(57)【要約】  クローン化されたイヌ科動物及びその生産方法が開示されている。該方法は，イヌ科動物の卵から核を除去して除核卵を製造する工程，イヌ科動物の体細胞を核供与細胞として使用して前記除核卵に最適化された条件で核移植を実施して核移植胚を製造する工程，及びこの核移植胚を代理母の卵管に移植する工程を含む。本発明はクローン化されたイヌ科動物を生産する方法を提供し，従って，優良なイヌ科動物の繁殖，貴重な又は絶滅の危機にあるイヌ科動物の保存，異種移植，疾患モデル動物など獣医学，人類学及び医学研究分野の発達に寄与することができる。【選択図】図２
2009502162.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）イヌ科動物の成熟卵から除核された受核卵を製造する工程と，
（ｂ）ドナーとなるイヌ科動物の組織から体細胞を分離して核供与細胞を製造する工程と，
（ｃ）前記工程（ａ）の前記除核卵に前記工程（ｂ）の前記核供与細胞を顕微注入して３．０〜３．５ｋＶ／ｃｍの電圧で前記供与細胞と前記除核卵を電気融合させる工程と，
（ｄ）前記工程（ｃ）で融合した前記卵を活性化させる工程とを含む
イヌ科動物の核移植胚の製造方法。
【請求項２】
前記成熟卵がin vivoで成熟した卵である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記in vivoで成熟した卵のイヌ科動物からの回収を排卵後４８〜７２時間に実施する請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記工程（ａ）の体細胞が，卵丘細胞，上皮細胞，繊維芽細胞，神経細胞，上皮細胞，角化細胞，造血細胞，メラニン細胞，軟骨細胞，赤血球，マクロファージ，単球細胞，筋肉細胞，Ｂリンパ球，Ｔリンパ球，胚幹細胞，胚生殖細胞，胎児細胞，胎盤細胞及び胚細胞からなる群より選択されるものである請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記体細胞が繊維芽細胞又は卵丘細胞である請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記工程の（ｃ）電気融合が，直流電圧３．０〜３．５ｋＶ／ｃｍ，１０〜３０μｓで，１〜３回実施する請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記工程（ｄ）の活性化工程が，融合した卵をカルシウムイオノフォア及びＤＭＡＰ（６−ジメチルアミノプリン）で同時に又は段階的に処理することにより行われる請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記活性化方法が，融合した卵をカルシウムイオノフォア５〜１０μＭで３７〜３９℃で３〜５分間処理した後，ＤＭＡＰ（６−ジメチルアミノプリン）１．５ｍＭ〜２．５ｍＭで３７〜３９℃で４〜５時間処理することにより行われる請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記イヌ科動物が，イヌ，オオカミ，キツネ，ジャッカル，コヨーテ，チョウセンオオカミ及びタヌキからなる群より選択される請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記イヌ科動物が，イヌ，オオカミ及びキツネからなる群より選択される請求項１記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０いずれか１項記載の方法によって製造された核移植胚。
【請求項１２】
寄託番号ＫＣＴＣ  １０８３１ＢＰで韓国生命工学研究員遺伝子銀行（ＫＣＴＣ）に寄託されている請求項１１記載の核移植胚。
【請求項１３】
請求項１１又１２記載の核移植胚を代理母の卵管に移植して産子を出生させる工程を含むクローン化されたイヌ科動物の生産方法。
【請求項１４】
前記イヌ科動物が，イヌ，オオカミ，キツネ，ジャッカル，コヨーテ，チョウセンオオカミ及びタヌキからなる群より選択される請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記イヌ科動物がイヌ，オオカミ及びキツネからなる群より選択される請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
請求項１３記載の方法によって生産されたクローン化されたイヌ科動物。
【請求項１７】
前記クローン化されたイヌ科動物が請求項１の核供与細胞又はドナー動物と同じ遺伝子型を有する請求項１６記載のクローン化されたイヌ科動物。
【請求項１８】
前記イヌ科動物が，イヌ，オオカミ，キツネ，ジャッカル，コヨーテ，チョウセンオオカミ及びタヌキからなる群より選択される請求項１６記載のクローン化されたイヌ科動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はクローン化されたイヌ科動物及びその生産方法に関する。より具体的には，本発明はイヌ科動物の成熟卵から核を除去して除核された受核卵を製造した後，イヌ科動物の体細胞を核供与細胞として使用して最適化された条件で前記除核された卵に核移植を実施して核移植胚を製造すること，この核移植胚を代理母の卵管に移植することを含むクローン化されたイヌ科動物の生産方法及び前記方法によって生産されたクローン化されたイヌ科動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の細胞融合又は細胞質内注入による体細胞核移植技術の発展により，クローン化動物の生産が本格的に行われている。
【０００３】
体細胞核移植技術は生殖過程で一般的に行われる減数分裂及び半数体保有生殖細胞形成を経由しなくても子孫を誕生させることができる技術であり，生体の二倍体保有体細胞を除核卵に移植して胚を生産して，前記胚をin vivoに移植して新しい個体を発生させる方法である。一般的に体細胞核移植技術において体細胞供与核を移植する受核卵(recipient oocyte)はin vitroで人工的に培養して第二減数分裂中期に到達するまで成熟させた後に使用される。そして，体細胞核移植にともなう染色体異常発生を防止するためには，体細胞を移植する前に前記成熟卵の核を除去する。前記成熟細胞の囲卵腔又は細胞質に体細胞を注入した後，前記除核卵と体細胞を電気的刺激により物理的に融合させる。融合対は，電気刺激又は化学物質によって活性化させた後，代理母に移植して産子を誕生させる。
【０００４】
このような体細胞核移植技術は，例えば優良動物の繁殖，希少動物又は絶滅するおそれのある動物の保存，特定栄養物質の生産，治療用生体物質の生産，臓器移植用動物の生産，病疾患動物の生産，細胞及び遺伝子治療のような医学的に価値のある臓器移植代替用の動物の生産などの分野で広く活用することができる。
【０００５】
動物のクローン化技術は，英国のロスリン研究所のウィルムート(Wilmut)博士によって，６才のヒツジから乳腺細胞を採取し，その細胞を核が除去された卵に移植して核移植胚を生産した後，この胚をin vivoに移植し，クローン化動物のドリーを誕生させることによって最初に成功した。以後，ウシ，マウス，ヤギ，ブタ及びウサギなどが，動物成体から得られる体細胞を用いた核移植方法により生産されてきた（国際特許公開第ＷＯ９９３７１４３Ａ２号，欧州特許第９３０００９Ａ１号，国際特許公開第ＷＯ９９３４６６９Ａ１号，国際特許公開第ＷＯ９９０１１６４Ａ１号及び米国特許第５９４５５７７号）。
【０００６】
一方，ウシ，ブタのような産業動物のクローン化だけでなく，イヌのような他の愛玩動物のクローン化も多くの人々の関心の対象になっている。近年は，ペットとしては初めてネコがクローン化され，イヌのクローン化についての研究も実施された。
【０００７】
しかし，まだ体細胞核移植方法によるイヌ科動物のクローン化が成功した事例は報告されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の発明者らはクローン化されたイヌ科動物の生産方法を研究し，その結果，電気融合条件，核移植胚活性化条件及び代理母への胚の移植条件を最適化して，体細胞移植方法によってクローン化されたイヌ科動物を初めて生産し，本発明を完成した。
【０００９】
従って，本発明の目的は体細胞核移植技術を利用したイヌ科動物の核移植胚の生産方法を提供することである。
【００１０】
また，本発明の他の目的は，前記方法によって製造されたイヌ科動物の核移植胚を提供することである。
【００１１】
また，本発明の他の目的は，前記核移植胚を代理母に移植して，産子を出生させる工程を含むクローン化されたイヌ科動物の生産方法を提供することである。
【００１２】
また，本発明の他の目的は，前記方法によって生産されたクローン化されたイヌ科動物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記の目的を達成するために，本発明は体細胞核移植技術を利用したイヌ科動物の核移植胚生産方法を提供する。
【００１４】
他の態様において，本発明は前記方法によって製造されたイヌ科動物の核移植胚を提供する。
【００１５】
さらに別の態様においては，本発明は前記核移植胚を代理母に移植して産子を出生させる工程を含むクローン化されたイヌ科動物の生産方法を提供する。
【００１６】
別の態様においては，本発明は前記方法によって製造されたクローン化されたイヌ科動物を提供する。
【００１７】
以下，本発明を詳細に説明する。
【００１８】
用語の定義 
本発明で使用される用語「核移植」は，除核細胞に他の細胞の核ＤＮＡを人工的に結合させて，同じ形質及び要求された品質を有するようにする遺伝子操作技術をいう。
【００１９】
本発明で使用される用語「核移植胚」は，核供与細胞が導入又は融合された胚をいう。
【００２０】
本発明で使用される用語「クローン化」は，一つの個体と同じ遺伝子セットを有する新しい個体を作る遺伝子操作技術を意味する。特に本発明では，細胞，胚細胞，胎児細胞及び／又は動物細胞が他の細胞，胚細胞，胎児細胞及び／又は動物細胞の核ＤＮＡ配列と実質的に類似又は同一の核ＤＮＡ配列を有することをいう。
【００２１】
本発明で使用される用語「核供与細胞」は核受容体である受核卵に核を移す細胞又は細胞の核をいう。  
【００２２】
本発明で使用される用語「受核卵」は，核が除去された後，核供与細胞からの核の移植を受ける卵をいう。
【００２３】
本発明で使用される用語「成熟卵」は第二減数分裂中期まで到達した卵をいう。
【００２４】
本発明で使用される用語「除核卵」は核が除去された卵を意味する。
【００２５】
本発明で使用される用語「融合」は核供与細胞と受核卵の脂質膜との結合を意味する。例えば，脂質膜は細胞の原形質膜又は核膜であり得る。融合は核供与細胞と受核卵が互いに隣接するように位置している時又は核供与細胞が受核卵の囲卵腔(perivitelline space)内に位置している時に核供与細胞と受核卵の間に電気的刺激を加えることによって起こすことができる。
【００２６】
本発明で使用される用語「活性化」は核移植工程前，核移植工程の間又は核移植工程後に細胞が分裂するように刺激を与えることをいう。望ましくは，本発明では核移植段工程に細胞が分裂するように刺激を与えることをいう。
【００２７】
本発明で使用される用語「産子(living offspring)」は子宮外で生存できる動物をいう。望ましくは，１秒間，１分間，１時間，１日，１週間，１ヶ月間，６ヶ月間又は１年間以上生存できる動物をいう。前記「産子」動物は生存のために子宮内環境の循環系を必要としない。
【００２８】
本発明で使用される用語「イヌ科動物」としてはイヌ，オオカミ，キツネ，ジャッカル，コヨーテ，チョウセンオオカミ及びタヌキが含まれる。望ましくは，イヌ又はオオカミが含まれる。イヌは野生のオオカミが家畜化されたものであることが分かっており，このため，オオカミとイヌは染色体数が同一で，妊娠期間，性ホルモンの変化が類似している(シール他（Seal US et al.）,Biology Reproduction １９７９年,21:1057-1066) 。
【００２９】
本発明は核移植胚の電気融合及び活性化条件を最適化してイヌ科動物の核移植胚を製造し，前記核移植胚を代理母の卵管に移植して産子を生産することによって，体細胞核移植技術によるイヌ科動物のクローン化に初めて成功したことに特徴がある。
【００３０】
本発明のイヌ科動物の核移植胚の生産方法は，
（ａ）イヌ科動物の成熟卵から除核された受核卵を製造する工程と，
（ｂ）ドナーとなるイヌ科動物の組織から体細胞を分離して核供与細胞を製造する工程と，
（ｃ）前記工程（ａ）の除核卵に工程（ｂ）の核供与細胞を顕微注入して３．０〜３．５ｋＶ／ｃｍの電圧で核供与細胞を除核卵と電気融合させる工程と，
（ｄ）前記工程（ｃ）で融合させた卵を活性化させる工程とを含む。
【００３１】
以下，本発明のイヌ科動物の核移植胚生産方法の各工程を説明する。
【００３２】
第１工程：受核卵の除核
受核卵として使用するためには，イヌ科動物から回収された未成熟卵をin vitroで成熟させることができ，また，in vivoで成熟した卵を回収することができる。一般的にほ乳動物(例えば，ウシ，ブタ，ヒツジなど)の卵は成熟卵，すなわち第二減数分裂中期(metaphase II)で排卵されるが，イヌ科動物の卵は他の動物とは違って第一減数分裂の前期に排卵されて，卵管内で４８〜７２時間の間，留まりながら成熟する。イヌ科動物の卵核成熟率が非常に低く，イヌ科動物の排卵時期及び繁殖生理が他の動物とは異なるため，in vivoで成熟したイヌ科動物の卵を回収し，受核卵として使用することが望ましい。
【００３３】
より具体的には，イヌ科動物からの成熟卵の回収は，好ましくはイヌ科動物の排卵誘発後約４８〜７２時間に，より望ましくは約７２時間に実施する。この点に関し，イヌ科動物の排卵日は当該分野で公知の方法により決めることができる。排卵日を決める方法には，例えば，膣スミア試験，血清性ホルモン値測定及び超音波診断システムが含まれるが，これらに限定されない。イヌ科動物の発情の開始は外陰部膨張及び漿液血性分泌により確認することができる。
【００３４】
本発明の一試験例では，膣スミア試験と血清プロゲステロン濃度の分析を実施し，非角質化上皮細胞が８０％以上，血清プロゲステロン濃度が約４．０〜７．５ｎｇ／ｍＬに達した時を排卵日と見なした。これに基づき，排卵後４８〜７２時間，望ましく排卵後約７２時間に卵を回収した。一方，イヌ科動物から排卵された卵の成熟時期は排卵後４８〜７２時間であることが公知であり，本発明の発明者らは排卵後４８時間，６０時間及び７２時間に回収した卵を分析し，その結果，排卵後約７２時間に回収された卵が第二減数分裂中期に該当する成熟卵であることを確認した。また，本発明で実際にクローン化イヌの生産に成功した卵も排卵後７２時間に回収された卵であった。したがって，イヌ科動物の成熟卵の回収は排卵後７２時間が最も望ましいということが分かった。
【００３５】
in vivoで成熟した卵を回収する方法としては，対象動物を麻酔した後に開腹することを含む外科的方法を用いることができる。より具体的には，in vivoで成熟した卵の回収は当該分野で公知の任意の方法で卵管切除法を用いて行うことができる。前記卵管切除法は卵管を外科的に切り出した後，卵回収培地を卵管内部に潅流させて得た潅流液から卵を回収する方法である。
【００３６】
また，in vivoで成熟した卵はカテーテルを卵管采に挿入した後，卵管−子宮の接合部位に針装着カテーテルを利用して潅流液を注入することによって回収することができる。この方法は卵管を損傷させないため，卵を供与する動物を次の発情にも利用できる長所がある。
【００３７】
したがって，望ましくは，in vivoで成熟した卵の回収は卵管を損傷させないカテーテルを利用した方法を用いる。一方，本発明の発明者らはカテーテルを利用した卵回収方法において，卵回収率を高めるために，卵管入口への挿入が容易になるように先端が丸く処理されている卵回収用ニードルを開発した（図１参照）。より具体的には，本発明の発明者らが開発したニードルを利用した卵回収方法は，先端が丸く処理された卵回収用ニードルを卵管内に挿入し，結紮した後，卵管−子宮の接合部位に卵回収用培地を潅流させて，前記卵回収用ニードルに潅流液が流入するようにして，この潅流液を顕微鏡で観察しながら成熟した卵を選択する方法である。
【００３８】
成熟した卵を回収した後，卵の半数体核を除去する。卵の除核は当該分野で公知の任意の方法を用いて実施できる（米国特許第４９９４３８４号，米国特許第５０５７４２０号，米国特許第５９４５５７７号，欧州特許公開第０９３０００９Ａ１号，大韓民国特許第３４２４３７号，カンダ他（Kanda et al）, J. Vet. Med. Sci., 57(4):641-646, １９９５年; Willadsen, Nature, 320:63-65, １９８６年, ナガシマ他（Nagashima et al.）, Mol. Reprod. Dev. 48:339-343 １９９７年; ナガシマ他, J. Reprod Dev 38:37-78, １９９２年; プラター他（Prather et al.）, Biol. Reprod 41:414-418, １９８９年, プラター他, J. Exp. Zool. 255:355-358, １９９０年; サイトウ他（Saito et al.）, Assis Reprod Tech Andro, 259:257-266, １９９２年; テロウ他（Terlouw et al.）, Theriogenology 37:309, １９９２年)。
【００３９】
望ましくは，受核卵の除核は下記の二種類の方法のいずれかを用いて実施できる。一つの方法は，成熟した受核卵の卵丘細胞(cumulus cell)を除去した後，マイクロニードルを利用して受核卵の透明帯の一部を切開してスリットを形成し，このスリットから第１極体，核及び周辺の細胞質(可能な限り少ない量)を除去することを含む。他の方法は，受核卵の卵丘細胞を除去し，卵を染色し，そして吸入ピペット(aspiration pipet)を利用して，第１極体及び卵の核を除去する。より望ましくは，卵の除核のためには，受核卵の状態を視覚的に評価して生存率が高い卵に対しては吸入方法を用い，生存率の低い卵に対してはスリットを形成する方法を用いる。
【００４０】
第２工程：核供与細胞の製造 
核供与細胞としてはイヌ科動物由来の体細胞を使用することができる。具体的には，本発明で使用される体細胞は，イヌ科動物の胚細胞，胎児細胞(fetus cell)，幼若細胞(juvenile cell)，成体細胞(adult cell)，望ましくは成体細胞から得られる卵丘，皮膚，口腔粘膜，血液，骨髄，肝臓，肺，腎臓，筋肉及び生殖器官などのような組織由来のものである。本発明で使用することができる体細胞としては例えば，卵丘細胞，上皮細胞，繊維芽細胞，神経細胞，表皮細胞，角化細胞，造血細胞，メラニン細胞，軟骨細胞，赤血球，マクロファージ，単球細胞，筋肉細胞，Ｂリンパ球，Ｔリンパ球，胚幹細胞，胚生殖細胞などが含まれるが，これらに限定されない。より望ましくは，本発明で使用される体細胞は，胎児繊維芽細胞及び成体繊維芽細胞，卵丘細胞でありうる。
【００４１】
そして，本発明で使用される核供与細胞は，野生型体細胞を遺伝子トランスファー法や遺伝子ターゲティング法を利用して，特定遺伝子で形質転換させたものであってもよい。前記遺伝子トランスファー法や遺伝子ターゲティング法は当該分野で公知のため，当業者であれば容易に実施することができる。
【００４２】
核供与細胞として提供される体細胞は，外科的サンプル又はバイオプシーサンプルを製造する方法により得ることができ，当該分野で公知の方法により前記サンプルから単一細胞を得ることができる。例えば，クローン化すべき動物からの組織の一部を無菌的に切開して前記の外科的標本又はバイオプシーサンプルを得て，このサンプルを細かく刻み，トリプシンで処理した後，組織培養用培地で培養する。組織培養用培地で３，４日培養した後に培養皿の細胞の生長を確認する。細胞が完全に生長したら，組織の一部を今後の使用のために凍結して液体窒素に保管して，残りは核移植に利用するために継代培養する。核移植に使用するために細胞は継代培養を１０回以下として，細胞が過度に大きくなるのを防止する。
【００４３】
前記組織培養用培地は，当該分野で公知のものでよく，例えば，ＴＣＭ−１９９，ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）などがある。
【００４４】
第３工程：核供与細胞の顕微注入(microinjection)及び融合
除核卵への核供与細胞の顕微注入は移植用ピペットを使用して，核供与細胞を除核卵の細胞質と透明帯との間に顕微注入することによって行われた。
【００４５】
前記核供与細胞を顕微注入した除核卵はセルマニピュレーターを使用して電気的に核供与細胞と融合させる。
【００４６】
電気的融合は交流電流でも直流電流でも行うことができる。望ましくは，３．０〜３．５ｋＶ／ｃｍの電圧で行うことができ，より望ましくは直流電圧３．０〜３．５ｋＶ／ｃｍで１０〜３０μｓを１〜３回実施することができる。最も望ましくは，直流電圧３．０〜３．５ｋＶ／ｃｍで２０μｓを２回実施することができる。前記で電圧が３．０ｋＶ／ｃｍ未満である場合又は３．５ｋＶ／ｃｍを超過する場合には，除核卵と核供与細胞の融合率が非常に低くなるであろう。前記電気的融合時の電圧範囲は今まで知られていた一般的な電気的融合時の電圧範囲（１．７〜２．０ｋＶ／ｃｍ）より高いという特徴がある。
【００４７】
本発明の一試験例では電気融合時の最適電圧範囲を決めるために核供与細胞を顕微注入した核移植胚を各々違う電圧範囲で電気的に融合した後，顕微鏡で融合率を調べた（試験例２参照）。その結果，核融合率は低い電圧より高い電圧で高いことがわかり，電圧範囲が３．０〜３．５ｋＶ／ｃｍの場合に融合率が７５．２％で最も高くなることが分かった（表７参照）。
【００４８】
核供与細胞と卵の電気的刺激による融合は融合用培地内で実施できる。本発明で使用される融合用培地はマンニトール，ＭｇＳＯ４，ＨＥＰＥＳ及びＢＳＡを含有する。
【００４９】
第４工程：融合した核移植胚の活性化 
融合した核移植胚の活性化は一時的に停止した細胞周期を再開させる工程である。細胞周期を再活性化するためには細胞周期を停止させる要素のＭＰＦ，ＭＡＰキターゼなどの細胞信号伝達物質の活性を低下させなければならない。
【００５０】
一般的に，核移植胚を活性化する方法には，電気的方法及び化学的方法がある。本発明では核移植胚を化学的方法により活性化するのが望ましい。前記化学的方法は電気的活性化方法に比べて，本発明による核移植胚の活性化をより多く促進することができる。前記化学的方法としては，エタノール，イノシトール三リン酸（ＩＰ３），２価イオン（例えばＣａ２＋又はＳｒ２＋），微小管抑制剤(microtubule inhibitors（例えばサイトカラシンＢ），２価イオンイオノフォア，６−ジメチルアミノプリン（ＤＭＡＰ）のような蛋白質キナーゼ抑制剤），蛋白質合成抑制剤（例えば，シクロヘキシミド），ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）のような物質で核移植胚を処理する方法がある。望ましくは，核移植胚の活性化のための化学的方法としては，本発明においてカルシウムイオノフォアと６−ジメチルアミノプリンで核移植胚を同時に又は段階的に処理する方法を用いることができる。より望ましくは，カルシウムイオノフォア５〜１０μＭで３７〜３９℃で３〜６分間処理した後，６−ジメチルアミノプリン１．５ｍＭ〜２．５ｍＭで３７〜３９℃で４〜５時間処理する。
【００５１】
本発明の一試験例では，前記核移植胚を電気的方法と化学的方法で各々活性化した後，核移植胚の発育段階を観察した（試験例３参照）。その結果，化学的活性化方法が，核移植胚の発育力を高め，化学的方法によって核移植胚を活性化することによって核移植胚を桑実胚期まで発育させることができることが確認された（表８参照）。
【００５２】
したがって，本発明は前記方法によって製造されたイヌ科動物の核移植胚を提供する。本発明の発明者らは本発明の一実施例で製造したイヌ科動物の核移植胚をスナッピー（Snuppy）（クローン化されたイヌ科動物の胚）と命名して，２００５年７月１５日付で韓国生命工学研究員遺伝子銀行（ＫＣＴＣ，大韓民国，大田（テジョン）広域市，儒城（ユソン）区，魚隠（オウン）洞，５２番地）に寄託番号ＫＣＴＣ  １０８３１ＢＰで寄託した。
【００５３】
前記核移植胚は凍結保存し，必要な時にこれを溶解して使うことができる。
【００５４】
そして，本発明によるイヌ科動物の核移植胚は代理母に移植して産子を出生させることによって，クローン化されたイヌ科動物を生産するのに使用することができる。望ましくは，本発明による核移植胚の代理母への移植は代理母の卵管に移植することにより行われる。移植は当該分野で公知の方法を用いて実施することができ，望ましくはカテーテルをクローン化した胚を移植するのに使用することができる。
【００５５】
本発明の一実施例において，本発明の核移植胚を代理母の卵管に移植することによってクローン化犬「スナッピー」と「ＮＴ−２＃」を初めて生産した（実施例６参照）。しかし，本発明の一試験例では，本発明の核移植胚を代理母の子宮に移植した場合には代理母は妊娠しなかったことが確認された（試験例４参照）。したがって，クローン化犬の生産において核移植胚の移植は代理母の卵管に行うことが望ましいことが分かった。
【００５６】
一方，核移植胚の代理母への移植において，前記核移植胚は１細胞期，２細胞期又は４細胞期でありうる。また，前記核移植胚は代理母が準備されるまで鉱物油で覆われた２５μｌのマイクロドロップ(microdrop)のｍＳＯＦで培養することができる。
【００５７】
したがって，本発明はクローン化されたイヌ科動物を提供する。クローン化されたイヌ科動物は核供与細胞又は供与体と完全に同じ遺伝的特性を有する。本発明の一実施例では本発明の方法によりクローン化犬を生産して，遺伝的特性をマイクロサテライト分析法を利用して分析した（試験例１参照）。その結果，本発明によるクローン化犬は核供与細胞又は供与体と完全に同じ遺伝的特性を有することを確認することができた（表６参照）。
【発明の効果】
【００５８】
前記で説明したように，本発明は，クローン化されたイヌ科動物を生産する方法を提供する。従って，本発明は，優良なイヌ科動物の繁殖，貴重な又は絶滅の危機にあるイヌ科動物の保存，異種移植，疾患モデル動物など獣医学，人類学及び医学研究分野の発達に寄与することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５９】
以下， 本発明を実施例によって詳細に説明する。しかしながら，下記実施例は本発明を例示する目的でのみ示されており，本発明の範囲を限定するものではないと理解すべきである。
【００６０】
実施例１：イヌからの受核卵の回収  
受核卵の回収のために使用したイヌは１〜３年の雑種雌イヌ１３１匹で，韓国のソウル大学校の飼育管理研究所で確立した標準により飼育されたものである。発情期が始まったイヌを対象に膣スミアと血清プロゲステロンの濃度を毎日測定して排卵日を決め，排卵日から４８〜７２時間後の成熟卵を回収した。
【００６１】
血清プロゲステロンの濃度を測定するために，血液３〜５ｍｌを毎日採取して遠心分離して血清を得た後，該血清をプロゲステロンコーティングされたチューブラジオイムノアッセーキットＤＳＬ−３９００  ＡＣＴＩＶＥ（ダイアグノスティック・システムズ・ラボラトリーズ・インコーポレイテッド（Diagnostic Systems Laboratories, Inc.）,テキサス州)を使って分析した。プロゲステロン濃度が４．０〜７．５ｎｇ／ｍｌに達した日を排卵日と見なした(ハセ他（Hase et al.）,J. Vet. Med. Sci.,62:243-248,２０００年)。
【００６２】
膣スミア試験は発情期の初期症候が現れた日から毎日スミアを採取することによって実施した。スミアは綿棒を外陰部に挿入することによって採取し，これをスライドグラスの上に塗抹した。ディフ・クイック(Diff-Quik)染色液(国際試薬株式会社（International chemical co.），日本)で染色した後，該スミアを顕微鏡で調べた。表皮細胞が上皮細胞角化指数(cornified index）（エヴァンス  Ｊ．Ｍ．他（Evans J.M. et al.）,Vet. Rec,7:598-599,１９７０年)８０％より高くに達した時を排卵時期と見なした。
【００６３】
排卵された卵の成熟時期は排卵後４８〜７２時間であることは公知である。したがって，本発明の発明者らは排卵後４８〜７２時間の卵を下記のような方法で回収した。
【００６４】
まず，体内成熟卵の採取時期に達した雌イヌに硫酸アトロピン(０．０５ｍｇ／ｋｇ)とマレイン酸アセプロマジン(０．０２５ｍｇ／ｋｇ)を投与し，ケタミン(５ｍｇ／ｋｇ)を投与して麻酔した。前記麻酔状態はイソフルレン(isoflurane)を投与することによって維持した。
【００６５】
前記麻酔した雌イヌに無菌的に外科手術を実施して中間腹部の部分を５〜１０ｃｍを切開して卵管が露出するようにした。その後，先端を丸く処理したニードル（図１）を卵管腹腔口に挿入し，縫合糸を利用して固定させた。その後，卵管−子宮接合部に２４ゲージIVカテーテルを装着して卵回収用培地（表１）を潅流させることによって潅流液が１６ゲージニードルに流れていくようにした。前記潅流液を滅菌ペトリ皿に移し，その後潅流液を顕微鏡で観察して成熟卵を選別した。
【００６６】
【表１】
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【００６７】
結果として，１匹のイヌから平均１２個の成熟卵が得られ，合計１３７０個の卵を回収した。
【００６８】
実施例２：受核卵の除核 
Ｃａ２＋無添加ＣＲ２培地（チャールズ・ローゼンクランス２(Charles Rosenkrans 2)）（ローゼンクランス他（Rosenkrans et al.），Biol. Reprod. 49，459-462，１９９３年）にＨＥＰＥＳバッファーを添加して製造したｈＣＲ２ａａ培地（表２）に０．１％（ｖ／ｖ）のヒアルロニダーゼ (シグマ（Sigma），米国)を添加した。その後，反復的にピペッティングして，前記実施例１で回収した卵から卵丘細胞を除去した。その後，この卵を５μｇ／ｍＬのビスベンズイミド(bisbenzimide) (Hoechst 33342)で５分間染色し，蛍光倒立顕微鏡を利用して×２００の倍率で観察して第１極体が確認された卵だけを選別した。ｈＣＲ２ａａ培地（表２）に１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳと５μｇ／ｍＬサイトカラシンＢを添加した後，該培地中，前記で選別された卵をマイクロマニピュレーター (ナリシゲ（Narishige），日本国，東京)を使用して除核した。すなわち，ホールディングマイクロピペット（内径１５０μｍ）で受核卵を固定した後，第１極体，周辺の細胞質（５％未満），及び卵核を吸引ピペットを用いて除去した。前記除核した卵を１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳが添加されたＴＣＭ−１９９培地（表３）中で保存した。
【００６９】
【表２】
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【００７０】
【表３】
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【００７１】
実施例３：核供与細胞の製造 
核供与細胞としてはイヌから得られた成体繊維芽細胞を使用した。この目的のために，まず３才の雄のアフガンハウンドの耳の皮膚組織を分離した。前記耳の皮膚組織片をダルベッコリン酸緩衝液 (ＤＰＢＳ；Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)中で３回洗浄して手術用ナイフで細かく刻んだ。前記の刻んだ皮膚組織を０．２５％（ｗ／ｖ）のトリプシン及び１ｍＭのＥＤＴＡを含むダルベッコ改変イーグル培地(ＤＭＥＭ；ライフテクノロジーズ社（Life Technologies），メリーランド州，ロックヴィル（Rockville）)に入れて３７℃で１時間処理した。トリプシンによって分解された細胞をＣａ２＋及びＭｇ２＋無添加ＤＰＢＳ内で３００×ｇで２分間の遠心分離を行うことにより１回洗浄した後，１００ｍｍのプラスチック培養皿に接種した。その後，前記接種した細胞を，１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ，１ｍＭのグルタミン，２５ｍＭのＮａＨＣＯ３及び１％（ｖ／ｖ）の最小必須培地非必須アミノ酸溶液(ライフテクノロジーズ社)が添加されたＤＭＥＭ培地で３９℃，５％のＣＯ２，９５％の大気下の飽和湿度雰囲気で６〜８日間継代培養した。付着しなかった細胞凝集塊を除去した後，付着した細胞を０．１％のトリプシン及び０．０２％のＥＤＴＡを使用して１分間トリプシン分解することにより，４〜６日間隔で継代培養した。その後，凍結用培地に入れて−１９６℃の液体窒素中に保管した。該凍結用培地は，８０％（ｖ／ｖ）のＤＭＥＭ，１０％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ及び１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳで構成される
【００７２】
実施例４：除核卵への核供与細胞の顕微注入及び融合  
実施例２で製造した除核卵に実施例３で製造した核供与細胞を顕微注入した。実施例２のマイクロマニピュレーターの吸引ピペットを移植用ピペットに交換した後，固定された卵をｈＣＲ２ａａ培地中の１００ｍｇ／ｍＬフィトヘマグルチニン(phitohemagglutinin)で処理した。除核卵のスリットを固定用ピペットで固定した後，移植用ピペットを挿入した。その後，実施例３の繊維芽細胞から分離した単一細胞を除核卵の細胞質と透明帯との間に移植ピペットで注入した。
【００７３】
前記のように核供与細胞が注入された卵を融合培地（０．２６Ｍのマンニトール，０．１ｍＭのＭｇＳＯ４，０．５ｍＭのＨＥＰＥＳ及び０．０５％のＢＳＡを含有する）に入れて，ステンレススチールワイヤ電極を備えた細胞融合チャンバー（ＢＴＸ  ４５３，３．２ｍｍ  ｇａｐ；ＢＴＸ，カリフォルニア州，サンディエゴ）に移した。３分間平衡させた後，ＢＴＸエレクトロセルマニピュレーターを使用して，電圧３．０〜３．５ｋＶ／ｃｍで２０秒間直流電流を通電して核供与細胞を卵に融合させた。融合は，回収された卵が弱い卵の場合には低い電圧で（３．０ｋｖ／ｃＭ程度）行う。また，健常な卵の場合には高い電圧（３．５ｋｖ／ｃｍ程度）で融合を実施した。融合は，平均３．３ｋｖ／ｃｍの電圧で実施した。
【００７４】
融合した核移植胚１０９５個を立体顕微鏡により選別し，これを表４に示す改変合成卵管液（ｍＳＯＦ；modified synthetic oviductal fluid)中で３時間培養した(ジャング他（Jang et al.）,Reprod Fertil Dev,15,179-185,２００３年)。
【００７５】
【表４】
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【００７６】
実施例５：核移植胚の活性化 
前記実施例４で得られた核移植胚を１０μＭイオノフォア（シグマ）を含有するｍＳＯＦ（表４）中，３９℃で４分間培養した。その後，前記胚を洗浄し，１．９ｍＭの６−ジメチルアミノプリンが添加されたｍＳＯＦ中でさらに４時間培養した。
【００７７】
本発明の発明者らは，前記で製造したイヌ科の核移植胚の一つを「スナッピー」（クローン化したイヌの胚）と命名して，２００５年７月１５日付で国際寄託機関である韓国生命工学研究員遺伝子銀行（ＫＣＴＣ，大田（テジョン）広域市，儒城（ユソン）区，魚隠（オウン）洞，５２番地）に寄託番号ＫＣＴＣ  １０８３１ＢＰとして寄託した。前記核移植胚は代理母に移植するまで鉱物油で覆われたｍＳＯＦのマイクロドロップ２５μl中で培養した。
【００７８】
実施例６：代理母への移植及びクローン化イヌの生産
前記実施例５の核移植胚を外科的方法により代理母の卵管に移植した。移植は前記実施例５で核移植胚を活性化した後代理母の準備状態により実施した。すなわち，代理母が直ちに準備される場合には核移植胚の移植を直ちに実施し，そうではない場合には核移植胚を活性化した翌日（クローン化胚芽段階：２細胞期又は４細胞期）に移植を実施した。代理母としては，雑種犬及びラブラドールリトリーバーで構成される１２３匹のイヌを使用した。選択されたイヌは病気がなく，正常な発情周期の反復を示し，正常な子宮状態を有していた。前記代理母に前記実施例５の再構築胚１，０９５個を外科的に移植した。この目的のために代理母に０．１ｍｇ／ｋｇのアセプロマジンと６ｍｇ／ｋｇのプロポフォール(propofol)を血管注射して麻酔させ，２％のイソフルレンを使用して麻酔状態を維持した。麻酔した雌イヌの手術部位を無菌処理して，卵管を露出させるために一般的な開腹手術法により腹の中央部分を５〜１０ｃｍ切開した。手で腹腔内を刺激して卵巣と卵管及び子宮をスリットに引き出した。引き出された卵巣の卵巣間膜を用心深く扱って，卵管の開口部を認識し，１．０ｍｌのツベルクリン注射器(ラテックスフリー，ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー（Becton Dickinson & CO.） ，ニュージャージー州０７４１７，フランクリンレイクス(Franklin lakes))が装着された３．５Ｆトムキャットカテーテル(Tom cat catheter)，シャーウッド（Sherwood）， ミズーリ州，セントルイス（St. Louis）)を卵管内に入れてカテーテルの前方に十分な空間を確保した。その後，核移植胚をカテーテルから卵管に注入した。核移植胚の注入が成功したかどうかを顕微鏡で観察し，抗生剤を含有する生理食塩水５００ｍｌを腹腔内注入した。腹部の縫合は吸水性縫合糸を利用して行い，その後，皮膚縫合を実施した。手術後感染を防止するために広範囲抗生剤を３日間投与した。
【００７９】
代理母に核移植胚を移植した後２２日目に７．０ＭＨＺのリニアアレイプローブ(linear-array probe)が装着されたＳＯＮＯＡＣＥ９９００超音波スキャナー(メジソン株式会社（Medison Co. LTD），韓国)を使用して妊娠の有無を検査した。妊娠状態は初期に妊娠を確認した後２週ごとに超音波でモニターした。その結果，３匹のイヌから妊娠事実を確認した。その中で１匹は死に至り，残り２匹のうち１匹から核移植胚を移植してから６０日後，２００５年４月２４日に帝王切開手術でクローン化イヌが分娩された。クローン化犬の体重は５３０ｇで健常であった。このクローン化犬を「スナッピー(Snuppy)」(Seoul National University puppy)と命名した。また，残り１匹から核移植胚を移植してから６０日後，２００５年５月２９日に帝王切開手術でクローン化犬が分娩された。クローン化犬の体重は５５０ｇで健常であった。このクローン化犬の名前を「ＮＴ−２＃」と命名した。
【００８０】
試験例１：本発明の方法により生産されたクローン化イヌの遺伝的同一性調査  
本発明の方法により，前記実施例６で得られたクローン化犬スナッピー及びクローン化犬ＮＴ−２＃が実施例３の核供与細胞を提供したドナー犬であるアフガンハウンドと遺伝的に同一であるかを調査した。
【００８１】
クローン化した子犬，ドナー犬，代理レシピエント(surrogate recipient)，核供与繊維芽細胞のゲノムＤＮＡを分離した。この目的のために，クローン化犬の尾から組織断片を回収し，ドナー犬及び代理母から血液試料を回収した。組織断片，血液試料及び繊維芽細胞の各々を４００μｇのプロテアーゼＫが添加された溶解緩衝液［０．０５Ｍのトリス（ｐＨ  ８．０），０．０５ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ  ８．０），０．５％のＳＤＳ］に入れて一晩培養した。その後，フェノール抽出及びエタノール沈殿を実施して各試料からゲノムＤＮＡを分離した。
【００８２】
前記で分離したＤＮＡを５０μｌのＴＥに溶解し，これを使用して８個のイヌ科動物に特異的なマーカー［ＰＥＺ０１，ＰＥＺ０２，ＰＥＺ０８，ＰＥＺ１５（米国特許第５８７４２１７号参照），ＲＥＮ１６２Ｂ０９，ＲＥＮ１０５Ｌ０３，ＲＥＮ１６５Ｍ１０，ＦＨ２１４０(http://www.fhcre.org/science/dog_ genome/dog.html参照)] を利用したマイクロサテライト分析を実施した(フランシスコ，Ｌ．Ｖ．他（Francisco,L.V. et al.） Mamm. Genome 7,359-362 １９９６年;ネフ，Ｍ．Ｗ．他（Neff,M.W. et al.）Genetics. 151,803-820,１９９９年;リッチマン，Ｍ．他（Richman,M. et al.） J. Biochem. Biophys. Methods 47,137-149,２００１年;デニス，Ｓ．他（Denise,S. et al.） Animal Genetics. 35,14-17,２００４年)。前記分離したゲノムＤＮＡを鋳型にして，前記公知マーカーの配列を基礎にして製造した蛍光標識部位特異的プライマー（表５）を使用してＰＣＲ増幅を実施した。この増幅産物を自動ＤＮＡ配列分析装置(ＡＢＩ３７３:アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）,カリフォルニア州，フォスターシティ（Foster City）)を使用して分析した。ＰＣＲ増幅反応では９４℃で１分間の変性前段階(predenaturation)，９４℃で２０秒間の変性，５８℃で２０秒間のアニーリング，７４℃で２０秒間の伸長のサイクル３０回，その後，７４℃で５分間の伸長後段階(post-extension)からなるものであった。また，ＰＣＲ産物の大きさを分析するためにソフトウェア(ジーンスキャン（GeneScan）及びゲノタイパー（Genotyper），アプライド・バイオシステムズ)を使った。
【００８３】
【表５】
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【００８４】
結果として，本発明の方法により生産されたクローン化犬スナッピー及びＮＴ−２＃はドナー犬であるアフガンハウンド及び該ドナー犬から分離した繊維芽細胞と完全に遺伝的同一性を有することが確認された。一方，本発明のクローン化犬と代理母（ラブラドールリトリーバー又は雑種犬）は遺伝的に異なることが確認された（表６）。
【００８５】
【表６】
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【００８６】
試験例２：核供与細胞の電気的融合条件の最適化
核供与細胞の除核卵への電気的融合条件を最適化するために前記実施例４と同じ方法で除核卵に核供与細胞を顕微注入し，電圧条件を各々１．７〜１．９ｋｖ／ｃｍ，２．１〜２．５ｋｖ／ｃｍ，３．０〜３．５ｋｖ／ｃｍの条件に変えて核供与細胞と卵を融合させた。その後，再構築した胚の融合を立体顕微鏡で調べた。
【００８７】
その結果，電圧を３．０〜３．５ｋｖ／ｃｍにした場合に核移植卵２７０個中２０３個が融合し（融合率７５．２％），他の条件に比べて融合率が非常に高いことが確認された（表７）。
【００８８】
【表７】
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【００８９】
試験例３：核移植胚の活性化条件の最適化
実施例４で得られた核移植胚を電気的方法又は化学的方法によって活性化させた。その後，核移植胚の発生段階を観察した。電気的方法においては，前記実施例４の核移植胚を塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）１００ｎＭが添加されたマンニトール培地（０．２６Ｍのマンニトール，０．１ｍＭのＭｇＳＯ４，０．５ｍＭのＨＥＰＥＳ及び０．０５％のＢＳＡ）に入れてステンレススチールワイヤ電極を備えた細胞融合チャンバー（ＢＴＸ  ４５３，３．２ｍｍ  ｇａｐ；ＢＴＸ，カリフォルニア州，サンディエゴ）に移した。３分間平衡させた後，ＢＴＸ電気細胞マニピュレーター(Electro-Cell Manipulator)を使用して，前記電極に電圧３．０〜３．５ｋＶ／ｃＭで２０秒間直流電流を通電した。
【００９０】
化学的活性化方法においては，実施例４の核移植胚を１０ｍＭのイオノフォア(シグマ)を含有するｍＳＯＦに入れ，該培地中，３９℃で４分間培養した。その後，培養物を洗浄して，１．９ｍＭの６−ジメチルアミノプリンが添加されたｍＳＯＦ（表４）中でさらに４時間培養した。培養が完了した後，胚をＴＣＭ１９９培地（表３）に移した。
【００９１】
電気的方法及び化学的方法により活性化された核移植胚の発育程度を倍率１００の立体顕微鏡で調べた。
【００９２】
その結果，化学的活性化が核移植胚の発育力を高めたことが確認された。すなわち，化学的方法によって活性化した核移植胚の場合には２細胞期まで到達した卵は８０％だったが，電気的方法により活性化した核移植胚の場合には約５３％のみが２細胞期に到達したことが確認された。また，化学的方法により活性化された胚は，核移植胚から桑実胚期まで発育したが，電気的に活性化した胚は１６細胞期までしか発育しないことが明らかになった（表８）。
【００９３】
【表８】
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【００９４】
試験例４：本発明によるイヌ科動物の核移植胚の代理母への移植条件の最適化 
実施例５で活性化された核移植胚を，ｍＳＯＦ培地（表４）中，３８〜３９℃，５％の二酸化炭素及び５％の酸素の雰囲気の培養器で培養して，８細胞期まで育った胚を０．１％のウシ胎児血清が添加されたＰＢＳに浸漬させてこれをストローで２０匹の代理母（雑種犬）の子宮角に移植した。
【００９５】
核移植胚を移植した後２２日目に妊娠の有無を前記実施例６と同じ方法により超音波スキャナー（メジソン株式会社，韓国）を使用して検査した。
【００９６】
その結果，子宮に移植した核移植胚は全て妊娠には至らなかった。したがって，核移植胚は実施例６に例示した通り卵管に移植することが望ましいことがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】本発明の一実施例において，犬から卵を回収するために使用した１５ゲージ及び１８ゲージ卵回収用ニードルの写真である。
【図２】本発明の方法により生産されたクローン化犬スナッピーとドナー犬の写真（ａ）及びクローン化犬スナッピーと代理母の写真（ｂ）である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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