(57)【要約】本発明は、ＣＴＢとして公知のコレラ毒素サブユニットＢからなる粘膜アジュバントと組み合わせた、細菌に感染した患者の血清によって認識されるＣＬＥとして公知の共通直線状タンパク質エピトープを含む、腸管毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）によって生じる感染症に対する使用のための鼻腔内ペプチドワクチンに関する。本発明は、腸管毒素原性大腸菌のＣＦＡ／Ｉ線毛の直鎖状配列に位置する２０アミノ酸を含むペプチドに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
末端システインを含み、配列番号１から成るペプチドＣＬＥであって、哺乳類に経鼻投与された場合に、パイエル板、鼠径部リンパ節、頸部リンパ節および脾臓において、ＥＴＥＣによって生じる疾患からの防御性を付与する免疫反応を生じさせる、ペプチドＣＬＥ。
【請求項２】
該末端システインが、ペプチドＣＬＥに対して安定性を増加させ、哺乳類の免疫系の受容体に対する認識を促進する２量体、３量体および５量体形成能を付与する、請求項１に記載のペプチドＣＬＥ。
【請求項３】
免疫反応が、ＣＤ４＋Ｔリンパ球およびＣＤ８＋Ｔリンパ球の増加から成る、請求項１に記載のペプチドＣＬＥ。
【請求項４】
ＣＤ４＋Ｔリンパ球の該増加が、パイエル板において約２倍高い、請求項３に記載のペプチドＣＬＥ。
【請求項５】
免疫反応が、頸部リンパ節および鼠径部リンパ節におけるサイトカインの産生の増加から成る、請求項１に記載のペプチドＣＬＥ。
【請求項６】
該サイトカインのＩＬ−４およびＩＬ−１０が、ＥＴＥＣ疾患に対する液性防御を発現させるＴｈ２反応を提供する、請求項５に記載のペプチドＣＬＥ。
【請求項７】
経鼻投与のための、薬学的に許容される賦形剤中にアジュバントと組み合わせた配列番号１と呼ばれるペプチドＣＬＥから成る、ＥＴＥＣによって生じる疾患に対するワクチン組成。
【請求項８】
該アジュバントと該ペプチドの組み合わせが、ＥＴＥＣ疾患に対する免疫の防御反応を相乗的に強めることを可能にするような比率となっている、請求項７に記載のワクチン組成。
【請求項９】
該アジュバントが、好ましくはＣＴＢであり、アジュバント１容に対してペプチド８容の比率となっている、請求項７に記載のワクチン組成。
【請求項１０】
該経鼻投与が、粘膜免疫系から遠位部位における防御性を提供する、請求項７に記載のワクチン組成。
【請求項１１】
相乗的な防御免疫反応が、ＣＤ４＋Ｔリンパ球反応を誘導する能力、ならびにＥＴＥＣによって生じる疾患に対する液性型の免疫反応を刺激するＩＬ−４およびＩＬ−１０といったサイトカインの産生を生じさせる能力に基づく、請求項７に記載のワクチン組成。
【請求項１２】
免疫系から遠位の前記部位が、パイエル板、鼠径部リンパ節および脾臓である、請求項１０に記載のワクチン組成。
【請求項１３】
薬学的に許容される賦形剤中にアジュバントをともなう配列番号１と呼ばれるペプチドＣＬＥ組成から成る、ＥＴＥＣ疾患に対する鼻腔内ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクチン接種のためのペプチドの使用に関し、具体的には、粘膜中の免疫反応を誘導するペプチドに関し、より具体的には、腸管毒素原性大腸菌によって引き起こされた疾患に対する哺乳類における防御免疫反応を誘発する鼻腔内ワクチン組成に含まれるペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在のところ、世界中で毎年１５億例を超える下痢症例が生じ、そのうち３００万が死亡すると推測される。下痢症例の総数のうちの、２億１０００万は細菌の腸管毒素原性細菌大腸菌（以下ＥＴＥＣと呼ばれる）によって引き起こされ、これらの症状のうちの３８０，０００症例は死亡に帰結する（非特許文献１）。この微生物によって引き起こされる下痢はすべての年齢のグループに生じるが、特にこの疾患が栄養失調に付随して生じる場合、死亡は５歳未満の子供においてより一般的であり、そのため開発途上国は特に影響を受ける。この細菌はいわゆる旅行者下痢の主要な病因でもまたある。  
【０００３】
ＥＴＥＣは、主に汚染された飲料または食物を通して経口的に感染し、細菌は、小腸に達するまで胃の酸性条件を克服し、そこでその定着因子抗原（ＣＦＡとして公知である）により腸粘膜に付着し、下痢の原因因子である、ＬＴとして公知の易熱性腸管毒素、および耐熱性毒素すなわちＳＴの、主として２つの腸管毒素を放出する。（非特許文献２）。  
【０００４】
２０を超える異なるＣＦＡが当該文献に記述されており、メキシコを含む世界中で下痢に罹患する患者から単離されたＥＴＥＣ株のうちの５０〜７５％で検出されたので、これらのうちの３つはより蔓延しているものとして同定され、それらは何人かの著者によって報告されたＣＦＡ／Ｉ、ＣＦＡ／ＩＩおよびＣＦＡ／ＩＶとして公知であり、大多数はファミリーＣＦＡ／Ｉに分類される。（非特許文献２〜４）。ＣＦＡのこれらのタイプは、細菌に対する防御免疫を誘導し、それらは効果的なワクチンの開発のための戦略の中で最も重要なものとして指摘される。（非特許文献５、６）。  
【０００５】
ＥＴＥＣの疫学的重要性のために、多くの取り組みが効果的で安全なワクチンの入手による疾患の防止に向けられた（非特許文献７）が、今日までこれらの努力は不成功であり、これらの要求を満たす製品は市場にまだ出ていない（非特許文献１）。  
【０００６】
開発中であり、異なる地域のヒトの健康なボランティア被験者に対する治験の段階へ移行したワクチンの１つは、スウェーデンのヨーテボリ大学（University of Gotemburg）で作られ、そのすべてが地球規模において最も疫学的に重要なＣＦＡを発現するＥＴＥＣの５つのホルマリン不活性化株と組み合わせたコレラ毒素のサブユニットＢに基づく。（非特許文献８）。  
【０００７】
ワクチンの開発のための他の戦略は、メリーランド大学（University of Maryland）のワクチン開発センター（Center for Development of Vaccines）ＣＶＤにおいて達成された研究で見られるように、ＥＴＥＣからの定着因子および腸管毒素の発現のためのベクターとして赤痢菌を利用した生細菌の使用に焦点を合わせてきた。（非特許文献９）。  
【０００８】
最近では、ワクチンは、ＣＳ６として公知の大腸菌の表面成分およびＬＴとして公知の易熱性毒素を含む経皮的な免疫処置のためのパッチを使った投与の新技術により作られ、それはＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ１によってそれぞれ特徴づけられるＴｈ１タイプおよびＴｈ２タイプの免疫反応が決定されたヒトのボランティア被験者において既に検査されている（非特許文献８、１０〜１２）。しかしながら、異なる地域における疾患の流行によって示されるように、定着因子に対する免疫反応は一貫性がなかった。  
【０００９】
ミクロスフェア中に封入された定着因子によって形成されたワクチン、または植物のタバコ、じゃがいも、トマトおよびバナナにおけるＬＴのサブユニットＢの発現を使ったものを含む開発済みの他のタイプの方法があるが、これらの方法は非常に高価であり、それにもかかわらず付与される防御性は低い。  
【００１０】
別のオプションは、より広範囲のスペクトルを提示し、ＥＴＥＣ感染からの防御レベルを増加するＣＦＡからの免疫優勢配列の共通直線状エピトープにより作られたワクチンでありえる。（非特許文献１３、１４）。  
【００１１】
異なるタイプのワクチンがＥＴＥＣによって引き起こされる下痢に対して評価されてきたこと、およびこれらのワクチンの多くはＥＴＥＣ感染に対する防御効果を示すが、それらのいくつかは特定の副作用を示すことについて我々は一般的に詳しく述べることができる。ＥＴＥＣに対するワクチンのデザインにおいて考慮されるべき別の重要な問題は、異なる定着因子の普及度におけるばらつきであり、異なるＥＴＥＣ血清型に対する効果的かつ安全なワクチンをデザインする我々の動機となった。  
【００１２】
経鼻投与はＥＴＥＣに対するワクチンの付加的な選択肢になりえ、付加的な利点を追加し、他のワクチンへの優位性を提供するだろう。この点において、ＭＡＬＴとして公知の粘膜関連リンパ組織は共通のシステムであり、すなわち誘導部位として公知の粘膜の特定の部位における刺激は、反応を局所的なレベルで遠隔でまたは作用部位において誘発することを実証する多数の研究が行なわれ、このことは非常に容易とした経粘膜的な投与形式によるワクチンのデザインにおいて大きな利点を示した。（非特許文献１５）。投与経路としての鼻腔内経路の使用は、高度に血管が発達した大きな面の存在の主要な長所として、リスクをともなう注射器の使用の除外、経口経路と比較した場合の投与用量の減少および副作用の減少、容易な投与、比較的短時間における多人数への適用、ならびに免疫反応の抗体および細胞の誘導を有している。（非特許文献１６）。経鼻投与が、腸レベルで分泌型ＩｇＡの産生を刺激することができることを実証する研究があり、これらは腸内病原菌に対する防御を目的としたワクチンの開発における大きな利点を提供する（非特許文献１７）。  
【００１３】
粘膜レベルでの免疫性を向上させるワクチン療法は、アジュバントと共にこれらの代替経路の使用を含む。（非特許文献１３）。最近では、鼻粘膜は、腸粘膜、呼吸器粘膜および生殖器粘膜におけるような粘膜のレベルでの免疫反応を局所的におよび遠位で増加させることを示す誘導部位として使用されている。リンパ組織関連粘膜への特定の抗原の投与は、粘膜から遠位部位における免疫反応を誘発する方法である。（非特許文献１１、１８）。    
【非特許文献１】世界保健機構（ＷＨＯ）「新しいワクチンの最先端技術、ワクチン研究のための研究開発イニシアチブ」（"State of the art of new vaccines Research & Development Initiative for Vaccine Research"）、ジュネーブ、２００３年４月
【非特許文献２】Gaastra W, Svennerholm AM.、「ヒト腸管毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）の定着因子」（"Colonization factors of human enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC)"）、Trends in Microbiology. 1996; 4(11): 444- 452
【非特許文献３】Lopez-Vidal Y, Calva JJ, Trujillo A, Ponce de Leon A, Ramos A, Svennerholm A-M, Ruiz-Palacios GM、「腸管毒素原性大腸菌の腸管毒素および付着因子はコミュニティーにおける急性下痢に対する危険要因であるのか？」（"Enterotoxins and adhesins of enterotoxigenic Escherichia coli; are they a risk factor for acute diarrhea in the community?"）、J Infect Dis 1990; 162:442-447
【非特許文献４】Steinsland H, Valentiner-Branth P, Gjessing HK, Aaby P, Molbak K, Sommerfelt H、「腸管毒素原性大腸菌への自然感染からの防御：縦断的研究。」（"Protection from natural infections with enterotoxigenic Escherichia coli: Longitudinal study."）、The Lancet. 2003;362
【非特許文献５】Middlebrook JL, Dorland RB、「細菌毒素：細胞の作用機序。」（"Bacterial Toxins: Cellular mechanisms of Action."）、Microbiological Reviews. 1984; 48(3): 199-221
【非特許文献６】McConell MM, Hibberd ML, Penny ME, Scotland SM, Cheasty T, Rowe B、「可能な定着因子についての３つの異なる地理的領域からのヒト腸管毒素原性大腸菌の調査」（"Surveys of human enterotoxigenic Escherichia coli from three different geographical areas for possible colonization factors."）、Epidemiol. Infect. 1991; 106: 477-484
【非特許文献７】Levine MM, Kaper JB, Black RE, Clements AM、「ワクチン開発に適用される細菌の腸管感染症の病因についての新しい知識」（"New Knowledge on Pathogenesis of Bacterial Enteric Infections as Applied to Vaccine Development."）、Microbiological Reviews. 1983; 47(4):510-550
【非特許文献８】Quadri F, Ahmed T, Ahmed F, Sack B, Sack A, Svennerholm AM、「１８〜３６月齢のバングラデシュの子供におけるコレラ毒素Ｂサブユニットワクチンを加えた経口不活性化腸管毒素原性大腸菌の安全性および免疫原性」（"Safety and Immunogenicity of an oral, inactivated enterotoxigenic Escherichia coli plus cholera Toxin B subunit vaccine in Bangladeshi children 18-36 months of age."）、Vaccine 2003;21 :2394-2403
【非特許文献９】Barry EM, Altboum Z, Losonsky G, Levine MM、「弱毒化された赤痢菌ワクチン株において発現される、複数の腸管毒素原性大腸菌線毛および変異ＬＴに対して誘発された免疫反応」、（"Immune responses elicited against multiple enterotoxigenic Escherichia coli fimbriae and mutant LT expressed in attenuated Shigella vaccine strains."）、Vaccine 2003;21:333-340
【非特許文献１０】Wenneras C, Firdausi Q, Prodeep KB, Bladley S and Svennerholm A-M、「腸管毒素原性大腸菌に感染した患者、およびワクチン被接種者における腸の免疫反応」（"Intestinal Immune Responses in patients Infected with Enterotoxigenic Escherichia coli and in vaccinees."）、Infect. Immun. 1999; 66:3311-3316
【非特許文献１１】Byrd, W., and F. J. Cassels、「変異易熱性腸管毒素を併用および非併用投与した腸管毒素原性大腸菌定着因子ＣＦＡ／ＩおよびＣＳ６を使用するＢＡＬＢ／ｃマウスの粘膜免疫処置」（"Mucosal immunization of BALB/c mice using enterotoxigenic Escherichia coli colonization factors CFA/I and CS6 administered with and without a mutant heat-labile enterotoxin."）、Vaccine 21:1884-1893  2003年
【非特許文献１２】Helander A, Wenneras C, Quadri F, Svennerholm AM、「腸管毒素原性大腸菌の大腸菌表面抗原６に対するヒトにおける抗体反応」（"Antibody Responses in Humans against Coli Surface Antigen 6 of Enterotoxigenic Escherichia coli."）、Infection and Immunity. 1998; 66(9):4507-4510
【非特許文献１３】Lopez-Vidal Y、"Epitopos continuos y comunes presentes en las fimbrias de Escherichia coli enterotoxigenica (ETEC)."、Gac. Med. Mex.1997; 133 (6): 511-525、
【非特許文献１４】Dominguez M、「ハムスターにおける腸管毒素原性大腸菌感染に対する鼻腔内ワクチン療法としての定着因子抗原性Ｉペプチド」（"Colonization Factor Antigenic I Peptide as Intranasal Vaccine Approach against enterotoxigenic Escherichia coli infection in hamsters."）、5th National Symposium, Basic Aspects of vaccines, 1999
【非特許文献１５】Cripps AW, Kyd JM, Foxwell AR、「ワクチンと粘膜免疫」（"Vaccines and Mucosal immunization."）、Vaccine 2001;19:2513-2515
【非特許文献１６】Zuercher AW、「上部気道免疫」（"Upper Respiratory Tract Immunity."）、Viral Immunology 2003;3;279-289
【非特許文献１７】Hong-Yin Wu, Russell MW、「アジュバントとして組み換え型コレラ毒素Ｂサブユニットを使用する経鼻免疫処置による、粘膜および全身的な免疫反応の誘導」（"Induction of mucosal and systemic immune responses by intranasal immunization using recombinant cholera toxin B subunit as an adjuvant"）Vaccine 1998;16(2/3):286-292
【非特許文献１８】Van Ginkel FW, Nguyen HH, McGhee JR、「新興感染症に有効な粘膜免疫のためのワクチン」（"Vaccines for Mucosal Immunity to Combat Emerging Infectious Diseases."）、Emerging Infectious Diseases. 2000; 6(2):123131
【非特許文献１９】Lopez-Vidal Y、「腸管毒素原性大腸菌の定着因子抗原(疫学的研究のためのモノクローナル抗体および方法)」（"Colonization Factor antigens of Enterotoxigenic Escherichia coli (Monoclonal Antibodies and Methods for Epidemiological Studies)"）、1990.スウェーデン  ヨーテボリ。博士論文
【非特許文献２０】Arredondo LJ, Zaragoza S, Dominguez M, Willms K, Lopez-Vidal Y, Cravioto A、 "Desarrollo de un nuevo Modelo Animal Experimental Hamster Sirio Dorado para el estudio de la infeccion por Escherichia coli enterotoxigenica (ETEC)."、Enf Infec Microbiol. 1997; 17(2):43-46）
【発明の開示】
【００１４】
上記のために、広域的にかつ迅速で容易な適用を可能にする投与経路を介して適用することができＥＴＥＣ感染に対して効果的なワクチンを重視することに、いまだに深い関連があり、それは生じるであろう副作用を最小限にすることができた。  本発明は、前記細菌に感染した患者の血清によって認識することができる、異なったＥＴＥＣ定着因子からの共通直線状タンパク質エピトープを含む、経鼻投与が可能なペプチドワクチンに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
図１は、ＣＬＥ、ＣＴＢまたは当該ワクチンにより免疫処置されたマウスおよび対照群から得られた、免疫処置後ＥＴＥＣ  Ｈ１０４０７に感染させた結果の要約を示し、ＥＴＥＣ排泄の％が示され：−は陰性に相当、＋は２５％に相当、＋＋は５０％に相当、＋＋＋は７５％に相当、および＋＋＋＋は１００％に相当し、下痢の発生に関して：０＝下痢無し、１＝糞便の硬さは消失するが、尾は濡れていない、２＝肛門周囲の領域および尾が濡れている、および３＝濡れた尾部、足および下腹部および不活発な様子をともなう。この図において、開発したワクチンが下痢の兆候に加えて、細菌の排泄を減少させる能力を有していることがわかり、これは感染後３日目において明らかである。  
【００１６】
図２は、ＣＬＥ、ＣＴＢまたは当該ワクチンにより免疫処置され、その後ＥＴＥＣ  Ｈ１０４０７に感染させたマウスおよび対照群の免疫処置後の脾臓およびパイエル板から得られた細胞のＣＤ４＋Ｔリンパ球およびＣＤ８＋Ｔリンパ球の亜集団に対応する結果を示し、ＣＤ４＋Ｔリンパ球およびＣＤ８＋Ｔリンパ球の最も高い割合が、脾臓およびパイエル板両方においてワクチン接種したグループで得られることが概ねわかる。  
【００１７】
図３は、ＣＬＥ、ＣＴＢまたは当該ワクチンにより免疫処置されたマウスの脾臓、鼠径部リンパ節、頸部リンパ節およびパイエル板から得られたワクチンに特異的なリンパ球の細胞内サイトカインを産生する細胞の割合を分析した総合的なグラフを示す。グラフから、ワクチン接種した動物について、検査したすべての器官においてサイトカインのＩＬ−４およびＩＬ−１０が主に産生されたことが観察できるが、ＩＮＦ−γの少量の産生もまた観察された。  
【００１８】
図４は、ワクチン投与後のシリアンゴールデンハムスターのモデルにおけるＣＦＡ／Ｉを発現するＥＴＥＣ感染の評価を示し、ワクチン接種した動物において、対照群と比較した場合、病気のハムスターの割合および下痢の継続期間の双方に減少があることが観察でき、ＥＴＥＣ排泄期間の減少があることもまた観察できる。  
【００１９】
図５は、ＥＴＥＣ  ＣＦＡ／Ｉ感染の１１日後に、ワクチン接種したハムスターおよび対照からのＥＴＥＣのＣＬＥおよびＣＦＡ／Ｉに対するＩｇＧ抗体のレベルを示し、ここでワクチン接種後の動物においてＣＬＥに対するＩｇＧ抗体力価の有意な増加が生じることがわかる。  
【００２０】
図６は、ＥＴＥＣ感染の８日後にワクチン接種したハムスターおよび対照における、ＣＬＥ、ＣＦＡ／Ｉ、ＣＦＡ／ＩＩ、ＣＴＢおよびＬＴに対する抗体力価を示し、ワクチン接種後に、ＣＬＥ、ＣＦＡ／Ｉ、ＣＦＡ／ＩＩ、ＣＴＢおよびＬＴに対する抗体のより高い力価が生じたことが明らかにわかる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
このワクチンの開発のために、最初に、マウスのモデルおよびシリアンゴールデンハムスターのモデルにおいて、粘膜アジュバント（ＣＴＢとして公知のコレラ毒素Ｂサブユニット）に組み合わせた、ＣＬＥとして公知の直線状共通エピトープに誘発された免疫反応の特徴が解析された。線毛ＣＦＡ／Ｉ全体から始まって、ＣＬＥという名称の２０アミノ酸のペプチドアミノ酸が同定および研究され、該ペプチドは、本明細書において配列番号１として同定されるアミノ酸３３からアミノ酸５２までの腸管毒素原性大腸菌ＣＦＡ／Ｉ線毛の直鎖状配列中に位置し、該ペプチドは位置５３において末端システインを含んでおり、このシステインは、３７℃においては３量体が優勢であり、２量体、３量体および５量体といったタンパク質複合体を形成するために含まれ、該ペプチドが配置における安定性、および組織適合性主複合体からのクラスＩＩ受容体による認識を容易にする能力を有し、Ｔリンパ球受容体を増加することができるように、末端システインを含む。このペプチドは、ＥＴＥＣの主要な血清型に対する免疫の防御反応を誘発することができる。  
【００２２】
ＣＬＥの合成は従来の方法によって行なわれた。ＣＴＢはフランスのメリュー・ラボラトリー（Merieux Laboratory）から購入された。  
【００２３】
ペプチドＣＬＥの配列を解明するために、ＥＴＥＣの異なる線毛に対する共通の直線状エピトープの特性評価は、ＣＦＡ／Ｉと呼ばれる定着因子抗原Ｉの全体の配列にわたる連続的なオクタペプチドの合成によって、ペプチドの各々がＥＬＩＳＡプレートのウェルの各々に相当するように、ペプチドの合成がポリエチレンスティックにおいて行なわれるGeysenの方法を使用して実行された。このアレンジは、ＥＴＥＣ感染症に罹患した５歳未満の子供からの血清、風土病地域および風土病でない地域からの成人の血清、異なる定着因子を保有するＥＴＥＣ株によるウサギの免疫処置によって作られた高度免疫血清および抗ＣＦＡ／１モノクローナル血清に対する抗体による認識の研究を可能にした。分析はＥＬＩＳＡと同様に行なわれた。回復期にある子供からの大部分の血清は、オクタペプチドをすべて認識し、前記オクタペプチドの３つに対してより高い認識であり、風土病地域に属する成人からの血清もオクタペプチドを同様に認識した。しかし抗ＣＦＡ／１モノクローナル抗体はいかなるペプチドも認識しなかった。オクタペプチドの認識はエピトープとして明示された。  
【００２４】
高度免疫の異種血清によるＣＦＡ／Ｉ中の共通の連続エピトープの同定は非常に可変的であり、それは血清の各々に依存し、より高い類似性をともなう定着因子および示された交差抗原反応が、ＣＦＡ／Ｉであることが発見され、ＣＳ１、ＣＳ３、ＣＳ４と呼ばれる大腸菌の表面成分１、３および４、ならびに推定上の定着因子０１６６すなわちＰＣＦ０１６６、ならびに共通の直線状エピトープＣＬＥからの配列の一部はこれらのエレメント上に認識された。ＣＬＥが子供の自然感染後の血清の１００％、およびＥＴＥＣの風土病地域の成人の血清によって認識されたので、ＣＬＥが選択された。この発見から、コレラ毒素のサブユニットＢのＣＴＢをともなう定着因子のペプチドワクチンＣＬＥは、当研究所において開発され、このワクチンの投与は既に述べられている長所のために鼻腔内経路であった。  
【００２５】
ＣＬＥ構造の分析：配列番号１  円二色性：トリフルオロエタン中のＣＬＥの１００μｇ／ｍＬの溶液が、１ｃｍの光学経路をともなう石英セルを使用して、測定のために使用された。測定はＪＡＳＣＯ  Ｊ−７１５分光光度計において行なわれた。得られたスペクトルは５つの測定値の平均である。  
【００２６】
ｐＨ７．４および室温２０℃におけるＰＢＳ中のＣＬＥについての円二色性スペクトルは、二次構造の形成を示唆する。スペクトルは、ＣＦＡからのＣＬＥがアンテプロット（Antheprot）５．０ソフトウェアにおいて行なわれた二次構造の予測に合う、βシートの優勢な構造を有することを示す。  
【００２７】
動的光散乱：ｐＨ７．４の１０ｍＭ  ＰＢＳ中に希釈された１ｍｌの１ｍｇ
／ｍｌ  ＣＬＥが、５℃、１５℃、２５℃、３５℃および３７℃の異なる温度での動的光散乱を評価するために使用された。ＣＬＥの流体力学直径は、ゼッド・ズィサー・ナノ・シリーズ（Zed ziser nano series）（Ｍｃモルヴァーン、アメリカ）を使用して決定された。生理学的条件のｐＨおよび温度において、ＣＬＥは３量体構造形成能を有することが発見された。  
【００２８】
適切にＣＬＥの特徴を解析し、防御免疫反応を誘発する能力を評価して、本発明者は、ＣＬＥの成分中のそのような関係と一体化し、ＣＬＥの防御効果を高めることができるワクチン組成の開発を進め、本発明において、ＣＬＥは１容の適切なアジュバントに対して８容のＣＬＥの比率で粘膜における使用のために好ましくは使用され、この場合、アジュバントのＣＴＢは薬学的に許容される水性媒体において薬理学的に有効な用量で経鼻投与のために使用され、このアジュバントの使用は限定的ではなく、単に本発明のこの形式において選択されたようである。このワクチン組成中で使用される比率は、用いられるアジュバントに従って異なるだろう。  
【００２９】
以下の実施例は本発明のよりよい理解をもたらすために示され、それらは同様に本発明を限定するように意図されたものではない。
【実施例１】
【００３０】
ペプチドＣＬＥのＥＴＥＣに対する防御免疫反応を誘発する能力の実証  ペプチドＣＬＥを、無菌の６〜８週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに適用し、マウスを、各々において５匹の動物のいる群へ無作為に分けて配置した。配列番号１に対応するペプチドＣＬＥを、０日、７日および２８日目に、薬理学的に効果的な用量（この場合については、１匹のマウス当たり容量７．５μＬ中に５０μｇ／ｍＬ）にて鼻腔内に３回投与した。対照群には、リン酸緩衝液のＰＢＳを経口投与した。感染は、経胃経路でＥＴＥＣ株Ｈ１０４０７の６×１０８ＣＦＵの接種物を投与することによって、最終免疫処置の１週間後に行なわれた。  
【００３１】
付与された防御性を評価するために、糞便培養による糞便中のＥＴＥＣの排泄、およびＤマンノース存在下の赤血球凝集反応による同定といったパラメータが決定され（非特許文献１９）、下痢の兆候の有無の判定を、以下の尺度による重症度に従って評価した：０＝下痢無し、１＝糞便の硬さは消失するが、尾は濡れていない、２＝肛門周囲の領域および尾が濡れている、ならびに３＝濡れた尾部、足および下腹部および不活発な様子をともなう（非特許文献２０）。  
【００３２】
ＥＴＥＣ  Ｈ１０４０７への感染後７日目のマウスより、脾臓、頸部リンパ節、鼠径部リンパ節およびパイエル板の細胞が得られた双方の研究群に関して、得られた免疫反応の特徴についてもまた解析した。各器官から得られた調整細胞懸濁液を、ＣＬＥ抗原の存在下において増殖させた。  
【００３３】
細胞増殖の終了時に、細胞をＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８といった表面マーカーを同定するために、ならびにＩＦＮγ、ＩＬ−４およびＩＬ−１０といった細胞内のサイトカインの同定のために抗体を使用して標識した。細胞を標識した後、フローサイトメトリーで分析した。  
【００３４】
この結果は、ＥＴＥＣの排泄に関して、１日目の双方の動物群において、陽性の糞便培養が１００％で生じることが観察されることを示した。３日目において、陽性の糞便培養は、対照群については７５％、およびペプチドＣＬＥによって免疫処置された群において５０％であった。ＥＴＥＣ感染後のマウスにおける下痢の有無は、ＣＬＥによる免疫処置群および対照群についての糞便の硬さの変化によってのみ観察され、後者の群において４日目まで下痢が続いたが、５日目から糞便の硬さはすべてのマウスにおいて正常であった。これらの結果は、図１においてより詳細に理解することができ、概要としてＥＴＥＣ  Ｈ１０４０７感染後のマウスのその後の状態を示す。  
【００３５】
図２においてみられるように、免疫反応の評価に関しては、ＣＤ４＋Ｔリンパ球およびＣＤ８＋Ｔリンパ球の反応が、対照群と比較して、ＣＬＥにより免疫処置された群についてわずかに高かったことが発見され、対照群に関してはＣＤ４＋Ｔリンパ球の増加がパイエル板において約２倍だったことを強調しなくてはならない。  
【００３６】
サイトカイン反応に関しては、図３に示されるように、ＩＬ−４およびＩＬ−１０の優勢な産生はＣＬＥにより免疫処置された群において観察され、対照に比べて、ＣＬＥにより免疫処置された群において頸部リンパ節で約２．６倍のＩＬ−４の産生、および同じ器官で０．８倍のＩＬ−１０の産生の増加が観察された。
【実施例２】
【００３７】
アジュバントＣＴＢのＥＴＥＣに対する免疫反応を誘発する能力の実証  容量７．５μＬを経鼻投与することによって、マウスを６μｇ／ｍＬの割合でＣＴＢにより免疫処置し、対照群には実施例１において記述されている同じ方法に従ってリン酸緩衝液を経口投与した。  
【００３８】
得られた結果は以下のとおりである：ＥＴＥＣの排泄に対しては、１日目に対照群およびＣＴＢにより免疫処置された群の双方が１００％の陽性の糞便培養を示すことが観察された。３日目まで、陽性の糞便培養は、実施例１の観察されているＣＬＥにより免疫処置されたマウスにおいて得られたものと同様の反応であり、対照群について７５％およびＣＴＢにより免疫処置された群について５０％であった。ＣＬＥにより免疫処置されたマウスについて観察されたものと同様に、図１においてより詳細にみられるように、ＣＴＢにより免疫処置されたものは、３日目まで糞便の緩さを示したが、４日目の後には糞便の硬さはＣＴＢ群および対照群において正常だった。  
【００３９】
このことにより、ＣＴＢがＥＴＥＣによって生じる感染症に対する一定の防御性をもたらす能力を有していることは実証されたが、この防御は糞便の緩さといったマウスにおける疾患の兆候を打ち消すには十分ではない。図２においてみられるように、免疫反応に関しては、対照に比べて、ＣＴＢにより免疫処置された群の脾臓においてＣＤ４＋Ｔリンパ球の亜集団が０．４倍増加したことが観察されたが、ＣＤ８＋Ｔリンパ球亜集団は、検査した器官において対照群と非常に類似していた。サイトカインプロフィールは、対照群に関しては、頸部リンパ節において２．７倍、およびパイエル板において１．１倍の差でＩＬ−４の優先的な増加が観察されることを示した。しかしながら、図３においてみられるように、ＩＮＦ−γのかなりの反応は鼠径部リンパ節において得られた。このことは、ＣＴＢが鼻腔内経路によりマウスへ単独で投与される場合、ＣＴＢが免疫反応細胞の増加およびＩＦＮ−γのような優勢型Ｔｈ１のサイトカインを誘導し、その結果として免疫の細胞性反応を刺激することを実証し、ＥＴＥＣ感染に対する防御反応が液性型であると既に記述されている。
【実施例３】
【００４０】
配列番号１で同定されたペプチドＣＬＥを含む本発明において開発されたワクチンを、ＣＬＥ：ＣＴＢの８：１の比率で使用し、薬理学的に効果的な用量において経鼻投与し、この実例において、実施例１および実施例２と同じ方法に従って、６μｇ／ｍＬの用量のＣＴＢを追加した５０μｇ／ｍＬの最終濃度で容量７．５μＬを投与するように、実験動物の重量に対して調整した。  
【００４１】
得られた結果は以下の通りであった：ＥＴＥＣの排泄に対して、１日目においては、対照群およびワクチンにより免疫処置された群の双方は、１００％で陽性の糞便培養を示すことが観察された。３日目においては、陽性の糞便培養は、対照群について７５％、およびワクチンにより免疫処置された群について２５％だった。ＥＴＥＣ感染後のマウスにおける下痢の有無は、対照群については糞便の硬さの変化でのみ観察され、図１においてみられるようにワクチンにより免疫処置された群においてはこの事象は見られなかった。  
【００４２】
本発明において開発されたワクチンが、ＥＴＥＣにより引き起こされた下痢に対して付与された防御性について、ペプチドＣＬＥおよびアジュバントＣＴＢ間の相乗効果を示すと確定できた。対照群に関して、ワクチンで免疫処置された群は、脾臓において０．５倍およびパイエル板において５．７倍のＣＤ４＋Ｔリンパ球の増加を示した。図２においてみられるように対照群に比較した場合、この増加は、ワクチンで免疫処置された群のＣＤ８＋Ｔリンパ球についてもまた観察され、脾臓において０．１倍高く、パイエル板において１．８倍高かった。  
【００４３】
ＩＬ−４産生は、対照群と比較してワクチンで免疫処置された群については、主に脾臓および鼠径部リンパ節において、それぞれ１倍および２．８倍高いかなりの増加を示した。ワクチンで免疫処置された群について、頸部リンパ節およびパイエル板における反応は、対照群との比較において、それぞれ２．１倍および０．２倍高いＩＬ−４産生の増加を示した。  
【００４４】
ＩＬ−１０に対する反応に関しては、増加はＩＬ−４について観察されたそれよりも低かったが、このサイトカインの増加は、対照に関してすべての群において観察された。より高い増加を示した群は、対照群と比較して、ワクチンで免疫処置された実施例３の群であり、それらは脾臓、頸部リンパ節、鼠径部リンパ節およびパイエル板において、それぞれ１９．５倍、０．４倍、８倍および６．８倍多かった。ＩＬ−１０産生細胞の最も高い割合は、ワクチンで免疫処置された群の中で頸部リンパ節において得られ、８．１％高かった。  
【００４５】
最終的に、ＩＦＮ−γの生産細胞の割合はすべての検査器官において非常に低いが、対照群に関して１．５倍および４．３倍の増加が、頸部リンパ節および鼠径部リンパ節においてそれぞれ観察された。図３においてみられるように、脾臓およびパイエル板では、ＩＦＮ−γの反応における差は観察されなかった。  
【００４６】
これらの結果は、薬学的に許容される賦形剤において８：１の比率でＣＴＢをそれぞれ追加されたペプチドＣＬＥを含むワクチンの経鼻投与が、パイエル板のような免疫反応の部位におけるＴリンパ球、主としてＣＤ４＋Ｔリンパ球の防御反応を誘発する能力を有していることを示し、これらがＥＴＥＣ感染の標的部位である小腸に位置するので、これは非常に有用である。さらに、ワクチンにより、ＥＴＥＣにより生じる疾患に対する主要な防御となる、液性型の免疫反応を刺激するＴｈ２型の反応に特有なＩＬ−４およびＩＬ−１０といったサイトカインの産生が生じた。  
【００４７】
実施例１、２および３より得られた結果から、アジュバントを含む製剤にて投与される場合、鼻腔内経路によりマウスに投与されるときにＣＬＥにより付与された防御性が増すことを結論付けることができ、この実例においてワクチンのこれらの２つの成分間に相乗効果をもたらすのが、アジュバントＣＴＢである。実施例４  
【００４８】
６〜８週齢の雌のシリアンゴールデンハムスターに、用量６μｇ／ｍＬのＣＴＢを追加した、配列番号１に対応するペプチドＣＬＥの用量５０μｇ／ｍＬを、各成分の容量７．５μＬの投与によって経鼻免疫処置した。各ハムスターに、０日目、７日目および２８日目に免疫処置した。最初の免疫処置の前および最終免疫処置の７日後に、血液サンプルを眼窩後方経路により、および唾液のサンプルを口腔内にセルロースの小片を置いて回収した。ハムスター対照群に対しては、リン酸緩衝液を投与した。  
【００４９】
付与された防御性を評価するために、既に報告されたように、糞便培養による糞便中のＥＴＥＣの排泄、およびＤマンノース存在下の赤血球凝集反応による同定といったパラメータが決定され（非特許文献１８）、下痢の兆候の有無の判定は、以下の重症度に従って評価された：０＝下痢無し、１＝糞便の硬さは消失するが、尾は濡れていない、２＝肛門周囲の領域および尾が濡れている、ならびに、３＝濡れた尾部、足および下腹部および不活発な様子をともなう（非特許文献１９）。  
【００５０】
免疫の防御反応を評価するために、ＣＬＥ、線毛ＣＦＡ／Ｉ、ならびにＣＴＢおよびＬＴに対する抗体力価をＥＬＩＳＡにより決定した。および、これらの抗体がＣＦＡ／Ｉファミリーに属する異なる型の線毛を有す
るＥＴＥＣを凝集させる能力を決定するために、凝集能力の分析は、線毛ＣＦＡ／Ｉを発現するホルマリン不活性化細菌（１×１０８ＣＦＵ）の懸濁液、および該ワクチンにより免疫処置され、ＣＦＡ／Ｉを発現するＥＴＥＣに感染したハムスターの血清により実行された。さらに、ニュージーランドウサギにおける細胞透過性によって、コレラ毒素（ＣＴ）およびＬＴ（５μｇ／ｍｌ）に対して免疫処置され感染させたハムスターの血清抗ＣＴＢ抗体の中和活性が決定された。  
【００５１】
得られた結果は、ＥＴＥＣの排泄、および下痢の兆候の有無に関して、ＥＴＥＣによって引き起こされた下痢の継続期間の平均が、免疫処置されたハムスターよりも対照ハムスターにおいて３倍高いことを実証した。図４に示すように、ＥＴＥＣ排泄の平均割合は、対照群において２．５倍増加した。  
【００５２】
ＥＬＩＳＡを使った、ＣＬＥ、ＣＦＡ／Ｉおよび腸管毒素に対する抗体力価に関して、ワクチンにより免疫処置されたハムスターおよび対照ハムスターにおいて、ＩｇＧ抗体のレベルを、ＣＦＡ／Ｉを発現するＥＴＥＣに感染させた後に比較し、図５において示すように、差はＣＦＡ／Ｉではなく、ＣＬＥに対して顕著であることが示された。他方では、ＣＬＥ、ＣＦＡ／Ｉ、コレラ菌（Vibrio cholerae）のＣＴＢおよびＥＴＥＣのＬＴに対する高力価が検出された。図６において示されるように、これらの力価は、ＣＦＡ／Ｉを発現するＥＴＥＣへの経口感染前後において、一定のままであった。さらに、ＣＦＡ／Ｉを力価２．６およびＣＴＢに対する抗体を力価２で発現する細菌全体に対してこれらの抗ＣＬＥ抗体が著しく凝集できることが発見され、それらは１００％において毒素ＬＴおよびＣＴ（５μｇ／ｍｌ）の活性を中和することができた。  
【００５３】
これらの結果は、シリアンゴールデンハムスターのモデルにおいて、ＣＬＥ、ＣＦＡ／Ｉ、ＥＴＥＣのＬＴおよびコレラ菌のＣＴＢに対する高力価の抗体が生成されたので、ＥＴＥＣによって引き起こされた下痢に対する鼻腔内ワクチンの使用の有効性を示し、さらにこれらの抗体は、ＣＦＡ／Ｉを発現するＥＴＥＣによって引き起こされた下痢からの防御性をもたらすことができた。  
【００５４】
最後に、ＥＴＥＣは、乳児下痢症および地球規模の旅行者の重要な病因であるので、ＥＴＥＣの同定は、一つには、迅速かつその場の適切な治療を提供する必要性のために、研究所で通常行なわれないが、それにもかかわらず、本発明において開示された配列番号１のペプチドは、ＣＦＡ／Ｉファミリーに属するＥＴＥＣ株において免疫優勢エピトープとして発見され、そのような理由のために、このＥＴＥＣファミリーに対して特異的な診断試薬の開発および製造のための優れた候補になるだろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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