(57)【要約】本発明は、正常な個体および乳管癌を含む乳癌を有する個体からの試料における、示差的にメチル化されているDNAマーカー配列を提供する。本発明はさらに、示差的にメチル化されたDNAマーカー配列を同定する方法ならびに乳癌の検出および診断のためのその使用を提供する。2009538624.tif 000072
2009538624.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、個体のメチル化状態を決定するための方法：
個体から生体試料を得る段階；ならびに
2009538624.tif 000063
からなる群より選択される配列と少なくとも90%同一である、個体由来の試料におけるDNA領域中の、少なくとも1つのシトシンのメチル化状態を決定する段階。
【請求項２】
決定する段階が、DNA領域中のバイオマーカー中のヌクレオチドに対応する、DNA領域中の少なくとも1つのシトシンのメチル化状態を決定する段階を含み、
バイオマーカーが、
2009538624.tif 000064
からなる群より選択される配列である、
請求項1記載の方法。
【請求項３】
決定する段階が、バイオマーカーに対応するDNA領域のメチル化状態を決定する段階を含む、請求項2記載の方法。
【請求項４】
試料が、血清、血漿、乳房の穿刺吸引液、乳房生検材料、管液、または管洗浄液由来である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
少なくとも1つのシトシンのメチル化状態と対照座位のメチル化状態とを比較する、請求項1記載の方法。
【請求項６】
対照座位が内在性対照である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
対照座位が外来性対照である、請求項5記載の方法。
【請求項８】
決定する段階が、
2009538624.tif 000065
からなる群より選択される少なくとも2つのDNA領域における、少なくとも1つのシトシンのメチル化状態を決定する段階を含む、
請求項1記載の方法。
【請求項９】
以下の段階を含む、個体における癌の有無を判定するための方法：
（a）
2009538624.tif 000066
からなる群より選択される配列と少なくとも90%同一である、個体由来の試料におけるDNA領域中の、少なくとも1つのシトシンのメチル化状態を決定する段階；
（b）少なくとも1つのシトシンのメチル化状態と少なくとも1つのシトシンに関する閾値とを比較する段階であって、閾値が、癌を有する個体と有さない個体とを識別し、メチル化状態と閾値との比較が、個体における癌の有無について予測的である、段階。
【請求項１０】
DNA領域が、
2009538624.tif 000067
からなる群より選択される配列である、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
決定する段階が、バイオマーカー中のヌクレオチドに対応する、DNA領域中の少なくとも1つのシトシンのメチル化状態を決定する段階を含み、
バイオマーカーが、
2009538624.tif 000068
からなる群より選択される配列と少なくとも90%同一である、
請求項9記載の方法。
【請求項１２】
決定する段階が、バイオマーカーに対応するDNA領域のメチル化状態を決定する段階を含む、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
試料が、血清、血漿、乳房の穿刺吸引液、乳房生検材料、管液、または管洗浄液由来である、請求項9記載の方法。
【請求項１４】
一覧の少なくとも1つのバイオマーカーのメチル化状態と対照座位のメチル化値とを比較する、請求項9記載の方法。
【請求項１５】
対照座位が内在性対照である、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
対照座位が外来性対照である、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
決定する段階が、少なくとも2つのDNA領域由来の少なくとも1つのシトシンのメチル化状態を決定する段階を含む、請求項9記載の方法。
【請求項１８】
以下の段階を含む、個体における癌の有無を判定するための、コンピューターで実行する方法：
2009538624.tif 000069
からなる群より選択される配列と少なくとも90%同一である、個体由来の試料におけるDNA領域中の、少なくとも1つのシトシンのメチル化状態を表すメチル化値を、ホストコンピューターで受信する段階；ならびに
ホストコンピューターにおいてメチル化値と閾値とを比較する段階であって、閾値が、癌を有する個体と有さない個体とを識別し、メチル化値と閾値との比較が、個体における癌の有無について予測的である、段階。
【請求項１９】
受信する段階が、2つの異なるDNA領域由来の少なくとも1つのシトシンバイオマーカーのメチル化状態を表す、少なくとも2つのメチル化値を受信する段階を含み；かつ
比較する段階が、メチル化値と1つまたは複数の閾値との比較を含み、閾値が、癌を有する個体と有さない個体とを識別し、メチル化値と閾値との比較が、個体における癌の有無について予測的である、
請求項18記載の方法。
【請求項２０】
コンピューター読み取り可能な製品が、以下を含むプログラムコードを用いてコード化されるコンピューター読み取り可能な媒体を含む、個体における癌の有無を判定するためのコンピュータープログラム製品：
2009538624.tif 000070
からなる群より選択される配列である、個体由来の試料中におけるDNA領域中の、少なくとも1つのシトシンのメチル化状態を表すメチル化値を受信するためのプログラムコード；ならびに
メチル化値と閾値とを比較するためのプログラムコードであって、閾値が、癌を有する個体と有さない個体とを識別し、メチル化値と閾値との比較が、個体における癌の有無について予測的である、プログラムコード。
【請求項２１】
以下を含む、少なくとも1つのバイオマーカーのメチル化状態を決定するためのキット：
2009538624.tif 000071
からなる群より選択されるDNA領域の少なくとも一部を特異的に増幅することが可能であるポリヌクレオチド対；ならびに
メチル化依存性またはメチル化感受性の制限酵素および/または亜硫酸水素ナトリウム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、各々の全体が参照により組み入れられる、2006年5月31日出願の米国特許仮出願第60/803,571号、および2006年9月28日出願の米国特許仮出願第60/848,543号の恩典を主張する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
ヒト癌細胞は、変異、増幅、または重大な遺伝子の欠失により特徴付けられる、体細胞において改変されたゲノムを典型的に含む。さらに、ヒト癌細胞由来のDNA鋳型は、DNAメチル化において体細胞における変化をしばしば示す。例えば、E.R. Fearon, et al., Cell 61:759 (1990)（非特許文献1）；P.A. Jones, et al., Cancer Res. 46:461 (1986)（非特許文献2）；R. Holliday, Science 238:163 (1987)（非特許文献3）；A. De Bustros, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5693 (1988)（非特許文献4）；P.A. Jones, et al., Adv. Cancer Res. 54:1 (1990)（非特許文献5）；S.B. Baylin, et al., Cancer Cells 3:383 (1991)（非特許文献6）；M. Makos, et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:1929(1992)（非特許文献7）；N. Ohtani-Fujita, et al., Oncogene 8:1063 (1993)（非特許文献8）を参照。
【０００３】
DNAメチル化酵素は、メチル基を一般的なメチルドナーであるS-アデノシルメチオニンからDNA上の特異的部位へ転移させる。いくつかの生物学的機能は、DNA中のメチル化された塩基に起因している。最も立証された生物学的機能は、同族の制限酵素による消化からのDNAの保護である。この制限修飾現象は、これまで細菌においてのみ観察されている。
【０００４】
しかしながら、哺乳動物細胞は、グアニンの5’に隣接する（CpG）DNA上のシトシン残基を排他的にメチル化する異なるメチル化酵素を有する。このメチル化はいくつかの証拠により、遺伝子活性、細胞分化、腫瘍形成、X染色体不活性化、ゲノムインプリンティング、および他の主要な生物学的過程において役割を担うことが示されている（Razin, A., H., and Riggs, R.D. eds. in DNA Methylation Biochemistry and Biological Significance, Springer-Verlag, N.Y., 1984（非特許文献9））。
【０００５】
真核細胞において、グアノシンの5’に隣接するシトシン残基のメチル化は、CGが不十分な座位において主に生じる（Bird, A., Nature 321:209 (1986)（非特許文献10））。対照的に、CGアイランド（CGi）と称されるCGジヌクレオチドの離散領域は、5’制御領域のメチル化により転写抑制が導かれうるX染色体不活性化および親特異的インプリンティングの間を除き（Li, et al., Nature 366:362 (1993)（非特許文献11））、正常細胞においてはメチル化されていないままである。例えば、Rb遺伝子のデノボ（de novo）メチル化は網膜芽細胞腫の小さい画分において実証されており（Sakai, et al., Am. J. Hum. Genet., 48:880 (1991)（非特許文献12））、かつVHL遺伝子のさらなる詳細な解析によって、散発性腎細胞癌のサブセットにおいて異常なメチル化が示されている（Herman, et al., Proc. Natl., Acad. Sci. U.S.A., 91:9700 (1994)（非特許文献13））。腫瘍抑制遺伝子の発現はまた、通常はメチル化されていない状態の5’CGアイランドのデノボDNAメチル化により無効にされうる。例えば、Issa, et al., Nature Genet. 7:536 (1994)（非特許文献14）；Merlo, et al., Nature Med. 1:686 (1995)（非特許文献15）；Herman, et al., Cancer Res., 56:722 (1996)（非特許文献16）；Graff, et al., Cancer Res., 55:5195 (1995)（非特許文献17）；Herman, et al., Cancer Res. 55:4525 (1995)（非特許文献18）を参照。
【０００６】
腫瘍形成における初期の遺伝学的およびエピジェネティックな変化の同定は、分子癌研究における主要な焦点である。これらの変化の同定に基づく診断的アプローチにより、初期検出ストラテジー、腫瘍進行度およびこれらの初期変化を標的にする新規治療アプローチの実行が許容されることが可能であり、より効果的な癌処置が導かれる。本発明はこれらおよび他の問題に対処する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】E.R. Fearon, et al., Cell 61:759 (1990)
【非特許文献２】P.A. Jones, et al., Cancer Res. 46:461 (1986)
【非特許文献３】R. Holliday, Science 238:163 (1987)
【非特許文献４】A. De Bustros, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5693 (1988)
【非特許文献５】P.A. Jones, et al., Adv. Cancer Res. 54:1 (1990)
【非特許文献６】S.B. Baylin, et al., Cancer Cells 3:383 (1991)
【非特許文献７】M. Makos, et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:1929(1992)
【非特許文献８】N. Ohtani-Fujita, et al., Oncogene 8:1063 (1993)
【非特許文献９】Razin, A., H., and Riggs, R.D. eds. in DNA Methylation Biochemistry and Biological Significance, Springer-Verlag, N.Y., 1984
【非特許文献１０】Bird, A., Nature 321:209 (1986)
【非特許文献１１】Li, et al., Nature 366:362 (1993)
【非特許文献１２】Sakai, et al., Am. J. Hum. Genet., 48:880 (1991)
【非特許文献１３】Herman, et al., Proc. Natl., Acad. Sci. U.S.A., 91:9700 (1994)
【非特許文献１４】Issa, et al., Nature Genet. 7:536 (1994)
【非特許文献１５】Merlo, et al., Nature Med. 1:686 (1995)
【非特許文献１６】Herman, et al., Cancer Res., 56:722 (1996)
【非特許文献１７】Graff, et al., Cancer Res., 55:5195 (1995)
【非特許文献１８】Herman, et al., Cancer Res. 55:4525 (1995)
【発明の概要】
【０００８】
発明の概要
本発明は、個体のメチル化状態を決定するための方法を提供する。1つの局面において、本方法は以下の段階を含む：
個体から生体試料を得る段階；ならびに
2009538624.tif 000003
からなる群より選択される配列番号である、個体由来の試料におけるDNA領域中の、少なくとも1つのシトシンのメチル化状態を決定する段階。
【０００９】
さらなる局面において、本方法は、個体において、癌（乳癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、卵巣癌、頭頸部癌、甲状腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、もしくは前立腺癌、または黒色腫を含むがこれらに限定されない）の有無を判定する段階を含む。
【００１０】
いくつかの態様において、本方法は以下の段階を含む：
（a）
2009538624.tif 000004
からなる群より選択される配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一である、またはそれを含む、個体由来の試料においけるDNA領域中の、少なくとも1つのシトシンのメチル化状態を決定する段階；
（b）少なくとも1つのシトシンのメチル化状態とバイオマーカーに関する閾値とを比較する段階であって、閾値が、癌を有する個体と有さない個体とを識別し、メチル化状態と閾値との比較が、個体における癌の有無について予測的である、段階。
【００１１】
いくつかの態様において、本方法は以下の段階を含む：
（a）
2009538624.tif 000005
からなる群より選択される配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、まもしくは99%同一である、またはそれを含む、個体由来の試料におけるDNA領域中の、少なくとも1つのシトシンのメチル化状態を決定する段階；
（b）少なくとも1つのシトシンのメチル化状態とバイオマーカーに関する閾値とを比較する段階であって、閾値が、乳癌を有する個体と有さない個体とを識別し、メチル化状態と閾値との比較が、個体における乳癌の有無について予測的である、段階。
【００１２】
いくつかの態様において、本方法は以下の段階を含む：
（a）
2009538624.tif 000006
からなる群より選択される配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一である、またはそれを含む、個体由来の試料におけるDNA領域中の、少なくとも1つのシトシンのメチル化状態を決定する段階；
（b）少なくとも1つのシトシンのメチル化状態とバイオマーカーに関する閾値とを比較する段階であって、閾値が、肺癌を有する個体と有さない個体とを識別し、メチル化状態と閾値との比較が、個体における肺癌の有無について予測的である、段階。
【００１３】
いくつかの態様において、本方法は以下の段階を含む：
（a）
2009538624.tif 000007
からなる群より選択される配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一である、またはそれを含む、個体由来の試料におけるDNA領域中の、少なくとも1つのシトシンのメチル化状態を決定する段階；
（b）少なくとも1つのシトシンのメチル化状態とバイオマーカーに関する閾値とを比較する段階であって、閾値が、腎臓癌を有する個体と有さない個体とを識別し、メチル化状態と閾値との比較が、個体における腎臓癌の有無について予測的である、段階。
【００１４】
いくつかの態様において、本方法は以下の段階を含む：
（a）
2009538624.tif 000008
からなる群より選択される配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一である、またはそれを含む、個体由来の試料におけるDNA領域中の、少なくとも1つのシトシンのメチル化状態を決定する段階；
（b）少なくとも1つのシトシンのメチル化状態とバイオマーカーに関する閾値とを比較する段階であって、閾値が、肝臓癌を有する個体と有さない個体とを識別し、メチル化状態と閾値との比較が、個体における肝臓癌の有無について予測的である、段階。
【００１５】
いくつかの態様において、本方法は以下の段階を含む：
（a）
2009538624.tif 000009
からなる群より選択される配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一である、またはそれを含む、個体由来の試料におけるDNA領域中の、少なくとも1つのシトシンのメチル化状態を決定する段階；
（b）少なくとも1つのシトシンのメチル化状態とバイオマーカーに関する閾値とを比較する段階であって、閾値が、卵巣癌を有する個体と有さない個体とを識別し、メチル化状態と閾値との比較が、個体における卵巣癌の有無について予測的である、段階。
【００１６】
いくつかの態様において、本方法は以下の段階を含む：
（a）
2009538624.tif 000010
からなる群より選択される配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一である、またはそれを含む、個体由来の試料におけるDNA領域中の、少なくとも1つのシトシンのメチル化状態を決定する段階；
（b）少なくとも1つのシトシンのメチル化状態とバイオマーカーに関する閾値とを比較する段階であって、閾値が、頭頸部癌を有する個体と有さない個体とを識別し、メチル化状態と閾値との比較が、個体における頭頸部癌の有無について予測的である、段階。
【００１７】
いくつかの態様において、本方法は以下の段階を含む：
（a）
2009538624.tif 000011
からなる群より選択される配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一である、またはそれを含む、個体由来の試料におけるDNA領域中の、少なくとも1つのシトシンのメチル化状態を決定する段階；
（b）少なくとも1つのシトシンのメチル化状態とバイオマーカーに関する閾値とを比較する段階であって、閾値が、甲状腺癌を有する個体と有さない個体とを識別し、メチル化状態と閾値との比較が、個体における甲状腺癌の有無について予測的である、段階。
【００１８】
いくつかの態様において、本方法は以下の段階を含む：
（a）
2009538624.tif 000012
からなる群より選択される配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一である、またはそれを含む、個体由来の試料におけるDNA領域中の、少なくとも1つのシトシンのメチル化状態を決定する段階；
（b）少なくとも1つのシトシンのメチル化状態とバイオマーカーに関する閾値とを比較する段階であって、閾値が、膀胱癌を有する個体と有さない個体とを識別し、メチル化状態と閾値との比較が、個体における膀胱癌の有無について予測的である、段階。
【００１９】
いくつかの態様において、本方法は以下の段階を含む：
（a）
2009538624.tif 000013
からなる群より選択される配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一である、またはそれを含む、個体由来の試料におけるDNA領域中の、少なくとも1つのシトシンのメチル化状態を決定する段階；
（b）少なくとも1つのシトシンのメチル化状態とバイオマーカーに関する閾値とを比較する段階であって、閾値が、子宮頸癌を有する個体と有さない個体とを識別し、メチル化状態と閾値との比較が、個体における子宮頸癌の有無について予測的である、段階。
【００２０】
いくつかの態様において、本方法は以下の段階を含む：
（a）
2009538624.tif 000014
からなる群より選択される配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一である、またはそれを含む、個体由来の試料におけるDNA領域中の、少なくとも1つのシトシンのメチル化状態を決定する段階；
（b）少なくとも1つのシトシンのメチル化状態とバイオマーカーに関する閾値とを比較する段階であって、閾値が、結腸癌を有する個体と有さない個体とを識別し、メチル化状態と閾値との比較が、個体における結腸癌の有無について予測的である、段階。
【００２１】
いくつかの態様において、本方法は以下の段階を含む：
（a）
2009538624.tif 000015
からなる群より選択される配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一である、またはそれを含む、個体由来の試料におけるDNA領域中の、少なくとも1つのシトシンのメチル化状態を決定する段階；
（b）少なくとも1つのシトシンのメチル化状態とバイオマーカーに関する閾値とを比較する段階であって、閾値が、子宮内膜癌を有する個体と有さない個体とを識別し、メチル化状態と閾値との比較が、個体における子宮内膜癌の有無について予測的である、段階。
【００２２】
いくつかの態様において、本方法は以下の段階を含む：
（a）
2009538624.tif 000016
からなる群より選択される配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一である、またはそれを含む個体由来の試料におけるDNA領域中の、少なくとも1つのシトシンのメチル化状態を決定する段階；
（b）少なくとも1つのシトシンのメチル化状態とバイオマーカーに関する閾値とを比較する段階であって、閾値が、食道癌を有する個体と有さない個体とを識別し、メチル化状態と閾値との比較が、個体における食道癌の有無について予測的である、段階。
【００２３】
いくつかの態様において、本方法は以下の段階を含む：
（a）
2009538624.tif 000017
からなる群より選択される配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一である、またはそれを含む、個体由来の試料におけるDNA領域中の、少なくとも1つのシトシンのメチル化状態を決定する段階；
（b）少なくとも1つのシトシンのメチル化状態とバイオマーカーに関する閾値とを比較する段階であって、閾値が、結腸癌を有する個体と有さない個体とを識別し、メチル化状態と閾値との比較が、個体における結腸癌の有無について予測的である、段階。
【００２４】
いくつかの態様において、本方法は以下の段階を含む：
（a）
2009538624.tif 000018
からなる群より選択される配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一である、またはそれを含む、個体由来の試料におけるDNA領域中の、少なくとも1つのシトシンのメチル化状態を決定する段階；
（b）少なくとも1つのシトシンのメチル化状態とバイオマーカーに関する閾値とを比較する段階であって、閾値が、前立腺癌を有する個体と有さない個体とを識別し、メチル化状態と閾値との比較が、個体における前立腺癌の有無について予測的である、段階。
【００２５】
いくつかの態様において、本方法は以下の段階を含む：
（a）
2009538624.tif 000019
からなる群より選択される配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一である、またはそれを含む、個体由来の試料におけるDNA領域中の、少なくとも1つのシトシンのメチル化状態を決定する段階；
（b）少なくとも1つのシトシンのメチル化状態とバイオマーカーに関する閾値とを比較する段階であって、閾値が、黒色腫を有する個体と有さない個体とを識別し、メチル化状態と閾値との比較が、個体における黒色腫の有無について予測的である、段階。
【００２６】
態様に関して、いくつかの態様において、決定する段階は、バイオマーカーが、
2009538624.tif 000020
からなる群より選択される配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一であるかまたはそれを含むDNA領域中の、バイオマーカー中のヌクレオチドに対応する、DNA領域中の少なくとも1つのシトシンのメチル化状態を決定する段階を含む。
【００２７】
いくつかの態様において、決定する段階は、バイオマーカーに対応するDNA領域のメチル化状態を決定する段階を含む。
【００２８】
いくつかの態様において、試料は、血清、血漿、乳房の穿刺吸引生検材料、乳房生検材料、管液、管洗浄液、便、尿、痰、唾液、精液、洗浄液、肺生検材料、気管支洗浄液、または気管支擦過物を含むがこれらに限定されない、任意の体液由来である。いくつかの態様において、試料は腫瘍またはポリープ由来である。いくつかの態様において、試料は肺、腎臓、肝臓、卵巣、頭部、頸部、甲状腺、膀胱、子宮頸部、結腸、子宮内膜、食道、前立腺、または皮膚組織由来の生検材料である。いくつかの態様において、試料は細胞切屑（cell scrape）、洗浄液、または切除組織由来である。
【００２９】
いくつかの態様において、少なくとも1つのシトシンのメチル化状態と対照座位のメチル化状態とを比較する。いくつかの態様において、対照座位は内在性の対照である。いくつかの態様において、対照座位は外来性の対照である。
【００３０】
いくつかの態様において、決定する段階が、少なくとも2つのDNA領域中の少なくとも1つのシトシンのメチル化状態を決定する段階を含む。
【００３１】
さらなる局面において、本発明は、個体における癌（乳癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、卵巣癌、頭頸部癌、甲状腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、前立腺癌、または黒色腫を含むがこれらに限定されない）の有無を判定するためのコンピューターで実行する方法を提供する。いくつかの態様において、本方法は以下の段階を含む：
2009538624.tif 000021
からなる群より選択される配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一である、またはそれを含む、個体由来の試料におけるDNA領域中の、少なくとも1つのシトシンのメチル化状態を表すメチル化値を、ホストコンピューターにおいて受信する段階；ならびに
メチル化値と閾値とをホストコンピューターにおいて比較する段階であって、閾値が、癌（乳癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、卵巣癌、頭頸部癌、甲状腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、前立腺癌、または黒色腫を含むがこれらに限定されない）を有する個体と有さない個体とを識別し、メチル化値と閾値との比較が、個体における癌（乳癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、卵巣癌、頭頸部癌、甲状腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、前立腺癌、または黒色腫を含むがこれらに限定されない）の有無について予測的である、段階。
【００３２】
いくつかの態様において、受信する段階が、少なくとも2つの異なるDNA領域由来の、少なくとも1つのシトシンバイオマーカーのメチル化状態を表す少なくとも2つのメチル化値を受信する段階を含み；
比較する段階が、メチル化値と1つまたは複数の閾値との比較を含み、閾値が、癌（乳癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、卵巣癌、頭頸部癌、甲状腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、前立腺癌、または黒色腫を含むがこれらに限定されない）を有する個体と有さない個体とを識別し、メチル化値と閾値との比較が、個体における癌（乳癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、卵巣癌、頭頸部癌、甲状腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、前立腺癌、または黒色腫を含むがこれらに限定されない）の有無について予測的である、段階。
【００３３】
別の局面において、本発明は、個体における癌（乳癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、卵巣癌、頭頸部癌、甲状腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、前立腺癌、または黒色腫を含むがこれらに限定されない）の有無を判定するためのコンピュータープログラム製品を提供する。いくつかの態様において、コンピューター読み取り可能な製品は、以下を含むプログラムコードを用いてコード化されるコンピューター読み取り可能な媒体を含む：
2009538624.tif 000022
からなる群より選択される配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一である、またはそれを含む、個体由来の試料におけるDNA領域中の、少なくとも1つのシトシンのメチル化状態を表すメチル化値を受信するためのプログラムコード；ならびに
メチル化値と閾値とを比較するためのプログラムコードであって、閾値が、癌（乳癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、卵巣癌、頭頸部癌、甲状腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、前立腺癌、または黒色腫を含むがこれらに限定されない）を有する個体と有さない個体とを識別し、メチル化値と閾値との比較が、個体における癌（乳癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、卵巣癌、頭頸部癌、甲状腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、前立腺癌、または黒色腫を含むがこれらに限定されない）の有無について予測的である、プログラムコード。
【００３４】
さらなる局面において、本方法は少なくとも1つのバイオマーカーのメチル化状態を決定するためのキットを提供する。いくつかの態様において、キットは以下を含む：
2009538624.tif 000023
からなる群より選択される配列であるDNA領域の、少なくとも一部を特異的に増幅することが可能なポリヌクレオチド対；ならびに
メチル化依存性またはメチル化感受性の制限酵素および/または亜硫酸水素ナトリウム。
【００３５】
いくつかの態様において、ポリヌクレオチド対は、
2009538624.tif 000024
の1つまたは複数からなる群より選択されるバイオマーカーを特異的に増幅することが可能である。
【００３６】
いくつかの態様において、キットは少なくとも2つのポリヌクレオチド対を含み、各対は、
2009538624.tif 000025
からなる群より選択される異なるDNA領域の少なくとも一部を増幅することが可能である。
【００３７】
いくつかの態様において、キットはリアルタイム増幅反応において増幅されたバイオマーカーを特異的に検出する、検出可能に標識されたポリヌクレオチドプローブをさらに含む。
【００３８】
さらなる局面において、本発明は、少なくとも1つのバイオマーカーのメチル化状態を決定するためのキットを提供する。いくつかの態様において、キットは、
2009538624.tif 000026
からなる群より選択されるDNA領域由来の少なくとも1つのシトシンの、変換されメチル化されたおよびまたは変換されメチル化されていない配列の存在を定量するための、亜硫酸水素ナトリウムおよびポリヌクレオチドを含む。
【００３９】
さらなる局面において、本発明は少なくとも1つのバイオマーカーのメチル化状態を決定するためのキットを提供する。いくつかの態様において、キットは、
2009538624.tif 000027
からなる群より選択されるDNA領域由来の少なくとも1つのシトシンの、変換されメチル化されたおよびまたは変換されメチル化されていない配列の存在を定量するための、亜硫酸水素ナトリウム、全ゲノム増幅のためのプライマーおよびアダプター、ならびにポリヌクレオチドを含む。
【００４０】
別の態様において、本方法は少なくとも1つのバイオマーカーのメチル化状態を決定するためのキットを提供する。いくつかの態様において、キットは、
2009538624.tif 000028
からなる群より選択されるDNA領域の、少なくとも一部のコピー数を定量するための、メチル化感受性の制限酵素、全ゲノム増幅のためのプライマーおよびアダプター、ならびにポリヌクレオチドを含む。
【００４１】
さらなる局面において、本発明は少なくとも1つのバイオマーカーのメチル化状態を決定するためのキットを提供する。いくつかの態様において、キットは、
2009538624.tif 000029
からなる群より選択されるDNA領域の、少なくとも一部のコピー数を定量するための、メチル化結合部分、および1つまたは複数のポリヌクレオチドを含む。
【００４２】
定義
「メチル化」とは、シトシンのC5位またはN4位のシトシンメチル化、アデニンのN6位、または他の型の核酸メチル化を意味する。インビトロのDNA増幅法は、増幅鋳型のメチル化のパターンを維持しないため、インビトロで増幅されたDNAはメチル化されていない。しかしながら、「メチル化されていないDNA」または「メチル化されたDNA」もまた、元の鋳型が各々メチル化された、またはメチル化されていない増幅されたDNAを意味しうる。
【００４３】
「メチル化プロファイル」とは、例えば、個体のゲノムまたは個体由来の細胞もしくは組織に由来するDNA分子内の、1つまたは複数の座位のメチル化状態を表す一連のデータを意味する。プロファイルには、個体における各塩基のメチル化状態が示されるか、ゲノム中の塩基対のサブセット（例えば、特定の制限酵素認識配列のメチル化状態）に関する情報が含まれるか、または各座位の局部的なメチル化密度に関する情報が含まれうる。
【００４４】
「メチル化状態」とは、特定のヌクレオチドまたはDNAの一部内のヌクレオチドでのメチル化の有無および/または量を意味する。特定のDNA配列（例えば、本明細書で記載されるDNAバイオマーカーまたはDNA領域）のメチル化状態は、配列中の各塩基のメチル化状態を示しうる、または配列内の塩基対のサブセットのメチル化状態（例えば、シトシンもしくは1つまたは複数の特異的な制限酵素認識配列のメチル化状態）を示しうる、または配列内のどこにメチル化が起こるかの正確な情報を提供することなく、配列内の局部的なメチル化密度に関する情報を示しうる。メチル化状態は、任意で「メチル化値」により表されうる、または示されうる。メチル化値は、例えば、メチル化依存性制限酵素を用いた制限消化後に存在する無傷のDNA量を定量することにより生成されうる。この例においては、DNA中の特定の配列が定量PCRを使用して定量される場合には、偽処理された対照とほぼ同等の鋳型DNA量によって、配列が高度にメチル化されていないことが示されるが、儀処理された試料中に生じるよりも実質的に少ない鋳型量によって、配列にメチル化DNAが存在することが示される。従って、値、すなわち例えば上に記載の例のメチル化値は、メチル化状態を表し、従ってメチル化状態の定量的指標として使用されうる。これは、試料中の配列のメチル化状態と閾値とを比較することが望ましい場合に特定の使用である。
【００４５】
「メチル化依存性制限酵素」とは、メチル化された認識配列でまたはその近傍でDNAを切断または消化する制限酵素を意味するが、認識配列がメチル化されていない場合には、同一の配列でまたはその近傍でDNAを切断しない。メチル化依存性制限酵素は、メチル化された認識配列で切断するもの(例えば、DpnI)、および認識配列では切断しないが近傍の配列では切断する酵素（例えば、McrBC）を含む。例えば、McrBCの認識配列は5’RmC（N40-3000）RmC 3’であり、ここで「R」はプリンであり、「mC」はメチル化されたシトシンであり、かつ「N40-3000」は、制限事象が観察されている2つのRmCハーフサイト（half site）の間の距離を示す。McrBCは一般に1つのハーフサイトまたは他方のハーフサイトの近傍を切断するが、切断位置は典型的に、メチル化塩基からおよそ30塩基対の複数塩基対に渡って分布している。McrBCは時に双方のハーフサイトの3’を、時に双方のハーフサイトの5’を切断し、かつ時に2つの部位の間を切断する。例示的なメチル化依存性制限酵素は、例えばMcrBC（例えば、米国特許第5,405,760号を参照）、McrA、MrrA、およびDpnIを含む。当業者は、本明細書に記載される制限酵素のホモログおよびオーソログを含む任意のメチル化依存性制限酵素もまた、本発明における使用に適することを理解すると考えられる。
【００４６】
「メチル化感受性の制限酵素」とは、メチル化されていない認識配列でまたはその近傍でDNAを切断するが、認識配列がメチル化されている場合には、同一の配列でまたはその近傍で切断しない制限酵素を意味する。例示的なメチル化感受性の制限酵素は、例えば、McClelland et al., Nucleic Acids Res. 22(17):3640-59 (1994)およびhttp://rebase.neb.com.に記載される。認識配列内のシトシンがC5位でメチル化されている場合に認識配列でまたはその近傍でDNAを切断しない適切なメチル化感受性の制限酵素は、例えば
2009538624.tif 000030
を含む。認識配列内のアデノシンがN6位でメチル化されている場合に、認識配列でまたはその近傍でDNAを切断しない適切なメチル化感受性の制限酵素は、例えばMbo Iを含む。当業者は、本明細書で記載される制限酵素のホモログおよびオーソログを含む任意のメチル化感受性の制限酵素もまた、本発明における使用に適することを理解すると考えられる。さらに当業者は、認識配列でまたはその近傍でシトシンのメチル化が存在する場合に、切断しないメチル化感受性の制限酵素が、その認識配列でまたはその近傍でアデノシンのメチル化の存在に対して非感受性であってもよいことを理解すると考えられる。同様に、認識配列でまたはその近傍でアデノシンのメチル化が存在する場合に切断しないメチル化感受性の制限酵素は、認識配列でまたはその近傍でシトシンのメチル化の存在に対して非感受性であってもよい。例えば、Sau3AIは認識配列でまたはその近傍でメチル化シトシンの存在に対して感受性である（すなわち、切断しない）が、認識配列でまたはその近傍でメチル化アデノシンの存在に対して非感受性（すなわち、切断する）である。当業者はまた、いくつかのメチル化感受性の制限酵素は、認識配列を包含するDNA鎖の一方または双方の塩基のメチル化により遮断され、他のメチル化感受性の制限酵素は、双方の鎖のメチル化によってのみ遮断されるが、認識部位がヘミメチル化されている場合には、切断されうることを理解すると考えられる。
【００４７】
特定の疾患を「有する個体と有さない個体とを識別する閾値」とは、疾患を有する個体由来の試料と疾患を有さない試料とを識別するために使用されうる特定の測定値の値または値の範囲を意味する。理想的には、2つの群を絶対的に識別する閾値が存在する（すなわち、疾患群由来の値は常に閾値の片方の側（例えば、より高い）であり、かつ健康な非疾患群由来の値は、閾値の他方の側（例えば、より低い）である）。しかしながら、多くの例において、閾値は疾患試料と非疾患試料とを絶対的に識別するわけではない（例えば、疾患試料および非疾患試料から生じた値にいくらかの重複が存在する場合）。
【００４８】
「バイオマーカー中の対応するヌクレオチド」という句は、バイオマーカー配列中の同一ヌクレオチド（例えば、シトシン）と整列するDNA領域におけるヌクレオチドを意味する。本明細書で記載されるように、一般にバイオマーカー配列はDNA領域の部分配列である。配列の比較は、デフォルトパラメーターを用いたBLAST2.2アルゴリズムを含む任意のBLASTを使用して遂行することが可能であり、各々Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 410 (1990)、およびAltschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389 3402 (1997)に記載される。従って、例えば、バイオマーカーまたはDNA領域と特定の当該ヒトゲノムとの間に軽微な変動がある場合においても、本明細書に記載されるDNA領域およびバイオマーカーは、ヒトゲノムにおけるDNA配列に対応しうる。そのような差異はヒト間の軽微な遺伝学的変動の結果でありうる。
【００４９】
所定のバイオマーカーの「感度」とは、腫瘍試料と非腫瘍試料とを識別する、閾値を上回るDNAメチル化値を報告する腫瘍試料の割合を意味する。割合は、以下のように算出される：
2009538624.tif 000031
。
等式はまた以下のようにも提示されてよい：
2009538624.tif 000032
ここで、真陽性は、閾値を上回るDNAメチル化値（すなわち、疾患に関連する範囲）を報告する組織学的に確認された腫瘍試料として定義され、偽陰性は、閾値を下回るDNAメチル化値（すなわち、非疾患に関連する範囲）を報告する組織学的に確認された腫瘍試料として定義される。従って、感度値は、公知の疾患試料から得られた所定のバイオマーカーに関するDNAメチル化の測定値が疾患に関連する測定値の範囲内にある可能性を反映する。ここで定義されるように、算出される感度値の臨床的関連性は、ある臨床状態の患者に適用される際に、所定のバイオマーカーにより該臨床状態の存在が検出される可能性の推定を表す。
【００５０】
所定のバイオマーカーの「特異性」とは、腫瘍試料と非腫瘍試料とを識別する閾値を下回るDNAメチル化値を報告する非腫瘍試料の割合を意味する。割合は、以下のように算出される：
2009538624.tif 000033
。
等式はまた以下のようにも提示されてよい：
2009538624.tif 000034
ここで、真陰性は、閾値を下回るDNAメチル化値（すなわち、非疾患に関連する範囲）を報告する組織学的に確認された非腫瘍試料として定義され、偽陽性は、閾値を上回るDNAメチル化値（すなわち、疾患に関連する範囲）を報告する組織学的に確認された非腫瘍試料として定義される。従って、特異性値は、公知の非疾患試料から得られた所定のバイオマーカーに関するDNAメチル化の測定値が、非疾患に関連する測定値の範囲内にある可能性を反映する。ここで定義されるように、算出される特異性値の臨床的関連性は、ある臨床状態を有しない患者に適用される際に、所定のバイオマーカーにより該臨床状態の非存在が検出される可能性の推定を表す。
【００５１】
BLAST解析を遂行するためのソフトウェアは、米国国立バイオテクノロジー情報センターを通して公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同一長の文字列と整列する場合に、いくつかの陽性値の閾値スコアであるTと一致するまたは満たす、調査配列中のW長の短い文字列を同定することにより、高スコアの配列対（HSP）を最初に同定することに関連する。Tは近隣文字列スコアの閾値を意味する（Altschul et al., 前記）。これらの初期的な近隣文字列ヒットは、それらを含むより長いHSPを見出すための検索を開始する手がかかりとして作用する。文字列ヒットは、累積アラインメントスコアが増加しうる限り、各配列に添って双方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列に関しては、パラメーターM（一対の一致する残基のリワードスコア；常に0を上回る）およびN（ミスマッチ残基のペナルティスコア；常に0未満）を使用して算出される。アミノ酸配列に関しては、累積スコアを算出するためにスコア行列が使用される。各方向における文字列ヒットの伸長は、累積アラインメントスコアが、その最大到達値から数量Xに下落する場合；1つまたは複数の負のスコア残基アラインメントの蓄積により累積スコアがゼロまたはそれを下回る場合；またはいずれかの配列の終点に到達した場合に、停止される。BLASTアルゴリズムのパラメーターであるW、T、およびXは、アラインメントの感度および速度を決定する。（ヌクレオチド配列のための）BLASTNプログラムは、文字列長（W）11、期待値（E）10、M=5、N=-4、および双方の鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列に関しては、BLASTPプログラムは、文字列長3、および期待値（E）10、ならびにBLOSUM62スコア行列（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)を参照）アラインメント（B）50、期待値（E）10、M=5、N=-4、および双方の鎖の比較をデフォルトとして使用する。
【００５２】
本明細書で使用されるように、「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、核酸領域、核酸セグメント、プライマー、プローブ、アンプリコン、およびオリゴマー断片を意味する。該用語は長さにより制限されず、かつポリデオキシリボヌクレオチド（2-デオキシ-D-リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（D-リボースを含む）、および任意の他のプリンもしくはピリミジン塩基または修飾されたプリンもしくはピリミジン塩基のN-グリコシドの線状ポリマーの総称である。これらの用語は、2本鎖および1本鎖DNA、ならびに2本鎖および1本鎖RNAを含む。
【００５３】
核酸、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドは例えば、ホスホトリエステル、ホスホルアミダート、シロキサン、炭酸、カルボキシメチルエステル、アセトアミダート、カルバミン、チオエーテル、架橋ホスホルアミダート、架橋メチレンホスホナート、ホスホロチオアート、メチルホスホナート、ホスホロジチオアート、架橋ホスホロチオアート、またはスルホン結合、およびそのような結合の組み合わせを含むがこれらに限定されない、ホスホジエステル結合または修飾結合を含みうる。
【００５４】
核酸、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドは、生物学的に生じる5つの塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシン、およびウラシル）および/または該生物学的に生じる5つの塩基以外の塩基を含みうる。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、以下を含むがこれらに限定されない、1つまたは複数の修飾型、非標準、または誘導体型の塩基部分を含みうる。N6-メチル-アデニン、N6-tert-ブチル-ベンジル-アデニン、イミダゾール、置換型イミダゾール、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルキューオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-メチルアデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D マンノシルキューオシン、5’-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酸（v）、ワイブトキソシン（wybutoxosine）、シュードウラシル（pseudouracil）、キューオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、ウラシル-5-オキシ酸メチルエステル、3-（3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル）ウラシル、（acp3）w、2,6-ジアミノプリン、および5-プロピニルピリミジン。修飾型、非標準、または誘導体型の塩基部分の他の例は、米国特許第6,001,611号；第5,955,589号；第5,844,106号；第5,789,562号；第5,750,343号；第5,728,525号；および第5,679,785号に見出されうる。
【００５５】
さらに、核酸、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドは、アラビノース、2-フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソースを含むがこれらに限定されない、1つまたは複数の修飾型糖部分を含みうる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】示差的メチル化スクリーニングの、実験設計の一般的概要を示す。ある予測された示差的メチル化遺伝子の、転写開始部位および5’構造の図解による表示が示される（A）。棒グラフ（B）は、この領域中のプリンCG配列に対する局部密度を示す。この座位での示差的DNAメチル化を報告しているDNAマイクロアレイフィーチャーの相対位置が（C）により示される。PCRプライマーは、（D）により示される領域を増幅するために選択された。垂直の棒（EおよびF）は、全乳房腫瘍（E）および全正常乳房試料（F）を表す、マイクロアレイDNAメチル化測定値を表す。
【図２】DNAメチル化状態をモニタリングするための、McrBCベースのリアルタイムPCRストラテジーの例を示す。パネルAは、乳房腫瘍試料中のGHSR座位の増幅に関する、未処置/処置されたPCR反復1を示す。ΔCt（処置1-未処置1）は、5.38サイクルである。パネルBは、同一腫瘍試料からの同一座位の増幅に関する、未処置/処置されたPCR反復2を示す。ΔCt（処置2-未処置2）は、5.40サイクルである。パネルCは、正常乳房試料中のGHSR座位の増幅に関する、未処置/処置されたPCR反復1を示す。ΔCt（処置1-未処置1）は、0.18サイクルである。パネルDは、同一正常試料からの同一座位の増幅に関する、未処置/処置されたPCR反復2を示す。ΔCt（処置2-未処置2）は、0.03サイクルである。腫瘍試料は、1.0またはそれより大きいサイクル閾値（「ΔCt」）における変化を産生する。正常試料は、1.0未満のΔCtを産生する。
【図３】図3A〜Bは、マイクロアレイDNAメチル化予測の実証を示す。中抜きの四角は、メチル化されていない座位を表し（1.0未満の平均ΔCt）、灰色の四角は、メチル化されている座位を表し（1を上回りかつ2未満の平均ΔCt）、かつ黒色の四角は、高密度にメチル化されている座位を表す（2を上回る平均ΔCt）。
【図４】図4Aおよび4Bは、独立な腫瘍および正常試料由来のバイオマーカーにおける、DNAメチル化差異の検証を示す。四角は、図3と同様に示される。
【図５】乳房腫瘍、正常乳房、および正常末梢血液試料の大型パネル由来のバイオマーカーにおける、DNAメチル化差異を示す。四角は、図3と同様に示される。
【図６】感度および特異性を決定するための、閾値調整の実証を示す。
【図７】示差的DNAメチル化の亜硫酸水素塩シーケンス確認を示す。
【図８】qPCRベースのDNAメチル化測定値と亜硫酸水素塩シーケンスにより決定されたDNAメチル化占有率との間の関連性を示す。プライマーは、上に記載されるようなqPCRにより解析された3つの座位の領域中のおよそ150 bpのアンプリコンを増幅するために設計された。座位には、フィーチャーID ha1p_39189（座位番号2)、ha1g_00644（座位番号3）、およびha1p_104423（座位番号12）が含まれた。各アンプリコンに関して、産物を、0.5未満の平均dCt値を報告した3つの正常乳房DNA試料、0.5および1.0の間の平均dCt値を報告した3つの正常乳房DNA試料、および1.0より大きい平均dCt値を報告した3つの乳房腫瘍DNA試料から増幅したアンプリコンを精製し、TAクローニングキット（Invitrogen）を使用してクローニングした。座位当り、アンプリコン当り少なくとも29個の独立したクローンをシーケンスした。グラフは、同一DNA試料中の座位に関する平均dCt値に対してプロットされた、アンプリコン当りの全てのシーケンスされたクローンに関する、5-メチルシトシン含有量の中央値を示す。破線垂直線は、DNAメチル化検出に関して陽性qPCR測定値を示すために使用された、dCt=1.0の閾値を表す。
【図９】CpG密度の解析に基づく潜在的な示差的メチル化領域の選択の例を示す（CGアイランドの同定）。
【図１０Ａ】ステージII〜IIIの乳房腫瘍と比較した、ステージI乳房腫瘍における16座位の示差的DNAメチル化の頻度を示す。16座位は、表5に列挙されるものを含む。
【図１０Ｂ】腫瘍ステージと比較した、3つの選択された座位のDNAメチル化密度を示す。McrBCによりメチル化された分子のおよその平均の除去のパーセンテージを、各試料中のメチル化分子の負荷を決定するために算出した[1-(1/2^ΔCt(McrBC消化-偽処置))*100]。データは、（左から右へ）正常乳房試料、ステージI腫瘍、ステージIIA腫瘍、ステージIIB腫瘍、およびステージIII腫瘍に関してプロットされる。
【図１１Ａ】乳房腫瘍、正常乳房組織、および癌を有しない女性由来の末梢血液における、4つの選択された座位の示差的DNAメチル化を示す。各データ点は、独立した臨床試料に関して、平均化したΔCt値を表す。
【図１１Ｂ】図11Aに示される4つの座位のROC曲線解析を示す。感度（メチル化閾値を上回るスコアの腫瘍試料の割合）および特異性（同じ閾値を下回るスコアの非腫瘍試料の割合）を、全ての観察されたΔCt値に関して算出した。
【図１２】亜硫酸水素塩シーケンスにより選択された、4つの座位のDNAメチル化解析を示す。解析された座位は番号2（A、B）、3（C、D）、4（E、F）、および12（G、H）を含んだ。亜硫酸水素塩シーケンスを遂行した。各試料内の各座位に関してシーケンスされた平均分子数は、587であった。各試料に関して算出されたDNAメチル化密度（シーケンスされた全CpG数で割られたメチル化されたCpG数）を、同一試料に関するqPCR DNAメチル化測定値に対してプロットした（A、C、E、G）。さらに、各々の解析されたCpGジヌクレオチドでの、メチル化占有のパーセンテージが示される（B、D、F、H）。解析された試料は、正常乳房組織（白い丸）、隣接する組織学的に正常な乳房組織（黒い丸）、および乳房腫瘍（黒い四角）を含んだ。
【図１３】DNA高メチル化と遺伝子発現との間の関連性を示す。GHSR（座位番号2）、MGA（座位番号4）、およびNFX1（座位番号12）の転写をRT-PCRにより解析した。正常乳房組織および4つの乳房腫瘍由来のcDNAの系列希釈を、示されるように鋳型として使用した。GAPDH発現を、各試料に関する内部対照として解析した。各腫瘍試料中の各座位に関するDNAメチル化測定値（qPCR）が、示される（-は平均dCtが1.0未満、+は平均dCtが1.0以上であるが2.0未満、および++は平均dCtが2.0以上）。
【図１４】マッチしない原発性乳房腫瘍試料（陽性腫瘍（%））に対する、穿刺吸引（陽性FNA（%））試料におけるDNAメチル化検出の比較を示す。実施例3に記載されるように、平均dCtが1.0以上の場合には、各試料を陽性として評価した。解析された試料は、7個のFNA試料および少なくとも14個の原発性乳房腫瘍試料を含んだ。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
発明の詳細な説明
I. 導入
本発明は、ある種のDNA領域中の配列は、癌細胞においてメチル化されているが、正常細胞ではメチル化されていないという発見に部分的に基づく。本明細書に記載されるDNA領域中のメチル化が、乳癌、とりわけ乳管癌、ならびに多数の他の癌に関連することが、本発明者らによって見出されている。
【００５８】
この発見を考慮して、本発明によって、バイオマーカー配列、ならびに該バイオマーカーに隣接し有意量のCG部分配列を含む配列、該DNA領域のメチル化、および/または該DNA領域により制御される遺伝子の発現を含む、バイオマーカー配列およびDNA領域を検出するための方法が、癌細胞を検出するために使用されうることが、本発明者らによって認識されている。癌細胞を検出することにより、疾患を検出し、疾患に罹患するリスクを評価し、疾病に対する素質を決定し、疾患のステージを決定し、疾患を診断し、疾患をモニタリングし、かつ/または患者のための処置の選択を支援する、診断検査が可能になる。
【００５９】
II. メチル化バイオマーカー
いくつかの態様において、配列番号：213〜265から選択されるDNA領域中またはその一部（例えば、少なくとも1つのシトシン）の染色体DNAのメチル化の有無または量が検出される。本明細書に記載されるDNA領域の一部は、少なくとも1つの潜在的メチル化部位（すなわち、シトシン）を含むと考えられ、かつ、いくつかの態様において、2、3、4、5、10個またはそれ以上の潜在的メチル化部位を一般的に含みうる。いくつかの態様において、該DNA領域に隣接する少なくとも20、50、100、200、500個またはそれ以上の塩基対内の全てのシトシンのメチル化状態が決定される。
【００６０】
いくつかの態様において、1つを超えるDNA領域（またはその一部）のメチル化が検出される。いくつかの態様において、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52または53個のDNA領域の少なくとも１つのシトシンのメチル化状態が決定される。
【００６１】
本発明のいくつかの態様において、DNA領域またはその一部のメチル化が決定され、続いて対照座位のメチル化と比較される（例えば、規格化される）。典型的には、対照座位は、公知の比較的一定のメチル化状態を有すると考えられる。例えば、対照配列は、メチル化を全く有さないか、いくらか有するか、または多く有することを以前に決定することが可能であり、従って癌の有無とは無関係に、検出方法等における誤差に関して対照に対して相対的に一定値を提供する。いくつかの態様において、対照座位は内在性、すなわち個々の試料のゲノムの一部である。例えば哺乳動物細胞において、精巣特異的ヒストン2B遺伝子（ヒトにおけるhTH2B）は、精巣を除く全ての体細胞性組織においてメチル化されていることが公知である。あるいは、対照座位は外来性座位でありうる、すなわち公知の量で試料中に導入され、かつ公知のメチル化状態を有するDNA配列でありうる。
【００６２】
DNA領域は、関心対象の1つまたは複数のメチル化部位を含む核酸（例えば、図1Cに示されるような「マイクロアレイフィーチャー」であるシトシン、または図1Dに示されるような選択プライマーから増幅されたアンプリコン）およびアンプリコンから3’または5’の一方向または双方向へ4キロベース（kb）までの隣接する核酸配列（「翼幅（windspan）」）を含む。この範囲は、2つまたはそれ以上の試料のDNAの間の示差的メチル化に関するスクリーニングの前に、該DNAを無作為に剪断することにより得られるDNA断片の長さに対応する（例えば、以下の実施例において記載されるように、示差的メチル化された配列を最初に同定するために使用される方法を遂行する）。いくつかの態様において、1つまたは複数のDNA領域の翼幅は、約0.5 kb、0.75 kb、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、3.5 kb、または4.0 kbである。
【００６３】
いくつかの場合において、関連するマイクロアレイフィーチャーまたはアンプリコンが染色体中の、よりCG密度の高いより大きな領域に存在するために、DNA領域は発見された方法の翼幅よりも単純に多いヌクレオチドを含む。この範囲は、隣接する核酸配列（例えば、「局部的最小」CG密度）（例えば、図8を参照）よりも、より高いCG密度（例えば、「CGアイランド」）を有する同定された核酸配列長に対応する。高いCG密度の伸長配列を有するDNA領域は、例えば、以下の配列を含む：
2009538624.tif 000035
（表2および「配列表」の項を参照）。
【００６４】
DNA領域におけるメチル化部位は、非コード性の転写制御配列中（例えば、プロモーター、エンハンサー等）または表1および2ならびに「配列表」の項において列挙される指定された遺伝子のイントロンおよびエキソンを含むコード配列中に存在しうる。いくつかの態様において、本方法は、表1および2ならびに「配列表」の項において同定される1つまたは複数の遺伝子のプロモーター領域中の、メチル化状態の検出を含む（例えば、転写開始部位から約1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、3.5 kb、または4.0 kbの5’側の核酸配列を含む）。
【００６５】
本発明のDNA領域もまた、例えば、異なる被験者集団に現れる変種および一塩基多型（SNP）から生じる変種を含む天然の変種を含む。変種は、本明細書に記載されるDNA領域に対して少なくとも90%、95%、98%、99%の配列同一性を共有する、すなわち1つまたは複数の欠失、付加、置換、逆転配列等を有する、同一DNA領域由来の核酸配列（例えば、表1および2ならびに「配列表」の項に示されるような）を含む。
【００６６】
III. メチル化を決定するための方法
本発明の方法において、DNAメチル化を検出する任意の方法が使用されうる。
【００６７】
いくつかの態様において、メチル化を検出するための方法は、ゲノムDNAを無作為に剪断するまたは無作為に断片化する段階、メチル化依存性またはメチル化感受性の制限酵素を用いてDNAを切断する段階、続いて切断DNAまたは未切断DNAを選択的に同定および/または解析する段階を含む。選択的同定は、例えば切断DNAと未切断DNAとを分離する段階（例えば、大きさにより）、切断されたまたは切断されていない関心対象の配列を定量する段階を含みうる。例えば、米国特許第7,186,512号を参照。あるいは本方法は、制限酵素による消化後に無傷のDNAを増幅する段階を包含することが可能であり、それにより、該増幅された領域において制限酵素によって切断されなかったDNAのみが増幅される。例えば、米国特許出願第10/971,986号；第11/071,013号；および第10/971,339号を参照。いくつかの態様において、増幅は、遺伝子特異的なプライマーを用いて遂行されうる。あるいは、アダプターが無作為に断片化されたDNAの末端へ添加され、該DNAがメチル化依存性またはメチル化感受性制限酵素を用いて消化され、無傷のDNAがアダプター配列へハイブリダイズするプライマーを使用して増幅されうる。この場合において、第二段階は、増幅されたDNAプール中の特定の遺伝子の有無または量を決定するために遂行されうる。いくつかの態様において、DNAはリアルタイム定量PCRを使用して増幅される。
【００６８】
いくつかの態様において、本方法は、ゲノムDNAの集団内の標的配列における平均メチル化密度を定量する段階を含む。いくつかの態様において、本方法は、座位中の潜在的制限酵素切断部位の少なくともいくつかのコピーが未切断のまま残ることが許容される条件下で、ゲノムDNAをメチル化依存性制限酵素またはメチル化感受性制限酵素と接触させる段階；座位の無傷のコピーを定量する段階；および増幅産物の量と対照DNAのメチル化量を表す対照値とを比較する段階、それにより対照DNAのメチル化密度と比較して該座位の平均メチル化密度を定量する段階を含む。
【００６９】
DNA座位のメチル化量は、座位を含むゲノムDNA試料を提供し、メチル化感受性またはメチル化依存性のいずれかである制限酵素を用いてDNAを切断し、続いて無傷のDNA量を定量することまたは関心対象のDNA座位での切断されたDNA量を定量することにより、決定されうる。無傷のまたは切断されたDNA量は、座位を含むゲノムDNAの初期量、座位におけるメチル化量、およびゲノムDNA中でメチル化されている座位におけるヌクレオチド数（すなわち、画分）に依存すると考えられる。DNA座位におけるメチル化量は、無傷のDNAまたは切断されたDNAの量と、同様に処置されたDNA試料における、無傷のDNAまたは切断されたDNAの量を表す対照値とを比較することにより決定されうる。対照値は、公知のまたは予測されるメチル化ヌクレオチド数を表しうる。あるいは、対照値は、別の（例えば、正常な、非疾患の）細胞の同一座位、または第二の座位由来の、無傷のまたは切断されたDNA量を表しうる。
【００７０】
座位中の潜在的な制限酵素切断部位の、少なくともいくつかのコピーを未切断のまま残すことを許容する条件下で、少なくとも1つのメチル化感受性またはメチル化依存性の制限酵素を使用し、続いて残りの無傷のコピーを定量し、対照と量を比較することにより、座位の平均メチル化密度が決定されうる。座位中の潜在的な制限酵素切断部位の少なくともいくつかのコピーを未切断のまま残すことを許容する条件下で、メチル化感受性制限酵素がDNA座位のコピーと接触した場合には、残りの無傷のDNAは、メチル化密度に対して正比例的であると考えられ、従って試料中の座位の相対的なメチル化密度を決定するために、対照と比較されてもよい。同様に、座位中の潜在的な制限酵素切断部位の、少なくともいくつかのコピーを未切断のまま残すことを許容する条件下で、メチル化依存性制限酵素がDNA座位のコピーと接触した場合には、残りの無傷のDNAはメチル化密度に対して反比例的であると考えられ、従って試料中の座位の相対的なメチル化密度を決定するために対照と比較されてもよい。そのようなアッセイは、例えば、米国特許出願第10/971,986号に開示される。
【００７１】
上の方法のためのキットは、例えば1つまたは複数のメチル化依存性制限酵素、メチル化感受性制限酵素、増幅（例えば、PCR）試薬、プローブ、および/またはプライマーを含みうる。
【００７２】
定量的増幅法（例えば、定量PCRまたは定量線形増幅）は、制限消化に続き、増幅プライマーが隣接する座位内の無傷のDNA量を定量するために使用されうる。定量的増幅の方法は、例えば、米国特許第6,180,349号；第6,033,854号；および第5,972,602号、ならびに例えば、Gibson et al., Genome Research 6:995-1001 (1996); DeGraves, et al., Biotechniques 34(1):106-10, 112-5 (2003); Deiman B, et al., Mol Biotechnol. 20(2):163-79 (2002)に開示される。増幅は、「リアルタイム」でモニタリングされてもよい。
【００７３】
DNAメチル化を検出するためのさらなる方法は、亜硫酸水素塩を用いるDNA処置の前および後のゲノムシーケンシングに関与しうる。例えば、Frommer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1827-1831 (1992)を参照。亜硫酸水素ナトリウムがDNAと接触する際に、メチル化されていないシトシンはウラシルに変換されるが、メチル化されているシトシンは修飾されない。
【００７４】
いくつかの態様において、亜硫酸水素塩により変換されたDNAから増幅されたPCR産物の制限酵素による消化が、DNAメチル化を検出するために使用される。例えば、Sadri & Hornsby, Nucl. Acids Res. 24:5058-5059 (1996); Xiong & Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534 (1997)を参照。
【００７５】
いくつかの態様において、MethyLightアッセイが単独でまたはDNAメチル化を検出する他の方法との組み合わせにおいて使用される（Eads et al., Cancer Res. 59:2302-2306 (1999)を参照）。端的に、MethyLight過程において、ゲノムDNAは亜硫酸水素ナトリウム反応中で変換される（亜硫酸水素塩による過程により、メチル化されていないシトシン残基がウラシルへ変換される）。続いて、関心対象のDNA配列の増幅がCpGジヌクレオチドにハイブリダイズするPCRプライマーを使用して遂行される。メチル化されていないDNAの亜硫酸水素塩による変換に起因する配列へのみ（または変換されていないメチル化配列へ）ハイブリダイズするプライマーを使用することにより、増幅によって、プライマーがハイブリダイズする配列のメチル化状態が示されうる。同様に、増幅産物は、メチル化されていない（またはメチル化された）DNAの亜硫酸水素塩による処置に起因する配列へ特異的に結合するプローブを用いて検出されうる。所望する場合には、プライマーおよびプローブの双方が、メチル化状態を検出するために使用されうる。従って、MethyLightを用いた使用のためのキットは、亜硫酸水素ナトリウム、ならびに亜硫酸水素塩を用いて処置されたメチル化されたDNAとメチル化されていないDNAとを識別するプライマーまたは検出可能に標識されたプローブ（Taqmanまたはモレキュラービーコン（molecular beacon）プローブを含むがこれらに限定されない）を含みうる。他のキット構成物は、例えば、PCRバッファー、デオキシヌクレオチドを含むがこれらに限定されない、DNAの増幅のために必要な試薬；および耐熱性ポリメラーゼを含みうる。
【００７６】
いくつかの態様において、Ms-SNuPE（Methylation-sensitive Single Nucleotide Primer Extension）反応が、単独でまたはDNAメチル化を検出する他の方法との組み合わせで使用される（Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531 (1997)を参照）。Ms-SNuPE技術は、DNAの亜硫酸水素塩による処置、続く単一ヌクレオチドプライマー伸長（Gonzalgo & Jones、前記）に基づく特異的CpG部位でのメチル化差異を評価するための定量的方法である。端的に、5-メチルシトシンを不変のまま残し、メチル化されていないシトシンをウラシルへ変換するために、ゲノムDNAを亜硫酸水素ナトリウムを用いて反応させる。続いて、所望の標的配列の増幅が、亜硫酸水素塩により変換されたDNAに特異的なPCRプライマーを使用して遂行され、得られる産物が単離され、関心対象のCpG部位でのメチル化解析のための鋳型として使用される。
【００７７】
Ms-SNuPE解析のための典型的な試薬は（例えば、典型的なMs-SNuPEベースのキットにおいて見出されうる）、特異的遺伝子（またはメチル化により変換されたDNA配列またはCpGアイランド）のためのPCRプライマー；最適化されたPCRバッファーおよびデオキシヌクレオチド；ゲル抽出キット；陽性対照プライマー；特異的遺伝子のためのMs-SNuPEプライマー；反応バッファー（Ms-SNuPE反応のための）；および検出可能に標識されたヌクレオチドを含みうるがこれらに限定されない。加えて、亜硫酸水素塩により変換する試薬は：DNA変性バッファー；スルホン化バッファー；DNA回収試薬またはキット（例えば、沈殿、超濾過、アフィニティーカラム）；脱スルホン化バッファー；およびDNA回収成分を含んでもよい。
【００７８】
いくつかの態様において、メチル化特異的PCR（「MSP」）反応が、単独でまたはDNAメチル化を検出する他の方法との組み合わせにおいて使用される。MSPアッセイは、亜硫酸水素ナトリウムによるDNAの初期修飾、メチル化されたものを除く、メチル化されていない全てのシトシンのウラシルへの変換、および続くメチル化対メチル化されていないDNAに特異的なプライマーを用いた増幅を伴う。Herman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, (1996)；米国特許第5,786,146号を参照。
【００７９】
さらなるメチル化検出方法は、メチル化されたCpGアイランドの増幅（Toyota et al., Cancer Res. 59:2307-12 (1999)を参照）ならびに例えば、米国特許出願公開第2005/0069879号；Rein, et al., Nucleic Acids Res. 26(10):2255-64 (1998); Olek, et al. Nat Genet. 17(3): 275-6 (1997); およびPCT国際公開公報第00/70090号に記載されるものを含むがこれらに限定されない。
【００８０】
ゲノムDNAのメチル化が、近傍の遺伝子配列の発現（転写および/または翻訳）に影響しうることは周知である。従って、いくつかの態様において、本方法は、表1および2ならびに「配列表」の項に記載されるように、近傍のコード配列の発現を伴うDNA領域における、少なくとも1つのシトシンのメチル化状態を関連付ける段階を含む。例えば、DNA領域中の関心対象のシトシンから3’または5’方向のいずれかで約1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、3.5 kb、または4.0 kb内の遺伝子配列の発現が、検出されうる。特定の遺伝子配列の転写および/または翻訳を測定するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, 1987-2006, John Wiley & Sons; およびSambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, 2000, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照。いくつかの態様において、表1および2ならびに「配列表」の項における遺伝子または遺伝子のタンパク質発現が、例えば、DNA領域中のメチル化状態、および/もしくは近傍の遺伝子配列の発現、および/もしくは癌に関して陰性または癌に関して陽性であることが公知である個体由来の試料からの同一の遺伝子配列のような対照と比較され、または癌の状態と癌でない状態とを識別する発現レベルと比較される。そのような方法は、本明細書に記載されるメチル化を検出する方法のように、乳癌の診断、予後等を提供する際に有用である。
【００８１】
いくつかの態様において、本方法は、メチル化状態ならびに表1および2および「配列表」の項に同定される1つまたは複数の遺伝子領域の発現を関連付ける段階をさらに含む。
【００８２】
IV. 癌の検出
本バイオマーカーおよび方法は、多数の型の癌の検出、診断、予後、分類、および処置において使用されうる。原発性癌、転移性癌、および再発性癌のような、任意の進行段階の癌が検出されうる。多数の型の癌に関する情報が、例えば、American Cancer Society （www.cancer.orgで利用可能）から、または例えば、Harrison’s Principles of Internal Medicine, Kaspar, et al., eds., 16th Edition, 2005, McGraw-Hill, Inc.から見出されうる。検出されうる例示的な癌は、例えば乳管癌を含む乳癌、ならびに肺癌、腎臓癌、肝臓癌、卵巣癌、頭頸部癌、甲状腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、もしくは前立腺癌、または黒色腫を含む。
【００８３】
本発明は、哺乳動物（例えば、ヒト）が癌を有するかどうか、すなわち哺乳動物から採取した生体試料が癌細胞を含むかどうかを判定し、哺乳動物が癌を発症するリスクまたは可能性を評価し、癌の型および段階を分類し、かつ抗癌処置の有効性をモニタリングするかまたは癌を有する哺乳動物における適切な抗癌処置を選択するための方法を提供する。そのような方法は、本発明に記載されるDNA領域において、正常細胞よりも癌細胞が異なるメチル化状態を有するという発見に基づく。従って、本明細書に記載されるDNA領域において細胞が示差的メチル化配列を含むかどうかを判定することにより、細胞が癌性であるかどうかを判定することが可能である。
【００８４】
本発明の多数の態様において、本発明の診断バイオマーカー配列中のメチル化ヌクレオチドの存在が、生体試料において検出され、従って、生体試料が採取された哺乳動物において癌細胞の有無を検出する。いくつかの態様において、生体試料は、癌細胞を含むことが疑われる組織由来の組織試料を含む。例えば、癌を有することが疑われる個体において、乳房組織、リンパ組織、肺組織、脳組織、または血液が評価されうる。あるいは、肺組織、腎臓組織、肝臓組織、卵巣組織、頭頸部組織、甲状腺組織、膀胱組織、子宮頸組織、結腸組織、子宮内膜組織、食道組織、前立腺組織、または皮膚組織が評価されうる。この組織または細胞は、例えば、手術、生検、静脈切開、スワブ、乳頭分泌物、便等を含む、当技術分野において公知の任意の方法により得ることができる。別の態様において、例えば腫瘍からの癌細胞を含むことが公知の組織試料が、例えば、ある処置の有効性、個体の生存予測等のような、癌についての情報を決定するために、本発明の1つまたは複数の診断バイオマーカーのメチル化の存在またはメチル化量に関して解析されると考えられる。いくつかの態様において、本方法は、例えば他の癌バイオマーカーの検出等のさらなる診断方法との組み合わせにおいて使用されると考えられる。
【００８５】
本発明の方法は、癌を有することが公知の個体または癌を有することが疑われる個体を評価するため、または通例の臨床試験として、すなわち必ずしも癌を有することが疑われるわけではない個体において、使用されうる。
【００８６】
さらには、本方法は処置過程の有効性を評価するために使用してもよい。例えば、抗癌処置の有効性は、本明細書に記載されるバイオマーカー配列のDNAメチル化を、癌を有する哺乳動物において一定期間モニタリングすることにより、評価することができる。例えば、処置後の哺乳動物から採取した生体試料において、処置の前または初期に哺乳動物から採取した試料中のレベルと比較して、本発明の任意の診断バイオマーカー中のメチル化が減少しているかまたは存在しないことにより、処置の有効性が示される。
【００８７】
癌を検出する方法は、1つまたは複数の他の癌関連ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の検出を含みうる。従って、本発明の任意の1つまたは複数の診断バイオマーカーのメチル化の検出が、癌の診断または予後に関して、単独でまたは他のバイオマーカーとの組み合わせにおいて使用されうる。
【００８８】
本発明の方法は、癌を有する哺乳動物における最適な処置過程を決定するために使用されうる。例えば、本発明の任意の診断バイオマーカー内のメチル化されたDNAの存在、または本発明の任意の診断バイオマーカー内のメチル化量の増加によって癌を有する哺乳動物の生存予測の減少が示されることが可能で、それにより哺乳動物に対するより積極的な処置が示される。さらに、本明細書に記載されるように、診断バイオマーカーでのメチル化の有無または量と1つまたは他の抗癌剤の相対的効果との関連性が容易に立証されうる。そのような解析は例えば、遡及的に、すなわち、1つまたは複数の型の抗癌治療を受けた哺乳動物から以前に採取した試料中の1つまたは複数の診断遺伝子中のメチル化を検出し、1つまたは複数の診断バイオマーカーのメチル化の有無またはレベルと公知の処置の効果とを関連付けることにより、遂行されうる。
【００８９】
診断、予後、リスク評価、または分類の際、疾患のモニタリングの際、または少なくとも1つの診断バイオマーカーにおけるメチル化の有無に基づいて最も有益な処置過程を決定する際に、メチル化の量と、診断、予後、リスク評価、分類等とを識別する閾値とを比較してもよい。例えば、閾値によって、所望のレベルの感度および特異性により乳癌試料と正常乳房試料とを適切に識別し、特定のDNA領域で見出されるメチル化の程度が表されうる。閾値は、メチル化を測定するために使用されるアッセイに依存して変動するであろうことが理解されるが、特定の所望のアッセイを使用し、続いて少なくとも大多数の非癌試料から大多数の癌試料を識別する値を決定して、疾患試料および正常試料中のDNA配列のメチル化を測定することにより閾値または範囲を決定することは、比較的単純なことであることも理解される。例は、図6および実施例に中の関連する文章に示される。2つまたはそれ以上のDNA領域のメチル化が検出される場合には、2つまたはそれ以上の異なる閾値（各DNA領域に関して1つ）がしばしば、しかし常にではなく、使用されると考えられる。試料中の配列のメチル化量と閾値との比較は、当技術分野において多少なりとも公知である。例えば、手作業による比較を行うことで、またはコンピューターにより値を比較および解析することで、疾患を検出し、疾患に罹患するリスクを評価し、疾患の素因を決定し、疾患の段階を決定し、疾患を診断し、モニタリングし、または疾患を有する個体のための処置の選択を援助しうる。
【００９０】
いくつかの態様において、閾値は、特定の癌型の検出のために、少なくとも特定の感度および特異性を提供する。いくつかの態様において、閾値は、例えば、乳癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、卵巣癌、頭頸部癌、甲状腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、前立腺癌、または黒色腫のような特定の癌の検出のために少なくとも50%、60%、70%、または80%の感度および特異性を許容する。様々な癌に関する特異性および感度についてのさらなる詳細は、例えば表5〜6、および8〜20に見出ることができる。
【００９１】
癌の予後（例えば、非悪性病変の浸潤性癌への進行の予測、転移の予測、疾患再発の予測、または特定の処置に対する応答の予測を含む）に関する態様におけるいくつかの態様においては、閾値は、癌の検出に関して少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80%またはそれ以上の感度、および少なくとも70%の特異性が存在するよう設定される。
【００９２】
いくつかの態様において、本方法は、個体から決定されるメチル化状態に基づく診断、予後、リスク評価、または分類を記録する段階を含む。例えばコンピューターによる電子的記録を含む任意の型の記録が考慮される。
【００９３】
V. キット
本発明はまた、本明細書に記載される方法を使用した、本発明の診断バイオマーカーまたはその発現もしくはメチル化の検出および/または定量のためのキットを提供する。
【００９４】
メチル化を検出するためのキットに関して、本発明のキットは、本発明の少なくとも1つの診断バイオマーカー配列にハイブリダイズする少なくとも1つのポリヌクレオチド、および遺伝子メチル化の検出のための少なくとも1つの試薬を含みうる。メチル化の検出のための試薬は、例えば、亜硫酸水素ナトリウム、バイオマーカー配列がメチル化されていない場合には、本発明のバイオマーカー配列の産物である配列へハイブリダイズするよう設計されたポリヌクレオチド（例えば、少なくとも1つのC→U変換を含む）、および/またはメチル化感受性またはメチル化依存性の制限酵素を含む。キットは、アッセイにおいて使用するよう調節されたアッセイ装置の形状において、固形支持体を提供しうる。キットは、例えばプローブのようなポリヌクレオチドへ連結されてもよい検出可能な標識をキット中にさらに含んでもよい。試験管、トランスファーピペット、等を含む、アッセイの遂行において有用な他の物質もまたキットに含まれうる。キットはまた、本明細書に記載される任意のアッセイにおける、1つまたは複数のこれらの試薬の使用に関する書面の使用説明書も含みうる。
【００９５】
いくつかの態様において、本発明のキットは、
2009538624.tif 000036
からなる群より選択される配列であるDNA領域の、少なくとも一部を特異的に増幅することが可能な1つまたは複数の（例えば、1、2、3、4、またはそれ以上）異なるポリヌクレオチドを含む。任意で、増幅された部分へハイブリダイズすることが可能な1つまたは複数の検出可能に標識されたポリペプチドもまたキットに含まれうる。いくつかの態様において、キットは2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上の異なるDNA領域またはその一部を増幅するために十分なプライマーを含み、各々増幅されたDNA領域またはその一部にハイブリダイズすることが可能な、検出可能に標識されたポリヌクレオチドを任意で含む。キットはさらに、メチル化依存性またはメチル化感受性の制限酵素および/または亜硫酸水素ナトリウムを含みうる。
【００９６】
いくつかの態様において、キットは、全ゲノム増幅のための亜硫酸水素ナトリウム、プライマー、およびアダプター（例えば、連結されうる、またはさもなくばゲノム断片に連結されたオリゴヌクレオチド）、ならびに、
2009538624.tif 000037
からなる群より選択されるDNA領域由来の、少なくとも1つのシトシンの変換型メチル化配列およびまたは変換型非メチル化配列の存在を定量するためのポリヌクレオチド（例えば、検出可能に標識されたポリヌクレオチド）を含む。
【００９７】
いくつかの態様において、キットは、全ゲノム増幅のためのメチル化識別性制限酵素（例えば、メチル化依存性の制限酵素および/またはメチル化感受性の制限酵素）、プライマー、およびアダプター、ならびに、
2009538624.tif 000038
からなる群より選択されるDNA領域の少なくとも一部のコピー数を定量するためのポリヌクレオチドを含む。
【００９８】
いくつかの態様において、キットは、メチル化結合部分、ならびに
2009538624.tif 000039
からなる群より選択されるDNA領域の少なくとも一部のコピー数を定量するための1つまたは複数のポリヌクレオチドを含む。メチル化結合部分とは、メチルシトシンへ特異的に結合する分子（例えば、ポリペプチド）を意味する。例としては、メチル化DNAへ結合する能力を保持するがDNA切断活性を欠如する制限酵素、またはその断片、メチル化DNAへ特異的に結合する抗体等を含む。
【００９９】
VI. コンピューターベースの方法
本明細書に記載される方法の算出は、コンピューターベースの算出およびツールに関与しうる。例えば、DNA領域またはその一部に関するメチル化値は、コンピューターにより本明細書に記載されるように閾値と比較されうる。ツールは、簡便な設計の一般的な目的のコンピューターシステム（本明細書で「ホストコンピューター」として言及される）によって実行可能である、コンピュータープログラムの形状で有利に提供される。ホストコンピューターは、多数の異なるハードウェア構成物で構成されてもよく、かつ多数の寸法および様式において作成されうる（例えば、デスクトップPC、ラップトップ、タブレットPC、手持ち型コンピューター、サーバー、ワークステーション、メインフレーム）。モニター、キーボード、ディスクドライブ、CDおよび/またはDVDドライブ等の標準的構成物が含まれてもよい。ホストコンピューターがネットワークに取り付けられる場所で、接続は任意の適切な伝達媒体（例えば、ワイヤー、視覚的媒体、および/またはワイヤレス媒体）、ならびに任意の適切なコミュニケーションプロトコル（例えば、TCP/IP）を介して提供されてもよい；ホストコンピューターは、適切なネットワークハードウェア（例えば、モデム、イーサネットカード、WiFiカード）を含んでもよい。ホストコンピューターは、UNIX、Linux、Microsoft Windows、MacOSまたは任意の他のオペレーティングシステムを含む、任意の様々なオペレーティングシステムを実行してもよい。
【０１００】
本発明の実行局面に関するコンピューターコードは、PERL、C、C++、Java、JavaScript、VBScript、AWK、またはホストコンピューターで実行されうるまたはホストコンピューター上で実行されるようにコンパイルされうる、任意の他のスクリプトまたはプログラム言語を含む様々な言語で記述されてもよい。コードもまた、アセンブリ言語またはマシン言語のような低級言語で記述または伝達されてもよい。
【０１０１】
ホストコンピューターシステムは、ユーザーがツールの操作を制御するインターフェースを有利に提供する。本明細書に記載される例において、ソフトウェアツールはスクリプトとして実行され（例えば、PERLを使用して）、ユーザーは、LinuxまたはUNIXのようなオペレーティングシステムの標準的コマンドラインインターフェースから実行を開始する。当業者は、コマンドが適切にオペレーティングシステムに調節されうることを理解すると考えられる。他の態様において、ユーザーがポインティングデバイスを使用して操作を制御することを許容するグラフィカルユーザーインターフェースが提供されてもよい。従って、本発明は、いかなる特定のユーザーインターフェースにも限定されない。
【０１０２】
本発明の様々な特徴を組み込んでいるスクリプトまたはプログラムは、記憶および/または伝達のために、様々なコンピューター読み取り可能な媒体上にコード化されてもよい。適切な媒体の例は、磁気ディスクまたはテープ、コンパクトディスク（CD）またはDVD（デジタル多目的ディスク）のような光学記憶媒体、フラッシュメモリー、ならびにインターネットを含む様々なプロトコルに適合する有線、光学、および/またはワイヤレスネットワークを介した伝達に適応したキャリア信号含む。
【０１０３】
実施例
実施例1. 乳癌のDNAメチル化バイオマーカーの同定
マッチする隣接する組織学的に正常な乳房組織と比較して乳房腫瘍において示差的にメチル化されている座位を、メチル化依存性制限酵素McrBCを利用するDNAマイクロアレイベースの技術プラットフォーム（米国特許第7,186,512号）を利用して同定した。この開示される段階において、浸潤性乳管癌10個（ステージIIが9個、ステージIIIが1個）およびマッチする隣接する組織学的に正常な乳房組織試料10個を解析した。各試料由来の精製されたゲノムDNA（60μg）を、1〜4kbの範囲で無作為に剪断した。続いて、剪断された各試料のDNAを、各々15μgの4つの等量部分へ分割した。2つの部分を以下の条件でMcrBCを用いて消化した：総容積600μL中に、15μgの剪断されたゲノムDNA、1 X NEB2バッファー（New England Biolabs）、0.1 mg/mLウシ血清アルブミン（New England Biolabs）、2 mM GTP(Roche)、および120単位のMcrBC酵素（New England Biolabs）、37℃でおよそ12時間。これらの2つの部分は、McrBC消化の技術的反復を表す（処置1および処置2）。残る2つの15μgの部分は、McrBC酵素の代わりに12μLの無菌50%グリセロールを添加したことを除き、同一条件下で偽処置した。これらの2つの部分は、偽処置の技術的反復を表す（未処置1および未処置2）。全ての反応は5μLのプロテアーゼK（50 mg/mL）を用いて50℃で1時間処置し、標準的条件下でEtOHを用いて沈殿させた。沈殿物を、70% EtOHを用いて2回洗浄し、乾燥し、30μL H2O中に再懸濁した。続いて試料を、1%低融点SeaPlaque GTG Agaroseゲル（Cambridge Bio Sciences）上で分離させた。未処置1部分および処置1部分は、未処置2部分および処置2部分と同様に並べて分離させた。正確なゲルスライス切除を導くために、1 kbのDNAサイズラダー（sizing ladder）を各未処置/処置対に隣接して分離させた。長波長UVを用いてゲルを可視化し、未処置画分の形式上のサイズ範囲内（およそ1〜4 kb）のDNAを含むゲルスライスを、清潔なかみそり刃を用いて切除した。ゲル抽出キット（Qiagen）を使用してゲルスライスからDNAを抽出した。
【０１０４】
McrBCは5’-PumC (N40-2000) PumC-3’（ここで、Pu=AまたはG、mC=5-メチルシトシン、かつN=任意のヌクレオチド）の前後関係においてメチル化シトシン残基対を認識し、メチル化シトシン残基の1つからおよそ30塩基対内で切断する。従って、高い局部密度のPumCを含む座位は、低い局部密度のPumCを含む座位よりも、より顕著な程度まで切断されると考えられる。未処置部分および処置部分はアガロースゲル電気泳動により分離され、未処置部分の形式上のサイズ範囲内のDNAが切除されゲル抽出されたため、処置部分はPumCを含むDNA断片が除去されているが、未処置部分は試料の断片化されたゲノム全体を表す。画分を二つ組の色素交換マイクロアレイハイブリダイゼーションパラダイムを使用して解析した。例えば、等質量（200 ng）の未処置1画分および処置1画分のDNAを、各々Cy3およびCy5を用いた標識のための鋳型として使用し、DNAマイクロアレイへハイブリダイズした（以下に記載）。等質量（200 ng）の同一の未処置1画分および処置1画分のDNAを、各々Cy5およびCy3を用いた標識のための鋳型として使用し、第二のDNAマイクロアレイへハイブリダイズした（これらの2つのハイブリダイゼーションは未処置1/処置1画分の色素交換を表す）。等質量（200 ng）の未処置2画分および処置2画分のDNAを、各々Cy3およびCy5を用いた標識のための鋳型として使用し、第三のDNAマイクロアレイへハイブリダイズした。最後に、等質量（200 ng）の同一の未処置2画分および処置2画分のDNAを、各々Cy5およびCy3を用いた標識のための鋳型として使用し、第四のDNAマイクロアレイへハイブリダイズした（最後の2つのハイブリダイゼーションは最初の色素交換の技術的反復を表す）。全20個のDNA試料（腫瘍試料10個および隣接する正常試料10個）を、この様式で解析した。従って、この開示される実験は、全部で80のマイクロアレイハイブリダイゼーションを含んだ。
【０１０５】
この実施例において記載されるマイクロアレイは、85,176フィーチャーからなる。各60merのオリゴヌクレオチドフィーチャーは、マイクロアレイスライド当り4回の反復により表され、全部で21,294の固有のフィーチャープローブが得られる。このフィーチャーは、同定されたヒト遺伝子の79%、1395個のGenBank BACによりアノテートされたCGアイランド（CGi）、9番染色体上でMTAPase/CDKN2A/B座位に沿って約165 kbに及ぶ161個のフィーチャー、癌遺伝子プロモーター特有の66個のさらなるフィーチャー、およびコピー数（HERV、LINEｓ、SINE）として設計される77個のフィーチャー、ならびに他の対照を表す、19,595個の無作為に選択されたヒト転写開始部位（TSS）を表す。総合して、TSSフィーチャーおよびCGiフィーチャーによって、UCSCによりアノテートされた9000個以上のヒトCGアイランドをスキャンすることができる。
【０１０６】
これらのデータセットの統計学的解析に続き、正常組織に対して少なくとも70%の腫瘍において示差的にメチル化されていることが予測された座位を同定した。以下の実施例において記載されるように、本明細書に記載される、開示されるマイクロアレイ実験によって同定された53座位の集合の示差的DNAメチル化は、10個のマッチする隣接する組織学的に正常な乳房試料に対する10個の浸潤性乳管癌の開示されるパネル内で検証され、かつ、独立した浸潤性乳管癌試料、正常乳房試料、および正常な女性末梢血液試料の、より大型のパネルにおいて検証された。表1および2ならびに「配列表」の項では、これらの53座位の各々に関して、固有のマイクロアレイフィーチャー識別子（フィーチャー名）が列挙されている。座位番号は、以下の例において座位を同定するために使用されるであろう任意の座位識別子である。53個のフィーチャーのうち、48個は少なくとも1つのアノテートされた転写遺伝子の1 kb以内の配列を表す。これらは表中において、Ensembl遺伝子ID、および各遺伝子の公式な遺伝子シンボル（遺伝子名）によって言及される。所定のマイクロアレイフィーチャーがDNAメチル化状態を報告することができるゲノム領域は、マイクロアレイハイブリダイゼーションのために標識されたDNA断片の分子サイズに依存する。上に記載されるように、1〜4 kbのサイズ範囲のDNAをアガロースゲル抽出法により精製し、シアン色素標識のための鋳型として使用した。従って、各マイクロアレイフィーチャーにより調べられるゲノム領域は、少なくとも1 kbである（すなわち、マイクロアレイフィーチャーにより表される配列の500 bp上流および500 bp下流）。5つのフィーチャーは、この1 kbの「翼幅」内にアノテートされた転写遺伝子を有しない座位を表すことに注意（座位番号3、9、20、31、および47）。また、8つのフィーチャーは、1つを超えるアノテートされた転写遺伝子が翼幅内に入る座位を表すことに注意（座位番号21、26、27、29、35、38、39および53）。これらの座位でのDNAメチル化は、任意のこれらの近傍の遺伝子の制御に影響を及ぼすことが可能で、従って、近傍の遺伝子からの遺伝子発現の検出もまた、多数の型の診断テストにおいて、癌の有無を判定するために有用である。
【０１０７】
(表１)示差的DNAメチル化を報告するマイクロアレイフィーチャー、および各フィーチャーの1 kb以内のアノテートされた遺伝子の正体
2009538624.tif 000040
【０１０８】
実施例2. 独立したDNAメチル化の立証および検証アッセイの設計
乳房腫瘍と隣接する組織学的に正常な乳房組織との間で示差的にメチル化されていることが予測される、53座位を調べるPCRプライマーが設計された。酵素の機能的特徴により、McrBCによるDNAメチル化依存的なDNA断片の切除が、実施例1において記載されたマイクロアレイ上のフィーチャーによって表されるゲノム配列の近傍の配列（翼幅）のDNAメチル化状態をモニタリングすることが可能である。実施例1において記載されるように、解析されたDNA断片のサイズがおよそ1〜4 kbであるため、本発明者らは、マイクロアレイフィーチャーにより表される配列の1 kbに及ぶ領域を、示差的メチル化が予測される領域の推定として選択した。各座位に関して、PCRプライマーを、DNAマイクロアレイ上で表されるゲノム配列に隣接するこのおよそ1 kb領域（およそ500 bp上流および500 bp下流）内で選択した。プライマー配列の選択は、ゲノムに渡ってのプライマー配列の固有性、ならびに1 kb領域中のプリンCG配列の分布により導かれた。PCRプライマー対を、各1 kb領域中のおよそ400〜600 bpの配列を増幅するために選択した。実証のために、1つのそのようなPCRアンプリコン設計の例を図1に示す。1つの予測される示差的にメチル化された遺伝子の転写開始部位および5’構造の図解的表示が示される（A）。棒グラフ（B）は、この領域中のプリンCG配列の相対的な局部密度を示す。この座位での示差的DNAメチル化を報告したDNAマイクロアレイフィーチャーの相対位置が、（C）により示される。PCRプライマーを、（D）により示される領域を増幅するために選択した。垂直の棒（EおよびF）は、全乳房腫瘍（E）および全正常乳房試料（F）を表すマイクロアレイDNAメチル化測定値を表す。例えばこの座位では、隣接する正常乳房試料（負の値）と比較して、乳房腫瘍（正の値）において高度にメチル化されていることが予測される。53個のプライマー対に関する適切なPCRサイクル条件が経験的に決定され、正確なサイズの特異的PCRアンプリコンの増幅が立証された。53個のマイクロアレイフィーチャー配列、プライマー対、およびアンプリコンは、表2および「配列表」の項に示される。
【０１０９】
(表２)本出願中に記載される全ての配列に関する配列同定番号。表中では座位番号で列挙されているため、実際の配列に関しては「配列表」の項を参照。
2009538624.tif 000041
2009538624.tif 000042
2009538624.tif 000043
【０１１０】
実施例3. マイクロアレイDNAメチル化予測の立証
初めに、これらの53座位のDNAメチル化状態を、上に記載される10個の浸潤性乳管癌試料および10個のマッチする隣接する組織学的に正常な試料（すなわち、マイクロアレイ実験のために使用される、開示される組織パネル）において、独立的にアッセイした。DNAメチル化を、DNAメチル化状態をモニタリングするためにMcrBC制限酵素による消化を利用して、定量PCRアプローチによりアッセイした。各試料から精製したゲノムDNAを、9.6μgの2つの等量部分へ分割した。1つの9.6μg部分（処置部分）を、1 X NEB2バッファー（New England Biolabs）、0.1 mg/mLウシ血清アルブミン（New England Biolabs）、2 mM GTP(Roche)、および80単位のMcrBC酵素（New England Biolabs）を含む総容積120μL中でMcrBCを用いて消化した。第二の9.6μg部分（未処置部分）を、McrBC酵素の代わりに8μLの無菌50%グリセロールが添加されたことを除き、処置部分と厳密に同一に処置した。反応物を37℃でおよそ12時間インキュベートし、続いてMcrBCを不活性化するために60℃で20分間インキュベートした。
【０１１１】
各座位でのMcrBC切断の程度を、定量リアルタイムPCR（qPCR）によりモニタリングした。アッセイされた各座位に関して、20 ngの未処置部分DNAを鋳型として使用し、および別個に20 ngの処置部分DNAを鋳型として使用し、qPCRを遂行した。各反応は、1 X LightCycler 480 SYBR Green I Master mix（Roche）および625 nMの各プライマーを含む総容積10μL中で遂行した。反応はRoche LightCycler 480機器において遂行した。最適アニーリング温度は、プライマー対に依存して変動した。プライマー配列（左側プライマー；右側プライマー）および適切なアニーリング温度（アニーリング温度）は、表2に示される。サイクル条件は：95℃で5分；95℃で1分、[アニーリング温度、表2を参照]で30秒、72℃で1分を45サイクル、83℃で2秒、続いてプレート判読。融解曲線は、以下の条件で算出した：95℃で5秒、65℃で1分、継続的プレート判読を伴う2.5℃/秒のランプ速度で65℃〜95℃。各未処置/処置qPCR反応対は二つ組で遂行した。各未処置/処置qPCR反応対に関して、増幅は、閾値を越えるサイクル数の差異（ΔCt）が、未処置部分のCtを処置部分のCtから差し引くことにより算出された。2つのプライマー間におけるMcrBCが介する切断により処置部分のCtが増加するため、ΔCt値の増加は、局部的なDNAメチル化密度の測定値の増加を反映する。未処置/処置qPCR反応の2つの反復の間での平均ΔCt、ならびに2つのΔCt値の間の標準偏差を算出した。
【０１１２】
実証目的のために、腫瘍試料および正常試料における1つの座位（GHSR）に関する増幅プロファイルを、図2に示す。パネルAは、乳房腫瘍試料中のGHSRアンプリコンの増幅に関する未処置/処置PCR反復1を示す。ΔCt(処置1-未処置1)は5.38サイクルである。パネルBは、同一腫瘍試料由来の同一アンプリコンの増幅に関する未処置/処置PCR反復2を示す。ΔCt(処置2-未処置2)は5.40サイクルである。2つの反復の平均ΔCtは5.39サイクルであり、未処置部分と比較した処置部分における増幅可能なコピーの、約97%の減少を表す[100%-((1/2^ΔCt)x100)]。2つのqPCR反復の間のΔCtの標準偏差は、0.01サイクルである。パネルCは、正常乳房試料におけるGHSRアンプリコンの増幅に関する未処置/処置PCR反復1を示す。ΔCt（処置1-未処置1）は、0.18サイクルである。パネルDは、同一の正常試料由来の同一アンプリコンの増幅に関する未処置/処置PCR反復2を示す。ΔCt（処置2-未処置2）は、0.03サイクルである。2つの反復の平均ΔCtは0.11サイクルであり、未処置部分と比較した処置部分における増幅可能なコピーの約7%の減少を表している。2つのqPCR反復の間のΔCtの標準偏差は、0.11サイクルである。腫瘍試料の平均ΔCtは、メチル化された座位として評価されると考えられる。対照的に、正常試料の平均ΔCtは比較的メチル化されていない座位として評価されると考えられる。未処置部分と比較した処置部分における増幅可能なコピーの約50%を超える減少を表す、1.0サイクルを超える平均ΔCtを、DNAメチル化に関して陽性として試料を評価するための閾値として設定した。qPCR反復における1.0サイクルを超える標準偏差を有する任意の平均ΔCt測定値は、信頼できない測定値として排除した（図3中のND）。最終的に、0未満の任意の平均ΔCtを、0に調整した。
【０１１３】
図3は、開示されるマイクロアレイ実験において使用された10個の腫瘍試料および10個の正常試料における、53座位に関するDNAメチル化の測定値の結果を示す。中抜きの四角は、メチル化されていない座位を表し（平均ΔCtが1.0未満）、灰色の四角は、メチル化されている座位を表し（平均ΔCtが1を上回りかつ2未満）、かつ黒色の四角は、高密度にメチル化されている座位を表す（2を上回る平均ΔCt）。
【０１１４】
実施例4. 独立した乳房腫瘍試料および正常乳房試料におけるDNAメチル化の変化の検証
53座位の示差的DNAメチル化状態を、16個の浸潤性乳管癌試料（ステージIが1個、ステージIIが4個、ステージIIIが11個）、および25個の正常な乳房組織試料の独立したパネルを解析することによりさらに検証した。このパネルに含まれる正常乳房組織は、乳癌と無関係の生検材料から得た。各試料を、4μgの2つの等量部分へ分割した。1つの部分は、1 X NEB2バッファー（New England Biolabs）、0.1 mg/mLウシ血清アルブミン（New England Biolabs）、2 mM GTP(Roche)、および32単位のMcrBC（New England Biolabs）を含む総容積200μL中で、McrBC（処置部分）を用いて消化した。第二の部分は、McrBC酵素の代わりに3.2μLの無菌50%グリセロールが添加されたことを除き、同一条件下で偽処置した（未処置部分）。試料を37℃でおよそ12時間インキュベートし、その後McrBC酵素を不活性化するために60℃でインキュベートした。qPCR反応およびデータ解析を、実施例3に記載されるように遂行した。
【０１１５】
DNAメチル化状態の測定値は、図4中に要約される。上に記載されるように、各座位を、メチル化されていない（1.0未満の平均ΔCt、中抜きの四角）、メチル化されている（1.0を上回りかつ2.0未満の平均ΔCt、灰色の四角）、または高密度にメチル化されている（2.0を上回る平均ΔCt、黒色の四角）と評価した。1サイクルを超えるpPCR反復の間の標準偏差を有する測定値は、解析に含まなかった（ND）。表3は、各座位に関する感度および特異性のパーセンテージを示す。感度は、各座位でのDNAメチル化に関して陽性であることが公知の腫瘍試料を評価する頻度を反映する。特異性は、各座位でのDNAメチル化に関して陰性であることが公知の正常試料を評価する頻度を反映する。上に記載されるように、1.0を上回る平均ΔCt（処置部分-未処置部分）を、各座位でのDNAメチル化に関して陽性として試料を評価するための閾値として使用した（未処置集団と比較した、DNAメチル化依存性制限集団における増幅可能分子の約50%を上回る除去を表している）。感度のパーセンテージは、1.0を上回る平均ΔCtを有する腫瘍試料の数を、その座位に関して解析された全腫瘍試料の数で割り（すなわち、1サイクルを上回るqPCR反復の間の標準偏差を有するいかなる測定値をも排除する）、X100することにより算出した。特異性のパーセンテージは、（1-（1.0を上回る平均ΔCtを有する正常試料の数をその座位に関して解析された正常試料の合計数で割った値））X100により算出した。表3に示されるように、53座位は13%を上回る感度、および80%を上回る特異性を有する。とりわけ、53座位のうち33座位が100%の特異性を有する。任意の所定の座位の示差的DNAメチル化状態の感度および特異性は、DNAメチル化感受性アッセイにより調査される正確な局部的遺伝領域のさらなる最適化により増加しうると指摘することは重要である。
【０１１６】
(表３Ａ)25個の正常乳房および16個の乳房腫瘍試料のパネルにおける、示差的にメチル化された座位の感度および特異性
2009538624.tif 000044
【０１１７】
(表３Ｂ)25個の正常乳房および16個の乳房腫瘍試料のパネルにおける、示差的にメチル化された座位の感度および特異性
2009538624.tif 000045
【０１１８】
実施例5. 乳房腫瘍試料、正常乳房試料、および正常な女性末梢血液試料のより大型のパネルにおける、選択されたDNAメチル化バイオマーカーのさらなる検証
9個のさらなる浸潤性乳管癌試料のパネルにおいて、15座位のパネルをさらなる検証のために選択し、解析した腫瘍試料の合計数を25個（ステージIIが1個、ステージIIIが8個）とした。さらに、25個の正常な女性末梢血液試料を解析した。試料を、実施例4に記載されるよう処置し、解析した。図5は、実施例4に記載される25個の正常乳房試料を含むこれらの解析の結果を示す。表4に示されるように、これらの座位は、正常乳房組織に対して17%を上回る感度、92%を上回る特異性、および正常な女性末梢血液に対して92%を上回る特異性を提示する。
【０１１９】
(表４)25個の正常乳房および25個の乳房腫瘍試料および25個の正常血液試料のパネルにおける、示差的にメチル化された座位の感度および特異性
2009538624.tif 000046
【０１２０】
実施例6. DNAメチル化測定閾値の実証
上の実施例において、示差的メチル化を評価する閾値（1.0を上回る平均ΔCt）が立証され、全座位に対して無差別に適用された。しかしながら、最も有益な閾値は、問題になっている特定の座位に依存する。これは、図6において示される。グラフは、25個の腫瘍試料、25個の正常乳房試料、および24個の正常な女性末梢血液試料中のGHSR座位の解析された領域に関する平均ΔCt（処置部分-未処置部分）を示す。1.0を上回る平均ΔCt閾値を、陽性のDNAメチル化測定値に関する基準として使用すると、感度は84%、正常組織に対する特異性は100%、および血液に対する特異性は96%（表4）である。しかしながら、最適閾値は各々別個の座位に関して設定してもよく、かつこの閾値は、示差的DNAメチル化状態を検出するために使用された技術に依存する。例えば、図6に示されるGSHR例において、1.3（図中の破線）を上回る閾値により、血液に対する特異性が100%に調整されると考えられる。
【０１２１】
実施例7. およそ100個の乳房腫瘍試料および100個の正常乳房試料を含むパネルにおいて、選択されたDNAメチル化バイオマーカーの検証
16個のバイオマーカー座位のパネルを、さらなる乳房腫瘍および正常乳房試料においてさらに検証した。合計およそ100個の試料を、各群に関して解析した。各バイオマーカーおよび各試料カテゴリーに関して解析された試料の合計数は、表5中に報告される。
【０１２２】
(表５)およそ100個の乳房腫瘍試料、100個の正常乳房試料、および25個の正常血液試料における、示差的にメチル化された座位の感度および特異性
2009538624.tif 000047
陽性腫瘍の数：1.0以上の平均dCtを報告した腫瘍試料の数（メチル化された座位）
腫瘍の合計：検査された腫瘍試料の数
感度（%）：（陽性腫瘍の数/腫瘍の合計）X100
陽性正常乳房の数：1.0以上の平均dCtを報告した正常乳房試料の数（メチル化された座位）
正常乳房の合計：検査された正常乳房試料の数
特異性（%）（正常乳房）：(1-(陽性正常乳房の数/正常乳房の合計))X100
陽性正常血液の数：1.0以上の平均dCtを報告した正常血液試料の数（メチル化された座位）
正常血液の合計：検査された正常血液試料の数
特異性（%）（正常血液）：(1-(陽性正常血液の数/正常血液の合計))X100
【０１２３】
実施例8. 示差的DNAメチル化の、亜硫酸水素塩シーケンスによる確認
亜硫酸水素塩シーケンスによる示差的DNAメチル化の確認の例が、図7に示される。プライマーを、亜硫酸水素塩により変換されたゲノムDNAから（上の実施例において議論されるように）qPCRにより解析したNuclear Factor 1 X-typeの412 bp領域内の130 bpアンプリコンを増幅するために設計した。プライマー配列は、CpGジヌクレオチドを欠如し、従って、DNAメチル化状態とは独立に亜硫酸水素塩により変換されたDNAを増幅する。産物を、1つの腫瘍試料（DNAメチル化に関して陽性）、および1つのプールされた正常な女性末梢血液試料から増幅した。アンプリコンを精製し、TAクローニングキット（Invitrogen）を使用してクローニングした。18個の独立したクローンを腫瘍試料に関してシーケンスした。7個の独立したクローンを血液試料に関してシーケンスした。亜硫酸水素塩による処置はメチル化されていないシトシンのウラシルへの変換をもたらすが、メチル化されたシトシンを変換しない。領域中の各CpGジヌクレオチドのメチル化のパーセンテージを、各CpGでのCのシーケンス判読数をシーケンス判読の合計数で割ることにより算出した。図7Aは、腫瘍試料中の18個のCpGジヌクレオチドの各々に関するメチル化占有率（%）を示す。図7Bは、正常血液試料中の18個のCpGジヌクレオチドの各々に関するメチル化占有率（%）を示す。全18個のCpGジヌクレオチドは、腫瘍中でメチル化されている（占有率は11%〜89%に及ぶ）。しかしながら、1つのCpGジヌクレオチドのみ、正常血液試料においてメチル化を提示した（14%）。
【０１２４】
DNAメチル化差異のさらなる確認を提供し、かつDNAメチル化のハイスループットな検出に関してqPCRベースのストラテジーを正当化するため、3つの座位を亜硫酸水素塩ゲノムシーケンスにより解析した。qPCRで解析した3つの座位の領域内でおよそ150 bpのアンプリコンを増幅するため、上に記載されるようにプライマーを設計した。座位には、フィーチャーID ha1p_39189（座位番号2）、ha1g_00644（座位番号3）、およびha1p_104423（座位番号12）が含まれた。プライマー配列はCpGジヌクレオチドを欠如し、従ってDNAメチル化状態とは独立に亜硫酸水素塩により変換されたDNAを増幅する。各アンプリコンに関して、0.5未満の平均dCt値を報告した3つの正常乳房DNA試料、0.5および1.0の間の平均dCt値を報告した3つの正常乳房DNA試料、および1.0より大きい平均dCt値を報告した3つの乳房腫瘍DNA試料から産物がを増幅した。アンプリコンを精製し、TAクローニングキット（Invitrogen）を使用してクローニングした。座位当り、アンプリコン当り少なくとも29個の独立したクローンがシーケンスされた。図8は、同一DNA試料中の座位に関する平均dCt値に対してプロットされた、アンプリコン当りの、全クローンに関する5-メチルシトシン含有量の中央値を示す。破線垂直線は、DNAメチル化検出に関する陽性qPCR測定値を示すために使用された、dCt=1.0の閾値を表す。これらのデータは、正常乳房試料と比較した、腫瘍における示差的DNAメチル化含有量を立証する。さらに、亜硫酸水素塩シーケンスにより決定されるqPCR測定値と5-メチルシトシン含有量との間の比例関係（R2=0.7965）は、DNAメチル化の検出のためのハイスループットqPCR法に関する正当性を提供する。
【０１２５】
実施例9. 示差的DNAメチル化の潜在的領域として同定された配列の選択
上の実施例において記載されるように、示差的にメチル化されていると同定された座位は、当初DNAメチル化依存性マイクロアレイ解析に基づき発見された。この示差的メチル化を報告する53個のマイクロアレイフィーチャー配列は、表2および「配列表」の項において示される。各フィーチャーによるゲノム調査の「翼幅」は保存的に1 kbであるため、各マイクロアレイフィーチャーにより表される配列の周囲の1 kb領域中のアンプリコンを増幅するPCRプライマーを選択し、独立した立証および検証実験に関して使用した。プライマー配列およびアンプリコン配列は、表2および「配列表」の項において示される。成功裡のPCR増幅を最適化するために、これらのアンプリコンは、マイクロアレイフィーチャーの翼幅により表される全1 kbの領域未満になるよう設計された。しかしながら、示差的メチル化は、この配列ウィンドウ内のいかなる場所でも検出可能であってもよいことが注意されるべきである。各座位に関して、マイクロアレイフィーチャーにより表される配列に隣接する少なくともこの1 kb領域を表す配列を、特許請求される潜在的に示差的メチル化されたゲノム領域として選択した。これらの配列は、表2（DNA領域配列）および「配列表」の項において示される。マイクロアレイフィーチャーにより表される配列に隣接する1 Kb領域に基づいて特許請求される配列は、表2において「1 kb」として示される（選択基準）。
【０１２６】
さらに、各領域の周囲の局部的なCpG密度を算出した。各フィーチャーの上流および下流双方のおよそ10 kbの配列をヒトゲノムから抽出した。ゲノムの各20 kb領域に関して、CG密度を算出するために、100 bpステップで移動する500 bpのスライディングウィンドウ（sliding window）を使用した。CG密度は、kb当りのCGジヌクレオチドの割合として表現された。例が図9に示され、周辺配列の局部的CpG密度と比較したGHSR遺伝子の転写開始部位の位置が示される。この例において、遺伝子のプロモーター領域に関連するCpG密度の約4 kbのピークを伴う任意の場所でのメチル化がモニタリングされ、臨床的診断アッセイにおいて有用である。特許請求される領域が局部的なCpG密度の解析により決定される座位は、表2において「CG」として示される（選択基準）。図9に図示されるように、特許請求される配列を、PCRアンプリコンにより上流および下流の境界として表される配列に隣接する、局部的な最小限のCpG密度の設定に基づき選択した。
【０１２７】
実施例10. 示差的DNAメチル化が疾患の初期において検出可能であることの実証
ステージIIまたはIII腫瘍と比較して、解析されたステージI腫瘍の数は少なかったが（103試料中8試料）、少数のステージI腫瘍を含有することにより、示差的メチル化事象が腫瘍段階に関連するかどうかを判定することが許容された。図10Aは、8個のステージI腫瘍に対して、ステージIIおよびIII腫瘍における16座位の高メチル化の頻度のプロット（すなわち、中程度から高密度にメチル化されていると評価されるステージI腫瘍のパーセンテージ）を示す。2つの感度算出の関連性（R2=0.887；傾き=0.9815）により、これらの座位の高メチル化の頻度は、腫瘍のステージに係らず同様であることが示された。従って、大多数の座位に関して、示差的メチル化事象は、より後期のステージの腫瘍において存在するのとほぼ同様に、ステージI腫瘍中においても存在する。続いて各ステージの腫瘍においてメチル化された座位の割合が、3つの選択された座位に関して解析された。試料内のメチル化分子負荷の測定値を提供するために、所定の座位がメチル化されていると評価される各試料に関して、McrBCによる除去のパーセンテージが[1-(1/2^ΔCt(McrBC消化-偽処置))*100]と算出された。各腫瘍ステージでの除去のパーセンテージの平均が図10B中に示される。腫瘍ステージの増加に伴い、これらの座位で、メチル化密度の増加への傾向が存在する一方で、ステージI腫瘍のメチル化密度は、ステージII〜III腫瘍とは有意に異なっていなかったが、全正常試料の平均とは劇的に異なっていた。従って、これらの座位の示差的メチル化は、頻度および高メチル化密度の双方について、腫瘍ステージと独立している。
【０１２８】
実施例11. バイオマーカーの感度および特異性の受信者動作曲線解析
示差的DNAメチル化事象の感度および特異性の算出のための最適閾値を決定するために、表5中に記載される16座位の各々に関して受信者動作特性(ROC)解析を遂行した。4つの選択された座位に関する主要なqPCRデータの例が、図11Aに示される。これらのプロットにより、腫瘍、正常乳房組織、および正常末梢血液試料の間の全体的な識別が実証される。これらの座位で腫瘍組織が示差的にメチル化されていると評価された頻度は、癌患者の年齢または患者の原発性腫瘍のエストロゲン受容体の状態のいずれにも有意に関連していなかった。対応する4つのデータベースに関するROC曲線が、図11Bに示される。最適閾値を、各々の観察されたΔCt値で算出された感度および特異性の最大総数として同定した。算出がqPCRプラットフォームの変動範囲内の閾値に基づかないよう、許容される最小閾値を0.5に設定した。結果は表6に要約される。最適閾値に基づく感度および特異性の算出は、標準ΔCt閾値1.0を使用して算出したものと類似している。仮定したように、乳癌において示差的にメチル化されている遺伝子として以前に同定された大多数と比較して、DNAメチル化の直接的な全体プロファイルによって実質的に改善された感度および特異性を示す多数の新規DNAメチル化ベースのバイオマーカーを同定した。実際、GHSRのプロモーター領域中に位置する唯一の示差的にメチル化されたバイオマーカーは、90%の感度および96%の特異性を有して、正常および良性乳房組織からIDCを識別することが可能であった。他のバイオマーカーは、減少した感度を有して同様の特異性を提示した。これらのバイオマーカーのいくつかは、以前に報告されている高メチル化されたバイオマーカーの大多数よりも、高頻度に高メチル化されていた（すなわち、16個のうち12個が53%および90%の間の感度を提示した）。
【０１２９】
(表６)乳癌バイオマーカーの検証。閾値は、腫瘍組織と非腫瘍組織との識別のための最適平均dCt値を示す。
2009538624.tif 000048
【０１３０】
実施例12. 亜硫酸水素塩シーケンスによるDNAメチル化の徹底的解析
異なる組織型の間での、メチル化されたDNA負荷のqPCRベースの測定値と比較したDNAメチル化状態の徹底的解析を提供するため、本発明者らは、大規模な亜硫酸水素塩シーケンス解析のために4つの座位（座位番号2、3、4、および12）を選択した（図12）。各座位に関して、解析された領域はqPCRアッセイにおいて増幅されたものと重複した。プライマー対は、CpGジヌクレオチドと隣接するが、CpGジヌクレオチドを含有しないように設計された。各座位の解析に関して、本発明者らは、中程度から高密度にメチル化されていると評価された腫瘍試料、および低密度にメチル化されていると評価された正常乳房試料を選択した。さらに、本発明者らは、3つの組織学的に正常な腫瘍に隣接する組織試料を選択した。亜硫酸水素塩により修飾されたゲノムDNAから、組織試料を同定するための患者に特異的な配列タグを含んだプライマーを用いて座位を増幅し、アンプリコンをプールし、シーケンスした。各試料中の各座位に関して解析された平均分子数は、587であった。各座位での局部的DNAメチル化密度の一般的測定値を提供するため、Cとシーケンスされた（メチル化されている）CpG部位の合計数を、各個体の試料に関してシーケンスされたCpG部位の合計数で割った。続いて、このメチル化されたCpG値のパーセンテージを、同一の組織試料に関するqPCRメチル化測定値に対してプロットした(図12A、C、E、G）。亜硫酸水素塩シーケンスおよびqPCRにより得られたメチル化負荷値は、座位番号2、12、および3に関して強い関連性を提示した（各々R2=0.76、0.87、および0.78）。腫瘍試料は、正常乳房および隣接する組織学的に正常な乳房試料よりも、座位番号4でより高いDNAメチル化負荷を提示し、一方非腫瘍組織は、他の座位よりもより高いベースラインDNAメチル化密度を提示した(図12E)。次に、各組織型における、CpG部位当りのDNAメチル化の平均発生を算出した（図12B、D、F、H）。腫瘍試料は、一般に非腫瘍(すなわち、正常)試料よりも、CpG部位当りのメチル化において高い変動を提示した（メチル化されたCpGの平均パーセンテージに関する、より高い標準偏差により示される）。各座位において、非腫瘍試料と比較したDNAメチル化のパターンは、有意に高メチル化されていた。さらに、CpG部位当りのDNAメチル化の解析によって、座位番号4において検出されたより高いベースラインDNAメチル化密度に関する説明が提供される（図12F）。非腫瘍試料においては、解析された領域の最初の3つのCpGジヌクレオチドでのメチル化密度が50%を超えたが、続く4つのCpGジヌクレオチドのメチル化は、他の解析された座位でのメチル化のベースラインレベルとより一致する、より低い密度へ低下した。興味深いことに、腫瘍試料は同一の一般的メチル化密度のパターンを示したが、解析された領域全体に渡り、CpG当たり有意により高いメチル化密度を有していた。総合すると、これらの結果によって乳癌におけるこれらの座位の高メチル化状態が確認され、この研究においてDNAメチル化の変化に関するスクリーニングのために使用されたqPCRベースの方法の正確性について、広範な検証が提供される。
【０１３１】
実施例13. DNA高メチル化は、転写の減少と関連する
高メチル化と転写抑制との関連に対処するため、本発明者らは、座位番号2、4、および12のRT-PCR解析を遂行した（図13）。4つの浸潤性乳管癌試料（90%を上回る腫瘍細胞性）が3つの遺伝子のDNAメチル化、および転写の双方に関して解析された。DNAメチル化は、上に記載されるqPCRベースのアッセイを使用して解析された。遺伝子発現解析に関して、イントロン配列に隣接するよう設計され、ゲノムDNAの混入が排除されうる遺伝子特異的プライマー対を使用してRT-PCRを遂行した。GAPDH発現の解析が、内部対照として遂行された。腫瘍試料および正常乳房組織試料由来の第一鎖cDNA調製物の系列希釈を、PCRの鋳型として使用した。図13に示されるように、座位番号2の転写産物の発現（GHSR）は、4つ全ての腫瘍試料において検出不可能であったが、発現は、正常乳房cDNAの1:10希釈で検出された。GHSR座位での高メチル化の高感度（90%）と一致して、全腫瘍試料によって、この座位における中程度から高密度のDNAメチル化が実証された。同様に全腫瘍試料は、正常乳房組織と比較して座位番号12（NFX1）の発現の減少を提示した。発現は、4つの腫瘍試料中3つにおいて検出不可能であったが、未希釈のcDNAを鋳型として使用して、1つの腫瘍試料において検出された。正常乳房組織において、発現はcDNAの1:10希釈で検出された。興味深いことに、NFX1発現が検出された腫瘍試料は、qPCRベースのアッセイによって低密度にメチル化されていると評価された。座位番号4（MGA）の解析領域のメチル化は、4つ全ての腫瘍において検出された。しかしながら、正常乳房と比較したMGAの発現の減少は、4つの腫瘍試料のうち2つにおいて実証された。
【０１３２】
実施例14. 穿刺吸引検体における腫瘍特異的DNAメチル化の検出
乳房において疑わしい塊（suspect mass）を生検する通常の手法は、組織の穿刺吸引（FNA）を遂行することである。本手法は、微細ゲージ針を使用して、疑わしい塊から少容量の液体および細胞物質を除去することを含む。さらに乳癌発生のリスクを評価するため、無作為の乳頭周囲の穿刺吸引（RPFNA）が無症候の女性における乳房組織の試料採取のために使用されうる。双方のアプローチは、典型的に、細胞学ベースの診断に関連する。従って、これらのアプローチによって得られた検体に対して分子試験を適用することで、現存の診療と比較して有意に改善された臨床感度および特異性が提供されることが約束される。特許請求される示差的にメチル化された座位の乳房腫瘍特異的DNAメチル化を検出する能力を評価するために、原発性乳房組織における示差的DNAメチル化の様々な頻度を有する8つの座位を、浸潤性乳管癌を有することが確認された女性から採取した7つのFNA検体のパネルにおいて解析した。DNAメチル化を、実施例3に記載されるように測定した。これらは、座位番号1、2、3、4、12、37、38、および43を含んだ。図14において、表3Aおよび3Bに列挙されるように（すなわち、1.0以上の平均dCtを報告する腫瘍のパーセンテージ）、各座位に関する感度のパーセンテージが、1.0以上の平均dCtを報告するマッチしないFNA試料のパーセンテージに対してプロットされる。DNAメチル化検出の頻度（すなわち、1.0以上の平均dCtを報告する試料）は、確認された乳癌患者由来の原発性腫瘍試料またはマッチしないFNAが解析されたかどうかに係らず、非常に類似している（R2=0.7415、傾き=0.817）。これらの結果により、本明細書に記載されるDNAメチル化バイオマーカーが、乳癌の分子診断に関連する試料型において検出されうることが示唆される。
【０１３３】
実施例15. 様々な癌型におけるDNAメチル化の解析
特許請求されるDNAメチル化バイオマーカーの、乳癌以外の癌型に対する適用性に対処するために、肺、腎臓、肝臓、卵巣、頭部、頸部、甲状腺、膀胱、子宮頸部、結腸、子宮内膜、食道、および前立腺の腫瘍のパネルにおいて、全53個の特許請求されるバイオマーカーを解析した。隣接する組織学的に正常な試料を、対照として解析した。さらに、黒色腫を解析したが、いかなる隣接する正常組織も利用可能ではなかった。各癌型に関して解析された試料の数が、表7中に提供される。DNAメチル化は、実施例3に記載されるよう測定された。各座位および各癌型に関して、腫瘍組織と隣接する正常組織とを識別するための感度および特異性が、表8〜20中に報告される。黒色腫（表20）に関しては、隣接する正常組織が利用不可能であるため、感度のみ（DNAメチル化検出の頻度（すなわち、1.0以上の平均dCtを報告する試料））が報告される。各座位に関して、腫瘍組織と隣接する正常組織とを識別するための最適閾値を算出し、実施例11に記載されるようにROC曲線解析が続いた。これらのデータにより、特定のバイオマーカー座位は乳癌以外の癌型に対して適用可能であることが実証された。
【０１３４】
(表７)53個のバイオマーカー座位のメチル化に関して試験された腫瘍および隣接する正常組織の数
2009538624.tif 000049
【０１３５】
(表８)隣接する組織学的に正常な肺組織と比較した、肺腫瘍において示差的にメチル化されている座位の感度および特異性
2009538624.tif 000050
閾値：腫瘍組織と隣接する正常組織とを識別するための、最適閾値としてROC曲線解析により立証された平均dCt値。感度：陽性(すなわち、閾値を上回るメチル化スコア)腫瘍の%。全体のうちの陽性：解析された腫瘍の合計数に対する陽性腫瘍の数。特異性：陰性（すなわち、閾値を下回るメチル化スコア）の隣接する正常試料の%。全体のうちの陰性：解析された隣接する正常試料の合計数に対する陰性の隣接する正常試料の数。
【０１３６】
(表９)隣接する組織学的に正常な腎臓組織と比較した、腎臓腫瘍において示差的にメチル化されている座位の感度および特異性
2009538624.tif 000051
閾値：腫瘍組織と隣接する正常組織とを識別するための、最適閾値としてROC曲線解析により立証された平均dCt値。感度：陽性(すなわち、閾値を上回るメチル化スコア)腫瘍の%。全体のうちの陽性：解析された腫瘍の合計数に対する陽性腫瘍の数。特異性：陰性（すなわち、閾値を下回るメチル化スコア）の隣接する正常試料の%。全体のうちの陰性：解析された隣接する正常試料の合計数に対する陰性の隣接する正常試料の数。
【０１３７】
(表１０)隣接する組織学的に正常な肝臓組織と比較した、肝臓腫瘍において示差的にメチル化されている座位の感度および特異性
2009538624.tif 000052
閾値：腫瘍組織と隣接する正常組織とを識別するための、最適閾値としてROC曲線解析により立証された平均dCt値。感度：陽性(すなわち、閾値を上回るメチル化スコア)腫瘍の%。全体のうちの陽性：解析された腫瘍の合計数に対する陽性腫瘍の数。特異性：陰性（すなわち、閾値を下回るメチル化スコア）の隣接する正常試料の%。全体のうちの陰性：解析された隣接する正常試料の合計数に対する陰性の隣接する正常試料の数。
【０１３８】
(表１１)隣接する組織学的に正常な卵巣組織と比較した、卵巣腫瘍において示差的にメチル化されている座位の感度および特異性
2009538624.tif 000053
閾値：腫瘍組織と隣接する正常組織とを識別するための、最適閾値としてROC曲線解析により立証された平均dCt値。感度：陽性(すなわち、閾値を上回るメチル化スコア)腫瘍の%。全体のうちの陽性：解析された腫瘍の合計数に対する陽性腫瘍の数。特異性：陰性（すなわち、閾値を下回るメチル化スコア）の隣接する正常試料の%。全体のうちの陰性：解析された隣接する正常試料の合計数に対する陰性の隣接する正常試料の数。
【０１３９】
(表１２)隣接する組織学的に正常な頭頸部組織と比較した、頭頸部腫瘍において示差的にメチル化されている座位の感度および特異性
2009538624.tif 000054
閾値：腫瘍組織と隣接する正常組織とを識別するための、最適閾値としてROC曲線解析により立証された平均dCt値。感度：陽性(すなわち、閾値を上回るメチル化スコア)腫瘍の%。全体のうちの陽性：解析された腫瘍の合計数に対する陽性腫瘍の数。特異性：陰性（すなわち、閾値を下回るメチル化スコア）の隣接する正常試料の%。全体のうちの陰性：解析された隣接する正常試料の合計数に対する陰性の隣接する正常試料の数。
【０１４０】
(表１３)隣接する組織学的に正常な甲状腺組織と比較した、甲状腺腫瘍において示差的にメチル化されている座位の感度および特異性
2009538624.tif 000055
閾値：腫瘍組織と隣接する正常組織とを識別するための、最適閾値としてROC曲線解析により立証された平均dCt値。感度：陽性(すなわち、閾値を上回るメチル化スコア)腫瘍の%。全体のうちの陽性：解析された腫瘍の合計数に対する陽性腫瘍の数。特異性：陰性（すなわち、閾値を下回るメチル化スコア）の隣接する正常試料の%。全体のうちの陰性：解析された隣接する正常試料の合計数に対する陰性の隣接する正常試料の数。
【０１４１】
(表１４)隣接する組織学的に正常な膀胱組織と比較した、膀胱腫瘍において示差的にメチル化されている座位の感度および特異性
2009538624.tif 000056
閾値：腫瘍組織と隣接する正常組織とを識別するための、最適閾値としてROC曲線解析により立証された平均dCt値。感度：陽性(すなわち、閾値を上回るメチル化スコア)腫瘍の%。全体のうちの陽性：解析された腫瘍の合計数に対する陽性腫瘍の数。特異性：陰性（すなわち、閾値を下回るメチル化スコア）の隣接する正常試料の%。全体のうちの陰性：解析された隣接する正常試料の合計数に対する陰性の隣接する正常試料の数。
【０１４２】
(表１５)隣接する組織学的に正常な子宮頸組織と比較した、子宮頸腫瘍において示差的にメチル化されている座位の感度および特異性
2009538624.tif 000057
閾値：腫瘍組織と隣接する正常組織とを識別するための、最適閾値としてROC曲線解析により立証された平均dCt値。感度：陽性(すなわち、閾値を上回るメチル化スコア)腫瘍の%。全体のうちの陽性：解析された腫瘍の合計数に対する陽性腫瘍の数。特異性：陰性（すなわち、閾値を下回るメチル化スコア）の隣接する正常試料の%。全体のうちの陰性：解析された隣接する正常試料の合計数に対する陰性の隣接する正常試料の数。
【０１４３】
(表１６)隣接する組織学的に正常な結腸組織と比較した、結腸腫瘍において示差的にメチル化されている座位の感度および特異性
2009538624.tif 000058
閾値：腫瘍組織と隣接する正常組織とを識別するための、最適閾値としてROC曲線解析により立証された平均dCt値。感度：陽性(すなわち、閾値を上回るメチル化スコア)腫瘍の%。全体のうちの陽性：解析された腫瘍の合計数に対する陽性腫瘍の数。特異性：陰性（すなわち、閾値を下回るメチル化スコア）の隣接する正常試料の%。全体のうちの陰性：解析された隣接する正常試料の合計数に対する陰性の隣接する正常試料の数。
【０１４４】
(表１７)隣接する組織学的に正常な子宮内膜組織と比較した、子宮内膜腫瘍において示差的にメチル化されている座位の感度および特異性
2009538624.tif 000059
閾値：腫瘍組織と隣接する正常組織とを識別するための、最適閾値としてROC曲線解析により立証された平均dCt値。感度：陽性(すなわち、閾値を上回るメチル化スコア)腫瘍の%。全体のうちの陽性：解析された腫瘍の合計数に対する陽性腫瘍の数。特異性：陰性（すなわち、閾値を下回るメチル化スコア）の隣接する正常試料の%。全体のうちの陰性：解析された隣接する正常試料の合計数に対する陰性の隣接する正常試料の数。
【０１４５】
(表１８)隣接する組織学的に正常な食道組織と比較した、食道腫瘍において示差的にメチル化されている座位の感度および特異性
2009538624.tif 000060
閾値：腫瘍組織と隣接する正常組織とを識別するための、最適閾値としてROC曲線解析により立証された平均dCt値。感度：陽性(すなわち、閾値を上回るメチル化スコア)腫瘍の%。全体のうちの陽性：解析された腫瘍の合計数に対する陽性腫瘍の数。特異性：陰性（すなわち、閾値を下回るメチル化スコア）の隣接する正常試料の%。全体のうちの陰性：解析された隣接する正常試料の合計数に対する陰性の隣接する正常試料の数。
【０１４６】
(表１９)隣接する組織学的に正常な前立腺組織と比較した、前立腺腫瘍において示差的にメチル化されている座位の感度および特異性
2009538624.tif 000061
閾値：腫瘍組織と隣接する正常組織とを識別するための、最適閾値としてROC曲線解析により立証された平均dCt値。感度：陽性(すなわち、閾値を上回るメチル化スコア)腫瘍の%。全体のうちの陽性：解析された腫瘍の合計数に対する陽性腫瘍の数。特異性：陰性（すなわち、閾値を下回るメチル化スコア）の隣接する正常試料の%。全体のうちの陰性：解析された隣接する正常試料の合計数に対する陰性の隣接する正常試料の数。
【０１４７】
(表２０)黒色腫腫瘍における各座位のメチル化頻度
2009538624.tif 000062
感度：陽性(すなわち、1.0を上回るメチル化スコア)腫瘍の%。全体のうちの陽性：解析された腫瘍の合計数に対する陽性腫瘍の数。隣接する組織学的に正常または正常皮膚試料が解析のために利用可能でなかったことに注意。陽性のメチル化スコアに対する閾値は、平均dCt 1.0で設定された。
【０１４８】
本発明は、理解の明確性の目的のため、図解および例示により多少詳細に記載されているが、本発明の教示に照らし合わせて、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、それにある種の変化および改変が行われてもよいことは、当業者にとって容易に自明であると考えられる。
【０１４９】
本明細書に引用される全ての刊行物、データベース、Genbankシーケンス、特許、および特許出願は、各々が具体的かつ個々に参照により組み入れられることが示されるように、参照により本明細書に組み入れられる。
【図１】
2009538624.tif 000073
【図２】
2009538624.tif 000074
【図３Ａ】
2009538624.tif 000075
【図３Ｂ】
2009538624.tif 000076
【図４Ａ】
2009538624.tif 000077
【図４Ｂ】
2009538624.tif 000078
【図５】
2009538624.tif 000079
【図６】
2009538624.tif 000080
【図７】
2009538624.tif 000081
【図８】
2009538624.tif 000082
【図９】
2009538624.tif 000083
【図１０Ａ】
2009538624.tif 000084
【図１０Ｂ】
2009538624.tif 000085
【図１１Ａ】
2009538624.tif 000086
【図１１Ｂ】
2009538624.tif 000087
【図１２】
2009538624.tif 000088
【図１３】
2009538624.tif 000089
【図１４】
2009538624.tif 000090
【配列表】
2009538624000001.app
【国際調査報告】
2009538624.tif 000091
2009538624.tif 000092
2009538624.tif 000093
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