(57)【要約】  本発明は、病理的瘢痕の予防及び／又は抑制を目的とする医薬の製造におけるCXCL13又はCXCR5活性のアンタゴニストの使用、線維症性異常の予防及び／又は抑制を目的とする医薬の製造におけるそのようなアンタゴニストの使用、及び慢性創傷の予防及び／又は治療を目的とする医薬の製造におけるそのようなアンタゴニストの使用を提供する。本発明の医薬又は方法は、ケロイド又は静脈潰瘍で使用するために特に適切である。CXCL13又はCXCR5活性の適切なアンタゴニストは、CXCL13／CXCR5シグナル経路を阻害することができる任意の化合物でありえる。本発明はまた、病理的瘢痕形成又は慢性創傷形成に至る可能性がある、異常な創傷治癒モデルを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
病理的瘢痕の予防及び／又は抑制用医薬の製造のための、CXCL13又はCXCR5活性のアンタゴニストの使用。
【請求項２】
病理的瘢痕がケロイド瘢痕、過形成瘢痕及び翼状片から成る群から選択される、請求項1に記載の使用。
【請求項３】
病理的瘢痕がケロイド瘢痕である、請求項2に記載の使用。
【請求項４】
線維症性異常の予防及び／又は抑制用医薬の製造のための、CXCL13又はCXCR5活性のアンタゴニストの使用。
【請求項５】
線維症性異常が、肝硬変、肝線維症、糸球体腎炎、結膜瘢痕形成、肺性線維症、肺線維症、硬皮症、皮膚線維症、筋線維症、放射線線維症、腎線維症、腎性線維症、糸球体硬化症、子宮線維症、子宮内膜症関連線維症、癒着、慢性閉塞性肺疾患、心筋線維症、心筋梗塞後線維症、進行性全身性線維症、再狭窄、虚血性疾患関連線維症、発作後中枢神経系線維症、神経変性疾患（例えば多発性硬化症）関連線維症、及び増殖性硝子体網膜症関連線維症から成る群から選択される、請求項4に記載の使用。
【請求項６】
慢性創傷の予防及び／又は治療用医薬の製造のための、CXCL13又はCXCR5活性のアンタゴニストの使用。
【請求項７】
慢性創傷が、静脈潰瘍、虚血性創傷、糖尿病性潰瘍、神経栄養性潰瘍、動脈潰瘍、微生物感染創傷、循環障害又は静脈性うっ血を有する患者の創傷、及び褥瘡性潰瘍（床ずれ）から成る群から選択される、請求項6に記載の使用。
【請求項８】
慢性創傷が静脈潰瘍である、請求項7に記載の使用。
【請求項９】
CXCL13又はCXCR5活性のアンタゴニストが、CXCL13とCXCR5との結合を妨げる化合物である、請求項1から8のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
CXCL13のアンタゴニストが機能中和抗体である、請求項9に記載の使用。
【請求項１１】
CXCL13とCXCR5との結合を妨げる化合物が、抗体、ペプチド、CXCR5レセプターの可溶型、又は小分子アンタゴニストである、請求項9に記載の使用。
【請求項１２】
機能中和抗体がMAB801及びMAB190から成る群から選択される、請求項10に記載の使用。
【請求項１３】
CXCL13又はCXCR5活性のアンタゴニストが、CXCL13又はCXCR5の発現を低下させる化合物である、請求項1から8のいずれかに記載の使用。
【請求項１４】
化合物がアンチセンス核酸、リボザイム、siRNA、アプタマー、およびLTβR-Igから成る群から選択される、請求項12に記載の使用。
【請求項１５】
CXCL13又はCXCR5のアンタゴニストが、CXCL13とCXCR5との結合に基づいて生じる細胞内シグナル伝達を阻害する化合物である、請求項1から8のいずれかに記載の使用。
【請求項１６】
CXCL13又はCXCR5のアンタゴニストがMHV-68 M3遺伝子の生成物である、請求項1から8のいずれかに記載の使用。
【請求項１７】
異常創傷治癒モデルにおけるCXCL13を過剰発現するトランスジェニック動物の使用。
【請求項１８】
前記異常創傷治癒が慢性創傷の形成に至る、請求項17に記載の使用。
【請求項１９】
異常創傷治癒が病理的瘢痕の形成に至る、請求項17に記載の使用。
【請求項２０】
異常な創傷治癒の予防、治療又は抑制で使用するための試験化合物をスクリーニングする方法であって、CXCL13を過剰発現するトランスジェニック動物の皮膚創傷部位に前記試験化合物を投与することを含む、前記スクリーニング方法。
【請求項２１】
異常創傷治癒が慢性創傷の形成に至る、請求項20に記載の使用。
【請求項２２】
異常創傷治癒が病理的瘢痕の形成に至る、請求項20に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病理的瘢痕の予防及び／又は抑制で使用される医薬及び治療方法の提供に関する。本発明はまた、慢性創傷の予防及び／又は治療で使用される医薬及び治療方法、並びに線維症性異常の予防及び／又は治療で使用される医薬及び治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人間の組織における出生後の創傷治癒は、最終的には損傷を受けた組織の再生というよりはむしろ修復（すなわち、全てではないが本来の組織の機能及び構造のいくらかの再構築）をもたらす、一連のオーバーラップするプロセスを含む。創傷治癒は、止血、炎症、細胞分裂、細胞遊走及び組織の改造を含む複雑な一連の事象を含む。治癒速度及び組織修復後に生じる瘢痕の質/機能性の両方が臨床的に重要な主要なものである。正常な治癒プロセスの混乱は、過剰な病理的瘢痕の形成、又は治癒プロセスを顕著に遅らせる慢性創傷の発生に至る可能性がある。
瘢痕は哺乳動物の組織修復の正常な連続体の終末点であり、“治癒創傷の最終産物から生じる、皮膚構造物の正常な機能及び構造における肉眼的障害”と定義されている。
瘢痕は、全てのタイプの外科手術、貫入性外傷及び火傷の後で生じる。大半の事例で、瘢痕形成に伴う機能低下が、望ましくないが許容可能な結果として観察されえる。しかしながら、病理的瘢痕の事例では、治癒応答の結果として生じた病巣は重篤で有害な影響をもたらすことがある。
病理的瘢痕は、多数の過剰瘢痕形態（例えばケロイド瘢痕、過形成性瘢痕及び翼状片）を含むと考えられる。病理的瘢痕は、正常な創傷治癒（すなわち非病理的瘢痕を生じる）時に観察される線維症の消散と比較してその消散が遅い、進行中の線維症の成分を取り込むことができる。
【０００３】
ケロイド瘢痕（又はケロイド）は病理的瘢痕の重要例を構成し、元々の創傷縁を越えて拡大し周囲の正常な皮膚に侵入する隆起瘢痕である。ケロイドは長期にわたって増殖を続け、自発的には退縮せず、しばしば外科的切除後に再発する。ケロイド瘢痕は、主に10歳から30歳の男性及び女性で同じ頻度で発生し、ピアスの穴あけ、外科手術、ワクチン接種、刺青、咬傷、鈍性外傷及び火傷から生じえる。多くの研究が、ケロイド形成に対する潜在的な遺伝性素因の存在を示唆している。なぜならばケロイド瘢痕は浅黒い皮膚の人種に多いからである。
ケロイドは盛り上がった瘢痕として出現し、周囲組織との関係で典型的には高色素沈着性又は低色素性でありえる。ケロイドは、創傷の初期境界を超えて増殖するその傾向を基準に特徴付けることができる。顕微鏡レベルでは、ケロイドは、コラーゲンの大きな渦巻きが存在すること及び病巣の内部はもっぱら無細胞性であることを特徴としえる。
これまでのケロイドの治療方法は経験的であり、コルチコステロイド注射、寒冷療法、シリコンゲル包帯及び外科的切除が含まれ、これらは単独利用又は併用される。しかしながら、これらの方法のいずれもケロイドの治療に普遍的に有効であるわけではない。効果的にケロイドを治療することができないこと及びそれらの高い再発傾向のために、ケロイドは解決が困難であり、罹患者に大きな苦痛を引き起こす。現在のところ、予防がケロイド治療で最優先され、必須でない美容外科の回避がケロイド形成患者には推奨される。しかしながら、ケロイドの予防又は治療は医学的要求が充足されていない領域に留まっていることは一般的に認識されている。
【０００４】
過形成性瘢痕は、ケロイド病巣と非常に類似する外観を有しえる隆起した瘢痕である。ケロイドと異なり、過形成性瘢痕は本来の損傷の境界を超えて拡大せず、切除後に再発する傾向はない。過形成性瘢痕はしばしば収縮することがあり、過形成性瘢痕のこの収縮性は、筋線維芽細胞数の上昇（このタイプの瘢痕でしばしば報告される）と関連があると考えられている。過形成性瘢痕は、一般的には火傷又は熱傷の結果として生じ、特に小児で一般的である。
翼状片は、角膜境界又は角膜以遠への結膜下組織の肥大成長である。前記成長は典型的には三角形であり、その先端は瞳孔に向いている。翼状片は視力を低下させる場合があり、肥大組織の除去のために外科手術が要求されえる。さらにまた、前記組織はケロイド瘢痕と同様な態様で切除後しばしば再成長することがあり、したがって繰り返し手術を必要とする。
病理的瘢痕は“極めて過剰な”創傷治癒応答の有害な作用であると考えることができるが、創傷治癒速度の低下もまた、悪影響を生じえる正常な治癒応答の混乱を構成する。
治癒速度は高齢者では重要な問題であり、この場合、不良治癒性及び非治癒性創傷は健康上の重大な負荷となる。米国における集団の2−3パーセントで、慢性創傷は、特殊な治療及び手当てを必要としえる医療問題となっている。典型的には数日又は数週間で治癒する急性創傷とは反対に、慢性創傷は数ヶ月又は数年間さえも持続しえる。糖尿病性潰瘍又は静脈潰瘍のような慢性創傷は、患者の罹病率及び保健システム支出の重要な発生原因である。英国だけで、慢性創傷の治療に年間およそ10億ポンドが出費され、この数字は、高齢人口及び糖尿病罹患者の顕著な増加によりおそらく増加する（以下を参照されたい：Margolis et al. 2002；Kesavadev et al. 2003）。
【０００５】
脚の慢性静脈潰瘍は英国では主要な疾病であり、国民医療サービス（National Health Service）は年間およそ4億ポンドを出費し、高齢者人口の1.5％までが罹患している。下肢に潰瘍を有する米国の320万人を超える人々のうち、80から90％が静脈不全（下肢に血液が滞留する）から派生する潰瘍を有する。静脈の異常は米国の成人人口の27％に存在し、2％が潰瘍を経験している。静脈潰瘍は80％までの再発率を有する。
静脈潰瘍の病理発生は完全には理解されていないが、一般的には、静脈不全及び持続的静脈高血圧の直接的な結果であると考えられている。静脈潰瘍治癒のための従来の方法は、脚部の上昇及び圧迫に依存する。これらの方法は皮膚の灌流を改善すると広く仮定されている。専門病院での4層の圧迫包帯によって12週以内に75％の静脈潰瘍の治癒が達成されているが、10−15％の潰瘍は治癒が困難であり、さらに多くの潰瘍が再発する。圧迫により治療され脚部潰瘍が治癒した対象者では、1年経過時の全体的再発率は26％と報告されている（18ヶ月で31％に上昇する）。したがって、慢性創傷（例えば脚部潰瘍）の予防及び／又は治療に用いることができる有効な医薬がなお希求されていることは理解されよう。
瘢痕は創傷治癒により生じた構造と定義することができるが、細胞外マトリックスの同様な混乱はまた、線維症性異常として知られている多数の症状に付随する。これらの異常では、過剰な線維増多は、（病理的瘢痕で観察される態様と類似の態様で）組織の病理的混乱及び機能不全に至る。線維症性異常は、損傷を受けた組織内に異常な態様で線維性組織（主としてコラーゲン）が蓄積されることを特徴とする。そのような線維性組織の蓄積は、同じ最終結果に至る多様な疾患プロセスから生じえる。
【０００６】
上記で述べたように、病理的瘢痕（例えばケロイド）はまた進行する線維症性応答が関与し、正常な創傷治癒時に観察される態様ではそれ自体自然に消散することはない。この持続的な線維症性成分が、病理的瘢痕（例えばケロイド及び翼状片）が本来の損傷の境界を超えて増殖し、さらに外科的切除後に再発するという傾向と密接に関係しえる。病理的瘢痕で見出される進行性線維増多は、線維症性異常で観察される線維症性応答を反映することは当業者には理解されよう。線維増多を招く生物学的メカニズムは、病理的瘢痕と線維症性異常との間で共通でありえることは予想され、したがって一方の症状で線維増多を予防又は軽減するために用いることができる方法及び医薬は他方においてもまた有用でありえることは予想しえる。
線維症性異常は通常慢性である。線維症性異常の例には、肝硬変、肝線維症、糸球体腎炎、肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、硬皮症、心筋線維症、心筋梗塞後線維症、発作後中枢神経系線維症、神経変性疾患（例えばアルツハイマー病、多発性硬化症）、増殖性硝子体網膜症（PVR）、関節炎、癒着（例えば消化管、腹部、骨盤、脊椎における）が含まれる。
線維増多症状（例えば上記に列挙したもの）の緩和又は治癒に用いることができる医薬及び治療に対する広く認識された希求がなお存在する。
上記の考えは主として人間の症状、異常又は疾患に適用されるが、異常な創傷治癒（例えば病理的瘢痕に至る創傷治癒）及び線維症性異常はまた、動物（例えばウマ、ウシ、イヌ、ネコなど）においても解決が困難でありえることは理解されよう。例えば、人間のケロイドで観察されるものと類似した過剰瘢痕又は線維増多に至る腱及び靭帯損傷のように、腹部の創傷又は癒着は、ウマ（特に競走馬）を安楽死させねばならない主要な理由である。
【０００７】
ケモカインは、最初免疫細胞の移動の制御因子と特徴付けられたサイトカインの大きなスーパーファミリーである。ケモカインは、誘導性ケモカイン（炎症機能を有する）又は構成的ケモカイン（免疫細胞の正常な往来に関係がある“ホーミング”分子として機能する）に機能的に分類される。前記スーパーファミリーのメンバーはいずれも、3つのβ-シート及びカルボキシ末端ヘリックスを含む全体的構造を共有する。ケモカインは、それらのN-末端近くのシステインモチーフ；“CC”ケモカインのための隣接システイン及び介在アミノ酸を有するもののために“CXC”を基準にして構造的に分類することができる。
既知のケモカインレセプターは、クラスAの7-トランスメンブレン-スパンニングG-タンパク質結合レセプター（GPCR）である。多くの他のサイトカインレセプターとは対照的に、GPCRは、薬剤として市販されている多くの小分子アンタゴニストとともに医薬的に扱いやすい標的であることを示した。
CXCL13（BCA-1、BLC、SCYb13、BLR1L、Angie、ANGIE2としても知られている）は“ホーミング”ケモカインであり、その発現は通常はB細胞ろ胞に限定される。CXCR5（BLR1、MDR15としても知られている）はCXCL13の既知のレセプターであり、主として成熟Bリンパ球及びバーキットリンパ腫細胞上で発現される。CXCL13は、ナイーブB細胞並びにある種の活性化及びメモリーT細胞を誘引することが知られている。
障害CXCL13又はCXCR5を有するマウスは鼠径部リンパ節を欠き、脾臓に極めて異形の胚中心を有し、パイアー斑はほとんどないか又は異常である（Ansel et al. 2000）。CXCL13のトランスジェニック発現はリンパ節様構造の異所性発生を誘導し、さらにCXCL13の発現は、いくつかの疾患（主として自己免疫）で異所性類リンパろ胞の不適切な形成と関連付けられてきた。
ヒトCXCL13のcDNAは、22アミノ酸リーダー配列を有する109アミノ酸タンパク質をコードする。CXCL13ヒト及びマウスタンパク質はいくつかのアミノ酸が異なっている（64％同一）。ヒト、ラット及びマウスCXCR5タンパク質は高い同一性を有する（ヒトとマウスで74％、ヒトとラットで72％）。
ヒトCXCL13のアミノ酸配列（リーダー配列をもつもの及びもたないものの両配列）は、CXCL13をコードするcDNAの配列と同様に配列情報部（Sequence Information section）で提供される。前記配列情報部はまた、CXCR5の2つのアイソフォームのアミノ酸配列（主要型（配列番号:3で示されるアイソフォーム1）及び短縮スプライス変種（配列番号:4で示されるアイソフォーム2））及び前記レセプターのこれらの型をコードするcDNA分子を提供する。
【発明の開示】
【０００８】
本発明の目的は、従来技術の欠点の少なくともいくつかを取り除くか軽減することである。特に、病理的瘢痕の予防及び／又は抑制に使用するための新規な医薬及び治療方法を提供することが本発明のある種の実施態様の目的である。慢性創傷の予防及び／又は治療で使用するための新規な医薬及び治療方法を提供することも本発明のある種の実施態様の目的である。線維症性異常の予防及び／又は抑制のための新規な医薬及び治療方法を提供することもまた、本発明のある種の実施態様の目的である。
本発明の第一の特徴では、病理的瘢痕の予防及び／又は抑制用医薬の製造のためのCXCL13又はCXCR5活性のアンタゴニストの使用が提供される。
本発明は、CXCL13又はCXCR5活性と拮抗する作用は病理的瘢痕形成を予防又は低下させることができるという本発明者らの驚くべき発見に基づく。CXCL13及びCXCR5は特異的なリガンド／レセプターシグナル伝達ペアを構成するので、治療効果はこれら分子のどちらか（又は両方）と拮抗する作用を介して達成されえることは理解されよう。病理的瘢痕の形成はCXCL13又はCXCR5と拮抗する作用によって予防又は低下させえることを示唆したものは従来技術にはない。美観を損なう瘢痕（例えば病理的瘢痕）の予防及び／又は治療は、大きな臨床的、学術的及び商業的重要性が存在する領域である。
【０００９】
本発明者らは、CXCL13又はCXCR5活性と拮抗する作用は、ケロイド瘢痕、過形成瘢痕及び翼状片から成る群から選択される病理的瘢痕の予防及び／又は治療に特に有効であることを見出した。CXCL13又はCXCR5活性に対する治療的拮抗作用はケロイド瘢痕の予防及び／又は治療に特に好ましい。本発明者らは、本発明の方法及び医薬はケロイドを形成しやすくさせる創傷の治療に特に適切でありえる。
本発明者らは、CXCL13の発現は病理的瘢痕を生じさせる運命にある急性創傷で極めて増加することを見出した。例えば、最終的にケロイド瘢痕を生じる急性創傷は、人種的に適合するコントロールで見出される発現よりも20倍高いCXCL13の発現レベルを示す。現在のところ、病理的瘢痕の予防、治療又は抑制のために利用できる治療は不足しており、本発明はしたがって解決が困難な創傷治癒のこの領域の技術状態に重要な添加を提供する。 本発明の第一の特徴にしたがって製造される新規医薬の開発は、病的瘢痕の予防、治療又は抑制で使用することができる新規な治療法の期待を高める。本発明の第一の特徴にしたがって製造される医薬は、ケロイド、又は偶発的再発を起こしやすい病理的瘢痕の他の形態の治療に特に有用でありえる。したがって、本発明は、ケロイド瘢痕の予防、治療又は抑制を目的とする医薬の製造における、CXCL13又はCXCR5活性のアンタゴニストの使用を提供する。
上記に概略した驚くべき用途に加えて、本発明者らはまた、CXCL13又はCXCR5と拮抗する作用は、慢性創傷の形成予防、又は既存の慢性創傷の治癒促進に有用でありえることを見出した。CXCL13をコードするmRNAの発現は、適合患者の急性創傷と比較して慢性静脈潰瘍の辺縁で顕著に（58倍まで）増加する。いかなる仮説にも拘束されないが、本発明者らは、生じたCXCL13活性の増加は慢性創傷の発達及び／又は維持に寄与すると考えている。したがって、本発明の第二の特徴では、慢性創傷の予防及び／又は治療を目的とする医薬の製造におけるCXCL13又はCXCR5活性のアンタゴニストの使用が提供される。
【００１０】
CXCL13又はCXCR5活性と拮抗する作用を介して予防及び／又は治療することができる慢性創傷には、静脈潰瘍（特に下肢（例えば脚部及び足）の静脈潰瘍）、虚血性創傷、褥瘡（床ずれ）、微生物感染創傷、及び循環障害又は静脈うっ血を有する患者の創傷、又は糖尿病性潰瘍（特に足）が含まれる。静脈潰瘍は本発明にしたがって予防又は治療することができる慢性創傷の好ましいサブセットを構成する。
本発明の第二の特徴の医薬は、そのような創傷が進行するリスクがある患者における慢性創傷の予防で用いることができる。慢性創傷進行リスクは、患者の一般的な健康状態によって示されえる。例えば、高齢患者又は糖尿病患者は一般的に慢性創傷進行リスクが上昇していると考えることができる。また別に、或いは前記に加えて、慢性創傷進行のリスク増加は素因的症状又は特徴（例えば脂肪性皮膚硬化症性皮膚の存在又は第V因子ライデン（Leiden）変異の存在（Maessen-Visch et al. 1999））によっても示しえる。また別に、或いは前記に加えて、ある種のタイプの創傷（例えば脛骨前部破裂）は、慢性創傷進行の素因と関連すると考えることができる。
本発明の第二の特徴にしたがって製造される医薬が予防的に用いられる場合は、それらは、好ましくは、慢性創傷形成リスクを認識したときに可能なかぎり最も早い時期に投与することができる。本発明の第二の特徴にしたがって製造されるもっとも好ましい医薬は、慢性創傷を形成しやすい患者に症状の出現前に投与することができる。本発明の第二の特徴にしたがって製造される医薬は特に慢性創傷の再発の予防での使用に適切であることは理解されよう。
【００１１】
いかなる仮説にも拘束されないが、本発明者らは、CXCL13又はCXCR5活性のアンタゴニストは、そのような処置に付される創傷が示す治癒速度を速めることによって慢性創傷治癒を促進すると考えている。したがって、本発明は、慢性創傷の治癒を加速させることを目的とする医薬の製造におけるCXCL13又はCXCR5活性のアンタゴニストの使用を含むことは当業者には理解されよう。本発明者らの発見は特に驚くべきことであることは当業者には理解されよう。なぜならば、本発明者らの発見は、ある種のケモカインの（本発明で開示するアンタゴニストではなく）アゴニストが創傷治癒に有用でありえるという以前に指示された考えと矛盾するからである。
本発明の目的のために、慢性創傷は、適切な（通常の）治療処置に付したとき8週間以内に全く治癒傾向を示さない任意の創傷と定義することができる。
慢性創傷（例えば静脈潰瘍）は、いくらかは根幹にある皮膚疾患（例えば脂肪性皮膚硬化症）の二次的な特徴であると考えられる。したがって、本発明は、慢性創傷（例えば静脈性潰瘍）の発生率を低下させるために、脂肪性皮膚硬化症の治療に適した医薬及び方法を提供することは理解されよう。
本発明の第三の特徴では、線維症性異常の予防、治療又は抑制を目的とする医薬の製造でCXCL13又はCXCR5活性のアンタゴニストの使用が提供される。本発明の範囲を限定しようとするものではないが、本発明の第三の特徴にしたがって製造される医薬は、以下から成る群から選択される線維症性異常に関連する線維症の予防、治療又は抑制で使用することができる：肝硬変、肝線維症、糸球体腎炎、肺性線維症、肺線維症、硬皮症、皮膚線維症、筋線維症、放射線線維症、腎線維症、子宮線維症、癒着（例えば腹部、骨盤、脊椎で生じるもの）、慢性閉塞性肺疾患、硬皮症、心筋線維症、心筋梗塞後線維症、発作後中枢神経系線維症、神経変性疾患（例えばアルツハイマー病又は多発性硬化症）関連線維症及び増殖性硝子体網膜症関連線維症。
【００１２】
本明細書の目的のために、“CXCL13又はCXCR5活性のアンタゴニスト”という場合、CXCR5レセプターを介して誘引することができるCXCL13の生物学的活性と拮抗することができる任意の物質又は物質混合物を包含すると解されるべきである。この用語は、CXCL13活性と拮抗しさらにCXCR5活性とも拮抗する物質又は物質混合物；CXCL13活性と拮抗するがCXCR5活性とは直接的には拮抗しない（例えばCXCL13と結合しそれによってCXCL13とCXCR5との結合及びCXCR5を介するシグナル伝達を妨げる）物質又は物質混合物；及びCXCR5活性と拮抗するがCXCL13活性とは直接的には拮抗しない（例えばCXCR5と結合するがCXCL13とは結合せず、それによってCXCL13とそのレセプターとの結合により生じるはずのシグナル伝達を妨げる）物質又は物質混合物を包含することが意図される。CXCL13又はCXCR5活性のアンタゴニストという場合、CXCL13／CXCR5シグナル伝達経路の阻害因子を包含すると解釈することができる。
本発明にしたがって製造される医薬は、好ましくは人間の患者での使用を目的とすることができる。
一般的には、本発明の使用に適切なアンタゴニストには、CXCL13又はCXCR5活性と拮抗することができる単純な有機又は無機化合物が包含され、さらにまた適切なアンタゴニスト作用を有するタンパク質、ペプチド、核酸、糖及び抗体又は抗体誘導体も含まれると解されるべきである。CXCL13/CXCR5シグナル伝達経路の拮抗作用に関与する適切な相互作用は共有結合でも又は非共有結合でもよく、製薬工業でしっかりと確立されたスクリーニング技術によって見つけることができる。
【００１３】
本発明の方法及び医薬での使用に適切なアンタゴニストには、野生型CXCL13又はCXCR5の活性と拮抗することができるものと同様に、CXCL13又はCXCR5の変種型と拮抗することができるものが含まれる。例えば適切なアンタゴニストには、CXCL13又はCXCR5の天然に存在する変種、例えば配列番号:4に示されるCXCR5の短縮スプライス変種と拮抗することができるものが含まれえる。
CXCL13活性又はCXCR5活性の適切なアンタゴニストには、問題の部位に存在する生物学的に活性なCXCL13又はCXCR5のレベルを低下させることができる物質が含まれえる。例えば、適切なアンタゴニストは、CXCL13若しくはCXCR5のmRNA又はタンパク質レベルを低下させることができる。このタイプの例示的なアンタゴニストの例には、CXCL13又はCXCR5をコードするmRNAを中和するアンチセンスオリゴヌクレオチド、CXCL13又はCXCR5をコードするmRNAを標的としこれを分解することができるリボザイム、CXCL13又はCXCR5をコードするmRNAと結合することができるアプタマーが含まれる。各々の事例で、mRNAの不活化又は分解はコードタンパク質の発現の低下をもたらすであろう。
CXCL13及びCXCR5のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号:1、2、3及び4として示され、CXCL13又はCXCR5をコードするcDNA分子の配列はそれぞれ配列番号:5、6及び7として示されている。したがって、当業者は、CXCL13又はCXCR5をコードするmRNAと相補的なオリゴヌクレオチド又はリボザイムの適切な配列を容易に考案することができよう。さらにまた、当業者は本明細書に提供した情報を用いて、CXCL13又はCXCR5をコードするそのようなmRNAと結合することができるアプタマーの開発を可能にすることができる。
【００１４】
本発明の医薬及び治療方法での使用に適したさらに別のクラスの核酸は、CXCL13又はCXCR5をコードするmRNAに特異的な、二本鎖又はヘアピンの短い干渉性RNA（又はRNA誘導体）を含む。適切な干渉性RNA又はその誘導体は、in vitroで化学的に合成するか、又は適切なベクターからin vitro若しくはin vivoで生成することができる（Montgomery, 2004；Schutze, 2004）。
一般的には、オリゴヌクレオチドはin vivoでは比較的迅速に分解される。したがって、本発明の医薬及び方法で用いられる核酸インヒビターを改変し、分解に対してそれらを安定化させることが好ましい。適切な方法は、Kurreck（2003）で開示された方法又はWO97/29116の方法に拠ることができる。
本発明の目的のために、本発明の医薬又は方法での使用に適切なCXCL13活性又はCXCR5活性のアンタゴニストには、CXCL13又はCXCR5の誘発を防止又は減少させることができる化合物（例えば上記で考慮したタイプの核酸以外）が含まれる。そのような化合物の一例はLTβR-Igである。LTβR-Igはリンホトキシンβレセプター（LTβR）及び免疫グロブリンIgG1の部分を結合させた融合タンパク質である。LTβR-Igは“おとり”レセプターとして機能し、LTβR（その正常な機能はCXCL13の誘発である）と競合し、それによってCXCL13の誘発を減少させる。LTβR-Igは、本発明の方法又は医薬で用いることができる、CXCL13活性又はCXCR5活性の好ましいアンタゴニストである。LTβR-Igは本発明の医薬又は方法における使用に適した、CXCL13活性又はCXCR5活性のまた別のアンタゴニストの作製のための“鋳型”として用いることができることは理解されよう。これらは、LTβR-Igの作製について以前に記載した方法を用いて製造することができ、好ましくはヒトLTβRを例えばヒト免疫グロブリンのようなタンパク質と組み合わせて利用することができる。
【００１５】
本発明での使用に適した他のCXCL13活性又はCXCR5活性のアンタゴニストは、CXCR5レセプター分子との結合についてCXCL13と直接的に競合することができるもの、又はCXCL13リガンドとの結合についてCXCR5と競合することができるものである。細胞内シグナル伝達関連ドメインを欠くCXCR5レセプターのリガンド結合部分は、後者のクラスのアンタゴニストの例を構成する。
本発明の医薬又は方法で用いることができるCXCL13活性又はCXCR5活性のまた別のアンタゴニストは、マウスガンマヘルペスウイルス68（MHV-68）のM3遺伝子によってコードされる44kDaタンパク質である。このタンパク質は、多くのケモカイン（CXCL13を含む）の活性を遮断することが示されたが、以前には、病理的瘢痕又は線維症性異常又は慢性創傷の予防及び／又は治療で有用であるとは提唱されなかった。
本発明にしたがって用いられるCXCL13活性又はCXCR5活性の適切なアンタゴニストには、CXCL13のレセプター結合部分又はCXCR5のリガンド結合部位のどちらかのブロッキングを介してCXCL13とCXCR5との結合に干渉するアンタゴニストが含まれる。本発明のこの実施態様のアンタゴニストの例には、CXCL13又はCXCR5の機能をブロッキングすることができる抗体、アプタマー又はペプチドが含まれる。
本発明での使用に適した抗体アンタゴニストには、CXCL13又はCXCL13のレセプター（例えばCXCR5）と結合することができる中和抗体（又は抗体誘導物）が含まれる。本発明の医薬又は治療方法での使用に適した抗体は、CXCL13又はCXCR5の生物学的活性と拮抗するようにそれら分子と結合することができる。適切な抗体は、好ましくはCXCL13又はCXCR5との特異的結合を示すことができることは理解されよう。本発明の医薬又は治療方法で用いることができる抗体には、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体とともにそのような抗体のフラグメント（Fab又はF(ab')hd2及びFvフラグメントが含まれるが、ただしこれらに限定されない）が含まれる。
【００１６】
例えば、CXCL13又はCXCR5活性と拮抗させるために用いることができる2機能ブロッキング抗体は、R&Dシステムズから市販されている。MAB801は、ヒトCXCL13と特異的に結合するモノクローナル抗体である。MAB190は、ヒトCXCR5と特異的に結合するモノクローナル抗体である。MAB801及びMAB190の両抗体がCXCL13及びCXCR5の活性と拮抗することができるということは、これら物質の両方を用いてCXCL13/CXCR5シグナル伝達を介して仲介される化学走性活性を阻害することができるという事実によって証明される。したがって、MAB801又はMAB190を別個に又は一緒に本発明の医薬又は方法で用いることが可能であり、そのような使用は本発明の好ましい実施態様である。
与えられた標的と特異的に結合することができる抗体の作製及び／又は同定に適切な方法は当業者にはよく知られている。一般的には、適切な抗体は、単離した標的を免疫原として使用することによって作製することができる。この免疫原を哺乳動物（例えばラット、ウサギ、ヤギ又はマウス（但しこれらに限定されない））に投与し、抗体は免疫応答の部分として誘引される。一般的には、抗体は本発明の方法及びキットとの関連で用いられ、遺伝子発現タンパク質生成物と結合されるであろう。適切な免疫原には究明されるべき完全長タンパク質又はその抗原性ペプチドフラグメントが含まれる。
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ（特異的モノクローナル抗体を分泌することができる不朽化細胞株）によって製造することができる。不朽化細胞株は、そのうちの一方は腫瘍細胞である2つの異なる細胞タイプ（通常はリンパ球）を融合することによってin vitroで作製することができる。
【００１７】
上記に示したように、アプタマーは、本発明の医薬又は治療方法での使用に適したまた別のクラスのアンタゴニストである。アプタマーは核酸分子であり、特異的な配列依存性形状を有し、アプタマーとリガンド間の錠前と鍵の対応性により特異的な標的リガンドと結合する。典型的には、アプタマーは一本鎖若しくは二本鎖DNA分子（ssDNA又はdsDNA）又は一本鎖RNA分子（ssRNA）を含むことができる。
アプタマーは核酸と非核酸標的との両方の結合に用いることができる。したがって、アプタマーは、発現されたタンパク質との結合を介するか、又は関連タンパク質をコードする核酸との結合を介して、CXCL13及び／又はCXCR5との拮抗作用に適切である。
適切なアプタマーはランダムな配列プールから選択することができる（前記プールから、選択標的分子と高い親和性で結合する特異的なアプタマーが同定されえる）。所望の特異性を有するアプタマーを作製及び選別するための方法は当業者に知られており、これにはSELEX（指数関数的濃縮による系統的リガンド進化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment））プロセスが含まれる。略記すれば、オリゴヌクレオチドの大ライブラリーを作製し、in vitro選別とその後のポリメラーゼ連鎖反応による増幅の反復過程によって大量の機能的核酸の単離を可能にする。
本発明の医薬又は治療方法でアプタマーを使用することは有利でありえる。なぜならば、アプタマーは比較的安定であり、したがって保存有効期限が長いからである。本発明の医薬及び／又は方法での使用に適切なアプタマーは、好ましくは化学的改変（例えば2'-NH2及び2'-F改変）によって安定化することができる。
本発明の医薬及び／又は方法での使用に適切なアンタゴニストにはまた、レセプターブロッキング物質（例えば機能中和ペプチド）が含まれる。そのようなペプチドには、レセプターのリガンド結合領域の模倣体（天然に存在するレセプターと競合することができるが、前記ペプチド模倣体との結合に拠るCXCL13活性は生じえない）、及び／又は天然に存在する結合タンパク質又はそれらの誘導体とともにCXCR5レセプターのリガンド結合ドメインの可溶型が含まれえる。
適切なアンタゴニストには、CXCL13とCXCR5レセプターとの間の結合発生率を間接的に、例えばCXCL13又はCXCR5の隔離により低下させることができる物質が含まれえる。
【００１８】
本発明の使用に適したさらに別のクラスのCXCL13又はCXCR5のアンタゴニストは、CXCL13とCXCR5との結合によって誘引されるシグナル伝達事象を間接的に調節することができる物質又は物質混合物を含む。
CXCL13とCXCR5との結合から生じる細胞内シグナル伝達に対する拮抗作用は、CXCL13又はCXCR5活性と拮抗することができる適切な手段であることは当業者には理解されよう。スクリーニング及び分子の改造を介するGPCR（例えばCXCR5）のアンタゴニストの発見及び最適化はしっかりと確立されてあり、CXCRファミリーアンタゴニストの小分子アンタゴニストの例は当業者には知られている。
例示すれば、CXCR5は、Gタンパク質Gαl及びGαqを介してシグナルを伝達することが知られている。Gタンパク質シグナル伝達調節物質（RGS）タンパク質、RGS1及びRGS13はともにGタンパク質（例えばGαl及びGαq）を介するシグナル伝達を障害することが知られている。したがって、RGS1又はRGS13（又は前記タンパク質の発現又は活性を高めることができる化合物）を用いて、本発明によって要求されるようにCXCL13又はCXCR5活性と効果的に拮抗させることができることは当業者には理解されよう。
また別には、或いは前記に加えて、CXCR5からの細胞内シグナル伝達をこのレセプターと関連するGタンパク質（例えばGαl）を不活化することによって崩壊させることができる。そのような不活化をもたらすことができる適切な化合物には、細菌の百日咳毒素（Gαlタンパク質をその不活性な状態で“固定”するために機能する）及びGタンパク質アンタゴニストペプチドG9541が含まれる。これら両物質はSigmaから市販されている。
【００１９】
好ましい実施態様では、本発明の第一の特徴にしたがって製造される医薬が、ケロイド瘢痕の予防、抑制又は治療に用いられる。この実施態様の医薬を用いて既存のケロイド瘢痕を治療するか、又はケロイドを形成しやすい人で新しいケロイド瘢痕の形成を予防することができる。個体のケロイド形成リスク（任意のケロイド形成素因の指標でありえる）を、患者の他の身体部位における既存のケロイドの存在、又は他の指標（例えば人種、年齢、ホルモンの状態及び／又は家族歴）と照らし合わせて判定することができる。ケロイド予防に用いられる医薬は、好ましくは症状の出現前に予防的に投与することができる。
本発明の第一の特徴のこの好ましい実施態様にしたがって製造される医薬は、ケロイドを形成しやすい患者のケロイド形成の予防、既存のケロイドの改善、ケロイドを有する患者の生活の質の向上、及びケロイド再発予防として外科手術の補助の提供において有用でありえる。ケロイドの予防及び／又は抑制を目的とする医薬の製造での使用に適したアンタゴニストは、以下の好ましい結果の少なくとも1つをもたらすことができるアンタゴニストでありえる：
i）処置創傷部位のケロイド再発の減少；
ii）処置部位のケロイドの最初の再発前の潜伏時間の延長；
iii）元の病巣体積又は対応する未処置ケロイドと比較してケロイドのサイズ及び／又は体積の減少；
iv）処置時のケロイドのサイズと比較してケロイドの広がりの減少及び／又は排除；
v）ケロイド処置に対する患者の満足の増加；
vi）未処置ケロイドとは対照的な（又は処置前の同じケロイドと比較して）、処置ケロイドによって許容される運動の程度；
vii）本来のケロイドと比較した瘢痕認識；これは試験者及び／又は患者によって（リアルタイムで）判定されるか、及び／又はレイパネル（画像判定）によって判定することができる。
【００２０】
本発明の第二の特徴にしたがって製造される医薬は、慢性創傷を形成しやすい患者で慢性症状の形成を予防し、慢性創傷を有する患者で治癒を促進し、慢性創傷を有する患者の生活の質を改善し、慢性創傷の治療及び慢性創傷の再発予防に関連するヘルスケア提供業者の出費を減少させることができる。
本発明の第二の特徴の医薬の製造での使用に適したアンタゴニストは、以下の有利な結果の少なくとも1つをもたらすことができるアンタゴニストが含まれる：
i）慢性創傷の再発の予防及び減少。これは、一定期間の間に特定の重篤度の慢性創傷が進行した感受性患者の数と照らし合わせて判定することができる。
ii）慢性創傷罹患者の生活の質の改善。これは、慢性創傷の罹患者が関心を有する主要問題（例えば痛み）をカバーするアンケートの手段によって判定することができる。
iii）慢性創傷の治癒の促進。これは、創傷サイズの顕著な低下を示すか、及び／又は一定期間以内に完全に治癒するか、及び／又は完全な治癒を達成するために要した平均期間の短縮を示すか、及び／又は別の技術（例えば皮膚移植）による通常的な閉鎖を可能にするために創傷が治癒に要した期間の短縮を示した処置慢性創傷の数と照らし合わせながら判定することができる。
iv）慢性創傷の罹患者へのヘルスケア提供経費の減少。
v）ヘルスケア経費の顕著な減少又は生活の質の向上を伴う程度まで潰瘍が治癒するために要した時間の短縮。
典型的には、慢性創傷のサイズ及び形状は、アセテートシート上でトレースするか、又は写真により記録することによって定期的にモニターすることができる。
【００２１】
本発明者らは、CXCL13又はCXCR5活性が、慢性創傷（例えば静脈潰瘍）又は病理的瘢痕（例えばケロイド）に至る運命にある創傷で生じる場所はまた、これら因子の阻害因子の治療的使用の最適化において重要であることを見出した。CXCL13及びCXCR5活性は、その後病理的瘢痕へと進行する創傷の辺縁、及び慢性創傷の辺縁でももっとも上昇する。したがって、本発明の医薬は処置されるべき創傷の縁に投与されることが好ましいであろう。そのような投与に適した形態には、創傷の辺縁での塗布に適した局所的処方及び創傷の辺縁中への注射に適した注射用溶液が含まれえる。
本発明の関係で病理的瘢痕の“予防”又は“抑制”は、既存の病理的瘢痕、又は本発明の方法及び／又は医薬による治療時に形成される病理的瘢痕の臨床的に有意な一切の減少を包含すると解されるべきである。
病理的瘢痕及び線維増多はともに視覚的に有害な作用を示しえる。上記で述べたように、翼状片は結膜の隆起した楔形の線維症性増殖から成る病理的瘢痕の一形態である。翼状片は日光の下及び／又は埃っぽい条件下で長時間を過ごす人々で一般的である。ある人々では増殖は不活発のままであるが、他の症例では、中央角膜を越えて増殖し視力に影響を及ぼす。翼状片が中央角膜に侵入する場合には外科的に除去されるが、外科的切除後に増殖は再発しえる。眼の病理的瘢痕が発生する蓋然性を決定するとき、外科医は、患者の身体の他の部位の既存瘢痕を精査することができる。ケロイド又は過剰瘢痕の存在は、眼における病理的瘢痕の蓋然性の増加の指標と考えることができる。
【００２２】
本発明者らはまた、本発明の医薬及び治療方法は、眼の線維症、例えば増殖性硝子体網膜症関連線維症の予防及び／又は抑制に用いることができると考える。
心臓又は心脈管系の線維症（例えば心筋梗塞又は際狭窄に続くもの）は異常な心機能を生じえる。本発明者らは、本発明の医薬及び治療方法は、心臓又は心脈管系の線維症の予防及び／又は抑制で用いることができると考える。
生殖管の線維症（例えば子宮線維症又は卵管癒着）は不妊をもたらしえる。本発明者らは、本発明の医薬及び治療方法は、生殖管の線維症の予防及び／又は抑制に用いることができると考える。
アンタゴニストは、CXCL13又はCXCR5活性の治療的に有効な低下を達成するために適切な任意の濃度で投与することができる。適切な濃度を決定することができる方法は当業者にはよく知られており、下記でさらに検討される。例示すれば、好ましくは、アンタゴニスト（例えば中和抗体）は、0.001から250μg/mL、好ましくは0.01から75μg/mL、もっとも好ましくは0.1から50μg/mLのアンタゴニストの局所濃度（それらが治療的に有効なアンタゴニスト活性を有するべき部位の濃度）を達成するように投与することができる。例えば、上記で言及したCXCL13中和抗体MAB801は、1から100μg/mL、好ましくは10から50μg/mL、より好ましくは15から45μg/mL、もっとも好ましくは約30μg/mLの局所濃度で治療的に有効な拮抗作用を達成することができる。比較すれば、CXCR5中和抗体MAB190は、0.01から5μg/mL、好ましくは0.1から1μg/mL、より好ましくは0.3から0.9μg/mL、もっとも好ましくは約0.6μg/mLの局所濃度で治療的に有効な拮抗作用を達成することができる。
【００２３】
アンタゴニストは、毒性のない不活性な医薬的に許容できる担体中に、アンタゴニストが単体から遊離されるときに生物学的活性を有するように処方することができる。さらにまた、いくつかの例では、適切なアンタゴニストは適切なベクター（例えばプラスミドまたはウイルスベクター）を用いてin situで合成することができる。そのようなベクターからの発現は構成的であってもよく、又は細胞型特異的誘導性又は別の化合物による活性化時に誘導性であってもよい。処方物は、以下を含む公知の投与ルートによってデリバーすることができる（ただしこれらに限定されない）：局所クリーム又はゲル；経皮絆創膏又は包帯；経粘膜スプレー又はエーロゾル；創傷洗浄溶液；注射可能な静脈用又は洗浄用処方物；経口投与液又はピル。
局所的非経口投与（例えば皮内、筋肉内及び皮下）用、及び全身的非経口投与（例えば静脈内及び動脈内）用に適したアンタゴニストの治療用処方物は、適切なアンタゴニスト（所望の純度を有する）を随意の生理学的に許容できる担体、賦形剤又は安定化剤とともに、使用前に再構成される凍結乾燥及び非凍結乾燥粉末処方物、非水性及び水性溶液並びに半固形処方物の形状に混合することによって製造することができる。許容可能な担体（賦形剤を含む）は用いられる投与量及び濃度では受容者に毒性がなく、以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：緩衝液、例えばリン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸；抗酸化剤（アスコルビン酸及びメチオニンを含む）；張度改変剤、例えば塩化ナトリウム、グルコース、グリセロールなど；保存料、例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル及び／又はプロピル及び／又はブチルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；3-ペンタノール；及びm-クレゾール）；低分子量（10残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；単糖類、二糖類及び他の炭水化物（グルコース、マンノース又はデキストリンを含む）；キレート剤、例えばEDTA；他の糖、例えばシュクロース、マンニトール、マルトース、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えば亜鉛-タンパク質複合体）；陰イオン性界面活性剤、例えば脂肪酸石鹸、アシルスルフェート又はアシルスルホスクシネート；陽イオン性界面活性剤、例えばアリキル第一、第二、第三又は第四アミン；非イオン性界面活性剤、例えばアシル酸のソルビタンエステル又はポリエトキシル化エステル、ポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドとのコポリマー。
【００２４】
適切なアンタゴニズムに加えて、非経口投与用無菌的溶液を含む本発明の医薬は以下を含むことができる：0.01から0.1Mのリン酸緩衝液、0.9％w/vまでの塩化ナトリウム（血液との等張性を達成するため、290−300mOsm/L）及び1から10w/v%のマルトース（又は別の糖）。上記溶液の凍結乾燥粉末“ケーキ”を調製することも可能である。本発明の医薬はバイアル、アンプル、または前充填注射筒の形状で提供することができ、無菌的溶液、再構成用無菌的凍結乾燥粉末、無菌的懸濁液、又は局所的非経口薬剤デリバリーに適した他の任意の医薬的に許容できる提示形態のいずれかを含む。
局所投与用（例えば経皮用、眼用、耳用、鼻用、咽頭用、頬用、直腸用、膣用、尿道用）の本発明の医薬の治療処方物は、適切なアンタゴニスト（所望の純度を有する）を随意の生理学的に許容できる担体、賦形剤又は安定化剤とともに、凍結乾燥又は非凍結乾燥粉末処方物、非水性又は水性溶液、非水性又は水性懸濁液／分散液（乳液及び半固形処方物を含む）の形状で混合することによって製造することができる。許容可能な担体（賦形剤を含む）は用いられる投与量及び濃度では受容者に毒性がなく、前記には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：精製水、食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、リンゲル液、リンゲル乳酸溶液、デキストロース溶液、デキストロース/生理食塩水溶液、アルコール水溶液、グルコース、シュクロース、デキストラン、マンノース、マンニトール、マルトース、ソルビトール、ポリエチレングリコール（PEG）、プロピレングリコール（PG）、リン酸塩、酢酸塩、ゼラチン、コラーゲン、カルボポール934TM（BF Goodrich Corp.）、植物及び合成油並びにロウ、陰イオン性界面活性剤、例えば脂肪酸石鹸、アシルスルフェート又はアシルスルホスクシネート；陽イオン性界面活性剤、例えばアリキル第一、第二、第三又は第四アミン；非イオン性界面活性剤、例えばアシル酸のソルビタンエステル又はポリエトキシル化エステル、ポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドとのコポリマーなど。本発明の医薬はさらにその他に適切な保存料、安定化剤、抗酸化剤、抗微生物剤及び緩衝物質を含むことができる（例えば、メチル及び／又はプロピル及び／又はブチルパラベン、ブチル化ヒドロキシアニソール（BHA）、ブチル化ヒドロキシトルエン（BHT）、クエン酸、アスコルビン酸など）。本発明の医薬処方物で有用な乳液、クリーム又は軟膏基剤には、水系クリーム及び乳液（水中油）、油系クリーム及び乳液（油中水）、軟膏（乳化及び非乳化炭水化物）、ゲル、ヒドロゲルなどが含まれえる。局所デリバリーに適切な他の処方物には、エーロゾル、バンデージ、及び他の創傷包帯が含まれえる。例えば、適切なアンタゴニストは、創傷に適用することができる包帯、例えばバンデージ、フィルム包帯、スポンジ包帯などに取り込むことができる。例えば、適切なアンタゴニストを取り込ませたスポンジ包帯を陰圧療法と併用して、慢性創傷を予防又は治療することができる。また別には、本発明の医薬は、適切なアンタゴニストを適切なポリマーマトリックス又は膜内に取り込むか又は被包化し、したがって徐放性デリバリー装置を提供することができ、治療される部位上での設置、又は部位近くの移植に適している。
【００２５】
局所適用のための半固形ヒドロゲル処方物形態を有する本発明の医薬処方物は、適切なアンタゴニストの他に以下を含むことができる：0.1％w/vから2.0％w/vのヒドロキシセルロース、0.1％w/vから1.0％w/vのカルボポール934TM（BF Goodrich Corp.）、10から20％w/vのプロピレングリコール、0.005％w/vから0.020％w/vのメチルパラベン、及び0.005％w/vから0.020％w/vのプロピルパラベン、水酸化ナトリウム又は塩酸を適量加えてpH4−10に調整し、さらに精製水を適量加えて100％w/vに調整。この例に合う本発明の医薬は、無菌的溶液、再構成用の無菌的凍結乾燥又は非凍結乾燥粉末、無菌的懸濁液／分散液、無菌的半固形物、又は局所薬剤デリバリーに適した他の任意の医薬的に許容可能な形態を入れたビン、ジャー、チューブ、スプレーの形状で提供されえる。
CXCL13又はCXCR5活性のアンタゴニストはまた全身的に投与することができる。ある実施態様では、適切なアンタゴニストの全身投与のための医薬ベヒクルは液体でもよく、適切な医薬組成物は溶液の形態であろう。別の実施態様では、医薬的に許容可能なベヒクルは固体であり、適切なアンタゴニストの全身投与のための組成物は散剤又は錠剤の形態であろう。さらに別の実施態様では、適切なアンタゴニストは医薬的に許容可能な経皮用絆創膏の部分として処方されえる。
固体ベヒクルは、香料、滑沢剤、可溶化剤、分散剤、充填剤、潤滑剤、圧縮補助剤、結合剤又は錠剤崩壊剤として機能することができる1つ以上の物質を含むことができ、前記はまた被包化材でもありえる。散剤では、ベヒクルは微細に分割された固体であり、微細分割アンタゴニストと混合されてある。そのような散剤は好ましくはカプセルの形態で提供されえる（すなわち崩壊可能なカプセルコーティング中で）。錠剤では、アンタゴニストは必要な圧縮特性を有するベヒクルと適切な比率で混合され、所望の形状及びサイズで打錠される。散剤及び錠剤は好ましくは、99％までの選択アンタゴニストを含む。適切な固体ベヒクルには、例えばリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリドン低温溶融ロウ及びイオン交換樹脂が含まれる。
【００２６】
適切なアンタゴニストの全身又は局所投与に適したさらに別の処方物は吸入組成物の形態として存在しえる。そのような組成物は、固体処方物（例えば微細分割粉末）又は適切な溶液（霧の形態で投与される）を利用することができる。吸入を用いて適切なアゴニストの全身的投与を可能にするだけでなく、肺又は他の呼吸組織で生じる線維症部位にアンタゴニストの局所的投与を提供することができる。
慢性創傷形成の予防では全身投与に適した投薬形（例えば錠剤、カプセル又は上記で考察した吸入形）を利用することが好ましいかもしれない。なぜならば、この方法は、未だ損傷は生じてはいないが引き続いて慢性創傷が形成される可能性がある部位に“防御的な”治療的有効量の抑制物質を生じさせることができるからである。そのような全身的処方物は、後に慢性創傷を形成する蓋然性が高いことを示唆するような症状（例えば脂肪性皮膚硬化症）を呈している者への投与で特に有効である。全身性線維症性異常又は接近不能な身体部位（例えば内臓又は組織）で生じる線維症性異常の予防、治療、抑制又は減少に、全身効果を生じる投薬形は特に有用であることもまた理解されよう。
多数の慢性創傷モデルが現時点で存在するが、これらのいずれもヒトの慢性創傷を模倣すると当業者に広く受け入れられているわけではない。本発明者らは、（例えばCXCL13の投与の結果として又は好ましくはCXCL13の過剰発現の結果として）皮膚に高レベルのCXCL13を有する実験動物は、慢性創傷（例えば静脈潰瘍）の適切な動物モデルを提供しえると考える。
【００２７】
ケロイド瘢痕のための認容された動物モデルは存在しない。本発明者らは、皮膚に高レベルのCXCL13を有する動物もまた臨床的に対応するケロイド瘢痕モデルを構成すると考える。上記のように、高レベルの皮膚CXCL13は、CXCL13の投与によって、又は好ましくはCXCL13の過剰発現により達成することができる。
したがってさらに別の特徴では、本発明は、異常な創傷治癒モデルでCXCL13を過剰発現するトランスジェニック動物の使用を提供する。
本発明はまた、異常な創傷治癒の予防、治療又は抑制で使用される試験化合物をスクリーニングする方法を提供する、前記方法は、CXCL13を過剰発現するトランスジェニック動物の皮膚創傷部位に試験化合物を投与することを含む。続いて、試験化合物で処置された創傷（“試験創傷”）を参照創傷と比較し、試験創傷が異常な創傷治癒を示すか否かを判定することができる。
適切な参照創傷は、CXCL13を過剰発現するトランスジェニック動物の未処置創傷であってもよいが、その場合には、試験創傷が参照創傷よりも正常な治癒創傷に類似するならば、試験化合物は異常な創傷治癒の予防、治療及び／又は抑制での使用に適切でありえる。また別に、正常な治癒創傷を参照創傷として用いることができるが、この場合には、異常な創傷治癒の予防、治療及び／又は抑制での使用に適した試験化合物は、参照創傷と綿密に類似する試験創傷を生じる化合物でありえる。
前述のパラグラフの中の“異常な創傷治癒”は、慢性創傷の形成に至る創傷治癒、及び病理的瘢痕（例えばケロイド）の形成に至る創傷治癒の両方を包含することは理解されよう。
【００２８】
本発明者らは、生じる異常創傷治癒のタイプはトランスジェニック動物で形成される創傷の性質によって決定されえると考える。例えば、切り傷又は穿刺生検は病理的瘢痕の形成に至る異常な創傷治癒を生じえる。対照的に、より大きな摘出創傷（例えばげっ歯類モデルの事例では約2cmｘ2cmの全層皮膚創傷）は慢性創傷の形成にいたる異常な創傷治癒を生じる。
本発明の先行する特徴にしたがって広範囲の試験化合物を精査することができること、及び適切な試験化合物はCXCL13又はCXCR5活性のアンタゴニストに全く限定されないことは当業者には理解されよう。
本発明のさらに別の特徴では、病的瘢痕を予防、及び／又は抑制する方法が提供され、前記方法は、治療的に有効な量のCXCL13又はCXCR5活性のアンタゴニストをそのような予防及び／又は抑制の必要がある患者に投与することを含む。
本発明のさらに別の特徴では、慢性創傷を予防、及び／又は治療する方法が提供され、前記方法は、治療的に有効な量のCXCL13又はCXCR5活性のアンタゴニストをそのような予防及び／又は治療の必要がある患者に投与することを含む。
本発明の治療方法にしたがって使用するために適したアンタゴニストは、先行する考察のいずれかを参照しながら選択することができる。
適切なアンタゴニストの治療的に有効な量は、本明細書のいずれかで概略されている適切な考察を参照しながら決定することができる。
本発明はまた、慢性創傷の治癒を促進して慢性創傷を治療する方法を提供する。前記方法はi）創傷の挫滅組織を除去する工程、ii）挫滅除去組織の境界の皮膚でCXCL13又はCXCR5の発現を判定する工程を含み、さらに挫滅除去組織の境界の皮膚でCXCL13又はCXCR5の発現が参照値より低くなるまで工程i）及びii）を繰り返す工程を含む。好ましくは、前記判定はin vitroでの方法を利用して実施することができる。
【００２９】
挫滅除去組織そのものでのCXCL13又はCXCR5の発現を判定することによってほぼ同じ情報が提供されえること、及び上述のパラグラフで規定された方法は、挫滅除去組織での遺伝子の発現を精査するように改変できることは当業者には理解されよう。挫滅除去組織は既に身体から除去されてあり、ex vivo分析により馴染みやすいであろうという理由から、ある種の環境下ではこの改変が好ましい可能性がある。
そのような方法にて使用するために適した参照値は、正常な皮膚で観察されるCXCL13又はCXCR5の発現レベルとの関連で決定することができる。例えば、適切な参照値は正常な皮膚で見出される発現レベルの少なくとも30倍、より好ましくは正常な皮膚で見出される発現レベルの少なくとも20倍、さらに好ましくは正常な皮膚で見出される発現レベルの少なくとも10倍、さらに好ましくは正常な皮膚で見出される発現レベルの少なくとも5倍、もっとも好ましくは正常な皮膚で見出される発現レベルの5倍未満でありえる。
本発明の先行する特徴にしたがって慢性創傷を治療する方法は、慢性創傷の治療用医薬（例えば創傷治癒促進に適した医薬）の投与を含む。
本発明はまた、創傷に与えられた治療の治療的有効性を判定する方法を提供する。前記方法は、治療が与えられた創傷でのCXCL13又はCXCR5の発現を判定し、この発現を創傷のない皮膚におけるCXCL13又はCXCR5の発現を表す参照値と比較することを含む。この場合、参照値と比較して創傷におけるCXCL13又はCXCR5の発現の増加は、与えられた処置が治療的に有効ではないことを示す。したがって、創傷治癒の改善を意図する治療の実施中にCXCL13又はCXCR5の発現の上昇が持続することは、前記処置が治療的に有効ではないという指標を提供する。
【００３０】
本発明のこの方法によって提供される情報は、創傷の治療を担当する医師に、利用した処置が治療的に有効ではなかったこと、及びしたがってまた別の処置を用いることが好ましいことを知らせることができる。好ましくは、前記創傷は慢性創傷であり、与えられる治療は慢性創傷の治癒速度を速めることを意図する処置でありえる。また別には、前記創傷は、病理的瘢痕形成リスクが高いと考えられるものであり、与えられる治療は病理的瘢痕形成を予防することを意図する処置でありえる。
患者に由来する材料（例えば挫滅除去組織又は皮膚若しくは創傷サンプル）のCXCL13又はCXCR5の発現は、mRNA及び／又はタンパク質レベルで測定することができる。適切な分析は、CXCL13若しくはCXCR5ペプチド配列（他の公知のCXCケモカイン又はケモカインレセプターの全てを除く）をコードするか又は前記と50％を超える同一性、より好ましくは80％を超える同一性を有する誘導ペプチド及び核酸フラグメント、スプライス変種、多形性変種及び相同な種を含むことができる。得られた発現情報は、診断、予後判定並びに創傷及び患者の管理の決定に用いることができる。
CXCL13又はCXCR5 mRNAレベルは、遺伝子特異的ハイブリダイゼーションを必要とする方法（核酸アレイ、PCR、NASBA、RCA、分枝鎖核酸とインベーダーアッセイ、アプタマーと抗体又は抗体誘導体が含まれるが、ただしこれらに限定されない）によって測定することができる（Singh et al. 1993；Boeckh and Boivin, 1998；Bloom and Dean, 2003；Jain, 2004；Millar and Moore, 2004；Olson, 2004；Yang and Rothman, 2004）。
CXCL13又はCXCR5タンパク質レベルは、アプタマー検出、質量分析、NMR、ウェスタンブロッティング及び他の抗体依存方法（例えばELISA、RIA及び当業者によく知られた他の方法）によって測定することができる（Singh et al. 1993；Crowther, 1995；Bloom and Dean, 2003）。さらに、CXCL13シグナル伝達アンタゴニストと考えられる試薬の多くもまたを、CXCL13核酸配列、タンパク質及びペプチド並びに生物学的活性の直接的又は間接的測定に用いることができることは理解されよう。
CXCL13又はCXCR5レベルの判定に使用される適切な抗体、抗体誘導体、アプタマー及び他の核酸は、CXCL13又はCXCR5活性のアンタゴニストとの関連で本明細書のいずれかで考察した基準を参照しながら選択することができることは当業者には理解されよう。
以下の実験方法及び結果を添付の図面とともに参照しながら、これからさらに本発明を説明する。
添付の配列情報のセクションには、CXCL13及びCXCR5のアミノ酸配列とともに、これらのタンパク質をコードするcDNA分子の配列並びにCXCL13発現の定量に用いられたプライマー及びプローブが示されている。
【００３１】
実施例
実験方法と結果
1.1  ヒトサンプルの供給源
1.1.1  創傷治癒異常を示す白人男性及び女性患者由来の正常治癒創傷及び遅延（慢性）治癒創傷
対象：慢性静脈潰瘍と臨床的に診断された5人の男性及び女性患者。
方法：対象者の慢性創傷は、実験0日目の前に最低限6週間モニターした。0日目に、各対象者は、各腕の内側面に2つの4mm全層穿刺生検創傷（互いに少なくとも5cm離れている）及び1つの1cm線状切開（穿刺生検から少なくとも3cmの位置にある）を与えられた（正常に治癒する創傷である）。続いて、これら腕の急性治癒創傷の遺伝子発現分析のために特定の時点（切開及び一方の穿刺生検については3日目、他方の穿刺生検については30日目）に各治癒創傷／瘢痕を摘出した。潰瘍辺縁の6mmの全層穿刺生検を3日目の来院の時点で採取し、これらの慢性創傷サンプル（遅延治癒創傷）もまた遺伝子発現分析に用いた。摘出組織は直ちに液体窒素中で凍結し、RNA抽出に必要とされるまで-80℃で保存した。
【００３２】
1.1.2  ケロイドを形成しやすい個体に由来する治癒創傷
対象：少なくとも1年間持続するケロイド瘢痕を示し、前記ケロイド瘢痕の外科的除去を受けることになったジャマイカ人。瘢痕の期間は、瘢痕歴の徹底的調査と併せてこの瘢痕が過形成性ではなくケロイド性であると正確に診断されていたことを担保した。
方法：ケロイドから2つの全層摘出楕円形片を別々に摘出した。この楕円形片の差し渡しはケロイド縁の端から端まであり、ケロイド縁に対して垂直に走っていた。この生検を、以下を含む3つのセグメントに分割した：ケロイドの境界の皮膚（本明細書ではエキストラケロイドと呼ぶ）、ケロイドの縁（ペリケロイドと呼ぶ）及びケロイド組織自体（イントラケロイドと呼ぶ）。前記生検切片をRNAレーター溶液（Ambion）に浸漬し、-80℃で保存した。摘出後3から4日で、前記楕円形創傷の一方を再摘出し、生検を上記のように分割し処理した。摘出7から10日後に残りの楕円形創傷を再摘出した。
ケロイド生検を上記のように水平領域に分割することによって、ケロイド感受性皮膚（エキストラケロイド部分によって表される）、ケロイド縁（ペリケロイド部分）及びケロイド内部（イントラケロイド部分）間の分子的相違の解明が可能になる。
【００３３】
1.1.3  若い健常な白人男性の正常治癒創傷及び創傷のない皮膚
対象：18歳から45歳の60人の非喫煙健常白人男性。
方法：全ての対象者は、各腕の内側面に互いに少なくとも5cm離れた2つの1cmの線状切開を受けた。対象者の一部分はまた、各腕に1つの3mm穿刺生検を受けた（前記切開から少なくとも3cm離れている）。前記3mm穿刺生検は、非創傷皮膚の例として用いることができるように保存した。各治癒創傷／瘢痕は、遺伝子発現分析のために創傷後一定の時点（1日目、3日目、5日目、30日目及び180日目を含む）で摘出した。摘出組織は直ちに液体窒素中で凍結し、RNA抽出が必要とされるまで-80℃で保存した。
【００３４】
1.1.4  アフリカ系カリブ人女性の腹部の皮膚
対象：ケロイド瘢痕歴のないジャマイカ人。
方法：対象者は、腹壁形成術前に1cmの深さで1cmの楕円形腹部皮膚を摘出された。前記生検切片をRNAレーター溶液（RNA Later solution, Ambion）に浸漬し、遺伝子発現プロファイリング実施前に-80℃で保存した。摘出3日後に前記楕円形創傷の1つを再摘出し、生検を上記のように分割し処理した。摘出7日後に残りの楕円形創傷を再摘出した。
【００３５】
1.1.5  女性の正常及び炎症扁桃組織のRNA
女性の正常及び炎症扁桃組織のRNAをクリノミクス・バイオサイエンシーズ社（Clinomics Biosciences Inc., Waterviliet, NY 12189）から入手した。
【００３６】
1.1.6  閉経後の白人女性の正常治癒創傷及び創傷のない皮膚
対象：ホルモン補充療法を受けていない9人の閉経後の女性。
方法：両腕の内側に4つの3mm穿刺生検創傷を作り、生検を非創傷皮膚サンプルとして保存した。前記生検を創傷後3、7及び30日で再摘出した。摘出組織は直ちに液体窒素中で凍結し、RNA抽出が必要とされるまで-80℃で保存した。
【００３７】
1.2  アフィメトリクスジーンチップ発現プロファイリング
組織をDiax（G-10）ホモジナイザーを用いて破砕し、全RNAをRNeasyミディキット（Qiagen）の皮膚特異的プロトコルを用いて精製した。遺伝子発現は、HGU133aアレイでアフィメトリクスジーンチップシステムの標準的な方法を用いて決定した（GeneChip Expression Analysis Technical Manual, Affymetrix 701021 rev 1, 2001）。
1.3  ジーンチップ発現データの分析
アフィメトリクスが推奨する品質管理メトリクス（存在パーセント、スケーリング係数、GAPDH 3'/5'比）にパスしたデータセットをスポットファイア（Spotfire AB）に移入した。1、2、3・・・アレイデータセットで存在すると判定された遺伝子はアフィメトリクスｐ値の基準にしたがって分類した。全てのアレイで存在しないとみなされた遺伝子は更なる分析から省いた。
1.4  リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
定量的リアルタイム逆転写PCR（リアルタイムRT PCR）を用いて、ハウスキーピング遺伝子（5-AMP活性化タンパク質キナーゼガンマ1サブユニット）と比較してCXCL13発現レベルを定量した。得られたRNAは、製造業者の指示（DNA-free, Ambion Inc.）にしたがって夾雑DNAを除去するために処理し、Stratagene MX4000サーマルサイクラーで製造業者の指示にしたがい（Stratagene One Step RT-PCR kit：Cat. No 929532）逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応に付した。使用したプライマー及びプローブは配列情報のセクションに示されている。
反応混合物（総体積25μL）の最終組成は以下のとおりであった：鋳型RNA（〜250ng）。1ｘのStratagene Core RT緩衝液、0.8mMのdNTP、3.5mMのMgCl2、75nMのRox、1.25ユニットのSure Start Taq、400nMの各プライマー、200nMのプローブ、10ユニットの逆転写酵素。
使用したサイクリング条件は以下のとおりであった：45℃で30分1回；95℃で10分1回；（95℃で30秒、58℃で1分、72℃で30秒）を45回。
鋳型なし及び逆転写酵素なしのコントロールを用いてRNAからの増幅だけであることを担保した。
【００３８】
2.  結果
2.1  アフィメトリクスデータは、CXCL13は、慢性創傷及びケロイドとなる運命の創傷の縁で発現されるが、正常創傷又は創傷のない皮膚では発現されないことを示している
CXCL13発現は、5人の別個の患者由来の10の静脈潰瘍のうち9つ、及びケロイドになる運命の59の急性創傷の42から検出された（肉眼的には正常なエキストラケロイド組織の8創傷のうち6つを含む）。比較として、慢性創傷を有する5人の患者全員の多数の急性創傷、非ケロイド形成ジャマイカ人の6つの創傷の全て、及び種々の治癒段階にある男女の218の急性創傷ではCXCL13発現は検出されなかった（検出の下方限界未満の遺伝子発現）。
CXCL13発現を表すシグナルは、慢性創傷において同一患者の急性創傷より58倍高く（log2データのスチューデント検定でｐ＝1.55ｘ10-10）、全ての急性ヒト創傷よりも33倍高かった（log2データのスチューデント検定でｐ＝2.90ｘ10-25）。これらの結果は、CXCL13発現及び活性は慢性創傷の進行及び／又は維持と関係があること、及びCXCL13活性の（又はCXCL13のレセプター、CXCR5の活性の）アンタゴニストはしたがって慢性創傷の予防及び／又は治療に用いることができることを明瞭に示していることを当業者は理解しえよう。CXCL13の発現レベルの低下はまた慢性創傷の治癒状態と相関性を有しえる。この情報は、治療の有効性の診断指標として有用でありえる。例えば、慢性創傷の縁のCXCL13発現レベルが治療の数週間後に高いままならば、これは、施療者に当該創傷が処置に応答していないこと、及びまた別の処置計画を用いるべきであることを示すこととなろう。
CXCL13発現を表すシグナルは、ケロイドになる運命の急性創傷で、非ケロイド形成ジャマイカ人の急性創傷に由来するコントロールサンプルよりも20倍高かった（log2データのスチューデント検定でｐ＜1.2ｘ10-4）。本発明者らは、この20倍の相違は極めて過小評価されていると考える。すなわち、アフィメトリクスのアルゴリズムは急性創傷のシグナルを“存在しない”と規定し、したがってこれら創傷に由来するシグナル値はシステムのノイズのために過大評価されるであろう。本発明者らは、CXCL13発現及び活性は病理的ケロイド瘢痕の進行と関連があること、及びCXCL13活性（又はCXCL13のレセプター、CXCR5活性）のアンタゴニストはしたがって病理的瘢痕（例えばケロイド）予防及び／又は抑制で用いることができることを当業者への例証に供するために前記の結果は十分であると確信している。この実験の結果はまた、創傷部位のCXCL13又はCXCR5の発現増加は、そのような創傷がケロイドを形成しやすいことと密接に関連しえることを明瞭に示している。したがって、創傷部位におけるCXCL13又はCXCR5の発現レベルの精査を予後診断ツールとして用い、当該精査創傷が病理的ケロイド瘢痕へと進行するリスクを判定することができる。さらにまた、ケロイドを伴う線維症でCXCL13又はCXCR5活性が中心的に関与するということは、これらの分子のアンタゴニズムが線維症性異常の予防、緩和又は治療に有効な処置でありえることを明確に示している。
【００３９】
2.2  コントロール扁桃組織及び炎症扁桃組織の分析は驚くべきことにCXCL13は炎症に付随しないことを明らかにする
CXCL13発現が（例えば創傷治癒の最初のステージで生じるように）炎症と関連しているか否かを解明するために、CXCL13の発現を炎症扁桃組織及び正常扁桃組織の両方で精査した。この実験の結果は、CXCL13発現はコントロール扁桃と比較して炎症組織で増加しないことを示し、したがってCXCL13発現は炎症それ自体ではなく類リンパ組織の維持と連関していることが示された。
この発見は、治癒の炎症期にある創傷から採取した多くのサンプルでCXCL13発現が検出されないという事実によってさらに支持された（創傷後1、3及び5日）。
【００４０】
2.3  リアルタイムRT-PCR実験はCXCL13のアフィメトリクス測定を裏付ける
リアルタイムRT-PCRは、急性創傷と比較してほぼ64倍高いCXCL13発現を慢性創傷で示している（表1参照）。リアルタイムRT-PCR実験では、閾値サイクル（Ct）は存在する遺伝子転写量を示す。より低いCt値は、逆転写酵素のないコントロール反応（-rt）がはるかに高いCt値を示す（ゲノムDNA夾雑に由来する遺伝子配列の増幅は全くないか又はきわめてわずかであることを示唆する）ことを条件に、より高レベルの標的転写物の指標である。我々の有効性証明実験は、いずれの与えられた全RNAインプットについても（ハウスキーピング遺伝子のCtによって示されるように）、CXCL13のCt値は、慢性静脈潰瘍サンプルで、同じ患者若しくは他の患者の急性損傷と比較して少なくとも6サイクルよりも早く、ほぼ26すなわち64倍高い発現を示した（表1を参照されたい）。ほとんどの事例で、CXCL13の発現は急性創傷では検出不能であった（45サイクルのCt、表1参照）。
病理的ケロイド瘢痕、慢性創傷及び急性創傷におけるCXCL13の発現を調べたさらに別の例示は図1で見ることができる。ここでは、CXCL13発現は、病理的瘢痕（及びそのような瘢痕に進行する創傷）及び慢性創傷において、急性創傷（病理的瘢痕に進行する創傷以外の創傷）のCXCL13の発現と比較したとき顕著に増加することを観察することができる。本発明者らは、種々のケロイドサンプル間で観察される発現の変動は、サンプリングの時期にケロイドにおいて活発に線維増多が進行しているか否かと連関していると考える（すなわち発現の上昇は生検に対する応答で線維増多が進行しているサンプル又は最初の損傷の境界を超えて増殖中の被検サンプルに付随し、一方、より低い発現は線維症性応答が比較的低下した時期にサンプリングされたケロイドで見出される）。
図1はまた、CXCL13発現は慢性創傷で顕著に増加することを示している。図1Bでは、慢性及び急性創傷サンプルで調べたハウスキーピング遺伝子に対する同一のCtは、両サンプルが同じ全RNA濃度を含むことを示している。対照的に、慢性創傷（静脈潰瘍）と急性創傷サンプルにおけるCXCL13のCt値の間の8サイクルの相違は、慢性創傷サンプルで急性創傷よりもCXCL13発現レベルが極めて高いことを示している。
【００４１】
表1：急性及び慢性創傷サンプルにおけるリアルタイムRT-PCR
-rt、逆転写酵素無し；CVU、慢性静脈潰瘍
45の閾値サイクル（Ct）は、標的が検出不能であることを示す。
2009538274.tif 000002
2009538274.tif 000003
結論
CXCL13は創傷のない皮膚では発現されない。
CXCL13は正常な瘢痕を生じる急性、治癒創傷では発現しない。
正常治癒のいずれの段階もCXCL13発現を伴わない。
CXCL13は扁桃組織で発現される。
CXCL13発現は、非炎症扁桃組織と比較して炎症扁桃組織でより高いことはない。
CXCL13は創傷治癒又は病的状態のどちらにおいても炎症に付随しない。
驚くべきことに、CXCL13は慢性静脈潰瘍の縁及びケロイドを形成する運命の創傷組織で強く発現される。したがって、CXCL13及び／又はCXCR5活性のアンタゴニストは、異常な創傷治癒症状、例えば慢性創傷又はケロイド瘢痕の予防、治療又は緩和を目的とする適切な治療的介入である。
さらにまた、CXCL13又はCXCR5に対する拮抗作用は、線維症性異常の予防、治療又は緩和で有用でありえる。
【００４２】
配列情報：
ヒトCXCL13及びCXCR5の核酸及びタンパク質配列
ヒトCXCL13のアミノ酸配列（リーダー配列を含む）
配列番号:1
1    mkfistslll mllvsslspv qgvlevyyts lrcrcvqess vfiprrfidr iqilprgngc
61    prkeiivwkk nksivcvdpq aewiqrmmev lrkrssstlp vpvfkrkip
ヒトCXCL13のアミノ酸配列（リーダー配列を含まない）
配列番号:2
1     vlevyytslr crcvqessvf iprrfidriq ilprgngcpr keiivwkknk sivcvdpqae
61    wiqrmmevlr krssstlpvp vfkrkip
【００４３】
CXCR5アイソフォーム1のアミノ酸配列
配列番号:3
1 mnypltlemd lenledlfwe ldrldnyndt slvenhlcpa tegplmasfk avfvpvaysl
61 ifllgvignv lvlvilerhr qtrsstetfl fhlavadlll vfilpfavae gsvgwvlgtf
121 lcktvialhk vnfycsslll aciavdryla ivhavhayrh rrllsihitc gtiwlvgfll
181 alpeilfakv sqghhnnslp rctfsqenqa ethawftsrf lyhvagfllp mlvmgwcyvg
241 vvhrlrqaqr rpqrqkavrv ailvtsiffl cwspyhivif ldtlarlkav dntcklngsl
301 pvaitmcefl glahcclnpm lytfagvkfr sdlsrlltkl gctgpaslcq lfpswrrssl
361 sesenatslt tf
【００４４】
CXCR5アイソフォーム2のアミノ酸配列
配列番号:4
1 masfkavfvp vayslifllg vignvlvlvi lerhrqtrss tetflfhlav adlllvfilp
61 favaegsvgw vlgtflcktv ialhkvnfyc sslllaciav drylaivhav hayrhrrlls
121 ihitcgtiwl vgfllalpei lfakvsqghh nnslprctfs qenqaethaw ftsrflyhva
181 gfllpmlvmg wcyvgvvhrl rqaqrrpqrq kavrvailvt sifflcwspy hivifldtla
241 rlkavdntck lngslpvait mceflglahc clnpmlytfa gvkfrsdlsr lltklgctgp
301 aslcqlfpsw rrsslsesen atslttf
【００４５】
ヒトCXCL13をコードするcDNA
配列番号:5
1 ttcggcactt gggagaagat gtttgaaaaa actgactctg ctaatgagcc tggactcaga
61 gctcaagtct gaactctacc tccagacaga atgaagttca tctcgacatc tctgcttctc
121 atgctgctgg tcagcagcct ctctccagtc caaggtgttc tggaggtcta ttacacaagc
181 ttgaggtgta gatgtgtcca agagagctca gtctttatcc ctagacgctt cattgatcga
241 attcaaatct tgccccgtgg gaatggttgt ccaagaaaag aaatcatagt ctggaagaag
301 aacaagtcaa ttgtgtgtgt ggaccctcaa gctgaatgga tacaaagaat gatggaagta
361 ttgagaaaaa gaagttcttc aactctacca gttccagtgt ttaagagaaa gattccctga
421 tgctgatatt tccactaaga acacctgcat tcttccctta tccctgctct ggattttagt
481 tttgtgctta gttaaatctt ttccagggag aaagaacttc cccatacaaa taaggcatga
541 ggactatgtg aaaaataacc ttgcaggagc tgatggggca aactcaagct tcttcactca
601 cagcacccta tatacacttg gagtttgcat tcttattcat cagggaggaa agtttctttg
661 aaaatagtta ttcagttata agtaatacag gattattttg attatatact tgttgtttaa
721 tgtttaaaat ttcttagaaa acaatggaat gagaatttaa gcctcaaatt tgaacatgtg
781 gcttgaatta agaagaaaat tatggcatat attaaaagca ggcttctatg aaagactcaa
841 aaagctgcct gggaggcaga tggaacttga gcctgtcaag aggcaaagga atccatgtag
901 tagatatcct ctgcttaaaa actcactacg gaggagaatt aagtcctact tttaaagaat
961 ttctttataa aatttactgt ctaagattaa tagcattcga agatccccag acttcataga
1021 atactcaggg aaagcattta aagggtgatg tacacatgta tcctttcaca catttgcctt
1081 gacaaacttc tttcactcac atctttttca ctgacttttt ttgtgggggc ggggccgggg
1141 ggactctggt atctaattct ttaatgattc ctataaatct aatgacattc aataaagttg
1201 agcaaacatt ttactt
【００４６】
ヒトCXCR5転写変種１をコードするcDNA
配列番号:6
1 gctgccacct ctctagaggc acctggcggg gagcctctca acataagaca gtgaccagtc
61 tggtgactca cagccggcac agccatgaac tacccgctaa cgctggaaat ggacctcgag
121 aacctggagg acctgttctg ggaactggac agattggaca actataacga cacctccctg
181 gtggaaaatc atctctgccc tgccacagag gggcccctca tggcctcctt caaggccgtg
241 ttcgtgcccg tggcctacag cctcatcttc ctcctgggcg tgatcggcaa cgtcctggtg
301 ctggtgatcc tggagcggca ccggcagaca cgcagttcca cggagacctt cctgttccac
361 ctggccgtgg ccgacctcct gctggtcttc atcttgccct ttgccgtggc cgagggctct
421 gtgggctggg tcctggggac cttcctctgc aaaactgtga ttgccctgca caaagtcaac
481 ttctactgca gcagcctgct cctggcctgc atcgccgtgg accgctacct ggccattgtc
541 cacgccgtcc atgcctaccg ccaccgccgc ctcctctcca tccacatcac ctgtgggacc
601 atctggctgg tgggcttcct ccttgccttg ccagagattc tcttcgccaa agtcagccaa
661 ggccatcaca acaactccct gccacgttgc accttctccc aagagaacca agcagaaacg
721 catgcctggt tcacctcccg attcctctac catgtggcgg gattcctgct gcccatgctg
781 gtgatgggct ggtgctacgt gggggtagtg cacaggttgc gccaggccca gcggcgccct
841 cagcggcaga aggcagtcag ggtggccatc ctggtgacaa gcatcttctt cctctgctgg
901 tcaccctacc acatcgtcat cttcctggac accctggcga ggctgaaggc cgtggacaat
961 acctgcaagc tgaatggctc tctccccgtg gccatcacca tgtgtgagtt cctgggcctg
1021 gcccactgct gcctcaaccc catgctctac actttcgccg gcgtgaagtt ccgcagtgac
1081 ctgtcgcggc tcctgacgaa gctgggctgt accggccctg cctccctgtg ccagctcttc
1141 cctagctggc gcaggagcag tctctctgag tcagagaatg ccacctctct caccacgttc
1201 taggtcccag tgtccccttt tattgctgct tttccttggg gcaggcagtg atgctggatg
1261 ctccttccaa caggagctgg gatcctaagg gctcaccgtg gctaagagtg tcctaggagt
1321 atcctcattt ggggtagcta gaggaaccaa cccccatttc tagaacatcc ctgccagctc
1381 ttctgccggc cctggggcta ggctggagcc cagggagcgg aaagcagctc aaaggcacag
1441 tgaaggctgt ccttacccat ctgcaccccc ctgggctgag agaacctcac gcacctccca
1501 tcctaatcat ccaatgctca agaaacaact tctacttctg cccttgccaa cggagagcgc
1561 ctgcccctcc cagaacacac tccatcagct taggggctgc tgacctccac agcttcccct
1621 ctctcctcct gcccacctgt caaacaaagc cagaagctga gcaccagggg atgagtggag
1681 gttaaggctg aggaaaggcc agctggcagc agagtgtggc cttcggacaa ctcagtccct
1741 aaaaacacag acattctgcc aggcccccaa gcctgcagtc atcttgacca agcaggaagc
1801 tcagactggt tgagttcagg tagctgcccc tggctctgac cgaaacagcg ctgggtccac
1861 cccatgtcac cggatcctgg gtggtctgca ggcagggctg actctaggtg cccttggagg
1921 ccagccagtg acctgaggaa gcgtgaaggc cgagaagcaa gaaagaaacc cgacagaggg
1981 aagaaaagag ctttcttccc gaaccccaag gagggagatg gatcaatcaa acccggcggt
2041 cccctccgcc aggcgagatg gggtggggtg gagaactcct agggtggctg ggtccagggg
2101 atgggaggtt gtgggcattg atggggaagg aggctggctt gtcccctcct cactcccttc
2161 ccataagcta tagacccgag gaaactcaga gtcggaacgg agaaaggtgg actggaaggg
2221 gcccgtggga gtcatctcaa ccatcccctc cgtggcatca ccttaggcag ggaagtgtaa
2281 gaaacacact gaggcaggga agtccccagg ccccaggaag ccgtgccctg cccccgtgag
2341 gatgtcactc agatggaacc gcaggaagct gctccgtgct tgtttgctca cctggggtgt
2401 gggaggcccg tccggcagtt ctgggtgctc cctaccacct ccccagcctt tgatcaggtg
2461 gggagtcagg gacccctgcc cttgtcccac tcaagccaag cagccaagct ccttgggagg
2521 ccccactggg gaaataacag ctgtggctca cgtgagagtg tcttcacggc aggacaacga
2581 ggaagcccta agacgtccct tttttctctg agtatctcct cgcaagctgg gtaatcgatg
2641 ggggagtctg aagcagatgc aaagaggcaa gaggctggat tttgaatttt ctttttaata
2701 aaaaggcacc tataaaacag gtcaatacag tacaggcagc acagagaccc ccggaacaag
2761 cctaaaaatt gtttcaaaat aaaaaccaag aagatgtctt caaaaaaaaa aaaaaaaaaa
2821 aaaa
【００４７】
ヒトCXCR5転写変種2をコードするcDNA
配列番号:7
1 ccactctaag gaatgcggtc cctttgacag gcgaaaaact gaagttggaa aagacaaagt
61 gatttgttca aaattgaaat ttgaaacttg acatttggtc agtgggccct atgtaggaaa
121 aaacctccaa gagagctagg gttcctctca gagaggaaag acaggtcctt aggtcctcac
181 cctcccgtct ccttgccctt gcagttctgg gaactggaca gattggacaa ctataacgac
241 acctccctgg tggaaaatca tctctgccct gccacagagg ggcccctcat ggcctccttc
301 aaggccgtgt tcgtgcccgt ggcctacagc ctcatcttcc tcctgggcgt gatcggcaac
361 gtcctggtgc tggtgatcct ggagcggcac cggcagacac gcagttccac ggagaccttc
421 ctgttccacc tggccgtggc cgacctcctg ctggtcttca tcttgccctt tgccgtggcc
481 gagggctctg tgggctgggt cctggggacc ttcctctgca aaactgtgat tgccctgcac
541 aaagtcaact tctactgcag cagcctgctc ctggcctgca tcgccgtgga ccgctacctg
601 gccattgtcc acgccgtcca tgcctaccgc caccgccgcc tcctctccat ccacatcacc
661 tgtgggacca tctggctggt gggcttcctc cttgccttgc cagagattct cttcgccaaa
721 gtcagccaag gccatcacaa caactccctg ccacgttgca ccttctccca agagaaccaa
781 gcagaaacgc atgcctggtt cacctcccga ttcctctacc atgtggcggg attcctgctg
841 cccatgctgg tgatgggctg gtgctacgtg ggggtagtgc acaggttgcg ccaggcccag
901 cggcgccctc agcggcagaa ggcagtcagg gtggccatcc tggtgacaag catcttcttc
961 ctctgctggt caccctacca catcgtcatc ttcctggaca ccctggcgag gctgaaggcc
1021 gtggacaata cctgcaagct gaatggctct ctccccgtgg ccatcaccat gtgtgagttc
1081 ctgggcctgg cccactgctg cctcaacccc atgctctaca ctttcgccgg cgtgaagttc
1141 cgcagtgacc tgtcgcggct cctgacgaag ctgggctgta ccggccctgc ctccctgtgc
1201 cagctcttcc ctagctggcg caggagcagt ctctctgagt cagagaatgc cacctctctc
1261 accacgttct aggtcccagt gtcccctttt attgctgctt ttccttgggg caggcagtga
1321 tgctggatgc tccttccaac aggagctggg atcctaaggg ctcaccgtgg ctaagagtgt
1381 cctaggagta tcctcatttg gggtagctag aggaaccaac ccccatttct agaacatccc
1441 tgccagctct tctgccggcc ctggggctag gctggagccc agggagcgga aagcagctca
1501 aaggcacagt gaaggctgtc cttacccatc tgcacccccc tgggctgaga gaacctcacg
1561 cacctcccat cctaatcatc caatgctcaa gaaacaactt ctacttctgc ccttgccaac
1621 ggagagcgcc tgcccctccc agaacacact ccatcagctt aggggctgct gacctccaca
1681 gcttcccctc tctcctcctg cccacctgtc aaacaaagcc agaagctgag caccagggga
1741 tgagtggagg ttaaggctga ggaaaggcca gctggcagca gagtgtggcc ttcggacaac
1801 tcagtcccta aaaacacaga cattctgcca ggcccccaag cctgcagtca tcttgaccaa
1861 gcaggaagct cagactggtt gagttcaggt agctgcccct ggctctgacc gaaacagcgc
1921 tgggtccacc ccatgtcacc ggatcctggg tggtctgcag gcagggctga ctctaggtgc
1981 ccttggaggc cagccagtga cctgaggaag cgtgaaggcc gagaagcaag aaagaaaccc
2041 gacagaggga agaaaagagc tttcttcccg aaccccaagg agggagatgg atcaatcaaa
2101 cccggcggtc ccctccgcca ggcgagatgg ggtggggtgg agaactccta gggtggctgg
2161 gtccagggga tgggaggttg tgggcattga tggggaagga ggctggcttg tcccctcctc
2221 actcccttcc cataagctat agacccgagg aaactcagag tcggaacgga gaaaggtgga
2281 ctggaagggg cccgtgggag tcatctcaac catcccctcc gtggcatcac cttaggcagg
2341 gaagtgtaag aaacacactg aggcagggaa gtccccaggc cccaggaagc cgtgccctgc
2401 ccccgtgagg atgtcactca gatggaaccg caggaagctg ctccgtgctt gtttgctcac
2461 ctggggtgtg ggaggcccgt ccggcagttc tgggtgctcc ctaccacctc cccagccttt
2521 gatcaggtgg ggagtcaggg acccctgccc ttgtcccact caagccaagc agccaagctc
2581 cttgggaggc cccactgggg aaataacagc tgtggctcac gtgagagtgt cttcacggca
2641 ggacaacgag gaagccctaa gacgtccctt ttttctctga gtatctcctc gcaagctggg
2701 taatcgatgg gggagtctga agcagatgca aagaggcaag aggctggatt ttgaattttc
2761 tttttaataa aaaggcacct ataaaacagg tcaatacagt acaggcagca cagagacccc
2821 cggaacaagc ctaaaaattg tttcaaaata aaaaccaaga agatgtcttc aaaaaaaaaa
2881 aaaaaaaaaa aaa
【００４８】
CXCL13発現の定量に用いたプライマー及びプローブ
CXCL13（MWG Biotech）
R           5’  tca gct cct gca agg tta tt             3’
L           5’  tct tcc ctt atc cct gct ct             3’
プローブ    5’  *tcc agg gag aaa gaa ctt ccc ca #      3’
ハウスキーピング遺伝子（Oswel）
R           5’     agc tca ggg ctt ctt ctc tc          3’
L           5’     ggt tca ccg act tgt agt gg          3’
プローブ    5’     *aca tcc tgc agg ccc tgg tg @       3’
記号：
* = 6 FAM 
# = ブラックホールクェンチャー1
@ = TAMRA 
【００４９】
参考文献
Ansel KM, Ngo VN, Hyman PL, Luther SA, Forster R, Sedgwick JD, Browning JL, Lipp M, Cyster JG (2000).   A chemokine-driven positive feedback loop organizes lymphoid follicles.  Nature 406, 309-14.
Bloom JC and Dean RA (2003) in Biomarkers in Clinical Drug Development.
Boeckh M, Boivin G (1998).  Quantitation of cytomegalovirus: methodologic aspects and clinical applications. Clin. Microbiol. Rev. 11, 533-54.
Crowther JR (1995) in Elisa: Theory and Practice.  Humana Press.
Jain KK (2004).  Applications of biochips: from diagnostics to personalized medicine.
Curr. Opin. Drug. Discovery Devel. 7, 285-9.
Kesavadev JD, Short KR, Nair, KS (2003).  Diabetes in old age: an emerging epidemic.
J. Assoc. Physicians India. 51, 1083-94.
Kurreck J (2003).  Antisense technologies. Improvement through novel chemical modifications. Eur. J. Biochem. 270, 1628-44.
Maessen-Visch MB, Hamulyak K, Tazelaar DJ, Crombag NH, Neumann HA (1999).
The prevalence of factor V Leiden mutation in patients with leg ulcers and venous insufficiency. Arch. Dermatol. 135, 41-4.
Margolis DJ, Knauss J, Bilker W (2002). Hormone replacement therapy and prevention of pressure ulcers and venous leg ulcers.  Lancet 359, 675-7.
Millar BC, Moore JE (2004). Molecular diagnostics: current options.  Methods Mol. Biol. 266, 139-66.
Montgomery MK (2004). RNA interference: historical overview and significance.
Methods Mol. Biol. 265,3-21.
Olson MC, Takova T, Chehak L, Curtis ML, Olson SM, Kwiatkowski RW (2004).
Invader assay for RNA quantitation.  Methods Mol. Biol. 258, 53-69.
Schutze N (2004).  siRNA technology.  Mol. Cell. Endocrinol. 213,115-9.
Singh, P, Sharma, BP, and Typle, P (editors), 1993. Diagnostics in the Year 2000: Antibody, Biosensor, and Nucleic Acid Technologies. (Van Nostrand Reinhold, New York, 1993).
Yang S, Rothman RE (2004).   PCR-based diagnostics for infectious diseases: uses, limitations, and future applications in acute-care settings. Lancet Infect. Dis. 4, 337-48
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１Ａ】図１Ａは、病理的ケロイド瘢痕、慢性創傷及び創傷のない皮膚のサンプルにおけるCXCL13発現の比較を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、急性及び慢性創傷のリアルタイムRT-PCRの比較を示す。
【図１Ａ】
2009538274.tif 000004
【図１Ｂ】
2009538274.tif 000005
【配列表】
2009538274000001.app
【国際調査報告】
2009538274.tif 000006
2009538274.tif 000007
2009538274.tif 000008