞、動脈内皮細胞、血管内膜中への炎症細胞侵入の部位、および動脈の新生内膜病変エリア中における、レグマインおよび／またはＺＢ−Ｉの活性、発現、および／または分泌の調整での、これらの単離精製されたポリヌクレオチド、ポリペプチド、および抗体、ならびに他のレグマインおよびＺＢ−Ｉのアゴニストおよびアンタゴニストの使用に関する。本発明はまた、レグマインおよびＺＢ−Ｉのアンタゴニスト、たとえばアンタゴニスト低分子、レグマインおよびＺＢ−Ｉに対する抗体および抗体断片、レグマインおよびＺＢ−Ｉの阻害性ポリペプチド、ならびにレグマインおよびＺＢ−Ｉの阻害性ポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、血管障害／疾患および炎症性障害／疾患を診断し、予後判定し、監視し、治療し、寛解させ、かつ／または予防するための新規な方法を対象とする。
2009538140.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１１に記載される核酸配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１２に記載されるアミノ酸配列、配列番号１２のアミノ酸２１〜３２３、または配列番号１２のアミノ酸２５〜３２３を含むポリペプチド。
【請求項３】
哺乳動物ＺＢ−１ポリペプチドまたは哺乳動物ＺＢ−１ポリペプチドの断片に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
前記哺乳動物ＺＢ−１ポリペプチドまたは前記哺乳動物ＺＢ−１ポリペプチドの断片がヒトに由来する、請求項３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
血管障害または炎症性障害を治療し、寛解させ、または予防する方法で使用する医薬組成物の調製のためのレグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストの使用であって、前記医薬組成物が、治療有効量の前記レグマインアンタゴニストおよび／または前記ＺＢ−１アンタゴニストならびに薬学的に許容し得る担体を含む使用。
【請求項６】
前記レグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストが、阻害性ポリヌクレオチド、阻害性ポリペプチド、低分子、アンタゴニスト抗体およびその抗原結合断片からなる群から選択される、請求項５に記載のレグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストの使用。
【請求項７】
哺乳動物での血管障害または炎症性障害を治療し、寛解させ、または予防するための方法であって、治療有効量のレグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストを哺乳動物に投与する工程を含む方法。
【請求項８】
前記レグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストが、阻害性ポリヌクレオチド、阻害性ポリペプチド、低分子、アンタゴニスト抗体、およびその抗原結合断片からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
哺乳動物での血管障害または炎症性障害を治療し、寛解させ、または予防するための方法であって、哺乳動物の細胞または細胞集団を治療有効量のレグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストと接触させる工程を含む方法。
【請求項１０】
前記細胞または細胞集団が、マクロファージ、単球、血管内皮細胞、泡沫細胞、または単球、マクロファージ、血管内皮細胞、および／もしくは泡沫細胞の混合物を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞または細胞集団がレグマインおよび／またはＺＢ−１を分泌する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
哺乳動物でのレグマインおよび／またはＺＢ−１の活性、発現、および／または分泌のレベルを減少させるための方法であって、哺乳動物に、レグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストを、哺乳動物のレグマインおよび／またはＺＢ−１の活性、発現、および／または分泌のレベルを減少させるのに十分な量で投与する工程を含む、前記方法。
【請求項１３】
患者の血管障害または炎症性障害に対する治療の経過を監視するための方法であって、
（ａ）患者由来の細胞または細胞集団中のレグマインおよび／またはＺＢ−１の活性、発現、および／または分泌のレベルを測定する工程と、
（ｂ）レグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストを患者に投与する工程と、
（ｃ）レグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストの投与後に、患者由来の細胞または細胞集団中のレグマインおよび／またはＺＢ−１の活性、発現、および／または分泌のレベルを測定する工程と
を含み、
レグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストの投与前の、患者由来の細胞または細胞集団中のレグマインおよび／またはＺＢ−１の活性、発現、および／または分泌のレベルと比較した、レグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストの投与後の、患者由来の細胞または細胞集団中のレグマインおよび／またはＺＢ−１の活性、発現、および／または分泌のより低いレベルから、患者の血管障害または炎症性障害に対する治療の効果が積極的に示唆される、前記方法。
【請求項１４】
哺乳動物での細胞移動を阻害するための方法であって、レグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストを哺乳動物に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項１５】
前記レグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストが、阻害性ポリヌクレオチド、阻害性ポリペプチド、低分子、アンタゴニスト抗体、およびその抗原結合断片からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
哺乳動物での創傷治癒を促進するための方法であって、レグマインアゴニストおよび／またはＺＢ−１アゴニストを哺乳動物に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項１７】
哺乳動物での血管形成を阻害するための方法であって、レグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストを哺乳動物に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項１８】
前記レグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストが、阻害性ポリヌクレオチド、阻害性ポリペプチド、低分子、アンタゴニスト抗体、およびその抗原結合断片からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
哺乳動物での内皮細胞の増殖を阻害するための方法であって、レグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストを哺乳動物に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項２０】
哺乳動物での腫瘍転移を阻害するための方法であって、レグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストを哺乳動物に投与する工程を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レグマイン、ならびに血管障害／疾患および炎症性障害／疾患の調節でのレグマインの使用に関する。本発明はさらに、ＺＢ−１と命名された、レグマインの新規なスプライス変異体に関する。本明細書に開示された方法および医薬組成物は、血管障害／疾患および炎症性障害／疾患を診断し、予後判定し、監視し、治療し、寛解させ、かつ／または予防するのに有用である。
【０００２】
関連出願
本出願は、２００６年５月２５日に出願された米国仮特許出願第６０／８０８，３８１号および２００６年８月１５日に出願された第６０／８３７，６０４号からの優先権の利益を主張し、それらの内容は、それらの全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
システインプロテアーゼ（ＣＰ）は、酵素活性部位の構造構成に基づいてタンパク質クランとして哺乳動物で分類される広範に分布する酵素に関連するクラスである（Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（２００２）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１３：２３８−７５）。哺乳動物ＣＰクランは、とりわけ、パパインと構造的および進化的共有性を有するプロテアーゼメンバーからなるＣＡクランならびにカスパーゼおよびレグマインを含有するＣＤクランを含む（同上）。アスパラギニルエンドペプチダーゼ（ＡＥＰ）または破骨細胞阻害ペプチド２（ＯＩＰ−２）としても知られているレグマイン（Ｃｈｏｉら（２００１）Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１６（１０）：１８０４−１１）は、ＰＲＳＣ１遺伝子によってコードされ（Ｔａｎａｋａら（１９９６）Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．７４：１２０−２３）、基質配列のＰ１部位のアスパラギニル結合の加水分解に対して厳密な特異性を有する、ＣＤクランの比較的新しいメンバーである（Ｃｈｅｎら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：８０９０−９８）。レグマインは、カスパーゼおよびセパラーゼを含むシステインプロテアーゼのＣ１３ファミリーに属する（Ｉｓｈｉｉ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４４：６０４−１５）。レグマインは、カテプシンが属する、リソソームプロテアーゼのパパインファミリーと相同性を共有しない唯一のリソソームシステインプロテアーゼである。生理学的条件下では、レグマインは、酸性エンドソーム／リソソーム区画中に存在し、細胞内タンパク質分解で機能する（Ｓｈｉｒａｈａｍａ−Ｎｏｄａら（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３３１９４−９９）。レグマイン欠損マウスは、インバリアント鎖の抗原提示またはクラスＩＩＭＨＣ産物の成熟に欠損を呈しないが（Ｍａｅｈｒら（２００５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：７０６６−７４）、レグマインは、抗原提示で役割を果たす可能性がある（Ｍａｎｏｕｒｙら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ３９６：６９５−９９）。
【０００４】
レグマインは、哺乳動物で高度に保存されたリソソームエンドペプチダーゼであり、マウスおよびヒトのレグマインは約８３％のアミノ酸同一性を示し（Ｃｈｅｎら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３５：１１１−１７）、ヒトおよびブタのレグマインは約８４％のアミノ酸同一性を示す（Ｃｈｅｎら（１９９７）前掲）。
【０００５】
レグマインプロテアーゼの発現および活性は、多数の様々な組織（たとえばＰＣＴ国際公開第０５／０７５６７５号を参照されたい）で評価されており、多数の組織で検出可能であることがわかっており、高ペプチダーゼ活性は腎臓で（Ｃｈｅｎら（１９９８）前掲）、特に腎臓近位尿細管細胞で（Ｓｈｉｒａｈａｍａ−Ｎｏｄａら（２００３）前掲）生じる。レグマインは単球中でさらに発現し、ここで、抗原および／またはカテプシンＬのプロセシングで役割を果たすと考えられる（Ｗｏｌｋら（２００５）Ｇｅｎｅｓ  Ｉｍｍｕｎ．５：４５２−５６；Ｍａｅｈｒら（２００５）前掲；Ｗａｔｔｓ（２００５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２０７：２１８−２８；Ａｌｖａｒｅｚ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１９１９５−２０３）。興味深いことには、レグマインの発現は、樹状細胞へのヒト血中単球の分化の間におよびＭ−ＣＳＦによるヒト血中マクロファージの活性化の間に上方調節される（Ｌｉら（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３８９８０−９０；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら（１９９９）Ｂｌｏｏｄ９４：８３７−４４）。レグマインはまた、破骨細胞形成および骨吸収（Ｃｈｏｉら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２７７４７−５３）、エンドトキシン耐性（Ｗｏｌｋら、前掲）、ならびに表皮角化（Ｚｅｅｕｗｅｎら（２００４）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１３：１０６９−７９）に役割を果たすことが報告されている。ＭＭＰ２（Ｃｈｅｎら（２００１）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８２：７７７−８３）、カテプシンＨ、Ｂ、およびＬ（Ｓｈｉｒａｈａｍａ−Ｎｏｄａら（２００３）前掲）、ならびにα−チモシン（Ｓａｒａｎｄｅｓｅｓら（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１３２８６−９３）を含む数種のタンパク質基質がレグマインに対して同定された。
【０００６】
レグマインは、エンドソーム酸性化またはエンドソーム／リソソーム系を通した進行によって制御されると考えられる異なるｐＨ許容限界で、ＣおよびＮ末端プロペプチドの連続的な除去（たとえばＮ末端での切断は残基Ａｓｐ25またはＡｓｐ21で生じ、一方、Ｃ末端での切断は残基Ａｓｎ323で生じる）によって自己活性化されるチモーゲンとして発現する（Ｌｉら、前掲；Ｋａｔｏら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：３３−３８；Ｃｈｅｎら（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５２：３２７−３４）。成熟レグマインタンパク質は、さらにＮ−グリコシル化され、低ｐＨ、つまり約ｐＨ６．０未満に大部分依存的であるプロテアーゼ活性を示す（Ｃｈｅｎら（１９９７）前掲）。
【０００７】
レグマインは、ある種のシスタチン（たとえばオボシスタチン（ovocystatin）ならびにシスタチンＣおよびＭ（たとえばＰＣＴ国際公開第００／０６４９４５号およびＶｉｇｎｅｓｗａｒａｎら（２００６）Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ７８：８９８−９０７を参照されたい））ならびにチオール依存性酵素（たとえばヨード酢酸、ヨードアセトアミド、およびマレイミド）の阻害剤によって阻害されるが、パパイン阻害剤Ｅ６４（トランス−エポキシスクシニル−Ｌ−ロイシルアミド−（４−グアニジノ）ブタン）、ロイペプチン、およびＺ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−ＣＨＮ2に影響されない（同上；Ｒｏｚｍａｎ−Ｐｕｎｇｅｒｃａｒら（２００３）Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆ．１０：８８１−８８；Ｖｉｇｎｅｓｗａｒａｎら、前掲；Ｃｈｅｎら（１９９８）前掲）。ある種のフルオロメチルケトンペプチドカスパーゼ阻害剤およびクロロメチルケトンペプチドカスパーゼ阻害剤（Ｒｏｚｍａｎ−Ｐｕｎｇｅｒｃａｒら、前掲中に開示されるもの等）ならびに抗レグマイン抗体（Ｃｈｏｉら（１９９９）前掲）もまたレグマイン活性を阻害する。
【０００８】
アザペプチドＭｉｃｈｅａｌ受容体／阻害剤（Ｎｉｅｓｔｒｏｊら（２００２）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８３：１２０５−１４；Ｅｋｉｃｉら（２００４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４７：１８８９−９２；Ｇｏｔｚ（２００４）「Ｄｅｓｉｇｎ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｙｌ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｃｌａｎ  ＣＡ  ａｎｄ  Ｃｌａｎ  ＣＤ  Ｃｙｓｔｅｉｎｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ」Ｔｈｅｓｉｓ  Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，２００４年５月，Ｇｅｏｒｇｉａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、アザペプチドエポキシド（Ｇｏｔｚ，前掲；Ａｓｇｉａｎら（２００２）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５：４９５８−６０；Ｊａｍｅｓら（２００３）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８４：１６１３−１８；米国特許第７，０５６，９４７号）、メチルケトン（アシロキシメチルケトン、たとえばＬｏａｋら（２００３）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８４：１２３９−４６中に開示される２，６−ジメチル−安息香酸３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４−カルバモイル−２−オキソ−ブチルエステル［ＭＶ０２６６３０］等、およびハロメチルケトン、たとえばＮｉｅｓｔｒｏｊら、前掲中に開示されるもの等）、ならびに他の合成物質（たとえば米国特許第６，００４，９３３号；ＰＣＴ国際公開第０３／０１６３３５号および国際公開第９９／０４８９１０号；Ｙａｍａｎｅら（２００２）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１５９６：１０８−２０（ｐ−クロロメルクリベンゼンスルホン酸、Ｈｇ２＋、およびＣｕ２＋によるレグマインの阻害を開示する）；ならびにＬｉら、前掲（可逆的ＡＥＰ阻害剤Ｆmoc−ＡＥＮＫ−アミドを開示する）を参照されたい）を含む様々な合成化合物もまたレグマインプロテアーゼ活性を阻害することが示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
アテローム性動脈硬化は、動脈の「硬化」と一般に呼ばれる動脈血管の全身性および炎症性血管疾患であり、血管壁の内側の脂肪沈着に起因する。アテローム発生の初段階は、脂肪線条の形成であり、脂肪線条は、大部分は、泡沫細胞、つまり大量の貪食したコレステロールで満たされたマクロファージ細胞からなる（たとえばＧｒｅａｖｅｓおよびＧｏｒｄｏｎ（２００５）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４６：１１−２０）。これらの線条は、動脈細胞壁中の活性化内皮細胞への単球の付着によって発生すると考えられている（同上）。付着単球は、次いで、血管外遊出として知られているプロセスで血管内膜（つまり新生内膜）の内皮下のスペース中に血管内腔から移動し、そこで、付着単球は、ＣＤ３６およびＳＲ−Ａ等のスカベンジャー受容体によって低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を認識し、飲み込むマクロファージに分化する（ＷａｓｓｅｒｍａｎおよびＳｈｉｐｌｅｙ（２００６）Ｍｔ．Ｓｉｎａｉ  Ｊ．Ｍｅｄ．７３：４３１−３９；ＬｕｃａｓおよびＧｒｅａｖｅｓ（２００１）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．５：１−１８）。次第に、血管中膜の平滑筋細胞もまた、増殖し、新生内膜中に移動し始め、そこで、平滑筋細胞はコレステロールを蓄積し、平滑筋由来泡沫細胞になる（同上）。平滑筋由来およびマクロファージ由来泡沫細胞の両方は、マトリックス分子、および細胞破片で豊富な、脂質で満たされたコアを残して、最終的に壊死し、そのコアは、残りの平滑筋細胞によって分泌されたマトリックスキャップによって動脈の内腔から隔てられる（同上）。結果として生じた構造物は、アテローム性動脈硬化病変となり、線維性の「アテローム性動脈硬化」プラークまたは「アテローム性」プラークによって覆われる。
【００１０】
非弾性アテローム性プラークが血管壁を厚くし、それによって、動脈内腔の直径を減少させるので、動脈はサイズが拡張し、動脈瘤をもたらす（ＷａｓｓｅｒｍａｎおよびＳｈｉｐｌｅｙ，前掲；Ｓｔａｒｙら（１９９５）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ９２：１３５５−７４）。その拡張が、動脈壁の肥厚に関し動脈の内腔を拡張するのに不十分である場合、狭窄が結果として生じる（同上）。そのうえ、より薄く、より弱い線維性キャップ（つまり「脆弱な」または「不安定な」キャップ）は破裂することがよくある（ＷａｓｓｅｒｍａｎおよびＳｈｉｐｌｅｙ，前掲）。プラーク破裂の間に、炎症細胞は、脆弱なプラークのショルダー領域に局在化する（ＬｕｃａｓおよびＧｒｅａｖｅｓ，前掲）。病変のこのエリアでは、Ｔリンパ球（ＣＤ４+）は、血管平滑筋細胞増殖およびコラーゲン合成を減じる炎症性サイトカインであるＩＦＮγを分泌し、ＩＦＮγはアテローム性プラークを弱める（同上）。加えて、病変内の活性化マクロファージは、コラーゲンを分解するマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を生成する（同上）。これらのメカニズムは、線維性キャップの裸出および破裂での炎症細胞の役割を際立たせる。
【００１１】
プラーク破裂は、破裂部位での血小板凝集、血管の部分的な閉塞、または完全な閉塞による血栓症およびアテローム性動脈硬化プラーク中への血栓の取り込みによるアテローム性動脈硬化病変の進行をもたらす可能性がある。動脈中の血栓の形成および蓄積は、アテローム性プラークの存在によって既に誘発された狭窄を増強し、心臓または腎臓等の下流の組織への血流の妨害（つまり虚血または発作）をもたらす（同上）。血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング（ＴＧＦ）アルファおよびベータ、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、トロンビン、マクロファージ走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、ならびにアンジオテンシンＩＩは、初期のアテローム発生、血管炎症、ならびにアテローム血栓症を特徴付ける、内皮細胞破壊の部位で活性化血小板、マクロファージ、ならびに活性化内皮細胞によって生成されるマイトジェンである（同上）。
【００１２】
タンパク質分解は、内皮下のスペース中への白血球の浸潤、内膜中へのＳＭＣの移動、細胞外マトリックスの分解およびプラークの不安定化、ならびに血管新生を含む、アテローム発生の多数の側面に関連する病理学的イベントである（Ｌｉｕら（２００４）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２４：１３５９−６６）。多くのプロテアーゼはアテローム性動脈硬化の発症に関係している。メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）およびセリンプロテアーゼに加えて、リソソームシステインプロテアーゼは、アテローム発生に最近関連づけられた。たとえば、カテプシンＳ、Ｋ、またはＬの欠失は、ＬＤＬＲ−／−マウスまたはＡｐｏＥ−／−マウスでアテローム性動脈硬化の低下につながり、アテローム発生でのこれらのシステインプロテアーゼの機能的役割を実証した（Ｓｕｋｈｏｖａら（２００３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１１（６）：８９７−９０６；Ｌｕｔｇｅｎｓら（２００６）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ１１３（ｌ）：９８−１０７；Ｋｉｔａｍｏｔｏら（２００７）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ１１５（１５）：２０６５−７５）。最近、レグマイン遺伝子は、安定したおよび不安定なヒトアテローム性動脈硬化プラーク中で差動的に発現することがわかった（Ｐａｐａｓｐｙｒｉｄｏｎｏｓら（２００６）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２６：１８３７−４４．）。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、哺乳動物レグマイン、たとえばヒト、マウス、およびブタのレグマインならびに哺乳動物レグマインスプライス変異体(variant)、特に新規なスプライス変異体ＺＢ−１に関連する様々な方法および組成物を提供する。本研究で、本発明者らは、アテローム性動脈硬化のマウスモデルでのレグマインの遺伝子およびタンパク質の発現を立証し、ヒトアテローム性動脈硬化組織でのレグマイン発現をさらに特徴付ける。加えて、本発明者らは、マクロファージで発現したレグマインが、プロテアーゼ依存性およびプロテアーゼ非依存性のメカニズムを介してアテローム発生の一因となる可能性があることを報告する。
【００１４】
少なくとも１つの実施形態では、本明細書に開示された本発明は、配列番号１１に記載される核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、その核酸配列または配列番号１１に記載される核酸配列の相補鎖に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸配列を含む。他の実施形態では、本発明は、配列番号１２に記載されるアミノ酸配列、配列番号１２のアミノ酸２１〜３２３、配列番号１２のアミノ酸２５〜３２３、および配列番号１２の他の活性断片からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１２に記載されるアミノ酸配列、配列番号１２のアミノ酸２１〜３２３、配列番号１２のアミノ酸２５〜３２３、および配列番号１２の他の活性断片からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸配列の相補鎖またはその核酸配列に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸配列を含む。他の実施形態では、１つまたは複数のこれらの配列に高い配列同一性を有するポリヌクレオチドが提供される。
【００１５】
少なくとも１つの実施形態では、本明細書に開示された本発明は、配列番号１２に記載されるアミノ酸配列、配列番号１２のアミノ酸２１〜３２３、または配列番号１２のアミノ酸２５〜３２３を含むポリペプチドを提供する。他の実施形態では、本発明は、配列番号１１に記載される核酸配列によってコードされたポリペプチドを提供する。他の実施形態では、本発明は、配列番号１１に記載される核酸配列の相補鎖に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされたポリペプチドを提供する。他の実施形態では、１つまたは複数のこれらの配列に高い配列同一性を有するポリペプチドが提供される。
【００１６】
少なくとも１つの実施形態では、本明細書に開示された本発明は、哺乳動物ＺＢ−１ポリペプチドまたは哺乳動物ＺＢ−１ポリペプチドの断片に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供する。他の実施形態では、哺乳動物ＺＢ−１ポリペプチドまたは哺乳動物ＺＢ−１ポリペプチドの断片はヒトに由来する。他の実施形態では、ヒトＺＢ−１ポリペプチドは、配列番号１２に記載されるアミノ酸配列または配列番号１２に記載されるアミノ酸配列の活性断片を含む。他の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片はアンタゴニストまたはアゴニストである。
【００１７】
少なくとも１つの実施形態では、本明細書に開示された本発明は、治療有効量のＺＢ−１および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を提供する。
【００１８】
少なくとも１つの実施形態では、本明細書に開示された本発明は、血管障害または炎症性障害を治療し、寛解させ、または予防する方法で使用する医薬組成物の調製のためのレグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストの使用を提供し、医薬組成物は、治療有効量のレグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストならびに薬学的に許容し得る担体を含む。他の実施形態では、疾患は炎症性障害である。他の実施形態では、炎症性障害は、関節炎、結核、多発性硬化症、クローン病、または潰瘍性大腸炎からなる群から選択される。他の実施形態では、疾患は血管障害である。他の実施形態では、血管障害は、アテローム性動脈硬化、うっ血性心不全、心筋梗塞、不整脈、心房性不整脈、心室性不整脈、狭窄、動脈瘤、末梢血管疾患、末梢動脈疾患、慢性末梢動脈閉塞性疾患、血栓症、アテローム血栓症、深部静脈血栓症、急性動脈血栓症、塞栓症、炎症性血管障害、レイノー現象、脈管炎、動脈炎、静脈障害、高血圧性血管疾患、跛行、狭心症、安定狭心症、不安定狭心症、発作、末梢動脈閉塞性疾患、冠動脈疾患、急性冠動脈症候群、代謝症候群、虚血、再灌流、慢性腎臓疾患、末期腎疾患、糖尿病性腎症、高脂血症、高血圧症、および糖尿病からなる群から選択される。他の実施形態では、レグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストは、阻害性ポリヌクレオチド、阻害性ポリペプチド、低分子、アンタゴニスト抗体、およびその抗原結合断片からなる群から選択される。他の実施形態では、阻害性ポリヌクレオチドは、アンチセンスポリヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ分子、リボザイム、およびアプタマーからなる群から選択される。他の実施形態では、阻害性ポリペプチドは、シスタチンまたはその活性断片、アザペプチドＭｉｃｈｅａｌ受容体／阻害剤、アザペプチドエポキシド、フルオロメチルケトンペプチドカスパーゼ阻害剤、およびクロロメチルケトンペプチドカスパーゼ阻害剤からなる群から選択される。他の実施形態では、低分子は、メチルケトン、ヨード酢酸、ヨードアセトアミド、およびマレイミドからなる群から選択される。
【００１９】
少なくとも１つの実施形態では、本明細書に開示された本発明は、哺乳動物での血管障害または炎症性障害を治療し、寛解させ、または予防するための方法であって、治療有効量のレグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストを哺乳動物に投与する工程を含む方法を提供する。他の実施形態では、疾患は炎症性障害である。他の実施形態では、炎症性障害は、関節炎、結核、多発性硬化症、クローン病、または潰瘍性大腸炎からなる群から選択される。他の実施形態では、疾患は血管障害である。他の実施形態では、血管障害は、アテローム性動脈硬化、うっ血性心不全、心筋梗塞、不整脈、心房性不整脈、心室性不整脈、狭窄、動脈瘤、末梢血管疾患、末梢動脈疾患、慢性末梢動脈閉塞性疾患、血栓症、アテローム血栓症、深部静脈血栓症、急性動脈血栓症、塞栓症、炎症性血管障害、レイノー現象、脈管炎、動脈炎、静脈障害、高血圧性血管疾患、アテローム血栓症、跛行、狭心症、安定狭心症、不安定狭心症、発作、末梢動脈閉塞性疾患、冠動脈疾患、急性冠動脈症候群、代謝症候群、虚血、再灌流、慢性腎臓疾患、末期腎疾患、糖尿病性腎症、高脂血症、高血圧症、および糖尿病からなる群から選択される。他の実施形態では、レグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストは、阻害性ポリヌクレオチド、阻害性ポリペプチド、低分子、アンタゴニスト抗体、およびその抗原結合断片からなる群から選択される。他の実施形態では、阻害性ポリヌクレオチドは、アンチセンスポリヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ分子、リボザイム、およびアプタマーからなる群から選択される。他の実施形態では、阻害性ポリペプチドは、シスタチンまたはその活性断片、アザペプチドＭｉｃｈｅａｌ受容体／阻害剤、アザペプチドエポキシド、フルオロメチルケトンペプチドカスパーゼ阻害剤、およびクロロメチルケトンペプチドカスパーゼ阻害剤からなる群から選択される。他の実施形態では、低分子は、メチルケトン、ヨード酢酸、ヨードアセトアミド、およびマレイミドからなる群から選択される。
【００２０】
少なくとも１つの実施形態では、本明細書に開示された本発明は、哺乳動物での血管障害または炎症性障害を治療し、寛解させ、または予防するための方法であって、哺乳動物の細胞または細胞集団を治療有効量のレグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストと接触させる工程を含む方法を提供する。他の実施形態では、細胞または細胞集団は、マクロファージ、単球、血管内皮細胞、泡沫細胞、または単球、マクロファージ、血管内皮細胞、および／もしくは泡沫細胞の混合物を含む。他の実施形態では、細胞または細胞集団はレグマインおよび／またはＺＢ−１を分泌する。他の実施形態では、細胞または細胞集団は動脈内皮細胞または腎臓近位尿細管細胞を含む。他の実施形態では、細胞または細胞集団は動脈の内膜中への炎症細胞浸潤の部位に由来する。他の実施形態では、細胞または細胞集団は動脈の新生内膜病変エリアに由来する。
【００２１】
少なくとも１つの実施形態では、本明細書に開示された本発明は、細胞または細胞集団中の、レグマインおよび／またはＺＢ−１の活性、発現、および／または分泌のレベルを減少させるための方法であって、細胞または細胞集団を、レグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストと、細胞または細胞集団中のレグマインおよび／またはＺＢ−１の活性、発現、および／または分泌のレベルを減少させるのに十分な量で接触させる工程を含む方法を提供する。他の実施形態では、細胞または細胞集団は、マクロファージ、単球、血管内皮細胞、泡沫細胞、または単球、マクロファージ、血管内皮細胞、および／もしくは泡沫細胞の混合物を含む。他の実施形態では、細胞または細胞集団はレグマインおよび／またはＺＢ−１を分泌する。他の実施形態では、細胞または細胞集団は動脈内皮細胞または腎臓近位尿細管細胞を含む。他の実施形態では、細胞または細胞集団は動脈の内膜中への炎症細胞浸潤の部位に由来する。他の実施形態では、細胞または細胞集団は動脈の新生内膜病変エリアに由来する。
【００２２】
少なくとも１つの実施形態では、本明細書に開示された本発明は、哺乳動物でのレグマインおよび／またはＺＢ−１の活性、発現、および／または分泌のレベルを減少させるための方法であって、哺乳動物に、レグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストを、哺乳動物のレグマインおよび／またはＺＢ−１の活性、発現、および／または分泌のレベルを減少させるのに十分な量で投与する工程を含む方法を提供する。他の実施形態では、レグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストは、阻害性ポリヌクレオチド、阻害性ポリペプチド、低分子、アンタゴニスト抗体、およびその抗原結合断片からなる群から選択される。他の実施形態では、阻害性ポリヌクレオチドは、アンチセンスポリヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ分子、リボザイム、およびアプタマーからなる群から選択される。他の実施形態では、阻害性ポリペプチドは、シスタチンまたはその活性断片、アザペプチドＭｉｃｈｅａｌ受容体／阻害剤、アザペプチドエポキシド、フルオロメチルケトンペプチドカスパーゼ阻害剤、およびクロロメチルケトンペプチドカスパーゼ阻害剤からなる群から選択される。他の実施形態では、低分子は、メチルケトン、ヨード酢酸、ヨードアセトアミド、およびマレイミドからなる群から選択される。
【００２３】
少なくとも１つの実施形態では、本明細書に開示された本発明は、患者の血管障害または炎症性障害治療の経過を監視するための方法であって、患者由来の細胞または細胞集団中のレグマインおよび／またはＺＢ−１の活性、発現、および／または分泌のレベルを測定する工程と、レグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストを患者に投与する工程と、レグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストの投与後に、患者由来の細胞または細胞集団中のレグマインおよび／またはＺＢ−１の活性、発現、および／または分泌のレベルを測定する工程とを含み、レグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストの投与前の、患者由来の細胞または細胞集団中のレグマインおよび／またはＺＢ−１の活性、発現、および／または分泌のレベルと比較した、レグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストの投与後の、患者由来の細胞または細胞集団中のレグマインおよび／またはＺＢ−１の活性、発現、および／または分泌のより低いレベルから、患者の血管障害または炎症性障害に対する治療の効果が積極的に示唆される（a positive indication）方法を提供する。
【００２４】
少なくとも１つの実施形態では、本明細書に開示された本発明は、患者の血管障害または炎症性障害を監視するための方法であって、第１の時点で、患者由来の細胞または細胞集団中のレグマインおよび／またはＺＢ−１の活性、発現、および／または分泌のレベルを測定する工程と、第２の時点で、患者由来の細胞または細胞集団中のレグマインおよび／またはＺＢ−１の活性、発現、および／または分泌のレベルを測定する工程とを含み、第１の時点での、患者由来の細胞または細胞集団中のレグマインおよび／またはＺＢ−１の活性、発現、および／または分泌のレベルと比較した、第２の時点での、患者由来の細胞または細胞集団中のレグマインおよび／またはＺＢ−１の活性、発現、および／または分泌のより低いレベルから、血管障害または炎症性障害の重症度が減少したことが示唆される方法を提供する。
【００２５】
少なくとも１つの実施形態では、本明細書に開示された本発明は、患者の血管障害または炎症性障害を監視するための方法であって、患者由来の細胞または細胞集団中のレグマインおよび／またはＺＢ−１の活性、発現、および／または分泌のレベルを測定する工程と、患者由来の細胞または細胞集団中のレグマインおよび／またはＺＢ−１の活性、発現、および／または分泌のレベルを基準の細胞または細胞集団中のレグマインおよび／またはＺＢ−１の活性、発現、および／または分泌のレベルと比較する工程とを含み、基準の細胞または細胞集団中のレグマインおよび／またはＺＢ−１の活性、発現、および／または分泌のレベルと比較した、患者由来の細胞または細胞集団中のレグマインおよび／またはＺＢ−１の活性、発現、および／または分泌のより低いレベルから、血管障害または炎症性障害の重症度が減少したことが示唆される方法を提供する。
【００２６】
少なくとも１つの実施形態では、本明細書に開示された本発明は、患者の血管障害または炎症性障害の予後を判定するための方法であって、第１の時点で、患者由来の細胞または細胞集団中のレグマインおよび／またはＺＢ−１の活性、発現、および／または分泌のレベルを測定する工程と、第２の時点で、患者由来の細胞または細胞集団中のレグマインおよび／またはＺＢ−１の活性、発現、および／または分泌のレベルを測定する工程とを含み、第１の時点での、患者由来の細胞または細胞集団中のレグマインおよび／またはＺＢ−１の活性、発現、および／または分泌のレベルと比較した、第２の時点での、患者由来の細胞または細胞集団中のレグマインおよび／またはＺＢ−１の活性、発現、および／または分泌のより低いレベルから、患者が血管障害もしくは炎症性障害を発症するまたはより重症型の血管障害もしくは炎症性障害を発症する可能性の減少が示唆される方法を提供する。
【００２７】
少なくとも１つの実施形態では、本明細書に開示された本発明は、患者の血管障害または炎症性障害の予後を判定するための方法であって、患者由来の細胞または細胞集団中のレグマインおよび／またはＺＢ−１の活性、発現、および／または分泌のレベルを測定する工程と、細胞または細胞集団中のレグマインおよび／またはＺＢ−１の活性、発現、および／または分泌のレベルを基準の細胞または細胞集団中のレグマインおよび／またはＺＢ−１の活性、発現、および／または分泌のレベルと比較する工程とを含み、基準の細胞または細胞集団中のレグマインおよび／またはＺＢ−１の活性、発現、および／または分泌のレベルと比較した、患者由来の細胞または細胞集団中のレグマインおよび／またはＺＢ−１の活性、発現、および／または分泌のより低いレベルまたは類似するレベルから、患者が血管障害もしくは炎症性障害を発症するまたはより重症型の血管障害もしくは炎症性障害を発症する可能性の減少が示唆される方法を提供する。
【００２８】
少なくとも１つの実施形態では、本明細書に開示された本発明は、血管障害または炎症性障害を治療し、寛解させ、または予防することができる化合物をスクリーニングする方法であって、レグマインおよび／またはＺＢ−１を含有するサンプルを興味のある化合物と接触させる工程と、接触させたサンプルのレグマインおよび／またはＺＢ−１の活性、発現、および／または分泌のレベルが、化合物と接触させていないサンプルのレグマインおよび／またはＺＢ−１の活性、発現、および／または分泌のレベルと比較して減少するかどうかを決定する工程とを含み、接触させたサンプルのレグマインおよび／またはＺＢ−１の活性、発現、および／または分泌のレベルの減少により、その化合物を、血管障害または炎症性障害を治療し、寛解させ、または予防することができる化合物として同定する方法を提供する。
【００２９】
少なくとも１つの実施形態では、本明細書に開示された本発明は、哺乳動物での血管障害または炎症性障害を治療し、寛解させ、または予防するための方法であって、治療有効量のレグマインアゴニストおよび／またはＺＢ−１アゴニストを哺乳動物に投与する工程を含む方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、血管障害または炎症性障害を治療し、寛解させ、または予防する方法での使用のための医薬組成物の調製のためのレグマインアゴニストおよび／またはＺＢ−１アゴニストの使用を提供し、医薬組成物は、治療有効量のレグマインアゴニストおよび／またはＺＢ−１アゴニストならびに薬学的に許容し得る担体を含む。
【００３０】
少なくとも１つの実施形態では、本明細書に開示された本発明は、哺乳動物での細胞移動を阻害するための方法であって、レグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストを哺乳動物に投与する工程を含む方法を提供する。他の実施形態では、レグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストは、阻害性ポリヌクレオチド、阻害性ポリペプチド、低分子、アンタゴニスト抗体、およびその抗原結合断片からなる群から選択される。他の実施形態では、阻害性ポリヌクレオチドは、アンチセンスポリヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ分子、リボザイム、およびアプタマーからなる群から選択される。他の実施形態では、阻害性ポリペプチドは、シスタチンまたはその活性断片、アザペプチドＭｉｃｈｅａｌ受容体／阻害剤、アザペプチドエポキシド、フルオロメチルケトンペプチドカスパーゼ阻害剤、およびクロロメチルケトンペプチドカスパーゼ阻害剤からなる群から選択される。他の実施形態では、低分子は、メチルケトン、ヨード酢酸、ヨードアセトアミド、およびマレイミドからなる群から選択される。他の実施形態では、本発明は、哺乳動物での細胞移動を阻害する方法での使用のための医薬組成物の調製のためのレグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストの使用を提供し、医薬組成物は、治療有効量のレグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストならびに薬学的に許容し得る担体を含む。
【００３１】
少なくとも１つの実施形態では、本明細書に開示された本発明は、哺乳動物での細胞移動を促進するための方法であって、レグマインアゴニストおよび／またはＺＢ−１アゴニストを哺乳動物に投与する工程を含む方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、哺乳動物での細胞移動の方法での使用のための医薬組成物の調製のためのレグマインアゴニストおよび／またはＺＢ−１アゴニストの使用を提供し、医薬組成物は、治療有効量のレグマインアゴニストおよび／またはＺＢ−１アゴニストならびに薬学的に許容し得る担体を含む。
【００３２】
少なくとも１つの実施形態では、本明細書に開示された本発明は、哺乳動物での創傷治癒を促進する方法であって、レグマインアゴニストおよび／またはＺＢ−１アゴニストを哺乳動物に投与する工程を含む方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、哺乳動物での創傷治癒を促進する方法での使用のための医薬組成物の調製のためのレグマインアゴニストおよび／またはＺＢ−１アゴニストの使用を提供し、医薬組成物は、治療有効量のレグマインアゴニストおよび／またはＺＢ−１アゴニストならびに薬学的に許容し得る担体を含む。
【００３３】
少なくとも１つの実施形態では、本明細書に開示された本発明は、哺乳動物での血管形成を阻害するための方法であって、レグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストを哺乳動物に投与する工程を含む方法を提供する。他の実施形態では、レグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストは、阻害性ポリヌクレオチド、阻害性ポリペプチド、低分子、アンタゴニスト抗体、およびその抗原結合断片からなる群から選択される。他の実施形態では、阻害性ポリヌクレオチドは、アンチセンスポリヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ分子、リボザイム、およびアプタマーからなる群から選択される。他の実施形態では、阻害性ポリペプチドは、シスタチンまたはその活性断片、アザペプチドＭｉｃｈｅａｌ受容体／阻害剤、アザペプチドエポキシド、フルオロメチルケトンペプチドカスパーゼ阻害剤、およびクロロメチルケトンペプチドカスパーゼ阻害剤からなる群から選択される。他の実施形態では、低分子は、メチルケトン、ヨード酢酸、ヨードアセトアミド、およびマレイミドからなる群から選択される。他の実施形態では、本発明は、哺乳動物での血管形成を阻害する方法での使用のための医薬組成物の調製のためのレグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストの使用を提供し、医薬組成物は、治療有効量のレグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストならびに薬学的に許容し得る担体を含む。
【００３４】
少なくとも１つの実施形態では、本明細書に開示された本発明は、哺乳動物での血管形成を促進するための方法であって、レグマインアゴニストおよび／またはＺＢ−１アゴニストを哺乳動物に投与する工程を含む方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、哺乳動物での血管形成を促進する方法での使用のための医薬組成物の調製のためのレグマインアゴニストおよび／またはＺＢ−１アゴニストの使用を提供し、医薬組成物は、治療有効量のレグマインアゴニストおよび／またはＺＢ−１アゴニストならびに薬学的に許容し得る担体を含む。
【００３５】
少なくとも１つの実施形態では、本明細書に開示された本発明は、哺乳動物での内皮細胞の増殖を阻害するための方法であって、レグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストを哺乳動物に投与する工程を含む方法を提供する。他の実施形態では、レグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストは、阻害性ポリヌクレオチド、阻害性ポリペプチド、低分子、アンタゴニスト抗体、およびその抗原結合断片からなる群から選択される。他の実施形態では、阻害性ポリヌクレオチドは、アンチセンスポリヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ分子、リボザイム、およびアプタマーからなる群から選択される。他の実施形態では、阻害性ポリペプチドは、シスタチンまたはその活性断片、アザペプチドＭｉｃｈｅａｌ受容体／阻害剤、アザペプチドエポキシド、フルオロメチルケトンペプチドカスパーゼ阻害剤、およびクロロメチルケトンペプチドカスパーゼ阻害剤からなる群から選択される。他の実施形態では、低分子は、メチルケトン、ヨード酢酸、ヨードアセトアミド、およびマレイミドからなる群から選択される。他の実施形態では、本発明は、哺乳動物での内皮細胞の増殖を阻害する方法での使用のための医薬組成物の調製のためのレグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストの使用を提供し、医薬組成物は、治療有効量のレグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストならびに薬学的に許容し得る担体を含む。
【００３６】
少なくとも１つの実施形態では、本明細書に開示された本発明は、哺乳動物での内皮細胞の増殖を促進する方法であって、レグマインアゴニストおよび／またはＺＢ−１アゴニストを哺乳動物に投与する工程を含む方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、哺乳動物での内皮細胞の増殖を促進する方法での使用のための医薬組成物の調製のためのレグマインアゴニストおよび／またはＺＢ−１アゴニストの使用を提供し、医薬組成物は、治療有効量のレグマインアゴニストおよび／またはＺＢ−１アゴニストならびに薬学的に許容し得る担体を含む。
【００３７】
少なくとも１つの実施形態では、本明細書に開示された本発明は、腫瘍転移を阻害する方法であって、哺乳動物の細胞または細胞集団をレグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストと接触させる工程を含む方法を提供する。少なくとも１つの他の実施形態では、本明細書に開示された本発明は、哺乳動物での腫瘍転移を阻害する方法であって、レグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストを哺乳動物に投与する工程を含む方法を提供する。他の実施形態では、レグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストは、阻害性ポリヌクレオチド、阻害性ポリペプチド、低分子、アンタゴニスト抗体、およびその抗原結合断片からなる群から選択される。他の実施形態では、阻害性ポリヌクレオチドは、アンチセンスポリヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ分子、リボザイム、およびアプタマーからなる群から選択される。他の実施形態では、阻害性ポリペプチドは、シスタチンまたはその活性断片、アザペプチドＭｉｃｈｅａｌ受容体／阻害剤、アザペプチドエポキシド、フルオロメチルケトンペプチドカスパーゼ阻害剤、およびクロロメチルケトンペプチドカスパーゼ阻害剤からなる群から選択される。他の実施形態では、低分子は、メチルケトン、ヨード酢酸、ヨードアセトアミド、およびマレイミドからなる群から選択される。他の実施形態では、本発明は、哺乳動物での腫瘍転移を阻害する方法での使用のための医薬組成物の調製のためのレグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストの使用を提供し、医薬組成物は、治療有効量のレグマインアンタゴニストおよび／またはＺＢ−１アンタゴニストならびに薬学的に許容し得る担体を含む。
【００３８】
少なくとも１つの実施形態では、本明細書に開示された本発明は、移植手術からの回復を促進する方法であって、哺乳動物の細胞または細胞集団をレグマインアゴニストおよび／またはＺＢ−１アゴニストと接触させる工程を含む方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、哺乳動物での移植手術からの回復を促進する方法での使用のための医薬組成物の調製のためのレグマインアゴニストおよび／またはＺＢ−１アゴニストの使用を提供し、医薬組成物は、治療有効量のレグマインアゴニストおよび／またはＺＢ−１アゴニストならびに薬学的に許容し得る担体を含む。
【００３９】
少なくとも１つの実施形態では、本明細書に開示された本発明は、哺乳動物での血管障害または炎症性障害を治療し、寛解させ、または予防するための方法であって、哺乳動物に治療有効量のＯＩＰ−２を投与する工程を含む方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、血管障害または炎症性障害を治療し、寛解させ、または予防する方法での使用のための医薬組成物の調製のためのＯＩＰ−２の使用を提供し、医薬組成物は、治療有効量のＯＩＰ−２および薬学的に許容し得る担体を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】健常動脈サンプル（Ｘ軸：「正常」）と比較した、プラーク（Ｘ軸：「アテロームプラーク」）またはプラークなし（Ｘ軸：「アテローム血管」）セグメントを有するヒトアテローム性動脈硬化動脈サンプルのレグマインｍＲＮＡ発現（上パネル；Ｙ軸：「標準化強度（倍数目盛り）」）を示す図である。レグマイン（２０１２１２＿ａｔ）発現は、プラークなしセグメントまたは非疾患動脈サンプルと比較して、プラークを含有するアテローム性動脈硬化動脈サンプルで増加する。値を下のパネルに示す。
【図２】５〜５５週齢（Ｘ軸：「齢（週）」）のＡｐｏＥ−／−マウス（「ＡｐｏＥ−／−」）およびＣ５７ＢＬ／６野生型コントロールマウス（「Ｃ５７ＢＬ／６」）の大動脈弓でのレグマインｍＲＮＡ発現（Ｙ軸：「頻度（ｐｐｍ）」）を示す図である。レグマイン遺伝子発現は疾患の進行と共に増加する。
【図３】リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）による、アテローム性動脈硬化でのレグマインｍＲＮＡ発現（Ｙ軸：「相対的ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ユニット（β−アクチンで標準化）」）プロファイルの検証を示す図である。ｍＲＮＡは、４０週齢、１２〜５４週齢（Ｘ軸：齢（週））のＡｐｏＥ−／−マウス（「ＡｐｏＥ−／−」）およびＣ５７ＢＬ／６野生型コントロールマウス（「Ｃ５７ＢＬ／６」）の大動脈弓から単離し、ＲＴ−ＰＣＲによって分析した。データは、アテローム性動脈硬化がマウスで進行するにつれてレグマイン遺伝子発現が増加することを実証する。
【図４】レグマインｍＲＮＡ、タンパク質、および活性が、分化（マクロファージ）ＴＨＰ１ヒト単球性白血病細胞で増加することを示す図である。（図４Ａ）ＴＨＰ１細胞は、０、１、２、または３日間で、ＰＭＡ（ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート）含有培地中で分化した（Ｘ軸：「分化後の日数」）。ｍＲＮＡレベル（Ｙ軸：「倍数変化」）は、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フォスターシティ、ＣＡ）定量的ＰＣＲによって決定した。（図４Ｂ）未分化細胞（左のレーン）またはＰＭＡ分化ＴＨＰ１細胞（右のレーン）中の成熟レグマインおよびアクチン（コントロール）のタンパク質レベルは、抗レグマインポリクローナル抗体および抗アクチンポリクローナル抗体をそれぞれ使用してウエスタン分析によって決定した。分子量マーカー（ｋＤａで）を左側に示す。（図４Ｃ）図４Ｂと同じ細胞溶解物を使用して、レグマインのプロテアーゼ活性（Ｙ軸：「反応速度」）を、レグマイン基質ペプチドであるＺ−ＡＡＮ−ＭＣＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ルイビル、ＫＹ）の加水分解を測定することにより決定した（Ｘ軸：未分化ＴＨＰ１単球、「非分化」；分化ＴＨＰ１マクロファージ、「分化」）。
【図５】レグマインタンパク質のレベルおよび活性がＭ−ＣＳＦ活性化初代ヒトマクロファージ中で増加することを示す図である。細胞溶解物は、Ｍ−ＣＳＦありまたはなしの無血清培地（図５Ａおよび５Ｂ）または０．２５％ＦＢＳを補足したＲＰＭＩ培地（図５Ｃ）中で培養した初代ヒトマクロファージから調製した。（図５Ａ）：ウエスタン分析によるＭ−ＣＳＦ刺激ヒトマクロファージ中のレグマインタンパク質（「成熟レグマイン」および「プロレグマイン」）の検出。レーン１：非刺激；レーン２：Ｍ−ＣＳＦ処置。「アクチン」：アクチン装填コントロール。（図５Ｂ）：Ｍ−ＣＳＦ刺激ヒトマクロファージからの、条件培地中のプロレグマインの検出。レーン１：非刺激；レーン２：Ｍ−ＣＳＦ処置。（図５Ｃ）：Ｚ−ＡＡＮ−ＭＣＡの加水分解によって測定された、Ｍ−ＣＳＦ刺激ヒトマクロファージ（Ｘ軸：「Ｍ−ＣＳＦ」）または非刺激マクロファージ（Ｘ軸：「未処置」）中のレグマイン活性（Ｙ軸：「反応速度」）の検出。
【図６】発光細胞生存率アッセイを使用して測定し、定量化した、Ｂｏｙｄｅｎチャンバー中での、精製レグマインへの初代ヒト単球の用量依存性の移動を示す図である（Ｙ軸：「発光」）。１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦおよび５％ＦＢＳをポジティブコントロールとして使用し、統計的有意差はｐ＜０．０５で達成した（分散分析）。アスタリスク（＊）は０ｎｇ／ｍｌと比較した有意性を表した。
【図７】細胞表面レグマイン活性の検出を示す図である。マウスレグマインを発現するアデノウイルスで２９３細胞を感染させた。細胞表面レグマイン活性（Ｙ軸：「反応速度」）は、プロテアーゼ阻害剤シスタチンＣまたはＥ６４の存在下または非存在下でのレグマイン基質ペプチドＺ−ＡＡＮ−ＭＣＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を含有する反応緩衝液中でのレグマイン発現細胞のインキュベートにより決定した。コントロール：「阻害剤なし」。
【図８】ｉｎ  ｖｉｔｒｏ創傷治癒アッセイでのＨＥＫ２９３細胞移動に対するレグマインの効果を示す図である。ＶＥＧＦ（１０  ｎｇ／ｍＬ）および５％ＦＢＳをポジティブコントロールとして使用した。結果は、アスタリスク（＊）によって表す、コントロールと比較した、１０ｎｇ／ｍＬおよび２５ｎｇ／ｍＬのレグマインでの刺激に応じた細胞移動での著しい増加を明らかにする。統計的有意差はｐ＜０．０５で達成される（分散分析）。
【図９】ｉｎ  ｖｉｔｒｏ創傷治癒アッセイでのヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）移動に対するレグマインの効果を示す図である。ＶＥＧＦ（１０  ｎｇ／ｍＬ）および５％ＦＢＳをポジティブコントロールとして使用した。結果は、アスタリスク（＊）によって表す、コントロールと比較した、２５ｎｇ／ｍＬのレグマインでの刺激に応じた細胞移動での著しい増加を明らかにする。２５ｎｇ／ｍＬのレグマインは、１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦと同じ程度まで移動の増加を促進する。統計的有意差はｐ＜０．０５で達成される（分散分析）。
【図１０】発光細胞生存率アッセイを使用して測定し、定量化した、改造したＢｏｙｄｅｎチャンバー中での、精製レグマインに暴露したＨＵＶＥＣの用量依存性のＭａｔｒｉｇｅｌ侵入を示す図である（Ｙ軸：「発光」）。１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦをポジティブコントロールとして使用した。２５ｎｇ／ｍＬで上部および下部のチャンバー中に装填したレグマインをネガティブコントロールとして使用した。結果は、アスタリスク（＊）によって表す、コントロールと比較した、２５ｎｇ／ｍＬのレグマインでの刺激に応じた細胞侵入での著しい増加を明らかにする。２５ｎｇ／ｍＬのレグマインは、１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦと同じ程度まで侵入の増加を促進する。統計的有意差はｐ＜０．０５で達成される（分散分析）。
【図１１】ヒトレグマイン配列（上部配列（１〜４３４））と整列させたヒトＺＢ−１（下部配列（１〜３７７））のアミノ酸配列を示す図である。「Ａｓｐ25切断」：Ｎ末端プロペプチド切断部位；「Ａｓｎ323切断」：Ｃ末端プロペプチド切断部位。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
発明の詳細な説明
本明細書に開示された発見は、血管障害、たとえばアテローム性動脈硬化等の心血管障害および炎症性障害、たとえば関節炎等の慢性炎症性障害に関連する遺伝子としてレグマインを同定する。
【００４２】
さらに、完全長ヒトレグマインのアミノ酸３４１〜３９７を欠き、レグマインと同様に細胞培養での過剰発現に際して分泌される、ＺＢ−１と命名された、レグマインの新規なスプライス変異体が本明細書に開示される。したがって、ＺＢ−１もまた血管障害および炎症性障害で機能する可能性がある。
【００４３】
以下の発見が本明細書に開示される：（１）レグマインのｍＲＮＡおよびタンパク質の発現はアテローム性動脈硬化のマウスモデルでの病変形成の間に劇的に増加する；（２）レグマインｍＲＮＡは非疾患組織と比較してヒトアテローム性動脈硬化サンプルで増加する；（３）レグマインタンパク質はＡｐｏＥ−／−マウスのアテローム性動脈硬化プラークの泡沫細胞中で検出される；（４）レグマインはＡｐｏＥ−／−マウスの大動脈洞の動脈内皮細胞によって発現される；（５）レグマインは、活性化ヒトマクロファージおよび分化マクロファージ中で高度に発現し、活性化ヒトマクロファージの培養培地中に放出される；（６）レグマイン活性は、マクロファージ分化およびマクロファージ活性化の間に細胞培養で顕著に増加する；（７）酵素的に活性なレグマインは組換えレグマイン過剰発現細胞の細胞表面に検出される；（８）レグマインは、腎臓中で、たとえば腎動脈の内皮細胞中でおよび近位尿細管細胞中で発現する；（９）レグマインはアテローム性動脈硬化患者の冠動脈中で発現する；（１０）レグマイン刺激はヒト単球移動を誘発する；ならびに（１１））レグマイン刺激は、ＨＥＫ２９３およびＨＵＶＥＣの培養物の創傷治癒モデルでの内皮細胞移動および増殖とＨＵＶＥＣ培養物での内皮細胞侵入とを誘発する。これらの発見は、一緒に考慮すると、レグマイン（およびＺＢ−１）ならびに血管疾患および／または炎症性疾患、たとえばアテローム性動脈硬化（つまりこれを含むが、これに限定されない）の間の機能的関係を証明する。
【００４４】
さらに、関節炎のマウスモデルでのコラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）の足でのレグマイン発現が増加するといった発見が本明細書に開示される。たとえばアテローム発生（血管炎症の形態）の間に生じる単球動員およびマクロファージ分化はまた、慢性炎症（たとえば関節炎および結核）によって特徴付けられる、疾患の典型的な特徴であるので、これらの発見は、レグマインおよびＺＢ−１が炎症性疾患で一般的な役割を有する可能性があることを示唆する。
【００４５】
これらの発見を考慮して、レグマインならびに新規なＺＢ−１等のレグマイン変異体の分泌、発現、ならびに／または活性のアッセイならびに／または調整は、血管障害および炎症性障害ならびにそれに関連する障害を診断する、予後を判定する、監視する、治療し、寛解させ、ならびに／または予防するための優れたツールを提供する。
【００４６】
そのため、本発明は、レグマインならびにＺＢ−１の修飾因子（たとえばレグマインおよびＺＢ−１のアンタゴニストならびにレグマインおよびＺＢ−１のアゴニスト）を提供する。したがって、本発明は、レグマインならびにＺＢ−１のアンタゴニスト、たとえば哺乳動物（たとえばマウスならびにヒト）のレグマインならびにＺＢ−１の阻害性ポリヌクレオチド（つまりレグマインならびに／またはＺＢ−１のレベル、細胞からの分泌、ならびに／または活性を直接または間接的に減少させるポリヌクレオチド、たとえばアンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ分子、アプタマー）；レグマインならびにＺＢ−１の阻害性ポリペプチド（つまりレグマインならびに／またはＺＢ−１のレベル、細胞からの分泌、ならびに／または活性を直接または間接的に減少させるポリペプチド、たとえば異常プロテアーゼ酵素ドメインを含有する断片等の、レグマインまたはＺＢ−１の断片ならびにその融合タンパク質）；アンタゴニスト抗レグマイン抗体ならびに抗ＺＢ−１抗体または抗体断片（つまりレグマインならびに／またはＺＢ−１のレベル、細胞からの分泌、ならびに／または活性を直接または間接的に減少させる抗体または抗体断片（つまり抗原結合断片）、たとえば完全長レグマインおよび／もしくはＺＢ−１ならびに／またはレグマインおよび／もしくはＺＢ−１の断片に結合するアンタゴニスト抗体ならびに抗体断片を含む）；ならびにアンタゴニスト低分子（たとえばｓｉＲＮＡ分子、アプタマー、ならびに低有機分子または化合物）を提供し、これらは、アスパラギニル結合の、レグマインならびに／またはＺＢ−１媒介性の加水分解を抑制するために使用してもよく、結果的に、これらは、レグマインおよび／もしくはＺＢ−１の活性の増加に関する障害ならびに／またはレグマインおよび／もしくはＺＢ−１の活性もしくは発現を減少させることにより治療可能な障害、つまりレグマインならびに／またはＺＢ−１関連性の状態または障害の診断、予後、監視、ならびに／または治療で使用してもよい。本明細書に使用されるように、用語「アンタゴニスト」は、直接的アンタゴニスト（たとえばレグマインおよび／またはＺＢ−１のポリペプチドまたはポリヌクレオチドと直接相互作用する分子）ならびに間接的アンタゴニスト（たとえばＺＢ−１および／またはレグマインの活性、分泌、および／または発現を間接的に減少させる分子（たとえばインテグリンとのレグマインの相互作用をブロックするＲＧＤ含有ペプチド））の両方を指す。
【００４７】
本発明はまた、レグマインならびにＺＢ−１のアゴニスト、たとえば哺乳動物（たとえばマウスならびにヒト）のレグマインならびにＺＢ−１のポリヌクレオチド（つまりレグマインならびに／またはＺＢ−１のレベル、細胞からの分泌、ならびに／または活性を直接または間接的に増加させるポリヌクレオチド、たとえばｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ）；レグマインならびにＺＢ−１のポリペプチド（つまりレグマインならびに／またはＺＢ−１のレベル、細胞からの分泌、ならびに／または活性を直接または間接的に増加させるポリペプチド、たとえばプロテアーゼ酵素ドメインを含有する断片等の、レグマインまたはＺＢ−１の断片ならびにその融合タンパク質）；アゴニスト抗レグマイン抗体ならびに抗ＺＢ−１抗体または抗体断片（つまりレグマインならびに／またはＺＢ−１のレベル、細胞からの分泌、ならびに／または活性を直接または間接的に増加させる抗体または抗体断片、たとえば完全長レグマインおよび／もしくはＺＢ−１ならびに／またはレグマインおよび／もしくはＺＢ−１の断片に結合するアゴニスト抗体ならびに抗体断片を含む）；ならびにアゴニスト低分子（たとえば低有機分子または化合物）を提供し、これらは、アスパラギニル結合の、レグマインならびに／またはＺＢ−１媒介性の加水分解を増強するために使用してもよく、結果的に、これらは、レグマインおよび／もしくはＺＢ−１の活性の減少に関する障害ならびに／またはレグマインおよび／もしくはＺＢ−１の活性もしくは発現を増加させることにより治療可能な障害、たとえば細胞（たとえば内皮細胞）の移動の増加によって治療可能なもしくはそれから利益を得ると思われる障害、たとえば創傷治癒（たとえば外科的に誘発されたまたは偶発的にもしくはその他の状態で生じる創傷）または前述の細胞移動の増加によって治療可能なもしくはそれから利益を得ると思われる他の状態、たとえば移植手術からの回復の診断、予後、監視、ならびに／または治療で使用してもよい。本明細書に使用されるように、用語「アゴニスト」は、直接的アゴニスト（たとえばレグマインおよび／またはＺＢ−１のポリペプチドまたはポリヌクレオチドと直接相互作用する分子）ならびに間接的アゴニスト（たとえばＺＢ−１および／またはレグマインの活性、分泌、および／または発現を間接的に増加させる分子（たとえばレグマインおよび／またはＺＢ−１の発現の転写エンハンサー））の両方を指す。
【００４８】
レグマインは、マトリックス分子および／または細胞表面と相互作用すると考えられる分泌タンパク質であるので、細胞外に存在するレグマインおよび／またはＺＢ−１の量を減少させる化合物は、レグマインおよび／またはＺＢ−１を分泌する細胞または細胞の集団、たとえばマクロファージ、泡沫細胞、血管および内皮の細胞（たとえば動脈内皮細胞）、血管壁中への（たとえば動脈内膜中への）炎症細胞侵入の部位、新生内膜病変エリア、腎臓近位尿細管細胞、単球等におけるレグマインおよび／またはＺＢ−１の活性を調整するのに有用である。
【００４９】
レグマインならびに／またはＺＢ−１の活性の増加に関する障害は、「レグマインおよび／もしくはＺＢ−１関連性の状態」または「レグマインおよび／もしくはＺＢ−１関連性の障害」等として本明細書に記載され、限定を伴うことなく、アテローム性動脈硬化（アテローム発生およびアテローム性動脈硬化の全期、たとえば内皮細胞活性化、脂肪線条の形成、血管壁の炎症細胞侵入、内皮細胞移動、泡沫細胞の形成、プラークの裸出、アテローム性プラーク形成、アテローム性プラーク破裂、アテローム血栓症、動脈瘤、狭窄等を含むが、これらに限定されない）、うっ血性心不全、心筋梗塞、不整脈（たとえば心房性および心室性不整脈）、狭窄、動脈瘤、末梢血管疾患、慢性末梢動脈閉塞性疾患（ＣＰＡＯＤ）、末梢動脈閉塞性疾患（ＰＡＯＤ）、血栓症（たとえば急性動脈血栓症、アテローム血栓症、および深部静脈血栓症を含む）、塞栓症、炎症性血管障害、レイノー現象、脈管炎および／もしくは動脈炎（たとえばベーチェット病、バージャー病、中枢神経系脈管炎、チャーグ−ストラウス症候群クリオグロブリン血症、巨細胞性動脈炎、川崎病、顕微鏡的多発血管炎、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発性筋痛、リウマチ性血管炎、高安動脈炎、およびヴェーゲナー肉芽腫症を含む）静脈障害、高血圧性血管疾患、跛行、狭心症（たとえば安定狭心症、不安定狭心症）、発作、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）、代謝症候群、虚血、再灌流、ならびに循環系によって影響を及ぼされる様々な疾患の増悪（たとえば糖尿病性腎症、慢性腎臓疾患、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）、高脂血症、高血圧症、および糖尿病）を含む。本明細書に開示された方法を使用する診断、予後、監視、治療、寛解、ならびに／または予防に適用可能なさらなる障害は、炎症性障害（たとえば、関節炎、結核、および多発性硬化症ならびにクローン病および潰瘍性大腸炎等の炎症性腸疾患を含むが、これらに限定されない慢性炎症性障害）を含む。
【００５０】
本発明は、次のものをスクリーニングする方法をさらに提供する：（１）レグマインおよび／またはＺＢ−１のアンタゴニスト、たとえばマウスおよびヒトのレグマインおよび／またはＺＢ−１の阻害性ポリヌクレオチド（たとえばアンチセンス、ｓｉＲＮＡ、アプタマー）；レグマインおよび／またはＺＢ−１の阻害性ポリペプチド（たとえばレグマインおよび／またはＺＢ−１の酵素的に不活性な断片）；アンタゴニスト抗レグマイン抗体および／もしくは抗ＺＢ−１抗体または抗体断片（レグマインおよび／またはＺＢ−１の断片に結合する抗体および抗体断片を含む）；ならびにアンタゴニスト低分子（たとえばｓｉＲＮＡ、アプタマー、および低有機分子または化合物）ならびに（２）レグマインおよび／またはＺＢ−１関連性の障害、たとえば血管障害および／または炎症性障害を治療し、寛解させ、および／または予防するのに有用である化合物。前述のスクリーニング法は、たとえばレグマインおよび／もしくはＺＢ−１の発現のレベル（たとえばレグマインおよび／もしくはＺＢ−１のｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、タンパク質、および／もしくはタンパク質断片のレベル）の変化を測定することによってまたはレグマインおよび／もしくはＺＢ−１の活性のレベルの変化（たとえば基質のアスパラギニル結合の加水分解のレベルの変化）を測定することによってまたはレグマインおよび／もしくはＺＢ−１の分泌のレベルの変化を測定することによって（たとえば免疫組織化学または他の知られている技術を使用することによって）行ってもよい。
【００５１】
本明細書に使用される用語「レグマイン」および「ＺＢ−１」は、適切な場合には、哺乳動物のレグマインおよびＺＢ−１、たとえば霊長類（ヒトを含む）および／またはげっ歯類（マウスを含む）のレグマインおよびＺＢ−１を指し、レグマインおよびＺＢ−１のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの両方を含む。
【００５２】
したがって、本出願は、レグマインおよびＺＢ−１に関するポリヌクレオチドおよびポリペプチドを提供する。本発明はまた、抗体およびその抗体断片、たとえばレグマインおよび／またはＺＢ−１、たとえば哺乳動物のレグマインおよび／またはＺＢ−１、特に、ヒト、ブタ、および／またはマウスのレグマインおよび／またはＺＢ−１に結合する完全抗体およびその抗原結合断片を提供する。一実施形態では、抗レグマイン抗体または抗ＺＢ−１抗体は、少なくとも１つのレグマインおよび／またはＺＢ−１関連性の活性を阻害するまたはアンタゴナイズする。たとえば、抗レグマイン抗体は、レグマインに結合し、レグマインおよびタンパク質／ペプチド基質の間の相互作用を阻害してもよい（たとえば減少させる、制限する、中和する、ブロックする、干渉する、またはその他の場合では低下させてもよい）。抗レグマイン抗体はまた、レグマインならびに／またはＺＢ−１に結合し、レグマインならびに／またはＺＢ−１の酵素活性（たとえばプロテアーゼ活性、タンパク質／ペプチド切断、タンパク質／ペプチド活性化）に、たとえば、レグマインもしくはＺＢ−１のアミノ酸の三次および／もしくは二次構造でのコンホメーション変化を誘発することによってまたは成熟ペプチドへのレグマインおよび／もしくはＺＢ−１のプロセシングを予防することによって（たとえばプロペプチドのＮ末端もしくはＣ末端のプロセシングを予防することによって）干渉してもよい。したがって、本発明の抗体は、レグマインならびに／またはＺＢ−１の活性（たとえばタンパク質／ペプチド基質とのレグマインおよび／もしくはＺＢ−１の相互作用またはレグマインおよび／もしくはＺＢ−１のアスパラギニルペプチダーゼ／プロテアーゼの活性）を検出するならびに任意選択で阻害するために使用してもよい。したがって、本発明の抗レグマイン抗体および抗ＺＢ−１抗体は、レグマインおよび／またはＺＢ−１関連性の障害、たとえば、アテローム性動脈硬化および関節炎等の血管障害および炎症性障害を診断する、予後を判定する、監視する、治療し、寛解させ、または予防するために使用してもよい。
【００５３】
レグマインおよびＺＢ−１のポリヌクレオチドおよびポリペプチド
本発明は、レグマインおよびＺＢ−１の特徴付け、たとえば大動脈、腎臓、およびアテローム性動脈硬化プラーク中での発現プロファイル、細胞内局在性、および酵素活性を提供する。そのため、本発明は、レグマインおよびＺＢ−１のポリヌクレオチドおよびポリペプチド（たとえば完全長および断片のレグマインおよびＺＢ−１のポリヌクレオチドおよびポリペプチド）ならびに阻害レグマインおよびＺＢ−１のポリヌクレオチドおよびポリペプチド（たとえば完全長および断片のレグマインおよびＺＢ−１の阻害性ポリヌクレオチドおよびポリペプチド）に関する。ヒトレグマイン核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１００８５３０およびＮＭ＿００５６０６に相当し、配列番号１および３に記載される。対応するヒトレグマインアミノ酸配列は、配列番号２および４にそれぞれ記載される。マウスレグマイン核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０１１１７５に相当し、配列番号５に記載される。対応するマウスレグマインアミノ酸配列は配列番号６に記載される。レグマインであることが予測されたチンパンジー核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ＿５１０１３３に相当し、配列番号７に記載される。対応するチンパンジーアミノ酸配列は配列番号８に記載される。レグマインであることが予測されるアカゲザル核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ＿００１０９２０４７に相当し、配列番号９に記載される。対応するマカクアミノ酸配列は配列番号１０に記載される。さらなるレグマインヌクレオチドならびにレグマインタンパク質であると予測されるヌクレオチドは、ウシ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿１７４１０１）、ヒツジ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＤＱ１５２９７４）、カニスファミリアリス(Canis familiaris)（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ＿８５１４８７およびＸＭ＿５３７３５５）、ならびにドブネズミ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０２２２２６）由来のものを含む。「レグマインポリペプチド」は、配列番号２、４、６、８、ならびに１０に記載されるアミノ酸配列等の、哺乳動物（たとえばヒトおよびマウス）のレグマインタンパク質（対立遺伝子変異体を含むが、これに限定されない）ならびにその断片を指す。「レグマインポリヌクレオチド」は、核酸配列１、３、５、７、ならびに９に記載される配列番号等の、哺乳動物（たとえばヒトおよびマウス）のレグマイン核酸（ＲＮＡおよびＤＮＡならびにその対立遺伝子変異体を含むが、これらに限定されない）ならびにその断片を指す。
【００５４】
本発明者らはまた、レグマインおよびＺＢ−１の間に高い相同性が存在し、ＺＢ−１は、レグマインと同様に分泌タンパク質であることを確立した。そのため、本発明は、ＺＢ−１のポリヌクレオチドおよびポリペプチド（たとえば完全長および活性断片のＺＢ−１のポリヌクレオチドおよびポリペプチド）ならびに阻害ＺＢ−１のポリヌクレオチドおよびポリペプチド（たとえば完全長および断片のＺＢ−１の阻害性ポリヌクレオチドおよびポリペプチド）に関する。この新規なタンパク質をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、ヒトＺＢ−１と命名され、配列番号１１に記載される。本発明のポリヌクレオチドはまた、配列番号１１もしくはその相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ／または完全長ヒトＺＢ−１の実質的な生物活性を保持するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチドはまた、少なくとも２１個の連続するヌクレオチドを含む、配列番号１１に記載される配列の連続的な部分を含む。
【００５５】
ヒトＺＢ−１の推定アミノ酸配列は配列番号１２に記載される。本発明のポリペプチドはまた、少なくとも７個の連続するアミノ酸を含む、配列番号１２に記載される配列の連続的な部分を含む。本発明の好ましいポリペプチドは、ヒトＺＢ−１の実質的な生物活性を保持する、配列番号１２に記載される配列の任意の連続的な部分（つまり活性断片）を含む。本発明のポリヌクレオチドはまた、上記に記載されるヒト起源のそれらのポリヌクレオチドに加えて、配列番号１２に記載されるアミノ酸配列またはその連続的な部分をコードし、遺伝子コードのよく知られている縮重によってのみ、上記に記載されるヒト起源のポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチドを含む。
【００５６】
「ＺＢ−１ポリペプチド」は、配列番号１２に記載されるアミノ酸配列等の、哺乳動物（たとえばヒトおよびマウス）のＺＢ−１タンパク質（対立遺伝子変異体を含む）ならびにその断片を指す。「ＺＢ−１ポリヌクレオチド」は、配列番号１１に記載される核酸配列等の、哺乳動物（たとえばヒトおよびマウス）のＺＢ−１核酸（ＲＮＡおよびＤＮＡならびにその対立遺伝子変異体を含む）ならびにその断片を指す。「活性断片」は、レグマインもしくはＺＢ−１のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの生物活性、たとえばアスパラギニルプロテアーゼ／ペプチダーゼ活性を実質的な程度まで保持するレグマインもしくはＺＢ−１のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの部分またはアスパラギニルプロテアーゼ／ペプチダーゼの活性を保持するポリペプチド／ペプチドをコードする部分を指す。当業者は、前述の断片の生物活性を評価するための数種のアッセイを知っているであろう。
【００５７】
本発明のまたは本発明に関する単離ポリヌクレオチドは、開示されたポリヌクレオチドをコードする配列と同一またはそれに類似する配列を有する核酸を同定および単離するためにハイブリダイゼーションプローブおよびプライマーとして使用してもよい。核酸を同定および単離するためのハイブリダイゼーション法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、サザンハイブリダイゼーション、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、およびノーザンハイブリダイゼーションを含み、当業者によく知られている。
【００５８】
ハイブリダイゼーション反応は異なるストリンジェンシー条件下で実行してもよい。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーは、任意の２つの核酸分子を互いにハイブリダイズする困難を伴う。好ましくは、各ハイブリダイズするポリヌクレオチドは、その対応するポリヌクレオチドに、低減されたストリンジェンシー条件、より好ましくはストリンジェントな条件、最も好ましくは高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。ストリンジェンシー条件の例を下記の表１に示す。高ストリンジェントな条件は、少なくともたとえば条件Ａ〜Ｆと同じくらいストリンジェントな条件であり、ストリンジェントな条件は、少なくともたとえば条件Ｇ〜Ｌと同じくらいストリンジェントな条件であり、低減されたストリンジェンシー条件は、少なくともたとえば条件Ｍ〜Ｒと同じくらいストリンジェントな条件である。
【００５９】
【表１】
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１：ハイブリッド長は、ハイブリダイズするポリヌクレオチドのハイブリダイズ領域（複数可）について予期されたハイブリッド長である。未知の配列の標的ポリヌクレオチドにポリヌクレオチドをハイブリダイズする場合、ハイブリッド長は、ハイブリダイズするポリヌクレオチドのハイブリッド長であると見なされる。知られている配列のポリヌクレオチドをハイブリダイズする場合、ハイブリッド長は、ポリヌクレオチドの配列を整列させ、最適な配列相補性の１つまたは複数の領域を同定することによって決定することができる。
２：ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、および１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）は、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液でＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）の代わりに置き換えることができる；ハイブリダイゼーションが完了した後、洗浄を１５分間実行する。
ＴB*−ＴR*：長さが５０未満の塩基対であることが予期されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの５〜１０℃未満の融解温度（Ｔm）とすべきであり、Ｔmは次の式によって決定される。長さが１８塩基対未満のハイブリッドについては、Ｔm（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の＃）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の＃）。長さが１８および４９塩基対の間のハイブリッドについては、Ｔm（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ10Ｎａ+）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）、Ｎはハイブリッド中の塩基の数であり、Ｎａ+はハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度（１ｘＳＳＣのＮａ+＝０．１６５Ｍ）である。
ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのためのストリンジェンシー条件のさらなる例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，第９および１１章ならびにＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，第２．１０および６．３−６．４節に提供され、それらは参照によって本明細書に組み込まれる。
【００６０】
本発明のまたは本発明に関する単離ポリヌクレオチドは、開示されたポリヌクレオチドの対立遺伝子変異体をコードする配列を有するＤＮＡを同定および単離するためにハイブリダイゼーションプローブおよびプライマーとして使用してもよい。対立遺伝子変異体は、開示されたポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドと同一であるまたは著しい類似性を有するポリペプチドをコードする、開示されたポリヌクレオチドの自然発生の代替形態である。好ましくは、対立遺伝子変異体は、開示されたポリヌクレオチドと、少なくとも９０％の配列同一性（より好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性）を有する。あるいは、核酸セグメントが、開示されたポリヌクレオチドに、選択的なハイブリダイゼーション条件（たとえば高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件）下でハイブリダイズする場合、著しい類似性が存在する。前述の変異体は本発明の範囲内に包含される。
【００６１】
本発明のまたは本発明に関する単離ポリヌクレオチドはまた、開示されたポリヌクレオチドに相同のポリペプチドをコードする配列を有するＤＮＡを同定および単離するためにハイブリダイゼーションプローブおよびプライマーとして使用してもよい。これらの相同体は、開示されたポリペプチドおよびポリヌクレオチド以外の異なる種からまたは同じ種内で単離されるが、開示されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドと著しい配列類似性を有するポリヌクレオチドおよびポリペプチドである。好ましくは、ポリヌクレオチド相同体は、高い配列同一性、たとえば少なくとも５０％の配列同一性（より好ましくは少なくとも７５％の同一性、たとえば８０％または８５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９０％の同一性、たとえば９２％、９４％、９６％、９８％、または９９％の同一性）を開示されたポリヌクレオチドと有するのに対して、ポリペプチド相同体は、高い配列同一性、たとえば少なくとも３０％の配列同一性（より好ましくは少なくとも４５％の同一性、たとえば５０％または５５％の同一性、最も好ましくは少なくとも６０％の同一性、たとえば６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性）を開示されたポリペプチドと有する。好ましくは、開示されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドの相同体は哺乳動物種から単離されたものである。前述の相同体は本発明の範囲内に包含される。
【００６２】
２つの配列の間の「相同性」または「配列同一性」の算出は、当技術分野でよく知られている比較法によって実行してもよい。たとえば、同一性に関して、配列を最適な比較目的のために整列させる（たとえば、ギャップを、最適な整列のために、第１のおよび第２のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方に導入することができ、非相同配列を比較目的のために無視することができる）。一実施形態では、比較目的のために整列させた参照配列の長さは、参照配列の少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％  ８０％、９０％、１００％の長さとする。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められる場合、分子はその位置で同一である。２つの配列の間の同一性パーセントは、２つの配列の最適な整列のために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。
【００６３】
配列の比較および２つの配列の間の配列同一性パーセントの決定は数学的アルゴリズムを使用して行ってもよい。一実施形態では、２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）中のＧＡＰプログラム中に組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−５３）のアルゴリズムを使用し、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２行列またはＰＡＭ２５０行列のいずれか、および１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップの重み、および１、２、３、４、５、または６の長さの重みを使用して決定される。他の実施形態では、２つのヌクレオチド配列の間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）中のＧＡＰプログラムを使用し、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列および４０、５０、６０、７０、または８０のギャップの重みおよび１、２、３、４、５、または６の長さの重みを使用して決定される。パラメーターの好ましいセット（および分子が本発明の配列同一性または相同性制限内にあるかどうかを決定するためにどのパラメーターを適用すべきか実施者が不確かな場合使用するはずのもの）は、１２のギャップペナルティ、４のギャップ伸長ペナルティ、および５のフレームシフトギャップペナルティでのＢｌｏｓｓｕｍ  ６２スコア行列である。２つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の間の同一性パーセントはまた、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）中に組み込まれたＭｅｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ４：１１−１７）のアルゴリズムを使用し、ＰＡＭ１２０ウェイト残基表、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティを使用して決定することができる。
【００６４】
本発明のまたは本発明に関する単離ポリヌクレオチドは、本発明のもしくは本発明に関するポリペプチドを発現する細胞および組織ならびにそれらが発現される条件を同定するためにハイブリダイゼーションプローブおよびプライマーとして使用してもよい。
【００６５】
さらに、本発明のまたは本発明に関するポリペプチドの機能は、細胞または生物中で、本発明のまたは本発明に関するポリヌクレオチドに対応する遺伝子の発現を変化させる（つまり増強する、低減する、または修飾する）ために、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用することによって直接試験してもよい。これらの「対応する遺伝子」は、本発明のまたは本発明に関するポリヌクレオチドが由来するｍＲＮＡを産生するために転写される、本発明のまたは本発明に関するゲノムＤＮＡ配列である。
【００６６】
本発明のまたは本発明に関する遺伝子の発現の変化は、本発明のまたは本発明に関する遺伝子から転写されたｍＲＮＡに結合し、かつ／またはそれを切断するアンチセンスポリヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、およびリボザイム等の様々な阻害性ポリヌクレオチドの使用を通して、細胞または生物中で達成され得る。（たとえばＧａｌｄｅｒｉｓｉら（１９９９）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１８１：２５１−５７；Ｓｉｏｕｄ（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１：５７５−８８を参照されたい）。レグマインおよび／またはＺＢ−１に対する阻害性ポリヌクレオチドは、有用なアスパラギニルペプチダーゼアンタゴニストである可能性があり、そのため、その阻害性ポリヌクレオチドはまた、レグマインおよび／またはＺＢ−１関連性の障害、たとえば血管障害および炎症性障害（たとえばアテローム性動脈硬化および関節炎）を治療し、寛解させ、および／または予防するのに有用である可能性がある。阻害性ポリヌクレオチドはまたアプタマー（つまりタンパク質に結合し、タンパク質活性、たとえばヒトレグマインおよび／またはＺＢ−１の活性を調節するポリヌクレオチド）からなってもよい。アプタマーは文献の至る所で記載される（たとえばＮｉｍｊｅｅら（２００５）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５６：５５５−８３；Ｐａｔｅｌ（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：３２−４６；Ｐｅｎｄｅｒｇｒａｓｔら（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｔｅｃｈ．１６：２２４−３４；Ｐｒｏｓｋｅら（２００５）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６９：３６７−７４；ＢｌａｎｋおよびＢｌｉｎｄ（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９：３３６−４２；Ｔｏｍｂｅｌｌｉら（２００５）Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．２０（１２）：２４２４−３４；ならびにＤｉ  Ｇｕｓｔｏら（２００６）Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．７（３）：５３５−４４）。
【００６７】
本発明に関するアンチセンスポリヌクレオチドまたはリボザイムは、本発明のもしくは本発明に関する遺伝子の全コーディング鎖またはその部分のみに相補的であってもよい。あるいは、アンチセンスポリヌクレオチドまたはリボザイムは、本発明のまたは本発明に関する遺伝子のコーディング鎖の非コーディング領域に相補的であってもよい。アンチセンスポリヌクレオチドまたはリボザイムは、当技術分野でよく知られている手順を使用して、化学合成および酵素によるライゲーション反応を使用して構築することができる。化学的に合成されたポリヌクレオチドのヌクレオシド連結は、ヌクレアーゼ媒介性の分解に抵抗するそれらの能力を増強するためにおよびそれらの配列特異性を増加させるために修飾することができる。前述の連結修飾は、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート（phosphoroamidate）、ボラノホスフェート（boranophosphate）、モルホリノ、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）の連結を含むが、これらに限定されない（Ｇａｌｄｅｒｉｓｉら、前掲，Ｈｅａｓｍａｎ（２００２）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２４３：２０９−１４；Ｍｉｃｋｌｅｆｉｅｌｄ（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８：１１５７−７９）。あるいは、これらの分子は、本発明のまたは本発明に関するポリヌクレオチドをアンチセンス（つまり逆）の方向づけでサブクローニングした発現ベクターを使用して生物学的に産生することができる。
【００６８】
本発明の阻害性ポリヌクレオチドはまた、高い特異性および親和性で、二重鎖ＤＮＡの主溝中で結合する三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）を含む（ＫｎａｕｅｒｔおよびＧｌａｚｅｒ（２００１）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１０：２２４３−５１）。本発明のまたは本発明に関する遺伝子の発現は、遺伝子の転写を予防する三重らせん構造を形成するように遺伝子の調節領域（つまりプロモーター配列および／またはエンハンサー配列）に相補的なＴＦＯを標的に向けることにより阻害することができる。
【００６９】
本発明の一実施形態では、本発明の阻害性ポリヌクレオチドは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子である。これらのｓｉＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡの配列特異的分解を引き起こす、短い（好ましくは１９〜２５個のヌクレオチド、最も好ましくは１９または２１個のヌクレオチド）二本鎖ＲＮＡ分子である。この分解はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られている（たとえばＢａｓｓ（２００１）Ｎａｔｕｒｅ４１１：４２８−２９）。ＲＮＡｉは、下等生物で初め同定されたが、哺乳動物細胞に有効に適用され、Ｆａｓ  ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子で治療されたマウスで劇症肝炎を予防することが最近示された（Ｓｏｎｇら（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．９：３４７−５１）。加えて、鞘内に送達されたｓｉＲＮＡは、ラットの２つのモデル（アゴニスト誘発性疼痛モデルおよび神経障害性疼痛モデル）で疼痛応答をブロックすることが最近報告された（Ｄｏｒｎら（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２（５）：ｅ４９）。
【００７０】
本発明のｓｉＲＮＡ分子は、２つの相補的一本鎖ＲＮＡ分子を一緒にアニールすることにより（そのうちの一方は標的ｍＲＮＡの部分とマッチする）（Ｆｉｒｅら、米国特許第６，５０６，５５９号）またはそれ自体の上に折り返して、必要な二本鎖部分を産生する単一ヘアピンＲＮＡ分子の使用を通して（Ｙｕら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９９：６０４７−５２）生成してもよい。ｓｉＲＮＡ分子は化学的に合成してもよい（Ｅｌｂａｓｈｉｒら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ４１１：４９４−９８）または一本鎖ＤＮＡ鋳型を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって産生してもよい（Ｙｕら、前掲）。あるいは、ｓｉＲＮＡ分子は、一過性に（Ｙｕら、前掲；Ｓｕｉら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９９：５５１５−２０）または安定して（Ｐａｄｄｉｓｏｎら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９９：１４４３−４８；Ｃｕｌｌｅｎ（２００６）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ１３：５０３−０８）、センスおよびアンチセンスｓｉＲＮＡ配列を含有する発現ベクター（複数可）を使用して生物学的に産生することができる。最近、効率的で配列特異的な様式での、初代ヒト細胞中の標的ｍＲＮＡのレベルの低下が、さらにプロセシングを受けてｓｉＲＮＡとなるヘアピンＲＮＡを発現するアデノウイルスベクターを使用して実証された（Ａｒｔｓら（２００３）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１３：２３２５−３２）。
【００７１】
本発明のまたは本発明に関するポリヌクレオチドを標的として向けられるｓｉＲＮＡ分子は、当技術分野でよく知られている基準に基づいて設計することができる（たとえばＥｌｂａｓｈｉｒら（２００１）ＥＭＢＯ  Ｊ．２０：６８７７−８８；Ａｒｏｎｉｎ（２００６）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １３：５０９−１６）。たとえば、標的ｍＲＮＡの標的セグメントは、好ましくは、ＡＡ（最も好ましい）、ＴＡ、ＧＡ、またはＣＡで始まるべきであり、ｓｉＲＮＡ分子のＧＣ比は好ましくは４５〜５５％とすべきであり、ｓｉＲＮＡ分子は好ましくは連続して３つの同じヌクレオチドを含有するべきでなく、ｓｉＲＮＡ分子は好ましくは連続して７つの混合Ｇ／Ｃを含有するべきでなく、標的セグメントは好ましくは標的ｍＲＮＡのＯＲＦ領域にあるべきであり、好ましくは開始ＡＴＧの後に少なくとも７５ｂｐおよび停止コドンの前に少なくとも７５ｂｐとすべきである。これらの基準または他の知られている基準に基づいて（たとえばＲｅｙｎｏｌｄｓら（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２２：３２６−３０）、本発明のまたは本発明に関するｍＲＮＡのポリヌクレオチドを標的とする、本発明に関するｓｉＲＮＡ分子が当業者によって設計されてもよい。
【００７２】
生物中での、本発明のまたは本発明に関する遺伝子の発現の変化はまた、本発明のまたは本発明に関するポリヌクレオチドがゲノムに導入された非ヒトトランスジェニック動物の創造を通して達成され得る。前述のトランスジェニック動物は、本発明の遺伝子（つまり導入遺伝子）の複数のコピーを有する動物を含む。組織特異的調節配列（複数可）を、特定の細胞または特定の発達段階に対する本発明のまたは本発明に関するポリペプチドの直接的な発現のために導入遺伝子に作動可能に連結させてもよい。胚操作およびマイクロインジェクションを介してのトランスジェニック動物、特にマウス等の動物を生成する方法は、従来のものであり、当技術分野でよく知られている（たとえばＢｏｃｋａｍｐら（２００２）Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ１１：１１５−３２）。
【００７３】
生物中での、本発明のまたは本発明に関する遺伝子の発現の変化はまた、外来性ポリヌクレオチド配列の挿入を通して本発明のまたは本発明に関するポリヌクレオチドに対応する内因性遺伝子が破壊された動物（つまりノックアウト動物）の創造を通して達成され得る。内因性遺伝子のコーディング領域を破壊し、それによって、非機能性タンパク質を生成してもよい。あるいは、内因性遺伝子の上流の調節領域を、破壊しまたは異なる調節エレメントと交換し、なお機能的なタンパク質の発現の変化をもたらしてもよい。ノックアウト動物を生成する方法は、相同組換えを含み、当技術分野でよく知られている（たとえばＷｏｌｆｅｒら（２００２）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：３３６−４０）。
【００７４】
本発明のまたは本発明に関する単離ポリヌクレオチドはまた、発現制御配列に作動可能に連結させてもよいならびに／または本発明のもしくは本発明に関するポリペプチド（その活性断片および／もしくは融合ポリペプチドを含む）の組換え生成のために発現ベクター中にライゲーションされてもよい。組換えタンパク質を発現する一般的な方法は当技術分野でよく知られている。
【００７５】
発現ベクターは、本明細書に使用されるように、そのベクターに連結された他の核酸を輸送することができる核酸分子を指すことが意図される。ベクターのうちの一種は、さらなるＤＮＡセグメントがライゲーションされてもよい環状二本鎖ＤＮＡループを指すプラスミドである。他の種類のベクターは、ウイルスベクターであり、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノム中にライゲーションされてもよい。ある種のベクターは、導入される宿主細胞中での自律複製が可能である（たとえば細菌の複製開始点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（たとえば非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入に際して宿主細胞のゲノム中に統合することができ、それによって、宿主ゲノムと共に複製される。そのうえ、ある種のベクターは、それらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指示することができる。前述のベクターは、組換え発現ベクター（単に発現ベクター）と本明細書で称される。一般に、組換ＤＮＡ技術で有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。本明細書では、プラスミドが最も一般に使用される形態のベクターであるので、プラスミドおよびベクターは区別なく使用してもよい。しかしながら、本発明は、等価な機能を果たすウイルスベクター（たとえば複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）等の発現ベクターの他の形態を含むことが意図される。
【００７６】
一実施形態では、本発明のまたは本発明に関するポリヌクレオチドは、組換えレグマインおよび／またはＺＢ−１のアンタゴニストを作り出すために使用される。レグマインアンタゴニストの例は、酵素的に不活性なレグマイン（ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）およびその酵素的に不活性な断片を含む。ＺＢ−１アンタゴニストの例は、酵素的に不活性なＺＢ−１（ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）およびその酵素的に不活性な断片を含む。酵素的に不活性なレグマインおよび／またはＺＢ−１は、Ｎ末端および／またはＣ末端プロペプチド（たとえばアミノ酸位置２１または２５に対してＮ末端の配列および／またはアミノ酸位置３２３に対してＣ末端の配列）のすべてまたは部分を含有する分子を含む。前述のアンタゴニストは、アスパラギニルプロテアーゼ活性を調節するのにならびに結果的に、アスパラギニル結合加水分解を減少させることが望ましいアテローム性動脈硬化または他の血管障害および炎症性障害の治療で有用である可能性がある。他の実施形態では、本発明のまたは本発明に関するポリヌクレオチドは、他のレグマインおよびＺＢ−１のアンタゴニスト、たとえばレグマインおよび／またはＺＢ−１の阻害性ポリヌクレオチド、レグマインおよび／またはＺＢ−１の阻害性ポリペプチド（その断片および融合タンパク質を含む）、アンタゴニスト抗レグマイン抗体およびその断片、アンタゴニスト抗ＺＢ−１抗体およびその断片、ならびにアンタゴニスト低分子を作り出すために使用される。
【００７７】
融合ポリペプチド、つまり第２のポリペプチド部分と連結された第１のポリペプチド部分を作り出す方法は当技術分野でよく知られている。たとえば、レグマインおよび／またはＺＢ−１のポリペプチドは、第２のポリペプチド部分、たとえば免疫グロブリンまたはその断片（たとえばＦｃ断片）に融合されてもよい。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド部分は、たとえば完全長ヒトレグマインまたはＺＢ−１のポリペプチドを含む。あるいは、第１のポリペプチドは、完全長レグマインまたはＺＢ−１のポリペプチドに満たないもの（たとえばレグマインまたはＺＢ−１の基質結合ドメイン）を含んでいてもよい。さらに、レグマインまたはＺＢ−１の可溶性形態は、免疫グロブリンのＦｃ部分に「リンカー」配列を通して融合されてもよい。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、Ｌｅｘ−Ａ、チオレドキシン（ＴＲＸ）、またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）を有するもの等の他の融合タンパク質もまた使用してもよい。
【００７８】
第２のポリペプチド部分は好ましくは可溶性である。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチド部分は、連結されたポリペプチドの半減期（たとえば血清半減期）を増強する。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチド部分は、レグマインまたはＺＢ−１ポリペプチドとの融合ポリペプチドの結合を容易にする配列を含む。一実施形態では、第２のポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドの少なくとも１つの領域を含む。免疫グロブリン融合ポリペプチドは当技術分野で知られており、たとえば米国特許第５，５１６，９６４号；第５，２２５，５３８号；第５，４２８，１３０号；第５，５１４，５８２号；第５，７１４，１４７号；および第５，４５５，１６５号に記載され、これらのすべては、それらの全体が本明細書に参照によってこれによって組み込まれる。融合タンパク質は、第１のポリペプチド部分、たとえばその断片を含むヒトレグマインまたはＺＢ−１を第２の部分に結びつけるリンカー配列をさらに含んでいてもよい。前述のリンカー配列の使用は当技術分野でよく知られている。たとえば、融合タンパク質は、ペプチドリンカー、たとえば、長さが約２〜２０個、より好ましくは１０個未満のアミノ酸のペプチドリンカーを含むことができる。一実施形態では、ペプチドリンカーは長が２個のアミノ酸であってもよい。他の実施形態では、本発明のまたは本発明に関する融合タンパク質は、２個を超えるポリペプチド部分を含む、たとえば、３部分よりなる融合タンパク質は、２個のレグマインポリペプチド（もしくはその断片）、２個のＺＢ−１ポリペプチド（もしくはその断片）、またはその組合せの結合を容易にする第３のポリペプチド部分によって連結された２個のレグマインポリペプチド（もしくはその断片）、２個のＺＢ−１ポリペプチド（もしくはその断片）、またはその組合せを含んでいてもよい。
【００７９】
他の実施形態では、組換えタンパク質は、そのＮ末端に、異種シグナル配列（つまりレグマインまたはＺＢ−１のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド中に存在しないポリペプチド配列）を含む。たとえば、他のタンパク質由来のシグナル配列は、その断片および／または融合タンパク質を含むレグマインまたはＺＢ−１のポリペプチドと融合されてもよい。ある種の宿主細胞（たとえば哺乳動物宿主細胞）では、組換えタンパク質の発現および／または分泌は、異種シグナル配列の使用を通して増加させることができる。融合タンパク質に含まれていてもよいシグナルペプチドは配列：ＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ（配列番号１３）を有するメリチンシグナルペプチドである。
【００８０】
本発明の融合タンパク質は標準の組換えＤＮＡ技術によって産生してもよい。たとえば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片は、たとえば、ライゲーションのために平滑末端化したまたは粘着末端化した末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、付着末端を適宜フィルインすること、望ましくない結びつきを回避するためのアルカリホスファターゼ処置、および酵素によるライゲーションを利用することによって従来の技術に従ってインフレームに一緒にライゲーションされる。他の実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置を含む従来の技術によって合成することができる。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、続いてアニールし、再増幅して、キメラ遺伝子配列を生成することができる２つの連続する遺伝子断片の間に相補的オーバーハングを生じるアンカープライマーを使用して行ってもよい（たとえばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら（編），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９２を参照されたい）そのうえ、融合部分（たとえば免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域）をコードする多くの発現ベクターが市販されている。レグマインコードまたはＺＢ−１コード核酸は、融合部分が免疫グロブリンタンパク質にインフレームで連結されるように前述の発現ベクター中にクローニングしてもよい。
【００８１】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中のベクターの複製を調節する配列（たとえば複製開始点）および選択マーカー遺伝子等のさらなる配列を保有していてもよい。選択マーカー遺伝子はベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする。たとえば、典型的に、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に、Ｇ４１８、ヒグロマイシン、またはメトトレキサート等の薬剤に対する抵抗性を付与する。好ましい選択マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅でのｄｈｆｒ宿主細胞中での使用のため）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）を含む。
【００８２】
プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、および他の配列、たとえば宿主細胞（たとえば複製開始点）中でベクターの複製を調節する配列を適宜含む適切な調節配列を含有する適したベクターを選ぶまたは構築することができる。ベクターは、適宜、プラスミドまたはウイルス性のもの、たとえばファージまたはファージミドであってもよい。さらなる詳細については、たとえばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：第２版，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照されたい。たとえば核酸構築物の調製、突然変異誘発、配列決定、細胞中へのＤＮＡの導入および遺伝子発現、ならびにタンパク質の分析での、核酸の操作のための多くの知られている技術およびプロトコールは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版，Ａｕｓｕｂｅｌら（編）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９２に詳細に記載される。
【００８３】
本発明のさらなる態様は、本明細書に開示される核酸を含む宿主細胞を提供する。他の態様は、宿主細胞中に前述の核酸を導入することを含む方法を提供する。導入は、任意の入手可能な技術を利用してもよい。真核細胞については、適した技術は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介性トランスフェクション、およびレトロウイルスもしくは他のウイルス、たとえばワクシニアウイルスまたは昆虫細胞についてはバキュロウイルスを使用する形質導入を含んでいてもよい。細菌細胞については、適した技術は、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション、およびバクテリオファージを使用するトランスフェクションを含んでいてもよい。導入の後に、たとえば、遺伝子の発現のための条件下での宿主細胞の培養により、核酸からの発現を引き起こすまたはそれを可能にしてもよい。
【００８４】
多くの細胞系は、本発明のまたは本発明に関するポリペプチドの組換え発現に適した宿主細胞として働いてもよい。哺乳動物宿主細胞系は、たとえば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３−Ｌ１、２９３細胞、Ａ４３１細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ−Ｉ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＨＬ−６０細胞、Ｕ９３７細胞、ＨａＫ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＴＨＰ−１細胞、ならびに初代組織および初代移植片のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物に由来する細胞株を含む。
【００８５】
あるいは、酵母等の下等真核生物または原核生物中で本発明のまたは本発明に関するポリペプチドを組換えで産生することが可能かもしれない。潜在的に適した酵母株は、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）、クルイベロミセス株、およびカンジダ株を含む。潜在的に適した細菌株は大腸菌、枯草菌、およびネズミチフス菌を含む。本発明のまたは本発明に関するポリペプチドが酵母または細菌で作製される場合、機能性を得るためにたとえば適切な部位のリン酸化またはグリコシル化によってそれらを修飾することが必要であるかもしれない。前述の共有結合は、よく知られている化学法または酵素法を使用して行うことができる。
【００８６】
細菌中での発現は、組換えタンパク質を組み込んだ封入体の形成をもたらしてもよい。したがって、組換えタンパク質の再折りたたみは活性なまたはより活性な物質を産生するために必要とされ得る。細菌の封入体から、正確に折りたたまれた異種タンパク質を得る数種の方法が当技術分野で知られている。これらの方法は、一般に、封入体由来のタンパク質を可溶性にし、次いで、カオトロピック剤を使用して、完全に、タンパク質を変性させることを含む。システイン残基がタンパク質の一次アミノ酸配列中に存在する場合、ジスルフィド結合の正確な形成を可能にする環境（レドックス系）での再折りたたみを成し遂げることが必要であることが多い。再折りたたみの一般的な方法はたとえばＫｏｈｎｏ（１９９０）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：１８７−９５に開示される。他の適切な方法は、たとえば欧州特許第０４３３２２５号および米国特許第５，３９９，６７７号に開示される。
【００８７】
本発明のまたは本発明に関するポリペプチドはまた、本発明の単離ポリヌクレオチドをバキュロウイルスベクター等の１つまたは複数の昆虫発現ベクター中で適した制御配列に作動可能に連結させることおよび昆虫細胞発現系を利用することによって組換えで産生してもよい。材料およびバキュロウイルス／Ｓｆ９発現系のための方法はキットの形態で市販されている（たとえばＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣ（登録商標）キットおよびＭＡＸＢＡＣ（登録商標）キット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバッド、ＣＡ）。
【００８８】
適切な宿主細胞中での組換え発現の後で、本発明の組換えポリペプチドは、次いで、免疫沈降、ゲル濾過、およびイオン交換クロマトグラフィー等の知られている精製プロセスを使用して細胞抽出物から精製してもよい。たとえば、レグマインおよび／またはＺＢ−１のポリペプチドの膜結合形態は、発現細胞から全膜画分を調製することおよびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００等の非イオン性界面活性剤で膜を抽出することによって精製してもよい。本発明のまたは本発明に関するポリペプチドは、市販のタンパク質濃縮フィルター、たとえばＡＭＩＣＯＮ（登録商標）または、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製ＰＥＬＬＩＣＯＮ（登録商標）限外濾過ユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ビレリカ、ＭＡ）を使用して濃縮してもよい。濃縮工程の後で、その濃縮物は、ゲル濾過培地等の精製マトリックスにかけることができる。あるいは、陰イオン交換樹脂、たとえばペンダントジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基またはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）基を有するマトリックスまたは基質を利用することができる。マトリックスは、タンパク質精製で一般に利用されるアクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、または他の種類とすることができる。あるいは、陽イオン交換工程を利用することができる。適した陽イオン交換体は、スルホプロピル基またはカルボキシメチル基を含む様々な不溶性マトリックスを含む。スルホプロピル基が好ましい（たとえばＳ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）カラム、シグマアルドリッチ社、セントルイス、ＭＯ）。培養上清からの組換えタンパク質の精製はまた、コンカナバリンＡアガロース、ヘパリン−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）（東洋曹達工業株式会社、日本）、もしくはＣｉｂａｃｒｏｍブルー３ＧＡＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、サンフランシスコ、Ｃａ）のような親和性樹脂に対する；またはフェニルエーテル、ブチルエーテル、もしくはプロピルエーテルのような樹脂を使用する疎水性相互作用クロマトグラフィーによる；または免疫親和性クロマトグラフィーによる１つまたは複数のカラム工程を含んでいてもよい。最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ培地、たとえばペンダントメチル基または他の脂肪族基を有するシリカゲルを利用する１つまたは複数の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程を、組換えタンパク質をさらに精製するために利用することができる。組換えタンパク質に対する抗体（たとえば本明細書での方法を使用する、記載されたもの）を含む親和性カラムはまた、知られている方法に従って精製で使用してもよい。様々な組合せのまたは他の知られている方法を有する、上述の精製工程のいくつかまたはすべてはまた、実質的に精製された単離組換えタンパク質を提供するために利用してもよい。好ましくは、単離組換えタンパク質は、他の哺乳動物タンパク質が実質的にないように精製される。さらに、これらの精製プロセスはまた、天然源を含む他の源から本発明のポリペプチドを精製するために使用してもよい。たとえば、トランスジェニック動物の産物として、たとえば、トランスジェニック動物、たとえばトランスジェニックの雌ウシ、ヤギ、ブタ、またはヒツジのミルク��成分として発現する本発明のまたは本発明に関するポリペプチド、たとえばマウスおよびヒトのレグマインおよびＺＢ−１（完全長または断片のレグマインまたはＺＢ−１およびその融合体）は上記に記載されるように精製してもよい。
【００８９】
あるいは、ポリペプチドはまた、精製を容易にする形態で組換えで発現させてもよい。たとえば、ポリペプチドは、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはチオレドキシン（ＴＲＸ）等のタンパク質を有する融合体として発現させてもよい。前述の融合タンパク質の発現および精製のためのキットは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社（ビバリー、ＭＡ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社（ピスカタウェイ、ＮＪ）、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社からそれぞれ市販されている。組換えタンパク質はまた、小さなエピトープでタグをつけ、続いて、エピトープに対する特異的抗体を使用して同定するまたは精製することができる。好ましいエピトープは、Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ社（ニューヘブン、ＣＴ）から市販されているＦＬＡＧエピトープである。
【００９０】
レグマインおよび／またはＺＢ−１のアンタゴニストを含む本発明のまたは本発明に関するポリペプチドはまた、知られている従来の化学合成によって産生してもよい。前述のポリペプチドを化学的に合成する方法は当業者によく知られている。前述の化学的合成ポリペプチドは、天然精製ポリペプチドと共通した生物学的特性を持っていてもよく、したがって、生物学的に活性なまたは免疫学的な代用物として天然ポリペプチドの代わりに利用してもよい。
【００９１】
レグマインおよび／またはＺＢ−１のアンタゴニストを含む本発明のまたは本発明に関するポリペプチドはまた、開示されたポリペプチドと構造的に異なる（たとえばわずかに変化した配列を有する）が、開示されたポリペプチドと同じ生化学的特性を実質的に有する（たとえば、機能的に非必須のアミノ酸残基でのみ変化している）分子を包含する。前述の分子は、自然発生の対立遺伝子変異体および変化、置換、交換、挿入、または欠失を含有する故意に操作された変異体を含む。前述の変化、置換、交換、挿入、または欠失のための技術は当業者によく知られている。いくつかの実施形態では、ポリペプチド部分は、タンパク質分解に対してより抵抗性の配列をもたらす（非突然変異配列と比較して）、自然発生の配列（野生型）中の突然変異を有する変異体ポリペプチドとして提供される。
【００９２】
レグマインおよびＺＢ−１のいくつかのアミノ酸配列は、レグマインまたはＺＢ−１の構造または機能を著しく修飾することなく変えることができる。特定の構造または機能を保持するために、置換残基が類似する機能を実行するという条件で、レグマインまたはＺＢ−１のタンパク質三次構造を形成する残基を交換することは可能である。他の事例では、変化が重要ではないエリアで生じる場合、残基の種類は全く無関係である可能性がある。したがって、本発明はレグマインまたはＺＢ−１の変異体をさらに含む。前述の変異体は、欠失、挿入、逆位、繰り返し、および種類の置換を含む（たとえば、ある親水性残基を他の親水性残基の代わりに置き換えるが、強い親水性残基を強い疎水性残基の代わりに置き換えない）。小さな変化または「中性」アミノ酸置換は、タンパク質機能に影響をほとんど及ぼさないことが多いであろう（Ｔａｙｌｏｒ（１９８６）Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．１１９：２０５−１８）。保存的置換は、脂肪族アミノ酸の間での交換、酸性残基の交換、アミド残基の間の置換、塩基性残基の交換、および芳香族残基の間での交換を含んでいてもよいが、これらに限定されない。どのアミノ酸変化が、おそらく、表現型的にサイレントであるかまたはノイジーであるかに関するさらなるガイダンスは、Ｂｏｗｉｅら（（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７：１３０６−１０）およびＺｖｅｌｅｂｉｌら（（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９５：９５７−６１）に見つけることができる。したがって、レグマインおよび／またはＺＢ−１のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、自然発生であってもよいまたは基質特異性および酵素活性を変化させることなく様々な残基を変化させることにより産生してもよい。あるいは、当業者は、開示されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列を使用して、変化した基質特異性および酵素活性を有するレグマインおよび／またはＺＢ−１のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを産生することができると思われる。
【００９３】
哺乳動物レグマインは、高度に保存されており、ｐｆａｍ０１６５０．１２「ペプチダーゼ＿Ｃ１３」保存ドメインを含有し、これは、異なる基質特異性、基質親和性、および酵素活性を示す組換えレグマインおよびＺＢ−１のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを設計および構築するためにガイドとして使用してもよい。たとえば、Ｃｈｅｎら（（２０００）前掲）は、活性部位システイン、つまり残基Ｃｙｓ（１８９）を突然変異させることにより不活性なレグマインを産生してもよいということを報告している。加えて、哺乳動物レグマインは、活性化を誘発するために、プロペプチドのＣおよびＮ末端プロセシングの両方を受ける（同上；Ｌｉら、前掲）。不活性レグマインは、Ｃ末端切断部位、つまりＡｓｎ（３２３）をアスパラギン酸、セリン、アラニン、またはグルタミン酸等の様々な残基で単に交換することにより産生してもよいことが示された（Ｃｈｅｎら（２０００）前掲）。さらに、レグマイン活性は、たとえばアラニン交換を介して、Ｎ末端切断部位、つまりＡｓｐ（２１）またはＡｓｐ（２５）を突然変異させることにより低下させてもよい（Ｌｉら、前掲）。したがって、本明細書に使用されるように、「レグマイン」および「ＺＢ−１」は、これらのおよび他の誘導体ならびに変異体ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの配列をさらに指す。前述の誘導体および変異体は当業者の範囲および知識内にあると考えられる。
【００９４】
レグマインならびに／またはＺＢ−１のポリペプチド、その断片、ならびに／または融合ポリペプチド、その組換えならびに／または天然形態、その変異体ならびに／または自然発生形態は、さらに本明細書に記載されるように、レグマインおよび／もしくはＺＢ−１に結合することができるならびに／またはレグマインおよび／もしくはＺＢ−１の活性を調節することができる作用物質（たとえば他のレグマインならびに／またはＺＢ−１のアンタゴニスト、たとえば抗レグマイン抗体）をスクリーニングするために使用してもよい。固定化されたまたはされていない所望の結合タンパク質を用いる結合アッセイは当技術分野でよく知られており、本発明のレグマインおよび／またはＺＢ−１のアンタゴニストを含む本発明のまたは本発明に関するポリペプチド、たとえばレグマインのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを用いて本目的のために使用してもよい。精製された細胞ベースまたはタンパク質ベース（無細胞）のスクリーニングアッセイは前述の作用物質を同定するために使用してもよい。たとえば、レグマインおよび／またはＺＢ−１のポリペプチドは担体上に精製形態で固定化してもよく、精製レグマインおよび／またはＺＢ−１に対する可能性のある基質／リガンド／アンタゴニストの結合を測定してもよい。
【００９５】
抗体
他の実施形態では、本発明は、レグマインおよび／もしくはＺＢ−１ならびに／またはその断片、好ましくは哺乳動物（たとえばヒトまたはマウス）のレグマインならびに／またはＺＢ−１に特異的に結合する抗体ならびにその抗体断片、つまり完全抗体ならびにその抗原結合断片としての、レグマインならびに／またはＺＢ−１のアンタゴニストを提供する。一実施形態では、抗体は阻害抗体である、つまり、それらは、少なくとも１つのレグマインおよび／またはＺＢ−１の活性（たとえばアスパラギニル結合の加水分解）を阻害しまたは低下させ、レグマインおよび／またはＺＢ−１関連性の障害、たとえば血管障害および／または炎症性障害を診断する、予後を判定する、監視する、治療し、寛解させ、および／また予防するのに有用であってもよい。さらに、本発明は、レグマインおよび／またはＺＢ−１に対して特異的に結合する（それぞれまたは同時に、終始適宜）が、レグマインおよび／またはＺＢ−１の活性を阻害しない抗レグマイン抗体および抗ＺＢ−１抗体を提供する（つまり検出抗体）。前述の抗体は、たとえば、レグマインおよび／またはＺＢ−１関連性の障害、たとえば血管障害および／または炎症性障害を診断する、予後を判定する、および／または監視するためのキットの一部として、たとえばレグマインまたはＺＢ−１のタンパク質の存在を検出するために使用してもよい。一実施形態では、抗体は、レグマイン、好ましくは哺乳動物レグマイン、より好ましくはヒトレグマインに向けられる。他の実施形態では、抗体は、ＺＢ−１、好ましくは哺乳動物ＺＢ−１、より好ましくはヒトＺＢ−１に向けられる。他の実施形態では、抗体はモノクローナル抗体または単一特異性抗体である。抗体はまた、たとえばヒトもしくはマウスのレグマインおよび／またはヒトもしくはマウスのＺＢ−１に対するヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成抗体であってもよい。
【００９６】
当業者は、本明細書に使用されるように、用語「抗体」が、少なくとも１個、好ましくは２個の重（Ｈ）鎖可変領域（ＶＨとして本明細書に略される）および少なくとも１個、好ましくは２個の軽（Ｌ）鎖可変領域（ＶＬとして本明細書に略される）を含むタンパク質を指すことを認識するであろう。抗体は、重および軽鎖定常領域をさらに含み、それによって重および軽免疫グロブリン鎖をそれぞれ形成してもよい。一実施形態では、抗体は、２個の重免疫グロブリン鎖および２個の軽免疫グロブリン鎖のテトラマーであり、重および軽免疫グロブリン鎖はたとえばジスルフィド結合によって相互連結される。
【００９７】
本明細書に使用される、たとえば抗体の「抗原結合断片」は（または単に「抗体部分」または「断片」）は、たとえば、抗原に特異的に結合するための能力を保持する、完全長抗体の１つまたは複数の断片を指す。抗体の「抗原結合断片」という用語内に包含された結合断片の例は、次のものを含むが、これらに限定されない：（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２個のＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）2断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片；ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）。さらにＦｖ断片の２個のドメインであるＶＬおよびＶＨは個々の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え法を使用して、単一のタンパク質鎖としてそれらの産生を可能にする合成リンカーによって結合してもよく、ＶＬおよびＶＨ領域は対になって、一価分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている）を形成する。前述の単鎖抗体はまた、用語「抗原結合断片」内に包含されることが意図される。これらの抗体断片または抗原結合断片は当業者に知られている従来の技術を使用して得られ、断片は、完全抗体と同じ様式で有用性についてスクリーニングされる。
【００９８】
いくつかの実施形態では、本発明は単一ドメイン抗体を提供する。単一ドメイン抗体は、そのＣＤＲが単一ドメインポリペプチドの一部である抗体を含むことができる。例として、重鎖抗体、軽鎖が自然に欠けている抗体、従来の４鎖抗体に由来する単一ドメイン抗体、操作された抗体、および抗体に由来するもの以外の単一ドメイン骨格を含むが、これらに限定されない。単一ドメイン抗体は、当技術分野で知られているもののいずれかまたは任意の今後の単一ドメイン抗体であってもよい。単一ドメイン抗体は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤギ、ウサギ、ウシを含むがこれらに限定されない任意の種に由来してもよい。本発明の一態様によれば、本明細書に使用される単一ドメイン抗体は、軽鎖が欠けている重鎖抗体として知られている自然発生の単一ドメイン抗体である。前述の単一ドメイン抗体はたとえば国際公開第９４／０４６７８号に開示される。軽鎖が自然に欠けている重鎖抗体に由来するこの可変ドメインは、その可変ドメインと４鎖免疫グロブリンの従来のＶＨを区別するためにＶＨＨまたはナノボディとして本明細書で見分けられる。前述のＶＨＨ分子は、ラクダ科の種で、たとえばラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカ、およびグアナコで産生された抗体に由来し得る。ラクダ科に加えた他の種が、軽鎖が自然に欠けている重鎖抗体を産生する可能性があり、前述のＶＨＨ分子は本発明の範囲内にある。
【００９９】
本発明のまたは本発明に関するポリペプチドに対する抗体分子、たとえばレグマインおよび／またはＺＢ−１に対する抗体は当業者によく知られている方法によって産生してもよい。本発明のレグマインおよび／またはＺＢ−１のタンパク質はまた、レグマインおよび／またはＺＢ−１のタンパク質と反応し、レグマインおよび／またはＺＢ−１との基質の相互作用を阻害する可能性があるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を得るために動物を免疫するために使用してもよい。本発明の完全長ポリペプチドは免疫原として使用してもよいまたはあるいは、ポリペプチドの抗原ペプチド断片を使用してもよい。本発明のポリペプチドの抗原ペプチドは、少なくとも７個の連続的なアミノ酸残基を含み、ペプチドに対して産生された抗体がポリペプチドと特異的免疫複合体を形成するようエピトープを包含する。好ましくは、抗原ペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも１５個のアミノ酸残基、さらに好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸残基、および最も好ましくは少なくとも３０個のアミノ酸残基を含む。
【０１００】
抗体を産生するための手順のさらなる改善では、臨床的に関係のあるエピトープを免疫原上で同定するための方法および関係のあるエピトープに高い親和性で免疫特異的に結合する抗体を選択するための相関的な方法は、たとえば米国特許公開第２００２／００２９３９１号に開示され、その全体が本明細書に参照によってこれによって組み込まれる。脂質アスパラギニルペプチダーゼおよび他のシステインペプチダーゼを標的とするのに一般に有用な例示的なエピトープは、ＣｏｌｅｍａｎおよびＬｅｅ（２００４）前掲に論じられる。
【０１０１】
モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ技術の、当業者に知られている他の方法によって生成してもよい。モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマの調製の代替として、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、本発明のまたは本発明に関するポリペプチド（たとえばマウスおよびヒトのレグマインおよび／またはＺＢ−１ならびにその断片）を用いた、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（たとえば抗体ファージディスプレイライブラリー）のスクリーニングによって単離し、同定して、それによって本発明のまたは本発明に関するポリペプチドに結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離してもよい。「コンビナトリアル抗体ディスプレイ」法は、よく知られており、特定の抗原特異性を有する抗体断片を同定し、単離するために開発されたものであり、モノクローナル抗体を産生するために用いることができる。
【０１０２】
ポリクローナル血清およびポリクローナル抗体は、本発明のまたは本発明に関するポリペプチドで適した被検体を免疫して産生してもよい。免疫された被検体中の抗体価は長い間にわたって監視してもよく、本発明のポリペプチドに対して向けられた抗体分子は、被検体または培養培地から単離され、よく知られている技術によってさらに精製してもよい。
【０１０３】
本発明のポリペプチドに対する抗体の断片は、当技術分野でよく知られている方法に従って抗体の切断によって産生してもよい。たとえば、免疫学的に活性なＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2断片は、ペプシン等の酵素で抗体を処置することにより生成してもよい。
【０１０４】
さらに、ヒトおよび非ヒト部分を含む、本発明のポリペプチドに対するキメラ抗体、ヒト化抗体、および単鎖抗体は、標準の組換えＤＮＡ技術および／または組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーを使用して産生してもよい。たとえば、たとえばヒトのレグマインおよび／またはＺＢ−１に対して向けられたヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、マウス免疫グロブリン遺伝子ではなくヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを使用して生成してもよい。
【０１０５】
抗体の他の部分、たとえば定常領域をたとえば欠失させ、付加し、または置き換えることによって修飾されたモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、およびヒト化抗体はまた本発明の範囲内である。非限定的な例として、抗体は、定常領域を欠失させることによって、定常領域を他の定常領域、たとえば、抗体の半減期、安定性、もしくは親和性を増加させるはずの定常領域または他の種もしくは他の抗体クラスの定常領域と交換することによって、および定常領域中の１つまたは複数のアミノ酸を修飾することによって修飾して、たとえば、グリコシル化部位の数、エフェクター細胞機能、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合、補体結合反応等を変化させることができる。
【０１０６】
変化した機能、たとえば細胞上のＦｃＲまたは補体のＣ１成分等のエフェクターリガンドに対する変化した親和性を有する抗体は、抗体の定常部分中の少なくとも１つのアミノ酸残基を異なる残基と交換することにより産生することができる（たとえば欧州特許第３８８，１５１号、米国特許第５，６２４，８２１号、および第５，６４８，２６０号を参照されたい、これらのすべての内容は、それらの全体が本明細書に参照によってこれによって組み込まれる）。
【０１０７】
本発明での使用のための抗体に加えて、他の分子もまた、レグマインおよび／またはＺＢ−１の活性を調整するために利用してもよい。前述の分子は、小モジュール免疫医薬（small modular immunopharmaceutical）（ＳＭＩＰ（商標））剤（Ｔｒｕｂｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社、シアトル、ＷＡ）を含む。ＳＭＩＰは、抗原等の同種の構造に対する結合ドメイン、カウンター受容体等、１個のシステイン残基を有するまたはシステイン残基を有していないヒンジ領域ポリペプチド、ならびに免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメインからなる単鎖ポリペプチドである（ｗｗｗ．ｔｒｕｂｉｏｎ．ｃｏｍもまた参照されたい）。ＳＭＩＰならびにそれらの使用および用途は、たとえば米国特許公開第２００３／０１１８５９２号、第２００３／０１３３９３９号、第２００４／００５８４４５号、第２００５／０１３６０４９号、第２００５／０１７５６１４号、第２００５／０１８０９７０号、第２００５／０１８６２１６号、第２００５／０２０２０１２号、第２００５／０２０２０２３号、第２００５／０２０２０２８号、第２００５／０２０２５３４号、および第２００５／０２３８６４６号ならびにその関連する特許ファミリーメンバーに開示され、これらのすべては、それらの全体が本明細書に参照によってこれによって組み込まれる。
【０１０８】
本発明の抗レグマイン抗体ならびに／または抗ＺＢ−１抗体は、レグマインおよび／もしくはＺＢ−１のポリペプチドならびにレグマインおよび／もしくはＺＢ−１のポリペプチド断片（またはその融合体）を、上清中で、細胞溶解物中で、細胞表面上で、または細胞外マトリックス内で単離、精製、および／または検出するのに有用であってもよい。本発明で開示された抗体はまた、たとえばレグマインおよび／もしくはＺＢ−１のポリペプチドレベルを診断上で監視するためにまたは抗体の抗原を含む細胞もしくは組織を標的として臨床的に治療修飾因子を誘導するために臨床試験手順の一部として使用してもよい。たとえば、低分子等の治療薬または本発明の他の治療薬は、レグマインおよび／またはＺＢ−１を発現する細胞または組織を標的として治療薬を向けるために抗レグマイン抗体および／または抗ＺＢ−１抗体に連結してもよい。レグマインおよび／またはＺＢ−１のポリペプチドに結合するアンタゴニスト抗体（モノクローナル抗体を含むが、これに限定されない）はまた、レグマインおよび／もしくはＺＢ−１の活性に関する疾患（複数可）またはレグマインおよび／もしくはＺＢ−１関連性の状態の治療に有用であってもよい。したがって、本発明は、レグマインおよび／またはＺＢ−１に特異的に結合し、レグマインおよび／またはＺＢ−１の活性を減少させる、制限する、ブロックする、またはその他の場合では低下させる阻害（アンタゴニスト）抗体を含む組成物をさらに提供する。同様に、抗レグマイン抗体ならびに／または抗ＺＢ−１抗体は、レグマインおよび／もしくはＺＢ−１を単離する、精製する、検出する、および／もしくは診断上で監視するならびに／またはレグマインおよび／もしくはＺＢ−１を含む細胞もしくは組織を標的として臨床的に治療修飾因子を誘導するのに有用であってもよい。
【０１０９】
スクリーニングアッセイ
レグマインならびにＺＢ−１のポリヌクレオチドならびにポリペプチドは、細胞または生物中でレグマインならびに／またはＺＢ−１の活性を調整することができ、それによって、血管障害および炎症性障害ならびにたとえばアスパラギニルペプチダーゼ活性の調節不全と関連した障害の可能性のある調節因子となる薬物を同定するまたはそのような作用物質のための化合物を導くためにスクリーニングアッセイで使用してもよい。たとえば、レグマインおよび／またはＺＢ−１を含有するサンプルを、複数の試験化合物（生物学的因子または低有機分子のいずれか）のうちの１つと接触させてもよく、それぞれの処置サンプル中のレグマインおよび／またはＺＢ−１の活性を、未処置サンプル中のまたは異なる試験化合物と接触させたサンプル中のレグマインおよび／またはＺＢ−１の活性と比較することができる。前述の比較により、試験化合物のうちのいずれかが次のことをもたらすかどうかが決定されるであろう：（１）レグマインおよび／もしくはＺＢ−１の発現および／もしくは活性（および／もしくは分泌、サンプルが完全な細胞（複数可）からなる場合）の実質的に減少したレベル、それによって、レグマインおよび／もしくはＺＢ−１のアンタゴニストを示す；または（２）レグマインもしくはＺＢ−１の発現および／もしくは活性（および／もしくは分泌、サンプルが完全な細胞（複数可）からなる場合）の実質的に増加したレベル、それによって、レグマインおよび／もしくはＺＢ−１のアゴニストを示す。一実施形態では、レグマインならびに／またはＺＢ−１の活性を調整することができる試験化合物の同定は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ社、ウプサラ、スウェーデン）アッセイ、ＢＲＥＴ（生物発光共鳴エネルギー移動）アッセイ、およびＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）アッセイ等のハイスループットスクリーニングアッセイならびにＥＬＩＳＡおよび細胞ベースのアッセイを使用して実行される。
【０１１０】
レグマインはアスパラギニル結合を加水分解する（ＺＢ−１は、同様に、前述の結合を加水分解することが予測される）ので、レグマインおよび／またはＺＢ−１の活性のアンタゴニストのスクリーニングは、システインプロテアーゼの活性を分析するための十分に確立された方法を利用してもよいまたは実施例に記載するプロトコールに従ってもよい。したがって、レグマインおよび／またはＺＢ−１を含有する細胞またはサンプルを試験化合物と接触させ、試験化合物が、レグマインおよび／またはＺＢ−１の発現を調整するかどうかを、たとえばウエスタン分析またはノーザン分析、ＰＣＲ、免疫組織化学、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ディファレンシャルディスプレイ等によって決定してもよい。あるいは、レグマインおよび／またはＺＢ−１を含有する細胞またはサンプルを試験化合物と接触させ、試験化合物が、レグマインおよび／またはＺＢ−１の活性（および／または分泌、サンプルが完全な細胞（複数可）からなる場合）を調整するかどうかを決定してもよい。レグマインおよび／またはＺＢ−１の活性は、Ｃｈｅｎら（（２００６）前掲），Ｌｉら（前掲）、およびＫａｔｏら（前掲）に開示されたものを含む様々な方法によって測定してもよい。実施例に示されるように、たとえばペプチド基質Ｚ−ＡＡＮ−ＭＣＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を使用して、レグマインまたはＺＢ−１は特定の試験化合物の存在下でプロテアーゼ活性を増加させるまたは減少させるかどうかを決定してもよい。様々な直接的なおよび間接的なレグマイン調節因子は、当技術分野でよく知られており、比較測定に使用してもよい（たとえばＶｉｇｒｅｓｗａｒａｎら、前掲およびＹａｍａｎｅら、前掲を参照されたい）。加えて、レグマインに対する活性ベースのプローブはＫａｔｏら、前掲に開示される。
【０１１１】
低分子
レグマインおよび／もしくはＺＢ−１の発現および／もしくは活性の増強に関する障害またはたとえばアスパラギニルプロテアーゼ活性の増加に関する障害、たとえばアテローム性動脈硬化、関節炎等に罹患した（または危険にさらされた）生物（または被検体）中でレグマインならびに／またはＺＢ−１の活性、発現、ならびに／または分泌を減少させ、または前述の生物由来の前述の障害に関連する細胞中でレグマインおよび／もしくはＺＢ−１の活性、発現、および／もしくは分泌を減少させることはまた、レグマインならびに／またはＺＢ−１にアンタゴナイズする、つまり、レグマインならびに／またはＺＢ−１の活性を減少させるまたは阻害する低分子（普通有機低分子）の使用を通して達成され得る。新規なアンタゴニスト低分子は本明細書に記載されるスクリーニング法によって同定してもよく、本明細書に記載される、本発明の方法に使用してもよい。レグマイン活性のさらなる低分子調節因子は当技術分野でよく知られており、比較測定にまたは本明細書に開示された方法に使用してもよい（たとえばＶｉｇｒｅｓｗａｒａｎら、前掲；Ｎｉｅｓｔｒｏら、前掲；およびＧｏｔｚ，前掲）。
【０１１２】
用語低分子は高分子ではない化合物を指す（たとえばＫａｒｐ（２０００）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ１６：２６９−８５；Ｖｅｒｋｍａｎ（２００４）ＡＪＰ−Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８６：４６５−７４を参照されたい）。したがって、低分子は、たとえば１０００ダルトン未満であるそれらの化合物と考えられることが多い（たとえばＶｏｅｔおよびＶｏｅｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２版，Ｎ．Ｒｏｓｅ編，Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１４（１９９５））。たとえば、Ｄａｖｉｓら（（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０２：５９８１−８６）は、葉酸、メトトレキサート、および神経ペプチドを示すために語句低分子を使用し、ＨａｌｐｉｎおよびＨａｒｂｕｒｙ（（２００４）ＰＬｏｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ２：１０２２−３０）は、低分子遺伝子産物、たとえばＤＮＡ、ＲＮＡ、およびペプチドを示すためにその語句を使用する。天然低分子の例は、コレステロール、神経伝達物質、アプタマー、およびｓｉＲＮＡを含むが、これらに限定されない（Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎら（２００６）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ１３：５４１−５２を参照されたい）。合成低分子は、多数の市販されている低分子データベース、たとえばＦＣＤ（Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ）、ＳＭＩＤ（Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ）、ＣｈＥＢＩ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｔｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、およびＣＳＤ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ）に記録された様々な化学物質を含むが、これらに限定されない（たとえばＡｌｆａｒａｎｏら（２００５）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｉｓｓｕｅ  ３３：Ｄ４１６−２４を参照されたい）。
【０１１３】
レグマインおよびＺＢ−１の活性に関する障害および状態の進行を診断する、予後を判定する、および監視するための方法
本発明は、被検体のレグマインおよび／またはＺＢ−１の活性に関する障害および状態（たとえば、レグマインおよび／またはＺＢ−１の活性の増加を直接または間接的に伴う、血管障害および炎症性障害等の状態）の進行を、たとえば、レグマインおよび／またはＺＢ−１の活性、発現、および／または分泌の上方制御を検出することによって診断する、予後を判定する、および監視するための方法を提供し、ヒト被検体での前述の方法の使用を含むが、これに限定されない。これらの方法は、本明細書に記載されるように、レグマインおよび／もしくはＺＢ−１のポリヌクレオチドもしくはその断片、レグマインおよび／もしくはＺＢ−１のポリペプチドもしくはその断片（その融合タンパク質を含む）、レグマインおよび／もしくはＺＢ−１のポリペプチドに対する抗体もしくは抗体断片、またはレグマインおよび／もしくはＺＢ−１の活性、発現、および／もしくは分泌の低分子修飾因子を含む群の少なくとも１つを含む包装済み診断キットを用いることにより実行してもよく、これらはたとえば臨床の場で好都合に使用してもよい。当業者は、たとえばヒトのレグマインおよび／またはＺＢ−１のたとえば上方制御を確認するために、アテローム性動脈硬化プラークの質量または寸法の変化の測定を含むが、これに限定されない他の間接法が使用してもよいことを認識するであろう。
【０１１４】
「診断」または「診断する」は、病的状態の存在または非存在を同定することを意味する。診断方法は、次のものの試験量：１）レグマインおよび／もしくはＺＢ−１の発現のレベル；２）レグマインおよび／もしくはＺＢ−１の活性のレベル；ならびに／または３）レグマインおよび／もしくはＺＢ−１の分泌のレベルを、レグマインおよび／もしくはＺＢ−１の発現のレベル（たとえばその断片を含むｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、および／もしくはポリペプチドのレベル）、レグマインおよび／もしくはＺＢ−１の活性のレベル（たとえばアスパラギニルプロテアーゼ／ペプチダーゼの活性のレベル）、ならびに／またはレグマインおよび／もしくはＺＢ−１の分泌のレベル（たとえば、細胞外に見つけられたレグマインおよび／もしくはＺＢ−１のレベル）の試験量を被検体（ヒトもしくは非ヒト哺乳動物）由来の生物学的サンプル中で決定することによってならびにレグマインおよび／もしくはＺＢ−１の試験レベル／活性／分泌を正常レベル／活性／分泌のレグマインおよび／もしくはＺＢ−１またはその範囲（たとえば、レグマインおよび／もしくはＺＢ−１の活性等に関する障害にかかっていないことで知られている個体（複数可）の量もしくは範囲等の基準量）と比較することによって検出することを含む。特定の診断方法は、レグマインおよび／またはＺＢ−１の活性等に関する障害の決定的な診断を提供しない可能性があるが、方法が診断を助ける陽性の指標を提供する場合十分である。
【０１１５】
本発明はまた、レグマインおよび／またはＺＢ−１の発現、分泌、および／または活性での変化を検出することにより、前述の障害の予後を判定するための方法を提供する。「予後」または「予後を判定する」は、病的状態の考えられる発症および／または重症度を予測することを意味する。予後法は、次のものの試験量：１）レグマインおよび／もしくはＺＢ−１の遺伝子産物の発現のレベル；２）レグマインおよび／もしくはＺＢ−１の活性のレベル；ならびに／または３）被検体由来の生物学的サンプル中のレグマインおよび／もしくはＺＢ−１の分泌のレベルを決定することならびにレグマインおよび／もしくはＺＢ−１の試験レベル／活性／分泌をレグマインおよび／もしくはＺＢ−１の予後レベル／活性／分泌またはその範囲（たとえば、レグマインおよび／もしくはＺＢ−１の活性等に関する障害ならびに／またはアスパラギニルペプチダーゼ／プロテアーゼ調節不全と関連する障害の種々の重症度を有する個体の量または範囲）と比較することを含む。一実施形態では、レグマインおよび／もしくはＺＢ−１の予後レベル／活性／分泌またはその範囲は、レグマインならびに／またはＺＢ−１の試験レベル／活性／分泌よりも初期の時点での個体の測定値としてもよい。試験サンプル中の様々な量のレグマインならびに／またはＺＢ−１の活性、分泌、ならびに／または発現は、レグマインおよび／もしくはＺＢ−１の活性に関する障害ならびに／またはアスパラギニルペプチダーゼ／プロテアーゼ調節不全と関連する障害のある種の予後と一致している。特定の予後レベルでのレグマインおよび／またはＺＢ−１の活性、分泌、および／または発現の量の検出は被検体の予後を提供する。
【０１１６】
本発明はまた、障害の進行もしくは経過またはレグマインおよび／もしくはＺＢ−１の活性に関する障害の治療（ならびに／またはアスパラギニルペプチダーゼ／プロテアーゼ調節不全、たとえば血管障害および炎症性障害と関連する障害）の進行または経過を、たとえば、レグマインならびに／またはＺＢ−１の活性、分泌、ならびに／または発現の上方制御または下方制御を検出することによって監視するための方法を提供する。監視方法は、次のものの試験量：１）レグマインおよび／もしくはＺＢ−１の遺伝子産物のレベル；２）レグマインおよび／もしくはＺＢ−１の活性のレベル；ならびに／または３）第１および第２の時期に被検体から採取した生物学的サンプル中のレグマインおよび／もしくはＺＢ−１の分泌のレベルを決定することならびにその量を比較することを含む。第１および第２の時期の間の、レグマインおよび／またはＺＢ−１の活性、分泌、および／または発現の量の変化は、レグマインおよび／またはＺＢ−１に関連する状態または障害の経過の変化を示す。前述の監視アッセイはまた、レグマインおよび／もしくはＺＢ−１関連性の状態ならびに／またはアスパラギニルペプチダーゼ／プロテアーゼ調節不全をもたらす状態について治療されている患者の特定の治療的介入の有効性を評価するのに有用である。
【０１１７】
上記に概説された方法でのレグマインならびに／またはＺＢ−１の活性、分泌、ならびに／または発現の増加は、体液（たとえば全血、血漿、および尿）、細胞（たとえば全細胞、細胞画分、および細胞抽出物）、ならびに他の組織を含む様々な生物学的サンプル中で検出してもよい。生物学的サンプルはまた、組織学的目的のために採取された生検材料および凍結切片等の、組織の切片を含む。好ましい生物学的サンプルは、動脈、腎臓、血管、内皮細胞、単球、およびマクロファージを含む。生物学的サンプルの分析は被検体からの細胞または組織の摘出を必ずしも必要とするわけではないことが理解されるであろう。たとえば、レグマインおよび／またはＺＢ−１の遺伝子産物に結合する適切に標識された作用物質（たとえば抗体、核酸）は、被検体に投与し、標準の画像技術（たとえばＣＡＴ、ＮＭＲ（ＭＲＩ）、およびＰＥＴ）を使用して可視化することができる（標的に結合した場合）。
【０１１８】
本発明の診断アッセイおよび予後アッセイで、レグマインおよび／またはＺＢ−１の活性、分泌、および／または発現のレベルは、試験量を得るために検出され、定量化される。次いで、試験量は正常量または範囲と比較される。レグマインおよびＺＢ−１の活性、分泌、および／または発現のレベルの検出および定量化の特定の方法は下記に記載される。
【０１１９】
正常量またはベースラインレベルのレグマインまたはＺＢ−１の活性、分泌（つまり、たとえば分泌されたもしくは細胞内に対する細胞外の遺伝子産物の局在）、および／または発現は任意の特定のサンプルの種類および集団について決定してもよい。一般に、レグマインおよび／またはＺＢ−１のタンパク質またはｍＲＮＡのベースライン（正常）レベルまたはベースラインの場所は、正常（つまり健常）被検体由来の生物学的サンプル中のレグマインおよび／またはＺＢ−１のタンパク質またはｍＲＮＡのそれぞれの量または場所を測定することにより決定される。あるいは、レグマインおよび／またはＺＢ−１の遺伝子産物の正常値または場所は、病気の（またはおそらく病気の）試験細胞または試験組織が採取された同じ被検体から採取された健常細胞または健常組織のレベルまたは場所を測定することにより決定してもよい。レグマインおよび／またはＺＢ−１の遺伝子産物の量（正常量もしくは試験量のいずれか）または前述の遺伝子産物の場所（つまり細胞外もしくは細胞内）は、細胞当たりで、全タンパク質当たりで、または容量ベースで決定し、または表すことができる。サンプル中のレグマインまたはＺＢ−１の標準／コントロールの細胞のレベルまたは場所を確立するために、恒常的に発現する遺伝子産物または生物学的サンプルが由来する種類の細胞中の知られているレベルもしくは場所で発現した他の遺伝子産物のレベルまたは場所を測定することができる。
【０１２０】
相対値がこれらの方法に多く適用するのに十分であるので、本発明のアッセイ法はレグマインおよび／またはＺＢ−１の活性、分泌、および／または発現の絶対値の測定を必ずしも必要とするわけではないことが理解されるだろう。レグマインおよび／またはＺＢ−１の遺伝子産物の数量または存在量に加えて、変異体のもしくは異常なレグマインおよび／もしくはＺＢ−１の遺伝子産物（たとえば突然変異転写物、切断型ポリペプチド）またはそれらの発現パターンは、正常な遺伝子産物および発現パターンに対する比較によって同定されてもよいこともまた理解されるであろう。
【０１２１】
２個のサンプル中の特定の遺伝子産物の発現または局在が著しく類似するまたは著しく異なる、たとえば所与のレベルを著しく上回るまたは著しく下回るかどうかは、遺伝子自体およびとりわけ、異なる個体または異なるサンプルの間の発現または局在化でのその変異性に依存する。発現のレベルまたは局在化が著しく類似するまたは異なるかどうかを決定することは当業者の能力の範囲内である。たとえば個体、種、器官、組織、または細胞の間のレグマインおよび／またはＺＢ−１の発現のレベルまたは局在化での遺伝的変異等の因子は、２個のサンプルの間のたとえばヒトのレグマインおよび／またはＺＢ−１の発現、活性、および／または分泌のレベルが著しく類似するまたは著しく異なる、たとえば所与のレベルを著しく上回るまたは下回るかどうかを決定する場合、（必要であれば）考慮に入れてもよい。個体、種、器官、組織、または細胞の間の遺伝子発現での天然の不均一性の結果として、「著しく類似する」、「著しくより高い」、「著しくより低い」、「著しく上回る」等のような語句は、正確な割合または値として定義することができないが、本発明の実施に際して当業者によって確かめることができる。
【０１２２】
本発明の診断アッセイ、予後アッセイ、および監視アッセイは、たとえば、生物学的サンプル中でレグマインおよび／またはＺＢ−１の遺伝子産物を検出することおよび定量化することを含む。レグマインおよびＺＢ−１の遺伝子産物はｍＲＮＡおよびポリペプチドを含むが、これらに限定されず、共に当業者によく知られている方法を使用して測定することができる。たとえば、ｍＲＮＡは、ノーザンハイブリダイゼーション、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ドットスロットブロット、およびオリゴヌクレオチドアレイ等のハイブリダイゼーションベースのアッセイを使用して直接検出し、定量化することができる。ハイブリダイゼーションベースのアッセイは、プローブ核酸が標的核酸にハイブリダイズするアッセイを指す。いくつかのフォーマットでは、標的、プローブ、または標的およびプローブの両方は固定化される。固定化された核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または他のオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドであってもよく、自然発生もしくは非自然発生ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、または主鎖を含んでいてもよい。本発明での使用のための核酸プローブ配列を選択する方法は、レグマインおよびＺＢ−１の核酸配列に基づき、その方法は当技術分野でよく知られている。
【０１２３】
あるいは、ｍＲＮＡは検出および定量化の前に増幅することができる。前述の増幅ベースのアッセイは当技術分野でよく知られており、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量的またはリアルタイムＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）、ＰＣＲ酵素連結抗体免疫吸着アッセイ（ＰＣＲ−ＥＬＩＳＡ）、およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を含む。増幅されたレグマインおよび／またはＺＢ−１の遺伝子産物（たとえばｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ）を検出および産生するためのプライマーおよびプローブは、当業者による過度の実験作業を伴うことなく、本明細書で提供され、当技術分野で知られているレグマインおよびＺＢ−１の核酸配列に基づいて容易に設計し、産生してもよい。非限定的な例として、増幅されたレグマインまたはＺＢ−１の遺伝子産物は、たとえばゲル電気泳動によって、プローブ核酸に対するハイブリダイゼーションによって、配列決定によって、蛍光性、リン光性、もしくは放射性シグナルの検出によって、または様々なよく知られている方法のうちのいずれかによって直接分析してもよい。加えて、標的核酸配列の増幅によって産生されたシグナルを増加させるための方法は当業者に知られている。どちらの増幅方法が使用されても、当技術分野で知られている様々な定量的方法（たとえば定量的ＰＣＲ）は、遺伝子産物の定量化が所望の場合、使用してもよいことを当業者は認識するであろう。
【０１２４】
レグマインおよび／またはＺＢ−１のポリペプチド（またはその断片）は、本明細書に記載されるように生成してもよい抗レグマイン抗体および抗ＺＢ−１抗体を利用する様々なよく知られている免疫学的アッセイを使用して検出してもよい。抗レグマイン抗体もまた文献に記載されている（Ｃｈｏｉら（１９９９）前掲）。免疫学的アッセイは、たとえばヒトのレグマインまたはＺＢ−１のポリペプチド（またはその断片）に特異的に結合する抗体（たとえばポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、ｓｃＦｖ、および／またはその断片）を用いるアッセイを指す。本発明の実施に適した前述のよく知られている免疫学的アッセイは、ＥＬＩＳＡ、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、免疫沈降、免疫蛍光、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）、およびウエスタンブロッティングを含む。レグマインおよび／またはＺＢ−１のポリペプチドはまた、プロテアーゼに対する標識された基質、たとえば実施例に示されるＺ−ＡＡＮ−ＭＣＡまたはＫａｔｏら、前掲に開示された活性ベースのプローブを使用して検出してもよい。当業者は、レグマインおよび／またはＺＢ−１の活性に関する障害および状態、たとえば血管障害および炎症性障害に先に述べた方法を適用してもよいことを理解するであろう。
【０１２５】
治療での、レグマインおよびＺＢ−１の活性に関する分子の使用
本発明者らは以下のことを実証した：（１）レグマインは、ヒトアテローム性動脈硬化サンプル中で健常動脈サンプルと比較して高度に発現される；（２）ＡｐｏＥ  ＫＯマウスの大動脈洞および大動脈弓中でのレグマイン発現はアテローム性動脈硬化疾患進行の間に増加する；（３）レグマインは、ＡｐｏＥ−／−マウスの大動脈弓および大動脈洞のアテローム性動脈硬化病変で強く陽性である；（４）ＡｐｏＥ−／−マウスの大動脈洞のアテローム性動脈硬化病変でのレグマイン発現は炎症細胞浸潤のエリアで生じる；（５）ＡｐｏＥ−／−マウスの冠動脈中でのレグマイン発現はアテローム性動脈硬化プラークを増加させる；（６）レグマイン発現は、加速化アテローム性動脈硬化のＡｐｏＥ−／−マウスモデル中の頚動脈の新生内膜病変エリア内に見つけられる；（７）レグマインはＡｐｏＥ−／−マウスの大動脈洞の動脈内皮細胞中で発現する；（８）レグマインは、腎臓中で、たとえば腎動脈の内皮細胞中でおよび近位尿細管細胞中で発現する；（９）レグマインのタンパク質レベル、ｍＲＮＡレベル、および活性は、分化ＴＨＰ−１マクロファージおよびＭ−ＣＳＦ活性化初代ヒトマクロファージ中で増加する；（１０）レグマインはＭ−ＣＳＦ活性化初代ヒトマクロファージの条件培地中に見つけられる；（１１）レグマインタンパク質は、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞中の組換え過剰発現に際して細胞表面上に存在し、ＨＥＫ２９３細胞によって発現された細胞表面レグマインは酵素的に活性である；（１２）レグマインはアテローム性動脈硬化患者の冠動脈中で発現する；（１３）レグマイン刺激はヒト単球移動を誘発する；（１４）レグマイン刺激は、ＨＥＫ２９３およびＨＵＶＥＣの培養物の創傷治癒モデルでの内皮細胞移動および増殖と同様にＨＵＶＥＣ培養物での内皮細胞侵入を誘発する；（１５）レグマイン発現は、関節炎のコラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）マウスモデルの病気の足で増加する；ならびに（１６）レグマインの新規なスプライス変異体、ＺＢ−１は、組換えＺＢ−１過剰発現ＨＥＫ２９３細胞の培養培地中に分泌される。
【０１２６】
上記の結果は、レグマインおよび／またはＺＢ−１の活性に関する分子、たとえばレグマインおよび／またはＺＢ−１のアンタゴニストを使用するための開示された方法は、レグマインおよび／またはＺＢ−１関連性の状態および障害、たとえばアテローム性動脈硬化および関節炎等の血管障害および炎症性障害を治療するために利用してもよいことを示す。これらの方法は、ヒトの前述の障害を治療するのに特に有用となるであろう。
【０１２７】
本明細書に記載される方法を使用して同定されてもよい、マウスならびに／またはヒトのレグマインならびに／またはＺＢ−１のポリヌクレオチドならびに／またはポリペプチドの活性、発現、ならびに／または分泌の修飾因子を含む、本明細書に開示されたレグマインならびにＺＢ−１に関連する分子は、ｅｘ  ｖｉｖｏで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用してもよいまたは医薬組成物中に組み込まれ、レグマインおよび／もしくはＺＢ−１の活性に関する障害ならびにアスパラギニルペプチダーゼ／プロテアーゼ活性に関する障害（たとえば血管障害および炎症性障害）を治療し、寛解させ、または予防するために、レグマインならびに／またはＺＢ−１のアンタゴニスト（複数可）（たとえば、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ分子、およびアプタマー等のレグマイン阻害性ポリヌクレオチド（つまり、レグマインのレベル、活性、および／もしくは分泌を直接もしくは間接的に減少させるポリヌクレオチド）；レグマイン阻害性ポリペプチド（つまりレグマインおよび／もしくはＺＢ−１のレベル、活性、および／もしくは分泌を直接もしくは間接的に減少させるポリペプチド、たとえば、不活性酵素ドメインを含有する断片等のレグマインの断片およびその融合タンパク質）；アンタゴニスト抗レグマイン抗体および／もしくは抗ＺＢ−１抗体または抗体断片（つまり、レグマインおよび／もしくはＺＢ−１の活性、発現、および／もしくは分泌を直接もしくは間接的に減少させる抗体もしくは抗体断片、レグマインおよび／もしくはＺＢ−１の断片に結合する抗体および抗体断片を含む）；ならびにアンタゴニスト低分子（たとえばｓｉＲＮＡ、アプタマー、および低有機分子もしくは化合物））の投与によって個体（たとえばヒト被検体）にｉｎ  ｖｉｖｏで投与してもよい。レグマインおよび／またはＺＢ−１のアンタゴニスト（複数可）を投与するべきかどうかの決定を考慮するための数種の薬理ゲノミクスアプローチは当業者によく知られており、ゲノムワイド関連解析、候補遺伝子アプローチ、および遺伝子発現プロファイリングを含む。本発明の医薬組成物は、投与のその意図された経路と適合するよう製剤される（たとえば、経口組成物は一般に非活性希釈剤または食用の担体を含む）。投与の経路の他の非限定的な例は、非経口（たとえば静脈内）、皮内、皮下、経口（たとえば吸入）、経皮（局所的）、経粘膜、および直腸投与を含む。それぞれの意図された経路と適合する医薬組成物は当技術分野でよく知られている。
【０１２８】
レグマインおよび／またはＺＢ−１のアンタゴニスト（複数可）は、薬学的に許容し得る担体と組み合わせる場合、医薬組成物として使用してもよい。前述の組成物は、レグマインおよび／またはＺＢ−１のアンタゴニスト（複数可）（たとえばヒトレグマインアンタゴニスト）に加えて、担体、様々な希釈剤、賦形剤、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤、および当技術分野でよく知られている他の物質を含有していてもよい。用語「薬学的に許容し得る」は、有効成分（複数可）の生物活性の有効度に干渉しない無毒性物質を意味する。担体の特徴は投与の経路に依存するであろう。
【０１２９】
本発明の医薬組成物は、水溶液中でミセル、不溶性単分子層、液晶、またはラメラ層として凝集形態で存在する脂質等の両親媒性剤と共に、他の薬学的に許容し得る担体に加えて、レグマインおよび／またはＺＢ−１のアンタゴニスト（複数可）が中で組み合わせられたリポソームの形態をしていてもよい。リポソーム製剤に適した脂質は、限定を伴うことなく、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸等を含む。
【０１３０】
本明細書に使用されるように、用語「治療有効量」は、意味のある患者の利益、たとえば、前述の状態の症状の寛解、その治癒、またはその治癒の速度の増加を示すのに十分な医薬組成物または方法の各活性成分の全量を意味する。その用語は、個々の有効成分に適用され、単独で投与された場合、その成分を単独で指す。組合せに適用された場合、組み合わせて、連続的に、または一斉に投与されたとしても、その用語は、治療効果をもたらす有効成分の組み合わせた量を指す。
【０１３１】
本発明の治療または使用の方法の実施では、治療有効量のレグマインおよび／またはＺＢ−１のアンタゴニスト（複数可）は被検体、たとえば哺乳動物（たとえばヒト）に投与される。レグマインおよび／またはＺＢ−１のアンタゴニスト（複数可）は、本発明の方法に従って単独でまたは他の治療と組み合わせて、たとえば、関節炎もしくはアテローム性動脈硬化のためのさらなる治療と組み合わせて等で投与してもよい。１つまたは複数の作用物質と同時投与された場合、レグマインおよび／またはＺＢ−１のアンタゴニスト（複数可）は第２の作用物質と一斉にまたは継続的に投与してもよい。継続的に投与された場合、主治医は、他の作用物質と組み合わせたレグマインおよび／またはＺＢ−１のアンタゴニスト（複数可）の投与の適切な順序を判断するであろう。
【０１３２】
治療有効量のレグマインおよび／またはＺＢ−１のアンタゴニスト（複数可）が経口的に投与される場合、結合剤は、錠剤、カプセル剤、散剤、液剤、またはエリキシル剤の形態をしているであろう。錠剤の形態で投与される場合、本発明の医薬組成物はさらにゼラチンまたは佐剤等の固体担体を含有していてもよい。錠剤、カプセル剤、および／または散剤は、約５〜９５％の結合剤、好ましくは約２５〜９０％の結合剤を含有する。液体の形態で投与される場合、水、石油、ピーナッツ油（ピーナッツアレルギーに関して注意を払う）等の動物もしくは植物起源の油、鉱油、大豆油、またはゴマ油、または合成油等の液体担体を添加してもよい。医薬組成物の液体の形態は、生理食塩液、ブドウ糖もしくは他の糖類溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコール等のグリコールをさらに含有していてもよい。液体の形態で投与される場合、医薬組成物は、結合剤の、重量で約０．５〜９０％、好ましくは結合剤の、重量で約１〜５０％を含有する。
【０１３３】
治療有効量のレグマインおよび／またはＺＢ−１のアンタゴニスト（複数可）が静脈内注射、皮膚注射、皮下注射によって投与される場合、レグマインおよび／またはＺＢ−１のアンタゴニスト（複数可）は、発熱物質なしの非経口的に許容し得る水溶液の形態をしているであろう。ｐＨ、等張性、安定性等に適正な注意を払った前述の非経口的に許容し得るタンパク質溶液の調製は当業者の能力の範囲内である。静脈内注射、皮膚注射、または皮下注射のための好ましい医薬組成物は、レグマインおよび／またはＺＢ−１のアンタゴニスト（複数可）に加えて、塩化ナトリウム液、リンガー液、ブドウ糖液、ブドウ糖および塩化ナトリウム液、乳酸加リンガー液等の等張溶媒または当技術分野で知られている他の溶媒を含有するはずである。本発明の医薬組成物はまた、安定剤、防腐剤、緩衝液、酸化防止剤、または当業者に知られている他の添加剤を含有していてもよい。
【０１３４】
本発明の医薬組成物中のレグマインならびに／またはＺＢ−１のアンタゴニスト（複数可）の量は、治療されている状態の性質および重症度ならびに患者が受けた前の治療の性質に依存する。最終的に、主治医は、個々の患者を治療するためのレグマインおよび／またはＺＢ−１のアンタゴニスト（複数可）の量を判断するであろう。最初に、主治医は、低用量のレグマインおよび／またはＺＢ−１のアンタゴニスト（複数可）を投与し、患者の応答を観察するであろう。最適な治療効果がその患者で得られるまで、より多い用量のレグマインおよび／またはＺＢ−１のアンタゴニスト（複数可）が投与してもよく、その時点で投薬量は一般にさらに増加されることはない。本発明の方法を実施するために使用される様々な医薬組成物は、体重１ｋｇ当たり約０．１μｇ〜約１００ｍｇのレグマインおよび／またはＺＢ−１のアンタゴニスト（複数可）、たとえば、ヒトレグマインポリペプチド（その融合タンパク質を含む）を含有するはずであることが企図される。
【０１３５】
本発明の医薬組成物を使用する静脈内（ｉ．ｖ．）治療の持続期間は、治療されている疾患の重症度ならびに各個々の患者の状態および可能性のある特異体質性の応答（複数可）に依存して変わるであろう。レグマインおよび／またはＺＢ−１のアンタゴニスト（複数可）の各適用の持続期間は、連続的または間欠性のｉ．ｖ．投与のたとえば１〜１２、６〜１８、または１２〜２４時間の範囲内にあってもよいことが企図される。本発明の医薬組成物を使用する皮下（ｓ．ｃ．）治療もまた企図される。これらの治療は、毎日、毎週、またはより好ましくは隔週でもしくは毎月施すことができる。レグマインおよび／またはＺＢ−１のアンタゴニスト（複数可）が低分子（たとえば経口送達用）である場合、治療は毎日、１日２回、１日３回等で施してもよいこともまた企図される。最終的に、主治医は、ｉ．ｖ．もしくはｓ．ｃ．治療または低分子での治療の適切な持続期間および本発明の医薬組成物を使用する治療の施与のタイミングを判断するであろう。
【０１３６】
本発明のポリヌクレオチドおよびタンパク質は、本明細書で同定された１つまたは複数の効用または生物活性（本明細書に記載されるアッセイと関連したものを含む）を呈することが期待される。本発明のタンパク質について記載された効用または活性は、前述のタンパク質の投与もしくは使用によってまたは前述のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの投与もしくは使用によって（たとえば遺伝子治療もしくはＤＮＡの導入に適したベクターで等で）提供されてもよい。
【０１３７】
レグマインおよび／またはＺＢ−１のアンタゴニストの使用
一態様では、本発明は、興味のある細胞またはサンプル（たとえば単球、泡沫細胞、マクロファージ、腎臓近位尿細管細胞、血管中への炎症細胞侵入の部位、アテローム性動脈硬化プラーク内膜、腎臓、または動脈）中でアスパラギニルペプチダーゼ／プロテアーゼ活性を調節する方法を特徴とする。前述の一方法は、細胞または細胞の集団をレグマインならびに／またはＺＢ−１のアンタゴニスト（複数可）（たとえばヒトレグマインおよび／もしくはＺＢ−１の阻害性ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド（たとえばｓｉＲＮＡ、アプタマー、アンチセンス、もしくは融合タンパク質を含むアンタゴニストレグマインおよび／もしくはＺＢ−１の可溶性タンパク質）；または抗レグマイン抗体もしくは抗ＺＢ−１抗体（つまりアンタゴニスト抗体））と、興味のある細胞またはサンプル中でアスパラギニルペプチダーゼ／プロテアーゼ活性のレベルを調整するのに十分な量で接触させることを含む。本発明の他の実施形態では、レグマインおよび／またはＺＢ−１のアンタゴニスト（複数可）は、レグマインおよび／またはＺＢ−１の分泌または発現のレベルが興味のある細胞またはサンプル中で減少するように使用される。アスパラギニルペプチダーゼ／プロテアーゼ活性、発現、および／または分泌の調整は、レグマイン関連性の状態、ＺＢ−１関連性の状態、および／またはアスパラギニルペプチダーゼ／プロテアーゼ調節不全が伴う状態、たとえばアテローム性動脈硬化および関節炎等の血管障害および炎症性障害にかかっている個体にとって有益であることが期待される。
【０１３８】
したがって、レグマインならびに／またはＺＢ−１のアンタゴニストは、アテローム性動脈硬化（アテローム発生およびアテローム性動脈硬化の全期、たとえば内皮細胞活性化、脂肪線条の形成、血管壁の炎症細胞侵入、内皮細胞移動、泡沫細胞の形成、プラークの裸出、アテローム性プラーク形成、アテローム性プラーク破裂、アテローム血栓症、動脈瘤、狭窄等を含むが、これらに限定されない）、うっ血性心不全、心筋梗塞、心房性不整脈および心室性不整脈、狭窄、動脈瘤、末梢血管疾患、慢性末梢動脈閉塞性疾患（ＣＰＡＯＤ）、末梢動脈閉塞性疾患（ＰＡＯＤ）、血栓症（たとえば急性動脈血栓症、アテローム血栓症、および深部静脈血栓症を含む）、塞栓症、炎症性血管障害、レイノー現象、脈管炎および／もしくは動脈炎（たとえばベーチェット病、バージャー病、中枢神経系脈管炎、チャーグ−ストラウス症候群クリオグロブリン血症、巨細胞性動脈炎、川崎病、顕微鏡的多発血管炎、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発性筋痛、リウマチ性血管炎、高安動脈炎、およびヴェーゲナー肉芽腫症を含む）静脈障害、高血圧性血管疾患、跛行、安定狭心症、不安定狭心症、発作、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）、代謝症候群、虚血、再灌流、ならびに循環系によって影響を及ぼされる様々な疾患の増悪（たとえば慢性腎臓疾患、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）、高脂血症、高血圧症、および糖尿病）等の状態に罹患した被検体を治療するのに有用であると考えられる。本明細書に開示された方法を使用する診断、予後、監視、治療、寛解、および／または予防に適用可能なさらなる障害は、炎症性障害（たとえば関節炎および結核等の慢性炎症性障害）を含む。
【０１３９】
本発明の方法は、レグマイン発現が、大動脈弓、大動脈洞、頚動脈  泡沫細胞、および血管中への炎症細胞浸潤の部位由来のアテローム性動脈硬化サンプル中で増加する、レグマインのレベルおよび活性が活性化マクロファージ中で増加する、ならびにＺＢ−１がレグマインのスプライス変異体であり、それはＺＢ−１過剰発現細胞から分泌されるといった発見に少なくとも部分的に基づく。したがって、レグマインおよび／またはＺＢ−１のアンタゴニスト、つまりレグマインおよび／またはＺＢ−１の活性、発現、および／または分泌を阻害する分子（たとえばアンタゴニスト抗レグマイン抗体）は、たとえば、アテローム性動脈硬化および関節炎等の障害を治療し、寛解させ、または予防するために、血管障害および炎症性障害と関連したアスパラギニルペプチダーゼ／プロテアーゼ活性を減少させるように使用してもよい。
【０１４０】
レグマインおよび／またはＺＢ−１のアンタゴニスト（複数可）を使用することによって、アスパラギニルプロテアーゼ／ペプチダーゼを多くの方法で調整することが可能である。たとえば、活性、発現、および／または分泌の減少は、確立されたレグマインおよび／もしくはＺＢ−１関連性の状態もしくは障害を阻害することもしくはブロックすることによって行ってもよく、またはレグマインおよび／もしくはＺＢ−１関連性の状態もしくは障害の誘発を予防することを含んでいてもよい。
【０１４１】
レグマインおよび／またはＺＢ−１のアンタゴニスト（複数可）を含有する本発明の医薬組成物はまた、特定の、標的とされた障害の治療のためのさらなる治療剤を含有していてもよい。たとえば、アテローム性動脈硬化の治療のための医薬組成物はまた、抗昇圧剤、コレステロール低下薬、スタチン、および／またはＨＵＭＩＲＡ（登録商標）もしくはＥＮＢＲＥＬ（登録商標）等の炎症性サイトカインの介在物質を含んでいてもよい。医薬組成物は、プラスミノーゲン活性化因子および第ＶＩＩＩ因子等の血栓溶解因子または抗血栓因子を含有していてもよい。医薬組成物はさらなる抗炎症剤をさらに含有していてもよい。前述のさらなる因子および／または作用物質は、レグマインおよび／もしくはＺＢ−１のアンタゴニスト（複数可）との相乗効果を生み出すまたはレグマインおよび／もしくはＺＢ−１のアンタゴニスト（複数可）によって引き起こされる副作用を最小限にするために医薬組成物中に含まれていてもよい。
【０１４２】
一実施形態では、その医薬組成物を含むレグマインおよび／またはＺＢ−１のアンタゴニスト（複数可）は、併用治療で投与される、つまり、病理学的状態または心血管系の障害等の障害を治療するのに有用である他の作用物質、たとえば治療剤と組み合わせられる。この文脈中の用語「組み合わせて」は、作用物質が実質的に同時期に、一斉にまたは継続的にのいずれかで与えられることを意味する。継続的に与えられる場合、第２の化合物の投与の開始時に、２つの化合物のうちの第１の化合物は、治療の部位で有効な濃度でなお検出可能であることが好ましい。
【０１４３】
レグマインおよび／またはＺＢ−１のアンタゴニスト（複数可）と組み合わせて使用される好ましい治療剤は、血管障害および炎症性障害の異なる側面を調整する作用物質、たとえば、炎症誘発性サイトカインの活性に干渉する作用物質である。
【０１４４】
したがって、レグマインならびに／またはＺＢ−１のアンタゴニスト（複数可）と組み合わせて有用な作用物質は、限定を伴うことなく、ＰＰＡＲ（つまりＰＰＡＲα、ＰＰＡＲβ、およびＰＰＡＲγ）の修飾因子、ＬＸＲ（肝臓Ｘ受容体、たとえばオキシステロール）の修飾因子、ならびにＡＢＣ（ＡＴＰ結合カセット輸送体、たとえばＡＢＣＡ、ＡＢＣＧ、およびＡＢＣ８）の修飾因子等の、コレステロール含有細胞、たとえばマクロファージならびに泡沫細胞からコレステロール流出を刺激する作用物質を含む。前述の作用物質は、チアゾリジンジオン（たとえば、ロシグリタゾンおよびトログリタゾン等のグリタゾン）、脂肪酸（多価不飽和脂肪酸を含む）、フィブラート（たとえばフェノフィブラート、ゲムフィブロジル、クロフィブラート、Ｗｙ−１４、６４３）、ＧＷ１５１６、ＧＷ７６４、ＧＷ７８４５、ＧＷ０７４２、ＧＷ７６４７、エイコサペンタエン酸、キサントフモール、ローズリピン、プレニルフラボノイド、ポリアセチレン、タンシノン、ならびにその誘導体を含む（たとえばＣｏｌｅｍａｎおよびＬｅｅ（２００４）Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４３：１３４−７６；ＣｈｅｎおよびＦａｒｓｅ（２００５）Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２５：４８２−８６；Ｒｕｓｔａｎら（１９８８）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．２９：１４１７−２６；Ｔａｂａｔａら（１９９７）Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４６：６８３−８７；Ｔｏｍｏｄａ（１９９９）Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ５２：６８９−９４；Ｃｈｕｎｇら（２００４）Ｐｌａｎｔａ  Ｍｅｄ．７０：２５８−６０；Ｌｅｅら（２００４）Ｐｌａｎｔａ  Ｍｅｄ．７０：１９７−２００；Ｋｏら（２００２）Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２５：４４６−４８；Ｌｉら（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１５６４−７６；ＣａｓｔｒｉｌｌｏおよびＴｏｎｔｏｎｚ（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１４：１５３８−４０；Ｍａｒｘら（２００４）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９４：１１６８−７８；Ｃｈａｗｌａら（２００１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．７：１６１−７１；Ｌｉｅら（２０００）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０６：５２３−３１；Ｃｏｌｌｉｎｓら（２００１）Ａｒｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２１：３６５−７１；Ｌｅｅら（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ３０２：４５３−５７；Ｄｕｅｚら（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：４８０５１−５７；Ｒｕｂｉｎｓら（１９９９）Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４１：４１０−１８；Ｏｌｉｖｅｒら（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  ＵＳＡ９８：５３０６−１１；Ｃｈｉｎｅｔｔｉら（２００１）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７：５３−５８；Ｒｉｃｏｔｔｅら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ３９１：７９−８２；Ｊｏｓｅｐｈら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  ＵＳＡ９９：７６０４−０９；Ｔａｎｇｉｒａｌａら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９９：１１８９６−９０１；Ｖｅｎｋａｔｅｓｗａｒａｎら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１４７００−０７；ならびにＷａｎｇら（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．���ｃａｄ．ＳｃＬ  ＵＳＡ１０１：９７７４−７９を参照されたい）。
【０１４５】
さらに、レグマインならびに／またはＺＢ−１のアンタゴニスト（複数可）との併用治療は、シトクロムＰ  ４５０（ＣＹＰ  ４５０）、ＣＹＰ  ３Ａ４、およびＣＹＰ  ２Ｃ８／９の阻害剤（たとえばマクロライド系抗生物質、アゾール、プロテアーゼ阻害剤、ベラパミル、ジルチアゼム、アミオダロン、ワルファリン、グレープフルーツジュース、ゲムフィブロジル、フェニトイン、ロサルタン、ジクロフェナク、イブプロフェン、およびドルブタミド（dolbutamide））ならびに肝性スタチン輸送体、ＯＡＴＰ−Ｃの阻害剤（たとえばシクロスポリンＡおよびゲムフィブロジル）等のスタチン（たとえばメバスタチン、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、セリバスタチン、およびロスバスタチン）、シスタチン（たとえばオボシスタチン、シスタチンＣ、およびシスタチンＭ）、ならびに／またはスタチン活性および／もしくは生物学的利用能を増大させる作用物質を用いてもよい（Ｒｕｔｉｓｈａｕｓｅｒ（２００６）Ｓｗｉｓｓ  Ｍｅｄ．Ｗｋｌｙ．１３６：４１−４９を参照されたい）。レグマインならびに／またはＺＢ−１のアンタゴニスト（複数可）と組み合わせて有用なさらなる作用物質は、高血糖を低下させる作用物質（たとえばレパグリニド、ＳｃｈｍｏｅｌｚｅｒおよびＷａｓｃｈｅｒ（２００６）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｄｉａｂｅｔｏｌ．５：９を参照されたい）；ロイコトリエンのアンタゴニスト（たとえば、５−リポキシエゲナーゼ（5-lipoxyegenase）（５−ＬＯ）、５−ＬＯ−活性化タンパク質（ＦＬＡＰ）、およびロイコトリエン加水分解酵素（たとえばＬＴＡ４加水分解酵素）等のロイコトリエン生合成に関連するタンパク質のアンタゴニスト）；コレステロール、ＬＤＬ、およびトリグリセリドのレベルを減じる作用物質（たとえばフィブリネート（fibrinate）、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、ニコチン酸誘導体）；抗昇圧剤；抗血小板剤；抗凝血剤；コレステロールアシルトランスフェラーゼ酵素の阻害剤（Ｋｒａｕｓｅら（１９９５）Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｗａｙｓ，ｐｐ．１７３−９８ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬを参照されたい）；糖尿病の治療のための作用物質（たとえばインスリン；メトホルミン等のインスリン抵抗性改善薬；エクセナチド（ＢＹＥＴＴＡ（登録商標））等のＧｌｐ−１ミメティック）；スルホニル尿素等のインスリン分泌促進物質（たとえばトラザミド、グリブリド、およびその他）ならびにメチグリニド（たとえばナテグリニド（ＳＴＡＲＬＩＸ（登録商標）））；アトルバスタチンおよびシンバスタチン（たとえばＬＩＰＩＴＯＲ（登録商標）およびＣＡＤＵＥＴ（登録商標））等の、ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）の修飾因子；ファルネソイドＸの受容体（ＦＸＲ）の修飾因子（たとえば胆汁酸）；ならびに組織の脂質およびコレステロールのレベルの他の修飾因子を含む。
【０１４６】
本発明の他の態様は、したがって、他の治療薬化合物と共にレグマインおよび／またはＺＢ−１のアンタゴニスト（複数可）の投与を実行するためのキットに関する。一実施形態では、キットは、医薬担体中で１つまたは複数の結合剤と共に製剤された１つまたは複数のレグマインおよび／またはＺＢ−１のアンタゴニストならびに１つまたは複数の個々の医薬調製物中で適宜製剤された少なくとも１つの他の作用物質、たとえば他の治療剤を含む。
【０１４７】
血管障害および炎症性障害へのレグマインの関与
本発明は、血管障害、たとえばアテローム性動脈硬化を治療し、寛解させ、または予防する方法であって、細胞もしくは細胞集団をリソソームシステインプロテアーゼであるレグマインおよび／もしくはＺＢ−１の修飾因子と接触させることを含むならびに／または前述の修飾因子を被検体に投与することを含む方法を提供する。リソソームシステインプロテアーゼ媒介性のタンパク質分解はアテローム発生の複数の病理学的側面と関連する。本発明者らは、システインプロテアーゼレグマインは、ＡｐｏＥ−／−マウスのアテローム性動脈硬化プラーク中でおよび結紮されたマウス頚動脈中で形成された病変で高度に発現されることを示した。アテローム性動脈硬化を起こしやすいＡｐｏＥ−／−マウスでは、病変のエリアでのレグマイン発現での進行性の増加は疾患進行と関連した。レグマインタンパク質は、正常血管組織中で観察されなかった、また、２月齢ＡｐｏＥ−／−マウスの発達中の病変で最初に検出された。目立ったレグマイン発現は、６月齢および１年齢のＡｐｏＥ−／−マウスの進行したアテローム性動脈硬化病変で見つけられた。ＡｐｏＥ−／−マウスの結果と一致して、ＧＥＮＥＬＯＧＩＣ（登録商標）データベースを使用したデータマイニングにより、同じ患者の無症状の血管または無症状の患者の血管と比較して、ヒトアテローム性動脈硬化プラーク中でのレグマインｍＲＮＡ発現の２．４倍の増加を明らかにした（図１）。したがって、レグマイン発現のパターンは、血管炎症性障害（たとえばアテローム性動脈硬化）へのその関与を示唆した。
【０１４８】
マクロファージがアテローム性動脈硬化プラーク中で疾患関連性のレグマインを発現する主要な細胞型であるという発見もまた本明細書で開示される。マクロファージは、細胞外マトリックスリモデリングおよびプラーク不安定化に関係を有する細胞外リソソームプロテアーゼの豊富な源である。Ｒｅｄｄｙらは、単球由来マクロファージが、血管リモデリングに関与し得る活性なカテプシンＳおよびＬを細胞外環境中に分泌することを示した（Ｒｅｄｄｙら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：３８４９−５３）。他には、カテプシンＳおよびＬがアテローム性動脈硬化を機能的に促進し得ることが確認された（Ｌｉｕら（２００６）Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ１８４：３０２−１１；Ｓｕｋｈｏｖａら、前掲）。分化マクロファージは高いレベルのレグマインを発現し、細胞外スペース中にレグマインを分泌することができるという発見が本明細書に開示される。分泌されたレグマインは、プロ形態として見つけられたが、カテプシンＢ、Ｌ、およびＳを含む他のマクロファージ由来リソソームプロテアーゼを活性化する細胞外酸性微小環境中で活性になる可能性がある（たとえばＲｅｄｄｙら、前掲）。あるいは、レグマインは細胞内区画で活性化され、次いで、細胞表面と関連するようになる可能性がある。実際に、レグマインを過剰発現する２９３細胞が細胞表面レグマイン活性を呈したという発見が本明細書に開示される（たとえば図７；Ｌｉｕら（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：２９５７−６４もまた参照されたい）。この活性は、原形質膜と融合するエンドソーム／リソソーム膜の結果として細胞表面上に提示されたエンドソーム／リソソーム中の活性レグマインに起因する可能性がある（Ａｎｄｒｅｗｓ（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０：３１６−２１）。細胞膜結合は、成熟レグマイン酵素中のＲＧＤ配列を介したインテグリンへのレグマインの結合によって媒介される可能性がある。
【０１４９】
内因性細胞表面レグマイン活性は検出するのが困難となり得る、また病変微小環境中にのみ存在する可能性がある。たとえば、腫瘍細胞表面結合レグマインは、培養中の腫瘍細胞上ではなく腫瘍微小環境中で見つけられた（Ｌｉｕら、前掲；Ｗｕら（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６：９７０−８０）。さらに、レグマインは、循環中の単球上ではなく腫瘍関連性のマクロファージの表面上で検出された（Ｗｕら、前掲）。
【０１５０】
アテローム性動脈硬化での他の細胞外リソソームシステインプロテアーゼについて提唱された役割は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分解および組織リモデリングである。カテプシンＬおよびＳは、ＥＣＭ分解に直接関連するコラーゲン分解性およびエラスチン分解性の活性を持つ（Ｌｉｕら（２００６）前掲；Ｒｅｄｄｙら、前掲）。加えて、カテプシンＢおよびＬを含む数種のカテプシンはカスパーゼをプロセシングし、アポトーシスを誘発して、アテローム性動脈硬化病変の進展につながる可能性がある（Ｇｕｉｃｃｉａｒｄｉら（２０００）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０６：１１２７−３７；Ｉｓｈｉｓａｋａら（１９９９）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｄ．２４：４６５−７０；Ｖａｎｃｏｍｐｅｒｎｏｌｌｅら（１９９８）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４３８：１５０−５８）。ＥＣＭ成分およびカスパーゼがレグマイン基質であることは現在知られていない。しかしながら、レグマインは、ＭＭＰ−２ならびにカテプシンＢ、Ｈ、およびＬ等の他のコラーゲン分解性の／エラスチン分解性の酵素をプロセシングし活性化することにより間接的にＥＣＭ分解の一因となる可能性がある。そのタンパク質分解機能と共にアテローム性動脈硬化プラーク中のレグマインの存在は、レグマインの発現および活性の修飾因子が、アテローム性動脈硬化を治療し、予防し、または寛解させる方法で有用であることを示唆する。
【０１５１】
マクロファージは、周囲の組織の分解を引き起こすことにより慢性炎症性疾患状態の宿主組織に損傷を与えることが仮定される（Ｒｅｄｄｙら、前掲）。本明細書に提供された結果は、マウスＣＩＡモデルの関節炎の足でレグマインが発現することを示す。関節リウマチは慢性炎症性疾患であるので、レグマインがＣＩＡモデルの関節炎の関節中で発現されるといった発見は、おそらくマクロファージ活性を介したレグマイン媒介性の関節分解の役割を示唆する。加えて、数種の血管障害もまた炎症性障害である、つまり、たとえば血管の内膜の炎症は、少なくとも部分的に、血管系に対する損傷の原因となることに注目することは重要である。したがって、レグマインの修飾因子は、炎症性障害、たとえば関節リウマチを治療し、予防し、または寛解させる方法に使用することができる。
【０１５２】
細胞移動は、血管炎症性障害、たとえばアテローム性動脈硬化を含むが、これらに限定されない炎症性疾患の主要な特徴である。たとえば、動脈壁中への単球の移動は、泡沫細胞の形成におよび最終的に、進行したアテローム性動脈硬化病変の発症につながるアテローム性動脈硬化プロセスの初期のイベントである。本明細書に開示されるように、レグマインはナノモル濃度で単球の移動を誘発することができ、レグマインの化学遊走物質活性はＶＥＧＦと同じくらい効力があり得る。これは、レグマインが化学遊走物質特性を持つことを示唆する。
【０１５３】
内皮細胞層の単球侵入は、血管外遊出（たとえば白血球血管外遊出）として知られているプロセスによって生じると思われ、単球は、最初に、血管の内皮細胞層に付着し、次いで、基底膜および血管新生内膜に向かって、内皮細胞の間に押し入る（Ｊａｎｅｗａｙら（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，第４版，ｐ．６０７，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．／Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）。本発明は、レグマインが、アテローム性動脈硬化病変の部位への単球動員を誘発することを開示するので、レグマインおよび／またはＺＢ−１のアンタゴニストは、単球動員および単球血管外遊出の両方を予防するのに有用となるであろう。新生内膜中にうまく血管外遊出した単球は、普通、マクロファージに分化する。したがって、レグマインおよび／またはＺＢ−１のアンタゴニストはまた、アテローム性動脈硬化プラークの部位で単球分化を予防するであろう。
【０１５４】
さらに、これらの同じデータは、レグマインおよび／またはＺＢ−１のアゴニストおよびアンタゴニストが、血管外遊出の他の形態、たとえば、癌転移（さらに下記を参照されたい）、白血球血管外遊出等の他の形態をそれぞれ促進および阻害するのに有用であることを示唆するものである。当業者は、実施例（下記）に提示された前述の関連するアッセイに加えて、細胞移動、血管外遊出等のような細胞プロセス／活性に対するたとえばレグマインのアゴニストまたはアンタゴニストの生物学的効果を評価するための数種の確立されたアッセイを知っているであろう。
【０１５５】
レグマインの精製形態および熱変性形態の両方は化学遊走物質機能を保持するので、レグマインの化学遊走物質機能はそのプロテアーゼ活性と非依存性に思われ（データ示さず）、これは、線状ペプチド配列がレグマインの走化性機能を媒介することを示唆する。興味深いことには、プロテアーゼ非依存性生物活性がレグマインについて記載されている。レグマインの不活性プロ形態は、自己触媒的活性化の間に切断される１７ｋＤａ  Ｃ末端ペプチドレグマイン、ＯＩＰ−２（破骨細胞阻害ペプチド２）を含有する。レグマイン／ＯＩＰ−２は、破骨細胞への単球の分化を阻害することおよび骨吸収を阻害することが示された（Ｃｈｏｉら（２００１）前掲；Ｃｈｏｉら（１９９９）前掲）。したがって、レグマイン受容体は単球の表面上に存在する可能性があり、レグマインのＣ末端ペプチドは化学誘引を媒介するのに十分である可能性がある。そのため、レグマインは、たとえばプロテアーゼとしておよび化学遊走物質としてアテローム発生に二重の機能を呈する可能性がある。レグマインプロテアーゼ機能は細胞外マトリックス分解につながる可能性があり、化学遊走物質機能は、アテローム性動脈硬化病変中への単球動員およびプラーク中でのマクロファージ保持の一因となる可能性がある。レグマインの二重の機能のために、レグマインのアンタゴニストは、レグマインのタンパク質分解機能および走化性機能の両方を阻害するであろう、したがって、たとえばアテローム性動脈硬化の治療の方法で有用となるであろう。加えて、ＯＩＰ−２ならびに関連するアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、たとえば哺乳動物で、様々な血管障害または炎症性障害を治療し、寛解させ、または予防するのに有用である可能性がある。
【０１５６】
加えて、本発明は、レグマインがＡｐｏＥ−／−マウスの内皮細胞によって発現されることを教示し、この結果は、腫瘍血管内皮細胞の表面でのレグマインの検出に一致している（Ｗｕら、前掲）。本明細書に開示されるように、内皮細胞、たとえばＨＥＫ２９３細胞およびＨＵＶＥＣはレグマインに応じて遊走性の特性を増加させた。ヒト冠動脈中のプラーク血管新生の領域でレグマインを発現する炎症細胞の高濃度の検出と組み合わせたこの結果は、血管形成におけるレグマインの役割を示唆する。プラーク内血管形成は、アテローム性動脈硬化の重大な病理学的特徴であり、プラークの成長および脆弱性を増強すると考えられる（Ｍｏｕｌｔｏｎら（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１００：４７３６−４１；Ｍｏｕｌｔｏｎら（１９９９）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ９９：１７２６−３２）。マクロファージによって分泌されたレグマインは、内皮細胞移動、侵入、および増殖の促進による新生血管形成の一因となる可能性がある。したがって、レグマインの修飾因子は、血管形成、たとえばアテローム性動脈硬化および腫瘍成長に関連した血管形成を治療し、寛解させ、または予防する方法ならびに内皮細胞の増殖を阻害するまたは促進する（たとえば組織の血管再生での増殖および血管形成を促進する）方法で有用となる可能性がある。
【０１５７】
興味深いことには、レグマインは、細胞外マトリックスおよび細胞表面と関連して、腫瘍細胞の微小環境中に存在し、その中で活性であることが最近わかった。細胞外レグマイン活性が、機能的に、腫瘍細胞の転移性の挙動の一因となる可能性があることが示唆された。実際に、研究者らは、レグマインが、腫瘍細胞の浸潤突起での膜結合性小胞中におよびレグマインがインテグリンと共存する腫瘍細胞の表面上に見つけられることを示した（Ｌｉｕら（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：２９５７−６４；Ｗｕら（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６：９７０−８０）。レグマインはまた腫瘍病理で役割を果たすことが報告された（Ｍｕｒｔｈｙら（２００５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１１：２２９３−９９）。本明細書に開示されるように、レグマインは内皮細胞移動を促進することにより、血管形成で鍵となる役割を果たす。したがって、レグマイン活性は転移性の癌に関連する血管形成の促進に重要となるであろう、またレグマインおよび／またはＺＢ−１のアンタゴニストは腫瘍転移を治療し、寛解させ、および予防する方法に有用となる可能性がある。
【０１５８】
反対に、レグマインおよび／またはＺＢ−１のアゴニストは、血管形成の増加を必要とする状態を治療し、寛解させ、または予防する方法に有用となる可能性がある。たとえば、レグマインのアゴニストは、たとえば血管再生、創傷治癒、移植手術からの回復等を促進する方法で使用してもよい。
【０１５９】
要約すると、本明細書に提供されたデータは、リソソームプロテアーゼレグマインならびに血管障害および炎症性障害の間の新規な関係を確立する。これらの結果はまた、単球／マクロファージが、アテローム性動脈硬化関連性のレグマインの主要な源であることおよび細胞表面／細胞外レグマインが、たとえば細胞移動の刺激を通して、機能的に、疾患形成の一因となる可能性があることを示す。
【０１６０】
本出願の全体にわたって引用されたすべての刊行物、特許、特許出願、他の参考文献の全内容は、それらの全体が本明細書に参照によってこれによって組み込まれる。
【実施例】
【０１６１】
以下の実施例は、本発明の例示的な実施形態を提供し、決して本発明を限定するものではない。当業者は、多数の他の実施形態が本発明の範囲内に包含されることを認識するであろう。
【０１６２】
実施例は、ベクターの構築、ポリペプチドをコードする遺伝子の前述のベクターおよびプラスミド中への挿入、前述のベクターおよびプラスミドの宿主細胞への導入、ならびに宿主細胞での前述のベクターおよびプラスミドからのポリペプチドの発現に利用される方法等の従来の方法の詳細な説明を含まない。前述の方法は当業者によく知られている。
【０１６３】
（実施例１）
レグマインは、ヒトアテローム性動脈硬化サンプル中でおよびＡｐｏＥ−／−マウスでアテローム性動脈硬化疾患進行の間に高度に発現される
システインプロテアーゼがアテローム性動脈硬化病変に関連する可能性があるかどうかを決定するために、レグマインの発現パターンをヒトアテローム性動脈硬化動脈サンプル中で分析した。
【０１６４】
実施例１．１：ヒトアテローム性動脈硬化でのレグマインの発現プロファイリング
ヒトアテローム性動脈硬化プラークおよびヒトプラークなし動脈サンプルの発現データをＧＥＮＥＬＯＧＩＣ（商標）データベースからダウンロードした。そのデータは、ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ（登録商標）（サンタクララ、ＣＡ）Ｈｇ＿１３３Ａ  ＧＥＮＥＣＨＩＰ（商標）オリゴヌクレオチドマイクロアレイへのＲＮＡのハイブリダイゼーションから生成された。データ分析はＧＥＮＥＳＰＲＩＮＧ（商標）を使用して実行した。標準化したデータを、コントロールの平均と比較して発現のレベルが増加したまたは減少した遺伝子転写物についてフィルターにかけた。発現のレベルが増加した遺伝子転写物は、少なくとも７０％のサンプルで「Ｐｒｅｓｅｎｔ」のコール、頻度＞５、および少なくとも２倍の発現の変化を有していなければならなかった。減少した遺伝子転写物は、少なくとも７０％のサンプルで「Ｐｒｅｓｅｎｔ」のコール、頻度＞５、および少なくとも２倍の発現の変化を有していなければならなかった。統計分析はＧＥＮＥＳＰＲＩＮＧ（商標）ｖ６．１を使用して実行した。
【０１６５】
実施例１．２：結果
レグマイン発現は、プラークなしセグメントまたは非疾患動脈サンプルと比較して、プラークを含有するヒトアテローム性動脈硬化動脈サンプルで増加した（図１）。
【０１６６】
（実施例２）
レグマインは、ＡｐｏＥ−／−マウスの大動脈弓、冠動脈、および大動脈洞のアテローム性動脈硬化病変で高度に発現される
アテローム性動脈硬化を起こしやすいアポリポタンパク質Ｅ欠損（ＡｐｏＥ−／−）マウスでの疾患進行と関連する遺伝子発現をマイクロアレイ分析によって決定した。ＡｐｏＥ−／−マウスは、大動脈洞、大動脈弓、および冠動脈の近位部分を含む血管系で特異的局在でアテローム性動脈硬化病変の形成を誘発する重症の高コレステロール血症を発症する（Ｎａｋａｓｈｉｍａら（１９９４）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｈｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．１４：１３３−４０；Ｒｅｄｄｉｃｋら（１９９４）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．１４：１４１−４７）。
【０１６７】
実施例２．１：動物および組織調製物
動物研究はすべてＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ社（ジャーマンタウン、ＮＹ）のオスＡｐｏＥ  ＫＯ（ＡｐｏＥ−／−）およびＣ５７ＢＬ／６マウスを通常の固形飼料食餌で維持し、選択した時点で安楽死させた。マウスはすべて１００％ＣＯ2の吸入によって屠殺し、左心室を通して注射した食塩水で灌流した。心臓および大動脈弓は、遺伝子発現研究に備えて、ＲＮＡＬＡＴＥＲ（登録商標）（Ａｍｂｉｏｎ社、オースティン、ＴＸ）でさらに灌流し、収集し、凍結させた。組織学的研究については、左心室を通した生理食塩水での灌流の後に４％パラホルムアルデヒドでの灌流を続けた。心臓、大動脈弓、および腎臓（下記参照）は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションまたは免疫組織化学に備えて、４％パラホルムアルデヒド中に一晩保存し、７０％エタノールに切り換え、脱水し、パラフィンブロックに包埋した。パラフィン包埋心臓サンプルは、大動脈洞内に位置する組織切片を収集するために先に記載されるように薄切した（Ｐａｉｇｅｎら（１９８７）Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ６８：２３１−４０）。
【０１６８】
実施例２．２：Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘハイブリダイゼーションおよび分析
実施例２．２．１：ＲＮＡ分析
全ＲＮＡを、ＡｐｏＥ  ＫＯ（ＡｐｏＥ−／−）マウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウスで、選択した時点で収集したプールした大動脈弓（ｎ＝３〜５）から単離精製した。全ＲＮＡをＲＮＡＥＡＳＹ（商標）ミニキットサンプル溶解緩衝液（ＲＬＴ）を使用して単離し、ＲＮＡをメーカーの推奨（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、ＣＡ）に従って精製した。各サンプルについて、全ＲＮＡを２６０ｎｍでのＵＶ吸収の計測値から定量し、一定分量を、Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標）２１００  ＢＩＯ  ＡＮＡＬＹＺＥＲ（商標）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、パロアルト、ＣＡ）で分析して、ＲＮＡ完全性を決定した。
【０１６９】
実施例２．２．２：オリゴヌクレオチドアレイ分析のためのハイブリダイゼーション溶液の調製
二本鎖ｃＤＮＡは、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（商標）Ｃｈｏｉｃｅキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバッド、ＣＡ）およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有する３３ｐｍｏｌのオリゴｄＴプライマー（Ｐｒｏｌｉｇｏ社、ＬＬＣ、ボールダー、ＣＯ）を使用して３〜５μｇの全ＲＮＡから調製した。第１鎖ｃＤＮＡ合成を以下のキット成分の添加により開始した：１×の第１鎖緩衝液、１０ｍＭのＤＴＴ、５００ｍＭのｄＮＴＰ、４００ＵのＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（商標）ＲＴ  ＩＩ、および４０ＵのＲＮＡ分解酵素阻害剤。反応は１時間４７℃で進んだ。第２鎖合成は以下のキット成分の添加により進んだ：１×の第２鎖緩衝液、２００ｍＭのさらなるｄＮＴＰ、４０Ｕの大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、２Ｕの大腸菌ＲＮＡ分解酵素Ｈ、１０Ｕの大腸菌ＤＮＡリガーゼ。反応は２時間１５．８℃で進んだ。６Ｕの最終濃度（ストック１ｍｌ当たり３０００Ｕの２μｌ）のＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、ビバリー、ＭＡ）を第２鎖反応の最後の５分間に添加した。二本鎖ｃＤＮＡを、メーカーによって記載されるようにＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）Ｓａｍｐｌｅ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｍｏｄｕｌｅを使用して精製した（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、サンタクララ、ＣＡ）。精製ｃＤＮＡ（１０μｌ）を、メーカーのプロトコール（Ｅｎｚｏ社、ファーミンデール、ＮＹ）に従って、Ｂｉｏａｒｒａｙ  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  ＲＮＡ  ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴ  ＬＡＢＥＬＩＮＧ  ＫＩＴ（Ｔ７）（商標）で転写した。ビオチン標識アンチセンスｃＲＮＡを、メーカーによって記載されるようにＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）Ｓａｍｐｌｅ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｍｏｄｕｌｅを使用して精製した（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製、サンタクララ、ＣＡ）。ｃＲＮＡ収量を２６０ｎｍでのＵＶ吸収の計測値から決定した。
【０１７０】
実施例２．２．３：オリゴヌクレオチドマイクロアレイハイブリダイゼーション手順
断片化ｃＲＮＡ（１５μｇ）を先に記載されるように調製し（Ｂｙｒｎｅら（２０００）Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｆｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ，Ａｕｓｕｂｅｌら（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ中）、メーカー（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、サンタクララ、ＣＡ）によって示唆されるように、それを使用してオリゴヌクレオチドマイクロアレイハイブリダイゼーション溶液を作り出した。ハイブリダイゼーション溶液は、それぞれ異なる既知濃度の１１個の原核生物ＲＮＡのミックスを含有し（Ｈｉｌｌら、前掲）、これらは、各マイクロアレイについての内部標準曲線を作り出すために使用し、検出された遺伝子の頻度を決定するために補間した。ハイブリダイゼーション溶液を９５℃で１〜２分間加熱し、２分間最高速度で微量遠心して不溶性破片をペレットにした。標識ｃＲＮＡ溶液を、ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ（登録商標）（サンタクララ、ＣＡ）Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  ４３０  ２．０  ＧＥＮＥＣＨＩＰ（商標）オリゴヌクレオチドマイクロアレイにハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションの後で、ｃＲＮＡ溶液を回収し、マイクロアレイを洗浄し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のプロトコールに従ってスキャニングのために調製した。生の蛍光発光データを収集し、ＧＥＮＥＣＨＩＰ（商標）ＭＡＳ  ５．０ソフトウェアアプリケーション（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、サンタクララ、ＣＡ）を使用して減じた。頻度は細菌ＲＮＡ標準曲線を使用して決定した（Ｈｉｌｌら（２００１）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．２（１２）：ｒｅｓｅａｒｃｈ００５５．１−００５５．１３）。
【０１７１】
実施例２．２．４：発現プロファイリングデータの分析
データを、コントロールの平均と比較して発現のレベルが増加したまたは減少した遺伝子転写物についてフィルターにかけることにより補正した。発現のレベルが増加した遺伝子転写物は、少なくとも７０％のサンプルで「Ｐｒｅｓｅｎｔ」のコール、頻度＞５、および少なくとも２倍の発現の変化を有していなければならなかった。減少した遺伝子転写物は、少なくとも７０％のコントロールで「Ｐｒｅｓｅｎｔ」のコールおよび頻度＞５ならびに少なくとも７０％のサンプルで少なくとも２倍の発現の変化を有していなければならなかった。統計分析は、Ｗｅｌｃｈの分散分析および数種の多重検定補正（multiple testing correction）を使用してＧＥＮＥＳＰＲＩＮＧ（商標）ｖ６．１（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、パロアルト、ＣＡ）によって分析した（ＢｅｎｊａｍｉｎｉおよびＨｏｃｈｂｅｒｇの偽発見率（False Discovery Rate）ならびにＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重検定補正−ファミリーワイズエラー率（Family-wise error rate）（ＦＷＥＲ）ｐ＜０．０５）。レグマインの条件を満たすものをさらなる分析のために選んだ。
【０１７２】
実施例２．３：ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）リアルタイム定量的ＰＣＲ
ＲＮＡを、メーカーの指示に従ってＲＮＥＡＳＹ（登録商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、ＣＡ）を使用してマウス組織（またはＴＨＰ−１細胞；下記を参照されたい）から単離精製した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７０００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フォスターシティ、ＣＡ）を使用して、レグマインｍＲＮＡレベルを、先に記載されるように（Ｌａｋｅら（２００５）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４６：２４７７−８７）、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）リアルタイム定量的ＰＣＲによって、Ａｓｓａｙ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ  ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）試薬（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フォスターシティ、ＣＡまたはＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社、サンディエゴ、ＣＡ）を用いて測定した。以下のプライマーを使用した：ＣＣＡＧＧＡＧＧＣＴＧＴＡＡＣＣＣＡＣＴＴ（フォワードプライマー；配列番号１４）およびＧＣＡＡＧＧＣＡＴＧＣＴＣＧＴＡＣＧＴ（リバースプライマー；配列番号１５）。データをメーカーの指示に従って分析した。
【０１７３】
実施例２．４：ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
マウスレグマインのセンスリボプローブおよびアンチセンスリボプローブは、センスリボプローブについてはＰＣＲ産物の５’末またはアンチセンスリボプローブについてはＰＣＲ産物の３’末にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ結合部位を有する２つの非依存性ＰＣＲ産物を生成することにより産生した。ジゴキシゲニン標識プローブは、ＤＩＧ  ＲＮＡ標識ミックスおよびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、マンハイム、ドイツ）を使用してメーカーによって記載されるように調製した。プライマーおよびプローブ配列を表２（下記）に記載する。
【０１７４】
パラフィン包埋組織の切片はキシレンを用いて脱パラフィンし（２回取り替え、各３分間）、水中で再水和した。ＲＮＡ分解酵素なしの水およびリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中でのすすぎの後、透過処理を、１５分間、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００／ＰＢＳを用いたインキュベーションによって実行した。各３分間のＰＢＳを用いた２回の洗浄の後に、切片はプロテイナーゼＫ（ＰＫ）（Ｓｉｇｍａ社、セントルイス、ＭＯ）処置の準備ができた。切片は、１５分間、５ｍｇ／ｍｌ  ＰＫを含有する、３７℃で予熱した０．１Ｍ  Ｔｒｉｓおよび５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ社）（ｐＨ８．０）中に浸漬した。ＰＫ活性を５分間０．１Ｍグリシン／ＰＢＳによって停止させ、その後、３分間の４％パラホルムアルデヒドを用いた後固定およびＰＢＳでのすすぎを後に続けた。プローブの非特異的静電気的結合を予防するために、切片は、１０分間０．２５％無水酢酸および０．１Ｍトリエタノールアミン溶液（ｐＨ８．０）中に、その後４℃で２０％酢酸中に１５秒間浸漬した。各５分間でＰＢＳを３回取り替えた後、切片は、各３分間で、７０％、９０％、および１００％エタノールを通して脱水した。切片は、４０ｍｌのプレハイブリダイゼーション緩衝液を適用する前に完全に風乾し、パラフィルムで覆い、３０分間５２℃でインキュベートして非特異的結合を低下させた。パラフィルムを除去し、５ｎｇ／ｍｌのジゴキシゲニン標識プローブを含有する４０ｍｌのハイブリダイゼーション緩衝液を各切片に適用し、パラフィルムで再び覆い、湿気のあるチャンバーで５２℃で一晩インキュベートした。
【０１７５】
パラフィルムを注意深く除去し、切片を、ＧＥＮＯＭＸ（商標）ｉ６０００（Ｂｉｏｇｅｎｅｘ社、サンラーモン、ＣＡ）自動染色システム中に置いた。切片は、２×クエン酸ナトリウム生理食塩水（ＳＳＣ）／０．１％ラウリル硫酸塩（ＳＤＳ）（共にＳｉｇｍａ社）中で各５分間で４回取り替えて室温で洗浄し、特異的ハイブリダイゼーションシグナルのみが残存していることを確実にするために、切片は、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳを含有する高ストリンジェンシー溶液中で各５分間で２回取り替えて５２℃で洗浄した。内因性ペルオキシダーゼ染色を低下させるために、切片を１５分間３％Ｈ2Ｏ2中でインキュベートし、その後緩衝液中での３回の洗浄を続けた。標識プローブは、２％正常ヒツジ血清／０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で１：５００に希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体に抱合した抗ジゴキシゲニン抗体（Ｒｏｃｈｅ社、ナトリー、ＮＪ）を用いて１時間検出した。ビオチン化複合体を、Ｔｙｒａｍｉｄｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＴＳＡ（商標））（Ｂｉｏｇｅｎｅｘ社、サンラーモン、ＣＡ）を使用して増幅した。切片を５分間ＴＳＡを用いてインキュベートし、その後緩衝液中での５回の洗浄を続けた。ＴＳＡ複合体を、次いで、１５分間、西洋ワサビペルオキシダーゼを用いたインキュベーションによってさらに増幅し、その後緩衝液中での５回の洗浄を続けた。増幅産物を、１０分間、３，３’−ジアミノベンジジン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社、バーリンゲーム、ＣＡ）を用いて現像し、水中で洗浄し、Ｍａｙｅｒのヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ社）を用いてしばらくの間染色し、キシレンへの段階的アルコールを通して脱水し、顕微鏡検査の前にＤＰＸマウント溶液中にマウントした。
【０１７６】
【表２】
2009538140.tif 000004
【０１７７】
実施例２．５：免疫組織化学および組織学
パラフィン包埋組織の４μｍ厚切片を脱パラフィンし、再水和した。Ｍａｓｓｏｎトリクローム染色をメーカーの指示（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ＭａｓｔｅｒＴｅｃｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ロディ、ＣＡ）に従って実行した。免疫組織化学については、組織切片を、メーカーの指示に従って、熱媒介性の抗原賦活処置（Ｔａｒｇｅｔ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ＤＡＫＯ社、カーピンテリア、ＣＡ；ＤＥＣＬＯＡＫＩＮＧ  ＣＨＡＭＢＥＲ（商標）、Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ社、コンコード、ＣＡ）にかけ、その後、非特異的バックグラウンド染色のブロッキングを続けた（Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｌｏｃｋ、ＤＡＫＯ社、カーピンテリア、ＣＡ）。レグマインの免疫蛍光検出は、ヒツジ抗マウスレグマイン一次抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネアポリス、ＭＮ）およびロバ抗ヒツジＡｌｅｘａ５９４二次抗体またはロバ抗ヒツジＡｌｅｘａ４８８二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、ユージーン、ＯＲ）を使用して達成した。レグマインの色素検出は、ヒツジ抗マウスレグマイン一次抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネアポリス、ＭＮ）およびアルカリホスファターゼ二次抗体に抱合したウサギ抗ヒツジＩｇＧを使用して実行した。シグナルの検出は、添加したレバミゾール溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社）と共に５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファート／ニトロブルーテトラゾリウム基質（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社、バーリンゲーム、ＣＡ）および核Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ対比染色を使用して得た。ＣＤ６８の免疫検出は、ラット抗マウスＣＤ６８一次抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ社、ローリー、ＮＣ）およびウサギ抗ラットＡｌｅｘａ４８８二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、ユージーン、ＯＲ）を使用して得た。ＣＤ６８およびレグマインの二重免疫蛍光染色については、上記に記載されるように適切な二次抗体を適用する前に、ＣＤ６８およびレグマインの一次抗体のカクテルを使用した。
【０１７８】
Ｐ−セレクチンの免疫検出は、内因性のビオチンおよびアビジンを市販のキット（＃Ｘ０５９０、ＤＡＫＯ社、カーピンテリア、ＣＡ）を使用してブロックした組織切片に適用した、ビオチンに抱合されたヤギ抗マウスＰ−セレクチン一次抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネアポリス、ＭＮ）を使用して得た。次いで、免疫蛍光シグナルは、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（登録商標）Ｈａｒｄｓｅｔ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社、バーリンゲーム、ＣＡ）中にマウントしたスライドで、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８に抱合されたストレプトアビジン（Ｓ３２３５４、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、ユージーン、ＯＲ）を使用して検出した。Ｐ−セレクチンおよびレグマインの二重免疫蛍光染色については、上記に記載されるＰ−セレクチン一次抗体およびラット抗マウスレグマイン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ＃  ＭＡＢ２０５８、クローン３０１４１７、ミネアポリス、ＭＮ）一次抗体のカクテルを使用した。Ｐ−セレクチンの検出は本明細書に記載されるように得、その場合にレグマインを検出するために使用した二次抗体は、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５９４に抱合されたウサギ抗ラット抗体とした。
【０１７９】
実施例２．６：結果
レグマインｍＲＮＡは、２５週齢から始まる、ＡｐｏＥ−／−マウスの大動脈弓中で上方調節された遺伝子のうちの１つとして同定された（統計的有意差はアスタリスクによって表される）が、Ｃ５７ＢＬ／６（野生型（ＷＴ））コントロール動物（図２）では長い間にわたって不変のまま低レベルで発現した。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）リアルタイムＰＣＲ分析により、１２週齢ＡｐｏＥ−／−マウスまたはコントロール４０週齢Ｃ５７ＢＬ／６（ＷＴ）コントロールマウスと比較した、成体ＡｐｏＥ−／−マウス（４０および５４週目）でのレグマインｍＲＮＡの増加を確認した（図３）。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、５５週齢ＡｐｏＥ−／−大動脈弓中で発現されたレグマインｍＲＮＡが検出されたが、コントロールプローブで染色した、４５週齢Ｃ５７ＢＬ／６の１つまたは複数のコントロール切片では検出されなかった（データ示さず）。
【０１８０】
免疫組織化学的染色により、レグマインタンパク質がＡｐｏＥ−／−マウスの大動脈洞の病変で発現されることを実証した（データ示さず）。大動脈洞では、レグマイン発現は、２月齢ＡｐｏＥ−／−マウスで最初に検出可能となった（データ示さず）。発現の増加は、発達中のアテローム性動脈硬化プラークでより高齢なマウスで検出された。１年齢ＡｐｏＥ−／−マウスでは、レグマインは、浸潤炎症細胞のエリアのアテローム性動脈硬化病変内に見つけられた（データ示さず）。レグマインは、成体Ｃ５７ＢＬ／６コントロールマウスの大動脈洞中では検出されなかった（データ示さず）。
【０１８１】
（実施例３）
レグマインは、加速化アテローム性動脈硬化のＡｐｏＥ−／−マウスモデルで発現される
レグマイン発現がＡｐｏＥ−／−マウスで自発的に発達しているアテローム性動脈硬化病変に限られるものであったかどうかを決定するために、レグマインの発現パターンを、血管外傷の後で、加速化アテローム性動脈硬化のモデルで分析した。
【０１８２】
実施例３．１：加速化アテローム性動脈硬化のマウスモデルの調製
動物のサブセットに、先に記載されるように左頚動脈結紮を受けさせた（Ａ．ＫｕｍａｒおよびＶ．Ｌｉｎｄｎｅｒ（１９９７）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１７：２２３８−４４）。しばらくの間、８〜１０週齢ＡｐｏＥ  ＫＯマウスを、腹腔内に注射したケタミン（１００ｍｇ／体重ｋｇ）およびキシラジン（２０ｍｇ／ｋｇ）の溶液で麻酔した。首で小さく正中切開して左総頚動脈を露出させた。動脈は、頚動脈の分岐のすぐ近位で完全に結紮して、血流を途絶させた。動物を４週間回復させた。回復期間の終わりに、動物を、本明細書に記載されるように安楽死させ、生理食塩水および４％パラホルムアルデヒドを用いて灌流し、左および右頚動脈の５ｍｍ長セグメントを収集して、免疫組織化学による分析のためにパラフィンブロックに包埋した。
【０１８３】
実施例３．２：結果
免疫組織化学的染色により、結紮の後の４週目に外傷頚動脈の新生内膜病変でレグマイン発現が検出されることを実証した（データ示さず）。正常ＩｇＧを使用するコントロール染色はいかなるシグナルをも検出しなかった（データ示さず）。抗レグマイン抗体を用いた無傷頚動脈の染色はいかなるシグナルをも示さなかった（データ示さず）。
【０１８４】
（実施例４）
レグマインはアテローム性動脈硬化病変の泡沫細胞中で発現される
アテローム性動脈硬化病変でレグマインと関連する細胞の種類を同定するために、細胞をレグマインおよびマクロファージマーカーＣＤ６８について免疫染色した。
【０１８５】
実施例４．１：レグマインおよびマクロファージマーカーについての、アテローム性動脈硬化病変の免疫染色
ＣＤ６８の免疫検出は、ラット抗マウスＣＤ６８一次抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ社、ローリー、ＮＣ）およびウサギ抗ラットＡｌｅｘａ４８８二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、ユージーン、ＯＲ）を使用して得た。二重免疫蛍光染色については、上記に記載されるように適切な二次抗体を適用する前に、ＣＤ６８およびレグマインの一次抗体のカクテルを使用した。レグマインの色素検出を本明細書に記載されるように実行した。
【０１８６】
実施例４．２：結果
色素染色および免疫蛍光染色により、レグマインタンパク質が冠動脈内のアテローム性動脈硬化プラークに局在化することを明らかにした（データ示さず）。また、大動脈洞で発達している病変でマクロファージマーカーＣＤ６８と共存するレグマインは、アテローム性動脈硬化プラーク中でレグマインを発現する主要な細胞型がマクロファージおよび泡沫細胞であることを示した（データ示さず）。
【０１８７】
（実施例５）
レグマインは大動脈洞の動脈内皮細胞によって発現される
レグマインが動脈内皮細胞によって発現されるかどうかを決定するために、細胞を、レグマインおよび内皮マーカー、Ｐ−セレクチンの両方について免疫染色した。
【０１８８】
実施例５．１：レグマインおよび内皮細胞マーカーについての、アテローム性動脈硬化病変の免疫染色
Ｐ−セレクチンの免疫検出は、ビオチンに抱合されたヤギ抗マウスＰ−セレクチン一次抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、その後、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８に抱合されたストレプトアビジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、ユージーン、ＯＲ）を使用して実行した。二重免疫蛍光染色については、二次抗体およびストレプトアビジンを適用する前に、レグマインおよびＰ−セレクチンの一次抗体のカクテルを使用した。
【０１８９】
実施例５．２：結果
免疫蛍光染色により、レグマインが、初期の炎症性病変の表面を覆う内皮細胞を含む、２月齢〜１年齢のＡｐｏＥ−／−マウスの大動脈洞の動脈内皮細胞によって発現されることを明らかにした（データ示さず）。
【０１９０】
（実施例６）
レグマインは、ＡｐｏＥ−／−マウスの腎動脈の腎臓近位尿細管細胞および内皮細胞内に発現される
腎病理での血管の機能不全および炎症プロセスの関与により、レグマインおよびの発現をＡｐｏＥ  ＫＯマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウスの腎臓で測定した。
【０１９１】
実施例６．１：材料
オスＡｐｏＥ  ＫＯマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウスから腎臓を摘出し、調製し、腎臓および腎動脈でのレグマインの発現を評価するために上記に記載されるように免疫組織化学分析にかけた。Ｐ−セレクチンを内皮細胞のマーカーとして使用した。
【０１９２】
実施例６．２：結果
ＡｐｏＥ  ＫＯ（ＡｐｏＥ−／−）マウスから単離した腎臓のレグマインタンパク質の免疫検出により、レグマインが腎臓近位尿細管細胞で優勢に発現されることを明らかにした（データ示さず）。Ｃ５７ＢＬ／６マウスでのレグマインおよびｐ−セレクチンについての二重免疫染色により、その２つのタンパク質が共存することおよびレグマインがマウス腎動脈の内皮細胞によって一貫して発現されることを明らかにした（データ示さず）。
【０１９３】
（実施例７）
ヒトアテローム性動脈硬化病変でのレグマインの発現
レグマインはまたヒトアテローム性動脈硬化病変で発現されるかどうかを決定するために、ヒト冠動脈切片をレグマイン発現について免疫染色した。
【０１９４】
実施例７．１：ヒト冠動脈免疫染色
進行したアテローム性動脈硬化プラークを有する５７歳の女性由来のヒト冠動脈を、ヤギ抗ヒトレグマイン一次抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）およびビオチン化ウサギ抗ヤギＩｇＧ二次抗体を使用してレグマインについて染色した。
【０１９５】
実施例７．２：結果
免疫組織化学実験により、レグマインタンパク質が正常ヒト冠動脈中では発現されないことを示した。対照的に、レグマインタンパク質は、進行した冠動脈アテローム性動脈硬化プラーク中で、プラークの線維性の部分および石灰化された部分の表面を覆う泡沫細胞の領域で、ならびに血管新生の部位で炎症細胞によって主に発現された（データ示さず）。
【０１９６】
（実施例８）
レグマインの発現および活性は、分化ＴＨＰ１単球および活性化初代ヒトマクロファージ中で増加する
レグマインの発現およびレグマインの酵素活性を、分化ＴＨＰ−１マクロファージおよびＣＳＦ刺激ヒトマクロファージ中で測定した。
【０１９７】
実施例８．１：細胞培養
ヒト単球のＴＨＰ−１細胞をＡＴＣＣから得て、１０％のウシ胎児血清およびβ−メルカプトエタノールを含有する、ＲＰＭＩ  １６４０培地（ＡＴＣＣ）中で維持した。ＴＨＰ−１単球を、１００μｇ／ｍｌホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）（Ｓｉｇｍａ社）を含有する成育培地中で３日間にわたりマクロファージに分化させた。
【０１９８】
実施例８．２：ヒト初代細胞培養条件
ヒト単球を、メーカーのプロトコールに従って、Ｒｏｓｅｔｔｅｓｅｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔカクテル（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、バンクーバー、ＢＣ）を使用して献血者のバフィーコート副産物から単離した。単球純度を、Ｃｅｌｌｄｙｎｅ臨床細胞カウンター（Ａｂｂｏｔｔ社、アラミダ、ＣＡ）によって８８％と決定した。単球は、ペニシリン、ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、２．５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｓｉｇｍａ社）、および１０％熱不活性化ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社、ローガン、ＵＴ）を補足したＲＰＭＩ中で２×１０6細胞／ｍｌに懸濁し、３７℃での、１０ｃｍ組織培養皿（Ｆａｌｃｏｎ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ロックビル、ＭＤ）のプラスチックへの２時間の付着によってさらに豊富にした。
【０１９９】
付着細胞を勢いよく洗浄し、０．２５％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ中で、２０ｎｇ／ｍｌ組換えヒトマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネアポリス、ＭＮ）の存在下または非存在下で７２時間培養した。上清を採取し、遠心分離によって浄化し、−８０℃で保存した。細胞を、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ社、ナトリー、ＮＪ）を含有する０．５ｍｌ修正ＲＩＰＡ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＮＰ４０、０．２５％デオキシコール酸）中にこすり取り、氷上で１５分間インキュベートした。不溶性物質を遠心分離によって除去し、上清を−８０℃で保存した。
【０２００】
実施例８．３：ウエスタンブロット分析
タンパク質抽出物は、プロテアーゼ阻害剤錠剤（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、ナトリー、ＮＪ）を補足した溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５のｍＭ  ＥＤＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、５ｍＭ  ＤＴＴ  ）中で細胞を溶解することによりＴＨＰ−１細胞またはヒトマクロファージから調製した。細胞溶解物を続いて遠心分離によってきれいにした。上清を収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、ヘラクレス、ＣＡ）に転写し、ＥＣＬ検出の前に一次抗体および二次抗体を用いてインキュベートした（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、ナトリー、ＮＪ）。使用した抗体は、抗アクチンポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、サンタクルーズ、ＣＡ）および抗レグマインポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネアポリス、ＭＮ）を含む。
【０２０１】
実施例８．４：レグマイン活性アッセイ
レグマインプロテアーゼ活性を測定する蛍光定量的アッセイをいくつか修正して先に記載されるように実行した（Ｊｏｈａｎｓｅｎら（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７３：２７８−８３）。細胞抽出物（２０〜５０μｌ）を９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、１０ｎＭの基質Ｚ−ＡＡＮ−ＭＣＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を含有する１５０μｌのアッセイ緩衝液をそれらに添加した。プレートを５分間室温でインキュベートし、ＶＩＣＴＯＲ  ３（商標）蛍光発光プレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、ウェルズリー、ＭＡ）中で３６０ｎｍの励起フィルターおよび４６０ｎｍの発光フィルターを使用して蛍光発光について測定した。繰り返し測定を、室温で、２０分間の期間にわたり５分間毎に１回行った。長い間にわたる蛍光発光の増加をプロットした。
【０２０２】
実施例８．５：ＴＡＱＭＡＮ（商標）リアルタイム定量的ＰＣＲ
ＲＮＡを、メーカーの指示に従ってＲＮＥＡＳＹ（商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、ＣＡ）を使用してマウス組織またはＴＨＰ−１細胞から単離精製した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（商標）７０００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フォスターシティ、ＣＡ）を使用して、レグマインｍＲＮＡレベルを、先に記載されるように（Ｌａｋｅら（２００５）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４６：２４７７−８７）、ＴＡＱＭＡＮ（商標）リアルタイム定量的ＰＣＲによって、オーダーメイドＴＡＱＭＡＮ（商標）試薬（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フォスターシティ、ＣＡまたはＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社、サンディエゴ、ＣＡ）を用いて測定した。以下のプライマーを使用した：フォワードプライマー（配列番号１４）およびリバースプライマー（配列番号１５）。データをメーカーの指示に従って分析した。
【０２０３】
実施例８．６：結果
未分化ＴＨＰ−１単球と比較して、レグマインｍＲＮＡ（図４Ａ）、タンパク質（図４Ｂ）、およびプロテアーゼ活性（図４Ｃ）は分化ＴＨＰ−１マクロファージで顕著に増加した。加えて、Ｍ−ＣＳＦを用いて分化させたヒトマクロファージはまた、レグマインタンパク質（図５Ａ）および活性（図５Ｃ）の増加を呈した。ウエスタン分析によって、分泌レグマイン（プロレグマイン）は、Ｍ−ＣＳＦ処置ヒトマクロファージの条件培地中で検出された（図５Ｂ）。これらの結果は、分化マクロファージが高いレベルのレグマインを発現し、細胞外環境中にレグマインを分泌することができるということを実証する。
【０２０４】
（実施例９）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化ヒト単球へのレグマイン化学遊走特性
細胞外環境中に放出されたレグマインが単球動員の一因となる化学遊走物質分子として働くかどうかを決定するために、レグマインの精製プロ形態への初代ヒト単球の移動を改造したＢｏｙｄｅｎチャンバーで試験した。
【０２０５】
実施例９．１：ヒト単球移動アッセイ
ヒト単球を、メーカーの指示に従ってＭｏｎｏｃｙｔｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用い、ネガティブ選択法を使用して健常ドナーの血液から単離した。単離単球の純度をＣＤ１４染色細胞のフローサイトメトリーによって確認した。細胞を、Ｍｕｌｔｉ  Ｓｃｒｅｅｎ  ９６ウェル濾過プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、５．０μｍのポアサイズ）を使用して、改造したＢｏｙｄｅｎチャンバーでのアッセイで試験した。血清欠乏単球を上部チャンバーに添加し（２０，０００細胞／ウェル）、無血清培養培地を精製レグマイン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）ありおよびなしで下部チャンバーに添加した。ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）をポジティブコントロールとして使用した。下部チャンバーに移動した細胞を、２時間の時点で発光細胞生存率アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）アッセイ、Ｐｒｏｍｅｇａ社、マディソン、ＷＩ）を使用して定量化した。
【０２０６】
実施例９．２：結果
レグマインへのヒト単球の移動の用量依存性の増加が観察された（図６）。２５ｎｇ／ｍＬの用量がレグマインの最小有効濃度であることがわかり、コントロールと比較して単球の移動で２．３倍の増加を誘発した。２５ｎｇ／ｍＬのレグマインおよび１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦに応じて移動した細胞の数は類似していた。
【０２０７】
（実施例１０）
活性レグマインは組換え過剰発現細胞の細胞表面上に発現される
レグマインが細胞表面上に発現されるかどうかを決定するために、マウスレグマインを過剰発現するＣＨＯ細胞を生成し、細胞表面レグマインについてアッセイした。前述の細胞表面レグマインが酵素的に活性かどうかを決定するために、レグマインを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞をレグマインプロテアーゼ活性についてアッセイした。
【０２０８】
実施例１０．１：ＣＨＯ細胞の蛍光抗体染色
５００のＭＯＩで、マウスレグマインを発現するアデノウイルスでＣＨＯ細胞を感染させた。感染の４８時間後、細胞を２０分間４℃でＰＢＳ中２％のパラホルムアルデヒドで固定した。３０分間室温でブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中１０％ＦＢＳ、３％ＢＳＡ）を用いて細胞をブロックした後、細胞は、ヒツジ抗マウスレグマイン抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネアポリス、ＭＮ）またはコントロールの正常ヒツジＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、サンタクルーズ、ＣＡ）で１時間室温でインキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、１時間室温でＡｌｅｘａ４８８抱合ロバ抗ヒツジ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、ユージーン、ＯＲ）でインキュベートした。ＰＢＳでの３回の洗浄の後、細胞を室温で５分間Ｈｏｅｃｈｓｔ染料（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、ユージーン、ＯＲ）を用いて対比染色した。細胞を、続いて、４０×の倍率で蛍光顕微鏡下で撮影した。
【０２０９】
実施例１０．２：ＨＥＫ２９３細胞表面レグマイン活性のアッセイ
ＨＥＫ２９３細胞を９６ウェル黒色組織培養プレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）中で平板培養し、１０のＭＯＩで、マウスレグマインを発現するアデノウイルスで感染させた。感染の２４時間後、細胞をレグマインアッセイ緩衝液で洗浄し［３９．５ｍＭクエン酸、１２５ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ５．８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．８％ＮａＣｌ］、１０ｎＭの基質Ｚ−ＡＡＮ−ＭＣＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ルイビル、ＫＹ）を含有する５０μｌのアッセイ緩衝液を各ウェルに添加した。プロテアーゼ阻害剤シスタチンＣ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネアポリス、ＭＮ）またはＥ６４（Ｓｉｇｍａ社）を１００ｎＭの濃度でアッセイ緩衝液中に含んだ。プレートを１０分間３７℃でインキュベートし、ＶＩＣＴＯＲ  ３（商標）蛍光発光プレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、ウェルズリー、ＭＡ）中で３６０ｎｍの励起フィルターおよび４６０ｎｍの発光フィルターを使用して蛍光発光について測定した。測定の繰り返しを、室温で、２０分間の期間にわたり５分間毎に１回行った。長い間にわたる蛍光発光の増加をプロットした。
【０２１０】
実施例１０．３：結果
免疫蛍光染色によって、レグマイン発現を、マウスレグマインを発現するアデノウイルスで感染させたＣＨＯ細胞の表面上で検出した（データ示さず）。レグマイン抗体で染色した細胞はタンパク質について陽性であったが、コントロールの正常ヒツジＩｇＧ染色細胞はバックグラウンド染色を示したにすぎなかった（データ示さず）。
【０２１１】
非透過性のアッセイ条件を使用することによって、マウスレグマインを発現するアデノウイルスで感染させたＨＥＫ２９３細胞の細胞表面レグマイン活性を、マウスレグマインを過剰発現する、生きているＨＥＫ２９３細胞上で直接測定した。図７に示されるように、測定された活性はＥ６４ではなくシスタチンＣで阻害することができ、その活性がレグマインに特異的であることを示した。偽感染ＨＥＫ２９３細胞はこのアッセイで測定可能な活性を呈しなかった（データ示さず）。したがって、細胞は、酵素的に活性な形態でそれらの表面上にレグマインを発現することができる。
【０２１２】
（実施例１１）
レグマイン媒介性の内皮細胞の移動および増殖
レグマインが細胞の移動および増殖、たとえばアテローム発生の間に生じる内皮細胞移動に関連するかどうかを決定するために、創傷治癒に対するレグマインの影響をＨＥＫ２９３培養物およびＨＵＶＥＣ培養物中で研究した。
【０２１３】
実施例１１．１：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ創傷治癒アッセイ
継代１０で使用したＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ、マナッサス、ＶＡ）および継代３で使用したＨＵＶＥＣ（キャンブレックス、ウォーカーズビル、ＭＤ）をシングルチャンバースライド（Ｌａｂ−Ｔｅｋ  カタログ＃１７７４１０、キャンベル、ＣＡ）に接種した。ＨＥＫ２９３細胞は、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミン（カタログ＃１０３７８−０１６、Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバッド、ＣＡ）を補足したＤＭＥＭ中で＞８０％コンフルエンスまで培養し、ＨＵＶＥＣは、ＥＧＭ（カタログ＃ＣＣ−３１２４、Ｃａｍｂｒｅｘ社、イーストラザフォード、ＮＪ）中で＞９０％コンフルエンスまで成長させた。無血清培地中で細胞を洗浄した後、単分子層を、細胞スクレーパー（カタログ＃３０１０、Ｃｏｓｔａｒ［Ｃｏｒｎｉｎｇ］、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ピッツバーグ、ＰＡ）を使用して機械的に傷つけ、２．０×１．７ｃｍ2の長方形の裸出エリアを得た。傷つけた細胞を、次いで、０．０５％脱脂ＢＳＡ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ベッドフォード、ＭＡ）およびＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネアポリス、ＭＮ）またはレグマイン（１０ｎｇ／ｍＬもしくは２５ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネアポリス、ＭＮ）を補足した無血清培地中で２４時間（ＨＥＫ２９３細胞）または２０時間（ＨＵＶＥＣ）インキュベートした。創傷治癒は、最初の創傷のエリアに存在する細胞の数を発光細胞生存率アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）アッセイ、Ｐｒｏｍｅｇａ社、マディソン、ＷＩ）を使用して測定することにより定量化した。
【０２１４】
実施例１１．２：結果
図８および９に提示されたデータは、コントロール（５％ＦＢＳおよびＶＥＧＦ）と比較した、１０ｎｇ／ｍＬおよび２５ｎｇ／ｍＬのレグマインでの刺激に応じた細胞移動の増加を示す。したがって、レグマインは内皮細胞移動に関連するよう思われる。前述の移動はアテローム発生の間に生じ、血管形成に関連する可能性がある。血管形成を伴う障害および／または状態（癌および炎症性障害を含むが、これらに限定されない）を診断する、予後を判定する、監視する、治療し、寛解させ、および／または予防するために設計された方法、治療薬等が本発明で企図される。
【０２１５】
（実施例１２）
内皮細胞のレグマイン媒介性の侵入
レグマインはまた内皮細胞侵入に関連する、たとえば血管形成に関するかどうかを決定するために、ＨＵＶＥＣを、改造したＢｏｙｄｅｎチャンバーでのアッセイで試験した。
【０２１６】
実施例１２．１：改造したＢｏｙｄｅｎチャンバーでのアッセイ
改造したＢｏｙｄｅｎチャンバーでのアッセイで、上部チャンバーに装填した２５，０００個の血清欠乏ＨＵＶＥＣを、下部チャンバーに添加した精製レグマインに応じて、ＭａｔｒｉｇｅｌコートＰＥＴ膜（３．０μｍポアサイズ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、ＢｉｏＣｏａｔ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ：Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｖａｓｉｏｎ）に侵入させた。Ｍａｔｒｉｇｅｌマトリックスを通して侵入した細胞を、発光細胞生存率アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）  Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ社、マディソン、ＷＩ）を使用して定量化した。ＶＥＧＦをポジティブコントロールとして使用した。
【０２１７】
実施例１２．２：結果
ＨＵＶＥＣを、改造したＢｏｙｄｅｎチャンバーでのアッセイでそれらの侵入特性について試験した場合、Ｍａｔｒｉｇｅｌコート膜に侵入する細胞の数の用量依存性の増加がレグマインに応じて観察され、２５ｎｇ／ｍＬのレグマインは２２時間の期間の間に１０ｎｇ／ｍＬ  ＶＥＧＦに類似する応答を誘発した（図１０）。
【０２１８】
（実施例１３）
レグマインは、関節炎のコラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）マウスモデルの病気の足で高度に発現される
マクロファージおよび単球の活性の増加によって特徴付けられる他の障害（たとえば結核および関節リウマチ）にレグマインが役割を果たすかどうかを決定するために、関節炎のコラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）モデルのレグマインの発現を試験した。
【０２１９】
実施例１３．１：コラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）モデル
オスＤＢＡ／１マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バーハーバー、メーンから得た。関節炎は、０．１Ｍ酢酸中で溶解し、１ｍｇ／ｍｌの結核菌（株Ｈ３７ＲＡ）を含有する等容量のＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｓｉｇｍａ社）中で乳化したウシコラーゲンＩＩ型（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ社、レドモンド、ＷＡ）を使用して誘発した。マウスは、１００μｇのコラーゲン混合物を尾のつけ根に皮下注射した。２１日目に、マウスは、等容量のＩｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｓｉｇｍａ社）と混合した０．１Ｍ酢酸中の１００μｇのウシコラーゲンＩＩを尾のつけ根にさらに皮下注射を受けさせた。未処理動物はコラーゲンを受けさせなかった。マウスは、疾患重症度について１週間当たり少なくとも３回監視した。四肢に、次の指数に基づいた臨床スコアを割り当てた：０＝正常；Ｐ＝指の先端の限局性の紅斑によって特徴付けられるプレ関節炎（prearthritic）；１＝１〜２本の腫脹した指が伴う可視的な紅斑；２＝明白な紅斑、足の膨張および／または複数の指の膨張；３＝足首または手関節に拡大する大きな膨張；４＝四肢の使用の困難または関節硬直；１６の最大全身スコアをもたらす。疾患の発症後の様々な間隔で、動物を屠殺し、組織を摘出し、足を４％パラホルムアルデヒド  ｐＨ７．４７中に固定し、２０％ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中で脱灰し、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのためにパラフィン中に包埋した。
【０２２０】
実施例１３．２：結果
レグマインシグナルは、ＣＩＡマウスの病気の足（臨床スコア３）では強く陽性であったが、正常コントロールの足では存在せず、レグマイン発現がこの関節炎モデルの疾患で上方調節されたことを示した（データ示さず）。これらの結果は、マクロファージおよび単球が慢性的に関連する炎症性障害でのレグマインの関与を示唆する。
【０２２１】
（実施例１４）
レグマインスプライス変異体ＺＢ−１の同定および特徴付け
さらなるレグマインタンパク質または転写物が血管障害および炎症性障害の一因となる可能性があるかどうかを決定するために、ヒト副腎由来のｃＤＮＡを、ヒトレグマインに対する高い相同性を有するタンパク質を同定するためにスクリーニングした。
【０２２２】
実施例１４．１：ヒト副腎由来のＺＢ−１の単離
ヒト副腎由来のｃＤＮＡをＡｄｏｒｉ発現ベクター中にサブクローニングした。Ａｄｏｒｉベクターでは、発現は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時型初期プロモーターおよびエンハンサーによってコントロールされる。Ａｄ５  Ｅ１ａ欠失組換えアデノウイルスを、ヒト胎児腎臓細胞系２９３（ＨＥＫ２９３、ＡＴＣＣ、マナッサス、ＶＡ）中での相同組換えによって生成した。組換えアデノウイルスを単離し、続いて２９３細胞で増幅させた。ウイルスは、３サイクルの凍結融解によって感染２９３細胞から放出された。ウイルスを、２つの塩化セシウム遠心分離勾配によってさらに精製し、４℃でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．２に対して透析した。透析の後で、グリセリンを１０％の濃度まで添加し、ウイルスを−８０℃で使用まで保存した。ウイルスを次のパラメーターを評価することにより特徴付けた；導入遺伝子の発現、２９３細胞上のプラーク形成単位、粒子／ｍｌ、エンドトキシン測定、ウイルスのＰＣＲ分析、およびウイルス中のレグマインまたはＺＢ−１コーディング領域の配列分析。アデノウイルスは、ウイルス感染ＨＥＫ２９３細胞を放射標識し、タンパク質発現を監視することによって、組換えタンパク質の発現について試験した。
【０２２３】
タンパク質合成を監視するために、細胞を35Ｓメチオニンおよび35Ｓシステインで６時間標識化した。ＨＥＫ２９３細胞を、４ｍｌの完全培地（ＤｕｌｂｅｃｃｏのＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉａ（ＤＭＥ）＋１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎｎ／Ｓｔｒｅｐ）＋２ｍＭのグルタミン）中で７．５×１０5細胞／プレートの密度でＰ６０培養プレート中で平板培養した。２４時間後に、培地を、２０〜１００のＭＯＩでアデノウイルスを含有する２ｍｌの血清低減培地（ＤＭＥ＋２％ＦＢＳ＋Ｐｅｎｎ／Ｓｔｒｅｐ＋グルタミン）と交換した。プレートを２時間インキュベートし、次いで３ｍｌの完全培地を供給し、さらに２４時間インキュベートした。次の日、培地を除去し、２ｍｌの血清なしでメチオニン／システインなしのＤＭＥと交換した。細胞を１時間インキュベートし、次いで、培地を除去し、35Ｓメチオニンおよび35Ｓシステインを補足した１ｍｌの血清なしのＤＭＥと交換した。細胞を１５分間インキュベートし、メチオニンおよびシステイン＋２％ＦＢＳ＋アプロトニン（１：１００アプロトニン；Ｓｉｇｍａ−６２７９）を含有する１ｍｌのＤＭＥを添加した。細胞をさらに４時間インキュベートし、その後２ｍｌの培地を収集し、低速度で遠心分離し、標識の間に脱離した可能性のある細胞を除去した。きれいにした培地を、ダイズトリプシン阻害剤（１ｍｇ／ｍｌ）および２０μｌフッ化フェニルメチルスルホニル（１ｍＭ）を含有するきれいなチューブに移した。放射標識条件培地を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーによる後の分析のために−２℃で保存した。
【０２２４】
実施例１４．２：結果
図１１に示されるように、ＺＢ−１は、ヒト副腎中で発現された新規な分泌タンパク質をコードする。ＺＢ−１は、５７個のアミノ酸残基（レグマインのアミノ酸３４１〜３９７に相当）が欠失していることを除いて、ヒトレグマインに対して１００％の同一性を有する、ヒトレグマインのスプライス変異体であると思われる。ＺＢ−１は、ＺＢ−１を過剰発現するアデノウイルスで感染させたＨＥＫ２９３細胞培養物の培地中で見つけられた分泌タンパク質である（データ示さず）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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