(57)【要約】基板上に置かれた試料内のプローブの存在を検出するための方法、コンピュータ、およびコンピュータプログラムの製品が提供される。該プローブは、複数の空間的に配置された標識を含む。データ記憶モジュールは複数の光イメージを記憶し、ここに、各光イメージは、複数の異なる波長範囲における対応する波長範囲において試料からの光を有する。標識同定モジュールは、基板上の相互に近接する複数の光イメージにおける複数の標識を同定する。複数の標識の空間的順序は、複数の標識のストリング配列を決定する。プローブ同定モジュールは、複数の標識のストリング配列が有効なレポーター配列を含むか否かを決定する。
2009538132.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンピュータープログラム製品であって、該コンピュータープログラム製品はコンピューター読取可能記憶媒体およびその中に内蔵されたコンピュータープログラムメカニズムを含み、該コンピュータープログラムメカニズムは基板の上に置かれた試料内のプローブの存在を検出するためのものであり、ここに、該プローブは複数の空間的に配置された標識を含み、該コンピュータープログラムメカニズムは：
複数の光イメージを記憶するための指令を含むデータ記憶モジュールであって、該複数の光イメージ中の各光イメージは、複数の異なる波長範囲におけるある波長範囲において該試料から受けた光についてのものである、データ記憶モジュール；
該基板上の相互に対して近接した、該複数の光イメージにおける複数の標識を同定するための指令を含む標識同定モジュールを含み、ここに、該複数の標識の空間的順序は該複数の標識のストリング配列を決定する、標識同定モジュール；および
該複数の標識のストリング配列が有効なレポーター配列を含むか否かを決定するための指令を含むプローブ同定モジュール
を含み、
ここに、該複数の標識の該ストリング配列が有効なレポーター配列として確認される場合、該複数の標識はプローブであると見なされ；および
該複数の標識の該ストリング配列が有効なレポーター配列として確認されない場合、該複数の標識はプローブではないと見なされるコンピュータープログラム製品。
【請求項２】
該複数の標識中の第一の標識は、該複数の異なる波長範囲における第一の波長範囲において光を発する基板上の第一の位置に関連し、該複数の標識における第二の標識は、該複数の異なる波長範囲における第二の波長範囲において光を発する基板上の第二の位置に関連する請求項１記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項３】
該第一の波長範囲の一部は該第二の波長範囲の一部に重複する請求項２記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項４】
該第一の波長範囲が該第二の波長範囲と重複しない請求項２記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項５】
該複数の標識における各標識は、該複数の光イメージにおける少なくとも１つの光イメージにおける光の閾値量よりも多くを発する基板上の位置に関連する請求項１記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項６】
該コンピュータープログラムメカニズムは、さらに、複数の有効なレポーター配列を含む参照テーブルを含み、ここに、該プローブ同定モジュールが、さらに、該複数の標識の該ストリング配列を該参照テーブル中の有効なレポーター配列と比較するための指令を含む請求項１記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項７】
該参照テーブルが次元化され、４４までの異なる有効レポーター配列を保持するように構成された請求項６記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項８】
該参照テーブルが次元化され、７４までの異なる有効レポーター配列を保持するように構成された請求項６記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項９】
該参照テーブルが次元化され、８を超える異なる有効レポーター配列を保持するように構成された請求項６記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項１０】
該プローブ同定モジュールが、さらに、有効レポーター配列として確認されない該複数の標識の該ストリング配列を記憶するための指令を含む請求項１記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項１１】
該データ記憶モジュールが、さらに、該基板上に存在する複数の基点を用い、該複数の光イメージにおいて、第一の光イメージを第二の光イメージに整列させるための指令を含む請求項１記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項１２】
該基板上のプローブの位置がランダムである請求項１記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項１３】
該プローブが単一分子よりなる請求項１記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項１４】
該プローブが分子骨格を含み、ここに、該複数の標識における各標識は該分子骨格上の異なる位置を表す請求項１記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項１５】
標識によって表される該分子骨格上の各位置はスペーサーによって骨格上の隣接位置から分離されている請求項１４記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項１６】
該プローブが一本鎖デオキシ核酸またはリボ核酸骨格を含み、ここに、該複数の標識における各標識は、該骨格上の異なる位置にハイブリダイズする染料負荷一本鎖デオキシ核酸またはリボ核酸配列によって表される請求項１記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項１７】
該プローブが第一の端部および第二の端部を有する分子骨格を含み；
標的特異的配列が該第一の端部に共有結合により付着しており；
バインダー配列が該第二の端部に共有結合により付着しており；および
該プローブは（ｉ）基板の第一の位置に結合した第一の分子体への標的特異的配列の結合、および（ｉｉ）基板上の第二の位置に結合した第二の分子体へのバインダー配列の結合を介して基板上に直線上に配置された請求項１記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項１８】
該第一の分子体が標的（一本鎖デオキシ核酸またはリボ核酸）−ビオチン複合体であって、
該第二の分子体が所定の（一本鎖デオキシ核酸またはリボ核酸）−ビオチン複合体である請求項１７記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項１９】
該標識同定モジュールが、さらに、該複数の光イメージにおける複数の候補標識を同定するための指令を含み、ここに、該複数の標識は、標識同定モジュールによって有効化された該複数の候補標識のサブセットである請求項１記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項２０】
該複数の候補標識における各候補標識は、該複数の光イメージにおけるいずれか１つの光イメージにおいて光の閾値量よりも多くを発する基板上の位置に関連する請求項１９記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項２１】
該複数の標識が、該複数の異なる波長範囲における第一の波長範囲において光を発する基板上の第一の位置と関連する第一の候補標識、および該複数の異なる波長範囲における第二の波長範囲において光を発する基板上の第二の位置に関連する第二の候補標識を含む請求項１９記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項２２】
該第一の波長範囲の一部が第二の波長範囲の一部と重複する請求項２１記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項２３】
該第一の波長範囲が第二の波長範囲と重複しない請求項２１記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項２４】
該複数の標識を同定するための指令が、該複数の候補標識における第一の候補標識の重心と第二の候補標識の重心の間の第一の距離基準を適用する請求項１９記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項２５】
該第一の距離基準が、該プローブにおける第一の標識および第二の標識の間の計算された距離によって決定される請求項２４記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項２６】
該複数の標識を同定するための指令が、該複数の候補標識における、第二の候補標識の重心と第三の候補標識の重心の間の第二の距離基準を適用する請求項２４記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項２７】
該第二の距離基準が、該プローブにおける第二の標識と第三の標識の間の計算された距離によって決定される請求項２６記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項２８】
該第一の距離基準が、第二の距離基準と同一である請求項２６記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項２９】
該第一の距離基準が該第二の距離基準と異なる請求項２６記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項３０】
該第一の距離基準の値および該第二の距離基準の値が、該複数の標識が該プローブであるか否かを決定するのに寄与する請求項２６記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項３１】
該コンピュータープログラムメカニズムが、さらに、複数の有効レポーター配列を含む参照テーブルを含み、ここに、該複数の有効レポーター配列における各有効レポーター配列が第一の標識の対の間の第一の距離、第二の標識の対の間の第二の距離を含み、該プローブ同定モジュールが、さらに、該複数の標識のストリング配列、該第一の距離基準、および該第二の距離基準を参照テーブル中の有効レポーター配列と比較するための指令を含む請求項２６記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項３２】
該複数の標識を同定するための指令が、該複数の候補標識における候補標識のトリプレットに対する角度基準を適用する請求項１９記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項３３】
該複数の標識を同定するための指令が、該複数の候補標識における候補標識を選択するためのモデルを適用するための指令を含む請求項１９記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項３４】
候補標識を選択するためのモデルを適用するための指令が、線形回帰を適用して、候補標識を選択する指令を含む請求項３３記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項３５】
該標識同定モジュールが、さらに、該複数の候補標識における候補標識がスポット形状基準を満足することを証明するための指令を含む請求項１９記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項３６】
該複数の候補標識における候補標識がスポット形状基準を満足することを証明するための指令が、候補標識上で点広がり関数モデリングを行うための指令を含む請求項３５記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項３７】
該複数の候補標識における候補標識がスポット形状基準を満足することを証明するための指令が、スポットセグメント化アルゴリズムを候補標識に適用するための指令を含む請求項３５記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項３８】
該スポットセグメント化アルゴリズムが分岐点変換を含む請求項３７記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項３９】
該複数の標識を同定するための指令が、該複数の候補標識における第一の末端候補標識の重心と第二の末端候補標識の重心の間の絶対距離基準を適用する請求項１９記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項４０】
該複数の標識を同定するための指令が、該複数の候補標識における候補標識を選択した基板の一部の周りのバッファーゾーンを同定するための指令を含み、ここに、該バッファーゾーンにおいて候補標識はない請求項１９記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項４１】
該複数の標識が基板上に直線状に配列された請求項１記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項４２】
該複数の標識が同一の直線向きに基板上に直線状に配置された請求項１記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項４３】
該複数の標識における各標識の直線状の向きが予め決定されている請求項４２記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項４４】
該複数の標識における各標識の直線状の向きが該基板を横切っての電流の適用によって決定される請求項４３記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項４５】
該複数の標識における各標識の直線状の向きが、該基板を横切っての流体の適用によって決定される請求項４３記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項４６】
該複数の標識における各標識が、該複数の光イメージにおける光イメージでの各標識の画素化表示における４と２０の間の画素を占める請求項１記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項４７】
該複数の標識における各標識が、該複数の光イメージにおける光イメージでの各標識の画素化表示における６と３０の間の画素を占める請求項１記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項４８】
該複数の標識における各標識が、該複数の光イメージにおける光イメージでの各標識の画素化表示における１と３０の間の画素を占める請求項１記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項４９】
該複数の標識における各標識が、該複数の光イメージにおける光イメージでの各標識の画素化表示における４と１００の間の画素を占める請求項１記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項５０】
該標識同定モジュールが、さらに：
該複数の光イメージにおける第一の候補標識を同定するための指令；および
第一の候補標識から所定の距離内にある該複数の光イメージにおける第二の候補標識を同定するための指令を含み；
ここに、該複数の標識は第一の候補標識および第二の候補標識を含む請求項１記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項５１】
該複数の異なる波長範囲が２つの異なる波長範囲と６つの異なる波長範囲の間よりなる請求項１記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項５２】
該複数の異なる波長範囲が、２つの異なる波長範囲と２０の異なる波長範囲の間よりなる群から選択される請求項１記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項５３】
該複数の標識が４つの標識を含む請求項１記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項５４】
該複数の標識が５つの標識を含む請求項１記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項５５】
該複数の標識が２つの標識と２０の標識の間よりなる請求項１記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項５６】
該ストリング配列における標識の第一のサブセットが、該ストリング配列における標識の第二のサブセットにおける標識の同一性をエラーチェックする請求項１記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項５７】
該ストリング配列における標識の第一のサブセットが、該ストリング配列における標識の第二のサブセットのためのチェックサムである請求項１記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項５８】
該標識同定モジュールが複数の標識を同定するための該指令を複数回反復するための指令を含み、ここに、複数の標識を同定するための該指令が反復される毎に、基板上で相互に近接する異なる複数の標識が該複数の光イメージにおいて同定され；および
ここに、該プローブ同定モジュールは、該標識同定モジュールによって同定された各該異なる複数の標識が有効なレポーター配列を含むか否かを決定し、ここに、各該異なる複数の標識について、該プローブ同定モジュールは：
該異なる複数の標識のストリング配列が有効なレポーター配列として確認される場合、該異なる複数の標識がプローブであると見なし；および
該異なる複数の標識のストリング配列が有効なレポーター配列として確認されない場合、該異なる複数の標識がプローブでないと見なす請求項１記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項５９】
複数のプローブが同定される請求項５８記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項６０】
該複数のプローブが３以上のプローブよりなる請求項５９記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項６１】
該複数のプローブが１０以上のプローブよりなる請求項５９記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項６２】
該複数のプローブが５０未満のプローブよりなる請求項５９記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項６３】
該プローブ同定モジュールが同定されたプローブの各タイプを記憶する請求項５８記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項６４】
該プローブ同定モデルが、有効なレポーター配列として確認されない各異なる複数の標識の各ストリング配列を記憶する請求項５８記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項６５】
該プローブ同定モデルが、有効なレポーター配列として確認される各異なる複数の標識の各ストリング配列を記憶する請求項５８記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項６６】
基板上に重ねられた試料内のプローブの存在を検出するためのコンピューターシステムであって、ここに、該プローブは複数の空間的に配列された標識を含み、該コンピューターシステムは：
中央プロセッシングユニット；および
該中央プロセッシングユニットに接続されたメモリー
を含み、該メモリーは：
複数の光イメージを記憶するための指令を含むデータ記憶モジュールであって、該複数の光イメージにおける各光イメージは複数の異なる波長範囲におけるある波長範囲において試料から受ける光についてのものである、データ記憶モジュール；
該複数の光イメージにおいて、基板上で相互に近接する複数の標識を同定するための指令を含む標識同定モジュールであって、ここに、該複数の標識の空間的順序は該複数の標識のストリング配列を決定する、標識同定モジュール；および
該複数の標識のストリング配列が有効なレポーター配列を含むか否かを決定するための指令を含むプローブ同定モジュール
を含み；
該複数の標識のストリング配列が有効なレポーター配列として確認される場合、該複数の標識がプローブであると見なされ；
該複数の標識のストリング配列が有効なレポーター配列として確認されない場合、該複数の標識はプローブではないと見なされるコンピューターシステム。
【請求項６７】
該複数の標識における第一の標識は、該複数の異なる波長範囲における第一の波長範囲において光を発する基板上の第一の位置に関連し、該複数の標識における第二の標識は、該複数の異なる波長範囲における第二の波長範囲において光を発する基板上の第二の位置に関連する請求項６６記載のコンピューターシステム。
【請求項６８】
該第一の波長範囲の一部が該第二の波長範囲の一部に重複する請求項６７記載のコンピューターシステム。
【請求項６９】
該第一の波長範囲が該第二の波長範囲と重複しない請求項６７記載のコンピューターシステム。
【請求項７０】
該複数の標識における各標識が、該複数の光イメージにおけるいずれか１つの光イメージにおいて閾値量を超えた光を発する基板上の位置に関連する請求項６６記載のコンピューターシステム。
【請求項７１】
該メモリーが、さらに、複数の有効レポーター配列を含む参照テーブルを記憶し、およびここに、該プローブ同一モジュールは、さらに、該複数の標識のストリング配列を該参照テーブル中の有効なレポーター配列と比較するための指令を含む請求項６６記載のコンピューターシステム。
【請求項７２】
該参照テーブルが次元化され、かつ４４までの異なる有効レポーター配列を保持するように構成された請求項７１記載のコンピューターシステム。
【請求項７３】
該参照テーブルが次元化され、かつ２０２０までの異なる有効なレポーター配列を保持するように構成された請求項７１記載のコンピューターシステム。
【請求項７４】
該プローブ同定モジュールが、さらに、有効なレポーター配列として確認されない該複数の標識のストリング配列を記憶するための指令を含む請求項６６記載のコンピューターシステム。
【請求項７５】
該データ記憶モジュールが、さらに、該基板上に存在する複数の基点を用いて、第一の光イメージを、該複数の光イメージにおける第二の光イメージに対して整列させるための指令を含む請求項６６記載のコンピューターシステム。
【請求項７６】
該基板上のプローブの位置がランダムである請求項６６記載のコンピューターシステム。
【請求項７７】
該プローブが単一分子からなる請求項６６記載のコンピューターシステム。
【請求項７８】
該プローブが分子骨格を含み、該複数の標識における各標識が該分子骨格上の異なる位置を表す請求項６６記載のコンピューターシステム。
【請求項７９】
標識によって表される該分子骨格上の各位置が、スペーサーによって骨格上の隣接位置から分離された請求項７８記載のコンピューターシステム。
【請求項８０】
該プローブが単一鎖デオキシ核酸またはリボ核酸骨格を含み、該複数の標識における各標識は、骨格上の異なる位置にハイブリダイズする染料負荷一本鎖デオキシ核酸またはリボ核酸配列によって表される請求項６６記載のコンピューターシステム。
【請求項８１】
該プローブが第一の端部および第二の端部を有する分子骨格を含み；
標的特異的配列が該第一の端部に共有結合により付着され；
バインダー配列が該第二の端部に共有結合により付着され：および
該プローブが（ｉ）該標的特異的配列の、該基板の第一の位置に結合した第一の分子体への結合、および（ｉｉ）該バインダー配列の、該基板上の第二の位置に結合した第二の分子体への結合を介して基板上に直線状に配置された請求項６６記載のコンピューターシステム。
【請求項８２】
該第一の分子体が標的（一本鎖核酸またはリボ核酸）−ビオチン複合体であり、および
該第二の分子体が所定の（一本鎖デオキシ核酸またはリボ核酸）−ビオチン複合体である請求項８１記載のコンピューターシステム。
【請求項８３】
該標識同定モジュールが、さらに、該複数の光イメージにおける複数の候補標識を同定するための指令を含み、ここに、該複数の標識は、該標識同定モジュールによって確証された該複数の候補標識のサブセットである請求項６６記載のコンピューターシステム。
【請求項８４】
該複数の候補標識における各候補標識が、該複数の光イメージにおけるいずれか１つの光イメージにおける閾値を超える量の光を発する基板上の位置に関連する請求項８３記載のコンピューターシステム。
【請求項８５】
該複数の標識が、該複数の異なる波長における第一の波長範囲において光を発する基板上の第一の位置に関連する第一候補標識を有し、および、該複数の異なる波長範囲における第二の波長範囲において光を発する基板上の第二の位置に関連する第二の候補標識を有する請求項８３記載のコンピューターシステム。
【請求項８６】
該第一の波長範囲の一部が第二の波長範囲の一部と重複する請求項８５記載のコンピューターシステム。
【請求項８７】
該第一の波長範囲が第二の波長範囲と重複しない請求項８５記載のコンピューターシステム。
【請求項８８】
該複数の標識を同定するための指令が、該複数の候補標識における、第一の候補標識の重心と第二の候補標識の重心の間の第一の距離基準を適用する請求項８３記載のコンピューターシステム。
【請求項８９】
該第一の距離基準が、該プローブにおける第一の標識と第二の標識の間の計算された距離によって決定される請求項８８記載のコンピューターシステム。
【請求項９０】
該複数の標識を同定するための指令が、該複数の候補標識における、第二の候補標識の重心と第三の候補標識の重心の間の第二の距離基準を適用する請求項８８記載のコンピューターシステム。
【請求項９１】
該第二の距離基準が、該プローブにおける第二の標識と第三の標識の間の計算された距離によって決定される請求項９０記載のコンピューターシステム。
【請求項９２】
該第一の距離基準値および該第二の距離基準値が、該複数の標識が該プローブであるか否かの決定に寄与する請求項９０記載のコンピューターシステム。
【請求項９３】
該コンピュータープログラムメカニズムが、さらに、複数の有効レポーター配列を含む参照テーブルを含み、ここに、該複数の有効レポーター配列における各有効レポーター配列が、標識の第一の対の間の第一の距離、および第二の標識の対の間の第二の距離を含み、ここに、該プローブ同定モジュールが、さらに、該複数の標識のストリング配列、該第一の距離基準、および該第二の距離基準を、該参照テーブルにおける有効レポーター配列と比較するための指令を含む請求項９０記載のコンピューターシステム。
【請求項９４】
該複数の標識を同定するための指令が、該複数の候補標識における候補標識のトリプレットに対する角度基準を適用する請求項８３記載のコンピューターシステム。
【請求項９５】
該複数の標識を同定するための指令が、該複数の候補標識における候補標識を選択するためのモデルを適用するための指令を含む請求項８３記載のコンピューターシステム。
【請求項９６】
候補標識を選択するためのモデルを適用するための該指令が、線形回帰を適用して、候補標識を選択するための指令を含む請求項９５記載のコンピューターシステム。
【請求項９７】
該標識同定モジュールが、さらに、該複数の候補標識における候補標識がスポット形状基準を満足することを証明するための指令を含む請求項９５記載のコンピューターシステム。
【請求項９８】
該スポット形状基準が、該候補標識の観察されたスポット形状と候補標識の倍率によって決定される回折制限点光源の理論的点広がりの間のマッチである請求項９７記載のコンピューターシステム。
【請求項９９】
該複数の候補標識における候補標識がスポット形状基準を満足していることを証明するための指令が、候補標識上で点広がり関数モデリングを行うための指令を含む請求項９７記載のコンピューターシステム。
【請求項１００】
該複数の候補標識における候補標識がスポット形状基準を満足していることを証明するための指令が、スポットセグメント化アルゴリズムを候補標識に適用するための指令を含む請求項９７記載のコンピューターシステム。
【請求項１０１】
該スポットセグメント化アルゴリズムが分岐点変換を含む請求項１００記載のコンピューターシステム。
【請求項１０２】
該複数の標識を同定するための指令が、該複数の候補標識における、第一の末端候補標識の重心と第二の末端候補標識の重心の間の絶対距離基準を適用する請求項８３記載のコンピューターシステム。
【請求項１０３】
該複数の標識を同定するための指令が、該複数の候補標識における候補標識を選択した基板上の一部の周りのバッファーゾーンを同定するための指令を含み、ここに、該バッファーゾーンにおいて候補標識はない請求項８３記載のコンピューターシステム。
【請求項１０４】
該複数の標識が基板上に直線状に配置された請求項６６記載のコンピューターシステム。
【請求項１０５】
該複数の標識が同一直線向きに基板上に直線状に配置された請求項６６記載のコンピューターシステム。
【請求項１０６】
該複数の標識における各標識が、該複数の光イメージにおける光イメージでの各標識の画素化表示における４と２０の間の画素を占める請求項６６記載のコンピューターシステム。
【請求項１０７】
該標識同定モジュールが、さらに：
該複数の光イメージにおける第一の候補標識を同定するための指令；および
該第一の候補標識から所定の距離内にある該複数の光イメージにおける第二の候補標識を同定するための指令を含み；
ここに、該複数の標識は第一の候補標識および第二の候補標識を含む請求項６６記載のコンピューターシステム。
【請求項１０８】
該複数の異なる波長範囲が、２つの異なる波長範囲と２０の異なる波長範囲の間よりなる請求項６６記載のコンピューターシステム。
【請求項１０９】
該複数の標識が２つの標識と２０の標識の間よりなる請求項６６記載のコンピューターシステム。
【請求項１１０】
該ストリング配列における標識の第一のサブセットが、該ストリング配列における標識の第二のサブセットにおける標識の同一性をエラーチェックする請求項６６記載のコンピューターシステム。
【請求項１１１】
該ストリング配列における標識の第一のサブセットが、該ストリング配列における標識の第二のサブセットのためのチェックサムである請求項６６記載のコンピューターシステム。
【請求項１１２】
該標識同定モジュールが、複数の標識を同定するための該指令を複数回反復するための指令を含み、ここに、複数の標識を同定するための該指令を反復される毎に、基板上で相互に近接する、該複数の光イメージにおける、異なる複数の標識が同定され；および
該プローブ同定モジュールは、該標識同定モジュールによって同定された各該異なる複数の標識が有効レポーター配列を含むか否かを決定し、ここに、各該異なる複数の標識について、該プローブ同定モジュールは：
該異なる複数の標識のストリング配列が有効レポーター配列として確認される場合、該異なる複数の標識をプローブであると見なし；および
該異なる複数の標識のストリング配列が有効レポーター配列として確認されない場合、該異なる複数の標識がプローブではないと見なす請求項６６記載のコンピューターシステム。
【請求項１１３】
複数のプローブが同定される請求項１１２記載のコンピューターシステム。
【請求項１１４】
該複数のプローブが３以上のプローブを含む請求項１１３記載のコンピューターシステム。
【請求項１１５】
該プローブ同定モデルが、有効なレポーター配列として確認されない各異なる複数の標識の各ストリング配列を記憶する請求項１１２記載のコンピューターシステム。
【請求項１１６】
該プローブ同定モデルが、有効なレポーター配列として確認される各異なる複数の標識の各ストリング配列を記憶する請求項１１２記載のコンピューターシステム。
【請求項１１７】
基板上に重ねられた試料内のプローブの存在を検出するためのシステムであって、該システムは：
複数の光イメージを測定する光測定メカニズムであって、該複数の光イメージにおける各光イメージは、複数の異なる波長範囲におけるある波長範囲において試料から受けた光についてのものである、光測定メカニズム；
該複数の光イメージを記憶するための指令を含むデータ記憶モジュール；
該基板上で相互に近接する該複数の光イメージにおける複数の標識を同定する標識同定メカニズムであって、ここに、該複数の標識の空間的順序は該複数の標識のストリング配列を決定する、標識同定メカニズム；および
該複数の標識のストリング配列が有効なレポーター配列を含むか否かを決定するプローブ同定メカニズム
を含み、
ここに、該複数の標識の該ストリング配列が有効なレポーター配列として確認される場合、該複数の標識はプローブであると見なされ；
該複数の標識の該ストリング配列が有効なレポーター配列として確認されない場合、該複数の標識はプローブではないと見なされるシステム。
【請求項１１８】
該複数の標識における第一の標識が、該複数の異なる波長範囲における第一の波長範囲において光を発する基板上の第一の位置に関連し、および該複数の標識における第二の標識が、該複数の異なる波長範囲における第二の波長範囲において光を発する基板上の第二の位置に関連する請求項１１７記載のシステム。
【請求項１１９】
該第一の波長範囲の一部が該第二の波長範囲の一部と重複する請求項１１８記載のシステム。
【請求項１２０】
該システムは、さらに、基板を照射する照射メカニズムを含む請求項１１７記載のシステム。
【請求項１２１】
該照射メカニズムが励起光源および複数の励起フィルターを含み、ここに、該複数の励起フィルターにおける各励起フィルターを、該複数の光イメージにおける対応する光イメージにおいて用いて、対応する光イメージが測定される場合、該光源を対応する異なるスペクトル範囲に制限する請求項１２０記載のシステム。
【請求項１２２】
該光測定メカニズムが複数の測定波長フィルターを含み、該複数の測定波長フィルターにおける各測定波長フィルターを、該複数の光イメージにおける対応する光イメージで用いて、対応するスペクトル範囲内にない光を拒絶する請求項１１７記載のシステム。
【請求項１２３】
該光測定メカニズムは、試料から発せられた光に応答して検出シグナルを形成する光ディテクターを含む請求項１１７記載のシステム。
【請求項１２４】
該光測定メカニズムは、該基板上に重ねられた試料から発せられた光を測定する検出シグナルによってアドレスされるディテクター回路を含み、該光測定メカニズムは、さらに、複数の標識位置を記憶するための電子メモリーを含み、ここに、該複数の標識位置における各標識位置は、標識を表し、および該複数の標識位置における各標識位置は閾値量を超える光に由来する請求項１１７記載のシステム。
【請求項１２５】
該標識同定メカニズムが、電子メモリーに記憶された複数の標識位置内から相互に近接する複数の標識も同定する請求項１１７記載のシステム。
【請求項１２６】
該標識同定メカニズムが、該複数の光イメージにおける複数の候補標識を同定するための指令を含み、およびここに、該複数の標識は該複数の候補標識のサブセットである請求項１１７記載のシステム。
【請求項１２７】
該複数の候補標識における各候補標識は、該複数の光イメージにおけるいずれか１つの光イメージにおいて閾値量を超える光を発する基板上の位置を含む請求項１２６記載のシステム。
【請求項１２８】
該複数の標識が、該複数の異なる波長範囲における第一の波長範囲において光を発する第一の候補標識、および該複数の異なる波長範囲における第二の波長範囲において光を発する該複数の標識における第二の候補標識を含む請求項１２６記載のシステム。
【請求項１２９】
該複数の標識を同定する指令が、該複数の候補標識における、第一の候補標識の重心と第二の候補標識の重心の間の第一の距離基準を適用する請求項１２６記載のシステム。
【請求項１３０】
該第一の距離基準が、該プローブにおける、第一の標識と第二の標識の間の計算された距離によって決定される請求項１２９記載のシステム。
【請求項１３１】
該複数の標識を同定するための指令が、該複数の候補標識における、第二の候補標識の重心と第三の候補標識の重心の間の第二の距離基準を適用する請求項１３０記載のシステム。
【請求項１３２】
該第二の距離基準が、該プローブにおける第二の標識と第三の標識の間の計算された距離によって決定される請求項１３１記載のシステム。
【請求項１３３】
該第一の距離基準が第二の距離基準と同一である請求項１３１記載のシステム。
【請求項１３４】
該第一の距離基準が該第二の距離基準とは異なる請求項１３１記載のシステム。
【請求項１３５】
該第一の距離基準の値および該第二の距離基準の値が、該複数の標識が該プローブであるか否かの決定に寄与する請求項１３１記載のシステム。
【請求項１３６】
該複数の標識を同定するための指令が、該複数の候補標識における候補標識のトリプレットに対する角度基準を適用する請求項１２６記載のシステム。
【請求項１３７】
該複数の標識を同定するための指令が、該複数の候補標識における候補標識を選択するためのモデルを適用するための指令を含む請求項１２６記載のシステム。
【請求項１３８】
候補標識を選択するためのモデルを適用するための指令が、線形回帰を適用して、候補標識を選択するための指令を含む請求項１３７記載のシステム。
【請求項１３９】
該標識同定モジュールが、さらに、該複数の候補標識における候補標識がスポット形状基準を満足することを証明するための指令を含む請求項１２６記載のシステム。
【請求項１４０】
該スポット形状基準が、該候補標識の観察されたスポット形状と候補標識の倍率によって決定される回折限定点光源の理論的点広がりの間のマッチである請求項１３９記載のシステム。
【請求項１４１】
該複数の候補標識における候補標識が該スポット形状基準を満足することを証明するための指令が、候補標識について点広がり関数モデリングを行うための指令を含む請求項１３９記載のシステム。
【請求項１４２】
該複数の候補標識における候補標識が、スポット形状基準を満足することを証明するための指令が、スポットセグメント化アルゴリズムを候補標識に適用するための指令を含む請求項１３９記載のシステム。
【請求項１４３】
該スポットセグメント化アルゴリズムが分岐点変換を含む請求項１４２記載のシステム。
【請求項１４４】
該複数の標識が基板上に直線状に配置された請求項１１７記載のシステム。
【請求項１４５】
該複数の標識の直線向きが予め決定された請求項１４４記載のシステム。
【請求項１４６】
該複数の標識の直線向きが、該基板を横切っての電流の適用によって決定される請求項１４４記載のシステム。
【請求項１４７】
該試料内のプローブが、該基板上のランダムな位置において該基板に重ねられた請求項１４４記載のシステム。
【請求項１４８】
基板上に重ねられた試料内のプローブの存在を検出するための方法であって、ここに、該プローブは複数の空間的に配置された標識を含み、該方法は：
複数の光イメージにおいて、基板上で相互に近接する複数の標識を同定することであって、ここに、該複数の標識の空間的順序が該複数の標識のストリング配列を決定し、ここに、該複数の光イメージにおける各光イメージは、複数の異なる波長範囲におけるある波長範囲において該試料から受けた光についてのものであることと；
該複数の標識の該ストリング配列が有効なレポーター配列を含むか否かを決定することとを含み、
ここに、該複数の標識のストリング配列が有効なレポーター配列として確認される場合、該複数の標識はプローブであると見なされ；および
該複数の標識のストリング配列が有効なレポーター配列として確認されない場合、該複数の標識はプローブでないと見なされる方法。
【請求項１４９】
該決定工程は、該複数の標識のストリング配列を、参照テーブル中の有効なレポーター配列と比較することを含む請求項１４８記載の方法。
【請求項１５０】
該方法が、さらに、有効なレポーター配列と確認されない複数の標識のストリング配列を記憶する請求項１４８記載の方法。
【請求項１５１】
該方法が、さらに、該基板上に存在する複数の基点を用いて、第一の光イメージを、該複数の光イメージにおける第二の光イメージに対して整列させることを含む請求項１４８記載の方法。
【請求項１５２】
複数の標識を同定するための工程が複数回反復され、ここに、複数の標識を同定する該工程が反復される毎に、該複数の光イメージにおいて、基板上で相互に近接する複数の異なる標識が同定され；該方法は、さらに：
各該異なる複数の標識が有効なレポーター配列を含むか否か決定することを含み、ここに、各該異なる複数の標識について、
該異なる複数の標識のストリング配列が有効なレポーター配列として確認される場合、該異なる複数の標識はプローブであると見なされ；および
該異なる複数の標識のストリング配列が有効なレポーター配列として確認されない場合、異なる複数の標識はプローブでないと見なされる請求項１４８記載の方法。
【請求項１５３】
複数のプローブが同定される請求項１５２記載の方法。
【請求項１５４】
該複数のプローブが３以上のプローブよりなる請求項１５２記載の方法。
【請求項１５５】
該複数のプローブが１０以上のプローブよりなる請求項１５２記載の方法。
【請求項１５６】
該方法が、さらに、同定されたプローブの各タイプを記憶することを含む請求項１５２記載の方法。
【請求項１５７】
有効なレポーター配列として確認されない各異なる複数の標識の各ストリング配列が記憶される請求項１５２記載の方法。
【請求項１５８】
有効なレポーター配列として確認される各異なる複数の標識の各ストリング配列が記憶される請求項１５２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００６年５月２２日に出願された米国仮特許出願第６０／８０２，８６２号の利益を主張する。米国仮特許出願第６０／８０２，８６２号は、本明細書中にその全体が参照として援用される。
【０００２】
（１．発明の分野）
本発明は、生体分子試料中の個々の標的分子の検出および定量のための組成物および方法に関する。特に、本発明は、個々の標的分子に結合することができる、本明細書中においては標識された「ナノレポーター」といわれるコードされ、標識されたレポーター分子に関する。ナノレポーターの標識のコードを通じて、ナノレポーターの標的分子への結合の結果、標的分子の同定がもたらされる。また、そのようなナノレポーターを作成し、それを使用する方法も提供される。該ナノレポーターは、診断、予後、質制御およびスクリーニング適用で用いることができる。
【背景技術】
【０００３】
（２．発明の背景）
ヒト身体中の全ての細胞は同一遺伝物質を含有するが、同一遺伝子はそれらの細胞の全てにおいて活性ではない。遺伝子発現パターンの変化は、生物学的機能に対してかなりの影響を有し得る。遺伝子発現におけるこれらの変動は、改変された生理学的および病理学的プロセスの中核におけるものである。従って、病気細胞と比較して正常な細胞における遺伝子の発現の同定および定量は、新しい薬物および診断標的の発見を助けることができる。
【０００４】
核酸は、その特異的ポリヌクレオチド配列に基づいて検出し、定量することができる。検出および定量の基本的原理が前提となる現存の方法は、試料中の注目する標的配列への標識された相補性プローブ配列のハイブリダイゼーションである。デュプレックスの形成は、その中に取り込まれた標識の量によって測定して、試料中の標的配列の存在、およびデュプレックス形成の程度を示し、それは標的配列の量に比例する。
【０００５】
分子ハイブリダイゼーションと呼ばれるこの技術は、複雑な混合物において特異的核酸配列を同定し、分析するための有用なツールであった。この技術は診断で用いられて、例えば、生物学的試料中の種々の微生物の核酸配列を検出してきた。加えて、ハイブリダイゼーション技術は、個体の間の遺伝的差または多形をマッピングするのに用いられてきた。さらに、これらの技術は、細胞の異なる集団における、または異なる剤で処理された細胞における遺伝子発現の差をモニターするのに用いられてきた。
【０００６】
過去において、少数の遺伝子が一度に複雑な試料中で検出できたに過ぎない。過去１０年内に、いくつかの技術は、いずれか一度に、細胞内の非常に多数の転写体の発現レベルをモニターするのを可能とした（例えば、Ｓｃｈｅｎａら、１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７０：４６７−４７０；Ｌｏｃｋｈａｒｔら、１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：１６７５−１６８０；Ｂｌａｎｃｈａｒｄら、１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：１６４９参照）。ゲノムのほとんどまたは全てが知られている生物では、細胞内の非常に多数の遺伝子の転写体を分析するのは可能である。これらの技術のほとんどはＤＮＡマイクロアレイ、このプロセスをより有効とした小型化表面に存在する数千の固定化ＤＮＡ配列よりなるデバイスを使用する。マイクロアレイを用い、１回の実験において、生物学的試料中での数千の遺伝子の存在または不存在を検出するのが可能である。これは、研究者が、１つの試料についていくつかの診断テストを同時に行い、あるいは１つの実験において数千の遺伝子の発現レベルの変化を観察するのを可能とする。一般に、マイクロアレイは、ＤＮＡ配列を、グリッド上の正確に規定された位置において、ナイロン膜またはスライドガラスのような表面へのＤＮＡ配列の結合によって調製される。次いで、生物学的試料中の核酸を標識し、アレイにハイブリダイズさせる。標識された試料ＤＮＡは、自動検出に従ってハイブリダイゼーションが起こる、アレイ上の正確な位置をマークする。
【０００７】
あいにくと、アレイフォーマットの小型化にかかわらず、この方法は、依然として、有意な量の生物学的試料を必要とする。しかしながら、区別される細胞型の病気となった組織または試料のバイオプシーのようないくつかの場合には、生物学的試料は限定された供給におけるものである。加えて、マイクロアレイの表面でのハイブリダイゼーションのキネティックスは、少量の水溶液においてハイブリダイゼーションよりも効率が低い。さらに、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果に基づいて試料に存在する核酸の量を見積るための方法が存在するが、マイクロアレイ技術は、かくして、個々のレベルでの標的分子の検出を全く可能とせず、かつ、与えられた試料において標的分子の量を直接的定量するためのマイクロアレイ−ベースの方法はない。
【０００８】
かくして、複雑な混合物における標的分子の正確かつ感度のよい検出、同定および定量に対する要望が存在する。
【０００９】
本明細書中において、考察または文献の引用は、そのような文献が本発明に対して先行技術であると自認するよう解釈されるべきではない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明の１つの態様は、コンピューター読取り可能記憶媒体およびその中に内蔵されたコンピュータープログラムメカニズムを含むコンピュータープログラム製品を提供する。該コンピュータープログラムメカニズムは、基板上に重ねられた試料内のプローブの存在を検出するためのものである。該プローブは複数の空間的に配置された標識を含む。該コンピュータープログラムメカニズムはデータ記憶モジュール、標識同定モジュール、およびプローブ同定モジュールを含む。該データ記憶モジュールは、複数の光イメージを記憶するための指令を含む。該複数の光イメージにおける各光イメージは、複数の異なる波長範囲におけるある波長範囲において試料から受けた光についてのものである。該標識同定モジュールは、該複数の光イメージにおいて、基板上で相互に近接する複数の標識を同定するための指令を含む。該複数の標識の空間的順序は、該複数の標識のストリング配列を決定する。該プローブ同定モジュールは、該複数の標識のストリング配列が有効なレポーター配列を含むか否かを決定するための指令を含む。該複数の標識のストリング配列が有効なレポーター配列として確認される場合、該複数の標識はプローブであると見なされる。該複数の標識のストリング配列が有効なレポーター配列として確認されない場合、該複数の標識はプローブではないと見なされる。
【００１１】
いくつかの具体例において、該複数の標識における第一の標識は、該複数の異なる波長範囲における第一の波長範囲において光を発する基板上の第一の位置に関連する。さらに、該複数の標識における第二の標識は、該複数の異なる波長範囲における第二の波長範囲において光を発する基板上の第二の位置に関連する。いくつかの具体例において、該第一の波長範囲の一部は該第二の波長範囲の一部と重複する。いくつかの具体例において、第一の波長範囲の一部は第二の波長範囲のいずれの部分にも重複しない。いくつかの具体例において、該複数の標識における各標識は、該複数の光イメージにおけるいずれかの１つの光イメージにおいて閾値量を超える光を発する基板上の位置に関連する。
【００１２】
いくつかの具体例において、コンピュータープログラムメカニズムは、さらに、複数の有効なレポーター配列を含む参照テーブルを含む。そのような具体例において、プローブ同定モジュールは、さらに、参照テーブルにおける有効なレポーター配列に対して、複数の標識のストリング配列を比較するための指令を含む。いくつかの具体例において、参照テーブルは次元化され、４４まで、７４まで、または２０２０までの異なる有効レポーター配列を保持するように構成される。
【００１３】
いくつかの具体例において、プローブ同定モジュールは、さらに、有効なレポーター配列として確認されない複数の標識のストリング配列を記憶するための指令を含む。いくつかの具体例において、該データ記憶モジュールは、さらに、基板上に存在する複数の基点を用いて、該複数の光イメージにおける第二の光イメージに対して第一の光イメージを整列させるための指令を含む。いくつかの具体例において、基板上のプローブ位置はランダムである。いくつかの具体例において、プローブは単一分子よりなる。いくつかの具体例において、プローブは分子骨格を含み、該複数の標識における各標識は分子骨格上の異なる位置を表す。いくつかの具体例において、標識によって表される分子骨格上の各位置は、スペーサーによって骨格上の隣接する位置から分離される。いくつかの具体例において、プローブは一本鎖デオキシ核酸またはリボ核酸骨格を含み、該複数の標識における各標識は、骨格上の異なる位置にハイブリダイズする染料負荷一本鎖デオキシ核酸またはリボ核酸配列によって表される。
【００１４】
いくつかの具体例において、該プローブは第一の端部および第二の端部を有する分子骨格を含む。標的特異的配列は第一の端部に共有結合により付着される。バインダー配列は該第二の端部に共有結合により付着される。そのような具体例において、該プローブは（ｉ）標的特異的配列の、基板の第一の位置に結合した第一の分子体への結合、および（ｉｉ）該バインダー配列の、基板上の第二の位置に結合している第二の分子体への結合を介して基板上に直線状に配置される。いくつかの具体例において、第一の分子体は標的（一本鎖デオキシ核酸またはリボ核酸）−ビオチン複合体であって、第二の分子体は所定の（一本鎖デオキシ核酸またはリボ核酸）−ビオチン複合体である。
【００１５】
いくつかの具体例において、該標識同定モジュールが、さらに、該複数の光イメージにおける複数の候補標識を同定するための指令を含む。この複数の標識は、標識同定モジュールによって確証された該複数の候補標識のサブセットである。いくつかの具体例において、該複数の候補標識における各候補標識は、該複数の光イメージにおけるいずれかの１つの光イメージにおいて閾値量を超える光を発する基板上の位置に関連する。いくつかの具体例において、該複数の標識は、該複数の異なる波長範囲における第一の波長範囲において光を発する基板上の第一の位置に関連する第一の候補標識、および該複数の異なる波長範囲における第二の波長範囲において光を発する基板上の第二の位置と関連する第二の候補標識を含む。いくつかの具体例において、該第一の波長範囲の一部は第二の波長範囲の一部と重複する。いくつかの具体例において、第一の波長範囲は第二の波長範囲と重複しない。いくつかの具体例において、該複数の標識を同定するための指令には、該複数の候補標識における、第一の候補レベルの重心と第二の候補標識の重心の間の第一の距離基準が適用される。該第一の距離基準は、該プローブにおける、第一の標識と第二の標識の間の計算された距離によって決定することができる。いくつかの具体例において、該複数の標識を同定するための指令には、該複数の候補標識における、第二の候補標識の重心と第三の候補標識の重心の間の第二の距離基準が適用される。第二の距離基準は、該プローブにおける、第二の標識と第三の標識の間の計算された距離によって決定することができる。いくつかの例において、該第一の距離基準は該第二の距離基準と同一である。他の場合において、該第一の距離基準は第二の距離基準とは異なる。いくつかの具体例において、第一の距離基準の値、および第二の距離基準の値は、該複数の標識がプローブであるか否かを決定するのに寄与する。
【００１６】
いくつかの具体例において、コンピュータープログラムメカニズムは、さらに、複数の有効なレポーター配列を含む参照テーブルを含む。いくつかの具体例において、該複数の有効レポーター配列における各有効なレポーター配列は、第一の標識の対の間の第一の距離、および第二の標識の対の間の第二の距離を含む。さらに、プローブ同定モジュールは、該複数の標識のストリング配列、第一の距離基準、および第二の距離基準を、参照テーブルにおける有効なレポーター配列と比較するための指令を含む。
【００１７】
いくつかの具体例において、該複数の標識を同定するための指令には、該複数の候補標識における候補標識のトリプレットに対する角度基準が適用される。いくつかの具体例において、該複数の標識を同定するための指令は、該複数の候補標識における候補標識を選択するためのモデル（例えば、線形回帰）を適用するための指令を含む。いくつかの具体例において、該標識同定モジュールは、さらに、該複数の候補標識における候補標識がスポット形状基準を満足することを証明するための指令を含む。スポット形状基準の例は、候補標識の観察されたスポット形状と候補標識の倍率によって決定された回折限定点光源の理論的点広がりの間のマッチである。いくつかの具体例において、該複数の候補標識における候補標識がスポット形状基準を満足することを証明するための指令は、候補標識に対して点広がり関数モデリングを行うための指令を含む。いくつかの具体例において、該複数の候補標識における候補標識がスポット形状基準を満足することを証明するための指令は、スポットセグメント化アルゴリズムを候補標識に適用するための指令を含む。いくつかの具体例において、スポットセグメント化アルゴリズムは分岐点変換を含む。
【００１８】
いくつかの具体例において、該複数の標識を同定するための指令には、該複数の候補標識における、第一の末端候補標識の重心と第二の末端候補標識の重心の間の絶対距離基準が適用される。いくつかの具体例において、該複数の標識を同定するための指令は、該複数の候補標識における候補標識を選択した基板の部分の周りのバッファーゾーンを同定するための指令を含み、ここでは、バッファーゾーンには候補標識はない。いくつかの具体例において、該複数の標識は（例えば、同一直線状の向きにて）基板上に直線状に配置される。いくつかの具体例において、該複数の標識における各標識の直線状の向きは（例えば、基板を横切る電流の適用によって、または基板を横切る流体の適用によって）予め決定されている。いくつかの具体例において、該複数の標識における各標識は、該複数の光イメージにおける光イメージでの各標識の画素化表示において４と２０の間の画素、１と３０の間の画素、または４と１０の間の画素を占める。
【００１９】
いくつかの具体例において、該標識同定モジュールは、さらに、該複数の光イメージにおける第一の候補標識を同定するための指令、および第一の候補標識からの所定距離内にある該複数の光イメージにおける第二の候補標識を同定するための指令を含む。そのような具体例において、該複数の標識は第一の候補標識および第二の候補標識を含む。
【００２０】
いくつかの具体例において、該複数の異なる波長範囲は、２つの異なる波長範囲と６つの異なる波長範囲の間、または２つの異なる波長範囲と２０の異なる波長範囲の間よりなる。いくつかの具体例において、該複数の標識は４または５の標識を含む。いくつかの具体例において、該複数の標識は２つの標識と２０の標識の間よりなる。
【００２１】
いくつかの具体例において、該ストリング配列における標識の最初のサブセットは、ストリング配列における標識の第二のサブセットにおける標識の同一性をエラーチェックする。いくつかの具体例において、該ストリング配列における標識の第一のサブセットは、ストリング配列における第二の標識のサブセットについてのチェックサムである。
【００２２】
いくつかの具体例において、該標識同定モジュールは、複数の標識を同定するための指令を複数回反復するための指令を含む。複数の標識を同定するための指令を反復するごとに、該複数の光イメージにおいて、基板上で相互に対して近接する異なる複数の標識が同定される。該プローブ同定モジュールは、該標識同定モジュールによって同定された異なる複数の標識の各々が有効なレポーター配列を含むか否かを決定する。同定された各異なる複数の標識については、該異なる複数の標識のストリング配列が有効なレポーター配列として確認される場合には、異なる複数の標識はプローブであると該プローブ同定モジュールにより見なされ、該異なる複数の標識のストリング配列が有効なレポーター配列として確認されない場合には、異なる複数の標識はプローブではないと該プローブ同定モジュールにより見なされる。いくつかの具体例において、複数のプローブが同定される。いくつかの具体例において、複数のプローブは３以上のプローブよりなる。いくつかの具体例において、複数のプローブは１０以上のプローブよりなる。いくつかの具体例において、複数のプローブは５０未満のプローブよりなる。いくつかの具体例において、プローブ同定モジュールは同定されたプローブの各タイプを記憶する。いくつかの具体例において、プローブ同定モデルは、有効なレポーター配列として確認されない各異なる複数の標識の各ストリング配列を記憶する。いくつかの具体例において、該プローブ同定モデルは、有効なレポーター配列として確認される各異なる複数の標識の各ストリング配列を記憶する。
【００２３】
本発明のもう１つの態様は、基板上に置かれた試料内のプローブの存在を同定するためのコンピューターシステムを提供する。該プローブは複数の空間的に配置された標識を含む。該コンピューターシステムは、中央プロセッシングユニット、および該中央プロセッシングユニットに接続されたメモリーを含む。該メモリーはデータ記憶モジュール、標識同定モジュール、およびプローブ同定モジュールを貯蔵する。データ記憶モジュールは、複数の光イメージを記憶するための指令を含む。該複数の光イメージにおける各光イメージは、複数の異なる波長範囲におけるある波長範囲において試料から受けた光についてのものである。該標識同定モジュールは、該複数の光イメージにおいて、基板上で相互に近接する複数の標識を同定するための指令を含む。該複数の標識の空間的順序は複数の標識のストリング配列を決定する。プローブ同定モジュールは、該複数の標識のストリング配列は有効なレポーター配列を含むか否かを決定するための指令を含む。該複数の標識のストリング配列が有効なレポーター配列として確認される場合、該複数の標識はプローブであると見なされる。該複数の標識のストリング配列は有効なレポーター配列として確認されない場合、該複数の標識はプローブでないと見なされる。
【００２４】
本発明のなおもう１つの態様は、基板上に重ねられた試料内のプローブの存在を検出するためのシステムを含む。該システムは光測定メカニズム、データ記憶モジュール、標識同定メカニズム、およびプローブ同定メカニズムを含む。該光測定メカニズムは複数の光イメージを測定する。該複数の光イメージにおける各光イメージは、複数の異なる波長範囲におけるある波長範囲において試料から受けた光についてのものである。データ記憶モジュールは、複数の光イメージを記憶するための指令を含む。該標識同定メカニズムは、基板上で相互に近接する複数の光イメージにおける複数の標識を同定する。該複数の標識の空間的順序は、該複数の標識のストリング配列を決定する。該プローブ同定メカニズムは、該複数の標識のストリング配列が有効なレポーター配列を含むか否かを決定する。該複数の標識のストリング配列が有効なレポーター配列として確認される場合、該複数の標識はプローブであると見なされる。該複数の標識のストリング配列が有効なレポーター配列として確認されない場合、該複数の標識はプローブではないと見なされる。いくつかの具体例において、該システムは、さらに、基板を照明する照明メカニズムを含む。いくつかの具体例において、該照明メカニズムは励起光源および複数の励起フィルターを含む。該複数の励起フィルターにおける各励起フィルターは、該複数の光イメージにおける対応する光イメージで用いられ、対応する光イメージが測定される場合に、対応する異なるスペクトル範囲に光源を制限する。いくつかの具体例において、光測定メカニズムは複数の測定波長フィルターを含み、ここに、複数の測定波長フィルターにおける各測定波長フィルターを該複数の光イメージにおける対応する光イメージで用いて、対応するスペクトル範囲内にはない光を拒絶する。いくつかの具体例において、該光測定メカニズムは、試料から発せられた光に応答して検出シグナルを形成する光ディテクターを含む。
【００２５】
いくつかの具体例において、該光測定メカニズムは、基板上に重ねられた試料から発せられる光を測定する検出シグナルによってアドレスされるディテクター回路を含む。そのような具体例において、該光測定メカニズムは、さらに、複数の標識位置を記憶するための電子メモリーを含み、ここに、該複数の標識位置における各標識位置は標識を表し、該複数の標識位置における各標識位置は閾値量を超える光に由来する。いくつかの具体例において、該標識同定メカニズムは、電子メモリーに記憶された複数の標識位置内からの相互に近接する複数の標識を同定する。いくつかの具体例において、該標識同定メカニズムは、該複数の光イメージにおける複数の候補標識を同定するための指令を含み、該複数の標識は該複数の候補標識のサブセットである。
【００２６】
本発明のなおもう１つの態様は、基板上に重ねられた試料内のプローブの存在を検出する方法を提供する。本発明のこの態様において、該プローブは複数の空間的に配置された標識を含む。１つのそのような方法において、複数の光イメージにおいて、基板上において相互に近接する複数の標識が同定される。該複数の標識の空間的順序は該複数の標識のストリング配列を決定する。該複数の光イメージにおける各光イメージは、複数の異なる波長範囲におけるある波長範囲において試料から受けた光についてのものである。該方法において、該複数の標識のストリング配列が有効なレポーター配列を含むか否かについて決定がなされる。該複数の標識のストリング配列が有効なレポーター配列として確認される場合、該複数の標識はプローブであると見なされる。該複数の標識のストリング配列が有効なレポーター配列として確認されない場合、該複数の標識はプローブではないと見なされる。
【００２７】
いくつかの具体例において、該決定工程は、該複数の標識のストリング配列を、参照テーブル中の有効なレポーター配列に対して比較することを含む。いくつかの具体例において、該方法は、さらに、有効なレポーター配列として確認されない複数の標識のストリング配列を記憶することを含む。例えば、該ストリング配列を電子メモリーに記憶することができる。いくつかの具体例において、該方法は、さらに、基板上に存在する複数の基点を用いて、該複数の光イメージにおける第二の光イメージに対して第一の光イメージを整列させることを含む。
【００２８】
いくつかの具体例において、複数の標識を同定する工程は複数回反復される。複数の標識を同定する工程が反復されるごとに、該複数の光イメージにおいて、基板上で相互に近接する異なる複数の標識が同定される。いくつかの具体例において、該方法は、さらに、異なる複数の標識の各々が有効なレポーター配列を含むか否かを決定することを含む。該異なる複数の標識のストリング配列が有効なレポーター配列として確認される場合、各異なる複数の標識はプローブであると見なされる。さらに、異なる複数の標識のストリング配列が有効なレポーター配列として確認されない場合、各異なる複数の標識はプローブでないと見なされる。いくつかの場合において、本発明のこの態様に従うと、複数のプローブが同定される。例えば、いくつかの具体例において、２以上のプローブ、３以上のプローブ、１０以上のプローブ、少なくとも５、１０、１５、２０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００または４００プローブ以上が同定される。
【００２９】
複数のプローブが同定されるいくつかの具体例において、同定されたプローブの各タイプは記録される。プローブの「タイプ」は、プローブのストリング配列によって同定される。各ユニークな有効なストリング配列は異なるプローブのタイプを表す。いくつかの具体例において、有効なレポーター配列として確認されない各異なる複数の標識の各ストリング配列は記憶される。このようにして、基板上に生起する共通の条件を決定するのが可能である。有効なストリング配列を形成しない複数の標識をトラッキングすることによって同定することができる条件の１つのタイプは、基板上に余りにも多くのプローブがある条件である。基板上に余りにも多いプローブがある場合、隣接するプローブの標識は相互に対して近接するようになり、各標識がいずれのプローブに属するかを決定するのを困難とする。同定することができる条件のもう１つのタイプは、過剰な数のプローブが全長でない条件である。いくつかの具体例において、標識、ストリング、有効でないレポーター配列、有効なレポーター配列、プローブのタイプの全ての種は、本発明の方法においてトラックされる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１Ａは、２つの８−位置ナノレポーター成分を用いる１６−位置ナノレポーターコードを持つデュアルナノレポーターを示す。図１Ｂは、１つの８−位置ナノレポーター成分および１つの単一位置ナノレポーター成分を用いる、９−位置ナノレポーターコードを持つデュアルナノレポーターを示す。図１Ｃは、１つのゴーストプローブおよび１つの８−位置ナノレポーター成分を用いる、８−位置ナノレポーターコードを持つデュアルナノレポーターを示す。図１Ｄは、８−位置ナノレポーターコードを持つ単一ナノレポーターを示す。図１Ａないし１Ｄにおいて（矢印で示される）星形状はアフィニティータグを示し、これを用いて、イメージングの目的で、ナノレポーターを精製し、またはナノレポーター（またはナノレポーター−標的分子複合体）を固定化することができる。図１Ａないし１Ｄにおけるナンバリングを施した領域は、別々の標識付着領域をいう。図１Ａの位置１２を除いて全ては、灰色、白色、ハッチングを施した、または縞の「太陽」ダイヤグラムとして描かれた、標識モノマーの４つのタイプのうち１つで標識される。図１Ａの位置１２は標識されていない「暗いスポット」である。図１Ｅおよび１Ｆは、各々、図１Ｂおよび１Ｄのナノレポーターでの変形を表し、そこでは、ナノレポーターが結合する標的分子は（小さなアスタリスクとして示された）ビオチン部位、例えば、標的核酸にランダムに取り込まれたビオチン−修飾ヌクレオチドを含む。ナノレポーターそれ自体は、さらに、所望により、アフィニティータグ（図示せず）を含む。
【図２】図２Ａは、パッチユニットを持つ骨格、およびその長さ方向に配された対応するスプリットフラップを含有するナノレポーターの標識ユニットの模式図である。図２Ｂは、１：ナノレポーター骨格（例えば、Ｍ１３一本鎖ＤＮＡ）の一部；２：パッチ対；３：スプリットフラップ対；および４：スプリットフラップにハイブリダイズされた、各々が取り込まれた標識モノマーを持つ標識されたオリゴヌクレオチドを含有する、単一パッチ対およびその対応するフラップの成分を示す。図２Ｃは、４つの「スポット」を持つナノレポーターを示し、各スポットは６０ないし６５ヌクレオチドの９つのパッチ対を含有するように設計されており、各々が９５ないし１００ヌクレオチドのスプリットフラップ対に付着している。各スプリットフラップ対は、各々が、単一標識モノマーに付着した１２のオリゴヌクレオチドに対する結合部位を有した。各スポットは、従って、１０８の標識モノマーに対する結合部位を有した。
【図３】ＲＮＡセグメントであるパッチがレジスターと共に（図３Ａ）およびそれなくして（図３Ｂ）用いることができるナノレポーター。図３Ａおよび３Ｂは（１）それに対して付着したナノレポーター骨格（黒色太線）、（２）８つのＲＮＡセグメント（線１ないし８）、（３）標的−特異的配列（点線「Ｔ」）および（４）ナノレポーター骨格に対して部分的に相補性であって、かつ標的−特異的配列に対して部分的に相補的であるオリゴヌクレオチド（チェッカー線「０」）を描く。このオリゴヌクレオチドは「リゲーター」オリゴヌクレオチドという。図３Ａにおいて、ただ１つのレジスター、すなわち各交互ＲＮＡセグメントが標識される。第二のレジスター位置は「スペーサー」として働き、コード中の連続位置は同一の「色」であるか、あるいはスペクトル的に区別できないナノレポーターコードを生じさせるのを可能とする。図３Ｂにおいて、双方のレジスター、すなわち、介入スペーサーがない隣接ＲＮＡセグメントを同一「色」の最も近い隣接体で標識しない。
【図４】図４は、標的分子にハイブリダイズしたデュアルナノレポーターのイメージである。ここに、双方のレジスターは標識される。ナノレポーターは３つの異なる色、Ａｌｅｘａ４８８、Ｃｙ３およびＡｌｅｘａ６４７（各々、１、２および３で標識する）で標識される。左側の括弧はデュアルナノレポーターの１つのプローブを示し、右側の括弧はデュアルナノレポーターの他のプローブを示す。色１、２および３が、各々、異なるチャネルで得られ、スポットの列として観察された第一および第二のレジスターは、数個の画素だけシフトして、各レジスターを個々に示すことができる。
【図５】この図面は、図４に示されたデュアルナノレポーターの種々の成分を示す。図５Ａは１つの色（ここに、塗りつぶしていない丸として左欄に示されたＡｌｅｘａ４８８）を示し、これは、（垂直にストライプの丸として左欄に示された図５Ｂに示された）Ｃｙ３および（対角線上にストライプの丸として図５Ｃに示された）Ａｌｅｘａ６４７からスペクトル的に区別できる。各々から得られたイメージを重ね合わせて、図５Ｄを得た。
【図６】図６Ａは、図６Ｂおよび６Ｃに示された実験の概略説明図である。この場合、星印は、ストレッチングに先立って一端で複合体を表面に付着させるのに用いたビオチンを表す。図６Ｂおよび６Ｃは、Ｓ２−Ａゴーストプローブ、Ｓ２−Ｂ標識ナノレポーターおよびＳ２標的ＤＮＡ（図６Ｂ）またはＳ２標的ＲＮＡ（図６Ｃ）がハイブリダイズされた実験からのイメージを示す。図６Ｅは、図６Ｂからのナノレポーター複合体のクローズアップを示し、各々が、Ｓ２−Ａゴーストプローブ、Ｓ２−Ｂ標識ナノレポーターおよびＳ２−標的ＤＮＡを含有する。図６Ｄは、Ｓ２−Ａゴーストプローブ、およびＳ２−Ｂ標識ナノレポーターがハイブリダイズされたが、Ｓ２標的ＲＮＡはされなかった陰性対照実験のイメージを示す。
【図７−１】図７Ａ、７Ｂ、７Ｃおよび７Ｄはナノレポーター骨格上のパッチの異なる順列を示す。図７Ｅおよび７Ｆは、図７Ｇにおけるように、所望により、１以上のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされたナノレポーター骨格上のスプリットフラップの異なる順列を示す。図７Ａないし７Ｇにおいて、αは５’または３’分子または分子の端部をいい、およびβは対応する３’または５’分子または分子の端部をいう。
【図７−２】図７Ａ、７Ｂ、７Ｃおよび７Ｄはナノレポーター骨格上のパッチの異なる順列を示す。図７Ｅおよび７Ｆは、図７Ｇにおけるように、所望により、１以上のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされたナノレポーター骨格上のスプリットフラップの異なる順列を示す。図７Ａないし７Ｇにおいて、αは５’または３’分子または分子の端部をいい、およびβは対応する３’または５’分子または分子の端部をいう。
【図８】図８は、一本鎖Ｍ１３ファージがナノレポーター骨格として用いられるために線状化された模式図を示す。円状Ｍ１３ファージは５倍過剰なＢａｍＨ１カッターオリゴヌクレオチド（ハッチングを施した線）にアニールされ（１）、その結果得られた部分的に二本鎖のＭ１３が、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨ１で消化され（２）、その結果、ＢａｍＨ１カッターオリゴヌクレオチドが依然として付着した線状化Ｍ１３が得られる（３）。このＭ１３−オリゴヌクレオチド複合体を、ＢａｍＨ１カッターオリゴヌクレオチド（「抗−ＢａｍＨ１オリゴヌクレオチド」）（灰色線）に相補的な過剰のオリゴヌクレオチドの存在下で加熱する（４）。ＢａｍＨ１カッターオリゴヌクレオチドは過剰の抗−ＢａｍＨ１オリゴヌクレオチドにアニールされ、Ｍ１３分子は、例えば、サイズ排除カラムを用いることによって、オリゴヌクレオチドから精製され、Ｍ１３骨格を得る。
【図９】図９は、本発明の具体例に従ったコンピューターシステムを説明する。
【図１０】図１０Ａは単一アフィニティータグＡ１を含有する標識されたナノレポーターを示す。もう１つのアフィニティータグＡ２は、図１０Ｂに示されるように、Ａ２を含有する分子へのナノレポーターの直接的結合によってナノレポーターに付着させることができる（例えば、もしナノレポーターが核酸であるか、またはそれを含めばそれはＡ２が付着されたもう１つの核酸と直接的にハイブリダイズすることができる）。別法として、第二のアフィニティータグＡ２は、図１０Ｃに示されたブリッジング核酸（「Ｘ」）のようなブリッジング分子を介して標識されたナノレポーターに付着させることができる。
【図１１】図１１Ａないし１１Ｂは、１つの端部において、アフィニティータグＡ１を持つ標識された（核酸−ベースの）ナノレポーターを示す。図１１において、標識されたナノレポーターは、Ａ１の固定化されたアフィニティーパートナーへの結合を通じて固定化される。ナノレポーターの他端は溶液中（図１１Ａ）にあるが、ナノレポーターを固定化するのに用いるもう１つのアフィニティータグ（Ａ２）を含有する相補的オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによって固定化することができる（図１１Ｂ）。Ａ１およびＡ２は、アビジン−またはストレプトアビジン−被覆表面への固定化のための同一の、例えば、ビオチンであり得る。Ａ１の固定化に際して、例えば、ナノレポーターコードの検出を可能とするように、標識付着領域の分離のため、例えば、エレクトロストレッチングによって図１１に示すようにナノレポーターをストレッチ、または「伸ばす」ことができる。所望により、ナノレポーターが伸びた状態にある間に、Ａ２を導入し、Ａ２に相補的なナノレポーターの端部を表面に結合させる。
【図１２】図１２Ａは固定化された第一の部分Ｆ１を含むナノレポーターの説明図であり；および図１２Ｂは、電場において伸びた、かつ固定化された第一の部分Ｆ１および固定化された第二の部分Ｆ２を含むナノレポーターの説明図を供し、ここに、Ｆ２は分子Ｆ３との複合体を介して固定化される。
【図１３】図１３Ａは、伸びたナノレポーターの固定化のための３−メンバー複合体の模式図であり；図１３Ｂは伸びたナノレポーターの固定化のための２−メンバー複合体の説明図を供し；および図１３Ｃは、伸びたナノレポーターの固定化のための不完全な複合体の説明図を供する。
【図１４】図１４Ａは固定化された第一の部分Ｆ１を含むナノレポーターの説明図を示し；図１４Ｂは第一の部分Ｆ１において、および第二の部分において、Ｆ２との複合体を介して固定化された伸ばされたナノレポーターの説明図を供し；図１４Ｃは、ビオチンを介してアビジン表面に固定化された第一の部分を含むナノレポーターの説明図を供し；および図１４Ｄは、第一の部分において、および第二の部分において、アビジン表面へのビオチンの選択的結合を介して固定化された伸びたナノレポーターの説明図を供する。
【図１５】図１５Ａはミクロ流体デバイスにおけるＤＮＡ分子の１つの末端の固定化を示し；図１５Ｂは電場におけるＤＮＡの伸長を示し；および図１５Ｃは伸びたＤＮＡ分子の第二の末端の選択的固定化を示す。
【図１６】図１６は、本発明の方法によって選択的に固定化された伸びたナノレポーターのイメージを供する。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ナノレポーター、およびその製造および使用に関する。十分に組立てられ、かつ標識されたナノレポーターは、２つの主な部分、標的分子に結合することができる標的−特異的配列、および標的−特異的配列に関連するシグナルの「コード」（「ナノレポーターコード」）を発する標識された領域を含む。ナノレポーターの標的分子への結合に際して、ナノレポーターコードは、ナノレポーターが結合した標的分子を特定する。
【００３２】
ナノレポーターはモジュールの構造である。一般に、ナノレポーターは３つの基本的エレメント：２以上の標識付着領域を含有する骨格、該骨格に付着した１以上のパッチ、および該骨格にも付着した標的−特異的配列を含有する分子体である。ナノレポーターのエレメントは単一の分子体（「シンギュラー」ナノレポーター）、または２つの区別される分子体（「デュアル」ナノレポーター）で見出すことができる。各分子体は、１つの分子、あるいは、共有結合または非−共有結合手段によってもう１つの分子に付着した１を超える分子から構成され得る。一般に、デュアルナノレポーターの各成分は、同一標的分子上の異なる部位に結合する標的−特異的配列を有する。これは、ナノレポーターの標的分子への結合のより効果的なキネティックス、およびより大きな結合特異性に由来する良好なシグナル：ノイズ比率を持つより小さなナノレポーター成分を可能とする。
【００３３】
ナノレポーター骨格に付着したパッチは、標識モノマーをナノレポーター骨格に付着させるように働く。パッチは、例えば、１以上の標識モノマーの核酸パッチへの共有結合取り込みによって直接的に標識することができる。別法として、パッチは、例えば、１以上の標識モノマーの核酸フラップへの共有結合取り込みによって直接的に、あるいは例えば、核酸の、１以上の標識モノマーに共有結合により付着したオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによって間接的に標識することができるフラップに付着させることができる。標識付着領域に付着した標識モノマーがパッチまたはフラップに直接的に取り込まれない場合、該パッチまたはフラップは標識モノマーと標識付着領域の間の「ブリッジ」として働き、これは、「ブリッジング分子」、例えば、ブリッジング核酸ということができる。
【００３４】
加えて、ナノレセプターは、精製のために、および／または（例えば、固体表面への）固定化のためにアフィニティータグを有することができる。ナノレポーター、またはナノレポーター−標的分子複合体は、好ましくは、２以上のアフィニティー選択工程において精製される。例えば、デュアルナノレポーターにおいては、１つのプローブは第一のアフィニティータグを含むことができ、および他のプローブは第二の（異なる）アフィニティータグを含むことができる。プローブを標的分子と混合し、デュアルナノレポーターの２つのプローブを含む複合体を、個々のアフィニティータグの一方または双方に対するアフィニティー精製によって結合していない物質（例えば、標的、またはナノレポーターの個々のプローブ）から分離する。第一の工程において、第一のアフィニティータグおよび所望の複合体を含む唯一のプローブが精製されるように、混合物を第一のアフィニティータグのためにアフィニティー試薬に結合させることができる。結合した物質を第一のアフィニティー試薬から放出させ、所望により、第二のアフィニティータグのためにアフィニティー試薬に結合させ、第一のアフィニティータグを含むプローブからの複合体の分離を可能とする。この時点において、十分な複合体のみが結合するであろう。複合体は、第二のアフィニティータグのためにアフィニティー試薬から最終的に放出され、続いて、好ましくは、伸ばされ、イメージされる。アフィニティー試薬は、結合パートナーで被覆されたカラム、ビード（例えば、ラテックスまたは磁性ビード）またはスライドのようなアフィニティータグについての結合パートナーで被覆されたいずれの固体表面でもあり得る。アフィニティー試薬を用いるナノレポーターの固定化およびストレッチングは、ここに引用してその全体を援用する、２００５年１２月２３日に出願された代理人書類番号１１６１６−０１４−８８８の、“Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  Ｏｒｉｅｎｔｅｄ，Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｉｒ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ”と題された、Ｓｅａｎ  Ｍ．Ｆｅｒｒｅｅ  ａｎｄ  Ｄｗａｙｎｅ  Ｌ．Ｄｕｎａｗａｙによる米国仮出願第６０／７５３，８１６号に十分に記載されている。
【００３５】
核酸である、または核酸を含むナノレポーターおよびナノレポーター−標的複合体は、ナノレポーターまたは標的の少なくとも一部に対して相補的である、オリゴヌクレオチドのような核酸を用いてアフィニティー−精製し、または固定化することができる。標的がポリＡまたはポリｄＡストレッチを含む特別な適用において、ナノレポーター−標的複合体は、ポリｄＴオリゴヌクレオチドで被覆したアフィニティー試薬によって精製し、または固定化することができる。
【００３６】
与えられたナノレポーターの骨格の種々の標識付着領域に会合した標識モノマーによって発せられるシグナルの配列は、ナノレポーターのユニークな同定を可能とする。ユニークな同一性またはユニークなスペクトルシグニチャーを有するナノレポーターは、特異的標的分子またはその部分を認識する標的−特異的配列に会合する。ナノレポーターが、ナノレポーターの標的−特異的配列の、標的分子への結合を許す条件下で標的分子を含有する混合物に暴露された場合、標的−特異的配列は標的分子に優先的に結合する。ナノレポーターに関連するスペクトルコードの検出は、混合物において標的分子の存在の検出を可能とする（定性的分析）。与えられたスペクトルコードまたはシグニチャーに関連する全ての標識モノマーの計数は、ナノレポーターにカップリングした標的−特異的配列に会合した混合物における全ての分子の計数を可能とする（定量的分析）。かくして、ナノレポーターは、公知の生物学的マーカーの定量的分析によって、異なる生物学的状態（例えば、病気ｖｓ．健康）の診断または予後で有用である。さらに、本発明のナノレポーターによって供される、単一分子検出および定量の優れた感度は、異なる生物学的状態の中の乱れが余りにも少なくて、伝統的な分子方法を用いて特定の生物学的状態との相関を検出できないことを含めた、新しい診断および予後マーカーの同定を可能とする。ナノレポーター−ベースの分子検出の感度は、小さな生物学的試料における治療および診断剤の詳細なファルマコキネティック分析を可能とする。
【００３７】
シンギュラーナノレポーターという多くのナノレポーターは、図１Ｄに示したように、１つの分子体から構成される。しかしながら、ナノレポーターの特異性を増加させ、および／または標的分子へのその結合のキネティックスを改良するためには、好ましいナノレポーターは、各々、同一標的分子の異なる領域に結合する異なる標的−特異的配列を含有する２つの分子体から構成されるデュアルナノレポーターである。デュアルナノレポーターの種々の具体例は図１Ａないし１Ｃに描かれる。デュアルナノレポーターにおいては、２つの分子体の少なくとも１つは標識される。他の分子体は必ずしも標識されない。デュアルナノレポーターのそのような標識されていない成分は、本明細書中においては、「ゴ−ストプローブ」といい（図１Ｃ参照）、しばしば、デュアルナノレポーターおよび標的分子を含有する複合体を固定化し、および／または伸ばして、複合体の可視化および／またはイメージングを可能とするのに有用な付着したアフィニティータグを有する。
【００３８】
それらの分子構造のため、ナノレポーターを種々の異なる方法で組み立て、標識することができる。例えば、ナノレポーター骨格を（例えば、ハイブリダイゼーションおよび、所望により、連結によって）標的−特異的配列に付着させることができ、骨格および標的−特異的配列を含む構造を１以上のパッチおよび、望めば、フラップに付着させる。別法として、ナノレセプター骨格を、まず、１以上のパッチ（および、所望により、フラップ）に付着させることができ、続いて骨格／パッチ構造が標的−特異的配列に結合される。かくして、特に断りのない限り、ナノレポーター組立てにおける工程の考察またはリストは、組立ての具体的経路が従われなければならないことを意味しない。
【００３９】
ナノレポーターの組立ておよび使用は、本明細書中においては、種々の核酸−ベースのナノレポーターの記載によって大いに例示されるが、当業者であれば、本明細書中に記載された方法はアミノ酸−ベースの（またはハイブリッド核酸−／アミノ酸−ベースの）ナノレポーターに適用することができるのを認識するであろう。部分的および十分に組立てられたナノレポーターの説明的具体例を以下にリストする。
【００４０】
その最も単純なものとして、ナノレポーターは、標識し、解像することができる少なくとも２つの標識付着領域を有する骨格を含む。該骨格は、別々に標識し、解像することができる骨格上での標識付着領域の形成を可能とするいずれの分子体でもあり得る。骨格上に形成されるべき標識付着領域の数は骨格の長さおよび性質、ナノレポーターを標識する手段、ならびに骨格の標識付着領域に付着したシグナルを発生する標識モノマーのタイプに基づく。本発明によるナノレポーターは、２以上の標識付着領域を含めた骨格を有することができる。適当な骨格構造は、ＤＮＡ−ベースの骨格を含む。
【００４１】
本発明は、標識されたナノレポーターを提供し、そこでは１以上の標識付着領域が対応する標識モノマーに付着しており、各標識モノマーはシグナルを発する。例えば、本発明による標識ナノレポーターは、少なくとも２つの標識モノマーが、これらの標識された標識付着領域、または「スポット」が識別可能なように、骨格の２つの対応する標識付着領域に付着した場合に得られる。骨格の異なる標識付着領域に会合したシグナルを発する標識モノマーは、検出条件下でスペクトル的に識別できないシグナル（「様」シグナル）を発することができるか、あるいは検出条件下でスペクトル的に識別可能なシグナルを発することができる。
【００４２】
また、本発明は、２以上の標識モノマーが標識付着領域に付着したナノレポーターを提供する。標識付着領域と会合した標識モノマーによって発生られるシグナルは、検出される凝集シグナルを生じる。生じた凝集シグナルは様シグナルからなるものでよく、または少なくとも２つのスペクトル的に識別可能なシグナルからなるものでよい。
【００４３】
１つの具体例において、本発明は、様シグナルを発する少なくとも２つの標識モノマーが骨格の２つの対応する標識付着領域に付着しており、かつ２つの標識モノマーが空間的に識別可能であるナノレセプターを提供する。もう１つの具体例において、本発明は、２つの識別可能なシグナルを発する少なくとも２つの標識モノマーが２つの隣接する標識付着領域、例えば、少なくとも２つの標識モノマーがスペクトル的に識別可能であるような２つの隣接標識付着領域に付着しているナノレポーターを提供する。
【００４４】
本発明は、様シグナルを発する２つのスポットがスペーサー領域によって分離されているナノレポーターを提供する。そのようなスペーサー領域は、２つのスポットに付着した標識モノマーによって発せられる様シグナルの解像または良好な解像を可能とする。１つの具体例において、スペーサー領域は、ナノレポーターを検出するにおいて使用される機器の解像によって決定される長さを有する。
【００４５】
本発明は、１以上の「二重スポット」を持つナノレポーターを提供する。各二重スポットは、スペーサー領域によって分離されることなく、様シグナルを発する２以上の（例えば、３つ、４つまたは５つの）隣接スポットを含有する。二重スポットはそれらのサイズによって同定することができる。本発明によるシグナルを発する標識モノマーは、標識付着領域に付着したパッチに（例えば、ハイブリダイゼーションを介して）共有結合的に、または非共有結合的に付着することができる。標識モノマーは、骨格に付着したパッチに付着したフラップに（例えば、ハイブリダイゼーションを介して）共有結合的に、または非共有結合的に付着させることもできる。フラップは、スプリットフラップを形成する１つの分子、または２以上の分子（「フラップピース」）によって形成することができる。
【００４６】
本発明は、ナノレポーターの骨格上の標識付着領域に（例えば、パッチを介して間接的に）付着した標識モノマーによって発せられるシグナルの配列によって決定されるスペクトルコードに関連するナノレポーターも提供し、それにより、スペクトルコードの検出はナノレポーターの同定を可能とする。
【００４７】
１つの具体例において、本発明は、支持体へのアフィニティータグの付着が、骨格上の異なる標識付着領域に対応する標識モノマーによって発せられるシグナルの骨格の伸びおよび解像を可能とするように、ナノレポーター骨格に付着したアフィニティータグをさらに含むナノレポーターを提供する。ナノレポーターストレッチングは、限定されるものではないが、物理的、水力学または電気的手段に関連する手段を含めた、当該分野で知られたいずれのストレッチング手段も含むことができる。
【００４８】
なおもう１つの具体例において、本発明は、骨格の標識付着領域に付着したフラップをさらに含むナノレポーターを提供し、そこでは、骨格の標識付着領域に付着したフラップは、標識付着領域に対応する標識モノマーに付着し、それにより、骨格上の対応する標識付着領域に標識モノマーを間接的に付着させる。さらなる具体例において、各標識モノマーはシグナルを発する部分および所定の配列のオリゴヌクレオチド部分を含み、およびフラップは対応する標識のオリゴヌクレオチド部分に対して相補的なフラップ配列の反復を含み、それにより、１以上の標識モノマーが、フラップ配列の反復への標識モノマーのオリゴヌクレオチド部分のハイブリダイゼーションを介して対応する標識付着領域に付着し、それにより、標識されたナノレポーターを生じさせる。
【００４９】
本発明によるナノレポーターは、さらに、骨格にカップリングした標的−特異的配列をさらに含むことができる。標的−特異的配列は、ナノレポーターが標的分子を認識し、それに結合し、または付着するのを可能とするように選択される。本発明のナノレポーターは、全てのタイプの標的分子の同定で適当である。例えば、適当な標的−特異的配列をナノレポーターの骨格にカップリングさせて、標的分子の検出を可能とすることができる。好ましくは、標的分子は（ｃＤＮＡを含めた）ＤＮＡ、（ｍＲＮＡおよびｃＲＮＡを含めた）ＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチド、または蛋白質である。
【００５０】
本発明の１つの具体例は、本発明による標識モノマーでの標的分子検出において増大した柔軟性を提供する。この具体例において、各々が、その少なくとも１つが標識された別々の標的−特異的領域を持つ、２つの異なる分子体を含むデュアルナノレポーターは同一標的分子に結合する。かくして、デュアルナノレポーターの２つの成分の標的−特異的配列は、選択された標的分子の異なる部分に結合し、それにより、デュアルナノレポーターに関連するスペクトルコードの検出は、デュアルナノレポーターと接触した生体分子試料における選択された標的分子の検出を提供する。
【００５１】
本発明は、：（ｉ）デュアルナノレポーターにおける標的−特異的配列の標的分子への結合を可能とする条件下で試料をデュアルナノレポーターと接触させ、次いで、（ｉｉ）デュアルナノレポーターと関連するスペクトルコードを検出することを含む、生体分子試料中の特異的標的分子の存在を検出する方法も提供する。ナノレポーター人工物に依存して、デュアルナノレポーターは、標的分子への結合の前または後に標識することができる。
【００５２】
ナノレポーターの構造的安定性は、パッチの連結および、所望により、スプリットフラップおよび／またはスプリットフラップにハイブリダイズした標識オリゴヌクレオチドの連結も介して増大させることができる。
【００５３】
本発明のナノレポーターによって供される定性的分析能力、およびそれに基づく分析技術に加えて、本発明のナノレポーターは、定量的分析を行うのにユニークに適している。本発明の（シンギュラーまたはデュアルナノレポーターであるかを問わず）ナノレポーターと生体分子試料内のその標的分子との間に１対１結合を供することによって、試料に存在する標的分子の全てのまたは代表的な部分を同定し、カウントすることができる。種々の分子種のこの個々の計数は、生体分子試料中の標的分子の絶対的または相対的濃度を決定するための正確かつ直接的方法を提供する。さらに、混合物中の各分子をアドレスする能力は、高感度、最小試料量要件、小容量における液相キネティックスによって供される高い反応速度、および結局は非常に低い試薬コストの利点を個々に高める。
【００５４】
以下に供する記載および実施例から認識されるように、本発明は多数の利点を供する。例えば、本発明によりナノレポーターを形成するにおける複雑なモジュール方式は、非常に高い程度の多様性を有するユニークなナノレポーター（例えば、数百万のユニークに認識可能なナノレポーター）のライブラリーの系統的作成を可能とする。このモジュール方式は、有意な製造効率を供する具体的適用に対するナノレポーター集団におけるカスタマイズの柔軟性を可能とする。以下の記載を通じて認識されるであろうもう１つの利点は、本発明のナノレポーターを組立てるにおける柔軟性に由来する。すなわち、そのモジュールの構造のため、本発明のナノレポーターは、使用の地点への出荷に先立って組立てることができるか、あるいは使用の地点において組立てることができる。
【００５５】
５．１  ナノレポーターの命名法
本明細書中で用いる全ての用語は、特に断りのない限り、当業者に対するその通常の意味を有する。以下の用語は以下の意味を有すべきである。
【００５６】
結合対。用語「結合対」とは、相互に対して選択的に結合することができ、すなわち、組成物中の他の成分に対するよりも大きな親和性でもって相互に結合することができる第一および第二の分子または部位をいう。結合対のメンバーの間の結合は共有結合、または非共有結合であり得る。ある具体例において、結合は非共有結合である。例示的な結合対は免疫学的結合対（例えば、対応する抗体またはその結合部分または断片と組合せたハプテンまたは抗原性化合物、例えば、ジゴキシゲニンおよび抗−ジゴキシゲニン、フルオレセインおよび抗−フルオレセイン、ジニトロフェノールおよび抗−ジニトロフェノール、ブロモデオキシウリジンおよび抗−ブロモデオキシウリジン、マウス免疫グロブリンおよびヤギ抗−マウス免疫グロブリン）、および非免疫学的結合対（例えば、ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジン、ホルモン−ホルモン結合蛋白質、受容体−受容体リガンド（例えば、アセチルコリン受容体−アセチルコリンまたはそのアナログ）、ＩｇＧ−プロテインＡ、レクチン−炭水化物、酵素−酵素補因子、酵素−酵素阻害剤、核酸デュプレックスを形成することができる相補的ポリヌクレオチド対、等）を含む。例えば、免疫反応性結合メンバーは抗原、ハプテン、アプタマー、抗体（一次または二次）、およびその複合体を含むことができ、組換えＤＮＡ方法またはペプチド合成によって形成されたものを含む。抗体はモノクローナルまたはポリクローナル抗体、組換え蛋白質またはその混合物または断片、ならびに抗体および他の結合メンバーの混合物であってよい。他の通常の結合対は、限定されるものではないが、ビオチンおよびアビジン（またはその誘導体）、ビオチンおよびストレプトアビジン、炭水化物およびレクチン、（プローブおよび捕獲核酸配列を含めた）相補的なヌクレオチド配列、組換え方法によって形成されたものを含めた相補的ペプチド配列、エフェクターおよび受容体分子、ホルモンおよびホルモン結合蛋白質、酵素補因子および酵素、酵素阻害剤および酵素等を含む。
【００５７】
暗いスポット。用語「暗いスポット」とは、ナノレポーター上の標識付着部位からのシグナルまたは「スポット」の欠如をいう。暗いスポットをナノレポーターコードに取込んで、より多くのコード順列を加え、ナノレポーター集団におけるより大きなナノレポーター多様性を生じさせることができる。
【００５８】
伸びた状態。用語「伸びた状態」とは、当業者によって伸びたと認識されるであろう状態のナノレポーターをいう。ある具体例においては、ナノレポーターは、それが溶液中でのその天然の立体配座に対して伸びている場合、伸びた状態にある。ある具体例において、ナノレポーターは、それがナノレポーターを伸ばすことができる力の場にある場合、伸びた状態にある。ある具体例において、ナノレポーターの伸びた状態は定量的に決定することができる。そのような具体例において、当業者であれば、ナノレポーターの端部−端部ベクターとしてのＲ、すなわち、ナノレポーターの２つの末端の間の距離として認識し、およびＲの９５％が当業者に適したと見なされる溶液中で２＜Ｒ＞内にあるような、平均端部−端部ベクターとしても＜Ｒ＞を認識するであろう。例示的な溶液は、例えば、水またはｐＨ緩衝液中のナノレポーターの希薄な溶液を含む。特別な具体例において、ナノレポーターは、Ｒが２．０＜Ｒ＞よりも大きな伸びた状態にある。
【００５９】
フラップ。本明細書中で用いる用語「フラップ」とは、標識付着領域に付着したパッチまたはパッチ対に付着した分子体をいう。該フラップは、標識モノマーを含有する１以上の分子であるか、あるいは標識モノマーを含有する１以上の分子に結合することができる。領域の間接的な標識を供することによって、フラップは、領域に関連するシグナルを発するモノマーの数、ならびにそれらのモノマーの性質を制御するにおいてより大きな柔軟性を供する。フラップは、「スプリットフラップ」を形成する単一分子ピースまたはいくつかの分子のピース（例えば、２つのピース）によって形成され得る（例えば、図７参照）。
【００６０】
ゴーストプローブ。標的−特異的配列を含むが、ナノレポーターコードに寄与するシグナルを発する標識モノマーで標識されていない分子。
【００６１】
標識されたナノレポーター。標識されたナノレポーターは、該ナノレポーターの少なくとも１つのパッチが、ナノレポーターコードの少なくとも一部を形成するシグナルを発する１以上の標識モノマーに付着されたナノレポーターである。
【００６２】
標識ユニット。用語「標識ユニット」とは、標識されたナノレポーターの非−標的−特異的部分をいう。
【００６３】
ナノレポーター。用語「ナノレポーター」とは、（ｉ）少なくとも２つの標識付着領域を含有する分子（「骨格」）；（ｉｉ）少なくとも１つの標識付着領域に付着した少なくとも１つのパッチ；および（ｉｉｉ）標的−特異的配列を有する分子体をいう。後に詳細に記載されるように、ナノレポーターはシンギュラーナノレポーター（全ての成分は単一分子体中にある）またはデュアルナノレポーター（全ての成分は２つの別々の分子体中にある）であり得る。ナノレポーターは、好ましくは、合成、すなわち、天然に生じない分子であり、例えば、１を超える分子（例えば、プラスミド、染色体、ウイルスゲノム、蛋白質など）に通常存在する２以上の人造および／または天然に生じる配列を連結することによって作製されたキメラ分子である。
【００６４】
ナノレポーターコード。ナノレポーターからのスポットの順序および性質（例えば、主な発光波長、また所望により長さ）は、ナノレポーターの標的特異的配列を通じてナノレポーターによって結合され得る標的分子を同定するナノレポーターコードとして働く。ナノレポーターが標的分子に結合すると、ナノレポーターコードは、また、標的分子を同定する。所望により、スポットの長さはナノレポーターコードの成分であり得る。
【００６５】
配向状態。用語「配向状態」とは、当業者によって配向されたのが認識されるであろう状態にあるナノレポーターをいう。ある具体例において、ナノレポーターは、それが溶液中でその天然立体配座に対して配向している場合、配向した状態にある。ある具体例において、ナノレポーターは、それがナノレポーターを配向させることができる力の場と平行に配置されている場合、配向している。ある具体例において、ナノレポーターは、それが当業者によって認識されるように平行に配置されている複数のナノレポーターの１つである場合、配向している。
【００６６】
パッチ。用語「パッチ」とは、一般には、ナノレポーターを標識する目的で、ナノレポーター骨格の標識付着領域に付着した分子体をいう。該パッチは、骨格へのその付着に先立って、またはその後に、それに直接的に（共有結合により、または非共有結合により）、または間接的に付着しているのいずれかである１以上の標識モノマーを有することができる。
【００６７】
プローブ。これは、標的−特異的配列を有する分子をいう。シンギュラーナノレポーターの関係では、用語「プローブ」とは、ナノレポーターそれ自体をいい；デュアルナノレポーターとの関係では、用語「プローブ」とは、ナノレポーターの２つの成分の一方または双方をいう。
【００６８】
プローブ対。用語「プローブ対」とは、デュアルナノレポーターをいう。
【００６９】
レジスター。用語「レジスター」とは、交互標識付着領域の組をいう。
【００７０】
選択的結合。用語「選択的結合」とは、当業者によって認識されるであろう組成物における他の分子または部位に関して相互に対する分子または部位の対のいずれかの優先的結合をいう。ある具体例において、分子または部位の対は、それらが他の分子または部位と比較して相互に優先的に結合する場合、選択的に結合する。選択的結合は、もう１つの分子または部位に対する１つの分子または部位の親和性、または結合活性、又はその両方を含むことができる。特別な具体例において、選択的結合は、約１×１０−５Ｍ未満、または約１×１０−６Ｍ、１×１０−７Ｍ、１×１０−８Ｍ、１×１０−９Ｍ、または１×１０−１０Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）を要する。対照的に、ある具体例においては、非−選択的結合は有意により低い親和性、例えば、１×１０−３Ｍよりも大きなＫＤを有する。
【００７１】
スポット。スポットは、ナノレポーター検出との関係では、ナノレポーター上の単一標識付着部位に結合し、かつ標識付着領域のサイズおよび標識モノマーの性質（例えば、主な発光波長）に依存して、顕微鏡下で可視化した場合に、光の単一点源として出現し得る標識モノマーから検出される凝集シグナルである。ナノレポーターからのスポットは、重複しているか、または重複していなくてもよい。その標的分子を同定するナノレポーターコードは、スポットの長さのいずれかの順列、他のスポットに対するその位置、および／またはそのシグナルの性質（例えば、主な発光波長）を含むことができる。
【００７２】
標的−特異的配列。用語「標的−特異的配列」とは、標的分子に結合することができる分子体をいう。ナノレポーターとの関係では、標的−特異的配列はナノレポーター骨格に付着している。標的分子は、好ましくは（しかしながら、必然的ではないが）、天然に生じる分子、または天然に生じる分子のｃＤＮＡ、または該ｃＤＮＡの相補体である。
【００７３】
５．２  ナノレポーター骨格
ナノレポーター骨格はいずれかの分子体、より好ましくは、標識モノマーが直接的にまたは間接的に付着することができる標識付着領域を含有する核酸分子であり得る。１つの具体例において、ナノレポーター骨格は蛋白質骨格であり；好ましい具体例において、ナノレポーター骨格は、標識付着領域が、オリゴヌクレオチドパッチ、ＲＮＡパッチ、またはＤＮＡパッチのような他の核酸がハイブリダイゼーションによって付着することができる一本鎖領域である核酸骨格である。特別な具体例において、ナノレポーター骨格は核酸分子である。
【００７４】
本発明のナノレポーターを形成するのに適当な骨格のタイプに対して特別な制限はない。本発明による骨格は、本質的には、例えば、一本鎖直線状骨格、二本鎖直線状骨格、一本鎖円状骨格または二本鎖円状骨格を含めたいずれかの構造を有することができる。骨格構造の例は、例えば、ポリペプチド、核酸または炭水化物のような１つの分子体から作製された骨格を含む。骨格は構造の組合せを含むこともでき、例えば、骨格は、１以上の炭水化物ストレッチにカップリングされた１以上のポリペプチドストレッチから作製することができる。
【００７５】
本発明による骨格に対する適当な分子体は、ポリマー構造、特に、ＤＮＡのような核酸ベースのポリマー構造を含む。ＤＮＡベースの構造は、少なくとも部分的には、ＤＮＡ構築体の操作を可能とする膨大な普遍的な現存の技術および方法のため、本発明との関係で多数の利点を供する。
【００７６】
先に示したように、骨格は一本鎖または二本鎖であってよい。二本鎖骨格は、慣用的な二本鎖ＤＮＡ、あるいはパッチユニットまたは平坦−パッチが付着した核酸の直線状一本鎖ストレッチから構成される二本鎖のいずれかであり得る。直線状骨格の形成スキームは図８に示される。
【００７７】
骨格は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１ないし１００の標識付着領域、またはそれ以上を有することができる。
【００７８】
ナノレポーター骨格の標識付着領域は、標識の方法に依存してサイズは変化するであろう。種々の具体例において、標識付着領域は１０ｎｍないし１０，０００ｎｍのいずれかの長さを有するが、より好ましくは、５０ｎｍないし５，０００ｎｍ、より好ましくは１００ｎｍないし１，０００ｎｍである。種々の具体例において、標識付着領域は約１００ｎｍないし約５００ｎｍ、約１５０ｎｍないし約４５０ｎｍ、約２００ｎｍないし約４００ｎｍ、または２５０ないし約３５０ｎｍである。好ましい具体例において、標識付着領域は、約３００ｎｍである、回折−制限スポット、例えば、標準オプティックスで検出することができる最小のスポットのサイズに密接に対応する。
【００７９】
骨格が核酸である場合、１ｎｍはほぼ３つのヌクレオチドに対応し；かくして、ほぼ３００ｎｍ−標識付着領域はほぼ９００塩基に対応する。他の好ましい具体例において、標識付着領域は約３００ヌクレオチドないし約１．５ｋｂ、約４５０ヌクレオチドないし約１．３５ｋｂ、約０．６ｋｂないし約１．２ｋｂ、または０．７５ｋｂないし約１．０５ｋｂである。
【００８０】
本発明によるナノレポーター骨格に対する分子体の説明例は、一本鎖であるＭ１３ＤＮＡである。１つの具体例において、ナノレポーター骨格は、円状Ｍ１３のような、円状の少なくとも部分的に一本鎖のＤＮＡである。より好ましい具体例において、ナノレポーター骨格は、直線状Ｍ１３のような直線状の少なくとも部分的に一本鎖のＤＮＡである。特別な具体例において、Ｍ１３一本鎖ＤＮＡは、円状Ｍ１３ＤＮＡのＢａｍＨ１部位において切断を操作することによって得られる。
【００８１】
本発明の関係内では、直線状ＤＮＡは円状ＤＮＡと比較してさらなる利点を供することに注意すべきである。本発明による骨格を形成するにおける直線状ＤＮＡを用いる１つの利点は、直線状ＤＮＡに関連する有意に低下したトーション応力に関する。円状ＤＮＡに関連する加えられたトーション応力は、パッチユニットのような、ナノレポーターの他の成分の骨格への付加に際して、骨格の構造的一体性に干渉し得る。酷いトーション応力は、骨格の構造の破壊に導き得る。しかしながら、ナノレポーターでは、ただ数個の短い標識付着部位が標識される場合、円状ＤＮＡは適当であろう。
【００８２】
５．２．１  新規な合成ナノレポーター骨格配列
本発明は、ナノレポーターの標識および検出を最適化する特徴を有するように設計された人工核酸分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド）であるナノレポーター骨格を提供する。本発明のこれらの態様において、ナノレポーター骨格は、５０ないし５０，０００塩基長である１以上の合成配列を含む人工核酸である。従って、好ましくはＤＮＡであるナノレポーター骨格は、特定の塩基の規則的なパターン（「規則的に反復した塩基」）を含む、標識付着領域として有用な１以上の領域を有するように設計されている。そのような領域において、規則的に反復した塩基は、ｎがいずれかの数、好ましくは、４ないし２５である各ｎ番目の残基の周期性でもって起こる。
【００８３】
好ましくは、領域における規則的に反復した塩基の２５％以下は、規則的間隔以外において出現する。例えば、もし１００ヌクレオチドの領域において、１２のチミジンの塩基があって、かつチミジンが規則的に反復した塩基であれば、本発明のこの態様において、これら、すなわち、３つのチミジン塩基の２５％以下はチミジンの規則的なパターンの外部に出現する。特別な具体例において、塩基の２０％以下、１５％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、または１％以下は、領域において規則的間隔以外で出現する。
【００８４】
ナノレポーター骨格における規則的に反復した塩基、またはアニールされたパッチ（またはセグメント）におけるその相補的規則的反復塩基を用いて、標識モノマー、好ましくは、光を発する標識モノマーを、ナノレポーターシグナルの良好な分布のための規則的な均一に間隔が設けられたパターンにてナノレポーターに付着させることができる。好ましくは、領域が標識されている場合、規則的に反復した塩基の出現の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％は、標識モノマーの塩基への共有結合付着によって、または規則的に反復した塩基の相補体がそのように標識された核酸へのハイブリダイゼーションによって、少なくとも１つの光を発する標識モノマーに付着される。
【００８５】
出現のこのパーセンテージは当該分野で知られたいずれかの手段によって測定することができる。１つの方法において、標識反応において生じた該量の核酸を精製し（例えば、ＲＮＡはＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙキットを用いて精製することができる）、ＵＶ分光分析に付される。適当な波長における吸光度（「Ａ」）は、核酸（２６０ｎｍ）、およびその出現が測定されるべき標識分子（例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８については４９５ｎｍ；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４については５９０ｎｍ；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７については６５０；およびＣｙ３については５５０ｎｍ）の各々について測定される。核酸の吸光度は修正可能であり、２６０ｎｍにおける吸光度（「Ａ２６０」）の値を調整して、標識モノマーについてのピーク波長における吸光度（ＡＬＭ）から合計標識モノマーについての修正因子を差し引くことによって、標識モノマーから「ノイズ」寄与を除去することによって修正される。核酸がＲＮＡである場合、１０００ヌクレオチドあたりの標識の数は式：
【００８６】
【数１】
2009538132.tif 000003
［式中、ＥＣＬＭは標識モノマーについての消光計数である］
に従って計算することができる。この式から、光を発する標識モノマーに付着した規則的反復塩基の出現のパーセンテージを計算することができる。
【００８７】
一般に、標識付着領域における好ましい規則的に反復する塩基はチミジンであり、従って、該領域は、規則的に反復した塩基がウリジンである１以上の相補的パッチ（例えば、ＲＮＡセグメント）へのハイブリダイゼーションによって標識することができる。これは、そうでなければランダムな配列において、標識モノマー付着部位としての、容易に商業的に入手可能な、アミノ−アリル−修飾ＵＴＰの使用を可能とする。好ましくは、領域の規則的周期性に加えて、領域（およびそれを含む核酸）は、最小の二次的構造を含有する。総じてのＧＣ−含有量は、好ましくは、５０％近くに維持され、好ましくは、比較的短いストレッチに渡って合致して、局所的なＴｍを同様なものとする。
【００８８】
本発明の人工的核酸、または少なくともその中の領域は、好ましくは、長さが１２塩基よりも大きな直接的、または逆転した反復を有しない。他の具体例において、人工的核酸および／または領域は、長さが１１、１０または９塩基よりも大きな直接的、または逆転した反復を有しない。
【００８９】
規則的に反復したヌクレオチドがチミジンであって、ＧＣ含有量がほぼ５０％である例示的な領域において、過剰なアデニンはＴの豊富性において喪失を補充するであろう。選択された配列を生じさせるためには、各４番目の塩基ないし各２５番目の塩基の範囲のＴの固定されたパターンを持つランダムな配列を作り出し、逆転したおよび直接的反復の存在を最小とするようにスクリーニングする。
【００９０】
また、配列は、好ましくは、共通する６塩基カッター制限酵素認識部位を回避するようにスクリーニングする。選択された配列は、加えて、予測された二次的構造分析に付され、最小の二次的構造を持つものを、さらなる評価のために選択する。ＭＦＯＬＤプログラム（Ｚｕｋｅｒ，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１（１３）：３４０６−１５；Ｍａｔｈｅｗｓら、１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８８：９１１−９４０）のような、当該分野で知られたいずれかのプログラムを用いて、二次的構造を予測することができる。
【００９１】
適当な配列を、５０塩基ないし２キロベース長（より長くあり得る）の範囲の標識付着領域に分割する。各標識付着領域はユニークな配列であるが、与えられたレポーター配列における他の標識付着領域に加えて、Ｔの一定数および間隔を含有する。これらの標識付着領域には、その配列が重要でない他の領域が間に存在し得る。ナノレポーター骨格における合成標識付着領域は異なる長さのものとすることができ、および／または異なる規則的反復塩基を有することができる。（転写体の位置＋１で始まる）ＲＮＡポリメラーゼＴ７、Ｔ３、またはＳＰ６による転写についての最適化された開始配列を、各標識付着領域の５’末端に付加することができる。制限部位を、所望により、各標識付着領域の境界に加えて、慣用的なクローニング技術を用い、個々の標識付着領域の配列への特異的付加、またはその欠失を可能とする。ナノレポーターにおける合成標識付着領域の数は、好ましくは、１ないし５０の範囲である。なお他の具体例において、ナノレポーターにおける合成標識付着領域の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０合成標識付着領域ないし１５、２０、３０、４０または５０合成標識付着領域の範囲であり、または間のいずれかの範囲である。
【００９２】
そのような新規な合成標識付着領域の例を以下に掲げる。５’から３’にかけて示したこの配列においては、Ｔは各８番目の位置に置かれ、該領域は５’ＳａｃＩ制限部位および３’ＫｐｎＩ制限部位によって境界が形成されている。Ｔ７ポリメラーゼ（ＧＧＧＡＧＡ）についての最適化された転写体開始部位は、５’制限部位から下流の領域の５’末端に含まれる。この配列の相補体は、一本鎖分子として生じさせた場合、この標識付着領域から転写されたＲＮＡ分子についての骨格を形成する。
【００９３】
【数２】
2009538132.tif 000004
【００９４】
【数３】
2009538132.tif 000005
本発明の合成核酸は、天然に生じるヌクレオチド、あるいは分子の生物学的安定性を増大させるように、または、標識付着領域およびアニールされたパッチまたはセグメントの間で形成されたデュプレックスの物理的安定性を増大させるように設計された種々に修飾されたヌクレオチドを用いて化学的に合成することができ、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換分子を用いることができる。合成核酸を生じさせるのに用いることができる修飾されたヌクレオチドの例は５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨウドウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトチン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルー２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータＤ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータＤ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを含む。
【００９５】
別法として、合成核酸は、核酸がサブクローンされたベクターを用いて生物学的に生産することができる。
【００９６】
種々の具体例において、本発明の合成核酸分子は、塩基部位、糖部位またはホスフェート骨格において修飾して、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解性を改良することができる。例えば、核酸のデオキシリボースホスフェート骨格を修飾して、ペプチド核酸を生じさせることができる（Ｈｙｒｕｐら、１９９６，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４（１）：５−２３参照）。本明細書中で用いるように、用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」とは、デオキシリボースホスフェート骨格がプソイドペプチド骨格によって置き換えられ、４つの天然ヌクレオベースのみが保持されている核酸ミミック、例えば、ＤＮＡミミックをいう。ＰＮＡの中性骨格は、低イオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションを可能とすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Ｈｙｒｕｐら、１９９６，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４（１）：５−２３；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ‘Ｋｅｅｆｅら、１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１４６７０−６７５に記載されているような標準固相ペプチド合成プロトコルを用いて行うことができる。
【００９７】
例示的な具体例において、選択された新規な合成配列は、商業的遺伝子合成会社によって二本鎖ＤＮＡとして合成より構築することができ、「ファゲミド」、ｐＵＣ１１９のような、ＤＮＡ複製およびファージキャプシド化に必要なシス−作用性配列を含有するＭ１３またはｆ１ファージ遺伝子間（ＩＧ）領域を含有するプラスミドベクターに配向させてクローン化することができる。ファージの複製起点に対するクローン化されたインサートの適当な配向は、各標識付着領域のためのイン・ビトロ転写によって生じたＲＮＡ分子の逆相補体である一本鎖ＤＮＡ骨格の作製を可能とする。
【００９８】
例として、新規なレポーターの一本鎖ＤＮＡ骨格を生じさせるために、ファゲミドを、Ｆ’エピソームを含有するＥ．ｃｏｌｉ株に形質転換する。Ｍ１３突然変異体Ｋ０７のようなヘルパーファージでの形質転換細菌の引き続いての感染の結果、標準的なプロトコルを用いて円状一本鎖ＤＮＡがそれから調製される一本鎖のパッケージされたファージとして新規なレポーター配列を運ぶファゲミドが分泌される。このＤＮＡを線状化し、短い相補性オリゴヌクレオチドを新規なレポーター配列のいずれかの末端にアニールして二本鎖制限部位を生じさせ、続いて、適当な制限酵素で処理することによって、ベクター部分を切り出す。
【００９９】
例として、各標識付着領域についてのＲＮＡ分子（パッチまたは「セグメント」）を作製するために、転写体開始部位の直接的に上流（５’側）のＲＮＡポリメラーゼプロモーター（Ｔ７，Ｔ３，またはＳＰ６）で開始し、３’制限酵素部位に続いて終了して、二本鎖鋳型を生じるようにＰＣＲプライマーを設計する。この鋳型を用い、ＲＮＡ分子のイン・ビトロ転写を、ＲＮＡ中のアミノ−アリル修飾された規則的に反復した塩基（例えば、ＵＴＰ）および修飾されていない他の塩基（例えば、ＡＴＰ、ＣＴＰおよびＧＴＰ）の存在下で行う。これは、各規則的に反復された塩基（例えば、Ｕ）が、ＲＮＡ分子におけるその位置での標識モノマーの共有結合カップリングを可能とするように修飾されたＲＮＡ産物に導く。
【０１００】
光を発する標識モノマーのＲＮＡ分子へのカップリング、および骨格への標識されたＲＮＡ分子のアニーリングを以下に記載するように行う。
【０１０１】
デ・ノボ配列についてのいくつかの設計的考慮を以下の表１にリストする。
【０１０２】
【表１】
2009538132.tif 000006
５．３  パッチ
ナノレポーターコードの全てまたは部分を構成するシグナルを発する標識モノマーを、本明細書中においては、「パッチ」という構造を介するナノレポーター骨格の標識付着領域に付着させる。標識モノマーはパッチに直接的に（例えば、共有結合により、または非共有結合により）付着させることができるか、または（例えば、ハイブリダイゼーションを通じて）パッチに間接的に付着させることができる。
【０１０３】
核酸パッチは、長さが２５ヌクレオチドないし数キロベース（例えば、５ｋｂ）のどこかであり得、好ましくは、長さが５０ヌクレオチドないし２ｋｂである。特別な具体例において、核酸パッチは、長さが、ほぼ２５ないし２５０、５０ないし２００、５０ないし１５０、または５０ないし１００ヌクレオチドである。他の具体例において、核酸パッチは長さがほぼ５００ないし２，０００、５００ないし１，５００、５００ないし１，０００、７５０ないし１，２５０、または７５０ないし１，０００ヌクレオチドである。核酸パッチはＲＮＡパッチまたはＤＮＡパッチであり得る。
【０１０４】
標識モノマーは、パッチがナノレポーター骨格の標識付着領域に付着された前または後にパッチに共有結合により付着させることができる。例えば、パッチが核酸分子である場合、標識は、標識モノマーを含有するヌクレオチドをその合成の間であるが、それが、例えば、ハイブリダイゼーションを介して骨格の標識付着領域に付着された後に、核酸に取込むことによって共有結合により付着させることができる。別法として、核酸パッチの合成の間に、標識モノマーアクセプター基を含有するヌクレオチドを含め、それが骨格の標識付着領域に付着される前または後いずれかに、標識モノマーをその合成後に核酸パッチに付加させる。別法として、標識モノマーは、例えば、標識モノマーのナノレポーターへの付着のための基礎として働く「フラップ」へのパッチのハイブリダイゼーションによってパッチへ間接的に付着させることができる。
【０１０５】
かくして、パッチが核酸である場合、それは、ナノレポーターの組立ての方法に依存して、長さが２０ヌクレオチドないし５ｋｂを超えるまでのどこかの範囲とすることができる。
【０１０６】
例えば、パッチが、標識されたナノレポーターの関係でナノレポーターコードの一部であるシグナルを発する１以上の標識モノマーをそれに共有結合により取込んだ場合、それは長さが好ましくは約５００ないし１５００ヌクレオチドであり、一般には、本明細書中においては、標識モノマーの取込みに先立ってパッチである「セグメント」、「暗色」セグメント（しかしながら、好ましい具体例においては、アミノアリルヌクレオチドのような標識モノマーアクセプター部位を含有する）、および所望の標識モノマーまたは標識モノマー類を含有するものである「着色」セグメントをいう。
【０１０７】
パッチがナノレポーターへのフラップ付着のための鋳型として単に働く場合、それはサイズが好ましくはより小さく、例えば、長さは約２５ないし２５０ヌクレオチドである、最も好ましくは、長さが約５０ないし１００ヌクレオチドである。そのようなパッチは、本明細書中においては、「オリゴヌクレオチドパッチ」という。以下のセクションにおいて詳細に記載するように、オリゴヌクレオチドは、それが骨格にアニールされた場合、負ラップの全部または一部に対して相補的である突出が生じるように、骨格に対して配列が好ましくは部分的に相補的である。
【０１０８】
用語「セグメント」および「オリゴヌクレオチドパッチ」は、本明細書中においては、単に記載の便宜性のために用い；しかしながら、「オリゴヌクレオチドパッチ」から「セグメント」を識別するためのサイズカットオフはない。双方のタイプの構造の目的は、ナノレポーターからの、標識−およびかくしてシグナル強度を最小化し、それにより、ナノレポーターによる単一標的分子検出を可能とする。
【０１０９】
ある態様において、本発明は、核酸（骨格）のストランド、および該ストランドにハイブリダイズした複数のパッチ対を含む、その立体配置が図７Ａを参照することによって示される、合成分子を提供し、ここに、各パッチ対は「Ａ」パッチおよび「Ｂ」パッチを含み、各パッチ対について、（ａ）各「Ａ」パッチは第一の領域（１Ｐ）および第二の領域（２Ｐ）を含むオリゴヌクレオチドであり、第一の領域は（ｉ）「Ａ」パッチのアルファ末端におけるもの、および（ｉｉ）該ストランドの第一の部分にハイブリダイズされており、第二の領域が（ｉｉ）「Ａ」パッチのベータ末端におけるものであり；（ｂ）各「Ｂ」パッチは第三の領域（３Ｐ）および第四の領域（４Ｐ）を含むオリゴヌクレオチドであり、第三の領域は（ｉ）「Ｂ」パッチのアルファ末端におけるものであり、および（ｉｉ）「Ａ」パッチの第二の領域にハイブリダイズされており、第四の領域は（ｉ）「Ｂ」パッチのベータ末端におけるものであり、および（ｉｉ）外ストランドの第二の部分にハイブリダイズされており、該ストランドの第二の部分はストランドの第一の部分のベータ末端に対するものであり、ここに、該第二の領域または該第三の領域は、さらに、各々、そのベータ末端またはアルファ末端において、各々、「Ｂ」パッチまたは「Ａ」パッチにハイブリダイズしないハイブリダイズ可能な領域を含む。
【０１１０】
図７Ａの合成分子において、第二の領域は、さらに、そのベータ末端において、図７Ｂに示すように、「Ｂ」パッチにハイブリダイズしないハイブリダイズ可能な領域を含み、あるいは第三の領域は、さらに、図７Ｃに示すように、そのアルファ末端において、「Ａ」パッチにハイブリダイズしないハイブリダイズ可能な領域を含む。
【０１１１】
本発明は、さらに、核酸（骨格）のストランド、および該ストランドにハイブリダイズされた複数のパッチ対を含む、その立体配置が図７Ｄを参照して示される、合成分子を提供し、ここに、各パッチ対は「Ａ」パッチ「Ｂ」パッチを含み、ここに、各パッチ対については、（ａ）各「Ａ」パッチは第一の領域（１Ｐ）および第二の領域（２Ｐ）を含むオリゴヌクレオチドである、第一の領域は（ｉ）「Ａ」パッチのアルファ末端におけるものであり、および（ｉｉ）ストランドの最初の部分にハイブリダイズされており、第二の領域は（ｉｉ）「Ａ」パッチのベータ末端におけるものであり；（ｂ）各「Ｂ」パッチは第三の領域（３Ｐ）および第四の領域（４Ｐ）を含むオリゴヌクレオチドであり、第三の領域は（ｉ）「Ｂ」パッチのアルファ末端におけるものであり、および（ｉｉ）「Ａ」パッチの第二の領域にハイブリダイズされており、第四の領域は（ｉ）「Ｂ」パッチのベータ末端におけるものであり、および（ｉｉ）該ストランドの第二の部分にハイブリダイズされており、該ストランドの第二の部分はストランドの第一の部分の最初に対するものであり、ここに、第二の領域は、さらに、そのベータ末端において、「Ｂ」パッチに対してハイブリダイズされていない第一のハイブリダイズ可能な領域を含み、および、ここに、第三の領域は、さらに、そのアルファ末端において、「Ａ」パッチにハイブリダイズされない第二のハイブリダイズ可能な領域を含む。
【０１１２】
図７Ｂの合成分子において、各パッチ対は、図７Ｆに示したように、フラップ対に付着することができ、ここに、各フラップ対は「Ａ」フラップおよび「Ｂ」フラップを含み、ここに、各フラップ対については、（ａ）各「Ａ」フラップは第一のフラップ領域（１Ｆ）および第二のフラップ領域（２Ｆ）を含むオリゴヌクレオチドであり；第一のフラップ領域は「Ａ」フラップのアルファ末端におけるものであり；第二のフラップ領域は（ｉ）「Ａ」フラップのベータ末端におけるものであり、および（ｉｉ）「Ａ」パッチ、「Ｂ」パッチまたは「Ｂ」フラップにハイブリダイズされないハイブリダイズ可能な領域をそのベータ末端において含むものであり；および（ｂ）各「Ｂ」フラップは第三のフラップ領域（３Ｆ）、第四のフラップ領域（４Ｆ）、および第五のフラップ領域（５Ｆ）を含むオリゴヌクレオチドであり；該第三のフラップ領域は（ｉ）「Ｂ」フラップのアルファ末端におけるものであり、および（ｉｉ）「Ａ」パッチ、「Ｂ」パッチまたは「Ａ」フラップにハイブリダイズされないハイブリダイズ可能な領域をそのアルファ末端において含み；該第四のフラップ領域は（ｉ）該第三のフラップ領域と第五のフラップ領域の間におけるものであり、および（ｉｉ）「Ａ」フラップの第一のフラップ領域にハイブリダイズされており；該第五のフラップ領域は（ｉ）「Ｂ」フラップのベータ末端におけるものであり、および（ｉｉ）「Ａ」パッチの第二の領域のハイブリダイズ可能な領域にハイブリダイズされている。
【０１１３】
図７Ｃの合成分子において、各パッチ対は、図７Ｅに示すように、フラップ対に付着することができ、ここに、各フラップ対は「Ａ」フラップおよび「Ｂ」フラップを含み、ここに、各フラップ対については、（ａ）各「Ａ」フラップは第一のフラップ領域（１Ｆ）、第二のフラップ領域（２Ｆ）、および第三のフラップ領域（３Ｆ）を含むオリゴヌクレオチドであり；「Ａ」フラップ領域は（ｉ）「Ａ」フラップのアルファ末端におけるものであり、および（ｉｉ）「Ｂ」パッチの第三の領域のハイブリダイズ可能な領域にハイブリダイズされており；該第二のフラップ領域は第一のフラップ領域と第三のフラップ領域の間にあり；該第三のフラップ領域は（ｉ）「Ａ」フラップのベータ末端におけるものであり、および（ｉｉ）「Ａ」パッチ、「Ｂ」パッチまたは「Ｂ」フラップにハイブリダイズされていないハイブリダイズ可能な領域をそのベータ末端において含み、（ｂ）各「Ｂ」フラップは第四のフラップ領域（４Ｆ）および第五のフラップ領域（５Ｆ）を含むオリゴヌクレオチドであり；第四のフラップ領域は（ｉ）「Ｂ」フラップのアルファ末端におけるものであり、および（ｉｉ）「Ａ」パッチ、「Ｂ」パッチまたは「Ａ」フラップにハイブリダイズされていないハイブリダイズ可能な領域をそのアルファ末端に含み；第五のフラップ領域は（ｉ）「Ｂ」フラップのベータ末端におけるものであり、および（ｉｉ）「Ａ」フラップの第二のフラップ領域にハイブリダイズされている。
【０１１４】
図７Ｄおよび７Ｅの合成分子において、スプリットフラップは、図７Ｇに示すように、１つ（例えば、（１Ｏ））、またはそれを超える（例えば、（２Ｏ）および（３Ｏ））オリゴヌクレオチドに付着させることができる。かくして、１以上のオリゴヌクレオチドは、個々に、「Ａ」フラップ（例えば、（１Ｏ））、個々に、「Ｂ」フラップ（例えば、（３Ｏ））の全てまたは部分に付着させることができ、あるいは「Ａ」フラップおよび「Ｂ」フラップの各々の全てまたは部分にわたることができる（例えば、（２Ｏ））。そのようなオリゴヌクレオチドは、好ましくは、１以上の標識モノマーに共有結合する。
【０１１５】
合成分子のハイブリダイズ可能な領域は、各々が、少なくとも１つの標識モノマーに、より好ましくは、少なくとも５つの標識モノマーに結合した、好ましくは共有結合した複数のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされうる。ある具体例において、単一パッチ対に付着した全てのオリゴヌクレオチドは同一の標識モノマーを含み、例えば、同一波長における光を発する標識モノマーを含み；特別な具体例において、少なくとも２つの、少なくとも４つの隣接するパッチ対に付着した全てのオリゴヌクレオチドは、好ましくは、同一標識モノマーを含む。オリゴヌクレオチドの１以上は少なくとも１つのアフィニィティータグに結合することができる。
【０１１６】
ある好ましい具体例において、標識モノマーはフルオロフォアまたは量子ドットである。
【０１１７】
前記した合成分子において、アルファは５’または３’いずれかをいうことができ、および対応するベータは、各々、３’または５’いずれかをいうことができる。
【０１１８】
各パッチ対における、または与えられたパッチと対応するフラップの間の相補的な領域は、好ましくは、２０ないし５，０００ヌクレオチドである。ある具体例において、相補性の領域は２０ないし１００ヌクレオチド、または５ないし５０ヌクレオチドである。
【０１１９】
前記した合成分子において、各フラップは、好ましくは、長さが５０ないし５，０００ヌクレオチドである。ある具体例において、各フラップは５０ないし１５０ヌクレオチドである。
【０１２０】
前記した合成分子は、さらに、標的分子に結合する標的−特異的領域をさらに含むことができる。標的−特異的領域は、ストランドのベータまたはアルファ末端に付着することができる。
【０１２１】
ある具体例において、前記した合成分子は少なくとも１０のパッチ対、または少なくとも５０パッチ対を含む。
【０１２２】
前記した合成分子において、ストランドまたは骨格は線状化Ｍ１３のような線状化ベクターであり得る。
【０１２３】
前記した合成分子は、さらに、（ａ）第一のシグナルを構成する光を発する１以上の標識モノマーが（直接的にまたは間接的に）付着した第一の標識付着領域；（ｂ）第二のシグナルを構成する光を発する１以上の標識モノマーが付着した第一の標識付着領域に重複していない第二の標識付着領域；（ｃ）第三のシグナルを構成する光を発する１以上の標識モノマーが付着した、第一および第二の標識付着領域に重複していない第三の標識付着領域を含み；ここに、各付着領域は複数のパッチ対を含み；ここに、第一および第二のシグナルはスペクトル的に識別でき；ここに、第二および第三のシグナルはスペクトル的に識別でき；ここに、第一および第二のシグナルな、第一、第二および第三のシグナルを検出するのに用いることができる条件下で空間的に解像可能でなく；ここに、第二および第三のシグナルは、第一、第二および第三のシグナルを検出するのに用いることができる条件下で空間的に解像可能でなく；ここに、第一および第三のシグナルは、第一、第二および第三のシグナルを検出するのに用いることができる条件下で空間的に解像可能であり、；およびここに、第一、第二および第三のシグナルの同一性、および相互に対する第一および第三のシグナルの位置は、標的分子を同定するコードの少なくとも一部を構成する。
【０１２４】
５．４  標識モノマー
本発明のナノレポーターは、放射性同位体、フルオロクローム、染料、酵素、ナノ粒子、ケミルミネセントマーカー、ビオチン、あるいは（例えば、光発光によって）直接的に、または（例えば、蛍光−標識抗体の結合によって）間接的に検出することができる当該分野で知られた他のモノマーのような種々の標識モノマーのいずれかで標識することができる。一般に、ナノレポーターにおける標識付着領域の１以上を１以上の標識モノマーで標識し、ナノレポーターの標識付着領域に付着した標識モノマーによって発せられたシグナルは、ナノレポーターの標的−特異的領域が結合する標的を同定するコードを構成する。ある具体例において、標識付着領域（すなわち、「暗所」スポット）からの与えられたシグナルの欠如もまた、ナノレポーターコードの部分を構成することもできる。暗所スポットの例は、図１Ａにおけるナノレポーターの位置１２において描かれえる。
【０１２５】
放射性同位体は、本発明によって利用することができる標識モノマーの例である。いくつかの放射性同位体は、例えば、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、３Ｈおよび１２５Ｉを含めた標識ヌクレオチドまたは蛋白質についての標識モノマーとして用いることができる。これらの放射性同位体は、特定の実験の必要性にマッチするように仕立てることができる異なる半減期、崩壊のタイプ、およびエネルギーのレベルを有する。例えば、３Ｈは低いバックグラウンドレベルをもたらす低いエネルギーエミッターであるが、この低いエネルギーもまた、オートラジオグラフィーのための長い時間をもたらす。放射性標識リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドおよびアミノ酸は商業的に入手可能である。第一のまたはαのホスフェート基、または第三のまたはγのホスフェート基において放射性標識されたヌクレオチドが入手可能である。例えば、［α−３２Ｐ］ｄＡＴＰおよび［γ−３２Ｐ］ｄＡＴＰの双方が商業的に入手可能である。加えて、放射性標識分子についての異なる特異的活性もまた商業的に入手可能であり、異なる実験のために仕立てることができる。
【０１２６】
本発明によって利用することができる標識モノマーのもう１つの例はフルオロファである。いくつかのフルオロファは、例えば、フルオレセイン、テトラメチルローダミン、およびテキサスレッドを含めた標識ヌクレオチドについての標識モノマーとして用いることができる。いくつかの異なるフルオロファが知られており、生産されるようにより継続され、全スペクトルにわたる。また、同一フルオロファの処方は異なる適用で生産されてきた。例えば、フルオレセインは、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＦＡＭ）の混合同位体または単一同位体形態として、またはフルオレセインの異性体ジクロロトリアジン形態（ＤＴＡＦ）として、そのイソチアシアネート形態（ＦＩＴＣ）において用いることができる。これらのモノマーは化学的に区別されるが、５１５ないし５２０ｎｍの間のピークにて全てが光を発し、それにより、同様なシグナルを生じる。フルオレセインの化学的修飾に加えて、完全に異なるフルオロファが合成されており、これはフルオレセインと同一または非常に同様な発光ピークを有する。例えば、オレゴングリーン染料が、フルオレセインと比較して、実質的に重ね合わせることができる励起および発光スペクトルを有する。ロードルグリーンおよびローダミングリーンのような他のフルオロファは、それらの発光ピークにおいてわずかにシフトするに過ぎず、従って、また、フルオレセインに対する代替物として機能的に働く。加えて、異なる処方または関連染料は、スペクトルの他の部分において光を発する他のフルオロフォアの周りで開発されてきた。
【０１２７】
また、非−放射性および非−蛍光標識モノマーも入手可能である。例えば、ビオチンはヌクレオチドに直接的に付着することができ、（ホスファターゼ、ルシフェラーゼまたはペルオキシダーゼのような）比色反応を触媒する酵素に化学的にカップリングされているアビジンまたはストレプトアビジンに対する特異的かつ高い親和性によって検出される。ジゴキシゲニン標識ヌクレオチドもまた、核酸の非−同位体検出のために同様に用いることもできる。ビオチニル化およびジゴキシゲニン−標識ヌクレオチドは商業的に入手可能である。
【０１２８】
ナノ粒子と呼ばれる非常に小さな粒子もまた標識モノマーとして用いて、核酸を標識することができる。これらの粒子はサイズが１ないし１０００ｎｍの範囲であって、金および銀粒子、および量子ドットのような多様な化学的構造を含む。
【０１２９】
角度をつけた入射白色光で照射した場合、４０ないし１２０ｎｍの範囲の銀または金ナノ粒子は高い感度にて単色光を散乱するであろう。散乱した光の波長は、粒子のサイズに依存する。非常に近接した４ないし５の異なる粒子は、各々、重ね合わせた場合に、特異的なユニークな色を与える単色光を散乱するであろう。粒子は、Ｇｅｎｉｃｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓのような会社によって製造されつつある。誘導体化された銀または金粒子は、蛋白質、抗体、小分子、受容体リガンドおよび核酸を含めた分子の広いアレイに付着させることができる。例えば、粒子の表面を化学的に誘導体化して、ヌクレオチドへの付着を可能とすることができる。
【０１３０】
標識モノマーとして用いることができるもう１つのタイプのナノ粒子は量子ドットである。量子ドットは、大きな範囲の波長の光によって励起可能である直径が１ないし５ｎｍの蛍光結晶である。これらの結晶は、その化学的およびサイズに依存した波長にて、単色光のような光を発する。ＣｄＳｅ、ＺｎＳｅ、ＩｎＰ、またはＩｎＡｓのような量子ドットはユニークな光学特性を保有する。
【０１３１】
粒子の多種のクラスは、多数のサイズクラスの量子ドット結晶に従って作り出すことができる。結晶のサイズクラスは、１）各所望のサイズのクラスの粒子を作り出すための結晶形成パラメーターの密接な制御によって、または２）ゆるく制御された結晶形成パラメーター下での結晶のバッチの作製、およびそれに続いての、所望のサイズおよび／または発光波長に従っての分類によって作製される。本発明との関係での、粒子を標識するための量子ドットの使用は新しいが、半導体の分野においては古い。量子ドットが、半導体発光／検出デバイスの真性シリコンエピタキシャル層内に埋め込まれた以前の文献の２つの例を、ここに引用してその全体を援用する（Ｃｈａｐｐｌｅ  Ｓｏｋｏｌらに対する米国特許第５，２９３，０５０号および第５，３５４，７０７号）。
【０１３２】
特別な具体例において、ナノレポーターにおける１以上の標識付着領域は、１以上の発光染料で標識され、各標識付着領域が、直接的にまたは間接的に、１以上の標識モノマーを含有する。染料によって発せられた光は目に見える光、または紫外または赤外光のような、目に見えない光であり得る。例示的な具体例において、染料は蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）染料；フルオレセインおよびローダミンのようなキサンテン染料；（ナフチルアミン染料、１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホネート、１−アニリノ−８−ナフタレンデスルホネートおよび２−ｐ−トロイジニル−６−ナフタレンスルホネートのような）アルファまたはベータ位置にアミノ基を有する染料；３−フェニル−７−イソシアナトクマリンを有する染料；９−イソチオシアナトアクリジンおよびアクリジンオレンジのようなアクリジン；ピレン、ベンゾオキサジアゾールおよびスチルベン；３−（ε−カルボキシペンチル）−３’−エチル−５，５’−ジメチルオキサカルボシアニン（ＣＹＡ）；６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）；５＆６−カルボキシローダミン−１１０（Ｒ１１０）；６−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）；６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）；ＡＬＥＸＡ  Ｆｌｕｏｒ（商標）；Ｃｙ２；テキサスレッドおよびローダミンレッド；６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）；６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）；５−カルボキシ−２’，４’，５’，７’−テトラクロロフルオレセイン（ＺＯＥ）；ＮＡＮ；ＮＥＤ；Ｃｙ３；Ｃｙ３．５；Ｃｙ５；Ｃｙ５．５；Ｃｙ７；およびＣｙ７．５；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４；またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７である。
【０１３３】
標識モノマーはその組み立ての異なる段階においてナノレポーターに、または成分（例えば、そのナノレポーターへの組み立てに先立ってナノレポーターの（「フラップ」）へ取込むことができる。
【０１３４】
標識モノマーは、当該分野で良く知られた方法を用いてヌクレオチドに直接的に結合させることができる。ヌクレオチドは化学的に修飾し、または誘導体化して、標識モノマーに付着させることもできる。例えば、フルオレセイン分子のような蛍光モノマーは、４−原子アミノアルキニル基を用いてｄＵＴＰ（デオキシウリジン−三リン酸）に付着させることができる。各標識モノマーは、標識モノマーを作製するヌクレオチド；ヌクレオチド複合体に付着させる。
【０１３５】
この標識モノマー：ヌクレオチド複合体は、種々の方法により、核酸（例えば、ＤＮＡパッチまたは検出オリゴヌクレオチド）に取込むことができる。例えば、標識モノマー：ヌクレオチド複合体は、核酸内のただ１つの位置に、または核酸内の２以上の位置に取込むことができる。
【０１３６】
アミン−反応性およびチオール−反応性フルオロフォアは入手可能であって、ヌクレオチドおよび生体分子を標識するのに用いられる。一般に、ヌクレオチドは化学合成の間に蛍光標識され、例えば、ヌクレオチド合成の間にアミンまたはチオールの取り込みはフルオロフォアの付加を可能とする。蛍光標識されたヌクレオチドは商業的に入手可能である。例えば、ウリジンおよびデオキシウリジン三リン酸は入手可能であり、これはスペクトルを網羅する１０の異なるフルオロフォアにコンジュゲートされる。
【０１３７】
ヌクレオチドはまず標識モノマーに付着させ、次いで、核酸に取込むことができる。別法として、現存する核酸は、標識モノマーを核酸内のヌクレオチドに付着させることによって標識することができる。例えば、アミノアリル−（「ＡＡ−」）修飾ＵＴＰヌクレオチドは、転写の間にＲＮＡ産物に取込むことができる。種々の具体例において、ＲＮＡパッチを作り出すための転写反応におけるＵＴＰヌクレオチドの２０％以上はＡＡ修飾されている。種々の具体例において、転写反応におけるＵＴＰの約２０％ないし１００％、２０％ないし８０％、３０ないし８０％、４０ないし６０％または５０％ないし７５％はＡＡ−修飾されており、好ましい具体例においては、転写反応におけるＵＴＰのほぼ５０％はＡＡ−修飾されている。
【０１３８】
加えて、例えば、異なるタイプの標識モノマー：ヌクレオチド複合体は単一酸の核酸に取込むことができ、ここに、ナノレポーターコードの１つの成分は１を超えるタイプのシグナルを含む。
【０１３９】
ヌクレオチドに直接的に結合させることができる蛍光染料もまた標識モノマーとして利用することもできる。例えば、ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、およびＲＯＸは、ヌクレオチドに付着されているアミン反応性蛍光色素であって、自動ＤＮＡ配列決定で用いられる。これらの蛍光標識ヌクレオチド、例えば、ＲＯＸ−ｄｄＡＴＰ、ＲＯＸ−ｄｄＣＴＰ、ＲＯＸ−ｄｄＧＴＰおよびＲＯＸ−ｄｄＵＴＰは商業的に入手可能である。
【０１４０】
ナノレポーターを標識するのに用いることができる他のタイプの標識モノマーは量子ドットである。その非常に小さなサイズのため、量子ドットは、オリゴヌクレオチドの溶解性または使用に影響することなく直接的にオリゴヌクレオチドにカップリングさせることができる。好ましい具体例において、ただ１つのオリゴヌクレオチド分子が各ナノ粒子にカップリングされる。慣用的なバッチ化学によってオリゴヌクレオチド−ナノ粒子複合体を１：１比率で合成するためには、オリゴヌクレオチドおよびナノ粒子の双方は、相互と反応することができる異なる種類の単一反応性基を必要とする。例えば、もしオリゴヌクレオチドがアミノ基を有し、かつナノ粒子がアルデヒド基を有するならば、これらの基はシッフ塩基を形成することができる。オリゴヌクレオチドは、当該分野で良く知られた化学を用いて、単一アミノまたは他の官能基を付着させるように誘導体化することができる。しかしながら、ナノ粒子を誘導体化する場合、それは化学試薬で被覆し、その結果、いくつかの官能基でのナノ粒子の全表面のコーティングがもたらされる。
【０１４１】
本発明は、オリゴヌクレオチド合成で用いられるガラス支持体のような固体表面にオリゴヌクレオチドを化学的にカップリングさせることによって１つのオリゴヌクレオチドを１つのナノ粒子にカップリングさせる方法を提供する。
【０１４２】
例えば、長鎖アルキルアミノ細孔性ガラス（ｌｃａａ  ＣＰＧ）のようなオリゴヌクレオチド合成用の商業的に入手可能な樹脂を用いることができる。
【０１４３】
別法として、誘導体化された顕微鏡スライドのような平坦な表面を用いることができる。新生オリゴヌクレオチド鎖の表面密度は、ナノ粒子の直径よりも低くすべきである。これは、反応基の低表面密度を持つガラス支持体を選択することによって、あるいは表面が飽和しないように、オリゴヌクレオチド合成の最初の工程のために希釈された試薬を用いることによって達成することができる。オリゴヌクレオチド合成のために標準的なガラスマトリックスを用いる場合に考慮すべきもう１つの点は、ナノ粒子の直径よりも高いポア直径を用いて、試薬の流動を確実とすることである。例えば、オリゴヌクレオチドは固体支持体に対して希釈されたベースで、例えば、通常の合成の１／１０のベースで合成して、ガラス支持体上でのオリゴヌクレオチドの良好な間隔を確実とすることができる。オリゴヌクレオチドを反応性官能基、例えば、アミノ基で合成した後、誘導体化されたナノ粒子をガラス支持体上に通して、オリゴヌクレオチドと反応させる。ガラス支持体の十分に大きなポアサイズは、ナノ粒子での目詰まりを防ぐために選択することができる。例えば、約２００ｎｍのポアサイズを用いることができる。反応が完了した後、ナノ粒子上の未反応基をブロックし、複合体をガラス支持体から外すことができる。
【０１４４】
５．５  ナノレポーターコード
５．５．１  デュアルナノレポーター
その成分が２つの分子体に存在するナノレポーターをデュアルナノレポーターという。デュアルナノレポーターにおいては、一般に、各成分は、その標的へのナノレポーターの結合キネティックスおよび特異性を改良する標的−特異的配列を含有する。２つの異なる標的特異的配列は、各々が標的分子の異なる部分を認識するように設計され、または選択される。
【０１４５】
図１Ａないし１Ｃは、デュアルナノレポーターに関連する本発明の具体例を示す。図１Ａおよび１Ｂは、ナノレポーターの２つの成分の各々が、ナノレポーターのスペクトルコードが、ナノレポーターの２つの成分がその標的分子へのデュアルナノレポーターの結合に際して一緒となる場合にのみ形成されるように標識される。しかしながら、デュアルナノレポーターにおいては、双方の成分が標識されている必要はない。例えば、図１Ｃに示したように、デュアルナノレポーターの１つの成分はナノレポーターコード、およびストレッチングおよび可視化のためにナノレポーターを固定化するのに有用なアフィニティータグ（矢印）に付着した他の成分で標識される。
【０１４６】
５．５．２  レジスター
用語「レジスター」とは、交互（あらゆる他の）標識付着領域の組をいう。スペーサー領域なくして隣接標識付着領域を標識するのが望ましい場合、および隣接標識付着領域から出てくるシグナルが、検出の望まれる方法を用いて空間的に解像できない場合にレジスターは有用である。かくして、レジスターの使用で検出されるシグナルは、隣接するよりはむしろ交互の標識付着領域によって形成されるものである。（例えば、一緒になって全ての標識付着領域である）複数のレジスターから検出されたシグナルを組合せて、ナノレジスターコードを形成することができる。一般に、レジスターを用いる場合、隣接標識付着領域を、スペクトル的に識別することができる標識モノマーで標識する。
【０１４７】
レジスターの例は図３および５に示す。例えば、図３Ａないし３Ｂにおいては、８つの標識付着領域１ないし８がある。交互標識付着領域１、３、５および７は１つのレジスターを形成し、標識付着領域２、４、６および８はもう１つのレジスターを形成する。図３Ａにおいては、レジスター（１、３、５および７）のうちの唯１つが標識され；図３Ｂにおいては、双方のレジスターが標識される。
【０１４８】
５．６  アフィニティータグ
当該分野で公知の種々のアフィニティータグを用いて、ナノレポーターを精製し、および／または固定化することができる。アフィニティータグを用いて検出またイメージングを目的としてナノレポーターを固定化する場合、それは本明細書中においては「アンカー」ということができる。好ましい具体例において、ビオチンアンカーをナノレポーターに付着させ、ストレプトアビジン被覆スライド上へのナノレポーターの固定化を可能とする。
【０１４９】
適当なアフィニティータブの非限定的例を以下に掲げる。ほとんどのアフィニティータグは２つの目的のために供され、すなわち：ナノレポーターの固定化のためのアンカーとして、および（十分にまたは部分的にのみ組立てられたかを問わず）ナノレポーター、またはそれらの成分の精製のためのタグとして働くことができると理解されるべきである。
【０１５０】
ある具体例において、アフィニティータグは蛋白質モノマーである。蛋白質モノマーの例は、限定されるものではないが、免疫グロブリン定常領域（Ｐｅｔｔｙ，１９９６，Ｍｅｔａｌ−ｃｈｅｌａｔｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，Ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ａｓｓｏｃ．＆  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ参照）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ；Ｓｍｉｔｈ，１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．４：２２０−２２９）、Ｅ．ｃｏｌｉマルトース結合蛋白質（Ｇｕａｎら、１９８７，Ｇｅｎｅ  ６７：２１−３０）、および種々のセルロース結合ドメイン（米国特許第５，４９６，９３４号；５，２０２，２４７号；５，１３７，８１９号；Ｔｏｍｍｅら、１９９４，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．７：１１７−１２３）を含む。他のアフィニティータグは特異的結合パートナーによって認識され、かくして、固体支持体に固定化することができる、結合パートナーへのアフィニティー結合によって単離および固定化を容易とする。例えば、アフィニティータグはエピトープであり得、および結合パートナーは抗体で有り得る。そのようなエピトープの例は、限定されるものではないが、ＦＬＡＧエピトープ、アミノ酸４０８ないし４３９におけるＭＹＣエピトープ、インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープ、またはジゴキシゲニン（「ＤＩＧ」）を含む。他の具体例において、アフィニティータグは、もう１つの蛋白質またはアミノ酸、例えば、アビジン／ストレプトアビジンおよびビオチンによって認識される蛋白質またはアミノ酸配列である。
【０１５１】
ある具体例において、アフィニティータグを、ナノレポーターの精製または固定化に加えて、ナノレポーターを標識するのに用いることができる。当業者によって認識されるように、ＤＮＡクローニング、ＤＮＡ増幅、および合成方法を含めた、多くの方法を用いて、アフィニティータグのコーディング領域を得ることができる。それらの検出および単離のためのアフィニティータグおよび試薬のいくつかは商業的に入手可能である。
【０１５２】
５．７  標的−特異的配列
用語「標的−特異的配列」とは、標的分子を結合させることができる分子体をいう。ナノレポーターとの関係では、標的−特異的配列をナノレポーター骨格に付着させる。標的特異的配列は、一般には、アミノ酸配列（すなわち、ポリペプチドまたはペプチド配列）または核酸配列である。特別な具体例においては、標的−特異的配列がアミノ酸配列である場合、標的−特異的配列は、抗体Ｆａｂ’断片、単一鎖Ｆｖ抗体のような抗体断片である。
【０１５３】
標的−特異的配列は好ましくは核酸配列であって、最も好ましくは、（例えば、連結によって）ナノレポーター骨格に共有結合により付着されており、または（例えば、ハイブリダイゼーションによって）非共有結合により付着されているオリゴヌクレオチド内にある。標的−特異的核酸配列は好ましくは長さが少なくとも１５ヌクレオチドであり、最も好ましくは長さが少なくとも２０ヌクレオチドである。特別な具体例において、標的−特異的配列が長さがほぼ１０ないし５００、２０ないし４００、３０ないし３００、４０ないし２００、または５０ないし１００ヌクレオチドである。他の具体例において、標的−特異的配列は、長さがほぼ３０ないし７０、４０ないし８０、５０ないし９０、または６０ないし１００、３０ないし１２０、４０ないし１４０、または５０ないし１５０ヌクレオチドである。
【０１５４】
５．８  標的分子
用語「標的分子」とは、その標的−特異的配列が認識する（それに対する特異的結合パートナーである）標識されたナノレポーターの結合によって検出されまたは測定される分子をいう。標的分子は、限定されるものではないが、以下の：ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチド／蛋白質（例えば、細菌またはウイルス蛋白質または抗体）、脂質、炭水化物、糖蛋白質、糖脂質、小分子、有機モノマー、または薬物のいずれかであり得る。一般には、標的分子は天然に生じる分子、または天然に生じる分子のｃＤＮＡ、または該ｃＤＮＡの相補体である。
【０１５５】
標的分子は、他の成分を含有する生体分子試料の一部であり得るか、あるいは試料の唯一の、または主な成分であり得る。標的分子は全細胞または組織の成分、細胞または組織抽出物、その分画された溶解物、または実質的に精製された分子であり得る。標的分子は、例えば、チップ、マイクロアレイまたはビーズのような固体表面に対して、溶液または固相を含めた状態にて付着させることができる。また、標的分子は公知のまたは未知の構造または配列いずれかであり得る。
【０１５６】
ある特別な具体例において、標的分子は染色体ではない。他の特別な具体例において、標的分子はサイズが１，０００ｋｂ（または１ｍｂ）以下、サイズが５００ｋｂ以下、サイズが２５０ｋｂ以下、サイズが１７５ｋｂ以下、サイズが１００ｋｂ以下、サイズが５０ｋｂ以下、サイズが２０ｋｂ以下、またはサイズか１０ｋｂ以下である。なお他の特別な具体例において、標的分子はその細胞環境から単離される。
【０１５７】
特別な非限定的具体例において、標的分子はアルファフェトプロテイン、アルファ−１抗トリプシン、α−２マクログロブリン、アジポネクチン、アポリプロテイン−Ａ−１、アポリプロテイン−ＣＩＩＩ、アポリプロテイン−Ｈ、ＢＤＮＦ、β−２ミクログロブリン、Ｃ反応性蛋白質、カルシトニン、癌抗原１９−９、癌抗原１２５、ＣＥＡ、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、補体３、ＣＫ−ＭＢ、ＥＧＦ、ＥＮＡ−７８、エンドセリン−１、エンラージ、エオタキシン、エリスロポエチン、第ＶＩＩ因子、ＦＡＢＰ、フェリチン、ＦＧＦ−塩基性、フィブロノーゲン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＳＴ、ＧＭ−ＣＳＦ、成長ホルモン、ハプトグロビン、ＩＣＡＭ−１、ＩＦＮ−ガンマ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩＧＦ−１、ＩｇＭ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、インスリン、レプチン、リポ蛋白質（ａ）、リンフォタクチン、ＭＣＰ−１、ＭＤＣ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−９、ミエロペルオキシダーゼ、ミオグロビン、ＰＡＩ−１、ＰＡＰ、ＰＡＰＰ−Ａ、ＳＧＯＴ、ＳＨＢＧ、ＰＳＡ（遊離）、ＲＡＮＴＥＳ、血清アミロイドＰ、幹細胞因子、ＴＢＧ、トロンボポエチン、ＴＩＭＰ−１、組織因子、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＴＮＦ  ＲＩＩ、ＴＳＨ、ＶＣＡＭ−１、ＶＥＧＦ、またはｖＷＦのような抗原である。
【０１５８】
ある具体例において、標的分子はＡＳＣＡ、β−２糖蛋白質、Ｃ１ｑ、動原体Ｐｒｏｔ．Ｂ、コラーゲン１型、コラーゲン２型、コラーゲン４型、コラーゲン６型、Ｃｙｔｏ  Ｐ４５０、ｄｓＤＮＡ、ヒストン、ヒストンＨ１、ヒストンＨ２Ａ、ヒストンＨ２Ｂ、ヒストンＨ３、ヒストンＨ４、ＨＳＣ−７０、ＨＳＰ−３２、ＨＳＰ−６５、ＨＳＰ−７１、ＨＳＰ−９０α、ＨＳＰ−９０β、インスリン、ＪＯ−１、ミトコンドリア、ミエロペルオキシダーゼ、膵臓島細胞、ＰＣＮＡ、ＰＭ−１、ＰＲ３、リボソームＰ、ＲＮＰ−Ａ、ＲＮＰ−Ｃ、ＲＮＰ、Ｓｅｌ−７０、Ｓｍｉｔｈ、ＳＳＡ、ＳＳＢ、Ｔ３、Ｔ４、チログロブリン、ｔＴＧ、（セリアック病）、または甲状腺ミクロソームのような自己免疫関連分子である。
【０１５９】
いつくかの具体例において、標的分子はコレラトキシン、コレラトキシンβ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、サイトメガロウイルス、ジフテリアトキシン、エプスタイン−バールＮＡ、エプスタイン−バールＥＡ、エプスタイン−バールＶＣＡ、Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、ＨＢＶコア、ＨＢＶエンベローブ、ＨＢＶ表面（Ａｄ）、ＨＢＶ表面（Ａｙ）、ＨＣＶコア、ＨＣＶ  ＮＳ３、ＨＣＶ  ＮＳ４、ＨＣＶ  ＮＳ５、Ａ型肝炎、Ｄ型肝炎、ＨＥＶ  ｏｒｆ２  ３ＫＤ、ＨＥＶ  ｏｒｆ２  ６ＫＤ、ＨＥＶ  ｏｒｆ３ＫＤ、ＨＩＶ−１  ｐ２４、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０、ＨＰＶ、ＨＳＶ−１／２、ＨＳＶ−１  ｇＤ、ＨＳＶ−２  ｇＤ、ＨＴＬＶ−１／２、インフルエンザＡ、インフルエンザＡ  Ｈ３Ｎ２、インフルエンザＢ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｒａｎｉ、ライム病、おたふく風邪、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、パラインフルエンザ１、パラインフルエンザ２、パラインフルエンザ３、ポリオウイルス、ＲＳＶ、風疹、麻疹、ストレプトリシンＯ、破傷風トキシン、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ  １５ｋＤ、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ  ｐ４７、Ｔ．ｃｒｕｚｉ，トキソプラズマ、Ｖａｒｉｃｅｌｌａ  ｚｏｓｔｅｒのような感染症から単離された成分である。
【０１６０】
５．９  ナノレポーター集団
本発明は、ナノレポーターまたはナノレポーター標識ユニット集団、例えば、各々、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも７５０、または少なくとも１，０００のユニークなナノレポーターまたはナノレポーター標識ユニットを含有するナノレポーターまたはナノレポーター標識ユニットライブラリーを提供する。本明細書中で用いるように、「ユニークな」は、集団内のナノレポーターまたはナノレポーター標識ユニットに言及して用いる場合、ナノレポーターまたは他のナノレポーターからそれを識別するコードを有する標識ユニット、または同一集団における標識ユニットを意味することを意図する。
【０１６１】
特別な具体例において、本発明は、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも２，０００または少なくとも５０，０００のユニークなナノレポーターまたはナノレポーター標識ユニットを持つナノレポーター集団を提供する。ナノレポーターの集団におけるナノレポーターはシンギュラーナノレポーター、デュアルナノレポーター、またはその組合せであり得る。ナノレポーターは標識され、または未標識であり得る。
【０１６２】
ナノレポーター集団のサイズ、およびその内のナノレポーターの標的−特異的配列の性質はナノレポーターの意図した使用に依存するであろう。標的−特異的配列が病気となった細胞型を含めた与えられた細胞型のマーカーに対応するナノレポーター集団を作成することができる。ある具体例において、標的−特異的配列が細胞における転写体の異なるタイプの少なくとも０．１％、少なくとも０．２５％、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％を表すナノレポーター集団が作成される。ある具体例において、標的−特異的配列が細胞における異なる遺伝子の少なくとも０．１％、少なくとも０．２５％、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％を表すナノレポーター集団が作成される。なお他の具体例において、標的−特異的配列の少なくともいくつかが細胞または組織における稀な転写体を表すナノレポーター集団が作成される。そのようなナノレポーター集団は好ましくは少なくとも５つの稀な転写体を表す。特別な具体例において、そのようなナノレポーター集団は少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０または少なくとも５０の稀な転写体を表す。特別な具体例において、細胞または組織は哺乳動物細胞組織であって、より好ましくはヒト細胞または組織である。
【０１６３】
ある具体例において、ナノレポーター集団は診断または予後ナノレポーター集団である。例えば、診断ナノレポーター集団が作成され、これは血液産物をスクリーニングするのに有用であり、ここに、標的−特異的配列は、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、およびヒト免疫不全ウイルスのようなヒト汚染ウイルスの核酸に結合する。別法として、診断ナノレポーター集団は、腫瘍抗原のような細胞病気マーカーに対応する標的−特異的配列を含有することができる。予後ナノレポーター集団は、一般には、癌のような与えられた病気の異なる段階を表す標的−特異的マーカーを含む。適当な標的−特異的配列を選択することによって、ナノレポーター集団を用いて、共に、病気を診断し、および予防することができる。
【０１６４】
５．１０  生体分子試料
本発明のナノレポーター系を用いて、多くの生態分子試料中の標的分子を検出することができる。当業者によって認識されるように、試料は、限定されるものではないが、実質的にいずれもの生物の（初代細胞および培養した細胞系双方を含めた）細胞、（限定されるものではないが、血液、尿、血清、リンパ球、胆汁、脳脊髄液、間質液、水性または硝子体液、初乳、痰、羊水、唾液、肛門および膣分泌物、汗および精液を含めた）組織および体液、漏出液、浸出液（例えば、膿瘍、または感染または炎症のいずれかの他の部位から得られた流体）、または関節（例えば、正常な関節、または慢性関節リウマチ、変形性関節炎、痛風または敗血症関節炎のような病気によって冒された関節）から得られた流体、哺乳動物試料は好ましく、ヒト試料は特に好ましい；（限定されるものではないが、空気、農業、水および土壌試料を含めた）環境試料；生物学的兵器剤試料；細胞外流体、細胞培養からの細胞外上清、細菌、細胞区画、細胞ペリプラズム、ミトコンドリア区画などにおける封入体を含めたいずれかの数のものを含むことができる。
【０１６５】
生物分子的試料は生物学的検体から間接的に由来することができる。例えば、注目する標的分子が細胞転写体、例えば、メッセンジャーＲＮＡである場合、本発明の生体分子試料は、メッセンジャーＲＮＡの逆転写によって生じたｃＤＮＡを含有する試料であり得る。もう１つの試料において、本発明の生体分子試料は生物学的検体を分画、例えば、サイズ分画または膜分画に付すことによって作製される。
【０１６６】
本発明の生体分子試料は「天然」、すなわち、操作または処理のされていない、または「処理された」のいずれであってもよく、「処理された」は、薬物、遺伝子エンジニアリング（例えば、遺伝子の付加または欠失）などを含めた候補剤への暴露を含めたいずれかの数の処理を含むことができる。
【０１６７】
５．１１  標識モノマーの分離
標識されたナノレポーターから作成された全シグナルを検出するのに加えて、本発明は、ナノレポーター上の標識モノマー（すなわち、スポット）から取り出されたシグナルの空間的位置の決定を提供し、各スポットは与えられた標識付着領域に付着した標識モノマーからの凝集シグナルを表す。スポットは同一波長の、または異なる波長のシグナルを含有することができる。かくして、ナノレポーター上のスポットの性質およびそれらの位置はナノレポーターコードを構成する。
【０１６８】
種々の手段のいずれかを用いて、ナノレポーターを「伸ばして」、個々のスポットを分離することができる。例えば、フローストレッチ技術（Ｈｅｎｅｇａｒｉｕら、２００１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３１：２４６−２５０）、後退メニスカス技術（Ｙｏｋｏｔａら、１９９７，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：１０６４−１０７０）、または電気ストレッチング技術（Ｍａｔｓｕｕｒａら、２００１，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：Ｅ７９）を用いてナノレポーターを伸ばすことができる。
【０１６９】
フロー−ストレッチング、後退メニスカス、または電気−ストレッチング技術の使用は、空間的に、特定のシグナルがナノレポーターにおいてどこに位置するかを決定することができるように、ナノレポーター内の標識付着領域の分離を可能とする。従って、標識モノマーおよび同一の全シグナルの同一組合せを有するユニークなナノレポーターを、ナノレポーター内の標識モノマーの位置に基づいて相互から識別することができる。
【０１７０】
ナノレポーター内の標識付着領域またはスポットの位置を突き止めるこの能力は、ユニークなナノレポーターの組を生じさせる場合に、区別する特徴として、各標識付着領域中の標識モノマーによって発せられるシグナルの位置が用いられることを可能とする。よって、ナノレポーターの複雑な組は、ナノレポーター内の標識モノマーの位置を変化させることによって、出発標識モノマーの同一組合せを用いて作成することができる。
【０１７１】
ナノレポーターを伸ばすに先立ち、前記セクション５．６に記載したように、アフィニティータグを用いてナノレポーターを固体表面に固定化するのが好ましい。本発明のある態様において、固体表面への特異的または非特異的結合を通じてナノレポーターの１つの端部を固定化し、ナノレポーターを伸ばし、次いで、やはり固体表面への特異的または非特異的結合いずれかを通じてレポーターの他の端部を固定化する。従って、ナノレポーターはその伸びた、または引き伸ばされた状態に「凍結」されて、ナノレポーターに付着した標識モノマーによって発せられるシグナルを検出および／またはイメージングすることによるナノレポーターコード、および相互に対するそれらの位置の解像を容易とする。本発明のこれらの態様を以下に記載する。
【０１７２】
５．１２  ナノレポーター
該方法において、ナノレポーターはマクロ分子のあるタイプである。ある具体例において、マクロ分子が、本発明の方法において引き伸ばすことができるマクロ分子である。ある具体例において、マクロ分子は、以下のセクションに記載するように１または２の部分において固定化することができる。
【０１７３】
ある具体例において、ナノレポーターは多糖、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドである。有用なポリヌクレオチドはリボ核酸、デオキシリボ核酸、および当業者に知られた他のポリヌクレオチドを含む。
【０１７４】
ナノレポーターは、本発明の方法に従うナノレポーターの伸長および固定化を可能とするのに十分ないずれかのサイズのもとすることができる。ナノレポーターがポリヌクレオチドである場合のある具体例において、ナノレポーターは５００ｂｐを超える、７５０ｂｐを超える、１ｋｂを超える、１．５ｋｂを超える、２．０ｋｂを超える、２．５ｋｂを超える、３．０ｋｂを超える、４．０ｋｂを超えるまたは５．０ｋｂを超える長さを有することができる。ある具体例において、ナノレポーターがポリペプチドである場合、ナノレポーターは５０アミノ酸を超える、１００アミノ酸を超える、２００アミノ酸を超える、３００アミノ酸を超える、４００アミノ酸を超える、５００アミノ酸を超える、７５０アミノ酸を超える、１０００アミノ酸を超える、１５００アミノ酸を超える、２０００アミノ酸を超える、２５００アミノ酸を超える、３０００アミノ酸を超える、４０００アミノ酸を超えるまたは５０００アミノ酸を超えるサイズを有することができる。ある具体例において、ナノレポーターが多糖である場合、ナノレポーターは５０糖を超える、１００糖を超える、２００糖を超える、３００糖を超える、４００糖を超える、５００糖を超える、７５０糖を超える、１０００糖を超える、１５００糖を超える、２０００糖を超える、２５００糖を超える、３０００糖を超える、４０００糖を超えるまたは５０００糖を超えるサイズを有することができる。
【０１７５】
ナノレポーターは、当業者によって理解される天然ナノレポーターであり得、あるいはナノレポーターは非−天然ナノレポーターであり得る。ある具体例において、ナノレポーターがポリペプチドである場合、ナノレポーターは天然に生じるアミノ酸のみを含むことができ、あるいはナノレポーターは天然に生じるアミノ酸および天然に生じないアミノ酸を含むことができる。他のアミノ酸は、当業者に知られたいずれかのアミノ酸、またはその誘導体またはアナログであり得る。ある具体例において、ナノレポーターがポリヌクレオチドである場合、ポリヌクレオチドは天然に生じるヌクレオチドのみを含むことができ、あるいはポリヌクレオチドは天然に生じる分子および天然に生じないヌクレオチドを含むことができる。ある具体例において、ナノレポーターが多糖である場合、多糖は天然に生じる糖のみを含むことができるか、あるいは多糖は天然に生じる糖および天然に生じない糖を含むことができる。ある具体例において、ポリマーは非−天然モノマーのみを含むことができる。ある具体例において、ナノレポーターはアミノ酸、ヌクレオチドおよび／または糖のような複数のクラスのモノマーを含むことができる。
【０１７６】
ある具体例において、ナノレポーターはモノマーの１つの主な共有結合により連結された鎖のみを含む。例えば、ナノレポーターがポリペプチドである場合、ある具体例においては、ナノレポーターは主なアミノ酸鎖のみを含む。ナノレポーターがポリヌクレオチドである場合、ある具体例においては、ナノレポーターは一本鎖である。さらなる具体例において、ナノレポーターはモノマーの２つの主な共有結合により連結した鎖を含む。例えば、ナノレポーターがポリペプチドである場合、ある具体例においては、ナノレポーターは２つの主なアミノ酸鎖を含む。ナノレポーターがポリヌクレオチドである場合、ある具体例においては、ナノレポーターは２つのポリヌクレオチドストランドを含み、ある具体例においては、ナノレポーターは部分的にまたは全部が二本鎖であり得る。さらなる具体例において、ナノレポーターはモノマーの３以上の主な共有結合により連結した鎖を有する。例えば、ナノレポーターがポリペプチドである場合、ある具体例において、ナノレポーターは３つの主なアミノ酸鎖を含む。ナノレポーターがポリヌクレオチドである場合、ある具体例においては、ナノレポーターは３つのポリヌクレオチドストランドを含む。例えば、ナノレポーターは３つのストランドＦ１、ＸおよびＦ２を含むことができ、ここに、ストランドＸの一部はストランドＦ１に対して相補的であって、ストランドＸの一部はストランドＦ２に対して相補的である。図１３Ａに例が示される。ある具体例において、ナノレポーターはモノマーの３を超える主な共有結合による連結された鎖を含む。
【０１７７】
有利には、本発明のナノレポーターは、当業者に知られた技術によるナノレポーターの検出、イメージングまたは同定を容易とする１以上の標識を含むことができる。標識は当業者に知られたいずれかの検出可能な部位であり得る。ナノレポーターの例示的な標識は検出可能な同位体、放射性同位体、蛍光体、染料、酵素、リガンド、受容体、抗原、抗体、レクチン、炭水化物、ヌクレオチド配列、および当業者に明らかないずれかの他の検出可能な標識を含む。有用な標識、標識を含むマクロ分子、およびそれらの調製の方法は、その内容をここに引用してその全体を援用する、２００５年１２月２３日に出願された「Ｎａｎｏｒｅｐｏｒｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」と題された米国仮特許出願第６０／７５３，７５８合に記載されている。
【０１７８】
ある具体例において、ポリヌクレオチドは天然（例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）または合成ヌクレオベースのポリマーまたは双方の組合せである。ポリヌクレオチドの骨格は全部が「天然」ホスホジエステル結合から構成することができるか、あるいはそれは１以上のホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、または他の修飾された結合のような１以上の修飾された結合を含有することができる。特別な例として、ポリヌクレオチドはアミド相互結合を含有するペプチド核酸（ＰＮＡ）であってよい。本発明と組合せて用いることができる合成塩基および骨格、ならびにそれらの合成のための方法のさらなる例は、例えば、米国特許第６，００１，９８３号；Ｕｈｌｍａｎ  ＆  Ｐｅｙｍａｎ，１９９０，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ９０（４）：５４４  ５８４；Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，１９９０，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１（３）：１６５  １８６；Ｅｇｈｏｌｍら、１９９２，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１８９５  １８９７；Ｇｒｙａｚｎｏｖら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：３１４３  ３１４４、ならびに前記の全てで引用された文献に見出すことができる。そのポリヌクレオチドが構成され得る普通の合成ヌクレオベースが３−メチルウラシル、５，６−ジヒドロウラシル、４チオウラシル、５ブロモウラシル、５−トロウラシル、５−ヨードウラシル、６−ジメチルアミノプリン、６−メチルアミノプリン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、６−アミノ−８−ブロモプリン、イノシン、５−メチルシトシン、７−デアザアデニン、および７−デアザグアノシンを含む。標的核酸がそれで構成できる合成ヌクレオベースのさらなる非限定的例は、その全てが、そのようなヌクレオベースの構造、特性および調製を記載する刊行物に対する参照を供する、Ｆａｓｍａｎ，ＣＲＣ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９８５，ｐｐ．３８５−３９２；Ｂｅｉｌｓｔｅｉｎ’ｓ  Ｈａｎｄｂｕｃｈ  ｄｅｒ  Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，ＢｅｒｌｉｎおよびＣｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓに見出すことができる。
【０１７９】
ナノレポーターは、当業者に明白ないずれの技術に従っても調製することができる。有利には、本発明によるナノレポーターは、ナノレポーターの調製および／または精製を容易とするのに用いることができる、以下のセクションに記載された、標識および／または結合対のメンバーを含むことができる。加えて、本発明のあるナノレポーターは、以下に記載される、結合対のメンバーを含む分子とで複合体を形成することができる。これらの複合体を用いて、ナノレポーターまたは複合体の調製および／または精製を容易とすることができる。
【０１８０】
５．１３  伸ばされたナノレポーターの固定化
マクロ分子は、伸長のために用いられるいずれの力の元でも十分に伸ばされつつ選択的に固定化することができる。加えて、本発明の方法は、相互に対して配向された伸ばされたマクロレポーターの選択的固定化を容易とする。言い換えれば、本発明の方法に従うと、複数のナノレポーターを相互に対して同一向きに容易に固定化することができる。
【０１８１】
１つの態様において、本発明は、ナノレポーターを伸ばされた状態で選択的に固定化する方法を提供する。ナノ分子はポリマー、多糖、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのような当業者に知られたいずれのマクロ分子でもあり得る。本発明のこの態様の方法では、一般には、ナノレポーターの第一の部分は当業者に知られたいずれかの技術によって固定化される。事実、ナノレポーターの第一の部分を固定化するための技術は本発明の多くの具体例に対して臨界的ではない。ある具体例において、ナノレポーターの第一の部分は選択的にまたは非選択的に固定化することができる。ある具体例において、第一の部分は１以上の共有結合によって固定化される。ある具体例において、第一の部分は１以上の非共有結合によって固定化される。
【０１８２】
固定化された第一の部分に関しては、ナノレポーターは、当業者に明らかなナノレポーターを伸長するためのいずれの技術によっても伸張させることができる。ある具体例においては、ナノレポーターを伸長させるための技術は、本発明の技術では臨界的ではない。ある具体例において、ナノレポーターを伸長させるための技術は、当業者の判断に従ってナノレポーターのクラスについて適切なものである。ある具体例において、ナノレポーターは、ナノレポーターを伸張させることができる力の適用によって伸長される。該力は、ナノレポーターを伸長させるための当業者に明らかないずれの力とすることもできる。例示的な力は重力、水力学力、電磁気的力およびその組合せを含む。ナノレポーターを伸長させるための特別な技術は以下のセクションに記載される。
【０１８３】
ナノレポーターは、もしそれが当業者によって伸長されたものとして認識されるならば、伸長された状態にある。ある具体例において、ナノレポーターは、それがナノレポーターを伸長できる力の場にある場合、伸長された状態にある。ある具体例において、ナノレポーターは、その平均水力学半径が、当業者によって認識されるその天然状態におけるナノレポーターの平均水力学半径の２倍を超える場合に伸長される状態にある。
【０１８４】
本発明のこの態様において、該方法は、一般には、それが伸長状態にありつつ、ナノレポーターの第二の部分を選択的に固定化する工程を含む。この結果、第一と第二の部分の間が伸長された固定化されたナノレポーターがもたらされ得る。顕著には、ナノレポーターは、伸長されている間に選択的に固定化されるので、その伸長は固定化されたナノレポーターにおいて維持することができる。一般には、ナノレポーターの第一の部分および第二の部分は同一ではない。
【０１８５】
選択的固定化は、当業者に明らかなナノレポーターの部分の選択的固定化のためのいずれの技術に従うこともできる。選択的固定化は、例えば、１以上の共有結合、または１以上の非共有結合または双方の形成を通じることができる。選択的固定化技術の特別な例は、以下のセクションに記載される。特別な具体例において、１以上の結合対を用いて、ナノレポーターの第二の部分を固定化する。
【０１８６】
第二の部分は、当業者に明らかないずれかの基板上に固定化することができる。該基板は、当業者に知られた固定化で有用であると判断されたいずれの基板とすることもできる。ある具体例において、第二の部分はもう１つの分子に対して固定化することができる。さらなる有用な基板は表面、膜、ビーズ、多孔性材料、電極、アレイ、および当業者に明らかないずれかの他の基板を含む。
【０１８７】
もう１つの態様において、本発明は、選択的に固定化された延長されたナノレポーターを含む組成物を含む。組成物は、一般には、基板、および該基板に選択的に固定化された伸長されたナノレポーターを含む。基板は当業者に知られたいずれの基板とすることもできる。例示的な基板は、以下のセクションに記載されたものを含む。ナノレポーターの少なくとも２つの部分は基板に固定化されており、ナノレポーターは２つの部分の間に伸びた状態にある。ある具体例において、ナノレポーターの少なくとも１つの部分は基板の上に選択的に固定化される。ある具体例において、ナノレポーターの２以上の部分は基板の上に選択的に固定化される。ナノレポーターは、特に、本発明の方法を含めた、当業者に明らかないずれの技術によっても伸長され、および／または固定化されうる。
【０１８８】
ある態様において、本発明は、配向した状態にあるナノレポーターを選択的に固定化する方法を提供する。ナノレポーターは、前記したいずれのナノレポーターとすることもできる。ある具体例において、ナノレポーターは柔軟なものとすることができ、あるいはある具体例においては、ナノレポーターは剛性または半−剛性であり得る。本発明のこの態様の方法では、一般には、ナノレポーターの第一の部分は前記したように固定化される。固定化された第一部の部分に関しては、ナノレポーターは、当業者に明らかなナノレポーターを伸長するためのいずれの技術によっても配向させるができる。ある具体例において、ナノレポーターを配向させるための技術は本発明の方法では臨界的ではない。ある具体例において、ナノレポーターを配向させるための技術は、当業者の判断に従ってナノレポーターのクラスに適したものである。ある具体例において、ナノレポーターは、ナノレポーターを配向させることができる力によって配向される。該力は、ナノレポーターを配向させるための当業者に明らかないずれの力とすることもできる。例示的な力は重力、水力学力、電磁気力、およびその組合せを含む。
【０１８９】
ナノレポーターは、もしそれが当業者によって配向していると認識されるならば、配向状態にある。ある具体例において、ナノレポーターは、それがナノレポーターを配向させることができる力の場にある場合、配向した状態にある。ある具体例において、ナノレポーターは、その末端が、ナノレポーターを配向させることができる力の場と、当業者によって認識されるように、平行に配置された場合に、配向した状態にある。ある具体例において、複数のナノレポーターは、ナノレポーターの末端が当業者に認識されるように平行に配置された場合には、配向した状態にある。
【０１９０】
本発明のこの態様において、該方法は、一般には、それが配向した状態にありつつ、ナノレポーターの第二の部分を選択的に固定化する工程を含む。この結果、第一と第二の部分の間に配向した固定化されたナノレポーターがもたらされ得る。顕著には、ナノレポーターは伸長している間に選択的に固定化されるので、その配向は固定化されたナノレポーターにおいて維持できる。選択的固定化は前記した方法に従うことができる。
【０１９１】
もう１つの態様において、本発明は、選択的に固定化された配向したナノレポーターを含む組成物を提供する。該組成物は、一般には、基板、および該基板上に選択的に固定化された配向したナノレポーターを含む。基板は当業者に知られたいずれの基板でもあり得る。例示的な基板は以下のセクションに記載されたものを含む。ナノレポーターの少なくとも２つの部分は基板上に固定化され、ナノレポーターは２つの部分の間に配向した状態にある。ある具体例において、ナノレポーターの少なくとも１つの部分は基板上に選択的に固定化される。ある具体例において、ナノレポーターの双方の部分は基板上に選択的に固定化される。ナノレポーターは、特に、本発明の方法を含めた、当業者に明らかないずれの技術によっても配向させ、および／または固定化することができる。
【０１９２】
本発明の方法および組成物は、当業者に明らかないずれの目的でも用いることができる。例えば、固定化され、かつ伸長され、および／または配向されたナノレポーターは、該ナノレポーターが固定化される基板用の標識として用いることができる。固定化され、かつ伸長され、および／または配向されたナノレポーターの主な配列は、当業者に明らかないずれの技術によっても同定することができる。有利には、伸長された、および／または配向されたナノレポーターの固定化はそのような技術を容易とすることができる。ある具体例において、固定化され、および伸長された、および／または配向したナノレポーターを用いて、ナノ路の製造をガイドして、例えば、ナノワイヤーまたはナノ回路を作成することができる。固定化され、かつ伸長され、および／または配向したナノレポーターについてのさらなる使用は以下のセクションに記載される。
【０１９３】
５．１３．１  選択的固定化の方法
前記したように、本発明は、伸長された状態のナノレポーターの選択的固定化のための方法を提供する。ナノレポーターは、一旦選択的に固定化されたならば、当業者に明らかないずれの目的で用いることもできる。
【０１９４】
５．１３．２  第一の部分の固定化
本発明の方法において、ナノレポーターの第一の部分は固定化される。一般には、第一の部分は、もしそれが当業者によって固定化されていると認識されるならば、固定化されている。第一の部分は、当業者に明らかないずれの技術によっても固定化することができる。ある具体例において、ナノレポーターの第一の部分の固定化のための技術は本発明の方法にとって臨界的ではない。
【０１９５】
ナノレポーターの第一の部分は、ナノレポーターにおけるいずれの位置におけるものでもあり得る。ある具体例において、第一の部分はナノレポーターの末端におけるものである。本発明の目的では、ナノレポーターの部分は、それがナノレポーターの末端から５、４、３、２、１または０モノマー少ない場合に、「末端における」ものであり得る。もちろん、多くのナノレポーターは２つの末端を有するが、本発明の方法は、２を超える末端を有するナノレポーターに、および１または０の末端を有するナノレポーター、例えば、円状ナノレポーターに適用することができる。ある具体例において、第一の部分はナノレポーターの末端にはない。
【０１９６】
ナノレポーターは、当業者に明らかないずれの基板に固定化することもできる。基板は、ナノレポーターが制限なく固定化することができるいずれの部位とすることもできる。ある具体例において、基板は表面、膜、ビーズ、多孔性材料、電極またはアレイである。
【０１９７】
ある具体例において、ナノレポーターの第一の部分は非選択的に固定化することができる。さらなる具体例において、ナノレポーターの第一の部分は選択的に固定化することができる。有利な具体例において、ナノレポーターの第一の部分を固定化した後に、ナノレポーターが以下の方法の工程において伸長し、および／または配向することができるように、十分に移動するように自由とすべきである。特に、ある具体例において、ナノレポーターの第一の部分が非選択的に固定化される場合、全ナノレポーターは、ナノレポーターのいずれの部分の伸長も妨げる程度まで非選択的に固定化されないのが重要である。
【０１９８】
固定化は、当業者に明らかな基板とのいずれの相互作用によるものとすることもできる。固定化は静電またはイオン相互作用を介して、１以上の共有結合を介して、１以上の非共有結合、またはその組合せを介することもできる。ある具体例において、固定化は電極との静電相互作用を介することもできる。さらなる具体例において、固定化は、電極以外の基板のとの静電相互作用を介するものである。
【０１９９】
ある具体例において、ナノレポーターの第一の部分は結合対の第一のメンバーを含む。結合対の第一のメンバーは、ナノレポーターの第一の部分に共有結合により結合させることができるか、あるいはそれは非共有結合させることができる。有用な共有結合および非共有結合は当業者に明らかであろう。有用な具体例において、ナノレポーターの第一の部分が結合する基板は、結合対の第二のメンバーを含む。基板は第二のメンバーに共有結合することができるか、あるいはそれは非共有結合することができる。図１２は、基板の部位を選択的に結合させることができる部位Ｆ１を含むナノレポーターを示す。部位Ｆ１は、例えば、アビジンで被覆された基板に結合することができる、例えば、ビオチンであり得る。
【０２００】
ある具体例において、ナノレポーターの第一の部分は、基板上の結合対のメンバーと結合して、１以上の非共有結合を形成できる結合対のメンバーを含むことができる。例示的な有用な基板は、リガンド、抗原、炭水化物、核酸、受容体、レクチンおよび抗体よりなる群から選択される結合部位を含むものを含む。ナノレポーターの第一の部分は、基板の結合部位と結合することができる結合部位を含むであろう。反応性部位を含む例示的な有用な基板は、限定されるものではないが、エポキシ、アルデヒド、金、ヒドラジド、スルフヒドリル、ＮＨＳ−エステル、アミン、チオール、カルボキシレート、マレイミド、ヒドロキシメチルホスフィン、イミドエステル、イソシアネート、ヒドロキシル、ペンタフルオロフェニル−エステル、プソラレン、ピリジルジスルヒドまたはビニルスルホン、またはその混合物を含む表面を含む。そのような表面は商業的な源から得ることができるか、あるいは標準的な技術に従って調製することができる。
【０２０１】
有利な具体例において、ナノレポーターの第一の部分は、アビジン−ビオチン結合対を介して基板に固定化することができる。ある具体例において、ナノレポーターはその第一の部分においてビオチン部位を含むことができる。例えば、ポリヌクレオチドナノレポーターは、ビオチニル化ヌクレオチド残基を含むことができる。同様に、ポリペプチドナノレポーターはビオチニル化アミノ酸残基を含むことができる。アビジンを含む基板は、当業者に知られたアビジンを含むいずれの基板とすることもできる。アビジンを含む有用な基板は、ＴＢ０２００（Ａｃｃｅｌｒ８），ＳＡＤ６，ＳＡＤ２０，ＳＡＤ１００，ＳＡＤ５００，ＳＡＤ２０００（Ｘａｎｔｅｃ），ＳｕｐｅｒＡｖｉｄｉｎ（Ａｒｒａｙ−Ｉｔ）、ストレプトアビジンスライド（カタログ＃  ＭＰＣ０００、Ｘｅｎｏｐｏｒｅ）およびＳＴＲＥＰＴＡＶＩＤＩＮｎｓｌｉｄｅ（カタログ＃  ４３９００３，Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ＯＮＥ）を含めて、商業的に入手可能である。
【０２０２】
ある具体例において、ナノレポーターの第一の部分は、基板上のヌクレオチド配列に選択的に結合することができるヌクレオチド配列を含むことができる。さらなる具体例において、ナノレポーターの第一の部分はアビジンを含むことができ、および基板はビオチンを含むことができる。商業的に入手可能なビオチンを含む有用な基板は、限定されるものではないが、Ｏｐｔｉａｒｒａｙ−ビオチン（Ａｃｃｌｅｒ８）、ＢＤ６、ＢＤ２０、ＢＤ１００、ＢＤ５００およびＢＤ２０００（Ｘａｎｔｅｃ）を含む。
【０２０３】
さらなる具体例において、ナノレポーターの第一の部分は、基板の結合部位に共有結合、または非共有結合することができる１以上の他の分子とで複合体を形成することができる。例えば、ナノレポーターの第一の部分は、例えば、基板のアビジン部位に選択的に結合することができる、例えば、ビオチン部位を含むもう１つの分子に選択的に結合することができる。図１３Ａは、Ｆ１を含む第三の分子に選択的に結合することができる第二の分子Ｘに選択的に結合することができるナノレポーターを示す。Ｆ１は基板上の部位に選択的に結合することができる。図１３Ｂは、Ｆ１を含む第二の分子に選択的に結合することができるナノレポーターを示し、Ｆ１は基板上の部位に選択的に結合することができる。
【０２０４】
さらなる具体例において、ナノレポーターの第一の部分は、基板上の結合対のメンバーと反応して、１以上の共有結合を形成することができる結合対のメンバーを含むことができる。反応性基を含む有用な基板は、スクシンアミド、アミン、アルデヒド、エポキシおよびチオールよりなる群から選択される反応性部位を含むものを含む。反応性部位を含む例示的な有用な基板は、限定されるものではないが、エポキシ、アルデヒド、金、ヒドラジド、スルフヒドリル、ＮＨＳ−エステル、アミン、チオール、カルボキシレート、マレイミド、ヒドロキシメチルホスフィン、イミドエステル、イソシアネート、ヒドロキシル、ペンタフルオロフェニル−エステル、プソラレン、ピリジルジスルヒドまたはビニルスルホン、またはその混合物を含む表面を含む。そのような表面は、商業的源から得ることができるか、あるいは標準的な技術に従って調製することができる。ナノレポーターの第一の部分は基板の反応性部位と反応することができる反応性部位を含むであろう。反応性部位を含む例示的な有用な基板は、限定されるものではないが、ＯｐｔＡｒｒａｙ−ＤＮＡ  ＮＨＳ基（Ａｃｃｌｅｒ８）、Ｎｅｘｔｅｒｉｏｎ  Ｓｌｉｄｅ  ＡＬ（Ｓｃｈｏｔｔ）およびＮｅｘｔｅｒｉｏｎ  Ｓｌｉｄｅ  Ｅ（Ｓｃｈｏｔｔ）を含む。
【０２０５】
ある具体例において、ナノレポーターの第一の部分は、光活性化によって基板に結合することができる反応性部位を含むことはできる。基板は光反応性部位を含むことができ、あるいはナノレポーターの第一の部分は光反応性部位を含むことができる。光反応性部位のいくつかの例は、Ｎ−（（２−ピリジルジチオ）エチル）−４−アジドサリシルアミドのようなアリールアジド；４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロ安息香酸のようなフッ素化アリールアジド；４−ベンゾイル安息香酸のスクシンイミジルエステルのようなベンゾフェノン−ベースの試薬；および５−ブロモ−デオキシウリジンのようなベンゾフェノン−ベースの試薬を含む。
【０２０６】
さらなる具体例において、ナノレポーターの第一の部分は、当業者に明らかな他の結合対を介して基板に固定化することができる。
【０２０７】
５．１３．３  ナノレポーターの伸長
本発明のある方法において、ナノレポーターは伸長した状態にある。一般に、いずれのナノレポーターも、もしそれが当業者によってそのように認識されるのであれば、伸長した状態にある。
【０２０８】
ある具体例において、ナノレポーターは、それが、ナノレポーターを伸長するのに適した条件下でナノレポーターを伸長することができる力の場にある場合、伸長した状態にある。そのような力および条件は当業者に明白なはずである。例えば、多くのナノレポーターは水力学力によってまたは重力によって伸長することができ、多くの荷電ナノレポーターは電磁気力によって伸長することができる。ある具体例において、該力は間接的にナノレポーターに適用することができる。例えば、ナノレポーターは、力によって移動することができる部位を含むことができ、または該部位に共有結合によりまたは非共有結合により連結させることができる。ある具体例において、ナノレポーターは、電磁気、水力学力または光学的力によって移動させることができる部位に連結することができる。
【０２０９】
ある具体例において、該力は電磁気力である。例えば、ポリヌクレオチドのように、ナノレポーターが荷電されている場合、ナノレポーターは電場または磁場において伸張させることができる。該場は、当業者の判断に従ってナノレポーターを伸長させるのに十分強くすべきである。電場または磁場においてナノレポーターを伸長させるための例示的な技術は、その内容をここに引用してその全体を援用する、Ｍａｔｓｕｕｒａら、２００２，Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｄｙｎ．２０（３）：４２９−３６；Ｆｅｒｒｅｅ  ＆  Ｂｌａｎｃｈ，２００３，Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ．８５（４）：２５３９−４６；Ｓｔｉｇｔｅｒ  ＆  Ｂｕｓｔａｍａｎｔｅ，１９９８，Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ．１９９８  ７５（３）：１１９７−２１０；Ｍａｔｓｕｕｒａら、２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９（１６）；Ｆｅｒｒｅｅ  ＆  Ｂｌａｎｃｈ，２００４，Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ．８７（１）：４６８−７５に記載されている。
【０２１０】
ある具体例において、該力は水力学力である。例えば、多糖、ポリペプチド、およびポリヌクレオチドを含めた多くのナノレポーターは移動する流体の場において伸長させることができる。水力学力は、当業者の判断に従って、ナノレポーターを伸長させるのに十分強くすべきである。水力学場においてナノレポーターを伸長するための例示的な技術は、その内容をここに引用してその全体を援用する、Ｂｅｎｓｉｍｏｎら、１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：２０９６−２０９８；Ｈｅｎｅｇａｒｉｕら、２００１，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３１：２４６−２５０；Ｋｒａｕｓら、１９９７，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ９９：３７４−３８０；Ｍｉｃｈａｌｅｔら、１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：１５１８−１５２３；Ｙｏｋｏｔａら、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（５）：１０６４−７０；Ｏｔｏｂｅら、２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２９：１０９；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ＆  Ｃｏｘ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２（３）：４９２−７，および米国特許第６，５４８，２５５号、第６，３４４，３１９号、第６，３０３，２９６号、第６，２６５，１５３号、第６，２２５，０５５号、第６，０５４，３２７号、第５，８４０，８６２号に記載されている。
【０２１１】
ある具体例において、該力は重力である。有利な具体例において、重力の力を、例えば、水力学力と組合せて、ナノレポーターを伸長させることができる。ある具体例において、力は、当業者の判断に従ってナノレポーターを伸長するのに十分強くすべきである。重力によってナノレポーターを伸長させるための例示的な技術は、その内容をここに引用してその全体を援用する、Ｍｉｃｈａｌｅｔら、１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：１５１８−１５２３；Ｙｏｋｏｔａら、１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（５）：１０６４−７０；Ｋｒａｕｓら、１９９７，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ９９：３７４−３８０に記載されている。
【０２１２】
特別な具体例において、力は移動するメニスカスを介して適用される。当業者であれば、移動するメニスカスは種々の力を水力学力、表面張力および／または当業者によって認識されるいずれかの他の力を含めたナノレポーターに適用することができるのを認識するであろう。メニスカスは、蒸発および重力を含めた当業者に明らかないずれの技術によって移動させることもできる。移動するメニスカスでナノレポーターを伸長させるための技術は、例えば、その内容をここに引用してその全体を援用する、米国特許第６，５４８，２５５号、第６，３４４，３１９号、第６，３０３，２９６号、第６，２６５，１５３号、第６，２２５，０５５号、第６，０５４，３２７号、第５，８４０，８６２号に記載されている。
【０２１３】
特別な具体例において、ナノレポーターは、光学的トラップまたは光学的ピンセットによって伸張させることができる。例えば、ナノレポーターは、光学的力の適当な源によって捕獲し、または移動させることができる粒子を含むことができ、または該粒子に共有結合によりまたは非共有結合により連結させることができる。光学的トラップまたは光学的ピンセットで粒子を移動させるための有用な技術は、その内容をここに引用して、その全体を援用するＡｓｈｋｉｎら、１９８６，Ｏｐｔｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １１：２８８−２９０；Ａｓｈｋｉｎら、１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：１５１７−１５２０；Ａｓｈｋｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３０：７６９−７７１；Ｐｅｒｋｉｎｓら、１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：８２２−８２６；Ｓｉｍｍｏｎｓら、１９９６，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ７０：１８１３−１８２２；Ｂｌｏｃｋら、１９９０，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：３４８−３５２；およびＧｒｉｅｒ，２００３，Ｎａｔｕｒｅ  ４２４：８１０−８１６に記載されている。
【０２１４】
ある具体例において、ナノレポーターは、当業者に明らかな前記力の組合せによって伸長させることができる。以下の実施例において、あるナノレポーターは、電場および水力学力の組合せによって伸長される。
【０２１５】
ナノレポーターは、ナノレポーターの伸長のための標準的基準に従って、当業者によって伸長されていると認識される場合に伸長されている。ある具体例において、ナノレポーターは、当業者によって認識されるようにその三次構造特徴のほとんどを失う場合、伸長されている。ある具体例において、ナノレポーターは、それが、当業者によって認識されるようにその二次構造特徴のほとんどを失う場合、伸長されている。ある具体例において、ナノレポーターは、その一次構造特徴が、標準的な技術に従ってイメージした場合に、配列が検出できる場合、伸長されている。例示的なイメージング技術は以下の実施例に記載される。
【０２１６】
ある具体例において、ナノレポーターの伸長した状態は、その水力学半径を希薄溶液中で遊離されている場合のその平均水力学半径と比較することによって認識することができる。例えば、ある具体例において、ナノレポーター、またはその部分は、その水力学半径が、希薄溶液中でのその平均水力学半径の約２倍を超える場合、伸長されている。より定量的には、Ｒはナノレポーター、またはその部分の水力学半径を表し、および＜Ｒ＞は希薄溶液におけるナノレポーター、またはその部分の平均水力学半径を表す。平均＜Ｒ＞は、ナノレポーター、またはその部分についてのＲが、希薄溶液中で結合していない場合に、２倍の＜Ｒ＞の９５％未満であるように計算されるべきである。ある具体例において、ナノレポーター、またはその部分は、Ｒが１．５＜Ｒ＞を超える、１．６＜Ｒ＞を超える、１．７＜Ｒ＞を超える、１．８＜Ｒ＞を超える、１．９＜Ｒ＞を超える、２．０＜Ｒ＞を超える、２．１＜Ｒ＞を超える、２．２＜Ｒ＞を超える、２．３＜Ｒ＞を超える、２．４＜Ｒ＞を超える、２．５＜Ｒ＞を超えるまたは３．０＜Ｒ＞を超える場合、伸びた状態にある。特別な具体例において、ナノレポーター、またはその部分は、Ｒが２．０＜Ｒ＞を超える場合、伸びた状態にある。
【０２１７】
５．１３．４  ナノレポーターの配向
本発明のある方法においては、ナノレポーターは配向した状態にある。一般に、いずれのナノレポーターも、もしそれが当業者によってそのように認識されるならば、配向した状態にある。
【０２１８】
ある具体例において、ナノレポーターは、それが、ナノレポーターを配向させるのに適した条件下でナノレポーターを配向させることができる力の場にある場合、配向した状態にある。そのような力および条件は当業者に明らかなはずである。
【０２１９】
ある具体例において、力は電磁気力である。例えば、ナノレポーターがポリヌクレオチドのように荷電している場合、ナノレポーターは電場または磁場において配向させることができる。該場は、当業者の判断に従って、ナノレポーターを配向させるのに十分強くすべきである。電場または磁場においてナノレポーターを配向させるための例示的な技術は先に記載した。
【０２２０】
ある具体例において、該力は水力学力である。例えば、多糖、ポリペプチド、およびポリヌクレオチドを含めた多くのナノレポーターは、移動する流体の場において配向させることができる。水力学力は、当業者の判断に従ってナノレポーターを配向させるのに十分強くすべきである。水力学場においてナノレポーターを配向させるための例示的技術は先に記載した。
【０２２１】
ある具体例において、該力は重力である。有利な具体例において、重力の力は、例えば、水力学力または表面張力と組合せて、ナノレポーターを配向させることができる。ある具体例において、力は、当業者の判断に従ってナノレポーターを配向させるのに十分強くすべきである。ナノレポーターを重力で配向させるための例示的な技術は先に記載した。
【０２２２】
ある具体例において、該力は光学的力である。例えば、マクロ分子は、前記したような光学的力の適当な源によって捕獲され、または移動させることができる粒子を含むことができ、または該粒子に共有結合によりまたは非共有結合により連結させることができる。
【０２２３】
ある具体例において、ナノレポーターは、当業者に明らかな前記力の組合せによって配向させることができる。以下の実施例において、あるナノレポーターは電場および水力学力の組合せによって配向される。
【０２２４】
ナノレポーターは、それが、ナノレポーターの配向のための標準的基準に従って当業者によって配向していると認識される場合、配向している。ある具体例において、ナノレポーターは、ナノレポーターを配向させることができる力の場でもって、当業者に認識されるように、平行に配置されている場合、配向している。ある具体例において、ナノレポーターは、当業者によって認識されるように、それが平行に配置している複数のナノレポーターの１つである場合、配向している。例えば、複数のナノレポーターは、ナノレポーターの第二の末端に対する第一の末端からのベクトルが、当業者によって認識されるように、複数の他のナノレポーターの対応する末端間のベクトルに対し平行している場合に配向させることができる。
【０２２５】
５．１３．５  ナノレポーターの第二の部分の選択的固定化
先に議論したように本発明の方法においては、ナノレポーターの第二の部分は選択的に固定化されている。ナノレポーターの第二の部分は、ナノレポーターの第一の部分に対して同一でないナノレポーターのいずれかの部分であり得る。いくつかの具体例においては、ナノレポーターの第二の部分は、ナノレポーターの第一の部分のいずれの部分にも重複しない。
【０２２６】
ある具体例において、本発明は、ナノレポーターが伸長した、または配向した状態にありつつ、かつナノレポーターの第一の部分が固定化されつつ、ナノレポーターの第二の部分を選択的に固定化する単一工程を含む方法を提供する。ナノレポーターの第一の部分の固定化のための、およびナノレポーターの伸長または配向のための例示的な方法は、前記セクションに詳細に記載されている。
【０２２７】
ある具体例において、本発明は、ナノレポーターの第一の部分が固定化されつつ、ナノレポーターを伸長する工程、およびナノレポーターが配向した状態にある間に、ナノレポーターの第二の部分を選択的に固定化する工程を含む方法を提供する。ナノレポーターの第一の部分の固定化のための、およびナノレポーターの伸長のための例示的な方法は前記セクションに詳細に記載されている。
【０２２８】
ある具体例において、本発明は、ナノレポーターの第一の部分を固定化する工程、第一の部分が固定化されつつ、ナノレポーターを伸長させる工程、およびナノレポーターが伸長した状態にある間に、ナノレポーターの第二の部分を選択的に固定化する工程を含む方法を提供する。ナノレポーターの第一の部分の固定化のための、およびナノレポーターの伸長のための例示的方法は先に詳細に記載した。
【０２２９】
ある具体例において、本発明は、ナノレポーターの第一の部分が固定化されつつナノレポーターを配向させる工程、およびナノレポーターが配向した状態にある間に、ナノレポーターの第二の部分を選択的に固定化する工程を含む方法を提供する。ナノレポーターの第一の部分の固定化のための、およびナノレポーターを配向させるための例示的方法は、前記セクションに詳細に記載されている。
【０２３０】
ある具体例において、本発明は、ナノレポーターの第一の部分を固定化する工程、該第一の部分が固定化されつつナノレポーターを配向させる工程、およびナノレポーターが配向した状態にある間に、ナノレポーターの第二の部分を選択的に固定化する工程を含む方法を提供する。ナノレポーターの第一の部分の固定化のための、およびナノレポーターを配向させるための例示的な方法は先に詳細に記載した。
【０２３１】
ナノレポーターの第二の部分の選択的固定化は、当業者に明らかなナノレポーターの選択的固定化のためのいずれかの技術に従うことができる。重要なことには、本発明の有利な具体例において、ナノレポーターの第二の部分は非選択的に固定化されてはいない。選択的固定化は、十分に伸長された状態、またはほとんど十分に伸長された状態にある間に、ナノレポーターが固定化されるのを可能とすることができる。選択的固定化は、ナノレポーターが配向した方法で固定化されるのを可能とすることもできる。言い換えれば、ナノレポーターの第一の部分および第二の部分は、場において第二の部分に先行する第一の部分でもって、ナノレポーターを伸長させるのに用いた場または複数の場の方向に沿って固定化することができる。複数のナノレポーターが固定化される場合、それは場に沿って均一に配向させることができる。
【０２３２】
ナノレポーターの第二の部分は、ナノレポーターにおけるいずれの位置におけるものとすることもできる。ある具体例において、第二の部分はナノレポーターの末端におけるものである。ある具体例において、第二の部分はナノレポーターの末端におけるものではない。ある具体例において、前記セクションに記載された第一の部分は、ナノレポーターの１つの末端におけるものであって、第二の部分はナノレポーターのもう１つの末端におけるものである。
【０２３３】
先に議論したように、ナノレポーターの第二の部分は選択的に固定化される。固定化は、当業者に明らかな基板とのいずれかの選択的相互作用によることができる。固定化は静電またはイオン相互作用を介し、１以上の共有結合を介し、１以上の非共有結合またはその組合せを介することができる。ある具体例において、固定化は電極との静電相互作用を介することができる。さらなる具体例において、固定化は電極以外の基板との静電相互作用を介する。
【０２３４】
もしナノレポーターの第一の部分および第二の部分が同一基板に選択的に固定化されているならば、選択的固定化の技術は、勿論、基板に適合すべきである。特別な具体例において、固定化の技術は同一である。例えば、アビジンで被覆した基板では、ナノレポーターの第一および第二の部分は共にビオチン−アビジン相互作用を介して選択的に固定化することができる。しかしながら、当業者に明らかなように、同一相互作用は同一の基板への固定化のために第一および第二の双方の部分において用いる必要がない。例えば、基板は選択的結合が可能な複数部位を含むことができるか、あるいは第一の部分は非選択的に固定化されるか、あるいは当業者に明らかな他の技術を用いても良い。
【０２３５】
ある具体例において、ナノレポーターの第二の部分は結合対の第一のメンバーを含む。結合対の第二のメンバーは、ナノレポーターの第二の部分に共有結合することができるか、あるいはそれらは非共有結合させることができる。有用な共有結合および非共有結合は当業者に明らかであろう。有用な具体例において、ナノレポーターの第二の部分が結合する基板は、結合対の第二のメンバーを含む。基板は第二のメンバーに共有結合することができるか、あるいは非共有結合することができる。
【０２３６】
ある具体例において、ナノレポーターの第二の部分は、基板上の結合対のメンバーと結合して、１以上の非共有結合を形成することができる結合対のメンバーを含むことができる。例示的な有用な基板は、前記セクションに記載されたもののようなリガンド、抗原、炭水化物、核酸、受容体、レクチン、および抗体よりなる群から選択される結合部位を含むものを含む。
【０２３７】
有利な具体例において、ナノレポーターの第二の部分はアビジン−ビオチン結合対を介して基板に固定化させることができる。ある具体例において、ナノレポーターはその第一の部分においてビオチン部位を含むことができる。例えば、ポリヌクレオチドナノレポーターはビオチニル化ヌクレオチド残基を含むことができる。同様に、ポリペプチドナノレポーターはビオチニル化アミノ酸残基を含むことができる。アビジンを含む有用な基板は先のセクションに記載されている。
【０２３８】
さらなる具体例において、ナノレポーターの第二の部分はアビジンを含むことができ、基板はビオチンを含むことができる。ビオチンを含む有用な基板は先のセクションに記載されている。
【０２３９】
さらなる具体例において、ナノレポーターの第二の部分は、基板上の結合対のメンバーと反応して、１以上の共有結合を形成することができる結合対のメンバーを含む。反応性基を含む有用な基板は先のセクションに記載されている。
【０２４０】
ある具体例において、ナノレポーターの第二の部分は、光活性化によって基板に結合することができる反応性部位を含むことができる。基板は光反応性基を含むことができ、あるいはナノレポーターの第二の部分は光反応性部位を含むことができる。光反応性部位のいくつかの例は、Ｎ−（（２−ピリジルジチオ）エチル）−４−アジドサリシルアミドのようなアリールアジド；４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロ安息香酸のようなフッ素化アリールアジド；４−ベンゾイド安息香酸のスクシンイミジルエステルのようなベンゾフェノン−ベースの試薬；および５−ブロモ−デオキシウリジンを含む。
【０２４１】
さらなる具体例において、ナノレポーターの第二の部分は、前記セクションに記載された他の結合対を介して基板に固定化することができる。
【０２４２】
さらなる具体例において、ナノレポーターの第二の部分は、基板の結合部位に共有結合により、または非共有結合により、結合することができる１以上の他の分子とで複合体を形成することができる。例えば、ナノレポーターの第二の部分は、例えば、基板のアビジン部位に選択的に結合することができる、例えば、ビオチン部位を含むもう１つの分子に選択的に結合することができる。図１２Ｂは、基板上の部位に選択的に結合することができるＦ３を含む第二の分子に選択的に結合する方法を示す。ナノレポーターの第二の部分、およびＦ３を含む分子の間の相互作用は、例えば、抗原−抗体相互作用によって媒介することができる。
【０２４３】
図１４Ａおよび１４Ｂは、本発明の方法に従うナノレポーターの選択的固定化を示す。図１４Ａにおいて、ナノレポーターの第一の部分は、示された基板Ｓ上の部位に選択的に結合することができる結合部位Ｆ１を含む。結合部位Ｆ１は、例えば、ビオチンとすることができ、基板Ｓは、例えば、アビジンで被覆することができる。図１４のナノレポーターは、前記セクションに記載されたような力によって伸長される。図１４Ｂでは、該力は電気的ポテンシャルである。伸長されつつ、ナノレポーターは、示された基板Ｓ上の部位に選択的に結合することができる結合部位Ｆ２を含む分子に接触される。結合部位Ｆ２は、例えば、ビオチンとすることができ、基板Ｓは、例えば、アビジンで被覆することができる。重要なことには、Ｆ２を含む３つまでの分子は、ナノレポーターの第二の部分に選択的に結合して、それをその伸長した状態に選択的に固定化することができる。示されたように、分子は、ナノレポーターの反復された結合部位に選択的に結合する第二の結合部位を含む。結合部位は、例えば、図１４Ｂに示されたように、相補的な核酸配列であり得る。得られたナノレポーターは、伸長した状態において選択的に固定化され、力が除去された場合においてさえ伸長されたままとすべきである。選択的に固定化された伸長されたナノレポーターは、当業者に明らかないずれの目的でも用いることができる。
【０２４４】
５．１３．６  伸長された、または配向されたナノレポーターの２つの部分の固定化
ある具体例において、本発明は、伸長した、または配向した状態にあるナノレポーターの第一の部分および第二の部分の選択的固定化のための方法を提供する。重要なことには、本発明のこれらの方法によると、ナノレポーターは、ナノレポーターを伸長させ、または配向することができる力の適用に先立って固定化される必要はない。
【０２４５】
これらの方法において、ナノレポーターは、ナノレポーターを伸長させ、または配向させることができる力によって伸長され、または配向され、または双方がなされる。そのような力は先のセクションに詳細に記載されている。特別な具体例において、該力は、ナノレポーターを１つの位置に維持しつつナノレポーターを伸長させ、または配向させることができる力、すなわち、ナノレポーターを実質的に移動させることなく伸長させ、または配向させることができる力である。例示的な力は、振動する電磁場および振動する水力学場を含む。特別な具体例において、該力は振動する電場である。振動する電場においてナノレポーターを伸長させ、または配向させるための例示的な技術は、その内容をここに引用してその全体を援用する、Ａｓｂｕｒｙら、２００２，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２３（１６）：２６５８−６６；Ｋａｂａｔａら、１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２（５１３９）：１５６１−３；およびＡｓｂｕｒｙ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｎｇｈ，１９９８，Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ．７４：１０２４−３０に記載されている。
【０２４６】
該方法において、ナノレポーターは、伸長され、または配向されている間に、第一の部分および第二の部分において固定化されている。第一の部分および第二の部分は共に非選択的に固定化することができ、双方は選択的に固定化することができるか、あるいは１つは選択的に固定化することができ、他方は非選択的に固定化することができる。第一の部分および第二の部分の固定化のための技術は先のセクションに詳細に記載されている。
【０２４７】
５．１３．７  固定化のための基板
本発明の方法においては、固定化のための基板は、当業者に明らかなナノレポーターを選択的に結合させることができるいずれの基板でもあり得る。さらに、ある態様においては、本発明は、伸長された状態で選択的に固定化されたナノレポーターを含む組成物を提供する。該組成物は、伸長された状態のそれに固定化されたナノレポーターを有する本明細書中に記載された基板を含む。ナノレポーターは、勿論、本発明の方法に従って固定化することができる。
【０２４８】
基板の唯一の要件は、それが、前記したナノレポーターの第二の部分に選択的に固定化することができることである。かくして、基板は、ニトロセルロースまたはナイロンのようなフィルターまたは膜、ガラス、ポリアクリルアミドのようなポリマー、アガロース、デキストラン、セルロース、ポリスチレン、ラテックスのようなゲル、あるいは捕獲化合物を固定化することができる当業者に知られたいずれかの他の材料であり得る。基板は、アクリル、スチレンメチルメタクリレートコポリマー、およびエチレン／アクリル酸のような多孔性材料から構成され得る。
【０２４９】
基板は、当該形態がナノレポーターの第二の部分の選択的固定化を妨げる限り、いずれの形態とすることもできる。例えば、基板はディスク、スラブ、ストリップ、ビーズ、サブミクロン粒子、被覆された磁気ビーズ、ゲルパッド、マイクロタイターウェル、スライド、膜、フリット、または当業者に知られた他の形態の形態を有することができる。基板は、所望により、基板上の、またはそれを通っての液体の流動を助ける、クロマトフラフィーカラム、スピンカラム、シリンジバレル、ピペット、ピペットチップ、９６または３８４ウェルプレート、マイクロチャネル、キャピラリー等のようなハウジング内に配置される。
【０２５０】
ナノレポーターは単一の基板に、または複数の基板に固定化することができる。例えば、ある具体例において、第一および第二の部分は、当業者に認識されるように、同一基板に固定化される。ある具体例において、ナノレポーターの第一の部分が第一の基板に固定化することができ、他方、ナノレポーターの第二の部分は第一から区別される第二の基板に固定化することができる。
【０２５１】
基板は、当業者に明らかないずれかの方法に従って調製することができる。反応性基の十分な密度を持つ本発明の例示的基板を活性化するのに用いることができる膨大な技術のレビューについては、Ｗｉｌｅｙ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｂｒｏｄｙ  ＆  Ｍａｒｓｈ，Ｅｄ．，“Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，”ｐｐ．８６７  ８７４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９７）、およびそこに引用された文献を参照されたし。酸化ケイ素基板上にアミノ基を生じさせるのに適した化学的方法は、Ａｔｋｉｎｓｏｎ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，“Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｉｄｅｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｐｈｏｓｐｈｉｔｅ  Ｔｒｉｅｓｔｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄ，”Ｉｎ：Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍ  Ｊ  Ｇａｉｔ，Ｅｄ．，１９８４、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ、特に４５  ４９ページ（およびそこに引用された文献）に記載されており；酸化ケイ素基板上にヒドロキシル基を生じさせるのに適した化学的方法はＰｅａｓｅら、１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：５０２２  ５０２６（およびそこに引用された文献）に記載されており；ポリスチレン、ポリアミドおよびグラフト化ポリスチレンのようなポリマー上に官能基を作成するための化学的方法はＬｌｏｙｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓら、１９９７，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（およびそこに引用された文献）に記載されている。
【０２５２】
例示的な有用な基板はストレプトアビジン、例えば、Ａｃｃｅｌｒ８、ＴＢ０２００で被覆された表面を含む。さらなる有用な基板は、アミンを含むナノレポーターの部分と反応することができるＮ−ヒドロキシスクシンアミドで被覆された表面を含む。１つのそのような表面はＯｐｔＡｒｒａｙ−ＤＮＡ（Ａｃｃｅｌｒ８）である。さらなる有用な表面はアルデヒド（例えば、Ｎｅｘｔｅｒｉｏｎ  Ｓｌｉｄｅ  ＡＬ，Ｓｃｈｏｔｔ）で被覆されており、表面はエポキシ（例えば、Ｎｅｘｔｅｒｉｏｎ  Ｓｌｉｄｅ  Ｅ，Ｓｃｈｏｔｔ）で被覆されている。もう１つの有用な表面は、アビジンまたはストレプトアビジンを含むナノレポーターの部分の選択的固定化で有用なビオチニル化ＢＳＡ被覆表面である。
【０２５３】
５．１３．８  選択的に固定化された、伸長されたまたは配向されたナノレポーターを用いる方法
選択的に固定化された、伸長された、および／または配向されたナノレポーターは、当業者に明らかないずれかの目的で用いることができる。例えば、選択的に固定化された、伸長された、および／または配向されたナノレポーターはナノアセンブリーおよび表面プラズモン共鳴をマッピングするのに有用である。ある具体例において、選択的に固定化された、伸長された、および／または配向されたナノレポーターは種々の技術、例えば、原子間力顕微鏡または電子顕微鏡でマクロ分子のために用いることができる。
【０２５４】
ある具体例において、選択的に固定化された、伸長されたおよび／または配向されたナノレポーターはマクロ分子マッピングで用いることができる。例えば、それらを用いて、例えば、蛍光分子またはＤＮＡ結合蛋白質によって結合の位置またはマクロ分子に沿ってのハイブリダイゼーションを決定することができる。
【０２５５】
ある具体例において、選択的に固定化され、伸長され、および／または配向されたナノレポーターをナノアセンブリーで用いることもできる。例えば、それらを用いて、伸長され、および／または配向されたナノレポーター上での結晶の成長、または伸長された、および／または配向されたマクロ分子に連結され、または結合されたポリペプチド上での結晶成長を容易とすることができる。ある具体例において、選択的に固定化され、伸長され、および／または配向されたマクロ分子はナノ路の構築で用いることができる。ある具体例において、選択的に固定化され、伸長され、および／または配向されたナノレポーターは、キネシンまたはミオシンのような分子モーターを用いて指令された輸送で用いることができる。ある具体例において、選択的に固定化され、伸長され、および／または配向されたナノレポーターは、分子計算のために、またはマクロ分子、例えば、ＤＮＡの計算を含む回路の組立てのために用いることができる。ある具体例において、選択的に固定化され、伸長され、および／または配向されたナノレポーターを用いて、カーボンナノチューブを操作することができる。
【０２５６】
ある具体例において、選択的に固定化され、伸長され、および／または配向されたナノレポーターは、ポリヌクレオチド結合蛋白質の研究で用いることができる。それらを用いて、例えば、ポリヌクレオチドに結合した蛋白質の存在または位置を決定することができる。有用な技術は表面プラズモン共鳴を含む。ある具体例において、選択的に固定化され、伸長され、および／または配向されたナノレポーターは、アミロイド、チチン、およびフィブロネクチンのような蛋白質繊維の研究で用いることができる。
【０２５７】
ある具体例において、選択的に固定化され、伸長され、および／または配向したナノレポーターを用いて、標識の分離および引き続いての検出の目的でマクロ分子バーコードを作成することができる。分子に沿って間隔が設けられたこれらの標識は、ナノレポーターが固定化され、かつ伸長され、および／または配向された場合に読むことができるユニークなコードを提供する。選択的固定化での伸長、および／または配向は、マクロ分子バーコードの解読を容易とすることができる。
【０２５８】
選択的に固定化され、伸長され、および／または配向したナノレポーターは、さらに、ナノレポーターの検出またはイメージングが有用であろういずれかの関係で用いることができる。それらが診断、予後的療法およびスクリーニングの目的で用いることができる。例えば、それらは、患者から得られ、または誘導された生体分子試料の分析に適用して、病気細胞型が試料に存在するか否かを決定し、および／または病気の段階を決定することができる。それらを用いて、試料中の、各々、細菌またはウイルスのマーカーの存在および／または量を決定することによって、病原体感染、例えば、細胞内細菌およびウイルスによる感染を診断することができる。本発明の組成物および方法を用いて、その豊富性が生物学的状態または病気状態、例えば、病気状態の結果としてアップレギュレートされ、またはダウンレギュレートされた血液マーカーを示す標的分子を定量することができる。加えて、本発明の組成物および方法を用いて、患者に対する治療のコースを決定するのを助ける予後情報を供することができる。
【０２５９】
５．１３．９  選択的に固定化され、伸長され、または配向されたナノレポーターを含むキット
本発明は、さらに、本発明の１以上の成分を含むキットを提供する。キットは、例えば、本発明による基板、および基板上に選択的に固定化された１以上の伸長され、および／または配向され、または双方がなされたナノレポーターを含むことができる。キットは、前記したもののような、当業者に明らかにいずれかの目的で用いることができる。
【０２６０】
ある具体例において、本発明は、ナノレポーターの伸長および／または配向、および選択的固定化で有用なキットも提供する。該キットは、固定化のための基板、およびナノレポーターの伸長、および／または配向または固定化を容易とするための１以上の結合パートナーを含むことができる。結合パートナーは、ある具体例において、適当な力でのナノレポーターの伸長、および／または配向で有用な部位を含む。ある具体例において、結合パートナーは、ナノレポーターの表面への固定化または選択的固定化を容易とすることができよう。さらなる具体例において、キットは伸長および／または配向および固定化のためのナノレポーターを含むことができよう。さらなる具体例において、該キットはナノレポーターを伸長させることができるデバイスを含むことができよう。
【０２６１】
５．１４  ナノレポーターの検出
ナノレポーターは、与えられたナノレポーター上の特異的シグナルを検出することができる当該分野で利用可能ないずれの手段によっても検出される。ナノレポーターが蛍光標識されている場合、適当な励起源の適当な考慮を調べてもよい。可能な源は、限定されるものではないが、アークランプ、キセノンランプ、レーザー、光を発するダイオード、またはそのいくつかの組合せを含むことができる。適当な励起源は適当な光学的検出系、例えば、倒立蛍光顕微鏡、エピ−蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡と組合せて用いる。好ましくは、十分な空間的分解能での検出を可能として、ナノレポーター上のスポットの配列を検出することができる顕微鏡が用いられる。
【０２６２】
５．１４．１  顕微鏡および対物レンズの選択
顕微鏡の対物レンズに関する主な考慮は、その開口数（ＮＡ）によって決定される光学的分解能に関する。一般に、ＮＡが大きくなると、光学的分解能は良好となる。必要なＮＡは、好ましくは、δ＝０．６１λ／ＮＡ（δ＝光学的分解能およびλ＝波長）の関係に基づいて少なくとも１．０７である。対物レンズによって集められた光の量はＮＡ４／Ｍａｇ２（Ｍａｇ＝対物レンズの倍率）によって決定される。従って、可能な限り多くの光を集めるためには、高いＮＡおよび低い倍率を持つ対物レンズを選択すべきである。
【０２６３】
５．１４．２  ＣＣＤカメラの選択およびイメージ捕獲技術
ＣＣＤカメラを選択する場合、第一の考慮は、イメージングシステムの最終的分解能を部分的に決定する画素サイズである。所望により、光学的分解能はＣＣＤカメラによって妥協されるべきではない。例えば、もし光学的分解能が６０×倍率後のＣＣＤチップ上の１２．６ないし１８μｍに対応する２１０ないし３００ｎｍであれば、光学的分解能を解決し、維持するためには、各スポットのサンプリングに対して少なくとも２の画素があるべきである。あるいは、ＣＣＤチップの画素サイズはせいぜい６．３ないし９μｍとすべきである。
【０２６４】
第二の考慮は、限定されるものではないが、画素サイズ、量子効率、リードアウトノイズおよび暗いノイズを含む多くの因子によって決定できる検出感度である。高い感度を達成するためには、（大きな収集面積を与えることができる）大きな画素サイズ、高い量子効率および低いノイズを持つ定性的カメラを選択する。これらの基準を持つ例示的カメラはＨａｍａｍａｔｓｕ  Ｉｎｃ．からのＯｒｅａ−Ａｇカメラである。
【０２６５】
５．１５  コンピューターシステム
本発明は、ナノレポーターのイメージ収集を自動化し、ナノレポーター同定を行い、および／またはナノレポーターコードを解読することに用いるコンピューターシステムを提供する。具体的には、本発明は、以下に記載された１以上のプログラムを実行する種々のコンピューターシステムを提供する（例えば、データ記憶モジュール４４、標識同定モジュール５０、プローブ同定モジュール５４）。コンピューターシステムは、基板上に結合したナノレポーターの光イメージを撮影するカメラを制御することができる。次いで、これらの光イメージは、本発明のコンピューターによって用いられ、ナノレポーターが同定され、解読される。
【０２６６】
図９は、本明細書中に記載された機能性を裏付ける例示的システムを詳細に示す。該システムは、好ましくは：
−中央プロセッシングユニット２２；
−主な不揮発性記憶ユニット１４、例えば、ソフトウェアおよびデータ、コントローラー１２によって制御された記憶ユニット１４を記憶するためのハードディスクドライブ；
−システム制御プログラム、データ、およびアプリケーションプログラムを記憶し、および不揮発性記憶ユニット１４からロードされたプログラムおよびデータを含むシステムメモリー３６、好ましくは高速ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）；システムメモリー３６は読出専用メモリー（ＲＯＭ）も含むことができ；
−１以上の入力デバイス（例えば、キーボード２８）およびディスプレイ２６または他の出力デバイスを含むユーザーインターフェース３２；
−ディテクター７２および、所望により、いずれかのワイヤードまたはワイヤレス通信ネットワーク３４に連結するためのネットワークインターフェースカード２０または他の通信回路（例えば、インターネットまたはいずれかのワイドエリアネットワーク）；
−システムの前記エレメントを相互結合させるための内部バス３０；および
−前記したエレメントに電力を与えるための電力源２４
を有するコンピューターシステム１０である。
【０２６７】
コンピューターシステム１０の操作は、中央プロセッシングユニット２２によって実行されるオペレーティングシステム４０によって主として制御される。オペレーティングシステム４０は、システムメモリー３６に記憶することができる。オペレーティングシステム４０に加えて典型的な実施においては、システムメモリー３６は以下のうち１以上を含むことができる：
−本発明によって用いられる種々のファイルおよびデータ構造に対するアクセスを制御するためのファイルシステム４２；
−複数の光イメージ４６を記憶するための指令を含むデータ記憶モジュール４４；
−基板上で相互に近接する複数の光イメージ中の複数の標識５２を同定するための標識同定モジュール５０、ここに、該複数の標識の空間的順序は複数の標識のストリング配列を決定し；
−複数の標識のストリング配列が有効なレポーター配列を含むか否かを決定するためのプローブ同定モジュール５４；および
−複数の有効なレポーター配列５８を含む参照テーブル５６。
【０２６８】
図９に示すように、コンピューターシステム１０はソフトウェアプログラムモジュールおよびデータ構造を含む。コンピューターシステム１０に記憶されたデータ構造は、例えば、イメージ４６、標識５２、および参照テーブル５６を含む。これらのデータ構造の各々は、限定されるものではないが、フラットなＡＳＣＩＩまたはバイナリーファイル、ＥＸＣＥＬスプレッドシート、リレーショナルデータベース（ＳＱＬ）、オンライン分析処理（ＯＬＡＰ）データベース（ＭＤＸおよび／またはその変形）、またはコンマセパレーテッドバリューファイルを含めたいずれかのデータ記憶形態を含むことができる。いくつかの具体例において、図９に示されたデータ構造およびソフトウェアモジュールはコンピューターシステム１０に収容されておらず、むしろ、ネットワーク３４を介してコンピューターシステム１０との電気的通信を行うコンピュータ、または記憶デバイスの他のタイプに収容される。
【０２６９】
本発明の態様は、コンピュータ読取り可能記憶媒体（例えば、メモリー３６、記憶ユニット１４、および／または、他のコンピュータ読取り可能記憶媒体）およびその中に内蔵されたコンピュータープログラムメカニズムを含むコンピュータープログラム製品を提供する。コンピュータープログラムメカニズムは、基板上に置かれた試料内のプローブの存在を検出するためのものである。前記したように、プローブは、与えられたナノレポーターの１以上の標識付着領域における複数の空間的に配置された標識モノマーを含む。与えられたナノレポーターの骨格の種々の標識付着領域に関連する標識モノマーによって発せられたシグナルの配列は、ナノレポータのユニークな同定を可能とする。コンピュータープログラムメカニズムは、データ記憶モジュール４４、標識同定モジュール５０、およびプローブ同定モジュール５４を含む。
【０２７０】
データ記憶モジュール４４。データ記憶モジュール４４は複数の光イメージ４６を記憶するための指令を含む。複数の光イメージにおける各光イメージは、基板の上に置かれた試料から発せられた光からのものである。代表的な生物学的試料は、前記セクション５．１０に記載されている。代表的な基板は、セクション５．１３．７に記載されている。典型的な具体例においては、複数の光イメージ中の各光イメージは、基板の一部の、ディテクター７２によって撮られたスキャンである。例示的なディテクター７２は、セクション５．１４．２に記載されている。非限定的な例示的ディテクター７２はＨａｍａｍａｔｓｕ  Ｉｎｃ．からのＯｒｃａ−Ａｇカメラである。各光イメージは、ナノレポーターを含有する試料が置かれた基板の、ディテクター７２によって撮られた写真である。各光イメージは、複数の異なる波長範囲における対応する波長範囲の試料からの光を記録する。言い換えれば、各光イメージは選択された波長範囲における光を測定する。いくつかの具体例において、光イメージの波長範囲は、ディテクター７２によって受け取られた光を濾過する光フィルターの仕様によって決定される。フィルターは、特定の波長範囲内にない光を効果的にブロックする。現実的には、複数の光イメージを撮り、複数の光イメージにおける各光イメージは、複数の異なるフィルターから選択されたフィルターを用いて撮られる。いくつかの具体例において、２以上の光イメージ、３以上の光イメージ、４以上の光イメージ、５以上の光イメージ、６以上の光イメージ、７以上の光イメージ、８以上の光イメージ、９以上の光イメージまたは１０以上の光イメージ、２と２０の間の光イメージ、２と１００の間の光イメージ、または３０未満の光イメージを撮る。光を所定の波長範囲に制限するフィルターは商業的に入手可能である。商業的に入手可能なフィルターの非限定的例は、Ｃｈｒｏｍａ  Ｉｎｃ．によるＨＱ４８０／４０、Ｑ５０５ＬＰ、ＨＱ５３５／５０、ＨＱ５４５／３０ｘ、５７０ＬＰ、ＨＱ５８７／３０ｍ、ＨＱ６３０／２０、Ｑ６４９ＬＰ、およびＨＱ６５５ＬＰである。複数の異なる波長範囲における例示的な波長範囲は、例えば、４８５ｎｍと５８５ｎｍの間の波長範囲、５５７ｎｍと６１７ｎｍの間の波長範囲、６３７ｎｍと６９７ｎｍの間の波長範囲、５１０ｎｍと６５０ｎｍの間の波長範囲、５８６ｎｍと６５８ｎｍの間の波長範囲、５１５ｎｍと５７５ｎｍの間の波長範囲、および４４０ｎｍと５２０ｎｍの間の波長範囲であり得る。多くの他の波長範囲が、前記した波長範囲のいくつか、または全てに加えて、またはその代わりに用いることができる。
【０２７１】
いくつかの具体例において、複数の異なる波長範囲が、２と６の間の異なる波長範囲、２と２０の間の異なる波長範囲、１０を超える異なる波長範囲、２０を超える異なる波長範囲、３０を超える異なる波長範囲、４０を超える異なる波長範囲、１００を超える異なる波長範囲、または５０未満の異なる波長範囲よりなる。いくつかの具体例において各波長範囲は異なる色を表す。いくつかの具体例において、異なる波長範囲の間にはある程度の重複がある。いくつかの具体例において、異なる波長範囲の間には重複はない。
【０２７２】
本発明の利点は、本発明のナノレポーターが、マイクロアレイ技術の場合のような基板上の所定の位置に重ねられるとの要件がないことである。本発明のナノレポーターは基板上の所定の位置に付着されるように特殊化された基板を調整できるが、好ましい具体例においては、ナノストリングが基板に付着される位置は全くランダムである。さらに、好ましい具体例において、決定すべき必要がある全ては、基板上のナノレポーターの同一性である。かくして、シグナルは、ナノレポーター同定の目的で基板から測定される。それにより、後に記載するソフトウェアモジュールを用いる好ましい具体例においては、シグナルがバイナリー様式（例えば、与えられた波長の不存在または存在）で処理される。いくつかの具体例においては、基板上のナノレポーターの位置がランダムであるのみならず、向きもそうである。基板上のナノレポーター配向がランダムである場合においてさえ、後に記載するソフトウェアモジュールはナノレポーターを同定することができる。本発明のもう１つの利点は、基板の複数の領域を複合光イメージとして結合（ステッチ）処理させる要件がないことである。基板の多数の光イメージが撮られるが、これらの光イメージの各々は、単に異なる波長において、基板の同一領域からのものである。
【０２７３】
いくつかの具体例において、標識は多数の波長（例えば、赤色および青色）において蛍光を発する。そのような具体例において、後に記載される標識同定モジュールは、多数の光イメージにおいて基板上の同一位置のスポットを測定することによって、そのような標識を検出する。強度基準をそのような場合に用いることができる。例えば、（ｉ）試料によって発せられた青色光を記憶する光イメージにおいて最小青色強度が観察されること、および（ｉ）最小赤色強度が、試料によって発せられる赤色光を記憶する光イメージにおいて同一スポットで観察されることという要件を課すことができよう。
【０２７４】
標識同定モジュール５０。標識同定モジュール５０は、基板上で相互に近接する、複数の光イメージ４６における、複数の標識（標識モノマー）を同定するための指令を含む。典型的な具体例において、ナノレポーターにおける各標識は、１以上の光イメージ４６において対応する明るいスポットを出現させる光を発するであろう。各光イメージ４６は、数ダース、数百、数千さえのスポットを有することがあり、ここに、各スポットはナノレポーター中の標識を表す。標識同定モジュール５０は、光イメージ中のこれらのスポットが、後に詳細に記載する具体的基準が満足される場合に標識であるとみなす。
【０２７５】
標識同定モジュール５０は、これらの標識が異なる光イメージに出現する場合さえ、基板上で相互に近接する標識を同定することができる。例えば、標識１（光モノマー１）および標識２（光モノマー２）は同一ナノレポーターにおけるものであって、基板上で空間的に近接する場合を考える。さらに、標識１および標識２は異なる波長範囲内の光を発すると考える。かくして、この例においては、標識１によって、および標識２によって発せられる光は、異なる光イメージ、例えば、各々、光イメージＡおよび光イメージＢに記録される。いくつかの具体例において標識１の光発光は光イメージＡにおいて明るい強度のスポットとして記録され、他方標識２の光発光は光イメージＢにおいて明るい強度のスポットとして記録される。本実施例において標識同定モジュール５０は光イメージＡと光イメージＢとを重ね合わせる。光イメージＡおよび光イメージＢは、共に、基板の同一領域を網羅する。基板のこの領域は、いくつかのナノレポーターを含むことができる。事実、基板のイメージＡおよび光イメージＢによって網羅される基板のこの領域は、数百または数千さえのナノレポーターを含む。従って、光イメージＡおよび光イメージＢは各々潜在的に数ダース、数百、または数千さえの標識を記録することができ、ここに、各そのような標識は例えば、光イメージＡ、光イメージＢ、またはディテクター７２によって撮られた、いくつかの他の光イメージ内の明るいスポットとして出現する。光イメージＡおよび光イメージＢは、記録される波長範囲だけが異なるに過ぎない。光イメージＡおよび光イメージＢは空間的に相互に重なる故に、標識同定モジュール５０は、重なった光イメージにおける標識１および標識２の空間的近接性に基づいて標識１および標識２が異なる光イメージに由来するとしても標識１および標識２の空間的近接性を同定することができる。
【０２７６】
光イメージ４６によって表される各波長範囲は、ナノストリングにおける１以上の標識モノマーによって発せられる特定の色を測定することを意図する。いくつかの具体例において、波長範囲は、１０ｎｍまで、２０ｎｍまで、３０ｎｍまで、４０ｎｍまで、５０ｎｍまで、６０ｎｍまで、７０ｎｍまで、８０ｎｍまで、９０ｎｍまで、または１００ｎｍまでのスペクトルを有する波長の連続組を含む。
【０２７７】
いくつかの具体例において、標識同定モジュール５０が、基点を用いて光イメージを整列させる。基点の非限定的例は染料の多くの異なるタイプを含浸させたラテックスビーズである。基点の１つの例は、ＭｕｌｔｉＳｐｅｃｋ（商標）マルチスペクトル蛍光顕微鏡測定キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ）である。ＭｕｌｔｉＳｐｅｃｋ（商標）マルチスペクトル蛍光顕微鏡測定標準キットは、異なる機器にて、および異なる研究所において、異なるオプティックスで収集したイメージを比較するためのならびに機器性能におけるルーチン日間変動をモニターするための外部参照として市販されている。該キットは、サブミクロン−直径マイクロスフィアーの２つの懸濁液を含む。最初の懸濁液、ＭｕｌｔｉＳｐｅｃｋ懸濁液は、全てが同一粒子において、３つの比較的区別される励起および発光バンド、赤色、緑色、および青色を呈するマルチスペクトル蛍光マイクロスフィアーから構成される。紫外光で励起した場合、各球は青色蛍光を発し、他方、フルオレセインまたはローダミン−テキサスレッド（登録商標）励起フィルターを用いる場合、球は、各々、フルオレセインまたはローダミン−テキサスレッド発光と同様な波長において蛍光を発する。さらに単一のマルチスペクトルマイクロスフィアーは、観察で用いるフィルターに依存して、異なる色を発現するので、これらのマイクロスフィアーは多数の波長を横断してイメージ登録して用いることができる。かくして、マルチパラメーター実験における多数の標識の空間的関係の正確な決定を可能とする。第二の懸濁液、ＲＧＢミックス懸濁液は、別々の粒子ではあるものの、マルチスペクトルマイクロスフィアーとして、同一の３つの励起／発光バンド、赤色、緑色および青色ＲＧＢを呈する（単一−バンド）マイクロスフィアーの混合物から構成される。かくして、基点は、いくつかの異なる波長に渡って光を発するであろう。基点は、試料と共に基板上にランダムに配置される。基点は広い範囲のスペクトル周波数に渡って光を発するので、それらは、複数の光イメージの全てではないにせよ、そのいくつかに存在する。かくして、標識同定モジュール５０は、光イメージが基板の同一領域のものである（例えば、同一の視野）場合に、光イメージに存在する基点スポットを用いて相互に対して、複数のイメージにおける光イメージの全てではないにせよほとんどを整列させることができる。
【０２７８】
複数の標識の空間的順序は、複数の標識のストリング配列を決定する。例えば、標識モノマーの以下のストリング：赤色−赤色−緑色−青色が基板上で検出される場合を考える。基板上のこれらの標識モノマーの空間的順序は、プローブの可能性があるストリング配列を述べている。かくして、もし、一連の配置された標識モノマーが一連の配置：赤色−赤色−緑色−青色を持つ基板上で検出されたならば、一連の配置された標識モノマーはストリング配列：ＲＲＧＢを形成し、ここにＲは赤色を表し、Ｇは緑色を表し、Ｂは青色を表す。ストリング配列ＲＲＧＢは、潜在的に有効なプローブのストリング配列である。
【０２７９】
本発明は、プローブで用いることができる広い範囲の異なる標識を含む。いくつかの具体例において、複数の空間的に配置された標識における各標識は４つの異なる波長範囲：赤色波長範囲、緑色波長範囲、青色波長範囲、またはブランク（発光なし）の１つにおいて光を発することができる。いくつかの具体例において、複数の空間的に配置された標識における各標識は、５つの異なる波長範囲、６つの異なる波長範囲、７つの異なる波長範囲、８つの異なる波長範囲、９つの異なる波長範囲、１０の異なる波長範囲、５と１５の間の異なる波長範囲、４と２０の間の異なる波長範囲、３と４０の間の異なる波長範囲、３０を超える異なる波長範囲、または１００未満の異なる波長範囲の１つにおいて光を発することができる。さらに、本発明は与えられたプローブに存在する標識（標識モノマー）の数に対して制限を課さない。いくつかの具体例において、プローブ中の２と１００の間の標識、プローブ中の２と１０００の間の標識、プローブ中の２と２０の間の標識、プローブ中の３と４０の間の標識、プローブ中の５を超える標識、プローブ中の６を超える標識、プローブ中の７を超える標識、プローブ中の１０を超える標識、またはプローブ中の５０未満の標識がある。
【０２８０】
標識同定モジュール５０は、基板上の標識の空間的順序を決定する。これを達成するために、イメージにおける複数の標識を同定する。典型的な具体例において、イメージされる基板の一部上に１を超えるプローブがあり、各々のそのようなプローブは、光イメージにおける、対応するスポットを生じさせる複数の空間的に配置された標識を有する。いくつかの具体例において、イメージされるべき基板の部分には、２と１０，０００の間のプローブがある。かくして、標識同定モジュール５０は、イメージ中のいずれのスポットが標識であるかを決定しなければならず、ならびに単一のプローブに各々属する標識の組を同定しなければならない。この仕事は、プローブが基板にランダムに結合する好ましい具体例においてはより複雑とされる。
【０２８１】
いくつかの具体例において、標識同定モジュール５０は、まず、光イメージにおける標識を確証する。次いで、標識同定モジュール５０は、複数の標識における標識のいずれが同一プローブに属するかを１以上の規則を用いて決定する処理を行なう。いくつかの具体例において標識同定モジュールは、まず、複数の光イメージにおいてスポットを励起させる複数の候補標識を同定する。複数の候補標識における各候補標識は、複数の光イメージにおける１以上の光イメージで閾値量を超える光を発する基板上の位置を含む。いくつかの具体例において、複数の標識は、複数の異なる波長における第一の波長において光を発する第一の候補標識、および複数の異なる波長における第二の波長において光を発する複数の標識中の第二の候補標識を含む。いくつかの具体例において候補標識は、それが複数の光イメージにおけるいずれか１つの光イメージにおいて閾値量を超える光を発する場合、有効な標識と見なされる。いくつかの具体例において、標識同定モジュール５０は、標識がスポットの形状基準（例えば、候補標識の観察されたスポット形状と候補標識の倍率によって決定された回折制限点源光の理論的点広がりの間のマッチ）を満足する場合、候補標識は有効な標識であることを確証する。いくつかの具体例において、標識同定モジュール５０は、点広がり関数モデリングを用いて候補標識が有効な標識であることを確証する。いくつかの具体例において、標識同定モジュール５０はスポットセグメント化アルゴリズム（例えば、分岐点変換）を用いて候補標識を確証する。分岐点変換は、ここに引用してその全体を援用する。Ｖｉｎｃｅｎｔ  ａｎｄ  Ｓｏｉｌｌｅ，１９９１，ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ  １３，ｐｐ．５８３−５９８に記載されている。
【０２８２】
いくつかの具体例において、標識同定モジュール５０は、標識がスポット形状基準（例えば、標識の観察されたスポット形状と標識が観察されるイメージにおける標識の倍率によって決定される回折制限点源光の理論的点広がりの間のマッチ）を満足する場合に、候補標識が有効な標識であることを確証する。いくつかの具体例において、スポット形状基準は、広がり関数モデリングを用いて評価する。いくつかの具体例において、スポットセグメント化アルゴリズム（例えば、分岐点変換）を用いてスポット形状基準が評価される。分岐点変換の例示適用はここに引用してその全体を援用する、Ｐａｒｋら、２００４，“Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｗａｔｅｒｓｈｅｄ  Ｔｒａｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，”Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  １７ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，ｖｏｌｕｍｅ  ３，ｐａｇｅｓ  ７８６−７８９に記載されている。
【０２８３】
いくつかの具体例において、複数の光イメージ中の光イメージにおける候補標識についての標識同定モジュール５０によって、イメージセグメント化工程を行って、いずれの画素が標識によって生じた光イメージにおいてスポットを形成するか、いずれの画素がバックグラウンドを形成するか、およびいずれの画素が単なるノイズまたは人工物であって排除すべきかが決定される。いくつかの具体例において、純粋な空間−ベースのシグナルセグメント化アプローチは標識同定モジュール５０によって用いられ、ここに円は標識によって生じたスポット上に置かれる。このアプローチにおいて、この円内の全ての画素は、スポットの一部としてカウントされ、該円の外部の全ての画素を用いてバックグラウンドを計算する。２つの円の間の画素は、スポットおよびそのバックグラウンドの間の転移領域に対応し、それを捨てて、データの質を改善する。このアプローチにおいて、所定の四角の境界内の円の外側の全ての画素はバックグラウンドと考えられる。
【０２８４】
いくつかの具体例において、強度ベースのセグメント化は標識同定モジュール５０によって用いられて、候補標識を確証する。このカテゴリーにおける方法は、強度情報を専ら用いて、バックグラウンドからシグナル画素をセグメント化する。そのようなアプローチでは、シグナル画素がバックグラウンド画素よりも平均して明るいと仮定する。例として、光イメージから取られたスポットの周りの標的領域は４０×４０画素よりなる。スポットは直径が約２０画素である。かくして、領域における合計１６００（４０×４０）画素のうち、約３１４（円の面積はπｒ２（式中、ｒは半径を表し、直径の半分である）なのでπ×１０２）画素、または２０％はシグナル画素であって、それらはバックグラウンド画素の強度より高い強度を有すると予測される。これらのシグナル画素を同定するためには標的領域からの全ての画素が、最低強度画素から最高強度の画素まで１次元アレイの順序とされる｛ｐ１，ｐ２，ｐ３，．．．，ｐ２５００｝。ここに、ｐｉは全ての画素内のｉ番目に低い強度の画素の強度値である。もし標的領域に汚染がなければ、強度ランクにおけるトップの２０％画素がシグナル画素として分類することができる。いくつかの具体例において、もし強度ベースセグメント化アプローチによって測定された強度が閾値を超えるならば、スポットはただ有効と考えられる。しかしながら、本発明においては、スポットのサイズは、直径において、典型的には、実質的に２０未満の画素であるが、記載された方法は依然として適用可能である。
【０２８５】
いくつかの具体例において、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙセグメント化は標識同定モジュール５０によって用いられて、候補標識を確証する。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙセグメント化は、ここに引用してその全体を援用する、Ｄｒａｇｈｉｃｉ，２００３，Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ，Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ／ＣＲＣ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．４７に記載されている。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙセグメント化アプローチは、空間的情報の使用と幾らかの強度ベースの分析とを組み合せる。標識同定モジュール５０によって行われたスポット発見操作の結果に基づいて、円は、スポットが見出されることが予測される領域を含む標的領域に配置される。円の外側の画素はバックグラウンドであると仮定されるので、これらのバックグラウンド画素の統計学的特性を用いて、円内部のいずれの画素がシグナル画素であるかを決定することができる。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙテストを用いて、たとえそれがスポットの予測される領域内にあっても、他の画素（例えば、バックグラウンド）からシグナル画素を分離する閾値強度レベルを得る。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙテストは、ここに引用してその全体を援用する、Ｓｍｉｔｈ，１９９１，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｒｅａｓｏｎｉｎｇ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｌｌｙｎ  ａｎｄ  Ｂａｃｏｎ，Ｂｏｓｔｏｎ，ｐｐ．７２４−７３０に記載されている、閾値強度よりも高い強度を有する円の内側の画素はシグナルとして処理される。いくつかの具体例において、もしＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙセグメント化アプローチにより計測された強度が閾値を超えるならば、スポットはただ有効と考えられる。
【０２８６】
いくつかの具体例において、組み合わせた強度−空間セグメント化手法（トリミングした測定アプローチ）が標識同定モジュール５０によって用いられて、候補標識を確証する。このアプローチは、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙアプローチと同様にして、バックグラウンドからのシグナル画素をセグメント化するにおける空間的および強度情報の双方を組み合わせる。このアプローチにおいては、一旦標識についてのスポットが標識同定モジュール５０によって突き止められ、かつ標的円が標的領域に入れられたならば、該円の内部の画素のほとんどはシグナル画素であって、該円の外部の画素の殆どはバックグラウンドであるとの仮定が採用される。しかしながら、スポット形状の不規則性のため、いくつかのシグナル画素は該円から漏出し、いくらかのバックグラウンド画素が円に入ってもよい。該円内のバックグランド画素が、シグナル画素の強度分布において異常値と考えることができる。同様に、該円の外側にあるシグナル画素もまた、バックグラウンド画素の強度分布に関しては異常値として出現する。汚染画素は、いずれかの箇所において、シグナルおよびバックグランド双方についての強度ドメインにおいて異常値として出現する。これらの異常値は、もしそれを排除しなければ、平均および合計シグナル強度の測定を酷く変化させるであろう。これらの測定に対する異常値の効果を除去するためには、標識同定モジュール５０のいくつかの具体例では、シグナルおよびバックグラウンドの双方の領域についての画素の強度分布から画素の固定されたパーセンテージを単に「トリミングにより除く」とすることができる。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙアプローチは、推定されるスポット領域の外側にある画素についての統計学的解析を行い、次いで、そこで計算された閾値を用いて、標的領域内部の画素をセグメント化する。トリミングされた測定アプローチは、双方の分布（推定されるスポットの外側ならびに内側）の統計学的解析を行い、外側の分布の特徴は内側の分布の特性も反映するであろうという賭けをすることなく、各そのような分布から異常値を独立して排除する。各分布のほぼ５ないし１０％を排除することは、このアプローチが、ダスト粒子および他の不純物のような人工物に対して対処するのを可能とする。好ましい具体例において、標識同定モジュール５０は、イメージにおける標識に対応するスポットの強度を定量する必要はない。しかしながら、いくつかの具体例において、標識の強度は、限定されるものではないが、合計シグナル強度、平均シグナル強度、およびメジアンシグナル強度を含めた、当該分野で知られたいずれかの定量技術を用いて定量される。例示的な定量技術は、ここに引用してその全体を援用する、Ｄｒａｇｈｉｃｉ，２００３，Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ，Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ／ＣＲＣ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ３．４．３に記載されている。
【０２８７】
前記技術は、複数の候補標識を同定し、これらの候補標識の全てまたはいくつかを確証する。これらをスポットレベル則という。いくつかの具体例において、有効であるためには、標識についてのスポットは、回折制限点源光の理論的点広がり関数とマッチすることが必要である。スポットは、例えば、分岐点変換によって同定することができる。いくつかの具体例において、回折制限を超えるスポットが記録される。次に、光イメージにおいて１を超えるプローブがあり得る故に、標識同定モジュール５０は、プローブ人工物についての先験的知識に適用されて、いずれの確証されたレベルが同一プローブに属するかを決定する。本質的には、この先験的知識を用いて、そのプローブが光イメージにおいてそのように見えるはずであるモデルを形成する。次いで、このモデルを、標識の所与の組が所与のプローブに属することを確証するのに用いることができるレポーターレベル則の組に変形することができる。そのような規則の例には、１つのスポットの重心ともう１つのスポットの重心との間の距離基準を適用すること、および同一プローブに属すると考えられるスポットが閾値量を超える角度を形成しないという要件が含まれる。本質的には、予測されるモデルが、観察された確証標識にフィットさせられる。いくつかの具体例において、プローブについて予測されるモデルにフィットさせた場合に最少量の誤差を与える標識の組は、同一プローブに属すると見なされる。
【０２８８】
いくつかの具体例において、モデルを処方するのに用いる先験的知識は、同一プローブに属する標識が直線状に配置されるという予測である。いくつかの具体例において、標識の組を線形回帰に付して、標識の組が直線状に配置されるかを決定する。もし線形回帰が満足されれば、他の規則を適用して、標識の組が同一プローブに属することをさらに確証することができる。いくつかの具体例において、標識の組は、もしそれが線形回帰モデル基準にフィットすれば、直線状と考えられる。いくつかの具体例において、標識の組は、回帰モデルについてのＲ−値が０．９以上である場合に、線形回帰モデル基準にフィットすると考えられる。いくつかの具体例において、本明細書中で記載されたように、実験条件が課されて（例えば、電場）プローブが直線的に配置されることを保証する。いくつかの具体例において、プローブが直線状に配置されず、予測されるプローブ曲率を取込んだより複雑なモデルが誘導される。いくつかの具体例において、基板上のプローブの直線方向は未知である（例えば、予め決定されていない）。いくつかの具体例において、基板上のプローブの直線的向きは知られていない（例えば、予め決定されていない）。各そのような具体例において、この先験的知識を用いて、モデルを形成する。プローブの形状（例えば、直線状、曲がった、所定の向きにおいて直線状）に関する規則に加えて、標識スペーシングについての規則がある。スペーシング則は、標識の組における標識の間の距離に対して拘束を課す。規則のさらなるタイプは、レポーターを構成するスポットの形状に関する。スポットの形状は、スポットを突き止め、スポット強度を測定するように設計されたアルゴリズムと組合せて先に議論されている（例えば、観察されたスポット形状と、標識の倍率、点広がり関数モデリング、分岐点変換のようなスポットセグメント化アルゴリズムによって決定された回折制限点源光の理論的点広がりとの間のマッチ）。
【０２８９】
いくつかの具体例において、同一プローブに属する標識を同定するのに用いるモデルは、プローブ中の各標識の間のスペーシングは規定された範囲と同等であるか、または該範囲内であることを要求する。１つの例において、モデルは、（ｉ）プローブについての標識は直線的に配置され、および（ｉｉ）標識は相互から４５０ｎｍと５５０ｎｍの間、離れて間隔が設けられるという規則を含む。いくつかの具体例において、同一プローブに属する標識を同定するのに用いるモデルは、標識が同等間隔に設けられるという要件を課さない。事実、いくつかの具体例において、プローブ同一性についての情報は、プローブスポットの間の等しくない間隔の形態でコード化される。さらに、いくつかの具体例において、プローブによってコードされるストリング配列は、複数の光イメージにおいて測定された波長のいずれもにおける光を発しないスペーサー標識モノマーを含む。本発明は、標識モノマーの間の間隔に対して拘束を課さない。しかしながら、一旦ナノレポーターが合成されれば、ナノレポーターについての先験的知識を用いて、モデルを構築することができる。従って、いくつかの具体例において、モデルは、同一プローブに属する標識が相互から１００ｎｍと１５０ｎｍの間、相互から１５０ｎｍと２００ｎｍの間、相互から２００ｎｍと２５０ｎｍの間、相互から２５０ｎｍと３００ｎｍの間、相互から３５０ｎｍと４００ｎｍの間、相互から４００ｎｍと４５０ｎｍの間、相互から４５０ｎｍと５００ｎｍの間、相互から５００ｎｍと５５０ｎｍの間、または相互から５５０ｎｍと６００ｎｍの間の間隔とされるという拘束を課す。いくつかの具体例において、標識モノマーの間の間隔は等しくないが、知られている。例えば、１つの４−標識ナノストリングにおいては、第一の標識および第二の標識の間の間隔は４００ｎｍであり、第二の標識および第三の標識の間の間隔は７５０ｎｍであって、第三の標識および第四の標識の間の間隔は６２５ｎｍである。この間隔の情報は、ナノストリングのこのクラスについてのモデルを構築するにおいて考慮されるであろう。
【０２９０】
標識が同等に間隔が設けられるモデルにおいては、モデルは、観察された標識にフィットされ、もし観察された標識が所定の許容性内に入れば、モデルは満足される。いくつかの具体例において、同一プローブに属する標識を同定するのに用いるモデルは角度規則を含む。例えば、４標識ナノストリングの場合を考える。いくつかの具体例において、このナノストリングに対するモデルは、ナノストリングにおける３つのモデルが、最大の許容できる角度拘束よりも大きな角度を形成しないように、最大許容角度拘束を課す。
【０２９１】
いくつかの具体例において、標識同定モジュールは、複数の標識における、第一の標識の重心と第二の標識の重心の間の第一の距離基準を適用する。いくつかの具体例において、第一の距離基準は、プローブにおける、第一の標識と第二の標識の間の計算された距離によって決定される。いくつかの具体例において、標識同定モジュールは、複数のラベルにおける、第二の標識の重心と第三の標識の重心の間の第二の距離基準を適用する。第二の距離基準は、例えば、プローブにおける、第二の標識と第三の標識の間の計算された距離によって決定することができる。いくつかの具体例において、第一の距離の基準は、第二の距離の基準と同一である。いくつかの具体例において、第一の距離基準は第二の距離基準とは異なる。いくつかの具体例において、第一の距離基準の値、および第二の距離基準の値は、複数の標識がプローブであるか否かを決定するのに寄与する。
【０２９２】
いくつかの具体例において、複数の標識を同定するための指令は、標識を選択した基板の部分の周りのバッファーゾーンを同定するための指令を含む。バッファーゾーンは標識を含有しない基板の領域である。バッファーゾーンは、標識の組を有する基板の部分を囲う。標識の組の周りのバッファーゾーンの同定は、バッファーゾーンによって囲われる標識の組が、事実、プローブに潜在的に対応する標識の組であることを保証する。もし標識の与えられた組の周りのバッファーゾーンが同定できないならば、標識の与えられた組は、潜在的に、基板上で相互に近接する２以上のプローブからのものである。これは望ましい結果ではない。なぜならば、それは適切なプローブの同定に至らないからである。したがって、バッファーゾーン基準の使用は、標識の与えられた組が単一プローブに属することを確実とするのを助けることができる。事実、いくつかの具体例において、基板上で同定された標識の組は、標識の組の回りにバッファーゾーンがあるのでなければ、確証された標識であるとは考えられない。かくして、いくつかの具体例において、標識の組は、バッファーゾーン基準が満足されるのでなければ、かつ満足されるまで、依然として、「候補」標識と考えることができる。いくつかの具体例において、バッファーゾーンは、それがありうべきプローブを現すスポットの直線状アレイの周りにフィットするような形状で伸びている。
【０２９３】
プローブ同定モジュール５４。一旦標識同定モジュール５０が基板上の候補プローブを同定するならば、プローブ同定モジュール５４は、同定された候補プローブの標識によって規定されるストリング配列が有効なレポーター配列を構成するか否かを決定する。複数の標識のストリング配列が有効なレポーター配列として確認される場合、複数の標識はプローブであると見なされる。複数の標識のストリング配列が有効なレポーター配列として確認されない場合、複数の標識はプローブではないと見なされる。そのような具体例において、プローブ同定モジュール５４は、複数の標識のストリング配列を比較して、参照テーブル中のレポーター配列を確証する。好ましい具体例において、参照テーブルは全ての可能な有効ストリング配列のリストを含む。参照テーブルの背後にある前提は、ストリング配列の可能な組のいくつかのみが現実には使用されるということである。例えば、ナノストリング（プローブ）が４つの標識モノマーで構築され、各標識モノマーが４つの異なる色（例えば、赤色、緑色、青色およびブランク）の１つを採用できる場合を考える。この場合において、４４＝６４の可能なストリング配列がある。これらのストリング配列の２０のみが、現実に、基板に暴露された試料で用いられると言う。そのような具体例において、参照テーブルにこれらの２０のストリング配列を装着する。もし標識同定モジュール５０が、これらの２０のストリング配列の１つにマッチするストリング配列を有する基板上のプローブを同定するならば、プローブは確証されるであろう。もし標識同定モジュール５０が、これらの２０のストリング配列の１つにマッチしないストリング配列を有する基板上のプローブを同定するならば、プローブは人工物質として捨てられるであろう。多くの具体例において、参照テーブルにおけるストリング配列の数は、ストリング配列の可能な数の小さな割合である。この状態は、有効なプローブのみが基板上で同定されることを確実とするのを助ける。いくつかの具体例において、プローブは７つの標識を有し、各標識は、合計７４の異なるストリング配列についての４つの異なる色の１つを採用し、その小さな割合を用いて、現実のナノレポーターを構築する。いくつかの具体例において、プローブは２０の標識を有し、各標識は合計２０２０の異なる有効レポーター配列についての２０の異なる色の１つを採用し、その小さな割合を用いて、現実のナノレポーターを構築する。これらの例示的な具体例は、本発明のいくつかの具体例の寸法を示すように単に働く。先に示したように、標識のより大きな範囲を、与えられたナノレポーターで用いることができ、各そのような標識は多くの異なる色を採用することができる。いくつかの具体例において、プローブにおいて２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上の標識があり、各標識は２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の異なる色のいずれか１つを採用することができる。いくつかの具体例において、プローブにおいて２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の標識があり、各標識は２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の異なる色のいずれか２つを採用することができる。いくつかの具体例において、プローブにおいて２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の標識があり、各標識は３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の異なる色のいずれか３つを採用することができる。いくつかの具体例において、プローブにおいて２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の標識があり、各標識は複数の色における多数の色（例えば、２つの色、３つの色、４つの色）を採用することができる。いくつかの具体例において、この複数の色は５以上の色、６以上の色、７以上の色、７と１００の間の色、または２０を超える色よりなる。いくつかの具体例において、色は区別される波長範囲（例えば、３４０ｎｍないし３５０ｎｍ、３５５ｎｍないし３６５ｎｍ等）である。
【０２９４】
いくつかの具体例において、プローブによって規定されたストリング配列における標識の第一のサブセットは、ストリング配列中の標識の第二のサブセットにおける標識の同一性のエラーチェックするように働く。例えば、プローブ中に８つの標識がある場合を考える。最後の２つの標識は、最初の６つの標識の同一性をエラーチェックするように働くことができる。例えば、ストリング配列中の最後の２つの標識は、ストリング配列中の最初の６つの標識についてのチェックサムとして働くことができる。いくつかの具体例において、チェックサム値は、現実には、標識同定モジュール５０によって誤って読まれたストリング配列をエラーチェックするのに用いることができる。かくして、いくつかの具体例において、チェックサム、またはストリング配列に存在するエラー修正コードの他の形態を用いて、エラー修正技術をストリング配列に適用することによって、参照テーブルに存在しないストリング配列を確証するのが可能である。
【０２９５】
いくつかの具体例において、距離情報が部分的にストリング同一性をコード化する場合、参照テーブルは有効なレポーター配列を含み、ここに、各そのような有効なレポーター配列は、ストリング配列に加え標識の間の距離情報を含む。そのような具体例において、距離情報およびストリング配列双方の間に、有効なプローブを同定するためのマッチがなければならない。例えば、標識同定モジュール５０によって同定されたストリング配列が３つの標識よりなり、ここに、第一と第二の標識の間の距離はｄ１であって、第二および第三の標識の距離がｄ２である場合を考える。この例において、プローブ同定モジュールは、同一のストリング配列をコード化し、各々、第一と第二の標識、および第二と第三の標識の間にｄ１およびｄ２距離のマッチングを有する参照テーブル５６においてストリング配列を見出さなければならない。
【０２９６】
いくつかの具体例において、標識同定モジュール５０は、複数の標識を同定するための指令を複数回反復するための指令を含む。複数の標識を同定するための指令が反復される毎に、基板上で相互に近接する、異なる複数の標識が、複数の光イメージ４６において同定される。そのような具体例において、プローブ同定モジュール５４は、標識同定モジュール５０によって同定される各そのような異なる複数の標識が有効なレポーター配列を含むか否かを決定する。各そのような異なる複数の標識に対して、プローブ同定モジュール５４は、異なる複数の標識のストリング配列が有効なレポーター配列として確認される場合、異なる複数の標識がプローブであると見なす。さらに、プローブ同定モジュール５４が、異なる複数の標識のストリング配列が有効なレポーター配列として確認されない場合、異なる複数の標識はプローブでないと見なす。いくつかの具体例において、複数のプローブは同定される。いくつかの具体例において、複数のプローブは３以上のプローブ、２以上のプローブ、３以上のプローブ、１０以上のプローブ、少なくとも５、１０、１５、２０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、または４００またはそれ以上のプローブよりなる。いくつかの具体例において、プローブ同定モジュール５４は同定されたプローブの各タイプを記憶する。プローブの「タイプ」はプローブのストリング配列によって同定される。いくつかの具体例において、プローブ同定モジュール５４は、有効なレポーター配列として確認されない各異なる複数の標識の各ストリング配列を記憶する。いくつかの具体例において、プローブ同定モジュール５４は、有効なレポーター配列として確認される各異なる複数の標識の各ストリング配列を記憶する。
【０２９７】
５．１６  ナノレポーター技術の適用
本発明の組成物および方法は、診断、予後的治療およびスクリーニング目的で用いることができる。本発明は、多くの異なる標的分子が、本発明の方法を用いて単一生体分子試料から一度に分析することができるという利点を提供する。これは、例えば、１つの試料で行うべき数個の診断テストを可能とする。
【０２９８】
５．１６．１  診断／予後方法
本発明の方法を、患者から得られた、または誘導された生体分子試料の分析に適用して、病気となった細胞型が試料に存在するか否かを決定し、および／または病気の段階を決定することができる。例えば、血液試料は、本明細書中に記載された方法のいずれかに従ってアッセイして、試料中の癌性細胞タイプのマーカーの存在、および／または量を決定し、それにより、癌を診断し、またはその段階を決定することができる。別法として、本明細書中に記載された方法を用いて、試料中の、各々、細菌またはウイルスのマーカーの存在、および／または量を決定することによって、病原体感染、例えば、細胞内細菌およびウイルスによる感染を診断することができる。かくして、本発明の組成物および方法を用いて検出された標的分子は、（癌マーカーのような）患者マーカー、または細菌またはウイルスマーカーのような外来性剤での感染でのマーカーいずれかであり得る。ナノレポーターの定量的性質のため、本発明の組成物および方法を用いて、その豊富性が生物学的状態または病気状態を示す標的分子、例えば、病気状態の結果としてアップレギュレートされ、またはダウンレギュレートされる血液マーカーを定量することができる。
【０２９９】
加えて、本発明の組成物および方法を用いて、患者についての治療のコースを決定するにおいて援助する予後情報を供することができる。例えば、腫瘍についての特定のマーカーの量は、患者からの小さな試料からさえ正確に定量することができる。乳癌のようなある種の病気では、Ｈｅｒ２−ｎｅｕのようなある遺伝子の過剰発現は、治療のより攻撃的コースを必要としていることを示す。
【０３００】
５．１６．２  スクリーニング方法
本発明の方法は、とりわけ、化学化合物、突然変異、温度の変化、成長ホルモン、成長因子、病気、または培養条件の変化を含めた乱れの種々の標的分子に対する効果を決定するために用いることができ、それにより、その存在、不存在またはレベルが特定の生物学的状態を示す標的分子を同定することができる。好ましい具体例において、本発明を用いて、病気状態の成分および経路を解明し、発見する。例えば、病気組織に存在する標的分子の量と、「正常な」組織のそれとの比較は、病気に関与する重要な標的分子の解明を可能とし、それにより、病気の治療で用いることができる新しい薬物候補の発見／スクリーニングのための標的を同定する。
【０３０１】
５．１７  プローブを同定するための方法
本発明の１つの態様は、基板に重ねられた試料内のプローブの存在を検出する方法を提供する。本発明のこの態様において、プローブは、複数の空間的に配置された標識を含む。１つのそのような方法において、基板上で相互に近接する、複数の光イメージにおける、複数の標識が同定される。複数の標識の空間的順序は、複数の標識のストリング配列を決定する。複数の光イメージにおける各光イメージは、複数の異なる波長範囲中の波長範囲における試料から受け取った光についてである。該方法において、複数の標識のストリング配列が有効なレポーター配列を含むか否かに関して決定を行う。複数の標識のストリング配列が有効なレポーター配列として確認された場合、複数の標識はプローブであると見なされる。複数の標識のストリング配列が有効なレポーター配列として確認されない場合、複数の標識はプローブではないと見なされる。
【０３０２】
いくつかの具体例において、決定工程は、複数の標識のストリング配列を、参照テーブル中の有効なレポーター配列と比較することを含む。いくつかの具体例において、該方法は、さらに、有効なレポーター配列として確認されない複数の標識のストリング配列を記憶することを含む。例えば、ストリング配列は電子メモリーに記憶することができる。いくつかの具体例において、該方法は、さらに、基板上に存在する複数の基点を用いて、複数の光イメージ中の第二の光イメージに対して第一の光イメージを整列させることを含む。
【０３０３】
いくつかの具体例において、複数の標識を同定するための工程は複数回反復される。複数の標識を同定する工程を反復する毎に、基板上で相互に近接する、異なる複数の標識が、複数の光イメージにおいて同定される。いくつかの具体例において、該方法が、さらに、異なる複数の標識の各々が有効なレポーター配列を含むか否かを決定することを含む。各異なる複数の標識は、異なる複数の標識のストリング配列が有効なレポーター配列として確認される場合に、プローブであると見なされる。さらに、各異なる複数の標識が、異なる複数の標識のストリング配列が有効なレポーター配列として確認されない場合、プローブではないと見なされる。本発明のこの具体例によると、いくつかの例において、複数のプローブが同定される。例えば、いくつかの具体例において、２以上のプローブ、３以上のプローブ、１０以上のプローブ、少なくとも５、１０、１５、２０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、または４００プローブまたはそれ以上が同定される。
【０３０４】
複数のプローブが同定されるいくつかの具体例において、同定されたプローブの各タイプが記録される。プローブの「タイプ」は、プローブのストリング配列によって同定される。各ユニークな有効なストリング配列は異なるプローブのタイプを表す。いくつかの具体例において、有効なレポーター配列として確認されない各異なる複数の標識の各ストリング配列が記憶される。このようにして、基板上のプローブにおいて生じる共通のエラーを決定するのが可能である。有効なストリング配列を形成しない複数の標識をトラッキングすることによって同定することができる１つのタイプのエラーは、基板上に余りにも多いプローブがある条件である。基板上に余りにも多いプローブがある場合、隣接するプローブの標識は相互に近接するようになり、各標識がいずれのプローブに属するかを決定するのを困難とする。同定することができるもう１つのタイプのエラーは、過剰の数のプローブが引き裂かれるようになり、基板上に切り離されたプローブを残す状態である。いくつかの具体例において、標識、ストリング、有効でないレポーター配列、有効なレポーター配列、プローブのタイプの全ての種は、本発明の方法で追跡される。
【実施例】
【０３０５】
以下の実施例は、本発明を説明するために供し、本発明の範囲を限定するものと断じて解釈されるべきではない。
【０３０６】
（実施例１）  伸長されたＤＮＡの選択的固定化
長さが７．２Ｋｂの二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドは、ビオチンで１つの末端が機能性化されている。他の末端において、ＤＮＡは、４回反復された１５塩基の一本鎖配列を含む（５’−ＧＴＣ  ＴＡＴ  ＣＡＴ  ＣＡＣ  ＡＧＣ  ＧＴＣ  ＴＡＴ  ＣＡＴ  ＣＡＣ  ＡＧＣ  ＧＴＣ  ＴＡＴ  ＣＡＴ  ＣＡＣ  ＡＧＣ  ＧＴＣ  ＴＡＴ  ＣＡＴ  ＣＡＣ  ＡＧＣ−３’；配列番号：２）。かくして、ＤＮＡは、選択的固定化のための１つの末端における４つの結合部位を含む。ハイブリッドは、ＲＮＡに取込まれたＣｙ３フルオロフォアを持つ４つの領域も有する。
【０３０７】
ＤＮＡの小さな試料（１×ＴＡＥ、または４０ｍＭトリス酢酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０中３μＬ、０．０１  ｆｍｏｌ／μＬ）を、ストレプトアビジン被覆カバーグラス（Ａｃｃｅｌｒ８，ＴＢ０２００）に受動的に接着されたポリジメチルシロキサンへ成型されたチャネルを含むミクロ流体デバイスに移す。チャネルの寸法は５０μｍ×１ｍｍ×１０ｍｍである。図１５Ａ参照。試料を室温にて１５分間カバーグラスと接触させ、ＤＮＡを、ＤＮＡの末端においてビオチンを介してストレプトアビジン表面に選択的に結合させる。未結合ＤＮＡを流体の流動によって洗浄除去する。ウェル中の１×ＴＡＥ緩衝液を新鮮な緩衝液に代えて交換し、流体レベルを各ウェルについて３０μＬで均一化する。図４Ａ参照。
【０３０８】
２００Ｖ／ｃｍの電場を印加して、陽極に向けて長い負に荷電されたＤＮＡを延長する（図１５Ｂ参照）。
【０３０９】
固定化剤、ＤＮＡの第二の末端に対する相補的なビオチニル化オリゴヌクレオチド（５’−ビオチンＧＣＴＧＴＧＡＴＧＡＴＡＧＡＣ−３’、配列番号：３、５０μＬ  ＠  １００ｎＭ，１Ｘ  ＴＡＥ）を負のウェルに加える。さらなる容量はウェル中で流体のレベルを隆起させ、静水流動を誘導して、固定化剤をチャネルに導入する（図１５Ｃ参照）。流動は、電場に加えて、ＤＮＡをさらに伸ばすよう働く。
【０３１０】
ビオチニル化オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡの第二の末端とハイブリダイズし、他方、それは伸長され、カバーグラスのストレプトアビジンに選択的に結合する。試料は、５分未満以内に伸長した状態で効果的に固定化することができる。
【０３１１】
選択的に固定化された伸長されたマクロ分子のイメージング。フルオロフォア標識およびビオチンアフィニティータグを含むマクロ分子を調製し、以下に供する実施例に従って精製する。マクロ分子はビオチンを含むカバーグラス表面に結合され、電場で伸ばす。最後に、マクロ分子はアークランプで照射し、カメラでイメージングした。例示的なイメージを図１６に供する。個々の染料、および重要なことには、個々のマクロ分子上での染料の純度はイメージにおいて検出することができる。
【０３１２】
選択的に固定化された伸長されたマクロ分子の調製およびイメージング。ここに、種々の成分からのナノレポーターの構築の段階的例を掲げる。種々の成分は他の成分の前または後に構築でき、または同時に加えることができる。例えば、パッチユニットまたはフラップの骨格へのアニーリングは同時に、または一方の後に他方を行うことができる。
【０３１３】
本実施例においては、出発物質は円状Ｍ１３ｍｐ１８ウイルスベクターである。単一の線状ストランドＭ１３ｍｐ１８を用い、パッチユニットをそれにアニーリングして、二本鎖骨格を形成する。次に、フラップを加え、次いで、標的−特異的配列を連結する。他方、精製工程は、過剰の、付着していないパッチユニットおよびフラップを濾過するのを助ける。ナノレポーターに結合する標識された核酸（パッチおよび／またはフラップおよび／または他の標識オリゴヌクレオチド）の構築も記載する。
【０３１４】
標的分子の（例えば、ハイブリダイゼーションを介する）付着に際して、ナノレポーターを表面に付着させ、伸ばす。最後に、ナノレポーターをカメラによってイメージングする。ナノレポーターを作成し、首尾よく使用して、本実施例において実質的に記載される方法を用いて標的分子を検出した。
【０３１５】
骨格構築。選択されたオリゴヌクレオチド骨格配列は、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（登録商標）ソフトウエアを用いて分析した。まず、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから商業的に購入した円状Ｍ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡを線状化することから作成した。円状Ｍ１３ｍｐ１８をＢａｍＨ１酵素で消化して、それを線状化した。用いた物質はＭ１３ｍｐ１８ベクター（２５０ｎｇ／μｌ）、パッチ  １Ｌ  ＢａｍＨ１．０２（１００μＭストックの１０μＭ希釈）、１０×  ＢａｍＨ１緩衝液、ＢａｍＨ１酵素よりなるものであった。合計０．８ｐｍｏｌの線状Ｍ１３ｍｐ１８を作成するためのプロトコルは、以下の工程を含む。１）３７℃までブロックを予め加熱する；２）０．６５ｍｌのエッペンドルフチューブ中で、４０μｌの２５０ｎｇ／μｌ  Ｍ１３ｍｐ１８ベクター、２μｌの１０μＭパッチ  １Ｌ  ＢａｍＨ１．０２、および５μｌの１０×  ＢａｍＨ１緩衝液を合わせる；３）エッペンドルフチューブを頂部上のホイルと共に３７℃の加熱ブロックに入れる。チューブを３７℃にて１５分間インキュベートして、パッチユニットをＭ１３ｍｐ１８骨格にハイブリダイズさせる；４）１５分後に、２μｌのＢａｍＨ１酵素を加え、反応を３７℃にて３０分間消化させ、その後、さらに２μｌのＢａｍＨ１酵素を加え、反応を継続して、３７℃にてさらに３０分間消化する（ＢａｍＨ１酵素の最終容量は８％であり）；および５）１０μｌを０．６５ｍｌのエッペンドルフチューブにアリコットし、フリーザー中で貯蔵する（線状Ｍ１３ｍｐ１８の最終濃度は２００ｎｇ／μｌである）。
【０３１６】
ベースパッチプール（ＢＰＰ）のパッチユニットの調製。第二に、パッチユニットはプール中で調製する。パッチオリゴヌクレオチド配列は最適な長さおよびＭ１３ｍｐ１８ストランドに対する所望の相同性／非相同性、およびヒトゲノム配列について選択する。パッチは、長さが６０または６５ヌクレオチド塩基いずれかの（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した）商業的に製造されたオリゴヌクレオチドであった。各パッチオリゴヌクレオチドの５０ヌクレオチド塩基はＭ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡに対して相補的であり、１０ヌクレオチド塩基は隣接するパッチに対して相補的であって、５ヌクレオチド塩基対は対応するフラップに対して相補的である。パッチの間の１０ヌクレオチド塩基マッチは、構造を安定化し、被覆された骨格のフラップをリフトするのを助け、したがって、それらは標識されたオリゴヌクレオチドに結合するのにより利用できる幹構造を形成する。フラップに結合するためのパッチ上の合成結合部位、５つのヌクレオチド塩基は、モジュールシステムのパワーの活用を可能とする。
【０３１７】
塩基パッチプールは、全てがナノレポーター上の特異的文字のグループ分けおよび位置に対応する９つのパッチユニットを含有する。本実施例では、４つの異なる蛍光染料（色）（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤと標識する）、および８つの異なる位置または領域があり、そこでは、標識された核酸がナノレポーター上に結合することができる。例えば、ＢＰＰ  Ａ３はナノレポーター上の位置３（パッチユニット１９ないし２７）におけるＡパッチユニットの全てに対応する。
【０３１８】
ナノレポーター位置は以下の通りである：
位置１：パッチユニット１ないし９（ＡまたはＣ）
位置２：パッチユニット１０ないし１８（ＢまたはＤ）
位置３：パッチユニット１９ないし２７（ＡまたはＣ）
位置４：パッチユニット２８ないし３６（ＢまたはＤ）
位置５：パッチユニット３７ないし４５（ＡまたはＣ）
位置６：パッチユニット４６ないし５４（ＢまたはＤ）
位置７：パッチユニット５５ないし６３（ＡまたはＣ）
位置８：パッチユニット６４ないし７２（ＢまたはＤ）
材料：相互に予めアニールされた右側および左側パッチ（各オリゴヌクレオチドは１０μＭの濃度におけるものである）。１００ｐｍｏｌのＢＰＰ１：（位置１においては、パッチ座標１ＬをＢａｍＨ１消化のために用い−このパッチはＢＰＰ１には含めない）：１０μｌの各予めアニールした（１０μＭ／各々）パッチユニット（座標２ないし９）、５μｌ（２０μＭ）パッチ  １Ｒ（ＡまたはＣ）を作成するための材料。各パッチの最終濃度は１．１８ｐｍｏｌ／μｌである。１００ｐｍｏｌのＢＰＰ２−８：１０μｌの各予めアニールされた（１０μＭ／各々）適切なパッチユニットを作成するための材料。各々に加えられた９パッチユニット、または合計９０μｌがある。各パッチの最終濃度は１．１１ｐｍｏｌ／μｌである。
【０３１９】
以下に、ナノレポーター上に結合する染料−標識核酸についての８つの位置または領域と共に、本実施例のために作成された全てのパッチユニットプールの表を掲げる。位置１、３、５、および７は染料Ａまたは染料Ｃで標識された核酸に結合することができ、および位置２、４、６および８は染料Ｂまたは染料Ｄで標識された核酸に結合することができる。
【０３２０】
【表２−１】
2009538132.tif 000007
【０３２１】
【表２−２】
2009538132.tif 000008
二本鎖骨格のためのパッチユニットと共に一本鎖オリゴヌクレオチドをアニールするための材料および調製する方法。第三に、パッチユニットを調製して、一本鎖線状Ｍ１３ｍｐ１８にアニールさせ、ストランドを被覆して、二本鎖オリゴヌクレオチド骨格を作成する。Ｍ１３ｍｐ１８に６０および６５ヌクレオチド塩基パッチをアニールするための条件は、結合が非常に特異的であって、パッチはＭ１３ｍｐ１８ストランド上の正しくない座標にアニールしないように、高い塩濃度で起こる必要がある。アニーリング工程のために、各パッチユニットは、０．５ｐｍｏｌ合計容量にて、一本鎖Ｍ１３ｍｐ１８配列と共に２：１ないし４：１比率で加える。過剰のパッチはフラップをアニールする前に除去する。
【０３２２】
用いた材料は２０×  ＳＳＣ、線状Ｍ１３ｍｐ１８（０．０８ｐｍｏｌ／μｌまたは２００ｎｇ／μｌで消化したＢａｍＨ１）、適切な塩基パッチプール（ＢＰＰ）（１．１１ｐｍｏｌ／μｌにおいて合計８を必要とする−前記参照）よりなり、デジタル加熱ブロックは４５℃に設定される。整えたアニーリング反応は以下の通りである。一般的ガイドライン：Ｍ１３ｍｐ１８分子当たり２×各パッチユニット、精製のため後に加えた予め連結されたフラップ／パッチ（位置１または８）、および５×  ＳＳＣ。実施例（Ｆ８フックフラップを持つ０．５ｐｍｏｌの骨格）反応は、０．０７１μＭの７．１μｌのＢａｍＨ１消化Ｍ１３ｍｐ１８ストランド、最初の７位置：Ａ１、Ｂ２、Ａ３、Ｂ４、Ｃ５、Ｂ６およびＡ７のための１．１１μＭの０．９μｌの各新しい塩基パッチプールよりなる。
【０３２３】
１．７μｌ  Ａ１  ＢＰＰ（予めアニール、１２／１５；１．１８μＭ／各パッチにて）
１．８μｌ  Ｂ２  ＢＰＰ（予めアニール、１２／１５；１．１１μＭ／各パッチにて）
１．８μｌ  Ａ３  ＢＰＰ（予めアニール、１２／１５；１．１１μＭ／各パッチにて）
１．８μｌ  Ｂ４  ＢＰＰ（予めアニール、１２／１５；１．１１μＭ／各パッチにて）
１．８μｌ  Ｃ５  ＢＰＰ（予めアニール、１２／１５；１．１１μＭ／各パッチにて）
１．８μｌ  Ｂ６  ＢＰＰ（予めアニール、１２／１５；１．１１μＭ／各パッチにて）
１．８μｌ  Ａ７  ＢＰＰ（予めアニール、１２／１５；１．１１μＭ／各パッチにて）
０．８３μＭ、および７．３μｌの２０×ＳＳＣの精製タグ−Ｆ８（パッチ座標７１Ｌ、７１Ｒ、７２Ｌ、７２Ｒ、７３Ｌにアニールし、位置Ｆ８において、ビオチンリンカーとして用いるための「Ｆ」特異性を有する十分なスプリット−フラップ／パッチユニットを形成するＦＨＦ）を持つ２．４μｌ  ＢＰＰ−Ｄ８（最初の７つのパッチユニット−位置８における座標６４、６５、６６、６７、６８、６９、および７０−のプール［Ｄ特異性］）。最終の反応容量は０．０２７ピコモル／μｌにおいて２９．３μｌであろう。
【０３２４】
抗−Ｂａｍオリゴヌクレオチドもまた加えて、（失われた）１Ｌパッチユニットに相補的なＭ１３中の領域にアニールさせ、および連結の間にＭ１３骨格の再環化を妨げる。
【０３２５】
二本鎖骨格を形成するための、パッチユニットの、一本鎖ｍ１３ｍｐ１８へのアニーリング。第四の工程は、パッチユニットを一本鎖線状Ｍ１３ｍｐ１８にアニールさせるプロトコルを含み、二本鎖オリゴヌクレオチド骨格を作成するためのストランドの被覆を以下の工程で行う：１）加熱ブロックの４２℃までの予備的加熱、１５分間の頂部にわたるホイルを持つ小さなＰＣＲ（またはストリップ）チューブにおける４５℃までの前記反応溶液の加熱、加熱ブロックの６５℃への折り返し、およびさらに１時間４５分の間のインキュベーション、およびチューブの除去、氷上への設置、または凍結。
【０３２６】
ストレプトアビジンでの、ビオチンおよび磁性ビーズを用いるナノレポーター骨格の精製。第五の工程はフラップに付着させる前に行い、そこでは、Ｍ１３ｍｐ１８ストランドへアニールしていない過剰のパッチユニットを二本鎖オリゴヌクレオチド骨格から分離する。パッチユニットの相補的な５つのヌクレオチド塩基突出のいくつかに対する５つのヌクレオチド塩基相同領域での精製タグをアニールして、骨格に「掛ける」。ビオチニル化オリゴヌクレオチドを「精製タグ」にアニールし、ストレプトアビジンと共に磁性ビーズを用いて、ビオチニル化オリゴヌクレオチドを用いて骨格を捕獲する。過剰のパッチユニットを上清で除去する。回収のために、骨格は磁性ビーズから融解して、溶液となる。
【０３２７】
ｄ−ビオチンキャッチャーを精製タグにアニールする。Ｄ−ビオチンキャッチャーをナノレポーター上の精製タグにアニールし（Ｍ１３に対して２×、または４×最終である、溶液中で利用可能なＤ８−フラップの位置の量に対して２×とし）：０．５ピコモル×２５はオリゴヌクレオチド位置を引っ掛け（５を掛け合わせる）、４×は５０ピコモルとし、０．５０μｌの１００ピコモル／μｌ  Ｄ−ビオチンまで移動させ、０．５μｌ（Ｄ，Ｅ，Ｆ）−（１００μＭの）ビオチンを試料に加え、混合し、室温で３０分間インキュベートする。
【０３２８】
二本鎖骨格から付着していないパッチユニットを洗浄除去するための精製プロトコル。２５倍過剰のＦ−フックオリゴヌクレオチドを、室温にて３０分間、５×  ＳＳＣ中のナノレポーターにアニールさせる。２００μｌのＤｙｎａＢｅａｄ  ＭｙＯｎｅストレプトアビジン（商標）ビーズ溶液をピペットで１．５ｍｌのチューブに入れ、磁石上に置き、上清を除去する。再懸濁させ、および上記工程におけるように磁石で清澄化させることによって、５×  ＳＳＣで２回洗浄する。５×  ＳＳＣ中の８０μｌの試料を加える（本実施例においては８０ｆｍｏｌの試料）。渦巻き上に１５分間置くことによって、十分に再懸濁させる。磁石で溶液を先に清澄化し、後のゲル分析のために上清を新鮮なチューブに移す。磁石上にある間に、元来加えた同一８０μｌ容量で３回ペレット上にピペッティングすることによって、ペレットを８０μｌのＴＥで洗浄する（再懸濁しない）。洗浄液を除去し、分析のために新鮮な「洗浄」チューブに入れる。ＴＥ緩衝液を４５℃まで加熱し、８０μｌを各ペレットに加え、再懸濁させる。チューブを１５分間、４５℃加熱ブロック上に置き、上下に１回ピペッティングして、ビーズが懸濁したままであることを確実とする。直ちに、温め、かつ保温する間に、生成物を磁石で清澄化する。精製されたナノレポーターの大部分は、４５℃で溶出するこの生成物に存在するはずである。
【０３２９】
フラップの骨格へのアニーリング、および連結。第六の工程は、骨格にアニールされて「被覆された骨格」を作成するフラップオリゴヌクレオチドを分裂させることを含む。磁性ビーズでの精製をその後に行って、過剰なスプリットフラップを除去する。被覆された骨格の連結は、Ｔ４リガーゼを用いて行って、構造の安定性を増加させる。ただ１つのタイプのフラップが、蛍光色素当たり必要である。フラップは長さが９５または１００塩基であり、パッチに対して、標識されたオリゴヌクレオチドに対して、および相互に相補性である領域を有する。各フラップは、標識されたオリゴヌクレオチドへの結合のための１５塩基反復配列を有する。反復配列は、いずれのパリンドロームおよびヘアピン構造も除去するために分析されたラムダ配列に基づく。
【０３３０】
フラップをアニーリングするための条件は以下の通りである。パッチに対応するフラップ上の配列は５ヌクレオチド塩基対長であり、従って、フラップは高い塩濃度でさえパッチに特異的にアニールする。パッチに対するフラップの比率は２：１である。高温における安定性を増大させるために、相互へのパッチの、およびパッチへのフラップの連結は同一反応において行うことができる。
【０３３１】
１）Ａ２６０ｎｍにおいて分光光度計を用いて精製された骨格を定量する。調製すべきナノレポーターの適当な量で必要な容量を計算する。この例については、我々は１１０ｎｇまたは０．０２３ピコモルを用い，Ａ２６０ｎｍにおける読みは、７．７ｎｇ／μｌ、または１１０ｎｇの代わりの１４．３μｌを示す。２）連結反応を以下のように設定する（容量は精製およびスケールに依存して変化する）。現在パッチに対する１．５×フラップを用い、それに従って計算する。本実施例では、４つの異なる蛍光染料（色）標識Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ、ならびに染料−標識核酸がナノレポーター上に結合することができる８つの異なる位置または領域がある。各色についての位置の数（この場合、１ないし４）に９を掛けて、骨格の１．５モルを掛けて＝使用に対するフラップのモルとなる。
【０３３２】
配列／位置［ＡＢＡＢＣＢＡＤ］における蛍光色素を持つナノレポーターでは：
ＡＢＡＢＣＢＡＤ＝
Ａ：４０．５×．０２３＝．９３ピコモル；容量：９３ｕｌのＳＦ（スプリットフラップ）−ＡＬ＠１μＭ
１μＭにおける０．９３μｌのＳＦ−ＡＲ
Ｂ：４０．５×．０２３＝．９３ピコモル；容量：．９３ｕｌのＳＦ−ＢＬ＠１μＭ
１μＭにおける０．９３μｌのＳＦ−ＢＲ
Ｃ：１３．５×．０２３＝．３１ピコモル；容量：．３１ｕｌのＳＦ−ＣＬ＠１μＭ
１μＭにおける０．３１μｌのＳＦ−ＣＲ
Ｄ：１３．５×．０２３＝．３１ピコモル；容量：．３１ｕｌのＳＦ−ＤＬ＠１μＭ
１μＭにおける０．３１μｌのＳＦ−ＤＲ
連結反応（合計２５μｌ）はスプリットフラップ（前記参照；合計４．９６μｌ，または〜５μｌ）、０．００１６ピコモル／μｌにおける１４．３μｌのＭＯＤＢ−骨格、２．５μｌ  １０×  Ｔ４連結緩衝液、２．２μｌのＮａｎｏＰｕｒｅ  Ｈ２Ｏおよび１μｌ  Ｔ４リガーゼよりなる。４５℃にて５分間チューブをインキュベートする。３７℃の水浴に５分間で移動させる。１μｌのＴ４リガーゼを試料に加える。３７℃においてさらに１時間インキュベートする。直ちに凍結し、あるいは７５℃にて５分間加熱して、Ｔ４リガーゼを殺傷する。
【０３３３】
標的−特異的配列のナノレポーターへの連結。第７番目の工程は、標的−特異的配列のナノレポーターへの連結を含む。ＤＮＡ標的−特異的配列は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）またはＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）であり得る、標的分子に対して相補的となるように設計される。標的−特異的配列は、長さが、３５、６０または７０ヌクレオチド塩基とすることができる。標的−特異的配列は、被覆された骨格上の一本鎖突出領域を用いて骨格に連結させることがきる。単一タイプの標的−特異的配列を持つ骨格は別々に製造し、次いで、混合して、ライブラリーを形成することができる。
【０３３４】
ナノレポーター構築。オリゴヌクレオチドのナノレポーターへの付加は、ナノレポーターの構築の間にいずれかの地点で行うことができる。本発明のある態様において、標識されたオリゴヌクレオチドは１５ヌクレオチド塩基長である。５’末端では、単一のフルオロフォア染料が付着される。特定のフルオロフォア染料を持つオリゴヌクレオチドは、一般には、同一の配列を有する。これらの標識されたオリゴヌクレオチドは、スプリットフラップの反復配列に結合する。この例に最良に適したフルオロフォアは、限定されるものではないがＡｌｅｘａ４８８、Ｃｙ３、Ａｌｅｘａ５９４、およびＡＡｌｅｘａ６４７を含む。１５ヌクレオチド塩基長は、フルオロフォアが相互に消光できず、かつ可視化プロセスにおける条件にて、標識された核酸が安定である（相補的ストランドを融解除去しない）ことを確実とするように、十分離れてフルオロフォアを保持する。標識されたオリゴヌクレオチドは４０℃にて安定である。この短い長さは、非常に多数の蛍光染料をフラップにパッキングするのを可能とする。本発明のある態様において、標識されたオリゴヌクレオチドは、標的試料プロセッシングの間に導入される。
【０３３５】
標的分子へのナノレポーターの付着。ナノレポーターは、当業者に知られたいずれの手段を用いても標的分子に付着させることができる。例示的な具体例において、各２５０ピコモルの第一のプローブおよび第二のプローブの双方を１２５ピコモルの標的と混合することによって、デュアルナノレポーターは標的分子にハイブリダイズする。合計容量を４μｌ、および５×  ＳＳＣの緩衝液の最終濃度に調整する。この混合物を、４２度において被覆されたＰＣＲチューブ中で一晩インキュベートして、ハイブリダイゼーションを起こさせる。
【０３３６】
表面付着。一旦、ナノレポーターが標的分子、および対応する標識された核酸、すなわち、標識モノマーに付着した核酸の双方に付着したならば、それらは表面に付着され、標識モノマーによって発せられたシグナルの順序を解明するにおいて伸ばされ、このようにして、標的分子を同定する。この例においては、ナノレポーターは伸ばされて、特定の標的分子に対応するそれらの蛍光染料コードを空間的に解像する。ナノレポーターは１つの端部を表面（この例では−カバーグラス、以下の調製参照）に付着させることによって伸ばされる。表面付着のための２つの方法を用いることができる：Ａ）ビオチニル化されているナノレポーターを持つＡｃｃｅｌｒ８  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのストレプトアビジン被覆スライド、およびＢ）ストレプトアビジンを有するナノレポーターを持つビオチン被覆スライド。緩衝液中では、ナノレポーターが活性な表面に接触され、一定時間インキュベートされる。反応は、チャネルを作成するためにエッチングされたシリコンウエハー中に成型されたＰＤＭＳから作成されたフローセル中で行う。金属チュービングを用いて、緩衝液および試料挿入のためのチャネルの末端においてウェルを開ける。チャネル寸法は０．５ｍｍまたは１ｍｍの広さであって、５４μｍの高さである。一旦試料がフローセルレーンに負荷され、インキュベートされたならば、ナノレポーターを付着すべきである。ナノレポーターは電圧を適用することによって、またはストリングを伸ばしかつ乾燥する後退メニスカスを持つ液体を除去することによって伸ばすことができる。
【０３３７】
表面の調製およびデバイスの組立て。結合表面（Ａｃｃｅｌｒ８ブランドストレプトアビジンＯｐｔｉＣｈｅｍ，被覆されたカバーグラス）をスライド容器当たり５表面のユニットにおいて搭載し、各容器はホイルパンチ中のシリカ乾燥剤のパッケージで包む。該パンチは使用するまで−２０℃で貯蔵する。結合用の表面を調製するために、パンチは、まず、フリーザーから引き出し、数分間にわたって室温となるまで放置する。もし従前に開放されなければ、次いで、パンチは１つのエッジに沿ってスライスして、スリットを形成し、表面の容器を取り出す。必要な表面の除去に際して、容器はその乾燥剤と共にパンチに戻し、スリットをパッケージングテープのストリップで閉じてシールし、パンチをフリーザーに戻す。
【０３３８】
次いで、表面をＮａｎｏｐｕｒｅ水（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ  Ｎａｎｏｐｕｒｅ  Ｄｉａｍｏｎｄ）の流れで軽く濯ぎ、清潔な穴つきのＣｏｐｌｉｎジャー中の０．２μｍ−濾過１×  ＰＢＳに１０分間浸漬する。浸漬の後、表面をＮａｎｏｐｕｒｅ水に浸漬し、表面エッジを横切って濾過窒素を吹き付けることによって乾燥する。
【０３３９】
表面と接合させ、および試料の局所化を供するのに用いるＰＤＭＳデバイスの清浄化を、セロハンテープをＰＤＭＳ表面に貼付し、次いで、貯蔵の間に付着するようになるかも知れないダストまたは他の粒子を剥がし落とすことによって、使用直前に行なう。Ａｃｃｅｌｒ８表面の結合側を上にして置き、次いで、清浄なＰＤＭＳ構造をチャネルを下にして表面の中心に置く。ＰＤＭＳは容易に被覆されたガラスに付着し、さらなる付着メカニズムは必要でない。
【０３４０】
試料の結合および洗浄。まず、（現在、１００ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．８中に希釈された）５μＬ液滴の試料を選択されたレーンの１つのウェルに適用することによって表面に結合させる。液滴は、丁度、チャネルがウェルに接合する地点にタッチすべきである（いくつかの試料はこの時点でチャネルに入り込むことができる）。チャネルを充填し、非常に弱い真空（＜２ｋＰａ）を用い、液滴をチャネルを通って反対側ウェルまで引くことによって、結合はチャネル全体に均等化される。プロセスはそれらの各レーン中の他の試料のために反復される。次いで、過剰の流体をウェルから取り出し、ウェルにテープを施して、蒸発を低下させ、デバイスを室温にて暗所で２０分間インキュベートする。
【０３４１】
結合後、テープを除去し、各レーンの頂部ウェルに１００μＬの前記ホウ酸塩緩衝液を満たす。約２０μＬのその緩衝液を真空を用いてチャネルを通って他のウェルへ引き出し、該プロセスを１回反復する。次いで、全てのホウ酸塩緩衝液を全てのウェルから除去し、頂部ウェルに１×  ＴＡＥ、ｐＨ８．３を満たす。約５０μＬのＴＡＥをチャネルを通じて引き出し、全てのＴＡＥを除去し、ウェルを再度満たす。プロセスを、合計約１５０μＬのＴＡＥすすぎについて、３回繰り返す。最後に、全てのウェルに１００μＬ  １×ＴＡＥを満たす。
【０３４２】
電子ストレッチング。カバーグラス／ＰＤＭＳデバイスの底部に浸漬油をスポットし、顕微鏡上に置く。電極を、第一のＰＤＭＳチャネルの反対端部のウェルに挿入する（頂部ウェルにおける陰極、底部における陽極）。チャネルの第一のイメージを底部ウェル近くで取り；顕微鏡ステージを、注目する領域が焦点内となるように調整する。次いで、電圧（２００Ｖ）をチャネルを横切って印加する。電圧をＤＣ電源（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｅ３６３０Ａ）によって供給し、自作増幅器を介して１００倍増幅する。電流を印加した後、焦点を再度調整し、イメージングプロセスが始まる。電気ストレッチングおよびイメージングプロセスを、次いで、残りのチャネルについて反復する。結合のイメージ化を行なう。
【０３４３】
ナノレポーター上の蛍光染料のための光源。光源としてアークランプを用いるにおいて、最良のフルオロフォア選択は、Ａｌｅｘａ  ４８８、Ｃｙ３、およびＡｌｅｘａ  ５９４のような蛍光重複に導くことのない最も明るいタイプである。Ａｌｅｘａ  ６４７およびＣｙ５．５のようなより弱い蛍光染料を用いることができる。
【０３４４】
ナノレポーター上の蛍光染料をイメージするためのフィルター。選択されたフルオロフォアＡｌｅｘａ  ４８８、Ｃｙ３、Ａｌｅｘａ  ５９４およびＡｌｅｘａ  ６４７については、Ｃｙ３とＡｌｅｘａ５９４の間に重複はあり得る。しかしながら、５７２ないし６００ｎｍのバンド幅を持つ発光フィルターのカスタムオーダーは重複を最小化する。
【０３４５】
ナノレポーターをイメージするための顕微鏡および対物レンズ。用いた顕微鏡モデルは、多数の蛍光染料候補からの蛍光発光の選択を可能とする６フィルターカセットを有する倒立蛍光イメージングステーションを用いるＮｉｋｏｎ  ＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２０００Ｅであった。選択された染料については、必要とされる光学的分解能は全ての波長（５００ないし７００ｎｍ）について約４００ｎｍである。選択された対物レンズは、１．４５のＮＡおよび６０の倍率を有するＮｉｋｏｎ  Ｐｌａｎ  ＡＰＯ  ＴＩＲＦレンズである。光学分解能は異なる波長について〜２１０ないし３００ｎｍである。
【０３４６】
（実施例２）：６．２  パッチ／フラップナノレポーターの製造プロトコル
本実施例は、一本鎖線状Ｍ１３ｍｐ１８ウィルスＤＮＡ、オリゴヌクレオチドパッチユニットおよび長いフラップよりなるナノレポーターを作成するもう１つの方法を示す。ナノレポーター標識ユニットは、実質的に本実施例に記載された方法を用いて首尾よく作成された。プレ−リン酸化パッチユニットおよびフラップをＭ１３ｍｐ１８  ＤＮＡベクターと共に加え、一緒に連結させる。Ｍ１３ｍｐ１８  ＤＮＡに連結されるパッチユニットへのフラップの連結の後、ＢａｍＨ１酵素を導入して、ベクターを線状化する。骨格として５μｇのＭ１３ｍｐ１８で出発してナノレポーターのバッチを調製する。ハイブリダイゼーションは、所望の量に応じてスケールアップすることができる。このプロセスは完成させるのに約１ないし２日必要である。
【０３４７】
【表３】
2009538132.tif 000009
水浴をプロトコルの開始前に３７℃および５５℃まで予備加熱する。緩衝液は全てよく混合され、使用前に解凍されたことを確認する。作動プレートは入手可能であって、プレート＃５２９９１６および＃６１０５９１におけるＩＤＴからの順序立ったオリゴで標識されるべきである。これらの２つのプレートを取り出し、室温にて０．５ないし１時間解凍し、ウェルを被覆するテープを除去する前に回転して内容物を降下させる。４つの別々の反応を、これらのプレートからの特異的オリゴヌクレオチドを用いて１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中に設定する。標識を開始するための、これらの４つはそれらのキャップ上のローマ数字を付したチューブを分ける。カラム５および６ＡないしＨは反応Ｉについてのものであり、カラム７および８ＡないしＨは反応ｉｉについてのものであって、全てはプレート＃５２９９１６に見出される。カラム１および２は反応ｉｖについてのものであって、カラム３および４は反応ｉｉｉについてのものである。
【０３４８】
フラップ連結（工程Ａ）：標識４は（前記した）ローマ数字ｉないしｉｖを付した１．５ｍｌチューブを分ける。５μｌの１０×リガーゼ緩衝液、プレート＃５２９９１６および＃６１０５９１からの命名されたウェルからの０．５μｌ／オリゴヌクレオチド、反応Ｉ、ｉｉおよびｉｖのための４μｌ  Ｌｏｎｇ  Ｆｌａｐ  Ｏｌｉｇｏ／反応（ＡまたはＢ）、領域ｉｉｉのための３ｕｌのＬＦ、反応Ｉ、ｉｉおよびｉｖのための２９Ｈ２０、反応ｉｉｉのための３２μｌのＨ２０、および４μｌのＴ４リガーゼを含有する各５０μｌ反応にそれに応じて以上の試薬を加える。リガーゼ無くしてこのミックス中のオリゴを３７℃にて３０分間プレアニールする。最後の試薬としてリガーゼを加え、室温にて少なくとも４時間連結させる。産物の濃度は１ピコモル／フラップ／μｌである。
【０３４９】
フラップ連結リン酸化（工程Ｂ）：標識４は、再度、ローマ数字を付した１．５ｍｌチューブを分け、１ないし４には、産物がリン酸化されているということを示すために円内部にＰを付す。以下の試薬を対応するチューブに加える：１０μｌ／フラップ連結、反応（前記した１０μｌ／フラップ連結反応を取る）、２．５μｌのオプティキナーゼ緩衝液、０．５μｌ  １００ｍＭ  ＡＴＰ、１１．５μｌ  Ｈ２０、および０．５μｌ  オプティキナーゼ酵素。３７℃にて１時間インキュベートする。産物の濃度は０．４ピコモル／フラップ／μｌである。
【０３５０】
オリゴヌクレオチドパッチユニットリン酸化（工程Ｃ）：２７μｌのオリゴヌクレオチド；パッチユニットミックス０．７４ピコモル／μｌ、５μｌ  １０×緩衝液、１μｌ  １００ｍＭ  ＡＴＰ、３μｌのオプティキナーゼ酵素、および１４μｌのＨ２０。一旦、試薬は全て一緒にされると、チューブを数回ぐいっと動かすことによって溶液を温和に混合し、回転させて沈降させる。３７℃にて１時間インキュベートする。
【０３５１】
Ｍ１３ｍｐ１８骨格へのハイブリダイゼーション（工程Ｄ）：新しい１．５ｍｌのチューブに、以下の試薬：２５０ｎｇ／μｌの２０μｌ  Ｍ１３ｍｐ１８、２７μｌリン酸化オリゴヌクレオチドパッチユニット０．４ピコモル／μｌを加え（工程Ｃ）、１２．５μｌ／Ｐｈｏｓｐｈ．フラップ連結（工程Ｂ）は５５℃にて５分間予備加熱し、氷上に１１μｌの１０×リガーゼ緩衝液を置き、全混合物を５５℃にて１分間加熱する。混合物を３７℃にて少なくとも４時間ハイブリダイズする。
【０３５２】
連結（工程Ｅ）：エッペンドルフ内容物を回転により沈降させる。１．２μｌ  １００  ｍＭ  ＡＴＰおよび３ｕｌ  Ｔ４リガーゼを加える。チューブをぐいっと動かすことによって内容物を温和に混合し、次いで、回転により沈降させる。
【０３５３】
ＢａｍＨ１消化（工程Ｆ）：１μｌの１０ピコモルＢａｍＨ１オリゴ、２０μｌ  １０×ＢａｍＨ１緩衝液を加え、３７にて〜１時間ハイブリダイズさせる。容量を２００μｌまで調整する。３μｌのＢａｍＨ１酵素を加える。３７℃にて１時間インキュベートする。
【０３５４】
第一の工程：２０μｌｍのＭ１３ｍｐ１８（ＮＥＢ  ２５０  μｇ／ｍｌ）を清浄な１．７ｍｌのエッペンドルフチューブに加えることによって開始する。５μｌのリン酸化フラップ連結反応を取り、それを７０にて２分間予備加熱し、直ちに氷上に置く。５μｌの各リン酸化フラップ連結反応（１ピコモル／フラップ／μｌ）をチューブに加え、数回ピペッティングすることによって温和に混合する。エッペンドルフチューブを３７℃にて１時間インキュベートする。
【０３５５】
第二工程：１３．５μｌのオリゴヌクレオチドパッチユニットミックス（０．７４ピコモル／μｌ）および１μｌのアクリダイトミックス（１０ピコモル／μｌ）を新しいエッペンドルフ１．７ｍｌエッペンドルフチューブに入れる。５μｌの１０×オプティキナーゼ緩衝液、１μｌの１００ｍＭ  ＡＴＰおよび２７．５μｌのＨ２０を加える。溶液をピペッティングすることによって温和に混合する。２μｌのオプティキナーゼ酵素を加え、ピペッティングによって温和に混合し、３７℃にて１時間インキュベートする。
【０３５６】
第三の工程：リン酸化されたオリゴｒｘｎを取り、それを、全部、Ｍ１３ｍｐ１８＋フラップハイブリダイゼーションの内容物に加える。ピペッティングによって反応を温和に混合し、それを３０℃にて１時間インキュベートする。ハイブリダイゼーションが完了した後、１μｌ（１００ＡＴＰ）を反応に加えることによってＡＴＰを調整する。
【０３５７】
第四の工程：エッペンドルフチューブ中の内容物を回転沈降させ、４μｌのＴ４リガーゼ酵素（５ユニット／μｌ）を加え、ピペッティングによって温和に混合する。室温にて少なくとも４時間インキュベートする。１μｌのＢａｍＨ１オリゴヌクレオチド（１０ピコモル／μｌ）を加えて、連結が起こりつつ室温にてハイブリダイズさせる。
【０３５８】
第五の工程：４μｌのＢａｍＨ１酵素（５ユニット／μｌ）を加えることによって連結反応を消化し、ピペッティングによって温和に混合し、３７℃にて１時間インキュベートする。一旦インキュベーション時間が終われば、ＱＣのために５００ｎｇのアリコットを取る。
【０３５９】
第六の工程：プソラレン、ＵＶまたはＤＭＰＡ光で１５分間処理する。
【０３６０】
計算は：
５μｇのＭ１３＝Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓからの２０μｌストック＝２ピコモル
オリゴヌクレオチドミックス：１８０−３４フラップ領域−１０アクリダイト修飾オリゴ＝０．７４ピコモル／オリゴ
１０ピコモル／オリゴヌクレオチド１３．５μｌ＝１３５０ピコモル
オプティキナーゼ１ユニットは１ナノモルのホスフェートを末端に変換し−過剰量を用いる。４μｌのオプティキナーゼを用いた。
【０３６１】
（実施例３）：６．３  ＲＮＡナノレポーターの生産のためのプロトコル
ナノレポーターを作成し、実質的に本実施例に記載された方法を用いて標的分子を検出するのに首尾よく使用された。そのようなこの方法を用いる標的検出の例を図６に示す。
【０３６２】
骨格の生成。一本鎖環状Ｍ１３ｍｐ１８  ＤＮＡ（ＵＳＢ）を、ＢａｍＨＩ認識部位（Ｂａｍ  Ｃｕｔｔｅｒオリゴ）に相補的な５倍モル過剰のオリゴヌクレオチドにアニールし、ＢａｍＨＩ制限酵素で切断して、線状一本鎖ＤＮＡ骨格を生じさせた。Ｂａｍ  Ｃｕｔｔｅｒオリゴヌクレオチド（抗−Ｂａｍオリゴヌクレオチド）に相補的なオリゴヌクレオチドを、引き続いて、５０倍過剰に加えて、遊離Ｂａｍ  Ｃｕｔｔｅｒオリゴヌクレオチドを隔離し、かくして、より後の工程の間にＭ１３の再環状化を妨げた。線状Ｍ１３分子は、それに、フルオロフォアが取込まれたＲＮＡパッチ、またはＲＮＡセグメントをアニールできる骨格として働くことができる。
【０３６３】
Ｍ１３骨格上に二本鎖位置を形成するためのＰＣＲ。オリゴヌクレオチドプライマー対の１０組を設計して、Ｍ１３骨格に沿って１０の異なる領域を作成した。各対は、５’末端にＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有する１つのプライマーを含有する。領域２ないし７は９００塩基（ほぼ３００ｎｍ）長であるように設計される。というのは、これは回折−制限スポット（標準オプティックスで達成することができる最小のスポット）の適切なサイズだからである。溶液１および８は、共に、長いおよび短いバージョンを有し：長いバージョンは全９００塩基領域を被覆し、他方、短いバージョンは９００塩基領域の部分のみを被覆して、標的−特異的配列が連結されるのを可能とする。かくして、標的−特異的配列はいずれかの端部に付着させることができる。また、端部はアンカーまたはタグの付着で用いることもできる。
【０３６４】
ＰＣＲは、Ｔａｑポリメラーゼ、および鋳型としての０．５ｎｇの二本鎖Ｍ１３ｍｐ１８  ＤＮＡ（ＵＳＢ）を用いて行う。反応は、ＱｉａｇｅｎからのＱｉａｑｕｉｃｋ精製キットを用いて清浄化する。各ＰＣＲ反応により、以下に説明する１つの特異的セグメントに対応する一本鎖断片を生じる。これらの断片は、ＲＮＡセグメントのイン・ビトロ転写のための鋳型として用いる。
【０３６５】
暗色ＲＮＡセグメントを生じさせるためのイン・ビトロ転写。二本鎖鋳型として記載されたＰＣＲ産物を用い、Ａｍｂｉｏｎからのイン・ビトロ転写キット（Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７  ｋｉｔ）を用いてＲＮＡセグメントを作成する。転写反応の産物はＱｉａｇｅｎからのＲＮｅａｓｙキットを用いて（鋳型を除去するためのＤＮＡｓｅＩでの処理を含めて）精製される。
【０３６６】
アミノアリル基で修飾されたＲＮＡセグメントを生じさせるためのイン・ビトロ転写。二本鎖鋳型として前記したＰＣＲ産物を用い、後の染料−カップリングのためのＲＮＡセグメントは、Ａｍｂｉｏｎからのイン・ビトロ転写キット（ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ  ａＲＮＡキット）を用いて作成される。アミノアリル−修飾ＵＴＰヌクレオチドは転写の間にＲＮＡセグメントに取込まれる。転写反応の産物は、ＱｉａｇｅｎからのＲＮｅａｓｙを用いて（鋳型を除去するためのＤＮＡｓｅＩでの処理を含めて）精製される。
【０３６７】
着色したＲＮＡセグメントを生じさせるためのアミノアリルＲＮＡセグメント染料カップリング。Ａｍｂｉｏｎアミノアリル標識キットを用い、２０ないし１００μｇのアミノアリル−修飾ＲＮＡセグメントをＮＨＳ−エステル染料でカップリングさせる。用いる染料はＡｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５９４およびＡｌｅｘａ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）ならびにＣｙ３（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含む。
【０３６８】
各セグメントは、骨格上の各位置が４色のいずれかでセグメントで満たすことができるように、別々に４色で作成し；かくして、異なる色を異なる位置で加えて、多くのユニークな色組合せを生じさせることができる。
【０３６９】
この特別な具体例において、隣接するセグメントは異なる色のものでなければならず、あるいは各セグメントは個々の「スポット」として検出されるように、散在する暗色セグメントがあってよい。暗色セグメントはナノレポーターコードの部分として用いられうる。
【０３７０】
標識分子の組立。各位置についてのセグメントを、１×  ＳＳＰＥ緩衝液中でＭ１３骨格に対するセグメントの２：１比率で７０℃にて２時間アニールする。標識されたＲＮＡセグメントを持つ組立てられたナノレポーターを図３Ａおよび３Ｂに示す。図３Ａは、交互「スポット」（１、３、５および７）のみが標識されるナノレポーターを示し、図３Ｂはあらゆるスポットが標識されるナノレポーターを示す。
【０３７１】
（実施例４）：６．４  ＲＮＡナノレポーター／ゴーストプローブ組合せを用いる標的（Ｓ２）ＲＮＡおよびＤＮＡ分子の検出
プローブおよび標的オリゴヌクレオチドの合成。Ｓ２  ＤＮＡ標的オリゴヌクレオチドを合成し、ポリアクリルアミドゲル電気詠動（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって精製した。Ｓ２  ＲＮＡ標的分子は、製造業者の指示により、Ａｍｂｉｏｎ  Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔ（商標）キットを用い、クローン化されたＳＡＲＳコロナウイルス遺伝子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の領域に対応するＰＣＲ産物のイン・ビトロ転写によって作成した。Ｓ２ゴーストプローブ（図６Ａ（ｉ））はＳ２標的配列（Ｓ２−ａ）の特異的５０−塩基領域に相補的であり、５’末端においてビオチン−ＴＥＧモノマーで合成し、高速液体クロマトフラフィー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって精製した。Ｓ２標的（Ｓ２−ｂ）に相補的な５０ｂｐ、プラス、Ｍ１３骨格への連結で用いる９ｂｐのさらなる配列（合計５９ｂｐ）を含む第二のオリゴヌクレオチドを合成し、ＨＰＬＣ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって精製した。Ｓ２−ａおよびＳ２−ｂ標的領域は重複していないことに注意されたし。
【０３７２】
ナノレポーター合成。オリゴヌクレオチドＳ２−ｂは線状化Ｍ１３の５’末端に連結し［図６Ａ（ｉｉｉ）］、製造業者の指示により、得られた産物は、ＹＭ１００フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通すサイズ−排除濾過によって残存する連結されていないオリゴヌクレオチドから精製した。位置２、４、６および８（図１Ｃ）におけるＭ１３に相補的なアミノ−アリル−修飾ＲＮＡ断片は、製造者の指示によりＡｍｂｉｏｎ  Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔ（商標）キットを介してＤＮＡ鋳型のイン・ビトロ−転写（ＰＣＲ産物）から生成させた。次いで、セグメントを、Ａｍｂｉｏｎの指示によりＮＨＳ−エステル−修飾Ａｌｅｘａ６４７染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にカップリングさせた（アミノアリルＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ（商標）  ＩＩ  ａＲＮＡキット）。Ｍ１３骨格の位置１、３、５および７に対応するＲＮＡセグメント（図１Ｃ）は、前記したようにＤＮＡ鋳型からの修飾されていないイン・ビトロ−転写ＲＮＡとして作成された。ナノレポーターの組立ては、１×  ＳＳＰＥ緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で、１０ｆｍｏｌ／μｌの８つのセグメントの各々を５ｆｍｏｌ／μｌのＭ１３−Ｓ１−ｂ骨格に７０℃にて２時間アニールすることによって行った。最終産物は、暗色セグメントが散在したＡ６４７（赤色）で標識された４つのセグメントを持つナノレポーターであった。
【０３７３】
ハイブリダイゼーション条件。ナノレポーターおよびゴーストプローブの標的へのハイブリダイゼーションは、以下の条件：５×  ＳＳＰＥ（７５０ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭ二ナトリウムＥＤＴＡ）、４０ｐＭゴーストプローブ（付着オリゴヌクレオチドＳ２−ａ）、４０ｐＭナノレポーターＳ２−ｂ、１００ｎｇ／μｌの剪断されたサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルトの溶液および０．１％Ｔｗｅｅｎ下で行った。最終標的濃度は２０ｐＭ  Ｓ２  ＤＮＡ標的（図６Ｂ）および１ｐＭ  Ｓ２  ＲＮＡ標的（図６Ｃ）。標的は陰性対照に加えなかった（図６Ｃ）。ハイブリダイゼーション反応は６５℃にて少なくとも１６時間インキュベートした。
【０３７４】
ハイブリダイゼーション反応は１００ｍＭホウ酸緩衝溶液（ｐＨ９．８）で１：２希釈し、フローセルチャネルに導入し、チャネルの底を形成するストレプトアビジン−被覆カバーグラス（Ａｃｃｅｌｒ８からのストレプトアビジン−ＯｐｔｉＣｈｅｍカバーグラス）に結合した。ナノレポーター／標的／ゴーストプローブ複合体の１つの端部によるスライドへの付着は、ビオチニル化ゴーストプローブとストレプトアビジン表面との相互作用を介して達成された。チャネルをさらなるホウ酸緩衝液で濯いで、表面に結合していない過剰のレポーターを除去した後、緩衝液を１×  ＴＡＥ（４０ｍＭトリス−酢酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で交換し、２００Ｖの電流を印加して、イメージ捕獲の間にナノレポーター／標的複合体を伸ばした。
【０３７５】
イメージは、６３Ｘ油浸漬対物レンズ（１．４ＮＡ）、Ｘｃｉｔｅ−１２０光源（Ｅｘｆｏ）、カスタマイズフィルター組（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｏｒｃａ−ＥＲ  ＣＣＤカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）およびＭｅｔａｍｏｒｐｈデータ獲得ソフトウエア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を備えたＬｅｉｃａ  ＤＭＩ  ６０００Ｂ顕微鏡を用いて得られた。予測したように、正しい標的分子Ｓ２がゴーストプローブ「図６Ａ（ｉ）、Ｓ２−ａ」およびＳ２−ｂ標的−特異的ナノレポーター［図６Ａ（ｉｉｉ）］双方にハイブリダイズする場合［図６Ａ（ｉｉ）］、ゴーストプローブ／標的／ナノレポーター複合体は単一の種を形成し、これはスライドに付着し、６４７ｎｍ波長の光（図６Ｂ、６Ｃ、および６Ｅ）に暴露した場合に４スポットとして可視化された。結合の量は標的の濃度に依存した。Ｓ２標的配列の存在下において有意な結合はなかった（図６Ｄ）。
【０３７６】
（実施例５）：６．５  一価抗体断片を含むナノレポーター
標的分子が蛋白質またはポリペプチドである場合、ナノレポーターを生じさせることができ、ここに、該ナノレポーターの骨格は核酸であって、標的−特異的配列は一価抗体断片である。ルーチン方法を用いて、注目する標的分子を認識する抗体は、所望により、ペプシンで消化して、Ｆ（ａｂ’）２断片を生じる。抗体の２つの部分、あるいはペプシン消化によって生じた２つのＦ（ａｂ’）２断片は、例えば、２−メルカプトエチルアミンでの温和な還元によって分離される。この還元は、該抗体または該２つのＦ（ａｂ’）２断片を、官能性化することができる２つのスルフヒドリル基を持つ２つの一価断片に分離する。
【０３７７】
ヘテロ二官能性架橋剤（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．からのｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）を用いて、（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのような多くの源から注文することができる）アミン修飾で、マレイミドをオリゴヌクレオチドに付着させる。架橋試薬上のＮＨＳはオリゴヌクレオチド上のアミンと反応させて、マレイミド−コンジュゲーテッドオリゴヌクレオチドを生じる。
【０３７８】
次いで、このマレイミドコンジュゲーテッドオリゴヌクレオチドを、抗体断片上のスルフヒドリル基の１つと反応させる。立体的制限のために、ただ１つのオリゴヌクレオチドを各断片に付着させるのが好ましい。次いで、オリゴヌクレオチドに付着させたこの一価抗体断片を、ナノレポーター骨格上の相補的配列にハイブリダイズさせて、標的−特異的配列が抗体配列であるナノレポーターを得ることができる。
【０３７９】
表面付着。一旦、ナノレポーターが、標的分子および対応する標識された核酸、すなわち、標識モノマーに付着した核酸双方に付着すれば、それらを表面に付着させ、標識モノマーによって発せられるシグナルの順序を分解するにおいて伸ばされ、かくして、標的分子を同定する。この例において、ナノレポーターは伸ばされ、特定の標的分子に対応するその蛍光染料コードを空間的に解像する。ナノレポーターは、一端を表面（本実施例においては−カバーグラス、以下の調製参照）に付着させることによって伸ばす。表面付着のために２つの方法を用いることができる：Ａ）ビオチニル化されているナノレポーターを備えたＡｃｃｅｌｒ８  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのストレプトアビジンで被覆されたスライド、およびＢ）ストレプトアビジンを有するナノレポーターを備えたビオチン被覆スライド。緩衝液中で、ナノレポーターは活性な表面と接触され、一定時間インキュベートさせる。この反応は、チャネルを作製するためにエッチングされたシリコンウエハー中に成型されたＰＤＭＳから作製されたフローセルで行う。金属チュービングを用いて、緩衝液および試料の挿入のためのチャネルの端部において穴を開けてウェルとする。チャネルの寸法は０．５ｍｍまたは１ｍｍ幅であって、５４μｍの高さである。一旦試料がフローセルレーンに負荷されインキュベートされれば、ナノレポーターを付着させるべきである。ナノレポーターは、電圧を印加することによって、または後退メニスカスを持つ液体を除去し、ストリングを伸ばし、乾燥されたものとすることによって伸ばすことができる。
【０３８０】
表面の調製およびデバイスの組立て。結合表面（Ａｃｃｅｌｒ８ブランドストレプトアビジン−ＯｐｔｉＣｈｅｍ、被覆されたカバーグラス）を、スライド容器当たり５表面のユニットにはめ込み、各容器をホイルパウチ中のシリカ乾燥剤のパッケージで包む。パウチを使用するまで−２０℃で貯蔵する。
【０３８１】
結合用の表面を調製するために、パウチを、まず、フリーザーから引き出し、数分間にわたって室温まで持っていく。もし従前に開かれていないならば、次いで、パウチを１つのエッチに沿ってスライスして、スリットを形成し、表面の容器を除去する。必要な表面の除去に際して、容器をその乾燥剤と共にパウチに戻し、スリットをパッケージングテープのストリップで閉じてシールし、パウチをフリーザーに戻す。
【０３８２】
次いで、表面をＮａｎｏ純水（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ  Ｎａｎｏｐｕｒｅ  Ｄｉａｍｏｎｄ）の流れで軽く濯ぎ、清浄化なスロットを形成されたＣｏｐｌｉｎジャー中の０．２μｍ−濾過１×  ＰＢＳ中に１０分間浸漬する。浸漬後、表面をＮａｎｏ純水に浸し、表面エッジを横切って濾過された窒素を吹き付けることによって乾燥する。
【０３８３】
セロハンテープをＰＤＭＳ表面に貼付し、次いで、貯蔵の間に付着するようになり得るダストまたは他の粒子を剥がすことによって、表面と接合し、試料の局所化を供するのに用いたＰＤＭＳデバイスを使用直前に清浄化する。Ａｃｃｅｌｒ８表面の結合側を上にして置き、清浄なＰＤＭＳ構造を、チャネルを下にして、表面の中心に置く。ＰＤＭＳは容易に被覆されたグラスに接着し、さらなる付着メカニズムが必要でない。
【０３８４】
試料の結合および洗浄。（現在、１００ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．８に希釈された）５μＬの試料の液滴を選択されたレーンの１つのウェルに適用することによって、試料を表面に結合させる。液滴は、チャネルがウェルに接合する地点に丁度触れるべきである（いくつかの試料はこの地点において吸い込まれ得る）。チャネルを満たし、非常に弱い真空（＜２ｋＰａ）を用いて液滴をチャネルを通って反対側のウェルに引き出すことによって、結合をチャネル全体に均等化する。該プロセスをその各レーンにおいて他の試料について反復する。次いで、過剰の流体をウェルから取り出し、ウェルにテープを貼って、蒸発を低下させ、デバイスを暗所で室温にて２０分間インキュベートする。
【０３８５】
結合後、テープを除去し、各レーンの頂部ウェルに前記した１００μＬのホウ酸塩緩衝液を満たす。約２０μＬのその緩衝液を真空を用いてチャネルから他のウェルへと引き出し、該プロセスを１回反復する。次いで、全てのホウ酸緩衝液を全てのウェルから除去し、頂部を１×  ＴＡＥ、ｐＨ８．３で満たす。約５０μＬのＴＡＥをチャネルを通じて引き出し、次いで、全てのＴＡＥを除去し、ウェルを再度満たす。該プロセスを、合計して約１５０μＬのＴＡＥ濯ぎのために、３回反復する。最後に、全てのウェルを１００μＬの１×  ＴＡＥで満たす。
【０３８６】
電気ストレッチング。カバーグラス／ＰＤＭＳデバイスの底に浸漬油をスポットし、顕微鏡上に置く。電極を、第一のＰＤＭＳチャネルの対向側のウェルに挿入する（頂部ウェルにおいては陰極、底部ウェルにおいては陽極）。チャネルの第一のイメージングを底部ウェル近くで取り；注目する領域が焦点に入るように顕微鏡のステージを調整する。
【０３８７】
次いで、電圧（２００  Ｖ）をチャネルを横切って印加する。電圧はＤＣ電源（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｅ３６３０Ａ）によって供給し、高電圧増幅器（Ｍａｔｓｕｓａｄａ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｃ．）によって増幅されたのを通じて１００倍増幅する。電流を印加した後、焦点を再度調整し、イメージングプロセスを開始する。
【０３８８】
次いで、電気ストレッチングおよびイメージングプロセスを残りのチャネルで反復する。ナノレポーターをイメージする。
【０３８９】
ナノレポーターに対する蛍光染料のための光源。光源としてのアークランプを用いるにおいて、最良のフルオロフォア選択は、Ａｌｅｘａ  ４８８、Ｃｙ３、およびＡｌｅｘａ  ５９４のような蛍光重複に導くことのない最も明るいタイプである。Ａｌｅｘａ  ６４７およびＣｙ５．５のようなより弱い蛍光染料を用いることもできる。
【０３９０】
ナノレポーターについての蛍光染料をイメージするためのフィルター。選択されたフルオロフォアＡｌｅｘａ  ４８８、Ｃｙ３、Ａｌｅｘａ  ５９４およびＡｌｅｘａ  ６４７については、Ｃｙ３とＡｌｅｘａ５９４の間に重複があり得る。しかしながら、５７２ないし６００ｎｍのバンド幅を持つ発光フィルターのカスタムオーダーは重複を最小化する。
【０３９１】
ナノレポーターをイメージするための顕微鏡および対物レンズ。用いる顕微鏡モデルは、多数の蛍光染料候補からの蛍光発光の選択を可能とする６つのフィルターカセットを有する倒立蛍光イメージングステーションを用いるＮｉｋｏｎ  ＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２０００Ｅである。選択された染料では、要求される光学的分解能は、全ての波長（５００−７００ｎｍ）について約４００ｎｍである。選択された対物レンズは、１．４５のＮＡおよび６０の倍率を有するＮｉｋｏｎ  Ｐｌａｎ  Ａｐｏ  ＴＩＲＦレンズである。光学分解能は異なる波長について〜２１０ないし３００ｎｍである。
【０３９２】
顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２０００Ｅ）を用いる５分前に、光源（Ｘ−ｃｉｔｅ  １２０，Ｅｘｆｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）にスイッチを入れ、強度が最大であることを確認する。ＣＣＤカメラドライバー（Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｏｒｃａ  Ａｇ）およびシャッターコントローラーにスイッチを入れる。６０×１．４５ＮＡの油対物レンズ（Ｐｌａｎ  Ａｐｏ  ＴＩＲＦ，Ｎｉｋｏｎ）を用いて、ナノレポーターを評価する。全てのナノレポーターの評価のために、オプティバールを１×に設定する。Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を開く。ｃｙ３、Ａ６４７（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のような対応するフィルター組を用いてイメージを獲得する。
【０３９３】
７．引用した文献
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許および特許出願は、あたかも各個々の刊行物または特許または特許出願が、全ての目的で本明細書中において引用によりその全体が援用されるように具体的かつ個々に指令されるかのように同程度に引用によりここに援用される。
【０３９４】
本発明は、コンピュータ読取可能記憶媒体に内臓されたコンピュータプログラムメカニズムを含むコンピュータプログラム製品として実行することができる。例えば、コンピュータプログラム製品は図９に示されたプログラムモジュールを含有することができよう。これらのプログラムモジュールは、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、磁気ディスク記憶製品、または他のコンピュータ読取可能データまたはプログラム記憶製品に記憶することができる。プログラムモジュールは、ＲＯＭのような永久記憶、１以上のプログラム可能なチップ、または１以上の特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）に埋め込むこともできる。そのような永久記憶は、サーバー、８０２．１１アクセスポイント、８０２．１１ワイヤレスブリッジ／ステーション、リピーター、ルーター、携帯電話、または他の電子デバイスに局所化することができる。コンピュータプログラム製品におけるプログラムモジュールは、（ソフトウェアモジュールが内蔵された）コンピュータデータシグナルの伝達によって、デジタル的に、または搬送波にて、インターネットその他を介して電子的に分配することもできる。
【０３９５】
当業者に明らかなように、本発明の多くの修飾および変形は、その精神および範囲を逸脱することなくなすことができる。例えば、データ記憶モジュール４４、標識同定モジュール５０、およびプローブ同定モジュール５４は単一のプログラムに組合せることができ、各々、別々のプログラムとすることができ、あるいは事実、多数の（例えば、３以上の）プログラムに分配することができよう。本明細書中に記載された特別な具体例は例としてのみ提供され、本発明は、特許請求の範囲が権限を持つ十分な同等範囲と共に、特許請求の範囲の用語によってのみ制限されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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