(57)【要約】  本発明は、タンパク質、ペプチド及び他の分子中に非未酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-アミノ基をもつシステイン残基の化学選択的PEG化法に関する。ホモシステイン、セレノシステイン、ペニシラミン及びN-メチル-システイン残基の化学選択的PEG化の同様の方法を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ある分子のシステイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-アミノ基に遊離アルデヒド基を含むPEGを化学的に結合（conjugate）させる方法であって、前記PEGの遊離アルデヒド基と前記システイン残基の非酸化スルフドリル側鎖と遊離α-アミノ基とを反応させて、生成物中に1,3-チアゾリジン基を生成することを含み、ここで前記生成物は、構造：
【化１】
2009538357.tif 000054
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法。
【請求項２】
ある分子のシステイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-アミノ基に遊離アルデヒド基を含むPEGを化学的に結合させる方法であって、前記PEGの遊離アルデヒド基と前記システイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-アミノ基とを反応溶液中で反応させて、中間体に1,3-チアゾリジン基を生成し、前記反応溶液のpHを約7に調節し、これによって前記中間体が再配置して最終生成物を形成することを含み、ここで前記中間体は、構造：
【化２】
2009538357.tif 000055
をもち、前記最終生成物は、構造：
【化３】
2009538357.tif 000056
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法。
【請求項３】
前記遊離アルデヒド基は、アミド、エステル、スルホンアミド、スルホニル、チオール、オキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、マレイミド若しくはアミン官能基、またはその任意の組み合わせを含んでもよいリンカーによって前記PEGに結合している、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記PEGが線状構造をもつ、請求項1または2に記載の方法。
【請求項５】
前記PEGが分岐構造をもつ、請求項1または2に記載の方法。
【請求項６】
前記PEGが多アーム（multi-arm）構造をもつ、請求項1または2に記載の方法。
【請求項７】
一つ以上の遊離アルデヒド基を前記PEGに結合させる、請求項1または2に記載の方法。
【請求項８】
前記PEGが約100 Da〜約500,000 Daの平均分子量をもつ、請求項1または2に記載の方法。
【請求項９】
前記PEGが約1,000 Da〜約50,000 Daの平均分子量をもつ、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記システイン残基がL-形である、請求項1または2に記載の方法。
【請求項１１】
前記システイン残基がD-形である、請求項1または2に記載の方法。
【請求項１２】
前記システイン残基がタンパク質中にある、請求項1または2に記載の方法。
【請求項１３】
前記システイン残基がペプチド中にある、請求項1または2に記載の方法。
【請求項１４】
前記システイン残基が有機分子中にある、請求項1または2に記載の方法。
【請求項１５】
前記生成物または前記最終生成物が、一つ以上のタンパク質、ペプチド若しくは有機分子部分、またはその任意の組み合わせを含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項１６】
前記中間体が、一つ以上のタンパク質、ペプチド若しくは有機分子部分、またはその任意の組み合わせを含む、請求項2に記載の方法。
【請求項１７】
還元剤を前記反応で使用する、請求項1または2に記載の方法。
【請求項１８】
前記還元剤が、TCEP及び、非酸化スルフヒドリル基を含む化合物からなる群から選択される、請求項16に記載の方法。
【請求項１９】
ある分子のペニシラミン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-アミノ基に遊離アルデヒド基を含むPEGを化学的に結合させる方法であって、前記PEGの遊離アルデヒド基と前記ペニシラミン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-アミノ基とを反応させて、生成物中に5,5-ジメチル-1,3-チアゾリジン基を生成させることを含み、ここで前記生成物は、構造：
【化４】
2009538357.tif 000057
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法。
【請求項２０】
ある分子のペニシラミン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-アミノ基に遊離アルデヒド基を含むPEGを化学的に結合させる方法であって、反応溶液中で前記PEGの遊離アルデヒド基と前記ペニシラミン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-アミノ基とを反応させて、中間体に5,5-ジメチル-1,3-チアゾリジン基を生成させ、前記反応溶液のpHを約7に調節し、これによって前記中間体が再配置して最終生成物を形成することを含み、ここで前記中間体は、構造：
【化５】
2009538357.tif 000058
をもち、前記最終生成物は、構造：
【化６】
2009538357.tif 000059
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法。
【請求項２１】
前記遊離アルデヒド基は、アミド、エステル、スルホンアミド、スルホニル、チオール、オキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、マレイミド若しくはアミン官能基、またはその任意の組み合わせを含んでもよいリンカーによって前記PEGに結合している、請求項19または20に記載の方法。
【請求項２２】
前記PEGが線状構造をもつ、請求項19または20に記載の方法。
【請求項２３】
前記PEGが分岐構造をもつ、請求項19または20に記載の方法。
【請求項２４】
前記PEGが多アーム構造をもつ、請求項19または20に記載の方法。
【請求項２５】
一つ以上の遊離アルデヒド基を前記PEGに結合させる、請求項19または20に記載の方法。
【請求項２６】
前記PEGが約100 Da〜約500,000 Daの平均分子量をもつ、請求項19または20に記載の方法。
【請求項２７】
前記PEGが約1,000 Da〜約50,000 Daの平均分子量をもつ、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
前記ペニシラミン残基がL-形である、請求項19または20に記載の方法。
【請求項２９】
前記ペニシラミン残基がD-形である、請求項19または20に記載の方法。
【請求項３０】
前記ペニシラミン残基がタンパク質中にある、請求項19または20に記載の方法。
【請求項３１】
前記ペニシラミン残基がペプチド中にある、請求項19または20に記載の方法。
【請求項３２】
前記ペニシラミン残基が有機分子中にある、請求項19または20に記載の方法。
【請求項３３】
前記生成物または前記最終生成物が、一つ以上のタンパク質、ペプチド若しくは有機分子部分、またはその任意の組み合わせを含む、請求項19または20に記載の方法。
【請求項３４】
前記中間体が、一つ以上のタンパク質、ペプチド若しくは有機分子部分、またはその任意の組み合わせを含む、請求項19または20に記載の方法。
【請求項３５】
還元剤を前記反応で使用する、請求項19または20に記載の方法。
【請求項３６】
前記還元剤が、TCEP及び、非酸化スルフヒドリル基を含む化合物からなる群から選択される、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
ある分子のホモシステイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-アミノ基に遊離アルデヒド基を含むPEGを化学的に結合させる方法であって、前記PEGの遊離アルデヒド基と前記ホモシステイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-アミノ基とを反応させて、生成物中に六員環系を生成させることを含み、ここで前記生成物は、構造：
【化７】
2009538357.tif 000060
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法。
【請求項３８】
ある分子のホモシステイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-アミノ基に遊離アルデヒド基を含むPEGを化学的に結合させる方法であって、反応溶液中で前記PEGの遊離アルデヒド基と前記ホモシステイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-アミノ基とを反応させて、中間体に六員環系を生成させ、前記反応溶液のpHを約7に調節し、これによって前記中間体が再配置して最終生成物を形成することを含み、ここで前記中間体は、構造：
【化８】
2009538357.tif 000061
をもち、前記最終生成物は、構造：
【化９】
2009538357.tif 000062
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法。
【請求項３９】
前記遊離アルデヒド基は、アミド、エステル、スルホンアミド、スルホニル、チオール、オキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、マレイミド若しくはアミン官能基、またはその任意の組み合わせを含んでもよいリンカーによって前記PEGに結合している、請求項37または38に記載の方法。
【請求項４０】
前記PEGが線状構造をもつ、請求項37または38に記載の方法。
【請求項４１】
前記PEGが分岐構造をもつ、請求項37または38に記載の方法。
【請求項４２】
前記PEGが多アーム構造をもつ、請求項37または38に記載の方法。
【請求項４３】
一つ以上の遊離アルデヒド基を前記PEGに結合させる、請求項37または38に記載の方法。
【請求項４４】
前記PEGが約100 Da〜約500,000 Daの平均分子量をもつ、請求項37または38に記載の方法。
【請求項４５】
前記PEGが約1,000 Da〜約50,000 Daの平均分子量をもつ、請求項44に記載の方法。
【請求項４６】
前記ホモシステイン残基がL-形である、請求項37または38に記載の方法。
【請求項４７】
前記ホモシステイン残基がD-形である、請求項37または38に記載の方法。
【請求項４８】
前記ホモシステイン残基がタンパク質中にある、請求項37または38に記載の方法。
【請求項４９】
前記ホモシステイン残基がペプチド中にある、請求項37または38に記載の方法。
【請求項５０】
前記ホモシステイン残基が有機分子中にある、請求項37または38に記載の方法。
【請求項５１】
前記生成物または前記最終生成物が、一つ以上のタンパク質、ペプチド若しくは有機分子部分、またはその任意の組み合わせを含む、請求項37または38に記載の方法。
【請求項５２】
前記中間体が、一つ以上のタンパク質、ペプチド若しくは有機分子部分、またはその任意の組み合わせを含む、請求項37または38に記載の方法。
【請求項５３】
還元剤を前記反応で使用する、請求項37または38に記載の方法。
【請求項５４】
前記還元剤が、TCEP及び、非酸化スルフヒドリル基を含む化合物からなる群から選択される、請求項53に記載の方法。
【請求項５５】
ある分子のセレノシステイン残基の非酸化遊離セレノ基と遊離α-アミノ基に遊離アルデヒド基を含むPEGを化学的に結合させる方法であって、前記PEGの遊離アルデヒド基と前記セレノシステイン残基の非酸化遊離セレノ基と遊離α-アミノ基とを反応させて、生成物中に五員環系を生成させることを含み、ここで前記生成物は、構造：
【化１０】
2009538357.tif 000063
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法。
【請求項５６】
ある分子のセレノシステイン残基の非酸化遊離セレノ基と遊離α-アミノ基に遊離アルデヒド基を含むPEGを化学的に結合させる方法であって、反応溶液中で前記PEGの遊離アルデヒド基と前記セレノシステイン残基の非酸化遊離セレノ基と遊離α-アミノ基とを反応させて、中間体に五員環系を生成させ、前記反応溶液のpHを約7に調節し、これによって前記中間体が再配置して最終生成物を形成することを含み、ここで前記中間体は、構造：
【化１１】
2009538357.tif 000064
をもち、前記最終生成物は、構造：
【化１２】
2009538357.tif 000065
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法。
【請求項５７】
前記遊離アルデヒド基は、アミド、エステル、スルホンアミド、スルホニル、チオール、オキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、マレイミド若しくはアミン官能基、またはその任意の組み合わせを含んでもよいリンカーによって前記PEGに結合している、請求項55または56に記載の方法。
【請求項５８】
前記PEGが線状構造をもつ、請求項55または56に記載の方法。
【請求項５９】
前記PEGが分岐構造をもつ、請求項55または56に記載の方法。
【請求項６０】
前記PEGが多アーム構造をもつ、請求項55または56に記載の方法。
【請求項６１】
一つ以上の遊離アルデヒド基を前記PEGに結合させる、請求項55または56に記載の方法。
【請求項６２】
前記PEGが約100 Da〜約500,000 Daの平均分子量をもつ、請求項55または56に記載の方法。
【請求項６３】
前記PEGが約1,000 Da〜約50,000 Daの平均分子量をもつ、請求項62に記載の方法。
【請求項６４】
前記セレノシステイン残基がL-形である、請求項55または56に記載の方法。
【請求項６５】
前記セレノシステイン残基がD-形である、請求項55または56に記載の方法。
【請求項６６】
前記セレノシステイン残基がタンパク質中にある、請求項55または56に記載の方法。
【請求項６７】
前記セレノシステイン残基がペプチド中にある、請求項55または56記載の方法。
【請求項６８】
前記セレノシステイン残基が有機分子中にある、請求項55または56に記載の方法。
【請求項６９】
前記生成物または前記最終生成物が、一つ以上のタンパク質、ペプチド若しくは有機分子部分、またはその任意の組み合わせを含む、請求項55または56に記載の方法。
【請求項７０】
前記中間体が、一つ以上のタンパク質、ペプチド若しくは有機分子部分、またはその任意の組み合わせを含む、請求項56に記載の方法。
【請求項７１】
還元剤を前記反応で使用する、請求項55または56に記載の方法。
【請求項７２】
前記還元剤が、TCEP及び、非酸化遊離セレノ基を含む化合物からなる群から選択される、請求項53に記載の方法。
【請求項７３】
ある分子のN-メチル-システイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-メチル-アミノ基に遊離アルデヒド基を含むPEGを化学的に結合させる方法であって、前記PEGの遊離アルデヒド基と前記N-メチル-システイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-メチル-アミノ基とを反応させて、生成物中に3-メチル-1,3-チアゾリジン基を生成させることを含み、ここで前記生成物は、構造：
【化１３】
2009538357.tif 000066
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法。
【請求項７４】
前記遊離アルデヒド基は、アミド、エステル、スルホンアミド、スルホニル、チオール、オキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、マレイミド若しくはアミン官能基、またはその任意の組み合わせを含んでもよいリンカーによって前記PEGに結合している、請求項73に記載の方法。
【請求項７５】
前記PEGが線状構造をもつ、請求項73に記載の方法。
【請求項７６】
前記PEGが分岐構造をもつ、請求項73に記載の方法。
【請求項７７】
前記PEGが多アーム構造をもつ、請求項73に記載の方法。
【請求項７８】
一つ以上の遊離アルデヒド基を前記PEGに結合させる、請求項73に記載の方法。
【請求項７９】
前記PEGが約100 Da〜約500,000 Daの平均分子量をもつ、請求項73に記載の方法。
【請求項８０】
前記PEGが約1,000 Da〜約50,000 Daの平均分子量をもつ、請求項79に記載の方法。
【請求項８１】
前記N-メチル-システイン残基がL-形である、請求項73に記載の方法。
【請求項８２】
前記N-メチル-システイン残基がD-形である、請求項73に記載の方法。
【請求項８３】
前記N-メチル-システイン残基がタンパク質中にある、請求項73に記載の方法。
【請求項８４】
前記N-メチル-システイン残基がペプチド中にある、請求項73に記載の方法。
【請求項８５】
前記N-メチル-システイン残基が有機分子中にある、請求項73に記載の方法。
【請求項８６】
前記生成物が、一つ以上のタンパク質、ペプチド若しくは有機分子部分、またはその任意の組み合わせを含む、請求項73に記載の方法。
【請求項８７】
還元剤を前記反応で使用する、請求項73に記載の方法。
【請求項８８】
前記還元剤が、TCEP及び、非酸化スルフヒドリル基を含む化合物からなる群から選択される、請求項87に記載の方法。
【請求項８９】
ある分子のN-メチル-システイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖に遊離マレイミド基を含むPEGを化学的に結合させる方法であって、前記PEGの遊離マレイミド基と前記N-メチル-システインの非酸化スルフヒドリル側鎖とを反応させて複合体生成物（conjugate  product）を生成させることを含み、ここで前記複合体生成物は、構造：
【化１４】
2009538357.tif 000067
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法。
【請求項９０】
前記マレイミド基は、アミド、エステル、スルホンアミド、スルホニル、チオール、オキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、マレイミド若しくはアミン官能基、またはその任意の組み合わせを含んでもよいリンカーによって前記PEGに結合している、請求項89に記載の方法。
【請求項９１】
前記PEGが線状構造をもつ、請求項89に記載の方法。
【請求項９２】
前記PEGが分岐構造をもつ、請求項89に記載の方法。
【請求項９３】
前記PEGが多アーム構造をもつ、請求項89に記載の方法。
【請求項９４】
一つ以上の遊離マレイミド基を前記PEGに結合させる、請求項89に記載の方法。
【請求項９５】
前記PEGが約100 Da〜約500,000 Daの平均分子量をもつ、請求項89に記載の方法。
【請求項９６】
前記PEGが約1,000 Da〜約50,000 Daの平均分子量をもつ、請求項95に記載の方法。
【請求項９７】
前記N-メチル-システイン残基がL-形である、請求項89に記載の方法。
【請求項９８】
前記N-メチル-システイン残基がD-形である、請求項89に記載の方法。
【請求項９９】
前記N-メチル-システイン残基がタンパク質中にある、請求項89に記載の方法。
【請求項１００】
前記N-メチル-システイン残基がペプチド中にある、請求項89に記載の方法。
【請求項１０１】
前記N-メチル-システイン残基が有機分子中にある、請求項89に記載の方法。
【請求項１０２】
前記複合体生成物が、一つ以上のタンパク質、ペプチド若しくは有機分子部分、またはその任意の組み合わせを含む、請求項89に記載の方法。
【請求項１０３】
還元剤を前記反応で使用する、請求項89に記載の方法。
【請求項１０４】
前記還元剤が、TCEPである、請求項103に記載の方法。
【請求項１０５】
ある分子のペニシラミン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖に遊離マレイミド基を含むPEGを化学的に結合させる方法であって、前記PEGの遊離マレイミド基と前記ペニシラミン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖とを反応させて複合体生成物を生成させることを含み、ここで前記複合体生成物は、構造：
【化１５】
2009538357.tif 000068
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法。
【請求項１０６】
前記遊離マレイミド基は、アミド、エステル、スルホンアミド、スルホニル、チオール、オキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、マレイミド若しくはアミン官能基、またはその任意の組み合わせを含んでもよいリンカーによって前記PEGに結合している、請求項105に記載の方法。
【請求項１０７】
前記PEGが線状構造をもつ、請求項105に記載の方法。
【請求項１０８】
前記PEGが分岐構造をもつ、請求項105に記載の方法。
【請求項１０９】
前記PEGが多アーム構造をもつ、請求項105に記載の方法。
【請求項１１０】
一つ以上の遊離マレイミド基を前記PEGに結合させる、請求項105に記載の方法。
【請求項１１１】
前記PEGが約100 Da〜約500,000 Daの平均分子量をもつ、請求項105に記載の方法。
【請求項１１２】
前記PEGが約1,000 Da〜約50,000 Daの平均分子量をもつ、請求項111に記載の方法。
【請求項１１３】
前記ペニシラミン残基がL-形である、請求項105に記載の方法。
【請求項１１４】
前記ペニシラミン残基がD-形である、請求項105に記載の方法。
【請求項１１５】
前記ペニシラミン残基がタンパク質中にある、請求項105に記載の方法。
【請求項１１６】
前記ペニシラミン残基がペプチド中にある、請求項105に記載の方法。
【請求項１１７】
前記ペニシラミン残基が有機分子中にある、請求項105に記載の方法。
【請求項１１８】
前記複合体生成物が、一つ以上のタンパク質、ペプチド若しくは有機分子部分、またはその任意の組み合わせを含む、請求項105に記載の方法。
【請求項１１９】
還元剤を前記反応で使用する、請求項105に記載の方法。
【請求項１２０】
前記還元剤が、TCEPである、請求項119に記載の方法。
【請求項１２１】
ある分子のホモシステイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖に遊離マレイミド基を含むPEGを化学的に結合させる方法であって、前記PEGの遊離マレイミド基と前記ホモシステイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖とを反応させて複合体生成物を生成させることを含み、ここで前記複合体生成物は、構造：
【化１６】
2009538357.tif 000069
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法。
【請求項１２２】
前記遊離マレイミド基は、アミド、エステル、スルホンアミド、スルホニル、チオール、オキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、マレイミド若しくはアミン官能基、またはその任意の組み合わせを含んでもよいリンカーによって前記PEGに結合している、請求項121に記載の方法。
【請求項１２３】
前記PEGが線状構造をもつ、請求項121に記載の方法。
【請求項１２４】
前記PEGが分岐構造をもつ、請求項121に記載の方法。
【請求項１２５】
前記PEGが多アーム構造をもつ、請求項121に記載の方法。
【請求項１２６】
一つ以上のマレイミド基を前記PEGに結合させる、請求項121に記載の方法。
【請求項１２７】
前記PEGが約100 Da〜約500,000 Daの平均分子量をもつ、請求項121に記載の方法。
【請求項１２８】
前記PEGが約1,000 Da〜約50,000 Daの平均分子量をもつ、請求項127に記載の方法。
【請求項１２９】
前記ホモシステイン残基がL-形である、請求項121に記載の方法。
【請求項１３０】
前記ホモシステイン残基がD-形である、請求項121に記載の方法。
【請求項１３１】
前記ホモシステイン残基がタンパク質中にある、請求項121に記載の方法。
【請求項１３２】
前記ホモシステイン残基がペプチド中にある、請求項121に記載の方法。
【請求項１３３】
前記ホモシステイン残基が有機分子中にある、請求項121に記載の方法。
【請求項１３４】
前記複合体生成物が、一つ以上のタンパク質、ペプチド若しくは有機分子部分、またはその任意の組み合わせを含む、請求項121に記載の方法。
【請求項１３５】
還元剤を前記反応で使用する、請求項121に記載の方法。
【請求項１３６】
前記還元剤が、TCEPである、請求項135に記載の方法。
【請求項１３７】
ある分子のセレノシステイン残基の非酸化セレノ側鎖に遊離マレイミド基を含むPEGを化学的に結合させる方法であって、前記PEGの遊離マレイミド基とセレノシステイン残基の非酸化セレノ側鎖とを反応させて複合体生成物を生成させることを含み、ここで前記複合体生成物は、構造：
【化１７】
2009538357.tif 000070
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法。
【請求項１３８】
前記遊離マレイミド基は、アミド、エステル、スルホンアミド、スルホニル、チオール、オキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、マレイミド若しくはアミン官能基、またはその任意の組み合わせを含んでもよいリンカーによって前記PEGに結合している、請求項137に記載の方法。
【請求項１３９】
前記PEGが線状構造をもつ、請求項137に記載の方法。
【請求項１４０】
前記PEGが分岐構造をもつ、請求項137に記載の方法。
【請求項１４１】
前記PEGが多アーム構造をもつ、請求項137に記載の方法。
【請求項１４２】
一つ以上の遊離アルデヒド基を前記PEGに結合させる、請求項137に記載の方法。
【請求項１４３】
前記PEGが約100 Da〜約500,000 Daの平均分子量をもつ、請求項137に記載の方法。
【請求項１４４】
前記PEGが約1,000 Da〜約50,000 Daの平均分子量をもつ、請求項143に記載の方法。
【請求項１４５】
前記セレノシステイン残基がL-形である、請求項137に記載の方法。
【請求項１４６】
前記セレノシステイン残基がD-形である、請求項137に記載の方法。
【請求項１４７】
前記セレノシステイン残基がタンパク質中にある、請求項137に記載の方法。
【請求項１４８】
前記セレノシステイン残基がペプチド中にある、請求項137に記載の方法。
【請求項１４９】
前記セレノシステイン残基が有機分子中にある、請求項137に記載の方法。
【請求項１５０】
前記複合体生成物が、一つ以上のタンパク質、ペプチド若しくは有機分子部分、またはその任意の組み合わせを含む、請求項137に記載の方法。
【請求項１５１】
還元剤を前記反応で使用する、請求項137に記載の方法。
【請求項１５２】
前記還元剤が、TCEPである、請求項151に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
本発明は、タンパク質、ペプチド及び他の分子中に非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-アミノ基とをもつシステイン残基の化学選択的PEG化法に関する。
【０００２】
通常は経口経路で投与する小分子薬剤とは異なり、タンパク質-及びペプチド-ベースの治療薬は、これらの経口生物学的利用能が非常に低いため、注射によって通常投与される。注射後、殆どのタンパク質とペプチドは酵素によって急速に分解されて身体から除去されるため、in-vivo循環半減期（circulating half-life）が短くなる。循環半減期が短いと、薬効がより低下したり、投与頻度が増えたり、患者のコンプライアンスが低下したり、タンパク質及びペプチド治療薬のコストが上昇したりする原因となる。かくして、タンパク質及びペプチド薬の作用持続時間を引き延ばす方法を開発する必要性が大いにある。
【０００３】
タンパク質またはペプチドをポリエチレングリコール（PEG）に共有結合させることは、体内でのタンパク質及びペプチドの循環半減期を増大させる有用な方法であることが証明されてきた（Abuchowski, A. et al., Cancer Biochem. Biophys., 1984, 7：175-486；Hershfield, M.S. et al., N. Engl. J. Medicine 316：589-596；及びMeyers, F.J. et al., Clin. Pharmacol. Ther., 1991、49：307-313）。PEGのタンパク質及びペプチドへの共有結合は、酵素による分解に対して分子を守るだけでなく、身体からのクリアランス率も低下させる。あるタンパク質に結合したPEGのサイズは、そのタンパク質の循環半減期に大きな影響を与える。通常、PEGが大きくなればなるほど、結合したタンパク質のin-vivo半減期は長くなる。数種のサイズのPEGが市販されており（Nektar Advanced PEGylation Catalog 2005-2006；及びNOF DDS Catalogue、第7.1版）、これらは目的とする循環半減期をもつタンパク質及びペプチドの製造に適している。PEG部分はタンパク質、ペプチド及び他の分子の水溶性を高め、そして免疫原性を低下させる（Karte, N.V. et al., Proc. Natl. Aced. Sci. USA, 1998, 84：1487-1491；及びKarte. N.V. et al., J．Immunology, 1990, 144：209-213）。
【０００４】
タンパク質をPEG化する幾つかの方法が文献で報告されてきた。たとえば、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）-PEGを使用して、タンパク質のN-末端とリジン残基の遊離アミン基をPEG化した。タンパク質は通常、複数のリジン残基と末端アミン基とを含んでいるので、この方法を使用することによってタンパク質の複数の部位をPEG化する。複数のPEG部分は通常、タンパク質とその生物学的標的分子との相互作用を邪魔するので、そのような非選択的PEG化によりPEG化タンパク質の効能が減少してしまう（Teh, L.-C.及びChapman, G.E., Biochem．Biophys．Res．Comm., 1988, 150：391-398；並びにClark, R. et al., J．Biol．Chem, 1996, 271：21969-21977）。複数の部位、非選択的PEG化により、最終生成物の不均質混合物が生成する。これらの不均質PEG化タンパク質の多くは、その比活性度が低いため、医学的用途には適していない。不均質PEG化タンパク質を精製しそしてキャラクタリゼーションするのは難しい。不均質PEG化タンパク質の種々の製品バッチ間で内容物が異なることは非常に多く、これらの混合物の品質管理は難しい。
【０００５】
アルデヒド基を保持するPEGは還元剤の存在下でタンパク質のアミノ末端をPEG化するのに使用されてきたが、そのような方法では唯一のN-末端PEG化タンパク質は生成せず、タンパク質のリジン残基もPEG化されてしまう。かくして、得られたタンパク質も不均質混合物である（Kinstler O.B. et al., 米国特許出願第09/817,725号）。この方法も強い還元反応条件を使用するという欠点がある。シアノ水素化ホウ素などの還元剤はタンパク質に悪影響を与え、反応収率を低下させる。
【０００６】
マレイミド官能基をもつPEGは、タンパク質中のシステイン残基の遊離チオール基を選択的にPEG化するのに使用された。そのような方法では新しいシステインを使用する点変異が必要なことが多い。殆どのタンパク質は一つ以上のシステイン残基を含むので、この新しい「非天然」システイン残基のチオール基が他のシステイン残基でジスルフィド橋を選択的に形成しないように、そして特定の新しいシステインを選択的にPEG化するには、複雑な反応条件が必要である（2004年6月22日発行の米国特許第6,753,165号；及び2003年8月19日発行の米国特許第6,608,183号）。制御された反応条件下であっても、他のシステイン残基がPEG化して、不均質混合物が得られることがある。
【０００７】
成長ホルモン類似体のアセチル-フェニルアラニン残基の部位特異的PEG化が報告された。そのような方法では、非天然アミノ酸アセチル-フェニルアラニンを使用する点変異が必要である（2005年1月28日出願の米国特許出願第11/046,432号）。この方法の欠点の一つは、アセチル-フェニルアラニンなどの非天然アミノ酸を保持するタンパク質のPEG化は、細菌中でのみ実施され、哺乳類細胞中では起きなかったという点である。
【０００８】
アミンチオラクトンとインターロイキン-2の遊離アミン基との反応から生成した遊離チオールとアミン基は、タンパク質をPEG化するのに使用されてきた。しかしながらこの方法では、使用したアミンチオラクトンはタンパク質中のリジン残基のどんなアミン官能基やN-末端とも反応するので、この方法は部位選択的ではない（2001年10月30日発行の米国特許第6,310,180号）。
【０００９】
従って、様々なグループによる上記努力にもかかわらず、タンパク質、ペプチド及び他の分子の部位特異的PEG化の容易でそして実用的な方法を開発する必要性がいまだにある。
【００１０】
発明の概要
本発明は、通常、タンパク質、ペプチド及び他の分子の部位特異的PEG化の新規方法に関する。アルデヒド官能基を含むPEG（PEG-アルデヒド）は、広範囲なpHで水溶液中、非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-アミノ酸とを保持するシステインと自発的に反応して、チアゾリジンを生成し、PEGの親水性の性質とサイズが大きい（たとえば30 kDa）ため、確実ではなかったが、PEG-アルデヒドが種々の官能基を含むペプチドフラグメントと反応が可能になることが見出された。我々は、非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-アミノ基とをもつシステイン残基のみがPEG-アルデヒドと反応することも見出した。他の残基中の他の官能基（たとえば、遊離α-アミノ基のないシステインのチオール基、Argのグアニジニル基、Lysのアミノ基、Aspの側鎖カルボン酸基、Gluの側鎖カルボン酸基、Tyrのヒドロキシル基及びSerのヒドロキシル基）は、PEG-アルデヒドと反応しない。
【００１１】
タンパク質、ペプチド及び他の分子中の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-アミノ基とをもつシステイン残基のみがPEG化され、他のどのアミノ酸もPEG化されない。かくして本発明の方法は非常に部位選択的である。本発明のPEG化方法の部位特異的な性質によって、キャラクタリゼーション、精製及び製造が容易であり、そしてバッチ間で含有量変化がより少ない、より均質な生成物が得られる。タンパク質及びペプチドの特定の部位（即ち、N-末端システイン）に結合したPEGは、生物学的標的と相互作用する機会がより少なくなるはずなので、より強力な治療薬となるはずである。
【００１２】
本発明では、PEGのアルデヒド官能基は自発的に、ある範囲のpH（たとえばpH2〜8）及び種々の温度（たとえば室温）の水溶液中のタンパク質またはペプチドのN-末端で、システイン残基のアミンとチオール官能基と反応する。PEGとタンパク質またはペプチドとの間に新しく生成した官能基は1,3-チアゾリジンである。グルタミン酸及びアスパラギン酸残基のカルボキシル基とC-末端カルボキシ基、リジン残基のアミン基、アルギニン残基のグアニジニル基、中間のシステイン残基のチオール基、並びにセリン、トレオニン及びチロシン残基のヒドロキシ基は、そのようなPEG化条件下ではPEGのアルデヒド官能基と反応しない。かくして、本発明は、N-末端システイン残基の部位特異的PEG化を提供する。PEG化の間にジスルフィド架橋が形成しないようにするために、トリス（カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）などの還元剤を使用することができ、この反応は、窒素及びアルゴン下で実施することができる。PEG-アルデヒド1〜4当量を使用することができる。反応は、通常、溶液のpH及び使用したPEG-アルデヒドの当量に依存して2〜72時間で完了する。PEG化が変性（unfolded）タンパク質でおきると、このタンパク質生成物はPEG化の後でリフォールディングすることができる。PEG化を正確に折りたたまれたタンパク質で実施すると、リフォールディング段階は省略される。
【００１３】
本発明で使用するPEGは、様々な分子量（たとえば2〜40 kDa）をもち、線状、分岐及び多アーム構造をもち、そして一つまたは二つ以上のアルデヒド官能基を含む。二つのアルデヒド官能基を含むPEGを使用するとき、最終生成物はタンパク質またはペプチドダイマー（二量体）であり、その間のリンカーはPEGである。複数のアルデヒド官能基をもつPEGはPEG化タンパク質またはペプチドのマルチマーを生成する。
【００１４】
反応溶液のpHを制御するために、PBSなどの緩衝溶液系を使用することができる。反応溶液はEDTAなどの他の薬剤も含んで、反応を促進することができる。
【００１５】
最終PEG化タンパク質及びペプチドは、逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）、サイズ排除クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーなどの種々の精製方法によって精製することができ、MALDI-MS、クロマトグラフィー法、電気泳動、アミノ酸分析並びにタンパク質及びペプチドシーケンス法によりキャラクタリゼーションすることができる。
【００１６】
第一の態様において、本発明は、ある分子のシステイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-アミノ基に対して、遊離アルデヒド基を含むPEGを化学的に結合（conjugate）させる方法であって、前記PEGの遊離アルデヒド基と前記システイン残基の非酸化スルフドリル側鎖と遊離α-アミノ基とを反応させて、生成物中に1,3-チアゾリジン基を生成することを含み、ここで前記生成物は、構造：
【００１７】
【化１】
2009538357.tif 000002
【００１８】
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法に関する。
【００１９】
第二の態様において、本発明は、ある分子のシステイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-アミノ基に対して、遊離アルデヒド基を含むPEGを化学的に結合させる方法であって、前記PEGの遊離アルデヒド基と前記システイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-アミノ基とを反応溶液中で反応させて、中間体に1,3-チアゾリジン基を生成し、前記反応溶液のpHを約7に調節し、これによって前記中間体が再配置して最終生成物を形成することを含み、ここで前記中間体は、構造：
【００２０】
【化２】
2009538357.tif 000003
【００２１】
をもち、前記最終生成物は、構造：
【００２２】
【化３】
2009538357.tif 000004
【００２３】
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法に関する。ここで「約」なる用語は±10％を意味する。
【００２４】
第三の態様では、本発明は、ある分子のペニシラミン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-アミノ基に対して、遊離アルデヒド基を含むPEGを化学的に結合させる方法であって、前記PEGの遊離アルデヒド基と前記ペニシラミン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-アミノ基とを反応させて、生成物中に5,5-ジメチル-1,3-チアゾリジン基を生成させることを含み、ここで前記生成物は、構造：
【００２５】
【化４】
2009538357.tif 000005
【００２６】
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法に関する。
【００２７】
第四の態様では、本発明は、ある分子のペニシラミン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-アミノ基に対して、遊離アルデヒド基を含むPEGを化学的に結合させる方法であって、前記PEGの遊離アルデヒド基と前記ペニシラミン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-アミノ基とを反応溶液中で反応させて、中間体に5,5-ジメチル-1,3-チアゾリジン基を生成させ、そして前記反応溶液のpHを約7に調節し、これによって前記中間体が再配置して最終生成物を形成することを含み、ここで前記中間体は、構造：
【００２８】
【化５】
2009538357.tif 000006
【００２９】
をもち、前記最終生成物は、構造：
【００３０】
【化６】
2009538357.tif 000007
【００３１】
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法に関する。ここで「約」なる用語は±10％を意味する。
【００３２】
第五の態様において、本発明は、ある分子のホモシステイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-アミノ基に対して、遊離アルデヒド基を含むPEGを化学的に結合させる方法であって、前記PEGの遊離アルデヒド基と前記ホモシステイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-アミノ基とを反応させて、生成物中に六員環系を生成させることを含み、ここで前記生成物は、構造：
【００３３】
【化７】
2009538357.tif 000008
【００３４】
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法に関する。
【００３５】
第六の態様において、本発明は、ある分子のホモシステイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-アミノ基に対して、遊離アルデヒド基を含むPEGを化学的に結合させる方法であって、前記PEGの遊離アルデヒド基と前記ホモシステイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-アミノ基とを反応溶液中で反応させて、中間体に六員環系を生成させ、そして前記反応溶液のpHを約7に調節し、これによって前記中間体が再配置して最終生成物を形成することを含み、ここで前記中間体は、構造：
【００３６】
【化８】
2009538357.tif 000009
【００３７】
をもち、前記最終生成物は、構造：
【００３８】
【化９】
2009538357.tif 000010
【００３９】
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法に関する。ここで「約」なる用語は±10％を意味する。
【００４０】
第七の態様において、本発明は、ある分子のセレノシステイン残基の非酸化遊離セレノ基と遊離α-アミノ基に対して、遊離アルデヒド基を含むPEGを化学的に結合させる方法であって、前記PEGの遊離アルデヒド基と前記セレノシステイン残基の非酸化遊離セレノ基と遊離α-アミノ基とを反応させて、生成物中に五員環系を生成させることを含み、ここで前記生成物は、構造：
【００４１】
【化１０】
2009538357.tif 000011
【００４２】
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法に関する。
【００４３】
第八の態様において、本発明は、ある分子のセレノシステイン残基の非酸化遊離セレノ基と遊離α-アミノ基に対して、遊離アルデヒド基を含むPEGを化学的に結合させる方法であって、前記PEGの遊離アルデヒド基と前記セレノシステイン残基の非酸化遊離セレノ基と遊離α-アミノ基とを反応溶液中で反応させて、中間体に五員環系を生成させ、そして前記反応溶液のpHを約7に調節し、これによって前記中間体が再配置して最終生成物を形成することを含み、ここで前記中間体は、構造：
【００４４】
【化１１】
2009538357.tif 000012
【００４５】
をもち、前記最終生成物は、構造：
【００４６】
【化１２】
2009538357.tif 000013
【００４７】
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法に関する。ここで「約」なる用語は±10％を意味する。
【００４８】
第九の態様において、本発明は、ある分子のN-メチル-システイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-メチル-アミノ基に対して、遊離アルデヒド基を含むPEGを化学的に結合させる方法であって、前記PEGの遊離アルデヒド基と前記N-メチル-システイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-メチル-アミノ基とを反応させて、生成物中に3-メチル-1,3-チアゾリジン基を生成させることを含み、ここで前記生成物は、構造：
【００４９】
【化１３】
2009538357.tif 000014
【００５０】
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法に関する。
【００５１】
本発明の上記態様のそれぞれにおいて、即ち本発明の第一から第九の態様において、遊離アルデヒド基は、アミド、エステル、スルホンアミド、スルホニル、チオール、オキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、マレイミド、若しくはアミン官能基、またはその任意の組み合わせを含み得るリンカーを介して、前記PEGに結合する。
【００５２】
第十の態様において、本発明は、ある分子のN-メチル-システイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖に対して、遊離マレイミド基を含むPEGを化学的に結合させる方法であって、前記PEGの遊離マレイミド基と前記N-メチル-システインの非酸化スルフヒドリル側鎖とを反応させて複合体生成物（conjugate product）を生成させることを含み、ここで前記複合体生成物は、構造：
【００５３】
【化１４】
2009538357.tif 000015
【００５４】
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法に関する。
【００５５】
第十一の態様において、本発明は、ある分子のペニシラミン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖に対して、遊離マレイミド基を含むPEGを化学的に結合させる方法であって、前記PEGの遊離マレイミド基と前記ペニシラミン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖とを反応させて複合体生成物を生成させることを含み、ここで前記複合体生成物は、構造：
【００５６】
【化１５】
2009538357.tif 000016
【００５７】
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法に関する。
【００５８】
第十二の態様において、本発明は、ある分子のホモシステイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖に対して、遊離マレイミド基を含むPEGを化学的に結合させる方法であって、前記PEGの遊離マレイミド基と前記ホモシステイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖とを反応させて複合体生成物を生成させることを含み、ここで前記複合体生成物は、構造：
【００５９】
【化１６】
2009538357.tif 000017
【００６０】
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法に関する。
【００６１】
第十三の態様において、本発明は、ある分子のセレノシステイン残基の非酸化セレノ側鎖に対して、遊離マレイミド基を含むPEGを化学的に結合させる方法であって、前記PEGの遊離マレイミド基とセレノシステイン残基の非酸化セレノ側鎖とを反応させて複合体生成物を生成させることを含み、ここで前記複合体生成物は、構造：
【００６２】
【化１７】
2009538357.tif 000018
【００６３】
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法に関する。
【００６４】
本発明の上記態様のそれぞれにおいて、即ち本発明の第十から第十三の態様において、遊離マレイミド基は、アミド、エステル、スルホンアミド、スルホニル、チオール、オキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、マレイミド、若しくはアミン官能基、またはその任意の組み合わせを含み得るリンカーを介して、前記PEGに結合する。
【００６５】
本発明の上記態様の全てにおいて、PEGは線状構造、分岐構造または多アーム構造をとることができる。
【００６６】
本発明の上記態様の全てにおいて、PEGは約100 Da〜約500,000 Da、より好ましくは約1,000 Da〜約50,000 Daの平均分子量をもつ。
【００６７】
発明の詳細な説明
本明細書の記載に基づいて、当業者は本発明を存分に利用できると考えられよう。従って、以下の具体的な態様は、単なる例示であって、本開示の残りの部分をいかなるものにも限定するものではない。
【００６８】
他に記載しないかぎり、本明細書中で使用する全ての技術的及び科学的用語は、本明細書が関連する技術分野の当業者に通常理解されるのと同じ意味をもつ。また本明細書中で述べた全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参照文献は、その全体が参照として含まれる。
【００６９】
命名法及び略号
記号：意味
【００７０】
AlaまたはA：アラニン
ArgまたはR：アルギニン
AsnまたはN：アスパラギン
AspまたはD：アスパラギン酸
CysまたはC：システイン
hCys：ホモシステイン
GlnまたはQ：グルタミン
GluまたはE：グルタミン酸
GlyまたはE：グリシン
HisまたはH：ヒスチジン
IleまたはH：イソロイシン
LeuまたはL：ロイシン
LysまたはK：リジン
MetまたはM：メチオニン
Nle：ノルロイシン
N-Me-CysまたはNMeCys：N-メチル-システイン、以下の構造をもつ。
【００７１】
【化１８】
2009538357.tif 000019
【００７２】
PEG：ポリエチレングリコール
Pen：ペニシラミン
PheまたはF：フェニルアラニン
ProまたはP：プロリン
SerまたはS：セリン
セレノCys：セレノシステイン
ThrまたはT：トレオニン
TrpまたはW：トリプトファン
TyrまたはY：チロシン
ValまたはV：バリン。
【００７３】
本明細書中で使用した特定の他の略号は以下のようにして定義する：
Boc：tert-ブチルオキシカルボニル
Bzl：ベンジル
DCM：ジクロロメタン
DIC：N,N-ジイソプロピルカルボジイミド
DIEA：ジイソプロピルエチルアミン
Damb：4-｛N-（1-（4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン）-3-メチルブチル）-アミノ｝ベンジル
DMAP：4-（ジメチルアミノ）ピリジン
DMF：ジメチルホルムアミド
DNP：2,4-ジニトロフェニル
DTT：ジチオトレイトール
EDTA：エチレンジアミン四酢酸
Fmoc：フルオレニルメチルオキシカルボニル
HBTU：2-（1H-ベンゾトリアゾール-1-イル）-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
cHex：シクロヘキシル
HOAT：O-（7-アザベンゾトリアゾール-1-イル）-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
HOBt：1-ヒドロキシ-ベンゾトリアゾール
Me：メチル
Mmt：4-メトキシトリチル
NMP：N-メチルピロリドン
Pbf：2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニル
tBu：tert-ブチル
TCEP：トリス（カルボキシエチル）ホスフィン
TIS：トリイソプロピルシラン
TOS：トシル
trt：トリチル
TFA：トリフルオロ酢酸
TFFH：テトラメチルフルオロフォラミジニウム（tetramethylfluoroforamidinium）ヘキサフルオロホスフェート
Z：ベンジルオキシカルボニル
Tha：1,3-チアゾリジン-4-カルボン酸、以下の構造をもつもの：
【００７４】
【化１９】
2009538357.tif 000020
【００７５】
Tmc：1,3-ジアゾリジン-3-メチル-4-カルボン酸、以下の構造をもつもの：
【００７６】
【化２０】
2009538357.tif 000021
【００７７】
Dma：5,5-ジメチル-1,3-チアゾリジン-4-カルボン酸、以下の構造をもつもの：
【００７８】
【化２１】
2009538357.tif 000022
【００７９】
Thc：1,3-チアジナン-4-カルボン酸、以下の構造をもつもの：
【００８０】
【化２２】
2009538357.tif 000023
【００８１】
Sez：1,3-セレナゾリジン-4-カルボン酸、以下の構造をもつもの：
【００８２】
【化２３】
2009538357.tif 000024
【００８３】
Hth：2-ヒドロキシメチル-1,3-チアゾリジン-4-カルボン酸、以下の構造をもつもの：
【００８４】
【化２４】
2009538357.tif 000025
【００８５】
Hdm：2-ヒドロキシメチル-5,5-ジメチル-1,3-チアゾリジン-4-カルボン酸、以下の構造をもつもの：
【００８６】
【化２５】
2009538357.tif 000026
【００８７】
Haz：2-ヒドロキシメチル-1,3-チアゾリジン-4-カルボン酸、以下の構造をもつもの：
【００８８】
【化２６】
2009538357.tif 000027
【００８９】
Hsz：2-ヒドロキシメチル-1,3-セレナゾリジン-4-カルボン酸、以下の構造をもつもの：
【００９０】
【化２７】
2009538357.tif 000028
【００９１】
マレイミドは以下の構造をもつ：
【００９２】
【化２８】
2009538357.tif 000029
【００９３】
Prd：ピロリジン-2,5-ジオン、以下の構造をもつもの：
【００９４】
【化２９】
2009538357.tif 000030
【００９５】
NMeCys（Prd-PEG）は以下の構造をもつ：
【００９６】
【化３０】
2009538357.tif 000031
【００９７】
Pen（Prd-PEG）は以下の構造をもつ：
【００９８】
【化３１】
2009538357.tif 000032
【００９９】
hCys（Prd-PEG）は以下の構造をもつ：
【０１００】
【化３２】
2009538357.tif 000033
【０１０１】
セレノCys（Prd-PEG）は以下の構造をもつ：
【０１０２】
【化３３】
2009538357.tif 000034
【０１０３】
PEGは、市販されているか、当該技術分野において公知の方法に従ってエチレングリコールの開環重合により製造し得る、周知の水溶性ポリマーである（Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, VO13, 138-161）。「PEG」なる用語は、PEGのサイズにもその末端における修飾に関係なく、いずれかのポリエチレングリコール分子を広く包含するために使用する。PEGは、線状構造、分岐構造または多アーム構造をとることができる。
【０１０４】
実施例
実施例1）H-NMeCys-Lys-Phe-NH2の製造
【０１０５】
【化３４】
2009538357.tif 000035
【０１０６】
RinkアミドMBHA樹脂（211 mg、0.152 mmol）（Novabiochem, San Diego, CA）をジクロロメタン（DCM）中に膨潤させて、ジメチルホルムアミド（DMF）で洗浄した。この樹脂を25％ピペリジン／DMF（10 mL）溶液で2×10分間処理することによって脱ブロックした。この樹脂をDMF（10 mL）で三回洗浄した。第一のアミノ酸を、Fmoc-Phe-OH（Novabiochem, San Diego, CA）（235 mg、0.606 mmol）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）（92.3 mg、0.606 mmol）及びジイソプロピルカルボジイミド（DIC）（77 mg、0.606 mmol）のN-メチルピロリドン（NMP）（2 mL）中の溶液で1時間処理して、樹脂に結合させた。この樹脂を濾過し、DMF（10 mL）で三回洗浄した。
【０１０７】
Fmoc保護基を25％ピペリジン／DMF（10 mL）溶液で2×10分間処理して除去し、樹脂をDMF（10 mL）で3回洗浄した。Fmoc-Lys（Boc）-OH（Novabiochem, San Diego, CA）（285 mg、0.606 mmol）を、NMP（2 mL）中のHOBt（0.606 mmol）とDIC（0.606 mmol）の存在下で1時間、得られた遊離アミン樹脂に結合させた。
【０１０８】
脱ブロック及び洗浄手順を上記の通り繰り返した。Fmoc-N-Me-Cys（Trt）-OH（Timen Chemicals, Lodz, Poland）（100 mg、0.167 mmol）をNMP（2 mL）中のHOBt（51 mg、0.33 mmol）とDIC（83.8 mg、0.66 mmol）を使用して、得られたペプチド樹脂に12時間結合させた。Fmoc-N-Me-Cys（Trt）-OH（45 mg、0.075 mmol）のカップリングをNMP（2 mL）中のテトラメチルフルオロホルムアミジニウムペンタフルオロホスフェート（TFFH）（20 mg、0.075 mmol）とジイソプロピルエチルアミン（DIEA）（19.4 mg、0.150 mmol）を1時間使用して繰り返した。脱ブロック及び洗浄手順は上記の通り繰り返した。樹脂をDCMで3回洗浄し、次いでメタノールで3回洗浄した。この樹脂を真空下で乾燥した。
【０１０９】
ペプチドは、樹脂を8％トリスプロピルシラン／トリフルオロ酢酸（TFA）（2 mL）で2時間、震蘯することによって樹脂から切り出した。この樹脂を濾過し、DCM（2 mL）で洗浄した。濾液を合わせ、1 mLに濃縮した。ジエチルエーテル（35 mL）を添加してペプチドを沈殿させた。沈殿したペプチドを遠心分離後に集めた。ペレットを水とアセトニトリルに溶解し、次いで凍結乾燥した。
【０１１０】
得られた粗生成物を逆相HPLC系（Luna 5ミクロンC8（2）100×20 mmカラム）上、100％緩衝液A（水中0.1％TFA）と0％緩衝液B（アセトニトリル中0.1％TFA）から80％緩衝液Aと20％緩衝液Bに30分間かけて溶出することにより精製し、235 nmでモニターした。凍結乾燥後、51.2 mgの最終生成物が得られた。410.3 DaにおけるM＋1イオンがESI質量分析により検出され、これは409.6 Daの計算分子量と一致する。
【０１１１】
実施例2）mPEG-Tmc-Lys-Phe-NH2の製造
本実施例のmPEGは、CH3O（CH2CH2O）n-（CH2）2-の構造をもち、ここでnは正の整数である。
【０１１２】
【化３５】
2009538357.tif 000036
【０１１３】
実施例1のペプチド生成物（0.5 mg、1.22マイクロモル）をpH4の緩衝液（20 mmolのNaOAc、150 mmolのNaCl及び1 mmolのEDTA）1.0 mL中に溶解した。この得られた溶液に、mPEG-アルデヒド（1.5当量、平均分子量は31378 Da、NOF Corp., Tokyo, Japan）を添加した。この反応は、逆相分取分析HPLC系（Vydac C18 5μペプチド／タンパク質カラム、4.6×250 mm）を使用して実施した分析に基づいて、室温で27時間後に約90％完了した。この反応混合物を5 mL Zeba（商標）脱塩スピンカラム（Pierce Biotechnology, Rockford, IL）に適用した。凍結乾燥後に白色泡状物が得られた（36.7 mg）。
【０１１４】
実施例3）H-NMeCys（Prd-PEG）-Lys-Phe-NH2の製造
【０１１５】
【化３６】
2009538357.tif 000037
【０１１６】
実施例1のペプチド生成物（0.5 mg、1.22マイクロモル）をpH7の緩衝液（20 mmolのNaOAc）1.0 mLに溶解した。この得られた溶液に、α-（3-（3-マレイミド-1-オキソプロピル）アミノ）プロピル-ω-メトキシ-ポリオキシエチレン（1.5当量、平均分子量は11962 Da、NOF Corp, Tokyo, Japan）及び2当量のトリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（TCEP）を添加した。この反応は、逆相分取分析HPLC系（Vydac C18 5μペプチド／タンパク質カラム、4.6×250 mm）を使用して実施した分析に基づいて、室温で1時間後に完了した。この反応混合物を5 mL Zeba（商標）脱塩スピンカラム（Pierce Biotechnology, Rockford, IL）に適用した。凍結乾燥後に白色泡状物が得られた（15.1 mg）。この生成物をさらにHigh Trap（商標）SPXLカチオン交換カラム（GE Healthcare, Piscataway, NJ）で精製した。精製した生成物の分子量分布は、MALDI-TOF質量分析により測定した。得られた実験結果は、計算分子量分布と一致した。
【０１１７】
実施例4）H-Cys-Lys-Phe-NH2の製造
【０１１８】
【化３７】
2009538357.tif 000038
【０１１９】
表記ペプチドは、RinkアミドMBHA樹脂（347 mg、0.25 mmol）（Novabiochem, San Diego, CA）を使用してLiberty（商標）モデルマイクロ波ペプチド合成器（CEM Corp., Matthew, NC）上で合成した。アミノ酸Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH及びFmoc-Cys（Trt）-OH（Novabiochem, San Diego, CA）を、HBTU活性化を使用して4倍過剰で使用し、それぞれのカップリングを繰り返した。
【０１２０】
ペプチドは、1％ジチオトレイトール（10 mL）を含む8％トリスプロピルシラン／トリフルオロ酢酸（TFA）と一緒に3時間震蘯することによって樹脂から切り出した。この樹脂を濾過し、DCM（5 mL）で洗浄した。濾液を合わせ、3 mLに濃縮した。ジエチルエーテル（35 mL）を添加してペプチドを沈殿させた。沈殿したペプチドを遠心分離後に集めた。ペレットを水とアセトニトリルとに溶解し、次いで凍結乾燥した。
【０１２１】
得られた粗生成物を逆相HPLC系（Luna 5ミクロンC8（2）100×20 mmカラム）上、100％緩衝液A（水中0.1％TFA）と0％緩衝液B（アセトニトリル中0.1％TFA）から70％緩衝液Aと30％緩衝液Bに35分間かけて溶出することにより精製し、235 nmでモニターした。凍結乾燥後、89.1 mgの最終生成物が得られた。396.5 DaにおけるM＋1イオンがESI質量分析により検出され、これは395.5 Daの計算分子量と一致する。
【０１２２】
実施例5）mPEG-Tha-Lys-Phe-NH2の製造
本実施例のmPEGは、CH3O（CH2CH2O）n-（CH2）2-の構造をもち、ここでnは正の整数である。
【０１２３】
【化３８】
2009538357.tif 000039
【０１２４】
実施例4のペプチド生成物（0.5 mg、1.26マイクロモル）をpH4の緩衝液（20 mmolのNaOAc）1.0 mL中に溶解した。この得られた溶液に、mPEG-アルデヒド（1.5当量、平均分子量は20644 Da、NOF Corp., Tokyo, Japan）とTCEP（2当量）を添加した。この反応は、逆相分取分析HPLC系（Vydac C18 5μペプチド／タンパク質カラム、4.6×250 mm）を使用して実施した分析に基づいて、室温で3時間後に約85％完了した。この反応混合物を10 mL Zeba（商標）脱塩スピンカラム（Pierce Biotechnology, Rockford, IL）に適用した。凍結乾燥後に白色泡状物が得られた。
【０１２５】
実施例6）H-hCys-Lys-Phe-NH2の製造
【０１２６】
【化３９】
2009538357.tif 000040
【０１２７】
表記ペプチドは、RinkアミドMBHA樹脂（347 mg、0.25 mmol）（Novabiochem, San Diego, CA）を使用してLiberty（商標）モデルマイクロ波ペプチド合成器（CEM Corp., Matthew, NC）上で合成した。アミノ酸Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH及びFmoc-hCys（Trt）-OH（Novabiochem, San Diego, CA）を、HBTU活性化を使用して4倍過剰で使用し、それぞれのカップリングを繰り返した。
【０１２８】
ペプチドは、1％ジチオトレイトール（10 mL）を含む8％トリスプロピルシラン／トリフルオロ酢酸（TFA）と一緒に3時間震蘯することによって樹脂から切り出した。この樹脂を濾過し、DCM（5 mL）で洗浄した。濾液を合わせ、3 mLに濃縮した。ジエチルエーテル（35 mL）を添加してペプチドを沈殿させた。沈殿したペプチドを遠心分離後に集めた。ペレットを水とアセトニトリルとに溶解し、次いで凍結乾燥した。
【０１２９】
得られた粗生成物を逆相HPLC系（Luna 5ミクロンC8（2）100×20 mmカラム）上、100％緩衝液A（水中0.1％TFA）と0％緩衝液B（アセトニトリル中0.1％TFA）から75％緩衝液Aと35％緩衝液Bに35分間かけて溶出することにより精製し、235 nmでモニターした。凍結乾燥後、85.7 mgの最終生成物が得られた。410.5 DaにおけるM＋1イオンがESI質量分析により検出され、これは409.6 Daの計算分子量と一致する。
【０１３０】
実施例7）H-Pen-Lys-Phe-NH2の製造
【０１３１】
【化４０】
2009538357.tif 000041
【０１３２】
表記ペプチドは、RinkアミドMBHA樹脂（347 mg、0.25 mmol）（Novabiochem, San Diego, CA）を使用してLiberty（商標）モデルマイクロ波ペプチド合成器（CEM Corp., Matthew, NC）上で合成した。アミノ酸Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH及びFmoc-Pen（Trt）-OH（Novabiochem, San Diego, CA）を、HBTU活性化を使用して4倍過剰で使用し、それぞれのカップリングを繰り返した。
【０１３３】
ペプチドは、1％ジチオトレイトール（10 mL）を含む8％トリスプロピルシラン／トリフルオロ酢酸（TFA）と一緒に3時間震蘯することによって樹脂から切り出した。この樹脂を濾過し、DCM（5 mL）で洗浄した。濾液を合わせ、3 mLに濃縮した。ジエチルエーテル（35 mL）を添加してペプチドを沈殿させた。沈殿したペプチドを遠心分離後に集めた。ペレットを水とアセトニトリルとに溶解し、次いで凍結乾燥した。
【０１３４】
得られた粗生成物を逆相HPLC系（Luna 5ミクロンC8（2）100×20 mmカラム）上、100％緩衝液A（水中0.1％TFA）と0％緩衝液B（アセトニトリル中0.1％TFA）から80％緩衝液Aと20％緩衝液Bに35分間かけて溶出することにより精製し、235 nmでモニターした。凍結乾燥後、83.9 mgの最終生成物が得られた。424.5 DaにおけるM＋1イオンがESI質量分析により検出され、これは423.6 Daの計算分子量と一致する。
【０１３５】
実施例8）mPEG-Dma-Lys-Phe-NH2の製造
本実施例のmPEGは、CH3O（CH2CH2O）n-（CH2）2-の構造をもち、ここでnは正の整数である。
【０１３６】
【化４１】
2009538357.tif 000042
【０１３７】
実施例7のペプチド生成物（0.5 mg、1.18マイクロモル）をpH4の緩衝液（20 mmolのNaOAc）1.0 mL中に溶解した。この得られた溶液に、mPEG-アルデヒド（1.5当量、平均分子量は20644 Da、NOF Corp., Tokyo, Japan）とTCEP（2.0当量）を添加した。この反応は、逆相分取分析HPLC系（Vydac C18 5μペプチド／タンパク質カラム、4.6×250 mm）を使用して実施した分析に基づいて、室温で3時間後に約80％完了した。この反応混合物を10 mL Zeba（商標）脱塩スピンカラム（Pierce Biotechnology, Rockford, IL）に適用した。凍結乾燥後に白色泡状物が得られた。
【０１３８】
実施例9）mPEG-Thc-Lys-Phe-NH2の製造
本実施例のmPEGは、CH3O（CH2CH2O）n-（CH2）2-の構造をもち、ここでnは正の整数である。
【０１３９】
【化４２】
2009538357.tif 000043
【０１４０】
実施例6のペプチド生成物（0.5 mg、1.22マイクロモル）をpH4の緩衝液（20 mmolのNaOAc）1.0 mL中に溶解した。この得られた溶液に、mPEG-アルデヒド（1.5当量、平均分子量は20644 Da、NOF Corp., Tokyo, Japan）とTCEP（2.0当量）を添加した。この反応は、逆相分取分析HPLC系（Vydac C18 5μペプチド／タンパク質カラム、4.6×250 mm）を使用して実施した分析に基づいて、室温で3時間後に約90％完了した。この反応混合物を10 mL Zeba（商標）脱塩スピンカラム（Pierce Biotechnology, Rockford, IL）に適用した。凍結乾燥後に白色泡状物が得られた。
【０１４１】
実施例10）セレノCys-Lys-Phe-NH2の製造
【０１４２】
【化４３】
2009538357.tif 000044
【０１４３】
表記ペプチドは、実施例1に記載の手順に実質的に従って合成する。Fmoc-セレノCys（4-MeOBzl）-OH（Novabiochem, San Diego, CA）をN-末端でセレノシステイン残基を取り込むために使用する。
【０１４４】
実施例11）mPEG-Sez-Lys-Phe-NH2の製造
本実施例のmPEGは、CH3O（CH2CH2O）n-（CH2）2-の構造をもち、ここでnは正の整数である。
【０１４５】
【化４４】
2009538357.tif 000045
【０１４６】
表記ペプチドは、実施例2に記載の手順に実質的に従って合成する。実施例10から得られた生成物はペプチド出発物質である。
【０１４７】
実施例12）
【０１４８】
【化４５】
2009538357.tif 000046
【０１４９】
の製造
本実施例のmPEGは、CH3O（CH2CH2O）n-（CH2）2-の構造をもち、ここでnは正の整数である。
【０１５０】
mPEG-C（O）OHセシウム塩は、DMF中でブロモアセトアルデヒドジメチルアセタールと、60℃で2時間反応する。溶媒を除去した後、生成物を少量の水とDCM中40％TFAで、0℃で約30分間処理する。
【０１５１】
実施例13）mPEG-Hth-Lys-Phe-NH2の製造
【０１５２】
【化４６】
2009538357.tif 000047
【０１５３】
本実施例のmPEGは、CH3O（CH2CH2O）n-（CH2）2-の構造をもち、ここでnは正の整数である。
【０１５４】
表記ペプチドは、実施例2に記載の手順に実質的に従って合成する。ペプチド出発物質は、実施例4から得られた生成物である。PEG-アルデヒド出発物質は、実施例12で得られた生成物である。緩衝溶液のpHを調節する追加の段階がある。pH4、室温で2時間静置した後、反応溶液のpHを7に調節し、室温で3日間静置した後、精製した。
【０１５５】
実施例14）mPEG-Hdm-Lys-Phe-NH2の製造
【０１５６】
【化４７】
2009538357.tif 000048
【０１５７】
本実施例のmPEGは、CH3O（CH2CH2O）n-（CH2）2-の構造をもち、ここでnは正の整数である。
【０１５８】
表記ペプチドは、実施例8に記載の手順に実質的に従って合成する。ペプチド出発物質は、実施例7から得られた生成物である。PEG-アルデヒド出発物質は、実施例12で得られた生成物である。緩衝溶液のpHを調節する追加の段階がある。室温で一晩静置した後、反応溶液のpHを7に調節し、そしてその溶液を室温で3日間静置した後、精製した。
【０１５９】
実施例15）mPEG-Haz-Lys-Phe-NH2の製造
【０１６０】
【化４８】
2009538357.tif 000049
【０１６１】
本実施例のmPEGは、CH3O（CH2CH2O）n-（CH2）2-の構造をもち、ここでnは正の整数である。
【０１６２】
表記ペプチドは、実施例9に記載の手順に実質的に従って合成する。ペプチド出発物質は、実施例6から得られた生成物である。PEG-アルデヒド出発物質は、実施例12で得られた生成物である。緩衝溶液のpHを調節する追加の段階がある。pH4、室温で一晩静置した後、反応溶液のpHを7に調節し、そしてその溶液を室温で3日間静置した後、精製した。
【０１６３】
実施例16）mPEG-Hsz-Lys-Phe-NH2の製造
【０１６４】
【化４９】
2009538357.tif 000050
【０１６５】
本実施例のmPEGは、CH3O（CH2CH2O）n-（CH2）2-の構造をもち、ここでnは正の整数である。
【０１６６】
表記ペプチドは、実施例11に記載の手順に実質的に従って合成する。ペプチド出発物質は、実施例10から得られた生成物である。PEG-アルデヒド出発物質は、実施例12で得られた生成物である。緩衝溶液のpHを調節する追加の段階がある。pH4、室温で2時間静置した後、反応溶液のpHを7に調節し、そしてその溶液を室温で3日間静置した後、精製した。
【０１６７】
実施例17）H-Pen（Prd-PEG）-Lys-Phe-NH2の製造
【０１６８】
【化５０】
2009538357.tif 000051
【０１６９】
表記ペプチドは、実施例3に記載の手順に実質的に従って合成する。ペプチド出発物質は、実施例7から得られた生成物である。
【０１７０】
実施例18）H-hCys（Prd-PEG）-Lys-Phe-NH2の製造
【０１７１】
【化５１】
2009538357.tif 000052
【０１７２】
実施例6のペプチド生成物（1.0 mg、2.44マイクロモル）をpH7の緩衝液1.0 mL（NaOAc 20 mmol）に溶解した。この得られた溶液に、α-（3-（3-マレイミド-1-オキソプロピル）アミノ）プロピル）-ω-メトキシ-ポリオキシエチレン（1.5当量、平均分子量は11962 Da、NOF Corp., Tokyo, Japan）及び2当量のトリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（TCEP）を添加した。この反応は、逆相分取分析HPLC系（Vydac C18 5μペプチド／タンパク質カラム、4.6×250 mm）を使用して実施した分析に基づいて、室温で1時間後に完了した。この反応混合物を10 mL Zeba（商標）脱塩スピンカラム（Pierce Biotechnology, Rockford, IL）に適用した。凍結乾燥後に白色泡状物が得られた。
【０１７３】
実施例19）H-セレノCys（Prd-PEG）-Lys-Phe-NH2の製造
【０１７４】
【化５２】
2009538357.tif 000053
【０１７５】
表記生成物は、実施例3に記載の手順に実質的に従って合成する。ペプチド出発物質は、実施例10から得られた生成物である。
【手続補正書】
【提出日】平成21年3月5日(2009.3.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ある分子のD-またはL-システイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-アミノ基に対して、1または複数の遊離アルデヒド基を含むPEGを化学的に結合（conjugate）させる方法であって、前記PEGの遊離アルデヒド基と前記システイン残基の非酸化スルフドリル側鎖と遊離α-アミノ基とを反応させて、生成物中に1,3-チアゾリジン基を生成することを含み、ここで前記生成物は、構造：
【化１】
2009538357.tif 000071
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法。
【請求項２】
前記PEGの遊離アルデヒド基と前記システイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-アミノ基とを反応溶液中で反応させて、中間体に1,3-チアゾリジン基を生成し；そして
前記反応溶液のpHを約7に調節し、これによって前記中間体が再配置して最終生成物を形成することをさらに含み、
ここで前記中間体は、構造：
【化２】
2009538357.tif 000072
をもち、前記最終生成物は、構造：
【化３】
2009538357.tif 000073
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
ある分子のD-またはL-ペニシラミン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-アミノ基に対して、1または複数の遊離アルデヒド基を含むPEGを化学的に結合させる方法であって、前記PEGの遊離アルデヒド基と前記ペニシラミン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-アミノ基とを反応させて、生成物中に5,5-ジメチル-1,3-チアゾリジン基を生成させることを含み、ここで前記生成物は、構造：
【化４】
2009538357.tif 000074
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法。
【請求項４】
前記PEGの遊離アルデヒド基と前記ペニシラミン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-アミノ基とを反応溶液中で反応させて、中間体に5,5-ジメチル-1,3-チアゾリジン基を生成させ；そして
前記反応溶液のpHを約7に調節し、これによって前記中間体が再配置して最終生成物を形成することをさらに含み、
ここで前記中間体は、構造：
【化５】
2009538357.tif 000075
をもち、前記最終生成物は、構造：
【化６】
2009538357.tif 000076
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
ある分子のD-またはL-ホモシステイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-アミノ基に対して、1または複数の遊離アルデヒド基を含むPEGを化学的に結合させる方法であって、前記PEGの遊離アルデヒド基と前記ホモシステイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-アミノ基とを反応させて、生成物中に六員環系を生成させることを含み、ここで前記生成物は、構造：
【化７】
2009538357.tif 000077
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法。
【請求項６】
前記PEGの遊離アルデヒド基と前記ホモシステイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-アミノ基とを反応溶液中で反応させて、中間体に六員環系を生成させ；そして
前記反応溶液のpHを約7に調節し、これによって前記中間体が再配置して最終生成物を形成することをさらに含み、
ここで前記中間体は、構造：
【化８】
2009538357.tif 000078
をもち、前記最終生成物は、構造：
【化９】
2009538357.tif 000079
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
ある分子のD-またはL-セレノシステイン残基の非酸化遊離セレノ基と遊離α-アミノ基に対して、1または複数の遊離アルデヒド基を含むPEGを化学的に結合させる方法であって、前記PEGの遊離アルデヒド基と前記セレノシステイン残基の非酸化遊離セレノ基と遊離α-アミノ基とを反応させて、生成物中に五員環系を生成させることを含み、ここで前記生成物は、構造：
【化１０】
2009538357.tif 000080
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法。
【請求項８】
前記PEGの遊離アルデヒド基と前記セレノシステイン残基の非酸化遊離セレノ基と遊離α-アミノ基とを反応溶液中で反応させて、中間体に五員環系を生成させ；そして
前記反応溶液のpHを約7に調節し、これによって前記中間体が再配置して最終生成物を形成することをさらに含み、ここで前記中間体は、構造：
【化１１】
2009538357.tif 000081
をもち、前記最終生成物は、構造：
【化１２】
2009538357.tif 000082
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
ある分子のD-またはL-N-メチル-システイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-メチル-アミノ基に対して、1または複数の遊離アルデヒド基を含むPEGを化学的に結合させる方法であって、前記PEGの遊離アルデヒド基と前記N-メチル-システイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-メチル-アミノ基とを反応させて、生成物中に3-メチル-1,3-チアゾリジン基を生成させることを含み、ここで前記生成物は、構造：
【化１３】
2009538357.tif 000083
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法。
【請求項１０】
ある分子のD-またはL-N-メチル-システイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖に対して、1または複数の遊離マレイミド基を含むPEGを化学的に結合させる方法であって、前記PEGの遊離マレイミド基と前記N-メチル-システインの非酸化スルフヒドリル側鎖とを反応させて複合体生成物（conjugate  product）を生成させることを含み、ここで前記複合体生成物は、構造：
【化１４】
2009538357.tif 000084
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法。
【請求項１１】
ある分子のD-またはL-ペニシラミン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖に対して、1または複数の遊離マレイミド基を含むPEGを化学的に結合させる方法であって、前記PEGの遊離マレイミド基と前記ペニシラミン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖とを反応させて複合体生成物を生成させることを含み、ここで前記複合体生成物は、構造：
【化１５】
2009538357.tif 000085
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法。
【請求項１２】
ある分子のD-またはL-ホモシステイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖に対して、1または複数の遊離マレイミド基を含むPEGを化学的に結合させる方法であって、前記PEGの遊離マレイミド基と前記ホモシステイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖とを反応させて複合体生成物を生成させることを含み、ここで前記複合体生成物は、構造：
【化１６】
2009538357.tif 000086
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法。
【請求項１３】
ある分子のD-またはL-セレノシステイン残基の非酸化セレノ側鎖に対して、1または複数の遊離マレイミド基を含むPEGを化学的に結合させる方法であって、前記PEGの遊離マレイミド基とセレノシステイン残基の非酸化セレノ側鎖とを反応させて複合体生成物を生成させることを含み、ここで前記複合体生成物は、構造：
【化１７】
2009538357.tif 000087
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法。
【請求項１４】
前記遊離アルデヒド基または遊離マレイミド基は、アミド、エステル、スルホンアミド、スルホニル、チオール、オキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、マレイミド若しくはアミン官能基、またはその任意の組み合わせを含んでもよいリンカーによって前記PEGに結合している、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
前記PEGが線状構造、分岐構造、または多アーム構造をもつ、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記PEGが約100 Da〜約500,000 Daの平均分子量をもつ、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記PEGが約1,000 Da〜約50,000 Daの平均分子量をもつ、請求項15に記載の方法。
【請求項１８】
前記システイン残基、ペニシラミン残基、ホモシステイン残基、セレノシステイン残基、N-メチル-システイン残基、またはマレイミド残基が有機分子中にある、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１９】
前記システイン残基、ペニシラミン残基、ホモシステイン残基、セレノシステイン残基、N-メチル-システイン残基、またはマレイミド残基がタンパク質またはペプチド中にある、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２０】
前記複合体生成物が、一つ以上のタンパク質、ペプチド若しくは有機分子部分、またはその任意の組み合わせを含む、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２１】
還元剤を前記反応で使用する、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２２】
前記還元剤が、TCEP、非酸化スルフヒドリルを含有する化合物、そして非酸化遊離セレノ基を含有する化合物からなる群から選択される、請求項20に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
他に記載しないかぎり、本明細書中で使用する全ての技術的及び科学的用語は、本明細書が関連する技術分野の当業者に通常理解されるのと同じ意味をもつ。本明細書中でPEGを修飾するために使用することができる全てのアミノ酸は、L-型であってもD-型であってもよい。また本明細書中で述べた全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参照文献は、その全体が参照として含まれる。
【手続補正書】
【提出日】平成21年8月11日(2009.8.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ある分子のD-またはL-システイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-アミノ基に対して、1または複数の遊離アルデヒド基を含むPEGを化学的に結合（conjugate）させる方法であって、前記PEGの遊離アルデヒド基と前記システイン残基の非酸化スルフドリル側鎖と遊離α-アミノ基とを反応させて、生成物中に1,3-チアゾリジン基を生成することを含み、ここで前記生成物は、構造：
【化１】
2009538357.tif 000088
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法。
【請求項２】
前記PEGの遊離アルデヒド基と前記システイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-アミノ基とを反応溶液中で反応させて、中間体に1,3-チアゾリジン基を生成し；そして
前記反応溶液のpHを約7に調節し、これによって前記中間体が再配置して最終生成物を形成することをさらに含み、
ここで前記中間体は、構造：
【化２】
2009538357.tif 000089
をもち、前記最終生成物は、構造：
【化３】
2009538357.tif 000090
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
ある分子のD-またはL-ペニシラミン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-アミノ基に対して、1または複数の遊離アルデヒド基を含むPEGを化学的に結合させる方法であって、前記PEGの遊離アルデヒド基と前記ペニシラミン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-アミノ基とを反応させて、生成物中に5,5-ジメチル-1,3-チアゾリジン基を生成させることを含み、ここで前記生成物は、構造：
【化４】
2009538357.tif 000091
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法。
【請求項４】
前記PEGの遊離アルデヒド基と前記ペニシラミン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-アミノ基とを反応溶液中で反応させて、中間体に5,5-ジメチル-1,3-チアゾリジン基を生成させ；そして
前記反応溶液のpHを約7に調節し、これによって前記中間体が再配置して最終生成物を形成することをさらに含み、
ここで前記中間体は、構造：
【化５】
2009538357.tif 000092
をもち、前記最終生成物は、構造：
【化６】
2009538357.tif 000093
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
ある分子のD-またはL-ホモシステイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-アミノ基に対して、1または複数の遊離アルデヒド基を含むPEGを化学的に結合させる方法であって、前記PEGの遊離アルデヒド基と前記ホモシステイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-アミノ基とを反応させて、生成物中に六員環系を生成させることを含み、ここで前記生成物は、構造：
【化７】
2009538357.tif 000094
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法。
【請求項６】
前記PEGの遊離アルデヒド基と前記ホモシステイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-アミノ基とを反応溶液中で反応させて、中間体に六員環系を生成させ；そして
前記反応溶液のpHを約7に調節し、これによって前記中間体が再配置して最終生成物を形成することをさらに含み、
ここで前記中間体は、構造：
【化８】
2009538357.tif 000095
をもち、前記最終生成物は、構造：
【化９】
2009538357.tif 000096
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
ある分子のD-またはL-セレノシステイン残基の非酸化遊離セレノ基と遊離α-アミノ基に対して、1または複数の遊離アルデヒド基を含むPEGを化学的に結合させる方法であって、前記PEGの遊離アルデヒド基と前記セレノシステイン残基の非酸化遊離セレノ基と遊離α-アミノ基とを反応させて、生成物中に五員環系を生成させることを含み、ここで前記生成物は、構造：
【化１０】
2009538357.tif 000097
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法。
【請求項８】
前記PEGの遊離アルデヒド基と前記セレノシステイン残基の非酸化遊離セレノ基と遊離α-アミノ基とを反応溶液中で反応させて、中間体に五員環系を生成させ；そして
前記反応溶液のpHを約7に調節し、これによって前記中間体が再配置して最終生成物を形成することをさらに含み、ここで前記中間体は、構造：
【化１１】
2009538357.tif 000098
をもち、前記最終生成物は、構造：
【化１２】
2009538357.tif 000099
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
ある分子のD-またはL-N-メチル-システイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-メチル-アミノ基に対して、1または複数の遊離アルデヒド基を含むPEGを化学的に結合させる方法であって、前記PEGの遊離アルデヒド基と前記N-メチル-システイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖と遊離α-メチル-アミノ基とを反応させて、生成物中に3-メチル-1,3-チアゾリジン基を生成させることを含み、ここで前記生成物は、構造：
【化１３】
2009538357.tif 000100
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法。
【請求項１０】
ある分子のD-またはL-N-メチル-システイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖に対して、1または複数の遊離マレイミド基を含むPEGを化学的に結合させる方法であって、前記PEGの遊離マレイミド基と前記N-メチル-システインの非酸化スルフヒドリル側鎖とを反応させて複合体生成物（conjugate  product）を生成させることを含み、ここで前記複合体生成物は、構造：
【化１４】
2009538357.tif 000101
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法。
【請求項１１】
ある分子のD-またはL-ペニシラミン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖に対して、1または複数の遊離マレイミド基を含むPEGを化学的に結合させる方法であって、前記PEGの遊離マレイミド基と前記ペニシラミン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖とを反応させて複合体生成物を生成させることを含み、ここで前記複合体生成物は、構造：
【化１５】
2009538357.tif 000102
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法。
【請求項１２】
ある分子のD-またはL-ホモシステイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖に対して、1または複数の遊離マレイミド基を含むPEGを化学的に結合させる方法であって、前記PEGの遊離マレイミド基と前記ホモシステイン残基の非酸化スルフヒドリル側鎖とを反応させて複合体生成物を生成させることを含み、ここで前記複合体生成物は、構造：
【化１６】
2009538357.tif 000103
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法。
【請求項１３】
ある分子のD-またはL-セレノシステイン残基の非酸化セレノ側鎖に対して、1または複数の遊離マレイミド基を含むPEGを化学的に結合させる方法であって、前記PEGの遊離マレイミド基とセレノシステイン残基の非酸化セレノ側鎖とを反応させて複合体生成物を生成させることを含み、ここで前記複合体生成物は、構造：
【化１７】
2009538357.tif 000104
｛式中、R1は前記PEGであり、R2は前記分子である｝をもつ、前記方法。
【請求項１４】
前記遊離アルデヒド基または遊離マレイミド基は、アミド、エステル、スルホンアミド、スルホニル、チオール、オキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、マレイミド若しくはアミン官能基、またはその任意の組み合わせを含んでもよいリンカーによって前記PEGに結合している、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
前記PEGが線状構造、分岐構造、または多アーム構造をもつ、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記PEGが約100 Da〜約500,000 Daの平均分子量をもつ、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記PEGが約1,000 Da〜約50,000 Daの平均分子量をもつ、請求項15に記載の方法。
【請求項１８】
前記システイン残基、ペニシラミン残基、ホモシステイン残基、セレノシステイン残基、N-メチル-システイン残基、またはマレイミド残基が有機分子中にある、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１９】
前記システイン残基、ペニシラミン残基、ホモシステイン残基、セレノシステイン残基、N-メチル-システイン残基、またはマレイミド残基がタンパク質またはペプチド中にある、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２０】
前記複合体生成物が、一つ以上のタンパク質、ペプチド若しくは有機分子部分、またはその任意の組み合わせを含む、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２１】
還元剤を前記反応で使用する、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２２】
前記還元剤が、TCEP、非酸化スルフヒドリルを含有する化合物、そして非酸化遊離セレノ基を含有する化合物からなる群から選択される、請求項21に記載の方法。
【国際調査報告】
2009538357.tif 000105