(57)【要約】  試料中のM. genitalium核酸検出方法を提供し、該方法は（ｉ）配列番号１（Mg219遺伝子）のフラグメントを含む核酸配列を増幅させる工程；および（ｉｉ）該増幅した核酸配列を検出する工程、を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のマイコプラズマ・ジェニタリウム核酸の検出方法であって：
（ｉ）配列番号１のフラグメントを含む核酸配列を増幅させる工程、および
（ｉｉ）該増幅した核酸配列を検出する工程、
を含む、方法。
【請求項２】
前記増幅工程が、前記試料とフォワードオリゴヌクレオチドプライマーおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマーとを接触させる工程を含み、該プライマーが、マイコプラズマ・ジェニタリウム核酸中の標的部位と、前記配列番号１のフラグメントを含む前記核酸配列の増幅を促進するのに適切な条件下で結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記フォワードプライマーが、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド−８０から４５０の間に位置する、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−７６から位置する（例えば、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−６０、−５５、−５３、−５０、−２５、−１０、１、２５、５１、１０１、１５１、２０１、２５１、３０１、３５１または４０１から位置する）、そして好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基４４７までに位置する（例えば、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基４５０、４２５、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０、２５、１、−５、−１０、−２５、−５０、−５４または−５５までに位置する）、標的部位と結合する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記フォワードプライマーが、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−２５から２５の間に位置する標的部位と、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖の残基−１１から１８によって規定される標的部位と結合する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記リバースプライマーが、配列番号１のヌクレオチド残基−５から＋５２５の間に位置する、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基−３から位置する（例えば、配列番号１のヌクレオチド残基１、１０、２５、４８、９８、１４８、１９８、２４８、２９８、３４８、３９８、＋４４８または＋５０３から位置する）、そして好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基＋５０２までに位置する（例えば、配列番号１のヌクレオチド残基４４７、３９７、３４７、２９７、２４７、１９７、１４７、９７、４７または２５までに位置する）、標的部位と結合する、請求項２から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記リバースプライマーが、配列番号１のヌクレオチド残基２００から２５０の間に位置する標的部位と、そして好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基２１４から２４０によって規定される標的部位と結合する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記フォワードオリゴヌクレオチドプライマーおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマーが、少なくとも５個のヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１０個のヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも２０個のヌクレオチド長であり、そして、好ましくは５０個以下のヌクレオチド長、より好ましくは４０個以下のヌクレオチド長、最も好ましくは３０個以下のヌクレオチド長である、請求項２から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記フォワードプライマーが、配列番号４、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または３１から選択される核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記リバースプライマーが、配列番号５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０から選択される核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記増幅した核酸配列が、ゲル電気泳動によって検出される、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１１】
前記検出工程が、
（ｉ）前記増幅した核酸配列とプローブとを接触させる工程であって、該プローブが、該増幅した核酸配列またはその相補体内の標的部位と結合する、工程；および
（ｉｉ）該プローブと該増幅した核酸配列との結合を検出する工程、
を含む、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
試料中のマイコプラズマ・ジェニタリウム核酸を検出する方法であって：
（ｉ）該試料とプローブとを接触させる工程であって、該プローブが、配列番号１またはその相補体内の標的部位と結合する、工程；および
（ｉｉ）該プローブと該標的部位との結合を検出する工程、
を含む、方法。
【請求項１３】
前記プローブが、配列番号１またはその相補体のヌクレオチド残基１〜４４７の間に位置する、好ましくは配列番号１またはその相補体のヌクレオチド残基１０から（例えば、配列番号１またはその相補体のヌクレオチド残基１５、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０または４００から）位置する、そして好ましくは配列番号１またはその相補体のヌクレオチド残基４４０まで（例えば、配列番号１またはその相補体のヌクレオチド残基４２０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００または５０から）に位置する、標的部位と結合する、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記プローブが、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基５０〜１００の間に位置する標的部位と、そして好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド６６〜８２によって規定される標的部位と結合する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記プローブが、オリゴヌクレオチドプローブである、請求項１１から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記プローブが、少なくとも５個のヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１０個のヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも１５個のヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも２０個のヌクレオチド長であり、そして該プローブが、５０個までのヌクレオチド長、好ましくは４０個までのヌクレオチド長、より好ましくは３０個までのヌクレオチド長である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記プローブが、配列番号３の核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記プローブが、配列番号３の核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有するその変異体からなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記プローブが、固体支持体またはプラットフォーム上に固定化される、請求項１１から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記プローブの結合が、検出可能なシグナルを提供し、そして前記検出工程が、該シグナルを検出する工程を含む、請求項１１から１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記検出可能なシグナルが、蛍光シグナルである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記プローブが、標識されている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記試料が、ヒト精液および／またはヒト卵子を含み；そして該シグナルの実質的な欠如が、試料中に実質的にマイコプラズマ・ジェニタリウム核酸がないこと、および該ヒト精液および／または卵子が体外受精に使用可能であることを示す、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項２４】
目的の試料中のマイコプラズマ・ジェニタリウム病原体負荷のインビトロでの定量方法であって、
（ａ）該目的の試料で、請求項１から２２のいずれかに記載の方法を実施する工程；および
（ｂ）所定の既知のマイコプラズマ・ジェニタリウム病原体負荷の試験試料で、請求項１から２２のいずれかに記載の方法を実施する工程；および
（ｃ）該目的の試料から検出されたシグナルを、該試験試料から検出されたシグナルと比較する工程；
を含み、そしてそれによって、該目的の試料中のマイコプラズマ・ジェニタリウム病原体負荷を定量する、
方法。
【請求項２５】
薬物治療期間の経過にわたる薬物効果のインビトロでの決定方法であって、
（ａ）該薬物治療期間内または前の最初の時点に得た第１の試料で、請求項１から２２のいずれかに記載の方法を実施する工程；
（ｂ）該薬物治療期間内の１以上の後の時点の試料で、請求項１から２２のいずれかに記載の方法を実施する工程；および
（ｃ）該第１の試料から検出されたシグナルを、該１以上の後の試料から検出されたシグナルと比較する工程；
を含み、そしてそれによって、該薬物治療期間の経過にわたる薬物効果を決定する、
方法。
【請求項２６】
マイコプラズマ・ジェニタリウムの薬物に対する耐性の発達のインビトロでの検出および／またはモニタリング方法であって、
（ａ）該マイコプラズマ・ジェニタリウムの該薬物への曝露の間またはその前の最初の時点に得た第１の試料で、請求項１から２２のいずれかに記載の方法を実施する工程；
（ｂ）該マイコプラズマ・ジェニタリウムの該薬物への曝露後の１以上の後の時点の試料で、請求項１から２２のいずれかに記載の方法を実施する工程；および
（ｃ）該第１の試料から検出されたシグナルを、該１以上の後の試料から検出されたシグナルと比較する工程；
を含み、該シグナルの減少がないことまたは該シグナルの増加が、該マイコプラズマ・ジェニタリウムが該薬物に対する耐性を発達させたことを示す、
方法。
【請求項２７】
前記いずれかの請求項に記載の方法で用いるプローブであって、前記増幅した核酸配列またはその相補体内、または配列番号１またはその相補体内の標的配列と結合する、プローブ。
【請求項２８】
前記プローブが、配列番号１またはその相補体のヌクレオチド残基１〜４４７の間に位置する、好ましくは配列番号１またはその相補体のヌクレオチド残基１０から（例えば、配列番号１またはその相補体のヌクレオチド残基１５、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０または４００から）位置する、そして好ましくは配列番号１またはその相補体のヌクレオチド残基４４０まで（例えば、配列番号１またはその相補体のヌクレオチド残基４２０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００または５０から）に位置する標的部位と結合する、請求項２７に記載のプローブ。
【請求項２９】
前記プローブが、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基５０〜１００の間に位置する標的部位と、そして好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド６６〜８２によって規定される標的部位と結合する、請求項２８に記載のプローブ。
【請求項３０】
前記プローブが、オリゴヌクレオチドプローブである、請求項２７から２９のいずれかに記載のプローブ。
【請求項３１】
前記プローブが、少なくとも５個のヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１０個のヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも１５個のヌクレオチド長であり、そして該プローブが、５０個までのヌクレオチド長、好ましくは４０個までのヌクレオチド長、より好ましくは３０個までのヌクレオチド長、より好ましくは２５個までのヌクレオチド長、最も好ましくは２０個までのヌクレオチド長である、請求項３０に記載のプローブ。
【請求項３２】
前記プローブが、配列番号３の核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項３０または３１に記載のプローブ。
【請求項３３】
前記プローブが、配列番号３の核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有するその変異体からなる、請求項３２に記載のプローブ。
【請求項３４】
前記プローブが、前記標的配列との結合に際して検出可能なシグナルを提供する、請求項２７から３３のいずれかに記載のプローブ。
【請求項３５】
前記検出可能なシグナルが、蛍光シグナルである、請求項３４に記載のプローブ。
【請求項３６】
前記プローブが、標識されている、請求項３５に記載のプローブ。
【請求項３７】
前記いずれかの請求項に記載の方法で用いるフォワードプライマーであって、（ｉ）配列番号１の相補体内、（ｉｉ）配列番号１の相補体に隣接する上流核酸配列内、または（ｉｉｉ）配列番号１の相補体および配列番号１の相補体に隣接する上流核酸配列と重複するかのいずれかに位置する標的部位と結合する、フォワードプライマー。
【請求項３８】
前記フォワードプライマーが、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド−８０から＋４５０の間に位置する、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−７６から位置する（例えば、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−６０、−５５、−５３、−５０、−２５、−１０、１、２５、５１、１０１、１５１、２０１、２５１、３０１、３５１または４０１から位置する）、そして好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基４４７までに位置する（例えば、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基４２５、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０、２５、１、−５、−１０、−２５、−５０、−５４または−５５までに位置する）、標的部位と結合する、請求項３７に記載のフォワードプライマー。
【請求項３９】
前記フォワードプライマーが、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−２５から２５の間に位置する標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖の残基−１１から１８によって規定される標的部位と結合する、請求項３８に記載のフォワードプライマー。
【請求項４０】
前記プライマーが、少なくとも５個のヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１０個のヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも１５個のヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも２０個のヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも２５個のヌクレオチド長であり、そして前記プローブが、５０個までのヌクレオチド長、好ましくは４０個までのヌクレオチド長、より好ましくは３０個までのヌクレオチド長である、請求項３７から３９のいずれかに記載のフォワードプライマー。
【請求項４１】
前記フォワードプライマーが、配列番号４、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または３１から選択される核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項３７から３９のいずれかに記載のフォワードプライマー。
【請求項４２】
前記いずれかの請求項に記載の方法で用いるリバースプライマーであって、該リバースオリゴヌクレオチドプライマーが、（ｉ）配列番号１内、（ｉｉ）配列番号１に隣接する下流核酸配列内、または（ｉｉｉ）配列番号１および配列番号１に隣接する下流核酸配列と重複するかのいずれかに位置する標的部位と結合する、リバースプライマー。
【請求項４３】
前記リバースプライマーが、配列番号１のヌクレオチド残基−５から＋５２５の間に位置する、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基−３から位置する（例えば、配列番号１のヌクレオチド残基１０、２５、４８、９８、１４８、１９８、２４８、２９８、３４８、３９８、＋４４８または＋５０３から位置する）、そして好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基＋５０２までに位置する（例えば、配列番号１のヌクレオチド残基４４７、３９７、３４７、２９７、２４７、１９７、１４７、９７、４７または２５までに位置する）、標的部位と結合する、請求項４２に記載のリバースプライマー。
【請求項４４】
前記リバースプライマーが、配列番号１のヌクレオチド残基２００から２５０の間に位置する標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基２１４から２４０によって規定される標的部位と結合する、請求項４３に記載のリバースプライマー。
【請求項４５】
前記プライマーが、少なくとも５個のヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１０個のヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも１５個のヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも２０個のヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも２５個のヌクレオチド長であり、そして前記プローブが、５０個までのヌクレオチド長、好ましくは４０個までのヌクレオチド長、より好ましくは３０個までのヌクレオチド長である、請求項４２から４４のいずれかに記載のリバースプライマー。
【請求項４６】
前記リバースプライマーが、配列番号５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０から選択される核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項４２から４５のいずれかに記載のリバースプライマー。
【請求項４７】
請求項３７から４１のいずれかに記載のフォワードプライマーおよび請求項４２から４６のいずれかに記載のリバースプライマーを含む、１対のオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項４８】
請求項２７から３６のいずれかに記載のプローブを含む、マイコプラズマ・ジェニタリウム核酸の検出のためのキット。
【請求項４９】
請求項３７から４１のいずれかに記載のフォワードプライマーをさらに含む、請求項４８に記載のキット。
【請求項５０】
請求項４２から４６のいずれかに記載のリバースプライマーをさらに含む、請求項４８または４９に記載のキット。
【請求項５１】
実施例および／または図１を参照して本明細書に実質的に記載された、試料中のマイコプラズマ・ジェニタリウム核酸を検出する方法。
【請求項５２】
図１を参照して本明細書に実質的に記載された、プローブ。
【請求項５３】
図１または２を参照して本明細書に実質的に記載された、フォワードプライマー。
【請求項５４】
図１または２を参照して本明細書に実質的に記載された、リバースプライマー。
【請求項５５】
図１または２を参照して本明細書に実質的に記載された、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイコプラズマ種、特に、マイコプラズマ・ジェニタリウム（Mycoplasma genitalium）の検出、ならびにそのための試薬およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
モリキューテス綱は、マイコプラズマ属、アコレプラズマ属およびウレアプラズマ属を含む、細胞壁を欠くグラム陽性菌を包含する。マイコプラズマだけで１００種以上あり、そしてモリキューテスの１７種は、ヒトフローラの一部と考えられている（M. pneumoniae、M. genitalium、M. fermentansおよびM. penetransを含む）。
【０００３】
ヒトおよび哺乳動物のマイコプラズマは、粘膜を含む細胞に感染し、そして厳格な宿主および組織特異性を有し得る。一例として、M. pneumoniaeによって感染される主な組織が気道であるのに対し、M. genitaliumは尿生殖路に主に感染する。
【０００４】
M. genitaliumは性感染し、感染率はクラミジア・トラコマチスと同様と考えられる。実際に、当該分野で働く臨床医は、M. genitaliumを「次のクラミジア」と表現している。M. genitaliumは、尿生殖路疾患、特に非淋菌性尿道炎（ＮＧＵ）における原因である。M. genitaliumは、女性の骨盤内炎症性疾患（ＰＩＤ）および不妊症にもまた関与している。M. genitaliumによる性器外感染は、例えば、気道内、眼内、および滑液中においてもまた生じ得、性感染性反応性関節炎（ＳＡＲＡ）に至る。
【０００５】
マイコプラズマ感染症の治療のために用いられる抗生物質は、テトラサイクリン、マクロライド−リンコサミドおよびフルオロキノロンに属する。これらの製品は、インビトロでマイコプラズマに対して高活性である。しかしながら、これらの抗生物質のいくつかは、種によって異なる活性を有し、そして主に性器マイコプラズマにおいて、獲得された耐性が報告されている。一例として、M. genitaliumは、クロラムフェニコール耐性である。大部分のマイコプラズマ感染症は、適した抗生物質を用いて治療されるが、それらは免疫抑制患者では治療が困難であり得る。
【０００６】
M. genitaliumのようなマイコプラズマは、その選好的な生育要件のためかつ選択マーカーの不在の結果として、古典的な遺伝子法によって研究することが非常に困難である。結果として、分離株を得ることは非常に困難であった。
【０００７】
さらに、M. pneumoniaeとM. genitaliumとの間の抗原的関連性のため交差反応が生じ、このことは、診断および疫学的研究のための血清学の使用を著しく妨げる。
【０００８】
マイコプラズマ検出のハイブリダイゼーションベースの技術には、ＤＮＡプローブの使用が包含される。一例として、M. genitalium 16S rRNAを標的とする放射性標識オリゴヌクレオチドプローブが記載されている。
【０００９】
M. genitalium感染の従来の診断方法（培養および血清学のような）を用いることで直面する問題のために、その病原性についての理解の遅れが生じている。ＰＣＲベースのアッセイの出現によって、広範囲にわたる臨床研究がやっと可能になった。
【００１０】
ＰＣＲは、その非常に高い感度のために、選好的なマイコプラズマの検出に特に有用なツールであることが判明している（Jensen, Dan. Med. Bull. 2006; 53: 1-27）。しかしながら、最近まで、この技術の主な欠点は市販キットがないことであった。
【００１１】
近年、M. genitalium MgPa遺伝子を増幅および検出するＰＣＲアッセイが開発されている（例えば、Jensenら、J. Clinical Microbiology、2004年2月、683〜692頁）。MgPa遺伝子は、宿主細胞への付着、特に上皮細胞（ヒト卵管のもののような）への付着の原因となる主要M. genitalium接着タンパク質をコードする。
【００１２】
アドヘシンのような表面成分の抗原変異による宿主免疫系の回避は、M. genitaliumのようなマイコプラズマが環境および選択圧の変化に適応することを可能にする。この抗原変異により、MgPa遺伝子のような表面タンパク質をコードする遺伝子の相当の配列変異に至る。したがって、表面タンパク質および対応する核酸の検出に依存する診断アッセイでは、いくつかの変異体を検出することができず、そのアッセイの感度を低下させる。
【００１３】
M. genitalium検出のための他の公開されたＰＣＲベースのアッセイは、16S rRNA遺伝子を目的とする（Yoshidaら、J. Clin. Microbiol. 2002: 40:1451-1455）。しかしながら、このアッセイの特異性および感度は、M. pneumoniaeおよびM. genitaliumの16S rRNA遺伝子間の高レベルの相同性、および16S rRNAの２次構造の優位性によって問題となっている。
【００１４】
ロックされた核酸プローブによるP115(MG299)遺伝子の検出を目的とする、LightCyclerアッセイもまた記載されている（Dupinら、Clin. Infect. Dis. 2003; 37:602-605）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、M. genitalium検出のための代替のおよび／または改良されたシステムを提供する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
第１の局面によれば、本発明は、試料中のM. genitalium核酸の検出方法を提供し、この方法は、（ｉ）配列番号１またはそのフラグメントを含む核酸配列を増幅させる工程、および（ｉｉ）該増幅した核酸配列を検出する工程、を含む。
【００１７】
第２の局面によれば、本発明は、試料中のM. genitalium核酸の検出方法を提供し、この方法は、（ｉ）該試料とプローブとを接触させる工程であって、該プローブが配列番号１またはその相補体内の標的配列と結合する、工程、および（ｉｉ）該プローブと該標的部位との結合を検出する工程、を含む。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、M. genitaliumに関する現存のＰＣＲベースの試験と比較して改良された特異性および感度を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】Mg219遺伝子（配列番号１）と、配列番号３のプローブと、配列番号４、８、または３１のフォワードプライマーと、そして配列番号５のリバースプライマーとの間の関係を図示する。
【図２】Mg219遺伝子（配列番号１）と、配列番号９〜１９のフォワードプライマーと、そして配列番号２０〜３０のリバースプライマーとの間の関係を図示する。
【図３】配列番号９および配列番号２０のプライマー配列を用いて最適アニーリング温度を決定するための勾配ＰＣＲの結果を図示する。
【図４】全遺伝子配列の全域にわたるオリゴヌクレオチドプライマーの範囲を用いた完全Mg219遺伝子の検出を図示する。
【図５】全遺伝子配列の全域にわたるオリゴヌクレオチドプライマーの範囲を用いた完全Mg219遺伝子の検出を図示する。
【図６】配列番号９および配列番号２０のプライマー対を用いた１２の培養M. genitalium株からのMg219の増幅を図示する。
【図７−１】M. genitalium株Ｇ３７に加えて１６の培養分離株由来のMg219遺伝子のアラインメントを示す。
【図７−２】図７−１の続きである。
【図７−３】図７−２の続きである。
【図７−４】図７−３の続きである。
【図７−５】図７−４の続きである。
【図８】図７に示したMg219配列間の配列同一性レベルを図示する、ClustalW多重配列アラインメントマトリックスである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
M. genitalium Mg219遺伝子（配列番号１）は、４４７ヌクレオチド長であり、機能の不明な１４８アミノ酸ポリペプチド（配列番号２）をコードする。
【００２１】
Mg219遺伝子（配列番号１）は、M. genitaliumの完全ゲノム（アクセッション番号NC_000908のM. genitalium G-37に詳述される）のヌクレオチド残基265596からヌクレオチド残基266042までに位置する。
【００２２】
Mg219は、Mg217、Mg218およびMg219遺伝子からなるオペロン中に見出され、Mg219の転写は、Mg217およびMg218から続く（Musatovova O.ら、FEMS Microbiol. Lett., 2003, 5, 229（1）73〜81頁）。Mg218は、チップ媒介接着に必要な高分子量細胞接着関連タンパク質をコードする。Mg219の機能はわかっていないが、M. genitaliumゲノムにおいてMg218に近接しているため、Mg219が接着性に関与し得る可能性がある。
【００２３】
すべての公開されたマイコプラズマ全ゲノム配列の本出願人による精査によって、Mg219遺伝子はM. genitalium以外のマイコプラズマ種にはホモログを有さないことが明らかになった。
【００２４】
さらに、公開された遺伝子およびタンパク質データベースを検索することによって、本出願人は、Mg219遺伝子と著しい相同性を有するどんな遺伝子も、またはコードされたMg219ポリペプチドと著しい相同性を有するどんなタンパク質も認めることができなかった。
【００２５】
これらの結果を、ORFANGEウエブベースプログラムを用いて確証した。これにより細菌ゲノム中で一度見られただけであり、他のゲノム中には見られない遺伝子が認められる。
【００２６】
したがって、本出願人は、Mg219遺伝子がM. genitaliumに特異的であり、そしてしたがって、試料中のM. genitaliumの識別に有用であることを予想外にも認めた。
【００２７】
性感染性疾患の検出および診断の分野において「偽陽性」結果の発生率をできる限り低く保つことは、患者、コストおよび不適切な治療の影響についての検査結果の慎重にすべき性質、および誤った結果を提供することの法的影響のために、特に重要である。
【００２８】
好都合に、Mg219遺伝子は、他のマイコプラズマ種、または他の公開された配列データベースにおいて配列ホモログを有さないため、Mg219核酸配列の検出に基づく本発明の検出アッセイは非常に特異的であり、「偽陽性」結果の発生率が非常に低い。
【００２９】
実施例（後述）で例示するように、本発明の１つの実施態様による検出アッセイを、本出願人がすべての公知のヒトモリキューテス、いくつかの他の細菌種および病原性微生物由来のＤＮＡに対して試験したとき、本アッセイによってM. genitaliumを検出しただけであった。したがって、本アッセイの高度な特異性を例示する。
【００３０】
本発明で検出される標的Mg219遺伝子はまた、M. genitaliumの異種株間で保存されるため、有利な標的遺伝子でもある。したがって、本発明のアッセイは、これまでのアッセイで試験されてきたM. genitaliumのすべての公知の株を有利に検出する。
【００３１】
試料は、例えば、食物、下水道、環境、獣医学または臨床の試料であり得る。１つの局面では、本方法は、臨床試料中のM. genitaliumの検出に用いられ得る。
【００３２】
臨床試料としては、動物由来の、特にヒト由来の、尿道スワブ、膣スワブ、子宮頚部スワブ、直腸スワブ、陰茎スワブ、咽喉／口腔スワブ、尿、血液、気道試料、滑液、脳脊髄液、液体ベースの細胞学試料、組織生検、潰瘍試料、結膜炎試料および任意の他の試料が挙げられ得る。１つの局面では、試料は、精液または卵子を含み得る。
【００３３】
したがって、１つの局面では、本発明の方法は、M. genitalium核酸を増幅させる工程を含む。
【００３４】
本願においては、「増幅した核酸配列」および「アンプリコン」の表現が互換可能に用いられ、同様の意味を有する。
【００３５】
特に、１つの局面では、本発明の方法は、配列番号１を含む核酸配列を増幅させる工程を含む。増幅した核酸配列（アンプリコン）は、配列番号１からなり得る。
【００３６】
１つの局面では、本発明の方法は、配列番号１のフラグメントを含む核酸配列を増幅させる工程を含む。増幅した核酸配列（アンプリコン）は、配列番号１のフラグメントからなり得る。
【００３７】
あるいは、アンプリコンは、配列番号１のフラグメント、およびまたM. genitaliumゲノム中で配列番号１の上流または下流に位置する１以上の付加ヌクレオチドを含み得る。
【００３８】
配列番号１のフラグメントは、好ましくは配列番号１の少なくとも１０個連続したヌクレオチドであり、そしてより好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも５０個であり、そして配列番号１の少なくとも７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５または４００個のヌクレオチドであり得る。配列番号１のフラグメントは、好ましくは配列番号１の４４０個までの連続したヌクレオチドであり、より好ましくは４２５個まで、より好ましくは４００個まで、そして配列番号１の３７５、３５０、３２５、３００、２７５、２５０、２２５、２００、１７５、１５０、１２５、１００、７５、５０または２５個までのヌクレオチドであり得る。
【００３９】
特定の例では、アンプリコンは、M. genitaliumゲノム中の配列番号１の１１位上流に位置するヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチド−１１位）から配列番号１の２４０位のヌクレオチドにわたる連続したヌクレオチドの伸長を含み得る。したがって、この特定の例では、アンプリコンは、配列番号１のヌクレオチド１から配列番号１のヌクレオチド２４０までの、配列番号１の２４０個のヌクレオチドフラグメント（加えて、M. genitaliumゲノム中の配列番号１の上流の１１個のヌクレオチド）を含む。
【００４０】
増幅は、当該分野で公知の方法によって、好ましくはＰＣＲによって行われ得る。本発明の増幅工程の実施に適したＰＣＲプラットフォームの例としては、Rotor-gene、LightCyclerおよびTaqmanプラットフォームなどのリアルタイムプラットフォームが挙げられる。
【００４１】
１つの局面では、M. genitalium核酸の増幅は、１対の配列特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いて行われ、このプライマーは、M. genitalium核酸中の標的部位と結合する。適切な条件下で、プライマーは伸長し、核酸合成を生じる。当業者であれば、配列番号１のフラグメントを含む核酸配列の増幅を促進するための適切な条件を決定することができる。
【００４２】
疑いの回避のために、本発明に関しては、オリゴヌクレオチドプライマーの定義は、全長Mg219遺伝子（またはその相補体）を含まない。
【００４３】
本発明のプライマーは、Primer Express（Applied Biosystems）のような従来のソフトウエアを用いて、所望のパラメータの選択に基づいて、標的遺伝子配列と結合するように設計される。この点で、結合条件は、高レベルの特異性が提供されるようなものであることが好ましい。プライマーの融解温度（Ｔｍ）は、好ましくは５０℃を上回り、そして最も好ましくは約６０℃である。本発明のプライマーは、好ましくは標的M. genitalium核酸と結合するが、好ましくは自己相補性および二量体形成（プライマーとプライマーとの結合）を最小化するように選抜される。
【００４４】
プライマー対は、フォワードオリゴヌクレオチドプライマーおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマーを含む。
【００４５】
フォワードプライマーは、標的M. genitalium核酸の相補（すなわち、アンチセンス）鎖と結合し、そしてリバースプライマーは、標的M. genitalium核酸のコーディング（センス）鎖と結合する。
【００４６】
フォワードオリゴヌクレオチドプライマーおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマーは、代表的に少なくとも５個のヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１０個のヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個のヌクレオチド長である。好ましくは、プライマーは６０個までのヌクレオチド長、好ましくは５５個までのヌクレオチド長、より好ましくは５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５または１０個までのヌクレオチド長である。
【００４７】
１つの局面では、フォワードプライマーおよび／またはリバースプライマーは、約５０〜５５個のヌクレオチド長である。１つの局面では、フォワードプライマーおよび／またはリバースプライマーは、約２０〜２５個のヌクレオチド長である。１つの局面では、フォワードプライマーおよび／またはリバースプライマーは、約２５〜３０個のヌクレオチド長である。１つの局面では、フォワードプライマーは約２９個のヌクレオチド長であり、そしてリバースプライマーは約２７個のヌクレオチド長である。より短いプライマーを用いることは、これが標的核酸とのより早いアニーリングを可能にするので有利である。
【００４８】
フォワードプライマーは、M. genitalium核酸内の標的部位と結合する。この標的部位は、配列番号１の相補体に位置し得る−すなわち、標的部位は、配列番号１の相補体のヌクレオチド１とヌクレオチド４４７との間に位置し得る。
【００４９】
「配列番号１の相補体の（例えば）ヌクレオチド残基１と４４７との間の標的部位」とは、標的部位が列挙された残基間にわたるものであるか、または列挙された残基によって定義されるものであることを意味するわけではない。したがって、フォワードプライマーについての標的部位は、４４７個のヌクレオチド長であり得、または、列挙されたヌクレオチド残基の範囲内のどこかに位置する限り、４４７個よりもより短い、より一層著しく短いヌクレオチド長（例えば、約２００、１００、７５、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０個までのヌクレオチド長）でもあり得る。
【００５０】
１つの局面では、フォワードプライマーの標的部位は、約５０〜５５個のヌクレオチド長である。１つの局面では、フォワードプライマーの標的部位は、約２５〜３０個のヌクレオチド長であり、好ましくは約２９個のヌクレオチド長である。
【００５１】
あるいは、フォワードプライマーについてのM. genitalium核酸内の標的部位は、M. genitaliumゲノム中の配列番号１の相補体に隣接する上流核酸配列内に位置し得る。
【００５２】
配列番号１は、M. genitaliumの完全ゲノム（アクセッション番号NC_000908のM. genitalium G-37に詳述される）のヌクレオチド残基265596からヌクレオチド残基266042までに位置する。したがって、M. genitaliumゲノム中の配列番号１の相補体の上流に位置する核酸配列は、ヌクレオチド番号1〜265595を有する。
【００５３】
あるいは、フォワードプライマーは、配列番号１の相補体およびM. genitaliumゲノム中の配列番号１の相補体に隣接する上流核酸配列と重複する標的部位と結合し得る。
【００５４】
上流ヌクレオチドは、一般的に負の番号を用いて称される。一例として、M. genitaliumゲノム中の配列番号１の相補体の先頭から１１残基上流のヌクレオチド残基（すなわち、完全M. genitaliumゲノムのヌクレオチド残基265585）は、「ヌクレオチド−１１」と称される。
【００５５】
M. genitaliumゲノム中の配列番号１から上流に位置する６０ヌクレオチド残基の核酸配列（すなわち、配列番号１のヌクレオチド−６０から−１）は、配列番号６によって表される。したがって、配列番号６のヌクレオチド残基番号１は、配列番号１のヌクレオチド残基番号−６０であり、配列番号６のヌクレオチド残基番号６０は、配列番号１のヌクレオチド残基番号−１である。
【００５６】
１つの局面では、フォワードプライマーは、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド−８０から＋４５０の間に位置する標的部位と結合する。ヌクレオチド残基のこの範囲内で、フォワードプライマーについての標的部位は、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−７６から位置し、そして、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−６０、−５５、−５３、−５０、−２５、−１０、１、２５、５１、１０１、１５１、２０１、２５１、３０１、３５１または４０１から位置し得る。好ましくは、フォワードプライマーについての標的部位は、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基４４７までに位置し、そして、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基４２５、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０、２５、１、−５、−１０、−２５、−５０または−５５までに位置し得る。
【００５７】
１つの局面では、フォワードプライマーは、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−２５から２５の間に位置する標的部位と結合する。好ましくは、フォワードプライマーについての標的部位は、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−２０、−１５、−１４、−１３または−１２から、そしてヌクレオチド残基２２、２０または１９までに位置する。
【００５８】
１つの局面では、フォワードプライマーについての標的部位は、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−１１から１８によって規定される。この標的領域は、配列番号６と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基５０〜６０、その後に続く配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基１〜１８からなる。
【００５９】
いかなる疑いも回避するために、配列番号１（および上流配列、配列番号６）の相補鎖の核酸残基に適用される上記番号付けシステムは、それらが相補的である配列番号１（および上流配列、配列番号６）の核酸の番号付けに基づく。
【００６０】
リバースプライマーは、M. genitalium核酸内の標的部位と結合する。この標的部位は、配列番号１内に位置し得る。すなわち、標的部位は、配列番号１のヌクレオチド１とヌクレオチド４４７との間に位置し得る。
【００６１】
「配列番号１の（例えば）ヌクレオチド残基１と４４７との間の標的部位」とは、標的部位が列挙された残基間にわたるものであるか、または列挙された残基によって定義されるものであることを意味するわけではない。したがって、リバースプライマーについての標的部位は、４４７個のヌクレオチド長であり得、または、列挙されたヌクレオチド残基の範囲内のどこかに位置する限り、４４７個よりもより短い、より一層著しく短いヌクレオチド長（例えば、２００、１００、７５、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１５個までのヌクレオチド長）でもあり得る。
【００６２】
１つの局面では、リバースプライマーについての標的部位は、約５０〜５５個のヌクレオチド長である。１つの局面では、リバースプライマーについての標的部位は、約２５〜３０個のヌクレオチド長であり、好ましくは約２７個のヌクレオチド長である。
【００６３】
あるいは、M. genitalium核酸内のリバースプライマーについての標的部位は、M. genitaliumゲノム中の配列番号１に隣接する下流核酸配列内に位置し得る。
【００６４】
配列番号１は、M. genitaliumの完全ゲノム（アクセッション番号NC_000908のM. genitalium G-37に詳述される）のヌクレオチド残基265596からヌクレオチド残基266042までに位置する。したがって、M. genitaliumゲノム中の配列番号１の下流に位置する核酸配列は、ヌクレオチド番号266043から580074を有する。
【００６５】
あるいは、リバースプライマーは、配列番号１およびM. genitaliumゲノム中の配列番号１に隣接する下流核酸配列と重複する標的部位と結合し得る。
【００６６】
下流ヌクレオチドは、配列番号１の最後のヌクレオチド番号（残基４４７）から続く正の番号を用いて称される。一例として、M. genitaliumゲノム中の配列番号１の終末端から２０残基下流に位置するヌクレオチド残基（すなわち、完全M. genitaliumゲノムのヌクレオチド残基266063）は、「ヌクレオチド＋４６７」（すなわち、４４７＋２０＝４６７）と称される。
【００６７】
M. genitaliumゲノム中の配列番号１から下流に位置する５３ヌクレオチド残基の核酸配列（すなわち、配列番号１のヌクレオチド＋４４８から＋５００）は、配列番号７によって表される。したがって、配列番号７のヌクレオチド残基番号１は、配列番号１のヌクレオチド残基番号＋４４８であり、配列番号７のヌクレオチド残基番号５３は、配列番号１のヌクレオチド残基番号＋５００である。
【００６８】
本発明の１つの局面では、リバースプライマーは、配列番号１のヌクレオチド残基−５から＋５２５の間の標的部位と結合する。ヌクレオチド残基のこの範囲内で、リバースプライマーについての標的部位は、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基−３から位置し、そして、配列番号１のヌクレオチド残基１、１０、２５、４８、９８、１４８、１９８、２４８、２９８、３４８、３９８、＋４４８または＋５０３から位置し得る。好ましくは、ヌクレオチド残基のこの範囲内で、リバースプライマーについての標的部位は、配列番号１のヌクレオチド残基＋５０２までに位置し、そして、配列番号１のヌクレオチド残基４４７、３９７、３４７、２９７、２４７、１９７、１４７、９７、４７または２５までに位置し得る。
【００６９】
１つの局面では、リバースプライマーは、配列番号１のヌクレオチド残基２００から２５０の間の標的部位と結合する。ヌクレオチド残基のこの範囲内で、リバースプライマーについての標的部位は、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基２０５、２１０、２１１、２１２または２１３から、そして配列番号１のヌクレオチド残基２４５、２４４、２４３、２４２または２４１までに位置する。１つの局面では、リバースプライマーは、配列番号１の残基２１４から２４０によって規定される標的領域と結合する。
【００７０】
増幅した核酸配列（アンプリコン）は、好ましくは少なくとも１０個のヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも２０個のヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも４０個のヌクレオチド長であり、そして少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５または４００個のヌクレオチド長であり得る。アンプリコンは、好ましくは４４０個までのヌクレオチド長、好ましくは４２５個までのヌクレオチド長、より好ましくは４００個までのヌクレオチド長であり、そして３７５、３５０、３２５、３００、２７５、２５０、２２５、２００、１７５、１５０、１２５、１００、７５、５０、４０または２０個までのヌクレオチド長であり得る。１つの局面では、アンプリコンは、約２２５〜２７５個のヌクレオチド長、好ましくは約２５１個のヌクレオチド長である。
【００７１】
以下の表に示す配列番号４、８または３１から選択されるフォワードプライマーを用いて、特に好適な結果が得られた。これらは、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−１１から１８によって規定された標的部位と結合する。
【００７２】
【表１】
2009538125.tif 000002
【００７３】
以下の表に示す配列番号９〜１９から選択されたフォワードプライマーを用いて、特に好適な結果が得られた（実施例４もまた参照のこと）。
【００７４】
【表２】
2009538125.tif 000003
【００７５】
以下の表に示す配列番号５のリバースプライマーを用いて、特に好適な結果が得られた。これらは、配列番号１のヌクレオチド残基２１４から２４０によって規定された標的部位と結合する。
【００７６】
【表３】
2009538125.tif 000004
【００７７】
以下の表に示す配列番号２０〜３０から選択されたリバースプライマーを用いて、特に好適な結果が得られた（実施例４もまた参照のこと）。
【００７８】
【表４】
2009538125.tif 000005
【００７９】
しかしながら、上述のプライマー配列と１以上のヌクレオチドが異なる変異体が用いられ得ることが理解される。この点について、同類置換が好ましい。
【００８０】
したがって、１つの局面では、フォワードプライマーは、配列番号４、８〜１９または３１から選択される配列と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００８１】
したがって、１つの局面では、リバースプライマーは、配列番号５、または配列番号２０〜３０から選択される配列と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００８２】
好ましくは、フォワードプライマーは、配列番号４、８〜１９または３１から選択される配列と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する核酸配列からなる。
【００８３】
好ましくは、リバースプライマーは、配列番号５、または配列番号２０〜３０から選択される配列と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する核酸配列からなる。
【００８４】
上述のプライマー配列のフラグメントもまた用いられ得る。
【００８５】
好ましくは、配列番号４、８および３１のフォワードプライマーのフラグメントは、該プライマー配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチド、より好ましくは該プライマー配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６または２７個の連続したヌクレオチドを含み、そして該プライマー配列の２８個までの連続したヌクレオチドを含み得る。
【００８６】
好ましくは、配列番号５のリバースプライマーのフラグメントは、該プライマー配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチド、より好ましくは該プライマー配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４または２５個の連続したヌクレオチドを含み、そして該プライマー配列の２６個までの連続したヌクレオチドを含み得る。
【００８７】
好ましくは、配列番号９および２０のプライマーのフラグメントは、該プライマー配列の少なくとも１０個の連続したヌクレオチド、より好ましくは該プライマー配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１個の連続したヌクレオチドを含み、そして該プライマー配列の２２個までの連続したヌクレオチドを含み得る。
【００８８】
好ましくは、配列番号１０〜３０のプライマーのフラグメントは、該プライマー配列の少なくとも３０個の連続したヌクレオチド、より好ましくは該プライマー配列の少なくとも３５、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７または４８個の連続したヌクレオチドを含み、そして該プライマー配列の４９個までの連続したヌクレオチドを含み得る。
【００８９】
本発明の方法では、配列番号４、８〜１９または３１から選択される任意のフォワードプライマー（またはそのフラグメント、またはそれと上述したような同一性％を有するその変異体）が、配列番号５または２０〜３０から選択される任意のリバースプライマー（またはそのフラグメント、またはそれと上述したような同一性％を有するその変異体）と組み合わせて用いられ得る。
【００９０】
１つの局面では、方法は、配列番号４、８または３１のフォワードプライマーおよび配列番号５のリバースプライマー（またはそれらのフラグメント、またはそれらと上述したような同一性％を有するそれらの変異体）を用い得る。
【００９１】
１つの局面では、方法は、配列番号９のフォワードプライマーおよび配列番号２０のリバースプライマー（またはそれらのフラグメント、またはそれらと上述したような同一性％を有するそれらの変異体）を用い得る。
【００９２】
これらのプライマーの少なくとも１つが副溝結合剤（ＭＧＢ）成分を含むことは必要に応じる。
【００９３】
検出工程は、任意の公知の方法によって実施され得る。１つの局面では、増幅した核酸配列は、ゲル電気泳動を含む方法によって検出される。
【００９４】
あるいは、または加えて、増幅した核酸配列を検出する工程は、該増幅した核酸配列とプローブとを接触させる工程であって、該プローブが、該増幅した核酸配列またはその相補体内の標的部位と結合する、工程、および該プローブと該増幅した核酸配列との結合を検出する工程を含み得る。
【００９５】
本発明の方法での使用に適したプローブは、M. genitalium核酸に特異的に結合するリガンドである。このようなリガンドは、オリゴヌクレオチドリガンドまたはタンパク質リガンド（例えば、抗体）であり得る。しかしながら、プローブがオリゴヌクレオチドプローブであることが好ましい。
【００９６】
疑いの回避のために、本発明に関しては、オリゴヌクレオチドプローブの定義は、全長Mg219遺伝子（またはその相補体）を含まない。
【００９７】
プローブは、従来のソフトウエアを用いて、所望のパラメータの選択に基づいて、標的遺伝子配列（すなわち、アンプリコン内、または配列番号１内）と結合するように設計される。結合条件は、高レベルの特異性が提供されるようなものである（すなわち、結合が「ストリンジェントな条件」下で生じる）ことが好ましい。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにて、特定の配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低いように選択される。Ｔｍは、（規定されたイオン強度およびｐＨ下で）標的配列の５０％が完全にマッチしたプローブと結合する温度である。この点で、本発明のプローブのＴｍは、ｐＨ７で約０．０２Ｍ以下の塩濃度で、好ましくは６０℃を上回り、より好ましくは約７０℃である。結合溶液のプレミックスが入手可能であり（例えば、CLONTECH Laboratories, Incからの、EXPRESSHYBハイブリダイゼーション溶液）、そして結合は製造者の使用説明書に従って行われ得る。あるいは、当業者は、これらの結合条件のバリエーションを考案し得る。
【００９８】
結合の後、ストリンジェントな（好ましくは高ストリンジェントな）条件下で洗浄し、未結合の核酸分子を除去する。代表的なストリンジェント洗浄条件としては、０．５〜２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの溶液中で５５〜６５℃にての洗浄が挙げられる。代表的な高ストリンジェントな洗浄条件としては、０．１〜０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの溶液中で５５〜６５℃にての洗浄が挙げられる。当業者は、例えば洗浄溶液中のＳＳＣの代わりにＳＳＰＥを用いることによって、同等の条件を容易に考案し得る。
【００９９】
プローブは、自己相補性および二量体形成（プローブとプローブとの結合）を最小化するように選抜されることが好ましい。本発明の好ましいプローブは、ヒトＤＮＡと最小の相同性を有するように選択される。選択プロセスは、候補プローブ配列とヒトＤＮＡとを比較する工程、および相同性が５０％よりも大きい場合にプローブを排除する工程を含み得る。この選択プロセスの目的は、夾雑するヒトＤＮＡ配列へのプローブのアニーリングを減少させ、したがってアッセイの改良された特異性を認めることである。
【０１００】
１つの実施態様において、副溝結合剤（ＭＧＢ）のプローブへの結合は、核酸２重鎖を安定させ、オリゴヌクレオチドＴｍ（２重鎖が分離する温度）の望ましい増加を生じる。このＴｍの増加は、別の場合で可能であるよりも相当に短いプローブが用いられることを可能にする。
【０１０１】
１つの局面では、オリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも５個のヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも１０個のヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも１２、１３、１４、１５または１６個のヌクレオチド長である。好ましくは、プローブは、５０個までのヌクレオチド長、より好ましくは３０個までのヌクレオチド長、そしてより好ましくは２０、１９または１８個までのヌクレオチド長である。より短いプローブの使用は、これが標的M. genitalium核酸とのより速いアニーリングを可能にするので、利点である。
【０１０２】
核酸配列の相補体は、その核酸配列と相補塩基対合を経て結合する。本発明では、「相補鎖」は、センス鎖と相補塩基対合を経て結合するアンチセンス核酸鎖を意味する。
【０１０３】
したがって、１の局面では、プローブは、標的M. genitalium核酸のコーディング（センス）鎖内（すなわち、配列番号１内）の標的配列と結合する。他の局面では、プローブは、標的M. genitalium核酸の相補非コーディング（アンチセンス）鎖内（すなわち、配列番号１の相補体内）の標的配列と結合する。
【０１０４】
プローブが結合する標的部位は、配列番号１内、または配列番号の相補体内のどこにでも位置し得る。試料中の核酸があらかじめ増幅されていれば、プローブは、その増幅した核酸配列またはその相補体内の標的部位と結合する。
【０１０５】
したがって、１つの局面では、プローブは、配列番号１またはその相補体の残基１および４４７の間のどこかに位置する標的部位と結合する。この点について、「配列番号１またはその相補体の（例えば）残基１と４４７との間の標的部位」とは、標的部位が列挙された残基間にわたるものであるか、または列挙された残基によって定義されるものであることを意味するわけではない。したがって、標的部位は、４４７個のヌクレオチド長であり得、または４４７個よりもより短い、より一層著しく短いヌクレオチド長（例えば、２００、１００、７５、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１５または１０個までのヌクレオチド長）でもあり得る。
【０１０６】
したがって、１つの局面では、プローブは、配列番号１またはその相補体の核酸残基１〜４４７の間の標的部位と結合する。ヌクレオチド残基のこの範囲内で、プローブについての標的部位は、好ましくは配列番号１またはその相補体のヌクレオチド残基１０から、より好ましくは配列番号１またはその相補体のヌクレオチド残基１５から位置し、そして配列番号１またはその相補体のヌクレオチド残基２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０または４００から位置し得る。ヌクレオチド残基のこの範囲内で、プローブについての標的部位は、好ましくは配列番号１またはその相補体のヌクレオチド残基４４０まで、より好ましくはヌクレオチド残基４２０までに位置し、そして配列番号１またはその相補体の残基４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００または５０までに位置し得る。
【０１０７】
１つの局面では、プローブは、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基５０から１００の間に位置する標的領域と結合する。好ましくは、プローブについての標的部位は、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基５５、６０、６３、６４または６５から、そしてヌクレオチド残基９０、８５、８４または８３までに位置する。最も好ましくは、プローブについての標的部位は、配列番号１と相補的な核酸鎖の残基６６〜８２によって規定される。
【０１０８】
疑いの回避のために、配列番号１の相補鎖の核酸残基に適用される上記番号付けシステムは、それらが相補的である配列番号１の核酸の番号付けに基づく。
【０１０９】
以下の表に示す、配列番号３の核酸配列からなるプローブを用いて、好適な結果が得られた。
【０１１０】
【表５】
2009538125.tif 000006
【０１１１】
しかしながら、上述のプローブ配列と１以上のヌクレオチドが異なる変異体が用いられ得ることが理解される。この点について、同類置換が好ましい。
【０１１２】
したがって、１つの局面では、プローブは、配列番号３と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１１３】
１つの局面では、プローブは、配列番号３と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する核酸配列からなる。
【０１１４】
変異型プローブ配列を規定するための代替手段は、変異型配列と本発明のプローブ配列との間の異なるヌクレオチド数を規定することによる。この点について、本発明は、６ヌクレオチド以下、好ましくは５ヌクレオチド以下、好ましくは４ヌクレオチド以下、より好ましくは３ヌクレオチド以下、さらに好ましくは２ヌクレオチド以下、最も好ましくは１ヌクレオチド以下が配列番号３と異なるプローブ配列を包含する。
【０１１５】
上述のプローブ配列のフラグメントもまた用いられ得、ここで、フラグメントは、配列番号３の少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１１、１２、１３、１４、１５または１６個連続したヌクレオチドを含む。
【０１１６】
１つの局面では、プローブは、固体支持体またはプラットフォーム上に固定化され得る。支持体は、例えば、ガラスまたはプラスチックからなる堅い固体支持体であり得、あるいは、支持体は、ナイロン膜またはニトロセルロース膜、または他の膜であり得る。３Ｄマトリックスは、本発明で用いるのに適切な支持体である（例えば、ポリアクリルアミドまたはＰＥＧゲル）。１つの実施態様では、固体支持体はビーズの形状であり得、これは、サイズまたはフルオロホアによって分類され得る。
【０１１７】
プローブは、種々の手段によって固体支持体に固定化され得る。一例として、プローブは、ＵＶ架橋によってナイロン膜上に固定化され得る。ビオチン標識プローブは、ストレプトアビジンコートされた基質と結合し得、そしてアミノリンカーによって調製されたプローブは、シラン処理された表面上に固定化され得る。
【０１１８】
プローブ固定化の別の手段は、（好ましくは３’末端にて）ポリＴテールを介する。ポリＴテールは、末端転移酵素でプローブの３’末端に付加される１から１００までのチミン残基の連続物からなる。好ましくは、１から２０までのチミン残基が付加される。ポリＴテールは、次いで、固体基材上に焼成またはＵＶ架橋される。さらに、ポリＴテールの付加は２つの機能を有するようである。第１に、ポリＴテールは、固体支持体上に固定化されるプローブの量を増加させる。第２に、ポリＴテールは、ハイブリダイゼーションの効率を改良するような方法に、プローブを適合させる。
【０１１９】
プローブが副溝結合剤（ＭＧＢ）成分を含むことは必要に応じる。
【０１２０】
１つの局面では、プローブのM. genitalium核酸との結合は、検出可能なシグナルを提供し、このシグナルは、公知の手段によって検出され得る。検出可能なシグナルは、例えば、放射性シグナルまたは蛍光シグナル（例えば、蛍光の変化）であり得る。
【０１２１】
１つの実施態様では、プローブが標識され、そしてアッセイは、標識を検出する工程および標識の存在をM. genitalium核酸の存在と相関させる工程を含む。標識は、放射性標識であり得るが、好ましくは非放射性である（例えば、蛍光性標識）。一例として、標識は、ジゴキシゲニンまたはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）であり得る。
【０１２２】
標識は、直接（写真またはＸ線フィルムへの露出によるなど）または間接的（例えば、２相システムで）に検出され得る。間接的標識検出の一例は、抗体の標識への結合である。別の局面では、プローブは、ビオチンで標識され、そして、検出可能なシグナルを生成する、検出可能な分子または酵素と結合したストレプトアビジンを用いて検出される。
【０１２３】
１つの局面では、方法は、プローブとその標的配列との結合を検出する前に、M. genitalium核酸を増幅させる工程を含む。試料が少量であるおよび／またはＤＮＡ配列の不均質の集まりを含む場合、標的ヒト乳頭腫ウイルス核酸を増幅させることが望ましいものであり得る。
【０１２４】
最も好ましくは、増幅工程は、核酸とプローブとを接触させる前に行われる。
【０１２５】
M. genitalium核酸の増幅は、好ましくは上述のように行われる。この点について、増幅は、好ましくは、試料と上述のようなフォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマーとを接触させることによって行われる。該プライマーは、プローブが配列番号１内で結合する標的配列を少なくとも含む核酸配列の増幅を促進するのに適切な条件下で、M. genitalium核酸中の標的部位と結合する。
【０１２６】
本発明は、病原体負荷の推定量を決定することを可能にする。病原体負荷の決定は、臨床指針および治療法の決定などの多くの有用な用途を有する。
【０１２７】
したがって、１つの局面では、本発明は、目的の試料中のM. genitalium病原体負荷の定量方法を提供し、該方法は、（ａ）該目的の試料で、本発明による検出方法を実施する工程；および（ｂ）所定の既知のM. genitalium病原体負荷の試験試料で、該方法を実施する工程；および（ｃ）該目的の試料から検出されたシグナルを、該試験試料から検出されたシグナルと比較する工程；を含み、そしてそれによって、該目的の試料中のM. genitalium病原体負荷を定量する。
【０１２８】
別の局面では、本発明の方法は、ある期間にわたる治療の経過（例えば、薬物治療の経過）の効果を決定するのに有用である。
【０１２９】
したがって、１つの局面では、本発明は、薬物治療期間の経過にわたる薬物効果のインビトロでの決定方法を提供し、該方法は、（ａ）該薬物治療期間内または前の最初の時点に得た第１の試料で、本方法を実施する工程；（ｂ）該薬物治療期間内の１以上の後の時点の試料で、本方法を実施する工程；および（ｃ）該第１の試料から検出されたシグナルを、該１以上の後の試料から検出されたシグナルと比較する工程；を含み、そしてそれによって薬物治療の期間の経過にわたる薬物効果を決定する。
【０１３０】
１つの局面では、本発明の方法は、ある期間にわたる薬物（例えば、M. genitaliumに対する抗生物質などの抗菌性物質）に対する耐性の発達の検出および／またはモニタリングに有用である。
【０１３１】
したがって、１つの局面では、本発明は、M. genitaliumの薬物に対する耐性の発達のインビトロでの検出および／またはモニタリング方法を提供し、該方法は、（ａ）該M. genitaliumの該薬物への曝露の間またはその前の最初の時点に得た第１の試料で、本方法を実施する工程；（ｂ）該M. genitaliumの該薬物への曝露後、１以上の後の時点の試料で、本方法を実施する工程；および（ｃ）該第１の試料から検出されたシグナルを、該１以上の後の試料から検出されたシグナルと比較する工程；を含み、ここで、該シグナルの減少がないことまたは該シグナルの増加が、該M. genitaliumが薬物に対する耐性を発達させたことを示す。
【０１３２】
１つの局面では、本発明の方法は、M. genitaliumの有無を確認する、人工授精前のヒト精液および／またはヒト卵子のスクリーニングに有用である。この点について、M. genitalium感染がないことの確認は、ＩＶＦ治療の前に必要であり得る。したがって、本発明の方法は、M. genitaliumが体外受精（ＩＶＦ）治療を受けている患者に感染する危険性を有利に減少させる（そして好ましくは実質的に排除する）。
【０１３３】
したがって、１つの局面では、本発明は、M. genitaliumについてのヒト精液および／または卵子を含む試料のインビトロでのスクリーニング方法を提供し、該方法は、本検出方法を実施する工程を含み；ここで、シグナルがないことが試料中にM. genitaliumがないことを示す。
【０１３４】
本発明の検出方法は、ＩＶＦ治療を受けている人および代理母のM. genitalium感染についてのスクリーニングにもまた有用であり得る。
【０１３５】
本発明の検出方法は、M. genitalium感染についての職業上のスクリーニングにもまた有用であり得る。本発明の検出方法は、法医学試験（例えば、逮捕、性的暴力または児童虐待事件における）にもまた有用であり得る。
【０１３６】
本発明は、本発明の上述の方法で用いる試薬もまた提供する。
【０１３７】
したがって、本発明は、本発明に従って用いる上述のようなフォワードプライマーを提供する。本発明は、本発明に従って用いる上述のようなリバースプライマーもまた提供する。本発明は、本発明に従って上述のプライマーから選択される１対のフォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマーもまた提供する。
【０１３８】
本発明は、本発明に従って用いる上述のようなプローブを提供する。
【０１３９】
本発明によって、M. genitalium核酸を検出するためのキットもまた提供され、該キットは、上述のようなフォワードプライマーを含む。必要に応じて、該キットは、上述のようなリバースプライマーを含む。必要に応じて、該キットは、上述のようなプローブを含む。
【０１４０】
本発明を、下記の実施例および図面によって、さらに詳細に説明する。
【０１４１】
図１は、Mg219遺伝子（配列番号１）と、配列番号３のプローブと、配列番号４、８、または３１のフォワードプライマーと、そして配列番号５のリバースプライマーとの間の関係を図示する。
【０１４２】
より詳細には、図１は、配列番号１の４４７個のヌクレオチド配列を、配列番号３のプローブ、配列番号４、８または３１のフォワードプライマー、および配列番号５のリバースプライマーについての標的／結合部位を表す３つの重なった網掛け領域と共に図示する。この点について、配列番号３のプローブおよび配列番号４、８または３１のフォワードプライマーは、配列番号１の相補体と結合するが、明確にするために、プローブおよびフォワードプライマーの標的部位を、配列番号１に関して図示する。
【０１４３】
したがって、第１の網掛け領域は、配列番号４、８または３１のフォワードプライマーが結合する標的部位（すなわち、配列番号１の相補体のヌクレオチド残基−１１から１８）を表す。第２の網掛け領域は、配列番号３のプローブについての標的部位（すなわち、配列番号１の相補体内のヌクレオチド残基６６〜８２）を表す。第３の網掛け領域は、配列番号５のリバースプライマーが結合する標的部位（すなわち、配列番号１のヌクレオチド残基２１４から２４０）を表す。
【０１４４】
したがって、図１は、配列番号４、８または３１のフォワードプライマー、ならびに配列番号５のリバースプライマーを用いて、生じるアンプリコンが２５１個のヌクレオチド長であること（ヌクレオチド残基−１１からヌクレオチド残基２４０にわたること）を図示する。
【０１４５】
図２は、Mg219遺伝子（配列番号１）と、配列番号９〜１９のフォワードプライマーと、そして配列番号２０〜３０のリバースプライマーとの間の関係を図示する。
【０１４６】
より詳細には、図２は、Mg219の４４７個のヌクレオチド配列（すなわち、配列番号１（中央の網掛けバー、１００ヌクレオチドごとに注釈をつけた）に加えて１００個の上流ヌクレオチドおよび５００個以上の下流ヌクレオチド）を図示する。網掛け矢印９および２０は、それぞれ配列番号９および２０の上流および下流のシークエンシングプライマーについての標的／結合部位を表す。網掛け矢印１０〜１９は、配列番号１０〜１９のフォワードプライマーについての標的／結合部位を示す。網掛け矢印２１〜３０は、配列番号２１〜３０のリバースプライマーについての標的／結合部位を表す。この点について、フォワードプライマーは、配列番号１の相補体と結合するが、明確にするために、フォワードプライマーの標的部位を、配列番号１に関して図示する。
【０１４７】
したがって、配列番号９および１０のプライマーが、Mg219核酸配列の相補体の上流にあるヌクレオチド配列内にその全体が位置する標的配列と結合することは、図２から明らかである。同様に、プライマー配列２０および２１は、Mg219核酸配列の下流にあるヌクレオチド配列内にその全体が位置する標的配列と結合する。対照的に、配列番号１１〜１８のプライマーは、Mg219核酸配列の相補体内にその全体が位置する標的配列と結合し、そして配列番号２２〜２９のプライマーは、Mg219核酸配列内にその全体が位置する標的配列と結合する。しかし、配列番号１９のプライマーについての標的部位は、Mg219核酸配列の相補体およびMg219核酸配列の相補体の下流に位置する（３）ヌクレオチドと重複する。同様に、配列番号３０のプライマーについての標的部位は、Mg219核酸配列およびMg219核酸配列の相補体の上流に位置する（３）ヌクレオチドと重複する。
【０１４８】
図３は、配列番号９および配列番号２０のプライマー配列を用いて最適アニーリング温度を決定するための勾配ＰＣＲの結果を図示する。試験した温度は、以下の通りである：Ａ＝５７．０℃、Ｂ＝５７．３℃、Ｃ＝５８．０℃、Ｄ＝５８．８℃、Ｅ＝６０．１℃、Ｆ＝６１．８℃、Ｇ＝６３．６℃、Ｈ＝６５．５℃、Ｉ＝６６．４℃、Ｊ＝６７．２℃、Ｋ＝コントロール。
【０１４９】
図４は、全遺伝子配列の全域にわたるオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号９のフォワードプライマーおよび配列番号２０〜３０から選択されたリバースプライマー）の範囲を用いた完全Mg219遺伝子の検出を図示する。使用したプライマー対は以下の通りである。
【０１５０】
Ａ＝配列番号９＋配列番号３０
Ｂ＝配列番号９＋配列番号２９
Ｃ＝配列番号９＋配列番号２８
Ｄ＝配列番号９＋配列番号２７
Ｅ＝配列番号９＋配列番号２６
Ｆ＝配列番号９＋配列番号２５
Ｇ＝配列番号９＋配列番号２４
Ｈ＝配列番号９＋配列番号２３
Ｉ＝配列番号９＋配列番号２２
Ｊ＝配列番号９＋配列番号２１
Ｋ＝配列番号９＋配列番号２０
【０１５１】
図５は、全遺伝子配列の全域にわたるオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号２０のリバースプライマーと配列番号９〜１９から選択されたフォワードプライマー）の範囲を用いた完全Mg219遺伝子の検出を図示する。使用したプライマー対は以下の通りである。
【０１５２】
Ａ＝配列番号２０＋配列番号１０
Ｂ＝配列番号２０＋配列番号１１
Ｃ＝配列番号２０＋配列番号１２
Ｄ＝配列番号２０＋配列番号１３
Ｅ＝配列番号２０＋配列番号１４
Ｆ＝配列番号２０＋配列番号１５
Ｇ＝配列番号２０＋配列番号１６
Ｈ＝配列番号２０＋配列番号１７
Ｉ＝配列番号２０＋配列番号１８
Ｊ＝配列番号２０＋配列番号１９
Ｋ＝配列番号２０＋配列番号９
Ｌ＝陰性コントロール
【０１５３】
図６は、配列番号９および配列番号２０のプライマー対を用いた１２の培養M. genitalium株（１〜１２とする、キーについて実施例５を参照のこと）からのMg219の増幅を図示する。
【０１５４】
図７は、M. genitalium株G37に加えて１６の培養分離株由来のMg219遺伝子（加えて、上流および下流ヌクレオチド）のアラインメントを示し、フォワードおよびリバースシークエンシングプライマー（配列番号９および２０）、フォワードアッセイプライマー（配列番号４、８または３１）、リバースアッセイプライマー（配列番号５）およびプローブ（配列番号３）についての結合部位を図示する。アラインした各々の配列に、配列番号を割り当てた（以下の実施例５参照）。
【０１５５】
図８は、図７に示したMg219配列（加えて、上流および下流ヌクレオチド）間の配列同一性レベルを図示する、ClustalW（v1.4）多重配列アラインメントマトリックスである。アラインメントスコア＝４７７７７２、ギャップ挿入＝３０、保存された同一性＝５４９。ペアワイズアラインメントモード：Fast。ペアワイズアラインメントパラメータ：ktup＝１、ギャップペナルティ＝３、トップダイアゴナル＝５、ウインドウサイズ＝５。多重アラインメントパラメータ：ギャップ開放ペナルティ＝１０．０、ギャップ伸長ペナルティ＝０．１、遅延分岐＝４０％、トランジション：重み付け。
【実施例】
【０１５６】
実施例１−M. genitalium Mg219遺伝子の検出のための標準的な操作手順
この実施例では、Corbett Rotor-geneリアルタイムＰＣＲ機で蛍光プローブを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による、臨床材料または培養物からのM. genitalium Mg219遺伝子ＤＮＡの検出のための手順を詳述する。
【０１５７】
手袋および安全眼鏡を常に装着し、すべての抽出手順を、クラス１の安全キャビネット内で行った。痰および肺生検のような下気道検体はクラス３の設備で取り扱ったが、他の試料はクラス１の安全キャビネットで処理した。
【０１５８】
ＰＣＲの準備および運転
Rotor-gene  ＰＣＲ機にチューブを入れる直前に、テンプレート試料を、ＰＣＲ無菌室内の指定のＰＣＲキャビネット内で混合物に添加した。サイクリングのために調製した混合物が入ったＰＣＲチューブは、キャビネットから出る前にふたをして、Rotor-geneに運んだ。
【０１５９】
材料
無菌スクリューキャップ1.5ｍＬ microfugeプラスチックチューブ
SputasolTM。(Oxoid)新鮮蒸留水（Sigma）
QIA-Amp DNA Mini Kit。(Qiagen  カタログ番号51306)
Gilsonピペット：P1000、P200、P20、P10（または同等品）
上部フィルタ付滅菌済みチップ（Rainin）
Corbett Rotagene Realtime PCR機
0.5mL  PCRチューブ（フラットトップ）
Tris-EDTA（TE）緩衝液  100倍濃度（Sigma  カタログ番号T9285）
AmpliTaq Gold（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、GeneAMP付き（Applied Biosystems  カタログ番号4311820）
AmpErase（登録商標）ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）（Applied Biosystems  カタログ番号N8080096) 
ヒートブロック  56±2℃
プライマーおよびプローブ：100μMストック溶液を得るように調整し、分注し（50μL）、そして−３０℃以下で保存。
ＤＮＡテンプレートのM. genitalium NCTC 10195T（陽性コントロール）クローン化ストック（E. coli TOP10F1中、pGEMT-EASY genit219 POS 1、2、3、4または5）
GeneQuant.II（Pharmacia Biotech）
ヌクレアーゼフリーの水（Promega  カタログ番号P119C）
ニシン精子ＤＮＡ
ｄＮＴＰブレンド、12.5ｍＭ、ｄＵＴＰ付き（Applied Biosystems  カタログ番号N8080270）
【０１６０】
手順
ＰＣＲ用に入手した試料を、マイコプラズマおよびウレアプラズマについて培養によって検査し得る（ＤＮＡ抽出の開始前の培養試料）。
【０１６１】
ＤＮＡは、従来のＤＮＡ抽出プロトコルを用いて抽出した（状況（例えば、試料の性質および量、依頼の緊急性など）によって、異なるＤＮＡ抽出プロトコルが用いられ得る）。
【０１６２】
尿由来のＤＮＡを、20000ｇにて１５分間の遠心分離を経て抽出し、次いでペレットを0.4ｍＬのＰＢＳに再懸濁し、そして100℃にて５分間加熱した（あるいは、magnapureコンパクトを、あらかじめ遠心分離せずに、熱不活性化した尿（95℃±10℃）0.5ｍＬに直接用いても良い）。0.4ｍＬのＰＢＳ中で攪拌し、そして上記と同じプロトコルに従うことによってスワブを抽出した。
【０１６３】
臨床試料と並行してＰＢＳまたは水を抽出し、交差汚染が生じないことを確実にするために、すべてのさらなる試験に含めた。
【０１６４】
抽出されたＤＮＡの１：１０希釈を、ヌクレアーゼを含まない水で調製した。組織のような独特で細胞密度の高い試料では、１：１０および１：１００希釈を調製した。
【０１６５】
回帰計算のためのクローン化M. genitalium標準品の調製
標準的なＤＮＡのストックをもたらすのに十分なマイコプラズマの増殖に関する問題のために、クローン化したテンプレートＤＮＡ配列を調製した。
【０１６６】
ＴＥ緩衝液中のプラスミド溶液の濃度および純度は、GeneQuantを用いて推定した（ＴＥブランクに対して）。
【０１６７】
プラスミド溶液を、10ｎｇ／μＬ（ｐＨ８．０のＴＥ緩衝液中で）のニシン精液ＤＮＡ中で既知濃度（100ｎｇ／ｍＬ）に調整し、分注し（25μＬ）、−20±10℃にて保存した。
【０１６８】
使用の直前に、臨床検体および水ブランクの予想されるダイナミックレンジをカバーするように（ＰＣＲ品質の水で）段階希釈を行った。各実行において、5ｎｇ、0.5ｎｇ、0.05ｎｇおよび0.05ｎｇの段階希釈を用いた。
【０１６９】
プライマーおよびプローブの調製
このアッセイに用いるプライマーは、M. genitaliumの２５１ｂｐの陽性生成物を産出し、そしてプローブは、Mg219遺伝子の中のｂｐ６６から８２までに結合する。
【０１７０】
フォワードプライマー＝配列番号４、８または３１；リバースプライマー＝配列番号５。
【０１７１】
プライマーアリコートを、100ｐＭμＬ−１になるようにＴＥ中で再懸濁し、分注し、バッチ番号を割り当て、そして−20±10℃またはそれ以下で保存した。
【０１７２】
プローブ（配列番号３［3ｎｍｏｌスケールで］）を、100ｐＭμＬ−１になるようにＴＥ中で再懸濁し、分注し、バッチ番号を割り当て、そして−20±10℃で保存した。
【０１７３】
プローブは感光性であり、したがって常時、暗い／琥珀色のmicrofugeチューブ中で取り扱うべきである。
【０１７４】
用いるプライマー／プローブミックスは、2.5ｐｍｏｌμＬ−１（2.5μＭ）の各プライマー（それぞれ最終濃度0.5μＭとなる）、および1ｐｍｏｌμＬ−１（10μＭ）のM. genitaliumプローブ（最終濃度0.2μＭとなる）を含む。ミックスを作製するために、以下の成分を加えた。
【０１７５】
μＬ      （合計4ｍＬ）
3760      水
100       Mg219Fプライマー（配列番号４、８または３１）
100       Mg219Fプライマー（配列番号５）
40        Mg219プローブ（配列番号３）
【０１７６】
プライマー／プローブミックスを、黒チューブ内に1000μＬアリコートに分け、バッチ番号および１２ヶ月の使用期限を割り当て、そして−20±10℃で保存した。
【０１７７】
ＰＣＲ試薬混合物の調製
１０００反応分のストックマスターミックスを作製し、カローセル全体（３７反応分）に十分なマスターミックスを供するように分注した。ストックマスターミックスを、−20±10℃で保存し、そして形成から１２ヶ月の使用期限を付した。試薬を、使用前にピペット操作によって穏やかに混合した。
【０１７８】
マスターミックス          １試料あたり    マスターミックス    最終濃度
水                            3.55μL        3.55mL
MgCl2 25mM                    4μL           4mL              5μM
dNTPs 12.5mM                  1μL           1mL              0.625mM
プライマー／プローブミックス  4μL           4mL
（0.2μM MG219プローブ、0.5μMプライマー）
Amplitaq gold 10倍緩衝液      2μL           2mL              １倍
【０１７９】
５３８．３５μＬを各チューブに分注し、−20±10℃で冷凍した。
【０１８０】
使用する日に１バイアルを解凍し、そして以下を３７反応に添加した。
【０１８１】
Amplitaq goldポリメラーゼ         0.25μL       9.25μL       1.25ユニット
ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ    0.2μL        7.4μL        1ユニット
合計                      15μL
【０１８２】
15μＬを各チューブに分注した。
【０１８３】
すべての操作を２〜８℃で行った。すべてのＰＣＲ実験に水ブランクを含めた。交差汚染を制御するために、他の溶液の後に水をピペット操作した。陽性コントロールを添加する前に、臨床試料、希釈物および抽出水コントロールを入れ、ピペット操作し、封をした。
【０１８４】
関連試料のうち5μＬを添加し、そしてチューブを閉じた（最終容量20μＬとした）。陽性コントロールＤＮＡの検量線を取り込んだ。ＰＣＲ機にロードし、0.1および0.2ｍＬチューブの両方で、ふたをしっかり押して、ふたを固定するために提供されたロッキングリングを常に用いることによって、チューブを確実に適切に閉じた。
【０１８５】
注記：校正は、すべてのチャンネルについて１本目のチューブで蛍光を測定し、そしてバックグラウンドを考慮するようにそれぞれの蛍光を調整する。したがって、１本目のチューブは、アッセイで用いるすべてのプローブを含有していなければならない。ベースラインの蛍光は〜２０であるが、蛍光の減少が予想されるクエンチＦＲＥＴアッセイについては５０〜７０である。関連したチャンネルについて、最初のサイクルの開始時に校正がされるようにセットする。
【０１８６】
ＰＣＲ生成物の検出
RotorgeneＰＣＲ機のセットアップ：
ＰＣＲ機をセットアップし、試料を置き、そしてプログラムを入力／開いた。フラットチューブおよび必要なプログラムチャンネルをセットし（Cy5−チャンネル４）、そしてそれぞれのカローセル位置の検体および標準の詳細を入力した。保存し、「開始」した。アッセイに含まれないとしても、カローセル全体にチューブを入れた。アッセイを実行させた。
【０１８７】
サイクリング条件
４５サイクル
温度        時間      遷移速度      収集モード
変性                  95℃        5分       20秒            None
定量化
セグメント１          95℃        15秒      20℃／秒        None
２          60℃        60秒      20℃／秒        Single
融解曲線
セグメント１          95℃        0秒       20℃／秒        None
２          45℃        2秒       20℃／秒        None
３          80℃        0秒       0.1℃／秒       Cont
冷却
Rotor-gene自動冷却
【０１８８】
データ解析
「analysis」ボタンをクリックし、Cy5チャンネルでダブルクリックすることによって、ソフトウエアは検量線に有効値を付与する。それらが予想外に高い場合には、アッセイを繰り返すべきである。
【０１８９】
実施例２−アッセイの検証
検証の目的は、以下を決定することであった：
１）特異性−同じ生態的地位由来の他のマイコプラズマ種および細菌種
２）感度−ＬＤＬの決定
３）公知の陽性株および陰性株
４）最適抽出方法
５）代替ＰＣＲプラットフォーム
６）種々の試料タイプ
７）再現性
８）MgPaアッセイとの比較
【０１９０】
【表６】
2009538125.tif 000007
【０１９１】
【表７】
2009538125.tif 000008
【０１９２】
ＬＤＬ計算：
検出可能な検出下限は、1μｇｍＬ−１ＤＮＡ抽出物の１０−４希釈物5μＬであった。これは、0.0001μｇｍＬ−１または100ｐｇ、反応5μＬあたり0.5ｐｇ、および１反応あたり８２５遺伝子コピーに相当する。本アッセイはさらに１段階希釈したもの（１反応あたり８２．５遺伝子コピー）においてもＤＮＡを検出し得たが、しかしながらその後の再現性に響いた。
【０１９３】
アッセイＬＤＬは＝１反応あたり0.5ｐｇ
【０１９４】
リアルタイムＰＣＲが陽性と決定されるポイントは、クロッシングポイント（Ｃｐ）として知られ得る。Ｃｐが低いほど、試料中の標的ＤＮＡの量が多いことまたは増幅がより効果的であることを示す。これまで、すべての陽性検体について、平均Ｃｐは、本発明のMg219アッセイで３４であり、公知のMgPaアッセイで３６である。
【０１９５】
これは、本発明のMg219アッセイが公知のMgPaアッセイよりも高感度であり得ることを示す。
【０１９６】
【表８】
2009538125.tif 000009
【０１９７】
４）最適抽出方法
M. hominisが混入した尿の抽出を、種々の方法（沸騰、qiagen、magnapure compact）を用いて行った。magnapure compactで最適な結果を得た。
【０１９８】
・試料は、室温ではなく4℃で保存するのが最適である。
・ＤＮＡは最長２８日間まで検出可能であった。
・ＲＮＤ／ＤＮＡプロテクトの添加は、検出を高め、温度差を排除する−しかし、結果は変わらず、したがって費用効率が良くない。
・ＤＮＡ抽出前の試料の濃縮を推奨する。
【０１９９】
５）代替ＰＣＲプラットフォーム
Mg219アッセイを、Roche LightcyclerおよびABI Taqman 7700で試験した。アッセイは、両方のプラットフォームで十分に機能した（陽性コントロールを増幅および検出したのに対し、陰性コントロールはそうではなかった）。
【０２００】
これらの結果は、Mg219アッセイで用いられる化学作用が、他のリアルタイムプラットフォームに振替可能であることを示す。
【０２０１】
【表９】
2009538125.tif 000010
【０２０２】
【表１０】
2009538125.tif 000011
【０２０３】
【表１１】
2009538125.tif 000012
【０２０４】
実施例３−疫学データ（英国住民）
これまで、５４８検体が試験され、そのうち９検体（1.65％）が、MG219アッセイにおいて陽性であった（以下の表を参照のこと）。これは、英国住民における感染者が、約1.65％のレベルであることを示す。
【０２０５】
【表１２】
2009538125.tif 000013
【０２０６】
試料は、症状を有する患者および無症状の患者の両方から採取され、したがって、特定の臨床グループ（症状のないグループまたは尿道炎を有するグループのような）における真の感染レベルは、本明細書中に示されるよりも低いかまたは高いものであり得る。また、これらの試料は、主に、0％から、1.82％、2.86％までのレベルが異なる３つの地域（コーンウォール、ロンドン、ノーサンプトン）からのものである。より大きなスケールのスクリーニングでは、地理的な相違が感染レベルに生じるかどうかを示す。
【０２０７】
公知のMgPaアッセイにおける偽陽性検体：
これまでに、Jensenら（2004）によって記述されたMgPaアッセイによれば陽性であり、そして本発明のMg219アッセイでは陰性の、２０の検体がある。反復試験では、それら２０のうちの２つのみがMgPa試験において陽性であった。このことは、それらがJensenらのMgPa試験において偽陽性である可能性があることを示す。この点について、本発明者らは、MgPa陽性結果を繰り返すことができず、そして他の２つのＰＣＲ方法（Cadieux Nら（1993） J Gen Microbiol. 1993年10月;139(10): 2431-7、およびMusatovova Oら、(2006) J Clin Microbiol. 44(2):598-603によるMG192 PCR）を用いても陽性とはならなかった。
【０２０８】
これらの試料の平均Ｃｐは３９であり、これは標的ＤＮＡの量がより少ないかまたは増幅が非特異的であるかのいずれかによる非効率な増幅を示し得た。両方のアッセイにおいて陽性であったすべての試料が、本発明のMg219アッセイにおいて、公知のMgPaアッセイにおけるよりも低い平均Ｃｐを有したので、前者はありそうにない。
【０２０９】
これは、本発明のMg219アッセイが、M. genitalium検出のための公知のMgPaアッセイよりも高感度であることを示す。
【０２１０】
実施例４−さらなるプライマー設計
Ａ．MG219の全体のＰＣＲのためのプライマーの設計
２つのプライマーを、Mg219核酸配列の上流および下流と結合するように設計した。以下の表に例示するように、配列番号９の上流フォワードプライマーは、MG219の−７６から−５４位（開始コドンの上流）にマッピングし、そして配列番号２０の下流リバースプライマーは、５０３から５２５位（終止コドンの下流）にマッピングした。プライマーのアニーリング温度は、式：Ｔｍ＝４＊（ＧおよびＣの数）＋２＊（ＡおよびＴの数）を用いて計算した。
【０２１１】
【表１３】
2009538125.tif 000014
【０２１２】
プライマーの適合性を確認するために、これらの各プライマーについて、M. genitalium G37遺伝子に対するBLASTアッセイを行った。「高度なBlast」パラメータを選択すると、小さなプライマー配列でも、特有の結合部位を示し、そしてゲノム上のどこか他の相同配列の決定、およびＰＣＲで多重増幅生成物が生じる可能性の予測を可能にした。
【０２１３】
Ｂ．ＰＣＲのための最適アニーリング温度の決定
アニーリング温度を最適化し、多重ＰＣＲ生成物を避けるために、配列番号９および配列番号２０のプライマーを用いて、57〜68℃の範囲で勾配ＰＣＲを行った。これをMJ Research ＤＮＡエンジンで実施したところ、ブロックの全域で線形勾配していない（図３）。
【０２１４】
他の生成物は見られなかった。このことは、MG219遺伝子だけが増幅したことを示す。得られたアンプリコンは、MG219遺伝子の配列の決定および遺伝子全域の増幅に用いられた。
【０２１５】
Ｃ．Mg219の検出
配列番号１０〜１９のフォワードプライマーを、Mg219の遺伝子配列全体を包含するように、開始コドンに対して−５３位から開始し、そして終止コドンを３塩基越えたところまで連続してマッピングするように設計した（以下の表を参照のこと）。
【０２１６】
【表１４】
2009538125.tif 000015
【０２１７】
配列番号２１〜３０のリバースプライマーを、開始コドンから＋５０２位から開始するように設計し、それらを開始コドンに向かって上流に連続してマッピングした（以下の表を参照のこと）。
【０２１８】
【表１５】
2009538125.tif 000016
【０２１９】
個々のＰＣＲを、配列番号９のフォワードプライマーに加えて、配列番号２１〜３０のリバースプライマーの任意の１つを用いて；そしてまた、配列番号２０のフォワードプライマーに加えて配列番号１０〜１９のリバースプライマーの任意の１つを用いて、実施した。
【０２２０】
図４および５に図示するように、上述したプライマー対を用いたＰＣＲ増幅は、Mg219遺伝子の全体を検出した。
【０２２１】
実施例５−Mg219遺伝子の保存
完全Mg219遺伝子および隣接領域（上流および下流配列）のＰＣＲ増幅を、配列番号９および配列番号２０のプライマーを用いて、１２の培養M. genitalium分離株（以下の表を参照のこと）および基準株MG37でRoche High Fidelity Taqを用いて実施した。
【０２２２】
得られた増幅したフラグメントは、すべて同じ大きさであった（アガロースゲル電気泳動でわずかに大きく見えた分離株９および１１以外）。図６参照。
【０２２３】
【表１６】
2009538125.tif 000017
【０２２４】
得られた増幅したフラグメントを精製し、そして濃度を決定した。ＰＣＲ生成物の両方の鎖を、配列番号９および配列番号２０のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて三連で配列決定した。配列決定を、Becton-Dickinsonシークエンシングキットを製造者の使用説明書に従って用い、そしてCEQ8000 ＤＮＡ配列決定装置を用いて実施し、各株の共通配列を、MapVectorおよびClustalWソフトウエアを用いて決定した。
【０２２５】
配列をアラインし、そしてアラインメントはMG219遺伝子の高度な保存を示した（以下の表ならびに図７および８を参照のこと）。コントロールG37株の５６９塩基と、４０塩基のみが異なっており、そしてこれらの差異は株９および１１内でのみ見出された。これらのうち、３０塩基は、コントロール株の５０４残基と５０５残基との間の分離株９および１１への挿入物からなった。
【０２２６】
４つの陽性試料（以下で、＋ve MG 2、＋ve MG 3、＋ve MG 5および＋ve MG 6として示した）のさらに後の配列解析で、陽性臨床検体でもまた高度に保存されることを決定した。挿入配列は、試料＋ve MG 6由来の配列にもまた存在する。
【０２２７】
【表１７】
2009538125.tif 000018
【図１】
2009538125.tif 000019
【図２】
2009538125.tif 000020
【図３】
2009538125.tif 000021
【図４】
2009538125.tif 000022
【図５】
2009538125.tif 000023
【図６】
2009538125.tif 000024
【図７−１】
2009538125.tif 000025
【図７−２】
2009538125.tif 000026
【図７−３】
2009538125.tif 000027
【図７−４】
2009538125.tif 000028
【図７−５】
2009538125.tif 000029
【図８】
2009538125.tif 000030
【配列表】
2009538125000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成20年3月18日(2008.3.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のマイコプラズマ・ジェニタリウム核酸の検出方法であって：
（ｉ）配列番号１のフラグメントを含む核酸配列を増幅させる工程であって、該配列番号１のフラグメントが、配列番号１の少なくとも２５個連続したヌクレオチドである、工程、および
（ｉｉ）該増幅した核酸配列を検出する工程、
を含む、方法。
【請求項２】
前記増幅工程が、前記試料とフォワードオリゴヌクレオチドプライマーおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマーとを接触させる工程を含み、該プライマーが、マイコプラズマ・ジェニタリウム核酸中の標的部位と、前記配列番号１のフラグメントを含む前記核酸配列の増幅を促進するのに適切な条件下で結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記フォワードオリゴヌクレオチドプライマーおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマーが、少なくとも５個のヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１０個のヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも２０個のヌクレオチド長であり、そして、好ましくは５０個以下のヌクレオチド長、より好ましくは４０個以下のヌクレオチド長、最も好ましくは３０個以下のヌクレオチド長である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項２または３に記載の方法であって、
（ａ）前記フォワードプライマーが、マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−２５とヌクレオチド残基２５との間の標的部位と、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖の残基−１１から１８によって規定される標的部位と結合し、そして
（ｂ）前記リバースプライマーが、配列番号１のヌクレオチド残基２００とヌクレオチド残基２５０との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基２１４から２４０によって規定される標的部位と結合する、
方法。
【請求項５】
前記フォワードプライマーが、配列番号４、８または３１から選択される核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記リバースプライマーが、配列番号５の核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
請求項２または３に記載の方法であって、
（ａ）前記フォワードプライマーが、マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−８０とヌクレオチド残基−２５との間の標的部位と、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−７６から−５４までの標的部位と結合し；そして
（ｂ）前記リバースプライマーが、
（ｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基−５とヌクレオチド残基９７との間の約５０〜５５ヌクレオチド長である標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基−３から４７までの標的部位；そして
（ｉｉ）配列番号１のヌクレオチド残基１０とヌクレオチド残基１４７との間の約５０〜５５ヌクレオチド長である標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基４８から９７までの標的部位；
（ｉｉｉ）配列番号１のヌクレオチド残基４８とヌクレオチド残基１９７との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基９８から１４７までの標的部位；
（ｉｖ）配列番号１のヌクレオチド残基９８とヌクレオチド残基２４７との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基１４８から１９７までの標的部位；
（ｖ）配列番号１のヌクレオチド残基１４８とヌクレオチド残基２９７との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基１９８から２４７までの標的部位；
（ｖｉ）配列番号１のヌクレオチド残基１９８とヌクレオチド残基３４７との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基２４８から２９７までの標的部位；
（ｖｉｉ）配列番号１のヌクレオチド残基２４８とヌクレオチド残基３９７との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基２９８から３４７までの標的部位；
（ｖｉｉｉ）配列番号１のヌクレオチド残基２９８とヌクレオチド残基４４７との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基３４８から３９７までの標的部位；
（ｉｘ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基３４８とヌクレオチド残基＋５０２との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基３９８から４４７までの標的部位；
（ｘ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基３９８とヌクレオチド残基＋５２５との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基＋４４８から５０２までの標的部位、またはマイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基＋５０３から＋５２５までの標的部位、
から選択される標的部位と結合する、
方法。
【請求項８】
前記フォワードプライマーが、配列番号９の核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記リバースプライマーが、配列番号２０〜３０のいずれかから選択される核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項２または３に記載の方法であって、
（ａ）前記リバースプライマーが、マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基＋４４８とヌクレオチド残基＋５２５との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基＋４４８から＋５０２までの標的部位、またはマイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基＋５０３から＋５２５までの標的部位と結合し；そして
（ｂ）前記フォワードプライマーが、
（ｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−８０とヌクレオチド残基−２５との間の標的部位、好ましくは配列番号１の相補鎖のヌクレオチド残基−７６から−５４までの標的部位；
（ｉｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−６０とヌクレオチド残基２５との間の標的部位、好ましくは配列番号１の相補鎖のヌクレオチド残基−５３から−１までの標的部位；
（ｉｉｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−２５とヌクレオチド残基１００との間の標的部位、好ましくは配列番号１の相補鎖のヌクレオチド残基１から５０までの標的部位；
（ｉｖ）配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基２５とヌクレオチド残基１５０との間の標的部位、好ましくは配列番号１の相補鎖のヌクレオチド残基５１から１００までの標的部位；
（ｖ）配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基５１とヌクレオチド残基２００との間の標的部位、好ましくは配列番号１の相補鎖のヌクレオチド残基１０１から１５０までの標的部位；
（ｖｉ）配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基１０１とヌクレオチド残基２５０との間の標的部位、好ましくは配列番号１の相補鎖のヌクレオチド残基１５１から２００までの標的部位；
（ｖｉｉ）配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基１５１とヌクレオチド残基３００との間の標的部位、好ましくは配列番号１の相補鎖のヌクレオチド残基２０１から２５０までの標的部位；
（ｖｉｉｉ）配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基２０１とヌクレオチド残基３５０との間の標的部位、好ましくは配列番号１の相補鎖のヌクレオチド残基２５１から３００までの標的部位；
（ｉｘ）配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基２５１とヌクレオチド残基４００との間の標的部位、好ましくは配列番号１の相補鎖のヌクレオチド残基３０１から３５０までの標的部位；
（ｘ）配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基３０１とヌクレオチド残基４２５との間の約５０〜５５ヌクレオチド長である標的部位、好ましくは配列番号１の相補鎖のヌクレオチド残基３５１から４００までの標的部位；および
（ｘｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基３５１とヌクレオチド残基＋４５０との間の約５０〜５５ヌクレオチド長である標的部位、好ましくは配列番号１の相補鎖のヌクレオチド残基４０１から＋４５０までの標的部位、
から選択される標的部位と結合する、
方法。
【請求項１１】
前記リバースプライマーが、配列番号２０または２１、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体から選択される核酸配列を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記フォワードプライマーが、配列番号９〜１９、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体から選択される核酸配列を含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項２または３に記載の方法であって、
（ａ）前記フォワードプライマーが、マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−２５とヌクレオチド残基２５との間の標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖の残基−１１から１８によって規定される標的部位と結合し；そして
（ｂ）前記リバースプライマーが、
（ｉ）配列番号１のヌクレオチド残基９８とヌクレオチド残基２４７との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基１４８から１９７までの標的部位；
（ｉｉ）配列番号１のヌクレオチド残基１４８とヌクレオチド残基２９７との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基１９８から２４７までの標的部位；
（ｉｉｉ）配列番号１のヌクレオチド残基１９８とヌクレオチド残基３４７との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基２４８から２９７までの標的部位；
（ｉｖ）配列番号１のヌクレオチド残基２４８とヌクレオチド残基３９７との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基２９８から３４７までの標的部位；
（ｖ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基２９８とヌクレオチド残基＋４４７との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基３４８から３９７までの標的部位；
（ｖｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基３４８とヌクレオチド残基＋５０２との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基３９８から＋４４７までの標的部位；および
（ｖｉｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基３９８とヌクレオチド残基＋５２５との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基＋４４８から５０２までの標的部位、またはマイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基＋５０３から＋５２５までの標的部位；
（ｖｉｉｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基−５とヌクレオチド残基９７との間の約５０〜５５ヌクレオチド長である標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基−３から４７までの標的部位；
（ｉｘ）配列番号１のヌクレオチド残基１０とヌクレオチド残基１４７との間の約５０〜５５ヌクレオチド長である標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基４８から９７までの標的部位；および
（ｘ）配列番号１のヌクレオチド残基４８とヌクレオチド残基１９７との間の約５０〜５５ヌクレオチド長である標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基９８から１４７までの標的部位、
から選択される標的部位と結合する、
方法。
【請求項１４】
前記フォワードプライマーが、配列番号４、８または３１、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体から選択される核酸配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記リバースプライマーが、配列番号２０〜３０のいずれかから選択される核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項２または３に記載の方法であって、
（ａ）前記リバースプライマーが、配列番号１のヌクレオチド残基２００とヌクレオチド残基２５０との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基２１４から２４０によって規定される標的部位と結合し；そして
（ｂ）前記フォワードプライマーが、
（ｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−８０とヌクレオチド残基−２５との間の標的部位、好ましくは配列番号１の相補鎖のヌクレオチド残基−７６から−５４までの標的部位；
（ｉｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−６０とヌクレオチド残基２５との間の標的部位、好ましくは配列番号１の相補鎖のヌクレオチド残基−５３から−１までの標的部位；
（ｉｉｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−２５とヌクレオチド残基１００との間の標的部位、好ましくは配列番号１の相補鎖のヌクレオチド残基１から５０までの標的部位；
（ｉｖ）配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基２５とヌクレオチド残基１５０との間の標的部位、好ましくは配列番号１の相補鎖のヌクレオチド残基５１から１００までの標的部位；または
（ｖ）配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基５１とヌクレオチド残基２００との間の約５０〜５５ヌクレオチド長である標的部位、好ましくは配列番号１の相補鎖のヌクレオチド残基１０１から１５０までの標的部位；または
（ｖｉ）配列番号１の相補鎖のヌクレオチド残基１５１から２００までの標的部位、
から選択される標的部位と結合する、
方法。
【請求項１７】
前記リバースプライマーが、配列番号５の核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記フォワードプライマーが、配列番号９〜１４から選択される核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項２または３に記載の方法であって、
（ａ）前記フォワードプライマーが、マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−６０とヌクレオチド残基２５との間の標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド−５３から−１までの標的部位と結合し；そして
（ｂ）前記リバースプライマーが、
（ｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基３９８とヌクレオチド残基＋５２５との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド＋５０３から＋５２５まで、またはマイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基＋４４８から＋５０２までの標的部位；
（ｉｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基３４８とヌクレオチド残基＋５０２との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基３９８から４４７までの標的部位；
（ｉｉｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基２９８とヌクレオチド残基＋４４７との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基３４８から３９７までの標的部位；
（ｉｖ）配列番号１のヌクレオチド残基２４８とヌクレオチド残基３９７との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基２９８から３４７までの標的部位；
（ｖ）配列番号１のヌクレオチド残基１９８とヌクレオチド残基３４７との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基２４８から２９７までの標的部位；
（ｖｉ）配列番号１のヌクレオチド残基１４８とヌクレオチド残基２９７との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基１９８から２４７までの標的部位；
（ｖｉｉ）配列番号１のヌクレオチド残基９８とヌクレオチド残基２４７との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基１４８から１９７までの標的部位；
（ｖｉｉｉ）配列番号１のヌクレオチド残基４８とヌクレオチド残基１９７との間の約５０〜５５ヌクレオチド長である標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基９８から１４７までの標的部位；
（ｉｘ）配列番号１のヌクレオチド残基１０とヌクレオチド残基１４７との間の約５０〜５５ヌクレオチド長である標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基４８から９７までの標的部位、
から選択される標的部位と結合する、
方法。
【請求項２０】
前記フォワードプライマーが、配列番号１０の核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記リバースプライマーが、配列番号２０〜２９から選択される核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項２または３に記載の方法であって、
（ａ）前記フォワードプライマーが、マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１と相補的な核酸配列のヌクレオチド残基−２５とヌクレオチド残基１００との間の標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸配列のヌクレオチド１から５０までの標的部位と結合し；そして
（ｂ）前記リバースプライマーが、
（ｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基３９８とヌクレオチド残基＋５２５との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド＋５０３から＋５２５まで、またはマイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基＋４４８から＋５０２までの標的部位；
（ｉｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基３４８とヌクレオチド残基＋５０２との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基３９８から＋４４７までの標的部位；
（ｉｉｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基２９８とヌクレオチド残基＋４４７との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基３４８から３９７までの標的部位；
（ｉｖ）配列番号１のヌクレオチド残基２４８とヌクレオチド残基３９７との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基２９８から３４７までの標的部位；
（ｖ）配列番号１のヌクレオチド残基１９８とヌクレオチド残基３４７との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基２４８から２９７までの標的部位；
（ｖｉ）配列番号１のヌクレオチド残基１４８とヌクレオチド残基２９７との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基１９８から２４７までの標的部位；
（ｖｉｉ）配列番号１のヌクレオチド残基９８とヌクレオチド残基２４７との間の約５０〜５５ヌクレオチド長である標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基１４８から１９７までの標的部位；
（ｖｉｉｉ）配列番号１のヌクレオチド残基９８から１４７までの標的部位、
から選択される標的部位と結合する、
方法。
【請求項２３】
前記フォワードプライマーが、配列番号１１の核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記リバースプライマーが、配列番号２０〜２８から選択される核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２５】
請求項２または３に記載の方法であって、
（ａ）前記フォワードプライマーが、配列番号１と相補的な核酸配列のヌクレオチド残基２５とヌクレオチド残基１５０との間の標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸配列のヌクレオチド５１から１００までの標的部位と結合し；そして
（ｂ）前記リバースプライマーが、
（ｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基３９８とヌクレオチド残基＋５２５との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド＋５０３から＋５２５まで、またはマイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基＋４４８から＋５０２までの標的部位；
（ｉｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基３４８とヌクレオチド残基＋５０２との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基３９８から＋４４７までの標的部位；
（ｉｉｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基２９８とヌクレオチド残基＋４４７との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基３４８から３９７までの標的部位；
（ｉｖ）配列番号１のヌクレオチド残基２４８とヌクレオチド残基３９７との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基２９８から３４７までの標的部位；
（ｖ）配列番号１のヌクレオチド残基１９８とヌクレオチド残基３４７との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基２４８から２９７までの標的部位；
（ｖｉ）配列番号１のヌクレオチド残基１４８とヌクレオチド残基２９７との間の約５０〜５５ヌクレオチド長である標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基１９８から２４７までの標的部位；
（ｖｉｉ）配列番号１のヌクレオチド残基１４８から１９７までの標的部位、
から選択される標的部位と結合する、
方法。
【請求項２６】
前記フォワードプライマーが、配列番号１２の核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記リバースプライマーが、配列番号２０〜２７から選択される核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項２または３に記載の方法であって、
（ａ）前記フォワードプライマーが、配列番号１と相補的な核酸配列のヌクレオチド残基５１とヌクレオチド残基２００との間の標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸配列のヌクレオチド１０１から１５０までの標的部位と結合し；そして
（ｂ）前記リバースプライマーが、
（ｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基３９８とヌクレオチド残基＋５２５との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド＋５０３から＋５２５まで、または配列番号１のヌクレオチド残基＋４４８から＋５０２までの標的部位；
（ｉｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基３４８とヌクレオチド残基＋５０２との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基３９８から＋４４７までの標的部位；
（ｉｉｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基２９８とヌクレオチド残基＋４４７との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基３４８から３９７までの標的部位；
（ｉｖ）配列番号１のヌクレオチド残基２４８とヌクレオチド残基３９７との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基２９８から３４７までの標的部位；
（ｖ）配列番号１のヌクレオチド残基１９８とヌクレオチド残基３４７との間の約５０〜５５ヌクレオチド長である標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基２４８から２９７までの標的部位；
（ｖｉ）配列番号１のヌクレオチド残基１９８から２４７までの標的部位、
から選択される標的部位と結合する、
方法。
【請求項２９】
前記フォワードプライマーが、配列番号１３の核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記リバースプライマーが、配列番号２０〜２６から選択される核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項２または３に記載の方法であって、
（ａ）前記フォワードプライマーが、配列番号１と相補的な核酸配列のヌクレオチド残基１０１とヌクレオチド残基２５０との間の標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸配列のヌクレオチド１５１から２００までの標的部位と結合し；そして
（ｂ）前記リバースプライマーが、
（ｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基３９８とヌクレオチド残基＋５２５との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド＋５０３から＋５２５まで、またはマイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基＋４４８から＋５０２までの標的部位；
（ｉｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基３４８とヌクレオチド残基＋５０２との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基３９８から＋４４７までの標的部位；
（ｉｉｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基２９８とヌクレオチド残基＋４４７との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基３４８から３９７までの標的部位；
（ｉｖ）配列番号１のヌクレオチド残基２４８とヌクレオチド残基３９７との間の約５０〜５５ヌクレオチド長である標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基２９８から３４７までの標的部位；
（ｖ）配列番号１のヌクレオチド残基２４８から２９７までの標的部位、
から選択される標的部位と結合する、
方法。
【請求項３２】
前記フォワードプライマーが、配列番号１４の核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記リバースプライマーが、配列番号２０〜２５から選択される核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
請求項２または３に記載の方法であって、
（ａ）前記フォワードプライマーが、配列番号１と相補的な核酸配列のヌクレオチド残基１５１とヌクレオチド残基３００との間の標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸配列のヌクレオチド２０１から２５０までの標的部位と結合し；そして
（ｂ）前記リバースプライマーが、
（ｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基３９８とヌクレオチド残基＋５２５との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド＋５０３から＋５２５まで、またはマイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基＋４４８から＋５０２までの標的部位；
（ｉｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基３４８とヌクレオチド残基＋５０２との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基３９８から＋４４７までの標的部位；
（ｉｉｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基２９８とヌクレオチド残基＋４４７との間の約５０〜５５ヌクレオチド長である標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基３４８から３９７までの標的部位；
（ｉｖ）配列番号１のヌクレオチド残基２９８から３４７までの標的部位、
から選択される標的部位と結合する、
方法。
【請求項３５】
前記フォワードプライマーが、配列番号１５の核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記リバースプライマーが、配列番号２０〜２４から選択される核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
請求項２または３に記載の方法であって、
（ａ）前記フォワードプライマーが、配列番号１と相補的な核酸配列のヌクレオチド残基２０１とヌクレオチド残基３５０との間の標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸配列のヌクレオチド２５１から３００までの標的部位と結合し；そして
（ｂ）前記リバースプライマーが、
（ｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基３９８とヌクレオチド残基＋５２５との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド＋５０３から＋５２５まで、またはマイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基＋４４８から＋５０２までの標的部位；
（ｉｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基３４８とヌクレオチド残基＋５０２との間の約５０〜５５ヌクレオチド長である標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基３９８から＋４４７までの標的部位；
（ｉｉｉ）配列番号１のヌクレオチド残基３４８から３９７までの標的部位、
から選択される標的部位と結合する、
方法。
【請求項３８】
前記フォワードプライマーが、配列番号１６の核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記リバースプライマーが、配列番号２０〜２３から選択される核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
請求項２または３に記載の方法であって、
（ａ）前記フォワードプライマーが、配列番号１と相補的な核酸配列のヌクレオチド残基２５１とヌクレオチド残基４００との間の標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸配列のヌクレオチド３０１から３５０までの標的部位と結合し；そして
（ｂ）前記リバースプライマーが、
（ｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基３９８とヌクレオチド残基＋５２５との間の約５０〜５５ヌクレオチド長である標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド＋５０３から＋５２５まで、またはマイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基＋４４８から＋５０２までの標的部位；
（ｉｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基３９８から＋４４７までの標的部位、
から選択される標的部位と結合する、
方法。
【請求項４１】
前記フォワードプライマーが、配列番号１７の核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４２】
前記リバースプライマーが、配列番号２０〜２２から選択される核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４３】
請求項２または３に記載の方法であって、
（ａ）前記フォワードプライマーが、
（ｉ）配列番号１と相補的な核酸配列のヌクレオチド残基３０１とヌクレオチド残基４００との間の標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸配列のヌクレオチド３５１から４００までの標的部位；または
（ｉｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１と相補的な核酸配列のヌクレオチド残基３５１とヌクレオチド残基＋４５０との間の約５０〜５５ヌクレオチド長である標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸配列のヌクレオチド４０１から＋４５０までの標的部位；
と結合し、そして
（ｂ）前記リバースプライマーが、マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基３９８とヌクレオチド残基＋５２５との間の約５０〜５５ヌクレオチド長である標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド＋５０３から＋５２５まで、またはマイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基＋４４８から＋５０２までの標的部位と結合する、
方法。
【請求項４４】
前記フォワードプライマーが、配列番号１８または１９の核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記リバースプライマーが、配列番号２０または２１から選択される核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４６】
請求項２または３に記載の方法であって、
（ａ）前記リバースプライマーが、マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基３４８と＋５０２との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド３９８から＋４４７までの標的部位と結合し；そして
（ｂ）前記フォワードプライマーが、
（ｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−８０とヌクレオチド残基−２５との間の標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−７６から−５４までの標的部位；
（ｉｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−６０とヌクレオチド残基２５との間の標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−５３から−１までの標的部位；
（ｉｉｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−２５とヌクレオチド残基１００との間の標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基１から５０までの標的部位；
（ｉｖ）配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基２５とヌクレオチド残基１５０との間の標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基５１から１００までの標的部位；
（ｖ）配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基５１とヌクレオチド残基２００との間の標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基１０１から１５０までの標的部位；
（ｖｉ）配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基１０１とヌクレオチド残基２５０との間の標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基１５１から２００までの標的部位；
（ｖｉｉ）配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基１５１とヌクレオチド残基３００との間の標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基２０１から２５０までの標的部位；
（ｖｉｉｉ）配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基２０１とヌクレオチド残基３５０との間の約５０〜５５ヌクレオチド長である標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基２５１から３００までの標的部位；
（ｉｘ）配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基３０１から３５０までの標的部位、
から選択される標的部位と結合する、
方法。
【請求項４７】
前記リバースプライマーが、配列番号２２の核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記フォワードプライマーが、配列番号９〜１７から選択される核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項４６または４７に記載の方法。
【請求項４９】
請求項２または３に記載の方法であって、
（ａ）前記リバースプライマーが、マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基２９８と＋４４７との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド３４８から３９７までの標的部位と結合し；そして
（ｂ）前記フォワードプライマーが、
（ｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−８０とヌクレオチド残基−２５との間の標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−７６から−５４までの標的部位；
（ｉｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−６０とヌクレオチド残基２５との間の標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−５３から−１までの標的部位；
（ｉｉｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−２５とヌクレオチド残基１００との間の標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基１から５０までの標的部位；
（ｉｖ）配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基２５とヌクレオチド残基１５０との間の標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基５１から１００までの標的部位；
（ｖ）配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基５１とヌクレオチド残基２００との間の標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基１０１から１５０までの標的部位；
（ｖｉ）配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基１０１とヌクレオチド残基２５０との間の標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基１５１から２００までの標的部位；
（ｖｉｉ）配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基１５１とヌクレオチド残基３００との間の約５０〜５５ヌクレオチド長である標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基２０１から２５０までの標的部位；
（ｖｉｉｉ）配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基２５１から３００までの標的部位、
から選択される標的部位と結合する、
方法。
【請求項５０】
前記リバースプライマーが、配列番号２３の核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記フォワードプライマーが、配列番号９〜１６から選択される核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項４９または５０に記載の方法。
【請求項５２】
請求項２または３に記載の方法であって、
（ａ）前記リバースプライマーが、配列番号１のヌクレオチド残基２４８と３９７との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド２９８から３４７までの標的部位と結合し；そして
（ｂ）前記フォワードプライマーが、
（ｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−８０とヌクレオチド残基−２５との間の標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−７６から−５４までの標的部位；
（ｉｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−６０とヌクレオチド残基２５との間の標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−５３から−１までの標的部位；
（ｉｉｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−２５とヌクレオチド残基１００との間の標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基１から５０までの標的部位；
（ｉｖ）配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基２５とヌクレオチド残基１５０との間の標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基５１から１００までの標的部位；
（ｖ）配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基５１とヌクレオチド残基２００との間の標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基１０１から１５０までの標的部位；
（ｖｉ）配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基１０１とヌクレオチド残基２５０との間の約５０〜５５ヌクレオチド長である標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基１５１から２００までの標的部位；
（ｖｉｉ）配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基２０１から２５０までの標的部位、
から選択される標的部位と結合する、
方法。
【請求項５３】
前記リバースプライマーが、配列番号２４の核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記フォワードプライマーが、配列番号９〜１５から選択される核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項５２または５３に記載の方法。
【請求項５５】
請求項２または３に記載の方法であって、
（ａ）前記リバースプライマーが、配列番号１のヌクレオチド残基１９８と３４７との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド２４８から２９７までの標的部位、または配列番号１のヌクレオチド２１４から２４０までの標的部位と結合し；そして
（ｂ）前記フォワードプライマーが、
（ｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−８０とヌクレオチド残基−２５との間の標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−７６から−５４までの標的部位；
（ｉｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−６０とヌクレオチド残基２５との間の標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−５３から−１までの標的部位；
（ｉｉｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−２５とヌクレオチド残基１００との間の標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基１から５０までの標的部位；
（ｉｖ）配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基２５とヌクレオチド残基１５０との間の標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基５１から１００までの標的部位；
（ｖ）配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基５１とヌクレオチド残基２００との間の約５０〜５５ヌクレオチド長である標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基１０１から１５０までの標的部位；
（ｖｉ）配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基１５１から２００までの標的部位、
から選択される標的部位と結合する、
方法。
【請求項５６】
前記リバースプライマーが、配列番号５または２５の核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記フォワードプライマーが、配列番号９〜１４から選択される核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項５５または５６に記載の方法。
【請求項５８】
請求項２または３に記載の方法であって、
（ａ）前記リバースプライマーが、配列番号１のヌクレオチド残基１４８と２９７との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド１９８から２４７までの標的部位と結合し；そして
（ｂ）前記フォワードプライマーが、
（ｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−８０とヌクレオチド残基−２５との間の標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−７６から−５４までの標的部位；
（ｉｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−６０とヌクレオチド残基２５との間の標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−５３から−１までの標的部位；
（ｉｉｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−２５とヌクレオチド残基１００との間の標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基１から５０までの標的部位；
（ｉｖ）配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基２５とヌクレオチド残基１５０との間の約５０〜５５ヌクレオチド長である標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基５１から１００までの標的部位；
（ｖ）配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基１０１から１５０までの標的部位、
から選択される標的部位と結合する、
方法。
【請求項５９】
前記リバースプライマーが、配列番号２６の核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記フォワードプライマーが、配列番号９〜１３から選択される核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項５８または５９に記載の方法。
【請求項６１】
請求項２または３に記載の方法であって、
（ａ）前記リバースプライマーが、配列番号１のヌクレオチド残基９８と２４７との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド１４８から１９７までの標的部位と結合し；そして
（ｂ）前記フォワードプライマーが、
（ｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−８０とヌクレオチド残基−２５との間の標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−７６から−５４までの標的部位；
（ｉｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−６０とヌクレオチド残基２５との間の標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−５３から−１までの標的部位；
（ｉｉｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−２５とヌクレオチド残基１００との間の約５０〜５５ヌクレオチド長である標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基１から５０までの標的部位；
（ｉｖ）配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基５１から１００までの標的部位、
から選択される標的部位と結合する、
方法。
【請求項６２】
前記リバースプライマーが、配列番号２７の核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記フォワードプライマーが、配列番号９〜１２から選択される核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項６１または６２に記載の方法。
【請求項６４】
請求項２または３に記載の方法であって、
（ａ）前記リバースプライマーが、配列番号１のヌクレオチド残基４８と１９７との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド９８から１４７までの標的部位と結合し；そして
（ｂ）前記フォワードプライマーが、
（ｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−８０とヌクレオチド残基−２５との間の標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−７６から−５４までの標的部位；
（ｉｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−６０とヌクレオチド残基２５との間の約５０〜５５ヌクレオチド長である標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−５３から−１までの標的部位；
（ｉｉｉ）配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基１から５０までの標的部位、
から選択される標的部位と結合する、
方法。
【請求項６５】
前記リバースプライマーが、配列番号２８の核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記フォワードプライマーが、配列番号９〜１１から選択される核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項６４または６５に記載の方法。
【請求項６７】
請求項２または３に記載の方法であって、
（ａ）前記リバースプライマーが、
（ｉ）配列番号１のヌクレオチド残基２５と１４７との間の標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド４８から９７までの標的部位；および
（ｉｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基−５と９７との間の約５０〜５５ヌクレオチド長である標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド−３から４７までの標的部位、
と結合し；そして
（ｂ）前記フォワードプライマーが、
（ｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−８０とヌクレオチド残基−２５との間の標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−７６から−５４までの標的部位；または
（ｉｉ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−６０とヌクレオチド残基２５との間の約５０〜５５ヌクレオチド長である標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−５３から−１までの標的部位、
から選択される標的部位と結合する、
方法。
【請求項６８】
前記リバースプライマーが、配列番号２９または３０の核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記フォワードプライマーが、配列番号９〜１０から選択される核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項６７または６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記増幅した核酸配列が、ゲル電気泳動によって検出される、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項７１】
前記検出工程が、
（ｉ）前記増幅した核酸配列とプローブとを接触させる工程であって、該プローブが、該増幅した核酸配列またはその相補体内の標的部位と結合する、工程；および
（ｉｉ）該プローブと該増幅した核酸配列との結合を検出する工程、
を含む、請求項１から７０のいずれかに記載の方法。
【請求項７２】
前記プローブ標的部位が、
（ａ）配列番号１またはその相補体のヌクレオチド残基５０〜１００からのヌクレオチド残基から；
（ｂ）配列番号１またはその相補体のヌクレオチド残基１から、ヌクレオチド残基４４７、４４０、４２０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００または５０まで；または
（ｃ）配列番号１またはその相補体のヌクレオチド残基１０、１５、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０または４００から、配列番号１またはその相補体のヌクレオチド残基４４７まで；
（ｄ）配列番号１またはその相補体のヌクレオチド残基１０、１５または２５から、ヌクレオチド５０、１００または１５０まで；
（ｅ）配列番号１またはその相補体のヌクレオチド残基５０、７５または１００から、ヌクレオチド１５０、２００または２５０まで；
（ｆ）配列番号１またはその相補体のヌクレオチド残基１５０または２００から、ヌクレオチド３００または３５０まで；
（ｇ）配列番号１またはその相補体のヌクレオチド２５０または３００から、ヌクレオチド３５０または４００まで、
に位置する、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
試料中のマイコプラズマ・ジェニタリウム核酸を検出する方法であって：
（ｉ）該試料とオリゴヌクレオチドプローブとを接触させる工程であって、該プローブが、配列番号１またはその相補体内の標的部位と結合する、工程；および
（ｉｉ）該プローブと該標的部位との結合を検出する工程、
を含み、該標的部位が、
（ａ）配列番号１またはその相補体のヌクレオチド残基５０〜１００からのヌクレオチド残基から；
（ｂ）配列番号１またはその相補体のヌクレオチド残基１から、ヌクレオチド残基４４７、４４０、４２０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００または５０まで；または
（ｃ）配列番号１またはその相補体のヌクレオチド残基１０、１５、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０または４００から、配列番号１またはその相補体のヌクレオチド残基４４７まで；
（ｄ）配列番号１またはその相補体のヌクレオチド残基１０、１５または２５から、ヌクレオチド５０、１００または１５０まで；
（ｅ）配列番号１またはその相補体のヌクレオチド残基５０、７５または１００から、ヌクレオチド１５０、２００または２５０まで；
（ｆ）配列番号１またはその相補体のヌクレオチド残基１５０または２００から、ヌクレオチド３００または３５０まで；
（ｇ）配列番号１またはその相補体のヌクレオチド２５０または３００から、ヌクレオチド３５０または４００まで、
に位置する、
方法。
【請求項７４】
前記プローブが、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基５０から１００までの、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基６０から８５までの、より好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド６６から８２までの標的部位と結合する、請求項７２または７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記プローブが、少なくとも１５個のヌクレオチド長であり、そして５０個までのヌクレオチド長、好ましくは４０個までのヌクレオチド長、より好ましくは３０個までのヌクレオチド長である、請求項７１から７４のいずれかに記載の方法。
【請求項７６】
前記プローブが、配列番号３の核酸配列、または少なくとも１５個のヌクレオチドを有するそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む（および好ましくはからなる）、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記プローブが、固体支持体またはプラットフォーム上に固定化される、請求項７１から７６のいずれかに記載の方法。
【請求項７８】
前記プローブの結合が、検出可能なシグナル（例えば、蛍光シグナル）を提供し、そして前記検出工程が、該シグナルを検出する工程を含む、請求項７１から７７のいずれかに記載の方法。
【請求項７９】
前記プローブが、標識されている、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記試料が、ヒト精液および／またはヒト卵子を含み；そして該シグナルの実質的な欠如が、該試料中に実質的にマイコプラズマ・ジェニタリウム核酸がないこと、および該ヒト精液および／または卵子が体外受精に使用可能であることを示す、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項８１】
目的の試料中のマイコプラズマ・ジェニタリウム病原体負荷のインビトロでの定量方法であって、
（ａ）該目的の試料で、請求項１から８０のいずれかに記載の方法を実施する工程；および
（ｂ）所定の既知のマイコプラズマ・ジェニタリウム病原体負荷の試験試料で、請求項１から８０のいずれかに記載の方法を実施する工程；および
（ｃ）該目的の試料から検出されたシグナルを、該試験試料から検出されたシグナルと比較する工程；
を含み、そしてそれによって、該目的の試料中のマイコプラズマ・ジェニタリウム病原体負荷を定量する、
方法。
【請求項８２】
薬物治療期間の経過にわたる薬物効果のインビトロでの決定方法であって、
（ａ）該薬物治療期間内または前の最初の時点に得た第１の試料で、請求項１から８０のいずれかに記載の方法を実施する工程；
（ｂ）該薬物治療期間内の１以上の後の時点の試料で、請求項１から８０のいずれかに記載の方法を実施する工程；および
（ｃ）該第１の試料から検出されたシグナルを、該１以上の後の試料から検出されたシグナルと比較する工程；
を含み、そしてそれによって、該薬物治療期間の経過にわたる薬物効果を決定する、
方法。
【請求項８３】
マイコプラズマ・ジェニタリウムの薬物に対する耐性の発達のインビトロでの検出および／またはモニタリング方法であって、
（ａ）該マイコプラズマ・ジェニタリウムの該薬物への曝露の間またはその前の最初の時点に得た第１の試料で、請求項１から８０のいずれかに記載の方法を実施する工程；
（ｂ）該マイコプラズマ・ジェニタリウムの該薬物への曝露後の１以上の後の時点の試料で、請求項１から８０のいずれかに記載の方法を実施する工程；および
（ｃ）該第１の試料から検出されたシグナルを、該１以上の後の試料から検出されたシグナルと比較する工程；
を含み、該シグナルの減少がないことまたは該シグナルの増加が、該マイコプラズマ・ジェニタリウムが該薬物に対する耐性を発達させたことを示す、
方法。
【請求項８４】
前記いずれかの請求項に記載の方法で用いるオリゴヌクレオチドプローブであって、１５から２５ヌクレオチド長であり、そして、
（ａ）配列番号１またはその相補体のヌクレオチド残基５０〜１００からのヌクレオチド残基から；
（ｂ）配列番号１またはその相補体のヌクレオチド残基１から、ヌクレオチド残基４４７、４４０、４２０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００または５０まで；
（ｃ）配列番号１またはその相補体のヌクレオチド残基１０、１５、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０または４００から、配列番号１またはその相補体のヌクレオチド残基４４７まで；
（ｄ）配列番号１またはその相補体のヌクレオチド残基１０、１５または２５から、ヌクレオチド５０、１００または１５０まで；
（ｅ）配列番号１またはその相補体のヌクレオチド残基５０、７５または１００から、ヌクレオチド１５０、２００または２５０まで；
（ｆ）配列番号１またはその相補体のヌクレオチド残基１５０または２００から、ヌクレオチド３００または３５０まで；
（ｇ）配列番号１またはその相補体のヌクレオチド２５０または３００から、ヌクレオチド３５０または４００まで、
に位置する標的配列と結合する、プローブ。
【請求項８５】
前記プローブが、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基５０〜１００の間に位置する標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基６０から８５までの標的部位、より好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド６６〜８２によって規定される標的部位と結合する、請求項８４に記載のプローブ。
【請求項８６】
前記プローブが、２０個までのヌクレオチド長、好ましくは１９個または１８個までのヌクレオチド長である、請求項８４または８５に記載のプローブ。
【請求項８７】
前記プローブが、配列番号３の核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む（および好ましくはからなる）、請求項８６に記載のプローブ。
【請求項８８】
前記いずれかの請求項に記載の方法で用いるオリゴヌクレオチドプローブであって、
（ａ）該プローブが、配列番号３の核酸配列、またはそれと少なくとも９５％の配列同一性を有するその変異体を含むか；または
（ｂ）該プローブが、配列番号３の核酸配列、または少なくとも１５個連続したヌクレオチドを有するそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体からなる、
プローブ。
【請求項８９】
前記プローブが、１５個から２５個までのヌクレオチド長、好ましくは２０個までのヌクレオチド長、より好ましくは１９個または１８個までのヌクレオチド長である、請求項８８に記載のプローブ。
【請求項９０】
前記プローブが、前記標的配列との結合に際して検出可能なシグナル（例えば、蛍光シグナル）を提供する、請求項８４から８９のいずれかに記載のプローブ。
【請求項９１】
前記プローブが、標識されている、請求項９０に記載のプローブ。
【請求項９２】
請求項１から８３のいずれかに記載の方法で用いるフォワードプライマーであって、該フォワードプライマーが、１５〜６０ヌクレオチド長であり、そして、マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド−８０から＋４５０の間に位置する標的部位と結合する、フォワードプライマー。
【請求項９３】
前記プライマーが、４０個までのヌクレオチド長、好ましくは３５個までのヌクレオチド長、より好ましくは２０〜３５ヌクレオチド長である、請求項９２に記載のフォワードプライマー。
【請求項９４】
前記フォワードプライマーが、マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−２５から２５の間に位置する標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖の残基−１１から１８によって規定される標的部位と結合する、請求項９２または９３に記載のフォワードプライマー。
【請求項９５】
前記フォワードプライマーが、配列番号４、８または３１から選択される核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項９４に記載のフォワードプライマー。
【請求項９６】
前記フォワードプライマーが、少なくとも４０個のヌクレオチド長、好ましくは少なくとも５０個のヌクレオチド長、より好ましくは５０〜５５ヌクレオチド長である、請求項９２に記載のフォワードプライマー。
【請求項９７】
前記フォワードプライマーが、配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９から選択される核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項９６に記載のフォワードプライマー。
【請求項９８】
請求項１から８３のいずれかに記載の方法で用いるフォワードプライマーであって、該フォワードプライマーが、
（ａ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド−８０から−１０まで；
（ｂ）配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド２５から１００まで；または
（ｃ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド１５１から＋４５０まで、
の間に位置する標的部位と結合する、フォワードプライマー。
【請求項９９】
前記プライマーが、４０個までのヌクレオチド長、好ましくは３５個までのヌクレオチド長、より好ましくは２０〜３５ヌクレオチド長である、請求項９８に記載のフォワードプライマー。
【請求項１００】
前記フォワードプライマーが、マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１と相補的な核酸鎖のヌクレオチド残基−８０から−２５の間に位置する標的部位、好ましくは配列番号１と相補的な核酸鎖の残基−７６から−５４によって規定される標的部位と結合する、請求項９２から９３、または９８から９９に記載のフォワードプライマー。
【請求項１０１】
前記フォワードプライマーが、配列番号９の核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項１００に記載のフォワードプライマー。
【請求項１０２】
前記フォワードプライマーが、少なくとも４０個のヌクレオチド長、好ましくは少なくとも５０個のヌクレオチド長、より好ましくは５０〜５５ヌクレオチド長である、請求項９８に記載のフォワードプライマー。
【請求項１０３】
前記フォワードプライマーが、配列番号１２、１４、１５、１６、１７、１８または１９から選択される核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項１０２に記載のフォワードプライマー。
【請求項１０４】
請求項１から８３のいずれかに記載の方法で用いるフォワードプライマーであって、該フォワードプライマーが、
（ａ）配列番号９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９または３１、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体；
（ｂ）配列番号４または８、または少なくとも２０個連続したそのヌクレオチドを有するそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体；
（ｃ）配列番号１３、または少なくとも３０個連続したそのヌクレオチドを有するそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体、
から選択される核酸配列を含む、フォワードプライマー。
【請求項１０５】
請求項１から８３のいずれかに記載の方法で用いるリバースプライマーであって、該リバースプライマーが、１５〜６０ヌクレオチド長であり、そして、
（ａ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基−５から２４７まで；または
（ｂ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基２９８から＋５２５まで、
の間に位置する標的部位と結合する、リバースプライマー。
【請求項１０６】
前記プライマーが、４０個までのヌクレオチド長、好ましくは３５個までのヌクレオチド長、より好ましくは２０〜３０ヌクレオチド長である、請求項１０５に記載のリバースプライマー。
【請求項１０７】
前記リバースプライマーが、配列番号１のヌクレオチド残基１９８から２４７の間に位置する標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基２１４から２４０によって規定される標的部位と結合する、請求項１０５または１０６に記載のリバースプライマー。
【請求項１０８】
前記リバースプライマーが、配列番号５の核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項１０７に記載のリバースプライマー。
【請求項１０９】
請求項１から８３のいずれかに記載の方法で用いるリバースプライマーであって、該リバースプライマーが、
（ａ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基−５から１９７まで；または
（ｂ）マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基２９８から＋５２５まで、
の間に位置する標的部位と結合する、リバースプライマー。
【請求項１１０】
前記プライマーが、４０個までのヌクレオチド長、好ましくは３５個までのヌクレオチド長、より好ましくは２０〜３０ヌクレオチド長である、請求項１０９に記載のリバースプライマー。
【請求項１１１】
前記リバースプライマーが、マイコプラズマ・ジェニタリウムアクセッション番号NC_000908の完全ゲノムを参照して、配列番号１のヌクレオチド残基３９８から＋５２５の間に位置する標的部位、好ましくは配列番号１のヌクレオチド残基＋５０３から＋５２５によって規定される標的部位と結合する、請求項１０６から１０７、または１０９から１１０に記載のリバースプライマー。
【請求項１１２】
前記リバースプライマーが、配列番号２０の核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項１１１に記載のリバースプライマー。
【請求項１１３】
前記プライマーが、少なくとも４０個のヌクレオチド長、好ましくは少なくとも５０個のヌクレオチド長、より好ましくは５０〜５５ヌクレオチド長である、請求項１０５に記載のリバースプライマー。
【請求項１１４】
前記リバースプライマーが、配列番号２１、２２、２３、２４、２６、２７、２８、２９または３０から選択される核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項１１３に記載のリバースプライマー。
【請求項１１５】
前記リバースプライマーが、少なくとも４０個のヌクレオチド長、好ましくは少なくとも５０個のヌクレオチド長、より好ましくは５０〜５５ヌクレオチド長である、請求項１０９に記載のリバースプライマー。
【請求項１１６】
前記リバースプライマーが、配列番号２１、２２、２３、２４、２７、２８、２９または３０から選択される核酸配列、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項１１５に記載のリバースプライマー。
【請求項１１７】
請求項１から８３のいずれかに記載の方法で用いるリバースプライマーであって、該リバースプライマーが、
（ａ）配列番号２０、２１、２２、２３、２４、２６、２７、２９または３０、またはそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体；
（ｂ）配列番号２５、または少なくとも３０個連続したそのヌクレオチドを有するそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体；または
（ｃ）配列番号５、または少なくとも２０個連続したそのヌクレオチドを有するそのフラグメント、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有するその変異体、
から選択される核酸配列を含む、リバースプライマー。
【請求項１１８】
請求項９２から１０４のいずれかに記載のフォワードプライマーおよび請求項１０５から１１７のいずれかに記載のリバースプライマーを含む、１対のオリゴヌクレオチドプライマー対。
【請求項１１９】
請求項８４から９１のいずれかに記載のプローブを含む、マイコプラズマ・ジェニタリウム核酸の検出のためのキット。
【請求項１２０】
請求項９２から１０４のいずれかに記載のフォワードプライマー、および／または請求項１０５から１１７のいずれかに記載のリバースプライマーをさらに含む、請求項１１９に記載のキット。
【請求項１２１】
実施例および／または図１を参照して本明細書に実質的に記載された、試料中のマイコプラズマ・ジェニタリウム核酸を検出する方法。
【請求項１２２】
図１を参照して本明細書に実質的に記載された、プローブ。
【請求項１２３】
図１または２を参照して本明細書に実質的に記載された、フォワードプライマー、リバースプライマー、またはキット。
【国際調査報告】
2009538125.tif 000047
2009538125.tif 000048
2009538125.tif 000049
2009538125.tif 000050