(57)【要約】  本発明は雑種強勢、雑種衰弱の誘発及び／又は疾患の診断、予後及び治療に有用な候補遺伝子及びそれによるコード化タンパク質の同定法に関する。特に本発明は動物又は植物で雑種強勢又は雑種衰弱を産生できる候補遺伝子の同定法に関し、（i）雑種強勢又は雑種衰弱を示す動物又は植物から単離の候補遺伝子の対立遺伝子のｍＲＮＡ配列を、該動物又は植物の親から単離の対応対立遺伝子のヌクレオチド配列と比較し、（ii）アミノ酸配列変異をコードした雑種強勢又は雑種衰弱を示す該動物又は植物の対立遺伝子でのｍＲＮＡ配列の差異物を同定し、且つ（iii）該動物又は植物の候補遺伝子の対立遺伝子間のアミノ酸配列変異を、この候補遺伝子内の二つ以上の異なるエクソン内に位置するｍＲＮＡ配列によるコード化を確認する段階を含む同定法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物又は植物で雑種強勢又は雑種衰弱を産生出来る候補遺伝子同定法で、
（i）雑種強勢又は雑種衰弱を示す動物又は植物から単離の候補遺伝子のｍＲＮＡ配列を、前記動物又は植物の親から単離の対応対立遺伝子のヌクレオチド配列を比較し、
（ii）アミノ酸配列変異をコードした雑種強勢又は雑種衰弱を示す前記動物又は植物での前記対立遺伝子のｍＲＮＡ配列の差異物を同定し、且つ
（iii）前記動物又は植物での前記候補遺伝子の対立遺伝子間の前記アミノ酸配列変異を、前記候補遺伝子内の二つ以上の異なるエクソン内に位置するｍＲＮＡ配列によりコード化されるのを確認する
段階を含む同定法。
【請求項２】
前記アミノ酸配列変異が保守的修飾変異である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アミノ酸配列変異が非保守的修飾変異である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ｍＲＮＡ配列の差異同定段階が前記植物又は動物で単離の前記ｍＲＮＡの配列決定段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記植物が大麦、ライ麦、サトウモロコシ、メイズ（maize）、大豆、小麦、トウモロコシ（corn）、じゃがいも、綿花、米、菜種（カノーラ油を含む）、ひまわり、ムラサキウマゴヤシ、サトウキビ、バナナ、ブラックベリー、ブルーベリー、イチゴ、ラズベリー、カンタロープ、にんじん、カリフラワー、コーヒー、キュウリ、なす、ブドウ、ハネデューメロン、レタス、マンゴー、メロン、タマネギ、パパイヤ、エンドウ豆、コショウ、パイナップル、ほうれん草、スカッシュ、スイートコーン、たばこ、トマト、スイカ、バラ科果実（リンゴ、桃、梨、サクランボ及びプラムのような）及びアブラナ科野菜（ブロッコリー、キャベツ、カリフラワー、もやし及びコールラビのような）からなる一群から選択し、表現形が変化しても良い他作物、果物及び野菜としては、大麦、カラント、アボカド、ミカン、レモン、グレープフルーツ及びタンジェリンのような柑橘類果物、アーティチョーク、チェリー類、クルミとピーナツのようなナッツ類、エンダイブ、リーキ、クズウコン、ビート、キャッサバ、かぶ、大根、ヤムイモ、サツマイモのような根類及び豆類である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記動物が哺乳類か魚である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記哺乳類が哺乳類の霊長目、げっ歯目、ウサギ目、鯨目、食肉目、奇蹄目及び偶蹄目から選択する請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記偶蹄目はイノシシ科、ベッカリー科、カバ科、らくだ科、マメジカ科、キリン科、シカ科、プロングホーン科及びウシ科の９つの科の一つから選択する請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ウシ科から選択する前記動物が有蹄動物である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記有蹄動物が雌牛又は雄牛、バイソン、バファロー、羊、オオツノヒツジ、ウマ、ポニー、ロバ、ラバ、シカ、ヘラジカ、カリブー、山羊、水牛、ラクダ、ラマ、アルパカ及び豚からなる一群から選択する請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記動物が魚である請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記魚が縞模様の魚、鯉、鮭、カダヤシ、テンチ、ヤツメウナギ、丸ハゼ、テラピア及びマスからなる一群から選択する請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記動物がヒトである請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
雑種強勢又は雑種衰弱をもたらす因子同定法で、
（i）候補遺伝子の対立遺伝子による複数種のコード化ｍＲＮＡ又はタンパク質の存在又は不在を同定し、
（ii）複数種のｍＲＮＡ又はタンパク質が存在する場合には、前記種がそれぞれ二つ以上のエクソン変異体に対応するヌクレオチド配列変異体又はアミノ酸配列変異体を有するか否かを解析し、段階（ii）で複数種のｍＲＮＡ又はタンパク質の存在が雑種強勢又は雑種衰弱を指示する段階を含む同定法。
【請求項１５】
動物又は植物の雑種強勢又は雑種衰弱産生法で、
（i）候補遺伝子の対立遺伝子による複数種のコード化ｍＲＮＡ又はタンパク質の存在又は不在を同定し、
（ii）複数種のｍＲＮＡ又はタンパク質が存在する場合には、前記種がそれぞれ二つ以上のエクソン変異体に対応するヌクレオチド配列変異体又はアミノ酸配列変異体があるか否かを解析し、段階（ii）で複数種のｍＲＮＡ又はタンパク質の存在が雑種強勢又は雑種衰弱を指示し、
（iii）いずれの種が前記植物又は動物で雑種強勢（ＨＶ）又は雑種衰弱（ＨＤ）を促進するかを決定するために、野生型タンパク質制御機能と比較して前記複数種のタンパク質機能を決定し、
（iv）段階（iii）のタンパク質種のコード化ヌクレオチド配列を含むコンストラクトを調製し、
（v）前記コンストラクトをレシピエント植物細胞又はレシピエント動物細胞に形質転換し、且つ
（vi）前記コンストラクトを発現する植物又は動物を前記細胞から再生する
段階を含む方法。
【請求項１６】
植物又は動物でのハイブリッドｍＲＮＡの存在又は不在検出法であって、
植物又は動物からのｍＲＮＡ単離段階を含み、前記ｍＲＮＡのヌクレオチド配列を前記植物又は動物の対立遺伝子の対応コード配列と比較する、
植物又は動物でのハイブリッドｍＲＮＡの存在又は不在検出法。
【請求項１７】
遺伝子の異なる対立遺伝子のエクソンを含む合成遺伝子を含むコンストラクトで、異なる対立遺伝子間で変異が起こるアミノ酸配列変異体を、前記対立遺伝子がコードするコンストラクト。
【請求項１８】
植物又は動物の雑種衰弱を克服し、及び／又は植物又は動物に雑種強勢を誘発するために、インビトロ又はインビボで産生のハイブリッドｍＲＮＡ配列分子の使用で、前記ハイブリッドｍＲＮＡを前記動物又は植物に導入する段階を含むハイブリッドｍＲＮＡ分子の使用。
【請求項１９】
前記ハイブリッドｍＲＮＡを前記動物又は植物に導入する段階が形質転換又は相同組み替えによる請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
植物への形質転換段階が相同組み替え、微粒子銃、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）仲介形質転換、電気穿孔、炭化ケイ素繊維仲介形質転換、又はアグロバクテリウム仲介形質転換からなる一群から選択する請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
植物又は動物の雑種衰弱を克服し、及び／又は植物又は動物に雑種強勢を誘発するために、インビトロ又はインビボで産生のハイブリッドタンパク質分子の使用で、前記ハイブリッドタンパク質を前記動物又は植物に導入する段階を含むハイブリッドタンパク質の使用。
【請求項２２】
前記ハイブリッドタンパク質を前記動物、ヒト又は植物に導入する段階が、前記ハイブリッドタンパク質を経口、局所又は非経口投与による請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
請求項１乃至１３のいずれかの一つに記載の方法で同定した候補遺伝子を動物又は植物に投与する段階を含む疾患の治療法又は予防法。
【請求項２４】
請求項１４に記載の方法で同定した因子を動物又は植物に投与する段階を含む疾患の治療法又は予防法。
【請求項２５】
請求項１７に記載のコンストラクトを動物又は植物に投与する段階を含む疾患の治療法又は予防法。
【請求項２６】
疾患の治療又は予防用薬剤の調合で請求項１乃至１３のいずれかの一つに記載の方法で同定した候補遺伝子の使用。
【請求項２７】
疾患の治療又は予防用薬剤の調合で請求項１４に記載の方法で同定した因子の使用。
【請求項２８】
疾患の治療又は予防用薬剤の調合で請求項１７に記載のコンストラクトの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は雑種強勢、雑種衰弱及び／又は疾患診断、予後及び治療に有用な候補遺伝子とそれによるコード化タンパク質の同定法に関する。特に本発明は候補遺伝子の対立遺伝子による複数種のコード化ｍＲＮＡ又はタンパク質の存在又は不在を含む雑種強勢又は雑種衰弱をもたらす因子の同定法に関し、複数種のｍＲＮＡ又はタンパク質の存在が雑種強勢又は雑種衰弱を表示する。
【背景技術】
【０００２】
作物類、野菜類、果物及び例えば牛、羊及び豚類のような動物の成長、生存率、害虫抵抗性又は頑強性に影響力を有する幾つかの遺伝因子が、遺伝的に無関係で生物学的な正常親の子孫で影響力がより大きいことは数百年の間認められている。この生物現象は雑種強勢（ＨＶ）又はヘテロシスと呼ばれる。遺伝学的に無関係な親の子孫はヘテロ接合生物と呼ばれる。
【０００３】
殆どの正常な生物学的表現型が同一遺伝子の異なる変異形態をそれぞれが保有する生物学的欠陥の親の子孫に保持されたＨＶの更によく知られた形態は、遺伝子内相補性又は遺伝子座間相補性（ＩＣ）と呼ばれる。
【０００４】
ＨＶの商業的重要性と将来的有用性はどれほど強調してもし過ぎることはない。例えば農業分野だけでもＨＶの応用により数十億ドル収益をもたらし、遺伝学分野での最大の応用成果の一つを反映する（例えばアラム等（Alam, et al.）、（２００４年）、ジャーナルオブチュチアンユニバーシティサイエンス（J. Zhejiang Uni. Sci.）、５巻、ｐ．４０６を参照）。
【０００５】
国際食料政策研究所（The International Food Policy Research Institute）は発展途上国世界での肉類需要が１９９５年の消費水準に比べ２０２０年には１００％増加すると予測している（ピンストラップ−アンダーソン等（Prinstrup-Andesen et al.）、２０２０年を展望する食糧政策報告（2020 Vision Food Policy Report）、国際食料政策研究所（The International Food Policy Research Institute）、ワシントン（Washington）、ディストリクトオブコロンビア（DC）)。食用作物に関してインドだけでも食料生産量は２０２５年には二倍にする必要があり、２０５０年には予測人口増加を支えるには三倍にもなると予測されている（セングプタ等（Sengupta, et al.）、（２００１年）、カレントゲノミックス（Curr. Genomics）、２巻、ｐ．１８１）。将来の推算世界的食料所要量にも関わらず、食用作物増産速度は近年、特に１９９０年代に年率約１％減少した（コンウエイ（Conway）、テニッセン（Toennissen）、（１９９９年）、ネーチャー（Nature）、４０２巻、Ｃ５５）。それ故将来の世界的食用作物増産速度に対する需要の充足を保証するには、ＨＶを促進する新技術の開発と応用が不可欠である。
【０００６】
ＨＶはヘテロ接合型生物又は雑種生物で独自に合成される新規タンパク質（ホルモン、酵素又は成長因子のような）により促進されると云う意見が長い間もたれてきた（例えばジル（Gill）（１９９７年）、遺伝学と小麦改良（Genetics and Wheat Improvement）、エイケイ、グプタ編（A.K. Gupta, Ed.）、（オックスフォードアンドアイビーエッチ出版社（Oxford and IBH Publishing Co.）、ニューデリー（New Delhi）、ｐ．２０４−２０７）；スキャンダリオス等（Scandalios et al.）、（１９７２年）、アーカイブバイオケミストリーバイオフィジク（Arch. Biochem. Biophys.）、１５３巻、ｐ．６９５；ロマグノリ等（Romagnoli et al.）、（１９９０年）、セオレティカルアンドアプライドジェネティックス（Theor. Appl. Genet.）、８０巻、ｐ．７６９；チェン等（Cheng et al.）、（１９９６年）、チャイニーズサイエンスブリティン（Chinese Sci. Bull.）、４１巻、ｐ．４０参照）。
【０００７】
新規タンパク質がヘテロ接合型子孫で如何に形成されるかを理解するのは常に困難なので、ＨＶを説明するために多くの代替えモデルが提案された。近年電気回路と同類のモデル（ミルボロウ（Milborrow）、（１９９８年）、ジャーナルオブエクスペリメンタルボタニー（J. Exp. Bot.）、４９巻、ｐ．１０６３）や他の数学ベースモデルが提案された（ゴードン（Gordon）、（１９９９年）、へレディティ（Heredity）、８３巻、ｐ．７５７）。しかしバーチラー等（Birchler et al.）、（２００３年）、ザプラントセル（The Plant Cell）、１５巻、ｐ．２２３６及びより最近にサイド（Syed）、チェン（Chen）、（２００５年）、へレディティ（Heredity）、９４巻、ｐ．２９５）が記載しているように、ＨＶ又はヘテロシス推進の根底にある分子遺伝学的機構は分からないままである。２００３年にバーチラー（Birchler）と同僚は又“ヘテロシスの最終的な分子的説明により農業と生物工学の利益のためにＨＶが操作出来るか否かが決まる”と予測した。
【０００８】
既に１９６０年にはハイブリッドタンパク質がヘテロ接合型子孫で形成できることが示された（シュワルツ（Schwartz）、（１９６０年）、プロシーディングオブナショナルアカデミーオブサイエンスユーエスエイ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、４６巻、ｐ．１２１０）。同一研究者は又これらハイブリッドタンパク質によりＨＶは推進されると仮定した。１０年以後にこの仮定は、ＨＶと新規タンパク質又はバイブリッドタンパク質形成との関連が確認され正しいことが証明された（ウイルス（Wills）、ニコルス（Nichols）、（１９７２年）、プロシーディングオブナショナルアカデミーオブサイエンスユーエスエイ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、６９巻、ｐ．３２３；シン等（Singh et al.）、（１９７５年）、ジェネティックス（Genetics）、８０巻、ｐ．６３７）。
【０００９】
より近年には新規タンパク質を産生し、且ついずれの親にも欠如の独自のｍＲＮＡ種が、異なる形態の雑種強勢を示すヘテロ接合型ニワトリで明確に同定された（サン等（Sun et al.）、（２００５年）、アニマルジェネティックス（Animal Genetics）、３６巻、ｐ．２１０）。
【００１０】
ヘテロ接合型子孫で形成した幾つかのハイブリッドタンパク質は、ＨＶとは対照的に頑強さ、生存率又は健康が低下し、その親のいずれかに比べ子孫で病気を引き起こす。この現象は雑種衰弱（ＨＤ（Ｃ））と呼ばれる（本発明者の同時係属国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ２００５／０００１４１号参照）。幾つかの形態のＨＤは野生型の親タンパク質の活性に比べ、ヘテロ接合型子孫のハイブリッドタンパク質の不適正活性又は異常活性により直接起こり得る。この種類の人疾患の例としては、２型糖尿病と同様に全身性エリテマトーデスを患う患者の血管塞栓性疾患が挙げられる。２型糖尿病に関しては、多くの研究により新規の遺伝子コード化カルパイン類似プロテアーゼ（ＣＡＰＮ１０）と呼ばれる酵素が疾病過程に関与することが示された。コックス（Cox）（２００１年）はＣＡＰＮ１０の遺伝変異性に関するこれら研究の全体結果を評価し、“ハイリスクの組み合わせを形成する二つの異なる（ＣＡＰＮ１０）ハプロタイプに関してヘテロ接合な個体は、ハロタイプの他の組み合わせ全てに比べ危険性が約３倍増加し、最小リスクのハロタイプの組み合わせに対し危険性が約７倍増加する。ハイリスクの組み合わせのハロタイプのいずれかに関してホモ接合な個体は、２型糖尿病発生の危険性増加はない”と結論した（ヒューマンモレキュラージェネティックス（Hum. Mol. Genet.）、１０巻、ｐ．２３０１）。
【００１１】
一方幾つかの形態のＨＤは、宿主免疫系がハイブリッドタンパク質を免疫学的に異質と認識した結果間接的に起こり得る。この種類の疾患例としては１型糖尿病と自己免疫性肝疾患が挙げられる。１型糖尿病を患う幾らかの患者は、インスリンを産生する膵臓細胞の島細胞構成物質に向う血液中に自己抗体を有する。これらの自己抗体の標的はグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ６５）である。
【００１２】
ブーチン等（Boutin et al.）、（２００３年）（ピーロスバイオロジー（PLoS Biol）、１巻、ｐ．６８）の研究により、ＨＤの免疫誘導モードを保持しながら、１型糖尿病の標的自己抗原ＧＡＤ６５に対する免疫が、異なる遺伝形態のＧＡＤ６５にヘテロ接合な被験者で増加することが確認された。
【００１３】
農業、園芸及び水産養殖へのＨＶの応用に関する大きな商業的重要性と、ＨＶとＨＤの根底にある分子遺伝学的原理の理解を目的とする国際的な広範囲な研究努力にもかかわらず、今までこれら二つの表現形のいずれかを植物類、動物類又は魚で推進する遺伝子は同定されていない。これに対する主な理由は、疾患を含む有利な表現型か不利な表現型を起こす遺伝子の現在利用できる同定法又はマッピング法は、試験中生物のゲノム全体に分布する一連の遺伝子マーカーの使用に依存していることによる。通常これら遺伝子マーカーは一組の一塩基多型又はＳＮＰ類を含む。次いで関連遺伝子の場所は、どのＳＮＰ類が研究中の生物学的形質又は疾患と最も厳密に分離されるか、又は同時遺伝するかを決定して決める。幾つかの家族構成員が研究中の疾患又は表現型を有する系図でＳＮＰ解析が出来るだけ多くの世代に適用できる場合には、同時分離研究は最も有効である。疾患又は表現型がメンデル遺伝則に従って各世代を通して順送りされる場合には、関連遺伝子同定に関する本法の成功性は非常高い。しかしＨＶ及びＨＤの遺伝率がメンデル遺伝則に一致しない場合には、これらの技法はＨＤ又はＨＶ関与遺伝子を同定出来ない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
それ故ＨＶ及びＨＤ促進が関与する遺伝子同定法の必要がある。更にどちらのハイブリッドタンパク質がＨＶ又はＨＤ誘導の原因であるかを決定する方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
新規ポリペプチド又はタンパク質を合成するために、該発明者はスプライシング時に、一方の親から受け継ぐ遺伝子エクソンの３’端末を、他の親から受け継ぐ同一遺伝子の次の下流エクソンの５’端末で連結できる一次ＲＮＡスプライシング機構によりハイブリッドｍＲＮＡをインビボに産生出来ると仮定した。ここでの雑種遺伝子産物の産生機構は複合タンパク質が同一染色体の異なるＤＮＡ鎖の一次ＲＮＡ種の融合、又は同一親種の異なる転写ユニットにより形成できる他のもの（例えばモンゲラード等（Mongelard et al.）、（２００２年）、ジェネティックス（Genetics）、１６０巻、ｐ．１４８１）とは異なることを認識することは重要である。従ってモンゲラード等（Mongelard et al.）は異なるＤＮＡ鎖の二つの別転写単位の連結を記載している。対照的に該発明者は新規ハイブリッドタンパク質が合成される新規又はハイブリッドｍＲＮＡが、二つの異なる親対立遺伝子の転写単位のそれぞれのエクソン又はその一部を同一成熟ｍＲＮＡ分子に組み入れる生化学的経路により産生することを示した。
【００１６】
その結果本発明の最も広い様態で、ＨＶとＨＤの生物学的現型がヘテロ接合型子孫で如何に産生されるかを説明する分子遺伝学的機構を記載する。ヘテロ接合型子孫で形成されＨＶとＨＤを産生する新規遺伝構造物は、その親の遺伝可能な遺伝暗号の参照では明白ではない。
【００１７】
従って第一様態では本発明は動物又は植物に雑種強勢又は雑種衰弱を産生出来る候補遺伝子の同定法を提供し、その同定法は
（i）雑種強勢又は雑種衰弱を示す動物又は植物から単離の候補遺伝子の対立遺伝子ｍＲＮＡ配列を、該動物又は植物の親から単離の対応対立遺伝子のヌクレオチド配列と比較し、
（ii）アミノ酸配列変異体をコードした雑種強勢又は雑種衰弱を示す該動物又は植物の対立遺伝子ｍＲＮＡ配列の差異を同定し、且つ
（iii）該動物又は植物の候補遺伝子の対立遺伝子間アミノ酸配列変異体が、候補遺伝子内の二つ以上の異なるエクソン内に位置するｍＲＮＡ配列によりコード化されるのを確認する
段階を含む。
【００１８】
第二様態では本発明は雑種強勢又は雑種衰弱をもたらす因子同定法を提供し、その同定法は
（i）候補遺伝子の対立遺伝子による複数種のコード化ｍＲＮＡ又はタンパク質の存在又は不在を同定し、
（ii）複数種のｍＲＮＡ又はタンパク質が存在する場合には、該種がそれぞれ二つ以上のエクソンの変異体に対応するヌクレオチド配列変異体又はアミノ酸配列変異体があるか否かを解析し、段階（ii）での複数種のｍＲＮＡ又はタンパク質の存在は雑種強勢又は雑種衰弱を指示する段階を含む。
【００１９】
第三様態では動物又は植物での雑種強勢又は雑種衰弱産生法を提供し、産生法が
（i）候補遺伝子の対立遺伝子による複数種のコード化ｍＲＮＡ又はタンパク質の存在又は不在を同定し、
（ii）複数種のｍＲＮＡ又はタンパク質が存在する場合には、該種がそれぞれ二つ以上のエクソンの変異に対応するヌクレオチド配列変異体又はアミノ酸配列変異体があるか否かを解析し、段階（ii）での複数種のｍＲＮＡ又はタンパク質の存在は雑種強勢又は雑種衰弱を指示し、
（iii）いずれの種が該植物又は動物でＨＶ又はＨＤを促進するかを決定するために、野生型タンパク質制御機能と比較して複数種のタンパク質機能を決定し、
（iv）段階（iii）の該タンパク質種のコード化ヌクレオチド配列を含むコンストラクトを調製し、
（v）該コンストラクトをレシピエント植物細胞又はレシピエント動物細胞に形質転換し、且つ
（vi）該コンストラクトを発現する植物又は動物を該細胞から再生する
段階を含む。
【００２０】
第四様態では該発明は、植物又は動物からｍＲＮＡを単離する段階を含む植物又は動物のハイブリッドｍＲＮＡの存在又は不在を検出し、該ｍＲＮＡのヌクレオチド配列を植物又は動物の対立遺伝子の対応コード配列と比較する方法を提供する。
【００２１】
第五様態では遺伝子の異なる対立遺伝子のエクソンを含む合成遺伝子を含むコンストラクトを提供し、対立遺伝子が異なる対立遺伝子間で変異が起こるアミノ酸配列変異体をコードする。
【００２２】
更に本発明は植物又は動物の疾患を克服し、及び／又は植物又は動物に雑種強勢を有やつするために、インビボ産生ハイブリッドｍＲＮＡ分子又はそれらにより翻訳されたハイブリッドタンパク質の使用に関連する。
【００２３】
植物細胞は裸子植物、単子葉植物及び双子葉植物を含む任意の高等植物から単離出来るが、農業上重要な植物種全てが好ましい。好ましくい植物細胞は、大麦、ライ麦、サトウモロコシ、メイズ（maize）、大豆、小麦、トウモロコシ（corn）、じゃがいも、綿花、米、菜種（カノーラ油を含む）、ひまわり、ムラサキウマゴヤシ、サトウキビ、バナナ、ブラックベリー、ブルーベリー、イチゴ、ラズベリー、カンタロープ、にんじん、カリフラワー、コーヒー、キュウリ、なす、ブドウ、ハネデューメロン、レタス、マンゴー、メロン、タマネギ、パパイヤ、エンドウ豆、コショウ、パイナップル、ほうれん草、スカッシュ、スイートコーン、たばこ、トマト、スイカ、バラ科果実（リンゴ、桃、梨、サクランボ及びプラムのような）及びアブラナ科野菜（ブロッコリー、キャベツ、カリフラワー、もやし及びコールラビのような）からなる一群から選択の植物から単離する。表現型が変化しても良い他の作物、果物及び野菜としては、大麦、カラント、アボカド、ミカン、レモン、グレープフルーツ及びタンジェリンのような柑橘類果物、アーティチョーク、チェリー類、クルミとピーナツのようなナッツ類、エンダイブ、リーキ、クズウコン、ビート、キャッサバ、かぶ、大根、ヤムイモ、サツマイモのような根類及び豆類が挙げられる。本発明に使用できるかもしれない他の植物細胞としては、松、ポプラ及びユーカリのような木質種から単離の細胞が挙げられる。より好ましくは該植物細胞は米細胞、小麦細胞、大麦細胞、ライ麦細胞、サトウモロコシ細胞又はトウモロコシ細胞である。
【００２４】
該植物細胞の形質転換法は、植物細胞を安定に形質転換できる技術的に周知の任意の方法を含む。適切なプロトコルはマメ科（ムラサキウマゴヤシ、大豆、クローバー等）、セリ科（にんじん、セロリ、アメリカボウフウ）、アブラナ科（キャベツ、大根、菜種、ブロッコリー等）、ウリ科（メロンとキュウリ）、イネ科（小麦、トウモロコシ、米、大麦、きび等）、ナス科（じゃがいも、トマト、たばこ、コショウ等）及び種々の他作物が利用できる。アンミラート等（Ammirato et al.）（１９８４年）、植物細胞培養−作物種ハンドブック（Handbook of Plant Cell CultureCrop Species）、マックミラン出版社（Mamillan Publ. Co.）；シマモト等（Shimamoto, et al.）、（１９８９年）、ネーチャー（Nature）、３３８巻、ｐ．２７４−２７６；フロム等（Fromm et al.）、（１９９０年）、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）、８巻、ｐ．８３３−８３９；及びバジル等（Vasil et al.）、（１９９０年）、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）、８巻、ｐ．４２９−４３４に記載のプロトコル参照。
【００２５】
好ましくは植物細胞は、例えばメガヌレアーゼ１−ＳｃｅＩ、微粒子銃、プロトプラストのＰＥＧ仲介形質転換、電気穿孔、炭化ケイ素繊維仲介形質転換、又はアグロバクテリウム仲介形質転換の使用に基づく技法を用いる相同組み替えからなる一群から選ぶ方法で形質転換する。該発明の好ましい実施形態では、形質転換手続きは微小粒子をコンストラクト含有のＤＮＡでコートし、レシピエント細胞をその微小粒子と接触する微粒子銃法を含む。
【００２６】
第六様態では該発明により植物又は動物の雑種衰弱を克服し、及び／又は植物又は動物の雑種強勢を誘発するために、該動物又は植物へ該ハイブリッドタンパク質の導入段階を含むインビトロ又はインビボ産生ハイブリッドタンパク質分子の使用が提供される。
【００２７】
動物細胞はいずれの動物から単離出来るが、哺乳類及び魚が特に有用である。適切な哺乳類源としては、霊長目、げっ歯目、ウサギ目、鯨目、食肉目、奇蹄目及び偶蹄目の構成員が挙げられる。奇蹄目と偶蹄目構成員が、それらが類似生物学であり且つ経済的重要性から特に好ましい。
【００２８】
例えば偶蹄目は以下の９つの科に分布する約１５０種の生きた種を含む。豚（イノシシ科）、ペッカリー（ベッカリー科）、カバ（カバ科）、らくだ（らくだ科）、ネズミジカ（マメジカ科）、キリンとオカーピ（キリン科）、シカ（シカ科）、プロングホーン（プロングホーン科）及び牛、羊、山羊及びアンテロープ（ウシ科）。これら動物の多くは種々の国で食用動物として使用されている。本発明に関してより重要なのは、山羊、羊、牛及び豚のような経済的に重要な動物の多くが非常に類似した生物学を有し、高度にゲノム相同性を共有することである。
【００２９】
奇蹄目はウマとロバを含み、両者は経済的に重要であり且つ緊密に関連している。実際にマウマとロバは雑種交配することがよく知られている。
【００３０】
一実施形態では動物細胞は有蹄動物から得る。好ましくは有蹄動物は牛科動物、オービッド、シカ科動物、豚科動物、ウマ科動物及びラクダ科動物の家畜又は野生の代表者からなる一群から選ぶ。これらの代表者の例としては、雌牛又は雄牛、バイソン、バファロー、羊、オオツノヒツジ、ウマ、ポニー、ロバ、ラバ、シカ、ヘラジカ、カリブー、山羊、水牛、ラクダ、ラマ、アルパカ及び豚である。特に牛種で好ましいのは、バリウシ、コブウシ及びバッファロー雌牛又は雄牛である。
【００３１】
一実施形態では動物細胞は脊椎動物海洋動物及び無脊椎動物海洋動物のような水生生物から単離される。より好ましいは水生生物は魚、両生類及び軟体動物からなる一群から選ぶ。魚としては制限なしで、縞模様の魚、鯉、鮭、カダヤシ、テンチ、ヤツメウナギ、丸ハゼ、テラピア及びマスが挙げられる。両生類としては制限なしで、ヒキガエルとカエルが挙げられる。軟体動物としては制限なしで、マガキ、カワホトトギスガイ、イガイダマシ、ニュージーランドキリガイダマシ、スクリミンゴカイ、アフリカンマイマイ及びビオンフェラリア属とブリヌス属の病原媒介カタツムリが挙げられる。
【００３２】
該発明コンストラクトの動物細胞への形質転換は、好ましくは相同組み替えによる。相同組み替え（分子遺伝学（Molecular Genetics）、ユー、メルチャー（U. Melcher (1998年)）参照）は、好ましくは標的遺伝子含有組織培養液で成長した胚幹細胞のような細胞に遺伝子操作コンストラクトを添加して誘発される。より好ましくは形質転換幹細胞を新規胚盤胞に注入し、成熟動物に新規コンストラクトを固定させる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
ここに記載の出版物の全ては、出版物に報告され且つ該発明との関連で用いるかもしれないプロトコルと試薬の記載開示の目的で引用する。該発明がここで先行発明に基づいてこの開示に先行権付与を認可するものでは決してない。
【００３４】
本発明の実施は他に示さない限り、技術の熟知範囲内の慣用分子生物学、植物生物学と動物生物学及び組み替えＤＮＡ技術を用いる。これらの技術は当業者には周知であり、文献に十分説明されている。例えばマニアチス（Maniatis）、フリッシュ（Fritsch）、サンブルック（Sambrook）、“分子クローニング、ラボラトリマニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）”、（１９８２年）；“ＤＮＡクローニング：実際的アプローチ（DNA Cloning: A Practical Approach）”、Ｉ巻及びＩＩ巻、（ディエヌ、グローバー編（D.N. Glover, Ed.）、１９８５年）；“オリゴヌクレオチド合成（Oligonucleotide Synthesis）”、（エムジェイ、ゲイト編（M.J. Gait, Ed.）、１９８４年）；“核酸ハイブリッド形成（Nucleic Acid Hybridization）”、（ビーディ、ハメス（B.D. Hames）、エスジェイ、ヒギンス編（S.J. Higgins, eds.）、１９８５年）；“転写と翻訳（Transcription and Translation）”、（ビーディ、ハメス（B.D. Hames）、エスジェイ、ヒギンス編（S.J. Higgins, eds.）、１９８４年）；ビー、パーバル（P. Perbal）、“分子クローニングの実際的ガイド（A Practical Guide to Molecular Cloning）”、（１９８４年）及びサンブルック等（Sambrook, et al.）、“分子クローニング；ラボラトリマニュアル（Molecular Cloning: a Laboratory Manual）”、１２版、（１９８９年）参照。
【００３５】
該発明は記載の特定材料と方法は限定されず、変わっても良いと理解される。又ここで用いる術語は特定の実施形態を記述する目的のためだけで、本発明の範囲を制限する意図はなく、その範囲は付随の特許請求の範囲にのみより限定されると理解する必要がある。ここと付随の特許請求の範囲で用いる“a”、“an”（「一つ」）及び“the”（「その」）と言う単数形は、別に明確に文脈が定めていない限り複数も含めて言及していることを知る必要がある。従って例えば“a plant cell”（「一つの植物細胞」）は複数のこの植物細胞を含み、“an animal cell”（「一つの動物細胞」）は一つ以上の動物細胞に関する。ここに記述のものと類似又は同等な任意の材料及び方法は本発明の実施又は試験に使用できるが、好ましい材料と方法を次いで説明する。
【００３６】
本発明の最も広範囲な様態の一つでハイブリッドｍＲＮＡ及び／又はハイブリッドタンパク質を形成する新規機構を記載する。ここに記載でより重要なのは、本発明で雑種強勢（ＨＶ）と雑種衰弱（ＨＤ（Ｃ））現象を説明する機構の記述である。
【００３７】
子孫がそのいずれかの親の同一の生物学的表現型の発現と比べて、いずれかの特定の生物学的表現型を増強型で示す場合にはＨＶが起こる。子孫がその親に比べていずれかの特定の生物学的表現型を低下型で示す場合にＨＤ（Ｃ）が起こる。
【００３８】
ＨＤの生物学的表現型は酵素のようなハイブリッドタンパク質活性の減少により直接引き起こされても良い。一方幾つかのハイブリッドタンパク質は免疫学的に異質と認識され、自己免疫プロセスを誘発してある形のＨＤ開始を引き起こす。
【００３９】
ここで用いた“ハイブリッドｍＲＮＡ”及び“ハイブリッドタンパク質”と言う用語は、単一遺伝子の対立遺伝子の転写及び／又は翻訳時に産生する異種又は複数種のｍＲＮＡ及び／又はタンパク質を意味する。
【００４０】
ここに記載のハイブリッドｍＲＮＡ分子のトランスエクソンアセンブリー機構による形成能を有するハイブリッドタンパク質範囲の例を図１に示す。シロイヌナズナ交雑種でのＲＦＲＩコード化ハイブリッドタンパク質は、コーレ等（Corre et al.）、（２００２年）、モレキュラーバイオロジーアンドエボリューション（Mol. Biol. Evol.）、１９巻、ｐ．１２６１に記載の代替えＦＲＩ対立遺伝子のゲノム構造から推定した。
【００４１】
シロイヌナズナ菌株ＣＹＲとＪＥＡ関連のＦＲＩ対立遺伝子のエクソン１、エクソン２及びエクソン３によるコード化野生型一次ペプチド及び潜在的ハイブリッド一次ペプチド
2009502143.tif 000002
【００４２】
Ｅ１、Ｅ２及びＥ３はそれぞれシロイヌナズナ遺伝子フリジダ（Frigida）内のエクソン１，エクソン２及びエクソン３を意味する。数字５５、３６８及び４７４はそれぞれエクソン１，エクソン２及びエクソン３内のコード化変異アミノ酸の位置を意味する。各エクソンによりアミノ酸位５５、３６８及び４７４で含まれるコード化アミノ酸変異体は従来の三文字表記で示される。ＣＹＲｘＪＥＡ  Ｆ１ハイブリッドで産生のハイブリッド一次ペプチド構造は、上記実験法により確証した生化学的経路を参考にして予測される。
【００４３】
更に以下に説明するように一旦上記現象を当業者が認識し高く評価すると、多数の病状が治療でき、植物／動物が改良出来ることが容易に理解される。
【００４４】
以下の説明では組み替えＤＮＡ技術で用いる多数の用語を利用する。別に定義しない限りここで用いる全ての科学技術用語は本発明が属する当事者が通常理解する意味を有する。以下の文献では本発明で用いる用語の多数の一般的定義が技術者に提供される。シングルトン等（Singleton, et al.）、“微生物学と分子生物学辞書（Dictionary of Microbiology and Molecular Biology）”、（２版、１９９４年）；“ケンブリッジ科学技術辞書（The Cambridge Dictionary of Science and Technology）”、ウオーカー編（Walker, ed.）、１９８８年）；“遺伝学用語集（The Glossary of Genetics）”、５版、リーガー、アール等編（Rieger, R., et al.）、スプリンガー出版（Springer Verlag）、（１９９１年）；及びへール（Hale）、マーハム（Marham）、“ハーパーコリンズ生物学辞書（The Harper Collins Dictionary of Biology）”、１９９１年。通常ここに記載の植物及び動物の維持管理と繁殖と同様に組み替えＤＮＡ技術での命名法と実験室手法は、技術的に周知で一般的に使用するものである。
【００４５】
（定義）
“ポリヌクレオチド”、“ポリヌクレオチド配列”、“核酸配列”及び“核酸断片”／“単離核酸断片”と言う用語はここでは互換可能に用いる。これらの用語はヌクレオチド配列と類似体を包含する。ポリヌクレオチドは一本鎖又は二本鎖で、随意に合成ヌクレオチド塩基、非天然ヌクレオチド塩基又は変質ヌクレオチド塩基含有のＲＮＡ又はＤＮＡポリマーでも良い。ＤＮＡポリマー型のポリヌクレオチドは、相補ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ又はそれらの混合物の一つ以上のセグメントがなっても良い。
【００４６】
ＲＮＡはｍＲＮＡでも良い。“ｍＲＮＡ”又は“伝令ＲＮＡ”はＤＮＡを転写し、鋳型として働きタンパク質のアミノ酸配列をコード化する一本鎖ＲＮＡ分子である。
【００４７】
“単離”ポリヌクレオチドと言う用語は、限定はしないが通常自然存在環境で見られるような単離ポリヌクレオチドを伴うか、又は相互作用する他染色体と染色体外ＤＮＡとＲＮＡのような他の核酸配列が実質的に存在しないポリヌクレオチドを意味する。単離ポリヌクレオチドは天然に存在する宿主細胞から精製出来る。当業者には周知の在来の核酸精製法を用いて単離ポリヌクレオチドが得られる。この用語は又組み替えポリヌクレオチドと化学的合成ポリヌクレオチドも包含する。
【００４８】
“組み替え”と言う用語は、例えば二つの別に分離した配列断片の人工的連結、例えば化学合成又は遺伝子工学技術による単離核酸の操作により核酸配列が作成されることを意味する。
【００４９】
ここで用いる“実質的に類似の”とは、一つ以上のヌクレオチド塩基の変化がコード化アミノ酸に変化をもたらさないか、又は一つ以上のアミノ酸の置換がヌクレオチド配列によるコード化ポリペプチドの機能性に影響しない核酸分子を意味する。
【００５０】
実質的に類似の核酸分子は又ハイブリッド形成能により特徴づけられる。この相同性の評価は、当業者が良く理解しているように、厳密な条件下でＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド形成のいずれかにより与えられる（ハメス（Hames）、ヒギンス（Higgins）編、（１９８５年）、核酸ハイブリッド形成（Nucleic Acid Hybridization）、アイアールエル出版（IRL Press）、オックスフォード（Oxford）、英国（U.K.））。ハイブリッド形成後、洗浄により厳密条件が決定される。一組の好ましい条件は、室温で１５分間、６ｘ ＳＳＣ、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で始まり、次いで４５℃で３０分間、２ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで間繰り返し、次いで５０℃で３０分間、０．２ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで二回繰り返す一連の洗浄を用いる。より好ましい厳密な条件の組み合わせでは、洗浄が最後の０．２ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳによる二回の３０分間洗浄温度を６０℃に上昇する以外は上記と同じのより高い温度を使用する。他の非常に厳密な条件の組み合わせでは、最後の０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる二回洗浄に６５℃を用いる。
【００５１】
“合成遺伝子”又は“合成核酸断片”は、当業者に周知の手法を用いて化学的合成のオリゴヌクレオチドから構築できる。これらの構成要素は結紮徐冷してより大きな核酸分子を形成し、次いで酵素により組み立てて所望の全核酸分子を構築する。核酸断片に関連する“化学的合成の”とは、その成分ヌクレオチドをインビトロで組み立てることを意味する。核酸断片の手作業による化学合成は良く確立された手法を用いて得るか、又は自動的化学合成が多数の市販機械を用いて実行できる。それ故その核酸断片は宿主細胞のコドンバイアスを反映するヌクレオチド配列最適化に基づく最適遺伝子に調整できる。当業者には使用コドンが宿主が好むコドンにバイアスした場合には、遺伝子発現の成功に有利なことが十分理解される。好ましいコドンは配列情報が利用できる宿主細胞由来遺伝子の調査に基づいて決定できる。
【００５２】
“候補遺伝子の対立遺伝子”とは、候補遺伝子配列の正常対立遺伝子と同様に、個体に雑種強勢又は雑種衰弱を発生しやすくする変異体を保有する対立遺伝子を意味する。それ故ここで用いる“候補遺伝子配列”及び“候補遺伝子の対立遺伝子”と言う用語は、遺伝子配列、対立遺伝子又は領域を含むＤＮＡ、更にはこの遺伝子配列、対立遺伝子又は領域を含む一本鎖ＤＮＡのいずれか（即ちコード鎖及び非コード鎖のいずれか）を意味する。
【００５３】
“候補遺伝子”又は“遺伝子”とは、雑種強勢又は雑種衰弱産生の可能性を有するコード配列前の制御配列（５’非コード配列）、その間の制御配列と、それに続く制御配列（３’非コード配列）を含む特定タンパク質を発現するｍＲＮＡ断片のような核酸断片を意味する。“ネイティブ遺伝子”とは自身の制御配列を有する自然に見られる遺伝子を意味する。“キメラ遺伝子”又は“外来遺伝子”はここでは互換可能に用い、ネイティブ遺伝子ではなく、制御配列とコード配列が天然で一緒には見られない任意の遺伝子を意味する。それ故キメラ遺伝子又は外来遺伝子は、異なる起源由来の制御配列とコード配列を含むか、又は同じ起源由来だが天然に見られるものとは異なる形の配列の制御配列とコード配列でも良い。“内在遺伝子”とは生物ゲノムの自然位置にあるネイティブ遺伝子を意味する。“異質な遺伝子”とは宿主生物には通常見られないが、遺伝子移入による宿主生物へ導入される遺伝子を意味する。異質な遺伝子は非ネイティブ生物に挿入のネイティブ遺伝子、又はキメラ遺伝子を意味する。“導入遺伝子”は形質転換法でゲノムに導入された遺伝子である。
【００５４】
“コード配列”は特異的アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を意味する。“アミノ酸配列の相同性”又は“アイデンティティ”と言う用語は、類似アミノ酸配列を有するタンパク質を意味する。技術者は重要なアミノ酸配列がタンパク質の機能ドメイン内にあることを認識する。従って相同タンパク質がアミノ酸配列の長さに対し４０％以下の相同性を有するが、一つの機能ドメインでは９０％以上の相同性を有することができる。
【００５５】
アミノ酸はここではその通常周知の三文字表記又は国際純正応用化学連合−国際生化学連合生化学命名法委員会（IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission）推薦の一文字表記を意味する。
【００５６】
ヌクレオチドは同様にその通常容認されている一文字コードを意味する。
【００５７】
“保守的修飾変異体”はアミノ酸配列と核酸配列両者に適用される。特定の核酸配列に関する保守的修飾変異体は、同一又は実質的に同一のアミノ酸配列をコード化した核酸、又はその核酸がアミノ酸をコード化していない場合には実質的に同一の配列を意味する。
【００５８】
遺伝暗号縮重のために多数の機能的に同一な核酸が任意の所定アミノ酸をコード化する。例えばコドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵ全てがアミノ酸アラニンをコード化する。従ってアラニンはコドンが指定する位置の全てで、コード化ポリペプチドを変更することなしにコドンは記載の対応コドンのいずれかに変更できる。この核酸変異体は“サイレント変異体”であり、保守的修飾変異体の一種である。ここでポリペプチドコード化核酸配列の全ては、又核酸の可能なサイレント変異体の全てを記述する。技術者は核酸の各コドン（通常メチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ以外）は、修飾して機能的に同一分子を産生できる。それ故ポリペプチドコード化核酸の各サイレント変異体が各記載配列で暗示される。
【００５９】
アミノ酸配列に関して技術者は“保守的修飾変異体”が化学的類似アミノ酸によるアミノ酸置換で生ずるコード配列への変化で生じことが分かる。機能的に類似なアミノ酸を与える同類置換表は技術的に周知である。
【００６０】
以下の六つのグループはそれぞれ互いに同類置換のアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）及び
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
（例えばクレイトン（Creighton）、タンパク質（Proteins）、（１９８４年）参照）。
【００６１】
“非保守的修飾変異体”と言う用語は同類置換を含まないアミノ酸変異を意味する。例えばフェニルアラニンのアラニン置換は非保守的終章変異体を構成するであろう。
【００６２】
“制御配列”とはコード配列上流（５’非コード配列）、コード配列内、又はコード配列下流（３’非コード配列）に位置し、関連コード配列の転写、ＲＮＡプロセシング又はＲＮＡ安定性、又は翻訳に影響するヌクレオチド配列を意味する。制御配列はプロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列及びスプライス部位選択に影響する配列を含んでも良い。
【００６３】
“プロモーター”とはコード配列又は機能性ＲＮＡ発現を制御できるヌクレオチド配列を意味する。通常コード配列はプロモーター配列の３’位に位置する。プロモーター配列は近位エレメントとより遠位な上流エレメントを含み、後者エレメントはしばしばエンハンサーエレメントと呼ばれる。それ故“エンハンサー”はプロモーター活性を刺激するヌクレオチド配列であり、且つプロモーターの先天性エレメントか又はプロモーターレベル又はプロモーターの組織特異性を増強するために挿入の異種エレメントでも良い。プロモーターはその全体がネイティブ遺伝子由来でも良く、自然に見られる異なるプロモーター由来の異なるエレメントからなっても良く、合成ヌクレオチドセグメントでさえも含められる。異なるプロモーターが、異なる組織又は細胞型、異なる発生段階、又は異なる環境条件に応えて遺伝子発現を命令することは当業者には理解される。核酸断片を最も多くの細胞型で最も多くの時に発現させるプロモーターは、通常“構成プロモーター”と呼ばれる。
【００６４】
“翻訳リーダー配列”とは、遺伝子のプロモーター配列とコード配列間に位置するヌクレオチド配列を意味する。翻訳リーダー配列は翻訳開始配列上流の完全処理ｍＲＮＡに存在する。翻訳リーダー配列はｍＲＮＡへの一次転写物のプロセシング、ｍＲＮＡ安定性又は翻訳効率に影響する。翻訳リーダー配列の例としては、ターナー（Turner）、フォスター（Foster）、（１９９５年）、モレキュラーバイオテクノロジー（Mol. Biotechnol.）、３巻、ｐ．２２５−２３６に記載されている。“３’非コード配列”とはコード配列下流に位置するヌクレオチド配列を意味し、ポリアデニル化認識配列とｍＲＮＡプロセシング又は遺伝子発現に影響できる制御シグナルをコード化する他配列を含む。ポリアデニル化シグナルは通常ポリアデニル酸路のｍＲＮＡ前駆体の３’末端への付加に影響する特徴を持つ。異なる３’非コード配列の使用はインゲルブレヒト等（Ingelbrecht et al.）、（１９８９年）、プラントセル（Plant Cell）、１巻、ｐ．６７１−６８０により例示された。
【００６５】
“ＲＮＡ転写物”とはＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ触媒転写で生ずる産生物を意味する。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全相補コピーの場合には、それはその一次転写物を意味するか、又は一次転写物の転写後プロセシング由来のＲＮＡ配列の場合には、成熟ＲＮＡと呼ばれる。“伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）”とはイントロがなく、細胞によりポリペプチドに翻訳できるＲＮＡを意味する。“相補ＤＮＡ”とはｍＲＮＡ鋳型に相補で且つｍＲＮＡ鋳型に由来するＤＮＡを意味する。相補ＤＮＡは一本鎖型でも、例えばＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ（Klenow）断片を用いて二本鎖型に変換出来る。“センスＲＮＡ”とはｍＲＮＡ含有のＲＮＡ転写物を意味し、それ故細胞によりポリペプチドに翻訳できる。“機能性ＲＮＡ”とはセンスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、又は翻訳はされないが細胞プロセスに影響する他のＲＮＡを意味する。
【００６６】
“操作可能に連結する”と言う用語は、単一ポリヌクレオチドの二つ以上の核酸の一つの機能が他により影響されるように、二つ以上の核酸の連結を意味する。例えばプロモーターはコード配列の発現に影響できる場合には、プロモーターはコード配列と操作可能に連結する（即ちコード配列がプロモーターの転写制御を受けている）。コード配列はセンス配向又はアンチセンス配向で制御配列と操作可能に連結する。
【００６７】
ここでも用いる“発現”と言う用語は、該発明の核酸断片由来センス（ｍＲＮＡ）の転写と安定な蓄積を意味する。発現は又ポリヌクレオチドへのｍＲＮＡ翻訳を意味する。
【００６８】
“タンパク質”又は“ポリペプチド”は、ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドコード配列が決定した特異的順序に配列のアミノ酸鎖である。各タンパク質又はポリペプチドは独自の機能を有する。
【００６９】
“変化レベル”又は“変化発現”とは、形質転換体での正常生物又は非形質転換生物とは異なる量又は割合の一つ又は複数の遺伝子産物の産生を意味する。
【００７０】
“成熟タンパク質”又は“成熟”と言う用語をタンパク質記述に用いた場合には、翻訳後プロセシングポリペプチド、即ち一次翻訳産物に存在する任意のプリペプチド又はプロペプチドが除去されたポリペプチドを意味する。“前駆体タンパク質”又は“前駆体”と言う用語がタンパク質記述に用いた場合には、ｍＲＮＡ翻訳の一次産物、即ちプリペプチド又はプロペプチドがなお存在する一次産物を意味する。プリペプチドとプロペプチドは細胞内移行シグナルでも良いが、限定はされない。
【００７１】
“形質転換”とは宿主生物ゲノムへの核酸断片を転移し、遺伝学的に安定な遺伝を意味する。形質転換した核酸断片含有宿主生物は、“形質転換”体と呼ばれる。植物形質転換法の例としては、アグロバクテリウム仲介形質転換（ドゥブラレ等（De Blaere et al.）、（１９８７年）、メソッドオブエンザイモモロジー（Meth. Enzymol.）、１４３巻，ｐ．２７７）、相同的組み替え及び粒子加速又は“遺伝子銃”形質転換技術（ここに文献として組み入れたクライン等（Klein et al.）、（１９８７年）、ネーチャー（ロンドン）（Nature (London)）、３２７巻、ｐ．７０−７３；米国特許第４９４５０５０号）が挙げられる。従って本発明の単離ポリヌクレオチドは宿主細胞に導入複製可能な組み替えコンストラクト、通常ＤＮＡコンストラクトに組み入れることができる。このコンストラクトは一つの複製システムと、所定宿主細胞でポリペプチドコード化配列の転写翻訳が可能な配列を含むベクターであり得る。植物細胞の安定な形質移入、又は形質転換植物の確立に適した多数のベクターは、例えばポウエル等（Pouwels et al.）、ベクターのクローニング：ラボラトリマニュアル（Cloning Vectors: A Laboratory Manual）、１９８５年、補刊、ｐ．１９８７；ワイスバッハ（Weissbach）、ワイスバッハ（Weissbach）、植物分子生物学の方法（Methods for Plant Molecular Biology）、アカデミックプレス（Academic Press）、１９８９年；及びフレビン等（Flevin et al.）、植物分子生物学マニュアル（Plant Molecular Biology Manual）、クルーワーアカデミック出版社（Kluwer Academic Publishers）、１９９０年に記載されている。通常植物発現ベクターとしては、例えば５’制御配列と３’制御配列の転写制御下での一つ以上のクローン植物遺伝子と支配的な選択可能マーカーが挙げられる。この植物発現ベクターとしては、又プロモーター調節領域（例えば誘導性又は構成的発現、環境的又は発生制御的発現、又は細胞特異的又は組織特異的発現）、転写開始部位、リボソーム結合部位、ＲＮＡプロセシングシグナル、転写終結部位及び／又はポリアデニル化シグナルが挙げられる。
【００７２】
“ＰＣＲ”又は“ポリメラーゼ連鎖反応”は、特異的ＤＮＡセグメント増幅に用いる技術として当業者には周知である（米国特許第４６８３１９５号及び米国特許第４８００１５９号）。
【００７３】
“子孫”と言う用語は、一つの特定親植物又は一組の親植物由来の種及びそれからの植物を含む任意の後続世代を意味する。
【００７４】
“再生”は植物細胞（例えば植物プロトプラスト又は外植体）からの植物成長工程である。
【００７５】
“選択ＤＮＡ”は宿主ゲノムに導入したＤＮＡセグメントである。好ましい選択ＤＮＡとしては、一つ以上の外来遺伝子と宿主細胞で外来遺伝子を発現するエレメント、例えば一つのプロモーターと一つのターミネーターが挙げられる。選択ＤＮＡを有する一つ以上のエンハンサー含有により利益が実現できる。
【００７６】
“形質転換細胞”は細胞への外来ＤＮＡ分子導入によりＤＮＡが変化した細胞である。
【００７７】
“形質転換植物”は、植物ＤＮＡが同一系統のネイティブの非形質転換植物には始めに存在しなかった導入外来ＤＮＡ分子を含有する形質転換植物細胞又はプロトプラストの植物、又はそれから誘導の任意の後続世代の子孫である。形質転換植物は更に形質転換された植物に生来のものであるが、元の又は野生型遺伝子産物の構造、又はその遺伝子の発現レベル又はパターンを変えるために“外来”遺伝子が遺伝子技術手段により変化した配列を含んでも良い。
【００７８】
“ベクター”は宿主細胞で複製でき、及び／又は他のＤＮＡセグメントが付着セグメントの複製が起こるように操作可能に連結できるＤＮＡ分子である。プラスミドは典型的ベクター又は新規遺伝子を細胞に運ぶのに用いるＤＮＡ分子である。プラスミドはＤＮＡの独立の安定な自己複製断片の典型的ベクターである。
【００７９】
ここで用いた“遺伝子型”と言う用語は、各細胞、細胞培養液、植物又は動物の遺伝構成である。
【００８０】
ここで用いた“ヘテロ接合体”と言う用語は、少なくとも一つの座位に異なる対立遺伝子（所定遺伝子形態）を有する二倍体又は倍数体の各細胞、植物又は動物を意味する。
【００８１】
ここで用いた“ヘテロ接合性の”と言う用語は、特定の遺伝子座位に異なる対立遺伝子（所定遺伝子形態）の存在を意味する。
【００８２】
ここで用いる“ホモ接合体”と言う用語は、一つ以上の座位に同一対立遺伝子を有する各細胞又は植物を意味する。
【００８３】
ここで用いた“ホモ接合性の”と言う用語は、相同染色体セグメントの一つ以上の座位に同一対立遺伝子の存在を意味する。
【００８４】
該明細書全体を通して“含む”及び“含んでいる”及び“含む（単数での使用）”のようなこの単語の変形は“制限なしに含む”を意味し、他の添加物類、成分類、整数類又は手段類を除外する意図はない。“からなる”とは、制限なしでこの成句“からなる”に続くものは何でも含むことを意味する。従って“からなる”と言う成句は列挙要素が必要又は必須であり、他の要素は存在しないことを指示する。“本質的にからなる”とは、成句に続いて任意の列挙要素と、列挙要素の開示で指定した活動又は行動を妨害しないか、又は寄与しない他要素に限定する要素を含むことを意味する。従って“本質的にからなる”と言う成句は列挙要素が必要又は必須であるが、他要素は随意ではなく、且つ列挙要素の活動又は行動に影響するかしないかにより他要素が存在するかしないことを指示する。
【００８５】
実験プロトコル
本発明の最も広範囲な様態の一つで、雑種強勢又は雑種衰弱をもたらす因子類の同定法を提供する。ここで用いた“因子類”と言う用語は、ここで定義する直接又は間接的に雑種強勢又は雑種衰弱をもたらす候補遺伝子の対立遺伝子による複数種のコード化ｍＲＮＡ又はタンパク質の存在を意味する。この因子類は一つ以上種のｍＲＮＡ又はタンパク質が直接存在する結果でも良い。代わりに因子類は複数種のｍＲＮＡ又はタンパク質が間接的に存在する結果でも良い。
【００８６】
他の場所で検討するように該発明者は雑種強勢又は雑種衰弱が一つ以上種の“バイブリッド”ｍＲＮＡ又はタンパク質の存在で生じると考える。これらのハイブリッドｍＲＮＡ種又はハイブリッドタンパク質種は標準法を用いて同定できる。例えば異なるｍＲＮＡ種がＳＳＣＰ（一本鎖高次構造多型分析法）又はＤＨＰＬＣ（変性剤高速液体クロマトグラフィ法）のような技法を用いて同定できる。例えば米国特許第５７９５９７６号及び米国特許第６４５３２４４号参照。
【００８７】
多種のタンパク質の存在は等電点電気泳動法でも同定できるであろう。各ｍＲＮＡのそれぞれをクローンし、標準的配列決定法を用いて配列決定出来るであろう。各タンパク質も又配列決定出来るであろう。これらの方法全ては標準的技術を用いるであろう。
【００８８】
一旦多種のｍＲＮＡ又はタンパク質が動物又は植物に存在することが同定されると、ハイブリッドｍＲＮＡ及び／又はハイブリッドタンパク質に関与する候補遺伝子を同定出来るであろう。
【００８９】
以前に定義したように“候補遺伝子”と言う用語は、雑種強勢又は雑種衰弱産生の可能性を有するｍＲＮＡ断片のような核酸断片を意味する。ここで用いた“雑種強勢”又は“ヘテロシス”と言う用語は互換可能であり、純血種の性能を超えるハイブリッドの性能、最も顕著には成長速度、繁殖性及び耐病性のような形質での増加を意味する。特に候補遺伝子は、一つの動物又は植物でヘテロ接合で且つ機能性であり、雑種強勢をもたらす遺伝子である。一実施形態では各遺伝子の対立遺伝子は、変異体がアミノ酸配列変異体をもたらすコード配列の異なるエクソンにヌクレオチド配列変異体を含む。例えば植物又は動物が遺伝子Ｘの二つの対立遺伝子、即ち遺伝子Ｘのヘテロ接合体を含む場合には、本発明の候補遺伝子としての第一必要条件を満たす。第二の基準は変異が任意の発現タンパク質にアミノ酸配列変異体をもたらすヌクレオチド配列での配列変異であろう。第三の基準は各対立遺伝子が、配列変異が各対立遺伝子の同一位置に見られない配列変異体を含むことであろう。例えば上記遺伝子Ｘで各対立遺伝子は、対立遺伝子１では変異は１位であるが、対立遺伝子２では変異は２０位である配列変異体を含む。変異がアミノ酸配列の変化をもたらす場合には、これは第二基準と第三基準を満たすであろう。第四の基準は変異が単に同一エクソンの異なる位置であるよりむしろ異なるエクソンで現れる変異体であろう。
【００９０】
一実施形態では候補遺伝子は、変異が異なる対立遺伝子の異なるエクソンに見られるアミノ酸変異体をコードする一つ以上のヌクレオチド配列変異体を有するであろう。
【００９１】
候補遺伝子は好ましくは少なくとも三種のｍＲＮＡを産生するであろう。それらは一つの対立遺伝子と同一の一つのｍＲＮＡ分子、第二対立遺伝子のコード配列と同一のｍＲＮＡ分子、及び両対立遺伝子のエクソンの組み合せ含むハイブリッドｍＲＮＡ分子である。明らかにエクソンの数により異種のハイブリッドｍＲＮＡ分子の数は非常に多いであろう。
【００９２】
候補遺伝子同定法は比較的簡単である。これらは常法の配列解析又は候補遺伝子のＰＣＲ増幅配列のサザンブロット解析により同定出来るであろう（例えばギーセルマン等（Gieselmann et al.）、（１９８９年）、プロシーディングオブナショナルアカデミーオブサイエンス、ユーエスエイ（Proc. Natl. Acad. Sci.）、８６巻、ｐ．９４３６−９４４０参照）。均一管及び／又は閉管で増幅の検出は技術的に多くの手段用いて、例えばＰＣＲ反応でのタクマン（登録商標）（TaqMan）ハイブリッド形成プローブと、一旦十分に増幅が起こると標的核酸に特異的な蛍光測定を用いて実施出来ることは当事者には良く理解できる。しかしロッシュライトサイクラー（登録商標）（Roche Lightcycler）の性質と速度から、好ましい方法はリアルタイムＰＣＲで蛍光標識ハイブリッド形成オリゴヌクレオチドを用いてロッシュリライトサイクラー（登録商標）（Roch Lightcyler）で融解曲線解析を用いることによる。
【００９３】
タクマン（登録商標）（Taqman）法の基づくもの（米国特許第５５３８８４８号及び米国特許第５６９１１４６号）、蛍光偏光測定法（例えばギブソン等（Gibson et al.）、クリニカルケミストリー（Clin. Chem.）、１９９７年、４３巻，ｐ．１３３６−１３４１）及びインベーダー（Invader）アッセイ（例えばアガラワル、ピー等（Agarwal P. et al、）ダイアグノスティックモレキュラーパソロジー（Diagn. Mol. Pathol.）、２０００年９月，９巻（３号）、ｐ．１５８−１６４；ライアン、ディ等（Ryan, D. et al.）、モレキュラーダイアグノシス（Mol. Diagn.）、１９９９年６月、４巻（２号）、ｐ．１３５−１４４）のような類似の他の定量的“リアルタイム”で均一な核酸増幅／検出システムが当業者には知られている。これらのシステムは又記載の該発明での使用に適用でき、適切にデザインされると遺伝子の突然変異と多型検出での核酸増幅と対立遺伝子識別をリアルタイムで監視できる。
【００９４】
一旦候補遺伝子を同定すると、次いで該発明の他様態に使用するために単離又は合成的に産生できる。例えば雑種強勢産生の疑いのある候補遺伝子が、宿主細胞（植物又は動物）に形質転換し、形質転換植物又は形質転換動物が再生できるであろう。
【００９５】
形質転換動物産生法は、通常（１）細胞核ゲノムへの特異的ＤＮＡ配列挿入に利用できる適切ＤＮＡコンストラクトを組み立て、（２）細胞にそのＤＮＡコンストラクトを形質移入し、（３）無作為挿入及び／又は相同組み替えを起こさせる段階を含む。このプロセスで生ずる修飾は、標的ゲノムへの一つ又は複数の適切なＤＮＡコンストラクトの挿入、標的ゲノムからのＤＮＡ削除、及び／又は標的ゲノムの突然変異である。
【００９６】
ＤＮＡコンストラクトは興味の遺伝子で、例えば異なるエクソンが異なる配列と同様に、制御プロモーター、インスレーター、エンハンサー及びレプレッサーを含む種々のエレメント、更にはＤＮＡコンストラクトの転写ＲＮＡとのリボソーム結合でのエレメントを含む異なる対立遺伝子で採取のエクソンを含む合成遺伝子を含むことができる。これらの例は当業者には周知であり、制限を意味するものではない。
【００９７】
データベースと商業部門で容易に利用可能な制御エレメントと遺伝子に関するＤＮＡ配列と併せて利用可能な有用な組み替えＤＮＡ技術により、技術の通常技術者はここに記載の材料と方法を用いて形質転換動物細胞構築に適切なＤＮＡコンストラクトを容易に産生できる。
【００９８】
例えば候補遺伝子に関する全ヌクレオチドコード配列が、例えばＤＮＡ配列決定解析又は制限酵素解析による決定で単一相補ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又は他のＤＮＡで得られない場合には、適切なＤＮＡ断片（例えば制限酵素断片又はＰＣＲ増幅産物）を幾つかのＤＮＡから回収し、互いに共有結合で接合して全コード配列を組み立てても良い。ＤＮＡ断片の共有結合による好ましい接合法は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼのようなＤＮＡリガーゼ酵素を用いる結紮による。次いで単離候補遺伝子をプラスミド又は発現ベクターに組み入れ得る。
【００９９】
動物細胞への形質移入技術は技術の通常技術者には周知であり、動物細胞へのＤＮＡコンストラクトの形質移入を実施する材料と方法は市販されている。動物細胞へのＤＮＡコンストラクトの形質移入に通常用いる材料は、例えばリポフェクチン（ＴＭ）（Lipofectin）のように脂肪親和性化合物である。特定の脂肪親和性化合物を誘導して細胞へのＤＮＡコンストラクトの形質移入を仲介するリポソームが形成できる。
【０１００】
ＤＮＡコンストラクトの標的配列は合理的なＤＮＡコンストラクトデザインにより核ゲノムの特異的領域に挿入できる。これらのデザイン技術は当業者には周知である。例えばここに全て文献として組み入れた米国特許第５６３３０６７号、米国特許第５６１２２０５号及び国際公開ＷＯ９３／２２４３２号参照。一旦所望ＤＮＡ配列が核ゲノムに挿入されると、挿入領域の場所と同様に所望ＤＮＡ配列が核ゲノムに挿入される頻度は当業者に周知の方法で同定できる。
【０１０１】
一旦導入遺伝子がドナー細胞の核ゲノムに挿入されると、その細胞は該発明の他のドナー細胞のように核移植法の核ドナーとして使用できる。卵母細胞への細胞核移植法は好ましくは再構成細胞が形成出来る細胞融合を含む。
【０１０２】
融合は通常接触／融合面に直流（ＤＣ）電気パルスを印加して誘発するが、追加の交流（ＡＣ）電流を用いてドナー細胞とレシピエント細胞の整列化を助けても良い。電気融合により原形質膜の一過的破壊を起すが、その膜の迅速な再編成に十分短い電気パルスを生ずる。従って二つの隣接膜の破壊が誘発され再編成で脂質二重層が混ざると、その二つの細胞間に小さいチャネルが開く。この小さい開口部の熱力学的不安定性により、二つの細胞が一つになるまで開口部は拡大する。この過程の更なる検討に関する文献としては、プラサー等（Prather et al.）の米国特許第４９９７３８４号がある（ここに全体を文献として取り入れている）。種々の電気融合培地、例えばショ糖、マンニトール、ソルビトール及びリン酸緩衝液を含む培地が使用できる。
【０１０３】
又融合は膜融合剤としてセンダイウイルスを用いても達成できる（グラハム（Graham））、ウイスターインスチチュートシンポジウムモノグラフ（Wister Inst. Symp. Monogr.、９巻、ｐ．１９、１９６９年）。融合は又ポリエチレングリコールのような融合促進試薬への細胞暴露によっても誘発できる。
【０１０４】
好ましくはドナー動物細胞と卵母細胞を５００μｍ融合チャンバーに入れ、２６℃−２７℃の融合培地（０．３Ｍマンニトール、０．１ｍＭ硫酸マグネシウム、０．０５ｍＭ塩化カルシウム）４ｍｌでカバーする。次いで７０−１００Ｖの直流重畳直流（ＤＣ）電気パルスを約１５μｓ、約１秒間隔で印加して電気融合する。次いで融合後生成した融合再編成細胞を活性化されるまで適切な培地、例えば組織培養培地（ＴＣＭ）−１９９培地に入れる。
【０１０５】
細胞融合の好ましい方法ではドナー動物細胞を先ず除核卵母細胞に付着する。例えば動物細胞を除核卵母細胞に付着し、この動物細胞と除核卵母細胞膜が融合できる化合物を選ぶ。この化合物としては細胞を凝集出来る任意の化合物である。その化合物は炭水化物と結合又は凝集出来るタンパク質又は糖タンパク質でも良い。より好ましい化合物はレクチンである。このレクチンとしてはコンカナバリンＡ、カナバリンＡ、リシン、大豆レクチン、ハスの種レクチン及び植物性血球凝集素（ＰＨＡ）を含む一群から選んでも良い。好ましくはその化合物はＰＨＡである。
【０１０６】
好ましい一実施形態では、上に記載の電気融合法は又追加の融合段階を含むか、又は上に記載の融合段階が一つのドナー動物細胞と二つ以上の除核卵母細胞を含む。二重融合法は再編成細胞の細胞質体積増加に有効な効果を有する。
【０１０７】
再編成動物細胞は通常核ドナーとレシピエント卵母細胞の融合前、融合間及び融合後に電気法及び／又は非電気法により活性化される（例えばサスコーパリッシュ等（Susko-Parrish, et al.）、米国特許第５４９６７２０号参照）。活性化法としては以下が挙げられる。
１）電気パルス；
２）化学誘導ショック；
３）精子の侵入；
４）卵母細胞原形質への二価カチオン、例えばマグネシウム、ストロンチウム、バリウム又はカルシウムの、例えばイオン透過孔型で導入による卵母細胞中の二価カチオンレベルの増加。二価カチオンレベル増加の他法としては、電気ショック、エタノール処理及びかご入りキレート化剤の使用が挙げられ、且つ
５）周知の方法、例えばキナーゼ阻害剤、例えば６−ジメチルアミノプリン、スタウロスポリン、２−アミノプリン及びスイフィンゴシンのようなセリン−スレオニンキナーゼ阻害剤の添加による卵母細胞中の細胞タンパク質のリン酸化の減少。代わりに細胞タンパク質のリン酸化は卵母細胞へのホスファターゼ、例えばホスファターゼ２Ａ及びホスファターゼ２Ｂの導入により阻害しても良い。
【０１０８】
活性化再編成動物細胞又は胚は通常技術の通常技術者には周知の培地で培養され、制限なしでＴＣＭ−１９９プラス１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ），タイロード−アルブミン−乳酸−ピルビン酸（ＴＡＬＰ）、ハムＦ−１０プラス１０％ＦＣＳ、合成卵管液（“ＳＯＦ”）、Ｂ２、ＣＲ１aa、中カリウムシンプレックス培地及び高カリウムシンプレックス培地（“ＫＳＯＭ”）が挙げられる。
【０１０９】
再編成細胞は又周知の方法で活性化しても良い。この方法としては、例えば実質的にこの再編成細胞に冷ショック又は実際に低温ショックを加える。再編成細胞の生理温度以下温度での培養が挙げられる。これを最も便利に行うには、再編成動物細胞を胚が通常暴露される生理温度条件に比べ冷たい室温で培養する。適切な卵母細胞活性化法は、ここに全体を文献として組み入れたサスコ−パリッシュ等（Susko-Parrish et al.）の米国特許第５４９６７２０号の主題である。
【０１１０】
次いで活性化再編成動物細胞を細胞類及び細胞群体類産生まで適切なインビトロ培地で培養できる。動物胚の培養成熟に適する培地は技術的に周知である。ウシ胚の培養維持に用いられる培地としては、ハムＦ−１０プラス１０％ＦＣＳ、ＴＣＭ−１９９プラス１０％ＦＣＳ，タイロード−アルブミン−乳酸−ピルビン酸（ＴＡＬＰ）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、イーグル−ウィッテン培地が挙げられる。卵母細胞の回収成熟に使用される最も普通の培地の一つは、ＴＣＭ−１９９と、ウシ胎仔血清、新生仔血清、発情期乳牛血清、子羊血清又は去勢ウシ血清を含む１−２０％血清サプリメントである。好ましい維持培地としては、アール塩を有するＴＣＭ−１９９、１０％ＦＣＳ、０．２ｍＭピルビン酸ナトリウム及び５０μｇ／ｍｌの硫酸ゲンタマイシンが挙げられる。又上記のいずれも顆粒膜細胞、卵管細胞、ラット肝由来（ＢＲＬ）細胞及び子宮細胞、及びマウス胎仔線維芽細胞芽（ＳＴＯ）細胞のような種々の細胞型との共培養が挙げられる。
【０１１１】
この培養した再編成動物細胞又は胚は好ましくは後で洗浄後、適切培地、例えば好ましくは適切な周密支持細胞層含有の穴プレートに含まれる１０％ＦＣＳ含有ＴＣＭ−１９９培地に入れる。適切な支持細胞層としては、一例として線維芽細胞と上皮細胞、例えば有蹄動物由来の線維芽細胞と子宮上皮細胞、ニワトリ線維芽細胞、ネズミ（例えばマウス又はラット）線維芽細胞、ＳＴＯとＳＩ−ｍ２２０支持株細胞株及びＢＲＬ細胞が挙げられる。
【０１１２】
一実施形態では支持細胞はマウス胎仔線維芽細胞を含む。適切な線維芽細胞支持細胞層の調製は技術的に周知である。
【０１１３】
再編成動物細胞はその再編成細胞が雌レシピエントへの移植か、又は細胞又は細胞群体産生に使用できる細胞獲得に適する大きさに達するまで支持細胞層で培養する。好ましくはこれらの再編成細胞は少なくとも約２乃至４００個の細胞、より好ましくは約４乃至１２８個の細胞、最も好ましくは少なくとも約５０個の細胞まで培養する。培養は適切な条件下、即ち約３９℃、５％炭酸ガス下で、成長最適化のために培地を通常約２−５日毎、好ましくは約３日毎に変えて達成される。
【０１１４】
本発明の胚移植法とレシピエント動物管理法は、胚移植産業で用いる標準的方法である。同時移植は本発明が成功するのに重要で、即ち核移植胚が雌レシピエントの発情周期と同期する。この利点と如何にレシピエントを維持するかについては、シーデル、ジーイージュニアー（Siedel, G.E. Jr.）（“牛胚移植法の批判的総説（Critical review of embryo transfer procedures with cattle）”、エル、マストロイアンニ、ジュニアー（L. Mastroianni, Jr.）、ジェイディ、ビッガーズ（J.D. Biggers）編、インビトロの受精と胚発生（Fertilization and Embryonic Development in Vitro）、プレナムプレス（Plenum Press）、ニューヨーク（New York）、ニューヨーク州（N.Y.）、ｐ．３２３）により概説され、この内容はここに文献として取り入れる。
【０１１５】
簡潔には胚盤胞は同期化レシピエントの子宮に非外科的か外科的に移植できる。又当業者に周知の技術と培地を用いて他の培地も使用できる。一方法ではクローン胚を新鮮なＫＳＯＭで三回洗浄し、５％炭酸ガス、５％酸素及び９０％窒素下、３９℃で０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を有するＫＳＯＭ中で４日間培養し、次いで１％ＢＳＡを有するＫＳＯＭで更に３日間培養する。胚発生を技術的に既知の標準的方法で検査し格付けする。切断率を二日目に記録し、切断胚を更に７日間培養する。７日目に胚盤胞発生を記録し、胚及び／又は動物利用の可能性を待って一つ又は二つの胚を各同期化乳母の子宮に非外科的に移植する。
【０１１６】
乳母は好ましくは妊娠期間の４０日目、６０日目、９０日目及び１２０日目のように定期的に直腸触診又は超音波診断により妊娠を調べる。好ましくは妊娠期間の種々の段階での胚損失を評価するために、妊娠中綿密な所見と継続的超音波モニター（毎月）を行う。流産胎仔のいずれについて可能ならば、クローン状態と確認のためのＤＮＡ分類と同様に定常的病理学検査のために回収する。
【０１１７】
再編成動物細胞、活性化再編成動物細胞、この方法段階で産生される胎仔及び動物及びそれらから回収できる細胞、核及び他の細胞成分は又本発明実施形態であることを主張する。産生動物と言う用語が生存動物であることが特に好ましい。
【０１１８】
本発明は又例えば細胞、組織及び器官移植に使用できる胚類、胎仔類又は子孫産生に使用できる。胎仔細胞又は成人細胞を動物から採取しそれをクローニング法に用いて、種々の細胞類、組織類及び多分器官類がクローン胎仔が臓器形成により発生して得られる。細胞類、組織類及び器官類が同様にクローン子孫から単離出来る。このプロセスにより細胞治療と遺伝子治療を含む多くの医学療法と動物治療用の“材料類”供給源が提供される。細胞が誘導された動物にその細胞を移植し戻すと、免疫拒絶が防げる。又多くの細胞型がこれらクローンから単離出来るので、造血キメラ現象のような他の手順を用いて、同種と同様に種間の動物での免疫拒絶を避けられる。
【０１１９】
一実施形態では候補遺伝子は上に検討したように雑種強勢を産生できる植物遺伝子である。
【０１２０】
従来は雑種植物は一つの優良純系植物を一つ以上の他の遺伝学的に異なり多様な純系植物と交雑して偶発的な事象により産生する。交雑は一つの優良純系植物の花粉を採取し、他の優良純系植物に移植することからなる。二つの純系交雑による種は第一世代雑種であり、Ｆ１と呼ばれる。商業的に有益な純系類はその親のいずれよりもより良い収率、立木性及び他の重要特性を有する。
【０１２１】
本発明で一旦候補遺伝子が同定されると、候補遺伝子が単離又は合成されて発現ベクターにサブクローンイングするか、又はレシピエント植物に直接形質転換する。
【０１２２】
ＤＮＡセグメントの細胞への形質転換法は多くあるが、その全てが植物細胞のＤＮＡへの送達に適するわけではない。現発明で用いる適切法は、プロトプラストのＰＥＧ仲介形質転換（オミルレー等（Omirulleh, et al.）、１９９３年）によるようなＤＮＡの直接送達、メガヌクレアーゼ１−ＳｃｅＩ使用のようなメガヌクレアーゼ利用遺伝子組換え（http://www.cellectis.com参照）の使用、電気穿孔法（ここに全体を文献として具体的に組み入れた米国特許第５３８４２５３号）、炭化ケイ素繊維との攪拌（ここに全体を文献として具体的に組み入れたケップラー等（Kaeppler, et al.）、１９９０年、米国特許第５３０２５２３号及びここに全体を文献として具体的に組み入れた米国特許第５４６４７６５号）、アグロバクテリウム仲介形質転換（両者ともここに文献として具体的に組み入れた米国特許第５５９１６１６号及び米国特許第５５６３０５５号）及びＤＮＡ塗布粒子の加速（いずれもここに全体を文献として具体的に組み入れた米国特許第５５５０３１８号、米国特許第５５３８８７７号及び米国特許第５５３８８８０号）によるＤＮＡを細胞に導入できるいずれかの方法が事実上含まれると考えられる。これらの技術の適用により植物細胞は安定に形質転換でき、これらの細胞は形質転換植物に進化する。ある実施形態では加速法が好まれ、例えば微粒子銃法や類似法が挙げられる。
【０１２３】
電気穿孔法ではＤＮＡを導入したい場合には、クリジゼック等（Krzyzek et al.）の方法（ここに全体を文献として具体的に組み入れた米国特許第５３８４２５３号）が特に有益であると考えられる。この方法ではペクチン分解酵素のような特定細胞壁分解酵素を用いて、標的レシピエント細胞を未処理細胞に比べて電気穿孔により、より形質転換され易くする。代わりに機械的創傷により、より形質転換され易くする。
【０１２４】
電気穿孔により形質転換を達成するには、細胞又は胚形成カルスの懸濁培養液のような脆弱な組織を用いるか、代わりに未熟胚又は他の器質化組織を直接形質転換できる。この技法では選択細胞の細胞壁をペクチン分解酵素（ペクトリアーゼ）に暴露するか、又は制御した形で機械的に傷つけて部分的に分解するであろう。無傷細胞の電気穿孔により形質転換された幾つかの種の例としては、トウモロコシ（米国特許第５３８４２５３号；ドゥハルイン等（D'Halluin et al.）、１９９２年；ローデス等（Rhodes et al.）、１９９５年）、小麦（ゾー等（Zhou et al.）、１９９３年）、トマト（ホー（Hou）、リン（Lin）、１９９６年）、大豆（クリストー等（Christou et al.）、１９８７年）及びたばこ（リー等（Lee et al.）、１９８９年）が挙げられる。
【０１２５】
又植物類の電気穿孔形質転換にプロトプラストを用いても良い（ベーツ（Bates）、１９９４年；ラッゼリ（Lazzeri）、１９９５年）。例えば子葉由来プロトプラストの電気穿孔による遺伝子組換え大豆植物の産生が、ディール（Dhir）、ウイドホルム（Widhholm）の国際公開ＷＯ９２／１７５９８号（ここに具体的に文献として組み入れてある）に記載されている。プロトプラストの形質転換が記載されている種の他例としては、大麦（ラゼッリ（Lazzeri）、１９９５年）、サトウモロコシ（バットロウ等（Battraw et al.）、１９９１年）、トウモロコシ（バッタチャジー等（Bhattacharjee et al.）、１９９７年）、小麦（ヘー等（He et al.）、１９９４年）、トマト（ツカダ（Tsukada）、１９８９年）及び大豆（ディール（Dhir）、１９９２年）が挙げられる。
【０１２６】
該発明に基づく植物細胞への候補遺伝子ＤＮＡセグメントの形質転換送達に好ましい方法は、微粒子銃法である（いずれもここに全体を文献として具体的に組み入れた米国特許第５５５０３１８号、米国特許第５５３８８８０号、米国特許第５６１００４２号及び国際公開ＷＯ９４／０９６９９号）。本法では粒子を核酸で塗布し、推進力により細胞内に送達する。代表的粒子としてはタングステン、白金及び好ましくは金からなる粒子である。ある場合には微粒子銃法を用いるレシピエント細胞へのＤＮＡ送達に、金属粒子上への候補遺伝子ＤＮＡの沈降が必要でないようと考える。しかし粒子はＤＮＡで塗布されるよりむしろＤＮＡを含有すると考えられる。それ故ＤＮＡ塗布粒子は粒子衝突によりＤＮＡ送達レベルを増加できるが、それ自身は必要ではないことを提案する。
【０１２７】
加速による植物細胞へのＤＮＡ送達法の具体例は微粒子銃粒子送達系であり、これを用いてＤＮＡ又は細胞塗布粒子をステンレススチール篩い又はナイテックス（Nytex）篩いのような篩いを通して、懸濁培養植物細胞で覆ったフィルター表面上に推進できる。この篩いにより粒子が大きい凝集物でレシピアント細胞に送達されないように分散される。発射装置と衝撃を加える細胞間に介在する篩いにより発射粒子凝集物の大きさが減少し、大きすぎる発射粒子がレシピエント細胞に与える損傷の減少に寄与出来ると考えられる。
【０１２８】
微粒子銃法技術は広く利用でき、実質的にいずれの植物種の形質転換にも使用できる。微粒子銃法による形質転換された種の例としては、トウモロコシ（国際公開第ＷＯ９５／０６１２８号）、大麦（リタラ等（Ritala et al.）、１９９４年；ヘンスゲンス等（Hensgens et al.）、１９９３年）、小麦（ここに全体を文献として具体的に組み入れた米国特許第５５６３０５５号）、米（ヘンスゲンス等（Hensgens et al.）、１９９３年）、カラスムギ（トルベット等（Torbet et al.）、１９９５年；トルベット等（Torbet et al.）、１９９８年）、ライ麦（ヘンスゲンス等（Hensgens et al.）、１９９３年）、サトウキビ（バウワー等（Bower et al.）、１９９２年）及びサトウモロコシ（カサ等（Casa et al.）、１９９３年；ハギオ等（Hagio et al.）、１９９１年）のような単子葉植物種、更にはたばこ（トメス等（Tomes et al.）、１９９０年；ビュジング（Buising）、ベンバウ（Benbow）、１９９４年）、大豆（ここに全体を文献として具体的に組み込まれている米国特許第５３２２７８３号）、ひまわり（ニッテル等（Knittel et al.）、１９９４年）、ピーナッツ（シングシット等（Singsit et al.）、１９９７年）、綿（マッカベー（McCabe）、マーティネル（Martinell）、１９９３年）、トマト（バンエック等（VanEck et al.）、１９９５年）及び通常マメ科植物（ここに全体を文献として具体的に組み入れた米国特許第５５６３０５５号）を含む多数の双子葉植物が挙げられる。
【０１２９】
衝撃により懸濁細胞はフィルターか固体培地上に濃縮される。代わりに未熟胚又は他の標的細胞を固体培地上に配置しても良い。衝撃を加える細胞をマクロプロジェクタイル阻止プレート下の適当距離に配置する。必要ならば一つ以上のふるいを加速装置と衝突を加える細胞間に配置しても良い。
【０１３０】
アグロバクテリウム仲介転移は、ＤＮＡが全植物組織に導入でき、その結果プロトプラストからの無傷植物再生の必要性が回避できるので、植物細胞への遺伝子導入に広く利用できるシステムである。植物細胞へのＤＮＡ導入にベクターを組み込むアグロバクテリウム仲介植物の使用は技術的に周知である。例えばフラリー等（Fraley et al.）（１９８５年）、ロジャース等（Rogers et al.）（１９８７年）及びここに全体を文献として具体的に組み入れた米国特許第５５６３０５５号に記載されている方法を参照。
【０１３１】
アグロバクテリウム仲介形質転換は双子葉植物で最も有効で、シロイヌナズナ、たばこ、トマト及びじゃがいもを含む双子葉植物形質転換の好ましい方法である。実際アグロバクテリウム仲介形質転換は多年にわたりごく普通に双子葉植物で用いられてきたが、最近になって初めて単子葉植物に適用できるようになった。アグロバクテリウム仲介形質転換技術の進歩により、現在はほぼ全ての単子葉植物に適用できる技術になった。例えばアグロバクテリウム仲介形質転換技術は、現在米（ヒエイ等（Hiei et al.）、１９９７年；ザン等（Zhang et al.）、１９９７年；ここに全体を文献として具体的に組み入れた米国特許第５５９１６１６号）、小麦（マッコーマック等（McCormac et al.）、１９９８年）、大麦（ティンゲイ等（Tingay et al.）、１９９７年；マッコーマック等（McCormac et al.）、１９９８年）及びトウモロコシ（イシディア等（Ishidia et al.）、１９９６年）に適用された。
【０１３２】
現代のアグロバクテリウム形質転換ベクターは大腸菌と同様にアグロバクテリウムで複製でき、記載のように便利な操作が可能である（クリー等（Klee et al.）、１９８５年）。更にアグロバクテリウム仲介遺伝子送達用ベクターでの最近の技術的進歩により、種々のペプチドコーディング遺伝子が発現可能なベクター構築を助けるベクターの遺伝子と制限酵素部位の配置が改良された。記載のベクター（ロジャース等（Rogers et al.）、１９８７年）は、挿入ポリペプチドコーディング遺伝子の直接発現に関するプロモーターとポリアデニル化部位が隣接する便利なマルチリンカー領域を有し本目的に適する。更に武装Ｔリンパ球抗原（Ｔｉ）遺伝子と安全Ｔｉ遺伝子両者含有のアグロバクテリウムは形質転換に使用できる。アグロバクテリウム仲介形質転換が効率的なこれらの植物株では、遺伝子転移の容易で明確な性質によりこれが選ばれた方法になる。
【０１３３】
植物プロトプラストの形質転換はリン酸カルシウム沈殿、ポリエチレングリコール処理、電気穿孔及びこれら処理の組み合わせに基づく方法を用いて達成できる（例えばポットリカス等（Potrykus et al.）、１９８５年；ロルズ等（Lorz et al.）、１９８５年；オミルレー等（Omirulleh, et al.）、１９９３年；フロム等（Fromm et al.）、１９８６年；ウチヤマ等（Uchiyama, et al.）、１９８６年；カリス等（Callis et al.）、１９８７年；マルコッテ等（Marcotte et al.）、１９８８年参照）。
【０１３４】
これらシステムの他の植物株への応用は、プロトプラストからのその特定植物株再生能に依存する。プロトプラストからの穀類再生に関する具体法は記載されている（フジマラ等（Fujimara, et al.）、１９８５年；トリヤマ等（Toriyama, et al.）；ヤマダ等（Yamada, et al）、１９８６年；アブダラー等（Abdullah et al.）；オミルレー等（Omirulleh, et al.）、１９９３年及び米国特許第５５０８１８４号で、それぞれはここに全体を文献として具体的に組み入れている）。穀類プロトプラストの直接取り込み形質転換の使用例としては、米（ゴッシュービスワズ等（Ghosh-Biswas et al.）、１９９４年）、サトウモロコシ（バットロウ（Battraw）、ホール（Hall）、１９９１年）、大麦（ラッゼリ（Lazzeri）、１９９５年）、カラスムギ（ゼン（Zheng）、エドワード（Edwards）、１９９０年）及びトウモロコシ（オミルレー等（Omirulleh, et al.）、１９９３年）が挙げられる。
【０１３５】
プロトプラストから旨く再生出来ない植物株を形質転換するには、別の無傷細胞又は組織へのＤＮＡ導入法が用いられる。例えば未熟胚又は外植片からの穀類再生は記載のように達成できる（バジル（Vasil）、１９８９年）。又炭化ケイ素繊維仲介形質転換も原形質体化有りか又は無しで使用できる（ケップラー（Kaeppler）、１９９０年；ケップラー等（Kaeppler et al.）、１９９２年；ここに全体を文献として具体的に組み入れた米国特許第５５６３０５５号）。この技法による形質転換は炭化ケイ素繊維をＤＮＡ溶液中の細胞と一緒に攪拌して達成される。細胞が穿刺されるとＤＮＡが受動的に進入する。この技法は例えば単子葉穀類のトウモロコシ（ここに全体を文献として具体的に組み入れた国際公開ＷＯ９５／０６１２８号；トンプソン（Thompson）、１９９５年）と米（ナガタニ（Nagatani）、１９９７年）で成功裏に用いられた。
【０１３６】
微粒子銃法の最適化
本発明に基づく微粒子銃法形質転換に関する物理的パラメーターと生物学的パラメーターの両者が最適化できる。物理的因子はＤＮＡ／マイクロプロジェクタイル沈殿の操作が関与する因子、又はマクロプロジェクタイル又はマイクロプロジェクタイルのいずれかの飛行速度に影響する因子である。生物学的因子としては、衝撃関連外傷の緩和を助けるため標的細胞浸透圧の調整、粒子軌道に対する未熟胚又は他の標的組織の配向、及び直線化ＤＮＡ又は高次コイル化無傷プラスミドのような形質転換ＤＮＡの性質のような、衝撃前と衝撃直後の細胞操作に関与する全段階が挙げられる。衝撃前操作が未熟胚形質転換の成功に特に重要であると考えられる。
【０１３７】
従って種々の衝撃パラメーターでの条件を小研究で完全に最適化したいと考える。特にＤＮＡ濃度、ギャップ距離、飛行距離、組織距離及びヘリウム圧のような物理的パラメーターを調整したい。更にヘリウム等級の形質転換効率への影響を考える。例えば工業用グレード（純度９９．９９％）ヘリウムと超高純度（純度９９．９９９％）ヘリウム使用の衝撃で形質転換効率の差が示されたが、どちらが衝撃の使用により有利であるかは現在明らかでない。又レシピエント細胞の生理状態に影響し、その結果形質転換効率と組み込み効率に影響する条件を修正して、外傷減少因子（ＴＲＦ）を最適化できる。例えばレシピエント細胞の浸透圧状態、組織水和及び継代培養又は細胞周期を最適形質転換に調整できる。
【０１３８】
更に弾道形質転換の最適化のために、衝撃に関する物理的パラメーターと生物学的パラメーター両者に取り組む。物理的因子はＤＮＡ／マイクロプロジェクタイル沈殿操作関与の因子か、又はマクロプロジェクタイル又はマイクロプロジェクタイルのいずれかの飛行速度に影響する因子である。生物学的因子は衝撃直前及び衝撃直後の細胞操作が関与する全段階を含む。浸透圧環境、衝撃パラメーター及びプラスミド配置のような衝撃前培養条件は最大数の安定な形質転換体を生ずるように調節された。
【０１３９】
（i）物理的パラメーター
１．ギャップ距離
可変ネスト（マクロフォルダー）を調整して、破裂板とマクロプロジェクタイル間距離、即ちギャップ距離を変化できる。この距離は０から２ｃｍまで変化できる。より狭いギャップによる予期効果は、マクロプロジェクタイルとマイクロプロジェクタイル両者の速度増加、衝撃波の増加（組織の飛散と組織外傷の増加をもたらす）、及びミクロプロジェクタイルのより深い侵入である。より大きなギャップ距離は反対効果を有するが、生存率、それ故安定な回収形質転換体の全数を増加できでるであろう。
【０１４０】
２．飛行距離
固定ネスト（可変ネスト内に含有）はマクロロプロジェクタイルが横切る飛行路を調節するために、前もって決めた増分０．５ｃｍでスペーサーリングを配置して０．５乃至２．２５ｃｍの間で変化できる。短い飛行路では飛行中のマクロプロジェクタイルの安定性をより大きくできるが、マイクロプロジェクタイルの全体速度を減少する。飛行中の安定性増加は、例えば集中β―グルクリオニターゼ（ＧＵＳ）増殖巣数を増加する。より大きな飛行距離（ある点まで）は速度を増加するが、又飛行中の不安定性を増加する。観察に基づいて通常衝撃は約１．０ｃｍ乃至１．５ｃｍの飛行路長さで行うことを推奨する。
【０１４１】
３．組織距離
組織の銃チャンバー内配置はマイクロプロジェクタイル侵入に大きな効果を有する。マイクロプロジェクタイル飛行路の増加により速度と衝撃波関連の外傷を減少する。速度減少は又マイクロプロジェクタイル侵入がより浅くなる。
【０１４２】
４．ヘリウム圧
破裂板の型と数を操作して、ガス加速管内圧力を４００乃至２０００ポンド／平方インチ（psi）の間で変化できる。安定な形質転換での最適圧は１０００乃至１２００psiの間に決定された。
【０１４３】
５．ミクロプロジェクタイルの塗布
微粒子銃法に関してＤＮＡがその形質転換に適する形態でレシピエント細胞に送達されるようにマイクロプロジェクタイルに付着（即ち“コート”）する。この点に関しては少なくとも形質転換するＤＮＡの幾らかが形質転換を起こす標的細胞に利用できる必要があるが、同時に送達時にそのＤＮＡはマイクロプロジェクタイルに付着する必要がある。それ故形質転換するＤＮＡがマイクロプロジェクタイルから利用可能なことは、マイクロプロジェクタイルを標的細胞に送達後、形質転換するＤＮＡとこのマクロプロジェクタイル間結合の物理的反転を含む。しかしＤＮＡの非結合セグメント又はこのマイクロプロジェクタイルとの物理的付着を含む他分子の切断の結果として標的細胞利用の可能性が起こる場合には、この必要性は無くなる。更に形質転換するＤＮＡとマイクロプロジェクタイルに直接的又は間接的のいずれかで付着する他分子間結合の切断結果として利用の可能性が起こっても良い。更に標的細胞の形質転換は形質転換するＤＮＡとレシピエント細胞のゲノムＤＮＡ間の直接組み替え経由で起こっても良い。それ故ここで用いた“塗布した”マイクロプロジェクタイルは、形質転換するＤＮＡが標的細胞に送達され、なお形質転換が起こるように標的細胞に到達できる標的細胞の形質転換に利用できるマイクロプロジェクタイルである。
【０１４４】
形質変換するＤＮＡを標的細胞に送達できるマイクロプロジェクタイル塗布技術のいずれもが使用できる。本発明で効を奏することが示されたマイクロプロジェクタイル塗布法を具体的にここに開示する。しかし代替え技術を用いてＤＮＡをマイクロプロジェクタイル粒子に結合できる。例えば粒子はストレプトアビジンと長鎖チオール切断可能なビオチニル化ヌクレオチド鎖で標識化したＤＮＡ末端を塗布しても良い。このＤＮＡはストレプトアビジンとビオチンとの相互作用により粒子に接着するが、細胞に存在する還元剤によりチオール結合を還元し細胞内で放出される。
【０１４５】
代わりに粒子は酸化金粒子表面を機能化して遊離アミノ基を供与して調製しても良い。強い陰電荷を有するＤＮＡは機能化粒子と結合する。更に荷電粒子はＰＤＳ−１０００微粒子銃装置使用のマイラーフライヤーディスク表面上に制御配列で蒸着し、その結果標的組織に送達する粒子分子の制御を助けても良い。
【０１４６】
上に検討したように更にマイクロプロジェクタイル塗布に用いるＤＮＡ濃度が、導入遺伝子の単一コピー含有形質転換体の回収に影響することを提案する。例えば低濃度のＤＮＡは必ずしもこの形質転換効率を変えないが、代わりに単一コピー挿入事象の比率を増加できる。この点で開始マイクロプロジェクタイル１．８ｍｇ毎に、約１ｎｇ乃至２０００ｎｇの形質転換するＤＮＡが使用できる。該発明の他実施形態では開始マイクロプロジェクタイル１．８ｍｇ毎に、約２．５ｎｇ乃至１０００ｎｇ、２．５ｎｇ乃至７５０ｎｇ、２．５ｎｇ乃至５００ｎｇ、２．５ｎｇ乃至２５０ｎｇ、２．５ｎｇ乃至１００ｎｇ又は２．５ｎｇ乃至５０ｎｇの形質転換するＤＮＡを使用できる。
【０１４７】
又種々の他法を用いて形質転換効率の増加、及び／又は低コピー形質転換効率事象の相対比率が増加できる。例えば該発明者はアルカリ性ホスファターゼ、又は形質転換前にＤＮＡ末端を平滑化する試薬で末端修飾した形質転換するＤＮＡについて熟慮した。更に不活性担体ＤＮＡは形質転換するＤＮＡを含んでも良く、その結果使用ＤＮＡの全体量を低下することなしに形質転換ＤＮＡの有効濃度を低下できる。これらの技術については更に１９９７年１２月２２日に申請の米国特許出願番号第０８／９９５４５１号に記載され、その開示の全体をここに具体的に文献として組み入れる。
【０１４８】
（ii）生物学的パラメーター
培養条件と他因子は標的細胞の生理状態に影響でき、形質転換効率及び組み込む効率に大きな影響を有する。第一に衝撃作用によりエチレン産生を刺激し、組織老化をもたらすかもしれない。抗エチレン化合物添加により形質転換効率を増加するかもしれない。第二に導入ＤＮＡの組み込みには細胞周期のある時点がより適切であることを提案する。従って細胞培養液の同期化により形質転換体の産生頻度を増強できる。例えば同期化は冷処理、アミノ酸飢餓、又は他の細胞周期停止剤を用いて達成できる。第三に組織水和度は又衝撃関連の外傷量と同様にマイクロプロジェクタイルの細胞壁侵入能に寄与できる。
【０１４９】
粒子軌道に対する胚又は他の標的組織の位置と配向は又重要であり得る。例えばＰＤＳ−１０００微粒子銃装置は標的ペトリ皿表面に均一に広がる粒子を発生しない。このプレート中心の粒子速度の方がペトリ皿中心から遠い距離の粒子速度より速い。それ故一部の人には“死の帯域”と呼ばれる皿中心を避けるように、標的組織をペトリ皿に置くのが有利である。更に標的軌道に対する標的組織の配向も又重要である。組織が粒子流れに方向に植物を最も再生し易いように配向するのが望ましいと考える。例えば未熟胚の小板が最大胚形成能を持つ細胞を含み、その結果粒子流れ方向に配向する必要がある。
【０１５０】
又僅かに原形質分離した酵母細胞により形質転換効率が増加できることが報告された（アルマレオ等（Armaleo et al.）、１９９０年）。細胞の浸透圧状態の変化がマイクロプロジェクタイル侵入関連外傷の低減を助けると仮定された。更に成長段階と細胞周期段階が形質転換に関して重要である。
【０１５１】
１．浸透圧調整
浸透圧前処理は形質分離細胞の膨圧減少の結果衝撃関連の損傷を減少しそうなことが示唆された。以前の研究で新鮮な培地と浸透圧調整培地の両者に継代培養後、ＧＵＳを一過的に発現する細胞数が増加した（ここに全体を具体的に文献として組み入れた国際公開ＷＯ９５／０６１２８号）。９０分の前処理時間ではより短時間より高いＧＵＳ発現増殖巣数を示した。培地ｋｇ当たり５００ミリオスモルで９０分間インキュベートした細胞は、対照に比べ約３．５倍の一過性ＧＵＳ増殖巣増加を示した。好ましくは衝撃前に未熟胚を１２％ショ糖含有培地で４−５時間前培養する。衝撃後第二培養を１２％ショ糖で１６−２４時間実施する。代わりにＩＩ型細胞を衝撃前に０．２Ｍマンニトールで３−４時間前処理する。他の浸透圧活性溶質による１−６時間の細胞前処理が又望まれると考える。
【０１５２】
２．プラスミド配置
幾つかの場合には制限なしでアンピシリン、カナマイシン及びテトラサイクリン耐性を含む抗生物質耐性遺伝子のような細菌宿主、例えば大腸菌中のプラスミドベクター維持に必要なＤＮＡ配列と、ＤＮＡ複製の原核生物起源を含んでいない細胞に候補遺伝子ＤＮＡを送達するのが好ましい。この場合には形質転換するＤＮＡ含有ＤＮＡ断片が形質転換前に精製できる。代表的精製法は１．２％低融点温度アガロースゲルでのゲル電気泳動後、アガロースゲルのゲル薄片を溶融して６乃至１０倍過剰のトリスーＥＤＴＡ緩衝液（１０ｍＭトリスー塩酸、ｐＨ８、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、７０℃―７２℃）に回収し、凍結融解（３７℃で融解）し、このアガロースを遠心分離によりペレット化する。次いでキアゲン（Qiagen）Ｑ−１００カラムを用いてＤＮＡを精製しても良い。高効率ＤＮＡの回収のためにカラム流速を４０ｍｌ／ｈｒに調節しても良い。
【０１５３】
単離ＤＮＡ断片は種々の電気的溶出技術、アガロースの酵素消化又はＤＮＡのガラスビーズ（例えばジーンクリーン（Gene Clean））との結合を用いてアガロースゲルから回収できる。更に高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）及び／又は磁気粒子を用いてＤＮＡ断片を単離しても良い。ＤＮＡ断片単離の代案としてプラスミドベクターを制限酵素で消化でき、このＤＮＡは発現カセット断片の事前精製なしでトウモロコシ細胞に送達できる。
【０１５４】
組織培養は培地と制御環境が必要である。“培地”とは細胞をインビトロ、即ち無傷の生きた生物外で成長するのに用いる多数の栄養混合物を意味する。この培地は通常大部分の細胞型の成長に必要な種々の種類の成分（塩類、アミノ酸類、成長調整物質、糖類、緩衝液類）の懸濁液である。しかし特異的細胞型の各々は成長に特定範囲の成分比率が必要で、最適の成長にはより特異的範囲の処方さえ必要となる。細胞成長速度は開始培養液の中でも、この細胞型が成長できる数々の培地で変わる。
【０１５５】
栄養培地は液体として調製するが、この液体を固体支持材提供可能な材料に加えて固体化しても良い。寒天はこの目的に最も良く使用される。バクトアガー、ハゼルトン（Hazelton）寒天、ゲルライト（Gelrite）及びゲルグロ（Gelgro）は組織培養液での植物細胞成長に適した特異型固体支持材である。
【０１５６】
幾つかの細胞型は液体懸濁物又は固体培地で成長分裂する。ここに開示のようにトウモロコシ細胞は液体懸濁物又は固体培地で成長するが、懸濁培養物からの植物再生には発達のある時点で液体培地から固体培地への移送が必要である。培養液での細胞分化の型と程度は、使用培地の形と環境、例えばｐＨだけでなく、又培地が固体か又は液体のいずれかによっても影響される。
【０１５７】
レシピエント細胞標的物としては制限なしで、茎頂（米国特許第５７３６３６９号）、Ｉ型カルス、ＩＩ型カルス及びＩＩＩ型カルス、未熟胚及び小胞子、花粉、精子及び卵細胞のような配偶子細胞を含む成長点細胞が挙げられる。稔性植物が再生できる任意の細胞がレシピエント細胞として有用であると考えられる。Ｉ型カルス、ＩＩ型カルス及びＩＩＩ型カルスは、制限なしで未熟胚、苗頂端分裂組織、小胞子及び類似物を含む組織供給源で開始できる。カルスとして増殖できるこれらの細胞は、又遺伝子形質転換のレシピエント細胞でもある。本発明は未熟胚の形質転換技術と後続の稔性形質転換植物の再生技術を提供する。未熟胚の形質転換により長期のレシピエント細胞培養物発達の必要が無くなる。花粉と同様にその前駆体細胞の小胞子は、遺伝子形質転換のレシピエント細胞、又は受精時に取り込む異質ＤＮＡを運ぶベクターとして機能できる。花粉の直接形質転換は細胞培養の必要をなくすであろう。成長点細胞（即ち連続細胞分裂が可能で、細胞学的未分化細胞外観で特徴付けられる植物細胞で、通常根端、茎頂部、側芽などのような植物成長点又は組織に見られる）は、他の形のレシピエント植物細胞を表す。これらの器官分化と分化全能性での未分化成長能力のために、単一形質転換成長点細胞が完全形質転換植物として回収出来るかもしれない。実際胚形成懸濁培養物はインビトロ成長点細胞系であり得、未分化状態で培地環境に制御されながら継続細胞分裂能を保持できる。
【０１５８】
所望ＤＮＡセグメントでは形質転換するためのレシピエント細胞として働く培養植物細胞は、トウモロコシ細胞を含む任意の植物細胞で良いが、より具体的には各種のトウモロコシ（Zea mays L.）体細胞の細胞は種々の型がある。胚形成細胞は胚形成により植物再生を誘発できる体細胞の一例である。非胚形成細胞は通常この方法では応答しない細胞である。非胚形成細胞の例は特定のブラックメキシカンスイート（ＢＭＳ）トウモロコシ細胞である。
【０１５９】
本発明との関連で有用な胚形成カルスと懸濁培養物、例えば形質転換のレシピエント細胞の発生は、米国特許第５１３４０７４号と米国特許第５４８９５２０号に記載されており、各々をここに全体を文献として取り入れる。
【０１６０】
レシピエント細胞を細胞集団内で濃縮する特定の技術が利用できる。例えば脆弱な胚形成組織の手作業による選択培養後、通常ＩＩ型カルスの発生により微粒子銃形質転換で用いるレシピエント細胞が濃縮される。特にここに開示の培地を用いた懸濁培養は、任意の所定集団での非レシピエント細胞の対するレシピエント細胞の比を改善できる。レシピエント細胞選択に使用できる手作業による選択技術としては、例えば細胞形態と分化の評価が挙げられ、又種々の物理的又は生物学的選択手段が用いられる。凍結保存は又レシピエント細胞の可能な選択法である。
【０１６１】
例えばＩＩ型カルス表面の胚細胞選択により、手作業によるレシピエント細胞の選択は、培養前（固体培地又は懸濁状での培養のいずれか）にレシピエント細胞を濃縮する試みに使用できる一手段である。好ましい細胞は細胞集団表面に位置する細胞であり、更に分化の欠如、その大きさ及び濃密な細胞質により同定可能である。好ましい細胞は通常分化がより少ない細胞、又は未だ分化を犯さない細胞である。従って細胞質的に濃密で、高い核対細胞質比（例えば細胞学的観察により決定する）で比較的非空胞化であり、大きさが小さく（例えば１０−２０μｍ）、持続的分裂と体細胞前芽形成可能な細胞を同定選択したい。
【０１６２】
この細胞の他の同定手段が使用できることを提案する。例えば胚形成細胞のような比較的非透過性膜を有する細胞により排除され、根類似細胞と蛇型細胞（所謂その蛇類似外観による）のような比較的分化した細胞により取り上げられるエバンス−ブルーのような染料を使用することである。
【０１６３】
レシピエント細胞同定の他の可能な手段としては、細胞化学的染色により検出できるグルタミン酸脱水素酵素のような胚形成細胞のアイソザイムマーカーの使用が挙げられる（フランズ等（Fransz et al.）、１９８９年）。しかしグルタミン酸脱水素酵素を含むアイソザイムマーカーの使用は、なお比較的高代謝活性を有する根状細胞のような非胚形成細胞ではある程度の擬陽性をもたらし得ることを警告する。
【０１６４】
一実施形態では候補遺伝子由来のハイブリッドｍＲＮＡ分子、又はハイブリッドｍＲＮＡ分子由来のハイブリッドタンパク質は、雑種強勢を産生するよりはむしろ病状を克服、治療又は少なくとも緩和する。上記の実験プロトコル概要を用いてこの結果が得られることがこの分野の熟練者に正しく理解される。
【０１６５】
通常“治療する”、“治療”と言う用語及び類似語は、ここでは所望の薬理効果及び／又は生理効果を得るための個体又は被験者、その組織又は細胞に影響する意味で用いる。その効果は疾患又はその兆候や症状を完全に又は部分的に防止すると言う点で予防的であり、及び／又は疾患の部分的又は完全治癒と言う点で治療的であり得る。ここで用いた“治療する”とは、植物又は動物の疾患の治療又は予防のいずれも包含し、以下が含まれる。（a）病気に罹りやすいが未だ病気に罹ったとは診断されていない植物又は動物で病気が起こるのを予防する、（ｂ）その疾患を阻害する、即ちその発達を停止する、又は（ｃ）その病状を軽減又は寛解する、即ち病状の退縮を起こす、又は（ｄ）動物又は植物の快適な暮らし、健康又は長寿を増強する。
【０１６６】
一旦植物又は動物が病気に苦しむと診断され、候補遺伝子又は遺伝子の組み合わせが同定されると、強制雑種に関して上述の技術を用いるか又は標準的医療技術又は農業技術のいずれかを用いて、これら遺伝子又は遺伝子産物をこの植物又は動物に投与できる。
【０１６７】
“投与”、“投与する”及び“投与した”と言う用語はここでは互換可能に用いる。例えば候補遺伝子産物は、舌下を含む経口的、局所的又は非経口的に在来の無毒で医薬品容認の担体、アジュバント及び媒体含有の単位用量処方で投与できる。ここで用いた非経口と言う用語は、皮下注入、エアロゾル、静脈内、筋肉内、くも膜下腔、頭蓋内注入又は点滴法、直腸又は膣を含む。
【０１６８】
本発明の他様態ではハイブリッドタンパク質を単離し、更にそれらがＨＶ又はＨＤに効果を有するか否かを決める研究ができる。例えばハイブリッドタンパク質の免疫原性の変性は、そのハイブリッドタンパク質アミノ酸配列を一連のプロテオミクス的物理化学的分析を行って決められる。多くの異なるコンピューター処理分析プログラムがコンパイルされてきた。ハイブリッドタンパク質免疫原性と野生型親のそれぞれとの比較に用いるプログラムのパッケージソフト例は、エピトープインフォマティクス（ePitopes Informatics）により提供されている。参考資料に関してはhttp://www.epitope-informaticscom/References.htm#ModernAb参照。
【０１６９】
限定はされないが物理化学的物性は以下の調査プログラムを用いて決定する。
i／タンパク質抗原性予測アルゴリズム
ii／タンパク質疎水性アルゴリズム
iii／タンパク質親水性アルゴリズム
iv／タンパク質可動性予測アルゴリズム
v／タンパク質二次構造アルゴリズム
【０１７０】
これらのタンパク質の物理化学的物性値は当業者には周知である。ハイブリッドタンパク質と野生型タンパク質間のインビトロでの構造機能的な差異は、一連の無料で入手可能な分析プログラムを用いてそのアミノ酸配列を照合して決定する。野生型タンパク質と比較したハイブリッドタンパク質の可能な構造特性又は機能特性は、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）データベース、ＥＭＢＯＳＳ（European Molecular Biology Open Software Suite）データベースにより利用できるソフトウエア、ワイズマン科学研究所（Weizmann Institute of Science）のジーンカード（GeneCards）ウエブサイトにより利用できるソフトウエアを含む広範囲のプロテオミクス分析ソフトウエアを用いて評価する。
http://bioinfo.wizmann.ac.il/cards/index.stml
【０１７１】
以下の非制限例の参照目的のためだけに該発明を更に説明する。しかし以下の例は説明のためだけで、上述の該発明の一般性を制限するとは決して取ってはいけないと理解する必要がある。特に該発明はＤＮＭＴ２対立遺伝子を用いて候補遺伝子同定との関連で上に詳細に説明したが、ここでの知見はこの遺伝子又は対立遺伝子に限定されないことは明らかに理解される。
【０１７２】
実施例１  ヘテロ接合子孫でハイブリッドｍＲＮＡ分子を形成する新規生化学経路の同定
二つの対立遺伝子型の遺伝子ＤＮＭＴ２が記載されている（フランキナ等（Franchina et al.）、（２００１年）、ヒューマンへレディティ（Hum. Hered.）、５２巻、ｐ．２１０）。ＤＮＭＴ２はＤＮＡメチル化過程で関与する酵素をコード化する。対立遺伝子ＤＮＭＴ２Ｉの一つはエクソン２の１０４位にヌクレオチドＧと、エクソン４の５０位にヌクレオチドＣを含む。代替え対立遺伝子のＤＮＭＴ２ＩＩはこれらの位置にそれぞれヌクレオチドＡとヌクレオチドＴを含む。従って二つの対立遺伝子型のＤＮＭＴ２それぞれの間でのエクソン２とエクソン４内ＤＮＡ配列の差異により、最終ｍＲＮＡ分子でのエクソン２とエクソン４の対立遺伝子起点が決定できる。これらの知見を用いてハイブリッド型のｍＲＮＡが、各対立遺伝子エクソンを同一成熟ｍＲＮＡ分子に取り入れることでヘテロ接合子孫に形成され、その結果ヘテロ接合子孫に独特の新規ポリペプチド又はタンパク質分子が産生するか否かを試験した。
【０１７３】
各ＤＮＭＴ２対立遺伝子のエクソン又はその一部が、一次転写物スプライシング後に同一成熟ｍＲＮＡ分子に組み入れられるか否か、及び如何に効果的に組み入れられるかを決めるために、分離研究により二つの対立遺伝子形ＤＮＭＴ２に関してヘテロ接合であると確認された二つの被験者ＩＩＩ１とＩＩＩ２の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）からｍＲＮＡを単離した（フランキナ等（Franchina et al.）、上記参照）。
【０１７４】
ＤＮＭＴ２のエクソン２とエクソン４含有の約４８０ｂｐの相補ＤＮＡ領域を増幅したプライマーを用いて、このｍＲＮＡを逆転ＰＲＣに付した。被験者ＩＩＩ１と被験者ＩＩＩ２の長さ約４８０ｂｐの逆転ＰＣＲ産物がクローンされ、各逆転ＰＣＲ産物の一連のクローンが配列決定された。
【０１７５】
表１に示すように被験者ＩＩＩ１で配列決定した１５個のクローン中１３個の挿入断片はＤＮＭＴ２の両アレル発現を示し、予期通り成熟ｍＲＮＡ分子のエクソン２とエクソン４のシス構造を示した。しかしこのクローンの一つはＤＮＭＴ２Ｉ対立遺伝子のエクソン２とＤＮＭＴ２ＩＩ対立遺伝子のエクソン４を含むスプライス産物を含んでいた。別のクローンはＤＮＭＴ２ＩＩ対立遺伝子のエクソン２と同様にＤＮＭＴ２Ｉ対立遺伝子のエクソン４を含んでいた。この知見の再現性を評価し、被験者ＩＩＩ１に見られる二つの見かけのハイブリッドｍＲＮＡ分子が、ある形の有糸分裂組み替え事象の結果である可能性を排除するために、被験者ＩＩＩ２のＰＢＬのｍＲＮＡ種を同様に調べた。
【０１７６】
表１に示すように１４個のクローン中１１個はＤＮＭＴ２の両アレン発現とシスエクソン構造を示す挿入断片を含有した。しかし三個の別のクローンの構造はハイブリッドｍＲＮＡ分子が組み立てられていることを示した。これらの内の二個はＤＮＭＴ２ＩＩ対立遺伝子のエクソン２とＤＮＭＴ２Ｉ対立遺伝子のエクソン４を含有した。別のクローン配列によりＤＮＭＴ２Ｉ対立遺伝子のエクソン２とＤＮＭＴ２ＩＩ対立遺伝子のエクソン４を組み入れてスプライスしたｍＲＮＡ分子が組み立てられていることが明らかになった。
【０１７７】
次いで二つの代替えアレル型のＤＮＭＴ２それぞれにホモ接合であることが確認された二つの別被験者、ＩＩ３とＩＩ４（フランキナ等（Franchina et al.）、上記）のＰＢＬからｍＲＮＡを単離した。被験者ＩＩＩ１と被験者ＩＩＩ２のＰＢＬに見られるハイブリッドｍＲＮＡＤＮＭＴ２分子が、先端切断逆転写産物形成により逆転写ＰＣＲのＰＣＲ段階で鋳型乗り換えによりインビトロで産生する可能性を排除するために、被験者ＩＩ３と被験者ＩＩ４の当量ｍＲＮＡのインビトロ作成混合物を、使用被験者ＩＩＩ１と被験者ＩＩＩ２のｍＲＮＡと同様に処理した。表１に示すように１３個のクローンの挿入断片配列を参照するとハイブリッドｍＲＮＡ分子は見いだされなかった。これらに基づいてこれら知見により全スプライスＤＮＭＴ２ｍＲＮＡ分子の２０％がハイブリッド型を含むことが確立された。
表１  エクソン２とエクソン４内の多型位置に存在するヌクレオチドによる末梢血リンパ球でのスプライスＤＮＭＴ２ｍＲＮＡ分子分布
【表１】
2009502143.tif 000003
注：遺伝子型ＤＮＭＴ２Ｉ／ＩＩは被験者ＩＩＩ１、ＩＩＩ２に、ＤＮＭＴ２Ｉ／Ｉ及びＤＮＭＴ２ＩＩ／ＩＩは被験者ＩＩ３とＩＩ４でそれぞれ系図分析により確認された（フランキナ（Franchina）、ケイ（Kay）、ヒューマンへレディティー（Hum. Hered.）、５２巻，ｐ．２１０（２００１年）参照）。
＊被験者ＩＩＩ１、ＩＩＩ２、（ＩＩ３及びＩＩ４）のホモ接合ＤＮＭＴ２Ｉ及びＮＤＭＴ２ＩＩ親のｍＲＮＡ混合物を又逆転写ＰＣＲに付し、その産生物をクローンし、配列決定した。混合ｍＲＮＡ試料のＧ−Ｔ又はＡ−ＣスプライスＤＮＭＴ２ｍＲＮＡ分子を特定する挿入断片は見いだされなかった。これらの結果によりｍＲＮＡ分子のトランスエクソンの両アレル構造を含むインビボ一次転写物スプライスシステムの存在が確認された。
【０１７８】
実施例２  ヒトＨＶモデルとしての骨粗鬆症
骨粗鬆症は閉経後女性のほぼ４０％が受ける骨障害である。これは破骨細胞による骨吸収増加により、骨密度の低下と骨折し易さの増加を起こして生ずる。カルシトニンは破砕細胞のカルシトニン受容体と結合し、骨崩壊を起こすその活性を減少するので骨粗鬆症治療に用いられる。
【０１７９】
タブレー等（Taboulet et al.）、（１９９８年）、ヒューマンモレキュラージェネティック（Hum. Mol. Genet.）、７巻、ｐ．２１２９に、表２に示すように野生型カルシトニン受容体対立遺伝子にヘテロ接合な被験者は、同一野生型対立遺伝子形にホモ接合な被験者に比べより高い骨密度を有し、骨折の危険を減少することを示した。
【０１８０】
表２に異なる対立遺伝子形のカルシトニン受容体の異なるアミノ酸をコード化するヌクレオチド変化のエクソン位置を示す。これらのコード配列変異体はＮＣＢＩデータベースで検索した。表２に示すようにエクソン１はアミノ酸位１２６でロイシン又はアルギニンのいずれかをコード化する一方、アミノ酸位４４７でエクソン９内のヌクレオチドの差異によりプロリン又はロイシンをコード化する。カルシトニン受容体の１２６位と４４７位の代替えアミノ酸をコード化するヌクレオチド配列分布の差異は、異なる対立遺伝子型のカルシトニン受容体遺伝子にヘテロ接合な被験者に新規又はハイブリッド型カルシトニン受容体形成に必要な構造的基準を満たす。
表２  代替えカルシトニン受容体対立遺伝子でのアミノ酸差異物をコード化するヌクレオチド変化物でのエクソン位置
【表２】
2009502143.tif 000004
【０１８１】
ここに記載の該発明に従うと、カルシトニン受容体内の１２６位と４４７位アミノ酸の容認組み合わせは、（a）ロイシン／プロリン、（ｂ）ロイシン／ロイシン、（ｃ）アルギニン／プロリン及び（ｄ）アルギニン／ロイシンを含み、その内の二つは野生型対立遺伝子を含む一方、他の二つは骨密度と骨折し易さに影響するハイブリッド型カルシトニン受容体を含む。
【０１８２】
実施例３  新規生化学経路による哺乳類ＨＶモデルとしてのアルギニノコハク酸尿症
ヒトでは酵素のアルギニノコハク酸分解酵素（ＡＳＬ）をコード化する遺伝子で５つの異なる対立遺伝子型の遺伝子が同定されている。例えばそれらの内の幾つかのＡＳＬ（Ｄ８７Ｇ）、ＡＳＬ（Ｑ２８６Ｒ）及びＡＳＬ（Ａ３９８Ｄ）は変異体型ＡＳＬをコード化する。これらの変異体型ＡＳＬのそれぞれにホモ接合な被験者は不活性型の酵素を産生し、アルギニノコハク酸尿症として知られる疾患の発病をもたらす。
【０１８３】
ＡＳＬ（Ｑ２８６Ｒ）とＡＳＬ（Ｄ８７Ｇ）のような変異誘発遺伝子型ＡＳＬを、それに冒された親それぞれからヘテロ接合型を受け継ぐ子孫では、ＡＳＬ活性を保持したＨＶ型が観察されることが良く認められている（ここに文献として取り入れたウオーカー等（Walker et al.）、（１９９７年）、ジャーナルオブバイオケミストリー（J. Biol. Chem.）、２７２巻、ｐ．６７７７参照）。ＡＳＬ（Ｄ８７Ｇ）とＡＳＬ（Ｑ２８６Ｒ）をコード化する対立遺伝子は、異なるＡＳＬエクソン内に位置するヌクレオチド差異物により特徴付ける。アミノ酸位８７でアスパラギン酸又はグリシンを産生するヌクレオチド変異体はエクソン３に位置する一方、グルタミン又はアルギニンをコード化するヌクレオチド変異物はエクソン１１内に位置する。エクソン３とエクソン１１の８７位と２８６位の代替えアミノ酸をそれぞれコード化するヌクレオチド配列差異物の局在化は、二つの異なる変異体型のＡＳＬ遺伝子にヘテロ接合な被験者で正常ＡＳＬ酵素の合成が可能になるのに必要な構造的基準を満たす。
【０１８４】
実施例４  新規生化学経路によるＨＶモデルとしてのシスチン尿症
シスチン尿症はシスチン及び他アミノ酸の腎吸収低下で特徴付けられるヒトの障害である。一つの形のシスチン尿症（非１型シスチン尿症と呼ばれる）は、ＳＬＣ７Ａ９と名付けられた遺伝子の突然変異で起こることが示された。Ｇ１０５Ｒ，Ｖ１７０Ｍ及びＡ３５４Ｔのような変異体型ＳＬＣ７Ａ９のホモ接合性はシスチン再吸収の著しい減少をもたらす。フォント等（Font et al.）により、（２００１年）、ヒューマンモレキュラージェネティック（Hum. Mol. Genet.）、１０巻、ｐ．３０５に示されたように、これら変異体型ＳＬＣ７Ａ９のそれぞれのヘテロ接合性はシスチン再吸収を劇的な保持する。モデルを保ちながら変異誘発遺伝子Ｇ１０５Ｒ、Ｖ１７０Ｍ及びＡ３５４Ｔを産生するＳＬＣ７Ａ９内でのヌクレオチドの変化物はそれぞれエクソン４、エクソン５及びエクソン１０に存在する。三つの変異体のＳＬＣ７Ａ９のそれぞれをコード化するヌクレオチド変化物の局在化は、上に示した三つの変異型ＳＬＣ７Ａ９内の任意の二つにヘテロ接合な被験者の正常な活性ＳＬＣ７Ａ９の合成に必要な構造的な必要性を満たす。
【０１８５】
実施例５  新規生化学経路による哺乳類ＨＶモデルとしての寿命
クロト遺伝子（ＫＬ）は１型推定膜タンパク質と同様に分泌型をコード化する。この分泌型は頭、胎盤、腎臓、前立腺及び小腸のような多くの異なる組織で発現されるが、その正確な機能は不明のままである。しかし欠損型相同遺伝子を有するマウスは、粥状動脈硬化、肺気腫及び不妊症を含むヒト老化に類似の症状を示すため、ＫＬは長寿に影響することが認められている。又クロトが死亡率への影響が知られた因子の血圧を減少することが示された（アーキング等（Arking et al.）、（２００２年）、プロシーディングオブナショナルアカデミーオブサイエンス、ユーエスエイ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、９９巻、ｐ．８５６参照）。
【０１８６】
ＨＶのヒトモデルを保ちながら最近の研究により、ホモ接合被験者に比べヘテロ接合クロト被験者は少なくとも早期死亡のリスクがより小さいことが示された（アーキング等（Arking et al.）、（２００５年）、サーキュレーションリサーチ（Circ. Res.）、９６巻、ｐ．４１２）。
【０１８７】
代替え対立遺伝子型のクロト遺伝子産物の異なるアミノ酸をコード化したヌクレオチド変化物のエクソン位置を表３に詳述する。コード領域の配列変異体はＮＣＢＩデータベースで検索した。表３に示すようにエクソン１はアミノ酸位１５でグルタミン又はプロリンのいずれかをコード化し、４５位でバリン又はフェニルアラニンのいずれかをコード化する。エクソン２は３５２位でバリン又はフェニルアラニンのいずれかをコード化し、３７０位でセリン又はシステインのいずれかをコード化する。エクソン３内でヌクレオチド変化物によりコード化したセリン又はプロリンのいずれかはアミノ酸位５１４を占めても良い。
【０１８８】
表３に示した異なるクロトエクソン内の非同義ヌクレオチド変化物の分布は、ここに記述の新規生化学経路により少なくとも二つの野生型タンパク質と、最低六つのハイブリッドタンパク質をコード化できることを示している。
表３  代替えクロト対立遺伝子のアミノ酸差異物をコード化するヌクレオチド変異体のエクソン位置
【表３】
2009502143.tif 000005
【０１８９】
実施例６  嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）変異複合ヘテロ接合体でのＨＶモデルとしての嚢胞性線維症
嚢胞性線維症は世界的に最も一般的な遺伝病の一つである。これは事実上常染色体劣性遺伝で、多数の変異型ＣＦＴＲ遺伝子の内の二つの遺伝で起こる。疾患の兆候は以下に説明するようにＨＶ型を反映し、非常に変りやすく、且つ任意の特定個体から遺伝の変異型ハロタイプで予測するのは難しい。
【０１９０】
この疾患は肺と膵臓を含む多臓器に影響し、出生時に深刻な腸閉塞を起こす。１９９２年に本発明者の技術を保ちながら、ハモッシュと同僚（Hamosh et al.）、（１９９２年）、アメリカンジャーナルオブヒューマンジェネティック（Am. J. Hum. Genet.）、５１巻、ｐ．２４５）は、二つの異なるＣＦＴＲ突然変異体のデルタＦ５０８とＧ５５１Ｄにホモ接合な患者は、二つの同一の変異誘発遺伝子をヘテロ接合型で受け継いだ患者に比べ、深刻な膵臓の関与と腸機能障害を持つことを見いだした。突然変異を起こすデルタＦ５０８とＧ５５１Ｄ疾患をコード化するヌクレオチドは、それぞれエクソン１０とエクソン１１に位置しているため、ホモ接合患者に比べて完全に正常なＣＦＴＲ分子の合成により、疾患減弱がヘテロ接合になることが本発明者の技術で得られる。
【０１９１】
実施例７  新規生化学経路による哺乳類ＨＤ（Ｃ）モデルとしての糖尿病
糖尿病はインスリン分泌障害又はその作用に対する妨害のため血糖レベルが適切に制御出来ない一般的な重病である。多くの機構的に異なる形の糖尿病がある。１型糖尿病（若年の糖尿病）では、インスリンを分泌する膵臓内細胞の島細胞への免疫攻撃のためにインスリン放出が損なわれる。グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ６５）は１型糖尿病の免疫系が標的とする主要島細胞自己抗原をコード化する。
【０１９２】
代替え対立遺伝子型のアミノ酸のグルタミン酸デカルボキシラーゼ酵素での異なるアミノ酸をコード化したヌクレオチド変化物のエクソン位置を表４に詳述する。コード領域の配列変異体はＮＣＢＩデータベースで検索した。表４に示すようにエクソン１はアミノ酸位１２でルギニン又はグリシンをコード化するヌクレオチドの変化物を含む。一方エクソン４はアミノ酸位１２４でアスパラギン又はリシンのいずれかと同様に、位置１５３でグルタミン又はプロリンをコード化するヌクレオチド変化物を含む。位置２３２の代替えアミノ酸のグルタミン酸又はグリシンがエクソン６内のヌクレオチド差異物によりコード化され、位置２８６のアルギニン又はリシンはエクソン８内のヌクレオチド変化物によりコード化され、位置３２６のアラニン又はグリシンのいずれかはエクソン１０内のヌクレオチド変化物によりコード化されることを表３は示す。
【０１９３】
代替えアミノ酸をコード化し、エクソン１，エクソン４、エクソン６、エクソン８又はエクソン１０に含まれるヌクレオチド配列差異物の分布は、表４で述べた異なる対立遺伝子型酵素内の任意の二つにヘテロ接合な被験者のハイブリッド型グルタミン酸デカルボキシラーゼ産生実現に必要な構造的基準を満たす。例えばエクソン６とエクソン８に位置するヌクレオチド差異物だけによりコード化出来る代替えアミノ酸を参照して、アミノ酸位２３２と２８６で（a）グルタミン酸／アルギニン、（ｂ）グルタミン酸／リシン、（ｃ）グリシン／アルギニン及び（ｄ）グリシン／リシンの組み合わせが、この新規生化学経路に従い形成する。これら組み合わせの内二つが野生型酵素を含む一方、他の二つはバイブリッド型を含む。
表４  代替えグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ６５）対立遺伝子アミノ酸差異物をコード化するヌクレオチド変化物のエクソン位置
【表４】
2009502143.tif 000006
【０１９４】
実施例８  自己抗体誘発でのＧＡＤ６５ヘテロ接合性の役割
ＧＡＤ６５自己抗体は疾患発症前に１型糖尿病を患う患者の血清と同様に、低レベルではあるがその無症候兄妹の血清で検出できる。
【０１９５】
本発明者の知見と構造的基準を満たすＧＡＤ６５対立遺伝子のヘテロ接合性により、ＧＡＤ６５に対する免疫反応を増強するハイブリッド型ＧＡＤ６５が産生できると言う仮説を保ちながら、自己抗体レベルは非１型糖尿病被験者でさえＧＡＤ６５遺伝子型に従い変化する必要がある。ブーチン等（Butin, et al.）による、（２００３年）、プロエスバイオロジー（PLoS Biol.）、１巻、ｐ．６８の最新の包括的研究により、ＧＡＤ６５自己抗体レベルはＧＡＤ６５対立遺伝子にヘテロ接合な被験者の方が、同一ＧＡＤ６５対立遺伝子にホモ接合な同一グループ被験者に比べ遙かに高いことが確認された。これらの知見は本発明者の構造的基準を満たす異型の対立遺伝子にヘテロ接合な被験者の新規生化学経路により形成した新規ポリペプチド又はタンパク質は、同一ＧＡＤ６５対立遺伝子にホモ接合な被験者に比べて、より容易に自己抗体を合成すると言う本発明者の主張を強く支持する。
【０１９６】
一方熟年で起こりその一部は肥満と関連する型の糖尿病は、自己免疫プロセスでは起こらない。この型の糖尿病は２型糖尿病と云われる。染色体２に位置する最も一貫して認識されている２型糖尿病の候補遺伝子は、カルパイン１０（ＣＡＬＰ−１０）である。ＣＡＬＰ−１０の変異型は２型糖尿病発生の最大の危険と関連するが、この遺伝子と２型糖尿病の発生との間の関係を説明するＣＡＬＰ−１０変異型は発見されていない。ＣＡＬＰ−１０と２型糖尿病発生のし易さと関連するＨＤモデルは、ハイブリッド酵素を新規生化学経路経由でヘテロ接合子孫に形成するのに必要な構造的基準を満たすＬ３４Ｖ、Ｔ５０４Ａ、Ｒ５５５Ｃ及びＶ６６６Ｉのような多くの異なる対立遺伝子型のＣＡＬＰ−１０が同定されたと言う知見（エバンス等（Evans, et al.）、アメリカンジャーナルオブジェネティック（Am. J. Genet.）、６９巻、ｐ．５４４（２００１年））により強く支持される。このモデルを保ちながら２型糖尿病発生のし易さの増加は、異なる対立遺伝子型のＣＡＬＰ−１０とのホモ接合性より、むしろヘテロ接合性と関連することが示された（コックス等（Cox, et al.）、（２００１年）、ヒューマンモレキュラージェネティック（Hum. Mol. Genet.）、１０巻、ｐ．２３０１；コックス等（Cox, et al.）、（２００４年）、ダイベテス（Diabetes）、５３巻、ｐ．１９参照）。
【０１９７】
インスリン分解酵素（IDE）はゲノム走査により染色体１０に位置することが見いだされた他の強力な候補２型糖尿病感受性遺伝子である。IDEはインスリンのタンパク質分解が、恐らくインスリン応答の終了の一部として関与する。ＣＡＬＰ−１０のように変異型のIDEを起こす疾患は発見されていない。
【０１９８】
IDE内の異なるアミノ酸をコード化するヌクレオチド変化物のエクソン位置を表５に示す。コード配列変異体はＮＣＢＩデータベースを検索した。表に示すようにエクソン３は、位置２９８で代替えアミノ酸のフェニルアラニン又はロイシンをコード化するヌクレオチド配列差異物を含む。更にアミノ酸のロイシン又はフェニルアラニンは、アミノ酸位５８２でエクソン５内に位置するヌクレオチド変化物によりコード化できるか、又はアミノ酸位８５４のセリン又はグリシンがエクソン１１内のヌクレオチド差異によりコード化できる。アスパラギン又はアスパラギン酸はアミノ酸位９４７でエクソン２０に含まれる配列変異体によりコード化できる。
【０１９９】
位置２９８、５８２、８４５及び９４７の代替えアミノ酸をコード化し、それぞれエクソン３、エクソン５、エクソン１１及びエクソン２０に位置するヌクレオチド配列差異物の分布は、表４に示した代替え対立遺伝子のいずれか二つにヘテロ接合な被験者のハイブリッド型ＩＤＥの合成に必要な構造的基準を満たす。例えばエクソン１１とエクソン２０でだけコード化される対立遺伝子を参照すると、位置８４５と９４７でのアミノ酸の組み合わせとしては、（a）セリン／アスパラギン、（ｂ）セリン／アスパラギン酸、（ｃ）グリシン／アスパラギン及び（ｄ）グリシン／アスパラギン酸が挙げられる。これら組み合わせの内二つは野生型酵素を反映する一方、他の二つはハイブリッド型の酵素を含む。
表５  代替えＩＤＥ対立遺伝子でアミノ酸差異物をコード化したヌクレオチド変化物のエクソン位置
【表５】
2009502143.tif 000007
【０２００】
実施例９  新規生化学経路による哺乳類ＨＤモデルとしての血栓塞栓症
ループス抗凝固因子を発生する全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に罹った患者は血栓塞栓症に罹りやすい。血栓塞栓症の発生は血液凝固系の不可欠部である血小板の不適切な活性化によると考えられる。ＳＬＥ患者では血小板がその表面のＦｃガンマＩＩa受容体と結合した免疫複合体の循環によるか、又はこれらに対抗する自己抗体により活性化される。
【０２０１】
最近の研究の結果（シャルモーザー等（Schallmoser et al.）、（２００５年）、スランボシスヘマスタシス（Thrombosis Haemostasis）、９３巻、ｐ．５４４）により、ルーパス抗凝固因子を有する患者が代替え対立遺伝子型のＦｃガンマＩＩaにヘテロ接合である場合には、その患者は血栓塞栓症発生がより起こり易いことが示された。
【０２０２】
代替え対立遺伝子形のＦｃガンマＩＩaの異なるアミノ酸をコード化するヌクレオチド変異でのエクソン位置を表６に示す。
【０２０３】
コード配列変異体はＮＣＢＩデータベースを検索した。表６に示すようにエクソン１はＦｃガンマＩＩaのアミノ酸位６１でアルギニン又はグルタミンのいずれかをコード化出来る一方、エクソン２はアミノ酸位１３８でバリン又はメチオニンをコード化し、且つアミノ酸位１６５でアルギニン又はヒスチジンのいずれかをコード化出来る。エクソン３はアミノ酸位２７２でプロリン又はロイシンをコード化できる。
【０２０４】
ここに記載の該発明に従うと位置６１、１３８、１６５及び２７２でのアミノ酸の組み合わせにより、最低で二個の野生型タンパク質と最低で少なくとも六個のハイブリッドタンパク質を形成できる。
表６  代替えＦｃガンマＩＩＡ対立遺伝子でのアミノ酸差異物をコード化するヌクレオチ変化物のエクソン位置
【表６】
2009502143.tif 000008
【０２０５】
実施例１０  ＨＶでの新規生化学経路の役割を支持する植物モデル
カタラーゼ１（Ｃａｔ−１）は植物での過酸化水素崩壊で重要な役割を果たす酸化還元型酵素である。トウモロコシでは少なくとも六つの異なる対立遺伝子型Ｃａｔ−１が同定され、その大部分はアミノ酸組成が異なる。
【０２０６】
１９７２年にハイブリッド型のＣａｔ−１が二つの異なる対立遺伝子型のＣａｔ−１にヘテロ接合な植物が同定された（スキャンダリオス等（Scandalios et al.）、（１９７２年）、アーカイブバイオケミストリーバイオフィジクス（Arch. Biochem. Biophys.）、１５３巻、ｐ．６９５）。ハイブリッドＣａｔ−１酵素はホモ接合な親型のいずれかに比べ、一連の増強された生化学的物性を持つことが示された。
【０２０７】
新規生化学経路により重合体型酵素の形成に依存しない野生型に比べ、生化学的物性が増強されたハイブリッドＣａｔ−１分子形成に関し真実性のある説明が提供される。
【０２０８】
実施例１１  ＨＶでの新規生化学経路の役割を支持する昆虫モデル
オクタノールデヒドロゲナーゼ（odh）はウスグロショウジョバエ及び他のハエに見られる酵素をコード化する。これは長鎖アルコールの代謝が関与する。二つの構造的に異形の酵素odhで、電気泳動移動度の差異に基づくＦとＳが同定された。１９７２年にウイルス（Wills）、ニコルス（Nichols）（プロシーディングオブナショナルアカデミーオブサイエンス、ユーエスエイ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、６９巻、ｐ．３２３（１９７２年））は、二つの構造的に異形なodhのそれぞれでのヘテロ接合性が、オクタノール含浸培地で発生のハエ生存に雑種的役割を果たすことが示された。雑種ヘテロ接合odhハエは各代替え型odhにそれぞれホモ接合性なその親のいずれにも見られない新規構造型の酵素を有する。新規生化学経路によりこの酵素の多量体化に依存しないヘテロ接合ハエでの新規構造型odhの形成に関し真実性のある説明が提供される（シン等（Singh et al.）、ジェネティック（Genetics）、８０巻、ｐ．６３７（１９７５年）参照）。
【０２０９】
実施例１２  ハイブリッドアルギニノコハク酸分解酵素（ＡＳＬ）分子の同定
以下に概説するように活性アルギニノコハク酸分解酵素（ＡＳＬ）は、異なる変異誘発遺伝子それぞれの野生型コード化エクソンを同一ｍＲＮＡ分子へ新規に同定の生化学的経路により含めることで影響を受けた親の子孫に産生出来ることを証明することが可能である。
【０２１０】
以前の研究によりＡＳＬ（Ｄ８７Ｇ）とＡＳＬ（Ｑ２８６Ｒ）のような不活性ＡＳＬ変異体の組み合わせがヘテロ接合型で受け継いだ場合には、活性は一部保持されることが示された。それ故二つの不活性変異誘発遺伝子型ＡＳＬのそれぞれを受け継いでいることが証明された被験者の線維芽細胞又は肝臓からｍＲＮＡが単離出来る。次いでそれぞれのエクソンにまたがるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて全ｍＲＮＡを逆転写ＰＣＲに付すことができる。次いでこれらの領域を含む逆転写ＰＲＣ産物をクローンし、配列決定する。
【０２１１】
ＡＳＬ（Ｄ８７Ｇ）／（Ｑ２８６Ｒ）として遺伝子同定した被験者の逆転写ＰＣＲ産物で産生したクローンの約８５％では、先ずＡＳＬの両アレン発現とシス構造のエクソンが確認されるであろう。しかしクローンの約１５％の挿入断片配列は、同一クローンの二つの親対立遺伝子のそれぞれによる遺伝子を含み、その結果酵素活性を説明する約１５％の野生型酵素を産生するであろう。
【０２１２】
実施例１３  ハイブリッドＧＡＤ６５分子とＧＡＤ６５自己抗体産生との関連
全ｍＲＮＡは１型糖尿病を患う患者から得た膵臓組織の島細胞から抽出できる。患者が非同義アミノ酸をコード化する異なるエクソンでのヌクレオチド変化物を有するＧＡＤ６５対立遺伝子にヘテロ接合な場合（表３参照）には、その患者は彼又は彼女の血液に高力価のＧＡＤ６５自己抗体を有するであろう。
【０２１３】
次いで膵臓ｍＲＮＡの全てを患者のＧＡＤ６５遺伝子型に従い、エクソン１、エクソン４、エクソン６、エクソン８又はエクソン１０にまたがるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、逆転写ＰＣＲに付すことが出来る。
【０２１４】
クローンの約８５％の挿入断片配列としては、二つの対立遺伝子型のそれぞれの両アレン発現とシス構造のエクソンが確認されることが予期される。クローンの別の１５％の配列は、上に定義の異なる対立遺伝子型ＧＡＤ６５にヘテロ接合で、その血液中に循環ＧＡＤ６５自己抗体を有する１型糖尿病を患う患者の島細胞で、ハイブリッド型ＧＡＤ６５が合成されることを確認する挿入断片を含むことが予期されるであろう。
【０２１５】
研究中の子孫が上に定義の対立遺伝子を有する遺伝子を受け継いだことがわかり、その遺伝子が発現される組織又は細胞の同定された場合には、全種に同一実験的原理が適用できる。
【０２１６】
上に含まれる方法論は実施例にしか過ぎないことを意味し、当業者になじみのいずれの他技術又は実験的プロトコルの使用が排除されるものではない。
【国際調査報告】
2009502143.tif 000009
2009502143.tif 000010
2009502143.tif 000011