(57)【要約】  本明細書に示されるように、アテローム硬化性プラーク中に存在する場合に、コレステロールは酸化される。この反応は、マクロファージの走化性誘引物質として作用することができ、単球のマクロファージへの分化を促進することができ、Ｅ−セレクチン及びＡクラススカベンジャー受容体（ＳＲ−Ａ）の発現を増加させることができるコレステロールの酸化産物又はオゾン化産物を生じる。本願は、このようなコレステロールオゾン化産物を使用して、アテローム硬化性又は他の炎症性動脈疾患を治療するのに使用できる因子を同定する方法に向けられる。
2009504184.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マクロファージを検査薬と接触させること、及びＬＤＬの存在下に前記マクロファージをコレステロールオゾン分解産物４ａ又は５ａ
【化１】
2009504184.tif 000051
に触れさせた後、前記マクロファージ中にてクラスＡスカベンジャー受容体（ＳＲ−Ａ）の発現が増大するかどうかを観察することを含む、アテローム硬化性組織中で泡沫細胞の発達を阻害することができる薬物を同定するための方法。
【請求項２】
ＳＲ−Ａ発現レベルを定量化することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
定量されたＳＲ−Ａ発現レベルを、定量された対照ＳＲ−Ａ発現レベルと比較することを更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
マクロファージを検査薬に触れさせずに、ＬＤＬの存在下にて前記マクロファージをコレステロールオゾン分解産物４ａ又は５ａに触れさせた後、前記マクロファージ中にてクラスＡスカベンジャー受容体（ＳＲ−Ａ）の発現が増加することを観察することによって、定量された対照ＳＲ−Ａ発現レベルが測定される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＬＤＬの存在下にてマクロファージを４ａ又は５ａのコレステロールオゾン分解産物に触れさせずに、前記マクロファージを検査薬に触れさせた後、前記マクロファージ中のクラスＡスカベンジャー受容体（ＳＲ−Ａ）の発現が増加することを観察することによって、定量された対照ＳＲ−Ａ発現レベルが測定される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
マクロファージを検査薬と接触させること、及び前記マクロファージがコレステロールオゾン分解産物４ａ又は５ａ
【化２】
2009504184.tif 000052
の源へ遊走するかどうかを観察することを含む、アテローム硬化性組織への前記マクロファージの動員を阻害することができる薬物を同定するための方法。
【請求項７】
コレステロールオゾン分解産物４ａ又は５ａの源へ遊走するマクロファージの百分率を定量化することを更に含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
コレステロールオゾン分解産物４ａ又は５ａの源へ遊走するマクロファージの百分率を、コレステロールオゾン分解産物４ａ又は５ａの源へ遊走するマクロファージの対照百分率と比較することを更に含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
マクロファージを検査薬に触れさせずにコレステロールオゾン分解産物４ａ又は５ａの源へ遊走するマクロファージの百分率を観察することによって、コレステロールオゾン分解産物４ａ又は５ａの源へ遊走するマクロファージの対照百分率が決定される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
内皮細胞を検査薬と接触させること、及びＬＤＬの存在下で内皮をコレステロールオゾン分解産物４ａ又は５ａ
【化３】
2009504184.tif 000053
に触れさせて、前記内皮細胞中にてＥ−セレクチンの発現が増大するかどうかを観察することを含む、アテローム性動脈硬化症を阻害することができる薬物を同定するための方法。
【請求項１１】
Ｅ−セレクチン発現レベルを定量化することを更に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
定量化されたＥ−セレクチン発現レベルを、定量された対照Ｅ−セレクチン発現レベルと比較することを更に含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
マクロファージを検査薬に触れさせずに、ＬＤＬの存在下にて前記マクロファージをコレステロールオゾン分解産物４ａ又は５ａに触れさせた後、前記マクロファージ中のＥ−セレクチンの発現が増加することを観察することによって、定量された対照Ｅ−セレクチン発現レベルが測定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＬＤＬの存在下で、マクロファージを４ａ又は５ａのコレステロールオゾン分解産物に触れさせずに、前記マクロファージを検査薬に触れさせた後、前記マクロファージ中のＥ−セレクチン発現の増大を観察することによって、定量された対照Ｅ−セレクチン発現レベルが決定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
単球細胞を検査薬と接触させること、前記単球がマクロファージへと分化するかどうかを観察することを含み、前記単球がコレステロールオゾン分解産物４ａ又は５ａ
【化４】
2009504184.tif 000054
とともに培養される、単球のマクロファージへの分化を阻害することができる薬物を同定するための方法。
【請求項１６】
マクロファージへ分化する単球の百分率を決定することを更に含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
マクロファージへ分化する単球の百分率を、マクロファージへ分化する単球の対照百分率と比較することを更に含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
単球を検査薬に触れさせずに、前記単球をコレステロールオゾン分解産物４ａ又は５ａに触れさせた後、マクロファージへ分化する単球の百分率を観察することによって、マクロファージへ分化する単球の対照百分率が決定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
単球を４ａ又は５ａのコレステロールオゾン分解産物に触れさせずに、前記単球を検査薬に触れさせた後、マクロファージへ分化する単球の百分率を観察することによって、マクロファージへ分化する単球の対照百分率が決定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
化合物５ｄ又は５ｅ
【化５】
2009504184.tif 000055
から本質的になるコレステロールオゾン分解産物の単離されたダンシル誘導体。
【請求項２１】
化合物９ｃ又は９ｄ
【化６】
2009504184.tif 000056
2009504184.tif 000057
から本質的になるコレステロールの単離されたダンシル誘導体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、その全ての内容が全体として本明細書に組み入れられる、２００５年８月１５日に出願された米国特許仮出願第６０／７０８，３１６号に対する優先権を主張する。本願は、２００３年９月５日に出願された米国特許仮出願第６０／５００，８４５号、２００３年１１月６日に出願された米国特許仮出願第６０／５１７，９４０号、２００４年９月３日に出願された米国特許出願第１０／９３４，３１９号、２００４年９月３日に出願された米国特許出願第１０／９３４，７９５号にも関し、これらの開示は、その全ての内容が全体として本明細書に組み入れられる。
【０００２】
政府の権利に関する陳述
本明細書に記載の本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって授与された助成金番号ＰＯＣＡ２７４８９の下での米国政府の援助によって為された。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本発明は、アテローム硬化性病変中で産生されるコレステロールオゾン化産物の効果を相殺することによって、アテローム性動脈硬化症及び／又は心血管疾患を治療及び予防するのに有用な薬物を同定するための方法に関する。本発明によると、コレステロールオゾン化産物は、アテローム性動脈硬化症の発達に関与する中心的細胞の分化、発現パターン及び／又は走化性を変化させる細胞毒である。
【背景技術】
【０００４】
心血管疾患は、なお、多くの国で主要な疾病及び主要な死因の１つである。男性の約３分の１は、６０歳前に主要な心血管疾患を発症する。一方、女性は、当初、リスクがより低く（１０分の１の割合）、心血管疾患は、加齢とともにより蔓延する。例えば、６５歳以後、女性は、男性と全く同様に、心血管疾患に罹患しやすくなる。冠動脈疾患、脳卒中、再狭窄及び末梢血管系の疾病等の血管系の疾病は、未だに、世界中で、死亡及び障害の主原因となっている。
【０００５】
医師は、心血管疾患の発達を抑制するために食事及び生活様式を変えるように勧告しているが、脂質代謝異常に至る遺伝的な素因は、血管系疾病由来の発作の発症及び死亡における有意な要因である。従って、問題となるアテローム硬化性病変の形成及び治療への新たな見識が必要とされている。
【発明の開示】
【０００６】
本発明者は、オゾン等の活性酸素種が抗体によって産生されることをすでに示している。Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ Ｊｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８，２１９５（２００２）；Ｂａｂｉｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，３９２０（２００３）；Ｐ．Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ  Ｊｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，１４９０（２００３）。本願は、オゾン等の活性酸素種及びコレステロールオゾン化産物が、アテローム硬化性プラーク物質によって生成されることを示す証拠を提供する。
【０００７】
本発明によると、コレステロールのオゾン化産物は、アテローム硬化性プラーク中に存在し、問題となるプラーク蓄積の発達を悪化又は加速できる。例えば、コレステロールのオゾン化産物は、マクロファージによる脂質の取り込みを促進し得、泡沫細胞が形成される速度を加速し得る。コレステロールのオゾン化産物は、アポタンパク質Ｂ１００の二次構造及びアポタンパク質Ｂ１００がその中に見出される低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）にも悪影響を及ぼし得る。更に、コレステロールのオゾン化産物は、アテローム硬化性の発達に関与する細胞の分化、発現パターン又は走化性も修飾できる。
【０００８】
従って、本発明の一態様は、コレステロールオゾン化産物の活性を相殺又は阻害することができる薬物を同定することを包含する。例えば、一実施形態において、本発明は、アテローム硬化性組織中での泡沫細胞の発達を阻害できる因子を同定するための方法に関する。この方法は、マクロファージを検査薬と接触させること、マクロファージをコレステロールオゾン分解産物に触れさせた後、マクロファージ中でクラスＡスカベンジャー受容体（ＳＲ−Ａ）の発現が増大するかどうかを観察することを包含する。幾つかの実施形態において、前記細胞は、ＬＤＬの存在下で、コレステロールオゾン分解産物４ａ又は５ａに触れさせられる。
【０００９】
本発明の別の態様は、アテローム硬化性組織へのマクロファージの動員を阻害できる因子を同定するための方法である。この方法は、マクロファージを検査薬と接触させること、前記マクロファージがコレステロールオゾン分解産物の源へ遊走するかどうかを観察することを包含する。幾つかの実施形態において、コレステロールオゾン分解産物４ａ又は５ａは、コレステロールオゾン分解産物として使用される。
【００１０】
本発明の別の態様は、アテローム性動脈硬化症を阻害できる因子を同定するための方法である。この方法は、内皮細胞を検査薬と接触させること、内皮をコレステロールオゾン分解産物に触れさせて、内皮細胞中でＥ−セレクチンの発現が増大するかどうかを観察することを包含する。幾つかの実施形態において、前記細胞は、ＬＤＬの存在下でコレステロールオゾン分解産物４ａ又は５ａに触れさせられる。
【００１１】
本発明の別の態様は、マクロファージへの単球の分化を阻害できる因子を同定するための方法である。この方法は、単球を検査薬と接触させること、前記単球がマクロファージへ分化するかどうかを観察することを包含し、前記単球は、コレステロールオゾン分解産物とともに培養される。幾つかの実施形態において、前記単球は、コレステロールオゾン分解産物４ａ又は５ａとともに培養される。
【００１２】
本発明によって提供されるように、コレステロールオゾン化産物は、アテローム硬化性病変に関するマーカーである。オゾンを発生しない抗体及びコレステロールのオゾン化産物へ結合する他の結合剤は、コレステロールのオゾン化産物の毒性を不活化又は阻害することにより、アテローム性動脈硬化症を治療及び予防するために使用できる。本発明はそれゆえ、コレステロールオゾン化産物に対する抗体及び結合実体を提供する。
【００１３】
本発明は、治療薬が連結された抗体又は結合実体を哺乳動物へ投与することによって、前記哺乳動物のアテローム性動脈硬化症を治療又は予防する方法であり、前記抗体又は結合実体が、アテローム硬化性プラーク中に存在する分子又は抗原、例えばコレステロールオゾン化産物へ結合することができる、前記方法に関する。このような治療薬は、例えば、アテローム硬化性病変の発達を遅延させ、又はアテローム硬化性病変の大きさを縮小するのに役立ち得る。
【００１４】
本願は、コレステロールオゾン化の細胞毒性産物に関し、並びに自己免疫疾患、癌、腫瘍、細菌感染、ウィルス感染、真菌感染、潰瘍及び／又は細胞毒の局所的な投与が有効である他の疾病の治療のための、このような細胞毒性コレステロールオゾン化産物を使用する方法にも関する。
【００１５】
本発明の一態様は、原核細胞又は真核細胞に対して細胞毒性であり得るコレステロールの単離されたオゾン化産物である。このようなオゾン化産物は、マクロファージの脂質取り込み又は泡沫細胞の形成を引き起こすことができる。本発明のオゾン化産物は、低密度リポタンパク質中のタンパク質の二次構造も変化させることができる。例えば、本発明のオゾン化産物は、アポタンパク質Ｂ１００の二次構造を変化させることができる。
【００１６】
本発明のオゾン化産物は、式４ａないし１５ａ、７ｃの何れか１つ又はこれらの組み合わせを有する全ての化合物を含む。
【００１７】
【化７】
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【００１８】
本発明の別の態様は、式４ａ又は式５ａを有するコレステロールのオゾン化産物を含むアテローム硬化性病変を治療又は予防するためのマーカーである。
【００１９】
本発明の別の態様は、原核細胞又は真核細胞に対して細胞毒性であり得る単離されたコレステロールオゾン化産物である。コレステロールオゾン化産物は、本明細書に記載されているコレステロールの全てのオゾン化産物であり得る。
【００２０】
本発明の別の態様は、コレステロールのオゾン化産物へ結合できる単離された結合実体である。結合実体が結合できるコレステロールオゾン化産物は、例えば、式４ａないし１５ａ、７ｃの何れか１つ又はこれらの組み合わせを有する全ての化合物であり得る。幾つかの実施形態において、オゾン化産物は、４ａ又は５ａである。結合実体は、例えば、抗体であり得る。結合実体は、ハプテン、例えば、式１３ａ、１４ａ又は１５ａを有するハプテンに対して産生し得る。抗体結合実体の例は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５４２７又はＰＴＡ−５４２８を有するハイブリドーマＫＡ１−１１Ｃ５又はＫＡ１−７Ａ６由来の抗体を含む。抗体結合実体の他の例は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５４２９及びＰＴＡ−５４３０を有するハイブリドーマＫＡ２−８Ｆ６又はＫＡ２−１Ｅ９由来の抗体を含む。
【００２１】
幾つかの実施形態において、本発明の結合実体は、治療薬へ連結される。使用される治療薬は、例えばアテローム硬化性病変を縮小できるか又は動脈の更なる閉塞を予防できる。本発明の結合剤とともに使用できる治療薬の例は、抗酸化剤、抗炎症薬、薬物、小分子、ペプチド、ポリペプチド又は核酸を含む。
【００２２】
本発明の別の態様は、コレステロールオゾン化産物へ連結される単離された結合実体であり、コレステロールオゾン化産物は、原核細胞又は真核細胞に対して細胞毒性がある前記実体である。
【００２３】
本発明の別の態様は、コレステロールオゾン化産物へ結合できる結合剤を患者へ投与することを含む、前記患者においてアテローム性動脈硬化症を治療するための方法である。結合剤が結合するコレステロールオゾン化産物は、式４ａないし１５ａ又は７ｃの何れか１つを有する化合物であり得る。好ましくは、結合剤は、活性酸素種を発生しない。幾つかの実施形態において、結合実体は、治療薬へ連結される。このような治療薬は、アテローム硬化性病変の発達を遅延させるか又は、アテローム硬化性病変の大きさを縮小するのに役立ち得る。使用できる治療薬の例は、抗酸化剤、抗炎症薬、薬物、小分子、ペプチド、ポリペプチド又は核酸を含む。
【００２４】
本発明の別の態様は、標的細胞へ結合することができる結合剤を患者へ投与することによって、患者において標的細胞を死滅させるための方法であり、結合剤がコレステロールオゾン化産物へ連結されている前記方法である。このような結合実体は、抗体であり得る。この実施形態において、結合実体又は抗体は、活性酸素種を生じ得る。抗体は、一重項酸素を発生できる化合物へも連結され得る。一重項酸素を発生することができる化合物の例は、アントラセン−９，１０−ジプロピオン酸エンドペルオキシド等のエンドペルオキシドを含む。一重項酸素を発生することができる化合物の他の例は、プテリン、フラビン、ヘマトポルフィリン、テトラキス（４−スルホナトフェニル）ポルフィリン、ビピリジルルテニウム（ＩＩ）複合体、バラベンガル染色剤、キノン、ローダミン染色剤、フタロシアニン、ハイポクレリン、ルブロシアニン、ピナシアノール又はアロシアニン等の化合物を含む。
【００２５】
本発明の別の態様は、コレステロールオゾン化産物へ結合できる結合実体又は抗体を使用して、哺乳動物の体液から細胞毒性コレステロールオゾン化産物を分離することによって、哺乳動物から細胞毒性コレステロールオゾン化産物を除去するための方法である。オゾン化産物は、哺乳動物の循環血から除去できる。別の実施形態において、オゾン化産物は、哺乳動物の血液から生体外で除去される。更なる実施形態において、結合実体又は抗体は、局在組織へ局在化した様式で投与される。
【００２６】
本発明の別の態様は、細胞毒性のコレステロールオゾン化産物へ連結された抗体を哺乳類へ投与することによって哺乳動物において癌を治療又は予防する方法であり、抗体が癌細胞へ結合することができる前記方法である。
【００２７】
本発明の別の態様は、細胞毒性のコレステロールオゾン化産物へ連結される抗体を哺乳類へ投与することによって哺乳動物における不適切な免疫反応を治療又は予防する方法であり、抗体が、不適切な免疫反応に関与する免疫細胞へ結合することができる前記方法である。
【００２８】
本発明の別の態様は、（ａ）抗体と候補剤を組み合わせること、（ｂ）形成された活性酸素種の量を測定すること、及び（ｃ）形成された活性酸素種の量を、候補剤なしで抗体から形成される活性酸素種の量を測定することによって得られる標準値と比較すること、によって抗体からの活性酸素種の産生を調節する因子を同定するための方法である。幾つかの実施形態において、活性酸素種はオゾンである。
【００２９】
図１Ａ−Ｄは、インジゴカルミン１が、１２−ミリスチン酸１３−酢酸４−β−ホルボール（ＰＭＡ）処理されたヒトアテローム硬化性病変により酸化され、イサチンスルホン酸２が形成され得ることを示す。
【００３０】
図１Ａは、オゾンによるインジゴカルミン１のイサチンスルホン酸２への転化中に生じる化学変化を示す。
【００３１】
図１Ｂは、ＰＭＡにより活性化されたアテローム硬化性病変によるインジゴカルミン１の漂白を示す。各ガラスバイアルは、インジゴカルミン１（２００μＭ）の溶液中のアテローム硬化性プラーク（約５０ｍｇ湿重量）の分散液及びリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）ｐＨ７．４中のウシカタラーゼ（５０μｇ）を等量含有した。ＤＭＳＯ中のＰＭＡの溶液（１０μＬ、４０μｇ／ｍＬ）を右のバイアルへ添加した３０分後に写真撮影した。ＰＭＡを有さない同一容積のＤＭＳＯを左のバイアルへ添加した。反応混合物の容積全体は、１ｍＬであった。
【００３２】
図１Ｃは、逆相ＨＰＬＣによって分析されるように、新たなＨＰＬＣピークが、図１Ｂに示される＋ＰＭＡバイアルの上清中に生じることを示す。新たなピークは、約９．７１分の保持時間（ＲＴ）を有するイサチンスルホン酸２に対応する。
【００３３】
図１Ｄは、図１Ｂに関して上述のとおりのインジゴカルミン１と反応した、遠心分離したＰＭＡにより活性化されたヒトアテローム硬化性プラーク物質由来の、上清の陰イオンエレクトロスプレー質量分析図を示す。指示薬であるインジゴカルミン１を使用して、懸濁したプラーク物質のＰＭＡ活性化がＨ２１８Ｏ中で実施されたとき、単離された開裂した生成物であるイサチンスルホン酸２の質量スペクトル中の［Ｍ−Ｈ］−２３０質量断片ピークの様相及び相対的強度によって示されるように、インジゴカルミン１のラクタムカルボニル酸素の約４０％は、１８Ｏを組み込んだ。標準的な水（Ｈ２１６Ｏ）の存在下でインジゴカルミン１から形成されるイサチンスルホン酸２は、２２８の質量断片ピーク［Ｍ−Ｈ］−を有する。
【００３４】
図２Ａは、アルドール化によって５ａへ転化できる５，６−セコステロール４ａを付与するためのコレステロール３のオゾン分解に包含される化学的ステップを示す。２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（０．０８％ＨＣｌ中の２ｍＭ）による誘導体化によって、ヒドラゾン誘導体４ｂ及び５ｂがそれぞれ供給された。誘導体化ステップの間に４ａから形成される５ｂの量は、約２０％であった。５ａ及び５ｂの立体構造の割り当ては、Ｋ．Ｗａｎｇ，Ｅ．Ｂｅｒｍｕｄｅｚ，Ｗ．Ａ．Ｐｒｙｏｒ，Ｓｔｅｒｏｉｄｓ  ５８，２２５（１９９３）に記載の通り割り当てられた。
【００３５】
図２Ｂは、オキシステロール６ａないし９ａ及び、約１８分で溶出するピークである図３の［Ｍ−Ｈ］−５７９に対する標準物質として研究された塩酸２，４−ジニトロフェニルヒドラジン誘導体６ｂないし７ｂの構造を示す。７ａないし７ｂの立体構造の割り当ては、確証的な合成７ｂ物質を使用する１Ｈ−１Ｈ  ＲＯＥＳＹ実験に基づいた。
【００３６】
図３Ａ−Ｅは、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）を使用するプラーク物質及びヒドラゾン４ｂ、５ｂ及び６ｂの化学的に合成された確証的な試料の分析を示す。条件：Ａｄｓｏｒｂｏｓｐｈｅｒｅ−ＨＳ  ＲＰ−Ｃ１８カラム、７５％アセトニトリル、２０％水、５％メタノール、０．５ｍＬ／分流速、３６０ｎｍ検出、塩酸２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ  ＨＣｌ）による誘導体化後のプラーク抽出物のインライン陰イオンエレクトロスプレー質量分析（ＭＳ）（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｍ８０００機）。
【００３７】
図３Ａは、ＰＭＡ活性化はないが、本明細書に記載の２，４−ジニトロフェニルヒドラジンによる誘導体化後のプラーク物質のＬＣＭＳ分析を示す。ＰＭＡ（４０μｇ／ｍＬ）による活性化の前に、アテローム硬化性病変中で化合物４ｂ（室温〜１４．１分）、５ｂ（室温〜２０．５分）及び６ｂ（室温〜１８分）を検出した。
【００３８】
図３Ｂは、ＰＭＡ（４０μｇ／ｍＬ）による活性化後のプラーク物質のＬＣＭＳ分析、抽出及び上述の２，４−ジニトロフェニルヒドラジンによる誘導体化を示す。ＰＭＡ（４０μｇ／ｍＬ）による活性化後に、アテローム硬化性病変中で化合物４ｂ（室温〜１４．１分）のより多くの量、化合物６ｂ（室温〜１８分）のより少ない量を検出した。
【００３９】
図３Ｃは、確証的な４ｂのＨＰＬＣ分析を示し、挿入図は、質量分析を示す。
【００４０】
図３Ｄは、確証的な６ｂのＨＰＬＣ分析を示し、挿入図は、質量分析を示す。
【００４１】
図３Ｅは、確証的な５ｂのＨＰＬＣ分析を示し、挿入図は、質量分析を示す。
【００４２】
図４Ａ−Ｄは、微量のヒドラゾンを検出可能にするために１００μＬ注入容積が使用される、抽出され誘導体化されたアテローム硬化性物質のＨＰＬＣ−ＭＳ分析を示す。図４Ａは、詳述された条件（上述参照）を使用する時間対強度のＬＣトレースを示す。ＲＴ２６．６は、７ｂである（確証的な物質との比較による。）。ＲＴ〜２４．７でのピークは、［Ｍ−Ｈ］−４６１を有する未知のヒドラゾンである。図４Ｂは、［Ｍ−Ｈ］−５９７の単一イオンのモニタリングを提供する。図４Ｃは、［Ｍ−Ｈ］−５７９の単一イオンのモニタリングを提供する。図４Ｄは、［Ｍ−Ｈ］−４６１の単一イオンのモニタリングを示す。
【００４３】
図５Ａ−Ｃは、患者ＡないしＮに関するアテローム硬化性抽出物中のコレステロールオゾン化産物の濃度を示す。
【００４４】
図５Ａは、ＰＭＡによる活性化前及び活性化後の患者のアテローム硬化性病変からの４ａの抽出及び誘導体化後のヒドラゾン４ｂの測定された濃度を示す棒グラフである。棒グラフは、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ用のＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｖ３を使用するＳｔｕｄｅｎｔの（両側の）ｔ検定（ｐ＜０．０５、ｎ＝１４）によって測定される、活性化前後に検出される量の数値を示す。
【００４５】
図５Ｂは、ＰＭＡによる活性化前後の、患者のアテローム硬化性病変からの５ａの抽出及び誘導体化後の５ｂの測定された濃度を示す棒グラフである（ｎ＝１４）。
【００４６】
図５Ｃは、患者から採取された血漿試料からの５ａの抽出及び誘導体化後の５ｂの測定された濃度を示す棒グラフである。コホートＡ（ｎ＝８）患者は、２４時間以内の頸動脈内膜切除法を受けた（血漿分析は、試料回収の３日後に実施した。）。コホートＢ（ｎ＝１５）患者は、一般的な医療診療所で診察を受けている患者から無作為に選択された（血漿分析は、試料回収の７日後に実施した。）。予備研究において、５ａの血漿レベルが１日あたり約５％だけ低下することに留意されたい。このアッセイの条件下で、４ｂ及び５ｂの検出限界は、１ないし１０ｎＭであった。従って、４ｂも５ｂも明白でない場合、４ｂ又は５ｂのレベルは１０ｎＭ未満であった。
【００４７】
図６Ａは、Ｂ細胞（ＷＩ−Ｌ２）系に対する３、４ａ及び５ａの細胞毒性を示す。各データ点は、少なくとも二つ組の測定結果の平均である。Ｍａｃｉｎｔｏｓｈコンピュータ用のＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  第３．０版による非線形回帰分析（Ｈｉｌｌプロット分析）を使用して、４ａ（黒四角）及び５ａ（黒塗り上向き三角）に関するＩＣ５０±標準誤差を算出した。３（黒塗り下向き三角）による細胞毒性は、この濃度範囲においては観察されなかった。
【００４８】
図６Ｂは、Ｔ細胞（ジャーカット細胞）系に対する３、４ａ及び５ａの細胞毒性を示す。各データ点は、少なくとも二つ組の測定結果の平均である。Ｍａｃｉｎｔｏｓｈコンピュータ用のＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  第３．０版による非線形回帰分析（Ｈｉｌｌプロット分析）を使用して、４ａ（黒四角）及び５ａ（黒塗り上向き三角）に関するＩＣ５０±標準誤差を算出した。３（黒塗り下向き三角）による細胞毒性は、この濃度範囲においては観察されなかった。
【００４９】
図７Ａ−Ｂは、コレステロールオゾン分解産物４ａ及び５ａが、マクロファージによる脂質負荷を増大させて泡沫細胞を産生することを示す。
【００５０】
図７Ａは、Ｊ７７４．１マクロファージとともに温置されたＬＤＬには、Ｊ７７４．１マクロファージの脂質負荷に及ぼす効果がほとんどないことを示す。最初に、１０％ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０中でマクロファージを２４時間生育させた後、ＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）を含有する同一培地中で７２時間温置した。４％ホルムアルデヒドで細胞を固定し、ヘマトキシリン及びオイルレッドＯで染色し、それにより脂質顆粒を暗赤色に染色した。倍率は、１００倍であった。
【００５１】
図７Ｂは、オゾン分解産物４ａとともに温置したＬＤＬが、マクロファージの脂質負荷を誘導して、泡沫細胞を産生することを示す。１０％ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０中でＪ７７４．１マクロファージを２４時間生育させた。次に、ＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）及びオゾン分解産物４ａ（２０μＭ）を含有する同一培地中で、細胞を７２時間温置した。４％ホルムアルデヒドで細胞を固定し、ヘマトキシリン及びオイルレッドＯで染色し、それにより脂質顆粒を暗赤色に染色した。倍率は、１００倍であった。マクロファージに及ぼすオゾン分解産物４ａの効果が、オゾン分解産物５ａの効果と区別できなかったことに留意されたい。
【００５２】
図８Ａ−Ｃは、ＬＤＬの二次構造が、円二色性によって検出されるように、オゾン分解産物４ａ又は５ａへ触れさせることによって変化することを示す。報告された結果は、各試料に関して少なくとも二つ組の実験からのものである。
【００５３】
図８Ａは、正常なＬＤＬのタンパク質含有量が、αへリックス構造の大きな割合（〜４０±２％）並びにβ構造（〜１３±３％）、βターン（〜２０±３％）及びランダムコイル（２７±２％）の少量を有することを示す。
【００５４】
図８Ｂは、３７℃のＰＢＳ（ｐＨ７，４）中でのオゾン分解産物４ａとのＬＤＬのインキュベーションによって、アポＢ−１００の二次構造が損失することを示す。図８Ａは、３７℃のＰＢＳ（ｐＨ７．４）中でのＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）及び４ａ（１０μＭ）の時間依存的円二色性スペクトルを示す。
【００５５】
図８Ｃは、３７℃のＰＢＳ（ｐＨ７，４）中でのオゾン分解産物５ａとのＬＤＬのインキュベーションによって、アポＢ−１００の二次構造が損失することを示す。図８Ａは、３７℃のＰＢＳ（ｐＨ７．４）中でのＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）及び５ａ（１０μＭ）の時間依存的円二色性スペクトルを示す。
【００５６】
図９は、ダンシルヒドラジンコレステロールオゾン化産物４ａ及び５ａに関する構造（それぞれ、４ｄ及び５ｃ）並びにこれらのヒドラジン誘導体のＨＰＬＣ溶出パターンを示す。示されるように、コレステロールオゾン化産物４ａ及び５ａは、異なるＨＰＬＣ保持時間を有するダンシルヒドラゾンコンジュゲートを発生させる。
【００５７】
図１０は、コレステロールオゾン化産物が、ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣＭＳ）によって、ヒト頸動脈検体中で検出できることを示す。示されるクロマトグラムは、典型的なアテローム硬化性プラーク抽出物である。２２．４９分で溶出するピークは、コレステロールオゾン化産物４ａ及び５ａの両者に対応するピークである。質量分析クロマトグラフの挿入図は、２２．４９分で溶出する種が、ｍ／ｚ３５４を有することを示す。
【００５８】
図１１は、ＩＤ−ＧＣＭＳによる２つのアテローム硬化性プラーク（Ｐ１及びＰ２）の定量的な分析を提供している。検出されるコレステロールオゾン化産物４ａ及び５ａの量は、約８０ないし１００ｐｍｏｌ／組織ｍｇであり、ＬＣ−ＭＳ分析によって検出されるものと同様であった。各バーは、二つ組の抽出物を表し、平均±平均の標準誤差として報告される。
【００５９】
図１２Ａ−Ｄは、コレステロールオゾン化産物５ｅのダンシル誘導体の取り込み及び局在化を示す。ＰＢＳ中の５ｅ（５０μＭ）で５分間（１００倍、図１２Ａ）及び１時間（２００倍、図１２Ｂ）処理した培養マクロファージ細胞（Ｊ７７４Ａ．１）の蛍光顕微鏡図。図１２Ｃは、ＦＣＳ（１０％）含有培地中のコレステロールオゾン化産物５ｅ（５０μＭ）で５分間処理した培養マクロファージを示す（６０倍）。図１２Ｄは、ＦＣＳ（１０％）含有培地中のコレステロールオゾン化産物５ｅ（５０μＭ）で６０分間処理した培養マクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）を示す（１００倍）。コントロール試料及び、化合物９ｄ又は５ｅを合成するのに使用されるダンシルアミド化合物で処理された細胞は、最小の蛍光を示した（データ非表示）。処理後、９５％冷メタノール中で細胞を固定し、グリセロール中でマウントした。６０倍の油浸対物レンズ及びフィルターセットの組み合わせ（励起）ＤＡＰＩ３６０／４０及び（発光）４５７／５０を使用して、これらのデータを回収した。
【００６０】
図１３は、マクロファージスカベンジャー受容体発現に及ぼすコレステロールオゾン化産物４ａ及び５ａの効果を示す。示されるように、ＬＤＬと複合体形成したコレステロールオゾン化産物４ａ及び５ａは、ＳＲ−Ａの発現を増大させたが、ＣＤ３６発現にはほとんど又は何ら効果がなかった。媒体、ＬＤＬ、Ｃｕ−ＯｘＬＤＬ、ＬＤＬ（１００μｇ／タンパク質ｍＬ）を有する２５μＭの（粥状Ａと呼ばれる）コレステロールオゾン化産物４ａ、又はＬＤＬ（１００μｇ／タンパク質ｍＬ）を有する２５μＭの（粥状Ｂと呼ばれる）コレステロールオゾン化産物５ａで、マクロファージ細胞（Ｊ７７４Ａ．１）を６時間処理した。未処理のコントロール試料は、最小の蛍光を示した（ＣＤ３６／ＦＩＴＣ１２．７±０．５；ＳＲ−Ａ／ＰＥ３１．７±４．１）。データは、２つの個々の実験の平均蛍光強度±平均の標準誤差を表し、コントロールに対して、＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１である。
【００６１】
図１４Ａ−Ｂは、（粥状Ａと呼ばれる）コレステロールオゾン分解産物４ａ及び（粥状Ｂと呼ばれる）５ａの源へのマクロファージの走化性を示す。走化性チャンバー中のコレステロール（２５μｍ）、Ｃ５ａ（１０ｎＭ）、オゾン分解産物４ａ（２５μＭ）、又はオゾン分解産物５ａ（２５μＭ）のいずれかでＪ７７４Ａ．１マクロファージを処理した。図１４Ａは、コレステロール、Ｃ５ａ、オゾン分解産物４ａ又はオゾン分解産物５ａを有するチャンバー中の顕微鏡視野あたりの遊走した細胞を示す。光学顕微鏡を使用して細胞を計数し、高倍率視野あたりの細胞として表した。各試料につき、合計１５個の高倍率視野を計数した。コレステロールは、媒体コントロールと同様の遊走を刺激した（４１±８個／視野）。
【００６２】
図１４Ｂは、オゾン分解産物５ａを含有する遊走チャンバー中の細胞の蛍光が、オゾン分解産物濃度とともに増大することをグラフで示す。より低いチャンバー中のオゾン分解産物５ａの異なる濃度の存在下で、カルセイン−ＡＭ標識した細胞を温置した。蛍光プレートリーダーによって、遊走した細胞の蛍光を測定し、遊走した細胞／ウェルの数として表した。示されるのは、３回の実験の平均±平均の標準誤差の値である。＊＊は、コントロールに対するＰ＜０．００１である。
【００６３】
図１５Ａ−Ｂは、ＬＤＬと複合体形成したオゾン分解産物４ａ（粥状Ａ）又は５ａ（粥状Ｂ）の存在下での血管内皮細胞中の接着分子の発現をグラフで示す。図１５Ａは、単一濃度でのこれらのコレステロールオゾン分解産物の効果を示す。図１５Ｂは、Ｅ−セレクチン発現に及ぼすＬＤＬオゾン分解産物４ａの上昇する濃度の効果を示す。図１５Ａに関して、ＬＤＬ、Ｃｕ−ｏｘＬＤＬ、オゾン分解産物４ａ／ＬＤＬ又はオゾン分解産物５ａ／ＬＤＬ（１００μｇ／タンパク質ｍＬ）とともに、ＨＡＡＥ−１内皮細胞を４時間温置した。ＶＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチン及びＩＣＡＭ−１の表面発現をＥＬＩＳＡによって測定した。示されるデータは、２回の個別の実験からの、媒体（１００％）に対する％発現の平均±平均の標準誤差である。媒体に対して、＊は、Ｐ＜０．０５、＊＊は、Ｐ＜０．００５である。図１５Ｂに関して、ＬＤＬ（１００μｇ／タンパク質ｍＬ）と複合体形成したオゾン分解産物４ａ（粥状Ａ）濃度（０ないし５０μＭ）の範囲とともに、培養した内皮細胞（ＨＡＡＥ−１）を温置し、図１５Ａに関して記載されているとおり、Ｅ−セレクチンの表面発現を測定した。三つ組実験の平均±平均の標準誤差として、データを報告する。
【００６４】
図１６ＡないしＨは、コレステロールオゾン分解産物によって誘発される単球のマクロファージへの分化を示す。ＴＨＰ−１懸濁細胞を次の試薬、すなわちコレステロール（図１６ＡないしＢ）、７−ケトコレステロール（陽性対照、図１６ＣないしＤ）、オゾン分解産物４ａ（粥状Ａ、図１６ＥないしＦ）、オゾン分解産物５ａ（粥状Ｂ、図１６ＧないしＨ）の１２．５μＭ若しくは２５μＭの何れかで７日間処理した。ＴＨＰ−１細胞は、７−ＫＣ又はオゾン分解産物５ａ（粥状Ｂ）による処理の４日後に接着し始めた。最大の接着は、７日後に観察された。対照的に、同一時間フレームにわたって、コレステロール及びオゾン分解産物４ａ処理では、細胞接着が誘導されなかった。代表的な位相差顕微鏡画像を示す。
【００６５】
発明の詳細な説明
本発明によると、コレステロールオゾン化産物は、アテローム硬化性プラーク中に存在する。これらのコレステロールオゾン化産物は、例えば、マクロファージをアテローム硬化性組織へ動員すること、マクロファージへの単球の分化を増大させること、及び細胞接着分子（Ｅ−セレクチン）又はクラスＡスカベンジャー受容体（ＳＲ−Ａ）の発現を変化させることによって、アテローム性動脈硬化症の発達を悪化させ又は加速できる。ＳＲ−Ａ受容体は、修飾されたＬＤＬ及びオキシステロールのマクロファージ内部移行に必要とされる重要な細胞表面受容体である。更に、コレステロールオゾン化産物は、マクロファージによる脂質取り込みを加速させ、形成される泡沫細胞の数を増加させることによって、アポタンパク質Ｂ１００の構造及びアポタンパク質Ｂ１００がその中に見出される低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の構造を修飾することができる。それゆえ、コレステロールオゾン化産物は、血管系疾病、例えば、心臓発作、鬱血性心不全、脳卒中等の問題となる症状に至る可能性がより高い、進行したアテローム硬化性病変の形成を加速することができる。
【００６６】
本発明は、アテローム硬化性のマーカーとして有用なコレステロールオゾン化産物も提供する。コレステロールオゾン化産物の効果を相殺できる組成物、キット及び結合剤も提供される。これらの組成物、キット及び結合剤は、アテローム硬化性、心血管疾患及び他の血管系疾病を治療及び予防するのに有用である。
【００６７】
別の実施形態において、本発明は、細胞毒としてのコレステロールオゾン化産物並びに、自己免疫疾患、癌、腫瘍、細菌感染、ウィルス感染、真菌感染、潰瘍及び／又は細胞毒の局所的な投与が有効である他の疾病を治療するための、これらの細胞毒性オゾン化産物を使用する方法を提供する。
【００６８】
本発明の別の態様は、哺乳動物細胞においてコレステロールオゾン分解産物活性を阻害できる因子を同定するための方法である。この方法は、細胞を検査薬と接触させること、細胞の分化、発現パターン又は走化性が変化するかどうかを観察することを包含し、細胞は、コレステロールオゾン化産物の存在下で培養される。幾つかの実施形態において、細胞は、コレステロールオゾン分解産物４ａ又は５ａとともに培養される。
【００６９】
コレステロールのオゾン処理
本発明によると、コレステロールは、オゾン等の活性酸素種によってアテローム硬化性プラーク物質内で酸化される。多数のコレステロールオゾン化産物が、このプロセスによって発生し、アテローム性動脈硬化症を罹患する患者から採取された組織又は液状試料中で検出できる。
【００７０】
コレステロールは、次の構造（３）を有する。
【００７１】
【化８】
2009504184.tif 000007
【００７２】
コレステロールが、動脈中に固着すると、アテローム硬化性プラークが形成し得る。本明細書で説明されるように、アテローム硬化性プラークは、オゾン等の活性酸素種を放出でき、このようなアテローム硬化性プラーク物質も、コレステロールオゾン化産物を発生させる。具体的な機序に限定されることを望むものではないが、マクロファージ、好中球、抗体及び他の免疫細胞が、アテローム硬化性病変において関与し、オゾン等の活性酸素種を放出するようである。生成された活性酸素種は、病変中のコレステロールと反応し、患者から採取された生物学的試料中に検出することができる多くの生成物へコレステロールを酸化する。
【００７３】
例えば、コレステロール３が酸化されるとき、セコ−ケトアルデヒド４ａ及びそのアルドール付加物５ａは、形成される主要な生成物である。
【００７４】
【化９】
2009504184.tif 000008
【００７５】
更に、化合物６ａないし１５ａ及び７ｃのものと類似の構造を有するコレステロールオゾン化産物も観察できる。
【００７６】
【化１０】
2009504184.tif 000009
2009504184.tif 000010
2009504184.tif 000011
2009504184.tif 000012
【００７７】
本発明によると、セコ−ケトアルデヒド４ａ、そのアルドール付加物５ａ及び６ａないし１５ａ又は７ｃ等の関連化合物は、アテローム性動脈硬化症を罹患する患者から採取されたアテローム硬化性プラーク物質中に存在する。さらに、セコ−ケトアルデヒド４ａ、アルドール付加物５ａ及び患者の血流中で検出される関連化合物６ａないし１５ａ又は７ｃの量は、前記患者におけるアテローム硬化性プラーク形成の範囲及び重度と相関する。
【００７８】
例えば、動脈内膜切除を必要とするまで十分に進行したアテローム硬化性疾病状態を有する８名の患者のうちの６名の血流（血漿）中に、７０ないし１６９０ｎＭの範囲の量でアルドール５ａが検出された（図５Ｃ）。しかしながら、一般的な医療診療所で診察を受けている患者の群から無作為に選択された患者から得た１５の血漿試料のうち５ａが検出可能であったのは、僅か１つであった。
【００７９】
更に、本発明によると、コレステロールオゾン化産物は、ＬＤＬ及び／又はアポタンパク質Ｂ１００（アポＢ−１００）であるＬＤＬのタンパク質構成成分を酸化修飾できる。セコ−ケトアルデヒド４ａ又はアルドール付加物５ａによるＬＤＬの処理は、ＬＤＬ及び／又はアポＢ−１００のαヘリックス含有量を減少させ、及びランダムコイル含量を増加させることができ、これにより、この複合体の二次構造を変化させることが可能である。更に重要なことに、セコ−ケトアルデヒド４ａ又はアルドール付加物５ａは、マクロファージによる脂質取り込みを増大させ、泡沫細胞の形成を促進させることができる。
【００８０】
本発明は、コレステロールオゾン化産物のこれらの負の効果を相殺するための方法を提供する。
【００８１】
コレステロールオゾン化産物活性を相殺する因子の同定
本明細書に説明されているように、コレステロールオゾン化産物は、アテローム性動脈硬化症の発達に関与する重要な細胞の分化、発現パターン又は走化性を変化させることができる。例えば、コレステロールオゾン化産物４ａ及び５ａは、アテローム硬化性組織へマクロファージを動員することができ、マクロファージへの単球の分化を増大させることができ、内皮細胞中での細胞接着分子（Ｅ−セレクチン）の発現を増大させることができ、マクロファージ中でのクラスＡスカベンジャー受容体（ＳＲ−Ａ）の発現を増大させることができる。
【００８２】
それゆえ、本発明のある態様は、哺乳動物細胞においてコレステロールオゾン分解産物活性を阻害できる因子を同定するための方法である。この方法は、細胞を検査薬と接触させること、細胞の分化、発現パターン又は走化性が変化するかどうかを観察することを包含し、前記細胞は、コレステロールオゾン化産物とともに培養される。幾つかの実施形態において、コレステロールオゾン化産物は、４ａ又は５ａである。
【００８３】
ある実施形態において、本方法は、マクロファージを検査薬と接触させること、マクロファージをコレステロールオゾン分解産物に触れさせた後、マクロファージ中でクラスＡスカベンジャー受容体（ＳＲ−Ａ）の発現が増大するかどうかを観察することを包含する。ＳＲ−Ａ受容体は、修飾されたＬＤＬ及びオキシステロールのマクロファージ内部移行に必要とされる重要な細胞表面受容体である。マクロファージによるＬＤＬ及びオキシステロールのこのような取り込みによって、細胞構造が形成される。従って、アテローム硬化性組織中で泡沫細胞を構築するのを遅延又は阻害するために細胞がコレステロールオゾン分解産物に触れたときにＳＲ−Ａ発現を阻害することができる因子を使用することができる。幾つかの実施形態において、前記細胞は、ＬＤＬの存在下で、コレステロールオゾン分解産物４ａ又は５ａに触れさせられる。
【００８４】
本発明の別の方法は、アテローム硬化性組織へのマクロファージの動員を阻害できる因子を同定することである。本明細書に説明されているように、コレステロールオゾン分解産物は、マクロファージを誘引する走化作用薬である。マクロファージの構築は、アテローム性プラークの構築の１つの指標である。従って、コレステロールオゾン分解産物の存在下でマクロファージの走化性を相殺する因子は、アテローム硬化性プラーク形成を阻害するために使用できる。この方法は、マクロファージを検査薬と接触させること、前記マクロファージがコレステロールオゾン分解産物の源へ遊走するかどうかを観察することを包含する。幾つかの実施形態において、コレステロールオゾン分解産物４ａ又は５ａは、コレステロールオゾン分解産物として使用される。
【００８５】
本発明の別の態様は、Ｅ−セレクチン発現の増大を阻害することによってアテローム性動脈硬化症を阻害できる因子を同定するための方法である。この方法は、内皮細胞を検査薬と接触させること、内皮をコレステロールオゾン分解産物に触れさせて、内皮細胞中でＥ−セレクチンの発現が増大するかどうかを観察することを包含する。幾つかの実施形態において、前記細胞は、ＬＤＬの存在下でコレステロールオゾン分解産物４ａ又は５ａに触れさせられる。
【００８６】
本発明の別の態様は、マクロファージへの単球の分化を阻害できる因子を同定するための方法である。本明細書に示されているように、コレステロールオゾン分解産物は、マクロファージへの単球の分化が増大させ、上述のように、マクロファージは泡沫細胞になり得る。この方法は、単球を検査薬と接触させること、前記単球がマクロファージへ分化するかどうかを観察することを包含し、前記単球は、コレステロールオゾン分解産物とともに培養される。幾つかの実施形態において、前記単球は、コレステロールオゾン分解産物４ａ又は５ａとともに培養される。
【００８７】
細胞発現、細胞動員及び細胞分化に対するコレステロールオゾン分解産物の効果を相殺する因子を助けるために、対照アッセイを実施することが可能である。従って、上述のように実施されるが、検査薬の存在下で細胞が触れさせられないか又は培養されない対照アッセイを実施することが可能である。検査薬の存在下での細胞の動員、発現及び分化を評価するための同一手法は、前記薬なしでの動員、発現及び分化のレベルを観察及び／又は定量するのに使用できる。検査薬なしで観察される対照レベルと比較して、細胞の動員、発現及び分化が検査薬によって有意により低レベルになる場合に、前記検査薬は、有用な抗アテローム硬化性薬である。
【００８８】
更なる対照アッセイも実施され得る。例えば、幾つかの実施形態において、細胞がコレステロールオゾン分解産物に触れさせられないか又は前記分解産物の存在下で培養されないアッセイを実施することが有用であり得る。このような対照アッセイによって、コレステロールオゾン化産物の影響を受けずに、細胞の動員、発現及び分化を評価することが可能である。従って、検査薬が、コレステロールオゾン化産物の活性を直接遮断若しくは調節するかどうか、又は前記検査薬が、細胞の動員、発現及び分化を独立に調節するかどうかを確認するために、細胞の動員、発現及び分化に及ぼす検査薬の効果のみを評価することができる。
【００８９】
細胞の発現は、全ての利用可能な手法によって評価及び／又は定量化できる。例えば、細胞の発現は、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノザン分析及び他の手法によって評価できる。
【００９０】
細胞の動員は、細胞遊走を観察するための利用可能な手法によって評価することができる。例えば、細胞の動員は、改変されたＢｏｙｄｅｎチャンバー遊走アッセイを使用して評価することができる。Ｚｗｉｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：１５７０−７７、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１６２：３８−５０。これらのアッセイは、一般に、チャンバー間の細胞移動が可能な孔サイズ（例えば、５μｍ孔サイズ）を有する膜によって分離された２つのチャンバーを使用することを包含する。検査されるべき細胞を第一のチャンバー中に配置し、走化作用薬（例えば、コレステロールオゾン化産物）を他の（第二の）チャンバー中に配置する。走化作用薬が、第二のチャンバー中に存在する場合に、細胞は、メンブレンを通じて、第一チャンバーから第二チャンバーまで遊走する。走化作用薬へ遊走する細胞の数は、細胞の動員レベルの測定結果である。それゆえ、検査薬が存在する場合に、走化作用薬の方向へ（すなわち、コレステロールオゾン分解産物の方向へ）遊走する細胞が有意に少なければ、その検査薬は、アテローム硬化性病変へのマクロファージの遊走を阻害することによってアテローム性動脈硬化症を阻害できる因子である。
【００９１】
細胞分化は、検査薬及びコレステロールオゾン分解産物の存在下で単球を培養し、分化したマクロファージに特徴的な形態学的変化が検出されるかどうかを観察することによって評価できる。このようなマクロファージの形態学的変化は、分化したマクロファージに特徴的な細胞の接着、細胞内小胞の発達及び長い細胞質の拡大を含む。あるいは、マクロファージの分化は、マクロファージマーカーの細胞内発現を観察することによって検出することができる。活性化されたマクロファージは、フォラート及びフォラートによって誘導体化された化合物を結合する３８ＬＤのＧＰＩ固定されたフォラート受容体を発現する。それゆえ、細胞における３８ＬＤのＧＰＩ固定されたフォラート受容体の発現又はフォラート若しくはフォラートにより誘導体化された化合物の結合は、マクロファージを検出するために使用することができる。
【００９２】
一度、検査薬が、細胞の動員、発現及び／又は分化を調節できると同定されると、その検査薬は、その有効性を更に特徴づけ、その毒性を評価し、適切な投薬量を決定するために、アテローム硬化性の動物モデルで更に検査できる。
【００９３】
コレステロールオゾン化産物の効果を相殺するための方法
本発明によると、コレステロールオゾン化産物の負の効果は、このようなコレステロールオゾン化産物へ結合する又は前記産物を阻害する因子によって調節又は阻害することができる。他の実施形態において、コレステロールオゾン化産物は、アテローム硬化性病変のためのマーカー及び部位特異的抗原として使用することができ、これにより、治療薬をアテローム硬化性病変へ送達することができる。
【００９４】
従って、本発明は、血管系疾患、コレステロールの沈着を包含する循環器疾患、細胞毒性コレステロールオゾン化産物の放出と関連した問題を治療又は予防するための方法に関する。このような疾患及び問題は、解剖学的部位又は系内の脈管構造の損失、損傷又は崩壊と関連付けられ得る。「血管系疾患」又は「血管系疾病」という語は、血流が損なわれている又は損なわれ得る血管組織の状態を指す。
【００９５】
本発明によって治療又は予防できる血管系疾病は、哺乳動物の血管系疾病である。哺乳動物という語は、全ての哺乳動物を意味する。哺乳動物の幾つかの例は、例えば、イヌ及びネコ等のペット動物、ブタ、ウシ、ヒツジ及びヤギ等の家畜、マウス及びラット等の実験動物、サル、類人猿及びチンパンジー等の霊長類並びにヒトを含む。幾つかの実施形態において、ヒトは、本発明の方法によって好ましく治療される。
【００９６】
本発明の組成物及び方法で治療又は予防できる血管系疾患及び疾病の例は、アテローム性動脈硬化症（又は動脈硬化）、子癇前症、末梢血管疾患、心臓病及び脳卒中を含む。従って、本発明は、脳卒中、アテローム硬化性、不安定狭心症、血栓症及び心筋梗塞を含む急性冠動脈症候群、プラーク崩壊、冠動脈又は末梢動脈中の一次及び二次（ステント中）再狭窄、移植誘発性硬化症、末梢肢疾患、間欠跛行及び（虚血性心不全、末梢動脈疾患、鬱血性心不全、網膜症、ニューロパチー及び腎症を含む）糖尿病合併症、脳卒中又は血栓症等の疾病を治療する方法に向けられる。
【００９７】
本明細書に記載されている方法及び試薬は、アテローム硬化性プラークの発達の何れの段階でも使用できる。米国心臓協会によって採用され、本研究に使用される新たな分類によると、アテローム性動脈硬化症が進行する間に８個の病変種類が区別できる。
【００９８】
Ｉ型病変は、内膜中の（細胞内及びマクロファージ泡沫細胞中の）わずかな脂質沈着によって形成され、動脈壁中の初期の及び最小の変化を生じる。このような変化は、動脈壁を肥厚させない。
【００９９】
ＩＩ型病変は、内膜の厚さをｍｍ未満に肥厚させる黄色の線条又はパッチを含む脂肪性線条によって特徴付けられる。ＩＩ型病変は、Ｉ型病変において観察されるものより多くの脂質の蓄積からなる。脂質含有量は、前記病変の乾燥重量の約２０ないし２５％である。脂質のほとんどは、細胞内にあり、主としてマクロファージ泡沫細胞及び平滑筋細胞中にある。細胞外空間は、脂質滴を含有し得るが、細胞内のもの及び小胞粒子よりも小さい。これらの脂質滴は、コレステロールエステル（オレイン酸コレステリル及びリノール酸コレステリル）、コレステロール及びリン脂質からなることが、すでに記載されている。本発明によると、コレステロールオゾン化産物は、アテローム硬化性病変形成を伴う細胞による脂質の取り込みを促進できる。更に、本明細書に記載されているようなコレステロールオゾン化産物は、このような細胞内で、細胞内又は細胞外に蓄積できる。
【０１００】
ＩＩＩ型病変も、前アテローム病変として記載される。ＩＩＩ型病変において、内膜は、ＩＩ型病変に関して観察されるものに比べて、わずかに肥厚するに過ぎない。ＩＩＩ型病変は、動脈血流を閉塞しない。細胞外脂質及び小胞粒子は、ＩＩ型病変において見られるものと同一であるが、量が増加して存在し（約２５ないし３５％乾燥重量）、小さなプール中に蓄積し始める。
【０１０１】
ＩＶ型病変は、アテロームを伴う。ＩＶ型病変は、三日月形であり、動脈の厚さを増大させる。前記病変は、非常に高い血漿コレステロールレベルの人以外は、動脈管腔を狭くし得ない（多くの人にとって、前記病変は血管造影法によって可視化できない。）。ＩＶ型病変は、内膜層（脂質中心と呼ばれることがある。）中の細胞外脂質の広範囲な蓄積（約６０％乾燥重量）からなる。脂質中心は、鉱物のわずかな固定を含有し得る。これらの病変は、崩壊しやすく、及び壁在性血栓を形成しやすい。
【０１０２】
Ｖ型病変は、線維アテローム（ｆｉｂｒｏａｔｈｅｒｏｍａ）を伴う。Ｖ型病変は、主としてＩ型コラーゲンからなる線維状組織を１層又は多層有する。Ｖ型病変では、アテローム性動脈硬化症が管腔の縮小の増大を進行させるので、壁の厚さが増大する。これらの病変は、更に細かく分類できる特徴を有する。Ｖａ型病変では、新しい組織は、脂質中心を有する病変の一部である。Ｖｂ型病変では、脂質中心及び病変の他の部分が石灰化する（ＶＩＩ型病変に至る。）。Ｖｃ型病変では、脂質中心はなく、脂質は一般に最小である（ＶＩＩＩ型病変に至る。）。一般に、崩壊する病変は、Ｖａ型病変である。Ｖａ型病変は、比較的柔らかく、遊離コレステロール一水和物血漿よりもむしろコレステロールエステルを高濃度で有する。Ｖ型病変は、崩壊することができ、壁在性血栓を形成することができる。
【０１０３】
ＶＩ型病変は、亀裂、糜爛又は潰瘍形成等の病変表面の破壊（ＶＩａ型）、血腫又は出血（ＶＩｂ型）、並びにＩＶ型及びＶ型病変の上に重なる血栓沈着（ＶＩｃ型）を有する複雑な病変である。ＶＩ型病変は、病変の厚さが拡大しており、管腔はしばしば、完全に遮断される。これらの病変は、Ｖ型病変へ変換できるが、より大きく、より閉塞的である。
【０１０４】
ＶＩＩ型病変は、更に進行した病変の大きな無機化によって特徴付けられる石灰化した病変である。無機化は、リン酸カルシウム及びアパタイトの形態を取り、死滅した細胞及び細胞外脂質の蓄積したレムナントを置換する。
【０１０５】
ＶＩＩＩ型病変は、主としてコラーゲン層からなる線維性病変であり、脂質はほとんど存在しない。ＶＩＩＩ型は、血栓の脂質退行の結果であり得、又は伸長部分がコラーゲンへ変換された脂質性病変の結果であり得る。これらの病変は、中間サイズの動脈の管腔を閉塞し得る。
【０１０６】
内皮の損傷が、アテローム硬化性病変の形成における初期段階であると信じられているが、このような損傷は、しばしば、コレステロールの蓄積、内膜の肥厚、細胞の増殖及び結合組織線維の形成をもたらす。損傷を受けた内皮細胞及び内皮細胞化されていない内膜において、ＩｇＧ及び補体因子Ｃ３の蓄積が観察されている。血液由来の単核の貪食細胞も、アテローム硬化性病変中の細胞集団の一部である。
【０１０７】
本発明によると、このような抗体及び免疫細胞の蓄積は、活性酸素種をもたらし得、前記活性酸素種は、次いで、コレステロールオゾン化産物の形成に関与し得る。上述のように、アテローム硬化性病変形成と関連した細胞内での脂質蓄積は、問題となるアテローム硬化性病変の発達における重要な段階の１つである。プラーク形成に関する１つの機序は、脂肪の沈着がマクロファージの流入をもたらし、次いで、Ｔ細胞、Ｂ細胞の流入及び抗体産生が起こる。本明細書に示されているように、本発明のコレステロールオゾン化産物は、マクロファージによる脂質取り込みを促進し、マクロファージ泡沫細胞の形成を増大させる。従って、本発明者らは、コレステロールオゾン化産物が、アテローム硬化性等の炎症性血管系疾病を悪化させ得ることを示した。
【０１０８】
本発明は、血管系疾病及び疾患を予防及び治療するための治療用組成物及び方法を想定する。本発明によって影響される組成物は、多様な様式で血管系の症状を治療するために使用できる。
【０１０９】
一実施形態において、本発明は、コレステロールオゾン化産物へ結合できる抗体又は結合剤を動物へ投与することを包含する方法を提供する。このような抗体又は結合実体は、コレステロールオゾン化産物を調節し、脂質負荷及びこのようなオゾン化産物の活性を生じさせる泡沫細胞を阻害する。好ましくは、本方法において使用される抗体は、オゾン等の活性酸素種を発生しない。抗体又は結合因子は、本明細書に記載されているコレステロールオゾン化産物、例えばセコ−ケトアルデヒド４ａ、そのアルドール付加物５ａ又は関連化合物６ａないし１５ａ又は７ｃの全てに結合できる。これらの抗体及び結合実体は、コレステロールオゾン化産物と構造的に関連している、及び天然のコレステロールオゾン化産物と交差反応する抗体又は結合実体調製物を生成させるハプテンを使用して産生することができる。
【０１１０】
例えば、別の実施形態において、本発明は、コレステロールのオゾン化産物と反応できる抗体を生成するのに使用できる式３ｃ、１３ａ、１３ｂ、１４ａ、１４ｂ、１５ａ又は１４ｂの何れか１つを有するハプテンを供与する。
【０１１１】
【化１１】
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2009504184.tif 000014
2009504184.tif 000015
【０１１２】
式１５ａを有する化合物に対して生じるハイブリドーマＫＡ１−１１Ｃ５及びＫＡ１−７Ａ６は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．，２０１１０−２２０９  ＵＳＡ（ＡＴＣＣ））において、ＡＴＣＣ受託番号ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５４２７及びＰＴＡ５４２８として、２００３年８月２９日に、ブダペスト条約の規定に基づいて寄託された。式１４ａを有する化合物に対して生じたハイブリドーマＫＡ２−８Ｆ６及びＫＡ２−１Ｅ９は、ＡＴＣＣ受託番号ＡＴＣＣＰＴＣ−５４２９及びＰＴＡ−５４３０として、同じく、２００３年８月２９日に、ブダペスト条約の規定に基づいて寄託された。
【０１１３】
別の実施形態において、コレステロールオゾン化産物は、アテローム硬化性病変の標的又はマーカーとして使用される。従って、コレステロールオゾン化産物へ結合できる結合実体へ連結される治療薬は、アテローム性動脈硬化症を罹患する哺乳動物へ投与できる。アテローム性動脈硬化症及び関連する血管系疾病を治療又は予防するために、コレステロールオゾン化産物は、従って、アテローム硬化性病変の標的又はマーカーとして使用できる。コレステロールオゾン化産物の全て、例えば、セコ−ケトアルデヒド４ａ、そのアルドール付加物５ａ、及び／又はＡ環脱水生成物６ａは、結合実体及び／又は治療薬をアテローム硬化性プラークへ標的化するためのマーカーとして使用できる。あるいは、式７ａないし１５ａ又は７ｃを有するコレステロールオゾン化産物の全ては、結合実体及び／又は治療薬をアテローム硬化性プラークへ標的化するためのマーカーとして使用できる。
【０１１４】
この結合実体は、コレステロールオゾン化産物へ結合するように設計されるのみならず、アテローム硬化性病変を軽減し又は動脈の更なる閉塞を予防するように局所的に作用することができる治療薬又は因子を送達するようにも設計される。あるいは、この治療薬は、コレステロールオゾン化産物の負の効果を遮断、遮蔽又は阻害できる。従って、コレステロールオゾン化産物へ結合できる結合実体へ連結された治療薬は、アテローム性動脈硬化症等の血管系疾病を罹患する哺乳動物へ投与することができる。
【０１１５】
コレステロールオゾン化産物を認識することができ、本発明の方法において使用することができる結合実体は、コレステロールオゾン化産物を結合することができる全ての小分子、ポリペプチド又は抗体を含む。このようなポリペプチド及び抗体は、以下において、更に詳細に記載されている。
【０１１６】
このような結合実体へ連結することができる治療薬は、全ての抗酸化剤、薬物、因子、化合物、ペプチド、ポリペプチド、核酸又は酸化を減少させ又はアテローム硬化性病変を治療するために当業者が選択する他の因子を含む。コレステロールオゾン化産物の活性を相殺するか又はアテローム硬化性プラークの発達を解消し、消化し、中断し、又は阻害するか又はその他アテローム硬化性の進行を寛解するように機能する全ての治療薬を使用することができる。
【０１１７】
治療薬は、活性代謝物及びそのプロドラックも含むものとする。活性代謝物は、治療薬が代謝されるときに生じる治療薬の有効な誘導体である。プロドラッグは、治療薬へ代謝されるか又は治療薬の活性代謝物へ代謝されるかの何れかである化合物である。本発明は、小分子量化合物、抗酸化剤、放射性核種、薬物、酵素、ペプチド、タンパク質、治療用ポリペプチド、発現ベクター、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、リボザイム又は抗体をコードする核酸等の治療薬を投与するために使用できる。
【０１１８】
例えば、本発明の結合実体は、線維素溶解性因子を送達するために使用できる。このような治療薬は、例えば、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、プラスミン及びウロキナーゼ等の血栓溶解薬、組織因子プロテアーゼ阻害剤（ＴＦＰＩ）等の抗血栓薬、抗炎症薬、メタロプロテアーゼ阻害剤、線形動物から抽出される抗凝固タンパク質（ＮＡＰ）、細胞増殖を阻害する薬物、細胞増殖因子を阻害する薬物等を含む。本発明の結合実体へ連結され得る治療薬の更なる例は、次のものを含む。
【０１１９】
１）脂質レベルを調節する因子（例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、甲状腺ホルモン様薬、フィブラート系薬剤、（ＰＰＡＲ−α、ＰＰＡＲ−γ及び／又はＰＰＡＲ−δを含む）ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（ＰＰＡＲ）のアゴニスト）。
【０１２０】
２）酸化的工程を制御及び調節する因子。例えば、抗酸化剤、活性酸素種の調節剤、コレステロールオゾン化産物の調節剤又はリポタンパク質を修飾する因子（コレステロールオゾン化産物を含む。）の阻害剤。
【０１２１】
３）ＰＰＡＲ−α、ＰＰＡＲ−γ及び／又はＰＰＡＲ−δのアゴニスト、ＤＰＰ−ＩＶの修飾因子及びグルココルチコイド受容体の修飾因子を含む（但し、これらに限定されるわけではない。）、インスリン抵抗性及び／又は活性又はグルコース代謝若しくは活性を制御及び調節する因子。
【０１２２】
４）全ての血管の位置における内皮細胞又は平滑筋細胞上での受容体又は接着分子又はインテグリンの発現を制御及び調節する因子。
【０１２３】
５）全ての血管の位置における内皮細胞又は平滑筋細胞の活性を制御及び調節する因子。
【０１２４】
６）ケモカイン受容体、ＲＡＧＥ、トール様受容体、アンギオテンシン受容体、ＴＧＦ受容体、インターロイキン受容体、ＴＮＦ受容体、Ｃ反応性タンパク質受容体及びＮＦ−ｋｂの活性化を含む炎症性シグナル伝達経路に関与する他の受容体を含む（但し、これらに限定されるわけではない。）、炎症関連受容体を制御及び調節する因子。
【０１２５】
７）内皮細胞、血管平滑筋又はリンパ球、単球及び血管へ接着するか又は血管内で接着する好中球の増殖、アポトーシス又は壊死を制御及び調節する因子。
【０１２６】
８）コラーゲン、エラスチン、及びプロテオグリカンを含む（但し、これらに限定されるわけではない。）全ての細胞外マトリクスタンパク質の生成、分解、又は架橋結合を制御及び調節する因子。
【０１２７】
９）哺乳動物血管内の全ての細胞種類の活性化、分泌、又は脂質負荷を制御及び調節する因子。
【０１２８】
１０）哺乳動物血管内で樹状細胞の活性化、増殖又はその他の修飾を制御及び調節する因子。
【０１２９】
１１）活性化、接着又は血管壁のレベルで血小板に関する現象を修飾する他の工程を制御及び調節する因子。
【０１３０】
１２）抗体及び／又はアテローム硬化性プラーク物質によるオゾンの産生を制御及び調節する因子。
【０１３１】
１３）イブプロフェン、アセチルサリチル酸、ケトプロフェン等の抗炎症薬。
【０１３２】
本発明の結合実体は、共有結合し得る、又は、その他の方法で、このような治療薬と結合し得る。結合実体を有し、治療薬を含有するリポソームは、治療送達を容易にするために使用できる。投与されると、治療薬は、結合実体によってアテローム硬化性病変の部位に局在化され、アテローム硬化性病変の領域中の動脈血流の改善を制御、低下又はその他促進するのを助ける。本発明の結合実体は、遺伝子治療のためのベクター等のナノ粒子を送達するためにも使用できる。
【０１３３】
本発明によって想定される治療薬は、酸化剤に対してアンタゴニスト効果を有する全ての分子として定義される「抗酸化剤」も含む。このように定義される抗酸化剤は、１）オゾン又は抗体による活性酸素種の発生の阻害剤、２）コレステロールオゾン化産物の阻害剤、及び３）コレステロールオゾン化産物によって生じる毒性効果の阻害剤も含む。好ましい抗酸化剤は、コレステロールオゾン化産物の産生を阻害するもの、及びすでに形成された前記産物を中和するものを含む。抗酸化剤効果は、触媒作用を含む全てのメカニズムによって生じ得る。カテゴリーとして、抗酸化剤は、活性酸素種スカベンジャー、オゾンスカベンジャー、又はフリーラジカルスカベンジャーを含む。抗酸化剤は、異なる種類であり得るので、抗酸化剤は必要とされれば、及び抗酸化剤が必要とされる場合には、それらを利用することが可能である。好気的生物体全体に酸素が存在することに鑑みれば、抗酸化剤は、異なる細胞、組織、臓器及び細胞外区画において利用可能であり得る。後者の細胞外区画は、細胞外液体空間、眼内液、滑液、脳脊髄液、胃腸分泌物、間質液、血液及びリンパ液を含む。抗酸化剤は、食事を補完することによって、又は注射、静脈内投与等によって供与できる。
【０１３４】
使用できる抗酸化剤の例は、アスコルビン酸、α−トコフェロール、γ−グルタミルシステイニルグリシン、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ、α−リポ酸、ジヒドロポロエート（ｄｉｈｙｄｒｏｌｉｐｏａｔｅ）、アセチル−５−メトキシトリプタミン、フラボン、フラボネン、フラバノール、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、メタロチオネイン及びブチル化ヒドロキシトルエンを含むが、これらに限定されるわけではない。
【０１３５】
別の実施形態において、結合実体は、アテローム硬化性プラークのレーザー血管形成焼灼術を利用するための手段を提供する。本発明の結合実体の１つ又はそれ以上は、その吸収最大値が、血管形成に使用されるべきレーザーの最大発光波長に相当する染色剤へ結合させることが可能である。投与後に、染色剤を有する結合実体は、アテローム硬化性病変中のコレステロールオゾン化産物へ結合するが、正常な組織に対する結合は実質的に示されない。染色剤は、アテローム硬化性病変上にレーザーエネルギーを集中させるための標的として使用できる。切除手法の間、レーザーからのエネルギーは染色剤によって吸収され、従って、罹患した領域上に集中できる。その結果、周囲の正常な組織に対する損傷を最小限に抑えつつ、切除の有効性が増大する。
【０１３６】
結合実体への結合のために、広範な蛍光染色剤を利用することが可能である。タンパク質、特に抗体に対して染色剤を結合させるための多くの方法が公表されている。染色剤の選択及び結合の方法は、レーザー血管形成及びタンパク質化学の分野の当業者には自明であろう。レーザー血管形成に有用であり得る染色剤の１つは、ローダミンである。ローダミンは、その多様な誘導体が、約５７０ｎｍの波長で光を吸収する蛍光染色剤である。
【０１３７】
結合実体は、利用可能な手法によってローダミン等の染色剤へ連結することができる。例えば、結合実体は、５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．２に対して透析できる。リサミンローダミンＢ塩化スルホニル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）の新鮮な溶液は、０．２５ｍｇ／ｍＬで、無水アセトン中に調製できる。結合されるべき結合実体の量を上回るローダミンの６倍モル過剰量に相当するこの溶液の一定分量をガラス管へ転移する。乾燥アルゴン流の下で、アセトンを蒸発させる。前記管中のローダミン残渣へ、透析した抗体を添加する。前記管をキャップし、アルミホイルで覆い、一定の振盪を与えながら、４℃で３時間温置する。
【０１３８】
結合実体溶液の容積の１０分の１に等しい１．５Ｍ塩酸ヒドロキシルアミン（Ｓｉｇｍａ）溶液（ｐＨ８．０）の一定分量を、反応混合物へ添加する。一定の振盪を与えながら、一定のこの溶液を４℃で３０分間温置する。次に、暗所で、反応混合物をホウ酸塩緩衝液に対して大規模に透析する。染色剤の光退色を回避するために、ローダミン−抗体コンジュゲートは、暗所にて、４℃で保存することができる。
【０１３９】
投与後、標識した結合実体は、染色剤をアテローム硬化性病変へ特異的に送達されるが、正常組織へは送達されない。標識した結合実体に結合する組織は、約５７０ｎｍの波長のレーザーを適用することによって切除できる。
【０１４０】
別の実施形態において、本発明の結合実体は、アテローム硬化性病変の部位へ酵素を特異的に送達するために使用できる。この酵素は、プラークの１つ又はそれ以上の構成成分を消化することができるあらゆる酵素であり得る。酵素又は酵素の組み合わせは、タンパク質化学の分野の当業者に公知の多様な結合技術のうちの１つによって、結合実体へ結合される。
【０１４１】
別のアプローチにおいて、本発明の結合実体は、酵素の不活性型形態、例えば酵素前駆体又は酵素−阻害剤複合体へ結合させることができる。この方法の利点は、より多量の酵素が投与され得ることであり、従って、より多量の酵素をプラークへ送達するにも関わらず、循環しているコンジュゲートによる正常組織への損傷をまったく生じないことである。結合している実体−酵素コンジュゲートがプラークへ結合し、結合していない循環中のコンジュゲートが排除された後に、酵素が活性化されてプラークの消化が開始され得る。活性化は、酵素前駆体の特異的な開裂又は酵素阻害剤の除去を包含する。
【０１４２】
別の実施形態において、アテローム硬化性病変中の他の因子を認識及び結合する抗体又は結合実体は、治療薬の送達のために使用される。多様な可溶性タンパク質が、ヒトアテローム硬化性プラークから抽出されており、ＩgＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、Ｂ１Ｃ（Ｃ３）、α１−アンチトリプシン、α２−マクログロブリン、フィブリノーゲン、アルブミン、ＬＤＬ、ＨＤＬ、α１−酸糖タンパク質、β２−糖タンパク質、トランスフェリン及びセルロプラスミンを含む。罹患した内膜は、組織結合型ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＢ１Ｃを少量含有することも明らかとなっている［Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ，Ｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，３４：３９１−４０５（１９７９）］。ＩｇＧは、病変及び隣接する内皮組織中で観察されている［Ｐａｒｕｍｓ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，３８：２１１−２１６（１９８１），Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，３４：２６４−２８０（１９８１），Ｈａｎｎｓｏｎ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｐａｔｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｅｃｔ．Ａ．，９２：４２９−４３５（１９８４）］。これらのタンパク質の何れもが、治療薬をアテローム硬化性病変へ送達するために使用できる。
【０１４３】
米国特許第６，０２５，４７７号は、アテローム硬化性プラークの細胞外構成成分として特異的に存在する精製された抗原、及び前記抗原に対して誘導された抗体を提供する。この抗原は、複雑な炭水化物構造、及び２００，０００ダルトン超の分子量を有する。ハイブリドーマＱ１０Ｅ７によって記載されるモノクローナル抗体は、アテローム硬化性病変へ選択的に結合する。米国特許第６，０２５，４７７号は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４４】
更なる実施形態において、アテローム性動脈硬化症を罹患する患者の血流中へ内因性に放出されるコレステロールの細胞毒性オゾン化産物は、患者を生体内治療することによって、又はオゾン化産物に結合し、コレステロールオゾン化産物の除去を容易にする結合実体で患者の血液を生体外で処理することによって除去できる。本明細書に記載されているとおり、アテローム性動脈硬化症の患者由来の血漿試料は、コレステロールオゾン化産物の検出可能なレベルを有した。アテローム硬化性患者の検査群は、動脈内膜切除が必要な程度まで十分に進行したアテローム硬化性病状を有する８名の患者を含んだ。一般的な医療診療所で診察を受けている患者から、患者の対照群を無作為に選択した。検査群中の８名の患者のうちの６名は、７０ないし１６９０ｎＭの範囲の量のアルドール５ａの検出可能な血漿レベルを有した（図５参照）。対照群からの１５名の血漿試料のうち５ａが検出可能であったのは、わずか１名に過ぎなかった。ケトアルデヒド４ａは、何れの患者の血液試料中でも実際に検出されなかったが、用いたアッセイは、約１ないし１０ｎＭの検出限界を有した。ケトアルデヒド４ａは、アテローム硬化性病変からの放出中又は放出後に、アルドール５ａへ変換される。従って、アテローム性動脈硬化症患者の血流から細胞毒性コレステロールオゾン化産物を除去するように計画された治療において、アルドール付加物５ａは、除去するための一次産物であり得る。
【０１４５】
血管系の疾患を治療し、血流から細胞毒性コレステロールオゾン化産物を除去するために、本発明によって提供される治療法は、外科的な及び他の侵襲的で危険な治療手法を回避できる。例えば、アテローム性動脈硬化症に対する最新の治療法は一般に、外科的な方法と、疾病を医学的に管理するための方法とに分けられる。外科的な方法は、閉塞領域をバイパスする血管移植手法（例えば、冠動脈バイパス移植）、動脈壁からの閉塞プラークの除去（例えば、頸動脈内膜剥離術）、又はプラークを経皮的に分解すること（例えば、バルーン血管形成術）を必要とし得る。外科的療法は、著しい危険性をはらんでおり、一回に、個別の病変のみを治療するに過ぎない。また、外科的療法は、アテローム硬化性の進行を制限せず、再狭窄等の合併症と関連する。
【０１４６】
本発明の方法を使用して、コレステロールオゾン化産物を標的とすることは、心臓病の治療を簡素化し得、患者が手術の危険性及び複雑さを回避し得る。本発明が手術を回避し得る理由の１つは、本明細書で同定されたコレステロールオゾン化産物が、アテローム硬化性病変によって特異的に生じるように見えることである。従って、それらのオゾン化産物を標的化することは、アテローム硬化性の部位及び原因を正確かつ特異的に標的とする。同様に、血流からの細胞毒性オゾン化産物の除去は、血管系に対する更なる損傷を予防できる。
【０１４７】
コレステロールのオゾン化を防ぐ因子の同定
本発明は更に、活性酸素種の形成を抗体によって遮断する因子を同定するための方法を提供する。このような方法は、一重項酸素（１Ｏ２＊）の源を用いて提供された抗体によって、活性酸素種産生を阻害する因子の選出を包含する。使用される一重項酸素（１Ｏ２＊）は、好中球等の一重項酸素（１Ｏ２＊）の天然源であり得る。あるいは、一重項酸素（１Ｏ２＊）は、一重項酸素の合成源であり得る。例えば、光等の誘導因子へ曝露した後に一重項酸素を生じる、金属を含まないポルフィリン等の「感作物質」分子が使用できる。
【０１４８】
本発明者によって示されたように、抗体又は好中球が一重項酸素（１Ｏ２＊）へ曝露されると、本質的に全ての抗体又は好中球が、スーパーオキシドラジカル（Ｏ２−）、ヒドロキシルラジカル（ＯＨ●）、過酸化水素Ｈ２Ｏ２又はオゾン（Ｏ３）などの（これらに限定されるものではない。）強力な活性酸素種を生じ得る。Ｐ．Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ  Ｊｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８，２１９５（２００２）、Ｂ．Ｍ．Ｂａｂｉｏｒ，Ｃ．Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｊ．Ｒｕｅｄｉ，Ａ．Ｇｕｉｔｉｅｒｒｅｚ，Ｐ．Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ  Ｊｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，３９２０（２００３）、Ｐ．Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ  Ｊｒ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，１４９０（２００３）を参照されたい。それゆえ、本明細書で使用されるように、「活性酸素種」という語は、抗体によって生成される酸素種を意味する。これらの活性酸素種は、１つ又はそれ以上の不対電子を有する、又は、前記活性酸素種が他の分子と容易に反応するので、その他の反応性を有する。このような活性酸素種は、スーパーオキシドフリーラジカル、過酸化水素、ヒドロキシルラジカル、ペルオキシルラジカル、オゾン及びオゾンと同一の化学的サインを有する寿命の短い他の三酸素付加物を含むが、これらに限定されるわけではない。更に、本明細書に記載の実験作業によって説明されるように、オゾンは、アテローム硬化性病変内で生じる。
【０１４９】
抗体は、免疫系のその他の構成成分を必要とせずに、すなわち構成成分カスケード又は食作用を必要とせずに、一重項酸素（１Ｏ２＊）の活性酸素種への変換を実施する。一重項酸素から活性酸素種を生じる能力は、インタクトな免疫グロブリン中、並びにＦＡｂ、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片等の抗体断片中に存在する。また、活性は、抗体分子中のジスルフィドの存在と関係しない。しかしながら、一重項酸素から活性酸素種を生成する抗体の能力は、抗体が変性されると、無効となる。このことは、インタクトの又は実質的にインタクトの三次元構造が、抗体による活性酸素種の発生に必要であることを示す。
【０１５０】
抗体によって活性酸素種を発生させるために最小限必要とされる条件は、酸素の存在である。従って、好気的条件が一般に必要である。より具体的には、生体内での抗体の使用は、鍵となる基質である１Ｏ２＊の利用可能性に依存するが、このような１Ｏ２＊は、多様な生理学的現象中で生じ、生体内で利用可能である。Ｊ．Ｆ．Ｋａｎｏｆｓｋｙ  Ｃｈｅｍ．−Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ７０，１（１９８９）及びその中の参考文献を参照されたい。例えば、１Ｏ２＊は、再灌流を含む現象で生じる。Ｘ．Ｚｈａｉ  ａｎｄ  Ｍ．Ａｓｈｒａｆ  Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６９（Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３８）Ｈ１２２９（１９９５）。１Ｏ２＊は、食作用中の好中球の活性化においても生じる。Ｊ．Ｒ．Ｋａｎｏｆｓｋｙ，Ｈ．Ｈｏｏｇｌａｎｄ，Ｒ．Ｗｅｖｅｒ，Ｓ．Ｊ．Ｗｅｉｓｓ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，９６９２（１９８８），Ｂａｂｉｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１０９：３３−３４（２０００）。
【０１５１】
一重項酸素（１Ｏ２）は、金属を含まないポルフィリン前駆体の光による照射からも生じる。一重項酸素の活性酸素種への生物学的変換は、可視光、赤外線光及び紫外線照射条件下などの光の中で生じる。可視光条件が使用される場合、一重項酸素の産生は、一重項酸素源を提供できる他の分子を使用して、増強させることが可能である。一重項酸素を生成する分子は、他の因子又は誘導因子及び、誘導因子への曝露後に一重項酸素を生成できる「感作物質」を必要とせずに一重項酸素を発生させる分子を含む。他の因子又は誘導因子を必要とせずに一重項酸素を生成することができる分子の例は、エンドペルオキシドを含むが、これに限定されるわけではない。幾つかの実施形態において、使用されるエンドペルオキシドは、アントラセン−９，１０−ジプロピオン酸エンドペルオキシドであり得る。感作物質分子の例は、プテリン、フラビン、ヘマトポルフィリン、テトラキス（４−スルホナトフェニル）ポルフィリン、ビピリジルルテニウム（ＩＩ）複合体、バラベンガル染色剤、キノン、ローダミン染色剤、フタロシアニン、ヒポクレリン、ルブロシアニン、ピナシアノール又はアロシアニンも含むが、これらに限定されるわけではない。
【０１５２】
感作物質分子は、誘導因子へ曝露されたとき、一重項酸素を生成するように誘導することができる。１つのこのような誘導因子は、光である。このような光は、感作物質の種類及び構造に応じて、可視光、紫外線光又は赤外線光であり得る。
【０１５３】
従って、本発明は、抗体と一重項酸素源との混合物を因子と接触させること、抗体による活性酸素産生が調節されるかどうかを観察することを包含する、抗体による活性酸素種の産生を調節できる因子に関するスクリーニングのための方法を供与する。幾つかの実施形態において、前記因子は、好ましくは、活性酸素種をほとんど産生させない。他の実施形態において、前記因子は、好ましくは、より多くの活性酸素種を産生させる。
【０１５４】
細胞毒性コレステロールオゾン化産物のための使用
本明細書に記載されているように、セコ−ケトアルデヒド４ａ、そのアルドール付加物５ａ及び関連化合物６ａないし１５ａ及び７ｃは、多くの細胞種に対して細胞毒である。化合物７ｃの構造を以下に示す。
【０１５５】
【化１２】
2009504184.tif 000016
【０１５６】
例えば、本明細書に説明されているように、セコ−ケトアルデヒド４ａ及びそのアルドール付加物５ａは、Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  ２２，５１７（１９６８）に記載のヒトＢリンパ球（ＷＩ−Ｌ２）、Ｗｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３，１２３（１９８４）に記載のＴリンパ球細胞系（Ｊｕｒｋａｔ  Ｅ６．１），Ｆｏｌｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７６，５２１７（１９７９）に記載されている血管平滑筋細胞系（ＶＳＭＣ）及び腹部大動脈内皮（ＨＡＥＣ）細胞系、Ｒａｌｐｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４３，１５２８（１９７６）に記載のネズミ組織マクロファージ（Ｊ７７４Ａ．１）及びＭｂａｗｕｉｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．４６，１１９（１９８９）に記載されている肺胞マクロファージ細胞系（ＭＨ−Ｓ）に対して細胞毒性がある。
【０１５７】
同様の手法を使用して、化合物６ａ、７ａ、７ｃ、１０ａ、１１ａ及び１２ａは、本発明者によって、白血球細胞系に対して細胞毒性であることが示されており、セコ−ケトアルデヒド４ａ及びそのアルドール付加物５ａは、ニューロン細胞系に対して細胞毒性があることが示されている。
【０１５８】
従って、本発明は、本コレステロールオゾン化産物を含有する組成物及び、不適切な免疫反応、自己免疫疾患、癌、腫瘍、細菌感染、ウィルス感染、真菌感染、潰瘍及び／又は細胞毒の局所的な投与に利点のある他の疾患又は疾病を治療及び予防するための方法を提供する。
【０１５９】
細胞毒は、コレステロールオゾン処理が、罹患していない組織に悪影響を及ぼさないようにマスクされなければならない場合があり得る。製剤中で４ａ又は５ａの細胞毒をマスクするための手法の一例に、リポソームの使用が含まれる。例えば、４ａ又は５ａの細胞毒は、リポソーム内に配置することが可能であり、結合実体は、リポソームのリン脂質膜内に固定できる。結合実体によって、リポソームが罹患した組織へ容易に局在化し、リポソームの脂質コーティングは、罹患していない組織を、細胞毒性コレステロールオゾン化産物から保護する。また、リポソーム脂質コーティングは、アテローム硬化性病変中の脂質と相互作用することが可能であり、これによりリポソーム含有物が融合及び放出される。
【０１６０】
癌及び腫瘍の治療
別の実施形態において、細胞毒性コレステロールオゾン化産物は、癌を治療又は予防するために使用できる。従って、本発明は、化合物４ａないし１５ａ及び７ｃの何れか及びその医薬組成物を含む抗癌細胞毒を提供する。本明細書で説明されているように、４ａ、５ａ及び関連化合物は、Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  ２２，５１７（１９６８）に記載されているヒトＢリンパ球（ＷＩ−Ｌ２）、Ｗｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３，１２３（１９８４）に記載されているＴリンパ球細胞系（Ｊｕｒｋａｔ  Ｅ６．１）、Ｆｏｌｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７６，５２１７（１９７９）に記載されている血管平滑筋細胞系（ＶＳＭＣ）及び腹部大動脈内皮（ＨＡＥＣ）細胞系、Ｒａｌｐｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４３，１５２８（１９７６）に記載されているネズミ組織マクロファージ（Ｊ７７４Ａ．１）及びＭｂａｗｕｉｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．４６，１１９（１９８９）に記載されている肺胞マクロファージ細胞系（ＭＨ−Ｓ）を含む多数の哺乳動物細胞に対して細胞毒性がある。従って、４ａ及び５ａの細胞毒は、多くの異なる癌細胞種を死滅させ又はその発達を阻害するために使用することができる。
【０１６１】
本明細書で使用されるように、「癌」という語は、哺乳動物の固体腫瘍及び血液学的悪性腫瘍を含む。「哺乳動物の固体腫瘍」は、頭部及び頸部、肺、中皮腫、縦隔、食道、胃、膵臓、肝胆道系、小腸、結腸、結腸直腸、直腸、肛門、腎臓、尿道、膀胱、前立腺、尿道、陰茎、精巣、婦人科臓器、卵巣、乳房、内分泌系、皮膚中枢神経系、柔組織の肉腫及び骨、皮膚及び眼内源の黒色腫の癌を含む。「血液学的悪性腫瘍」という語は、小児白血病、リンパ腫、ホジキン病、リンパ球源及び皮膚源のリンパ腫、急性及び慢性白血病、形質細胞腫瘍及びＡＩＤＳ関連癌を含む。更に、原発癌、転移癌及び再発癌等、進行のあらゆる段階の癌を治療することができる。癌の数多くの種類に関する情報は、例えば、アメリカ癌協会（ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｏｒｇ）、又は、例えば、Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１２ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．から見出され得る。ヒト及び動物用の両方の使用が想定される。
【０１６２】
本明細書で使用されるように、「正常な哺乳動物細胞」及び「正常な動物細胞」という語は、正常な発達制御メカニズム（例えば、遺伝的制御）のもとで発達しており、及び正常な細胞分化を示す細胞として定義される。癌細胞は、その発達パターン及びその細胞表面の性質において、正常細胞とは異なる。例えば、癌細胞は、本分野で周知の特徴の他、特に、癌細胞の近隣にかかわらず、連続的及び無秩序に発達する傾向がある。
【０１６３】
哺乳動物及びトリを含む他の動物は、本明細書に記載及び請求されている方法及び組成物によって治療され得る。このような哺乳動物及びトリは、ヒト、イヌ、ネコ、及び家畜、例えばウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、シチメンチョウ等を含む。
【０１６４】
本発明は、従って、動物において標的癌を治療又は予防するのに効果的な量の化合物４ａないし１５ａ及び７ｃの何れか１つの化合物を含む細胞毒と医薬として許容される担体とを含む、動物中の癌細胞の発達を治療、阻害又は予防するための医薬組成物であって、前記細胞毒は、癌細胞に選択的に結合する抗体又は結合実体へ連結され得る、前記医薬組成物を提供する。
【０１６５】
本発明は、非癌性哺乳動物細胞死の望ましくない量を誘導せずに、標的となる癌細胞の死滅を誘導するのに十分な量の化合物４ａないし１５ａ及び７ｃの何れか１つの化合物を含む細胞毒に標的癌細胞を接触させることを含む、動物において癌細胞の発達を治療、阻害又は予防するための方法であり、前記細胞毒は、癌細胞へ選択的に結合する抗体又は結合実体へ連結され得る前記方法を提供する。
【０１６６】
本発明は更に、癌以外の哺乳動物細胞の死滅の望ましくない量を誘導せずに、標的となる癌細胞の死滅を誘導する又は癌細胞の発達を阻害するのに十分な量の化合物４ａないし１５ａ及び７ｃの何れか１つの化合物を含む細胞毒を含む製剤を投与することを含む、動物において癌細胞の発達を治療、阻害又は予防するための方法であり、前記細胞毒は、癌細胞へ選択的に結合する抗体又は結合実体へ連結され得る前記方法を提供する。
【０１６７】
癌細胞へ選択的に結合する抗体又は結合実体は、当業者によって選択される全ての利用可能な組織特異的抗原又は癌マーカーを認識することができる又はこれに結合することができる。
【０１６８】
腫瘍抗原及び腫瘍抗原に対する抗体は公知である。癌若しくは肉腫細胞若しくはリンパ腫に存在する腫瘍関連抗原に対して反応性のある結合実体、抗体又は抗体断片は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ  ９，Ｎｏ．４，ｐｐ．５４８−５６４，１９９１及びＰａｗｌａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ  ４９，ｐｐ．４５６８−４５７７，１９８９中に、ＬＬ−２及びＥＰＢ−２（同一）として開示されている。他のものは、抗ＣＥＡモノクローナル抗体を開示するＰｒｉｍｕｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４３：６８６−６９２，１９８３、抗ＣＥＡモノクローナル抗体を開示及び比較するＨａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，３０：４１４，１９８９、結腸特異的ｐ抗原（ＣＳＡｐ）と反応性を有するモノクローナル抗体を開示するＧｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５０：６４０５−６４０９，１９９０及び膵臓の腫瘍関連エピトープと反応性のあるモノクローナル抗体を開示するＧｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３１：２９２，１９９０に開示されている。ＫＣ−４ネズミモノクローナル抗体を使用することも可能であり、これは、特有の抗原決定因子に対して特異的であり、腫瘍性の癌細胞に対して選択的に強力に結合するが、正常ヒト組織には結合しない（Ｃｏｕｌｔｅｒに対する米国特許第４，７０８，９３０号）。
【０１６９】
ＢｒＥ−３抗体（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ９：２２１（１９９０）、米国特許第５，０７５，２１９号）は、ヒト乳房上皮ムチンのポリペプチド中心のタンデム反復へ結合することが示された。ムチンが脱グリコシル化されると、より多くのタンデム反復エピトープの存在が曝露され、抗体の結合が増大する。従って、前記抗体が、正常な上皮組織では発現されない乳房上皮ムチンのグリコシル化していない形態を発現する故に、ＢｒＥ−３等の抗体は、腫瘍性癌腫瘍に優先的に結合する。乳癌患者等の癌患者の血行中のこれらの抗体に対するエピトープの濃度が低いことが観察されることに加えて、この優先的な結合のために、ムチンエピトープに対する特異性を有する抗体は、癌治療に対して極めて効果的なものとなっている。
【０１７０】
それゆえ、本発明は、癌を治療及び／又は予防するための組成物及び方法を提供する。
【０１７１】
移植拒絶の治療
Ｔリンパ球は、同種異系移植片（例えば、心臓等の移植された臓器）の拒絶を生じる主要な原因となる細胞種である。Ｔリンパ球（キラー及びヘルパー）は、ＩＬ−２受容体のＴリンパ球表面上での一過性の存在によって特徴付けられる増殖性バーストを受けることによって、同種異系移植片に反応する。増殖性バーストの間に、Ｔリンパ球と特異的に反応する細胞毒を投与することによってこれらの細胞を死滅させることは、同種異系移植片拒絶を阻害することができる。活性型Ｔリンパ球を特異的に認識する結合実体へ細胞毒を連結することによって、細胞毒は、有利なことに、（感染と戦うのに必要な休止又は長期記憶Ｔリンパ球を含む）他の細胞に悪影響を及ぼすことができない。活性型Ｔリンパ球に存在するが、休止又は長期記憶Ｔリンパ球には存在しないある細胞表面タンパク質は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）受容体である。それゆえ、ＩＬ−２受容体に結合する結合実体へ連結された細胞毒の使用によって、活性型Ｔリンパ球に対する選択性が提供される。
【０１７２】
本明細書に記載のように、採用される細胞毒は、セコ−ケトアルデヒド４ａ、そのアルドール付加物５ａ又は化合物４ａないし１５ａ及び７ｃを有する関連化合物の何れかである。これらのコレステロールオゾン化産物は、Ｗｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３，１２３（１９８４）に記載されているＴリンパ球細胞系（Ｊｕｒｋａｔ  Ｅ６．１）に対して細胞毒性がある。幾つかの実施形態において、４ａないし１２ａ又は７ｃの細胞毒は、細胞溶解を誘導できるか、細胞の死滅を誘導できるか、又は細胞の増殖を阻害できる。
【０１７３】
４ａないし１４ａ又は７ｃの細胞毒が、Ｔリンパ球の機能又は増殖を阻害するので、使用される結合実態は、ＩＬ−２のＩＬ−２受容体との相互作用を遮断し、又は遮断しないように結合することができる。しかしながら、ＩＬ−２の結合部位を遮断することによって、Ｔリンパ球が完全に活性化されず、組織拒絶の阻害に関与する幾つもの重要な現象をもたらし得ることがさらに確保される。
【０１７４】
活性型Ｔリンパ球を選択的に標的とすることによって、本発明の方法は、全身的な免疫抑制を生じない様式で、その結果、生命を脅かす感染のリスクなしに、同種異系移植拒絶を阻害する。更に、本方法は、ドナー特異的Ｔサプレッサー細胞を温存させるので、ドナー特異的Ｔサプレッサー細胞が増殖することができ、同種異系移植片の生存の延長化を補助する。更に、この治療法は、同種異系移植後に継続する必要はなく、治療の経過後に中止することができる。
【０１７５】
本発明の一実施形態は、ＩＬ−２受容体特異的結合実体として、例えば、４ａないし１５ａ又は７ｃの細胞毒へ共有結合された、Ｔリンパ球上のＩＬ−２受容体に対して特異的な抗体を使用する。細胞毒は、結合実体が結合するＴリンパ球を溶解できる。Ｔリンパ球上のＩＬ−２受容体に特異的な抗体は、本明細書に記載されている標準的な技術を使用してなされ得る。あるいは、このような抗体は、例えばＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ（例えば、マウス−ヒトモノクローナル抗ＩＬ−２受容体抗体）から購入することができる。抗体は、モノクローナル又はポリクローナルであり得、何れかの適切な動物に由来し得る。抗体がモノクローナルであり、治療される哺乳動物がヒトである場合、ヒト又はヒト化抗ＩＬ−２受容体抗体が好ましい。
【０１７６】
ＩＬ−２受容体に特異的なモノクローナルを得るためのモノクローナル抗体の産生及び初期スクリーニングは、Ｕｃｈｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２６（４），１３９３に記載されているとおり実施できる。要約すると、この方法は、以下の工程を採用する。培養ヒトＴリンパ球を哺乳動物、例えばマウス中へ注射し、免疫化された動物の脾臓を摘出し、脾臓細胞を分離した後、不死化細胞、例えばマウス又はヒトのミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマを形成する。次に、補体依存的細胞毒性検査を使用して、ＩＬ−２受容体特異的な抗体について、培養上清由来の抗体を含有する上清をスクリーニングする。ヒトＴリンパ球及びＥＢＶ形質転換されたＢリンパ球を５１Ｃｒクロム酸ナトリウムで標識し、標的細胞として使用する。これらの細胞をハイブリドーマ培養上清及び補体とともに温置した後、上清を回収し、γカウンタで計数する。活性型Ｔリンパ球に対する毒性を示すが、休止のＴリンパ球にもＢリンパ球にも毒性を示さない上清を選択した後、更なるスクリーニング工程へ供し、（Ｌｅｏｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ  ８０，６９５７に詳述される）５０キロダルトンの糖タンパク質であるＩＬ−２受容体を沈殿させる（すなわち、特異的に反応性がある）抗体を含有する上清を選択する。望ましい抗ＩＬ−２受容体抗体は、従来法を使用して上清から精製される。
【０１７７】
自己免疫疾患の治療
（本明細書では、ＣＤ４＋Ｔ細胞と呼ばれる）ＣＤ４＋Ｔリンパ球は、感染と戦っていない他の白血球及び潜在的な癌細胞に「補助」を与えるので、免疫系における中心的なプレーヤーである。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、体液性免疫及び細胞媒介性免疫の両者において必須の役割を担う。更に、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、寄生虫感染の間、好酸球及び肥満細胞の分化を促進するように作用する。（エイズ患者における場合のように）ＣＤ４＋Ｔ細胞集団が枯渇する場合、宿主は、通常宿主に対して脅威を与えない多くの病原体及び腫瘍に対して感染しやすくなる。
【０１７８】
しかしながら、ＣＤ４＋Ｔ細胞は疾病予防に重要な有利な役割を担っているが、これらの細胞の異常な機能は、重大な問題を生じ得る。幾つかの個体において、ＣＤ４＋Ｔ細胞の異常な機能によって、自己免疫疾患及び他の疾病が生じる。ＣＤ４＋Ｔ細胞が関与する自己免疫疾患は、多発性硬化症、関節リウマチ及び自己免疫ぶどう膜炎を含む。本質的に、これらの疾病では、免疫系は病原体の侵入を攻撃するという正常な役割とは逆に、宿主の体組織を攻撃し、病気及び時には死に至る場合さえある異常な免疫反応が関与している。異なる自己免疫疾患において、攻撃される標的の宿主組織は異なる。例えば、多発性硬化症において、免疫系は、脳の白質及び骨髄を攻撃し、関節リウマチでは、免疫系は、関節の滑膜の裏打ちを攻撃する。活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞は、移植する組織及び臓器の拒絶並びにＣＤ４＋Ｔ細胞リンパ球の発達を含む他の疾病にも関与している。
【０１７９】
それゆえ、本発明は、望ましくない免疫反応に対して有用な治療の方法を提供する。ある実施形態において、本発明は、Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患を治療又は予防するための方法を提供する。他の実施形態において、本発明は、活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患を治療及び予防するための方法を提供する。治療できる疾病は、例えば、多発性硬化症、関節リウマチ、サルコイドーシス及び自己免疫ぶどう膜炎、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）及び／又は炎症性腸疾患を含む。
【０１８０】
これらの方法において採用される細胞毒は、セコ−ケトアルデヒド４ａ、そのアルドール付加物５ａ又は式４ａないし１５ａ若しくは７ｃの何れかを有する化合物である。これらのコレステロールオゾン化産物は、Ｗｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３，１２３（１９８４）に記載されているＴリンパ球細胞系（Ｊｕｒｋａｔ  Ｅ６．１）に対して細胞毒性がある。幾つかの実施形態において、４ａないし１５ａ又は７ｃの細胞毒は、細胞溶解を誘導し、細胞の死滅を誘導し、又は細胞の増殖を阻害することができる。
【０１８１】
４ａないし１５ａ又は７ｃの細胞毒は、Ｔ細胞又は、好ましくはＣＤ４＋Ｔ細胞を特異的に認識し、それに結合する結合実体とともに利用される。このような結合実体は、Ｔ細胞に対して選択性を有するあらゆる結合実体であり得る。例えば、本明細書に記載されている細胞毒性コレステロールオゾン化産物を送達するための結合実体として作用できる抗体を産生するために、あらゆるＴ細胞特異的抗原を使用することができる。例には、ヒト受容体タンパク質Ｈ４−１ＢＢが含まれる。ベクターｐＨ４−１ＢＢ中にコードされるＨ４−１ＢＢに対するｃＤＮＡは、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されており、受託番号ＮＲＲＬ  Ｂ２１１３１が与えられた。このＨ４−１ＢＢタンパク質に対して特異的な抗体は、米国特許第６，５６９，９９７号に記載されている。
【０１８２】
米国特許第６，５６６，０８２号によると、ＯＸ−４０と呼ばれる特定のタンパク質抗原は、抗原により活性化されるＴ細胞、特に例えば活性型ＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞表面上に特異的に発現される。ラットにおけるＥＡＥ疾病モデルを使用して、この抗原は、炎症の部位に存在する活性化された自己抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の表面上で発現するが、非炎症部位のＣＤ４＋Ｔ細胞上には存在しないことが示された。これらのＣＤ４＋Ｔ細胞上でのこの抗原の最大量の発現は、自己免疫の臨床徴候の開始の前日に起きることが明らかとなっており、この抗原の発現は、疾病が進行するにつれて低下した。ＯＸ−４０抗原の発現の特異性及び本発明において初めて示されたこの発現の一過性の性質のために、Ｔ細胞媒介性疾患を有するヒト等の動物において活性化されたＴ細胞の抗体媒介性枯渇のための標的の候補としてこの抗原を検査することになった。
【０１８３】
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）、コラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）、及び実験的自己免疫ぶどう膜炎（ＥＡＵ）を含む、動物において実験的に誘発された幾つかの自己免疫疾患の原因であることが示されている。このような動物モデルは、本明細書で供与される方法及び製剤を検査するために使用できる。
【０１８４】
潰瘍の治療
ヘリコバクターピロリ菌は、１９８２年に、慢性胃炎患者の胃生検から最初に単離された、曲がった微好気性グラム陰性細菌である（Ｗａｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ：１２７３−７５（１９８３））。当初命名されたカンピロバクターピロリ菌は、ヘリコバクターと命名された別個の属の一部であると認識されている（Ｇｏｏｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３９：３９７−４０５（１９８９））。細菌は、ヒト胃粘膜でコロニー形成し、感染は何十年間も持続できる。最近の数年間で、前記細菌の存在は、Ｂ型慢性胃炎（多くの感染者で無症候性のままであり得るが、消化性潰瘍及び胃腺癌のリスクをかなり増大させる症状）と関連付けられている。他の研究は、ヘリコバクターピロリ菌感染が、Ｂ型胃炎、消化性潰瘍、及び胃の腫瘍の原因又は補助因子の何れかであり得ることを強く示唆しており、例えば、Ｂｌａｓｅｒ，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ９３：３７１−８３（１９８７）、Ｄｏｏｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：１５６２−６６（１９８９）、Ｐａｒｓｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２５：１１２７−３１（１９９１）を参照されたい。ヘリコバクターピロリ菌は、経口経路によって伝染すると信じられている（Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌｌ．，Ｌａｎｃｅｔ：３４０，１１９４（１９９２））。感染の危険性は、加齢とともに増大し（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １００：１４９５−１５０１（１９９１））、叢生によって容易になる（Ｄｒｕｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．４３２２：３５９−６３（１９９０）、Ｂｌａｓｅｒ，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５：３８６−９３（１９９２））。先進国では、ヘリコバクターピロリ菌抗原に対する抗体の存在は、３０歳の人と６０歳の人で、それぞれ２０％未満から５０％超まで増大する（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２２：５７−６２（１９８６）、Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｚ．Ｍｅｄ．Ｊ．９９：６５７−５９（１９８６））のに対し、途上国では、人口の８０％超が２０歳までにすでに感染している（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ３６：１０８４−８８（１９９１））。
【０１８５】
本発明によると、ヘリコバクターピロリ菌抗原へ結合する結合実体へ連結された細胞毒は、ヘリコバクターピロリ菌の増殖を阻害するために使用できる。使用される細胞毒は、セコ−ケトアルデヒド４ａ、そのアルドール付加物５ａ又は式６ａないし１５ａ若しくは７ｃの何れか１つを有する化合物である。幾つかの実施形態において、４ａないし１５ａ又は７ｃの細胞毒は、細胞溶解を誘導し、細胞の死滅を誘導し、又は細胞の増殖を阻害することが可能である。
【０１８６】
細菌感染の治療
本発明の細胞毒性コレステロールオゾン化産物は、微生物の増殖及び感染を調節するためにも使用できる。
【０１８７】
以下の標的微生物体、すなわちエロモナス菌種、バチルス菌種、バクテロイデス菌種、カンピロバクター菌種、クロストリジウム菌種、エンテロバクター菌種、エンテロコッカス菌種、エシェリキア菌種、ガストロスピリラム菌種、ヘリコバクター菌種、クレブシエラ菌種、サルモネラ菌種、シゲラ菌種、スタフィロコッカス菌種、シュードモナス菌種、ビブリオ菌種、エルシニア菌種等に関する感染は、本発明の細胞毒性コレステロールオゾン化産物によって治療できる。本発明の細胞毒性コレステロールオゾン化産物によって治療できる感染は、スタフィロコッカス感染（黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ））、チフス（サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ））、食中毒（Ｏ１５７：Ｈ７等のエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ））、細菌性赤痢（志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａ））、肺炎（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）及び／又はシュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｐａｃｉａ））、コレラ（コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ））、潰瘍菌（ヘリコバクター・ピロリ）及びその他を伴うものを含む。エシェリキア・コリの血清型Ｏ１５７：Ｈ７は、下痢、出血性大腸炎、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）及び血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）の病変形成に関与している。本発明の細胞毒性コレステロールオゾン化産物は、細菌の薬剤耐性系及び増殖薬剤耐性系、例えば黄色ブドウ球菌の増殖薬剤耐性系及びエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）及びエンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）のバンコマイシン耐性系に対しても活性がある。
【０１８８】
本発明の抗菌組成物は、ウィルスに対しても有効である。「ウィルス」という語は、ＤＮＡウィルス及びＲＮＡウィルス、ウィロイド及びプリオンを指す。ウィルスは、外被のあるウィルスと外被のないウィルスの両者を含み、例えばＡ型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、Ｃ型肝炎ウィルス、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、ポックスウィルス、ヘルペスウィルス、アデノウィルス、パポーバウィルス、パルボウィルス、レオウィルス、オルビウィルス、ピコルナウィルス、ロタウィルス、アルファウィルス、ルビウィルス、Ａ型及びＢ型インフルエンザウィルス、コロナウィルス、パラミクソウィルス、モルビリウィルス、ニューモウィルス、ラブドウィルス、リッサウィルス、オルソクソウィルス、ブニアウィルス、フレボウィルス、ナイロウィルス、ヘパドナウィルス、アレナウィルス、レトロウィルス、エンテロウィルス、リノウィルス、ライノウィルス及びフィロウィルスを含む。
【０１８９】
本発明の化合物は、全身的感染、局所的感染及び粘膜の感染の治療のための、ヒトを含む動物において真菌感染を治療するのに有用な活性のある抗真菌薬である。本発明によって治療できる真菌感染の例は、カンジダ、アスペルギルス、及びフザリウムによる感染を含む。幾つかの実施形態において、真菌感染は、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）又はカンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）により生じる。
【０１９０】
本発明の化合物は、ヒトを含む動物における多様な真菌感染の治療に有用である。このような感染は、気道感染、胃腸管感染、心臓血管系感染、尿路感染、中枢神経系感染、カンジダ症及び慢性粘膜カンジダ症並びに、真菌による皮膚感染、皮膚及び皮膚粘膜カンジダ症、足部白癬、爪周囲炎、真菌性おむつかぶれ、カンジダ亀頭炎及び外耳炎等の表層感染、皮膚感染、皮下感染及び全身性糸状菌感染を含む。前記化合物は、全身性及び局所的真菌感染を予防するための予防薬として使用され得る。予防薬としての使用は、免疫不全患者、例えば、エイズ患者、癌治療を受けている患者又は移植手術を受ける患者における感染の予防における選択的腸汚染除去療法の一部として適切であり得る。
【０１９１】
アスペルギルスの幾つかの種は、重篤な免疫不全患者における侵襲的気道感染を生じることが知られている。胞子の吸入後、臨床的アスペルギルス症は、３つの主要な形態で生じ得る。アスペルギルス種が気管支樹をコロニー化し、過敏性肺臓炎を生じる抗原を放出する場合に、第一の形態であるアレルギー性気管支肺アスペルギルス症が発症する。第二の形態であるアスペルギローマ（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｍａ）又は「菌球」は、肺腔中に発症し、多くの場合、結核等の他の肺疾患とともに発症する。第三の形態である侵襲的肺又は播種性アスペルギルス症は、高い死亡率で生命に危険をもたらす感染である。
【０１９２】
細胞毒性コレステロールオゾン化産物の抗菌活性は、当業者に利用可能な方法を使用して、これらの多様な微生物に対して評価することができる。抗菌活性は、例えば、特定の微生物種の増殖を予防する本発明の細胞毒性コレステロールオゾン化産物の最小阻害濃度（ＭＩＣ）を同定することによって測定される。ある実施形態において、抗菌活性は、標準的な用量又は用量反応方法を使用して測定される場合に、微生物の５０％を死滅させる細胞毒性コレステロールオゾン化産物の量である。
【０１９３】
本明細書に記載されている細胞毒性コレステロールオゾン化産物を用いて微生物感染を治療するための治療的有効投薬量を評価する方法は、試験管内で微生物が実質的に増殖しない細胞毒性コレステロールオゾン化産物の最小阻害濃度を測定することを含む。このような方法によって、微生物の増殖を阻害し又は微生物の５０％を死滅させる容積あたりに必要な細胞毒性コレステロールオゾン化産物の適切な量が算出できる。このような量は、例えば標準的な微量希釈法によって測定できる。例えば、培地と同一容積及び微生物と実質的に同じ量を含有する一連の微生物培養チューブが調製され、細胞毒性コレステロールオゾン化産物の一定分量が添加される。一定分量は、溶液の同一容積中に細胞毒性コレステロールオゾン化産物の異なる量を含有する。１ないし１０世代に相当する時間、微生物を培養し、培地中の微生物の数を測定する。
【０１９４】
培地の光学密度は、微生物の増殖が生じたかどうかを概算するためにも使用することが可能であり、光学密度に有意な増大が生じなかった場合、微生物の有意な増殖は生じていない。しかしながら、光学密度が増大すれば、微生物の増殖が生じている。細胞毒性コレステロールオゾン化産物への曝露後に、いくつの微生物細胞が生存した状態を保っているかを測定するために、細胞毒性コレステロールオゾン化産物を添加した（時間０）時点で回収し、その後、一定間隔で、培地のわずかな一定分量を回収できる。培地の一定分量を微生物培養プレート上へ延展し、微生物の増殖を誘導する条件下で前記プレートを温置し、コロニーが出現した時点で、前記コロニーの数を計数する。
【０１９５】
抗体及び結合実体
本発明は、コレステロールオゾン化産物を結合することができ、又は、疾病の部位へ本細胞毒性オゾン化産物を送達するためのマーカーとして作用できる何れかの標的抗原と結合することができる抗体及び結合実体を提供する。本明細書で記載されているように、コレステロールオゾン化産物に対する抗体及び結合剤は、これらのコレステロールオゾン化産物の細胞毒性を阻害又は調節し、これによりアテローム硬化性、心臓病、又は心血管疾患等の循環器病を治療するために使用できる。上記のとおり、細胞毒性コレステロールオゾン化産物は、抗体又は結合剤へ連結されることが可能であり、自己免疫疾患、癌、腫瘍、細菌感染、ウィルス感染、真菌感染、潰瘍及び／又は細胞毒素の局所的な投与が有効な他の疾患若しくは疾病等の、疾患及び疾病を治療又は予防するために使用できる。
【０１９６】
本明細書で使用される結合実体という用語は、コレステロールオゾン化産物又は疾病の他のマーカーに結合できる抗体及び他のポリペプチドを含む。
【０１９７】
それゆえ、ある実施形態において、本発明は、コレステロールオゾン化産物、例えばセコ−ケトアルデヒド４ａ、そのアルドール付加物５ａ、３ｃ、６ａないし１５ａ又は７ｃのコレステロールオゾン化産物又はハプテンの何れか等の関連化合物に対する抗体調製物及び結合実体を提供する。このような抗体及び結合実体は、炎症性血管病、アテローム性動脈硬化症、心臓病及び心血管疾患等の、コレステロール関連血管病を治療するのに有用である。幾つかの実施形態において、コレステロールオゾン化産物は、抗体の調製を容易にするように化学的に修飾できる。例えば、セコ−ケトアルデヒド４ａ、そのアルドール付加物５ａ及び３ｃ、６ａないし１５ａ又は７ｃの何れかなどの関連化合物のヒドラゾン誘導体は、抗体調製のために使用され得る。これらのヒドラゾン誘導体は、化合物４ｂ、４ｃ、５ｂ及び６ｂないし１５ｂ又は１０ｃの何れかなどの構造を有する化合物を含む。
【０１９８】
【化１３】
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【０１９９】
コレステロールオゾン化産物は、例えば、２，４−ジニトロフェニルヒドラジン等のヒドラジン化合物との反応によって、ヒドラゾン誘導体へ転化され得る。幾つかの実施形態において、前記反応は、アセトニトリル又はアルコール（例えば、メタノール又はエタノール）等の有機溶媒中で実施される。酸性環境及び酸素非含有、非反応性大気は、しばしば利用される。
【０２００】
本発明は更に、コレステロールオゾン化産物及びこのようなオゾン化産物のヒドラゾン誘導体と構造上関連したハプテンに関する。例えば、本発明は、オゾン化産物及びコレステロールのヒドラゾン産物と反応することができる抗体を産生するのに使用できる式３ｃ、１３ａ、１３ｂ、１４ａ、１４ｂ、１５ａ又は１５ｂを有するハプテンを提供する。
【０２０１】
【化１４】
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【０２０２】
式１５ａを有する化合物に対して惹起されたハイブリドーマＫＡ１−１１Ｃ５及びＫＡ１−７Ａ６は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．，２０１１０−２２０９  ＵＳＡ（ＡＴＣＣ））において、ＡＴＣＣ受託番号ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５４２７及びＰＴＡ５４２８として、２００３年８月２９日に、ブダペスト条約の規定に基づいて寄託された。式１４ａを有する化合物に対して惹起されたハイブリドーマＫＡ２−８Ｆ６及びＫＡ２−１Ｅ９は、ＡＴＣＣ受託番号ＡＴＣＣ  ＰＴＣ−５４２９及びＰＴＡ−５４３０として、これも、２００３年８月２９日に、ブダペスト条約の規定に基づいて寄託された。
【０２０３】
本発明は、コレステロールのオゾン化産物又は疾病の何れかの都合のよいマーカーに結合することができる、利用可能な手法によって作製された抗体及び結合実体も提供する。このような抗体の結合ドメイン、例えば、これらの抗体のＣＤＲ領域も、あらゆる都合のよい結合実体骨格中に移すか、又は前記骨格とともに利用できる。
【０２０４】
抗体分子は、その基本構築ブロックである免疫グロブリンの折りたたみ又はドメインが、免疫系及び他の生物学的認識系の多くの分子において多様な形態で使用される免疫グロブリンと呼ばれる血漿タンパク質のファミリーに属する。標準的な抗体は、２つの同一の免疫グロブリン重鎖及び２つの同一の軽鎖からなる四量体構造であり、分子量約１５０，０００ダルトンである。
【０２０５】
抗体の重鎖及び軽鎖は、異なるドメインからなる。各軽鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＬ）及び１つの定常ドメイン（ＣＬ）を有するのに対し、各重鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＨ）及び３又は４つの定常ドメイン（ＣＨ）を有する。例えば、Ａｌｚａｒｉ，Ｐ．Ｎ．，Ｌａｓｃｏｍｂｅ，Ｍ．−Ｂ＆Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．（１９８８）Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，５５５−５８０を参照されたい。各ドメインは、約１１０個のアミノ酸残基からなり、互いに対してパックされた２つのβシートから形成される特徴的なβサンドイッチ構造である免疫グロブリンの折りたたみへと折りたたまれる。ＶＨ及びＶＬドメインは、各々、ドメインの１つの末端でβ鎖を接続しているループ又はターンである３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１ないし３）を有する。軽鎖及び重鎖の両者の可変領域は、一般に、抗原特異性に関与するが、特異性に対する個々の鎖の関与は必ずしも等しいとは限らない。抗体分子は、６個の無作為化されたループ（ＣＤＲ）によって多数の分子へ結合するように進化してきた。
【０２０６】
免疫グロブリンは、それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、異なるクラスへ割り当てられ得る。免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭであるという少なくとも５つの主要なクラスがある。これらの幾つかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３及びＩｇＧ−４、ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２へ更に分類され得る。免疫グロブリンのＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭクラスに相当する重鎖定常ドメインは、それぞれ、アルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）及びミュー（μ）と呼ばれる。抗体の軽鎖は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に異なる種類のうちの１つへ割り当てられ得る。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配置は、周知である。
【０２０７】
抗体の可変ドメインにおける「可変」という語は、ある抗体から別の抗体で、可変ドメインのある種の部分の配列が大きく異なるという事実を指す。可変ドメインは、結合のためのものであり、特定の抗原に対する各特定の抗体の特異性を決定する。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメインを通じて、均一に分配されているわけではない。その代わり、可変性は、軽鎖及び重鎖の両者の可変ドメイン中の、相補性決定領域（ＣＤＲ）（高頻度可変領域としても知られる。）と呼ばれる３つのセグメントに集中している。
【０２０８】
可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）領域と呼ばれる。未変性の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を接続するループを形成し、幾つかの事例ではβシート構造の一部を形成する、３つのＣＤＲによって接続された４つのＦＲ領域（概ねβシート立体配置を採る。）を各々含む。各鎖中のＣＤＲは、ＦＲ領域によって互いに近接した状態に保たれ、別の鎖由来のＣＤＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常ドメインは、抗体を抗原へ結合する上で直接関与しないが、抗体依存的細胞毒性における抗体の関与等の多様なエフェクター機能を示す。
【０２０９】
本発明において使用されることが想定される抗体は従って、完全な免疫グロブリン、Ｆｖ、Ｆａｂ等の抗体断片及び同様の断片、可変ドメインである相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む一本鎖抗体、及び類似の形態を含む多様な形態の何れかであり得、その全ては、本明細書で使用されるように、「抗体」という広義の用語に含まれる。本発明は、抗体（ポリクローナル又はモノクローナル）のあらゆる特異性の使用を想定し、特異的なコレステロールオゾン化産物又はその誘導体を認識し、これらと免疫反応する抗体に限定されるものではない。
【０２１０】
さらに、抗体の結合領域又はＣＤＲは、あらゆる便利な結合実体ポリペプチドの骨格内に配置することができる。好ましい実施形態において、本明細書に記載の方法の文脈において、式３、３ｃ、４ａないし１５ａ、７ｃの化合物の何れか及びヒドラゾン誘導体を含むそれらの誘導体に対して免疫特異性を有する抗体、結合実体又はそれらの断片が使用される。
【０２１１】
「抗体断片」という語は、完全長の抗体の一部を指し、一般に、抗体結合領域又は可変領域を指す。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片を含む。抗体のパパイン消化によって、各々、単一の抗原結合部位を有する、Ｆａｂ断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片及び残余のＦｃ断片が生じる。従って、Ｆａｂ断片は、１つのインタクトな軽鎖と、１つの重鎖の一部とを有する。ペプシン処理によって、抗原を架橋できる２つの抗原結合断片を有するＦ（ａｂ’）２断片と、ｐＦｃ’断片と呼ばれる残余断片が生じる。Ｆａｂ’断片は、ペプシン消化された抗体の還元後に得られ、完全な状態を保った軽鎖と、重鎖の一部とからなる。抗体１分子あたり、２つのＦａｂ’断片が得られる。Ｆａｂ’断片は、抗体蝶番領域由来の１つ又はそれ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に数個の残基が付加されている点で、Ｆａｂ断片とは相違する。
【０２１２】
Ｆｖは、完全な抗原認識部位及び結合部位を含有する最小の抗体断片である。この領域は、緊密な非共有的会合状態にある１つの重鎖及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体（ＶＨ−ＶＬ二量体）からなる。各可変ドメインの３つのＣＤＲが、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を画するように相互作用するのはこの立体配置である。共同で、６つのＣＤＲは、抗体に対する抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、抗原を認識及び結合する能力を有するが、完全な結合部位より低い親和性で結合する。本明細書で使用されるように、抗体に関する「機能的断片」とは、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ）及びＦ（ａｂ’）２断片を指す。
【０２１３】
更なる断片は、二重特異性抗体、線形抗体、一本鎖抗体分子及び抗体断片から形成される多重特異性抗体を含み得る。一本鎖抗体は、遺伝的に融合された一本鎖分子として適切なポリペプチドリンカーによって連結される、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含む遺伝子工学的に改変された分子である。このような一本鎖抗体は、「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片とも呼ばれる。一般に、Ｆｖポリペプチドは更に、ｓＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成できる、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーを含む。ｓＦｖの概説に関しては、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。
【０２１４】
「二重特異性抗体」という語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、ここで、前記断片は、同一ポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）中の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）へ接続される重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同一鎖上の２つのドメイン間で対を形成するには短すぎるリンカーを使用することによって、前記ドメインは、別の鎖の相補的なドメインと対を形成して、２つの抗原結合部位を作製せざるを得なくなる。二重特異性抗体は、例えば欧州特許第４０４，０９７号、ＷＯ９３／１１１６１、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４−６４４８（１９９３）中で、より完全に記載されている。
【０２１５】
本発明によって想定される抗体断片は、それゆえ、完全長の抗体ではない。しかしながら、このような抗体断片は、完全長の抗体と比較して同様の又は改善された免疫学的特性を有し得る。このような抗体断片は、約４個のアミノ酸、５個のアミノ酸、６個のアミノ酸、７個のアミノ酸、９個のアミノ酸、約１２個のアミノ酸、約１５個のアミノ酸、約１７個のアミノ酸、約１８個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸、約２５個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸又はそれ以上の、小さなものであり得る。
【０２１６】
一般に、本発明の抗体断片は、疾病マーカー、例えばコレステロールのオゾン化産物に対して特異的に結合する抗体と比較して同様の又は改善された免疫学的特性を有する限り、あらゆる上限サイズを有し得る。例えば、抗体断片が、軽鎖抗体サブユニットに関する場合、より小さな結合実体及び軽鎖抗体断片は、約２００個未満のアミノ酸、約１７５個未満のアミノ酸、約１５０個未満のアミノ酸、又は約１２０個未満のアミノ酸を有し得る。さらに、抗体断片が、重鎖抗体サブユニットに関する場合、より大きな結合実体及び重鎖抗体断片は、約４２５個未満のアミノ酸、約４００個未満のアミノ酸、約３７５個未満のアミノ酸、又は約３５０個未満のアミノ酸、約３２５個未満のアミノ酸又は約３００個未満のアミノ酸を有し得る。
【０２１７】
疾病マーカーに対して誘導された抗体は、利用可能な全ての手法によって作製できる。ポリクローナル抗体の調製方法は、当業者に利用可能である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、「Ｇｒｅｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｓｅｒａ，ｉｎ：Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍａｎｓｏｎ，ｅｄ．），ｐａｇｅｓ  １−５（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｓｅｒａ  ｉｎ  Ｒａｂｂｉｔｓ，Ｒａｔｓ  Ｍｉｃｅ  ａｎｄ  Ｈａｍｓｔｅｒｓ，ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｓｅｃｔｉｏｎ  ２．４．１（１９９２）」を参照されたい。
【０２１８】
モノクローナル抗体も、本発明において利用できる。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指す。換言すると、前記集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る幾つかの抗体中の偶発的に自然発生する変異を除けば同一である。モノクローナル抗体は、非常に特異的であり、単一の抗原部位に対して誘導される。更に、通例、異なる決定要因（エピトープ）に対して誘導された異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定要因に対して誘導されている。その特異性に加え、モノクローナル抗体には、他の免疫グロブリンによって夾雑されていないハイブリドーマ培養物によって合成されるという利点がある。「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均質な集団から得られる抗体の特徴を表すものであり、何れかの特定の方法によって抗体を産生することを要求するものと解釈されるべきではない。
【０２１９】
本明細書において、モノクローナル抗体は、特に、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種に由来する又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一である又は相同的であるが、前記重鎖及び／又は軽鎖の残りは、別の種由来の又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一である又は相同的である「キメラ」抗体を含む。このような抗体の断片も、それらが望ましい生物学的活性を示す限り使用できる。米国特許第４，８１６，５６７号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．８１，６８５１−５５（１９８４）を参照されたい。
【０２２０】
モノクローナル抗体の調製は、同様に、慣用的である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）、Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．，ｓｅｃｔｉｏｎｓ  ２．５．１−２．６．７及びＨａｒｌｏｗ，ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｐａｇｅ  ７２６（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂ．（１９８８））を参照されたい。モノクローナル抗体は、十分に確立された多様な技術によって、ハイブリドーマ培養物から単離及び精製することができる。このような単離技術は、タンパク質Ａセファロースを使用するアフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーを含む。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．，ｓｅｃｔｉｏｎｓ  ２．７．１−２．７．１２及びｓｅｃｔｉｏｎｓ  ２．９．１−２．９．３、Ｂａｒｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ（ＩｇＧ），ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１０，ｐａｇｅｓ  ７９−１０４（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９２））を参照されたい。
【０２２１】
抗体の試験管内及び生体内操作の方法は、当業者に利用可能である。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、上述のようなハイブリドーマ法によって作製され得、又は例えば米国特許第４，８１６，５６７号に記載の組換え法によって作製され得る。本発明による使用のためのモノクローナル抗体は、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載されている技術を使用してファージ抗体ライブラリからも単離され得る。
【０２２２】
抗体断片を作製する方法も、本分野で公知である（例えば、参照により、本明細書に組み込まれる、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８８）参照）。本発明の抗体断片は、抗体のタンパク質分解性加水分解によって、又は適切な宿主中で抗体断片をコードする核酸の発現によって調製することができる。抗体断片は、抗体全体をペプシン又はパパインで消化する従来法によって得られ得る。例えば、抗体断片は、ペプシンによって抗体を酵素開裂して、Ｆ（ａｂ’）２として記載の５Ｓ断片を供与することによって作製され得る。この断片は、チオール還元剤を使用して、及び必要に応じてジスルフィド連結の開裂から生じるスルフヒドリル基のためのブロッキング基を使用して更に開裂することができ、３．５ＳＦａｂ’一価断片を生じる。あるいは、ペプシンを使用する酵素開裂によって、２つの一価Ｆａｂ’断片及びＦｃ断片が直接生じる。これらの方法は、例えば米国特許第４，０３６，９４５号及び第４，３３１，６４７号及び本明細書に含有される参考文献に記載されている。これらの特許は、その全ての内容が全体として参照により、本明細書に組み込まれる。
【０２２３】
完全な状態の抗体によって認識される抗原へ前記断片が結合する限り、重鎖の分離等の、抗体を開裂して一価の軽鎖−重鎖断片を形成する他の方法、断片の更なる開裂又は他の酵素的、化学的若しくは遺伝子技術も使用され得る。例えば、Ｆｖ断片は、ＶＨ鎖とＶＬ鎖との会合を含む。この会合は、非共有結合的であり得、又は、可変鎖は、分子間ジスルフィド結合によって連結され得若しくはグルタルアルデヒド等の化学物質によって架橋され得る。好ましくは、前記Ｆｖ断片は、ペプチドリンカーによって接続されたＶＨ鎖及びＶＬ鎖を含む。これらの一本鎖抗原結合タンパク質（ｓＦｖ）は、オリゴヌクレオチドによって接続されたＶＨドメインとＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。構造遺伝子は、発現ベクター中に挿入され、前記発現ベクターがその後、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）等の宿主細胞中へ導入される。組換え宿主細胞は、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドを有する単一ポリペプチド鎖を合成する。ｓＦｖを調製するための方法は、例えば、Ｗｈｉｔｌｏｗ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ：ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，ｐａｇｅ  ９７（１９９１）、Ｂｉｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６（１９８８）、Ｌａｄｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ，米国特許第４，９４６，７７８号及びＰａｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１２７１−７７（１９９３）に記載されている。
【０２２４】
抗体断片の別の形態は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小の認識単位」）は、しばしば、抗原認識及び結合に関与する。ＣＤＲペプチドは、対象の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子をクローニング又は構築することによって得られ得る。このような遺伝子は、例えば、抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成するポリメラーゼ連鎖反応を使用することによって調製される。例えば、Ｌａｒｒｉｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ：ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，ｐａｇｅ  １０６（１９９１）を参照されたい。
【０２２５】
本発明は、ヒト以外（例えば、ネズミ）の抗体のヒト形態及びヒト化された形態を想定する。このようなヒト化抗体は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、又はヒト以外の免疫グロブリン由来の最小の配列を含有する（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は抗体の他の抗原結合サブ配列等の）これらの断片である。ヒト化抗体の大部分はヒト免疫グロブリン（レシピテント抗体）であり、その中で、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、望ましい特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット又はウサギ等のヒト以外の種のＣＤＲ由来の残基（ドナー抗体）によって置換されている。
【０２２６】
幾つかの事例で、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応するヒト以外の残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中にも、導入されたＣＤＲ若しくはフレームワークの配列中にも見出されない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体の性能を更に改良及び最適化するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てがヒト以外の免疫グロブリンのものに相当し、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン共通配列のものである、少なくとも１つの及び典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの少なくとも一部も最適に含む。更なる詳細に関しては、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１，５２２−２５（１９８６）、Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２，３２３−２９（１９８８）、Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２，５９３−５９６（１９９２）、Ｈｏｌｍｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：２１９２−２２０１（１９９７）及びＶａｓｗａｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ  ＆  Ｉｍｍｕｎｏｌ．８１：１０５−１１５（１９９８）を参照されたい。
【０２２７】
標準化された手法が、抗体を産生するために利用可能であるが、抗体のサイズ、抗体の多重鎖構造、及び抗体中に存在する６つの結合ループの複雑性は、多量の抗体を改良及び製造するための障害となっている。それゆえ、本発明は更に、コレステロールのオゾン化産物を含む疾病マーカーを認識及び結合できるポリペプチドを含む結合実体を使用することを想定する。
【０２２８】
多くのタンパク質は、疾病マーカーに対する結合ドメインに付着することが可能であり、これにより適切な結合実体を形成できるタンパク質足場として機能できる。結合ドメインは、本発明のコレステロールオゾン化産物に結合する又は前記産物と相互作用するのに対し、タンパク質足場は単に、結合ドメインを保持及び安定化し、これにより結合ドメインが結合できる。多くのタンパク質足場が使用できる。例えば、ファージカプシドタンパク質が使用できる。Ｒｅｖｉｅｗ  ｉｎ  Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ＆  Ｗｅｌｌｓ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：１７３−８４（１９９４）を参照されたい。ファージカプシドタンパク質は、ウシ膵臓トリプシン阻害剤（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ８９：２４２９−３３（１９９２））、ヒト成長ホルモン（Ｌｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０８３２−３８（１９９１）、Ｖｅｎｔｕｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １：７０−７５（１９９４））、及び連鎖球菌のＩｇＧ結合ドメイン（Ｏ’Ｎｅｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖ（Ｃｒａｂｂ，Ｌ．，ｅｄ．）ｐｐ．５１７−２４，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９４））を含む無作為なペプチド配列を提示するための足場として使用されてきた。これらの足場は、コレステロールオゾン化産物等の疾病マーカーのための結合ドメインを含むように修飾できる単一の無作為化されたループ又は領域を提示してきた。
【０２２９】
研究者は、糸状ファージＭ１３上の提示足場として、小さな７４個のアミノ酸のα−アミラーゼ阻害剤テンダミスタット（Ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔ）も使用してきた。ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ｓ．Ｊ．，＆  Ｈｏｅｓｓ，Ｒ．Ｈ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５０：４６０−４７０（１９９５）。テンダミスタットは、ストレプトミセス・テンダエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｅｎｄａｅ）由来のβシートタンパク質である。テンダミスタットは、その小さなサイズ、安定性並びに高解像ＮＭＲおよびＸ線構造データの利用可能性など、結合ペプチドにとって魅力的な足場としての多くの特長を有する。テンダミスタットの全体的な形態は、免疫グロブリンドメインのものと同様であり、２つのβシートが一連のループによって接続されている。免疫グロブリンドメインとは対照的に、テンダミスタットのβシートは、１つではなく、２つのジスルフィド結合とともに保持されており、このことによってタンパク質のかなりの安定性が説明される。テンダミスタットのループは、免疫グロブリンにおいて見られるＣＤＲループと同様の機能を供し得、試験管内変異原性によって簡単に無作為化できる。テンダミスタットは、ストレプトミセス・テンダエ由来であり、ヒトにおいて抗原性であり得る。それゆえ、テンダミスタットを使用する結合実体は、好ましくは試験管内で使用される。
【０２３０】
フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインも、結合実体が結合できるタンパク質足場として使用されてきた。フィブロネクチンＩＩＩ型は、免疫グロブリンスーパーファミリーの大きなサブファミリー（Ｆｎ３ファミリー又はｓ型Ｉｇファミリー）の一部である。結合実体（例えば、ＣＤＲペプチド）に対するタンパク質足場として、このようなフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを使用するための配列、ベクターおよびクローニング手法は、例えば米国特許出願公報第２００２００１９５１７号に記載されている。Ｂｏｒｋ，Ｐ．＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．（１９９２）Ｐｒｏｐｏｓｅｄ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｉｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｂｙ  ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，８９９０−８９９４、Ｊｏｎｅｓ，Ｅ．Ｙ．（１９９３）Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３，８４６−８５２、Ｂｏｒｋ，Ｐ．，Ｈｏｍ，Ｌ．＆  Ｓａｎｄｅｒ，Ｃ．（１９９４）Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｆｏｌｄ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｍｏｎ  ｃｏｒｅ。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４２，３０９−３２０、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｉ．Ｄ．＆  Ｓｐｉｔｚｆａｄｅｎ，Ｃ．（１９９４）Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｔｙｐｅＩＩＩ  ｍｏｄｕｌｅｓ  Ｓｔｒｕｃｒｔｕｒｅ  ２，２３３−３３７、Ｈａｒｐｅｚ，Ｙ．＆  Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．（１９９４）も参照されたい。
【０２３１】
免疫系において、特異的抗体は、大きなライブラリから選択及び増幅される（親和性成熟）。免疫細胞において使用される組み合わせ技術は、結合実体の組み合わせライブラリの変異原性及び作製によって模倣することが可能である。変異体結合実体、抗体断片及び抗体は、それゆえ、ディスプレイ型技術を通じても作製することができる。このようなディスプレイ型技術は、例えばファージディスプレイ、レトロウィルスディスプレイ、リボソームディスプレイ、及び他の技術を含む。本分野で利用可能な技術は、結合実体のライブラリを発生させるために、それらのライブラリをスクリーニングするために使用することが可能であり、選択された結合実体は、親和性成熟等の更なる成熟へ供され得る。Ｗｒｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ，上述、Ｈａｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｔｈａｕ  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９４：４９３７−４９４２（１９９７）（リボゾームディスプレイ）、Ｐａｒｍｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  ７３：３０５−３１８（１９８８）（ファージディスプレイ）、Ｓｃｏｔｔ  ＴＩＢＳ  １７：２４１−２４５（１９９２）、Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８７：６３７８−６３８２（１９９０）、Ｒｕｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１：１０８１−１０８５（１９９３）、Ｈｏｇａｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ  １３０：４３−６８（１９９２）、Ｃｈｉｓｗｅｌｌ  ａｎｄ  ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ＴＩＢＴＥＣＨ  １０：８０−８４（１９９２）及び米国特許第５，７３３，７４３号。
【０２３２】
本発明は、従って、親和性、選択性、結合強度及び／又は他の望ましい特性を最適化するために、抗体、ＣＤＲ又は結合ドメインを変異させる方法も提供する。変異体結合ドメインとは、選択された結合ドメイン（例えば、ＣＤＲ）のアミノ酸配列変異体を指す。一般に、変異体結合ドメイン中のアミノ酸残基の１つ又はそれ以上は、参照結合ドメイン中に存在するものとは異なる。このような変異体抗体は、参照アミノ酸配列と１００％未満の配列同一性又は類似性を必ず有する。一般に、変異体結合ドメインは、参照結合ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性又は類似性を有する。好ましくは、変異体結合ドメインは、参照結合ドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性又は類似性を有する。
【０２３３】
例えば、ファージディスプレイを使用する親和性成熟は、変異体結合ドメインを発生させるための１つの方法として利用できる。ファージディスプレイを使用する親和性成熟とは、Ｌｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０（４５）：１０８３２−１０８３８（１９９１）に記載されている工程を指し、Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２５４：８８９−８９６（１９９２）も参照されたい。以下の記述に厳密に限定されるわけではないが、この工程は、各部位に可能なアミノ酸置換を全て発生させる目的として、多くの異なる部位に幾つかの結合ドメイン又は抗体超可変領域の変異を導入するものとして簡潔に記載できる。従って、作製される結合ドメイン変異体は、融合タンパク質として繊維状ファージ粒子から一価の様式で提示される。融合は、一般に、Ｍ１３の遺伝子ＩＩＩ産物に対してなされる。様々な変異体を発現するファージは、目的の形質（例えば、結合親和性又は選択性）に対する選択の幾つものラウンドを通じて、周期を繰り返すことができる。対象の変異体が単離及び配列決定される。このような方法は、米国特許第５，７５０，３７３号、米国特許第６，２９０，９５７号及びＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｂ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１３（１１），２５０８−２５１５（１９９４）において、より詳細に記載される。
【０２３４】
従って、一実施形態において、本発明は、結合実体又は抗体ポリペプチド又はそれらをコードする核酸を操作して、コレステロールオゾン化産物等の疾病マーカーを認識する改善された結合特性を有する結合実体、抗体及び抗体断片を作製する方法を提供する。
【０２３５】
存在する結合実体又は抗体の一部を変異させるこのような方法は、疾病マーカーに対する結合ドメインをコードするポリペプチドをコードする核酸を、ファージコートタンパク質をコードする核酸へ融合して、融合タンパク質をコードする組換え核酸を作製すること、融合タンパク質をコードする組換え核酸を変異させて、変異体融合タンパク質をコードする変異体核酸を作製すること、ファージの表面上で変異体融合タンパク質を発現させること、及び疾病マーカーへ結合するファージを選択することを包含する。
【０２３６】
従って、本発明は、疾病マーカー（例えば、コレステロールオゾン化産物、ハプテン又はコレステロール誘導体）を認識し、前記疾病マーカーへ結合できる抗体、抗体断片、及び結合実体ポリペプチドを提供する。本発明は更に、結合特性又は他の望ましい特性（例えば、安定性、サイズ、使用の簡便さ）を最適化するために、前記抗体、抗体断片、及び結合実体ポリペプチドを操作する方法を提供する。
【０２３７】
投薬量、製剤及び投与経路
本発明の組成物は、アテローム硬化性、心臓病、心血管疾患、自己免疫疾患、癌、腫瘍、細菌感染、ウィルス感染、真菌感染、潰瘍及び／又は細胞毒の局所的な投与に利点のある他の疾患若しくは疾病等の疾病と関連した少なくとも１つの症状の緩和を達成するために投与される。
【０２３８】
望ましい効果を達成するために、細胞毒、結合実体、抗体又はそれらの組み合わせは、単一の又は分割された投薬量として、例えば体重の少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇないし約５００ないし７５０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇないし約３００ないし５００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇないし約１００ないし３００ｍｇ／ｋｇ又は少なくとも約１ｍｇ／ｋｇないし約５０ないし１００ｍｇ／ｋｇで投与され得るが、他の投薬量も、有利な結果を提供し得る。投与される量は、治療薬が細胞毒、結合実体又は抗体であるかどうか、疾病、体重、身体的状態、健康状態、哺乳動物の年齢、予防又は治療が達成されるべきであるかどうか、治療薬が化学的に修飾されているかどうかを含む多様な因子に依存して変動する。このような因子は、本分野で利用可能な動物モデル又は他の検査システムを利用する医師によって容易に決定できる。
【０２３９】
本発明に記載の治療薬の投与は、例えばレシピエントの生理学的状態、投与の目的が治療であるか又は予防であるかどうか、及び当業者に公知の他の因子に依存して、単一用量で、複数回用量で、連続的又は間欠的な様式で実施され得る。細胞毒、結合実体、抗体又はそれらの組み合わせの投与は、あらかじめ選択された時間にわたって実質的に連続して行われ得るか、又は一連の分散された用量で行われ得る。局所的及び全身性投与の両者が想定される。
【０２４０】
前記組成物を調製するために、細胞毒、結合実体、抗体又はそれらの組み合わせは、合成されるか又はその他取得され、必要に応じて又は所望に応じて精製される。次に、これらの治療薬は、凍結乾燥させ又は安定化させることが可能であり、前記治療薬の濃度は、適切な量になるように調整することが可能であり、治療薬は必要に応じて他の因子と組み合わせることができる。単位用量中に含まれる所定の細胞毒、結合実体、抗体又はそれらの組み合わせの絶対重量は、広範囲に変動できる。例えば、特定の細胞種類に特異的な少なくとも１つの細胞毒、結合実体又は抗体の約０．０１ないし約２ｇ、又は約０．１ないし約５００ｍｇが投与できる。あるいは、単位投薬量は、約０．０１ｇから約５０ｇまで、約０．０１ｇから約３５ｇまで、約０．１ｇから約２５ｇまで、約０．５ｇから約１２ｇまで、約０．５ｇから約８ｇまで、約０．５ｇから約４ｇまで、又は約０．５ｇから約２ｇまでを変動し得る。
【０２４１】
細胞毒、結合実体、抗体又はこれらの組み合わせの日用量は同様に変動できる。このような日用量は、例えば約０．１ｇ／日から約５０ｇ／日まで、約０．１ｇ／日から約２５ｇ／日まで、約０．１ｇ／日から約１２ｇ／日まで、約０．５ｇ／日から約８ｇ／日まで、約０．５ｇ／日から約４ｇ／日まで、及び約０．５ｇ／日から約２ｇ／日までの範囲であり得る。
【０２４２】
従って、本発明の治療薬を含む１つ又はそれ以上の適切な単位剤形は、経口的、（皮下、静脈内、筋肉内及び腹腔内を含む）非経口的、直腸的、皮膚的、経皮的、胸腔内、肺内及び鼻内（呼吸的）経路を含む多様な経路によって投与できる。治療薬は、徐放用にも製剤され得る（例えば、微小封入を使用する。ＷＯ９４／０７５２９及び米国特許第４，９６２，０９１号を参照されたい。）。製剤は、適切である場合、個別の単位剤形で都合よく存在し得、薬学の分野で周知の方法の何れかによって調製され得る。このような方法は、治療薬を液体担体、固体マトリクス、半固体担体、細かく分割された固体担体又はこれらの組み合わせと混合する工程、及び次に、必要であれば、製剤を望ましい送達システムへ導入又は成形する工程を含み得る。
【０２４３】
本発明の治療薬が、経口投与のために調製される場合には、前記治療薬は、一般に、医薬として許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤と組み合わせられ、医薬製剤又は単位剤形を形成する。経口投与の場合、治療薬は、粉末、顆粒製剤、溶液、懸濁液、乳剤として、又はチューインガムから活性成分を摂取するための天然若しくは合成のポリマー若しくは樹脂中に存在し得る。治療薬は、巨丸剤、舐剤又はペーストとしても存在し得る。本発明の経口的に投与される治療薬も、徐放用に製剤できる。例えば、治療薬は、コーティングでき、微小封入でき、又はその他、持続的送達デバイス内に配置できる。このような製剤中の活性成分は全体として、製剤の０．１ないし９９．９重量％を含む。
【０２４４】
「医薬として許容される」によって意味されるのは、製剤の他の成分と混合可能であり、そのレシピエントに対して有害ではない担体、希釈剤、賦形剤及び／又は塩である。
【０２４５】
本発明の治療薬を含有する薬学的製剤は、周知であり、容易に利用可能な成分を使用して、本分野で公知の手法によって調製できる。例えば、治療薬は、共通の賦形剤、希釈剤、又は担体とともに製剤でき、錠剤、カプセル、溶液、懸濁液、粉末、エアロゾル等中に形成できる。このような製剤に適した賦形剤、希釈剤及び担体の例は、緩衝液並びにデンプン、セルロース、糖、マンニトール、及びケイ酸誘導体等の充填剤及び増量剤を含む。カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及び他のセルロース誘導体、アルギナート、ゼラチン及びポリビニルピロリドン等の結合剤も含まれ得る。グリセロール等の加湿剤、炭酸カルシウムおよび炭酸水素ナトリウム等の崩壊剤が含まれ得る。パラフィン等の、溶解を遅延させるための因子も含まれ得る。第四級アンモニウム化合物等の再吸収加速剤も含まれ得る。セチルアルコール及びモノステアリン酸グリセロール等の界面活性剤が含まれ得る。カオリン及びベントナイト等の吸収性担体が添加され得る。滑石、ステアリン酸カルシウム及びマグネシウム、並びに固体ポリエチレングリコール等の潤滑剤も含まれ得る。保存料も添加され得る。本発明の組成物は、セルロース及び／又はセルロース誘導体等の増粘剤も含有し得る。前記組成物は、キサンタン、グアーガム若しくはカーボガム又はアラビアゴム、又はその他、ポリエチレングリコール、ベントン（ｂｅｎｔｏｎｅ）及びモンモリロナイト等のガムも含有し得る。
【０２４６】
例えば、本発明の治療薬を含有する錠剤又はカプレットは、炭酸カルシウム、酸化マグネシウム及び炭酸マグネシウム等の緩衝剤を含み得る。カプレット及び錠剤は、セルロース、あらかじめゼラチン化されたデンプン、二酸化シリコン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、微結晶性セルロース、デンプン、滑石、二酸化チタン、安息香酸、クエン酸、コーンスターチ、ミネラルオイル、ポリプロピレングリコール、リン酸ナトリウム、ステアリン酸亜鉛等の不活性成分も含み得る。本発明の少なくとも１つの治療薬を含有する硬質又は軟質ゼラチンカプセルは、ゼラチン、微結晶性セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、デンプン、滑石、及び二酸化チタン等の不活性成分、並びにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び植物油等の液体媒体を含有し得る。更に、本発明の治療薬の１つ又はそれ以上を含有する腸溶性コーティングしたカプレット又は錠剤は、胃の中での消化に耐え、十二指腸のより中性ないしアルカリ性の環境中で溶解するように設計される。
【０２４７】
本発明の治療薬は、経口投与のための使いやすいエリキシル剤若しくは溶液として、又は例えば筋肉内、皮下的、腹腔内若しくは静脈内経路による非経口投与に適した溶液としても製剤できる。本発明の治療薬の医薬製剤は、水溶性又は無水の溶液又は分散液の形態、又はその他乳剤若しくは懸濁液若しくは軟膏の形態も取り得る。
【０２４８】
従って、治療薬は、（例えば、注射、例えば急速注射又は連続注入による）非経口投与のために製剤され得、アンプル、あらかじめ充填されたシリンジ、わずかな容積の注入容器又は複数投与用容器中で、単位剤形で存在し得る。上述のように、保存料は、剤形の保存期間を維持するのを補助するために添加できる。活性因子及び他の成分は、油性又は水性媒体中で懸濁液、溶液又は乳剤を形成し得、懸濁液、安定化剤及び／又は分散剤等の製剤を含有し得る。あるいは、治療薬及び他の成分は、適切な媒体、例えば、発熱物質を含有しない滅菌水とともに使用前に構成するための、滅菌した固体の無菌的単離によって、又は溶液からの凍結乾燥によって得られる粉末形態にあり得る。
【０２４９】
これらの製剤は、本分野で周知の医薬として許容される担体、媒体及びアジュバントを含有し得る。例えば、水に加え、アセトン、エタノール、イソプロピルアルコール等の溶媒、「ドワノール（Ｄｏｗａｎｏｌ）」という名称のもとで販売されている製剤等のグリコールエーテル、ポリグリコール及びポリエチレングリコール、短鎖の酸のＣ１−Ｃ４アルキルエステル、エチル又は乳酸イソプロピル、「ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）」の名称で市販されている製剤等の脂肪酸トリグリセリド、ミリスチン酸イソプロピル、動物油、ミネラルオイル、植物油及びポリシロキサン等の、生理学的見地から許容可能な１つ又はそれ以上の有機溶媒を使用して溶液を調製することが可能である。
【０２５０】
必要であれば、抗酸化剤、界面活性剤、他の保存料、フィルム形成剤、角質溶解薬又は面皰溶解薬、香水、香料及び着色料から選択されるアジュバントを添加することができる。ｔ−ブチルヒドロキノン、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン及びα−トコフェロール等の抗酸化剤及びその誘導体が添加できる。
【０２５１】
更に、治療薬は、徐放性剤形等としての製剤に極めて適している。製剤は、例えば循環器系又は呼吸器の特定の一部において、場合によってある時間にわたって、活性因子を放出するように構成することができる。コーティング、エンベロープ、及び保護マトリクスは、例えばグリコール酸ポリラクチド、リポソーム、微小乳剤、ミクロ粒子、ナノ粒子又はワックス等のポリマー物質から作製され得る。これらのコーティング、エンベロープ及び保護マトリクスは、内在デバイス、例えばステント、カテーテル、腹膜透析チューブ、排水デバイス等をコーティングするのに有用である。
【０２５２】
局所的な投与に関して、治療薬は、本分野で公知のように、標的領域への直接的な適用のために製剤され得る。局所的な適用のために主に調整される形態は、例えば、クリーム、ミルク、ジェル、分散液又は微小乳剤、多かれ少なかれ増粘されたローション、含浸パッド、軟膏又はスティック、エアロゾル製剤（例えば、スプレー又は泡）、石鹸、洗剤、ローション又は固形石鹸の形態を取る。この目的のための他の従来の形態は、創傷包帯、コーティングされた包帯又は他のポリマーカバー、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゼリー、スプレー、及びエアロゾルを含む。従って、本発明の治療薬は、皮膚への投与のためのパッチ又は包帯を介して送達できる。あるいは、前記治療薬は、ポリアクリル酸塩又はアクリル酸塩／酢酸ビニル共重合体等の接着性ポリマーの一部であるように製剤化することができる。長期適用の場合、微小多孔性及び／又は通気性を有する裏打ち積層体を使用することが望ましくあり得、これにより皮膚の水和又は浸軟を最小化できる。裏打ち層は、望ましい保護及び支持機能を与える何れかの適切な厚さであり得る。適切な厚さは一般に、約１０ミクロンから約２００ミクロンまでである。
【０２５３】
軟膏及びクリームは、例えば、適切な増粘剤及び／又はゲル剤の添加された水性又は油性ベースで製剤化され得る。ローションは、水性又は油性ベースで製剤化され得、一般に、１つ又はそれ以上の乳化剤、安定化剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤又は着色料を含有する。例えば、米国特許第４，１４０，１２２号、第４，３８３，５２９号又は第４，０５１，８４２号に開示されるように、イオン泳動を介しても活性成分を送達できる。局所的製剤中に存在する本発明の治療薬の重量％は、多様な因子に依存するが、一般に、製剤の総重量の０．０１％から９５％までであり、典型的には０．１ないし８５重量％である。
【０２５４】
点眼薬又は点鼻薬等の滴下薬は、同じく１つ又はそれ以上の分散剤、可溶化剤又は懸濁剤を含む水性又は非水性ベース中で、治療薬の１つ又はそれ以上を用いて製剤化され得る。液体スプレーは、加圧されたパックから都合よく送達される。滴下薬は、単純な点眼器でキャップされた瓶を介して、又は液体含有物を滴下して送達するのに適したプラスチック瓶を介して、特に成形された密閉物を介して送達できる。
【０２５５】
治療薬は、口腔又は咽喉中の局所的な投与のために、更に製剤化され得る。例えば、活性成分は、香料ベース、通常はショ糖及びアカシア又はトラガントを更に含むトローチ剤、ゼラチン及びグリセリン又はショ糖及びアカシア等の不活性ベース中に前記組成物を含むトローチ、及び適切な液体担体中に本発明の組成物を含む口腔洗浄薬として製剤され得る。
【０２５６】
本発明の薬学的製剤は、場合によって使用される成分として、医薬として許容される担体、希釈剤、可溶化剤又は乳化剤及び本分野で利用可能な種類の塩を含み得る。このような物質の例は、生理学的に緩衝される塩類溶液等の標準塩類溶液及び水を含む。本発明の医薬製剤において有用な担体及び／又は希釈剤の非限定的な具体例は、水及び、リン酸緩衝塩類溶液ｐＨ７．０ないし８．０等の生理学的に許容可能な緩衝塩類溶液を含む。
【０２５７】
本発明の活性成分は、気道へも投与できる。従って、本発明は、エアロゾルタイプの医薬製剤及び本発明の方法において使用するための剤形も提供する。一般に、このような剤形は、具体的な免疫反応、血管の疾患又は疾病の臨床的症状を治療又は予防するのに効果的な本発明の因子の少なくとも１つの一定量を含む。本発明の方法に準拠して治療された免疫反応の１つ又はそれ以上の症状、血管系疾患又は疾病の何れかの統計的に有意な減弱は、本発明の範囲内のこのような免疫反応、血管系疾患又は疾病の治療であると考えられる。
【０２５８】
あるいは、吸入又はガス注入による投与の場合、前記組成物は、乾燥粉末、例えば治療薬と乳糖若しくはデンプン等の適切な粉末ベースとの粉末混合物の形態を取り得る。粉末組成物は、例えばカプセル又はカートリッジ、又は例えば粉末が吸入器（ｉｎｈａｌａｔｏｒ）、吸入器（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）、又は用量の計量された吸入器（ｉｎｈａｌｅｒ）（例えば、加圧され、用量の計量された吸入器（ＭＤＩ）及びＮｅｗｍａｎ，Ｓ．Ｐ．ｉｎ  Ａｅｒｏｓｏｌｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｌｕｎｇ，Ｃｌａｒｋｅ，Ｓ．Ｗ．ａｎｄ  Ｄａｖｉａ，Ｄ．ｅｄｓ．，ｐｐ．１９７−２２４，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９８４に開示されている乾燥粉末吸入器参照）を使用して投与され得るゼラチン又はブリスターパック中の単位剤形で存在し得る。
【０２５９】
本発明の治療薬は、エアロゾル又は吸入形態で投与される場合、水溶液中に入れて投与されることもできる。従って、他のエアロゾルの医薬製剤は、例えば、治療されるべき徴候又は疾病に特異的な本発明の治療薬の１つ又はそれ以上の約０．１ｍｇ／ｍＬと約１００ｍｇ／ｍＬとの間を含有する生理学的に許容可能な緩衝塩類溶液を含み得る。液体中に溶解されないか又は懸濁されない細かく分割された固体治療薬の形態にある乾燥エアロゾルも、本発明の実施において有用である。本発明の治療薬は、散布剤として製剤され得、約１μｍと５μｍとの間、あるいは２μｍと３μｍとの間の平均粒子サイズの細かく分割された粒子を含み得る。細かく分割された粒子は、本分野で周知の技術を使用する粉状化及び篩によるろ過によって調製され得る。粒子は、粉末の形態であり得る細かく分割された材料の所定量を吸入することによって投与され得る。必要な有効量が複数の投薬量単位の投与によって達成できるので、各剤形の個々のエアロゾル用量中に含有される活性成分又は成分の単位含有量は、それ自体、特定の免疫反応、血管の疾患又は疾病を治療するのに有効な量を構成する必要がないことが理解される。更に、有効な量は、個々に又は連続した投与での何れかで、剤形中の投薬量よりも少なく使用することによって達成され得る。
【０２６０】
吸入による上位気道（鼻部）又は下位気道への投与に関し、本発明の治療薬は、噴霧器又は加圧されたパック又はエアロゾルスプレーを送達する他の便利な手段から都合よく送達される。加圧されたパックは、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適切な気体等の適切な高圧ガスを含み得る。加圧されたエアロゾルの場合、投薬量単位は、バルブを提供して計量された量を送達することによって決定され得る。噴霧器は、米国特許第４，６２４，２５１号、第３，７０３，１７３号、第３，５６１，４４４号及び第４，６３５，６２７号に記載されるものを含むが、これらに限定されるわけではない。本明細書に開示される種類のエアロゾル送達システムは、Ｆｉｓｏｎｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．），Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．（Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ，ＮＪ）及びＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍｏｓｅａｌ  Ｃｏ．，（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を含む数多くの商業的供給源から入手可能である。鼻内投与の場合、治療薬は、プラスチック瓶噴霧器又は用量の計量された吸入器を介するなど、点鼻薬、液体スプレーを介しても投与され得る。噴霧器の典型的なものは、Ｍｉｓｔｏｍｅｔｅｒ（Ｗｉｎｔｒｏｐ）及びＭｅｄｉｈａｌｅｒ（Ｒｉｋｅｒ）である。
【０２６１】
更に、活性成分は、記載されている疾患に対するものであれ、又はその他の疾患に対するものであれ、他の治療薬、例えば、疼痛緩和剤、抗炎症薬、抗ヒスタミン、気管支拡張薬等と組み合わせても使用され得る。
【０２６２】
キット
本発明は更に、疾病を抑制、予防又は治療するためのキット又は他の容器等に包装された医薬組成物に関する。キット又は容器は、疾病の抑制のための医薬組成物を使用するための治療的有効量を保持する。医薬組成物は、疾病が抑制、予防又は治療されるような治療的有効量で、本発明の少なくとも１つの結合実体又は抗体を含む。
【０２６３】
ある実施形態において、キットは、コレステロールのオゾン化産物へ特異的に結合する抗体を含有する容器を含む。抗体は、治療薬と直接結合し得るか又は間接的に結合し得る。抗体は、液状、粉末状又は動物へ迅速に投与できる他の形態でも提供できる。
【０２６４】
別の実施形態において、本発明は、疾病が抑制、予防又は治療されるような治療的有効量で、少なくとも１つの細胞毒性コレステロールオゾン化産物を含む医薬組成物を提供する。このようなキットは、例えば望ましくない細胞種を阻害又は死滅させるための細胞毒として使用できるコレステロールのオゾン化産物を有する。
【０２６５】
本発明の別の実施形態において、キットは、コレステロールの細胞毒性オゾン化産物と抱合された結合実体を含有する。このようなキットは、自己免疫疾患、癌、腫瘍、細菌感染、ウィルス感染、潰瘍及び／又は細胞毒の局所投与が有利である他の疾病を罹患する患者を治療するのに使用できる。この結合実体−細胞毒コンジュゲートは、注射によって患者へ投与するのに適した形態で好ましく提供される。従って、キットは、適切な医薬賦形剤中で懸濁される等の懸濁された形態で、結合実体−細胞毒コンジュゲートを含有し得る。あるいは、前記コンジュゲートは、再構成に適した固体形態であり得る。
【０２６６】
本発明のキットは、本発明の組成物を投与するのに有用なツールを有する容器も含み得る。このようなツールは、シリンジ、綿棒、カテーテル、消毒液等を含む。
【０２６７】
以下の実施例は、本発明を例示するものであって、本発明を限定するものではない。本発明に記載されている数多くの改変及び修飾が、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく達成され得る。
【実施例１】
【０２６８】
材料及び方法
アテローム硬化性動脈標本の手術による単離及び取り扱い
頸動脈内膜切除によって組織試料を得た。前記試料は、アテローム硬化性プラーク並びに付着する幾らかの内膜及び媒質を含有した。プラーク分析のためのプロトコールは、Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｕｂｊｅｃｔｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって認可され、手術前に患者の同意を得た。新鮮な頸動脈内膜切除組織を、手術による摘出の３０分以内に分析した。プラーク試料は、保存及び貯蔵していなかったことに留意されたい。分析操作は全て、手術による摘出の２時間以内に完了した。固定液を標本へ添加しなかった。
【０２６９】
ヒトアテローム硬化性動脈標本によるインジゴカルミン１の酸化
上述のように単離した動脈内膜切除標本（ｎ＝１５）を、ほぼ等しい湿重量（±５％）の２つの部分へ分割した。インジゴカルミン１（２００μＭ、Ａｌｄｒｉｃｈ）及びウシカタラーゼ（１００μｇ）を含有するリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、１．８ｍＬ）中へ各標本を配置した。オゾンのための化学的捕捉剤として作用させるために、インジゴカルミン１を添加した。Ｔａｋｅｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ２３０，１８３（１９９０）、Ｔａｋｅｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６１，６１９（１９８９）。ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ、ＤＭＳＯ０．２ｍＬ中の４０μｇ）又はＤＭＳＯ（０．２ｍＬ）をプロテインキナーゼＣの活性化因子として添加した。組織ホモジナイザーを使用して各試料を１０分間ホモジナイズした後、遠心分離した（１０，０００ｒｐｍで１０分間）。容器を傾けて上清を採取し、フィルター（０．２μｍ）を通過させ、定量的ＨＰＬＣを使用して、イサチンスルホン酸２の存在に関してろ液を分析した。
【０２７０】
図１Ｂによって示されるように、インジゴカルミン１の可視光吸収を退色させ、反応は、定量的ＨＰＬＣを使用して検出し（表１）、イサチンスルホン酸２として同定した（図１Ａも参照）新たな化学種を生成させた。
【０２７１】
イサチンスルホン酸２の定量化のためのＨＰＬＣアッセイ
ＨＰＬＣ分析は、Ｌ−７２００オートサンプラー、Ｌ−７１００ポンプ及びＬ−７４００紫外線検出器（２５４ｎｍ）を装備したＨｉｔａｃｈｉ  Ｄ−７０００機で実施した。Ｌ−７１００は、Ｄｅｌｌ  ＧＸ１５０  ＰＣコンピュータ上のＨｉｔａｃｈｉ−ＨＳＭソフトウェアを使用して制御した。ＬＣ条件は、Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ  ＲＰ−Ｃ１８カラム及び１．２ｍＬ／分でのアセトニトリル：水（０．１％ＴＦＡ）（８０：２０）移動相であった。イサチンスルホン酸２は、約９．４分の保持時間ＲＴを有した。定量化は、Ｍａｃｈｉｎｔｏｓｈ用のＧｒａｐｈＰａｄ  ｖ３．０ソフトウェアを使用して、標品のピーク面積対濃度の標準曲線に対するピーク面積の比較によって実施した（表１）。
【０２７２】
【表１】
2009504184.tif 000026
【０２７３】
Ｈ２１８Ｏ中でのヒトアテローム硬化性動脈標本によるインジゴカルミン１の酸化
次の例外を除いて、上述のインジゴカルミンアッセイ中に記載のとおり、本実験を実施した。第一に、９５％超のＨ２１８Ｏ中で各プラーク標本（ｎ＝２）をリン酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）へ添加した。第二に、ろ液をＰＤ１０カラムで脱塩し、Ｆｉｎｎｅｇａｎエレクトロスプレー質量分析装置におけるネガティブエレクトロスプレー質量分析によって分析した。表示のため、イオン存在量の生データをＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ３．０へ抽出した。
【０２７４】
これらの実験は、プラーク材料及びＨ２１８Ｏ（９５％超の１８Ｏ）の存在下で、１８Ｏ同位体がイサチンスルホン酸２のラクタムカルボニル中へと組み込まれることを示す。Ｐ．Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ  Ｊｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８，２１９５（２００２）、Ｂ．Ｍ．Ｂａｂｉｏｒ，Ｃ．Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｊ．Ｒｕｅｄｉ，Ａ．Ｇｕｉｔｉｅｒｒｅｚ，Ｐ．Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ  Ｊｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，３９２０（２００３）、Ｐ．Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ  Ｊｒ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，１４９０（２００３）も参照されたい。
【０２７５】
アテローム性動脈標本からのアルデヒドの抽出及び誘導体化手法
上述のように単離した動脈内膜切除標本を、ほぼ等しい湿重量（±５％）の２つの部分へ分割した。ウシカタラーゼ（１００μｇ）及びミリスチン酸ホルボール（ＤＭＳＯ０．２ｍＬ中の４０μｇ）若しくはＤＭＳＯ（０．２ｍＬ）のいずれかを含有するリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、１．８ｍＬ）中へ各標本を配置した。組織ホモジナイザーを使用して、各試料を１０分間ホモジナイズした。上述のように単離した動脈内膜切除試料をホモジナイズした後、ジクロロメタン（ＤＣＭ、３×５ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機画分を真空で蒸発させた。残渣をエタノール（０．９ｍＬ）中に溶解し、エタノール中の２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（１００μＬ、２ｍＭ、及び１Ｎ  ＨＣｌ）の溶液を添加した。前記溶液を通じて窒素を５分間泡立たせた後、溶液を２時間撹拌した。得られた懸濁液を０．２２μｍのフィルターでろ過し、下記のとおり、ろ液をＨＰＬＣアッセイによって分析した。これらの条件下でコレステロール３（１ないし２０μＭ）を処理するとき、４ａも５ａも形成されなかった。動脈抽出物中の４ａのレベルに関するＰＭＡ添加の有意性を決定するために（ｐ＜０．０５を有意と考えた。）、ＰＭＡ添加前後の両者のアテローム性動脈抽出物中で検出される４ｂの量を、Ｓｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定解析へ供し、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ用のＧｒａｐｈｐａｄ  ｖ３．０で決定した。
【０２７６】
これらの条件下での４ａの誘導体化の間、４ａの濃度の範囲（５ないし１００μＭ）にわたって、４ａの約２０％が５ｂへと転化された。これらのデータは、同一プラーク試料中に存在する４ａの２０％を超過する５ａの測定された量が、３のオゾン分解後のアルドール化から生じたことを示す。使用した誘導体化条件下での４ａの６ｂへの転化の程度は、４ａの濃度の範囲（５ないし１００μＭ）にわたって、常に２％未満であった。これらの観察結果は、ケトアルデヒド４ａの量の２％を超過する、プラーク抽出物内に存在する６ａの量が、誘導体化前に存在し、水のβ脱離によってオゾン分解産物４ａから生じたことを示す。
【０２７７】
３つの主要なヒドラゾン生成物４ｂないし６ｂに加え、幾つものプラーク抽出物中で７ａのヒドラゾン誘導体（７ｂと呼ぶ。）を痕跡量（５ｐｍｏｌ／ｍｇ未満）で検出した（ＲＴ約２６分、［Ｍ−Ｈ］−５７９、ＳＯＭ  図２及び４）。化合物７ａは、５ａのＡ環脱水産物である。誘導体化したプラーク抽出物中の７ｂの量は、使用したＨＰＬＣアッセイの検出限界に接近しており、このため、プラーク試料全てにおける本化合物の完全な分析研究は実施されなかった。化合物７ａ及び７ｂの立体配置の割り当ては、合成材料７ｂの１Ｈ−１Ｈ  ＲＯＥＳＹ実験に基づいた。
【０２７８】
【化１５】
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2009504184.tif 000028
【０２７９】
化合物６ｂ、７ａ、７ｂ、８ａ及び９ａの合成された調製物を採用して、図４のＲＴ約２６分のピーク［Ｍ−Ｈ］−５７９の化合物を同定した。
【０２８０】
ヒドラゾンのＨＰＬＣ−ＭＳ分析
ＨＰＬＣ−ＭＳ分析は、Ｌ−７２００オートサンプラー（正規の注入容積１０μＬ）、Ｌ−７１００ポンプ及びＬ−７４００紫外線検出器（３６０ｎｍ）又はＬ−７４５５ダイオードアレイ検出器（２００ないし４００ｎｍ）の何れか及び（陰イオンモードの）インラインＭ−８０００イオン捕捉質量分析装置を装備したＨｉｔａｃｈｉ  Ｄ−７０００機で実施した。Ｌ−７１００は、Ｄｅｌｌ  ＧＸ１５０  ＰＣコンピュータ上のＨｉｔａｃｈｉ−ＨＳＭソフトウェアを使用して制御した。ＨＰＬＣは、Ｖｙｄｅｃ  Ｃ１８逆相カラムを使用して実施した。０．５ｍＬ／分での均一濃度の移動相（７５％アセトニトリル、２０％メタノール及び５％水）を使用した。ピークの高さ及び面積は、Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｄ７０００クロマトグラフィーステーションソフトウェアを使用して測定し、表品の標準曲線との比較によって濃度へ変換した。これらの条件下で、ヒドラゾン４ｂないし６ｂに関する検出限界は、１ないし１０ｎＭであった。シスとトランスヒドラゾンとの分子種の分解能は、本ＨＰＬＣシステムを使用することでは得られなかった。
【０２８１】
抽出され誘導体化されたアテローム硬化性材料の代表的なＨＰＬＣ−ＭＳを図４に示す。重要なヒドラゾン化合物の幾つもの標品の保持時間及び質量比を表２に示す。
【０２８２】
【表２】
2009504184.tif 000029
ａ標準アルデヒド８ａのヒドラゾンは、上述の誘導体化手法によって調製し、アルデヒド８ａは、独立に合成及び精製されなかった。ｂ市販のケトン９ａのヒドラゾンは、上述の誘導体化手法によって調製され、独立して合成及び精製されなかった。ｃ標準アルデヒド１０ａのヒドラゾンは、上述の誘導体化手法によって調製され、独立に合成及び精製されなかった。ｄ８ｂと９ｂとの間には、［Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｌ−７４５５ダイオードアレイ検出器（２００ないし４００ｎｍ）によって測定される］それらの紫外線スペクトルに基づいて差異が生じた。α，β不飽和ヒドラゾン８ｂは、４３５ｎｍのλｍａｘを有したのに対し、ヒドラゾン９ｂは、４１６ｎｍのλｍａｘを有した。
【０２８３】
アルデヒド４ａ及び５ａに関する血漿試料の分析
２４時間以内に頸動脈内膜切除を受ける予定の患者（ｎ＝８）から血漿試料を得た。試料回収から３日後に、４ａ及び５ａの存在に関して、このような血漿試料を全て分析した。一般的な医療診療所で受診している無作為な患者（ｎ＝１５）から、対照血漿試料を取得し、回収から７日後に分析した。典型的な手法において、ＥＤＴＡ（１ｍＬ）中の血漿をジクロロメタン（ＤＣＭ、３×１ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機画分を真空で蒸発させた。残渣をメタノール（０．９ｍＬ）中に溶解し、エタノール中の２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（１００μＬ、０．０１Ｍ、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ）及び１Ｎ  ＨＣｌの溶液を添加した。前記溶液を通じて窒素を５分間泡立たせた後、溶液を２時間撹拌した。得られた溶液を０．２２μｍのフィルターでろ過し、下記のとおり、ろ液をＨＰＬＣアッセイによって分析した。血漿から抽出できる５ａの量が、１日あたり約５％低下することが、予備研究によって明らかとなった。
【０２８４】
標品４ａ、４ｂ、５ａ、５ｂ、６ａ、６ｂ、７ａ、７ｂ、８ａ、及び８ｂの調製
一般的な方法
別段の記載がない限り、全ての反応は、不活性雰囲気下で、乾燥試薬、溶媒、炎光乾燥したガラス器具を使用して実施した。全ての出発材料は、Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｉｇｍａ、Ｆｉｓｈｅｒ、又はＬａｎｃａｓｔｅｒから購入し、受領した状態で使用した。ケトン９ａは、Ａｌｄｒｉｃｈから得た。全てのフラッシュカラムクロマトグラフィーは、シリカゲル６０（２３０ないし４００メッシュ）を使用して実施した。調製用薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、Ｍｅｒｃｋ（０．２５、０．５、又は１ｍｍ）コーティングされたシリカゲルＫｉｅｓｅｌｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４プレートを使用して実施した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＭＸ−６００（６００ＭＨｚ）、ＡＭＸ−５００（５００ＭＨｚ）、ＡＭＸ−４００（４００ＭＨｚ）、又はＡＣ−２５０（２５０ＭＨｚ）分光計で記録した。１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＭＸ−５００（１２５．７ＭＨｚ）又はＡＭＸ−４００（１００．６ＭＨｚ）分光計で記録した。化学シフトは、内部標準からδ尺度上で、百万分率（ｐｐｍ）で記録する。高解像質量スペクトルは、ＶＧ  ＺＡＢ−ＶＳＥ機器で記録した。
【０２８５】
３β−ヒドロキシ−５−オキソ−５，６−セココレスタン−６−アル（４ａ）
本化合物は、Ｋ．Ｗａｎｇ，Ｅ．Ｂｅｒｍｕｄｅｚ，Ｗ．Ａ．Ｐｒｙｏｒ，Ｓｔｅｒｏｉｄｓ  ５８，２２５（１９９３）に一般的に記載されるとおり合成した。クロロホルム−メタノール（９：１）（１００ｍＬ）中のコレステロール３（１ｇ、２．６ｍｍｏｌ）の溶液をドライアイス温度で、１０分間オゾン化した。反応混合物を蒸発させ、水−酢酸（１：９、５０ｍＬ）中のＺｎ粉末（６５０ｍｇ、１０ｍｍｏｌ）とともに室温で３時間撹拌した。還元された混合物をジクロロメタン（１００ｍＬ）で希釈し、水（３×５０ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機画分を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空で乾燥するまで蒸発させた。シリカゲルクロマトグラフィー［酢酸エチル−へキサン（２５：７５）］を使用して残渣を精製すると、表題化合物４ａが白色固体（８２０ｍｇ、７６％）として得られた。
【０２８６】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ９．５３３（ｓ，１Ｈ，ＣＨＯ），４．３８８（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３），３．０００（ｄｄ，Ｊ＝１４．０，４．０Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−４ｅ），０．９２７（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３−１９），０．８２７（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３−２１），０．７８２（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３），０．７７８（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３），０．６０３（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３−１８）；１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ２１７．９０（Ｃ−５），２０２．７６（Ｃ−６），７０．８１（Ｃ−３），５５．９６（Ｃ−１７），５４．２６（Ｃ−１４），５２．５２（Ｃ−１０），４６．７０（Ｃ−４），４４．１７（Ｃ−７），４２．４３（Ｃ−１３），４２．１７（Ｃ−９），３９．７５（Ｃ−１２），３９．３３（Ｃ−２４），３５．８５（Ｃ−２２），３５．６１（Ｃ−２０），３４．５８（Ｃ−８），３３．９９（Ｃ−１），２７．８７（Ｃ−２５），２７．７３（Ｃ−１６），２７．５２（Ｃ−２），２５．２２（Ｃ−１５），２３．６２（Ｃ−２３），２２．９１（Ｃ−１１），２２．７０（Ｃ−２７），２２．４４（Ｃ−２６），１８．４４（Ｃ−２１），１７．４６（Ｃ−１９），１１．４２（Ｃ−１８）。ＨＲＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ  Ｃ２７Ｈ４６Ｏ３Ｎａ（Ｍ＋Ｎａ）＋に関する計算値４４１．３３３９、実測値４４１．３３５５。
【０２８７】
３β−ヒドロキシ−５−オキソ−５，６−セココレスタン−６−アルの２，４−ジニトロフェニルヒドラゾン（４ｂ）
本化合物は、Ｋ．Ｗａｎｇ，Ｅ．Ｂｅｒｍｕｄｅｚ，Ｗ．Ａ．Ｐｒｙｏｒ，Ｓｔｅｒｏｉｄｓ  ５８，２２５（１９９３）に一般的に記載されているとおりに合成した。２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（５２ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）及びｐ−トルエンスルホン酸（１ｍｇ、０．００５２ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル（１０ｍＬ）中のケトアルデヒド４ａ（１００ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）の溶液へ添加した。反応混合物を室温で４時間撹拌し、真空で乾燥するまで蒸発させた。残渣を酢酸エチル（１０ｍＬ）中に溶解し、水（３×２０ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機画分を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空で乾燥するまで蒸発させた。シリカゲルクロマトグラフィー［酢酸エチル−ヘキサン（１：４）］によって残渣を精製すると、表題化合物４ｂを黄色の固体（１００ｍｇ、７０％）として、並びにシス及びトランス異性体の混合物（１：４）として付与した。ヘキサン−塩化メチレンからの結晶化によって、トランス４ｂが黄色の針状物質（３０ｍｇ、２１％）として得られた。
【０２８８】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ１０．９９４（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），９．１０７（ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−３’），８．３１６（ｄｄ，Ｊ＝９．６，２．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５’），７．９２３（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−６’），７．４１９（ｄｄ，Ｊ＝６．０，３．６Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−６），４．４１７（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３），２．９７１（ｄｄ，Ｊ＝１３．６，４．０Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−４ｅ），１．０７６（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３−１９），０．９１５（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３−２１），０．８５３（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３），０．８４９（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３），０．７１０（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３−１８）；１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ２１６．０５（Ｃ−５），１５０．８４（Ｃ−６），１４４．９６（Ｃ−１’），１３７．８７（Ｃ−４’），１３０．２３（Ｃ−５’），１２８．９０（Ｃ−２’），１２３．５０（Ｃ−３’），１１６．５２（Ｃ−６’），７１．４２（Ｃ−３），５６．０７（Ｃ−１７），５４．５４（Ｃ−１４），５２．６９（Ｃ−１０），４７．３４（Ｃ−４），４２．６１（Ｃ−１３），４２．６１（Ｃ−９），３９．８２（Ｃ−１２），３９．４２（Ｃ−２４），３６．９９（Ｃ−８），３５．９６（Ｃ−２２），３５．６７（Ｃ−２０），３４．１３（Ｃ−１），３２．６５（Ｃ−７），２７．９８（Ｃ−１６），２７．９３（Ｃ−２５），２７．９０（Ｃ−２），２５．３１（Ｃ−１５），２３．７０（Ｃ−２３），２３．１２（Ｃ−１１），２２．７８（Ｃ−２７），２２．５２（Ｃ−２６），１８．５６（Ｃ−２１），１７．７７（Ｃ−１９），１１．６７（Ｃ−１８）；ＨＲＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ  Ｃ３３Ｈ５０Ｎ４Ｏ６Ｎａ（Ｍ＋Ｎａ）に関する計算値６２１．３６２２、実測値６２１．３６２２：λｍａｘ３６０ｎｍ，ε２．５７±０．３１×１０４Ｍ−１ｃｍ−１
【０２８９】
３β−ヒドロキシ−５β−ヒドロキシ−Ｂ−ノルコレスタン−６β−カルボキシアルデヒド（５ａ）
本化合物は、Ｔ．Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｋ．Ｋｏｄａｍａ，Ｙ．Ａｒａｍａｋｉ，Ｒ．Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｒ．Ｗ．Ｍ．Ｖａｎ  Ｓｏｅｓｔ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒ  ４２，６３４９（２００１）に一般的に記載されているとおりに合成した。アセトニトリル−水（２０：１、１００ｍＬ）中のケトアルデヒド４ａ（８００ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ）の溶液へ、Ｌ−プロリン（２２０ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ）を添加した。
反応混合物を室温で２時間撹拌し、真空で乾燥するまで蒸発させた。残渣を酢酸エチル（５０ｍＬ）中に溶解し、水（３×５０ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機画分を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空で乾燥するまで蒸発させた。シリカゲルクロマトグラフィー［酢酸エチル−へキサン（１：４）］によって残渣を精製すると、表題化合物５ａが白色固体（５８０ｍｇ、７３％）として得られた。
【０２９０】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ９．６８９（ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨＯ），４．１１５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３），３．５６５（ｓ，１Ｈ，３β−ＯＨ），２．４９５（ｂｒｏａｄ  ｓ，１Ｈ，５β−ＯＨ），２．２３４（ｄｄ，Ｊ＝９．２，３．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−６），０．９２０（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３−１９），０．９０４（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３−２１），０．８５４（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３），０．８５０（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３），０．７０５（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３−１８）；１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ２０４．７４（Ｃ−７），８４．２６（Ｃ−５），６７．３３（Ｃ−３），６３．８９（Ｃ−９），５６．１０（Ｃ−１４），５５．６７（Ｃ−１７），５０．４２（Ｃ−６），４５．４７（Ｃ−１０），４４．７２（Ｃ−１３），４４．２２（Ｃ−４），４０．０２（Ｃ−８），３９．６７（Ｃ−１２），３９．４４（Ｃ−２４），３６．１５（Ｃ-２２），３５．５８（Ｃ−２０），２８．３０（Ｃ−１６），２７．９８（Ｃ−２），２７．９１（Ｃ−２５），２６．６９（Ｃ−１），２４．５５（Ｃ−１５），２３．７８（Ｃ−２３），２２．７８（Ｃ−２７），２２．５２（Ｃ−２６），２１．５４（Ｃ−１１），１８．７１（Ｃ−２１），１８．４３（Ｃ−１９），１２．４８（Ｃ−１８）。ＨＲＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ  Ｃ２７Ｈ４６Ｏ３Ｎａ（Ｍ＋Ｎａ）＋に関する計算値４４１．３３３９、実測値４４１．３３５１。
【０２９１】
３β−ヒドロキシ−５β−ヒドロキシ−Ｂ−ノルコレスタン−６β−カルボキシアルデヒドの２，４−ジニトロフェニルヒドラゾン（５ｂ）
本化合物は、Ｋ．Ｗａｎｇ，Ｅ．Ｂｅｒｍｕｄｅｚ，Ｗ．Ａ．Ｐｒｙｏｒ，Ｓｔｅｒｏｉｄｓ  ５８，２２５（１９９３）に一般的に記載されているとおりに合成した。２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（５２ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）及び塩酸（１２Ｍ、２滴）を、アセトニトリル（１０ｍＬ）中のアルデヒド５ａ（１００ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）の溶液へ添加した。反応混合物を室温で４時間撹拌し、真空で乾燥するまで蒸発させた。残渣を酢酸エチル（１０ｍＬ）中に溶解し、水（３×２０ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機画分を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空で乾燥するまで蒸発させた。シリカゲルクロマトグラフィー［酢酸エチル−へキサン（１：４）］によって残渣を精製すると、表題化合物５ｂが、トランス５ｂフェニルヒドラゾンとしての黄色の固体（９０ｍｇ、６２％）として得られた。
【０２９２】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）１１．０４９（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），９．１０８（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−３’），８．２８０（ｄｄ，Ｊ＝９．６，２．６Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５’），７．９０１（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−６’），７．５６１（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−７），４．２１４（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３），３．３４９（ｓ，１Ｈ，３β−ＯＨ），２．３３７（ｄｄ，Ｊ＝９．２，６．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−６），０．９６７（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３−１９），０．９１７（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３−２１），０．８５０（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３），０．８４６（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３），０．７１３（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３−１８）；１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１５５．１８（Ｃ−７），１４５．１２（Ｃ−１’），１３７．５１（Ｃ−４’），１２９．９１（Ｃ−５’），１２８．６４（Ｃ−２’），１２３．５７（Ｃ−３’），１１６．３６（Ｃ−６’），８３．３５（Ｃ−５），６７．５６（Ｃ−３），５６．３４（Ｃ−１７），５６．３４（Ｃ−９），５５．５６（Ｃ−１４），５１．４７（Ｃ−６），４５．５０（Ｃ−１０），４４．７６（Ｃ−１３），４３．６２（Ｃ−４），４２．５９（Ｃ−８），３９．６６（Ｃ−１２），３９．４３（Ｃ−２４），３６．１６（Ｃ−２２），３５．５８（Ｃ−２０），２８．５０（Ｃ−１６），２８．０７（Ｃ−２），２７．９８（Ｃ−２５），２７．７０（Ｃ−１），２４．６７（Ｃ−１５），２３．７８（Ｃ−２３），２２．７８（Ｃ−２７），２２．５２（Ｃ−２６），２１．６３（Ｃ−１１），１８．７５（Ｃ−２１），１８．６７（Ｃ−１９），１２．４８（Ｃ−１８）；ＨＲＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ  Ｃ３３Ｈ５０Ｎ４Ｏ６Ｎａ（Ｍ＋Ｎａ）＋に関する計算値６２１．３６２２、実測値６２１．３６２５。ＨＰＬＣ−ＭＳ検出：  ＲＴ  ２０．８分；［Ｍ−Ｈ］−５９７；λｍａｘ３６１ｎｍ、ε２．４７±０．６８×１０４Ｍ−１ｃｍ−１。
【０２９３】
５−オキソ−５，６−セココレスト−３−エン−６−アル（６ａ）
本化合物は、Ｐ．Ｙａｔｅｓ，Ｓ．Ｓｔｉｖｅｅｒ，Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．６６，１２０９（１９８８）に一般的に記載されているとおり合成した。塩化メタンスルホニル（４００μＬ、２．８７ｍｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）中のケトアルデヒド４ａ（３００ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（６５μＬ、０．８４ｍｍｏｌ）の撹拌した溶液へ、氷槽の温度で滴下して添加した。得られた溶液をアルゴン下、０℃で３０分間撹拌した後、トリエチルアミン（４００μＬ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を室温へ加温した。２時間後、反応混合物を真空下で乾燥するまで蒸発させた。残渣を塩化メチレン（１５ｍＬ）中に溶解し、水（３×２０ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機画分を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空で蒸発させた。シリカゲルクロマトグラフィー［酢酸エチル−ヘキサン（１：９）］によって未精製の残渣を精製した。画分を蒸発させると、アルデヒド６ａ（１５３ｍｇ、５３％）が無色の油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）は、δ９．５７４（ｓ，１Ｈ，ＣＨＯ），６，７６９（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３），５．８２２（ｄ，Ｊ＝１０Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−４），２．５１２（ｄｄ，Ｊ＝１６．８，３．６Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−７），１．０７０（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３−１９），０．８８２（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３−２１），０．８４５（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３），０．８４１（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３），０．６７４（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３−１８）を示し；１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ２０８．２２（Ｃ−５），２０２．４２（Ｃ−６），１４７．４６（Ｃ−３），１２８．４４（Ｃ−４），５６．０８（Ｃ−１７），５４．９６（Ｃ−１４），４７．８０（Ｃ−１０），４５．０５（Ｃ−７），４２．３３（Ｃ−１３），４２．０４（Ｃ−９），３９．７３（Ｃ−１２），３９．４３（Ｃ−２４），３５．９３（Ｃ−２２），３５．７１（Ｃ−２０），３５．４２（Ｃ−１），３３．７７（Ｃ−８），２７．９７（Ｃ−２５），２７．６７（Ｃ-１６），２５．２２（Ｃ−１５），２４．６７（Ｃ−２），２３．７１（Ｃ−２３），２３．２７（Ｃ−１１），２２．７７（Ｃ−２７），２２．５１（Ｃ−２６），１８．５４（Ｃ−２１），１７．７１（Ｃ−１９），１１．４８（Ｃ−１８）である。ＨＲＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ  Ｃ２７Ｈ４５Ｏ２（Ｍ＋Ｈ）＋に関する計算値４０１．３４１４、実測値４０１．３４０４。
【０２９４】
５−オキソ−５，６−セココレスト−３−エン−６−アルの２，４−ジニトロフェニルヒドラゾン（６ｂ）
２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（４５ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル（１０ｍＬ）中のケトアルデヒド６ａ（８０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）及びｐ−トルエンスルホン酸（１ｍｇ、０．００５２ｍｍｏｌ）の溶液へ添加した。反応混合物を室温で２時間撹拌し、真空で乾燥するまで蒸発させた。残渣を塩化メチレン（１０ｍＬ）中に溶解し、水（３×２０ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機画分を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空で乾燥するまで蒸発させた。シリカゲルクロマトグラフィー［酢酸エチル−へキサン（１５：８５）］によって残渣を精製すると、表題化合物６ｂが黄色の固体（７０ｍｇ、６０％）として得られた。
【０２９５】
トランス６ｂ  １Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）は、δ１０．９５８（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），９．１０４（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−３’），８．２８８（ｄｄ，Ｊ＝９．８，２．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５’），７．８９６（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−６’），７．３３７（ｄｄ，Ｊ＝５．６，５．６Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−６），６．７７１（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３），５．８２２（ｄ，Ｊ＝１０Ｈｚ，１−Ｈ，Ｈ−４），２．６００（ｄｄｄ，Ｊ＝１６．４，４．８，４．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−７），１．１３９（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３−１９），０．８９７（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３−２１），０．８４０（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３），０．８３７（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３），０．７０３（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３−１８）を示し；１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ２０７．７８（Ｃ−５），１５１．１７（Ｃ−６），１４７．６９（Ｃ−３），１４５．００（Ｃ−１’），１３７．６１（Ｃ−４’），１２９．９７（Ｃ−５’），１２８．５２（Ｃ−２’），１２８．３８（Ｃ−４），１２３．４８（Ｃ−３’），１１６．４６（Ｃ−６’），５６．０５（Ｃ−１７），５４．６８（Ｃ−１４），４７．８７（Ｃ−１０），４２．３０（Ｃ−１３），４１．６９（Ｃ−９），３９．７２（Ｃ−１２），３９．３７（Ｃ−２４），３６．３５（Ｃ−８），３５．９１（Ｃ−２２），３５．６６（Ｃ−２０），３５．３４（Ｃ−１），３２．８４（Ｃ−７），２７．９３（Ｃ−２５），２７．７３（Ｃ−１６），２４．９３（Ｃ−１５），２４．６８（Ｃ−２），２３．６９（Ｃ−２３），２３．２４（Ｃ−１１），２２．７４（Ｃ−２７），２２．４８（Ｃ−２６），１８．５２（Ｃ−２１），１７．８１（Ｃ−１９），１１．５８（Ｃ−１８）；ＨＲＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ  Ｃ３３Ｈ４８Ｎ４Ｏ５Ｎａ（Ｍ＋Ｎａ）＋に関する計算値６０３．３５１７、実測値６０３．３５２３。ＨＰＬＣ−ＭＳ検出：  ＲＴ  １８．３分；［Ｍ−Ｈ］−５７９；λｍａｘ３６０ｎｍ、ε２．２９±０．２３×１０４Ｍ−１ｃｍ−１。
【０２９６】
５β−ヒドロキシ−Ｂ−ノルコレスト−３−エン−６β−カルボキシアルデヒド（７ａ）
本化合物は、Ｐ．Ｙａｔｅｓ，Ｓ．Ｓｔｉｖｅｅｒ，Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．６６，１２０９（１９８８）に一般的に記載されているとおり合成した。室温で、アルゴン雰囲気下、メタノール中のナトリウムメトキシド（０．５Ｍ、０．１６ｍｍｏｌ）を、無水メタノール（１０ｍＬ）中のケトアルデヒド４ａ（５０ｍｇ、０．１２５ｍｍｏｌ）の溶液へ滴下して添加した。３０分後、メタノールを真空下で除去し、残渣をジクロロメタン（２０ｍＬ）中に溶解し、水（３×２０ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機画分を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空で蒸発させた。シリカゲルクロマトグラフィー［酢酸エチル−へキサン（１：９）］によって残渣を精製すると、表題のアルデヒド７ａを無色の油（１６ｍｇ、３２％）として付与した。
【０２９７】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ９．７０３（ｄ，Ｊ＝３．２，１Ｈ，ＣＨＯ），５．７１６（ｍ，２Ｈ，Ｈ−３及びＨ−４），２．３９８（ｄｄ，Ｊ＝９．６，３．６Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−６），０．９５３（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３−１９），０．９０４（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３−２１），０．８５４（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３），０．８４９（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３），０．７０６（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３−１８）；１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ２０４．４１（Ｃ−７），１３４．２１（Ｃ−３），１２６．６６（Ｃ−４），８１．４４（Ｃ−５），６４．４９（Ｃ−９），５５．８６（Ｃ−１４），５５．５５（Ｃ−１７），４８．４４（Ｃ−６），４５．１２（Ｃ−１０），４４．４７（Ｃ−１３），３９．９２（Ｃ−８），３９．４５（Ｃ−１２），３９．４０（Ｃ−２４），３６．１６（Ｃ−２２），３５．５７（Ｃ−２０），２９．０６（Ｃ−１），２８．３１（Ｃ−１６），２７．９８（Ｃ−２５），２４．７３（Ｃ−１５），２３．７６（Ｃ−２３），２２．７８（Ｃ−２７），２２．５３（Ｃ−２６），２１．６９（Ｃ−２），２１．２４（Ｃ−１１），１８．７４（Ｃ−２１），１８．４４（Ｃ−１９），１２．３７（Ｃ−１８）；ＨＲＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ  Ｃ２７Ｈ４４Ｏ２Ｎａ（Ｍ＋Ｎａ）＋に関する計算値４２３．３２３３，実測値４２３．３２４０。
【０２９８】
５β−ヒドロキシ−Ｂ−ノルコレスト−３−エン−６β−カルボキシアルデヒドの２，４−ジニトロフェニルヒドラゾン（７ｂ）
２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（８ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）及びｐ−トルエンスルホン酸（１ｍｇ、５．２μｍｏｌ）を、アセトニトリル（５ｍＬ）中のアルデヒド７ａ（１５ｍｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）の溶液へ添加した。反応混合物を室温で２時間撹拌し、真空下で蒸発させ、塩化メチレン（１０ｍＬ）で希釈した。有機層を水（３×２０ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させた。シリカゲルクロマトグラフィー［酢酸エチル−へキサン（１：９）］によって残渣を精製すると、ヒドラゾン７ｂが黄色の固体（９ｍｇ、４１％）として得られた。
【０２９９】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）トランス７ｂ  １１．０６０（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），９．１１９（ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−３’），８．２９１（ｄｄ，Ｊ＝９．２，２．０Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５’），７．９３０（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−６’），７．５４６（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−７），５．７６１（ｄｄｄ，Ｊ＝１０．２，４．４，２．０Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−３），５．７０５（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−４），２．４８５（ｄｄ，Ｊ＝１０．４，７．６Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−６），０．９７７（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３−１９），０．９１７（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３−２１），０．８４８（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３），０．８４４（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３），０．７０７（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３−１８）；１Ｈ−１Ｈ  ＲＯＥＳＹ  ＮＭＲ  有意な相関（Ｈ４−Ｈ６），（Ｈ６−Ｈ７），（Ｈ７−Ｈ８），（Ｈ７−Ｈ１９），相関欠如（Ｈ３−Ｈ１９），（Ｈ４−Ｈ７），（Ｈ４−Ｈ１９），（Ｈ６−Ｈ１９）；１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１５４．６２（Ｃ−７），１４５．０９（Ｃ−１’），１３７．５９（Ｃ−４’），１３３．８９（Ｃ−３），１２９．９４（Ｃ−５’），１２８．６８（Ｃ−２’），１２７．１２（Ｃ−４），１２３．５７（Ｃ−３’），１１６．４２（Ｃ−６’），８０．９１（Ｃ−５），５６．８３（Ｃ−９），５６．０７（Ｃ−１４），５５．３９（Ｃ−１７），４９．５８（Ｃ−６），４５．００（Ｃ−１０），４４．５８（Ｃ−１３），４２．５０（Ｃ−８），３９．４４（Ｃ−１２），３９．４４（Ｃ−２４），３６．１７（Ｃ−２２），３５．５４（Ｃ−２０），３０．４６（Ｃ−１），２８．５３（Ｃ−１６），２７．９８（Ｃ−２５），２４，９１（Ｃ−１５），２３．７４（Ｃ−２３），２２．７７（Ｃ−２７），２２．５２（Ｃ−２６），２１．７９（Ｃ−２），２１．３１（Ｃ−１１），１８．７６（Ｃ−２１），１８．７６（Ｃ−１９），１２．３４（Ｃ−１８）。ＨＰＬＣ−ＭＳ検出：  ＲＴ  １８．３分；［Ｍ−Ｈ］−５７９；λｍａｘ３６４ｎｍ，ε２．３２±０．１７×１０４Ｍ−１ｃｍ−１。
【０３００】
３β−ヒドロキシ−Ｂ−ノルコレスト−５−エン−６−カルボキシアルデヒド（８ａ）
アセトニトリル−塩化メチレン中のアルデヒド５ａ（５０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）及びリン酸（８５％、５ｍＬ）の溶液を還流下で３０分間加熱した。反応混合物を真空下で蒸発させ、塩化メチレン（５０ｍＬ）で希釈し、水（３×２０ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空下で蒸発させた。酢酸エチル−ヘキサン（１：４）を使用するシリカゲル上での液体クロマトグラフィーによって、残渣を精製すると、α，β不飽和アルデヒド８ａの表題のアルデヒド１２ｍｇ（２５％）が得られた。８ａの１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）は、δ９．９５８（ｓ，１Ｈ，ＣＨＯ），３．７１１（ｔｔ，Ｊ＝１０．８，４．５Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−３），３．４７５（ｄｄ，Ｊ＝１４．１，４．８，１Ｈ，Ｈ−４），２．５６３（ｄｄ，Ｊ＝１１．０，１１．０Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−８），０．９５３（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３−１９），０．９４１（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３−２１），０．８８１（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３），０．８７６（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３），０．７４６（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３−１８）を示し；１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１８９．４４（Ｃ−７），１６８．７４（Ｃ−５），１３９．２１（Ｃ−６），７０．８８（Ｃ−３），６０．１６（Ｃ−９），５５．４０（Ｃ−１７），５４．４８（Ｃ−１４），４６．３５（Ｃ−１０），４６．１９（Ｃ−８），４５．２７（Ｃ−１３），３９．８６（Ｃ−１２），３９．５５（Ｃ−２４），３６．２６（Ｃ−４），３６．２２（Ｃ−２２），３５．６４（Ｃ−２０），３３．９３（Ｃ−１），３１．３２（Ｃ−２），２８．６２（Ｃ−１６），２８．０９（Ｃ−２５），２６．６５（Ｃ−１５），２４．００（Ｃ−２３），２２．９０（Ｃ−２７），２２．６４（Ｃ−２６），２０．８０（Ｃ−１１），１９．０２（Ｃ−２１），１５．７３（Ｃ−１９），１２．５９（Ｃ−１８）；ＨＲＭＳ  Ｃ２７Ｈ４４Ｏ２Ｎａ（Ｍ＋Ｎａ）＋に関する計算値４２３．３２３３、実測値４２３．３２３９。
【０３０１】
本反応から、Ｂ−ノルコレスト−３，５−ジエン−６−カルボキシアルデヒド１２ａの白色固体（２７ｍｇ、６０％）を副産物として得た：１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１０．０１７（ｓ，１Ｈ，ＣＨＯ），６．９１９（ｄ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−４），６．２２５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３），２．６７５（ｄｄ，Ｊ＝１０．８，１０．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−８），０．９５０（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３−２１），０．９１４（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３−１９），０．８８２（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３），０．８７７（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３），０．７６９（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３−１８）；１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１８９．４１（Ｃ−７），１６３．３３（Ｃ−５），１３８．１８（Ｃ−６），１３５．７５（Ｃ−３），１２０．６８（Ｃ−４），５９．５４（Ｃ−９），５５．４１（Ｃ−１７），５４．３０（Ｃ−１４），４５．４７（Ｃ−８），４５．０８（Ｃ−１０），４４．７２（Ｃ−１３），３９．７９（Ｃ−１２），３９．５５（Ｃ−２４），３６．２７（Ｃ−２２），３５．６５（Ｃ−２０），３４．１８（Ｃ−１），２８．６２（Ｃ−１６），２８．０９（Ｃ−２５），２６．７２（Ｃ−１５），２４．００（Ｃ−２３），２３．９６（Ｃ−２），２２．９０（Ｃ−２７），２２．６４（Ｃ−２６），２０．７２（Ｃ−１１），１９．０３（Ｃ−２１），１４．８７（Ｃ−１９），１２．６２（Ｃ−１８）；ＨＲＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ  Ｃ２７Ｈ４３Ｏ（Ｍ＋Ｈ）＋に関する計算値３８３．３３０８、実測値３８３．３３０９。
【０３０２】
【化１６】
2009504184.tif 000030
【０３０３】
アミノ酸によるケトアルデヒド４ａのアルドール化
典型的な手法において、ＮＭＲチューブ中のＤＭＳＯ−ｄ６（８００μＬ）及びＤ２Ｏ（８０μＬ）中にケトアルデヒド４ａ（２ｍｇ、４．８μｍｏｌ）を溶解した。この溶液へ、ａ）Ｌ−プロリン、ｂ）グリシン、ｃ）塩酸Ｌ−リジン又はｄ）二塩酸Ｌ−リジンエチルエステルの何れかの１当量を添加した。分析時点で、１Ｈ  ＮＭＲによって試料を分析した。本反応の後、常に、１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）中の多くの共鳴における変化をモニターした。１Ｈ  ＮＭＲ５ａは、δ９．５２７（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨＯ），３．８７６（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３），０．８６０（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３−２１），０．７７２（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３），０．７６７（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３），０．７７１（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３−１９），０．６４２（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３−１８）を示す。１Ｈ  ＮＭＲ４ａは、δ９．５１８（ｓ，１Ｈ，ＣＨＯ），４．２２３（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３），２．９９４（ｄｄ，Ｊ＝１２．８，４．０Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−４ｅ），０．８５８（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３），０．８４２（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３−１９），０．８１１（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３），０．８０７（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３−２１），０．６１５（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３−１８）を示す。これらの条件下で、４ａのアルドール化は、ＤＭＳＯ−ｄ６（８００μＬ）及びＤ２Ｏ（８０μＬ）中で生じなかった。
【０３０４】
アテローム硬化性動脈及び血液画分によるセコケトアルデヒド４ａのアルドール化
典型的な手法において、ＤＭＳＯ−ｄ６（８００μＬ）及びＤ２Ｏ（８０μＬ）中にケトアルデヒド４ａ（５ｍｇ、０．００１２ｍｍｏｌ）を溶解した。この溶液へ、ａ）組織ホモジナイザー中でＰＢＳ（１ｍＬ）中でホモジナイズした後、乾燥するまで凍結乾燥させたアテローム硬化性動脈（２．１ｍｇ）、ｂ）凍結乾燥したヒト血液（１ｍＬ）、ｃ）凍結乾燥したヒト血漿（１ｍＬ）又はｄ）凍結乾燥したＰＢＳ（１ｍＬ）の何れかを添加した。分析の時点で試料を回収し、上述のとおり１Ｈ  ＮＭＲによって分析した。これらの条件下で、４ａのアルドール化は、凍結乾燥したＰＢＳの存在下で生じなかった。
【０３０５】
４ａ及び５ａによる生物学的研究
生体内でのコレステロールの酸化によって発生した幾つかのオキシステロールが記載されている。Ｅ．Ｌｕｎｄ，Ｉ．Ｂｊｏｒｋｈｅｍ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２８，２４１（１９９５）。更に、コレスタン側鎖中でのみ構造が異なる５ａの類縁体が、細胞毒性天然産物のための一般的なスクリーニングの一部として、海綿ステレッタ・ヒワサエンシス（Ｓｔｅｌｌｅｔｔａ  ｈｉｗａｓａｅｎｓｉｓ）から単離されている。Ｔ．Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｋ．Ｋｏｄａｍａ，Ｙ．Ａｒａｍａｋｉ，Ｒ．Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｒ．Ｗ．Ｍ．Ｖａｎ  Ｓｏｅｓｔ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．４２，６３４９（２００１）；Ｂ．Ｌｉｕ，Ｚ．Ｗｅｉｓｈａｎ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．４３，４１８７（２００２）。しかしながら、ステロール４ａ及び５ａにあるような、ステロイド核が崩壊した誘導体は、ヒトにおいて報告されていない。
【０３０６】
細胞毒性アッセイ
ＷＩ−Ｌ２ヒトＢリンパ球系、ＨＡＡＥ−１ヒト腹部大動脈内皮系、ＭＨ−Ｓネズミ肺胞マクロファージ系、及びＪ７７４Ａ．１ネズミ組織マクロファージ系をＡＴＣＣから得た。ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）及びヒト血管平滑筋細胞（ＶＳＭＳ）をＣａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅから得た。Ｊｕｒｋａｔ  Ｅ６−１Ｔリンパ球は、Ｊ．Ｋａｙｅ博士（Ｔｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）からいただいた。１０％ウシ胎仔血清含有ＡＴＣＣ推奨培地中で、細胞を培養した。３７℃、５又は７％ＣＯ２の制御された大気中で細胞を温置した。乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）放出アッセイに関し、０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡの添加によって又は掻爬することによって、接着細胞を回収した。得られた細胞を９６ウェルのマイクロタイタープレート（２５，０００個の細胞／ウェル）へ播種し、２４ないし４８時間で回収した。細胞を優しく洗浄し、培地を、５％ウシ胎仔血清を含有する新鮮培地と交換した。細胞試料の二つ組又はより多くの数を３、４ａ又は５ａの何れか（０ないし１００μＭ）で１８時間処理した。次に、培養中の細胞からの乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を測定することによって、細胞毒性を測定した。簡潔には、ケトアルデヒド４ａ、アルドール５ａ、又はコレステロール３の何れかによる処理時間の終了時に、９６ウェルプレート中で培養した細胞のＣｙｔｏＴｏｘ  ９６  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を使用して、細胞上清中でＬＤＨ活性を測定した。
【０３０７】
脂質負荷アッセイ（泡沫細胞形成）
８ウェルチャンバースライド中で、３７℃での５又は７％ＣＯ２の制御された大気下で、１０％ウシ胎仔血清を含有するＡＴＣＣ推奨培地中で、Ｊ７７４．１マクロファージを温置した。次に、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノールトルエン（１００μＭ）、ジエチレントリアミン五酢酸（１００μＭ）並びにＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）、ＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）及びアテローナル（ａｔｈｅｒｏｎａｌ）−Ａ  ４ａ（２０μＭ）又はＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）及びアテローナル−Ｂ５ａ（２０μＭ）の何れかを含有する同一培地中で、細胞を７２時間温置した。終了時に、細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄した。次に、ＰＢＳ中の６％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒドで細胞を３０分間固定し、プロピレングリコールで２分間すすぎ、５ｍｇ／ｍＬのオイルレッドＯで脂質を８分間染色した。ハリスのヘマトキシリンで細胞を４５秒間対比染色し、６％パラホルムアルデヒドで背景染色を除去した後、ＰＢＳ中で１回、水道水で１回洗浄した。グリセロールを使用して、ガラススライド上にカバースリップをマウントし、スライドプレパラートを光学顕微鏡によって検討した。脂質を有する細胞の数は、各スライド中の単一視野において計数される少なくとも合計１００個の細胞から記録し、総細胞数の百分率として表した。１００倍の倍率で写真を撮影した。
【０３０８】
円二色性
ＰＢＳ（ｐＨ７．４、１％イソプロパノール含有）中のＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）、ＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）及び４ａ（１０μＭ）、並びにＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）及び５ａ（１０μＭ）の円二色性（ＣＤ）スペクトルを、サーモスタットで制御した（±０．１℃）０．１ｃｍのクォーツキュベット中で、Ａｖｉｖスペクトル旋光計を用いて３７℃で記録した。ペプチド性の範囲（２００ないし２６０ｎｍ）で、スペクトルを記録した。シグナル対ノイズ比を増大させるため、各測定に関して、複数のスペクトル（３個）を平均化した。Ｄｅｌｌ  ＰＣの（Ｃｏｌｏｒａｄｏ  Ｓｔａｔｅ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＮａｒａｓｉｍｈａ  Ｓｒｅｅｒａｍａによる）ソフトウェアのＣＤＰｒｏ一式を使用して、各測定に関するモル楕円率スペクトルの逆重畳積分を実施した。
【実施例２】
【０３０９】
アテローム硬化性プラークは、オゾン及びコレステロールオゾン分解産物を発生させる
上述の方法を使用して、本実施例は、１５名のヒト患者（ｎ＝１５）からの頸動脈内膜切除法によって得られたアテローム硬化性組織が、インジゴカルミン１との反応によって検出可能なオゾンを発生できることを示す。
【０３１０】
アテローム硬化性プラークによって産生されるオゾンによるインジゴカルミンの退色
本発明者は、抗体によりコーティングされた白色細胞が、インジゴカルミン１（オゾンのための化学的捕捉）の溶液中のタンパク質キナーゼＣ活性化因子である酢酸ミリスチン酸４−β−ホルボール（ＰＭＡ）で処理されると、インジゴカルミン１の可視光吸光が退色し、インジゴカルミン１が、イサチンスルホン酸２へ転化されたことをすでに示している。例えば、Ｐ．Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ  Ｊｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８，２１９５（２００２）、Ｂ．Ｍ．Ｂａｂｉｏｒ，Ｃ．Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｊ．Ｒｕｅｄｉ，Ａ．Ｇｕｉｔｉｅｒｒｅｚ，Ｐ．Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ  Ｊｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，３９２０（２００３）、Ｐ．Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ  Ｊｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，１４９０（２００３）を参照されたい。イサチンスルホン酸２の構造を図１Ａに提供する。これらの実験が、Ｈ２１８Ｏ（９５％超の１８Ｏ）中で実施された場合、イサチンスルホン酸２のラクタムカルボニル中への同位体の組み込みが観察された。同文献。炎症と関連すると思われる酸化体のうち、オゾンのみが、インジゴカルミン１の二重結合を酸化的に開裂させ、イサチンスルホン酸２のラクタムカルボニルへ（Ｈ２１８Ｏ中から）同位体を組み込むので、この手法は、オゾン及び１Ｏ２＊をインジゴカルミン１も酸化し得る他の酸化体と区別した（同文献及び図１Ａ参照）。
【０３１１】
実施例１に記載されているとおり、問題のアテローム性動脈硬化症を有すると考えられる１５名のヒト患者からの頸動脈内膜切除法によって、プラーク材料を得た。各プラークを２つの等しい部分へと分離した（ＰＢＳ１ｍＬ中に懸濁された約５０ｍｇ湿重量）。プラーク材料の各部分を、リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、１０ｍＭリン酸緩衝液、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）（１ｍＬ）中のインジゴカルミン１（２００μＭ）及びウシカタラーゼ（５０μｇ／ｍＬ）の溶液へ添加した。ＤＭＳＯ（１０μＬ）又はＤＭＳＯ中のミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ、１０μＬ、２０μｇ／ｍＬ）を、懸濁したプラーク材料のある一定分量又はその他の一定分量へ添加することによって、分析を開始した。
【０３１２】
ＰＭＡを添加すると、１５個のプラーク試料のうちの１４個で、１の可視光吸光の退色を観察した（図１Ｂ）。この退色に付随して、逆相ＨＰＬＣ分析によって測定されるイサチンスルホン酸２が形成された（図１Ａ及びＣ）。形成されるイサチンスルホン酸２の量は、検査されるプラーク単離物に応じて、１．０ｎｍｏｌ／ｍｇから２６２．１ｎｍｏｌ／ｍｇまで変動した。異なる単離物によって発生したイサチンスルホン酸２の平均量は、７２．６２±２１．６９ｎｍｏｌ／ｍｇであった。
【０３１３】
懸濁したプラーク材料のＰＭＡ活性化が、インジゴカルミン１（２００μＭ）を有するＨ２１８Ｏ含有ＰＢＳ（９５％超の１８Ｏ）（ｎ＝２）中で実施された場合、単離された開裂した生成物であるイサチンスルホン酸２の質量スペクトルにおける［Ｍ−Ｈ］−２２８及び２３０質量断片ピークの相対的な強度によって示されるように、インジゴカルミン１のラクタムカルボニル酸素の約４０％が、１８Ｏを取り込んだ（図１Ｄ）。
【０３１４】
インジゴカルミン１を使用するこれらの研究は、活性化されたアテローム硬化性プラーク材料によって、オゾンが産生されたことを示す。
【０３１５】
コレステロールのオゾン分解産物
アテローム硬化性プラーク中に存在する主な脂質の１つは、コレステロール３である。Ｄ．Ｍ．Ｓｍａｌｌ，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ８，１０３（１９８８）。化学的モデル研究において、研究者は、３Ｏ２、１Ｏ２＊、・Ｏ２−、Ｏ２２−、ヒドロキシルラジカル、Ｏ３及び・Ｏ２＋及びオゾンＯ３のうち、オゾンのみが、コレステロール３のデルタ５，６二重結合を開裂させ、５，６−セコステロール４ａを生じることを示している（図２Ａ）。この観察は、同じく５，６−セコステロール４ａがコレステロール３オゾン分解の主要産物であることを示す他の化学的報告と一致している。Ｇｕｍｕｌｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５，１９７２（１９８３）、Ｊａｗｏｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ  ５３，５４５（１９８８）、Ｐａｒｙｚｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１，１２２２（１９９０）、Ｃｏｒｎｆｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．５４，５９０（１９５３）。
【０３１６】
従って、５，６−セコステロール４ａ又はコレステロールの他のオゾン分解産物が、アテローム硬化性プラーク中に存在するかどうかを検出及び同定することを目標として、更なる実験を実施した。従って、１４名の患者のヒトアテローム硬化性プラーク（ｎ＝１４）が、ＰＭＡによる活性化の前後の両者で、５，６−セコステロール４ａの存在について検査された。
【０３１７】
Ｐｒｙｏｒ及び共同研究者によって開発された分析手法の改変をこれらの研究に使用した。Ｋ．Ｗａｎｇ，Ｅ．Ｂｅｒｍｕｄｅｚ，Ｗ．Ａ．Ｐｒｙｏｒ，Ｓｔｅｒｏｉｄｓ  ５８，２２５（１９９３）を参照されたい。この改変されたプロセスは、有機溶媒（塩化メチレン、３×５ｍＬ）を有するＰＢＳ（１ｍＬ、ｐＨ７）中のホモジナイズされたプラーク材料（約５０ｍｇ湿重量）の懸濁液を抽出した後、塩酸２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ  ＨＣｌ）のエタノール溶液（ｐＨ６．５の、エタノール中の２ｍＭ）によって有機画分を室温で２時間処理することを包含した。ＨＰＬＣ（直接注入、３６０ｎｍでの紫外線検出）及び、オゾン分解産物４ａの２，４−ジニトロフェニルヒドラゾン誘導体である４ｂの存在に関するインライン陰イオンエレクトロスプレー質量分析によって、この反応混合物を分析した（図３）。１４個の不活性型プラーク抽出物の１１個（プラークの６．８ｐｍｏｌ／ｍｇと６１．３ｐｍｏｌ／ｍｇとの間）で、及び全ての活性型プラーク抽出物中（１．４ｐｍｏｌ／ｍｇと２００．６ｐｍｏｌ／ｍｇとの間）でヒドラゾン４ｂを検出した。更に、４ｂの平均量によって判断される、プラーク材料中の４ａの量は、ＰＭＡによる活性化に応じて有意に増加した。特に、ＰＭＡが使用されない場合、４ｂの平均量は、１８．７±５．７ｐｍｏｌ／ｍｇであった。これに対して、ＰＭＡが添加される場合、４ｂの平均量は、４２．５±１３．６ｐｍｏｌ／ｍｇであった（ｎ＝１４、ｐ＜０．０５）（図３ＡないしＢ）。
【０３１８】
プラーク抽出物のＨＰＬＣ分析中に、４ｂに加え、他の２つのヒドラゾン主要ピークを観察した。第一のピークは、ＲＴ約２０．５分及び［Ｍ−Ｈ］−＝５９７を有し、第二は、ＲＴ約１８．０分及び［Ｍ−Ｈ］−５７９を有した（図３Ａ，Ｂ）。ヒドラゾン４ｂは、約１３．８分の保持時間を有した（ＲＴ約１３．８分、［Ｍ−Ｈ］−５９７）ので、これらのピークとは容易に識別可能であった（図３Ａ，Ｂ）。標品との比較によって、ＲＴ約２０．８分でのピークは、アルドール濃縮産物５ａのヒドラゾン誘導体５ｂであると測定された（図２及び３Ｅ）。化学的モデル研究において、Ｐｒｙｏｒはすでに、４ａのヒドラジン誘導体化の主要副産物が、アルドール濃縮産物５ａのヒドラゾン誘導体５ｂであり、その相対量が、酸濃度及び反応時間の両者の関数であることを記載していた。Ｋ．Ｗａｎｇ，Ｅ．Ｂｅｒｍｕｄｅｚ，Ｗ．Ａ．Ｐｒｙｏｒ，Ｓｔｅｒｏｉｄｓ  ５８，２２５（１９９３）。
【０３１９】
使用した誘導体化条件下での４ａの５ｂへの転化の程度は、検査された４ａの濃度の範囲（５ないし１００μＭ）にわたって、約２０％であった。しかしながら、しばしば、２０％超の転化が観察された。同一プラーク試料中に存在する４ａの２０％を超過する５ａの測定された量が、３のオゾン分解後のアルドール化から生じたようである。
【０３２０】
アミノ基又はカルボン酸基を含有する多くの生化学的成分は、アルドール化反応を触媒し得る。このような構成要素は、プラーク及び血液中に存在し、４ａの５ａへの転化を促進し得る。更なる実験は、次のアミノ酸及び材料、すなわちＬ−Ｐｒｏ（２時間、完全な転化）、Ｇｌｙ（２４時間、完全な転化）、Ｌ−Ｌｙｓ・ＨＣｌ（２４時間、完全な転化）、Ｌ−Ｌｙｓ（ＯＥｔ）・２ＨＣｌ（１００時間、６２％転化）並びに、アテローム性動脈（２２時間、完全な転化）、全血（１５時間、完全な転化）、血漿（１５時間、完全な転化）及び血清（１５時間、完全な転化）由来の抽出物が、４ａの５ａへの転化を促進することを示した。このような因子は全て、背景反応の速度に比べて、４ａから５ａへの転化を加速した。
【０３２１】
上述のように、プラーク内のケトアルデヒド４ａの量は、ＰＭＡ活性化に応じて増加した。しかしながら、５ａの形成に及ぼすＰＭＡの効果は、あまり明確ではなかった。幾つかの場合、５ａのレベルは、ＰＭＡの活性化後に増大した（図５Ｂ、患者Ｆ及びＨ）のに対し、他の場合においては、５ａのレベルは、ＰＭＡの活性化後に低下した（図５Ｂ、患者Ｃ、Ｇ及びＮ）。
【０３２２】
２，４−ジニトロフェニルヒドラゾン誘導体が、質量スペクトルにおいて５７９の［Ｍ−Ｈ］−ピークを有する、多くのカルボニル含有ステロイド誘導体６ａないし９ａを合成及び分析し、１８分での［Ｍ−Ｈ］−５７９のピークの同定を補助した（図３Ａ，Ｂ）。標品のＨＰＬＣ同時注入、ネガティブエレクトロスプレー質量分析及び紫外線スペクトルの比較によって、約１８分のピークが、６ｂ、６ａのヒドラゾン誘導体、及び４ａのＡ環脱水産物であると決定された（図３Ｄ）。誘導体化のために選択された標準的な条件下で、４ａから６ｂへ転化される程度を研究した。この転化の程度は、検査された４ａ濃度の範囲（５ないし１００μＭ）にわたって、一貫して２％未満であることが明らかとなった。これらのデータは、抽出物内のケトアルデヒド４ａの量の２％を超過する、プラーク抽出物内に存在する６ａの量が、誘導体化前に存在し、水のβ脱離によってオゾン分解産物４ａから生じたことを示す。
【０３２３】
３つの主要なヒドラゾン産物４ｂないし６ｂに加え、別の産物７ｂが検出され、７ａのヒドラゾン誘導体及び５ａのＡ環脱水産物であると決定された。この生成物（７ｂ）は、幾つものプラーク抽出物中に痕跡量（５ｐｍｏｌ／ｍｇ未満）で存在し、約２６分の保持時間を有した（［Ｍ−Ｈ］−５７９、図４）。しかしながら、プラーク抽出物中の７ｂの量は、採用されるＨＰＬＣアッセイの検出限界に接近しており、プラーク試料全てにおける本化合物の存在又は不存在に関する完全な研究がいまだに実施されていない。
【０３２４】
活性型プラーク材料が、オゾンの化学的サインを有するインジゴカルミン１の二重結合を酸化的に開裂させ、公知の化学反応によると、オゾン特有の経路によってコレステロールのデルタ５，６−二重結合が開裂するという実験的な証拠は、アテローム硬化性プラークがオゾンを発生できるという説得力のある証拠を与える。更に、これらの特有のコレステロールのオゾン酸化産物は、プラーク活性化前にも存在するので、アテローム硬化性プラークの発達の間にも発生するようである。
【０３２５】
外因的に投与されるオゾンが、インターロイキン（ＩＬ）−１α、ＩＬ−８、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ、血小板凝集因子（ＰＡＦ）、増殖関連癌遺伝子（Ｇｒｏ）−α、核因子（ＮＦ）−κＢ及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αの活性化を介して、生体内で炎症誘発性であることは、十分確定されている。炎症におけるこれらのオゾンの一般的に公知の効果に加え、この部位で産生された場合に、疾病の惹起及び永続化のための、内因的に発生するオゾンの病理学的役割を増大させ得るアテローム硬化性プラークに特有の環境が存在する。生成された全てのオゾンを補足し得る他の反応性物質の不在下でオゾン及びコレステロールの必要な高濃度が生じたのは、この部位のみなので、コレステロールのオゾン分解は、プラーク特有であり得る。
【０３２６】
アテローム硬化性動脈が、活性化されたマクロファージ及びミエロペルオキシダーゼの形態で、抗体及び１Ｏ２＊の発生系をともに含有する限り、アテローム硬化性病変は、抗体によって触媒される水の酸化経路を介してＯ３を生成できるようである。実際、３のデルタ５，６二重結合が開裂して４ａを付与するという知見は、炎症における抗体触媒によるオゾンの産生に関する更なる証拠である。多くのオキシステロールは、生体内のコレステロールの酸化によって産生されることが公知であり、コレスタン側鎖においてのみ構造が異なる５ａの類縁体は、細胞毒性天然産物に対する一般的なスクリーニングの一環として海綿ステレッタ・ヒワサエンシスから単離されている。Ｔ．Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｋ．Ｋｏｄａｍａ，Ｙ．Ａｒａｍａｋｉ，Ｒ．Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｒ．Ｗ．Ｍ．Ｖａｎ  Ｓｏｅｓｔ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．４２，６３４９（２００１）；Ｂ．Ｌｉｕ，Ｚ．Ｗｅｉｓｈａｎ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．４３，４１８７（２００２）。しかしながら、ステロール４ａないし６ａにおけるように、ステロイド核が崩壊した誘導体は、本発明者らが知る限り、これまでヒトにおいて一度も報告されていない。従って、このようなステロイド及びそれらの誘導体に関する探索を推進し、前記ステロイド及び誘導体の生物学的機能を研究することは重要である。
【実施例３】
【０３２７】
コレステロールオゾン分解産物は、アテローム硬化性患者の血流中に存在する
本発明者は、オゾンが、抗体触媒性の水の酸化経路中で発生し、強力な酸化剤としてのオゾンが炎症における役割を果たし得ることをすでに示している。Ｐ．Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ  Ｊｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８，２１９５（２００２）、Ｂ．Ｍ．Ｂａｂｉｏｒ，Ｃ．Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｊ．Ｒｕｅｄｉ，Ａ．Ｇｕｉｔｉｅｒｒｅｚ，Ｐ．Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ  Ｊｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，３９２０（２００３）、Ｐ．Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ  Ｊｒ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，１４９０（２００３）。
【０３２８】
炎症は、アテローム硬化性の病変形成における一因子であると思われる。Ｒ．Ｒｏｓｓ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４０，１１５（１９９９）、Ｇ．Ｋ．Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｐ．Ｌｉｂｂｙ，Ｕ．Ｓｃｈｏｎｂｅｃｋ，Ｚ．−Ｑ．Ｙａｎ，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９１，２８１（２００２）。しかしながら、本発明より前に、炎症性動脈疾患を他の炎症性過程と区別することができる具体的な非侵襲性方法は利用可能でなかった。アテローム硬化性プラーク特有の組成、及びアテローム硬化性プラーク材料によって血流中へ放出される産物は、このような方法を提供し得る。特に、アテローム硬化性病変は、コレステロールの高濃度を含有する。本明細書で示されているように、オゾンは、アテローム硬化性病変によって生じ、４ａ及び／又はそのアルドール化産物５ａ等のコレステロールオゾン分解産物も、アテローム硬化性病変によって生じる。従って、このようなコレステロールオゾン分解産物が、アテローム硬化性等の炎症性動脈疾患のためのマーカーであり得るかどうかを解明するために、更なる実験を実施した。
【０３２９】
患者の２つのコホートからの血漿試料を、４ａ又は５ａの何れかの存在に関して分析した。コホートＡは、動脈内膜切除術を必要とする程度まで十分に進行したアテローム硬化性疾病状態を有する患者（ｎ＝８）を含んだ。コホートＢ患者は、一般的な医療診療所で受診した無作為に選択した患者であった。コホートＡの８名の患者のうち６名で、７０ないし１６９０ｎＭの範囲の量で、アルドール５ａを検出した（約１ないし１０ｎＭが、本アッセイの検出限界である。）（図５ＡないしＣ）。コホートＢからの１５個の血漿試料のうちたった１つにおいて、５ａが検出可能であった。ケトアルデヒド４ａは、全患者の血液試料において検出されなかった（約１ないし１０ｎＭが、本アッセイの検出限界である。）。これらのデータは、何れかの４ａが、血中に含有される触媒によって５ａへと転化されるか、又は血漿内の成分が４ａ及び５ａに対する異なる親和性を有することを示す。
【０３３０】
過去に、「オキシステロール」の血清分析が、コレステロールの自動酸化の問題による困難さをはらんでいた。Ｈ．Ｈｉｅｔｔｅｒ，Ｐ．Ｂｉｓｃｈｏｆｆ，Ｊ．Ｐ．Ｂｅｃｋ，Ｇ．Ｏｕｒｉｓｓｏｎ，Ｂ．Ｌｕｕ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．９，７５（１９８６）。しかしながら、本明細書に記載されているように、コレステロール３の生物学的に関連する酸化によって生じるコレステロールの酸化産物の全てのうち、ステロイド誘導体４ａ及び５ａは、オゾン特有である。これらの研究は、ＤＮＰヒドラゾン誘導体５ｂとして検出される血漿中のアルドール化産物５ａの存在が、アテローム性動脈硬化症における進行した動脈炎症のためのマーカーであり得ることを示す。従って、オゾンの抗体触媒性産生は、コレステロールの蓄積、炎症、酸化及び細胞損傷という、本来一見して独立した因子を、アテローム硬化性に至る病理学的カスケードへ連結し得る。
【０３３１】
幾つかの研究は、コレステロール酸化産物が、細胞毒性、アテローム生成及び変異原性等の生物学的活性を有することを示す。Ｈ．Ｈｉｅｔｔｅｒ，Ｐ．Ｂｉｓｃｈｏｆｆ，Ｊ．Ｐ．Ｂｅｃｋ，Ｇ．Ｏｕｒｉｓｓｏｎ，Ｂ．Ｌｕｕ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．９，７５（１９８６）、Ｊ．Ｌ．Ｌｏｒｅｎｓｏ，Ｍ．Ａｌｌｏｒｉｏ，Ｆ．Ｂｅｒｎｉｎｉ，Ａ．Ｃｏｒｓｉｎｉ，Ｒ．Ｆｕｍａｇａｌｌｉ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１８，７７（１９８７）、Ａ．Ｓｅｖａｎｉａｎ，Ａ．Ｒ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１，４１９８（１９８４）。コレステロール酸化産物４ａ及び５ａは、これまでヒトにおいて生じると一度も考えられてこなかったので、アテローム生成の重要な態様に及ぼすこれらの化合物を、以下に記載されているとおり更に研究した。
【実施例４】
【０３３２】
コレステロールオゾン分解産物の細胞毒性
幾つかのコレステロール酸化産物は、細胞毒性、アテローム生成及び変異原性等の生物学的活性を有する。本実施例において、多様な細胞系に対する４ａ及び５ａの細胞毒性効果を分析した。
【０３３３】
次の細胞系、すなわちＬｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  ２２，５１７（１９６８）に記載されているヒトＢリンパ球（ＷＩ−Ｌ２）、Ｗｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３，１２３（１９８４）に記載されているＴリンパ球細胞系（Ｊｕｒｋａｔ  Ｅ６．１）、Ｆｏｌｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７６，５２１７（１９７９）に記載されている腹部大動脈内皮（ＨＡＥＣ）細胞系、Ｒａｌｐｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４３，１５２８（１９７６）に記載されているネズミ組織マクロファージ（Ｊ７７４Ａ．１）及びＭｂａｗｕｉｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．４６，１１９（１９８９）に記載されている肺胞マクロファージ細胞系（ＭＨ−Ｓ）を本研究に使用した。
【０３３４】
化学的に合成された４ａ及び５ａは、アテローム硬化性プラーク内に存在することが知られているある範囲の細胞種類、すなわち白血球、血管平滑筋細胞及び内皮細胞に対して細胞毒性がある。結果を図６及び表３に示す。
【０３３５】
【表３】
2009504184.tif 000031
【０３３６】
４ａ及び５ａのＩＣ５０値は、検査された全ての細胞系に対して非常に類似している。更に、検査された細胞系に対する化合物４ａ及び５ａの細胞毒性特性は、非常に類似していた。これらの結果は、４ａと５ａとの間の構造上の著しい差を考慮すると驚くべきことであった。しかしながら、４ａ及び５ａは、上述のアミノ酸等の細胞成分によって促進される工程において互いに平衡化し、４ａ及び５ａは、細胞毒性アッセイの時間枠の間、互いに平衡に達し得る。従って、化合物４ａ及び５ａは、生体内で同様の細胞毒性を有し得る。
【０３３７】
同様の手法を使用して、化合物６ａ、７ａ、７ｃ、１０ａ、１１ａ及び１２ａは、本発明者によって、白血球細胞系に対して細胞毒性であることが示されており、セコ−ケトアルデヒド４ａ及びそのアルドール付加物５ａは、ニューロン細胞系に対して細胞毒性があることが示されている。
【０３３８】
オゾンとコレステロールとの並置は、細胞毒性ステロイド４ａないし６ａをもたらすことが可能であり、生体内原位置で産生される前記細胞毒性ステロイドは、内皮細胞若しくは平滑筋細胞の損傷を促進することによって、又は上述のアテローム内で炎症性細胞のアポトーシスを惹起することによって、病変の進行においてある役割を十分担い得る。アテローム硬化性プラークの上述の結晶相内でのコレステロールのオゾン分解は、動脈閉塞の前の最終段階であると思われるプラークの不安定化に関与し得る。
【実施例５】
【０３３９】
コレステロールオゾン分解産物は、泡沫細胞の形成を促進し、ＬＤＬ及びアポタンパク質Ｂ１００の構造を変化させる
低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）のアテローム生成を亢進する前記ＬＤＬの修飾は、心血管疾患の発達における極めて重要な事象と考えられる。Ｄ．Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，２０９６３（１９９７）。例えば、ＬＤＬ又は、ＣＤ３６及び他のマクロファージスカベンジャー受容体を介してマクロファージへＬＤＬが取り込まれるのを亢進するアポタンパク質Ｂ１００（アポＢ−１００、ＬＤＬのタンパク質成分）に対する酸化的修飾は、アテローム性動脈硬化症の発病の原因となる重大な病理学的事象と考えられる。本実施例は、コレステロールオゾン分解産物４ａ及び５ａが、マクロファージからの泡沫細胞の形成を促進でき、ＬＤＬ及びアポＢ−１００の構造を修飾できることを示す実験について記載する。
【０３４０】
実施例１に記載されているとおり、不活性型ネズミマクロファージ（Ｊ７７４．１）の存在下で、ＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）を４ａ又は５ａとともに温置した。４ａ又は５ａへの曝露の後、マクロファージは、脂質負荷を開始し、泡沫細胞は、反応槽中に現れ始めた（図７）。
【０３４１】
更に、ヒトＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）の４ａ及び５ａ（１０μＭ）との温置によって、円二色性によって検出されるようなアポＢ−１００の構造が時間依存的に変化した（図８Ｂ、Ｃ）。４ａ及び５ａなしでの総ＬＤＬの円二色性分析によって、ＬＤＬ二次構造が、実験時間（４８時間）中、一般的に安定であることが明らかとなった（図８Ａ）。図８Ａに示されるように、正常ＬＤＬのタンパク質含有量は、αヘリックス構造（約４０±２％）の大きな割合及びβ構造（約１３±３％）、βターン（約２０±３％）及びランダムコイル（２７±２％）のより少量を有する。しかしながら、４ａ及び５ａとともに温置したＬＤＬのスペクトル形状は、未変性のＬＤＬと若干同様の状態を保つ（図８Ｂ及びＣ）のに対し、二次構造の著しい喪失が存在し、これは主としてαヘリックス構造の喪失（４ａが約２３±５％、５ａが約２０±２％）、及び相当するランダムコイルのより高い百分率（４ａが約３９±２％、５ａが３２±４％）である。従って、４ａ及び５ａのコレステロールオゾン分解産物は、ＬＤＬの構造統合性を弱体化させるように見える。
【０３４２】
ＬＤＬの構造を修飾するために、共有結合性反応が、４ａ及び５ａコレステロールオゾン分解産物のアルデヒド部分とアポＢ−１００リジン残基のεアミノ側鎖基との間で生じ得、アポＢ−１００を用いた、マロンジアルデヒドと４−ヒドロキシノネナルとの間の反応においてすでに観察された化合物と同様の、シッフ塩基中間体又はエナミン中間体を形成し得る。Ｓｔｅｉｎｂｒｅｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１，３８８３（１９８４）、Ｓｔｅｉｎｂｒｅｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  １，１３５（１９８７）、Ｆｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ．Ｒｅｓ．２８，１４６６（１９８７）。このようなシッフ塩基中間体又はエナミン中間体は、著しい寿命を有し得、マクロファージスカベンジャー受容体によって認識される形態へとＬＤＬを誘導体化させ得る。従って、４ａ及び５ａコレステロールオゾン分解産物とアポＢ−１００−ＬＤＬの間の共有結合性反応は、マクロファージスカベンジャー受容体によって認識され、より高い速度で取り込まれる誘導体化されたアポＢ−１００−ＬＤＬ複合体を発生し得、これにより図７に見られる泡沫細胞を産生し得る。
【０３４３】
アルデヒド成分を含有するコレステロールの唯一の公知の酸化型は、４ａ及び５ａオゾン分解産物である。従って、このようなコレステロール誘導体とＬＤＬ／アポＢ−１００との反応は、コレステロールと泡沫細胞形成と動脈プラーク形成の間のこれまで見過ごされてきた関連性を提供し得る。従って、患者の血流中での４ａ及び５ａオゾン分解産物の高レベルの検出は、患者がアテローム性動脈硬化症を罹患している程度に関する直接的な測定結果を提供し得る。
【実施例６】
【０３４４】
コレステロールオゾン化産物に対する抗体
本実施例は、コレステロールのオゾン処理及びヒドラゾン産物と反応し得る式１３ａ、１４ａ又は１５ａを有するハプテンに対して産生する抗体について記載する。式１３ａ、１４ａ及び１５ａを有するハプテンの構造を以下に示す。
【０３４５】
【化１７】
2009504184.tif 000032
【０３４６】
化合物１３ａは、４−［４−ホルミル−５−（４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−シクロヘキシル）−７ａ−メチル−オクタヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル］ペンタン酸である。
【０３４７】
【化１８】
2009504184.tif 000033
【０３４８】
方法
化合物１３ａ、１４ａ及び１５ａのＫＬＨコンジュゲートを調製した。標準的な手法によってこれらのＫＬＨコンジュゲートでマウスを免疫化した。前記マウスから脾臓を摘出及び分散し、抗体産生可能細胞として脾臓細胞を得た。
【０３４９】
３７℃へ予め加温しておいた無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ７．２）中で、脾臓細胞及び、マウスミエローマ由来のＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８１であるＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞を同時懸濁し、それぞれ３×１０４個／ｍＬ及び１×１０４個／ｍＬの細胞密度を付与した。懸濁液を遠心分離して、沈殿物を回収した。前記沈殿物へ、５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（ｐＨ７．２）を含有する無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地１ｍＬを１分かけて滴下した後、得られた混合物を３７℃で１分間温置した。前記混合物へ無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ７．２）を更に滴下し、５０ｍＬの最終容積を付与し、沈殿物を遠心分離により回収した。ＨＡＴ培地中で沈殿物を懸濁し、９６ウェルのマイクロプレートの１つのウェルに関し、各２００μＬの一定分量へと分割した。マイクロプレートを３７℃で１週間温置した結果、ハイブリドーマ約１，２００種を形成した。コレステロールオゾン化産物への結合に関するイムノアッセイによって、前記ハイブリドーマからの上清を分析した。
【０３５０】
式１５ａを有する化合物に対して生じるハイブリドーマＫＡ１−１１Ｃ５及びＫＡ１−７Ａ６は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．，２０１１０−２２０９  ＵＳＡ（ＡＴＣＣ））において、ＡＴＣＣ受託番号ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５４２７及びＰＴＡ５４２８として、２００３年８月２９日に、ブダペスト条約の規定に基づいて寄託された。式１４ａを有する化合物に対して生じるハイブリドーマＫＡ２−８Ｆ６及びＫＡ２−１Ｅ９は、ＡＴＣＣ受託番号ＡＴＣＣ  ＰＴＣ−５４２９及びＰＴＡ−５４３０として、これも２００３年８月２９日にブダペスト条約の規定に基づいて寄託された。
【０３５１】
ハプテン１５ａのＫＬＨコンジュゲートに対して産生されたモノクローナル抗体調製物ＫＡ１−７Ａ６：６及びＫＡ１−１１Ｃ５：６、並びにハプテン１４ａのＫＬＨコンジュゲートに対して産生されたＫＡ２−８Ｆ６及びＫＡ２−１Ｅ９のプールが生成された。オゾン化産物５ａ及びコレステロールハプテン３ｃに対する、１５ａに対して惹起されたＫＡ１−７Ａ６：６及びＫＡ１−１１Ｃ５：６モノクローナル抗体の結合力価を、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。１３ｂ、１４ｂ及びコレステロールハプテン３ｃに対する、（オゾン化産物５ａに対して惹起された）ＫＡ２−８Ｆ６：４及びＫＡ２−１Ｅ９：４抗体の結合力価を測定するためのＥＬＩＳＡアッセイも実施した。
【０３５２】
コレステロールハプテン３ｃの構造を以下に記載する。
【０３５３】
【化１９】
2009504184.tif 000034
【０３５４】
ＥＬＩＳＡアッセイを次のとおり実施した。１３ａ、１４ａ、３ｃ、１３ｂ、１４ｂ又は１５ａのＢＳＡコンジュゲートを高結合９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．）へ個別に添加し、４℃で一晩静置させた。前記プレートをＰＢＳで徹底的に洗浄し、ミルク溶液（ＰＢＳ中の１％（ｗ／ｖ）、１００μＬ）を添加した。プレートを、室温で２時間静置させた後、ＰＢＳで洗浄した。異なる抗体調製物を含有する培養物を、ＰＢＳで連続希釈し、各希釈５０μＬを各行の第一のウェルへ個別に添加した。混合及び希釈の後、プレートを４℃で一晩静置させた。プレートをＰＢＳで洗浄し、ヤギ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（０．０１μｇ、５０μＬ）を添加した。プレートを３７℃で２時間温置した。プレートを洗浄し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン［酢酸ナトリウム（０．１Ｍ、ｐＨ６．０）及び過酸化水素（０．０１％（ｗ／ｖ））の１０ｍＬ中の０．１ｍｇ］の基質溶液（５０μＬ）を添加した。前記プレートを暗所で３０分間発色させた。硫酸（１．０Ｍ、５０μＬ）を添加して、反応を停止させ、４５０ｎｍで光学密度を測定した。
【０３５５】
報告した力価は、最大光学密度の５０％に相当する血清希釈である。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ．３．０を使用してデータを分析し、少なくとも二つ組の測定結果の平均値として報告した。
【０３５６】
結果
ＥＬＩＳＡ検査の結果を表４及び５に示す。
【０３５７】
【表４】
2009504184.tif 000035
【０３５８】
表４によって示されるように、上述のように測定される見かけの結合親和性はほぼ同一である。
【０３５９】
【表５】
2009504184.tif 000036
＊１５ｂ、１４ｂ及びコレステロールハプテン３ｃのＢＳＡコンジュゲートに対するＥＬＩＳＡによって、力価を測定した。絶対値は、１３ｂ、１５ｂ及びコレステロールハプテン３ｃのＢＳＡコンジュゲートへ結合したときの最大吸光の５０％に相当する抗体の組織培養上清溶液の希釈因子である。
【０３６０】
これらの結果は、コレステロールオゾン化産物に対して、高親和性抗体調製物が生じ得ることを示す。
【実施例７】
【０３６１】
コレステロールオゾン化産物を検出するための更なる方法
本実施例は、コレステロールオゾン化産物が、これらのオゾン化産物中の遊離アルデヒド基の蛍光部分への抱合によること、及びこれらのオゾン化産物と反応する抗体の使用によることを含む、多様な手法によって検出できることを説明する。
【０３６２】
材料及び方法
一般的な方法
別段の記載がない限り、乾燥試薬、溶媒、及び炎光乾燥したガラス器具を使用して、全ての反応を実施した。別段の記載がない限り、出発材料をＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから購入し、受領した状態で使用した。コレステロール−［２６,２６，２６，２７，２７，２７−Ｄ６］は、ＭＥＤＩＣＡＬ  ＩＳＯＴＯＰＥＳ，ＩＮＣから購入した。シリカゲル６０（２３０ないし４００メッシュ）を使用して、フラッシュカラムクロマトグラフィーを実施した。コレステロールオゾン化産物４ａ及び５ａ並びにオゾン化産物４ａ及び５ａの２，４−ジニトロフェニルヒドラゾン（それぞれ４ｂ及び５ｂ）を、先行実施例に記載されているとおり合成した。Ｍｅｒｃｋ（０．２５ｍｍ）コーティングしたシリカゲルＫｉｅｓｅｌｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４プレートを使用して、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を実施し、パラアニスアルデヒド染色で可視化した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ  ＡＭＸ−６００（６００ＭＨｚ）分光計で記録した。１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ  ＡＭＸ−６００（１５０ＭＨｚ）分光計で記録した。化学シフトは、外部標準からδ尺度上で、百万分率（ｐｐｍ）で報告する。
【０３６３】
３β−ヒドロキシ−５−オキソ−５，−6−セココレスタン−６−アルのダンシルヒドラゾン（４ｄ）
ダンシルヒドラジン（５０ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）及びｐ−トルエンスルホン酸（１ｍｇ、０．００５２ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル（８ｍＬ）中の、コレステロールオゾン化産物４ａ（６５ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）の溶液へ添加した。アルゴン雰囲気下で、反応混合物を室温で２時間撹拌し、真空で乾燥するまで蒸発させた。残渣を塩化メチレン（１０ｍＬ）中に溶解し、水（２×１０ｍＬ）で洗浄した。有機画分を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、真空下で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー［酢酸エチル−ヘキサン（１：１、７：３）］によって黄色の粗油を精製すると、幾何学的異性体の混合物（シス：トランス＝８：９２）として表題化合物４ｄが得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ９．３４１（ｓ，１Ｈ），８．５６７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），８．３５８（ｄｄ，Ｊ＝７．２，１．２Ｈｚ，１Ｈ），８．２９０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５５０（ｄｄ，Ｊ＝８．４，７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．５３９（ｄｄ，Ｊ＝８．４，７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．１６７（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．０００（ｔ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，０．９２Ｈトランス），６．６４２（ｄｄ，Ｊ＝６．８，２．８Ｈｚ，０．０８Ｈシス），４．２７３（ｂｓ，１Ｈ），３．０４５（ｄｄ，Ｊ＝１３．６，３．４Ｈｚ，１Ｈ），２．８６９（ｓ，６Ｈ），２．２３３（ｄ，Ｊ＝１３．６Ｈｚ，１Ｈ），２．０９７（ｄｔ，Ｊ＝１８，４．４Ｈｚ，１Ｈ），１．１６２（ｓ，３Ｈ），０．９０４（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ），０．８９９（ｄ，Ｊ＝６．８ＨＺ，３Ｈ），０．８９２（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ），０．５１３（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ２０９．６６，１５１．７７，１４９．４９，１３３．５２，１３１．２０，１３０．９９，１２９．６４（２Ｃ）＊，１２８．５２，１２３．２５，１１８．８３，１１５．２５，７１．０７，５６．２０，５２．６８，５２．５６，４７．１０，４５．４０，４２．３２，４０．８１，３９．８２，３９．４８，３６．５１，３６．０５，３５．７９，３４．３９，３１．０５，２８．０２，２７．７４，２７．３０，２４．２７，２４．１３，２２．９９，２２．８４，２２．５６，１８．５３，１７．４５，１１．３１；ＨＲＭＡＬＤＯＦＴＭＳ  Ｃ３９Ｈ５９Ｎ３Ｏ４ＳＮａ（Ｍ＋Ｎａ）に関する計算値６８８．４１１８、実測値６８８．４１５２；Ｒｆ  ０．４３［酢酸エチル−ヘキサン（７：３）］。
＊２Ｃは、このシグナルが、ダンシル部分からの２つの炭素シグナル（ｇＨＳＱＣあたりとしてのＣ０）に相当すると信じられることを示す。
【０３６４】
３β−ヒドロキシ−５β−ヒドロキシ−Ｂ−ノルコレスタン−６β−カルボキシアルデヒドのダンシルヒドラゾン（５ｃ）
テトラヒドロフラン（５ｍＬ）中のコレステロールオゾン化産物５ａ（３０ｍｇ、０．０７２ｍｍｏｌ）の溶液へ、ダンシルヒドラジン（２５ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）及び塩酸（濃塩酸、０．０５ｍＬ）を添加した。直ちに形成される白色沈殿物を、水（０．２ｍＬ）の添加によって溶解した。アルゴン雰囲気下で、均質な反応混合物を室温で３時間撹拌し、真空で乾燥するまで蒸発させた。赤い残渣を酢酸エチル（１０ｍＬ）中に溶解し、水（２×１０ｍＬ）で洗浄した。有機画分を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、真空下で濃縮した。まず、シリカゲルクロマトグラフィー［酢酸エチル−塩化メチレン（１：４ないし１：１）］によって、黄色の粗油を精製した後、調製用ＨＰＬＣ（Ｃ１８  Ｚｏｒｂａｘ  ２１．２２ｍｍ及び２５ｃｍ、１００％アセトニトリル）によって精製すると、幾何学的異性体の混合物（シス：トランス＝１７：８３）として、表題化合物５ｃ（１４．５ｍｇ、３０％）が得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ８．５５７（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），８．３７２（ｄｄ，Ｊ＝７．２，１．２Ｈｚ，１Ｈ），８．３００（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），８．０８４（ｓ，１Ｈ），７．５７５（ｄｄ，Ｊ＝８．８，７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．５５４（ｄｄ，Ｊ＝８．８，７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．１９７（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．０５７（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，０．８４Ｈトランス），６．５１７（ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，０．１６Ｈシス），４．２２９（ｍ，０．１７Ｈシス），４．００４（ｍ，０．８３Ｈトランス），２．９０５（ｓ，６Ｈ），２．３７９（ｂｍ，４Ｈ），１．９１３（ｄｄ，Ｊ＝９．６，７．２Ｈｚ，２Ｈ），０．８８６（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），０．８７９（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ），０．８４１（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），０．６９１（ｓ，３Ｈ），０．３９３（ｓ，３Ｈ）；  １３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１５４．０８１，１３３．４２５，１３１．３６７，１３０．９１２，１２９．６９５，１２８．６１１，１２３．３５０，１１５．１２１，８３．２６８，７０．４６９，６７．０７９，５５．７７３，５５．６７７，５５．２８０，５１．６５２，４５．４２９，４５．０３８，４４．３７２，４３．１２９，４２．４４３，３９．４８８，３６．１４３，３５．５８５，２８．５８０，２８．４５８，２７．９８４，２７．７６６，２３．８５０，２２．８２５，２２．５４９，２１．３８９，１８．６５９，１８．０６３，１２．１９２；ＨＲＭＡＬＤＩＦＴＭＳ  Ｃ３９Ｈ５９Ｎ３Ｏ４ＳＮａ（Ｍ＋Ｎａ）に関する計算値６８８．４１１８、実測値６８８．４１１８；Ｒｆ  ０．４１［酢酸エチル−塩化メチレン（１：１）］。
【０３６５】
３β−ヒドロキシ−５−オキソ−５，６−セコ−［２６，２６，２６，２７，２７，２７−Ｄ６］−コレスタン−６−アル（Ｄ６−４ａ）
５ｍＬのクロロホルム−メタノール（９：１）中のＤ６−コレステロール（５０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）の溶液を通じて、酸素中のオゾンの気体混合物を、−７８℃で１分間泡立たせ、その時間までに、溶液はわずかに青色に変化した。反応混合物を蒸発させ、２．５ｍＬの酢酸−水（９：１）中のＺｎ粉末（４０ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ）とともに室温で３時間撹拌した。この不均一な混合物を塩化メチレン（１０ｍＬ）で希釈し、水（３×５ｍＬ）及び塩水（５ｍＬ）で洗浄した。有機画分を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、蒸発させた。（ヘキサン−酢酸エチル５：１、３：１及び２：１で溶出する）シリカゲルクロマトグラフィーを使用して、残渣を精製すると、白色固体として表題化合物を生じ、収率は８１％であった。１Ｈ  ＮＭＲ  ６００ＭＨｚ（δ，ｐｐｍ，ＣＤＣｌ３）：９．６１（ｓ，１Ｈ），４．４７（ｓ，１Ｈ），３．０９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．６Ｈｚ，４．０Ｈｚ），２．２５ないし２．４０（ｍ，３Ｈ），２．１５ないし２．１９（ｍ，１Ｈ），１．０１（ｓ，３Ｈ），０．８８（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．１Ｈｚ），０．６７（ｓ，３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ  １５０ＭＨｚ（δ，ｐｐｍ，ＣＤＣｌ３）：２１７．５，２０２．８，７１．０，５６．１，５４．２，５２．６，４６．８，４４．１，４２．５，４２．１，３９．８，３９．３，３５．９，３５．７，３４．７，３４．０，２７．８，２７．７，２７．５，２５．３，２３．７，２３．０，１８．５，１７．５，１１．５。
【０３６６】
３β−ヒドロキシ−５β−ヒドロキシ−Ｂ−ノルコレステロール−［２６，２６，２６，２７，２７，２７−Ｄ６］−６β−カルボキシアルデヒド（Ｄ６−５ａ）
アセトニトリル−水（２０：１、５ｍＬ）中のＤ６−４ａ（２６ｍｇ、０．０６１ｍｍｏｌ）の溶液へ、Ｌ−プロリン（１１ｍｇ）を添加した。反応混合物を室温で２．５時間撹拌し、真空で蒸発させた。残渣を酢酸エチル（１０ｍＬ）中に溶解し、水（２×５ｍＬ）及び塩水で洗浄した。有機画分を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、蒸発させると、ＮＭＲに関して分析上純粋な白色固体を残した（２６ｍｇ、０．０６１ｍｍｏｌ、収率：１００％）。１Ｈ  ＮＭＲ  ６００ＭＨｚ（δ，ｐｐｍ，ＣＤＣｌ３）：９．６９（ｓ，１Ｈ），４．１１（ｓ，１Ｈ），２．２３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，３．０Ｈｚ），０．９１（ｓ，３Ｈ），０．９０（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），０．７０（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ  １５０ＭＨｚ（δ，ｐｐｍ，ＣＤＣｌ３）：２０４．７，８４．２，６７．３，６３．９，５６．１，５５．７，５０．４，４５．５，４４．７，４４．２，４０．０，３９．７，３９．３，３６．１，３５．６，２８．３，２７．９，２７．５，２６．７，２４．５，２３．８，２１．５，１８．７，１８．４，１２．５。
【０３６７】
４−（５−（４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソシクロヘキシル）−７α−メチル−４−（２−オキソエチル）−オクタヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル）ペンタン酸１５ａ
３β−ヒドロキシコレスト−５−エン−２４−酸３ｃのオゾン分解は、Ｄ６−５ａに関して記載されているとおり実施した。１Ｈ  ＮＭＲ  ４００ＭＨｚ（δ，ｐｐｍ，ＣＤＣｌ３）：９．６０（ｓ，１Ｈ）；  ４．４７（ｓ，１Ｈ），３．４０（ｄｄ，Ｊ＝１３．６Ｈｚ，４Ｈｚ，１Ｈ）；  １．００（ｓ，１Ｈ），０．９１（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ），０．６７（ｓ，３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ  １００ＭＨｚ（δ，ｐｐｍ，ＣＤＣｌ３）：  ２１８．７，２０２．９，１７９．８，７０．９，５５．５，５４．１，５２．５，４６．４，４４．０，４２．４，４２．１，３９．６，３５．１，３４．５，３４．０，３０．８，３０．４，２７．５，２７．３，２５．１，２２．８，１７．９，１７．４，１１．４。
【０３６８】
コレステロールオゾン化産物抽出
改変されたＢｌｉｇｈ及びＤｙｅｒ法を使用して、血液試料及び組織試料の両者から、全ての脂質を抽出した。Ｂｌｉｇｈ  ＥＧ，Ｄ．Ｗ．Ｃａｎ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １９５９，３７，９１１−１７を参照されたい。抗凝固薬としてクエン酸塩又はＥＤＴＡを含有するＶａｃｕｔａｉｎｅｒチューブ中に回収し、４℃で保存したヒト血漿（２００μＬ）を、キャップつきのガラス管中のリン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ、３００μＬ）へ添加した。メタノール（５００μＬ）を添加し、試料を簡単に渦巻き撹拌した。クロロホルム（１ｍＬ）を添加し、試料を２分間渦巻き撹拌し、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、有機層を回収した。このクロロホルム添加、渦巻き撹拌及び遠心分離の工程を反復した。合わせた有機画分を組み合わせ、真空で蒸発させた。定型的な徴候のために頸動脈内膜切除法を受けている患者から、動脈内膜切除標本を得た。Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｇｒｅｅｎ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄは、ヒト対象のプロトコールを認可した。標本を凍結し、−７０℃で保存した後、分析した。分析のため、組織試料を室温まで加温させた後、組織ホモジナイザー（Ｔｅｋｍａｒ）を使用して水性緩衝液（ＫＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ、１ないし２ｍＬ）中でホモジナイズした。ホモジネートをメタノール：クロロホルム（１：３、６ｍＬ）の溶液へ添加し、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。有機画分を回収した。クロロホルム（６ｍＬ）を残りの水性混和画分へ添加し、試料を遠心分離した（３０００ｒｐｍで５分間）。次に、合わせた有機画分を真空で蒸発させた。
【０３６９】
抽出されたコレステロールオゾン化産物のダンシルヒドラジンによる誘導体化及びＨＰＬＣ分析
ダンシルヒドラジン（２００μＭ）及びＨ２ＳＯ４（１００μＭ）を含有するイソプロパノール（２００μＬ）中で、上述の蒸発した血液又は組織抽出物を再懸濁し、３７℃で４８時間温置する。分析方法は、均一濃度の移動相がアセトニトリル：水（９０：１０、０．５ｍＬ／分）であり、蛍光検出（励起波長３６０ｎｍ、発光波長４５０ｎｍ）を使用する、Ｖｙｄｅｃ  Ｃ−１８  ＲＰカラムへ接続したＨｉｔａｃｈｉ  Ｄ−７０００  ＨＰＬＣシステムでのＨＰＬＣ分析を包含した。オゾン化産物５ａ（５ｃ）のダンシル誘導体に関する保持時間（ＲＴ）は、約８．１分であった。５ａ（５ｂ）のヒドラジン誘導体に関する保持時間は、約１０．７分であった。Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ  ＰＣ及びＰｒｉｓｍ  ４．０ソフトウェアを使用して、標品を基準とするピーク面積によって濃度を規定どおりに測定した。
【０３７０】
ガスクロマトグラフィー−質量分析
蒸発させた標本を塩化メチレン中で１ｍＬ容積に再構成し、１００μＬのピリジン及び、１％トリメチルクロロシランを有する１００μＬのＮ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）−トリフルオロアセトアミドを、濃縮したプラーク抽出物へ添加することによってシリル化した。３７℃で２時間、試料を温置した後、回転蒸発によって、乾燥するまで蒸発させた。１００ｍＬ塩化メチレン中に各試料を再懸濁した後、分析した。分岐していない注入（Ａｇｉｌｅｎｔ  ７６７３オートサンプラー）を介してＨＰ−５ｍｓカラム、３０ｍ×内径０．２５ｍｍ×フィルム厚０．２５μｍへ、１．２ｍＬ／分の流速で注入し、注入器温度は２９０℃であり、温度プログラムは５０℃で開始し、５分間保持した後、３００℃まで２０℃／分の傾斜をつけてから、１２分間保持する。質量分析は、Ａｇｉｌｅｎｔモデル５９７３不活性型のスキャン範囲５０ないし７００ｍ／ｚで実施した後、ｍ／ｚ３５４及び３６０に関して選択されたイオンモニタリング（ＳＩＭ）スキャンを実施した。ＭＳクォード（ｑｕａｄ）温度は１５０℃であり、ＭＳソース温度は２８０℃であった。
【０３７１】
ＫＬＨ及びＢＳＡのタンパク質を運搬するためのハプテン１５ａの結合
塩酸１−エチル−３，３’−ジメチルアミノプロピル−カルボジイミド（ＥＤＣ、１．５ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ）及びスルホＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１．８ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ）を０．０１ｍＬのＨ２Ｏ中に溶解し、０．１ｍＬのＤＭＦ中のハプテン（２．５ｍｇ、０．００６ｍｍｏｌ）の溶液へ添加した。混合物を渦巻き攪拌し、室温で２４時間維持した後、４℃のＰＢＳ緩衝液（０．９ｍＬ、０．０５ｍＭ、ｐＨ＝７．５）中のＢＳＡ（５ｍｇ）へ添加した。この最終混合物を４℃で２４時間維持し、−２０℃で保存した。化合物１５ａのＫＬＨ又はＢＳＡコンジュゲートを合成するのに関与する反応を以下に示す。
【０３７２】
【化２０】
2009504184.tif 000037
2009504184.tif 000038
【０３７３】
反応ａは、上述のＯ３／Ｏ２で化合物３ｃのオゾン分解を包含した。反応ｂは、ＤＭＦ中のＥＤＣ及びＨＯＢｔで化合物１５ａを一晩処理した後、リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４中でＢＳＡ又はＫＬＨとともに温置することを包含した。
【０３７４】
標準的な方法によって、モノクローナル抗体産生を実施した。ＲＩＢＩアジュバントの等しい容積と混合した、マウス１匹当たり５０μＬのＰＢＳ中の１０μｇのＫＬＨ−１５ａコンジュゲートを、合計５回の免疫化のために３日ごとに腹腔内注射することによって、８週齢の１２９ＧＬＸ＋マウスの免疫化を実施した。血清力価をＥＬＩＳＡによって測定した。３０日後、１００μＬのＰＢＳ中の５０μｇのＫＬＨ−１５ａコンジュゲートの最終的な注射を外側尾静脈中に静脈内注射（ＩＶ）した。融合のため、３日後に動物を屠殺し、脾臓を摘出した。免疫化された動物由来の脾臓細胞を、ＲＰＭＩ培地中のＸ６３−Ａｇ８．６５３ミエローマ細胞を遠心分離したものと５：１で混合し、３７℃の１ｍＬのＰＥＧ１５００中に再懸濁した。９ｍＬのＲＰＭＩで、３分にわたってＰＥＧを希釈し、３７℃で１０分間温置した後に遠心分離し、培地中に再懸濁し、１５×９６ウェルプレート中で播種した。コレステロールオゾン化産物４ａ又は５ａと結合するがコレステロールとは結合しない抗体に関してスクリーニングするため、ＥＬＩＳＡを実施した。選択したハイブリドーマを、２世代にわたってサブクローニングし、単クローン性を保証した。
【０３７５】
アポＥノックアウトマウスの上行大動脈からの組織学的切片の調製
液体窒素中で、標本を瞬時凍結した。１０ミクロン切片を作製し、ガラススライド上に載置した。１：１のエチルアルコール：ジエチルエーテル中で２０分間、１００％エタノール中で１０分間、９５％エタノール中で１０分間の連続的な浸漬によって、標本を固定した。ＰＢＳ中での洗浄後、コレステロールオゾン化産物に特異的な抗体の１：２００希釈を適用し、組織とともに１時間温置した。ＦＩＴＣ標識したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の４０：１希釈で、二次標識を実施した。オプトエレクトロニクスマイクロファイアデジタルカメラを使用して画像を得、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用して加工した。
【０３７６】
結果
コレステロールオゾン化産物のダンシルヒドラゾンの蛍光検出
先行実施例において記載されているとおり、コレステロールオゾン化産物は、Ｋ．Ｗａｎｇ，Ｅ．Ｂｅｒｍｕｄｅｚ，Ｗ．Ａ．Ｐｒｙｏｒ，Ｓｔｅｒｏｉｄｓ  ５８，２２５（１９９３）による化学的研究において開発された分析手法の改変を使用して、生体内で検出できる。この改変したプロセスは、有機溶媒（塩化メチレン、３×５ｍＬ）を有するＰＢＳ（１ｍＬ）ｐＨ７．４中のホモジナイズしたプラーク材料（約５０ｍｇ湿重量）の懸濁液を抽出した後、塩酸２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ  ＨＣｌ）のエタノール溶液（２ｍＭ、ｐＨ６．５）によって有機可溶性画分を室温で２時間処理することを包含した。逆相ＨＰＬＣ（直接注入、３６０ｎｍでの紫外線検出）及び、４ａの２，４−ジニトロフェニルヒドラゾン（２，４−ＤＮＰ）である４ｂ及び５ａの２，４−ＤＮＰ誘導体である５ｂの存在に関するインライン陰イオンエレクトロスプレー質量分析によって、この反応混合物を分析した。この技術は、迅速かつ高感度である。しかしながら、生物学的試料へ適用する場合、本アッセイに対して多くの制限が存在する。これらは、３６０ｎｍでの紫外線吸光を有する他の生物学的化合物による干渉、及びコレステロールオゾン分解産物の低濃度での抱合反応の効率性の低下を含む。
【０３７７】
従って、アッセイ感度の増加が達成され得るかどうかを解明するために、新たな手法を検査した。この手法は、コレステロールオゾン化産物を、蛍光発色団を有するヒドラジンと抱合した後の蛍光検出及びＨＰＬＣ分析を包含した。選択した蛍光発色団は、ダンシル基であった。前記アッセイは、上述の酸性条件下で、抽出したコレステロールオゾン化産物をダンシルヒドラジンによって誘導体化することを包含した。コレステロールオゾン化産物４ａとのダンシルヒドラジン反応の産物は４ｄであり、以下に示す。
【０３７８】
【化２１】
2009504184.tif 000039
【０３７９】
コレステロールオゾン化産物５ａとのダンシルヒドラジン反応の産物は５ｃであり、以下に示す。
【０３８０】
【化２２】
2009504184.tif 000040
【０３８１】
ヘキサン、メタノール、クロロホルム、テトラヒドロフラン、アセトニトリル及びイソプロパノール（ＩＰＡ）等のある範囲の溶媒中で、ダンシルヒドラジン誘導体化に関する反応効率性を評価した。この分析から、ＩＰＡが、コレステロールオゾン化産物４ａの５ａへの自発的アルドール化の反応効率性及び最低速度に関して最適な溶媒であった。化学的に合成されたダンシルヒドラゾン標品４ｄ及び５ｃを使用するＨＰＬＣによって、反応効率性を定量化した（図９）。保持時間（ＲＴ）約１１．２分の４ａヒドラゾン誘導体４ｄを形成するための、ＩＰＡ中のダンシルヒドラジン（２００μＭ）及び硫酸（１００μＭ）によるコレステロールオゾン化産物４ａに関する誘導体化効率性は、８６．０±８．０％であった。重要なことに、５ｃの１．３％のみが、誘導体化プロセス中の４ａ又は４ｄのアルドール化によって形成された。５ａのダンシルヒドラゾン誘導体５ｃ（ＲＴ約１９．４分）への転化の効率性は、０．０１ないし１００μＭの５ａの濃度範囲に関して８３±１１％であった。ダンシル−ヒドラゾン４ｄ及び５ｃに関する感度のレベルは、約１０ｎＭである。
【０３８２】
４ａ及び５ａコレステロールオゾン化産物が、血漿試料から抽出及び誘導体化される効率性を測定するため、ヒト血漿試料を５ａでスパイクした後、抽出し、２，４−ＤＮＰ又はダンシルヒドラジンの何れかと抱合させた。何れかの方法で検出された、抱合されたヒドラゾンの量に有意差は存在せず、３７．５±１．９％がダンシルヒドラゾン５ｃとして誘導体化され、３１±８．９％が２，４−ＤＮＰヒドラゾン５ｂとして回収された。
【０３８３】
同位体希釈−インライン質量分析つきガスクロマトグラフィー（ＩＤ−ＧＣＭＳ）
目下のところ、血液（血漿）及びアテローム硬化性動脈等のコレステロールの豊富な組織中のオキシステロールの測定のための最も分析的な方法は、水素炎イオン化検出（ＦＩＤ）又は選択されたイオンモニタリング（ＳＩＭ）を備えたＧＣに基づいている。ＦＩＤを上回るＳＩＭの利点は、検出の特異性である。この特異性は、生物学的マトリクスにおけるオキシステロールの分析に必要である。ＳＩＭ戦略に対する決定的な態様は、内部標準の使用である。最も普遍的なのは、５α−コレスタンである。Ｊｉａｌｉｌ，Ｉ．，Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｄ．Ａ．，Ｇｒｕｎｄｙ，Ｓ．Ｍ．Ａｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．１９９１，１１，４８２−４８８、Ｈｏｄｉｓ，Ｈ．Ｎ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｄ．Ｗ．，Ｓｅｖａｎｉａｎ，Ａ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  １９９１，８９，１１７−１２６を参照されたい。しかしながら、高感度であり、特異的であり、異なる分析物の異なる回収に補正されるので、重水素標識された内部標準を使用するＧＣ−ＭＳは、好ましい方法である。Ｄｚｅｌｅｔｏｖｉｃ，Ｓ．，Ｂｒｕｅｕｅｒ，Ｏ．，Ｌｕｎｄ，Ｅ．，Ｄｉｓｚｆａｌｕｓｙ，Ｕ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９５，２２５，７３−８０。重水素標識した内部標準の役割は２つある。第一に、同位体量と濃度の相関を可能にすることによって、定量化を可能とすることである。第二に、抽出操作の前に、重水素標識された分子の公知の量を添加することによって、コレステロールオゾン化産物が抽出される効率性を評価できることである。Ｌｅｏｎｉ，Ｖ．，Ｍａｓｔｅｒｍａｎ，Ｔ．，Ｐａｔｅｌ，Ｐ．Ｍｅａｎｅｙ，Ｓ．，Ｄｉｃｚｆａｌｕｓｙ，Ｕ．Ｂｊｏｒｋｈｅｌｍ，Ｉ．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ．Ｒｅｓ．２００３，４４，７９３−７９９。
【０３８４】
以下に概述されているように、［２６，２６，２６，２７，２７，２７−Ｄ］−コレステロール（重水素置換した３ｃ）から、６重水素置換されたコレステロールオゾン化産物Ｄ６−４ａ及びＤ６−５ａを調製した。
【０３８５】
【化２３】
2009504184.tif 000041
【０３８６】
合成の第一の工程（ａ）において、７８℃のクロロホルム−メタノール（９：１）中のＤ６−３ｃの溶液を通じてオゾンを泡立たせ、Ｄ６−４ａを生じた。第二の工程（ｂ）において、ＤＭＳＯ中にＤ６−４ａを溶解し、室温で２．５時間プロリンと反応させ、Ｄ６−５ａを生じた。
【０３８７】
Ｄ６−４ａ及びＤ６−５ａを内部標準として使用して、インハウスＡｇｉｌｅｎｔ  ＧＣ／ＭＳでのＧＣ／ＭＳ法の感度を検査した。典型的な手法において、アルゴン下、３７℃で、ピリジン及びＢＳＴＦＡで２時間処理することによって、標品コレステロール、４ａ、５ａ、Ｄ６−コレステロール、Ｄ６−４ａ及びＤ６−５ａの試料をこれらのトリメチルシリルエーテルへ転化した。（真空での）揮発物質の除去後、残渣を塩化メチレン中に溶解し、オートサンプラーバイアルへ移した。
【０３８８】
次に、５９７３不活性型ＭＳＤへ連結された（分岐型／非分岐型入口システム及び７６８３オートインジェクタモジュールを備えた）Ａｇｉｌａｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｏｇｉｅｓ  ６８９０ＧＣで、ＧＣ−ＭＳを実施した。全イオン操作モードで質量分析装置を作動した。観察した保持時間（ＲＴ）及びＭ＋イオンは、次のとおりであった。オゾン化産物４ａ及び５ａ（ＲＴ＝２９．６分、Ｍ＋３５４）、Ｄ６−４ａ及びＤ６−５ａ（ＲＴ＝２９．６分、Ｍ＋３６０）、コレステロール（ＲＴ＝２７．２分、Ｍ＋３２９）、Ｄ６−コレステロール（ＲＴ＝２７．２分、Ｍ＋３３５）。ＧＣ−ＭＳ内でのコレステロールオゾン化産物４ａ及び５ａの推定断片化を以下に示す。
【０３８９】
【化２４】
2009504184.tif 000042
2009504184.tif 000043
【０３９０】
上述のように、コレステロールオゾン化産物４ａ及び５ａは何れも、約Ｍ＋３５４の断片を生じる。重水素置換された（Ｄ６）４ａ及び５ａコレステロールオゾン化産物は、約Ｍ＋３６０の断片を生じる。
【０３９１】
従って、ＧＣ−ＭＳアッセイでは、コレステロールオゾン化産物４ａと５ａの間に区別は観察されず、その理由はおそらく、シリル化工程の間に、コレステロールオゾン化産物４ａが５ａへと転化されるからである。従って、Ｍ＋３５４（又は３６０）の量は、標品４ａ及び５ａコレステロールオゾン化産物の濃度の測定結果である。３５４イオンピークの面積は、濃度とともに直線的であり、測定される感度のより低いレベルは、これまでのところ、コレステロールオゾン化産物に関して（先行実施例において記載されているＬＣ／ＭＳアッセイから得られる検出限界の概ね２桁増加に等しい）１０ｆｇ／μＬである。
【０３９２】
臨床的に摘出された頚動脈プラーク材料からコレステロールオゾン化産物を抽出することによって、ＧＣＭＳアッセイの正当性を更に確認した。所定の分析のために頸動脈内膜切除法を受けている患者から得られた頸動脈内膜切除組織（ｎ＝２）を、組織ホモジナイザーを使用して（アルゴン下で）１０分間ホモジナイズした後、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ中に抽出した。上述のとおり、抽出物をシリル化した後、ＧＣ−ＭＳ分析へ供した（図１０及び１１）。イオン量の時間に対するＧＣ−ＭＳ軌跡は、今後確定されなければならない多くのオキシステロールが存在することを示す。しかしながら、合わせたオゾン化産物４ａ及び５ａの解像度は明瞭であった（ＲＴ＝２２．４９分）。
【０３９３】
これらのデータは、生物学的試料中の４ａ及び５ａコレステロールオゾン化産物を分析するための全般的な抽出及びＧＣ−ＭＳアッセイの実現性を明確に確立しており、先行実施例におけるアテローム硬化性プラーク材料の分析に関して記載された結果が正当であることを確認する。
【０３９４】
コレステロールオゾン化産物４ａないし５ａの免疫組織化学的局在化
上述のように、コレステロールオゾン化産物４ａの類縁体である化合物のＫＬＨコンジュゲートでマウスを免疫化した。ハイブリドーマ法によってモノクローナル抗体を産生した。２つのネズミモノクローナル抗体１１Ｃ５及び７Ａ７は、コレステロールオゾン化産物５ａに対する１μＭ未満の良好な結合親和性及びコレステロール（１０００倍低い親和性）を上回る優れた特異性を有していた。
【０３９５】
４ａ類縁体であるハプテンに対する抗５ａ抗体の産生は、上述に示されるように、コレステロールオゾン化産物４ａを血液へ添加することによって５ａへの中間体転化が生じるので、あまり驚くべきことではなかった。
【０３９６】
アポＥ欠損マウス由来の動脈の凍結固定切片を、抗体１１Ｃ５及びＦＩＴＣ標識した抗ＩｇＧ二次抗体による免疫組織化学的染色によって、非特異的ネズミ抗体で染色した連続切片と比較すると、血管の内膜下層内のアテローム硬化性の領域中に、コレステロールオゾン化産物５ａが局在化していることが示された。可溶性コレステロールによる抗体の吸収は、内膜下の蛍光を除去しなかった。
【実施例８】
【０３９７】
コレステロールオゾン分解産物の更なる前アテローム生成効果
本実施例は、ＬＤＬが存在する場合に、コレステロールオゾン分解産物４ａ及び５ａがマクロファージを部位へ動員するのを促進する走化薬であることを示すデータを提供する。本実施例は、ＬＤＬの存在する場合に、コレステロールオゾン分解産物４ａ及び５ａがマクロファージ中でＡクラススカベンジャー受容体（ＳＲ−Ａ）の発現を上方制御し、また、内皮細胞接着分子においてＥ−セレクチンの発現も上方制御することも示す。更に、本実施例は、オゾン分解産物（４ａではなく）５ａが、単球のマクロファージへの分化を誘導したことを示す。
【０３９８】
【化２５】
2009504184.tif 000044
【０３９９】
材料及び方法
別段の記載がない限り、全ての反応は、不活性雰囲気の下で、乾燥試薬、溶媒、炎光乾燥したガラス器具を使用して実施した。全ての出発材料は、Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｉｇｍａ、Ｆｉｓｈｅｒ、又はＬａｎｃａｓｔｅｒから購入し、受領した状態で使用した。全てのフラッシュカラムクロマトグラフィーは、シリカゲル６０（２３０ないし４００メッシュ）を使用して実施した。Ｍｅｒｃｋ（０．２５、０．５、又は１ｍｍ）でコーティングしたシリカゲルＫｉｅｓｅｌｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４プレートを使用して、調製用薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を実施した。コレステロールオゾン分解産物４ａ（３β−ヒドロキシ−５−オキソ−５，６−セココレスタン−６−アル）及びコレステロールオゾン分解産物５ａ（３β−ヒドロキシ−５β−ヒドロキシ−Ｂ−ノルコレスタン−６β−カルボキシアルデヒド）を、上述のとおり合成した。
【０４００】
リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４に対して、５μＭ  ＣｕＳＯ４中でＬＤＬ（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を、３７℃で１２時間透析することによって、酸化された低密度リポタンパク質（ｏｘ−ＬＤＬ）が生成された。チオバルビツール酸反応物質の形成を測定することによって、脂質過酸化を評価した。反応混合物を２部の３．８％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸、０．０６Ｎ  ＨＣｌ中の０．１％２−チオバルビツール酸、及び０．２部の０．６２５ｍＭ  ＳＤＳで処理した後、９５℃で３０分間加熱した。冷却後、試料を１００μＬのｎ−ブタノールで２回抽出した後、抽出物の吸光度を５３２ｎｍで測定した。酸処理によってマロンジアルデヒドを生じるマロンジアルデヒドビス（ジメチルアセタル）を標準物質として使用した。
【０４０１】
細胞培養
ＨＡＡＥ−１ヒト動脈内皮細胞系（ＣＲＬ−２４７２）、Ｊ７７４Ａ．１ネズミ組織マクロファージ細胞系（ＴＩＢ−６７）及び単球細胞系であるＵ９３７組織球リンパ腫（ＣＲＬ−１５９３．２）及びＴＨＰ−１急性単球白血病（ＴＩＢ−２０２）をＡＴＣＣから得た。Ｎｉｃｈｏｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３２：４５３−６２、Ｒａｌｐｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４３：１５２８−３３、Ｔｓｕｃｈｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２：１５３０−３６、Ｓｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｃ．＆  Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｋ．（１９７６）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １７：５６５−７７を参照されたい。１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）含有ＡＴＣＣ推奨培地中で、全ての細胞系を培養した。３７℃、５又は７％ＣＯ２の制御された大気中で細胞を温置した。細胞からの乳酸脱水素酵素の放出を使用して、実施例１に記載されているとおり、コレステロールオゾン化産物の細胞毒性を測定した。
【０４０２】
コレステロールオゾン化産物の局在化
Ｊ７７４Ａ．１細胞を８ウェルチャンバースライド（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）中に播種した。コレステロールオゾン化産物５ｄ又は５ｅの５０μＭダンシル誘導体、ダンシルコレステロール誘導体９ｃ若しくは９ｄ、又はＦＣＳを有さない培地中で希釈したダンシルヒドラジン（０．０５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ終濃度）への曝露５分前又は１時間前に、細胞をＰＢＳ、ｐＨ７．４で２回洗浄した。
【０４０３】
【化２６】
2009504184.tif 000045
2009504184.tif 000046
【０４０４】
培地を吸引除去し、９５％氷冷メタノール中で５分間、細胞を直ちに固定した。Ａｎｔｉｆａｄｅ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を含有するグリセロール中で細胞をマウントした。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ ７０倒立顕微鏡へ装着されたＰｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ  ＣＨ３５０Ｌ液体冷却ＣＣＤカメラを装備したＤｅｌｔａＶｉｓｉｏｎ  Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ顕微鏡（ＡＰＩ，Ｉｓｓａｑｕａｈ  ＷＡ）を使用して、蛍光画像を記録した。これらのデータは、６０倍油浸対物レンズ（ＮＡ１．４）及び（励起）ＤＡＰＩ３６０／４０及び（発光）４５７／５０のフィルターセットの組み合わせを使用して回収した。ＤｅｌｔａＶｉｓｉｏｎソフトウェア（ｓｏｆｔＷｏＲｘ，ｖ２．５）の制約のある反復アルゴリズム（１０反復）を使用して、全ての画像を解析した。ｓｏｆｔＷｏＲｘ，ｖ２．５を使用して、解析した画像をその後処理した。
【０４０５】
幾つかの実験において、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）中でネズミマクロファージＲＡＷ２６４．７（ＥＣＡＣＣ９１０６２７０２）細胞を３７℃、５％ＣＯ２で生育させた。蛍光画像化のため、６ウェルチャンバーつきプレート（Ｃｏｓｔａｒ）中のカバースリップ上で細胞を１２時間温置し、ｐＨ７．４のＰＢＳ中で３回優しく洗浄し、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ中で、コレステロールオゾン化産物５ｄ又は５ｅの５０μＭダンシル誘導体、ダンシルコレステロール誘導体９ｃ又は９ｄとともに５、１５、３０、及び６０分間温置した。次に、ダンシル誘導体の溶液をＤＭＳＯ中に添加した［最終ＤＭＳＯ、０．０５％（ｖ／ｖ）］。培地を吸引除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中の３．７％）中で１０分間固定した。カバースリップをＭＯＷＩＯＬ  ４−８８（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）中に載置した。Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｃｏｐｅ  ２  Ｐｌｕｓ倒立蛍光顕微鏡を使用して顕微鏡検査を実施し、Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェア（第３．１版）を使用するＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｃａｍデジタルカメラで画像を得た。６３倍油浸レンズ及びＤＡＰＩフィルター（励起３６０／発光４６０）を使用してデータを回収し、Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェア及びＡｄｏｂｅソフトウェア（Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ６．０）で画像を処理した。
【０４０６】
スカベンジャー受容体発現
ＣＤ３６（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）及びＣＤ２０４（Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）特異的モノクローナル抗体を使用するフローサイトメトリによって、細胞表面ＣＤ３６及びＳＲ−Ａを測定した。Ｌｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２０：１９６８−７５、Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｌｏｏｄ  ８７：２０２０−２８を参照されたい。０．５％ＢＳＡ含有培地中で、ネズミマクロファージＪ７７４Ａ．１細胞を一晩血清枯渇させた。次に、コレステロールオゾン化産物で、又は特定の時間ＬＤＬと複合体形成したコレステロールオゾン化産物で処理された細胞（１×１０６個）を、ＰＢＳで２回洗浄した。掻爬によって細胞を回収した後、６％パラホルムアルデヒドで２０分間固定した。次に、２％熱失活したＦＣＳ、０．０５％ＮａＮ３及び適切な一次抗体、抗体コンジュゲート又はアイソタイプ対照（１：１００希釈）を含有するＰＢＳ中で細胞を再懸濁し、氷上で３０分間温置した。ＣＤ３６又はＳＲ−Ａの何れかの発現を、Ｃ３６（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）及びＣＤ２０４（Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．）特異的モノクローナル抗体でそれぞれ測定した。一次抗体を洗浄した後、二次抗体を添加し、細胞を再度洗浄した後、ＦＡＣＳキャリバー２（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）フローサイトメーターで分析し、ＣｅｌｌＱｕａｎｔソフトウェアによって分析した。少なくとも２つの二つ組測定結果の平均蛍光強度±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として結果を表した。Ｓｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定を使用して有意性を決定し、対照に対して（＊）は、ｐ＜０．０５を示し、（＊＊）は、ｐ＜０．０１を示した。
【０４０７】
改変したＢｏｙｄｅｎチャンバー遊走アッセイを使用して、走化性及び浸潤アッセイを実施した。Ｚｗｉｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：  １５７０−７７、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１６２:３８−５０。ポリビニルピロリドンを含有しないポリカーボネートメンブレン（５μｍ孔サイズ）を使用するＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ−ＭＩＣプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）でアッセイを準備した。細胞（ネズミマクロファージＪ７７４Ａ．１）を洗浄し、０．２％ＢＳＡを含有する無血清ＤＭＥＭ中に、１×１０６個／ｍＬで再懸濁した。細胞５０μＬをマイクロチャンバーの上部ウェルへ添加し、ＤＭＥＭ／０．２％ＢＳＡ中の化学誘引物質１５０μＬを下部ウェルへ添加した。温置時間は、８％ＣＯ２大気中、３７℃で４時間であった。膜の上側の細胞を拭い去った後、染色及び位相差顕微鏡又は蛍光の何れかによって、下側の細胞を可視化した。ＤｉｆｆＱｕｉｋ染色キット（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ，Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ）を使用して、膜へ接着した細胞を染色した。各実験を三つ組で実施し、２００倍の５つの視野で遊走している細胞の数を計数した。蛍光標識のためにＰＢＳ−ＥＤＴＡで回収した細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、カルセインＡＭ（５μＭ）を含有する無血清培地中で再懸濁した。穏やかに間欠的に混合しながら、細胞を３０分間温置した（３７℃、５％ＣＯ２）。カルセイン標識した細胞を２回洗浄し、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ（商標）ＧＥＭＩＮＩ二重走査マイクロプレート分光蛍光光度計を使用して、カルセイン蛍光（励起＝３９０ｎｍ及び発光＝４６０ｎｍ）を測定した。９６ウェルプレート中へ分散し、１００μＬ中のＰＢＳ／ＢＳＡ中で細胞を希釈することによって生じた蛍光測定結果を標準曲線と比較した。蛍光を上述のとおり定量化した。
【０４０８】
内皮細胞接着分子の発現
抗ヒトＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）、ＣＤ１０６（ＶＣＡＭ−１）及びＣＤ６２Ｅ（Ｅ−セレクチン）抗体（Ｌｅｉｎｃｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用するＥＬＩＳＡによって、内皮細胞表面接着分子の発現を測定した。すでに記載の手法からＥＬＩＳＡ法を改変した。Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００３  Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．４２：１９６７−７４、Ｋｈａｎ（１９９５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：１２６２−７０、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２５：１９２５−４５。媒体、ＬＤＬ（１ないし３ｎｍｏｌ／タンパク質ｍｇ）、ＣｕＯｘ−ＬＤＬ（ＴＢＡＲＳ，８０ないし１００ｎｍｏｌタンパク質ｍｇ）、コレステロールオゾン化産物４ａ又は５ａ（２５μＭ／ＬＤＬ）へ、９６ウェルプレート中で生育させたＨＡＡＥ−１細胞を適切な時間だけ曝露し、ＰＢＳで１回洗浄した。
【０４０９】
次に、５％ＦＣＳを含有するＰＢＳ中で１：４００希釈した、ＶＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチン又はＩＣＡＭ−１に対する抗体とともに細胞を３７℃で３０分間温置した。ウェルをＰＢＳで２回洗浄した後、ＰＢＳ／５％ＦＣＳ中の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抱合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ，ＵＳＡ）とともに３７℃で３０分間温置した。ウェルをＰＢＳで４回洗浄した後、Ｈ２Ｏ２／３，３’，５，５’−テトラメチル−ベンジジンペルオキシダーゼ基質（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）とともに、暗所で３０分間温置した。８Ｎ  Ｈ２ＳＯ４２５μＬを添加することによって反応を停止させ、二次抗体のみで染色されたウェルをブランクとしながら、プレートをマイクロプレートリーダーで読み取った。各アッセイを三つ組で実施し、媒体の発現レベルの％としての平均±平均の標準誤差としてデータを報告した。Ｅ−セレクチン発現に及ぼすコレステロールオゾン化産物５ａ濃度（５ないし５０μＭ）の効果を研究するために、上記と同一の様式でアッセイを実施し、各点は、少なくとも二つ組の測定結果の平均±平均の標準誤差であった。
【０４１０】
単球の形態学的変化
懸濁液中のＴＨＰ−１単球を８ウェルチャンバースライド中に播種した。媒体（ＤＭＥＭ及び０．４％ＤＭＳＯ）、コレステロール、７−ケトコレステロール（７−ＫＣ）、又はコレステロールオゾン分解産物４ａ若しくは５ａ（１２及び２５μＭ）とともに細胞を温置し、３７℃、７日間の温置期間にわたって形態学的変化を検討した。適切な処理化合物を含有する培地を４日後に置換した。４日間の処理後、位相差顕微鏡によって接着細胞の形態学的変化を評価し、Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｍｉｃｒｏｆｉｒｅデジタルカメラを使用して写真撮影した。
【０４１１】
統計解析
全ての場合において、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥＸＣＥＬソフトウェアの両側の、対になったＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定によってデータを統計的に解析した。Ｐ≦０．０５の値を有意とした。記載されているデータは、平均±標準誤差を表す。
【０４１２】
結果及び考察
先行実施例は、コレステロールオゾン分解産物４ａ及び５ａ並びに低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）で処理した培養マクロファージが、広範囲の脂質負荷と関連した泡沫細胞性形態を示すことを示している。この現象を更に研究し、コレステロールオゾン化産物の内部移行の経過への洞察を得るため、ダンシル化されたコレステロールオゾン化産物４ｅ、５ｄ、５ｅ又は９ｃでマクロファージを処理した後、蛍光顕微鏡によって取り込みを追跡した。ダンシルコレステロールオゾン化産物４ｅ、５ｄ、５ｅ又は９ｃは、上に示されているとおりである。
【０４１３】
これらの実験によって、マクロファージ細胞質中でのコレステロールオゾン化産物の有意な蓄積は、５分後にのみ生じることが明らかとなった（図１２Ａ）。曝露から１時間後に、核周囲への有意な局在化が生じる（図１２Ｂ）。
【０４１４】
コレステロールオゾン化産物４ａ及び５ａは、ＬＤＬと複合体形成しない場合でさえ、マクロファージによって効率的に取り込まれた。機能的ＬＤＬを欠失している細胞外区画において、コレステロールオゾン化産物が発生し得る条件下（アテローム硬化性動脈の動脈内膜内での場合など）で、これらの分子が、おそらくは受容体独立型経路によって細胞中になお蓄積し得、従ってマクロファージの機能に及ぼす細胞内効果を有し得るので、このＬＤＬ独立型取り込みは、生体内において特に適切であり得る。更に、ダンシル化されたコレステロールオゾン化産物５ｅが、最初、点状に細胞質へ蓄積した後、細胞内の核周辺に増加したことは、５ｅが、エステル化されておらず、及び細胞質全体に局在化されている脂質滴中に保存されていないことを示唆する。
【０４１５】
コレステロールオゾン化産物のこのような取り込みは、化合物がコレステロールの細胞外酸化によって生じるか、又はマクロファージ内で産生され、壊死の際に放出されるかどうかにかかわらず、マクロファージ機能の下流に影響し得る。更に、コレステロールオゾン化産物が、当初、細胞質に蓄積した後に、細胞内で増加したということは、未だ不明の何らかの機序によって、コレステロールの正常なエンドソームリサイクルの擾乱へ連結された脂質負荷の機序が存在することを示唆する。Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．(１９９２)Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１６：３０７−１９、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．１４：９０３−１５。
【０４１６】
Ａクラススカベンジャー受容体（ＳＲ−Ａ）及びＣＤ３６は、修飾されたＬＤＬ及びオキシステロールのマクロファージ内部移行の原因となる主要表面受容体である。Ｈｕｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｌｏｏｄ  ８７：２０２０−２８、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１  Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４７：２２４−２８、Ｋｕｎｊａｔｈｏｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：４９９８２−８８。両受容体は、ｏｘ−ＬＤＬの存在下で上方制御される。しかしながら、ＳＲ−Ａは、アセチル化されたＬＤＬの存在下で、ＣＤ３６よりも高い程度まで上方制御される。Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ａｒｔｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１８：７９４−８０２、Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２１６５４-５９；Ｎａｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ａｒｔｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１８：１３５０−５７。
【０４１７】
細胞溶解液の間接的フローサイトメトリ（図１３）及び免疫ブロッティングの両者によって測定されるように、ＬＤＬ及びコレステロールオゾン分解産物４ａ又は５ａの何れかによるＪ７７４Ａ．１マクロファージの処理によって、ＳＲ−Ａが有意に上方制御される（約３倍、Ｐ＜０．０５）。しかしながら、コレステロールオゾン化産物がＬＤＬと複合体形成される場合、ＬＤＬ受容体（Ｃ３６）の有意な増加は観察されなかった。ＣｕＯｘ−ＬＤＬ（ＴＢＡＲＳ，５０ないし７５ｎｍｏｌ／タンパク質ｍｇ）によるＪ７７４Ａ．１マクロファージの処理の結果、ＣＤ３６（未変性のＬＤＬの約４倍増）及びＳＲ−Ａ（未変性のＬＤＬの約３倍増）の両者が有意に上方制御された。対照的に、ＬＤＬ不在下でのコレステロールオゾン分解産物４ａ又は５ａによる培養マクロファージの処理によって、何れの受容体の発現も増大しなかった。
【０４１８】
ＳＲ−Ａ及びＣＤ３６は、修飾されたＬＤＬ及びオキシステロールのマクロファージ内部移行の原因となる主要表面受容体である。両表面受容体が、酸化された低密度リポタンパク質（ｏｘ−ＬＤＬ）の存在下で上方制御されることが示されている（Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１８：７９４−８０２（１９９８）、Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２１６５４−２１６５９（１９９７））。しかしながら、ＳＲ−Ａは、アセチル化されたＬＤＬの存在下で、ＣＤ３６よりも高い程度まで上方制御される（Ｎａｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１８：１３５０−１３５７（１９９８））。従って、コレステロールオゾン分解産物４ａ又は５ａの何れかと複合体を形成したＬＤＬでの処理に応答した、マクロファージ中でＳＲ−Ａが上方制御されたが、ＣＤ３６は上方制御されなかったということは、アセチル化されたＬＤＬのものと極めて類似した推定シッフ塩基ＬＤＬ−オゾン分解産物付加物のための内部移行経路を示唆する。
【０４１９】
これらのデータは、オゾン分解産物５ａが、ＬＤＬの不存在下でマクロファージ内の細胞質中に迅速に蓄積することを示す（図１２Ａ）。更に、データは、ＬＤＬの存在下で、オゾン分解産物４ａ又は５ａがＳＲ−Ａの上方制御に至るのに対し、ＬＤＬの不在下では上方制御に至らないことも示す（図１３）。併せて、これらのデータは、ＬＤＬと複合体形成するかどうかに依存する２つの別個の機序によって、オゾン分解産物４ａ又は５ａがマクロファージへ入ることができることを示唆する。ＬＤＬと複合体を形成しない場合には、オゾン分解産物４ａ又は５ａは、受動性拡散によってマクロファージへ入り得るが、ＬＤＬと複合体形成される場合には、オゾン分解産物４ａ又は５ａは、表面受容体により媒介される経路によって進入し得る。
【０４２０】
オゾン分解産物４ａ又は５ａはいずれも、Ｂｏｙｄｅｎチャンバー遊走アッセイにおいて測定されるように、マクロファージの用量依存的動員を刺激する（０ないし２５μＭ、Ｐ＜０．００１、図１４Ａ及び１４Ｂ）。興味深いことに、オゾン分解産物４ａ又は５ａが未変性のＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ；ＴＢＡＲＳ、１ないし４ｎｍｏｌ／タンパク質ｍｇ）と複合体形成するとき、マクロファージ細胞の有意な遊走は生じない。しかしながら、オゾン分解産物４ａ又は５ａがＢＳＡ遊走物と同時温置される場合には、マクロファージ遊走も生じる。このコレステロールオゾン分解産物によって誘導されたマクロファージ遊走がＬＤＬによって抑制されるが、ＢＳＡによっては抑制されないということは、ＬＤＬと複合体を形成したオゾン分解産物４ａ又は５ａが、酸化的に修飾されたＬＤＬと類似した様式で挙動するという結論を更に支持する。この結論は、マクロファージが、酸化されたＬＤＬの蓄積後に遊走できなくなることを示すデータによって支持される（Ｐａｒｔｈａｓａｒａｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂａｓｉｃ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ４９：３７５−８０、Ｑｕｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２９９５−９８）。
【０４２１】
マクロファージは、複製が遅いことが知られており、従って、炎症の部位で局所的な組織レベルを増大させるために、炎症の部位に白血球蓄積を増大させる多くの天然の走化薬（単球化学誘引物質タンパク質１（ＭＣＰ−１）又はロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ−４）等）が存在する。マクロファージは、アテロームアッセイ進行の間と最終的な塞栓段階の両者において、アテローム硬化性動脈中に存在する特に主要な白血球である。従って、オゾン分解産物４ａ又は５ａがマクロファージを動員する能力は、複数の方法においてアテローム発生に影響し得る。第一に、動脈壁内にすでに存在するマクロファージは、コレステロールオゾン分解産物が細胞外で生成されている部位へ動員され得、不安定なプラークの端に発生することが知られているとおり、プラーク内に高い白血球密度の領域をもたらす。あるいは、コレステロールオゾン分解産物の高いレベルを含有するマクロファージは壊死し得、コレステロールオゾン分解産物の放出及び炎症性病巣へのマクロファージの更なる動員に至り得る。最終的に、コレステロールオゾン分解産物は、動脈壁の脆弱な部位から拡散し得、これは、ヒトアテローム硬化性患者の血漿中のコレステロールオゾン分解産物５ａの存在によって裏付けられる可能性がある。これらの現象は、化学誘引物質の形成、マクロファージの走化性、動員及び活性化の周期を生じ、これが更に化学誘引物質を形成するに至る。このプロセスは、アテローム硬化性病変の形成及び進行を十分に促進し得る。
【０４２２】
ＬＤＬの存在下でのオゾン分解産物４ａ（２５μＭ）による血管内皮細胞（ＨＡＡＥ−１）単層の処理は、媒体対照と比較して、接着分子内皮Ｅ−セレクチンの発現の４倍超の上方制御を刺激する（Ｐ＜０．０５、図１５）。これに対して、インテグリン、血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ）−１及び細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）−１のレベルは変化しないままである。オゾン分解産物４ａによるＥ−セレクチンレベルの誘導は用量依存的であり、レベルは１．２５μＭオゾン分解産物４ａでの２倍から、５０μＭアテローナルＡでの約８倍まで増大した(図１５Ｂ）。Ｅ−セレクチンの上方制御のこの特性は、インテグリン発現に対する効果が存在しないことと相俟って、ＣｕＯｘ−ＬＤＬに関して観察されるものと同一であった［（ＴＢＡＲＳ、８０ないし１００ｎｍｏｌ／タンパク質ｍｇ）、ｐ＜０．００５］。オゾン分解産物５ａ及びＬＤＬとの内皮細胞の温置の結果、媒体対照と比較して、Ｅ−セレクチンレベルが上方制御され（１．８倍）、未変性のＬＤＬで観察されるもの（約３倍増、三つ組で検査された複数回の実験）と同様であった（図１５）。（ＬＤＬと複合体形成していない）オゾン分解産物４ａ又は５ａ、コレステロール（データ非表示）、又は媒体の投与は、セレクチン又はインテグリンの何れの発現にも影響しない結果となった。
【０４２３】
ＬＤＬと複合体を形成している場合、オゾン分解産物４ａが、Ｅ−セレクチンの上方制御における有意で用量依存的な亢進を生じることを前提として、蛍光顕微鏡を使用して細胞間接着を評価した。これらの実験によって、単独の又はＬＤＬと複合体を形成したオゾン分解産物４ａ及び５ａも、ＣｕＯｘ−ＬＤＬも、培養Ｕ−９３７単球細胞の内皮細胞単層への接着を有意に亢進させ、ＬＤＬ単独のものを上回ることが明らかとなった。ＬＤＬと複合体を形成されたオゾン分解産物４ａ及び５ａの動脈内皮細胞接着に及ぼす効果を総合すると、ＣｕＯｘ−ＬＤＬのものと非常に類似している（Ｋｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：１２６２−７０、Ｖｉｅｌｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４５：８７３−８０）。インテグリン発現に対して効果を及ぼさず、単球細胞の内皮細胞への平衡的結合を有意に増加させないセレクチン上方制御の特性は、弱い白血球−内皮相互作用の誘導と合致するものであり、白血球の完全な接着ではなくローリングを誘導するための古典的なモデルである（Ｃｈａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：９９３５−９９３８（１９８７）ａ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｆｆｅｃｔ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅａｒｌｙ  ｓｔａｇｅｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）。
【０４２４】
先行研究は、オキシステロールである７−ケトコレステロール、７−ヒドロキシコレステロール及び２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロールは、単球の分化を誘導できるのに対し、２５−ヒドロキシコレステロール等のその他のものは、誘導できないことを示している（Ｈａｙｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４３：２６−３５）。従って、オゾン分解産物４ａ又は５ａの単球分化特性を検討した。
【０４２５】
培養ヒト単球ＴＨＰ−１細胞分化に及ぼすコレステロール５，６−セコステロールの効果を研究する初期の研究は、これらの細胞が、本来、懸濁液中においてオゾン分解産物５ａで処理した２４ないし４８時間後に塊に凝集し始めることを示した。オゾン分解産物５ａ（１２．５及び２５μＭ）による曝露のより長い期間（約４日）で、細胞の集団は接着し始めた。培養の７日以内に、接着性ＴＨＰ−１細胞は、肥大を示し、細胞質液胞を発達させ、突起の延長を形成し、これらは全て成熟マクロファージに特有のものであった（図１６ＧないしＨ）。ＴＨＰ−１分化に及ぼすオゾン分解産物５ａのこれらの効果は、７−ＫＣの陽性対照（２５μＭ）に対して、量及び時間枠の両者で正確に模倣されていた(図１６ＣないしＤ）。これに対して、媒体単独（データ非表示）、コレステロール（２５μＭ、図１６ＡないしＢ）、又はオゾン分解産物４ａ（２５μＭ、図１６ＥないしＦ）の何れかで処理されたＴＨＰ−１細胞は、接着性にならず、且つ上述の形態学的変化も発達させなかった。従って、オゾン分解産物５ａの分化活性は、特に単球を動員する天然のケモカイン、例えばＭＣＰ−１と結合されたときに、炎症性動脈壁内での機能的マクロファージの数を増加させるように機能する。
【０４２６】
オゾン分解産物５ａによって誘導されたＴＨＰ−１細胞の分化は、試験管内でのヒト単球分化の同様の時間経過にわたって生じ、典型的には、ＴＨＰ−１細胞由来のマクロファージが発達するためには４ないし７日間を要する。更に、測定されたＴＨＰ−１細胞分化を生じるオゾン分解産物５ａの濃度である２５μＭ（１０．４μｇ／ｍＬ）は、オキシステロール７−ＫＣによるＴＨＰ−１細胞分化に必要な桁と同じ桁であり、この点において、これらが等しい効力を有することを示唆する（Ｈａｙｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４３：２６−３５（２００２））。オゾン分解産物５ａがマクロファージの分化を誘導する機序は明らかではない。しかしながら、細胞接着の誘導及び形態学的変化が相対的に遅いという事実を基礎とすれば、サイトカインの誘導及び放出を包含する機序が、妥当であるように思われる。分化が遅い場合、７−ＫＣを含む他のオキシステロールが、他の血管細胞中に、単球コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）及び顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）等の炎症誘発性サイトカインを生じ得ることがすでに示されている。オゾン分解産物５ａが単球のマクロファージへの分化を惹起するのに対して、オゾン分解産物４ａが単球のマクロファージへの分化を惹起しないという事実は、コレステロールオゾン分解産物が同一の化学的組成及び同様の構造を共有しながら、別個の分子種として挙動できることを明らかにする。
【０４２７】
概して、プラーク中よりも何倍も高いレベルで、オキシステロールのレベルが泡沫細胞中に濃縮されていることが、複数の研究によって明らかにされてきた。粥状プラーク内で及びヒトアテローム硬化性プラークから単離された泡沫細胞内に、オキシステロールが、総コレステロールの１％のレベルで存在し得ることが示されている（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．３８：１７３０−１７４５（１９９７））。コレステロールオゾン化産物については、疾病になったアテローム硬化性動脈内での絶対濃度は、コレステロールに関して、これまでのところ確かに公知ではない。しかしながら、先行実施例に記載されているとおり、オゾン分解産物５ａの血漿レベルは、（健常な受診者及び進行した頸動脈疾病を有する受診者のコホートにおいて）２０ｎＭから５００ｎＭまで変動できる。一般にオキシステロールレベルについて知られていることに鑑みれば、アテローム硬化性動脈内において、オゾン分解産物のレベルは有意により高いことはあり得る。本実施例で実施された実験は、平衡血漿レベルよりもむしろ、アテローム硬化性プラーク内及びプラーク中に見出される泡沫細胞内でのレベルをより反映していると考えられる３ないし２５μＭのオゾン分解産物濃度範囲に焦点を絞っている。実施された研究は全て、直接又はマクロファージ表面受容体の上方制御を介してマクロファージ中へ取り込むこと、及び単球の組織マクロファージへの分化等の、プラーク材料内で惹起される効果か、又はプラーク材料から血管内皮細胞等の密接に会合された細胞へのオゾン分解産物の漏出によって惹起できる効果の何れかを研究しているので、これらの効果は有効であると考えられる。
【０４２８】
従って、本実施例は、アテローム硬化性プラーク材料中に存在するコレステロールオゾン分解産物４ａ又は５ａが、アテローム発生及びアテローム硬化性の進行に有意に影響し得る生物学的効果を有することを示す。オゾン分解産物４ａ又は５ａは、走化性及び内皮接着分子の上方制御を介して、血管組織へのマクロファージの動員を容易にする。更に、これらのオゾン分解産物は、単球のマクロファージへの分化、及びオゾン分解産物によって修飾されたＬＤＬのスカベンジャー受容体取り込みを介するマクロファージ泡沫細胞形成を惹起する。更に、コレステロールオゾン化産物４ａ及び５ａは、受容体とは独立した過程によってマクロファージ中に入る。これらのコレステロールオゾン化産物によって誘導される効果は全て、炎症性動脈疾患に関して進行している重要な病理学的過程である。
【０４２９】
本発明者は、他の実施例で、切り出されたアテローム硬化性動脈中において、炎症性細胞の活性化がオゾン分解産物４ａ又は５ａの急性産生に寄与することを示している。しかしながら、オゾン分解産物４ａ又は５ａが、一つには、環境汚染に由来するオゾンへの肺の曝露から慢性的に生じる可能性もある。このように、オゾン分解産物４ａ又は５ａは、環境汚染と心臓血管疾病との間に存在する公知の関連性において、これまで認識されていなかった化学的プレーヤーであり得る。
【０４３０】
【表６】
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【０４３１】
本明細書中に引用又は掲記されている全ての特許及び公報は、本発明が属する当業者の技術レベルを示すものであり、引用されたこのような各特許又は公報は、個別にその全ての内容が参照により組み込まれ、又はその全体が本明細書に記載された場合と同程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。出願人は、このような引用された全ての特許又は公報から得られる一切の資料及び情報を本明細書に物理的に組み入れる権利を留保する。
【０４３２】
本明細書に記載されている具体的な方法及び組成物は、好ましい実施形態の代表であり、典型的なものであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。本明細書を検討すれば、当業者は、他の目的、態様及び実施形態に想到し、他の目的、態様及び実施形態は、特許請求の範囲によって定義される本発明の精神に包含される。本発明の範囲及び精神から逸脱せずに、本明細書に開示されている本発明に対して、様々な置換及び改変がなされ得ることは、当業者にとって自明である。本明細書に例示的に記載されている本発明は、必須なものとして本明細書に具体的に開示されていない全ての要素又は限定の不存在下で適切に実施され得る。本明細書に例示的に記載されている方法及びプロセスは、工程の異なる順序で適切に実施され得、しかも本明細書又は特許請求の範囲に示されている工程の順序に必ずしも限定されるものではない。本明細書及び上述の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「一つの（ａ，ａｎ）」及び「その」は、別段の明確な記載がなければ複数形の表記を含む。従って、例えば「抗体」にという表記は、このような抗体の複数形（例えば、抗体又は一連の抗体調製物の溶液）を含む。いかなる場合でも、本特許は、本明細書に具体的に開示されている具体的な実施例又は実施形態又は方法に限定されるものと解釈され得るものではない。いかなる場合においても、本特許は、特許庁の審査官又はその他の官吏又は被用者によって為された陳述が、出願人による答弁書において、具体的に、及び限定又は留保なしに明示的に採用された場合を除き、このような陳述によって限定され得ない。
【０４３３】
使用されている用語及び表現は、説明の用語として用いられているものであり、限定の用語として用いられているものではなく、示されている及び記載されている特長及びその一部のあらゆる均等物を除外するように、このような用語及び表現を使用することを意図するものではないが、多様な改変が、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲内で可能であることが認識される。従って、本発明は、好ましい実施形態及び必要に応じて存在する特長によって具体的に開示されているが、本明細書に開示されている概念の改変及び変動が、当業者によって使用され得、このような改変及び変動は、上述の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲に属するものと考えられることが理解される。
【０４３４】
本発明は、本明細書において、広範囲に及び包括的に記載されている。包括的な開示の中に属する、より狭い種及び亜属のグループの各々も、本発明の一部を形成する。摘出された資料が本明細書中に具体的に記載されているかどうかに関わらず、これには、属からの何れかの主題を除去する但し書き又は否定的限定を伴う本発明の包括的記載が含まれる。
【０４３５】
その他の実施形態は、上記の特許請求の範囲内に属する。さらに、本発明の特徴又は態様がマーカッシュ群として記載されている場合には、当業者は、これにより、本発明がマーカッシュ群の個別の全ての要素又は要素の亜群に関しても記載されていることを認識する。
【図面の簡単な説明】
【０４３６】
【図１Ａ】図１Ａは、インジゴカルミン１が、１２−ミリスチン酸１３−酢酸４−β−ホルボール（ＰＭＡ）処理されたヒトアテローム硬化性病変により酸化され、イサチンスルホン酸２が形成され得ることを示し、オゾンによるインジゴカルミン１のイサチンスルホン酸２への転化中に生じる化学変化を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、インジゴカルミン１が、１２−ミリスチン酸１３−酢酸４−β−ホルボール（ＰＭＡ）処理されたヒトアテローム硬化性病変により酸化され、イサチンスルホン酸２が形成され得ることを示し、ＰＭＡにより活性化されたアテローム硬化性病変によるインジゴカルミン１の漂白を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、インジゴカルミン１が、１２−ミリスチン酸１３−酢酸４−β−ホルボール（ＰＭＡ）処理されたヒトアテローム硬化性病変により酸化され、イサチンスルホン酸２が形成され得ることを示し、逆相ＨＰＬＣによって分析されるように、新たなＨＰＬＣピークが、図１Ｂに示される＋ＰＭＡバイアルの上清中に生じることを示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、インジゴカルミン１が、１２−ミリスチン酸１３−酢酸４−β−ホルボール（ＰＭＡ）処理されたヒトアテローム硬化性病変により酸化され、イサチンスルホン酸２が形成され得ることを示し、図１Ｂに関して上述のとおりのインジゴカルミン１と反応した、遠心分離したＰＭＡにより活性化されたヒトアテローム硬化性プラーク物質由来の、上清の陰イオンエレクトロスプレー質量分析図を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、アルドール化によって５ａへ転化できる５，６−セコステロール４ａを付与するためのコレステロール３のオゾン分解に包含される化学的ステップを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、オキシステロール６ａないし９ａ及び、約１８分で溶出するピークである図３の［Ｍ−Ｈ］−５７９に対する標準物質として研究された塩酸２，４−ジニトロフェニルヒドラジン誘導体６ｂないし７ｂの構造を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）を使用するプラーク物質及びヒドラゾン４ｂ、５ｂ及び６ｂの化学的に合成された確証的な試料の分析を示し、ＰＭＡ活性化はないが、本明細書に記載の２，４−ジニトロフェニルヒドラジンによる誘導体化後のプラーク物質のＬＣＭＳ分析を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）を使用するプラーク物質及びヒドラゾン４ｂ、５ｂ及び６ｂの化学的に合成された確証的な試料の分析を示し、ＰＭＡ（４０μｇ／ｍＬ）による活性化後のプラーク物質のＬＣＭＳ分析、抽出及び上述の２，４−ジニトロフェニルヒドラジンによる誘導体化を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）を使用するプラーク物質及びヒドラゾン４ｂ、５ｂ及び６ｂの化学的に合成された確証的な試料の分析を示し、確証的な４ｂのＨＰＬＣ分析を示し、挿入図は、質量分析を示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）を使用するプラーク物質及びヒドラゾン４ｂ、５ｂ及び６ｂの化学的に合成された確証的な試料の分析を示し、確証的な６ｂのＨＰＬＣ分析を示し、挿入図は、質量分析を示す。
【図３Ｅ】図３Ｅは、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）を使用するプラーク物質及びヒドラゾン４ｂ、５ｂ及び６ｂの化学的に合成された確証的な試料の分析を示し、確証的な５ｂのＨＰＬＣ分析を示し、挿入図は、質量分析を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、微量のヒドラゾンを検出可能にするために１００μＬ注入容積が使用される、抽出され誘導体化されたアテローム硬化性物質のＨＰＬＣ−ＭＳ分析を示し、詳述された条件（上述参照）を使用する時間対強度のＬＣトレースを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、微量のヒドラゾンを検出可能にするために１００μＬ注入容積が使用される、抽出され誘導体化されたアテローム硬化性物質のＨＰＬＣ−ＭＳ分析を示し、［Ｍ−Ｈ］−５９７の単一イオンのモニタリングを提供する。
【図４Ｃ】図４Ｃは、微量のヒドラゾンを検出可能にするために１００μＬ注入容積が使用される、抽出され誘導体化されたアテローム硬化性物質のＨＰＬＣ−ＭＳ分析を示し、［Ｍ−Ｈ］−５７９の単一イオンのモニタリングを提供する。
【図４Ｄ】図４Ｄは、微量のヒドラゾンを検出可能にするために１００μＬ注入容積が使用される、抽出され誘導体化されたアテローム硬化性物質のＨＰＬＣ−ＭＳ分析を示し、［Ｍ−Ｈ］−４６１の単一イオンのモニタリングを示す。
【図５Ａ】図５Ａは、患者ＡないしＮに関するアテローム硬化性抽出物中のコレステロールオゾン化産物の濃度を示し、ＰＭＡによる活性化前及び活性化後の患者のアテローム硬化性病変からの４ａの抽出及び誘導体化後のヒドラゾン４ｂの測定された濃度を示す棒グラフである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、患者ＡないしＮに関するアテローム硬化性抽出物中のコレステロールオゾン化産物の濃度を示し、ＰＭＡによる活性化前後の、患者のアテローム硬化性病変からの５ａの抽出及び誘導体化後の５ｂの測定された濃度を示す棒グラフである（ｎ＝１４）。
【図５Ｃ】図５Ｃは、患者ＡないしＮに関するアテローム硬化性抽出物中のコレステロールオゾン化産物の濃度を示し、患者から採取された血漿試料からの５ａの抽出及び誘導体化後の５ｂの測定された濃度を示す棒グラフである。
【図６Ａ】図６Ａは、Ｂ細胞（ＷＩ−Ｌ２）系に対する３、４ａ及び５ａの細胞毒性を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、Ｔ細胞（ジャーカット細胞）系に対する３、４ａ及び５ａの細胞毒性を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、コレステロールオゾン分解産物４ａ及び５ａが、マクロファージによる脂質負荷を増大させて泡沫細胞を産生することを示し、Ｊ７７４．１マクロファージとともに温置されたＬＤＬには、Ｊ７７４．１マクロファージの脂質負荷に及ぼす効果がほとんどないことを示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、コレステロールオゾン分解産物４ａ及び５ａが、マクロファージによる脂質負荷を増大させて泡沫細胞を産生することを示し、オゾン分解産物４ａとともに温置したＬＤＬが、マクロファージの脂質負荷を誘導して、泡沫細胞を産生することを示す。
【図８Ａ】図８Ａは、ＬＤＬの二次構造が、円二色性によって検出されるように、オゾン分解産物４ａ又は５ａへ触れさせることによって変化することを示し、正常なＬＤＬのタンパク質含有量が、αヘリックス構造の大きな割合（〜４０±２％）並びにβ構造（〜１３±３％）、βターン（〜２０±３％）及びランダムコイル（〜２７±２％）の少量を有することを示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＬＤＬの二次構造が、円二色性によって検出されるように、オゾン分解産物４ａ又は５ａへの曝露によって変化することを示し、３７℃のＰＢＳ（ｐＨ７，４）中でのオゾン分解産物４ａとのＬＤＬのインキュベーションによって、アポＢ−１００の二次構造が損失することを示す。
【図８Ｃ】図８Ｃは、ＬＤＬの二次構造が、円二色性によって検出されるように、オゾン分解産物４ａ又は５ａへの曝露によって変化することを示し、３７℃のＰＢＳ（ｐＨ７，４）中でのオゾン分解産物５ａとのＬＤＬのインキュベーションによって、アポＢ−１００の二次構造が損失することを示す。
【図９】図９は、ダンシルヒドラジンコレステロールオゾン化産物４ａ及び５ａに関する構造（それぞれ、４ｄ及び５ｃ）並びにこれらのヒドラジン誘導体のＨＰＬＣ溶出パターンを示す。
【図１０】図１０は、コレステロールオゾン化産物が、ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣＭＳ）によって、ヒト頸動脈検体中で検出できることを示す。
【図１１】図１１は、ＩＤ−ＧＣＭＳによる２つのアテローム硬化性プラーク（Ｐ１及びＰ２）の定量的な分析を提供している。
【図１２】図１２Ａは、コレステロールオゾン化産物５ｅのダンシル誘導体の取り込み及び局在化を示す。ＰＢＳ中の５ｅ（５０μＭ）で５分間（１００倍、図１２Ａ）及び１時間（２００倍、図１２Ｂ）処理した培養マクロファージ細胞（Ｊ７７４Ａ．１）の蛍光顕微鏡図。図１２Ｃは、ＦＣＳ（１０％）含有培地中のコレステロールオゾン化産物５ｅ（５０μＭ）で５分間処理した培養マクロファージを示す（６０倍）。図１２Ｄは、ＦＣＳ（１０％）含有培地中のコレステロールオゾン化産物５ｅ（５０μＭ）で６０分間処理した培養マクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）を示す（１００倍）。
【図１３】図１３は、マクロファージスカベンジャー受容体発現に及ぼすコレステロールオゾン化産物４ａ及び５ａの効果を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａは、（粥状Ａと呼ばれる）コレステロールオゾン分解産物４ａ及び（粥状Ｂと呼ばれる）５ａの源へのマクロファージの走化性を示し、コレステロール、Ｃ５ａ、オゾン分解産物４ａ又はオゾン分解産物５ａを有するチャンバー中の顕微鏡視野あたりの遊走した細胞を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、（粥状Ａと呼ばれる）コレステロールオゾン分解産物４ａ及び（粥状Ｂと呼ばれる）５ａの源へのマクロファージの走化性を示し、オゾン分解産物５ａを含有する遊走チャンバー中の細胞の蛍光が、オゾン分解産物濃度とともに増大することをグラフで示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、ＬＤＬと複合体形成したオゾン分解産物４ａ（粥状Ａ）又は５ａ（粥状Ｂ）の存在下での血管内皮細胞中の接着分子の発現をグラフで示し、単一濃度でのこれらのコレステロールオゾン分解産物の効果を示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、ＬＤＬと複合体形成したオゾン分解産物４ａ（粥状Ａ）又は５ａ（粥状Ｂ）の存在下での血管内皮細胞中の接着分子の発現をグラフで示し、Ｅ−セレクチン発現に及ぼすＬＤＬオゾン分解産物４ａの上昇する濃度の効果を示す。
【図１６】図１６は、コレステロールオゾン分解産物によって誘発される単球のマクロファージへの分化を示す。ＴＨＰ−１懸濁細胞を次の試薬、すなわちコレステロール（図１６ＡないしＢ）、７−ケトコレステロール（陽性対照、図１６ＣないしＤ）、オゾン分解産物４ａ（粥状Ａ、図１６ＥないしＦ）、オゾン分解産物５ａ（粥状Ｂ、図１６ＧないしＨ）の１２．５μＭ若しくは２５μＭの何れかで７日間処理した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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