(57)【要約】本発明は、サイトカインが病因に関与する免疫疾患を処置する材料および方法を、提供する。本発明の材料および方法は、自己免疫疾患の処置に有用である。本発明の材料および方法は、ヒトＩＬ−２３および／またはヒトＩＬ−１２サイトカインに結合することができ、それゆえそれらの生物学的活性を調節することができる核酸リガンドに関し、また、本発明の材料および方法は、免疫治療、自己免疫治療および癌治療における治療薬として有用である。
2009521208.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−２３に結合するアプタマーであって、該アプタマーは、ＩＬ−２３誘導性ＳＴＡＴ３リン酸化を阻害し、該アプタマーは、配列番号３０９であるか、または配列番号３０９がＩＬ−２３誘導性ＳＴＡＴ３リン酸化を阻害する能力と同じ能力を有するアプタマーであり、そして該アプタマーは、１００ｎＭ未満のＫＤを含む、アプタマー。
【請求項２】
ＩＬ−２３誘導性ＳＴＡＴ３リン酸化を阻害する前記同じ能力を有する前記アプタマーが、配列番号３０６〜３０８および配列番号３１０〜３１４からなる群から選択される、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項３】
前記アプタマーが、ヒトＩＬ−２３と結合する、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項４】
前記アプタマーが、少なくとも１つの化学改変を含むようにさらに改変されている、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項５】
前記改変が、核酸の糖の位置における化学的置換；核酸のリン酸の位置における化学的置換；および核酸の塩基の位置における化学的置換からなる群から選択される、請求項４に記載のアプタマー。
【請求項６】
前記改変が、改変ヌクレオチドの組み込み、３’キャッピング、高分子量で非免疫原性化合物との結合体化および親油性化合物との結合体化からなる群から選択される、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項７】
前記非免疫原性で高分子量の化合物が、ポリアルキレングリコールである、請求項６に記載のアプタマー。
【請求項８】
前記ポリアルキレングリコールが、ポリエチレングリコールである、請求項７に記載のアプタマー。
【請求項９】
前記アプタマーが、インビトロにおいてＩＬ−２３誘導性ＳＴＡＴ３リン酸化を阻害する、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項１０】
ＩＬ−２３に結合し、そして配列番号３０９と少なくとも９５％同一のアプタマー核酸配列を含む、アプタマー。
【請求項１１】
配列番号３０９に示される前記アプタマー核酸配列を含む、請求項１０に記載のアプタマー。
【請求項１２】
ＰＥＧをさらに含む、請求項１１に記載のアプタマー。
【請求項１３】
前記ＰＥＧが、２０および４０ｋＤＡからなる群から選択される分子量を含む、請求項１２に記載のアプタマー。
【請求項１４】
以下に示す構造：
【化１】
2009521208.tif 000153
ここで：
【化２】
2009521208.tif 000154
は、リンカーを示し、
【化３】
2009521208.tif 000155
ここで、「ｄ」は、２’デオキシヌクレオチドを示し、「ｍ」は、２’−Ｏｍｅヌクレオチドを示し、ｓは、非架橋リン酸位のホスホロチオエート置換を示し、そして３Ｔは、逆位デオキシチミジンを示す、構造
を有するアプタマー。
【請求項１５】
前記リンカーが、アルキルリンカーである、請求項１４に記載のアプタマー。
【請求項１６】
前記アルキルリンカーが、２〜１８個連続したＣＨ２基を含む、請求項１５に記載のアプタマー。
【請求項１７】
前記アルキルリンカーが、２〜１２個連続したＣＨ２基を含む、請求項１６に記載のアプタマー。
【請求項１８】
前記アルキルリンカーが、３〜６個連続したＣＨ２基を含む、請求項１７に記載のアプタマー。
【請求項１９】
以下に示す構造：
【化４】
2009521208.tif 000156
ここで、「ｄ」は、２’デオキシヌクレオチドを示し、「ｍ」は、２’−Ｏｍｅヌクレオチドを示し、ｓは、非架橋リン酸位のホスホロチオエート置換を示し、そして３Ｔは、逆位デオキシチミジンを示す、構造
を有する、請求項１８に記載のアプタマー。
【請求項２０】
請求項１に記載のアプタマーまたはその塩の治療有効量および薬学的に許容可能なキャリアまたは希釈剤を含む組成物。
【請求項２１】
Ｉｌ−２３によって媒介される疾患を処置、予防または改善する方法であって、それらを必要とする患者に請求項１９に記載のアプタマーを投与する工程を含む、方法。
【請求項２２】
請求項１に記載のアプタマーと試験組成物とを接触させる工程およびＩＬ−２３の有無を検出する工程を含む、診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、核酸分野一般、より詳細には、ヒトインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）サイトカインファミリーのメンバー、より具体的には、ヒトインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、ヒトインターロイキン−２３（ＩＬ−２３）またはＩＬ−１２とＩＬ−２３の両方および他の関連サイトカイン（例えば、ＩＬ−２７およびｐ４０ダイマー）に結合することができるアプタマーに関する。そのようなアプタマーは、ＩＬ−１２ファミリーのサイトカイン、具体的にはＩＬ−２３およびＩＬ−１２が関係している自己免疫関連疾患および／または他の疾患もしくは障害の治療薬および診断薬として有用である。本発明は、さらに、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２に結合することができるアプタマーを投与するための材料および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
アプタマーは、古典的なＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成以外の相互作用を介して分子への特異的な結合親和性を有する核酸分子である。
【０００３】
ファージディスプレイによって生成されるペプチドまたはモノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）のようなアプタマーは、選択された標的に特異的に結合することができ、そして、例えば、結合アプタマーが、それらの標的が機能する能力を阻止し得ることによって、その標的の活性を調節することができる。ランダム配列オリゴヌクレオチドのプールからインビトロセレクション（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）プロセスによって作製されるアプタマーは、成長因子、転写因子、酵素、免疫グロブリンおよびレセプターを含む１００個を超えるタンパク質について作製されている。代表的なアプタマーは、１０〜１５ｋＤａのサイズ（３０〜４５ヌクレオチド）であり、サブナノモル濃度の親和性でその標的と結合し、密接に関連した標的を識別する（例えば、アプタマーは、代表的には、同じ遺伝子ファミリー由来の他のタンパク質と結合しない）。一連の構造的研究により、アプタマーは、抗体−抗原複合体における親和性および特異性を駆動するのと同じタイプの結合相互作用（例えば、水素結合、静電気的相補性（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｉｅｓ）、疎水性接触、立体排除）を使用することができることが示されている。
【０００４】
アプタマーは、治療薬および診断薬として使用するために望ましい多くの特性（高い特異性および親和性、生物学的効率ならびに優れた薬物動態学的特性を含む）を有する。さらに、アプタマーは、抗体および他のタンパク質生物学よりも特定の競合的な利点をもたらす。例えば：
１）速度および制御。アプタマーは、完全にインビトロプロセスによって作製されるので、治療的リード化合物（ｌｅａｄｓ）を含む最初のリード化合物を迅速に作製することができる。インビトロセレクションにより、アプタマーの特異性および親和性を厳密に制御することが可能となり、有毒かつ非免疫原性の標的に対するリード化合物を含むリード化合物を作製することができる。
【０００５】
２）毒性および免疫原性。ある１つのクラスとしてアプタマーは、毒性または免疫原性をほとんどまたは全く示さない。高レベルのアプタマーをラットまたはウッドチャックに長期間投与するとき（毎日１０ｍｇ／ｋｇを９０日間）、いかなる臨床的、細胞性または生化学的な測定によっても毒性が観察されない。多くのモノクローナル抗体の有効性が、抗体自体に対する免疫応答によって厳しく制限され得るのに対し、アプタマーは、ＭＨＣを介してＴ細胞によって提示され得ず、また、免疫応答は一般に、核酸フラグメントを認識するように教育されていない可能性が非常に高いので、アプタマーに対する抗体を誘発することは、極度に困難である。
【０００６】
３）投与。現在承認されている抗体治療法のほとんどが、静脈内注射（代表的には、２〜４時間に亘る注射）によって投与されるのに対し、アプタマーは、皮下注射によって投与することができる（皮下投与を介したアプタマーバイオアベイラビリティは、サルを用いた研究において８０％超である（非特許文献１）。この差は、主に、溶解性が比較的低いことに起因し、それゆえほとんどの治療的ｍＡｂは、大量に必要である。溶解性が良好（１５０ｍｇ／ｍＬ超）であり、かつ、比較的低分子量（アプタマー：１０〜５０ｋＤａ；抗体：１５０ｋＤａ）であるので、１週間あたりのアプタマー用量は、０．５ｍＬ未満の容積で注射により送達され得る。さらに、アプタマーのサイズが小さいことから、抗体または抗体フラグメントが透過できない構造的狭窄領域を透過することができ、これは、アプタマーベースの治療または予防のさらに別の利点であることを示している。
【０００７】
４）拡張性およびコスト。治療的アプタマーは、化学合成されるため、その結果として、生産需要を満たすのに必要なスケールに容易に調節することができる。生産量の調節が困難であることから、現在、いくつかの生物製剤の利用可能性が制限されている。また、大規模タンパク質生産プラントの資本コストが莫大であるのに対し、１台の大規模オリゴヌクレオチド合成装置では１００ｋｇ／年より多く生産することができ、比較的多くない初期投資ですむ。キログラム規模でのアプタマー合成に対する現在の商品コストは、＄５００／ｇと見積もられており、その額は、高度に最適化された抗体に対するコストに匹敵する。プロセス開発の継続的な改良により、商品コストを５年間で＄１００／ｇ未満に抑えられると予想される。
【０００８】
５）安定性。治療的なアプタマーは、化学的に頑強である。治療的アプタマーは、因子（例えば、熱および変性剤）に曝露された後に活性を回復するように本質的に順応し、また、凍結乾燥粉末として室温において長期間（１年超）に亘って保存可能である。
【０００９】
（サイトカインおよび免疫応答）
哺乳動物における免疫応答は、「免疫ネットワーク」と呼ばれる一連の複雑な細胞相互作用に基づいている。リンパ球、マクロファージ、顆粒球および他の細胞のネットワーク様細胞相互作用に加えて、リンフォカイン、サイトカインまたはモノカインとして知られている可溶性タンパク質は、これらの細胞相互作用を調節する際に重大な役割を果たす。免疫系の細胞によるサイトカイン発現は、免疫応答の制御において重要な役割を果たす。ほとんどのサイトカインは、多面発現性であり、抗原提示；ＣＤ４＋細胞サブセットの活性化、増殖および分化；Ｂ細胞の抗体応答；ならびに過敏症の徴候を含む複数の生物学的活性を有する。サイトカインは、免疫系および／または造血細胞に直接または間接的にかかわる、多岐にわたる変性状態または異常状態に関与する。サイトカインの重要なファミリーは、例えば、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７ならびにｐ４０モノマーおよびｐ４０ダイマーを含むＩＬ−１２ファミリーである。
【００１０】
ＩＬ−２３は、ｐ１９およびｐ４０サブユニット（各々は、別個の遺伝子によってコードされる）を含む共有結合したヘテロダイマー分子である。ＩＬ−１２はまた、共有結合したヘテロダイマー分子であり、ｐ３５およびｐ４０サブユニットからなる。従って、ＩＬ−２３とＩＬ−１２の両方が、ｐ４０サブユニットを共通して有する（図１）。ヒトおよびマウスのｐ１９は、約７０％のアミノ酸配列同一性を有し、ｐ３５に密接に関連している（このサブユニットは、ＩＬ−１２に特有である）。トランスフェクションアッセイにより、ｐ１９タンパク質は、ｐ３５と同様に、単独で発現されるときは、その分泌が不十分であり、高い発現のためには、ヘテロダイマー化パートナーのｐ４０との同時発現が必要であることが明らかになっている。ｐ４０およびｐ１９は、一緒になってジスルフィド結合したヘテロ二量体を形成する。ｐ１９構成要素は、活性化マクロファージ、樹状細胞（「ＤＣ」）、内皮細胞およびＴ細胞によって大量に生産される。Ｔｈ１細胞は、Ｔｈ２細胞よりも大量のｐ１９  ｍＲＮＡを発現する；しかしながら、これらの細胞タイプのうち、活性化マクロファージおよびＤＣだけが、恒常的にＩＬ−２３の他方の構成要素であるｐ４０を発現する。ｐ１９の発現は、Ｔｏｌｌ様レセプター−２を介してシグナルを送る細菌の生成物によって増大されることから、ｐ１９、およびそれに伴ってＩＬ−２３は、ある特定の細菌の感染に対する免疫応答において機能し得ることが示唆される。
【００１１】
ＩＬ−１２およびＩＬ−２３の共通した作用の１つは、Ｔ細胞に対する増殖促進効果である（非特許文献２）。しかしながら、これらのサイトカインが作用するＴ細胞サブセットにおいて明らかな差が存在する。マウスにおいて、ＩＬ−１２は、マウスナイーブＴ細胞の増殖を誘導するが、メモリーＴ細胞の増殖は誘導しないのに対し、ＩＬ−２３の増殖促進効果は、メモリーＴ細胞に限定される。ヒトにおいて、ＩＬ−１２は、ヒトナイーブＴ細胞およびヒトメモリーＴ細胞の両方の増殖を促進する；しかしながら、ＩＬ−２３の増殖促進効果は、なおもメモリーＴ細胞に限られる。また、ＩＦＮ−γ生成に対するＩＬ−２３の作用は、ヒトにおいて主にメモリーＴ細胞に対するものである。ＩＬ−１２が、ナイーブＴ細胞において、およびメモリーＴ細胞においてはより高い程度で、ＩＦＮ−γ生成を誘導し得るが、ＩＬ−２３は、ナイーブＴ細胞におけるＩＦＮ−γ生成に対して非常に小さい効果しか有しない。ＩＦＮ−γ生成の中程度の増大は、ＩＬ−２３によって刺激されたメモリーＴ細胞において観察されるが、この効果は、ＩＬ−１２による刺激から生じる効果よりもいくらか小さい。
【００１２】
従って、ＩＬ−２３は、ＩＬ−１２とは異なる生物学的活性を有するが、それらの両方は、自己免疫性疾患および炎症性疾患（例えば、骨粗鬆症における骨吸収（ｂｏｎｅ  ｒｅｓｏｐｒｔｉｏｎ）、Ｉ型糖尿病および癌などの疾患に加えて、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈａｍａｔｏｓｕｓ）および過敏性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎を含む））に関与していると考えられている。
【００１３】
（自己免疫疾患治療薬としてのＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２特異的アプタマー）
理論に拘束する意図はないが、ＩＬ−１２およびＩＬ−２３は、多発性硬化症（「ＭＳ」）の病因に関与すると考えられている。例えば、ｐ４０レベルは、ＭＳ患者の脳髄液においてアップレギュレートされる（非特許文献３）。さらに、抗ｐ４０ｍＡｂは、脳における病変に局在することが示されている（非特許文献４）。さらに、より低いベースラインレベルのｐ４０  ｍＲＮＡは、ＩＦＮ−β処置に対する臨床応答を予測することが示されている（非特許文献５）。従って、ｐ４０を介したＩＬ−１２とＩＬ−２３の両方のノックダウンにより、ＭＳの症状が改善し得る。実際に、抗ｐ４０抗体が、マウス（非特許文献６）およびマーモセット（非特許文献４）において実験的自己免疫性脳脊髄炎（「ＥＡＥ」）の発症および重症度を有意に抑制することが示されている。
【００１４】
ＩＬ−２３とＩＬ−１２の両方ともをノックアウトすることにより、ＭＳの発症および症状が抑制されることを示す証拠が存在するにもかかわらず、ＥＡＥマウスモデルに対するＩＬ−１２およびＩＬ−２３ノックアウトの効果によって示されているような、マウスにおけるＭＳ／ＥＡＥ病因において、その２つのうちＩＬ−２３のほうが、重要であるという証拠が有力である（非特許文献７）。例えば、ｐ３５ノックアウトマウスにおいてＥＡＥは生じ得るが、ｐ１９またはｐ４０ノックアウトマウスでは生じ得ない（非特許文献７）。ＣＮＳにおけるＩＬ−２３の発現は、ｐ１９／ｐ４０ノックアウトマウスにおいてＥＡＥを救済するが、ＩＬ−１２の発現は救済せず、ＩＬ−１２の過剰発現は、ＥＡＥを悪化させ、それゆえ、ＩＬ−１２は、通常のＴＨ１細胞の発達および活性化においていくつかの役割を果たすと見られる（非特許文献７）。ヒトでは、ＭＳ患者の中枢神経系（ＣＮＳ）においてｐ４０  ｍＲＮＡの過剰発現は、観察されているが、ｐ３５  ｍＲＮＡの過剰発現は観察されていない。
【００１５】
ＩＬ−１２は、Ｔｈ１細胞を活性化する際に通常の役割を果たすことに加えて、感染への対処に対してＩＬ−２３よりも重要であり得る。マウスでは、ｐ１９ノックアウトにより、古典的なＴｈ１細胞応答（高ＩＦＮ−ガンマ、低ＩＬ−４）が誘導されるのに対し、ｐ３５およびｐ４０ノックアウトマウスにおける応答は、Ｔｈ２細胞に限定される（低ＩＦＮ−ガンマ、高ＩＬ−４）（非特許文献７）。さらに、ｐ１９ノックアウト免疫細胞は、強力な炎症促進性サイトカインを生成するのに対し、ｐ４０ノックアウト免疫細胞は、それらを生成することができない。最後に、ｐ４０、ＩＬ−１２Ｒβ１およびＩＬ−１２Ｒβ２ノックアウトマウスは、種々の感染症に罹患しやすい（非特許文献８）。従って、アプタマー治療薬を介して特異的にＩＬ−２３を阻害することにより、効果的にＩＬ−２３媒介性疾患に対処し得るのと同時に、患者を感染に対して一層対処できるようにする。
【００１６】
ＩＬ−２３およびＩＬ−１２の両方またはいずれかは、末期の関節の炎症を助長するものとして関節リウマチに関与する。理論に拘束する意図はないが、ＩＬ−２３は、メモリーＴ細胞および炎症性マクロファージ上のＩＬ−２３レセプター（ＩＬ−２３Ｒ）の会合を介してこれらの細胞の機能に影響を及ぼすと考えられている。研究により、ＩＬ−２３サブユニットのｐ１９および／またはｐ４０は、関節リウマチについてのマウスモデルであるマウスのコラーゲン誘導関節炎（「ＣＩＡ」）に関わっていることが示唆されている。抗ｐ４０抗体は、単独で、そして抗腫瘍壊死因子（抗ＴＮＦ）処置と併用するとき、マウスＣＩＡにおける症状を改善し、そして発症および進行を防ぐと示されている（非特許文献９、非特許文献１０および非特許文献１１）。さらに、ｐ３５ノックアウトマウスでは、ＣＩＡの発症および重症度が悪化するが、ｐ１９およびｐ４０ノックアウトマウスは、ＣＩＡの発症に対して完全に抵抗性であることが示されている（非特許文献１２および非特許文献１３）。従って、ＩＬ−２３に結合し、それを阻害する本発明のアプタマーおよび方法は、関節リウマチに対する治療薬として有用である。
【００１７】
ＩＬ−２３およびＩＬ−１２の両方またはいずれかはまた、Ｔｈ−１媒介性疾患（例えば、尋常性乾癬および過敏性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎が挙げられるがこれらに限定されない））における炎症細胞の動員において主要な役割を果たすと考えられている。例えば、高レベルのｐ１９およびｐ４０  ｍＲＮＡは、尋常性乾癬に罹患した患者の皮膚病変において定量的ＲＴ−ＰＣＲによって検出されたのに対し、ｐ３５  ｍＲＮＡは、検出されなかった（非特許文献１４）。マウスにおける炎症性腸疾患の実験モデルである、２，４，６，トリニトロベンゼンスルホン酸（「ＴＮＢＳ」）大腸炎において、抗ＩＬ−１２モノクローナル抗体による処置により、粘膜の炎症を完全に改善／予防する際に有効であることが証明された（非特許文献１５）。ＴＮＢＳ大腸炎モデルにおいていくつかの異なるＩＬ−１２アンタゴニストを評価した別の研究では、抗ＩＬ−１２  ｐ４０抗体は、粘膜の炎症を予防する際に最も有効であったことから、ＩＬ−１２とＩＬ−２３の両方ともが関与することが証明された（非特許文献１６）。従って、ＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３に結合し、それを阻害する本発明のアプタマーは、乾癬および炎症性腸疾患に対する治療薬として有用である。
【００１８】
ＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３は、全身性エリテマトーデス（「ＳＬＥ」）に関わっているとも考えられている。例えば、ＳＬＥ患者から得られた血清には、ヘテロ二量体（例えば、ＩＬ−１２（ｐ３５／ｐ４０）およびＩＬ−２３（ｐ１９／ｐ４０））としてのｐ４０の血清レベルよりもモノマーとしてのｐ４０の量が有意に多く含まれていることが見出されたことから、不十分なＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２の生成は、ＳＬＥの病因に関与し得ることが示唆される。従って、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２の生物学的機能を増強する本発明のアプタマーは、全身性エリテマトーデスの処置における治療薬として有用である（非特許文献１７）。
【００１９】
（腫瘍学的治療薬としてのＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２特異的アプタマー）
ＩＬ−１２の抗腫瘍活性は、十分に特性付けられており、また、最近の研究により、ＩＬ−２３もまた抗腫瘍活性および抗転移性活性を有することが示されている。例えば、レトロウイルスによりＩＬ−２３を形質導入された結腸癌腫細胞は、免疫適格マウスにおける細胞株によって確立された結腸腫瘍の増殖がコントロール細胞株と比較して有意に低下したことから、腫瘍におけるＩＬ−２３の発現は、抗腫瘍効果をもたらすことが示唆される（非特許文献１８）。同様に、一本鎖ＩＬ−２３（「ｓｃＩＬ−２３」）を放出するようにレトロウイルスにより操作された肺癌腫細胞株は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて肺転移を有意に抑制し、ほぼ完全な腫瘍拒絶がもたらされた（非特許文献１９）。従って、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２に結合し、それらの生物学的機能を増強するアプタマーは、結腸癌、肺癌、具体的には肺転移ならびにＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２が抗腫瘍効果を有する他の腫瘍学的疾患の処置に対する腫瘍学的治療薬として有用である。
【００２０】
ヒトＩＬ−２３を特異的に標的にする治療薬は、現在のところ知られていない。ＩＬ−２３を標的にする利用可能な薬剤としては、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を介して入手可能な研究使用目的のみの抗ヒトＩＬ−２３  ｐ１９ポリクローナル抗体、ＩＬ−１２とＩＬ−２３の両方がｐ４０サブユニットを共通して有するために両方のサイトカインを標的にする抗ヒトｐ４０モノクローナル抗体、および抗マウスＩＬ−２３  ｐ１９ポリクローナル抗体および抗マウスＩＬ−２３  ｐ１９モノクローナル抗体（マウスＩＬ−２３を標的にするが、ヒトＩＬ−２３を標的にしない）（非特許文献２０）が挙げられる。先に説明したように、ＩＬ−２３とＩＬ−１２の両方ともの活性を阻害する薬剤は、患者を感染症によりかかりやすくし得、一般に、治療薬を開発する点でＩＬ−２３のみを阻害する薬剤よりも多くの合併症を引き起こし得る。ＩＬ−２３が、脳および関節における自己免疫性炎症に対してＩＬ−１２よりも重要な役割を果たすという証拠が存在するので、ＩＬ−２３だけに特異的な治療薬は、両方のサイトカインを標的にする薬剤（例えば、抗ｐ４０ヒトｍＡｂ）よりも有益であり得る。
【非特許文献１】Ｔｕｃｋｅｒら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ．７３２：２０３−２１２，１９９９
【非特許文献２】Ｂｒｏｍｂａｃｈｅｒら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎ．（２００３）
【非特許文献３】Ｆａｓｓｂｅｎｄｅｒら、（１９９８）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ５１：７５３
【非特許文献４】Ｂｒｏｋら、ＪＩ（２００２）１６９：６５５４
【非特許文献５】Ｖａｎ−Ｂｏｘｅｌ−Ｄｅｚａｉｒｅら、１９９９
【非特許文献６】Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｅｓｃｕら、ＪＩ（１９９８）１６１：５０９７
【非特許文献７】Ｃｕａら，（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  ４２１：７４４
【非特許文献８】Ａｄｏｒｉｎｉ，Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００３）ｐｇ．２５３
【非特許文献９】Ｍａｌｆａｉｔら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８）１１１：３７７
【非特許文献１０】Ｍａｔｔｈｙｓら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８）２８：２１４３
【非特許文献１１】Ｂｕｔｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２２０５
【非特許文献１２】ＭｃＩｎｔｙｒｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９６）２６：２９３３
【非特許文献１３】Ｍｕｒｐｈｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（２００３）１９８：１９５１
【非特許文献１４】Ｌｅｅら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ（２００４）１９９（ｌ）：１２５−３０
【非特許文献１５】Ｎｅｕｒａｔｈら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ（１９９５）１８２：１２８１−１２９０
【非特許文献１６】Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００２−０３）；７０：１７７−１８３
【非特許文献１７】Ｌａｕｗｅｒｙｓら、Ｌｕｐｕｓ（２００２）１１（６）：３８４−７
【非特許文献１８】Ｗａｎｇら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：１０５，８２０−８２４（２００３）
【非特許文献１９】Ｌｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３，１７１：６００−６０７）
【非特許文献２０】Ｐｉｒｈｏｎｅｎら（２００２），Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６９：５６７３−５６７８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
アプタマーの特異性、小ささおよび親和性が、治療薬として有利である場合、ヒトサイトカイン、具体的にはＩＬ−２３およびＩＬ−１２が病因に関わっている疾患を処置するアプタマー治療薬のための材料および方法を有することが有益であり得る。本発明は、これらの必要性およびその他の必要性を満たす材料および方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
（発明の要旨）
本発明は、自己免疫性疾患および炎症性疾患、ならびにＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２が病因に関与する他の関連疾患／障害の処置のための材料および方法を提供する。
【００２３】
１つの実施形態において、本発明の材料は、ＩＬ−２３に特異的に結合するアプタマーを提供する。１つの実施形態において、本発明のアプタマが結合するＩＬ−２３は、ヒトＩＬ−２３であるのに対し、別の実施形態では、ＩＬ−２３は、ヒトＩＬ−２３の改変体である。１つの実施形態において、ＩＬ−２３の改変体は、ヒトＩＬ−２３の機能と本質的に同じ生物学的機能を示し、実質的に同じ構造を有し、そしてヒトＩＬ−２３が前記アプタマーに結合する能力と実質的に同じ能力を有する。
【００２４】
１つの実施形態において、ヒトＩＬ−２３またはその改変体は、配列番号４および／または５を含む配列と少なくとも７０％同一、好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、ヒトＩＬ−２３またはその改変体は、配列番号４および５を含むアミノ酸配列を有する。
【００２５】
１つの実施形態において、本発明のアプタマーは、約１００ｎＭ以下、好ましくは５０ｎＭ以下、より好ましくは１０ｎＭ以下、さらにより好ましくは１ｎＭ以下のヒトＩＬ−２３またはその改変体に対する解離定数を有する。
【００２６】
１つの実施形態において、本発明のアプタマーは、ヒトＩＬ−２３またはその改変体の機能を調節する。１つの実施形態において、本発明のアプタマーは、ヒトＩＬ−２３の機能を刺激する。別の実施形態において、本発明のアプタマーは、ヒトＩＬ−２３またはその改変体の機能を阻害する。さらに別の実施形態において、本発明のアプタマーは、ヒトＩＬ−２３またはその改変体の機能をインビボにおいて阻害する。さらに別の実施形態において、本発明のアプタマーは、ＩＬ−２３がＩＬ−２３レセプターに結合するのを防ぐ。いくつかの実施形態において、本発明のアプタマーによって調節されるヒトＩＬ−２３またはその改変体の機能は、ヒトＩＬ−２３関連疾患（例えば：自己免疫疾患（多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、全身性エリテマトーデスおよび過敏性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎））、炎症性疾患、癌（結腸癌、肺癌および肺転移が挙げられるがこれらに限定されない）、骨粗鬆症における骨吸収およびＩ型糖尿病が挙げられるがこれらに限定されない）を媒介する。
【００２７】
１つの実施形態において、本発明のアプタマーは、
【００２８】
【化５】
2009521208.tif 000003
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアプタマーがヒトＩＬ−２３に結合する能力と実質的に同じ能力を有する。別の実施形態において、本発明のアプタマーは、
【００２９】
【化６−１】
2009521208.tif 000004
【００３０】
【化６−２】
2009521208.tif 000005
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアプタマーと実質的に同じ構造およびそれらのアプタマーがＩＬ−２３に結合する能力と実質的に同じ能力を有する。
【００３１】
１つの実施形態において、本発明は、
【００３２】
【化７】
2009521208.tif 000006
からなる群から選択される配列のいずれか１つと少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一である、核酸配列を含むヒトＩＬ−２３に結合するアプタマーを提供する。別の実施形態において、本発明は、
【００３３】
【化８】
2009521208.tif 000007
の群から選択される配列のいずれか１つの固有配列領域中の４、８または２０個連続したヌクレオチドの配列と同一である４個連続したヌクレオチド、好ましくは８個連続したヌクレオチド、より好ましくは２０個連続したヌクレオチドを含むアプタマーを提供する。さらに別の実施形態において、本発明は、
【００３４】
【化９】
2009521208.tif 000008
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むヒトＩＬ−２３またはその改変体と結合することができるアプタマーを提供する。別の実施形態において、本発明は、配列番号１７７、好ましくは配列番号２２４、より好ましくは配列番号３０９、より好ましくは配列番号３１０およびより好ましくは配列番号３１１に示される配列を有するアプタマーを提供する。
【００３５】
１つの実施形態において、本発明は、マウスＩＬ−２３に特異的に結合するアプタマーを提供する。別の実施形態において、本発明は、マウスＩＬ−２３の機能と本質的に同じ生物学的機能を示し、マウスＩＬ−２３の構造と実質的に同じ構造およびマウスＩＬ−２３が前記アプタマーに結合する能力と実質的に同じ能力を有する、マウスＩＬ−２３の改変体に結合するアプタマーを提供する。
【００３６】
１つの実施形態において、本発明のアプタマーが結合するマウスＩＬ−２３またはその改変体は、配列番号３２１および／または３２２を含む配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、マウスＩＬ−２３またはその改変体は、配列番号３２１および３２２を含むアミノ酸配列を有する。
【００３７】
１つの実施形態において、本発明のアプタマーは、約１００ｎＭ以下、好ましくは５０ｎＭ以下、より好ましくは１０ｎＭ以下のマウスＩＬ−２３またはその改変体に対する解離定数を有する。
【００３８】
１つの実施形態において、本発明のアプタマーは、マウスＩＬ−２３またはその改変体の機能を調節する。１つの実施形態において、本発明のアプタマーは、マウスＩＬ−２３の機能を刺激する。別の実施形態において、本発明のアプタマーは、マウスＩＬ−２３またはその改変体の機能を阻害する。さらに別の実施形態において、本発明のアプタマーは、マウスＩＬ−２３またはその改変体の機能をインビボにおいて阻害する。さらに別の実施形態において、本発明のアプタマーは、マウスＩＬ−２３がマウスＩＬ−２３レセプターに結合するのを防ぐ。いくつかの実施形態において、本発明のアプタマーによって調節されるマウスＩＬ−２３の機能は、マウスＩＬ−２３関連疾患モデル（例えば、実験的自己免疫性脳脊髄炎、マウスのコラーゲン誘導関節炎およびＴＮＢＳ大腸炎）を媒介する。
【００３９】
１つの実施形態において、本発明のアプタマーは、配列番号１２４〜１３４および配列番号１９９〜２０２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアプタマーがマウスＩＬ−２３に結合する能力と実質的に同じ能力を有する。別の実施形態において、本発明のアプタマーは、配列番号１２４〜１３４および配列番号１９９〜２０２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアプタマーと実質的に同じ構造およびそれらのアプタマーがマウスＩＬ−２３に結合する能力と実質的に同じ能力を有する。
【００４０】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号１２４〜１３４および配列番号１９９〜２０２からなる群から選択される配列のいずれか１つと少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも９０％同一である核酸配列を含む、マウスＩＬ−２３に結合するアプタマーを提供する。別の実施形態において、本発明は、配列番号１２４〜１３４および配列番号１９９〜２０２からなる群から選択される配列のいずれか１つの固有配列領域中の４、８または２０個連続したヌクレオチドの配列と同一である、４個連続したヌクレオチド、好ましくは８個連続したヌクレオチド、より好ましくは２０個連続したヌクレオチドを含むアプタマーを提供する。別の実施形態において、本発明は、配列番号１２４〜１３４および配列番号１９９〜２０２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、マウスＩＬ−２３またはその改変体と結合することができるアプタマーを提供する。
【００４１】
１つの実施形態において、本発明の材料は、ＩＬ−１２に特異的に結合するアプタマーを提供する。１つの実施形態において、本発明のアプタマーが結合するＩＬ−１２は、ヒトＩＬ−１２であるのに対し、別の実施形態では、ＩＬ−１２は、ヒトＩＬ−１２の改変体である。１つの実施形態において、ＩＬ−１２の改変体は、ヒトＩＬ−１２の機能と本質的に同じ生物学的機能を示し、ヒトＩＬ−１２と実質的に同じ構造およびヒトＩＬ−１２が前記アプタマーと結合する能力と実質的に同じ能力を有する。
【００４２】
１つの実施形態において、ヒトＩＬ−１２またはその改変体は、配列番号４および／または６を含む配列と少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、ヒトＩＬ−１２またはその改変体は、配列番号４および６を含むアミノ酸配列を有する。
【００４３】
１つの実施形態において、本発明のアプタマーは、ヒトＩＬ−１２またはその改変体の機能を調節する。１つの実施形態において、本発明のアプタマーは、ヒトＩＬ−２３の機能を刺激する。別の実施形態において、本発明のアプタマーは、ヒトＩＬ−１２またはその改変体の機能を阻害する。さらに別の実施形態において、本発明のアプタマーは、ヒトＩＬ−１２またはその改変体の機能をインビボにおいて阻害する。さらに別の実施形態において、本発明のアプタマーは、ＩＬ−１２がＩＬ−１２レセプターに結合するのを防ぐ。１つの実施形態において、本発明のアプタマーによって調節されるヒトＩＬ−１２またはその改変体の機能は、ヒトＩＬ−１２関連疾患（例えば：自己免疫疾患（多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、全身性エリテマトーデスおよび過敏性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）が挙げられるがこれらに限定されない）、炎症性疾患、癌（結腸癌、肺癌および肺転移が挙げられるがこれらに限定されない）、骨粗鬆症における骨吸収およびＩ型糖尿病）を媒介する。
【００４４】
１つの実施形態において、本発明は、リボ核酸またはデオキシリボ核酸のいずれかであるアプタマーを提供する。さらなる実施形態において、これらのリボ核酸またはデオキシリボ核酸のアプタマーは、一本鎖である。別の実施形態において、本発明は、少なくとも１つの化学改変を有するアプタマーを提供する。１つの実施形態において、その改変は、核酸の糖の位置における化学的置換；核酸のリン酸の位置における化学的置換；および核酸の塩基の位置における化学的置換；改変ヌクレオチドの組み込み；３’キャッピング；高分子量で非免疫原性の化合物との結合体化；親油性化合物との結合体化；およびリン酸骨格の改変からなる群から選択される。１つの実施形態において、本発明のアプタマーと結合体化される非免疫原性で高分子量の化合物は、ポリアルキレングリコール、好ましくはポリエチレングリコールである。１つの実施形態において、骨格の改変は、リン酸骨格への１つ以上のホスホロチオエートの組み込みを含む。別の実施形態において、本発明のアプタマーは、リン酸骨格における１０個未満、６個未満または３個未満のホスホロチオエートの組み込みを含む。
【００４５】
１つの実施形態において、本発明の材料は、
【００４６】
【化１０】
2009521208.tif 000009
からなる群から選択される核酸配列を含むアプタマーまたはその塩の治療有効量および薬学的に許容可能なキャリアまたは希釈剤を含む薬学的組成物を提供する。別の実施形態において、本発明の材料は、
【００４７】
【化１１】
2009521208.tif 000010
からなる群から選択される核酸配列を含むアプタマーまたはその塩の治療有効量および薬学的に許容可能なキャリアまたは希釈剤を含む薬学的組成物を提供する。好ましい実施形態において、本発明の材料は、配列番号１７７、配列番号２２４および配列番号３０９〜３１２からなる群から選択される核酸配列を含むアプタマーの治療有効量を含む薬学的組成物を提供する。
【００４８】
１つの実施形態において、本発明は、ＩＬ−２３によって媒介される疾患を処置、予防または改善する方法を提供し、その方法は、
【００４９】
【化１２】
2009521208.tif 000011
からなる群から選択される核酸配列を含むアプタマーの治療有効量を含む組成物を脊椎動物に投与する工程を含む。別の実施形態において、本発明は、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２によって媒介される疾患を処置、予防または改善する方法を提供し、その方法は、
【００５０】
【化１３】
2009521208.tif 000012
からなる群から選択される核酸配列を含むアプタマーの治療有効量を含む組成物を脊椎動物に投与する工程を含む。好ましい実施形態において、脊椎動物に投与されるアプタマーの治療有効量を含む組成物は、配列番号１７７、配列番号２２４および配列番号３０９〜３１２からなる群から選択される核酸配列を含む。１つの実施形態において、薬学的組成物を投与される脊椎動物は、哺乳動物である。好ましい実施形態において、その哺乳動物は、ヒトである。
【００５１】
１つの実施形態において、本発明の方法によって処置、予防または改善される疾患は、自己免疫疾患（多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、全身性エリテマトーデスおよび過敏性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）が挙げられるがこれらに限定されない）、炎症性疾患、癌（結腸癌、肺癌および肺転移が挙げられるがこれらに限定されない）、骨粗鬆症における骨吸収およびＩ型糖尿病からなる群から選択される。
【００５２】
１つの実施形態において、本発明は、
【００５３】
【化１４】
2009521208.tif 000013
からなる群から選択される核酸配列を有するアプタマーを、ＩＬ−２３および／もしくはＩＬ−１２またはその改変体を含むと思われる組成物と接触させる工程ならびにＩＬ−２３および／もしくはＩＬ−１２またはその改変体の有無を検出する工程を含む診断方法を提供する。
【００５４】
１つの実施形態において、本発明は、
【００５５】
【化１５】
2009521208.tif 000014
からなる群から選択される核酸配列を有し、インビトロ診断薬として使用するためのアプタマーを提供する。別の実施形態において、本発明は、
【００５６】
【化１６】
2009521208.tif 000015
からなる群から選択される核酸配列を有し、インビボ診断薬として使用するためのアプタマーを提供する。さらに別の実施形態において、本発明は、
【００５７】
【化１７】
2009521208.tif 000016
からなる群から選択される核酸配列を有し、疾患をインビボにおいて処置、予防または回復するために使用するためのアプタマーを提供する。
【００５８】
別の実施形態において、ＩＬ−２３に結合するアプタマーが提供され、ここで、そのアプタマーは、ＩＬ−２３誘導性ＳＴＡＴ３リン酸化を阻害し、そしてそのアプタマーは、配列番号３０９であるか、または配列番号３０９がＩＬ−２３誘導性ＳＴＡＴ３リン酸化を阻害する能力と同じ能力を有するアプタマーであり、ここで、このアプタマーは、１００ｎＭ未満のＫＤを含む。いくつかの実施形態において、本発明のこの局面のアプタマーは、５００ｎＭ未満のＫＤ、いくつかの実施形態では５０ｎＭ未満のＫＤを含む。本発明のこの局面の実施形態において、アプタマーは、ＩＬ−２３誘導性ＳＴＡＴ３リン酸化をインビトロにおいて阻害する。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２３誘導性ＳＴＡＴ３リン酸化のアプタマー阻害は、末梢血単核球の溶解産物を測定するのに対し、他の実施形態においては、ＰＨＡ  Ｂｌａｓｔを測定する。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２３誘導性ＳＴＡＴ３リン酸化を阻害する能力と同じ能力を有するアプタマーは、配列番号３０６〜３０８および３１０〜３１４からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、そのアプタマーは、ヒトＩＬ−２３と結合する。
【００５９】
いくつかの実施形態において、本発明のこの局面のアプタマーは、少なくとも１つの化学改変を含むようにさらに改変される。いくつかの実施形態において、化学改変は、核酸の糖の位置における化学的置換；核酸のリン酸の位置における化学的置換；および核酸の塩基の位置における化学的置換からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、改変は、改変ヌクレオチドの組み込み、３’キャッピング、高分子量で非免疫原性の化合物との結合体化、親油性化合物との結合体化からなる群から選択される。特定の実施形態において、非免疫原性で高分子量の化合物は、ポリアルキレングリコール、好ましくはポリエチレングリコールである。
【００６０】
特定の実施形態において、本発明によって提供されるアプタマーは、ＩＬ−２３に結合し、配列番号３０９に記載の主要配列と少なくとも９５％同一であるアプタマー核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明によって提供されるアプタマーは、ＩＬ−２３に結合し、化学改変を含む配列番号３０９の配列と少なくとも９５％同一であるアプタマー核酸配列を含み、ここで、相同性パーセントは、目視検査によって判定され、同一性パーセントは、アラインメントを助けるために１０ヌクレオチドの長さの中に１つのギャップが導入され得るときに、比較される配列中の同一のヌクレオチド残基（化学改変を含む）でアラインメントする２つの配列のうち小さいほうの配列に見られるヌクレオチドのパーセンテージとして算出される。特定の実施形態において、配列番号３０９に示される核酸配列を含むアプタマーが提供される。
【００６１】
特定の実施形態において、配列番号３０９に示される核酸配列を含むアプタマーが提供される。本発明のこの局面の別の実施形態において、配列番号３０６〜３０８および配列番号３１０〜３１４からなる群から選択される核酸配列を含むアプタマーが提供される。いくつかの実施形態において、この局面のアプタマーは、ＰＥＧ、特に、２０および４０ｋＤＡからなる群から選択される分子量を含むＰＥＧをさらに含む。
【００６２】
特定の実施形態において、以下に示される構造：
【００６３】
【化１８】
2009521208.tif 000017
（ここで：
【００６４】
【化１９】
2009521208.tif 000018
は、リンカーを示し、このアプタマーは、配列番号３０６〜３１１および配列番号３１４からなる群から選択される）
を有するアプタマーが提供される。この局面の特定の実施形態において、
【００６５】
【化２０】
2009521208.tif 000019
（ここで、「ｄ」は、２’デオキシヌクレオチドを示し、「ｍ」は、２’−Ｏｍｅヌクレオチドを示し、ｓは、非架橋リン酸位のホスホロチオエート置換を示し、そして３Ｔは、逆位デオキシチミジンを示している）。
【００６６】
いくつかの実施形態において、リンカーは、アルキルリンカー、特に、２〜１８個連続したＣＨ２基を含むアルキルリンカーであり、より具体的には、アルキルリンカーは、２〜１２個連続したＣＨ２基を含み、より具体的には３〜６個連続したＣＨ２基を含むアルキルリンカーである。
【００６７】
１つの実施形態において、以下に示される構造：
【００６８】
【化２１−１】
2009521208.tif 000020
（ここで、このアプタマーは、配列番号３０６〜３１１および配列番号３１４からなる群から選択される）
を有するアプタマーが提供される。この局面の特定の実施形態において、
【００６９】
【化２１−２】
2009521208.tif 000021
（ここで、「ｄ」は、２’デオキシヌクレオチドを示し、「ｍ」は、２’−Ｏｍｅヌクレオチドを示し、ｓは、非架橋リン酸位のホスホロチオエート置換を示し、そして３Ｔは、逆位デオキシチミジンを示している）。
【００７０】
別の実施形態において、以下の構造：
【００７１】
【化２２】
2009521208.tif 000022
（ここで、
【００７２】
【化２３】
2009521208.tif 000023
は、リンカーを示し、そしてこのアプタマーは、そのアプタマーが、３’３Ｔを有しないこと以外は、配列番号３０６〜３１１および配列番号３１４からなる群から選択される）
を含むアプタマーが提供される。この局面の実施形態において、
【００７３】
【化２４】
2009521208.tif 000024
（ここで、「ｄ」は、２’デオキシヌクレオチドを示し、「ｍ」は、２’−Ｏｍｅヌクレオチドを示し、ｓは、非架橋リン酸位のホスホロチオエート置換を示している）。
【００７４】
いくつかの実施形態において、リンカーは、アルキルリンカー、特に、２〜１８個連続したＣＨ２基を含むアルキルリンカーであり、より具体的には、アルキルリンカーは、２〜１２個連続したＣＨ２基を含み、より具体的には、３〜６個連続したＣＨ２基を含むアルキルリンカーである。
【００７５】
特定の実施形態において、以下の構造：
【００７６】
【化２５】
2009521208.tif 000025
（ここで、このアプタマーは、そのアプタマーが３’３Ｔを有しないこと以外は、配列番号３０６〜３１１および配列番号３１４からなる群から選択される）
を含むアプタマーが提供される。この局面の特定の実施形態において、
【００７７】
【化２６】
2009521208.tif 000026
（ここで、「ｄ」は、２’デオキシヌクレオチドを示し、「ｍ」は、２’−Ｏｍｅヌクレオチドを示し、ｓは、非架橋リン酸位のホスホロチオエート置換を示している）。
【００７８】
別の局面において、本発明は、本発明のアプタマーまたはその塩の治療有効量および薬学的に許容可能なキャリアまたは希釈剤を含む組成物を提供する。別の局面において、本発明は、ＩＬ−２３によって媒介される疾患を処置、予防または改善する方法を提供し、その方法は、本発明のアプタマーを投与する必要のある患者に投与する工程を含む。本発明のさらに別の局面において、本発明のアプタマーを試験組成物と接触させる工程およびＩＬ−２３の有無を検出する工程を含む診断方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７９】
（発明の詳細な説明）
本発明の１つ以上の実施形態の詳細を以下に添付する説明に示す。本明細書中に記載するものと類似または等価である任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料をここに記載する。本発明の他の特性、目的および利点は、この説明により明らかになるであろう。明細書において、単数形は、文脈が明らかに他のものを規定していない限り、複数形も含む。他に定義されない限り、本明細書中で使用される技術用語および科学用語のすべては、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されているものと同じ意味を有する。矛盾する場合は、本明細書が、支配するものである。
【００８０】
（ＳＥＬＥＸＴＭ法）
アプタマーの作製に適した方法は、図２に大まかに示す「指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）（「ＳＥＬＥＸＴＭ」）という名称が与えられたプロセスを用いるものである。ＳＥＬＥＸＴＭプロセスは、標的分子に対して高度に特異的に結合する核酸分子をインビトロで進化させるための方法であり、例えば、１９９０年１月１１日に出願され、現在は放棄されている米国特許出願番号０７／５３６，４２８、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ」と題された米国特許第５，４７５，０９６号および「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ」と題された米国特許第５，２７０，１６３号（ＷＯ９１／１９８１３もまた参照のこと）に記載されている。ＳＥＬＥＸＴＭで同定された核酸リガンドの各々、すなわち、各アプタマーは、所与の標的化合物または標的分子に特異的なリガンドである。ＳＥＬＥＸＴＭプロセスは、核酸が、種々の２次元構造および３次元構造を形成するために十分な容量を有し、かつ、単量体であっても多量体であってもよい実質的に任意の化合物とともにリガンドとして作用する（すなわち、特定の結合対を形成する）それらのモノマー内で利用可能な十分な化学的万能性を有するという独特の見識に基づくものである。任意のサイズの分子または組成物が、標的として働き得る。
【００８１】
ＳＥＬＥＸＴＭは、出発点として、ランダム化された配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドの大きなライブラリーまたはプールに依存している。それらのオリゴヌクレオチドは、改変されているか、または改変されていないＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであり得る。いくつかの実施例において、そのプールは、１００％ランダムか、または部分的にランダムなオリゴヌクレオチドを含む。他の実施例において、そのプールは、ランダム化配列の内部に組み込まれた少なくとも１つの固定配列および／または保存配列を含む、ランダムか、または部分的にランダムなオリゴヌクレオチドを含む。他の実施例において、そのプールは、オリゴヌクレオチドプールのすべての分子によって共有されている配列を含み得る、５’および／または３’末端に少なくとも１つの固定配列および／または保存配列を含むランダムか、または部分的にランダムなオリゴヌクレオチドを含む。固定配列は、予め選択された目的に対して組み込まれている、プール内のオリゴヌクレオチドに共有の配列（例えば、以下でさらに記載されるＣｐＧモチーフ、ＰＣＲプライマーのハイブリダイゼーション部位、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ７およびＳＰ６）のプロモーター配列、制限酵素認識部位またはホモポリマー配列（例えば、ポリＡまたはポリＴ域）、触媒コア、アフィニティーカラムに対して選択的に結合するための部位ならびに目的のオリゴヌクレオチドのクローニングおよび／または配列決定を容易にする他の配列）である。保存配列は、同じ標的に結合する多くのアプタマーによって共有される配列で、先に記載された固定配列以外の配列である。
【００８２】
プールのオリゴヌクレオチドは、好ましくは、ランダム化配列部分ならびに効率的な増幅に必要な固定配列を含む。代表的には、出発プールのオリゴヌクレオチドは、３０〜５０個のランダムヌクレオチドの内部領域に隣接した、固定された５’および３’末端配列を含む。そのランダム化ヌクレオチドは、多くの方法において生成され得、その方法としては、化学合成およびランダムに切断された細胞内の核酸からのサイズ選別が挙げられる。試験核酸中の配列バリエーションはまた、選別／増幅を繰り返す前またはその最中に突然変異誘発によって導入または増加され得る。
【００８３】
オリゴヌクレオチドのランダム配列部分は、任意の長さであり得、リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを含み得、そして、改変されているか、または非天然のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含み得る。例えば、米国特許第５，９５８，６９１号；米国特許第５，６６０，９８５号；米国特許第５，９５８，６９１号；米国特許第５，６９８，６８７号；米国特許第５，８１７，６３５号；米国特許第５，６７２，６９５号およびＰＣＴ公開ＷＯ９２／０７０６５を参照のこと。ランダムオリゴヌクレオチドは、当該分野で周知の固相オリゴヌクレオチド合成技術を用いて、ホスホジエステル結合したヌクレオチドから合成され得る。例えば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１４：５３９９−５４６７（１９８６）およびＦｒｏｅｈｌｅｒら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２７：５５７５−５５７８（１９８６）を参照のこと。ランダムオリゴヌクレオチドはまた、トリエステル合成法などの液相法を用いても合成され得る。例えば、Ｓｏｏｄら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．４：２５５７（１９７７）およびＨｉｒｏｓｅら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．，２８：２４４９（１９７８）を参照のこと。自動ＤＮＡ合成装置において行われる代表的な合成により、１０１４〜１０１６個の個別分子が得られ、その数は、ほとんどのＳＥＬＥＸＴＭ実験に十分な数である。配列設計物中のランダム配列が十分に大きな領域であることにより、合成分子の各々が、固有配列を示し得る確率が高まる。
【００８４】
オリゴヌクレオチドの出発ライブラリーは、ＤＮＡ合成装置において、自動化された化学合成によって作製され得る。ランダム化配列を合成するために、合成プロセス内の各ヌクレオチド添加工程において４種すべてのヌクレオチド混合物が加えられることにより、ヌクレオチドのランダムな取り込みが可能となる。上で述べたように、１つの実施形態において、ランダムオリゴヌクレオチドは、完全にランダムな配列を含む；しかしながら、他の実施形態では、ランダムオリゴヌクレオチドは、ランダムでないか、または部分的にランダムな一続きの配列を含み得る。部分的にランダムな配列は、各添加工程において異なったモル比で４種のヌクレオチドを加えることにより作製され得る。
【００８５】
オリゴヌクレオチドの出発ライブラリーは、ＲＮＡであってもＤＮＡであってもよい。ＲＮＡライブラリーが出発ライブラリーとして使用される場合、ＲＮＡライブラリーは、代表的には、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼまたは改変Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡライブラリーをインビトロにおいて転写することによって生成され、そして精製される。次いで、そのＲＮＡまたはＤＮＡライブラリーは、結合に好ましい条件下で標的と混合され、そして、結合親和性および選択性の実質的に任意の所望の基準を達成する同じ一般的セレクションスキームを用いて、結合、分別および増幅の段階的な反復に供される。より詳細には、核酸の出発プールを含む混合物から出発するとき、ＳＥＬＥＸＴＭ法は、以下の工程：（ａ）結合に好ましい条件下で、混合物を標的と接触させる工程；（ｂ）標的分子に対して特異的に結合した核酸から未結合核酸を分別する工程；（ｃ）核酸−標的複合体を解離させる工程；（ｄ）核酸−標的複合体から解離された核酸を増幅して、リガンド−核酸濃縮混合物を得る工程；および（ｅ）標的分子に対して高度に特異的で、高親和性の核酸リガンドを得るのに望まれる回数のサイクルを通じて、結合、分別、解離および増幅の工程を反復する工程を含む。ＲＮＡアプタマーが選択される場合、ＳＥＬＥＸＴＭ法は、以下の工程：（ｉ）工程（ｄ）の増幅の前に核酸−標的複合体から解離された核酸を逆転写する工程；および（ｉｉ）プロセスを再開する前に、工程（ｄ）から増幅された核酸を転写する工程をさらに含む。
【００８６】
可能性のある大量の配列および構造を含む核酸混合物の中には、所与の標的に対して、多岐にわたる結合親和性が存在する。例えば、２０ヌクレオチドのランダム化セグメントを含んでいる核酸混合物は、４２０個の候補の可能性があり得る。標的に対してより高い親和定数を有するものが、標的に結合する可能性が最も高い。分別、解離および増幅の後、より結合親和性が高い候補について濃縮された第２の核酸混合物が作製される。生じる核酸混合物がただ１つの配列または数個の配列から主に構成されるまで、セレクションをさらに繰り返すことにより、徐々に最良のリガンドに絞っていく。次いで、これらをクローニングし、配列決定し、そして純粋なリガンドまたはアプタマーとして個別に結合親和性について試験することができる。
【００８７】
所望の目標が達成されるまで、セレクションおよび増幅のサイクルを繰り返す。最も一般的な場合では、サイクルを反復しても結合強度が有意に向上しなくなるまでセレクション／増幅を続ける。代表的には、約１０１４個の異なる核酸種を標本抽出するためにこの方法を用いるが、約１０１８個程度の異なる核酸種が標本抽出するために使用することができる。一般に、核酸アプタマー分子は、５〜２０サイクルの手順により選別される。１つの実施形態において、初期のセレクション段階においてのみ不均一性が導入され、複製プロセスを通してでは不均一性は生じない。
【００８８】
ＳＥＬＥＸＴＭの１つの実施形態において、セレクションプロセスは、選ばれた標的に対して最も強く結合する核酸リガンドを単離する際に非常に有効であるので、たった１サイクルのセレクションおよび増幅が必要となるだけである。このように有効なセレクションは、例えば、クロマトグラフィのタイプのプロセスにおいて生じ得、ここで、カラムに結合している標的に核酸が会合する能力は、そのカラムが、最も親和性の高い核酸リガンドの分離および単離を十分に可能にし得るような様式において機能する。
【００８９】
多くの場合において、単一の核酸リガンドが特定されるまで必ずしもＳＥＬＥＸＴＭの反復工程を行うことが望ましいわけではない。標的特異的な核酸リガンド溶液は、多くの保存配列および、標的に対する核酸リガンドの親和性に著しく影響することなく置換または付加され得る多くの配列を有する核酸構造またはモチーフのファミリーを含み得る。完了する前にＳＥＬＥＸＴＭプロセスを終結することにより、核酸リガンド溶液ファミリーの多数のメンバーの配列を決定することができる。
【００９０】
種々の核酸の１次、２次および３次構造が存在することは公知である。非Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋタイプの相互作用に関与すると最もよく示されている構造またはモチーフは、ヘアピンループ、対称バルジおよび非対称バルジ、シュードノットおよびそれらの無数の組み合わせと呼ばれる。そのようなモチーフの公知の事例のほとんどすべてが、３０ヌクレオチド以下の核酸配列において形成され得ることを示唆している。この理由により、隣接するランダム化セグメントを用いるＳＥＬＥＸＴＭ手順が、約２０〜約５０ヌクレオチド、およびいくつかの実施形態において、約３０〜約４０ヌクレオチドのランダム化セグメントを含む核酸配列で開始されることが好ましい場合が多い。１つの実施例において、５’−固定：ランダム：３’−固定配列は、約３０〜約５０ヌクレオチドのランダム配列を含む。
【００９１】
中心となるＳＥＬＥＸＴＭ法は、多くの特定の目的を達成するために改変されてきた。例えば、米国特許第５，７０７，７９６号では、ベントＤＮＡなどの特定の構造的特性を有する核酸分子を選別するためにＳＥＬＥＸをゲル電気泳動と組み合わせて使用することが記載されている。米国特許第５，７６３，１７７号では、標的分子に結合および／または光架橋および／または光不活化することができる光応答基を含む核酸リガンドを選別するためのＳＥＬＥＸＴＭベースの方法が記載されている。米国特許第５，５６７，５８８号および米国特許第５，８６１，２５４号では、標的分子に対する親和性が高いオリゴヌクレオチドと低いオリゴヌクレオチドとの分別が高度に効果的に達成されるＳＥＬＥＸＴＭベースの方法が記載されている。米国特許第５，４９６，９３８号では、ＳＥＬＥＸＴＭプロセスが行われた後に改善された核酸リガンドを得るための方法が記載されている。米国特許第５，７０５，３３７号では、リガンドをその標的に共有結合するための方法が記載されている。
【００９２】
ＳＥＬＥＸＴＭを使用して、標的分子上の２つ以上の部位に結合する核酸リガンドおよび標的上の特定の部位に結合する非核酸種を含む核酸リガンドを得ることもできる。ＳＥＬＥＸＴＭにより、大型および小型の生体分子（例えば、核酸−結合タンパク質およびその生物学的機能の一部として核酸と結合することが知られていないタンパク質ならびに補助因子および他の小分子）を含む任意の想定可能な（ｅｎｖｉｓｉｏｎａｂｌｅ）標的に結合する核酸リガンドを単離し、同定するための手段がもたらされる。例えば、米国特許第５，５８０，７３７号では、カフェインおよび密接に関連するアナログであるテオフィリンに高親和性で結合することができる、ＳＥＬＥＸＴＭを通じて同定された核酸配列が開示されている。
【００９３】
Ｃｏｕｎｔｅｒ−ＳＥＬＥＸＴＭは、１つ以上の非標的分子に対して交差反応性を有する核酸リガンド配列を排除することによって標的分子に対する核酸リガンドの特異性を改善するための方法である。Ｃｏｕｎｔｅｒ−ＳＥＬＥＸＴＭは、以下の工程：（ａ）候補核酸混合物を調製する工程；（ｂ）その候補混合物と標的とを接触させる工程（ここで、標的に対する親和性が候補混合物と比べて高い核酸は、候補混合物の残りから分別され得る）；（ｃ）候補混合物の残りから親和性の高い核酸を分別する工程；（ｄ）親和性の高い核酸を標的から解離する工程；（ｅ）親和性の高い核酸と、１つ以上の非標的分子とを接触させる工程（非標的分子に対して特定の親和性を有する核酸リガンドは除去される）；および（ｆ）標的分子に対してのみ特定の親和性を有する核酸を増幅することにより、標的分子への結合に対して比較的高い親和性および特異性を有する核酸配列について濃縮された核酸の混合物を得る工程から構成される。ＳＥＬＥＸＴＭについて上で記載したように、所望の目標が達成されるまで、必要に応じてセレクションおよび増幅のサイクルを繰り返す。
【００９４】
治療薬およびワクチンとして核酸を使用する際に遭遇する１つの潜在的な問題は、ホスホジエステル型でのオリゴヌクレオチドが、所望の効果を発揮する前に、細胞内および細胞外の酵素（例えば、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ）によって体液中で急速に分解され得ることである。ゆえに、ＳＥＬＥＸＴＭ法は、リガンドに特性の改善（例えば、インビボ安定性の改善または送達特性の改善）をもたらす改変ヌクレオチドを含む高親和性の核酸リガンドの同定を包含する。そのような改変の例としては、リボースおよび／またはリン酸および／または塩基の位置における化学的置換が挙げられる。ＳＥＬＥＸＴＭで同定される改変ヌクレオチド含有核酸リガンドは、例えば、リボースの２’位、ピリミジンの５位およびプリンの８位において化学改変されたヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチドについて記載している米国特許第５，６６０，９８５号、様々な２’−改変ピリミジンを含むオリゴヌクレオチドについて記載している米国特許第５，７５６，７０３号、ならびに２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）および／または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）置換基で改変された１つ以上のヌクレオチドを含む非常に特異的な核酸リガンドについて記載している米国特許第５，５８０，７３７号に記載されている。
【００９５】
本発明において企図される核酸リガンドの改変としては、核酸リガンド塩基または核酸リガンド全体にさらなる電荷、分極率、疎水性、水素結合、静電気的相互作用および流動性を組み込む他の化学基をもたらす改変が挙げられるが、これらに限定されない。ヌクレアーゼに抵抗性のオリゴヌクレオチド集団を作製するための改変としては、１つ以上の別のヌクレオチド間結合、糖の変更、塩基の変更またはそれらの組み合わせも挙げられ得る。そのような改変としては、２’位の糖の改変、５位のピリミジンの改変、８位のプリンの改変、環外のアミンにおける改変、４−チオウリジンの置換、５−ブロモ−ウラシルまたは５−ヨード−ウラシルの置換；骨格の改変、ホスホロチオエートまたはアルキルホスフェートの改変、メチル化および通常でない塩基対の組み合わせ（例えば、イソ塩基のイソシチジンおよびイソグアノシン）が挙げられるが、これらに限定されない。改変はまた、キャッピングなどの３’および５’改変も含み得る。
【００９６】
１つの実施形態において、Ｐ（Ｏ）Ｏ基が、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）または３’−アミン（−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−）（ここで、ＲまたはＲ’の各々は、独立してＨまたは置換もしくは非置換アルキルである）によって置換されているオリゴヌクレオチドが提供される。結合基は、−Ｏ−、−Ｎ−または−Ｓ−結合を介して隣接ヌクレオチドに結合され得る。オリゴヌクレオチド中のすべての結合が同一である必要はない。本明細書中で使用されるとき、用語ホスホロチオエートとは、ホスホジエステル結合において、１つ以上の硫黄原子によって置換された１つ以上の非架橋酸素原子を含む。
【００９７】
さらなる実施形態において、オリゴヌクレオチドは、改変糖基を含み、例えば、ヒドロキシル基の１つ以上がハロゲン、脂肪族基で置換されているか、またはエーテルまたはアミンとして官能性付与されている。１つの実施形態において、フラノース残基の２’位が、Ｏ−メチル、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリル、Ｓ−アルキル、Ｓ−アリルまたはハロ基のいずれかによって置換されている。２’改変糖の合成方法は、例えば、Ｓｐｒｏａｔら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：７３３−７３８（１９９１）；Ｃｏｔｔｅｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：２６２９−２６３５（１９９１）；およびＨｏｂｂｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２：５１３８−５１４５（１９７３）に記載されている。他の改変が、当業者に公知である。そのような改変は、プレＳＥＬＥＸＴＭプロセス改変であっても、ポストＳＥＬＥＸＴＭプロセス改変（先に同定された非改変リガンドの改変）であってもよく、またはＳＥＬＥＸＴＭプロセスに組み込むことによって行ってもよい。
【００９８】
プレＳＥＬＥＸＴＭプロセス改変またはＳＥＬＥＸＴＭプロセスに組み込むことによって行われる改変により、ＳＥＬＥＸＴＭ標的に対する特異性と改善された安定性、例えば、インビボ安定性の両方を備えた核酸リガンドが得られる。核酸リガンドになされるポストＳＥＬＥＸＴＭプロセス改変により、核酸リガンドの結合能力に悪影響を及ぼさずに、安定性、例えば、インビボ安定性の改善がもたらされ得る。
【００９９】
ＳＥＬＥＸＴＭ法は、米国特許第５，６３７，４５９号および米国特許第５，６８３，８６７号に記載されたように、選択されたオリゴヌクレオチドを他の選択されたオリゴヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチド機能単位と混合する工程を包含する。ＳＥＬＥＸＴＭ法は、例えば、米国特許第６，０１１，０２０号、米国特許第６，０５１，６９８号およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／１８４８０に記載されているように、選択された核酸リガンドを診断的複合体または治療的複合体中の親油性または非免疫原性の高分子量化合物と混合する工程をさらに包含する。これらの特許および出願は、広範なアレイの形状および他の特性と、オリゴヌクレオチドの効率的な増幅および複製の特性ならびに他の分子の望ましい特性との組み合わせを教示している。
【０１００】
低分子で可撓性のペプチドに対する核酸リガンドのＳＥＬＥＸＴＭ法を介した同定もまた、探索されてきた。低分子ペプチドは、可撓性構造を有し、通常は、複数の配座異性体が平衡状態である溶液中に存在するので、その結合親和性は、可撓性ペプチドと結合する際に失われる配座エントロピーによって制限され得ると最初は考えられていた。しかしながら、溶液中の低分子ペプチドに対して核酸リガンドを同定できる可能性が、米国特許第５，６４８，２１４号において証明された。この特許において、１１アミノ酸ペプチドである物質Ｐに対する高親和性ＲＮＡ核酸リガンドが同定された。
【０１０１】
本発明の標的に対する特異性および結合親和性を有するアプタマーは、代表的には、本明細書中に記載するようなＳＥＬＥＸＴＭプロセスによって選択される。ＳＥＬＥＸＴＭプロセスの一部として、標的に結合するために選択された配列を、必要に応じて最小化することにより、所望の結合親和性を有する最小配列が決定する。選択された配列および／または最小化された配列は、結合親和性を高めるために配列のランダム突然変異誘発または定方向突然変異誘発を行うことによって、あるいは、配列中のどの位置が、結合活性にとって必須であるかを判定することによって、必要に応じて最適化される。さらに、インビボでの分解に対してアプタマー分子を安定化するために改変ヌクレオチドを組み込んだ配列を用いてセレクションを行うことができる。
【０１０２】
（２’改変ＳＥＬＥＸＴＭ）
アプタマーが治療薬としての使用に適するために、アプタマーは、好ましくは、合成が安価で、安全で、そしてインビボにおいて安定である。野生型ＲＮＡおよびＤＮＡのアプタマーは、ヌクレアーゼによる分解を受けやすいので、代表的にはインビボにおいて安定でない。ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性は、改変基を２’位に組み込むことにより大きく増大させることができる。
【０１０３】
フルオロ基およびアミノ基は、後にアプタマーが選択されるオリゴヌクレオチドプールにうまく組み込まれてきた。しかしながら、これらの改変により、得られるアプタマーの合成コストが非常に高くなり、また、いくつかの場合において、改変ヌクレオチドは、改変オリゴヌクレオチドの分解およびＤＮＡ合成用の基質として後にヌクレオチドを使用することによって、宿主ＤＮＡ中に再循環され得る可能性があるために、安全性の問題を引き起こし得る。
【０１０４】
２’−Ｏ−メチル（「２’−ＯＭｅ」）ヌクレオチドを含むアプタマーは、本明細書中で提供されるとき、これらの欠点の多くを克服する。２’−ＯＭｅヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ抵抗性であり、合成が安価である。２’−ＯＭｅヌクレオチドは、生体系において遍在性であるが、天然のポリメラーゼは、生理学的条件下において２’−ＯＭｅ  ＮＴＰを基質として認めないので、宿主ＤＮＡへの２’−ＯＭｅヌクレオチドの再循環に対する安全性の問題はない。２’−改変アプタマーを作製するために使用されるＳＥＬＥＸＴＭ法は、例えば、２００２年１２月３日出願の米国仮特許出願番号６０／４３０，７６１、２００３年７月１５日出願の米国仮特許出願番号６０／４８７，４７４、２００３年１１月４日出願の米国仮特許出願番号６０／５１７，０３９、２００３年１２月３日出願の米国特許出願番号１０／７２９，５８１および「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ」と題された２００４年６月２１日出願の米国特許出願番号１０／８７３，８５６（これらの各々は、その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
【０１０５】
本発明は、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２に結合し、そしてそれらの機能を調節するアプタマーを含み、そのアプタマーは、改変ヌクレオチド（例えば、２’位に改変を有するヌクレオチド）を含むことにより、オリゴヌクレオチドを、非改変オリゴヌクレオチドよりも酵素的分解および化学的分解ならびに熱分解および物理的分解に対して安定にするものである。文献（例えば、Ｇｒｅｅｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２，６８３−６９５，１９９５）に２’−ＯＭｅ含有アプタマーのいくつかの例が存在するが、これらは、ＣおよびＵ残基が、２’−フルオロ（２’−Ｆ）置換されており、ＡおよびＧ残基が、２’−ＯＨである改変転写産物のライブラリーのインビトロセレクションによって作製されたものである。機能的配列が同定されたら、ＡおよびＧ残基の各々を、２’−ＯＭｅ置換に対する許容性について試験し、そして、２’−ＯＭｅ置換に許容性を示したすべてのＡおよびＧ残基を２’−ＯＭｅ残基として有するアプタマーを再合成した。この２工程様式において作製されるアプタマーのＡおよびＧ残基のほとんどは、２’−ＯＭｅ残基による置換が許容されるが、平均して、約２０％は許容されない。その結果として、この方法を用いて作製されたアプタマーは、２〜４個の２’−ＯＨ残基を含む傾向にあり、結果として、安定性および合成コストが悪くなる。ＳＥＬＥＸＴＭ（および／またはその変法および改良法のいずれか（本明細書中に記載されるものを含む））によってアプタマーが選別され、濃縮されるオリゴヌクレオチドプールにおいて使用される安定化オリゴヌクレオチドを作製する転写反応に改変ヌクレオチドを組み込むことにより、本発明の方法では、選択されたアプタマーオリゴヌクレオチドを安定化する必要がなくなる（例えば、改変ヌクレオチドを用いてアプタマーオリゴヌクレオチドを再合成することによって）。
【０１０６】
１つの実施形態において、本発明は、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰおよびＵＴＰヌクレオチドの２’−ＯＨ、２’−Ｆ、２’−デオキシおよび２’−ＯＭｅ改変を組み合わせたアプタマーを提供する。別の実施形態において、本発明は、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰおよびＵＴＰヌクレオチドの２’−ＯＨ、２’−Ｆ、２’−デオキシ、２’−ＯＭｅ、２’−ＮＨ２および２’−メトキシエチル改変を組み合わせたアプタマーを提供する。別の実施形態において、本発明は、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰおよびＵＴＰヌクレオチドの２’−ＯＨ、２’−Ｆ、２’−デオキシ、２’−ＯＭｅ、２’−ＮＨ２および２’−メトキシエチル改変の５６個の組み合わせを含むアプタマーを提供する。
【０１０７】
本発明の２’改変アプタマーは、改変ポリメラーゼ、例えば、改変Ｔ７ポリメラーゼを使用して作製され、その改変ポリメラーゼは、フラノース２’位にかさ高い置換基を有する改変ヌクレオチドを、野生型ポリメラーゼが取り込む割合よりも高い割合で取り込む。例えば、６３９位のチロシン残基がフェニルアラニンに変化している単変異Ｔ７ポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｆ）は、２’デオキシ、２’アミノ−および２’フルオロ−ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）を基質として容易に利用し、種々の用途のための改変ＲＮＡを合成するために広く使用されている。しかしながら、この変異Ｔ７ポリメラーゼは、報告によれば、かさ高い２’置換基（例えば、２’−ＯＭｅまたは２’−アジド（２’−Ｎ３）置換基）を有するＮＴＰを容易に利用する（すなわち、取り込む）ことができない。かさ高い２’置換基を取り込むために、Ｙ６３９Ｆ変異に加えて、７８４位のヒスチジンがアラニン残基に変化しているＴ７ポリメラーゼ二重変異体（Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ）が報告されており、限られた状況において、改変ピリミジンＮＴＰを取り込むために使用されている。Ｐａｄｉｌｌａ，Ｒ．ａｎｄ  Ｓｏｕｓａ，Ｒ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２００２，３０（２４）：１３８を参照のこと。７８４位のヒスチジンがアラニン残基に変化している単変異Ｔ７ポリメラーゼ（Ｈ７８４Ａ）もまた報告されている。Ｐａｄｉｌｌａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００２，３０：１３８を参照のこと。Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ二重変異体とＨ７８４Ａ単変異体のＴ７ポリメラーゼの両方において、アラニンなどのより小さいアミノ酸残基への変更により、よりかさ高いヌクレオチド基質、例えば、２’−ＯＭｅ置換ヌクレオチドの取り込みが可能となる。
【０１０８】
一般に、本明細書中で開示される条件下において、ＧＴＰ以外のすべての２’−ＯＭｅ置換ＮＴＰを取り込むためにＹ６９３Ｆ単変異体を使用することができること、およびＧＴＰを含むすべての２’−ＯＭｅ置換ＮＴＰを取り込むためにＹ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ二重変異体を使用することができることが見出されている。Ｈ７８４Ａ単変異体は、本明細書中で開示される条件下で使用されるとき、Ｙ６３９ＦおよびＹ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ変異体と類似の特性を有すると考えられる。
【０１０９】
２’−改変オリゴヌクレオチドは、改変ヌクレオチドからか、または改変ヌクレオチドのサブセットから完全に合成され得る。その改変は、同じであっても異なっていてもよい。すべてのヌクレオチドが改変され得、また、すべてが同じ改変を含み得る。すべてのヌクレオチドが改変され得るが、異なる改変を含む、例えば、同じ塩基を含むすべてのヌクレオチドが１つのタイプの改変を有し得、他の塩基を含むヌクレオチドは、異なるタイプの改変を有し得る。すべてのプリンヌクレオチドが、１つのタイプの改変を有し得（または改変されず）、すべてのピリミジンヌクレオチドが、別の異なるタイプの改変を有する（または改変されない）。このように、任意の組み合わせの改変（例えば、リボヌクレオチド（２’−ＯＨ）、デオキシリボヌクレオチド（２’−デオキシ）、２’−Ｆおよび２’−ＯＭｅヌクレオチドを含む）を用いて、転写産物または転写産物のプールが作製される。２’−ＯＭｅ  ＣおよびＵおよび２’−ＯＨ  ＡおよびＧを含む転写混合物は、「ｒＲｍＹ」混合物と呼ばれ、そこから選択されたアプタマーは、「ｒＲｍＹ」アプタマーと呼ばれる。デオキシＡおよびＧならびに２’−ＯＭｅ  ＵおよびＣを含む転写混合物は、「ｄＲｍＹ」混合物と呼ばれ、そこから選択されたアプタマーは、「ｄＲｍＹ」アプタマーと呼ばれる。２’−ＯＭｅ  Ａ、ＣおよびＵならびに２’−ＯＨ  Ｇを含む転写混合物は、「ｒＧｍＨ」混合物と呼ばれ、そこから選択されたアプタマーは、「ｒＧｍＨ」アプタマーと呼ばれる。２’−ＯＭｅ  Ａ、Ｃ、ＵおよびＧならびに２’−ＯＭｅ  Ａ、ＵおよびＣならびに２’−Ｆ  Ｇを交互に含む転写混合物は、「交互（ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ）混合物」と呼ばれ、そこから選択されたアプタマーは、「交互混合物」アプタマーと呼ばれる。２’−ＯＭｅ  Ａ、Ｕ、ＣおよびＧを含む転写混合物は、そのＧの１０％以下がリボヌクレオチドである場合、「ｒ／ｍＧｍＨ」混合物と呼ばれ、そこから選択されたアプタマーは、「ｒ／ｍＧｍＨ」アプタマーと呼ばれる。２’−ＯＭｅ  Ａ、ＵおよびＣならびに２’−Ｆ  Ｇを含む転写混合物は、「ｆＧｍＨ」混合物と呼ばれ、そこから選択されたアプタマーは、「ｆＧｍＨ」アプタマーと呼ばれる。２’−ＯＭｅ  Ａ、ＵおよびＣならびにデオキシＧを含む転写混合物は、「ｄＧｍＨ」混合物と呼ばれ、そこから選択されたアプタマー  は、「ｄＧｍＨ」アプタマーと呼ばれる。デオキシＡならびに２’−ＯＭｅ  Ｃ、ＧおよびＵを含む転写混合物は、「ｄＡｍＢ」混合物と呼ばれ、そこから選択されたアプタマーは、「ｄＡｍＢ」アプタマーと呼ばれ、そしてすべての２’−ＯＨヌクレオチドを含む転写混合物は、「ｒＮ」混合物と呼ばれ、そこから選択されたアプタマーは、「ｒＮ」または「ｒＲｒＹ」アプタマーと呼ばれる。「ｍＲｍＹ」アプタマーは、すべての２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含むアプタマーであり、可能であれば、任意の２’−ＯＨ  Ｇを２’−ＯＭｅ  Ｇで置換するときのポストＳＥＬＥＸＴＭ置換によってｒ／ｍＧｍＨオリゴヌクレオチドから通常誘導される。
【０１１０】
好ましい実施形態は、２’−ＯＨ、２’−デオキシおよび２’−ＯＭｅヌクレオチドの任意の組み合わせを含む。より好ましい実施形態は、２’−デオキシと２’−ＯＭｅヌクレオチドとの任意の組み合わせを含む。さらにより好ましい実施形態は、ピリミジンが、２’−ＯＭｅ（例えば、ｄＲｍＹ、ｍＲｍＹまたはｄＧｍＨ）である２’−デオキシおよび２’−ＯＭｅヌクレオチドの任意の組み合わせによるものである。
【０１１１】
本発明のアプタマーへの改変ヌクレオチドの組み込みは、セレクションプロセスの前（プレセレクションプロセス）（例えば、プレＳＥＬＥＸＴＭプロセス改変）に達成される。必要に応じて、改変ヌクレオチドがプレＳＥＬＥＸＴＭプロセス改変によって組み込まれた本発明のアプタマーは、ポストＳＥＬＥＸＴＭプロセス改変によってさらに改変され得る（すなわち、プレＳＥＬＥＸＴＭ改変の後にポストＳＥＬＥＸＴＭプロセス改変）。プレＳＥＬＥＸＴＭプロセス改変により、ＳＥＬＥＸＴＭ標的に対する特異性を有する改変核酸リガンドおよびインビボでの安定性の改善がもたらされる。ポストＳＥＬＥＸＴＭプロセス改変、すなわち、改変（例えば、プレＳＥＬＥＸＴＭプロセス改変によって組み込まれるヌクレオチドを有する先に同定されたリガンドの切断、欠失、置換または付加によるヌクレオチド改変）により、プレＳＥＬＥＸＴＭプロセス改変によって組み込まれたヌクレオチドを有する核酸リガンドの結合能力に悪影響を及ぼすことなく、インビボでの安定性のさらなる改善がもたらされ得る。
【０１１２】
ポリメラーゼが２’−改変ＮＴＰを許容する条件において２’−改変（例えば、２’−ＯＭｅ）ＲＮＡ転写産物のプールを作製するために好ましいポリメラーゼは、Ｙ６９３Ｆ／Ｈ７８４Ａ二重変異体またはＹ６９３Ｆ単変異体である。他のポリメラーゼ、具体的には、かさ高い２’−置換基に対して高い許容性を示すポリメラーゼもまた、本発明において使用することができる。そのようなポリメラーゼは、本明細書中で開示される転写条件下で改変ヌクレオチドを組み込む能力をアッセイすることによって、この能力についてスクリーニングされ得る。
【０１１３】
本明細書中で開示される方法において有用な転写条件について重要である多くの因子が決定されてきた。例えば、得られる転写産物の少なくとも最初の約６残基が、すべてプリンとなるように、ＤＮＡ転写鋳型の５’末端における固定配列の５’末端にリーダー配列が組み込まれているときに改変転写産物の収率の上昇が観察される。
【０１１４】
改変ヌクレオチドを組み込んでいる転写産物を得る際に重要な別の因子は、２’−ＯＨ  ＧＴＰの存在または濃度である。転写は、２つの相に分割され得る：第１相は、開始であり、この間に、ＮＴＰが、ＧＴＰ（または別の置換グアノシン）の３’−ヒドロキシル末端に付加されてジヌクレオチドが得られ、次いでそのジヌクレオチドが、約１０〜１２ヌクレオチド伸長される；第２相は、伸長であり、この間に、転写は最初の約１０〜１２ヌクレオチドの付加を超えて進む。過剰量の２’−ＯＭｅ  ＧＴＰを含む転写混合物に加えられる少量の２’−ＯＨ  ＧＴＰは、ポリメラーゼが、２’−ＯＨ  ＧＴＰを用いて転写を開始することが可能となるのに十分であるが、一旦転写が伸長相に入ると、２’−ＯＭｅと２’−ＯＨＧＴＰとの識別性が低下すること、および２’−ＯＨ  ＧＴＰに対して２’−ＯＭｅが過剰となることにより、主に２’−ＯＭｅ  ＧＴＰの取り込みが可能となることが見出されている。
【０１１５】
転写産物への２’−ＯＭｅ置換ヌクレオチドの組み込みにおける別の重要な因子は、転写混合物において二価のマグネシウムとマンガンの両方を使用することである。塩化マグネシウムおよび塩化マンガンの濃度の様々な組み合わせが、２’−Ｏ−メチル化転写産物の収率に影響を及ぼすことが見出されており、塩化マグネシウムおよび塩化マンガンの最適濃度は、二価金属イオンを錯化するＮＴＰの転写反応混合物中の濃度に左右される。最大限に２’置換されたＯ−メチル化転写産物（すなわち、Ａ、ＣおよびＵのすべてならびにＧヌクレオチドの約９０％）の最高の収率を得るためには、各ＮＴＰが、０．５ｍＭの濃度で存在するとき、約５ｍＭ塩化マグネシウムおよび１．５ｍＭ塩化マンガンの濃度が、好ましい。各ＮＴＰの濃度が１．０ｍＭであるとき、約６．５ｍＭ塩化マグネシウムおよび２．０ｍＭ塩化マンガンの濃度が好ましい。各ＮＴＰの濃度が２．０ｍＭであるとき、約９．６ｍＭ塩化マグネシウムおよび２．９ｍＭ塩化マンガンの濃度が、好ましい。いずれの場合においても、これらの濃度からの２倍以下の逸脱であれば、さらにかなりの量の改変転写産物がもたらされる。
【０１１６】
ＧＭＰまたはグアノシンで転写を開始することもまた重要である。この作用は、開始ヌクレオチドに対するポリメラーゼの特異性から生じるものである。結果として、この様式において生成される任意の転写産物の５’−末端のヌクレオチドは、２’−ＯＨ  Ｇである可能性がある。ＧＭＰ（またはグアノシン）の好ましい濃度は、０．５ｍＭであり、さらにより好ましくは１ｍＭである。転写反応においてＰＥＧ、好ましくはＰＥＧ−８０００を含むことが、改変ヌクレオチドの取り込みを最大にするために有用であることも見出されている。
【０１１７】
転写産物への２’−ＯＭｅ  ＡＴＰ（１００％）、ＵＴＰ（１００％）、ＣＴＰ（１００％）およびＧＴＰ（約９０％）（「ｒ／ｍＧｍＨ」）の取り込みを最大限にするためには、以下の条件が好ましい：２００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、４０ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭのスペルミジン、１０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ−８０００、０．０１％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５ｍＭ（各２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度が１．０ｍＭである場合は６．５ｍＭ）のＭｇＣｌ２、１．５ｍＭ（各２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度が１．０ｍＭである場合は２．０ｍＭ）のＭｎＣｌ２、５００μＭ（より好ましくは、１．０ｍＭ）の２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（各々）、３０μＭの２’−ＯＨ  ＧＴＰ、５００μＭ，ｐＨ７．５の２’−ＯＨ  ＧＭＰ、１５単位／ｍＬのＹ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ  Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、５単位／ｍＬの無機ピロホスファターゼおよび少なくとも８ヌクレオチド長のすべてプリンのリーダー配列。本明細書中で使用されるとき、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（または本明細書中で特定される他の任意の変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ）の１単位は、ｒ／ｍＧｍＨ条件下で１ナノモルの２’−ＯＭｅ  ＮＴＰを転写産物に組み込むために必要な酵素の量と定義される。本明細書中で使用されるとき、無機ピロホスファターゼの１単位は、ｐＨ７．２および２５℃において、１分あたりに１．０モルの無機オルトホスフェートを遊離する酵素の量と定義される。
【０１１８】
転写産物への２’−ＯＭｅ  ＡＴＰ、ＵＴＰおよびＣＴＰ（「ｒＧｍＨ」）の組み込みを最大限（１００％）にするためには、以下の条件が好ましい：２００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、４０ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭのスペルミジン、１０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ−８０００、０．０１％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５ｍＭ（各２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合は９．６ｍＭ）のＭｇＣｌ２、１．５ｍＭ（各２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合は２．９ｍＭ）のＭｎＣｌ２、５００μＭ（より好ましくは、２．０ｍＭ），ｐＨ７．５の２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（各々）、１５単位／ｍＬのＹ６３９Ｆ  Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、５単位／ｍＬの無機ピロホスファターゼおよび少なくとも８ヌクレオチド長のすべてプリンのリーダー配列。
【０１１９】
転写産物への２’−ＯＭｅ  ＵＴＰおよびＣＴＰ（「ｒＲｍＹ」）の組み込みを最大限（１００％）にするためには、以下の条件が好ましい：２００ｍＭのＨＥＰＥＳ  緩衝液、４０ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭのスペルミジン、１０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ−８０００、０．０１％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５ｍＭ（各２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合は９．６ｍＭ）のＭｇＣｌ２、１．５ｍＭ（各２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合は２．９ｍＭ）のＭｎＣｌ２、５００μＭ（より好ましくは、２．０ｍＭ），ｐＨ７．５の２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（各々）、１５単位／ｍＬのＹ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ  Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、５単位／ｍＬの無機ピロホスファターゼおよび少なくとも８ヌクレオチド長のすべてプリンのリーダー配列。
【０１２０】
転写産物へのデオキシＡＴＰおよびＧＴＰならびに２’−ＯＭｅ  ＵＴＰおよびＣＴＰ（「ｄＲｍＹ」）の組み込みを最大限（１００％）にするためには、以下の条件が好ましい：２００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、４０ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭのスペルミン、２ｍＭのスペルミジン、１０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ−８０００、０．０１％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、９．６ｍＭのＭｇＣｌ２、２．９ｍＭのＭｎＣｌ２、２．０ｍＭ，ｐＨ７．５の２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（各々）、１５単位／ｍＬのＹ６３９Ｆ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、５単位／ｍＬの無機ピロホスファターゼおよび少なくとも８ヌクレオチド長のすべてプリンのリーダー配列。
【０１２１】
転写産物への２’−ＯＭｅ  ＡＴＰ、ＵＴＰおよびＣＴＰならびに２’−Ｆ  ＧＴＰ（「ｆＧｍＨ」）の組み込みを最大限（１００％）にするためには、以下の条件が好ましい：２００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、４０ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭのスペルミジン、１０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ−８０００、０．０１％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、９．６ｍＭのＭｇＣｌ２、２．９ｍＭのＭｎＣｌ２、２．０ｍＭ，ｐＨ７．５の２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（各々）、１５単位／ｍＬのＹ６３９Ｆ  Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、５単位／ｍＬの無機ピロホスファターゼおよび少なくとも８ヌクレオチド長のすべてプリンのリーダー配列。
【０１２２】
転写産物へのデオキシＡＴＰならびに２’−ＯＭｅ  ＵＴＰ、ＧＴＰおよびＣＴＰ（「ｄＡｍＢ」）の組み込みを最大限（１００％）にするためには、以下の条件が好ましい：２００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、４０ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭのスペルミジン、１０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ−８０００、０．０１％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、９．６ｍＭのＭｇＣｌ２、２．９ｍＭのＭｎＣｌ２、２．０ｍＭ，ｐＨ７．５の２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（各々）、１５単位／ｍＬのＹ６３９Ｆ  Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、５単位／ｍＬの無機ピロホスファターゼおよび少なくとも８ヌクレオチド長のすべてプリンのリーダー配列。
【０１２３】
上記の各々について、（ａ）転写は、好ましくは、少なくとも２時間に亘って、約２０℃〜約５０℃、好ましくは約３０℃〜４５℃、およびより好ましくは約３７℃の温度において行い、（ｂ）５０〜３００ｎＭの二本鎖ＤＮＡ転写鋳型を用いる（本明細書中に記載の条件を用いて、多様性を高めるために第１回では２００ｎＭの鋳型を用い（ｄＲｍＹ転写では３００ｎＭの鋳型を用いる）、その後の回では約５０ｎＭ、すなわち、最適化されたＰＣＲ反応物の１／１０希釈物を用いる）。好ましいＤＮＡ転写鋳型を、以下に記載する（ここで、ＡＲＣ２５４およびＡＲＣ２５６は、すべて２’−ＯＭｅ条件下で転写し、ＡＲＣ２５５は、ｒＲｍＹ条件下で転写する）。
【０１２４】
【化２７】
2009521208.tif 000027
本発明のｒＮ転写条件下において、転写反応混合物は、２’−ＯＨアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、２’−ＯＨグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、２’−ＯＨシチジン三リン酸（ＣＴＰ）および２’−ＯＨウリジン三リン酸（ＵＴＰ）を含む。本発明のｒＮ転写混合物を用いて生成された改変オリゴヌクレオチドは、実質的にすべての２’−ＯＨアデノシン、２’−ＯＨグアノシン、２’−ＯＨシチジンおよび２’−ＯＨウリジンを含む。ｒＮ転写の好ましい実施形態において、得られる改変オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が、２’−ＯＨアデノシンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が、２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が、２’−ＯＨシチジンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が、２’−ＯＨウリジンである配列を含む。ｒＮ転写のより好ましい実施形態において、本発明の得られる改変オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が、２’−ＯＨアデノシンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が、２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が、２’−ＯＨシチジンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が、２’−ＯＨウリジンである配列を含む。ｒＮ転写の最も好ましい実施形態において、本発明の改変オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの１００％が、２’−ＯＨアデノシンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの１００％が、２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの１００％が、２’−ＯＨシチジンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの１００％が、２’−ＯＨウリジンである配列を含む。
【０１２５】
本発明のｒＲｍＹ転写条件下において、転写反応混合物は、２’−ＯＨアデノシン三リン酸、２’−ＯＨグアノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸および２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸を含む。本発明のｒＲｍＹ転写混合物を用いて生成される改変オリゴヌクレオチドは、実質的にすべての２’−ＯＨアデノシン、２’−ＯＨグアノシン、２’−Ｏ−メチルシチジンおよび２’−Ｏ−メチルウリジンを含む。好ましい実施形態において、得られる改変オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が、２’−ＯＨアデノシンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が、２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が、２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が、２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。より好ましい実施形態において、得られる改変オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が、２’−ＯＨアデノシンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が、２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が、２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が、２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。最も好ましい実施形態において、得られる改変オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの１００％が、２’−ＯＨアデノシンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの１００％が、２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの１００％が、２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの１００％が、２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。
【０１２６】
本発明のｄＲｍＹ転写条件下において、転写反応混合物は、２’−デオキシアデノシン三リン酸、２’−デオキシグアノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸および２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸を含む。本発明のｄＲｍＹ転写条件を用いて生成される改変オリゴヌクレオチドは、実質的にすべての２’−デオキシアデノシン、２’−デオキシグアノシン、２’−Ｏ−メチルシチジンおよび２’−Ｏ−メチルウリジンを含む。好ましい実施形態において、本発明の得られる改変オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が、２’−デオキシアデノシンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が、２’−デオキシグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が、２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が、２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。より好ましい実施形態において、本発明の得られる改変オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が、２’−デオキシアデノシンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が、２’−デオキシグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が、２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が、２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。最も好ましい実施形態において、本発明の得られる改変オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの１００％が、２’−デオキシアデノシンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの１００％が、２’−デオキシグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの１００％が、２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの１００％が、２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。
【０１２７】
本発明のｒＧｍＨ転写条件下において、転写反応混合物は、２’−ＯＨグアノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸、２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸および２’−Ｏ−メチルアデノシン三リン酸を含む。本発明のｒＧｍＨ転写混合物を用いて生成される改変オリゴヌクレオチドは、実質的にすべての２’−ＯＨグアノシン、２’−Ｏ−メチルシチジン、２’−Ｏ−メチルウリジンおよび２’−Ｏ−メチルアデノシンを含む。好ましい実施形態において、得られる改変オリゴヌクレオチドは、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が、２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が、２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が、２’−Ｏ−メチルウリジンであり、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が、２’−Ｏ−メチルアデノシンである配列を含む。より好ましい実施形態において、得られる改変オリゴヌクレオチドは、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が、２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が、２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が、２’−Ｏ−メチルウリジンであり、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が、２’−Ｏ−メチルアデノシンである配列を含む。最も好ましい実施形態において、得られる改変オリゴヌクレオチドは、すべてのグアノシンヌクレオチドの１００％が、２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの１００％が、２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの１００％が、２’−Ｏ−メチルウリジンであり、すべてのアデノシンヌクレオチドの１００％が、２’−Ｏ−メチルアデノシンである配列を含む。
【０１２８】
本発明のｒ／ｍＧｍＨ転写条件下において、転写反応混合物は、２’−Ｏ−メチルアデノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸、２’−Ｏ−メチルグアノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸および２’−ＯＨグアノシン三リン酸を含む。本発明のｒ／ｍＧｍＨ転写混合物を用いて生成される、得られる改変オリゴヌクレオチドは、実質的にすべての２’−Ｏ−メチルアデノシン、２’−Ｏ−メチルシチジン、２’−Ｏ−メチルグアノシンおよび２’−Ｏ−メチルウリジンを含み、ここで、グアノシンヌクレオチドの集団は、最高約１０％の２’−ＯＨグアノシンである。好ましい実施形態において、本発明の得られるｒ／ｍＧｍＨ改変オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が、２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が、２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が、２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が、２’−Ｏ−メチルウリジンであり、そしてすべてのグアノシンヌクレオチドの約１０％以下が、２’−ＯＨグアノシンである配列を含む。より好ましい実施形態において、得られる改変オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が、２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が、２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が、２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が、２’−Ｏ−メチルウリジンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの約１０％以下が、２’−ＯＨグアノシンである配列を含む。最も好ましい実施形態において、得られる改変オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの１００％が、２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの１００％が、２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの９０％が、２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの１００％が、２’−Ｏ−メチルウリジンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの約１０％以下が、２’−ＯＨグアノシンである配列を含む。
【０１２９】
本発明のｆＧｍＨ転写条件下において、転写反応混合物は、２’−Ｏ−メチルアデノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸および２’−Ｆグアノシン三リン酸を含む。本発明のｆＧｍＨ転写条件を用いて生成される改変オリゴヌクレオチドは、実質的にすべての２’−Ｏ−メチルアデノシン、２’−Ｏ−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルシチジンおよび２’−Ｆグアノシンを含む。好ましい実施形態において、得られる改変オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が、２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が、２’−Ｏ−メチルウリジンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が、２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が、２’−Ｆグアノシンである配列を含む。より好ましい実施形態において、得られる改変オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が、２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が、２’−Ｏ−メチルウリジンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が、２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が、２’−Ｆグアノシンである配列を含む。最も好ましい実施形態において、得られる改変オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの１００％が、２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの１００％が、２’−Ｏ−メチルウリジンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの１００％が、２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの１００％が、２’−Ｆグアノシンである配列を含む。
【０１３０】
本発明のｄＡｍＢ転写条件下において、転写反応混合物は、２’−デオキシアデノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸、２’−Ｏ−メチルグアノシン三リン酸および２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸を含む。本発明のｄＡｍＢ転写混合物を用いて生成される改変オリゴヌクレオチドは、実質的にすべての２’−デオキシアデノシン、２’−Ｏ−メチルシチジン、２’−Ｏ−メチルグアノシンおよび２’−Ｏ−メチルウリジンを含む。好ましい実施形態において、得られる改変オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が、２’−デオキシアデノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が、２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が、２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が、２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。より好ましい実施形態において、得られる改変オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が、２’−デオキシアデノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が、２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が、２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が、２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。最も好ましい実施形態において、本発明の得られる改変オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの１００％が、２’−デオキシアデノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの１００％が、２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの１００％が、２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの１００％が、２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。
【０１３１】
各々の場合において、次いで、その転写産物をＳＥＬＥＸＴＭプロセスにおいてライブラリーとして用いて、アプタマーを同定し得、そして／または所与の標的に対する結合特異性を有する配列の保存モチーフを決定し得る。得られる配列は、すでに部分的に安定化されているので、最適化アプタマー配列に到達するプロセスからこの工程が排除される。結果として、より高度に安定化されたアプタマーが得られる。２’−ＯＭｅ  ＳＥＬＥＸＴＭプロセスの別の利点は、得られる配列が、配列中に必要な２’−ＯＨヌクレオチドをほとんど、おそらくは全く有しない可能性があるという点である。２’ＯＨヌクレオチドが残存する範囲内で、ポストＳＥＬＥＸＴＭ改変を行うことによって２’ＯＨヌクレオチドを除去することができる。
【０１３２】
以下に記載するように、２’置換ヌクレオチドを完全に組み込んでいる転写産物を、上で記載した最適化された条件以外の条件下において、収率が低いがさらに有用である収率で得ることができる。上記の転写条件に対する変更点としては、例えば以下が挙げられる：
ＨＥＰＥＳ緩衝液濃度は、０〜１Ｍの範囲であり得る。本発明はまた、５〜１０のｐＫａを有する他の緩衝剤（例えばＴｒｉｓ−ヒドロキシメチル−アミノメタンが挙げられる）の使用も企図する。
【０１３３】
ＤＴＴ濃度は、０〜４００ｍＭの範囲であり得る。本発明の方法はまた、他の還元剤（例えばメルカプトエタノールが挙げられる）の使用も提供する。
【０１３４】
スペルミジンおよび／またはスペルミンの濃度は、０〜２０ｍＭの範囲であり得る。
【０１３５】
ＰＥＧ−８０００濃度は、０〜５０％（ｗ／ｖ）の範囲であり得る。本発明の方法はまた、他の親水性ポリマー（例えば、他の分子量のＰＥＧまたは他のポリアルキレングリコールが挙げられる）の使用も提供する。
【０１３６】
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度は、０〜０．１％（ｗ／ｖ）の範囲であり得る。本発明の方法はまた、他の非イオン性界面活性剤（例えば、他のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ界面活性剤を含む他の界面活性剤が挙げられる）の使用も提供する。
【０１３７】
ＭｇＣｌ２濃度は、０．５ｍＭ〜５０ｍＭの範囲であり得る。ＭｎＣｌ２濃度は、０．１５ｍＭ〜１５ｍＭの範囲であり得る。ＭｇＣｌ２とＭｎＣｌ２の両方が、記載した範囲内で存在しなければならず、そして好ましい実施形態においては、ＭｇＣｌ２：ＭｎＣｌ２の比が約１０〜約３であり、好ましくは、その比は、約３〜５：１であり、より好ましくは、その比は、約３〜４：１である。
【０１３８】
２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ濃度（各ＮＴＰ）は、５μＭ〜５ｍＭの範囲であり得る。
【０１３９】
２’−ＯＨ  ＧＴＰ濃度は、０μＭ〜３００μＭの範囲であり得る。
【０１４０】
２’−ＯＨ  ＧＭＰ濃度は、０〜５ｍＭの範囲であり得る。
【０１４１】
ｐＨは、ｐＨ６〜ｐＨ９の範囲であり得る。本発明の方法は、改変ヌクレオチドを組み込むほとんどのポリメラーゼの活性のｐＨ範囲内で実施され得る。さらに、本発明の方法は、転写反応条件におけるキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよびＤＴＴが挙げられる）の任意の使用を提供する。
【０１４２】
（ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２アプタマーセレクションストラテジー）
本発明は、ヒトＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２に結合し、いくつかの実施形態において、それらのレセプターへの結合を阻害し、そして／またはそれらの機能を他の方法で調節するアプタマーを提供する。ヒトＩＬ−２３およびＩＬ−１２の両方ともが、ヘテロダイマーであり、その１つのサブユニットが共通で、もう１つが固有である。共通のサブユニットは、以下のアミノ酸配列（アクセッション＃ＡＦ１８０５６３）（配列番号４）を含むｐ４０サブユニットである：
【０１４３】
【化２８−１】
2009521208.tif 000028
【０１４４】
【化２８−２】
2009521208.tif 000029
ｐ１９サブユニットは、ＩＬ−２３に固有であり、以下のアミノ酸配列（アクセッション＃ＢＣ０６７５１１）（配列番号５）を含む：
【０１４５】
【化２９】
2009521208.tif 000030
ｐ３５サブユニットは、ＩＬ−１２に固有であり、以下のアミノ酸配列（アクセッション＃ＡＦ１８０５６２）（配列番号６）を含む：
【０１４６】
【化３０】
2009521208.tif 000031
本発明はまた、マウスＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２に結合し、いくつかの実施形態において、それらのレセプターへの結合を阻害し、そして／またはそれらの機能を他の方法で調節するアプタマーを提供する。ヒトと同様に、マウスＩＬ−２３とＩＬ−１２の両方ともが、ヘテロダイマーであり、マウスｐ４０サブユニットを共有するのに対し、マウスｐ１９サブユニットがマウスＩＬ−２３に特異的であり、そしてマウスｐ３５サブユニットが、マウスＩＬ−１２に固有である。マウスｐ４０サブユニットは、以下のアミノ酸配列（アクセッション＃Ｐ４３４３２）（配列番号３２１）を含む：
【０１４７】
【化３１】
2009521208.tif 000032
マウスｐ１９サブユニットは、以下のアミノ酸配列（アクセッション＃ＮＰ１１２５４２）（配列番号３２２）を含む：
【０１４８】
【化３２】
2009521208.tif 000033
マウスｐ３５サブユニットは、以下のアミノ酸配列（アクセッション＃Ｐ４３４３１）（配列番号３２３）を含む：
【０１４９】
【化３３】
2009521208.tif 000034
いくつかのＳＥＬＥＸＴＭストラテジーを用いて、ＩＬ−２３およびＩＬ−１２に対する種々の特異性を有したアプタマーを作製することができる。１つのスキームにおいて、ネガティブセレクション工程にＩＬ−１２を含めることによってＩＬ−１２よりもＩＬ−２３に対して特異的なアプタマーがもたらされる。これにより、共通のサブユニットであるｐ４０（配列番号４）を認識する配列が排除され、図３に示されるように、ＩＬ−２３、すなわちｐ１９サブユニット（配列番号５）に特異的なアプタマーについて選別される。１つのスキームにおいて、ネガティブセレクション工程にＩＬ−２３を含めることによってＩＬ−２３よりもＩＬ−１２に特異的なアプタマーがもたらされる。これにより、共通のサブユニットであるｐ４０（配列番号４）を認識する配列が排除され、ＩＬ−１２、すなわちｐ３５サブユニット（配列番号６）に特異的なアプタマーについて選別される。ＩＬ−２３とＩＬ−１２とを１つおきの回で交互に用いる別個のセレクションにより、共通のサブユニットであるｐ４０（配列番号４）を認識するために、両方のタンパク質を認識するアプタマーが排除される。一旦、所望の結合特異性を有する配列が見出されると、それらの配列の最小化に着手し、結合特性を改善しながら同時に配列の大きさを体系的に減じ得る。
【０１５０】
下記の実施例に記載されるような生物学的アッセイによって証明されるとき、最も高い親和性および特異的結合性を有する選別されたアプタマーは、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２が病因に関与する状態を処置するために適した治療薬である。
【０１５１】
（ＩＬ−２３／ＩＬ−１２特異的結合アプタマー）
本発明の材料は、ヒトＩＬ−１２サイトカインファミリーのサイトカインに特異的に結合する約２５〜９０ヌクレオチド長の一連の核酸アプタマーを含み、そのサイトカインファミリーは、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＬ−２７；ｐ１９、ｐ３５およびｐ４０サブユニットモノマー；ならびにｐ４０サブユニットダイマーを含み；そしてインビボおよび／または細胞ベースアッセイにおいてＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２の活性を機能的に調節する、例えば、阻止する。
【０１５２】
ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２に結合し、調節することが特異的にできるアプタマーを本明細書中に示す。これらのアプタマーは、低毒性、安全性を提供し、ならびに自己免疫性および炎症性に関連する疾患または障害の処置および／または予防の有効な様式を提供する。１つの実施形態において、本発明のアプタマーは、炎症性疾患および自己免疫疾患を処置および／または予防するために使用され、その炎症性疾患および自己免疫疾患としては、多発性硬化症、関節リウマチ、尋常性乾癬および過敏性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎が挙げられるがこれらに限定されない）が挙げられるがこれらに限定されず、これらの疾患の各々は、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２サイトカインによって引き起こされるか、または他の方法でそれらに関連することが知られている。別の実施形態において、本発明のアプタマーは、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２サイトカインによって引き起こされるか、または他の方法でそれらに関連することが知られているＩ型糖尿病を処置および／または予防するために使用される。別の実施形態において、本発明のアプタマーは、サイトカインレセプター結合の活性化が望ましい他の徴候を処置および／または予防するために使用され、その徴候としては、例えば、全身性エリテマトーデス、結腸癌、肺癌および骨粗鬆症における骨吸収が挙げられる。
【０１５３】
治療薬および／または診断薬として使用するためのＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２特異的結合アプタマーの例としては、下記に列挙される以下の配列が挙げられる。
【０１５４】
他に述べられない限り、
【０１５５】
【化３４】
2009521208.tif 000035
は、プリン（ＡおよびＧ）がデオキシであり、ピリミジン（ＣおよびＵ）が２’−ＯＭｅであるというＳＥＬＥＸＴＭ条件下で選別された、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２に結合するアプタマーの配列のことを表す。
【０１５６】
ＡＲＣ４８９（配列番号９１）およびＡＲＣ４９１（配列番号９４）の固有配列領域は、配列
【０１５７】
【化３５】
2009521208.tif 000036
（配列番号６９）の直後のヌクレオチド２３から始まり、３’固定核酸配列
【０１５８】
【化３６】
2009521208.tif 000037
（配列番号９０）に遭遇するまで続く。
【０１５９】
ＡＲＣ６２１（配列番号１０８）およびＡＲＣ６２７（配列番号１１０）の固有配列領域は、配列
【０１６０】
【化３７】
2009521208.tif 000038
（配列番号１０１）の直後のヌクレオチド２３から始まり、３’固定核酸配列
【０１６１】
【化３８】
2009521208.tif 000039
（配列番号１０２）に遭遇するまで続く。
【０１６２】
【化３９−１】
2009521208.tif 000040
【０１６３】
【化３９−２】
2009521208.tif 000041
ＡＲＣ１６２３（配列番号３０９）、ＡＲＣ１６２４（配列番号３１０）およびＡＲＣ１６２５（配列番号３１１）は、ＡＲＣ９７９（配列番号１７７）に基づいて最適化された配列を表しており、ここで、「ｄ」は、デオキシを表し、「ｍ」は、２’−Ｏ−メチルを表し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を示し、そして「３Ｔ」は、３’−逆位デオキシチミジンを表している。
【０１６４】
【化４０】
2009521208.tif 000042
配列番号１３９〜１４０、配列番号１４４〜１４５、配列番号１４７および配列番号１５１〜１５２は、プリン（ＡおよびＧ）が２’−ＯＨ（リボ）であり、ピリミジン（ＣおよびＵ）が２’−フルオロであるというＳＥＬＥＸＴＭ条件下で選別されたＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２に結合するアプタマーの配列を表している。
【０１６５】
【化４１−１】
2009521208.tif 000043
【０１６６】
【化４１−２】
2009521208.tif 000044
ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２と結合する他のアプタマーは、下記の実施例１〜３に記載されている。
【０１６７】
これらのアプタマーは、本明細書中に記載されるような改変を含み得、その改変としては、例えば、親油性または高分子量の化合物（例えば、ＰＥＧ）との結合体化、ＣｐＧモチーフの組み込み、キャッピング部分の組み込み、改変ヌクレオチドの組み込みおよびリン酸骨格中のホスホロチオエートの組み込みが挙げられる。
【０１６８】
１つの実施形態において、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２に結合する、単離された天然に存在しないアプタマーが提供される。いくつかの実施形態において、単離された天然に存在しないアプタマーのＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２に対する解離定数（「ＫＤ」）は、１００μＭ未満、１μＭ未満、５００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、１ｎＭ未満、５００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満および５０ｐＭ未満である。本発明のいくつかの実施形態において、解離定数は、下記の実施例１に記載されるようなドットブロット力価測定によって測定される。
【０１６９】
別の実施形態において、本発明のアプタマーは、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２の機能を調節する。別の実施形態において、本発明のアプタマーは、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２の機能を阻害するが、別の実施形態では、本アプタマーは、標的の機能を刺激する。本発明の別の実施形態において、本アプタマーは、ＩＬ−２３またはＩＬ−１２改変体に結合し、そして／またはそれらの機能を調節する。ＩＬ−２３またはＩＬ−１２改変体は、本明細書中で使用されるとき、ＩＬ−２３またはＩＬ−１２の機能と本質的に同じ機能を示す改変体を包含し、好ましくは実質的に同じ構造を含み、そしていくつかの実施形態では、ＩＬ−２３またはＩＬ−１２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、そしてより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を含む。本発明のいくつかの実施形態において、標的改変体の配列同一性は、下記に記載するようにＢＬＡＳＴを用いて決定される。
【０１７０】
２つ以上の核酸またはタンパク質配列の文脈における用語「配列同一性」とは、同じであるか、または以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いるか、もしくは目視検査によって測定する際に、比較されて一致が最大となるようにアラインメントされたときに同じである特定のパーセンテージのアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する２つ以上の配列または部分配列のことをいう。配列比較のために、代表的には、１つの配列は、試験配列が比較される参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを用いるとき、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要であれば、部分配列座標を設定し、そして配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列と比較して試験配列のパーセント配列同一性を計算する。例えば、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）または目視検査（一般に、Ａｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと）によって、比較のための最適な配列のアラインメントを行うことができる。
【０１７１】
パーセント配列同一性の決定に適したアルゴリズムの１つの例は、ベーシックローカルアラインメントサーチツール（ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ）（本明細書中以後、「ＢＬＡＳＴ」）において使用されているアルゴリズムである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１５：３３８９−３４０２（１９９７）を参照のこと。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（本明細書中以後「ＮＣＢＩ」）を介して公的に利用可能である。ＮＣＢＩから利用可能なソフトウェアを用いて配列同一性を決定する際に使用されるデフォルトのパラメータ、例えば、ＢＬＡＳＴＮ（ヌクレオチド配列用）およびＢＬＡＳＴＰ（アミノ酸配列用）は、ＭｃＧｉｎｎｉｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３２：Ｗ２０−Ｗ２５（２００４）に記載されている。
【０１７２】
本発明の１つの実施形態において、本発明のアプタマーは、
【０１７３】
【化４２】
2009521208.tif 000045
のいずれか１つを含むアプタマーがＩＬ−２３に結合する能力と実質的に同じ能力を有する。本発明の別の実施形態において、本発明のアプタマーは、
【０１７４】
【化４３】
2009521208.tif 000046
のいずれか１つを含むアプタマーの構造と実質的に同じ構造およびそのアプタマーがＩＬ−２３に結合する能力と実質的に同じ能力を有する。
【０１７５】
本発明の１つの実施形態において、本発明のアプタマーは、
【０１７６】
【化４４】
2009521208.tif 000047
のいずれか１つを含むアプタマーがＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２に結合する能力と実質的に同じ能力を有する。本発明の別の実施形態において、本発明のアプタマーは、
【０１７７】
【化４５】
2009521208.tif 000048
のいずれか１つを含むアプタマーと実質的に同じ構造およびそのアプタマーがＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２に結合する能力と実質的に同じ能力を有する。
【０１７８】
別の実施形態において、本発明のアプタマーは、薬学的組成物中の活性成分として使用される。別の実施形態において、本発明のアプタマーまたは本発明のアプタマーを含む組成物は、炎症性疾患および自己免疫疾患（多発性硬化症、関節リウマチ、尋常性乾癬、全身性エリテマトーデスおよび過敏性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎が挙げられるがこれらに限定されない）が挙げられるがこれらに限定されない）、Ｉ型糖尿病、結腸癌、肺癌および骨粗鬆症における骨吸収を処置するために使用される。
【０１７９】
いくつかの実施形態において、本発明のアプタマー治療薬は、それらの標的に対する親和性および特異性が高く、たとえアプタマー治療薬が患者または被験体の体内で分解したとしても、天然に存在しないヌクレオチド置換に由来する有害な副作用が低い。いくつかの実施形態において、本発明のアプタマー治療薬を含む治療的組成物は、フッ化ヌクレオチドを含んでいないか、または少量のフッ化ヌクレオチドを含んでいる。
【０１８０】
本発明のアプタマーは、当該分野で公知の任意のオリゴヌクレオチド合成技術を用いて合成され得、その技術としては、固相オリゴヌクレオチド合成技術（例えば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１４：５３９９−５４６７（１９８６）およびＦｒｏｅｈｌｅｒら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２７：５５７５−５５７８（１９８６）を参照のこと）および当該分野で周知の液相法（例えば、トリエステル合成法（例えば、Ｓｏｏｄら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．４：２５５７（１９７７）およびＨｉｒｏｓｅら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．，２８：２４４９（１９７８）を参照のこと））が挙げられる。
【０１８１】
（免疫賦活性モチーフを有するアプタマー）
本発明は、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２に結合し、そしてそれらの生物学的機能を調節するアプタマーを提供する。より詳細には、本発明は、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２のレセプターへのＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２の結合を増大させることによって、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２の生物学的機能を向上するアプタマーを提供する。そのようなアプタマーのアゴニスト作用は、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２に結合し、かつ、免疫賦活性モチーフを含むアプタマーを選別することによってか、または、免疫賦活性配列に結合することが知られている標的に対するアプタマーと組み合わせて、ＩＬ−２３および／もしくはＩＬ−１２に結合するアプタマーで処置することによってさらに増強され得る。
【０１８２】
脊椎動物免疫系による細菌ＤＮＡの認識は、特定の配列コンテクスト（「ＣｐＧモチーフ」）中の非メチル化ＣＧジヌクレオチドの認識に基づくものである。そのようなモチーフを認識する１つのレセプターは、異なる微生物の成分を認識することによって先天的な免疫応答に関与するＴｏｌｌ様レセプターのファミリー（約１０メンバー）のメンバーであるＴｏｌｌ様レセプター９（「ＴＬＲ９」）である。ＴＬＲ９は、配列特異的様式で非メチル化オリゴデオキシヌクレオチド（「ＯＤＮ」）ＣｐＧ配列に結合する。ＣｐＧモチーフを認識することにより、生得的免疫応答および最終的に獲得される免疫応答をもたらす防御機構が引き起こされる。例えば、マウスにおけるＴＬＲ９の活性化は、抗原提示細胞の活性化、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子のアップレギュレーション、ならびに重要な共刺激分子およびサイトカイン（ＩＬ−１２およびＩＬ−２３を含む）の発現を誘導する。直接的と間接的との両方によるこの活性化は、ＴＨ１サイトカインＩＦＮ−ガンマの強いアップレギュレーションをはじめとしたＢ細胞およびＴ細胞の応答を促進する。まとめると、ＣｐＧ配列に対する応答は、感染症に対する保護、ワクチンに対する免疫応答の改善、喘息に対する効果的な応答および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害の改善をもたらす。従って、ＣｐＧ  ＯＤＮは、感染症に対する保護、免疫増強剤または癌治療薬（単剤療法またはｍＡｂもしくは他の治療法との併用）としての機能をもたらし得、また、喘息およびアレルギー性応答を低減し得る。
【０１８３】
１つ以上のＣｐＧまたは他の免疫賦活性配列を含む本発明のアプタマーは、種々のストラテジーによって、例えば本明細書中に記載のＳＥＬＥＸＴＭプロセスを用いて同定され得るか、または作製され得る。組み込まれる免疫賦活性配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ  および／またはＤＮＡ／ＲＮＡの組み合わせであり得る。概して、ストラテジーは、２つの群に分類され得る。群１において、そのストラテジーは、ＣｐＧモチーフまたは他の免疫賦活性配列と標的に対する結合部位との両方を含むアプタマーの同定または作製に関し、ここで、その標的（本明細書中以後「非ＣｐＧ標的」）は、ＣｐＧモチーフまたは他の免疫賦活性配列を認識することが知られている標的以外およびＣｐＧモチーフに結合した際に免疫応答を刺激することが知られている標的以外の標的である。本発明のいくつかの実施形態において、非ＣｐＧ標的は、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２標的である。この群の第１ストラテジーは、抑制された免疫応答が疾患の発症に関わっている場合に、オリゴヌクレオチドプールを用いて特定の非ＣｐＧ標的、好ましくはある標的、例えば、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２に対するアプタマーを得るためにＳＥＬＥＸＴＭを行うこと（ここで、ＣｐＧモチーフは、固定領域または固定領域の一部としてそのプールの各メンバーに組み込まれており、例えば、いくつかの実施形態において、プールメンバーのランダム化領域は、その中に組み込まれたＣｐＧモチーフを有する固定領域を含む）およびＣｐＧモチーフを含むアプタマーを同定することを含む。この群の第２ストラテジーは、抑制された免疫応答が疾患の発症に関わっている場合に、特定の非ＣｐＧ標的、好ましくはある標的、例えば、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２に対するアプタマーを得るためにＳＥＬＥＸＴＭを行うこと、ならびにセレクション後にその５’および／または３’末端にＣｐＧモチーフを付加すること、またはアプタマーのある領域、好ましくは、非必須領域にＣｐＧモチーフが入るように操作することを含む。この群の第３ストラテジーは、抑制された免疫応答が疾患の発症に関わっている場合に、特定の非ＣｐＧ標的、好ましくはある標的、例えば、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２に対するアプタマーを得るためにＳＥＬＥＸＴＭを行うこと（ここで、プールの各メンバーのランダム化領域にＣｐＧモチーフが豊富となるように１つ以上のヌクレオチド添加工程においてプールの合成中の様々なヌクレオチドのモル比を偏らせる）およびＣｐＧモチーフを含むアプタマーを同定することを含む。この群の第４ストラテジーは、抑制された免疫応答が疾患の発症に関わっている場合に、特定の非ＣｐＧ標的、好ましくはある標的、例えば、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２に対するアプタマーを得るためにＳＥＬＥＸＴＭを行うこと、およびＣｐＧモチーフを含むアプタマーを同定することを含む。この群の第５ストラテジーは、抑制された免疫応答が疾患の発症に関わっている場合に、特定の非ＣｐＧ標的、好ましくはある標的、例えば、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２に対するアプタマーを得るためにＳＥＬＥＸＴＭを行うこと、および結合した際に免疫応答を刺激するが、ＣｐＧモチーフを含ま���いアプタマーを同定することを含む。
【０１８４】
群２において、そのストラテジーは、ＣｐＧモチーフおよび／またはＣｐＧモチーフに対するレセプター（例えば、ＴＬＲ９または他のｔｏｌｌ様レセプター）によって結合しており、そして結合した際に免疫応答を刺激する他の配列を含むアプタマーを同定することまたは作製することに関する。この群の第１ストラテジーは、ＣｐＧモチーフまたは他の免疫賦活性配列に結合し、そして結合した際に免疫応答を刺激することが知られている標的に対するアプタマーを得るためにオリゴヌクレオチドプールを用いてＳＥＬＥＸＴＭを行うこと（ここで、ＣｐＧモチーフは、固定領域または固定領域の一部としてプールの各メンバーに組み込まれており、例えば、いくつかの実施形態において、プールメンバーのランダム化領域は、そこに組み込まれたＣｐＧモチーフを有する固定領域を含む）およびＣｐＧモチーフを含むアプタマーを同定することを含む。この群の第２ストラテジーは、ＣｐＧモチーフまたは他の免疫賦活性配列に結合し、そして結合した際に免疫応答を刺激することが知られている標的に対するアプタマーを得るためにＳＥＬＥＸＴＭを行うこと、および次いでＣｐＧモチーフを５’および／もしくは３’末端に付加すること、またはＣｐＧモチーフがアプタマーの一領域、好ましくは非必須領域に入るように操作することを含む。この群の第３ストラテジーは、ＣｐＧモチーフまたは他の免疫賦活性配列に結合し、そして結合した際に免疫応答を刺激することが知られている標的に対するアプタマーを得るためにＳＥＬＥＸＴＭを行うこと（ここで、プールの各メンバーのランダム化領域にＣｐＧモチーフが豊富となるように１つ以上のヌクレオチド添加工程においてプールの合成中の様々なヌクレオチドのモル比を偏らせる）およびＣｐＧモチーフを含むアプタマーを同定することを含む。この群の第４ストラテジーは、ＣｐＧモチーフまたは他の免疫賦活性配列に結合し、そして結合した際に免疫応答を刺激することが知られている標的に対するアプタマーを得るためにＳＥＬＥＸＴＭを行うことおよびＣｐＧモチーフを含むアプタマーを同定することを含む。この群の第５ストラテジーは、ＣｐＧモチーフまたは他の免疫賦活性配列に結合することが知られている標的に対するアプタマーを得るためにＳＥＬＥＸＴＭを行うことおよび結合した際に免疫応答を刺激するが、ＣｐＧモチーフを含まないアプタマーを同定することを含む。
【０１８５】
種々の異なるクラスのＣｐＧモチーフが同定されており、その各々は、事象の異なるカスケードにおける認識、サイトカインおよび他の分子の放出ならびにある特定の細胞タイプの活性化をもたらす。例えば、ＣｐＧ  Ｍｏｔｉｆｓ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｅｆｆｅｃｔｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２，２０：７０９−７６０（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。さらなる免疫賦活性モチーフは、以下の米国特許：米国特許第６，２０７，６４６号；米国特許第６，２３９，１１６号；米国特許第６，４２９，１９９号；米国特許第６，２１４，８０６号；米国特許第６，６５３，２９２号；米国特許第６，４２６，４３４号；米国特許第６，５１４，９４８号および米国特許第６，４９８，１４８号に開示されており、これらの各々は、本明細書中で参考として援用される。これらのＣｐＧまたは他の免疫賦活性モチーフのいずれかが、アプタマーに組み込まれ得る。アプタマーの選択は、処置される疾患または障害に依存する。好ましい免疫賦活性モチーフは、以下のとおりであり（左から右に５’から３’を示す）、ここで、「ｒ」は、プリンを示し、「ｙ」は、ピリミジンを示し、そして「Ｘ」は、任意のヌクレオチドを示す：
【０１８６】
【化４６】
2009521208.tif 000049
（ここで、Ｘ１はＧまたはＡであり、Ｘ２はＣではなく、Ｙ１は、Ｇではなく、そしてＹ２は好ましくはＴである）。
【０１８７】
ＣｐＧモチーフに結合し、そして結合した際に免疫応答を刺激することが知られている標的以外の特定の標的（「非ＣｐＧ標的」）に結合するアプタマーにＣｐＧモチーフが組み込まれている場合に、ＣｐＧは、好ましくはアプタマーの非必須領域に位置する。アプタマーの非必須領域は、部位特異的突然変異誘発、欠失解析および／または置換解析によって同定され得る。しかしながら、アプタマーが非ＣｐＧ標的に結合する能力を有意に干渉しない任意の位置が、使用することができる。ＣｐＧモチーフは、アプタマー配列に取り囲まれることに加えて、５’および３’末端のいずれかまたはその両方に付加され得るか、または他の方法でアプタマーに結合され得る。アプタマーが非ＣｐＧ標的に結合する能力が著しく干渉されない限り、いかなる結合の位置または手段を使用してもよい。
【０１８８】
本明細書中で使用されるとき、「免疫応答の刺激」とは、（１）特定の応答の誘発（例えば、Ｔｈ１応答の誘発）もしくはある特定分子の生成の誘発、あるいは（２）特定の応答の阻害もしくは抑制（例えば、Ｔｈ２応答の阻害または抑制）または特定分子の阻害もしくは抑制のいずれかを意味し得る。
【０１８９】
（薬学的組成物）
本発明はまた、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２に結合するアプタマー分子を含む薬学的組成物を含む。いくつかの実施形態において、その組成物は、内服に適しており、また、本発明の薬理学的に活性な有効量の化合物を単独または１つ以上の薬学的に許容可能なキャリアと組み合わせて含む。その化合物は、毒性がある場合であっても、その毒性は非常に低いという点で特に有用である。
【０１９０】
本発明の組成物は、病状（例えば、疾患または障害）を処置または予防するためか、または患者におけるそのような疾患または障害の症状を改善するために使用することができる。例えば、本発明の組成物は、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２サイトカインに関連する病状（炎症性および自己免疫に関連する疾患、Ｉ型糖尿病、骨粗鬆症における骨吸収および癌を含む）を処置または予防するために使用することができる。
【０１９１】
本発明の組成物は、本発明のアプタマーが特異的に結合する標的に関連する疾患もしくは障害またはその標的由来の疾患もしくは障害に罹患しているか、または罹患しやすくなっている被験体に投与するために有用である。本発明の組成物は、ある病状を有する患者または被験体を処置するための方法において使用することができる。その方法は、アプタマーまたは上記病状に関連するＩＬ−２３および／もしくはＩＬ−１２に結合するアプタマーを含む組成物を患者または被験体に投与する工程を含み、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２へのアプタマーの結合により、その標的の生物学的機能が変化し、それによってその病状が処置される。
【０１９２】
ある病状を有する患者または被験体、すなわち、本発明の方法によって処置される患者または被験体は、脊椎動物、より具体的には哺乳動物、またはより具体的にはヒトであり得る。
【０１９３】
実際には、アプタマーまたはその薬学的に許容可能な塩は、その所望の生物学的活性を発揮する（例えば、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２がそのレセプターに結合するのを阻害する）のに十分な量で投与される。
【０１９４】
本発明の１つの局面は、炎症性疾患および自己免疫疾患、癌ならびに他の関連障害に対する他の処置と組み合わせた本発明のアプタマー組成物を含む。本発明のアプタマー組成物は、例えば、２つ以上のアプタマーを含み得る。いくつかの実施例において、１つ以上の本発明の化合物を含む本発明のアプタマー組成物は、別の有用な組成物（例えば、抗炎症剤、免疫抑制剤、抗ウイルス剤など）と組み合わせて投与される。さらに、本発明の化合物は、上記のような細胞傷害性薬剤、細胞分裂抑制剤または化学療法剤（例えば、アルキル化剤、抗代謝産物、有糸分裂阻害剤または細胞傷害性抗生物質）と組み合わせて投与され得る。一般に、そのような組み合わせで使用するための公知の治療薬の現在利用可能な剤形が適当である。
【０１９５】
「併用療法」（または「同時療法」）は、本発明のアプタマー組成物、および特定の処置レジメンの一部としてこれらの治療薬の相互作用から有益な効果を提供するように意図された少なくとも第２の薬剤の投与を含む。この併用の有益な効果としては、治療薬の併用によってもたらされる薬物動態学的または薬力学的な相互作用が挙げられるがこれらに限定されない。併用療法におけるこれらの治療薬の投与は、代表的には、規定された時間（通常、選択される併用療法に依存して、分、時間、日または週）に亘って行われる。
【０１９６】
「併用療法」は、本発明の併用療法において偶発的かつ任意にもたらされる別個の単剤療法レジメンの一部としてこれらの治療薬の２つ以上の投与を包含すると意図され得るが、通常は、意図されない。「併用療法」は、連続した様式（すなわち、各治療薬は異なる時点で投与される）でこれらの治療薬を投与すること、ならびに実質的に同時の様式でこれらの治療薬または治療薬の少なくとも２つを投与することを包含すると意図される。実質的に同時の投与は、例えば、固定された比の各治療薬を有する単一のカプセルまたは治療薬の各々について単一のカプセルの複数を被験体に投与することによって達成され得る。
【０１９７】
各治療薬の連続した投与または実質的に同時の投与は、任意の適切な経路によって実施され得、その経路としては、局所的経路、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路および粘膜組織を介した直接的な吸収が挙げられるがこれらに限定されない。治療薬は、同じ経路または異なる経路によって投与することができる。例えば、選択された組み合わせの第１の治療薬が、注射によって投与され得るのに対し、その組み合わせにおける他方の治療薬は、局所的に投与され得る。
【０１９８】
あるいは、例えば、すべての治療薬が、局所的に投与され得るか、またはすべての治療薬が、注射によって投与され得る。治療薬が投与される順序は、他に述べられない限り、厳密には重要ではない。「併用療法」はまた、他の生物学的に活性な成分とさらに組み合わせて上記のように治療薬を投与することを包含し得る。併用療法が非薬物処置をさらに含む場合、治療薬と非薬物処置との組み合わせの相互作用から有益な効果が達成される限り、非薬物処置は、適当などの時点でも行ってよい。例えば、適切な場合において、その有益な効果は、非薬物処置が、治療薬の投与から時間的に離れている場合でさえ（おそらく数日または数週間でさえ）も達成される。
【０１９９】
本発明の治療的組成物または薬理学的組成物は、一般に、薬学的に許容可能な媒質に溶解または分散されるとき、その治療薬の有効量の活性成分を含む。薬学的に許容可能な媒質またはキャリアとしては、任意およびすべての溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。薬学的に活性な物質に対してそのような媒質および薬剤を使用することは、当該分野で周知である。補充性活性成分もまた、本発明の治療的組成物に組み込まれ得る。
【０２００】
薬学的組成物または薬理学的組成物の調製は、本開示に鑑みて当業者に公知である。代表的には、そのような組成物は、注射可能な液体溶液または懸濁液；注射の前の液体中の溶液または懸濁液に適した固体の形態；経口投与用の錠剤または他の固体；徐放性カプセル；または現在使用されている他の任意の形態（点眼剤、クリーム剤、ローション剤、軟膏剤、吸入剤などを含む）として調製され得る。外科医、医師または手術現場において特定の領域の処置を行う医療従事者によって滅菌された処方物（例えば、食塩水ベースの洗浄液）が使用されることもまた、特に有用であり得る。組成物はまた、マイクロデバイス、微小粒子またはスポンジを介しても送達され得る。
【０２０１】
処方物において、治療薬は、投薬処方物に適合した様式および薬理学的に有効である量で投与される。処方物は、種々の剤形（例えば、上記の注射可能な溶液のタイプ）で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなどもまた使用することができる。
【０２０２】
この文脈において、投与される活性成分の量および組成物の容積は、処置される宿主動物に依存する。投与に必要な活性化合物の正確な量は、主治医の判断に依存し、各個体に特有のものである。
【０２０３】
活性化合物を分散するのに必要な組成物の最小量が、代表的には使用される。投与に適したレジメンもまた可変的であるが、まず化合物を投与し、そしてその結果をモニターすることによって類型化し、次いで、さらなる間隔でさらに制御された用量を与えてもよい。
【０２０４】
例えば、錠剤またはカプセル（例えば、ゼラチンカプセル）の形態での経口投与に対して、活性な薬物成分は、経口的で、無毒性で、薬学的に許容可能な不活性なキャリア（例えば、エタノール、グリセロール、水など）と組み合わせることができる。さらに、所望されるか、または必要とされるとき、適当な結合剤、潤滑剤、崩壊剤および着色剤もまた、混合物に組み込むことができる。適当な結合剤としては、デンプン、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、デンプンペースト、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシルメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドン、天然の糖（例えば、グルコースまたはβ−ラクトース、トウモロコシ甘味料）、天然ゴムおよび合成ゴム（例えば、アラビアゴム、トラガカントゴム）またはアルギン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、ろうなどが挙げられる。これらの剤形において使用される潤滑剤としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、シリカ、タルク、ステアリン酸、そのマグネシウム塩もしくはカルシウム塩および／またはポリエチレングリコールなどが挙げられる。崩壊剤としては、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガム、デンプン、寒天、アルギン酸もしくはそのナトリウム塩または発泡性混合物などが挙げられるがこれらに限定されない。希釈剤としては、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロースおよび／またはグリシンが挙げられる。
【０２０５】
本発明の化合物はまた、経口剤形（例えば、徐放性および持続性の錠剤またはカプセル、丸剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、懸濁液、シロップ剤およびエマルジョン）で投与され得る。坐剤は、脂肪性のエマルジョンまたは懸濁液から有利に調製される。
【０２０６】
薬学的組成物は、滅菌され得、そして／または補助剤（例えば、保存剤、安定化剤、湿潤剤または乳化剤、溶解促進剤、浸透圧を制御するための塩および／または緩衝液）を含み得る。さらに、薬学的組成物はまた、他の治療的に価値のある物質も含み得る。この組成物は、従来の混合、顆粒化またはコーティングの方法に従って調製され、そして代表的には活性成分の約０．１％〜７５％、好ましくは約１％〜５０％を含む。
【０２０７】
液体、特に注射可能な組成物は、例えば、溶解、分散などによって調製され得る。活性化合物は、薬学的に純粋な溶媒（例えば、水、食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなど）に溶解されるか、またはそれらと混合され、それによって、注射可能な溶液または懸濁液を形成する。さらに、注射の前に液体に溶解されるのに適した固体の形態が、処方され得る。
【０２０８】
本発明の化合物は、静脈内（ボーラスと点滴の両方）、腹腔内、皮下または筋肉内の形態で投与され得、すべての使用形態が薬学分野の当業者に周知である。注射可能物は、液体溶液または懸濁液のいずれかの従来の形態で調製され得る。
【０２０９】
非経口で注射可能な投与は、一般に、皮下、筋肉内または静脈内の注射および点滴で使用される。さらに、非経口投与のための１つのアプローチは、米国特許第３，７１０，７９５号（本明細書中に参考として援用される）に従って一定レベルの用量が維持されることが保証されている持続放出系または徐放系の埋め込みを用いる。
【０２１０】
さらに、本発明のための好ましい化合物は、適当な鼻腔内ビヒクル、吸入剤の局所的使用を介してか、またはこの分野の当業者に周知の経皮的皮膚パッチを用いた経皮的経路を介して鼻腔内形態で投与され得る。経皮的送達系の形態で投与するために、当然のことながら、用量投与は、全投与レジメンに亘って断続的ではなく連続的である。他の好ましい局所的調製物としては、クリーム剤、軟膏、ローション剤、エアロゾルスプレーおよびゲルが挙げられ、ここで、活性成分の濃度は、代表的には、０．０１％〜１５％、ｗ／ｗまたはｗ／ｖの範囲であり得る。
【０２１１】
固体組成物のための賦形剤としては、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。上で定義した活性化合物はまた、例えば、キャリアとしてポリアルキレングリコール、例えば、プロピレングリコールを用いて坐剤として処方され得る。いくつかの実施形態において、坐剤は、脂肪性のエマルジョンまたは懸濁液から有利に調製される。
【０２１２】
本発明の化合物はまた、リポソーム送達系（例えば、小型単層ベシクル、大型単層ベシクルおよび多重膜ベシクル）の形態で投与され得る。リポソームは、種々のリン脂質（コレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンを含む）から形成され得る。いくつかの実施形態において、薄膜の脂質成分は、米国特許第５，２６２，５６４号に記載されているように、薬物の水溶液で水和され、薬物を封入する脂質層を形成する。例えば、本明細書中に記載のアプタマー分子は、当該分野で公知の方法を用いて構築された親油性化合物または非免疫原性で高分子量の化合物との複合体として提供され得る。核酸会合複合体の例は、米国特許第６，０１１，０２０号に提供されている。
【０２１３】
本発明の化合物はまた、標的化可能薬物キャリアとして可溶性ポリマーと結合され得る。そのようなポリマーとしては、ポリビニルピロリドン、ピラン共重合体、ポリヒドロキシプロピル−メタクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシエチルアスパンアミドフェノールまたはパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリシンが挙げられ得る。さらに、本発明の化合物は、薬物の放出制御を達成する際に有用なクラスの生分解性ポリマー（例えば、ポリ乳酸、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレートおよびヒドロゲルの架橋ブロック共重合体または両親媒性ブロック共重合体）に結合され得る。
【０２１４】
所望であれば、投与される薬学的組成物はまた、少量の無毒性補助剤物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤および他の物質（例えば、酢酸ナトリウムおよびオレイン酸トリエタノールアミン））を含み得る。
【０２１５】
アプタマーを利用する投与レジメンは、種々の因子（患者のタイプ、人種、年齢、体重、性別および病状；処置される状態の重症度；投与経路；患者の腎臓および肝臓の機能；ならびに使用する特定のアプタマーまたはその塩）に従って選択される。通常の熟練した医師または獣医師は、その状態の進行を予防、阻止または停止するのに必要な薬物の有効量を容易に決定および処方することができる。
【０２１６】
示された効果のために使用されるときの本発明の経口用量は、経口的に約０．０５〜７５００ｍｇ／日の範囲である。本発明の組成物は、好ましくは、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００．０、２５０．０、５００．０および１０００．０ｍｇの活性成分を含む、溝がつけられた錠剤の形態で提供される。注入用量、鼻腔内用量および経皮的用量は、０．０５〜７５００ｍｇ／日の範囲である。皮下、静脈内および腹腔内の用量は、０．０５〜３８００ｍｇ／日の範囲である。
【０２１７】
本発明の化合物の有効な血漿レベルは、０．００２ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬの範囲である。
【０２１８】
本発明の化合物を１日あたり１回の用量で投与してもよいし、１日あたりの総用量を１日あたり２回、３回または４回の分割量で投与してもよい。
【０２１９】
（アプタマー治療薬の薬物動態および体内分布の調節）
アプタマーを含むすべてのオリゴヌクレオチドベース治療薬についての薬物動態学的な目的を、所望の薬学的用途と一致するように調整することが重要である。細胞外の標的に特異的なアプタマーは、細胞内送達に関連する問題に悩まされないが（アンチセンスおよびＲＮＡｉベースの治療薬と同様に）、そのようなアプタマーはさらに、標的器官および組織に分布することができなければならず、また、所望の投薬レジメンに一致した時間に亘って体内に（改変されずに）残存しなければならない。
【０２２０】
従って、本発明は、アプタマー組成物の薬物動態および特にアプタマー薬物動態を調整する能力に影響を及ぼす材料および方法を提供する。アプタマー薬物動態の調整能力（すなわち、調節する能力）は、アプタマーへの改変部分（例えば、ＰＥＧポリマー）の結合体化および／または核酸の化学組成を変化させる改変ヌクレオチド（例えば、２’−フルオロまたは２’−Ｏ−メチル）の組み込みを介して達成される。アプタマー薬物動態を調整する能力は、既存の治療用途の改善、あるいは新規の治療用途の開発に使用される。例えば、いくつかの治療用途において、例えば、抗新生物薬または急速な薬物クリアランスまたは機能停止が所望され得る急性病治療設定において、血液循環中のアプタマーの滞留時間を短縮することが望ましい。あるいは、他の治療用途において、例えば、治療薬の体循環が所望される維持療法において、血液循環中のアプタマーの滞留時間の延長が望ましいことがある。
【０２２１】
さらに、アプタマー薬物動態の調整能力は、被験体におけるアプタマー治療薬の体内分布を改変するために用いられる。例えば、いくつかの治療用途では、特定タイプの組織または特定器官（または一連の器官）を標的にする目的でアプタマー治療薬の体内分布を変更することが望ましいことがある。これらの用途において、アプタマー治療薬は、特定の組織または器官に優先的に蓄積する。他の治療用途においては、アプタマー治療薬が優先的に罹患組織に蓄積するように、所与の疾患、細胞損傷または他の異常な病状に関連する細胞マーカーまたは症状を示す組織を標的にすることが望ましいことがある。例えば、「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｐｔａｍｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」と題され、２００４年３月５日に出願された同時係属中の米国仮特許出願番号６０／５５０７９０および「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｐｔａｍｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」と題された、２００５年３月７日に出願された仮出願でない米国特許出願番号１０／−−−，−−−に記載されているように、アプタマー治療薬のＰＥＧ化（例えば、２０ｋＤａのＰＥＧポリマーによるＰＥＧ化）を用いて炎症組織を標的にすることにより、ＰＥＧ化アプタマー治療薬が優先的に炎症組織に蓄積する。
【０２２２】
アプタマー治療薬（例えば、アプタマー結合体または改変ヌクレオチドなどの変更性化学を有するアプタマー）の薬物動態学的プロファイルおよび体内分布プロファイルを測定するために、種々のパラメータがモニターされる。そのようなパラメータとしては、例えば、半減期（ｔ１／２）、血漿クリアランス（Ｃｌ）、分布容積（Ｖｓｓ）、濃度時間曲線下面積（ＡＵＣ）、観察された最大血清濃度または最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）およびアプタマー組成物の平均滞留時間（ＭＲＴ）が挙げられる。本明細書中で使用されるとき、用語「ＡＵＣ」とは、アプタマー投与後の時間に対するアプタマー治療薬の血漿濃度のプロット下の面積のことをいう。ＡＵＣ値は、所与のアプタマー治療薬のバイオアベイラビリティ（すなわち、アプタマー投与後の投与されたアプタマー治療薬の血液循環中のパーセンテージ）および／または総クリアランス（Ｃｌ）（すなわち、アプタマー治療薬が血液循環から除去される速度）を推定するために使用される。分布容積は、アプタマー治療薬の血漿濃度を体内のアプタマーの量に関連付けるものである。Ｖｓｓが大きいほど、血漿外に認められるアプタマーが多い（すなわち、血管外遊出が多い）。
【０２２３】
本発明は、調節部分（例えば、小分子、ペプチドまたはポリマー末端基）にアプタマーを結合体化することによってか、または改変ヌクレオチドをアプタマーに組み込むことによって、インビボ安定化アプタマー組成物の薬物動態および体内分布を制御された様式において調節する材料および方法を提供する。本明細書中に記載されるように、改変部分および／または変更ヌクレオチドの化学組成物の結合体化によって、血液循環中のアプタマー滞留時間および組織への分布の基本的局面が変化する。
【０２２４】
オリゴヌクレオチド治療薬は、ヌクレアーゼによるクリアランスに加えて、腎臓濾過を介した排出に供される。同様に、静脈内に投与されたヌクレアーゼ抵抗性オリゴヌクレオチドは、濾過が阻止され得ない限り、代表的には１０分未満のインビボ半減期を示す。これは、血流外から組織への急速な分布を促進することによってか、またはオリゴヌクレオチドの見かけの分子量を糸球体に対する有効なサイズカットオフ値を超えて増加させることによって達成され得る。以下に記載するＰＥＧポリマーへの小型の治療薬の結合体化（ＰＥＧ化）によって、アプタマーの血液循環中の滞留時間を劇的に延長することができ、それによって投薬頻度を低下し、そして血管標的に対する有効性が増大する。
【０２２５】
アプタマーは、種々の改変部分（例えば、高分子量ポリマー、例えば、ＰＥＧ；ペプチド、例えば、Ｔａｔ（ＨＩＶ  Ｔａｔ  タンパク質の１３アミノ酸フラグメント（Ｖｉｖｅｓら（１９９７），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（２５）：１６０１０−７））、Ａｎｔ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオティックタンパク質の第３へリックス由来の１６アミノ酸配列（Ｐｉｅｔｅｒｓｚら（２００１），Ｖａｃｃｉｎｅ  １９（１１−１２）：１３９７−４０５））およびＡｒｇ７（ポリアルギニンから構成される、正に帯電した短い細胞透過性ペプチド（Ａｒｇ７）（Ｒｏｔｈｂａｒｄら（２０００），Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６（１１）：１２５３−７；Ｒｏｔｈｂａｒｄ，Ｊ．ら（２００２），Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５（１７）：３６１２−８））；および小分子、例えば、コレステロールなどの親油性化合物に結合体化され得る。本明細書中に記載の様々な結合体のうち、アプタマーのインビボ特性は、ＰＥＧ基との複合体形成によって最も大きく変更される。例えば、２’Ｆと２’−ＯＭｅとが混合された改変アプタマー治療薬と２０ｋＤａのＰＥＧポリマーとの複合体形成により、腎臓濾過が妨げられ、健常組織と炎症組織の両方へのアプタマー分布が促進する。さらに、２０ｋＤａのＰＥＧポリマー−アプタマー結合体は、アプタマーの腎臓濾過を妨げる際に、４０ｋＤａのＰＥＧポリマーと同程度の有効性をもたらすことが判明している。ＰＥＧ化の１つの効果は、アプタマークリアランスに対するものであり、２０ｋＤａ部分の存在によってもたらされる全身曝露の延長によって、組織、特に高度に灌流される器官の組織および炎症部位の組織へのアプタマーの分布が促進される。アプタマー−２０ｋＤａ  ＰＥＧポリマー結合体は、ＰＥＧ化アプタマーが優先的に炎症組織に蓄積するようにアプタマー分布を炎症部位に向かわせる。いくつかの場合において、２０ｋＤａ  ＰＥＧ化アプタマー結合体は、細胞（例えば、腎臓細胞）の内部に到達することができる。
【０２２６】
改変ヌクレオチドは、アプタマーの血漿クリアランスを調節するためにも使用することができる。例えば、インビトロおよびインビボにおいて高度のヌクレアーゼ安定性を示すことから現在のアプタマー作製の代表である、２’−Ｆと２’−ＯＭｅの両方の安定化化学を組み込まれた非結合体化アプタマーは、非改変アプタマーと比較するとき、血漿からの急速な喪失（すなわち、急速な血漿クリアランス）および組織（主に腎臓）への急速な分布を示す。
【０２２７】
（ＰＥＧ誘導体化核酸）
上に記載したように、高分子量で非免疫原性のポリマーによる核酸の誘導体化は、核酸の薬物動態学的特性および薬力学的特性を変更する能力を有し、その核酸をより有効な治療薬にする。活性の好ましい変更は、ヌクレアーゼによる分解に対する抵抗性の増大、腎臓を通過する濾過の減少、免疫系への曝露の減少および体内を通過する治療薬の分布の変更が挙げられ得る。
【０２２８】
本発明のアプタマー組成物は、ポリアルキレングリコール（「ＰＡＧ」）部分で誘導体化され得る。ＰＡＧ誘導体化核酸の例は、２００３年１１月２１日出願の米国特許出願番号１０／７１８，８３３（この全体が本明細書中で参考として援用される）に見出される。本発明において使用される代表的なポリマーとしては、ポリエチレンオキシド（「ＰＥＯ」）としても知られるポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）およびポリプロピレングリコール（ポリイソプロピレングリコールを含む）が挙げられる。さらに、様々なアルキレンオキシド（例えば、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシド）のランダム共重合体またはブロック共重合体が、多くの用途において使用することができる。その最も一般的な形態において、ＰＥＧなどのポリアルキレングリコールは、各末端がヒドロキシル基で終結している線状ポリマー：ＨＯ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨである。このポリマー、すなわち、アルファ−、オメガ−ジヒドロキシルポリエチレングリコールは、ＰＥＧ−という記号が、以下の構造単位：−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−（ここで、ｎは、代表的には約４〜約１０，０００の範囲である）を示すと理解されている場合に、ＨＯ−ＰＥＧ−ＯＨとしても示され得る。
【０２２９】
示されるように、ＰＥＧ分子は、二官能性であり、時折、「ＰＥＧジオール」と呼ばれる。ＰＥＧ分子の末端部分は、化合物上の反応部位で他の化合物にＰＥＧが結合するために活性化され得るかまたは機能性部分に変換され得る、比較的反応性でないヒドロキシル部分、すなわちＯＨ基である。そのような活性化されたＰＥＧジオールは、本明細書中で二活性化ＰＥＧと呼ばれる。例えば、ＰＥＧジオールの末端部分は、比較的活性でないヒドロキシル部分である−ＯＨを、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド由来のスクシンイミジル活性エステル部分で置換することによって、アミノ部分との選択的反応のための活性な炭酸エステルとして官能性付与されている。
【０２３０】
多くの用途において、ＰＥＧ分子が一官能性（または一活性化）となるように、一方の末端におけるＰＥＧ分子を本質的に非活性な部分でキャップすることが望ましい。活性化ＰＥＧ用の複数の反応部位を一般に示すタンパク質治療薬の場合において、二官能性活性化ＰＥＧは、大規模な架橋をもたらし、それにより、機能的な凝集が低下する。一活性化ＰＥＧを作製するために、代表的には、ＰＥＧジオール分子の末端上の１つのヒドロキシル部分を、非反応性メトキシ末端部分である−ＯＣＨ３で置換する。他方、ＰＥＧ分子の非キャップ末端は、代表的には、表面上またはタンパク質などの分子上の反応部位での結合のために活性化され得る反応性末端部分に変換される。
【０２３１】
ＰＡＧは、代表的には、水および多くの有機溶媒に対する可溶性、無毒性ならびに非免疫原性という特性を有するポリマーである。ＰＡＧの１つの用途は、そのポリマーを不溶性分子に共有結合して、得られるＰＡＧ−分子「結合体」を可溶性にすることである。例えば、水不溶性薬物であるパクリタキセルは、ＰＥＧに結合されると水溶性になることが示されている。Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６０：３３１−３３６（１９９５）。ＰＡＧ結合体は、溶解性および安定性を向上するためだけでなく、分子の血液循環半減期を延長させるためにも使用されることが多い。
【０２３２】
本発明のポリアルキル化化合物は、代表的には５〜８０ｋＤａのサイズであるが、しかしながら、任意のサイズを使用することができ、その選択は、アプタマーおよび用途に依存する。本発明の他のＰＡＧ化合物は、１０〜８０ｋＤａのサイズである。本発明のさらに他のＰＡＧ化合物は、１０〜６０ｋＤａのサイズである。例えば、ＰＡＧポリマーは、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０または８０ｋＤａのサイズであり得る。そのようなポリマーは、線状であっても、分枝状であってもよい。いくつかの実施形態において、そのポリマーは、ＰＥＧである。いくつかの実施形態において、そのポリマーは、分枝状のＰＥＧである。さらに他の実施形態において、そのポリマーは、図４に示されるような４０ｋＤａの分枝状のＰＥＧである。いくつかの実施形態において、その４０ｋＤａの分枝状のＰＥＧは、図５に示されるようにアプタマーの５’末端に結合している。
【０２３３】
生物学的に発現されたタンパク質治療薬とは対照的に、核酸治療薬は、代表的には、活性化モノマーヌクレオチドから化学合成される。ＰＥＧ−核酸結合体は、同じモノマー合成を繰り返してＰＥＧを組み込むことによって調製され得る。例えば、ホスホルアミダイト型への変換によって活性化されるＰＥＧは、固相オリゴヌクレオチド合成に組み込まれ得る。あるいは、オリゴヌクレオチド合成は、反応性ＰＥＧの結合部位の部位特異的な組み込みで終結され得る。これは、最も一般には、５’末端に遊離第１級アミンを付加する（固相合成の最後のカップリング工程において改変物質であるホスホルアミダイトを用いて組み込む）ことによって達成された。このアプローチを用いて、反応性ＰＥＧ（例えば、活性化されて、アミンと反応してアミンとの結合を形成するもの）を、精製オリゴヌクレオチドと混合し、カップリング反応を溶液中で起こす。
【０２３４】
ＰＥＧ結合体化が治療薬の体内分布を変化させる能力は、多くの因子（結合体の見かけのサイズ（例えば、流体力学的半径に関して測定されるとき）を含む）に関連する。大きい結合体（１０ｋＤａ超）は、腎臓による濾過をより効果的に阻止し、その結果として、小型の高分子（例えば、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド）の血清半減期を増大させることが知られている。ＰＥＧ結合体が濾過を阻止する能力は、最大約５０ｋＤａのＰＥＧのサイズに伴って増大することが示されている（その能力のさらなる増大は、半減期が腎臓による排出ではなくマクロファージ媒介性代謝によって定義されるようになるとき、有益な効果が最小となる）。
【０２３５】
高分子量ＰＥＧ（１０ｋＤａ超）の作製は、困難、非効率的、かつ高価であり得る。以前の研究では、高分子量ＰＥＧ−核酸結合体の合成経路として、より高分子量の活性化ＰＥＧの作製に焦点が当てられていた。そのような分子を作製するための１つの方法は、２つ以上のＰＥＧが活性化基を有する中心コアに結合している分枝状の活性化ＰＥＧの形成を含む。これらのより高分子量のＰＥＧ分子の末端部分、すなわち、比較的非反応性のヒドロキシル（−ＯＨ）部分は、活性化され得るか、または化合物上の反応部位において他の化合物にＰＥＧの１つ以上を結合するための官能性部分に変換され得る。分枝状の活性化ＰＥＧは、３つ以上の末端を有し、２つ以上の末端が活性化されている場合は、そのような活性化されたより高分子量のＰＥＧ分子は、本明細書中で多活性化ＰＥＧと呼ばれる。いくつかの場合において、分枝状ＰＥＧ分子中のすべての末端が活性化されているわけではない。分枝状ＰＥＧ分子の任意の２末端が活性化されている場合において、そのようなＰＥＧ分子は、二活性化ＰＥＧと呼ばれる。分枝状ＰＥＧ分子中のただ１つの末端だけが活性化されているいくつかの場合において、そのようなＰＥＧ分子は、一活性化と呼ばれる。このアプローチの例として、後に反応用に活性化されるリシンコアへの２つのモノメトキシＰＥＧの結合によって調製される活性化ＰＥＧが報告されている（Ｈａｒｒｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．２：２１４−２２１，２００３）。
【０２３６】
本発明は、高分子量ＰＥＧ−核酸（好ましくは、アプタマー）結合体（多様にＰＥＧ化された核酸を含む）を合成するための別の対費用効果の高い経路を提供する。本発明はまた、ＰＥＧ結合型多量体オリゴヌクレオチド、例えば、ダイマー化アプタマーも包含する。本発明はまた、ＰＥＧ安定化部分が、アプタマーの様々な部分を分離するリンカーである、例えば、ＰＥＧが、単一のアプタマー配列内で結合体化されて、高分子量アプタマー組成物の線状の配置が、例えば、核酸−ＰＥＧ−核酸（−ＰＥＧ−核酸）ｎ（ここで、ｎは１以上である）となる高分子量組成物にも関する。
【０２３７】
本発明の高分子量組成物は、少なくとも１０ｋＤａの分子量を有するものを含む。組成物は、代表的には１０〜８０ｋＤａのサイズの分子量を有する。本発明の高分子量組成物は、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０または８０ｋＤａのサイズである。
【０２３８】
安定化部分は、本発明の高分子量アプタマー組成物の薬物動態学的特性および薬力学的特性を改善する分子または分子の部分である。いくつかの場合において、安定化部分は、２つ以上のアプタマーまたはアプタマードメインを近接して配置するか、または本発明の高分子量アプタマー組成物の回転性自由全体を低下させる分子またはその分子の部分である。安定化部分は、線状または分枝状の、ホモポリマーまたはヘテロポリマーであり得る、ポリエチレングリコールのようなポリアルキレングリコールであり得る。他の安定化部分は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などのポリマーを含む。オリゴヌクレオチドもまた、安定化部分であり得る；そのようなオリゴヌクレオチドは、改変ヌクレオチドおよび／またはホスホロチオエートなどの改変結合を含み得る。安定化部分は、アプタマー組成物の不可欠な部分であり得、すなわち、安定化部分は、アプタマーに共通結合している。
【０２３９】
本発明の組成物は、２つ以上の核酸部分が、少なくとも１つのポリアルキレングリコール部分に共有結合的に結合体化している高分子量アプタマー組成物を含む。そのポリアルキレングリコール部分は、安定化部分として働く。ポリアルキレングリコール部分がアプタマーのいずれかの末端に共有結合し、ポリアルキレングリコールが、１つの分子中の核酸部分と結合している組成物において、そのポリアルキレングリコールは、結合部分といわれる。そのような組成物において、共有結合性分子の１次構造は、核酸−ＰＡＧ−核酸という線状配置を含む。１つの例は、核酸−ＰＥＧ−核酸という１次構造を有する組成物である。別の例は、核酸−ＰＥＧ−核酸−ＰＥＧ−核酸という線状配置である。
【０２４０】
核酸−ＰＥＧ−核酸結合体を作製するために、最初に、単一の反応性部位を有するように核酸を合成する（例えば、それは一活性化である）。好ましい実施形態において、この反応性部位は、オリゴヌクレオチドの固相合成法における最後の工程として改変物質ホスホルアミダイトを付加することによって５’末端に導入されたアミノ基である。改変オリゴヌクレオチドの脱保護および精製の後、活性化ＰＥＧの自発的な加水分解を最小限にする溶液中で高濃度に再構成される。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドの濃度は、１ｍＭであり、再構成された溶液は、２００ｍＭのＮａＨＣＯ３緩衝液，ｐＨ８．３を含む。結合体の合成は、高度に精製された二官能性ＰＥＧをゆっくりと段階的に加えることによって開始される。好ましい実施形態において、ＰＥＧジオールは、プロピオン酸スクシンイミジルを用いた誘導体化によって両端において活性化される（二活性化）。反応後、ＰＥＧ−核酸結合体を、ゲル電気泳動または液体クロマトグラフィによって精製することにより、完全に結合体化された種と部分的に結合体化された種と結合体化されていない種に分離される。複数の鎖状ＰＡＧ分子（例えば、ランダム共重合体またはブロック共重合体として）またはより短いＰＡＧ鎖が連結されて、様々な長さ（または分子量）が達成され得る。非ＰＡＧリンカーは、様々な長さのＰＡＧ鎖の間において使用することができる。
【０２４１】
２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−フルオロヌクレオチドおよび他の改変ヌクレオチドによる改変は、ヌクレアーゼに対してアプタマーを安定化し、そしてそのインビボにおける半減期を延長する。３’−３’−ｄＴキャップもまた、エキソヌクレアーゼ抵抗性を増大させ得る。例えば、米国特許第５，６７４，６８５号；同第５，６６８，２６４号；同第６，２０７，８１６号；および同第６，２２９，００２号（これらの各々の全体が、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【０２４２】
（反応性核酸のＰＡＧ誘導体化）
高分子量ＰＡＧ−核酸−ＰＡＧ結合体は、２つ以上の反応性部位を含む核酸との単官能性活性化ＰＥＧの反応によって調製され得る。１つの実施形態において、その核酸は、二反応性または二活性化であり、そして従来のホスホルアミダイト合成、例えば：図６に示されるような３’−５’−ジ−ＰＥＧ化を介してオリゴヌクレオチドに導入される２つの反応性部位：５’−アミノ基および３’−アミノ基を含む。別の実施形態において、反応性部位は、例えば、第１級アミンの結合用の部位としてピリミジンの５位、プリンの８位またはリボースの２’位を用いて内部の位置に導入され得る。このような実施形態において、核酸は、いくつかの活性化部位または反応性部位を有し得、そして、その核酸は、多様に活性化されているといわれる。合成および精製の後、改変オリゴヌクレオチドは、自発的な加水分解を最小限にしながら、オリゴヌクレオチド反応性部位との選択的反応を促進する条件下で一活性化ＰＥＧと結合される。好ましい実施形態において、モノメトキシ−ＰＥＧは、プロピオン酸スクシンイミジルによって活性化され、そしてその結合化反応は、ｐＨ８．３で行われる。二置換ＰＥＧの合成を駆動するために、オリゴヌクレオチドに対して化学量論的に過剰なＰＥＧを提供する。反応後、ＰＥＧ−核酸結合体を、ゲル電気泳動または液体クロマトグラフィによって精製することにより、完全に結合体化された種と部分的に結合体化された種と結合体化されていない種とに分離される。
【０２４３】
連結ドメインはまた、それに結合される１つ以上のポリアルキレングリコール部分を有し得る。そのようなＰＡＧは、様々な長さであり得、適切な組み合わせにおいて使用されることにより、組成物の所望の分子量が達成され得る。
【０２４４】
特定のリンカーの効果は、その化学組成と長さの両方によって影響され得る。長すぎるか、短すぎるか、またはＩＬ−２３および／もしくはＩＬ−１２と望ましくない立体的相互作用および／もしくはイオン性相互作用を形成するリンカーは、アプタマーとＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２との間に複合体が形成されるのを妨害する。核酸間にまたがる必要とされる長さよりも長いリンカーは、リガンドの有効濃度を低下させることによって結合安定性を低減させ得る。従って、標的へのアプタマーの親和性を最大にするために、しばしば、リンカーの組成および長さを最適化する必要がある。
【０２４５】
本明細書中に引用されるすべての出版物および特許文献は、その出版物または文献の各々が、本明細書中で参考として援用されると明確かつ個々に示されているかのように、本明細書中で参考として援用される。出版物および特許文献の引用は、いずれも関連する先行技術であるという容認と解釈されず、また、それらの内容および日付に関する容認とするようには解釈されない。本発明は、記述された書面を介して説明されるが、本発明が種々の実施形態において実施され得ること、および前述の記載および下記の実施例が添付の特許請求の範囲を説明する目的であり、特許請求の範囲を限定する目的でないことを当業者は理解するだろう。
【実施例】
【０２４６】
（実施例１：アプタマーのセレクションおよび配列）
（ＩＬ−２３アプタマーのセレクション）
ＩＬ−２３およびＩＬ−１２に対して種々の特異性を有するリガンドを作製するために、いくつかのＳＥＬＥＸＴＭストラテジーを用いた。ＩＬ−１２よりもＩＬ−２３に特異的なアプタマーを生成するように設定された１つのスキームは、ネガティブセレクション工程にＩＬ−１２を含めて共通のサブユニットを認識するアプタマーを排除し、ＩＬ−２３に特異的なアプタマーについて選別するものであった。ＩＬ−２３とＩＬ−１２とを１回おきに代わる代わる用いる別個のＳＥＬＥＸＴＭスキームにより、共通のサブユニットを認識するために両方とものタンパク質を認識するアプタマーを排除した。実施例１Ａおよび１Ｅでは、２’−ＯＨプリンおよび２’−Ｆピリミジン（ｒＲｆＹ）を含んでいるプールを用いてセレクションを行った。細胞ベースアッセイにおいてＩＬ−２３活性を阻止した際の結合親和性および効率に基づいて、これらのセレクション由来のクローンを最適化した。さらに、２’−ＯＭｅヌクレオチド含有プール、すなわち、ｒＲｍＹ（２’−ＯＨ  ＡおよびＧならびに２’−ＯＭｅ  ＣおよびＵ）、ｒＧｍＨ（２’−ＯＨ  Ｇおよび２’−ＯＭｅ  Ｃ、Ｕ、Ａ）およびｄＲｍＹ（デオキシＡおよびＧならびに２’−ＯＭｅ  ＣおよびＵ）によるセレクションを以下の実施例１Ｂ、１ＣおよびＩＤに記載する。
【０２４７】
（実施例１Ａ：２’−フルオロピリミジン含有プール（ｒＲｆＹ）を用いたヒトＩＬ−２３に対するセレクション）
２’−ＯＨプリン（リボプリン（ｒｉｂｏ−ｐｕｒｉｎｅ））および２’−Ｆピリミジンヌクレオチドからなるプールを用いて（ｒＲｆＹ条件）ヒト（「ｈ」）−ＩＬ−２３に対するアプタマーを同定するために、３つのセレクションを行った。第１のセレクション（ｈ−ＩＬ−２３）は、ｐ１９およびｐ４０ドメインを含むｈ−ＩＬ−２３に対する直接的なセレクションであった。第２のセレクション（Ｘ−ＩＬ−２３）は、ｈ−ＩＬ−２３とｈ−ＩＬ−１２とを交互に利用して、２つのタンパク質に共通のサブユニットｐ４０に対するアプタマーのセレクションを推進するものであった。第３のセレクション（ＰＮ−ＩＬ−２３）では、ネガティブセレクション工程にｈ−ＩＬ−１２を含めて、ｈ−ＩＬ−２３に固有のサブドメインｐ１９に結合するアプタマーの濃縮を推進した。下に記載されるように、この第３のセレクション、すなわち、ＰＮ−ＩＬ−２３セレクションのための出発物質は、ｈ−ＩＬ−２３セレクション由来のプールの一部、すなわち、ｈ−ＩＬ−２３タンパク質に対するセレクションを２回行った後のｈ−ＩＬ−２３プールの残りの部分から分離されたものであった。３つすべてのセレクションストラテジーによって、ｈ−ＩＬ−２３に対するアプタマーが得られた。いくつかのアプタマーが、ｈ−ＩＬ−２３に対して高度に特異的であり、いくつかのアプタマーが、ｈ−ＩＬ−２３とｈ−ＩＬ−１２との間で交差反応性を示し、そして１つのアプタマーが、ｈ−ＩＬ−２３よりもｈ−ＩＬ−１２に対して特異的である。
【０２４８】
第１回のｈ−ＩＬ−２３およびＰＮ−ＩＬ−２３セレクションは、１００μＬの最終容積中に１００ｐｍｏｌのＩＬ−２３タンパク質（Ｒ＆Ｄ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）とともにα３２Ｐ  ＡＴＰ本体が標識されたプールのスパイク（ｓｐｉｋｅ）を含んでいる、２×１０１４分子の２’Ｆピリミジン改変ＡＲＣ２１２プール（配列番号８）
【０２４９】
【化４７】
2009521208.tif 000050
の室温で１時間のインキュベーションから開始した。鋳型（配列番号８）中のＮの連なりは、任意のヌクレオチドの組み合わせであり得、得られるアプタマーに固有の配列領域をもたらす。
【０２５０】
第２回の後、プールを２つに等しく分割し、一方の部分を、ｈ−ＩＬ−２３セレクションのその後の回（すなわち、第３〜１２回）に使用し、他方の部分を、ＰＮ−ＩＬ−２３セレクションのその後の回（すなわち、第３〜１１回）に使用した。プールＲＮＡを５０ｐｍｏｌのｈ−ＩＬ−２３および５０ｐｍｏｌのｈ−ＩＬ−１２とともにインキュベートしたこと以外は同様に、Ｘ−ＩＬ−２３セレクションの第１回を行った。
【０２５１】
すべてのセレクションを、１×ＳＨＭＣＫ緩衝液，ｐＨ７．４（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２）中で行った。Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ（Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）製の０．４５μｍニトロセルローススピンカラムを用いて、ＲＮＡ：ｈ−ＩＬ−２３複合体と遊離ＲＮＡ分子とを分離した。そのカラムは、１ｍＬの１×ＳＨＭＣＫで予め洗浄しておき、次いで、ＲＮＡ：タンパク質含有溶液をそのカラムに加え、１５００ｇで２分間遠心した。緩衝液による洗浄を行うことにより、非特異的結合物をフィルターから除去し（第１回は、２×５００μＬの１×ＳＨＭＣＫ；その後の回は、回数および容積を増やして、よりストリンジェントな洗浄を行うことにより、特異的な結合物を濃縮した）、次いで、フィルターに付着しているＲＮＡ：タンパク質複合体を、溶出緩衝液（９５℃に予め加熱しておいた、７Ｍ尿素、１００ｍＭ酢酸ナトリウム、３ｍＭ  ＥＤＴＡ）の２×２００μＬでの洗浄（後の回では、２×１００μＬでの洗浄）により溶出した。溶出されたＲＮＡをフェノール：クロロホルム抽出し、次いで、沈殿させた（４０μｇのグリコーゲン、１容積のイソプロパノール）。そのＲＮＡを、３’プライマー
【０２５２】
【化４８】
2009521208.tif 000051
（配列番号１０）を使用して、ＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔＴＭＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を製造者の指示書に従って用いて逆転写した後、ＰＣＲ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．４、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５μＭの５’プライマー
【０２５３】
【化４９】
2009521208.tif 000052
（配列番号９）、０．５μＭの３’プライマー（配列番号１０）、０．５ｍＭ  各ｄＮＴＰ、０．０５単位／μＬのＴａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））により増幅した。ＰＣＲ反応は、以下のサイクル条件下で行った：ａ）９４℃３０秒；ｂ）５５℃３０秒；ｃ）７２℃３０秒。サイクルは、十分なＰＣＲ産物が生成されるまで繰り返した。十分なＰＣＲ産物を生成するのに必要なサイクルの最小数を以下の表１〜３に「ＰＣＲ閾値」として報告する。
【０２５４】
ＰＣＲ鋳型を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。α３２Ｐ  ＡＴＰ本体標識（ｂｏｄｙ  ｌａｂｅｌｉｎｇ）（４％ＰＥＧ−８０００、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭスペルミジン、０．００２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、３ｍＭ  ２’ＯＨプリン、３ｍＭ  ２’Ｆピロリジン、２５ｍＭ  ＤＴＴ、０．００２５単位／μＬの無機ピロホスファターゼ、２μｇ／ｍＬのＴ７  Ｙ６３９Ｆ単変異ＲＮＡポリメラーゼ、５μＣｉのα３２Ｐ  ＡＴＰ）を用いて、３７℃で一晩、鋳型を転写した。この反応物を、Ｂｉｏ  Ｓｐｉｎカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を製造者の指示書に従って用いて脱塩した。
【０２５５】
表１〜３に示す変更点以外は第１回と同じ方法を用いて３つすべてのセレクションのその後の回を繰り返した。タンパク質標的とのインキュベーションの前に、プールＲＮＡを０．４５ミクロンのニトロセルロースフィルターカラムに通すことにより、フィルターに結合する配列を除去し、次いで、その濾液を用いて、ポジティブセレクション工程を続けた。交互回において、プールＲＮＡをゲル精製した。転写反応を５０ｍＭ  ＥＤＴＡでクエンチし、エタノール沈殿して、１．５ｍｍ変性ポリアクリルアミドゲル（８Ｍ尿素、１０％アクリルアミド；１９：１のアクリルアミド：ビスアクリルアミド）上で精製した。１×ＴＢＥ（９０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、９０ｍＭホウ酸、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で２２５Ｖにて１時間、Ｅｌｕｔｒａｐ（登録商標）装置（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ）における電気溶出によって、プールＲＮＡをゲルから取り出した。溶出した材料を３００ｍＭ酢酸ナトリウムおよび２．５容積のエタノールを加えることによって沈殿させた。
【０２５６】
そのＲＮＡは、全セレクションにわたって過剰量のタンパク質中に残存していた（約１〜２μＭのＲＮＡ）。そのタンパク質濃度は、最初の２回は１μＭであり、その後、特定のセレクションに基づいて様々な低い濃度に低下させた。競合ｔＲＮＡを０．１ｍｇ／ｍＬで結合反応物に加えたが、この手順は、セレクションに依存して第３回または第４回で開始した。選ばれた回で結合アッセイを行いながら、合計１１〜１２回を完了した。以下の表１〜３は、ｈ−ＩＬ−２３、Ｘ−ＩＬ−２３およびＰＮ−ＩＬ−２３セレクションストラテジーを用いたｒＲｆＹセレクションに使用したセレクションの詳細（各回に使用したプールＲＮＡ濃度、タンパク質濃度およびｔＲＮＡ濃度を含む）を含んでいる。ドットブロット結合アッセイとともに溶出値（タンパク質結合ＲＮＡのＣＰＭ値  対  フィルターカラムを通過して流出した全ＲＮＡのＣＰＭ値の比）を使用して、セレクションの進行をモニターした。
表１．ｈ−ＩＬ−２３セレクションに使用した条件
【０２５７】
【表１】
2009521208.tif 000053
表２．Ｘ−ＩＬ−２３セレクションに使用した条件
【０２５８】
【表２】
2009521208.tif 000054
表３．ＰＮ−ＩＬ−２３に使用した条件
【０２５９】
【表３−１】
2009521208.tif 000055
【０２６０】
【表３−２】
2009521208.tif 000056
ｒＲｆＹセレクションの進行のモニタリング。全セレクションにわたってドットブロット結合アッセイを行い、プールのタンパク質結合親和性をモニターした。微量３２Ｐ標識ＲＮＡをｈ−ＩＬ−２３の希釈系列と混合し、そして１×ＳＨＭＣＫ（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２，ｐＨ７．４）＋０．１ｍｇ／ｍＬのｔＲＮＡ中、最終容積２０μＬで室温にて３０分間インキュベートした。結合反応を、Ｍｉｎｉｆｏｌｄ  Ｉドットブロット，９６ウェル真空濾過マニフォールド（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）を用いたニトロセルロース濾過によって解析した。（上から下に）Ｐｒｏｔｒａｎニトロセルロース（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ）、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐナイロン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＧＢ００２ゲルブロットペーパー（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ）からなる３層の濾過媒体を用いた。タンパク質に結合したＲＮＡは、ニトロセルロースフィルター上に捕捉されるのに対し、非タンパク質結合ＲＮＡは、ナイロンフィルター上に捕捉される。ゲルブロットペーパーは、単に他のフィルターに対する支持媒体として含められた。濾過後、そのフィルター層を分離し、乾燥し、蛍光体スクリーン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）上で露光し、そしてＳｔｏｒｍ  ８６０  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（登録商標）ブロットイメージングシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて定量化した。
【０２６１】
ｈ−ＩＬ−２３非存在下のＲＮＡの結合性に対するｈ−ＩＬ−２３存在下のＲＮＡの結合性の比が、著しい正の比であるとき、そのプールを、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を製造者の指示書に従って用いてクローニングした。ｈ−ＩＬ−２３およびＸ−ＩＬ−２３のセレクションでは、第８回のプール鋳型をクローニングし、そして各セレクション由来の３２個の個別のクローンを１点ドットブロットスクリーニング（＋／−７５ｎＭ  ｈ−ＩＬ−２３、ならびに＋／−７５ｎＭ  ｈ−ＩＬ−１２で別個のスクリーニング）でアッセイした。ＰＮ−ＩＬ−２３セレクションでは、第１０回のプールをクローニングして配列決定し、そして８個の固有クローンを、１点ドットブロットスクリーニング（＋／−２００ｎＭ  ｈ−ＩＬ−２３および＋／−２００ｎＭ  ｈ−ＩＬ−１２での別個のスクリーニング）においてタンパク質結合性についてアッセイした。続いて、第１０回のＰＮ−ＩＬ−２３プールを、Ｒ１２  ＰＮ−ＩＬ−２３プールと同様にさらなる配列決定に向けて再クローニングし、そしてそのクローンを、１点ドットブロット（ｄｏ  ｂｌｏｔ）スクリーニング（＋／−１００ｎＭ  ｈ−ＩＬ−２３または＋／−２００ｎＭ  ｈ−ＩＬ−１２）においてタンパク質結合性についてアッセイした。ＫＤを決定するために、クローン転写産物をγ３２Ｐ  ＡＴＰで５’末端標識した。ＫＤ値は、最初のスクリーニングにおいて良好な＋／−ｈ−ＩＬ−２３結合比を有したすべての固有配列に対するドットブロットアッセイにおけるｈ−ＩＬ−２３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）の希釈系列を用いて、かつ、得られたデータを１：１のＲＮＡ：タンパク質複合体を示す方程式（結合した画分アプタマー＝振幅＊（［ＩＬ−２３］／（ＫＤ＋［ＩＬ−２３］））（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ  ｖ．３．５１，Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）に当てはめることによって決定した。タンパク質結合性の特徴付けの結果を表４に作表した。ｈ−ＩＬ−２３に対して高親和性を有するクローンを調製し、以下の実施例３に記載する細胞ベースアッセイにおいて機能性についてスクリーニングした。
表４．ｒＲｆＹクローン結合活性（すべての測定を０．１ｍｇ／ｍＬのｔＲＮＡ存在下で行った）
【０２６２】
【表４−１】
2009521208.tif 000057
【０２６３】
【表４−２】
2009521208.tif 000058
【０２６４】
【表４−３】
2009521208.tif 000059
Ｎ．Ｂ．＝顕著な結合が観察されなかった
表５において特徴付けられたｒＲｆＹアプタマーの核酸配列を以下に示す。下記の各アプタマーに固有の配列は、配列ＧＧＧＡＡＡＡＧＣＧＡＡＵＣＡＵＡＣＡＣＡＡＧＡ（配列番号１１）の直後のヌクレオチド２５から開始し、３’固定核酸配列ＧＣＵＣＣＧＣＣＡＧＡＧＡＣＣＡＡＣＣＧＡＧＡＡ（配列番号１２）に遭遇するまで続く。
【０２６５】
他に述べられない限り、以下に列挙される個別の配列は、５’から３’の方向で示されており、ｒＲｆＹ  ＳＥＬＥＸＴＭ条件下で選別された、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２に結合する配列を示し、ここで、プリン（ＡおよびＧ）は２’−ＯＨであり、ピリミジン（ＵおよびＣ）は２’−フルオロである。表５に列挙される配列の各々は、ポリアルキレングリコール（「ＰＡＧ」）部分を用いて誘導体化され得、そしてキャッピング（例えば、３’−逆位ｄＴ）を含んでいても含んでいなくてもよい。
表５．ｈ−ＩＬ−２３セレクション（第８回）、Ｘ−ＩＬ−２３セレクション（第８回）、ＰＮ−ＩＬ−２３セレクション（第１０／１２回）由来のｒＲｆＹクローン配列
【０２６６】
【表５−１】
2009521208.tif 000060
【０２６７】
【表５−２】
2009521208.tif 000061
【０２６８】
【表５−３】
2009521208.tif 000062
【０２６９】
【表５−４】
2009521208.tif 000063
【０２７０】
【表５−５】
2009521208.tif 000064
上記のドットブロット結合アッセイによって測定されたときにＩＬ−２３標的タンパク質に対する結合活性を有し、かつ、細胞ベースアッセイ（下記の実施例３に記載する）において機能的であった配列を最小化した（下記の実施例２に記載する）。
【０２７１】
（実施例１Ｂ：リボ／２’Ｏ−Ｍｅヌクレオチド含有プールを用いたヒトＩＬ−２３に対するＩＬ−２３セレクション）
リボ／２’Ｏ−メチルヌクレオチドを含むアプタマーを同定するために２つのセレクションを行った。一方のセレクションは、２’Ｏ−メチルＡ、ＣおよびＵならびに２’ＯＨ  Ｇ（ｒＧｍＨ）を用い、他方のセレクションは、２’−ＯＭｅ  Ｃ、Ｕおよび２’−ＯＨ  Ｇ、Ａ（ｒＲｍＹ）を用いた。両方とものセレクションが、疎水性プレート上に固定されたｈ−ＩＬ−２３に対する直接的なセレクションであった。ｐ１９またはｐ４０サブドメインに特異的なアプタマーのセレクションを偏らせる工程は行わなかった。両方のセレクションから、未処理で選別されていないプールよりもｈ−ＩＬ−２３結合性について著しく濃縮されたプールを得た。個別のクローン配列を本明細書中において報告し、選別された個別のクローンに対するｈ−ＩＬ−２３結合データを提供する。
【０２７２】
プールの調製。配列
【０２７３】
【化５０】
2009521208.tif 000065
（配列番号３）を有するＤＮＡ鋳型を、ＡＢＩ  ＥＸＰＥＤＩＴＥＴＭＤＮＡ合成装置を用いて合成し、そして標準的な方法によって脱保護した。ＤＮＡ鋳型（配列番号３）中のＮの連なりは、ヌクレオチドの任意の組み合わせであり得、得られるアプタマーに固有の配列領域をもたらす。
【０２７４】
その鋳型を５’プライマー
【０２７５】
【化５１】
2009521208.tif 000066
（配列番号６７）および３’プライマー
【０２７６】
【化５２−１】
2009521208.tif 000067
（配列番号６８）を用いて増幅し、次いで、Ｙ６３９Ｆ単変異Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロ転写に鋳型として使用した。転写は、２００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、４０ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭスペルミジン、．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０％ＰＥＧ−８０００、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、５００μＭ  ＮＴＰ、５００μＭ  ＧＭＰ、０．０１単位／μＬの無機ピロホスファターゼおよび２μｇ／ｍＬのＹ６３９Ｆ単変異Ｔ７ポリメラーゼを用いて、３７℃で一晩行った。２つの異なる組成物ｒＧｍＨおよびｒＲｍＹを転写した。
【０２７７】
セレクション。各回のセレクションは、室温で２時間、１００μＬの１×Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳ（ＤＰＢＳ（＋Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋））中でＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ疎水性プレートの表面に２０ｐｍｏｌのｈ−ＩＬ−２３を固定することによって開始した。次いで、上清を除去し、ウェルを１２０μＬの洗浄緩衝液（１×ＤＰＢＳ、０．２％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で４回洗浄した。プールＲＮＡを３分間９０℃に加熱し、１０分間室温に冷却してリフォールディングした。第１回では、ポジティブセレクション工程を行った。簡潔には、１×１０１４分子（０．２ｎｍｏｌ）のプールＲＮＡを、タンパク質標的が固定されたウェル内の１００μＬの結合緩衝液（１×ＤＰＢＳおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中で１時間インキュベートした。次いで、上清を除去し、ウェルを１２０μＬの洗浄緩衝液で４回洗浄した。その後の回では、ネガティブセレクション工程を含めた。ポジティブセレクション工程の前に、プールＲＮＡを空のウェル中で室温にて３０分間インキュベートして、任意のプラスチック結合配列をプールから除去した。ストリンジェンシーを高めるために、第４回の後、洗浄回数を増加した。すべての場合において、ＲＴミックス（３’プライマー（配列番号６８）およびＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔＴＭＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を加えた後、６５℃で１時間インキュベートすることによって、固定されたｈ−ＩＬ−２３に結合しているプールＲＮＡをセレクションプレート中で直接、逆転写した。
【０２７８】
得られたｃＤＮＡを、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いるＰＣＲの鋳型として使用した。６０℃のアニーリング温度と組み合わせた「ホットスタート」ＰＣＲ条件を用いて、プライマーダイマー形成を最小にした。増幅されたプール鋳型ＤＮＡを、Ｃｅｎｔｒｉｓｅｐカラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ａｄｅｌｐｈｉａ，ＮＪ）を用いて製造者が推奨する条件に従って脱塩し、そしてそれを用いて、次の回のセレクション用のプールＲＮＡを転写した。転写されたプールを、毎回、１０％ポリアクリルアミドゲル上でゲル精製した。セレクション１回あたりに使用したＲＮＡ濃度を表６に示す。
表６．セレクション１回あたりのＲＮＡプール濃度。
【０２７９】
【表６】
2009521208.tif 000068
セレクションの進行は、実施例１Ａに記載したようにドットブロットサンドイッチフィルター結合アッセイを用いてモニターした。５’−３２Ｐ標識プールＲＮＡを９０℃で３分間リフォールディングし、そして１０分間室温に冷却した。次に、プールＲＮＡ（極低濃度）をｈ−ＩＬ−２３  ＤＰＢＳ＋０．１ｍｇ／ｍＬのｔＲＮＡとともに３０分間、室温にてインキュベートし、次いで、ドットブロット装置（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ）におけるニトロセルロースフィルターとナイロンフィルターとのサンドイッチに適用した。ニトロセルロースに結合したプールＲＮＡのパーセンテージを計算し、そしておよそ３回ごとに１点スクリーニング（＋／−２５０ｎＭ  ｈ−ＩＬ−２３）を用いてモニターした。プールＫＤ測定値を上に記載したようにｈ−ＩＬ−２３タンパク質（Ｒ＆Ｄ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）の力価測定およびドットブロット装置を用いて測定した。
【０２８０】
セレクションを４回行った後に、ｒＲｍＹ  ｈ−ＩＬ−２３セレクションを未処理プールに対してｈ−ＩＬ−２３結合性について濃縮した（データ示さず）。セレクションストリンジェンシーを上げて、セレクションを８回超続けた。第９回において、プールＫＤは、約５００ｎＭ以上であった。第１０回において未処理プールの結合性に対してｒＧｍＨセレクションを濃縮した。プールＫＤはまた、約５００ｎＭ以上であった。図７は、ｈ−ＩＬ−２３に結合するｒＲｍＹおよびｒＧｍＨプールセレクションの結合曲線である。これらのプールを、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いてクローニングし、個別の配列を生成して、結合性について試験した。まず、１：２００希釈，＋／−２００ｎＭ  ＩＬ−２３＋０．１ｍｇ／ｍＬ競合ｔＲＮＡを用いてすべての粗ｒＲｍＹクローン転写物において１点結合スクリーニングを行った。次いで、１点スクリーニングにおいて最良の結合性を示したｒＲｍＹクローンのうちの２４個について、１０点スクリーニングを行った。その１０点スクリーニングは、０〜４８０ｎＭのＩＬ−２３を３倍の連続希釈を用いて行った。結合曲線を作成し（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ  ｖ．３．５１，Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）、そのデータを方程式：結合ＲＮＡの割合＝振幅＊［ｈ−ＩＬ−２３］／ＫＤ＋［ｈ−ＩＬ−２３］）に当てはめることによって、ＫＤを推定した。以下の表７は、ｈ−ＩＬ−２３に対して結合親和性を示したｒＲｍＹの選別されたアプタマーの配列データを示している。作製されたｒＲｍＹクローンのうち１群の６重複配列および４対の２重複配列が存在した。表８は、そのように試験したｒＲｍＹクローンの結合特性を示している。１：２００希釈で４８個の粗ｒＧｍＨクローン転写からのクローンも試験し、０．１ｍｇ／ｍＬのｔＲＮＡを競合物として使用した。バックグラウンドの平均結合性は、たったの約１４％であったのに対し、同じアッセイにおけるｒＲｍＹクローンの平均は、約３０％であり、１０クローンが４０％超であった。試験されたｒＧｍＨクローンの配列および結合特性は、示していない。
【０２８１】
表７において特徴付けられるｒＲｍＹアプタマーの核酸配列を以下に示す。表７中の各アプタマーに固有の配列は、配列
【０２８２】
【化５２−２】
2009521208.tif 000069
（配列番号６９）の直後のヌクレオチド２３から始まり、３’固定核酸配列
【０２８３】
【化５３】
2009521208.tif 000070
（配列番号７０）に遭遇するまで続く。
【０２８４】
他に述べられない限り、以下に列挙される個別の配列は、５’から３’の方向で示され、ｒＲｍＹ  ＳＥＬＥＸＴＭ条件下で選択されたＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２に結合するアプタマーの配列を示し、ここで、プリン（ＡおよびＧ）は、２’−ＯＨであり、ピリミジン（ＵおよびＣ）は、２’−ＯＭｅである。表７に列挙される配列の各々は、ポリアルキレングリコール（「ＰＡＧ」）部分で誘導体化され得、そしてキャッピング（例えば、３’−逆位ｄＴ）を含んでいても含んでいなくてもよい。
表７−ｒＲｍＹ（第１０回）配列
【０２８５】
【表７−１】
2009521208.tif 000071
【０２８６】
【表７−２】
2009521208.tif 000072
表８−ｒＲｍＹ  ＩＬ−２３クローン結合データ。
【０２８７】
【表８−１】
2009521208.tif 000073
【０２８８】
【表８−２】
2009521208.tif 000074
＊＊アッセイは、１×ＤＰＢＳ（＋Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋）中、室温、３０分間のインキュベートにおいて行った。
＊＊Ｒ＆Ｄ  ＩＬ−２３（キャリアを含まないタンパク質）
（実施例１Ｃ：デオキシ／２’Ｏ−メチルヌクレオチド含有プールを用いたヒトＩＬ−２３に対するセレクション）
ｈ−ＩＬ−２３ストラテジーを用いて、デオキシプリン（ＡおよびＧ）および２’−Ｏ−Ｍｅピリミジン（ＣおよびＵ）を使用した、ＩＬ−２３に特異的で安定化されたアプタマーを得るために、別のセレクションを行った。
【０２８９】
プールの調製。配列
【０２９０】
【化５４】
2009521208.tif 000075
（ＡＲＣ２５６、配列番号３）を有するＤＮＡ鋳型を、ＡＢＩ  ＥＸＰＥＤＩＴＥＴＭＤＮＡ合成装置を用いて合成し、標準的な方法により脱保護した。ＤＮＡ鋳型（配列番号３）中のＮの連なりは、ヌクレオチドの任意の組み合わせであり得、得られるアプタマーに固有の配列領域をもたらす。その鋳型を、５’プライマー
【０２９１】
【化５５】
2009521208.tif 000076
（配列番号６７）および３’プライマー
【０２９２】
【化５６】
2009521208.tif 000077
（配列番号８９）を用いて増幅し、次いで、Ｙ６３９Ｆ単変異Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いるインビトロ転写の鋳型として使用した。転写を、２００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、４０ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭスペルミジン、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０％ＰＥＧ−８０００、９．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．９ｍＭ  ＭｎＣｌ２、２ｍＭ  ＮＴＰ、２ｍＭ  ＧＭＰ、２ｍＭスペルミン、０．０１単位／μＬの無機ピロホスファターゼおよび２μｇ／ｍＬのＹ６３９Ｆ単変異Ｔ７ポリメラーゼを用いて、３７℃で一晩行った。
【０２９３】
セレクション：各回のセレクションは、室温で１時間、１００μＬの１×ＰＢＳ中でＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ疎水性プレートの表面に２０ｐｍｏｌのｈ−ＩＬ−２３を固定することによって開始した。次いで、上清を除去し、ウェルを１２０μＬの洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ、０．１ｍｇ／ｍＬのｔＲＮＡおよび０．１ｍｇ／ｍＬのサケ精子ＤＮＡ（「ｓｓＤＮＡ」））で５回洗浄した。第１回において、ポジティブセレクション工程を行った：１００ｐｍｏｌのプールＲＮＡ（６×１０１３固有分子）を、タンパク質標的が結合したウェル内の１００μＬの結合緩衝液（１×ＰＢＳ、０．１ｍｇ／ｍＬのｔＲＮＡおよび０．１ｍｇ／ｍＬのｓｓＤＮＡ）中で１時間インキュベートした。次いで、上清を除去し、ウェルを１２０μＬの洗浄緩衝液で５回洗浄した。その後の回では、ネガティブセレクション工程を含めた。ポジティブセレクション工程の前に、プールＲＮＡを空のウェル中で室温にて１時間インキュベートすることにより、任意のプラスチック結合配列をプールから除去した。第３回の開始時に、第２のネガティブセレクション工程を加えた。ポジティブセレクション工程の前に、標的が固定されたウェルを、１００μＬのブロッキング緩衝液（１×ＰＢＳ、０．１ｍｇ／ｍＬのｔＲＮＡ、０．１ｍｇ／ｍＬのｓｓＤＮＡおよび０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ）中で室温にて１時間ブロッキングした。すべての場合において、ＲＴミックス（３’プライマー（配列番号８９）およびＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔＴＭＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を加えた後、６５℃で１時間インキュベートすることによって、固定されたｈ−ＩＬ−２３に結合しているプールＲＮＡをセレクションプレート中で直接、逆転写した。得られたｃＤＮＡを、ＰＣＲ（Ｔａｑポリメラーゼ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）の鋳型として使用した。６８℃のアニーリング温度と組み合わせた「ホットスタート」ＰＣＲ条件を用いて、プライマーダイマー形成を最小にした。増幅されたプール鋳型ＤＮＡを、Ｍｉｃｒｏ  Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて製造者が推奨する条件に従って脱塩し、そしてそれを用いて、次の回のセレクション用のプールＲＮＡの転写をプログラムした。転写されたプールを、毎回、１０％ポリアクリルアミドゲル上でゲル精製した。
【０２９４】
タンパク質結合解析。セレクションの進行は、実施例１Ａにおいて先に記載したサンドイッチフィルター結合アッセイを用いてモニターした。５’−３２Ｐ標識プールＲＮＡ（極低濃度）を、ｈ−ＩＬ−２３、１×ＰＢＳ＋０．１ｍｇ／ｍＬのｔＲＮＡ、０．１ｍｇ／ｍＬのｓｓＤＮＡおよび０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡとともに室温にて３０分間インキュベートし、次いで、ドットブロット装置（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）におけるニトロセルロースフィルターとナイロンフィルターとのサンドイッチに適用した。ｈ−ＩＬ−２３による７点スクリーニング（０．２５ｎＭ、０．５ｎＭ、１ｎＭ、４ｎＭ、１６ｎＭ、６４ｎＭおよび１２８ｎＭ）を用いて、第６、７および８回の後にニトロセルロースに結合したプールＲＮＡのパーセンテージを計算した。プールＫＤ測定値を先に記載したように計算した。
【０２９５】
セレクションを６回行った後に、ｄＲｍＹ  ｈ−ＩＬ２３セレクションを未処理のプールに対してｈ−ＩＬ−２３結合性について濃縮した。第８回において、プールＫＤは、約５４ｎＭ以上であった。第６、７および８回のプールを、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いてクローニングし、個別の配列を生成した。表９には、第６、７および８回のプールから生成されたｄＲｍＹクローンの配列を列挙している。タンパク質結合解析を各クローンについて行った。１×ＰＢＳ＋０．１ｍｇ／ｍＬのｔＲＮＡ、０．１ｍｇ／ｍＬのサケ精子ＤＮＡ、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ中で、室温にて３０分間インキュベートすることにより、結合アッセイを行った。表１０には、これらの個別の配列についての結合特性が含まれている。
【０２９６】
表９において特徴付けられるｄＲｍＹアプタマーの核酸配列を以下に示す。下記の各アプタマーに固有の配列は、配列
【０２９７】
【化５７】
2009521208.tif 000078
（配列番号６９）の直後のヌクレオチド２３から始まり、３’固定核酸配列
【０２９８】
【化５８】
2009521208.tif 000079
（配列番号９０）に遭遇するまで続く。
【０２９９】
他に述べられない限り、以下に列挙される個別の配列は、５’から３’の方向で示され、ｄＲｍＹ  ＳＥＬＥＸＴＭ条件下で選別されたＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２に結合するアプタマーの配列を示し、ここで、プリン（ＡおよびＧ）は、デオキシであり、ピリミジン（ＵおよびＣ）は、２’−ＯＭｅである。表９に列挙される配列の各々は、ポリアルキレングリコール（「ＰＡＧ」）部分で誘導体化され得、そしてキャッピング（例えば、３’−逆位ｄＴ）を含んでいても含んでいなくてもよい。
表９．ｄＲｍＹ  ＩＬ−２３クローン配列
【０３００】
【表９】
2009521208.tif 000080
表１０−ｄＲｍＹ  ＩＬ−２３アプタマー結合性データ
【０３０１】
【表１０−１】
2009521208.tif 000081
【０３０２】
【表１０−２】
2009521208.tif 000082
＊＊アッセイは、１×ＰＢＳ＋０．１ｍｇ／ｍＬのｔＲＮＡ、０．１ｍｇ／ｍＬのｓｓＤＮＡ、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ中で室温、３０分間のインキュベーションにより行った。
＊＊Ｒ＆Ｄ  ＩＬ−２３（キャリアを含まないタンパク質）
Ｎ．Ｂ．＝検出可能な結合は無し
（実施例１Ｄ：デオキシ／２’Ｏ−メチルヌクレオチド含有プールを用いたヒトＩＬ−２３に対するさらなるセレクション）
導入：デオキシ／２’Ｏ−メチルヌクレオチドを含んでいるプールを使用し、ｈ−ＩＬ−２３に対するアプタマーを同定するために、３つのセレクションストラテジーを用いた。これらのセレクションでは、２’Ｏ−Ｍｅ  ＣおよびＵならびにデオキシＡおよびＧを使用した。第１のセレクションストラテジー（ｄＲｍＹ  ｈ−ＩＬ−２３）は、ｈ−ＩＬ−２３に対する直接的なセレクションであった。第２のセレクションストラテジー（ｄＲｍＹ  ｈ−ＩＬ−２３／ＩＬ−１２ｎｅｇ）では、ｈ−ＩＬ−１２をネガティブセレクション工程に含めることにより、ｈ−ＩＬ−２３に固有のサブドメインであるｐ１９に結合するアプタマーの濃縮を推進した。第３のセレクションストラテジー（ｄＲｍＹ  ｈ−ＩＬ−２３−Ｓ）では、ポジティブセレクションにおいて長時間の洗浄を含めることによる高ストリンジェンシーを用いることによって、より親和性の高いアプタマーに対して選別するセレクションを推進した。３つすべてのセレクションストラテジーにより、ｈ−ＩＬ−２３に対するアプタマーが得られた。いくつかのアプタマーが、ｈ−ＩＬ−２３に特異的であり、そしていくつかがｈ−ＩＬ−２３とｈ−ＩＬ−１２との間の交差反応性を示した。
【０３０３】
ｄＲｍＹセレクション：ｄＲｍＹ  ｈ−ＩＬ−２３セレクションの第１回は、配列
【０３０４】
【化５９】
2009521208.tif 000083
（配列番号９８）（ＡＢＩ  ＥＸＰＥＤＩＴＥＴＭＤＮＡ合成装置を用いて合成し、標準的な方法によって脱塩したもの）を有する３×１０１４分子の２’Ｏ−Ｍｅ  ＣおよびＵならびにデオキシＡおよびＧで改変されたＲＮＡプールを用いて開始した。鋳型（配列番号９８）中のＮの連なりは、ヌクレオチドの任意の組み合わせであり得、得られるアプタマーに固有の配列領域をもたらす。
【０３０５】
各回のセレクションは、室温で１時間、１００μＬの１×ＰＢＳ中でＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ疎水性プレートの表面に２０ｐｍｏｌのｈ−ＩＬ−２３を固定することによって開始した。次いで、上清を除去し、ウェルを１２０μＬの洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ、０．１ｍｇ／ｍＬのｔＲＮＡおよび０．１ｍｇ／ｍＬのサケ精子ＤＮＡ（「ｓｓＤＮＡ」））で５回洗浄した。第１回では、５００ｐｍｏｌのプールＲＮＡ（３×１０１４分子）を、タンパク質標的が固定されたウェル内の１００μＬの結合緩衝液（１×ＰＢＳ、０．１ｍｇ／ｍＬのｔＲＮＡおよび０．１ｍｇ／ｍＬのｓｓＤＮＡ）中で１時間インキュベートした。次いで、上清を除去し、ウェルを１２０μＬの洗浄緩衝液で５回洗浄した。その後の回では、ネガティブセレクション工程を含め、その工程では、ポジティブセレクション工程の前に、プールＲＮＡを空のウェル中で室温にて１時間インキュベートすることにより、任意のプラスチック結合配列をプールから除去した。
【０３０６】
第３回の開始時に、第２のネガティブセレクション工程を加えた。ポジティブセレクション工程の前に、標的が固定されたウェルにおいて、上記プールを１００μＬのブロッキング緩衝液（１×ＰＢＳ、０．１ｍｇ／ｍＬのｔＲＮＡ、０．１ｍｇ／ｍＬのｓｓＤＮＡおよび０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ）を用いて室温にて１時間ブロッキングする、１時間のインキュベートに供した（表１１Ａ）。第３回において、ｄＲｍＹ  ｈ−ＩＬ−２３プールを、２０ｐｍｏｌのｈ−ＩＬ−１２で室温にて１時間ブロッキングされ、そして１２０μＬの洗浄緩衝液で５回洗浄されたウェルにおいて室温でさらに１時間ネガティブインキュベート工程に供すること（ポジティブｈ−ＩＬ−２３ポジティブインキュベーションの前に行った）によって、そのプールをｄＲｍＹ  ｈ−ＩＬ−２３／ＩＬ−１２ｎｅｇセレクションに分割した。ストリンジェンシーを高めるために、そのプールをその後の回においてさらにｈ−ＩＬ−１２でブロックされたウェルに分割した（表１１Ｂを参照のこと）。
【０３０７】
ｈ−ＩＬ−２３とｈ−ＩＬ−１２との結合性の識別を高めるためのさらなる方法は、ｈ−ＩＬ−１２をプールとともに低濃度でポジティブセレクションに加えることであり、ここで、特異的ｈ−ＩＬ−２３結合物は、固定されたｈ−ＩＬ−２３に結合し、そのｈ−ＩＬ−１２結合物をインキュベーションの１時間後に洗浄する。ポジティブセレクションに「ストリンジェントな洗浄」を加えることにより、ｄＲｍＹ  ｈ−ＩＬ−２３−Ｓセレクションを第６回のｄＲｍＹ  ｈ−ＩＬ−２３プールから分離し、ｈ−ＩＬ−２３とのインキュベーションの１時間後に、プールを除去し、次いで、１００μＬの１×ＰＢＳ、０．１ｍｇ／ｍＬのｔＲＮＡおよび０．１ｍｇ／ｍＬのｓｓＤＮＡを加え、３０分間インキュベートした（表１１Ｃ）。親和性の高い分子を選別する意図で、このストリンジェントな洗浄工程を、除いたり繰り返したりした。
【０３０８】
すべての場合において、ＲＴミックス（３’プライマー、
【０３０９】
【化６０】
2009521208.tif 000084
（配列番号１００））およびＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔＴＭＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を加えた後に６５℃で１時間インキュベートすることによって、固定されたｈ−ＩＬ−２３に結合しているプールＲＮＡをセレクションプレート中で直接、逆転写した。得られたｃＤＮＡを、ＰＣＲ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．４、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５μＭの５’プライマー  
【０３１０】
【化６１】
2009521208.tif 000085
（配列番号９９）、０．５μＭの３’プライマー（配列番号１００）、０．５ｍＭ  各ｄＮＴＰ、０．０５単位／μＬのＴａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））の鋳型として使用した。ＰＣＲ反応を以下のサイクル条件下で行った：ａ）：９４℃３０秒；ｂ）５５℃３０秒；ｃ）７２℃３０秒。サイクルは、十分なＰＣＲ産物が生成されるまで繰り返した。十分なＰＣＲ産物を生成するのに必要なサイクルの最小数を以下の表１１Ａ〜１１Ｃに「ＰＣＲ閾値」として報告する。
【０３１１】
ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてＰＣＲ鋳型を精製し、そしてそれを用いて、次の回のセレクションのためのプールＲＮＡの転写をプログラムした。２００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、４０ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭスペルミジン、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０％ＰＥＧ−８０００、９．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．９ｍＭ  ＭｎＣｌ２、２ｍＭ  ＮＴＰ、２ｍＭ  ＧＭＰ、２ｍＭスペルミン、０．０１単位／μＬの無機ピロホスファターゼおよび２μｇ／ｍＬのＹ６３９Ｆ単変異Ｔ７ポリメラーゼを用いて３７℃で一晩、鋳型を転写した。転写反応を５０ｍＭ  ＥＤＴＡでクエンチし、エタノール沈殿し、次いで、１．５ｍｍ変性ポリアクリルアミドゲル（８Ｍ尿素、１０％アクリルアミド；１９：１のアクリルアミド：ビスアクリルアミド）上で精製した。プールＲＮＡを、３７℃で３００ｍＭ  ＮａＯＡｃ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ中に受動的溶出（ｐａｓｓｉｖｅ  ｅｌｕｔｉｏｎ）することによって、ゲルから取り出した後、エタノール沈殿を行った。各回についてのセレクション条件を以下の表に示す。
表１１Ａ：ｄＲｍＹ  ｈＩＬ−２３セレクション条件
【０３１２】
【表１１−Ａ】
2009521208.tif 000086
表１１Ｂ：ｄＲｍＹ  ＩＬ−２３／ＩＬ−１２ｎｅｇセレクション条件
【０３１３】
【表１１−Ｂ】
2009521208.tif 000087
表１１Ｃ：ｄＲｍＹ  ｈＩＬ−２３−Ｓセレクション条件
【０３１４】
【表１１−Ｃ】
2009521208.tif 000088
タンパク質結合解析：実施例１Ａにおいて先に記載したようにプールのタンパク質結合親和性をモニターするために、全セレクションにわたってドットブロットアッセイを行った。ｈ−ＩＬ−２３非存在下のＲＮＡの結合に対するｈ−ＩＬ−２３存在下のＲＮＡの結合の比が、著しい正の比であるとき、そのプールを、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を製造者の指示書に従って用いてクローニングした。３つすべてのセレクションにおいて６回行ったプールから類似の配列が見出され、そして３つのセレクションの間に４５個の固有クローンをスクリーニング用に選択した。その４５個のクローンを、ＡＢＩ  ＥＸＰＥＤＩＴＥＴＭＤＮＡ合成装置において合成し、次いで、標準的な方法によって脱塩した。その４５個の個別のクローンを１０％ＰＡＧＥゲル上でゲル精製し、そしてそのＲＮＡを３００ｍＭ  ＮａＯＡｃおよび２０ｍＭ  ＥＤＴＡ中に受動的に溶出した後、エタノール沈殿を行った。
【０３１５】
それらのクローンをγ−３２Ｐ  ＡＴＰで５’末端標識し、そして３点ドットブロットスクリーニング（０ｎＭ、２０ｎＭおよび１００ｎＭのｈ−ＩＬ−２３；０ｎＭ、２０ｎＭおよび１００ｎＭのｈ−ＩＬ−１２）においてＩＬ−２３とＩＬ−１２の両方の結合性についてアッセイした（データ示さず）。ＩＬ−２３とＩＬ−１２の両方について２０ｎＭおよび１００ｎＭのタンパク質条件での有意な結合性を示すクローンを、先に記載したドットブロットアッセイにおいて０ｎＭ〜４８０ｎＭ（３倍希釈）のタンパク質力価測定を用いてＫＤ決定のためにさらにアッセイした。ＫＤ値は、１：１のＲＮＡ：タンパク質複合体を示す方程式（結合したアプタマーの割合＝振幅＊（［ＩＬ−２３］／（ＫＤ＋［ＩＬ−２３］））＋バックグラウンド結合）（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ  ｖ．３．５１，Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）に得られたデータを当てはめることによって決定した。親和性がより高いクローンのタンパク質結合特性の結果を表１３に作表し、対応するクローン配列を表１２に列挙する。
【０３１６】
表１２において特徴付けられるｄＲｍＹアプタマーの核酸配列を以下に示す。以下の各アプタマーに固有の配列は、配列
【０３１７】
【化６２】
2009521208.tif 000089
（配列番号１０１）の直後のヌクレオチド２３から始まり、３’固定核酸配列
【０３１８】
【化６３】
2009521208.tif 000090
（配列番号１０２）に遭遇するまで続く。
【０３１９】
他に述べられない限り、以下に列挙される個別の配列は、５’から３’の方向で示されており、ｄＲｍＹ  ＳＥＬＥＸＴＭ条件下で選別されたＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２に結合するアプタマーの配列を示し、ここで、プリン（ＡおよびＧ）はデオキシであり、ピリミジン（ＣおよびＵ）は２’−ＯＭｅである。表１２に列挙される配列の各々は、ポリアルキレングリコール（「ＰＡＧ」）部分を用いて誘導体化され得、そしてキャッピング（例えば、３’−逆位ｄＴ）を含んでいても含んでいなくてもよい。
表１２：ｄＲｍＹクローン配列
【０３２０】
【表１２−１】
2009521208.tif 000091
【０３２１】
【表１２−２】
2009521208.tif 000092
表１３：ｄＲｍＹクローンの結合性のまとめ
【０３２２】
【表１３−１】
2009521208.tif 000093
【０３２３】
【表１３−２】
2009521208.tif 000094
＊ドットブロットアッセイにおいてＫＤを決定するための室温、３０分間のインキュベーション
＊１×ＰＢＳ＋０．１ｍｇ／ｍＬのｔＲＮＡ、サケ精子ＤＮＡ、ＢＳＡ反応緩衝液
（ヒトＩＬ−２３アプタマーセレクションのまとめ）
ＩＬ−２３  ＳＥＬＥＸＴＭに対する様々なセレクションの条件およびストラテジーにより、様々な結合特性を有し、安定化され、そして／または最小化されたいくつかのアプタマーが得られた。ｒＲｆＹセレクションアプタマーは、およそ１５ｎＭから４６０ｎＭの範囲の親和性を有し、任意のＳＥＬＥＸＴＭ後の最適化の前に、およそ５０ｎＭから５μＭの範囲のＩＣ５０での細胞性効力（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｏｔｅｎｔｃｙ）を有する。これらは、結合特性の適切な増大によってさらに最小化され得、そして細胞ベースアッセイにおいて高い効力を示すと予想される。これらのアプタマーはまた、最も顕著にＩＬ−２３を識別し、ＩＬ−１２よりもＩＬ−２３を１００倍超識別する。
【０３２４】
ｒＲｍＹセレクション条件下で得られたアプタマーは、約８ｎＭ〜３μＭの範囲の親和性を有する。しかしながら、それらの細胞性効力は、ｒＲｆＹアプタマーの効力よりも低い。ｒＧｍＨ構築物に関しては、１点スクリーニングを行ったが、バックグラウンドに対するそれらの結合の程度が、ｒＲｍＹクローンほど良好でないので、いかなるそれ以上のものは行わなかった。４８個の粗ｒＧｍＨクローン転写物を１：２００希釈で使用し、また、０．１ｍｇ／ｍＬのｔＲＮＡを競合物として使用した。バックグラウンドに対する平均結合性は、たった約１４％であったのに対し、同じアッセイにおけるｒＲｍＹクローンの平均は、約３０％であり、１０クローンが、４０％超であった。
【０３２５】
ｄＲｍＹセレクションアプタマーは、約３ｎＭ〜約２００ｎＭの範囲の高親和性を有し、そしてＳＥＬＥＸＴＭ後の任意の最適化の前に、約５０ｎＭ〜約５００ｎＭの範囲のＩＣ５０という顕著な細胞性効力を示す（下記の実施例３に記載する）。これらのアプタマーのうちのいくつかはまた、ＩＬ−１２よりもＩＬ−２３に対して約４倍の識別性を有し、それは、さらなる最適化によって改善され得る。
【０３２６】
（実施例１Ｅ：２’−Ｆピリミジン含有プール（ｒＲｆＹ）を用いたマウス（「ｍ」）−ＩＬ−２３に対するセレクション）
導入：２’−ＯＨプリンおよび２’−Ｆピリミジンヌクレオチド（ｒＲｆＹ組成物）からなるプールを使用してｍＩＬ−２３に対するアプタマーを同定するために、２つのセレクションストラテジーを用いた。第１のセレクションストラテジー（ｍＩＬ−２３）は、ｍＩＬ−２３に対する直接的なセレクションであった。第２のセレクションストラテジー（ｍＩＬ−２３Ｓ）は、よりストリンジェントなセレクションであり、ここで、より親和性の高い結合物に向けたセレクションを推進する目的で、その初期の回でのＲＮＡおよびタンパク質の濃度はより低いものであった。
両方のセレクションストラテジーにより、ｍＩＬ−２３に対するアプタマーが得られた。
【０３２７】
セレクション：２つのセレクション（ｍＩＬ−２３およびｍＩＬ−２３Ｓ）は、γ３２Ｐ  ＡＴＰ  ５’末端標識プールのスパイクを含む、配列
【０３２８】
【化６４】
2009521208.tif 000095
（配列番号１１９）を含む２’Ｆピリミジン改変プールの２×１０１４分子とマウスＩＬ−２３（研究室内で単離されたもの）とのインキュベーションで開始した。鋳型（配列番号１１９）中のＮの連なりは、ヌクレオチドの任意の組み合わせであり得、得られるアプタマーに固有の配列領域をもたらす。
【０３２９】
ｍＩＬ−２３セレクションの第１回において、プールＲＮＡを最終容積１００μＬ中の５０ｐｍｏｌのタンパク質とともに室温で１時間インキュベートした。ｍＩＬ−２３Ｓセレクションの第１回では、プールＲＮＡを最終容積１３００μＬ中の６５ｐｍｏｌのｍＩＬ−２３とともに室温で１時間インキュベートした。セレクションは、１×ＰＢＳ緩衝液中で行った。ＲＮＡ：ｍＩＬ−２３複合体および遊離ＲＮＡ分子を、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ（Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）製の０．４５μｍニトロセルローススピンカラムを用いて分離した。そのカラムを、１ｍＬの１×ＰＢＳで予め洗浄し、次いで、ＲＮＡ：タンパク質含有溶液をそのカラムに加え、２０００ｒｐｍで１分間遠心した。緩衝液での洗浄は、非特異的結合物をフィルターから除去するために行い（第１回、２×５００μＬの１×ＰＢＳ；その後の回では、特異的な結合物を濃縮するために回数と容積を増やして、よりストリンジェントな洗浄）、次いで、溶出緩衝液（７Ｍ尿素、１００ｍＭ酢酸ナトリウム、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、９０℃に予め加熱しておいたもの）の２×２００μＬの洗浄（後の回では２×１００μＬの洗浄）により、フィルターに付着しているＲＮＡ：タンパク質複合体を溶出した。その溶出されたＲＮＡを沈殿させた（４０μｇのグリコーゲン、１容積のイソプロパノール）。そのＲＮＡを、３’プライマー
【０３３０】
【化６５】
2009521208.tif 000096
（配列番号１２１）を使用するＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔＴＭＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて製造者の指示書に従って逆転写した後、ＰＣＲ増幅（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．４、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５μＭの５’プライマー
【０３３１】
【化６６】
2009521208.tif 000097
（配列番号１２０）、０．５μＭの３’プライマー（配列番号１２１）、０．５ｍＭ  各ｄＮＴＰ、０．０５単位／μＬのＴａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））を行った。ＰＣＲ反応を以下のサイクル条件下で行った：ａ）９４℃３０秒；ｂ）６０℃３０秒；ｃ）７２℃３０秒。サイクルは、十分なＰＣＲ産物が精製されるまで繰り返した。十分なＰＣＲ産物を生成するのに必要なサイクルの最小数を表１４に「ＰＣＲ閾値」として報告する。
【０３３２】
ＰＣＲ鋳型を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。鋳型を、α３２Ｐ  ＧＴＰ本体標識を用いて３７℃で一晩転写した（４％ＰＥＧ−８０００、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭスペルミジン、０．００２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、３ｍＭ  ２’ＯＨプリン、３ｍＭ  ２’Ｆピリミジン、２５ｍＭ  ＤＴＴ、０．２５単位／１００μＬの無機ピロホスファターゼ、２μｇ／ｍＬ  Ｔ７  Ｙ６３９Ｆ単変異ＲＮＡポリメラーゼ、５ｕＣｉ  α３２Ｐ  ＧＴＰ）。
【０３３３】
第１回と同じであるがネガティブセレクション工程を加えた方法を用いて、その次の回を繰り返した。タンパク質標的とのインキュベーションの前に、プールＲＮＡを０．４５ミクロンのニトロセルロースフィルターカラムに通すことによって、フィルター結合配列を除去し、次いで、その濾液をポジティブセレクション工程において用いた。交互回において、プールＲＮＡをゲル精製した。転写反応を５０ｍＭ  ＥＤＴＡでクエンチし、エタノール沈殿し、次いで、１．５ｍｍ変性ポリアクリルアミドゲル（８Ｍ尿素、１０％アクリルアミド；１９：１のアクリルアミド：ビスアクリルアミド）上で精製した。プールＲＮＡを、３００ｍＭ  ＮａＯＡｃ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ中に受動的に溶出することによってゲルから取り出した後、３００ｍＭ酢酸ナトリウムおよび２．５容積のエタノールを加えてエタノール沈殿した。
【０３３４】
ＲＮＡは、全セレクションにわたってタンパク質過剰のままであった（約１μＭ  ＲＮＡ）。特定のセレクションに基づいて、タンパク質濃度を様々な低さの濃度に低下させた。セレクションに依存して、第２または３回の開始時に競合ｔＲＮＡを０．１ｍｇ／ｍＬで結合反応物に加えた。結合アッセイを選択した回において行い、合計７回を完了した。表１４には、セレクションの詳細（各回に用いたプールＲＮＡ濃度、タンパク質濃度およびｔＲＮＡ濃度を含む）が含まれている。結合アッセイとともに溶出値（フィルターカラムに通した全ＲＮＡのＣＰＭ値に対する、タンパク質結合ＲＮＡのＣＰＭ値の比）を用いてセレクションの進行をモニターした。
表１４：ｒＲｆＹ  ｍＩＬ−２３セレクション条件：
【０３３５】
【表１４−１】
2009521208.tif 000098
【０３３６】
【表１４−２】
2009521208.tif 000099
ｒＲｆＹ  ｍＩＬ−２３タンパク質結合解析：先に記載したようにプールのタンパク質結合親和性をモニターするために、全セレクションにわたってドットブロットアッセイを行った。ｍＩＬ−２３存在下でかなりのレベルのＲＮＡの結合性が観察された場合は、そのプールを、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を製造者の指示書に従って用いてクローニングした。両方のｍＩＬ−２３セレクションのために、第７回のプール鋳型をクローニングし、各セレクション由来の１６個の個別のクローンを、８点ｍＩＬ−２３力価測定を用いてアッセイした。スクリーニングした合計３２個のクローンのうち７個が、特異的な結合曲線を有し、それらを下記の表１６に列挙する。表１５には、その対応する配列を列挙する。他のすべてのものが、選別されていない未処理プールに類似した非特異的な結合曲線を示した。引き続いて、ｍＩＬ−２３に対する親和性が高いクローンを、マウスＩＬ−１２、ヒトＩＬ−２３およびヒトＩＬ−１２に対するタンパク質結合性について同じ様式でスクリーニングした。
【０３３７】
表１５において特徴付けられるｒＲｆＹアプタマーの核酸配列を以下に示す。以下の各アプタマーに固有の配列は、配列
【０３３８】
【化６７】
2009521208.tif 000100
（配列番号１２２）の直後のヌクレオチド１８から始まり、３’固定核酸配列
【０３３９】
【化６８】
2009521208.tif 000101
（配列番号１２３）に遭遇するまで続く。
【０３４０】
他に述べられない限り、以下に列挙される個別の配列は、５’から３’の方向で示されており、ｒＲｆＹ  ＳＥＬＥＸＴＭ条件下で選別されたマウスＩＬ−２３に結合する配列を示し、ここで、プリン（ＡおよびＧ）は２’−ＯＨであり、ピリミジン（ＵおよびＣ）は２’−フルオロである。表１５に列挙される配列の各々は、ポリアルキレングリコール（「ＰＡＧ」）部分を用いて誘導体化され得、そしてキャッピング（例えば、３’−逆位ｄＴ）を含んでいても含んでいなくてもよい。
表１５：ｍＩＬ−２３  ｒＲｆＹクローン配列
【０３４１】
【表１５−１】
2009521208.tif 000102
【０３４２】
【表１５−２】
2009521208.tif 000103
表１６：ｍＩＬ−２３  ｒＲｆＹクローンの結合活性
【０３４３】
【表１６】
2009521208.tif 000104
＊ＫＤ測定のための室温、３０分間のインキュベーション
＊１×ＰＢＳ＋０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ反応緩衝液
（実施例１Ｆ：マウスＩＬ−１２に対して特異性を有するマウスＩＬ−２３アプタマーのセレクション）
導入。マウスＩＬ−１２（ｍＩＬ−１２）に対する特異性を有する、マウスＩＬ−２３（ｍＩＬ−２３）に対するアプタマーを同定するために、１つのセレクションを行った。このセレクションは、第３回で開始する上節に記載したｒＲｆＹセレクションｍＩＬ−２３Ｓから分離したものであった。このセレクションにより、ｍＩＬ−１２よりも約３〜５倍の特異性を有する、ｍＩＬ−２３に対するアプタマーが得られた。
ｍＩＬ−２３Ｓ／ｍＩＬ−１２  ｎｅｇ  ｒＲｆＹセレクション。
マウスＩＬ−１２に対する特異性を有するマウスＩＬ−２３アプタマーを得るために、実施例１Ａにおいて上で記載したネガティブ（ＰＮ−ＩＬ−２３）セレクションにおけるタンパク質と同様に、マウスＩＬ−１２をネガティブセレクションに含めた。上の実施例１Ｅにおいて記載したｍＩＬ−２３Ｓセレクションの第２回から得られたＲＮＡを用いて、Ｒ３ＰＮ  ｍＩＬ−２３／１２ｎｅｇセレクションを開始し、ここで、ｍＩＬ−１２をセレクションのネガティブ工程に含めた。結合アッセイを選択した回において行い、セレクションを９回行った。セレクション条件（各回に使用したプールＲＮＡ濃度、タンパク質濃度およびｔＲＮＡ濃度を含む）を表１７にまとめた。結合アッセイとともに溶出値（フィルターカラムに通した全ＲＮＡのＣＰＭ値に対する、タンパク質結合ＲＮＡのＣＰＭ値の比）を用いてセレクションの進行をモニターした。
表１７：ｒＲｆＹ  ｍＩＬ−２３Ｓ／ｍＩＬ−１２  ｎｅｇフィルターセレクションのまとめ
【０３４４】
【表１７】
2009521208.tif 000105
セレクション緩衝液：１×ＰＢＳ
＊１時間のポジティブインキュベーション
ｒＲｆＹ  ｍＩＬ−２３Ｓ／ｍＩＬ−１２  ｎｅｇタンパク質結合解析。プールのタンパク質結合親和性をモニターするために、先に記載したドットブロット結合アッセイを全セレクションにわたって行った。微量の３２Ｐ標識ＲＮＡをｍＩＬ−２３またはｍＩＬ−１２と混合し、室温で３０分間、１×ＰＢＳ＋０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ中、最終容積３０μＬでインキュベートした。その反応物をドットブロット装置（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ  Ｍｉｎｉｆｏｌｄ−１  Ｄｏｔ  Ｂｌｏｔ，Ａｃｒｙｌｉｃ）に添加した。前節に記載したように結合曲線を作成した。ｍＩＬ−２３存在下でかなりのレベルのＲＮＡの結合性が観察された場合は、そのプールを、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を製造者の指示書に従って用いてクローニングした。第９回のプール鋳型をクローニングし、そしてセレクション由来の１０個の個別のクローンをｍＩＬ−２３に対する８点ドットブロット力価測定においてアッセイした。次いで、著しくｍＩＬ−２３に結合しているクローンを、ｍＩＬ−１２への結合性についてスクリーニングした。結合クローンのタンパク質結合特性を表１８にまとめた。スクリーニングした合計１０個のうち４つのクローンが、様々な親和性でｍＩＬ−２３およびｍＩＬ−１２に特異的に結合した。他のすべてのクローンは、選別されていない未処理プールに類似した非特異的結合曲線を示した。４つの結合クローンについての配列を以下の表１９に列挙する。
表１８：ｒＲｆＹ  ｍＩＬ−２３Ｓ／ｍＩＬ−１２  ｎｅｇクローン結合活性
【０３４５】
【表１８】
2009521208.tif 000106
＊ＫＤ測定のための室温、３０分間のインキュベーション
＊１×ＰＢＳ＋０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ反応緩衝液
表１９において特徴付けられるｒＲｆＹアプタマーの核酸配列を以下に示す。下記の各アプタマーに固有の配列は、配列
【０３４６】
【化６９】
2009521208.tif 000107
（配列番号１２２）の直後のヌクレオチド１８から開始し、３’固定核酸配列
【０３４７】
【化７０】
2009521208.tif 000108
（配列番号１２３）に遭遇するまで続く。
【０３４８】
他に述べられない限り、以下に列挙される個別の配列は、５’から３’の方向で示されており、ｒＲｆＹ  ＳＥＬＥＸＴＭ条件下で選別されたマウスＩＬ−２３に結合する配列を示し、ここで、プリン（ＡおよびＧ）は２’−ＯＨであり、ピリミジン（ＵおよびＣ）は２’−フルオロである。表１９に列挙される配列の各々は、ポリアルキレングリコール（「ＰＡＧ」）部分を用いて誘導体化され得、そしてキャッピング（例えば、３’−逆位ｄＴ）を含んでいても含んでいなくてもよい。
表１９：ｒＲｆＹ  ｍＩＬ−２３Ｓ／ｍＩＬ−１２  ｎｅｇ配列情報
【０３４９】
【表１９】
2009521208.tif 000109
（実施例２：組成物および配列の最適化ならびに配列決定）
（実施例２Ａ：最小化）
セレクションが成功した後およびアプタマー配列を決定した後、インビトロにおける機能性の測定に加えて、その意図された標的に対する結合特異性を保持しているが、結合特性が改善された（例えば、ＫＤおよび／またはＩＣ５０が改善された）一層短いオリゴヌクレオチド配列を得るために、それらの配列を最小化した。
【０３５０】
（実施例２Ａ．１：ｒＲｆＹクローンの最小化：）
実施例１Ａに記載したｒＲｆＹセレクション由来の結合親クローンを、タイプ１およびタイプ２と呼ばれる２つの主要なアプタマーのファミリーに分類した。図８Ａおよび８Ｂに、タイプ１およびタイプ２アプタマーの配列および予測される二次構造配置の例を示す。図９Ａおよび９Ｂに、タイプ１および２の最小化されたアプタマー配列および予測される二次構造配置を示す。
【０３５１】
上の実施例１に記載したＩＬ−２３結合解析および下記の実施例３に記載する細胞ベースアッセイのデータに基づいて、ｒＲｆＹ  ＰＮ−ＩＬ−２３セレクション由来のいくつかのタイプ１クローン（ＡＭＸ８４−Ａ１０（配列番号４３）、ＡＭＸ８４−Ｂ１０（配列番号４４）およびＡＭＸ８４−Ｆ１１（配列番号４６）を含む）を、さらなる特徴付けのために選択した。最小化されたＤＮＡ構築物オリゴヌクレオチドを転写し、ゲル精製し、そしてドットブロットアッセイにおいてｈ−ＩＬ−２３への結合性について試験した。
【０３５２】
最小化されたクローンのＡ１０ｍｉｎ５（配列番号１３９）、Ａ１０ｍｉｎ６（配列番号１４０）は、ＡＭＸ８４−Ａ１０（配列番号４３）に基づくものであり、最小化されたクローンのＢ１０ｍｉｎ４（配列番号１４４）およびＢ１０ｍｉｎ５（配列番号１４５）は、ＡＭＸ８４−Ｂ１０（配列番号４４）に基づくものであり、そして最小化されたクローンＦ１１ｍｉｎ２（配列番号１４７）は、ＡＭＸ８４−Ｆ１１（配列番号４６）に基づくものであった（図９Ａ）。これらのクローンを、γ−３２Ｐ  ＡＴＰで５’末端標識し、そして親クローンと同じ方法を用いてドットブロットアッセイにおいてＫＤ決定のためにアッセイした。すべてが、著しいタンパク質結合性を有し（表２１にまとめ）、そしてその各々は、下記の実施例３において記述するような細胞ベースアッセイにおいて試験されるとき、それらが由来するそれぞれの親クローンよりも高い効力を有していた。
【０３５３】
さらに、タイプ１およびタイプ２アプタマーを代表する最小化された構築物を作製し、そしてタイプ１およびタイプ２アプタマー配列ファミリーのコンセンサス（ｃｏｎｃｅｎｓｕｓ）配列に基づいて試験した。タイプ１．４（配列番号１５１）およびタイプ１．５（配列番号１５２）は、タイプ１ファミリー配列に基づいてそのような最小化された構築物の２つの例であり、それらは、上に記載した他のタイプ１最小化物と比較したとき、高いＩＬ−２３結合親和性および実施例３に記載する細胞ベースアッセイにおいて最も強い活性を示した。
【０３５４】
得られたｒＲｆＹ最小化物の配列を以下の表２０に列挙する。表２１には、表２０に列挙する最小化物についての最小化物の結合性データを示す。
【０３５５】
以下の表２０に記載される最小化ｒＲｆＹアプタマーについて、プリン（ＡおよびＧ）は、２’−ＯＨプリンであり、ピリミジン（ＣおよびＵ）は、２’−フルオロピリミジンである。他に述べられない限り、個別の配列は、５’から３’の方向で示される。表２０に列挙される配列の各々は、ポリアルキレングリコール（「ＰＡＧ」）部分を用いて誘導体化され得、そしてキャッピング（例えば、３’−逆位ｄＴ）を含んでいても含んでいなくてもよい。
表２０−ＰＮ−ＩＬ−２３  ２’Ｆ（ｒＲｆＹ）最小化物アプタマー配列
【０３５６】
【表２０−１】
2009521208.tif 000110
【０３５７】
【表２０−２】
2009521208.tif 000111
表２１−ＰＮ−ＩＬ−２３  ｒＲｆＹ最小化物の結合性データ
【０３５８】
【表２１】
2009521208.tif 000112
＊＊＋０．１ｍｇ／ｍＬのｔＲＮＡ、室温、３０分間のインキュベーションによりアッセイを行った
＊＊Ｒ＆Ｄ  ＩＬ−２３（キャリアを含まないタンパク質）
（実施例２Ａ．２：ｄＲｍＹセレクション１の最小化：）
ＩＬ−２３に結合するアプタマーに対するｄＲｍＹセレクションプロセス（上の実施例１Ｃに記載）およびオリゴヌクレオチド配列の決定の後、結合特性を保持する一層短いオリゴヌクレオチド配列を得るために、それらの配列を体系的に最小化した。上の実施例１Ａに記載したＩＬ−２３結合解析および下記の実施例３に記載する細胞ベースアッセイデータに基づいて、ＡＲＣ４８９（配列番号９１）（７４マー）をさらなる特徴付けのために選択した。クローンＡＲＣ４８９（配列番号９１）に基づいた３つの最小化された構築物を設計し、作製した。これらのクローンをγ−３２Ｐ  ＡＴＰで５’末端標識し、そして親クローンと同じ方法を用いてＫＤ決定のためにドットブロットアッセイにおいて、１×ＰＢＳ＋０．１ｍｇ／ｍＬのｔＲＮＡ、０．１ｍｇ／ｍＬのサケ精子ＤＮＡ、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ中、３０分間の室温でのインキュベーションにおいてアッセイした。表２２に、最小化ｄＲｍＹアプタマーについての配列を示す。表２３は、ｄＲｍＹ最小化アプタマーについての結合性データを含む。ただ１つの最小化クローンＡＲＣ５２７（配列番号１５９）だけが、ＩＬ−２３に対する結合性を示した。このクローンを、以下の実施例３に記載するＴｒａｎｓＡＭＴＭＳＴＡＴ３活性化アッセイにおいて試験し、そのそれぞれの親であるＡＲＣ４８９（配列番号９１）と比較して、アッセイ活性の低下が示された。
【０３５９】
以下の表２２に記載される最小化ｄＲｍＹアプタマーについて、プリン（ＡおよびＧ）は、デオキシ−プリンであり、ピリミジン（ＵおよびＣ）は、２’−ＯＭｅピリミジンである。他に述べられない限り、個別の配列は、５’から３’の方向で示されている。表２２に列挙される配列の各々は、ポリアルキレングリコール（「ＰＡＧ」）部分を用いて誘導体化され得、そしてキャッピング（例えば、３’−逆位ｄＴ）を含んでいても含んでいなくてもよい。
表２２：最小化ｄＲｍＹの配列
【０３６０】
【表２２】
2009521208.tif 000113
表２３：ｄＲｍＹセレクション１最小化物の結合特性
【０３６１】
【表２３】
2009521208.tif 000114
＊Ｒ＆Ｄ  ＩＬ−２３（キャリアを含まないタンパク質）
Ｎ．Ｂ．＝検出可能な結合は無し
（実施例２Ａ．３：ｄＲｍＹセレクション２の最小化：）
ＩＬ−２３に結合するアプタマーに対するｄＲｍＹセレクションプロセス（上の実施例１Ｄに記載）およびオリゴヌクレオチド配列の決定の後、結合特性を保持する一層短いオリゴヌクレオチド配列を得るために、それらの配列を体系的に最小化した。
【０３６２】
上の実施例１Ｄに記載した親ｄＲｍＹアプタマー配列の配列解析および目視検査に基づいて、ｄＲｍＹ  ｈ−ＩＬ−２３結合クローンおよびそれらの最小化構築物の活性な立体配座が、Ｇ−四量体（ｑｕａｒｔｅｔ）構造（図１０）にフォールディングすると仮定した。機能的結合配列の解析により、Ｇ二量体（Ｇ  ｄｏｕｂｌｅ）のパターンが、Ｇ四量体構造に一致することが明らかになった（表２４）。Ｇ四量体ファミリー内の配列を、２つのサブクラス（第１ステム中に３つの塩基対を含むものおよび２個の塩基対を含むもの）に分類した。二重鎖ＲＮＡおよびＤＮＡに結合するとエチジウムブロマイド蛍光が増大するという様式とほとんど同じ様式で、Ｇ−四量体構造に結合するとＮ−メチルメソポルフィリンＩＸ（ＮＭＭ）蛍光が増大することが報告されている（Ａｒｔｈａｎａｒｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２６（１６）：３７２４（１９９６）；Ｍａｒａｔｈａｉｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２８（９）：１９６９（２０００）；Ｊｏｙｃｅら、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，５８（７）：８３１（２００４））。従って、図１１に示されるように、ＮＭＭ蛍光を用いて、ＡＲＣ９７９（配列番号１７７）が実際にＧ−四量体構造をとることを確認した。文献のプロトコールに従って、マグネシウムおよびカルシウムを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳ中に約１マイクロモル濃度のＮＭＭおよび約２マイクロモル濃度のアプタマーを含む１００マイクロリットルの反応物を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  ＸＳ蛍光プレートリーダーを用いて解析した。励起波長４０５ｎｍで、蛍光発光スペクトルを５５０〜７５０ｎｍにおいて集めた。抗トロンビンＤＮＡアプタマーＡＲＣ１８３のＧ−四量体構造（Ｍａｃａｙａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，９０：３７４５（１９９３））をこの実験のポジティブコントロールとして用いた。ＡＲＣ１３４６は、Ｇ−四量体構造を有すると予測されていないＡＲＣ９７９（配列番号１７７）と類似のサイズおよびヌクレオチド組成のアプタマーであり、この実験のネガティブコントロールとして用いた。図１１に見られるように、ＡＲＣ１８３およびＡＲＣ９７９（配列番号１７７）は、ＮＭＭ単独と比較してＮＭＭ蛍光の著しい増加を示しているのに対し、ネガティブコントロールのＡＲＣ１３４６は、増加を示していない。
【０３６３】
最小化された構築物をＡＢＩ  ＥＸＰＥＤＩＴＥＴＭＤＮＡ合成装置において合成し、次いで、標準的な方法によって脱塩した。最小化されたクローンを１０％ＰＡＧＥゲル上でゲル精製し、そのＲＮＡを３００ｍＭ  ＮａＯＡｃおよび２０ｍＭ  ＥＤＴＡ中に受動的に溶出した後、エタノール沈殿を行った。
【０３６４】
それらのクローンをγ−３２Ｐ  ＡＴＰで５’末端標識し、そして直接的結合アッセイを用い、ＫＤ決定のためにドットブロットアッセイにおいてアッセイしたが、ここで、アプタマーは放射標識されており、また、室温での３０分間のインキュベーションのために０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含んだ１×ＰＢＳ中のＩＬ−２３の濃度は、様々であったが、そのアプタマーは極低濃度（＜９０ｐＭ）で保持されていた。［ＩＬ−２３］に対する結合アプタマーの割合を用いて、そのデータを以下の方程式：
結合アプタマーの割合＝振幅＊（［ＩＬ−２３］／（ＫＤ＋［ＩＬ−２３］））＋バックグラウンド結合
に当てはめることによってＫＤを算出した。
【０３６５】
非放射性アプタマーを力価測定し、微量３２Ｐ  ＡＴＰ標識アプタマーと競合させる競合形式で、ｄＲｍＹセレクション２由来の最小化された構築物のいくつかをアッセイした。競合アッセイにおいて、［ＩＬ−２３］を一定に保持し、［微量標識アプタマー］を一定に保持し、そして［非標識アプタマー］を変化させた。そのデータを以下の方程式：
結合アプタマーの割合＝振幅＊（［アプタマー］／（ＫＤ＋［アプタマー］））＋バックグラウンド結合
に当てはめることによってＫＤを算出した。
【０３６６】
Ｇ四量体に基づいた最小化物は、機能的結合物であったのに対し、ステムループ（ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅ；Ｄ．Ｈ．Ｍａｔｈｅｗｓら、「Ｅｘｐａｎｄｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  Ｉｍｐｒｏｖｅｓ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  Ｓｅｃｏｕｎｄａｒｙ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２８８，９１１−９４０，（１９９９））を予測するフォールディングアルゴリズムに基づき、かつＧ二量体のパターンを含まなかった最小化物は、機能的でなかった（ＡＲＣ７９３（配列番号１６３））。
【０３６７】
下記の表２５では、最小化された配列およびそれらが由来する親クローンをまとめ、表２６では、試験された最小化構築物の直接的結合アッセイ（＋／−ｔＲＮＡ）および競合結合アッセイからの結合特性をまとめている。
表２４：機能的クローンのアラインメント（Ｇ四量体内の領域のみを示している）
【０３６８】
【表２４】
2009521208.tif 000115
表２４に列挙したクローンについての配列番号は、表１２に見られるものである。
【０３６９】
以下の表２５に記載する最小化されたｄＲｍＹアプタマーについて、プリン（ＡおよびＧ）は、デオキシ−プリンであり、ピリミジン（ＣおよびＵ）は、２’−ＯＭｅピリミジンである。他に述べられない限り、個別の配列は、５’から３’の方向で示される。表２５に列挙される配列の各々は、ポリアルキレングリコール（「ＰＡＧ」）部分を用いて誘導体化され得、そしてキャッピング（例えば、３’−逆位ｄＴ）を含んでいても含んでいなくてもよい。
表２５：ｄＲｍＹ最小化物の配列
【０３７０】
【表２５−１】
2009521208.tif 000116
【０３７１】
【表２５−２】
2009521208.tif 000117
【０３７２】
【表２５−３】
2009521208.tif 000118
表２６：ｄＲｍＹ最小化物のタンパク質結合特性
【０３７３】
【表２６−１】
2009521208.tif 000119
【０３７４】
【表２６−２】
2009521208.tif 000120
リガンド（アプタマー）の濃度を変化させ、そしてレセプター（ＩＬ−２３）の濃度を一定に保持した飽和結合実験において競合結合データを再解析し、そして［総投入アプタマー］に対して［結合アプタマー］をプロットした。ＡＲＣ９７９（配列番号１７７）をこの解析に用いた。
【０３７５】
結合している［ＡＲＣ９７９］は、約１．７ｎＭで飽和し（図１２）、このことは、アプタマーとの結合が許容されるＩＬ−２３の濃度が、１ｎＭまたは投入ＩＬ−２３の２％（１／５０）であったことが示唆された。計算されたＫＤ値は、８ｎＭであり、これは、競合様式で示されたデータ（８．７ｎＭ）を当てはめることによって得られる値とよく一致している。
【０３７６】
ＩＬ−１２競合結合データを同じ解析に供したところ（図１３）、活性ＩＬ−１２の割合は、より高く（１０％）、また、ＩＬ−１２と比べたＩＬ−２３に対するＡＲＣ９７９の特異性（３３倍）は、直接的な結合測定によって予測された値（２〜５倍）よりも高かった。
【０３７７】
引き続いて、先に記載した結合反応条件（０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含む１×ＰＢＳによる室温での３０分間のインキュベーション）および異なる結合反応条件（０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含む１×Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳ（Ｍｇ＋＋およびＣａ＋＋含有）による室温での３０分間）を用いて、直接的な結合アッセイをＡＲＣ９７９について繰り返した。両方の条件において、新たに化学合成されたアプタマーを、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて精製し、γ−３２Ｐ  ＡＴＰで５’末端標識し、そして全長ヒトＩＬ−２３への直接的な結合について試験した。８点タンパク質力価測定をドットブロット結合アッセイ（｛１００ｎＭ、３０ｎＭ、１０ｎＭ、３ｎＭ、１ｎＭ、３００ｐＭ、１００ｐＭ、０ｐＭ｝または｛１０ｎＭ、３ｎＭ、１ｎＭ、３００ｐＭ、１００ｐＭ、３０ｐＭ、１０ｐＭ、０ｐＭ｝のいずれか）において使用した。ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ  ｖ．３．５１，Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて、方程式ｙ＝（最大値／（１＋Ｋ／タンパク質））＋ｙ切片に当てはめることによってＫＤ値を計算した。緩衝液の条件が、結合親和性にいくらか影響を及ぼすとみられた。１×ＰＢＳ条件下では、ＡＲＣ９７９についてのＫＤ値は、約１０ｎＭと計算されたのに対し、１×Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳ条件化では、ＡＲＣ９７９についてのＫＤ値は、約１ｎＭと計算された（図１４を参照のこと）。これらのＫＤ値は、その後のアッセイにおいて検証され（データ示さず）、以下の実施例３Ｄに記載されるＰＨＡ  ＢｌａｓｔアッセイにおいてＡＲＣ９７９がもたらす約６ｎＭというＩＣ５０値と一致するものである。
【０３７８】
（実施例２Ａ．４：マウスＩＬ−２３  ｒＲｆＹ最小化）
実施例１Ｅに記載したマウスＩＬ−２３  ｒＲｆＹアプタマーの親クローン配列の目視検査、およびＲＮＡフォールディングプログラム（ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を用いた予測ＲＮＡ構造に基づいて、７つの結合性ｍＩＬ−２３クローンの各々に対して、最小化された構築物を設計した。最小化された構築物オリゴ用のＰＣＲ鋳型は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｖｉｌｌｅ，ＩＡ）に発注した。構築物をＰＣＲ増幅し、転写し、ゲル精製し、そして先に記載したドットブロット結合アッセイを用いてｍＩＬ−２３への結合について試験した。微量３２Ｐ標識ＲＮＡを、ｍＩＬ−２３と混合し、１×ＰＢＳ＋０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ中、最終容積３０μＬで室温にて３０分間インキュベートした。この反応物をドットブロット装置（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ  Ｍｉｎｉｆｏｌｄ−１  Ｄｏｔ  Ｂｌｏｔ，Ａｃｒｙｌｉｃ）に添加した。前節で記載したように結合曲線を作成した。表３２には、ｍＩＬ−２３に結合する最小化構築物の配列を列挙する。表３３では、ｍＩＬ−２３への著しい結合性を有する各ｒＲｆＹ最小化構築物についてのタンパク質結合特性をまとめた。
【０３７９】
他に述べられない限り、以下に列挙される個別の配列は、５’から３’の方向で示されており、ｒＲｆＹ  ＳＥＬＥＸＴＭ条件下で選別されたマウスＩＬ−２３に結合する配列を示し、ここで、プリン（ＡおよびＧ）は２’−ＯＨであり、ピリミジン（ＵおよびＣ）は２’−フルオロである。表３２に列挙される配列の各々は、ポリアルキレングリコール（「ＰＡＧ」）部分を用いて誘導体化され得、そしてキャッピング（例えば、３’−逆位ｄＴ）を含んでいても含んでいなくてもよい。
表３２  最小化されたマウスｒＲｆＹクローン配列
【０３８０】
【表３２】
2009521208.tif 000121
表３３：ｍＩＬ−２３  ｒＲｆＹクローンのＫＤのまとめ
【０３８１】
【表３３】
2009521208.tif 000122
＊ＫＤ測定のための室温、３０分間のインキュベーション
＊１×ＰＢＳ＋０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ反応緩衝液
（実施例２Ｂ：医薬品化学による最適化）
アプタマー医薬品化学は、改変体アプタマーセットを化学合成するアプタマー改良法である。これらの改変体セットは、代表的には、単一置換基を導入することによって親アプタマーと異なるものとなり、また、この置換基の配置によって互いに異なるものとなる。次いで、これらの改変体を互いに、そしてその親と比較する。単一置換基を含むことが、特定の治療的基準を達成するために必要なすべてであり得るのに十分な特性の改良は意味深いものであり得る。
【０３８２】
あるいは、単一改変体のセットから集められる情報を用いて、２つ以上の置換基が同時に導入されるさらなる改変体セットを設計し得る。１つの設計ストラテジーでは、単一置換基改変体のすべてに順位をつけ、上位４つを選択し、これらの４つの単一置換基改変体のすべての可能性のある組み合わせ（２つからなるもの（６個）、３つからなるもの（４個）および４つからなるもの（１個））を合成し、アッセイする。第２の設計ストラテジーでは、最良の単一置換基改変体を新しい親と見なし、そしてこの最高位の単一置換基改変体を含む可能性のあるすべての置換基改変体（２つからなるもの）を合成し、アッセイする。他のストラテジーを使用してもよく、これらのストラテジーは、さらに改善される改変体を同定し続けながら置換基の数を徐々に増やして繰り返し適用され得る。
【０３８３】
アプタマー医薬品化学は、全体的ではなく局所的な置換基の導入を探索する方法として最も価値のある方法である。アプタマーは、転写によって生成されるライブラリー内で発見されるので、ＳＥＬＥＸＴＭプロセス中に導入されるいかなる置換基も全体的に導入されなければならない。例えば、ヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を導入することが望ましい場合、その結合は、すべてのＡ（またはすべてのＧ、Ｃ、Ｔ、Ｕなど）において導入され得るだけである（全体的な置換）。一部のＡ（またはいくつかのＧ、Ｃ、Ｔ、Ｕなど）においてホスホロチオエートを必要とするが、他のＡにおいてはホスホロチオエートを許容できないアプタマー（局所的な置換）は、このプロセスによって容易に発見され得ない。
【０３８４】
アプタマー医薬品化学プロセスによって利用され得る置換基の種類は、固相合成試薬としてそれらを作製し、オリゴマー合成スキームにそれらを導入する能力によってしか制限されない。無論、プロセスは、ヌクレオチドだけに制限されない。アプタマー医薬品化学スキームは、立体的なかさ高さ、疎水性、親水性、親油性、疎油性、正電荷、負電荷、中性電荷、両性イオン、分極率、ヌクレアーゼ耐性、配座的剛性、配座的可撓性、タンパク質結合特性、質量などを導入する置換基を含み得る。アプタマー医薬品化学スキームは、塩基改変、糖改変またはホスホジエステル結合改変を含み得る。
【０３８５】
治療的アプタマーの概念の中で有益である可能性のある置換基の種類を考慮するとき、以下のカテゴリーの１つ以上に分類される置換を導入することが望ましい場合がある：
（１）本体にすでに存在する置換基、例えば、２’−デオキシ、２’−リボ、２’−Ｏ−メチルプリンもしくはピリミジンまたは５−メチルシトシン。
（２）承認された治療薬のすでに一部である置換基、例えば、ホスホロチオエート結合したオリゴヌクレオチド。
（３）上記２カテゴリーの１つに加水分解または分解する置換基、例えば、メチルホスホネート結合したオリゴヌクレオチド。
【０３８６】
（実施例２Ｂ．１：ホスホロチオエート置換によるＡＲＣ９７９の最適化）
ＡＲＣ９７９（配列番号１７７）は、ｄＲｍＹ組成のＩＬ−２３に対する３４ヌクレオチドアプタマーである。各リン酸エステル結合（ＡＲＣ１１４９〜ＡＲＣ１１６９）（配列番号２０３〜配列番号２２３）において単一ホスホロチオエート置換がなされた２１個のＡＲＣ９７９のホスホロチオエート誘導体を設計し、合成した（表２７を参照のこと）。これらの分子をゲル精製し、上に記載したようなドットブロットアッセイを用いて、互いにそして親分子のＡＲＣ９７９と比較してＩＬ−２３結合についてアッセイした。８点ＩＬ−２３力価測定（０ｎＭ〜３００ｎＭ、３倍系列希釈）を結合アッセイにおいて使用した。算出されたＫＤを表２８にまとめた。
【０３８７】
ＡＲＣ９７９にホスホロチオエート結合を含めることは、ＡＲＣ９７９と比較して十分に許容された。これらの構築物の多くは、ＩＬ−２３に結合する割合が増大し、さらにそのＫＤ値が改善された（すなわち、低くなった）（図１５）。類似の親和性の増大は、競合アッセイにおいて見られ（図１６）、このことは、ＡＲＣ９７９のホスホロチオエート誘導体が、ＡＲＣ９７９より高い親和性でＩＬ−２３に対して競合することをさらに支持するものである。
【０３８８】
他に述べられない限り、以下の表２７に列挙される配列の各々は、５’から３’の方向であり、ポリアルキレングリコール（「ＰＡＧ」）部分を用いて誘導体化され得、そしてキャッピング（例えば、３’−逆位ｄＴ）を含んでいても含んでいなくてもよい。
表２７：ＡＲＣ９７９ホスホロチオエート誘導体の配列：単一ホスホロチオエート置換
【０３８９】
【表２７】
2009521208.tif 000123
表２８：ＡＲＣ９７９ホスホロチオエート誘導体に対するＫＤのまとめ
【０３９０】
【表２８−１】
2009521208.tif 000124
【０３９１】
【表２８−２】
2009521208.tif 000125
（実施例２Ｂ．２：最適化：２’−ＯＭｅ、ホスホロチオエートおよびイノシン置換）
体系的な改変をＡＲＣ９７９（配列番号１７７）に対して行うことにより、全体的な安定性および血漿ヌクレアーゼ耐性が増大した。ＡＲＣ９７９の最も安定で強力な改変体を、４期のアプタマー合成、精製および結合活性についてのアッセイを含む体系的な合成アプローチを通じて同定した。そのプロセスにおける第１工程は、ＡＲＣ１３８６（配列番号２２４）（３’逆位ｄＴを含むＡＲＣ９７９）の合成および結合活性についてのアッセイであった。一旦、ＡＲＣ１３８６（配列番号２２４）が、親分子ＡＲＣ９７９（配列番号１７７）の親和性と同様の親和性でＩＬ−２３に結合することが示されたら、その後のすべてのＡＲＣ９７９の誘導体は、安定化３’−逆位−ｄＴを用いて合成された。
【０３９２】
先に記載したドットブロット結合アッセイを用いて、合成した大部分のアプタマーの相対的効力を特徴付けた。ＫＤを決定するために、化学合成されたアプタマーを、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて精製し、γ−３２Ｐ  ＡＴＰで５’末端標識し、そして完全長ヒトＩＬ−２３への直接的な結合について試験した。８点タンパク質力価測定を、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳ（Ｍｇ＋＋およびＣａ＋＋含有）中でのドットブロット結合アッセイ（｛１００ｎＭ、３０ｎＭ、１０ｎＭ、３ｎＭ、１ｎＭ、３００ｐＭ、１００ｐＭ、０ｐＭ｝または｛１０ｎＭ、３ｎＭ、１ｎＭ、３００ｐＭ、１００ｐＭ、３０ｐＭ、１０ｐＭ、０ｐＭ｝のいずれか）において使用した。ＫＤ値は、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ  ｖ．３．５１，Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて方程式ｙ＝（最大値／（１＋Ｋ／タンパク質））＋ｙ切片に当てはめることにより計算した。合成され、精製され、そしてＩＬ−２３への結合についてアッセイされたＡＲＣ９７９誘導体の配列ならびにタンパク質結合特性の結果を下記の表２９および３０に作表した。表３０に見られるように、また、上の実施例２Ａ．３において先に記載したように、ＡＲＣ１３８６（配列番号２２４）（これは、３’逆位ｄＴを含むＡＲＣ９７９（配列番号１７７）である）は、これらの条件下において１ｎＭというＫＤを有する。
【０３９３】
ＡＲＣ１４２７〜ＡＲＣ１４７１（配列番号２２５〜２６９）を含む最適化プロセスの第１期において、ＡＲＣ１３８６（配列番号２２４）中の各個別のプリン残基を、対応する２’−Ｏメチル含有残基によって置換した。第１期ではさらに、ホスホロチオエート置換が、ヌクレアーゼ安定性をもたらすことに加えて、ＡＲＣ９７９の誘導体の結合親和性を増大させると示唆された、先に得られた結果に基づいて、一連の個別および混成のホスホロチオエート置換を試験した。最終的には、第１期の終わりに、ＡＲＣ９７９／ＡＲＣ１３８６の機能的状況におけるステム１の役割をさらに探索する試験を一連のアプタマーに行った。表３０における結合データからわかるように、多くの位置において、２’−Ｏメチル残基へのデオキシ残基の置換が容易に許容された。任意の特定のホスホロチオエートの付加は、アプタマーの親和性を著しく増大させるようにはみえなかった。興味深いことに、ＡＲＣ１４６５〜１４７１（配列番号２６３〜２６９）の比較によってわかるように、ステム１は、高い親和性結合の維持にとって重要であったが、しかしながら、アプタマーコアとステム１を含む２本の鎖との間へのＰＥＧスペーサーの導入が、アプタマーの結合特性に著しく影響すると思われなかったので、ステム１の役割は、構造的クランプであるように思われた。
【０３９４】
最適化プロセスの第１期からの構造活性関係（ＳＡＲ）結果に基づいて、第２のシリーズのアプタマーを設計し、合成し、精製し、そしてＩＬ−２３への結合について試験した。ＡＲＣ１５３９〜ＡＲＣ１５４５（配列番号２７０〜２７６）を含む第２期の最適化において、第１期からのデータを使用し、もっぱら２’−Ｏメチル置換を用いて、より高度に改変された複合性分子を作製した。これらの分子およびその後のすべての分子に対しては、約２ｎＭまたはそれよりも良好な親和性（ＫＤ）ならびに１００ｎＭ（または第３および４期では１０ｎＭ）で少なくとも５０％のＩＬ−２３に結合するという程度を保持した分子を同定することが目標であった。単純な結合親和性に関してこれらのうち最良のものは、ＡＲＣ１５４４（配列番号２７５）であった。
【０３９５】
ＡＲＣ１５９１〜ＡＲＣ１６２６（配列番号２７７〜３１２）を含む最適化の第３期では、ＡＲＣ９７９（配列番号１７７）のＧ−四量体構造の安定性は、デオキシイノシン（ｄＩ）による（デオキシグアノシン）ｄＧの体系的な置換の間にＩＬ−２３結合についてアッセイすることによって探査された。デオキシイノシンが、デオキシグアノシンに見られる環外アミンを有しないので、ｄＧからｄＩへの置換ごとに可能性のあるＧ−四量体からアミノ−Ｎ７水素結合が１つだけ除去される。データからわかるように、重大な置換だけが、ＩＬ−２３に対する親和性の実質的な低下をもたらすことから、アプタマー構造が頑強であることが示唆される。さらに、ＡＲＣ１５４４（配列番号２７５）へのホスホロチオエート含有残基の付加を評価した（ＡＲＣ１６２０〜ＡＲＣ１６２６（配列番号３０６〜３１２）を含む）。表３０に見られるように、ＡＲＣ１６２０〜１６２６（配列番号３０６〜３１２）の親和性は、ＡＲＣ９７９（配列番号１７７）と比較して実際に改善された。図１７は、第３期最適化の試み由来の選ばれたＡＲＣ９７９誘導体（ＡＲＣ１６２４およびＡＲＣ１６２５）についての結合曲線を示すものであり、ここで、選ばれたホスホロチオエート含有残基を含めることによってもたらされる結合親和性が、親分子ＡＲＣ９７９と比較して著しく改善されたことが示されている。
【０３９６】
ＡＲＣ１７５５〜１７５６（配列番号３１３〜３１４）を含む最適化の第４期は、一層多いデオキシを２’−Ｏメチル置換に導入し、親和性を保持する目的で、たった２つの配列だけを含むものであった。ＡＲＣ１７５５および１７５６とともに見られるように、これらの実験は成功であった。
【０３９７】
他に述べられない限り、表２９に列挙される配列の各々は、５’から３’の方向であり、ポリアルキレングリコール（「ＰＡＧ」）部分を用いて誘導体化され得る。
表２９：第１〜４期のＡＲＣ９７９最適化の配列情報
【０３９８】
【表２９−１】
2009521208.tif 000126
【０３９９】
【表２９−２】
2009521208.tif 000127
【０４００】
【表２９−３】
2009521208.tif 000128
【０４０１】
【表２９−４】
2009521208.tif 000129
【０４０２】
【表２９−５】
2009521208.tif 000130
【０４０３】
【表２９−６】
2009521208.tif 000131
【０４０４】
【表２９−７】
2009521208.tif 000132
【０４０５】
【表２９−８】
2009521208.tif 000133
表３０：結合特性
【０４０６】
【表３０−１】
2009521208.tif 000134
【０４０７】
【表３０−２】
2009521208.tif 000135
【０４０８】
【表３０−３】
2009521208.tif 000136
【０４０９】
【表３０−４】
2009521208.tif 000137
【０４１０】
【表３０−５】
2009521208.tif 000138
【０４１１】
【表３０−６】
2009521208.tif 000139
＊ＫＤ測定のための室温、３０分間のインキュベーション
＊１×Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳ（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋含有）＋０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ反応緩衝液
（実施例２Ｃ：抗ＩＬ−２３アプタマーの血漿安定性）
最適化プロセスの間に同定されたアプタマーのサブセットを、ヒト血漿中におけるヌクレアーゼ安定性についてアッセイした。以下に記載するような変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて血漿ヌクレアーゼ分解を測定した。簡潔には、血漿安定性測定に向けて、化学合成したアプタマーを、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて精製し、γ−３２Ｐ  ＡＴＰで５’末端標識し、次いで、再度ゲル精製した。２００マイクロリットルの結合反応物中において、９５％ヒト血漿中の１００ｎＭの未標識アプタマー存在下で微量３２Ｐ標識アプタマーをインキュベートした。血漿をＰＢＳに置き換えること以外は同じ成分を用いて時間０についての反応物を別個に作製し、ゲル上に負荷された放射能の量を、実験を通じて一致することを確実にした。反応物を、１、３、１０、３０および１００時間、サーモサイクラーにおいて３７℃でインキュベートした。各時点において、２０マイクロリットルの反応物を取り出し、２００マイクロリットルのホルムアミドローディング色素と混合し、そして液体窒素中で急凍し、−２０℃で保存した。最後の時点が終わった後、凍結サンプルを解凍し、各時点のものから２０マイクロリットルを取り出した。次いで、最終濃度が０．１％となるように少量のサンプルにＳＤＳを加えた。次いで、そのサンプルを９０℃で１０〜１５分間インキュベートし、１５％変性ＰＡＧＥゲル上に直接ロードし、１２Ｗで３５分間電気泳動した。Ｓｔｏｒｍ  ８６０  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いてゲル上の放射能を定量した。完全長アプタマーバンドを定量し、そしてレーン中の総数で割ることによって、各時点での完全長アプタマーのパーセンテージを決定した。次いで、各時点での完全長アプタマーの割合を、０時間での完全長アプタマーのパーセンテージに対して正規化した。時間の関数として完全長アプタマーの割合を方程式：
ｍ１＊ｅ＾（−ｍ２＊ｍ０）
（式中、ｍ１は、完全長アプタマーの最大％（ｍ１＝１００）であり；ｍ２は、分解速度である）
に当てはめた。アプタマーの半減期（Ｔ１／２）は、（ｌｎ２）／ｍ２に等しい。
【０４１２】
サンプルデータを図１８に示し、試験したアプタマーに対する結果を表３１にまとめる。
表３１：血漿安定性
【０４１３】
【表３１−１】
2009521208.tif 000140
【０４１４】
【表３１−２】
2009521208.tif 000141
（実施例２Ｄ：アプタマー−５’−ＰＥＧ結合体の合成）
抗ＩＬ−２３アプタマーＡＲＣ１６２３（配列番号３０９）およびＡＲＣ１６２６（配列番号３１２）の５’−ＰＥＧ結合体は、化学結合を促進するアプタマーの５’−アミン改変バージョンをまず合成することによって調製した。
【０４１５】
【化７１】
2009521208.tif 000142
を、ＡＫＴＡ  ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ１００合成装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）において製造者の推奨する手順に従って標準的な市販の２’−ＯＭｅ  ＲＮＡ、ＤＮＡホスホルアミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）および逆位デオキシチミジンＣＰＧ支持体を使用して合成した。硫化試薬（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）を使用し、標準的な手順に従ってホスホロチオエート結合を導入した。末端のアミン官能基を５’−アミノ−改変因子Ｃ６−ＴＦＡ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）と結合した。脱保護した後、そのオリゴヌクレオチドを、Ｓｕｐｅｒ  Ｑ  ５ＰＷ（３０）樹脂（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によるイオン交換クロマトグラフィによって精製し、そしてエタノール沈殿した。
【０４１６】
５’−アミン−改変アプタマーのアリコートを、合成後にＰＥＧ部分（例えば、４０ｋＤａ  ＰＥＧ部分）に結合体化した。アプタマーを水／ＤＭＳＯ（１：１）溶液に１．５〜３ｍＭの濃度に溶解した。炭酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ８．５を最終濃度１００ｍＭとなるように加え、そして等容積のアセトニトリルに溶解された、１．７〜３倍の過剰なモル濃度の所望のＰＥＧ試薬（４０ｋＤａ  Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ  ＧＬ２−４００ＮＰ  ｐ−ニトロフェニル炭酸エステル［ＮＯＦ  Ｃｏｒｐ，Ｊａｐａｎ］）とそのオリゴを一晩反応させた。得られた４０ｋＤａ  ＰＥＧ化産物をＳｕｐｅｒ  Ｑ  ５ＰＷ（３０）樹脂（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によるイオン交換クロマトグラフィによって精製し、Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ  ＣＧ３００−Ｓ樹脂（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ）において行われる逆相クロマトグラフィを用いて脱塩し、そして凍結乾燥した。
【０４１７】
得られた５’−ＰＥＧ化アプタマーの一般的な概略を図２６に示す。得られたＰＥＧ化アプタマー配列を以下に列挙する。小文字の「ｍ」および「ｄ」は、それぞれ２−Ｏ−メチルおよびデオキシ改変を示し、「ｓ」は、ヌクレオチド間のホスホロチオエート置換を示し、「ＮＨ」は、化学結合を促進するアミンを示し、そして「３Ｔ」は、３’逆位ｄＴを示している。
【０４１８】
（ＡＲＣ１９８８の結合解析）
Ｂｉａｃｏｒｅバイオセンサーシステムを用いて、ＩＬ−２３へのＡＲＣ１９８８（配列番号３１７）の結合性をＡＲＣ１６２３（配列番号３０９）と比較して測定した。
【０４１９】
すべてのバイオセンサー結合測定を、研究等級のＣＭ３バイオセンサーチップ（ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｉｎｃ．Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を装着したＢＩＡＣＯＲＥ  ２０００を用いて２５℃において行った。精製された組換えヒトＩＬ−２３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を、アミノ結合化学を用いてバイオセンサー表面に固定した。これを達成するために、０．１Ｍ  ＮＨＳ（Ｎヒドロキシスクシンイミド）と０．４Ｍ  ＥＤＣ（３−（Ｎ，Ｎジメチルアミン）プロピル−Ｎ−エチルカルボジイミド）との１：１混合物を用いて、５μｌ／分の流速で、２つの流動細胞の表面をまず７分間活性化した。表面活性化後に、一方の流動細胞を、５０μｇ／ｍｌのＩＬ−２３とともに１０μｌ／分の速度で１５分間注入することにより、活性化された表面への共有結合を確立させた。次に、１Ｍ  塩酸エタノールアミンｐＨ８．５を、不活性な残留エステルに５μｌ／分の速度で７分間注入した。ネガティブコントロールとして、不活性な残留エステルにタンパク質注入なしで１Ｍ  塩酸エタノールアミンｐＨ８．５を連続的に７分間注入することによって、空の流動細胞を調製した。
【０４２０】
ＩＬ−２３結合にむけて、アプタマーをＨＢＳ−Ｐ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ２０）に連続希釈した。様々な濃度のアプタマー（１．６ｎＭ〜１００ｎＭの範囲）サンプルを、結合のために２０μｌ／分の速度で連続的に５分間、一度に注入した後、５分間注入しない時間を設けた。その後の濃度を試験するために、２０μｌ／分の速度で３０秒間１Ｎ  ＮａＣｌを注入することによって表面を再生成した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ソフトウェアを用いて速度定数および解離定数を計算した。両方のＡＲＣ１９８８に対する解離定数（ＫＤ）を、Ｂｉａｃｏｒｅ法を用いて計算したところ、約２ｎＭであったことから、ＰＥＧ化が、ＡＲＣ１９８８の結合親和性に対して影響を与えなかったことが示唆される。
抗ＩＬ−２３アプタマーＡＲＣ１６２３およびＡＲＣ１６２６の５’ＰＥＧ結合体
【０４２１】
【化７２】
2009521208.tif 000143
（実施例２Ｅ：アプタマー−３’−５’−ＰＥＧ結合体の合成）
抗ＩＬ−２３アプタマーＡＲＣ１６２３（配列番号３０９）の５’−３’−ＰＥＧ結合体を、化学結合を促進するアプタマーの５’−アミン改変バージョンをまず合成することによって調製した。オリゴヌクレオチド
【０４２２】
【化７３】
2009521208.tif 000144
を、ＡＫＴＡ  ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ  １００合成装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）において製造者の推奨する手順に従って標準的な市販の２’−ＯＭｅ  ＲＮＡ、ＤＮＡホスホルアミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）および３’−フタルイミド−アミノ−改変因子Ｃ６  ＣＰＧ支持体（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）を使用して合成した。末端のアミン官能基を５’−アミノ−改変因子Ｃ６−ＴＦＡ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）と結合した。硫化試薬（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）を使用し、標準的な手順に従ってホスホロチオエート結合を導入した。脱保護した後、そのオリゴヌクレオチドを、Ｓｕｐｅｒ  Ｑ  ５ＰＷ（３０）樹脂（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によるイオン交換クロマトグラフィによって精製し、そしてエタノール沈殿した。
【０４２３】
３’−５’−ジアミン−改変アプタマーのアリコートを、合成後にＰＥＧ部分（例えば、２０ｋＤａ部分）に結合体化した。アプタマーを１．５〜３ｍＭの濃度に水／ＤＭＳＯ（１：１）溶液に溶解した。炭酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ８．５を最終濃度１００ｍＭとなるように加え、そしてそのオリゴを等容積のアセトニトリルに溶解された、２．７〜３．５倍の過剰なモル濃度の所望のＰＥＧ試薬（例えば、２０ｋＤａ  Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ  ＭＥＮＰ−２０Ｔ  ｐ−ニトロフェニル炭酸エステル［ＮＯＦ  Ｃｏｒｐ，Ｊａｐａｎ］）と一晩反応させた。得られた２×２０ｋＤａ  ＰＥＧ化産物をＳｕｐｅｒ  Ｑ  ５ＰＷ（３０）樹脂（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）におけるイオン交換クロマトグラフィによって精製し、Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ  ＣＧ３００−Ｓ樹脂（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ）において行われる逆相クロマトグラフィを用いて脱塩し、そして凍結乾燥した。
【０４２４】
得られた５’−ＰＥＧ化アプタマーの一般的な概略を図２７に示す。得られた二ＰＥＧ化アプタマー配列を以下に列挙する。小文字の「ｍ」および「ｄ」は、それぞれ２−Ｏ−メチルおよびデオキシ改変を示し、「ｓ」は、ヌクレオチド間のホスホロチオエート置換を示し、「ＮＨ」は、化学結合を促進するアミンを示している。
抗ＩＬ−２３アプタマーＡＲＣ１６２３の３’−５’−ＰＥＧ結合体
【０４２５】
【化７４】
2009521208.tif 000145
（実施例３：機能的細胞アッセイ）
（活性ｒＲｆＹ  ＩＬ−２３アプタマーの細胞ベースアッセイおよび最小化）
ＩＬ−２３は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達に関与しており、ＳＴＡＴ１、３、４および５をリン酸化する。ＩＬ−２３アプタマーが、細胞ベース活性を示すか否かを試験するために、ＰＨＡ（フィトヘマグルチニン）を含む培養液中で生育された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、すなわちＰＨＡ  Ｂｌａｓｔの溶解産物においてシグナル伝達をアッセイした。より詳細には、細胞ベースアッセイは、ＩＬ−２３アプタマーが、ＰＨＡ  Ｂｌａｓｔ中でＩＬ−２３誘導性ＳＴＡＴ−３リン酸化を阻害することができるか否かを判定するものであった。
【０４２６】
本質的には、ＩＬ−２３処理細胞の溶解産物は、静止状態の細胞またはアプタマーで阻止された細胞よりも活性化されたＳＴＡＴ３を含み得る。ＩＬ−２３誘導性ＳＴＡＴ３リン酸化の阻害は、２つの方法：抗リン酸型ＳＴＡＴ３抗体（Ｔｙｒ７０５）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いたウエスタンブロット；およびＴｒａｎｓＡＭＴＭアッセイ（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって測定された。ＴｒａｎｓＡＭＴＭアッセイキットは、ＳＴＡＴコンセンサス結合部位（５’ＴＴＣＣＣＧＧＡＡ−３’）を含むオリゴヌクレオチドが固定された９６ウェルプレートを備える。ＳＴＡＴ３が活性化されているときだけ到達可能なＳＴＡＴ３上のエピトープを認識する抗ＳＴＡＴ３抗体は、ＨＲＰ−結合体化２次抗体と組み合わせて使用することにより、分光測定によって定量可能な比色結果をもたらす（図１９を参照のこと）。
【０４２７】
まとめれば、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて全血から末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離することによって細胞ベースアッセイを行った。ＰＨＡを含み、ＩＬ−２（１００単位／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）が補充されたＰｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ）中で３〜５日間、３７℃／５％ＣＯ２でＰＢＭＣを培養することにより、ＰＨＡ  Ｂｌａｓｔがもたらされた。ＩＬ−２３アプタマーを試験するために、そのＰＨＡ  Ｂｌａｓｔを１×ＰＢＳで２回洗浄し、次いで、ＲＰＭＩ、０．２０％ＦＢＳ中で４時間、血清欠乏にした。血清欠乏後、約２００万細胞を、適切に標識されたエッペンドルフチューブに等分した。３ｎｇ／ｍＬという一定の最終濃度のｈＩＬ−２３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を、実施例１に記載したような様々なＩＬ−２３アプタマーの希釈系列と混合し、サイトカイン／アプタマー混合物を、等分された細胞に最終容積１００μｌで加え、３７℃で１０〜１２分間インキュベートした。このインキュベーション反応を、１ｍＬの１．５ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４を含んだ氷冷ＰＢＳを加えることによって停止した。製造者の指示書に従ってＴｒａｎｓＡＭＴＭＳＴＡＴ３アッセイによってもたらされる溶解緩衝液を用いて、細胞溶解産物を作製した。図２０には、細胞ベースアッセイに使用したプロトコールの流れのまとめを示している。
【０４２８】
２’−Ｆピリミジン含有プール（ｒＲｆＹ）、リボ／２’Ｏ−Ｍｅ含有プール（ｒＲｍＹ）、デオキシ／２’Ｏ−Ｍｅ含有プール（ｄＲｍＹ）および最適化されたｄＲｍＹアプタマーを用いた様々なセレクション由来の親アプタマーおよび最小化ＩＬ−２３アプタマーを、ＴｒａｎｓＡＭＴＭ法を用いて試験した。
【０４２９】
（実施例３Ａ：ｒＲｆＹセレクション由来の親クローンおよび最小化クローンについての細胞ベースアッセイ結果）
実施例１Ａに記載したｒＲｆＹセレクション由来の完全長クローンおよび実施例２Ａ．１に記載した、選ばれた最小化ｒＲｆＹクローンを、ＴｒａｎｓＡＭＴＭＳＴＡＴ３活性化アッセイを用いて試験した。実施例１Ａに記載したｒＲｆＹセレクションから得られたＩＬ−２３完全長アプタマーについての細胞ベースアッセイのデータを表３４にまとめている。実施例２Ａ．１に記載したｒＲｆＹ最小化クローンの活性データをそれぞれの親（完全長）クローンの活性と比較して表３５にまとめている。最小化ｒＲｆＹクローンＦ１１ｍｉｎ２（配列番号１４７）、Ａ１０ｍｉｎ５（配列番号１３９）、Ａ１０ｍｉｎ６（配列番号１４０）、Ｂ１０ｍｉｎ４（配列番号１４４）、Ｂ１０ｍｉｎ５（配列番号１４５）、タイプ１．４（配列番号１５１）およびタイプ１．５（配列番号１５２）各々は、ＴｒａｎｓＡＭＴＭＳＴＡＴ３活性化アッセイにおいて試験したとき、完全長ｒＲｆＹクローンのすべてに加えてそれぞれの親クローン（図２１を参照のこと）よりも優れていた。
表３４：細胞ベースアッセイ結果：試験したｒＲｆＹクローンのまとめ
【０４３０】
【表３４−１】
2009521208.tif 000146
【０４３１】
【表３４−２】
2009521208.tif 000147
【０４３２】
【表３４−３】
2009521208.tif 000148
表３５：親アプタマーと比較したときのＩＬ−２３  ２’Ｆ  ｒＲｆＹ最小化アプタマーの結合性
【０４３３】
【表３５】
2009521208.tif 000149
（実施例３Ｂ：第１ｄＲｍＹセレクション由来の親クローンおよび最小化クローンに対する細胞ベースアッセイの結果）
実施例１Ｃに記載したｄＲｍＹセレクションからの親クローンおよびこのセレクション（実施例２Ａ．２に記載）由来の最小化ｄＲｍＹクローンを、ＴｒａｎｓＡＭＴＭＳＴＡＴ３活性化アッセイを用いて活性について試験した。実施例１Ｃに記載した、ＩＬ−２３に対して最も高い結合親和性を示した３つの完全長ｄＲｍＹクローンであるＡＲＣ４８９（配列番号９１）、ＡＲＣ４９０（配列番号９２）、ＡＲＣ４９１（配列番号９４）を試験した。ＩＬ−２３に結合しないことを示したＡＲＣ４９２（配列番号９７）をネガティブコントロールとして使用した。ＡＲＣ４８９（配列番号９１）およびＡＲＣ４９１（配列番号９４）は、ＴｒａｎｓＡＭＴＭＳＴＡＴ３活性化アッセイにおいて類似の細胞ベース活性を示し、予備データは、５０ｎＭ〜５００ｎＭ範囲のＩＣ５０を示している（データ示さず）。
【０４３４】
ＩＬ−２３に結合することが示され、実施例２Ａ．２に記載されたｄＲｍＹ最小化の試みからの唯一の最小化クローンであるＡＲＣ５２７（配列番号１５９）を、ＴｒａｎｓＡＭＴＭＳＴＡＴ３活性化アッセイにおいて試験し、そのそれぞれの完全長ＡＲＣ４８９（配列番号９１）と比較してアッセイ活性の低下が示された（データ示さず）。
【０４３５】
（実施例３Ｃ：第２ｄＲｍＹセレクション由来の親クローンおよび最小化クローンについての細胞ベースアッセイの結果）
実施例１Ｄに記載されたｄＲｍＹセレクションからの親クローンおよびｈＩＬ−２３に対して高い親和性を示したこのセレクション（実施例２Ａ．３に記載）由来の最小化クローンを、３ｎｇ／ｍＬという一定のＩＬ−２３濃度と組み合わせた０〜３μＭ、３倍希釈の８点ＩＬ−２３力価測定を用いて、ＴｒａｎｓＡＭＴＭアッセイにおいて機能性についてスクリーニングした。完全長クローンについてのＩＣ５０を用量反応曲線から算出した。図２２は、ＴｒａｎｓＡＭＴＭアッセイにおいて強力な細胞ベース活性を示した、実施例１Ｄに記載されたセレクション由来のｄＲｍＹクローン（ＡＲＣ６１１（配列番号１０３）、ＡＲＣ６１４（配列番号１０５）、ＡＲＣ６２１（配列番号１０８）およびＡＲＣ６２７（配列番号１１０））についての用量反応曲線の例である。
【０４３６】
最小化ｄＲｍＹクローン（実施例２Ａ．３に記載）を機能性についてスクリーニングし、そしてＴｒａｎｓＡＭＴＭアッセイにおいてそれぞれの親クローンと比較した。ＩＣ５０を用量反応曲線から算出した。図２３は、親完全長クローンであるＡＲＣ６２１（配列番号１０８）およびＡＲＣ６２７（配列番号１１０）と比較したときの、いくつかのより強力な最小化ｄＲｍＹクローンであるＡＲＣ９７９（配列番号１７７）、ＡＲＣ９８０（配列番号１７８）、ＡＲＣ９８２（配列番号１８０）についての用量反応曲線の例である。３つの実験にわたって平均したとき、ＡＲＣ９７９（配列番号１７７）は、ＴｒａｎｓＡＭＴＭアッセイにおいて一貫して最良の結果（４０ｎＭ＋／−１０ｎＭのＩＣ５０）を示した。ＡＲＣ７９２（配列番号１６２）、ＡＲＣ７９４（配列番号１６４）、ＡＲＣ７９５（配列番号１６５）は、ＴｒａｎｓＡＭＴＭアッセイにおいても強力な活性を示した。
【０４３７】
（実施例３Ｄ：最適化されたＡＲＣ９７９誘導体についての細胞ベースアッセイの結果）
ｈＩＬ−２３に対して高い親和性を示した、実施例２Ｂ．２に記載の最適化されたＡＲＣ９７９誘導体のいくつかを、ＩＬ−２３誘導性ＳＴＡＴ３活性化を阻害する能力について、先に記載したＰＨＡ  Ｂｌａｓｔアッセイを用いてスクリーニングした。Ｐａｔｈｓｃａｎ（登録商標）Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）Ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いてＩＬ−２３誘導性ＳＴＡＴ３リン酸化の阻害を測定した。
【０４３８】
先に記載したＴｒａｎｓＡＭＴＭアッセイ方法と同様に、Ｐａｔｈｓｃａｎ（登録商標）Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）Ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔは、９６ウェルプレートのウェル上にコーティングされているＳＴＡＴ３ウサギモノクローナル抗体を使用することによって内在性レベルのＰｈｏｓｐｈｏ−ＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）タンパク質を検出する。細胞溶解産物とのインキュベーションの後、非リン酸型とリン酸型のＳＴＡＴ３タンパク質との両方をコーティングされた抗体によって捕捉する。リン酸型ＳＴＡＴ３マウスモノクローナル抗体を加えることにより、捕捉されたリン酸型ＳＴＡＴ３タンパク質を検出し、次いで、ＨＲＰ−連結抗マウス抗体を用いて、結合した検出抗体を認識する。ＨＲＰ基質であるＴＭＢを加えることによって発色させる。この発色についての光学密度の規模は、リン酸型ＳＴＡＴ３タンパク質の量に比例する。
【０４３９】
ＰＨＡ  Ｂｌａｓｔを単離し、上に記載したように調製し、そして、先に記載したようにＴｒａｎｓＡＭＴＭアッセイで３ｎｇ／ｍＬを使用する代わりに最終一定濃度６ｎｇ／ｍＬ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）においてｈＩＬ−２３で処理することにより、ＳＴＡＴ３活性化を誘導した。ＳＴＡＴ３活性化を誘導するために、先に記載したようにＴｒａｎｓＡＭＴＭアッセイで３ｎｇ／ｍＬを使用する代わりにＩＬ−２３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）の６ｎｇ／ｍＬという一定のＩＬ−２３濃度と組み合わせて、０〜７００ｎＭ、３倍希釈の６点ＩＬ−２３力価測定を用いることによってクローンをスクリーニングした。処理細胞の溶解産物を、Ｐａｔｈｓｃａｎキットに備えられていた緩衝液を用いて調製し、そして製造者の指示書に従ってアッセイを行った。完全長クローンについてのＩＣ５０を用量反応曲線から算出した。
【０４４０】
ＴｒａｎｓＡＭＴＭ法を用いたとき４０＋／−１０ｎＭというＩＣ５０を示したＡＲＣ９７９は、Ｐａｔｈｓｃａｎ（登録商標）法を用いたとき６＋／−１ｎＭというＩＣ５０を一貫して示した。先に述べたように、このＩＣ５０値は、ＡＲＣ９７９についての１ｎＭというＫＤ値と一致し、この値は、実施例２Ｂ．２に記載の直接結合アッセイ条件下で繰り返し確認された。表３６からわかるように、ＡＲＣ９７９の最適化された誘導体のいくつかは、Ｐａｔｈｓｃａｎ（登録商標）法を用いて直接比較したとき、ＡＲＣ９７９よりもさらに高い効力を著しく示し、特に、ＡＲＣ１６２４およびＡＲＣ１６２５は、それぞれ２ｎＭおよび４ｎＭというＩＣ５０値を示した。
【０４４１】
図２４は、ＩＬ−２３に対して高い親和性およびＰａｔｈｓｃａｎ（登録商標）アッセイにおいて強力な細胞ベース活性を示した最適化クローンのいくつかについての用量反応曲線の例である。表３６には、試験した最適化アプタマーについての用量反応曲線から得られたＩＣ５０をまとめた。
表３６：Ｐａｔｈｓｃａｎ（登録商標）アッセイにおける最適化ＡＲＣ９７９誘導体についてのＩＣ５０
【０４４２】
【表３６】
2009521208.tif 000150
（実施例３Ｅ：ＰＥＧ化抗ＩＬ−２３アプタマーＡＲＣ１９８８  Ｐａｔｈｓｃａｎ（登録商標）についての細胞ベースアッセイの結果）
５’−ＰＥＧ化アプタマーであるＡＲＣ１９８８（５’末端に結合体化された４０ｋＤａ  ＰＥＧを有するＡＲＣ１６２３）（配列番号３１７）を非ＰＥＧ化対応物であるＡＲＣ１６２３（配列番号３０９）と同時に上の実施例３Ｄに記載したＰａｔｈｓｃａｎアッセイにおいて試験した。図２８からわかるように、ＡＲＣ１９８８は、Ｐａｔｈｓｃａｎアッセイにおいて非ＰＥＧ化のＡＲＣ１６２３と比較してより強力であった。
【０４４３】
（マウス脾細胞によるＩＬ−１７生成）
ＡＲＣ１９８８（配列番号３１７）をＡＲＣ１６２３（配列番号３０９）と同時に、アプタマーがマウス脾細胞によるＩＬ−２３／ＩＬ−２誘導性ＩＬ−１７生成を阻害する能力を測定するように設定されたエキソビボ脾細胞アッセイにおいても試験した。脾細胞は、以下のように調製した。２匹のＣＤ−２雌マウス（６〜８週齢）（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から脾臓を（安楽死後に）取り出し、中型のペトリ皿に移した。脾臓をすりつぶすために先端が平坦な３ｍＬ注射器を用いて細胞を脾臓から分離した。分離後、細胞を回収し、５０ｍＬチューブに移し、そして１２００ｒｐｍで遠心することにより、細胞を沈殿させた。遠心分離後、沈殿した細胞を５ｍＬの溶解緩衝液（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ，ｃａｔ＃ｐ３０４−１００）に再懸濁し、そして室温で５分間インキュベートして赤血球を溶解した。溶解した後、ＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ  １６４０（Ｇｉｂｃｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ  ｃａｔ＃０７５９９）を用いて細胞を最終容積５０ｍＬにし、１２００ｒｐｍで５分間遠心することにより、細胞を沈殿させた。沈殿、溶解した細胞を１０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０に再懸濁した。次いで、溶解した細胞を計数し、９６ウェルＭｉｃｒｏｔｅｓｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅプレート（Ｆａｌｃｏｎ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ），ｃａｔ＃３５３０７２）中、最終容積５０μＬ  １に４×１０５細胞／ウェル（ｗｅｌ）の密度で蒔いた。
【０４４４】
ＩＬ−２３およびＩＬ−２を、マウス脾細胞によるＩＬ−１７生成を誘発するために使用し、αヒトＩＬ−１２（ｐ４０）抗体（Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）ｃａｔ＃５５４６５９）およびマウスＩｇＧ（Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ  ｃａｔ＃５５４７２１）を、ＡＲＣ１９８８アプタマー用のポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとして使用した。５０μｌのＩＬ−２（２０，０００Ｕ／ｍＬ）およびＩＬ−２３（２００ｎｇ／ｍＬ）を、それぞれ最終濃度５０００Ｕ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬとなるように各ウェルに加えた。５０μＬのアプタマー（４μＭ）またはコントロール抗体（８００ｎｇ／ｍＬ）のいずれかを、それぞれ最終濃度１μＭおよび２００ｎｇ／ｍＬとなるように適切なウェルに加えた。最終容積が２００μｌ／ウェルになるまでＲＰＭＩ−１６４０を各ウェルに加えた。蒔いて処理されたこれらの細胞を３７℃で２４時間インキュベートし、次いで、後の定量のために−２０℃で凍結するか、またはすぐに定量した。ＩＬ−１７生成をＥＬＩＳＡ（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｍｕｒｉｎｅ  ＩＬ−１７キットｃａｔ．＃Ｍ１７００，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）によって製造者の推奨プロトコールに従って定量した。
【０４４５】
図２９からわかるように、ＡＲＣ１９８８（４０ｋＤａ  ＰＥＧ）は、マウス脾細胞において用量依存的様式でＩＬ−２３誘導性ＩＬ−１７生成を阻害した（ＩＣ５０は２７ｎＭと算出された）のに対し、ＡＲＣ１６２３（無ＰＥＧ）は、マウス脾細胞においてＩＬ−２３誘導性ＩＬ−１７生成に影響を及ぼさなかった。この結果は、すぐ上に記載したＰａｔｈｓｃａｎアッセイにおけるＡＲＣ１６２３と比較したとき、ＡＲＣ１９８８で見られたようなＰＥＧ結合体化によってもたらされる活性の増大と一致する。
【０４４６】
（ＰＨＡ  ＢｌａｓｔによるＩＬ−１２およびＩＬ−２３依存性インターフェロンガンマ生成）
ＡＲＣ１９８８（配列番号３１７）を、ＰＨＡ  Ｂｌａｓｔにおいて抗ＩＬ−２３アプタマーがＩＬ−１２／ＩＬ−１８またはＩＬ−２３／ＩＬ−１８依存性ＩＦＮ−γ生成を阻害する能力について設定されたアッセイにおいても試験した。
【０４４７】
ＰＨＡ  Ｂｌａｓｔを単離し、上に記載したように調製した。ＰＨＡ  Ｂｌａｓｔを単離したら、使用する前に４日間培養した（使用の前夜に再供給しない）。４日間培養した後、適切な数の細胞（０．５×１０６細胞／ウェルで十分）を回収し、遠心分離によって沈殿させ、そしてＲＰＭＩ１６４０および．２％ＦＢＳで洗浄した（２回繰り返す）。次いで、それぞれ２５ｍＬのＲＰＭＩ１６４０−．２％ＦＢＳが入った２枚の１５０ｍＭ滅菌培養皿に２〜３時間置き換えることによってこれらの細胞を血清欠乏にした。血清欠乏後、細胞を、０．５×１０６細胞／２００μｌ血清欠乏培地の密度で９６ウェルマイクロタイタープレートに蒔いた。
【０４４８】
ＩＬ−１２／ＩＬ−１８またはＩＬ−２３／ＩＬ−１８を用いて、ＰＨＡ  ＢｌａｓｔにおいてＩＦＮ−γ生成を以下のように誘発した。６０ｎｇ／ｍＬという濃度の１０μｌのＩＬ−２３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（または２０ｎｇ／ｍＬという濃度の１０μｌのＩＬ−１２）および２００ｎｇ／ｍＬという濃度の１０μｌのＩＬ−１８（ＭＢＬ）を適切なウェルに加えた。ＡＲＣ１９８８の１０点連続希釈（１：３希釈、０〜６０ｕＭ）を血清欠乏培地中に調製し、各濃度の１０μｌを適切なウェルに加えた。蒔いた細胞の各ウェルの最終容積は、２３０μｌであり、各々以下の最終濃度を含んでいた：約３ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２３（または約１ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２）；約１ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１８；約０〜３μＭのＡＲＣ１９８８力価測定。αヒトＩＬ−１２（ｐ４０）抗体（Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）ｃａｔ＃５５４６５９）およびマウスＩｇＧ抗体（Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）ｃａｔ＃５５４７２１）をポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとして使用した。すべての点において２つ組で試験した。ＰＨＡ  Ｂｌａｓｔを３７℃で２４時間処理しながらインキュベートした。インキュベーション後、２００μｌの上清を各ウェルから取り出し、−８０℃で急凍するか、またはすぐにＩＦＮ−γについて定量した。ＥＬＩＳＡキットを用いて、製造者の推奨プロトコールに従ってＰＨＡ  ＢｌａｓｔにおけるＩＬ−２３／ＩＬ−１８およびＩＬ−１２／ＩＬ−１８誘導性ＩＦＮ−γを定量した（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ−γ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ｋｉｔ，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）。９６ウェルプレートリーダーを用いて比色結果を定量し、そして吸光度値をグラフにした。図３０は、ＡＲＣ１９８８が、用量依存的様式でＩＬ−２３／ＩＬ−１８とＩＬ−１２／ＩＬ−１８誘導性ＩＦＮ−γ生成の両方を阻害する（ＩＣ５０はそれぞれ約４ｎＭおよび約１２２ｎＭと算出される）ことを示しており、このことから、ＡＲＣ１９８８が予想されたようにＩＬ−１２よりもＩＬ−２３に対してより特異的であることが示唆される。
【０４４９】
（実施例３Ｇ：マウスＩＬ−２３セレクション由来の親クローンおよび最小化クローンについての細胞ベースアッセイの結果）
上に記載したＰＨＡ  ＢｌａｓｔアッセイおよびＴｒａｎｓＡＭＴＭ法を用いて、マウスＩＬ−２３が、ヒトＰＨＡ  ｂｌａｓｔにおいてＳＴＡＴ３を活性化することが示された（図２５を参照のこと）。それゆえ、実施例１Ｅに記載のマウスＩＬ−２３セレクション由来の親クローンおよびｍＩＬ−２３への親和性を示したこのセレクション（実施例２Ａ．４に記載）由来の最小化クローンがヒトＰＨＡ  ｂｌａｓｔ細胞においてマウスＩＬ−２３誘導性ＳＴＡＴ３活性化を阻止する能力を、ＴｒａｎｓＡＭＴＭアッセイを用いて測定した。使用したプロトコールは、３ｎｇ／ｍＬという濃度でヒトＩＬ−２３を使用する代わりに３０ｎｇ／ｍＬという濃度でマウスＩＬ−２３を用いてＰＨＡ  ＢｌａｓｔにおいてＳＴＡＴ３活性化を誘導したこと以外は、先に記載したプロトコールと同一であった。親クローンについての結果を表３７に列挙し、最小化クローンについての結果を以下の表３８に列挙する。
表３７：ＴｒａｎｓＡＭＴＭアッセイにおける親ｍＩＬ−２３−ｒＲｆＹクローン活性
【０４５０】
【表３７】
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＊複数の実験結果の平均。
表３８：ＴｒａｎｓＡＭＴＭアッセイにおけるマウスＩＬ−２３  ｒＲｆＹ最小化クローン活性
【０４５１】
【表３８】
2009521208.tif 000152
記述された説明および実施例によって本発明を説明してきたが、本発明が種々の実施形態において実施され得ることおよび上記の説明および実施例が例示目的であり、以下の特許請求の範囲を制限するものではないことを当業者は認識するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０４５２】
【図１】図１は、サイトカインのインターロイキン−１２ファミリーの略図である。
【図２】図２は、ランダム配列オリゴヌクレオチドのプールからのインビトロアプタマーセレクション（ＳＥＬＥＸＴＭ）プロセスの略図である。
【図３】図３は、ネガティブセレクション工程にＩＬ−１２を含めることによってＩＬ−２３に特異的なアプタマーを選別し、それによって、ＩＬ−１２とＩＬ−２３の両方に共通のサブユニットであるｐ４０を認識する配列を排除するためのインビトロセレクションスキームの概略図である。
【図４】図４は、４０ｋＤａ分枝状ＰＥＧの図である。
【図５】図５は、アプタマーの５’末端に結合した４０ｋＤａ分枝状ＰＥＧの図である。
【図６】図６は、標準的な一ＰＥＧ化、多ＰＥＧ化およびＰＥＧ化を介したダイマー形成を表している様々なＰＥＧ化ストラテジーを示している図である。
【図７】図７は、様々な回数のセレクションを行った後の、ＩＬ−２３へのｒＲｍＹおよびｒＧｍＨプールの結合を示しているグラフである。
【図８Ａ】図８Ａは、タイプ１ＩＬ−２３アプタマーの配列および予測される二次構造配置の代表的な概略図である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、いくつかのタイプ２ＩＬ−２３アプタマーの配列および予測される二次構造配置の代表的な概略図である。
【図９Ａ】図９Ａは、タイプ１ＩＬ−２３アプタマーの最小化されたアプタマー配列および予測される二次構造配置の概略図である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、タイプ２ＩＬ−２３アプタマーの最小化されたアプタマー配列および予測される二次構造配置の概略図である。
【図１０】図１０は、ｄＲｍＹ最小化物ＡＲＣ９７９（配列番号１７７）の予測されるＧ−四量体構造を示している。
【図１１】図１１は、ＡＲＣ９７９（配列番号１７７）におけるＮＭＭ蛍光の増加を示しているグラフであり、ＡＲＣ９７９がＧ−四量体構造をとることを裏付けている。
【図１２】図１２は、５０ｎＭのＩＬ−２３を用いて結合した総［アプタマー］に基づいて解析されたＡＲＣ９７９（配列番号１７７）競合結合曲線のグラフである。
【図１３】図１３は、２５０ｎＭのＩＬ−１２を用いて結合した［アプタマー］に基づいて解析されたＡＲＣ９７９（配列番号１７７）競合結合曲線のグラフである。
【図１４】図１４は、２つの異なる結合反応条件下（１×ＰＢＳ（Ｃａ＋＋またはＭｇ＋＋を含まない）または１×Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ  ＰＢＳ（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を含む）におけるＡＲＣ９７９（配列番号１７７）についての直接結合曲線のグラフである。
【図１５】図１５は、ＡＲＣ９７９（配列番号１７７）ホスホロチオエート誘導体についての直接結合曲線のグラフであり、単一ホスホロチオエート置換が、ＩＬ−２３への結合の割合の増大をもたらすことを示している。
【図１６】図１６は、ＡＲＣ９７９（配列番号１７７）ホスホロチオエート誘導体についての競合結合曲線のグラフであり、ＡＲＣ９７９において単一ホスホロチオエート置換が、ＩＬ−２３に対してより高い親和性で競合することを示している。
【図１７】図１７は、親ＡＲＣ９７９（配列番号１７７）アプタマーと比較した、ＡＲＣ９７９最適化誘導体であるＡＲＣ１６２４（配列番号３１０）およびＡＲＣ１６２５（配列番号３１１）についての直接結合曲線のグラフである（ＡＲＣ８９５はネガティブコントロールである）。
【図１８】図１８は、最適化ＡＲＣ９７９誘導体構築物と比較した、ＡＲＣ９７９（配列番号１７７）の血漿安定性を示しているグラフである。
【図１９】図１９は、本発明のアプタマーに曝露されたＰＨＡ  ｂｌａｓｔ細胞の溶解産物中のＳＴＡＴ３活性を測定するために使用したＴｒａｎｓＡＭＴＭアッセイの略図である。
【図２０】図２０は、本発明のアプタマーに曝露されたＰＨＡ  ｂｌａｓｔにおけるＩＬ−２３誘導性ＳＴＡＴ３リン酸化の検出に使用したプロトコールのフローチャートである。
【図２１】図２１は、ＴｒａｎｓＡＭＴＭアッセイを用いてＰＨＡ  ＢｌａｓｔにおけるＩＬ−２３誘導性ＳＴＡＴ３リン酸化に対するｒＲｆＹ組成の親ＩＬ−２３アプタマーの阻害効果をそれぞれの最適化クローンと比較して示している代表的なグラフである。
【図２２】図２２は、ＴｒａｎｓＡＭＴＭアッセイにおけるｄＲｍＹ組成のＩＬ−２３アプタマーによるＩＬ−２３誘導性ＳＴＡＴ３リン酸化のパーセント阻害のグラフである（ＡＲＣ７９３（配列番号１６３）は非結合アプタマーである）。
【図２３】図２３は、ＴｒａｎｓＡＭＴＭアッセイにおいて、最適化クローン（ＡＲＣ９７９（配列番号１７７）、ＡＲＣ９８０（配列番号１７８）、ＡＲＣ９８２（配列番号１８０））と比較した、ｄＲｍＹ組成のそれぞれの親ＩＬ−２３アプタマー（ＡＲＣ６２１（配列番号１０８）、ＡＲＣ６２７（配列番号１１０））によるＩＬ−２３誘導性ＳＴＡＴ３リン酸化のパーセント阻害のグラフである。
【図２４】図２４は、Ｐａｔｈｓｃａｎ（登録商標）アッセイにおける、ＡＲＣ９７９（配列番号１７７）およびＡＲＣ９７９の２つの最適化誘導体クローン（ＡＲＣ１６２４（配列番号３１０）およびＡＲＣ１６２５（配列番号３１１））によるＩＬ−２３誘導性ＳＴＡＴ３リン酸化のパーセント阻害グラフである。
【図２５】図２５は、ＴｒａｎｓＡＭＴＭアッセイによって測定された、ヒトＰＨＡ  ＢｌａｓｔにおいてヒトとマウスのＩＬ−２３誘導性ＳＴＡＴ３活性化を比較しているグラフである。
【図２６】図２６Ａは、抗ＩＬ−２３アプタマーの１つのＰＥＧ化ストラテジーの概略図であり、ここで、４０ｋＤａ分枝状ＰＥＧは、リンカーを介してアプタマーの５’末端に結合体化されている。図２６Ｂは、６個連続したＣＨ２基を含んでいるアルキルリンカーを介して５’末端に結合体化された４０ｋＤａ分枝状ＰＥＧを有する抗ＩＬ−２３アプタマーの概略図である。
【図２７Ａ】図２７Ａは、抗ＩＬ−２３アプタマーに対する１つのＰＥＧ化ストラテジーの概略図であり、ここで、２０ｋＤａ  ＰＥＧは、リンカーを介してアプタマーの５’末端と３’末端の両方に結合体化されている。
【図２７Ｂ】図２７Ｂは、６個連続したＣＨ２基を含んでいるアルキルリンカーを介してアプタマーの５’末端と３’末端の両方に結合体化された２０ｋＤａ  ＰＥＧを有する抗ＩＬ−２３アプタマーの概略図である。
【図２８】図２８は、Ｐａｔｈｓｃａｎ（登録商標）アッセイにおいてＡＲＣ１６２３（配列番号３０９）と比較したときのＡＲＣ１９８８（配列番号３１７）によるＩＬ−２３誘導性ＳＴＡＴ３リン酸化のパーセント阻害のグラフである。「コントロール」は、アッセイにおいてネガティブコントロールとして使用した非特異的で無関係のアプタマーである。
【図２９】図２９は、抗ＩＬ−２３アプタマーであるＡＲＣ１６２３（配列番号３１７）、ＡＲＣ１６２３（配列番号３０９）による、マウス脾細胞におけるＩＬ−２３／ＩＬ−２誘導性ＩＬ−１７生成の阻害を比較している棒グラフである。Ｘ軸上の「マイナスＩＬ−２３」との表示は、コントロール、すなわち、ＩＬ−２３なし（ＩＬ−２のみ）で処理されたマウス脾細胞を示し、Ｘ軸上の「プラスＩＬ−２３」との表示は、コントロール、すなわち、ＩＬ−２およびＩＬ−２３単独で処理されたマウス脾細胞を示し、凡例中の「ｐ４０  Ｍａｂ」との表示は、ＩＬ−２３／ＩＬ−２を用いて誘導されるマウス脾細胞を処理するために使用し、アプタマーに対するポジティブコントロールとして使用したヒトｐ４０抗体を示し、凡例中の「ｉｒｒ  ａｂ」は、ヒトｐ４０抗体に対してネガティブコントロールとして使用した無関係の抗体を示し、またそれは、Ｘ軸上の「Ａｂコントロール」との表示に対応し、そして凡例中の「ｉｒｒ  ａｐｔ」は、抗ＩＬ−２３アプタマーに対してネガティブコントロールとして使用した非特異的アプタマーを示す。
【図３０】図３０は、ＰＨＡ  Ｂｌａｓｔにおける、ＩＬ−２３／ＩＬ−１８およびＩＬ−１２／ＩＬ−１８誘導性インターフェロン−ガンマ生成の抗ＩＬ−２３アプタマーＡＲＣ１９８８（配列番号３１７）によるパーセント阻害を比較しているグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
2009521208000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成21年3月30日(2009.3.30)
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2009521208.tif 000328
2009521208.tif 000329
2009521208.tif 000330
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