(57)【要約】遺伝的関連を決定する製法およびツール。該方法は、予測仮説が必要なく、個々または好ましくは集団のいずれかで、個体のいくつかの群によって共有される表現型形質の出現；特性が異なる疾患でありうるような異なるコンテキストに現れる各群、同一疾患の同一治療または異なる兆候に対する異なる反応に影響を及ぼす遺伝子を同定する。各表現型コンテキストについて、統計的有意性を有する遺伝子または遺伝子の組み合わせの関連を発生させる、患者および対照の研究を実施する。これらの関連をフィルターにかけ、対照対対照を比較する場合にも現れるものを除外する。残りの関連のうち、全ての患者および対照に現れているものは選択され、好ましくは合理化され、より大きな群におけるその存在を分析することによって立証される。
2009523285.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
種のゲノムにおける１個または複数の遺伝子座とある種の個体のサブグループによって示される表現型の間の関連を決定する方法であって、以下の工程：
ａ）これらのゲノムにおける個々の遺伝子座に位置する所定の遺伝子マーカーの多様性を示すデータを、表現型を示さない対照群を形成する種の複数の個体のゲノムから得ること；
ｂ）ノイズフィルターを生成させるためにこれを使用するために、前記の対照群の第１のサブグループの異なるメンバーの異なる遺伝子座のマーカーの存在を同一の対照群の第２のサブグループの異なるメンバーのこれらの遺伝子座のマーカーの存在と相関させること；
ｃ）個々の遺伝子座に位置する所定の遺伝子マーカーの該多様性の存在を示すデータを、表現型（Ｆ）を示す研究群を形成する種の複数の個体のゲノムから得ること；
ｄ）各研究群の個体のゲノムの該表現型および遺伝子座の間の様々な仮説相関を策定すること；
ｅ）疑似相関を拒絶するためにノイズフィルターとのこれらの仮説相関をフィルターにかけること
を含む方法。
【請求項２】
研究群が、異なる生物学的状態を示すが、共通の表現型または危険因子を有するヒトからなる種々の研究サブグループを含む、請求項１記載の方法であって、工程ｃ）が、該表現型またはリスク因子ならびにこれらの各研究サブグループのメンバーのゲノムの内部および共通する１個または複数の遺伝子座の間の関連を同定することを含む、方法。
【請求項３】
ヒトのサブグループが、異なる診断疾患を示すが、共通の臨床表現型を有する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
研究群が、同一疾患または生物学的状態を示すヒトからなり、工程ｃ）が、該疾患または生物学的状態ならびに各研究サブグループのメンバーのゲノムの内部および共通する１個または複数の遺伝子座の間の関連の決定を意味することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
研究サブグループにおける研究群の個体の分布が、ランダムに行われる、請求項４記載の方法。
【請求項６】
研究サブグループにおける研究群の個体の分布が、各研究サブグループが、疾患または生物学的状態の特定の発症または薬剤に対する特定の反応などの明らかな表現型形質によって特徴付けられるといった方法で行われる、請求項４記載の方法。
【請求項７】
研究群が、少なくとも３つの研究サブグループからなる、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
（ｉ）第１および第２の対照サブグループならびに研究サブグループにおける２個の遺伝子座の組み合わせを計算すること；（ｉｉ）ノイズ設定（Ｒ０）を測定する閾値水準以下の信頼水準によって特徴付けられるこれらの第１および第２の対照サブグループ間の２種の遺伝子座の組み合わせを指定すること；（ｉｉｉ）；種々および潜在的に有効な二遺伝子関連（Ｒ１、Ｒ２、．．．Ｒｎ）のセットを生成するために各研究サブグループを（ｉｉ）の結果と比較すること；ならびに（ｉｖ）研究群のゲノムにおける一組の遺伝子座と表現型の間の関連を決定するために、Ｒ０に存在せずＲ１〜Ｒｎの共有の正の関連を選択することを含む、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
（ｉ）第１および第２の対照サブグループならびに研究サブグループにおける３つの遺伝子座の組み合わせを計算すること；（ｉｉ）ノイズ設定（Ｒ０）を決定する閾値水準以下の信頼水準によって特徴付けられる第１および第２の対照サブグループ間の３つの遺伝子座の組み合わせを指定すること；（ｉｉｉ）種々および潜在的に有効な三遺伝子関連（Ｒ１、Ｒ２、．．．Ｒｎ）を生成するために各研究サブグループと（ｉｉ）の結果と比較すること；ならびに（ｉｖ）該研究群のゲノム内部の３つの遺伝子座の一群と該表現型の間の関連を決定するために、Ｒ０に存在せずＲ１〜Ｒｎの共有の正の関連を選択することを含む、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
マーカーの組み合わせの可能な各階層を考慮し、それを遺伝子座に位置する所定の遺伝子マーカーの組み合わせに関する全ての他の可能な階層と比較しても、研究群の表現型および研究群の個体のゲノムの遺伝子座の間の仮説相関が策定される、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
階層が、研究サブグループと対照群からのサブグループの比較の１つ１つにおける正の関連を発生させる場合に、マーカーの組み合わせの階層および研究群の表現型の間の相関の存在が策定される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
マーカーの組み合わせが、研究サブグループと対照群からのサブグループの比較の１つ１つにおける正の関連を発生させる同一の階層が少なくとも存在する場合に、マーカーの組み合わせと研究群の表現型の間の相関の存在が策定される、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
研究群の表現型と研究群の個体のゲノムの遺伝子座の間の仮説相関が、組み合わせの部分をなす各マーカー少なくとも１コピー存在するマーカーの組み合わせの全ての階層を考慮し、残りの階層の組み合わせに対するこれを比較して策定される、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
仮想を限定するためにこれらのマーカーに近接する遺伝子を同定し、関連参考文献を調べるために種のゲノムの地図を用いてフィルターにかけられたこれらの仮説相関を含むマーカーの遺伝子座を比較するさらなる段階を含む、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
仮説を限定するためにこれらのマーカーに隣接するさらなるマーカーを決定し、相関を再分析するために、種のゲノムの地図を用いてフィルターにかけられたこれらの仮説相関を含むマーカーの遺伝子座を比較するさらなる段階を含む、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
大きな群の個体における仮説相関を再試験するさらなる工程を含む、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
サブグループが、１０００未満のメンバーを含む、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
サブグループが、１００未満のメンバーを含む、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
マーカーが、１個の単一ヌクレオチドの多型である、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
所定の複数の遺伝子マーカーの存在を示しているデータを得る工程が、これらのゲノムにおける個々の遺伝子座に位置するこれらの所定の遺伝子マーカーを含むオリゴヌクレオチドの配列に対する個体のゲノムＤＮＡから生じるサンプルの適用を含む、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
配列が、３，５００、１０，０００、５０，０００以上の個々のオリゴヌクレオチドを含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
種のゲノムの遺伝子座および該種の個体のサブグループによって示される表現型の間の仮説相関を限定するノイズフィルターであって、ここで、該フィルターは、
ランダムノイズ関連が、信頼の閾値水準以下の種の個体の対照サブグループに共通する遺伝子マーカーの多座の組み合わせを含む遺伝子型エラーまたは他の偽の関連を指定する、データベース、および
これらのノイズ関連に相当する一連のこれらの仮説関連の組み合わせから除外する手段
を含む、ノイズフィルター。
【請求項２３】
種のゲノムの遺伝子座および種の個体のサブグループによって示される表現型の間の関連を決定する方法であって、以下の工程：
ａ）個々の遺伝子座のこれらのゲノム中に位置する所定の遺伝子マーカーの多様性の存在を示すデータを、表現型を示さない対照群を形成する、種の複数の個体のゲノムから得ること；
ｂ）したがって、ノイズフィルターを生成させるために、該対照群の第１のサブグループの種々のメンバーの種々の遺伝子座のマーカーの存在を該対照群の第２のサブグループの種々のメンバーのマーカーの存在と相関させること；
ｃ）これらの各研究サブグループのメンバーのゲノムに共通している所定の遺伝子マーカーの該多様性の存在を示すデータを、異なる生物学的状態を示すが、共通の該表現型を有する種々の研究サブグループを形成する種の複数の個体のゲノムから得ること；
ｄ）これらの研究サブグループの個体のゲノムの遺伝子座および該表現型の間の複数の仮想相関を表すこと；ならびに
ｅ）ノイズによる相関を拒絶するためにこれらの仮想相関をノイズフィルターでフィルカーにかけること；
を含む方法。
【請求項２４】
種のゲノムにおける１種または複数の遺伝子座および種の個体のサブグループによって示される表現型の間の仮説相関を決定するツールであって、
該表現型を示す該種の研究個体の多様性のゲノム長の間の個々の遺伝子座に位置する所定の遺伝子マーカーの多様性の存在を示すデータを受信する手段；
信頼の閾値水準以下の種の対照個体の２群に共通する遺伝子マーカーの多様な組み合わせを含むノイズによる関連を記録する手段；
これらの試験個体に対する所定の遺伝子マーカーの多様性の存在を示すデータに基づいて、遺伝子マーカーを運ぶ遺伝子座および表現型の間の仮説相関を計算する手段；
一連のこれらの計算された仮説関連、ノイズ関連に相当する計算された仮説組み合わせから予測する手段；
を含むプログラムコンピュータを含むツール。
【請求項２５】
ノイズに相当する該組み合わせを一連の仮想的に計算された関連から予測するために異なる手段の使用をしてもできるように設計された、請求項２４記載のツール。
【請求項２６】
種のゲノムの１個または複数の遺伝子座および該種の個人のサブグループによって示される表現型の間の関連の仮説をもたらすための、請求項２４または２５記載のツールの使用。
【請求項２７】
関連の仮説が、種のゲノムの遺伝子座および該表現型を示す個体のサブグループの間の計算された仮説関連から種の対照個体の２群に共通するノイズ関連の以下の予測をもたらす、請求項２６記載の使用。
【請求項２８】
関連仮説が、種のゲノムの遺伝子座および該表現型を示す個体のサブグループの間の計算された仮説関連から種の対照個体の２群に共通するノイズ関連を予測することなくもたらされる、請求項２６記載の使用。
【請求項２９】
以下の工程：
ａ）特定の表現型を示す研究個体の多様性のゲノム長の間に個々の遺伝子座に位置する所定の遺伝子マーカーの多様性の存在を示すデータを受信すること；
ｂ）研究個体の表現型を示さない２つの対照群における遺伝子マーカーの同一多様性の存在を示すデータを受信すること；
ｃ）表現型を示す個体の群として対照群の１つを考慮すれば、各２つの対照群における遺伝子マーカーの存在および研究個体の表現型の間の仮説関連を計算すること；
ｄ）表現型を示す研究個体におけるゲノムの遺伝子マーカーの存在および該表現型の間の仮説関連を計算すること；
ｅ）段階ｃ）において計算される関連を工程ｄ）において計算される仮説関連から予測すること；
を実施するために請求項２４または２５記載のツールに含まれるコンピュータまたはコンピュータシステムに命令を与えるのに適当な、コンピュータ可読媒体および該コンピュータ可読媒体上に記録された、コンピュータ可読プログラムコードを含むコンピュータプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝的関連研究を実施するための新規方法および装置を記載する。特に、本発明は、分析的アッセイの実行時間および研究者が費やす時間を少なくする必要があり、より少数の臨床患者サンプルを使用し、個体間で認識できる任意の形質、表現型、疾患または特性の多遺伝子塩基の同定を可能とする、引用研究の実施に有用である方法の範囲を記載する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝的関連研究は、疾患、症候群、臨床症状、または薬剤によって誘導される副作用でありうる、単一（単一遺伝子）および複合（多重遺伝子および／または多遺伝子）の生物学的病態に関する遺伝子および遺伝変種を単離するために設計された一群の技法を包含する。生物学的病態に関する遺伝子の解明は、疾患原因の有用な識見、または疾患および他の生物学的状態の機構および経路に関する少なくとも部分的な説明を提供する。その結果として、該知識は、予防および治療の可能な対策を選択し、治療の新規標的を示唆する。したがって、これらの研究で、本発明者らは、欠乏プロテインの投与、食生活の変化、遺伝子療法、または低分子での療法の治療標的の単離（従来の薬理学）などの治療対照を特定しうる。加えて、これらの研究はまた、多型、変種タンパク質、生体分子および他の生物学的マーカーの濃度プロファイルの存在に基づく臨床試験を発展させる。これらの全ては、早期診断、正確な診断、特定疾患に対する感受性の確立（予測医薬）を実施するのに用いられうる。さらに、それは、臨床試験における患者区分対策に、ならびに特定の個体における薬剤の危険性および可能な有効性の評価を踏まえて個体の最適な個別治療を確立するのに用いられうる（薬理ゲノム学的および薬理遺伝学的試験）。
【０００３】
遺伝的関連の全ての研究の基礎の基本的概念は、正常な表現型特性ならびに疾患などの臨床兆候両方が、独特かつ個々の遺伝的背景に影響する環境因子間相互作用またはその組み合わせに起因することである。多数の共通疾患は、複合的であるといわれている：これは、それらが多遺伝子または多因子のいずれかであるか、あるいは環境因子と相互作用する複数（または多数）の遺伝子の複合効果の最終結果であることを意味する。遺伝的関連研究における一般的アプローチは、（患者には存在し、対照にはない）研究される形質および研究されている個体のゲノムの特定の要素の間の統計的に有意な関連を同定するために、個体「患者」および個体「対照」のゲノムの系統的試験を実施することである。これは、単一遺伝子またはメンデル形質をうまく得られている。さらに最近になって、プロトコルは、多くのより複雑な問題：多遺伝子および／または多因子形質の遺伝的根拠の単離に取り組むために開発されている。
【０００４】
遺伝におけるメンデルの法則は、実際には遺伝子は事実上よく連鎖するけれども、表現型が独立して遺伝することを確立する。要するに、それらはＤＮＡの長い断片で遺伝する。該現象は、連鎖不均衡と呼ばれる。ハプロタイプとして知られる、ＤＮＡのこれらの長い断片は、複雑な起源または原因を有する疾患または薬剤に対する拒絶反応などの複雑な形質に大抵付随するので、（ＬＤ）は非常に重要である。ＬＤの存在は、意味する。単一ヌクレオチドの変化（一塩基変異多型またはＳＮＰ）であるのでゲノムの長さを通じて遺伝子型で同定されうるかまたは特徴付けられうる、マーカーが、非常に一貫した手段において隣接ＤＮＡの他の物理的要素と付随し、その結果として、関連の研究が、特定の形質に付随する遺伝要素をたどる遺伝子座または単一遺伝子座の単離または発見に向けての方法としてゲノムの長さに沿ってマーカーの起点を用いて実施されうることを意味する。該方法を用いて、遺伝子が同定されるとすぐに、本発明者らは、ヒトゲノムのマップを使用し、遺伝子が該領域に存在するので、どのような機能を有するのかを同定しうる。このことは、本発明者らがより特異的関連アッセイ、他の非遺伝型の研究により検証またはチェックされうるより洗練された仮説を構築し、研究される形質の遺伝的根拠の理解をさらに進歩させる。かなりの年数、種々の技法は、遺伝的関連研究を実施するために用いられているが、遺伝子型決定法に基づく新規ＤＮＡの開発、ＳＮＰの単離、およびヒトゲノム計画の終了のために、遺伝的関連研究の量は大幅に増加している。
【０００５】
遺伝的関連研究に対する２つの基本的アプローチが存在する。その１つは、１個／複数の候補遺伝子の研究に集中している。候補遺伝子は、作業仮説に基づいて、研究を実施する前に選択される遺伝子座である。該仮説は、研究される病態の分子基盤の状況および知識（例えば、特定疾患の原因論または発病の知識）に依存する。該候補遺伝子アプローチのいくつかの例は、特定疾患の原因論に関すると疑われる特定の生化学的経路に起因している酵素、異なる受容体、トランスポーター、成長因子、または他の生体分子の合成に関するものである。例えば、Ｄｒｙｊａ  ＴＰら，１９９０およびＺｅｅ  ＲＹら，１９９２を参照のこと。
【０００６】
特定の候補遺伝子を選択する根拠は、非常に困難な手法にて文献から選択されなければならないので、該研究は、それを実施する側の有意な知的成果を必要とする。さらに、構築される仮説は、正しくても正しくなくてもよく、これは、通常、一連の非常にコストのかかる研究が終了すると確実に知られるのみでありうる。一方、これらの研究は、目的の候補遺伝子が位置するゲノムの特異的領域に集中させるための治験活動を認める。したがって、該アプローチは、通常、統計的に有意な関連を同定しうるために、多数の比較的まれな患者および対象を必要とする。最終的に、これらの研究は、より一般的な関連研究によって構築されるものを含む仮説を検証するために用いられうる。にもかかわらず、「候補遺伝子」アプローチは、研究されている疾患の知識によって制限される。
【０００７】
遺伝的関連研究に用いられる他の基本的方法は、全ゲノムの特性を通じて遺伝子の同定からなる（「ｓｈｏｔ  ｇｕｎ  ａｐｐｒｏａｃｈ」、全ゲノムに関する関連研究など）。例として：Ｐｅｒｉｃａｋ−Ｖａｎｃｅ  ＭＡら，２０００、およびＨｏｒｉｋａｗａ  Ｙ，ら．２０００を参照のこと。
【０００８】
連鎖不均衡を当てにする、該方法において、複数のマーカーは、対照が特性を示さない場合、関連しないが、研究下で特性が存在する個々の遺伝子を比較するのにゲノムを通して用いられる。この度、同定能力を有するゲノムの長さの間のＳＮＰを検出するオリゴヌクレオチドのマイクロデバイスに基づく遺伝学的研究の製品を用い、各個体における１０，０００以上のＳＮＰの遺伝子型を決定し、特定の遺伝的関連研究の患者および対照においてＳＮＰが存在するかまたは非存在であるかどうかを明らかにしうることによって個体の完全ゲノムを分析することができる。これらの研究で生成されたデータは、各縦列が、個々のゲノムを表し、各横列が、研究される各ゲノムにおいて問題になっているＳＮＰの存在または非存在を表す各細胞における記号＋または−でこれらのゲノムの特定のＳＮＰを表す値の表として概念化されうる。例えば、Ｓｕｍｓｔａｔ（Ｏｔｔ  Ｊ，Ｈｏｈ  Ｊ．，２００３）などの多数のコンピュータプログラムは、これらのデータを研究されている特性と統計的に相関する遺伝子座を同定する目的で分析しうる。さらに、これらの同一プログラムは、事実であるこの関連または単なるデータのアーチファクトの確率を計算しうる。最終的に、ヒトゲノムの地図を走査することによって、関連マーカーに近接な遺伝子についての情報に基づくより洗練された仮説を作成し、得られた結果の確認または検証の戦略を設計することが可能である。該アプローチは、単一遺伝子形質の研究に用いられている。しかしながら、単一遺伝子が、非常に小さいのみであり、検出さえされないそれ自体の効果を有するものを含む、複合（多遺伝子）形質に適用することも可能である。例として：Ｈｏｈら，２００３；またはＭａｒｃｈｉｎｉら，２００５を参照のこと。
【０００９】
遺伝的関連研究は、非常に高価であり、その重要な問題は、比較的大きな患者および対照群数を必要とする検定の方法を用いて同定されうる偽または無作為の関連（一般に、「ノイズ」と呼ばれる）の連続的出現に根差ししている。この点において、遺伝的関連研究を実施しようと試みるものの大問題として、この度、広く認められるようになっている（Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２００１；５７：３０−１３５４を参照のこと）。例えば、過去十年間で研究する最も注目すべき遺伝的関連研究の１つは、ＡＰＯＥ遺伝子とアルツハイマー病（ＡＤ）の関連である。該関連は、ＡＤおよび他の関連疾患の原因および病理生物学の新しい考えを刺激した。その一方、ＡＤに関する５０もの関連が記載されており、数種の新規マーカーが提示されているが、そのほとんどは複製され得ない。したがって、大多数のこれらの関連は認められておらず、残りは科学界の論題である。
【００１０】
遺伝的関連の研究の起こりうる問題は、研究者が、本質的に、かなり複雑であるか、漠然としているかまたは一部の研究者におけるある程度の主観性を受けうる遺伝子データを作成する例として追跡されうる。これらの問題には、
１．研究されている特性の診断基準の実行可能性。全ての個体は、同一疾患を有するか？
２．適当な対照群の選択。特に関連のあるものは、研究されている集団の年齢、性別および民族プールである。
３．単一祖先によって関連する個体の特性の伝達の分析法を用いる家系の研究に基づく）連鎖研究に基づくアプローチまたは非関連個体の患者および対照を有する関連研究に基づくアプローチの使用のような、研究戦略の選択
４．多重比較（多重検定）に関する問題は、研究中大多数の比較を用いてランダムに偽の正の結果を得る高い可能性がある
５．統計分析の種類および有意性の閾値の選択
６．負の結果を有するものよりむしろ正の結果を有する唯一の研究を出版する著者および雑誌編集者の大きな傾向（出版バイアス）
が含まれる。
【００１１】
通常、結論を出すためにより少ない試料およびより少ない遺伝子データの収集を必要とするので、「候補遺伝子」アプローチは、本質的に、よい信号対ノイズ比を有し、全ゲノムを特徴付けている関連研究より低価となる。にもかかわらず、成功させるためには、優れた初期分析、優れた創造性および非常に有能な科学者の知的な作業を必要とする。さらに、連続して検証し、長期で実施した後、負の結果をもたらしうる危険を伴う。最後に、この種類の分析は、直接的または間接的に、早期化学的結果に基づくのみでありうる。
【００１２】
最近になって、何人かの著者は、ゲノムに存在する共通変種が、有意に、共通疾患の危険性に寄与しうることを主張している。該共通疾患共通変種仮説が真実であるならば、理論上は、疾患に関与する変種の同定に対する概念的に非常に単純なアプローチ：すなわち、ヒト群の遺伝子における制限された数の共通変種の包括的カタログの構築を可能にするであろう。これらは、複数の臨床表現型との関連を評価するために直接分析されうる（Ｃａｒｇｉｌｌら，１９９９）。
【００１３】
該仮説の拡張は、最近になって、ベッカーによって提案された(Becker, KG, 2004)。ベッカーは、統合失調症および二極性障害、ＩＩ型糖尿病および肥満症、または自己免疫疾患間のような、本来関連する共通疾患における共通対立遺伝子の共通の性質を強調する共通疾患の遺伝子の一般的モデルを提案する。該モデルは、多数の遺伝子が疾患特異的でないことを強調する。結果として、群における比較的高い発生率の共通の有害な対立遺伝子は、異なる遺伝的背景についておよび環境因子に対する異なる説明に臨床的に関連する表現型の役割を果たしうる。この意味において、共通疾患間の類似性は、遺伝的またはエピジェネティック（環境など）因子によって生じうることが広く確立される。残念なことに、本発明者らは、この重要な問題を分析する手段を欠いている。
【非特許文献１】Ａｌｔｓｈｕｌｅｒ  Ｄ，ら，Ｇｕｉｌｔ  ｂｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２０００  Ｏｃｔ；２６（２）：１３５−７
【非特許文献２】Ｂｅｃｋｅｒ，ＫＧ，Ｔｈｅ  ｃｏｍｍｏｎ  ｖａｒｉａｎｔｓ／ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｍｍｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｍｅｄ  Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ．２００４；Ｖ．６２（２）：ｐｐ．３０９−１７
【非特許文献３】Ｃａｒｇｉｌｌら．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｉｎ  ｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１９９９  Ｊｕｌ；Ｖ．２２（３）：ｐｐ．２３１−８．Ｅｒｒａｔｕｍ  ｉｎ：Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １９９９  Ｎｏｖ；２３（３）：３７３
【非特許文献４】Ｃｒａｉｇ  Ｄ．Ｗ．ら．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ＳＮＰ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ．２００５  Ｍａｒ；５（２）：１５９−７０．Ｒｅｖｉｅｗ
【非特許文献５】Ｄｅ  Ｃａｓｔｒｏ  Ｆ，Ｍｏｒｏｎ  ＦＪ，Ｍｏｎｔｏｒｏ  Ｌ，Ｒｅａｌ  ＬＭ，Ｒｕｉｚ  Ａ．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｏｖａｒｉａｎ  ｈｙｐｅｒｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００５ａ  Ｓｅｐ；６（６）：６２９−３７．Ｒｅｖｉｅｗ
【非特許文献６】Ｄｅ  Ｃａｓｔｒｏ  Ｆ，Ｍｏｒｏｎ  ＦＪ，Ｍｏｎｔｏｒｏ  Ｌ，Ｇａｌａｎ  ＪＪ，Ｒｅａｌ  ＬＭ，Ｒｕｉｚ  Ａ．Ｒｅ：Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｓｅｘ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  ｗｏｍｅｎ．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．２００５ｂ  Ｊａｎ  １９；９７（２）：１５２−３
【非特許文献７】Ｄｅ  Ｃａｓｔｒｏ  Ｆ，Ｍｏｒｏｎ  ＦＪ，Ｍｏｎｔｏｒｏ  Ｌ，Ｇａｌａｎ  ＪＪ，Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ  ＤＰ，Ｐａｄｉｌｌａ  ＥＳ，Ｒａｍｉｒｅｚ−Ｌｏｒｃａ  Ｒ，Ｒｅａｌ  ＬＭ，Ｒｕｉｚ  Ａ．Ｈｕｍａｎ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｏｖａｒｉａｎ  ｈｙｐｅｒｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｉｓ  ａ  ｐｏｌｙｇｅｎｉｃ  ｔｒａｉｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．２００４  Ｍａｙ；１４（５）：２８５−９３
【非特許文献８】Ｄｅ  Ｃａｓｔｒｏ  Ｆ，Ｒｕｉｚ  Ｒ，Ｍｏｎｔｏｒｏ  Ｌ，Ｐｅｒｅｚ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ  Ｄ，Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｃａｓａｓ  Ｐａｄｉｌｌａ  Ｅ，Ｒｅａｌ  ＬＭ，Ｒｕｉｚ  Ａ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｆｏｌｌｉｃｌｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｓｅｒ６８０Ａｓｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｆｏｌｌｉｃｌｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ．Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ．２００３  Ｓｅｐ；８０（３）：５７１−６
【非特許文献９】Ｄｉ  Ｐａｓｑｕａｌｅ  Ｅ，Ｒｏｓｓｅｔｔｉ  Ｒ，Ｍａｒｏｚｚｉ  Ａ，Ｂｏｄｅｇａ  Ｂ，Ｂｏｒｇａｔｏ  Ｓ，Ｃａｖａｌｌｏ  Ｌ，Ｅｉｎａｕｄｉ  Ｓ，Ｒａｄｅｔｔｉ  Ｇ，Ｒｕｓｓｏ  Ｇ，Ｓａｃｃｏ  Ｍ，Ｗａｓｎｉｅｗｓｋａ  Ｍ，Ｃｏｌｅ  Ｔ，Ｂｅｃｋ−Ｐｅｃｃｏｚ  Ｐ，Ｎｅｌｓｏｎ  ＬＭ，Ｐｅｒｓａｎｉ  Ｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｗ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＢＭＰ１５  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ａ  ｌａｒｇｅ  ｃｏｈｏｒｔ  ｏｆ  ｗｏｍｅｎ  ｗｉｔｈ  ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｏｖａｒｉａｎ  ｆａｉｌｕｒｅ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．２００６  Ｍａｙ；９１（５）：１９７６−９
【非特許文献１０】Ｄｉｘｉｔ  Ｈ，Ｒａｏ  ＬＫ，Ｐａｄｍａｌａｔｈａ  ＶＶ，Ｋａｎａｋａｖａｌｌｉ  Ｍ，Ｄｅｅｎａｄａｙａｌ  Ｍ，Ｇｕｐｔａ  Ｎ，Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｙ  Ｂ，Ｓｉｎｇｈ  Ｌ．Ｍｉｓｓｅｎｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＢＭＰ１５  ｇｅｎｅ  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｏｖａｒｉａｎ  ｆａｉｌｕｒｅ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．２００６  Ｍａｙ；１１９（４）：４０８−１５．Ｅｐｕｂ  ２００６  Ｍａｒ  １
【非特許文献１１】Ｄｒｙｊａ  ＴＰ，ら．  Ａ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｏｎｅ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．Ｎａｔｕｒｅ．１９９０  Ｊａｎ  ２５；３４３（６２５６）：３６４−６
【非特許文献１２】Ｆａｒｒｅｒ  ＭＪ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｐａｒａｄｉｇｍ  ｓｈｉｆｔｓ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．２００６  Ａｐｒ；７（４）：３０６−１８．Ｒｅｖｉｅｗ
【非特許文献１３】Ｆｕｎｇ  ＨＣ，Ｓｃｈｏｌｚ  Ｓ，Ｍａｔａｒｉｎ  Ｍ，Ｓｉｍｏｎ−Ｓａｎｃｈｅｚ  Ｊ，  Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ  Ｄ，Ｂｒｉｔｔｏｎ  Ａ，Ｇｉｂｂｓ  ＪＲ，Ｌａｎｇｅｆｅｌｄ  Ｃ，Ｓｔｉｅｇｅｒｔ  ＭＬ，Ｓｃｈｙｍｉｃｋ  Ｊ，Ｏｋｕｎ  ＭＳ，Ｍａｎｄｅｌ  ＲＪ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ＨＨ，Ｆｏｏｔｅ  ＫＤ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ＲＬ，Ｐｅｃｋｈａｍ  Ｅ，Ｄｅ  Ｖｒｉｅｚｅ  ＦＷ，Ｇｗｉｎｎ−Ｈａｒｄｙ  Ｋ，Ｈａｒｄｙ  ＪＡ，Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  Ａ．Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ｎｏｒｍａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ：ｆｉｒｓｔ  ｓｔａｇｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｕｂｌｉｃ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｄａｔａ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ．２００６  Ｎｏｖ；５（１１）：９１１−６
【非特許文献１４】Ｈａｒｄｙ  ＧＨ（１９０８）．「Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｍｉｘｅｄ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ」．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８：４９−５０．
【非特許文献１５】Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ  ＪＮ，ら．Ｏｎｃｅ  ａｎｄ  ａｇａｉｎ−ｉｓｓｕｅｓ  ｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．２００２  Ｏｃｔ；８７（１０）：４４３８−４１
【非特許文献１６】Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ  ＪＮ，ら，２００２  Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｄ  ４：４５６１
【非特許文献１７】Ｈｏｈ  Ｊ  ｙ  Ｏｔｔ  Ｊ．Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｍｕｌｔｉ−Ｌｏｃｕｓ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｌｏｃａｌｉｚｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｒａｉｔ  Ｇｅｎｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２００３，Ｖ．４，ｐ．７０１−７０９
【非特許文献１８】Ｈｏｒｉｋａｗａ  Ｙ，ら．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｃａｌｐａｉｎ−１０  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２０００  Ｏｃｔ；２６（２）：１６３−７５
【非特許文献１９】Ｌａｉｓｓｕｅ  Ｐ，Ｃｈｒｉｓｔｉｎ−Ｍａｉｔｒｅ  Ｓ，Ｔｏｕｒａｉｎｅ  Ｐ，Ｋｕｔｔｅｎｎ  Ｆ，Ｒｉｔｖｏｓ  Ｏ，Ａｉｔｔｏｍａｋｉ  Ｋ，Ｂｏｕｒｃｉｇａｕｘ  Ｎ，Ｊａｃｑｕｅｓｓｏｎ  Ｌ，Ｂｏｕｃｈａｒｄ  Ｐ，Ｆｒｙｄｍａｎ  Ｒ，Ｄｅｗａｉｌｌｙ  Ｄ，Ｒｅｙｓｓ  ＡＣ，Ｊｅｆｆｅｒｙ  Ｌ，Ｂａｃｈｅｌｏｔ  Ａ，Ｍａｓｓｉｎ  Ｎ，Ｆｅｌｌｏｕｓ  Ｍ，Ｖｅｉｔｉａ  ＲＡ．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｉｎ  ＧＤＦ９  ａｎｄ  ＢＭＰ１５  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｏｖａｒｉａｎ  ｆａｉｌｕｒｅ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２００６  Ｍａｙ；１５４（５）：７３９−４４
【非特許文献２０】Ｍａｒａｇａｎｏｒｅ  ＤＭ，ｄｅ  Ａｎｄｒａｄｅ  Ｍ，Ｌｅｓｎｉｃｋ  ＴＧ，Ｓｔｒａｉｎ  ＫＪ，Ｆａｒｒｅｒ  ＭＪ，Ｒｏｃｃａ  ＷＡ，Ｐａｎｔ  ＰＶ，Ｆｒａｚｅｒ  ＫＡ，Ｃｏｘ  ＤＲ，Ｂａｌｌｉｎｇｅｒ  ＤＧ．Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．２００５  Ｎｏｖ；７７（５）：６８５−９３
【非特許文献２１】Ｍａｒｃｈｉｎｉら，Ｇｅｎｏｍｅ−Ｗｉｄｅ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｌｏｃｉ  Ｔｈａｔ  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ａｂｒｉｌ  ２００５，Ｖ．３７  Ｎｏ．４，ｐ．４１３−４１７
【非特許文献２２】Ｍｏｒｏｎ  ＦＪ，ｄｅ  Ｃａｓｔｒｏ  Ｆ，Ｒｏｙｏ  ＪＬ，Ｍｏｎｔｏｒｏ  Ｌ，Ｍｉｒａ  Ｅ，Ｓａｅｚ  ＭＥ，Ｒｅａｌ  ＬＭ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ  Ａ，Ｍａｎｅｓ  Ｓ，Ｒｕｉｚ  Ａ．Ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １５（ＢＭＰ１５）  ａｌｌｅｌｅｓ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｏｖｅｒ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｆｏｌｌｉｃｌｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ａｎｄ  ｉａｔｒｏｇｅｎｉｃ  ｏｖａｒｉａｎ  ｈｙｐｅｒｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＯＨＳＳ）．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００６  Ｊｕｌ；１６（７）：４８５−９５
【非特許文献２３】Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２００１；５７：３０−１３５４
【非特許文献２４】Ｏｔｔ  Ｊ，Ｈｏｈ  Ｊ．Ｓｅｔ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＳＮＰ  ｃａｓｅ−ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｄａｔａ．Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ．２００３；１０（３−４）：５６９−７４
【非特許文献２５】Ｐｅｒｉｃａｋ−Ｖａｎｃｅ  ＭＡ，ら．Ｌｉｎｋａｇｅ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｆａｍｉｌｉａｌ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １９  ｌｉｎｋａｇｅ．Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．１９９１  Ｊｕｎ；４８（６）：１０３４−５０
【非特許文献２６】Ｒｏｔｈｍａｎ  ＫＪ  ｙ  Ｂｏｉｃｅ  Ｊｒ  ＪＤ：Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ．  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｗｅｌｆａｒｅ，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．７９−１６４９，１９７９．
【非特許文献２７】Ｒｏｔｈｍａｎ  ＫＪ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ：ａｎ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｎｕｅｖａ  Ｙｏｒｋ．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００２．
【非特許文献２８】Ｓｙｖａｎｅｎ  Ａ．Ｃ．，Ｔｏｗａｒｄ  ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ＳＮＰ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２００５  Ｊｕｎ；３７  Ｓｕｐｐｌ：Ｓ５−１０
【非特許文献２９】Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  Ｗ．（１９０８）．「Ｕｂｅｒ  ｄｅｎ  Ｎａｃｈｗｅｉｓ  ｄｅｒ  Ｖｅｒｅｂｕｎｇ  ｂｅｉｍ  Ｍｅｎｓｃｈｅｎ」．Ｊａｈｒｅｓｈ．Ｖｅｒｅｉｎ  ｆ．Ｖａｔｅｒｌ．Ｎａｔｕｒｋ  ｉｎ  Ｗｕｔｔｅｍｂｅｒｇ  ６４：３６８−８２．
【非特許文献３０】Ｗｅｉｒ，Ｂ．Ｓ．，Ａ．Ｈ．Ｄ．Ｂｒｏｗｎ  ｙ  Ｄ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ．１９７６．Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｎｅｕｔｒａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃａｌｌｙ  ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８４：６３９−６５９．
【非特許文献３１】Ｗｅｉｓｓ  ＫＭ，ら，Ｈｏｗ  ｍａｎｙ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｄｏｅｓ  ｉｔ  ｔａｋｅ  ｔｏ  ｍａｐ  ａ  ｇｅｎｅ  ｗｉｔｈ  ＳＮＰｓ？  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２０００  Ｏｃｔ；２６（２）：１５１−７
【非特許文献３２】Ｚｅｅ  ＲＹ，ら．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  Ｉ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｇｅｎｅ  ｗｉｔｈ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９９２  Ａｐｒ  １５；１８４（１）：９−１５
【非特許文献３３】Ｚｏｎｄｅｒｖａｎ  ＫＴ，ら，Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｉｎｔｅｒｐｌａｙ  ａｍｏｎｇ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｔｈａｔ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ａｌｌｅｌｉｃ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．  ２００４  Ｆｅｂ；５（２）：８９−１００
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
ゲノムと表現型間の関係の深い理解を習得する可能性は、本発明者らがヒトの健康の分野の新時代に非常に近づいていると考えさせる一般的楽観主義の基盤である。結果として、本発明者らがより効率的にこれらの研究を実施可能にする方法論的ツールは、非常に有益であろう。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、新しい遺伝的仮説の構築のための新規かつ効率的方法を提供する。例えば：遺伝子座、最終的に、遺伝子または遺伝子の組み合わせが、いくつかの表現型特性の出現または持続に関与するという発見は、研究する価値がある。言い換えれば、（変異単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、帰無対立遺伝子、異常スプライシングを行う変種などによって理解する）一、二、三遺伝子または多遺伝子変異が、研究されている表現型に関与すること。方法は、一遺伝子形質の研究に用いられうるが、多遺伝子または複雑な形質の研究について処理する特徴を有する。該文書に記載されるように、方法は、分析および複数グループの健常人の対照サンプルおよび１つまたは複数の目的の表現型を有する個体のサンプルのインビトロでの系統的処理を組み合わせ、研究されている表現型に関与する高い可能性を有する１個または複数の遺伝子位置（遺伝子座）の同定をもたらす、同定される遺伝的関連は、後で、絞り込まれ、検証されうる（あるいは、研究から除外され、切り捨てられる）。さらに、同定される関連の分子機構は、他の定評のある技法によってチェックされうる。
【００１６】
該方法には、「候補遺伝子」アプローチの複雑な分析作業の大部分を回避するだけでなく、また完全ゲノム特性解析の高価かつ非効率的方法の最適化という利点がある。実質的に任意の表現型または疾患に関与する遺伝子の同定を可能とし、作業仮説が、研究者の考えに基づく生化学的経路の帰納的推理および分析を通してではなく、システムによって生じることを考えれば、該方法は、無仮説臨床クローニングまたはＨＦＣＣと名付けられている。言い換えれば、仮説は生成されるかまたは研究にて臨床的表現型の見解から直接的に明らかにされる。最終結果は、目的の１個の遺伝子または複数の遺伝子（一組、三つ組、四つ組など）の同定である。
【００１７】
ＨＦＣＣは、バックグラウンドノイズ濾過の新規方法を使用する。これは、臨床的に関連した表現型の複合研究に基づき、複数の、臨床的に関連した、表現型の特徴のＳＮＰ（または他の遺伝子マーカー）の遺伝的プロファイルの共通要素を同時に抽出する。これは、実質上任意の群の遺伝的に関係のある特徴における複数のマーカーまたは独立遺伝子の複合効果の調査を可能にする。これらの特徴は、例えば、疾患、または障害の発症もしくは経過に対する感受性であってもよい。あるいは、ＨＦＣＣは、副作用および薬剤の有効性の分析に用いられうるかまたは特定の個体が特定の表現型を示すであろうかどうかを表すバイオマーカーを見出すために用いられうる。
【００１８】
したがって、その最も基本的な態様において、該方法は、検証され、さらなる作業が帰納的に実施されうる新規の科学的指針または仮説の作成の原動力を提供する。これらの仮説は、個体対照（例えば、健常人）ならびに特異的な表現型を検証する個体（例えば、特定の診断方法に関連する疾患）からの複数の試料のゲノム（ｐａｎ−ｇｅｎｏｍｉｃ）研究の結果を分析するシステムから現れる。
【００１９】
その最も基本的態様の１つにおいて、本発明は、種の個体のサブグループに現れる特定の種のゲノム内の１個または複数の遺伝子座の関連の決定方法を提供するであろう。該方法は、工程：
ａ）対照群を定義し、研究中に表現型を示さない同一種の複数の個体のゲノムからゲノムの長さに沿って異なる遺伝子座に位置する多数の所定の遺伝子マーカーの存在または欠損のデータを得ること；
ｂ）該方法が、工程ａ）に定義される対照群内のサブグループの異なるメンバーの種々の遺伝子座のマーカーの存在を同一対照群の対照の第２のサブグループにおける特定の遺伝子座内の同一マーカーの存在と相関させるノイズデータフィルターを生成すること；
ｃ）複数かつ物理的に分離された遺伝子座に位置する複数かつ所定の遺伝子マーカーからの遺伝子データを、同一表現型（Ｆ）を共有し、発現する標的または研究群を構成する同一種の複数の個体のゲノムから得ること；
ｄ）研究される個体のゲノムで分析される記載の表現型（Ｆ）と選択される遺伝子座間の種々の仮説相関を策定すること；
ｅ）デノイズデータフィルター（ｄｅ  ｎｏｉｓｅ  ｄａｔａ  ｆｉｌｔｅｒ）との得られた仮説相関をフィルターにかけ、分離し、最終的に偽相関を削除すること
からなる。
【００２０】
研究を、同セットの予め選択した遺伝子マーカーを用いて研究に組み込まれる各個体の遺伝子プロファイルを取得してから開始しうる。これらのデータは、例えば、研究されている種のゲノムの一部に位置するＳＮＰ型マーカーに各々特異的で、何千ものオリゴヌクレオチドからなるマイクロデバイスで個体から取り込まれるＤＮＡサンプルの適用（ＤＮＡ配列）によって得られうる。該配列は、多型マーカーが全遺伝子型個体に存在するかまたは非存在であるかどうかを同定することができる。該配列は、各々異なる遺伝子マーカーに相当する、３，５００、１０，０００、５０，０００またはそれ以上の異なるオリゴヌクレオチドを含有しうる。より多くのマーカーを含むことによって、これらの遺伝子地図は、より洗練させた関連分析を可能にするが、必要なコンピュータ分析の量を増加する。マーカーは、ＳＮＰ型のものでありうるが、本発明のシステムはまた、他種の遺伝子マーカーを含みうる。研究の特徴によって、個体から遺伝子型生データを得るために、該方法は、ゲノム分析および（両対立遺伝子であるか否かの情報を得る）両染色体における選択された遺伝子マーカーの存在または非存在の同定を可能にする他の入手可能な技法、かかるパイロシークエンシング技法（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）または多数のＰＣＲ由来プロトコル（すなわち、蛍光共鳴エネルギー転移と共役しているリアルタイムＰＣＲ）を用いうる。別の可能性は、多数の高い社会的影響のある疾患を有する複数の個体およびその対応する健康な対照群に基づく全ゲノムにおける遺伝子型決定の結果をそのウェブサイトにアップロードしている複数の国際的イニシアチブおよびコンソーシアムによる構築下で、研究中に公開データベースから直接用いられる生遺伝子型決定データを得ることである。該方法は、共通の表現型を共有し、研究を行う全ての選択される個体によって共有されるゲノムパネルを探索する必要がある異なる疾患を組み合わせうる。
【００２１】
前段落に記載の対照群は、目的の表現型が存在する患者として同一の民族的かつ地理的背景を有する集団からランダムに選択される一連の健常人である。これらの対照群から、本発明者らは、２つのサブグループの個体を、好ましくはランダムに選択することができる。対照群「患者」（Ｃｆ１）として分類される第１の対照サブグループの全てのメンバーにおける複数の遺伝子座の存在または遺伝子型は、「対照」（Ｃｃ１）として分類される第２の対照サブグループの全てのメンバーにおける複数の遺伝子座の存在または遺伝子型と比較される。該研究でさえ、２つの対照群間の比較の場合において、対照群内の選択バイアス、遺伝子型決定中の技法問題、または単に偶然に起こることによってのみ説明されうる多数の見掛け上の関連（患者および対照の比較の場合に、研究される表現型と検出される１種または複数の変種の群の１つにおけるより高い頻度での出現の間の関連を示しうる正の理論的相関）が生じる。この群の検出される関連は、本明細書に記載されるように、得られるデータのノイズフィルターとして機能を果たすことができ、工程ｃ）に記載され、同一技法およびフィルターとして機能を果たす「対照−対照」研究中に用いられるマーカー群を用いて行われるように患者（本物）および対照の次の研究から偽の関連の除外を可能にする。除外された関連は、（対照に対する対照の比較研究において検出される関連からなる）ノイズフィルターで検出されている患者および対照の研究に出現するものであろう。
【００２２】
ノイズデータフィルターの構築前、同時、または後に、本発明者らが研究群（試験群、Ｆ群）として定義する異なる個体のゲノムから得られるマーカーの特定前セットの同一群における存在から生データを得ることができる。これらの群は、個体（例えば、目的の表現型を示す患者）に基づいて構成される。標的表現型を発現するＦ群における利用可能な遺伝子型を用いて、Ｆ群のゲノムにて分析される表現型および遺伝子座の間の複数の仮説相関を策定することを可能にする。かかる仮説相関を策定するために、Ｆ群は、コンピュータツールによって、一連の種々の起こり得るまたは仮説相関の生成を得ている対照（Ｃｃ）と比較される。
【００２３】
最終的に、偽の相関を同定、分類または削除するために、仮説相関は、前工程において生成されるノイズデータフィルターの適用によってフィルターにかけられうる。該最終工程には、対照群のバイアス、技法問題またはランダム発生によって高い可能性を有するものを除外し、前工程ｂ）で得られたそれらの相関と、工程ｄ）で得られる相関の比較およびフィルタリングが含まれる。言い換えれば、患者群（Ｆ）および対照（Ｃｃ）を比較する場合に得られるが、対照を相互に比較する場合（Ｃｃ対Ｃｆ）にも発生する相関は、すぐに切り捨てられるか、加重されるかまたは結果の表で分離されうる。該方法は、研究中に得られる相関の数を減らし、例えば、遺伝子に基づく表現型または表現型に関する遺伝子調節についての以前の知識に基づくマーカーのさらなる浄化、選択遺伝子の機能、疾患の既知の候補代謝経路内の選択遺伝子の役割、選択遺伝子の組み合わせまたは大きな患者対照系におけるさらなる検証のための一番良いマーカーの単に選択のための遺伝子−遺伝子相互作用についての前データを用いることによって研究の次の工程のマーカーの候補マーカーの評価を容易にする。
【００２４】
ＨＦＣＣの研究群（Ｆ群、試験群）の理想構成は、ｎ研究群（Ｆ１〜Ｆｎ）を含み、その各々は、同一種のＮ個体、例えば、異なる疾患または生物学的病態を示すが、それらの全てで存在する特徴的、共通の表現型または同一の危険因子を共有するヒトの群を含む。該構成において、該方法は、全ての研究群で存在する表現型、特徴的または共通の危険因子と１個または複数の遺伝子座の間の関連、研究群（Ｆ１〜Ｆｎ）の一つ一つで観測されうる関連の決定を含む。例えば、サブグループ（Ｆ１〜Ｆｎ）は、異なる疾患、異なる臨床段階における同一疾患または他のいかなる表現型の組み合わせと診断されているが、共通の臨床表現型、共通の危険因子、または共通の合併症を全て共有するヒトでありうるか、あるいは、Ｆ群でさえ、同一表現型または障害を有しうるが、臨床経過が異なる。該方法をまさに同一疾患または生物学的状態を有する患者の異なるサブグループに適用することも可能である。該方法を、異なる疾患、生物学的状態または特有および共通の表現型を共有する薬物反応に適用することは（前記のとおり）より良いことであるけれども、発明方法は、表現型サブグループ間を区別するための基準なく同一表現型を有するランダムに選ばれた患者のサブグループに適用されうる。
【００２５】
好ましくは、少なくとも３つのＦ群を構成すべきである。これらのサブグループの試料サイズは、１，０００未満の個体を含みうるか、あるいはさらに１５０未満のメンバーまたは１００未満のメンバーを有する。各Ｆサブグループのサイズの最適化は、本発明者らが適用するのを望む遺伝モデル、マーカーの密度および本発明者らが研究するのを望む遺伝子の組み合わせの数に依存しうる（表１および以下の説明を参照のこと）。
【００２６】
ＨＦＣＣの他の重要な態様は、該方法が、分析される各Ｆ群の全対照群（対照プール）からランダムに選択される２つの対照サブグループ（ＣｃおよびＣｆ）を選択し、分析することである。目的は、そのフィルター（Ｃｃ対Ｃｆ）との各比較Ｃｃ対Ｆ研究が、残りの分析とは無関係であろうことである。このことは、例えば、Ｆ１の分析について、対照（Ｃ）の一般的組み合わせから２つの対照サブグループ（Ｃｃ１およびＣｆ１）をランダムに選択することを必要とすることを意味する。両対照サブグループ（Ｃｆ１およびＣｃ１）は、結果Ｒ１を最終的に提供するであろう、１回目の比較（Ｃｃ１対Ｆ１）中に用いられるノイズフィルター１（Ｎｓ１）を得るために相互に比較される。研究群（Ｆ１．．．Ｆｎ）と対照群（Ｃｃ１．．．Ｃｃｎ）の間の独立性を確保するために、対照サブグループのランダム選択のこの工程は、研究される各Ｆ群について繰り返される。したがって、ｎノイズフィルター（Ｎｓ１．．．Ｎｓｎ）は、研究されるＦ群（Ｆ１．．．Ｆｎ）の数によって得られるであろう。最終的に、全ノイズフィルターは、対照サブグループの並べ替えおよび分析（Ｎｓ１＋Ｎｓ２＋Ｎｓ３．．．＋Ｎｓｎ）を得られた全関連を含みうる記録Ｒ０に集められるであろう。
【００２７】
ノイズフィルターは、各表現型群（Ｆ）とその対応する対照サブグループ（Ｃｃ）との比較によって発生する関連づけの各サブグループ（Ｒ１．．．Ｒｎ）で得られる予備結果に適用される。ノイズフィルター適用の方法は、すなわち、対応するノイズフィルター（Ｎｓ１，Ｎｓ２．．．．，Ｎｓｎ）が、各結果群Ｒ１．．．Ｒｎ  Ｎｓに最初に適用されうるかまたは予備結果の最初のフィルターが一般的バックグラウンドノイズ記録Ｒ０との直接的比較によって実施されうることを変化させることができる。とにかく、目的は、対照群および表現型研究群の各組（Ｃｃ１対Ｆ１、Ｃｃ２対Ｆ２，．．．、Ｃｃｎ対Ｆｎ）の潜在的に有効な二遺伝子（または三遺伝子など）の関連の一群を選択することである。データのこの完全な要約で、アプリケーションは、全結果群（Ｒ１、Ｒ２，．．．Ｒｎ）に現れるが、アーカイブＲ０に存在しない関連を選択するため、全てのＲ群（Ｒ１．．．Ｒｎ）で現れ、Ｒ０では現れない一群の関連変数（ＲＰ、有理結果）を得る。結果として、ＨＦＣＣは、研究中、試験群（Ｆ）の個体のゲノム中の一組（または三つ組など）の遺伝子座と表現型の間の関連を決定し、それはＦ群に属する全個体に共通する。
【００２８】
他の次の段階において、該方法は、遺伝子が選択マーカーに隣接することを決定し、次いで、仮説を限局化するために文献を調べる目的で研究される種のゲノムの地図とそれらを相関するため、マーカーに隣接した遺伝子、およびその機能の合理的検査によって仮説相関の数を減らす、選別後に得られたマーカーの比較の連続的工程を含みうる。あるいはおよび／またはさらに、該方法は、前に確立された相関を後で立証の再分析を行うために、新規マーカーを選択し、加えるために種のマーカーの地図に付随する遺伝子座の比較によって相関を改善し、以前に選択されたものに隣接する次の工程を含むであろう。
【００２９】
典型的には、該発見方法によって選択される相関は、以前に同定された相関を立証するために、結果を再現しうるチェックを、独立個体、通常、より大きなサンプルサイズ（図１を参照のこと）の一群で再分析されるであろう。方法の該部分は、図１にて「検証エンジン」に分類されていることを構成するであろう。
【００３０】
別の態様において、本発明は、研究される種のゲノムの遺伝子座とＦ群個体によって示される表現型の間で検出される関連を減少させるために、ノイズフィルターを提供する。フィルターは、（並べ替え検定、関連の統計的有意性水準が、従来の統計的計算を信頼しないのではなく、並べ替えの数であろう、多回数の自動的に再標識化することに基づく統計的関連の経験的計算を信頼する非常に特異的な統計的検定を用い、研究シリーズにおいて各個体の患者または対照の階層のランダム形成では、行われる並べ替えの総数で関連した並べ替え数を割ることによって行われる計算を、研究中に観測される関連の程度をこれらの標識の各並べ替えで計算することによって実験的に合理化される）偽の関連を指定するデータベースからなる。該データベースは、対照プール（Ｃ）から得られる明らかな対照サブグループ間の比較を行い、統計的有意性の所定の閾値以上の正の関連を有すると共通して関連するように見えるマーカーの全ての多座組み合わせを包含する。該ノイズフィルターは、ランダム発生、患者対照研究または対照選択のための選択方法の設計中の対照の悪い選択によって関連するように見えるマーカーの組み合わせを除外するかまたは数学的に合理化するための計算ツールとして用いられる。該情報は、関連研究におけるマーカーの組み合わせの優先順位付けに重要であり、さらに、関連研究におけるノイズを生成する相反しそうなマーカーまたはマーカーの組み合わせを同定しうる。
【００３１】
さらに、本発明は、種のゲノムの１個または複数の遺伝子座と種の個体のサブグループによって示される表現型の間の検出される関連の仮説の生成の装置を提供する。該装置は、本発明の別の重要な要素である。装置は、プログラムされたコンピュータシステムまたは以下のプログラムまたはモジュールを含有するコンピュータネットワークからなる：
１．表現型（Ｆ群）を示す種のゲノムの長さを通して独立部位または遺伝子座に位置する所定の遺伝子マーカーの一群の入力されたデータを受信するシステムまたはデバイス。２．統計的有意または信頼閾値（通常、ｐ＜０．０１）以下の統計値を有する対照群間（それぞれ、Ｃｆ１〜Ｃｆｎに対するＣｃ１〜Ｃｃｎ）の関連の研究から得られる全ての複数遺伝子座の組み合わせを含む偽の関連を保存し、記録するシステムまたはデバイス。３．患者群（Ｆ群、試験群）における所定のマーカーの一群の存在を登録するデータ、研究されるマーカーとＦ群で観察される共通表現型の間の登録されたマーカーとの関連に基づく、計算のためのシステムまたはデバイス、すなわち、異なるアッセイの特有の個体の複数および所定の表現型データまたは選択された遺伝子マーカーを運ぶ遺伝子座およびＦ群に含まれる関連に相当する選択された表現型の間の仮説関連に基づき計算するためのシステムまたはデバイス。４．デバイス３を用いて選択されるが、対照−対照デバイス（デバイス２、ノイズフィルター）にも登録されている関連を除外するかまたは合理化するため、デバイス３について得られたものからのノイズによる組み合わせを除外するフィルターデバイス。
【００３２】
この種類の装置は、１０万のマーカーの存在または非存在および罹患した個体における標的疾患のその組み合わせについて調べる大多数の個体の生遺伝子型データを分析するのに有益である。しかしながら、対照の利用可能なサンプルサイズが非常に小さくため、ノイズデータフィルターを適用することができないかまたはサンプルが研究の利点を提供することができないという可能性もある。このため、ならびに該方法の多様性を改良するために、本デバイスの構成は、システム２、すなわち、ノイズデータフィルターを組み入れるかどうかを承認する。該オプションは、例えば、選択された関連数を増加するかあるいは他の利用可能な方法を用いて得られた相関のさらなる重要性または評価を進めるのに補助しうる、ノイズデータフィルター制限を有しない遺伝相関を同定するために有用でありうる。
【００３３】
全ての特異的特性を考慮しても、本発明およびその関連装置は、特異的種の個体のサブグループによって示される表現型を有する種のゲノムにおける遺伝子座の単一または多座の組み合わせの間の関連の仮説を生成するために用いられうる。ノイズデータフィルターの有無に関わらずデバイスおよび全発明を用いることができる。ゲノムにおける多座または一遺伝子関連研究を実施するためのデバイスおよび全発明を用いることも可能である。
【００３４】
本発明の別の重要態様は、コンピュータ可読デバイスおよびコンピュータ可読デバイスに登録され、以下の工程：
ａ）特有の表現型を共有する複数の個体のゲノムの間の別の遺伝子座内に位置する複数の所定の遺伝子マーカーの存在を含む生データを受信すること；
ｂ）特有の表現型を示していない複数の個体のゲノムの間の別の遺伝子座内に位置する複数の所定の遺伝子マーカーの存在を含む生データを受信すること；
ｃ）表現型を示す群のような対照群の１つを考慮すると、特有の表現型を示していない２つの対照群を用いて、遺伝子マーカーの存在と選択される表現型の仮説関連を評価すること；
ｄ）一方が、特有の表現型を示しておらず、他方が、標的の表現型を示している個体の２つの群を用いて、遺伝子マーカーの存在と選択される表現型の間の仮説関連を評価すること；
ｅ）工程ｄ）で得られるだけでなく工程ｃ）に含まれる仮説関連を同定し、分離しおよび／または除外すること
を実施するためにコンピュータへの指令または本発明に記載の装置に含まれるコンピュータのクラスタを与えるのに適合するコンピュータ可読プログラムコードを含む情報科学ソフトウェアの方法である。
【００３５】
（図面の簡単な説明）
図１は、本発明の方法およびシステムの一例を説明し、３つの異なる機能：発見エンジン、分析ツールおよび検証エンジンを含有するブロック図である。見出し「Ｄｓ」を有する、図１の左側は、発見エンジンを表し、ここで、円は個体の群を表す。Ｃ＝対照、Ｆ＝患者。Ｃｆ１〜Ｃｆ３：それぞれ同数の個体からなる、対照個体のサブグループ。Ｃｃ１〜Ｃｃ３：それぞれ同数の個体を含有するが、Ｃｆサブグループより大きなサイズの対照個体のサブグループ。Ｆ１〜Ｆ３：それぞれ同数の個体からなり、好ましくはＣｆ１〜Ｃｆ３の各サブグループのサイズとも一致する、患者のサブグループ。サブグループＦ１〜Ｆ３の１つ１つのメンバーは、同一疾患に罹患するかまたは同一治療を受けている、同一表現型特性を示しうる、共通の特徴を共有するが、各サブグループのメンバーは、それらを他のサブグループと区別する共有の顕著な特徴を共有する（例えば、同一表現型特性自体を現す障害は、各サブグループで異なるか、疾患は、各サブグループにおいて異なる手法で進行するか、または同一治療の効果が異なる）。Ｃｃ１：Ｆ１、Ｃｃ２：Ｆ２、Ｃｃ３：Ｆ３対の１つ１つの間の矢印は、マーカー関連を探求するのに各対間の比較の実行を示す。文字「Ａｎ」が見出しである、図１の中心部は、遺伝子−遺伝子相互作用の研究を実施する全ての数学的方法を包含する分析ツールを表し、サーチエンジンによって単離される遺伝子またはＳＮＰの組み合わせを選択する。
【００３６】
文字「Ｖｄ」が見出しである、図１の右側は、検証エンジンを表し、より大きなサイズのサブグループの分析によってサーチエンジンで得られる関連を検証する。Ｖ１、Ｖ２およびＶ３は、サブグループＦ１、Ｆ２およびＦ３として同一の共通特性を有するが、これらのサブグループより非常に大きなサイズのサブグループの群を表す。Ｖ群の１つ１つのメンバーは、対応するＦサブグループのメンバーとして同一識別特性がある。Ｑ１は、Ｖ群の１つ１つと同等またはそれより大きいサイズの一般的集団の個体のサンプルを示す。Ｖ群とＱ１を連結する矢印は、発見エンジンで見出される関連を確認するかあるいは診断有用性、治療標的として使用する可能性または新規薬剤の発見の有用性などの基準にしたがってそれらを分類するために、Ｖ群の１つ１つとＱ１の間の比較分析をの実行を表す。
【００３７】
図２−５は、優性モデル（優性モデルとの対応が、図上の文字Ｄで示される、図２Ａ、３Ａ、４Ａおよび５Ａ）または全ての可能な遺伝子の組み合わせを研究し、全ての因子を考慮するモデル（ｐａｎ−ｆａｃｔｏｒ）（ｐａｎ−ｆａｃｔｏｒモデルとの対応が、図上の文字ＦＦで示される、図２Ｂ、３Ｂ、４Ｂおよび５Ｂ）下で二遺伝子（図２Ａおよび２Ｂ）、三遺伝子（図３Ａおよび３Ｂ）、四遺伝子（図４Ａおよび４Ｂ）および五遺伝子（図５Ａおよび５Ｂ）である相互作用研究の患者数（Ｎ）の機能として統計的検出力（Ｐｏ）の予測のグラフ表示である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
複合疾患の現行モデルは、複合的特徴または表現型が、複数の、物理的に、非関連遺伝要素によって引き起こされるかまたはそれから構成されることを構築する。通常、各遺伝子要素自体は、非常に小さな大きさを有し、不十分で、単独であり、所定の表現型をもたらす。これは、これらの遺伝子が、所定の表現型の出現をもたらすために、別の変種および／または追加的な環境性もしくは外因性危険因子を必要とすることを意味する。その一方、同一の個体において２個または複数の因子が一致する場合、（表現型を表示する遺伝子型の個体キャリアーまたは遺伝子型の組み合わせの比率として理解される）浸透率を常に増加する。ＯＲ（オッズ比）は、所定の因子の効果の範囲の測定である。該測定は、一般に、患者対照研究に用いられ、事象（この場合における表現型の存在）が、別群の同一事象の確率（対照）で割られる個体のｕｎ群（患者）に生じうる原因または確率比の有効な予測値である。該概念は、あらかじめ適用されるならば、ＯＲまたは特有の遺伝子の組み合わせの浸透率が分離してマーカーの研究で観測されたものより高いという意味を含むかまたは意味するために非常に重要である（Ｈｏｈ  ＪおよびＯｔｔ  Ｊ，２００３）。
ＯＲ単一マーカー＜ＯＲ二遺伝子＜ＯＲ三遺伝子＜ＯＲ五遺伝子、その他諸々。
【００３９】
事実上、遺伝子−遺伝子相互作用（インタラクトーム）の探索が、全ゲノムをスキャンする範囲におけるマーカー研究戦略によってマーカーを有するトラッキング表現型より有益であろうこと最近になって前提としている（Ｍａｒｃｈｉｎｉ  Ｊ，ら．２００５）。
【００４０】
関連研究の大きな課題の１つは、多重比較：各特徴または疾患に対する感受性と比較する遺伝子の組み合わせ（またはマーカーの組み合わせ）の有効な関連を同定および分離する方法の問題である（Ｈｏｈ  ＪおよびＯｔｔ  Ｊ，２００３を参照のこと）。例えば、
ゲノムの長さを通じて１０００万個の共通ＳＮＰマーカーが存在するならば、次いで、各特性について潜在的に関与するマーカーの対の１０，０００，０００！／（２！ｘ９，９９９，９９８！）または約５ｘ１０１３の組み合わせが存在する（例えば、Ｗｅｉｓｓ  ＫＭ，ら．２０００；Ａｌｔｓｈｕｌｅｒ  Ｄ，ら．２０００；Ｚｏｎｄｅｒｖａｎ  ＫＴ，ら．２００４を参照のこと）。包括的および系統的方法で、選択された表現型にて、関連研究を実施することは、落胆させる作業であり、そのため、本発明の方法は、比較的経済的方法で真に関連する遺伝子型組み合わせを発見し、さらに「誤判定」またはランダム関連の危険性、あるいは他の偽の原因を減少される目的で開発されている。本発明の方法におけるデータの分析のためのフィルターの設計は、本発明者らが多数のマーカーおよびマーカーの組み合わせを用いる場合に実施されなければならない多量の関連検定によるノイズを減少させうる。
【００４１】
たった１回の試験における遺伝子型数万または数十万のＳＮＰマーカーのプロトコルは、この１０年間で開発されている（Ｓｙｖａｎｅｎ  Ａ．Ｃ．，２００５、文献について思い浮かぶ）。これらの利点は、各疾患に付随するタンパク質の同定の可能性、および治療標的としてその対応する生化学的経路を有する（Ｃｒａｉｇ  Ｄ．Ｗ．ら．２００５）。全ゲノム解読の基本的特徴は、該関連研究が特異的遺伝子自体に基づかないことである；研究されているゲノムの要素に関する仮説が存在しない（ポテンショナル・クローニングアプローチまたは非仮説アプローチ）。
【００４２】
本発明の方法は、研究されている固体（患者および対照）のＳＮＰの全遺伝子プロファイルまたはフットプリントを得るために、ＳＮＰを用いて、ゲノムの完全な解読に基づく戦略を用いる。この実現は、アフィメトリクスのＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）１０Ｋなどの商業用マイクロアレイを用い、全２００，０００対の塩基に対する１個のマーカーの解像度でゲノム全体に分布する１０，０００個のマーカーの地図を利用しようと試みる。しかしながら、本発明の方法はまた、高解像度遺伝子地図を用い、別法として、未来技術を用いて容易に達成されうる（Ｓｙｖａｎｅｎ  Ａ．Ｃ．２００５）。これは、初期成果の制度および消費される費用便益研究に依存するであろう。
【００４３】
該方法は、系統的に評価されていない遺伝子研究で広く受け入れられている２つの概念または仮説を利用する。第１の仮説は、研究に含まれる臨床症状が共通遺伝因子を共有することである。第２は、臨床症状の原因が、それらの間の遺伝的連関（言い換えれば、２個または複数の非関連遺伝子マーカーからなる遺伝型）がない異なるマーカーの組み合わせであることである。したがって、（個々のマーカーの役割は、該方法で非常に簡単に調べられうるけれども）、検査方法は、いくつかの臨床的に関連する特徴または表現型に関与する遺伝子の組み合わせを優先する。
【００４４】
前述するように、Ｃとして表示されるサンプルは、対照群と称され、Ｆ群は、研究されている患者のグループを表す。これらの各群は、サブグループに分類されなければならない。図１において、一例として、患者の３つのサブグループ（Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３）の存在が示され、２組の対照群：一方は、Ｃｆ１、Ｃｆ２、Ｃｆ３および他方は、Ｃｃ１、Ｃｃ２、Ｃｃ３の生成を意味する。各群のサンプルサイズは、変化するか、好ましくは、有意な遺伝的関連が得られるようにするために少なくとも十分な大きさであろう。これらの計算を行うために伴うモデルおよびプレフィックス値（ｐｒｅ−ｆｉｘｅｄ）は研究の統計的重みを決定するので、各ＦサブグループおよびＣサブグループの大きさは、好ましくは、マーカーの一組以上の組み合わせ（例えば、多型）の存在／非存在を検証するために行われうる計算に基づくであろう。帰無仮説が虚偽である場合、統計的検出力は、（本発明の方法の場合において、マーカーの組み合わせと考えられる疾患、表現型特徴、治療に対する反応の基準などの間の関連の非存在であろう）帰無仮説を拒絶する可能性を表す、すなわち、統計的に有意な差異または所定の規模の関連として検出する試験または実験の能力を表す。関連研究の有用性は、大部分は、該関連が存在する場合に因子間の関連を検出するその能力に依存する。該能力（統計的検出力）が不十分であり、研究の終了にしたがって、帰無結果が得られる（統計的有意性がない）場合、結果が研究の検出力不足の結果として得られた、言い換えれば、「検出漏れ」が存在するという可能性を除外することは不可能である。該状態は、得られた結果、したがって、研究を無効にする。結果として、この予測結果が不十分であれば、研究を行わないことが望ましいかもしれないので、研究を完成させる前に研究の検出力を予測することが重要である。したがって、本発明者らは、本発明の方法に達する。用いられる最も望ましい戦略は、異なるシナリオを探索することおよびその１つ１つについて異なる予測を得ることからなる。しかしながら、予測するように、計算を行う場合、パラメータは、研究が完成するまである程度の確実性を有するとは知られていないであろうと仮定され、研究における一連の患者および対照の統計的検出力に影響を及ぼすパラメータを決定し、そのパラメータは、
ｉ）関連が存在しない場合に正の結果を得る確率を表し、大抵、（関連が実際に存在しない場合２個または複数のマーカー間の関連の結果を正として認める０．０５の確率を許容される最大値として設定することを意味する）５％で決定されるエラータイプアルファ（α）；したがって、ｐ値（研究で得られた結果が、研究群間で差異がないと仮定して起こり得る確率）は、０．０５に等しいかまたはそれ以上で得られた関連は、統計的に有意であるとして見なされないので除外されるであろう；
ｉｉ）対照対患者比（好ましくは、各Ｃｃサブグループの少なくとも１５０対照対各Ｆサブグループの７５患者）；
ｉｉｉ）考えられる遺伝モデルにしたがって決定され、各組み合わせにおいて考えられる各マーカーについて、２つの可能な対立遺伝子が存在すると仮定すると、（マーカーの組み合わせが同時に２回考えられる）優性二遺伝子モデルにおいて、  例えば、対照における遺伝子型の展示（言い換えれば、第１のマーカーの可能な対立遺伝子の１つと第２のマーカーの可能な対立遺伝子の１つの特異的組み合わせ）が２５％で決定されうるといった方法で、その各々は、同等の頻度、（０．５）で存在する、対照における遺伝子型の有病率（言い換えれば、分析される対照の総数で割られる特異的遺伝子型を有する対照数）；
ｉｖ）患者および対照における所定の遺伝型のキャリアーおよび非キャリアーを比較することに由来するＯＲ；および
ｖ）遺伝子モデルおよびマーカー組み合わせモデル
である。
【００４５】
マーカーの組み合わせの各モデルは、各組み合わせにおける所定数のマーカーを考慮することを意味する。例えば、二遺伝子モデルでは、各組み合わせにおいて考えられる２個のマーカーが存在する。本発明の理想的なシナリオでは、２個のマーカーは、２種の可能な対立遺伝子、ＡおよびＢを有する２種のＳＮＰ型多型（１および２）であり、その各々（１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ）は、一般に、多型性部位が存在する対立遺伝子Ｂと考えられ、通常、ヌクレオチドが、低頻度の２つの可能性があると考えられている位置で遭遇する対立遺伝子Ｂであると考えられることを意味する。表１で示されるように、該モデルでは、各変数は、９の異なる階層（可能な遺伝子型構造）を有する二遺伝子組み合わせからなり、表では、最初に考えられている（１２：多型２を有する多型１）マーカーの組み合わせ（この場合はＳＮＰ）を、次いで、それに相当する特異的遺伝子型構造を示すことによって指定される：
【表１】
2009523285.tif 000003
【００４６】
二遺伝子モデルの各変数（考えられる個々の多型の対または組み合わせ）について、表１に含まれるものと同様の構成が存在するであろう。
【００４７】
三遺伝子モデルでは、各変数にて可能と考えられるマーカーの数は３である。前記患者と同様の方法において、マーカー多型の例として考慮すると、３種の多型を各々（１，２，３）と見なすべきであり、２種の可能な対立遺伝子は、（１Ａ，１Ｂ；２Ａ，２Ｂ；３Ａ，３Ｂ）で存在し、一般に、対立遺伝子Ｂは頻度が低いと考えられる。表２に示されるように、該モデルにおいて、各変数は、２７の異なる階層を有する三遺伝子組み合わせからなり、その構造は、表１のものと類似の注釈を有する表２にも示されている。
【表２】
2009523285.tif 000004
【００４８】
生じる変数の各構成は、２つの異なる遺伝子モデル：優性モデルまたはパン−因子モデルを用いることによって分析されうる。優性モデルは、古典的閾値モデル（Ｍａｒｃｈｉｎｉら，２００５）と同等であり、任意のモデルで得られる可能な組み合わせの数は、反復なく可能な変動の数に相当する古典的式、Ｍ！／（Ｇ！ｘ（Ｍ−Ｇ）！）｛式中：Ｍは、分析されるマーカー数であり、Ｇは、可能な各組み合わせを形成するために取得する必要があるマーカーの数（二遺伝子モデルでは、Ｇ＝２マーカー／組み合わせ；三遺伝子では、Ｇ＝３マーカー／組み合わせ、その他諸々）｝を用いて容易に得られうる。優性モデルは、２群における遺伝子マーカーの情報：残りの組み合わせに対する少なくとも１コピーの各ＳＮＰの存在を分析する。二遺伝子モデルでは、例えば、これは、考えられる４つの可能性：両多型におけるＢの存在（階層１２ＡＢＡＢ、１２ＡＢＢＢ、１２ＢＢＡＢ、１２ＢＢＢＢを完成させるであろう状態）、両多型におけるＡの存在（階層１２ＡＡＡＡ、１２ＡＡＡＢ、１２ＡＢＡＡ、１２ＡＢＡＢを完成させるであろう状態）、多型１におけるＡおよび多型におけるＢの存在（階層１２ＡＡＡＢ、１２ＡＡＢＢ、１２ＡＢＡＢ、１２ＡＢＢＢを完成させるであろう状態）ならびに多型１におけるＢおよび多型２におけるＡの存在（階層１２ＡＢＡＡ、１２ＡＢＡＢ、１２ＢＢＡＡ、１２ＢＢＡＢを完成させるであろう状態）を意味するであろう。表３では、少なくとも１コピーの所定のマーカーの存在の各可能性を完成させるであろう階層を太字およびイタリック体で示している、二遺伝子モデルの可能な遺伝子型組み合わせを再現している。これらの各可能性について、患者および対照両方において、残りの出現頻度に対するこれらの出現頻度を検証し、患者の各群（Ｆ１，Ｆ２．．．Ｆｎ）で得られる値をその対応する対照群（Ｃｃ１，Ｃｃ２．．．Ｃｎ）で得られる値と比較する、それを完成する階層を考える必要があろう。
【表３】
2009523285.tif 000005
【００４９】
ｐａｎ−ｆａｃｔｏｒモデルは、情報を多重層に分割し、最低効果の大きさに達する階層、統計的検出力の研究によって示されており、研究にて定数の患者および対照を得ると、８０％以上の検出力で患者対照研究にて検出されうる最小ＯＲをいわれるパラメータを分析のために選択する。各変数の各階層は、残りに対して比べる独立変数と考えられる（二遺伝子モデルの場合では、残りに対する１２ＡＡＡＡ、次いで、残りに対する１２ＡＢＡＡ、その他諸々）。あるいは、カイ二乗表は、（ｎ＝階層−１の番号である）自由度ｎで構成されうる。この場合において、各二遺伝子モデルは、ＯＲ、信頼区間、標準誤差および示されている各階層全てのｐで９回（各変数の９階層）計算される。
【００５０】
ｐａｎ−ｆａｃｔｏｒモデルは、優性モデルより低い統計的検出力を有するが、以前の
仮説に頼ることなく遺伝的関連を捕獲する。
【００５１】
必須パラメータを決定し、明確なシナリオ（考える組み合わせのマーカーの番号および用いられる遺伝モデル）を選択し、統計的検出力およびＨＦＣＣの実現可能性を評価するために種々の統計的計算を行っている。表４は、遺伝子検査の数、（分析する患者のＦ群数、「ｎ」と呼ばれる）必要な表現型群の分析を示し、分析されるゲノムの間に分布するマーカー数が１０，０００（１０Ｋ）であり、正として見なされる関連の有意性水準がα＝０．０１で決定された理論的研究について、各Ｆ群を構成する個体数Ｎに依存する必要な実験数（言い換えれば、各構成にて遺伝子型決定がされる必要がある、個体数、患者＋対照）と同じような、同時マーカーの明確な組み合わせおよび用いられる遺伝モデルにしたがってＨＦＣＣの異なる構成で観測されるランダムな正の関連の数を計算する。各群の個体を、異なる遺伝モデルおよび他の仮説を独立して用いて再分析することでき、システムを、それに応じてプログラム化することができることを強調させなければならない。明らかに、より複合的なモデル（四遺伝子、五遺伝子、六遺伝子．．．）を評価するたびに、組み合わせの数は急激に増加し、そのため、Ｆ群の数（ｎ）をまた、徐々に増加しなければならない。
【表４】
2009523285.tif 000006
【００５２】
ソフトウェアＳｔａｔｃａｌｃ（ＥｐｉＩｎｆｏ  ５．１、疾病予防管理センター、Ａｔｌａｎｔａ）を用い、ソフトウェアＥｐｉｓｈｅｅｔ（Ｒｏｔｈｍａｎ  ＫＪ，２００２）でサンプルサイズの計算を実行しうる。
【００５３】
表５は、考えられるマーカーの組み合わせのタイプの機能および用いられる遺伝モデルとしてＦ群における２種の異なるサンプルサイズを用いて、８０％以上の統計的検出力での研究における、最小効果の大きさ、すなわち、ＨＦＣＣを用いて検出される最小オッズ比（ＯＲ）を示す。これらのＯＲは、αエラー＝０．０１、Ｐ＝Ｑ＝０．５，患者：対照２：１比ならびに以下：
−優性二遺伝子モデル：曝露＝０．５６
−ｐａｎ−ｆａｃｔｏｒ二遺伝子モデル：曝露＝０．０６２５
−優性三遺伝子モデル：曝露＝０．４２
−ｐａｎ−ｆａｃｔｏｒ三遺伝子モデル：曝露＝０．０１５６２５
−優性四遺伝子モデル：曝露＝０．３１
−ｐａｎ−ｆａｃｔｏｒ四遺伝子モデル：曝露＝０．００３９０６２
−優性五遺伝子モデル：曝露＝０．２３
−ｐａｎ−ｆａｃｔｏｒ五遺伝子モデル：曝露＝０．０００９７
に示されるように、マーカーの組み合わせおよび用いられる遺伝モデルに依存する遺伝子マスターへの対照における曝露を仮定して、ソフトウェアＥｐｉｓｈｅｅｔを用いて計算されている。
【表５】
2009523285.tif 000007
【００５４】
図２Ａ〜５Ｂでは、一方で、図は明確なＯＲ値について患者の数の機能として検出力の予測の変化を証明することを示されうる。ＨＦＣＣの異なる構成に対応する検出力の計算の実測値は、表６（優性二遺伝子モデル）、７（ｐａｎ−ｆａｃｔｏｒ二遺伝子モデル）８（優性三遺伝子モデル）、９（ｐａｎ−ｆａｃｔｏｒ三遺伝子モデル）、１０（優性四遺伝子モデル、１１（ｐａｎ−ｆａｃｔｏｒ四遺伝子モデル）、１２（優性五遺伝子モデル）および１３（ｐａｎ−ｆａｃｔｏｒ五遺伝子モデル）で示される。
【００５５】
【表６】
2009523285.tif 000008
【００５６】
【表７】
2009523285.tif 000009
【００５７】
【表８】
2009523285.tif 000010
【００５８】
【表９】
2009523285.tif 000011
【００５９】
【表１０】
2009523285.tif 000012
【００６０】
【表１１】
2009523285.tif 000013
【００６１】
【表１２】
2009523285.tif 000014
【００６２】
【表１３】
2009523285.tif 000015
【００６３】
優性モデルが、各群における７５〜１５０の個体の範囲のＦにおけるサンプルサイズを用いることによって分析されうることは明らかである（表６、８、１０および１２で強調表示されるボックスを見ると、各Ｆ群における７５サンプルは、優性モデルを評価するための最適条件と思われる）。その一方、４個または複数の遺伝子座を組み合わせて用いる、ｐａｎ−ｆａｃｔｏｒモデルは、各Ｆサブグループにおけるより多数のサンプルを必要とするであろう
【００６４】
一般に、検出力の計算は、６９および１３８対照が、ＨＦＣＣ：優性モデルの仮説根拠、二遺伝子組み合わせ（２×２で得られるマーカー）、効果の最小サイズ（ＯＲ＞３）、対照：患者比＝２：１、αエラー＝０．０１および８０％の検出力で実行可能な関連を達成するのに十分であることを示す。明らかに、他の構成は、特異的適合を必要とするであろう。しかしながら、表示された計算は、７５患者を用いて、ＨＦＣＣが、四遺伝構成として考えても、古典的閾値モデル（優性）に近づきうることを示す（表５）。
【００６５】
ゲノムの完全な地図による関連研究に関し、複数の遺伝子座研究を用いる最も重大な課題の１つは、一組または三つ組のマーカーが、個々のマーカーの代わりに用いられる場合の多数の可能な組み合わせである（優性モデルの一組または三つ組の遺伝子などについて、各々、１００００！／（２！ｘ９９９８！）および１００００！／（３！ｘ９９９７！））。本発明の方法は、最初に、遺伝的関連を探索している相互の対照群（Ｃｃ１およびＣｆ１）を比較する。該比較から得られる正の結果は、非常に制限された方法：偶然、対照の選択におけるバイアス、マーカーの同定中の技術課題、またはこれらのいくつかの組み合わせのいずれかで説明されうるのみである。偶然に得られた関連に関して、プレフィックスした有意性水準（通常、１％）を用いて、分析される全１００の組み合わせの正の関連を得ることが期待されている。言い換えれば、表現型の分析において、本発明者らは、優性および二遺伝子モデル（１０，０００！／（２！ｘ９９９８！）の１％）を用いて、偶然に約５００，０００の正の関連を得ることができることを計算により示唆する。対照の選択におけるバイアスに関して、システムは、個体の選択が悪く、対照の再サンプリングの必要性を示唆する疑わしい対照群を検出しうる。該タイプの関連は、定量的に、対照対対照を比較する工程の間、偶然で期待されるもの以上に、過剰の正の関連として分析される。
【００６６】
該戦略を用いて、ＨＦＣＣは、全ゲノムの分析の結果に関する研究のノイズを測定することができ、推測的に中性として選択される小グループのマーカーを選択しない。この点において、患者および対照の統計データは、詳細に分析されうる。さらに、（他の理由が存在しうるけれども）選択されない対照におけるハーディ−ワインベルグ平衡からの偏差は、通常、研究されている多型における技術的課題を示すので、ハーディ−ワインベルグ（ＨＷＤ）平衡（Ｈａｒｄｙ  ＧＨ，１９０８；Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  Ｗ，１９０８）からの偏差は、対照のバイアス水準を決定させる基準を提供する。該パラメータを計算することによって、研究のマーカーについて分類が行われ、後で真の関連を合理化するために適用されうる。分類は、例えば、対照−対照関連研究に用いられる図によって２つの遺伝子座（δ）のハーディ−ワインベルグ平衡（Ｗｅｉｒ  Ｂ．Ｓ．ら．１９７６）に関する図を拡大させることによって定められうる。結果として、最も異常かつ（対照間で）関連するマーカーは、最初に、Ｒ０分類で現れる。対照−対照関連およびＨＷＤからの情報の該組み合わせは、対照の悪い選択および／または遺伝子型の問題による真のノイズを定めるためにＨＦＣＣ分析で用いられうる。最終的に、対照群間の比較によって提供される情報は、患者（Ｆ）と対照（Ｃｃ）の間で観測される関連を合理化し、フィルターにかけ、優先順位を付けるために用いられるツールである。
【００６７】
ＨＦＣＣの発見エンジンの設計の最も注目すべき特性の１つは、危険性、薬理遺伝学的評価（副作用および有効性）または複数の疾患の病因の異なる態様を調べるシステムの柔軟性である。該プラットフォームの検出力は、研究者が発見エンジンに導入しうる表現型の組み合わせ（Ｆ１〜Ｆｎ）に備わっている。本発明者らが後で説明するように、エンジンにおける表現型の数を前科すると、検定の特異性もまた増加する。例えば、ＨＦＣＣプラットフォームを用いて、本発明者らは、癌の出現に関する遺伝型の探索にてゲノムを調べうる。したがって、本発明者らは、３つまたは複数の明確な癌（Ｆ１〜Ｆ３、例えば、Ｆ１＝胸部の癌、Ｆ２＝胸部の癌、Ｆ３＝喉頭の癌）を選択し、非常に正確に、研究における全種の癌に共通する遺伝子組み合わせを抽出するためにＨＦＣＣサーチエンジンを適用しうる。このように、本発明者らは、ＨＦＣＣはまた、個体の全ゲノムの遺伝子フットプリントに基づく複数の疾患の階層的分類を生成するか、または同一病変を罹患しているが、異なる合併症または症状を有する個体の異なる群を調べるために用いられうることを推測しうる。本発明者らが導入している該最終概念は、多数の関連表現型の分類を大きく変化させ、効き目があるかもしれない薬剤の臨床試験中に観測される多数の共通の副作用を説明するのにも役立ちうる。したがって、多数の複合的疾患または表現型を同時に分析するシステムの可能性を理解することも容易である。
【００６８】
該システムの別の重要な特徴は、定量的手法における結果の処置にある。事実上、表現型Ｆ１〜Ｆｎ間に共有する遺伝子の組み合わせの過剰または欠如は、表現型または薬剤の副作用の間の臨床的類似性を説明するかまたは説明しない、研究されている表現型に関する遺伝的因子の重みの間接的測定としての機能を果たしうる。
【００６９】
発見エンジンに導入される生データは、最も重要な遺伝子の組み合わせを選択する一連のフィルターを系統的に適用する分析ソフトウェアによって処理される。より具体的には、プログラムには、生データに連続的に適用される４つの数学的アルゴリズムが含まれうる：
ａ．最初に、システムは、（概略モデルの）群Ｃｃ１、Ｃｃ２、Ｃｃ３、Ｃｆ１、Ｃｆ２、Ｃｆ３、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３にて観測される、２ｘ２、二遺伝子（および／または３ｘ３、三遺伝子またはｎ−遺伝子）で得られるマーカーの全組み合わせを計算する。
ｂ．二番目に、システムは、多数の統計上有意な結果またはマーカーの組み合わせ（ｐ＜０．０１）をもたらし、アーカイブＲ０に含まれる不均衡のハーディ−ワインベルグ計算によって評価される、対照群ＣｃｎおよびＣｆｎ間の２−遺伝子座、３−遺伝子座またはｎ−遺伝子座の組み合わせの研究におけるノイズ選択関連の水準を構築する。
ｃ．３番目に、システムは、結果表Ｒ１を得ているＦ１対Ｃｃ１、Ｆ２対Ｃｃ２（Ｒ２）およびＦ３対Ｃｃ３（Ｒ３）を比較する。
ｄ．４番目に、システムは、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３に共通するが、Ｒ０に現れない組み合わせの正の関連を探索し、それらを選択する。
【００７０】
興味深いことには、単なる偶然および有意水準の確立は、各比較により、理論上、１％の関連した組み合わせを同定することである。しかしながら、偶然にこれらの関連を得る可能性は、各Ｆ群の結果を各Ｃｃ群と比較し、全ての群に含まれるそれらの組み合わせのみを選択することにより指数関数的に減少させる（言い換えれば、ちょうど１／１００ｘ１／１００の組み合わせは、臨床上関連する表現型などを２個ずつ偶然に共有される）。確率論に基づき、ある者は、（二遺伝子または２−遺伝子座）を複合した２個のマーカーのモデル、および研究される１０，０００マーカーを用いて、１００００！／２！ｘ９９９８！のマーカーの可能な組み合わせ、言い換えれば、（優性モデルを仮定すると）約５０，０００，０００の可能な組み合わせが存在する。ちょうど３つのＦ群（Ｆｎ＝Ｆ１，Ｆ２およびＦ３）、およびα＝０．０１を用いて、本発明者らは、同時および偶然に３つの群によって共有される５０の組み合わせを期待しうるのみである（（１００００！／２！ｘ９９９８！）／αｎ）。したがって、該アプローチは、後でＨＦＣＣ検証エンジンにて評価させなければならない組み合わせの複雑性を大幅に減少させる。関連した特徴の結果を比較し、ノイズフィルターに適用される組み合わせの選択をさらに検証して、本発明者らは、単なる偶然で得られる組み合わせの数を減少させる（詳細については、表１を参照のこと）。
【００７１】
三遺伝子モデルをもって、システムは、適当に機能し続ける、すなわち、１０，０００マーカーおよび該モデルを用いて、本発明者らは、患者および対照の各研究で分析されなければならない１６００億の異なる組み合わせを得る。優性モデル（閾値モデル）を仮定すると、偶然に、本発明者らは、各患者対照研究において１６億の正の関連を得るであろう。にもかかわらず、６の独立した表現型群（例えば、同一タンパク質または生化学経路に作用する６種の癌または６種の薬剤）を用いて、本発明者らは、６群間でランダムに共有されるちょうど１６０の関連した三遺伝子の組み合わせを得るであろう。これらは、検証過程中に受信または拒絶されうる。したがって、該システムおよび方法は、（例えば）新規薬剤の開発の最終段階中薬理遺伝学的試験の費用を大幅に減らす、高級サンプルサイズの臨床試験（フェーズＩＩＩおよびフェーズＩＶ）を伴う薬理遺伝学的研究中に研究されなければならない遺伝子マーカーおよび組み合わせの選択に大いに用いられうる。
【００７２】
可能な遺伝子座または遺伝子座の組み合わせが選択されているとすぐに、ソフトウェアは、所望によりおよび／または科学技術を用いて、よりもっともらしい遺伝子の一組または三つ組の選択のための他の第２フィルターを適用しうる：これは、以前「分析ツール」と呼ばれていた段階である。例えば、システムは、共有多点遺伝的セグメントを探索しうる。その後、システムは、ヒトゲノムの地図におけるこれらのセグメントを特定し、表現型へのリンクを対照させるために隣接マーカーを再評価さえしうる。さらに、「生物学的フィルター」はまた、選択される各領域におけるテキストマイニングアプローチを用いて、目的の情報を同定する候補領域に近い遺伝子を抽出しうるシステムを、分析の段階中に低要されうる（選択されるＳＮＰを囲む約２００，０００塩基対（ｂｐ）の領域を徹底的に探索する必要があろうことを電流計算は示す）：
ａ．選択される組み合わせに過剰に出現する遺伝子座
ｂ．選択される遺伝子座に近接な遺伝子の全ての関連した生化学および代謝経路の抽出
ｃ．選択されるマーカーの領域における連鎖研究
ｄ．領域の遺伝子における関連研究
ｅ．領域の遺伝子座の遺伝子発現のパターン
ｆ．関与する領域の遺伝子間の遺伝子−遺伝子およびタンパク質−タンパク質相互作用の情報。
【００７３】
検証エンジンは、それ自体は技術革新ではない。むしろ、検証過程には、システムによって得られた結果を再評価するために、患者および対照の古典的戦略ならびに定量的特徴に関連する遺伝子座の研究（ＱＴＬ分析）の使用が含まれることである。選択される任意の組み合わせは、通常、選択される表現型のその関連を確認するために大勢の患者で再分析される。早期研究から独立している、多くの遺伝的関連研究の複製は、診断、薬理遺伝学的試験および／または薬剤を見出す過程に重要な生化学経路のトレースのマーカーの選択の最良のオプションである（Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ  ＪＮ，ら．２００２ａ；およびＨｉｒｓｃｈｈｏｒｎ  ＪＮ，ら．２００２ｂを参照のこと）。
【００７４】
ＨＦＣＣの一例として、ＤＮＡマイクロチップの本研究は、５２５個体に適用されうる：３群の７５患者（Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３）および３群の１５０対照（Ｃｃ１、Ｃｃ２，Ｃｃ３）およびノイズを測定するための３群の内部対照（Ｃｆ１、Ｃｆ２、Ｃｆ３）。全ての対照は抽出され、正常な集団から得られる群からランダムに選択される（通常、対応するＦ群が７５の大きさを有する場合、３００健康個体、ならびに対応するＦ群が１５０の大きさを有する場合、５００個体）。患者（Ｆ）は、例えば、３種の異なる疾患と診断されるが、それらの全ての臨床プロファイルが、重大な特徴をそれらの間で共有する事実によって特徴付けられる個体から得られる（これらの共有特徴が、全ての患者のプロファイルにて共通遺伝的塩基を有すると仮定する）。例えば、メタボリック・シンドローム、ＰＣＯＳ、および高血圧／心臓病と診断された患者が選択される。これらの全ては、通常、糖尿病要因を共有している高血圧、インスリン抵抗性を発症する傾向にある。多数の他の研究は設計されうる。例えば、対照の群は、副作用の発症が記録されていなかった、特定疾患の薬剤または薬剤群で投薬されている個体からなりうる。一方、３つの試験群（Ｆ）は、同一薬剤を投与しているが、アレルギー性皮疹（Ｆ１）、呼吸刺激（Ｆ２）または腸炎（Ｆ３）、医原性および炎症性疾患に適合する表現型を共有しているこれらの全てを経験している個体でありうる。３種の副作用を説明する遺伝的関連が存在するならば、ＨＦＣＣは、それを見出すと期待されうる。他の興味深い例は、個体のサブグループにおいて同一生化学経路を有し（または３つの同一治療標的を有する）、同一副作用（例えば、頭痛）を引き起こすが３つの異なる薬剤にＨＦＣＣを適用することであろう。該モデルにおいて、本発明者らは、対照（Ｃｃ１〜Ｃｃ３）治療１、２、３を有するが、登録された副作用を有しない患者として用い、研究されている各薬剤について登録された頭痛を有する患者群Ｆ１〜Ｆ３において、Ｃｃ１〜Ｃｃ３に存在しないＦ１〜Ｆ３における共通因子を探しうる。この場合における対照群の別法として、バイアス因子に影響を受けやすい個体より一般的集団における遺伝子の組み合わせを観測する方がよいので、本発明者らは、治療される患者の代わりに一般的集団から個体を使用しうる。
【００７５】
本技術の別の具体例は、癌の研究に対するその適用であろう。この場合において、もたらされる課題は、全種の癌にて共通の遺伝的要因が存在するかということである。したがって、ノイズフィルターとして前記されるように、対照Ｃｃ１、Ｃｃ２およびＣｃ３、ならびにＣｆ１、Ｃｆ２およびＣｆ３それぞれの比較を再使用し、一連の異なる種の癌を表現型群に含むことは可能であろう。例えば、Ｆ１：胸部の癌、Ｆ２：結腸の癌；Ｆ３：肺の癌、Ｆ４：咽頭の癌（など〜Ｆｎ）。目的は、Ｆ１〜Ｆｎに共通し、Ｒ０と異なるものを同定することであろう（対照サブグループ間の無作為化および関連研究によって検出される全てのノイズまたは偽の関連を含む）。
【００７６】
遺伝分析は、確立した技術、例えば、５２５の各個体のＤＮＡに対する１０，０００点集合を有するマイクロチップを用いて実施されうる。配列の各要素は、これらの特性を有するＳＮＰをコードする異なる一定のオリゴヌクレオチドを含有しうる：
１．合理的に高頻度でヒト集団に存在する（対立遺伝子ｐ＞０．２）
２．これらの全ては、ゲノムを有する明確な位置で特定される。
【００７７】
例えば、全３００キロベースを生じ、集団の約４０または５０％個体の集団の頻度を有しうる各染色体の４００オリゴヌクレオチドを選択することが可能であろう。個体のＤＮＡは、全配列にわたって分布され、ハイブリダイゼーションのパターンは、各個体について決定されうる。一見、起ころうとしていることは、評価における個体の１つのＤＮＡセグメントが、各ＳＮＰに対し各特異的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズするであろうことである。これらの研究を実施、ＨＦＣＣを実施するための生データを生成する試薬および装置は、商業上入手可能である。例えば、イルミナ社またはアフィメトリクス社（または将来開発される他の技術）から入手可能な、全ゲノムをスキャンする商業用チップ。
【００７８】
レコードは、各個体のデータの登録に備えている（本発明者らは、典型的には、Ｉ．Ｔ．記録支援ツールを用いるであろう）。これらのレコードは、例えば、研究を行う各個体（患者  ｙ  対照）について、
−個体の同定情報（同定コード）
−個体の症状および表現型特性を有する１個または複数の細胞
−考えられる各ＳＮＰ（用いられるマイクロアレイがアフィメトリクス  １０Ｋであるならば、１０，０００）について、該個体において考えられている多型の存在または非存在を示している、記号「＋」もしくは「−」または「ａａ、ａｂ、ｂｂ」または他のコードを有する細胞
−優性二遺伝子モデルの場合において、１０，０００！／（２！ｘ９．９９８！）のＳＮＰの二遺伝子組み合わせ、および／または優性三遺伝子モデルの場合における１０，０００！／（３！ｘ９９９７！）の組み合わせ、などを含む。
【００７９】
これは、２２５個体（いくつかの対照の個体は１以上のサブグループに現れうることが可能であるけれども、７５患者および１５０個体対照）を有する各サブグループである、３セットの患者および対照のサブグループに相当する、６７５列をもたらすであろう。各６７５列は、データの少なくとも１．６６ｘ１０１１項目（研究の表現型（Ｆ）を同定するそれらの１つ）を含むであろう。この種の無限マトリクスは、真実の計算チャレンジを表す。しかしながら、仮説関連の発見は、種々の戦略によって単純化されうる。例えば、独立マトリクスの複数群は、各研究にて実行される明確なＳＮＰの各一組および明確なアルゴリズムについて生成されうる（研究ついて１０億回の計算）。従来のＰＣは、毎秒７億回のこれらの計算を実行しうる。この点において、計算条件は、各組み合わせ（２：二遺伝子、３：三遺伝子、４：四遺伝子、５：五遺伝子）にて考えられるＳＮＰの全数にしたがって予測され、、表１１に示される。
【表１４】
2009523285.tif 000016
【００８０】
三つ組の遺伝子またはより多くのマーカーの組み合わせについて、計算の容量はまた、指数関数的に増加する。事実上、各群ならびに各対照群における三遺伝子を有する１．６６ｘ１０１１変数を、２つのモデルのみを用いて分析すると、各研究にて２．３９ｘ１０１３計算を実施する必要がある。この場合において、コンピュータのグループ化、例えば、２５クラスタＰＣは、適当な時間で作業を終了するために必要であろう；しかしながら、分析は、従来の計算を用いてさらに可能になるであろう。計算作業量は、五遺伝子モデルについて予測されているが、この場合において、（テラフロップス、１テラフロップス＝１１  Ｓｐａｎｉｓｈ  ｂｉｌｌｉｏｎ（１．０００  ａｍｅｒｉｃａｎ  ｂｉｌｌｉｏｎｓ）１秒当たりの浮動小数点演算命令実行回数）の範囲で作業する装置を備える超計算は、計算の効率的対応を必要とすることは明らかである。
【００８１】
コンピュータ研究の目的は、一緒に研究されている表現型に正式に付随する２個（または３個など）のＳＮＰを得ることである。該研究は、全ての群における各遺伝子の組み合わせの系統的チェックおよび全群に共通するものの選択からなる。したがって、ＨＦＣＣは、研究されている３個（または複数）の表現型に共通して付随し、さらに、対照群で少し表される遺伝子座を選択する。結果として、患者に存在する各組み合わせについて、システムは、患者と対照の間の統計的差異を分析し、それらを対照−対照研究の結果と比較するであろう。高度な例において、分析は、所定の遺伝子の組み合わせが、全ての患者に存在し、対照に存在しないであろう結論をもたらしうる。次いで、該組み合わせ（またはおそらくより多くの本マーカーに近接（２００，０００ｐｂ未満）の遺伝的変異）が表現型に付随することを本発明者らは、まさに確信することができた。言い換えれば、表現型になりやすい個体の危険性に影響を与えることである。該情報をもって、ヒトゲノムの地図を調べることでき、選択されるＳＮＰの近接に位置し、その機能に近い機能を有することが知られている遺伝子を調べた。該スクリーニングは、（仮説に基づく場合に）新規分子分析をもたらし、最終的に、異なる治療標的を選択しうる経路の解明をもたらし、組換えタンパク質を用いて治療を示唆し、あるいは、少なくとも研究されている表現型の原因論のより良い理解をもたらすことができた。該情報は、所定の表現型、所定の予後に罹患している可能性または薬剤を消費し、個体における効率が低下する間の副作用の出現を予測する診断試験の開発のデータを生成することができた。これは、遺伝子分析、あるいは特定の流体または患者の組織におけるタンパク質濃度に基づく試験、患者のタンパク質が変化されるどうかまたはそれ自体を単離した特定の遺伝的決定基の結果でありうる他の測定可能な特性を決定する試験によって行うことができた。
【００８２】
もちろん、この極端な仮説例は、ほとんど起こらない。これらの試験の事実は、一連の見掛け上の関連であろうし、その多数は、偶然によるものであり、ほんの少しだけ真実であろう。コンピュータプログラムによる従来のデータ分析は、マトリクスの細胞の比較分析によって関連を単離し、次いで、その関連が明確に真実であるかどうかを決定しようと試みる。通常、「真実」の関連を得ることができるために多数の患者を必要とする。しかしながら、多数の患者および対照を用いてさえ、観測されることがランダムではなく、研究されている表現型に関するという有限の可能性は常にある。これは、（ショットガンからペレットのカートリッジを撃つことにより得られる部位の無作為同定のような）ランダムのスクリーニングおよびゲノムの未知の部位を用い、こうして、関連を捕獲しようとする、本発明者らが、系統的ゲノムアプローチ（ショットガン分析）と呼ぶものである。
【００８３】
関連研究において、５２５サンプルは、実行可能な分析を実施するには不十分である。しかしながら、ＨＦＣＣシステムおよびその技術特性は、この低数のサンプルを用いてさえ実行可能な関連を同定する。これは、システムが、対照群間に関連した組み合わせの比率（偶然によるものの全て、対照の悪い選択または技術問題）を計算するので可能である。該情報を用いて、システムは、エラー型１（例えば、対照関連研究に対して対照に見られるｐの低値）を特定するだけではなく、対照の悪い選択によって研究に導入される可能な紛らわしい要因の詳細な分析から生じるデータとの各正の関連と見なすかまたは特定しうる。さらに、システムはまた、Ｃｃｎに対するＦｎ群の比較が実施される研究における標識化またはその除外について、Ｃｃ１〜Ｃｃ３対Ｃｆ１〜Ｃｆ３の比較からの正の結果を比較するであろう。
【００８４】
したがって、ＨＦＣＣは、少なくとも、組込型で表される３つの態様における遺伝子同定法とは異なる：１）システムは、はるかに少ない数のサンプルと有意な結果を生成する新データフィルターを用いる。２）システムは、好ましくは、明らかな診断を有する患者の明らかな群に由来しているサンプルの分析に用いる。３）システムは、好ましくは、多遺伝子関連を探索する。全体として見ると、これらの特性は、本質的に、所定の表現型の（もし存在するならば）遺伝子塩基のチェックの非常に最適化された方法を定義し、表現型または疾患の遺伝子塩基が存在スルかどうかを決定するかまたは薬剤の有効性または毒性を分析するために用いられうる。対照群および異なる表現型を有する個体の群の大きさを決める過程中に選択される関連は、非常に確実性が高いか（または本発明者らは）研究されている表現型に関与する（と仮定しうる）。
【実施例】
【００８５】
ＨＦＣＣ技術のアプリケーションを証明するために、そのアプリケーションの実例は以下に含まれる。これらの実施例の理解を補助するために、本発明者らは、複合的表現型の遺伝子マーカーの選択のためのツールとしてＨＦＣＣの適用を検証するために開発されたコンピュータプログラムの簡単な説明を得ることによって開始し、実データおよびこれらの結果で実施される３つの実施例を以下に記載する。
【００８６】
ＨＦＣＣソフトウェア
図１に要約される技術は、「ＨＦＣＣ」プログラムと呼ばれているコンピュータプログラムで開発され、実施されている。該コンピュータプログラムは、ＨＦＣＣ発見エンジンの全ての多数の分析および評価過程を（系統的および自動的手法にて）組み込む。さらに、プログラムは、ＨＦＣＣ実験の実行およびＨＦＣＣ検証エンジンの実行を促進する追加の有用性が提供されている。その３つのツールに分類すると、プログラムによって実行される手段の説明はより良く理解される：
【００８７】
ツール１：マトリクス生成。
該有用性をもって、遺伝子型ツールから得られるデータは作成され、独立したテキスト形式ファイル（．ｔｘｔ）として生成される、マトリクスに変換される。これらのマトリクスは、患者（Ｆファイル）、対照（Ｃｃファイル）および、用いられると、Ｃｃ対照との比較に用いられるであろう（Ｃｆファイル）対照の全ての遺伝子型結果を含有する。したがって、各研究について、考えられるであろうＦ群の数と同数のＦマトリクス、用いられるであろうＣｃ群の数と同数のＣｃマトリクスおよび、必要であれば、用いられるであろうＣｆ群の数と同数のＣｆマトリクスが生成されなければならない。ＨＦＣＣソフトウェアの生データまたは原始データの各マトリクスは、群の個体数と同数の列および研究のマーカー数と同数の行を有する。マトリクスの各位置において、本発明者らは、値：０，１，２，３を見出す。その位置（列番号および行番号）から、本発明者らは、各個体の各遺伝子型結果を示しうる。表１、２および３を導入する場合に注釈される同一命名法および同一当量を用いて、これらの値の有意は、以下となるであろう：
ａ．値０は、帰無、すなわち、考えられる個体におけるマーカーに利用可能な遺伝子型データが存在しない患者に相当する；
ｂ．値１は、野生型遺伝子型または「ＡＡ」に相当する、すなわち、分析される特性が、ＳＮＰ型多型であるならば、値１は、個体が、対応する位置にて、両染色体を含み、該位置に現れうる２つの可能なヌクレオチドの最も高い頻度で生成するヌクレオチドは、多型の野生型変種として見なされることを示すであろう；
ｃ．値２は、異型遺伝子型または「ＡＢ」に相当する、すなわち、個体は、一の染色体において、野生型（「Ａ」）対立遺伝子と考えられる、多型の最も共通形態で存在し、一組の他の染色体において、考えられている２つの可能なものの低い頻度のヌクレオチドが、変種対立遺伝子の、対応する位置（「Ｂ」）に現れる；
ｄ．値３は、同型変種遺伝子型または「ＢＢ」に相当する。
【００８８】
ツール２：計算モジュールまたはＺ検定（発見エンジンの実施）．
−定義：これは、ＨＦＣＣソフトウェアのコアアルゴリズムであり、ＨＦＣＣ発明の原報で考えられるように多座分析を行うことを可能にする。言い換えれば、システムは、遺伝子型方法を通じて得られる作成された生遺伝子型データを使用し、ツール１によってテキスト形式マトリクスに変換した。これらのファイルを用いて、モジュールは、二遺伝子、三遺伝子など、研究で用いられる患者および対照の全群の全てのマーカーの組み合わせから生じる可能な相互作用的変数１つ１つの評価を行う。現在では、ＨＦＣＣソフトウェアは、ｐａｎ−ｆａｃｔｏｒｉａｌモデルを実施するために開発され、前述したように、各変数の各階層は、分析について選択されている効果が最小規模に達する階層で、残りと比較される独立変数と考えられる。したがって、システムは、各階層の正および負の個体数を同定し、各階層の帰無を計算する。各変数のマトリクスの集計の４つの得られた値（ａ、ｂ、ｃ、およびｄ、ここで、ａ＝研究における階層の正の患者数、ｂ＝階層の正の対照数、ｃ＝階層の負の患者数、ｄ＝階層の負の対照数）によれば、システムは、ワルド検定（Ｚ＝ｌｎ（ＯＲ）／ＳＥ（ｌｎ（ＯＲ））（式中：ＯＲはオッズ比である（ＯＲ＝ａｄ／ｂｃ））を適用する。ＳＥは、標準誤差（ＳＥ（ｌｎＯＲ）＝（１／ａ＋１／ｂ＋１／ｃ＋１／ｄ）の平方根である。ワルド検定は、実施例の手法で用いられるが、システムは、他のアルゴリズムに適合でき、優性モデルまたはプログラムのユーザーのために特別に設計された他のものを用いて計算モジュールを利用させるもの間の利用性を計算する。
【００８９】
−計算モジュールアプリケーションのパラメータ化：それを適当に使用させるために、計算モジュールは、オプションまたはパラメータの以下のメニューを有し、ＨＦＣＣ実験を開発および最適化させ、計算モジュールを適用するためにシステムに入力させなければならない：
ａ．各比較群（Ｆ）の患者の最大数の入力。
（システムは、群当たり１−１０００患者の範囲を受信する）
ｂ．各Ｃｃ比較群の対照の最大数の入力。
（システムは、群当たり１−１０００患者の範囲を受信する）
ｃ．各Ｃｆ比較群に含まれる対照の最大数の入力。
（システムは、群当たり１−１０００の範囲を受信する）
ｄ．比較群の数の入力。
（システムは、１０までのＦ群、１０のＣｃ群および１０の独立Ｃｆ群を同時に分析する）
ｅ．研究の遺伝子マーカーの数の入力。
（システムは、シミュレートされており、２〜５００，０００の独立マーカーを受信する）
ｆ．正の組み合わせの選択のための統計閾値の入力は、階層を選択するために、Ｚ−検定またはＷａｌｄ検定の平方に等しい統計値であり、正の結果を定義するために用いられる。
（下記の実施例１において、正常値は、ｐ＝０．０１に相当するＺ２＞６．６５が用いられている。にもかかわらず、システムは、正の数値の範囲および０を受信する。選択されるＺ２の値が良ければ良いほど、研究は一層制限される）。
ｇ．ａ、ｂ、ｃ、およびｄの帰無値の相関因子の入力
（通常、０．３３。各研究群の最大試料サイズから各計算にて引き算しなければならないので、帰無値を導入することは重要である。）
ｈ．Ｆ、ＣｃおよびＣｆファイルの局在化経路の入力
ｉ．ノイズフィルター適用の入力：システムは、適用されるかどうか、ノイズフィルターの選択を可能にし、適用されるならば、Ｃｃ群とＣｆ群の比較をもたらすであろう。
（ＹｅｓまたはＮｏ：Ｙ／Ｎ）
ｊ．選択される多遺伝子座モジュールまたは組み合わせの入力：
ｉ．一遺伝子
ｉｉ．二遺伝子
ｉｉｉ．三遺伝子
ｉｖ．四遺伝子
ｖ．五遺伝子
ｋ．入力：中間データの表示（ｙ／ｎ）。「Ｙｅｓ」（Ｙ）を示すと、システムは、各階層の結果および分析される変数：観測数、帰無数、オッズ比、Ｚ、Ｚ２を記録する。
分析タイプの入力
ｖｉ. ハード：選択される階層は、Ｆ対Ｃｃの各比較において正でなければならず、ノイズフィルターを適用するためのオプションが選択されるならば、階層は、Ｃｃ対Ｃｆの比較において正であるべきではない。
ｖｉｉ．ファジー理論: 階層の少なくとも１つは全てのＦ対Ｃｃ比較において正である、変数（すなわち、マーカーの組み合わせ）を選択し、ノイズフィルターを適用するためのオプションが選択されているならば、該組み合わせまたは変数（該変数の全階層）はＣｃ対Ｃｆ比較において正でないであろう。
ｌ．適用される統計モデルの入力
ｖｉｉｉ．包括的。該モデルは、相互変数をコンパイルするために研究の全マーカーを選択し、選択される組み合わせモデル（二遺伝子、三遺伝子．．．）に記載のこれらのマーカー間に存在しうる組み合わせが全て可能になるであろう。
ｉｘ．条件。システムは、限界効果を有するマーカー（一遺伝子研究の既定の閾値以下の統計的有意性を有するいくつかのその階層を有するそれらのマーカー）のみ選択し、残りの変数とそれらを比較する。
ｘ．同時。これは、相互変数の構成についての限界効果を有するマーカーを使用するのみである。
【００９０】
−計算モジュールの出力レコード：全てのパラメータ入力に基づき、計算モジュールは、階層（ＨＡＲＤ）または変数（ファジー理論）が研究について正であると同定する。計算モジュールにてプログラム化された方法の結果は、システムが入力ファイルに書き込む、過程中に選択される相互作用的変数の一覧からなる。さらに、本発明者らは、「ノイズフィルター」オプションを適用するならば、システムは、対照対対照検定（Ｃｃ対Ｃｆ）にて正である変数を特定する。出力ファイルは、研究が正であると証明しているマーカーの組み合わせの一覧を提供する、テキスト形式ファイル（．ｔｘｔ）である。ＨＡＲＤ分析の場合において、正の階層のみが出現する（例えば、マーカー２３および１７８の組み合わせに相当する、２３  ２  １７８  １、最初は、異型またはＡＢであり、二番目は、野生型またはＡＡである）。ファジー理論分析の場合において、システムは、出力レコードに対する研究変数の全ての可能な階層を保存する。
【００９１】
３．ツール３：ｐｏｓｔ−ｈｏｃ（「帰納的」）分析．
計算モジュールの計算の能力および速度を改善するために、システムは、任意の患者にて中間データをプリントしないバージョンに処理する。したがって、モジュールは、負または正の階層の結果のいずれかを保存しないが、最初の入力パラメータにしたがって正の階層または変数のファイルのみ作成する。ｐｏｓｔ−ｈｏｃ分析は、全ての値または正の変数の結果を示すために用いられる。この場合において、システムは、排他的分析変数として保存した正の結果を使用し、これらにおける研究の各群の対応する計算を全て行う：言い換えれば、データ形式は、プリントされている全ての群にて得られたものに対応する全ての階層のデータを有する、正の変数のみに相当する。このプリントされたデータは、得られた結果の追加のフィルターを構築するかまたはこれらに関する結論を出すために、研究者が正の変数として得られる値の詳細な研究を行い、補助的基準にしたがってそれらを分析することを可能にする。ｐｏｓｔ−ｈｏｃ分析のプリントアウトにて得られた結果の一例は、実施例１で見られる、以下の表１５で観測されうる。
ツール３がまた、図１に記載の検証エンジンで提案され、報告を通して言及される検証試験の基準ツールとして用いられうることも注目に値する。
【００９２】
３つの実施例は以下に含まれ、ＨＦＣＣソフトウェアは、本物の遺伝子型データに適用される。
【００９３】
−実施例１：排卵刺激（ＣＯＳ）の薬理遺伝学的試験に対するＨＦＣＣの小規模利用．
１．１研究目標：
本発明者らの会社は、（Ｄｅ  Ｃａｓｔｒｏら，２００５ａにて再検討される）生殖補助医療を受ける女性の卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の反応に関連する遺伝的因子の同定の広い経験がある。これらの研究は、組換えＦＳＨ（ｒＦＳＨ）が薬理学的に投与される場合に、遺伝子マーカーが、治療に対する正常反応、低い有効性または病理学的過剰反応を決定するものを同定することを目指す。研究の目標は、該治療に対して（これが高反応または低反応であるかどうかにかかわらず）悪い反応に共通しうる多座遺伝型が存在するかどうかを見出すことである。ＨＦＣＣ法は、該課題に答えうるために用いられた。その見解は、両表現型に最も関与しそうである遺伝子および将来開発が集中するであろう遺伝子を優先するかまたは選択することである。
【００９４】
１．２．研究表現型の説明：
該研究を実施するために、一連の患者および対照は、発明者グループの研究室にて利用可能なデータが存在するものおよび国際科学雑誌（Ｄｅ  Ｃａｓｔｒｏら，２００３；２００４；２００５ａ；２００５ｂ；Ｍｏｒｏｎら，２００６）にてすでに広く提供されていたものが用いられている。
ａ．Ｆ群：２つのＦ群は、「極端」と見なされる表現型で用いられ、発明者グループによって既刊の試験対象患者基準（Ｍｏｒｏｎ，２００６）にしたがって、ＦＳＨホルモンに対する反応について拮抗された。両表現型が、両表現型に同時に関与されうるいくつか共通遺伝子または遺伝子の組み合わせを有するかどうかをチェックすることがその考えである。
ｉ．Ｆ１：共通してＦＳＨに対して低い反応性を有する３５の女性から選択されるマーカー群の遺伝子型結果を含む。これらの女性の選択基準は、公開されている（Ｄｅ  Ｃａｓｔｒｏら，２００３）：それらは、ホルモン治療の最後に行われる腹腔鏡検査中３未満の卵胞を得ると見なされている低い反応性を有する、組換えＦＳＨを用いて生殖補助治療を受けた女性に適用される。卵巣機能不全を有すると診断された女性を除外する。
ｉｉ．Ｆ２：共通してＦＳＨに対して高い反応性を有する３５の女性から選択されるマーカー群の遺伝子型結果を含む。これらの女性の選択基準は公開されている（Ｍｏｒｏｎら，２００６）：ホルモン治療の最後に行われる腹腔鏡検査中１１以上の卵胞として高い反応性を考慮すると、それらは、組換えＦＳＨを用いて生殖補助治療を受けた女性に適用される。卵巣機能不全を有すると診断された女性を除外する。
ｂ．Ｃｃ群：２つの対照群は、ＦＳＨに対する正常な反応を有する女性が用いられた。各群の大きさは、２７５個体である。
ｃ．Ｃｆ群：２つのランダム対照群は、ＦＳＨに対する正常な反応を有する７５女性から用いられた。これは、発明者グループの実験室で利用可能なホルモンに対する正常は反応を有する女性からの無作為抽出である。
【００９５】
１．３．研究における患者および対照の得られた遺伝子型．
遺伝子型決定を行うために、従来のＤＮＡ解読法は、前述の科学研究の本発明者らのグループによって前述されているものを用いられた（ピロシーケンスおよび／またはリアルタイムＰＣＲ）。合計１０のＳＮＰ（単一ヌクレオチド多型）型マーカーは、選択され、７個の異なる遺伝子：ＦＭＲ１（２つのマーカーＡＴＬ１およびＡＴＬ２）、ＧＮＡＳ１、ＣＹＰ１９、ＦＳＨ−受容体、ＥＳＲ１、ＥＳＲ２、ＮＲＩＰ１およびＢＭＰ１５（２つのマーカーｂｍｐ１５−１およびｂｍｐ１５−２）に分布された。特に、利用されるマーカーは、以下の表１５に示されるものであった：
【００９６】
【表１５】
2009523285.tif 000017
【００９７】
これにしたがって、患者の各遺伝子型マーカーに相当する、全てのマトリクスにて１０列存在する、一方、縦列数は、各群に含まれる個体数（それぞれ、Ｆ１について３３縦列、Ｆ２について３５縦列、Ｃｃ１およびＣｃ２について２７５ならびにＣｆ１およびＣｆ２について７５縦列）に相当するであろう。結果として、各位置において、マーカーの計算される値（０、１、２、または３）は、マーカーの横列を個体の対応する縦列とリンクすることにより見出される。各群について、研究で用いられるマトリクスは、以下に示されるものであった；群Ｃｃ１およびＣｃ２の場合において、４列の各群が、マトリクスのファイルの単列を示し、全横列が、同一マーカーに相当しうることを理解しなければならない：
【００９８】
2009523285.tif 000018
【００９９】
2009523285.tif 000019
【０１００】
2009523285.tif 000020
【０１０１】
2009523285.tif 000021
【０１０２】
2009523285.tif 000022
【０１０３】
2009523285.tif 000023
【０１０４】
１．４．研究に適用される計算モジュールパラメータ．
ＨＦＣＣソフトウェアは、計算モジュールの種々のパラメータで入力された入力値、すなわち
・Ｆ＝３５での患者の最大数の入力
・Ｃｃ＝２７５での対照の最大数の入力
・Ｃｆ＝７５での対照の最大数の入力
・比較グループ数の入力＝２
・研究における遺伝子マーカー数の入力＝１０
・選択のための統計的閾値の入力：Ｚ２＞６．６５
・帰無値の相関因子の入力＝０．３３
・Ｆ、Ｃｃ、Ｃｆのロケーションパスの入力およびファイルの出力
・／ｈｏｍｅ／ａｒｕｉｚ／ｈｆｃｃ／ｐｒｕｅｂａｓ  ｐｈａｓｅ  ３／
・ノイズフィルター適用の入力＝Ｙｅｓ
・選択される多座モデルの入力＝二遺伝子
・中間データのプリンティング（ｙ／ｎ）の入力＝Ｙｅｓ
・分析型の入力＝ファジー理論（それらは、変数を共有するが、階層を共有しないであろうと期待されるため、グループは明確な表現型を含むという理由で選択される）
・適用される統計モデルの入力＝Ｅｘｈａｕｓｔｉｖｅ
にしたがってこれらの入力マトリクスに提供される。
【０１０５】
１．５．得られた特異的結果．
ａ．相互作用的変数および計算数の計算を行った。これらの研究パラメータを用いて、ＨＦＣＣソフトウェアは、２ｘ２で得られる１０の要素（４５変数）および４０５階層（二遺伝子モデルで処理する場合、９階層／変数）の複合分析を行わなければならない。各階層から、４つの比較を行わなければならず（Ｆ１対Ｃｃ１：Ｇ１、Ｆ２対Ｃｃ２：Ｇ２、Ｃｃ１対Ｃｆ１：ＦＲ  Ｇ１、およびＣｃ２対Ｃｆ２：ＦＲ  Ｇ２）、該研究における合計１６２０のワルド検定で行われている計算をもたらす。
ｂ．結果。システムは、ＥＳＲ２およびＢＭＰ１５−２内のマーカーの複合分析に相当する、両グループ（変数７＿９）の４０５の可能な組み合わせの正の組み合わせのみ選択した。該結果をランダムに得る可能性は、ｐ＝０．００８１である。ファジー理論分析を受けると、結果のアーカイブは、該変数の全ての階層を含んだ：
7 1 9 1
7 1 9 2
7 1 9 3
7 2 9 1
7 2 9 2
7 2 9 3
7 3 9 1
7 3 9 2
7 3 9 3
【０１０６】
ｐｏｓｔ−ｈｏｃ分析の適用は、以下の表１６に示される結果を生成した：
【表１６】
2009523285.tif 000024
【０１０７】
得られた正の階層が、表１６のボックスに示されるもの、すなわち：
Ｆ１について7 1 9 3（ＯＲ＝８．９７８９、Ｚ２＝７．５５）
Ｆ２について7 2 9 3（ＯＲ＝８．５９６５、Ｚ２＝９．３０）
であることを、手動でマトリクスを数え、従来の統計的技法（ＳＰＳＳ）ならびにＨＦＣＣソフトウェアｐｏｓｔ−ｈｏｃ分析を用いることにより証明した。
【０１０８】
結論を出すために、ＨＦＣＣシステムは、２つの極端な表現型の単一二遺伝子の遺伝子の組み合わせを明らかにする。該組み合わせは、その分析される７遺伝子がＦＳＨに対する反応に最も関与しそうであることを示す。表１６に示されるように、ノイズフィルターを含む計算モジュールの適用中拒絶されないもののみであるため、対照群（ＦＲ  Ｇ１およびＦＲ  Ｇ２）の研究は、Ｚ２＞６．６５の統計的有意性の閾値を超えることはない。
【０１０９】
１．６．得られた肯定性の評価．
該研究中ＨＦＣＣソフトウェアを用いて得られた結果は、以前の操作で得られた本発明者らの結果と完全に適合する（Ｍｏｒｏｎ，２００６）。遺伝子ＢＭＰ１５およびＥＳＲ２の相互作用は完全に新規であるけれども、（２つの間の強力な相互作用および両極端な表現型の役割は知られていなかったけれども、ＥＳＲ２は低反応にのみ関連したので（表現型１、Ｆ１）、ｄｅ  Ｃａｓｔｒｏ，２００４を参照のこと）両方とも以前の操作で発明者らのグループによって同定されており、ＢＭＰ１５は、独立して、ＦＳＨに対する過剰反応のみに付随していた（Ｆ２）、（Ｍｏｒｏｎ  ２００６）。
【０１１０】
具体的には、特許請求はすでに、遺伝子ＢＭＰ１５の薬理遺伝学的適用の保護のために存在しており、卵巣機能の役割は、独立した国際公開によって支持される（Ｍｏｒｏｎ  ２００６で再検討）。
さらに、ヒトの卵巣機能における役割の拡大は、最近の研究および発明者自身のグループによって支持されている（Ｄｉｘｉｔら，２００６；Ｄｉ  Ｐａｓｃｕａｌｅら，２００６；  Ｌａｉｓｓｕｅら，２００６；Ｍｏｒｏｎら，未だ公開されていない）。
【０１１１】
従来の統計的手法を用いて、本発明者らは、選択される２つのマーカー間の統計的エピスタシス（遺伝子相互作用）の存在を検出する（ｐ＜０．０１）。さらに、エストロゲンによるＢＭＰファミリーの遺伝子の機能調節は、文献に記録され、ＢＭＰ１５のプロモーターのＤＮＡ配列の領域は、エストロゲン受容体に結合することが同定されている（Ｍｏｒｏｎ  ２００６および非公開データ）。
【０１１２】
このことは、該実験で得られた結果の生物学的妥当性を全て強め、大規模薬理遺伝学的試験の強力候補としてこれらの遺伝子を分類し、同時に研究される残りのマーカーの前方にその優先順位を示す。
【０１１３】
−実施例２：大規模ゲノムスケールにおけるパーキンソン病の遺伝的関連研究における遺伝子マーカーの優先順位付けのためのＨＦＣＣ技術の使用
２．１．研究目標：
本実験室で生成された内部データ上のプログラムの信頼性を証明していたので、公にアクセス可能な大容量遺伝子型データを用いて、発明であるマーカーの選択システムのロバスト性および能力を証明することが決定された。この目的を達成するために、大きな社会的影響を有する共有疾患の一連の患者および対照における全ゲノムの遺伝子型決定の生データのダウンロードを行うために一連の国際的なイニシアチブの存在を利用した。特に、アメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）傘下の国立老化研究所は、パーキンソン病の進行中のイニシアチブを有し、全ゲノム遺伝子型決定の生データは、パーキンソン病の患者および対照両方に分布されている（Ｆｕｎｇら，２００６；ｈｔｔｐ：／／ｑｕｅｕｅ．ｃｏｒｉｅｌｌ．ｏｒｇを介してアクセス可能な生データ）。該研究を実施するために、２７０の患者および２７０の健康な対照をダウンロードし、これらの患者および対照に対するヒト第１染色体に相当する３１，５３２のマーカー（合計１６，９３２，６８４遺伝子型）を選択した。該情報を考慮して、概念試験は、大容量実データを用いてＨＦＣＣシステムで実施された。
【０１１４】
２．２．研究表現型の説明：
パーキンソン病は、かなり共通した慢性神経変性過程である（６５歳以上の個体における発症率１：１０００）。さらに、その世界的発症率は、大部分については、西洋人口の進行性老化により増加傾向にある。疾患の遺伝的塩基は、十分に解明されていない。寄与する遺伝的因子の存在は、疾患によって影響を及ぼされる患者の家族および一般的集団の疾患の発症率を比較する疫学リスク研究に基づいて疑われる。さらに、単一遺伝子型は、ＯＭＩＭ（Ｏｎｌｉｎｅ  Ｍｅｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ＯＭＩＭにて利用可能、Ｒｅｆ．１６８６００）というヒト遺伝子および遺伝子変化のデータベースで修正される、該病状の出現に関連する遺伝性因子の存在を支持することを記載されている。しかしながら、大多数の患者の該疾患が、複合的かつ多因子性病因を有するであろうと疑われている（Ｆａｒｒｅｒ，２００６）。疾患は、ブラックサブスタンスのドーパミン作動性ニューロンの特性欠損、および基底神経節の変性（脳によって制御される動作の開始および制御に関するニューロン中心）に関連する進行性神経機能の低下によって発症する。疾患の主要な臨床的特徴は、手足の震え、動作緩慢、筋硬直および不安定な姿勢によって特徴付けられる個体の動きの変化として明らかである、パーキンソニズムである。
【０１１５】
該研究を行うために、ＮＩＨアーカイブで公開されている一連の公開されている患者および対照が用いられ、（Ｆｕｎｇら，２００６を参照し、この一連の患者および対照の詳細を分析する）神経学の国際的な専門家の集団によってすでに広く認められている。
ａ．Ｆ群：９０の個体を有し、全ての異なる３つのＦ群を用いた（Ｆ１、Ｆ２およびＦ３）。先の実施例と対照的に、これらの表現型群は、パーキンソン病によって影響を及ぼされる階層：個体に関して「臨床上同一」と考えられる。３つの同種の群が共有する遺伝子の組み合わせが存在するかどうかひいては病変に完全に付随するであろうかどうかをチェックすることがその考えである。その結果として、結果は、予想どおりに、全種で完全に一致しうるので、それらは、疾患に関連している高い可能性を有しうる。
ｂ．Ｃｃ群：同様に、９０の独立した対照の３つの群は、ＮＩＨで定義されるような疾患の兆候がないものを用いた（詳細については、Ｆｕｎｇら，２００６を参照のこと）。
ｃ．Ｃｆ群：Ｃｏｒｉｅｌｌデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｑｕｅｕｅ．ｃｏｒｉｅｌｌ．ｏｒｇ）がＣｃ群を形成するために用いられるものとは異なる個体を有するＣｆ群を形成するための十分な対照を含まないならば、Ｃｆ１＝Ｃｃ２、Ｃｆ２＝Ｃｃ３、Ｃｆ３＝Ｃｃ１となるように、Ｃｆ群は、Ｃｃ群の部分を形成した個体を用いて構築された。
【０１１６】
２．３．研究の患者および対照の得られた表現型．
該実施例のグループＦ１−Ｆ３および対照群に含有されるサンプルの遺伝子型結果は、国立衛生研究所（ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）の神経遺伝学研究室および分子遺伝学研究室で遺伝子型決定されている。これらの生遺伝子型結果は、イルミナ社（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）のＩｎｆｉｎｉｕｍ  ＩおよびＩｎｆｉｎｉｕｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｈａｐ３００法を用いて生成された。本ＨＦＣＣ実験の選択される５４０患者および対照の第１染色体の３１，５３２遺伝子型からの生結果における局在データおよび情報は、上記のＣｏｒｉｅｌｌデータベースから自由に得られうる。該研究に含まれる患者のこれらの遺伝子型を得るために用いられる遺伝子型決定過程の品質対照は、前述されている（Ｆｕｎｇら，２００６）。
【０１１７】
したがって、各マトリクス（Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｃｃ１、Ｃｃ２、Ｃｃ３、Ｃｆ１、Ｃｆ２、Ｃｆ３）は、各々、選択される個体の遺伝子型を決定するマーカーの１つに相当する、３１，５３２列ならびに各群それぞれに含まれる個体数に相当している９０の縦列を含むであろう。
【０１１８】
２．４．研究に適用される計算モジュールパラメータ．
ＨＦＣＣソフトウェアは、これらの入力マトリクスに適用され、計算モジュールの種々のパラメータで入力された入力値、すなわち、
・最大数の入力でのＦ＝９０
・対照の最大数の入力でのＣｃ＝９０．
・対照の最大数でのＣｆ＝９０
・比較群の数の入力＝３
・研究における遺伝子マーカー数の入力＝３１，５３２
・選択のための統計的閾値の入力：Ｚ２＞７．８７９
・帰無値の相関因子の入力＝０．３３）
・Ｆ、Ｃｃ、Ｃｆのロケーションパスおよび出力ファイルの入力
・／ｈｏｍｅ／ａｒｕｉｚ／ｈｆｃｃ／ｐｒｕｅｂａｓ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １−３  ｇｒｏｕｐｓ／
・ノイズフィルターの液用の入力＝Ｙｅｓ
・選択される多座モデルの入力＝二遺伝子
・中間データのプリンティング（ｙ／ｎ）の入力＝Ｎｏ
・分析型の入力＝Ｈａｒｄ
・適用される統計的モデルの入力＝Ｅｘｈａｕｓｔｉｖｅ
にしたがって適用された。
【０１１９】
２．５．得られた特異的結果
今回の場合、実施例１と対比し、該実施例２では、パーキンソン病について、研究され、２ｘ２（二遺伝子モデル）で得られる３１，５３２マーカーの組み合わせから生じる４９７，１１７．７４６の可能なものの中からの一組のマーカーの優先順位を付けるために探索するので、優先順位付けシステムは、重大な問題に直面する。さらに、各相互作用的変数は、該報告で前述されるように、９階層からなるので、これは、グループ当たり９回以上の多数の数値計算をもたらす（４，４７４，０５９，７１４）。ランダムに得られた変数の対応する確率計算を行うので、確率論に基づく本発明者らの予測にしたがって、正の変数の数が５５９．２でなければならないと算出された。
【０１２０】
ＨＦＣＣソフトウェアおよび生データから生じるマトリクスを用いて、６５７の変数を生成した出力レコードは、第１染色体にわたって分散した。これは、偶然に期待した以上の１７％の肯定性の過剰発現を示す。得られた変数の一覧は、表１６で観測されうる。
【表１７−１】
2009523285.tif 000025
【表１７−２】
2009523285.tif 000026
【表１７−３】
2009523285.tif 000027
【表１７−４】
2009523285.tif 000028
【表１７−５】
2009523285.tif 000029
【０１２１】
結果のマトリクスの要約研究は、６０１の得られた組み合わせ（９１％の正の組み合わせ）に存在した単一マーカー（ｎｕｍ．６３２１、第１染色体のマーカーｒｓ１２０６９７３３に相当する）を同定した。該結果の簡単な説明は、２つの可能性：
−マーカー６３２１が、パーキンソン病に非常に重要である遺伝子を探知していること
−該マーカーの結果が、その悪い遺伝子型決定によるものであったこと（疾患の特性を得た、さらに一層もっともらしい仮説）
を示すのみである。
【０１２２】
Ｃｏｒｉｅｌｌデータベースはまた、研究される全てのマーカーの一変量データおよびこれら全てのハーディ−ワインベルグ平衡（ＨＷＥ）値を含有する。したがって、該マーカーは、顕著なＨＷＥ不均衡（ＨＷＤ、ｐ＝０．０００００００１３１）を有するので、第２の仮説が検証され、該ＳＮＰの遺伝子型決定課題と完全に適合しうる（ＨｏおよびＯｔｔ，２００３）。
【０１２３】
研究から生じる残りの正の変数（５５組み合わせ、１１０マーカー）は、マーカー６３２１を含まず、検出される可能な相互作用の方向および遺伝モデルを評価するために、ｐｏｓｔ−ｈｏｃ分析を受けた。前述したように、ＨＦＣＣｐｏｓｔ−ｈｏｃ分析は、全ての階層および同時研究の陽性グループを系統的に評価する。マーカー６３２１が、介在した全ての変数を除外し、プリントアウトで得られた出力は、表１８に示され、効果の同種方向を証明した階層は、印の付いた線によって示されている
【表１８−１】
2009523285.tif 000030
【表１８−２】
2009523285.tif 000031
【表１８−３】
2009523285.tif 000032
【表１８−４】
2009523285.tif 000033
【表１８−５】
2009523285.tif 000034
【表１８−６】
2009523285.tif 000035
【表１８−７】
2009523285.tif 000036
【表１８−８】
2009523285.tif 000037
【表１８−９】
2009523285.tif 000038
【表１８−１０】
2009523285.tif 000039
【表１８−１１】
2009523285.tif 000040
【表１８−１２】
2009523285.tif 000041
【表１８−１３】
2009523285.tif 000042
【表１８−１４】
2009523285.tif 000043
【表１８−１５】
2009523285.tif 000044
【表１８−１６】
2009523285.tif 000045
【表１８−１７】
2009523285.tif 000046
【表１８−１８】
2009523285.tif 000047
【表１８−１９】
2009523285.tif 000048
【表１８−２０】
2009523285.tif 000049
【表１８−２１】
2009523285.tif 000050
【表１８−２２】
2009523285.tif 000051
【表１８−２３】
2009523285.tif 000052
【表１８−２４】
2009523285.tif 000053
【表１８−２５】
2009523285.tif 000054
【表１８−２６】
2009523285.tif 000055
【表１８−２７】
2009523285.tif 000056
【表１８−２８】
2009523285.tif 000057
【表１８−２６】
2009523285.tif 000058
【表１８−２７】
2009523285.tif 000059
【表１８−２８】
2009523285.tif 000060
【表１８−２９】
2009523285.tif 000061
【表１８−３０】
2009523285.tif 000062
【表１８−３１】
2009523285.tif 000063
【表１８−３２】
2009523285.tif 000064
【表１８−３３】
2009523285.tif 000065
【表１８−３４】
2009523285.tif 000066
【表１８−３５】
2009523285.tif 000067
【表１８−３６】
2009523285.tif 000068
【表１８−３７】
2009523285.tif 000069
【表１８−３８】
2009523285.tif 000070
【表１８−３９】
2009523285.tif 000071
【表１８−４０】
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【表１８−４１】
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【表１８−４２】
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【表１８−４３】
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【表１８−４４】
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【表１８−４５】
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【表１８−４６】
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【表１８−４７】
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【表１８−４８】
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【表１８−４９】
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【表１８−５０】
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【表１８−５１】
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【表１８−５２】
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【表１８−５３】
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【表１８−５４】
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【表１８−５５】
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【表１８−５６】
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【表１８−５７】
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【表１８−５８】
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【表１８−５９】
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【表１８−６０】
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【表１８−６１】
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【表１８−６２】
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【表１８−６３】
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【表１８−６４】
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【表１８−６５】
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【表１８−６６】
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【表１８−６７】
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【表１８−６８】
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【表１８−６９】
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【表１８−７０】
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【表１８−７１】
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【表１８−７２】
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【表１８−７３】
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【表１８−７４】
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【表１８−７５】
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【表１８−７６】
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【表１８−７７】
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【表１８−７８】
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【表１８−７９】
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【表１８−８０】
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【表１８−８１】
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【表１８−８２】
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【表１８−８３】
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【表１８−８４】
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【表１８−８５】
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【表１８−８６】
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【表１８−８７】
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【表１８−８８】
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【表１８−８９】
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【表１８−９０】
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【表１８−９１】
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【表１８−９２】
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【表１８−９３】
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【表１８−９４】
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【表１８−９５】
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【表１８−９６】
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【表１８−９７】
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【０１２４】
該簡単研究は、５５の残りの組み合わせの２５のみ（４５％）が、効果の同種方向を有していたことを決定させた。言い換えれば、同一階層について、比較グループＧ１、Ｇ２およびＧ３において（その各々は、健康な対照とパーキンソン病との比較を含む）、ＯＲは、これら全てにおいて１以上であるかまたはこれら全てにおいて１未満であり、さらに、Ｚ２＞７．８７９の要件を満たす。（目印の付いた線によって上記表に示される）これらの２５の組み合わせは、３１の異なるマーカーの複合効果を含まれる。したがって、研究される３１，５３２の３１マーカーの組み合わせのみ（０．０９６％）が、パーキンソン病の初期ＨＦＣＣ基準（３群間の効果の均一性、ＨＡＲＤ）に基づき、選択されうる。これは、検証エンジンで将来の研究のための直接的な優先順位付けを可能にする。
【０１２５】
これらのマーカーおよびゲノムのその位置と一緒になって、Ｃｏｒｉｅｌｌデータベースの分子マーカーとのその一致は、表１９に要約される。
【表１９】
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【０１２６】
２．６．得られる肯定性の評価．
大容量ゲノムデータを有するＨＦＣＣの使用に対する最初のアプローチに基づく研究から、２ｘ２の３１，５３２要素を得ることによって可能な５億近くの第１染色体上のパーキンソン病に関与する可能性があるマーカーの２５の組み合わせのみの選択を可能にするという結論に達する。結果として、該方法が、ヒトゲノムの多座研究の説明の複雑性を大幅に減少させることが招請されうる。さらに、該生データを生成した研究者らによって用いられる種々の従来の統計分析法によって選択される全マーカー（Ｆｕｎｇら，２００６）が、期待することなく、優先順位表に現れる（下線）ことは指摘しておく価値がある。したがって、ＨＦＣＣシステムは、該系の従来の方法を用いて統計的に観測可能ないずれかのマーカーを除外しなかった。しかしながら、ＨＦＣＣは、新規の一群、従来の研究にて用いられる方法によって完全に除外されていた、潜在的に有意なマーカーを同定した。これは、ＨＦＣＣシステムが、局在化および通常、全ゲノム解読の過程中に用いられる古典的分析を通して完全に新規かつアクセス不可能である遺伝モデルをもたらし、複雑な病状の多座精査の有用なツールでありうることを証明する。
【０１２７】
２．７．ノイズフィルターを有しない研究の実施
ノイズフィルターを有しないシステムの可能性、特に、利用可能な対照数は制限され、最適条件で適用され得ないというような条件で評価するために、セクション２．１〜２．６に記載の研究は、同一個体および同一マトリクスＦ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｃｃ１、Ｃｃ２、Ｃｃ３を用いて繰り返された。対照群マトリクス間の比較を行わなかった。これは、研究が計算モジュールのパラメータの２つの差異をもって実施されなければならなかったことを意味した：
・Ｃｆにおける対照の最大数の入力：（非適用）
・ノイズフィルターアプリケーションの入力＝Ｎｏ
【０１２８】
得られた結果は、以前のものと同一であり、研究で用いられるパラメータは、非常に制限され、広範なノイズスキャンをもたらすので驚くことではない。これは、ノイズフィルターを用いることなくＨＦＣＣシステムの適用性を証明する。
【０１２９】
−実施例３：ノイズフィルターおよび「ファジー理論」分析を用いて大規模ゲノムスケールにおけるパーキンソン病のゲノム関連研究における遺伝子マーカーの優先順位付けのためのＨＦＣＣ技術を用いること
３．１．研究目標：
開発されたノイズフィルターの能力およびＨＦＣＣ技術のファジー理論システムの適用を検証するために、研究のパラメータを変更して、実施例２記載の実験を繰り返すことを決定した。目的は、実施された分析の２つのシステム間の冗長性の非存在および設計されたノイズフィルターの可能性を証明することである。システムのフィルターの能力を評価するために、ファジー理論分析システムは、その操作方法によって、ｈａｒｄモードよりはるかに多数の正の結果を生成するものが使用された。さらに、有意性の閾値は、Ｚ２＞６．６５（ｐ＜０．０１に等しい）に減らされた。該実験という考え方は、これらの条件下でノイズフィルターを通過する変数の変化率を計算することである。
【０１３０】
３．２．          研究表現型の説明
実施例２と同一。
【０１３１】
３．３．          研究における患者および対照の得られた遺伝子型
実施例２と同一。
【０１３２】
３．４．          研究に適用される計算モジュールパラメータ
実施例２に記載される初期検定で用いられる同一入力マトリクスを用いて、ＨＦＣＣソフトウェアは、計算モジュールの種々のパラメータに導入される入力値、すなわち：
・Ｆ＝９０の最大数の患者の入力
・Ｃｃ＝９０の最大数の対照の入力
・Ｃｆ＝９０の最大数の対照の入力
・比較群数＝３の入力
・研究の遺伝子マーカー数＝３１，５３２の入力
・選択のための統計的閾値の入力：Ｚ２＞６．６５
・ヌル値の相関因子＝０．３３の入力
Ｆ、Ｃｃ、Ｃｆのロケーションパスの入力およびファイルの出力
／ｈｏｍｅ／ａｒｕｉｚ／ｈｆｃｃ／ｐｒｕｅｂａｓ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １−３  ｇｒｏｕｐｓ／
・ノイズフィルターの適用＝Ｙｅｓの入力
・選択される多遺伝子座モデル＝Ｄｉｇｅｎｉｃの入力
・中間データのプリンティング（ｙ／ｎ）＝Ｎｏの入力
・分析型＝Ｆｕｚｚｙ  ｌｏｇｉｃの入力
・適用される統計モデル＝Ｅｘｈａｕｓｔｉｖｅの入力
にしたがって適用された。
【０１３３】
３．５．          得られた特異的結果
上記されるパラメータを適用し、実施例２で用いられるものとして同一マトリクスを正確に用いて、ノイズフィルターが適用されないならば、システムは、結果ファイルにて１１，２０２の正変数を（予想通り）生成するであろう。しかしながら、本システムは、正の階層が、いくつかの対照対対照比較群（Ｃｃ１対Ｃｆ１など）で検出された１１，１１７の変数を自動的に予測した。したがって、ノイズフィルターを用いることによって、９９．２４％の関連は、ノイズフィルターによる対照群間の差異の存在の検出によって除外された。残りの０．７６％（８５変数）は、先の実施例で用いられるものと同一戦略を用いて、ｐｏｓｔ−ｈｏｃ分析を用いて分析された。該研究の陽性の結果は、表２０に示される。
【表２０−１】
2009523285.tif 000131
【表２０−２】
2009523285.tif 000132
【表２０−３】
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【表２０−４】
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【０１３４】
顕著に、マーカー６３２１は、該研究における８５の正数のＯＮＥの組み合わせで出現する。８５の変数は、検出される可能な相互作用の方向および遺伝モデルを評価するために、ｐｏｓｔ−ｈｏｃ分析を受けた。前述するように、ＨＦＣＣのｐｏｓｔ−ｈｏｃ分析は、同時研究の全ての階層および正数群の系統的評価を可能にする。これをするために、２，２９６列（８５変数ｘ９階層ｘ３群＝データの２，２９５列、ヘッダーを加えなければならない）からなる、実施例２の表１８に示されるものと同様のプリントアウトを得た。
【０１３５】
前述の２，２９５例に含有されるデータの研究は、８５の残りの組み合わせの１３のみ（１５．２９％）が、明確な群の同一階層にて反対方向のＯＲを有する全ての変数（Ｒ／ＣＳ／Ｅ列において、ｒｕｉｄｏ（ノイズ）について、「Ｒ」として表示されるであろう変数）を除外して、遺伝モデル（優性、劣性、など）と適合可能な効果の方向を有することを決定させた。この場合（ファジー理論）において、正の階層は、異なる群で異なっている限り、必ずしも連続している必要はない。これらの組み合わせに関するデータおよび対応する選択される階層は、以下の表２１に示される。
【表２１−１】
2009523285.tif 000135
【表２１−２】
2009523285.tif 000136
【０１３６】
これらの１３の組み合わせには、２９の異なるマーカーの複合効果が含まれる。したがって、研究される３１，５３２の２９マーカーのみの組み合わせ（０．０９１％）は、パーキンソン病の初期ＨＦＣＣ基準下で選択されうる（ファジー理論：患者対対照ではいくつかの正の階層および対照対対照では正の階層はない）。これは、検証エンジンで将来の研究について直接的な優先順位付けを可能にする。ゲノム上の位置に加えて、これらのマーカーおよびＣｏｒｉｅｌｌデータベースの分子マーカーとの相関は、表２２に要約される。
【表２２】
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【０１３７】
３．６．得られる肯定性の評価。
大容量ゲノムデータを有するＨＦＣＣの使用に対する第２のアプローチに基づく研究から、分析のシステムを変更して、システムが、第１染色体上のパーキンソン病に関与する可能性のあるマーカーの新規組み合わせを選択し、その５億近くは、２ｘ２の３１，５３２要素を得ることを見込めるという結論に達する。該第２の分析は、分析の２つのシステムが重複だけでなく相補的であり、ただし、結果が異なるという結論を引き出す。該データのＦｕｎｇら，２００６の原書が、２００５年にＭａｒａｇａｎｏｒｅらによる既刊の結果の複製の非存在を示すことは指摘しておく価値がある。しかしながら、ファジー理論モードで機能する、本システムは、該染色体についてＭａｒａｇａｎｏｒｅらが作成する結果と完全に適合する（同定される候補遺伝子から３０Ｋｂの）遺伝子ＰＲＤＭ２周辺の右側の陽性マーカー（ｒｓ２０３８０９５）を検出する。これらの結果は、最初に独立した該遺伝子座の複製であり、逆説的に、該複製は、Ｍａｒａｇａｎｏｒｅら（２００５）によって用いられるものと異なるマーカーの一群および該近辺への関連を示すことなく刊行されている患者および対照の一群（Ｆｕｎｇら，２００６）．と以前の研究を用いて得られる。該結果は、またしても、ＨＦＣＣ法が、従来の統計的手法を用いる場合、完全に目に見えないかまたは検出できない遺伝子座を同定する能力を有することを確認する。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】本発明の方法およびシステムの一例を説明し、３つの異なる機能：発見エンジン、分析ツールおよび検証エンジンを含有するブロック図を示す。
【図２】二遺伝子である相互作用研究の患者数（Ｎ）の機能として統計的検出力（Ｐｏ）の予測のグラフ表示を示す。図２Ａは、優性モデルであり、図２Ｂは、ｐａｎ−ｆａｃｔｏｒモデルである。
【図３】三遺伝子である相互作用研究の患者数（Ｎ）の機能として統計的検出力（Ｐｏ）の予測のグラフ表示を示す。図３Ａは、優性モデルであり、図３Ｂは、ｐａｎ−ｆａｃｔｏｒモデルである。
【図４】四遺伝子である相互作用研究の患者数（Ｎ）の機能として統計的検出力（Ｐｏ）の予測のグラフ表示を示す。図４Ａは、優性モデルであり、図４Ｂは、ｐａｎ−ｆａｃｔｏｒモデルである。
【図５】五遺伝子である相互作用研究の患者数（Ｎ）の機能として統計的検出力（Ｐｏ）の予測のグラフ表示を示す。図５Ａは、優性モデルであり、図５Ｂは、ｐａｎ−ｆａｃｔｏｒモデルである。
【図１】
2009523285.tif 000138
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
2009523285.tif 000143
【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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