(57)【要約】  本発明は、高親和性および阻害機能を伴ってα５β１インテグリンと結合する組換えヒトまたはヒト化ポリペプチドに関する。さらには、該ポリペプチドの診断および医薬的適用を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１００ｎＭ以下の親和性でα５β１インテグリンに結合し、かつインビトロおよびインビボで受容体へのα５β１インテグリン−発現細胞の接着を阻害する、ヒト若しくはヒト化抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２】
１０ｎＭ以下の親和性でα５β１インテグリンに結合する、請求項１に記載の抗体または断片。
【請求項３】
インビトロでのＫ５６２細胞系の接着を阻害する、請求項１または２に記載の抗体または抗体断片。
【請求項４】
（ａ）以下の：
（ｉ）配列番号：１（ＭＯＲ０４６２４）、配列番号：３（ＭＯＲ０４０５５）のアミノ酸配列、またはＶＨ領域の１つの１Ｈ−ＣＤＲ１領域、Ｈ−ＣＤＲ２領域および／若しくはＨ−ＣＤＲ３領域の少なくとも１つ；または、
（ｉｉ）少なくとも１つのＨ−ＣＤＲ領域の変更により、配列（ｉ）に由来するアミノ酸配列、
より選択されるＶＨ−領域、および／あるいは、
（ｂ）以下の：
（ｉ）配列番号：２（ＭＯＲ０４６２４）、配列番号：４（ＭＯＲ０４０５５）のアミノ酸配列または該ＶＬ領域の１つのＬ−ＣＤＲ１領域、Ｌ−ＣＤＲ２領域および／またはＬ−ＣＤＲ３領域の少なくとも１つ；または、
（ｉｉ）少なくとも１つのＬ−ＣＤＲ領域の変更により、配列（ｉ）に由来するアミノ酸配列、
より選択されるＶＬ−領域、
を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体または断片。
【請求項５】
該Ｈ−ＣＤＲ２領域のランダム化により（ａ）（ｉ）のＶＨ−領域に由来するＶＨ−領域を含む、請求項４に記載の抗体または抗体断片。
【請求項６】
該Ｌ−ＣＤＲ３領域のランダム化により（ｂ）（ｉ）のＶＬ−領域に由来するＶＬ−領域を含む、請求項４または５に記載の抗体または抗体断片。
【請求項７】
抗体鎖の入れ替えにより、（ａ）（ｉ）のＶＨ−領域、および／または（ｂ）（ｉ）のＶＬ−領域に由来するＶＨ−および／またはＶＬ−領域を含む、請求項４〜６のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片。
【請求項８】
（ａ）配列番号：５（ＭＯＲ０４９７１）、配列番号：７（ＭＯＲ０４９７４）、配列番号：９（ＭＯＲ０４９７５）、配列番号：１１（ＭＯＲ０４９７７）、および配列番号：１１（ＭＯＲ０４９８５）のアミノ酸配列、あるいはＶＨ−領域の少なくとも１つのＨ−ＣＤＲ１領域、Ｈ−ＣＤＲ２領域および／またはＨ−ＣＤＲ３領域より選択されるＶＨ−領域、および／または、
（ｂ）配列番号：６（ＭＯＲ０４９７１）、配列番号：８（ＭＯＲ０４９７４）、配列番号：１０（ＭＯＲ０４９７５）、配列番号：１２（ＭＯＲ０４９７７）および配列番号：１４（ＭＯＲ０４９８５）のアミノ酸配列、あるいはＶＬ−領域の少なくとも１つのＬ−ＣＤＲ１領域、Ｌ−ＣＤＲ２領域および／またはＬ−ＣＤＲ３領域より選択されるＶＬ−領域、
を含む、請求項４〜７のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片。
【請求項９】
配列番号：１のＶＨ領域、および配列番号：２（ＭＯＲ０４６２４）のＶＬ領域、あるいは少なくとも１つのＨ−ＣＤＲ１−、Ｈ−ＣＤＲ−２、Ｈ−ＣＤＲ３−、Ｌ−ＣＤＲ１−、Ｌ−ＣＤＲ２−またはＬ−ＣＤＲ３−領域を含む、抗体または抗体断片。
【請求項１０】
配列番号：３のＶＨ領域、および配列番号：４（ＭＯＲ０４０５５）のＶＬ領域、あるいは少なくとも１つのＨ−ＣＤＲ１−、Ｈ−ＣＤＲ−２、Ｈ−ＣＤＲ３−、Ｌ−ＣＤＲ１−、Ｌ−ＣＤＲ２−またはＬ−ＣＤＲ３−領域を含む、抗体または抗体断片。
【請求項１１】
配列番号：５のＶＨ領域、および配列番号：６（ＭＯＲ０４９７１）のＶＬ領域、あるいは少なくとも１つのＨ−ＣＤＲ１−、Ｈ−ＣＤＲ−２、Ｈ−ＣＤＲ３−、Ｌ−ＣＤＲ１−、Ｌ−ＣＤＲ２−またはＬ−ＣＤＲ３−領域を含む、抗体または抗体断片。
【請求項１２】
配列番号：７のＶＨ領域、および配列番号：８（ＭＯＲ０４９７４）のＶＬ領域、あるいは少なくとも１つのＨ−ＣＤＲ１−、Ｈ−ＣＤＲ−２、Ｈ−ＣＤＲ３−、Ｌ−ＣＤＲ１−、Ｌ−ＣＤＲ２−またはＬ−ＣＤＲ３−領域を含む、抗体または抗体断片。
【請求項１３】
配列番号：９のＶＨ領域、および配列番号：１０（ＭＯＲ０４９７５）のＶＬ領域、あるいは少なくとも１つのＨ−ＣＤＲ１−、Ｈ−ＣＤＲ−２、Ｈ−ＣＤＲ３−、Ｌ−ＣＤＲ１−、Ｌ−ＣＤＲ２−またはＬ−ＣＤＲ３−領域を含む、抗体または抗体断片。
【請求項１４】
配列番号：１１のＶＨ領域、および配列番号：１２（ＭＯＲ０４９７７）のＶＬ領域、あるいは少なくとも１つのＨ−ＣＤＲ１−、Ｈ−ＣＤＲ−２、Ｈ−ＣＤＲ３−、Ｌ−ＣＤＲ１−、Ｌ−ＣＤＲ２−またはＬ−ＣＤＲ３−領域を含む、抗体または抗体断片。
【請求項１５】
配列番号：１３のＶＨ領域、および配列番号：１４（ＭＯＲ０４９８５）のＶＬ領域、あるいは少なくとも１つのＨ−ＣＤＲ１−、Ｈ−ＣＤＲ−２、Ｈ−ＣＤＲ３−、Ｌ−ＣＤＲ１−、Ｌ−ＣＤＲ２−またはＬ−ＣＤＲ３−領域を含む、抗体または抗体断片。
【請求項１６】
ヒト若しくはヒト化ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体の如きＩｇＧ抗体、あるいはＦａｂ、Ｆａｂ1またはＦ（ａｂ）2断片の如きその断片である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１７】
単鎖（ｓｃ）抗体の如き組換え抗体、あるいはｓｃＦｖ断片の如きその断片である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１８】
治療薬と結合した形態である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１９】
該治療薬が放射線療法薬および化学療法薬より選択される、請求項１８に記載の抗体または抗体断片。
【請求項２０】
該放射線療法薬がＩ125、Ｉ131またはＹ90である、請求項１９に記載の抗体または抗体断片。
【請求項２１】
融合ポリペプチドの形態である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片。
【請求項２２】
サイトカインとの融合タンパク質または二重特異性抗体である、請求項２１に記載の抗体または抗体断片。
【請求項２３】
検出可能な標識基の形態である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片。
【請求項２４】
該検出可能な標識基が、放射性標識基、ＮＭＲ標識基、色素標識基、酵素標識基および蛍光性標識基から選択される、請求項２３に記載の抗体または抗体断片。
【請求項２５】
該検出可能な放射性標識基が、Ｉ125、Ｉ131またはＹ90より選択される、請求項２４に記載の抗体または抗体断片。
【請求項２６】
活性薬剤として、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を含む、医薬組成物。
【請求項２７】
過剰増殖性疾患の予防または治療のための、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
癌の予防または治療のための、請求項２６または２７に記載の組成物。
【請求項２９】
結腸癌の予防または治療のための、請求項２６または２７に記載の組成物。
【請求項３０】
腫瘍の予防または治療のための、請求項２６または２７に記載の組成物。
【請求項３１】
診断試薬として、請求項１〜１７または２３〜２４のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を含む、診断用組成物。
【請求項３２】
過剰増殖性疾患またはその素因の診断のための、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３３】
癌またはその素因の診断のための、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
人間医学における使用のための、請求項２６〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３５】
請求項１〜１７若しくは２１〜２２のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片をコードする、核酸。
【請求項３６】
発現制御配列に動作可能に連結されている、請求項３５に記載の核酸。
【請求項３７】
請求項３５または３６に記載の核酸を含む、ベクターまたはベクター系。
【請求項３８】
請求項３５または３６に記載の核酸、あるいは請求項３７に記載のベクターによって形質転換された、細胞。
【請求項３９】
請求項３５または３６に記載の核酸、あるいは請求項３７に記載のベクターによって形質転換された、非ヒト生物体。
【請求項４０】
請求項３８に記載の細胞または請求項３９に記載の非ヒト生物体を、ポリペプチドが発現し該発現ポリペプチドが回収される条件下で培養する、請求項１〜１７または２１〜２２のいずれか１項に記載のポリペプチドの調製方法。
【請求項４１】
α５β１インテグリン関連疾患またはその素因における予防または治療用薬物の製造のための、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項４２】
癌の予防または治療用薬剤の製造のための、請求項４１に記載の使用。
【請求項４３】
α５β１インテグリン関連疾患またはその素因の診断用試薬の製造のための、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項４４】
癌の診断用試薬の製造のための、請求項４３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高親和性および機能阻害を伴ってα５β１インテグリンと結合する組換えヒトまたはヒト化ポリペプチドに関する。さらに、該ポリペプチドの診断および製薬的適用を開示する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生は、既存の血管から新しい血管が発達するプロセスである。新しい血管の発達は胚発生、創傷治癒、および女性の生殖周期を促進する。それはまた固形癌の病理学的発達および他の疾患、例えば血管腫、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性、乾癬、関節リウマチおよび骨関節炎の可能性および炎症性腸疾患において重要な役割を果たす（１）。
【０００３】
低酸素の腫瘍組織から放出された成長因子は新しい血管の発達を刺激する。成長因子およびそれらの受容体が血管新生における発芽において重要な役割を果たす一方で、細胞外基質（ＥＣＭ）への接着もまた血管新生における主要な制御因子となる。接着は、血管内膜増殖および移動と同様に、内皮細胞の生存を促進する（２−５）。特にＥＣＭタンパク質である、フィブロネクチンは、一時的な（腫瘍）基質内で発現し、血管細胞に対する増殖シグナルを提供する（２、３）。特に、フィブロネクチン−ゼロマウスは一連の欠損症より発生の初期段階で死に、それは不適切に形成された脈管構造も含む（６、７）。
【０００４】
実験的動物モデルおよび変異体マウスにおける研究は、フィブロネクチンのための最も重要な受容体であるα５β１インテグリンが血管新生の制御において重要な役割を果たすことを示している。このインテグリンの胎期欠損は、早期および到死性の間葉系異常を誘導し、これはインビトロでの脈管構造の出現における機構の欠落（８、９）および内皮細胞の血管的な構造の形成能の欠落を含む（１０、１１）。
【０００５】
α５β１インテグリンの発現は特に血管新生と関係がある：それは静止状態の内皮中においては検出可能ではないが、インビトロまたはインビボの増大腫瘍の血管新生脈管構造内（１２、２０、２１）において、血管新生成長因子に応答して発現する（３、４）。
【０００６】
Ｋｉｍら（３）は、マウス抗−α５β１インテグリン−機能阻害抗体ＩＩＡ１がインビボにおいて成長因子−誘導および腫瘍血管新生の両者共に阻害することを示すことができた。このインテグリンが拮抗された時の形質転換シグナルの研究は、非連結型の受容体はＰＫＡを活性化し、それが次にカスパーゼ３および８を活性化し、アポトーシスを誘導することを示している（２、１３）。
【０００７】
マウス抗体ＩＩＡ１（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  Ｃａｔ．Ｎｏ．５５５６１４）のヒト化誘導体を製造するための試みが行われてきた。結果として、Ｍ２００と呼ばれる８２％ヒト／１８％マウスのキメラｌｇＧ４モノクローナル抗体が産生された。さらに、Ｆ２００と呼ばれる、Ｍ２００の１価のＦａｂ−断片が作成され、黄斑変性症のカニクイザルモデルにおいて成功裏に試験された。しかしながら、Ｍ２００の完全ヒト化抗体誘導体を用意するためのさらなる試みは、生物活性の劇的な減少という結果になった（１４）。
【発明の概要】
【０００８】
ヒト医学において、Ｍ２００またはＦ２００等の如き、α５β１インテグリンに対する現時点で既知の抗体のいずれかの適用は、ヒト患者における免疫原性ヒト抗−キメラ抗体（ＨＡＣＡ）反応を誘導する危険性を有する。それゆえ、本発明の目的は、標的特異性および高生物活性および親和性を保つ一方で、存在するキメラ抗体と比較して免疫原性を減らすヒト抗−α５β１インテグリン抗体を提供することであった。
【０００９】
本発明によると、Ｆａｂ形式における完全ヒト抗体は、α５β１インテグリンの形質転換された細胞を用いるファージディスプレイによって、ＨｕＣＡＬ（登録商標）−Ｇｏｌｄ抗体ライブラリーから単離された。完全ヒト起源に起因してヒト患者において低免疫原性が期待される一方で、これらの抗体は高インビトロ活性を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】α５発現のためのＫ５６２細胞のＦＡＣＳ分析：生きているＫ５６２−細胞の細胞表面上におけるヒトα５β１インテグリンの発現を、機能阻害抗α５β１インテグリンマウスモノクローナル抗体ＩＩＡ１と共に示した（１４）。この目的のために、標準ＦＡＣＳ−手順を、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓによって提供されたＨｕＣＡＬ（登録商標）ＧＯＬＤ  Ｍａｎｕａｌに記載されるように使用した。
【図１Ｂ】ヒト結腸癌細胞系ＨＴ２９は、α５−インテグリン鎖を発現しない。ＦＡＣＳ分析は、ＨＴ２９細胞がα５−インテグリン鎖を発現しないことを実証し、一方、β１鎖は細胞表面に高密度で存在している。この理由から、ＨＴ２９細胞はα５−インテグリン鎖のトランスフェクションに優れて適している。
【図１Ｃ】ヒト結腸癌細胞系ＨＴ２９は、α５−インテグリンｃＤＮＡでのトランスフェクション後に、α５β１インテグリンを発現する。α５−インテグリン鎖でのトランスフェクション後、ＨＴ２９α５細胞の表面上でのα５β１インテグリンの相同発現を、機能阻害マウス抗ヒトα５β１−インテグリンモノクローナル抗体ＩＩＡ１を参照として用いるＦＡＣＳ分析によって示した。
【図２】フィブロネクチン−コート培養プレートへのＫ５６２細胞の接着阻害。カルセインが予め組み込まれているＫ５６２−細胞を、機能阻害（ＩＩＡ１）または非−阻害（ＶＣ５）抗α５β１インテグリンマウスモノクローナル抗体の存在下で、インキュベートした。フィブロネクチンへのＫ５６２−細胞のインテグリン−非依存性バックグラウンド結合を、１０ｍＭＥＤＴＡを用いて測定した。アッセイの全体的なバックグラウンドを、培養プレート表面へのＫ５６２細胞の接着を支持しないＢＳＡ阻害ウェル上で測定した。接着細胞（洗浄後）を溶解し、蛍光を測定した。
【図３】フィブロネクチンへのＫ５６２細胞のＦａｂ−媒介投与量−依存性阻害。抗ヒトα５β１−特異的Ｆａｂを、蛍光色素を伴うＫ５６２−細胞の固定化フィブロネクチンへの結合を阻害する能力について試験した。接着後、細胞を溶解し、蛍光を接着細胞用の方法で測定した。フィブロネクチン単独では最大の接着を示す一方で、アッセイの全体的なバックグラウンドはＢＳＡでコートされた細胞上で決定された。
【図４】抗α５β１−機能阻害抗体は内皮細胞においてアポトーシスを誘導する。一価の形式における精製Ｆａｂのカスパーゼ３／７活性化の誘導を、無血清内皮細胞培養液中のＨＵＶＥＣ細胞を用いて測定した。カスパーゼ活性を、メーカーの説明書に従って市販の化学発光アッセイ系（カスパーゼ  ＧＩｏ、ＰＲＯＭＥＧＡ）を用いて測定した。
【図５】ＦａｂおよびＩＩＡ１の競合ＦＡＣＳ。ＦＡＣＳ−競合は、ＭＯＲ０４６２４がＨＴ２９α５細胞上で参照抗体ＩＩＡ１のエピトープと競合することを示す。これにより結論づけられることは、両抗体が同様のエピトープを共有し、一方全ての他のＦａｂはα５β１インテグリンと無関係の結合部位と反応する。（黒線−Ｆａｂ結合、緑線−参照抗体ＩＩＡ１と競合した時のＦａｂ結合）。
【図６】親和性−成熟抗α５β１−機能阻害抗体は、内皮細胞におけるアポトーシスを強力に誘導する。一価の形式における精製Ｆａｂのカスパーゼ３／７活性化の誘導を、無血清内皮細胞培養液中のＨＵＶＥＣ細胞を用いて測定した。カスパーゼ活性をメーカーの説明書に従って市販の化学発光アッセイ系（カスパーゼＧＩｏ1  ＰＲＯＭＥＧＡ）を用いて測定した。
【図７】親和性−成熟抗α５β１−機能阻害Ｆａｂ抗体は、内皮細胞の増殖を阻害する。無血清内皮細胞培養液内の接着性ＨＵＶＥＣ細胞を、指定された量の精製Ｆａｂまたは参照抗体ＩＩＡ１の存在下で、４８時間インキュベートした。増殖細胞を、メーカーの説明書に従って市販のＸＴＴ−アッセイを用いて測定した。ＩＣ５０−値を測定し、表４にまとめた。
【図８】ＨＵＶＥＣ接着アッセイにおける最適化ＩｇＧ。α５β１機能阻害ＩｇＧ抗体によるＨＵＶＥＣ細胞のフィブロネクチンへの接着阻害。ＩｇＧ  ＭＯＲ０４９７４、ＭＯＲ０４９７５、ＭＯＲ０４９７７、ＭＯＲ０４９８５は、ＩＩＡ１と同じようなＩＣ５０を伴って接着を阻害する。ＦａｂからＩｇＧへの変換は、およそ２倍の改善という結果になった。
【図９】ＨＵＶＥＣ生存率アッセイ−抗α５β１インテグリンＩｇＧの分析。α５β１機能阻害ＩｇＧ抗体によるＨＵＶＥＣ細胞の生存率の阻害。ＨＵＶＥＣ細胞を、フィブロネクチンコートプレート上に蒔き、増大する濃度のＩｇＧ抗体と共にインキュベートし、生存率を４８時間後に測定した。ＩｇＧ  ＭＯＲ０４９７４、ＭＯＲ０４９７５、ＭＯＲ０４９７７、ＭＯＲ０４９８５は、ＩＩＡ１と同じようなＩＣ５０を伴って接着を阻害する。ＦａｂからＩｇＧへの変換はおよそ２倍の改善という結果になった。
【図１０】抗−α５β１インテグリンＩｇＧのＨＵＶＥＣカスパーゼアッセイ。α５β１機能阻害ＩｇＧ抗体によるカスパーゼ３／７活性化の誘導を、無血清内皮細胞培養液中のＨＵＶＥＣ細胞を用いて測定した。カスパーゼ活性を、メーカーの説明書に従って、市販の化学発光アッセイ系（カスパーゼｇｌｏ、ＰＲＯＭＥＧＡ）を用いて測定した。ＭＯＲ０４９７４、ＭＯＲ０４９７５、ＭＯＲ０４９７７およびＭＯＲ０４９８５は参照抗体ＩＩＡ１と同様の有効性である。
【図１１】親和性−成熟Ｆａｂはビオチン化細胞可溶化物の表面からα５β１インテグリンを特異的に沈殿させる。ＨＴ２９α５およびＨＴ２９ｗｔの表面−ビオチン化ＮＰ４０−細胞可溶化物を、マグネチックダイナビーズと結合するＦａｂと共にインキュベートした。免疫沈降を、ＰＶＤＦ−膜に移動させ、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ（ＡＰ）で分析した。全てのＦａｂは、ＨＴ２９α５細胞可溶化物からの参照抗体ＩＩＡ１に相当する期待されるサイズのタンパク質を特異的に沈殿させ、一方、ＨＴ２９ｗｔ細胞可溶化物中にはタンパク質は検出されなかった。無関係のＦａｂＭＯＲ０３２０７は、どのタンパク質も特異的に沈殿させなかった。
【図１２】抗−α５β１インテグリンＩｇＧ（ＭＯＲ０４９７４の例）のＨＴ２９−ｗｔおよびＨＴ２９α５への結合特異性（ＦＡＣＳ測定）。親和性成熟ＩｇＧ抗体を、５×１０5ＨＴ２９ｗｔおよびＨＴ２９α５細胞と共に、１０μｇ／ｍＬでインキュベートした。特異的な結合抗体を、Ｃｙ３標識された二次抗体を用いて検出した。上図：ＨＴ２９ｗｔ（左）またはＨＴ２９α５−細胞（右）とインキュベートしたＩＩＡ１、下図：ＩｇＧ１  ＭＯＲ０４９７４。蛍光シフトは、α５インテグリンとの特異的結合を示し、ＭＯＲ０４９７５、ＭＯＲ０４９７７、ＭＯＲ０４９８５およびＭＯＲ０４６２４において見られた。抗体アイソタイプ対照は陰性である（黒線）。我々の抗−インテグリン抗体はα５−鎖トランスフェクト細胞と、参照抗体ＩＩＡ１と同様の特異性で結合する。
【図１３】ＩＩＡ１とＨＴ２９α５細胞における抗−α５β１インテグリンＩｇＧ（ＭＯＲ０４９７４の例）との競合結合（ＦＡＣＳ測定）。抗−α５β１インテグリンＩｇＧはＩＩＡ１と重複エピトープにおいて競合する。室内で産生された抗−α５β１インテグリン抗体を、２０μｇ／ｍＬのＩＩＡ１と共にプレインキュベートしたか、しなかった５×１０5のＨＴ２９α５細胞と共に１μｇ／ｍＬにおいてインキュベートした。ＩＩＡ１結合の存在は、ヤギ−抗−マウス−ＦＩＴＣでの検出で示される（左図）。ヒト抗体（ＭＯＲ０４９７４）の結合および競合は、ヤギ−抗−ヒト−ＦＩＴＣ二次抗体での検出で示される（右図）。この例はＭＯＲ０４９７４における競合を示す。同一の結果がＭＯＲ０４９７５、ＭＯＲ０４９７７、ＭＯＲ０４９８５、ＭＯＲ０４６２４において見られた。
【図１４】管形成アッセイにおけるＩｇＧ１抗−α５β１インテグリン抗体の分析（ＭＯＲ０４９７４の例）。親和性最適化抗−α５β１インテグリンＩｇＧ１抗体は、ＩＩＡ１と同様に効率的に管形成を阻害する。初期のヒト内皮静脈臍細胞（ＨＵＶＥＣｓ＃２５１９）を、６０〜８０％の密集度で蒔き、２ｘ１０4細胞を、ＥＢＭ−２培養液（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ＃ＣＣ３１５６）中のマルチゲル（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＃３５４２３４）含有ウェル上で接種した。抗体を１５分後に添加し、管形成を１８〜２４時間、３７℃において進行させた。次いで、細胞を固定し（４％  ホルマリン）、透過処理し、ブロックし、そして抗−ＣＤ３１で染色した。抗体を、６ｎＭ、３ｎＭ、６００ｐＭ、３００ｐＭ、および６０ｐＭで適用した。代表的な画像は、３００ｐＭで効果を示した。Ａ：未処理サンプル、Ｂ：ヒトＩｇＧ１抗−リゾチームＭＯＲ０３２０７、Ｃ：ＩｇＧ１  ＭＯＲ０４６２４、Ｄ：ＩｇＧ１  ＭＯＲ０４９７４、Ｅ：ＩＩＡ１、Ｆ：マウスＩｇＧ１。同様の結果が、ＭＯＲ０４９７５およびＭＯＲ０４９７７においても見られた。
【図１５】トランスウェル遊走アッセイにおける親和性最適化抗−α５β１インテグリンＩｇＧ抗体活性。遊走アッセイを、フィブロネクチンを唯一の刺激剤として９６−ウェルトランスウェル遊走マイクロプレート（８μｍ孔、＃３５１１６３Ｆａｌｃｏｎ／ＢＤ）において行う。フルオロブロク（ｆｌｕｏｒｏｂｌｏｋ）膜の下側を２μｇ／ｍＬのフィブロネクチンで１時間、３７℃でコートし、そして２％ＢＳＡで３０分、３７℃でブロックした。０．１％ＢＳＡを含むヒト内皮無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を容器の上部および下部内で遊走バッファーとして用いた。抗−α５β１インテグリン抗体（０．６〜１０μｇ／ｍＬ）を各ウェルの容器の上部に添加し、初期継代のＨＵＶＥＣ（２×１０4）を添加し、そして細胞の遊走を４時間、３７℃において進行させた。次いで、膜下で移動した細胞をカルセイン−染色し、そして結果として生じた蛍光を、４８５ｎｍ励起および５３５ｎｍ発光で、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ１２２０  Ｖｉｃｔｏｒ  ｃｏｕｎｔｅｒで測定した。  Ａ：１０μｇ／ｍＬ抗体濃度で示している画像を得た。ＭＯＲ０４９７４、ＭＯＲ０４９７５、ＭＯＲ０４９７７はＩＩＡ１と同様の効果でＨＵＶＥＣの移動を阻害した。  Ｂ：ＭＯＲ０４９７４、−７５、−７７（ｌｇＧ４−Ｐｒｏ抗体アイソタイプ）の抗−遊走性活性の容量反応。ＩＣ５０（ＭＯＲ０４９７４：１μｇ／ｍｌ、ＭＯＲ０４９７５：１．５μｇ／ｍｌ、ＭＯＲ０４９７７：１μｇ／ｍｌ、ＩＩＡ１：２μｇ／ｍｌ）。
【図１６】結腸癌組織における親和性−最適化ＩｇＧ１抗−α５β１−インテグリン抗のＩＨＣ染色パターン。拡大率１０×で、ビオチン化抗体を結腸癌の練増組織切片上で滴定した。検出はストレプトアビジン−アルカリホスファターゼを用いて行った。２．５μｇ／ｍＬ濃度で得られた免疫組織化学的な切片の例を示す。ＩＩＡ１およびＭＯＲ０４９７４において、小〜中規模サイズの血管の染色および間質性の区画が明らかとなった。黒色の矢印は両抗体で染色された同じ血管を示す。同様の染色パターンがＭＯＲ０４９７５およびＭＯＲ０４９７７で見られた。青色の矢印は染色された血管を示す。最適化抗−α５β１インテグリン抗体はＩＩＡ１に相当する染色パターンを見せることが結論付けられる。
【図１７】親和性最適化抗−α５β１インテグリン抗体（ｌｇＧ４−Ｐｒｏ）の腫瘍標的。抗−α５β１インテグリン抗体をヨウ素−１２５（１分、ヨードゲン法）を用いて放射能標識した。残存する免疫活性を７５〜８０％と測定し、そして３μｇの標識抗体をＨＴ２９α５異種移植ヌードマウスに注入した。  Ａ：ＩｇＧ１ＭＯＲ０４９７４、ＭＯＲ０４９７５および対照（参照抗体ＩＩＡ１および抗−リゾチームＭＯＲ０３２０７）における腫瘍取り込み、Ｂ：ＩｇＧ１ＭＯＲ０４９７７および対照における腫瘍取り込み。  抗−α５β１インテグリン抗体の抗体取り込みは、ＩＩＡ１と類似しており、および無関係のＩｇＧ１ＭＯＲ０３２０７と比較して著しく高かった。我々はこの結果より、抗−α５β１インテグリン抗体がα５β１インテグリン−陽性ＨＴ２９α５異種移植を特異的に標的にすることを結論付ける。
【図１８】血管新生の３Ｄインビボ球状体代理モデルにおける最適化抗−α５β１インテグリンＩｇＧ抗体の分析。定義した内皮細胞数の球状体を含むマルチゲルプラグを、ＶＥＧＦおよびＦＧＦ２と共に、ＳＣＩＤマウスの皮下に移植した。ＥＣ−出芽およびマウス脈管構造を伴う血管形成の複合ネットワークを、最適化ヒト抗−α５β１インテグリン抗体および対照抗体との処理後、分析した。ヒトＩｇＧＭＯＲ０４９７４およびＭＯＲ０４９７５は、ＩＩＡ１と同程度に効果があった。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
従って、本発明の第一の側面は、（ｉ）１００ｎＭ、好ましくは１０ｎＭ以下の親和性でα５β１インテグリンに結合し、（ｉｉ）インビトロおよびインビボにおいてα５β１インテグリン発現細胞の受容体への接着を阻害するヒト若しくはヒト化抗体またはその抗原結合性断片である。
【００１２】
本発明のポリペプチドはヒト若しくはヒト化抗体またはその抗原結合性断片である。本発明において、「ヒト抗体」なる用語は、実質的にヒト若しくは完全ヒト可変領域および、もし存在すれば、ヒト定常ドメインを有する抗体分子を示す。本出願において、「ヒト」なる用語は、個々のヒトの中に形成され得る配列、または結果としてそこから生じる共通配列の使用により形成され得る配列を示し、例えばＫａｂａｔら（１９９１）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．  ９１−３２４２、ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣによる対応する概要中に記載されている様に、参照により本明細書中に引用される。「実質的にヒト」なる用語は、Ｋａｂａｔらによって記載されるように、１、２、３、４または５までのアミノ酸における「完全ヒト」配列とは異なるだろう配列である。より詳細には、本発明にかかる抗体または抗体断片は、重（Ｈ）および軽（Ｌ）免疫グロブリン鎖における実質的または完全なヒト可変フレームワーク領域を含む。本発明における「ヒト化抗体」なる用語は、実質的にマウスまたは完全マウス可変領域およびヒトまたは実質的にヒト定常ドメインを有し、かつ＞８２％、好ましくは少なくとも９０％であり、特に好ましくは少なくとも９８％はヒトである抗体分子を示す。本出願において、「マウス」なる用語は、個々の齧歯類の中に形成され得る、または結果としてそこから生じる共通配列の使用により形成され得る配列を示す。「実質的にマウス」なる用語は、１、２、３、４または５アミノ酸までにおける「完全マウス」配列とは異なるだろう配列を示す。好ましくは、抗体またはその抗体断片はＩｇＧ抗体であり、例えばヒト若しくはヒト化ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体またはその断片｛例えばＦａｂ、Ｆａｂ’または（Ｆａｂ）2断片｝である。しかしながら、本発明は、ヒト配列、例えば単鎖（ｓｃ）抗体またはその断片（例えばｓｃＦｖ断片）を有する組換え抗体にも関する。
【００１３】
本発明の抗体または抗体断片は、α５β１インテグリンと特異的に相互作用する１以上の抗原結合性部位を含む。好ましくは、この抗原結合性特性は、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）領域を組み合わせることで得られる。ＶＨまたはＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）、および抗原結合性−媒介ＣＤＲ領域（ＶＨ領域のためにＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３、およびＶＬ領域のためにＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３）を含む。
【００１４】
本発明のヒト若しくはヒト化抗体または抗体断片は、好ましくは、ＫD値が１００ｎＭ以下、好ましくは１ＯｎＭ以下および最も好ましくは１ｎＭ以下に対応するα５β１インテグリンへの親和性を有し、該親和性はα５β１陽性ヒトＨＵＶＥＣ細胞上でＦＡＣＳ−滴定によって、実施例に記載するようにまたはコンペティションＢＩＡｃｏｒｅ若しくはコンペティションＥＬＩＳＡ測定によって、測定される。
【００１５】
さらに、本発明のポリペプチドは、実施例に記載されるように、α５β１インテグリン発現ヒト腫瘍細胞の接着を阻害する、例えば、Ｌｏｚｚｉｏら（１９７９）、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３：３６３−３７０によって、Ｋ５６２細胞（ＡＴＣＣ受入番号：ＣＣＬ−２４３）はインビトロで研究された。好ましくは、抗体または抗体断片は、１０ｎＭ以下および好ましくは５ｎＭ以下の濃度において細胞接着の５０％の阻害を示す（ＩＣ５０）。
【００１６】
さらに、本発明のポリペプチドは、好ましくはＨＵＶＥＣ細胞においてカスパーゼ活性を誘導することができる。ＨＵＶＥＣ生存率に関するＩＣ５０値は、好ましくは１０ｎＭ以下、より好ましくは５ｎＭ以下であり、ここで該ＩＣ５０（５０％生存率）値は実施例に記載するように決定される。
【００１７】
さらに、本発明のポリペプチド、抗体および抗体断片は、腫瘍および癌、特に結腸癌の診断および予防および治療に好ましくは用いられ得る。
【００１８】
該ポリペプチド、抗体および抗体断片は、放射性、ＮＭＲ、色素、酵素および蛍光性標識基等の如き検出可能な標識基と結合し得る。放射性の基は、例えばＩ125、１131またはＹ90であり得る。
【００１９】
好ましくは、本発明の抗体または抗体断片は、
（ａ）以下の：
（ｉ）配列番号：１（ＭＯＲ０４６２４）、配列番号：３（ＭＯＲ０４０５５）のアミノ酸配列、または該ＶＨ領域の１つであるＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２および／若しくはＨ−ＣＤＲ３領域の少なくとも１つ；または
（ｉｉ）少なくとも１つのＨ−ＣＤＲ領域の変更により、（ｉ）の配列に由来するアミノ酸配列、
より選択されるＶＨ領域、および／あるいは、
（ｂ）以下の：
（ｉ）配列番号：２（ＭＯＲ０４６２４）、配列番号：４（ＭＯＲ０４０５５）のアミノ酸配列、または該ＶＬ領域の１つであるＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２および／またはＬ−ＣＤＲ３領域の少なくとも１つ、または
（ｉｉ）少なくとも１Ｌ−ＣＤＲ領域での変更により、（ｉ）の配列に由来するアミノ酸配列、
より選択されるＶＬ領域、
を含む。
【００２０】
特に好ましくは、Ｈ−ＣＤＲ２領域のランダム化によって、上記のような（ａ）（ｉ）のＶＨ−領域に由来するＶＨ領域を含む抗体または抗体断片である。
【００２１】
他の特に好ましい実施形態において、抗体または抗体断片は、Ｌ−ＣＤＲ３領域のランダム化によって、上記のような（ｂ）（ｉ）のＶＬ−領域に由来するＶＬ−領域を含む。
【００２２】
さらに他の特に好ましい実施形態において、抗体または抗体断片は、抗体鎖を混合することによって、（ａ）（ｉ）のＶＨ−領域および／または（ｂ）（ｉ）のＶＬ−領域に由来するＶＨ−および／またはＶＬ−領域を含む。
【００２３】
Ｈ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３のサブライブラリーは、Ｈ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を、各々、タンパク質工学手法によってヒトＣＤＲレパートリーと交換することにより作成される（１７）。
【００２４】
例えば抗体または抗体断片は、配列番号：１または配列番号：２（ＭＯＲ０４６２４）中に記載されるＶＬおよび／またはＶＨ領域に由来するＶＨおよび／またはＶＬ領域を含む。
【００２５】
特に好ましくは、以下の：
（ａ）、配列番号：５（ＭＯＲ０４９７１）、配列番号：７（ＭＯＲ０４９７４）、配列番号：９（ＭＯＲ０４９７５）、配列番号：１１（ＭＯＲ０４９７７）、および配列番号．１１（ＭＯＲ０４９８５）のアミノ酸配列、または該ＶＨ−領域のＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２および／若しくはＨ−ＣＤＲ３領域の少なくとも１つから選択されるＶＨ−領域；および／あるいは、
（ｂ）配列番号：６（ＭＯＲ０４９７１）、配列番号：８（ＭＯＲ０４９７４）、配列番号：１０（ＭＯＲ０４９７５）、配列番号：１２（ＭＯＲ０４９７７）および配列番号：１４（ＭＯＲ０４９８５）のアミノ酸配列、または該ＶＬ−領域のＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２および／若しくはＬ−ＣＤＲ３領域の少なくとも１つから選択されるＶＬ−領域、を含むポリペプチドである。
【００２６】
本発明におけるポリペプチドの具体例は以下の通りである：
配列番号：１のＶＨ領域、および配列番号：２（ＭＯＲ０４６２４）のＶＬ領域またはそのＨ−ＣＤＲ１−、Ｈ−ＣＤＲ−２、Ｈ−ＣＤＲ３−、Ｌ−ＣＤＲ１−、Ｌ−ＣＤＲ２−若しくはＬ−ＣＤＲ３−領域の少なくとも１つを含む、抗体または抗体断片。
【００２７】
配列番号：３のＶＨ領域、および配列番号：４（ＭＯＲ０４０５５）のＶＬ領域またはそのＨ−ＣＤＲ１−、Ｈ−ＣＤＲ−２、Ｈ−ＣＤＲ３−、Ｌ−ＣＤＲ１−、Ｌ−ＣＤＲ２−若しくはＬ−ＣＤＲ３−領域の少なくとも１つを含む、抗体または抗体断片。
【００２８】
配列番号：５のＶＨ領域、および配列番号：６（ＭＯＲ０４９７１）のＶＬ領域またはそのＨ−ＣＤＲ１−、Ｈ−ＣＤＲ−２、Ｈ−ＣＤＲ３−、Ｌ−ＣＤＲ１−、Ｌ−ＣＤＲ２−若しくはＬ−ＣＤＲ３−領域の少なくとも１つを含む、抗体または抗体断片。
【００２９】
配列番号：７のＶＨ領域、および配列番号：８（ＭＯＲ０４９７４）のＶＬ領域またはそのＨ−ＣＤＲ１−、Ｈ−ＣＤＲ−２、Ｈ−ＣＤＲ３−、Ｌ−ＣＤＲ１−、Ｌ−ＣＤＲ２−若しくはＬ−ＣＤＲ３−領域の少なくとも１つを含む、抗体または抗体断片。
【００３０】
配列番号：９のＶＨ領域、および配列番号：１０（ＭＯＲ０４９７５）のＶＬ領域またはそのＨ−ＣＤＲ１−、Ｈ−ＣＤＲ−２、Ｈ−ＣＤＲ３−、Ｌ−ＣＤＲ１−、Ｌ−ＣＤＲ２−若しくはＬ−ＣＤＲ３−領域の少なくとも１つを含む、抗体または抗体断片。
【００３１】
配列番号：１１のＶＨ領域、および配列番号：１２（ＭＯＲ０４９７７）のＶＬ領域またはそのＨ−ＣＤＲ１−、Ｈ−ＣＤＲ−２、Ｈ−ＣＤＲ３−、Ｌ−ＣＤＲ１−、Ｌ−ＣＤＲ２−若しくはＬ−ＣＤＲ３−領域の少なくとも１つを含む、抗体または抗体断片。
【００３２】
配列番号：１３のＶＨ領域、および配列番号：１４（ＭＯＲ０４９８５）のＶＬ領域またはそのＨ−ＣＤＲ１−、Ｈ−ＣＤＲ−２、Ｈ−ＣＤＲ３−、Ｌ−ＣＤＲ１−、Ｌ−ＣＤＲ２−またはＬ−ＣＤＲ３−領域の少なくとも１つを含む、抗体または抗体断片。
【００３３】
本発明はまた、上記の好ましいおよび／または例示された抗体または抗体断片として、抗原上の同じエピトープに対する抗体または抗体断片に関する。
【００３４】
ポリペプチドのＶＨおよびＶＬ鎖は、以下の領域を含む。
【００３５】
ＭＯＲ０４６２４、ＭＯＲ０４０５５、および誘導体（（１７）による番号付けスキーム）のＶＨ鎖：
−アミノ酸１〜３０ａａに伸びるフレームワーク１領域
−アミノ酸３１〜３５ａａに伸びるＣＤＲ１領域
−アミノ酸３６〜４９ａａに伸びるフレームワーク２領域
−アミノ酸５０〜６５ａａに伸びるＣＤＲ２領域
−アミノ酸６６〜９４ａａに伸びるフレームワーク３領域
−アミノ酸９５〜１０２ａａに伸びるＣＤＲ３領域
−アミノ酸１０３〜１１３ａａに伸びるフレームワーク４領域。
【００３６】
ＭＯＲ０４６２４のＶＬκ１鎖、および誘導体（（１７）による番号付けスキーム）：
アミノ酸１〜２３ａａに伸びるフレームワーク１領域
アミノ酸２４〜３５ａａに伸びるＣＤＲ１領域
アミノ酸３６〜５０ａａに伸びるフレームワーク２領域
アミノ酸５１〜５７ａａに伸びるＣＤＲ２領域
アミノ酸５９〜８９ａａに伸びるフレームワーク３領域
アミノ酸９０〜９８ａａに伸びるＣＤＲ３領域
アミノ酸９９〜１０９ａａに伸びるフレームワーク４領域。
【００３７】
ＭＯＲ０４０５５のＶＬκ１鎖および誘導体（（１７）による番号付けスキーム）：
アミノ酸１〜２３ａａに伸びるフレームワーク１領域
アミノ酸２４〜３５ａａに伸びるＣＤＲ１領域
アミノ酸３６〜５０ａａに伸びるフレームワーク２領域
アミノ酸５１〜５７ａａに伸びるＣＤＲ２領域
アミノ酸５８〜８９ａａに伸びるフレームワーク３領域
アミノ酸９０〜９８ａａに伸びるＣＤＲ３領域
アミノ酸９９〜１０９ａａに伸びるフレームワーク４領域。
【００３８】
ＶＨ−および／またはＶＬ−鎖のフレームワーク領域は、１以上のアミノ酸の交換、例えば１、２、３、４または５アミノ酸の交換により変化し得る。例えば、ＶＬκ１鎖のフレームワーク３領域はＭＯＲ０４６２４ファミリーのメンバー内で変化し得る。好ましくは、Ｆａｂ配列の８５番目の位置のアミノ酸が交換可能であり、バリン（ＭＯＲ０４６２４、ＭＯＲ０４９８５）をスレオニン（ＭＯＲ０４９７４、−７５、−７７）に交換することが特に好ましい。
【００３９】
さらに、ＶＨ鎖のフレームワーク１領域も変化し得る。好ましい実施形態において、各ＶＨ−Ｆａｂ配列の３番目の位置のアミノ酸が交換可能である。特に好ましくは、例えば、クローニングの際に起こり得る、グルタミン（ｑ）をグルタミン酸（ｅ）に交換することである。
【００４０】
本発明のポリペプチドは、治療または診断的適用、例えばインビトロまたはインビボでの診断的適用に適している。
【００４１】
治療的適用として、抗体または抗体断片は、それ自体として用いられ得る。あるいは、前記ポリペプチドは、治療薬と結合した形であり、例えば放射線治療薬または化学療法薬（例えば低分子量または生物的細胞分裂阻害剤または細胞毒性剤）から選択される。治療薬は、場合によりホモ−またはヘテロ−二官能性リンカーを用いて、好ましくは前記ポリペプチドの活性アミノ、カルボキシ、ヒドロキシおよび／またはスルフヒドリル基の共有結合を介して、既知の手法により抗体または抗体断片と結合する。
【００４２】
更なる実施形態において、前記ポリペプチドは、例えばＩＬ−２、ＩＬ−１２またはＴＮＦ−α等のサイトカインである、抗体または抗体断片ドメインおよび異種融合ドメインを含む融合タンパク質の形を取り得る。
【００４３】
他の本発明における抗体または抗体断片の治療的に関連する融合パートナーは、増大または減少免疫エフェクター細胞動員のための改変ＩｇＧＦｃ−部分、ＲＮＡ分解酵素またはＥＴＡ等のタンパク毒素、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）またはアウリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）誘導体等の如き小薬物分子、プロドラッグ活性化用酵素、他のインテグリン機能阻害拮抗薬との融合タンパク質、またはＭＭＰ−２またはＭＭＰ−９等の抗血管新生活性を有する酵素との融合タンパク質を含む（１５）。
【００４４】
さらに、融合タンパク質は、上記の少なくとも１つのα５β１インテグリン結合ドメイン、および更なる抗原に特異的な結合ドメインを含む二重特異性抗体の形を取り得る。例えば、第二抗原結合ドメインは、90Ｙの如きアルファ、ベータまたはガンマ放射性核種である診断および／または治療用放射性ヌクレオチドへのキレート薬、診断用ＮＩＲ（近赤外）色素、治療的活性色素、ＮＫ−細胞、細胞毒性Ｔ−細胞またはＮＫＴ−細胞等の如き免疫エフェクター細胞上の表面分子、機能阻害抗−ＶＥＧＦ結合ドメインおよびＶＥＧＦ受容体１、２および３、並びにインターロイキン等のサイトカインに対する機能阻害結合ドメインに直接対応するものであり得る。
【００４５】
診断的適用として、ポリペプチドは検出可能な標識基、例えばインビトロまたはインビボにおける診断的適用のための標識基と結合した形を取り得る。例えば、検出可能な標識基は放射性、ＮＭＲ、色素、酵素および蛍光（例えばＮＩＲ蛍光性）標識基から選択され得る。
【００４６】
治療的適用として、ポリペプチドは、好ましくは、さらに活性成分および／または医薬として許容され得る担体、希釈剤、および／あるいはアジュバントを付加的に含み得る医薬組成物中に処方される。当該医薬組成物は、治療的に活性のある投与量の活性薬剤を含み、それは標準方法に従い当業者によって決定され、例えばインビトロ実験または動物実験モデルにより決定される。当該組成物は、好ましくは注入、注射または吸入によって投与される。活性成分の投与量は、疾患の型および重症度および治療を受ける患者の体質によって決定される。好ましくは、当該治療用組成物は、少なくとも２〜４週間に渡り幾度かの服用により投与される。それは、例えばＦｅｒｒａｒａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、  Ｖｏｌ．  ３、  Ｍａｙ  ２００４、  ３９１−４００および  Ｓａｌｇａｌｌｅｒ、  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２００３、５（６）、６５７−６６７  に記載されるように、抗体または抗体複合体の投与のための既知のプロトコル、あるいはＲｉｔｕｘｉｍａｂ、  Ｃａｍｐａｔｈ、Ｒｅｍｉｃａｄｅ等の医薬抗体の投与のためのプロトコルを示す。
【００４７】
さらに、本発明は、診断試薬として上述されるように、抗体または抗体断片を含む診断用組成物に関する。診断用組成物は、さらに診断用に認容性のある試薬、担体、希釈剤および／またはアジュバントを含み得る。診断用組成物は、各々の分析形式、例えばインビボまたはインビトロ診断分析形式において、診断的検出が可能となるのに十分量のポリペプチドを含む。
【００４８】
前記組成物は、α５β１インテグリン関連疾患における治療または診断的適用に用いられ得る。例えば、これらの疾患は過剰増殖性疾患であり、例えば血管新生および／または転移に関連する疾患、特には癌であり得る。本発明に関する組成物によって治療される癌は、特に、全種類の固形腫瘍、例えば結腸、腎臓、肺、前立腺、乳房、脳、胃、肝臓または皮膚癌を含む。あるいは、当該組成物は、血管新生と関連する血液癌の治療にも使用され得る。他の新血管新生と関連する疾患は、非制限的に、子宮内膜症、血管腫、関節リウマチ、骨関節炎、動脈硬化斑、炎症性腸疾患、炎症性ＣＮＳ病、乾癬、糖尿病性網膜症または加齢性黄斑疾患等の目の疾患、および肥厚性瘢痕を含む。好ましい実施形態において前記組成物の抗血管新生活性は成長因子に非依存性である。
【００４９】
前記組成物は、１またはいくつかの抗体または抗体断片、例えばα５β１インテグリンの異なるドメインと結合する抗体または抗体断片の組み合わせを含み得る。前記組成物は、また併用療法用の低分子薬を含み得る。前記組成物は、ヒトおよび獣医学における適用に適している。特に好ましくは、ヒト医学における適用に適している。
【００５０】
さらに、本発明は、上記の抗体または抗体断片または融合ポリペプチドをコードする核酸に関する。当該核酸は、例えば一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。好ましくは、核酸は発現制御配列に動作可能に連結され、それは適した宿主細胞または宿主細胞における発現を可能とする。当該核酸は、ベクターまたはベクター系（すなわち複数個のベクター）上に存在し得、宿主細胞または宿主生物中に導入され得る。当該ベクターは、例えばプラスミドまたはバクテリオファージの如き原核細胞に適した原核生物ベクターであり得る。さらに、当該ベクターは、例えばプラスミド、人工染色体またはウイルスベクターの如き真核生物宿主細胞または宿主生物用の真核生物ベクターであり得る。適切なベクターは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、  Ｊｏｈｎ  ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓに記載されている。
【００５１】
本発明は、また、例えば上記の核酸またはベクターで形質転換されたヒト細胞等の原核細胞または真核細胞の如き細胞に関する。さらに、本発明は、非ヒト生物体、例えば上記の核酸またはベクターで形質転換されたトランスジェニック非−ヒト哺乳類などのトランスジェニック動物に関する。「形質転換」なる用語は、外来核酸を細胞に導入する全ての方法またはトランスフェクションまたは感染を含む生物体を含む。
【００５２】
前記ポリペプチドは、例えば細胞、培養液、生物体または生物体の排出物からポリペプチドを発現させ該発現ポリペプチドを回収する条件下、上記の非ヒト生物体によって調製され得る。
【００５３】
次に、実施例を挙げて本発明を詳しく説明する。しかし、以下の実施例は限定を意図するものと解されるべきではない。
【実施例】
【００５４】
１．機能阻害抗−α５β１インテグリン抗体の作成
１．１  スクリーニング戦略
マウスモノクローナル抗体ＩＩＡ１は、活性型の生きている（内皮）細胞上にのみ存在するα５β１インテグリンの高次構造エピトープと結合する。選択性および機能的活性の両者を網羅するために、機能的細胞ベースのスクリーニング検定と組み合わせた単離抗原および抗原−発現細胞上の交互パニング（ａｌｔｅｒｎａｔｅパニング）から成るスクリーニング経路を、Ｆａｂ形式でＨｕＣＡＬ（登録商標）ＧＯＬＤ由来リード抗体候補を同定するために確立した。
【００５５】
１．ＨｕＣＡＬ（登録商標）−Ｇｏｌｄライブラリー（ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ）を用いたファージディスプレイによる抗−α５β１インテグリン結合Ｆａｂ抗体断片の選定。パニング実験を単離抗原および抗原−発現細胞上で行った。最良の抗体クローンのアミノ酸配列に基づいて、サブライブラリーを、ヒトＣＤＲ配列を用いて、ＶＬ−ＣＤＲ３またはＶＨ−ＣＤＲ２のいずれかのランダム化により作成し、そしてこれからさらなるパニング実験においてより高性能の結合剤を選択した。付加的なクローンを、１つの抗体分子に着目のＶＬ−ＣＤＲ３およびＶＨ−ＣＤＲ２を含む軽鎖および重鎖のクローニングの組み合わせにより得た（「Ｘ−クローニング」）。
【００５６】
２．豊富なＦａｂ−抗体のスクリーニングを以下のように行った。全パニングの結合剤を、α５β１インテグリン−陽性およびα３β１インテグリン−陰性細胞上のＥＬＩＳＡ−結合においてテストした。次いで、ＥＬＩＳＡ陽性クローンをα５−過剰発現細胞およびα５−陰性細胞上のＦＡＣＳ実験における細胞結合においてさらに分析した。適切なクローンを、ｉ）フィブロネクチンへの細胞接着、ｉｉ）ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）および／またはＨＤＭＶＥＣ（ヒト真皮の血管内皮細胞）のアポトーシス誘導、ｉｉｉ）参照抗体ＩＩＡ１を伴った親和性測定およびＦＡＣＳ競合分析、およびｉｖ）種交差反応性のために、機能分析において分析した。
【００５７】
１．２ツール作成およびアッセイ開発
α５−インテグリン鎖ｃＤＮＡ
ヒトα５−鎖のｃＤＮＡを、ＲＺＰＤ（ＩＭＡＧＥ−ＩＤ６８２１５７７）から購入し、標準的な方法に従ってｐｃＤＮＡ３−発現ベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）中にクローン化した。
【００５８】
精製インテグリン受容体
界面活性剤で可溶化したヒトインテグリン受容体α５β１（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ＣＣ１０５２）およびα３β１（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ＣＣ１０９２）をＣＨＥＭＩＣＯＮ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。固相ファージディスプレイ、ＥＬＩＳＡおよびＢｉａＣｏｒｅ−アッセイのために、少なくとも９０％の精度を伴うインテグリン−バッチを、非変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって選別した。
【００５９】
細胞系
ヒト慢性骨髄性白血病細胞系Ｋ５６２（ＡＴＣＣ受入番号：ＣＣＬ−２４３）のフィブロネクチンへの接着性は、α５β１インテグリンによって単に仲介される（１６）。この細胞系を、最初の機能的スクリーニングのためのフィブロネクチン−仲介接着アッセイ中で使用した。α５β１−インテグリンの存在を、検出のために抗体ＩＩＡ１を用いたＦＡＣＳ−アッセイによって実証した（図１Ａ）。
【００６０】
分化細胞パニングの戦略における必要条件は、着目の標的物が標的−陰性細胞系において過剰発現されるモデル系である。この目的のために、我々はβ１−インテグリン鎖は発現するがα５−鎖を発現しないヒト結腸癌細胞系ＨＴ２９（ＡＴＣＣ受入番号：ＨＴＢ−３８）を選択した（図１Ｂ）。α５−鎖のｃＤＮＡを、メーカーの説明書に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いて親ＨＴ２９−細胞に形質移入した。安定したα５−過剰発現クローンを、α５β１インテグリンが発現した表面の特異的標識に対するマウスモノクローナル抗体ＩＩＡ１を用いるＦＡＣＳ−スクリーニングによって選別した（図１Ｃ）。
【００６１】
接着アッセイ
機能的スクリーニングにおける高感度接着アッセイを、ヒトα５β１インテグリンのみを発現するＫ５６２細胞系を用いて確立した。この目的のために、９６ウェルプレートを非接着性基質として１μｇ／ｍｌヒトフィブロネクチンまたはＢＳＡで覆い、アッセイの全体的なバックグラウンドを決定した。インテグリンのＥＣＭ分子への接着はＣａ２＋／Ｍｇ2+の存在に依存するので、１０ｍＭＥＤＴＡをフィブロネクチンに結合するインテグリン非依存性バックグランドを決定するために用いた。機能阻害抗体ＩＩＡ１を参照として用い、そして非ブロッキング抗α５β１インテグリンマウスモノクローナル抗体（ＶＣ５）を陰性抗体−対照として利用した。期待したように、ＥＤＴＡ、ＩＩＡ１（５μｇ／ｍｌ）およびＢＳＡ−コーティング両者とも、Ｋ５６２−仲介接着の結合を阻害し、一方ＶＣ５（５μｇ／ｍｌ）は細胞接着に干渉しなかった（図２）。
【００６２】
１．３  抗体ファージディスプレイおよびパニング戦略
完全ヒト抗α５β１インテグリン抗体の同定のための抗体ファージディスプレイを、文献（１７−２０）に記載されたプロトコルに従ってＨｕＣＡＬ（登録商標）−ＧＯＬＤライブラリーを用いて行った。その後のパニング戦略を平行して適用および実行した（表１）。
【００６３】
【表１】
2009537158.tif 000002
【００６４】
結果：
パニング１２９８−１３２４の間に、数千クローンをスクリーニングした。様々なディスプレイ−戦略を適用したという事実にもかかわらず、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳにおいて選択された１クローン（ＭＯＲ０４０５５）を繰り返し単離した。免疫優性エピトープと明らかに結合するＭＯＲ０４０５５に加えて、４つの付加的なクローンを同定した（ＭＯＲ０４１３９、０４１４１、０４１６０、０４５６８）。より多様で特異的なインテグリン結合剤を選択する機会をさらに増やすために、２回の付加的なパニング（１３６９．１−２および１３７１．１−２）を行った。ここで、１０μｇ／ｍｌＭＯＲ０４０５５−Ｆａｂを、豊富な支配的クローンＭＯＲ０４０５５を抑制するために、ファージディスプレイ中に添加した。Ｆａｂ−競合にもかかわらず、パニング１３６９を通じて見つかった全ての特異的結合剤は、再びＭＯＲ０４０５５であった。パニング１３７１において、１つの付加的な個別結合剤（ＭＯＲ０４６２４）を同定した。
【００６５】
１．４機能テストＦａｂ−抗体
接着アッセイ
第一パニングアプローチから得た抗体をプレスクリーニング実験における機能阻害効力に従って順位付けた結果は、以下の通りである：ＭＯＲ０４６２４＞ＭＯＲ０４０５５＞ＭＯＲ０４１４１＝ＭＯＲ０４５６８＝ＭＯＲ０４１６０。ＭＯＲ０４１３９は、僅かに阻害的であったが、５０％の阻害には届かなかった。Ｋ５６２接着アッセイにおける異なる濃度での抗体の投与量依存性再テストは、我々のプレスクリーニング実験の結果を一つの例外とともに決定づけた：それはＭＯＲ０４１３９がいかなる用量依存的な阻害も見せなかったことであった。この抗体は、さらに検討しなかった（図３）。
【００６６】
アポトーシス誘導
第一のパニングアプローチから得た抗体を、アポトーシス−誘導特性においてさらに評価した。それゆえ、９６ウェルプレートを、３７℃で１時間、０．２および０．４μｇ／ｍｌのフィブロネクチンで覆い、そして２％ＢＳＡでブロックした。１×１０4ＨＵＶＥＣ細胞を、内皮細胞培養液（Ｇｉｂｃｏ）の無血清培地中で、各抗体と共にインキュベートした。１８時間後、カスパーゼ３／７アッセイキットを、メーカー（カスパーゼＧＩｏ３／７；Ｐｒｏｍｅｇａ）によって記載された手順に従って、細胞溶解およびカスパーゼ活性の定量化に用いた。１００μｇ／ｍｌの濃度において、一価のＦａｂＭＯＲ０４０５５および０４６２４が、ＨＵＶＥＣ細胞において、１０μｇ／ｍｌの二価参照ＩｇＧＩＩＡ１と同等の強さで、カスパーゼ３／７活性を誘発した（図４）。全ての他のＦａｂは本アッセイにおいては陰性であった。
【００６７】
ＦＡＣＳ滴定による親和性測定
天然α５β１−インテグリンの結合強度を分析するために、全抗体をＦＡＣＳ滴定によってα５β１−陽性ＨＵＶＥＣ細胞上で試験した（表２）。ＭＯＲ０４０５５は最も高い結合親和性（０．９ｎＭ）を有し、二量体ＩｇＧ形式において増加を示した。ＭＯＲ０４６２４においては、一価Ｆａｂにおける低ナノモル範囲でのＫＤ、および二量体ＩｇＧにおけるＫＤでの増加を発見した。
【００６８】
【表２】
2009537158.tif 000003
【００６９】
ＦａｂおよびＩＩＡ１の競合ＦＡＣＳ
Ｆａｂ抗体が同じエピトープをＩＩＡ１と共有するか否かを検討するために、ＨＴ２９α５細胞を、０．５μｇ／ｍｌＦａｂ単独または０．５μｇ／ｍｌＦａｂおよび１０μｇ／ｍｌＩＩＡ１と共に、インキュベートした。ヒトＦａｂｓの細胞への結合を、ＦＡＣＳ分析のためのヤギ抗ヒトＦａｂ−特異的−ＰＥ複合体で検出した。図７は、Ｆａｂ染色のみ（黒色の線）およびＦａｂ＋ＩＩＡ１（緑色の線）の重ね合わせを示す。結果として、ＩＩＡ１の添加は、ＭＯＲ０４６２４による染色強度の明らかな減少を引き起こす。全ての他のＦａｂｓは、ＩＩＡ１によって影響を受けなかった。この結果は、ＩＩＡ１およびＭＯＲ０４６２４が同一または重複エピトープへの結合において互いに競合し、一方、他の４Ｆａｂｓは無関係なエピトープと結合することを示す。
【００７０】
１．５  親和性−成熟：ＦａｂおよびＩｇＧ抗体分析
ＦａｂｓＭＯＲ０４０５５および０４６２４を１ラウンドの親和性成熟に供した。それゆえ、サブライブラリーを、ＶＬ−ＣＤＲ３またはＶＨ−ＣＤＲ２のいずれかのランダム化により親Ｆａｂから作成し（１７）、そして精製α５β１およびＨＴ２９α５細胞上でファージディスプレイ選択に供した。このスクリーニングの陽性結合剤を、ＨＴ２９α５細胞上で接着アッセイにおいてさらに分析し、そしてそれらの阻害活性に従って順位付けた。最良の抑制ポテンシャルをＭＯＲ０４６２４誘導体において発見した。ＭＯＲ０４０５５、ＭＯＲ０４５６８、ＭＯＲ０４１４１の誘導体は、阻害性においてせいぜい中程度または何の有意な向上も見せなかった。これらのクローンの軽および重鎖に基づいて、ＶＬ−ＣＤＲ３およびＶＨ−ＣＤＲ２の１２の新しい組み合わせを更なる最適化のためにクローン化した（いわゆる「Ｘ−クローニング」）。最良の阻害的クローンおよびＸ−クローニング由来のクローンを、インビトロにおいて発現させ精製し比較し、最終的に改良された機能阻害活性を伴う７つの強化されたユニークな結合剤を、更なる詳細な分析のために同定した（ＭＯＲ０４９７１、−７２、−７４、−７５、−７７、−８５、−８７）。
【００７１】
アポトーシス誘導
インビトロで、ＨＵＶＥＣ細胞上でのアポトーシス−誘導を、カスパーゼ活性および細胞生存によって測定した（図６および図７）。両アッセイにおいて一価のＦａｂＭＯＲ０４９７４、０４９７５および０４９７７の有効性は、二価のマウスモノクローナル参照抗体ＩＩＡ１に相当した。
【００７２】
【表３】
2009537158.tif 000004
【００７３】
表３：ＸＴＴ−増殖アッセイにおけるＦａｂ抗体のＩＣ５０値
親Ｆａｂと比較して、親和性成熟抗体は有意に改善された（因数１９０まで）。一価のＦａｂの増殖阻害は二価参照抗体ＩＩＡ１より４倍に少ない効果であった。
【００７４】
免疫沈降
Ｆａｂ抗体の特異性を明らかにするために、表面−ビオチン化ＨＴ２９α５およびＨＴ２９ｗｔ細胞のＮＰ−４０ライセートを、マグネチックダイナビーズと結合したＦａｂと共にインキュベートした。ＩＩＡ１は参照抗体として使用した。集中的に洗浄した後、沈殿物をＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー中において還元性条件下で煮沸し、ＰＶＤＦ膜にブロットし、そしてストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｅ）−ＡＰによってプローブした。全ての抗−α５β１インテグリン抗体は、インテグリン鎖α５およびβ１の期待される分子量に相当する〜１３５ｋＤａのタンパク質２本ｋバンド（ｋｂａｎｄ）を特異的に沈降し（図１１）、ＨＴ２９ｗｔ細胞可溶化物中には見つからなかった。同様の２本のバンドがＩＩＡ１と共に見つかった。無関係のＦａｂＭＯＲ０３２０７を陰性対照として用いたところ、この２本のバンドには沈降しなかった。この結果はＦａｂ抗体の高い特異性を示している。
【００７５】
ＨＵＶＥＣ接着アッセイにおける最適化したＩｇＧ
上記Ｆａｂ抗体のインビトロでの効力が二量体形式においてさらに向上されるかどうか検討するために、当該抗体をＭｏｒｐｈｏＳｙｓ  ＨｕＣＡＬ  ＩｇＧ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ（ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ  ＡＧ、Ｍｕｎｉｃｈ；Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた標準技術に従って、完全ＩｇＧ１分子に変換し、参照抗体ＩＩＡ１と比較して、ＨＵＶＥＣ接着アッセイ（図８）、ＨＵＶＥＣ生存率アッセイ（図９）およびＨＵＶＥＣアポトーシスアッセイ（図１０）によって分析した。
【００７６】
最も重要なことに、ＩＩＡ１を、参照点としての全ての実験に含んだ。この点において、ＭＯＲ０４９７４、−７５および−７７のＩｇＧ変換は、ＩＩＡ１と非常によく似たＩＣ50を有するＨｕＣＡＬＩｇＧをもたらし、これは一価Ｆａｂ形式と比較して、変換が実際に１〜２倍の向上をもたらしたことを示している。
【００７７】
ＨＵＶＥＣ生存率アッセイにおける最適化ＩｇＧ
ＩｇＧ変換後、５つの結合剤がＦａｂ形式と比較して〜２倍の改善されたＩＣ50値を有することを観察した。ＭＯＲ０４９７４、−７５、および−７７は、ＨＵＶＥＣ生存率を減少させる上で参照ＩｇＧＩＩＡ１と非常によく似た有効性を示した。
【００７８】
ＨＵＶＥＣアポトーシスアッセイにおける最適化ＩｇＧ
カスパーゼ３、７アッセイにおける誘導ＩｇＧの分析より、ＭＯＲ０４９７４、−７５および−７７は、参照抗体ＩＩＡ１と比べて、比較的よりアポトーシスを誘導したと結論付けられ得た。
【００７９】
１．６抗−インテグリンＩｇＧ抗体に最適化された親和性のより深い分析
最適化された抗−インテグリン抗体の親和性の特異性
ＩｇＧ１−形式の親和性成熟抗体を、ＨＴ２９ｗｔ対ＨＴ２９α５細胞のＦＡＣＳ分析によって、それらの結合特異性について試験した。ＨＴ２９ｗｔ細胞はα５−陰性であるがβ１−インテグリン鎖を含む。ＨＴ２９α５であるがＨＴ２９ｗｔでない細胞は、蛍光シフトによって示されるように、ＩｇＧ１−抗−インテグリン抗体および参照抗体ＩＩＡ１によって特異的に認識された（図１２）。非特異的抗体アイソタイプ対照は、細胞と結合せず、測定された蛍光においてシフトは見られなかった。これらの実験は、最有力候補の抗体がα５インテグリンを特異的に認識し、および参照抗体ＩＩＡ１と同様の特異性で結合することを示している。
【００８０】
抗−α５β１−インテグリン抗体のエピトープ特異性は、親和性成熟およびＩｇＧ形式へのリクローニング後、維持される。
我々はＦＡＣＳ競争実験によって、Ｆａｂ抗体ＭＯＲ０４６２４およびその誘導体が重複エピトープへの結合について参照抗体ＩＩＡ１と競合することを示している。ＩｇＧ１形式への変換後、抗α５β１インテグリン抗体を、ＩＩＡ１との結合競争について再度テストした。ＩｇＧ１抗−α５β１インテグリン抗体ＭＯＲ０４９７４、−７５、−７７、−８５およびＭＯＲ０４６２４のＨＴ２９α５細胞への結合は、細胞をＩＩＡ１とプレインキュベートした場合に完全に阻害される蛍光シフトをもたらした。この結果は、ＩＩＡ１およびＩｇＧ１抗−α５β１インテグリン抗体のエピトープ競争を確証させた（図１３）。
【００８１】
管形成血管新生アッセイにおける抗−α５β１インテグリンＩｇＧ１抗体の定量分析
活性化した内皮細胞由来の新しく形成された血管の遮断は、抗−α５β１インテグリン抗体の一つの重要な阻害活性と考えられている。完全な性質決定のために、我々は、ＨＵＶＥＣ管形成アッセイにおいて参照抗体ＩＩＡ１と比較して、親和性−最適化ＩｇＧ１抗−α５β１インテグリン抗体を分析した。
【００８２】
このアッセイにおいて、２×１０4のヒト内皮静脈臍細胞（ＨＵＶＥＣｓ＃２５１９、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）を、ＥＢＭ−２溶液（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ＃ＣＣ３１５６）中、成長因子リッチマルチゲル（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＃３５４２３４）上に蒔いた。抗体（６ｎＭ、３ｎＭ、６００ｐＭ、３００ｐＭ、６０ｐＭ）を１５分後に添加し、そして管形成を、１８〜２４時間、３７℃で行わせた。次いで、細胞を、管形成の写真の証拠文献のために固定および抗−ＣＤ３１で染色した。
【００８３】
ウェル中に形成された複合ネットワークの視覚分析は、参照抗体と同様の効力を伴った、全てのＭＯＲ０４６２４−由来の抗−α５β１インテグリン抗体についての管形成阻害活性を明らかにした（図１４）。高濃度において、管形成の抗体遮断は、また、ヒトおよびマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照においても発見した。しかしながら、より低い抗体濃度（３００ｐＭにまで下がって）において、活性ウィンドウは、管形成特異的抗体で処理されたウェルのみで阻害されるが未処理のウェルまたは抗体アイソタイプ対照または弱い機能阻害抗体ＭＯＲ０４６２４で処理されたウェルにおいては阻害されない場合に、観察された。
【００８４】
遊走アッセイにおける抗−α５β１インテグリンＩｇＧ抗体の分析
血管新生の過程において、活性型内皮細胞は、主にフィブロネクチン（ＦＮ）から成る血管新生−特異的な暫定的マトリックス上の血管新生刺激に向かって移動する。我々は、トランスウェル遊走アッセイにおいて最適化抗−α５β１インテグリンＩｇＧ抗体を分析し、そしてＩＩＡ１と同じ規模（１〜１０μｇ／ｍｌ）での有効性を伴った、全ての抗−α５β１抗体に対するα５β１−フィブロネクチン依存性ＨＵＶＥＣ移動の阻害活性を発見した（図１５）。
【００８５】
抗−α５β１インテグリン抗体の反応性
腫瘍および内皮細胞系における反応性
抗−α５β１インテグリン抗体の反応性を、ＦＡＣＳ結合実験によって様々な内皮および腫瘍細胞系上でテストした（表４）。α５鎖陰性と知られている、ＨＴ２９ｗｔ細胞を除いた全ての試験された内皮および腫瘍細胞系への結合を観察した。参照抗体ＩＩＡ１と比較して、最も有力な候補抗体は、全ての試験された細胞系に等しく結合し、および得られた蛍光シフトは全ての抗体において似ていた。アイソタイプ対照抗体は結合しなかった。要約すれば、抗−α５β１インテグリン抗体は、ＦＡＣＳ細胞結合実験において、ＩＩＡ１に相当する反応性を示す。
【００８６】
【表４】
2009537158.tif 000005
【００８７】
正常および腫瘍組織切片上での抗−α５β１抗体の反応性−免疫組織化学
親和性−最適化抗−α５β１インテグリン抗体を、異なる組織片上で免疫組織化学実験として分析し、そして各組織上の抗−インテグリン抗体の特異的反応性特性は非常にＩＩＡ１の染色と似ていた。要約すれば、我々は、我々の抗−α５β１インテグリン抗体がＩＩＡ１に相当する染色パターンを示すと結論付けた（図１６）。
【００８８】
親和性最適化抗−α５β１インテグリンＩｇＧ抗体のインビボでの性質決定
異種移植ヌードマウスでのインビボ標的化の実証
ＩＩＡ１と比較した最適化抗−α５β１インテグリン抗体のインビボ標的化特性を、ＨＴ２９α５細胞の異種移植を保有するヌードマウスにおいて比較した。
【００８９】
最適化抗−α５β１インテグリン抗体の放射能標識（ｌｇＧ４−Ｐｒｏ）を、標準手順に従い、１分間、ヨードゲン法によってヨウ素−１２５を用いて行った。免疫活性を、細胞−結合アッセイ（「Ｌｉｎｄｍｏアッセイ」）において測定した。５０ｎｇの放射能標識された抗体を、２時間、４℃で、増加しつつある（０、２５〜１０Ｍｉｏ）α５β１インテグリン−陽性細胞と共にインキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、そして結合された放射活性をシンチレーションカウンターで測定した。総数／結合数の商を、１／細胞数に対してプロットし、データを非線形回帰モデルに合わせた。ｙ−軸との交点から無限抗原密度における残りの免疫活性を計算し、そして全ての抗−α５β１インテグリン抗体において７５−８０％であることがわかった。
【００９０】
ヒト抗−α５β１インテグリン抗体は、２４時間から９６時間続く１０％以上のＩＤ／ｇを伴うＨＴ２９α５異種移植において、４８時間後に急速に減少し７２時間後に５％未満のＩＤ／ｇとなったＭＯＲ０４９７５を除き、全ての分析された抗体において、蓄積された。ＭＯＲ０４９７４は、そのピーク値に４８時間後に１８％ＩＤ／ｇを伴って到達し、ＭＯＲ０４９７７は、７２時間後に１８％ＩＤ／ｇを伴って到達した。相対的に、マウスＩＩＡ１抗体は、１０％以上のＩＤ／ｇを伴うＨＴ２９α５異種移植において、２４時間後から蓄積し、９６時間まで継続した。非−特異的抗−リゾチーム（ｌｙｓｏｚｍｅ）抗体ＭＯＲ０３２０７において、３％未満のＩＤ／ｇをどの時点でも発見した。これらの結果から、α５β１−陽性ＨＴ２９α５異種移植の特異的標的化が結論づけられる。抗−α５β１インテグリン抗体ＭＯＲ０４９７４およびＭＯＲ０４９７７のインビボ標的化は、ＩＩＡ１に類似しており、単一の時点ではさらに優れている。
【００９１】
血管新生の代理動物モデルからの抗−α５β１インテグリン抗体のインビボ有効性
参照抗体ＩＩＡ１として、抗−α５β１インテグリン抗体は、マウスおよびラットα５β１インテグリンとは交差反応性を示さない。それゆえ、インビボでの治療的有効性の分析、および動物モデルにおける特異的インビボ抗血管新生効果の実証は難しく、そして血管新生の代理モデルにおいて行う必要がある。抗−α５β１インテグリンＩｇＧ抗体とＩＩＡ１とのインビボ比較を、血管新生における３Ｄインビボ球状体代用モデルにおいて、実施した（図１８）。
【００９２】
このモデルにおいて、定義された内皮細胞数の球状体を、２４ウェルプレートにおける重合を可能とするコラーゲンと混合した。次いで、ＶＥＧＦおよびＦＧＦ２を含むマトリゲルプラグにおけるＥＣ球状体を、刺激されたＥＣがマウス脈管構造と吻合するヒト毛細血管の複雑な三次元網目構造を形成するＳＣＩＤマウスの皮下に移植した。抗−α５β１インテグリン抗体（２００μｇ）を３週間に渡り週に２回与えた。２１日目で研究は終了し、マルチゲルプラグを除去し、そして血管密度を調べた。参照抗体ＩＩＡ１に関しては、最適化抗−α５β１インテグリンＩｇＧ抗体ＭＯＲ０４９７４およびＭＯＲ０４９７５での処理は、２倍までマルチゲルプラグにおける微小血管密度を減少させ（１ｍｍ２あたりおよそ２０微小血管）、一方、無関係なヒト抗−リゾチーム抗体ＭＯＲ０３２７７での処理は、１ｍｍ２あたりおよそ４０微小血管という結果となった。
【００９３】
この結果に基づいて、最適化ヒト抗−α５β１インテグリン抗体ＭＯＲ０４９７４およびＭＯＲ０４９７５は、血管新生の３Ｄインビボ球状体代用モデルにおいて、ＩＩＡ１に匹敵するインビボ抗−血管新生有効性を有することが結論付けられる。
【００９４】
結論：
インビトロ実験において、ＩｇＧ１形式と同様に、Ｆａｂにおける最善の阻害特性は、一貫してＭＯＲ４９７４、−７５、−７において見つかった。全３つのＩｇＧは、参照ｍＡｂＩＩＡ１に相当する。これらの結合剤は、ＭＯＲ０４６２４の誘導体である。インビボ実験において、完全ヒトおよび最適化ＩｇＧＭＯＲ０４９７４、−７５、−７７を、ヌードマウスにおいて腫瘍異種移植を効率的に標的とするよう実施したところ、血管新生３Ｄ球状モデルにおいて、ＭＯＲ０４９７４およびＯＲ０４９７５は、参照抗体ＩＩＡ１と同等に有効であった。
【００９５】
上記抗体のＶ鎖のアミノ酸配列を表４中に示す：
親ＭＯＲ０４６２４
最終ｈｌｇＧ１カッパ  ＶＨ−ｈ−ｌｇＧ−ベクター  ＶＬ−ｈ−カッパ−ベクター
ＭＯＲ０４９７４      ＭＯＲ０４９８５            ＭＯＲ０４９９０
ＭＯＲ０４９７５      ＭＯＲ０４９８５            ＭＯＲ０４９９１
ＭＯＲ０４９７７      ＭＯＲ０４９８７            ＭＯＲ０４９８９
ＭＯＲ０４９８５      ＭＯＲ０４９８５            ＭＯＲ０４６２４
【００９６】
【化１】
2009537158.tif 000006
【００９７】
【化２】
2009537158.tif 000007
【００９８】
【化３】
2009537158.tif 000008
【００９９】
【化４】
2009537158.tif 000009
【０１００】
【化５】
2009537158.tif 000010
【０１０１】
【化６】
2009537158.tif 000011
【０１０２】
【化７】
2009537158.tif 000012
【０１０３】
２．結論：
抗−α５β１インテグリン機能阻害抗体は、キメラ抗体形式において利用可能なだけである。完全ヒト化への試みは失敗した。かかる抗体の臨床症状での適用は、ヒト患者において免疫応答を誘発するであろう。特に抗−血管新生化合物の慢性的な適用において、これは、投与量の増加または治療の早期終了を導き得る重篤な副作用を導くであろう。
【０１０４】
我々は、素晴らしい生物学的特徴を伴った完全ヒトα５β１インテグリン機能阻害抗体を同定した。それは、臨床において可能な限り副作用がないことを保障するだろうその完全なヒト性質に起因して、現存するマウスおよびキメラ抗体にとって有利である。重篤な副作用およびまたは投与量の増大を伴う、この分子に対する免疫応答を引き起こす可能性は非常に低いことが期待される。それゆえ、これらの分子は、例えば固形腫瘍の治療の如きヒト医学における適用に、より適している。
【０１０５】
【化８】
2009537158.tif 000013
【図１Ａ】
2009537158.tif 000014
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2009537158.tif 000019
【図５】
2009537158.tif 000020
【図６】
2009537158.tif 000021
【図７】
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【図８】
2009537158.tif 000023
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2009537158.tif 000029
【図１５】
2009537158.tif 000030
【図１６】
2009537158.tif 000031
【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2009537158.tif 000035
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