(57)【要約】  耐糖能異常など、代謝性障害、特に２型糖尿病又はインスリン欠損と関連する他の病態若しくは疾患の前形成状態の診断、予後予測、及び層別化の方法。単独又は併用で２型糖尿病のプリフォームの診断、予後予測、又は層別化を可能とするペプチド。加えて、本発明は、前記方法のための試験キット、並びに新規のペプチド分子及びその使用に関する。
2009537812.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における２型糖尿病のプリフォームの存在又は不在を検出する方法であって、
ａ）個体由来の試料中における、Ｆ０６７．４１８１．５（配列番号３）、Ｆ０６７．２４４０．５（配列番号４）、Ｆ０２４．１１６１．５（配列番号５）、Ｆ０３４．２００８．５、Ｆ０２９．１７３６．５（配列番号６）、Ｆ０６６．４３９０．５（配列番号７）、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０７３．１１２２．５、Ｆ０７５．４３９９．５（配列番号１４）、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０３３．１２１０．５、Ｆ０７５．４３４２．５（配列番号１５）、Ｆ０７５．３４７４．５、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０６８．３８４１．５、Ｆ０７５．３９８８．５、Ｆ０３４．２６３８．５（配列番号１６）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチド、又はその修飾形態の量を測定するステップと、
ｂ）ａ）の結果を、対照試料を使用して、又は既知の基準値を用いて決定した結果と比較するステップと、
ｃ）前記個体における前記２型糖尿病のプリフォームの存在又は不在を判定するステップと
を含む方法。
【請求項２】
請求項１のａ）に記載のペプチドから選択される少なくとも１つのペプチド又はその修飾形態の量と、少なくとも１つの追加のペプチドマーカーとを組み合わせて、ペプチドマーカーパネル又はその修飾形態を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ペプチドマーカーパネル又はその修飾形態を形成する、請求項１のａ）に記載のペプチドから選択される少なくとも１つのペプチド又はその修飾形態及び少なくとも１つの追加のペプチドマーカーの組合せの量を測定する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１のａ）に記載のペプチドから選択される少なくとも２つのペプチド又はその修飾形態の量を測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
２型糖尿病のプリフォームが耐糖能異常（ＩＧＴ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記試料が、全血、血漿、血清、尿、脂肪組織及び肝組織からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチドが、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、ウェスタンブロット法、プロテインチップ法、質量分析法、免疫組織学法、フローサイトメトリー法からなる群から選択される方法によって、又は既知の分子生物学的方法を用いることによって決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
食事及び／又は運動レジメンを含む治療法の有用性を判定する、２型糖尿病のプリフォームである個体の層別化方法であって、
ａ）個体由来の試料中における、Ｆ０３６．２５９１．５（配列番号１）、Ｆ０４６．４８７４．５（配列番号２）、Ｆ０７６．４７５８．５、Ｆ０４６．４７４５．５、Ｆ０３５．２６１５．５、Ｆ０４１．１９０６．５、Ｆ０４６．４９０１．５、Ｆ０４６．４８７４．５、Ｆ０４６．１６９０．５（配列番号１７）、Ｆ０５０．２１９９．５、Ｆ０３１．１８２０（配列番号１８）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチド、又はその修飾形態の量を測定するステップと、
ｂ）ａ）の結果を、対照試料を使用して、又は既知の基準値を用いて決定した結果と比較するステップと、
ｃ）前記個体に対する前記治療法の有用性を判定するステップと
を含む方法。
【請求項９】
請求項８のａ）に記載のペプチドから選択される少なくとも１つのペプチド又はその修飾形態の量と、少なくとも１つの追加のペプチドマーカーとを組み合わせて、ペプチドマーカーパネル又はその修飾形態を形成する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ペプチドマーカーパネル又はその修飾形態を形成する、請求項８のａ）に記載のペプチドから選択される少なくとも１つのペプチド又はその修飾形態及び少なくとも１つの追加のペプチドマーカーの組合せの量を測定する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項８のａ）に記載のペプチドから選択される少なくとも２つのペプチド又はその修飾形態の量を測定する、請求項８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ペプチドが、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、ウェスタンブロット法、プロテインチップ法、質量分析法、免疫組織学法、フローサイトメトリー法からなる群から選択される方法によって、又は既知の分子生物学的方法を用いて決定される、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
個体が２型糖尿病のプリフォームに罹患する予後予測の方法であって、
ａ）個体由来の試料中における、Ｆ０６６．４３９０．５（配列番号７）、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０７３．１１２２．５、Ｆ０６６．２８４３．５、Ｆ０６６．２８０４、Ｆ０６４．２７８９．５（配列番号８）、Ｆ０６４．３０２０（配列番号９）、Ｆ０６６．１３９４．５（配列番号１０；配列番号１１）、Ｆ０１８．２０６９．５（配列番号１２）、Ｆ０３４．１８７０．５、Ｆ０３９．２１５８．５、Ｆ０４６．４９０１．５（配列番号１３）、Ｆ０６８．５１７１．５、Ｆ０６６．２８５１．５、Ｆ０６６．４３９０．５、Ｆ０２５．２９６６．５、Ｆ０６８．７９６０．５、Ｆ０７６．４７５８．５、Ｆ０２４．１４６３．５（配列番号１９）、Ｆ０２１．２３７８．５（配列番号２０）、Ｆ０２４．１７５３．５（配列番号２１）、Ｆ０６８．７６６５（配列番号２２）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチド、又はその修飾形態の量を測定するステップと、
ｂ）ａ）の結果を、対照試料を使用して、又は既知の基準値を用いて決定した結果と比較するステップと、
ｃ）前記個体における２型糖尿病のプリフォームの存在又は不在を判定するステップと
を含む方法。
【請求項１４】
請求項１３のａ）に記載の群の少なくとも２つのペプチドの量を測定する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
２型糖尿病のプリフォームが耐糖能異常（ＩＧＴ）である、任意の請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記試料が、全血、血漿、血清、尿、脂肪組織及び肝組織からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記ペプチドが、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、ウェスタンブロット法、プロテインチップ法、質量分析法、免疫組織学法、フローサイトメトリー法からなる群から選択される方法によって、又は既知の分子生物学的方法を用いて決定される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
代謝性障害の存在を検出するか、又は代謝性障害の発生可能性を予測する際に用いるペプチドであって、Ｆ０６７．４１８１．５（配列番号３）、Ｆ０６７．２４４０．５（配列番号４）、Ｆ０２４．１１６１．５（配列番号５）、Ｆ０３４．２００８．５、Ｆ０２９．１７３６．５（配列番号６）、Ｆ０６６．４３９０．５（配列番号７）、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０７３．１１２２．５、Ｆ０７５．４３９９．５（配列番号１４）、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０３３．１２１０．５、Ｆ０７５．４３４２．５（配列番号１５）、Ｆ０７５．３４７４．５、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０６８．３８４１．５、Ｆ０７５．３９８８．５、Ｆ０３４．２６３８．５（配列番号１６）、Ｆ０３６．２５９１．５（配列番号１）、Ｆ０４６．４８７４．５（配列番号２）、Ｆ０７６．４７５８．５、Ｆ０４６．４７４５．５、Ｆ０３５．２６１５．５、Ｆ０４１．１９０６．５、Ｆ０４６．４９０１．５、Ｆ０４６．４８７４．５、Ｆ０４６．１６９０．５（配列番号１７）、Ｆ０５０．２１９９．５、Ｆ０３１．１８２０（配列番号１８）、Ｆ０６６．４３９０．５（配列番号７）、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０７３．１１２２．５、Ｆ０６６．２８４３．５、Ｆ０６６．２８０４、Ｆ０６４．２７８９．５（配列番号８）、Ｆ０６４．３０２０（配列番号９）、Ｆ０６６．１３９４．５（配列番号１０；配列番号１１）、Ｆ０１８．２０６９．５（配列番号１２）、Ｆ０３４．１８７０．５、Ｆ０３９．２１５８．５、Ｆ０４６．４９０１．５（配列番号１３）、Ｆ０６８．５１７１．５、Ｆ０６６．２８５１．５、Ｆ０６６．４３９０．５、Ｆ０２５．２９６６．５、Ｆ０６８．７９６０．５、Ｆ０７６．４７５８．５、Ｆ０２４．１４６３．５（配列番号１９）、Ｆ０２１．２３７８．５（配列番号２０）、Ｆ０２４．１７５３．５（配列番号２１）、Ｆ０６８．７６６５（配列番号２２）からなる群から選択される分子、又はその修飾形態であるペプチド。
【請求項１９】
前記代謝性障害が２型糖尿病のプリフォームである、請求項１８に記載のペプチド。
【請求項２０】
前記２型糖尿病のプリフォームがＩＧＴである、請求項１９に記載のペプチド。
【請求項２１】
請求項１８に記載のペプチドのネオエピトープに特異的に結合し、前記ペプチドが由来するタンパク質には結合しない抗体。
【請求項２２】
個体における２型糖尿病のプリフォームの存在又は不在を判定する試験キットであって、
ａ）Ｆ０６７．４１８１．５（配列番号３）、Ｆ０６７．２４４０．５（配列番号４）、Ｆ０２４．１１６１．５（配列番号５）、Ｆ０３４．２００８．５、Ｆ０２９．１７３６．５（配列番号６）、Ｆ０６６．４３９０．５（配列番号７）、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０７３．１１２２．５、Ｆ０７５．４３９９．５（配列番号１４）、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０３３．１２１０．５、Ｆ０７５．４３４２．５（配列番号１５）、Ｆ０７５．３４７４．５、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０６８．３８４１．５、Ｆ０７５．３９８８．５、Ｆ０３４．２６３８．５（配列番号１６）、Ｆ０３６．２５９１．５（配列番号１）、Ｆ０４６．４８７４．５（配列番号２）、Ｆ０７６．４７５８．５、Ｆ０４６．４７４５．５、Ｆ０３５．２６１５．５、Ｆ０４１．１９０６．５、Ｆ０４６．４９０１．５、Ｆ０４６．４８７４．５、Ｆ０４６．１６９０．５（配列番号１７）、Ｆ０５０．２１９９．５、Ｆ０３１．１８２０（配列番号１８）、Ｆ０６６．４３９０．５（配列番号７）、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０７３．１１２２．５、Ｆ０６６．２８４３．５、Ｆ０６６．２８０４、Ｆ０６４．２７８９．５（配列番号８）、Ｆ０６４．３０２０（配列番号９）、Ｆ０６６．１３９４．５（配列番号１０；配列番号１１）、Ｆ０１８．２０６９．５（配列番号１２）、Ｆ０３４．１８７０．５、Ｆ０３９．２１５８．５、Ｆ０４６．４９０１．５（配列番号１３）、Ｆ０６８．５１７１．５、Ｆ０６６．２８５１．５、Ｆ０６６．４３９０．５、Ｆ０２５．２９６６．５、Ｆ０６８．７９６０．５、Ｆ０７６．４７５８．５、Ｆ０２４．１４６３．５（配列番号１９）、Ｆ０２１．２３７８．５（配列番号２０）、Ｆ０２４．１７５３．５（配列番号２１）、Ｆ０６８．７６６５（配列番号２２）；
からなる群から選択されるペプチド、及び／又は
ｂ）前記ペプチドのネオエピトープに特異的に結合し、前記ペプチドが由来するタンパク質には結合しない抗体若しくは抗体断片、及び
ｃ）２型糖尿病のプリフォームの存在若しくは不在を判定する前記試験キットを用いるための説明書
を含む試験キット。
【請求項２３】
請求項２２に記載の試験キットの製造におけるペプチドの使用であって、
ａ）１つ又は複数の前記ペプチド、及び／又は
ｂ）前記ペプチドのネオエピトープに特異的に結合する抗体若しくは抗体断片
を含むペプチドの使用。
【請求項２４】
個体が２型糖尿病のプリフォームに罹患する予後を判定するための試験キットであって、
ａ）Ｆ０６７．４１８１．５（配列番号３）、Ｆ０６７．２４４０．５（配列番号４）、Ｆ０２４．１１６１．５（配列番号５）、Ｆ０３４．２００８．５、Ｆ０２９．１７３６．５（配列番号６）、Ｆ０６６．４３９０．５（配列番号７）、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０７３．１１２２．５、Ｆ０７５．４３９９．５（配列番号１４）、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０３３．１２１０．５、Ｆ０７５．４３４２．５（配列番号１５）、Ｆ０７５．３４７４．５、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０６８．３８４１．５、Ｆ０７５．３９８８．５、Ｆ０３４．２６３８．５（配列番号１６）、Ｆ０３６．２５９１．５（配列番号１）、Ｆ０４６．４８７４．５（配列番号２）、Ｆ０７６．４７５８．５、Ｆ０４６．４７４５．５、Ｆ０３５．２６１５．５、Ｆ０４１．１９０６．５、Ｆ０４６．４９０１．５、Ｆ０４６．４８７４．５、Ｆ０４６．１６９０．５（配列番号１７）、Ｆ０５０．２１９９．５、Ｆ０３１．１８２０（配列番号１８）、Ｆ０６６．４３９０．５（配列番号７）、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０７３．１１２２．５、Ｆ０６６．２８４３．５、Ｆ０６６．２８０４、Ｆ０６４．２７８９．５（配列番号８）、Ｆ０６４．３０２０（配列番号９）、Ｆ０６６．１３９４．５（配列番号１０；配列番号１１）、Ｆ０１８．２０６９．５（配列番号１２）、Ｆ０３４．１８７０．５、Ｆ０３９．２１５８．５、Ｆ０４６．４９０１．５（配列番号１３）、Ｆ０６８．５１７１．５、Ｆ０６６．２８５１．５、Ｆ０６６．４３９０．５、Ｆ０２５．２９６６．５、Ｆ０６８．７９６０．５、Ｆ０７６．４７５８．５、Ｆ０２４．１４６３．５（配列番号１９）、Ｆ０２１．２３７８．５（配列番号２０）、Ｆ０２４．１７５３．５（配列番号２１）、Ｆ０６８．７６６５（配列番号２２）；
からなる群から選択されるペプチド、及び／又は
ｂ）前記ペプチドのネオエピトープに特異的に結合し、前記ペプチドが由来するタンパク質には結合しない抗体若しくは抗体断片及び、
ｃ）個体が２型糖尿病のプリフォームに罹患する可能性を判定する前記試験キットを用いるための説明書
を含む試験キット。
【請求項２５】
請求項２４に記載の試験キットの製造におけるペプチドの使用であって、
ａ）１つ又は複数の前記ペプチド、及び／又は
ｂ）前記ペプチドのネオエピトープに特異的に結合する抗体若しくは抗体断片
を含むペプチドの使用。
【請求項２６】
２型糖尿病のプリフォームに罹患した個体を層別化して、食事及び／又は身体運動レジメンを含む治療プログラムの有用性を判定する試験キットであって、
ａ）Ｆ０６７．４１８１．５（配列番号３）、Ｆ０６７．２４４０．５（配列番号４）、Ｆ０２４．１１６１．５（配列番号５）、Ｆ０３４．２００８．５、Ｆ０２９．１７３６．５（配列番号６）、Ｆ０６６．４３９０．５（配列番号７）、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０７３．１１２２．５、Ｆ０７５．４３９９．５（配列番号１４）、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０３３．１２１０．５、Ｆ０７５．４３４２．５（配列番号１５）、Ｆ０７５．３４７４．５、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０６８．３８４１．５、Ｆ０７５．３９８８．５、Ｆ０３４．２６３８．５（配列番号１６）、Ｆ０３６．２５９１．５（配列番号１）、Ｆ０４６．４８７４．５（配列番号２）、Ｆ０７６．４７５８．５、Ｆ０４６．４７４５．５、Ｆ０３５．２６１５．５、Ｆ０４１．１９０６．５、Ｆ０４６．４９０１．５、Ｆ０４６．４８７４．５、Ｆ０４６．１６９０．５（配列番号１７）、Ｆ０５０．２１９９．５、Ｆ０３１．１８２０（配列番号１８）、Ｆ０６６．４３９０．５（配列番号７）、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０７３．１１２２．５、Ｆ０６６．２８４３．５、Ｆ０６６．２８０４、Ｆ０６４．２７８９．５（配列番号８）、Ｆ０６４．３０２０（配列番号９）、Ｆ０６６．１３９４．５（配列番号１０；配列番号１１）、Ｆ０１８．２０６９．５（配列番号１２）、Ｆ０３４．１８７０．５、Ｆ０３９．２１５８．５、Ｆ０４６．４９０１．５（配列番号１３）、Ｆ０６８．５１７１．５、Ｆ０６６．２８５１．５、Ｆ０６６．４３９０．５、Ｆ０２５．２９６６．５、Ｆ０６８．７９６０．５、Ｆ０７６．４７５８．５、Ｆ０２４．１４６３．５（配列番号１９）、Ｆ０２１．２３７８．５（配列番号２０）、Ｆ０２４．１７５３．５（配列番号２１）、Ｆ０６８．７６６５（配列番号２２）；
からなる群から選択されるペプチド、及び／又は
ｂ）請求項１８に記載のペプチドのネオエピトープに特異的に結合し、前記ペプチドが由来するタンパク質には結合しない抗体若しくは抗体断片及び、
ｃ）２型糖尿病のプリフォームの存在又は不在を判定する前記試験キットを用いるための説明書
を含む試験キット。
【請求項２７】
請求項２６に記載の試験キットの製造におけるペプチドの使用であって、
ａ）１つ又は複数の前記ペプチド、及び／又は
ｂ）前記ペプチドのネオエピトープに特異的に結合する抗体若しくは抗体断片
を含むペプチドの使用。
【請求項２８】
場合によっては少なくとも１つの追加のペプチドマーカーと組み合わせて、個体における２型糖尿病のプリフォームの診断を容易にするペプチドマーカーパネルを形成する、Ｆ０６７．４１８１．５（配列番号３）、Ｆ０６７．２４４０．５（配列番号４）、Ｆ０２４．１１６１．５（配列番号５）、Ｆ０３４．２００８．５、Ｆ０２９．１７３６．５（配列番号６）、Ｆ０６６．４３９０．５（配列番号７）、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０７３．１１２２．５、Ｆ０７５．４３９９．５（配列番号１４）、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０３３．１２１０．５、Ｆ０７５．４３４２．５（配列番号１５）、Ｆ０７５．３４７４．５、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０６８．３８４１．５、Ｆ０７５．３９８８．５、Ｆ０３４．２６３８．５（配列番号１６）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチド又はその修飾形態の使用。
【請求項２９】
２型糖尿病のプリフォームがＩＧＴである、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
２型糖尿病のプリフォームに罹患した個体の層別化のための、Ｆ０３６．２５９１．５（配列番号１）、Ｆ０４６．４８７４．５（配列番号２）、Ｆ０７６．４７５８．５、Ｆ０４６．４７４５．５、Ｆ０３５．２６１５．５、Ｆ０４１．１９０６．５、Ｆ０４６．４９０１．５、Ｆ０４６．４８７４．５、Ｆ０４６．１６９０．５（配列番号１７）、Ｆ０５０．２１９９．５、Ｆ０３１．１８２０（配列番号１８）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチド又はその修飾形態の使用。
【請求項３１】
２型糖尿病のプリフォームがＩＧＴである、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
個体が２型糖尿病のプリフォームに罹患した予後予測のための、Ｆ０６６．４３９０．５（配列番号７）、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０７３．１１２２．５、Ｆ０６６．２８４３．５、Ｆ０６６．２８０４、Ｆ０６４．２７８９．５（配列番号８）、Ｆ０６４．３０２０（配列番号９）、Ｆ０６６．１３９４．５（配列番号１０；配列番号１１）、Ｆ０１８．２０６９．５（配列番号１２）、Ｆ０３４．１８７０．５、Ｆ０３９．２１５８．５、Ｆ０４６．４９０１．５（配列番号１３）、Ｆ０６８．５１７１．５、Ｆ０６６．２８５１．５、Ｆ０６６．４３９０．５、Ｆ０２５．２９６６．５、Ｆ０６８．７９６０．５、Ｆ０７６．４７５８．５、Ｆ０２４．１４６３．５（配列番号１９）、Ｆ０２１．２３７８．５（配列番号２０）、Ｆ０２４．１７５３．５（配列番号２１）、Ｆ０６８．７６６５（配列番号２２）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチド又はその修飾形態の使用。
【請求項３３】
２型糖尿病のプリフォームがＩＧＴである、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
個体が代謝性障害に罹患する可能性を判定する方法であって、
ａ）個体由来の試料中における、Ｆ０６６．４３９０．５（配列番号７）、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０７３．１１２２．５、Ｆ０６６．２８４３．５、Ｆ０６６．２８０４、Ｆ０６４．２７８９．５（配列番号８）、Ｆ０６４．３０２０（配列番号９）、Ｆ０６６．１３９４．５（配列番号１０；配列番号１１）、Ｆ０１８．２０６９．５（配列番号１２）、Ｆ０３４．１８７０．５、Ｆ０３９．２１５８．５、Ｆ０４６．４９０１．５（配列番号１３）、Ｆ０６８．５１７１．５、Ｆ０６６．２８５１．５、Ｆ０６６．４３９０．５、Ｆ０２５．２９６６．５、Ｆ０６８．７９６０．５、Ｆ０７６．４７５８．５、Ｆ０２４．１４６３．５（配列番号１９）、Ｆ０２１．２３７８．５（配列番号２０）、Ｆ０２４．１７５３．５（配列番号２１）、Ｆ０６８．７６６５（配列番号２２）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチド、又はその修飾形態の量を測定するステップと、
ｂ）ａ）の結果を、陰性対照試料を使用して、又は既知の基準値を用いて決定した結果と比較するステップと、
ｃ）前記個体における２型糖尿病のプリフォームの存在又は不在を判定するステップと
を含む方法。
【請求項３５】
請求項３４のａ）に記載の群の少なくとも２つのペプチドの量を測定する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
代謝性障害が２型糖尿病のプリフォームである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
２型糖尿病のプリフォームが耐糖能異常（ＩＧＴ）である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
試料が、全血、血漿、血清、尿、脂肪組織、及び肝組織からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
ペプチドが、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、ウェスタンブロット法、プロテインチップ法、質量分析法、免疫組織学法、フローサイトメトリー法からなる群から選択される方法によって、又は既知の分子生物学的方法を用いて決定される、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、耐糖能異常（ＩＧＴ）など、２型糖尿病プリフォーム又はインスリン欠損と関連する他の病態若しくは疾患の診断、予後予測、及び層別化の方法に関する。具体的には、単独又は併用で２型糖尿病プリフォームの診断、予後予測、又は層別化（ｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を可能にする新規のペプチドを提供する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病とは、インスリン分泌、インスリン作用、又はその両方の欠損から生じる高血糖を特徴とする代謝性疾患の群である。糖尿病の慢性高血糖は、各種の器官、特に、眼、腎臓、神経、心臓、及び血管の長期にわたる損傷、機能障害、不全を伴う。世界保健機構（「ＷＨＯ」）は、１型糖尿病、２型糖尿病、及び妊娠性糖尿病（又は３型糖尿病、妊娠中に生じる）という糖尿病の３大形態を認めているが、糖尿病のこれらの３つの「型」は、単一の疾患というよりも、より正確には膵不全のパターンとして考えられる。１型糖尿病がインスリン産生細胞の自己免疫性破壊に起因するのに対し、２型糖尿病及び妊娠性糖尿病は、組織によるインスリン抵抗性に起因する。
【０００３】
糖尿病の危険性のスクリーニングを目的として、異常なグルコースホメオスタシスの分類が定義されている。耐糖能異常（ＩＧＴ）と、より近年に創出された分類である空腹時血糖異常（ＩＦＧ）とは、それぞれ、糖負荷後血糖値又は空腹時血糖値（ＦＰＧ）に基づき、糖尿病を発症する危険性の高い個体を同定する。ＩＧＴ及びＩＦＧは、「前糖尿病」と総称されるが、基礎的な病態生理において異なる。ＩＦＧにおいてはインスリン分泌の欠損が明らかであることが多いのに対し、ＩＧＴにおいてはインスリン感受性の異常がより明らかであることがある。人口の大半において、ＩＧＴの方がＩＦＧよりもはるかに高頻度であるため、前者の方が糖尿病を発症する人々のより大きな割合を示す。ＩＧＴ及びＩＦＧは、糖尿病への異なる進行速度及び心血管疾患（ＣＶＤ）の危険性における差と関連することが示唆されている。複数の研究結果は、食後の高血糖（又は血糖負荷２時間後の血糖値）の方が、空腹時血糖値よりも、将来の心血管疾患事象の危険性を評価するのに優れていることを示す。ＣＶＤ又は将来の糖尿病の危険性は血糖値範囲にわたって連続的であるように思われ、範囲の区切りは、証拠よりもむしろ同意に基づいている。
【０００４】
２時間のＯＧＴＴ（経口ブドウ糖負荷試験）は、その診断的価値にもかかわらず、患者及び検査者の双方にとって煩雑で時間をとるため、多くの医療提供者は、同試験法の施行に消極的である。したがって、ＩＧＴの特異的でより正確な診断を可能とする別のマーカーを同定することが望ましい。
【０００５】
２型糖尿病、耐糖能異常（ＩＧＴ）、肥満、メタボリックシンドローム、心血管疾患、及びアテローム性動脈硬化は、すべて相互に関連する疾患である。
【０００６】
耐糖能異常又はＩＧＴは、正常よりも高いが、糖尿病患者の場合よりも低い血糖値を定義する名称である。ＩＧＴは、（ｉ）インスリンの分泌異常と、（ｉｉ）インスリン感受性の低下（インスリン抵抗性）との組合せである。
【０００７】
耐糖能異常（ＩＧＴ）は、後年に２型糖尿病及び心血管疾患（ＣＶＤ）を発症する危険性の高さと関連する主要な健康問題である。ＩＧＴ及びＩＦＧは「前糖尿病」と総称されるが、ＩＦＧは、ＩＧＴとは異なる病態生理的特徴を有する。人口の大半において、ＩＧＴの方がＩＦＧよりもはるかに高頻度であるため、前者の方が糖尿病を発症する人々のより大きな割合を同定する。ＩＧＴは、経口ブドウ糖負荷試験のみにより同定することができ、空腹時血糖値（ＦＰＧ）の測定にはよらない。さらに、ＩＧＴは、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性症候群、又は症候群Ｘとして知られる、相互に関連する心血管危険因子の一群と関連することが多い。
【０００８】
通常、いわゆる経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）を実施して、ＩＧＴ又は糖尿病の存在を判定する。すなわち、ＩＧＴ患者においては、７５ｇグルコースを摂取した後に生じる血糖の増加が正常よりも大きく、とりわけ長時間続く、すなわち、６．７ｍＭ超１０ｍＭ未満の血漿グルコースを示す。ＷＨＯが定義する通り、７５ｇグルコースの摂取２時間後に決定した血糖値（ＯＧＴＴ）１０ｍＭ以上から、糖尿病の血糖値となる。空腹時血糖値は、正常又は中程度に上昇する。ＩＧＴは、２型糖尿病へと進行する高い危険性、米国糖尿病学会が「前糖尿病」と呼ぶ状態、又は境界型糖尿病若しくは無症状糖尿病を生じる高い危険性を伴う。すなわち、ＩＧＴを発症する人々には、正常な耐糖能に戻りうる人々もいる。ＩＧＴの状態にとどまる人々もいる。しかし、ＩＧＴを発症すると、体内のインスリン分泌及び感受性が減退し続ける傾向があり、最終的には２型糖尿病を生じる。実際、ＩＧＴを有する個体の約４０〜５０％は、１０年以内に２型糖尿病を発症する（心血管疾患及び微小血管合併症の危険性増大を伴う）。現在のところ、ＩＧＴ患者の数が最も多く、有病率が最も高い東南アジア地域では、３億１４００万人の人々がＩＧＴを有すると推定されている。ＩＧＴの有病率は年齢とともに上昇し、男女間に著明な差はなく、特定の民族集団がＩＧＴのより高い有病率を有し、欧州におけるＩＧＴの有病率は米国の場合と同様であることが判明した。
【０００９】
別の研究は、２型糖尿病患者が追跡期間中に死亡する可能性は、正常な血糖コントロールを有する人々と比べて２倍超高いことを示した。ＩＧＴ患者が追跡期間中に心血管合併症で死亡する可能性は、正常な血糖コントロールを有する人々と比べて５０％超高かった。
【００１０】
今日、ＩＧＴは、上記に示した通り、個体が７５ｇグルコースを摂取し、１及び２時間後にそれぞれ血糖値を決定する、経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）を用いて判定される。或いは、被験者が試料採取以前に何も食べないように求められる、空腹時血糖値試験が用いられる。ＩＧＴを有する患者は、病態の診断がまれであるために、治療されることもまれである。ＩＧＴは、身体活動を増やすこと、健康な体重を維持すること、及び健康的でバランスのとれた食事をとることによって予防することができる。
【００１１】
上記の観点から、ＩＧＴの判定及び診断を可能とする手段を提供することに対する依然として強い関心が存在する。
【００１２】
メタボリックシンドロームは、糖尿病又は前糖尿病、腹部肥満又は肥満、コレステロールの変化、及び高血圧という、最も危険な心血管疾患（ＣＶＤ）の危険因子の一群である。腹部肥満又は肥満は、メタボリックシンドロームの有病率の上昇の主な原因である。肥満は、インスリン抵抗性と因果関係のある軽度の炎症状態に寄与する複数の急性期タンパク質及び炎症性サイトカインの循環レベルの上昇と関連する。インスリン抵抗性は、メタボリックシンドローム患者の大半において存在し、心血管疾患及び２型糖尿病の危険性とも強く関連している。
【００１３】
脂肪組織又は脂肪細胞は、「アディポカイン」と総称される広範なタンパク質因子を分泌又は放出する。これらのアディポカインは、脂質代謝、インスリン感受性、副経路補体系、血管止血、血圧調節、及び血管新生のほか、エネルギーバランスの調節に関与する。加えて、炎症（ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、形質転換成長因子、神経成長因子）及び急性期反応（プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＰＡＩ−１）、ハプトグロビン、血清アミロイドＡ）に関与するアディポカインのリストが増大しつつある。ＰＡＩ−１レベルの上昇が血栓形成促進状態に寄与する一方、アディポネクチンの低レベルは、代謝性危険因子の増悪と相関する。インスリン抵抗性も、ＩＩ型糖尿病の根底をなす主要な影響の１つである。
【００１４】
現在のところ、耐糖能異常（ＩＧＴ）など２型糖尿病プリフォームに罹患する患者の初期同定を裏付ける唯一の診断法は、経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）を実施することである。この試験は、時間がかかり、その結果費用がかかり、定期的には実施されない。バイオマーカー、例えば、血液、血漿、血清、尿などの体液に由来するタンパク質又はペプチドを測定する診断的試験であれば、２型糖尿病プリフォームの診断に対する価値が高いであろう。
【００１５】
現在のところ、耐糖能異常（ＩＧＴ）など２型糖尿病プリフォームの治療は、まず、身体活動及び特別の食事及び体重減量によって治療する。これは、多くの場合に、ともに強力なインスリン増感剤であるグリタゾン又はチアゾリジネジオン（ＴＺＤ）などの物質を用いて２型糖尿病を治療する、化学的治療法の早期の適用を回避することができる。最後に、これらの化学的治療法が失敗し始めた後で、これにインスリン注射を併用するか、又はインスリン注射を２型糖尿病の単一の治療として用いる。
【００１６】
しかし、すべての患者が初期の治療的試みに対して同様に反応するわけではない。身体活動、特別の食事、及び体重減量から利益を得ない患者もいるが、利益を得る患者もいる。この差の理由は不明であり、どのＩＧＴ患者が身体活動の増加、食事、及び体重減量から利益を得るかを層別化又は予測する、信頼できる診断法は現在のところ得られていない。こうした診断法であれば、この治療戦略に対して最も有望な患者を同定する価値が高いであろう。同時に、予測結果が陽性であれば、他の方法では達成の困難な、身体活動及び食事に関する自身の生活の変更に対する患者の遵守を高度に改善する可能性が最も高いであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本出願は、耐糖能異常などの２型糖尿病プリフォームの検出を可能とし、この目的に利用可能な現在の診断法（経口ブドウ糖負荷試験）に代替することのできる新規の方法を提供する。
【００１８】
加えて、患者が、身体活動の増加、特別な食事、及び体重減量から利益を得られるかどうか、又は患者がインスリン増感剤などの薬剤での治療を直接に開始すべきであるかどうかを決定するに際し、患者を予測又は層別化する方法を開示する。
【００１９】
さらに、本出願は、個体が２型糖尿病又は２型糖尿病プリフォームを発症する可能性が高いかどうか、又は個体が過去に２型糖尿病プリフォームに中程度に罹患した場合、この患者がこうした２型糖尿病プリフォームを再発する危険性が増大するかどうかを予測する方法を提供する。後者は、これらの患者に対する緊密なモニタリングにより、２型糖尿病プリフォームを再発するかどうかを迅速に観察することを可能にし、これによって、認知されず対処されない２型糖尿病プリフォームの結果としての合併症を回避する。これらの診断法に加えて、これらの方法にバイオマーカーとして適するペプチド、試験キット、及びこれらのバイオマーカーを認識する抗体を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明及びその各種の実施形態は、１）耐糖能異常のスクリーニング及び／又は耐糖能異常のサブグループの診断を可能とする新規のペプチドバイオマーカーの同定、２）正常な耐糖能から耐糖能異常への進行に対する予測因子を見出すこと、及び３）ライフスタイルの変化に反応する予測因子を見出すことを対象とする。
【００２１】
本発明及び各種の実施形態はさらに、耐糖能異常など、代謝性障害、特に２型糖尿病、又はインスリン欠損と関連する他の病態若しくは疾患の前形成状態の診断、予後予測、及び層別化の方法を対象とする。単独又は併用で２型糖尿病プリフォームの診断、予後予測、又は層別化を可能とするペプチド。
【００２２】
本出願は、本発明の方法及びバイオマーカーに従って用いる試験キットをも企図する。
【００２３】
以下に添付する説明において、本発明の１つ又は複数の実施形態の詳細を示す。本発明の実施又は試験では、本明細書に記載の方法及び材料と類似又は同等の任意の方法及び材料を用いることができるが、好ましい方法及び材料をここに記載する。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、その説明から明らかであろう。本明細書及び添付の特許請求の範囲において、単一の形態は、文脈が別段に明示しない限り、複数の形態をも含む。別段に定義しない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者により通常に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書に引用するすべての特許及び刊行物を、参照により本明細書に組み込む。
【００２４】
本発明は、添付図を参照することにより、よりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】試料解析の図式を示す図である。
【図２】図１の試料の測定値のグループであって、解析中に比較したグループを示す表である。
【図３】本発明の様々な実施形態に従って用いるペプチドを収載する表である。
【図４】２型糖尿病プリフォームを判定するマーカーパネルとして適するペプチドの組合せを収載する表である。
【図５】個体が２型糖尿病プリフォームの改善に関する身体運動及び／又は食事による介入から利益を得るかどうかを判定する個体の層別化のためのマーカーパネルとして適するペプチドの組合せを収載する表である。
【図６】開示された方法に従って用いる２８８個のペプチドを収載する表である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本明細書で用いる「個体」又は「対象」又は「生物」という用語は、治療若しくは予防を必要とするか、又は本明細書に記載の病態若しくは疾患に罹患すると推定される個体又は対象又は生物を、本明細書の全体において互換的に指す。対象又は個体又は生物は、脊椎動物であることが好ましく、哺乳類、特にヒトであることがより好ましい。
【００２７】
本発明の実施形態による方法は、個体に由来する試料を用いるステップと、当業者に知られる適切な手段及び手順を用いて、本発明に従う少なくとも１つのタンパク質若しくはペプチド又はその修飾形態の量をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて測定するステップとにより実施することが好ましい。
【００２８】
図１では、７つの大ボックスのそれぞれが、試料グループを表す。「ＮＧＴ」と標識したボックスは、経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）による測定で、正常な耐糖能を有する試料を表す。「ＩＧＴ」と標識したボックスは、経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）による測定で、耐糖能異常を有する試料を表す。中段の２つのボックスは、試験開始（ｔ０、ベースライン）時において分析した試料を表し、下段の４つのボックスは、１２カ月後の試験終了（ｔ１２、追跡）時に測定した試料を表す。「ベースライン」とは、ライフスタイル介入試験以前に測定したペプチドのシグナルを意味し、「追跡」とは、ライフスタイル介入試験以後に測定したペプチドのシグナルを意味する。中段の２つのボックスは、下半分において、各々が、これもまたＮＧＴ及びＩＧＴで標識した２つの「サブボックス」に分かれる。これらのサブボックスは、試験開始時ｔ０における試料であって、将来試験終了時ｔ１２においてＮＧＴ試料又はＩＧＴ試料となる試料を表す。小文字ａ、ａ１、ａ２、ｂ、ｂ１、ｂ２、ｃ、ｄ、ｅ、及びｆを付したグレーの小ボックスは、試料の各グループの標識であり、これが、図２に対応し、どのグループのどの測定値を分析において比較したのかを示す。グループ「ａ」は、グループ「ａ１」と「ａ２」との和に等しく、グループ「ｂ」は、グループ「ｂ１」と「ｂ２」との和に等しい。
【００２９】
図２は、データ解析中に相互に比較した試料の異なるグループ（ａ、ｂ、ａ１、ａ２、ｂ１、・・・）を表し、その結果としてペプチドグループ（グループＩ、ＩＩ、及びＩＩＩ）が得られ、これらのグループが、「食事及び身体運動による介入」の有益性の判定、２型糖尿病プリフォームの判定、及び２型糖尿病プリフォームの予後予測に適するペプチドを表す。加えて、グループＩ、ＩＩ、及びＩＩＩのサブグループを示す（Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｄ１、・・・）。
【００３０】
図３は、本発明の各種の実施形態に従うペプチド及び各々のシグナルＩＤを番号順に収載する。シグナルＩＤとは、対応するペプチドが、分画３６（Ｆ０３６．）で同定され、該ペプチドが、２５９１．５ドルトンの分子量を有することを示す。質量決定の精度が±１ドルトンであることに注意する。これらのデータは、本発明書で以下に記載の実施例の説明とともに、その配列が今まで知られておらず、このために図３の表の右端の欄に収載されない場合であっても、前記ペプチドを正確に同定する。さらに、図３中の表は、「グループ番号」と称する欄において、各ペプチドが属するペプチドの１つ又は複数のグループを収載する。本特許出願の特許請求の範囲においては、これらのグループを参照する。図３中の表は、図１に示し、本記載の後出において説明するＡ１、Ａ２、Ａ３など、グループＩ、ＩＩ、及びＩＩＩのサブグループをも収載する。「エンドポイントマーカー」及び「パネルに対する適性」と称する欄は、ペプチドバイオマーカーが有用である測定の１つ又は複数の種類を示す。
【００３１】
図３中の表で用いる「有益性」という用語は、このペプチドの測定が、個体が２型糖尿病プリフォームの改善に関する身体運動及び／又は食事による介入から利益を得るかどうかを判定する個体の層別化に適することを示す。「ＯＧＧＴ」又は「ＩＧＴ」は、このペプチドの測定が、経口ブドウ糖負荷試験又は２型糖尿病プリフォームを診断するための別の診断法に代替する又はこれを補完するのに適することを示す。
【００３２】
図３中の表と関連して用いる「診断」という用語は、特定のペプチドの測定が、経口ブドウ糖負荷試験又は２型糖尿病プリフォーム、特に、ＩＧＴを診断するための別の診断法に代替する又はこれを補完するのに適することを示す。
【００３３】
図３で用いる「予後予測」という用語は、特定のペプチドの測定が、２型糖尿病プリフォームを発症する及び／又は２型糖尿病を発症する危険性が高い遺伝的な素因を有するか、又は過去に２型糖尿病プリフォームに罹患した及び／又は２型糖尿病に罹患した可能性が高い個体を検出するのに適することを示す。２型糖尿病プリフォームにかつて罹患したがもはや罹患しない、及び／又は２型糖尿病に罹患した個体は、その体内に一定の不可逆的な変化を蒙る可能性があり、この不可逆的な変化が、その体内のペプチド量の変化により反映される可能性があることを仮定する。これらの個体は、２型糖尿病プリフォームを再発する、及び／又は２型糖尿病を再発する可能性が高いことをさらに仮定する。結果として、「予後予測」に分類されたペプチドは、２型糖尿病プリフォーム及び／又は２型糖尿病に罹患することに関する個体の予後予測に適しうる。
【００３４】
図３中の「調節」と称する欄は、個体が２型糖尿病プリフォーム及び／又は２型糖尿病に罹患しつつある、又は罹患する可能性が高い、又は過去に罹患した可能性が高い場合に、前記個体において特定のペプチド量がどちらの方向に変化するのかを示す。ペプチド量の変化の方向（増加又は減少）は、２型糖尿病プリフォーム及び／又は２型糖尿病、特に、ＩＧＴに罹患する、又は罹患する可能性が高い、又は過去に罹患した可能性が高い個体の群のいずれの１つにも属さない個体における同一のペプチド量と比べて計算する。
【００３５】
図３において、「前駆体の名称」と称する欄は、該ペプチドが由来するタンパク質の名称を示す。「配列」と称する欄は、１文字のアミノ酸コードで記した該ペプチドのアミノ酸配列を列挙し、「分子と配列位置」と称する欄は、該タンパク質の省略名を提示し、該ペプチドの由来及び前記タンパク質内における該ペプチドのアミノ酸配列位置を示す。さらに、「修飾」と称する欄は、前記ペプチド中で同定されるか、又は質量分析検査により前記ペプチド中に存在する可能性が高い修飾を示す。
【００３６】
図４は、２型糖尿病プリフォームの「マーカー」として役立ち、マーカーパネルを提供するのに適する他のペプチドマーカーと組み合わせる、本明細書に開示のペプチドの組合せを収載する。
【００３７】
図５では、個体が２型糖尿病プリフォームの改善に関する身体運動及び／又は食事による介入から利益を得るかどうかを判定する、個体の層別化のためのマーカーパネルとして適するペプチドの組合せを収載する。図５の左側の欄は、「マーカーパネルに適するマーカー」と称する欄における任意の１つのペプチドと組み合わせてマーカーパネルを作製することのできるペプチド（図３中の表に従う「シグナルＩＤ」により示す）を収載する。
【００３８】
グループＩ、ＩＩ、及び／又はＩＩＩのペプチドと組み合わせる、図４及び５のペプチドを、特許請求の範囲では「追加のペプチドマーカー」と呼ぶ。
【００３９】
図６は、本明細書に記載の現在の方法により用い、及び／又は調べ、若しくは同定する２８８のペプチドを収載する。図６のペプチドはすべて、サブグループＡ１、Ａ２、又はＡ３に属するペプチドを表す。これらのペプチドの一部は、図３にも収載する。
【００４０】
２型糖尿病プリフォームの診断
図３中の表に示す通り、一実施形態に従うグループＩのペプチドは、２型糖尿病プリフォームの診断において役割を果たすペプチドを含む。グループＩのペプチドは、Ｆ０６７．４１８１．５、Ｆ０６７．２４４０．５、Ｆ０２４．１１６１．５、Ｆ０３４．２００８．５、Ｆ０２９．１７３６．５、Ｆ０６６．４３９０．５、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０７３．１１２２．５、Ｆ０７５．４３９９．５、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０３３．１２１０．５、Ｆ０７５．４３４２．５、Ｆ０７５．３４７４．５、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０６８．３８４１．５、Ｆ０７５．３９８８．５、Ｆ０３４．２６３８．５を含む。
【００４１】
第１の実施形態では、個体における２型糖尿病プリフォームの存在又は不在を検出する方法であって、
ａ）個体の試料中における、Ｆ０６７．４１８１．５、Ｆ０６７．２４４０．５、Ｆ０２４．１１６１．５、Ｆ０３４．２００８．５、Ｆ０２９．１７３６．５、Ｆ０６６．４３９０．５、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０７３．１１２２．５、Ｆ０７５．４３９９．５、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０３３．１２１０．５、Ｆ０７５．４３４２．５、Ｆ０７５．３４７４．５、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０６８．３８４１．５、Ｆ０７５．３９８８．５、Ｆ０３４．２６３８．５からなる群（グループＩ）から選択される少なくとも１つのペプチド、又はその修飾形態の量を測定するステップと、
ｂ）ａ）の結果を、対照試料を使用して、又は既知の基準値を用いて決定した結果と比較するステップと、
ｃ）前記個体における前記２型糖尿病プリフォームの存在又は不在を判定するステップと
を含む方法を記載する。
【００４２】
前記方法は、グループＩの少なくとも１つ若しくは２つのペプチド、又はその修飾形態の量を測定することを特徴とすることが好ましい。
【００４３】
その方法は、グループＩから選択される少なくとも１つのペプチド又はその修飾形態、及びグループＩの対応するペプチドと組み合わせてペプチドマーカーパネル又はその修飾形態を形成する、図４中のペプチドから選択される少なくとも１つの追加のペプチドの量を測定することを特徴とすることが好ましい。
【００４４】
好ましい実施形態において、その方法は、グループＩの少なくとも２つのペプチド又はその修飾形態の量を測定することを特徴とする。さらに、その方法は、グループＩの少なくとも１つのペプチド又はその修飾形態の量が、２型糖尿病プリフォームを有する前記個体において増大することを特徴とする。
【００４５】
別の実施形態において、その方法は、グループＩの少なくとも１つのペプチド又はその修飾形態の量が、２型糖尿病プリフォームを有する前記個体において減少するか又は不在であることを特徴とする。例えば、本方法は、グループＩの対応するペプチドと組み合わせてペプチドマーカーパネルを形成する、図４中のペプチドから選択される少なくとも１つのペプチド、又は図４中のこれらのペプチドの修飾形態の量が、２型糖尿病プリフォームを有する前記個体において増加することを特徴とする。或いは、その方法は、グループＩの対応するペプチドと組み合わせてペプチドマーカーパネルを形成する、図４中のペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのペプチド、又は図４中のこれらのペプチドの修飾形態の量が、２型糖尿病プリフォームを有する前記個体において減少するか又は不在であることを特徴とする。
【００４６】
食事及び運動療法の成功に対する予後予測
別の好ましい実施形態において、本方法は、食事及び／又は運動（身体運動）レジメンを含む治療法の有用性を判定する、２型糖尿病プリフォームに罹患した個体の層別化に関する。この方法は、図３に示す少なくとも１つのグループＩＩペプチドの量の検出及び決定を含む。具体的には、グループＩＩペプチドは、ペプチドＦ０３６．２５９１．５、Ｆ０４６．４８７４．５、Ｆ０７６．４７５８．５、Ｆ０４６．４７４５．５、Ｆ０３５．２６１５．５、Ｆ０４１．１９０６．５、Ｆ０４６．４９０１．５、Ｆ０４６．４８７４．５、Ｆ０４６．１６９０．５、Ｆ０５０．２１９９．５、Ｆ０３１．１８２０を含む。
【００４７】
より具体的には、この代替の好ましい実施形態に従う方法は、
ａ）個体の試料中における、Ｆ０３６．２５９１．５、Ｆ０４６．４８７４．５、Ｆ０７６．４７５８．５、Ｆ０４６．４７４５．５、Ｆ０３５．２６１５．５、Ｆ０４１．１９０６．５、Ｆ０４６．４９０１．５、Ｆ０４６．４８７４．５、Ｆ０４６．１６９０．５、Ｆ０５０．２１９９．５、Ｆ０３１．１８２０からなる群（グループＩＩ）から選択される少なくとも１つのペプチド、又はその修飾形態の量を測定するステップと、
ｂ）ａ）の結果を、対照試料を使用して、又は既知の基準値を用いて決定した結果と比較するステップと、
ｃ）前記個体に対する前記治療法の有用性を判定するステップと
を含む。
【００４８】
前記方法は、グループＩＩの少なくとも１つ若しくは少なくとも２つのペプチド、又はその修飾形態の量を測定することを特徴とすることが好ましい。例えば、該方法では、グループＩＩのペプチド又はその修飾形態の量が、２型糖尿病プリフォームを有する前記個体において増加する。或いは、グループＩＩの少なくとも１つのペプチド又はその修飾形態の量が、２型糖尿病プリフォームを有する前記個体において減少するか不在である。
【００４９】
例えば、上述の方法は、グループＩＩから選択される少なくとも１つのペプチド又はその修飾形態、及びグループＩＩの対応するペプチドと組み合わせてペプチドマーカーパネル又はその修飾形態を形成する図６中のペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのペプチドの量を測定することを特徴とする。さらなる実施形態において、その方法は、グループＩＩの少なくとも２つのペプチドの量を測定することを特徴とする。
【００５０】
さらに、その方法は、グループＩＩの対応するペプチドと組み合わせてペプチドマーカーパネルを形成する、図５中のペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのペプチド、又は図５中のこれらのペプチドの修飾形態の量が、２型糖尿病プリフォームを有する前記個体において増大することを検出するステップに関する。グループＩＩの対応するペプチドと組み合わせてペプチドマーカーパネルを形成するペプチド、図５中のペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのペプチド、又は図５中のこれらのペプチドの修飾形態の量が、２型糖尿病プリフォームを有する前記個体において減少する又は不在であることが好ましい。
【００５１】
２型糖尿病プリフォーム又は２型糖尿病の予後予測
さらに好ましい実施形態において、個体が２型糖尿病プリフォームに罹患する予後の判定法を提供する。この方法は、図３に示す通り、少なくとも１つのグループＩＩＩペプチドの量の検出及び決定を含む。具体的には、グループＩＩＩペプチドは、ペプチドＦ０６６．４３９０．５、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０７３．１１２２．５、Ｆ０６６．２８４３．５、Ｆ０６６．２８０４．５、Ｆ０６４．２７８９．５、Ｆ０６４．３０２０、Ｆ０６６．１３９４．５、Ｆ０１８．２０６９．５、Ｆ０３４．１８７０．５、Ｆ０３９．２１５８．５、Ｆ０４６．４９０１．５、Ｆ０６８．５１７１．５、Ｆ０６６．２８５１．５、Ｆ０６６．４３９０．５、Ｆ０２５．２９６６．５、Ｆ０６８．７９６０．５、Ｆ０７６．４７５８．５、Ｆ０２４．１４６３．５、Ｆ０２１．２３７８．５、Ｆ０２４．１７５３．５、Ｆ０６８．７６６５．５を含む。
【００５２】
より具体的には、個体が２型糖尿病プリフォームに罹患する予後の判定法は、
ａ）個体の試料中における、Ｆ０６６．４３９０．５、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０７３．１１２２．５、Ｆ０６６．２８４３．５、Ｆ０６６．２８０４、Ｆ０６４．２７８９．５、Ｆ０６４．３０２０、Ｆ０６６．１３９４．５、Ｆ０１８．２０６９．５、Ｆ０３４．１８７０．５、Ｆ０３９．２１５８．５、Ｆ０４６．４９０１．５、Ｆ０６８．５１７１．５、Ｆ０６６．２８５１．５、Ｆ０６６．４３９０．５、Ｆ０２５．２９６６．５、Ｆ０６８．７９６０．５、Ｆ０７６．４７５８．５、Ｆ０２４．１４６３．５、Ｆ０２１．２３７８．５、Ｆ０２４．１７５３．５、Ｆ０６８．７６６５からなる群（グループＩＩＩ）から選択される少なくとも１つのペプチド、又はその修飾形態の量を測定するステップと、
ｂ）ａ）の結果を、対照試料を使用して、又は既知の基準値を用いて決定した結果と比較するステップと、
ｃ）前記個体における２型糖尿病プリフォームの存在又は不在を判定するステップと
を含む。
【００５３】
前記方法は、グループＩＩＩの少なくとも１つ若しくは２つのペプチド又はその修飾形態の量を測定することを特徴とすることが好ましい。さらに、該方法は、２型糖尿病プリフォームを有する前記個体において増大する、グループＩＩＩの少なくとも１つのペプチド又はその修飾形態の量を測定することが好ましい。別の実施形態では、２型糖尿病プリフォームを有する前記個体において、グループＩＩＩのペプチド又はその修飾形態の量が減少する又は不在である。前述の方法は、２型糖尿病プリフォームが、耐糖能異常（ＩＧＴ）であることを特徴とすることが好ましい。
【００５４】
その方法は、全血、血漿、血清、尿、脂肪組織及び肝組織を含みうる試料を用いて行ってよい。加えて、該ペプチドは、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定）法、ＲＩＡ法（ラジオイムノアッセイ）、ウェスタンブロット法、プロテインチップ法、質量分析法、免疫組織学法、フローサイトメトリー法などの１つ若しくは複数の方法、又は分子生物学的方法により決定する。
【００５５】
別の実施形態は、グループＩ、ＩＩ、若しくはＩＩＩの任意の１つの分子であるペプチド又はその修飾形態に関する。該ペプチドは、図３の表に示す配列を有することが好ましい。
【００５６】
本出願は、記載した実施形態に従うペプチドのネオエピトープに特異的に結合し、ペプチド自体が由来するタンパク質には結合しない抗体をさらに開示する。
【００５７】
加えて、
ａ）本発明に従うペプチド；並びに／又は
ｂ）本明細書に記載の抗体若しくは前記抗体の断片；及び
ｃ）本明細書に記載の実施形態に従う方法に前記試験キットをどのように用いるかについての説明書
を含む試験キットを提供する。
【００５８】
最後に、別の実施形態に従って、本明細書に記載の実施形態に従う試験キットの製造のための、
ａ）上述のペプチド；及び／又は
ｂ）本明細書において特許請求に係る抗体若しくは前記抗体の断片
の使用を開示する。
【００５９】
個体における２型糖尿病プリフォームの診断のための、場合によってはグループＩの対応するペプチドと組み合わせてペプチドマーカーパネルを作製する図４に収載の少なくとも１つのペプチド又は図４中のこれらのペプチドの修飾形態と組み合わせた、グループＩの少なくとも１つのペプチド又はその修飾形態の使用について特許請求することが好ましい。
【００６０】
或いは、２型糖尿病プリフォームの改善に関する若しくは２型糖尿病の改善に関する身体運動及び／又は食事による介入から利益を得る個体の層別化のための場合によってはグループＩＩの対応するペプチドと組み合わせてペプチドマーカーパネルを作製する図５に収載の少なくとも１つのペプチド又は図５中のこれらのペプチドの修飾形態と組み合わせた、グループＩＩの少なくとも１つのペプチド又はその修飾形態の使用について特許請求する。さらに、本出願は、２型糖尿病プリフォームに罹患する可能性の高い個体の予後予測のための、グループＩＩＩの少なくとも１つのペプチド又はその修飾形態の使用に関する。
【００６１】
好ましい実施形態において、本発明に従う使用は、ＩＧＴの予後予測、診断、又は層別化への使用である。
【００６２】
本明細書に記載の方法及びペプチドは、本明細書に記載し、図３に示す少なくとも２つの異なるペプチド又はその修飾形態を用いて、個体のペプチド若しくはタンパク質パターン又はパネル（例えば、それぞれ、図４及び５を参照のこと）を決定することにより、前記個体における本明細書に記載の病態をモニターするのに特に有用である。ＭＳ−ＴＯＦ法又はＣＥ−ＭＳ法、ＳＥＬＤＩ法（表面増強レーザー脱離イオン化法）など、当業者に知られた通例の機器を用いることができる。
【００６３】
以下の定義は、本出願全体において頻用される特定の用語の理解を容易にする目的で提示する。
【００６４】
ペプチド
本明細書で用いる「ペプチド」は、リン酸基、炭水化物基、又は脂質部分などの翻訳後修飾を含むタンパク質を含む、天然に存在するすべての種類のタンパク質の断片でありうる。遺伝子コードがコードする標準的な２０種類のアミノ酸のセットとは異なるアミノ酸を含むペプチドをも含む。試料は、全血、血清、血漿若しくは尿、残余の血液細胞を含む血清、血小板、赤血球、白血球など残余の血液細胞、又は試料が由来する個体に感染した微生物を含む血漿であることが好ましい。個体は、ヒト、哺乳類、げっ歯類、霊長類、マウス若しくはラット又は別の実験動物であることが好ましい。
【００６５】
本明細書で用いる「ペプチド」という用語は、ペプチド結合により共有結合した２以上、好ましくは３以上、好ましくは４以上、好ましくは６以上、好ましくは８以上、好ましくは１０以上、好ましくは１３以上、好ましくは１６以上、好ましくは２１以上のアミノ酸からなる物質を指す。「タンパク質」という用語は、大きなペプチド、好ましくは少なくとも１６０アミノ酸を有するペプチドを指すが、一般に、「ペプチド」という用語と「タンパク質」という用語とは同意語であり、本出願においては同意語として用いる。本発明に従う「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸を含む物質のみでなく、非アミノ酸成分を含む物質をも含み、ペプチド結合のみを含む物質のほか、他の結合、例えば、エステル結合、チオエーテル結合、又はジスルフィド結合をも含む物質を含む。
【００６６】
修飾ペプチド
本明細書で用いるペプチドの「修飾形態」は、翻訳後修飾、化学修飾、酵素修飾による修飾、及び他の機構による修飾などの修飾を含むペプチドを含む。可能な修飾の例は、グリコシル化、リン酸化、硫酸化、ピログルタミン酸修飾、システイン−ジスルフィド架橋、メチル化、アセチル化、アシル化、ファルネシル化、ホルミル化、ゲラニルゲラニル化、ビオチニル化、ステアロイル化、パルミチル化、リポイル化、Ｃ−マンノーシル化、ミリストイル化、アミド化、脱アミド化、メチル化、脱メチル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、酸化、ＰＥＧ化、プレニル化、ＡＤＰ−リボシル化、脂質付加、ホスファチジルイノシトール付加、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー付加、リン酸ピリドキサール付加、カルボキシアミドメチルシステインをもたらすシステイン残基修飾、カルボキシメチルシステインをもたらすシステイン残基修飾、ピリジルエチルシステインをもたらすシステイン残基修飾、リポ酸をもたらすリシン残基修飾、ピログルタミン酸をもたらすグルタミン酸修飾などを含むがこれに限定されない。
【００６７】
本発明の実施形態に従うペプチドの修飾形態は、アルファアミノブチル酸、ベータアミノブチル酸、ベータアミノイソブチル酸、ベータアラニン、ガンマブチル酸、アルファアミノアジピン酸、４−アミノ安息香酸、アミノエチルシステイン、アルファアミノペニシラン酸、アリシン、４−カルボキシグルタミン酸、シスタチオニン、カルボキシグルタミン酸、カルボキシアミドメチルシステイン、カルボキシメチルシステイン、システイン酸、シトルリン、デヒドロアラニン、ジアミノブチル酸、デヒドロアミノ−２−ブチル酸、エチオニン、グリシン−プロリンジペプチド、４−ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシン、ヒドロキシプロリン、ホモセリン、ホモシステイン、ヒスタミン、イソバレイン、リシノアラニン、ランチオニン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、２−ピピリジン−カルボキシル酸、ピログルタミン酸、ピロリシン、プロリン−ヒドロキシプロリンジペプチド、サルコシン、４−セレノシステイン、シンデシン、チオプロリンなどを含むがこれに限定されない、まれなアミノ酸、化学的若しくは酵素的に修飾されたアミノ酸などを含んでよい。さらなる例は、ＡＢＲＦ「分子生物資源機関会議」のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｂｒｆ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｃｆｍ／ｄｍ．ｈｏｍｅ？ＡｖｇＭａｓｓ＜：＞＝ａｌｌ）で検索可能なデータベース「Ｄｅｌｔａ  Ｍａｓｓ」などのデータベース中に見出すことができる。
【００６８】
加えて、本発明に従うペプチドの修飾形態は、１つ又は複数のアミノ酸残基の変化、１つ又は複数のアミノ酸残基の欠失、及び１つ又は複数のアミノ酸残基の挿入（ペプチド若しくはタンパク質の突然変異体又はその多型形態）を含みうるアミノ酸配列における差異を特徴とする。
【００６９】
ペプチド及び／又はタンパク質の多型形態とは、天然に存在する突然変異又は分子生物学、遺伝学、若しくは化学（核酸又はペプチド合成）などの技術を用いる実験的若しくは無作為的な配列の操作により生じる突然変異による配列の変異を意味する。さらに、ペプチド及び／又はタンパク質の多型形態は、配列アライメントにより判定する通り、相互に好ましくは７０％の配列同一性、好ましくは７５％、好ましくは８０％、好ましくは８５％、好ましくは９０％、好ましくは９５％、好ましくは９７％、及び好ましくは９９％の配列同一性を有する。２つの配列の配列アライメント内においてアミノ酸残基又はヌクレオチドが同一の配列位置におかれる場合、このアミノ酸又はヌクレオチドをこれら２つの配列において同一であるとみなす。例えば、第１の架空の配列「ＡＣＤＥＦ」と、「Ｄ」が欠失した第２の架空の配列「ＡＣＥＦ」とを整列する場合、第２の配列の「Ｆ」と「Ｈ」との間にギャップを挿入する結果として「ＡＣ−ＥＦ」が生じ、これにより、第２の配列の第１の配列に対するより良好なアライメントが可能となる。結果として生じるアライメントにおいては、５つの配列位置のうち４つが、同一のアミノ酸残基により占められる結果として、第１の配列の第２の配列に対する８０％の配列同一性を生じる。配列アライメントをどのように計算するかという方法は、本明細書の以下において記載する。
【００７０】
一般に、「修飾ペプチド」又は「ペプチドの修飾形態」という用語は、天然に見出される該ペプチドのすべての種類の修飾を含む。加えて、「修飾ペプチド」という用語は、天然に見出されるペプチドに存在しうる修飾であって、試料を分析又は測定する、例えば、質量分析又は他の適切な方法により該ペプチドを測定する過程以前又は該過程中において、これらのペプチドを含むこれらの試料を保存及び／又は操作することから生じるすべての種類の修飾を含む。試料の保存及び／又は操作の結果として生じるこうした修飾の例は、酸化ペプチドである。
【００７１】
２型糖尿病プリフォーム
糖尿病の「前形成状態」とは、耐糖能異常（ＩＧＴ）、空腹時血糖異常（ＩＦＧ）、境界型糖尿病、無症状糖尿病、インスリン抵抗性など、２型糖尿病をもたらすと考えられる疾患又は病態を指す。
【００７２】
陰性対照試料
「陰性対照試料」とは、２型糖尿病プリフォーム又は２型糖尿病に罹患しない同一種の個体の試料である。陰性試料は、試料と同一の種類である、例えば、試料及び陰性試料ともに、血漿試料である、又はともに午前中に採取した尿試料である、又はともに生検により採取した脂肪組織試料などであることが好ましい。
【００７３】
基準値
「基準値」とは、診断法において決定する同一のマーカー又はペプチドの既知の値である。基準値は、試料の値を決定する前、決定すると同時、又は決定した後に決定することができる。
【００７４】
試料
本発明に従う「試料」とは、全血、血漿、血清、血液濾液、尿、脂肪組織、肝組織など、個体から得た生物学的材料である。試料は、個体から得た細胞であって、細胞自体又はこれら細胞から得た細胞培養物上清でありうる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて培養した細胞から試料を得る前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて培養していた細胞など、個体から間接に得た材料でもありうる。試料は、本発明の方法による分析前に前処理することもできる。こうした前処理は、例えば、室温、４℃、０℃、−２０℃、−７０℃、−８０℃、若しくは他の温度などの各温度における試料の保存、又は水氷若しくはドライアイス上での保存、又は液体窒素中における保存、或いは他の固体媒質、液体媒質、又は気体媒質中での保存でありうる。とりわけ、さらなる前処理は、１、３、５、３０、５０、１００、１５０、３００、又は１０００ｋＤａの分子分画値によることが好ましい限外濾過などの試料の濾過、塩、エタノール又は他のアルコール、アセトンなどの有機溶媒を用いる試料の沈析、クロマトグラフィー、液相抽出、固相抽出などの方法を用いる試料の亜分画への分離、抗体、抗体断片、又は試料成分に結合する他の物質を用いる免疫沈降反応である。とりわけ、クロマトグラフィー法は、限外クロマトグラフィー、陰イオンクロマトグラフィー又は陽イオンクロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、キャピラリークロマトグラフィーなどであり、逆相クロマトグラフィーが好ましい。亜分画への分離により試料を前処理する場合、個々の、一部の、又はすべての分画及び／又は流動物及び／又はクロマトグラフィー媒質上に残った任意の物質を、試料のさらなる分析に用いてよい。
【００７５】
量
「量」という用語は、ペプチドの絶対量又は、例えば、陰性試料中の同一のペプチドと比べた、若しくは同一のペプチドの基準値と比べたペプチドの相対量について述べる。相対的とは、モル又はｍｇ／リットルなどの明確な量を明示することではなく、例えば、該試料が、基準試料又は基準値と比べて、より多い量の、より少ない量の、又は同一量の特定ペプチドを含むことを明示することを意味する。この状況における「より多い量、より少ない量、又は同一量」という用語は、測定単位が明示されさえすれば、吸光値、減衰係数、質量分析シグナル強度、ウェスタンブロット法の濃度測定値、又は該ペプチドの絶対量に変換されない他の種類の測定値などをも含む。
【００７６】
減少した又は不在である
本発明に従う「減少した」は、試料中にペプチドが、別の試料と比べて、又は対照試料と比べて、又は陰性対照試料と比べて、又は、これらの測定値が相対測定値であるか若しくは絶対測定値であるかにかかわらず、基準値と比べて、より低量（ｓｍａｌｌｅｒ  ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ，  ｏｒ  ａｍｏｕｎｔｓ）又はより低濃度において存在することを意味する。本発明に従う「不在である」とは、ペプチドが試料中に全く存在しないこと、又はペプチドが試料中に一定量（ａ  ｑｕａｎｔｉｔｙ，  ｏｒ  ａｍｏｕｎｔ）又は一定濃度において存在するが、その量又は濃度が、前記ペプチドを検出又は測定するのに用いる試験系の検出限界未満であることを意味する。減少したペプチドは、一定の濃度又は量において存在し、比較対象の値を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％、又は少なくとも１０００％超下回ることが好ましい。
【００７７】
増加した又は存在する
「増加した」とは、試料中にペプチドが、別の試料と比べて、又は対照試料と比べて、又は陰性対照試料と比べて、又は、これらの測定値が相対測定値であるか若しくは絶対測定値であるかにかかわらず、基準値と比べて、より高量（ｈｉｇｈｅｒ  ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ，  ｏｒ  ａｍｏｕｎｔｓ）又はより高濃度において「存在する」ことを意味する。増加したペプチドは、一定の濃度又は量において存在し、比較対象の値を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％、又は少なくとも１０００％超上回ることが好ましい。
【００７８】
試料を分析するのに適する方法
一般に、試料中に存在するペプチドを検出及び分析するのに適するすべての方法を、開示の方法において用いることができ、本発明のペプチド、核酸及び断片、誘導体の存在、不在、又は量を測定するのに用いることができる。好ましくは、質量分析法、プロテインチップアッセイ、免疫学及び分子生物学の方法を用いうる。
【００７９】
とりわけ、適切な質量分析法は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法、連続的又はパルス状のエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法、及びイオンスプレー法若しくはサーモスプレー法若しくはマッシブクラスター衝撃（ＭＣＩ）法などの関連する方法でありうる。イオン供給源は、リニア反射型又は非リニア反射型の飛行時間（ＴＯＦ）法、単独又は多重の四重極法、単独又は多重の磁場法、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴＩＣＲ）法、イオントラップ法、及びこれらの組合せ、例えば、イオントラップ／飛行時間法を含む検出形式と適合させることができる。イオン化では、多数のマトリックス／波長の組合せ（ＭＡＬＤＩ）又は溶媒の組合せ（ＥＳＩ）を用いることができる。他の適切な質量分析法は、例えば、高速原子衝撃（ＦＡＢ）質量分析法、表面増強レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）質量分析法、同位体コード親和性タグ（ＩＣＡＴ）質量分析法、又は親和性質量分析法である。
【００８０】
さらに、適切な免疫学的方法は、とりわけ、酵素結合免疫測定（ＥＬＩＳＡ）法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法、直接ＥＬＩＳＡ法、間接ＥＬＩＳＡ法、競合ＥＬＩＳＡ法、酵素結合免疫スポット測定（ＥＬＩＳＰＯＴ）法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ法）、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ＝蛍光活性化細胞選別）法、免疫組織化学法、ウェスタンブロット法、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）法、例えば、開示のペプチドに対して特異的な抗体、抗体断片、受容体、リガンド、又は他の結合作用物質を用いるプロテインチップ法である。
【００８１】
食事及び／又は身体運動を含む治療
本明細書で用いる「食事及び／又は身体運動を含む治療」という表現は、２型糖尿病プリフォームを予防、治癒、若しくは改善するための治療戦略及び／又は２型糖尿病を予防、治癒、若しくは改善するための治療戦略を指す。２型糖尿病プリフォームの改善、又は２型糖尿病の改善とは、個体が、食事及び／又は身体運動により、２型糖尿病プリフォームを治療する又は２型糖尿病を治療するのにもはや薬剤を必要としない、或いはより少量の薬剤及び／又はより低用量の薬剤及び／又はより低投与回数の薬剤、及び／又は「より弱い薬剤」のみを必要とすることを意味する。「より弱い薬剤」とは、例えば、２型糖尿病プリフォームを治療するのに用いるのが通例である、又は２型糖尿病を治療するのには用いない若しくは他の薬剤との併用でのみ用いる薬剤を意味する。例えば、インスリン注射と比べて「弱い薬剤」は、化学療法剤である。
【００８２】
予後予測
「予後予測」とは、個体が、２型糖尿病プリフォーム又は２型糖尿病などの病態を発症する可能性が高いかどうかを予測することを目的とする。予後予測は、個体が将来においてこうした病態に罹患する可能性が高いこと、又は個体が将来においてこうした病態に罹患する可能性が低いこと、又は個体が過去においてこうした病態に罹患した可能性が高いこと、又は個体が過去においてこうした病態に罹患した可能性が低いことでありうる。
【００８３】
ネオエピトープ
「ネオエピトープ」とは、その抗原にいまだ結合している抗体又は抗体断片が認識する抗原のエピトープであって、タンパク質の断片である特定のペプチド中のみにおいて存在し、完全なタンパク質中には存在しないエピトープである。
【００８４】
抗体
「抗体」は、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ウサギ、畜牛、ブタ、ヤギ、ヒツジなど、すべての種の抗体、血清、血漿、卵子など、天然において見出される材料に由来する抗体、分子生物学又は遺伝子組換え技術を用いて作製した抗体、例えば、マウスなど異なる種の抗体に由来する抗体の抗原結合部分以外の部分に限りヒトアミノ酸配列を含む、ヒト化抗体などのキメラ抗体を含むものとする。さらに、本発明には、抗体が依然その抗原に結合する限りにおけるＦａｂ、Ｆａｂ２、又は他の抗体断片などの抗体断片、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＹなどすべての抗体クラスの抗体、モノクローナル抗体、オリゴクローナル抗体（複数のモノクローナル抗体の混合物）、及びポリクローナル抗体、血漿、血清、組織培養物上清、腹水、細胞培養槽などの供給源から精製した又は非精製の又は部分精製の抗体、約１％、約５％、約１０％、約２０％、約５０％、約７５％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、９８％超の純度まで精製した抗体が含まれる。抗体は、目的の抗原に特異的な抗体のみを含むことができるか、又は加えて、例えば、非精製のポリクローナル抗血清若しくは非精製の抗体含有細胞培養物上清（抗体産生細胞を培養するのに用いる血清に由来することが通例である非特異的抗体）の場合が通例である、他の特異性を有する他の抗体を含むことができる。
【００８５】
試験キット
「試験キット」は、試験キットにより検出するペプチドと同一の精製した、又は部分精製の若しくは非精製のペプチドでありうる標準物質を含んでよい。さらに、試験キットは、陽性対照試料（試験中にシグナルを発する）及び陰性対照試料（シグナルを発しないか、又は予測される背景シグナルを示す）、抗体又は抗体断片又は酵素と結合した抗体などの結合作用物質、フルオロフォア、放射性物質、前記結合作用物質で被覆したマイクロタイタープレート、ＳＥＬＤＩチップ、プロテインチップ、ＢＩＡＣＯＲＥチップなどの表面、酵素基質、オリゴヌクレオチドプローブ、緩衝液、ペプチド標準物質、試験をどのように行うかの説明書などを含んでよい。
【００８６】
本発明の方法と他の診断法との併用
本発明の方法を他の診断法と併用して、診断の正確さ、信頼性、特異性などを改善してよい。例えば、本発明の方法を以下の１つ又は複数の診断法と併用することができる。肥満指数（ＢＭＩ）の判定、「ウエスト対ヒップ比」の判定、血圧の測定、「経口ブドウ糖負荷試験」の実施、磁気共鳴分光法などの方法を用いる肝脂肪含量の測定、以下の物質のいずれか１つの測定：Ｃペプチド（インスリンの断片）、インスリン、アディポネクチン、グリコシル化ヘモグロビン（Ｈｂａ１ｃとも呼ぶ）、並びにコレステロール及び／又は脂肪酸若しくは脂質の測定。
【００８７】
有益性
「有益性」という用語は、個体が２型糖尿病プリフォームの改善に関する身体運動及び／又は食事による介入から利益を得るかどうかを判定する、個体の層別化に適する特定のペプチドの測定に関して用いる。「ＯＧＧＴ」又はＩＧＴは、このペプチドの測定が、経口ブドウ糖負荷試験又は２型糖尿病プリフォームを診断するための別の診断法に代替する又はこれを補完するのに適することについて述べる。
【００８８】
「予後予測」
本明細書で用いる「予後予測」とは、２型糖尿病プリフォーム及び／又は２型糖尿病を発症する危険性の高い素因、好ましくは遺伝的素因を有する個体、或いは過去において２型糖尿病プリフォーム及び／又は２型糖尿病に罹患した可能性の高い個体を検出するのに適するペプチドを測定することを指す。２型糖尿病プリフォーム及び／又は２型糖尿病を過去に有したがもはや有さない個体は、その体内に一定の不可逆的変化を蒙る可能性があり、この不可逆的変化がその体内におけるペプチド量の変化により反映される可能性があることを仮定する。これらの個体が、２型糖尿病プリフォームを再発する及び／又は２型糖尿病を再発する可能性が高いことをさらに仮定する。結果として、「予後予測」に分類されるペプチドは、２型糖尿病プリフォーム及び／又は２型糖尿病に罹患する個体の予後予測に適しうる。
【００８９】
「診断」
「診断」という用語は、経口ブドウ糖負荷試験、又は２型糖尿病プリフォーム、特に、ＩＧＴを診断するための別の診断法に代替する又はこれを補完するのに適するペプチドの測定について述べることを目的とする。
【００９０】
配列アライメント並びに配列相同性及び配列同一性の計算の準備
配列相同性を計算するために、ＧＡＰアルゴリズム（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第１２巻、３８７〜３９５頁）、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズム、ＦＡＳＴＡアルゴリズム（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．、第２１５巻、４０３〜４１０頁）又はよく知られたＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎｎアルゴリズムを含む、ＧＣＧソフトウェア一式（米国、ウィスコンシン州、マジソン、ウィスコンシン大学、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）などのコンピュータプログラムを用いることができる。アミノ酸配列の比較又はアライメントに用いる好ましいパラメータは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．、第４８巻、４４３〜４５３頁）、ＢＬＯＳＵＭ  ６２マトリックス（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．、第８９巻、１０９１５〜１０９１９頁）、ギャップペナルティー１２、ギャップ長ペナルティー４、及び類似性の閾値０を含む。ＧＡＰソフトウェアは、前述のパラメータにより用いるのにも適する。前述のパラメータは、アミノ酸比較のためのデフォルトのパラメータであって、配列の端部におけるギャップが相同性値を減少させないパラメータである。８〜２０アミノ酸残基長の配列など極めて短い配列を比較する場合、期待値を１０００００まで増加させ、ワード長を２まで減少させることが必要な場合がある。さらに適切なアルゴリズムは、ギャップ開始ペナルティー、ギャップ伸長ペナルティーの使用、及び１９９７年９月以降のＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン９のプログラムハンドブックに見出される行列の使用である。最適のアルゴリズムの選択は、実施する比較の種類によって決まる。２つの配列を比較する場合は、ＧＡＰアルゴリズム又はＢｅｓｔ  Ｆｉｔアルゴリズムが好ましく、１つの配列を配列データベースと比較する場合は、ＦＡＳＴＡアルゴリズム及びＢＬＡＳＴアルゴリズムが好ましい。７０％の配列同一性を、７０％の相同性ともいう。同一性とは、アライメントのいずれの配列内においても同一の配列位置に同一のアミノ酸残基又はヌクレオチドが存在することを意味する。
【００９１】
ＩＧＴ用となる可能性のあるバイオマーカー
食後のグルコース代謝における変化と相関するペプチドバイオマーカーを得るために、以下のグループをｔ０及びｔ１２において比較した（ｐ＜０．０１）。２つのマーカーセットの間には最小限の重複が存在する結果、１４ペプチドのより頑健なリスト（「ＩＧＴマーカー」）が得られた。
【００９２】
ベースライン時（ｔ０）のＯＧＴＴにおいて正常であった被験者をＮ＠ＢＬ又はグループａ（図１参照）（ベースライン時におけるＮＧＴ）と記し、追跡来院時（ｔ１２）に正常であった被験者をＮ＠ＦＵ又はグループｂ（図１参照）（追跡時におけるＮＧＴ）と記した。同様に、ベースライン時のＯＧＴＴにおいて異常であった被験者をＩ＠ＢＬ又はグループｂ（ベースライン時におけるＩＧＴ）と記し、追跡来院時（ｔ１２）に異常であった被験者をＩ＠ＦＵ又はグループｄ＋ｆ（追跡時におけるＩＧＴ）と記した。ＮＧＴからＩＧＴを発症した個体は、ベースライン来院時におけるＮＢＬＩＦＵ又はグループａ２（ベースライン時にはＮＧＴであったが、追跡時にはＩＧＴを発症した）、及び追跡来院時におけるＩＦＵＮＢＬ又はグループｄ（追跡時にはＩＧＴであったが、ベースライン時にはＮＧＴであった）と記した。他のＩＧＴサブグループ又はＮＧＴサブグループにも同じ表記法を用いた。
【表１】
2009537812.tif 000003
Ａ１＋Ａ３＝マーカーがより頑健
【００９３】
ＩＧＴからＮＧＴへの転換者は、食後高血糖の履歴を有する。被験者が追跡来院時にＮＧＴでありえても、過去における耐糖能異常に関連する代謝特性又は表現型特性は残存し、特定のペプチドプロファイル（「不可逆性マーカー」）と相関すると仮定した。マーカーグループＡ２は、別のグループへ転換したか否かにかかわらず、追跡時におけるもとのＮＧＴグループ及びＩＧＴグループの間で異なるペプチドについて述べる。
【表２】
2009537812.tif 000004
Ａ１＋Ａ２＋Ａ３＝マーカーがより頑健
【００９４】
ライフスタイル介入に対する反応の予測因子
以下のグループ比較を行い、どの被験者がライフスタイルの変化から利益を得てＩＧＴからＮＧＴへと転換するかを予測するバイオマーカーを同定する。当初ＩＧＴでＮＧＴに転換した被験者のペプチドプロファイルを、ＩＧＴにとどまった被験者の場合とＴ０及びＴ１において比較した。さらに、２つのマーカーセットの間の重複を計算した。
【表３】
2009537812.tif 000005
Ｄ１＋Ｄ２＝マーカーがより頑健
【００９５】
遺伝的素因マーカー
肥満であるか、ＩＧＴと診断されたか、又は２型糖尿病患者の第１等親者であるかした被験者を試験に組み入れた（１）。２型糖尿病を発症する家族的素因を有する被験者において、これらの異常は、ＩＧＴの診断以前に存在することがある。２回の検査間でＮＧＴにとどまる患者が遺伝的素因を有さないのに対し、ＮＧＴからＩＧＴに転換する患者又は該検査間でＩＧＴにとどまる患者は遺伝的素因を有すると仮定した。将来においてＩＧＴを発症する素因を示すマーカーを同定するため、Ｔ０におけるペプチドプロファイルであって、試験の全期間においてＮＧＴにとどまる患者に由来するプロファイルと、試験の全期間においてＩＧＴにとどまる患者に由来するプロファイルとを比較した。
【００９６】
加えて、Ｔ０及びＴ１におけるＮＧＴ及びＩＧＴの非転換者のサブグループを統合し、相互に比較した。いずれのペプチドリストも、３６ペプチドの重複（「遺伝マーカー」）を有した。
【表４】
2009537812.tif 000006
Ｆ１＋Ｆ２＝マーカーがより頑健
【００９７】
ペプチドの同定
統計学的解析に基づき、異なるグループ比較に由来する２５ペプチドのリストをまとめた。配列の同定には、同一分画中における低〜高存在比である５％のピークを上回る質量分析シグナルのみを選択した。ペプチドプロファイルの作製には患者の血漿を用いたので、前述の試験以来の既に分画された血漿のみが使用可能であった。こうして、ＩＧＴグループにおいて増加したペプチドの存在量があまりに少量であるため、健康ボランティア被験者の血漿プールに由来するペプチドを同定することができない場合もあった。
【００９８】
１３前駆体に由来する全２０ペプチドを同定した。その前駆体タンパク質に仮定される代謝機能に従って、そのペプチドを、以下の種類に類別することができる。
・  高密度リポタンパク質：アポＣ−ＩＩＩ、アポＬ−Ｉ
・  鉄及びヘムの代謝及び輸送タンパク質及びペプチド：ヘモペキシン、ヘプシジン
・  炎症感受性血漿タンパク質：補体Ｃ４、フィブリノーゲン
・  活性化血小板から放出されるタンパク質：チモシンベータ４
・  骨吸収／形成に関与するペプチドホルモン：オステオカルシン、ＩＧＦ−Ｉ
・  Ｉ型コラーゲン
・  アルブミン（プレアルブミン＝トランスチレチン）
・  グルコース輸送及び代謝：ＩＧＦ−Ｉ及びインスリン
【００９９】
マーカー候補物質の詳細な説明
アポＣ−ＩＩＩ
アポＣ−ＩＩＩの一般的な説明
血漿アポリポタンパク質ＣＩＩＩ（アポＣ−ＩＩＩ）は、トリグリセリド（Ｔｇ）に富むリポタンパク質（キロミクロン及びＶＬＤＬ）の主要成分及びＨＤＬの微量成分である。アポＣ−ＩＩＩは、リポタンパク質粒子のクリアランスに干渉するが、その主要な役割は、リポタンパク質リパーゼに対する生化学的な阻害によるとともに、脂肪分解酵素及びリポタンパク質受容体が滞留する細胞表面のグリコサミノグリカンマトリックスへのリポタンパク質の結合に対する干渉にもよる、脂肪分解阻害剤としてのものである。アポＣ−ＩＩＩ発現の変化は、高トリグリセリド血症において重要な役割を有することが、明確に実証されている。食後の試験は、Ｔｇに富むリポタンパク質（ＴＲＬ）クリアランスの遅延が、心筋虚血症、頸動脈アテローム性硬化症、及びアテローム性動脈硬化の危険性と関連することを見出した。アポＣ−ＩＩＩは、ヒト血漿において最も豊富なＣアポリポタンパク質であり、約１２ｍｇ／ｄＬの濃度である。
【０１００】
同定されたアポＣ−ＩＩＩペプチド
そのグリコシル化のパターンのみが異なる、３つの同一なアポＣ−ＩＩＩ（アミノ酸８９〜９９）ペプチドを同定した。そのＣ末端の長さのみが異なるアポＣ−ＩＩＩのＮ末端から、さらに２つのペプチドを同定した（アミノ酸２０〜６０、２０〜６１）。アポＣ−ＩＩＩのＮ末端に由来するペプチド（アミノ酸２６〜４６）は、脂質間相互作用特性を有することが示されている。親水性残基が、トリグリセリド代謝にとって重要なアポリポタンパク質と脂質との交換に関与すると推測された。
【０１０１】
アポＣ−ＩＩＩの潜在的な開裂部位
アポＣ−ＩＩＩは、肝臓で、また少量は腸で、９９アミノ酸のペプチドとして合成される。小胞体内における２０アミノ酸のシグナルペプチドの除去後、７９アミノ酸の成熟アポＣ−ＩＩＩタンパク質は、８．８ｋＤａの分子量を有する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるアポＣ−ＩＩＩのトロンビン開裂の結果、残基２１〜６０のＮ末端ドメイン、及び残基６１〜７９のＣ末端ドメインが生じる。こうして、同定されたアポＣ−ＩＩＩ断片の１つ（アミノ酸２１〜６０）は、トロンビン開裂産物でありうる。
【０１０２】
アポＣ−ＩＩＩの示差的なグリコシル化
アポＣ−ＩＩＩは、配列位置７４のスレオニン残基におけるＯ結合型シアリル化の程度に応じて、アポＣ−ＩＩＩ−０（シアル酸なし）、アポＣ−ＩＩＩ−１（１モルのシアル酸）、及びアポＣ−ＩＩＩ−２（２モルのシアル酸）の３つの異なるアイソフォームにおいて存在する。本試験において本発明者らが同定したペプチドは、そのグリコシル化のパターンにおいて異なる。
【０１０３】
アポＣ−ＩＩＩの機能
アポＣ−ＩＩＩは、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、リポタンパク質リパーゼによるＴＧに富む粒子の加水分解、及びアポＥが介在する該分解物の肝臓による取り込みを阻害する。こうして、アポＣ−ＩＩＩは、Ｔｇに富むリポタンパク質の分解において重要な役割を有する可能性がある。ＭｃＣｏｎａｔｈｙらは、アポＣ−ＩＩＩの合成ポリペプチド断片を用いて、アポＣ−ＩＩＩのＮ末端ドメインが、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）活性の阻害の主な原因であることを観察した。候補物質１８（アミノ酸２１〜６１）と同一なＣＮＢｒ開裂ペプチド（アミノ酸１〜４１）が、ＬＰＬ活性を阻害する。
【０１０４】
アポＣ−ＩＩＩと糖尿病又はＩＧＴ
アポＣ−ＩＩＩのアテロームを誘発する役割のほか、メタボリックシンドロームにおいて冠動脈疾患（ＣＡＤ）の危険性を生じる高トリグリセリド血症の該役割がよく認識されている。大規模なＣＡＲＥ（コレステロール及び再発事象）臨床試験の結果は、アポＣ−ＩＩＩレベルが、従来測定されたＴＧレベルよりも優れた、ＣＡＤの発現及び進行危険性に関する予測因子であることを示した。
【０１０５】
アポＣ−ＩＩＩ遺伝子は、インスリンレベルにより転写が下方調節され、インスリン応答を媒介する核転写因子に対する親和性の低下と関連する、プロモーター領域における遺伝子多型が記載されている。こうして、遺伝子レベルにおいて「インスリン抵抗性」と関連すると思われる、インスリン応答要素における遺伝子多型が記載された。アポＣ−ＩＩＩ  Ｔ−４５５Ｃ変異体のホモ接合性は、ＣＡＤの危険性に対する感受性の独立因子をなす。
【０１０６】
欧州アテローム性動脈硬化研究試験（ＥＡＲＳ）ＩＩでは、アポＣ−ＩＩＩ変異体を有する男性被験者の食後応答が解析された。まれなＣ−４８２Ｔ変異体の相同保有が、ＯＧＴＴ後におけるグルコース濃度及びインスリン濃度を著明に上昇させた。
【０１０７】
バイオマーカーとしてのアポＣ−ＩＩＩペプチドの使用
同定されたペプチドは、アポＣ−ＩＩＩのＮ末端及びＣ末端に由来し、ＩＧＴと正に相関した。これらのペプチドレベルの上昇は、ＯＧＴＴを用いる必要なく見出された。こうして、一晩の絶食後にレベルの上昇を検出しうる。該ペプチドレベルは、アポＣ−ＩＩＩ前駆体レベルの上昇と相関する可能性が高い。血漿アポＣ−ＩＩＩ濃度は、ＥＤＴＡ血漿中で、和光純薬工業株式会社（日本、大阪）製のキットを用いて測定することができる。
【０１０８】
該ペプチドを用いて、インスリン感受性の異常を診断してよい。さらに、タンパク質分解による開裂は、ＬＰＬ活性を阻害する可能性を有する循環ペプチドを放出する。アポＣ−ＩＩＩ発現の上昇のほか、ＬＰＬ活性を阻害しうるペプチドの放出もともに、ＬＰＬ活性の低下に寄与しうる。
【０１０９】
アポＬ−Ｉ
アポＬ−Ｉの一般的な説明
アポＬ−Ｉは、血漿並びに肝臓、肺、脳、膵臓、胎盤、及び血管内皮など各種の組織中に見出される４２ｋＤａのタンパク質である。血漿中において、アポＬ−Ｉは、大径ＨＤＬ粒子（アポＡ−Ｉを含むリポタンパク質の１０％において見出される）と主に関連する。遊離アポＬは、血漿中において検出されなかった。コレステロールの輸送に関与するリポタンパク質との関連により、アポＬ−Ｉは、脂質の輸送及び代謝に役割を果たすと考えられる。
【０１１０】
加えて、アポＬ−Ｉは、ヒト血清におけるトリパノソーマ溶解因子であることが近年判明した。該タンパク質は、病原体の膜を透過化する、細孔形成ドメインを含む。
【０１１１】
アポＬ−Ｉの潜在的な開裂部位
同定されたアポＬ−Ｉペプチドは、該タンパク質のＮ末端に由来する。Ｌｐ（Ａ−Ｉ）粒子から単離されたアポＬは、４２ｋＤａ及び３９ｋＤａ（微量形態）の２つの形態において観察された。切断型の種は、他の複数の血漿アポリポタンパク質の場合と同様に、該タンパク質のタンパク質分解による活性化形態を表しうると推測された。Ｎ末端配列決定を実施して、該３９Ｋｄａ形態のＮ末端である、ＤＷＡＡＧＴＭＤＰＥを決定した。本発明者らが同定したＮ末端ペプチドは、タンパク質分解による予測開裂部位と一致する。
【０１１２】
アポＬ−Ｉと糖尿病又はＩＧＴ
血漿アポＬ−Ｉレベルは、原発性高コレステロール血症（対照における８．５μｇ／ｍＬに対して１０．１μｇ／ｍＬ）、内因性高トリグリセリド血症（１３．８μｇ／ｍＬ）、高脂血症表現型の統合（１８．７ｇ／ｍＬ）、及び高脂血性のＩＩ型糖尿病患者（１６．２μｇ／ｍＬ）において上昇する。アポＬと、肥満指数、年齢、性別、ＨＤＬコレステロール、又は空腹時の血糖値及びグリコヘモグロビンレベルとの間に著明な相関関係は認められなかった。原発性コレステリルエステル輸送タンパク質欠損症患者の血漿中におけるアポＬレベルは、著明に上昇した（５．４７±０．２７に対して７．１±０．５）。
【０１１３】
バイオマーカーとしてのアポＬ−Ｉの使用
同定されたペプチドは、ＩＧＴ（ＷＨＯ基準）の存在と正に相関する。この知見は、これまで述べられなかった。アポＬ−Ｉ値の上昇は、ＩＦＧ又は２型糖尿病を有する被験者のみにおいて測定されてきた。該ペプチドは、３９Ｋｄａ形態の存在とも相関しうる。しかし、３９Ｋｄａ形態が明確な生物学的機能を有するかどうかは、現在のところ知られていない。こうして、該ペプチドは、ＯＧＴＴを実施する必要なくＩＧＴ（及び高い可能性でＩＦＧも）を測定する単独マーカー又は多重マーカーとして用いてよい。しかし、アポＬ−Ｉレベル間の高度のばらつきにより、明確な分画値を定めることが困難となりうる。
【０１１４】
オステオカルシンプロペプチド
オステオカルシンの一般的な説明
オステオカルシン又は骨ガンマカルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）タンパク質（ＢＧＬＡＰ、又はＢＧＰ）は、翻訳中に開裂する２３残基の転座シグナルペプチド、ガンマカルボキシル化するタンパク質を標的とする２６残基のプロペプチド、及び４９残基の成熟ペプチドからなる、１１ｋＤの分子として当初合成される。新規に合成されたオステオカルシンの大半が骨マトリックス内に沈着するが、少量は血中で検出することができ、骨芽細胞活性の特異的な指標としての現在の臨床的使用をもたらしているのはこの特性である。オステオカルシンは、完全な分子及び断片として、骨吸収中にも骨マトリックスから放出される。こうして、オステオカルシンは、骨形成及び骨代謝回転の両方に対するマーカーとして考えるべきである。オステオカルシンは、主に骨芽細胞、骨細胞、及び象牙芽細胞により産生されるが、メッセンジャーＲＮＡは、骨以外の組織においても検出されている。
【０１１５】
しかし、該プロペプチドの帰趨についてはほとんど知られていない。オステオカルシン及びそのプロペプチドが共分泌されるならば、そのプロペプチドの濃度も骨芽細胞機能のマーカーとして有用でありえ、さらに、骨への結合による影響を受けないのでオステオカルシンより優れている可能性もある。オステオカルシンプロペプチドの血中における存在については、矛盾する結果が公表されている。
【０１１６】
オステオカルシンプロペプチドのタンパク質分解によるプロセシング
同定されたペプチドは、予測プロペプチドに由来する。オステオカルシンプロペプチドは、そのＣ末端の二塩基部位において開裂して成熟オステオカルシンペプチドを放出する。同定されたプロペプチドは、予測プロペプチドの小型の形態であり、Ｎ末端における２アミノ酸Ｌｙｓ−Ａｌａ及びＣ末端におけるＡｒｇを欠いている。これらの知見は、該プロペプチドのＮ末端が、ＤＰＰＩＶ開裂部位を含む一方、Ｃ末端は、細胞内において、又はＣ末端のＡｒｇ残基に特異的な血漿カルボキシペプチダーゼＢによりプロセシングされる可能性がある。
【０１１７】
こうして、本知見は、なぜ特定の抗体が該プロペプチドの循環形態を検出できないのかを説明する一助となるであろう。
【０１１８】
オステオカルシンと糖尿病又はＩＧＴ
高血糖値及びインスリン分泌の欠如を標識とするインスリン依存性糖尿病は、骨量の低下及び骨折率の上昇と関連する。これに対して、２型糖尿病患者は、健康な対照と比べて、骨ミネラル密度（ＢＭＤ）レベルが上昇することさえ多い。Ａｋｉｎら、Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、第１７巻、１９〜２９頁、２００３年、は、閉経後の２型糖尿病患者における骨代謝回転を評価し、糖尿病患者におけるＢＭＤ値が健康な閉経後の対照群よりも高く、血清オステオカルシンレベルが該対照群よりも著明に低いことを見出した。肥満指数とＢＭＤ値との間にも著明な相関関係が観察された。これらの知見は、２型糖尿病患者における骨代謝回転速度が、健康な閉経後患者と比べて著明に低いことを示唆する。
【０１１９】
Ｄｅｎｎｉｓｏｎら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ、第４７巻、１９６３〜１９６８頁、２００４年、は、１９３０年代にハートフォードシャーに生まれた男女を、グルコース代謝、インスリン分泌及びインスリン抵抗性並びに骨量の測定値に関して特徴づけた、ハートフォードシャーコホート試験において、２型糖尿病と骨密度の上昇との関係を探索した。彼らは、その根底にある機序は不明なままであるが、部分的には脂肪症を介し、男性よりも女性において著明な、ＢＭＤと２型糖尿病との間の正の相関をも見出した。
【０１２０】
Ｒｏｓａｔｏら、Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ、第６３巻、１０７〜１１１頁、１９９８年、は、糖尿病患者において、血糖コントロールの改善が、血清オステオカルシン値及び血清インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）値の上昇と関連することを示した。糖尿病患者においては、オステオカルシン及びＨｂＡ１ｃ及びグルコースに関して、ベースライン時から血糖コントロールの改善時に至る百分率変化に逆相関が存在した。これらのデータは、血糖コントロールの改善が、男女の糖尿病患者の骨代謝回転の上昇を伴い、おそらくは循環ＩＧＦ−Ｉレベルの上昇を介していることを示唆する。
【０１２１】
バイオマーカーとしてのオステオカルシンプロペプチドの使用
本発明者らは、オステオカルシンのプロペプチドが、ベースライン時におけるＮＧＴ被験者と比較して、ＩＧＴ被験者においては減少することを見出した（ＩＧＴマーカー）。オステオカルシンレベルは、ライフスタイルの変更後にＮＧＴに転換するＩＧＴ被験者における方が、転換しない被験者の場合と比べて高い。現在までのところ、本発明者らは、オステオカルシンプロペプチドレベルを年齢又は性別と相関させていない。
【０１２２】
ＩＧＴにおける血漿オステオカルシンレベルは、様々な機序により低下しうる。該プロペプチドが、骨芽細胞の活性及び機能（骨形成）の直接のマーカーであるらしい。
Ａ）骨芽細胞のオステオカルシン分泌は、高血糖値により減少するので、オステオカルシンにより評価される骨形成は、糖尿病コントロールに応じて低下する。
Ｂ）ヒトオステオカルシンの発現は、グルココルチコイドにより負に調節される。グルココルチコイドは、生理学的効果の広いスペクトルを有するストレスホルモンであり、メタボリックシンドロームの病態生理に関与している（１９）。
Ｃ）一般に、身体活動は骨喪失を低下させ、これも部分的に、オステオカルシンレベルの変化に反映される。
こうして、オステオカルシンプロペプチドレベルの差は、ＩＧＴを有する個体における身体活動又はホルモンレベルの違いを反映しうる。
【０１２３】
インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）
ＩＧＦ−Ｉの一般的な説明
インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）は、骨成長、細胞分化、及び代謝を刺激するペプチドである。ＩＧＦ−Ｉは、ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ及びそのアミノ酸の約５０パーセントを共有するインスリンからなる、ＩＧＦファミリーに属する。ＩＧＦは、インスリンと構造的に関連するが、Ｃペプチドを保持し、延長されたＣ末端を有する。インスリンがピコモル濃度で循環し、分単位の半減期を有するのに対し、ＩＧＦは、はるかに高い（ナノモル）濃度で循環し、ＩＧＦ活性を調節する６つのＩＧＦ結合タンパク質の１つに大部分が結合する。これらの結合タンパク質は、ＩＧＦと同様、主に肝臓で合成される。ＩＧＦ及びその結合タンパク質は、大半の組織によっても局所的に産生され、この場合、自己分泌的又は傍分泌的に作用する。インスリンが主に肝臓、筋肉、及び脂肪組織に作用するのに対し、ＩＧＦは、体内のほとんどすべての器官の機能において重要である。どちらのＩＧＦも、胚発生に不可欠であり、成人となっても両方のナノモル濃度は循環中で維持される。年齢、性別、栄養状態、及び成長ホルモン分泌など、多くの変数が、血清ＩＧＦ−Ｉ濃度に影響する。その濃度は出生時には低く、幼少期及び思春期に著明に上昇し、第三期に低下し始める。これらの変化は、成長ホルモンの分泌と並行する。
【０１２４】
同定されたＩＧＦ−Ｉペプチド
ＩＧＦ−Ｉは、不活性のプロペプチド前駆体として合成される。７０アミノ酸の成熟ＩＧＦ−Ｉ分子は、２つの異なるプロホルモン前駆体であるプロ−ＩＧＦ−ＩＡ又はプロ−ＩＧＦ−ＩＢから、Ｅドメインの除去により産生することができる。ＩＧＦ−Ｉ  ｍＲＮＡの別のスプライシングが、２つのＩＧＦ−Ｉプロホルモンの産生の原因であるが、異なる形態の生理学的な意義は知られていない。ヒトプロＩＧＦ−ＩＡ及びプロＩＧＦ−ＩＢの配列は、独自の五塩基プロホルモン開裂モチーフであるＬｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｌｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ａｒｇを含む、Ｅドメインの最初の１６残基を介して一致する。このモチーフは、哺乳類、鳥類、両生類、及び硬骨類において保存されている。
【０１２５】
本研究において、本発明者らは、ＩＧＦ−Ｉの２つの形態を同定した。分子量７６６５を有する１つのペプチドが、Ａｒｇ１１９での開裂から生じる成熟ＩＧＦ−Ｉ  １〜７０に対応する一方、他のペプチド（１〜７６）は、Ａｒｇ１９５での開裂から生じるＣ末端における６つの追加アミノ酸を含む。いずれのＩＧＦ−Ｉ形態も、プロ−ＩＧＦ−ＩＡを発現するＨＥＫ２９３細胞から同定されており、フリンが、五塩基モチーフ内の複数の部位においてプロＩＧＦ−ＩＡを開裂しうることが示された。本発明者らの知る限りで、ＩＧＦ−Ｉの長い方の形態は、いまだ血漿中で同定されていない。新規に同定され、肝臓において高度に発現する、ヒトプロタンパク質転換酵素ＰＣＳＫ９又はＮＡＲＣ−１（神経アポトーシス調節型転換酵素）における突然変異が、家族性高コレステロール血症と関連する。ＰＣＳＫ９の発現は、肝細胞においてインスリン又は脂質降下剤スタチンにより調節され、ＩＧＦ−Ｉの別のプロセシング形態を心血管疾患及び耐糖能異常と関連させうる。
【０１２６】
ＩＧＴ、糖尿病、及び心血管疾患とＩＧＦ−Ｉとの関連
近年、ＩＧＦ−Ｉが、グルコースのホメオスタシス及び心血管疾患のいずれにおいても役割を有する可能性があることを示唆する証拠が増えつつある。正常被験者、極度のインスリン抵抗性を有する患者、及び１型又は２型糖尿病患者を対象に実施された臨床試験は、組換えＩＧＦ−Ｉの投与が、血糖を著明に低下させ、インスリン感受性を著明に上昇させたことを示している。ＩＧＦ−Ｉがインスリン作用を促進するという考えを裏付ける近年の研究（Ｎａｔｕｒｅ、第４２２巻、８３〜８７頁、２００３年）は、循環中におけるＩＧＦ−Ｉ濃度が低いと、４〜５年間の追跡期間中に２型糖尿病を発症する危険性が極めて高くなると結論づけた。循環中の低ＩＧＦ−Ｉレベルは、非糖尿病被験者において血管造影法により記録された冠動脈疾患のほか、頸動脈におけるアテローム硬化性プラーク、及び冠動脈疾患と関連している。様々な程度の耐糖能を有する被験者における血漿ＩＧＦ−Ｉ濃度とインスリン感受性との間の関係が、Ｓｅｓｔｉら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ、第２８巻、１２０〜１２５頁、２００５年によって研究されている。彼らのデータは、血漿ＩＧＦ−Ｉ濃度が、インスリン感受性の異常及びメタボリックシンドロームの他の構成要素と独立に関連することを示し、低ＩＧＦ−Ｉレベルが、心血管疾患の危険性にある被験者を同定する有用なマーカーでありうることを示唆した。
【０１２７】
複数の研究が、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子のプロモーター領域における遺伝子多型の、循環ＩＧＦ−Ｉレベル及び２型糖尿病及び心筋梗塞との関係について述べている。
【０１２８】
バイオマーカーとしてのＩＧＦ−Ｉの使用
本明細書における方法を用いると、ＩＧＴを有する個体においてＩＧＦ−Ｉレベルが低下することが示される。ＩＧＦ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）及びカテプシンＤなどのＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）及びＩＧＦＢＰプロテアーゼの自己分泌による産生を含むＩＧＦ軸の異常が、前立腺癌、肺癌、及び乳癌の細胞及び組織で同定されている。近年の症例対照研究は、最も高頻度で診断される癌のうち、前立腺癌、乳癌、及び肺癌の患者において、血清ＩＧＦ−Ｉレベルが約１０％上昇することを見出している。血漿ＩＧＦ−Ｉレベルは、年齢依存的に低下するので、ＩＧＦ−Ｉは、別のマーカーペプチドとの併用に限り、診断検査マーカーとして考えるべきである。
【０１２９】
ヘプシジン
ヘプシジンの一般的な説明
肝臓において産生される２５アミノ酸のペプチドホルモンであるヘプシジンは、全身の鉄ホメオスタシスの主要な調節因子である。ヘプシジンは、腸による鉄吸収、マクロファージによる鉄再利用、及び肝貯蔵からの鉄移動を阻害することにより、血漿鉄濃度及び鉄の組織分布を制御する。ヘプシジンは、細胞内で唯一知られた鉄エクスポーターであるフェロポルチンへの結合及びその分解の誘導を介して、細胞からの鉄流出を阻害することにより作用する。ヘプシジンの合成はホメオスタシスを維持するように、鉄負荷により増加し、貧血症及び低酸素症により減少する。ヘプシジンは、おそらくは侵入する微生物への鉄利用能を制限する宿主防御機構として、感染症及び炎症中にも増加し、血清鉄レベルの低下を生じ、炎症性貧血症の発症に寄与する。スペクトルの反対側において、ヘプシジン欠損は、ヘプシジン遺伝子自体における突然変異、又はヘプシジン合成の調節因子における突然変異により、大半の形態のヘモクロマトーシスの最終原因であると思われる。
【０１３０】
同定されたヘプシジンペプチド
ヘプシジンは、循環抗菌ペプチドとして個別に単離されている。主要なヘプシジン形態は、２５アミノ酸残基及び４ジスルフィド架橋を有する陽イオン性ペプチドであった。ヒトにおいて、該ペプチドは８４アミノ酸プレプロペプチドのＣ末端に由来する。
【０１３１】
ヘプシジンと糖尿病、ＩＧＴ、及び脂肪肝
血清フェリチン濃度として表現される鉄貯蔵が、インスリン抵抗性症候群の構成要素であると仮定されている。実際、循環フェリチン濃度は、主に体内脂肪の分布と関連するほか、他の複数の肥満測定値とも著明に関連している。見掛け上健康な一般の集団において、フェリチンの血清レベルは、経口ブドウ糖負荷試験中におけるベースライン時の血清グルコース及びグルコースの曲線下面積とも正に相関した。妊娠性糖尿病では、ＢＭＩレベル及び血清フェリチンレベルともに、２時間にわたる経口ブドウ糖負荷試験中におけるグルコースの独立した予測因子であることがわかった。フェリチンレベルは、ＢＭＩについて調整した後でなお、拡張期動脈血圧とも相関した。鉄貯蔵の減少を生じる頻繁な献血は、健康なボランティア被験者における食後の高インスリン血症を低減し、インスリン感受性を改善し、２型糖尿病の発現に対する防御因子を構成することが示されている。欧米諸国の人口全般における鉄貯蔵増加の高有病率、及び鉄貯蔵の増加が２型糖尿病の高発症率を予測するらしいという観察を踏まえると、この知見は極めて重要である。
【０１３２】
新規の肝鉄過剰症候群が記載され、インスリン抵抗性関連肝鉄過剰症（ＩＲ−ＨＩＯ）として知られている。その症候群は、鉄代謝異常（正常なトランスフェリン飽和率を伴う孤発性高フェリチン血症）、脂肪性肝炎、及びインスリン抵抗性症候群（肥満、高脂血症、異常グルコース代謝、及び高血圧）を統合する。ＩＲ−ＨＩＯでは、肝細胞及び類洞細胞の両方において鉄過剰が生じるが、類洞細胞における方が高頻度であり、症例の４５％で生じ、所見がヘモクロマトーシスを有する被験者において見られるのは３％に過ぎない。これらの患者の約３分の２が脂肪症を発症し、残りの３分の１が孤発性の炎症徴候を示す。こうして、これら患者は、肝線維症を発症する危険性が高く、鉄過剰の存在が中程度である場合でも、全症例の６０％において合併症が観察される。
【０１３３】
ヘプシジンの合成及び放出は、細菌性リポ多糖及びサイトカイン、特に、ＩＬ−６により迅速に調節される。こうして、ヘプシジン遺伝子は、炎症に反応して過剰発現する急性期反応性遺伝子である。
【０１３４】
バイオマーカーとしてのヘプシジンの使用
肥満において、脂肪組織は、ＩＬ−６を含む広範な炎症分子であって、脂肪組織に対する局所性の効果を有するだけでなく他の器官に対する全身性の効果をも有しうる炎症分子の産生及び分泌の増加を特徴とする。ＩＬ−６は、大網脂肪組織から門脈を経て肝臓に運ばれ、これによりヘプシジン発現を増加させることがある。まとめると、ヘプシジン２５は、耐糖能異常を有する個体における酸化ストレスの増大及び肝機能異常／脂肪肝の新規マーカーとして考えてよい。
【０１３５】
ヘモペキシン
ヘモペキシンの一般的な説明
ヘモペキシンは、既知のタンパク質中で、ヘムに対する結合親和性が最も高い血漿タンパク質である。該タンパク質は、主に肝臓で発現し、炎症後にその合成が誘発される急性期反応物質に属する。ヘムは、呼吸及びエネルギー移動を含む広範な生物学的過程において用いられ、全血清タンパク質の約１．４％を占める。ヘムタンパク質、特にヘモグロビンの代謝回転は、細胞外液中へのヘム放出を生じ、健康に重大な結果を生じる可能性がある。遊離鉄と同様に、ヘムは、侵入する細菌性病原体に対する必須鉄の供給源であり、そのフリーラジカル形成に対する触媒能のために毒性が高い。遊離ヘムレベルは低いことが通例であるが、溶血性疾患の病態においては危険なまでに高くなりうる。防御は６０ｋＤａの血清糖タンパク質であるヘモペキシンによってもたらされ、それは極めて高い親和性（Ｋｄ＜１０１２Ｍ）で血流からヘムを隔離し、肝細胞上の特異的な受容体にヘムを輸送し、そこでヘムが受容体媒介エンドサイトーシスを受け、それと結合したヘムを細胞中に放出する。こうして、ヘモペキシンは、ヘム毒性に対する防御並びに鉄の保持及び再利用の両方に寄与する。
【０１３６】
同定されたヘモペキシンペプチド
同定されたペプチドは、ヘモペキシンのＮ末端に由来し、ＤＰＰＩＶ開裂部位に一致する予測Ｎ末端の最初の２アミノ酸を欠く。したがって、ヘモペキシンペプチドは、ＤＰＰＩＶ開裂の産物でありうる。そのペプチドの新規のＮ末端をＤＰＰＩＶ（ＬＰ／Ｐ）により開裂することはできないので、そのペプチド（少なくともＮ末端部分）が血中に蓄積するように思われる。ＤＰＰＩＶは、より小型のタンパク質及びペプチドを優先的に開裂するので、ヘモペキシンの全体もＤＰＰＩＶ基質であると結論づけることはできない。
【０１３７】
ヘモペキシンと糖尿病、ＩＧＴ、又は脂肪肝
ヘモペキシンは、ＩＬ−６及び成長ホルモンがその転写を上方調節する急性期肝タンパク質であるが、インスリンは、ヘモペキシンの転写速度には影響を与えない。２型糖尿病患者においては、ヘモペキシンレベルの上昇がみられた。
【０１３８】
バイオマーカーとしてのヘモペキシンの使用
本発明者らは、ヘモペキシンのＮ末端に由来するペプチドが、ＩＧＴを有する個体であって、ＮＧＴに転換する個体の場合と比べて、ライフスタイルの変化によって耐糖能が改善しない個体において減少することを見出した。この知見は新しく、２型糖尿病患者におけるヘモペキシンの増加が公表されているので、より詳細な分析を要する。可能な説明は、再生肝ではヘモペキシンレベルが上昇するという知見でありうる。こうして、レベルの低下は、肝インスリン耐性再生能の低下を示しうる。
【０１３９】
補体Ｃ４−Ａ
Ｃ４の一般的な説明
補体系は、生得的免疫の主要な構成要素であり、侵入する病原体に対する防御の最前線を提供する。補体タンパク質は、血清タンパク質の約１０％を構成し、第４成分であるＣ４は、血中に３５０〜６００μｇ／ｍｌの濃度で存在する。Ｃ４は、細胞内でアルファ鎖、ベータ鎖、及びガンマ鎖にプロセシングされ、これらはジスルフィド架橋により連結される。補体の古典的経路及びレクチン経路による認識は、それ自体セリンプロテアーゼである補体成分Ｃ２、及びＣ４を開裂するセリンプロテアーゼの活性化をもたらし、Ｃ３をＣ３ａ及びＣ３ｂに開裂するプロテアーゼ複合体Ｃ４ｂ２ａの形成をもたらす。Ｃ３ｂ及びＣ４ｂは、Ｃ３及びＣ４における表面のヒドロキシ基又はアミノ基と同内部のチオールエステルとの間のエステル交換反応により、補体活性化表面に共有結合する。古典的経路の複数の産物は、宿主防御に寄与する強力な生物学的活性を有する、例えば、放出されたＣ４ａ断片が弱いアナフィロトキシンであるのに対し、Ｃ４ｂは補体受容体への結合による食作用を促進するオプソニンである。
【０１４０】
古典的経路の重要な下方調節因子は、アルギニル特異性を有するセリンプロテアーゼ因子Ｉである。該因子は、活性型で循環し、タンパク質分解活性を必要としない。因子Ｉは、Ｃ４ｂ結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ）又は因子Ｈ（ＦＨ）などの補因子タンパク質に結合する場合に限り、補体因子３（Ｃ３ｂ）及び４（Ｃ４ｂ）の活性型を分解する。因子Ｉによる分解の間、Ｃ３ｂ及びＣ４ｂのα鎖における複数のペプチド結合が開裂する（３７）。
【０１４１】
同定されたＣ４ペプチド
Ｃ４前駆体に由来する２つのペプチドを同定した。いずれのペプチドも、補体Ｃ４−Ａアルファ鎖（Ｃ４ｂａ、アミノ酸６８０〜１４４６）に由来する。アミノ酸１３３７〜１３５２に由来するＣ４−Ａアルファペプチドは、著明には調節されなかった。そのペプチドは、アミノ酸Ｒ／Ｎにおける因子Ｉ開裂により放出されうる。Ｎ末端開裂産物が、Ｃ４ｄ（アミノ酸９５７  １３３６）である。Ｃ４分子の活性化及び分解に続き、Ｃ４活性化部位の近傍における内皮細胞表面及び血管基底膜細胞外マトリックス成分に対する、分解産物Ｃ４ｄの一過性共有結合を可能にするチオエステル基が露出される。Ｃ４ｄは、体液媒介アロ反応の免疫組織化学的マーカーとみなされる。アミノ酸１４２９〜１４４９を含む第２のペプチドは、Ｃ末端側に延長され、補体アルファ鎖と同ガンマ鎖（アミノ酸１４５４〜１７４４）との間の予測プロペプチドドメインにわたる。どちらのペプチドも、予測外の翻訳後修飾を有する。
【０１４２】
チモシンβ４ペプチド
チモシンβ４の一般的な説明
βチモシンは、高度に保存的で極めて水溶性の高い５ｋＤａのポリペプチドファミリーを構成する。チモシンβ４が最も多く存在するメンバーであり、大半の細胞型において発現し、主要な細胞内Ｇアクチン隔離ペプチドとみなされる。この４３アミノ酸のオリゴペプチドは、Ｇアクチンと１：１複合体を形成し、これによりＦアクチンへの塩誘導重合を阻害する。チモシンβ４は、白血球及び血小板中に極めて高濃度で存在するが、該ペプチドは分泌のシグナル配列を有さないので、その血漿濃度は低い。しかし、凝血が生じると、血清中のチモシンβ４レベルは著明に上昇しうる。細胞外のチモシンβ４は、血管新生、創傷治癒、及び炎症の調節を含む複数の生理学的過程に寄与しうる。このペプチドは、内皮細胞のマトリックス成分への付着及び拡大の速度を増大させ、ヒト臍静脈内皮細胞の移動を刺激し、マトリックスメタロプロテイナーゼを誘発し、角質創傷の治癒を促進し、炎症メディエータを調節する。チモシンβ４の硫酸化物は、炎症反応を阻害すると報告されている。血小板の活性化後、チモシンβ４が放出され、組織トランスグルタミナーゼによりフィブリン及びコラーゲンなどのタンパク質に架橋する。
【０１４３】
同定されたチモシンβ４ペプチド
本発明者らは、チモシンβ４ペプチドに対応する配列タグを同定した。しかし、該ペプチドは、さらなる解明を要する翻訳後修飾を有する。
【０１４４】
チモシンβ４の役割
本明細書に開示される方法によれば、チモシンβ４ペプチドは、ＩＧＴを有する個体であって、ライフスタイルの変更後にＮＧＴに転換しない個体において増加した。他の試験は、血漿試料中のチモシンβ４ペプチド量が、試料の血小板含量の間接的な測定値であることを見出している。チモシンｂ４ペプチドレベルの上昇は、血液採取、血液凝固における変化、又は血小板カウント及び血小板体積における変化までも示しうる。
【０１４５】
複数の研究が、血小板カウント又は血小板体積のインスリン抵抗性、糖尿病、及び肥満との関係を示してきた。ＮＧＴ又はＩＧＴ分類との関係における血小板カウント及び血小板体積に関する追加のデータが、この仮定を裏付ける必要がある。本発明者らは、チモシンペプチドのレベルが、ベースライン時の試料と比べて追跡時の試料においてより低いことをも見出している。
【０１４６】
フィブリノーゲンペプチド
フィブリノーゲンの一般的な説明
フィブリノーゲンは、肝臓で合成される３４０ｋＤａのタンパク質であり、主に血漿中に見出される。該タンパク質は、ジスルフィド結合により結合される同一でない３つの鎖の２つのセットからなり、１つの中心ドメイン、及び同一な２つの外側ドメインを有する３結節構造を生じる。フィブリノーゲンからフィブリンへの転換は、軟凝血塊の形成の原因であるＮ末端重合部位を露出させるアルファ鎖及びベータ鎖からフィブリノペプチドＡ及びＢを開裂する、トロンビンにより開始される。トロンビンは、フィブリンにおけるイプシロン−（ガンマ−グルタミル）−リシン架橋の形成を介して凝血塊を安定化させる因子ＸＩＩＩａをも活性化する。したがって、フィブリノペプチドＡ及びＢ並びに因子ＸＩＩＩａの活性化ペプチドは、凝固経路のマーカーである。
【０１４７】
不溶性のタンパク質マトリックスであるフィブリンの沈着は、一過性であるに過ぎない。タンパク質分解によるフィブリン除去の主に知られた機構（線溶）は、プラスミノーゲンからのプラスミンの形成をもたらすカスケード型のタンパク質分解過程を伴う。プラスミンは、循環中にプラスミノーゲンとして放出され、組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子、トロンビン、フィブリン、及び因子ＸＩＩ（Ｈａｇｅｍａｎ因子）により活性化されるセリンプロテアーゼである。線溶において、プラスミンは、様々な部位でフィブリンメッシュを切開し、他のプロテイナーゼによりさらにプロセシングされる循環断片の産生をもたらす。
【０１４８】
同定されたペプチド
フィブリノーゲン前駆体から、２つのペプチドを同定した。１つのペプチド候補物質であるＦ４６＿１６９０．５がＦｉｂＡであり、活性化トロンビンがフィブリンを開裂するときに放出される。したがって、ＦｉｂＡは、凝固マーカーである。同定された第２のペプチドは、フィブリノーゲンアルファ鎖に由来するペプチドであって、プラスミン開裂により放出されうるペプチドであるので、線溶マーカーでありうる。
【０１４９】
凝固及び線溶と糖尿病、肥満、及び耐糖能異常に対する関係
本発明の方法を用いると、ＦｉｂＡペプチドのレベルは、ＩＧＴを有する個体であって、ライフスタイルの変更後にＩＧＴに転換しない個体において、ＮＧＴに転換する個体と比べて低下する。本発明者らは、線溶の潜在的なペプチドマーカーが、ＮＧＴを有する個体と比べて、ＩＧＴを有する個体において低下することをも見出した。これらの結果は、インスリン抵抗性、肥満、及びメタボリックシンドロームの症状として十分に確立された凝固線溶系の障害と一致する。止血異常においては、線溶の強力な阻害剤であるプラスミノーゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ）−１の血漿中における増加が、メタボリックシンドロームの主要症状であると考えられる。ＰＡＩ−１の高血漿濃度は、血栓形成と関連し、心血管事象を生じることがある。
【０１５０】
さらに、ＰＡＩ−１レベルの低下が示す通り、食事及び身体運動による強化介入は、線溶に対して長期の有益な効果を及ぼす。これらの結果は、耐糖能異常を有する肥満被験者におけるＰＡＩ−１レベルの上昇は、ライフスタイルの変更、特に、体重減量に向けられた変更により、大半は可逆的であることを示唆する。
【０１５１】
コラーゲンペプチド
他の多くの細胞もそれを合成することができるが、哺乳類体内における大部分のＩ型コラーゲンは、線維芽細胞及び骨芽細胞により産生される。
【０１５２】
骨は、頻繁なリモデリングを受け、大きな再生能を有する組織である。成体では、約１０〜１１年ごとに骨格が置き換わるようにリモデリングが生じる。この生理的リモデリングは、骨を吸収する破骨細胞により開始され、骨芽細胞による新規の等量の骨の形成がこれに続く。骨吸収量が新規の骨形成量を上回るときに、骨喪失という。これは、老齢の骨格において、特に閉経に関連する骨粗鬆症の間に生じる。
【０１５３】
Ｉ型糖尿病は、実質的な骨喪失とも関連してきた。これに対して、２型糖尿病における骨喪失の存在はそれほど明らかでなく、現在の理解は、この形態の糖尿病の方が、より頻繁に骨ミネラル密度の上昇と関連することを示唆する。
【０１５４】
骨吸収が、血漿Ｉ型コラーゲン架橋Ｃテロペプチド（ＣＴＸ）の測定により判定される一方、骨形成は、Ｉ型プロコラーゲン血漿アミノ末端プロペプチド（ＰＩＮＰ）レベル及びオステオカルシンレベルの測定により判定される。骨吸収は夜間に最高となり、ＣＴＸ値は早朝に最高となる。最高値及び最低値は、２４時間の平均値と２４％異なる。骨吸収は、摂食により抑制され、インクレチンホルモンＧＬＰ−２が関与すると思われる（４７、４８）。
【０１５５】
同定されたコラーゲンペプチド
同定されたコラーゲンペプチドは、コラーゲンアルファ−１（Ｉ）鎖の三重らせん領域にマップされ、多重分解事象の産物である。本発明者らは、このペプチドが、ＮＧＴを有する個体と比べてＩＧＴを有する個体において減少し、骨吸収の低下を反映しうることを見出した。
【０１５６】
本発明のさらなる特性及び利点については、制限を含意するのでなく例示のみを目的に提示される、以下の実施例との関連でより明確に理解されたい。
【実施例】
【０１５７】
（実施例１）
試験デザインと被験者
９６例のヒト個体が、試験に参加した（男性３９例、女性６１例）。すべての個体は、２型糖尿病の既罹患者の親近者であるか、又は肥満指数＞２７／ｍ２を有する肥満者若しくは過体重者、耐糖能異常を有する個体、及び妊娠性糖尿病の履歴を有する女性であるなどの理由による２型糖尿病の危険性が高い者であった。アルコール乱用が臨床的に疑われる者は、本試験から除外した。すべての個体は、一晩の絶食後、午前中に、当技術分野で知られる経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）に従って、７５ｇグルコース溶液の経口摂取前に１つ目、また同摂取の２時間後に２つ目の２つの血液試料の採取を受けた。両血液試料の血糖値は、当技術分野で知られる標準的な臨床的方法により測定し、ＯＧＴＴ開始の２時間後に個体が正常血糖値（＜６．７ｍＭ）を有するか、個体を耐糖能異常（ＩＧＴ）に罹患すると分類する血糖値の上昇（≧６．６ｍＭ〜≦１０ｍＭ）を有するか、又は個体を２型糖尿病に罹患すると分類する血糖値（＞１０ｍＭ）を有するかを判定した。グルコースに関するすべての閾値は、１９９７年の世界保健機構（ＷＨＯ）による診断基準（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ、１９９７年、第２０巻、１１８３〜１１９７頁）に従った。
【０１５８】
この初回来院の後、すべての個体が、標準化された身体運動及び食事による介入プログラムを開始した。身体運動プログラムは、すべての試験参加者が、各自の身体能力に応じて、週に３回各回１時間ずつ運動することを要請した。身体運動は、例えば、徒歩、ジョギング、トレッドミル上でのランニングなどであった。参加者の食事は、脂肪摂取を減らし、線維摂取を増やすことを意図し、その結果、全個体の約５０％が、食物摂取１０００ｋｃａｌあたり線維約１５ｇの線維を摂取した。この介入プログラムの１２カ月後、一晩の絶食後、午前中に、すべての個体が、経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）に従って、７５ｇグルコースの摂取前に１つ目、また同摂取の２時間後に２つ目の２つの血液試料の２回目の採取に来院した。試験を完了した各個体から採取した計４つの血液試料から、実施例２に従って血漿を調製した。血漿グルコースは、ベッドサイドグルコースアナライザー（米国、コロラド州、イエロースプリング、Ｙｅｌｌｏｗ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ［ＹＳＩ］社製、グルコースオキシダーゼ法）を用いて決定した。
【０１５９】
（実施例２）
血清及び血漿の調製
健康ヒト成人及び耐糖能異常（ＩＧＴ）に罹患することが疑われる又は知られているヒトが、書面によるインフォームドコンセントを提出し、ハノーバー医学院の施設内倫理委員会がプロトコールを承認した後で、本試験に組み入れられた。血液試料は、一晩絶食後の個体から採取し、次いで個体が所定のグルコース溶液を摂取し、グルコース摂取の１２０分後に２つ目の血液試料を採取した。１年後に、同じ個体が同じ手順に従ったので、試験を完了した各個体から、計４つの血液試料を採取した。この１年間に、すべての個体が、その健康状態を変更するために、標準化された身体運動及び食事の介入プログラムを実行した。経口ブドウ糖負荷試験及び試験デザインの詳細は、実施例１に述べてある。血液試料は、肘脈から血液採取試験管（ドイツ、ニュンブレヒト、ザールシュテット、ＥＤＴＡカリウムを含む、又は０．１０６ｍｏｌ／Ｌクエン酸溶液を含む９ｍＬのＳ−Ｍｏｎｏｖｅｔｔｅ）に採取した。採取直後、２０００×ｇ、室温で１０分間の遠心分離により、血漿を得た。低温は、血小板を活性化して、何よりもタンパク質及びペプチドを血漿内に放出させ、これが血漿試料中に存在するペプチド又はタンパク質分析のための試料品質に好ましくない影響を与えるので、４℃のような低温での遠心分離は避けるべきである。２ｍｌ容の血漿試料は、細孔径０．２μｍで濾過面積５ｃｍ２の酢酸セルロース製濾過ユニットを装着した２ｍｌ試験管（ドイツ、ニュンブレヒト、ザールシュテット、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製、Ｍｉｎｉｓａｒｔ（登録商標））に移した。血漿試料は、さらなる解析まで、−８０℃の冷凍庫に移した。
【０１６０】
（実施例３）
試料の液体クロマトグラフィー
実行した分離法は、逆相クロマトグラフィーであった。各種のＲＰクロマトグラフィー用樹脂及び溶離剤が、同様に適切である。ペプチド及びタンパク質の分離は、供給源５ＲＰＣ、４．６×１５０ｍｍの逆相クロマトグラフィーカラム（ドイツ、フライブルク、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ製）を用いて行った。分離は、以下に述べる通りに行った。以下の成分からなる移動相を用いた。移動相Ａ：０．０６％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸、移動相Ｂ：０．０５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸、８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル。クロマトグラフィーは、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のマイクロフローセルを伴うＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製ＨＰ  １１００を用い、３３℃で行った。
【０１６１】
試料は、ｐＨを２〜３に調整した０．０６％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸により希釈し、該試料を１８０００×ｇで１０分間遠心分離し、こうして調製された最終的に７５０μｌの血漿同等物を、クロマトグラフィーカラムに投入した。クロマトグラフィーの条件は、以下の通りであった。時点０分において５％の移動相Ｂ、時点１〜４５分において移動相Ｂ濃度を５０％まで継続的に上昇させ、時点４５〜４９分において移動相Ｂ濃度を１００％まで継続的に上昇させ、その後時点５３分まで緩衝液Ｂを１００％で一定に保つ。０．５ｍｌずつ９６分画の採取は、クロマトグラフィー開始の７分後から開始する。
【０１６２】
（実施例４）
試料の質量分析
質量分析法による解析のため、ペプチドの典型的な陽イオンスペクトルを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計（マトリックス支援レーザー脱イオン化法）により産生した。適切なＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計は、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ社製（Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ、Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  ＰＲＯ、又はＶｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  ＳＴＲ）、又はＢｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｋ  Ｂｒｅｍｅｎ社製（ＢＩＦＬＥＸ）である。試料は、有機酸からなることが通例であるマトリックス物質と試料とを混合することにより調製する。ペプチドに適する通例のマトリックス物質は、３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ桂皮酸、αα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸、及び２，５−ジヒドロキシ安息香酸である。逆相クロマトグラフィーにより得られ、１５μｌ血漿又は血清に対応する凍結乾燥した同等物を用いて、ペプチド及び／又はタンパク質及び／又は標準物質を測定する。クロマトグラフィーにかけた試料を１５μｌのマトリックス溶液中に溶解する。このマトリックス溶液は、例えば、容積比で４９：４９：１：１のアセトニトリル、水、トリフルオロ酢酸、及びアセトンからなる溶媒混合液中に溶解した、１０ｇ／ｌのαα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸及び１０ｇ／ｌのＬ（−）フコースを含む。この溶液０．３μｌをＭＡＬＤＩキャリアプレートに移し、乾燥試料を、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＶｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  ＳＴＲ  ＭＡＬＤＩ質量分析計により解析する。測定は、遅延抽出法による直線モードで行う。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計を用いて、例えば、質量分析計の測定ダイナミックレンジ内の濃度でこれらのペプチドが存在し、このために検出器飽和を回避する場合は、本発明の標準的なペプチドなどのペプチドを定量することができる。各ペプチドの測定するシグナルと濃度との間には特定の存在比が存在し、これは、ＭＡＬＤＩ質量分析法を、好ましくは、ペプチドの相対的な定量に用いうることを意味する。標準物質及び試料に由来するペプチドのシグナル強度を測定することができる。
【０１６３】
（実施例５）
ペプチドの同定
ペプチドからなる標準物質は、例えば、ｎａｎｏＳｐｒａｙ−ＭＳ／ＭＳを用いて同定することができる。これは、当業者に知られた方式で、特定のｍ／ｚ（質量／電荷）値に基づき、質量分析計内において選択される標準的なペプチドイオンを必要とする。次いで、この選択されたイオンを、衝突ガス、例えば、ヘリウム又は窒素による衝突エネルギーを供給することにより断片化し、結果として得られる標準ペプチドの断片を、質量分析計の統合解析ユニットにより検出し、対応するｍ／ｚ値を決定する（タンデム質量分析法の原理）。ペプチドの断片化挙動は、ペプチドの明確な同定を可能にする。この特殊事例では、米国、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ−Ｓｃｉｅｘ社製の四重極ＴＯＦ機である、ＱＳｔａｒ−Ｐｕｌｓａｒモデルを用いて、質量分析法による解析を行った。
【０１６４】
（実施例６）
データ解析
実施例３に述べた分画化に続き、実施例４に述べたＭＡＬＤＩ質量分析法により各分画を個別に解析する結果、各試料につき９６の質量スペクトルが得られる。これらの９６の質量スペクトルを、いわゆるペプチドディスプレイに電気的に統合する。これらのペプチドディスプレイのｘ軸が分子量を示し、ｙ軸が分画番号を示し、色強度が質量分析法によるシグナル強度を表す。
【０１６５】
解析グループ間の識別が可能な属性の同定（図１及び２を参照のこと）には、多重仮説検定手順を適用した。多重仮説検定は、ランクに基づく統計解析法であるＭａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定手順を用いて実行した。ランクに基づく方法の利点は、比較するシグナル強度について正規性を仮定しないことである。集めたクラスが、異なる個体特性を有する異なる個体からなるため、この方法が必要であり、正規性は予測されない。データの許容基準は、Ｕ検定のｐ値≦０．０１であった。
【０１６６】
１９１試料から産生したペプチドディスプレイを、１つの平均マスターペプチドディスプレイに統合した。この平均マスターペプチドディスプレイに基づき、ピーク認識及びシグナル座標の定義（分画及び質量）を実行した。各ディスプレイからシグナル強度をエクスポートしてシグナル座標の行列を生成した。次いで、グループ間において、ベースピーク強度のｐ値及び百分率を計算した。Ｐｉｒｏｕｅｔｔｅ  ３．１１ソフトウェア（企業名、国名、所在地名）を用いて、異常値検出及び主成分分析を行った。Ｍａｈａｌａｎｏｂｉｓの距離に関する臨界値を超える（＞１０）試料は、該分析から除外した。この手順の結果、ベースラインのノイズから識別された計９９６６シグナルが得られ、これを各ペプチドディスプレイの個別の特徴として後続の生物統計学的解析に用いた。
【０１６７】
ペプチドディスプレイのデータは、背景ノイズについて調整することによって予め加工することができ、異常値は解析から除外することができる。ペプチドディスプレイ間の差は、ペプチドディスプレイ同士を電子的に減じ合うことにより計算する。ペプチドの異なる濃度の検出は、異なる時間間隔にわたりインキュベートした血清試料又は血漿試料からの質量分析データ（シグナル強度）の比較、又は異なる濃度の１３ペプチド混合物でスパイクした血清試料又は血漿試料の比較により行う。血漿試料中に存在する他のペプチドに由来する何千ものシグナルから１３個の標準ペプチドを識別するため、相関解析を行った。異なる濃度の標準ペプチド混合物をスパイクした血漿試料により得られるペプチドディスプレイを、ｒ＝０．８の相関係数を用いる相関解析により比較した。標準ペプチドの濃度は試料ごとに極めて一様に変化するので（異なる濃度を異なる血清試料に加えたので）、この高相関係数ｒのみが結果として得られる。
【０１６８】
他の実施形態
本発明をその詳細な記載とともに述べてきたが、上記の記載は本発明の例示を目的とし、付属の特許請求の範囲が定義する本発明の適用範囲の制限を目的とするものではない。他の態様、利点、及び変更も、以下の特許請求の範囲内にある。
【図１】
2009537812.tif 000007
【図２】
2009537812.tif 000008
【図３−１】
2009537812.tif 000009
【図３−２】
2009537812.tif 000010
【図３−３】
2009537812.tif 000011
【図３−４】
2009537812.tif 000012
【図４−１】
2009537812.tif 000013
【図４−２】
2009537812.tif 000014
【図５】
2009537812.tif 000015
【図６−１】
2009537812.tif 000016
【図６−２】
2009537812.tif 000017
【図６−３】
2009537812.tif 000018
【図６−４】
2009537812.tif 000019
【図６−５】
2009537812.tif 000020
【図６−６】
2009537812.tif 000021
【国際調査報告】
2009537812.tif 000022
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