(57)【要約】  位置Ｔｙｒ-７５、Ｔｙｒ-３０２、又はＡｓｐ-３０４に一又は複数の置換を有するＳ.モバレンス由来のトランスグルタミナーゼ。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｙｒ-７５、Ｔｙｒ-３０２、Ａｓｐ-３０４から選択されるアミノ酸残基の一又は複数が修飾されている、配列番号１に示す配列を含んでなる単離されたペプチド。
【請求項２】
前記配列のＴｙｒ-７５が修飾される、請求項１に記載の単離されたペプチド。
【請求項３】
Ｔｙｒ-７５が酸性アミノ酸残基に置換される、請求項２に記載の単離されたペプチド。
【請求項４】
Ｔｙｒ-７５がＡｓｐ又はＧｌｕに置換される、請求項３に記載の単離されたペプチド。
【請求項５】
Ｔｙｒ-７５がＧｌｕに置換される、請求項４に記載の単離されたペプチド。
【請求項６】
前記配列のＴｙｒ-３０２が修飾される、請求項１から５のいずれか一に記載の単離されたペプチド。
【請求項７】
Ｔｙｒ-３０２がＴｙｒと異なる塩基性アミノ酸残基に置換される、請求項６に記載の単離されたペプチド。
【請求項８】
Ｔｙｒ-３０２がＡｒｇ又はＬｙｓに置換される、請求項７に記載の単離されたペプチド。
【請求項９】
Ｔｙｒ-３０２がＡｒｇに置換される、請求項８に記載の単離されたペプチド。
【請求項１０】
前記配列のＡｓｐ-３０４が修飾される、請求項１から９のいずれか一に記載の単離されたペプチド。
【請求項１１】
Ａｓｐ-３０４が塩基性アミノ酸残基に置換される、請求項１０に記載の単離されたペプチド。
【請求項１２】
Ａｓｐ-３０４がＴｙｒ、Ｌｙｓ又はＡｒｇに置換される、請求項１１に記載の単離されたペプチド。
【請求項１３】
Ａｓｐ-３０４がＬｙｓに置換される、請求項１２に記載の単離されたペプチド。
【請求項１４】
配列番号２に示す配列を有する請求項５に記載の単離されたペプチド。
【請求項１５】
配列番号３に示す配列を有する請求項９に記載の単離されたペプチド。
【請求項１６】
配列番号４に示す配列を有する請求項１３に記載の単離されたペプチド。
【請求項１７】
配列番号５に示す配列を有する請求項２〜１３のいずれか一に記載の単離されたペプチド。
【請求項１８】
置換Ｔｙｒ-７５→酸性アミノ酸残基；Ｔｙｒ-３０２→Ｔｙｒでない塩基性アミノ酸残基；及び、Ａｓｐ-３０４→塩基性アミノ酸残基のうちの一又は複数を含んでなる、配列番号１に示す配列を含んでなるペプチド。
【請求項１９】
置換Ｔｙｒ-７５→Ａｓｐ又はＧｌｕ；Ｔｙｒ-３０２→Ａｒｇ又はＬｙｓ；及び、Ａｓｐ-３０４→Ｔｙｒ、Ｌｙｓ又はＡｒｇのうちの一又は複数を含んでなる配列番号１に示す配列を有する、請求項１８に記載のペプチド。
【請求項２０】
置換Ｔｙｒ-７５→Ｇｌｕ；Ｔｙｒ-３０２→Ａｒｇ；及び、Ａｓｐ-３０４→Ｌｙｓのうちの一又は複数を含んでなる配列番号１に示す配列を有する、請求項１８又は１９に記載のペプチド。
【請求項２１】
配列が、Ｔｙｒ-７５のＧｌｕとの置換とＴｙｒ-３０２のＡｒｇとの置換を含んでなる配列番号１に示すものである、請求項１８から２０のいずれか一に記載のペプチド。
【請求項２２】
配列が配列番号２に示すものである、請求項１８から２０のいずれか一に記載のペプチド。
【請求項２３】
配列が配列番号３に示すものである、請求項１８から２０のいずれか一に記載のペプチド。
【請求項２４】
配列が配列番号４に示すものである、請求項１８から２０のいずれか一に記載のペプチド。
【請求項２５】
配列が配列番号５に示すものである、請求項１８に記載のペプチド。
【請求項２６】
ペプチドがトランスグルタミナーゼ活性を有する、請求項１から２５のいずれか一に記載のペプチド。
【請求項２７】
ペプチドがｈＧＨのＧｌｎ-１４１と比較してｈＧＨのＧｌｎ-４０に特異性を有し、ｈＧＨのＧｌｎ-１４１と比較してｈＧＨのＧｌｎ-４０に対して、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドと特異性が異なる、請求項１から２６のいずれか一に記載の単離されたペプチド。
【請求項２８】
ペプチドがｈＧＨのＧｌｎ-１４１と比較してｈＧＨのＧｌｎ-４０に特異性を有し、ｈＧＨのＧｌｎ-１４１と比較してｈＧＨのＧｌｎ-４０に対して、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドよりも特異性が高い、請求項２７に記載の単離されたペプチド。
【請求項２９】
ｈＧＨのＧｌｎ-１４１と比較してｈＧＨのＧｌｎ-４０に特異性を有するトランスグルタミナーゼであって、ｈＧＨのＧｌｎ-１４１と比較してｈＧＨのＧｌｎ-４０に対して、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドと特異性が異なるトランスグルタミナーゼ。
【請求項３０】
ｈＧＨのＧｌｎ-１４１と比較してｈＧＨのＧｌｎ-４０に特異性を有し、ｈＧＨのＧｌｎ-１４１と比較してｈＧＨのＧｌｎ-４０に対して、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドよりも特異性が高い、請求項２９に記載のトランスグルタミナーゼ。
【請求項３１】
請求項１から３０のいずれか一に記載のペプチドをコードする核酸コンストラクト。
【請求項３２】
請求項３１に記載の核酸コンストラクトを含んでなるベクター。
【請求項３３】
請求項３２に記載のベクターを含んでなる宿主。
【請求項３４】
請求項１から３０のいずれか一に記載のペプチドを含んでなる組成物。
【請求項３５】
ｈＧＨのコンジュゲート方法であって、請求項１から３０のいずれか一に記載のペプチドの存在下でアミンドナーと該ｈＧＨを反応させることを含んでなる方法。
【請求項３６】
位置Ｇｌｎ-１４１でコンジュゲートされたｈＧＨの量と比較したときの位置Ｇｌｎ-４０でコンジュゲートされたｈＧＨの量が、前記方法においてペプチドが請求項１から３０のいずれか一に記載のペプチドでなく、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドが用いられる場合の位置Ｇｌｎ-１４１でコンジュゲートされたｈＧＨの量と比較したときの位置Ｇｌｎ-４０でコンジュゲートされたｈＧＨの量と比べて有意に増加する、請求項３５に記載のｈＧＨのコンジュゲート方法。 
【請求項３７】
コンジュゲートされたｈＧＨの調製における請求項１から３０のいずれか一に記載のペプチドの使用。
【請求項３８】
ｈＧＨが位置Ｇｌｎ-４０でコンジュゲートされる、請求項３７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、ストレプトマイセス・モバレンス(Streptomyces mobaraense)由来のトランスグルタミナーゼの新規の変異体に関する。この変異体は、向上された選択性を有するペプチドを修飾するために使われてもよい。
【０００２】
（発明の背景）
適切に性質を変えるタンパク質に基をコンジュゲートすることによってペプチドの性質及び特徴を修飾することは、周知である。特に治療用のペプチドにとって、ペプチドの半減期を延長するペプチドへの基のコンジュゲートは、望ましいか又は、さらに必要である。一般的に、このようなコンジュゲート基はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)又は脂肪酸である−J.Biol.Chem. 271, 21969-21977 (1996)を参照。
既にトランスグルタミナーゼ(ＴＧアーゼ)を用いてペプチドの性質が変更されている。食品産業、特にダイアリー産業において、例えばＴＧアーゼを用いた交差結合ペプチドには多くの技術が有用である。他の文書は、生理的に活性なペプチドの性質を変更するためのＴＧアーゼの使用を開示する。欧州特許第９５０６６５号、欧州特許第７８５２７６号及びSato, Adv. Drug Delivery Rev. 54, 487-504 (2002)は、ＴＧアーゼの存在下で、少なくとも一のＧｌｎとアミン-機能化ＰＥＧないしは類似のリガンドを含んでなるペプチド間の直接反応を開示し、、Biotech. Lett. 23, 1367-1372 (2001)においてWadaは、ＴＧアーゼによる脂肪酸とのβ-ラクトグロブリンの直接的な結合を開示する。国際特許出願の国際公開第２００５０７０４６８号は、ＴＧアーゼを用いて官能基をグルタミン含有ペプチドに組み込んで機能化ペプチドを形成してもよいこと、そしてその後の工程においてこの機能化ペプチドを該機能化タンパク質と反応してＰＥＧ化ペプチドを形成しうるＰＥＧなどと反応させてもよいことを開示している。
【０００３】
また、トランスグルタミナーゼ(Ｅ.Ｃ.2.3.2.13)は、タンパク質-グルタミン-γ-グルタミルトランスフェラーゼとして知られていて、以下のような一般的な反応を触媒する。
2009504171.tif 000002
このとき、Ｑ-Ｃ(Ｏ)-ＮＨ２はグルタミン含有ペプチドを表し、次いでＱ'-ＮＨ２は、上記の反応においてペプチドに取り込まれる官能基を提供するアミンドナーを表す。
【０００４】
インビボにおいて一般的なアミンドナーはペプチド結合リジンであり、次いで上記の反応によりペプチドの交差結合が生じる。凝固因子第XIII因子は、損傷の際の血液の凝固に作用するトランスグルタミナーゼである。例えばＧｌｎのまわりのどのアミノ酸残基がタンパク質が基質であるために必要であるかは、異なるＴＧアーゼで互いに異なる。すなわち、異なるＴＧアーゼは、どのアミノ酸残基がＧｌｎ残基に隣接しているかによって基質として異なるＧｌｎ含有ペプチドを有するであろう。修飾されるペプチドが１より多いＧｌｎ残基を含有する場合に、この態様が利用されうる。存在するＧｌｎ残基のいくつかでペプチドを選択的にコンジュゲートすることが望ましい場合、関連するＧｌｎ残基(一又は複数)を基質として受け入れるだけであるＴＧアーゼの選別によってこの選択性が可能となりうる。 
ヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)は１１のグルタミン残基を含んでなり、任意のＴＧアーゼが媒介するｈＧＨのコンジュゲートは低選択性によって潜在的に妨害される。特定の反応条件下において、Ｓ.モバレンスＴＧアーゼ媒介反応においてｈＧＨが機能化される上記の２工程のコンジュゲート反応は、２つの位置、すなわち４０-Ｇｌｎ及び１４１-Ｇｌｎで機能化されているｈＧＨを生じうることを発見した。ｈＧＨのより特異的な機能化を媒介するＴＧアーゼの変異体を同定する必要がある。
【０００５】
（発明の概要）
本発明の発明者は、驚くべきことに、Ｓ.モバレンスのＴＧアーゼの特定のアミノ酸残基の置換によりｈＧＨをより特異的に機能化するＴＧアーゼを産出することを発見した。
一実施態様では、本発明は、３以下の酸性又は塩基性のアミノ酸残基が他の塩基性又は酸性のアミノ酸残基に置換されているＳ.モバレンスのＴＧアーゼ(配列番号１)に関する。
一実施態様では、本発明は、置換Ｔｙｒ-７５→酸性アミノ酸残基；Ｔｙｒ-３０２→塩基性アミノ酸残基；及び、Ａｓｐ-３０４→塩基性アミノ酸残基のうちの一又は複数を含んでなる、配列番号１に示すペプチドに関する。 
一実施態様では、本発明は、本発明に係るペプチドをコードする核酸コンストラクトに関する。
一実施態様では、本発明は、本発明に係るペプチドをコードする核酸を含んでなるベクターに関する。
一実施態様では、本発明は、本発明に係るペプチドをコードする核酸を含んでなるベクターを含む宿主に関する。
一実施態様では、本発明は、本発明に係るペプチドを含んでなる組成物に関する。
一実施態様では、本発明は、ｈＧＨのコンジュゲート方法であって、本発明に係るペプチドの存在下でアミンドナーとｈＧＨを反応させることを含んでなる方法に関する。
【０００６】
（本発明の説明）
本明細書において、「酸性アミノ酸残基」なる用語は、７未満のｐＫａを有する天然のアミノ酸残基を示すことを意図する。具体的な例はＡｓｐ及びＧｌｕを含む。
本明細書において、「塩基性アミノ酸残基」なる用語は、７より上のｐＫａを有する天然のアミノ酸残基を示すことを意図する。具体的な例はＴｙｒ、Ｌｙｓ及びＡｒｇを含む。
本明細書において「アミノ基転移」又はその類似語は、グルタミンの側鎖の窒素が他の化合物の窒素、特に他の窒素含有求核試薬の窒素と交換される反応を示すことを意図する。
名詞の「コンジュゲート」なる用語は、修飾した(変更した)ペプチド、すなわち、該ペプチドの性質を修飾するために結合した成分を有するペプチドを表すことを意図する。動詞としては、この用語は、前記ペプチドの性質を修飾するためにペプチドに成分を結合する過程を示すことを意図する。
【０００７】
本明細書において、「特異性」及び「選択性」なる用語は交換可能に用いられ、ｈＧＨの他の特定のグルタミン残基と比較して、ｈＧＨの一又は複数の特定のグルタミン残基との反応に対するＴＧアーゼの優先度を表す。本明細書のために、ｈＧＨのＧｌｎ１４１と比較したＧｌｎ-４０に関する本発明のペプチドの特異性は、実施例３に記載のように測定される。
また、微生物ストレプトマイセス・モバレンシスはストレプトベルチキリウム・モバレンスにも分類される。ＴＧアーゼは生物体から単離されてもよく、このＴＧアーゼは相対的に低い分子量(〜３８ｋＤａ)であることと、カルシウム非依存性であることに特徴を有する。Ｓ. モバレンスのＴＧアーゼは比較的十分に記載されている；例えば、結晶構造が解析されている(米国特許第１５６９５６号；Appl. Microbiol. Biotech. 64, 447-454 (2004))。
【０００８】
コンジュゲートされたｈＧＨを調製する一つの方法は、機能化したｈＧＨを産出するための、官能基を含んでなるアミンドナーとｈＧＨとの間の第一反応を含んでなり、この第一反応はＴＧアーゼに媒介される(すなわち触媒される)ものである。第二反応工程では、前記の機能化したｈＧＨを、前記の組み込まれた官能基と反応してコンジュゲートされたｈＧＨを提供することが可能なＰＥＧ又は脂肪酸などとさらに反応させる。第一反応を以下に略図する。
2009504171.tif 000003
Ｘは、官能基又は潜在的な官能基、すなわち更なる反応、例えば酸化又は加水分解の際に官能基に変わる基を表す。
【０００９】
上記の反応がＳ.モバレンスのＴＧアーゼによって媒介される場合、ｈＧＨとＨ２Ｎ-Ｘ(アミンドナー)との間の反応は主にＧｌｎ-４０及びＧｌｎ-１４１で起こる。上記の反応を用いてｈＧＨをＰＥＧ化するなどして、延長された半減期を有する治療用の成長ホルモン生成物を獲得しうる。一般的に治療用組成物が単一の化合物組成物であることが望ましいので、上記の特異性の欠如には、Ｇｌｎ-４０機能化ｈＧＨがＧｌｎ-１４１機能化ｈＧＨ及び／又は、Ｇｌｎ-４０／Ｇｌｎ-１４１二重機能化ｈＧＨから分離される更なる精製工程が必要である。
本発明のペプチドは、ｈＧＨのＧｌｎ-１４１と比較してＧｌｎ-４０に対して特異性を有し、この特異性は実施例３に記載のように測定するところの、Ｇｌｎ-１４１と比較してＧｌｎ-４０に対する、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドの特異性と異なるものである。したがって、本発明のペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するＴＧアーゼを用いた反応と比較して、記載の方法において産生されるＧｌｎ-４０機能化ｈＧＨ又はＧｌｎ-１４１機能化ｈＧＨの比率を変更するためのｈＧＨのトランスグルタミン化方法に用いられてもよい。
【００１０】
以下は、本発明の実施態様の非制限的な一覧である。
実施態様１：Ｔｙｒ-７５、Ｔｙｒ-３０２、Ａｓｐ-３０４から選択されるアミノ酸残基の一又は複数が修飾されている、配列番号１に示す配列を含んでなる単離されたペプチド。
実施態様２：前記配列のＴｙｒ-７５が修飾される、実施態様１に記載の単離されたペプチド。
実施態様３：Ｔｙｒ-７５が酸性アミノ酸残基に置換される、実施態様２に記載の単離されたペプチド。
実施態様４：Ｔｙｒ-７５がＡｓｐ又はＧｌｕに置換される、実施態様３に記載の単離されたペプチド。
実施態様５：Ｔｙｒ-７５がＧｌｕに置換される、実施態様４に記載の単離されたペプチド。
実施態様６：前記配列のＴｙｒ-３０２が修飾される、実施態様１から５のいずれか一に記載の単離されたペプチド。
実施態様７：Ｔｙｒ-３０２がＴｙｒと異なる塩基性アミノ酸残基に置換される、実施態様６に記載の単離されたペプチド。
実施態様８：Ｔｙｒ-３０２がＡｒｇ又はＬｙｓに置換される、実施態様７に記載の単離されたペプチド。
実施態様９：Ｔｙｒ-３０２がＡｒｇに置換される、実施態様８に記載の単離されたペプチド。
実施態様１０：前記配列のＡｓｐ-３０４が修飾される、実施態様１から９のいずれか一に記載の単離されたペプチド。
実施態様１１：Ａｓｐ-３０４が塩基性アミノ酸残基に置換される、実施態様１０に記載の単離されたペプチド。
実施態様１２：Ａｓｐ-３０４がＴｙｒ、Ｌｙｓ又はＡｒｇに置換される、実施態様１１に記載の単離されたペプチド。
実施態様１３：Ａｓｐ-３０４がＬｙｓに置換される、実施態様１２に記載の単離されたペプチド。
実施態様１４：配列番号２に示す配列を有する実施態様５に記載の単離されたペプチド。
実施態様１５：配列番号３に示す配列を有する実施態様９に記載の単離されたペプチド。
実施態様１６：配列番号４に示す配列を有する実施態様１３に記載の単離されたペプチド。
実施態様１７：配列番号５に示す配列を有する実施態様２〜１３のいずれか一に記載の単離されたペプチド。
実施態様１８：置換Ｔｙｒ-７５→酸性アミノ酸残基；Ｔｙｒ-３０２→Ｔｙｒでない塩基性アミノ酸残基；及び、Ａｓｐ-３０４→塩基性アミノ酸残基のうちの一又は複数を含んでなる、配列番号１に示す配列を含んでなるペプチド。
実施態様１９：置換Ｔｙｒ-７５→Ａｓｐ又はＧｌｕ；Ｔｙｒ-３０２→Ａｒｇ又はＬｙｓ；及び、Ａｓｐ-３０４→Ｔｙｒ、Ｌｙｓ又はＡｒｇのうちの一又は複数を含んでなる配列番号１に示す配列を有する、実施態様１８に記載のペプチド。
実施態様２０：置換Ｔｙｒ-７５→Ｇｌｕ；Ｔｙｒ-３０２→Ａｒｇ；及び、Ａｓｐ-３０４→Ｌｙｓのうちの一又は複数を含んでなる配列番号１に示す配列を有する、実施態様１８又は１９に記載のペプチド。
実施態様２１：配列が、Ｔｙｒ-７５のＧｌｕとの置換とＴｙｒ-３０２のＡｒｇとの置換を含んでなる配列番号１に示すものである、実施態様１８から２０のいずれか一に記載のペプチド。
実施態様２２：配列が配列番号２に示すものである、実施態様１８から２０のいずれか一に記載のペプチド。
実施態様２３：配列が配列番号３に示すものである、実施態様１８から２０のいずれか一に記載のペプチド。
実施態様２４：配列が配列番号４に示すものである、実施態様１８から２０のいずれか一に記載のペプチド。
実施態様２５：配列が配列番号５に示すものである、実施態様１８に記載のペプチド。
実施態様２６：ペプチドがトランスグルタミナーゼ活性を有する、実施態様１から２５のいずれか一に記載のペプチド。
実施態様２７：ペプチドがｈＧＨのＧｌｎ-１４１と比較してｈＧＨのＧｌｎ-４０に特異性を有し、ｈＧＨのＧｌｎ-１４１と比較してｈＧＨのＧｌｎ-４０に対して、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドと特異性が異なる、実施態様１から２６のいずれか一に記載の単離されたペプチド。
実施態様２８：ペプチドがｈＧＨのＧｌｎ-１４１と比較してｈＧＨのＧｌｎ-４０に特異性を有し、ｈＧＨのＧｌｎ-１４１と比較してｈＧＨのＧｌｎ-４０に対して、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドよりも特異性が高い、実施態様２７に記載の単離されたペプチド。
実施態様２９：ｈＧＨのＧｌｎ-１４１と比較してｈＧＨのＧｌｎ-４０に特異性を有するトランスグルタミナーゼであって、ｈＧＨのＧｌｎ-１４１と比較してｈＧＨのＧｌｎ-４０に対して、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドと特異性が異なるトランスグルタミナーゼ。
実施態様３０：ｈＧＨのＧｌｎ-１４１と比較してｈＧＨのＧｌｎ-４０に特異性を有し、ｈＧＨのＧｌｎ-１４１と比較してｈＧＨのＧｌｎ-４０に対して、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドよりも特異性が高い、実施態様２９に記載のトランスグルタミナーゼ。
実施態様３１：実施態様１から３０のいずれか一に記載のペプチドをコードする核酸コンストラクト。
実施態様３２：実施態様３１に記載の核酸コンストラクトを含んでなるベクター。
実施態様３３：実施態様３２に記載のベクターを含んでなる宿主。
実施態様３４：実施態様１から３０のいずれか一に記載のペプチドを含んでなる組成物。
実施態様３５：ｈＧＨのコンジュゲート方法であって、実施態様１から３０のいずれか一に記載のペプチドの存在下でアミンドナーと該ｈＧＨを反応させることを含んでなる方法。
実施態様３６：位置Ｇｌｎ-１４１でコンジュゲートされたｈＧＨの量と比較したときの位置Ｇｌｎ-４０でコンジュゲートされたｈＧＨの量が、前記方法においてペプチドが実施態様１から３０のいずれか一に記載のペプチドでなく、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドが用いられる場合の位置Ｇｌｎ-１４１でコンジュゲートされたｈＧＨの量と比較したときの位置Ｇｌｎ-４０でコンジュゲートされたｈＧＨと比べて量が有意に増加する、実施態様３５に記載のｈＧＨのコンジュゲート方法。 
実施態様３７：コンジュゲートされたｈＧＨの調製における実施態様１から３０のいずれか一に記載のペプチドの使用。
実施態様３８：ｈＧＨが位置Ｇｌｎ-４０でコンジュゲートされる、実施態様３７に記載の使用。
【００１１】
一実施態様では、Ｇｌｎ-１４１と比較したときのＧｌｎ-４０に対する本発明のペプチドの特異性が、Ｇｌｎ-１４１と比較してＧｌｎ-４０に対して、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドの特異性よりも高く、その結果、本明細書中に記載のＴＧアーゼを用いたトランスグルタミナーゼ反応においてＧｌｎ-１４１と比較したときのＧｌｎ-４０の産生が増加する。
一実施態様では、Ｇｌｎ-１４１と比較したときのＧｌｎ-４０に対する本発明のペプチドの特異性は、Ｇｌｎ-１４１と比較してＧｌｎ-４０に対して、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドの特異性より、少なくとも１．２５、例として少なくとも１．５０、例えば少なくとも１．７５、例として少なくとも２．０、例えば少なくとも２．５、例として少なくとも３．０、例えば少なくとも３．５、例として少なくとも４．０、例えば少なくとも４．５、例として少なくとも５．０、例えば少なくとも５．５、例として少なくとも６．０、例えば少なくとも６．５、例として少なくとも７．０、例えば少なくとも７．５、例として少なくとも８．０、例えば少なくとも８．５、例として少なくとも９．０、例えば少なくとも９．５で、例として少なくとも１０．０倍高い。
【００１２】
配列番号２に記載のＴＧアーゼが用いられる場合、主にＧｌｎ-１４１機能化ｈＧＨが得られ、ごくわずかな量のＧｌｎ-４０機能化ｈＧＨ又は、Ｇｌｎ-４０／Ｇｌｎ-１４１二重機能化ｈＧＨが得られる。
一実施態様では、本発明は、配列番号１に示すアミノ酸配列を含んでなるペプチドであって、このとき配列Ｔｙｒ-７５がＡｓｐ又はＧｌｕに置換されている；及び／又は、Ｔｙｒ-３０２がＡｒｇ又はＬｙｓに置換されている；及び／又は、Ａｓｐ-３０４がＴｙｒ、Ｌｙｓ又はＡｒｇに置換されているペプチドに関する。 
一実施態様では、本発明は、配列番号１に示すアミノ酸配列を含んでなるペプチドであって、このとき配列Ｔｙｒ-７５がＧｌｕに置換されている；及び／又は、Ｔｙｒ-３０２がＡｒｇに置換されている；及び／又は、Ａｓｐ-３０４がＬｙｓに置換されているペプチドに関する。
一実施態様では、本発明は、Ｔｙｒ-７５→Ｇｌｕ置換を有する配列番号１である、配列番号２に示すアミノ酸配列を含んでなるペプチドに関する：
一実施態様では、本発明は、Ｔｙｒ-３０２→Ａｒｇ置換を有する配列番号１である、配列番号３に示すアミノ酸配列を含んでなるペプチドに関する。
一実施態様では、Ａｓｐ-３０４→Ｌｙｓ置換を有する配列番号１である、配列番号４に示すアミノ酸配列を含んでなるペプチドに関する。
一実施態様では、本発明は、Ｔｙｒ-７５→Ｇｌｕ置換、Ｔｙｒ-３０２→Ａｒｇ置換及びＡｓｐ-３０４→Ｌｙｓ置換を有する配列番号１である、配列番号５に示すアミノ酸配列を含んでなるペプチドに関する。
【００１３】
米国特許第５１５６９５６号に記載のアッセイにおいて決定されるように、本発明のペプチドはＴＧアーゼ活性を表す。簡単に説明すると、所定のペプチドの活性の測定は、Ｃａ２＋の非存在下でベンジルオキシカルボニル-Ｌ-グルタミニルグリシン及びヒドロキシルアミンを基質として用いた反応を行うこと、トリクロロ酢酸の存在下で結果として生じるヒドロキサム酸との鉄複合体を形成すること、５２５ｎｍの吸光度を測定すること及び、ヒドロキサム酸の量を較正曲線によって測定して活性を算出することによって実施される。本明細書のために、前記アッセイにおいてトランスグルタミナーゼ活性を表すペプチドをトランスグルタミナーゼ活性を有するものとみなした。特に、本発明のＴＧアーゼ変異体は、Ｓ. モバレンスのＴＧアーゼの活性の３０％より高い、例として５０％より高い、例として７０％より高い、例として９０％より高い活性を表す。
一実施態様では、本発明は、配列番号：２、３、４又は５のいずれかを有するポリペプチドを含んでなる組成物に関する。
【００１４】
本発明のペプチドは異なる方法で調製されてもよい。ペプチドは、当分野で公知のタンパク質合成方法によって調製されてもよい。ペプチドのサイズによって、本発明のペプチドを提供するためにその時組み合わされるいくつかのペプチドの断片を合成することによってより都合よく行われてもよい。しかしながら、特定の実施態様では、本発明のペプチドは、本発明のペプチドをコードする核酸コンストラクトを含んでなる好適な宿主の発酵によって調製される。 
【００１５】
一実施態様では、本発明はまた、本発明のペプチドをコードする核酸コンストラクトにも関する。
本明細書中で用いられる「核酸コンストラクト」なる用語は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ又はＲＮＡ起源の任意の核酸分子を示すことを意図する。「コンストラクト」なる用語は、一本鎖又は二本鎖であり、対象のタンパク質をコードする完全ないしは部分的な天然に生じるヌクレオチド配列に基づきうる核酸セグメントを示すことを意図する。場合によってコンストラクトは他の核酸セグメントを含有してもよい。
本発明のペプチドをコードする本発明の核酸コンストラクトは、適切にゲノム又はｃＤＮＡの起源のものでよく、例えばゲノム又はｃＤＮＡライブラリを調製して、標準的な技術に従った合成オリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーションによってすべて又は一部のタンパク質をコードするＤＮＡ配列をスクリーニングすることによって得てもよい(J. Sambrook等, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New Yorkを参照)。
【００１６】
また、タンパク質をコードする本発明の核酸コンストラクトは、確立された標準的な方法、例えばBeaucage及びCaruthers, Tetrahedron Letters 22, 1859-1869 (1981)に記載の亜リン酸アミダイト法又はMatthes等., EMBO Journal 3, 801-805 (1984)に記載の方法などによって合成して調製してもよい。リン酸アミダイト法によると、オリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡ合成機において合成され、精製され、アニールされ、ライゲートされ、適切なベクターにクローニングされる。
さらに、核酸コンストラクトは、標準的な技術によって、核酸コンストラクト全体の様々な部分に対応する断片である合成起源、ゲノム起源又はｃＤＮＡ起源(必要に応じて)の断片をライゲートすることによって調製された、混合した合成とゲノムの起源、混合した合成とｃＤＮＡの起源、又は混合したゲノムとｃＤＮＡの起源のものであってもよい。
また、例えば米国特許第４６８３２０２号又はSaiki等, Science 239, 487-491 (1988)に記載のように、核酸コンストラクトは、特定のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって調製されてもよい。 
核酸コンストラクトは以下、もっぱら用いられるＤＮＡコンストラクトであることが好ましい。
【００１７】
更なる態様では、本発明は、本発明のＤＮＡコンストラクトを含んでなる組み換えベクターに関する。本発明のＤＮＡコンストラクトが挿入される組み換えベクターは、組み換えＤＮＡ手順に都合よく供される任意のベクターであってもよく、ベクターの選択は導入しようとする宿主細胞に依存することが多いであろう。したがって、ベクターは自己複製するベクター、すなわち染色体外の実体として存在し、その複製が染色体複製から独立しているベクター、例えばプラスミドであってもよい。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入される場合、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、組み込まれている染色体(一又は複数)と共に複製されるものであってもよい。
好ましくは、ベクターは、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列がＤＮＡの転写に必要な付加的なセグメントに作用可能に連結されている発現ベクターである。通常、発現ベクターは、プラスミド又はウイルスＤＮＡ由来であるか、又は両方の成分を含有してもよい。「作用可能に連結される」なる用語は、セグメントが、意図する目的の通りに機能するように、例えば転写がプロモーターにおいて開始しタンパク質をコードするＤＮＡ配列まで進行するように整列されることを表す。
【００１８】
プロモーターは、選択した宿主細胞において転写活性を示す任意のＤＮＡ配列でよく、宿主細胞に相同な又は異種性のタンパク質をコードする遺伝子由来でもよい。
酵母宿主細胞における使用に好適なプロモーターの例には、酵母糖分解遺伝子(Hitzeman等, J. Biol. Chem. 255, 12073-12080 (1980)；Alber及びKawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1, 419 - 434 (1982))又はアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(Young等, in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollaender等, eds.), Plenum Press, New York, 1982)由来のプロモーター、又はＴＰＩ１(米国特許第４５９９３１１号)ないしははＡＤＨ２-４ｃ(Russell等, Nature 304, 652 - 654 (1983))プロモーターが含まれる。
糸状菌宿主細胞における使用に好適なプロモーターの例は、例えば、ＡＤＨ３プロモーター(McKnight等, The EMBO J. 4, 2093 - 2099 (1985))又はｔｐｉＡプロモーターである。他の有用なプロモーターの例は、Ａ. オリゼーＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミーヘイ(Rhizomucor miehei)アスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａ. ニガー中性α-アミラーゼ、Ａ. ニガー酸安定性α-アミラーゼ、Ａ. ニガーないしはＡ. アワモリのグルコアミラーゼ(ｇｌｕＡ)、リゾムコール・ミーヘイリパーゼ、Ａ. オリゼーアルカリプロテアーゼ、Ａ. オリゼートリオースリン酸イソメラーゼ、又はＡ.ニデュランスアセトアミダーゼをコードする遺伝子由来のものである。ＴＡＫＡ-アミラーゼ及びｇｌｕＡプロモーターが好ましい。
細菌性宿主細胞における使用に好適なプロモーターの例には、バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)マルトジェニック(maltogenic)アミラーゼ遺伝子、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)α-アミラーゼ遺伝子、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)ＢＡＮアミラーゼ遺伝子、バチルス・スブチリスアルカリプロテアーゼ遺伝子、又はバチルス・プミラス(Bacillus pumilus)キシロシダーゼ遺伝子のプロモーター、又は、ファージλＰＲプロモーターないしはＰＬプロモーターないしは大腸菌ｌａｃ、ｔｒｐ又はｔａｃプロモーターが含まれる。
【００１９】
また、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、必要に応じて、ヒト成長ホルモンターミネーター(前掲のPalmiter等)又は(真菌宿主のための)ＴＰＩ１(前掲のAlber及びKawasaki)ないしはＡＤＨ３(前掲のMcKnight等)ターミネーターなどの、適切な転写ターミネーターに作用可能に連結されうる。さらに、ベクターは、ポリアデニル化シグナル(例えばＳＶ４０又はアデノウイルス５Ｅｌｂ領域由来)、転写エンハンサー配列(例えばＳＶ４０エンハンサー)及び翻訳エンハンサー配列(例えばアデノウイルスＶＡ ＲＮＡをコードするもの)などの成分を含みうる。
さらに、本発明の組み換えベクターは、問題の宿主細胞中でのベクターの複製を可能にするＤＮＡ配列を含みうる。
宿主細胞が酵母菌である場合、ベクターの複製を可能にする好適な配列は、酵母プラスミド２μ複製遺伝子ＲＥＰ１-３及び複製開始点である。
宿主細胞が細菌細胞である場合、ベクターの複製を可能にする配列は、ＤＮＡポリメラーゼIII複合体コード遺伝子及び複製開始点である。
【００２０】
また、ベクターは、選択マーカー、例えば宿主細胞中の欠損を補う生成物の遺伝子、例として、ジヒドロ葉酸還元酵素(ＤＨＦＲ)をコードする遺伝子又はシゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)ＴＰＩ遺伝子(P.R. Russell, Gene 40, 125-130 (1985)に記載)、又はアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシン又はメトトレキセートなどの薬剤に耐性を与えるものを含む。糸状菌では、選択マーカーには、ａｍｄＳ、ｐｙｒＧ、ａｒｇＢ、ｎｉａＤ及びｓＣが含まれる。
宿主細胞の分泌経路に本発明のタンパク質を導くために、分泌シグナル配列(リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列ともしても知られる)を組み換えベクターに提供してもよい。分泌シグナル配列を、正確なリーディングフレーム内のタンパク質をコードするＤＮＡ配列に結合する。一般的に、分泌シグナル配列はタンパク質をコードするＤＮＡ配列の５'に位置する。分泌シグナル配列は、タンパク質と正常に結合されるか、又は他の分泌されたタンパク質をコードする遺伝子からのものであってもよい。
【００２１】
酵母細胞からの分泌には、分泌シグナル配列は、細胞の分泌経路内への発現されたタンパク質の効率的な誘導を導く任意のシグナルペプチドをコードしうる。シグナルペプチドは、天然に生じるペプチドないしはその機能的な部分であってよく、合成ペプチドであってもよい。好適なシグナルペプチドは、α-因子シグナルペプチド(米国特許第４８７０００８号を参照)、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド(O. Hagenbuchle等, Nature 289, 643-646 (1981)を参照)、変性カルボキシペプチダーゼシグナルペプチド(L.A. Valls等, Cell 48, 887-897 (1987)を参照)、酵母ＢＡＲ１シグナルペプチド(国際公開第８７／０２６７０号を参照)、又は酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３(ＹＡＰ３)シグナルペプチド(M. Egel-Mitani等, Yeast 6, 127-137 (1990)を参照)であることが明らかとなった。
酵母での効率的な分泌のために、リーダーペプチドをコードする配列も、シグナル配列の下流とタンパク質をコードするＤＮＡ配列の上流に挿入されうる。リーダーペプチドの機能は、発現されたタンパク質を小胞体からゴルジ体へ、さらに培養培地への分泌のために分泌小胞へ誘導することである(すなわち、細胞壁を越えて、又は少なくとも細胞膜を通過して酵母菌の細胞膜周辺腔へのタンパク質の輸出)。リーダーペプチドは酵母α-因子リーダーであってよい(その使用は例えば米国特許第４５４６０８２号、欧州特許第１６２０１号、欧州特許第１２３２９４号、欧州特許第１２３５４４号及び欧州特許第１６３５２９号に記載される)。あるいは、リーダーペプチドは合成リーダーペプチドであってもよく、それは天然には見られないリーダーペプチドであると言える。合成リーダーペプチドは、例えば、国際公開第８９／０２４６３号又は国際公開第９２／１１３７８号に記載のように構築されてもよい。
【００２２】
糸状菌での使用について、シグナルペプチドは、都合よく、アスペルギルスｓｐ.アミラーゼないしはグルコアミラーゼをコードする遺伝子、リゾムコール・ミーヘイリパーゼないしはプロテアーゼをコードする遺伝子、又はフミコーラ・ラヌギノーサ(Humicola lanuginosa)リパーゼをコードする遺伝子由来でもよい。シグナルペプチドは、Ａ. オリゼーＴＡＫＡアミラーゼ、Ａ. ニガー中性α-アミラーゼ、Ａ. ニガー酸安定性アミラーゼ、又はＡ. ニガーグルコアミラーゼをコードする遺伝子由来であることが好ましい。
本タンパク質をコードするＤＮＡ配列、プロモータ及び場合によってターミネーター及び／又は分泌シグナル配列のそれぞれをライゲートして、複製に必要な情報を含む好適なベクターにこれらを挿入するために用いられる手順は、当業者に周知である(例えば上掲のSambrook等を参照のこと)。
【００２３】
本発明のＤＮＡコンストラクト又は組み換えベクターが導入される宿主細胞は、本タンパク質を生産することが可能である任意の細胞であって、細菌、酵母、真菌類及び高等真核細胞が含まれる。
培養の際に、本発明のタンパク質を生産することが可能である細菌性宿主細胞の例は、グラム陽性細菌、例えばＢ. スブチリス(B. subtilis)、Ｂ. リチェニホルミス(B. licheniformis)、Ｂ. レンタス(B. lentus)、Ｂ. ブレビス(B. brevis)、Ｂ. ステアロサーモフィルス(B. stearothermophilus)、Ｂ. アルカロフィルス(B. alkalophilus)、Ｂ. アミロリケファシエンス(B. amyloliquefaciens)、Ｂ. コアグランス(B. coagulans)、Ｂ. サーキュランス(B. circulans)、Ｂ. ロータス(B. lautus)、Ｂ. メガテリム(B. megatherium)又はＢ. サリンジエンシス(B. thuringiensis)などのバシラス属の株、又はＳ. リビタンス(S. lividans)又はＳ. ミュリナス(S. murinus)などのストレプトマイセス、又はエシェリキア・コリ(大腸菌)などのグラム陰性細菌である。細菌の形質転換は、プロトプラスト形質転換によって又は当然知られている方法のコンピテント細胞を用いて行ってもよい(上掲のSambrook等を参照)。他の好適な宿主には、Ｓ. モバレンス(S. mobaraense)、Ｓ. リビダンス(S. lividans)及びＣ. グルタミカム(C. glutamicum)が含まれる(Appl. Microbiol. Biotechnol. 64, 447-454 (2004))。
【００２４】
大腸菌といった細菌でタンパク質が発現されると、タンパク質は、一般的に不溶性顆粒(封入体ともいう)として細胞質で保持されうるか、又は細菌性分泌配列によって細胞膜周辺腔に誘導されうる。前者の場合、細胞は溶解され、顆粒が回収されて変性された後に、変性剤を希釈することによってタンパク質が再フォールディングされる。後者の場合、タンパク質は、例えば超音波処理又は浸透圧ショックにより細胞を崩壊させて細胞膜周辺腔の内容物を放出させて、タンパク質を回収することによって細胞膜周辺腔から回収されうる。
【００２５】
好適な酵母細胞の例には、サッカロマイセスｓｓｐ.又はシゾサッカロマイセスｓｓｐ.の細胞、特にサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)又はサッカロマイセス・クリヴェリ(Saccharomyces kluyveri)の菌株が含まれる。異種性のＤＮＡにより酵母細胞を形質転換して、そこから異種性タンパク質を生産する方法は、例えば米国特許第４５９９３１１号、米国特許第４９３１３７３号、米国特許第４８７０００８号、米国特許第５０３７７４３号及び米国特許第４８４５０７５号に記載される。これらはすべて出典明記によって本明細書中に援用される。形質転換細胞は、選択マーカー、一般的に薬剤耐性又は特定の栄養分(例えばロイシン)の非存在での生育能によって決定される表現型により選択可能である。酵母における使用に好適なベクターは、米国特許第４９３１３７３号に開示されるＰＯＴ１ベクターである。本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列はシグナル配列及び場合によってリーダー配列(例えば上記のもの)の後にあってもよい。さらに、好適な酵母細胞の例は、Ｋ. ラクチス、ハンゼヌラ、例えばＨ. ポリモルファ(H. polymorpha)といったクリベロマイセス属、又はＰ.パストリスなどのピキア属の菌株である(参照Gleeson等, J. Gen. Microbiol. 132, 3459-3465 (1986)；米国特許第４８８２２７９号)。
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルスｓｐｐ.、パンカビｓｐｐ.、フザリウムｓｐｐ.又はトリコデルマｓｓｐ.、特にＡ. オリゼー、Ａ.ニデュランス又はＡ. ニガーの菌株の細胞である。タンパク質の発現のためのアスペルギルスｓｐｐ.の使用は、例として欧州特許第２７２２７７号及び欧州特許第２３００２３号に記述される。Malardier等 Gene 78, 147-156 (1989)に記載のように、例えばＦ. オキシスポラム(F. oxysporum)の形質転換が行われてもよい。 
【００２６】
糸状菌を宿主細胞として用いる場合、宿主染色体にＤＮＡコンストラクトを組み込んで、組み換え宿主細胞を得ることによって都合よく、本発明のＤＮＡコンストラクトにて形質転換されうる。ＤＮＡ配列は細胞中で安定して維持される傾向が強いので、一般的にこの組み込みは有用であると思われる。ＤＮＡコンストラクトの宿主染色体への組み込みは、従来法、例えば相同組み換え又は異種性の組み換えによって実施されうる。
次いで、上記の形質転換された又は形質移入された宿主細胞を、本発明のペプチドの発現を促す条件下で適切な栄養培地に培養し、その後結果として生じるタンパク質を培養物から回収する。
細胞を培養するために用いられる培地は、適切な添加物を含有する最少培地又は混合培地といった、宿主細胞を生育するために適した任意の従来の培地であってよい。好適な培地は、市販元から入手可能であるか又は公開された製法(例えばアメリカ培養細胞系統保存機関のカタログにおいて)に従って調製されてもよい。次いで、細胞によって生産されるタンパク質は、遠心ないしは濾過によって培地から宿主細胞を分離する、塩、例えば硫酸アンモニウムによる上清又は濾過液のタンパク質の構成成分を沈殿させる、様々なクロマトグラフィの手順によって精製、例えばイオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、親和性クロマトグラフィ、等ことを含んでいる従来の手順によって培養液から取り戻されてもよい。そして、問題のタイプのタンパク質に依存している。
【００２７】
本明細書中で引用される刊行物、特許出願及び特許を含む全ての文献は、本明細書の至る所に個別に特定の記載がなされようとも、あたかも各文献が個々にかつ特に出典明示により援用されることが示され、その全体が本明細書中に記載されている場合と同じ程度にその全体が出典明示により(法が許容する最大の範囲で)ここに援用される。
発明を特定する文脈における「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」なる用語並びに類似の表現の使用は、ここに特段の注記がなければ又は文脈上明らかに矛盾するということがなければ、単数と複数の双方をカバーするものとみなされる。例えば、「化合物」なる表現は、特に明記しない限り、本発明又は特定の記述された態様の様々な「化合物」を指すと理解されるものである。
【００２８】
特に明記しない限り、本明細書において示されたすべての正確な値は、対応する近似値の代表である(例えば、特定の因子又は測定に関して示されたすべての正確な例示値は、必要に応じて「およそ」を修飾した対応するおよその測定値を示すともみなされうる)。
一又は複数の構成成分に関して「含む(comprising)」、「有する(having)」、「包含する(including)」、及び「含有する(containing)」といった用語を用いた本発明の態様ないしは任意の態様の本明細書中の記載は、特に明記しない限り又は内容と明らかに矛盾しない限り、特定の一又は複数の構成成分「からなる」、「から実質的になる」又は「を本質的に含む」本発明の態様ないしは類似の態様をサポートすることを意図する(例えば、特定の構成成分を含有するような本明細書中に記載の組成物は、特に明記しない限り又は内容と明らかに矛盾しない限り、その構成成分からなる組成物を表すとも理解されるべきである)。
【実施例】
【００２９】
実施例１
ｈＧＨのＰＥＧ化  
a) ｈＧＨをリン酸バッファ(５０ｍＭ、ｐＨ８．０)に溶解する。この溶液を、アミンドナーの溶液、例えば１,３-ジアミノ-プロパン-２-オール溶解リン酸バッファ(５０ｍＭ、１ｍｌ、ｐＨ８．０、アミンドナーの溶解後に希塩酸にてｐＨを８．０に調整)と混合する。 
最後に、リン酸バッファ(５０ｍＭ、ｐＨ８．０、１ｍｌ)に溶解したＴＧアーゼ(〜４０Ｕ)の溶液を加え、容量をリン酸バッファ(５０ｍＭ、ｐＨ８)を加えて１０ｍｌに調整する。混合した混合物を３７℃でおよそ４時間インキュベートした。
温度を室温にまで下げ、Ｎ-エチル-マレイミド(ＴＧアーゼ阻害薬)を１ｍＭの終濃度で加える。さらに１時間後、混合物を、１０容量のトリスバッファ(５０ｍＭ、ｐＨ８．５)で希釈する。
b) 次いで、a)から得られるアミノ基転移ｈＧＨを場合によってさらに反応させ、アミンドナーに存在する場合には潜在的な官能基を活性化してもよい。 
c) 次いで、a)又はb)から得られる機能化ｈＧＨをｈＧＨに導入される官能基と反応することができる好適な機能化されたＰＥＧと反応させる。例えば、オキシム結合は、アルコキシアミンによってカルボニル成分(アルデヒド又はケトン)を反応させることによって形成してもよい。
【００３０】
実施例２
ＴＧアーゼ特異的アッセイI
記載する方法を用いて、実施例１に記載の反応において修飾されているｈＧＨのＧｌｎ残基(一又は複数)を決定してもよい。すなわち、ここで記載する方法を用いて、本発明のＴＧアーゼの選択性を決定してもよいと言える。
【００３１】
ＰＥＧ化部位(一又は複数)の測定
実施例１において得られたモノＰＥＧ化ｈＧＨを、イオン交換クロマトグラフィ及びゲル濾過の組合せを用いて精製する。
ＰＥＧ化の部位(一又は複数)を決定するために、精製された化合物を希釈して、ジチオトレイトール及びヨードアセトアミドを用いてアルキル化する。その後、化合物を非特異的なプロテアーゼであるプロテアーゼＫを用いて消化し、結果として生じた消化物をアセトニトリル／ＴＦＡバッファシステムを用いた逆相Ｃ-１８ＨＰＬＣカラムにて分離する。ＰＥＧ化ペプチドの保持時間は主にＰＥＧ成分によって決定されるので、これらの条件下にてＰＥＧ化したペプチドをＰＥＧ化していないペプチドよりも有意にゆっくりと溶出し、さらに、すべてのＰＥＧ化ペプチド(１より多い場合)を同じピークで溶出する。
ピーク含有ＰＥＧ化ペプチド(一又は複数)を回収し、自動エドマン分析を用いたアミノ酸配列決定を行う。その結果、ＰＥＧ化の正確な位置−ＰＥＧ化アミノ酸は配列決定分析においてブランクサイクルを生じる−と同時に存在するペプチドの数と相対的な量についての情報が得られ、それにより、ＰＥＧ化が１より多い部位で生じているかどうかが明らかとなる。
【００３２】
実施例３
ｈＧＨのＧｌｎ-４０とＧｌｎ-１４１に対する特異性についてのＴＧアーゼ変異体の試験
２０μｌの１,３-ジアミノ-２-プロパノール(１０ｍＭのリン酸バッファ中に１８０ｍｇ／ｍｌ、濃縮ＨＣｌを加えてｐＨを８．３に調整)を、１０ｍＭ リン酸バッファｐＨ８．１の溶液(５０μｌ)中のｈＧＨ(１ｍｇ)の溶液に加える。１０ｍＭ リン酸バッファを、最終反応混合物容量が１００μｌとなる容量で加える。反応は、酵素(終濃度０．０７〜７μＭ)を加えて開始する。反応混合物を３７℃でインキュベートし、その反応の後にキャピラリー電気泳動法(ＣＥ)を行う。
一定量の反応混合物(１０μｌ)に、１００ｍＭ(１μｌ)のＮ‐エチルマレイミドを加える。混合物を室温で５分間インキュベートし、次いでＨ２Ｏで１００倍に希釈してＣＥ分析を行う。
ＣＥは、Agilent Technologies 3D-CEシステム(Agilent Technologies)を用いて行う。データ収集及びシグナル処理は、Agilent Technologies 3DCE ChemStationを用いて行う。キャピラリーは、６４．５ｃｍ(有効な長さ５６．０ｃｍ)の５０μｍ、すなわちAgilent製の"Extended Light Path Capillary"である。２００ｎｍでＵＶ検出を行う(１６ｎｍＢｗ、３８０ｎｍ及び５０ｎｍのＢｗを参照)。ランニング電解質は５０ｍＭ リン酸バッファｐＨ７．０である。キャピラリーは、０．１Ｍ ＮａＯＨにて３分間、次いでミリＱ水にて２分間、そして、電解質にて３分間調整する。
【００３３】
各動作の後、ミリＱ水にて２分間、次いでリン酸にて２分間、そして、ミリＱ水にて２分間によりキャピラリーを終える。４．０秒間、５０ｍｂａｒで水力学的注入を行う。電圧は＋２５ｋＶである。キャピラリーの温度は３０℃とし、動作時間は１０．５分とする。
図１は、１,３-ジアミノ-２-プロパノールによるｈＧＨのＴＧアーゼ-触媒トランスグルタミン化の代表的なＣＥ分析の画像を示す。
単一-アミノ基転移生成物の量が５時間の反応時間内でその最大に達するように、酵素量を調整する。
反応速度の指標は、基質であるｈＧＨの半分がアミノ基転移される時間によるものである。
表１は、選択されたＴＧアーゼの結果を示す。
【００３４】
表１
2009504171.tif 000004
ＷＴ                  配列番号１のアミノ酸配列を有するＴＧアーゼ
Ｙ７５Ｅ              配列番号２のアミノ酸配列を有するＴＧアーゼ
Ｙ３０２Ｒ            配列番号３のアミノ酸配列を有するＴＧアーゼ
Ｙ７５Ｅ、Ｙ３０２Ｒ  Ｔｙｒ-７５がＧｌｕに置換され、Ｔｙｒ-３０２がＡｒｇに置換されている配列番号１に記載のＴＧアーゼ
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】１,３-ジアミノ-２-プロパノールによるｈＧＨのＴＧアーゼ-触媒トランスグルタミン化の代表的なＣＥ分析の画像を示す。
【図１】
2009504171.tif 000005
【配列表】
2009504171000001.app
【国際調査報告】
2009504171.tif 000006
2009504171.tif 000007