(57)【要約】前立腺上皮中にのみＡＲを欠く最初の条件付きノックアウトＡＲ（ｐｅｓ−ＡＲＫＯ）マウスの生成が本発明に記載される。さらに、ＡＲ獲得実験および機能損失実験を通して、正常前立腺細胞と癌性前立腺細胞の中での新たな増殖および上皮ＡＲの示差的役割が本発明で実証される。一実施形態において、本発明は、被験体における細胞増殖を阻害する方法を提供し、この方法は、上皮組織特異的プロモーターに作動可能に結合されたアンドロゲンまたはアンドロゲン受容体遺伝子を含むベクターを被験体に投与する工程を包含する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
上皮組織特異的プロモーターに作動可能に結合されたアンドロゲンまたはアンドロゲン受容体遺伝子を含むベクターを被験体に投与する工程を包含する、該被験体における細胞増殖を阻害する方法。
【請求項２】
上皮組織特異的プロモーターに作動可能に結合されたアンドロゲンまたはアンドロゲン受容体遺伝子を含むベクターを被験体に投与する工程を包含する、該被験体における癌を治療する方法。
【請求項３】
前記癌が前立腺癌である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
抗アンドロゲンまたは抗アンドロゲン受容体薬剤を前記被験体に投与する工程をさらに包含し、該薬剤が間質組織に標的化される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
抗アンドロゲンまたは抗アンドロゲン受容体薬剤を被験体に投与する工程を包含し、該薬剤が間質組織に標的化される、該被験体における癌を治療する方法。
【請求項６】
前記癌が前立腺癌である、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記薬剤が抗アンドロゲンまたは抗アンドロゲン受容体抗体である、請求項４または５に記載の方法。
【請求項８】
前記薬剤が間質組織標的化部位を含む抗体融合タンパク質である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記薬剤が抗アンドロゲンまたは抗アンドロゲン受容体ｓｉＲＮＡである、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記ｓｉＲＮＡが配列番号１３、２０、または２１に示される配列を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記薬剤がＡＳＣ−Ｊ９である、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
アンドロゲン受容体プロモーターに作動可能に結合されたアンドロゲン受容体遺伝子を含むベクター。
【請求項１３】
前記ベクターが上皮組織に標的化される、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
請求項１２に記載のベクターを被験体に投与する工程を包含する、細胞増殖を阻害する方法。
【請求項１５】
請求項１２に記載のベクターを被験体に投与する工程を包含する、癌を治療する方法。
【請求項１６】
前記癌が前立腺癌である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
アンドロゲンプロモーターに作動可能に結合されたアンドロゲン遺伝子を含むベクター。
【請求項１８】
前記ベクターが上皮組織に標的化される、請求項１７に記載のベクター。
【請求項１９】
請求項１７に記載のベクターを被験体に投与する工程を包含する、細胞増殖を阻害する方法。
【請求項２０】
請求項１７に記載のベクターを被験体に投与する工程を包含する、癌を治療する方法。
【請求項２１】
前記癌が前立腺癌である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
上皮組織特異的プロモーターに作動可能に結合されたアンドロゲンまたはアンドロゲン受容体遺伝子を含むベクター。
【請求項２３】
請求項２２に記載のベクターを被験体に投与する工程を包含する、細胞増殖を阻害する方法。
【請求項２４】
請求項２２に記載のベクターを被験体に投与する工程を包含する、癌を治療する方法。
【請求項２５】
前立腺成長を阻害する薬剤をスクリーニングする方法であって、該方法は、前立腺細胞に該薬剤を投与する工程、および該細胞上の上皮アンドロゲン受容体のレベルをモニタリングする工程を包含し、ここで、対照と比較した上皮アンドロゲン受容体の増加が、前立腺成長を阻害する薬剤であることを示す、方法。
【請求項２６】
アンドロゲン依存性腫瘍増殖を阻害する薬剤をスクリーニングする方法であって、該方法は、前立腺細胞に該薬剤を投与する工程、および該細胞上の上皮アンドロゲン受容体のレベルをモニタリングする工程を包含し、ここで、対照と比較した上皮アンドロゲン受容体の増加が、アンドロゲン依存性腫瘍増殖を阻害する薬剤であることを示す、方法。
【請求項２７】
前立腺成長を阻害する薬剤をスクリーニングする方法であって、該方法は、被験体から組織サンプルを入手する工程、該サンプルに該薬剤を投与する工程、および該組織中の上皮アンドロゲン受容体のレベルをモニタリングする工程を包含し、ここで、対照と比較した上皮アンドロゲン受容体の増加が、前立腺成長を阻害する薬剤であることを示す、方法。
【請求項２８】
前立腺成長を阻害する薬剤をスクリーニングする方法であって、該方法は、前立腺細胞に該薬剤を投与する工程、および該細胞上の間質アンドロゲン受容体のレベルをモニタリングする工程を包含し、ここで、対照と比較した間質アンドロゲン受容体の減少が、前立腺成長を阻害する薬剤であることを示す、方法。
【請求項２９】
アンドロゲン依存性腫瘍増殖を阻害する薬剤をスクリーニングする方法であって、該方法は、前立腺細胞に該薬剤を投与する工程、および該細胞上の間質アンドロゲン受容体のレベルをモニタリングする工程を包含し、ここで、対照と比較した間質アンドロゲン受容体の減少が、アンドロゲン依存性腫瘍増殖を阻害する薬剤であることを示す、方法。
【請求項３０】
前立腺成長を阻害する薬剤をスクリーニングする方法であって、該方法は、被験体から組織サンプルを入手する工程、該サンプルに該薬剤を投与する工程、および該組織中の間質アンドロゲン受容体のレベルをモニタリングする工程を包含し、ここで、対照と比較した間質アンドロゲン受容体の減少が、前立腺成長を阻害する薬剤であることを示す、方法。
【請求項３１】
ＡＲ遺伝子が破壊されており、該破壊された遺伝子は、プロモーターに作動可能に結合されているリコンビナーゼの作用によって産生される、細胞。
【請求項３２】
前記細胞が、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、乳房細胞、乳癌細胞、卵巣細胞、卵巣癌細胞、前立腺細胞、精巣細胞、骨細胞、脳細胞、神経細胞、または筋肉細胞である、請求項３１に記載の細胞。
【請求項３３】
前記細胞が前立腺癌細胞または前立腺癌細胞株である、請求項３２に記載の細胞。
【請求項３４】
前記プロモーターが組織特異的プロモーターである、請求項３１に記載の細胞。
【請求項３５】
前記組織特異的プロモーターが前立腺上皮特異的プロモーターである、請求項３４に記載の細胞。
【請求項３６】
前記前立腺上皮特異的プロモーターが、プロバシンプロモーター、前立腺分泌タンパク質−９４（ＰＳＰ９４）プロモーター、およびＮｋｘ３．１プロモーターからなる群より選択される、請求項３５に記載の細胞。
【請求項３７】
前記組織特異的プロモーターが前立腺間質特異的プロモーターである、請求項３４に記載の細胞。
【請求項３８】
前記前立腺間質特異的プロモーターがＡＲＡ５５プロモーターまたはトランスジェリン（ｔｒａｎｓｇｅｌｉｎ）プロモーターである、請求項３７に記載の細胞。
【請求項３９】
前記プロモーターが上皮前立腺細胞と間質前立腺細胞との両方において発現される、請求項３１に記載の細胞。
【請求項４０】
前記プロモーターがＭｘプロモーターである、請求項３９に記載の細胞。
【請求項４１】
前記ＡＲ遺伝子がマウスＡＲ遺伝子である、請求項３１に記載の細胞。
【請求項４２】
前記ＡＲ遺伝子の残基８５７において置換をさらに含む、請求項４１に記載の細胞。
【請求項４３】
前記置換がＴｈｒからＡｌａの置換（Ｔ８５７Ａ）である、請求項４２に記載の細胞。
【請求項４４】
前記ＡＲ遺伝子がヒトＡＲ遺伝子である、請求項３１に記載の細胞。
【請求項４５】
前記ＡＲ遺伝子の残基８７７において置換をさらに含む、請求項４４に記載の細胞。
【請求項４６】
前記置換がＴｈｒからＡｌａの置換（Ｔ８７７Ａ）である、請求項４５に記載の細胞。
【請求項４７】
前記リコンビナーゼがＣｒｅリコンビナーゼである、請求項３１に記載の細胞。
【請求項４８】
前記破壊されたＡＲ遺伝子が第１および第２のｌｏｘＰ部位を含む、請求項３１に記載の細胞。
【請求項４９】
前記破壊されたＡＲ遺伝子がナンセンス変異を含む、請求項３１に記載の細胞。
【請求項５０】
前記第１および第２のｌｏｘＰ部位が前記ナンセンス変異に隣接する、請求項４９に記載の細胞。
【請求項５１】
前記破壊されたＡＲ遺伝子がミスセンス変異を含む、請求項３１に記載の細胞。
【請求項５２】
第１および第２のｌｏｘＰ部位が前記ミスセンス変異に隣接する、請求項５１に記載の細胞。
【請求項５３】
前記破壊されたＡＲ遺伝子が遺伝子カセットを含む、請求項３１に記載の細胞。
【請求項５４】
第１および第２のｌｏｘＰ部位が前記遺伝子カセットに隣接する、請求項５３に記載の細胞。
【請求項５５】
請求項３１〜５４に記載の細胞を含むトランスジェニック哺乳動物。
【請求項５６】
前記哺乳動物がマウスである、請求項５５に記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項５７】
前記マウスがトランスジェニックマウス前立腺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｓｉｎｏｍａ）（ＴＲＡＭＰ）マウスである、請求項５６に記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項５８】
破壊されたＡＲ遺伝子を含むトランスジェニック哺乳動物であって、該破壊された遺伝子は、プロモーターに作動可能に結合されているリコンビナーゼの作用によって産生される、トランスジェニック哺乳動物。
【請求項５９】
前記プロモーターが組織特異的プロモーターである、請求項５８に記載の哺乳動物。
【請求項６０】
前記組織特異的プロモーターが前立腺上皮特異的プロモーターである、請求項５９に記載の哺乳動物。
【請求項６１】
前記前立腺上皮特異的プロモーターが、プロバシンプロモーター、前立腺分泌タンパク質−９４（ＰＳＰ９４）プロモーター、およびＮｋｘ３．１プロモーターからなる群より選択される、請求項６０に記載の哺乳動物。
【請求項６２】
前記組織特異的プロモーターが前立腺間質特異的プロモーターである、請求項５９に記載の哺乳動物。
【請求項６３】
前記前立腺間質特異的プロモーターがＡＲＡ５５プロモーターまたはトランスジェリンプロモーターである、請求項６２に記載の哺乳動物。
【請求項６４】
前記プロモーターがＭｘプロモーターである、請求項５８に記載の哺乳動物。
【請求項６５】
前記ＡＲ遺伝子がマウスＡＲ遺伝子である、請求項５８に記載の哺乳動物。
【請求項６６】
前記ＡＲ遺伝子の残基８５７において置換をさらに含む、請求項６５に記載の哺乳動物。
【請求項６７】
前記置換がＴｈｒからＡｌａの置換（Ｔ８５７Ａ）である、請求項６６に記載の哺乳動物。
【請求項６８】
前記ＡＲ遺伝子がヒトＡＲ遺伝子である、請求項５８に記載の哺乳動物。
【請求項６９】
前記ＡＲ遺伝子の残基８７７において置換をさらに含む、請求項５８に記載の哺乳動物。
【請求項７０】
前記置換がＴｈｒからＡｌａの置換（Ｔ８７７Ａ）である、請求項６９に記載の哺乳動物。
【請求項７１】
前記リコンビナーゼがＣｒｅリコンビナーゼである、請求項５８に記載の哺乳動物。
【請求項７２】
前記破壊されたＡＲ遺伝子が第１および第２のｌｏｘＰ部位を含む、請求項５８に記載の哺乳動物。
【請求項７３】
前記破壊されたＡＲ遺伝子がナンセンス変異を含む、請求項５８に記載の哺乳動物。
【請求項７４】
第１および第２のｌｏｘＰ部位が前記ナンセンス変異に隣接する、請求項７３に記載の哺乳動物。
【請求項７５】
前記破壊されたＡＲ遺伝子がミスセンス変異を含む、請求項５８に記載の哺乳動物。
【請求項７６】
第１および第２のｌｏｘＰ部位が前記ミスセンス変異に隣接する、請求項７５に記載の細胞。
【請求項７７】
前記破壊されたＡＲ遺伝子が遺伝子カセットを含む、請求項５８に記載の哺乳動物。
【請求項７８】
第１および第２のｌｏｘＰ部位が前記遺伝子カセットに隣接する、請求項７７に記載の哺乳動物。
【請求項７９】
前記哺乳動物がマウスである、請求項５８に記載の哺乳動物。
【請求項８０】
前記マウスがトランスジェニックマウス前立腺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｓｉｎｏｍａ）（ＴＲＡＭＰ）マウスである、請求項７８に記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項８１】
請求項５８に記載のマウスを含む前立腺癌のモデル。
【請求項８２】
アンドロゲン受容体（ＡＲ）陰性前立腺転移性細胞であり、ＡＲプロモーターの制御下でＡＲ遺伝子で安定にトランスフェクトされている、細胞。
【請求項８３】
前記細胞がＰＣ−３細胞である、請求項８２に記載の細胞。
【請求項８４】
アンドロゲン受容体（ＡＲ）陽性前立腺転移性細胞であり、ＡＲ  ｓｉＲＮＡで安定にトランスフェクトされている、細胞。
【請求項８５】
前記細胞がＷＲＭＹ１細胞、ＣＷ２２Ｒ−ＡＲ＋／＋細胞、またはＣＷ２２Ｒ−ＡＲ＋／−細胞である、請求項８４に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
１．背景
アンドロゲンおよび上皮−間葉相互作用は前立腺の成長および発達のために必要である。アンドロゲンシグナル伝達は、アンドロゲン受容体（ＡＲ）を通して起こり（非特許文献１；非特許文献２）これは、すべての哺乳動物の前立腺の中の間質と上皮の両方で見出される。機能的なアンドロゲン／ＡＲシグナル系を欠いているマウスは、正常な前立腺を発達させることに失敗する（非特許文献３；非特許文献４）。先駆的な発達の研究は、上皮ではなく間質のＡＲが、上皮細胞の同一性、形態学、芽形成、管分岐、増殖、アポトーシス、および分泌プロフィールの調節のために必須であることを示した（非特許文献５；非特許文献６）。実験的証拠は、上記ＡＲが、アンドロゲンによって活性化されたときに、細胞増殖が増加するという教義的に保持されている仮説に導いた（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。この概念は、前立腺疾患のための鍵となる治療である、アンドロゲン除去療法の中心的な前提である。多くの研究が、間質ＡＲが鍵となる発生事象を媒介していることを実証してきたが（非特許文献５；非特許文献６）、これらの研究は、典型的には、短時間にわたって評価されたので、表現型が顕在化するために数ヶ月を要し得る事象の再現は、十分に試験されていない可能性がある。
【０００２】
すべての哺乳動物の成体前立腺において、アンドロゲン欠乏は、上皮のアポトーシスおよび脱分化をもたらし、基底細胞の数の増加および管腔細胞の減少を生じる（非特許文献１０；非特許文献１１）。良性前立腺過形成および前立腺癌において、アンドロゲン欠乏は、成長を減少し、アポトーシスを増加し、腫瘍体積を減少する。しかし、しばしば、効果は一時的であり、アンドロゲンの除去後、異常な上皮細胞が存続し、ホルモンとは独立して不可避的に増殖する。毎年３０，０００人を超える男性が死亡し、より多くの男性がこの不可解なプロセスに苦しんでいる。前立腺の生物学ならびに治療標的におけるアンドロゲン／ＡＲシグナル伝達の役割をよりよく理解するために、上皮ＡＲの役割を決定することが肝要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｃｈａｎｇ，Ｃ．Ｓ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，３２４−６
【非特許文献２】Ｑｕｉｇｌｅｙ，Ｃ．Ａ．ら、Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ（１９９５）１６，２７１−３２１
【非特許文献３】Ｙｅｈ，Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（２００２）９９，１３４９８−５０３
【非特許文献４】Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐｒｏｇ  Ｈｏｒｍ  Ｒｅｓ（１９９５）５０，３４９−６４
【非特許文献５】Ｃｕｎｈａ，Ｇ．Ｒ．およびＬｕｎｇ，Ｂ．、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｚｏｏｌ（１９７８）２０５，１８１−９３
【非特許文献６】Ｃｕｎｈａ，Ｇ．Ｒ．ら、Ｊ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（２００４）９２，２２１−３６
【非特許文献７】Ｂｅｌｌｏ，Ｄ．ら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ（１９９７）１８，１２１５−２３
【非特許文献８】Ｄａｎｉｅｌｐｏｕｒ，Ｄ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（１９９４）５４，３４１３−２１
【非特許文献９】Ｓｕｚｕｋｉ，Ｈ．ら、Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｌａｔ  Ｃａｎｃｅｒ（２００３）１０，２０９−１６
【非特許文献１０】Ｅｖａｎｓ，Ｇ．Ｓ．およびＣｈａｎｄｌｅｒ，Ｊ．、Ｐｒｏｓｔａｔｅ（１９８７）１１，３３９−５１
【非特許文献１１】Ｍｉｒｏｓｅｖｉｃｈ，Ｊ．ら、Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（１９９９）１６２，３４１−５０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上皮アンドロゲン受容体（ＡＲ）に関連する方法および組成物が開示される。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
本願に組み込まれ、本願の一部を構成する添付の図面はいくつかの図面を例証し、本明細書とともに、開示される組成物および方法を例証する。
【図１ａ】図１は，ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスの特徴を示す。図１ａは、野生型（ＷＴ、左）およびｐｅｓ−ＡＲＫＯマウス（ＫＯ、右）遺伝子型決定を示す。ＩＬ−２  ＲＮＡは両方のマウスにおいて存在し、内部陽性対照として働く。導入遺伝子：ｃｒｅ（１１０ｂｐ）およびｆｌｏｘＡＲ（５４０ｂｐｓ）はｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスにおいてのみ存在する。ＷＴマウスのみが野生型ＡＲ遺伝子を有する。図１ｂはエキソン１の中のプライマーからのＲＴ−ＰＣＲを示し、ＡＲ遺伝子のエキソン３は、ＷＴマウスにおいてＷＴ  ＡＲ（３０５ｂｐ）の１本のバンドのみを示す。ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウス（ＫＯ）においては、ＷＴバンド（ＷＴ  ＡＲは間質中に存在する）とＫＯバンド（１５３ｂｐ；エキソン２を欠く）の両方が背外側前立腺（ＤＬＰ）および腹側前立腺（ＶＰ）において見られるが、ＷＴバンドのみは他の組織の中で見られる。図１ｃは、ＶＰを除く両方の株において同じに見える外部器官（ｃ）および内部器官からの結果を示す。ｅｓ−ＡＲＫＯマウスからのＶＰのより大きなサイズに注目のこと。図１ｅは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスと比較した、ＷＴマウスにおけるＶＰにおける、年齢に伴うＡＲ（左）およびプロバシン（右）の発現を示す。プロバシンレベルは上皮ＡＲとともに下降する。図１ｆは、ＷＴ雌×ＷＴ雄（赤棒）または×ｐｅｓ−ＡＲＫＯ（青棒）雄マウスからの子／同腹仔が同様であったことを示す。左。血清テストステロンレベルは（ｆ、右）、ＷＴ（赤棒）およびｐｅｓ−ＡＲＫＯ（青棒）雄マウスにおいて、１２週および２４週で同様であった。キー：精嚢（ＳＶ）、腎臓（Ｋｉｄ）、尿管（Ｕ）、前部前立腺（ＡＰ）、背外側前立腺（ＤＬＰ）、腹側前立腺（ＶＰ）、前立腺のすべての葉（Ｐｒ）、精巣（Ｔ）、陰茎亀頭（Ｐｅ）；
【化１】
2009537142.tif 000003
。
【図１ｂ】図１は，ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスの特徴を示す。図１ａは、野生型（ＷＴ、左）およびｐｅｓ−ＡＲＫＯマウス（ＫＯ、右）遺伝子型決定を示す。ＩＬ−２  ＲＮＡは両方のマウスにおいて存在し、内部陽性対照として働く。導入遺伝子：ｃｒｅ（１１０ｂｐ）およびｆｌｏｘＡＲ（５４０ｂｐｓ）はｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスにおいてのみ存在する。ＷＴマウスのみが野生型ＡＲ遺伝子を有する。図１ｂはエキソン１の中のプライマーからのＲＴ−ＰＣＲを示し、ＡＲ遺伝子のエキソン３は、ＷＴマウスにおいてＷＴ  ＡＲ（３０５ｂｐ）の１本のバンドのみを示す。ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウス（ＫＯ）においては、ＷＴバンド（ＷＴ  ＡＲは間質中に存在する）とＫＯバンド（１５３ｂｐ；エキソン２を欠く）の両方が背外側前立腺（ＤＬＰ）および腹側前立腺（ＶＰ）において見られるが、ＷＴバンドのみは他の組織の中で見られる。図１ｃは、ＶＰを除く両方の株において同じに見える外部器官（ｃ）および内部器官からの結果を示す。ｅｓ−ＡＲＫＯマウスからのＶＰのより大きなサイズに注目のこと。図１ｅは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスと比較した、ＷＴマウスにおけるＶＰにおける、年齢に伴うＡＲ（左）およびプロバシン（右）の発現を示す。プロバシンレベルは上皮ＡＲとともに下降する。図１ｆは、ＷＴ雌×ＷＴ雄（赤棒）または×ｐｅｓ−ＡＲＫＯ（青棒）雄マウスからの子／同腹仔が同様であったことを示す。左。血清テストステロンレベルは（ｆ、右）、ＷＴ（赤棒）およびｐｅｓ−ＡＲＫＯ（青棒）雄マウスにおいて、１２週および２４週で同様であった。キー：精嚢（ＳＶ）、腎臓（Ｋｉｄ）、尿管（Ｕ）、前部前立腺（ＡＰ）、背外側前立腺（ＤＬＰ）、腹側前立腺（ＶＰ）、前立腺のすべての葉（Ｐｒ）、精巣（Ｔ）、陰茎亀頭（Ｐｅ）；
【化２】
2009537142.tif 000004
。
【図１ｃ】図１は，ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスの特徴を示す。図１ａは、野生型（ＷＴ、左）およびｐｅｓ−ＡＲＫＯマウス（ＫＯ、右）遺伝子型決定を示す。ＩＬ−２  ＲＮＡは両方のマウスにおいて存在し、内部陽性対照として働く。導入遺伝子：ｃｒｅ（１１０ｂｐ）およびｆｌｏｘＡＲ（５４０ｂｐｓ）はｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスにおいてのみ存在する。ＷＴマウスのみが野生型ＡＲ遺伝子を有する。図１ｂはエキソン１の中のプライマーからのＲＴ−ＰＣＲを示し、ＡＲ遺伝子のエキソン３は、ＷＴマウスにおいてＷＴ  ＡＲ（３０５ｂｐ）の１本のバンドのみを示す。ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウス（ＫＯ）においては、ＷＴバンド（ＷＴ  ＡＲは間質中に存在する）とＫＯバンド（１５３ｂｐ；エキソン２を欠く）の両方が背外側前立腺（ＤＬＰ）および腹側前立腺（ＶＰ）において見られるが、ＷＴバンドのみは他の組織の中で見られる。図１ｃは、ＶＰを除く両方の株において同じに見える外部器官（ｃ）および内部器官からの結果を示す。ｅｓ−ＡＲＫＯマウスからのＶＰのより大きなサイズに注目のこと。図１ｅは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスと比較した、ＷＴマウスにおけるＶＰにおける、年齢に伴うＡＲ（左）およびプロバシン（右）の発現を示す。プロバシンレベルは上皮ＡＲとともに下降する。図１ｆは、ＷＴ雌×ＷＴ雄（赤棒）または×ｐｅｓ−ＡＲＫＯ（青棒）雄マウスからの子／同腹仔が同様であったことを示す。左。血清テストステロンレベルは（ｆ、右）、ＷＴ（赤棒）およびｐｅｓ−ＡＲＫＯ（青棒）雄マウスにおいて、１２週および２４週で同様であった。キー：精嚢（ＳＶ）、腎臓（Ｋｉｄ）、尿管（Ｕ）、前部前立腺（ＡＰ）、背外側前立腺（ＤＬＰ）、腹側前立腺（ＶＰ）、前立腺のすべての葉（Ｐｒ）、精巣（Ｔ）、陰茎亀頭（Ｐｅ）；
【化３】
2009537142.tif 000005
。
【図１ｄ】図１は，ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスの特徴を示す。図１ａは、野生型（ＷＴ、左）およびｐｅｓ−ＡＲＫＯマウス（ＫＯ、右）遺伝子型決定を示す。ＩＬ−２  ＲＮＡは両方のマウスにおいて存在し、内部陽性対照として働く。導入遺伝子：ｃｒｅ（１１０ｂｐ）およびｆｌｏｘＡＲ（５４０ｂｐｓ）はｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスにおいてのみ存在する。ＷＴマウスのみが野生型ＡＲ遺伝子を有する。図１ｂはエキソン１の中のプライマーからのＲＴ−ＰＣＲを示し、ＡＲ遺伝子のエキソン３は、ＷＴマウスにおいてＷＴ  ＡＲ（３０５ｂｐ）の１本のバンドのみを示す。ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウス（ＫＯ）においては、ＷＴバンド（ＷＴ  ＡＲは間質中に存在する）とＫＯバンド（１５３ｂｐ；エキソン２を欠く）の両方が背外側前立腺（ＤＬＰ）および腹側前立腺（ＶＰ）において見られるが、ＷＴバンドのみは他の組織の中で見られる。図１ｃは、ＶＰを除く両方の株において同じに見える外部器官（ｃ）および内部器官からの結果を示す。ｅｓ−ＡＲＫＯマウスからのＶＰのより大きなサイズに注目のこと。図１ｅは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスと比較した、ＷＴマウスにおけるＶＰにおける、年齢に伴うＡＲ（左）およびプロバシン（右）の発現を示す。プロバシンレベルは上皮ＡＲとともに下降する。図１ｆは、ＷＴ雌×ＷＴ雄（赤棒）または×ｐｅｓ−ＡＲＫＯ（青棒）雄マウスからの子／同腹仔が同様であったことを示す。左。血清テストステロンレベルは（ｆ、右）、ＷＴ（赤棒）およびｐｅｓ−ＡＲＫＯ（青棒）雄マウスにおいて、１２週および２４週で同様であった。キー：精嚢（ＳＶ）、腎臓（Ｋｉｄ）、尿管（Ｕ）、前部前立腺（ＡＰ）、背外側前立腺（ＤＬＰ）、腹側前立腺（ＶＰ）、前立腺のすべての葉（Ｐｒ）、精巣（Ｔ）、陰茎亀頭（Ｐｅ）；
【化４】
2009537142.tif 000006
。
【図１ｅ】図１は，ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスの特徴を示す。図１ａは、野生型（ＷＴ、左）およびｐｅｓ−ＡＲＫＯマウス（ＫＯ、右）遺伝子型決定を示す。ＩＬ−２  ＲＮＡは両方のマウスにおいて存在し、内部陽性対照として働く。導入遺伝子：ｃｒｅ（１１０ｂｐ）およびｆｌｏｘＡＲ（５４０ｂｐｓ）はｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスにおいてのみ存在する。ＷＴマウスのみが野生型ＡＲ遺伝子を有する。図１ｂはエキソン１の中のプライマーからのＲＴ−ＰＣＲを示し、ＡＲ遺伝子のエキソン３は、ＷＴマウスにおいてＷＴ  ＡＲ（３０５ｂｐ）の１本のバンドのみを示す。ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウス（ＫＯ）においては、ＷＴバンド（ＷＴ  ＡＲは間質中に存在する）とＫＯバンド（１５３ｂｐ；エキソン２を欠く）の両方が背外側前立腺（ＤＬＰ）および腹側前立腺（ＶＰ）において見られるが、ＷＴバンドのみは他の組織の中で見られる。図１ｃは、ＶＰを除く両方の株において同じに見える外部器官（ｃ）および内部器官からの結果を示す。ｅｓ−ＡＲＫＯマウスからのＶＰのより大きなサイズに注目のこと。図１ｅは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスと比較した、ＷＴマウスにおけるＶＰにおける、年齢に伴うＡＲ（左）およびプロバシン（右）の発現を示す。プロバシンレベルは上皮ＡＲとともに下降する。図１ｆは、ＷＴ雌×ＷＴ雄（赤棒）または×ｐｅｓ−ＡＲＫＯ（青棒）雄マウスからの子／同腹仔が同様であったことを示す。左。血清テストステロンレベルは（ｆ、右）、ＷＴ（赤棒）およびｐｅｓ−ＡＲＫＯ（青棒）雄マウスにおいて、１２週および２４週で同様であった。キー：精嚢（ＳＶ）、腎臓（Ｋｉｄ）、尿管（Ｕ）、前部前立腺（ＡＰ）、背外側前立腺（ＤＬＰ）、腹側前立腺（ＶＰ）、前立腺のすべての葉（Ｐｒ）、精巣（Ｔ）、陰茎亀頭（Ｐｅ）；
【化５】
2009537142.tif 000007
。
【図１ｆ】図１は，ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスの特徴を示す。図１ａは、野生型（ＷＴ、左）およびｐｅｓ−ＡＲＫＯマウス（ＫＯ、右）遺伝子型決定を示す。ＩＬ−２  ＲＮＡは両方のマウスにおいて存在し、内部陽性対照として働く。導入遺伝子：ｃｒｅ（１１０ｂｐ）およびｆｌｏｘＡＲ（５４０ｂｐｓ）はｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスにおいてのみ存在する。ＷＴマウスのみが野生型ＡＲ遺伝子を有する。図１ｂはエキソン１の中のプライマーからのＲＴ−ＰＣＲを示し、ＡＲ遺伝子のエキソン３は、ＷＴマウスにおいてＷＴ  ＡＲ（３０５ｂｐ）の１本のバンドのみを示す。ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウス（ＫＯ）においては、ＷＴバンド（ＷＴ  ＡＲは間質中に存在する）とＫＯバンド（１５３ｂｐ；エキソン２を欠く）の両方が背外側前立腺（ＤＬＰ）および腹側前立腺（ＶＰ）において見られるが、ＷＴバンドのみは他の組織の中で見られる。図１ｃは、ＶＰを除く両方の株において同じに見える外部器官（ｃ）および内部器官からの結果を示す。ｅｓ−ＡＲＫＯマウスからのＶＰのより大きなサイズに注目のこと。図１ｅは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスと比較した、ＷＴマウスにおけるＶＰにおける、年齢に伴うＡＲ（左）およびプロバシン（右）の発現を示す。プロバシンレベルは上皮ＡＲとともに下降する。図１ｆは、ＷＴ雌×ＷＴ雄（赤棒）または×ｐｅｓ−ＡＲＫＯ（青棒）雄マウスからの子／同腹仔が同様であったことを示す。左。血清テストステロンレベルは（ｆ、右）、ＷＴ（赤棒）およびｐｅｓ−ＡＲＫＯ（青棒）雄マウスにおいて、１２週および２４週で同様であった。キー：精嚢（ＳＶ）、腎臓（Ｋｉｄ）、尿管（Ｕ）、前部前立腺（ＡＰ）、背外側前立腺（ＤＬＰ）、腹側前立腺（ＶＰ）、前立腺のすべての葉（Ｐｒ）、精巣（Ｔ）、陰茎亀頭（Ｐｅ）；
【化６】
2009537142.tif 000008
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【図２】図２は、ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスの腹側前立腺における組織形態学的変化を示す。図２ａは、３２週にわたってＷＴマウスの腹側前立腺が腺陥入（矢印）および高い分泌上皮を示すことを示す。ｐｅｓ−ＡＲＫＯ（ＫＯ）同腹仔において、これらの特徴は２週および６週においてのみ見られた。９週においては、ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスはいくつかの腹側前立腺管が腺陥入（＊）を喪失し、ＷＴ同腹仔と比較して、短く、分化が乏しい上皮細胞を有する。上皮の変化は、１４週のｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスの前立腺の中の〜５０％の管において明白である。１４週（およびそれ以上）では、ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスにおいて、ほぼすべての腺陥入および高分泌細胞が失われ、拡大された管は、多くの脱落した上皮細胞、断片化された核、および免疫細胞を有する。３２週までに、ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスは腺陥入を欠き、うずくまった（ｓｑｕａｔ）上皮細胞を有する。図２ｂ−ｅは、１４週で、ｐｅｓ−ＡＲＫＯにおいて、腹側前立腺が継続して腺陥入を欠くことを示す。脱落した上皮細胞の層は、前立腺管腔において豊富である。図２ｂは、１４週のｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスにおいて、いくつかの腺陥入（矢印）が出現することを示す。図２ｃは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスにおいて、陥入（矢印）がより小さくかつ短くなることを示し、ｄは、陥入（矢印）が細胞極性を失い、それらの基部で収縮する（赤矢印）ことを示す。最終的には、ｅにおいて、推定の腺陥入（矢印）は失われ、脱落した管腔細胞（矢印）が管腔内に出現する。
【図３】図３は、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ（ＫＯ）マウスと比較した、野生型（ＷＴ）マウスの腹側前立腺におけるアンドロゲン受容体（ＡＲ）およびプロバシン（Ｐｒｂ）の局在化を示す。ＷＴ前立腺は、評価したすべての時点で、上皮細胞と間質細胞の両方（矢印）の中でＡＲを発現した。プロバシンの細胞質および管腔の局在化は３週目に最初に観察され、ＷＴマウスと比較して、ＫＯマウスにおいて６〜２４週で減少する。
【図４−１】図４は、上皮アンドロゲン受容体の損失が、アンドロゲン調節タンパク質および遺伝子発現の損失、ならびに増殖の増加をもたらすことを示す。図４ａは、アンドロゲン調節遺伝子発現が、上皮ＡＲが失われるにつれて減少することを示す。定量的ＲＴ−ＰＣＲがＷＴマウス（赤棒）およびｐｅｓ−ＡＲＫＯマウス（青棒）からの腹側前立腺に対して行なわれた。アンドロゲン調節遺伝子であるプロバシン、ＰＳＰ９４、およびＮｋｘ３．１は、ＷＴ前立腺と比較して、すべてｐｅｓ−ＡＲＫＯ前立腺においてダウンレギュレートされる。図４ｂは、腹側前立腺をＷＴマウス（赤棒）およびｐｅｓ−ＡＲＫＯマウス（青棒）から異なる段階で収集し、増殖について分析したことを示す。ＢｒｄＵ陽性核によって決定されるような増殖は、評価したすべての段階において、主として上皮細胞で起こり、ｃでは、上皮細胞増殖は、ＷＴ同腹仔よりも、ｐｅｓ−ＡＲＫＯにおいて、有意に（Ｐ＜０．０１）より高かった。＊＝Ｐ＜０．０５。
【図４−２】図４は、上皮アンドロゲン受容体の損失が、アンドロゲン調節タンパク質および遺伝子発現の損失、ならびに増殖の増加をもたらすことを示す。図４ａは、アンドロゲン調節遺伝子発現が、上皮ＡＲが失われるにつれて減少することを示す。定量的ＲＴ−ＰＣＲがＷＴマウス（赤棒）およびｐｅｓ−ＡＲＫＯマウス（青棒）からの腹側前立腺に対して行なわれた。アンドロゲン調節遺伝子であるプロバシン、ＰＳＰ９４、およびＮｋｘ３．１は、ＷＴ前立腺と比較して、すべてｐｅｓ−ＡＲＫＯ前立腺においてダウンレギュレートされる。図４ｂは、腹側前立腺をＷＴマウス（赤棒）およびｐｅｓ−ＡＲＫＯマウス（青棒）から異なる段階で収集し、増殖について分析したことを示す。ＢｒｄＵ陽性核によって決定されるような増殖は、評価したすべての段階において、主として上皮細胞で起こり、ｃでは、上皮細胞増殖は、ＷＴ同腹仔よりも、ｐｅｓ−ＡＲＫＯにおいて、有意に（Ｐ＜０．０１）より高かった。＊＝Ｐ＜０．０５。
【図４−３】図４は、上皮アンドロゲン受容体の損失が、アンドロゲン調節タンパク質および遺伝子発現の損失、ならびに増殖の増加をもたらすことを示す。図４ａは、アンドロゲン調節遺伝子発現が、上皮ＡＲが失われるにつれて減少することを示す。定量的ＲＴ−ＰＣＲがＷＴマウス（赤棒）およびｐｅｓ−ＡＲＫＯマウス（青棒）からの腹側前立腺に対して行なわれた。アンドロゲン調節遺伝子であるプロバシン、ＰＳＰ９４、およびＮｋｘ３．１は、ＷＴ前立腺と比較して、すべてｐｅｓ−ＡＲＫＯ前立腺においてダウンレギュレートされる。図４ｂは、腹側前立腺をＷＴマウス（赤棒）およびｐｅｓ−ＡＲＫＯマウス（青棒）から異なる段階で収集し、増殖について分析したことを示す。ＢｒｄＵ陽性核によって決定されるような増殖は、評価したすべての段階において、主として上皮細胞で起こり、ｃでは、上皮細胞増殖は、ＷＴ同腹仔よりも、ｐｅｓ−ＡＲＫＯにおいて、有意に（Ｐ＜０．０１）より高かった。＊＝Ｐ＜０．０５。
【図４−４】図４は、上皮アンドロゲン受容体の損失が、アンドロゲン調節タンパク質および遺伝子発現の損失、ならびに増殖の増加をもたらすことを示す。図４ａは、アンドロゲン調節遺伝子発現が、上皮ＡＲが失われるにつれて減少することを示す。定量的ＲＴ−ＰＣＲがＷＴマウス（赤棒）およびｐｅｓ−ＡＲＫＯマウス（青棒）からの腹側前立腺に対して行なわれた。アンドロゲン調節遺伝子であるプロバシン、ＰＳＰ９４、およびＮｋｘ３．１は、ＷＴ前立腺と比較して、すべてｐｅｓ−ＡＲＫＯ前立腺においてダウンレギュレートされる。図４ｂは、腹側前立腺をＷＴマウス（赤棒）およびｐｅｓ−ＡＲＫＯマウス（青棒）から異なる段階で収集し、増殖について分析したことを示す。ＢｒｄＵ陽性核によって決定されるような増殖は、評価したすべての段階において、主として上皮細胞で起こり、ｃでは、上皮細胞増殖は、ＷＴ同腹仔よりも、ｐｅｓ−ＡＲＫＯにおいて、有意に（Ｐ＜０．０１）より高かった。＊＝Ｐ＜０．０５。
【図５】図５は、前立腺中での上皮特異的マーカーの局在化を示す。どの上皮細胞集団が細胞増殖に起因して増加したかを決定するために、基底細胞マーカーｐ６３ａ、ならびに管腔細胞サイトケラチン−８および１８および上皮マーカーパン−サイトケラチンｂについての免疫組織化学を実施した。推定の基底細胞の増加数（矢印；ｐ６３陽性）が、ＷＴマウスに対してｐｅｓ−ＡＲＫＯにおいて３２週で観察されるのに対して、上皮および管腔細胞マーカーは、ＷＴマウスに対してｐｅｓ−ＡＲＫＯからの腹側前立腺において減少するようであることに注目のこと。
【図６ａ】図６は、ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスの前立腺中の上皮の脱落およびアポトーシスを示す。上皮細胞の脱落は、任意の時点での野生型（ＷＴ）の腹側前立腺、または１６週より前のｐｅｓ−ＡＲＫＯにおいてはまれである。図６ａは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ腹側前立腺のヘマトキシリンおよびエオシン染色を示す。２４週にわたっての管腔細胞（矢印）の脱落層、細胞細片、推定の免疫細胞、および断片化された核の蓄積に注目のこと。図６ｂは、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の同定を１６週、２４週、および３２週に実施したことを示す。前立腺細胞層（間質および上皮）がＴＵＮＥＬ陽性でないのに対して、ＴＵＮＥＬ陽性細胞は前立腺管腔中で見出されることに注目のこと。図６ｃは、増殖している（ＢｒｄＵ陽性、緑色）細胞が基底細胞か（ＣＫ５陽性、赤色）または管腔細胞か（ＣＫ８陽性、赤色）を決定するための試みを示し、本発明者らは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスおよびＷＴマウスにおいて、ＢｒｄＵ＋ＣＫ５対ＢｒｄＵ＋ＣＫ８について二重染色を評価した。ＣＫ８＋ＢｒｄＵ陽性細胞はまれにしか見られないが、ＢｒｄＵ陽性細胞は基底層中で見出されるのに対して（矢印）、ＣＫ８＋ＴＵＮＥＬ陽性細胞（矢印）は主としてｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスの管腔中で観察され、無傷上皮層の中で観察されるＴＵＮＥＬ陽性細胞はほとんどないことに注目のこと。従って、ＣＫ５＋ＢｒｄＵ陽性細胞は基底層（矢印）の中で観察されるが、すべてのＣＫ５陽性細胞がＢｒｄＵ陽性であるわけではない（矢印の先端に注意のこと）。ＴＵＮＥＬ陽性細胞はＣＫ５陰性であることに注目のこと（矢印）。図６ｄは、２４週齢のｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスからの異なる前立腺葉におけるＢｒｄＵ標識指標を示す。
【図６ｂ】図６は、ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスの前立腺中の上皮の脱落およびアポトーシスを示す。上皮細胞の脱落は、任意の時点での野生型（ＷＴ）の腹側前立腺、または１６週より前のｐｅｓ−ＡＲＫＯにおいてはまれである。図６ａは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ腹側前立腺のヘマトキシリンおよびエオシン染色を示す。２４週にわたっての管腔細胞（矢印）の脱落層、細胞細片、推定の免疫細胞、および断片化された核の蓄積に注目のこと。図６ｂは、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の同定を１６週、２４週、および３２週に実施したことを示す。前立腺細胞層（間質および上皮）がＴＵＮＥＬ陽性でないのに対して、ＴＵＮＥＬ陽性細胞は前立腺管腔中で見出されることに注目のこと。図６ｃは、増殖している（ＢｒｄＵ陽性、緑色）細胞が基底細胞か（ＣＫ５陽性、赤色）または管腔細胞か（ＣＫ８陽性、赤色）を決定するための試みを示し、本発明者らは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスおよびＷＴマウスにおいて、ＢｒｄＵ＋ＣＫ５対ＢｒｄＵ＋ＣＫ８について二重染色を評価した。ＣＫ８＋ＢｒｄＵ陽性細胞はまれにしか見られないが、ＢｒｄＵ陽性細胞は基底層中で見出されるのに対して（矢印）、ＣＫ８＋ＴＵＮＥＬ陽性細胞（矢印）は主としてｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスの管腔中で観察され、無傷上皮層の中で観察されるＴＵＮＥＬ陽性細胞はほとんどないことに注目のこと。従って、ＣＫ５＋ＢｒｄＵ陽性細胞は基底層（矢印）の中で観察されるが、すべてのＣＫ５陽性細胞がＢｒｄＵ陽性であるわけではない（矢印の先端に注意のこと）。ＴＵＮＥＬ陽性細胞はＣＫ５陰性であることに注目のこと（矢印）。図６ｄは、２４週齢のｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスからの異なる前立腺葉におけるＢｒｄＵ標識指標を示す。
【図６ｃ】図６は、ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスの前立腺中の上皮の脱落およびアポトーシスを示す。上皮細胞の脱落は、任意の時点での野生型（ＷＴ）の腹側前立腺、または１６週より前のｐｅｓ−ＡＲＫＯにおいてはまれである。図６ａは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ腹側前立腺のヘマトキシリンおよびエオシン染色を示す。２４週にわたっての管腔細胞（矢印）の脱落層、細胞細片、推定の免疫細胞、および断片化された核の蓄積に注目のこと。図６ｂは、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の同定を１６週、２４週、および３２週に実施したことを示す。前立腺細胞層（間質および上皮）がＴＵＮＥＬ陽性でないのに対して、ＴＵＮＥＬ陽性細胞は前立腺管腔中で見出されることに注目のこと。図６ｃは、増殖している（ＢｒｄＵ陽性、緑色）細胞が基底細胞か（ＣＫ５陽性、赤色）または管腔細胞か（ＣＫ８陽性、赤色）を決定するための試みを示し、本発明者らは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスおよびＷＴマウスにおいて、ＢｒｄＵ＋ＣＫ５対ＢｒｄＵ＋ＣＫ８について二重染色を評価した。ＣＫ８＋ＢｒｄＵ陽性細胞はまれにしか見られないが、ＢｒｄＵ陽性細胞は基底層中で見出されるのに対して（矢印）、ＣＫ８＋ＴＵＮＥＬ陽性細胞（矢印）は主としてｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスの管腔中で観察され、無傷上皮層の中で観察されるＴＵＮＥＬ陽性細胞はほとんどないことに注目のこと。従って、ＣＫ５＋ＢｒｄＵ陽性細胞は基底層（矢印）の中で観察されるが、すべてのＣＫ５陽性細胞がＢｒｄＵ陽性であるわけではない（矢印の先端に注意のこと）。ＴＵＮＥＬ陽性細胞はＣＫ５陰性であることに注目のこと（矢印）。図６ｄは、２４週齢のｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスからの異なる前立腺葉におけるＢｒｄＵ標識指標を示す。
【図６ｄ】図６は、ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスの前立腺中の上皮の脱落およびアポトーシスを示す。上皮細胞の脱落は、任意の時点での野生型（ＷＴ）の腹側前立腺、または１６週より前のｐｅｓ−ＡＲＫＯにおいてはまれである。図６ａは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ腹側前立腺のヘマトキシリンおよびエオシン染色を示す。２４週にわたっての管腔細胞（矢印）の脱落層、細胞細片、推定の免疫細胞、および断片化された核の蓄積に注目のこと。図６ｂは、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の同定を１６週、２４週、および３２週に実施したことを示す。前立腺細胞層（間質および上皮）がＴＵＮＥＬ陽性でないのに対して、ＴＵＮＥＬ陽性細胞は前立腺管腔中で見出されることに注目のこと。図６ｃは、増殖している（ＢｒｄＵ陽性、緑色）細胞が基底細胞か（ＣＫ５陽性、赤色）または管腔細胞か（ＣＫ８陽性、赤色）を決定するための試みを示し、本発明者らは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスおよびＷＴマウスにおいて、ＢｒｄＵ＋ＣＫ５対ＢｒｄＵ＋ＣＫ８について二重染色を評価した。ＣＫ８＋ＢｒｄＵ陽性細胞はまれにしか見られないが、ＢｒｄＵ陽性細胞は基底層中で見出されるのに対して（矢印）、ＣＫ８＋ＴＵＮＥＬ陽性細胞（矢印）は主としてｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスの管腔中で観察され、無傷上皮層の中で観察されるＴＵＮＥＬ陽性細胞はほとんどないことに注目のこと。従って、ＣＫ５＋ＢｒｄＵ陽性細胞は基底層（矢印）の中で観察されるが、すべてのＣＫ５陽性細胞がＢｒｄＵ陽性であるわけではない（矢印の先端に注意のこと）。ＴＵＮＥＬ陽性細胞はＣＫ５陰性であることに注目のこと（矢印）。図６ｄは、２４週齢のｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスからの異なる前立腺葉におけるＢｒｄＵ標識指標を示す。
【図７ａ】図７は、ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウス中でのＴ８５７Ａ変異体アンドロゲン受容体導入遺伝子の発現が、腹側前立腺表現型を野生型（ＷＴ）に戻すことを示す。図７ａは、ＷＴマウス、ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウス、およびｐｅｓ−ＡＲＫＯ／Ｔ８５７Ａマウスからの３２週腹側前立腺のヘマトキシリンおよびエオシン染色を示す。ｐｅｓ−ＡＲＫＯ／Ｔ８５７Ａマウスの上皮は、形態学、細胞の高さ、構築、および腺陥入の点において、ＷＴマウスと非常に類似していることに注目のこと。図７ｂは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ／Ｔ８５７Ａマウスが、通常のＡＲ遺伝子転写レベルおよび増殖速度を有することを示す。定量的ＲＴ−ＰＣＲは、３２週の腹側前立腺におけるプロバシンについてである（橙色棒）。ｐｅｓ−ＡＲＫＯ／Ｔ８５７Ａマウスにおいて、プロバシン発現は、ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスと比較して有意に増加するが、ＷＴと比較すると違いがない。定量的ＲＴ−ＰＣＲは、３２週の腹側前立腺におけるＰＳＰ−９４についてである（緑色棒）。ｐｅｓ−ＡＲＫＯ／Ｔ８５７Ａマウスにおいて、ＰＳＰ−９４発現は、ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスと比較して有意に増加するが、ＷＴと比較すると違いがない。ＢｒｄＵ標識指標（青色棒）は３２週の腹側前立腺においてである。ｐｅｓ−ＡＲＫＯ／Ｔ８５７Ａマウスにおいて、上皮細胞増殖は、ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスと比較して有意に減少するが、ＷＴと比較すると違いがない；＊＝Ｐ＜０．０５、＊＊＝Ｐ＜０．００１。
【図７ｂ】図７は、ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウス中でのＴ８５７Ａ変異体アンドロゲン受容体導入遺伝子の発現が、腹側前立腺表現型を野生型（ＷＴ）に戻すことを示す。図７ａは、ＷＴマウス、ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウス、およびｐｅｓ−ＡＲＫＯ／Ｔ８５７Ａマウスからの３２週腹側前立腺のヘマトキシリンおよびエオシン染色を示す。ｐｅｓ−ＡＲＫＯ／Ｔ８５７Ａマウスの上皮は、形態学、細胞の高さ、構築、および腺陥入の点において、ＷＴマウスと非常に類似していることに注目のこと。図７ｂは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ／Ｔ８５７Ａマウスが、通常のＡＲ遺伝子転写レベルおよび増殖速度を有することを示す。定量的ＲＴ−ＰＣＲは、３２週の腹側前立腺におけるプロバシンについてである（橙色棒）。ｐｅｓ−ＡＲＫＯ／Ｔ８５７Ａマウスにおいて、プロバシン発現は、ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスと比較して有意に増加するが、ＷＴと比較すると違いがない。定量的ＲＴ−ＰＣＲは、３２週の腹側前立腺におけるＰＳＰ−９４についてである（緑色棒）。ｐｅｓ−ＡＲＫＯ／Ｔ８５７Ａマウスにおいて、ＰＳＰ−９４発現は、ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスと比較して有意に増加するが、ＷＴと比較すると違いがない。ＢｒｄＵ標識指標（青色棒）は３２週の腹側前立腺においてである。ｐｅｓ−ＡＲＫＯ／Ｔ８５７Ａマウスにおいて、上皮細胞増殖は、ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスと比較して有意に減少するが、ＷＴと比較すると違いがない；＊＝Ｐ＜０．０５、＊＊＝Ｐ＜０．００１。
【図８】図８は、プロバシンおよびＡＲＫＯ構築物を示す。図８ａは、ＡＲＲ２ＰＢ−Ｃｒｅ−ＳＶ４０導入遺伝子構築物の構造を示す。このプラスミドは、ＡＲＲ２ＰＢ複合ＰＢプロモーター、続いてＣｒｅのｃＤＮＡおよびＳＶ４０ポリアデニル化配列を含んだ。矢印は、トランスジェニックマウスのＰＣＲベースの同定において使用されるプライマーの位置を示す。図８ｂは、ｆｌｏｘ化ＡＲフラグメントの構築を示す。ＰＫＩベクターは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドから改変する。これは、３’末端にＴ７プロモーター、５’末端にＴ３プロモーター、２つのマルチプルクローニングサイト（ＭＣＳ）、２つのｌｏｘ部位、陽性Ｎｅｏ選択マーカー（ＰＫＧ−Ｎｅｏ）、および陰性チミジンキナーゼ選択マーカー（ＭＣＴ−ＴＫ）を含む。クローニングのために、５’末端ＭＣＳのＸｈｏＩ部位を最初に破壊した。３ｋｂイントロン２フラグメントを３ＥｃｏＲ１クローニング部位（Ｒ１）に導入し、続いて、イントロン１、エキソン２、およびイントロン２の小さなフラグメントを含むフラグメントを、５ＸｂａＩ部位（Ｘ）に導入した。ｌｏｘ配列プラス人工ＫｐｎＩ部位は、エキソン２の開始に対してすぐに５’であるＸｈｏＩ部位に最終的に導入した。構築したプラスミドは、ＮｏｔＩにより線状化し、その後ＥＳ細胞にエレクトロポレーションした。
【図９−１】図９は、上皮ＡＲがインビトロでの前立腺癌浸潤のための抑制因子であり、間質ＡＲが刺激因子であることを示す。図９（ａ−ｃ）は、ヒト前立腺癌ＰＣ３−ｖ細胞中でのノックインＡＲが、浸潤能力の増加を生じることを示す。天然の近接するＡＲプロモーター領域ＰＣ３−ＡＲ９または強力なＳＶ４０プロモーターＰＣ３−ＡＲ２（上）の制御下にある異なるＰＣ３−ｖ細胞株中でのＡＲタンパク質発現はＡＲｃＤＮＡとトランスフェクトした（ａ）。ＰＣ３−ＡＲ９におけるＡＲＥ−（４）−Ｌｕｃを使用するＡＲの転写活性は、１ｎＭ  ＤＨＴを用いて５倍増加し、１μＭ  ＨＦの添加はＤＨＴ誘導性トランス活性化の抑制を生じた（ｂ）。ＰＣ３−ＡＲ９の浸潤は、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）コートされたＢｏｙｄｅｎチャンバーで増殖させたＰＣ３−ｖ細胞と同様に比較した場合に、ＤＨＴの存在下で減少され、ＨＦの添加とともに増加する（ｃ）。図９（ｄ〜ｆ）は、ＡＲがＰＣ３−ｖおよびＰＣ３−ＡＲ９細胞浸潤においてポジティブな役割を果たすことを示した。Ｂｏｙｄｅｎチャンバーの上層で培養したＰＣ３−ｖおよびＰＣ３−ＡＲ９細胞は、ＷＰＭＹ１ベクター（ＷＰＭＹ１−ｖ）またはＷＰＭＹ１  ＡＲノックダウン（ＷＰＭＹ１−ＡＲｓｉ）細胞とともに同時培養し、これらは、示されるように、チャンバーの下層に配置した（ｄ）。Ｗｔ  ＡＲを有するＷＰＭＹ１細胞は、ＷＰＭＹ１−ＡＲｓｉ細胞（下のパネル）と比較して、ＰＣ３−ｖまたはＰＣ３−ＡＲ９細胞（上のパネル）の浸潤を有意に増加し（ｅ）、このデータは定量化した（ｆ）。図９ｇは、ヒト前立腺癌ＣＷＲ２２Ｒ細胞におけるＡＲの減少が浸潤能力の増加を生じることを示す。ＡＲ遺伝子のいくつかの対立遺伝子が遺伝的に破壊されているＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／−細胞は、相同組換えストラテジーによって生成した。ウェスタンブロットは、１ｎＭ  ＤＨＴの存在下または非存在下で、ＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／＋と比較して、ＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／−細胞中でＡＲの発現が低いことを示す（上）。ＡＲの転写活性は、１ｎＭ  ＤＨＴの存在下で、ＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／＋と比較して、ＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／−で減少する。マトリゲルへの浸潤は、親のＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／＋と比較して、ＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／−で増加した（右下）。図９ｈは、ＡＲ−ｓｉＲＮＡを使用するＣＷＲ２２Ｒ細胞中のノックダウンＡＲがインビトロで細胞浸潤を増加したことを示す。
【図９−２】図９は、上皮ＡＲがインビトロでの前立腺癌浸潤のための抑制因子であり、間質ＡＲが刺激因子であることを示す。図９（ａ−ｃ）は、ヒト前立腺癌ＰＣ３−ｖ細胞中でのノックインＡＲが、浸潤能力の増加を生じることを示す。天然の近接するＡＲプロモーター領域ＰＣ３−ＡＲ９または強力なＳＶ４０プロモーターＰＣ３−ＡＲ２（上）の制御下にある異なるＰＣ３−ｖ細胞株中でのＡＲタンパク質発現はＡＲｃＤＮＡとトランスフェクトした（ａ）。ＰＣ３−ＡＲ９におけるＡＲＥ−（４）−Ｌｕｃを使用するＡＲの転写活性は、１ｎＭ  ＤＨＴを用いて５倍増加し、１μＭ  ＨＦの添加はＤＨＴ誘導性トランス活性化の抑制を生じた（ｂ）。ＰＣ３−ＡＲ９の浸潤は、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）コートされたＢｏｙｄｅｎチャンバーで増殖させたＰＣ３−ｖ細胞と同様に比較した場合に、ＤＨＴの存在下で減少され、ＨＦの添加とともに増加する（ｃ）。図９（ｄ〜ｆ）は、ＡＲがＰＣ３−ｖおよびＰＣ３−ＡＲ９細胞浸潤においてポジティブな役割を果たすことを示した。Ｂｏｙｄｅｎチャンバーの上層で培養したＰＣ３−ｖおよびＰＣ３−ＡＲ９細胞は、ＷＰＭＹ１ベクター（ＷＰＭＹ１−ｖ）またはＷＰＭＹ１  ＡＲノックダウン（ＷＰＭＹ１−ＡＲｓｉ）細胞とともに同時培養し、これらは、示されるように、チャンバーの下層に配置した（ｄ）。Ｗｔ  ＡＲを有するＷＰＭＹ１細胞は、ＷＰＭＹ１−ＡＲｓｉ細胞（下のパネル）と比較して、ＰＣ３−ｖまたはＰＣ３−ＡＲ９細胞（上のパネル）の浸潤を有意に増加し（ｅ）、このデータは定量化した（ｆ）。図９ｇは、ヒト前立腺癌ＣＷＲ２２Ｒ細胞におけるＡＲの減少が浸潤能力の増加を生じることを示す。ＡＲ遺伝子のいくつかの対立遺伝子が遺伝的に破壊されているＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／−細胞は、相同組換えストラテジーによって生成した。ウェスタンブロットは、１ｎＭ  ＤＨＴの存在下または非存在下で、ＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／＋と比較して、ＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／−細胞中でＡＲの発現が低いことを示す（上）。ＡＲの転写活性は、１ｎＭ  ＤＨＴの存在下で、ＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／＋と比較して、ＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／−で減少する。マトリゲルへの浸潤は、親のＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／＋と比較して、ＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／−で増加した（右下）。図９ｈは、ＡＲ−ｓｉＲＮＡを使用するＣＷＲ２２Ｒ細胞中のノックダウンＡＲがインビトロで細胞浸潤を増加したことを示す。
【図９−３】図９は、上皮ＡＲがインビトロでの前立腺癌浸潤のための抑制因子であり、間質ＡＲが刺激因子であることを示す。図９（ａ−ｃ）は、ヒト前立腺癌ＰＣ３−ｖ細胞中でのノックインＡＲが、浸潤能力の増加を生じることを示す。天然の近接するＡＲプロモーター領域ＰＣ３−ＡＲ９または強力なＳＶ４０プロモーターＰＣ３−ＡＲ２（上）の制御下にある異なるＰＣ３−ｖ細胞株中でのＡＲタンパク質発現はＡＲｃＤＮＡとトランスフェクトした（ａ）。ＰＣ３−ＡＲ９におけるＡＲＥ−（４）−Ｌｕｃを使用するＡＲの転写活性は、１ｎＭ  ＤＨＴを用いて５倍増加し、１μＭ  ＨＦの添加はＤＨＴ誘導性トランス活性化の抑制を生じた（ｂ）。ＰＣ３−ＡＲ９の浸潤は、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）コートされたＢｏｙｄｅｎチャンバーで増殖させたＰＣ３−ｖ細胞と同様に比較した場合に、ＤＨＴの存在下で減少され、ＨＦの添加とともに増加する（ｃ）。図９（ｄ〜ｆ）は、ＡＲがＰＣ３−ｖおよびＰＣ３−ＡＲ９細胞浸潤においてポジティブな役割を果たすことを示した。Ｂｏｙｄｅｎチャンバーの上層で培養したＰＣ３−ｖおよびＰＣ３−ＡＲ９細胞は、ＷＰＭＹ１ベクター（ＷＰＭＹ１−ｖ）またはＷＰＭＹ１  ＡＲノックダウン（ＷＰＭＹ１−ＡＲｓｉ）細胞とともに同時培養し、これらは、示されるように、チャンバーの下層に配置した（ｄ）。Ｗｔ  ＡＲを有するＷＰＭＹ１細胞は、ＷＰＭＹ１−ＡＲｓｉ細胞（下のパネル）と比較して、ＰＣ３−ｖまたはＰＣ３−ＡＲ９細胞（上のパネル）の浸潤を有意に増加し（ｅ）、このデータは定量化した（ｆ）。図９ｇは、ヒト前立腺癌ＣＷＲ２２Ｒ細胞におけるＡＲの減少が浸潤能力の増加を生じることを示す。ＡＲ遺伝子のいくつかの対立遺伝子が遺伝的に破壊されているＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／−細胞は、相同組換えストラテジーによって生成した。ウェスタンブロットは、１ｎＭ  ＤＨＴの存在下または非存在下で、ＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／＋と比較して、ＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／−細胞中でＡＲの発現が低いことを示す（上）。ＡＲの転写活性は、１ｎＭ  ＤＨＴの存在下で、ＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／＋と比較して、ＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／−で減少する。マトリゲルへの浸潤は、親のＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／＋と比較して、ＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／−で増加した（右下）。図９ｈは、ＡＲ−ｓｉＲＮＡを使用するＣＷＲ２２Ｒ細胞中のノックダウンＡＲがインビトロで細胞浸潤を増加したことを示す。
【図９−４】図９は、上皮ＡＲがインビトロでの前立腺癌浸潤のための抑制因子であり、間質ＡＲが刺激因子であることを示す。図９（ａ−ｃ）は、ヒト前立腺癌ＰＣ３−ｖ細胞中でのノックインＡＲが、浸潤能力の増加を生じることを示す。天然の近接するＡＲプロモーター領域ＰＣ３−ＡＲ９または強力なＳＶ４０プロモーターＰＣ３−ＡＲ２（上）の制御下にある異なるＰＣ３−ｖ細胞株中でのＡＲタンパク質発現はＡＲｃＤＮＡとトランスフェクトした（ａ）。ＰＣ３−ＡＲ９におけるＡＲＥ−（４）−Ｌｕｃを使用するＡＲの転写活性は、１ｎＭ  ＤＨＴを用いて５倍増加し、１μＭ  ＨＦの添加はＤＨＴ誘導性トランス活性化の抑制を生じた（ｂ）。ＰＣ３−ＡＲ９の浸潤は、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）コートされたＢｏｙｄｅｎチャンバーで増殖させたＰＣ３−ｖ細胞と同様に比較した場合に、ＤＨＴの存在下で減少され、ＨＦの添加とともに増加する（ｃ）。図９（ｄ〜ｆ）は、ＡＲがＰＣ３−ｖおよびＰＣ３−ＡＲ９細胞浸潤においてポジティブな役割を果たすことを示した。Ｂｏｙｄｅｎチャンバーの上層で培養したＰＣ３−ｖおよびＰＣ３−ＡＲ９細胞は、ＷＰＭＹ１ベクター（ＷＰＭＹ１−ｖ）またはＷＰＭＹ１  ＡＲノックダウン（ＷＰＭＹ１−ＡＲｓｉ）細胞とともに同時培養し、これらは、示されるように、チャンバーの下層に配置した（ｄ）。Ｗｔ  ＡＲを有するＷＰＭＹ１細胞は、ＷＰＭＹ１−ＡＲｓｉ細胞（下のパネル）と比較して、ＰＣ３−ｖまたはＰＣ３−ＡＲ９細胞（上のパネル）の浸潤を有意に増加し（ｅ）、このデータは定量化した（ｆ）。図９ｇは、ヒト前立腺癌ＣＷＲ２２Ｒ細胞におけるＡＲの減少が浸潤能力の増加を生じることを示す。ＡＲ遺伝子のいくつかの対立遺伝子が遺伝的に破壊されているＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／−細胞は、相同組換えストラテジーによって生成した。ウェスタンブロットは、１ｎＭ  ＤＨＴの存在下または非存在下で、ＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／＋と比較して、ＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／−細胞中でＡＲの発現が低いことを示す（上）。ＡＲの転写活性は、１ｎＭ  ＤＨＴの存在下で、ＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／＋と比較して、ＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／−で減少する。マトリゲルへの浸潤は、親のＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／＋と比較して、ＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／−で増加した（右下）。図９ｈは、ＡＲ−ｓｉＲＮＡを使用するＣＷＲ２２Ｒ細胞中のノックダウンＡＲがインビトロで細胞浸潤を増加したことを示す。
【図９−５】図９は、上皮ＡＲがインビトロでの前立腺癌浸潤のための抑制因子であり、間質ＡＲが刺激因子であることを示す。図９（ａ−ｃ）は、ヒト前立腺癌ＰＣ３−ｖ細胞中でのノックインＡＲが、浸潤能力の増加を生じることを示す。天然の近接するＡＲプロモーター領域ＰＣ３−ＡＲ９または強力なＳＶ４０プロモーターＰＣ３−ＡＲ２（上）の制御下にある異なるＰＣ３−ｖ細胞株中でのＡＲタンパク質発現はＡＲｃＤＮＡとトランスフェクトした（ａ）。ＰＣ３−ＡＲ９におけるＡＲＥ−（４）−Ｌｕｃを使用するＡＲの転写活性は、１ｎＭ  ＤＨＴを用いて５倍増加し、１μＭ  ＨＦの添加はＤＨＴ誘導性トランス活性化の抑制を生じた（ｂ）。ＰＣ３−ＡＲ９の浸潤は、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）コートされたＢｏｙｄｅｎチャンバーで増殖させたＰＣ３−ｖ細胞と同様に比較した場合に、ＤＨＴの存在下で減少され、ＨＦの添加とともに増加する（ｃ）。図９（ｄ〜ｆ）は、ＡＲがＰＣ３−ｖおよびＰＣ３−ＡＲ９細胞浸潤においてポジティブな役割を果たすことを示した。Ｂｏｙｄｅｎチャンバーの上層で培養したＰＣ３−ｖおよびＰＣ３−ＡＲ９細胞は、ＷＰＭＹ１ベクター（ＷＰＭＹ１−ｖ）またはＷＰＭＹ１  ＡＲノックダウン（ＷＰＭＹ１−ＡＲｓｉ）細胞とともに同時培養し、これらは、示されるように、チャンバーの下層に配置した（ｄ）。Ｗｔ  ＡＲを有するＷＰＭＹ１細胞は、ＷＰＭＹ１−ＡＲｓｉ細胞（下のパネル）と比較して、ＰＣ３−ｖまたはＰＣ３−ＡＲ９細胞（上のパネル）の浸潤を有意に増加し（ｅ）、このデータは定量化した（ｆ）。図９ｇは、ヒト前立腺癌ＣＷＲ２２Ｒ細胞におけるＡＲの減少が浸潤能力の増加を生じることを示す。ＡＲ遺伝子のいくつかの対立遺伝子が遺伝的に破壊されているＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／−細胞は、相同組換えストラテジーによって生成した。ウェスタンブロットは、１ｎＭ  ＤＨＴの存在下または非存在下で、ＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／＋と比較して、ＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／−細胞中でＡＲの発現が低いことを示す（上）。ＡＲの転写活性は、１ｎＭ  ＤＨＴの存在下で、ＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／＋と比較して、ＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／−で減少する。マトリゲルへの浸潤は、親のＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／＋と比較して、ＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／−で増加した（右下）。図９ｈは、ＡＲ−ｓｉＲＮＡを使用するＣＷＲ２２Ｒ細胞中のノックダウンＡＲがインビトロで細胞浸潤を増加したことを示す。
【図１０−１】図１０は、ＰＣ３−ＡＲ９細胞における機能的ＡＲの付加が、インビボマウスモデルにおいて浸潤の減少を生じたことを示す。図１０ａは、ＰＣ３−ＡＲ９細胞が、ＰＣ３−Ｖ細胞よりも少ない溶骨性病変を形成したことを示す。皮質骨ウェハ上の破骨細胞および破骨細胞前駆体（ＯＣ）は、ＰＣ３−ｖ細胞およびＰＣ３−ＡＲ９細胞とともに培養した。１０日後、これらのウェハをかき取り、乾燥させ、ＯＣ細胞について酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）で染色した。ＰＣ３（ＡＲ）９を用いる骨再吸収の程度は、骨ウェハ上の破骨細胞の脱落の領域による測定を介して、ＰＣ３−Ｖと比較して減少した。ＯＣ単独およびＰＴＨを伴うＯＣは、それぞれ、陰性対照および陽性対照として使用した。データは平均±ＳＤであり、３回の独立した実験の＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および破骨細胞前駆体を単離するためにｎ＝３野生型ヌードラット（２日齢ラット）である。図１０（ｂ、ｃ）は、ＰＣ３−ＡＲ９細胞が骨浸潤においてＰＣ３−ｖ細胞よりも弱い能力を有したことを示す。ヌードマウスにおけるＰＣ３−ｖおよびＰＣ３−ＡＲ９細胞の脛骨内注射の効果である。１２週で、ＰＣ３−ｖ細胞は、ダイアルキャリパーによって測定されるようなより大きくかつより浸潤性の腫瘍を生じ（ｂ）、６〜８週の放射線写真（Ｘ腺）においてＰＣ３−ＡＲ９細胞よりも高い溶骨活性を生じた（ｃ、矢印）。データは平均±ＳＤ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、である。図１０ｄは、ＰＣ３−ＡＲ９細胞が、リンパ節中で、ＰＣ３−Ｖによって生成されるよりも小さな転移性腫瘍を生成したことを示す。５０μｌマトリゲル中に懸濁した５×１０３個のＰＣ３−ｖ細胞およびＰＣ３−ＡＲ９細胞を、ヌードマウスの前部前立腺に直接注射した。注射の１２週間後、腫瘍が発達し、リンパ節中の転移性腫瘍を比較した。図１０ｅは、ＷＰＭＹ１−ｖ細胞およびＷＰＭＹ１−  ＡＲｓｉ細胞と合わせたＰＣ３−ＡＲ９細胞が、それらの対照であるＰＣ３−ｖ組み合わせ群よりも小さな転移性腫瘍を生成したことを示す。５×１０５個のＷＰＭＹ１−ｖ細胞またはＷＰＭＹ１−ＡＲｓｉ細胞とそれぞれ合わせた５×１０５個のＰＣ３−ｖ細胞またはＰＣ３−ＡＲ９細胞は、５０μｌのマトリゲルに懸濁し、ヌードマウスの前部前立腺に直接注射した。注射の１２週間後、腫瘍が発達し、リンパ節中の転移性腫瘍を比較した。
【図１０−２】図１０は、ＰＣ３−ＡＲ９細胞における機能的ＡＲの付加が、インビボマウスモデルにおいて浸潤の減少を生じたことを示す。図１０ａは、ＰＣ３−ＡＲ９細胞が、ＰＣ３−Ｖ細胞よりも少ない溶骨性病変を形成したことを示す。皮質骨ウェハ上の破骨細胞および破骨細胞前駆体（ＯＣ）は、ＰＣ３−ｖ細胞およびＰＣ３−ＡＲ９細胞とともに培養した。１０日後、これらのウェハをかき取り、乾燥させ、ＯＣ細胞について酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）で染色した。ＰＣ３（ＡＲ）９を用いる骨再吸収の程度は、骨ウェハ上の破骨細胞の脱落の領域による測定を介して、ＰＣ３−Ｖと比較して減少した。ＯＣ単独およびＰＴＨを伴うＯＣは、それぞれ、陰性対照および陽性対照として使用した。データは平均±ＳＤであり、３回の独立した実験の＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および破骨細胞前駆体を単離するためにｎ＝３野生型ヌードラット（２日齢ラット）である。図１０（ｂ、ｃ）は、ＰＣ３−ＡＲ９細胞が骨浸潤においてＰＣ３−ｖ細胞よりも弱い能力を有したことを示す。ヌードマウスにおけるＰＣ３−ｖおよびＰＣ３−ＡＲ９細胞の脛骨内注射の効果である。１２週で、ＰＣ３−ｖ細胞は、ダイアルキャリパーによって測定されるようなより大きくかつより浸潤性の腫瘍を生じ（ｂ）、６〜８週の放射線写真（Ｘ腺）においてＰＣ３−ＡＲ９細胞よりも高い溶骨活性を生じた（ｃ、矢印）。データは平均±ＳＤ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、である。図１０ｄは、ＰＣ３−ＡＲ９細胞が、リンパ節中で、ＰＣ３−Ｖによって生成されるよりも小さな転移性腫瘍を生成したことを示す。５０μｌマトリゲル中に懸濁した５×１０３個のＰＣ３−ｖ細胞およびＰＣ３−ＡＲ９細胞を、ヌードマウスの前部前立腺に直接注射した。注射の１２週間後、腫瘍が発達し、リンパ節中の転移性腫瘍を比較した。図１０ｅは、ＷＰＭＹ１−ｖ細胞およびＷＰＭＹ１−  ＡＲｓｉ細胞と合わせたＰＣ３−ＡＲ９細胞が、それらの対照であるＰＣ３−ｖ組み合わせ群よりも小さな転移性腫瘍を生成したことを示す。５×１０５個のＷＰＭＹ１−ｖ細胞またはＷＰＭＹ１−ＡＲｓｉ細胞とそれぞれ合わせた５×１０５個のＰＣ３−ｖ細胞またはＰＣ３−ＡＲ９細胞は、５０μｌのマトリゲルに懸濁し、ヌードマウスの前部前立腺に直接注射した。注射の１２週間後、腫瘍が発達し、リンパ節中の転移性腫瘍を比較した。
【図１０−３】図１０は、ＰＣ３−ＡＲ９細胞における機能的ＡＲの付加が、インビボマウスモデルにおいて浸潤の減少を生じたことを示す。図１０ａは、ＰＣ３−ＡＲ９細胞が、ＰＣ３−Ｖ細胞よりも少ない溶骨性病変を形成したことを示す。皮質骨ウェハ上の破骨細胞および破骨細胞前駆体（ＯＣ）は、ＰＣ３−ｖ細胞およびＰＣ３−ＡＲ９細胞とともに培養した。１０日後、これらのウェハをかき取り、乾燥させ、ＯＣ細胞について酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）で染色した。ＰＣ３（ＡＲ）９を用いる骨再吸収の程度は、骨ウェハ上の破骨細胞の脱落の領域による測定を介して、ＰＣ３−Ｖと比較して減少した。ＯＣ単独およびＰＴＨを伴うＯＣは、それぞれ、陰性対照および陽性対照として使用した。データは平均±ＳＤであり、３回の独立した実験の＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および破骨細胞前駆体を単離するためにｎ＝３野生型ヌードラット（２日齢ラット）である。図１０（ｂ、ｃ）は、ＰＣ３−ＡＲ９細胞が骨浸潤においてＰＣ３−ｖ細胞よりも弱い能力を有したことを示す。ヌードマウスにおけるＰＣ３−ｖおよびＰＣ３−ＡＲ９細胞の脛骨内注射の効果である。１２週で、ＰＣ３−ｖ細胞は、ダイアルキャリパーによって測定されるようなより大きくかつより浸潤性の腫瘍を生じ（ｂ）、６〜８週の放射線写真（Ｘ腺）においてＰＣ３−ＡＲ９細胞よりも高い溶骨活性を生じた（ｃ、矢印）。データは平均±ＳＤ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、である。図１０ｄは、ＰＣ３−ＡＲ９細胞が、リンパ節中で、ＰＣ３−Ｖによって生成されるよりも小さな転移性腫瘍を生成したことを示す。５０μｌマトリゲル中に懸濁した５×１０３個のＰＣ３−ｖ細胞およびＰＣ３−ＡＲ９細胞を、ヌードマウスの前部前立腺に直接注射した。注射の１２週間後、腫瘍が発達し、リンパ節中の転移性腫瘍を比較した。図１０ｅは、ＷＰＭＹ１−ｖ細胞およびＷＰＭＹ１−  ＡＲｓｉ細胞と合わせたＰＣ３−ＡＲ９細胞が、それらの対照であるＰＣ３−ｖ組み合わせ群よりも小さな転移性腫瘍を生成したことを示す。５×１０５個のＷＰＭＹ１−ｖ細胞またはＷＰＭＹ１−ＡＲｓｉ細胞とそれぞれ合わせた５×１０５個のＰＣ３−ｖ細胞またはＰＣ３−ＡＲ９細胞は、５０μｌのマトリゲルに懸濁し、ヌードマウスの前部前立腺に直接注射した。注射の１２週間後、腫瘍が発達し、リンパ節中の転移性腫瘍を比較した。
【図１１】図１１はｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスの生成を示す。図１１ａは、抗ＡＲ（Ｃ１９）抗体を使用する免疫組織化学によって実証された、ＷＴ−ＴＲＡＭＰと比較した１２週齢ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスの前立腺上皮におけるＡＲタンパク質発現の損失を示す。図１１ｂは、６週齢のＷＴ−ＴＲＡＭＰマウスおよびｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスの内部泌尿生殖器の同様の発達を示す。
【図１２ａ】図１２は、前立腺上皮においてのみＡＲを欠くｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスがより攻撃的かつ浸潤性の転移性腫瘍を発達されることを示す。図１２ａは、骨盤リンパ節（ＰＬＮ）腫瘍が、２４週齢ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおいて、ＷＴ−ＴＲＡＭＰよりも有意に大きいことを示す。図１２ｂは、２４週齢ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスおよびＷｔ  ＴＲＡＭＰマウス（各群においてｎ＝７）から単離したＰＬＮの重量を示す。図１２ｃは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおいて、ｗｔ−ＴＲＡＭＰと比較して（各群においてｎ＝４）、肝臓腫瘍部位の数が増加していたことを示す。図１２ｄは、２４週齢ＷＴ−ＴＲＡＭＰマウスまたはｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスのいずれかからのＰＬＮ腫瘍中のＡＲタンパク質のウェスタンブロット分析によって決定されたＡＲの発現を示す。図１２ｅは、Ｂｏｙｄｅｎチャンバー浸潤アッセイを使用して、ＷＴ−ＴＲＡＭＰマウスからの浸潤と比較した、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスのＰＬＮ腫瘍初代培養細胞からのより高い浸潤を示す。ｐＢａｂｅウイルス発現ＡＲ  ｃＤＮＡを経由する機能的ＡＲの付加は、浸潤の抑制を生じる。ＰＬＮ腫瘍初代培養細胞の純度／オリジナリティーは、パン−ＣＫ上皮マーカーの発現によって確証した。データは平均±ＳＤであり、３回の独立した実験の＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および各群においてｎ＝５マウスである。図１２ｆは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰ（Ｃ５７Ｂ１７６／１２９×ＴＲＡＭＰ−ＦＶＢ、ｎ＝１０）においては、ＷＴ−ＴＲＡＭＰ（Ｃ５７ＢＬ／６／１２９×ＴＲＡＭＰ−ＦＶＢ、ｎ＝１６）と比較した場合に、生存が減少したことを示す。
【図１２ｂ】図１２は、前立腺上皮においてのみＡＲを欠くｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスがより攻撃的かつ浸潤性の転移性腫瘍を発達されることを示す。図１２ａは、骨盤リンパ節（ＰＬＮ）腫瘍が、２４週齢ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおいて、ＷＴ−ＴＲＡＭＰよりも有意に大きいことを示す。図１２ｂは、２４週齢ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスおよびＷｔ  ＴＲＡＭＰマウス（各群においてｎ＝７）から単離したＰＬＮの重量を示す。図１２ｃは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおいて、ｗｔ−ＴＲＡＭＰと比較して（各群においてｎ＝４）、肝臓腫瘍部位の数が増加していたことを示す。図１２ｄは、２４週齢ＷＴ−ＴＲＡＭＰマウスまたはｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスのいずれかからのＰＬＮ腫瘍中のＡＲタンパク質のウェスタンブロット分析によって決定されたＡＲの発現を示す。図１２ｅは、Ｂｏｙｄｅｎチャンバー浸潤アッセイを使用して、ＷＴ−ＴＲＡＭＰマウスからの浸潤と比較した、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスのＰＬＮ腫瘍初代培養細胞からのより高い浸潤を示す。ｐＢａｂｅウイルス発現ＡＲ  ｃＤＮＡを経由する機能的ＡＲの付加は、浸潤の抑制を生じる。ＰＬＮ腫瘍初代培養細胞の純度／オリジナリティーは、パン−ＣＫ上皮マーカーの発現によって確証した。データは平均±ＳＤであり、３回の独立した実験の＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および各群においてｎ＝５マウスである。図１２ｆは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰ（Ｃ５７Ｂ１７６／１２９×ＴＲＡＭＰ−ＦＶＢ、ｎ＝１０）においては、ＷＴ−ＴＲＡＭＰ（Ｃ５７ＢＬ／６／１２９×ＴＲＡＭＰ−ＦＶＢ、ｎ＝１６）と比較した場合に、生存が減少したことを示す。
【図１２ｃ】図１２は、前立腺上皮においてのみＡＲを欠くｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスがより攻撃的かつ浸潤性の転移性腫瘍を発達されることを示す。図１２ａは、骨盤リンパ節（ＰＬＮ）腫瘍が、２４週齢ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおいて、ＷＴ−ＴＲＡＭＰよりも有意に大きいことを示す。図１２ｂは、２４週齢ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスおよびＷｔ  ＴＲＡＭＰマウス（各群においてｎ＝７）から単離したＰＬＮの重量を示す。図１２ｃは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおいて、ｗｔ−ＴＲＡＭＰと比較して（各群においてｎ＝４）、肝臓腫瘍部位の数が増加していたことを示す。図１２ｄは、２４週齢ＷＴ−ＴＲＡＭＰマウスまたはｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスのいずれかからのＰＬＮ腫瘍中のＡＲタンパク質のウェスタンブロット分析によって決定されたＡＲの発現を示す。図１２ｅは、Ｂｏｙｄｅｎチャンバー浸潤アッセイを使用して、ＷＴ−ＴＲＡＭＰマウスからの浸潤と比較した、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスのＰＬＮ腫瘍初代培養細胞からのより高い浸潤を示す。ｐＢａｂｅウイルス発現ＡＲ  ｃＤＮＡを経由する機能的ＡＲの付加は、浸潤の抑制を生じる。ＰＬＮ腫瘍初代培養細胞の純度／オリジナリティーは、パン−ＣＫ上皮マーカーの発現によって確証した。データは平均±ＳＤであり、３回の独立した実験の＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および各群においてｎ＝５マウスである。図１２ｆは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰ（Ｃ５７Ｂ１７６／１２９×ＴＲＡＭＰ−ＦＶＢ、ｎ＝１０）においては、ＷＴ−ＴＲＡＭＰ（Ｃ５７ＢＬ／６／１２９×ＴＲＡＭＰ−ＦＶＢ、ｎ＝１６）と比較した場合に、生存が減少したことを示す。
【図１２ｄ】図１２は、前立腺上皮においてのみＡＲを欠くｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスがより攻撃的かつ浸潤性の転移性腫瘍を発達されることを示す。図１２ａは、骨盤リンパ節（ＰＬＮ）腫瘍が、２４週齢ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおいて、ＷＴ−ＴＲＡＭＰよりも有意に大きいことを示す。図１２ｂは、２４週齢ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスおよびＷｔ  ＴＲＡＭＰマウス（各群においてｎ＝７）から単離したＰＬＮの重量を示す。図１２ｃは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおいて、ｗｔ−ＴＲＡＭＰと比較して（各群においてｎ＝４）、肝臓腫瘍部位の数が増加していたことを示す。図１２ｄは、２４週齢ＷＴ−ＴＲＡＭＰマウスまたはｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスのいずれかからのＰＬＮ腫瘍中のＡＲタンパク質のウェスタンブロット分析によって決定されたＡＲの発現を示す。図１２ｅは、Ｂｏｙｄｅｎチャンバー浸潤アッセイを使用して、ＷＴ−ＴＲＡＭＰマウスからの浸潤と比較した、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスのＰＬＮ腫瘍初代培養細胞からのより高い浸潤を示す。ｐＢａｂｅウイルス発現ＡＲ  ｃＤＮＡを経由する機能的ＡＲの付加は、浸潤の抑制を生じる。ＰＬＮ腫瘍初代培養細胞の純度／オリジナリティーは、パン−ＣＫ上皮マーカーの発現によって確証した。データは平均±ＳＤであり、３回の独立した実験の＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および各群においてｎ＝５マウスである。図１２ｆは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰ（Ｃ５７Ｂ１７６／１２９×ＴＲＡＭＰ−ＦＶＢ、ｎ＝１０）においては、ＷＴ−ＴＲＡＭＰ（Ｃ５７ＢＬ／６／１２９×ＴＲＡＭＰ−ＦＶＢ、ｎ＝１６）と比較した場合に、生存が減少したことを示す。
【図１２ｅ】図１２は、前立腺上皮においてのみＡＲを欠くｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスがより攻撃的かつ浸潤性の転移性腫瘍を発達されることを示す。図１２ａは、骨盤リンパ節（ＰＬＮ）腫瘍が、２４週齢ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおいて、ＷＴ−ＴＲＡＭＰよりも有意に大きいことを示す。図１２ｂは、２４週齢ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスおよびＷｔ  ＴＲＡＭＰマウス（各群においてｎ＝７）から単離したＰＬＮの重量を示す。図１２ｃは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおいて、ｗｔ−ＴＲＡＭＰと比較して（各群においてｎ＝４）、肝臓腫瘍部位の数が増加していたことを示す。図１２ｄは、２４週齢ＷＴ−ＴＲＡＭＰマウスまたはｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスのいずれかからのＰＬＮ腫瘍中のＡＲタンパク質のウェスタンブロット分析によって決定されたＡＲの発現を示す。図１２ｅは、Ｂｏｙｄｅｎチャンバー浸潤アッセイを使用して、ＷＴ−ＴＲＡＭＰマウスからの浸潤と比較した、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスのＰＬＮ腫瘍初代培養細胞からのより高い浸潤を示す。ｐＢａｂｅウイルス発現ＡＲ  ｃＤＮＡを経由する機能的ＡＲの付加は、浸潤の抑制を生じる。ＰＬＮ腫瘍初代培養細胞の純度／オリジナリティーは、パン−ＣＫ上皮マーカーの発現によって確証した。データは平均±ＳＤであり、３回の独立した実験の＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および各群においてｎ＝５マウスである。図１２ｆは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰ（Ｃ５７Ｂ１７６／１２９×ＴＲＡＭＰ−ＦＶＢ、ｎ＝１０）においては、ＷＴ−ＴＲＡＭＰ（Ｃ５７ＢＬ／６／１２９×ＴＲＡＭＰ−ＦＶＢ、ｎ＝１６）と比較した場合に、生存が減少したことを示す。
【図１２ｆ】図１２は、前立腺上皮においてのみＡＲを欠くｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスがより攻撃的かつ浸潤性の転移性腫瘍を発達されることを示す。図１２ａは、骨盤リンパ節（ＰＬＮ）腫瘍が、２４週齢ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおいて、ＷＴ−ＴＲＡＭＰよりも有意に大きいことを示す。図１２ｂは、２４週齢ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスおよびＷｔ  ＴＲＡＭＰマウス（各群においてｎ＝７）から単離したＰＬＮの重量を示す。図１２ｃは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおいて、ｗｔ−ＴＲＡＭＰと比較して（各群においてｎ＝４）、肝臓腫瘍部位の数が増加していたことを示す。図１２ｄは、２４週齢ＷＴ−ＴＲＡＭＰマウスまたはｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスのいずれかからのＰＬＮ腫瘍中のＡＲタンパク質のウェスタンブロット分析によって決定されたＡＲの発現を示す。図１２ｅは、Ｂｏｙｄｅｎチャンバー浸潤アッセイを使用して、ＷＴ−ＴＲＡＭＰマウスからの浸潤と比較した、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスのＰＬＮ腫瘍初代培養細胞からのより高い浸潤を示す。ｐＢａｂｅウイルス発現ＡＲ  ｃＤＮＡを経由する機能的ＡＲの付加は、浸潤の抑制を生じる。ＰＬＮ腫瘍初代培養細胞の純度／オリジナリティーは、パン−ＣＫ上皮マーカーの発現によって確証した。データは平均±ＳＤであり、３回の独立した実験の＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および各群においてｎ＝５マウスである。図１２ｆは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰ（Ｃ５７Ｂ１７６／１２９×ＴＲＡＭＰ−ＦＶＢ、ｎ＝１０）においては、ＷＴ−ＴＲＡＭＰ（Ｃ５７ＢＬ／６／１２９×ＴＲＡＭＰ−ＦＶＢ、ｎ＝１６）と比較した場合に、生存が減少したことを示す。
【図１３】図１３は、ｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスは転移の発症が遅れたことを示す。図１３ａは、２４週におけるｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスを示し、これは、前立腺の上皮と乾湿の両方においてＡＲ発現を有意に減少し、同じ齢のＷｔの腫瘍と比較して、より少ない攻撃性および転移を伴うより小さな腫瘍を発達したことを示す。そして、群間の転移性腫瘍サイズは以下の順番に従った：ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰ＞Ｗｔ  ＴＲＡＭＰ（ＰＩＰＣありまたはなしで）＞ｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰ。図１３ｂは、異なる腫瘍の悪性度が、群間の類似のサイズの転移状態を比較することによって実証されたことを示す。約２２週において、Ｗｔ  ＴＲＡＭＰマウスは、１ｃｍ直径の腫瘍を発達させ、その多くは、小さな骨盤リンパ節転移を伴う、十分に分化した腫瘍であった。逆に、同様のサイズのｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰ腫瘍は、１８週というこれらの初期の齢において、複数の領域において、たとえ腸間膜においてでさえ、はるかに大きなリンパ節を発達させた。しかし、１ｃｍ直径のｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰ腫瘍は、３６週まで遅くに形成したが、精嚢に浸潤し、肝臓に移動した。ＨＥ染色は、Ｗｔ  ＴＲＡＭＰ腫瘍が、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰ腫瘍およびｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰ腫瘍よりもはるかにより分化されたことを示した（第２のパネル）。ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰ腫瘍およびｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰ腫瘍におけるＡＲ染色は有意に減少したが（第３のパネル）、これらの腫瘍におけるＴ抗原（Ｔ−ａｇ）発現は有意に変化しなかった（最も下のパネル）。
【図１４】図１４は、原発性前立腺腫瘍と比較した、ヒト転移性腫瘍におけるＡＲ発現の損失を示す。図１４ａは、ＡＲについての陽性の核染色を示す高度原発性腫瘍の領域を示す。図１４ｂは、ＡＲについてのネガティブ染色を示す高度転移性腫瘍の領域を示す。免疫染色、４００倍。図１４ｃは、転移性腫瘍に対して原発性腫瘍を比較する、ＡＲ発現の要約を示す。どの腫瘍も神経内分泌分化を示さず、すべての腫瘍は、同時に行う前立腺切除の間の生検またはリンパ節切開のいずれかとして、生きている患者から得られた。アンドロゲン非依存性転移性疾患についての選択は行わなかった。治療のためのデータは、リンパ節転移の場合以外は利用可能ではなく、これらはすべて治療されない症例であった。転移部位には、リンパ節（１０例）、骨（１２例）、肝臓（１例）、肺（２例）、ペニス／尿道（２例）、腸（１例）を含んだ。＊＊Ｐ＜０．０１。
【図１５−１】図１５は、異なる転移／浸潤関連遺伝子に対するＡＲの影響を示す。図１５ａは、ウェスタンブロットが、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰのＰＬＮ腫瘍およびＰＣ３−ｖ異種移植片からのＮＥＰタンパク質の発現の減少を、それぞれ、ＷＴ−ＴＲＡＭＰおよびＰＣ３−ＡＲ９からのそれらと比較して実証することを示す。ＰＣ３−ＡＲ９中のＮＥＰ−Ｌｕｃを使用するＮＥＰの転写活性は、ＡＲ−ｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＡＲ）の存在下で減少した。図１５ｂは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰのＰＬＮ腫瘍およびＰＣ３−ｖ異種移植片におけるＣｏｘ−２の発現の増加を、ＷＴ−ＴＲＡＭＰおよびＰＣ３−ＡＲ９腫瘍異種移植片からのそれらと比較して示す（上図）。ＰＣ３−ＡＲ９中のＣｏｘ−２−Ｌｕｃを使用するＣｏｘ−２の転写活性は、ＡＲ  ｃＤＮＡを有するｐＢａｂｅウイルスを介して機能的ＡＲの回復後に減少した（下図）。図１５ｃは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＡＲＭＰマウスおよびＰＣ３−ｖ異種移植片のＰＬＮ腫瘍からのウェスタンブロットを使用して、ＷＴ−ＴＲＡＭＰおよびＰＣ３−ＡＲ９からのそれらと比較した場合のｐ２７タンパク質発現の減少を示す（上図）。ＡＲを用いる，ｃｄｋ阻害剤ｐ２７の安定性の増加（中図）。ＰＣ３−ｖ細胞ＰＣ３−ＡＲ９細胞は、１ｎＭ  ＤＨＴの存在下または非存在下で４８時間処理した。次いで、細胞は、示された時間、５０μｇ／ｍｌ  シクロヘキシミド（ＣＨＸ）で処理し、５０μｇ細胞溶解物を、抗ｐ２７抗体を用いるウェスタンブロットによって試験し（中図）、データの定量化を行った（中下）。図１５ｄは、ＡＲを用いるＭＭＰ−９の発現および活性の減少を示す。ＰＬＮ腫瘍ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰおよびＰＣ３−Ｖ腫瘍異種移植片からのサンプルにおいて、ｗｔ−ＴＲＡＭＰおよびＰＣ３−ＡＲ９腫瘍異種移植片と比較して、ＭＭＰ−９は増加した（上図）。ＰＣ３−ＡＲ９細胞中のＭＭＰ−９の酵素アッセイは、１ｎＭ  ＤＨＴがＭＭＰ−９のゼラチナーゼ活性を抑制し得、１μＭ  ＨＦがこれを回復し得ることをさらに示す（中上）。ＭＭＰ−９の活性についてのザイモグラフィーは、１０ｎＭ  ＴＰＡ（ＮＦ−κＢ活性化因子）を用いる処理後に増加し、１μｇ／ｍｌパーセノリド（ｐａｒｔｈｅｎｏｌｉｄ）（ＮＦ−κＢ阻害剤）の付加後に減少した（中下）。１ｎＭ  ＤＨＴの存在下でＮＦ−κＢ−Ｌｕｃを使用するトランス活性化アッセイは、ＰＣ−３（ＡＲ）９においてＮＦ−κＢ活性を抑制する。１μＭ  ＨＦはＤＨＴの効果を回復した（下図）。図１５ｅは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰからのＰＬＮ腫瘍およびＰＣ３−ｖ異種移植片のウェスタンブロットアッセイにおいてｐ−Ａｋｔ−４７３抗体を使用してセリン４７３のリン酸化によって測定した場合に、ＷＴ−ＴＲＡＭＰおよびＰＣ３−ＡＲ９（左）ならびにＰＣ３−ｖおよびＰＣ３−ＡＲ９に由来する腫瘍細胞（右）と比較して、Ａｋｔ活性が増加したことを示す。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤ、＊Ｐ＜  ０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１であり、各群についてｎ＝３である。（ｆ）比と間質ＷＰＭＹ１細胞における安定なノックダウンＡＲ発現は、間質傍分泌因子発現を有意に変化させた。ウェスタンブロットは、ＡＲ−ｓｉＲＮＡによって、Ｗ���ＭＹ１−ＡＲｓｉ細部株においてＡＲ発現がノックダウンされたことを示した（上のパネル）。腫瘍転移に影響を与える間質傍分泌因子のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ測定は（下のパネル）、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ１、ＳＤＦ−１、およびＶＥＧＦの発現の減少を示した。
【図１５−２】図１５は、異なる転移／浸潤関連遺伝子に対するＡＲの影響を示す。図１５ａは、ウェスタンブロットが、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰのＰＬＮ腫瘍およびＰＣ３−ｖ異種移植片からのＮＥＰタンパク質の発現の減少を、それぞれ、ＷＴ−ＴＲＡＭＰおよびＰＣ３−ＡＲ９からのそれらと比較して実証することを示す。ＰＣ３−ＡＲ９中のＮＥＰ−Ｌｕｃを使用するＮＥＰの転写活性は、ＡＲ−ｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＡＲ）の存在下で減少した。図１５ｂは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰのＰＬＮ腫瘍およびＰＣ３−ｖ異種移植片におけるＣｏｘ−２の発現の増加を、ＷＴ−ＴＲＡＭＰおよびＰＣ３−ＡＲ９腫瘍異種移植片からのそれらと比較して示す（上図）。ＰＣ３−ＡＲ９中のＣｏｘ−２−Ｌｕｃを使用するＣｏｘ−２の転写活性は、ＡＲ  ｃＤＮＡを有するｐＢａｂｅウイルスを介して機能的ＡＲの回復後に減少した（下図）。図１５ｃは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＡＲＭＰマウスおよびＰＣ３−ｖ異種移植片のＰＬＮ腫瘍からのウェスタンブロットを使用して、ＷＴ−ＴＲＡＭＰおよびＰＣ３−ＡＲ９からのそれらと比較した場合のｐ２７タンパク質発現の減少を示す（上図）。ＡＲを用いる，ｃｄｋ阻害剤ｐ２７の安定性の増加（中図）。ＰＣ３−ｖ細胞ＰＣ３−ＡＲ９細胞は、１ｎＭ  ＤＨＴの存在下または非存在下で４８時間処理した。次いで、細胞は、示された時間、５０μｇ／ｍｌ  シクロヘキシミド（ＣＨＸ）で処理し、５０μｇ細胞溶解物を、抗ｐ２７抗体を用いるウェスタンブロットによって試験し（中図）、データの定量化を行った（中下）。図１５ｄは、ＡＲを用いるＭＭＰ−９の発現および活性の減少を示す。ＰＬＮ腫瘍ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰおよびＰＣ３−Ｖ腫瘍異種移植片からのサンプルにおいて、ｗｔ−ＴＲＡＭＰおよびＰＣ３−ＡＲ９腫瘍異種移植片と比較して、ＭＭＰ−９は増加した（上図）。ＰＣ３−ＡＲ９細胞中のＭＭＰ−９の酵素アッセイは、１ｎＭ  ＤＨＴがＭＭＰ−９のゼラチナーゼ活性を抑制し得、１μＭ  ＨＦがこれを回復し得ることをさらに示す（中上）。ＭＭＰ−９の活性についてのザイモグラフィーは、１０ｎＭ  ＴＰＡ（ＮＦ−κＢ活性化因子）を用いる処理後に増加し、１μｇ／ｍｌパーセノリド（ｐａｒｔｈｅｎｏｌｉｄ）（ＮＦ−κＢ阻害剤）の付加後に減少した（中下）。１ｎＭ  ＤＨＴの存在下でＮＦ−κＢ−Ｌｕｃを使用するトランス活性化アッセイは、ＰＣ−３（ＡＲ）９においてＮＦ−κＢ活性を抑制する。１μＭ  ＨＦはＤＨＴの効果を回復した（下図）。図１５ｅは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰからのＰＬＮ腫瘍およびＰＣ３−ｖ異種移植片のウェスタンブロットアッセイにおいてｐ−Ａｋｔ−４７３抗体を使用してセリン４７３のリン酸化によって測定した場合に、ＷＴ−ＴＲＡＭＰおよびＰＣ３−ＡＲ９（左）ならびにＰＣ３−ｖおよびＰＣ３−ＡＲ９に由来する腫瘍細胞（右）と比較して、Ａｋｔ活性が増加したことを示す。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤ、＊Ｐ＜  ０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１であり、各群についてｎ＝３である。（ｆ）比と間質ＷＰＭＹ１細胞における安定なノックダウンＡＲ発現は、間質傍分泌因子発現を有意に変化させた。ウェスタンブロットは、ＡＲ−ｓｉＲＮＡによって、Ｗ���ＭＹ１−ＡＲｓｉ細部株においてＡＲ発現がノックダウンされたことを示した（上のパネル）。腫瘍転移に影響を与える間質傍分泌因子のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ測定は（下のパネル）、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ１、ＳＤＦ−１、およびＶＥＧＦの発現の減少を示した。
【図１５−３】図１５は、異なる転移／浸潤関連遺伝子に対するＡＲの影響を示す。図１５ａは、ウェスタンブロットが、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰのＰＬＮ腫瘍およびＰＣ３−ｖ異種移植片からのＮＥＰタンパク質の発現の減少を、それぞれ、ＷＴ−ＴＲＡＭＰおよびＰＣ３−ＡＲ９からのそれらと比較して実証することを示す。ＰＣ３−ＡＲ９中のＮＥＰ−Ｌｕｃを使用するＮＥＰの転写活性は、ＡＲ−ｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＡＲ）の存在下で減少した。図１５ｂは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰのＰＬＮ腫瘍およびＰＣ３−ｖ異種移植片におけるＣｏｘ−２の発現の増加を、ＷＴ−ＴＲＡＭＰおよびＰＣ３−ＡＲ９腫瘍異種移植片からのそれらと比較して示す（上図）。ＰＣ３−ＡＲ９中のＣｏｘ−２−Ｌｕｃを使用するＣｏｘ−２の転写活性は、ＡＲ  ｃＤＮＡを有するｐＢａｂｅウイルスを介して機能的ＡＲの回復後に減少した（下図）。図１５ｃは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＡＲＭＰマウスおよびＰＣ３−ｖ異種移植片のＰＬＮ腫瘍からのウェスタンブロットを使用して、ＷＴ−ＴＲＡＭＰおよびＰＣ３−ＡＲ９からのそれらと比較した場合のｐ２７タンパク質発現の減少を示す（上図）。ＡＲを用いる，ｃｄｋ阻害剤ｐ２７の安定性の増加（中図）。ＰＣ３−ｖ細胞ＰＣ３−ＡＲ９細胞は、１ｎＭ  ＤＨＴの存在下または非存在下で４８時間処理した。次いで、細胞は、示された時間、５０μｇ／ｍｌ  シクロヘキシミド（ＣＨＸ）で処理し、５０μｇ細胞溶解物を、抗ｐ２７抗体を用いるウェスタンブロットによって試験し（中図）、データの定量化を行った（中下）。図１５ｄは、ＡＲを用いるＭＭＰ−９の発現および活性の減少を示す。ＰＬＮ腫瘍ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰおよびＰＣ３−Ｖ腫瘍異種移植片からのサンプルにおいて、ｗｔ−ＴＲＡＭＰおよびＰＣ３−ＡＲ９腫瘍異種移植片と比較して、ＭＭＰ−９は増加した（上図）。ＰＣ３−ＡＲ９細胞中のＭＭＰ−９の酵素アッセイは、１ｎＭ  ＤＨＴがＭＭＰ−９のゼラチナーゼ活性を抑制し得、１μＭ  ＨＦがこれを回復し得ることをさらに示す（中上）。ＭＭＰ−９の活性についてのザイモグラフィーは、１０ｎＭ  ＴＰＡ（ＮＦ−κＢ活性化因子）を用いる処理後に増加し、１μｇ／ｍｌパーセノリド（ｐａｒｔｈｅｎｏｌｉｄ）（ＮＦ−κＢ阻害剤）の付加後に減少した（中下）。１ｎＭ  ＤＨＴの存在下でＮＦ−κＢ−Ｌｕｃを使用するトランス活性化アッセイは、ＰＣ−３（ＡＲ）９においてＮＦ−κＢ活性を抑制する。１μＭ  ＨＦはＤＨＴの効果を回復した（下図）。図１５ｅは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰからのＰＬＮ腫瘍およびＰＣ３−ｖ異種移植片のウェスタンブロットアッセイにおいてｐ−Ａｋｔ−４７３抗体を使用してセリン４７３のリン酸化によって測定した場合に、ＷＴ−ＴＲＡＭＰおよびＰＣ３−ＡＲ９（左）ならびにＰＣ３−ｖおよびＰＣ３−ＡＲ９に由来する腫瘍細胞（右）と比較して、Ａｋｔ活性が増加したことを示す。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤ、＊Ｐ＜  ０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１であり、各群についてｎ＝３である。（ｆ）比と間質ＷＰＭＹ１細胞における安定なノックダウンＡＲ発現は、間質傍分泌因子発現を有意に変化させた。ウェスタンブロットは、ＡＲ−ｓｉＲＮＡによって、Ｗ���ＭＹ１−ＡＲｓｉ細部株においてＡＲ発現がノックダウンされたことを示した（上のパネル）。腫瘍転移に影響を与える間質傍分泌因子のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ測定は（下のパネル）、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ１、ＳＤＦ−１、およびＶＥＧＦの発現の減少を示した。
【図１５−４】図１５は、異なる転移／浸潤関連遺伝子に対するＡＲの影響を示す。図１５ａは、ウェスタンブロットが、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰのＰＬＮ腫瘍およびＰＣ３−ｖ異種移植片からのＮＥＰタンパク質の発現の減少を、それぞれ、ＷＴ−ＴＲＡＭＰおよびＰＣ３−ＡＲ９からのそれらと比較して実証することを示す。ＰＣ３−ＡＲ９中のＮＥＰ−Ｌｕｃを使用するＮＥＰの転写活性は、ＡＲ−ｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＡＲ）の存在下で減少した。図１５ｂは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰのＰＬＮ腫瘍およびＰＣ３−ｖ異種移植片におけるＣｏｘ−２の発現の増加を、ＷＴ−ＴＲＡＭＰおよびＰＣ３−ＡＲ９腫瘍異種移植片からのそれらと比較して示す（上図）。ＰＣ３−ＡＲ９中のＣｏｘ−２−Ｌｕｃを使用するＣｏｘ−２の転写活性は、ＡＲ  ｃＤＮＡを有するｐＢａｂｅウイルスを介して機能的ＡＲの回復後に減少した（下図）。図１５ｃは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＡＲＭＰマウスおよびＰＣ３−ｖ異種移植片のＰＬＮ腫瘍からのウェスタンブロットを使用して、ＷＴ−ＴＲＡＭＰおよびＰＣ３−ＡＲ９からのそれらと比較した場合のｐ２７タンパク質発現の減少を示す（上図）。ＡＲを用いる，ｃｄｋ阻害剤ｐ２７の安定性の増加（中図）。ＰＣ３−ｖ細胞ＰＣ３−ＡＲ９細胞は、１ｎＭ  ＤＨＴの存在下または非存在下で４８時間処理した。次いで、細胞は、示された時間、５０μｇ／ｍｌ  シクロヘキシミド（ＣＨＸ）で処理し、５０μｇ細胞溶解物を、抗ｐ２７抗体を用いるウェスタンブロットによって試験し（中図）、データの定量化を行った（中下）。図１５ｄは、ＡＲを用いるＭＭＰ−９の発現および活性の減少を示す。ＰＬＮ腫瘍ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰおよびＰＣ３−Ｖ腫瘍異種移植片からのサンプルにおいて、ｗｔ−ＴＲＡＭＰおよびＰＣ３−ＡＲ９腫瘍異種移植片と比較して、ＭＭＰ−９は増加した（上図）。ＰＣ３−ＡＲ９細胞中のＭＭＰ−９の酵素アッセイは、１ｎＭ  ＤＨＴがＭＭＰ−９のゼラチナーゼ活性を抑制し得、１μＭ  ＨＦがこれを回復し得ることをさらに示す（中上）。ＭＭＰ−９の活性についてのザイモグラフィーは、１０ｎＭ  ＴＰＡ（ＮＦ−κＢ活性化因子）を用いる処理後に増加し、１μｇ／ｍｌパーセノリド（ｐａｒｔｈｅｎｏｌｉｄ）（ＮＦ−κＢ阻害剤）の付加後に減少した（中下）。１ｎＭ  ＤＨＴの存在下でＮＦ−κＢ−Ｌｕｃを使用するトランス活性化アッセイは、ＰＣ−３（ＡＲ）９においてＮＦ−κＢ活性を抑制する。１μＭ  ＨＦはＤＨＴの効果を回復した（下図）。図１５ｅは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰからのＰＬＮ腫瘍およびＰＣ３−ｖ異種移植片のウェスタンブロットアッセイにおいてｐ−Ａｋｔ−４７３抗体を使用してセリン４７３のリン酸化によって測定した場合に、ＷＴ−ＴＲＡＭＰおよびＰＣ３−ＡＲ９（左）ならびにＰＣ３−ｖおよびＰＣ３−ＡＲ９に由来する腫瘍細胞（右）と比較して、Ａｋｔ活性が増加したことを示す。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤ、＊Ｐ＜  ０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１であり、各群についてｎ＝３である。（ｆ）比と間質ＷＰＭＹ１細胞における安定なノックダウンＡＲ発現は、間質傍分泌因子発現を有意に変化させた。ウェスタンブロットは、ＡＲ−ｓｉＲＮＡによって、Ｗ���ＭＹ１−ＡＲｓｉ細部株においてＡＲ発現がノックダウンされたことを示した（上のパネル）。腫瘍転移に影響を与える間質傍分泌因子のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ測定は（下のパネル）、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ１、ＳＤＦ−１、およびＶＥＧＦの発現の減少を示した。
【図１５−５】図１５は、異なる転移／浸潤関連遺伝子に対するＡＲの影響を示す。図１５ａは、ウェスタンブロットが、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰのＰＬＮ腫瘍およびＰＣ３−ｖ異種移植片からのＮＥＰタンパク質の発現の減少を、それぞれ、ＷＴ−ＴＲＡＭＰおよびＰＣ３−ＡＲ９からのそれらと比較して実証することを示す。ＰＣ３−ＡＲ９中のＮＥＰ−Ｌｕｃを使用するＮＥＰの転写活性は、ＡＲ−ｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＡＲ）の存在下で減少した。図１５ｂは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰのＰＬＮ腫瘍およびＰＣ３−ｖ異種移植片におけるＣｏｘ−２の発現の増加を、ＷＴ−ＴＲＡＭＰおよびＰＣ３−ＡＲ９腫瘍異種移植片からのそれらと比較して示す（上図）。ＰＣ３−ＡＲ９中のＣｏｘ−２−Ｌｕｃを使用するＣｏｘ−２の転写活性は、ＡＲ  ｃＤＮＡを有するｐＢａｂｅウイルスを介して機能的ＡＲの回復後に減少した（下図）。図１５ｃは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＡＲＭＰマウスおよびＰＣ３−ｖ異種移植片のＰＬＮ腫瘍からのウェスタンブロットを使用して、ＷＴ−ＴＲＡＭＰおよびＰＣ３−ＡＲ９からのそれらと比較した場合のｐ２７タンパク質発現の減少を示す（上図）。ＡＲを用いる，ｃｄｋ阻害剤ｐ２７の安定性の増加（中図）。ＰＣ３−ｖ細胞ＰＣ３−ＡＲ９細胞は、１ｎＭ  ＤＨＴの存在下または非存在下で４８時間処理した。次いで、細胞は、示された時間、５０μｇ／ｍｌ  シクロヘキシミド（ＣＨＸ）で処理し、５０μｇ細胞溶解物を、抗ｐ２７抗体を用いるウェスタンブロットによって試験し（中図）、データの定量化を行った（中下）。図１５ｄは、ＡＲを用いるＭＭＰ−９の発現および活性の減少を示す。ＰＬＮ腫瘍ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰおよびＰＣ３−Ｖ腫瘍異種移植片からのサンプルにおいて、ｗｔ−ＴＲＡＭＰおよびＰＣ３−ＡＲ９腫瘍異種移植片と比較して、ＭＭＰ−９は増加した（上図）。ＰＣ３−ＡＲ９細胞中のＭＭＰ−９の酵素アッセイは、１ｎＭ  ＤＨＴがＭＭＰ−９のゼラチナーゼ活性を抑制し得、１μＭ  ＨＦがこれを回復し得ることをさらに示す（中上）。ＭＭＰ−９の活性についてのザイモグラフィーは、１０ｎＭ  ＴＰＡ（ＮＦ−κＢ活性化因子）を用いる処理後に増加し、１μｇ／ｍｌパーセノリド（ｐａｒｔｈｅｎｏｌｉｄ）（ＮＦ−κＢ阻害剤）の付加後に減少した（中下）。１ｎＭ  ＤＨＴの存在下でＮＦ−κＢ−Ｌｕｃを使用するトランス活性化アッセイは、ＰＣ−３（ＡＲ）９においてＮＦ−κＢ活性を抑制する。１μＭ  ＨＦはＤＨＴの効果を回復した（下図）。図１５ｅは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰからのＰＬＮ腫瘍およびＰＣ３−ｖ異種移植片のウェスタンブロットアッセイにおいてｐ−Ａｋｔ−４７３抗体を使用してセリン４７３のリン酸化によって測定した場合に、ＷＴ−ＴＲＡＭＰおよびＰＣ３−ＡＲ９（左）ならびにＰＣ３−ｖおよびＰＣ３−ＡＲ９に由来する腫瘍細胞（右）と比較して、Ａｋｔ活性が増加したことを示す。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤ、＊Ｐ＜  ０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１であり、各群についてｎ＝３である。（ｆ）比と間質ＷＰＭＹ１細胞における安定なノックダウンＡＲ発現は、間質傍分泌因子発現を有意に変化させた。ウェスタンブロットは、ＡＲ−ｓｉＲＮＡによって、Ｗ���ＭＹ１−ＡＲｓｉ細部株においてＡＲ発現がノックダウンされたことを示した（上のパネル）。腫瘍転移に影響を与える間質傍分泌因子のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ測定は（下のパネル）、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ１、ＳＤＦ−１、およびＶＥＧＦの発現の減少を示した。
【図１５−６】図１５は、異なる転移／浸潤関連遺伝子に対するＡＲの影響を示す。図１５ａは、ウェスタンブロットが、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰのＰＬＮ腫瘍およびＰＣ３−ｖ異種移植片からのＮＥＰタンパク質の発現の減少を、それぞれ、ＷＴ−ＴＲＡＭＰおよびＰＣ３−ＡＲ９からのそれらと比較して実証することを示す。ＰＣ３−ＡＲ９中のＮＥＰ−Ｌｕｃを使用するＮＥＰの転写活性は、ＡＲ−ｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＡＲ）の存在下で減少した。図１５ｂは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰのＰＬＮ腫瘍およびＰＣ３−ｖ異種移植片におけるＣｏｘ−２の発現の増加を、ＷＴ−ＴＲＡＭＰおよびＰＣ３−ＡＲ９腫瘍異種移植片からのそれらと比較して示す（上図）。ＰＣ３−ＡＲ９中のＣｏｘ−２−Ｌｕｃを使用するＣｏｘ−２の転写活性は、ＡＲ  ｃＤＮＡを有するｐＢａｂｅウイルスを介して機能的ＡＲの回復後に減少した（下図）。図１５ｃは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＡＲＭＰマウスおよびＰＣ３−ｖ異種移植片のＰＬＮ腫瘍からのウェスタンブロットを使用して、ＷＴ−ＴＲＡＭＰおよびＰＣ３−ＡＲ９からのそれらと比較した場合のｐ２７タンパク質発現の減少を示す（上図）。ＡＲを用いる，ｃｄｋ阻害剤ｐ２７の安定性の増加（中図）。ＰＣ３−ｖ細胞ＰＣ３−ＡＲ９細胞は、１ｎＭ  ＤＨＴの存在下または非存在下で４８時間処理した。次いで、細胞は、示された時間、５０μｇ／ｍｌ  シクロヘキシミド（ＣＨＸ）で処理し、５０μｇ細胞溶解物を、抗ｐ２７抗体を用いるウェスタンブロットによって試験し（中図）、データの定量化を行った（中下）。図１５ｄは、ＡＲを用いるＭＭＰ−９の発現および活性の減少を示す。ＰＬＮ腫瘍ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰおよびＰＣ３−Ｖ腫瘍異種移植片からのサンプルにおいて、ｗｔ−ＴＲＡＭＰおよびＰＣ３−ＡＲ９腫瘍異種移植片と比較して、ＭＭＰ−９は増加した（上図）。ＰＣ３−ＡＲ９細胞中のＭＭＰ−９の酵素アッセイは、１ｎＭ  ＤＨＴがＭＭＰ−９のゼラチナーゼ活性を抑制し得、１μＭ  ＨＦがこれを回復し得ることをさらに示す（中上）。ＭＭＰ−９の活性についてのザイモグラフィーは、１０ｎＭ  ＴＰＡ（ＮＦ−κＢ活性化因子）を用いる処理後に増加し、１μｇ／ｍｌパーセノリド（ｐａｒｔｈｅｎｏｌｉｄ）（ＮＦ−κＢ阻害剤）の付加後に減少した（中下）。１ｎＭ  ＤＨＴの存在下でＮＦ−κＢ−Ｌｕｃを使用するトランス活性化アッセイは、ＰＣ−３（ＡＲ）９においてＮＦ−κＢ活性を抑制する。１μＭ  ＨＦはＤＨＴの効果を回復した（下図）。図１５ｅは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰからのＰＬＮ腫瘍およびＰＣ３−ｖ異種移植片のウェスタンブロットアッセイにおいてｐ−Ａｋｔ−４７３抗体を使用してセリン４７３のリン酸化によって測定した場合に、ＷＴ−ＴＲＡＭＰおよびＰＣ３−ＡＲ９（左）ならびにＰＣ３−ｖおよびＰＣ３−ＡＲ９に由来する腫瘍細胞（右）と比較して、Ａｋｔ活性が増加したことを示す。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤ、＊Ｐ＜  ０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１であり、各群についてｎ＝３である。（ｆ）比と間質ＷＰＭＹ１細胞における安定なノックダウンＡＲ発現は、間質傍分泌因子発現を有意に変化させた。ウェスタンブロットは、ＡＲ−ｓｉＲＮＡによって、Ｗ���ＭＹ１−ＡＲｓｉ細部株においてＡＲ発現がノックダウンされたことを示した（上のパネル）。腫瘍転移に影響を与える間質傍分泌因子のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ測定は（下のパネル）、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ１、ＳＤＦ−１、およびＶＥＧＦの発現の減少を示した。
【図１６】図１６は、前立腺癌細胞株ＰＣ３におけるノックインＡＲが異種移植片腫瘍増殖を抑制したこと、および前立腺間質細胞株ＷＰＭＹ１におけるノックダウンＡＲもまた、インビボ組織組換えにおけるＰＣ３異種移植片腫瘍生成を抑制したことを示す。図１６ａは、ＰＣ３−ＡＲ９細胞が、ＰＣ３によって生成されたものよりもより遅く増殖し、かつ前部前立腺においてより小さな腫瘍を生成したことを示す。５０μｌマトリゲルに懸濁した５×１０５個のＰＣ３−Ｖ細胞およびＰＣ３−ＡＲ９細胞は、ヌードマウスの前部前立腺に直接注射した。注射の１２週間後、腫瘍を収集し、腫瘍増殖活性を示したＫｉ６７は、免疫組織化学によって染色した。図１６ｂは、ＷＰＭＹ１−ｖと組み合わせたＰＣ３細胞が、インビボでのＰＣ３およびＷＰＭＹ１−ＡＲｓｉの組み合わせからの腫瘍よりも、より小さな腫瘍を生成したことを示す。５×１０５個のＷＰＭＹ１−ｖまたはＷＰＭＹ１ＡＲｓｉ細胞とそれぞれ組み合わせた５×１０５個のＰＣ３−ｖ細胞またはＰＣ３−ＡＲ９細胞を５０μｌマトリゲルに懸濁し、ヌードマウスの前部前立腺に直接注射した。注射の１２週間後、異種移植片を収集および比較した。Ｈ＆Ｅ染色は、ＰＣ３＋ＷＰＭＹ１−ｖ細胞がＰＣ３−ＡＲ９＋ＷＰＭＹ１−ｖからの腫瘍よりも比較的分化が乏しい腫瘍を形成したことを管腔形成によって示す（中央のパネル）。Ｋｉ６７染色は、ＰＣ３＋ＷＰＭＹ１−ｖ腫瘍がＰＣ３−ＡＲ９＋ＷＰＭＹ１−ｖ腫瘍よりも速い増殖速度を有したことを示した（下のパネル）。
【図１７−１】図１７は、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスおよびｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスの生成および確認を示す。図１７ａは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰ（Ｃ５７ＢＬ／６／１２９×ＴＲＡＭＰ−ＦＶＢ）およびｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウス（Ｃ５７ＢＬ／６／１２９×ＴＲＡＭＰ−ＦＶＢ）の交配ストラテジーを示す。図１７ｂは、尾スニップＤＮＡからのマウスの遺伝子型スクリーニングを示す。Ｔ−ａｇ（ＳＶ４０）プライマーは、１２週齢のＴＲＡＭＰマウスを同定するために使用した（上図）。プライマー２〜３およびＡＲエキソン２領域を増幅する選択は、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスおよびｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおけるＦｌｏｘ／ＡＲを同定するために使用した（中図）。Ｐｂ−ＣｒｅおよびＭｘ−Ｃｒｅに特異的なプライマーは、それぞれ、Ｐｂ−ＣｒｅおよびＭｘ−Ｃｒｅ導入遺伝子マウスを同定するために使用した（下図）。図１７ｃは、ＡＲノックアウトが、ＡＲ  ｍＲＮＡにおけるエキソン２の欠失を検出することによって確認されたことを示す。エキソン１およびエキソン３プライマーを使用して、特異的ＡＲＫＯバンドは、異なる器官からＡＲ  ｍＲＮＡを増幅することによって示された。ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおいて、ＡＲＫＯバンドは、背外側前立腺（ＤＬＰ）、腹側前立腺（ＶＰ）、および前部前立腺（ＡＰ）において示されるが、ＷＴ−ＴＲＡＭＰと比較して、精嚢（ＳＶ）においては有意ではなかった。ｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおいては、ＡＲＫＯバンドは、ＤＬＰ、ＶＰ、ＡＰ、およびＳＶにおいて示された。
【図１７−２】図１７は、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスおよびｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスの生成および確認を示す。図１７ａは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰ（Ｃ５７ＢＬ／６／１２９×ＴＲＡＭＰ−ＦＶＢ）およびｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウス（Ｃ５７ＢＬ／６／１２９×ＴＲＡＭＰ−ＦＶＢ）の交配ストラテジーを示す。図１７ｂは、尾スニップＤＮＡからのマウスの遺伝子型スクリーニングを示す。Ｔ−ａｇ（ＳＶ４０）プライマーは、１２週齢のＴＲＡＭＰマウスを同定するために使用した（上図）。プライマー２〜３およびＡＲエキソン２領域を増幅する選択は、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスおよびｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおけるＦｌｏｘ／ＡＲを同定するために使用した（中図）。Ｐｂ−ＣｒｅおよびＭｘ−Ｃｒｅに特異的なプライマーは、それぞれ、Ｐｂ−ＣｒｅおよびＭｘ−Ｃｒｅ導入遺伝子マウスを同定するために使用した（下図）。図１７ｃは、ＡＲノックアウトが、ＡＲ  ｍＲＮＡにおけるエキソン２の欠失を検出することによって確認されたことを示す。エキソン１およびエキソン３プライマーを使用して、特異的ＡＲＫＯバンドは、異なる器官からＡＲ  ｍＲＮＡを増幅することによって示された。ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおいて、ＡＲＫＯバンドは、背外側前立腺（ＤＬＰ）、腹側前立腺（ＶＰ）、および前部前立腺（ＡＰ）において示されるが、ＷＴ−ＴＲＡＭＰと比較して、精嚢（ＳＶ）においては有意ではなかった。ｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおいては、ＡＲＫＯバンドは、ＤＬＰ、ＶＰ、ＡＰ、およびＳＶにおいて示された。
【図１８ａ】図１８は、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスおよびｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおけるＡＲ発現を示す。図１８ａは、間質から上皮を分離するためのレーザーキャプチャーマイクロダイセクションの使用を示す。腹側前立腺上皮において発現されるＡＲエキソン２  ｍＲＮＡは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスは、６週目からＡＲ  ｍＲＮＡ発現を喪失し（２５％）、１２週目には徐々に約５０％に到達し、１６週目にはほぼ消失した。
【図１８ｂ】図１８は、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスおよびｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおけるＡＲ発現を示す。図１８ｂは、ＩＨＣ  ＡＲ（Ｃ−１９）染色が、腹側前立腺上皮（基底細胞および管腔細胞を含む）においてＡＲタンパク質が失われたが１６週齢ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスの間質においては失われなかったことを、Ｗｔ  ＴＲＡＭＰマウスと比較して示した。
【図１８ｃ】図１８は、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスおよびｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおけるＡＲ発現を示す。図１８ｃは、ＡＲが上皮においてのみノックアウトされ、１６週齢ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスの腹側前立腺における間質中ではノックアウトされていなかったことを、間質から上皮を分離するＬＣＭ後のＡＲエキソン２のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用して示す。ＡＲノックアウトは、ＡＲエキソン２  ｍＲＮＡの相対的発現レベルを検出するためにリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用することによってさまざまな程度で異なる器官において誘導した。
【図１８ｄ】図１８は、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスおよびｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおけるＡＲ発現を示す。図１８ｄは、ＩＨＣ  ＡＲ染色が、１６週齢ｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスの腹側前立腺上皮および間質において、Ｗｔ  ＴＲＡＭＰマウスと比較して失われたことを示す。
【図１８ｆ】図１８は、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスおよびｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおけるＡＲ発現を示す。図１８ｆは、１６週齢ｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスの腹側前立腺の上皮と間質の両方においてＡＲが部分的にノックアウトされたことを、間質から上皮を分離するＬＣＭ後のＡＲエキソン２のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用して示す。
【図１９ａ】図１９は、ＡＲＫＯが前立腺腫瘍の生殖器全体の外見の変化および細胞集団の変化をもたらすことを示す。図１９ａは、生殖器の一般的全体的な外見の変化が、１６週齢ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウス、ｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウス、去勢したＴＲＡＭＰマウス、および  Ｗｔ  ＴＲＡＭＰマウスの間で観察されたことを示す。ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスは、Ｗｔ  ＴＲＡＭＰマウスと比較して、前立腺が拡大したが、他の生殖器官は変化がなかった。ｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰおよび去勢したＴＲＡＭＰは、１２週目で、前立腺の種々の葉、精嚢、および精巣を含むすべての生殖器官のサイズが収縮した。
【図１９ｂ】図１９は、ＡＲＫＯが前立腺腫瘍の生殖器全体の外見の変化および細胞集団の変化をもたらすことを示す。図１９ｂは、血清テストステロンレベルが、１２週（ＰＩＰＣ注射または去勢前）、１６週、２０週、および２４週で連続して検出されたことを示す。血清Ｔレベルは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスでは変化しないままであり、ｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスおよび去勢したＴＲＡＭＰマウスにおいては有意に減少した。
【図１９ｃ】図１９は、ＡＲＫＯが前立腺腫瘍の生殖器全体の外見の変化および細胞集団の変化をもたらすことを示す。図１９ｃは、二重免疫蛍光染色ＣＫ５（緑色）およびＣＫ８（赤色）腹側前立腺腫瘍によって、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウス、ｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウス、去勢したＴＲＡＭＰマウス、および去勢したｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおいて、Ｗｔ  ＴＲＡＭＰ腫瘍と比較して、より多くの中間体細胞様集団が観察されたことを示す。
【図１９ｄ】図１９は、ＡＲＫＯが前立腺腫瘍の生殖器全体の外見の変化および細胞集団の変化をもたらすことを示す。図１９ｄは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰ、ｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰ、去勢したＴＲＡＭＰ、および去勢したｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰの腫瘍が、高レベルのＣＤ４４細胞マーカーを発現したことを示す。
【図２０ａ】図２０は、上皮腫瘍の増殖におけるＡＲのネガティブな役割が、上皮−間質相互作用を通して上皮増殖をポジティブに刺激するＡＲ間質機能によって支配されたことを示す。図２０ａは、１６週および２０週のｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおける前立腺の異なる葉の全体の外見およびＨ＆Ｅ染色が、Ｗｔ  ＴＲＡＭＰマウスよりも大きな腫瘍を生じたのに対して、ｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスおよび去勢したＴＲＡＭＰマウスは、腫瘍を生じなかったか、またはそれらの同腹仔よりもはるかに小さな腫瘍を生じたかのいずれかであったことを示す。
【図２０ｂ】図２０は、上皮腫瘍の増殖におけるＡＲのネガティブな役割が、上皮−間質相互作用を通して上皮増殖をポジティブに刺激するＡＲ間質機能によって支配されたことを示す。図２０ｂは、マウスが、１６週、２０週、および２４週の異なる時点で屠殺され、腫瘍重量の違いが測定されたことを示す。
【図２０ｃ】図２０は、上皮腫瘍の増殖におけるＡＲのネガティブな役割が、上皮−間質相互作用を通して上皮増殖をポジティブに刺激するＡＲ間質機能によって支配されたことを示す。図２０ｃは、腫瘍増殖速度がＢｒｄＵ取り込みによって検出されたことを示す。屠殺の２４時間前に、マウスに、６時間毎にＢｒｄＵを腹腔内注射した。パラフィン固定組織切片を、特別なＢｒｄＵ検出キットによって染色した。
【図２０ｄ】図２０は、上皮腫瘍の増殖におけるＡＲのネガティブな役割が、上皮−間質相互作用を通して上皮増殖をポジティブに刺激するＡＲ間質機能によって支配されたことを示す。図２０ｄは、Ｋｉ６７（緑色）およびＣＫ５（赤色）の二重免疫蛍光染色が、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおけるＣＫ５陽性細胞中での増殖を位置付けしたことを示す。ｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰおよび去勢したＴＲＡＭＰもまた、高い割合のＣＫ５陽性細胞を得たが、それらの前立腺における増殖はなお低かった。
【図２０ｅ】図２０は、上皮腫瘍の増殖におけるＡＲのネガティブな役割が、上皮−間質相互作用を通して上皮増殖をポジティブに刺激するＡＲ間質機能によって支配されたことを示す。図２０ｅは、ＴＵＮＥＬアッセイを使用して、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰ、ｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰ、および去勢したＴＲＡＭＰにおけるアポトーシスシグナルが、Ｗｔ  ＴＲＡＭＰよりも高かったことを示す。
【図２０ｆ】図２０は、上皮腫瘍の増殖におけるＡＲのネガティブな役割が、上皮−間質相互作用を通して上皮増殖をポジティブに刺激するＡＲ間質機能によって支配されたことを示す。図２０ｆは、Ｗｔ  ＴＲＡＭＰマウス、ｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウス、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウス、および去勢したＴＲＡＭＰマウスの間の寿命の違いが統計学的に有意であったことを示す。
【図２１ａ】図２１は、前立腺上皮におけるＡＲ抑制因子の役割に関与するメカニズムを示す。図２１ａは、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴβＲ−ＩＩ、ＦＧＦ２、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ−Ｒ１、ＥＧＦ、ＥＧＦ−Ｒ、ＳＤＦ１、ＣＸＣＲ４、およびＶＥＧＦの相対的発現レベルが、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって、ＷＴ  ＴＲＡＭＰおよびｐｅｓ−  ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰの１６週腹側前立腺において検出されたことを示す。
【図２１ｂ】図２１は、前立腺上皮におけるＡＲ抑制因子の役割に関与するメカニズムを示す。図２１ｂは、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションによって分離された、１６週腹側前立腺上皮および間質におけるＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴβＲ−ＩＩの相対的発現レベルが、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって検出されたことを示す。
【図２１ｃ】図２１は、前立腺上皮におけるＡＲ抑制因子の役割に関与するメカニズムを示す。図２１ｃは、ＤＨＴ処理あり対ＤＨＴ処理なしのＬＮＣａＰ細胞、ＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／＋対ＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／−におけるＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴβＲ−ＩＩの相対的発現レベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって検出したことを示す。
【図２１ｄ】図２１は、前立腺上皮におけるＡＲ抑制因子の役割に関与するメカニズムを示す。図２１ｄは、１６週腹側前立腺および２０週前立腺腫瘍におけるＴＧＦβ１、ＴβＲ−ＩＩ、およびホスホＳｍａｄ２／３タンパク質が、ウェスタンブロッティングおよびＩＨＣ染色によって検出されたことを示す。ＴＧＦβ１およびＴβＲ−ＩＩタンパク質レベルの上昇と一貫して、ホスホＳｍａｄ２／３タンパク質は、１６週および２０週のｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰサンプルにおいて細胞質中で増加した（下のパネル）。
【図２１ｅ】図２１は、前立腺上皮におけるＡＲ抑制因子の役割に関与するメカニズムを示す。図２１ｅは、ＴＧＦβシグナル伝達がクロストークするＥＲＫ１／２、ＪＮＫ、およびｐ３８を含むＭＡＰＫシグナル伝達経路が、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰ  １６週腹側前立腺および２０週前立腺腫瘍において増強されたことを示す。
【図２１ｆ】図２１は、前立腺上皮におけるＡＲ抑制因子の役割に関与するメカニズムを示す。図２１ｆは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスの１６週腹側前立腺および２０週前立腺腫瘍において、高レベルのホスホ−Ａｋｔ（Ｗ．Ｂ．とＩＨＣの両方によって示された）およびホスホ−ＣＲＥＢの理由を説明する、比較的高いレベルのＥＧＦ−Ｒ、ＦＧＦ−Ｒ１、およびＣＸＣＲ４が観察されたことを示す。
【図２１ｇ】図２１は、前立腺上皮におけるＡＲ抑制因子の役割に関与するメカニズムを示す。図２１ｇは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰ前立腺における過剰活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達ならびにホスホ−Ａｋｔおよびホスホ−ＣＲＥＢの上昇が、それらの同腹仔と比較して、低レベルのｐ１６およびｐ２１、ならびに高レベルのサイクリンＤ１を生じることを示す。
【図２２ａ】図２２は、前立腺間質におけるＡＲ刺激因子の役割に関与するメカニズムを示す。図２２ａは、ウェスタンブロットおよびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲがＡＲはＷＰＭＹ１−ＡＲｓｉ細胞中でノックダウンされていたことを示したことを示す。
【図２２ｂ】図２２は、前立腺間質におけるＡＲ刺激因子の役割に関与するメカニズムを示す。図２２ｂは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲが、間質傍分泌因子、ＦＧＦ２、ＦＧＦ７およびＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ７、およびＦＧＦ１０の発現の相対的発現レベルが、ｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスのＷＰＭＹ１−ＡＲｓｉ細胞および１６週腹側前立腺において、それぞれ、ＷＰＭＹ  １−ｖ細胞および１６週Ｗｔ  ＴＲＡＭＰサンプルと比較して低かったことを示す。
【図２２ｃ】図２２は、前立腺間質におけるＡＲ刺激因子の役割に関与するメカニズムを示す。図２２ｃは、ｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰおよびＷＰＭＹ１−ＡＲｓｉ細胞の１６週腹側前立腺において、１６週Ｗｔ  ＴＲＡＭＰサンプルおよびＷＰＭＹ  １−ｖ細胞と比較して、より高い発現レベルのＩＮＨＢＡおよびＢＭＰ４が観察されたことを示す。ＴＧＦβ１もまた、ｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおいて上昇した。
【図２２ｄ】図２２は、前立腺間質におけるＡＲ刺激因子の役割に関与するメカニズムを示す。図２２ｄは、ＷＴ  ＴＲＡＭＰマウスの発現レベルと比較して、比較的低い発現レベルのＨＢ−ＥＧＦ、ＩＧＦ１、およびＳＤＦ１が、ｉｎｄ−ＡＥＸＯ−ＴＲＡＭＰマウスの１６週腹側前立腺において見出され、これは、ＷＰＭＹ１−ＡＲｓｉ細胞におけるより低い発現レベルと同様に確認されたことを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
詳細な説明
本発明の化合物、組成物、物品、デバイス、および／または方法が開示および記載される前に、これらは、他に明示されない限り、特定の合成方法もしくは特定の組換えバイオテクノロジー方法、または他に明示されない限り、特定の試薬に限定されず、当然、これ自体が変更され得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される命名法は、特定の実施形態を記載する目的のみのためであり、限定を意図しないこともまた理解されるべきである。
【０００７】
Ａ．定義
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（ａ）（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に他を指示しない限り、複数形の言及を含む。従って、例えば、「薬学的キャリア」との言及は、２種以上のこのようなキャリアの混合物などを含む。
【０００８】
範囲は、本明細書では、「約」１つの特定の値から、「約」別の特定の値までとして表現することができる。このような範囲が表現される場合、別の実施形態は、１つの特定の値から、および／または他の特定の値までを含む。同様に、先行詞「約」の使用によって、値が近似値として表現される場合、特定の値が別の実施形態を形成することが理解されるべきである。範囲の各々の終点は、他の終点と関連することと、他の終点とは独立することの両方で意味があることがさらに理解されるべきである。本明細書に開示される多くの値が存在すること、および各値は、その値それ自体に加えて、「約」その特定の値としてもまた本明細書に開示されることもまた理解されるべきである。例えば、値「１０」が開示されるならば、「約１０」もまた開示される。その値「以下」である値が開示される場合、当業者によって好適に理解されるように、「その値以上」およびそれらの値の間の可能な範囲もまた開示されることもまた理解されるべきである。例えば、値「１０」が開示されるならば、「１０以下」ならびに「１０以上」もまた開示される。本願を通して、データは多数の異なる形式で提供されること、およびこのデータは、終点および出発点、ならびにデータの点の任意の組み合わせの範囲を表すこともまた理解されるべきである。例えば、特定のデータ点「１０」および特定のデータ点「１５」が開示されるならば、１０および１５よりも大きい、１０および１５以上、１０および１５未満、１０および１５以下、ならびに１０および１５に等しいが、１０と１５の間と同様に開示されると見なされることが理解されるべきである。２つの特定の単位の間の各単位もまた開示されることもまた理解されるべきである。例えば、１０および１５が開示されるならば、１１、１２、１３、および１４もまた開示される。
【０００９】
本明細書および以下に続く特許請求の範囲において、以下の意味を有するとして定義される多数の用語に対して参照がなされる。
【００１０】
「選択的な」または「選択的に」は、引き続いて記載される事象または状況が存在してもよくまたは存在しなくてもよいこと、およびその記載が、その事象または状況が存在する場合および存在しない場合を含むことを意味する。
【００１１】
「プライマー」は、酵素的操作が起こり得るように、ある種の酵素的操作を補助することが可能であり、かつ標的核酸とハイブリダイズし得るプローブのサブセットである。プライマーは、酵素的操作と干渉しない、当該分野において利用可能であるヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体もしくは類似体の任意の組み合わせから作製できる。
【００１２】
「プローブ」は、例えば、ハイブリダイゼーションを通して、典型的には、配列特異的な様式で、標的核酸と相互作用可能である分子である。核酸のハイブリダイゼーションは、当該分野において十分に理解されており、本明細書に議論される。典型的には、プローブは、当該分野において利用可能であるヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体もしくは類似体の任意の組み合わせから作製できる。
【００１３】
本願を通して、種々の刊行物が引用される。これらの刊行物の開示は、それが属する技術分野の状態をより完全に説明するために、参照によりそれらの全体が本願に組み込まれる。開示される引用文献はまた、その参照が依存する文章中に議論されている、それらに含まれる構成要素のために、個々におよび具体的に参照により組み込まれる。
【００１４】
Ｂ．アンドロゲン受容体
アンドロゲン受容体は、ステロイドホルモン受容体のスーパーファミリーであり、１９８８年に最初にサブクローニングされた（Ｃｈａｎｇ，１９８８）。これは、Ｎ末端トランス活性化ドメイン、中心ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、およびＣ末端リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を含む（Ｕｍｅｓｏｎｏ，１９９５）。ホモダイマーを形成すること、ならびにリガンドおよびコレギュレーターを取り入れることにより、アンドロゲン受容体は、多数の標的遺伝子と相互作用し、その転写を調節する（Ｉｎｇ，１９９２；Ｓｃｈｕｌｍａｎ，１９９５；Ｂｅａｔｐ，１９９６；Ｙｅｈ，１９９６；Ｇｌａｓｓ，１９９７、Ｓｈｉｂａｔａ，１９９７）。アンドロゲンはアンドロゲン受容体の最も強いリガンドである。しかし、これは唯一のリガンドではない。エストラジオールは、アンドロゲン受容体との相互作用を通して、アンドロゲン受容体トランス活性化を活性化することが見出されている（Ｙｅｈ，１９９８）。また、アンドロゲンおよびアンドロゲン受容体は、雄性個体中でのみ作用するのではない。卵胞形成、骨代謝、および脳機能の維持を含む、雌性個体の生理学的プロセスにおいてもまた、アンドロゲンおよびアンドロゲン受容体（ＡＲ）が重要な役割を果たしている可能性があることを示す証拠が増加しつつある（Ｍｉｌｌｅｒ，２００１）。
【００１５】
アンドロゲンは、卵巣中で最も目立つステロイドホルモンである（Ｒｉｓｃｈ  ＨＡ，１９９８）。後期卵胞期におけるテストステロンおよびエストラジオールの濃度は、それらのピークにおいて、それぞれ、０．０６〜０．１０ｍｇ／日および０．０４〜０．０８ｍｇ／日である（Ｒｉｓｃｈ  ＨＡ，１９９８）。閉経後の女性の卵巣静脈におけるアンドロゲン対エストロゲンの比率は、１５対１である（Ｒｉｓｃｈ，１９９８；Ｄｏｌｄｉ  Ｎ，１９９８）。アンドロゲン受容体は、卵巣の顆粒膜細胞の中で主として発現される（Ｈｉｌｌｅｒ  ＳＧ，１９９２；Ｈｉｌｄ−Ｐｅｔｉｔｏ  Ｓ，１９９１）。卵巣アンドロゲンの過剰産生によって、多嚢胞卵巣症候群の女性は、小さな胞状卵胞の数の増加で特徴付けられるが、胞状卵胞卵胞発生を停止する卵巣機能障害に苦しめられている（Ｋａｓｅ，１９６３；Ｆｕｔｔｅｒｗｅｉｔ  Ｗ，１９８６；Ｐａｃｈｅ  ＴＤ，１９９１；Ｓｐｉｎｄｅｒ  Ｔ，１９８９；Ｓｐｉｎｄｅｒ  Ｔ，１９８９；Ｈｕｇｈｅｓｄｏｎ  ＰＥ，１９８２）。この徴候は、ＡＲが初期の卵胞形成において役割を果たし得るが、後期の卵胞形成において阻害効果に転換することを示唆してきた。動物において行われた最近の研究はこの仮説を支持してきた（Ｈａｒｌｏｗ  ＣＲ，１９８８；Ｈｉｌｌｌｉｅｒ  Ｓ，１９８８；Ｗｅｉｌ  Ｓ，１９９８；  Ｖｅｎｄｏｌａ  Ｋ，１９９８；Ｗｅｉｌ  Ｓ，１９９９；Ｖｅｎｄｏｌａ  Ｋ，１９９９）。アカゲザルにおけるジヒドロキシテストステロン（ＤＨＴ）の投与は、一次卵胞、前胞状卵胞、および小さな胞状卵胞の数を増加した。ＤＨＴはテストステロンの代謝物であり、芳香化できないので、この結果は、増殖効果がＡＲ系を通してであったことを示唆した（Ｖｅｎｄｏｌａ  Ｋ，１９９９）。
【００１６】
Ｃ．癌を治療する方法
当該分野において現在使用されているアンドロゲン除去療法は、無差別に間質ＡＲと拮抗して増殖を妨害し、そうすることによって前立腺恒常性における上皮ＡＲの役割を無視しているという概念が、本明細書に開示される。上皮ＡＲは、前立腺腫瘍の上皮増殖ならびに浸潤性および転移の潜在性を抑制するための抑制因子として作用する。アンドロゲン除去療法を通しての上皮ＡＲの損失はＡＲの損失を生じ、従って、浸潤性および転移の潜在性を増強する。加えて、上皮ＡＲの損失は有糸分裂誘発を刺激する。これは、間質組織に対するアンドロゲン除去療法の確立された効果とは対照的である。
【００１７】
それゆえに、標的化されたアンドロゲンまたは抗アンドロゲン療法を通して、選択的に、細胞増殖を阻害し、または癌を治療する方法が本明細書に開示される。開示される方法は、ＡＲによって促進される上皮抑制を促進可能であることが理解され、これは本発明において意図される。従って、例えば、上皮細胞に指向されるＡＲを被験体に投与する工程を包含する、被験体における細胞増殖を阻害する方法が本明細書に開示される。上皮細胞に指向されるアンドロゲンを被験体に投与する工程を包含する、被験体における細胞増殖を阻害する方法もまた開示される。上皮細胞に指向されるアンドロゲンを被験体に投与する工程を包含する、被験体における癌を治療する方法もまた開示される。
【００１８】
細胞増殖に対する上皮ＡＲの抑制効果の阻害を妨害するための１つの方法は、間質細胞に特異的に指向される抗アンドロゲン療法の標的化された適用を通してであることがさらに理解される。従って、間質細胞に指向される抗アンドロゲンまたは抗アンドロゲン受容体を投与する工程を包含する、被験体における癌を治療し、または細胞増殖を阻害する方法が本明細書に開示される。
【００１９】
「阻害する」「阻害すること」および「阻害」は、活性、応答、状態、疾患、または他の生物学的パラメーターを減少させることを意味する。これは、活性、応答、状態、または疾患の完全な除去を含み得るがこれに限定されない。これは、例えば、天然または対照レベルと比較して、活性、応答、状態、または疾患の１０％減少もまた含み得る。従って、減少は、天然または対照レベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはその間の任意の減少量であり得る。
【００２０】
「治療」「治療する」または「治療すること」は、疾患または状態の効果を減少する方法を意味する。治療とは、徴候だけではなく、疾患または状態それ自体を減少する方法をもまたいうことができる。治療は、天然レベルからの任意の減少であり得、疾患、状態、または疾患もしくは状態の徴候の完全な除去であり得るがこれに限定されない。それゆえに、開示される方法において、「治療」は、確立された疾患の重篤度または疾患の進行の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の減少をいうことができる。例えば、前立腺癌の効果を減少させるための開示される方法は、同じ被験体または対照被験体における天然レベルと比較した場合に、疾患を有する被験体において疾患の１つ以上の徴候の１０％減少が存在する場合に、治療であると見なされる。従って、減少は、天然または対照レベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはその間の任意の減少量であり得る。「治療」は必ずしも疾患または状態の治癒をいう必要はないが、疾患または状態の見通しの改善をいうことが理解され、本発明で意図されるべきである。
【００２１】
「減少」は、ＡＲなどの組成物または化合物のより少ない量を生じる任意の量をいうことができる。従って、「減少」は、活性の減少をいうことができる。物質もまた、その物質を伴う遺伝子産物の遺伝的出力が、その物質を伴わない遺伝子産物の出力と比較して少ない場合に、遺伝子の遺伝的出力を減少することが理解される。また、例えば、減少は、徴候が以前に観察されたよりも少なくなるような、障害の徴候の変化であり得る。
【００２２】
「増加」は、対照と比較したＡＲなどの、大量の組成物または化合物を生じる任意の変化をいうことができる。従って、例えば、ＡＲの量の増加は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の増加を含み得るがこれに限定されない。
【００２３】
アンドロゲンまたはアンドロゲン受容体は直接投与することができ、またはベクター中に含有できることが理解され、本発明で意図される。ベクターは上皮細胞に直接的に標的化でき、またはベクター上にコードされるアンドロゲン遺伝子もしくはアンドロゲン受容体遺伝子は、組織特異的プロモーターに作動可能に結合できることもまた理解される。それゆえに、アンドロゲンまたはアンドロゲン受容体を含み、このアンドロゲンまたはアンドロゲン受容体が、プロバシンなどの上皮組織特異的プロモーターに作動可能に結合されているベクターが本明細書に開示される。従って、上皮組織特異的プロモーターが前立腺上皮組織であり得ることが本発明で意図される。ベクターそれ自体が、組織特異的部位に標的化でき、アンドロゲン遺伝子および／またはアンドロゲン受容体遺伝子がその天然プロモーターに作動可能に結合されていることもまた、本発明で意図される。従って、アンドロゲンまたはアンドロゲン受容体を含むベクターを被験体に投与する工程を包含する、被験体における細胞増殖を阻害し、または癌を治療する方法が本明細書に開示される。ベクターが上皮組織に標的化される、アンドロゲンまたはアンドロゲン受容体を含むベクターを被験体に投与する工程を包含する、被験体における細胞増殖を阻害し、または癌を治療する方法もまた開示される。アンドロゲンまたはアンドロゲン受容体が組織特異的プロモーターに作動可能に結合されている、アンドロゲンまたはアンドロゲン受容体を含むベクターを被験体に投与する工程を包含する、被験体における細胞増殖を阻害し、または癌を治療する方法もまた開示される。
【００２４】
上皮細胞におけるＡＲ促進性抑制のアンドロゲン促進が、癌などの調節されない細胞増殖を阻害できることが理解される。間質組織を標的とする抗アンドロゲン療法もまた、癌などの調節されない参謀増殖を阻害することもまた理解される。抗アンドロゲン薬剤が間質細胞におけるアンドロゲンおよびアンドロゲン受容体の相互作用を阻害し、この抗アンドロゲン薬剤が上皮細胞におけるアンドロゲンおよびアンドロゲン受容体の相互作用を阻害しない、抗アンドロゲン薬剤を被験体に投与する工程を包含する、癌を治療する方法が、本明細書に開示される。このような薬剤は、アンドロゲンおよびアンドロゲン受容体の相互作用を阻害する任意の組成物であり得ることが理解される。従って、例えば、この薬剤は、ｓｉＲＮＡ、小分子、抗体、または非機能的アンドロゲン受容体もしくはアンドロゲンを含み得る。従って、例えば、間質組織に標的化される抗アンドロゲンもしくは抗アンドロゲン受容体抗体融合タンパク質、またはベクターを介して間質細胞に送達される抗アンドロゲンもしくは抗アンドロゲン受容体抗体もしくはｓｉＲＮＡである薬剤が本明細書に開示される。従って、抗アンドロゲンもしくは抗アンドロゲン受容体薬剤、ｓｉＲＮＡ、または抗体を含むベクターを被験体に投与する工程を包含する、被験体における細胞増殖を阻害し、または癌を治療する方法が本明細書に開示される。ベクターが間質組織に標的化される、抗アンドロゲンまたはは抗アンドロゲン受容体を含むベクターを被験体に投与する工程を包含する、被験体における細胞増殖を阻害し、または癌を治療する方法もまた開示される。アンドロゲンまたはアンドロゲン受容体が組織特異的プロモーターに作動可能に結合されている、抗アンドロゲンまたはは抗アンドロゲン受容体を含むベクターを被験体に投与する工程を包含する、被験体における細胞増殖を阻害し、または癌を治療する方法もまた開示される。
【００２５】
上皮組織に指向される開示される治療は、間質組織に指向される治療と組み合わせ可能であることが理解され、本発明で意図される。治療は、疾患の進行が指示するのに応じて、同時にまたは連続して投与できることがさらに理解される。当業者は、上皮組織にアンドロゲン療法を投与するか、または間質組織に抗アンドロゲン療法を投与するかを決定できることが理解される。例えば、当業者は、疾患の進行の初期の上皮組織または間質組織のいずれかを標的としない、アンドロゲン療法を投与することができる。
【００２６】
開示される組成物は、癌などの制御できない細胞増殖が起こる任意の疾患を治療するために使用できる。異なる型の癌の非限定的な例は以下である：リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱癌、脳腫瘍、神経系の癌、頭頸部癌、頭頸部の扁平上皮癌、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ  ｃａｎｃｅｒ）、小細胞肺癌および非小細胞肺癌などの肺癌（ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ）、神経芽細胞腫／膠芽細胞腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、肝臓癌、黒色腫、口、喉、咽頭、および肺の扁平上皮癌、結腸癌、子宮頸癌、子宮頸癌腫、乳癌、および上皮癌、腎癌（ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、泌尿生殖器癌、肺癌（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｃａｎｃｅｒ）、食道癌、頭頸部癌腫、大腸癌、造血細胞癌；精巣癌；結腸および直腸癌、前立腺癌、または膵臓癌。開示される治療は、任意の既知の癌を治療するために使用できることもまた理解される。従って、例えば、開示される治療は、前立腺癌を治療するために使用できることが理解される。
【００２７】
本明細書に開示される化合物は、子宮頸部および肛門の異形成、他の異形成、重篤な異形成、過形成、異型過形成、および新生物形成などの治療のためにもまた使用されてもよい。
【００２８】
アンドロゲン、アンドロゲン受容体相互作用、またはアンドロゲン受容体関連タンパク質（ＡＲＡ）を伴うＡＲを調節する組織特異的薬剤が、癌を治療するため、または調節されない細胞増殖を阻害するために使用できることが本発明で意図される。従って、例えば、間質においてＡＲまたはＡＲ−ＡＲＡとのアンドロゲンの相互作用を阻害する薬剤は、癌を治療するために使用できる。また、例えば、上皮においてＡＲまたはＡＲ−ＡＲＡとのアンドロゲンの相互作用を促進する薬剤は、癌を治療するために使用できる。前立腺細胞に薬剤を投与する工程、および細胞上での上皮アンドロゲン受容体のレベルをモニタリングする工程を包含し、対照と比較した上皮アンドロゲン受容体の増加が、前立腺成長を阻害する薬剤であることを示す、前立腺成長を阻害する薬剤をスクリーニングする方法が本明細書に開示される。前立腺細胞に薬剤を投与する工程、および細胞上での上皮アンドロゲン受容体のレベルをモニタリングする工程を包含し、対照と比較した上皮アンドロゲン受容体の増加が、前立腺成長を阻害する薬剤であることを示す、アンドロゲン依存性腫瘍増殖を阻害する薬剤をスクリーニングする方法もまた開示される。このような薬剤は、エキソビボ方法を使用してもまたスクリーニングできることが理解される。従って、例えば、被験体から組織サンプルを入手する工程、組織サンプルに薬剤を投与する工程、および細胞上での上皮アンドロゲン受容体のレベルをモニタリングする工程を包含し、対照と比較した上皮アンドロゲン受容体の増加が、前立腺成長を阻害する薬剤であることを示す、前立腺成長を阻害する薬剤をスクリーニングする方法が開示される。
【００２９】
「組織サンプルを入手する」または「組織サンプルの入手」は、被験体からの組織のサンプルを収集すること、または被験体において組織を測定することを意味する。組織サンプルは、浸潤性技術および非浸潤性技術を含む、当該分野で公知である任意の手段によって入手できることが理解され、本発明で意図される。測定の方法は、直接的または間接的であり得ることもまた理解される。組織サンプルを入手または測定する方法の例には、組織生検、組織洗浄液、吸引、組織スワブ、脊椎穿刺、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）、コンピュータ断層（ＣＴ）スキャン、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）スキャン、およびＸ腺（造影剤を用いるかまたは用いない）が含まれ得るがこれらに限定されない。
【００３０】
Ｄ．組成物
開示される組成物を調製するために使用される成分、ならびに本明細書に開示される方法の中で使用される組成物それ自体が開示される。これらおよびその他の物質は本明細書に開示され、これらの物質の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示される場合、これらの化合物の各々の種々の個別および集合的な組み合わせおよび順列の特定の参照は明確に開示されないかもしれないが、各々が本明細書で具体的に意図されかつ記載されることが理解される。例えば、特定のＡＲが開示および議論され、ならびにＡＲを含む多数の分子に作ることができる多数の改変が議論される場合、反対のことが具体的に示されない限り、ＡＲおよび可能な修飾の各々のおよびすべての組み合わせおよび順列が具体的に意図される。従って、分子Ａ、Ｂ、およびＣのクラスが開示され、ならびに分子Ｄ、Ｅ、およびＦのクラス、ならびに組み合わせ分子の例、Ａ−Ｄが開示されるならば、たとえ個別に引用されないとしても、各々は個別にかつ集合的に組み合わせを意味することが意図され、Ａ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ、およびＣ−Ｆが開示されると意図される。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせもまた開示される。従って、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、およびＣ−Ｅのサブグループは開示されると見なされる。この概念は、開示される組成物を作製および使用する方法における工程を含むがこれらに限定されない、本願のすべての局面に適用される。従って、実施できる種々のさらなる工程が存在する場合、これらのさらなる工程の各々は、開示される方法の任意の特定の実施形態または実施形態の組み合わせを用いて実施できることが理解される。
【００３１】
１．ＡＲ遺伝子座を破壊するための組成物および方法
Ｃｒｅ−ｌｏｘ系は、組織特異的アンドロゲン受容体ノックアウトマウス（ＡＲＫＯ）を生成するために本発明で首尾よく使用された。例えば、本明細書に開示される１匹の組織特異的アンドロゲン受容体ノックアウトマウスは、前立腺上皮ＡＲＫＯマウス（ｐｅｓ−ＡＲＫＯ）である。この原理は、組織特異的導入遺伝子発現のために（Ｏｒｂａｎ  ＰＣ，１９９２）、部位特異的遺伝子標的化のために（Ｇｕ，１９９４）、および「ノックイン」法による遺伝子配列の交換のために（Ｈａｎｋ  Ｍ，１９９５）、首尾よく適用されてきた。本明細書に開示されるように、この系は、アンドロゲン受容体ノックアウトの雄性キャリアの不妊症の問題を回避するため、および前立腺上皮へのノックアウト表現型の発現を制限するために適用されてきた。このストラテジーを使用して、マウス前立腺のトランスジェニック腺癌（ＴＲＡＭＰ）マウスとｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスを交配させることによって前立腺癌の進行のためのノックアウトモデルを生成し、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスを作製した。ＡＲ遺伝子におけるＴ８５７Ａ置換の存在に起因して、ＡＲ機能を回復したｐｅｓ−ＡＲＫＯ誘導マウス（ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−Ｔ８５７Ａ）を生成するための「ノックイン」法の利用が、本明細書に開示される。
【００３２】
ＡＲ遺伝子座が破壊されている細胞株を生成する方法が開示される。例えば、ＡＲ遺伝子座は、例えば、終止コドンがＡＲペプチドの翻訳を初期に終了するように、またはそのエキソンが完全に除去されるように、エキソンの１つを破壊することによって破壊することができる。ＡＲ遺伝子座は、Ｘ染色体上のＡＲ遺伝子と関連する任意のエキソンまたはイントロンを含む。
【００３３】
ＡＲ遺伝子は、ＡＲ遺伝子座と関連する任意の遺伝子座と見なされる。従って、これは、ＡＲを発現する任意の生物の中に含まれる染色体核酸、例えば、イントロン、エキソン、ＡＲコード配列および非コード配列に関与する５’上流配列、ならびにＡＲコード配列および非コード配列に関与する３’下流配列を少なくとも含む。
【００３４】
破壊されたＡＲ遺伝子座は、天然ＡＲタンパク質を産生しない任意のＡＲ遺伝子座であり得る。破壊されたＡＲ遺伝子座は、エキソンおよびイントロンを含む天然のＡＲ遺伝子が変化されている任意のＡＲ遺伝子座もまた含む。典型的には、ＡＲ遺伝子の変化は、例えば、ＡＲ遺伝子産物におけるＤＮＡ結合、またはＡＲ遺伝子産物におけるリガンド結合、またはＡＲ遺伝子産物におけるトランス活性化活性を妨害することによって、ＡＲ機能の破壊を引き起こす。破壊されたＡＲ遺伝子座は、相同組換え技術を含む任意の公知の技術を使用して作製することができる。この破壊されたＡＲ遺伝子座は、機能的でないＡＲタンパク質を産生するための、任意のエキソンの変化であり得る。さらに、周囲のエキソンを介しての相同組換えを通して、ＡＲにおける任意のエキソンを変異させるための構築物および方法が開示される。例えば、エキソン１は、イントロン１およびイントロン２と相同組換えする配列中のｌｏｘ部位の付加を通してフロクス化（ｆｌｏｘ）することができる。同様に、ｌｏｘ部位は、エキソン２についてはイントロン２およびイントロン３と、エキソン３についてはイントロン４と、エキソン４についてはイントロン４およびイントロン５と、エキソン５についてはイントロン５およびイントロン６と、その他、本明細書に開示されると見なされる各エキソンについてのイントロンと相同組換えする配列に挿入できる。
【００３５】
破壊されたＡＲ遺伝子座は、ＡＲ遺伝子座を含む任意の細胞、例えば、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、乳房細胞、乳癌細胞、卵巣細胞、卵巣癌細胞、ならびに発現されるＡＲ遺伝子を含む任意の細胞の細胞株、例えば、前立腺細胞、精巣細胞、骨細胞、脳細胞、神経細胞、および筋肉細胞の中に存在し得る。
【００３６】
ＡＲ遺伝子座が破壊されており、ここで、ａ）この破壊が組織特異的であり、ｂ）ＡＲ遺伝子座と関連する配列が、リコンビナーゼに対して作用できる部位、例えば、ｌｏｘＰ部位によって隣接され、ｃ）これらの部位が、プロバシンプロモーターなどの組織特異的プロモーターの制御下で、ｃｒｅリコンビナーゼなどのリコンビナーゼによって切断できる、動物を生成する方法が開示される。
【００３７】
ｃｒｅリコンビナーゼが、胸部組織のために特異的なプロモーター、例えば、ＷＡＰプロモーター、卵巣組織に特異的なプロモーター、例えば、ＡＣＴＢプロモーター、骨組織に特異的なプロモーターの制御下にある方法もまた開示される。任意の組織特異的なプロモーターが使用できる。前立腺、精巣、および神経に特異的なプロモーターもまた開示される。
【００３８】
機能的アンドロゲン受容体を有さないマウスを生成するための誘導性発現系が開示される。多くの誘導性発現系が当該分野において存在しており、本明細書に記載されるように使用されてもよいことが理解される。誘導性発現系には、Ｃｒｅ−ｌｏｘ系、Ｆｌｐリコンビナーゼ、およびテトラサイクリン応答性プロモーターが含まれ得るがこれらに限定されない。Ｃｒｅリコンビナーゼ系は、使用する場合，ｌｏｘＰ部位において部位特異的組換え事象を実行する。ｌｏｘＰ部位によって隣接され、ｆｌｏｘ化されたＤＮＡのセグメントは、転写物から切除される。Ｃｒｅ−ｌｏｘ系を使用してヌルマウスを作製するために、２つの型のトランスジェニックマウスを作製した。第１のものは、既知の誘導性プロモーターおよび／または組織特異的プロモーターの制御下にあるＣｒｅリコンビナーゼについてトランスジェニックであるマウスである。第２のものは、ｆｌｏｘ化遺伝子を含むマウスである。次いで、これらの２つのトランスジェニックマウス系統は交配されて、療法の変異を含む１つの系統を作製する。組換えの際にヌル変異が作製されるように、ｆｌｏｘ化位置にアンドロゲン受容体（ＡＲ）を配置する構築物およびマウスが開示される。Ｃｒｅリコンビナーゼを介する組換え事象の制御は、Ｃｒｅ発現を制御するために使用されるプロモーターに依存して、構成的または誘導性、ならびに遍在性または組織特異的であり得る。Ｃｒｅリコンビナーゼがβアクチンプロモーターから発現される構成的系が開示される。他の誘導性発現系が存在し、本明細書に開示されるように使用できる。本明細書に開示されるように、非組織特異的プロモーター、βアクチンは、ＦＶＢ／Ｎ−ＴｇＮ（ＡＣＴＢ−Ｃｒｅ）２Ｍｒｔ（ストック番号００３３７６）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）の型で使用される。しかし、ＣＭＶプロモーターおよびアデノウイルスＥＩＩａプロモーターは、例えば、遍在性プロモーターの例でもあり、同じ結果を達成するためにβアクチンを置き換えることができる。誘導性ヌル変異の確立のためにＷＡＰプロモーターを含む構築物およびそれらの使用もまた開示される。ここでは、Ｂ６１２９−ＴｇＮ（ＷＡＰＣｒｅ）１１７３８Ｍａｍ（ストック番号００３５５２）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）マウスが、ＷＡＰの制御下にあるＣｒｅを用いる、組織特異的Ｃｒｅリコンビナーゼ発現を確立するために使用される。他の発現系が、本明細書に開示されるＣｒｅ発現系の代わりに置換されてもよいことが理解される。使用される発現系のバリエーションは、組換え事象の他の構成要素、例えば、プロモーターを変化させる必要性を生じ得ることが予想される。ｃｒｅ−ｌｏｘ誘導性発現系を利用する市販のマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）には、少なくとも以下が含まれる：１２９−ＴｇＮ（ＰＲＭ−Ｃｒｅ）５８０ｇ（ストック番号００３３２８）、１２９．Ｃｇ−Ｆｏｘｇ１ｔｍｌ（Ｃｒｅ）Ｓｋｍ（ストック番号００４３３７）、１２９Ｓ６−Ｔｇ（Ｐｒｎｐ−ＧＦＰ／Ｃｒｅ）１  Ｂｌｗ（ストック番号００３９６０）、Ｂ６．１２９−Ｔｇ（Ｐｃｐ���−Ｃｒｅ）２Ｍｐｉｎ（ストック番号００４１４６）、Ｂ６．１２９Ｓ４−Ｍｅｏｘ２ＣｒｅＳｏｒ（ストック番号００３７５５）、Ｂ６．Ｃｇ（Ｄ２）−ＴｇＮ（ｘｓｔｐｘＬａｃＺ）３２Ａｎｄ（ストック番号００２９８２）、Ｂ６．Ｃｇ（ＳＪＬ）−ＴｇＮ（ＮｅｓＣｒｅ）１Ｋｌｎ（ストック番号００３７７１）、Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｇ（Ｒｂｐ３−Ｃｒｅ）５２８Ｊｘｍ（ストック番号００３９６７）、Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｇ（Ｓｙｎ１−Ｃｒｅ）６７１Ｊｘｍ（ストック番号００３９６６）、Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｇ（Ｔｅｋ−Ｃｒｅ）１２Ｆ１ｖ（ストック番号００４１２８）、Ｂ６．Ｃｇ−ＴｇＮ（ＬｃｋＣｒｅ）５４８Ｊｘｍ（ストック番号００３８０２）、Ｂ６．ＦＶＢ−ＴｇＮ（ＥＩＩａ−Ｃｒｅ）Ｃ５３７９Ｌｍｇｄ（ストック番号００３７２４）、Ｂ６１２９−ＴｇＮ（ＭＭＴＶ−Ｃｒｅ）１Ｍａｍ（ストック番号００３５５１）、Ｂ６１２９−ＴｇＮ（ＭＭＴＶ−Ｃｒｅ）４Ｍａｍ（ストック番号００３５５３）、Ｂ６１２９−ＴｇＮ（ＷＡＰＣｒｅ）１１７３８Ｍａｍ（ストック番号００３５５２）、Ｂ６；Ｄ２−ＴｇＮ（Ｓｙｃｐｌ−Ｃｒｅ）４Ｍｉｎ（ストック番号００３４６６）、Ｂ６；ＦＶＢ−ＴｇＮ（ＧＺＭＢ−Ｃｒｅ）１Ｊｃｂ（ストック番号００３７３４）、Ｂ６；ＳＪＬ−ＴｇＮ（Ｃｏ１２ａ１−Ｃｒｅ）１Ｂｈｒ（ストック番号００３５５４）、ＢＡＬＢ／ｃ−ＴｇＮ（ＣＭＶ−Ｃｒｅ）＃Ｃｇｎ（ストック番号００３４６５）、Ｃ．１２９Ｐ２−Ｃｄ１９ｔｍｌ（Ｃｒｅ）Ｃｇｎ（ストック番号００４１２６）、Ｃ５７ＢＬ／６−ＴｇＮ（ＡｌｂＣｒｅ）２１Ｍｇｎ（ストック番号００３５７４）、Ｃ５７ＢＬ／６−ＴｇＮ（Ｉｎｓ２Ｃｒｅ）２５Ｍｇｎ（ストック番号００３５７３）、Ｃ５７ＢＬ／６−ＴｇＮ（Ｚｐ３−Ｃｒｅ）３Ｍｒｔ（ストック番号００３３９４）、Ｃ５７ＢＬ／６−ＴｇＮ（Ｚｐ３−Ｃｒｅ）９３Ｋｎｗ（ストック番号００３６５１）、Ｃ５７ＢＬ／６−ＴｇＮ（Ｍｘｌ−Ｃｒｅ）１Ｃｇｎ（ストック番号００３５５６）、ＤＢＡ／２、ＴｇＮ（ｘｓｔｐｘＬａｃＺ）３６Ａｎｄ（ストック番号００２９８１）、ＦＶＢ／Ｎ−ＴｇＮ（ＡＣＴＢ−Ｃｒｅ）２Ｍｒｔ（ストック番号００３３７６）、ＦＶＢ／Ｎ−ＴｇＮ（ＥＩＩａ−Ｃｒｅ）Ｃ５３７９Ｌｍｇｄ（ストック番号００３３１４）、ＦＶＢ／Ｎ−ＴｇＮ（Ｚｐ３−Ｃｒｅ）３Ｍｒｔ（ストック番号００３３７７）、ＳＴＯＣＫ  ＭｔｔｐｔｍｌＳｇｙＬｄｌｒｔｍｌＳｇｙＡｐｏｂｔｍｌＳｇｙＴｇ（Ｍｘ−Ｃｒｅ）１Ｃｇｎ（ストック番号００４１９２）、ＳＴＯＣＫ  ＴｇＮ（Ｗｎｔｌ−ＧＡＬ４）１１Ｒｔｈ（ストック番号００３８２９）、ＳＴＯＣＫ  ＴｇＮ（Ｗｎｔ１  −Ｃｒｅ）１１Ｒｔｈ（ストック番号００３８２９）、ＳＴＯＣＫ  ＴｇＮ（ｂａｌａｎｃｅｒ１）２Ｃｇｎ（ストック番号００２８５８）、ＳＴＯＣＫ  ＴｇＮ（ｂａｌａｎｃｅｒ２）１Ｃｇｎ（ストック番号００２８５９）、およびＳＴＯＣＫ  ＴｇＮ（ｈＣＭＶ−Ｃｒｅ）１４０Ｓａｕ（ストック番号００２４７１）。これらのマウスの中で、Ｂ６．Ｃｇ（ＳＪＬ）−ＴｇＮ（ＮｅｓＣｒｅ）１Ｋｌｎ（ストック番号００３７７１）、Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｇ（Ｓｙｎ１−Ｃｒｅ）６７１Ｊｘｍ（ストック番号００３９６６）、お��びＣ５７ＢＬ／６−ＴｇＮ（Ｉｎｓ２Ｃｒｅ）２５Ｍｇｎ（ストック番号００３５７３）が、組織特異的Ｃｒｅプロモーターを有するマウスの例である。Ｂ６．Ｃｇ−ＴｇＮ（ＬｃｋＣｒｅ）５４８Ｊｘｍ（ストック番号００３８０２）マウスは、ＣｒｅをＬｃｋプロモーターの制御下に配置し、組織特異性は有さない。Ｂ６．ＦＶＢ−ＴｇＮ（ＥＩＩａ−Ｃｒｅ）Ｃ５３７９Ｌｍｇｄ（ストック番号００３７２４）およびＢＡＬＢ／ｃ−ＴｇＮ（ＣＭＶ−Ｃｒｅ）＃Ｃｇｎ（ストック番号００３４６５）もまた、非組織特異的プロモーターの制御下にＣｒｅリコンビナーゼを有する。開示されるｆｌｏｘ化ＡＲマウスは、さらなるプロモーターの活性および特異性の利点を利用可能であるＣｒｅマウスのいずれかと交配させてもよおい。Ｆｌｐリコンビナーゼ発現系を利用する市販のマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）は、１２９Ｓ４／ＳｖＪａｅＳｏｒ−Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍｌ（ＦＬＰＩ）Ｄｙｍ（ストック番号００３９４６）およびＢ６；ＳＪＬ−ＴｇＮ（ＡＣＴＦＬＰｅ）９２０５Ｄｙｍ（ストック番号００３８００）である。開示されるＣｒｅマウスと交雑した開示されるｆｌｏｘ化ＡＲマウスの子孫もまた開示される。従って、例えば、ＡＲノックアウトマウス（ＡＲＫＯ）マウス（すなわち、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰ、ｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰ、およびｔｇｎ−ＡＲＫＯ）が本明細書に開示される。
【００３９】
従って、破壊された遺伝子が、組織特異的プロモーターに作動可能に結合されたリコンビナーゼの作用によって産生される、破壊されたＡＲ遺伝子を含むトランスジェニック哺乳動物が本明細書に開示される。組織特異的プロモーターは、前立腺上皮特異的プロモーターであり得ることが理解される。例えば、組織特異的プロモーターが、プロバシン、前立腺プロモーター、分泌タンパク質−９４（ＰＳＰ９４）プロモーター、およびＮｋｘ３．１プロモーターからなる群より選択される上皮前立腺特異的プロモーターである、トランスジェニック哺乳動物が本明細書に開示される。また、例えば、組織特異的プロモーターが、ＡＲＡ５５プロモーター、およびトランスゲリンプロモーター（ＳＭ２２を含む誘導性プロモーターＳＭ２２−ｒｔＴＡおよびＴａｇｌｎ−ｃｒｅ）などの間質前立腺特異的プロモーターである、トランスジェニック哺乳動物が本明細書に開示される。本明細書に開示されるトランスジェニック哺乳動物は、ブタ、ウシ、マウス、霊長類（ヒトおよび非ヒト）、ラット、モルモット、およびウサギであり得ることが理解される。従って、例えば、破壊された遺伝子が組織特異的プロモーターに作動可能に結合されたリコンビナーゼの作用によって産生される、破壊されたＡＲ遺伝子を含むトランスジェニックマウスが本明細書に開示される。組織特異的プロモーターは、上皮特異的プロモーターまたは間質特異的プロモーターであり得ることが理解され、本発明で意図される。または、組織特異的プロモーターが、上皮細胞と間質細胞の間を区別しない前立腺特異的プロモーターであり得ることが理解され、本発明で意図される。
【００４０】
特定のＡＲ遺伝子が本明細書に開示される場合、そのＡＲ遺伝子の各々のおよびすべての種の変種が具体的に開示されることもまた理解される。従って、例えば、破壊された遺伝子が、組織特異的プロモーターに作動可能に結合されたリコンビナーゼの作用によって産生され、ＡＲ遺伝子がマウス遺伝子である、破壊されたＡＲ遺伝子を含むトランスジェニックマウスが本明細書に開示される。開示されたトランスジェニックマウスが所定の遺伝子についてキメラであり得ることもまた本発明で意図される。従って、例えば、開示されるトランスジェニックマウスは、組織特異的プロモーターに作動可能に結合された、破壊されたヒトＡＲ遺伝子を含み得る。
【００４１】
開示されるトランスジェニック哺乳動物は、ＡＲノックアウトに対する機能を回復するために、破壊されたＡＲ遺伝子に「ノックイン」変異もまた含み得る。例えば、マウスＡＲ遺伝子の残基８５７におけるスレオニンからアラニンへの置換は、ヒトＡＲ遺伝子の残基８７７におけるスレオニンからアラニンへの置換と同様に、構成的に活性なＡＲを生じる。得られるトランスジェニックマウスは、アミノ酸置換を生じる点変異に起因して、時間とともにＡＲ発現を喪失しないことが理解される。
【００４２】
上述のように、ＡＲ遺伝子の破壊は、当該分野において公知である多数の方法で生じ得る。例えば、破壊された遺伝子が、ＡＲ遺伝子の中に、ミスセンス変異またはナンセンス変異などの変異を含む、破壊されたＡＲ遺伝子が本明細書に開示される。ＡＲが、遺伝子カセットまたはレポーター遺伝子、例えば、ネオマイシンの挿入を通して破壊されているＡＲ遺伝子もまた本明細書に開示される。従って、ＡＲ遺伝子が遺伝子カセット、ミスセンス変異、またはナンセンス変異を含む、破壊されたＡＲ遺伝子を含むトランスジェニック動物が本明細書に開示される。
【００４３】
開示されるトランスジェニック動物は、ｃｒｅリコンビナーゼの発現に際して、変異または挿入が遺伝子から切除されて、ＡＲの完全な発現を可能にするような、ｌｏｘＰによって隣接される変異または挿入の存在を通してＡＲ遺伝子発現を破壊した。組織特異的プロモーターにｃｒｅリコンビナーゼを作動可能に結合することによって、ノックアウト表現型は特定の組織に限定されたことが理解される。例えば、ｃｒｅリコンビナーゼを含む開示されるトランスジェニック動物は、プロバシンプロモーターの制御下においてのみ、前立腺上皮におけるＡＲの発現を喪失する。ｃｒｅリコンビナーゼはｌｏｘＰ部位においてＡＲ遺伝子の破壊された領域を切除するので、プロモーター制御の構築された発現として、ｃｒｅ発現は機能的ＡＲ遺伝子の発現を生じることもまた理解される。プロモーター発現の喪失はｌｏｘＰ部位を無傷ままにし、従って、Ａｒ機能は失われる。従って、例えば、プロバシン発現が失われるとき、ＡＲ発現は減少する。
【００４４】
両方の親の特徴を有する新たなトランスジェニック動物を樹立するために、開示されるトランスジェニック動物が他のトランスフェクション動物と交配可能であることが理解される。例えば、ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスのＴＲＡＭＰマウスとの交配から生じるトランスジェニック動物が本明細書に開示され、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスを生じる。このようなトランスジェニックマウスは、癌の進行の研究のためのモデルとして使用できる。
【００４５】
破壊されたＡＲ遺伝子を有し、この破壊された遺伝子が、組織特異的プロモーターに作動可能に結合されたリコンビナーゼの作用によって産生される、細胞が本明細書に開示される。この細胞は、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、乳房細胞、乳癌細胞、卵巣細胞、卵巣癌細胞、前立腺細胞、精巣細胞、骨細胞、脳細胞、神経細胞、または筋肉細胞ことが理解され、本発明で意図される。この細胞は、癌から誘導することができ、例えば。被験体または前立腺癌細胞株から得られた前立腺癌細胞であり得ることもまた理解される。
【００４６】
本明細書に開示される細胞は、ｃｒｅ−ｌｏｘ系などの誘導性発現系を含み得る。本明細書に開示される細胞は組織特異的であり得ることもまた理解される。ＡＲの組織特異的発現を達成するための公知の１つの方法は、ＡＲ遺伝子の中にミスセンスもしくはナンセンス変異を作製すること、または遺伝子カセットの挿入を通して遺伝子を破壊することによって、ＡＲ遺伝子を破壊することである。ｌｏｘＰ部位と、ＡＲ遺伝子中の挿入または変異を隣接させること、および組織特異的プロモーターの制御下にｃｒｅリコンビナーゼを配置することによって、ｃｒｅリコンビナーゼ発現を促進し、かつＡＲ遺伝子中の破壊をｌｏｘＰ部位において除去する、組織特異的プロモーターが発現されたときにのみ、得られる細胞はＡＲを発現する。組織特異的プロモーターは、プロバシンプロモーター、前立腺分泌タンパク質−９４（ＰＳＰ９４）プロモーター、およびＮｋｘ３．１プロモーターからなる群より選択される前立腺上皮プロモーターであり得ることが理解される。従って、例えば、ＡＲ遺伝子に挿入され、かつｌｏｘＰ部位に隣接する遺伝子カセットの存在によってＡＲ遺伝子が破壊される、破壊されたＡＲ遺伝子を含む細胞が本明細書に開示され、ここで、この細胞は、プロバシンプロモーターに作動可能に結合されたｃｒｅリコンビナーゼをさらに含む。
【００４７】
ノックアウト導入遺伝子を含む、細胞に対する機能を回復する点変異を含む細胞もまた本明細書に開示される。「ノックイン」は、例えば、スレオニンからアラニンへの置換であり得る。従って、ｃｒｅ−ｌｏｘ系の制御下で破壊されたＡＲ遺伝子を含み、マウスＡＲ遺伝子のＴ８５７Ａ置換をさらに含む細胞が本明細書に開示される。ｃｒｅ−ｌｏｘ系の制御下で破壊されたＡＲ遺伝子を含み、ヒトＡＲ遺伝子のＴ８７７Ａ置換をさらに含む細胞もまた開示される。本明細書に開示される細胞のＡＲ遺伝子は任意の哺乳動物供給源からであり得ることが理解され、本発明で意図される。従って、例えば、破壊されたＡＲ遺伝子を含み、このＡＲ遺伝子がマウスＡＲ遺伝子である、破壊されたヒトＡＲ遺伝子もまた開示される。
【００４８】
本明細書に開示されるベクターおよび／または細胞を含む哺乳動物が開示される。例えば、破壊されたＡＲ遺伝子を有する細胞を含む哺乳動物が本明細書に開示され、この破壊された遺伝子は、組織特異的プロモーターに作動可能に結合されたリコンビナーゼの作用によって産生される。開示される哺乳動物は他の遺伝子についてトランスジェニックであり得ることが理解される。従って、例えば、マウス前立腺の腺癌の導入遺伝子（ＴＲＡＭＰ）をさらに含む哺乳動物が開示される。従って、例えば、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスおよびｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスが本明細書に開示される。
【００４９】
ウシ、ヒツジ、ブタ、霊長類（ヒトおよび非ヒト）、マウス（ネズミ）、ラット、ハムスター、またはウサギである哺乳動物が開示される。
【００５０】
アンドロゲン受容体（ＡＲ）陰性前立腺転移細胞であり、ＡＲプロモーターの制御下でＡＲ遺伝子で安定にトランスフェクトされている細胞もまた本明細書に開示される。例えば、ＡＲプロモーターの制御下でＡＲ遺伝子で安定にトランスフェクトされているＰＣ−３細胞（すなわち、ＰＣ−３（ＡＲ）９細胞）が本明細書に開示される。
【００５１】
ＡＲ陽性前立腺転移細胞であり、「ノックダウン」された発現を有する細胞もまた本明細書に開示される。例えば、ＡＲ  ｓｉＲＮＡで安定にトランスフェクトされている細胞が本明細書に開示される。例えば、ＡＲ  ｓｉＲＮＡで安定にトランスフェクトされているＷＰＭＹ１細胞（すなわち、ＷＰＭＹ１−ＡＲｓｉ細胞）が本明細書に開示される。ＡＲ「ノックダウン」を作製するための代替方法が遺伝子組換えを通してであることが理解される。従って、ノックダウンされたＡＲ発現を有する細胞が本明細書に開示される。例えば、組換え的にノックダウンされたＡＲを有するＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／＋細胞（すなわち、ＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／−細胞）が本明細書に開示される。
【００５２】
２．相同性／同一性
本明細書で議論されるように、相同性および同一性という用語は、類似性と同じことを意味することが理解される。従って、例えば、相同性という言葉の使用が、２つの非天然配列の間で使用される場合、これは、これらの２つの配列間の進化的な関連性を必ずしも意味するのではなく、むしろ、それらの核酸配列間の類似性または関連性を見ていることが理解される。２つの進化的に関連する分子間で相同性を決定するための方法は、それらが進化的に関連するか否かに関わりなく、配列の類似性を測定する目的のために、任意の２つ以上の核酸またはタンパク質に日常的に適用される。
【００５３】
本明細書に開示される遺伝子およびタンパク質の、任意の既知の改変体もしくは誘導体または生じる可能性があるこれらを規定するための１つの方法は、特定の既知の配列に対する相同性によって、改変体または誘導体を規定することを通してであることが理解される。例えば、配列番号９はＡＲ遺伝子の特定の配列を示し、配列番号８は、配列番号９によってコードされるタンパク質、ＡＲタンパク質の特定の配列を示す。言及される配列に対して、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有する、本明細書に開示されるこれらの改変体および他の遺伝子ならびにタンパク質が具体的に開示される。当業者は、２つのタンパク質または核酸、例えば、遺伝子の相同性をいかにして決定するかを容易に理解する。例えば、相同性は、相同性がその最高レベルにあるように、２つの配列を整列させた後で計算することができる。
【００５４】
相同性を計算する別の方法は、公開されたアルゴリズムによって実施することができる。比較のための配列の最適なアラインメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行によって（ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または目視によって実施されてもよい。
【００５５】
同じ型の相同性は、例えば、少なくとも核酸アラインメントに関連する材料のために、参照により本明細書に組み込まれる、Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：４８−５２，１９８９，Ｊａｅｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：７７０６−７７１０，１９８９、Ｊａｅｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６，１９８９に開示されるアルゴリズムによって、核酸のために得ることができる。
【００５６】
３．ハイブリダイゼーション／選択的ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションという用語は、典型的には、プライマーまたはプローブおよび遺伝子などの、少なくとも２つの核酸分子間の、配列によって促進される相互作用を意味する。配列によって促進される相互作用とは、２つのヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体またはヌクレオチド誘導体の間で、ヌクレオチド特異的な様式で起こる相互作用を意味する。例えば、ＧとＣの相互作用、またはＡとＴの相互作用は、配列によって促進される相互作用である。典型的には、配列によって促進される相互作用は、ヌクレオチドのＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ面またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ面の上で起こる。２つの核酸のハイブリダイゼーションは、当業者に公知である多くの条件およびパラメーターによって影響を受ける。例えば、塩濃度、ｐＨ、および反応温度はすべて、核酸分子がハイブリダイズするか否かに影響を与える。
【００５７】
２つの核酸分子間の選択的ハイブリダイゼーションのためのパラメーターは、当業者には周知である。例えば、ある実施形態において、選択的ハイブリダイゼーション条件は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件として定義することができる。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション工程および洗浄工程のいずれかまたは両方の、温度と塩濃度の両方によって制御される。例えば、選択的ハイブリダイゼーションを達成するためのハイブリダイゼーションの条件は、Ｔｍ（分子の半分がそれらのハイブリダイゼーションパートナーから解離する融解温度）よりも約１２〜２５℃下である温度における、高イオン強度溶液（６×ＳＳＣまたは６×ＳＳＰＥ）中でのハイブリダイゼーション、続いて、洗浄温度がＴｍよりも約５℃〜２０℃であるように選択した、温度および塩濃度の組み合わせで洗浄することを含み得る。温度および塩濃度は、予備実験において容易に経験的に決定され、ここでは、フィルター上に固定された参照ＤＮＡのサンプルは、標識された目的の核酸にハイブリダイズされ、次いで、異なるストリンジェンシーの条件下で洗浄される。ハイブリダイゼーション温度は、典型的には、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡのハイブリダイゼーションのためには、より高い。これらの条件は、ストリンジェンシーを達成するために上記に記載されたように、または当該分野において公知であるように、使用することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｋｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７：１５４：３６７，１９８７、これらは、核酸のハイブリダイゼーションに少なくとも関連する材料のために、参照により本明細書に組み込まれる）。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションのための好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳＣまたは６×ＳＳＰＥ中、約６８℃（水溶液中）においてであり得、続いて、６８℃で洗浄を行い得る。ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは、所望される場合、所望される相補性の程度が減少するにつれて、およびさらに、変動性が検索される任意の領域のＧ−ＣまたはＡ−Ｔの豊富さに依存して、減少させることができる。同様に、すべて当該分野において公知であるように、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは、所望される場合、所望される相補性の程度が増加するにつれて、およびさらに、高い相同性が所望される任意の領域のＧ−ＣまたはＡ−Ｔの豊富さに依存して、増加させることができる。
【００５８】
選択的ハイブリダイゼーションを規定するための別の方法は、他の核酸に結合する１つの核酸の量（パーセンテージ）を検討することによる。例えば、ある実施形態において、選択的ハイブリダイゼーション条件は、少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％の限定的な核酸が非限定的な核酸に結合する場合である。典型的には、非限定的なプライマーは、例えば、１０倍過剰、または１００倍過剰、または１０００倍過剰である。この型のアッセイは、限定的なプライマーと非限定的なプライマーの両方が、例えば、それらのｋｄの１０倍もしくは１００倍もしくは１０００倍下であるか、または核酸分子の一方のみが１０倍もしくは１００倍もしくは１０００倍下であるか、または核酸分子の一方もしくは両方がそれらのｋｄよりも上である条件下で実施することができる。
【００５９】
選択的ハイブリダイゼーションを規定するための別の方法は、所望される酵素的操作を促進するためにハイブリダイゼーションが必要とされる条件下で、酵素的操作を得るプライマーのパーセンテージを検討することによる。例えば、ある実施形態において、選択的ハイブリダイゼーション条件は、少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％のプライマーが、酵素的操作を促進する条件下で酵素的に操作される場合であり、例えば、酵素的操作がＤＮＡ伸長であるならば、選択的ハイブリダイゼーション条件は、少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％のプライマーが伸長される場合である。好ましい条件は、操作を実施する酵素のために好適であるように、製造業者によって示唆されるか、または当該分野において示されるものもまた含む。
【００６０】
相同性と同様に、２つの核酸分子間のハイブリダイゼーションのレベルを決定するために、本明細書に開示される種々の方法が存在することが理解される。これらの方法および条件は、２つの核酸分子間のハイブリダイゼーションの異なるパーセンテージを提供し得るが、他に示さない限り、任意の方法のパラメーターを満たすことが十分であることが理解される。例えば、８０％ハイブリダイゼーションが必要とされる場合、これらの方法のいずれか１つの中で必要とされるパラメーターの中でハイブリダイゼーションが起こる限り、これは本明細書に開示されると見なされる。
【００６１】
当業者は、組成物または方法が、集合的または単独でのいずれかでハイブリダイゼーションを決定するためのこれらの判断基準の任意の１つに合致する場合、これは本明細書に開示される組成物または方法であることを理解することが理解される。
【００６２】
４．核酸
例えば、ＡＲをコードする核酸、ＡＲノックアウトを作製するための本明細書に開示される任意の核酸、またはそのフラグメント、ならびに種々の機能的な核酸を例えば含む、核酸ベースである、本明細書に開示される種々の分子が存在する。開示される核酸は、例えば、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、またはヌクレオチド代替物から作られる。これらおよび他の分子の非限定的な例は本明細書に開示される。例えば、ベクターが細胞の中で発現される場合、発現されるｍＲＮＡは、典型的には、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびうから作られることが理解される。同様に、例えば、アンチセンス分子が、例えば、外因性送達を通して、細胞または細胞環境に導入される場合、アンチセンス分子が、細胞間胸中でアンチセンス分子の分解を減少させるヌクレオチド類似体から作られることは有利であることが理解される。
【００６３】
ａ）ヌクレオチドおよび関連分子
ヌクレオチドは、塩基部分、糖部分、およびリン酸部分を含む分子である。ヌクレオチドは、それらのリン酸部分および糖部分を通して一緒に結合でき、ヌクレオシド間の結合を形成している。ヌクレオチドの塩基部分は、アデニン−９−イル（Ａ）、シトシン−１−イル（Ｃ）、グアニン−９−イル（Ｇ）、ウラシル−１−イル（Ｕ）、およびチミン−１−イル（Ｔ）であり得る。ヌクレオチドの糖部分は、リボースまたはデオキシリボースである。ヌクレオチドのリン酸部分は、５価リン酸である。ヌクレオチドの非限定的な例は、３’−ＡＭＰ（３’−アデノシン一リン酸）または５’−ＧＭＰ（５’−グアノシン１リン酸）である。当該分野において利用可能であり、本明細書で利用可能であるこれらの型の分子の多くの変種が存在する。
【００６４】
ヌクレオチド類似体は、塩基部分、糖部分、またはリン酸部分のいずれかにある型の修飾を含むヌクレオチドである。ヌクレオチドへの修飾は当該分野において周知であり、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、および２−アミノアデニン、ならびに糖部分またはリン酸部分における修飾が含まれる。当該分野において利用可能であり、本明細書で利用可能であるこれらの型の分子の多くの変種が存在する。
【００６５】
ヌクレオチド代替物は、ヌクレオチドと類似の機能的特性を有するが、リン酸部分を含まない分子、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ヌクレオチド代替物は、Ｗａｔｓｏｎ−  ＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ様式で核酸を認識するが、リン酸部分以外の部分を通して一緒に結合されている分子である。ヌクレオチド代替物は、好適な標的核酸と相互作用する場合に、二重らせん型構造をとることができる。当該分野において利用可能であり、本明細書で利用可能であるこれらの型の分子の多くの変種が存在する。
【００６６】
例えば、細胞の取り込みを増強するために、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体に他の型の分子を結合する（結合体化する）こともまた可能である。結合体は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体に化学的に結合できる。このような結合体は、コレステロール部分などの脂質部分を含むがこれらに限定されない（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３−６５５６）。当該分野において利用可能であり、本明細書で利用可能であるこれらの型の分子の多くの変種が存在する。
【００６７】
Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ相互作用は、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、またはヌクレオチド代替物のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ面との少なくとも１つの相互作用である。ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、またはヌクレオチド代替物のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ面には、プリンベースのヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、またはヌクレオチド代替物のＣ２位、Ｎ１位、およびＣ６位、ならびにピリミジンベースのヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、またはヌクレオチド代替物のＣ２位、Ｎ３位、およびＣ４位が含まれる。
【００６８】
Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ相互作用は、二重鎖ＤＮＡの大きな溝に露出しているヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体のＨｏｏｇｓｔｅｅｎ面上で起こる相互作用である。Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ面には、プリンヌクレオチドのＮ７位およびＣ６位における反応基（ＮＨ２またはＣ）が含まれる。
【００６９】
ｂ）配列
本明細書に開示されるシグナル伝達経路に含まれるタンパク質分子に関連する種々の配列が存在し、そのすべてが、核酸によってコードされるか、または核酸である。これらの遺伝子のヒト類似体および他の類似体、ならびにこれらの遺伝子の対立遺伝子、ならびにスプライシング改変体および他の型の改変体の配列は、Ｇｅｎｂａｎｋを含む種々のタンパク質および遺伝子データベースにおいて利用可能である。本願の出願時にＧｅｎｂａｎｋにおいて利用可能であった配列は、それらの全体ならびにそこに含まれる個々のサブ配列が、参照により本明細書に組み込まれる。Ｇｅｎｂａｎｋはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉにおいてアクセス可能である。当業者は、配列の相違および違いをいかにして解明するか、ならびに特定の配列に関連する組成物および方法をいかにして他の関連する配列に適合させるかを理解している。プライマーおよび／またはプローブは、本明細書に開示される情報および当該分野において公知である情報が与えられると、任意の所定の配列のために設計することができる。
【００７０】
ｃ）プライマーおよびプローブ
本明細書に開示されるように、ＡＲ、プロバシン，Ｎｋｘ３．１、および前立腺分泌タンパク質−９４（ＰＳＰ９４）などの開示される核酸と相互作用可能であるプライマーおよびプローブを含む組成物が開示される。特定の実施形態において、プライマーは，］ＤＮＡ増幅反応を補助するために使用される。典型的には、プライマーは、配列特異的な様式で伸長可能である。配列特異的な様式でのプライマーの伸長は、プライマーがハイブリダイズしまたはさもなくば結合する核酸分子の配列および／または組成が、プライマーの伸長によって産生される産物の組成または配列を指向しまたはそれに影響を与える、任意の方法を含む。それゆえに、配列特異的な様式でのプライマーの伸長には、ＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡ伸長、ＤＮＡ重合，ＲＮＡ転写、または逆転写が含まれるがこれらに限定されない。配列特異的な様式でプライマーを増幅する技術および条件が好ましい。特定の実施形態において、プライマーは、ＰＣＲまたは直接的配列決定などのＤＮＡ増幅反応のために使用される。特定の実施形態において、プライマーはまた、例えば、プライマーを伸長するために使用されるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが、これらが化学反応を行って配列特異的な様式でプライマーを伸長するように修飾される、非酵素的技術を使用して伸長できることが理解される。典型的には、開示されるプライマーは、開示される核酸または核酸の領域とハイブリダイズし、またはこれらのプライマーは、核酸の相補物または核酸領域の相補物とハイブリダイズする。
【００７１】
核酸との相互作用のためのプライマーまたはプローブのサイズは、特定の実施形態において、プローブまたはプライマーのＤＮＡ増幅または単純なハイブリダイゼーションなどの、プライマーの所望される酵素的操作を補助する任意のサイズであり得る。典型的なプライマーまたはプローブは、少なくとも、
【００７２】
【化７】
2009537142.tif 000009
ヌクレオチド長である。
【００７３】
他の実施形態において、プライマーまたはプローブは、
【００７４】
【化８】
2009537142.tif 000010
ヌクレオチド長以下であり得る。
【００７５】
ＡＲ遺伝子のためのプライマーは、典型的には、ＡＲ遺伝子の領域または完全な遺伝子を含む増幅したＤＮＡ産物を産生するために使用される。一般的に、典型的には、産物のサイズは、そのサイズが３ヌクレオチドまたは２ヌクレオチドまたは１ヌクレオチド以内で正確に決定できるようなものである。
【００７６】
特定の実施形態において、産物は、少なくとも
【００７７】
【化９】
2009537142.tif 000011
ヌクレオチド長である。
【００７８】
他の実施形態において、産物は、
【００７９】
【化１０】
2009537142.tif 000012
ヌクレオチド長以下である。
【００８０】
三重鎖を形成する機能的核酸分子は、二本鎖核酸または一本鎖核酸のいずれかと相互作用し得る分子である。三重鎖分子が標的領域と相互作用する場合、三重鎖と呼ばれる構造が形成され、ここでは、Ｗａｔｓｏｎ−ＣｒｉｃｋおよびＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成に依存して複合体を形成する３本鎖のＤＮＡが存在する。三重鎖分子は好ましい。なぜなら、これらは、高い親和性および特異性で標的領域に結合し得るからである。三重鎖形成分子は、１０−６、１０−８、１０−１０、または１０−１２未満のｋｄで標的分子に結合することが好ましい。種々の異なる標的分子に結合するための三重鎖形成分子をいかにして作製および使用するかの代表的な例は、以下の非限定的な米国特許のリストにおいて見出される：５，１７６，９９６号、５，６４５，９８５号、５，６５０，３１６号、５，６８３，８７４号、５，６９３，７７３号、５，８３４，１８５号、５，８６９，２４６号、５，８７４，５６６号、および５，９６２，４２６号。
【００８１】
外部ガイド配列（ＥＨＳ）は、標的核酸分子に結合して複合体を形成する分子であり、この複合体は、ＲＮａｓｅＰによって認識され、これは標的分子を切断する。ＥＧＳは、選択したＲＮＡ分子を特異的に標的とするように設計できる。ＲＮａｓｅＰは、細胞中で転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）をプロセシングする際に補助を行う。細菌ＲＮａｓｅＰは、標的ＲＮＡ：ＥＧＳ複合体を天然のｔＲＮＡ基質に模倣させるＥＧＳを使用することによって、実質的に任意のＲＮＡ配列を切断するために採用することができる（ＹａｌｅによるＷＯ  ９２／０３５６６、ならびにＦｏｒｓｔｅｒおよびＡｌｔｍａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：４０７−４０９（１９９０））。
【００８２】
同様に、ＲＮＡの真核生物ＥＧＳ／ＲＮＡｓｅ  Ｐ−指向性切断は、真核生物細胞中で所望の標的を切断するために利用することができる（Ｙｕａｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：８００６−８０１０（１９９２）；ＹａｌｅによるＷＯ  ９３／２２４３４；ＹａｌｅによるＷＯ  ９５／２４４８９；ＹｕａｎおよびＡｌｔｍａｎ、ＥＭＢＯＪ  １４：１５９−１６８（１９９５）、ならびにＣａｒｒａｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９２：２６２７−２６３１（１９９５））。種々の異なる標的分子の切断を容易にするためにＥＧＳ分子をいかにして作製および使用するかの代表的な例は、以下の非限定的な米国特許のリストにおいて見出される：５，１６８，０５３号、５，６２４，８２４号、５，６８３，８７３号、５，７２８，５２１号、５，８６９，２４８号、および５，８７７，１６２号。
【００８３】
細胞への組成物の送達
インビトロまたはインビボのいずれかで、核酸を細胞に送達するために使用できる多数の組成物および方法が存在している。これらの方法および組成物は、大部分が２つのクラスに分けることができる：ウイルスベースの送達系および非ウイルスベースの送達系である。例えば、核酸は、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミドなどの多数の直接的な送達系を通して、または細胞中の遺伝物質もしくはカチオン性リポソームなどのキャリアの移動を経由して送達することができる。ウイルスベクター、化学的トランスフェクト体、または物理的−機械的方法、例えば、エレクトロポレーションおよびＤＮＡの直接拡散を含む、トランスフェクションのための好適な手段は、例えば、Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５−１４６８（１９９０）；およびＷｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ，３５２，８１５−８１８（１９９１）に記載されている。このような方法は当該分野で周知であり、本明細書に記載される組成物および方法を用いる使用のために容易に適合可能である。特定の場合において、これらの方法は、大きなＤＮＡ分子とともに特異的に機能するように修飾される。さらに、これらの方法は、キャリアの標的化特徴を使用することによって、特定の疾患および細胞集団を標的化するために使用できる。
【００８４】
ａ）核酸ベースの送達系
移入ベクターは、遺伝子を細胞に送達するために使用される任意のヌクレオチド構築物であり得（例えば、プラスミド）、または遺伝子を送達するための一般的ストラテジーの一部として、例えば、組換えレトロウイルスまたはアデノウイルスの一部としてであり得る（Ｒａｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：８３−８８（１９９３））。
【００８５】
本明細書で使用されるとき、プラスミドまたはウイルスベクターは、開示される核酸、例えば、ＡＲを、分解を伴うことなく細胞に輸送する薬剤であり、それが送達される細胞中で遺伝子の発現を生じるプロモーターを含む。ウイルスベクターは、例えば、以下である：アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ＡＩＤＳウイルス、神経栄養ウイルス、シンドビスおよび他のＲＮＡウイルス、これは、ＨＩＶ骨格を有するこれらのウイルスを含む。ベクターとしての使用のために好適にする、これらのウイルスの特性を共有する任意のウイルスファミリーもまた好ましい。レトロウイルスには、マウスモロニー白血病ウイルス、ＭＭＬＶ、およびベクターとしてのＭＭＬＶの所望の特性を発現するレトロウイルスが含まれる。レトロウイルスベクターは、他のウイルスベクターよりも、より長い遺伝子ペイロード、すなわち、導入遺伝子またはマーカー遺伝子を運ぶことができ、この理由のために、一般的に使用されているベクターである。しかし、これらは、増殖していない細胞においては有用ではない。アデノウイルスベクターは作用させることが比較的安定かつ容易であり、高い力価を有し、エアロゾル製剤で送達することができ、分裂していない細胞にトランスフェクトすることができる。ポックスウイルスベクターは、大きくかつ遺伝子を挿入するために数個の部位を有し、これらは熱安定性であり、室温で保存することができる。好ましい実施形態は、ウイルス抗原によって誘発される、宿主生物の免疫応答を抑制するために操作されたウイルスベクターである。この型の好ましいベクターは、インターロイキン８または１０のためのコード領域を有する。
【００８６】
ウイルスベクターは、細胞に遺伝子を導入するために、化学的または物理的方法よりも、より高度なトランスアクションを有し得る。典型的には、ウイルスベクターは、非構造的初期遺伝子、構造的後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写物、複製およびキャプシド形成のために必要である逆方向末端反復、ならびにウイルスゲノムの転写および複製を制御するためのプロモーターを含む。ベクターとして操作される場合、ウイルスは、典型的には、初期遺伝子の１つ以上が除去され、遺伝子または遺伝子／プロモーターカセットが、除去されたウイルスＤＮＡの代わりにウイルスゲノムに挿入される。この型の構築物は、約８ｋｂまでの外来性遺伝子物質を有し得る。除去された初期遺伝子の必要な機能は、典型的には、初期遺伝子の遺伝子産物をトランスで発現するように操作された細胞株によって供給される。
【００８７】
（１）レトロウイルスベクター
レトロウイルスは、任意の型、サブファミリー、属、または向性を含むレトロウイルス科のウイルスファミリーに属する動物ウイルスである。レトロウイルスベクターは、一般的には、Ｖｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ−１９８５所収，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．２２９−２３２，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ（１９８５）によって記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。遺伝子治療のためにレトロウイルスベクターを使用するための方法の例は、米国特許第号４，８６８，１１６号および同第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願ＷＯ  ９０／０２８０６およびＷＯ  ８９／０７１３６；ならびにＭｕｌｌｉｇａｎ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３））に記載されており、これらの教示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８８】
レトロウイルスは、本質的に、核酸カーゴを充填したパッケージである。この核酸カーゴは、それとともにパッケージングシグナルを有し、これは、複製された娘分子がパッケージコートの中に効率的にパッケージされることを保証する。パッケージシグナルに加えて、複製、および複製されたウイルスのパッケージングのためにシスで必要とされる多数の分子が存在する。典型的には、レトロウイルスゲノムは、タンパク質コートの作製に関与する遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖを含み、これらは、典型的には、標的細胞に移入される外来性ＤＮＡによって置換される。レトロウイルスベクターは、典型的には、パッケージコートへの取り込みのためのパッケージングシグナル、ｇａｇ転写単位の開始をシグナル伝達する配列、逆転写のために必要なエレメントが含まれ、これらには、逆転写のｔＲＮＡプライマーを結合するためのプライマー結合部位、ＤＮＡ合成の間にＲＮＡ鎖のスイッチを導く末端反復配列、ＤＮＡ合成の第２鎖の合成のためのプライミング部位として働くプリンリッチ配列５’→３’ＬＴＲ、およびＤＮＡ状態のレトロウイルスの挿入物を宿主ゲノムに挿入可能にする、ＬＴＲの末端の近傍の特異的配列が含まれる。遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖの除去は、ウイルスゲノムに約８ｋｂの外来性配列が挿入されること、逆転写されること、および複製の際に新たなレトロウイルス粒子にパッケージされることを可能にする。この核酸の量は、各転写物のサイズに依存して、１個から多数の遺伝子までの送達のために十分である。挿入物中の他の遺伝子とともに、ポジティブまたはネガティブのいずれかの選択マーカーを含めることが好ましい。
【００８９】
多くのレトロウイルスベクター中の複製機構およびパッケージングシグナルは除去されているので（ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ）、ベクターは、典型的には、それらをパッケージング細胞株に配置することによって生成される。パッケージング細胞株は、複製およびパッケージング機構を含むが、パッケージングシグナルを欠くレトロウイルスでトランスフェクトまたは形質転換された細胞株である。選択したＤＮＡを有するベクターがこれらの細胞株にトランスフェクトされるとき、目的の遺伝子を含むベクターは、ヘルパー細胞によってシスで提供される機構によって、複製され、新たなレトロウイルス粒子にパッケージングされる。これらの機構のについてのゲノムはパッケージングされない。なぜなら、これらは必要なシグナルを欠いているからである。
【００９０】
（２）アデノウイルスベクター
複製欠損アデノウイルスの構築は記載されてきた（Ｂｅｒｋｎｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６１：１２１３−１２２０（１９８７）；Ｍａｓｓｉｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８７２−２８８３（１９８６）；Ｈａｊ−Ａｈｍａｄら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５７：２６７−２７４（１９８６）；Ｄａｖｉｄｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６１：１２２６−１２３９（１９８７）；Ｚｈａｎｇ「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｂｙ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＰＣＲ  ａｎａｌｙｓｉｓ」ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １５：８６８−８７２（１９９３））。ベクターとしてのこれらのウイルスの使用の利点は、これらが、最初に感染した細胞中で複製できるが、新たな感染性ウイルス粒子を形成することができないので、これらが他の細胞株に伝播できる程度に限定されているという点である。組換えアデノウイルスは、気道上皮、肝細胞、血管内皮、ＣＮＳ柔組織、および多数の他の組織部位への直接的なインビボ送達後に、高度に効率的な遺伝子移入を達成することが示されてきた（Ｍｏｒｓｙ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１５８０−１５８６（１９９３）；Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：３８１−３８７（１９９３）；Ｒｏｅｓｓｌｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１０８５−１０９２（１９９３）；Ｍｏｕｌｌｉｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４：１５４−１５９（１９９３）；Ｌａ  Ｓａｌｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：９８８−９９０（１９９３）；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２５１２９−２５１３４（１９９２）；Ｒｉｃｈ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：４６１−４７６（１９９３）；Ｚａｂｎｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：７５−８３（１９９４）；Ｇｕｚｍａｎ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７３：１２０１−１２０７（１９９３）；Ｂｏｕｔ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：３−１０（１９９４）；Ｚａｂｎｅｒ，Ｃｅｌｌ  ７５：２０７−２１６（１９９３）；Ｃａｉｌｌａｕｄ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ５：１２８７−１２９１（１９９３）；およびＲａｇｏｔ，Ｊ．Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４：５０１−５０７（１９９３））。組換えアデノウイルスは、特異的細胞表面受容体への結合によって、遺伝子形質導入を達成し、その後、ウイルスは、野生型または複製欠損アデノウイルスと同じ様式で、受容体媒介エンドサイトーシスによって内部移行する（ＣｈａｒｄｏｎｎｅｔおよびＤａｌｅｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４０：４６２−４７７（１９７０）；ＢｒｏｗｎおよびＢｕｒｌｉｎｇｈａｍ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２：３８６−３９６（１９７３）；ＳｖｅｎｓｓｏｎおよびＰｅｒｓｓｏｎ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５５：４４２−４４９（１９８５）；Ｓｅｔｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６５０−６５５（１９８４）；Ｓｅｔｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１５２８−１５３３（１９８４）；  Ｖａｒｇａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６５：６��６１−６０７０（１９９１）；Ｗｉｃｋｈａｍら、Ｃｅｌｌ  ７３：３０９−３１９（１９９３））。
【００９１】
ウイルスベクターは、Ｅ１遺伝子が除去されているアデノウイルスに基づくものであり得、これらのビリオンはヒト２９３細胞株などの細胞株中で生成される。別の好ましい実施形態において、Ｅ１とＥ３の両方の遺伝子はアデノウイルスゲノムから除去されている。
【００９２】
（３）アデノ関連ウイルスベクター
別の型のウイルスベクターは、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）に基づく。この欠損パルボウイルスベクターは、これが多くの細胞型に感染し、ヒトに対して病原性ではないので、好ましいベクターである。ＡＡＶ型ベクターは、約４〜５ｋｂを輸送することができ、第１９染色体に安定して挿入されることが知られている。この部位の特異的組み込み特性を含むベクターが好ましい。この型のベクターのとりわけ好ましい実施形態は、Ａｖｉｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡによって製造されているＰ４．１Ｃベクターであり、これは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、ＨＳＶ−ｔｋ、および／またはマーカー遺伝子、例えば、グリーン蛍光タンパク質、ＧＦＰをコードする遺伝子を含み得る。
【００９３】
別の型のＡＡＶウイルスにおいて、ＡＡＶは、異種遺伝子に作動可能に結合された、細胞特異的発現を指向するプロモーターを含む少なくとも１つのカセットに隣接する逆方向末端反復（ＩＴＲ）の対を含む。異種とは、この状況において、ＡＡＶまたはＢ１９パルボウイルスに対して天然ではない任意のヌクレオチド配列または遺伝子をいう。
【００９４】
典型的には、ＡＡＶまたはＢ１９コード領域が欠失され、安全な非細胞毒性ベクターを生じる。ＡＡＶ  ＩＴＲまたはその改変は、感染性および部位特異的組み込みを付与するが、細胞毒性は付与せず、プロモーターは細胞特異的発現を指向する。米国特許第６，２６１，８３４号は、ＡＡＶベクターに関する材料のために参照により本明細書に組み込まれる。
【００９５】
このように開示されるベクターは、実質的な毒性を伴うことなく、哺乳動物染色体への組み込みが可能であるＤＮＡ分子を提供する。
【００９６】
ウイルスおよびレトロウイルスに挿入される遺伝子は、通常は、所望の遺伝子産物の発現の制御を補助するために、プロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。プロモーターは、一般的に、転写開始部位に関して比較的固定された位置にある場合に機能するＤＮＡの配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的相互作用のために必要とされるコアエレメントを含み、上流エレメントおよび応答エレメントを含み得る。
【００９７】
（４）大きなペイロードのウイルスベクター
大きなヘルペスウイルスを用いる分子遺伝実験は、それによって大きな異種ＤＮＡがクローニングされ、増殖され、ヘルペスウイルスでの感染のために許容される細胞中で樹立される手段を提供する（Ｓｕｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８：３３−４１，１９９４；ＣｏｔｔｅｒおよびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ５：６３３−６４４，１９９９）。これらの大きなＤＮＡウイルス（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）およびエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ））は、＞１５０ｋｂのヒト異種ＤＮＡのフラグメントを特定の細胞に送達するための潜在能力を有する。ＥＢＶ組換え体は、エピソームＤＮＡとして感染したＢ細胞中でＤＮＡの大きな断片を維持できる。個々のクローンは、遺伝的に安定であると思われる３３０ｋｂまでのヒトゲノム挿入物を有した。これらのエピソームの維持は、ＥＢＶの感染の間に構成的に発現される特異的ＥＢＶ核タンパク質、ＥＢＮＡ１を必要とする。加えて、これらのベクターは、トランスフェクションのために使用することができ、ここでは、大量のタンパク質が一過性にインビトロで生成できる。ヘルペスウイルスアンプリコン系もまた、＞２２０ｋｂのＤＮＡの断片をパッケージし、エピソームとしてＤＮＡを安定に維持できる細胞に感染させるために使用される。
【００９８】
他の有用な系には、例えば、複製および宿主制限非複製ワクシニアウイルスベクターが含まれる。
【００９９】
ｂ）非核酸ベース系
開示される組成物は、種々の方法で標的細胞に送達することができる。例えば、組成物は、エレクトロポレーションを通して、またはリポフェクションを通して、またはリン酸カルシウム沈殿を通して送達することができる。選択される送達メカニズムは、標的化される細胞の型、および送達が、例えば、インビボまたはインビトロで行われているかに部分的に依存する。
【０１００】
従って、組成物は、開示されるＡＲまたはベクターに加えて、例えば、脂質、例えば、カチオン性リポソーム（例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ−コレステロール）またはアニオン性リポソームなどのリポソームを含み得る。リポソームは、さらに、所望される場合、特定の細胞の標的化を容易にするためのタンパク質をさらに含む。化合物およびカチオン性リポソームを含む組成物の投与は、標的器官に対して導入性である血液に投与可能であり、または気道の細胞を標的とするために気道に吸入可能である。リポソームに関しては、例えば、Ｂｒｉｇｈａｍら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１：９５−１００（１９８９）；Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７（１９８７）；米国特許第４，８９７，３５５号を参照のこと。さらに、化合物は、マクロファージなどの特定の細胞型に標的化できるマイクロカプセルの成分として投与でき、またはマイクロカプセルからの化合物の核酸もしくは化合物の送達が、特定の速度もしくは投薬量のために設計される。
【０１０１】
被験体の細胞への外因性ＤＮＡの投与および取り込みを含む上記の方法において（すなわち、遺伝子形質導入またはトランスフェクション）、細胞への組成物の送達は、種々のメカニズムを介して可能である。１つの例として、送達は、リポソームを介してあり得、これは、市販のリポソーム調製物、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ、ＬＥＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｉｎｃ．，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ならびに当該分野における標準的な手順に従って開発した他のリポソームを使用する。加えて、開示される核酸またはベクターは、Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から利用可能な技術であるエレクトロポレーション、ならびにＳＯＮＯＰＯＲＡＴＩＯＮマシン（ＩｍａＲｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）の手段によって、インビボで送達できる。
【０１０２】
これらの材料は、溶液中、懸濁液中（例えば、微粒子リポソーム、または細胞）であり得る。これらは、抗体、受容体、または受容体リガンドを介して、特定の細胞型に標的化されてもよい。以下の参考文献は、腫瘍組織に特定のタンパク質を標的化するためのこの技術の使用の例である（Ｓｅｎｔｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２：４４７−４５１，（１９９１）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６０：２７５−２８１，（１９８９）；Ｂａｇｓｈａｗｅら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：７００−７０３，（１９８８）；Ｓｅｎｔｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，４：３−９，（１９９３）；Ｂａｔｔｅｌｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３５：４２１−４２５，（１９９２）；ＰｉｅｔｅｒｓｚおよびＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２９：５７−８０，（１９９２）；およびＲｏｆｆｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４２：２０６２−２０６５（１９９１））。これらの技術は、種々の他の特定の細胞型のために使用できる。ビヒクルは、例えば、「ステルス」などのおよび他の抗体結合体化リポソーム（結腸癌に標的化される脂質媒介薬物を含む）、細胞特異的リガンドを通してのＤＮＡの受容体媒介標的化、リンパ球指向性腫瘍標的化、およびインビボでのマウス神経膠腫細胞の高度に特異的な治療用レトロウイルス標的化である。以下の参考文献は、腫瘍組織に特定のタンパク質を標的化するためのこの技術の使用の例である（Ｈｕｇｈｅｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４９：６２１４−６２２０（１９８９）；ならびにＬｉｔｚｉｎｇｅｒおよびＨｕａｎｇ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１１０４：１７９−１８７（１９９２））。一般的に、受容体はエンドサイトーシスの経路に関与し、構成的であるか、またはリガンド誘導性であるかのいずれかである。クラスリン被覆ピット中のこれらの受容体クラスターは、クラスリン被覆小胞を介して細胞に入り、受容体が識別される酸性化エンドソームを通過し、次いで、細胞表面にリサイクルされて細胞内に保存されるか、またはリソソーム中で分解されるかのいずれかである。内部移行経路は、栄養の取り込み、活性化タンパク質の除去、高分子のクリアランス、ウイルスおよび毒素の日和見性の侵入、リガンドの解離および分解、ならびに受容体レベルの調節などの種々の機能に役立つ。多くの受容体は、細胞型、受容体濃度、リガンドの型、リガンドの価数、およびリガンドの濃度に依存して、１つより多くの細胞内経路に付随する。受容体媒介性エンドサイトーシスの分子および細胞のメカニズムは概説されている（ＢｒｏｗｎおよびＧｒｅｅｎｅ、ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：６，３９９−４０９（１９９１））
宿主細胞ゲノムに組込まれる、細胞に送達される核酸は、典型的には、組込み配列を含む。これらの配列は、特に、ウイルスベースの系が使用される場合には、しばしば、ウイルス関連配列である。これらのウイルス組込み系は、送達系に含まれる核酸が宿主ゲノムに組込むことができるように、リポソームなどの非核酸ベースの系を使用して送達される核酸に組込むこともできる。
【０１０３】
宿主ゲノムへの組込みのための他の一般的な技術には、例えば、宿主ゲノムとの相同組換えを促進するように設計された系が含まれる。これらの系は、典型的には、ベクター核酸と標的核酸との間の組換えが起こる宿主細胞ゲノム中で、標的配列との十分な相同性を有する、発現される核酸と隣接する配列に依存し、送達された核酸を宿主ゲノム中に組込む。相同組換えを促進するために必要なこれらの系および方法は、当業者に公知である。
【０１０４】
ｃ）インビボ／エキソビボ
上記のように、本発明の組成物は、薬学的に受容可能なキャリア中で投与でき、当業者に周知である種々のメカニズムによって（例えば、裸のＤＮＡの取り込み、リポソーム融合、遺伝子銃を介するＤＮＡの筋肉内注射エンドサイトーシスなど）、インビボおよび／またはエキソビボで、被験体の細胞に送達させることができる。
【０１０５】
エキソビボ方法が利用される場合、当該分野において周知である標準的なプロトコールに従って、細胞または組織は、取り出され、身体の外側で維持することができる。本発明の組成物は、例えば、リン酸カルシウム媒介遺伝子送達、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、またはプロテオリポソームなどの任意の遺伝子移入メカニズムを介して細胞に導入することができる。次いで、形質導入された細胞は、細胞または組織型のための標準的な方法に従って、注入し（例えば、薬学的に受容可能なキャリア中で）または同位置に移植して被験体に戻すことができる。被験体への種々の細胞の移植または注入のための標準的な方法は公知である。
【０１０６】
６．発現系
細胞に送達される核酸は、典型的には、発現制御系を含む。例えば、ウイルスおよびレトロウイルス系に挿入される遺伝子は、通常、所望の遺伝子産物の発現の制御を補助するために、プロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。プロモーターは、一般的に、転写開始部位に関して比較的固定された位置にある場合に機能するＤＮＡの配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的相互作用のために必要とされるコアエレメントを含み、上流エレメントおよび応答エレメントを含み得る。
【０１０７】
ａ）ウイルスプロモーターおよびエンハンサー
哺乳動物宿主においてベクターからの転写を制御する好ましいプロモーターは、種々の供給源、例えば、ポリオーマ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスなどのウイルス、最も好ましくは、サイトメガロウイルスのゲノムから、または異種哺乳動物プロモーター、例えば、βアクチンプロモーターから入手されてもよい。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点もまた含む、ＳＶ４０制限フラグメントとして便利に得られる（Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ，２７３：１１３（１９７８））。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは，ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントとして便利に得られる（Ｇｒｅｅｎｗａｙ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｇｅｎｅ  １８：３５５−３６０（１９８２））。当然、宿主細胞または関連する種からのプロモーターもまた、本発明では有用である。
【０１０８】
エンハンサーは、一般的には、転写開始部位から固定された距離で機能し、転写単位に対して５’（Ｌａｉｍｉｎｓ，Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：９９３（１９８１））または３’（Ｌｕｓｋｙ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．３：１１０８（１９８３））のいずれかであり得るＤＮＡの配列をいう。さらに、エンハンサーは、イントロン中に（Ｂａｎｅｒｊｉ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｃｅｌｌ  ３３：７２９（１９８３））ならびにコード配列それ自体の中に（Ｏｓｂｏｍｅ，Ｔ．Ｆ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．４：１２９３（１９８４））あり得る。これらは、通常は、１０〜３００ｂｐ長であり、これらはシスで機能する。エンハンサーは、すぐ近くのプロモーターからの転写を増加するように機能する。エンハンサーはまた、しばしば、転写の調節を媒介する応答エレメントも含む。プロモーターもまた、転写の調節を媒介する応答エレメントを含む。エンハンサーは、しばしば、遺伝子の発現の調節を決定する。哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトプロテイン、およびインスリン）からの多くのエンハンサー配列が今日知られているが、典型的には、一般的な発現のためには真核生物細胞ウイルスからのエンハンサーを使用する。好ましい例は、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーである。
【０１０９】
プロモーターおよび／またはエンハンサーは、光、またはそれらの機能を誘発する特定の化学的事象のいずれかによって、特異的に活性化されてもよい。系は、テトラサイクリンおよびデキサメタゾンなどの試薬によって調節することができる。γ照射などの照射への曝露、またはアルキル化化学療法剤によって、ウイルスベクター遺伝子発現を増強するための方法もまた存在する。
【０１１０】
特定の実施形態において、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域は、転写される転写単位の領域の発現を最大化するために、構成的プロモーターおよび／またはエンハンサーとして作用することができる。特定の構築物において、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域は、たとえ特定の細胞型で特定の時間にのみ発現されるとしても、すべての真核生物型の中で活性である。この型の好ましいプロモーターはＣＭＶプロモーター（６５０塩基）である。他の好ましいプロモーターはＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（全長プロモーター）、およびレトロウイルスベクターＬＴＲである。
【０１１１】
すべての特異的調節エレメントがクローニングでき、黒色腫細胞などの特定の細胞型で選択的に発現される発現ベクターを構築するために使用できることが示されてきた。グリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターは、グリア起源の細胞において遺伝子を選択的に発現するために使用されてきた。
【０１１２】
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または有核細胞）において使用される発現ベクターは、ｍＲＮＡ発現に影響を与え得る転写の終結のために必要な配列もまた含み得る。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分の中のポリアデニル化セグメントとして転写される。３’非翻訳領域もまた、転写終結部位を含む。転写単位は、ポリアデニル化領域もまた含むことが好ましい。この領域の１つの利点は、転写された単位がプロセシングされ、ｍＲＮＡのように輸送される可能性をこれが増加させるという点である。発現構築物におけるポリアデニル化シグナルの同定および使用は十分に確立されている。相同ポリアデニル化シグナルが導入遺伝子構築物中で使用されることが好ましい。特定の転写単位において、ポリアデニル化領域は、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルから誘導され、約４００塩基からなる。転写された単位が、単独で、または上記の配列と組み合わせて、他の標準的な配列を含み、構築物からの発現、または構築物の安定性を改善することもまた好ましい。
【０１１３】
ｂ）マーカー
ウイルスベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含み得る。このマーカー産物は、遺伝子が細胞に送達されたか否かを決定するために使用され、一旦送達されると、遺伝子は発現される。好ましいマーカー遺伝子は、βガラクトシダーゼをコードするＥ．Ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ遺伝子、およびグリーン蛍光タンパク質である。
【０１１４】
ある実施形態において、マーカーは選択マーカーである。哺乳動物のための好適な選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシン類似体Ｇ４１８、ハイグロマイシン、およびピューロマイシンである。このような選択マーカーが哺乳動物宿主細胞に首尾よく移入するとき、形質転換された哺乳動物宿主細胞は、選択圧下に置かれた場合に生存する。広範に使用されている２つの別個の選択レジメンのカテゴリーが存在する。第１のカテゴリーは細胞の代謝および補充した培地とは独立して増殖する能力を欠く変異体細胞株の使用に基づく。２つの例としては：ＣＨＯ  ＤＨＦＲ−細胞およびマウスＬＴＫ−細胞である。これらの細胞は、チミジンまたはヒポキサンチンのような栄養素の添加なしで増殖する能力を欠いている。これらの細胞は完全なヌクレオチド合成経路のために必要な特定の遺伝子を欠いているので、これらは、欠けているヌクレオチドが補充培地中に提供されない限り、生存できない。培地を補充するための代替法は、それぞれの遺伝子を欠く細胞に無傷ＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子を導入し、このようにしてそれらの増殖要求性を変化させることである。ＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子で形質転換しなかった個々の細胞は、補充されない培地中では生存が可能ではない。
【０１１５】
第２のカテゴリーは、任意の細胞型で使用される選択スキームをいい、変異体細胞株の使用を必要としない優性選択である。これらのスキームは、典型的には、宿主細胞の増殖を停止するための薬物を使用する。新規な遺伝子を有するこれらの細胞は、薬物耐性を伝達するタンパク質を発現し、選択で生き残る。このような優性選択の例は、薬物、ネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｐ．およびＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７（１９８２））、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．およびＢｅｒｇ，Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０９：１４２２（１９８０））、またはハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎ，Ｂ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４１０−４１３（１９８５））を使用する。これらの３つの例は、好適な薬物Ｇ４１８またはネオマイシン（ジェネティシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）、またはハイグロマイシンに対する耐性をそれぞれ伝達するために、真核生物制御下で細菌遺伝子を利用する。他の例には、ネオマイシン類似体Ｇ４１８およびピューロマイシンが含まれる。
【０１１６】
７．ペプチド
ａ）タンパク質改変体
本明細書に議論されるように、公知であり、本発明で意図されるＡＲタンパク質の多数の改変体が存在する。既知の機能的ＡＲ株改変体に加えて、開示される方法および組成物においてもまた機能する、ＡＲタンパク質の誘導体が存在する。タンパク質改変体および誘導体は、当業者に十分に理解されており、アミノ酸配列修飾を含むことができる。例えば、アミノ酸配列の修飾は、典型的には、３つのクラスのうちの１つ以上に含まれる：置換、挿入、または欠失改変体である。挿入には、アミノ末端および／またはカルボキシル末端の融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。挿入は、通常は、例えば、１〜４残基の範囲のアミノ末端またはカルボキシ末端の融合物よりも小さな挿入である。免疫原性融合タンパク質誘導体、例えば、実施例に記載されるものは、インビトロでの架橋によって、または融合物をコードするＤＮＡで形質転換した組換え細胞培養物によって、標的配列に免疫原性を付与するために十分に大きなポリペプチドを融合することにより作製される。欠失は、タンパク質配列の１つ以上のアミノ酸残基の除去によって特徴付けられる。典型的には、約２〜６残基以下が、タンパク質分子内の任意の部位において欠失される。これらの改変体は、通常、タンパク質をコードするＤＮＡ中のヌクレオチドの特異的変異誘発によって調製され、それによって、改変体をコードするＤＮＡを産生し、その後、組換え細胞培養中でそのＤＮＡを発現させる。既知の配列を有するＤＮＡ中の所定の部位において置換変異を作製するための技術は周知であり、例えば、Ｍ１３プライマー変異誘発およびＰＣＲ変異誘発である。アミノ酸置換は、典型的には、単一残基であるが、一度に多数の異なる位置で起こすこともでき；挿入は、通常、約１〜１０アミノ酸残基の範囲であり；そして欠失は、約１〜３０残基の範囲である。欠失または挿入は、好ましくは、隣接対で作製され、すなわち、２残基の欠失または２残基の挿入である。置換、欠失、またはその任意の組み合わせは、最終産物に到達するために組み合わせることができる。変異は、リーディングフレームから外部に配列を配置してはならず、好ましくは、二次ＲＮＡ構造を生じ得る相補的を作らない。置換改変体は、少なくとも１つの残基が除去されており、異なる残基がその場所に挿入される。このような置換は、一般的には、以下の表１および２に従って作製され、保存性置換と呼ばれる。
【０１１７】
【化１１】
2009537142.tif 000013
【０１１８】
【化１２】
2009537142.tif 000014
機能または免疫学的同一性の実質的変化は、表４の置換よりも保存性が低い置換を選択すること、すなわち、以下を維持することに対するそれらの効果がより有意に異なる残基を選択することによって作製される：（ａ）置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造、例えば、シートまたはヘリカル構造として、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさ高さ。一般的に、タンパク質特性の最大変化を生じることが予測される置換は、（ａ）疎水性残基、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、またはアラニルの代わりに（またはこれらによって）、親水性残基、例えば、セリルまたはスレオニルが置換されるもの；（ｂ）任意の他の残基の代わりに（またはこれらによって）システインまたはプロリンが置換されるもの；（ｃ）電気陰性残基、例えば、グルタミルまたはアスパルチルの代わりに（またはこれらによって）電気陽性側鎖を有する残基、例えば、リジル、アルギニル、またはヒスチジルが置換されるもの；あるいは（ｄ）側鎖を有さない残基、例えば、この場合は、グリシンの代わりに（またはこれらによって）かさ高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンシステインが置換されるもの、（ｅ）硫酸化および／またはグリコシル化のための部位の数を増加させること。
【０１１９】
例えば、生物学的および／または化学的に類似の別のアミノ酸による、１つのアミノ酸残基の置換は、保存性置換として当業者に公知である。例えば、保存性置換は、１つの疎水性残基を別の疎水性残基の代わりに、または１つの極性残基を別の極性残基の代わりに置換する。この置換は、例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒなどの組み合わせを含む。各々明示的に開示される配列のこのような保存性置換のバリエーションは、本明細書に提供されるモザイクポリペプチドの中に含まれる。
【０１２０】
置換および欠失変異誘発は、Ｎ−グリコシル化（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）またはＯ−グリコシル化（ＳｅｒまたはＴｈｒ）のための部位を挿入するために利用することができる。システインまたはその他の不安定な残基もまた、所望されてもよい。潜在的プロテオリシス部位、例えば、Ａｒｇの欠失または置換は、例えば、塩基性残基の１つを欠失されること、またはグルタミル残基もしくはヒスチジル残基によって置換することによって、達成される。
【０１２１】
特定の翻訳後誘導体は、発現されたポリペプチドに対する組換え宿主の作用の結果である。グルタミニル残基およびアスパラギニル残基は、頻繁に、翻訳後脱アミド化され、対応するグルタミルおよびアスパリル残基になる。または、これらの残基は、穏やかな酸性条件下で脱アミド化される。他の翻訳後修飾には、プロリンおよびリジンの水酸化、セリルまたはスレオニル残基の水酸基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のｏ−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ｐｐ  ７９−８６［１９８３］）、Ｎ末端アミンのアセチル化、および、ある場合において、Ｃ末端カルボキシルのアミド化が含まれる。
【０１２２】
本明細書に開示されるタンパク質の改変体および誘導体を規定するための１つの方法は、特定の既知の配列に対する相同性／同一性によって、改変体および誘導体を規定することを通してであることが理解される。例えば、配列番号９は、ＡＲの特定の配列を示し、配列番号８はＡＲタンパク質の特定の配列を示す。言及される配列に対して、少なくとも７０％または７５％または８０％または８５％または９０％または９５％の相同性を有する、これらおよび他の本明細書に記載されるタンパク質の改変体が具体的に開示される。当業者は、２つのタンパク質の相同性をいかにして決定するかを容易に理解する。例えば、相同性は、相同性がその最高レベルにあるように、２つの配列を整列させた後で計算することができる。
【０１２３】
相同性を計算する別の方法は、公開されたアルゴリズムによって実施することができる。比較のための配列の最適なアラインメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行によって（ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または目視によって実施されてもよい。
【０１２４】
同じ型の相同性は、例えば、少なくとも核酸アラインメントに関連する材料のために、参照により本明細書に組み込まれる、Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：４８−５２，１９８９、Ｊａｅｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：７７０６−７７１０，１９８９、Ｊａｅｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６，１９８９に開示されるアルゴリズムによって、核酸のために得ることができる。
【０１２５】
保存性変異および相同性の説明は、任意の組み合わせで、例えば、改変体が保存性変異である、特定の配列に対して少なくとも７０％相同性を有する実施形態で、一緒に合わせることができることが理解される。
【０１２６】
本明細書は種々のタンパク質およびタンパク質配列を議論するので、これらのタンパク質配列をコードし得る核酸もまた開示されることが理解される。これは、特定のタンパク質配列に関連するすべての縮重配列、すなわち、１つの特定のタンパク質配列をコードする配列を有するすべての核酸、ならびに、縮重核酸、開示される改変体をコードする核酸、およびタンパク質配列の誘導体を含むすべての核酸を含む。従って、各々の特定の核酸配列は本明細書に書かれていないかもしれないが、各々のおよびすべての配列が、開示されたタンパク質配列を通して、実際に開示または記載されることが理解される。例えば、配列番号８に示されるタンパク質配列をコードし得る多くの核酸配列のうちの１つが配列番号９に示される。アミノ酸配列は、どの特定のＤＮＡ配列が生物の中でそのタンパク質をコードするかを示していないが、開示されるタンパク質の特定の改変体が本明細書に開示される場合、タンパク質がそこから生じる特定のＡＲにおけるタンパク質をコードする既知の核酸配列もまた、公知であり、本明細書に開示され、記載されることもまた理解される。
【０１２７】
開示される組成物に組み込むことができる多数のアミノ酸およびペプチド類似体が存在することが理解される。例えば、異なる機能の置換基を有する多数のＤアミノ酸が存在し、次いで、これらのアミノ酸は表３および表４に示される。天然に存在するペプチドの反対向きの立体異性体、ならびにペプチド類似体の立体異性体が開示される。これらのアミノ酸は、ｔＲＮＡ分子に選択したアミノ酸を委託すること、ならびに例えば、アンバーコドンを利用する遺伝子構築物を操作して、部位特異的なやり方で、類似体アミノ酸をペプチド鎖に挿入することによって、ポリペプチド鎖に容易に取り込むことができる（Ｔｈｏｒｓｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．７７：４３−７３（１９９１）、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３：３４８−３５４（１９９２）；Ｉｂｂａ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＆  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｒｒｉｎｇ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １３：１９７−２１６（１９９５）、Ｃａｈｉｌｌら、ＴＩＢＳ，１４（１０）：４００−４０３（１９８９）；Ｂｅｎｎｅｒ，ＴＩＢ  Ｔｅｃｈ，１２：１５８−１６３（１９９４）；ＩｂｂａおよびＨｅｎｎｅｃｋｅ、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：６７８−６８２（１９９４）、これらのすべては、少なくともアミノ酸類似体に関連する材料のために、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１２８】
ペプチドに類似しているが、天然のペプチド結合を介して接続されてはいない分子を産生することができる。例えば、アミノ酸またはアミノ酸類似体のための結合には以下が含まれ得る：ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−，−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨＨ２ＳＯ−（これらおよび他のものは、以下において見い出すことができる：Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ所収、Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．２６７（１９８３）；Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，Ｖｅｇａ  Ｄａｔａ（Ｍａｒｃｈ  １９８３），Ｖｏｌ．１，Ｉｓｓｕｅ  ３，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ（一般的概説）；Ｍｏｒｌｅｙ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  （１９８０）ｐｐ．  ４６３−４６８；Ｈｕｄｓｏｎ，Ｄ．ら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔ  Ｒｅｓ  １４：１７７−１８５（１９７９）（−ＣＨ２ＮＨ−，ＣＨ２ＣＨ２−）；Ｓｐａｔｏｌａら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ３８：１２４３−１２４９（１９８６）（−ＣＨ  Ｈ２−Ｓ）；Ｈａｎｎ  Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．Ｉ  ３０７−３１４（１９８２）（−ＣＨ−ＣＨ−、シスおよびトランス）；Ａｌｍｑｕｉｓｔら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２−１３９８（１９８０）（−ＣＯＣＨ２−）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２３：２５３３  （１９８２）（−ＣＯＣＨ２−）；Ｓｚｅｌｋｅら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ａｐｐｌｎ，ＥＰ  ４５６６５  ＣＡ（１９８２）：９７：３９４０５（１９８２）（−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−）；Ｈｏｌｌａｄａｙら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．Ｌｅｔｔ  ２４：４４０１−４４０４（１９８３）（−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−）；およびＨｒｕｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ３１：１８９−１９９（１９８２）（−ＣＨ２−Ｓ−）；これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる）。ペプチド類似体は、結合原子間に１つより多くの原子を有し得ること（例えば、ｂアラニン、ｇアミノ酪酸など）が理解される。
【０１２９】
アミノ酸類似体およびペプチド類似体は、しばしば、より経済的な製造、より高い化学的安定性などの、増強されたまたは所望の特性、薬理学的特性の増強（半減期、吸収、効力、有効性など）、特異性の変化（例えば、広いスペクトルの生物学的活性）、抗原性の減少、およびその他を有する。
【０１３０】
Ｄアミノ酸は、より安定なペプチドを生成するために使用できる。なぜなら、Ｄアミノ酸は、ペプチダーゼによって、そのように認識されないからである。同じ型のＤアミノ酸とのコンセンサス配列の１つ以上のアミノ酸の系統的置換は（例えば、Ｌリジンの代わりにＤリジン）、より安定なペプチドを生成するために使用できる。システイン残基は、２つ以上のペプチドを一緒に環化または結合するために使用できる。このことは、ペプチドを特定の構造に制約するために有益であり得る（ＲｉｚｏおよびＧｉｅｒａｓｃｈ  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７（１９９２）、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１３１】
８．抗体
（１）抗体一般
「抗体」という用語は、広い意味で本明細書で使用され、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方を含む。無傷免疫グロブリン分子に加えて、抗体がＡＲと相互作用する能力のために選択される限り、「抗体」という用語には、これらの免疫グロブリンのフラグメントまたはポリマー、および免疫グロブリン分子またはそのフラグメントのヒトまたはヒト化バージョンもまた含まれる。ＡＲとアンドロゲンの間の相互作用に関与するＡＲの開示された領域に結合する抗体もまた、開示される。抗体は、本明細書に記載されるインビトロアッセイを使用して、または類似の方法によって、それらの所望の活性について試験することができ、その後、それらのインビボでの治療的および／または予防的活性が、公知の臨床試験方法に従って試験される。
【０１３２】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体をいい、すなわち、この集団の中の個々の抗体は、抗体分子の小さなサブセット中に存在し得る可能な天然に存在する変異以外は同一である。本発明のモノクローナル抗体は、抗体が所望のアンタゴニスト活性を示す限り、具体的に、「キメラ」抗体、ならびにこのような抗体のフラグメントを含み、キメラ抗体においては、重鎖および／または軽鎖の一部は、特定の種に由来する抗体または特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体の中の対応する配列と同一であるかまたはそれと相同であるのに対して、鎖の残りは、別の種に由来する抗体または別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体の中の対応する配列と同一であるかまたはそれと相同である（米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）を参照のこと）。
【０１３３】
開示されるモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体を産生する任意の手順を使用して作製できる。例えば、開示されるモノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって記載されたようなハイブリドーマ技術を使用して調製できる。ハイブリドーマ法において、マウスまたは他の好適な宿主動物が、典型的には、免疫剤に特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生可能であるリンパ球を誘発する免疫剤で免疫される。代替的には、リンパ球は、例えば、本明細書に記載されるＨＩＶ  Ｅｎｖ−ＣＤ４−コレセプターを使用して、インビトロで免疫されてもよい。
【０１３４】
モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号（Ｃａｂｉｌｌｙら）によってもまた、作製されてもよい。開示されるモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来的な手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離および配列決定できる。抗体または活性抗体フラグメントのライブラリーもまた、例えば、Ｂｕｒｔｏｎらへの米国特許第５，８０４，４４０号およびＢａｒｂａｓらへの同第６，０９６，４４１号に記載されているようなファージディスプレイ技術を使用して、生成およびスクリーニングできる。
【０１３５】
インビトロ方法もまた、一価抗体を調製するために好適である。それらのフラグメント、特に、Ｆａｂフラグメントを生じるための抗体の消化は、当該分野で公知である日常的な技術を使用して達成することができる。例えば、消化は、パパインを使用して実施することができる。パパイン消化の例は、１９９４年１２月２２日に公開されたＷＯ  ９４／２９３４８および米国特許第４，３４２，５６６号に記載されている。抗体のパパイン消化は、典型的には、Ｆａｂフラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメントを生じ、各々が単一の抗原結合部位、および残りのＦｃフラグメントを有する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、なお抗原を架橋可能であるフラグメントを生じる。
【０１３６】
抗体または抗体フラグメントの活性が、非修飾抗体または抗体フラグメントと比較して有意に変化されておらず、または損なわれていないという条件で、フラグメントは、他の配列に結合されるか否かに関わらず、特定の領域または特定のアミノ酸残基の挿入、欠失、置換、または他の選択された修飾もまた含み得る。これらの修飾は、あるさらなる特性、例えば、ジスルフィド結合可能なアミノ酸を除去／付加すること、その生物学的な長寿を増加すること、その分泌特性を変化させることなどを提供し得る。いずれの場合においても、抗体または抗体フラグメントは、生物活性特性、例えば、その同種抗原への特異的結合などを有さなければならない。抗体または抗体フラグメントの機能的または活性領域は、タンパク質の特異的領域の変異誘発、続いて、発現および発現されたポリペプチドの試験によって同定されてもよい。このような方法は、当業者には容易に明らかであり、これには、抗体または抗体フラグメントをコードする核酸の部位特異的変異誘発が含まれ得る（Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：３４８−３５４，１９９２）。
【０１３７】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、ヒト抗体またはヒト化抗体をいうこともできる。多くの非ヒト抗体（例えば、マウス、ラット、またはウサギ由来の抗体）は、ヒトの中では天然に抗原性であり、従って、ヒトに投与されたときには、望ましくない免疫応答を生じ得る。それゆえに、本発明の方法におけるヒト抗体またはヒト化抗体の使用は、ヒトに投与した抗体が望ましくない免疫応答を惹起する機会を少なくするように機能する。
【０１３８】
（２）ヒト抗体
開示されるヒト抗体は任意の技術を使用して調製することができる。ヒトモノクローナル抗体酸性のための技術の例には、Ｃｏｌｅら（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７，１９８５）によって記載されるものおよびＢｏｅｒｎｅｒら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５，１９９１）によって記載されるものが含まれる。ヒト抗体（およびそのフラグメント）は、ファージディスプレイライブラリーを使用して産生させることもできる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１，１９９１；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２２：５８１，１９９１）。
【０１３９】
開示されるヒト抗体は、トランスジェニック動物から得ることもできる。例えば、免疫に応答してヒト抗体の完全なレパートリーを産生可能であるトランスジェニック変異型マウスが記載されている（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１−２５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，７：３３（１９９３）を参照のこと）。詳細には、これらのキメラおよび生殖系列変異型マウスにおける抗体重鎖結合領域（Ｊ（Ｈ））のホモ接合性欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害を生じ、このような生殖系列変異型マウスへのヒト生殖系列抗体遺伝子アレイの首尾よい移入は、抗原チャレンジに際してヒト抗体の産生を生じる。所望の活性を有する抗体は、本明細書に記載されるように、Ｅｎｖ−ＣＤ４−コレセプター複合体を使用して選択する。
【０１４０】
（３）ヒト化抗体
抗体のヒト化技術は、一般的には、抗体分子の１つ以上のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡを操作するための組換えＤＮＡ技術の使用を含む。従って、非ヒト抗体（またはそのフラグメント）のヒト化型は、ヒト（レシピエント）抗体のフレームワークに組込まれた非ヒト（ドナー）抗体からの抗原結合部位の一部を含む、キメラ抗体または抗体鎖（またはそのフラグメント、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、または抗体の他の抗原結合部分）である。
【０１４１】
ヒト化抗体を生成するために、レシピエント（ヒト）抗体分子の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の抗原結合特性（例えば、標的抗原に対して特定のレベルの特異性および親和性）を有することが知られているドナー（非ヒト）抗体分子の１つ以上のＣＤＲからの残基によって置換される。ある例において、ヒト抗体のＦｖフレームワーク（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体においても、移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列においても見い出されない。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からそこに導入される１つ以上のアミノ酸残基を有する。実際上、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基およびおそらくＦＲ残基が、齧歯類抗体中の類似の部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。ヒト化抗体は、一般的には、抗体定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的には、ヒト抗体のそれを含む（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，  ３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）、およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２））。
【０１４２】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は当該分野において周知である。例えば、ヒト化抗体は、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６），Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８），Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））に従って、ヒト抗体の対応する配列の代わりに齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列を置換することによって生成することができる。ヒト化抗体を産生するために使用できる方法は、米国特許第４，８１６，５６７号（Ｃａｂｉｌｌｙら）、同第５，５６５，３３２号（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら）、同第５，７２１，３６７号（Ｋａｙら）、同第５，８３７，２４３号（Ｄｅｏら）、同第５，９３９，５９８号（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら）、同第６，１３０，３６４号（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら）、および同第６，１８０，３７７号（Ｍｏｒｇａｎら）にもまた記載されている。
【０１４３】
９．薬学的キャリア／薬学的産物の送達
上記に記載されるように、本発明の組成物は、薬学的に受容可能なキャリア中、インビボで投与することもできる。「薬学的に受容可能」とは、生物学的にまたは他の点で望ましくないわけではない物質を意味し、すなわち、この物質は、いかなる望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、またはそれが含まれる薬学的組成物の他の成分のいずれかと有害な様式で相互作用することなく、核酸またはベクターとともに、被験体に投与されてもよい。キャリアは、当然ながら、当業者に周知であるように、活性成分のいかなる分解も最小化し、被験体におけるいかなる副作用も最小化するように、選択される。
【０１４４】
本発明の組成物は、経口的に、非経口的に（例えば、静脈内に）、筋肉内注射によって、腹腔内注射によって、経皮的に、体外で、局所的、他などで投与されてもよく、これには、局所的鼻内投与または吸入による投与が含まれる。本明細書で使用される場合、「局所的鼻内投与」とは、鼻孔の片方または両方を通しての鼻または鼻の中への組成物の送達を意味し、噴霧メカニズムもしくは液滴メカニズムによる、または核酸もしくはベクターのエアロゾル化を通しての送達を含み得る。吸入による組成物の投与は、噴霧または液滴メカニズムによる送達を介して鼻または口を通してであり得る。送達は、挿管を介して呼吸系（例えば、肺）の任意の領域に直接的であり得る。必要とされる組成物の正確な量は、被験体の種、年齢、体重、および一般的状態、治療されるアレルギー性疾患の重篤度、使用される特定の核酸またはベクター、その治療の様式などに依存して、被験体から被験体で変化する。従って、すべての組成物について正確な量を特定することは不可能である。しかし、好適な量は、本明細書の教示が与えられれば、日常的な実験のみを使用して、当業者によって決定可能である。
【０１４５】
組成物の非経口的投与は、使用される場合、一般的には、注射によって特徴付けられる。注射液は、従来的な形態で、液体溶液または懸濁液のいずれかとして、液体中の懸濁溶液のために好適な注射前の固体形態、またはエマルジョンとして、調製することができる。より最近修正された非経口投与のためのアプローチは、一定の投薬量が維持されるような、遅延放出または持続放出系の使用を含む。例えば、米国特許第３，６１０，７９５号を参照のこと。これは、参照として本明細書に組み込まれる。
【０１４６】
これらの材料は、溶液、懸濁液（例えば、微粒子、リポソーム、または細胞に取り込まれる）中にあり得る。これらは、抗体、受容体、または受容体リガンドを介して特定の細胞型に標的化されてもよい。以下の参考文献は、腫瘍組織に特定のタンパク質を標的化するためのこの技術の使用の例である（Ｓｅｎｔｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２：４４７−４５１（１９９１）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６０：２７５−２８１（１９８９）；Ｂａｇｓｈａｗｅら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：７００−７０３（１９８８）；Ｓｅｎｔｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，４：３−９（１９９３）；Ｂａｔｔｅｌｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３５：４２１−４２５（１９９２）；ＰｉｅｔｅｒｓｚおよびＭｃＫｅｎｚｉｅ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２９：５７−８０（１９９２）；ならびにＲｏｆｆｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４２：２０６２−２０６５，（１９９１））。「ステルス」および他の抗体結合体化リポソームなどのビヒクル（結腸癌に標的化される脂質媒介薬物を含む）、細胞特異的リガンドを通してのＤＮＡの受容体媒介標的化、リンパ球指向性腫瘍標的化、およびインビボでのマウス神経膠腫の高度に特異的な治療用レトロウイルス標的化である。以下の参考文献は、腫瘍組織に特定のタンパク質を標的化するためのこの技術の使用の例である（Ｈｕｇｈｅｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４９：６２１４−６２２０（１９８９）；ならびにＬｉｔｚｉｎｇｅｒおよびＨｕａｎｇ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１１０４：１７９−１８７（１９９２））。一般的に、受容体はエンドサイトーシスの経路に関与し、構成的であるか、またはリガンド誘導性であるかのいずれかである。クラスリン被覆ピット中のこれらの受容体クラスターは、クラスリン被覆小胞を介して細胞に入り、受容体が識別される酸性化エンドソームを通過し、次いで、細胞表面にリサイクルされて細胞内に保存されるか、またはリソソーム中で分解されるかのいずれかである。内部移行経路は、栄養の取り込み、活性化タンパク質の除去、高分子のクリアランス、ウイルスおよび毒素の日和見性の侵入、リガンドの解離および分解、ならびに受容体レベルの調節などの種々の機能に役立つ。多くの受容体は、細胞型、受容体濃度、リガンドの型、リガンドの価数、およびリガンドの濃度に依存して、１つより多くの細胞内経路に付随する。受容体媒介性エンドサイトーシスの分子および細胞のメカニズムは概説されている（ＢｒｏｗｎおよびＧｒｅｅｎｅ、ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：６，３９９−４０９（１９９１））
ａ）薬学的に受容可能なキャリア
抗体を含む組成物は、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて、治療的に使用することができる。
【０１４７】
好適なキャリアおよびそれらの製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（第１９版）Ａ．Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ  １９９５に記載されている。典型的には、好適な量の薬学的に受容可能な塩が、製剤を等張性にするために、製剤中で使用される。薬学的に受容可能なキャリアの例には、生理食塩水、リンガー液、およびデキストロース溶液が含まれるがこれらに限定されない。溶液のｐＨは、好ましくは約５〜約８であり、より好ましくは約７〜約７．５である。さらなるキャリアには、抗体を含む固体の疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの持続放出調製物が含まれ、このマトリックスは、成型された物品、例えば、フィルム、リポソーム、または微粒子の形態である。例えば、投与の経路および投与される組成物の濃度に依存して、特定のキャリアがより好ましいことが当業者には明らかである。
【０１４８】
薬学的キャリアは当業者に公知である。これらは、最も典型的には、滅菌水、生理食塩水、および生理的ｐＨにおける緩衝溶液を含む、ヒトへの薬物の投与のための標準的なキャリアである。本発明の組成物は、筋肉内または皮下的に投与することができる。他の化合物は、当業者によって使用される標準的な手順に従って投与される。
【０１４９】
薬学的組成物は、選択した分子に加えて、キャリア、濃厚剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤、界面活性剤などを含み得る。薬学的組成物は、抗微生物剤、抗炎症剤、麻酔剤などのような１種以上の活性成分を含み得る。
【０１５０】
薬学的組成物は、局所的または全身的な治療が望まれているか、および治療される領域に依存して、多数の方法で投与されてもよい。投与は、局所的（眼科的、膣、直腸、鼻内を含む）、経口的、吸入による、または非経口的、例えば、静脈内点滴、皮下、腹腔内、または筋肉内の注射であり得る。開示される抗体は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、または経皮的に投与され得る。
【０１５１】
非経口投与のための調製物は、滅菌水溶液または非水性溶液、懸濁液、およびエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性キャリアには、アルコール／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液が含まれ、生理食塩水および緩衝化媒体が含まれる。非経口的ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸を含むリンガー液、および固定油が含まれる。静脈内ビヒクルには、液体および栄養補充剤、電解質補充剤（例えば、リンガーデキストロースに基づくもの）などが含まれる。保存剤および他の添加剤、例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどが存在してもよい。
【０１５２】
局所的投与のための製剤には、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐剤、スプレー、液体、および粉末が含まれ得る。従来的な薬学的キャリア、水溶液、粉末、または油ベース、濃厚剤などは、必要であり得るかまたは所望され得る。
【０１５３】
経口投与のための組成物には、粉末または顆粒、水または非水系媒体中の懸濁液または溶液、カプセル、サシェ剤、または錠剤が含まれる。濃厚剤、香料、希釈剤、乳化剤、分散補助剤、または結合剤が所望され得る。
【０１５４】
いくつかの組成物は、潜在的には、薬学的に受容可能な酸または塩基付加塩として投与されてもよい。この塩は、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、およびリン酸などの無機酸、ならびにギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸などの有機酸との反応によって、または水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなどの無機塩基、ならびにモノ−、ジ−、トリアルキル、およびアリールアミンおよび置換エタノールアミンなどの有機塩基との反応によって形成される。
【０１５５】
ｂ）治療的使用
組成物を投与するための有効な投薬量およびスケジュールは経験的に決定されてもよく、このような決定を行うことは当業者の範囲内である。組成物の投与のための投薬量の範囲は、徴候の障害が影響を受ける所望の効果を生じるために十分に大きい。投薬量は、有害な副作用、例えば、望ましくない交差反応アナフィラキシー反応などを引き起こすほどには大きくあるべきではない。一般的に、投薬量は、患者の年齢、状態、性別、および疾患の程度、投与の経路、または他の薬物がレジメンに含まれているか否かで変化し、当業者によって決定することができる。投薬量は、任意の反対表示（ｃｏｕｎｔｅｒｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ）の事象において個別の医師によって調整できる。投薬量は変化可能であり、１日から数日間、毎日１回以上の用量で投与可能である。指針は、所定のクラスの薬学的製品についての好適な投薬量について文献中に見い出すことができる。例えば、抗体についての好適な用量を選択する際の指針は、抗体の治療的使用に関する文献、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｆｅｒｒｏｎｅら編、Ｎｏｇｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐａｒｋ  Ｒｉｄｇｅ，Ｎ．Ｊ．（１９８５）ｃｈ．２２およびｐｐ．３０３−３５７；Ｓｍｉｔｈら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｈａｂｅｒら編、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７７）ｐｐ．３６５−３８９の中に見い出すことができる。単独で使用される典型的な１日の抗体の投薬量は、上記に言及される要因に依存して、１日あたり１μｇ／１ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重以上の範囲であり得る。
【０１５６】
癌（例えば、前立腺癌）を治療、阻害、または予防するための、ＡＲを含むベクターなどの開示される組成物の投与後に、治療用ベクターの効力が、当業者に周知である種々の方法で評価できる。例えば、当業者は、本明細書に開示される、ＡＲを含むベクターなどの組成物が、腫瘍増殖速度を減少し、または腫瘍サイズのさらなる増大を予防することを観察することによって、この組成物が前立腺癌を治療または阻害する際に有効であることを理解する。
【０１５７】
本明細書に開示される組成物は、癌、例えば、前立腺癌のリスクがある患者または被験体に予防的に投与されてもよい。
【０１５８】
１０．開示される組成物を用いてスクリーニングすることによって同定される組成物
開示される組成物は、開示される組成物の構造を同定するため、または潜在的なもしくは実際の分子、例えば、開示される組成物と所望の方法で相互作用する低分子を同定するためのいずれかのために、任意の分子モデリング技術の標的として使用できる。本明細書に開示される核酸、ペプチド、および関連分子は、任意の分子モデリングプログラムまたはアプローチにおける標的として使用できる。
【０１５９】
モデリング技術において開示される組成物を使用する場合、阻害または刺激または標的分子の機能などの特定の所望の特性を有する高分子などの分子が同定されることが理解される。開示される組成物を使用する場合、同定され、単離される分子、例えば、ＡＲもまた開示される。従って、開示される組成物を含む分子モデリングアプローチを使用して産生される産物、例えば、ＡＲもまた、本明細書に開示されると見なされる。
【０１６０】
従って、選択した分子を結合する分子を単離するための１つの方法は、合理的設計を通してである。これは、構造情報およびコンピュータモデリングを通して達成される。コンピュータモデリング技術は、選択した分子の三次元原子構造の可視化、およびその分子と相互作用する新規な化合物の合理的設計を可能にする。この三次元構築物は、典型的には、選択した分子のｘ線結晶学的解析またはＮＭＲイメージングからのデータに依存する。この分子ダイナミックスは力場データを必要とする。コンピュータグラフィックスシステムは、新規な化合物がいかにして標的分子に結合するかの予測を可能にし、ならびにその化合物および標的化合物の構造の実験的操作を、完全な結合特異性まで可能にする。どの分子結合化合物の相互作用があるか、小さな変化が一方または両方でいつ起こるかの予測は、分子メカニクスソフトウェアおよび計算力が強化されたコンピュータを必要とし、通常は、分子設計プログラムとユーザーとの間のユーザーフレンドリーなメニューによって行われるインターフェースと結び付けられている。
【０１６１】
分子モデリングシステムの例は、ＣＨＡＲＭｍおよびＱＵＡＮＴＡプログラム、Ｐｏｌｙｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡである。ＣＨＡＲＭｍは、エネルギー最小化関数および分子ダイナミックス関数を実行する。ＱＵＡＮＴＡは、構築、グラフィックモデリング、および分子構造の分析を実行する。ＱＵＡＮＴＡは、反復的な構築、修飾、可視化、および互いの分子の挙動の分析を可能にする。
【０１６２】
以下の多数の論文が、特定のタンパク質と相互作用的な薬物のコンピュータモデリングを概説している：Ｒｏｔｉｖｉｎｅｎら、１９８８  Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ  Ｆｅｎｎｉｃａ  ９７，１５９−１６６；Ｒｉｐｋａ，Ｎｅｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  ５４−５７（Ｊｕｎｅ  １６，１９８８）；  ＭｃＫｉｎａｌｙおよびＲｏｓｓｍａｎｎ，１９８９  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｉｏｌ．２９，１１１−１２２；ＰｅｒｒｙおよびＤａｖｉｅｓ，ＱＳＡＲ：Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｐｐ．１８９−１９３（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８９）；ＬｅｗｉｓおよびＤｅａｎ，１９８９  Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．２３６，１２５−１４０および１４１−１６２；ならびに、核酸成分のためのモデル酵素に関しては、Ａｓｋｅｗら、１９８９  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１，１０８２−１０９０。化学物質をスクリーニングし、かつ画像を描く、他のコンピュータプログラムは、ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ，Ｉｎｃ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ．、Ａｌｌｅｌｉｘ，Ｉｎｃ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ、およびＨｙｐｅｒｃｕｂｅ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｏｎｔａｒｉｏなどの企業から利用可能である。これらは、主として、特定のタンパク質に特異的な薬物の適用のために設計されているが、一旦領域が同定されると、これらは、ＤＮＡまたはＲＮＡの特定の領域と特異的に相互作用する分子の設計のために適合させることができる。
【０１６３】
結合を変化できる化合物の設計および生成に関して上記に記載したが、基質結合または酵素活性を変化させる化合物について、天然物または合成化学物質、およびタンパク質を含む生物学的に活性な物質を含む、既知の化学物質のライブラリーをスクリーニングすることができる。
【０１６４】
１１．キット
本明細書に開示される方法を実施する際に使用できる試薬になるキットが本明細書に開示される。このキットは、本明細書に開示されるか、または開示される方法の実施において必要とされるかまたは有益であると理解される、任意の試薬または試薬の組み合わせを含み得る。例えば、これらのキットは、本発明の方法の特定の実施形態において議論される増幅反応を実施するためのプライマー、ならびに意図されるようなプライマーを使用するために必要とされる緩衝液および酵素を含むことができる。例えば、配列番号１１および１２に示されるオリゴヌクレオチドを含む、前立腺癌になる被験体のリスクを評価するためのキットが開示される。
【０１６５】
１２．類似の機能を有する組成物
本明細書に開示される組成物は、特定の機能、例えば、上皮ＡＲ発現の増強を有することが理解される。開示される機能を実施するための特定の構造的な要件が本明細書に開示され、開示される構造に関連するのと同じ機能を実施できる種々の構造が存在すること、およびこれらの構造が、同じ結果、例えば、上皮ＡＲ発現の刺激または阻害を最終的に達成することが理解される。
【０１６６】
Ｅ．組成物を作製する方法
本明細書に開示される組成物、および開示される方法を実施するために必要な組成物は、他に特に注記されない限り、その特定の試薬または化合物のために当業者に公知である任意の方法を使用して作製することができる。
【０１６７】
１．核酸合成
例えば、核酸、例えば、プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、標準的な化学合成法を使用して作製可能であり、または酵素的な方法または任意の他の方法を使用して作製可能である。このような方法は、核酸フラグメント単離に従う標準的な酵素的消化から（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）第５章、第６章を参照のこと）、例えば、ＭｉｌｌｉｇｅｎまたはＢｅｃｋｍａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  １Ｐｌｕｓ  ＤＮＡシンセサイザー（例えば、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ−Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡのＭｏｄｅｌ  ８７００自動シンセサイザーまたはＡＢＩ  Ｍｏｄｅｌ  ３８０Ｂ）を使用する、シアノエチルホスホルアミダイト法による純粋な合成方法までの範囲であり得る。オリゴヌクレオチドを作製するために有用な合成方法は、Ｉｋｕｔａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３−３５６（１９８４）（ホスホトリエステルおよびホスファイト−トリエステル法）、およびＮａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６５：６１０−６２０（１９８０）（ホスホトリエステル法）によってもまた記載されている。タンパク質核酸分子は、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．５：３−７（１９９４）によって記載されるものなどの公知の方法を使用して作製することができる。
【０１６８】
２．ペプチド合成
配列番号８などの開示されるタンパク質を作製する１つの方法は、タンパク質化学技術によって、２つ以上のペプチドまたはポリペプチドを一緒に結合することである。例えば、ペプチドまたはポリペプチドは、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）またはＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）のいずれかの化学反応を使用して、現在利用可能な実験設備を使用して化学合成できる（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。当業者は、開示されるタンパク質に対応するペプチドまたはポリペプチドが、標準的な化学反応によって合成可能であることを容易に認識する。例えば、あるペプチドまたはポリペプチドが合成でき、その合成樹脂から切断できないのに対して、ペプチドまたはタンパク質の他のフラグメントは、合成でき、続いて樹脂から切断でき、それによって、他のフラグメントに対して機能的にブロックされている末端基を露出する。ペプチド縮合反応によって、これらの２つのフラグメントは、それぞれ、それらのカルボキシル末端およびアミノ末端で、ペプチド結合を介して共有結合可能であり、抗体またはそのフラグメントを形成する（Ｇｒａｎｔ  ＧＡ（１９９２）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．（１９９２）；Ｂｏｄａｎｓｋｙ  Ｍ  ａｎｄ  ＴｒｏｓｔＢ．編（１９９３）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｉｎｃ．，ＮＹ（これは、少なくともペプチド合成に関連する物質のために、参照により本明細書に組み込まれる））。代替として、ペプチドまたはポリペプチドは、本明細書に記載されるように、独立してインビボで合成される。一旦単離されると、これらの独立したペプチドまたはポリペプチドは、同様のペプチド縮合反応を介して、ペプチドまたはペプチドフラグメントに結合されてもよい。
【０１６９】
例えば、クローニングされたセグメントまたは合成ペプチドセグメントの酵素的ライゲーションは、比較的短いペプチドフラグメントが、大きなペプチドフラグメント、ポリペプチド、または全体のタンパク質ドメインを産生されるように結合されることを可能にする（Ａｂｒａｈｍｓｅｎ  Ｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：４１５１（１９９１））。または、合成ペプチドの天然な化学的結合は、より短いペプチドフラグメントから、大きなペプチドまたはポリペプチドを合成的に構築するために利用することができる。この方法は２段階化学反応からなる（Ｄａｗｓｏｎら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：７７６−７７９（１９９４））。第１段階は、保護されていない合成ペプチド−チオエステルの、アミノ末端Ｃｙｓを含む別の保護されていないペプチドセグメントとの化学選択的反応であり、初期の共有結合生成物として、チオエステル結合中間体を与える。反応条件の変化を伴うことなく、この中間体は、自発的な、迅速な分子内反応を受けて、結合部位において天然ペプチド結合を形成する（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ  Ｍら（１９９２）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０７：９７−１０１；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ  Ｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１６０７５（１９９４）；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ  Ｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：３１２８（１９９１）；Ｒａｊａｒａｔｈｎａｍ  Ｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：６６２３−３０（１９９４））。
【０１７０】
または、保護されていないペプチドセグメント化学的に結合され、ここで、化学的結合の結果としてペプチドセグメント間で形成した結合は、非天然（非ペプチド）結合である（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，Ｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：２２１（１９９２））。この技術は、タンパク質ドメインの類似体、ならびに完全な活性を有する比較的純粋な大量のタンパク質を合成するために使用されてきた（ｄｅＬｉｓｌｅ  Ｍｉｌｔｏｎ  ＲＣら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＩＶ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２５７−２６７（１９９２））。
【０１７１】
３．組成物を作製するためのプロセスクレーム
組成物を作製するためのプロセス、ならびに組成物に導く中間体を作製するためのプロセスが開示される。例えば、配列番号９の核酸が開示される。これらの組成物を作製するために使用できる種々の方法、例えば、合成化学の方法および標準的な分子生物学の方法が存在する。これらおよび他の開示される組成物を作製する方法が具体的に開示されることが理解される。
【０１７２】
配列番号９に示される配列を含む核酸、および核酸の発現を制御する配列を操作的な方法で結合する工程を含むプロセスによって産生される核酸分子が開示される。
【０１７３】
配列番号９に示される配列に対して８０％同一性を有する配列を含む核酸分子、および核酸の発現を制御する配列を操作的な方法で結合する工程を含むプロセスによって産生される核酸分子が開示される。
【０１７４】
配列番号９に示される配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする配列を含む核酸分子、および核酸の発現を制御する配列を操作的な方法で結合する工程を含むプロセスによって産生される核酸分子が開示される。
【０１７５】
配列番号９に示されるペプチドをコードする配列を含む核酸分子、およびこの核酸分子の発現を制御する配列を操作的な方法で結合する工程を含むプロセスによって産生される核酸分子が開示される。
【０１７６】
配列番号９に示されるペプチドに対して８０％同一性を有するペプチドをコードする配列を含む核酸分子、およびこの核酸分子の発現を制御する配列を操作的な方法で結合する工程を含むプロセスによって産生される核酸分子が開示される。
【０１７７】
配列番号８からの任意の変化が保存性変化である、配列番号８に示されるペプチドに対して８０％同一性を有するペプチドをコードする配列を含む核酸分子、およびこの核酸分子の発現を制御する配列を操作的な方法で結合する工程を含むプロセスによって産生される核酸分子が開示される。
【０１７８】
開示される任意の核酸で細胞を形質転換するプロセスによって産生される細胞が開示される。天然には存在しない任意の開示される核酸で細胞を形質転換するプロセスによって産生される細胞が開示される。
【０１７９】
開示される任意の核酸を発現するプロセスによって産生される任意の開示されるペプチドが開示される。開示される任意の核酸を発現するプロセスによって産生される任意の天然には存在しない開示されるペプチドが開示される。天然には存在しない開示される任意の核酸を発現するプロセスによって産生される任意の開示されるペプチドが開示される。
【０１８０】
本明細書に開示される任意の核酸分子で動物の中の細胞をトランスフェクトするプロセスによって産生される動物が開示される。本明細書に開示される任意の核酸分子で、動物の中の細胞をトランスフェクトするプロセスによって産生される動物が開示され、ここで、動物は哺乳動物である。本明細書に開示される任意の核酸で動物の中の細胞をトランスフェクトするプロセスによって産生される動物もまた開示され、ここで、哺乳動物はマウス、ラット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、または霊長類である。
【０１８１】
本明細書に開示される任意の細胞を動物に加えるプロセスによって産生される動物もまた開示される。
【０１８２】
本願を通して、種々の刊行物が種々の刊行物が引用される。これらの刊行物の開示は、それが属する技術分野の状態をより完全に説明するために、参照によりそれらの全体が本願に組み込まれる。開示される引用文献はまた、その参照が依存する文章中に議論されている、それらに含まれる構成要素のために、個々におよび具体的に参照により組み込まれる。
【０１８３】
本発明の範囲および技術思想から逸脱することなく、種々の改変およびバリエーションが本発明において作製可能であることは当業者に明らかである。本発明の他の実施形態は、本明細書を考慮することおよび本明細書に開示される本明細書の実施から、当業者には明らかである。明細および実施例は例示のみと見なされ、本発明の真の範囲および技術思想は以下の特許請求の範囲によって示されることが意図される。
【実施例】
【０１８４】
Ｆ．実施例
以下の実施例は、当業者に、本明細書で特許請求される化合物、組成物、物品、デバイス、および／または方法がいかにして作製および評価されるかについての完全な開示および説明を提供するために示され、純粋に例示的であることが意図され、開示を限定することは意図されない。数値（例えば、量、温度など）に関して正確さを保証するための努力はなされてきたが、ある程度の誤差および偏差は考慮されるべきである。他に示されない限り、部は重量部であり、温度は℃または大気温度であり、圧力は大気圧またはその周辺である。
【０１８５】
実施例１：前立腺上皮アンドロゲン受容体を欠くマウスにおける前立腺細胞増殖の増加および細胞分化の損失
ａ）ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスの生成および特徴付け
ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスはｃｒｅリコンビナーゼを促進する前立腺上皮特異的プロモーターを含む（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｎ．Ｍ．ら、（１９９４）Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ８，２３０−９）。プロバシンプロモーター導入遺伝子の発現は、２〜７週で発現が増加し、発現の持続が生涯を通じて観察されることが報告されている（Ｗｕ，Ｘ．ら、（２００１）Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ  １０１，６１−９）。ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスの前立腺上皮におけるＡＲ遺伝子欠損を確証するために、候補マウスを、プロバシン−ｃｒｅ導入遺伝子および条件付きｆｌｏｘ−ＡＲ対立遺伝子について遺伝子型決定した（図１ａ）。組換えの特異性もまた、ＡＲ遺伝子のエキソン１および３に向けられたプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲによっていくつかの鍵となる器官において評価した。ＡＲエキソン２の欠失は、ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスの腹側前立腺および背外側前立腺の中でのみ存在する、ＲＴ−ＰＣＲを介する短縮型転写物の検出によって確認した（図ｂ）。この葉特異的発現は、他のモデルにおけるプロバシンプロモーター導入遺伝子促進性発現と一貫している（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｎ．Ｍ．ら（１９９５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２，３４３９−４３）。野生型（ＷＴ）またはｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスにおける他の組織は、短縮型のＡＲ−ＤＮＡを含まなかった。
【０１８６】
ＷＴマウスとｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスの間の生殖器−肛門の距離を含む、外部の特徴に変化はなかった（図１ｃ）。内部の泌尿生殖器器官もまた、ＷＴマウスとｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスの間で違いはなかった（図１ｄ、上のパネル）。対照的に、ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスは、２４週で有意に大きな腹側前立腺を有した（図１ｄ、右下）。ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスの腹側前立腺と背外側前立腺のいずれも、サイズが有意に変化していなかった。
【０１８７】
ＡＲの進行性の喪失は、免疫組織化学によって確認した。上皮ＡＲについての標識指標を決定し、一覧にした（図１ｅ、左）。上皮核に局在化したＡＲタンパク質は、ＷＴ同腹仔と比較して、ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスの齢とともにゆっくりと減少した。２４週までに、上皮ＡＲはほぼなくなった。上皮ＡＲシグナル伝達を間接的に評価するために、成熟動物におけるアンドロゲン調節タンパク質であるプロバシンの染色強度を定量した。プロバシン強度は、１２週齢まで、ｐｅｓ−ＡＲＫＯおよびＷＴ同腹仔の中で同様であり、ここでは、ＷＴと比較して減少したレベルのｐｅｓ−ＡＲＫＯサンプルは、有意さに近づいた（Ｐ＜０．０５７）。２４週までおよびその後、この違いは、有意であった（Ｐ＜０．０２７）（図１ｅ、右）。これらのデータは、プロバシン発現がＡＲの有意な喪失前には正常であり、上皮ＡＲの減少がＡＲ依存性分泌タンパク質の損失に先立つことを示す。
【０１８８】
ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスが拡大された腹側前立腺以外の異常を含むか否かを評価するために、生殖能力を評価した。ＷＴまたはｐｅｓ−ＡＲＫＯのいずれかである雄をＷＴ雌とつがわせたとき、同腹仔サイズの有意な違いが存在した（図１ｆ）。腹側前立腺のサイズの変化が循環しているアンドロゲンレベルに起因し得る可能性を除外するために、血清テストステロンレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。１２週齢または２４週齢のＷＴ雄とｐｅｓ−ＡＲＫＯ雄の間で違いは観察されなかった（図１ｆ、右）。それとともに、図１に示される結果は、ＡＲの効果的な欠失が前立腺上皮に限定されること、およびＡＲ遺伝子欠失の結果は前立腺に制限されるようであり、血清テストステロンの影響を伴わないことを実証する。
【０１８９】
ｂ）ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスにおける分化した腺構造の損失
前立腺の組織形態学は、前側前立腺、背外側前立腺、および腹側前立腺について、２〜６週まで毎週、次いで、３２週まで週２回調べた。初期には、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ腺は正常に見え、考慮すべき前立腺の出芽および長い柱状の腺上皮への分化を示した（図２）。９週目の件から開始して、この分化状態の進行性の損失は、腹側前立腺において観察された。顕著に腺の陥入の喪失が存在し、上皮細胞はここでは短くかつ立方形状に見え、分裂した分泌上皮細胞の典型的な特徴を欠いていた（図２）。
【０１９０】
ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスの腹側前立腺における前立腺の出芽の誘導は正常に発達し、前立腺上皮は成熟に達し、ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスとＷＴ同腹仔の両方について５〜６週齢において腺陥入を有する高分泌性柱状上皮を含んだ（図２ａ）。９週齢のｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスにおいて、腹側前立腺の中のいくつかの管は、ＷＴ同腹仔からのより長いまたはより柱状の上皮と比較して、高さがより短くまたは低い立方形であった上皮を含んだ。ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスにおける腺陥入の損失は、前立腺上皮の形態の損失と一貫した（図２ａ）。これらの組織形態学的変化は、２４週（およびそれ以降）までの時間にわたって増加し、ほぼすべての管が、低い高さの上皮の脱分化および腺陥入の欠如を含んだ（図２ａ）。
【０１９１】
１４週齢のｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスにおいて、増加した数の細胞が、前立腺管腔中で脱離した層として見い出された（図２ｅ）。組織学的な脱分化が見られた管において、正常な腺陥入（図２ｂ）ならびにそれらの基部における収縮を有する一連の陥入（図２ｃ、ｄ）が観察できた。陥入がそれらの基部において狭くなるにつれて、基部から先端部まで移動する核によって観察されるように、細胞は極性を失ったように見える。最終的には、腺陥入は失われ、外見上前立腺管腔に脱落した（図２ａ）。
【０１９２】
ｃ）上皮ＡＲの損失はアンドロゲンによって調節される遺伝子発現を減少する
異なる齢のＷＴおよびｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスからの腹側前立腺を、ＡＲおよびアンドロゲンによって調節されるプロバシンについて染色した（図３）。３週目において、上皮細胞と間質細胞の両方におけるＡＲ染色は２つの系統において明白であった。６週目において、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ前立腺は、顕著に弱い上皮ＡＲ染色を有し始め、２４週までに、上皮におけるＡＲ染色は消失したようである。ＡＲタンパク質を欠いているｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスの背外側前立腺の中の上皮細胞の少ないパーセンテージもまた存在したが、腹側前立腺のほぼすべての管腔細胞がＡＲについてポジティブであった。ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスの腹側前立腺の中でのプロバシンの下降は、ＡＲのそれに遅れたが、２４週までに消失した（図３）。重要なことに、間質ＡＲは、評価したすべての段階において見られた。
【０１９３】
プロバシン、前立腺分泌タンパク質−９４（ＰＳＰ９４）、およびＮｋｘ３．１は、アンドロゲンによって転写制御されることが知られている３つの前立腺特異的タンパク質である（Ｈｅ，Ｗ．Ｗ．ら（１９９７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４３，６９−７７；Ｋｗｏｎｇ，Ｊ．，（２０００）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４１，４５４３−５１）。しかし、間質ＡＲシグナル伝達または上皮ＡＲがそれらの調節の原因であるか否かについては知られていない。下流の遺伝子発現に対する上皮ＡＲシグナル伝達の損失を評価するために、６週、１２週、１８週、および３２週のＷＴおよびｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスからの腹側上皮ＲＮＡに対して、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。ｐｅｓ−ＡＲＫＯ腹側前立腺において、プロバシンおよびＰＳＰ９４の転写的ダウンレギュレーションが１８週目で観察され、３２週の最終的な時点にわたって残った（図４ａ）。Ｎｋｘ３．１は、前立腺の形態形成およびパターン化を支配する転写因子（Ｂｈａｔｉａ−Ｇａｕｒ，Ｒ．ら（１９９９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １３，９６６−７７）、ならびに腫瘍の開始および進行におけるマーカーである（Ｋｉｍ，Ｍ．Ｊ．ら（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６２，２９９９−３００４）。Ｎｋｘ３．１遺伝子発現は、１２週までに有意に減少し（Ｐ＜０．０５）、３２週にわたって低いままであった（図４ａ）。Ｎｋｘ３．１の発現の減少は、腺陥入の顕著な損失と一致する。従って、ＡＲシグナル伝達は、１２週までに前立腺上皮の中で顕著に失われ、その上皮ＡＲは、これらの遺伝子の主要な転写調節因子である。これらのデータは、上皮ＡＲが分泌タンパク質発現を支配することを示唆する報告と一致し（Ｄｏｎｊａｃｏｕｒ，Ａ．Ａ．  ＆  Ｃｕｎｈａ，Ｇ．Ｒ．（１９９３）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３２，２３４２−５０）、上皮ＡＲシグナル伝達の損失は、成熟前立腺の生化学的と構造的の両方の脱分化に導く。
【０１９４】
ｄ）成熟前立腺成長はｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスにおいて増加する
組織成長は肥大および／または過形成を通して起こり、細胞死によってバランスがとれている。正常な成体前立腺は成長静止状態であるのに対して、前立腺疾患においては、器官サイズおよび上皮増殖が増加する。ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスの腹側前立腺は、それらのＷＴ同腹仔のそれよりも大きかった。ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスからの腹側前立腺の組織学的試験において注目されるように、上皮細胞はサイズが縮小し、腹側前立腺の拡大は肥大に起因するのではなかった（図２ａ、１４〜３２週）。腹側前立腺成長を調べるために、ブロモ−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込みを評価した。１４週までの成熟期前および成熟前立腺は、系統に関わらずＢｒｄＵ取り込みに違いはなく、上皮細胞核に主として局在化された（図４ｂ）。しかし、２４週までに、上皮ＡＲのほぼ完全な損失と同時に、ＢｒｄＵ取り込みは、ＷＴ同腹仔よりもｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスの前立腺上皮の中で有意に高かった（図４ｂおよびｃ）。この知見は、増殖している細胞の核抗原についての免疫組織化学試験（ＰＣＮＡ）で確認した。前立腺上皮細胞の増殖は、アンドロゲンによって調節される間質因子によって（Ｃｈａｎｇ，Ｃ．Ｓ．ら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０，３２４−６；Ｗａｎｇ，Ｙ．ら、（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６１，６０６４−７２）、および上皮細胞上で直接的な増殖効果を有するアンドロゲンによって（Ｂｅｌｌｏ，Ｄ．ら（１９９７）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １８，１２１５−２３；Ｄａｎｉｅｌｐｏｕｒ，Ｄ．ら（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５４，３４１３−２１）維持されていることは広く受け入れられている。しかし、今や、上皮アンドロゲン／ＡＲシグナル伝達が管腔上皮細胞中の成長抑制因子の産生を誘導することが明らかである。これは、増殖を阻害するために、根底にあるＡＲ−陰性前駆細胞に作用する。それゆえに、ＡＲの除去は、管腔細胞の成長抑制効果を放棄し、増殖が起こる。ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスの上皮の中のＡＲの欠如は、ＡＲが間質中にのみ存在し、上皮には存在しないという点において、初期前立腺発生において観察されるものを空間的に反復する（Ｓｈａｎｎｏｎ，Ｊ．Ｍ．およびＣｕｎｈａ，Ｇ．Ｒ．（１９８３）Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ４，３６７−３７３；Ｔａｋｅｄａ，Ｈ．ら（１９８５）Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１０４，８７−９２）。興味深いことに、発生のこの時間中、上皮増殖は高い（Ｄｏｎｊａｃｏｕｒ，Ａ．Ａ．およびＣｕｎｈａ，Ｇ．Ｒ．（１９８８）Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｌ．１２８，１−１４；Ｓｕｇｉｍｕｒａ，Ｙ．，Ｃｕｎｈａ，Ｇ．Ｒ．およびＤｏｎｊａｃｏｕｒ，Ａ．Ａ．（１９８６）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．３４，９６１−９７１）。ここに提示する結果は、前立腺生物学の新たな概念概念を提示し、ここでは、上皮ＡＲが、成熟前立腺における上皮増殖の抑制因子として作用することによって、上皮増殖を制御可能である。
【０１９５】
基底および管腔の上皮細胞のための免疫細胞化学マーカーを使用し、次いで、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ動物が成熟するにつれて、ｐ６３−陽性基底上皮細胞集団が成熟期の間に増加し、次いで、上昇したままであるのに対して、サイトケラチン−８および−１８陽性管腔上皮細胞集団は下降したことが決定された。対照的に、ＷＴ動物において、基底細胞数は年齢とともに下降したが、管腔細胞集団は安定なままであった（図５）。
【０１９６】
ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスにおいて時間の経過とともに上皮細胞の集団が増加したことを評価するために、各細胞型を、細胞特異的マーカーを使用して同定した。基底細胞および管腔細胞は、ｐ６３（Ｓｉｇｎｏｒｅｔｔｉ，Ｓ．ら（２０００）  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １５７，１７６９−７５；Ｗａｎｇ，Ｙ．ら（２００１）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ６８，２７０−２７９）ならびにサイトケラチン−８および−１８（Ｈａｙｗａｒｄ，Ｓ．Ｗ．ら（１９９６）Ａｃｔａ  Ａｎａｔ（Ｂａｓｅｌ）１５５，８１−９３）に対する抗体を使用すると、それぞれ、組織化学的に同一であった。ｐ６３の発現は、上皮発生および形態形成を持続するために必要である前駆細胞−細胞集団を維持するために重要である（Ｙａｎｇ，Ａ．ら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ３９８，７１４−８；Ｓｉｇｎｏｒｅｔｔｉ，Ｓ．およびＬｏｄａ，Ｍ．（２００６）Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ５，１３８−４１）。予想された通り、基底細胞の数は、ＷＴマウスにおいて時間の経過とともに減少したのに対して、ｐ６３陽性細胞数は、３２週にわたって、ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスにおいて上昇したままであった（図５）。ＢｒｄＵ−陽性細胞は、主として、ＣＫ５−陽性基底細胞とともに、より少ない程度では、ＣＫ８陽性細胞と共局在化する（図６ｄ）。サイトケラチン−８および−１８、ならびにパン−サイトケラチン陽性細胞の局在化は、成熟期にわたって、ＷＴおよびｐｅｓ−ＡＲＫＯにおいて類似していた。しかし、ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスが加齢するにつれて、ＡＲタンパク質発現は減少し、サイトケラチン−８、−１８、ならびにパン−サイトケラチン陽性細胞の発現は減少した（図５）。
【０１９７】
細胞死を評価するために、組織学的およびＴＵＮＥＬ染色をｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスからの腹側前立腺において使用した（図６ｂ）。しかし、管腔中では、脱落した上皮の層、免疫細胞、および断片化したＤＮＡが観察された。ＴＵＮＥＬ分析は、腹側前立腺上皮および間質で、ＷＴとｐｅｓ−ＡＲＫＯの間でアポトーシス速度に違いがないことを実証した。しかし、ＴＵＮＥＬ陽性細胞または核断片は、ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスの前立腺管腔の中で観察された。アンドロゲン／ＡＲシグナル伝達の欠如は、間質を通して媒介されることが示されてきたので、上皮層の中でのアポトーシスの欠如は驚くべきことではない。無傷上皮中ではアポトーシス細胞はほとんど存在しなかったので、このことは、ＤＮＡ断片化の検出の前にそれらの基底膜から脱離することによって、管腔中のＴＵＮＥＬ陽性上皮細胞がアノイキスを受け（Ｒｅｄｄｉｇ，Ｐ．Ｊ．およびＪｕｌｉａｎｏ，Ｒ．Ｌ．（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ  ２４，４２５−３９）、ＴＵＮＥＬ陽性ＤＮＡの蓄積および管腔中での免疫細胞の除去をもたらしたことを示す。これらのデータは、上皮ＡＲ／シグナル伝達の欠如が、上皮細胞の管腔への脱落（図２ｂ−ｄおよび図６ａ）、最終的には上皮細胞の細胞死（図６ｂ）をもたらすことを実証する。
【０１９８】
ｅ）Ｔ８５７Ａ−ＡＲのノックインを介するＡＲの回復機能はｐｅｓ−ＡＲＫＯを正常前立腺表現型に回復させる
成長および形態学的属性が構成的に活性されるＴ８５７Ａ−ＡＲ（機能的ヒト変異体ＡＲ、Ｔ８７７Ａに等価なマウスＡＲ変異体は、ＬＮＣａＰ細胞ならびにヒト前立腺腫瘍において見い出される（Ｈａｎ，Ｇ．ら、（２００５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０２，１１５１−６；Ｈａｎ，Ｇ．ら（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６，１１２０４−１３）の、ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスの前立腺上皮への「ノックイン」後に、レスキューできるか否かの決定が望まれていた。なぜなら、細胞増殖および分化の欠如は、前立腺上皮中でＷＴ  ＡＲの除去に伴って観察されたからである。それゆえに、このようなノックインマウスを作製し、次いで、上皮ＡＲおよびＡＲ依存性機能の回復についてこれらを評価した。上記の研究に記載される判断基準を使用して、前立腺上皮へのＡＲの回復は、細胞増殖および分化に対するＡＲ依存性効果を回復したことが見い出された（図７）。集合的に、ノックインＡＲ実験を介してのこれらの機能の獲得は、結論として、上皮ＡＲが細胞分化および増殖のための必須の役割を果たしていることを実証し、この役割とは、以前には間質因子に帰するとされていた役割である（Ｃｕｎｈａ，Ｇ．Ｒ．およびＬｕｎｇ，Ｂ．（１９７８）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｚｏｏｌ  ２０５，１８１−９３；Ｃｕｎｈａ，Ｇ．Ｒ．ら（２００４）Ｊ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ９２，２２１−３６）。
【０１９９】
ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスの前立腺上皮へのＡＲの回復は記載されるｐｅｓ−ＡＲＫＯ表現型を逆転するか否かを決定するために、三重変異体マウスを作製した。これは、Ｔ８５７Ａ−ＡＲ、ｆｌｏｘＡＲ、およびＡＲＲＰＢ２−ｃｒｅを含み、Ｔ８５７Ａ／ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスを生じ、これは、前立腺上皮中にＷＴ  ＡＲを有さないが、トランスジェニックＴ８５７Ａ−ＡＲを発現する。ゲノムＤＮＡ（ＰＣＲ）、ｍＲＮＡ（ｒｔＰＣＲ）、およびタンパク質アッセイ（免疫組織化学）は、すべて、Ｔ８５７Ａ／ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスにおいてＷＴ  ＡＲの欠失およびＴ８５７Ａ−ＡＲの好適な発現が生じたことを実証した。Ｔ８５７Ａ／ｐｅｓ−ＡＲＫＯと、ＷＴまたはｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスの間では、外的な違いは見られなかった。Ｔ８５７Ａ／ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスの全体の解剖は、任意の段階において、ＷＴとｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスの間で内部泌尿生殖器にほとんど違いがないことを明らかにした。重要なことに、腹側前立腺は、ＷＴ同腹仔と比較してサイズが同様であった。腹側前立腺は、ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスにおけるよりも、Ｔ８５７Ａ／ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスにおいてはるかに小さかった。予想されたように、ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスにおけるＡＲシグナル伝達の回復は、３２週齢のＷＴマウスのそれと全く同様の腺上皮表現型を生じた（図７）。これには、腺陥入および長い分泌性柱状細胞の存在が含まれた。正常前立腺構造を回復することに加えて、Ｔ８５７Ａ／ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスの上皮中の機能的ＡＲの発現は、上皮の中での生化学的変化および分化マーカーの再発現を刺激した。これらの変化には、分泌タンパク質、ＰＳＰ９４およびプロバシンの遺伝子発現の増加が含まれた（図７）。Ｔ８５７Ａ／ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスにおける上皮細胞増殖を測定するために、ＢｒｄＵ標識指標を上記のように決定した。重要なことには、Ｔ８５７Ａ／ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスにおける腹側前立腺は、ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスにおけるそれよりも小さく、このことは、ＷＴマウスからの前立腺におけるものと同様の増殖の欠如を示す。ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスにおけるアンドロゲン／ＡＲ作用の回復は、上皮増殖を、ＷＴ同腹仔と違わないレベルまで顕著に減少した（図７ｂ、右）。集合的に、これらの機能獲得実験は、ＡＲが前立腺上皮増殖をインサイチュとインビボの両方で抑制可能であることを示す。
【０２００】
ｆ）結論
成体正常前立腺の鍵となる特徴は、増殖を刺激するアンドロゲンが存在する場合であっても増殖が欠如することである。これは、上皮細胞が増殖する能力を獲得している良性前立腺過形成および前立腺癌とは対照的である。本発明において、細胞生物学および癌研究において大きな影響力を持つ２つの発見が開示される。第１に、成熟前立腺上皮において、ＡＲが前立腺の分化した表現型および全体的な恒常性を維持するために重要であることが開示される。さらに、上皮ＡＲシグナル伝達の除去は、さもなくば増殖静止状態である前立腺の有糸分裂誘発を刺激する。これらのデータは、分化した前立腺上皮におけるＡＲが、上皮増殖抑制因子の誘導（または成長刺激因子の産生の減少）を介して恒常性を維持するという仮説を支持する。この抑制因子は、間質因子を間接的に通過することができ、または推定のＡＲ陰性幹細胞または前駆細胞に対して直接的に作用でき、それによって、上皮増殖を阻害する。第２に、マウスおよびヒトの前立腺癌細胞モデルからの４通りの別々の手段を通して、上皮ＡＲシグナル伝達の損失は、浸潤性および転移の潜在性を増強することが開示される。ＡＲがこれらのプロセスを媒介するメカニズムは、傍分泌因子を含む、複数の要因であり得る。アンドロゲン／ＡＲシグナル伝達は、前立腺癌において異常であるので、上皮ＡＲ誘導性増殖抑制因子の欠損が、幹細胞および／または前駆細胞の増殖を可能にし、これが次には、発癌を容易にし、最終的には不死化に導くという可能性がある。正常な前立腺成長は、間質ＡＲの増殖的な役割と上皮ＡＲの成長抑制的な役割の間の繊細な時間的および空間的なバランスを必要とする。これらの知見は、前立腺におけるアンドロゲン／ＡＲシグナル伝達の役割を再構築し、結果として、上皮のＡＲの抑制的な役割を考慮することなく、増殖を防止するために間質のＡＲと拮抗させることに、専らかつ無差別的に依存している、前立腺疾患のための現在の治療的ストラテジーに疑問を呈する。
【０２０１】
ｇ）方法
（１）トランスジェニックマウスの生成
ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスを生成するために、ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウス、ＡＲＲＰＢ２−Ｃｒｅトランスジェニックマウス（Ｗｕ，Ｘ．ら（２００１）Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ  １０１，６１−９）（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ、ＮＩＨより）を、条件付きＡＲ対立遺伝子（ｆｌｏｘｅｄ  ＡＲ；図８）を含むマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）（Ｙｅｈ，Ｓ．ら（２００２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９９，１３４９８−５０３）とつがわせた。ｐｅｓ−ＡＲＫＯ／Ｔ８５７Ａ  ＡＲマウスを生成するために、３種のトランスジェニックマウス、ＡＲＲＰＢ２−Ｃｒｅマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ）、ｆｌｏｘｅｄ  ＡＲマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）、および  Ｔ８５７Ａ  ＡＲマウス（ＦＶＢ）（Ｄｒ．Ｎ．Ｇｒｅｅｎｂｕｒｇ，ＦＨＣＲＣ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡから寄与された）を異種交配させた。
【０２０２】
（２）統計学
データは平均±標準偏差（ＳＤ）として表示した。比較は、両側スチューデントｔ検定を使用して群間で行った。Ｐ値＊Ｐ＜０．０５または＊＊Ｐ＜０．０１は有意であると見なした。生存曲線は、カプラン−マイヤー分析およびログ−ランク検定によって分析した。
【０２０３】
（３）免疫組織化学
ｐｅｓ−ＡＲＫＯ試料：３つすべての葉は、同じブロックに包埋し、５μｍ切片を調製した。免疫検出は、ＶｅｃｔａＳｔａｉｎキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）中で実施した。以下の抗体を使用した：抗ＡＲ（Ｃ−１９、１：２００）、抗プロバシン（１：３００）、抗Ｅ−カドヘリン（１：１００）、抗ＣＫ１４（１：５０）、抗ＣＫ８／１８（１：１００）、抗Ｐ２７（１：２００）、抗ＲｈｏＢ（１：３００）、抗ＰＣＮＡ（１：５００）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、抗ｐ６３（１：５０）（ａｂｃａｍ）、および抗ＳＭＡ（１：１００）（Ｓｉｇｍａ）。ＡＲポジティブ対全体の核の比率は、３つの無作為に選択した領域の各々において、少なくとも５００個の細胞において計算した。
【０２０４】
免疫蛍光染色は、一次抗体（抗ＣＫ８／１８、抗パンサイトケラチン、抗カルポニン）との、室温で１時間のインキュベーションによって実施した。次いで、切片を、二次ビオチン化抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）と、次いで、ＦＩＴＣまたはＴｅｘａｓ  ｒｅｄ結合体化（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）とインキュベートした。スライドは、顕微鏡検査のためにアンチフェイディング媒体とともに装着した。
【０２０５】
（４）Ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰおよびＰＣ−３組織：
ＰＬＮおよび肝臓からの組織サンプルは、緩衝化中性ホルマリン（ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）中で、室温にて一晩固定した。組織は、７０、８５、９５、および１００％エタノールを通すことによって脱水し、キシレンで清浄し、１：１キシレン／パラフィンで４５分間処理し、パラフィン中に包埋した。この組織切片は、５〜７μｍ厚に切断し、Ｐｒｏｂｅ−Ｏｎ  Ｐｌｕｓ充填スライド（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に装着した。免疫組織化学のために、切片は５５℃で少なくとも２時間加熱し、キシレン中で脱パラフィン処理し、再水和し、Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）／ｐＨ  ８．０中で洗浄した。抗原検索のために、スライドは、０．０１Ｍ  クエン酸ナトリウム／ｐＨ  ６．０中でマイクロ波照射し、メタノール中１％過酸化水素に３０分間浸漬し、ＴＢＳ中２０％正常ヤギ血清で６０分間ブロッキングした。ＰＢＳでの洗浄後、切片は、１％ＢＳＡを含むＴＢＳ中で１：２００希釈したＴ−ａｇ、ＡＲ、およびパン−ＣＫ−１０抗体と９０分間、続いて、１％ＢＳＡを含むＴＢＳ中で１：３００希釈したヤギ抗ウサギビオチン化二次抗体とインキュベートした。スライドは、ヘマトキシリンで３０分間対比染色し、脱水し、キシレンで清浄し、装着し、陰性対照のために、一次抗体をＴＢＳ中正常ヤギＩｇＧまたは１％  ＢＳＡで置き換えた。
【０２０６】
（５）ＲＮＡの単離および分析
総細胞ＲＮＡは各葉から単離し、ＲＴ−ＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲによる分析のためにランダムプライムド第１鎖相補的ＤＮＡを合成するために使用した。ＡＲエキソン２、Ｎｋｘ３．１、プロバシン、およびＰＳＰ  ９４の増幅は（プライマー配列については表５を参照のこと）、各サンプル中のβアクチンに標準化した。
【０２０７】
【化１３】
2009537142.tif 000015
（６）アポトーシスアッセイ
インサイチュ細胞死検出キット（Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）（Ｒｏｃｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｎｕｔｌｅｙ  ＮＪ）は、アポトーシス細胞の検出のために製造業者の指示書に従って使用した。
【０２０８】
（７）ＢｒｄＵ標識指標
マウスは、屠殺の２４時間前にＢｒｄＵ（３０ｕｇ／ｇｍ体重、Ｓｉｇｍａ）をＩ．Ｐ．で注射した。ＢｒｄＵ標識上皮細胞は、アポトーシス細胞の検出のために製造業者の指示に従って、モノクローナル抗ＢｒｄＵ抗体（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を利用して検出した。標識した細胞は、各スライドの複数の視野から計算した。各前立腺からのいくつかの切片を分析し、ＢｒｄＵ陽性上皮細胞の平均値を得た。前立腺の各葉から増殖している細胞の平均値を報告した。
【０２０９】
２．実施例２：前立腺上皮アンドロゲン受容体は前立腺癌転移のための抑制因子として機能する
未分化前立腺癌細胞株の研究からの実験的証拠は、アンドロゲンによって活性化されたときに、上皮ＡＲが細胞増殖を増加するというアイデアをもたらした（Ｂｅｌｌｏ，Ｄ．ら（１９９７）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １８，１２１５−１２２３；Ｄａｎｉｅｌｐｏｕｒ，Ｄ．ら（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４，３４１３−３４２１；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｈ．ら（２００３）Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｌａｔ  Ｃａｎｃｅｒ  １０，２０９−１６）。臨床的研究はまた、アンドロゲン／アンドロゲン受容体（ＡＲ）機能の抑制を伴うアンドロゲン枯渇療法（ＡＤＴ）が、多くの前立腺癌患者にとって有効な治療であることを指摘している（（１９６７）Ｓｕｒｇ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｂｓｔｅｔ．１２４：１０１１−１０１７；Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｅ．Ｍ．ら（１９９９）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４１，１７８１−１７８８）。しかし、多くの患者の腫瘍は、継続的なＡＤＴの１〜２年後に再成長する（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ａ．ら（１９９８）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３９，１０３６−１０４２）。アンドロゲン／ＡＲの抑制が最終的に前立腺腫瘍転移を抑制するのに失敗する理由の詳細なメカニズムは明らかではない。
【０２１０】
前立腺上皮中にのみＡＲを欠き、自発的に前立腺癌を生成する最初のマウス（ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰ）の世代が本発明に開示される。顕著には、ＡＲ獲得−および機能の損失−および上皮−間質細胞との同時培養実験を通して、前立腺癌細胞における上皮ＡＲの新規な抑制的な役割が実証される。本発明から導き出された、直観で分かるものではないアイデアは、前立腺疾患と闘う方法に革命を起こす。
【０２１１】
ａ）結果
（１）上皮ＡＲは前立腺癌細胞の浸潤性の抑制因子であり、間質ＡＲはその刺激因子である
（ａ）ＰＣ３−ｖ細胞対ＰＣ３−ＡＲ９細胞
ＡＲが以下にして前立腺癌の転移に影響を与えるかを精査するために、前立腺癌患者からの骨転移性腫瘍からもともと単離した前立腺癌ＰＣ３細胞を、ヒトＡＲプロモーターと結合した機能的ＡＲ  ｃＤＮＡで安定にトランスフェクトした（Ｍｉｚｏｋａｍｉ，Ａ．ら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８  ７７−８８）。ＡＲが強力なウイルスプロモーターで過剰発現され（Ｙｕａｎ，Ｓ．ら（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３，１３０４−１３１１）、非天然のＡＲの積み重ねをもたらす他の細胞モデルとは異なり、ＰＣ３−ＡＲ９と名付けられたこれらの細胞は、正常な量の機能的ＡＲを発現し、アンドロゲンであるジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）によって活性化される（図９ａ−ｂ）。浸潤アッセイを使用して２つの系統を比較すると、ＰＣ３−ＡＲ９は、ベクターのみで安定にトランスフェクトされた親のＰＣ３細胞（ＰＣ３−ｖと名付けた）よりも、有意に低い浸潤性であることが見い出された（図９ｃ）。
【０２１２】
（ｂ）ＷＰＭＹｌ−ｖ細胞対ＷＰＭＹｌ−ＡＲｓｉ細胞
これらの驚くべき結果は、前立腺ＡＲが前立腺癌の進行を促進するための刺激因子として機能するはずであると考えている、前立腺分野における古典的な概念と対照的であり、前立腺癌の細胞浸潤におけるＡＲの役割を確認するために、間質ＷＰＭＹ１細胞（Ｗｅｂｂ，Ｍ．Ｍ．ら（１９９９）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２０，１１８５−１１９２）とＰＣ３−ｖ細胞を同時培養することのさらなる適用を促進した。初期の報告は、ＷＰＭＹ１細胞において発現された機能的ＡＲが、アンドロゲン依存性ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）遺伝子発現の促進をもたらしたことを実証した（Ｈｅｉｔｚｅｒ，Ｍ．Ｄ．およびＤｅＦｒａｎｃｏ，Ｄ．Ｂ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６，７３２６−７３３３）。本発明において、内因性ＡＲ発現は、ＡＲ−ｓｉＲＮＡ（ＷＰＭＹｌ−ＡＲｓｉと名付けた）の安定なトランスフェクションを用いてＷＰＭＹ１細胞中でノックダウンされ、細胞浸潤アッセイのために、Ｂｏｙｄｅｎチャンバーの異なる層で（図９ｄ）、ＰＣ３−ｖ細胞と同時培養した。結果は、ＷＰＭＹｌ−ＡＲｓｉ細胞中での間質ＡＲのノックダウンは、上皮ＰＣ３−ｖ細胞浸潤の抑制を生じることを示した（図９ｅ−ｆ）。対照的に、Ｂｏｙｄｅｎチャンバー中でＰＣ３−Ｖ細胞またはＰＣ３−ＡＲ９細胞のいずれかのみを有するベクターでトランスフェクトしたＷＰＭＹ１−ｖ細胞の同時培養からの結果は、ＰＣ３−ＡＲ９細胞中の上皮ＡＲの添加が上皮細胞浸潤の抑制を生じること（図９ｅ−ｆ）、およびＷＰＭＹｌ−ＡＲｓｉ細胞とのＰＣ３−ＡＲ９細胞の同時培養は、細胞浸潤をさらに抑制したこと（図９ｅ−ｆ）を示した。これらの同時培養の結果は図９ｃを確認し、上皮ＡＲが前立腺癌の細胞浸潤の抑制因子として機能すること、および間質ＡＲが前立腺癌の細胞浸潤の刺激因子として機能することを示す。
【０２１３】
（ｃ）ＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／＋細胞対ＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／−細胞
上皮ＡＲが前立腺癌の細胞浸潤の抑制因子として機能することを示す、予測しなかった結果をさらに確認するために、相同遺伝子組換えストラテジーを使用する別のアプローチ（Ｙｅｈ，Ｓ．ら（２００３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９８，１８９９−１９０８）を、ホルモン不応性前立腺腫瘍から単離したヒトＣＷＲ２２Ｒ前立腺癌細胞におけるノックダウンＡＲ（Ｎａｇａｂｈｕｓｈａｎ，Ｍ．ら（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６，３０４２−３０４６）に適用した。図９ｇに示されるように、ＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／−細胞細胞は、親のＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／＋細胞と比較して、はるかに少ないＡＲを発現し、無視できるＡＲトランス活性化であった。Ｂｏｙｄｅｎチャンバー浸潤アッセイは、再度、ＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／−細胞におけるノックダウンＡＲが、親のＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／＋細胞と比較して、より浸潤性を生じることを実証した（図９ｇ、下のパネル）。ＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／−細胞におけるノックダウンＡＲに対するＡＲ−ｓｉＲＮＡを介する異なるアプローチを使用することもまた、親のＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／＋細胞と比較して、より浸潤性を有するという同様の結論を生じ、機能的ＡＲをＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／−細胞に戻して加えると、空のベクターのみでトランスフェクトされたＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／−細胞と比較して、細胞浸潤の減少を生じる（図９ｈ）。
【０２１４】
異なる前立腺癌細胞を用いる、４つの異なるアプローチ（ノックイン、遺伝子組換えを用いるノックダウン、ｓｉＲＮＡを用いるノックダウン、および同時培養系）を使用する図９からの結果をまとめると、すべては、上皮ＡＲが前立腺癌浸潤を抑制するための抑制因子として機能することを実証している。
【０２１５】
（２）ＰＣ３−ＡＲ９細胞中の機能的ＡＲの付加は、インビボマウスモデルにおいて浸潤の減少を生じる
ＰＣ３細胞は骨転移性腫瘍から単離されるので、骨と接触したＰＣ３−ＡＲ９細胞中のＡＲの浸潤活性をさらに調べた。破骨細胞形成は、骨−ウェハ再吸収アッセイにおいてアッセイした（Ｇｏａｔｅｒ，Ｊ．Ｊ．ら（２００２）Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．２０，１６９−１７３）。ＰＣ３−ｖまたはＰＣ３−ＡＲ９細胞は、骨ウェハの上に重層した新生ラット骨髄からの骨細胞とともに同時培養し、破骨細胞形成（Ｇｏａｔｅｒ，Ｊ．Ｊ．ら（２００２）Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．２０，１６９−１７３）を定量した。この実験からの結果は、親のＰＣ３−ｖ細胞と比較して，ＰＣ３−ＡＲ９細胞において、減少した数の溶骨性病変（へこんだ部分）を実証した（図１０ａ）。インビボでの浸潤特性を評価するために、細胞は、ヌードマウスの脛骨に注射した（Ｃｏｒｅｙ，Ｅ．ら（２００２）Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ５２，２０−３３）。ｘ線分析により決定されるように、ＰＣ３−ｖ腫瘍は、ＰＣ３−ＡＲ９よりも、より攻撃的に（図１０ｂ）かつより浸潤的に（図１０ｃ）成長した。集合的には、機能的ヒトＡＲのノックインからのこれらの機能獲得データは、前立腺上皮ＡＲシグナル伝達の損失は、インビボとインビトロの両方で、浸潤を直接的に促進し、間接的に周囲の微小環境に影響を及ぼすことを示す。
【０２１６】
さらに、転移性アッセイにおけるＡＲの役割は、インビボマウスモデルにおいて試験した。ＰＣ３−ｖ細胞またはＰＣ３−ＡＲ９細胞のいずれかを、ヌードマウスの前部前立腺に直接的に同所注射した。予想されたように、ＰＣ３−ｖ細胞を注射したマウスは、ＰＣ３−ＡＲ９細胞を注射したマウスと比較して、リンパ節により大きな転移性腫瘍を発生した（図１０ｄ）。
【０２１７】
ＰＣ３−ｖ、ＰＣ３−ＡＲ９、ＷＰＭＹ１−ｖ、およびＷＰＭＹ１−ＡＲｓｉの異なる同時培養の組み合わせもまたヌードマウスの前部前立腺に同所注射した。予想されたように、これらのインビボデータは図９のインビトロデータと一致して、ＰＣ３−ＡＲ９中の上皮ＡＲの付加は、リンパ節中でより少ない転移性腫瘍を発生し、間質ＷＰＭＦ１−ＡＲｓｉ細胞におけるノックダウンＡＲもまた、リンパ節においてより少ない転移性腫瘍を発生した（図１０ｅ）。
【０２１８】
まとめると、種々のヒト前立腺癌細胞におけるノックダウンまたはノックインのいずれかのＡＲを使用して、インビトロ細胞株データおよびインビボマウスデータは、すべてが、上皮ＡＲが前立腺転移性腫瘍浸潤を抑制するための抑制因子として機能すること、および間質ＡＲが前立腺転移性腫瘍浸潤を促進するための刺激因子として機能することを実証する。
【０２１９】
（３）ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスは、より攻撃性かつ浸潤性の転移性腫瘍を発生する
これまでのところ、上記のすべてのデータは、インビトロ細胞同時培養系からまたはインビボマウスモデルからのいずれも、すべてがヒト前立腺癌細胞から生じた。従って、実験は、上記の結論を証明するために、別のインビボ動物モデルとして、前立腺腫瘍を自発的に発生できるマウスを使用するように修飾した。雌性ｆｌｏｘ／ＡＲ（Ｃ５７ＢＬ／６／１２８）マウス（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｈ．ら（２００３）Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｌａｔ  Ｃａｎｃｅｒ  １０，２０９−１６）を、ＴＲＡＭＰ（Ｃ５７ＢＬ／６／ＴＲＡＭＰ×ＦＶＢ）マウス（Ｈｉｌｌ，Ｒ．Ｅ．ら（２００３）Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２２８，８１８−８２２）とつがわせて、ｆｌｏｘ／ＡＲ−ＴＲＡＭＰ（Ｃ５７ＢＬ／６／１２９×ＴＲＡＭＰ−ＦＶＢ）マウスを生じ、これらのマウスをＰｂ−Ｃｒｅ（Ｃ５７ＢＬ／６）マウス（Ｗｕ，Ｘ．ら（２００１）Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．１０１，６１−６９）と交配させて、前立腺中でのみＡＲを欠くｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰ（Ｃ５７ＢＬ／６／１２９×ＴＲＡＭＰ−ＦＶＢ）マウスを生じた。ＡＲ  Ｃ−末端領域に特異的なＣ−１９抗体を使用する、前立腺腫瘍の免疫組織化学分析は（Ｍｉｒｏｓｅｖｉｃｈ，Ｊ．ら（１９９９）Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１６２，３４１−３５０）、Ｗｔ−ＴＲＡＭＰマウスの腫瘍のみがＡＲを発現したのに対して（図１１ａ、左のパネル）、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスは、ほとんどＡＲを発現しなかった（図１１ａ、右のパネル）ことを示した。予想されたように、Ｗｔ−ＴＲＡＭＰとｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスの両方からの泌尿生殖器は、正常に発達していた（図１１ｂ）。
【０２２０】
ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスが、ＷＴ−ＴＲＡＭＰマウスよりも、より大きな（Ｐ＜０．０５；３．０対１．７ｍｇ）骨盤リンパ節（ＰＬＮ）を有したことが見い出された（図１２ａ−１２ｂ）。さらに、より多くの転移性病巣が、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスの肝臓中で観察された（図１２ｃ）。ウェスタン分析は、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスからのＰＬＮ中でのＡＲの損失を確証した（図１２ｄ）。ＴＲＡＭＰ細胞の浸潤性を評価するために、Ｂｏｙｄｅｎチャンバーマトリゲル浸潤アッセイ（Ｐｉｌａｔｕｓ，Ｕ．ら（２０００）Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ２，２７３−２７９）を、マウスの両方の株からのＰＬＮの一次培養細胞に対して使用した。ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスからのＰＬＮ細胞は、ＷＴ−ＴＲＡＭＰマウスからのそれよりも浸潤性であった（図１２ｅ）。さらに、機能的ＡＲを回復させることは、ＰＬＮ一次腫瘍細胞の浸潤性を減少させた（図１２ｅ）。まとめると、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウス（図１２ａ−ｄ）およびＰＬＮ腫瘍研究からの一次培養細胞（図１２ｅ）からの結果は、前立腺上皮ＡＲの損失は、より浸潤性の転移性前立腺腫瘍の発生をもたらし、ＡＲ機能の獲得は、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスからのＰＬＮ細胞における増加した浸潤を逆転させることを示す。次いで、より浸潤性の転移性前立腺腫瘍は、ＷＴ−ＴＲＡＭＰ同腹仔からのそれと比較して、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおけるより低い生存率をもたらす（図１２ｆ）。
【０２２１】
（４）Ｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスは、攻撃性および浸潤性がより少ない転移性腫瘍を発生する
誘導性ノックアウト系はまた、１２週齢のＩｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスへのインターフェロンγの注射（ＰＩＰＣ）を介して（Ｋｕｈｎ，Ｒ．ら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９，１４２７−１４２９）、前立腺上皮ＡＲ（〜５０％〜６０％）と間質ＡＲ（〜５０％）の両方をノックダウンするＩｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスを生成するために使用することもできる。２４週のｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウス、野生型マウス（１２週齢でＰＩＰＣの注射ありまたはなし）、および１２週齢でＰＩＰＣを注射したｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスの中での転移性腫瘍サイズの比較は、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスが、それらの野生型同腹仔と比較して、リンパ節においてより大きくかつより攻撃的な転移性腫瘍を発生することを明らかにした（図１３ａ）。対照的に、ｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおける上皮細胞と間質細胞の両方の中のノックダウンＡＲは、ＩＰＩＣを注射したそれらの野生型同腹仔と比較して、リンパ節においてより小さくかつより攻撃性が少ない転移性腫瘍を発生をもたらした（図１３ａ）。
【０２２２】
前立腺腫瘍は、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスとｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスの間で異なる速度で発生したので、別のアプローチを採用して、これら２種の異なるマウス間の転移性腫瘍の発生を比較した。ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスは、１ｃｍ直径近くのサイズを有する前立腺原発性腫瘍を発生するために１８週間を要することが見い出された。しかし、ｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰは、同様のサイズの前立腺原発性腫瘍を発生するために３６週間かかった（図１３ｂ）。さらに、異なる程度の悪性度が、同様のサイズを有するこれら２種の腫瘍において見い出され、より攻撃的な腫瘍は、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰにおいて見い出された。さらに、原発性腫瘍が１ｃｍ直径まで発達した段階で、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウス腫瘍は腸間膜リンパ節に移動し、ｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスは精嚢に移動した（図１３ｂ）。
【０２２３】
まとめると、図１３からの結果は、上皮細胞と間質細胞の両方におけるノックダウンＡＲは、それらの野生型同腹仔と比較して、リンパ節においてより小さくかつより攻撃性が少ない転移性腫瘍の発生をもたらすことを明確に実証する。対照的に、上皮ＡＲの損失は、それらの野生型同腹仔、ならびに上皮ＡＲと間質ＡＲの両方の損失と比較して、より攻撃的な転移性腫瘍を生じる。それゆえに、刺激因子として機能する間質ＡＲは、前立腺転移の抑制因子として機能する上皮ＡＲと比較して、より支配的な役割を果たす。
【０２２４】
（５）ＡＲ発現は、前立腺癌患者から単離した原発性前立腺腫瘍と比較して、転移において減少される
前立腺癌患者からの前立腺転移および原発性腫瘍におけるＡＲ染色の強度のアッセイを介する直接的臨床データの調査もまた、上皮ＡＲが前立腺転移の抑制因子として機能するという上記の結論を支持した。前立腺原発性腫瘍（９７例）および前立腺転移（２８例）を評価し、ＡＲ核染色はすべてのＡＲ陽性腫瘍において見い出され、原発性腫瘍（９１．７５％）と転移性腫瘍（６７．８６％）の間にＡＲ発現の顕著な違いが見い出された（Ｐ＜０．０１）（図１４）。これらのインビトロ臨床データは、前立腺全摘出術で治療下前立腺癌患者からの組織アレイを利用した最近の臨床研究と一致しており（Ｌｉ，Ｒ．ら（２００４）Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈｏｌ．２８，９２８−９３４）、ここでは、ＡＲ発現は、転移性前立腺癌において、原発性前立腺癌または正常前立腺と比較して有意に減少したと結論付けられた（平均１．３０対３．４９、Ｐ＝０．０００）。これらの２つのインビボ臨床研究において、ＡＲ発現が、転移性腫瘍において、原発性腫瘍と比較して減少したという事実は、前立腺転移性腫瘍におけるＡＲのネガティブな役割を支持する。
【０２２５】
（６）前立腺癌に対する現在の臨床治療の影響
異なるヒト前立腺腫瘍細胞（図９、１０）および種々の前立腺腫瘍マウスモデル（図１０〜１３）、ならびにヒト臨床データ（図１４）からの結果は、すべてが、上皮ＡＲは前立腺転移の抑制因子として機能し、間質ＡＲはその抑制因子として機能することを指摘したので、驚くべきことでありかつ前立腺ＡＲの古典的な概念（抑制因子としては機能するはずがない）とは矛盾するこれらの結果が、現在の前立腺癌治療に影響を与えるか否かを研究した。上記の結論に基づくと、前立腺癌と闘うための理想的な治療的アプローチは、ＡＲ−ｓｉＲＮＡまたは化合物、例えば、ＡＳＣ−１９のいずれかを介して、間質ＡＲを標的として、間質細胞中のＡＲのみを抑制または分解することである。不運にも、これまでは、このような理想的な間質特異的な送達系は、間質ＡＲのみを標的とするためのＡＲキラーを送り込むことができなかった。さらに、すべての現在の外科的な去勢または利用可能な抗アンドロゲンを用いての化学的去勢は、主としてアンドロゲンを標的とし、ＡＲを標的としていない（その理由は、抗アンドロゲン治療後に不応性前立腺腫瘍を有する患者が、前立腺腫瘍中に比較的多量のアンドロゲンをなお維持していることである可能性がある（Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ｄ．ら（２００４）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０，３３−３９））。それにも関わらず、ｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおいて行ったように、たとえ全体のＡＲが標的化できる場合でさえ、前立腺癌と、正しいタイミングで、なお効果的に闘うことができた。異なる時期にＡＲを標的とするｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスモデルに基づくと、ノックダウンＡＲを介するＡＲの初期の標的化（４週目）は、より後期の時期（２０週目）に行ったものと比較して、はるかにより良好な前立腺腫瘍の抑制を生じる（表１を参照のこと）。これらの結果は、間質ＡＲが上皮ＡＲよりもより支配的な役割を果たすのみならず、これはまた、より初期の段階でＡＲを標的化することが前立腺癌を闘うためのより良好なストラテジーであり得ることを指摘する。
【０２２６】
表１．初期の齢（４週齢）においてｉｎｄｏ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスで誘導されたＡＲノックアウトは、腫瘍の発生および進行を有意に減少したのに対して、２０週齢の後期の齢においては、腫瘍進行をブロックすることに失敗した。
【０２２７】
【化１４】
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（７）上皮ＡＲが前立腺転移性腫瘍浸潤を促進する分子メカニズム
ＡＲが前立腺転移性腫瘍浸潤を促進する分子メカニズムを精査するために、Ｑ−ＰＣＲを使用して、その発現が前立腺腫瘍転移と密接に相関している、多くの報告されている前立腺転移／浸潤関連遺伝子のｍＲＮＡ発現を定量した。表２に示されるように、ＷＴ−ＴＲＡＭＰおよびｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスからのＰＬＮ腫瘍、ならびにＰＣ−３対ＰＣ３−ＡＲ９からの異種移植腫瘍における多くの前立腺転移／浸潤関連遺伝子の相対的ｍＲＮＡ発現は、それらの転移状態とよく相関する。
【０２２８】
表２．ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスおよびＰＣ３異種移植腫瘍の骨盤リンパ節腫瘍（ＰＬＮ）における前立腺転移／浸潤関連遺伝子発現プロフィール、Ｗｔ  ＴＲＡＭＰマウスのＰＬＮおよびＰＣ３−ＡＲ３異種移植腫瘍とそれぞれ比較。
【０２２９】
【化１５】
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定量的ＲＴ−ＰＣＲデータは、Ｗｔ  ＴＲＡＭＰマウスのＰＬＮおよびＰＣ３−ＡＲ３異種移植腫瘍に対する倍数増加を表す。統計学的分析は、平均±ＳＤ  ＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１である。Ｎ．Ｓ．は有意差なしを示す。
【０２３０】
これらの結果は、前立腺上皮ＡＲの損失が転移性腫瘍浸潤を促進することを示すインビボの知見を強化する。図１５に提示されるさらなるメカニズムの精査は、ＡＲが、これらの転移／浸潤関連遺伝子を調節するために複数のメカニズムを利用することを示す。
【０２３１】
（８）上皮ＡＲが前立腺転移性腫瘍浸潤を抑制する分子メカニズム
さらなるメカニズムの精査は、ＡＲが、これらの転移／浸潤関連遺伝子を調節するために複数のメカニズムを利用することを示す。
【０２３２】
（ａ）アンドロゲン／ＡＲは、いくつかの転移／浸潤関連遺伝子、例えば、神経エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）およびシクロオキシゲナーゼ２（Ｃｏｘ−２）を転写レベルで調節する
ＮＥＰは、前立腺癌細胞の移動を促進する際に関係する、ボンベシン、エンドセリン−１、およびニューロテンシンなどのニューロペプチドを分解可能である（Ｎｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｂ．およびＣａｒｄｕｃｃｉ，Ｍ．Ａ．（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔ．１８，８７−９６Ｐａｐａｎｄｒｅｏｕ，  Ｃ．Ｎ．ら（１９９８）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４，５０−５７；Ｓｅｈｇａｌ，Ｉ．ら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１，４６７３−４６７７）。ここで、ＮＥＰ  ｍＲＮＡ（表１）およびタンパク質（図１５ａ）の発現は，ＡＲを欠く両方の転移性腫瘍においてより低い。ＮＥＰ  ５’プロモーター−ルシフェラーゼアッセイを使用するトランス活性化は、誘導されたＮＥＰ転写が、ＡＲ−ｓｉＲＮＡを加えることによって抑制されることをさらに確証する（図１５ａ、下のパネル）。
【０２３３】
Ｃｏｘ−２の発現は前立腺癌において上昇すること（Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｍ．Ａ．ら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，１８８９７−１８９０４）、および前立腺腫瘍におけるＣｏｘ−２活性の阻害はそれらの浸潤を抑制する（Ａｔｔｉｇａ，Ｆ．Ａ．ら（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０，４６２９−４６３７）ことが示されてきた。本発明において、Ｃｏｘ−２  ｍＲＮＡ（表１）およびタンパク質（図１５ｂ、上のパネル）の発現は、ＡＲを欠く両方の転移性腫瘍においてより高い。Ｃｏｘ−２，５’プロモーター−ルシフェラーゼアッセイを使用するトランス活性化は、Ｃｏｘ−２転写が、ｐＢａｂｅウイルスによって発現されるＡＲ  ｃＤＮＡを介する、ＰＣ３−ＡＲ９細胞へのより多くの機能的ＡＲの付加によって抑制されることもまた示した（図１５ｂ、下のパネル）。
【０２３４】
（ｂ）アンドロゲン／ＡＲは、ｐ２７などの転移／浸潤関連遺伝子のタンパク質レベルを増強する
ｐ２７はサイクリン依存性キナーゼ阻害剤であり、ｐ２７のダウンレギュレーションは、多くの腫瘍における局所的浸潤または離れた距離での転移に関連付けられている（Ｂｅｌｌｅｔｔｉ，Ｂ．ら（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１２，１５８９−１６０５）。最近、細胞質ｐ２７タンパク質が、腫瘍の移動および浸潤を阻害することが報告されている（Ｂａｌｄａｓｓａｒｒｅ，Ｇ．ら（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ７，５１−６３））。本発明では、ｐ２７  ｍＲＮＡ（表１）とタンパク質（図１５ｃ）の両方の発現が、ＡＲを欠く転移性腫瘍においてより低いことが見い出された。しかし、ｐ２７  ５’プロモーター−ルシフェラーゼアッセイを使用するトランス活性化は、アンドロゲン／ＡＲがｐ２７トランス活性化にほとんど影響がないことを示す。ｐ２７タンパク質の安定性をアッセイし、１ｎＭ  ＤＨＴの存在下で、Ｐ２７は、ＰＣ３細胞中で、ＰＣ３−ＡＲ９細胞と比較して迅速に分解されたことを観察した。このことは、アンドロゲン／ＡＲが、ｐ２７タンパク質を、その安定性を増強することによりアップレギュレートすることを示す。
【０２３５】
（ｃ）アンドロゲン／ＡＲは、ＮＦ−κＢシグナルの間接的な調節を介して、ＭＭＰ−９などの転移関連遺伝子を抑制する
ＭＭＰ−９は腫瘍転移に関与することが知られている（Ｗａｎｇ，Ｘ．ら（２００３）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９，１３１３−１３１７）。ＭＭＰ−９のより高度な発現は、いくつかの原発性腫瘍から生じた骨転移において見い出されてきた（Ｃｏｒｅｙ，Ｅ．ら（２００３）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．９，２９５−３０６）。ＭＭＰ−９  ｍＲＮＡ（表１）とタンパク質（図１５ｄ）の両方の発現は、ＡＲを欠く転移性腫瘍においてより高いことが見い出された。ＰＣ３−ＡＲ９細胞中のＭＭＰ−９の酵素アッセイは、１ｎＭ  ＤＨＴがＭＭＰ−９のゼラチナーゼ活性を抑制でき、１μＭ  抗アンドロゲンＨＦがその活性を回復できることをさらに示す（図１５ｄ）。しかし、ＭＭＰ−９  ５’プロモーター−ルシフェラーゼアッセイを使用するトランス活性化アッセイは、アンドロゲン／ＡＲがＭＭＰ−９転写に対してほとんど影響がないことを示す。初期の報告は、ＭＭＰ−９がＮＦ−κＢによって調節されること（Ｅｂｅｒｈａｒｄｔ，Ｗ．ら（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５，５７８８−５７９７）、およびアンドロゲン／ＡＲが前立腺癌細胞においてＮＦ−κＢをダウンレギュレートできること（Ａｌｔｕｗａｉｊｒｉ，Ｓ．ら（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３，７１０６−７１１２）を示唆した。図１３ｄは、ＭＭＰ−９活性の増加が、ＮＦ−κＢ誘導因子である１０ｎＭ  ＴＰＡの添加を介して増強でき、ＮＦ−κＢ阻害剤である１μｇ  Ｐａｒｔｈのさらなる添加を行い、次いで、ＭＭＰ−９活性を減少することができることを示す（図１５ｄ）。さらに、１ｎＭ  ＤＨＴは、ＮＦ−κＢ発現を有意に減少でき、１μＭ  ＨＦの添加が、ＰＣ３−ＡＲ９細胞中でのＤＨＴ抑制効果を逆転できる。それゆえに、アンドロゲン／ＡＲは、ＮＦ−κＢシグナルの中断を介してＭＭＰ−９活性を抑制できる。
【０２３６】
（ｄ）アンドロゲン／ＡＲは、転移／浸潤遺伝子、例えば、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、インスリン様増殖因子ｂ鎖（ＩＧＦ−ｂ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に関連するＡｋｔの上流シグナルを調節することを介して、Ａｋｔ活性を抑制する
初期の報告は、Ａｋｔシグナルの活性化が前立腺腫瘍浸潤を引き起こすことを示唆した（Ｅｎｏｍｏｔｏ，Ａ．ら（２００５）Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ  ９，３８９−４０２）。
【０２３７】
興味深いことに、いくつかの報告は、表１に記載される４種の転移／浸潤関連遺伝子（ＥＧＦＲ、ＩＧＦ−ｂ、ＥＬ−６、およびＴＮＦα）はＡｋｔ活性を活性化可能であることを実証した（Ｍｉｚｏｋａｍｉ，Ａ．ら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８，７７−８８；Ｙｅｈ，Ｓ．ら（２００３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９８，１８９９−１９０８；Ｃｏｒｅｙ，Ｅ．ら（２００２）Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ５２，２０−３３；Ｐｉｌａｔｕｓ，Ｕ．ら（２０００）Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ２，２７３−２７９）。以前の報告は、アンドロゲン／ＡＲ活性の抑制が、Ａｋｔの活性化を生じることもまた実証した（Ｙｕａｎ，Ｓ．ら（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３，１３０４−１３１１；Ｗｅｂｂ，Ｍ．Ｍ．ら（１９９９）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２０，１１８５−１１９２；Ｈｅｉｔｚｅｒ，Ｍ．Ｄ．およびＤｅＦｒａｎｃｏ，Ｄ．Ｂ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６，７３２６−７３３３；Ｙｅｈ，Ｓ．ら（２００３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９８，１８９９−１９０８；Ｎａｇａｂｈｕｓｈａｎ，Ｍ．ら（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６，３０４２−３０４６；Ｇｏａｔｅｒ，Ｊ．Ｊ．ら（２００２）Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．２０，１６９−１７３）。従って、転移性腫瘍におけるＡＲの損失は、おそらく、Ａｋｔ上流のシグナル、例えば、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ−ｂ、ＩＬ−６、およびＴＮＦαなどを増強することを介して、Ａｋｔの活性化を生じる。予測されるように、抗ホスホ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）を用いるウェスタンブロットアッセイは、Ａｋｔ活性が、ＡＲを欠くＰＬＮ−ｐｅｓ−ＡＲＫＯとＰＣ−３の両方の転移性腫瘍においてより高いことを示す（図１５ｅ）。
【０２３８】
（９）間質ＡＲが前立腺転移性腫瘍浸潤を促進する分子メカニズム
上記のような、上皮ＡＲが前立腺転移を抑制することによって反対の様式で機能する理由のメカニズムを精査することと比較すると、ここで、間質ＡＲが前立腺転移を促進する理由を説明することは比較的容易である。ＷＰＭＹ１−ＡＲｓｉ細胞におけるＡＲ−ｓｉＲＮＡを介するＡＲのノックダウンは、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＶＥＧＦ、およびＳＤＦ１のｍＲＮＡ発現の減少を生じ（図１５ｆ）これは、前立腺転移の促進におけるそれらの極めて重要な役割について、間質−上皮相互作用を介してよく研究された（Ｄｅｒｙｎｃｋ，Ｒ．ら（２００１）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２９，１１７−１２９；Ｊｅｎｎｂａｃｋｅｎ，Ｋ．ら（２００５）Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ６５，１１０−１１６；Ｔａｉｃｈｍａｎ，Ｒ．Ｓ．ら（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６２，１８３２−１８３７）。初期の研究はまた、間質ＴＧＦβが、血管形成を増強することおよび免疫細胞を阻害することを介して、前立腺転移の促進において鍵となる役割を果たし得ることを十分に実証した。それゆえに、間質細胞からのこれらの転移の鍵となる役割の調節を介して、間質ＡＲが前立腺転移を促進すると考えることは合理的である。
【０２３９】
ｂ）結論
本発明において、マウスおよびヒトの前立腺癌細胞モデル（ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウス、マウスＰＬＮ腫瘍からの原発性腫瘍、ヒトＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／−細胞、およびヒトＰＣ３−ＡＲ９細胞）から４つの別々の手段を通して、上皮ＡＲシグナル伝達の損失が浸潤性および転移の潜在性を増強することが開示される。これらの知見は、アンドロゲン／ＡＲが癌の増殖および／または進行を促進していると考えている、前立腺癌に対する現在の臨床的な治療を伴う古典的な概念と一致しないように見える（（１９６７）Ｓｕｒｇ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｂｓｔｅｔ．１２４：１０１１−１０１７；Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｅ．Ｍ．ら（１９９９）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４１，１７８１−１７８８）。この不一致についての１つの可能な説明は以下であり得る。転移部位においてさえ、隣接する間質細胞中のＡＲは、ＡＤＴまで悪性の前立腺上皮細胞を刺激し続け、間質中のＡＲをサイレンシングすることによって、この疾患は寛解に導かれ、これは最終的には逆転され、継続的なＡＤＴが前立腺上皮ＡＲの転移抑制因子機能をサイレンシングする場合には、「アンドロゲン非依存性」疾患の進行に導く。前立腺腫瘍進行に対するＡＲの影響の最終的な結果は、これら２つの対照的な役割（転移の刺激因子としての間質ＡＲ  対  転移の抑制因子としての上皮ＡＲ）のバランスに依存し、データは、間質ＡＲが前立腺癌の初期段階において上皮ＡＲよりもより支配的な役割を果たすことを示す。これらの結論の暗示は現在の治療アプローチに挑戦する。なぜなら、これらは、現在利用されているようなＡＤＴは、最終的には、それ自体の治療効果に対する抵抗性を誘導することを暗示しているからである。
【０２４０】
ｃ）方法
（１）細胞培養、プラスミド、および試薬
ヒト前立腺癌細胞株ＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／＋、ＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／−、ＰＣ３−ｖ、ＰＣ３−ＡＲ２、およびＰＣ３−ＡＲ９を、１０％ウシ胎仔血清、２５Ｕ／ｍｌ  ペニシリン、および２５μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを有するＲＰＭＩ  １６４０培地中に維持した。ＤＨＴおよびＨＦはＳｉｇｍａから入手した。ＡＲ（Ｃ−１９）、ＮＥＰ、Ｃｏｘ−２、ｐ２７、ＭＭＰ−９、およびアクチンに対する抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）および全体のＡｋｔおよびｐ−Ａｋｔ（４７３）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を使用した。天然のプロモーターで促進されるＡＲプラスミドは、ｈＡＲ  ５’−ＵＴＲを有する３．６ｋｂ  ｈＡＲプロモーター、および全長ＡＲ  ｃＤＮＡを、ｐＩＲＥＳプラスミドに挿入することによって構築し，ＡＲの発現は、ｐＩＲＥにクローニングされた３．６ｋｂの近位のＡＲプロモーター領域の制御下に配置した。ネオマイシン耐性細胞は、５００μｇ  Ｇ４１８を伴うインキュベーションによって選択した。
【０２４１】
（２）マウスｐＢａｂｅ−ＡＲ、ｈＡＲｐＣＤＮＡ３、およびヒトＡＲ−ｓｉＲＮＡの構築
オリゴヌクレオチド
【０２４２】
【化１６】
2009537142.tif 000018
（配列番号１１）および
【０２４３】
【化１７】
2009537142.tif 000019
（配列番号１２）を使用して、ＰＣＲを使用してマウス前立腺ｃＤＮＡライブライリーからＡＲフラグメントをクローニングした。レトロウイルスベクターｐＢａｂｅ−ＡＲは、ＢａｍＨＩ／Ｂｇｌ  ＩＩ消化したＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩ／Ｂｇｌ  ＩＩ消化したｐＢａｂｅ−ＧＦＰベクターにライゲーションすることによって構築し、ＰＣＲ−生成したＡＲ  ｃＤＮＡフラグメントはｐＣＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入し、全長ＡＲ  ｃＤＮＡ、および３１０ｂｐ  ３’−ＵＴＲ、続いて、２８０ｂｐウシＧＨ  ｐｏｌｙ（Ａ）シグナルはｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ｓｋ（−）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に挿入した。哺乳動物細胞中でｓｉＲＮＡ標的化ＡＲを発現するヒトＡＲ低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）発現ベクターは、二本鎖ポリヌクレオチド
【０２４４】
【化１８】
2009537142.tif 000020
（配列番号１３）を消化し、ＤＮＡベースのベクターＢＳ／Ｕ６のＡｐａｌ−ＥｃｏＲＩ部位に挿入することによって構築した（Ｗｕ，Ｘ．ら（２００１）Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．１０１，６１−６９）。
【０２４５】
（３）浸潤アッセイ
浸潤アッセイは、６．４μｍインサートおよび８μｍ細孔を有するＢｏｙｄｅｎチャンバー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用した。マトリゲルマトリックス（１００ｇ／ｃｍ２表面積）を、浸潤チャンバーの内層上の培地中に配置し（１：５希釈）、３７℃で３０分間インキュベートし、その後細胞を加えた。これらのチャンバーは、２４ウェル培養プレートのウェルに、マトリゲルの存在／不在で配置し、チャンバーの内側に５００μｌアリコート中の細胞を加え、５％  ＣＯ２雰囲気中、１ｎＭ  ＤＨＴの存在下および非存在下で、３７℃にて２０時間チャンバーをインキュベートし、細胞浸潤および移動アッセイのために収集し、これは記載されるように（Ａｔｔｉｇａ，Ｆ．Ａ．ら（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０，４６２９−４６３７）、標準的なＭＴＴアッセイによって定量した。
【０２４６】
（４）インビトロ骨−ウェハ再吸収および破骨細胞形成アッセイ
ＰＣ−３およびＰＣ−３（ＡＲ）９細胞をラット頭蓋冠骨細胞（破骨細胞および間質細胞）に加え、これを骨ウェハ上で培養し、１０ｎＭ  副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）（Ｂａｃｈｅｍ）の存在下で１０日間処理し、２週間毎に培地を交換した。１０日後、ウェハをかき取り、乾燥させ、トルイジンブルーで染色し、光学顕微鏡を用いて、４０×拡大でこれらを調べた。デジタルカメラを使用してウェハからの画像をキャプチャーし、ウェハの表面上のピットを追跡し、Ｏｓｔｅｏｍｅｔｒｉｅｓソフトウェアを使用して、閉じた領域を測定した。１０日後、ウェハをかき取り、乾燥させ、ＴＲＡＰについて、白血球酸ホスファターゼキット（Ｓｉｇｍａ）を使用してそれらを染色した。破骨細胞形成を定量するために，多核ＴＲＡＰ陽性細胞の数を、記載されたように計数した（Ｇｏａｔｅｒ，Ｊ．Ｊ．ら（２００２）Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．２０，１６９−１７３）。
【０２４７】
（５）トランスジェニックマウスの生成
ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスを生成するために、ｐｅｓ−ＡＲＫＯマウス、ＡＲＲＰＢ２−Ｃｒｅトランスジェニックマウス（Ｗｕ，Ｘ．ら（２００１）Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ  １０１，６１−９）（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ、ＮＩＨより）を、条件付きＡＲ対立遺伝子（ｆｌｏｘｅｄ  ＡＲ；図８）を含むマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）（Ｙｅｎ，Ｓ．ら（２００２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９，１３４９８−５０３）とつがわせた。ｐｅｓ−ＡＲＫＯ／Ｔ８５７Ａ  ＡＲマウスを生成するために、３種のトランスジェニックマウス、ＡＲＲＰＢ２−Ｃｒｅマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ）、ｆｌｏｘｅｄ  ＡＲマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）、およびＴ８５７Ａ  ＡＲマウス（ＦＶＢ）（Ｄｒ．Ｎ．Ｇｒｅｅｎｂｕｒｇ，ＦＨＣＲＣ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡから寄与された）を異種交配させた。ＴＲＡＭＰ  （Ｃ５７ＢＬ／６−ＴＲＡＭＰｘＦＶＢ）およびプロバシンＣｒｅ（Ｐｂ−Ｃｒｅ）（Ｃ５７ＢＬ／６）マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得た。
【０２４８】
（６）統計学
データは平均±標準偏差（ＳＤ）として表示した。比較は、両側スチューデントｔ検定を使用して群間で行った。ｐ値＊Ｐ＜０．０５または＊＊Ｐ＜０．０１は有意であると見なした。生存曲線は、カプラン−マイヤー分析およびログ−ランク検定によって分析した。
【０２４９】
３．実施例３：上皮アンドロゲン受容体の損失は前立腺癌の進行を促進する
ＴＲＡＭＰマウスにおける腫瘍形成は、最小プロバシンプロモーターの制御下で、ＳＶ４０初期遺伝子Ｔ抗原（Ｔ−ａｇ）の発現によって促進される。ＴＲＡＭＰ腫瘍において、ｐ５３の抑制および通常高いニューロエンドクリン細胞集団のために、ヒト前立腺癌に対するこのモデルの関連性についてはある程度の懸念が存在しているが、このモデルは、これらの腫瘍が正常組織から開始する可能性があり、腫瘍の進行が、前立腺上皮内新形成（ＰＩＮ）から低度、次いで高度の癌までに発達するという点でヒト前立腺癌のそれを模倣するので、依然として優秀な動物モデルのままである。重要なことに、ＴＲＡＭＰマウスがＡＲノックアウト（ＡＲＫＯ）マウスと交配されるときに、プロバシンは継続して（誕生後１日目から５週目まで）発現されるのに対して、ＡＲは５週目でノックアウトされ始め、これは、２４週まで継続し、その時点ではＡＲはほとんど発現されない。従って、プロバシンプロモーターによって促進され、発現されるＴ−ａｇのために十分な時間ウィンドウ（生涯の最初の５週間の間）が存在する。この観察はまた、ＴＲＡＭＰマウスは、マウスが４週齢で去勢されたときでさえ、前立腺腫瘍をなお発症することを示す初期の報告と一致する。ＴＲＡＭＰマウスにおいてプロバシン−Ｃｒｅ（Ｐｂ−Ｃｒｅ）を使用して前立腺上皮ＡＲをノックアウトすることは（ＡＲ発現の抑制は５週目で開始し、２４週にわたって増加する）、それゆえに、前立腺上皮ＡＲの損失がいかにして前立腺癌の進行に影響を与えるかについて研究するための優秀な動物モデルを提供する。
【０２５０】
ａ）結果
（１）上皮ＡＲは、同時培養した上皮細胞と間質細胞を異種移植したヌードマウスにおける前立腺癌進行の抑制因子として機能し、間質ＡＲはその刺激因子として機能する
前立腺癌の進行におけるＡＲの役割を研究するために、ヒトＡＲの天然のプロモーターによって促進される機能的ヒトＡＲ  ｃＤＮＡは、ＰＣ３細胞に安定にトランスフェクトされた（ＰＣ３−ＡＲ９と名付けた）。ＡＲトランス活性化アッセイは、これらのＰＣ３−ＡＲ９細胞においてアンドロゲンがＡＲ活性を刺激し得ることを実証した。ＰＣ３−ＡＲ９細胞および安定にベクターにトランスフェクトした親のＰＣ３細胞（ＰＣ３−ｖと名付けた）は、ヌードマウスの前部前立腺に正しく局所的に（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃａｌｌｙ）注射した。興味深いことに、有意に大きな原発性前立腺腫瘍は、ＰＣ３−ＡＲ９細胞を注射したマウスと比較して、ＰＣ３−ｖ細胞を注射した１２週齢マウスにおいて見い出された（図１６ａ）。このことは、ＰＣ３−ＡＲ９における機能的ＡＲの付加が前立腺癌進行の抑制を生じることを示す。
【０２５１】
この予測されなかった結果は、前立腺ＡＲが前立腺癌の進行のための刺激因子として機能するはずであり、抑制因子ではないと考えている、前立腺分野における古典的な概念に反している。これらの知見は、上皮細胞および間質細胞の同時培養を用いる別のアプローチを介して確証した：ＰＣ３−ｖまたはＰＣ３−ＡＲ９は、機能的ＡＲを発現した間質ＷＰＭＹ１−ｖ細胞とともに同時培養し、これらの同時培養した細胞は、ヌードマウスの前部前立腺に正しく局所的に注射した。これらの結果は、ＰＣ３−ＡＲ９細胞におけるＡＲの付加が、１２週齢マウスにおいてより小さな前立腺腫瘍を生じることを示す図１６ａと一致している（図１６ｂ）。
【０２５２】
内因性ＡＲを効果的にノックダウンし得るＡＲ−ｓｉＲＮＡは、ＷＰＭＹ１−ｖ細胞に安定にトランスフェクトし（ＷＰＭＹ１−ＡＲｓｉと名付けた）、ＰＣ３−ｖまたはＰＣ３細胞−ＡＲ９細胞のいずれかと同時培養され、ヌードマウスの前部前立腺に正しく局所的に注射した。結果は、間質ＷＰＭＹ１−ＡＲｓｉ細胞中のノックダウンＡＲが原発性腫瘍成長の抑制を生じること（ＰＣ３−ｖ＋ＷＰＭＹｌ−ｖ対ＰＣ３−ｖ＋ＷＰＭＹ１−ＡＲｓｉ）、およびＰＣ３−ＡＲ９細胞中のノックインＡＲが原発性腫瘍増殖の促進を生じること（ＰＣ３−ｖ＋ＷＰＭＹ１−ｖ対ＰＣ３−ＡＲ９＋ＷＰＭＹ１）を示す。腫瘍の悪性度に伴うＨＥ染色もまた、ＰＣ３−ＡＲ９＋ＷＰＭＹ１−Ａｒｓｉ細胞の中で原発性前立腺腫瘍はより分化が乏しく、より悪性であることを示した。増殖マーカーＫｉ６７を用いる細胞増殖アッセイは、ＡＲがヌードマウスにおける前立腺癌進行を促進するための刺激因子として機能することを示す上記の表現型の観察をさらに確証する。
【０２５３】
まとめると、図１６ａと１６ｂの両方からの結果は、上皮ＡＲが前立腺癌進行のための抑制因子として機能し、間質ＡＲがその刺激因子として機能することを示す明確に実証する。
【０２５４】
（２）前立腺上皮においてのみＡＲを欠くｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスの生成および確認
インビトロ細胞同時培養系からの上記のすべてのデータは、インビボマウスモデルとともに、すべてがヒト前立腺癌細胞から生成したので、上記の結論を証明するために、別のインビボ動物モデルとして、自発的に前立腺腫瘍を発生するマウスの使用は関心対照となる。最初に、前立腺上皮においてのみＡＲを欠くｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスを生成し、これらのｐｅｓ−ＡＲＫＯマウスにおける上皮ＡＲの損失は、前立腺細胞増殖の増加を生じることを実証した。また、前立腺間質平滑筋においてのみＡＲを欠くｔｇｎ−ＡＲＫＯマウスを生成し、これらのｔｇｎ−ＡＲＫＯマウスにおける間質平滑筋ＡＲの損失が前立腺細胞増殖の減少を生じることを実証した。
【０２５５】
これらのｐｅｓ−ＡＲＫＯおよびｔｇｎ−ＡＲＫＯマウスからの結果は、上皮ＡＲが正常前立腺成長の抑制因子であり、間質ＡＲがその刺激因子であることを示した。これらのｆｌｏｘｅｄ／ＡＲマウスは、自発的に前立腺癌を発生できるｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスを生成するために使用した。雌性ｆｌｏｘ／ＡＲ（Ｃ５７ＢＬ／６／１２８）マウスを、ＴＲＡＭＰ（Ｃ５７ＢＬ／６／ＴＲＡＭＰ×ＦＶＢ）マウスとつがわせて、ｆｌｏｘ／ＡＲ−ＴＲＡＭＰ（Ｃ５７ＢＬ／６／１２９×ＴＲＡＭＰ−ＦＶＢ）マウスを生じ、次いで、これらのマウスをＰｂ−Ｃｒｅ（Ｃ５７ＢＬ／６）マウスと交配させて、前立腺上皮中でのみＡＲを欠くｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰ（Ｃ５７ＢＬ／６／１２９×ＴＲＡＭＰ−ＦＶＢ）マウスを生じた（図１７ａ）。
【０２５６】
このｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスを、以前に記載されたように、尾スニップＤＮＡからのＰＣＲによって遺伝子型決定した１０。図１７ｂに示されるように、野生型（Ｗｔ）−ＴＲＡＭＰとｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスの両方がＴ−ａｇを発現したのに対して（図１７ｂ）、上のパネル）、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスのみがｆｌｏｘｅｄ  ＡＲ（図１７ｂ、中央のパネル）およびＰｂ−ｃｒｅ（図１７ｂ、下のパネル）のバンドを発現した。ｍＲＮＡレベルは、前部前立腺（ＡＰ）、背外側前立腺（ＤＬＰ）、腹側前立腺（ＶＰ）、および精嚢（ＳＶ）からのＰＣＲを介して、ＡＲの欠失エキソン２に特異的なプライマーを用いて分析し、ＡＲ−エキソン２が、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスからのＡＰ、ＤＬＰ、およびＶＰにおいて切除されていたが、Ｗｔ−ＴＲＡＭＰにおいては切除されていなかったことを実証した（図１７ｃ）。
【０２５７】
（３）前立腺においてＡＲをノックダウンしているｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスの生成および確認
誘導性ノックアウト系は、雌性ｆｌｏｘ／ＡＲ−ＴＲＡＭＰ（Ｃ５７ＢＬ／６／１２９×ＴＲＡＭＰ−ＦＶＢ）マウスをＭｘ−Ｃｒｅ（Ｃ５７ＢＬ／６／ＦＶＢ）マウスをつがわせることを介して、ＡＲ（上皮と間質の両方）をノックダウンし得るｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスを生成するために適用した（図１７ａ）。次いで、ｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスへのインターフェロンχの注射は、前立腺を含む種々の組織中でのＡＲのノックダウンを誘導する。
【０２５８】
遺伝子型を確証するために、尾スニップＤＮＡを鋳型として使用して、ＰＣＲを実行した。図１７ｂに示されるように、野生型（Ｗｔ）−ＴＲＡＭＰとｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスの両方がＴ−ａｇを発現したのに対して（図１７ｂ）、上のパネル）、ｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスのみがｆｌｏｘｅｄ  ＡＲ（図１７ｂ、中央のパネル）およびＭｘ−Ｃｒｅ（図１７ｂ、下のパネル）のバンドを発現した。ｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおけるＡＲのノックダウンは、前部前立腺（ＡＰ）、背外側前立腺（ＤＬＰ）、腹側前立腺（ＶＰ）、精嚢（ＳＶ）、肝臓、脾臓、および精巣などの異なる器官において、ＡＲエキソン２のｍＲＮＡ欠失を検出することを介して、ＲＴ−ＰＣＲによってｍＲＮＡレベルでさらに確証した（図１７ｃ）。
【０２５９】
（４）ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰおよびｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおけるＡＲ発現
ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおけるＡＲノックアウト効率をモニタリングするために、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを利用して、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）を介して前立腺上皮から抽出したＡＲエキソン２  ｍＲＮＡの発現を測定した。図１８ａからの結果は、ＡＲ  ｍＲＮＡが、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスの６週、１２週、および１６週において、２５％、５０％、および９０％以上ノックアウトされたことを示した。１６週ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスからの前立腺におけるＡＲ発現の免疫組織化学染色は、管腔細胞および基底細胞を含む、前立腺上皮におけるＡＲの損失を確証し、間質ではないことを確証した（図１８ｃ）。
【０２６０】
１２週目でＰＩＰＣを注射したｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスの、４週目または８週目のいずれかの期間でのノックダウン効率のモニタリングについては、ＡＲ  ｍＲＮＡが前立腺において４０〜５０％、精巣において４０％、精嚢において２０％、および肝臓において８０％ノックダウンされたことが見い出された（図１８ｄ）。１６週齢ｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおけるＬＣＭ単離した上皮または間質からのＡＲ  ｍＲＮＡの定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲもまた、上皮細胞における６０％  ＡＲ  ｍＲＮＡおよび間質細胞における５０％  ＡＲ  ｍＲＮＡを確証した（図１８ｆ）。
【０２６１】
（５）ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰおよびｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおける前立腺サイズおよびテストステロンの変化
全体の生殖器官は、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおける前立腺がより大きいことを除いて、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスとそれらの野生型（ＷＴ）同腹仔の間で同様であった（図１９ａ）。対照的に、ｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスは、それらのＷＴ同腹仔と比較して、前立腺を含むより小さな生殖器官を有していた（図１９ａ）。血清テストステロンは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスとそれらのＷＴ同腹仔の間で互換性があるままである。しかし、血清テストステロンは、１２週目でＰＩＰＣを注射したｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスで１６〜２４週まで減少していた。まとめると、図１９ａおよび１９ｂからの結果は、前立腺上皮におけるノックアウトＡＲが、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウス中で血清テストステロンの変化がほとんどないより大きな前立腺を生じ、ｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおけるＡＲの誘導性ノックダウンは、より低い血清テストステロンを有するより小さな前立腺を生じることを示す。
【０２６２】
（６）ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰおよびｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスの前立腺上皮において見い出される中間体細胞のより大きな集団
前立腺上皮中の３種の主要な細胞（リザーブ幹細胞、中間体細胞、および分泌管腔細胞）の中で、上皮ＡＲのノックダウンは、分泌管腔細胞の大部分の損失を生じる。対照的に、ＣＫ５／ＣＫ８二重陽性中間体細胞は、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰとｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰの両方のマウスにおいて増加した（図１９ｄ）。この結論は、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰおよびｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおいてより高いＣＤ４４発現を示す別の中間体マーカーＣＤ４４の免疫蛍光染色によってさらに支持されている。まとめると、図１９ｃから１９ｅまでの結果は、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰおよびｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおいて、上皮におけるノックアウトＡＲが、より多くの中間体細胞、およびはるかに少ない分泌管腔細胞を有する、細胞集団の変化を生じることを示す。
【０２６３】
（７）ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰおよびｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおける前立腺癌の進行の増加対減少
上皮ＡＲのノックアウトを介して上皮中の中間体細胞が増加している変化した細胞集団が前立腺癌の進行に影響を与えるか否かを試験して、１６、２０、および２４週齢のｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおいて、ＷＴ同腹仔よりも大きな原発性前立腺腫瘍が見い出された。対照的に、１２週目でＩＰＩＣを注射したｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスの２４週においては、ＷＴ同腹仔と比較して、より小さな原発性前立腺腫瘍が観察された（図２０ａ−ｂ）。ＨＥ染色もまた、１６週齢または２０週齢のそれらのＷＴ同腹仔と比較して、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおける原発性腫瘍が乏しく分化していることを見い出した（図２０ａ、ＨＥ）。このことは、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおけるより小さな原発性腫瘍が、それらのｗｔ同腹仔と比較して、より攻撃的な挙動を有することを示す。
【０２６４】
顕著には、ｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおいて見い出されたより小さな原発性腫瘍もまた、それらのＷＴ同腹仔と比較して、乏しく分化していた（図２０ａ）。
【０２６５】
サイズの増加を原発性前立腺腫瘍における成長速度と相関させるために、ＢｒｄＵ染色を介する増殖速度と、ＴＵＮＥＬアッセイを介したアポトーシス速度の両方をアッセイした。実質的により高いＢｒｄＵ染色が、それらのＷＴ同腹仔と比較して、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスの原発性腫瘍において観察された（図２０ｃ）。対照的に、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおいて、それらのＷＴ同腹仔と比較してより少ないＢｒｄＵ染色が見い出された（図２０ｃ）。別の増殖マーカーＫｉ６７の、ＣＫ−５陽性中間体細胞との二重染色もまた、ＢｒｄＵデータを確証し、それらのＷＴ同腹仔と比較して、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスの原発性前立腺腫瘍におけるより高い増殖活性、およびｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおける少ない増殖を示す（図２０ｃ）。ＴＵＮＥＬアッセイを使用して、それらのＷＴ同腹仔と比較して、より高いアポトーシス速度がｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスの原発性前立腺腫瘍において見られ、より低いアポトーシス速度がｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスの原発性前立腺腫瘍において見られた（図２０ｄ）。まとめると、これは、それらのＷＴ同腹仔と比較して、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおけるより高い増殖速度およびアポトーシス速度を有するより大きくかつより攻撃的な前立腺腫瘍、ならびにｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおけるより低い増殖速度およびアポトーシス速度を有するより小さくかつより攻撃性が少ない前立腺腫瘍を示す。ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおけるより大きくかつより攻撃的な原発性前立腺腫瘍は、それらのＷＴ同腹仔と比較して、より早期の死亡を生じる（図２０ｅ）。対照的に、ｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおけるより小さくかつより攻撃性が少ない前立腺腫瘍は、それらのＷＴ同腹仔と比較して、より長い生存を生じる（図２０ｅ）。まとめると、同時培養系でノックインまたはノックアウトのいずれかのＡＲを有するヒト前立腺癌細胞と（図１６）、ノックアウト上皮ＡＲまたは上皮および間質ＡＲでノックダウンしたかのいずれかのマウスは（図２０）、すべて、上皮ＡＲが前立腺癌進行のための抑制因子として機能し、間質ＡＲがその刺激因子として機能することを実証する。さらに、間質ＡＲは、上皮および間質のＡＲの同時ノックダウンが前立腺癌の進行の抑制を生じるように、上皮ＡＲよりも支配的な役割を果たす。
【０２６６】
（８）ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおける上皮ＡＲの損失が細胞増殖を促進する分子メカニズム
上皮ＡＲの損失が前立腺癌の進行の促進をいかにして生じるかの分子メカニズムを精査するために、細胞増殖の促進と関連があるいくつかのシグナル伝達経路をスクリーニングした。リアルタイムＰＣＲ定量からの結果は、ＴＧＦβ、ＥＧＦ、ＳＤＦ１、ＶＥＧＦ、およびＦＧＦ受容体のシグナルのみが、１６週齢のｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰからの腹側前立腺（これはすでにＰＩＮを発症している）において、ＷＴ同腹仔からのそれと比較して増加したことを示す（図２１ａ）。次に、上皮増殖に対するそれらのネガティブな効果について以前に研究されたＴＧＦβを研究した。リアルタイムＰＣＲからの結果は、１６週齢のｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスのＬＣＭ単離した前立腺上皮からのＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびそれらの受容体ＴβＲ−ＩＩを確証した（図２１ｂ）。対照的に、ＬＣＭ単離した前立腺間質からのＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、および受容体ＴβＲ−ＩＩのｍＲＮＡ発現は、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰとそれらの同腹仔の間で適合可能である（図２１ｂ）。これらの結果は、２種のヒト前立腺癌細胞からさらに確証した：図２１ｃからのデータは、ＣＷＲ２２Ｒ細胞中のＡＲのノックダウンまたはＬＮＣａＰ細胞中のＤＨＴの欠乏を示し、すべては、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２  ｍＲＮＡ発現の増加を生じる。ウェスタンブロットおよび免疫染色のデータはもまた、ＷＴ同腹仔におけるそれと比較して、１６週齢および２０週齢のｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスからの腹側前立腺におけるＴＧＦβ１タンパク質発現の増加を見い出した（図２１ｄ）。
【０２６７】
ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスのＬＣＭ単離した上皮におけるＴＧＦβシグナルの増加は、細胞質におけるその下流の標的であるホスホ−Ｓｍａｄ２／３発現の増加を生じた（図２１ｅ）。ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスの前立腺上皮における細胞質ホスホ−Ｓｍａｄ２／３発現の増加の蓄積が細胞増殖を促進するためにＭＡＰＫシグナルを通過するか否かをさらに試験するために、ホスホ−Ｓｍａｄ２／３発現の増加が見い出され、これには、それらのｗｔ同腹仔のそれと比較した、１６週齢および２０週齢のｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスから単離した前立腺中のホスホ−Ｅｒｋ１／２、ホスホ−ＪＮＫ、およびホスホ−３８の増加が付随した（図２１ｅ）。
【０２６８】
図２１ａに示す他の増加したシグナルについては、免疫染色を使用して、それらのｗｔ同腹仔のそれと比較した、１６週齢および２０週齢のｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスから単離した腹側前立腺中のＥＧＦ−Ｒ、ＥＧＦ−Ｒ１、およびＣＸＣＲ４についてのタンパク質発現の増加をさらに確証した。これらの増殖因子経路からのシグナルの増加は、ホスホ−ＡＫＴおよびホスホ−ＣＲＥＢのより高い発現を生じる（図２１ｆ）。
【０２６９】
集合的に、ＴＧＦβ  ホスホ  Ｓｍａｄ２／３  ホスホ−Ｅｒｋ１／２／ホスホ−ＪＮＫ／ホスホ３８と、ＥＧＦＲ／ＦＧＦＲ／ＳＤＦ１−ＣＸＣＲ４  ホスホ−ＡＫＴ／ホスホ−ＣＲＥＢの両方は、すべて、ｐ１６およびｐ２１の発現の現象に寄与し、サイクリンＤ１発現の増加は（図２１ｇ）、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスの前立腺腫瘍増殖の増加を生じる。
【０２７０】
（９）間質ＡＲが細胞増殖を促進するための刺激因子として機能するメカニズム
間質ＡＲが上皮ＡＲに対して反対の役割を果たす（刺激因子対抑制因子）メカニズムを精査するために、ＦＧＦ、ＴＧＦβ１、ＥＧＦ、および  ＳＤＦ−１のシグナルを研究し、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスにおいて見い出されるような増加の代わりに、ｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスからの前立腺中で減少されることを見い出した（図２２ｂ−ｄ）。リアルタイムＰＣＲ定量からの結果はまた、ＰＣ３−ＷＰＭＹ２−Ｖの同時培養に対して比較して、同時培養ＰＣ３中の−ＷＰＭＹ１−ＡＲｓｉ、ＦＧＦ２、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０（図２２ｂ）、ならびにＨＢ−ＥＧＦおよびＳＤＦ−１（図２２ｄ）のｍＲＮＡ発現の減少を確証した。さらに、ＩＧＦ１の発現の減少、ならびに同時培養したＰＣ３−ＷＰＭＹ−ＡＲｓｉとｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスの両方におけるＩＮＨＢＡおよびＢＭＰ４の発現の増加もまた、前立腺腫瘍進行を促進するために間質ＡＲの刺激因子の役割を支持する。
【０２７１】
ｂ）方法
（１）細胞培養、プラスミド、および試薬
ＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／−細胞株は、以前に記載されたように、ＡＲ発現をノックダウンするために相同遺伝子組換えストラテジーを使用して、親のＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／＋細胞株から生成される。ｗ  ＰＣ３遺伝子は、ヒトプロモーターによって以前に促進されたＡＲ  ｃＤＮＡで安定にトランスフェクトされ、この細胞株をＰＣ３−ＡＲ９と名付けた。ネオマイシン耐性遺伝子を、５００μｇ  Ｇ４１８／ｍｌとのインキュベーションによって選択した。ヒト前立腺癌細胞株ＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／＋、ＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲ＋／−、ＰＣ−３、およびＰＣ−３（ＡＲ）９を、１０％ウシ胎仔血清、２５Ｕ／ｍｌ  ペニシリン、および２５μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ  １６４０培地中に維持した。ＤＨＴおよびＨＦはＳｉｇｍａからであった。
【０２７２】
（２）安定にトランスフェクトされた細胞株ＷＰＭＹ１−ＡＲｓｉの樹立
ｓｉＲＮＡ標的化ＡＲ  ｍＲＮＡ配列
【０２７３】
【化１９】
2009537142.tif 000021
を哺乳動物細胞において、ｐＳｕｐｅｒｉｏｒベクター中で発現するヒトＡＲ小分子干渉ＲＮＡ発現ベクターを構築した。
【０２７４】
アメリカンタイプカルチャーコレクション（ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手したＷＰＭＹ１細胞は、増殖の対数期の中期または後期まで培養した。トリプシン処理後、細胞を再懸濁し、抗生物質を含まない２．５％  ＦＢＳ培地で２回洗浄した。４００μｌの細胞懸濁液（１０７細胞）をエレクトロポレーションキュベット（ＶＷＲ）に移し、エレクトロポレーター（Ｂｉｏ−ＲＡＤ  ＧＥＮＥ  ＰＵＬＳＥＲ  ＩＩ）の電圧を３００Ｖに設定し、ヒンジキャパシティーは９５０μＦに設定し、各キュベットに総計２０μｇのｐＳｕｐｅｒｉｏｒ−ベクターまたはｐＳｕｐｅｒｉｏｒ−ＡＲｓｉ  ＤＮＡを加え、ＲＴで５分間インキュベートした。パルスチャージ後、細胞は氷上で５分間インキュベートし、３５ｍｍ培養ディッシュに移した。完全な培地中３７℃、５％  ＣＯ２での７２時間の培養後、トランスフェクトした細胞はトリプシン処理し、感染細胞を選択するために、５μｇ／ｍｌのピューロマイシン中で再プレーティングした。選択培地は、耐性細胞のコロニーが形成するまで、２〜３週間の間、２〜４日毎に選択培地を交換した。この方法により、ＷＰＭＹ−１ベクター（ＷＰＭＹ１−ｖ）およびＷＰＭＹ１−ＡＲｓｉ安定細胞系統が樹立された。
【０２７５】
（３）ヌードマウスにおける腫瘍形成
ＡＲがインビボで前立腺腫瘍成長において役割を果たすか否かを調べるために、無胸腺ヌードマウスの前部前立腺にＰＣ３細胞およびＰＣ３−ＡＲ９細胞を直接的に導入するプロトコールを利用した。麻酔後、８週齢ヌードマウスの腹部を無菌環境下で外科的に切開した。１００μｌのマトリゲルに懸濁した５×１０６ＰＣ３またはＰＣ３−ＡＲ９細胞を、細針により前部前立腺に直接注射した。手術後、腹部は絹縫合により閉じた。注射の１２週間後、マウスを屠殺して異種移植腫瘍を収集した。組織をパラフィン中に固定した。
【０２７６】
（４）トランスジェニックマウスの生成
ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰまたはｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰマウスを生成するために、ＴＲＡＭＰ（Ｃ５７ＢＬ／６−ＴＲＡＭＰ×ＦＶＢ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙより）トランスジェニックマウスを、条件付きＡＲ対立遺伝子（ｆｌｏｘｅｄ  ＡＲ）３を含むｆｌｏｘｅｄ  ＡＲマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）とつがわせて、ＴＲＡＭＰ−ｆｌｏｘＡＲ雌性マウスを生成した。次いで、ＴＲＡＭＰ−ｆｌｏｘＡＲ雌性マウスを、ＡＲＲＰＢ２−Ｃｒｅマウス１３（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ、ＮＩＨより）またはＭｘ  Ｃｒｅ（Ｃ５７ＢＬ／６−ＦＶＢ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙより）のいずれかと交配させて、ｐｅｓ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰまたはｉｎｄ−ＡＲＫＯ−ＴＲＡＭＰをそれぞれ生成した。
【０２７７】
（５）レーザーキャプチャーマイクロダイセクション
前立腺組織はドライアイス中でＯ．Ｃ．Ｔ．で包埋し、切断するまで−８０℃に保存した。５μｍ切片を平らなコートしていないガラススライド上で切断し、これらを、ＨｉｓｔｏＧｅｎｅ  ＬＣＭ  Ｆｒｏｚｅｎ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｒｃｔｕｒｕｓより）によって、製造業者の指示書に従って、すぐに染色した。Ｐｉｘｃｅｌｌ  ＩＩ  ＬＣＭシステム上で、前立腺上皮および間質は、異なるキャップ上でレーザー移動した。マイクロダイセクション後、キャップは、ＰｉｃｏＰｕｒｅ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｒｃｔｕｒｕｓより）のＲＮＡ抽出緩衝液中に浸漬し、ＲＮＡを、製造業者の指示書に従って単離した。ＲｉｂｏＡｍｐ  ＲＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｒｃｔｕｒｕｓより）を使用して、１ラウンドのＲＮＡ増幅を行った。
【０２７８】
（６）ＲＮＡ抽出、ＲＴ−ＰＣＲ、およびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
組織をＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で収集し、総ＲＮＡを製造業者の指示書に従って抽出した。５μｇの総ＲＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって、オリゴ−ｄＴプライマーを用いて、２０μｌのｃＤＮＡにすぐに逆転写した。ＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲを実行し、それぞれ、ＭｙＣｙｃｌｅｒサーマルサイクラー（Ｂｉｏ−ＲＡＤ）上で、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって１μｌ  ｃＤＮＡを増幅し、ｉＣｙｃｌｅｒ  ＩＱマルチカラーリアルタイムＰＣＲ検出システム上で、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘによって１／５μｌ  ｃＤＮＡを増幅した。
【０２７９】
プライマーは、Ｂｅａｃｏｎ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ  ２ソフトウェアを使用して、以下のように設計した：ＡＲエキソン２
【０２８０】
【化２０】
2009537142.tif 000022
を内部標準として使用した。Δ閾値（ＣＴ値）は、対照ＣＴ値を、各時点からの対応するβアクチンＣＴから減算することによって計算した。非特異的増幅産物の非存在は、アガロースゲル電気泳動によって確認した。
【０２８１】
（７）免疫組織化学
サンプルは、５％中性緩衝化ホルマリン中で固定し、パラフィンに包埋した。ＡＲ、ＡＲＡ７０、およびＰＳＡのタンパク質発現レベルは、サンプルの４通りすべての対でＥＨＣ法によって研究した。ウサギ抗Ｋｉ６７、ウサギ抗Ｔａｇ、ウサギ抗ＡＲ（Ｃ１９）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＣＫ５、抗ＣＫ８、抗ＣＤ４４、抗ＴＧＦβ１、抗ｐＳｍａｄ２／３、および抗ｐＡＫＴ抗体を使用した。結合した一次抗体は、ビオチン化二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ）によって認識され、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  ＡＢＣペルオキシダーゼシステム（Ｖｅｃｔｏｒ）およびペルオキシダーゼ基質ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ）によって可視化された。ポジティブ染色は、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアにより半定量的であった。
【０２８２】
（８）免疫蛍光染色
サンプルは、５％中性緩衝化ホルマリン中で固定し、パラフィンに包埋した。切片は一次抗体、マウス抗ＣＫ５（）およびニワトリ抗ＣＤ８抗体（Ａｂｃａｍ）とともに４℃で一晩インキュベートした。６０分間のすすぎ後（３×２０分間、ＰＢＳ＋１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００）、スライスを二次抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｓ、ロバ抗ニワトリ５９６およびウマ抗マウス４８８）とともに室温で１時間インキュベートした。スライスを６０分間すすぎ（３×２０分間）、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｈ１０００（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）に装着し、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）で調べた。
【０２８３】
（９）ウェスタンブロット分析
組織および細胞溶解物は、ＲＩＰＡ緩衝液中で調製した。次いで、ｗタンパク質サンプルをＳＤＳ−１０％  ＰＡＧＥ上で分離し、ポリビニリデンジフルオリドメンブレンにこれらを転写した。ＰＢＳＴ緩衝液中の５％ノンファットミルクおよび５％ＦＢＳによるブロッキング後、このメンブレンを一次抗体でイムノブロットし、次いで、ＡＰ結合体化二次抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）とともにインキュベートした。最後に、メンブレンは、ＡＰカラー発色試薬（Ｂｉｏ−ＲＡＤ）によって発色させた。ＡＲ（Ｃ−１９）、ＮＥＰ、Ｃｏｘ−２、ｐ２７、ＭＭＰ−９、およびアクチン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に対する抗体、ならびに総Ａｋｔおよびｐ−Ａｋｔ（４７３）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を使用した。
【０２８４】
（１０）ＢｒｄＵ取り込みアッセイ
５’−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）はＳｉｇｍａから購入し、１０ｍｇ／ｍｌ濃度でＤＤＷに溶解した。屠殺の２４時間後、マウスは、グラム体重あたり１０μｇ  ＢｒｄＵを、６時間毎に腹腔内注射した。収集後、組織はパラフィンに包埋し、Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．からのＢｒｄＵ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔの製造業者による指示書に従って標識した。
【０２８５】
（１１）ＴＵＮＥＬアッセイ
フルオレセイン−Ｆｒａｇ  ＥＬ（商標）ＤＮＡ  Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＫｉｔをＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ  ＣＯ．から購入した。パラフィン包埋組織切片は、製造業者による指示書に従って標識した。標識した核は、４６５〜４９５ｎｍの標準的なフルオレセインフィルターを使用することによって対比した。
【０２８６】
（１２）統計学
データは平均±標準偏差（ＳＤ）として表示した。比較は、両側スチューデントｔ検定を使用して群間で行った。Ｐ値＊Ｐ＜０．０５または＊＊Ｐ＜０．０１は有意であると見なした。生存曲線は、カプラン−マイヤー分析およびログ−ランク検定によって分析した。
【０２８７】
Ｇ．参考文献
【０２８８】
【化２１】
2009537142.tif 000023
【０２８９】
【化２２】
2009537142.tif 000024
【０２９０】
【化２３】
2009537142.tif 000025
【０２９１】
【化２４】
2009537142.tif 000026
【０２９２】
【化２５】
2009537142.tif 000027
Ｈ．配列
１．Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ８０１７２．アンドロゲン受容体のＭ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ遺伝子５’非翻訳領域
【０２９３】
【化２６】
2009537142.tif 000028
２．Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ５９５９１．アンドロゲン受容体プロモーター領域のマウス遺伝子
【０２９４】
【化２７】
2009537142.tif 000029
３．Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ５９５９０．アンドロゲン受容体のマウス遺伝子３’ＵＴＲ
【０２９５】
【化２８】
2009537142.tif 000030
４．Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ５９５９２．アンドロゲン受容体のマウスタンパク質
【０２９６】
【化２９】
2009537142.tif 000031
５．Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ５９５９２．アンドロゲン受容体のマウスｍＲＮＡ
【０２９７】
【化３０】
2009537142.tif 000032
６．Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ５９５９２．アンドロゲン受容体のマウスタンパク質
【０２９８】
【化３１】
2009537142.tif 000033
７．Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ５９５９２．アンドロゲン受容体のマウスｍＲＮＡ
【０２９９】
【化３２】
2009537142.tif 000034
８．Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ３７８９０．マウスアンドロゲン受容体タンパク質
【０３００】
【化３３】
2009537142.tif 000035
９．Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ３７８９０．マウスアンドロゲン受容体ｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ
【０３０１】
【化３４】
2009537142.tif 000036
１０．配列番号１０マウスＡＲエキソン２に隣接する配列：エキソン２の配列に下線を伏した
【０３０２】
【化３５】
2009537142.tif 000037
１１．配列番号１１
【０３０３】
【化３６】
2009537142.tif 000038
１２．配列番号１２
【０３０４】
【化３７】
2009537142.tif 000039
１３．配列番号１３
【０３０５】
【化３８】
2009537142.tif 000040
１４．配列番号１４  プロバシンのフォワードプライマー
【０３０６】
【化３９】
2009537142.tif 000041
１５．配列番号１５  プロバシンのリバースプライマー
【０３０７】
【化４０】
2009537142.tif 000042
１６．配列番号１６  前立腺分泌タンパク質−９４（ＰＳＰ９４）のフォワードプライマー
【０３０８】
【化４１】
2009537142.tif 000043
１７．配列番号１７  前立腺分泌タンパク質−９４（ＰＳＰ９４）のリバースプライマー
【０３０９】
【化４２】
2009537142.tif 000044
１８．配列番号１８  Ｎｋｘ３．１のフォワードプライマー
【０３１０】
【化４３】
2009537142.tif 000045
１９．配列番号１９  Ｎｋｘ３．１のリバースプライマー
【０３１１】
【化４４】
2009537142.tif 000046
【０３１２】
【化４５】
2009537142.tif 000047
【０３１３】
【化４６】
2009537142.tif 000048
【０３１４】
【化４７】
2009537142.tif 000049
【図１ａ】
2009537142.tif 000050
【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図１ｆ】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１２ｄ】
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【図１２ｅ】
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【図１２ｆ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１５−５】
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【図１５−６】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８ａ】
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【図１８ｂ】
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【図１８ｃ】
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【図１８ｄ】
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【図１８ｅ】
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【図１８ｆ】
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【図１９ａ】
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【図１９ｂ】
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【図１９ｃ】
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【図１９ｄ】
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【図２０ａ】
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【図２０ｂ】
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【図２０ｃ】
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【図２０ｄ】
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【図２０ｅ】
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【図２０ｆ】
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【図２１ａ】
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【図２１ｂ】
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【図２１ｃ】
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【図２１ｄ】
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【図２１ｅ】
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【図２１ｆ】
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【図２１ｇ】
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【図２２ａ】
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【図２２ｂ】
2009537142.tif 000121
【図２２ｃ】
2009537142.tif 000122
【図２２ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2009537142.tif 000124
2009537142.tif 000125
2009537142.tif 000126