(57)【要約】  本発明は、Ｍｏｓ−１トランスポゾンの高活性組換え誘導体の転移のためのシステムであって、少なくとも以下の２つのパートナー：ａ）目的外来塩基配列が本来のＭｏｓ−１トランスポゼースをコードする塩基配列を置換してなるＭｏｓ−１シュードトランスポゾン、および、ｂ）上記シュードトランスポゾンにイン・トランスで提供されるＭｏｓ−１トランスポゼースを含んでなり、前記パートナーの少なくとも１つが上記目的外来塩基配列の転移頻度を向上させるように適切に遺伝的に改変されているシステムに関する。このようなシステムに加え、本発明は、高活性Ｍｏｓ−１トランスポゾン、高活性Ｍｏｓ−１トランスポゼース、キットに関する。本発明はさらに、配列の転移、より具体的には効率的な遺伝子導入を行うための、１つまたは２つ以上の上記手段の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
高活性Ｍｏｓ−１シュードトランスポゾンであって、
ａ）２つの非翻訳末端反復配列（ＵＴＲ）のうち少なくとも１つおよび／または２つの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）のうち少なくとも１つが遺伝的に改変され、かつ
ｂ）目的外来塩基配列が本来のＭｏｓ−１トランスポゼースをコードする塩基配列を置換するものであって、ここで：
以下のシュードトランスポゾンから選択されるものであることを特徴とする、高活性Ｍｏｓ−１シュードトランスポゾン：
α）ＩＴＲ３’−ＵＴＲ３’−目的外来塩基配列−ＵＴＲ３’−ＩＴＲ３’（シュードトランスポゾン３３ｓｅｑ３３）、
β）ＩＴＲ３’−目的外来塩基配列−ＵＴＲ３’−ＩＴＲ３’（シュードトランスポゾン３ｓｅｑ３３）、
γ）ＩＴＲ３’−ＵＴＲ５’−目的外来塩基配列−ＵＴＲ３’−ＩＴＲ５’（シュードトランスポゾン３５ｓｅｑ３５）、
δ）配列番号３９の配列を有する少なくとも１つのＩＴＲ４０を含んでなる、シュードトランスポゾン、および
ε）配列番号３８の配列を有する少なくとも１つのＩＴＲ４６を含んでなる、シュードトランスポゾン。
【請求項２】
Ｍｏｓ−１トランスポゾンの高活性組換え誘導体を転移させるためのシステムであって、少なくとも以下の２つのパートナー：
ａ）請求項１に記載の高活性Ｍｏｓ−１シュードトランスポゾン、および
ｂ）前記シュードトランスポゾンにイン・トランスで提供される、Ｍｏｓ−１トランスポゼース
を含んでなり、
目的外来塩基配列の転移頻度が、少なくとも５に等しい倍率、好ましくは少なくとも１０に等しい倍率で向上する、システム。
【請求項３】
前記イン・トランスで提供される前記Ｍｏｓ−１トランスポゼースが、変異型トランスポゼースである、請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
前記変異型Ｍｏｓ−１トランスポゼースが高活性である、請求項３に記載のシステム。
【請求項５】
前記高活性変異型Ｍｏｓ−１トランスポゼースが、配列番号２の配列における以下の残基：Ｆ５３、Ｑ９１、Ｅ１３７、Ｔ１２６およびＹ２３７から選択される少なくとも１つの残基における、少なくとも１つの変異を含んでなる、請求項４に記載のシステム。
【請求項６】
少なくとも２つの以下のパートナーを含んでなる、請求項５に記載のシステム：
ａ）配列番号３９の配列を有する少なくとも１つのＩＴＲ４０を含んでなる高活性Ｍｏｓ−１シュードトランスポゾン、ならびに変異Ｔ２１６ＡおよびＹ２３７Ｃを含んでなる高活性変異型Ｍｏｓ−１トランスポゼース、
ｂ）配列番号３８の配列を有する少なくとも１つのＩＴＲ４６を含んでなる高活性Ｍｏｓ−１シュードトランスポゾン、ならびに変異Ｔ２１６ＡおよびＹ２３７Ｃ、または、Ｅ１３７ＫおよびＴ２１６Ａ、または、Ｆ５３ＹおよびＴ２１６ＡおよびＹ２３７Ｃを含んでなる高活性変異型Ｍｏｓ−１トランスポゼース、
ｃ）高活性Ｍｏｓ−１シュードトランスポゾン３ｓｅｑ３３、ならびに変異Ｔ２１６ＡおよびＹ２３７Ｃ、または、Ｅ１３７ＫおよびＴ２１６Ａ、または、Ｆ５３ＹおよびＱ９１Ｒ、または、Ｆ５３ＹおよびＱ９１ＲおよびＥ１３７ＫおよびＴ２１６Ａを含んでなる高活性変異型Ｍｏｓ−１トランスポゼース。
【請求項７】
Ｍｏｓ−１トランスポゾンの高活性組換え誘導体を転移させるためのシステムであって、少なくとも２つの以下のパートナー：
ａ）目的外来塩基配列が本来のＭｏｓ−１トランスポゼースをコードする塩基配列を置換している、Ｍｏｓ−１シュードトランスポゾン、および
ｂ）前記シュードトランスポゾンにイン・トランスで提供される、高活性Ｍｏｓ−１トランスポゼースであって、
配列番号２の配列のうち以下の残基：Ｆ５３、Ｑ９１およびＹ２３７から選択される少なくとも１つの残基における１つの変異、および／または
変異Ｔ２１６Ａ
を少なくとも含んでなる、高活性Ｍｏｓ−１トランスポゼース
を含んでなり、
目的外来塩基配列の転移頻度が、少なくとも５に等しい倍率、好ましくは少なくとも１０に等しい倍率で向上する、システム。
【請求項８】
前記高活性Ｍｏｓ−１トランスポゼースが、変異Ｆ５３Ｙ、Ｑ９１Ｒ、Ｔ２１６Ａ、Ｙ２３７Ｃ、およびこれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの変異を含んでなる、請求項７に記載のシステム。
【請求項９】
前記高活性Ｍｏｓ−１トランスポゼースが、残基Ｅ１３７における変異も含んでなる、請求項７または８に記載のシステム。
【請求項１０】
前記高活性Ｍｏｓ−１トランスポゼースが、変異Ｅ１３７Ｋも含んでなり、Ｑ９１Ｒ＋Ｅ１３７Ｋ＋Ｔ２１６ＡまたはＦ５３Ｙ＋Ｅ１３７Ｋ＋Ｔ２１６Ａの変異の組み合わせは除外されることを特徴とする、請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
前記Ｍｏｓ−１シュードトランスポゾンにおける２つの非翻訳末端反復配列（ＵＴＲ）のうち少なくとも１つおよび／または２つの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）のうち少なくとも１つが、遺伝的に改変されている、請求項７〜１０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１２】
前記イン・トランスで提供されるＭｏｓ−１トランスポゼースが、発現調節エレメントの制御下の、ベクター上に配置された塩基配列によりコードされてなる、請求項２〜１１のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１３】
前記トランスポゼースの発現が誘導可能である、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
前記目的外来塩基配列が機能遺伝子である、請求項１に記載のシュードトランスポゾンまたは請求項２〜１３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１５】
少なくとも１つの請求項１に記載のシュードトランスポゾンを含んでなる、ベクター。
【請求項１６】
ａ）請求項１〜１４に記載の１つのシュードトランスポゾン、または
ｂ）請求項２〜１４のいずれか一項に記載の１つのシステム、または
ｃ）請求項１５に記載の１つのベクター、または
ｄ）これらの組み合わせ
を少なくとも含んでなる、宿主細胞。
【請求項１７】
ａ）請求項１〜１４に記載の１つのシュードトランスポゾン、または
ｂ）請求項２〜１４のいずれか一項に記載の１つのシステム、または
ｃ）請求項１５に記載の１つのベクター、または
ｄ）請求項１６に記載の１つの宿主細胞、または
ｅ）これらの組み合わせ
を少なくとも含んでなる、キット。
【請求項１８】
イン・ビトロまたはイン・ビボまたはエクス・ビボでの目的外来塩基配列の効率的な転移のための、少なくとも：
ａ）請求項１〜１４に記載の１つのシュードトランスポゾン、または
ｂ）請求項２〜１４のいずれか一項に記載の１つのシステム、または
ｃ）請求項１５に記載の１つのベクター、または
ｄ）請求項１６に記載の１つの宿主細胞、または
ｅ）請求項１７に記載の１つのキット、または
ｆ）これらの組み合わせ
の使用。
【請求項１９】
挿入突然変異のための、少なくとも：
ａ）請求項１〜１４に記載の１つのシュードトランスポゾン、または
ｂ）請求項２〜１４のいずれか一項に記載の１つのシステム、または
ｃ）請求項１５に記載の１つのベクター、または
ｄ）請求項１６に記載の１つの宿主細胞、または
ｅ）請求項１７に記載の１つのキット、または
ｆ）これらの組み合わせ
の使用。
【請求項２０】
核酸のシークエンシングおよび／またはクローニングのための、少なくとも：
ａ）請求項１〜１４に記載の１つのシュードトランスポゾン、または
ｂ）請求項２〜１４のいずれか一項に記載の１つのシステム、または
ｃ）請求項１５に記載の１つのベクター、または
ｄ）請求項１６に記載の１つの宿主細胞、または
ｅ）請求項１７に記載の１つのキット、または
ｆ）これらの組み合わせ
の使用。
【請求項２１】
イン・ビトロまたはエクス・ビボで目的転移性ＤＮＡ配列を標的ＤＮＡ配列中へ転移する、少なくとも１つの工程を含んでなる、医薬品の製造方法であって、
前記転移が、以下の手段のうちの少なくとも１つによって媒介される、方法：
ａ）請求項１〜１４に記載の１つのシュードトランスポゾン、または
ｂ）請求項２〜１４のいずれか一項に記載の１つのシステム、または
ｃ）請求項１５に記載の１つのベクター、または
ｄ）請求項１６に記載の１つの宿主細胞、または
ｅ）請求項１７に記載の１つのキット、または
ｆ）これらの組み合わせ。
【請求項２２】
Ｍｏｓ−１シュードトランスポゾンに含まれる目的外来塩基配列の転移頻度を少なくとも５に等しい倍率、好ましくは少なくとも１０に等しい倍率で、向上させるための、少なくとも：
配列番号２の配列の以下の残基：Ｆ５３、Ｑ９１およびＹ２３７から選択される少なくとも１つの残基における１つの変異、および／または
変異Ｔ２１６Ａ
を含んでなる高活性Ｍｏｓ−１トランスポゼースの使用であって、
前記目的外来塩基配列が、本来のＭｏｓ−１トランスポゼースをコードする塩基配列を置換している、高活性Ｍｏｓ−１トランスポゼースの使用。
【請求項２３】
前記高活性Ｍｏｓ−１トランスポゼースが、変異Ｆ５３Ｙ、Ｑ９１Ｒ、Ｔ２１６Ａ、Ｙ２３７Ｃ、およびこれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの変異を含んでなる、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記高活性Ｍｏｓ−１トランスポゼースが、残基Ｅ１３７における変異も含んでなる、請求項２２または２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記高活性Ｍｏｓ−１トランスポゼースが、変異Ｅ１３７Ｋも含んでなり、Ｑ９１Ｒ＋Ｅ１３７Ｋ＋Ｔ２１６ＡまたはＦ５３Ｙ＋Ｅ１３７Ｋ＋Ｔ２１６Ａの変異の組み合わせは除外される、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
前記高活性Ｍｏｓ−１トランスポゼースが、発現調節エレメントの制御下の、ベクター上に配置された塩基配列によりコードされてなる、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２７】
前記トランスポゼースの発現が誘導可能である、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
前記高活性Ｍｏｓ−１トランスポゼースが、前記Ｍｏｓ−１シュードトランスポゾンにイン・トランスで提供される、請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２９】
前記目的外来塩基配列が機能遺伝子である、請求項２２〜２８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３０】
前記Ｍｏｓ−１シュードトランスポゾンにおける２つの非翻訳末端反復配列（ＵＴＲ）のうち少なくとも１つおよび／または２つの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）のうち少なくとも１つが、遺伝的に改変されてなる、請求項２２〜２９のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、転移因子と関連した分子生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、バイオテクノロジーにおけるその利用目的のため、マリナー可動遺伝因子(mariner mobile genetic elements)由来の天然転移システムの特性を強化することに関する。
【０００２】
本発明は、Ｍｏｓ−１トランスポゾンの高活性組換え誘導体の転移のためのシステムであって、少なくとも以下の２つのパートナー：
ａ）目的外来塩基配列が本来のＭｏｓ−１トランスポゼースをコードする塩基配列を置換している、Ｍｏｓ−１シュードトランスポゾン（pseudo-transposon）、および
ｂ）前記シュードトランスポゾンにイン・トランス（in trans）で提供されるＭｏｓ−１トランスポゼース
を含んでなり、前記パートナーの少なくとも１つが前記目的外来塩基配列の転移頻度を向上させるように適切に遺伝的に改変されているシステムに関する。
【０００３】
このようなシステムに加え、本発明は高活性Ｍｏｓ−１トランスポゾン、高活性Ｍｏｓ−１トランスポゼース、キットに関する。
【０００４】
本発明はさらに、配列の転移、およびより具体的には効率的な遺伝子導入を行うための、１つまたは２つ以上の上記手段の使用に関する。
【０００５】
転移因子（ＴＥ）または可動遺伝因子（ＭＧＥ）は、ある染色体部位から他の部位へ移動しうる短いＤＮＡ断片である（Renault et al., 1997）。該ＤＮＡ断片は５’および３’末端部位に位置する逆方向反復配列（ＩＴＲ）によって特徴付けられる。ＴＥ自身によりコードされる酵素であるトランスポゼースは、その転移プロセスを触媒する。
【０００６】
ＴＥは原核生物および真核生物の両者において同定されている（この分野の参考文献を参照のこと：Craig et al., 2002）。
【０００７】
ＴＥはその転移機構により２種類に分けられる。第１に、クラスＩエレメント、すなわちレトロトランスポゾンは、ＲＮＡ中間体の逆転写を介して転移する。第２に、クラスＩＩエレメントは、ＤＮＡ中間体を介してある染色体部位から他の部位へ「カットアンドペースト」型の機構により直接転移する。
【０００８】
原核生物においては、これまでに数多くのＴＥが報告されてきた。それらの中には、例えばＩＳ１等の挿入配列、およびＴｎ５等のトランスポゾンが含まれる。
【０００９】
真核生物においては、クラスＩＩエレメントは２つのファミリーを含んでなる：Ｐ、ＰｉｇｇｙＢａｃ、ｈＡＴ、ヘリトロン（helitron）、Ｈａｒｂｉｎｇｅｒ、Ｅｎ／Ｓｐｍ、ミューテーター（Mutator）、Ｔｒａｎｓｉｂ、ＰｏｇｏおよびＴｃ１−マリナー。
【００１０】
マリナー可動遺伝因子（またはマリナー様エレメント、ＭＬＥ）はクラスＩＩのＴＥの主要なグループを形成しており、Ｔｃ−１マリナースーパーファミリーに属している（Plasterk et al., 1999）。
【００１１】
標的核酸、具体的には宿主の染色体中の標的核酸に挿入するために、目的の配列を含んでなる、多かれ少なかれ長く、相同または非相同なＤＮＡ断片を可動化するＴＥトランスポゼースの能力は、これまでに、および現在でも、バイオテクノロジーの分野、特に遺伝子工学の分野において広く利用されている。
【００１２】
ＴＥの中でも、ＭＬＥはバイオテクノロジー、特に遺伝子工学および機能ゲノミクスにおける利用に対して特に有利な特性を示す。例えば、限定されない態様において、以下の特性を挙げることができる：
（ｉ）ＭＬＥは短く扱いやすいトランスポゾンである。
（ｉｉ）ＭＬＥの転移機構は単純である。事実上、トランスポゼースは単独でＭＬＥ転移の全工程を触媒することができる。さらに、これは宿主因子の非存在下でＭＬＥの可動性を保証するのに必要かつ十分である（Lampe et al., 1996）。
（ｉｉｉ）ＭＬＥは原核生物および真核生物における極めて広範な遍在性により特徴付けられる。Ｍｏｓ−１とも呼ばれる最初のＭＬＥであるＤｍｍａｒ１は、JacobsonおよびHartl (1985)によりDrosphila mauritianaにおいて発見された。続いて、多数の関連するエレメントが、特にバクテリア、原生動物、菌類、植物、無脊椎動物、変温脊椎動物および哺乳類に属するゲノムにおいて同定された。
（ｉｖ）ＭＬＥの転移活性は高度に特異的であり、メチル化干渉現象（methylation interference phenomena）［ＭＩＰ；Jeong et al. (2002); Martienssen and Colot (2001)］のような、またはＲＮＡ［ＲＮＡｉ；Ketting et al. (1999); Tabara et al. (1999) ］による、宿主ゲノムの「耐性」機構を誘発しない。転移事象は温度、特定の２価陽イオンの存在およびｐＨ等の各種要因により制御されうる。
【００１３】
構造的には、マリナーＭｏｓ−１エレメントは３５４アミノ酸のトランスポゼースをコードする単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、コンパクトな１２８６ｂｐのエレメントである。該トランスポゼースは、ＤＮＡとの結合、２量体形成および４量体形成に関わるＮ末端ドメインと、ＤＤＥ（Ｄ）パターンが触媒金属イオンに配位する活性部位を含むＣ末端ドメインとからなる。リーディングフレームには２８±２ｂｐの２つの逆方向末端配列（ＩＴＲ）が隣接する。ＩＴＲとＯＲＦとの間に位置する２つの領域は翻訳されず、ＵＴＲ（「非翻訳末端領域」）と呼ばれる。Ｍｏｓ−１の２つのＩＴＲは４個のヌクレオチドで配列が相違しており、これは本エレメントの天然の構造が転移に対して最適ではないことを示している。さらにこれは、Ｍｏｓ−１の３’側のＩＴＲが２つ隣接したシュードトランスポゾンでは、天然の構造であって５’側および３’側のＩＴＲが隣接したものよりも、イン・ビボでバクテリアにて１０，０００倍良好に転移することを示す実験によって確認されている（Auge-Gouillou et al., 2001b）。
【００１４】
バイオテクノロジー、特に非ウイルスの遺伝子組み換えツールにおけるＭＬＥの潜在的用途は注目に値する。
【００１５】
典型的には、イン・ビトロでの挿入突然変異の用途においては、トランスポゼースをコードするトランスポゾンの遺伝子が、「標識された」ＤＮＡに置き換えられる。トランスポゼースはイン・トランスでタンパク質の形態で提供される。イン・ビボまたはイン・ビトロでの遺伝子導入用途においては、トランスポゼースをコードする遺伝子は導入されるべき外来ＤＮＡに置き換えられる（このようにして「シュードトランスポゾン」が得られる）。この場合、トランスポゼースはイン・トランスで発現プラスミド、メッセンジャーＲＮＡまたはタンパク質そのものを介して供給される。しかし、現存の手段を用いた、すなわちマリナーシュードトランスポゾンを用いた外来ＤＮＡの導入には困難が伴い、特にこれは導入遺伝子の組み込み効率および特異性が極めて限定的であることによるものである。
【００１６】
しかし、これら用途のそれぞれにおいては効率的な転移システムを有することが不可欠である。
【００１７】
しかし、天然ＭＬＥの転移効率は他のＴＥと比べて低いままである。特に、ＭＬＥは他のクラスＩＩ  ＭＧＥよりも真核生物において活性が低いと思われる。製造業者または研究者にとっては必要な転移を行うのに要する手順の数、費用および時間を減らすような効率的な転移ツールを有することが重要であるため、今日まで天然ＭＬＥに対する実際的な関心は非常に限られたものであった。利用可能な転移システムでは十分な効率が得られず、ＭＬＥトランスポゾンを用いて構築された組換え転移システムには不利益に鑑み、製造業者または研究者は現在のところ可能な限りウイルスによる遺伝子導入システムをその欠点にも関わらず利用することを優先する傾向がある。
【００１８】
従って、現在、（ｉ）遺伝子を効率的に導入することができ、（ｉｉ）宿主に対する免疫原性において十分な安全性を示し、（ｉｉｉ）宿主および環境の安全性を保証し（コンタミネーション、特に組換えウイルスの発生が起こらないこと）、（ｉＶ）作成が容易である、システムが必要とされている。
【００１９】
本発明は、具体的には、Ｍｏｓ−１エレメントの利点（遍在性、転移活性、作成および使用の容易さ等）を利用し、同時に野生型の状態の該エレメントの低い転移効率と関連する欠点を改善した組換え転移システムを提供することにより、この要求を満たすことを可能にする。
【００２０】
このように、現存する要求を十分な方法で満たすため、本発明者らは、ファミリー内で特に特徴が明らかになっているメンバーであり、唯一天然で活性のある、Drosophila mauritianaのＭｏｓ−１  ＭＬＥエレメントに着目した。さらに、該Ｍｏｓ−１エレメントは真核細胞およびバクテリアの両者において活性があるという注目すべき利点を示しており、従って、効率的で遍在性の転移システムの開発におけるその重要性は明らかである。
【００２１】
以下の詳細に記載される本発明の各種態様から明らかになるように、本発明者らは天然のＭｏｓ−１転移システムを改善するいくつかのツールを提供する。これらのツールは単独で、または予想される用途に応じて組み合わせて用いてもよく、
ｉ）高活性変異型Ｍｏｓ−１トランスポゼース、
ｉｉ）高活性組換えＭｏｓ−１シュードトランスポゾン
を含んでなる。
【００２２】
ここで、「シュードトランスポゾン」とは、トランスポゼースをコードする遺伝子が外来の塩基配列により置換されたトランスポゾンと定義される。従って、シュードトランスポゾンはＩＴＲおよびＵＴＲ末端を含んでなるがトランスポゼース活性を欠く。その結果、これには外部のトランスポゼースを伴わない限り転移の能力が無い。
【００２３】
このように、本発明者らは、Ｍｏｓ−１トランスポゾンの高活性組換え誘導体の転移のためのシステムであって、少なくとも以下の２つのパートナー：
ａ）目的外来塩基配列が本来のＭｏｓ−１トランスポゼースをコードする塩基配列を置換しているＭｏｓ−１シュードトランスポゾン、および
ｂ）上記シュードトランスポゾンにイン・トランスで提供されるＭｏｓ−１トランスポゼース
を含んでなり、上記パートナーの少なくとも１つが目的外来塩基配列の転移頻度を少なくとも５に等しい倍率、好ましくは少なくとも１０に等しい倍率で向上させるように適切に遺伝的に改変されているシステムに着目した。
【００２４】
提供された組換え転移システムにおいて、２つのパートナー、すなわちシュードトランスポゾンおよびトランスポゼースは、遺伝的に改変されてもよい。このように、これらパートナーのどちらか、または両パートナーは、遺伝的に改変され、高活性であってもよい。
【００２５】
本発明の「塩基配列」または「核酸」は、生物学分野における通常の意味に従ったものである。これら２つの表現はＤＮＡまたはＲＮＡのどちらも包含し、前者は例えばゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、組換えＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）；後者はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）でありうる。好ましくは、本発明の塩基配列および核酸はＤＮＡである。
【００２６】
「活性」「機能」「生物活性」および「生物学的機能」という語および表現は同等であり、本発明の技術分野における通常の意味に従ったものである。本発明の範囲内において、問題となる活性は転移活性である。
【００２７】
ここで、「高活性」とは、
ａ）目的外来塩基配列が本来のＭｏｓ−１トランスポゼースをコードする塩基配列を置換しているＭｏｓ−１シュードトランスポゾン、および
ｂ）前記シュードトランスポゾンにイン・トランスで提供される野生型のＭｏｓ−１トランスポゼース
を含んでなる天然のＭｏｓ−１転移システムを用いて観察されるものよりも高い活性に相当する。
【００２８】
さらに、本発明の「高活性」とは、
ａ）Ｍｏｓ−１シュードトランスポゾンであって、
（ｉ）目的外来塩基配列が本来のＭｏｓ−１トランスポゼースをコードする塩基配列を置換しており、
（ｉｉ）野生型の５’側に位置する逆方向末端反復配列（ＩＴＲ  ５’）が、３’側に位置する野生型の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ  ３’）の完全なコピーであるように変異しているもの、および
ｂ）上記シュードトランスポゾンにイン・トランスで提供される野生型のＭｏｓ−１トランスポゼース
を含んでなる組換えＭｏｓ−１を転移させるためのシステムを用いて観察されるものよりも高い転移活性を意味する。
【００２９】
従って、前記シュードトランスポゾンは２つのＩＴＲ  ３’に境される（「シュードトランスポゾン  ２  ＩＴＲ  ３’」または「シュードトランスポゾン３Ｔ３」）。ＩＴＲ  ３’の存在は天然のＭｏｓ−１トランスポゾンに対して転移効率を向上させうることが既に報告されており（Auge-Gouillou et al., 2001b）、そのため、ある組換え転移システムが本発明による「高活性」であるかどうかを決定するための基準として、上記の組換えシステムがここで用いられる。以下、上記の基準組換えシステムを「基準（転移）システム」または「３Ｔ３（転移）システム」という。
【００３０】
「転移効率」は転移頻度に従って決定される。転移効率は従って転移頻度が増加すると向上する。以下、「（転移）活性の向上」「転移の向上」または「（転移）効率の向上」という語は互換的に用いられ、これら全ての表現が「転移頻度の向上」、すなわちその増加を表す。
【００３１】
「高活性」を定量するために、「倍率」又は「高活性倍率」がここでは用いられ、それは次の式に従った転移頻度の割合に等しい：
【００３２】
高活性倍率（Ｆ）＝（任意の組換え転移システムで観察された転移頻度）／（上記定義された３Ｔ３基準転移システムで観察された転移頻度）。
【００３３】
すなわち、イン・トランスで提供されたＭｏｓ−１トランスポゼースの存在下における、Ｍｏｓ−１シュードトランスポゾンに含まれる外来塩基配列の転移頻度と、イン・トランスで提供されたＭｏｓ−１トランスポゼースの存在下における、基準Ｍｏｓ−１シュードトランスポゾンに含まれる場合の上記外来塩基配列の転移頻度（３Ｔ３システム）とが比較される。この転移活性の評価方法はこの分野における最も一般的な実践の一つである。
【００３４】
本発明の範囲の目的とする組換え転移システムは、従って、転移を少なくとも５に等しい倍率で向上させうる。好ましくは、高活性倍率は少なくとも１０に等しく、また好ましくは、それは少なくとも１５に等しい。さらに好ましくは、それは少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５、５５、６０およびそれ以上に等しい。
【００３５】
以下の実施例から明らかになるように、シュードトランスポゾンおよび／またはトランスポゼースの遺伝的改変は、転移の高活性を誘導するその能力のために特異的に選択される。トランスポゼースおよび／またはシュードトランスポゾンおよび／または転移システムを高活性にする変異および組み合わせまたは変異はランダムでも予測可能でもない。適した変異の選択のため、本発明者らは当該分野において周知の転移試験を用いた。この試験は既に文献に（具体的にはAuge-Gouillou et al., 2001bにおいて）開示されており、所望により任意の他の好適な試験を適宜用いうる当業者の一般的な知識に属する。
【００３６】
本発明の第１の態様は、Ｍｏｓ−１トランスポゾンの高活性組換え誘導体を転移させるためのシステムに関するものであり、該システムは少なくとも１つのＭｏｓ−１シュードトランスポゾンと、イン・トランスで提供される１つのＭｏｓ−１トランスポゼースとを含んでなる。
【００３７】
第１の態様によれば、Ｍｏｓ−１トランスポゾンの高活性組換え誘導体を転移させるためのシステムは以下の２つのパートナー：
ａ）高活性Ｍｏｓ−１シュードトランスポゾンであって、
ｉ）２つの非翻訳末端反復配列（ＵＴＲ）のうちの少なくとも１つおよび／または２つの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）のうちの少なくとも１つが遺伝的に改変されており、かつ
ｉｉ）目的外来塩基配列が本来のＭｏｓ−１トランスポゼースをコードする塩基配列を置換しているものであり、
上記シュードトランスポゾンが、以下のシュードトランスポゾン：
α）ＩＴＲ３’−ＵＴＲ３’−目的外来塩基配列−ＵＴＲ３’−ＩＴＲ３’（シュードトランスポゾン３３ｓｅｑ３３）、
β）ＩＴＲ３’−目的外来塩基配列−ＵＴＲ３’−ＩＴＲ３’（シュードトランスポゾン３ｓｅｑ３３）、
γ）ＩＴＲ３’−ＵＴＲ５’−目的外来塩基配列−ＵＴＲ３’−ＩＴＲ５’（シュードトランスポゾン３５ｓｅｑ３５）、
δ）配列番号３９の配列を有する少なくとも１つのＩＴＲ４０を含んでなるシュードトランスポゾン、および
ε）配列番号３８の配列を有する少なくとも１つのＩＴＲ４６を含んでなるシュードトランスポゾン
から選択される、シュードトランスポゾン、
ｂ）上記シュードトランスポゾンにイン・トランスで提供されるＭｏｓ−１トランスポゼース
を含んでなり、上記システムの目的外来塩基配列の転移頻度が少なくとも５に等しい倍率、好ましくは少なくとも１０に等しい倍率で向上する。
【００３８】
本発明の範囲において、シュードトランスポゾンは次のように記載される：ＩＴＲ−ＵＴＲ−目的外来塩基配列−ＵＴＲ−ＩＴＲ。ＩＴＲ３’−ＵＴＲ３’−目的外来塩基配列−ＵＴＲ３’−ＩＴＲ３’という具体例の場合、３３ｓｅｑ３３または３３Ｔ３３という省略形となる。より具体的には、３３Ｔ３３という用語は、目的外来塩基配列がテトラサイクリン耐性遺伝子であるシュードトランスポゾンを指してもよい（具体的には下記実施例を参照）。必然的に、これは文脈から明瞭に明らかになるであろう。
【００３９】
上記された通り、前記システムにおいてイン・トランスで提供されるＭｏｓ−１トランスポゼースは、変異型Ｍｏｓ−１トランスポゼース、特に高活性変異型Ｍｏｓ−１トランスポゼースであってよい。例えば、好適な高活性変異型Ｍｏｓ−１トランスポゼースは、配列番号２の配列の以下の残基：Ｆ５３、Ｑ９１、Ｅ１３７、Ｔ１２６およびＹ２３７から選択される少なくとも１つの残基における少なくとも１つの変異を含んでなる。
【００４０】
ここで、本発明の好ましい転移システムは少なくとも２つの以下のパートナーを含んでなる：
ａ）配列番号３９の配列を有する少なくとも１つのＩＴＲ４０を含んでなる高活性Ｍｏｓ−１シュードトランスポゾン、ならびに変異Ｔ２１６ＡおよびＹ２３７Ｃを含んでなる高活性変異型Ｍｏｓ−１トランスポゼース、
ｂ）配列番号３８の配列を有する少なくとも１つのＩＴＲ４６を含んでなる高活性Ｍｏｓ−１シュードトランスポゾン、ならびに変異Ｔ２１６ＡおよびＹ２３７Ｃ、または、Ｅ１３７ＫおよびＴ２１６Ａ、または、Ｆ５３ＹおよびＴ２１６ＡおよびＹ２３７Ｃを含んでなる高活性変異型Ｍｏｓ−１トランスポゼース、
ｃ）高活性Ｍｏｓ−１シュードトランスポゾン３ｓｅｑ３３、ならびに変異Ｔ２１６ＡおよびＹ２３７Ｃ、または、Ｅ１３７ＫおよびＴ２１６Ａ、または、Ｆ５３ＹおよびＱ９１Ｒ、または、Ｆ５３ＹおよびＱ９１ＲおよびＥ１３７ＫおよびＴ２１６Ａを含んでなる高活性変異型Ｍｏｓ−１トランスポゼース。
【００４１】
第２の態様によれば、本発明の高活性組換え体を転移させるためのシステムは少なくとも２つの次のパートナー：
ａ）目的外来塩基配列が本来のＭｏｓ−１トランスポゼースをコードする塩基配列を置換しているＭｏｓ−１シュードトランスポゾン、および、
ｂ）前記シュードトランスポゾンにイン・トランスで提供され、少なくとも：
配列番号２の配列における以下の残基：Ｆ５３、Ｑ９１およびＹ２３７から選択される少なくとも１つの残基における１つの変異、および／または
変異Ｔ２１６Ａ
を含んでなる高活性Ｍｏｓ−１トランスポゼース
を含んでなり、上記システムの目的外来塩基配列の転移頻度が少なくとも５に等しい倍率、好ましくは少なくとも１０に等しい倍率で向上するものである。
【００４２】
好ましくは、高活性Ｍｏｓ−１トランスポゼースは、変異Ｆ５３Ｙ、Ｑ９１Ｒ、Ｔ２１６Ａ、Ｙ２３７Ｃ、およびこれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの変異を含んでなる。さらに、残基Ｅ１３７において変異、具体的には変異Ｅ１３７Ｋを含んでいてもよいが、変異Ｑ９１Ｒ＋Ｅ１３７Ｋ＋Ｔ２１６ＡまたはＦ５３Ｙ＋Ｅ１３７Ｋ＋Ｔ２１６Ａの組み合わせは除外される。
【００４３】
有利には、このようなシステムにおいて、Ｍｏｓ−１シュードトランスポゾンの２つの非翻訳末端反復配列（ＵＴＲ）のうち少なくとも１つ、および／または２つの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）のうち少なくとも１つは遺伝的に改変されていてもよい。
【００４４】
本発明の転移システムにおいて、野生型または遺伝的に改変されたＭｏｓ−１トランスポゼースはイン・トランスでシュードトランスポゾンに提供される。この方法では、それは、発現調節エレメントの制御下で、ベクター上に配置された塩基配列にコードされてもよい。その結果、有利には、トランスポゼースの発現が誘導可能となる。このために、当業者は従来のプロモーターを用いることができる。例えば、周知のＩＰＴＧ誘導性プロモーターｐＬａｃを用いてもよい。または、トランスポゼースはタンパク質または精製された機能性タンパク質画分の形態で転移システムに添加されてもよい。また、これはメッセンジャーＲＮＡの形態で供給されてもよい。この場合、トランスポゼースの発現はメッセンジャーＲＮＡの不安定性のため時間的に制限（数時間まで）がある。
【００４５】
特に有利には、Ｍｏｓ−１シュードトランスポゾンに含まれる目的外来塩基配列は機能遺伝子である。本発明によれば、遺伝子は、対応する塩基配列が、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、すなわち、野生型遺伝子産物の活性を示すアミノ酸配列を産生しうるコード配列を少なくとも含んでなる場合に「機能」的であるという。好ましくは、機能遺伝子は野生型遺伝子である。それにも関わらず、これは、変異遺伝子の産物が活性を維持していれば（該変異遺伝子の産物の活性が天然の遺伝子産物のものよりも低かったとしても）、１つまたは２つ以上の変異を含んでなる遺伝子からなっていてもよい。ここで「機能遺伝子」の定義は、それに対するプロモーターを欠いたコード配列も包含する。例えば、目的外来塩基配列は、それに対するプロモーターを欠く、もしくは欠いていない、抗生物質耐性遺伝子（例えばテトラサイクリン耐性遺伝子）または他の任意の適した選択マーカーであってよい。
【００４６】
本発明によれば、「変異」とはバイオテクノロジーにおける通常の意味に従ったものである。ここで、変異は塩基配列中の１つもしくは２つ以上の塩基の、またはタンパク質配列中の１つもしくは２つ以上のアミノ酸の、置換、挿入または欠失でありうる。「変異」は特に塩基配列のコドンの少なくとも１つの塩基の置換を意味してもよく、該置換は例えば問題の塩基配列の翻訳の際に、結果として生ずるタンパク質配列中に天然のアミノ酸とは異なったアミノ酸の組み込みを誘導することを包含する。原則として、変異は変異産物の生物学的機能の喪失を誘発しないものであることが好ましい。一方、活性の低下については、変異エレメント（例えばシュードトランスポゾンおよび／またはトランスポゼース）が「高活性」（活性が対応する野生型エレメントよりも高くあるべき場合）でない限りは許容されうる。
【００４７】
ここで、トランスポゼースが「高活性」であるとみなされ、またはシュードトランスポゾンが「高活性」であるとみなされるのは、これらを用いた際に観察される転移効率が上昇する場合である。問題のエレメント（シュードトランスポゾンまたはトランスポゼース）の活性の上昇は、本発明の組換え体を転移させるためのシステムにおいてそれらが用いられる際に測定される。高活性倍率がこのように測定され、得られた転移活性の水準が本発明の範囲で定義された基準値に達した場合にそのエレメントが「高活性」であると称される。
【００４８】
原則的に「遺伝的改変」はこの場合１つまたは２つ以上の変異に相当すると理解されるべきである。コード配列が遺伝的に改変される場合、典型的には、そこに１つまたは２つ以上の変異が含まれる。しかし、これらの変異はコードされた産物の機能の喪失をもたらさないものである必要がある。一方、例えば遺伝的に改変されたＭｏｓ−１トランスポゼースの場合、好ましくは、その活性の上昇（すなわち、高活性組換えトランスポゼース）が必要である。非コード配列（例えばＩＴＲまたはＵＴＲ）が遺伝的に改変される場合、１つまたは２つ以上の変異が含まれるか；または、個々の配列それ自体は改変されないが、この配列の反復数および／または配列のつながりにおける順番および／または前記配列の他の配列に対する向きが通常の構造に対して（例えば野生型Ｍｏｓ−１トランスポゾンに対して）改変されるか；のいずれかである。ＩＴＲまたはＵＴＲ等の非コード配列の遺伝的改変の例としては、特に、該配列の全体または一部の欠失、その環境中に存在する他の配列による置換等が挙げられる。つまり、配列の配置が異なることは、それらがコード配列であるか否かに関わらず、本発明の「遺伝的改変」の定義に含まれる。
【００４９】
上記記載に従い、本発明の組換え体を転移させるためのシステムにおいて、Ｍｏｓ−１シュードトランスポゾンの２つの非翻訳末端反復配列（ＵＴＲ）のうちの少なくとも１つおよび／または２つの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）のうちの少なくとも１つが遺伝的に改変されている高活性Ｍｏｓ−１シュードトランスポゾンを用いることが可能である。
【００５０】
好ましくは、シュードトランスポゾン  ２  ＩＴＲ  ３’は、本発明の範囲で用いられる対象のＭｏｓ−１トランスポゾンから除外される。先に明記したとおり、このシュードトランスポゾンは本発明の転移システムの高活性を測定するための基準として用いられる。
【００５１】
一部の例では、高活性Ｍｏｓ−１シュードトランスポゾンの２つの非翻訳末端反復配列（ＵＴＲ）のうちの少なくとも１つは遺伝的に改変されている。代わりに、またはそれに加えて、該高活性Ｍｏｓ−１シュードトランスポゾンの２つの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）のうちの少なくとも１つは遺伝的に改変されている。
【００５２】
上記に従い、そして、以下の実施例に例証されるように、高活性組換えＭｏｓ−１シュードトランスポゾンの遺伝的に改変されたＩＴＲは、ＩＴＲ４０（配列番号３９）およびＩＴＲ４６（配列番号３８）と称されるＩＴＲＳｅｌｅｘ配列から有利に選択されうる。
【００５３】
または、高活性組換えＭｏｓ−１シュードトランスポゾンは特に以下の組み合わせから選択されるＩＴＲおよびＵＴＲの組み合わせを含んでなっていてもよい：ＩＴＲ  ３’  ＋  ＵＴＲ  ３’  ／  ＵＴＲ  ３’  ＋  ＩＴＲ  ３’（３３Ｔ３３または３３ｓｅｑ３３という）、ＩＴＲ  ３’  ／  ＵＴＲ  ３’  ＋  ＩＴＲ  ３’（３Ｔ３３または３ｓｅｑ３３という）。
【００５４】
一部の態様においては、組換え体を転移させるためのシステムにおいてイン・トランスで提供されるＭｏｓ−１トランスポゼースは、配列番号２の配列の以下の残基：Ｆ５３、Ｑ９１、Ｅ１３７、Ｔ１２６およびＹ２３７から選択される少なくとも１つの残基における少なくとも１つの変異を含んでなるが、変異Ｑ９１Ｒ＋Ｅ１３７Ｋ＋Ｔ２１６ＡまたはＦ５３Ｙ＋Ｅ１３７Ｋ＋Ｔ２１６Ａの組み合わせは除外される、高活性トランスポゼースである。本発明者らにより行われた実験の結果は、Ｍｏｓ−１トランスポゼースにどのような変異または変異の組み合わせを与えても高活性トランスポゼースを得ることは不可能であるということを示している。特に、今回除外された２つの変異の組み合わせでは転移が起こらなくなることが明らかである（下記の実験セクションを参照のこと）。従って、上記の除外された組み合わせにおいては、変異は拮抗的であると考えられうる。
【００５５】
有利には、高活性Ｍｏｓ−１トランスポゼースは、変異Ｆ５３Ｙ、Ｑ９１Ｒ、Ｅ１３７Ｋ、Ｔ２１６Ａ、Ｙ２３７Ｃ、およびこれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの変異を含んでいてよく、変異Ｑ９１Ｒ＋Ｅ１３７Ｋ＋Ｔ２１６ＡまたはＦ５３Ｙ＋Ｅ１３７Ｋ＋Ｔ２１６Ａの組み合わせは除外される。
【００５６】
好ましくは、高活性Ｍｏｓ−１トランスポゼースは、Ｔ２１６残基における少なくとも１つの変異を含んでいてもよい。より好ましくは、少なくとも変異Ｔ２１６Ａを含んでいてもよい。有利には、このような高活性トランスポゼースは、変異Ｆ５３Ｙ、Ｑ９１Ｒ、Ｅ１３７Ｋ、Ｙ２３７Ｃおよびこれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの変異も含んでなっていてよく、変異Ｑ９１Ｒ＋Ｅ１３７Ｋ＋Ｔ２１６ＡまたはＦ５３Ｙ＋Ｅ１３７Ｋ＋Ｔ２１６Ａの組み合わせは除外される。
【００５７】
下記実験部分から明らかなように、特に有利な高活性Ｍｏｓ−１トランスポゼースは、以下の変異の組み合わせのうち少なくとも１つを含んでなる：
Ｔ２１６Ａ＋Ｙ２３７Ｃ；Ｆ５３Ｙ＋Ｔ２１６Ａ＋Ｙ２３７Ｃ：少なくとも２０に等しい高活性倍率；
Ｆ５３Ｙ＋Ｑ９１Ｒ＋Ｅ１３７Ｋ＋Ｔ２１６Ａ＋Ｙ２３７Ｃ：少なくとも３０に等しい高活性倍率；
Ｆ５３Ｙ＋Ｅ１３７Ｋ＋Ｔ２１６Ａ＋Ｙ２３７Ｃ：少なくとも４５に等しい高活性倍率。
【００５８】
別の態様、あるいはさらなる態様によれば、本発明の組換え体を転移させるためのシステムにおいてイン・トランスで供給されるＭｏｓ−１トランスポゼースは、リン酸化可能な残基における少なくとも１つの変異を含んでなる高活性トランスポゼースであり、該変異は真核細胞（例えば植物、脊椎動物または無脊椎動物細胞）におけるリン酸化部位を抑制するものである。ここでまた、真核細胞において１つまたは２つ以上のリン酸化部位を抑制する、想定される変異は、明らかにタンパク質酵素機能に対し保存的である。好適な高活性変異型トランスポゼースが２００３年１月２８日付のフランス特許出願第０３  ００９０５号に記載されている。具体的には、前記トランスポゼースでは変異したリン酸化可能な残基が、配列番号２の以下の残基から選択される：Ｔ１１、Ｔ２４、Ｓ２８、Ｔ４２、Ｔ８８、Ｓ９９、Ｓ１０４、Ｔ１３５、Ｓ１４７、Ｔ１５４、Ｓ１７０、Ｔ１８１、Ｓ２００、Ｔ２１６、Ｔ２５５およびＳ３０５。好ましくは、高活性トランスポゼースは、リン酸化可能残基Ｔ８８における少なくとも１つの変異を含んでなる。有利には、リン酸化可能残基Ｔ１１、Ｔ２４、Ｓ２８、Ｔ４２、Ｓ９９、Ｓ１０４、Ｔ１３５、Ｓ１４７、Ｔ１５４、Ｓ１７０、Ｔ１８１、Ｓ２００、Ｔ２１６、Ｔ２５５およびＳ３０５における少なくとも１つの変異も含んでなる。具体的には、上記リン酸化可能な残基が、ここで真核細胞における１つまたは２つ以上の非リン酸化可能残基で置換される。
【００５９】
原則として、本発明の範囲において、高活性組換え体または野生型Ｍｏｓ−１トランスポゼースは、安定に、原核細胞において有利に産生されうる。この場合、活性（または高活性）Ｍｏｓ−１および安定なトランスポゼースの原核宿主細胞による産生に適した方法は、少なくとも以下の工程を含んでなる：
ａ）活性トランスポゼースをコードする塩基配列の、発現ベクターへのクローニング、
ｂ）ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ｐＫａ）の活性触媒サブユニットをコードする塩基配列の、発現ベクターへのクローニング；
ｃ）上記発現ベクターによる上記宿主細胞の形質転換；
ｄ）上記宿主細胞による上記塩基配列の発現；および
ｅ）ｐＫａによるリン酸化によって安定化された活性トランスポゼースの入手。
【００６０】
または、工程ａ）およびｂ）のクローニングは単一の発現ベクターにおいて行われる。
【００６１】
興味深いことに、このような方法はトランスポゼース精製工程も含んでなる。
【００６２】
上記方法と関連するさらなる詳細については、当業者は２００５年１１月３０日付のフランス特許出願第０５１２１８０号を参照してもよい。
【００６３】
本発明の第２の態様は、高活性Ｍｏｓ−１シュードトランスポゾンに関するものであり、該高活性Ｍｏｓ−１シュードトランスポゾンは、
ａ）２つの非翻訳末端反復配列（ＵＴＲ）のうちの少なくとも１つおよび／または２つの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）のうち少なくとも１つが遺伝的に改変され、
ｂ）目的外来塩基配列が本来のＭｏｓ−１トランスポゼースをコードする塩基配列を置換してなり、
上記シュードトランスポゾンは、以下のシュードトランスポゾンから選択される：
α）ＩＴＲ３’−ＵＴＲ３’−目的外来塩基配列−ＵＴＲ３’−ＩＴＲ３’（シュードトランスポゾン３３ｓｅｑ３３）、
β）ＩＴＲ３’−目的外来塩基配列−ＵＴＲ３’−ＩＴＲ３’（シュードトランスポゾン３ｓｅｑ３３）、
γ）ＩＴＲ３’−ＵＴＲ５’−目的外来塩基配列−ＵＴＲ３’−ＩＴＲ３’（シュードトランスポゾン３５ｓｅｑ３５）、
δ）配列番号３９の配列を有する、少なくとも１つのＩＴＲ４０を含んでなるシュードトランスポゾン、および
ε）配列番号３８の配列を有する、少なくとも１つのＩＴＲ４６を含んでなるシュードトランスポゾン。
【００６４】
このようなシュードトランスポゾンは、上記の高活性組換え体を転移させるためのシステムにおいて特に有用である。
【００６５】
本発明の第３の態様は、本発明のシュードトランスポゾンを少なくとも１つ含んでなるベクターに関する。
【００６６】
第４の態様においては、本発明は、
ａ）上記の組換え体を転移させるための１つのシステム、または
ｂ）本発明の１つのシュードトランスポゾン、または
ｃ）本発明の１つのベクター、または
ｄ）それらの組み合わせ
を少なくとも含んでなる宿主細胞に関する。
【００６７】
このような宿主細胞は原核細胞（例えばバクテリア、特にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）および真核細胞（特に植物、脊椎動物および無脊椎動物細胞）から選択される。
【００６８】
本発明の第５の態様は、
ａ）本発明の１つの転移システム、または
ｂ）本発明の１つのシュードトランスポゾン、または
ｃ）本発明の１つのベクター、または
ｄ）本発明の１つの宿主細胞、または
ｅ）それらの組み合わせ
を少なくとも含んでなるキットに関する。
【００６９】
例えば、このようなキットは特に、トランスポゼースに適合する緩衝液、転移反応を停止する「停止」緩衝液、１または２つ以上の対照ＤＮＡ（反応対照）、反応後のシークエンシングに有用なオリゴヌクレオチド、コンピテントバクテリア、使用説明書等から選択される１つまたは２つ以上のエレメントも含んでいてもよい。
【００７０】
第６の態様において、本発明は、上記手段、すなわち少なくとも：
ａ）１つの転移システム、または
ｂ）１つのシュードトランスポゾン、または
ｃ）１つのベクター、または
ｄ）１つの宿主細胞、または
ｅ）１つのキット、または
ｆ）それらの組み合わせ
のうち少なくとも１つを用いることに関する。
【００７１】
１つの態様において、これらの手段のうち少なくとも１つは、目的外来塩基配列の効率的なイン・ビトロまたはイン・ビボ（特に植物宿主細胞）またはエクス・ビボでの転移のために用いられる。
【００７２】
他の態様によれば、これら手段のうち少なくとも１つは、目的外来塩基配列の効率的なイン・ビボでの転移を可能にすることを意図した医薬品の製造のために用いられる。
【００７３】
または、これら手段のうち少なくとも１つは、目的転移性ＤＮＡ配列（目的外来塩基配列）のイン・ビトロまたはエクス・ビボによる標的ＤＮＡ配列内への転移により産生される医薬品の製造のために用いられる。例えば、本発明は、目的転移性ＤＮＡ配列を標的ＤＮＡ配列中に（例えばイン・ビトロまたはエクス・ビボで）転移させるすくなくとも１つの工程を含んでなり、該転移が本発明の少なくとも１つの手段により媒介される、医薬品の製造方法を提供する。従って、該医薬品は、転移がイン・ビトロで行われる場合はエクス・ビボで、または転移がイン・ビボで起こる場合はｉｎ  ｓｉｔｕで製造されてもよい。
【００７４】
本発明の範囲内で提供される手段は、例えば細胞を医薬品タンパク質（すなわち、治療的または予防的関心の対象であるタンパク質、例えばインシュリン、特定の抗体等）を発現するように改変しうるようにするものであってよい。上記手段は、欠損した生体機能を回復させるために細胞を「矯正（correct）」しうるようにするものであってもよい。さらなる態様によれば、これらの手段のうち少なくとも１つは、挿入突然変異のため、または核酸のシークエンシングおよび／もしくはクローニングのために用いられる。
【００７５】
これらの用途は、原則的に（特に植物宿主細胞において）イン・ビトロまたはイン・ビボでの転移を利用することを伴うものであり、これは本発明の分野の当業者における一般的な知識の範囲内に含まれる（Ausubel et al., 1994; Craig et al., 2002）。イン・ビボ転移に関して、より具体的には、標的ＤＮＡ配列は典型的には宿主のゲノムであり、該宿主は真核生物（例えば植物宿主細胞）もしくは原核生物といった生物、または、生物由来の組織、または、生物もしくは組織由来の細胞であってよい。
【００７６】
いずれの場合も、本発明の手段が重要であると認められる多くの用途において、当業者に周知の従来の分子生物学的手法が利用される。
【００７７】
本発明の第７の態様は、
配列番号２の配列の以下の残基：Ｆ５３、Ｑ９１およびＹ２３７、から選択される少なくとも１つの残基における１つの変異、および／または
変異Ｔ２１６
を少なくとも含んでなる、高活性Ｍｏｓ−１トランスポゼースの使用であって、Ｍｏｓ−１シュードトランスポゾンに含まれる目的外来塩基配列の転移頻度を少なくとも５に等しい倍率、好ましくは少なくとも１０に等しい倍率で向上し、上記Ｍｏｓ−１シュードトランスポゾンにおいて、上記目的外来塩基配列が本来のＭｏｓ−１トランスポゼースをコードする塩基配列を置換している、使用に関する
【００７８】
このようなトランスポゼースの使用は、具体的には上記の高活性組換え体を転移させるためのシステムにおいて行われる。
【００７９】
具体的には、上記高活性Ｍｏｓ−１トランスポゼースは、変異Ｆ５３Ｙ、Ｑ９１Ｒ、Ｔ２１６Ａ、Ｙ２３７Ｃ、およびこれらの組み合わせから選択される、少なくとも１つの変異を含んでなる。さらに、残基Ｅ１３７における変異、具体的には変異Ｅ１３７Ｋを含んでいてもよいが、変異Ｑ９１Ｒ＋Ｅ１３７Ｋ＋Ｔ２１６ＡまたはＦ５３Ｙ＋Ｅ１３７Ｋ＋Ｔ２１６Ａの組み合わせは除外される。
【００８０】
実際には、高活性Ｍｏｓ−１トランスポゼースは一般的に発現調節エレメントの制御下の、ベクター上に配置された塩基配列によりコードされる。トランスポゼースの発現はこのように有利に誘導可能である。
【００８１】
上記に従えば、高活性Ｍｏｓ−１トランスポゼースは、好ましくは高活性組換え転移システムに属し、ここで上記Ｍｏｓ−１シュードトランスポゾンにイン・トランスで提供される。具体的には、Ｍｏｓ−１シュードトランスポゾンに含まれる目的外来塩基配列は機能遺伝子である。さらに、Ｍｏｓ−１シュードトランスポゾンの２つの非翻訳末端反復配列（ＵＴＲ）のうち少なくとも１つ、および／または２つの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）のうち少なくとも１つは遺伝的に改変されている。実際には、ベクターに含まれるＭｏｓ−１シュードトランスポゾンを用いるのが有利である。
【００８２】
下記の実験部分において、本発明を、実施例および図面を用いて説明するが、これらに限定されない。
【実施例】
【００８３】
第Ｉ部：高活性変異型Ｍｏｓ−１トランスポゼース（Ｔｎｐ）
Ｉ−  材料および方法
Ｉ−Ａ−  用いたベクター
Ｉ−Ａ−１−  用いたプラスミドの記載
ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙベクター（３．１ｋｂ）（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｈａｒｂｏｎｎｉｅｒｅｓ  Ｆｒａｎｃｅ；  ｃａｔ．  ＃Ａ１３６０）は、ＰｕおよびＰｒｅｖシークエンシングプライマー（Ausubel et al., 1994）ならびにアンピシリン耐性遺伝子を含んでなる。これは、Ｘ−ＧａｌおよびＩＰＴＧの存在下、ＬＢアンピシリンプレート上に得られたバクテリアのコロニーの青／白スクリーニングを可能にするＬａｃＺ遺伝子中に、ＰＣＲ産物をクローニングするように考案されたものである。これを用いてｐＧＥＭ−Ｔ（Ｔｎｐ）（Auge-Gouillou et al, 2001）を生じさせた。これはｐＫＫ−２３３−２およびｐＣＳ２＋ベクターにそれをサブクローニングする前にトランスポゼース突然変異生成のための鋳型として働く。
【００８４】
ｐＫＫ−Ｔｎｐベクター（５．６ｋｂ）は、ＩＰＴＧ誘導性Ｐｌａｃプロモーターによりトランスポゼースの強い発現を可能にする。該プロモーターは調節不可能であり、天然の発現リーク（expression leakage）を示す。ｐＫＫ−ＴｎＰはアンピシリン耐性遺伝子も含んでなる。このプラスミドはｐＫＫ−２３３−２ベクターから得られる（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，  Ｏｚｙｍｅ，  Ｓａｉｎｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  ｅｎ  Ｙｖｅｌｉｎｅｓ、フランス）。
【００８５】
ｐＭａｌＣ２ｘ−ＴｎｐベクターはｐＭａｌＣ２ｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｏｚｙｍｅ，  Ｓａｉｎｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  ｅｎ  Ｙｖｅｌｉｎｅｓ、フランス）から得られ、Ｎ末端でＭＢＰタンパク質（マルトース結合タンパク質）と融合したトランスポゼースの発現を可能にする。これはアンピシリン耐性遺伝子を含んでなる。
【００８６】
ｐＣＳ２＋−ＴｎｐベクターはｐＣＳ２＋ベクター（Turner DL et al., 1994）から得られ、ＣＭＶｉｅプロモーターの調節下で真核細胞においてトランスポゼースの発現を可能にする。このベクターはトランスポゼースをコードするメッセンジャーＲＮＡに相当するイン・ビトロＲＮＡを合成することも可能にする。転写はＳＰ６プロモーターの調節下で行われ、ＲＮＡはポリアデニル化されている。
【００８７】
ｐＢＣ  ３Ｔ３はＭｏｓ−１マリナー様ドナープラスミドである（Auge-Gouillou et al, 2001）。これは２つのＩＴＲ３’が隣接する「ＯＦＦ」（すなわちプロモーターの無い）テトラサイクリン耐性遺伝子を有する。このため、転移したシュードトランスポゾンをプロモーター（「タギング（tagging）」プロモーター）下流に有するバクテリアのみがＬＢテトラサイクリンプレート上で選択される。該ベクターはクロラムフェニコール耐性遺伝子を含んでなる。
【００８８】
ｐＢＣ３Ｎｅｏ３（図３）はＭｏｓ−１マリナー様ドナープラスミドである。これは２つのＩＴＲ３’が隣接するＳＶ４０プロモーターの調節下のネオマイシン耐性遺伝子を有する。これは細胞ゲノム中にネオマイシン耐性遺伝子が組み込まれた真核細胞の選択を可能にする。この選択はＧ４１８（８００μｇ／ｍｌ）を２週間用いて行われる。該ベクターはクロラムフェニコール耐性遺伝子を含んでなる。
【００８９】
従って、プラスミドｐＢＣ  ３Ｔ３およびｐＢＣ３Ｎｅｏ３は、５’に位置する野生型逆方向末端反復配列（ＩＴＲ  ５’）を、それが３’に位置する野生型逆方向末端反復配列（ＩＴＲ  ３’）の完全なコピーとなるように変異させたＭｏｓ−１シュードトランスポゾンを有する。従って、このシュードトランスポゾンは２つのＩＴＲ３’により境されている（「シュードトランスポゾン  ２  ＩＴＲ３’」）。該シュードトランスポゾンは野生型Ｍｏｓ−１トランスポゼースとともに基準転移頻度を決定するために用いられ、ここから本発明のシステムの使用と関連した高活性倍率が決定された。
【００９０】
一般に、このタイプの構築物（シュードトランスポゾン）においては、「Ｔ」という文字がテトラサイクリン耐性をもたらすレポーター遺伝子を表す。
【００９１】
ｐＢＣ  ＫＳ  ＮｅｏはＳＶ４０プロモーター調節下のネオマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドである。該ベクターはクロラムフェニコール耐性遺伝子を含んでなる。
【００９２】
ｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｃａｔ．＃Ｅ１７４１）はＳＶ４０プロモーター調節下のルシフェラーゼをコードする遺伝子を有するプラスミドである。これはアンピシリン耐性遺伝子も含んでなる。
【００９３】
Ｉ−Ａ−２−  ベクターの構築
Ｉ−Ａ−２−１−  ベクターＤＮＡの製造
各種構築物に対し、全てのアガロースゲルからのＤＮＡ溶出をＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  ｓｙｓｔｅｍ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、フランス）を用いて行った。バクテリア培養液を用いたプラスミド少量調製を全てＷｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行った。大量ＤＮＡ調製をＰｕｒｅｙｉｅｌｄ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｍｉｄｉｐｒｅｐ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）またはＭｉｄｉｐｒｅｐもしくはＭａｘｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて行った。
【００９４】
Ｉ−Ａ−２−２−  変異体を得るための特異的突然変異誘発
特異的突然変異誘発を、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ  ｓｉｔｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のプロトコルに従って行った。変異を導入するのに用いたオリゴヌクレオチドはＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｒｏｉｓｓｙ  ＣＤＧ）により合成された。ＰｆｕポリメラーゼおよびＤｐｎ１酵素はＰｒｏｍｅｇａ（フランス）より供給された。手短に述べると、導入すべき変異は２つの相補的なオリゴヌクレオチドに含まれている。プラスミド全体をＰＣＲ（９５℃１分の後、１６サイクルの９５℃３０秒間、５５℃１分間、６８℃２分間／プラスミドｋｂ）によって増幅した。ＰＣＲの鋳型として用いたプラスミドをＤｐｎ１で消化した（３７℃１時間、２−３ｕ／５０μｌのＰＣＲ）。次いで、Ｄｐｎ１処理後の２−３μｌのＰＣＲでケモコンピテントＸＬ１ＢｌｕｅまたはエレクトロコンピテントＪＭ１０９バクテリアを形質転換した。
【００９５】
特異的突然変異誘発に用いたオリゴヌクレオチド配列を下の表１に示し、該変異を太字のヌクレオチドで明示する。
【表１】
2009537130.tif 000002
【００９６】
Ｉ−Ａ−２−３−  トランスポゼース配列の確認
ｐＧＥＭ−Ｔ−ｅａｓｙプラスミドにクローニングされたトランスポゼースへの変異の導入をシークエンシングによって確認した。このために、１０マイクロリットルのＤＮＡ少量調製物をシークエンシングのためにＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈに送付した。用いたプライマー（Ｐｕｎｉｖ  −２１およびＰｒｅｖ  −４９）はこの会社により供給された。
【００９７】
Ｉ−Ａ−２−４  ｐＫＫ−２３３−２プラスミドへの変異型トランスポゼースのサブクローニング
野生型または変異型トランスポゼース（Ｔｎｐ）をコードする断片をｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｔｎｐ）からＮｃｏ１／ＨｉｎｄＩＩＩ消化により調製し、０．８％アガロースゲル（ＴＡＥ１Ｘ：０．０４Ｍ  Ｔｒｉｓ−アセテート、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８）上で溶出した。ｐＫＫ−２３３−２プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ／Ｎｃｏ１により消化し、アガロースゲル上に置き、溶出し、Ｍｏｓ−１トランスポゼース（Ｔｎｐと呼ぶ）をコードする断片と１６℃で一晩ライゲートした。トランスポゼースをコードする断片の非存在下で該プラスミドのライゲーションを行うことにより、プラスミド再環状化セルフチェックを行った。
【００９８】
ライゲーション産物を用いて、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９バクテリアを転換し、次いで該バクテリアをＬＢ−アンピシリンプレート（１００μｇ／ｍｌ）上で選択した。４個のアンピシリン耐性クローンを培養にかけ、プラスミド抽出を行った。ＤＮＡ少量調製物をＥｃｏＲ１／ＨｉｎｄＩＩＩ消化後０．８％アガロースゲル（ＴＡＥ  １Ｘ）上で電気泳動することにより試験し、それらがトランスポゼースをコードする遺伝子を組み込んだことを確かめた。
【００９９】
Ｉ−Ａ−２−５−  変異型トランスポゼースのｐＭａｌＣ２Ｘプラスミドへのサブクローニング
ｐＭａｌＣ２Ｘへのサブクローニングのため、トランスポゼースをコードする遺伝子を、ＭＴＰ  ｕｐおよび３’  ＨｉｎｄＩＩＩプライマー：
ＭＴＰ  ｕｐ：５’−ＴＡＣＧＴＡＡＴＧＴＣＧＡＧＴＴＴＣＧＴＧＣＣＧ（配列番号３３）
３’ＨｉｎｄＩＩＩ：５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＴＣＡＡＡＧＴＡＴＴＴＧＣ（配列番号３４）
を用いたＰＣＲによって再増幅する必要があった。
【０１００】
サイクル条件：９５℃５分間に続き、２０サイクルの（９５℃３０秒間、５０℃１分間、７２℃１分間）の後、７２℃５分間。
【０１０１】
次にＰＣＲ産物をゲル上に置き、５０μｌに溶出し、ｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ  ｐｌａｓｍｉｄにクローニングした（１μｌのベクター＋２μｌの溶出したＰＣＲ産物）。１６℃での一晩のライゲーションの後、該ライゲーション産物をＪＭ１０９細胞にエレクトロポレーションで転換し、該バクテリアを、１ｍＭ  ＩＰＴＧ  ２％  Ｘ−Ｇａｌを含んだＬＢアンピシリンプレート（１００μｇ／ｍｌ）上で選択した。２つのアンピシリン耐性ブランククローンを培養にかけ、プラスミドＤＮＡを抽出した。ＥｃｏＲ１消化および０．８％アガロースゲル（ＴＡＥ  １Ｘ）上での電気泳動によりクローニングを試験後、該プラスミドをシークエンシングのためにＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈに送付した。
【０１０２】
配列の確認後、トランスポゼースをコードする断片をＳｎａＢ１／ＨｉｎｄＩＩＩ消化により調製し、ゲル上で溶出した。これをＸｍｎ１／ＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＭａｌＣ２Ｘプラスミドにライゲートした。ＪＭ１０９バクテリアを次に該ライゲーション産物で転換し、ＬＢアンピシリンプレート（１００μｇ／ｍｌ）上に塗布した。
【０１０３】
Ｉ−Ａ−２−６−  ｐＣＳ２＋プラスミドへの変異型トランスポゼースのサブクローニング
野生型または変異型トランスポゼース（Ｔｎｐ）をコードする断片をＥｃｏＲ消化によりｐＧＥＭ−Ｔ（Ｔｎｐ）ベクターから調製し、０．８％アガロースゲル（ＴＡＥ１Ｘ：０．０４Ｍ  Ｔｒｉｓ−アセテート、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８）上で溶出した。ｐＣＳ２＋プラスミドをＥｃｏＲ１で切断し、脱リン酸化し、トランスポゼースを含んだ断片とライゲートした。該ライゲーション産物をＪＭ１０９バクテリアで形質転換し、クローンをＬＢアンピシリンプレート（１００μｇ／ｍｌ）上で選択した。８個のクローンを培養にかけ、プラスミドＤＮＡを抽出した。インサートの存在およびその向きを、Ｐｖｕｌｌ／ＢａｍＨ１またはＰｖｕｌｌ単独による消化と、ＴＡＥ  １Ｘ中の０．８％アガロースゲル上での電気泳動とにより判断した。該クローンは、遺伝子がセンス（sense）に挿入され、ＳＰ６プロモーターの調節下でトランスポゼースに対応するｍＲＮＡの転写が可能である際に＋ｓｅｎｓｅと示される。該クローンは、該遺伝子がＳＰ６プロモーター調節下における転写とは反対のセンスに挿入される際に−ｓｅｎｓｅと示される。
【０１０４】
Ｉ−Ｂ−  バクテリアにおける変異型トランスポゼースの活性の分析：バクテリア転移試験
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９バクテリアを、ｐＢＣ  ３Ｔ３プラスミド（転移レポーター  ２  ＩＴＲ  ３’マリナー様エレメントおよびクロラムフェニコール耐性遺伝子を含んでなる）、ならびにアンピシリン耐性遺伝子を含んでなりトランスポゼースをコードする誘導可能なベクター（ｐＫＫ−ＴｎｐまたはｐＭａｌ−Ｔｎｐ）で、同時形質転換した。バクテリアの選択をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコールで行い、該２つのプラスミドの存在を確認した。
【０１０５】
ｐＢＣ  ３Ｔ３プラスミドおよびｐＫＫ−Ｔｎｐ（またはｐＭａｌＣ２Ｘ−Ｔｎｐ）プラスミドの両者を含んだＪＭ１０９バクテリアを２５０μｌのＬＢ中、１時間３７℃で培養にかけた。次いでこの種菌を、１ｍＭ  ＩＰＴＧを補った５ｍｌのＬＢに注いだ。該培養物をＬＢプレート上（１００μｌの１／１０００希釈物）およびＬＢ−Ｔｅｔプレート上（１２．５μｇ／ｍｌ）（２５０μｌの無希釈培養液）でタイター測定（titrate）した。次に、ＩＰＴＧで誘導された培養物を、撹拌下（２５０ｒｐｍ）、５時間３２℃（トランスポゼースの至適温度）で培養した。次いでバクテリア懸濁液をＬＢプレート上（１００μｌの１／２５０，０００希釈物）およびＬＢ−ｔｅｔプレート上（１００μｌの無希釈バクテリア懸濁液）でタイター測定した。該プレートを３７℃に一晩置いた。次の日、ＬＢおよびＬＢ−Ｔｅｔプレート上でコロニーを計数し、転移頻度（１ｍｌの無希釈バクテリア懸濁液あたり、テトラサイクリンバクテリアの数をバクテリアの数で割ったものに等しい）を算出した。
【０１０６】
Ｉ−Ｃ−  真核細胞における変異型トランスポゼースの活性の分析
Ｉ−Ｃ−１−  細胞トランスフェクション
トランスフェクションの前日、６ウェルプレートにウェルあたり２．１０５個のＨｅＬａ細胞を分配した。次の日、該細胞を３μｇのＤＮＡ（７５０ｎｇのｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ、７５０ｎｇのｐＣＳ２／Ｔｎｐ、１５００ｎｇのｐＢＣ３Ｔ３）およびＰＥＩ（１／１０比）（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）でトランスフェクトした。各条件を二重に試験した。
【０１０７】
トランスフェクションの２日後、細胞を溶解してルシフェラーゼ活性を評価することにより、トランスフェクション効率を評価した。第２のウェルの細胞をトリプシン処理し、２つの１０ｃｍ径の培養皿中、Ｇ４１８選択剤（８００μｇ／ｍｌ）の存在下で培養にかけた。培地を２日ごとに交換し、１５日間選択圧を維持した。条件当たり５個のクローンを単離し、選択圧（２００μｇ／ｍｌのＧ４１８）のもと１５日間増やした。
【０１０８】
Ｉ−Ｃ−２−  クローンの分子分析
各種クローンのゲノムＤＮＡを抽出し、制限酵素処理後にサザンブロット分析にかける。この方法は各種Ｇ４１８抵抗性カセット挿入部位を分析するために用いられる。シークエンシング分析により、実際の転移イベントを示すジヌクレオチドＴＡの重複の存在を確認することができ、ランダムな、およびトランスポゼース依存の、組換え事象の頻度を評価することができる。
【０１０９】
ＩＩ−  結果
Ｍｏｓ−１マリナー転移の全工程を真核細胞よりも単純なシステムにおいて分析できるように、バクテリア分析モデルを開発した。このシステムを使用することにより、様々な時点において、各種変異型トランスポゼースの転移効率を評価することが可能になった。
【０１１０】
単純な変異で得られた結果を、誘導後の転移時間Ｔ０について図６Ａおよび６Ｂに示す。これらの結果は野生型トランスポゼースに対するメジアン増加倍率（median increase factor）として表されている。最も有利な変異はポジションＥ１３７、Ｑ９１、Ｙ２３７、Ｔ２１６に位置する変異である。同様な分析を誘導後の転移時間Ｔ＝５時間について行ったものは、図６Ｃおよび６Ｄに図示される結果を示した。
【０１１１】
最も有望な変異を組み合わせて多重変異体を作成した。７つの２重、３つの３重、２つの４重、および１つの５重の変異体を下記の表２のようにして得た。
【表２】
2009537130.tif 000003
【０１１２】
多重変異体で行った転移試験の結果を図６Ｅないし６Ｈに記録する。
【０１１３】
一部の組み合わせ（Ｑ９１Ｅ  Ｅ１３７Ｋ  Ｔ２１６Ａ；Ｆ５３Ｙ  Ｅ１３７Ｋ  Ｔ２１６Ａ）においては転移の完全な喪失が引き起こされた。他の組み合わせではＴ０の時点で少なくとも６倍に転移が向上した（図６Ｅ）。最も有利な組み合わせはＦ５３Ｙ  Ｑ９１Ｒ  Ｅ１３７Ｋ  Ｔ２１６Ａ、Ｆ５３Ｙ  Ｅ１３７Ｋ  Ｔ２１６Ａ  Ｙ２３７Ｃおよび５重の変異体の組み合わせである（図６Ｅおよび６Ｆ）。
同様の結果が５時間の転移時間で得られた（図６Ｇおよび６Ｈ）。
【０１１４】
留意すべきは、Ｍｏｓ−１トランスポゼースの一部の特性に対して効果を有するとして文献にも記載されている変異は、高活性変異型Ｍｏｓ−１トランスポゼースを同定する必要がある場合においてほとんど有利ではないことである。例えば、Ｍｏｓ−１トランスポゼースのタンパク質相互作用生成能力を改変するとしてZhang et al. (2001)に示されている変異Ｓ１０４Ｐの場合がそうである。彼らの研究の範囲内において、本願発明者らは実際に、この変異が、バクテリアにおける転移試験を用いた際に、Ｍｏｓ−１トランスポゼースの転移活性の完全な消滅をもたらすことを観察した（不掲載データ）。
【０１１５】
第ＩＩ部：高活性組換えＭｏｓ−１シュードトランスポゾン
Ｉ−  ＩＴＲ（逆方向末端反復配列）
簡単に述べると、組み合わせ法によって１組のＩＴＲを得ることからなるＳＥＬＥＸ法を用いて、最適化されたＩＴＲ配列の検出を行った（図７）。トランスポゼースが適切に機能することに対して重要であることが公知の、一部のポジションのみを維持した。従って、他のヌクレオチドの性質はランダムに変化した。各種ＩＴＲを選択し、トランスポゼースを固定する能力を向上させた。選択されたＩＴＲの中でも、一部のみがリターデーションゲル（ＥＭＳＡ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）内でトランスポゼースを遅延させることができた。改変したＩＴＲと結合したトランスポゼースをバクテリア中での転移試験において試験し、転移効率に対するＩＴＲ配列の変化の影響を評価した。（例えば野生型配列に対して１または２つのヌクレオチドに影響する）一部の構成に関して、有意な倍率、具体的には少なくとも５に等しい倍率で転移効率が向上した。
【０１１６】
Ｉ−１−  材料および方法
ａ）ＳＥＬＥＸ法の開発
本発明の組換えＭｏｓ−１シュードトランスポゾンおよび転移システムの性能を向上させるため、ＳＥＬＥＸ法の使用により、本発明者らはトランスポゼースに対して野生型ＩＴＲよりもより高い親和性を示すＩＴＲを選択することができた。
【０１１７】
１９９０年に記載されたＳＥＬＥＸ法（Ellington et al., 1990; Tuerk et al., 1990）は、特異的性質、例えばタンパク質に結合する能力によって、１０１５超の異なる分子を含んだ混合物中の核酸を選択することを可能にする。この方法の一般的原理は、特異的な標的分子を異なる配列（ＲＮＡ、１本鎖または２本鎖ＤＮＡ）の混合物とともにインキュベートすることからなる。標的分子と結合しうる画分を、クロマトグラフィーカラム、免疫沈降または他の任意の適した精製法により、残りの核酸から単離する。続いて、濃縮された画分をＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、別の選択ラウンドに用いる。選択および増幅のサイクルの反復により、初期の混合物を「アプタマー」とも称される機能性オリゴヌクレオチドで富ませることが可能である。選択および増幅のサイクルの数の増加が大きくなるほど、アプタマーの量の増加が大きくなり、ひいてはオリゴヌクレオチド集団中でそれらが優勢になる（Ｓｅｌｅｘ法に関する概説はKlug et al., 1994を参照のこと）。
【０１１８】
下記の２つのＳＥＬＥＸ法が本発明者らにより開発された。
Ａ１）トランスポゼースの調達
トランスポゼース（Ｔｎｐ）によるＩＴＲ結合特性とマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）によるマルトース結合特性とを結びつけた組換えタンパク質を用いた。バクテリアで産生され、ＭＢＰ−Ｔｎｐと称されるこの組換えタンパク質は、Ｎ末端に位置するトランスポゼースの特異的結合ドメインを介してＩＴＲに結合し、ＭＢＰがマルトースカラム上でＩＴＲ／トランスポゼース複合体を精製することを可能にする。
【０１１９】
Ａ２）変性配列（degenerated sequence）ＩＴＲの性質
ＳＥＬＥＸを行うため、７９塩基を有するオリゴヌクレオチドの混合物がＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈにより合成された。これらオリゴヌクレオチドの一般的な構造は、各２５塩基を有するＲおよびＦプライマー配列が各末端に隣接した、２９塩基を有する変性ＩＴＲの配列を含んでなる。５’−ＣＡＧＧＴＣＡＧＴＴＣＡＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＴＣＧ−３’（配列番号３５）および５’−ＧＡＧＧＣＧＡＡＴＴＣＡＧＴＧＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣ−３’（配列番号３６）の配列をそれぞれ有するこれらのプライマーにより、ＳＥＬＥＸの次の工程において、選択されたＩＴＲ配列のＰＣＲによる増幅が可能になった。
【０１２０】
２つの別々のオリゴヌクレオチド混合物を合成した；２９塩基を有するＩＴＲが１４箇所のポジションで変性されているもの（ＩＴＲ１４）、およびＩＴＲが２１箇所のポジションで変性されているもの（ＩＴＲ２１）である。全てのマリナーサブファミリーエレメントにおいて１００％保持されているポジションはＩＴＲ１４およびＩＴＲ２１において維持されたが、６０／８０％保持されているポジションはＩＴＲ１４においてのみ維持された。ＩＴＲ１４は２．７ｘ１０８種類の配列に相当し、ＩＴＲ２１は４．４ｘ１０１２種類の配列に相当した。
【０１２１】
この方法の有効性を実証するため、Ｍｏｓ−１  ＩＴＲ３’を対照として用いた。
トランスポゼースは２本鎖ＤＮＡに結合することから、第１のＳＥＬＥＸラウンドの前にＩＴＲ１４およびＩＴＲ２１のそれぞれをＰＣＲにより２本鎖にした。
【０１２２】
Ａ３）ＳＥＬＥＸ法１の原理
この方法を図８に図解する。ここでは、１４または２１箇所のポジションが変性されている２９ヌクレオチド（ｎｔ）を有するＩＴＲと、ＩＴＲ１４およびＩＴＲ２１の末端に隣接する、２５ヌクレオチドを有する２つのＲおよびＦプライマーとから形成される、１本鎖ＤＮＡ鋳型（ｓｓ）のプールが用いられる（ａ）。鋳型をＰＣＲにより２本鎖（ｄｓ）にする（ｂ）。次いで、これらを放射標識し（ｃ）、樹脂およびＭＢＰ−Ｔｎｐ融合タンパク質（図を簡単にするためにＴｎｐという）またはＭＢＰとともに溶液中でインキュベートする（ｄ）。相互作用反応（interaction reaction）を２４時間４℃で行う。カラムを洗浄後、マルトース溶液を用いてＤＮＡ／タンパク質複合体を精製する（ｅ）。回収された溶出液は、鋳型がＭＢＰ−Ｔｎｐとともにインキュベートされた場合はＴｎｐ／ＩＴＲ溶出液と呼び、鋳型がＭＢＰとインキュベートされた場合はＭＢＰ溶出液という。各ＳＥＬＥＸラウンド後の選択をモニターするために、各溶出液の一部をナイロンメンブレン上に置き、カウントする（ｆ）。各ＳＥＬＥＸラウンドにおいて選択された鋳型をＰＣＲにより増幅する（ｇ）。次いで、増幅産物をアガロース上で試験する。目的とする断片を精製し（ｈ）、別の選択ラウンドで用いる。
【０１２３】
＊  ＤＮＡ／タンパク質結合工程：
各ＳＥＬＥＸラウンドにおけるＩＴＲの選択をモニターするため、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、またはＰＣＲにより、塩基配列を放射標識した。ＭＢＰ−Ｔｎｐ、放射標識したＩＴＲ１４またはＩＴＲ２１、およびマルトース樹脂の溶液中でのインキュベーションにより、標的配列を選択した。
【０１２４】
並行して２つの対照実験を行った。ＤＮＡに対して特異的親和性を有しないＭＢＰをＩＴＲ１４またはＩＴＲ２１とインキュベートすることにより、ネガティブコントロールでＤＮＡ／タンパク質相互作用の特異性が保証されうるようにした。ポジティブコントロールはＩＴＲ３’を、一方でＭＢＰ−Ｔｎｐとともに、他方でＭＢＰとともに、インキュベートすることからなった。
【０１２５】
＊洗浄工程および溶出：
タンパク質をその標的配列に結合した後、複合体を分離させることなく全ての未結合オリゴヌクレオチドを除くために洗浄工程を行った。樹脂をマルトースで飽和させることにより、維持されている複合体の溶出を行った。２種類の溶出液を得た。Ｔｎｐ／ＩＴＲ溶出液は、ＭＢＰ−Ｔｎｐ組換えタンパク質とともに標的オリゴヌクレオチドをインキュベートする実験のシリーズを溶出することにより生成された。ＭＢＰ溶出液は、前記標的ＩＴＲをＭＢＰと相互作用させるカラムを溶出することにより生成された。
【０１２６】
＊選択された配列の増幅工程：
ＩＴＲ配列に隣接するＲおよびＦプライマー（配列番号３５および３６）の存在により、選択されたＩＴＲの増幅をＴｎｐ／ＩＴＲ溶出液およびＭＢＰ溶出液に対して直接行った。選択が有効であった場合、Ｔｎｐ／ＩＴＲ溶出液に含まれる鋳型の増幅に対して、（７９ｂｐを有する）特異的ＰＣＲシグナルが認められるが、ＭＢＰ溶出液の鋳型に対しては認められない（ＭＢＰはＩＴＲに対して親和性を有しないため）必要があった。この陽性の断片をアガロースゲルから溶出し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで放射標識した。一部のＰＣＲサイクルで増幅工程中に直接標識を行った。
【０１２７】
その後、このアンプリマ−（amplimer）を、Ｔｎｐ純化配列（Tnp refined sequence）に富む標的として次のＳＥＬＥＸラウンドで用いた。
【０１２８】
Ａ４）ＳＥＬＥＸ法２の原理
本発明者らによって行われた研究により、ＩＴＲ３’およびＩＴＲ５’は同一の解離定数を有するが、トランスポゼースに結合するその能力は異なっていることが証明された。ＩＴＲ５’存在下における活性タンパク質の量はＩＴＲ３’の存在下で観察されるものよりも１０倍低い。これは、ＩＴＲ３’がＩＴＲと結合するトランスポゼースの能力の活性化因子として働くことを示している。従って、情報の２つのアイテムがＩＴＲに含まれている。第１のアイテムはタンパク質活性化の効果（Ｂｍａｘに対する影響）を有しており、第２のアイテムはＩＴＲに対するトランスポゼースの親和性（Ｋｄに対する影響）を調節する。これらのデータを説明するため、ＳＥＬＥＸ法２が本発明者らにより開発された。この方法の原理はＳＥＬＥＸ法１のものと同一である。しかし、マルトースカラムへの結合の前に、ＤＮＡ鋳型がタンパク質とともに５分間４℃でインキュベートされる。この方法はこのように、トランスポゼースを活性化し、それと結合する能力を有するＩＴＲを選択することを可能にするはずである。
【０１２９】
Ａ５）プロトコル
原則として、本発明者らによって用いられる実験手順は当業者に周知の常法を基盤としている（Ausubel et al., 1994; Sambrook and Russel, 2001）。
【０１３０】
（ｉ）鋳型調製
＊  追加の鎖（Supplementary strand）の合成
トランスポゼースは２本鎖の形態のＤＮＡにのみ結合する。標的オリゴヌクレオチドであるＩＴＲ１４およびＩＴＲ２１の追加の鎖の合成を、プライマー伸長法により行った。反応はＳＥＬＥＸ法１および２について行った。
【０１３１】
＊  ＤＮＡ断片の精製
ＰＣＲ産物を１ＸＴＡＥ緩衝液中の３％Ｎｕｓｉｅｖｅアガロースゲル（ＦＭＣ）上で分析した。次いであらゆる微量のコンカテマーを除去するために、ＤＮＡ断片をアガロースゲルを用いて精製した。
【０１３２】
＊  ＩＴＲ１４およびＩＴＲ２１の放射標識
配列の放射標識により、各ＳＥＬＥＸサイクルで選択の進行をモニターすることが可能になった。［γ３２  Ｐ］ＡＴＰ（４５００Ｃｉ／ｍｍｏｌ超の比放射能）による標識を、Ｔ４ファージポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）を用いて行い、［α３２  Ｐ］ＡＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ超の比放射能）による標識を、ＲおよびＦプライマー（配列番号３５および３６）の存在下でＰＣＲによって行った。
【０１３３】
（ｉｉ）トランスポゼースによる標的の選択
＊  ＤＮＡ／タンパク質結合工程
マルトース樹脂（Ｎｅｗ−Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を緩衝液１（２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ９、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ）で平衡化した。溶液中でのインキュベーションを、最終容量１ｍｌの緩衝液１中で、２００μｌの樹脂とともに、５０μｇのＭＢＰ−ＴｎｐまたはＭＢＰタンパク質；２００ｎｇのＩＴＲ１４、ＩＴＲ２１またはＩＴＲ３’；競合物としての２μｇのＩＴＲ５’；５ｍＭのＭｇＣｌ２および２μｇのサケ精子ＤＮＡを順次加えて行った。ＳＥＬＥＸ法１の相互作用反応を、２４時間４℃において持続的な撹拌（３００ｒｐｍ）の下で維持した。ＳＥＬＥＸ法２においては、ＤＮＡ鋳型およびＭＢＰ−ＴｎｐまたはＭＢＰタンパク質を、マルトースカラムに通す前に、５分間４℃でインキュベートし、相互作用反応を１時間だけ４℃で維持した。
【０１３４】
＊  樹脂洗浄工程および複合体溶出
インキュベーションの終わりに、樹脂を洗浄し、タンパク質／ＩＴＲ複合体を溶出した。全ての複合体を回収するため、２回の連続した溶出を行った。
【０１３５】
（ｉｉｉ）選択された配列の増幅工程
各ＳＥＬＥＸラウンドの後、次のＳＥＬＥＸラウンドで用いる前に、Ｔｎｐ／ＩＴＲおよびＭＢＰ溶出液中に含まれる選択された鋳型を増幅した。
【０１３６】
ＰＣＲ反応は１５ないし３０サイクル、典型的には２０サイクル（寄生的な（parasitic）断片増幅の場合は１５サイクル）を含んでなった。
【０１３７】
ＩＴＲ１４およびＩＴＲ２１の増幅のために用いられた反応媒質は、５０μｌの最終容量中に、鋳型：１０μｌのＴｎｐ／ＩＴＲ溶出液または１０μｌのＭＢＰ溶出液、５μｌの１０Ｘ緩衝液の存在下；２００μＭのｄＮＴＰ；２．５ｍＭのＭｇＣｌ２；１μＭのＲおよびＦプライマーならびに５Ｔａｑポリメラーゼユニットを含んでいた。アガロースゲル上では、Ｔｎｐ／ＩＴＲ溶出液を用いた増幅は７９ｂｐ、およびＩＴＲ３’（ポジティブコントロール）については３００ｂｐのバンドを生成する必要がある。ＰＣＲ産物を、アガロースゲルを用いて精製し、ＰＮＫを用いて標識し、別のＳＥＬＥＸラウンドに用いた。
【０１３８】
第５のＳＥＬＥＸラウンドにおいて、［α３２  Ｐ］ＡＴＰによる標識のために放射性物質の存在下でＰＣＲを行った。
【０１３９】
ｂ）選択された配列のクローニングおよびシークエンシング
ＳＥＬＥＸ法１のラウンド数７およびＳＥＬＥＸ法２のラウンド数８からの精製されたＰＣＲ産物を、供給業者が推薦する条件下でｐＧＥＭＴ−Ｅａｓｙプラスミド（ｐＧＥＭＴ−Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｋｉｔ、Ｐｒｏｍｅｇａ）中にクローニングした。ｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙへのライゲーションを、ＳＥＬＥＸ法１のＩＴＲ１４断片、ＳＥＬＥＸ法２のＩＴＲ１４断片、ＳＥＬＥＸ法１のＩＴＲ２１断片およびＳＥＬＥＸ法２のＩＴＲ２１断片を用いて生成した。このライゲーションを用いてＤＨ５αコンピテントバクテリアを形質転換した。各ライゲーションの２０個の組換えクローンのプラスミドＤＮＡを１本鎖シークエンシングにより分析した。配列のアラインメントはｗｗｗ．ｉｎｆｏｂｉｏｇｅｎ．ｆｒのサイトで入手可能なＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウェアを用いて行った。
【０１４０】
ｃ）クローン配列の迅速なスクリーニング
潜在的なＩＴＲのそれぞれを、トランスポゼースへの結合の能力について、ゲルリターデーションにより試験した。そのために、ＩＴＲをＭＢＰ−Ｔｎｐ存在下でインキュベートした。これはトランスポゼースがＩＴＲに結合している場合に移動の遅延をもたらすはずである。第１に、ＰＣＲによって放射標識されたＤＮＡを、精製することなく、タンパク質の存在下でインキュベートすることにより、迅速ＩＴＲスクリーニングを行った。第２に、人為的な配列増幅によって生ずるバックグラウンドノイズを除くためにゲルリターデーションを行った。
【０１４１】
Ｃ１）クローニングした配列の放射標識
（ｉ）ＰＣＲ標識
８０個のＩＴＲを選択した。これらのＩＴＲを、［α３２  Ｐ］ＡＴＰおよびｐＵおよびｐＲＥＶユニバーサルプライマーの存在下で、プラスミドＤＮＡ少量調製物を用いて、ＰＣＲにより標識した。
期待される増幅断片の長さは７９ｂｐであった。
【０１４２】
（ｉｉ）Ｋｌｅｎｏｗフィル（Klenow fill）標識
迅速スクリーニング後の陽性ＩＴＲを、ＥｃｏＲＩ酵素による消化後にアガロースゲル上で精製した。これによりＲおよびＦプライマーを除くことができた。ＩＴＲ３’をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＩＴＲ３’プラスミドのＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ酵素による消化後に精製した。前記の精製断片を、Ｋｌｅｎｏｗサイトフィル（Klenow site fill）法を用いて［α３２  Ｐ］ＡＴＰで放射標識した。
【０１４３】
Ｃ２）ＤＮＡ／タンパク質複合体形成
（ｉ）迅速スクリーニング
迅速スクリーニングを行うため、ＩＴＲ／タンパク質複合体を、最後のＳＥＬＥＸ反応サイクル後にＰＣＲにより標識された配列を用いて、あらかじめ精製することなく、形成させた。該配列はＲおよびＦプライマーにより隣接されたＩＴＲを含んでいた。相互作用反応は、最終容量２０μｌで：４０μｇのＭＢＰ−ＴｎｐまたはＭＢＰタンパク質；１μｌの放射性ＰＣＲ反応；１μｇのサケ精子ＤＮＡ；２μｌの５０％グリセロール；５ｍＭのＭｇＣｌ２および０．５μＭのｐＲｅｖを含んでいた。遊離プローブを１μｌの放射性ＰＣＲ、２μｌの５０％グリセロールおよび１７μｌの緩衝液を用いて調製した。相互作用反応を１５分間４℃で維持した後、ポリアクリルアミド上での分析を行った。
【０１４４】
（ｉｉ）精製したプローブに対するゲルリターデーション
Ｔｎｐとのインキュベーション後に移動の遅延が生ずる配列（陽性ＩＴＲ）を、精製ＤＮＡ断片を用いたさらなるゲルリターデーションにかけた。ＩＴＲ／タンパク質複合体を：４０μｇのＭＢＰ−Ｔｎｐタンパク質；１ｎＭのＩＴＲプローブ；１μｇのサケ精子ＤＮＡ；２μｌの５０％グリセロール；５ｍＭのＭｇＣｌ２および０．５μＭのｐＲｅｖを含んだ最終容量２０μｌ中で形成した。ＩＴＲのみのものは２μｌの５０％グリセロールおよび１７μｌの緩衝液を含んだ混合物中で１ｎＭの最終濃度で用いた。相互作用反応を１５分間４℃で維持した後、ポリアクリルアミドゲル上での分析を行った。
【０１４５】
ｄ）競合試験
これらの試験の原理を図９に図解する。この試験により、放射標識ＩＴＲ３’のトランスポゼース結合をシフトさせるＩＴＲＳｅｌｅｘの能力が証明されうる。シフトが大きいほど、ＩＴＲ３’に対するＩＴＲＳｅｌｅｘ配列の「向上」も大きい。実際には、トランスポゼース結合反応は、１０  ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ９緩衝液、０．５ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５％（容量／容量）のグリセロール、１μｇのニシン精子ＤＮＡおよび１００ｎｇのＢＳＡを含んだ２０μｌ中で、１５ｎＭの放射標識ＩＴＲ３’および非放射標識ＩＴＲＳｅｌｅｘの存在下で行う。試験した非放射標識ＩＴＲＳｅｌｅｘの濃度は、０ｎＭ、１５ｎＭ、７５ｎＭ、１５０ｎＭ、３００ｎＭ、７５０ｎＭ、１５００ｎＭであった。
【０１４６】
ｅ）ｐＢＣ３ＴＳｅｌｅｘプラスミド構築
８個のＳｅｌｅｘ  ＩＴＲの挙動をバクテリア中でイン・ビボで分析するため、ｐＢＣ３Ｔ５プラスミドから一連の８個のプラスミドを構築した。ｐＢＣ３Ｔ５プラスミドは、Ｍｏｓ−１  ＩＴＲ３’および５’が隣接する、プロモーターの無いＴｅｔ（テトラサイクリン耐性遺伝子）ＯＲＦを含んでいる。このＴｅｔ遺伝子（Ｘｂａ１およびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位の間にクローニングされている）は、クロラムフェニコール耐性遺伝子およびＬａｃＺタンパク質をコードする遺伝子に対して逆方向となっている。ＩＴＲ３’はｐＢＣＫＳ＋プラスミドのＫｐｎＩ制限酵素部位によって５’を、ＳａｌＩ制限酵素部位によって３’を区切られている。ＩＴＲ５’はｐＢＣＫＳ＋プラスミドのＳａｃＩ制限酵素部位によって５’を、ＮｏｔＩ制限酵素部位によって３’を区切られている。ｐＢＣ３Ｔ５プラスミドのＩＴＲ５’はＮｏｔＩおよびＳａｃＩによる二重消化後にＩＴＲＳｅｌｅｘで置換され、ｐＢＣ３ＴＳｅｌｅｘプラスミドを生成した。ＩＴＲＳｅｌｅｘはＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（ドイツ）により１本鎖オリゴヌクレオチドの形態で合成された。２本鎖ＩＴＲＳｅｌｅｘの形成は、付着性（cohesive）ＮｏｔＩおよびＳａｃＩハーフサイト（half-site）を生成するようにしてハイブリダイゼーションにより行った。付着性オリゴヌクレオチドは、５’でＩＴＲＳｅｌｅｘに隣接するＴＡジヌクレオチドがシュードエレメントの外側に配置されるように設計した。ｐＢＣ３ＴＳｅｌｅｘプラスミドを生成するため、前記のリン酸化２本鎖オリゴヌクレオチドを、前記の２つの酵素で方向付けられたベクターにＴ４リガーゼＤＮＡにより結合した。以下、該プラスミドを、ｐＢＣ３ＴｓまたはｐＢＣ３ＴＳｅｌｅｘの後にＩＴＲＳｅｌｅｘ番号を付記した名称でいう。
【０１４７】
ｆ）転移試験
実験プロトコルの詳細な説明を上記第Ｉ部の段落Ｉ−Ｂに示す。
これらの試験は１０ｎｇのトランスポゼースドナープラスミド（ｐＫＫ−ＴｎｐまたはｐＫＫ）および１０ｎｇのシュードトランスポゾンドナープラスミド（ｐＢＣ３ＴＳｅｌｅｘ）で同時形質転換したＪＭ１０９  Ｅ．  ｃｏｌｉバクテリアにおいて行った。これらのバクテリアをアンピシリンおよびクロラムフェニコールを含有する培地上で選択した。これらの試験（「方法Ｉ」）の操作条件を図１０に記載する。
【０１４８】
Ｉ−２−  結果
ａ）ＳＥＬＥＸで得られたＩＴＲ候補配列のスクリーニング
本発明者らによって開発されたＳＥＬＥＸ法では７９ｂｐを有するオリゴヌクレオチドの混合物が用いられ；該オリゴヌクレオチドは２９ｂｐを有するＩＴＲから形成され；該ＩＴＲは１４または２１箇所のポジション（ＩＴＲ１４およびＩＴＲ２１）において変性されており、かつその末端において２５ｂｐを有するＲおよびＦプライマー（配列番号３５および３６）が隣接している。これにはＭｏｓ１トランスポゼース（基準Ｔｎｐ）およびＭＢＰを融合した組換えタンパク質も用いられる。
【０１４９】
２種のＳＥＬＥＸ法を開発した。これら２種の方法の一般的な原理は同一である。ＳＥＬＥＸ法１では、オリゴヌクレオチド、タンパク質およびマルトース樹脂を同時にインキュベートする。ＳＥＬＥＸ法２においては、鋳型をタンパク質と５分間４℃でインキュベートし、その後マルトース樹脂と接触させる。
【０１５０】
ＳＥＬＥＸ法１のラウンド７およびＳＥＬＥＸ法２のラウンド８において選択されたＩＴＲ１４およびＩＴＲ２１の配列をクローニングした。各方法において、ＩＴＲ１４に対応する２０個のクローンとＩＴＲ２１に対応する２０個のクローンとを単離し、シークエンシングした。これら８０個の配列を、その性質：すなわち１４箇所のポジションで変性されているＩＴＲ１４からなっているか、２１箇所のポジションで変性されているＩＴＲ２１からなっているか；およびそれらが得られた方法（ＳＥＬＥＸ法１またはＳＥＬＥＸ法２）；により分析した。結果は、用いた方法が、行う選択の種類に対して影響を有しうることを示した（不掲載データ）。
【０１５１】
８０個の配列をゲルリターデーションにより試験し、トランスポゼースとのその結合能を試験した。結果は、ＩＴＲ１、６、９、４０、４６、４９、６０および６９（ＩＴＲＳｅｌｅｘ；図１１；配列番号３８ないし４５）のクローンがこのタンパク質と複合体を形成しうることを示した。これらがＩＴＲとしてトランスポゼースに認識されるのか、それとも標的として認識されるのかを決定するため、これらの陽性クローンをゲルリターデーションにより試験した。結果は、クローン１、４０、４６、４９および６９がＩＴＲであることを示した（図１１および不掲載データ）。結果からは、クローン６および９については何ら結論を得られなかった（図１１）。
【０１５２】
ｂ）競合試験
結果は、上記ゲルリターデーション実験に基づいて選択された８個のＩＴＲのうち、ＩＴＲ４０および４６のみが放射標識ＩＴＲ３’に対するトランスポゼースの結合を阻害しうることを示した。
ＩＴＲ４０  ５’−ＴＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＡＧＴＡＴＧＴＡＡＴＧＴＣＧＴＴＡ−３’（配列番号３９）；
ＩＴＲ４６  ５’−ＴＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＡＧＴＡＴＧＡＧＡＴＧＴＣＧＴＴＴ−３’（配列番号３８）。
【０１５３】
図１２に示すとおり、ＩＴＲ４０および４６のみがＩＴＲ３’と競合し、放射標識ＩＴＲ３’のトランスポゼース結合をシフトすることができる。
【０１５４】
ｃ）転移試験
ＩＴＲ４０および４６は競合試験に基づくと最良の候補と思われるが、前記８個のＩＴＲの挙動について、該ＩＴＲが転移全体を媒介する能力を有するか、およびそれがどの程度なのかを確認するために、バクテリアにおけるイン・ビボの転移試験において評価した。
【０１５５】
得られた結果を図１３ＡおよびＢに示す。ＩＴＲ４０および４６のみが実際に試験条件下において転移を向上させうると思われる。基準（または対照）の場合、方法Ｉの実験条件下では、ｐＢＣ３Ｔ３の転移効率はｐＢＣ３Ｔ５プラスミドで得られたものに対して１０倍上昇した（図１３Ａ）。
【０１５６】
最終的に、図１３Ｂに示すように、シュードトランスポゾン３Ｔ３０および３Ｔ３６が高活性である。
【０１５７】
ＩＩ−  ＵＴＲ（非翻訳末端反復配列）
最適なＭｏｓ−１エレメントの転移のための最小限の核酸構造は、ＩＴＲに加え、ＵＴＲの少なくとも一部を含んでいるようである。実際、イン・ビトロでは、Ｍｏｓ−１  ＩＴＲ５’および３’のみに隣接された耐性マーカーは転移しないが、ＵＴＲ５’の最初の３８ｂｐおよびＵＴＲ３’の最初の５ｂｐをそれぞれのＩＴＲの配列に付加すると、野生型の活性が十分に回復する（Tosi et al., 2000）。
【０１５８】
ＩＴＲの近傍にＵＴＲが存在することの必要性を、多くの考え得る構造を構築することにより評価した：５’または３’のＵＴＲ、ＩＴＲ３’と組み合わせたＵＴＲ５’、またはその逆。
【０１５９】
手短に述べると、得られた結果により、ＵＴＲの存在が転移に好都合であることが示された（具体的には、少なくともおよそ５に等しい倍率の向上）。
【０１６０】
ＩＩ−１−  材料および方法
ａ）ＩＴＲ−ＵＴＲ構造の構築
Ａ１）プラスミド
ＩＴＲ／ＵＴＲプラスミドは全て、同一の操作方法を用いてｐＢＣ３Ｔ５プラスミドから構築された。ＩＴＲ３’は、ＫｐｎＩおよびＳａｌＩ酵素による二重消化後に置き換えた。ＩＴＲ５’は、ＮｏｔＩおよびＳａｃＩの二重消化により置き換えた。ＡＴＧ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｓ（ドイツ）により、各種ＩＴＲ／ＵＲＴ３３および５５配列が合成され、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へクローニングされた。Ｉｎｔｅｌｅｃｈｏｎ（ドイツ）により、ＩＴＲ／ＵＴＲ３５−ＭＣＳ−ＵＴＲ／ＩＴＲ３５配列、すなわちＩＴＲ３’／ＵＴＲ５；−マルチクローニング部位（ＭＣＳ）−ＵＴＲ３’／ＩＴＲ５’が合成され、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  ＡｍｐＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングされた。この配列をＫｐｎＩおよびＳａｃＩの二重消化によりｐＢＣに導入した。これらの配列は、５’のＩＴＲ／ＵＴＲに隣接するＴＡジヌクレオチドがシュードエレメントの外側に配置されるように設計された。約１５種の構造が生成され、方法２によるバクテリア内での転移試験において評価された。結果は、ｐＢＣ  ＩＴＲ／ＵＴＲ−Ｔ−ＵＴＲ／ＩＴＲとして参照される次のプラスミド：ｐＢＣ３３Ｔ３３、ｐＢＣ３３Ｔ５５およびｐＢＣ３５Ｔ３５について示される。
【０１６１】
ｐＫＫＴｎｐトランスポゼースドナープラスミドはｐＫＫ２３３−２プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ａｍｐ’）の誘導体であり、Ｎｃｏｌ部位において、Ｍｏｓ−１トランスポゼースＯＲＦ基準Ｔｎｐがクローニングされている。その発現はＰｔｒｃ  ＩＰＴＧ誘導性プロモーターの調節下にある（しかし、該プロモーターは誘導因子不在下における基本的な転写活性を含んでなる；不掲載データ）。以下、トランスポゼースＯＲＦが存在しない場合に前記ｐＫＫ２３３−２プラスミドを単にｐＫＫという。
【０１６２】
Ａ２）転移試験のためのＪＭ１０９  Ｅ．  ｃｏｌｉ系統の形質転換
コンピテントなＪＭ１０９バクテリアを、プラスミドｐＢＣ３３Ｔ３、ｐＢＣ３Ｔ５、ｐＢＣ３Ｔ３、ｐＢＣ３３Ｔ５５、ｐＢＣ３５Ｔ３５、ｐＢＣ３Ｔ３３を含むトランスポゾンドナープラスミドと、ｐＫＫＴｎｐ  Ｔｎｐドナープラスミドとにより同時形質転換した。対照系統を、同一のトランスポゾンドナープラスミドとｐＫＫ対照プラスミドとにより同時形質転換した。
【０１６３】
ｂ）転移試験
実験プロトコルの詳細な説明を上記第Ｉ部の段落Ｉ−Ｂに示す。
【０１６４】
約１５種の構造が、図１４に図解される方法ＩＩによるバクテリア内でのイン・ビボ転移について試験された。
【０１６５】
ＩＩ−２−  結果
生じたＴｅｔＲクローンの数を、ｐＫＫ−Ｔｎｐトランスポゼースドナープラスミドの存在下で分析されたバクテリアの数で割り、ここからｐＫＫ対照プラスミドの存在下で得られた実験のバックグラウンドノイズを除いて、転移効率を算出した。最も有意な結果は、構築物３Ｔ３３、３３Ｔ３３および３５Ｔ３５において、対照構築物３Ｔ３、３Ｔ５および３３Ｔ５５との比較で得られた。転移効率は、ｐＢＣ３３Ｔ３３およびｐＢＣ３Ｔ３３構築物において、対照構築物ｂＢＣ３Ｔ３に対して５および２０の倍率で上昇した。ｐＢＣ３３Ｔ３３構築物においては、ｂＢＣ３Ｔ５プラスミドおよびｐＢＣ３５Ｔ３５プラスミドで得られる転移効率に対して３００倍優れた転移効率が観察されることから、これらの結果は、ＵＴＲ配列の存在が転移反応にとって極めて重要であることを示している。最良の結果はｐＢＣ３５Ｔ３５構築物において得られ、これはｂＢＣ３Ｔ５に対して５４，０００倍の倍率で、またｐＢＣ３Ｔ３に対して１０００倍の倍率で転移効率を上昇させる。
【０１６６】
図１５Ａによると、ｐＢＣ３５Ｔ３５、ｐＢＣ３Ｔ３３およびｐＢＣ３３Ｔ３３の有利な構築物。
【０１６７】
図１５Ｂは、シュードトランスポゾン３Ｔ３３、３３Ｔ３３および３５Ｔ３５が高活性であることを示す。
【０１６８】
それに加え、本願発明者らは構築物５３Ｔ３５、５３Ｔ３３、３５Ｔ３３、５５Ｔ３５、５３Ｔ５５、５５Ｔ５５、５Ｔ３５、５Ｔ３３、３Ｔ５５、３Ｔ５３を試験した。ここでは、これらの構築物が高活性をもたらさないことが観察された；その効率は３Ｔ５または３Ｔ３のものと等価であるか、それよりも低いか、またはゼロであった（不掲載データ）。
【０１６９】
第ＩＩＩ部：高活性変異型Ｍｏｓ−１トランスポゼースと高活性組換えＭｏｓ−１シュードトランスポゾンとを含んでなる高活性組換え転移システム
高活性トランスポゼースと、同様に高活性なシュードトランスポゾンとを組み合わせたシステムの転移効率を評価するため、各種組み合わせを上記第Ｉ部の段落Ｉ−Ｂに記載したバクテリア中での転移試験において試験した。
【０１７０】
この試験においては、ｐＢＣ３Ｔ３プラスミドを、高活性シュードトランスポゾンｐＢＣ３Ｔ３３、ｐＢＣ３Ｔ４０、ｐＢＣ３Ｔ４６で置き換えた。野生型ｐＫＫ−Ｔｎｐプラスミドは、それぞれが固有の高活性の変異型トランスポゼースを発現するｐＫＫ型ベクターで置き換えた。
【０１７１】
下記の表３に、高活性トランスポゼース（ＦＥＴＹ、ＦＱＥＴＹ、ＦＴＹ、ＦＴ、ＴＹ、ＥＴ、ＦＱ、ＦＱＥＴ、ＱＹ）とシュードトランスポゾン３Ｔ３３、３Ｔ４０、３Ｔ３６、３３Ｔ５５（これは対象として用いられる）とを組み合わせて得られた結果を示す。
【表３】
2009537130.tif 000004
【０１７２】
驚くべきことに、また意外なことに、試験した組み合わせで得られた結果は、高活性Ｍｏｓ−１トランスポゼースと高活性Ｍｏｓ−１シュードトランスポゾンとの全ての組み合わせが必ずしも高活性ではないということを示している。
【０１７３】
ここで得られた結果により、本発明の目的に有利な組み合わせとして、次の組み合わせ：
−  シュードトランスポゾン３Ｔ４０＋トランスポゼースＴＹ；
−  シュードトランスポゾン３Ｔ４６＋トランスポゼースＴＹまたはＥＴまたはＦＴＹ；
−  シュードトランスポゾン３Ｔ３３＋トランスポゼースＴＹまたはＥＴまたはＦＱまたはＦＱＥＴ；
を選択することが可能である。
【０１７４】
ここで報告されるバクテリア中における転移試験の条件のもとでは、シュードトランスポゾン３Ｔ３３＋トランスポゼースＥＴの組み合わせが最も有利であり、シュードトランスポゾン３Ｔ３＋トランスポゼースＷＴ（２００倍）、シュードトランスポゾン３Ｔ３＋トランスポゼースＦＥＴＹ（３．５倍）、およびシュードトランスポゾン３Ｔ３３＋トランスポゼースＷＴ（１０倍）のそれぞれの組み合わせよりも効率的である。
【０１７５】
トランスポゼース＋ＩＴＲまたはトランスポゼース＋ＩＴＲ／ＵＴＲ複合体の安定性を測定するため、生化学的リターデーションゲル分析を上記の［具体的には、２００４年９月１６日公開のＷＯ２００４／０７８９８１、およびAuge-Gouillou et al. (2001b)中の］手順により行った。
【０１７６】
この研究は、ＩＴＲ３’をＴＵＲ３’と、およびＩＴＲ３’をＵＴＲ５’と組み合わせたＤＮＡ断片が、ＩＴＲのみ、または他の組み合わせで形成されたＤＮＡ断片よりもずっと安定である（４倍）ことを示した（図１６）。この、より高い複合体安定性は、観察された高活性の原因でありうる。
【０１７７】
文献
2009537130.tif 000005
【０１７８】
以下の図面は純粋に例証を目的として示されるものであり、本発明の主題を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１７９】
【図１】ｍｏｓ−１トランスポゾンのトランスポゼース遺伝子の塩基配列（配列番号１）および該Ｍｏｓ−１トランスポゼースのタンパク質配列（配列番号２）。高活性部位（特異的突然変異誘発（directed mutagenesis）標的部位）は灰色の背景の残基周辺の１本線の枠で位置を示す。推定上のリン酸化部位は以下のように位置している：    −  ２本線の枠：ＡＴＭキナーゼによりリン酸化可能なアミノ酸；    −  太い斜線の枠：プロテインキナーゼＣ（ｐＫｃ）によりリン酸化可能なアミノ酸；    −  太い薄い灰色の枠：ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ｐＫａ）によりリン酸化可能なアミノ酸；    −  太い黒色の枠：ｐＫａおよびｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ｐＫｇ）によりリン酸化可能なアミノ酸；    −  １本線の斜線の枠：カゼインキナーゼＩＩ（ＣＫＩＩ）によりリン酸化可能なアミノ酸。  残基ＱＴＱ（配列番号２のタンパク質配列におけるポジション８７ないし８９）はＡＴＭキナーゼファミリーによる推定上のリン酸化部位に相当する。点を打った背景の円は高度にリン酸化可能な残基を示す印である。  灰色の背景の円はＭＬＥトランスポゼースの特徴的な触媒トライアッド（Ｄ，Ｄ３４−３５［Ｄ／Ｅ］）に関わり、ＤＮＡの切断に関与する残基を示す。  縦方向の矢印はタンパク質分解による切断部位を示す。
【図２】Ｍｏｓ−１エレメントトランスポゼースの構造を表す図である。    Ｎ−ｔｅｒｍ：ＩＴＲとの結合に関与するＮ末端ドメイン；    Ｃ−ｔｅｒｍ：ＤＮＡ鎖転移触媒作用に関与するＣ末端ドメイン；ＮＬＳ：推定上の核移行（核インターナショナライゼーション（nuclear internationalisation））シグナル；ＨＴＨ：ヘリックス・ターン・ヘリックスパターン；ａａ：アミノ酸。  数字はアミノ酸のポジションを表す。  特徴的な触媒トライアッド（Ｄ，Ｄ３４−３５［Ｄ／Ｅ］）を示す。
【図３Ａ】ｐＢＣ  ＳＫ＋プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から構築されたｐＢＣ３Ｎｅｏ３プラスミドの模式図（Ａ）である。
【図３Ｂ】ｐＢＣ  ＳＫ＋プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から構築されたｐＢＣ３Ｎｅｏ３プラスミドの誘導体（Ｂ）の模式図である。
【図４Ａ】ｐＣＭＶ−Ｔｎｐプラスミド（Ａ）の模式図である。
【図４Ｂ】ｐＣＭＶ−Ｔｎｐプラスミドの誘導体（Ｂ）の模式図である。
【図５】転移試験の模式図である。    Ａ）：トランスポゼース（Ｔｎｐ）をコードした発現ベクターおよび転移レポーターベクターで同時形質転換されたバクテリア。    Ｂ）：発現ベクター誘導後の転移イベント。    Ｃ）：転移頻度の決定。
【図６Ａ】変異型トランスポゼースの転移効率：高活性倍率および変異体転移頻度。    ｉ）単独変異体：      −  誘導後、ｔ＝０時間における：Ａ）高活性倍率    ＷＴ（５３）：野生型トランスポゼース。
【図６Ｂ】変異型トランスポゼースの転移効率：高活性倍率および変異体転移頻度。    ｉ）単独変異体：      −  誘導後、ｔ＝０時間における：Ｂ）転移頻度    ＷＴ（５３）：野生型トランスポゼース。
【図６Ｃ】変異型トランスポゼースの転移効率：高活性倍率および変異体転移頻度。    ｉ）単独変異体：      −  誘導後、ｔ＝５時間における：Ｃ）高活性倍率    ＷＴ（５３）：野生型トランスポゼース。
【図６Ｄ】変異型トランスポゼースの転移効率：高活性倍率および変異体転移頻度。    ｉ）単独変異体：      −  誘導後、ｔ＝５時間における：Ｄ）転移頻度    ＷＴ（５３）：野生型トランスポゼース。
【図６Ｅ】変異型トランスポゼースの転移効率：高活性倍率および変異体転移頻度。    ｉｉ）多重変異体：      −  誘導後、ｔ＝０時間における：Ｅ）高活性倍率    ＷＴ（５３）：野生型トランスポゼース。
【図６Ｆ】変異型トランスポゼースの転移効率：高活性倍率および変異体転移頻度。    ｉｉ）多重変異体：      −  誘導後、ｔ＝０時間における：Ｆ）転移頻度    ＷＴ（５３）：野生型トランスポゼース。
【図６Ｇ】変異型トランスポゼースの転移効率：高活性倍率および変異体転移頻度。    ｉｉ）多重変異体：      −  誘導後、ｔ＝５時間における：Ｇ）高活性倍率    ＷＴ（５３）：野生型トランスポゼース。
【図６Ｈ】変異型トランスポゼースの転移効率：高活性倍率および変異体転移頻度。    ｉｉ）多重変異体：      −  誘導後、ｔ＝５時間における：Ｈ）転移頻度    ＷＴ（５３）：野生型トランスポゼース。
【図７】ＳＥＬＥＸ法の一般的原理を説明する図である。
【図８】ＳＥＬＥＸ法１の原理を説明する図である。
【図９】競合試験（competition test）を示す図である。
【図１０】方法Ｉによるバクテリアにおけるイン・ビボ転移試験の操作条件を表す図である。
【図１１Ａ】ＩＴＲ（本発明者らによって開発されたＳＥＬＥＸ法を用いて選択されたＩＴＲＳｅｌｅｘ）を示す。
【図１１Ｂ】（Ａ）に示すＩＴＲ（本発明者らによって開発されたＳＥＬＥＸ法を用いて選択されたＩＴＲＳｅｌｅｘ）で行ったリターデーションゲル（Ｂ）の結果である。
【図１２】競合試験の結果である。
【図１３Ａ】ＩＴＲで得られた転移試験の結果である。
【図１３Ｂ】ＩＴＲＳｅｌｅｘおよび野生型Ｍｏｓ−１トランスポゼースを用いたバクテリアにおける転移試験の補足的な結果である。
【図１４】バクテリアにおいてイン・ビボで転移させるための方法ＩＩの操作条件を説明する図である。
【図１５Ａ】ＩＴＲ／ＵＴＲで得られた転移試験の結果である。
【図１５Ｂ】ＩＴＲ／ＵＴＲの組み合わせおよび野生型Ｍｏｓ−１トランスポゼースを用いたバクテリアにおける転移試験の補足的な結果である。
【図１６】ＩＴＲ／ＵＴＲの組み合わせで形成された［野生型Ｍｏｓ−１トランスポゼース  ＋  ＩＴＲ］複合体の量をグラフで示したものである。
【図１】
2009537130.tif 000006
【図２】
2009537130.tif 000007
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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