(57)【要約】  本発明は、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）をコードする遺伝子に対抗する治療的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、および組み合わせたこれらのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用に関する。これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、急性呼吸促迫症候群、気管支炎、慢性気管支炎、珪肺症、肺線維症、肺同種移植片拒絶、アレルギー性鼻炎、および慢性副鼻腔炎をはじめとする気道の炎症性疾患など、患者の細胞内ｃＡＭＰ低下と関連付けられている疾患、ならびに環式ＡＭＰレベルの増大またはＰＤＥレベルの低下が有益なその他の病状の治療において分析的ツールとして、および／または治療薬として使用されてもよい。
2009537118.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つの塩基挿入、欠失または置換を含有する、（ｉ）配列番号１〜９２および１１３〜１２６および（ｉｉ）配列番号１〜９２および１１３〜１２６からなる群から選択される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１〜９２および１１３〜１２６からなる群から選択される塩基配列を有する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
リン酸ジエステル主鎖を有する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
ホスホロチオエート主鎖を有する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドが、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノヌクレオチドである、請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号４１〜８８および１１５〜１２６からなる群から選択される、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
医薬的に許容可能なキャリアと組み合わさった、請求項１〜６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの少なくとも１つを含んでなる医薬組成物。
【請求項８】
医薬的に許容可能なキャリアと組み合わさった、請求項１〜６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの少なくとも２つを含んでなる医薬組成物。
【請求項９】
前記少なくとも２つのオリゴヌクレオチドの第１のオリゴヌクレオチドがＰＤＥ７Ａに向かう、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記少なくとも２つのオリゴヌクレオチドの第２のオリゴヌクレオチドがＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄに向かう、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記少なくとも２つのオリゴヌクレオチドが、配列番号４１〜８８および１１５〜１２６からなる群から選択される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記少なくとも２つのオリゴヌクレオチドが配列番号２および配列番号１４である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記少なくとも２つのオリゴヌクレオチドが配列番号２および配列番号２４である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記少なくとも２つのオリゴヌクレオチドが配列番号２および配列番号３７である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記少なくとも２つのオリゴヌクレオチドが配列番号２および配列番号４０である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記少なくとも２つのオリゴヌクレオチドが配列番号２および配列番号８５である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記少なくとも２つのオリゴヌクレオチドが配列番号２および配列番号１２２である、
請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記少なくとも２つのオリゴヌクレオチドが配列番号５３および配列番号１４である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記少なくとも２つのオリゴヌクレオチドが配列番号５３および配列番号２４である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記少なくとも２つのオリゴヌクレオチドが配列番号５３および配列番号３７である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記少なくとも２つのオリゴヌクレオチドが配列番号５３および配列番号４０である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記少なくとも２つのオリゴヌクレオチドが配列番号５３および配列番号８５である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記少なくとも２つのオリゴヌクレオチドが配列番号５３および配列番号１２２である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記少なくとも２つのオリゴヌクレオチドが配列番号５４および配列番号１４である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記少なくとも２つのオリゴヌクレオチドが配列番号５４および配列番号２４である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記少なくとも２つのオリゴヌクレオチドが配列番号５４および配列番号３７である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記少なくとも２つのオリゴヌクレオチドが配列番号５４および配列番号４０である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記少なくとも２つのオリゴヌクレオチドが配列番号５４および配列番号８５である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記少なくとも２つのオリゴヌクレオチドが配列番号５４および配列番号１２２である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
請求項７〜２９のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与するステップを含んでなる、低下したｃＡＭＰと関連付けられている疾患を有する対象を治療する方法。
【請求項３１】
請求項７〜２９のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与するステップを含んでなる、対象において呼吸器炎症を治療する方法。
【請求項３２】
前記呼吸器炎症が、慢性閉塞性肺疾患、喘息、好酸球性咳、気管支炎、肺同種移植片の急性および慢性拒絶、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、副鼻腔炎、ウイルス感染症または新生物疾患のいずれか１つによって引き起こされる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記疾患が慢性閉塞性肺疾患である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
低下したｃＡＭＰと関連付けられている疾患を治療するための薬剤を調製するための請求項７〜２９のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３５】
呼吸器炎症を治療するための薬剤を調製するための請求項７〜２９のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３６】
前記呼吸器炎症が、慢性閉塞性肺疾患、喘息、好酸球性咳、気管支炎、肺同種移植片の急性および慢性拒絶、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、副鼻腔炎、ウイルス感染症または新生物疾患のいずれか１つによって引き起こされる、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
前記疾患が慢性閉塞性肺疾患である、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
低下したｃＡＭＰと関連付けられている疾患を治療するための請求項７〜２９のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３９】
呼吸器炎症を治療するための請求項７〜２９のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項４０】
前記呼吸器炎症が、慢性閉塞性肺疾患、喘息、好酸球性咳、気管支炎、肺同種移植片の急性および慢性拒絶、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、副鼻腔炎、ウイルス感染症または新生物疾患のいずれか１つによって引き起こされる、請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】
前記疾患が慢性閉塞性肺疾患である、請求項４０に記載の使用。
【請求項４２】
医薬的に許容可能なキャリアと共に、配列番号５４および配列番号１２２を有する２つのオリゴヌクレオチドを含んでなる医薬組成物。
【請求項４３】
ＰＤＥ３Ａ、ＰＤＥ３Ｂ、ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｃ、ＰＤＥ４Ｄ、ＰＤＥ７Ａ１、ＰＤＥ７Ａ２、ＰＤＥ７Ａ３、およびＰＤＥ７Ｂの少なくとも１つのｍＲＮＡに少なくとも８０％相補的であり、少なくとも１つのヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノヌクレオチドである、オリゴヌクレオチド。
【請求項４４】
前記ｍＲＮＡに少なくとも８５％相補的な請求項４３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４５】
前記ｍＲＮＡに少なくとも９０％相補的な請求項４３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４６】
前記ｍＲＮＡに少なくとも９５％相補的な請求項４３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４７】
前記ｍＲＮＡに少なくとも１００％相補的な請求項４３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４８】
１つの塩基挿入、欠失または置換を含有する（ｉ）配列番号１〜９２および１１３〜１２６および（ｉｉ）配列番号１〜９２および１１３〜１２６からなる群から選択される塩基配列を有する、請求項４３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４９】
医薬的に許容可能なキャリアと組み合わさった、請求項４３〜４８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの少なくとも１つを含んでなる医薬組成物。
【請求項５０】
医薬的に許容可能なキャリアと組み合わさった、請求項４３〜４８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの少なくとも２つを含んでなる医薬組成物。
【請求項５１】
請求項４９〜５０のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与するステップを含んでなる、低下したｃＡＭＰと関連付けられている疾患を有する対象を治療する方法。
【請求項５２】
請求項４９〜５０のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与するステップを含んでなる、呼吸器炎症を有する対象を治療する方法。
【請求項５３】
低下したｃＡＭＰと関連付けられている疾患を治療するための薬剤を調製するための請求項４９〜５０のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項５４】
呼吸器炎症を治療するための薬剤を調製するための請求項４９〜５０のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項５５】
低下したｃＡＭＰと関連付けられている疾患を治療するための請求項４９〜５０のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項５６】
呼吸器炎症を治療するための請求項４９〜５０のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本明細書は、２００６年５月１９日に出願された米国仮特許出願第６０／８０１，３８４号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドベースの治療法のために有用な方法、試薬、および組成物に関する。特に本発明は、患者において低下したｃＡＭＰと関連付けられている、例えば炎症状態および癌などのＰＤＥ関連疾患をはじめとする疾患の治療におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドベースの治療法の応用に関する。本発明はまた、環式ＡＭＰホスホジエステラーゼが関与する、遺伝子治療法および新規なアンチセンスベースのストラテジーを同定する方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
肺胞および気道上皮は、酸化的ストレス、敗血症、内毒血症、およびその他の肺の重篤な病気に対する炎症性および代謝反応を調節する上で重要な役割を果たす動的バリアとして認識されている。特に呼吸上皮は、上皮性−血液境界面における炎症状態／感染の一次標的であり、それ自体が炎症細胞を動員して炎症性メディエータを産生することにより、炎症シグナルを増幅できる。
【０００４】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、炎症の持続性上方制御が役割を果たすと考えられる、炎症性気道および肺胞疾患の一例である。ＣＯＰＤにおける炎症は、好中球、ＣＤ８陽性リンパ球、およびマクロファージの気道内への浸潤増大によって特徴づけられる。好中球およびマクロファージは、組織炎症および損傷を促進するエラスターゼ、金属プロテアーゼ、および酸素ラジカルをはじめとするいくつかのメディエータを放出するそれらの能力のために、ＣＯＰＤにおける気道炎症の発病機序において重要な役割を果たす。ＣＯＰＤがある患者の気道内の炎症細胞の蓄積は、炎症細胞を気道に誘引してそれらを活性化し、それらの存在を維持する、炎症促進性サイトカインおよびケモカインの放出増大によって駆動されることが示唆されている。存在する細胞もまた、組織に対して悪影響を与えて疾患を永続化させる酵素（金属プロテアーゼなど）および酸素ラジカルを放出する。ＣＯＰＤがある患者の肺において、広範囲の炎症促進性サイトカインおよびケモカインが増大することが示されている。中でも重要な役割を果たすのが、ＣＯＰＤがある患者の気道内で増大する腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、およびインターロイキン８（ＩＬ−８）である。
【０００５】
炎症が役割を果たすようである呼吸器疾患のその他の例としては、喘息、好酸球性咳、気管支炎、肺同種移植片の急性および慢性拒絶、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎および副鼻腔炎が挙げられる。喘息は気道炎症、可逆的閉塞、および気道応答性亢進が特徴である。この疾患においては、好中球およびマクロファージもまた重要であるかもしれないが、関与する炎症細胞は、大部分が好酸球、Ｔリンパ球、および肥満細胞である。広範囲のサイトカインおよびケモカインが気道内で増大して、炎症、閉塞、および応答性亢進を促進することにより、この疾患の病態生理学において役割を果たすことが示されている。
【０００６】
好酸球性咳は、気道閉塞または応答性亢進の不在下で、慢性の咳と、患者の気道内の大部分が好酸球である炎症細胞の存在とによって特徴づけられる。この疾患ではいくつかのサイトカインおよびケモカインが増大するが、それらはほとんどが好酸球誘導性である。好酸球は、気道内で動員され活性化されて、炎症および咳の永続化において役割を果たす酵素および酸素ラジカルを放出する可能性がある。
【０００７】
急性気管支炎は、感染または例えば汚染、粉塵、ガスまたは化学物質による刺激的事象中に起こる下気道の急性疾患である。慢性気管支炎とは、２年間にわたり少なくとも年に３ヶ月間ほぼ毎日咳や痰が認められることで定義される。急性または慢性気管支炎においては、気道内に広範囲のケモカインおよびサイトカインと共に、ほとんどが好中球である炎症細胞も見られる。これらのメディエータは、これらの疾患中に起こる炎症、症状、および粘液産生において役割を果たすと考えられる。
【０００８】
肺組織移植は、末期肺疾患がある患者において実施される。我々の身体の炎症細胞であるリンパ球が、供与者臓器を「自己」と認識しない場合に、急性、およびより重要には慢性同種移植片拒絶が起きる。炎症細胞はケモカインとサイトカインによって動員されて、広範囲の酵素を放出し、それは組織破壊をもたらし、慢性拒絶の場合は閉塞性細気管支炎と称される疾患をもたらす。
【０００９】
サルコイドーシスは、慢性非乾酪性肉芽腫が組織内で生じる原因不明の疾患である。肺は最も一般に影響される臓器である。肺気管支肺胞の洗浄液は、大抵はリンパ球、マクロファージの、時折好中球および好酸球の増大を示す。これらの細胞はまた、サイトカインおよびケモカインによって動員および活性化され、疾患の発病機序に関与すると考えられる。
【００１０】
肺線維症は、慢性呼吸不全をもたらす進行性および慢性線維症（瘢痕）によって特徴づけられる肺組織の疾患である。異なるタイプおよび原因の肺線維症が存在するが、全て肺組織内へのコラーゲン沈着と共に、炎症細胞流入、および線維芽細胞の持続、活性化、および増殖によって特徴づけられる。これらの事象は、肺組織内のサイトカインおよびケモカインの放出に関連するようである。
【００１１】
急性鼻炎は、感染または例えば汚染、粉塵、ガスまたは化学物質による刺激的事象中に起こる鼻または上気道の急性疾患である。慢性鼻炎は、絶え間ない慢性鼻水、鼻閉、くしゃみ、および心因性掻痒症の存在によって定義される。急性または慢性鼻炎においては、上気道内に、広範囲のケモカインおよびサイトカインと共に、炎症細胞も見られる。これらのメディエータは、これらの疾患中に起こる炎症、症状、および粘液産生において役割を果たすと考えられる。
【００１２】
急性副鼻腔炎は、発熱を伴うかまたは伴わない、鼻閉、粘性の低い化膿性痰、頭痛または副鼻腔痛によって特徴づけられる、急性の通常は感染性の副鼻腔の疾病である。慢性副鼻腔炎は、急性副鼻腔炎症状の６ヶ月を超える持続によって定義される。急性または慢性副鼻腔炎においては、上気道および副鼻腔内に、広範囲のケモカインおよびサイトカインと共に、炎症細胞も見られる。これらのメディエータは、これらの疾患中に起こる炎症、症状、および痰産生において役割を果たすと考えられる。
【００１３】
炎症と新生物疾患との密接なつながりを示唆する、増大する一連の証拠がある。腫瘍微小環境はそれに入る細胞によって形作られ、それらの機能は局所状態を反映する。腫瘍進行中に腫瘍部位で起こる連続変化は、慢性炎症と類似している。この慢性炎症性反応は大部分は腫瘍によって編成されるようであり、腫瘍の生存を促進するようである。成長する新生物の中またはその周辺で観察される初期および持続性の炎症反応は、例えば可溶性生育および生存因子、マトリックス再形成酵素、反応性酸素種、およびその他の生物活性分子など、組織恒常性の維持に関係があるとされる多様なメディエータを提供することで、腫瘍成長の多くの側面（マトリックス再形成、血管新生、悪性度）を制御することが明らかになっている。
【００１４】
上述のように、その中で炎症が重要な役割を果たすこれらの炎症性呼吸器疾患または疾患群は全て、酵素または酸素ラジカルを放出する異なる炎症細胞を動員して活性化し、症状、炎症の持続、および慢性の場合は、正常な組織の破壊または中断を引き起こすメディエータの存在によって特徴づけられる。
【００１５】
論理的な治療的アプローチは、サイトカインおよびケモカイン産生、および炎症細胞応答を下方制御することであろう。これは、局所性または全身性どちらかのコルチコステロイドを用いることにより、異なる成功レベルをもって上述の全ての疾患中で実施されている。コルチコステロイドは免疫抑制性であり、炎症細胞に対してだけでなく身体のその他の細胞に対してもまた、慢性的に投与すると毒性をもたらす効果を与える。
【００１６】
ＣＯＰＤ、喘息、およびその他の炎症性呼吸器疾患のための薬剤が利用できるにもかかわらず、これらの疾患の有病率および罹患率は安定したままであり、または増大している。炎症性呼吸器疾患の治療法に対する満たされていない医療的必要性があることは明らかであり、革新的な治療薬が緊急に必要とされている。アンチセンスオリゴヌクレオチドベースの治療法は、新しい代案のアプローチを提供して、従来の治療的戦略の望ましくない毒性効果なしに、特定遺伝子の発現を選択的に低下させる。いくつかの疾患を治療するために、アンチセンス治療法が研究されている。国際公開第９９６６０３７号パンフレットに記載されているように、炎症性メディエータ受容体に対抗するアンチセンスオリゴヌクレオチドを肺に投与して、それらの標的を下方制御できることが以前示されている。
【００１７】
抗炎症性メディエータまたは酵素の放出に対する低下した効果を与えながら、広範囲の細胞による炎症促進性のサイトカインおよびケモカイン放出を低下させる治療的アプローチは、炎症性呼吸器疾患または任意のその他の全身性の炎症性疾患のための現行の治療法に対して利点を有するかもしれない。
【００１８】
環式ヌクレオチドｃＡＭＰおよびｃＧＭＰは、シグナル伝達経路および機序に関与する遍在性二次メッセンジャーである。哺乳類の細胞は、複数の複雑なフィードフォワードおよびフィードバック機序を通じて、環式ヌクレオチドの発生および不活性化を制御する、複雑で高度に保存された酵素相補体を発達させた。ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰは、どちらもエセイアン（Ｅｓｓａｙａｎ）Ｄ．Ｍ．、「環式ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害剤および免疫調節（Ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ（ＰＤＥ）ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）」Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１９９９年、５７、９６５〜９７３頁に記載されているように、それぞれアデニリル（アデニル酸）またはグアニリル（グアニル酸）環化酵素の触媒活性によって、それらのそれぞれの三リン酸塩（ＡＴＰおよびＧＴＰ）から形成される。ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰの不活性化は、エセイアン（Ｅｓｓａｙａｎ）、１９９９年、およびペリー（Ｐｅｒｒｙ）Ｍ．Ｊ．およびヒッグズ（Ｈｉｇｇｓ）Ｇ．Ａ．「ホスホジエステラーゼ阻害剤の化学療法薬可能性（Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）」、１９９８年、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．４：４７２〜８１頁に記載されているように、環式−ヌクレオチド−依存ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）によって触媒される３’−リン酸ジエステル結合の加水開裂によって達成され、対応する不活性５’−一リン酸塩の形成がもたらされる。
【００１９】
炎症反応およびその進行は、ペリー（Ｐｅｒｒｙ）およびヒッグズ（Ｈｉｇｇｓ）、１９９８年；エセイアン（Ｅｓｓａｙａｎ）、１９９９年に記載されているように、環式ヌクレオチドの定常状態レベルの調節に対して強く感応性であることが示されており、それらの影響の標的細胞は免疫細胞を超えて広がり、気道平滑筋、上皮および内皮細胞、およびニューロンなどのアクセサリー細胞を含む。この点において、細胞内環式ヌクレオチド
の調節が炎症性環境の制御において主要な役割を果たすという新しい概念は、最近、炎症性／自己免疫応答のターゲティングと改善に発展した。環式ヌクレオチドＰＤＥは、少なくとも１１族のＰＤＥ酵素を含んでなる大きな増大しつつある多重遺伝子族である。したがって生体外および生体内における選択的および非選択的ＰＤＥ阻害剤のプロフィールは、抗うつ薬、抗増殖性剤、免疫調節剤、子宮収縮抑制薬、変力薬／変周期薬、および細胞保護剤としての可能な治療的な有用性を示唆する。
【００２０】
細胞内ｃＡＭＰは、平滑筋弛緩、活性化、および増殖においてだけでなく、炎症細胞によるメディエータの放出調節にもおいても基本的な役割を果たすようである。ｃＡＭＰレベルの低下は、気道上皮細胞内のＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＬ−８などの炎症性メディエータの産生増大をもたらすことができる。
【００２１】
細胞恒常性ならびに炎症疾患／自己免疫疾患／感染症におけるサイトカインの調節的役割の分子機序の洞察は、薬理学的介入のための治療的戦略をデザインする新しいアプローチを提供しはじめた。このような１つの新規なアプローチがＰＤＥ酵素遮断の化学療法可能性であり、それは広範な疾患状態スペクトルにわたる有望な治療薬のための現象的多様性および複雑性スキームを明らかにした。ＰＤＥ阻害の１つの機構的理解は、環式ヌクレオチド（ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ）の免疫調節特性を軸とし、それによって抗炎症的な治療的応用がそれを通じて明白に実証できる路を開く。
【００２２】
炎症反応およびその進行は、環式ヌクレオチドの定常状態レベルの調節に対して強く感応性であり、それらの影響の標的細胞は免疫細胞を超えて広がり、上皮性、平滑筋、および内皮細胞、およびニューロンなどの構造細胞を含む（ペリー（Ｐｅｒｒｙ）およびヒッグズ（Ｈｉｇｇｓ）、１９９８年；エセイアン（Ｅｓｓａｙａｎ）、１９９９年）。細胞内環式ヌクレオチドの調節は、炎症反応の制御において主要な役割を果たす。環式ヌクレオチドＰＤＥは、少なくとも１１族のＰＤＥイソ酵素を含んでなる大きな増大しつつある多重遺伝子族である。ＰＤＥはそれらの組織および細胞分布において、ならびにヌクレオチドおよびタンパク質配列、基質特異性、阻害剤感受性、および補助因子要件をはじめとする、それらの分子および物理化学的特徴において異なる。異なる族内で、代案のｍＲＮＡスプライシングおよび差動的プロモーターの使用により、組織特異的イソ型が同一遺伝子から発生する。
【００２３】
ｃＡＭＰ−特異的ＰＤＥ４酵素ファミリーは、最も広く研究されているＰＤＥの１つである。このファミリー内の酵素は、ほとんどの炎症促進性および免疫細胞に見られ、それらはｃＡＭＰ代謝の制御において重要な役割を果たしている。ＰＤＥ４酵素は、マクロファージ、好中球、細胞毒性ＣＤ８＋Ｔ細胞、気管支上皮細胞、および気道平滑筋細胞内で発現する。さらにＰＤＥ４阻害剤は呼吸器疾患の動物モデルで炎症を制御し、小型分子阻害剤を用いた介入のための治療に基づくストラテジーにおいて、ＰＤＥ４が適切な標的に相当するかもしれないことが示唆される。抗ＰＤＥ４薬剤は細胞内ｃＡＭＰの加水分解を阻害し、それは次に気管支拡張および炎症反応抑制を提供する。シロミラストおよびロフルミラストなどの選択的ＰＤＥ４阻害剤は、好中球炎症の動物モデル中で活性である（ブントシューク（Ｂｕｎｄｓｃｈｕｃｈ）ＤＳら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２００１年、２９７：２８０〜２９０頁）。気道炎症を治療するためのＰＤＥ４阻害剤の使用は集中的な臨床研究下にあるが、いくつかの阻害剤は、それらの毒性と、悪心および嘔吐が最も一般的な生理学的症状発現である用量制限的副作用のために断念された。したがってＰＤＥ４阻害剤の治療的比率を改善することは、なおも重要な研究分野である大きな課題を提起した。
【００２４】
気道平滑筋および炎症細胞内のＰＤＥ３およびＰＤＥ４の高活性と共に、標的組織中の酵素分布を考慮して、これらの酵素の選択的阻害剤を慢性気道閉塞の治療法に追加しても
よい。一般に、ＰＤＥの全てのイソ酵素を阻害することの可能な有害効果を評価することはなく、小型分子阻害剤が１つまたはいくつかのＰＤＥ上に集中される。例えばＰＤＥ４拮抗薬に起因する毒性のほとんどは、ＰＤＥ４アイソタイプＤの阻害を通じて起こることが示唆されている。さらに本明細書において示すように、特定のＰＤＥのイソ酵素の阻害は、全ての炎症促進性のメディエータを低下させるわけではないが、アイソタイプ特異的オリゴヌクレオチドの組み合わせは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの適正な組み合わせを用いた場合に、より幅広い効果をもたらすことができる。
【００２５】
ＰＤＥ３ファミリーは、ｃＧＭＰを阻害してｃＡＭＰに対して高親和性を示す、２つの異なる遺伝子ＰＤＥ３ＡおよびＰＤＥ３Ｂを含有する。各ＰＤＥ３遺伝子は、少なくとも２つのスプライスイソ型をコードする。ＰＤＥ３Ａは、平滑筋、血小板、および心臓組織中で同定されている。ＰＤＥ３Ｂは、脂肪細胞および肝細胞内に最も豊富である。しかしこれらの薬剤は限定的有効性を有し、それらの使用は副作用を通じて臨床的に制限されたので、選択的ＰＤＥ３阻害剤またはＰＤＥ４阻害剤との組み合わせを用いた臨床試験からの初期データは、いくらか失望させるもので期待をかなり裏切った。
【００２６】
ＰＤＥ７は、ヒト膠芽細胞腫から最初に単離された。ＰＤＥ７Ａは、ｃＧＭＰと、ＰＤＥ３およびＰＤＥ４阻害剤とに非感応性であり、その他のｃＡＭＰ  ＰＤＥと異なるアミノ酸配列を有するｃＡＭＰ−特異的ＰＤＥをコードする。ヒトでは２つの遺伝子（ＰＤＥ７ＡおよびＰＤＥ７Ｂ）が特性決定されている。ＰＤＥ７Ａ遺伝子は、代案のｍＲＮＡスプライシングによって同一遺伝子から誘導される３つのイソ酵素（ＰＤＥ７Ａ１、ＰＤＥ７Ａ２、およびＰＤＥ７Ａ３）をコードする。ヒトではＰＤＥ７Ａ２  ｍＲＮＡが、骨格筋、心臓、および腎臓中に豊富に発現される一方、精巣、肺、および免疫系（胸線、脾臓、リンパ節、血液白血球）はＰＤＥ７Ａ１の豊かな供給源である。さらに活性化されているが未感作でないヒトＴリンパ球は、スプライス変異体ＰＤＥ７Ａ３を発現する。対照的にＰＤＥ７Ｂは、ヒトにおいて単一イソ酵素として存在し、ＰＤＥ７Ａと約７０％の配列類似性を共有するが、力学的特性は特徴的である。ＰＤＥ７Ｂは大部分が、脳内で、および肝臓、心臓、甲状腺、および骨格筋をはじめとするいくつかのその他の組織内で発現する。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体によるヒト未感作Ｔ細胞の刺激は、ＩＬ−２産生およびクローン増幅を促進することが示されている。これらの効果はＰＤＥ７Ａに起因し、この酵素の下方制御はリンパ球増殖を妨げた（リー（Ｌｉ）Ｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９年、２８３、８４８〜８５１頁）。
【００２７】
ＰＤＥ４ファミリーは、４つの異なる遺伝子（ＰＤＥ４  Ａ〜Ｄ）を含有する。代案の遺伝子スプライシングのために複数のスプライス変異体が報告され、長型および短型の主要な２群に分類されている。ＰＤＥ４  Ａ、Ｂ、およびＤ遺伝子産物は、ほとんどの免疫および炎症細胞に見られる。これらは、ビュルヌフ（Ｂｕｒｎｏｕｆ）Ｃ．およびプリュニオ（Ｐｒｕｎｉａｕｘ）Ｍ．Ｐ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ２００２年；８：１２５５〜１２９６頁に記載されているように、構成的に、または活性化後のどちらかで存在する。ＰＤＥ４の全てまたは特定のアイソタイプの阻害は、いくつかの炎症性メディエータの下方制御と関連付けられているが、特定の炎症促進性サイトカイン（例えばＩＬ−６）の増大について記載されている（ギエムビチ（Ｇｉｅｍｂｙｃｚ）Ｍ．Ａ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｒｕｇｓ  ２００年、１０：１３６１〜１３７９頁）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
したがって３つのＰＤＥ酵素を全て阻害することが望ましいであろう。しかしこのアプローチは、これらの各酵素の阻害剤投与に関して記載されている毒性を受けるかもしれない。アンチセンスオリゴヌクレオチドの局所塗布は酵素阻害の全身毒性を回避できるかも
しれないが、このアプローチが実用的であるためには、これらのＰＤＥのイソ酵素の数が多すぎるようである。ＰＤＥ酵素の１つまたはいくつかのアイソタイプの阻害は、その他のアイソタイプが存在してそれらの炎症促進性の効果を与えるので、完全なＰＤＥ阻害程には効果的でないかもしれない。
【００２９】
したがって炎症性呼吸器疾患の治療のために、抗炎症性メディエータまたは阻害性酵素により少ない影響を与えながら、炎症促進性メディエータおよびそれらの細胞を下方制御する方法を捜すことが望ましいようである。したがって選択されたＰＤＥ酵素アイソタイプに対抗するアンチセンスオリゴヌクレオチドの組み合わせの治療的な応用は、本明細書において炎症性呼吸器疾患や、または増大する環式ＡＭＰが役割を果たす任意の疾患のための治療法として提案される。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
本発明は、対抗するＰＤＥアイソタイプ遺伝子を下方制御するのに効果的なアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物、ならびに対抗するＰＤＥアイソタイプ遺伝子だけでなく、その他のＰＤＥアイソタイプ遺伝子、炎症性および分裂促進遺伝子をはじめとするその他の関連遺伝子もまた下方制御するのに効果的な選択されたアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物を提供する。
【００３１】
別の態様では、本発明は、各アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物が異なる遺伝子を下方制御できる、少なくとも２つのアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物を含んでなる組成物を提供する。この態様のいくつかの実施態様では、少なくとも２つのアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物の組み合わせが、各アンチセンスが各遺伝子を個々に下方制御する相加能力を超える、各遺伝子の顕著な下方制御をもたらす。さらなる実施態様では、本発明はまた、少なくとも２つのアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物を含んでなる組成物も提供し、各アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物は異なる遺伝子を下方制御でき、各アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物が事実上、単独でそれが対抗する遺伝子を下方制御する効果がない濃度で存在し、少なくとも２つのアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物の組み合わせは、アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物が対抗する遺伝子、および場合によりその他の関連遺伝子のそれぞれの顕著な下方制御をもたらす。本発明のこの態様のさらに他の実施態様では、少なくとも２つのアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物の組み合わせを含んでなる組成物が提供され、それぞれは異なるＰＤＥ標的遺伝子に対抗し、それぞれはＰＤＥ標的遺伝子を下方制御または阻害するのに効果的であり、各オリゴヌクレオチド化合物はその標的遺伝子の２０％未満の阻害を示す濃度で組み合わさって存在し、オリゴヌクレオチド化合物の組み合わせは２０％を超える阻害を示し、標的遺伝子の少なくとも１つの阻害を少なくとも倍加する。
【００３２】
本発明は、配列番号１〜９２および１１３〜１２６からなる群から選択される配列を有する、本発明の組成物および方法において有効なアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらに提供する。
【００３３】
本発明は、医薬的に許容可能なキャリアと、本発明のオリゴヌクレオチドまたは上述のような少なくとも２つのアンチセンスオリゴヌクレオチドとの組み合わせを含んでなる、医薬組成物をさらに提供する。本発明はまた、炎症性呼吸器疾患およびその他の炎症関連疾患の治療および／または予防における、このような組成物の使用も提供する。
【００３４】
本発明の組み合わせは、同義遺伝子ノックダウンと称されているアプローチによって抑制作用を発揮するようである。同義遺伝子ノックダウンは、以下の状況を包含する。
【００３５】
１）アンチセンスオリゴヌクレオチドは、それが対抗する遺伝子を下方制御するだけでなく、その他の関連遺伝子もまた下方制御し、および／または
２）少なくとも２つのアンチセンスオリゴヌクレオチドの組み合わせは、アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物が事実上、単独でそれが対抗する遺伝子を下方制御する効果がない濃度でそれぞれが存在し、組み合わせはアンチセンスオリゴヌクレオチドが対抗する双方の遺伝子、および場合によりその他の関連遺伝子の顕著な下方制御をもたらす。
【００３６】
本発明は、上のアプローチを使用して、ＰＤＥ関連疾患と、呼吸器疾患、より具体的にはＣＯＰＤおよび喘息をはじめとする炎症性疾患と、癌をはじめとする、炎症が重要な役割を果たすその他の疾患をはじめとする、患者において低下したｃＡＭＰと関連付けられている疾患を治療および／または予防するための方法、組成物、およびキットを提供する。
【００３７】
本発明はまた、細胞環式−ＡＭＰホスホジエステラーゼの発現、ひいては活性を低下させ、それによって細胞内ｃ−ＡＭＰおよびサイトカイン／ケモカイン産生の適切な均衡を維持するための方法、試薬、および組成物も提供する。
【００３８】
本発明は、ＰＤＥ発現を妨害して細胞内ｃ−ＡＭＰレベルを上昇できる、新規なアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物、薬剤、およびワクチンの組み合わせを、生体外、生体内および生体外において同定／スクリーニングする方法およびツールをさらに提供する。
【００３９】
本発明はまた、１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物が細胞形質移入のために使用され、またはＰＤＥアイソタイプ遺伝子発現を用いた妨害のためにヒトおよび動物に送達される、遺伝子ベースの治療法および形質移入方法も提供する。
【００４０】
本発明は、ＰＤＥ中でも特に、ＰＤＥ３ＡおよびＰＤＥ３ＢなどのＰＤＥ３アイソタイプと、ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、およびＰＤＥ４ＤなどのＰＤＥ４アイソタイプと、ＰＤＥ７ＡなどのＰＤＥ７アイソタイプとに対して効果的なアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらに提供する。
【００４１】
本発明の別の幅広い態様に従って、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドを好ましくは２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノヌクレオチド（ＦＡＮＡ）であるアラビノース修飾ヌクレオチドで置換するステップを含んでなる、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ安定性および標的遺伝子阻害活性の少なくとも１つを増大させる方法が提供される。
【００４２】
本発明のその他の目的および利点は、添付の図面を参照して以下のいくつかの好ましい実施態様の非限定的な説明を読めば、明らかになるであろう。
【００４３】
本発明について、添付の図面に注目してここでより詳細に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１Ａ】それらの特異的標的ノックダウンを阻害するにあたっての異なるＡＯＮの有効性を示す。インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのリポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（商標）２０００（１μｇのオリゴヌクレオチド：１μＬのリポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（商標）２０００の比率）および２００ｎｇ〜４００ｎｇのＡＯＮ（ＡＳ）または対応するミスマッチ配列（Ｍｉ／Ｓｅｎｓｅ）を使用して、特異的ＡＯＮターゲティングＰＤＥ３Ａ、ＰＤＥ３Ｂ、ＰＤＥ７Ａ、ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４ＢまたはＰＤＥ４Ｄで、Ａ５４９細胞を２４時間にわたり形質移入した。パノミクス（Ｐａｎｏｍｉｃｓ）からのクオンティジェン（Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ）（登録商標）アッセイを使用してＰＤＥ３Ｂ、ＰＤＥ４Ａ、およびＰＤＥ４Ｂ  ｍＲＮＡの発現レベルを定量化した。リアルタイムＰＣＲを使用して、ＰＤＥ３Ａ、ＰＤＥ７ＡおよびＰＤＥ４Ｄ発現を定量化した。ＰＤＥ発現を対照遺伝子（β２Ｍ、ＰｐｉｂまたはＨＰＲＴ）の発現に正常化した。データは、未処理細胞内の発現レベルに対する平均％阻害として表わされる（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎ＝３）。
【図１Ｂ】２つ以上のＰＤＥ４イソ型を標的とするＡＯＮで、２９３細胞を一晩形質移入した。リアルタイムＰＣＲを使用して、ＰＤＥ４イソ型  ｍＲＮＡ発現レベルを定量化し、対照遺伝子β２Ｍの発現に正常化した。データは、関連するセンスまたはミスマッチＡＯＮで形質移入した細胞に対する平均％阻害発現レベルとして表わされる。
【図２】肺上皮細胞に対するＡＯＮの生物学的効果を示す。上述のように一晩ＡＯＮで形質移入したＡ５４９細胞をＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ）で４時間刺激して、ケモカイン（ＩＬ−８、ＭＣＰ−１）およびサイトカイン（ＧＭ−ＳＣＦ）の分泌を誘発した。細胞上清を収集し、ＥＬＩＳＡを使用してケモカイン／サイトカインのレベルを判定した。データはＰＤＥ−ＡＯＮ標的細胞とミスマッチ／センスＡＯＮ標的細胞との間で分泌レベルを比較する、特異的分泌の平均％阻害を表わす。
【図３】免疫細胞に対するＡＯＮの生物学的効果を示す。脂質試薬エスコート（Ｅｓｃｏｒｔ）ＩＶ（１μｇ  ＡＯＮ：０．５μＬ脂質）を使用してＡＯＮで２０時間形質移入したヒトＰＢＭＣを次にＰＨＡ（１０μｇ／ｍＬ）で６時間刺激する。細胞上清を収集し、ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）からのＥＬＩＳＡを使用して、ＰＨＡに応答してＰＢＭＣによって分泌されたサイトカインＴＮＦ−αおよびＩＬ−２のレベルを評価した。サイトカインの低下をＡＯＮ送達不在下のＰＨＡ刺激細胞内のレベルと比較した。データは、ミスマッチまたはセンス対照配列ＡＯＮ（左側軸）について観察される特異的サイトカイン阻害のレベルに対する、ＡＯＮの％阻害として表わされる。ＰＤＥ活性の一つの指標として、ケイマン・ケミカル（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）からのｃＡＭＰ  ＥＩＡを使用したｃＡＭＰ判定のために細胞溶解産物を収集した。ｃＡＭＰの増大をＡＯＮ送達不在下のＰＨＡ刺激細胞内のレベルと比較した。データは、ミスマッチまたはセンス対照配列ＡＯＮ（右側軸）で達成されたレベルに対するｃＡＭＰの％特異的増大として表わされる。データは９〜１５供与者間の平均％変化±ＳＥとして表わされる。
【図４】２’Ｆ−ＡＮＡ含有ＡＯＮが標的遺伝子発現を阻害する効力を示す。リポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（商標）２０００（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１μｇ  ＡＯＮ：１μＬリポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（商標）２０００）を指定の用量で使用して、ＰＳ−ＤＮＡから構成されるか、またはＰＳ−ＦＡＮＡ修飾または対応するミスマッチ配列を有して構成されるＰＤＥ４Ｄ−特異的ＡＯＮで、Ａ５４９細胞を２４時間形質移入した（Ａ）。標的遺伝子のＰＤＥ４Ｄ  ｍＲＮＡ発現レベルをパノミクス（Ｐａｎｏｍｉｃｓ）からのクオンティジェン（Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ）（登録商標）アッセイを使用して定量化し、β２Ｍ遺伝子発現に正常化した。データは、センス対照配列で処理された細胞内の発現レベルに対する、特異的阻害％として表わされる。異なる時点（８、２４または４８時間）において、リポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（商標）２０００（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１μｇ  ＡＯＮ：１μＬリポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（商標）２０００）を単一用量で使用して、ＰＳ−ＤＮＡから構成されるか、またはＰＳ−ＦＡＮＡ修飾または対応するミスマッチ配列を有して構成されるＰＤＥ４Ｄ−特異的ＡＯＮで、Ａ５４９細胞を２４時間形質移入した（Ｂ）。標的遺伝子のＰＤＥ４Ｄ  ｍＲＮＡ発現レベルをパノミクス（Ｐａｎｏｍｉｃｓ）からのクオンティジェン（Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ）（登録商標）アッセイを使用して定量化し、β２Ｍ遺伝子発現に正常化した。データは、センス対照配列で処理された細胞内の発現レベルに対する、特異的阻害％として表わされる。図の下の説明文は、ＴＯＰ  １４９７（ＰＤＥ４−特異的）ＡＯＮ中のＦＡＮＡ修飾を実証する。
【図５】肺上皮細胞の生物学的効果に対する２’Ｆ−ＡＮＡ含有ＡＯＮの効果を示す。ＰＳ−ＤＮＡ（ＴＯＰ  １５４５）から構成される、またはＦＡＮＡ（ＰＳ−ＦＡＮＡ、ＴＯＰ  １５４５−Ｆ３）で修飾されたＰＤＥ４Ｂ／４Ｄ−二重特異的ＡＯＮで、Ａ５４９細胞を一晩形質移入し、次にＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ）で４時間刺激した。ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）からのＥＬＩＳＡにより、上清をＩＬ−８およびＭＣＰ−１分泌について分析し、アラマーブルー（ａｌａｍａｒＢｌｕｅ）（商標）アッセイによって判定された細胞生存度にレベルを正常化した。データは、対応するセンス対照配列で処理された細胞内の発現レベルに対する平均％阻害として表わされる（＊＊ｐ＜０．０１、ｎ＝３）。
【図６】免疫細胞内の２’−Ｆ−ＡＮＡ含有ＡＯＮの効果を示す。（Ａ）ヒトＰＢＭＣをＦＡＮＡ修飾二重特異的ＰＤＥ４Ｂ／４Ｄ  ＡＯＮ（ＴＯＰ  １５４５）またはＦＡＮＡ修飾ＰＤＥ７Ａ特異的ＡＯＮ（ＴＯＰ  １７３１）または双方で２０時間形質移入し、次にＰＨＡ（１０μｇ／ｍＬ）で６時間刺激した。パノミクス（Ｐａｎｏｍｉｃｓ）からのクオンティジェン（Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ）（登録商標）アッセイを使用して、標的遺伝子のｍＲＮＡ発現を評価し、全てのＰＤＥ遺伝子発現レベルをβ２Ｍ遺伝子発現に正常化した。データは、センスＡＯＮで形質移入した細胞内のレベルに対する、ＰＤＥ４Ｂ（ｎ＝８）、ＰＤＥ４Ｄ（ｎ＝６）、およびＰＤＥ７Ａ（ｎ＝８）のｍＲＮＡに関する発現の％特異的阻害として表わされる。指定のカラムを比較する対応のないｔ−検定について、Ｐ値を判定した。（Ｂ）細胞上清を収集し、メディコープ（Ｍｅｄｉｃｏｒｐ）からのＥＬＩＳＡを使用して、ＰＨＡに応答してＰＢＭＣによって分泌されたサイトカインＴＮＦ−αおよびＩＬ−２のレベルを評価した。サイトカインの低下をＡＯＮ送達不在下のＰＨＡ刺激細胞内のレベルと比較した。データは、同一用量のミスマッチまたはセンス対照オリゴヌクレオチドについて観察される阻害のレベルに対するＡＯＮの％阻害として表わされる。データは、８供与者間の平均％変化±ＳＥとして表わされる。
【図７】リポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（商標）２０００（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、比率１μｇオリゴヌクレオチド：１μＬリポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（商標）２０００）、および２００ｎｇ、４００ｎｇ、および８００ｎｇのＴＯＰ−１５４５−Ｆ３またはＴＯＰ−１５４９ＡＯＮのどちらかを使用して、ＰＤＥ４Ｂ／４Ｄ特異的ＡＯＮ（ＴＯＰ−１５４５−Ｆ３）またはＴＹＭＳ特異的ＡＯＮ（ＴＯＰ−１５４９）で形質移入した２９３細胞内のチミジレートシンターゼ（ＴＹＭＳ）遺伝子発現の阻害を示す。リアルタイムＰＣＲを使用してＴＹＭＳ発現を定量化し、それを対照遺伝子（Ｐｐｉｂ）の発現に正規化した。データは、関連するセンスまたはミスマッチＡＯＮで形質移入した細胞の発現レベルに対する平均％阻害として表わされる。
【図８】ＣＹＮＯＭ−Ｋ１サル細胞系中で、（Ａ）ＰＤＥ４ＤおよびＰＤＥ４Ｂ  ｍＲＮＡ発現を低下させるＴＯＰ１５７２−Ｆ２、および（Ｂ）ＰＤＥ７Ａ  ｍＲＮＡ発現を低下させるＴＯＰ１７３１−Ｆ３の有効性を示す。抗生物質を含まない培地中で、１μｇオリゴ：２μＬ脂質の比率でリポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（商標）２０００と複合体化させた、２５０ｎＭのＡＯＮまたは対応する対照で、細胞を２４時間にわたり形質移入した。ＰＰＩＢ対照遺伝子の発現に相対定量化して、ＲＴ−ＰＣＲにより、ＰＤＥ４Ｄ、ＰＤＥ４Ｂ、およびＰＤＥ７Ａ  ｍＲＮＡ発現レベルを測定した。非形質移入細胞の遺伝子レベルと比較したＰＤＥ  ｍＲＮＡ阻害の百分率を判定した。一元配置分散分析と、それに続くダネット比較、＊＊ｐ＜０．０１を使用して、統計学的分析を実施した。
【図９】ＴＯＰ１５７２−Ｆ２およびＴＯＰ１５４５が、正常なヒト気管支上皮細胞（ＮＨＢＥ）中で（Ａ）ＰＤＥ４Ｄ  ｍＲＮＡ発現、および（Ｂ）ＭＣＰ−１タンパク質分泌を低下させる有効性を示す。抗生物質を含まない培地中で、１μｇオリゴ：１μＬ脂質の比率でリポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（商標）２０００と複合体化させた、２５０ｎＭのＡＯＮまたは対応する対照で、細胞を２４時間にわたり形質移入した。形質移入期間の終わりに、細胞をサイトミクス（ｃｙｔｏｍｉｘ）（５００Ｕ／ｍＬ  ＴＮＦ−α＋１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ１−β＋１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＦＮγ）で４時間にわたり刺激した。アラマーブルー（ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ）アッセイで測定される細胞生存度に正常化して、ＥＬＩＳＡにより、上清中でＭＣＰ−１タンパク質分泌を測定した。Ｂ２Ｍ対照遺伝子の発現に相対定量化して、ＲＴ−ＰＣＲによりＰＤＥ４Ｄ  ｍＲＮＡ発現レベルを測定した。対応する対照で処理された細胞と比較した、阻害百分率を判定した。ｔ検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１を使用して、統計学的分析を実施した。
【図１０】アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）ＴＯＰ  １５７２が、ＰＨＡ−刺激ヒトＰＢＭＣによるサイトカイン分泌を阻害する有効性を示す。ＰＢＭＣをＴＯＰ  １５７２（６．２ｎＭ）または関連する対照ＡＯＮ（ＴＯＰ  １５７２ｓ、６．３ｎＭ）のどちらかで一晩形質移入し、翌日マイトジェンＰＨＡ（１０μｇ／ｍｌ）で６時間刺激した。ＥＬＩＳＡを使用して、細胞上清中のサイトカインＩＬ−２（Ａ）およびＴＮＦ−α（Ｂ）のレベルを定量化した。データはＩＬ−２（ｐｇ／ｍｌ）またはＴＮＦ−α（ｎｇ／ｍｌ）の三連ウェルの平均値±ＳＥを表す。一元配置分散分析とそれに続くボンフェローニ多重比較試験を使用して、統計学的分析を実施し、ＰＨＡ−刺激細胞へのＡＯＮ形質移入に引き続いて、または関連する対照ＡＯＮ処理細胞のサイトカインレベルを比較した、＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１。サイトカイン分泌の％阻害は、ＰＨＡに応答して得られたレベルとの比較である。
【図１１】ＡＯＮ  ＴＯＰ  １７３１が、マイトジェン刺激ヒトＰＢＭＣによるサイトカイン分泌を阻害する有効性を示す。エスコート（Ｅｓｃｏｒｔ）ＩＶと複合体化させたＴＯＰ１７３１（３．１ｎＭ）または関連する対照ＡＯＮ（ＴＯＰ  １７３１ｓ、３．１ｎＭ）のどちらかでＰＢＭＣを一晩形質移入し、翌日マイトジェンＰＨＡ（１０μｇ／ｍｌ）で６時間刺激した。ＥＬＩＳＡによって、細胞上清中のサイトカインＩＬ−２（Ａ）およびＴＮＦ−α（Ｂ）のレベルを定量化した。データはＩＬ−２（ｐｇ／ｍｌ）またはＴＮＦ−α（ｎｇ／ｍｌ）の三連ウェルの平均値±ＳＥを表す。一元配置分散分析とそれに続くボンフェローニ多重比較試験を使用して統計学的分析を実施し、ＰＨＡ刺激細胞のＡＯＮ−処置に引き続いて、または関連する対照ＡＯＮ処理細胞のサイトカインレベルを比較した、＊＊＊ｐ＜０．００１。サイトカイン分泌の％阻害は、ＰＨＡに応答して得られたレベルとの比較である。
【図１２】Ｆ’ＡＮＡ修飾ＴＯＰ  １５７２およびＴＯＰ  １７３１を組み合わせた場合の、ＰＨＡ−刺激ＰＢＭＣによるサイトカイン分泌の低下における改善された有効性を示す。ヒトＰＢＭＣをＴＯＰ  １５７２−Ｆ２（３．１および６．３ｎＭ）、ＴＯＰ１７３１−Ｆ３（３．１および６．３ｎＭ）または双方のＡＯＮ（各３．１ｎＭ、合計６．３ｎＭ）のいずれかで、一晩形質移入した。翌日、ＰＢＭＣをＰＨＡ（１０μｇ／ｍｌ）で６時間刺激し、次にＥＬＩＳＡによって細胞上清中のサイトカインＩＬ−２のレベルを定量化した。ＰＨＡ刺激に引き続き非形質移入細胞によって生成されるレベルと比較して、ＩＬ−２分泌の％阻害を判定した。値は平均±Ｓ．Ｅ．を表す。
【図１３】２９３細胞系中で（Ａ）ＰＤＥ４Ｄおよび（Ｂ）ＰＤＥ４Ｂ  ｍＲＮＡ発現を低下させるにあたってのＴＯＰ１５７２（ＰＳ−ＤＮＡ）の有効性と、ＴＯＰ１５７２−Ｆ１、ＴＯＰ１５７２−Ｆ２、およびＴＯＰ１５７２−Ｆ３（ＰＳ−ＦＡＮＡバージョン）の有効性とを比較する。抗生物質を含まない培地中で、リポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（商標）２０００と１μｇオリゴ：１μＬ脂質の比率で複合体化させた２５０ｎＭのＡＯＮまたは対応する対照で、細胞を２４時間、４８時間または７２時間にわたり形質移入した。ＰＰＩＢ対照遺伝子の発現に相対定量化して、ＲＴ−ＰＣＲによって、ＰＤＥ４ＤおよびＰＤＥ４Ｂ  ｍＲＮＡの発現レベルを測定した。特異的ＰＤＥ  ｍＲＮＡ阻害の百分率は、対応する対照で形質移入した細胞内の遺伝子レベルと比較して判定した。
【図１４】Ａ５４９細胞系内でＰＤＥ７Ａ  ｍＲＮＡ発現を低下させるにあたってのＴＯＰ１７３１（ＰＳ−ＤＮＡ）の有効性と、ＴＯＰ１７３１−Ｆ３、（ＰＳ−ＦＡＮＡ）の有効性とを比較する。抗生物質を含まない培地中で０．８μｇオリゴ：１μＬ脂質の比率でリポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（商標）２０００と複合体化させた２５０ｎＭ、１２５ｎＭまたは７５ｎＭのＡＯＮまたは対応する対照オリゴで、細胞を４８時間形質移入した。Ｂ２Ｍ対照遺伝子の発現に相対定量化して、クオンティジェン（Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ）（登録商標）アッセイによって、ＰＤＥ７Ａ  ｍＲＮＡ発現レベルを測定した。特異的ＰＤＥ  ｍＲＮＡ阻害の百分率は、対応する対照で形質移入した細胞内の遺伝子レベルと比較して判定した。
【００４５】
表の簡単な説明
表１ａは、本発明に従ったヒトＰＤＥ７Ａアンチセンスオリゴヌクレオチドを同定する。
【００４６】
表１ｂは、本発明に従ったヒトＰＤＥ３Ａアンチセンスオリゴヌクレオチドを同定する。
【００４７】
表１ｃは、本発明に従った２つ以上のＰＤＥ４イソ型（ＰＤＥ４Ａ／４ＤまたはＰＤＥ４Ｂ／４Ｄのどちらか）に対する二重特異性がある、アンチセンスオリゴヌクレオチドを同定する。ＡＯＮ配列中のＰＤＥ４イソ型間の塩基対ミスマッチは、下線で示される。ＡＯＮ中のイノシンによる塩基対置換は、アルファベットＩで示される。
【００４８】
表１ｄは、ＰＤＥ３Ｂ、ＰＤＥ４Ｄ、およびＰＤＥ７Ａに対する特異性、およびＰＤＥ４Ａおよび４Ｂに対する二重特異性があるアンチセンスオリゴヌクレオチドを同定する。
【００４９】
表２ａは、本発明に従ったＦＡＮＡ塩基を含有するヒトＰＤＥ７Ａアンチセンスオリゴヌクレオチドを同定する。ＦＡＮＡ修飾塩基は太字によって示される。
【００５０】
表２ｂは、本発明に従ったＦＡＮＡ塩基を含有するヒトＰＤＥ３Ａアンチセンスオリゴヌクレオチドを同定する。ＦＡＮＡ修飾塩基は太字によって示される。
【００５１】
表２ｃは、本発明に従ったＦＡＮＡ塩基を含有するヒトＰＤＥ３Ｂアンチセンスオリゴヌクレオチドを同定する。ＦＡＮＡ修飾塩基は太字によって示される。
【００５２】
表２ｄは、本発明に従ったＦＡＮＡ塩基を含有するヒトＰＤＥ４Ａアンチセンスオリゴヌクレオチドを同定する。ＦＡＮＡ修飾塩基は太字によって示される。
【００５３】
表２ｅは、本発明に従ったＦＡＮＡ塩基を含有するヒトＰＤＥ４Ｄアンチセンスオリゴヌクレオチドを同定する。ＦＡＮＡ修飾塩基は太字によって示される。
【００５４】
表２ｆは、本発明に従ったＦＡＮＡ塩基を含有するヒトＰＤＥ４Ｂアンチセンスオリゴヌクレオチドを同定する。ＦＡＮＡ修飾塩基は太字によって示される。
【００５５】
表２ｇは、２つ以上のＰＤＥ４イソ型に対する二重特異性があり、本発明に従ったＦＡＮＡ塩基を含有するヒトアンチセンスオリゴヌクレオチドを同定する。ＦＡＮＡ修飾塩基は太字によって示される。
【００５６】
表３は、リアルタイムＰＣＲで使用されるヒトオリゴヌクレオチドプライマーを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
本明細書の発明は、細胞内ｃＡＭＰの低下と関連付けられている疾患および／または少なくとも１つのＰＤＥの上昇したレベルと関連付けられている疾患を治療するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドベースの化合物、治療的組成物、および方法に関する。本発明は、炎症促進性メディエータならびに炎症細胞によって放出される酵素のレベルを減少
させながら、細胞中のｃＡＭＰレベルを増大させることを目的としている。
【００５８】
これらの効果を得るために、本発明はその一態様で、本明細書において「同義遺伝子ノックダウン」と称されるものを利用する。同義遺伝子ノックダウンとは、それが対抗するイソ酵素遺伝子だけでなく関連遺伝子もまた下方制御する、本発明に従った単一アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物と、またはそれぞれ異なるイソ酵素遺伝子を下方制御する少なくとも２つのアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物の組み合わせとのどちらかによる、同義遺伝子の阻害または下方制御を指す。
【００５９】
細胞内ｃＡＭＰレベルの低下と関連付けられている疾患としては、少なくとも１つのｃＡＭＰ−特異的ＰＤＥのレベルが増大する疾患（すなわちＰＤＥ関連疾患）が挙げられる。
【００６０】
「下方制御する」という用語は、本明細書において遺伝子発現の少なくとも部分的な阻害を指すのに使用される。本発明に従って、アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物は、それが対抗する遺伝子、すなわちそれに対してアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物が阻害を引き起こすのに十分な配列相補性を示す遺伝子を下方制御または阻害する。
【００６１】
「関連遺伝子」という用語は、細胞内ｃＡＭＰの低下および／または少なくとも１つのＰＤＥレベルの増大と関連付けられている疾患の病態生理学における役割もまた果たしてもよいが、それに対してオリゴヌクレオチドアンチセンス化合物が完全にまたは部分的に相補的でない、その他の遺伝子を指す。このような遺伝子としては、ＰＤＥ酵素またはアイソタイプ、例えばサイトカインおよびケモカインなどのメディエータをコードする遺伝子、および酵素をコードする遺伝子が挙げられるが、これに限定されるものではない。メディエータの例としては、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、およびＴＮＦ−αが挙げられる。適切な酵素の例としては、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−９、およびＭＭＰ−１２などのマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００６２】
本発明に従って、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）化合物は、本明細書において特定の標的タンパク質についてＤＮＡまたはｍＲＮＡコーディングに対する相補性を示し、ｍＲＮＡの転写または翻訳を妨害しおよび／またはＲＮＡ分解酵素またはＲＮＡ分解酵素様活性を誘発して、それによって標的タンパク質の発現を低下させるように機能できる、天然のまたは修飾された、好ましくはヌクレアーゼ抵抗性のオリゴヌクレオチドと定義される。オリゴヌクレオチド化合物が標的ＤＮＡまたはｍＲＮＡにハイブリダイズすると、標的タンパク質の発現は低下し、それによってその転写／翻訳が妨害／防止される。したがって本オリゴヌクレオチド化合物は、それにハイブリダイズするために、それが対抗する核酸と十分相補的でなくてはならない。したがって当業者は理解するように、最も好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチド化合物はそれらが対抗する核酸と１００％相補的であるが、オリゴヌクレオチド化合物とそれらが対抗する核酸との間でハイブリダイゼーションが起きるためには、１００％の相補性は必要でない。したがっていくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチド化合物は、それらが対抗する核酸と約９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６０％、および５０％相補的であってもよい。
【００６３】
「核酸」および「核酸分子」という用語は、本明細書において同義的に使用され、ヌクレオチド、すなわちリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、または双方を含んでなる分子を指す。この用語は、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドのモノマーおよびポリマーを含み、ポリマーの場合、５’−３’結合を通じてリボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドが一緒に結合される。しかし結合は、例えば５’−２’結合を含んでなる核酸をはじめとする、核酸合成技術分野で知られている結合の
いずれを含んでもよい。核酸分子中で使用されるヌクレオチドは天然であってもよく、または天然塩基対と塩基対関係を形成できる合成類似体であってもよい。塩基対合関係を形成できる非天然塩基の例としては、プリンおよびピリミジン環の炭素および窒素原子の１つ以上が、例えば酸素、イオウ、セレン、リンなどのヘテロ原子によって置換されている、アザおよびデアザピリミジン類似体、アザおよびデアザプリン類似体、およびその他の複素環式塩基類似体が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００６４】
本明細書の発明はまた、標的タンパク質の発現を低下させまたは阻害するそれらの活性に顕著に悪影響を及ぼさないがこの活性を増強してもよい、アンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾にも関する。
【００６５】
本アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物はまた、それらの活性に対する顕著な有害効果なしに、１つ以上の塩基の挿入または欠失によって修飾されてもよい。特にそれらが対抗する遺伝子に対して１００％相補性を示すオリゴヌクレオチド末端への塩基の付加または欠失は、一般に阻害活性の顕著な損失なしに実施できる。このような修飾は、オリゴヌクレオチドの活性を増大し、または改善された安定性を提供するために実施してもよい。さらに例えば別のプリン（アデニン、グアニン）によるプリンの置換、およびピリミジン（シトシン、チミン、ウラシル）によるピリミジンの置換など、本アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物中の１つ以上の塩基の置換は、活性に対する有害効果なしに実施できる。
【００６６】
本発明に従ったアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物はまた、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）アプローチに由来するｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、およびそれらを含有するＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）を含んでもよい。最近記載されたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）アプローチは、標的遺伝子発現阻害のための新しいツールと見なされる。数年前から既に知られているように、ＲＮＡｉは下等真核生物における古代の抗ウイルス性防御機序に基づく。これは二本鎖ＲＮＡによって誘発され、その２１〜２３ｎｔの低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）へのプロセシングは、ＲＩＳＣ複合体を用いて一本鎖の様式で標的ｍＲＮＡにハイブリダイズした後、相同的な内在性ｍＲＮＡの分解を引き起こす。ＲＮＡｉが働く様式は依然として完全に解明されていないが、それは既に線形動物、ハエ、植物、真菌、および哺乳類などの幅広い真核生物種において、機能喪失型フェノタイプを発生させるアプローチの第一候補としての役割を果たしている。
【００６７】
本発明に従ったアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物はまた、リボザイムおよび短いヌクレオチド配列、一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡを含んでもよく、それらには上述のように化学修飾が組み込まれてもよく、生体外および／または生体内で遺伝子転写および／または翻訳を阻害できる。
【００６８】
本発明の組成物および方法は、一態様では、特定の作用様式に拘束されるものではないが、「同義遺伝子ノックダウン」と称される機序によって作用するように見える。本発明の文脈で、同義遺伝子ノックダウンとは以下を指す。
【００６９】
１）それが対抗する遺伝子を下方制御するだけでなく、その他の関連遺伝子もまた下方制御する、アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物、および
２）それぞれが遺伝子を下方制御できる少なくとも２つのアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物の組み合わせであり、それぞれが、アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物が事実上、単独でそれが対抗する遺伝子を下方制御する効果がない濃度で存在し、組み合わせは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが対抗する双方の遺伝子の顕著な下方制御をもたらし、その他の関連遺伝子もまた下方制御してもよい。この効果については、本出願人の国際公開第０５／０３０７８７号パンフレットで最初に開示された。
【００７０】
一態様では本発明は、少なくとも２つのアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物を含んでなる組成物を提供し、各アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物は異なる遺伝子を下方制御できる。この態様のいくつかの実施態様では、少なくとも２つのアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物の組み合わせは、各アンチセンスが遺伝子を個々に下方制御する相加能力を超える、各遺伝子の顕著な下方制御をもたらす。
【００７１】
一態様では本発明は、細胞内ｃＡＭＰの低下および／または少なくとも１つのＰＤＥレベルの上昇と関連付けられている疾患を治療および／または予防するための医薬組成物を提供し、前記組成物は、医薬的に許容可能なキャリアおよび少なくとも２つのアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物を含んでなり、各オリゴヌクレオチド化合物は異なる標的ＰＤＥ−コーディング遺伝子の少なくとも一部に対抗し、各オリゴヌクレオチド化合物はそれが対抗する標的遺伝子を下方制御でき、各オリゴヌクレオチド化合物はその標的ＰＤＥ遺伝子の２０％未満の阻害を示す濃度で存在し、組み合わせは２０％を超える阻害を示し、標的遺伝子の少なくとも１つ、および場合によりその他の関連遺伝子の阻害を少なくとも倍加する。
【００７２】
当業者は理解するように、例えば標的ＰＤＥ遺伝子の１％未満の阻害を示す濃度など、非常に低濃度の本発明に従ったオリゴヌクレオチド化合物の組み合わせを併用して、少なくとも２０％の阻害を示すことはできないかもしれない。各オリゴヌクレオチド化合物を使用して本発明に従った組み合わせを形成できる最低濃度は変動し、この濃度は０．５％阻害が達成される濃度、または１％〜５％阻害が達成される濃度でであってもよい。
【００７３】
本発明は、細胞内ｃＡＭＰの低下および／または少なくとも１つのＰＤＥレベルの上昇と関連付けられている疾患を治療および／または予防するための医薬組成物を提供し、前記組成物は、医薬的に許容可能なキャリア、およびそれぞれ異なる標的遺伝子を下方制御できる少なくとも２つのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでなり、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、例えば標的遺伝子の２０％未満の阻害を示す濃度など、事実上、単独で効果がない濃度で存在し、オリゴヌクレオチドの組み合わせは２０％を超える阻害を示し、標的遺伝子の少なくとも１つ、および場合によりその他の関連遺伝子の阻害を少なくとも倍加する。
【００７４】
本発明は、呼吸器炎症性疾患などの細胞内ｃＡＭＰの低下と関連付けられている疾患を治療および／または予防するための少なくとも２つのアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物の組み合わせの使用をさらに提供し、各オリゴヌクレオチド化合物は、異なるＰＤＥアイソタイプをコードする遺伝子に対抗し、各オリゴヌクレオチド化合物はそれが対抗する遺伝子を下方制御でき、オリゴヌクレオチド化合物は各オリゴヌクレオチドが事実上、単独でそれが対抗する遺伝子を下方制御する効果がない濃度で存在し、少なくとも２つのオリゴヌクレオチド化合物の組み合わせは、オリゴヌクレオチド化合物が対抗する遺伝子の少なくとも１つ、および場合によりその他の関連遺伝子を下方制御するのに効果的である。
【００７５】
本発明は、炎症性呼吸器疾患などの細胞内ｃＡＭＰの低下と関連付けられている疾患を治療および／または予防する方法をさらに提供し、本方法は、それぞれ異なる標的ＰＤＥ遺伝子を下方制御できる少なくとも２つのアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物を対象に投与するステップを含んでなり、オリゴヌクレオチド化合物は、例えば標的遺伝子の２０％未満の阻害を示す濃度など、各オリゴヌクレオチド化合物が事実上、単独で標的遺伝子を下方制御する効果がない濃度で投与され、オリゴヌクレオチド化合物の組み合わせはオリゴヌクレオチド化合物が対抗する遺伝子の少なくとも１つ、および場合によりその他の関連遺伝子を下方制御するのに効果的である。
【００７６】
本発明は、炎症性疾患および癌などの細胞内ｃＡＭＰの低下またはｃＡＭＰ−特異的ＰＤＥレベルの増大（ＰＤＥ関連疾患）と関連付けられている疾患を治療および／または予防するための薬剤を製造するための上述のような医薬組成物の使用をさらに提供する。本方法および組成物が目的とする炎症性疾患は、一般に炎症細胞および／またはメディエータが存在する疾患と定義される。炎症性疾患の例としては、多発性硬化症、接触性皮膚炎、アレルギー性および非アレルギー性眼疾患、関節リウマチ、敗血症ショック、骨粗鬆症および認知障害が挙げられるが、これに限定されるものではない。本方法および組成物が目的とする炎症性呼吸器疾患は、一般に炎症細胞およびメディエータが存在する気道および肺の疾患と定義される。炎症性呼吸器疾患の例としては、ＣＯＰＤ、喘息、好酸球性咳、気管支炎、肺同種移植片の急性および慢性拒絶、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、および副鼻腔炎が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００７７】
本発明は、環式ＡＭＰの低下が生理病理学に関与する疾患を治療および／または予防するための薬剤を製造するための上述のような医薬組成物の使用をさらに提供する。
【００７８】
本発明は、炎症性呼吸器疾患を治療および／または予防するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的ヌクレオチドに到達し、および／または標的遺伝子に対してより効果的であるように、それを修飾する方法をさらに提供する。
【００７９】
本発明は、上述の組成物を含む製剤をさらに提供し、製剤は全身および／または局所用である。
【００８０】
本発明は、組成物が標的遺伝子に到達できるようにする界面活性剤と組み合わさった、上述のような組成物を対象に投与するステップを含んでなる、医薬組成物を標的ポリヌクレオチドに送達する生体内の方法をさらに提供する。
【００８１】
好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物を使用して治療してもよい対象または患者としては、無脊椎動物、脊椎動物、鳥類、ブタ、ヤギ、ヒツジ、雌牛、イヌ、ネコなどの哺乳類、および特にヒトが挙げられるが、これに限定されるものではない。本発明に従ったオリゴヌクレオチド化合物は、治療する特定の動物に適するようにデザインされる。特にアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物の配列は、種間のゲノムの違いを鑑みて、治療する対象次第で変動する。
【００８２】
本発明は、ＰＤＥ３、ＰＤＥ４、およびＰＤＥ７をはじめとするがこれに限定されるものではない、ＰＤＥファミリーの酵素に対して効果的である、例えば発現を阻害できる、アンチセンスオリゴヌクレオチドをさらに提供する。当業者は理解するように、各ＰＤＥサブタイプはまた、アイソタイプを含んでもよい。例えばＰＤＥ３サブタイプはＰＤＥ３ＡおよびＰＤＥ３Ｂアイソタイプを含み、ＰＤＥ４サブタイプはアイソタイプＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｃ、およびＰＤＥ４Ｄを含み、ＰＤＥ７サブタイプはアイソタイプＰＤＥ７Ａ１、ＰＤＥ７Ａ２、ＰＤＥ７Ａ３、およびＰＤＥ７Ｂを含む。
【００８３】
本明細書での使用では、アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物が事実上効果がない「濃度」という用語は、事実上、単独で、オリゴヌクレオチド化合物が対抗する遺伝子の下方制御が観察されない濃度（標的遺伝子の２０％未満の阻害が示される濃度）での各オリゴヌクレオチド化合物の使用を指す。これはそれぞれが、単独ではそれらが対抗する遺伝子を下方制御する効果がない濃度（２０％未満の阻害が示される濃度）で存在する、本発明に従った少なくとも２つのオリゴヌクレオチド化合物の組み合わせの効果とは対照的であり、この組み合わせは２０％を超える阻害を示し、オリゴヌクレオチド化合物が対抗する遺伝子の少なくとも１つの阻害を少なくとも倍加するのに効果的である。
【００８４】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書での用法では、約１〜約１００個のヌクレオチド、より好ましくは１〜８０個のヌクレオチド、およびさらにより好ましくは約４〜約３５個のヌクレオチドを含んでなる核酸分子を指す。「オリゴヌクレオチド」という用語は、上記に示したような修飾オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド化合物もまた含む。
【００８５】
「修飾オリゴヌクレオチド」および「修飾核酸分子」という用語は、本明細書での用法では、核酸塩基、糖部分、ヌクレオシド間リン酸結合の全てまたはのいずれかの天然分子構造の分子レベルで１つ以上の化学修飾がある、オリゴヌクレオチドをはじめとする核酸、ならびにジアミン、コレステリル、またはその他の親油性基などの付加置換基を有する分子、またはこれらの部位における修飾の組み合わせを指す。ヌクレオシド間のリン酸結合は、リン酸ジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロアミダート、シロキサン、炭酸塩、カルボキシメチルエステル、アセトアミダート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホロアミダート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｎｉｄａｔｅ）、架橋ホスホン酸メチレン、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸、ホスホロジチオ酸、架橋ホスホロチオエートおよび／またはスルホンヌクレオチド間結合、または３’−３’、２’−５’または５’−５’結合、およびこのような同様の結合の組み合わせ（混合主鎖修飾オリゴヌクレオチドを生成するため）であることができる。修飾はオリゴヌクレオチド分子の内部（単一または反復）または末端であることができ、コレステリル、アミノ基と末端リボース、デオキシリボース間の変動する炭素残基数があるジアミン化合物などのヌクレオシド間リン酸結合分子への付加、および対向鎖または結合酵素またはその他のタンパク質を切断し、またはそれに架橋するリン酸修飾を含むことができる。リボース−ジアルデヒドなどの求電子基は、このようなタンパク質のリシル−残基のεアミノ基と共有結合していてもよい。オリゴマーに係留するｎ−エチルマレイミドなどの求核基は、ｍＲＮＡの５’末端に、または別の求電子性部位に、共有結合的に結合できる。修飾オリゴヌクレオチドという用語はまた、２’−置換リボヌクレオチドなどの糖部分の修飾を含んでなるオリゴヌクレオチド、またはそのいずれでも５’−３’結合を通じて共に結合するデオキシリボヌクレオチドモノマーも含む。修飾オリゴヌクレオチドはまた、配列の標的特異性が維持される、ＰＮＡまたはモルホリノ修飾主鎖を含んでいてもよい。
【００８６】
場合により、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、多様な生理学的キャリア分子と共に調合されてもよい。本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドはまた、標的細胞に侵入するそれらの能力を増強する分子と複合体化させてもよい。このような分子の例としては、炭水化物、ポリアミン、アミノ酸、ペプチド、脂質、および細胞生育に不可欠な分子が挙げられるが、これに限定されるものではない。例えばオリゴヌクレオチドを脂質と組み合わせてもよく、得られるオリゴヌクレオチド／脂質エマルジョン、またはリポソームの懸濁液は、とりわけオリゴヌクレオチドの生体内半減期を効果的に増大してもよい。
【００８７】
あるいは、ＰＤＥ標的に対抗するオリゴヌクレオチドはまた、プロトン化／酸性化されて、ホスホジエステラーゼ阻害剤および抗細菌剤としての二重の役割を果たしてもよい。したがって本明細書に記載される発明の別の実施態様は、さらにプロトン化／酸性化されて細胞取り込みが増大され、抗生物質としても機能できるようにリポソーム内へのカプセル封入が改善される、治療的なオリゴヌクレオチドを調節するＰＤＥの使用である。さらにオリゴヌクレオチドは、例えばオリゴヌクレオチドの生体内安定性をさらに増強する、または別の方法でその薬理学的特性を増強する（例えば生体内半減期増大、毒性低下など）、多様な確立された化合物または構造物と複合体化されてもよい。
【００８８】
「核酸主鎖」という用語は、本明細書での用法では、分子内でヌクレオチドを連結する
化学部分の構造を指す。これはヌクレオチドを化学的に連結する、任意の全ての手段から形成される構造を含んでもよい。修飾主鎖とは、本明細書での用法では、ヌクレオチド間の化学結合の修飾と、ならびに糖構造修飾などの安定性および親和性を増強するのに使用してもよいその他の修飾とを含む。例えば天然のデオキシリボースの［β］−アノマーに対して塩基が反転される、［α］−アノマーを使用してもよい。好ましい実施態様では、糖類の２’−ＯＨは、親和性を損なうことなく、分解抵抗性を提供する２’−Ｏ−アルキルまたは２’−Ｏ−アルキル−ｎ（Ｏ−アルキル）に改変されてもよい。
【００８９】
本明細書において同義的に使用される「酸性化」および「プロトン付加／酸性化」という用語は、それによってプロトン（または陽性水素イオン）が核酸上のプロトン受容体部位に付加される過程を指す。プロトン受容体部位としては、核酸の塩基構造上のアミン基、およびリン酸ジエステル結合のリン酸が挙げられる。ｐＨが低下するとプロトン化されたこれらの受容体部位数が増大し、より高度にプロトン化／酸性化された核酸がもたらされる。
【００９０】
「プロトン化／酸性化された核酸」という用語は、１ｍＬあたりおよそ１６  Ａ２６０の濃度で水に溶解すると、生理学的ｐＨよりも低い、すなわちおよそｐＨ７よりも低いｐＨを有する核酸を指す。修飾核酸、ヌクレアーゼ−抵抗性核酸、およびアンチセンス核酸は、この定義に包含されることが意図される。核酸のｐＨを低下させるその他の修飾もまた使用でき、この用語に包含されることが意図されるが、一般に核酸は、核酸上の反応性部位にプロトンを付加することで、プロトン化／酸性化される。
【００９１】
「末端ブロックされた」という用語は、本明細書での用法では、例えばヌクレアーゼ作用による選択されたヌクレオチドの分解を妨げる、分子レベルの化学修飾がある核酸を指す。この化学修飾は、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドのコード領域などの核酸の一体部分を保護するように配置される。末端ブロックは、３’末端ブロックまたは５’末端ブロックであってもよい。例えば３’末端ブロックは、分子の３’−位最先端にあってもよく、またはそれが核酸の一体配列の３’であれば、それは３’末端の内側にあってもよい。
【００９２】
「実質的にヌクレアーゼ抵抗性」という用語は、天然または無修飾核酸と比較して、ヌクレアーゼ分解に抵抗性である核酸を指す。本発明の修飾核酸は、それらの無修飾対応物よりも少なくとも１．２５倍ヌクレアーゼ分解抵抗性であり、より好ましくはそれらの無修飾対応物よりも少なくとも２倍抵抗性であり、さらにより好ましくは少なくとも５倍抵抗性であり、最も好ましくは少なくとも１０倍抵抗性である。このような実質的にヌクレアーゼ抵抗性の核酸としては、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、エチルホスホトリエステル、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエート、２’−Ｏ−メチル−ｐ−エトキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アルキル−ｎ（Ｏ−アルキル）、３’−Ｏ−アルキル、３’−Ｏ−アルキル−ｎ（Ｏ−アルキル）、２’−フルオロ、２’−デオキシ−エリスロペントフラノシル、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシド、メチルカルバメート、炭酸メチル、反転塩基（例えば反転Ｔ）などの修飾主鎖、またはこれらの主鎖のキメラ体がある核酸が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００９３】
「実質的に酸抵抗性」という用語は、本明細書での用法では、無修飾核酸と比較して酸分解に抵抗性である核酸を指す。典型的に核酸の相対酸抵抗性は、抵抗性核酸の分解％をその無修飾対応物（すなわち「通常の」主鎖、塩基、およびリン酸ジエステル結合がある対応する核酸）の分解％と比較することで測定される。酸抵抗性の核酸は、好ましくはそれらの無修飾対応物よりも少なくとも１．５倍酸分解抵抗性であり、少なくとも２倍酸分解抵抗性であり、さらにより好ましくは少なくとも５倍酸分解抵抗性であり、最も好ましくは少なくとも１０倍酸分解抵抗性である。
【００９４】
「ＰＤＥ３Ａ、ＰＤＥ３Ｂ、ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｃ、ＰＤＥ４Ｄ、ＰＤＥ７Ａ、ＰＤＥ７Ｂオリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書での用法では、ＰＤＥ３Ａ、ＰＤＥ３Ｂ、ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｃ、ＰＤＥ４Ｄ、ＰＤＥ７Ａ、ＰＤＥ７Ｂの発現または活性に影響を与える配列をそれぞれ標的とする、オリゴヌクレオチドをそれぞれ指す。これらとしては、ＰＤＥ３Ａ、ＰＤＥ３Ｂ、ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｃ、ＰＤＥ４Ｄ、ＰＤＥ７Ａ、ＰＤＥ７ＢＤＮＡコード配列、ＰＤＥ３Ａ、ＰＤＥ３Ｂ、ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｃ、ＰＤＥ４Ｄ、ＰＤＥ７Ａ、ＰＤＥ７ＢＤＮＡプロモーター配列、ＰＤＥ３Ａ、ＰＤＥ３Ｂ、ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｃ、ＰＤＥ４Ｄ、ＰＤＥ７Ａ、ＰＤＥ７ＢＤＮＡエンハンサー配列、ＰＤＥ３Ａ、ＰＤＥ３Ｂ、ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｃ、ＰＤＥ４Ｄ、ＰＤＥ７Ａ、ＰＤＥ７ＢをコードするｍＲＮＡなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００９５】
上で考察したように、本発明の一実施態様は、ＰＤＥ３Ａ、ＰＤＥ３Ｂ、ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｄ、ＰＤＥ７Ａの発現または活性に影響する配列を標的とする、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。一実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、表１ａ〜ｄまたは表２ａ〜ｇで同定される配列の１つを有してもよい。別の実施態様では、当業者に理解されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの構成および／または長さを変更してもよいが、オリゴヌクレオチドが遺伝子発現を下方制御する活性を維持または増大する、これらの配列の断片または変異型を含んでなってもよい。別の実施態様では、本発明は、表１ａ〜ｄまたは表２ａ〜ｇで同定される配列を有する、少なくとも２つのアンチセンスオリゴヌクレオチドの組み合わせを提供する。
【００９６】
単一オリゴヌクレオチドの有効性の比較を図１ａ、図１ｂ、および図５に示すが、これに限定されるものではない。例えば図１ａでは、ＴＯＰ  １５１２（配列番号９１）はヒトＰＤＥ４ＡおよびＰＤＥ４Ｂに向かい、生体外でこれらの双方の標的を阻害する。同様に図１ｂは、ＰＤＥ４ＢとＰＤＥ４Ｄで共通する配列を認識して、双方の標的配列阻害を実証する、ＴＯＰ  １５４５（配列番号１４）およびＴＯＰ  １５５６（配列番号２４）を示す。ＰＤＥ４ＡとＰＤＥ４Ｄで共通する配列を認識するＴＯＰ  １５０７（配列番号１０）およびＴＯＰ  １５０８（配列番号１１）は、双方の標的遺伝子を阻害するように機能する。
【００９７】
少なくとも２つのオリゴヌクレオチド化合物の組み合わせの有効性の比較を図６ａおよび１２に示すが、これに限定されるものではない。例えば図６では、ＴＯＰ  １５４５−Ｆ３（配列番号８５）とＴＯＰ−１７３１−Ｆ２（配列番号５３）の組み合わせは、単独使用時にどちらのオリゴヌクレオチドがそれらの各標的に対して有する効果よりも、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｄ、およびＰＤＥ７Ａの発現をいずれも減少させるより大きな効果を示す。図６ｂでは、ＴＯＰ−１５４５−Ｆ３（配列番号８５）とＴＯＰ−１７３１−Ｆ２（配列番号５３）の組み合わせは、同一総用量（６．３ｎＭ）での単独使用時にどちらのオリゴヌクレオチドがＩＬ−２に対して有する効果よりも、ヒトＰＢＭＣ中のＩＬ−２−放出を減少させるより大きな効果を示す。図１２を参照すると、ＴＯＰ  １５７２−Ｆ２（配列番号１２２）とＴＯＰ  １７３１４−Ｆ３（配列番号５４）の組み合わせは、単独使用時よりも、ＩＬ−２分泌を阻害するより大きな効果を示す。
【００９８】
本発明に従って、アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物の多くの組み合わせを使用してもよく、組み合わせは上述のような同義遺伝子ノックダウンもたらす。アンチセンスオリゴヌクレオチドの組み合わせの例は、ＰＤＥ３に対抗する少なくとも１つのオリゴヌクレオチド化合物、およびＰＤＥ７に対抗する少なくとも１つのオリゴヌクレオチド化合物を含んでもよいが、これに限定されるものではない。組み合わせの別の例は、ＰＤＥ４に
対抗する少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、およびＰＤＥ７に対抗する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含んでもよい。組み合わせの別の例は、ＰＤＥ３に対抗する少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、ＰＤＥ４に対抗する少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、およびＰＤＥ７に対抗する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含んでもよい。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物は、表１ａ〜ｄおよび表２ａ〜２ｇに提供するオリゴヌクレオチドから選択されてもよいが、これに限定されるものではない。
【００９９】
本明細書において使用される「治療」、「治療する」、「治療法」などという用語は、一般に、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味する。効果は、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に予防する観点から予防的であってもよく、および／または疾患の部分的または完全治癒および／または疾患に帰する有害効果の寛解の観点から治療的であってもよい。「治療」とは、本明細書での用法では、以前定義されたような対象、特にヒトにおける疾患のあらゆる治療を包含し、次を含む。
【０１００】
（ａ）疾患にかかりやすい可能性があるが、疾患があるとまだ診断されていない対象において、疾患が生じるのを予防し、
（ｂ）疾患を阻止する、すなわちその進行を止め、または
（ｃ）疾患を緩和する、すなわち疾患の退縮を引き起こす。
【０１０１】
「医薬的に許容可能な」という用語は、キャリア、界面活性剤、および組成物にかかわる本明細書での使用では、本明細書に記載される経路のいずれかによる投与のために有毒でない、あるいは許容不可能でない、対象患者の治療での使用において許容可能な物質を指す。
【０１０２】
本発明は、一般に、ｓｉＲＮＡと、リボザイムと、標的核酸に相補的であってもよく、または場合により上述のように修飾されていてもよい、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡをはじめとする一本または二本鎖としての短いヌクレオチド配列と、ＲＮＡとハイブリダイズしてオリゴヌクレオチド−ＲＮＡ二本鎖を形成できる前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドの少なくとも一部を有するＲＮＡオリゴヌクレオチドと、または生体内で内在性遺伝子の発現を下方制御しまたは阻害するキメラオリゴヌクレオチドとをはじめとする、本発明に従った治療的に有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物の投与による、対象の治療に関する。
【０１０３】
「治療的に有効」量とは、所望の治療効果を提供する、無毒であるが十分な量のアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物を意味する。この場合、アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物のその用量は、例えば細胞内ｃＡＭＰの低下と関連付けられている疾患、ＰＤＥ関連疾患、炎症性呼吸器疾患のような炎症性疾患など、治療される病状または疾患の症状を緩和し、寛解し、または予防するのに効果的である。
【０１０４】
本明細書において提供される医薬組成物は、上述のアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物と１つ以上の医薬的に許容可能な界面活性剤とを含んでなる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの取り込みを増強するのに適した界面活性剤または界面活性剤構成要素については、界面活性剤に関してその内容を援用する、米国特許出願公開第２００３／００８７８４５号明細書で、以前に記載されている。この出願には、適切な界面活性剤は、「特に合成および天然のならびに完全および切断型の界面活性剤タンパク質Ａ、界面活性剤タンパク質Ｂ、界面活性剤タンパク質Ｃ、界面活性剤タンパク質Ｄ、および界面活性剤タンパク質Ｅ、ジ−飽和ホスファチジルコリン（ジパルミトイル以外）、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン；ホス
ファチジン酸、ユビキノン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルコリン、パルミトイル−リゾホスファチジルコリン、デヒドロエピアンドロステロン、ドリコール、スルファチド酸、グリセロール−３−ホスフェート、ジヒドロキシアセトンホスフェート、グリセロール、グリセロ−３−ホスホコリン、ジヒドロキシアセトン、パルミチン酸、シチジンジホスフェート（ＣＤＰ）ジアシルグリセロール、ＣＤＰコリン、コリン、コリンホスフェート；ならびに界面活性剤構成要素の天然キャリアビヒクルである天然および人工層板小体、ω−３脂肪酸、ポリエン酸（ｐｏｌｙｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ポリエン酸（ｐｏｌｙｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、レシチン、パルミチン酸、酸化エチレンまたは酸化プロピレンの非イオン性ブロック共重合体、モノマーおよびポリマーのポリオキシプロピレン、モノマーおよびポリマーのポリオキシエチレン、デキストランおよび／またはアルカノイル側鎖があるポリ（ビニルアミン）、ブリッジ（Ｂｒｉｊ）３５、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、および合成界面活性剤ＡＬＥＣ、エクソサーフ（Ｅｘｏｓｕｒｆ）、サーバン（Ｓｕｒｖａｎ）、およびアトバクオン（Ａｔｏｖａｑｕｏｎｅ）を含む。これらの界面活性剤は、単独で、または製剤中の複合成分界面活性剤の一部として、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴ）の５’および／または３’末端への共有結合付加としてのいずれかで使用してもよい」と記載されいる。
【０１０５】
少なくとも２つのアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物の組み合わせを含む、本組成物のアンチセンス構成要素は、リポソームまたは微結晶などの脂質粒子または小胞内の医薬製剤中に含有されてもよい。米国特許第６，０２５，３３９号明細書に記載されているように、脂質粒子は、その中にアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有しさえすれば、単層または複層などの任意の適切な構造物であってもよい。このような粒子および小胞のためには、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウムエチルスルフェート、または「ＤＯＴＡＰ」などの正に帯電した脂質が特に好ましい。このような脂質粒子の調製については、よく知られている。例えばジャノフ（Ｊａｎｏｆｆ）らに付与された米国特許第４，８８０，６３５号明細書；クロノ（Ｋｕｒｏｎｏ）らに付与された米国特許第４，９０６，４７７号明細書；、ワーラッハ（Ｗａｌｌａｃｈ）に付与された米国特許第４，９１１，９２８号明細書；ワーラッハ（Ｗａｌｌａｃｈ）に付与された米国特許第４，９１７，９５１号明細書；アレン（Ａｌｌｅｎ）らに付与された米国特許第４，９２０，０１６号明細書；ホイートリー（Ｗｈｅａｔｌｅｙ）らに付与された米国特許第４，９２１，７５７号明細書などを参照されたい。
【０１０６】
本発明の組成物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物を肺などの所望部位に輸送する任意の手段によって投与してもよい。本明細書で開示されるアンチセンス化合物は、任意の適切な手段によって患者の肺に投与してもよいが、好ましくは、アンチセンス化合物を含んでなる呼吸用粒子を含んでなる、煙霧剤の吸入によって投与される。
【０１０７】
本発明の組成物は、呼吸用サイズの粒子、例えば吸入時に、鼻、口、および喉頭を通過して、肺の気管支および肺胞を通るのに十分に小さいサイズの粒子を含む製剤として、呼吸器系内に投与してもよい。一般に呼吸用粒子はサイズが約０．５〜１０μｍの範囲である。煙霧剤に含まれる非呼吸用サイズの粒子は、喉に付着して飲み込まれる傾向があり、したがって煙霧剤中の非呼吸用粒子の量は、好ましくは最小化される。経鼻投与のためには、鼻腔内の保持を確実にするために１０〜５００μＭ（ミクロメートル）の範囲内の粒度が好ましい。
【０１０８】
煙霧剤を生成するための活性化合物（アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物）の液体医薬組成物は、アンチセンス化合物と、無菌の発熱物質を含有しない水またはリン酸緩衝食塩水などの適切なビヒクルとを組み合わせて調製してもよい。
【０１０９】
アンチセンス化合物を含んでなる固体微粒子組成物は、場合により、煙霧剤ならびにそ
の他の治療的な化合物の形成を容易にする役割を果たす分散剤を含有してもよい。適切な分散剤は乳糖であり、それはアンチセンス化合物と、例えば重量比１：１などの任意の適切な比率で混和されてもよい。
【０１１０】
アンチセンス組成物は、抗気管支収縮、抗アレルギーおよび／または抗炎症性有効量で投与してもよく、その量は治療される疾患の程度、対象患者の病状、特定の製剤、投与経路、対象への投与タイミングなどに左右される。一般に０．０５〜５０μＭ、または特に０．２〜５μＭのオリゴヌクレオチドの細胞内濃度が望ましい。ヒトなどの哺乳類患者への投与のためには、約０．００１、０．０１、０．１、または１ｍｇ／ｋｇから約５０まで、または１００ｍｇ／ｋｇ以上の投薬量が典型的に用いられる。しかしその他の用量もまた考察される。任意の特定の製剤中の活性化合物の溶解度次第で、１日量を１回または数回の単位用量投与に分割してもよい。
【０１１１】
アンチセンス化合物を含んでなる液体粒子の煙霧剤は、ネブライザーなどの任意の適切な手段によって生成されてもよい。ネブライザーは、狭いベンチュリ開口部を通じた、典型的に空気または酸素である圧縮ガスの加速によって、または超音波撹拌によって、活性成分の溶液または懸濁液を治療的煙霧剤ミストに転換する市販される装置である。ネブライザー中で使用するための適切な処方は、製剤の４０％ｗ／ｗまで、好ましくは２０％ｗ／ｗ未満の量で、液体キャリア中に活性アンチセンスオリゴヌクレオチド成分を含んでなる。キャリアは典型的に水または希釈水性アルコール溶液であり、好ましくは例えば塩化ナトリウムの添加によって体液と等張にされる。任意の添加剤としては、製剤が無菌調製でない場合は例えばヒドロキシ安息香酸メチルなどの保存料、抗酸化剤、抗細菌、香料、揮発性油、緩衝剤および乳化剤、およびその他の製剤界面活性剤が挙げられる。
【０１１２】
任意の固体微粒子薬剤煙霧剤発生装置を使用して、活性オリゴヌクレオチド化合物および医薬的に許容可能な界面活性剤を含んでなる、固体粒子の煙霧剤を同様に生成してもよい。固体微粒子薬剤を対象に投与するための煙霧剤発生装置は、上で説明したような呼吸用の粒子を生成し、ヒト投与に適した速度で、所定用量の薬剤を含有する一定容積の煙霧剤を生成する。活性オリゴヌクレオチド成分は、典型的に製剤の０．１〜１００ｗ／ｗを構成する。例示的な煙霧剤発生装置の第２のタイプは、定量吸入器を含んでなる。定量吸入器は、加圧煙霧剤計量分配装置であり、典型的に液化噴霧剤中に活性成分の懸濁液または溶液製剤を含有する。使用中、これらの装置は、典型的に１０〜１５０μＬである計量される容積を送達するように構成されたバルブを通じて製剤を送り出し、活性成分を含有する微細な粒子スプレーを生じる。適切な噴霧剤としては、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたはヒドロフルオロアルカン、およびそれらの混合物などの特定のクロロフルオロカーボン化合物が挙げられる。製剤は、例えばエタノールなどの１つ以上の補助溶剤、オレイン酸またはソルビタントリオレエートなどの乳化剤およびその他の製剤界面活性剤、抗酸化剤、および適切な着香剤をさらに含有してもよい。
【０１１３】
煙霧剤は、固体または液体粒子のどちらから形成されるかにかかわらず、煙霧剤発生装置によって、分あたり約１〜１５０Ｌの速度で生成されてもよい。
【０１１４】
本発明の製剤は、経口、頬内、肺内、直腸、子宮内、腫瘍内、頭蓋内、経鼻、筋肉内、皮下、血管内、くも膜下腔内、吸入可能、経皮、皮内、腔内、埋込型、イオン注入、眼球、膣、関節内、耳、静脈内、筋肉内、腺内、臓器内、リンパ管内、埋込型、徐放または腸内コーティング製剤であってもよい。製剤中で使用されるキャリアは、例えば固体および／または液体キャリアであってもよい。
【０１１５】
本オリゴヌクレオチド化合物との組み合わせに適し、組成物／製剤が呼吸器疾患を治療
する投与に適するようにするその他のキャリアについては、「レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、第１７版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．、１９８５年を参照されたい。
【０１１６】
本発明のさらなる態様では、炎症性疾患をはじめとする、細胞内ｃＡＭＰの低下またはＰＤＥレベルの上昇と関連付けられている病状を治療するのに治療的に効果的な医薬的に許容可能なアンチセンスオリゴヌクレオチド組成物がその中に含有される包装材料を含む、製品が提供される。一実施態様では、組成物は、ＰＤＥ遺伝子を阻害するのに効果的なアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物を含んでなり、前記オリゴヌクレオチド化合物は、遺伝子に少なくとも５０％相補的である。別の態様では、組成物は少なくとも２つのアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物を含んでなり、各アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物は異なるＰＤＥ遺伝子を下方制御でき、各アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物が単独では事実上、それが対抗する遺伝子を下方制御する効果がない濃度で存在し、アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物の組み合わせは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが対抗する遺伝子の少なくとも１つを下方制御するのに効果的である。
【０１１７】
一実施態様では、製品包装材料は、組成物が炎症性疾患を治療するのに使用できることを示すラベルを含んでなり、疾患が多発性硬化症、接触性皮膚炎、アレルギー性および非アレルギー性眼疾患、関節リウマチ、敗血症ショック、骨粗鬆症および認知障害の１つであるという表示をさらに含んでもよい。
【０１１８】
別の実施態様では、製品包装材料は、組成物が炎症性呼吸器疾患を治療するのに使用できることを示すラベルを含んでなり、疾患がＣＯＰＤ、喘息、好酸球性咳、気管支炎、肺同種移植片の急性および慢性拒絶、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎または副鼻腔炎の１つであるという表示をさらに含んでもよい。
【０１１９】
本発明の目的で、包装材料は、瓶またはその他の容器（プラスチックまたはガラス）、紙箱、管またはその他の保護ラッピングをはじめとする、本発明に従ったヌクレオチド含有組成物の包装のための任意の適切な材料であってもよい。理解されるように、包装は、オリゴヌクレオチド組成物の性質次第で変動してもよく、例えば液体製剤は、煙霧剤製剤とは異なって包装されてもよい。
【０１２０】
以下の非限定的実施例によって、本発明をさらに詳しく例示する。
【実施例】
【０１２１】
材料および試薬
ＡＩＭ−Ｖ培地（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カタログ番号３１０３５−０２５）；Ｏｐｔｉ  ＭＥＭ  Ｉ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カタログ番号３１９８５−０７、ロット番号１２４４２０６）；ＦＢＳ（ウシ胎仔血清、ヴィセント（Ｗｉｓｅｎｔ）、カタログ番号８０１５０）；ペニシリン、ストレプトマイシン（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）、カタログ番号１５１４０−１２２）；ＨＥＰＥＳ（ヴィセント（Ｗｉｓｅｎｔ）、カタログ番号２６０６０ＣＩ）およびＬ−グルタミン（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）、カタログ番号２５０３０−０８１）；ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ヴィセント（Ｗｉｓｅｎｔ）、カタログ番号１００９０ＣＶ）；ピルビン酸ナトリウム（ヴィセント（Ｗｉｓｅｎｔ）、カタログ番号２５０００−Ｃｉ）；無菌ＰＢＳ（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）、カタログ番号２５０３０−０８１）；トリプシン０，２５％およびＥＤＴＡ０，０１％（ヴィセント（Ｗｉｓｅｎｔ）、カタログ番号２５−０５２−Ｃｉ）；ＨＢＳＳ（ハンクの平衡塩類溶液、ヴィセント（Ｗｉｓｅｎｔ）、カタログ番号２１−０２２ＣＶ）；ＰＨＡ（
フィトヘマグルチニン、シグマ（Ｓｉｇｍａ）、カタログ番号Ｌ−９１３２、ロット番号：０１５Ｋ８８９１３）；フィコール−パック（Ｆｉｃｏｌｌ  ｐａｑｕｅ）（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、カタログ番号１７−１４４０−０３）；トリゾール（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カタログ番号１５５９６−０１８）；デオキシリボヌクレアーゼＩ（フェルメンタス（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、カタログ番号ＥＮ０５２１）；ＲＴ−ＰＣＲ用スーパースクリプトファーストストランド合成システム（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）キット（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カタログ番号１１９０４−０１８）；ｄＮＴＰ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カタログ番号１０２９７−０１８）；オリゴ（ｄＴ）１２−１８：（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カタログ番号１１９０４−０１８）；キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＲＮイージー（ＲＮｅａｓｙ）ミニキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、カタログ番号７４１０６）；キアバック（ＱｉａＶａｃ）２４マニホルド（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、カタログ番号１９４０３）；使い捨てバックコネクター（Ｖａｃｃｏｎｎｅｃｔｏｒ）（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、カタログ番号１９４０７）；リボグリーン（ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ）定量化試薬（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）−分子プローブ、カタログ番号Ｒ−１１４９０）；・ライトサイクラーインスツルメント（Ｌｉｇｈｔ−Ｃｙｃｌｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）バージョン１．５（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）、カタログ番号３５３１４１４）；２０ｍＬ反応用ＬＣ毛細管（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）、カタログ番号１９０９３３９）；ＬＣファーストスタートＤＮＡマスター（ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ）ＳＹＢＲグリーン１プラス（Ｇｒｅｅｎ  １  ＰＬＵＳ）（１００ｍｌ）（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）、カタログ番号０３７５２１８６００１）；Ｋ３ＥＤＴＡ管（グライナーバイオワン（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ）、カタログ番号：４５５０３６Ｂ１１０３０６）；環式ＡＭＰ
ＥＩＡキット（ケイマン（Ｃａｙｍａｎ）、カタログ番号５８１００１）ヒトＴＮＦ−αＥＬＩＳＡキット、（バイオソース（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）カタログ番号ＣＨＣ−１７５４、ロット番号０４１７０３）；ヒトＩＬ−８／ＣＸＣＬ８ＥＬＩＳＡキット（バイオソース（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）、カタログ番号ＣＨＣ１３０３）；ヒトＭＣＰ−１／ＣＣＬ２ＥＬＩＳＡキット（バイオソース（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）、カタログ番号ＫＨＣ１０１２）；ｃＡＭＰ  ＥＩＡキット（ケイマン（Ｃａｙｍａｎ）、カタログ番号５８１００１）；ヒトＧＭＣＳＦ  ＥＬＩＳＡ（メディコープ（Ｍｅｄｉｃｏｒｐ）、カタログ番号ＣＨＣ０９０４）；ヒトＩＬ−２  ＥＬＩＳＡ（ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、カタログ番号５５５１９０）；ＥＬＩＳＡプレートリーダー（フィルター４５０ｎｍ、参照フィルター６５０ｎｍ、バイオラド（Ｂｉｏｒａｄ）、モデル６８０）；エスコート（Ｅｓｃｏｒｔ）ＩＶ形質移入剤（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、カタログ番号３２８７、ロット番号０９４Ｋ０５６５）；ｈＩＬ−１β（ぺプロテック（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、カタログ番号１１１９５Ｄ１９５）；フォルスコリン（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）カタログ番号Ｆ３９１７）；ロリプラム（Ｒｏｌｉｐｒａｍ）（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）カタログ番号Ｒ６５２０、ロット番号０２２Ｋ４６０４）；アラマーブルー（Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ）、（バイオソース（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）カタログ番号ＤＡＬ１１００）；１２−ウェルプレート高親和結合（コスター（Ｃｏｓｔａｒ）、カタログ番号６６５１０２）；ＥＬＩＳＡ用ＴＭＢ発色試薬（メディコープ（Ｍｅｄｉｃｏｒｐ）、カタログ番号ＳＢ０１）；リポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（商標）２０００形質移入試薬（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カタログ番号１１６６８−０１９）；クオンティジェン（Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ）（登録商標）スクリーンキット（パノミクス（Ｐａｎｏｍｉｃｓ）、カタログ番号ＱＧ−０００−０５０）；２０×ＳＳＣ（３ＭＮａＣｌ、０，３Ｍ二水和クエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０）；硫酸ドデシルリチウム１０％ｗ／ｖ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、カタログ番号Ｌ９７８１）；５３℃、０％ＣＯ２に設定した恒温器；ＭＷ９６プレートウォッシャー（ＭＷ９６  Ｐｌａｔｅ  Ｗａｓｈｅｒ）（ベックマン・コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ  
Ｃｏｕｌｔｅｒ））；サーモルミノスキャン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ）（ラブシステム（ＬａｂＳｙｓｔｅｍ））；ＥＭＥＭ（ハイクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、カタログ番号ＳＨ３００２４．０１）；非必須アミノ酸（ハイクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、カタログ番号３０２３８．０１）；ＢＥＢＭ（クロンティックス（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）、カタログ番号ＣＣ−３１７１）；ＢＥＢＭキット（クロンティックス（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）、カタログ番号３１７０）；ヒトＴＮＦ−α（ぺプロテック（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、カタログ番号３００−０１Ａ）；ヒトＩＦＮγ（ぺプロテック（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、カタログ番号３１５−０５）。
細胞培養
２９３細胞（ヒト形質転換胎生期腎細胞系；ＡＴＣＣカタログ番号：ＣＲＬ−１５７３）を２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１．５ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウム、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中で培養した。Ａ５４９（ヒト肺癌腫細胞系；ＡＴＣＣ）を２ｍＭＬ−グルタミン、１．５ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウム、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するハムＦ１２培地中で培養した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（末梢血単核細胞）は、健康なボランティアから得た。正常な供与者からのＥＤＴＡ  Ｋ３血液のフィコール・ハイパック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）濃度勾配遠心分離によって、ＰＢＭＣを単離した。ＰＢＭＣを１２ウェルプレート内で、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したＡＩＭ−Ｖ培養液中に、２×１０６細胞／ｍＬ／ウェルで播種した。ＣＹＮＯＭ−Ｋ１細胞を２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１％非必須アミノ酸、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＥＭＥＭ中で培養した。ＮＨＢＥ細胞をＢＥＢＭ（２ｍＬ  ＢＰＥ、０．５ｍＬヒドロコルチゾン、０．５ｍＬ  ｈＥＧＦ、０．５ｍＬエピネフリン、０．５ｍＬトランスフェリン、０．５ｍＬインシュリン、０．５ｍＬレチノイン酸、０．０５ｍＬトリヨードチロニンを添加した５００ｍＬ）中で培養した。
細胞生存度
製造業者のガイドラインに従ってアラマーブルー（Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ）試験を使用して、細胞生存度を体系的にアッセイした。
アンチセンスの調製
シグマジェノシス（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ）からのホスホロチオエート−ＤＮＡアンチセンス、およびモントリオールのトピジェン（Ｔｏｐｉｇｅｎ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ））またはカルガリー（Ｃａｌｇａｒｙ）のＵＣＤＮからのホスホチオレート−ＦＡＮＡアンチセンスを滅菌水中に再懸濁し、形質移入のためにＯｐｔｉ−ＭＥＭ中で希釈した。実施例中で言及されるＤＮＡ（非ＦＡＮＡ）オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート−ＤＮＡオリゴヌクレオチドである。
細胞のアンチセンス処理：
Ａ５４９細胞系：
細胞をトリプシン処理して、抗生物質飢餓条件下で１０％血清を添加したＨＡＭ−Ｆ１２培地中に再懸濁し（４８ウェルプレート内で０．５×１０５細胞／ウェル）、次に３７℃で一晩インキュベートした。翌日、付着細胞を図説明で指定される濃度のアンチセンス／リポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）複合体（１μｇオリゴヌクレオチド：１μＬリポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）の比率）で形質移入し、所定の期間にわたり３７℃でインキュベートした。
２９３細胞系：
細胞をトリプシン処理して、抗生物質奪取条件下で１０％血清を添加したＤＭＥＭ培地中に再懸濁し（４８ウェルプレート内で１×１０５細胞／ウェル）、次に３７℃で一晩インキュベートした。翌日、付着細胞を図説明で指定される濃度のアンチセンス／リポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）複合体（１μｇオリゴヌクレオチド：１μＬリポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）の比率）で形質移入し、所定の期間
にわたり３７℃でインキュベートした。
ＰＢＭＣ
単離日に、ＰＢＭＣをＡＩＭ−Ｖ培地に播種した（１２ウェルプレート内２．０×１０６／ｍＬ）。アンチセンスをエスコート（Ｅｓｃｏｒｔ）ＩＶ試薬（シグマ（Ｓｉｇｍａ））と複合体化させ（１μｇオリゴヌクレオチド：０．５μＬエスコート（Ｅｓｃｏｒｔ）ＩＶの比率）、図に指定する濃度で添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２、湿潤性で１８〜２４時間培養した。
ＣＹＮＯＭ−Ｋ１細胞系：
細胞をトリプシン処理し、抗生物質飢餓条件下で１０％血清を添加したＥＭＥＭ培地中に再懸濁し（４８ウェルプレート内２００μＬ中に０．５×１０５細胞／ウェル）、次に３７℃で一晩インキュベートした。翌日、付着細胞を図説明で指定される濃度のアンチセンス／リポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００複合体（１μｇオリゴヌクレオチド：２μＬリポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）の比率）で形質移入し、所定の期間にわたり３７℃でインキュベートした。
ＮＨＢＥ細胞：
細胞をトリプシン処理し、抗生物質飢餓条件下でＢＥＢＭ完全培地中に再懸濁し（４８ウェルプレート内２００μＬ中に１×１０５細胞／ウェル）、次に３７℃で一晩インキュベートした。翌日、付着細胞を図説明で指定される濃度のアンチセンス／リポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００複合体（１μｇオリゴヌクレオチド：１μＬリポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）の比率）で形質移入し、所定の期間にわたり３７℃でインキュベートした。
ＲＮＡ抽出
キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）からのキアバック（ＱｉａＶａｃ）２４マニホルドを使用して、ＲＮイージー（ＲＮｅａｓｙ）ミニキットプロトコルに従って、ＲＮＡを細胞ペレットから抽出し、フェルメンタス（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）手順に従ってデオキシリボヌクレアーゼ−Ｉで処理した。製造業者のプロトコル（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）−分子プローブ）に従ってリボグリーン（ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ）試薬を使用し、ＲＮＡを定量化した。
逆転写（ＲＴ）
総反応容積２０μＬ中で、ＲＴ−ＰＣＲ用スーパースクリプトファーストストランド合成システム（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
Ｓｙｓｔｅｍ）キットを使用して、ファーストストランドｃＤＮＡの調製を実施した。１μｇのＲＮＡを最初に６５℃で５分間０．５ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．５μｇのオリゴ（ｄＴ）１２−１８で変性し、氷上で少なくとも１分間冷却した。混合物を４２℃で２分間インキュベートし、１×ファースト−ストランド緩衝液、１０ｍＭ  ＤＴＴ、および４０単位のスーパースクリプト（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ）ＩＩ  ＲＴを含有する第２のプレミクスを添加した。反応を４２℃で１０分間、５０℃で１時間インキュベートし、７０℃で１５分間加熱して不活性化した。
リアルタイムＰＣＲ
０．４ｍＭの各ＰＣＲプライマーおよび４μＬのＬＣファーストスタートＤＮＡマスター（ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ）ＳＹＢＲグリーン１プラス（Ｇｒｅｅｎ  １  ＰＬＵＳ）の存在下で、ＰＣＲ反応混合を総容積２０μＬ中の３μＬのｃＤＮＡ反応で実施した。ステップ１（変性）：９５℃、１０分間（勾配２０℃／秒）；ステップ２（サイクル×４０）：９５℃、（勾配２０℃／秒）；５７℃または５９℃、５秒間（勾配２０℃／秒）７２℃、１０秒間（勾配２０℃／秒）；ステップ３（融解曲線）：９５℃、（勾配２０℃／秒）；７０℃、３０秒間（勾配２０℃／秒）；９５℃、０秒間（勾配０，１℃／秒）；ステップ４（冷却）：４０℃、３０秒間（勾配２０℃／秒）。各遺伝子で使用したＰＣＲプライマー配列については、表３に記載される。ＰＣＲ産物の定量化は、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）からのレルカント（ＲｅｌＱｕａｎｔ）プログラムを使用して実施した。
クオンティジェン（Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ）アッセイ
細胞を収集し、クオンティジェン（Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ）（登録商標）キットからの１×溶解混合物中で５３℃で３０分間溶解した。細胞溶解産物を特異的プローブセット存在下で、クオンティジェン（Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ）（登録商標）捕捉プレート内において５３℃で一晩ハイブリダイズし、ルミノスキャン（Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ）を使用してルミネセンスシグナルにより、ｍＲＮＡ発現を直線的に定量化した。
細胞アッセイ：（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）
Ａ５４９細胞
形質移入期間の終わりに、Ａ５４９細胞をＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）と共に４時間インキュベートした。上清を収集し、ＥＬＩＳＡを使用して、ヒトＩＬ−８、ヒトＭＣＰ−１、およびヒトＧＭ−ＣＳＦについて分析した。
ＰＢＭＣ
一晩の形質移入後、細胞にＰＨＡ（１０μｇ／ｍＬ）を６時間にわたり添加した。いくつかの細胞は、細胞収集前にロリプラム（Ｒｏｌｉｐｒａｍ）（１０μｇ／ｍＬ）またはフォルスコリン（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）（２μＭ）で３０分間処置した。上清を収集し、製造業者のガイドラインに従って、ＩＬ−２およびＴＮＦ−αＥＬＩＳＡを実施する時まで凍結した。細胞内ｃＡＭＰレベルの判定を溶解した細胞ペレットについて実施し、溶解産物を製造業者のプロトコルに従ってｃＡＭＰ  ＥＩＡを実施する時まで凍結した。
ＮＨＢＥ細胞：
形質移入期間の終わりに、ＮＨＢＥ細胞をサイトミクス（ｃｙｔｏｍｉｘ）（５００Ｕ／ｍＬ  ＴＮＦ−α＋１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ１−β＋１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＦＮγ）で４時間刺激した。ＭＣＰ−１タンパク質分泌をＥＬＩＳＡにより上清中で測定し、アラマーブルー（ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ）アッセイで測定される細胞生存度に正常化した。
実施例１：アンチセンスの組成および生体外効力
この試験で調製したアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列および組成を表１ａ、１ｂ、１ｃ、および１ｄに示す。全てのオリゴヌクレオチドは、陰イオン交換ＨＰＬＣまたはゲル電気泳動法によって精製し、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５ビーズを使用してサイズ排除クロマトグラフィーを通じて脱塩した。表１ａ〜１ｄに列挙されるいくつかの選択された配列の効力は、示されるＡＯＮでの形質移入に引き続いて、細胞内の特異的ＰＤＥイソ型遺伝子発現の低下を示す、図１ａおよび１ｂで実証される。図１Ａは、ＰＤＥ３Ａ、ＰＤＥ３Ｂ、およびＰＤＥ７ＡのためのＡ５４９細胞、またはＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、およびＰＤＥ４Ｄのための２９３細胞のどちらの細胞系も特異的ＡＯＮでの一晩の形質移入に引き続いて、標的イソ型のレベルが低下したことを示す。パノミクス（Ｐａｎｏｍｉｃｓ）からのＰＤＥ３Ａ／Ｂ、ＰＤＥ４Ｄ、およびＰＤＥ７Ａ用クオンティジェン（Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ）（登録商標）アッセイを使用して、ＰＤＥ  ｍＲＮＡ発現レベルを定量化し、リアルタイムＰＣＲを使用してＰＤＥ４Ａ／４Ｂの発現を定量化した。ＰＤＥイソ型レベルを対照遺伝子（β２Ｍ、ＰｐｉｂまたはＨＰＲＴ）の発現に正常化し、これらのレベルを未処理細胞の発現レベルと比較した。
【０１２２】
デザインされるアンチセンスオリゴヌクレオチドの大部分はＰＤＥイソ型に特異的であるが、いくつかのＡＯＮ、特にＰＤＥ４イソ型は、２つ以上のＰＤＥ４イソ型の標的ノックダウンに対する二重特異性を実証した。表１ｃに列挙される配列は、単一ＡＯＮで２つ以上の標的遺伝子ノックダウンを実証したＡＯＮについて記載する。図１ｂは、二重標的特異性のためにデザインされたこれらのＡＯＮの有効性を実証する。ＡＯＮ  ＴＯＰ  １５４５（配列番号１４）およびＴＯＰ  １５５６（配列番号２４）が、それぞれＰＤＥ４Ｂイソ型およびＰＤＥ４Ｄイソ型の間で共有される遺伝子配列を認識し（表１ｃ）、ＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄに関する標的遺伝子ノックダウンを実証する一方、ＡＯＮ  ＴＯＰ  １５０７（配列番号１０）および１５０８（配列番号１１）は、形質移入した細胞内のＰＤＥ４ＡおよびＰＤＥ４ＤのｍＲＮＡのレベルを減少させる上で効果的であり、どちらのＡＯＮもＰＤＥ４ＡおよびＰＤＥ４Ｄイソ型の間で共有される配列を認識する（表１
ｃ）。データは、対照ミスマッチまたはセンスＡＯＮ配列により得られた阻害レベルと、それらのそれぞれのＰＤＥ−特異的ＡＯＮ配列により得られた％阻害とを比較することで判定された％特異的阻害として表わされる。
実施例２：細胞の生物学的機能に対するＡＯＮ送達の効果
この実施例は、異なる細胞タイプの生物学的機能、具体的にはサイトカインおよびケモカイン分泌に対するＡＯＮ有効性に関する。サイトカインおよびケモカインは、細胞活性化および動員の重要なメディエータである。肺上皮細胞は、好中球および単球／マクロファージなどの免疫細胞動員をもたらすケモカイン分泌を通じて、炎症性呼吸器疾患の病態生理学において役割を果たすことができる。インターロイキン−８（ＩＬ−８／ＣＸＣＬ８）および単球化学誘引物質タンパク質−１（ＭＣＰ−１／ＣＣＬ２）レベルは、ＣＯＰＤ患者において増大する（シラジ（Ｓｚｉｌａｓｉ）Ｍら、Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００６年、１２：５２〜６０頁）。ＩＬ−８およびＭＣＰ−１のレベルは、それぞれ好中球およびマクロファージ動員を伴ってもよい。ＩＬ−８およびＭＣＰ−１はどちらもＩＬ−１βによる刺激に応答して、肺上皮細胞系Ａ５４９によって分泌される。刺激されたＡ５４９細胞はまた、改善された機能のために好中球およびマクロファージを活性化することが知られているサイトカインである、顆粒球−マクロファージ細胞刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）も分泌する。図２は、ＰＤＥ４Ｄイソ型に対して特異的であるＡＯＮ  ＴＯＰ  １４９７（配列番号９０）が、Ａ５４９細胞内で、一晩のＡＯＮの形質移入、次にＩＬ−１βでの４時間の刺激に引き続いて、ケモカインＩＬ−８／ＣＸＣＬ−８およびＭＣＰ−１／ＣＣＬ２、およびサイトカインＧＭ−ＣＳＦの分泌を制限する有効性を実証する。このアッセイの使用によって、肺上皮細胞による炎症性メディエータの放出に関与するＰＤＥイソ型が検証できるようになる。図２では、Ａ５４９細胞内でのＴＯＰ  １４９７（配列番号９０）によるその阻害を通じて、ＰＤＥ４Ｄの寄与が明らかに実証される。一方で、ＡＯＮ  ＴＯＰ  １７１６（配列番号９２）での形質移入は、この遺伝子のｍＲＮＡのレベルを成功裏に低下させるが、これらの細胞内でケモカインおよびサイトカインの放出に対するＰＤＥ７Ａの寄与はない。図２は、ＡＯＮでの形質移入に引き続いて肺上皮細胞内で起きる炎症性メディエータの分泌低下を通じた、機能性の変化、具体的には炎症可能性の低下を実証する。
【０１２３】
図３は、異なる細胞タイプ、具体的にはヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の生物学的機能を制限するＡＯＮの有効性を実証する。ＰＢＭＣとは、マクロファージと、Ｔ細胞およびＮＫ細胞を活性化および刺激することが知られているＩＬ−２とを活性化することが知られているサイトカイン、具体的にはＴＮＦαを分泌する免疫細胞の混合集団を指す。ＡＯＮターゲティングＰＤＥイソ型で一晩形質移入し、翌日フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）で刺激したヒトＰＢＭＣは、ミスマッチまたはセンスＡＯＮ配列で形質移入したＰＢＭＣよりも少ないＴＮＦαおよびＩＬ−２を分泌した（図３）。記載したＡＯＮによるＰＢＭＣの形質移入は、これらの細胞タイプの炎症可能性の低下をもたらす。ＣＯＰＤにおいて、炎症細胞および活性化上皮細胞による炎症促進性メディエータおよび化学誘引物質の放出は、さらに増大する炎症レベルに寄与する（シラジ（Ｓｚｉｌａｓｉ）Ｍら、Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００６年、１２：５２〜６０頁）。
【０１２４】
ＰＤＥ遺伝子発現の阻害は低下したＰＤＥ活性につながり、それは次に細胞内のｃＡＭＰ蓄積をもたらすことが予期される。図３は、ＡＯＮターゲティング特異的ＰＤＥイソ型での形質移入は、ＰＢＭＣにおける細胞内ｃＡＭＰレベル増大につながることを実証する（右側軸）。データは、ミスマッチまたはセンス配列での形質移入に引き続くレベルと比較した、ＰＤＥ−特異的ＡＯＮでの形質移入に引き続く、ＰＢＭＣ中のサイトカインまたはｃＡＭＰのどちらかのレベル変化を表す。
【０１２５】
サイトカインは全ての疾患で、喘息およびＣＯＰＤをはじめとする慢性炎症を編成する
のに重要な役割を果たす。ＴＮＦ−αは、いくつかの炎症性疾患で発現する最も重要な炎症促進性サイトカインの１つである。ＴＮＦαレベルは、ＣＯＰＤがある患者の誘発された痰中で著しく増大する（キーティングズ（Ｋｅａｔｉｎｇｓ）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．ＣａｒｅＭｅｄ．１９９６年；１５３；５３０〜５３４頁）。さらに体重減少があるＣＯＰＤ患者は、循環細胞からのＴＮＦα放出の増大を示すという証拠があり、ＴＮＦαは骨格筋細胞のアポトーシスを誘発して、重篤なＣＯＰＤがある患者の一部で見られる特徴的な筋肉消耗および悪液質をもたらすかもしれない（デゴドイ（Ｄｅ  Ｇｏｄｏｙ）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１９９６年、１５３、６３３〜６３７頁）。ＴＮＦ−αは、それ自体およびＩＬ−８をはじめとする多くの炎症促進性サイトカインの遺伝子発現を誘発する。サイトカイン、具体的にはＴＮＦαは、炎症性呼吸器疾患の病態生理学において増大するおよび／または役割を果たし、組織破壊に関与することが示されているメディエータの一つである。
【０１２６】
ＰＤＥ４阻害剤は、細胞内環式ＡＭＰの増大を通じて炎症細胞からのサイトカインおよびケモカインの放出低下を引き起こした（トロフィー（Ｔｏｒｐｈｙ）、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１９９８年、１５７、３５１〜３７０頁）。コルチコステロイドとは対照的に、ＰＤＥ４阻害剤は好中球に対して強力な阻害効果を有し（オ−（Ａｕ）ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９８年、１２３、１２６０〜１２６６頁）、それらがＣＯＰＤの有用な抗炎症性療法であるかもしれないことが示唆される。ＰＤＥ４阻害剤シロミラストが、ＣＯＰＤがある患者における肺機能および症状を改善するという予備的証拠があり、これはサイトカイン阻害によるものかもしれない（コンプトン（Ｃｏｍｐｔｏｎ）ら、Ｌａｎｃｅｔ．２００１年、３５８、２６５〜２７０頁）。
【０１２７】
ＴＮＦαは、炎症性および慢性呼吸器疾患における一般的な共通因子と見なされるので、本発明は、いくつかの炎症性疾患を治療する上で幅広い治療的な応用を提供する。
実施例３：２’Ｆ−ＡＮＡ化学作用で修飾されたＡＯＮは、標的遺伝子ノックダウンに関して有効性の増大と持続的作用を実証する
この実施例は、ＦＡＮＡ修飾をＡＯＮの化学作用に施した場合のＰＤＥ−特異的ＡＯＮの改善された有効性に関する。表２ａ〜２ｇは、Ｆ−ＡＮＡ残基で修飾されたＡＯＮの組成について記載する。図４では、図４で提供される説明が示すように、ホスホチオレート組成物（ＰＳ−ＤＮＡ）中の、またはＦＡＮＡ塩基修飾（ＰＳ−ＦＡＮＡ；ＴＯＰ  １４９７−Ｆ１（配列番号７２）、ＴＯＰ−１４９７−Ｆ５（配列番号７６）、ＴＯＰ  １４９７−Ｆ６（配列番号７７））を含有する、ＰＤＥ４Ｄ−特異的ＡＯＮ  ＴＯＰ  １４９７（配列番号９０）で、Ａ５４９細胞を２４時間にわたり形質移入した。パノミクス（Ｐａｎｏｍｉｃｓ）からのクオンティジェン（Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ）（登録商標）アッセイを使用してＰＤＥ４Ｄ  ｍＲＮＡノックダウンを判定し、ＰＤＥレベルをβ２Ｍ遺伝子発現に正規化した。ＦＡＮＡモノマー（ＴＯＰ  １４９７−Ｆ１（配列番号７２））によるＴＯＰ  １４９７配列の修飾は、ＡＯＮが、１００〜４００ｎｇの間の用量で標的遺伝子発現を阻害する有効性を改善し、ＡＯＮ活性に関わるこの修飾の利点を明らかに示した（図４ａ）。２’−Ｆ−ＡＮＡ修飾はＡＯＮの安定性を増強し、それをヌクレオシダーゼ消化に対してより抵抗性にすることが予期され、それはその活性を延長させるであろう。図４ｂでは、経時的な単一用量でのＰＤＥ４Ｄ−特異的ＡＯＮ  ＴＯＰ  １４９７の異なる製剤の比較は、２’−Ｆ−ＡＮＡ含有ＡＯＮがＰＳ−ＤＮＡ  ＡＯＮと比較して、持続性の阻害活性を４８時間まで有することを明らかに示す。形質移入後４８時間では、ＡＯＮのＰＳ−ＤＮＡ製剤で阻害は観察されないが、塩基１９個のＡＯＮ  ＴＯＰ  １４９７−Ｆ６（配列番号７７）のわずか５個の塩基を２’−Ｆ−ＡＮＡで修飾することでさえ、この時点の阻害効果を持続させるには十分であった。ＴＯＰ  １４９７−Ｆ５（配列番号７６）およびＴＯＰ  １４９７−Ｆ１（配列番号７２）での形質移入に引き続いて示されるように、元の配列中により多くの２’−Ｆ−ＡＮＡ残基を組み込むことで、持続性の阻
害が増大した。一晩の形質移入（２４時間）では、７個の残基を含有するＰＳ−ＦＡＮＡが１１個の残基を含有するＰＳ−ＦＡＮＡと同様のレベルの阻害を生じたが、ＡＯＮ中のより多量の２’−Ｆ−ＡＮＡ組成物は最も長期の効果を生じた。
実施例４：２’Ｆ−ＡＮＡ化学作用で修飾されたＡＯＮは細胞内で生物学的機能を維持する
この実施例は、細胞の炎症反応を低下させるにあたってのＰＤＥ−特異的ＡＯＮの２’−Ｆ−ＡＮＡ化学修飾の耐性に言及する。図２では、ＰＤＥ−特異的ＡＯＮが、肺上皮細胞によるケモカイン分泌を低下させる有効性を実証した。図５では、Ａ５４９の生物学的機能に対する２’−Ｆ−ＡＮＡ含有ＡＯＮの効果を試験した。ＰＳ−ＤＮＡとしてＰＤＥ４Ｂ／４Ｄ二重特異的ＡＯＮ  ＴＯＰ  １５４５（配列番号１４）で、または２’−Ｆ−ＡＮＡ修飾ＴＯＰ  １５４５−Ｆ３（配列番号８５）で形質移入したＡ５４９細胞は、２’−Ｆ−ＡＮＡ含有ＡＯＮをＡ５４９細胞内で形質移入すると、無修飾ＡＯＮと比較して、ケモカイン分泌のより高い阻害レベルを実証する。
【０１２８】
２’−Ｆ−ＡＮＡ含有ＡＯＮのこの生物学的有効性の維持は、一次細胞、具体的にはヒトＰＢＭＣ中で実証される。アンチセンス配列はその他の標的遺伝子との相同性を有さないが、第２のアンチセンスが存在する場合、ＰＤＥ４Ｂ／４Ｄ特異的ＡＯＮ  ＴＯＰ  １５４５−Ｆ３（配列番号８５）とＰＤＥ７Ａ特異的ＡＯＮ  ＴＯＰ  １７３１−Ｆ２（配列番号５３）との組み合わせは、それらのそれぞれの遺伝子標的の阻害を増大した（図６ａ）。図６ａでは、黒塗り棒グラフは、ＡＯＮを低および高用量（６．３ｎＭ）で単独使用するのと比較した、双方のＡＯＮをそれぞれ低用量（３．２ｎＭ）で組み合わせて使用した場合のＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４ＤまたはＰＤＥ７Ａいずれかの標的遺伝子ｍＲＮＡの％特異的阻害を表し、２−Ｆ−ＡＮＡ含有ＡＯＮが一次免疫細胞における標的遺伝子ノックダウン機能を維持することが実証される。生物学的機能では、ＰＤＥ４Ｂ／４Ｄ二重特異的ＴＯＰ  １５４５−Ｆ３（配列番号８５）とＰＤＥ７Ａ特異的ＡＯＮ  ＴＯＰ  １７３１−Ｆ２（配列番号５３）との組み合わせによるＰＢＭＣの形質移入は、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２分泌の双方の阻害をもたらした。２’−Ｆ−ＡＮＡ含有ＡＯＮは、免疫細胞の炎症可能性を低下させるそれらの機能性を維持する。
【０１２９】
図６ａの結果はまた、２つの異なる標的遺伝子に特異的なＡＯＮの組み合わせを細胞に同時に投与した際に生じる改善された効果も示す。ＡＯＮは、単独で用いると、それらの標的遺伝子に対する効果がほとんどないかまたは皆無である濃度で投与されるが、組み合わせると、ＡＯＮはそれらのそれぞれの標的（ＴＯＰ  １５４５−Ｆ３（配列番号８５）ではＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄ、ＴＯＰ  １７３１−Ｆ２（配列番号５３）ではＰＤＥ７Ａ）遺伝子の発現に対する顕著な阻害を誘発する。
実施例５：分裂促進調節遺伝子に対するＰＤＥ４Ｂ／４ＤＡＯＮの効果
表１ｃは、ＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄの双方に対して二重特異性を有するＴＯＰ  １５４５  ＡＯＮ配列について記載する。ＴＯＰ  １５４９（配列番号１７）ＡＯＮの配列は、チミジレートシンターゼ（ＴＹＭＳ）遺伝子配列と１００％の相同性を有し、ＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄと５塩基対ミスマッチする。ＴＯＰ  １５４９（配列番号１７）ＡＯＮは、６時間の形質移入に引き続いて、その標的遺伝子発現（ＴＹＭＳ）を用量反応様式（２００、４００、および８００ｎｇ）で阻害する。ＴＹＭＳ遺伝子配列と５塩基対のミスマッチを有するにもかかわらず、ＴＯＰ  １５４５（配列番号１４）ＡＯＮ含有２’−Ｆ−ＡＮＡもまた、６時間の形質移入に引き続いて、２９３細胞内でＴＹＭＳ遺伝子の発現を阻害する上で効率的である。ＴＹＭＳはＤＮＡ合成の重要な律速酵素であり、いくつかの癌では上方制御される。ＴＯＰ  １５４５（配列番号１４）ＡＯＮは、ＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄ  ｍＲＮＡレベルの低下を通じてＰＤＥ機能を阻害するだけでなく、ＴＹＭＳ遺伝子発現に対するその効果を通じて細胞増殖を阻害するように機能する可能性も有する。この図は、ＴＯＰ１５４５（配列番号１４）が、ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）およびチミジレートシンターゼ（ＴＳ）に対して二重特異性を有する、新規なアン
チセンス分子であることを実証する。
【０１３０】
ＰＤＥ４の阻害剤については、ｃＡＭＰ上昇剤として文献にも記載されている。ＰＤＥ４の阻害はｃＡＭＰのＡＭＰへの分解をブロックし、ｃＡＭＰの蓄積をもたらす。高い細胞内ｃＡＭＰレベルは、生体外で癌細胞を効果的に死滅できることがよく知られている。
【０１３１】
チミジレートシンターゼ（ＴＹＭＳ）は、ほとんどの生物にとって、ＤＮＡ合成および細胞分裂に必要なチミジン一リン酸の供給源であり、したがって明らかな抗癌標的である。ＴＹＭＳは、そのコード領域内の１７個の連続的ヌクレオチドの小さなひと続きを除いて、ＰＤＥと構造的に関連していない。ＴＯＰ１５４５（配列番号１４）は、ＴＹＭＳおよびＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄの間のこの相同性領域を標的とし、ＴＯＰ１５４５（配列番号１４）を独自の抗癌化合物にする。
実施例６：生体外でのＡＯＮの効力
この実施例は、ＰＤＥ４Ｄ／４Ｂ特異的ＡＯＮ  ＴＯＰ１５７２−Ｆ２（配列番号１２２；図８Ａ）またはＰＤＥ７Ａ特異的ＡＯＮ  ＴＯＰ１７３１−Ｆ３（配列番号５４、図８Ｂ）で形質移入したＣＹＮＯＭ−Ｋ１サル細胞中の遺伝子発現低下を示す。非形質移入細胞と比較して、ＰＤＥ４ＤおよびＰＤＥ４Ｂ  ｍＲＮＡレベルはそれぞれ５３％および６６％（図８Ａ）低下し、ＰＤＥ７Ａ遺伝子発現は７０％低下した（図８Ｂ）。
実施例７：細胞の生物学的機能に対するＡＯＮ送達の効果
この実施例は、ＰＤＥ４Ｄ／４Ｂ特異的ＡＯＮ  ＴＯＰ１５７２−Ｆ２（配列番号１２２）およびＴＯＰ１５４５（配列番号１４）が、ＰＤＥ４Ｄ  ｍＲＮＡ発現レベル（図９Ａ）と、サイトミクス（ｃｙｔｏｍｉｘ）（５００Ｕ／ｍＬ  ＴＮＦ−α＋１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ１−β＋１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＦＮγ）での４時間の刺激に応答してＮＨＢＥ細胞内で刺激されたＭＣＰ−１サイトカイン分泌とを低下させる有効性に関する（図９Ｂ）。ＴＯＰ１５７２−Ｆ２（配列番号１２２）はＰＤＥ４Ｄ  ｍＲＮＡ発現レベルを７１％低下させ、ＭＣＰ−１分泌の３４％阻害と相関性があった。同様に、対応する対照で形質移入した細胞と比較して、ＴＯＰ１５４５（配列番号１４）はＰＤＥ４Ｄ  ｍＲＮＡ発現レベルを３６％低下させ、ＭＣＰ−１分泌の４６％阻害と相関性があった。
実施例８：細胞中の生物学的効果に対するＡＯＮ送達の効果
この実施例は、ＰＤＥ−特異的ＡＯＮが、ＰＨＡ−刺激ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）による炎症促進性サイトカイン分泌を阻害する有効性に言及する。ＰＢＭＣは、刺激して炎症促進性サイトカインを放出させることができる、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、および単球／マクロファージを含む白血球の混合集団である。ＰＤＥ４Ｂ／４Ｄ特異的ＴＯＰ  １５７２で一晩形質移入し（図１０）、翌日マイトジェンフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ、１０μｇ／ｍｌ）で６時間刺激したヒトＰＢＭＣは、ＰＨＡで刺激されたが形質移入されていない細胞と比較して、５１％少ない炎症促進性のサイトカインＩＬ−２（図１０Ａ）および４２％少ないＴＮＦ−α（図１０Ｂ）を分泌した。同様に、ＰＤＥ７Ａ特異的ＡＯＮ  ＴＯＰ  １７３１で形質移入したＰＢＭＣ（図１１）は、形質移入されていないがＰＨＡで刺激したＰＢＭＣよりも、４８％少ないＩＬ−２および６０％少ないＴＮＦ−αを分泌した。
実施例９：ＴＯＰ  １５７２およびＴＯＰ  １７３１を組み合わせた場合の免疫応答阻害における改善された有効性
この実施例は、ＡＯＮを組み合わせた際に、ＰＨＡ−刺激ＰＢＭＣによるＩＬ−２分泌を低下させる効果に言及する。それぞれ３．１ｎＭのＴＯＰ  １５７２−Ｆ２（配列番号１２２）およびＴＯＰ  １７３１−Ｆ３（配列番号５４）で形質移入したＰＢＭＣはＩＬ−２の阻害レベル（３３％）をもたらし、これは３．１ｎＭまたは６．３ｎＭのどちらかの用量での各ＡＯＮ単独での形質移入に引き続いて観察された阻害レベルよりも大きかった（図１２）。この実施例では、低用量のＴＯＰ  １５７２−Ｆ２がＩＬ−２の１０％未満の阻害を生じたのに対し、より高い用量（６．３ｎＭ）はＩＬ−２の２４％阻害を生じた（図１２）。ＴＯＰ  １７３１−Ｆ３に関しては、低用量（３．１ｎＭ）はＩＬ−２の
２０％阻害を生じ、このレベルは用量を６．３ｎＭに増大した際に（２２％阻害）統計学的に増大しなかった（図１２）。ＴＯＰ  １５７２−Ｆ２とＴＯＰ  １７３１−Ｆ３双方の組み合わせがＩＬ−２分泌の３３％阻害をもたらすのは、同時にＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｄ、およびＰＤＥ７Ａの異なるＰＤＥイソ型をターゲティングすることに起因するかもしれない（図１２）。
実施例１０：細胞系中のＰＳ−ＤＮＡおよびＰＳ−ＦＡＮＡの化学作用の比較
この実施例は、標的ｍＲＮＡ発現を低下させるにあたってのＰＳ−ＤＮＡ  ＡＯＮの有効性と、ＰＳ−ＦＡＮＡ  ＡＯＮの有効性とを比較する。ＴＯＰ１５７２−Ｆ２バージョン（配列番号１２２）は、ＰＤＥ４Ｄ（図１３Ａ）およびＰＤＥ４Ｂ（図１３Ｂ）双方のｍＲＮＡの発現を低下させるにあたって、標準ＰＳ−ＤＮＡバージョンＴＯＰ１５７２（配列番号４０）よりも長い作用持続時間を示す。２９３細胞内での７２時間の形質移入後、ＴＯＰ１５７２−Ｆ３がなおもＰＤＥ４Ｂ  ｍＲＮＡ発現を７２％、ＰＤＥ４Ｄ  ｍＲＮＡ発現を５５％低下させるのに対して、ＴＯＰ１５７２の有効性はＰＤＥ４Ｂでは１８％、ＰＤＥ４Ｄでは２９％に低下した。ＦＡＮＡＡＯＮ活性の増大はまた、より低い用量でも観察される。１２５ｎＭおよび７５ｎＭ用量で４８時間形質移入したＡ５４９細胞中において、ＴＯＰ１７３１−Ｆ３  ＦＡＮＡ  バージョン（配列番号５４）は、ＰＳ−ＤＮＡバージョンＴＯＰ１７３１（配列番号２）よりも良好にＰＤＥ７Ａ  ｍＲＮＡ発現をブロックする（図１４）。
【０１３２】
本発明の好ましい実施態様について本明細書に記載したが、当業者は、本発明の趣旨または添付の特許請求の範囲を逸脱することなく変更が加えられることを理解するであろう。本明細書中で引用される全ての文献は、参照によって本明細書に援用される。
【０１３３】
【表１】
2009537118.tif 000003
【０１３４】
【表２】
2009537118.tif 000004
【０１３５】
【表３】
2009537118.tif 000005
【０１３６】
【表４】
2009537118.tif 000006
【０１３７】
【表５】
2009537118.tif 000007
【０１３８】
【表６】
2009537118.tif 000008
【０１３９】
【表７】
2009537118.tif 000009
【０１４０】
【表８】
2009537118.tif 000010
【０１４１】
【表９】
2009537118.tif 000011
【０１４２】
【表１０】
2009537118.tif 000012
【０１４３】
【表１１】
2009537118.tif 000013
【０１４４】
【表１２】
2009537118.tif 000014
【図１Ａ】
2009537118.tif 000015
【図１Ｂ】
2009537118.tif 000016
【図２】
2009537118.tif 000017
【図３】
2009537118.tif 000018
【図４】
2009537118.tif 000019
【図５】
2009537118.tif 000020
【図６】
2009537118.tif 000021
【図７】
2009537118.tif 000022
【図８】
2009537118.tif 000023
【図９】
2009537118.tif 000024
【図１０】
2009537118.tif 000025
【図１１】
2009537118.tif 000026
【図１２】
2009537118.tif 000027
【図１３】
2009537118.tif 000028
【図１４】
2009537118.tif 000029
【配列表】
2009537118000001.app
【国際調査報告】
2009537118.tif 000030
2009537118.tif 000031
2009537118.tif 000032
2009537118.tif 000033