(57)【要約】  本発明は、慢性全腸炎の新規な治療法に関する。より具体的には、本発明は、抗−ＴＮＦα抗体産生乳酸菌を含む薬剤の生産、およびこの薬剤の慢性全腸炎の治療における使用、に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＢＤ治療用薬剤の調製のための、抗−ＴＮＦαＶＨＨ産生微生物の使用。
【請求項２】
前記抗−ＴＮＦαＶＨＨが二価抗体である、請求項１記載の使用。
【請求項３】
前記微生物が乳酸菌である、請求項１または２記載の抗−ＴＮＦαＶＨＨ産生微生物の使用。
【請求項４】
前記乳酸菌がLactococcus lactisである、請求項３記載の使用。
【請求項５】
前記乳酸菌がLactobacillus種である、請求項３記載の使用。
【請求項６】
前記微生物が酵母である、請求項１または２記載の抗−ＴＮＦαＶＨＨ産生微生物の使用。
【請求項７】
前記酵母がSaccharomyces種である、請求項６記載の抗−ＴＮＦαＶＨＨ産生微生物の使用。
【請求項８】
前記ＩＢＤが慢性大腸炎である、請求項１〜７のいずれか一項記載の使用。
【請求項９】
前記ＩＢＤがクローン病である、請求項１〜７のいずれか一項記載の使用。
【請求項１０】
前記ＩＢＤが潰瘍性大腸炎である、請求項１〜７のいずれか一項記載の使用。
【請求項１１】
少なくとも一種の抗−ＴＮＦαＶＨＨ産生微生物を含む、経口投与のための医薬組成物。
【請求項１２】
前記抗−ＴＮＦαＶＨＨが二価抗体である、請求項１１記載の経口投与のための医薬組成物。
【請求項１３】
前記微生物が乳酸菌および酵母からなる群より選ばれる、請求項１１または１２記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記乳酸菌がLactococcus lactisである、請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記乳酸菌がLactobacillus種である、請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記酵母がSaccharomyces cerevisiaeである、請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１７】
有効量の抗−ＴＮＦαＶＨＨ産生微生物を胃腸管へ投与する工程を含む、少なくとも一つの胃腸管の疾患または障害を予防、治療、および／または緩和する方法。
【請求項１８】
前記抗−ＴＮＦαＶＨＨが二価抗体である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記投与が経口投与である、請求項１７または１８記載の方法。
【請求項２０】
前記疾患または障害が過敏性腸疾患である、請求項１７〜１９のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
前記過敏性腸疾患が、慢性大腸炎、クローン病、および潰瘍性大腸炎からなる群より選ばれる、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記微生物が乳酸菌および酵母からなる群より選ばれる、請求項１７〜２１のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
前記乳酸菌がLactococcus lactisである、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記乳酸菌がLactobacillus種である、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
前記酵母がSaccaromyces cerevisiaeである、請求項２２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、慢性全腸炎の新規な治療法に関する。より具体的には、本発明は、抗−ＴＮＦαを産生する乳酸菌を含む薬剤の生産、およびこの薬剤の慢性全腸炎の治療における使用、に関する。炎症性腸疾患（ＩＢＤ）とは、胃腸管の一部の慢性非特異的炎症によって特徴づけられる胃腸障害の群を指す。ヒトのＩＢＤの最も顕著な例は、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）およびクローン病（ＣＤ）である。ＩＢＤの病因または病因群は不明確である。ＩＢＤ疾患は、腸管における炎症反応の無制限の活性化に起因するように見える。この炎症カスケードは、炎症誘発性サイトカインの作用およびリンパ球サブセットの選択的活性化を通じて存続すると考えられている。ＵＣおよびＣＤは、小児の成長遅延、直腸脱、血便、消耗、鉄分欠乏および貧血を含む多くの症状および合併症に関連している。ＵＣとは、主として結腸粘膜中に現れる、慢性、非特異的、炎症性および潰瘍性の疾患を指す。それはしばしば、血性下痢、腹部仙痛、便中の血液および粘液、不快感、発熱、貧血、食欲不振、体重減少、白血球増多、低アルブミン血、および赤沈亢進によって特徴づけられる。
【０００２】
クローン病は、潰瘍性大腸炎と共通の多くの特徴を共有する。クローン病は、かなり拡散している潰瘍性大腸炎の病変とは対照的に、病変が隣接する正常な腸からはっきり区別される傾向がある点によって識別することができる。さらに、クローン病は、主に回腸（回腸炎）ならびに回腸および結腸（回結腸炎）を冒す。ある場合には結腸のみが罹患し（肉芽腫性大腸炎）、またある場合には全小腸が含まれる。
【０００３】
結腸癌は慢性ＩＢＤの公知の合併症である。それは、長年ＩＢＤを有する患者中で、次第に頻度が高くなる。癌の危険性はＩＢＤの８〜１０年後に著しく上昇し始め、速くて効率的なＩＢＤの治療をさらに重要にする。ＩＢＤを治療するために最も一般的に使用される薬剤には、コルチコステロイドなどの抗炎症薬、ならびにスルファサラジンなどのサルチル酸およびその誘導体が含まれる。これらの薬に応答しない人々のために、シクロスポリンＡ、メルカプトプリン、およびアザチオプリンなどの免疫抑制剤が用いられる。しかし、これらの薬剤はすべて重い副作用を有する。ＩＢＤの治療における最近の成功した進展は、ＴＮＦまたはそのレセプターの働きを遮断する化合物の使用である。その点で最も有望な新しい治療法の一つは、ＴＮＦ抗体の使用である。腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）は、単球およびマクロファージを含む多数の細胞型によって産生されるサイトカインであり、最初は、あるマウス腫瘍の壊死を引き起こす能力に基づいて同定された（例えば、Old, L. (1985) Science 230:630-632を参照のこと）。ＴＮＦαは、敗血症、感染、自己免疫性疾患、移植拒絶反応、および移植片対宿主病を含む、様々な他のヒトの疾患および障害の病態生理に関連することが示唆されている（例えば、Moeller, A. et al. (1990) Cytokine2: 162-169; MoellerらへのU.S. Patent No. 5,231,024 ; Moeller, A.らによるEuropean Patent Publication No. 260 610 (B1); Vasilli. P.(1992) Annu. Rev.Immunol. 10:411-452; Tracey, K.J. and Cerami, A. (1994) Annu. Rev. Med. 45:491-503を参照のこと）。様々なヒトの障害におけるヒトＴＮＦα（ｈＴＮＦα）の有害な役割のために、ｈＴＮＦα活性を阻害するかまたは中和する治療戦略が立案された。ｈＴＮＦα活性を阻害する手段として、特に、ｈＴＮＦαに結合し中和する抗体が探索された。
【０００４】
いくつかの抗体製剤が、ＩＢＤの治療のためにテストされた。ポリクローナル抗体が第II相臨床試験においてテストされたが、モノクローナル抗体が明白に好ましい。インフリキシマブは、ＩｇＧ１Ｋサブクラスの、キメラヒト−マウスモノクローナル抗体であり、それは細胞膜上および血液中のＴＮＦαを特異的に標的とし、非可逆的に結合する。５〜２０mg/kgの範囲の抗体インフリキシマブの一回の静脈内投与が、活動的なクローン病の大幅な臨床的改善をもたらし；それは、１９９８年にクローン病を治療するために市場に出された。
【０００５】
キメラ抗体に関連して起こり得る問題を解決するために、ヒトモノクローナルＴＮＦαアダリムマブが開発され、それは現在クローン病治療の第III相臨床試験でテストされている。患者中の抗体の半減期を改善するために、Celltech社は、セルトリズマブ・ペゴールを開発した、それはヒト化モノクローナルＰＥＧ化抗−ＴＮＦα抗体であり、現在クローン病の治療の第III相臨床試験でテストされている。
【０００６】
しかし、それらのすべての場合において、抗体は全身性に、主として皮下注射によって投与される。抗−ＴＮＦα抗体の全身性投与は、頭痛、膿瘍、上気道感染症、および疲労を含む、かなり重大な望ましくない影響をもたらす可能性がある。
【０００７】
全身性送達に関連する望ましくない影響を、炎症箇所への局所的送達によって解決することができよう。腸の中へ生物学的活性化合物を送達するための有望なシステムが、ＷＯ９７／１４８０６に開示されており、それによれば、乳酸菌のような非侵襲性のグラム陽性細菌が、生物学的活性化合物を消化管へ送達するために用いられる。ＷＯ００／２３４７１は、このシステムを回腸にＩＬ−１０を送達するために用いることができ、それによってＩＢＤを治療するためにこの菌株を用いることができることを開示する。ＷＯ０１／９８４６１は、酵母を用いる腸への送達のための代替法を開示する。しかし、生物学的活性化合物の送達については記述されているが、これらの文書は抗体の腸への送達については教示しない。抗体の折り畳みおよび分泌の両方が決定的に重要であるので、活性を有する抗体の腸中でのインサイチューの産生は、決して簡単ではない。特に、硫黄架橋による構造の安定化が、細菌または酵母中での抗体の産生について、問題を引き起こす可能性がある。さらに、ＩＬ−１０のようなサイトカインは触媒機能を果たすが、ＴＮＦ抗体は、産生された内因性ＴＮＦを不活性化するのに十分な量が産生される必要がある。驚くべきことに、我々は、遺伝子操作した微生物による抗−ＴＮＦα抗体の局所的送達を、ＩＢＤを治療するために効率的な形で用いることができることを見出した。
【０００８】
本発明の第１の局面は、抗−ＴＮＦα抗体を産生する遺伝子操作された微生物の、ＩＢＤを治療する薬剤の調製のための使用である。本明細書で用いる用語、抗体には、ＶＨＨなどの抗体フラグメントも含む、普通の抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、二機能性抗体、二価抗体、二特異性抗体およびラクダ科動物抗体が非限定的に含まれる。好ましくは、前記抗体はラクダ科動物抗体フラグメント（ＶＨＨ；以下ナノボディと呼ぶ）であり、さらに好ましくは前記抗体は二価抗−ＴＮＦαナノボディである。二価抗体は、ＴＮＦのそのレセプターへの結合を、一価抗体よりも著しく効率的に阻害するという長所を有する（それぞれ、ＥＣ５０＝１６pMおよび６．７nM）。驚いたことに、我々は、Lactococcus中の二価抗体の産生が一価抗体と同程度か、またはさらに高くさえなることを見出した。
【０００９】
好ましくは、前記遺伝子操作された微生物は、乳酸菌または酵母である。乳酸菌による、生物学的活性を有するポリペプチドの動物体内への送達が、ＷＯ９７１４８０６に開示されており；酵母によるペプチドの腸への送達が、ＷＯ０１９８４６１に記述されている。しかし、これらの文書のいずれも、腸中への抗体またはナノボディの送達には言及しない。抗体の正確な折り畳みおよび分泌が必要であり、中和活性を得るためには十分な抗体が必要であるので、生物学的活性を有する抗体またはナノボディのインビボの産生、分泌および送達は決して明白ではない。
【００１０】
一つの好ましい実施態様では、前記遺伝子操作された微生物は、Lactococcus lactis株であり、好ましくは前記遺伝子操作菌株は、Lactococcus lactis ThyA突然変異株である。特に好ましい実施態様は、ＴＮＦ−α抗体をコードする遺伝子がＴＨＹＡ遺伝子を破断するために用いられた、Lactococcus lactis ThyA突然変異株の使用である。
【００１１】
別の好ましい実施態様では、酵母が抗−ＴＮＦα抗体を送達するために用いられる。好ましくは前記酵母は、Saccharomyces cerevisiaeであり、さらに好ましくは、前記酵母はSaccharomyces cerevisiaeの亜種Boulardiiである。
【００１２】
本明細書で用いるＩＢＤには、慢性大腸炎、潰瘍性大腸炎およびクローン病が非限定的に含まれる。好ましくは、ＩＢＤは慢性大腸炎である。
【００１３】
本発明の別の局面は、少なくとも一つの遺伝子操作抗−ＴＮＦαＶＨＨ産生微生物を含む経口投与用の医薬組成物である。好ましくは、前記抗−ＴＮＦαＶＨＨは二価抗体である。医薬組成物は、生物活性を有する微生物を含む液体であってよいし、またはそれは適当な環境に入れられたときに再活性化できる、乾燥微生物を含む固体であってもよい。微生物を、凍結乾燥および噴霧乾燥を含む任意のシステムによって乾燥させてよい。本明細書で用いる「抗−ＴＮＦαＶＨＨを産生する」とは、微生物が医薬組成物中でＶＨＨを生成していることを意味するのではなく、微生物が適当な環境に置かれたときに、生存可能で、ＶＨＨを産生することができることを意味する。胃腸管への送達を促進するために、微生物を被覆してもよい。そのような被覆はその当業者には公知であり、それはとりわけ、Huyghebaert et al. (2005)によって記述された。医薬組成物は、さらにトレハロース（しかしそれに限定されない）などの微生物の生存度を改善する試薬を含んでもよい。好ましくは、微生物は乳酸菌および酵母からなる群より選ばれる。一つの好ましい実施態様は、ＶＨＨ産生微生物がLactococcus lactis、好ましくはＴｈｙＡ突然変異株である、医薬組成物である。別の好ましい実施態様は、ＶＨＨ産生微生物がLactobacillus種であり、好ましくはＴｈｙＡ突然変異株である医薬組成物である。好ましくは、前記ＴｈｙＡ突然変異株は、ＶＨＨをコードするコンストラクトを挿入として用いて、遺伝子破断によって得られる。さらに別の好ましい実施態様は、ＶＨＨ産生微生物が、Saccharomyces cerevisiae、好ましくはS. cerevisiae亜種boulardiiである医薬組成物である。
【００１４】
本発明の別の局面は、有効量の抗−ＴＮＦαＶＨＨ産生微生物を胃腸管へ投与する工程を含む、少なくとも１つの胃腸管の疾患または障害を予防し、治療し、および／または緩和する方法である。好ましくは、前記抗−ＴＮＦαＶＨＨは二価抗体である。投与する方法は、当業者に公知の任意の方法でよく、経口および直腸内投与を非限定的に含む。好ましくは、投与方法は経口投与である。好ましくは、前記疾患または障害は、ＴＮＦα産生の不均衡によって特徴づけられる疾患または障害であり、ＴＮＦα抗体などのＴＮＦαを不活性化する化合物によって治療することができる。さらにより好ましくは、前記疾患は、慢性大腸炎、潰瘍性大腸炎およびクローン病を非限定的に含む、過敏性腸疾患である。最も好ましくは、前記疾患または障害は慢性大腸炎である。
【００１５】
好ましくは、前記遺伝子操作微生物は、乳酸菌または酵母である。一つの好ましい実施態様では、前記遺伝子操作微生物はLactococcus lactis株、好ましくは前記遺伝子操作微生物はLactococcus lactis ThyA突然変異株である。特に好ましい実施態様は、ＴＮＦ−α抗体をコードする遺伝子がＴＨＹＡ遺伝子を破断するために用いられた、Lactococcus lactis ThyA突然変異株である。別の好ましい実施態様では、遺伝子操作微生物はLactobacillus種菌株であり、好ましくは前記遺伝子操作微生物は、Lactobacillus ThyA突然変異株である。特に好ましい実施態様は、ＴＮＦ−α抗体をコードする遺伝子がＴＨＹＡ遺伝子を破断するために用いられた、Lactobacillus ThyA突然変異株である。別の好ましい実施態様では、酵母が、抗−ＴＮＦα抗体産生微生物である。好ましくは前記酵母は、Saccharomyces cerevisiaeであり、さらに好ましくは前記酵母はSaccharomyces cerevisiae亜種Boulardiiである。
【００１６】
実施例
実施例の材料と方法
【００１７】
細菌およびプラスミド
この研究の全体に亘ってL. lactis菌株ＭＧ１３６３を用いた。細菌を、ＧＭ１７培地、即ち０．５％グルコースを補填したＭ１７（Difco Laboratories, Detroit, MI）中で培養した。すべての菌株のストック懸濁液を、ＧＭ１７中の５０％グリセロール中で、−２０℃で保存した。胃内接種のために、ストック懸濁液を、新鮮なＧＭ１７で２００倍薄め、３０℃でインキュベーションした。それらは、１６時間以内に１ml当たり２×１０9コロニー形成単位（ＣＦＵ）の飽和密度に達した。細菌を遠心分離により収穫し、ＢＭ９培地中で１０倍濃縮した(Schotte, Steidler et al. 2000)。処理については、マウスがそれぞれ、胃内カテーテルによって毎日この懸濁液１００μlを投与された。
【００１８】
抗−マウスＴＮＦナノボディの同定および構成
抗−マウスＴＮＦナノボディの生成を、本質的にＷＯ２００４０４１８６２に述べられているように実行した。ｍＴＮＦでラマを免疫し、それに続くＶＨＨレパートリーのクローニングおよび選別の後に、ナノボディＮＡＮＯ３Ｆ（ＭＷ約１５kDa）を単離した。スペーサーとしてラマＩｇＧ２ａ上端ヒンジ配列の１２のアミノ末端残基を用いて、マウスＴＮＦ特異的ナノボディを二価のフォーマット（ＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆとよぶ、ＭＷ約３０kDa）に変換した。３’端部がＨｉｓＧおよびＭｙｃタグをコードする配列によって伸張された、ＮＡＮＯ３ＦおよびＮＡＮＯ３Ｆ−３ＦのｃＤＮＡを、乳酸菌Ｐ１プロモーター（Waterfield, Le Page et al. 1995）の下流のＵｓｐ４５分泌シグナル（van Asseldonk, Rutten et al. 1990）に融合し、ＭＧ１３６３中に発現させた（著者らからプラスミドコンストラクションの詳細を得ることができる）。ＮＡＮＯ３ＦまたはＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆのコード配列を所持するプラスミドで形質転換されたＭＧ１３６３菌株を、それぞれＬＬ−ＮＡＮＯ３ＦおよびＬＬ−ＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆと名付けた。空ベクターｐＴＲＥＸ１を含むＭＧ１３６３であるＬＬ−ｐＴＲＥＸ１が、対照となった。
【００１９】
L. lactis培地中のナノボディの定量化
Ｍｙｃタグを付けたＬＬ−ＮＡＮＯ３ＦおよびＬＬ−ＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆを、L. lactisの粗上清液のＥＬＩＳＡプレートへの直接の吸着（Maxisorp F96, Nunc, Rochester, NY）、およびそれに続くＭｙｃエピトープに対する特異的マウスｍＡｂ（Sigma, St. Louis, MO）による検出によって定量した。インビボで結腸組織に分泌された３Ｆ−３Ｆナノボディの定量化のために、全結腸を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中でホモジナイズし、超音波処理した。３Ｆ−３Ｆナノボディを、ナノボディ定量化プロトコルにより、結腸上清中で測定した。
【００２０】
マウス血清中の抗−ナノボディ抗体レベルの測定
１４日の間毎日、マウスに、１００μgのナノボディを腹腔内に、またはＬＬ−ＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆを胃内に注入し、続いて瀉血した。我々は、１０μg/mlの濃度のナノボディを、４℃で終夜、マイクロタイタープレート（NUNC Maxisorb）にコートした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで５回洗浄し、室温でＰＢＳ−１％カゼインによって２時間ブロックした。試料をＰＢＳで１／５０稀釈して、室温で２時間適用した。プレートを５回洗浄し、ウサギポリクローナル抗マウス免疫グロブリンＨＲＰ（DAKO、３，０００倍希釈）と、室温で１時間インキュベーションし、洗浄の後、ＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2でプレートを染色して、検出を行なった。ＯＤ405nmを測定した。
【００２１】
抗−可溶性および膜結合型ＴＮＦのバイオアッセイ
ＮＡＮＯ３ＦおよびＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆナノボディの、可溶性ｍＴＮＦ（２０IU/ml）に対する阻害効果を、マウス繊維芽ＷＥＨＩ１６４ｃｌ１３細胞を１μg/mlのアクチノマイシンＤの存在下で用いる１６時間の細胞毒性分析で、記述されたようにして（Espevik and Nissen-Meyer 1986）、測定した。膜結合型ＴＮＦの細胞毒性を打ち消すＮＡＮＯ３ＦおよびＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆの効果を、ＷＥＨＩ１６４ｃｌ１３細胞について、切断されない膜結合型のＴＮＦを発現しているＬ９２９細胞を細胞培養液に加えた後に測定した（Decoster et al. 1998）。
【００２２】
ＬＰＳによるマクロファージの刺激
ＬＰＳによる炎症誘発性サイトカインの誘導に対するＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆの効果を測定するために、ＭＦ４／４マクロファージ（Desmedt et al. 1998）をＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆ（１００μg/ml）とインキュベーションした。１時間後に細胞を十分な体積のＰＢＳで十分に（３回）洗浄して、溶液中に存在する全てのナノボディを完全に除去した。細胞を再懸濁し、ＬＰＳ存在下または不存在下で、４時間インキュベーションした。細胞をＰＢＳで洗浄し（１回）、また４時間のインキュベーションの後、上清と細胞を遠心分離によって分離した。可溶性ＴＮＦの放出を測定するために、ＷＥＨＩ１６４ｃｌ１３細胞バイオアッセイを用いた。
【００２３】
動物
１１週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、Charles River Laboratories (Sulzfeld, Germany)から得た。それらを、ＳＰＦ条件下に収容した。ＩＬ−１０ノックアウトマウス（１２９Ｓｖ／Ｅｖ ＩＬ−１０-/-）(Kuhn, Lohler et al. 1993)を、ＳＰＦ条件下に収容し繁殖させた。ＩＬ−１０-/-マウスを２０週齢で用いた。その週齢で慢性大腸炎が完全に発病していた。全てのマウスは、標準的実験室食料および水道水を好きなだけ与えられた。動物研究は、ゲント大学分子生体医学研究部門の倫理委員会によって承認された（ファイル番号０４／０２）。
【００２４】
ＤＳＳによる慢性大腸炎の誘導
体重およそ２１ｇのマウスが、飲料水中の５％（w/v）ＤＳＳ（４０kDa、Applichem, Darmstadt, Germany）の、正常な飲料水による回復の１０日の期間と交互の、４サイクルの投与によって、慢性大腸炎を誘起された(Okayasu, Hatakeyama et al. 1990; Kojouharoff, Hans et al. 1997)。ＤＳＳの第４サイクル後の２１日目に、任意に治療を開始した。
【００２５】
ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）分析
中央結腸組織中のＭＰＯ活性を、記述されているように（Bradley, Priebat et al. 1982）測定した。純粋なヒトＭＰＯ（Calbiochem, San Diego, CA）を標準として用いた。データをμgＭＰＯ/mm2結腸組織として表す。
【００２６】
組織学的分析
組織学的分析のために、結腸を取り出し、洗浄し、縦に開いた。結腸の中央部から１cmの分画を取り出して、パラフィンに包埋し、縦に切片にした。３つの４μm切片を２００μm間隔で切り出し、ヘマトキシリン／エオシンで染色した。結腸切片にランダムに番号を付け、それを病理学者が盲検法で半定量的に解釈した。組織学的スコアは、記述されているように各々が０〜４の範囲の（Kojouharoff, Hans et al. 1997）、上皮の損害およびリンパ浸潤の合計である。
【００２７】
統計的分析
全てのデータを平均値±ＳＥＭとして表す。パラメトリックデータを、一元配置分散分析および続くダネットの多重比較ポストテストにより分析した。ノンパラメトリックデータ（スコアリング）を、マン・ホイットニー検定で解析した。
【００２８】
実施例１：L. lactisによる抗−ＴＮＦαＶＨＨのインビトロでの産生
L. lactisを、ＮＡＮＯ３ＦおよびＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆをコードするプラスミドで形質転換した。空のプラスミドｐＴＲＥＸで形質転換された菌株およびＩＬ１０産生菌株を参照として用いて、ウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡにより、抗体の産生を検査した。結果を図１に示す。L. lactisによってＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆが、ＮＡＮＯ３Ｆと同程度またはより高い量で産生される。産生された量は、ＩＬ１０よりも有意に多い。
【００２９】
実施例２：ＬＬ−ＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆは生物活性を有し、可溶性および膜結合ＴＮＦ−αの双方を阻害する。
L. lactisによって産生されたＮＡＮＯ３ＦおよびＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆナノボディの可溶性ｍＴＮＦに対する阻害効果を、Espevik and Nissen-Meyer (1986)によって記述されたように、マウス繊維芽ＷＥＨＩ１６４ｃｌ１３細胞を用いる細胞毒性分析により測定した。E.coliが産生したＮＡＮＯ３ＦおよびＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆを、正の参照として用いた。精製されたナノボディおよびL. lactisによって産生されたナノボディの双方が、可溶性ＴＮＦを中和することができる（図２Ａ）。膜結合型ＴＮＦの細胞毒性を中和するＮＡＮＯ３ＦおよびＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆの効果を、切断されない膜結合型ＴＮＦを発現するＬ９２９細胞を細胞培養液に加えた後に、ＷＥＨＩ１６４ｃｌ１３細胞について測定した（Decoster et al. 1998）。ＮＡＮＯ３Ｆの効果は、精製されたものおよびL. lactisが産生したもの、の両方で、それほど明白ではないが、ＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆナノボディの効果は、両方の場合において明白である（図２Ｂ）。
【００３０】
実施例３：確立したＤＳＳ誘起慢性大腸炎に対する、インビボでのＬＬ−ＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆの効果
慢性大腸炎が、材料および方法に述べたようにＤＳＳにより誘起された。マウスを毎日２×１０9コロニー形成単位（CFU）のＬＬ−ｐＴＲＥＸ１、ＬＬ−ＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆ、またはＬＬ−ｍＩＬ１０のいずれかで処理した。擬処理および健康なマウス（「水対照」）を、追加の対照として用いた。L. lactisにより送達されるＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆナノボディの効果は、インサイチューで産生されたＩＬ−１０によって得られる保護に匹敵する（図３）。
【００３１】
実施例４：確立されたＩＬ−１０-/-全腸炎に対する、インビボでのＬＬ−ＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆの効果
ＩＬ−１０-/-全腸炎における保護を評価するために、２０週齢の処理されたまたは未処理の１２９Ｓｖ／Ｅｖ ＩＬ−１０-/-マウスの病的状態。各群は、擬処理群以外は、１４日間、毎日２×１０9ＣＦＵのＬＬ−ｐＴＲＥＸ１（ベクター対照）、ＬＬ−ＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆ、またはＬＬ−ｍＩＬ１０のいずれかを投与された。図４に結果を要約する。ミエロペルオキシダーゼ分析ならびに組織学的スコアの両方が、ＬＬ−ＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆ処理マウスでの有意な保護を示す。
【００３２】
実施例５：ＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆの免疫原性
ＬＬ−ＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆのあり得る有害な免疫原性効果を評価するために、マウスを１４日間に亘ってＬＬ−ＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆで胃内処理し、対照として精製されたナノボディの腹腔内注射を用いた。抗−ナノボディ抗体のレベルをマウス血清中で測定した。結果を図５に示す。ＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆの腹腔内注射が明らかな免疫応答を与えている一方で、ＬＬ−ＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆによる処理には免疫原性がなく、その点で安全であることを証明している。
【００３３】
実施例６：ＬＰＳによる炎症誘発性サイトカインの誘導に対するＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆの効果
ＬＰＳによる炎症誘発性サイトカインの誘導に対するＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆの効果を測定するために、ＭＦ４／４マクロファージ（Desmedt et al., 1998）をＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆとインキュベーションした。細胞を洗浄し、次にＬＰＳとインキュベーションした。可溶性ＴＮＦの放出を、ＷＥＨＩ１６４ｃｌ１３細胞毒性分析を用いて測定した。結果を図６に示す。ＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆナノボディによるマクロファージの前処理が、ＬＰＳによって誘起される可溶性ＴＮＦ産生に対して明確な保護を与える。
【００３４】
実施例７：二価抗体は一価抗体より驚くほど高性能である。
二価抗体は一価抗体より大きいが、それは乳酸菌中での産生に影響を与えない。二価抗体の産生は、一価抗体よりも良いことはないとしても、少なくとも同程度には良い（図１）。しかし、さらに重要なのは、二価抗体の有効性である。インビボの実験から、一価の抗−ＴＮＦ抗体は、組織学的スコアのわずかであって有意でない改良をもたらすのみであるが、一方で二価抗体を分泌するL. lactisの投与は有意な改良をもたらすことが明白である（図７）。確かに、二価抗体の中和作用は、同程度のタンパク質濃度について、一価抗体よりも顕著である。完全な中和が達成されないうちは、改良は２倍を越えており、それは単にナノボディの２倍の価数によるものではないことを示している（図８）。
【００３５】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】遺伝子操作されたL. lactisによる異種の一価および二価のナノボディＮＡＮＯ３Ｆ（ＬＬ−ＮＡＮＯ３ＦおよびＬＬ−ＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆ）産生の時間経過。ＬＬ−ｐＴＲＥＸ１：ベクター対照；ＬＬ−ｍＩＬ１０：マウスインターロイキン１０を分泌するL. lactis株。（Ａ）抗−Ｍｙｃ抗体によって示された、様々な菌株から分泌されたタンパク質のウエスタンブロット解析。ブロットの各レーンは、種々の増殖期間の後に得られた２５０μlのL. lactis培養液上清である（時間ゼロで、２×１０7ＣＦＵ）。E.coliの精製された一価ＮＡＮＯ３Ｆ（＋）および二価ＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆ（＋＋）を、正の対照として用いた。（Ｂ）ＬＬ−ｐＴＲＥＸ１（◇）、ＬＬ−ＮＡＮＯ３Ｆ（■）、ＬＬ−ＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆ（▲）およびＬＬ−ｍＩＬ１０（○）の培養液上清中に分泌された、異種のＭｙｃタグ付きタンパク質の濃度（ＥＬＩＳＡによって測定した）。
【図２Ａ】L. lactisから分泌された、またはE.coliから精製された一価および二価のナノボディＮＡＮＯ３Ｆは、可溶性のおよび膜結合性のＴＮＦを効率的に中和することができる。（Ａ）可溶性ＴＮＦ（２０IU/ml）が、１μg/mlのアクチノマイシンＤ存在下でＷＥＨＩ１６４ｃｌ１３細胞を用いる１６時間の細胞毒性分析において、ＮＡＮＯ３ＦおよびＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆによって中和された。（Ｂ）L. lactisから分泌された、またはE.coliから精製されたナノボディ、ＮＡＮＯ３ＦおよびＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆは、切断されない膜結合型ＴＮＦを発現するＬ９２９の細胞毒性効果を阻害することができた。灰色のバーは、精製されたＮＡＮＯ３ＦまたはＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆ（総濃度２５０ng/ml）を加えたウエルを表わす。黒いバーは、濾過した（０.２２μm）乳酸菌上清５０μlを加えたウエルを表わす。ＬＬ−ＮＡＮＯ３ＦおよびＬＬ−ＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆの最終濃度は、各設定中で２５０ng/mlであった。
【図２Ｂ】L. lactisから分泌された、またはE.coliから精製された一価および二価のナノボディＮＡＮＯ３Ｆは、可溶性のおよび膜結合性のＴＮＦを効率的に中和することができる。（Ａ）可溶性ＴＮＦ（２０IU/ml）が、１μg/mlのアクチノマイシンＤ存在下でＷＥＨＩ１６４ｃｌ１３細胞を用いる１６時間の細胞毒性分析において、ＮＡＮＯ３ＦおよびＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆによって中和された。（Ｂ）L. lactisから分泌された、またはE.coliから精製されたナノボディ、ＮＡＮＯ３ＦおよびＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆは、切断されない膜結合型ＴＮＦを発現するＬ９２９の細胞毒性効果を阻害することができた。灰色のバーは、精製されたＮＡＮＯ３ＦまたはＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆ（総濃度２５０ng/ml）を加えたウエルを表わす。黒いバーは、濾過した（０.２２μm）乳酸菌上清５０μlを加えたウエルを表わす。ＬＬ−ＮＡＮＯ３ＦおよびＬＬ−ＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆの最終濃度は、各設定中で２５０ng/mlであった。
【図３】慢性ＤＳＳ大腸炎の病的状態の分析。（Ａ〜Ｅ）健康な対照マウス（Ａ）、および擬処理された（Ｂ）、あるいはＬＬ−ｐＴＲＥＸ１（Ｃ）、ＬＬ−ＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆ（Ｄ）またはＬＬ−ｍＩＬ１０（Ｅ）で処理された、慢性のＤＳＳ大腸炎を有するマウスの中央結腸の代表的な組織構造。（Ｆ）中央結腸の組織学的スコアの統計的評価。バーは、平均値±ＳＥＭを表わす。白いバーは、健康な対照群を表わす。ＤＳＳによって誘起された慢性大腸炎を有するマウスが、擬処理された（斜線バー）か、あるいはＬＬ−ｐＴＲＥＸ１（黒バー）、ＬＬ−ＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆ（赤バー）またはＬＬ−ｍＩＬ１０（灰色バー）を投与された。＊＊＊および＊＊は、擬処理群およびベクター対照群と比較した、それぞれＰ＜０．００１およびＰ＜０．０１の統計的有意差を表わす。
【図４】２０週齢の１２９Ｓｖ／Ｅｖ ＩＬ−１０-/-マウスの病的状態の分析。擬処理群を除いて、各群は、１４日間毎日２×１０9ＣＦＵのＬＬ−ｐＴＲＥＸ１（ベクター対照）、ＬＬ−ＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆ、またはＬＬ−ｍＩＬ１０を投与された。（Ａ〜Ｄ）擬処理された（Ａ）、あるいはＬＬ−ｐＴＲＥＸ１（Ｂ）、ＬＬ−ＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆ（Ｃ）、またはＬＬ−ｍＩＬ１０（Ｄ）で処理された、ＩＬ−１０-/-マウスの中央結腸の代表的な組織像（ヘマトキシリン−エオシン染色）。結腸組織のmm2当たりのＭＰＯレベル（Ａ）および遠位結腸の組織学的スコア（Ｂ）、の統計的評価。バーは、平均値±ＳＥＭを表す。斜線付きバーは、擬処理された１２９Ｓｖ／Ｅｖ ＩＬ−１０-/-マウスを表し、黒バーは、ベクター対照ＬＬ−ｐＴＲＥＸ１を投与された１２９Ｓｖ／Ｅｖ ＩＬ−１Ｏ-/-マウスを表し、赤バーはＬＬ−ＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆを投与された１２９Ｓｖ／Ｅｖ ＩＬ−１０-/-マウスを表し、および灰色バーはＬＬ−ｍＩＬ１０で処理された１２９Ｓｖ／Ｅｖ ＩＬ−１０-/-マウスを表わす。＊および＊＊は、それぞれベクター対照群と比較したＰ＜０．０５およびＰ＜０．０１の統計的有意差を表す。
【図５】ナノボディ特異抗体の存在を、ＥＬＩＳＡにより評価した。
【図６】ＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆによる前処理が、Ｍｆ４／４マクロファージをＬＰＳ無応答にする。ＷＥＨＩ１６４ｃｌ１３細胞は、依然として５IU ＴＮＦで殺される。
【図７】慢性ＤＳＳ大腸炎を有するマウスの遠位結腸の組織学的スコアの統計的評価。バーは、平均値±ＳＥＭを表す。白バーは健康な対照群を表す。ＤＳＳ誘起慢性大腸炎を有するマウスが、種々のL. lactis培養液を２８日間投与され、その後直ちに殺され、解析された。黒バーは、ベクター対照のＬＬ−ｐＴＲＥＸ１処理群、斜線付きバーは、ＬＬ−ＮＡＮＯ３Ｆ（L. lactisが分泌する一価の３Ｆ）を投与された群、灰色バーは、ＬＬ−ＮＡＮＯ３Ｆ−３Ｆ（L. lactisが分泌する二価の３Ｆ−３Ｆ）を投与された群を表す。＊＊は、ベクター対照ＬＬ−ｐＴＲＥＸ１処理群およびＬＬ−ＮＡＮＯ３Ｆ処理群と比較した、Ｐ＜０．０１の統計有意差を表わす。
【図８】L. lactis が分泌した一価および二価のナノボディ３Ｅ（抗−ヒトＴＮＦナノボディ）は、可溶性ヒトＴＮＦを効率的に中和することができる。可溶性ヒトＴＮＦ（３０〜３．３IU/mlの範囲の種々の濃度）が、１μg/mlアクチノマイシンＤの存在下でＬ９２９細胞を用いた、１６時間の細胞毒性分析において、３Ｅおよび３Ｅ−３Ｅによって中和された。細胞生存率を正常細胞と比較して計算した。白バーは、濾過した（０．２２μm）ベクター対照ＬＬ−ｐＴＲＥＸ１の乳酸菌上清５０μLを加えたウエルを表す。黒および灰色バーは、それぞれL. lactisが分泌した３Ｅまたは３Ｅ−３Ｅを含む、濾過した（０．２２μm）乳酸菌上清５０μLを加えたウエルを表す。L. lactisが分泌した３Ｅまたは３Ｅ−３Ｅの最終濃度は、各設定において、２５０ng/mlであった。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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