(57)【要約】  ヒト胚芽幹細胞の未分化増殖を誘導するオカダ酸含有培地組成物、および前記培地組成物でヒト胚芽幹細胞の未分化増殖を誘導する方法を開示する。
2009506785.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オカダ酸を含む、胚芽幹細胞の未分化増殖を誘導する培地組成物。
【請求項２】
胚芽幹細胞がヒトに由来する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物がオカダ酸を０．５〜１．５ｎＭの濃度で含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
請求項１記載の培地組成物で胚芽幹細胞を培養する段階を含む、胚芽幹細胞の未分化増殖を誘導する方法。
【請求項５】
胚芽幹細胞がヒトに由来する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記方法がオカダ酸を０．５〜１．５ｎＭの濃度で含む、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、ヒト胚芽幹細胞の未分化増殖を誘導するオカダ酸含有培地組成物、および前記培地組成物でヒト胚芽幹細胞の未分化増殖を誘導する方法に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
ヒト胚芽幹細胞(human embryonic stem cells：ｈＥＳＣｓ)は、ヒトの身体を構成する全器官に分化できる能力を持つ細胞であって、１９９８年にＴｈｏｍｓｏｎグループ(Science 1998, 282:1145-1147)およびＲｅｕｂｉｎｏｆｆグループ(Nat Biotechnol 2000, 18:399-404)などによって確立された。以後、ｈＥＳＣｓは、難治病などを治療することが可能な細胞治療のための足場として作用した。ｈＥＳＣｓは、マウスＭＥＦ(mouse embryonic fibroblast)を支持細胞と共培養することにより増殖することができる。ところが、マウス細胞の共培養は細胞治療においてマウスウィルス感染などの多くの問題点を持っている。
【０００３】
かかる問題点を解決するために、最近、ヒト細胞起源の支持細胞（feeder cell）と支持細胞のない培養条件(feeder-free)を確立するために多くの研究が盛んに行われている(Richards M et al. Nat Biotechnol 2002,20:933-936; Hovatta O et al. Hum Reprod 2003, 18:1404-1409; Amit M et al. Biol Reprod 2003, 68:2150-2156; Richards M et al. STEM CELLS 2003, 21:546-556; Xu C et al. Nat Biotechnol 2001, 19:971-974; Rosler et al. Dev Dyn 2004,229:259-274; Carpenter et al. Dev Dyn 2004, 229:243-258; Amit et al. Biol Reprod 2004,70:837-845; Sato N et al., Nat Med 2004, 10:55-63; Xu R-H et al. Nat Methods 2005,2:185-190; Xu C et al. STEM CELLS 2005, 23:315-323)。Ｈｏｖａｔｔａグループ(Hum Reprod 18:1404, 2003)は、マウス細胞の代わりにヒト包皮細胞(foreskin cell)と共培養してｈＥＳＣｓを維持することができると報告した。また、Ａｍｉｔ(Biol Reprod 68:2150, 2003)とＲｉｃｈａｒｄｓ(STEM CELLS 21:546, 2003)なども、ヒト由来の支持細胞に未分化されたｈＥＳＣｓの成長を維持した。Ｘｕグループは、ＭＥＦ由来のＣＭ(conditioned media)とマトリックス、例えばラミニン(laminin)、マトリゲル(matrigel)などを用いて支持細胞のない培養条件を確立した。Ｒｏｓｌｅｒ等(Dev Dyn 229:259, 2004)は、Ｘｕグループで確立したＣＭを用いて１年以上支持細胞のない(feeder-free)状態でｈＥＳＣｓを維持した。ところが、このようなＣＭは、マウス由来の成分が培地中に残っているという欠点がある。２００５年、Ｘｕ等は、ＣＭを使用せず、ｂＦＧＦ等の成長因子の組み合わせで支持細胞のない状態の培養条件を確立した(STEM CELLS 23:315, 2005)。Ｓａｔｏ等は、Ｗｎｔ経路(Wnt pathway)を活性化させるために、ＧＳＫ−３−特異的抑制剤であるＢＩＯを用いて支持細胞のない状態で未分化マウスおよびヒト胚芽幹細胞を維持した(Nat. Med 10:55, 2004)。Ｘｕグループは、ｂＦＧＦとＢＭＰアンタゴニストとしてのｎｏｇｇｉｎを培地内に添加し、未分化ｈＥＳＣｓを支持細胞のない状態で維持した(Nat Methods 2:185, 2005)。
【０００４】
このような背景の下に、本発明者は、支持細胞のない条件でも、オカダ酸が含まれた培地では胚芽幹細胞が未分化増殖を維持し、この際、胚芽幹細胞は幹細胞マーカーを正常的に発現し、正常的核型(karyotype)を持つということを確認し、胚芽幹細胞の未分化増殖を誘導する条件を確立し、本発明を完成した。
【０００５】
〔発明の開示〕
本発明のある目的は、胚芽幹細胞の未分化増殖を誘導するオカダ酸含有培地組成物を提供することにある。
本発明の他の目的は、オカダ酸含有培地組成物で培養する段階を含む、胚芽幹細胞の未分化増殖を誘導する方法を提供することにある。
【０００６】
〔図面の簡単な説明〕
図１は支持細胞のない条件で胚芽幹細胞培養の際にオカダ酸が細胞に及ぼす効果を示す結果である。ＡとＢは１ｎＭの濃度で、Ｃは０．１ｎＭの濃度でオカダ酸を添加したものを示し、Ｄはオカダ酸を添加していない対照群を示す。
【０００７】
図２は支持細胞のない条件で培養されたヒト胚芽幹細胞を示す結果である。Ａは支持細胞上における胚芽幹細胞を、Ｂ〜Ｄは支持細胞における胚芽幹細胞を観察した結果である。
【０００８】
図３は支持細胞上におけるヒト胚芽幹細胞を示すもので、ＡはｂＦＧＦを添加していない胚芽幹細胞を、ＢはｂＦＧＦのない条件で１ｎＭオカダ酸を添加した胚芽幹細胞を示す結果である。
【０００９】
図４は支持細胞のない条件で培養した胚芽幹細胞が正常的な核型を持つことを示す結果である。
【００１０】
図５は支持細胞のない条件で培養した胚芽幹細胞で未分化マーカーの発現を確認した結果である。
【００１１】
〔発明を実施するための最良の様態〕
胚芽幹細胞の培養過程で分化を誘導する前まで細胞を未文化状態に維持および増殖させることは、幹細胞研究とその利用において非常に重要な技術的課題である。本発明者は、オカダ酸が胚芽幹細胞の未分化増殖を誘導することができることを解明した。
【００１２】
一つの様態として、本発明は、胚芽幹細胞の未分化増殖を誘導するオカダ酸含有培地組成物に関する。
【００１３】
本発明において、用語「胚芽幹細胞(embryonic stem cell)」とは、動物の胚から獲得した澱粉化能力を維持しながら増殖する潜在力を持っている細胞を意味する。
【００１４】
本発明の胚芽幹細胞は、ヒト(human)、猿(monkey)、豚(pigs)、馬(horses)、牛(cows)、羊(sheep)、犬(dogs)、猫(cats)、マウス(mice)、ラット(rats)などの全動物に由来する胚芽幹細胞を含むが、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト由来の胚芽幹細胞である。
【００１５】
本発明において、用語「増殖(proliferation)」とは、細胞数の増加を意味し、「成長(growth)」と同一の意味で使用される。
【００１６】
本発明において、用語「未分化増殖(undifferentiated proliferation)」とは、幹細胞が特定の細胞に分化されていないまま、元の細胞と同一の性質を持つ、すなわち澱粉化能を持つ細胞に増殖することを意味する。当業者は、分化されていない状態と分化された状態を一般な方法で確然に区別することができる。例えば、分化されていない細胞は高い（核／細胞質の比）値を有し、顕著な核小体（仁）が見られる(prominent nucleoli)という特徴を持つ。
【００１７】
本発明者は、オカダ酸を培地に含まさせて胚芽幹細胞を培養する際に、細胞は支持細胞のない条件でも未分化状態を維持し増殖することを確認した。
【００１８】
オカダ酸は、タンパク質ホスファターゼ２Ａ（protein phosphatase：ＰＰ２Ａ）抑制剤であって、ｃ−ｍｙｃの分解を抑制して安定性を増加させると報告されたが(Yeh E et al. Nat Cell Biol 2004, 6:308-318)、幹細胞の分化と増殖に関連して知られたことはない。本発明の具体的な実施によれば、胚芽幹細胞をオカダ酸含有培地で培養させると、１５継代以上でも、胚芽幹細胞は未分化状態を維持したまま増殖した。この際、細胞で未分化ＥＳマーカー、例えばｎａｎｏｇ、ｏｃｔ−４、ｒｅｘ１、Ｔｅｒｔなどの遺伝子が全て発現し、正常的な核型を持つ。これにより、オカダ酸は支持細胞のない条件で胚芽幹細胞を安定的に未分化増殖させることが分かる。
【００１９】
また、オカダ酸は、幹細胞培養で増殖を調節する成長因子として一般に使用するｂＦＧＦの機能を代替する。したがって、オカダ酸は、支持細胞、マトリックスなどを使用する既存の胚芽幹細胞培養法においてもｂＦＧＦなどの通常用いられる分化制御物質を代替して使用し、あるいはこれらと併用して使用することができる。
【００２０】
本発明において、用語「培地」とは、インビトロで幹細胞の成長及び生存を支持可能とする培地を意味し、幹細胞の培養に適切な、当分野で使用される通常の培地を全て含む。細胞の種類によって培地と培養条件を選択することができる。培養に用いられる培地は、好ましくは細胞培養最小培地（cell culture minimum medium：ＣＣＭＭ）であって、一般に炭素源、窒素源および微量元素成分を含む。このような細胞培養最小培地には、例えば、ＤＭＥＭ(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)、ＭＥＭ(Minimal essential Medium)、ＢＭＥ(Basal Medium Eagle)、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ−１０、Ｆ−１２、αＭＥＭ(α Minimal essential Medium)、ＧＭＥＭ(Glasgow's Minimal essential Medium)、ＩＭＤＭ(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)などがあるが、これに制限されない。
【００２１】
また、前記培地は、ペニシリン(penicillin)、ストレプトマイシン(streptomycin)、ゲンタマイシン(gentamicin)などの抗生剤を含むことができる。
【００２２】
オカダ酸を用いて胚芽幹細胞の未分化増殖を誘導しようとする本発明の目的上、培地の種類と培養方式に特別な制限なく、胚芽幹細胞培地にオカダ酸を含んで使用することができる。この際、オカダ酸を単独で使用し、或いは周知の一つ以上の分化制御物質と共に使用するなど、多様な応用が可能である。
【００２３】
本発明のオカダ酸は、前記培地に有効濃度で含まれるようにしなければならない。本発明において、用語「有効濃度」とは、オカダ酸が未分化増殖を誘導することが可能な十分な量を意味する。有効濃度以下では活性を示さず、有効濃度以上では細胞に毒性を示すので、有効濃度内でオカダ酸を使用するようにする。当分野でよく知られている要素、例えば胚芽幹細胞の起源、培地の種類、培地に含まれる成分、同時に使用される分化制御物質などに、オカダ酸の有効濃度は影響されることがある。例えば、ヒト胚芽幹細胞において分化制御物質としてオカダ酸を単独で使用する場合、有効濃度は０．５〜１．５ｎＭである。
【００２４】
別の様態として、本発明は、オカダ酸含有培地組成物で培養する段階を含む、胚芽幹細胞の未分化増殖を誘導する方法に関する。
【００２５】
オカダ酸含有培地組成物で胚芽幹細胞を増殖させることにより、胚芽幹細胞の培養において分化を所望する時点まで細胞の自発的な分化を防ぎ、未分化状態に維持可能である。
【００２６】
胚芽幹細胞は、一般な方法で獲得することができる。例えば、ヒト胚芽幹細胞は、Ｔｈｏｍｓｏｎが記述した方法によって獲得することができる（米国特許第５８４３７８０号; Science 282; 1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844, 1995）。獲得した胚芽幹細胞を本発明のオカダ酸含有培地組成物で培養することにより、ウィルス性感染、動物源性感染による汚染などのおそれなしに胚芽幹細胞の未分化増殖を調節および制御することができるので好ましい。
【００２７】
以下、下記実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。但し、下記実施例は本発明を例示するためのもので、本発明の範囲を限定するものではない。
【００２８】
〔実施例１．ｈＥＳＣｓ培養〕
ヒト胚芽幹細胞（ＨＳＦ−６：University of California, San Francisco）を１３．５日齢のＣＦ１マウス（ＯＲＩＥＮＴ）胎児(mouse fetus)を支持細胞として用いて培養した。支持細胞は１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）、０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ非必須アミノ酸が含まれているＤＭＥＭ（high glucose、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した後、有糸分裂(mitosis)を中止させるために１０μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ）を１時間３０分間処理した。その後、０．１％ゼラチン(gelatin)でコートされた４ウェル培地皿に、６．１×１０４の濃度でマイトマイシンＣを処理した支持細胞をシード(seeding)した。支持細胞をシードした翌日、ヒト胚芽幹細胞をシードし、５〜７日間隔で機械的(mechanical)方式で継代培養した。
【００２９】
ヒト胚芽幹細胞は、２０％ knockout serum replacement (ＳＲ)（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール、１％非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧ、１００ｇ／ｍＬストレプトマイシン、および４ｎｇ／ｍＬ ｈｒ−ｂＦＧＦ（human recombinant basic fibroblast growth factor、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が添加されたＤＭＥＭ(Dulbecco's modified Eagle's medium)／Ｆ１２(without pyruvate)で培養した。図２ＡはＣＦ１マウス支持細胞上にあるヒト胚芽幹細胞を示す。
【００３０】
〔実施例２．ヒト胚芽幹細胞におけるオカダ酸の効果〕
支持細胞上にある胚芽幹細胞におけるオカダ酸の効果を考察するために、様々な濃度（０．０１、０．１、１、１０、１００ｎＭ）でオカダ酸をヒト胚芽幹細胞培養液に添加した。１０、１００ｎＭでは、培養液に添加した翌日（２４時間後）、胚芽幹細胞と支持細胞がリーシス(lysis)されながらオカダ酸に毒性(toxicity)を示し、１ｎＭ以下では、多数回継代培養を行った後にも、オカダ酸に毒性を示さず、オカダ酸を処理していない対照群と同様の未分化された胚芽幹細胞の形を示した。
【００３１】
〔実施例３．支持細胞のない条件でオカダ酸がヒト胚芽幹細胞に及ぼす効果〕
支持細胞のない培養条件でヒト胚芽幹細胞に及ぼすオカダ酸の効果を考察した。０.０１、０．１、１ｎＭ濃度のオカダ酸を、ＣＭを使用していないヒト胚芽幹細胞培養液に添加し、その効果を考察した。先行研究者らが、支持細胞のない状態で一般に使用したラミニンやマトリゲルなどのマトリックスを処理していない条件で、４−ウェル培養皿に常温で３０分間０．１％ゼラチンコーティングを行った後、支持細胞上にある胚芽幹細胞を機械的方法で小さい欠片に切った後、０．０１、０．１、１ｎＭの濃度が添加された培養液にシードした。
【００３２】
その結果、０．０１、０．１ｎＭ（図１Ｃ）ではオカダ酸を処理していない対照群（図１Ｄ）と同様に分化される形態を示し、３継代以上ではヒト胚芽幹細胞がすべて分化され、未分化された胚芽幹細胞を観察することができなかった。ところが、１ｎＭを添加したグループでは、未分化されたヒト胚芽幹細胞の形態（図２Ｂ〜Ｄ）を維持し、０．０１、０．１ｎＭで得られる結果のように分化される傾向は示していない。また、支持細胞上にある胚芽幹細胞の細胞質に比べて核の比率が高い胚芽幹細胞の性格も観察することができた（図２Ｄ）。
【００３３】
〔実施例４．支持細胞上にある胚芽幹細胞（ｂＦＧＦのない培養液）におけるオカダ酸の効果〕
ｂＦＧＦは、ヒト胚芽幹細胞に４ｎｇ／ｍＬの濃度で培養液に添加し、未分化胚芽幹細胞の増殖に影響を及ぼすものと知られている。ｂＦＧＦのない条件でオカダ酸１ｎＭを培養液に添加して胚芽幹細胞の増殖および分化有無を観察した。支持細胞上にある胚芽幹細胞にｂＦＧＦがない条件では２継代以上で全て分化される傾向を示しており（図３Ａ）、ｂＦＧＦのない条件下にオカダ酸１ｎＭを添加したグループでは未分化状態のヒト胚芽幹細胞を観察することができた（図３Ｂ）。オカダ酸がｂＦＧＦを代替する効果を持つことを確認することができた。
【００３４】
〔実施例５．支持細胞のない条件におけるヒト胚芽幹細胞のＥＳマーカー及び核型の確認〕
支持細胞のない条件で成長したヒト胚芽幹細胞が正常的なＥＳマーカーを発現するか否かをＲＴ−ＰＣＲによって考察した。総ＲＮＡはＴｒｉｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。逆転写（Reverse-Transcription：ＲＴ）は、総ＲＮＡの５００ｎｇ、ｏｌｉｇｏ ｄ（Ｔ）１２−１８プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＡＭＶ逆転写酵素（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いてｃＤＮＡを作った。ＲＴ−ＰＣＲは、ｃＤＮＡ１μＬ、それぞれのプライマー１０ｐｍｏｌ、およびＰＣＲ ｐｒｅｍｉｘ（１Ｕ Ｔａｇ ＤＮＡポリメラーゼ、２５０μＭ ｄＮＴＰｓ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、４０ｍＭ ＫＣｌおよび１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２ Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて行った。
【００３５】
プライマーは、未分化ＥＳマーカーであるｎａｎｏｇ（配列番号１と２）、ｏｃｔ−４（配列番号３と４）およびｒｅｘ１（配列番号５と６）、並びにＥＳで発現するｈＴｅｒｔ（配列番号７と８）遺伝子に特異的なプライマーを使用した。β−アクチン（配列番号９と１０）を陰性対照区として使用した。使用されたｃＤＮＡは、陽性対照区として、支持細胞上で成長したヒト胚芽幹細胞を使用し、支持細胞のない条件で成長した胚芽幹細胞を５、１０、１５継代のサンプルとして使用した。図５のＲＴ−ＰＣＲ結果より、支持細胞のない条件で成長したヒト胚芽幹細胞は、陽性対照区と同様に、ＥＳマーカーであるｎａｎｏｇ、ｏｃｔ−４およびｒｅｘ１、並びにＥＳで発現するｈＴｅｒｔが全て発現することを確認した。核型は（株）Ｓａｍｋｗａｎｇに依頼し、支持細胞のない条件で１５継代から確認した。その結果、正常的な核型を確認した。支持細胞のない条件で成長したヒト胚芽幹細胞は、支持細胞上で成長したヒト胚芽幹細胞のように正常的な形態と同一の遺伝子発現および核型を示した（図４）。
【００３６】
〔産業上の利用可能性〕
本発明のオカダ酸含有培地組成物を用いて、ウィルス性感染、動物源性感染による汚染などのおそれなしに胚芽幹細胞の未分化増殖を調節および制御することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】支持細胞のない条件で胚芽幹細胞培養の際にオカダ酸が細胞に及ぼす効果を示す結果である。ＡとＢは１ｎＭの濃度で、Ｃは０．１ｎＭの濃度でオカダ酸を添加したものを示し、Ｄはオカダ酸を添加していない対照群を示す図である。
【図２】支持細胞のない条件で培養されたヒト胚芽幹細胞を示す結果である。Ａは支持細胞上における胚芽幹細胞を、Ｂ〜Ｄは支持細胞における胚芽幹細胞を観察した結果である。
【図３】支持細胞上におけるヒト胚芽幹細胞を示すもので、ＡはｂＦＧＦを添加していない胚芽幹細胞を、ＢはｂＦＧＦのない条件で１ｎＭオカダ酸を添加した胚芽幹細胞を示す結果である。
【図４】支持細胞のない条件で培養した胚芽幹細胞が正常的な核型を持つことを示す結果である。
【図５】支持細胞のない条件で培養した胚芽幹細胞で未分化マーカーの発現を確認した結果である。
【図１】
2009506785.tif 000003
【図２】
2009506785.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
2009506785.tif 000007
【配列表】
2009506785000001.app
【国際調査報告】
2009506785.tif 000008
2009506785.tif 000009
2009506785.tif 000010