(57)【要約】  本発明は、増殖性疾患を生じさせる標的遺伝子の過剰発現を抑制する有効量のヌクレオチドベースの組成物を投与する前に、有効量の前治療を患者に施すことによって、増殖性疾患を有するヒト患者を治療するための方法に関する。本発明は、Ｘ線、陽子線、電子ビームのような放射線療法、温熱療法、超音波療法、化学療法、および生物学的療法のうちの１つ以上による前治療を含む。また本発明は、治療が必要な患者を、当該の遺伝子発現のヌクレオチドベースの阻害剤で治療するための、改善された投薬およびスケジューリングシーケンスにも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍性疾患または自己免疫疾患を有し、その治療を必要とするヒト患者を治療するための方法であって、少なくとも１つの治療サイクルを前記患者に施すステップを含み、前記治療サイクルは、
ｉ．有効量の前治療であって、放射線療法、音響療法、温熱療法、および抗腫瘍療法のうちの１つ以上からなる群から選択される前治療と、
ｉｉ．約６μｇ／ｍＬ乃至約５０μｇ／ｍＬのオリゴマの平均ピーク血漿濃度を提供する有効量のオリゴマと、を含む、方法。
【請求項２】
前記オリゴマは、ｏｂｌｉｍｅｒｓｅｎ、Ｇ４４６０、およびＩＮＸ−３００１からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記平均ピーク血漿濃度は、少なくとも約４０μｇ／ｍＬである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記平均ピーク血漿濃度は、少なくとも約２０μｇ／ｍＬである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記平均ピーク血漿濃度は、少なくとも１５μｇ／ｍＬである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記抗腫瘍療法は、薬理学的療法および生物学的療法のうちの１つ以上からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記オリゴマは、2日おき、3日おき、または4日おきから選択される頻度で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記治療サイクルにおいて、前記前治療は、前記オリゴマの単回投薬を施す１日前に施される放射線療法である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記治療サイクルにおいて、前記前治療は、放射線療法と、同じ日に投与される約３０ｍｇ／ｋｇの前記オリゴマの単回投薬とを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記治療サイクルにおいて、前記前治療は、約４ｍｇ／ｋｇ乃至約３０ｍｇ／ｋｇのオリゴマの初回投薬の１日前に施される放射線療法と、少なくとも１回の後のオリゴマの投薬とを含み、前記最初の後の投薬は、前記初回投薬の約１日乃至約５日後に施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記後のオリゴマの投薬は、１日おきに投与される約６ｍｇ／ｋｇ乃至約１０ｍｇ／ｋｇのオリゴマを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記オリゴマの前記後の投薬は、５日間毎日投与される、投薬１回あたり６ｍｇ／ｋｇを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記オリゴマの前記後の投薬は、投薬１回あたり約１５ｍｇ／ｋｇである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記オリゴマの前記後の投薬は、前記初回投薬の約２日後である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記オリゴマは、ｏｂｌｉｍｅｒｓｅｎである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
治療サイクルにおいて放射線療法によって前治療した、腫瘍性疾患または自己免疫疾患を有するヒト患者を治療するための医薬組成物であって、治療の各サイクルにおいて、約６μｇ／ｍＬ乃至約５０μｇ／ｍＬのオリゴマの平均ピーク血漿濃度を提供する、有効量のｏｂｌｉｍｅｒｓｅｎを前記患者に投与するのに好適である、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００６年３月３１日に出願の出願番号第６０／７８７，８４６号に対する優先権を主張するものであり、参照することによりその全体が本願明細書に組み込まれる。
【０００２】
〔０００１〕本発明は、遺伝子の発現を抑制する有効量のヌクレオチドベースの組成物を投与する前に、有効量の前治療を患者に施すことによって、これに限定されないが、癌促進遺伝子または薬剤耐性遺伝子を含む癌遺伝子を含む標的遺伝子の過剰発現によって生じるか、またはこの過剰発現によって治療をより困難にする、癌または自己免疫疾患のような増殖性疾患を有するヒト患者を治療するための方法に関する。より具体的には、前治療は、Ｘ線、陽子線、電子ビームのような放射線療法、温熱療法、超音波療法、化学療法、および生物学的療法のうちの１つ以上である。また本発明は、治療が必要な患者を、当該の遺伝子発現のヌクレオチドベースの阻害剤で治療するための、改善された投薬およびスケジューリングシーケンスにも関する。
【背景技術】
【０００３】
〔０００２〕癌を含む増殖性疾患の治療に対するこれまでの手法には、特異性の不足という欠点がある。開発された大部分の薬剤は、天然物であるか、または代謝経路をブロックするか（Ａｒａｕｊｏ，ｅｔ  ａｌ．，２００６、Ｃｕｒｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ．６：７７−８７）、またはＤＮＡとランダムに相互作用する誘導体である。さらに、大部分の癌治療は、治療指数が低いために、用量規定毒性を伴う。例えば、患者に投与されるときに、大部分の抗癌剤は、癌細胞だけでなく、正常な非癌性細胞も殺してしまう。これらの悪影響により、癌性細胞により特異的に影響を及ぼす治療が必要である。
【０００４】
〔０００３〕腫瘍進行における分子機構の解明が進んだことで、細胞の形質変換および癌性状態のメンテナンスに関わる、癌遺伝子、薬剤耐性遺伝子、および細胞サイクル調節遺伝子を含む、多数の潜在的な遺伝子標的が識別された。特に、これらの遺伝子の転写を妨害するか、またはそれらのタンパク質産物を抑制することによって、好適な治療効果をもたらし得る。多数のヒト癌の病因における癌遺伝子の役割は、Ｂｉｓｈｏｐ、１９８７、“Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ”、Ｓｉｅｎｃｅ、２３５：３０５−３１１で概説されている。例えば、多くの種類のヒト癌、Ｂｃｌ−２（Ｂ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ／ｌｅｕｋｅｍｉａ−２）は、過剰発現することが知られており、この過剰発現は、腫瘍形成性（Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５、“Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｃｌ−２  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ｌｙｍｐｈｏｍａ”、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１４４０−１４４３）に関連付けることができる。Ｂｃｌ−２遺伝子は、主に、細胞分裂を促進するのではなく、細胞生存を延ばすことによって、癌の病因、および治療に対する耐性に関与するものと考えられる。
【０００５】
〔０００４〕ヒトＢｃｌ−２は、特定の白血病、リンパ性腫瘍、リンパ腫、神経芽腫、および前立腺癌、乳癌、ならびに大腸癌の病因に関与している。（Ａｄｖａｎｃｅ  ｉｎ  Ｖｉｒａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，７：３５−５１，Ｇ．Ｋｌｅｉｎ（ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ内の、Ｃｒｏｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｂ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ”；Ｒｅｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，“Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｃｌ−２  ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｏｆ  ｎｅｕｒａｌ  ｏｒｉｇｉｎ”，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：６５２９−３８；Ｙｕｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，“Ｂｃｌ−２  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ”，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２０：１０４７−５４；Ｃａｍｐｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，“Ｈｉｇｈ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｃｌ−２  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｏｏｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ”，Ｂｌｏｏｄ  ８１：３０９１−６；ＭｃＤｏｎｎｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｂｃｌ−２  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｔｉｈ  ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｎｄｒｏｇｅｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ”，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：６９４０−４；Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，“Ｂｃｌ−２  ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  Ｖｉｒｕｓ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ”，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５３：２９−３５；Ｂｏｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，“Ｂｃｌ−２  ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｏｄｅｌ  ａｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｐｒｏｐｏｓｅｄ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６８：４３Ａ）。Ｂｃｌ−２は、非ホジキンリンパ腫、肺癌、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、腎臓癌、および急性／慢性白血病を含む、種々の腫瘍内に過剰反応することが分かっている（Ｒｅｅｄ，１９９５，「Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｂｙ  Ｂｃｌ−２  ｆａｍｉｌｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ」，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．７：５４１−６）。
【０００６】
〔０００５〕アンチセンスオリゴヌクレオチドは、潜在的な治療ツールを、癌遺伝子および他の標的遺伝子機能の特異的妨害に提供する。これらのオリゴマは、標的遺伝子のＤＮＡ、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡに対して相補的な、または部分的に相補的な配列を有し、水素結合した塩基対によって二本鎖を形成する。このハイブリダイゼーションは、標的ｍＲＮＡおよびそれが符合化するタンパク質の発現を妨害することができるので、下流の相互作用およびシグナリングを妨げることができる。１つのｍＲＮＡ分子は複数のタンパク質のコピーを生じさせるので、ｐｒｅ−ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの抑制は、例えば酵素の活性部位または他のタンパク質ベースの機能を抑制することによって、タンパク質レベルで破壊を生じさせるよりも、効率的かつ特異的となり得る。
【０００７】
〔０００６〕ｃ−ｍｙｃ癌遺伝子のｍＲＮＡと相補的なオリゴヌクレオチドを使用して、ｃ−ｍｙｃタンパク質の生成を特異的に抑制し、それによって、生体外でヒト白血病細胞の成長を抑制する。（Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８：９６３−７３；Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：１０２８−３２）。オリゴヌクレオチドは、ヒト免疫不全ウイルスを含むレトロウイルスの特異的阻害剤としても用いられている（Ｚａｍｅｃｎｉｋ  ａｎｄ  Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５：２８０−４；Ｚａｍｅｃｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：４１４３−６）。
【０００８】
〔０００７〕アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用は、個々の癌関連遺伝子を標的にして抑制するそれらの能力とともに、臨床前癌モデルおよび臨床実験中に効果を発揮する。ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドは、生体外でＢｃｌ−２の発現を抑制し、リンパ腫異種移植したマウスモデルにおいて腫瘍を根絶する能力を示している。一部の癌の化学療法に対する耐性は、Ｂｃｌ−２癌遺伝子の発現と関連している（Ｇｒｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，“Ｂｃｌ−２  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ”，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２２（４）：３４７−９）。Ｂｃｌ−２標的オリゴヌクレオチドの投与は、研究用マウスにおける腫瘍異種移植において、Ｂｃｌ−２タンパク質レベルを選択的に減じることができる（Ｊａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，“Ｂｃｌ−２  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｉｎ  ＳＣＩＤ  ｍｉｃｅ”，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４（２）：２３２−４）。さらに、Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与は、研究用マウスにおける腫瘍異種移植を、より化学療法剤の影響を受けやすいものとすることができる（Ｊａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，“Ｂｃｌ−２  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｉｎ  ＳＣＩＤ  ｍｉｃｅ”，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．  ４（２）：２３２−４）。マウスでは、Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドによる全身的治療により、Ｂｃｌ−２タンパク質が減られ、アポトーシスが高められた。Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチド単独での治療では、抗腫瘍活性は穏やかであるが、化学療法剤のような他の従来の療法と組み合わせたときに、抗腫瘍活性が高められることが観察された。また、Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた、複数の腫瘍タイプにおける臨床実験でも、実証された活性を有する。しかし、一般的に、これらの反応は、これらの治療法に対する耐性の結果として、その後に、クローン的生存および疾病の進行を生じさせる。したがって、ヒトの癌を防止するように、これらの抗腫瘍治療を拡張するという切迫した必要性が存在する。
【０００９】
〔０００８〕生物学的療法、薬剤療法、および併用療法の有用性が高まっているにもかかわらず、多数の癌患者の予後は不十分である。例えば、転移性黒色腫の治療にはダカルバジン（ＤＴＩＣ）が一般的に使用されるが、ほとんどの患者は、長期的な改善を示さない。実際に、ＤＴＩＣを、シスプラチン、カルムスチン、およびタモキシフェンのような他の化学療法剤と組み合わせて使用したときに、大規模な第３相臨床試験では、いかなる良好な生存も示されなかった（Ｃｈａｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，“Ｐｈａｓｅ  ＩＩＩ  ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄａｒｔｍｏｕｔｈ  ｒｅｇｉｍｅｎ  ｖｅｒｓｕｓ  ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ”，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．  １７（９）：２７４５−５１）。さらに、後に従来の治療が続くＢｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドによる治療の組み合わせを用いた、多数の臨床研究が促進されているが、特に化学療法剤の場合は、更なる調査が必要である。しかし、医学的に許容でき、好都合であり、費用効率の高い形で、十分な用量のオリゴヌクレオチドを標的細胞へ供給する能力が限られることは、なかなか解決しない問題である。
【発明の開示】
【００１０】
〔０００９〕一側面では、本発明は、増殖性疾患を有し、その治療を必要とする患者を治療するための方法であって、治療の各サイクルで有効量の前治療を患者に施すステップと、その後、有効量のオリゴマを患者に投与するステップとを含む方法を提供する。別の本発明の側面では、増殖性疾患は、腫瘍性疾患または自己免疫疾患である。腫瘍性疾患は、癌、固形腫瘍、または血液学的な悪性腫瘍となり得る。前治療は、オリゴマを投与する前に施され、好適な実施形態では、前治療は、放射線療法、抗腫瘍療法、音響療法、および温熱療法のうちの１つ以上を含む。一実施形態では、オリゴマまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アプタマ、モルホリノ、デコイ分子、およびリボザイムのうちの１つ以上から選択される。オリゴマは、腫瘍細胞のような細胞内で過剰発現し、それによって増殖性疾患を生じさせるか、またはその一因となる遺伝子の発現を抑制させることができる。このような遺伝子には、これに限定されないが、癌遺伝子、抗アポトーシス遺伝子、転写アクティベータ、プロテインキナーゼ、信号伝達経路、代謝経路に関与する遺伝子、および細胞成長および細胞死を調節する遺伝子が挙げられる。
【００１１】
〔００１０〕別の側面では、本発明は、癌遺伝子（例、抗アポトーシス遺伝子）の発現を抑制するように、細胞を治療する方法を提供する。好適な一実施形態では、遺伝子は、Ｂｃｌ−２遺伝子、ｃ−Ｍｙｂ遺伝子、またはｃ−Mｙｃ遺伝子である。さらに別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｏｂｌｉｍｅｒｓｅｎである。さらに別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｇ４４６０またはＩＮＸ−３００１であり、ｃ−Ｍｙｂ  ｍＲＮＡ（Ｇｅｎｔａ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）にハイブリッド化するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００１２】
〔００１１〕さらに別の側面では、本発明は、増殖性疾患を有し、その治療を必要とする患者を治療するための方法であって、有効量のオリゴマを患者に投与するステップを含み、このオリゴマを断続的に投与する方法を提供する。好適な一実施形態では、オリゴマの次の投薬まで、少なくとも１日放置する。別の実施形態では、オリゴマの次の投薬まで、少なくとも２日、好ましくは少なくとも３日、より好ましくは５日放置する。他の実施形態では、オリゴマは、ほぼ毎週、約２週間おきに、または約３週間または４週間おきに投与される。
【００１３】
〔００１２〕本発明の別の側面は、癌を有し、その治療を必要とするヒト患者を治療するための方法であって、患者が、有効量の前治療を最初に施され、その後に有効量のオリゴマが投与される、１つ以上の治療サイクルを含む方法である。好適な実施形態では、前治療は放射線療法であり、オリゴマはｏｂｌｉｍｅｒｓｅｎである。別の実施形態では、オリゴマは、１日おきを超えない頻度で投与され、より好ましくは３日おきを超えない頻度で投与される。本発明の一側面では、オリゴマは、ほぼ毎週、約２週間おきに、または約３週間おきに投与される。本発明の別の側面では、オリゴマは、最初の前治療用量のサイクル後に、少なくとも１日、好ましくは少なくとも２日間、より好ましくは少なくとも３日間投与される。本発明のさらに別の側面では、腫瘍性疾患は、肺癌、乳癌、前立腺癌、黒色腫、慢性骨髄性白血病、またはリンパ腫である。
【００１４】
〔００１３〕本発明の側面は、癌を有し、その治療を必要とする患者を治療するための方法であって、１つ以上の治療サイクルを含み、このサイクルにおいて、患者は、１回の投薬あたり、オリゴマを約１乃至５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約５乃至３０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約７乃至２５ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約１０乃至約３０ｍｇ／ｋｇ投与され、オリゴマは、１日おきに１度を超えない頻度で投与され、より好ましくは３日おきに１度を超えない頻度で投与される方法を提供する。別の実施形態では、オリゴマは、ｏｂｌｉｍｅｒｓｅｎである。別の実施形態では、オリゴマは、少なくとも約６μｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも約８μｇ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも約１０μｇ／ｍＬの、平均ピーク血漿濃度を提供する量で投与される。さらに別の実施形態では、平均ピーク血漿濃度は、少なくとも約１０μｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも約１５μｇ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも約２０μｇ／ｍＬである。別の実施形態では、オリゴマは、ｏｂｌｉｍｅｒｓｅｎであり、少なくとも約６μｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも約８μｇ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも約１０μｇ／ｍＬの、平均ピーク血漿濃度を提供する量で投与される。さらに別の実施形態では、平均ピーク血漿濃度は、少なくとも約１０μｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも約１５μｇ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも約２０μｇ／ｍＬである。
【００１５】
〔００１４〕本発明の別の側面は、増殖性疾患の治療のための、前治療と組み合わせて使用する薬剤を製造するためのオリゴマの使用である。好適な実施形態では、増殖性疾患は、腫瘍性疾患である。本発明の別の側面は、増殖性疾患の治療のための、前治療と組み合わせて使用する薬剤を製造するためのオリゴマの使用であり、このオリゴマは断続的に投与される。好適な実施形態では、前治療は、放射線療法、化学療法、音響療法、生物学的療法、温熱療法、またはそれらの組み合わせから選択される。
【００１６】
〔００１５〕本発明の別の側面は、増殖性疾患の治療のための、薬剤を製造するためのオリゴマの使用であり、このオリゴマは断続的に投与される。さらに別の本発明の側面は、増殖性疾患の治療のための、放射線療法である前治療と組み合わせて用いる薬剤を製造するための抗Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用であり、この抗Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、断続的に投与される。好適な実施形態では、Ｂｃｌ−２オリゴヌクレオチドは、ｏｂｌｉｍｅｒｓｅｎである。
【００１７】
〔００１６〕本発明の別の側面は、腫瘍性疾患の治療のための、放射線療法である前治療と組み合わせて用いる薬剤を製造するためのｏｂｌｉｍｅｒｓｅｎの使用であり、このｏｂｌｉｍｅｒｓｅｎは、少なくとも約６μｇ／ｍＬの平均ピーク血漿濃度を達成するように、断続的に投与される。好適な実施形態では、ｏｂｌｉｍｅｒｓｅｎは、少なくとも８μｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも約１０μｇ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも約１５μｇ／ｍＬのピーク血漿濃度を達成するように、断続的に投与される。本発明の別の実施形態は、腫瘍性疾患の治療のための、放射線療法である前治療と組み合わせて用いる薬剤を製造するためのｏｂｌｉｍｅｒｓｅｎの使用であり、このｏｂｌｉｍｅｒｓｅｎは、少なくとも約２０μｇ／ｍＬの平均ピーク血漿濃度を達成するように、断続的に投与される。
【００１８】
〔００１７〕本発明の別の側面は、薬剤を製造するための、ｏｂｌｉｍｅｒｓｅｎである抗Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用であり、この抗Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１回の投薬あたり約５乃至約５０ｍｇ／ｋｇが断続的に投与される。本発明の好適な実施形態は、薬剤を製造するための、ｏｂｌｉｍｅｒｓｅｎである抗Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用であり、このｏｂｌｉｍｅｒｓｅｎは、１回の投薬あたり約１０乃至約５０ｍｇ／ｋｇが断続的に投与される。本発明の別の好適な実施形態は、薬剤を製造するための、ｏｂｌｉｍｅｒｓｅｎである抗Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用であり、このｏｂｌｉｍｅｒｓｅｎは、１回の投薬あたり約１５乃至約５０ｍｇ／ｋｇが断続的に投与される。
【００１９】
〔００１８〕本発明の別の側面は、毎日または最高で週に５日間併用療法が施されたときに、３ｍｇ／ｋｇ未満、２ｍｇ／ｋｇ未満、または１ｍｇ／ｋｇ未満のｏｂｌｉｍｅｒｓｅｎの皮下または静脈内投与を通じた前治療の後、毎日または１日おきに患者を治療する方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
〔００３０〕本発明は、前治療とともに、または前治療無しに断続的に投与されるオリゴマの投与によって、自己免疫疾患と、癌、血液学的悪性腫瘍、および固形腫瘍を含む腫瘍性疾患とを含む増殖状態を有するヒト患者を治療するための方法および組成物を提供する。癌、腫瘍、腫瘍性疾患、または腫瘍という用語は、固形腫瘍および血液学的悪性腫瘍の両方を示すように代替可能に用いられる場合があることは、当業者には明らかとなろう。本発明の別の側面は、１つ以上のサイクルの治療を施すことによる増殖状態の治療であり、それぞれのサイクルは、放射線療法、化学療法、音響療法、およびそのサイクルにおけるオリゴマの投与に先行する生物学的療法のうちの１つ以上を含む前治療を含む。当該の前治療は、前治療を施された細胞によるオリゴマの改善された摂取を提供する。好適な実施形態は、前治療、当該の放射線療法、温熱療法、または音響療法と組み合わせて投与される、これに限定されないが、Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む１つ以上のアンチセンスオリゴマによって、癌のような癌遺伝子関連の疾患を治療することを目的とし、それによって、前治療は、アンチセンスオリゴマの前に施され、アンチセンスオリゴマは、疾患細胞への改善された供給およびその治療を提供する断続的な投薬スケジュールで投与される。オリゴマ、ヌクレオチドオリゴマまたはアンチセンスオリゴマ、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドという用語は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アプタマ、モルホリノ、分子デコイ、およびその誘導体を含むものと理解されたい。本願明細書で使用する場合、「誘導体」という用語は、あらゆる薬学的に許容可能な、自然発生的または合成の相同物、類似物、または断片のことであり、本発明の医薬組成物に対応する。当該の前治療は、有効量、すなわち、前治療を施した細胞によるオリゴマの改善された摂取を提供するに十分な量、好ましくはオリゴマを投与せずに疾患に影響を及ぼすに十分な量が投与されなければならない。有効量は、増殖状態の治療時にルーチン的に施される前治療の量を含むものと理解されよう。同様に、オリゴマの有効量は、対象となる標的分子の量を減じるに十分な量である。
【００２１】
ヌクレオチドオリゴマおよび対象となる遺伝子の発現の他の阻害剤
〔００３１〕「オリゴマ」は、上述のように一般的な用語であるが、抑制すべき疾患細胞内に過剰発現する一部の遺伝子またはそのｍＲＮＡにハイブリッド化され、よってこれと相補的である核酸の短い断片のことでもある。疾患細胞の例には、これに限定されないが、腫瘍性または腫瘍細胞、および自己免疫疾患のような他の増殖性疾患に関与する細胞が挙げられる。腫瘍細胞内で過剰発現する遺伝子には、これに限定されないが、癌遺伝子、抗アポトーシス遺伝子、転写アクティベータ、プロテインキナーゼ、信号伝達経路に関与する遺伝子、および細胞成長および細胞死を調節する遺伝子が挙げられる。癌遺伝子の発現は、悪性度の度数を増加させるか、またはこれと関連する。加えて、細胞は、放射線療法または他の抗腫瘍剤による天然細胞の死亡または損傷を克服する発達した方法、および抗アポトーシス遺伝子のような特定の遺伝子を上方調節によって治療する発達した方法を有するが、これらは悪性腫瘍の発症または治療耐性のある疾患の発症をもたらす場合もある。このような遺伝子のタンパク質産物は、ｃａｐａｓｅｓ、ｐ５３、ＢＡＤ、ＢＡＸ、および他の細胞死の作動薬のような、細胞死を調節するタンパク質に結合して機能させなくすることによってアポトーシスを抑制する。したがって、本発明の目的とするアンチセンスオリゴマは、癌遺伝子、抗アポトーシス遺伝子、およびプロテインキナーゼのファミリ、転写アクティベータ、および細胞成長の調整剤に関連する遺伝子を含む。本発明の一実施形態では、目的とするアンチセンスオリゴマは、これに限定されないが、ｃ−Ｍｙｂ、ｃ−Ｍｙｃ、ＥｒｂＢ、Ｊｕｎ、Ｓｒｃ、ＴＧＦ−β、およびＭＣＣのような癌遺伝子を対象とする。別の実施形態では、アンチセンスオリゴマは、Ｂｃｌ−ＸＬ、ＭＤＭ−２、ｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２、およびｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ＩＡＰ（ＸＩＡＰ）のようなＩＡＰ（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：アポトーシスタンパク質阻害剤）、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、Ｂｆｌ−１、相同物／類似物を含むＬＭＰ１、およびそれらの誘導体のような、抗アポトーシス遺伝子ファミリのアンチセンスオリゴヌクレオチドである。更なる一実施形態では、アンチセンスオリゴマは、ＦＡＤＤ、ＴＲＡＤＤ、およびＴＲＡＦＦのような、信号伝達経路を伴う遺伝子を対象とする。好適な一実施形態では、アンチセンスオリゴマは、Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴマである。
【００２２】
〔００３２〕低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡｓ）は、長さ約２１ヌクレオチドの短い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり、片側においてオーバーハングする２−３ヌクレオチドを有する。したがって、分子のそれぞれのストランドは、５’端にリン酸基を有し、３’端に水酸基を有する。アンチセンスＲＮＡと同様に、ｓｉＲＮＡｓは、転写レベルで遺伝子の発現を妨げることが分かっており、したがって、対象となる特異的遺伝子、特に癌関連の遺伝子をサイレンシグするのに有用である。ｓｉＲＮＡは、長いｄｓＲＮＡまたはヘアピンＲＮＡのいずれかをｓｉＲＮＡに変換する酵素（ダイサー酵素）による開裂の結果として、細胞内に自然に形成されるが、合成ｓｉＲＮＡｓは、対象となるあらゆる遺伝子を標的にするように特異的にデザインすることができる。しかし、片側のオーバーハングにより、ｓｉＲＮＡは、人工的に細胞に導入したときには、非常に短い半減期を有する。このように、本発明の更なる目的は、ｓｉＲＮＡの有効な送達および摂取のための方法を提供し、よって、ｓｉＲＮＡを使用した抗アポトーシス関連の疾患を有するヒト患者の高められた治療を提供することである。別の実施形態では、本発明は、これに限定されないが、治療用量またはサブ治療用量での放射線療法のような前治療の後の、改善されたｓｉＲＮＡの送達および摂取のための方法を提供する。
【００２３】
〔００３３〕Ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡまたはｍｉＲＮＡは、長さが約２０乃至２５ヌクレチオドの単鎖ＲＮＡの形状であり、翻訳レベルで他の遺伝子の発現を調節すると考えられる。ｓｉＲＮＡとは異なり、成熟ｍｉＲＮＡは、ＤＮＡから転写されたより長いｍｉＲＮＡ分子から処理された非線形二本鎖である。これらのＲＮＡ分子は、タンパク質に翻訳されないが、例えばＥ２Ｆ−１のｍＲＮＡに結合することが示され、また、Ｅ２Ｆ−Ｉタンパク質（細胞増殖を調節するタンパク質）のような遺伝子産物への翻訳を抑制することが示されている。一実施形態では、本発明は、ｍｉＲＮＡの改善された送達および摂取のための方法を提供し、それによって、ｍｉＲＮＡは、Ｅ２Ｆ−Ｉのような細胞増殖を調節するタンパク質に関連するプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの一部と略相補的である。別の実施形態では、本発明は、これに限定されないが、治療用量またはサブ治療用量での放射線療法のような、細胞の損傷または炎症を生じさせる薬剤による前治療の後の、ｍｉＲＮＡの改善された送達および摂取のための方法を提供する。
【００２４】
〔００３４〕アプタマは、他の分子に結合することができる小分子である。より具体的には、アプタマは、ＤＮＡまたはＲＮＡアプタマに分類することができる。ＤＮＡまたはＲＮＡアプタマは、結合ポケットを形成することによって特異的リガンドを認識することができる、選択的な配列である。ＲＮＡまたはＤＮＡアプタマは、核酸、タンパク質、または小さな無機化合物に結合することができる。核酸ベースのアプタマの一例には、サイクリックＡＭＰ反応要素（ＣＲＥ）−デコイアプタマ（Ｇｅｎｔａ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）が挙げられる。ＣＲＥデコイアプタマは、ＣＲＥによって調節される遺伝子を正常にオンにするタンパク質複合体に結合して、これをブロックし、それによって、腫瘍細胞の成長を抑制する。
【００２５】
〔００３５〕一実施形態では、本発明は核酸アプタマの送達および摂取を向上させるための方法を提供し、このアプタマは、転写レベルまたは翻訳レベルのいずれかにおいて遺伝子を特異的に抑制するようにデザインされる。別の実施形態では、本発明は、核酸アプタマの改善された送達および摂取のための方法を提供し、このアプタマは、細胞増殖またはアポトーシスを調節するパク質を特異的に結合し、また、これに限定されないが、放射線療法を含む、前治療を施した後に、断続的な間隔で投与される。
【００２６】
前治療
本発明の一側面は、オリゴマベースの治療を施す前の前治療を含む、１つ以上の治療サイクルに関する。前治療は、以下に詳述する１つ以上の複数のより従来的な療法を含む。
【００２７】
〔００３６〕放射線療法：放射線療法は、乳癌、肺癌、および前立腺癌のような特に癌治療において、癌を治療するための主要な療法のうちの１つである。（放射線療法に関する概略は、Ｄｅ  Ｖｉｔａ，Ｊｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ＆Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ），３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｃｈａｐｔｅｒ  １５−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｏｆ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙを参照のこと）。放射線単独、または有効な療法である従来の化学療法と組み合わせた場合、患者は、しばしば大用量の放射線で治療される。高用量の放射線に対する高度な計画および専心の送達方法の結果、放射線療法による治癒率は上昇しているが、それでも治療の失敗が生じる。一般的に、放射線療法は、化学療法薬、抗体、またはホルモンのような他の抗腫瘍剤と組み合わせて用いられる。特定のタイプの癌では、癌遺伝子の過剰発現によって、放射線および抗悪性腫瘍剤に対する耐性が生じ、通常は放射線療法または他の抗腫瘍剤によって細胞に損傷が生じた後に活性化される、アポトーシス経路の抑制がもたらされる。例えば、Ｂｃｌ−２の過剰発現では、アポトーシスの阻害剤が、黒色腫、慢性骨髄性白血病その他を含む多数のタイプの癌の一因となることが知られている。このように、Ｂｃｌ−２の機能を抑制することで、腫瘍細胞における放射線に対する感度を高めることができる。
【００２８】
〔００３７〕従来、他の抗悪性腫瘍治療と組み合わせてアンチセンスオリゴマを用いる全ての治療計画には、抗悪性腫瘍治療を施す前に、抗アポトーシス遺伝子の発現を抑制すると考えられている、アンチセンスオリゴマの初回投与が必要であった。Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドのようなアンチセンスオリゴヌクレオチド療法を用いた臨床研究が行われ、それによって、オリゴヌクレオチドは、従来の療法による治療の前に、一般的に、１０日間の連続静脈内注入によって、または１４日間の連続皮下注入によって、毎日投与される。（Ｇ．Ｍａｒｃｕｃｃｉ，ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０１：４２５−４３２；およびＪ．Ｓ．Ｗａｔｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１８：１８１２−１８２３を参照）。このようなスケジューリング方法の論拠は、Ｂｃｌ−２遺伝子の発現を容易に抑制し、それによって、細胞が、例えば放射線または抗腫瘍剤による治療によって生じる損傷を克服しないために、より従来的な治療を施す前に、細胞内のオリゴヌクレオチドの局所レベルを十分に高くすることが必要であるとの信念にある。これらの研究の結果は、有望なものであったが、最適なものではなかった。
【００２９】
〔００３８〕ＧＭＰ（Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ：適正製造規範）の要件下での臨床的グレードのオリゴヌクレオチドの合成は、しばしば費用がかかり、したがって、大量のオリゴヌクレオチドの投与は、特に現在用いられている毎日の／連続的なスケジュールについて、多くの患者および／または健康保険に対して経済的に極めて高額なものとなり得る。一実施形態では、本発明は、より費用効率が高い治療の方法を提供する。
【００３０】
〔００３９〕オリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡとハイブリッド化して、抗アポトーシスの機能によって遺伝子産物の発現を抑制することができる細胞内へ再分配できなければならないので、細胞質へのアクセスは、重要な問題である。天然摂取機構は今のところ知られていないが、オリゴヌクレオチドは、受動拡散またはエンドソームの漏出のいずれかによって、細胞質絵へのアクセスを得ることができるものと考えられている。しかし、特に荷電オリゴヌクレオチドによる受動拡散による摂取の根拠は弱く、健康な細胞は、通常は漏出しにくい。さらに、第１相臨床試験における研究は、オリゴヌクレオチドを除去するための平均血漿半減期は、用量および投与方法によるが、約３０分乃至約８時間である。これまで、オリゴマを腫瘍細胞に供給する能力は、腫瘍細胞が循環オリゴマに晒される継続時間の関数であり、可能な限り長く露出させ、それによって、連続的かつ毎日の投与スケジュールを提供することを目的とした治療計画を有するものとみなされている。効果的なだけでなく経済的でもある最大の治療的価値を提供するために、腫瘍細胞内のオリゴヌクレオチドの摂取を最適化する領域についての問題が残る。
【００３１】
〔００４０〕本発明は、断続的な間隔で投与されたＢｃｌ−２に対する高用量の抗アポトーシスオリゴヌクレオチドが、マウスにオリゴヌクレオチドを毎日投与する従来の様態で治療した場合よりも、マウス異種移植内の腫瘍細胞によるオリゴヌクレオチドの摂取を高くするという、驚くべき発見に基づくものである。１日目、４日目、７日目に１５ｍｇ／ｋｇの用量（３日おきの連続的な投薬スケジュール）での、蛍光標識化Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドの異種移植腫瘍を有するマウスへの連続的な投薬は、毎日投薬したものに比べて、５日間の後治療であっても、大幅に改善された標識化オリゴヌクレオチドの摂取および保持を示した。（図１Ｂを参照）。この摂取の増加は、意外にも、Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与前に、腫瘍塊に対する放射線療法のような前治療を施すことによって、さらに高められることが示された。最良の結果は、動物が最初に前治療を受け、その後にオリゴマを、従来の連続的な／毎日のスケジュールではなく、断続的に投与したときに示された。
【００３２】
〔００４１〕意外にも、現在の実行法に反して、日用量５ｍｇ／ｋｇのオリゴヌクレオチドの１０日間のＢｃｌ−２アンチセンス治療計画の前に、放射線療法（５ＧｙのＸ線）を１日目に施したときに、蛍光標識化Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドの摂取は、５ｍｇ／ｋｇの日用量のオリゴヌクレオチドで１０日間治療した後、１０日目に同じ日用量の放射線療法を施したとき（図２Ｂの左パネルを参照）、またはいかなる放射線療法も施さなかったとき（図２Ｂの右パネルを参照）と比べて大幅に高められていることが分かった。さらに、放射線によって前治療を施し、その後、同じ合計用量のＢｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドを１日目、４日目、７日目、および１０日目に断続的に投薬（合計４回、それぞれ１５ｍｇ／ｋｇの３日おきの断続的な投薬スケジュール）したものも、摂取が大幅に改善された。（図３Ｂを参照のこと）。オリゴマの断続的な治療計画によって、１０日目の最後のＢｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチド治療後に放射線を照射した細胞における毎日の投薬を比較して、同じく摂取が増加したが、最大の摂取は、腫瘍を、オリゴマを投与する前に、１日目に放射線で前治療したときに観察された。
【００３３】
〔００４２〕放射線療法による前治療が、オリゴマに対する摂取を高めるという驚くべき観察に加えて、オリゴマによる断続的な治療を行ったときに、放射線によって前治療を施し、その後、オリゴマによる断続的な治療を行うことによって最高の摂取が見られ、意外にも、オリゴマによる治療を開始する前の放射線での前治療は、また、放射線で前治療された細胞内へのオリゴマの改善された／長期間の保持も提供した。オリゴマの実質的な量は、少なくとも５日間乃至７日間後治療を施した細胞内で掲出することができた。さらに、放射線療法の後に、単回で大用量のオリゴマを投与した動物は、断続的に投薬を施した動物よりも大きな保持を示し、その結果、日用量のオリゴマで治療した動物よりも大きな保持を示した。全ての場合において、保持は、前治療を受けた動物においてかなり大きかった。特に、放射線療法によって前治療を施し、その後、１０ｍｇ／ｋｇのオリゴヌクレオチドを１日おき（１日目、３日目、および５日目）に投与するか、または５日間で６ｍｇ／ｋｇを毎日投与したマウスと比較して、オリゴヌクレオチドは、１日目に放射線療法を施し、同じ日だが放射線療法後に、単回で３０ｍｇ／ｋｇの高用量のオリゴヌクレオチドを投与した後、少なくとも最高５日乃至７日間残存した。（図４および図５を参照）。
【００３４】
〔００４３〕これらの研究による結果は、放射線療法のような前治療を用いることで、オリゴヌクレオチドの摂取および保持を改善するだけでなく、状況に応じて、より好都合な様態で投与されるオリゴヌクレオチドの用量をより少なくするといった改善された利益も提供することを示している。アンチセンスオリゴヌクレオチドの改善された摂取および長期間の保持を提供することによって、本治療方法は、抗アポトーシス遺伝子の発現を抑制する改善された手段と、それによる、当該の状態の改善された治療とを提供する。（図７および図８を参照）。これらの研究は、癌療法における改善されたアンチセンスヌクレオチド療法の臨床応用のための方法を提供する。さらに、少用量のオリゴヌクレオチドの有無に関わらず、投薬頻度を減じることで、治療センタへの訪問回数が減り、時間と費用の両方が節約される。
【００３５】
〔００４４〕上述の驚くべき結果に基づいて、本発明は、したがって、好ましくは断続的な間隔で、これに限定されないが、Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドのような高または低用量のオリゴマを投与する前に、１つ以上の前治療を各サイクルにおいて施すステップを含む、１つ以上の採掘の治療を含む治療計画を目的とする。このような治療計画は、状況に応じて、所望の結果が得られ、所定のサイクル数が施されるまで、または治療する医師が、治療における変化が適切であると判断するまで、サイクル内で施される。本発明は、高用量による断続的な治療の前に、１つ以上の前治療を施すことによって、抗アポトーシス遺伝子の発現を抑制する組成物の送達を向上させる／高めるための方法も目的とする。前治療は、細胞膜に損傷を与えることができ、および／または炎症反応を生じさせることができる治療に関する。本発明の一実施形態では、前治療の選択は、細胞に与える損傷および／または炎症反応の程度および深刻さを制御する能力に基づいている。前治療は、物理的、生物学的、または薬理学的治療とすることができる。物理的な前治療の一例は、これに限定されないが、Ｘ線、ガンマ線、ベータ粒子、紫外線光線、赤外の光線、電波、およびマイクロ波のような電磁放射である。放射線療法の別の実施形態は、陽子線または電子パルスである。
【００３６】
〔００４５〕Ｘ線またはガンマ線は、癌治療に使用される最も一般的な放射線療法のうちの２つであり、悪性腫瘍に対する一次治療のモダリティのままである。しかし、これらの作用因子は、臨床医には、オリゴマの摂取を高めるための方法と見なされていなかった。Ｘ線またはガンマ線を使用する利点の１つは、放射線が、体腔の深部にまで貫通し、また、放射線を、物理的な侵襲性または全身性とせずに、特異的な部位に導く能力であるが、本発明は、このような治療モダリティの、全身照射（ｔｏｔａｌ  ｂｏｄｙ  ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ：ＴＢＩ）、皮膚リンパ腫のような状況に対する皮膚照射、および当業者には容易に明らかである適切な環境内での小線源療法としての使用を目的とする。
【００３７】
〔００４６〕本発明の一実施形態では、電磁放射はベータ粒子である。本発明の別の実施形態では、電磁放射は電波またはマイクロ波である。本発明の好適な一実施形態では、電磁放射はガンマ線であり、より好適な実施形態では、電磁放射はＸ線である。
【００３８】
〔００４７〕電磁放射は、定位的に、従来通りに、または全身照射として患者に投与することができる。定位放射は、周囲の正常な組織を損なわずに、放射線を腫瘍に供給する精密な方法である。放射線は、単回投薬として、従来の分画で、または多分割の放射線として投与することができる。
【００３９】
〔００４８〕本発明の一実施形態では、放射線療法は、オリゴマによる治療の前に、定位的に、または従来通りに患者に施される。本発明の別の実施形態では、放射線療法は、定位的に施され、その後、前治療の約１乃至約２４時間後にオリゴマを断続的に投与する。このような前治療は、数日間または数週間にわたって施すことができ、その間、オリゴマ治療の前に前治療が開始されたならば、オリゴマが投与される。
【００４０】
〔００４９〕本発明のより好適な一実施形態では、放射線療法は、定位的に、または従来通りに施され、その後、前治療の約１日乃至約１０日後にオリゴマを断続的に投与する。例えば、本発明の一実施形態では、オリゴマは、１日おきを超えない頻度で投与される。更なる一実施形態では、オリゴマは、２日おき、３日おき、または４日おきに投与される。好適な一実施形態では、オリゴマは、５日おきに投与される。本発明のより好適な一実施形態では、オリゴマは、毎週、１週間おき、毎月、または１ヵ月おきに投与される。別の好適な実施形態では、オリゴマは、前治療と同じ日の前治療の後に、または前治療の約１日乃至約７日後に１回投与される。
【００４１】
〔００５０〕本発明の別の実施形態では、放射線療法は、オリゴマによる治療の前に、定位的な方法で患者に施される。本発明の別の実施形態では、放射線療法は、定位的な方法で施され、その後、前治療の約３時間乃至約２４時間後にオリゴマまたは阻害剤を断続的に投与する。本発明のより好適な一実施形態では、放射線療法は、分画的な方法で施され、その後、前治療の約２日乃至約１０日後にオリゴマを断続的に投与する。
【００４２】
〔００５１〕さらに好適な一実施形態では、放射線療法は、定位的な方法で施され、その直後にオリゴマによる治療が行われ、続けて、ほぼ２日乃至ほぼ１０日おきに断続的に投与される。例えば、本発明の一実施形態では、オリゴマは、１日おきを超えない頻度で投与される。更なる一実施形態では、オリゴマは、２日おき、３日おき、または４日おきに投与される。好適な一実施形態では、オリゴマは、５日おきまたは６日おきに投与される。本発明のより好適な一実施形態では、オリゴマは、毎週、１週間おき、毎月、または１ヵ月おきに投与される。
【００４３】
〔００５２〕前治療として投与される放射線の量は、当業者には容易に明らかとなろう。投薬は、腫瘍の量、タイプ、および形状に依存する。加えて、正常な構造体または組織の近接性も考慮しなければならない。一実施形態では、前治療として投与される放射線療法の量は、従来は治療用量とは見なされない量である。このような投与量も当業者には明らかとなり、状況に応じて、以前に治療した領域に使用することができ、もしくはより多くの従来の放射線の治療用量の投与を許容できない場合がある。別の実施形態では、前治療は、単独で用いられるか、化学療法または他の一般的に用いられる抗腫瘍剤と組み合わせて用いられる場合の治療量と見なされる、用量および方法で施される。
【００４４】
〔００５３〕更なる一実施形態では、本発明は、最初の前治療を施し、その後、オリゴマをほぼ２日おきに１回乃至ほぼ７日おきに１回投与する、１回以上のオリゴマの投与を行うことによって、治療サイクル中に投与されるオリゴマの量を減じるための方法を目的とする。
【００４５】
〔００５４〕音響療法：本発明は、オリゴマを投与する前に、癌を有する患者に対する非侵襲的前治療として、低または高強度焦点式超音波の利用も目的とする。放射線療法と同様に、音響療法は、体腔の特異的な部位まで深く貫通し、正常な組織の損傷を最小限に抑える、非侵襲的方法を提供する。
【００４６】
〔００５５〕本発明の一実施形態では、オリゴマによる治療の前に、低強度または高強度の超音波による前治療が施される。本発明の別の実施形態では、低強度または高強度の超音波を施し、その後、前治療の約１時間乃至約２４時間後にオリゴマを断続的に投与する。本発明のより好適な一実施形態では、癌を有する患者には、低強度または高強度の超音波を施し、その後、前治療の約２日乃至約１０日後にオリゴマを断続的に投与する。例えば、本発明の一実施形態では、オリゴマは、１日おきを超えない頻度で投与される。更なる一実施形態では、オリゴマは、ほぼ２日おき、３日おき、または４日おきに投与される。好適な一実施形態では、オリゴマは、５日おきに投与される。本発明のより好適な一実施形態では、オリゴマは、ほぼ毎週、１週間おき、毎月、または１ヵ月おきに投与される。
【００４７】
〔００５６〕前治療として施される超音波の量は、当業者に容易に明らかである。用いる超音波の強度は、腫瘍の量、タイプ、および形状に依存する。加えて、腫瘍の位置と関連する正常な構造体および組織の近接性（すなわち、腫瘍が体腔の深い凹部または皮膚の表面に位置する）も考慮しなければならない。本発明の一実施形態では、約０．１乃至約３Ｗ／ｃｍ２のエネルギが用いられる。本発明の別の実施形態では、強度エネルギは、約３乃至約１０Ｗ／ｃｍ２である。本発明の更なる一実施形態では、強度エネルギは、約１００乃至約１０００Ｗ／ｃｍ２である。
【００４８】
〔００５７〕温熱療法：温熱療法の１つの形態はハイパーサーミア療法であり、通常は正常な組織に対する損傷を最小限に抑えて、最高で約４５℃の高温を生体組織に適用する。
【００４９】
〔００５８〕一実施形態は、腫瘍を加熱する種々の方法を使用して、局所ハイパーサーミアを腫瘍全体内の小さな領域に適用することを包含するものと想定される。その手法には、これに限定されないが、マイクロ波、高周波、および超音波が挙げられる。局所ハイパーサーミアには、皮膚内または直下の、腔内の腫瘍への外部的手法、または体腔内または付近の腫瘍のための空洞内手法、体内の深部に局所化された腫瘍のための間入法、単離した四肢の潅流手段のような単離潅流を提供する手段が挙げられる。
【００５０】
〔００５９〕さらに別の実施形態では、局所ハイパーサーミアを用いて、広範囲の腫瘍組織を加熱することができる。本発明の更なる一実施形態では、全身ハイパーサーミアを用いて、身体全体に転移した転移癌を治療することができる。瞬間的実施形態における体温は、約４１℃乃至約４２℃まで上昇する場合がある。
【００５１】
〔００６０〕さらに別の実施形態では、前治療は、局所的、領域的、または全身ハイパーサーミアの交互の適用を含む。
〔００６１〕本発明の好適な一実施形態では、ハイパーサーミアを用いた前治療は、約２日乃至約１０日の断続的な間隔でそれ以降のオリゴマの投与の有無に関わらず、オリゴマを投与する直前に施される。例えば、本発明の一実施形態では、オリゴマは、ほぼ１日おきを超えない頻度で投与される。更なる一実施形態では、オリゴマは、ほぼ２日おき、３日おき、または４日おきに投与される。好適な一実施形態では、オリゴマは、５日おきに投与される。本発明のより好適な一実施形態では、オリゴマは、毎週、１週間おき、毎月、または１ヵ月おきに投与される。
【００５２】
〔００６２〕本発明のより好適な一実施形態では、前治療のハイパーサーミアは、オリゴマを投与する約１乃至２４時間前に適用され、その後、約２日乃至約１０日の断続的間隔で以降のオリゴマの投与を行う。本発明の一実施形態では、オリゴマは、１日おきを超えない頻度で投与される。更なる一実施形態では、オリゴマは、２日おき、３日おき、または４日おきに投与される。好適な一実施形態では、オリゴマは、５日おきに投与される。本発明のより好適な実施形態内に、オリゴマは、毎週、１週間おき、毎月、または１ヵ月おきに投与される。
【００５３】
〔００６３〕薬理学的療法：さらに、本発明は、これに限定されないが、癌を含む増殖性疾患を有するヒト患者の前治療として、薬理学的療法の使用も目的とする。これらの薬理学的薬剤は、オリゴマを投与する前に腫瘍細胞を前治療するに十分な量が適用される。有効量は、当業者によって容易に決定され、これに限定されないが、従来の治療量の薬理学的薬剤またはサブ治療量を含む。薬理学的薬剤の例には、これに限定されないが、抗腫瘍剤、抗生物質、リパーゼ、洗浄剤、小分子、作動薬、またはその誘導体および類似物の類に属する化学薬剤が挙げられる。抗腫瘍剤の種類には、これに限定されないが、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、植物性アルカロイドおよびテルペノイド、ヌクレオチド／ヌクレオシド類似物、および代謝拮抗剤が挙げられる。目的とする抗腫瘍剤のいくつかの例には、これに限定されないが、ボルテゾミブ、ゲムシタビン、イマチニブ、フルダラビン、オキサリプラチン、ドセタキセル、ｐａｌｃｉｔａｘｅｌ、サリドマイド、５−ＦＵ、ドキソルビシン、アラビノシド−Ｃ、カルボプラチン、ダウノマイシン、デキサメタゾン、およびエトポシドが挙げられる。
【００５４】
〔００６４〕本発明の一実施形態では、癌を有するヒト患者は、約２日乃至約１０日の断続的な間隔でのオリゴマの以降の投与の有無に関わらず、オリゴマの投与前の前治療を含む１つ以上の治療サイクルで治療される。例えば、本発明の一実施形態では、オリゴマは、１日おきを超えない頻度で投与される。更なる一実施形態では、オリゴマは、２日おき、３日おき、または４日おきに投与される。好適な一実施形態では、オリゴマは、ほぼ５日おき乃至ほぼ１０日おきに投与される。本発明のより好適な実施形態内に、対象となる遺伝子の発現のオリゴマは、ほぼ毎週、１週間おき、毎月、または１ヵ月おきに投与される。
【００５５】
〔００６５〕本発明の別の好適な実施形態では、薬理学的前治療は、オリゴマを投与する約１乃至約２４時間前に施され、その後、約２日乃至約１０日の断続的な間隔で、オリゴマの以降の投与を行う。本発明の一実施形態では、オリゴマは、１日おきを超えない頻度で投与される。更なる一実施形態では、オリゴマは、２日おき、３日おき、または４日おきに投与される。好適な一実施形態では、オリゴマは、５日おきに投与される。本発明のより好適な実施形態内に、オリゴマは、ほぼ毎週、１週間おき、毎月、または１ヵ月おきに投与される。
【００５６】
〔００６６〕生物学的療法：本発明は、前治療として１つ以上の生物学的療法を含む、医薬組成物を提供する。生物学的前治療の例には、これに限定されないが、パーフォリン、プロテアーゼ、ホルモン、サイトカイン、成長因子、およびプロスタグランジンのようなタンパク質が挙げられる。
【００５７】
〔００６７〕本発明の一実施形態では、癌を有するヒト患者は、１つ以上の生物学的組成物による前治療を受ける。生物学的前治療組成物は、サブ治療用量とすることができ、約２日乃至約１０日の断続的な間隔で、それ以降のオリゴマの投与の有無に関わらず、前治療の阻害剤の投与直前に適用することができる。
【００５８】
〔００６８〕本発明の別の好適な実施形態では、生物学的前治療組成物は、オリゴマを投与する約１乃至２４時間前に適用し、その後、約２日乃至約１０日の断続的な間隔で、それ以降のオリゴマの投与を行う。例えば、本発明の一実施形態では、オリゴマは、１日おきを超えない頻度で投与される。更なる一実施形態では、オリゴマは、２日おき、３日おき、または４日おきに投与される。好適な一実施形態では、オリゴマは、ほぼ５日おき乃至ほぼ１０日おきに投与される。本発明のより好適な実施形態内に、オリゴマは、ほぼ毎週、１週間おき、毎月、または１ヵ月おきに投与される。
【００５９】
抗アポトーシス遺伝子の発現阻害剤
〔００６９〕本発明は、これに限定されないが、ｏｂｌｉｍｅｒｓｅｎ（Ｇｅｎａｓｅｎｓｅ（登録商標）；Ｇ３１３９）、類似物、断片、ハイブリッド体、模倣剤、およびその癌遺伝子のようなＢｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、抗アポトーシス遺伝子の１つ以上の阻害剤の使用を目的とする。本願明細書で使用する場合、「誘導体」という用語は、本発明の医薬組成物に対応する、自然発生または合成のあらゆる薬学的に許容可能な相同物、類似物、または断片のことである。本発明での使用に好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、サイズが、５乃至１０、１０乃至２０、２０乃至５０、５０乃至７５、または７５乃至１００の塩基長さ、好ましくは１０乃至４０の塩基長さ、より好ましくは１５乃至２５の塩基長さ、さらに好ましくは１８塩基長さのヌクレオチドオリゴマを含む。アンチセンスヌクレチオドが結合する標的配列は、疾患細胞または癌細胞内で高いレベルでタンパク質を発現したＲＮＡまたはＤＮＡとすることができる。標的配列は、単鎖または二本鎖の場合がある。標的分子は、これに限定されないが、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、およびタンパク質を含む。一実施形態では、ターゲット分子は、ｍＲＮＡである。好適な一実施形態では、ターゲット分子は、Ｂｃｌ−２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡまたはＢｃｌ−２  ｍＲＮＡである。特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｂｃｌ−２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに沿ったどこかの部分にハイブリッド化する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｂｃｌ−２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの翻訳開始部位、ドナースプライシング部位、受容スプライシング部位、輸送のための部位、または分解のための部位にハイブリッド化する。
【００６０】
〔００７０〕複数のＢｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、可変的な結果で評価されていた（例えば、米国特許第５，８３１，０６６号のＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯＳ．：１−１７を参照）。本発明に基づいて用いることができるＢｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドの実施例は、米国特許出願第０８／２１７０８２号（現在の米国特許第５，７３４，０３３号）；米国特許出願第０８／４６５４８５号（現在の米国特許第５，８３１，０６６号）；および米国特許出願第０９／０８０２８５号（現在の米国特許第６，０４０，１８１号）に詳述されており、それぞれ参照することによりその全体が本願明細書に組み込まれる。
【００６１】
〔００７１〕一実施形態では、Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｂｃｌ−２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの一部と、またはＢｃｌ−２に関連するｐｒｅ−ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの一部と略相補的である。好適な一実施形態では、Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ暗号鎖の翻訳開始部位の一部にハイブリッド化する。より好適な一実施形態では、Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトＢｃｌ−２遺伝子の翻訳開始部位を含むｐｒｅ−ｍＲＮＡ暗号鎖の一部にハイブリッド化する。Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｂｃｌ−２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡまたはＲＮＡのＡＵＧ開始配列と相補的なＴＡＣ配列を含むことがより好ましい。
【００６２】
〔００７２〕別の実施形態では、Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトＢｃｌ−２遺伝子のためのｐｒｅ−ｍＲＮＡ暗号鎖のスプライスドナー部位の一部にハイブリッド化する。このヌクレオチドは、Ｂｃｌ−２遺伝子のＧＴスプライスドナー配列と相補的であるＣＡ配列を含むことが好ましく、また、５乃至５０塩基、より好ましくは約１０乃至２０塩基の隣接部分をさらに含むことが好ましく、このスプライスドナー部位に隣接するＢｃｌ−２遺伝子暗号鎖の一部にハイブリッド化する。
【００６３】
〔００７３〕さらに別の実施形態では、Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトＢｃｌ−２遺伝子のためのｐｒｅ−ｍＲＮＡ暗号鎖のスプライス受容部位の一部にハイブリッド化する。このヌクレオチドは、Ｂｃｌ−２遺伝子のＡＧスプライスアクセプタ配列と相補的であるＴＣ配列を含むことが好ましく、また、５乃至５０塩基、より好ましくは約１０乃至２０塩基の隣接部分をさらに含むことが好ましく、このスプライスアクセプタ部位に隣接するＢｃｌ−２遺伝子暗号鎖の一部にハイブリッド化する。別の実施形態では、Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、スプライシング、輸送、または分解に関与するｐｒｅ−ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの一部にハイブリッド化する。
【００６４】
〔００７４〕平均的な当業者は、本発明での使用に好適なアンチセンスオリゴマは、Ｂｃｌ−２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに沿った他の部位と略相補的でもあり、ハイブリッドを形成することができるものと理解することができよう。また、当業者は、治療の特異性を保持するために、その配列が、一般的に無関係な遺伝子からの転写物内に生じない、Ｂｃｌ−２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの一部にハイブリッド化するアンチセンスオリゴマが好ましいことも理解されよう。
【００６５】
〔００７５〕Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列のデザインは、Ｂｃｌ−２遺伝子、Ｂｃｌ−２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、Ｂｃｌ−２  ｍＲＮＡ、またはＢｃｌ−２関連のヌクレオチド配列への配列ホモロジ、またはこれらとのハイブリッド化の程度に関わらず、経験的な試験および臨床的有効性の評価によって決定することもできる。当業者は、例えば、好適な実施形態のものと比較して、配列ホモロジが少ない、修飾ヌクレオチドが多いかまたは少ない、あるいは長さが長いまたは短いが、それでも、臨床的治療において反応を示すＢｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドも本発明の範囲内にあるものと理解されよう。
【００６６】
〔００７６〕アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡ、あるいはその誘導体とすることができる。特定の形態のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、生物学的利用能、代謝、半減期などのような、オリゴマの薬物動態学的パラメータに影響を及ぼす場合がある。このように、本発明は、細胞摂取を向上させ、ヌクレアーゼ耐性を高め、標的配列への結合を向上させるか、または標的配列の開裂または分解を増加させる特性を有する、アンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体を目的とする。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸塩を含む塩基を含む場合がある。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、その代わりに、とりわけリン酸ジエステル、ホスホロチオエート、および／またはメチルホスホン酸塩ヌクレオチドの組み合わせを含む、混合したオリゴマとすることができる。このようなオリゴマは、これに限定されないが、２−Ｏ′−アルキルまたは２−Ｏ′ｈａｌｏ糖修飾、バックボーン修飾（例、メチルホスホン酸塩、ホスホロ  ジチオン酸、ホスホロ  ジチオン酸、ギ酸アセタール、３′−チオギ酸アセタール、スルホン、スルファミン酸塩、ニトロキシドバックボーン、モルホリノ誘導体、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）誘導体）、または塩基部分を修飾した誘導体を含む、修飾体を有することができる（Ｅｇｈｏｉｍ，ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（ＰＮＡ）−Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ  Ｗｉｔｈ  Ａｎ  Ａｃｈｉｒａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ，Ａｒｇｈｙａ  ａｎｄ  Ｎｏｒｄｅｎ  ２０００，“Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（ＰＮＡ）：ｉｔｓ  ｍｅｄｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｉｓｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｆｕｔｕｒｅ”，ＦＡＳＥＢ  １４：１０４１−１０６０）。別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと、その誘導体との複合体を含む（Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，１９９０，“Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅｉｒ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ”，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１（３）：１６５−８７）。
【００６７】
〔００７７〕生体内治療の場合は、１つには分解に対するより大きな耐性があるため、Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドのホスホロチオエート誘導体が好ましい。一実施形態では、Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート塩基を含む、ハイブリッドオリゴマである。別の実施形態では、Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む。別の実施形態では、Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも３つホスホロチオエート結合を含む。さらに別の実施形態では、Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも３つ連続したホスホロチオエート結合を含む。さらに別の実施形態では、Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、全体的にホスホロチオエート結合を含む。オリゴヌクレオチド誘導体を調製するための方法は、従来技術において既知である。例えば、Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎｕｃｌ，Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６：３２０９−２１（ホスホロチオエート）；Ｂｌａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４：６１３２−３８（メチルホスホン酸塩）；Ｍｏｒｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：５０１９−３２（アルファデオキシヌクレチオド）；Ｍｏｎｉａ  ｅｔ  ａｌ．，1993「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ２′−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｔｉｏｄｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ２′ｄｅｏｘｙ  ｇａｐｓ  ａｓ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６８：１４５１４−２２（２′−０−メチル−リボヌクレオシド）；Ａｓｓｅｌｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１）：３２９７−３３０１（アクリジン）；Ｋｎｏｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ  ６７：７８３−９；Ｖｌａｓｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：４０６５−７６（Ｎ−２−クロロセチラミンおよびフェナジン）；Ｗｅｂｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：７６６１−７４（５−メチル−Ｎ４−Ｎ４−エタノシトシン）；Ｂｏｕｔｏｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １７２：４３−６（Ｆｅ−エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）および類似物）；Ｃｈｉ−Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：７１４７−５１（５−グリシルアミド−１，１０−ｏ−フェナントロリン）；およびＣｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：９６３−７（ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）誘導体）を参照。
【００６８】
〔００７８〕１回の投薬あたりに投与されるべきＢｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量は、投薬１回あたり約０．１乃至約５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは投薬１回あたり約１乃至約５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは投薬１回あたり約５乃至約３０ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは投薬１回あたり約１０乃至約３０ｍｇ／ｋｇである。投与されるべきＢｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドの用量は、投与方法に依存することがある。例えば、Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドの静脈内投与は、Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を含む局所的埋め込み物から得られる全身投薬量よりも著しく高い全身投薬量となる可能性がある。一実施形態では、Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、投薬１回あたり約１乃至約５０ｍｇ／ｋｇの用量で、好ましくは投薬１回あたり約４乃至約３０ｍｇ／ｋｇの用量で、より好ましくは投薬１回あたり約５乃至約１５ｍｇ／ｋｇの用量で皮下に投与される。別の実施形態では、Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、投薬１回あたり約１乃至約５０ｍｇ／ｋｇの用量で、好ましくは投薬１回あたり約４乃至約３０ｍｇ／ｋｇの用量で、より好ましくは投薬１回あたり約５乃至約１５ｍｇ／ｋｇの用量で静注により投与される。さらに別の実施形態では、Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、投薬１回あたり約１乃至約５０ｍｇ／ｋｇの用量で、好ましくは投薬１回あたり約４乃至約３０ｍｇ／ｋｇの用量で、より好ましくは投薬１回あたり約５乃至約１５ｍｇ／ｋｇの用量で局所投与される。局所投与では、全身投薬量がより少なくなり得ることは、当業者には明らかとなろう。例えば、腫瘍内投与、眼内注入、または埋め込みのような局所投与法は、局所的に高濃度のＢｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドを生じさせ得るが、全身に関しては比較的低い用量を示す。したがって、そのような場合、Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドの局所投与は、投薬１回あたり約０．１乃至約５０ｍｇ／ｋｇの全身投薬量をもたらすことを目的とする。
【００６９】
〔００７９〕別の実施形態では、治療サイクル中に、特に高用量のＢｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチド（投薬１回あたり約１０乃至約５０ｍｇ／ｋｇ）が投与される。
〔００８０〕さらに、特定のＢｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量は、癌のタイプ、疾病状態または疾病ステージ、オリゴヌクレオチドの毒性、癌細胞によるオリゴヌクレオチドの摂取速度、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与すべき個人の体重、年齢、および健康状態を含む、更なる因子に依存する。Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドの作用または生物活性を妨げる場合がある生体内に存在する多数の因子により、当業者は、Ｂｃｌ−２ンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量が個々に変化する場合があることを理解でき、また、本願明細書の特定の患者に対する適切な用量の教示から容易に識別できる。
【００７０】
〔００８１〕本発明の別の実施形態では、Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドｏｂｌｉｍｅｒｓｏｎは、少なくとも６μｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも約８μｇ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも約１０μｇ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも約１５μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは少なくとも約２０μｇ／ｍＬの平均ピーク血漿濃度（Ｃｍａｘ）を提供する用量で、断続的に投与される。別の実施形態では、平均ピーク血漿濃度は、少なくとも約４０μｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも約５０μｇ／ｍＬである。意外にも、本発明に従って断続的に投与した場合、臨床的に有意な毒性を示さずに、より高く、より効果的なピーク血漿レベルを達成できることが分かった。平均ピーク血漿濃度は、少なくとも４人の患者の試料からの血漿濃度を用いて決定すべきであり、また、対象試料のそれぞれにおけるピーク血漿濃度を決定するために、ｏｂｌｉｍｅｒｓｅｎ治療を施した後に、１５分乃至最高２４時間測定すべきである。ｏｂｌｉｍｅｒｓｅｎの血漿濃度は、高性能陰イオン交換によって測定することができ、それによって、平均ピーク血漿濃度を液体クロマトグラフィで測定することができる。簡潔に言えば、二重標準曲線は、０．２５、０．５、１、２、５、１０、および２０ｍｇ／ｍｌのｏｂｌｉｍｅｒｓｅｎのレベルでの制御血漿で生成することができる。標準曲線および患者試料からの血漿は、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールによって抽出される。クロマトグラフ分離は、ＧｅｎＰａｋ−ＦＡＸカラム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｗａｔｆｏｒｄ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）上で達成される。Ｏｂｌｉｍｅｒｓｅｎは、２０ｍｍｏｌ／ＬのＬｉ（ＯＨ）２内の２ｍｏｌのＬｉＣｌ２の勾配で溶出される。検出は、２５４ｎｍでの分光法によって達成される。オリゴヌクレオチド抽出は、０．５ｍｌの血漿を、２．４５ｍｌの０．４％ドデシル硫酸ナトリウム、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）に加えて、２分間渦混合することによって行うことができる。ＨＰＬＣの条件：ＨＰＬＣシステムは、２つのＫｏｎｔｒｏｎポンプと、勾配形成剤４６０と、Ｋｏｎｔｒｏｎオートサンプラとで構成される。ＵＶ検出は、Ｕｎｉｃａｍダイオードアレイ検出器によって２５４回行われる。ＨＰＬＣカラムは、Ｗａｔｅｒｓ  ＧｅｎＰａｋ−Ｆａｘカラム（４．６  ３  １００  ｍｍ）であり、バッファＡは、２０％アセトニトリル／１０ｍＭ  Ｌｉ（ＯＨ）２であり、バッファＢは、２０％アセトニトリル／１０ｍＭ  Ｌｉ（ＯＨ）２／２Ｍ  ＬｉＣｌ２である。線形勾配は、０．５ｍｌ／分の流量で、３０分間、１０乃至１００％のバッファＢで行われる。８０マイクロリットルの試料を、オートサンプラに注入する。留分（０．５ｍｌ）は、Ｐａｃｋａｒｄ１１２２留分コレクタで採集され、５ｍｌのＨｉｏｎｉｃ  Ｆｌｕｏｒ  ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔを試料に加えて、５分間計時する。Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．９（Ｍａｙ），２０００：ｐｐ．１８１２−１８２３、およびＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．２���１，Ｎｏ．１，４２０−４２７，１９９７を参照（これらは参照することにより本願明細書に組み込まれる）。
【００７１】
〔００８２〕Ｍａｒｃｕｃｃｉ他は、４ｍｇ／ｋｇ／日および７ｍｇ／ｋｇ／日の用量のＢｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｇｅｎａｓｅｎｓｅ（登録商標）、Ｇ３１３９）を、２つの患者群に１０日間毎日連続的に投与したときに、定常状態濃度（Ｃｓｓ）が２４時間以内に達成されたが、血漿濃度は単一指数関数的に減少し、４時間以内に検出できなくなったことを示した。血漿の半減期は、約６０分である。（Ｇ．Ｍａｒｃｕｃｃｉ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０１：４２５−４３２）。Ｇ３１３９を１４日間連続して皮下注入で供給したときの、定常状態血漿レベルを、注入開始後４８時間観察した。消失に対する平均血漿半減期は、７．４６時間であった。（Ｗａｔｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．  １８：１８１２−１８２３を参照）。一方で、Ｙｕｅｎ他は、ＰＫＣ−αに対して特異的な長さ２０のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの血漿濃度は、オリゴヌクレオチドの連続的な静脈内注入を開始後の２４時間において、また２１日目において同様であったこと、すなわち、Ｃｓｓが２４時間で達成されたことを報告した。（Ａ．Ｒ．Ｙｕｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５：３３５７−３３６３を参照）。血漿半減期は、１．０ｍｇ／ｋｇ／日の投与後約４０分、乃至３．０ｍｇ／ｋｇ／日の投与後約６０分であった。これらの見解は、Ｂｃｌ−２抗アポトーシス機能の抑制に有効となるように、オリゴヌクレオチドを細胞に輸送するのに十分である血漿濃度を達成するためには、投与方法が重要であることを示している。
【００７２】
〔００８３〕高用量は、１日の治療での連続的な注入として、または状況に応じて、ボーラス注入として、数分乃至数時間、好ましくは数時間にわたって投与することによって達成することができる。高用量の単回投与は、過渡的に３０μｇ／ｍＬをはるかに超えるＢｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドの循環血漿レベルをもたらす場合がある。さらに、特に高用量のＢｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドの単回投与は、わずか１２時間足らずで、Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドのＣｍａｘをもたらす場合がある。本発明の一実施形態では、高用量は、約２日乃至約１０日、好ましくは約３日乃至約９日、より好ましくは約５日乃至約７日の断続的な間隔で投与することができるものと想定される。好適な一実施形態では、治療サイクルにおいて、腫瘍の治療に必要なオリゴヌクレオチドの量を減じるために、十分なＣｍａｘを達成するに十分な高濃度の単回投与が施される。更なる一実施形態では、高用量のオリゴヌクレオチドは、１日おきの長い期間にわたって低用量投与するといった方法によって投与される。
【００７３】
〔００８４〕加えて、Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドの用量は、用いられる特定のＢｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドによって変化させることができる。
〔００８５〕Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量の測定において考慮される他の因子は、他の治療法と組み合わせてオリゴヌクレオチドを投与するかどうかを含む。そのような場合、高用量のＢｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドによる治療は、併用療法を提供することができ、他の治療の量が減じられることで毒性が減じられる。例えば、断続的な間隔での投薬１回あたり約１０乃至約５０ｍｇ／ｋｇのＢｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドによる患者の治療は、対象の癌治療に対する感度をさらに増加させることができる。そのような場合、本発明に従って投与される高用量のＢｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、低用量の癌治療剤と組み合わせて、治療が必要な患者の治療を改善する。
【００７４】
〔００８６〕一実施形態では、１８塩基のホスホロチオエートＢｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチド指定のＧ３１３９（ｏｂｌｉｍｅｒｓｅｎ；Ｒ．Ｊ．Ｋｌａｓａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２：１９３−２１３）は、Ｂｃｌ−２  ｍＲＮＡの最初の６つのコドンと相補的であり、またＲＮＡ塩基にハイブリッド化し、約２日乃至約１０日の断続的な間隔で投与される。
【００７５】
〔００８７〕別の実施形態では、ｏｂｌｉｍｅｒｓｅｎは、投薬１回あたり約０．１乃至約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。特定の実施形態では、ｏｂｌｉｍｅｒｓｅｎは、投薬１回あたり約１乃至約５０ｍｇ／ｋｇの用量で、好ましくは投薬１回あたり約４乃至約３０ｍｇ／ｋｇの用量で、より好ましくは投薬１回あたり約５乃至約１５ｍｇ／ｋｇの用量で、約２日乃至約１０日の断続的な間隔で投与される。別の実施形態では、ｏｂｌｉｍｅｒｓｅｎは、上記の用量で約３日乃至約９日の断続的な間隔で投与される。さらに別の実施形態では、ｏｂｌｉｍｅｒｓｅｎは、上記の用量で約４日乃至約７日の断続的な間隔で投与される。好適な一実施形態では、ｏｂｌｉｍｅｒｓｅｎは、上記の用量で約３日乃至約５日の断続的な間隔で投与される。さらに好適な実施形態では、ｏｂｌｉｍｅｒｓｅｎは、投薬１回あたり約５乃至約３０ｍｇ／ｋｇの用量で、約３日乃至約１４日の断続的な間隔で投与される。本発明は、使用すべき特定のＢｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドに基づいた、または特定の投与方法に基づいた、あるいはＢｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドが、併用療法の一部として（例えば、癌治療剤と組み合わせて）施されるかどうかに基づいた、他の好適な治療計画を目的とする。断続的な投薬は、１つ以上の治療において施すことができる。
【００７６】
投薬およびスケジューリングサイクル
〔００８８〕本発明は、上述の前治療を施した後にオリゴマを投与するための投薬およびスケジューリングサイクルのための方法および組成物をさらに提供する。これまで、癌治療のためのＢｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、オリゴマを用いた研究では、例えば、約１４日間または約２１日間、Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドの日用量を投与し、その後、約１４日または約２１日のサイクル中に約７日の休止期間を有する放射線療法または化学療法のような従来の治療を施すことによって、患者を治療している。これらの研究による結果は有望であったが、本発明に従って異種移植腫瘍を有するマウスを治療し、断続的な高用量のＢｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドで治療する前にＸ線治療を施したときに、Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドの摂取の更なる改善が観察された。
【００７７】
〔００８９〕したがって、本発明の一実施形態では、患者に前治療を施した後に、高用量のオリゴマを１回以上投与するステップからなるサイクルであって、オリゴマは、約２日乃至約１０日の断続的な間隔で投薬するサイクルを目的とする。１週間乃至４週間の休止期間は、第２のサイクルが患者に施される前に設けることができる。合計１乃至６サイクルまたはそれ以上を患者に施すことができる。
【００７８】
〔００９０〕当然、本願明細書に開示された本発明の原理の変更を当業者が行い得ることであり、このような変更は、本発明の範囲内に含まれることを意図したものであると理解および予想されるべきである。
【００７９】
〔００９１〕本願明細書で触れた全ての参考文献は、本願明細書にその全体が組み込まれる。
【実施例】
【００８０】
〔００９２〕下述する実験に使用するオリゴヌクレオチドは、全てｂｃｌ−２を標的とするホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであった。使用するオリゴヌクレオチドは、使用前に、ＨＰＬＣで精製し、無菌の生理食塩水中に溶解した。
Ｇ３１３９  ５′−ＴＣＴＣＣＣＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＡＴ−３′抗ｂｃｌ−２（塩基＋１乃至＋１８）
ＦＡＭ−Ｇ３１３９  Ｆ−ＴＣＴＣＣＣＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＡＴ−３′蛍光Ｇ３１３９
Ｇ３６２２  ５′−ＴＡＣＣＧＣＧＴＧＣＧＡＣＣＣＴＣＴ−３′逆極性制御
実施例１：断続的に高用量オリゴヌクレオチドによって治療される異種移植腫瘍を有するマウスにおける、蛍光標識化オリゴヌクレオチド、Ｇ３１３９のより高い摂取。
【００８１】
〔００９３〕生体内腫瘍モデル：ＰＣ−３−Ｂｃｌ−２異種移植腫瘍は、１ｍｇ／ｍＬのＭａｔｒｉｇｅｌＴＭにおいて１×１０６の細胞を、雌の無胸腺ヌードマウスの脇腹に注入することによって確立した。平均腫瘍サイズが６５ｍｍ３となったときに、動物をランダム化し、５ｍｇ／ｋｇの用量（低用量）で７日間毎日、または1５ｍｇ／ｋｇの用量（高用量）で断続的に１日目、４日目、および７日目（すなわち３日おきの投与）に、蛍光Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＦＡＭ−Ｇ３１３９）によりＩＰを通じて治療した。（図１Ａ）。
【００８２】
〔００９４〕蛍光化Ｇ３１３９オリゴヌクレオチドの摂取。８日目および１２日目に、動物は死亡し、皮下および器官を切除した。それぞれの切除した組織の一部は、（ａ）ＯＣＴ（Ｍｉｌｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に包埋するか、または（ｂ）クリオセクショニング（厚さ８乃至１０μＭ）のために、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ−ｐｌｕｓスライド（Ｆｉｓｈｅｒ）上に載置したクリオチューブ内に配置してスナップ凍結（液体窒素）した。蛍光強度は、立体顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、４０）およびスポットカメラ（ＱＩｍａｇｉｎｇ）を使用して記録した。
【００８３】
〔００９５〕図１Ｂの結果は、８日目において、５ｍｇ／ｋｇのオリゴヌクレオチド（低用量、左パネル）で毎日治療したマウスと比較して、１５ｍｇ／ｋｇのオリゴヌクレオチド（高用量、中央パネル）で断続的に１日目、４日目、および７日目に治療したマウスの腫瘍細胞による蛍光化Ｇ３１３９の摂取がより高いことを示している。１２日目では、１５ｍｇ／ｋｇのＧ３１３９で断続的に治療したマウスにおいて、蛍光化Ｇ３１３９の摂取がさらに高いことが観察された（右パネル）。
【００８４】
実施例２：Ｘ線照射による前前治療は、高用量のオリゴヌクレオチドで断続的に治療した異種移植腫瘍を有するマウスにおける蛍光標識化オリゴヌクレオチド、Ｇ３１３９の摂取を高めた。
【００８５】
〔００９６〕生体内腫瘍モデル：ＰＣ−３−Ｂｃｌ−２異種移植腫瘍は、上述の実施例１に記載されているように、雌の無胸腺ヌードマウスに確立した。平均腫瘍サイズが６５ｍｍ３となったときに、動物をランダム化し、マウスは、５ｍｇ／ｋｇの低用量で７日間毎日、または１５ｍｇ／ｋｇの高用量で断続的に１日目、４日目、および７日目に、ＩＰによってＦＡＭ−Ｇ３１３９を投与する前に５ＧｙのＸ線によって前治療するか、またはＧ３１３９の投与を完了した後の最終日にＸ線で治療した。（図２Ａ）。
【００８６】
〔００９７〕蛍光化Ｇ３１３９オリゴヌクレオチドの摂取。１１日目に、動物は死亡し、皮下および器官を切除した。切除した組織は、上述の実施例１のように処置し、蛍光強度は、立体顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、４０）およびスポットカメラ（ＱＩｍａｇｉｎｇ）を使用して記録した。
【００８７】
〔００９８〕図２Ｂは、最初に５ｍｇ／ｋｇのＧ３１３９を投与して、その後、サイクルの終わりにＸ線で治療したマウスよりも、５ｍｇ／ｋｇのＧ３１３９を投与する前に、サイクルの始めに５ＧｙのＸ線によって前治療する方が、腫瘍細胞による蛍光化Ｇ３１３９の摂取が高いことを示している。
【００８８】
〔００９９〕図３は、サイクルの始めに５ＧｙのＸ線で前治療し、断続的な間隔で１５ｍｇ／ｋｇのＧ３１３９を投与したときに、摂取がさらに高くなることを示している。
実施例３：Ｇ３１３９の単回投薬で治療した異種移植腫瘍を有するマウスにおける、Ｘ線による前前治療は、蛍光標識化オリゴヌクレオチドＧ３１３９の保持を延長した。
【００８９】
〔０１００〕生体内腫瘍モデル：ＰＣ−３−Ｂｃｌ−２異種移植腫瘍は、上述の実施例１に記載されているように、雌の無胸腺ヌードマウスに確立した。平均腫瘍サイズが６５ｍｍ３となったときに、動物をランダム化し、左脇腹に異種移植腫瘍を有するマウスは、６ｍｇ／ｋｇの低用量で５日間毎日（左上パネル）、１０ｍｇ／ｋｇの高用量で１日目、３日目、および５日目（中央上パネル）において、３０ｍｇ／ｋｇの単回投薬でＸ線の前治療と同じ日（右上パネル）において、および異種移植腫瘍を有する無治療の左側脇腹（下部３パネル）において、蛍光化Ｇ３１３９オリゴヌクレオチドを投与する前に、５ＧｙのＸ線によって前治療を行った。それぞれのマウスには、合計用量３０ｍｇ／ｋｇの蛍光Ｇ３１３９を投与した。
【００９０】
〔０１０１〕蛍光化Ｇ３１３９オリゴヌクレオチドの摂取。８日目に、動物は死亡し、皮下および器官を切除して、核を染色するための内部染色対照として、ＤＡＰＩで対比染色した。切除した組織は、上述の実施例１のように処置し、蛍光強度は、立体顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、４０）およびスポットカメラ（ＱＩｍａｇｉｎｇ）を使用して記録した。信号強度は、ＭＣＩＤ  Ｅｌｉｔｅ（Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して各サンプルの３つの領域において記録および定量化を行い、平均化して、報告された強度を求めた。
【００９１】
〔０１０２〕図６は、１日目にＸ線によって前治療を行い、その後、３０ｍｇ／ｋｇのＧ３１３９を単回投薬することで、オリゴヌクレオチドの摂取を高められるだけでなく、照射およびＧ３１３９の両方を投与した後に７日間持続することも示している。蛍光Ｇ３１３９の摂取は、６ｍｇ／ｋｇの日用量で５日間治療したマウス（左上パネル）よりも、１０ｍｇ／ｋｇのＧ３１３９を断続的に投薬して治療したマウス（中央上パネル）の方が高い。Ｘ線によって感作しなかった左脇腹から採取した腫瘍には目に見える染色は無い。
【００９２】
〔０１０３〕図５は、３つの群の動物から採取した腫瘍内のＦＡＭ−３１３９を定量化した図である。グラフは、１０ｍｇ／ｋｇの FAM − Ｇ３１３９を断続的に投薬して治療したマウス（１日おき、計３回の投薬）、または６ｍｇ／ｋｇの日用量で５日間治療したマウスよりも、最初にＸ線によって前治療を行い、その後、３０ｍｇ／ｋｇの FAM − Ｇ３１３９を単回投薬して治療したマウスから採取した組織において、摂取が最も高いことを示している。
【００９３】
実施例４：Ｂｃｌ−２アンチセンスの断続的な投薬は、単剤としての抗腫瘍薬の活性を高める。
〔０１０４〕生体内腫瘍モデル：ＮＳＣＬＣ異種移植腫瘍は、５乃至９×１０６のＡ５４９腫瘍細胞を注入することによって、雄の無胸腺ヌードマウスの脇腹内に確立した。平均腫瘍サイズが６５ｍｍ３となったときに、動物をランダム化し、マウスには、２．５、５、７．５ｍｇ／ｋｇの用量で４週間（２８日間）、１０ｍｇ／ｋｇの用量で４週間（２８日間）、１日おきに４週間（計１４日）、２日おきに４週間（計１０日）、および３日おきに４週間（計７日）のいずれかで、Ｇ３１３９を腹腔内に注入した。また、１日おきに４週間（計１４日）、２０ｍｇ／ｋｇの注入も行った。３０ｍｇ／ｋｇおよび４０ｍｇ／ｋｇのマウスへの注入は、それぞれ２日おき、または３日おきの間隔で行った。（図６）。腫瘍の成長は、埋め込み前の１５乃至５５日測定し、腫瘍の量は、式（（幅）２×長さ）／２に基づいて計算した。図７は、２０ｍｇ／ｋｇのＧ３１３９で１日おきに治療したマウスにおける腫瘍は、１０ｍｇ／ｋｇを毎日注入（計２８０ｍｇ／ｋｇ）したマウスよりも成長が遅かったことを示している。高用量だが、２乃至３日おきに断続的に注入したマウスの腫瘍も、低用量で毎日投薬したマウスよりも成長が遅かった。
【００９４】
〔０１０５〕異種移植腫瘍マウスの生存は、埋め込み後７５日間観察した。上述のスケジュールを用いて、種々の用量を注入したマウスの生存率を図８に示す。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】〔００１９〕図１Ａは、異種移植腫瘍を有するマウスへの蛍光Ｇ３１３９の投与のための用量およびスケジューリングのタイムラインを示す図である。〔００２０〕図１Ｂは、７日間連続して５ｍｇ  ＦＡＭ−Ｇ３１３９／ｋｇ（ＯＢＬ５、低用量）でＩＰ治療したマウス（左パネル）の、および２日おき（１日目、４日目、および７日目）に断続的に１５ｍｇ  ＦＡＭ−Ｇ３１３９／ｋｇ（ＯＢＬ1５、高用量）でＩＰ治療したマウスの異種移植腫瘍組織内の蛍光標識化Ｇ３１３９オリゴヌクレオチド、ＦＡＭ−Ｇ３１３９、Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドの摂取を示す図である。腫瘍組織は、８日目（中央パネル）および１２日目（右パネル）のＦＡＭ−３１３９の摂取に対して調査する。
【図２】〔００２１〕図２Ａは、異種移植腫瘍マウスにおける、５ｍｇ／ｋｇの蛍光標識化Ｇ３１３９オリゴヌクレオチド、ＦＡＭ−Ｇ３１３９（ＯＢＬ５）およびＸ線の投与のための用量およびスケジューリングのタイムラインを示す図であり、Ｘ線（ＸＲＴ）は、Ｇ３１３９の投与の前に、治療の１日目に投与するか、またはＧ３１３９の最後の投与前に、治療の最終日に投与する。〔００２２〕図２Ｂは、７日間連続して５ｍｇ  ＦＡＭ−Ｇ３１３９／ｋｇを静脈内投与して治療したマウスの異種移植腫瘍組織内の蛍光Ｇ３１３９オリゴヌクレオチド、ＦＡＭＧ３１３９の摂取を示す図であり、Ｘ線を最初に投与したもの（左パネル）、および（Ｂ）Ｘ線を最後に投与したもの（右パネル）である。腫瘍組織は、１１日目の摂取に対して調査する。
【図３】〔００２３〕図３Ａは、異種移植腫瘍マウスにおける、１５ｍｇ／ｋｇの蛍光標識化Ｇ３１３９オリゴヌクレオチド、ＦＡＭ−Ｇ３１３９（ＯＢＬ１５）およびＸ線の投与のための用量およびスケジューリングのタイムラインを示す図であり、Ｘ線（ＸＲＴ）は、Ｇ３１３９の投与前に最初に投与されるか、またはＧ３１３９の最後の投与後に最後に投与される。〔００２４〕図３Ｂは、２日おき（１日目、４日目、および７日目）に断続的に１５ｍｇ  ＦＡＭ−Ｇ３１３９／ｋｇ（ＯＢＬ１５）を静脈内投与して治療したマウスの異種移植腫瘍組織内の蛍光標識化Ｇ３１３９オリゴヌクレオチド、ＦＡＭ−Ｇ３１３９の摂取を示す図であり、Ｘ線を最初に投与したもの（左パネル）、および（Ｂ）Ｘ線を最後に投与したもの（右パネル）である。腫瘍組織は、１１日目の摂取に対して調査する。
【図４】〔００２５〕図４は、最初に右脇腹の腫瘍をＸ線で前治療し、その後、５日間連続して６ｍｇ／ｋｇのＦＡＭ−Ｇ３１３９を静脈内投薬し（左上パネル）、１日おきに（すなわち１日目、３日目、５日目に）１０ｍｇ／ｋｇのＦＡＭ−Ｇ３１３９を３回投薬（上中央パネル）し、また、Ｘ線の前治療と同じ日に３０ｍｇ／ｋｇのＦＡＭ−Ｇ３１３９を単回投薬（右上パネル）したマウスの異種移植腫瘍組織内のオリゴヌクレオチドの摂取による、蛍光標識化Ｇ３１３９オリゴヌクレオチド、ＦＡＭ−G３１３９の長期持続性を示す図である。マウスは、全ての群で８日目に死亡し、腫瘍はＦＡＭ−Ｇ３１３９の摂取に対して評価した。ＦＡＭ−Ｇ３１３９の摂取は、照射せずにＦＡＭ−Ｇ３１３９で治療したそれぞれのマウスの左脇腹内の腫瘍の制御と比較した（下部パネル）。
【図５】〔００２６〕図５は、図４のマウスの腫瘍におけるＦＡＭ−３１３９の定量化を示す図である。
【図６】〔００２７〕図６は、Ａ５４９  ＮＳＣＬＣ異種移植マウスに投与されたＧ３１３９の実験的なスケジュールおよび用量を示す図である。用いた用量は、２．５、５、７．５、１０、２０、３０、および４０ｍｇ／ｋｇであり、毎日、１日おき、または２日および３日おきに投与した。
【図７】〔００２８〕図７は、図８に示されるスケジュールおよび用量を用いた腫瘍成長曲線を示す図である。
【図８】〔００２９〕図８は、図８に示される種々の用量を用いて種々の用量の投与を行った、Ａ５４９  ＮＳＣＬＣ異種移植マウスの生存率を示す図である。
【図１】
2009538272.tif 000002
【図２】
2009538272.tif 000003
【図３】
2009538272.tif 000004
【図４】
2009538272.tif 000005
【図５】
2009538272.tif 000006
【図６】
2009538272.tif 000007
【図７】
2009538272.tif 000008
【図８】
2009538272.tif 000009
【国際調査報告】
2009538272.tif 000010
2009538272.tif 000011
2009538272.tif 000012