(57)【要約】【課題】ＬＤＬ受容体に対する抗体を提供すること。【解決手段】本発明は、ＬＤＬ受容体ペプチド配列の１９５〜２２２（配列番号１）アミノ酸の対応するペプチドに結合した、ヒトＬＤＬ（低密度リポタンパク質）受容体に対するモノクローナル抗体と、薬物の形態でのその使用と、前記抗体を含有する医薬組成物と、癌組織、健常組織、または無硬変組織もしくは硬変組織の免疫組織化学分析、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、またはｉｎ  ｖｉｖｏ定量試験におけるその使用とに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＬＤＬ（低密度リポタンパク質）受容体についてのペプチド配列のアミノ酸２８０〜３０７（配列番号１）に対応するペプチドに結合する、ヒトＬＤＬ受容体に対して惹起されたモノクローナル抗体。
【請求項２】
各軽鎖の少なくとも１つのＣＤＲ（相補性決定領域）が、配列番号２、配列番号３、配列番号４の配列から選択される配列と少なくとも７０％同一のペプチド配列を有すること、ならびに各重鎖の少なくとも１つのＣＤＲが、配列番号５、配列番号６、配列番号７の配列から選択される配列と少なくとも７０％同一のペプチド配列を有することを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
各軽鎖の各ＣＤＲが、それぞれ配列番号２、配列番号３および配列番号４の配列と少なくとも７０％同一のペプチド配列を有すること、および各重鎖の各ＣＤＲが、それぞれ配列番号５、配列番号６、配列番号７の配列と少なくとも７０％同一のペプチド配列を有することを特徴とする、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
各軽鎖の可変領域が、配列番号８の核酸配列と少なくとも７０％同一の核酸配列によりコードされること、および各重鎖の可変領域が、配列番号９の核酸配列と少なくとも７０％同一の核酸配列によりコードされることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
前記各軽鎖の可変領域が、配列番号８の核酸配列によりコードされること、および前記各重鎖の可変領域が配列番号９の核酸配列によりコードされることを特徴とする、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ断片、ＣＤＲ、またはこれらの断片もしくはこの領域のうち任意の１つの任意の改変型であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
マウスであることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体であることを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
毒素と結合していることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
免疫エフェクター細胞を動員させることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
癌細胞を破壊させることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
ＳＰ２／０−ＡＧ１４マウス細胞系で産生されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１３】
番号Ｉ−３４８８でＣＮＣＭに寄託されているＨ５Ｅ５ハイブリドーマにより産生することができることを特徴とする、請求項１から１１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１４】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の抗体を産生する安定な細胞系。
【請求項１５】
ＹＢ２／０、ＳＰ２／０−ＡＧ１４、ＩＲ９８３Ｆ、Ｎａｍａｌｗａヒト骨髄腫、ＰＥＲＣ６、ＣＨＯ細胞系、特にＣＨＯ−Ｋ−１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１０、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１３、ＣＨＯ  Ｐｒｏ−５、ＣＨＯ  ｄｈｆｒ−、Ｗｉｌ−２、Ｊｕｒｋａｔ、Ｖｅｒｏ、Ｍｏｌｔ−４、ＣＯＳ−７、２９３−ＨＥＫ、ＢＨＫ、Ｋ６Ｈ６、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、およびＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３からなる群から選択される、請求項１４に記載の安定な細胞系。
【請求項１６】
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ［Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ］（ＣＮＣＭ）にＣＮＣＭ登録番号Ｉ−３４８８で寄託されているＨ５Ｅ５ハイブリドーマ。
【請求項１７】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の抗体の重鎖の可変領域をコードしている、配列番号９の配列を有するＤＮＡ断片。
【請求項１８】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の抗体の軽鎖の可変領域をコードしている、配列番号８の配列を有するＤＮＡ断片。
【請求項１９】
配列番号９および配列番号８の配列を有する断片から選択される少なくとも１つのＤＮＡ断片を含む発現ベクター。
【請求項２０】
ヒトＬＤＬ受容体のペプチド配列のアミノ酸２８０〜３０７（配列番号１）に対応するペプチド。
【請求項２１】
免疫エフェクター細胞のＦｃγＲＩＩＩ受容体をｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化させるための、請求項１から１３のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項２２】
薬物の製造における、請求項１から１３のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項２３】
癌の治療を意図した薬物の製造における、請求項２２に記載の抗体の使用。
【請求項２４】
治療される癌が、前記癌の細胞表面に前記ＬＤＬ受容体が過剰発現している癌であることを特徴とする、請求項２２または２３のいずれかに記載の使用。
【請求項２５】
前記癌が、前立腺癌、膵臓癌、肝臓癌、乳癌、胃癌、卵巣癌、結腸癌、もしくは肺癌、または白血病であることを特徴とする、請求項２２から２４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２６】
急性骨髄性白血病、急性単球性白血病、骨髄性単球性白血病、急性転化した慢性骨髄性白血病、リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、ならびに類表皮子宮頸癌、子宮内膜腺癌、胃癌、肝細胞癌、絨毛癌、および脳腫瘍などの固形腫瘍を含む癌の治療を意図した薬物の調製における、請求項２２から２４のいずれか一項に記載の使用。  
【請求項２７】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容できる賦形剤および／または担体とを含む医薬組成物。
【請求項２８】
癌組織、健常組織、もしくは硬変組織の免疫組織化学分析、ウエスタンブロット分析もしくはＥＬＩＳＡ分析、またはｉｎ  ｖｉｖｏ定量試験における、請求項１から１３のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＬＤＬ（低密度リポタンパク質）受容体についてのペプチド配列のアミノ酸２８０〜３０７（配列番号１）に対応するペプチドに結合する、ヒトＬＤＬ受容体に対して惹起されたモノクローナル抗体と、薬物としてのその使用と、この抗体を含有する医薬組成物と、癌組織、健常組織、もしくは硬変組織の免疫組織化学分析、ウエスタンブロット分析もしくはＥＬＩＳＡ分析、またはｉｎ  ｖｉｖｏ定量試験におけるその使用とに関する。
【背景技術】
【０００２】
コレステロールは、肝臓、腸、および副腎により合成される脂質であるが、食物によってもまた供給される。コレステロールは、性ホルモンの合成、天然コルチゾンなどのコルチコステロイド、および胆汁成分に関与している。
【０００３】
血液に不溶性であることから、γ−コレステロールはリポタンパク質、特にＬＤＬ（低密度リポタンパク質）により輸送される。
【０００４】
次に、コレステロールは、ＬＤＬを認識することができる細胞表面タンパク質であるＬＤＬ受容体（ＬＤＬ−Ｒ）によって細胞に侵入する。次に、ＬＤＬ／ＬＤＬ−Ｒ複合体はエンドサイトーシスによりインターナリゼーションし、ＬＤＬはリソソームにより消化され、細胞が使用するためのコレステロールを放出する。
【０００５】
コレステロール血症は、血中コレステロール濃度を示す。低コレステロール血症は血中のコレステロール不足を示し、それに対して高コレステロール血症は血中のコレステロール過剰を示す。
【０００６】
高コレステロール血症は、ＬＤＬとＬＤＬ−Ｒとの結合の欠損が原因で、またはＬＤＬのインターナリゼーションの欠損が原因で起こりうることが実証されている。これらの欠損は、これらの患者の間のＬＤＬ−Ｒの家族性構造変化により起こりうる（Ｂｅｉｓｉｅｇｅｌら、１９８１）。
【０００７】
さらに、ある種の癌を有する患者が低コレステロール血症を患うことが研究から示された。この低コレステロール血症は、癌細胞によるコレステロールの使用過多の結果である。これらの癌細胞は、自分の生存のために腫瘍性器官の中のＬＤＬ受容体（ＬＤＬ−Ｒ）の発現レベルの増加を誘導する（Ｈｅｎｒｉｃｋｓｓｏｎら、１９８９）。
【０００８】
したがって、細胞によるＬＤＬ−Ｒ発現レベルの増加とある種の癌との間に相関がある。これらの癌には、特に前立腺癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌、および胃癌、ならびに白血病がある。
【０００９】
さらに、Ｃ型肝炎ウイルスのエンドサイトーシスはＬＤＬ−Ｒにより仲介されることが現在知られている。このように、ＬＤＬ−Ｒはウイルス受容体として作用することができる。
【００１０】
したがって、ＬＤＬ−Ｒは、多数の重要な細胞生存メカニズムおよび多数の疾患状態に関与すると思われる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、ＬＤＬ−Ｒの研究は、それが関与する疾患状態におけるその組織発現プロファイルを理解するためだけではなく、このような疾患状態の処置のための新しい治療手段の開発および研究にも関する大きな難題のままである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
したがって、この必要性を満たすために、本出願人はＬＤＬ−Ｒに感受性と特異性との両方を示すことにより、特に健常組織、腫瘍組織、または硬変組織の免疫組織化学分析、ウエスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡ分析、もしくはｉｎ  ｖｉｖｏ定量試験でのＬＤＬ−Ｒの発現の研究に、または特に癌の治療に使用するための新しい治療ツールの開発にさえも特によく適合する新しいツールを開発しようとした。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、ヒトＬＤＬ（低密度リポタンパク質）受容体に対して惹起されたモノクローナル抗体に関する。
【００１４】
本発明の第１の目的は、ヒトＬＤＬ（低密度リポタンパク質）受容体についてのペプチド配列のアミノ酸２８０〜３０７（配列番号１）に対応するペプチドに結合する、ヒトＬＤＬ受容体に対して惹起されたモノクローナル抗体に関する。
【００１５】
ヒトＬＤＬ受容体（ＬＤＬ−Ｒ）は、８３９アミノ酸からなる膜貫通タンパク質であり、３つの領域、すなわち細胞外領域（１〜７６８）、膜貫通領域（７６８〜７９０）、および細胞質領域（７９０〜８３９）を含む。細胞外領域は２つの小領域、すなわちＬＤＬ結合小領域（１〜３２２）とＬＤＬ結合領域以外の小領域（３２２〜７６８）とに分けられる。
【００１６】
本発明による抗体は、ＬＤＬ−Ｒペプチド配列のアミノ酸２８０〜３０７（配列番号１）に対応するペプチドに特異的に結合するように産生された。このペプチドは、ＬＤＬ結合領域に存在する。このペプチドは、本発明による抗体に良好な接触性を示すことから、ＬＤＬ結合領域にこのペプチドが存在することから、そしてこのペプチドの三次元コンホメーションから選択された。このペプチドは、そのアミノ酸組成が原因で免疫原性であるという性質もまた有する。
【００１７】
したがって、このペプチドは、ヒトＬＤＬ−Ｒに特異的である故にＬＤＬ−Ｒによい親和性を示す抗体を産生する目的で、本発明による抗体の標的として選択された。このペプチドは、マウスＬＤＬ−Ｒとも８５％の相同性を示し、このことは、ヒトおよびマウスにおいて交差反応する抗体の産生を可能にし、したがって、マウスでの試験（特に毒性試験）およびヒトでの使用の両方を実行する可能性を提供する。
【００１８】
この特定のペプチドを選択する他の利点は、残りの説明を概説するうえで明らかとなるであろう。
【００１９】
本発明のために、この抗体が結合するペプチドは、ＬＤＬ−Ｒのアミノ酸２８０〜３０７（配列番号１）に対応するペプチドに含まれるペプチドに対応することもできる。さらに具体的には、用語「ペプチド」は、少なくとも２個のアミノ酸、好ましくは５から３５個のアミノ酸、可能性があることには３５個を超えるアミノ酸の連結により形成される任意の分子を指すと理解されたい。
【００２０】
本発明の目的のために、用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、同一または独特な特異性を示す抗体分子の調製物を指す。
【００２１】
さらに、「抗体」は、任意の抗体全体、および少なくとも１つの免疫グロブリンドメインまたは免疫グロブリン断片を有する任意のポリペプチド、ペプチド、またはタンパク質および任意の抗体誘導体を意味する。
【００２２】
免疫グロブリン分子は、４つのポリペプチド、すなわちそれぞれ５０ｋＤａの２つの同一の重（Ｈ）鎖と、それぞれ２５ｋＤａの２つの同一の軽（Ｌ）鎖とからなる。軽鎖は２つのドメイン、すなわち可変ドメインＶと定常ドメインＣとからなり、これらは相互に独立した空間に折り畳まれている。これらのドメインは、「ＶＬ」および「ＣＬ」と呼ばれる。重鎖もまた、「ＶＨ」と呼ばれる１つのＶドメインと、「ＣＨ１」から「ＣＨ４」と呼ばれる３つまたは４つのＣドメインとを有する。各ドメインは、約１１０個のアミノ酸を有し、類似の構造をもつ。２つの重鎖はジスルフィド結合で結合し、各重鎖はジスルフィド結合により軽鎖ともまた結合している。
【００２３】
抗原に対する抗体の特異性を決定する領域は、可変部に保有されるが、定常部は、エフェクター細胞のＦｃ受容体または補体などの分子と相互作用して様々な機能的性質を仲介することができる。
【００２４】
このように、用語「免疫グロブリンドメイン」は、以下のドメインの任意の１つを指す：ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４。本発明による抗体は、有利にはこれらのドメインを１つまたは複数有し得、上記ドメインの全ての組合せが本発明の範囲内に入る。
【００２５】
用語「免疫グロブリン断片」は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｃ断片から選択される断片の１つか、ｓｃＦｖか、またはＣＤＲ（相補性決定領域）を指す。
【００２６】
パパインによる免疫グロブリンの酵素消化は、「Ｆａｂ断片」（「抗原結合断片」断片）およびＦｃ断片（結晶性断片）と呼ばれる２つの同一の断片を発生する。Ｆｃ断片は、免疫グロブリンのエフェクター機能を支える。
【００２７】
ペプシン消化により、２つのＦａｂ断片が２つのジスルフィド結合により結合したＦ（ａｂ’）２断片が発生し、Ｆｃ断片は多数のペプチドに開裂する。Ｆ（ａｂ’）２断片は、鎖間ジスルフィド結合により結合してＦ（ａｂ’）２を形成する２つのＦａｂ’断片からなる。
【００２８】
重鎖および軽鎖の可変領域に関して、配列多様性が等しく分布していないことを理解することができる。実際に可変領域は、一方で「フレームワーク」（ＦＲ）領域（ＦＲ１からＦＲ４の４つがある）として知られている非常に可変性が限られた領域と、他方で極度に可変性の領域とからなり、これらの極度に可変性の領域は、いわゆる「超可変」領域またはＣＤＲであり、その領域には３つ（ＣＤＲ１からＣＤＲ３）がある。
【００２９】
ｓｃＦｖ（可変一本鎖断片）は、モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ可変ドメインのみからなる断片であり、その構造は２つのドメインの間に位置する柔軟な短いペプチドアームにより安定化されている（Ｂｉｌｌｉａｌｄら、１９９５）。このような断片は細菌により産生されることができる。これらの分子は、特異的な方法で抗原を認識する能力を有する。分子量が小さいことから（２９ｋＤａ）、これらの分子は比較的低い免疫原性を示し、抗体全体よりも認容性が高い。
【００３０】
したがって、本発明による抗体は、有利にはこれらの断片の１つまたは複数を含み得０、上記断片の組合せの全てが本発明の範囲内に入る。
【００３１】
本発明の特定の一態様によると、本発明による抗体は、少なくとも１つの免疫グロブリンドメインと、少なくとも１つの免疫グロブリン断片、例えばＦｃ断片と、１つまたは複数の可変領域または超可変領域とを有する。
【００３２】
最後に、用語「抗体誘導体」は、１つまたは複数のアミノ酸残基の１つまたは複数の突然変異、置換、欠失、および／または付加を有することがある任意の抗体を指す。
【００３３】
本発明の特定の態様では、ヒトＬＤＬ受容体のアミノ酸２８０〜３０７（配列番号１）に対応するペプチドに結合する特定の性質および下に示す性質を有する本発明による抗体は、有利にはエフェクター細胞を動員させる。これに関して、「エフェクター細胞」は、抗体が結合した細胞（「標的細胞」）の破壊を引き起こす細胞である。さらに具体的には、エフェクター細胞はその表面にその抗体のＦｃ断片に対する受容体を発現する。さらに、用語「動員」は、本発明による抗体が、標的細胞の破壊を引き起こすことのできる細胞と結合する能力を指す。この破壊は、溶解、すなわち内容物の放出を伴う標的細胞の破壊からなえい得る。本発明による抗体が結合するペプチド（「標的ペプチド」）は、ＬＤＬ結合領域（ＬＤＬ−Ｒの天然リガンド）に位置する。
【００３４】
この結合により、本発明による抗体は、本発明による抗体が結合する細胞、なわち細胞表面にＬＤＬ−Ｒを発現する細胞（「標的細胞」）の破壊を引き起こすことのできる細胞、を動員させる。
【００３５】
用語「結合」は、標的ペプチドへの抗体の結合および標的細胞の破壊を引き起こすことのできる細胞の結合を指す。
【００３６】
エフェクター細胞は、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞であり得る。エフェクター細胞は、マクロファージ、好中球、Ｔ４リンパ球、Ｔ８リンパ球、または好酸球のことであり得る。これらの細胞は、細胞表面に本発明による抗体のＦｃ断片に対する受容体を発現する。本発明による抗体は、その可変断片を介して標的細胞に結合し、その定常断片を介してエフェクター細胞に結合する。標的細胞とエフェクター細胞との間のこの抗体依存的な関係は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞性細胞傷害作用）型のメカニズムにより標的細胞の溶解を引き起こす。
【００３７】
本発明による標的細胞は、有利には腫瘍細胞である。
【００３８】
本発明による抗体は、有利には癌細胞（「標的細胞」）を破壊させる。実際に、エフェクター細胞の動員は、本発明による抗体が結合している細胞の破壊を伴う。そのうえ研究は、細胞によるＬＤＬ−Ｒ発現の増加とある種の癌との間に相関があることを実証した。実際に、ある種の癌を有する患者は低コレステロール血症を患う。この低コレステロール血症は、癌細胞によるコレステロールの過剰利用の結果である。癌細胞は、自分の生存のために腫瘍性器官中のＬＤＬ受容体（ＬＤＬ−Ｒ）の発現レベルの増加を誘導する（Ｈｅｎｒｉｃｋｓｓｏｎら、１９８９）。これらには、特に前立腺癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌、および胃癌、ならびに白血病がある。したがって、ＬＤＬ−Ｒを過剰発現する癌細胞は、本発明による抗体の好ましい標的であろう。その抗体は、その抗体が結合した細胞を殺滅することのできる細胞を動員することによって、このような癌細胞の破壊を引き起こすであろう。
【００３９】
したがって、本発明の目的は、ヒトＬＤＬ（低密度リポタンパク質）受容体についてのペプチド配列のアミノ酸２８０〜３０７（配列番号１）に対応するペプチドに結合するヒトＬＤＬ受容体に対して惹起されたモノクローナル抗体である。
【００４０】
有利には、本発明による抗体の各軽鎖の少なくとも１つのＣＤＲ（相補性決定領域）は、以下の配列、すなわち配列番号２、配列番号３、配列番号４から選択される配列と少なくとも７０％の同一性を示すペプチド配列を有する。そして、本発明による抗体の各重鎖の少なくとも１つのＣＤＲは、以下の配列、すなわち配列番号５、配列番号６、配列番号７から選択される配列と少なくとも７０％の同一性を示すペプチド配列を有する。
【００４１】
問題のＣＤＲは、ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３のＣＤＲである。
【００４２】
特に有利には、上記各配列との同一性は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、または９９％であり、なおさらに好ましくは１００％である。同一率は、比較する２つの配列を整列させ、１つの同一のアミノ酸を有する位置の数を計数し、次にその数を配列中のアミノ酸の総数で割ることにより計算される。いずれにしても、これらの配列の差は、モノクローナル抗体のその標的に対する親和性にも、モノクローナル抗体が免疫エフェクター細胞を動員する能力にも決して影響しない。
【００４３】
特に有利には、本発明による抗体の各軽鎖の各ＣＤＲは、以下の配列、すなわちそれぞれ配列番号２、配列番号３、配列番号４と少なくとも７０％の同一性を示すペプチド配列を有する。そして、本発明による抗体の各重鎖の各ＣＤＲは、以下の配列、すなわちそれぞれ配列番号５、配列番号６、配列番号７と少なくとも７０％の同一性を示すペプチド配列を有する。したがって、本発明による抗体の各軽鎖のＣＤＲ１領域は、配列番号２の配列と少なくとも７０％同一のペプチド配列を有し、本発明による抗体の各軽鎖のＣＤＲ２領域は、配列番号３の配列と少なくとも７０％同一のペプチド配列を有し、本発明による抗体の各軽鎖のＣＤＲ３領域は、配列番号４の配列と少なくとも７０％同一のペプチド配列を有し、本発明による抗体の各重鎖のＣＤＲ１領域は、配列番号５の配列と少なくとも７０％同一のペプチド配列を有し、本発明による抗体の各重鎖のＣＤＲ２領域は、配列番号６の配列と少なくとも７０％同一のペプチド配列を有し、本発明による抗体の各重鎖のＣＤＲ３領域は、配列番号７の配列と少なくとも７０％同一のペプチド配列を有する。
【００４４】
特に有利には、上記各配列との同一性は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、または９９％であり、なおさらに好ましくは１００％である。
【００４５】
有利には、本発明による抗体の各軽鎖の可変領域は、配列番号８の核酸配列と少なくとも７０％同一の核酸配列によりコードされ、本発明による抗体の各重鎖の可変領域は、配列番号９の核酸配列と少なくとも７０％同一の核酸配列によりコードされる。
【００４６】
特に有利には、上記各配列との同一性は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、なおさらに好ましくは９５％または９９％である。同一率は、比較する２つの配列を整列させること、および１つの同一のヌクレオチドを有する位置の数を計数し、次にその数を配列中のヌクレオチドの総数で割ることにより計算される。遺伝暗号の縮重は、なぜ１つのアミノ酸が、種々のヌクレオチドの複数のトリプレットにコードされることができるかの理由でありうる。いずれにしても、これらの配列の差は、モノクローナル抗体のその標的に対する親和性に決して影響せず、モノクローナル抗体が免疫エフェクター細胞を動員する能力にも影響しない。
【００４７】
好ましくは、本発明による抗体の各軽鎖の可変領域は、配列番号８の核酸配列によりコードされ、その各重鎖の可変領域は配列番号９の核酸配列によりコードされる。
【００４８】
有利には、本発明による抗体の各軽鎖の可変領域は、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であり、その各重鎖の可変領域は配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一である。特に有利な方法では、上記各配列との同一性は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、なおさらに好ましくは９５％または９９％である。同一率は、比較する２つの配列を整列させること、および１つの同一のアミノ酸を有する位置の数を計数し、次にその数を配列中のアミノ酸の総数で割ることによって計算される。
【００４９】
好ましくは、本発明による抗体の各軽鎖の可変領域は、配列番号１０のペプチド配列を有し、本発明による抗体の各重鎖の可変領域は、配列番号１１のペプチド配列を有する。配列番号１０のペプチド配列は、配列番号８のヌクレオチド配列から推定されるペプチド配列であり、配列番号１１のペプチド配列は、配列番号９のヌクレオチド配列から推定されるペプチド配列である。
【００５０】
本発明による抗体は、本発明の性質を示す任意の修飾された抗体もまた包含し、その抗体では１つまたは複数のアミノ酸が付加、置換、または欠失している。このような付加、置換、または欠失は分子中の任意の位置に位置してもよい。多数のアミノ酸が付加、置換、または欠失している場合に、任意の組合せの付加、置換、または欠失を考慮することができる。標的ペプチドと接触することができる残基の数を増加させるために、本発明による抗体の可変領域の配列にこのような改変を加えることができる。
【００５１】
有利には、本発明による抗体は、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ断片、ＣＤＲ、またはこれらの断片もしくはこの領域の任意の１つの任意の改変型であってもよい（すなわち、それからなってもよい）。
【００５２】
本発明による抗体は、有利にはマウス抗体である。このマウス抗体は、有利にはＩｇＧ１κ抗体である。このような抗体は、動物、具体的にはマウスに、アミノ酸２８０〜３０７（配列番号１）に対応するペプチドまたはＬＤＬ結合領域に位置する任意の他のヒトＬＤＬ−Ｒペプチドを免疫することにより産生されることができる。抗体を産生するための方法は、当業者に公知である。ＬＤＬ−Ｒのアミノ酸２８０〜３０７（配列番号１）に対応するペプチドに対して惹起されたモノクローナル抗体を産生する特定の一方法によると、ＬＤＬ−Ｒ配列のアミノ酸２８０〜３０７（配列番号１）に対応するペプチドは、フロイントアジュバントの存在下でＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注射することができる。フロイント不完全アジュバントの存在下で多数回の追加免疫を行う。マウスの免疫反応は、配列番号１のペプチドに対するＥＬＩＳＡで血液試料によりモニターする。ハイブリドーマは、免疫されたマウス由来の脾臓細胞をＰＥＧ（ポリエチレングリコール）の存在下でマウス骨髄腫細胞と融合させて得る。次に、その細胞を培養し、配列番号１のペプチドに対するその細胞の反応をＥＬＩＳＡで試験する。
【００５３】
本発明による抗体は、有利にはキメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である。
【００５４】
本発明による抗体は、好ましくはキメラ抗体である。
【００５５】
用語「キメラ抗体」は、軽鎖および重鎖の可変領域がその軽鎖および重鎖の定常領域の種とは異なる種に属する抗体を指す。したがって、本発明による抗体は、さらにはマウス可変領域および非マウス種に属する定常領域を有する。この点で、例えば特にヒト、サル、ネズミ科（マウス以外）、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、およびイヌを含む全ての科および種の非マウス哺乳類ならびに鳥類を使用することができる。なおさらに好ましくは、本発明による抗体の各軽鎖および各重鎖の定常領域はヒト定常領域である。本発明のこの好ましい実施形態は、ヒトにおける抗体の免疫原性を減少させることを可能にすることによって、ヒトに投与したときにその抗体の有効性を向上させることもまた可能にする。
【００５６】
本発明の好ましい実施形態では、本発明による抗体の各軽鎖の定常領域はκ型領域である。本発明の実施形態には任意のアロタイプ、例えばＫｍ（１）、Ｋｍ（１，２）、Ｋｍ（１，２，３）、またはＫｍ（３）が適している。
【００５７】
本発明の別の実施形態では、本発明による抗体の各軽鎖の定常領域は、λ型領域である。
【００５８】
本発明の特定の一態様では、そして具体的には特に本発明による抗体の各軽鎖および各重鎖の定常領域がヒト領域である場合には、この抗体の各重鎖の定常領域はγ型領域である。この選択肢によれば、この抗体の各重鎖の定常領域はγ１、γ２、またはγ３型領域であり得（この３種類の定常領域は、ヒト補体と結合する特定の性質を有する）、またγ４型領域のことさえある。各重鎖の定常領域がγ型領域である抗体は、ＩｇＧクラスに属する。Ｇ型免疫グロブリン（ＩｇＧ）は、相互にジスルフィド結合で結合した２つの重鎖および２つの軽鎖からなるヘテロ二量体である。Ｎ末端では、各鎖は抗原（それに対してこの抗体が惹起された）に特異的な（軽鎖については再配列されたＶ−Ｊ遺伝子に、重鎖については再配列されたＶ−Ｄ−Ｊ遺伝子によりコードされている）可変領域または可変ドメインからなる。そしてＣ末端では、各鎖は、軽鎖については単一のＣＬドメイン、または重鎖については３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）からなる定常領域からなる。可変ドメインと、重鎖および軽鎖のＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインとが結合するとＦａｂ部が形成し、それは非常に柔軟なヒンジ領域によりＦｃ領域に結合している。ヒンジ領域は、各Ｆａｂをその抗原標的に結合させるが、その一方で抗体のエフェクター性の仲介因子であるＦｃ領域は、ＦｃγＲ受容体およびＣ１ｑなどのエフェクター分子に接触可能なままである。２つの球状ドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）からなるＦｃ領域は、Ａｓｎ２９７残基に結合する二分岐型Ｎ−グリカンが２つの鎖のそれぞれに存在して、ＣＨ２ドメインでグリコシル化されている。
【００５９】
抗体の各重鎖の定常領域は好ましくはγ１型領域である。それは、このような抗体が最大数の個体（ヒト）にＡＤＣＣ（抗体依存性細胞性細胞傷害作用）活性を示す能力を発揮するからである。この点で、任意のアロタイプ、例えばＧ１ｍ（３）、Ｇ１ｍ（１，２，１７）、Ｇ１ｍ（１，１７）、またはＧ１ｍ（１，３）は、本発明の実施に適する。
【００６０】
本発明によるキメラ抗体は、当業者に周知の標準的な組換えＤＮＡ技法を使用して、さらに具体的には、例えばＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１〜５５（１９８４）に記載されているキメラ抗体構築技法（この技法では、非ヒト哺乳動物から得られた抗体の重鎖の定常領域および／または軽鎖の定常領域を、ヒト免疫グロブリンの対応する領域と置換するために組換えＤＮＡ技法が使用されている）を使用して構築することができる。このような抗体およびその調製は、例えば特許公報ＥＰ１７３４９４、Ｎｅｕｂｅｒｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  １９８５  Ｍａｒ  ２７〜２１；３１４（６００８）：２６８〜７０の文献、およびＥＰ１２５０２３の文献にもまた記載されている。キメラ抗体を発生させる方法は、当業者に広く利用することができる。例えば、抗体の重鎖および軽鎖は、各鎖についてベクターを使用することにより別々に発現させてもよいし、あるいは単一のベクターに組み込んでもよい。
【００６１】
発現ベクターは、抗体の各重鎖または各軽鎖の可変ドメインをコードするマウス核酸配列、および／または抗体の各重鎖または各軽鎖の定常領域をコードする、好ましくはヒトである核酸配列を宿主細胞に導入して維持するために、それらの配列が挿入されている核酸分子である。発現ベクターは、これらの外来核酸断片の発現に不可欠な配列（プロモーター、ポリアデニル化配列、および選択遺伝子）を有することから、宿主細胞にこれらの外来核酸断片を発現させる。ベクターは、例えばプラスミド、アデノウイルス、レトロウイルス、またはバクテリオファージからなり得、宿主細胞は、任意の哺乳動物細胞、例えばＳＰ２／０、ＹＢ２／０、ＩＲ９８３Ｆ、Ｎａｍａｌｗａヒト骨髄種、ＰＥＲＣ６、ＣＨＯ細胞系、特にＣＨＯ−Ｋ−１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１０、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１３、ＣＨＯ  Ｐｒｏ−５、ＣＨＯ  ｄｈｆｒ−、Ｗｉｌ−２、Ｊｕｒｋａｔ、Ｖｅｒｏ、Ｍｏｌｔ−４、ＣＯＳ−７、２９３−ＨＥＫ、ＢＨＫ、Ｋ６Ｈ６、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、およびＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３であってもよい。
【００６２】
本発明によるキメラ抗体のための発現ベクターを構築するために、ＰＣＲ増幅反応時に適切な合成シグナル配列および制限部位を可変領域に融合させてもよい。次に、可変領域を抗体、好ましくはヒトＩｇＧ１の定常領域と組み合わせる。この方法で構築された遺伝子は、２つの別々のベクターを使用して（各鎖について１つ）、プロモーター（例えばＲＳＶプロモーター）の制御下でポリアデニル化部位の上流にクローニングする。これらのベクターには、例えばｄｈｆｒ遺伝子またはネオマイシン耐性遺伝子などの、当業者に公知の選択遺伝子もまた用意される。
【００６３】
本発明によるキメラ抗体は、当業者に周知の方法（例えばリン酸カルシウムを用いた共沈、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションなど）を使用して、宿主細胞に軽鎖の発現ベクターおよび重鎖の発現ベクターを同時トランスフェクションすることにより産生することができる。トランスフェクションの終わりに、選択培地、例えば５％透析血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、参照品番１０６０３−０１７）、５００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、参照品番１０１３１−０２７）、および２５ｎＭメトトレキサート（Ｓｉｇｍａ、参照品番Ｍ８４０７）を含有するＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、参照品番２１８７５−０３４）に細胞を入れることができる。耐性のトランスフェクションウェルからの上清は、ヒトＩｇ配列に特異的なＥＬＩＳＡアッセイによりキメラ免疫グロブリン（Ｉｇ）の存在についてスクリーニングする。最多の抗体を産生するトランスフェクタントを増幅し、その上清は、細胞の生産性を推定し、限界希釈クローニング（４０細胞／プレート）についての３つの最良産生細胞を選択するためにもう一度ＥＬＩＳＡによりアッセイする。
【００６４】
用語「ヒト化抗体」は、非ヒト起源の抗体由来のＣＤＲを有し、抗体分子のその他の部分は１つ（または複数）のヒト抗体由来である抗体を指す。このような抗体は、当業者に周知のＣＤＲグラフティング法により調製することができる［米国特許公報第５２２５５３９号および第６１８０３７０号；Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ３２１（６０６９）：５２２〜５（１９８６）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｂｉｏａｓｓａｙｓ８（２）：７４〜８（１９８８）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３〜７（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ  Ｃ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６（２４）：１００２９〜３３（１９８９）；Ｌｅｗｉｓ  Ａ．Ｐ．およびＣｒｏｗｅ  Ｊ．Ｓ．、Ｇｅｎｅ１０１（２）：２９７〜３０２（１９９１）；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ  Ｂ．Ｌ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９（９）：２４７１〜６（１９９１）；Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：４２８５（１９９２）；Ｓｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０（７）：２８４４〜５７（１９９３）；およびＰｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３）］。ヒト化抗体の産生のためにグラフトさせるヒト可変ドメインの選択は、その抗体の標的に対するその親和性を変えずに、その抗体の免疫原性を減少させるために重要である。ヒト化抗体を産生させる一方法において、マウス抗体の可変ドメインの配列は、ヒト可変領域の公知の配列のライブラリーと比較され、マウス配列に最も近いヒト可変配列は、ヒト化抗体のＦＲ領域として選択される［Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３〜７（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ  Ｃ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６（２４）：１００２９〜３３（１９８９）；およびＳｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）］。ヒトＦＲ領域を選択するための別の方法は、各ＦＲ領域についてマウス配列に最も近いヒトＦＲ配列を選択するために、マウスＦＲ配列の各小領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）の配列を公知のヒトＦＲ配列のライブラリーと比較することからなる［米国特許公報２００３／００４０６０６；Ｓｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０（７）：２８４４〜５７（１９９３）；Ｓａｔｏ  Ｋ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１（５）：３７１〜８１（１９９４）；およびＬｅｕｎｇ  Ｓ．Ｏ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２（１７〜１８）：１４１３〜２７（１９９５）］。別の方法では、特定の重鎖または軽鎖亜群のヒト抗体全てのコンセンサス配列由来の特定のＦＲ領域を使用する［Ｓａｔｏ  Ｋ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１（５）：３７１〜８１（１９９４）］。大部分の場合で、ＣＤＲのグラフティングは、ヒト化抗体のその標的に対する良好な親和性を保つために、ヒトＦＲに位置するある主要な残基を突然変異させることにより完了する。（Ｈｏｌｍｅｓ  Ｍ．Ａ．およびＦｏｏｔｅ  Ｊ．Ｊ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８（５）：２１９２〜２０１（１９９７）］。
【００６５】
本発明によるヒト化抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断法での使用に、またはｉｎ  ｖｉｖｏ予防法および／または治療法での使用に好ましい。
【００６６】
この方法でキメラ化またはヒト化される本発明による抗体は、人体によりよく認容され、少なくともマウス抗体と同様に有効であるという利点を有する。特に有利には、この方法でキメラ化またはヒト化された抗体は、対応するマウス抗体よりも２倍の大きさの細胞傷害性である。なおさらに有利には、この方法でキメラ化またはヒト化された抗体は、対応するマウス抗体よりも１０倍の、または１００倍もの、または好ましくは１００倍を超えた大きさの細胞傷害性である。
【００６７】
用語「ヒト抗体」は、各領域がヒト抗体に由来する抗体を意味するものとして理解されるべきである。このような抗体は、ヒト抗体遺伝子を有するトランスジェニックマウス由来であってもよいし、ヒト細胞由来であってもよい［Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６（５）：５６１〜６（１９９５年１０月）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  Ｎ．およびＨｕｓｚａｒ  Ｄ．、Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３：６５〜９３（１９９５）；ならびにＴｏｍｉｚｕｋａ  Ｋ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９７（２）：７２２〜７２７（２０００）］。
【００６８】
本発明による抗体は、有利には毒素と結合している。この毒素は、例えばジフテリア毒素またはリシンである。本発明による抗体と毒素との間の結合は、その毒素の全身放出を阻止するに足るほど強く、標的細胞に毒素を放出させるのに十分なほど不安定でもある。
【００６９】
本発明の別の態様では、抗体は放射性同位体と結合している。放射性同位体の存在は、細胞傷害性を実質的に増加させる。２つの同位体、すなわち半減期が比較的長く（８日）、本発明による抗体と結合した腫瘍細胞の周囲約１ｍｍの領域に殺腫瘍効果を有するヨウ素−１３１（βおよびγ放射体）が主に使用される。ヨウ素−１３１は、撮像を可能にする利点を有するが、放射線防護措置の遵守を必要とする。半減期がさらに短い（２．５日）イットリウム−９０（β放射体）は、５ｍｍの距離で殺腫瘍効果を有する。
【００７０】
本発明による抗体は、有利には免疫エフェクター細胞を動員させる。この抗体は、その良好な特異性および感受性のおかげでＡＤＣＣ（抗体依存性細胞性細胞傷害）反応を仲介するために使用することができるツールである。実際に、本発明による抗体は、例えばキメラ化またはヒト化することによってＡＤＣＣを誘導するために修飾することができる。本発明による抗体は、免疫エフェクター細胞を動員させる。
【００７１】
本発明による抗体は、有利には癌細胞を破壊させる。実際に、本発明による抗体によるエフェクター細胞の動員は、その抗体が結合している細胞（標的細胞）の破壊を伴う。したがって、ＬＤＬ−Ｒを過剰発現している癌細胞は、本発明による抗体の好ましい標的であろう。したがって、ＬＤＬ−Ｒを過剰発現しないか、限られた程度でしか過剰発現しないことから健常細胞は保たれるので、溶解した細胞はある程度特異的に癌細胞からなるであろう。
【００７２】
本発明により好まれる抗体は、ハイブリドーマＨ５Ｅ５（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ［Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ］（ＣＮＣＭ）、２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、Ｆ−７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５に番号Ｉ−３４８８で寄託されている）により産生することができる抗体５Ｅ５である。Ｈ５Ｅ５ハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体の各軽鎖の可変領域は、配列番号８の核酸配列によりコードされ、Ｈ５Ｅ５ハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体の各重鎖の可変領域は、配列番号９の核酸配列によりコードされる。
【００７３】
本発明の特定の一目的は、ＬＤＬ−Ｒに結合してエフェクター細胞を動員させるモノクローナル抗体に関する。この抗体は５Ｅ５抗体であるか、または５Ｅ５抗体の可変部を有する任意のキメラ抗体、ヒト化抗体、もしくはヒト抗体である。
【００７４】
特定の一実施形態では、この抗体はＳＰ２／０−Ａｇ１４マウス細胞系（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８１）で産生される。
【００７５】
本発明の別の目的は、本明細書上記の、本発明による抗体を産生する安定な細胞系に関する。
【００７６】
本発明による安定な細胞系は、有利にはＳＰ２／０、ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６６２でＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されているＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞）、ＳＰ２／０−ＡＧ１４（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８１）、ＩＲ９８３Ｆ、Ｎａｍａｌｗａヒト骨髄種、ＰＥＲＣ６、ＣＨＯ細胞系、特にＣＨＯ−Ｋ−１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１０、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１３、ＣＨＯ  Ｐｒｏ−５、ＣＨＯ  ｄｈｆｒ−、Ｗｉｌ−２、Ｊｕｒｋａｔ、Ｖｅｒｏ、Ｍｏｌｔ−４、ＣＯＳ−７、２９３−ＨＥＫ、ＢＨＫ、Ｋ６Ｈ６、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、およびＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３からなる群から選択される。
【００７７】
本発明の別の目的は、ＣＮＣＭ登録番号Ｉ−３４８８でＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマＨ５Ｅ５に関する。
【００７８】
本発明の別の目的は、本発明による抗体の重鎖の可変領域をコードする配列番号９の配列を有するＤＮＡ断片に関する。このＤＮＡ断片は、アミノ酸２８０〜３０７（配列番号１）に対応するペプチドに結合するポリペプチドの製造に使用することができ、そのポリペプチドは抗体であってもよい。
【００７９】
本発明の別の目的は、本発明による抗体の軽鎖の可変領域をコードする配列番号８の配列を有するＤＮＡ断片に関する。同様に、このＤＮＡ断片は、アミノ酸２８０〜３０７（配列番号１）に対応するペプチドに結合するポリペプチドの製造に使用することができ、そのポリペプチドは抗体であってもよい。
【００８０】
本発明の別の目的は、配列番号９および配列番号８を有する断片から選択される少なくとも１つのＤＮＡ断片を含む発現ベクターに関する。
【００８１】
本発明の別の目的は、ヒトＬＤＬ受容体のペプチド配列のアミノ酸２８０〜３０７（配列番号１）に対応するペプチドからなる。
【００８２】
本発明の別の目的は、免疫エフェクター細胞のＦｃγＲＩＩＩ受容体をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで活性化するために本発明に従う抗体の使用である。実際に、本発明による抗体がそのＦｃ領域によりＦｃγＲＩＩＩＡ受容体を活性化する能力から、その抗体を使用することができる。この受容体が「エフェクター細胞」として知られている細胞の表面に発現していることから、このことはかなり関心対象である。この抗体のＦｃ領域の、エフェクター細胞が有するその受容体への結合は、ＦｃγＲＩＩＩＡの活性化および標的細胞の破壊を引き起こす。エフェクター細胞は、例えばＮＫ（ナチュラルキラー）細胞、マクロファージ、好中球、ＣＤ８リンパ球、Ｔγδリンパ球、ＮＫＴ細胞、好酸球、好塩基球、またはマスト細胞である。
【００８３】
本発明の別の特定の目的は、薬物としての使用を意図した本明細書上記の抗体である。
【００８４】
本発明の特定の一態様では、使用される抗体はヒトＬＤＬ受容体に結合され、エフェクター細胞を動員させる。この細胞傷害性抗体は、有利にはＬＤＬ受容体の細胞外領域の全てまたは一部に結合することができ、すなわちこの抗体はＬＤＬ結合領域（アミノ酸１〜３２２に対応する）またはＬＤＬ結合領域以外の領域（ＬＤＬ−Ｒのアミノ酸３２２〜７６８に対応する）に結合することができる。この点に関して、ＬＤＬ受容体のペプチド配列のアミノ酸２８０〜３０７（配列番号１）に対応するペプチドに結合する、本発明による抗体は、本発明のこの態様の特定の一実施形態である。
【００８５】
さらに具体的には、本発明の一目的は、薬物の製造への本明細書上記の抗体の使用である。この細胞傷害性抗体は、有利にはＬＤＬ受容体の細胞外領域の全てまたは一部に結合することができ、すなわちこの抗体はＬＤＬ結合領域（アミノ酸１〜３２２に対応する）またはＬＤＬ結合領域以外の領域（ＬＤＬ−Ｒのアミノ酸３２２〜７６８に対応する）に結合することができる。この点に関して、ヒトＬＤＬ受容体のペプチド配列のアミノ酸２８０〜３０７（配列番号１）に対応するペプチドに結合する、本発明による抗体は、本発明のこの目的の特定の一実施形態である。
【００８６】
本発明の別の目的は、癌の治療を意図した薬物の製造における、本明細書上記の抗体、すなわちヒトＬＤＬ受容体の細胞外領域の全てまたは一部、有利にはヒトＬＤＬ受容体の配列のアミノ酸２８０〜３０７（配列番号１）に対応するペプチドに結合する能力を有する抗体の使用である。実際に、本発明による抗体は、特異的にＬＤＬ−Ｒを標的にする。この点に関して、本発明による抗体は、この受容体に結合すると、特異的には標的癌細胞に対するＡＤＣＣにより標的癌細胞に溶解反応を引き起こし、その溶解を可能にする。したがって、ＬＤＬ−Ｒを過剰発現しないか、限られた程度でしか発現しないことから健常細胞は保たれるので、溶解した細胞はある程度特異的に癌細胞からなるであろう。
【００８７】
有利には、本発明による抗体を使用して治療される癌は、対応する健常細胞に比べてＬＤＬ受容体が癌細胞表面に過剰発現している癌である。
【００８８】
特に有利には、治療される癌は、前立腺癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、結腸癌、もしくは肺癌、または白血病であり、これらの癌では、癌細胞膜表面でのＬＤＬ受容体の密度増加が観察される。標的癌細胞はＡＤＣＣ反応の間に動員されたエフェクター細胞により溶解されることができるが、ＬＤＬ−Ｒを過剰発現しないことから健常細胞は保たれる。
【００８９】
特に有利には、本発明による抗体は、急性骨髄性白血病、急性単球性白血病、骨髄性単球性白血病、急性転化した慢性骨髄性白血病、リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、ならびに類表皮子宮頸癌、子宮内膜腺癌、胃癌、肝細胞癌、絨毛癌、および脳腫瘍などの固形腫瘍を含む癌の治療を意図した薬物の調製に使用される。
【００９０】
本発明の別の目的は、本明細書上記の本発明による抗体と、薬学的に許容できる賦形剤および／または担体とを含む医薬組成物に関する。この医薬組成物の目的は、癌細胞、具体的にはＬＤＬ−Ｒを過剰発現する癌細胞を標的にすることである。健常細胞により発現される受容体の量よりも多量のＬＤＬ受容体をこれらの癌細胞が細胞表面に発現することから、このように調製された薬物は、癌細胞により優先的に結合されるであろう。
【００９１】
賦形剤は、医薬用途に適合性で、当業者に公知の食塩水、等張溶液、または緩衝溶液などの任意の溶液、および任意の懸濁液、ゲル、または粉末などである。本発明による組成物は、分散剤、可溶化剤、安定化剤、界面活性剤、保存料などから選択される１つまたは複数の薬剤または担体もまた含有してもよい。本発明による組成物は、他の薬剤または活性成分もまた含んでもよい。
【００９２】
さらに、この組成物は、異なる方法で、異なる剤形で投与することができる。投与は、この種の治療アプローチについての任意の従来の経路、例えば具体的には特に静脈内注射、皮内注射、腫瘍内注射、皮下注射、腹腔内注射、筋肉内注射、または動脈内注射などを含む全身経路からなっていてもよい。例えば、腫瘍内注射または腫瘍近くまたは腫瘍を潅注する領域での注射を参照することができる。
【００９３】
薬用量は、投与回数、他の活性成分との関連、疾患状態の進行段階などに応じて変化することがある。
【００９４】
本発明の別の目的は、癌組織、健常組織、もしくは硬変組織の免疫組織化学分析、またはウエスタンブロット分析もしくはＥＬＩＳＡ分析、またはｉｎ  ｖｉｖｏ定量試験における本発明による抗体の使用である。
【００９５】
５Ｅ５抗体は、ヒトＬＤＬ−Ｒのグリコシル化形態および非グリコシル化形態にそれぞれ対応する１６０ｋＤａのバンドおよび１２０ｋＤａのバンドを特異的に認識することから、ウエスタンブロット分析での使用に特に適する。したがって５Ｅ５抗体は、ＬＤＬ−Ｒが関与する疾患状態のための、さらに詳細には癌のための診断ツールであるという利点を有する。
【００９６】
本発明の別の態様および利点を以下の実施例に記載するが、この実施例は例示であり、本発明の範囲を限定するものではないとみなさなければならない。
【実施例】
【００９７】
実施例１：ヒトＬＤＬ受容体配列（配列番号１）のアミノ酸２８０〜３０７の配列に対応するペプチドに対して惹起されたモノクローナル抗体の産生、選択、および特徴付け
適切なペプチド配列の選択
ＬＤＬ結合領域に位置する配列番号１の配列（ヒトＬＤＬ受容体配列のアミノ酸２８０〜３０７に対応する）に対応するペプチド断片を合成した。システイン残基のチオール基の酸化事象でのジスルフィド結合の形成を避けるために、（システイン残基をセリン残基に置換することによって）選択した配列番号１の配列を修飾した。（配列番号１７）
ペプチド合成
ペプチドは、０．５ｍｍｏｌ  ＭＢＨＡ樹脂でＢｏｃ／Ｂｚｌ法を使用して、ＡＢＩ  ４３３  Ａモデル自動合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州、米国）を用いた固相合成法により合成した。
質量分析
分子量は、イオン−エレクトロスプレー質量分析により決定した。エレクトロスプレースペクトルは、イオンスプレー（ネブライザー補助エレクトロスプレー）源（Ｓｃｉｅｘ、トロント、カナダ）を備えるイオン−エレクトロスプレーシングル四重極質量分析器でＡＰＩシステム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｓｃｉｅｘ）を使用して得た。
モノクローナル抗体の産生
配列番号１の配列に対応するペプチドに対して惹起されたモノクローナル抗体は、配列番号１７に対応するペプチドの腹腔内注射により雄性ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫することにより産生した。このペプチドは、等体積のフロイント完全アジュバントを用いて予め乳化させておいた。
【００９８】
次に、フロイント不完全アジュバントの存在下で２週間毎に３回の注射を行った。最後の注射の４日後に動物の脾臓を除去し、次に細胞を単離し、ポリエチレングリコールなどの融合剤の存在下でＳｐ２／０−Ａｇ１４マウス骨髄腫細胞と融合させた。次に、未融合の悪性細胞の増殖を阻害する選択培地（ＨＡＴ培地）の中で融合細胞をインキュベートした。
【００９９】
ハイブリドーマのモノクローナル性を調べるために、限界希釈によるサブクローニングを繰り返して行った。これらのサブクローニングの終わりに、配列番号１に対応するペプチドに対する抗体を産生する「Ｈ５Ｅ５」と呼ばれるハイブリドーマを選択した。このハイブリドーマは、サブクラス１のＩｇＧクラスのメンバーである。
【０１００】
所望の特異性、すなわち配列番号１に対応するペプチドに対する特異性を有するモノクローナル抗体の分泌について、ハイブリドーマＨ５Ｅ５により産生される抗体をＥＬＩＳＡで試験した。
【０１０１】
プリスタンの注射を前もって受けた雄性ＢＡＬＢ／ｃマウスから腹水を得て、そのマウスにＨ５Ｅ５ハイブリドーマの２×１０６細胞を注射した。
【０１０２】
２７％硫酸アンモニウムを用いた沈殿によりモノクローナル抗体を単離し、次にプロテインＡゲル（ＨｉＴｒａｐプロテインＡ  ＨＰカラム、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ウプサラ、スウェーデン）を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。保持されなかったタンパク質は、緩衝食塩水（ＰＢＳ：５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩、ｐＨ７．２、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ）で洗い流した。配列番号１の配列に対応するペプチドに対して惹起された抗体に特異的なモノクローナルＩｇＧ免疫グロブリンの溶出は、０．２Ｍグリシン（ｐＨ２．８）を使用して行った。精製した抗体は直ちに１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＢＳで透析し、凍結乾燥により濃縮し、次に−２０℃で一定分量の０．５〜１ｍｇ±１％ＢＳＡに入れて保存した。
【０１０３】
これらの抗体を以後「抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５」抗体と呼ぶ。
ウエスタンブロット分析
抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体は、ウエスタンブロット法により試験した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の総タンパク質の抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１０％）で変性剤電気泳動に供し、次にニトロセルロース膜に移し、抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体と反応させた。免疫反応性タンパク質は、ペルオキシダーゼ複合抗ＩｇＧモノクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を使用して可視化した。反応物の展色は化学ルミネセンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により行った。
【０１０４】
ウエスタンブロット分析から、抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体が、それぞれヒトＬＤＬ−Ｒのグリコシル化形態および非グリコシル化形態に対応する１６０ｋＤａのバンドおよび１２０ｋＤａのバンドを認識したことが示された（図９）。
アイソタイプ分類
ハイブリドーマのアイソタイプ分類は、ＳＢＡ  Ｃｌｏｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ／ＨＲＰキット（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）およびＩｓｏｓｔｒｉｐ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｔｅｓｔ（Ｒｏｃｈｅ参照品番１４９３０２７）を使用してＥＬＩＳＡで行った。５Ｅ５抗体はＩｇＧ１κ抗体である。
実施例２：癌細胞系におけるＬＤＬ−Ｒ発現レベルのスクリーニング
標識ＬＤＬの結合を研究することにより、ＬＤＬ−Ｒの発現について以下の癌細胞系をスクリーニングした：ＨｅｐＧ２、ＨｅＬａ、ＭＣＦ−７、Ｊｕｒｋａｔ、Ｒａｍｏｓ、ＨｕＨ７、およびＨｅｋ２９３（図１および２）。この目的のために、超遠心分離によりＬＤＬ（密度＝１．０３〜１．０５３ｇ／ｍＬ）を調製し、それをｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液中で透析し、変性条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認し、次に蛍光色素１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチル−インドカルボシアニド（Ｄｉｌ）で標識した。ＬＤＬ−Ｄｉｌを終濃度０、１０、および１００μｇ／ｍＬで細胞上で４℃で３時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後に、ＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取）サイトフルオロメトリーにより結合を分析した。すなわち、所与の細胞集団中の各細胞の蛍光をＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ装置（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いたフローサイトメトリーにより個別に測定した。測定したパラメーターは、ＦＳＣ（Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｓｃａｔｔｅｒ）、ＳＳＣ（Ｓｉｄｅ  Ｓｃａｔｔｅｒ）、および４８８ｎｍのアルゴンレーザを用いた励起後に波長５３０ｎｍで発光した蛍光であった。結果を蛍光細胞の率で表した（図１）。
【０１０５】
図１に示した結果は、ＨｅｐＧ２およびＨｅＬａ細胞がＬＤＬ−Ｒを最も強く発現することを示している。
【０１０６】
さらに、いくつかの乳癌細胞系を入手することができた：ＭＣＦ７−ｒａｓ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１。これらのヒト癌細胞系でのＬＤＬ−Ｒの発現は、この細胞系の標識ＬＤＬの結合を研究することにより検出した。この目的のために、ＬＤＬ（ｄ＝１．０３〜１．０５３）を超遠心分離により調製し、ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液中で透析し、変性条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認し、次に蛍光色素１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチル−インドカルボシアニド（Ｄｉｌ）で標識した。ＬＤＬ−Ｄｉｌを終濃度６．２５、１２．５、２５、５０、および１００μｇ／ｍＬで細胞上で４℃で３時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後に、結合をサイトフルオロメトリー（ＦＡＣＳ）により分析し、結果を蛍光細胞の率で表した。
【０１０７】
このように、各細胞系をそのＬＤＬ−Ｒ発現レベルについて試験した（図３）：ＭＣＦ７−ｒａｓおよびＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞は、ＨｅｐＧ２細胞の半分に等しいＬＤＬ−Ｒ発現レベルを有した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、高レベルでＬＤＬ−Ｒを発現する均一集団に相当した。
実施例３：実施例１で選択された配列番号１の配列に対応するペプチドに対して惹起されたモノクローナル抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能試験
配列番号１の配列に対応するペプチドに対して惹起されたモノクローナル抗体の機能性は、細胞レベル（Ａ５４９細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞）でＬＤＬ−Ｒへの抗体の結合を研究すること；Ｃ２Ｃ１２（マウス）、ＣＨＯ−Ｋ１（ハムスター）、およびＹＢ２／０（ラット）細胞上のＬＤＬ−Ｒとのこれらの抗体の交差反応性を研究すること；Ａ５４９細胞のＬＤＬ受容体に対するこれらの抗体とＬＤＬとの間の競合を研究すること；それらのインターナリゼーション動態を研究すること；ならびにこれらの抗体のアポトーシス促進性を研究することにより評価した。
Ａ５４９細胞のＬＤＬ受容体への抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体の結合の研究
ＬＤＬ−Ｒへの抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体の結合は、ＬＰＤＳ（リポタンパク質欠乏血清）の存在下で２４時間増殖させたＡ５４９細胞の標識をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）で定量することにより評価した。この試験を行うために、抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体を終濃度１、３、１０、３０、および１００μｇ／ｍＬで４℃で３時間インキュベートした。抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体と同条件下で調製およびインキュベートした市販の１Ｃ６（抗ＳＲＥＢＰ２、ＩｇＧ１、ＡＴＣＣ−ＬＧＣ  Ｐｒｏｍｏｃｈｅｍ  ＣＲＬ−２２２４）およびＣ７（抗ＬＤＬ−Ｒ、ＩｇＧ２ｂ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６９１）抗体をそれぞれ陰性対照抗体および陽性対照抗体として使用した。抗ＩｇＧ−ＰＥ二次抗体を使用して結合の検出を行った。結果を蛍光細胞の率（図４）で表した。
【０１０８】
抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体は、Ａ５４９細胞のＬＤＬ受容体を用量依存的に認識した。
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＬＤＬ受容体への抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体の結合の研究
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＬＤＬ受容体への抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体の結合は、Ａ５４９細胞のＬＤＬ受容体への抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体の結合の研究について説明したものと同じプロトコールに従って、ＬＰＤＳの存在下で２４時間増殖したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の標識をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により定量することにより評価した。この試験を行うために、抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体を終濃度１、３、１０、３０、および１００μｇ／ｍＬで４℃で３時間インキュベートした。抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体と同条件下で調製およびインキュベートした市販の１Ｃ６（抗ＳＲＥＢＰ２、ＩｇＧ１）抗体およびＣ７（抗ＬＤＬ−Ｒ、ＩｇＧ２ｂ）抗体をそれぞれ陰性対照抗体および陽性対照抗体として使用した。結合の検出は抗ＩｇＧ−ＰＥ抗体を使用して行った。結果を蛍光細胞の率（図５）で表した。
【０１０９】
抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＬＤＬ受容体を認識した。
Ｃ２Ｃ１２細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、およびＹＢ２／０細胞のＬＤＬ受容体への抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体の交差反応性の研究
抗ＬＤＬ−Ｒ抗体の交差反応性は、マウス（Ｃ２Ｃ１２細胞）、ラット（ＹＢ２／０細胞）、およびハムスター（ＣＨＯ−Ｋ１細胞）で試験した。前もってＬＰＤＳ条件下で２４時間培養しておいたＣ２Ｃ１２細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、およびＹＢ２／０細胞を用いて、抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体を終濃度３０μｇ／ｍＬで４℃で３時間インキュベートした。市販の１Ｃ６（抗ＳＲＥＢＰ２、ＩｇＧ１）抗体およびＣ７（抗ＬＤＬ−Ｒ、ＩｇＧ２ｂ）抗体をそれぞれ陰性対照抗体および陽性対照抗体として使用した。結合の検出は、抗ＩｇＧ  ＰＥ抗体を使用して行った。結果を蛍光細胞の率（図６Ａ）および平均蛍光（図６Ｂ）で表した。
Ａ５４９細胞上の抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体とＬＤＬとの競合の研究
ＬＤＬと抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体との競合は、Ａ５４９細胞に対して、増加する濃度の未標識ＬＤＬ（抗体濃度の１、４、および１６倍をｎＭで表したもの）と競合している抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体（３０μｇ／ｍＬ）の結合を４℃で３時間試験することにより研究した。結合の検出は、抗ＩｇＧ−ＰＥ抗体を使用して行った。次に、ＬＤＬ−Ｒへの抗体の結合をＦＡＣＳにより分析し、その結果を平均蛍光で表した（図７）。
【０１１０】
抗体とＬＤＬとの競合のこの試験は、Ａ５４９細胞のＬＤＬ受容体への５Ｅ５抗体の結合が、培地への生理学的濃度のＬＤＬの添加により減少しなかったことを実証することを可能にした。これは、５Ｅ５抗体がＬＤＬと同じ部位に結合しないことを意味する。
抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体のインターナリゼーション動態
抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体のインターナリゼーション動態は、ローダミン（ＮＨＳ−ローダミン、Ｐｉｅｒｃｅ、参照品番４６１０２）で標識した抗体（３０μｇ／ｍＬ）をＡ５４９細胞上で３７℃でインキュベーションしたときに２４時間にわたり研究した。ローダミン標識Ｃ７対照抗体（３０μｇ／ｍＬ）およびＬＤＬ−Ｄｉｌ（３０μｇ／ｍＬ）のインターナリゼーション動態を並行して研究した。２、４、６、および２４時間のインキュベーションの後で、結合しているがインターナリゼーションしていない抗体／ＬＤＬ−Ｄｉｌは、硫酸デキストランを用いて離し、蛍光定量法により定量した。次に、Ａ５４９細胞をソーダ（０．１Ｎ）で溶解させ、次にインターナリゼーションした抗体の量を蛍光定量法により定量した。インターナリゼーション率は以下の式により計算した：インターナリゼーションした抗体の蛍光／（インターナリゼーションした抗体の蛍光＋結合しているがインターナリゼーションしていない抗体の蛍光）。
【０１１１】
抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体のインターナリゼーション動態は、ＬＤＬの動態（４時間後に６０％のインターナリゼーションとなって最も迅速な動態）と、少し低速でインターナリゼーションしたＣ７の動態との間の中程度であった（図８）。ＬＤＬと同様に、抗体のインターナリゼーション動態は二相性で、最初の４から６時間に急速にインターナリゼーションした。６時間のインキュベーション後に、試験した３つの抗体は同じインターナリゼーション速度を示し、２４時間後には６０％程度でインターナリゼーションのプラトーとなった。
抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体のアポトーシス促進性の研究
抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体の存在下および不在下でのＡ５４９細胞の増殖は、ＦＩＴＣ−アネキシンＶ（初期にアポトーシス細胞のホスファチジルセリンに結合する）およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ、細胞膜が損傷した壊死細胞だけを標識する）を用いた二重標識によりフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）で研究した。この試験を行うために、抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体を終濃度３０μｇ／ｍＬで３７℃で１６時間（ＡＤＣＣ試験の時間）インキュベートした。抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体と同じ条件下で調製およびインキュベートした市販の１Ｃ６（抗ＳＲＥＢＰ２、ＩｇＧ１）およびＣ７（抗ＬＤＬ−Ｒ、ＩｇＧ２ｂ）抗体を参照として使用した。抗体不在下の細胞からなる陰性対照およびカンプトテシン存在下でインキュベートした細胞からなる陽性対照を並行して調製した。
【０１１２】
抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体は、１６時間のインキュベーション後にＡ５４９細胞に強いアポトーシス促進作用を示さなかった。
実施例４：ｉｎ  ｖｉｖｏ研究
選択した動物モデルは、ヌードマウスへのヒト腫瘍組織の異種移植からなるモデルであった。腫瘍細胞の異種移植片を皮下に埋め込んだ。
異種移植片のためのヒト癌細胞系の選択
−  ＬＤＬ−Ｒの発現についての細胞系のスクリーニング
以下のいくつかの乳癌細胞系を利用することができた：ＭＣＦ７−ｒａｓ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１。本発明者らの研究について、埋め込む細胞系の選択はＬＤＬ−Ｒ発現レベルに依存した。これらのヒト癌細胞系でのＬＤＬ−Ｒの発現は、標識ＬＤＬのこの細胞系への結合を研究することによって検出した。この目的のために、ＬＤＬ（ｄ＝１．０３〜１．０５３ｇ／ｍＬ）を超遠心分離により調製し、それをｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液中で透析し、変性条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認し、次に蛍光色素１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチル−インドカルボシアニド（Ｄｉｌ）で標識した。ＬＤＬ−Ｄｉｌを終濃度６．２５、１２．５、２５、５０、および１００μｇ／ｍＬで細胞上で４℃で３時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後に、サイトフルオロメトリー（ＦＡＣＳ）により結合を分析し、結果を蛍光細胞の率で表した。
【０１１３】
したがって、各細胞系をそのＬＤＬ−Ｒ発現レベルについて試験した（図２および３）：ＭＣＦ７−ｒａｓおよびＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞は、ＨｅｐＧ２細胞の半分に等しいＬＤＬ−Ｒ発現レベルを有した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、高レベルでＬＤＬ−Ｒを発現する均一集団に相当した。これらの結果を考慮して、埋め込む細胞系としてＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を選択した。
−  異種移植片についての埋め込む細胞数の決定
ヌードマウスに埋め込む細胞数の関数としての腫瘍の発病速度を研究した。この研究は、０．５×１０６、１０６、２×１０６、および５×１０６細胞の埋め込みに集中した。
−  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞での抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体とＬＤＬとの競合の研究
ＬＤＬと抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体との競合は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対して、増加する濃度（６．２５、１２．５、２５、５０、および８０μｇ／ｍＬ）の抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体と競合しているＤｉｌ標識ＬＤＬ（１２．５μｇ／ｍＬ）の結合を、４℃で３時間試験することによって研究した。次に、ＬＤＬ−Ｒへの抗体の結合をＦＡＣＳにより分析し、その結果を蛍光細胞の率で表した。
ｉｎ  ｖｉｖｏプロトコール
抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体でマウスを処置するために選択したアプローチは、細胞系および抗体を同時に注射することからなった（Ｗｉｎｎ試験）。このアプローチは、抗体が腫瘍の形成を阻止する能力を評価することを可能にした。
【０１１４】
第１群（対照群）は、ＬＤＬ−Ｒを認識しない抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５（ＩｇＧ１）抗体と同じアイソタイプの対照抗体２００μＬに取り込んだ１０６個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞が埋め込まれ、細胞の埋込み後にその後の処置を行わなかったヌードマウス５匹からなった。
【０１１５】
第２群は、抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体２００μＬに取り込んだ１０６個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞が埋め込まれ、細胞の埋込み後にその後の処置を行わなかったヌードマウス５匹からなった。
【０１１６】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞および抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体の同時埋込み後に、ヌードマウスを抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体で４週間の試験中に週に２回処置することからなるＷｉｎｎ試験の「修正」アプローチもまた実行した（第３群）。第３群は、抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体２００μＬに取り込んだ１０６個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を埋め込み、週に２回抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体５００μｇで腹腔内処置した（細胞の埋込みの３から４時間後に最初の５００μｇ処置を適用した）５匹のヌードマウスからなった。
【０１１７】
マウスを毎日調べ、体重増加および腫瘍のサイズを週に３回測定した。４週間のプロトコールの終わりに、マウスを犠牲にし、肝臓、心臓、腎臓、および脾臓を回収し、各群５匹のマウスのそれぞれについて−８０℃で凍結した。マウスの血清もまた収集し、凍結した。
実施例５：治療の実現可能性の研究
治療の実現可能性の研究目標は、種々の種類の癌において癌組織でのＬＤＬ−Ｒの過剰発現を健常組織と比較して検出することであった。この目的のために、肝細胞癌のウエスタンブロット（ＷＢ）分析を行った。
【０１１８】
アルコール誘導性硬変（患者３人）と共に、またはＣ型肝炎ウイルス感染により起こった肝硬変（患者１５人）と共に発生した肝細胞癌（ＨＣＣ）を有する患者から得た組織を使用してウエスタンブロット分析を行った。各患者について２つの組織試料を用意した：（ｉ）硬変領域であるが非腫瘍領域から採取した試料、および（ｉｉ）同患者から得た、腫瘍組織から採取した試料（最低７０％の腫瘍性肝細胞を有する）。
【０１１９】
ウサギポリクローナル抗ＬＤＬ−Ｒ抗体（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．）を使用して、これらの組織にウエスタンブロット型の分析を行った。成熟型ＬＤＬ−Ｒに対応する１６０ｋＤａのバンドを硬変組織および癌組織の両方で観察した。このバンドに加えて、未成熟（非グリコシル化）型ＬＤＬ−Ｒに対応する１２０ｋＤａのバンドもまた存在した。
【０１２０】
アクチンに対して基準化した、成熟ＬＤＬ−Ｒに対応するバンドの定量は、以下の検出を可能にした。
−  アルコール誘導性肝硬変と共に発生したＨＣＣを有する患者３人およびＣ型肝炎ウイルス感染により起こった肝硬変と共に発生したＨＣＣを有する患者１５人のうち２人の健常組織におけるＬＤＬ−Ｒの過剰発現。
−  Ｃ型肝炎ウイルス感染により起こった肝硬変と共に発生したＨＣＣを有する患者１５人のうち７人の癌組織でのＬＤＬ−Ｒの過剰発現（これらの患者の間の過剰発現レベルは２から１４倍であった）。
−  Ｃ型肝炎ウイルス感染により起こった肝硬変と共に発生したＨＣＣを有する患者６人は、ＬＤＬ−Ｒ発現に関して全く差を示さなかった。
実施例６：抗体の特異性の研究
１０％ホルモール中で固定した５４個の異なる正常ヒト組織に対応する１０８個のスポットを有する正常ヒト組織マイクロアレイスライドを用いて免疫組織化学研究を行った。Ｃ７抗体および抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体を１／１０（１０μｇ／ｍＬ）に希釈した。抗原を用いた再活性化は、マイクロ波（７５０ワットで５分間３回、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６）中）を使用して行った。
【０１２１】
標識の不在は、採用した抗体に関係なく造血系（扁桃、脾臓、およびリンパ節）、筋組織（心臓および横紋骨格筋）、皮膚、および乳房組織で観察された。中枢神経系（大脳皮質、小脳、中心核、海馬、および脊髄）、副腎（皮質および髄質）、肝臓、および胆嚢を２つの抗体で標識した。
【０１２２】
これらの結果は、副腎、肝臓、中枢神経系、精巣、および腎臓がＬＤＬ−Ｒを強く発現する組織として記載されていることから、ＬＤＬ−Ｒの組織分布に関する文献と一致するものである。
実施例６：抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体の可変領域の増幅および配列決定
１．ＶＨおよびＶκ領域の増幅
ＩｇＧ１κ型の免疫グロブリンを産生するマウス５Ｅ５ハイブリドーマの総ＲＮＡを抽出した（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ  Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ＲＮＡキット、参照品番７４０６０９．２５０）。５Ｅ５抗体の軽鎖（Ｖκ）および重鎖（ＶＨ）の可変ドメインは、５’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）技法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ５’ＲＡＣＥキット、参照品番１８３７４．０４１）を使用して、軽鎖についてはマウス定常κ領域（Ｃκ）に、また重鎖についてはマウスＧ１領域にアンカーすることによって増幅した。
【０１２３】
簡潔には、マウス定常領域Ｃκ領域またはＧ１領域の５’領域に位置するプライマーを使用して初回の逆転写期をまず行った。次に、ポリｄＣ配列を認識する５’プライマーおよび逆転写プライマーの５’末端でマウス定常Ｃκ領域またはＧ１領域に位置する３’プライマーを使用してＶκ領域およびＶＨ領域の増幅前に合成したｃＤＮＡの３’末端にポリｄＣ配列を付加した。増幅の特異性を改善するために、初回ＰＣＲの３’プライマーの５’末端に位置する３’プライマーを使用して、ＰＣＲ  ＶＨ産物について第２の「半ネステッド」ＰＣＲを行った。
【０１２４】
これらの様々な段階に使用したプライマーを以下に挙げる：
１）逆転写プライマー
ａ．マウスκ特異的アンチセンスプライマー
5'-ACT GCC ATC AAT CTT CCA CTT GAC-3'（配列番号１２）
ｂ．マウスＧ１特異的アンチセンスプライマー
5'-CTGGACAGGGATCCAGAGTTCCA-3'（配列番号１３）
２）５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲプライマー
ａ．マウスκ特異的アンチセンスプライマー
5'-TTGTTCAAGAAGCACACGACTGAGGCAC-3'（配列番号１４）
ｂ．マウスＧ１特異的アンチセンスプライマー
第１ＰＣＲプライマー：
5'-TGTCACTGGCTCAGGGAAATAGCCCTTGAC-3'（配列番号１５）
「半ネステッド」ＰＣＲプライマー：
5'-CACCATGGAGTTAGTTTGGGCAGCAGATCCA-3'（配列番号１６）
２．ＶＨ領域およびＶκ領域の配列の決定
増幅後に、５Ｅ５抗体のＶκ配列およびＶＨ配列をｐＣＲ４−ＴＯＰＯプラスミド（ＴＯＰＯ−ＴＡ−Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、参照品番４５−００３０）にクローニングした。少なくとも３つの組換えコロニーからのプラスミドを精製し、Ｍ１３−ｕｎｉおよびＭ１３−ｒｅｖユニバーサルプライマーを使用してそれらの挿入物を配列決定した。
【０１２５】
５Ｅ５マウス抗体のＶκ領域のヌクレオチド配列を配列番号８の配列に示す、推定されるペプチド配列は配列番号１０の配列である。Ｖκ遺伝子はＶκ４亜群に属する（Ｖκ４／５、Ａｌｍａｇｒｏ  Ｊ．Ｃ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９９８、４７：３５５〜３６３）。Ｋａｂａｔ［Ｋａｂａｔら「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、９１〜３２４２（１９９１）］に従い定義されたマウス５Ｅ５抗体のＶκ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ配列番号２、配列番号３、および配列番号４の配列に示す。５Ｅ５のＶＨ領域のヌクレオチド配列は配列番号９の配列であり、推定されるペプチド配列は配列番号１１の配列である。ＶＨ遺伝子はＶＨ１亜群に属する（Ｈｏｎｊｏ  Ｔ．およびＭａｔｓｕｄａ  Ｆ．「Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｇｅｎｅｓ」Ｈｏｎｊｏ  Ｔ．およびＡｌｔ  Ｆ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ロンドン、１９９６、１４５〜１７１頁）。Ｋａｂａｔ［Ｋａｂａｔら「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、９１〜３２４２（１９９１）］に従い定義されたマウス５Ｅ５抗体のＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ配列番号５、配列番号６、および配列番号７の配列に示す。
【０１２６】
【表１】
2009502189.tif 000002
【０１２７】
【表２】
2009502189.tif 000003
【０１２８】
【表３】
2009502189.tif 000004
【０１２９】
【表４】
2009502189.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】癌細胞系でのＬＤＬ−Ｒの発現レベルのスクリーニング（結果は任意の蛍光単位で表す）。
【図２】ＨｅｐＧ２細胞へのＬＤＬ−Ｄｉｌの結合（結果は蛍光細胞の率で表す）。
【図３】ＬＤＬ−Ｒの発現についての乳癌細胞系のスクリーニング（結果は蛍光細胞の率で表す）。
【図４】Ａ５４９細胞への抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体の結合（結果は蛍光細胞の率で表す）。抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体は５Ｅ５ハイブリドーマにより産生され、ＬＤＬ受容体配列のアミノ酸２８０〜３０７（配列番号１）に対応するペプチドに対して惹起される。
【図５】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞への抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体の結合（結果は蛍光細胞の率で表す）。
【図６Ａ】Ｃ２Ｃ１２細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、およびＹＢ２／０細胞での抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体の交差反応性（結果は蛍光細胞の率で表す）。
【図６Ｂ】Ｃ２Ｃ１２細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、およびＹＢ２／０細胞での抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体の交差反応性（結果は平均蛍光で表す）。
【図７】Ａ５４９細胞での抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体とＬＤＬとの競合（結果は平均蛍光で表す）。
【図８】Ａ５４９細胞での抗ＬＤＬ−Ｒ  ５Ｅ５抗体のインターナリゼーション動態をＬＤＬと共に示す（結果はインターナリゼーションの率で表す）。
【図９】ウエスタンブロットを用いた５Ｅ５抗体の特徴付け。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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