(57)【要約】  ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）主要表面タンパク質ＧＰ５の低グリコシル化された変異体に曝露したブタは、野生型（ｗｔ）又はグリコシル化されたＧＰ５で免疫化したブタによって産生される中和抗体のレベルに比して、ＰＲＲＳＶ中和抗体の産生を増強した。本発明は、ＰＲＲＳＶに対するブタにおける改善された免疫応答を得る方法、改善された免疫応答を得るのに有用な組成物、及びＰＲＲＳＶ主要表面タンパク質ＧＰ５の低グリコシル化されたバリアントをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
2009506129.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の参照ＧＰ５タンパク質におけるアスパラギン３４又はアスパラギン５１に対応する少なくとも１つのＮ結合型グリコシル化部位が不活化されている、低グリコシル化されたブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）ＧＰ５ポリペプチドバリアントをコードするポリヌクレオチドを含む組成物を投与することにより、ＰＲＲＳＶ抗原に対するブタの改善された免疫応答を誘発することを含む、ブタにおけるＰＲＲＳＶ抗原に対する改善された免疫応答を誘発する方法。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが、感染性ＰＲＲＳＶＲＮＡ分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが、感染性ＰＲＲＳＶＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記感染性ＰＲＲＳＶＲＮＡ分子が、北米ＰＲＲＳＶ誘導体又は欧州ＰＲＲＳＶ誘導体である、請求項２又は請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記感染性ＰＲＲＳＶＲＮＡ分子が、低グリコシル化されたＰＲＲＳＶＧＰ５ポリペプチドバリアントタンパク質をコードする北米ＰＲＲＳＶ誘導体であり、配列番号１の参照ＧＰ５タンパク質におけるアスパラギン３４又はアスパラギン５１に対応する少なくとも１つのＮ結合型グリコシル化部位が不活化されている、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
配列番号１におけるアスパラギン５１に対応するＮ結合型グリコシル化部位が不活化されている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
配列番号１の参照ＧＰ５タンパク質におけるアスパラギン３４及びアスパラギン５１に対応する前記Ｎ結合型グリコシル化部位の両者が不活化されている、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｎ結合型グリコシル化部位の両者が、前記アスパラギン３４及び前記アスパラギン５１をコードするコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンと置換することによって不活化されている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
別のアミノ酸をコードする前記コドンが、アラニン又はグルタミン残基の何れかをコードする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記コドンがアラニン残基をコードする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡ分子を含み、哺乳動物細胞中で活性なプロモーターが、低グリコシル化されたＧＰ５タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドへ作用可能に連結されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記プロモーターがＣＭＶプロモーターである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｎ結合型グリコシル化部位が、前記アスパラギン５１をコードするコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンと置換することによって不活化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
別のアミノ酸をコードする前記コドンが、アラニン又はグルタミン残基をコードする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
アスパラギン３４に対応する前記Ｎ結合型グリコシル化部位が、前記アスパラギン３４をコードするコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンと置換することによって不活化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
別のアミノ酸をコードする前記コドンが、アラニン又はグルタミン残基をコードする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドが、低グリコシル化されたＰＲＲＳＶＧＰ５ポリペプチドバリアントタンパク質をコードし、配列番号１の参照ＧＰ５タンパク質におけるアスパラギン３４及びアスパラギン５１に対応する前記Ｎ結合型グリコシル化部位の両者が不活化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｎ結合型グリコシル化部位の両者が、前記アスパラギン３４及び前記アスパラギン５１をコードするコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンと置換することによって不活化されている、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
別のアミノ酸をコードする前記コドンが、アラニン又はグルタミン残基の何れかをコードする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｎ結合型グリコシル化部位の１つが、前記アスパラギン３４又は前記アスパラギン５１をコードする１つのコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンと置換することによって不活化されている、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記組成物が、皮下注射、静脈内注射、皮内注射、非経口注射、筋肉内注射、無針注射、電気穿孔法、経口送達、鼻内送達、口腔鼻送達又はこれらの何れかの組み合わせによって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記組成物が、治療上許容される担体を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記担体が、タンパク質、緩衝液、界面活性剤及びポリエチレングリコールポリマー又はこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記組成物が、アジュバントを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記アジュバントが、水酸化アルミニウム、キルＡ（Ｑｕｉｌ  Ａ）、アルミナゲル懸濁液、ミネラルオイル、グリセリド、脂肪酸、脂肪酸副産物、マイコバクテリア及びＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド又はこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ポリヌクレオチドが、ワクシニアウィルスベクター、単純ヘルペスウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アルファウィルスベクター及びＴＧＥＶベクターからなる群から選択されるウィルスベクターを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
ＰＲＲＳＶ抗原に対する前記ブタの前記改善された免疫応答が、前記ブタによるＰＲＲＳＶ中和抗体の増加された産生を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記ブタが、成熟雌ブタ、雌ブタ、去勢されていない雄ブタ又は仔ブタである、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
低グリコシル化されたＰＲＲＳＶＧＰ５ポリペプチドバリアントをコードする前記ポリヌクレオチドが、直接的な合成、北米ＰＲＲＳＶ単離株ＧＰ５ヌクレオチド配列の変異誘発又は北米ＰＲＲＳＶコンセンサスＧＰ５ヌクレオチド配列の変異誘発によって得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記北米ＰＲＲＳＶ単離株ＧＰ５ヌクレオチド配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３からなる群から選択されるペプチドをコードする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記コンセンサス北米ＰＲＲＳＶＧＰ５ヌクレオチド配列が、配列番号１４と少なくとも８５％同一であるコンセンサスＧＰ５タンパク質をコードする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
低グリコシル化されたＰＲＲＳＶＧＰ５ポリペプチドバリアントをコードする前記ポリヌクレオチドが、直接的な合成、欧州ＰＲＲＳＶ単離株ＧＰ５ヌクレオチド配列の変異誘発又はコンセンサス欧州ＰＲＲＳＶＧＰ５ヌクレオチド配列の変異誘発によって得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記欧州ＰＲＲＳＶ単離株ＧＰ５ヌクレオチド配列が、配列番号１５と少なくとも８５％同一であるＧＰ５タンパク質をコードする、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記欧州ＰＲＲＳＶＧＰ５ヌクレオチド配列が、配列番号１５である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
配列番号１の参照ＧＰ５タンパク質におけるアスパラギン３４又はアスパラギン５１に対応する少なくとも１つのＮ結合型グリコシル化部位が不活化されている低グリコシル化されたＰＲＲＳＶ  ＧＰ５ポリペプチドバリアントを含む組成物をブタに投与することにより、ＰＲＲＳＶ抗原に対する前記ブタの改善された免疫応答を誘発することを含む、前記ブタにおけるＰＲＲＳＶ抗原に対する改善された免疫応答を誘発する方法。
【請求項３６】
配列番号１の参照ＧＰ５タンパク質におけるアスパラギン５１に対応する少なくとも１つのＮ結合型グリコシル化部位が不活化されている低グリコシル化された北米ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５ポリペプチドバリアントをコードするポリヌクレオチドと、及び治療上許容される担体とを含む組成物。
【請求項３７】
前記ポリヌクレオチドが、感染性北米ＰＲＲＳＶ  ＲＮＡ分子を含む、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記ポリヌクレオチドが、感染性北米ＰＲＲＳＶ  ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を含む、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３９】
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡ分子を含み、哺乳動物細胞中で活性なプロモーターが、前記低グリコシル化された北米ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５ポリペプチドバリアントをコードする前記ポリヌクレオチドへ作用可能に連結されている、請求項３６に記載の組成物。
【請求項４０】
前記プロモーターがＣＭＶプロモーターである、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
前記Ｎ結合型グリコシル化部位が、前記アスパラギン５１をコードするコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンと置換することによって不活化されている、請求項３６に記載の組成物。
【請求項４２】
アスパラギン以外のアミノ酸をコードする前記コドンが、アラニン又はグルタミン残基をコードする、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記ポリヌクレオチドが、低グリコシル化された北米ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５ポリペプチドバリアントタンパク質をコードし、配列番号１の北米参照ＧＰ５タンパク質におけるアスパラギン３４及びアスパラギン５１に対応する前記Ｎ結合型グリコシル化部位の両者が不活化されている、請求項３６に記載の組成物。
【請求項４４】
前記Ｎ結合型グリコシル化部位の両者が、前記アスパラギン３４及び前記アスパラギン５１をコードするコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンと置換することによって不活化されている、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
別のアミノ酸をコードする前記コドンが、アラニン又はグルタミン残基の何れかをコードする、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
前記Ｎ結合型グリコシル化部位の１つが、前記アスパラギン３４又は前記アスパラギン５１をコードする１つのコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンと置換することによって不活化されている、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４７】
前記治療上許容される担体が、タンパク質、緩衝液、界面活性剤及びポリエチレングリコールポリマー又はこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択される、請求項３６に記載の組成物。
【請求項４８】
前記組成物が、少なくとも１つのアジュバントを更に含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項４９】
前記アジュバントが、水酸化アルミニウム、キルＡ、アルミナゲル懸濁液、ミネラルオイル、グリセリド、脂肪酸、脂肪酸副産物、マイコバクテリア及びＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド又はこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択される、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
前記組成物が、インターロイキン１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ガンマインターフェロン（ｇ−ＩＦＮ）、細胞壊死因子、ＭＤＰ（ムラミルジペプチド）、免疫賦活薬複合体（ＩＳＣＯＭ）及びリポソームからなる群から選択される第二アジュバントを更に含む、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５１】
前記ポリヌクレオチドが、ワクシニアウィルスベクター、単純ヘルペスウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アルファウィルスベクター及びＴＧＥＶベクターからなる群から選択されるウィルスベクターを含む、請求項３６に記載の組成物。
【請求項５２】
配列番号１の参照ＧＰ５コンセンサスタンパク質におけるアスパラギン５１に対応する少なくとも１つのＮ結合型グリコシル化部位が不活化されている低グリコシル化された北米ＰＲＲＳＶＧＰ５ポリペプチドバリアントと、治療上許容される担体とを含む組成物。
【請求項５３】
配列番号１の参照ＧＰ５タンパク質におけるアスパラギン５１に対応する少なくとも１つのＮ結合型グリコシル化部位が不活化されている低グリコシル化された北米ＰＲＲＳＶＧＰ５ポリペプチドバリアントをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５４】
配列番号１におけるアスパラギン３４及びアスパラギン５１に対応するＮ結合型両グリコシル化部位が不活化されている、請求項５３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５５】
前記ポリヌクレオチドが、感染性北米ＰＲＲＳＶＲＮＡ分子を含む、請求項５３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５６】
前記ポリヌクレオチドが、感染性北米ＰＲＲＳＶ  ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を含む、請求項５３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５７】
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡ分子を含み、哺乳動物細胞中で活性なプロモーターが、前記低グリコシル化された北米ＰＲＲＳＶＧＰ５ポリペプチドバリアントをコードする前記ポリヌクレオチドへ作用可能に連結されている、請求項５３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５８】
前記プロモーターがＣＭＶプロモーターである、請求項５７に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５９】
アスパラギン５１に対応する前記Ｎ結合型グリコシル化部位が、前記アスパラギン５１をコードするコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンと置換することによって不活化されている、請求項５３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６０】
別のアミノ酸をコードする前記コドンが、アラニン又はグルタミン残基をコードする、請求項５９に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６１】
配列番号１の参照ＧＰ５タンパク質におけるアスパラギン３４に対応するＮ結合型グリコシル化部位が不活化されている、請求項５３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６２】
前記アスパラギン３４をコードするコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンと置換することによる、請求項６１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６３】
別のアミノ酸をコードする前記コドンが、アラニン又はグルタミン残基をコードする、請求項６１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６４】
前記Ｎ結合型グリコシル化部位の１つが、前記アスパラギン３４又は前記アスパラギン５１をコードする１つのコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンと置換することによって不活化されている、請求項６１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６５】
前記ポリヌクレオチドが、ワクシニアウィルスベクター、単純ヘルペスウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アルファウィルスベクター及びＴＧＥＶベクターからなる群から選択されるウィルスベクターを含む、請求項５３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６６】
配列番号１の参照ＧＰ５タンパク質におけるアスパラギン５１に対応する少なくとも１つのＮ結合型グリコシル化部位が不活化されている低グリコシル化された北米ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５ポリペプチドバリアントである単離されたポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００５年８月３０日に出願された、米国仮特許出願第６０／７１２，３５７号に対する優先権を主張する。
【０００２】
連邦支援の研究又は開発に関する供述
本発明は、米国農務省からのＮａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  Ｇｒａｎｔ第２００４−０１５７６号の下で、及びＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔ第Ｐ２０ＲＲ１５６３６号のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ＣＯＢＲＥプログラムの下で、政府の支援で実施された。政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本発明は、一般的には、改善された免疫原性を有するブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）抗原を含む組成物及びその使用のための方法に関する。本明細書に記載されている組成物及び方法は、ＰＲＲＳＶ抗原に対するブタの改善された免疫原性反応をもたらし、従って、ＰＲＲＳＶ感染に対する、ブタの改善された保護を与える。
【背景技術】
【０００４】
ＰＲＲＳＶは、ブタを冒す経済的に重要な病原体である。ＰＲＲＳＶによる成熟雌ブタ及び雌ブタの感染は、生殖障害をもたらし得る。また、ＰＲＲＳＶは、全ての年齢のブタにおいて呼吸疾患を引き起こし得る。ＰＲＲＳＶによる感染からブタを保護するために、ブタにワクチンを接種することは可能である。しかしながら、現在市販されているワクチン（そのほとんどは、弱毒化生ワクチンである。）は、少々効果がなく、それゆえ改良されるべきである。ＰＲＲＳＶに対する保護の完全な免疫学的機序は不明であるが、ＰＲＲＳＶ中和抗体がこの保護に対して中心的な役割を占めていることは明確に示されている。不運なことに、（野生型の形態にある）ＰＲＲＳＶ自体又はこれから誘導された現在の生ワクチンは、タイミングよく、且つ効果的な（すなわち保護的な）レベルで、ウィルス特異的中和抗体を誘導する能力が乏しい。
【０００５】
（２００２年１２月３１日、Ｃａｌｖｅｒｔらによる）米国特許第６，５００，６６２号「Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＰＲＲＳ）ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ」は、感染性北米ＰＲＲＳＶ  ｃＤＮＡクローンの開発及びワクチンとしてのその使用を記載する。しかしながら、米国特許第６，５００，６６２号は、低グリコシル化されたＰＲＲＳＶ抗原を含むＰＲＲＳＶワクチンを開示していない。
【０００６】
別の研究では、多様な北米ＰＲＲＳＶ系由来のＧＰ５タンパク質（又はＯＲＦ５タンパク質）の配列が、互いに、及びレリスタッド系として知られる代表的な欧州ＰＲＲＳＶ単離株と比較され、ＧＰ５コンセンサス配列のアスパラギン４４（Ｎ４４）及びアスパラギン５１（Ｎ５１）におけるＮ結合型グリコシル化部位が、検査されたＰＲＲＳＶ単離株全てにおいて保存されていることを明らかにした（Ｐｉｒｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎ．Ｊ．Ｖｅｔ  Ｒｅｓ．，１９９８，  ６２：１７０−７７）。しかしながら、ＧＰ５コンセンサス配列のアスパラギン３１（Ｎ３１）に位置するＮ−グリコシル化部位は、ある種の北米ＰＲＲＳＶ単離株中には存在せず、及び欧州ＰＲＲＳＶレリスタッド系単離株中に存在しない。４つの北米ＰＲＲＳＶ系及びレリスタッド系由来の組換えＧＳＴ−ＧＰ５融合タンパク質が、不溶性封入体としてイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で産生され、再生され、ウサギにおける免疫原として使用された。イー・コリ中で産生されたこのような組換えタンパク質は、その本来のＮ−グリコシル化部位を保持しているが、本部位をグリコシル化しない。
【０００７】
ＩＡＦ−Ｋｌｏｐ北米ＰＲＲＳＶ単離株のＧＰ５遺伝子へのＣＭＶプロモーター融合物を含むＤＮＡワクチンをブタに接種することによって、免疫化された動物において、ＰＲＲＳＶ曝露に対する保護が得られることも示されている（Ｐｉｒｚａｄｅｈ  ａｎｄ  Ｄｅａ，１９９８，Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７９，  ９８９−９９９）。このＧＰ５遺伝子単離株は、ＤＮＡワクチンで免疫化されたブタで発現されると、グリコシル化されると推定されるＮ３１、Ｎ４４及びＮ５１アスパラギン残基を含有するＧＰ５タンパク質をコードする。イー・コリによって産生されたＧＳＴ−ＧＰ５（ＩＡＦ−Ｋｌｏｐ系のＧＰ５遺伝子の固有のＮ−グリコシル化部位を保持するが、本部位をグリコシル化しない。）によるブタのワクチン接種は、ウィルス曝露されたブタの肺を保護しなかった。
【０００８】
低グリコシル化されたＰＲＲＳＶタンパク質の発現をもたらす変異を含有する欧州ＰＲＲＳＶ感染性クローンも記載されている（Ｗｉｓｓｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８５：３７１５−２３）。本参考文献は、ＰＲＲＳＶレリスタッド系ＧＰ（５）タンパク質のアスパラギン残基５３（Ｎ５３）部位のＮ結合型グリコシル化を防止する変異を前記部位に含有するＰＲＲＳＶが感染性であること、及び感染性ＰＲＲＳＶレリスタッド系ウィルス粒子を産生できることを報告している。これに対して、Ｎ４６の部位のＮ結合型グリコシル化を防止するＰＲＲＳＶレリスタッド系ＧＰ（５）タンパク質のＮ４６に変異を含有するＰＲＲＳＶは、感染性ではなく、感染性ＰＲＲＳＶレリスタッド系ウィルス粒子を産生しない。Ｗｉｓｓｉｎｋらは、欧州ＰＲＲＳＶ  ＧＰ２ａタンパク質中のＮ−グリカン部位が、及び、その類推に基づき、ＧＰ５タンパク質のＮ５３部位が、天然宿主中で、受容体相互作用又は免疫遮蔽を含むなどの多くの異なるレベルで作用し得ることを推測している。
【０００９】
ＰＲＲＳＶ以外のウィルスでは、グリカン残基は、多様な役割に関与している。一般に、Ｎ結合型グリコシル化は、タンパク質の正確な折りたたみ、標的化及び生物活性のために重要である（Ｈｅｌｅｎｉｕｓ，Ａ．ａｎｄ  Ｍ．Ａｅｂｉ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７３：１０１９−１０４９，  ２００４．、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｄ．Ｂ．ａｎｄ  Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ  Ｊ．，１２：ｉｉｉ−ｉｖ，  １９９５、Ｚｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４：１２２９−４６，  ２００４）。外被に封入された多くのウィルスにおいて、外被タンパク質は、糖部分の付加によって修飾され、外被タンパク質のＮ結合型グリコシル化は、受容体結合、膜融合、細胞中への透過及びウィルス発芽等の、ウィルス糖タンパク質の多様な機能を担っている（Ｂｒａａｋｍａｎ，Ｉ．ａｎｄ  Ｅ．ｖａｎ  Ａｎｋｅｎ，Ｔｒａｆｆｉｃ  １：５３３−９，  ２０００、Ｄｏｍｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９３：５４５−６２，  １９９３）。最近の研究は、タンパク質の折りたたみ及び細胞内輸送（Ｓｈｉ，Ｘ．ａｎｄ  Ｒ．Ｍ．Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：５４１４−２２，  ２００４）並びにインフルエンザウィルス赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質の生物活性及び抗原性（Ａｂｅ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：９６０５−１１，  ２００４）における、ハンタンウィルスの糖タンパク質のＮ結合型グリコシル化の役割を示している。更に、ウィルス外被タンパク質のグリコシル化は、ウィルス中和抗体反応を回避、遮断又は最小化するために、幾つかの異なる、外被に封入されたウィルスによって使用されている、ウィルスの免疫回避及び持続のための主要なメカニズムであることが明白になってきた。この効果の例は、ＳＩＶ（Ｒｅｉｔｔｅｒ，Ｊ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：６７９−８４，  １９９８）及びＨＩＶ−１（Ｗｅｉ，Ｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４２２：３０７−１２，  ２００３）、ＨＢＶ（Ｌｅｅ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３０３：４２７−３２，  ２００３）、インフルエンザ（Ｓｋｅｈｅｌ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１７７９−８３，  １９８４）及びアルテリウィルスＬＤＶ（Ｃｈｅｎ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２６６：８８−９８，  ２０００）に関して報告されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
発明の要旨
本発明は、上述の問題に照らして開発された。ＰＲＲＳＶ主要表面タンパク質ＧＰ５の低グリコシル化されたバリアントが、野生型（ｗｔ）又はグリコシル化されたＧＰ５で免疫化されたブタによって産生される中和抗体のレベルと比べて、免疫化されたブタによって産生されるＰＲＲＳＶ中和抗体のレベルを増大させたことが示されている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、第一に、配列番号１の参照ＧＰ５タンパク質におけるアスパラギン３４又はアスパラギン５１に対応する少なくとも１つのＮ結合型グリコシル化部位が不活化されている低グリコシル化されたＰＲＲＳＶＧＰ５ポリペプチドバリアントをコードするポリヌクレオチドを含む組成物を投与することを含む、前記ブタにおけるＰＲＲＳＶ抗原に対する改善された免疫応答を誘発する方法を提供する。前記方法のある実施形態において、配列番号１におけるアスパラギン３４又はアスパラギン５１に対応する少なくとも１つのＮ結合型グリコシル化部位は、不活化されている。このポリヌクレオチドは、感染性ＰＲＲＳＶ  ＲＮＡ分子又は、感染性ＰＲＲＳＶ  ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を含み得る。感染性ＰＲＲＳＶ  ＲＮＡ分子は、北米ＰＲＲＳＶ誘導体又は欧州ＰＲＲＳＶ誘導体である。あるいは、本ポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞中で活性なプロモーターが低グリコシル化されたＧＰ５タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドへ作用可能に連結されたＤＮＡ分子を含み得る。本プロモーターは、本発明のある好ましい実施形態において、ＣＭＶプロモーターである。あるいは、本ポリヌクレオチドは、ウィルスベクターであり得る。使用できる代表的なウィルスベクターは、ワクシニアウィルスベクター、単純ヘルペスウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アルファウィルスベクター及びＴＧＥＶベクターを含む。
【００１２】
配列番号１の参照ＧＰ５タンパク質におけるアスパラギン３４又はアスパラギン５１に対応する少なくとも１つのＮ結合型グリコシル化部位が不活化されている低グリコシル化されたＰＲＲＳＶ  ＧＰ５ポリペプチドバリアントをコードするポリヌクレオチドを得るために、ＰＲＲＳＶ配列の多様な種類及び源を使用することが可能である。本発明のある実施形態において、低グリコシル化されたＰＲＲＳＶ  ＧＰ５ポリペプチドバリアントをコードするポリヌクレオチドは、直接的な合成、北米ＰＲＲＳＶ単離株ＧＰ５ヌクレオチド配列の変異誘発又はコンセンサス北米ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５ヌクレオチド配列の変異誘発によって得られる。北米ＰＲＲＳＶ単離株ＧＰ５ヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３のＧＰ５タンパク質をコードするヌクレオチドの群から選択できる。コンセンサス北米ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５ヌクレオチド配列は、配列番号１４と少なくとも８５％同一であるコンセンサスＧＰ５タンパク質をコードする。本発明の他の実施形態において、低グリコシル化されたＰＲＲＳＶ  ＧＰ５ポリペプチドバリアントをコードするポリヌクレオチドは、直接的な合成、欧州ＰＲＲＳＶ単離株ＧＰ５ヌクレオチド配列の変異誘発又はコンセンサス欧州ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５ヌクレオチド配列の変異誘発によって得られる。欧州ＰＲＲＳＶ単離株ＧＰ５ヌクレオチド配列は、配列番号１５と少なくとも８５％同一であるＧＰ５タンパク質をコードする。
【００１３】
本発明の方法を効果的に実施するために、特定されたＮ結合型グリコシル化部位を不活化する多様な方法を使用することが可能である。アスパラギン５１に対応するＮ結合型グリコシル化部位を不活化するための好ましい方法の１つは、アスパラギンコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンと置換することである。この置換コドンは、アラニン又はグルタミン残基をコードすることができる。より好ましい実施形態において、配列番号１の参照ＧＰ５タンパク質におけるアスパラギン３４及びアスパラギン５１に対応するＮ結合型グリコシル化部位の両者が不活化されている。他の実施形態において、アスパラギン３４に対応するＮ結合型グリコシル化部位が不活化されている。このアスパラギン３４のＮ結合型グリコシル化部位は、該アスパラギン３４をコードするコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンと置換することによって不活化できる。別のアミノ酸をコードするコドンは、アラニン又はグルタミン残基をコードすることができる。他の好ましい実施形態において、参照ＧＰ５タンパク質におけるアスパラギン３４及びアスパラギン５１に対応するＮ結合型グリコシル化部位の両者は、アスパラギン３４及びアスパラギン５１をコードするコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンで置換することによって不活化することができる。アスパラギン３４及びアスパラギン５１をコードする両コドンは、それらのグリコシル化部位を不活化するために、アラニン又はグルタミン残基の何れかをコードするコドンと置換することができる。あるいは、両グリコシル化部位を不活化するために、両コドンは、アラニン残基をコードするコドンと置換することができる。あるいは、他の技術によって、他のＮ結合型グリコシル化部位を不活化しながら、前記アスパラギン３４又は前記アスパラギン５１をコードする１つのコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンで置換することによって、Ｎ結合型グリコシル化部位の１つが不活化される。
【００１４】
好ましい実施形態において、前記方法は、配列番号１の参照ＧＰ５タンパク質におけるアスパラギン３４又はアスパラギン５１に対応する少なくとも１つのＮ結合型グリコシル化部位が不活化されている低グリコシル化されたＰＲＲＳＶ  ＧＰ５ポリペプチドバリアントタンパク質をコードする北米ＰＲＲＳＶ誘導体である感染性ＰＲＲＳＶＲＮＡ分子を使用する。より好ましい実施形態において、配列番号１の参照ＧＰ５タンパク質におけるアスパラギン３４及びアスパラギン５１に対応するＮ結合型グリコシル化部位の両者が、不活化されている。参照ＧＰ５タンパク質におけるアスパラギン３４及びアスパラギン５１に対応するＮ結合型グリコシル化部位の両者は、アスパラギン３４及びアスパラギン５１をコードするコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンで置換することによって不活化することができる。アスパラギン３４及びアスパラギン５１をコードする両コドンは、それらのグリコシル化部位を不活化するために、アラニン又はグルタミン残基の何れかをコードするコドンで置換することができる。あるいは、両コドンは、そのグリコシル化部位を不活化するために、アラニン残基をコードするコドンと置換することができる。
【００１５】
この方法を実施するため、前記ポリヌクレオチドを含有する組成物は、皮下注射、静脈内注射、皮内注射、非経口注射、筋肉内注射、無針注射、電気穿孔法、経口送達、鼻内送達、口腔鼻送達又はこれらの何れかの組み合わせによって投与される。投与される組成物は、治療上許容される担体を更に含み得る。この治療上許容される担体は、タンパク質、緩衝液、界面活性剤及びポリエチレングリコールポリマー又はこれらの何れかの組み合わせからなる群より選択される。
【００１６】
投与される組成物は、アジュバントを更に含み得る。このアジュバントは、水酸化アルミニウム、キルＡ、アルミナゲル懸濁液、ミネラルオイル、グリセリド、脂肪酸、脂肪酸副産物、マイコバクテリア及びＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド又はこれらの何れかの組み合わせであり得る。投与される組成物は、インターロイキン１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ガンマインターフェロン（ｇ−ＩＦＮ）、細胞壊死因子、ＭＤＰ（ムラミルジペプチド）、免疫賦活薬複合体（ＩＳＣＯＭ）及びリポソーム等の第二のアジュバントも含み得る。
【００１７】
ＰＲＲＳＶ抗原に対するブタの改善された免疫応答は、該ブタによるＰＲＲＳＶ中和抗体の増大した産生を含み得る。典型的には、本発明の方法及び組成物によるブタの免疫化に際して、ＰＲＲＳＶ中和抗体の増大した産生が観察される。改善された免疫応答は、成熟雌ブタ、雌ブタ、成熟雄ブタ又は仔ブタにおいて得られ得る。
【００１８】
本発明は、配列番号１の参照ＧＰ５タンパク質におけるアスパラギン３４又はアスパラギン５１に対応する少なくとも１つのＮ結合型グリコシル化部位が該ブタに対して不活化されている低グリコシル化されたＰＲＲＳＶＧＰ５ポリペプチドバリアントを含む組成物を投与することを含む、ＰＲＲＳＶ抗原に対する、ブタにおける改善された免疫応答を誘発する方法も提供する。低グリコシル化されたＰＲＲＳＶＧＰ５ポリペプチドバリアントタンパク質は、上述の方法で使用された同一のポリヌクレオチドによって、細菌、酵母又は哺乳動物発現系中で産生され得る。
【００１９】
本発明は、配列番号１の参照ＧＰ５タンパク質におけるアスパラギン５１に対応する少なくとも１つのＮ結合型グリコシル化部位が不活化されている低グリコシル化された北米ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５ポリペプチドバリアントをコードするポリヌクレオチドと、治療上許容される担体とを含む組成物も提供する。ある実施形態において、前記組成物は、配列番号１におけるアスパラギン３４及びアスパラギン５１に対応するＮ結合型両グリコシル化部位が不活化されている、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態において、本組成物は、感染性北米ＰＲＲＳＶＲＮＡ分子又は感染性北米ＰＲＲＳＶＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子の何れかを含み得る。他の実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞中で活性なプロモーターが、低グリコシル化された北米ＰＲＲＳＶＧＰ５ポリペプチドバリアントをコードするポリヌクレオチドへ作用可能に連結されているＤＮＡ分子を含む。ある実施形態において、このプロモーターはＣＭＶプロモーターである。更に他の実施形態において、前記組成物中のポリヌクレオチドは、ウィルスベクターを含む。前記組成物中で使用できるウィルスベクターは、ワクシニアウィルスベクター、単純ヘルペスウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アルファウィルスベクター及びＴＧＥＶベクターの何れか１つであり得る。
【００２０】
前記組成物のポリヌクレオチドにおいて、Ｎ結合型グリコシル化部位は、アスパラギン５１をコードするコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンで置換することによって不活化される。アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンは、アラニン又はグルタミン残基をコードする。本組成物の他の実施形態において、さらなるＮ結合型グリコシル化部位は、アスパラギン３４をコードするコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンで置換することによって不活化される。別のアミノ酸をコードする本コドンは、アラニン又はグルタミン残基をコードすることができる。従って、本願によって、配列番号１の北米参照ＧＰ５タンパク質におけるアスパラギン３４及びアスパラギン５１に対応する前記Ｎ結合型グリコシル化部位の両者が不活化されている低グリコシル化された北米ＰＲＲＳＶＧＰ５ポリペプチドバリアントタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む好ましい組成物が提供される。Ｎ結合型グリコシル化部位の両者は、アスパラギン３４及びアスパラギン５１をコードするコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンと置換することによって不活化することができる。アスパラギン以外のアミノ酸をコードするこれらのコドンは、アラニン又はグルタミン残基の何れかをコードする。
【００２１】
前記組成物中で使用される治療上許容される担体は、タンパク質、緩衝液、界面活性剤、及びポリエチレングリコールポリマー又はこれらの何れかの組み合わせであり得る。前記組成物は、少なくとも１つのアジュバントを更に含む。このアジュバントは、水酸化アルミニウム、キルＡ、アルミナゲル懸濁液、ミネラルオイル、グリセリド、脂肪酸、脂肪酸副産物、マイコバクテリア及びＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド又はこれらの何れかの組み合わせであり得る。前記組成物は、更に、インターロイキン１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ガンマインターフェロン（ｇ−ＩＦＮ）、細胞壊死因子、ＭＤＰ（ムラミルジペプチド）、免疫賦活薬複合体（ＩＳＣＯＭ）及びリポソームからなる群から選択される第二のアジュバントも含み得る。
【００２２】
配列番号１の参照ＧＰ５タンパク質におけるアスパラギン５１に対応する少なくとも１つのＮ結合型グリコシル化部位が不活化されている低グリコシル化された北米ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５ポリペプチドバリアントと、治療上許容される担体とを含む組成物も、本発明によって提供される。好ましい実施形態において、配列番号１の参照ＧＰ５タンパク質におけるアスパラギン３４又はアスパラギン５１の両者に対応するＮ結合型グリコシル化部位が不活化されている。低グリコシル化されたＰＲＲＳＶＧＰ５ポリペプチドバリアントタンパク質は、上述の方法において使用される同一のポリヌクレオチドによって、細菌、酵母、又は哺乳動物発現系中で産生され得る。
【００２３】
本発明は、配列番号１の参照ＧＰ５タンパク質におけるアスパラギン５１に対応する少なくとも１つのＮ結合型グリコシル化部位が不活化されている低グリコシル化された北米ＰＲＲＳＶＧＰ５ポリペプチドバリアントをコードする単離されたポリヌクレオチドも提供する。ある実施形態において、配列番号１におけるアスパラギン３４及びアスパラギン５１に対応するＮ結合型両グリコシル化部位が不活化されているポリヌクレオチドが提供される。好ましい実施形態において、この単離されたポリヌクレオチドは、感染性北米ＰＲＲＳＶＲＮＡ分子又は感染性北米ＰＲＲＳＶＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子の何れかを含み得る。他の実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞中で活性なプロモーターが、低グリコシル化された北米ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５ポリペプチドバリアントをコードするポリヌクレオチドへ作用可能に連結されたＤＮＡ分子を含む。ある実施形態において、このプロモーターはＣＭＶプロモーターである。更に他の実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、ウィルスベクターを含む。前記組成物中で使用できるウィルスベクターは、ワクシニアウィルスベクター、単純ヘルペスウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アルファウィルスベクター及びＴＧＥＶベクターの何れか１つであり得る。
【００２４】
単離されたポリヌクレオチドにおいて、Ｎ結合型グリコシル化部位は、アスパラギン５１をコードするコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンで置換することによって不活化される。アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンは、アラニン又はグルタミン残基をコードする。他の好ましい実施形態において、更なるＮ結合型グリコシル化部位は、アスパラギン３４をコードするコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンと置換することによって不活化される。別のアミノ酸をコードする本コドンは、アラニン又はグルタミン残基をコードすることができる。従って、低グリコシル化された北米ＰＲＲＳＶＧＰ５ポリペプチドバリアントタンパク質をコードし、配列番号１の北米参照ＧＰ５タンパク質におけるアスパラギン３４及びアスパラギン５１に対応するＮ結合型グリコシル化部位の両者が不活化されている好ましいポリヌクレオチドが提供される。Ｎ結合型グリコシル化部位の両者は、アスパラギン３４及びアスパラギン５１をコードするコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンと置換することによって不活化することができる。アスパラギン以外のアミノ酸をコードするこれらのコドンは、アラニン又はグルタミン残基の何れかをコードする。
【００２５】
本発明は、配列番号１の参照ＧＰ５タンパク質におけるアスパラギン５１に対応する少なくとも１つのＮ結合型グリコシル化部位が不活化されている低グリコシル化された北米ＰＲＲＳＶＧＰ５ポリペプチドバリアントである単離されたポリペプチドも提供する。単離した低グリコシル化されたＰＲＲＳＶＧＰ５ポリペプチドバリアントタンパク質は、上述の方法において使用される同一のポリヌクレオチドによって、細菌、酵母又は哺乳動物発現系中で産生し、クロマトグラフィー又は他の技術によって精製することができる。
【００２６】
本発明の更なる特徴及び利点並びに本発明の多様な実施形態の構造及び操作は、添付の図面を参照しながら、以下に詳しく記載されている。
【００２７】
図面の簡単な説明
添付の図は、明細書に組み入れられ、明細書の一部を形成し、本発明の実施形態を説明し、明細書とともに、本発明の原理を説明するために役立つ。
【００２８】
図１は、ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５及びＭタンパク質の一過性発現を示す。Ａ．脳心筋炎ウィルスからＩＲＥＳ（ＩＥ）に隣接するＧＰ５及びＭコード領域を示すバイシストロン性構築物の模式図。コード領域は、ＧＰ５コード領域のすぐ上流に存在するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（黒四角）の調節下にある。折れ曲がった矢印は、ベクターからのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによる転写の位置及び方向を示す。Ｂ．バイシストロン性ベクターによって形質移入された細胞におけるＧＰ５及びＭタンパク質の発現。偽の形質移入した細胞（レーン１）又はプラスミドを形質移入した細胞（レーン２ないし７）を材料及び方法に記載されているとおりに放射性標識し、抗Ｇｐ５抗体（レーン１ないし５）又は抗Ｍ抗体（レーン６ないし７）で免疫沈降させた。免疫沈降されたタンパク質は、未処理のままとし（−）（レーン１、２、６、及び７）、又はＥｎｄｏ  Ｈ（レーン３）、ＰＮＧａｓｅＦ（レーン４）で処理し（＋）、電気泳動によって分析した。レーン５は、ツニカマイシンで処理された、（＋）形質移入された細胞から免疫沈降したタンパク質を含有する。キロダルトンにおける相対的な分子量（Ｍｒ）を有するタンパク質の移動度を示す。
【００２９】
図２は、ＷＴ−ＧＰ５及びバイシストロン性プラスミドを有するその変異体のグリコシル化分析を示す。Ａ．バイシストロン性ベクター、及びアミノ酸位置３４、４４及び５１における３つのグリコシル化候補部位を有するＰＲＲＳＶ  ＧＰ５の示される模式図。Ｂ．本研究で使用される多様な変異体。Ｃ．ｗｔ及びＧＰ５変異体の発現及びＥｎｄｏ  Ｈに対するそれらの感受性。実験は、図１に対する説明文に記載のとおり実施し、タンパク質を抗ＧＰ５抗体で免疫沈降させ、Ｅｎｄｏ  Ｈｄｅ消化する（＋）か又は未消化のままにし（−）、電気泳動によって分析した。ＧＰ５変異体タンパク質を矢頭によって示す。キロダルトンにおける相対的な分子量（Ｍｒ）を有するタンパク質の移動度を右に示す。
【００３０】
図３は、ＧＰ５変異体をコードする変異体ウィルスの特徴づけを示す。Ａ．ＭＡＲＣ−１４５細胞中でのｗｔ（ＦＬ−１２）及び多様なＰＲＲＳＶ変異体の単一段階の増殖動態。６ウェル中に播種した細胞を、３の感染効率でＰＲＲＳＶに感染させ、感染後の示される時点で培養上清を回収し、ウィルス力価を測定した。３つの独立した実験から、標準偏差（誤差バー）とともに平均力価を示す。Ｂ．変異体ウィルスのプラーク形態。開いた矢印及び矢頭は、ほとんど透明ではないプラークを示す。Ｃ．ＰＲＲＳＶ変異体を回収するトランス相補性。ｗｔ  ＧＰ５タンパク質を発現させる細胞からの変異体ウィルス回収物の定量分析。３つの独立した実験からのウィルスの平均収量を、（誤差バーによって表される）標準偏差とともに示す。
【００３１】
図４は、変異体ウィルス粒子中へ組み込まれ、変異体ウィルスで感染した細胞中で合成したＧＰ５の検査を示す。Ａ．感染した細胞の培養上清からの放射性標識したウィルス粒子を免疫沈降させ、Ｅｎｄｏ  Ｈで処理し（＋）又は処理せず（−）に、電気泳動によって分析した。レーン１及び２では、Ｅｎｄｏ  Ｈ消化されたＧＰ５及びＥｎｄｏ  Ｈ消化さていないＧＰ５が白括弧によって示されている。Ｂ．多様な変異体ウィルスで感染した細胞を放射性標識し、ＧＰ５を免疫沈降させ、Ｅｎｄｏ  Ｈで処理し（＋）、又は処理せず（−）に、電気泳動によって分析した。レーン２及び３におけるＥｎｄｏ  Ｈ消化した及びしていないＧＰ５を白括弧により示す。キロダルトンで示された相対的な分子量（Ｍｒ）を有するタンパク質の移動度を、各パネルの右側に示す。
【００３２】
図５は、北米ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５のｎ末端アミノ酸配列と、北米ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５参照ｎ末端配列（配列番号１、ＮＶＳＬ９７−７８９５系）との配列比較を示す。２００個のアミノ酸のタンパク質を並置した最初の６０個のＮ末端アミノ酸を示す。前記タンパク質中のアスパラギン３４「ＮＳＳ」及びアスパラギン５１「ＮＧＴ」のＮ結合型グリコシル化部位を太字で示す。参照ＧＰ５タンパク質の残基２９と残基３５の間に存在する他のＮ結合型グリコシル化部位に下線が付されている。
【００３３】
図６は、欧州ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５  Ｎ末端アミノ酸配列と北米ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５参照ｎ末端配列（配列番号１、ＮＶＳＬ９７−７８９５系）との配列比較を示す。約２００個のアミノ酸タンパク質の完全なＧＰ５タンパク質の並置を示しており、ここで、前記タンパク質中のアスパラギン５１「ＮＧＴ」Ｎ結合型グリコシル化部位を太字で示す（すなわち、配列番号１５中のアスパラギン５３）。
【００３４】
定義
本明細書で使用される「許容される担体」とは、組成物の他の成分に対して有害ではなく、及び適用されるべき材料に対して有害ではない担体を指す。「治療上許容される担体」とは、組成物の他の成分に対して有害ではなく、及びヒト又は他の動物のレシピエントに対して有害ではない担体を指す。組成物の他の成分に関して、「有害ではない」とは、前記担体が、他の成分と反応せず、又は他の成分を分解せず、又はその他それらの有効性を妨害しないことを意味する。成分の有効性の妨害は、成分の単なる希釈を包含しない。動物との関連で、「有害ではない」とは、前記担体が、植物又は動物に対して傷害を与えず、又は致死的ではないことを意味する。
【００３５】
本明細書で使用される「アジュバント」とは、免疫応答を誘導する抗原の能力を亢進させる、前記抗原とともに使用される全ての材料を指す。
【００３６】
本明細書で使用される「投与」とは、ポリヌクレオチド、ポリペプチド又はそれらの組成物を対象へ提供する全ての手段を指す。投与手段の非限定的な例は、皮下注射、静脈内注射、皮内注射、非経口注射、筋肉内注射、無針注射、電気穿孔法、経口送達、鼻内送達、口腔鼻送達又はこれらの何れかの組み合わせを含む。
【００３７】
本明細書で使用される「抗原」とは、宿主中に免疫応答を誘導する全ての実体を指す。
【００３８】
本明細書で使用される「コンセンサス配列」とは、２つ又はそれ以上の相同的な配列を並置し、共通のアミノ酸、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列に対応する新たな配列を誘導することによって作製されるアミノ酸、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列を指す。
【００３９】
本明細書で使用される「低グリコシル化されたＰＲＲＳＶ  ＧＰ５ポリペプチドバリアント」とは、生じたＧＰ５変異タンパク質中のＮ結合型グリコシル化部位の数が減少するように、１つ又は以上のＮ結合型グリコシル化部位を含む、元のアミノ酸又は非バリアントアミノ酸配列が変化されているＰＲＲＳＶ  ＧＰ５タンパク質を指す。この定義の下では、グリコシル化部位の同一数を含有する元のＧＰ５配列を有するＧＰ５タンパク質を産生するために、元のＧＰ５タンパク質又は非バリアントＧＰ５タンパク質をイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させても、低グリコシル化されたＰＲＲＳＶ  ＧＰ５ポリペプチドバリアントの産生をもたらさない。
【００４０】
本明細書で使用される「免疫応答」とは、特定の抗原に結合し、分解し又はその他阻害する抗体及び／又は（Ｔリンパ球等の）細胞の産生を指す。「改善された免疫応答」等の関連する語は、免疫化された宿主の抗原に対する反応において、何らかの測定可能な改善をもたらす方法及び組成物の使用を指す。例えば、免疫応答における測定可能な改善は、改善された免疫応答を与える構造的修飾を欠如する抗原で免疫化された対照動物において観察される産生のレベルに対する、中和抗体の増大した産生（すなわち、増大した抗体力価）を含むが、これに限定されるわけではない。
【００４１】
「感染性ＲＮＡ分子」とは、許容的宿主細胞中に導入されたときに、機能的なウィルス粒子の産生のための全ての必要な要素をコードするＲＮＡ分子を指す。
【００４２】
本明細書で使用される「感染性クローン」とは、感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を指す。
【００４３】
本明細書で使用される「北米ＰＲＲＳＶ」とは、以下に限定されるわけではないが、ＮＶＳＬ９７−７８９５系（Ｔｒｕｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３２５：３０８−３１９及びこれに含有される参考文献）又は、（Ｐｉｒｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎ．Ｊ．Ｖｅｔ  Ｒｅｓ，６２：１７０−１７７及びこれに含有される参考文献に記載されている）ＩＡＦ−Ｋｌｏｐ、ＭＬＶ、ＡＴＣＣ  ＶＲ−２３３２、ＡＴＣＣ  ＶＲ−２３８５、ＩＡＦ−ＢＡＪ、ＩＡＦ−ＤＥＳＲ、ＩＡＦ−ＣＭ、ＩＡＦ９３−６５３、ＩＡＦ９３−２６１６、ＩＡＦ９４−３１８２ＩＡＦ９４−２８７系等の北米ＰＲＲＳＶ単離株と関連するポリヌクレオチド配列を含む全てのＰＲＲＳＶを指す。本発明において、北米ＰＲＲＳＶ単離株と関連するポリヌクレオチド配列を含むＰＲＲＳＶは、ＧＰ５コード領域が、配列番号１と少なくとも８５％のタンパク質配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含有するＰＲＲＳＶである。
【００４４】
本明細書で使用される「欧州ＰＲＲＳＶ」とは、以下に限定されるわけではないが、レリスタッド系等の、北米ＰＲＲＳＶ単離株と関連するポリヌクレオチド配列を含む全てのＰＲＲＳＶを指す（Ｗｉｓｓｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８５：３７１５，  ２００４及びこれに含有される参考文献）。本発明において、欧州ＰＲＲＳＶ単離株と関連するポリヌクレオチド配列を含むＰＲＲＳＶは、ＧＰ５コード領域が、配列番号１５と少なくとも８５％のタンパク質配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含有するＰＲＲＳＶである。
【００４５】
本明細書で使用される「％同一性」とは、２つの最適に並置されたＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質セグメントの規定された長さの中で同一である配列中の要素（すなわちアミノ酸又はヌクレオチド）の数を指す。「％同一性」を算出するために、同一の要素の数を、並置されたセグメントの所定の長さ中の要素の総数によって除し、１００を乗じる。同一性％が、タンパク質に関して使用される場合には、ある種のアミノ酸残基は同一でなくてもよいが、それにも関わらず、類似の化学的特性（例えば、酸性又は塩基性残基、疎水性残基、親水性残基、水素結合のドナー又はアクセプター残基）を有するアミノ酸残基の置換を反映する保存的アミノ酸置換であることが理解される。このような置換は、分子の機能的特性を変化させない場合があり得る。その結果、保存的置換を説明するために、タンパク質配列の％同一性を増加させることが可能である。
【００４６】
序論
ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）糖タンパク質５（ＧＰ５）は、最も豊富な外被糖タンパク質であり、インビボでの中和抗体の主要な誘導因子である。Ｎ結合型グリコシル化部位と推定される３つの部位（Ｎ３４、Ｎ４４、及びＮ５１）が、ＧＰ５外部ドメインに存在し、該ドメイン中には、主要な中和エピトープも存在する。グリコシル化部位と推定されるこれらの部位の何れがＰＲＲＳＶのライフサイクル及び中和抗体の誘導におけるグリカン部分の役割に使用されるかを決定するために、本発明者は、これらの部位に単一及び複数のアミノ酸置換を含有するＧＰ５変異体のパネルを作製した。野生型（ｗｔ）及び変異体タンパク質の一過性発現及びその後の生化学的研究は、成熟ＧＰ５が、３つの部位全てに高濃度マンノース型の糖部分を含有することを明らかにした。その後、感染性ＰＲＲＳＶを回収するために、これらの変異は完全長のｃＤＮＡクローン中に取り込まれた。本発明者らの結果は、Ｎ４４残基を含む変異が、感染性子孫の産生をもたらさなかったことを示し、Ｎ４４が、ウィルス感染性のための最も重要なアミノ酸残基であることを示唆する。Ｎ３４、Ｎ５１及びＮ３４／５１に変異を有するウィルスは、ｗｔＰＲＲＳＶよりも低い力価になり、ＭＡＲＣ１４５細胞において低下した細胞変性効果を示した。血清中和アッセイにおいて、変異体ウィルスは、ｗｔ  ＰＲＲＳＶ特異的抗体による中和に対して増強された感受性を示した。更に、変異体ウィルスをブタに接種すると、ｗｔＰＲＲＳＶ及び変異体に対する中和抗体の有意により高いレベルが誘導され、従って、ＧＰ５の外部ドメイン中のグリカン残基の喪失は、近くの中和エピトープの免疫原性及びインビトロでの中和に対するこれらのウィルスの感受性の両者を強化することが示唆された。これらの結果は、増強された保護的効力のＰＲＲＳＶワクチンを開発するために多大な重要性を有するはずである。
【００４７】
中和抗体は、ＰＲＲＳＶに対する保護と大きな相関があることが知られている。本発明者らは、ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５タンパク質中のグリコシル化部位の除去が、（１）修飾されたＰＲＲＳＶ系がＰＲＲＳＶ回復期抗血清によって中和される能力、及び（２）ブタに接種するために使用された場合に、この修飾されたＰＲＲＳＶ系がＰＲＲＳＶ中和抗体の前例のないレベルを生じる能力の有意な亢進をもたらすことを発見した。ＰＲＲＳＶ感染に対して免疫化するために使用される全ての生の（ｗｔ又は弱毒化された）ウィルスに対してこの概念を適用することは、ＰＲＲＳＶ感染に対する効果的な保護を付与するために使用する上で、多大な影響を有する。
【００４８】
現時点で、（１）弱毒化された生ワクチン、（２）（試験管内で増殖され、化学的に不活化されたｗｔ  ＰＲＲＳＶに基づいた）不活化されたワクチン、及び（３）群れの全ての動物に対して、体系的様式で、目的を定めて病原性ｗｔＰＲＲＳＶでの感染を使用するという、ＰＲＲＳＶ感染に対して免疫化するための３つの主要なアプローチが存在する。これら３つの方法のうちの何れが最も効果的であるかにについての考察及び論議は数多く存在する。本発明は、免疫化のために使用されるアプローチに関わらず、有益である。ＰＲＲＳＶのタンパク質のグリコシル化レベルを修飾するための生ＰＲＲＳＶの遺伝的変化は、弱毒化されたＰＲＲＳＶワクチン系、又は不活化したワクチンを作製するために使用されるｗｔＰＲＲＳＶ系、又は大量感染による集団の直接的な接種に使用されるｗｔ  ＰＲＲＳＶ系の何れかで実施できる。
【００４９】
ＰＲＲＳＶは、ウマ動脈炎ウィルス（ＥＡＶ）、乳酸脱水素酵素ウィルス（ＬＤＶ）、及びサル出血熱ウィルス（ＳＨＦＶ）も含むニドウィルス目内のアルテリウィルス科に属する。ウィルスゲノムは、約１５．０ｋｂ長の正の螺旋状直鎖ＲＮＡ分子であり、５’末端にキャップ構造を、３’末端にポリ（Ａ）尾部を有する。８個の翻訳領域（ＯＲＦ）が、前記ウィルスゲノム中でコードされている。最初の２つの翻訳領域（ＯＲＦ１ａ及びＯＲＦ１ａｂ）は、ポリタンパク質の加工並びにゲノムの転写及び複製に関与する非構造性（ＮＳ）ウィルスポリタンパク質をコードする。ＯＲＦ２ないし７中にコードされるウィルス構造タンパク質は、５’末端に共通のリーダー配列を有するｍＲＮＡの３’共末端入れ子状セットとして合成される、６個のサブゲノムのキャップ及びポリアデニル化されたｍＲＮＡから発現される。主要なウィルス外被タンパク質は、糖タンパク質５（ＧＰ５）であり、これは、ウィルスゲノムのＯＲＦ５中にコードされている。ＧＰ５は、大きさが約２５ｋＤａのグリコシル化された膜通過タンパク質である。ＧＰ５は、推定上のＮ末端シグナルペプチドを有し、成熟タンパク質の最初の４０残基を含む小さな外部ドメイン中に位置する３つのＮ結合型グリコシル化部位の候補を有する。ＥＡＶ及びＬＤＶでは、主要な外被糖タンパク質は、ＯＲＦ６遺伝子産物であるウィルスマトリクス（Ｍ）タンパク質とジスルフィド結合されたヘテロ二量体を形成する。ＰＲＲＳＶＧＰ５とＭタンパク質との間で同様の相互作用が観察されているが、相互作用の様式はまだ定義されていない。ＧＰ５及びＭタンパク質のヘテロ二量体の形成が、感染性ＰＲＲＳＶの重合において重大な役割を担っている可能性があると推測されている。ウィルスの重合における役割に加え、ＧＰ５は、感受性宿主細胞中へのウィルスの侵入に関与すると思われる。ＧＰ５は、ＰＲＲＳＶに対する生体内での標的細胞であるブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）中に侵入するための宿主細胞受容体であるシアロアドヘシンと相互作用すると推測されている。受容体認識におけるＧＰ５の役割は、Ｎ末端外部ドメイン中の主要な中和エピトープの存在によって裏付けられ、従って、感染過程におけるＧＰ５外部ドメインに関する中心的な役割を示唆する。
【００５０】
ＧＰ５外部ドメインのＮ結合型グリカンは、タンパク質の適切な機能性のために不可欠であり得る。Ｎ結合型グリコシル化は、一般的に、タンパク質の正確な折りたたみ、標的化及び生物活性にとって重要である。多くの封入されたウィルスにおいて、外被タンパク質は、糖部分の付加によって修飾され、外被タンパク質のＮ結合型グリコシル化は、受容体結合、膜融合、細胞への浸透及びウィルス出芽等のウィルス糖タンパク質の多岐にわたる機能を担う。最近の研究は、タンパク質の折りたたみ及び細胞内輸送、並びに赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質の生物活性及び抗原性における、ハンタンウィルス糖タンパク質のＮ結合型グリコシル化の役割を示してきた。更に、ウィルス外被タンパク質のグリコシル化が、ウィルス中和抗体反応を回避し、遮断し又は最小化するために、外被に封入された幾つもの異なるウィルスによって使用されているウィルスの免疫回避及び持続のための主要なメカニズムであることが明白になってきた。この効果の例は、ＳＩＶ及びＨＩＶ−１、ＨＢＶ、インフルエンザに関して報告されており、更に重要なことに、ＰＲＲＳＶ、アルテリウィルスＬＤＶの事例で報告されている。
【００５１】
近年、ＰＲＲＳＶに対する逆遺伝子系の開発が、本発明者を含む幾つもの研究室から報告されている。明らかに、感染性クローンを用いた変異性研究によって、アルテリウィルスのウィルスゲノムの転写及び複製機序がよりよく理解されるに至った。従って、生体内で感染性ウィルスを発生させ又は中和抗体を惹起させる上での、ＰＲＲＳＶのＧＰ５の生物活性におけるＮ結合型グリコシル化の重要性を検討するために、本発明者らは、個別に又は多様な組み合わせで、Ｎ結合型グリコシル化候補部位の各々が変異されたＧＰ５変異体タンパク質の系列を構築した。グリコシル化パターン、実験での接種を通じた、感染性ウィルス回収における役割及びｗｔ  ＰＲＲＳＶに対して又は変異体ウィルスに対して生じた抗体による交差中和における役割に関して、得られた変異体タンパク質を調べた。本データは、３つのグリコシル化候補部位が全て、高濃度マンノース型グリカンでのグリコシル化のために使用され、残基４４でのＧＰ５タンパク質のグリコシル化が、感染性ＰＲＲＳＶの回収にとって不可欠であることを示す。極めて重要なことに、中和及び抗体反応研究から得られた本発明者らのデータは、他のウィルスに対してすでに記載されているとおり、ＰＲＲＳＶによる天然の感染がグリカン遮蔽メカニズムを基礎とした免疫回避を伴い得、従って、ＰＲＲＳＶに感染した動物で観察される、あまり有効であない保護的液性免疫応答を説明するために役立ち得ることを示す。
【００５２】
Ｎ結合型グリコシル化部位及び不活化方法
糖タンパク質におけるＮ結合型グリコシル化は、典型的に、Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ＮＸＳ／Ｔ）配列（式中、Ｘａａ（Ｘ）は、Ｐｒｏ以外の何れかのアミノ酸残基である。）に生じる。多様な変異が、Ｎ結合型グリコシル化部位に導入されて、それらの不活化を付与することができる。不活化の好ましい方法は、アスパラギン残基を、アスパラギン以外の何れかのアミノ酸をコードする残基で置換することを含む。本発明のより好ましい実施形態において、アスパラギン残基は、アラニン又はグルタミン残基で置換される。
【００５３】
Ｎ結合型グリコシル化部位、特に配列番号１のＧＰ５参照タンパク質のアスパラギン３４及び／又は５１に対応するＮ結合型グリコシル化部位を不活化する他の方法も、本明細書で想定される。Ｘａａ位置のプロリン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はロイシン等の特定のアミノ酸の置換も、Ｎ結合型グリコシル化部位を不活化するために使用することができる（Ｋａｓｔｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３２３（２）：４１５−９，  １９９７）。あるいは、Ｎ結合型グリコシル化部位の最終ヒドロキシアミノ酸位置（すなわち、ＮＸＳ／Ｔ配列のセリン又はスレオニン残基）を、何れかの非ヒドロキシアミノ酸（すなわち、セリン又はスレオニン以外の何れかのアミノ酸）と置換することも、Ｎ結合型グリコシル化部位を不活化するために使用することができる。Ｎ結合型グリコシル化部位を不活化するために使用される非ヒドロキシアミノ酸の例は、システインを含む（Ｋａｓｔｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７０（２４），  １４７５６−１４７６１，  １９９５）。
【００５４】
アミノ酸置換に加え、アミノ酸の挿入又はアミノ酸の欠失等のＮ結合型グリコシル化部位を不活化する変異の他の種類も、本発明によって想定される。当業者は、Ｎ結合型グリコシル化部位が、ＮＸＳ／Ｔ配列中の中心的アミノ酸（すなわち、アスパラギン残基）を除去して、当該グリコシル化部位の不活化をもたらす欠失によって容易に不活化できることを理解する。Ｘ残基又はセリン／スレオニン残基の欠失は、Ｓ残基又はＴ残基の後に、天然に存在する配列中の別のＳ残基又はＴ残基が続かないある種のＮ結合型グリコシル化部位を同様に不活化することができる。Ｘが、非ヒドロキシアミノ酸である（すなわち、セリンでもスレオニンでもない）場合には、Ｎ残基のカルボキシ末端に何れかのアミノ酸残基を挿入することによって、Ｎ結合型グリコシル化部位を不活化することができる。Ｘ残基のカルボキシ末端に何れかの非ヒドロキシアミノ酸を挿入することによっても、Ｎ結合型グリコシル化部位を不活化することができる。
【００５５】
要約すれば、本発明を実施するために使用される変異の重要な特徴は、変異が、ＧＰ５タンパク質中のアスパラギン３４及び／又はアスパラギン５１の部位におけるＮ結合型グリコシル化を不活化することであることが理解される。理論によって限定されるものではないが、これらの変異の重要な特徴は、タンパク質のある種の領域（すなわち、配列番号１のＧＰ５参照タンパク質中のアスパラギン３４及び／又はアスパラギン５１の部位に対応する残基）におけるグリコシル化を防止することであると考えられる。これらの部位でグリコシル化を防止することによって、野生型ウィルスの重要なエピトープを通常遮蔽している糖残基が除去され、したがって、免疫応答の改善が誘発可能となる。その結果、同定されたＮ結合型グリコシル化部位を不活化するために、及び改善された免疫応答を誘発する抗原を取得するために、変異の多くの異なる種類（すなわち、アミノ酸の置換、挿入又は欠失）を使用できることが期待される。
【００５６】
本発明のＰＲＲＳＶポリヌクレオチド及びポリペプチドの説明
本発明の方法は、多様な異なる源から誘導され得る多様な異なるポリヌクレオチドを用いて実施することができる。ポリヌクレオチドの全ての共通した特徴は、配列番号１の参照ＧＰ５タンパク質におけるアスパラギン３４、アスパラギン５１、又はアスパラギン３４とアスパラギン５４の両者に対応するＮ結合型グリコシル化部位が不活化されている、低グリコシル化されたＰＲＲＳＶ  ＧＰ５ポリペプチドバリアントをコードすることである。配列番号１の参照ＧＰ５タンパク質中のアスパラギン３４及びアスパラギン５４に対応するＮ結合型グリコシル化部位を同定するために、非変異体及び正常にグリコシル化されたＰＲＲＳＶ  ＧＰ５ポリペプチド配列を、配列番号１の参照ＧＰ５タンパク質と並置することが可能である。このような並置の例は、図５及び６に示される。本配列比較において使用される具体的な配列が、表１に記載されている。
【００５７】
【表１】
2009506129.tif 000003
2009506129.tif 000004
2009506129.tif 000005
【００５８】
本発明の方法において不活化し、使用することができる配列番号１の参照ＧＰ５タンパク質中のアスパラギン３４又はアスパラギン５１に対応するＮ結合型グリコシル化部位を同定するために、所望の北米ＰＲＲＳＶ単離株（図５）又は欧州ＰＲＲＳＶ単離株（図６）のＧＰ５タンパク質が、配列番号１の参照ＧＰ５タンパク質（北米系ＮＶＳＬ９７−７８９５）と並置される。参照タンパク質として配列番号１のＧＰ５タンパク質を使用することによって、当業者は、何れかのＧＰ５タンパク質におけるＮ結合型グリコシル化部位を容易に同定することができ、次に、本発明の低グリコシル化されたＧＰ５タンパク質変異体を構築することができる。従って、「配列番号１の参照ＧＰ５タンパク質における（アスパラギン３４及び／又はアスパラギン５１）に対応する」という語は、何れかのＧＰ５タンパク質中のＮ結合型グリコシル化部位の記述子としての役割を果たすことが明らかである。
【００５９】
低グリコシル化されたＧＰ５タンパク質は、配列番号１ないし１３を含む（但し、これらに限定されるわけではない。）北米ＰＲＲＳＶ単離株、配列番号１４等の北米ＰＲＲＳＶコンセンサス配列とアミノ配列レベルで少なくとも８５％同一である北米ＰＲＲＳＶ単離株、又は北米ＰＲＲＳＶコンセンサス配列から取得され得る。低グリコシル化されたＧＰ５タンパク質は、配列番号１５を含む（但し、これに限定されるわけではない。）欧州ＰＲＲＳＶ単離株、配列番号１５等の欧州ＰＲＲＳＶコンセンサス配列とアミノ配列レベルで少なくとも８５％同一である欧州ＰＲＲＳＶ単離株、又は欧州ＰＲＲＳＶコンセンサス配列からも取得され得る。低グリコシル化されたＧＰ５変異体をコードするポリヌクレオチドを取得するために、上に列挙された源の何れかから得たポリヌクレオチドは、低グリコシル化されたＧＰ５変異体ポリペプチドをコードするように、標準的な部位特異的変異誘発技術によって変異誘発することができる。あるいは、望ましい低グリコシル化されたＧＰ５変異体ポリペプチドをコードする完全に合成のＤＮＡ配列を構築することが可能である。これは、典型的には、ポリペプチド配列を対応するポリヌクレオチド配列へと変換する「ｂａｃｋ  ｔｒａｎｓｌａｔｅ」等の配列分析プログラムを使用することによって達成される（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（商標）、Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。所望であれば、望ましい発現宿主（すなわち、哺乳動物又は酵母）中での使用に適したコドンを取り込んだ合成遺伝子の設計を与えるために、「ｂａｃｋ  ｔｒａｎｓｌａｔｅ」プログラム中に、適切な「コドンバイアス」が組み込まれる。
【００６０】
配列番号１の参照ＧＰ５タンパク質のアスパラギン５１に対応するＮ結合型グリコシル化部位は、図５に示される代表的な北米ＰＲＲＳＶ単離株の全てに、及び代表的な欧州ＰＲＲＳＶレリスタッド系に存在する（図６）。これらの典型的及び非限定的北米及び欧州ＰＲＲＳＶ系において、この位置でのＮ結合型グリコシル化部位は、配列「ＮＧＴ」を含む。しかしながら、他のＰＲＲＳＶバリアントが、本明細書で教示されている方法によって同様に不活化され得る、構造的に互換性のある他のＮ結合型グリコシル化部位をこの位置（すなわち、ＮＸＳ又はＴ）に含み得ることも予期される。Ｎ結合型グリコシル化部位は、対応するポリヌクレオチド配列において、アスパラギン５１の代わりに、グルタミン又はアラニン等の他のアミノ酸残基をコードするコドンを使用することによって不活化することができる。これらの場合、低グリコシル化された北米ＰＲＲＳＶＧＰ５タンパク質中での対応するアミノ酸配列は、「ＱＧＴ」、「ＡＧＴ」、又は「ＸＧＴ」等の配列を含み、ここで、Ｘは、アスパラギン以外の何れかのアミノ酸である。アスパラギン５１に対応するＮ結合型グリコシル化部位が不活化された北米ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５タンパク質単離株のこれら又は他の低グリコシル化された変異体は、他のＮ結合型グリコシル化部位が不活化された他の低グリコシル化されたＧＰ５変異体とも組み合わせられ得る。Ｎ結合型グリコシル化部位を不活化する他の方法は、ＮＸＳ／Ｔ配列の「Ｘ」又は「Ｓ／Ｔ」残基のアミノ酸置換、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含み、上に記載されている。
【００６１】
配列番号１の参照ＧＰ５タンパク質のアスパラギン３４に正確に対応するＮ結合型グリコシル化部位は、本明細書に示されているある種の代表的な北米ＰＲＲＳＶ単離株中のみに存在する。より具体的には、代表的な北米ＰＲＲＳＶ単離株であるＩＡＦ−ＢＡＪ（配列番号３）、９４−３１８２（配列番号７）及び９４−２８７（配列番号８）のＧＰ５タンパク質は、配列番号１の参照ＧＰ５タンパク質のアスパラギン３４に正確に対応するＮ結合型グリコシル化部位を含有し、Ｎ結合型グリコシル化部位「ＮＳＳ」を含む。本明細書に示されていない他のＰＲＲＳＶＧＰ５単離株は、配列番号１の参照ＧＰ５タンパク質のアスパラギン３４に対応するＮ結合型グリコシル化部位も含有し、これらの他のＧＰ５タンパク質の低グリコシル化されたバリアントも、本明細書に記載されている方法を使用して取得できることは、もちろん予期される。配列番号３、７及び８のこのＮ結合型グリコシル化部位又はアスパラギン３４Ｎ結合型グリコシル化部位を含有する他のＰＲＲＳＶ単離株は、対応するポリヌクレオチド配列中のアスパラギン３４の代わりに、グルタミン又はアラニン等の他のアミノ酸残基をコードするコドンを使用することによって不活化することが可能である。アスパラギン３４におけるＮ結合型グリコシル化部位が「ＮＳＳ」である場合には、低グリコシル化された北米ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５タンパク質変異体中の対応するアミノ酸配列は、「ＱＳＳ」、「ＡＳＳ」、又は「ＸＳＳ」等の配列を含む（Ｘは、アスパラギン以外の何れかのアミノ酸である。）。あるいは、「ＮＳＳ」配列のセリン残基は、非ヒドロキシアミノ酸（すなわち、非スレオニンの非セリン）で置換することができる。これらの場合、低グリコシル化された北米ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５タンパク質バリアント中の対応するアミノ酸配列は、配列「ＮＳＸ」を含む（Ｘは、アスパラギン以外の何れかのアミノ酸である。）。この特定のグリコシル化部位を不活化するために、「ＮＳＳ」配列の２つのセリン残基の間への（すなわち、セリン３５と３６の間への）非ヒドロキシアミノ酸の挿入も使用することができる。
【００６２】
配列番号１の参照ＧＰ５タンパク質のアスパラギン３４に正確に対応するＮ結合型グリコシル化部位を欠失する他の北米ＰＲＲＳＶ単離株において、残基３０（配列番号２、３、４、６、７、８、９、１１、１３における図５の「ＮＡＳ」）及び残基３３（配列番号３、８における図５の「ＮＮＳ」、配列番号６、１０における「ＮＳＳ」、配列番号１１、１３における「ＮＤＳ」）に位置する他のＮ結合型グリコシル化部位も不活化することができる。換言すれば、配列番号１の参照ＧＰ５タンパク質の残基３０及び３３に対応するアミノ酸の位置に位置する、他の北米単離株中のＮ結合型グリコシル化部位を不活化することも可能であり、本発明の方法において使用することができる。理論によって限定されるものではないが、配列番号１のＧＰ５参照タンパク質の残基２９と残基３５との間に位置するＰＲＲＳＶ  ＧＰ５タンパク質の領域は、多様な異なるアミノ酸配列を許容できる超可変領域（図５）であるように思われる（図５；Ｐｉｒｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎ．Ｊ．Ｖｅｔ  Ｒｅｓ．，１９９８，  ６２：１７０−１７７も参照されたい。）。天然に存在するある種のＰＲＲＳＶ単離株は、この領域（すなわち、配列５、１２の北米単離株、配列番号１５の欧州単離株）中にＮ結合型グリコシル化部位を含有しないが、他の単離株は、この領域中に１ないし３個のグリコシル化部位を含有し得る。その結果、配列番号１のＧＰ５参照タンパク質の残基２９と残基３５の間に位置する領域において、所定のＧＰ５タンパク質のグリコシル化部位の何れか１つを不活化することが、ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５タンパク質に対する改善された免疫応答を誘発するための組成物又は方法として、本明細書において想定される。更に、配列番号１のＧＰ５参照タンパク質の残基２９と残基３５の間に位置する領域において、所定のＧＰ５タンパク質のグリコシル化部位の２つ以上又は全てを不活化することも、ＰＲＲＳＶＧＰ５タンパク質に対する改善された免疫応答を誘発するための組成物又は方法として、本明細書において想定される。
【００６３】
北米及び欧州ＰＲＲＳＶ配列の並置は、配列番号１の参照ＧＰ５タンパク質のアスパラギン５１に対応するＮ結合型グリコシル化部位が、代表的な欧州ＰＲＲＳＶ単離株中にも存在することを示す。この事例において、Ｎ結合型グリコシル化部位は、配列「ＮＧＴ」を含み、配列番号１参照配列のアスパラギン５１は、配列番号１５のアスパラギン５３に対応する。このＮ結合型グリコシル化部位は、対応する欧州ＰＲＲＳＶポリヌクレオチド配列において、グルタミン又はアラニン等の他のアミノ酸残基をコードするコドンを、アスパラギン５３の代わりに使用することによって不活化できる。これらの場合、低グリコシル化された欧州ＰＲＲＳＶＧＰ５タンパク質変異体中の対応するアミノ酸配列は、「ＱＧＴ」、「ＡＧＴ」又は「ＸＧＴ」等の配列を含む（Ｘは、アスパラギン以外の何れかのアミノ酸である。）。アスパラギン５１に対応するＮ結合型グリコシル化部位が不活化されている欧州ＰＲＲＳＶ単離株のこれら又は他の低グリコシル化された変異体は、他のＮ結合型グリコシル化部位が不活化されている他の低グリコシル化されたＧＰ５変異体とも組み合わせられ得る。
【００６４】
低グリコシル化されたＧＰ５変異体タンパク質は、ＰＲＲＳＶ感染からブタを保護するための生ワクチン、不活化ワクチン又は弱毒ワクチンを調製するために使用することができるＰＲＲＳウィルスによってコードされ得る。本発明の好ましい実施形態において、本発明の低グリコシル化されたＧＰ５変異体タンパク質は、感染性ＰＲＲＳＶのＲＮＡを産生することができる感染性ＰＲＲＳＶクローンへ加工される。低グリコシル化されたＧＰ５変異体タンパク質をコードするように加工され得る感染性北米ＰＲＲＳＶクローンに関する記述は、米国特許第６，５００，６６２号、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：３７０２−１１，  ２００３、及びＴｒｕｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３２５：３０８−１９，  ２００４に見出される。ワクチン中で使用するためのＰＲＲＳＶウィルスを得るために変異誘発され得る北米ＰＲＲＳＶ感染性クローン配列には、北米ＮＶＳＬ９７−７８６５系（配列番号１６）及びＶＲ−２３３２系（配列番号１７）が含まれるが、これらに限定されるものではない。低グリコシル化されたＧＰ５変異体タンパク質をコードするように加工され得る感染性欧州ＰＲＲＳＶクローンに関する記述は、米国特許第６，２６８，１９９号に見出される。ワクチンが、生のＰＲＲＳＶ又は弱毒されたＰＲＲＳＶを含む実施形態において、配列番号１の参照ＧＰ５タンパク質中のＮ４４に対応するＮ結合型グリコシル化部位（すなわち、図５及び６の「ＮＬＴ」配列）は、この部位のグリコシル化がＰＲＲＳＶの感染性に必要であるので、不活化されない。欧州ＰＲＲＳＶ単離株の場合には、配列番号１の参照ＧＰ５タンパク質中のＮ４４に対応するＮ結合型グリコシル化部位は、代表的な欧州ＰＲＲＳＶレリスタッド系（配列番号１５、図６）のアスパラギン４６で始まるＮＬＴ配列である。欧州ＰＲＲＳＶ系のＮ４６Ｎ結合型グリコシル化部位も、感染性に必要であり、生の又は弱毒したＰＲＲＳＶワクチンが使用される本発明の実施形態において不活化されない。
【００６５】
あるいは、低グリコシル化されたＧＰ５変異体タンパク質は、ＤＮＡワクチンとともにブタへ導入できる。このようなＤＮＡワクチンは、典型的には、哺乳動物細胞中で活性なプロモーターが、低グリコシル化されたＰＲＲＳＶ  ＧＰ５ポリペプチドバリアントをコードするポリヌクレオチドへ作用可能に連結されたＤＮＡ分子を含む。低グリコシル化されたＧＰ５バリアントタンパク質の発現を誘導するために使用することができるプロモーターは、ＣＭＶ（サイトメガロウィルス）最初期プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウィルス）長期反復プロモーター及びＳＶ４０（サルウィルス４０）Ｔ抗原プロモーターを含むが、これらに限定されるわけではない。ある実施形態において、このプロモーターは、ＣＭＶプロモーターである。
【００６６】
更なる他の実施形態において、低グリコシル化されたＧＰ５変異体タンパク質を発現する単離されたポリヌクレオチドは、ＰＲＲＳＶ以外のウィルスベクターを含む。ＰＲＲＳＶ以外のウィルスベクターは、ワクシニアウィルスベクター、単純ヘルペスウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アルファウィルスベクター及びＴＧＥＶベクターを含むが、これらに限定されるわけではない。このようなベクターは、（ＴＧＥＶベクターに関する）米国特許第７，０４１，３００号及び（アルファウィルスベクターに関する）第６，６９２，７５０号等の多様な刊行物中に記載されている。
【００６７】
治療上許容される担体及びアジュバント
本発明を実施する際に、低グリコシル化されたＧＰバリアントポリペプチド又は低グリコシル化されたＧＰ５バリアントポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、治療上許容される担体又は賦形剤と組み合わせられ得る。このような担体に関する非限定的な例には、生理塩類溶液又は他の同様の塩類溶液、血清アルブミンタンパク質等のタンパク質、炭酸塩、リン酸塩、ホスホン酸塩又はトリスベースの緩衝液等の緩衝液、ＮＰ４０又はトリトンＸ１００等の界面活性剤、及びポリエチレングリコールポリマーが含まれる。このような担体の何れの組み合わせも、本発明の組成物及び方法において使用することができる。生の又は弱毒したＰＲＲＳＶウィルスを含む組成物のための好ましい担体は、５０ないし１００ｍｇ／ｍＬの間の濃度の酢酸ｄｌ−α−トコフェロールである。
【００６８】
低グリコシル化されたＧＰ５バリアントポリペプチド又は低グリコシル化されたＧＰ５バリアントポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの何れかを含有する組成物中でのアジュバントの使用も想定される。このようなアジュバントは、典型的には、実際、水性又は油性の何れかである。使用できるアジュバントは、水酸化アルミニウム、キルＡ、アルミナゲル懸濁液、ミネラルオイル、グリセリド、脂肪酸、脂肪酸副産物、マイコバクテリア、及びＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド又はこれらの何れかの組み合わせが含まれるが、これらに限定されるわけではない。使用できるＣｐＧアジュバントの多様な種類は、米国特許第６，９７７，２４５号及び第６，４０６，７０５号に記載される。
【００６９】
細胞の免疫応答を増強させる他のアジュバント（すなわち、Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ．ｓｕｂ．１及びＴｈ．ｓｕｂ．２）亜集団増強物質）の使用も想定される。このようなアジュバントには、インターロイキン１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ガンマインターフェロン（ｇ−ＩＦＮ）、細胞壊死因子、ＭＤＰ（ムラミルジペプチド）、免疫賦活薬複合体（ＩＳＣＯＭ）及びリポソームが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００７０】
組成物の投与は、皮下注射、静脈内注射、皮内注射、非経口注射、筋肉内注射、無針注射、電気穿孔法、経口送達、鼻内送達、口腔鼻送達又はこれらの何れかの組み合わせによって達成できる。無針注射は、典型的には、Ａｇｒｏ−Ｊｅｔ（登録商標）注射器（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）等のデバイスで典型的に達成される。
【００７１】
(実施例)
【実施例１】
【００７２】
以下の実施例は、低グリコシル化された多様な北米ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５ポリペプチドバリアントをコードする多様なＰＲＲＳＶの構築、ＰＲＲＳＶ抗原に対する改善された免疫応答を誘発するために使用されるこのようなポリヌクレオチドを含む組成物、及びＰＲＲＳＶ抗原に対するブタにおける改善された免疫応答を誘発するための組成物を説明する。
【００７３】
材料及び方法
細胞、培地、及び抗体  
１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び増殖培地１ｍＬあたりペニシリン１００単位、ストレプトマイシン２０単位及びカナマイシン２０単位を含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、ＭＡＲＣ−１４５細胞を増殖させた。ＲＮＡ電気穿孔法、ウィルス感染、ウィルス増殖及びプラークアッセイのために、これらの細胞を使用した。５％ＦＢＳ及び上述の抗生物質を含有するアールの塩を有する基礎培地（ＭＥＭ）中で、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ−２１）細胞を維持した。ＧＰ５の一過性発現の後の免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）又は放射能標識及び免疫沈降実験の何れかのために、ＢＨＫ−２１細胞を使用した。全ての細胞を３７℃及び５％ＣＯ２の環境で維持した。ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５及びＭタンパク質に対するウサギポリクローナル抗体は、Ｃａｒｌ  Ａ．Ｇａｇｎｏｎ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｑｕｅｂｅｃ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）から頂いた。ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）に対するモノクローナル抗体は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＮＶＳＬ，Ａｍｅｓ，ＩＡ，ＵＳＡ）から購入した。抗マウスＡｌｅｘａ−４８８は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）から入手した。
【００７４】
ＧＰ５及びＰＲＲＳＶ感染性クローンをコードするプラスミドの遺伝子操作
ｐＢＲ３２２中の完全長のＰＲＲＳＶ感染性ｃＤＮＡクローン（ＦＬ１２、配列番号１６）を、ＥｃｏＲＶ及びＢｓｔＺ１７Ｉ制限酵素で消化し、同一酵素部位を使用して、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、完全なＯＲＦ３ないし７及び全体的な３’ＵＴＲを包含する約４．９ｋｂｐの断片をｐＢＲ３２２中にクローニングした。この中間体プラスミドは、突然変異誘発のためのテンプレートとしての役割を果たし、ＧＰ５内のＮ結合型グリコシル化候補部位（Ｎ３４、Ｎ４４、及びＮ５１）に変異を導入した（図２）。突然変異誘発は、標準的な技術を使用して、合成プライマー（表２）による重複伸長ＰＣＲを使用して実施した。
【００７５】
【表２】
2009506129.tif 000006
【００７６】
ＢｓｒＧＩ及びＢｓｔＥＩＩ制限酵素でＰＣＲ産物を消化し、中間体プラスミド中に戻した。望ましい変異を含有するクローンを同定し、配列決定によって確認した。ＧＰ５のコード領域全体を配列決定し、クローン中に更なる変異が存在しないことを確認した。同一制限酵素部位を使用して、ＧＰ５コード領域中に変異を含有する中間体プラスミドからのＥｃｏＲＶ−ＰａｃＩ断片を、全長のｃＮＤＡクローン中に戻した。全長のクローン中のＧＰ５コード領域を再度、ＰＲＲＳＶ特異的内部プライマーで配列決定し、変異の存在を確認した。
【００７７】
ＧＰ５が第一シストロンであり、その後に、脳心筋炎ウィルス（ＥＭＣＶ）配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）及びＭコード配列が続くバイシストロン性ベクター中にｗｔ  ＧＰ５及び個々の変異をクローニングした（図１Ａ）。相補性研究のため、完全長のＧＰ５も、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるベクター（ｐｃＤＮＡ３．０（商標）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）中にクローニングした。この目的のため、ＧＰ５コード領域をＰＣＲ増幅し、クローニングし、配列決定した。
【００７８】
インビトロでの転写及び電気穿孔法
完全長プラスミドをＡｃｌＩで消化し、直鎖化したＤＮＡをテンプレートとして使用して、製造元（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｘ，ＵＳＡ）の推奨どおりに、及び上述のとおり、ｍＭＥＳＳＡＧＥ  ｍＭＡＣＨＩＮＥ  Ｕｌｔｒａ  Ｔ７（商標）キットを使用して、キャッピングされたＲＮＡ転写産物を得た。反応混合物をＤＮａｓｅＩで処理して、ＤＮＡテンプレートを消化し、フェノール及びクロロホルムで抽出し、最後にイソプロパノールで沈殿させた。インビトロでの転写産物の完全性を、グリオキサルアガロースゲル電気泳動後の臭化エチジウム染色によって分析した。
【００７９】
ＭＡＲＣ−１４５細胞から単離した全ＲＮＡ５．０μｇとともに、インビトロでの転写産物約５．０μｇをＭＡＲＣ−１４５細胞に電気穿孔した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ（商標）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、１．２５％ＤＭＳＯを含有するＤＭＥＭ４００μＬ中の約２×１０６個の細胞を、４．０ｍｍキュベット中にて、２５０Ｖ、９５０μＦで１回パルスした。標準的な増殖培地中に前記細胞を希釈し、６０ｍｍ細胞培養プレート中に播種した。電気穿孔された細胞の少量を２４ウェルプレート中に播種し、電気穿孔から４８時間後のＮタンパク質の発現（これは、ゲノムの複製及び転写を示す。）を検討した。間接的免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）を使用して、Ｎタンパク質の発現を一度確認すると、６０ｍｍプレート中の電気穿孔された細胞のバルクから得た上清を、電気穿孔から４８時間後に回収し、清澄化し、未処理のＭＡＲＣ−１４５細胞上へと通過させた。ＩＦＡを使用して、Ｎタンパク質の発現とともに、細胞変性効果（ＣＰＥ）について、感染した細胞を観察した。ＣＰＥ及び正の蛍光の両者を示す感染細胞から得た上清を、感染性ウィルスを含有するように割り当てた。確認後、ウィルス原株を増殖させ、更なる研究のため、少量の一定分量で、−８０℃で凍結した。全ての実験において、ｗｔＰＲＲＳＶゲノムを含有するＦ１２及びポリメラーゼ欠損ＰＲＲＳＶゲノムを含有するＦＬ１２ｐｏｌを対照として使用した。
【００８０】
タンパク質の代謝性放射能標識及び分析
３．０の感染効率で、組換えワクシニアウィルス（ｖＴＦ７−３）で６ウェルプレート中のＢＨＫ−２１細胞を感染させた後、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの下で、ｗｔ又は多様な変異体のＧＰ５をコードするバイシストロン性プラスミドＤＮＡを形質移入した。製造元のプロトコールどおりに、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商標）を使用して、ＤＮＡ形質移入を実施した。形質移入１６時間後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、メチオニン／システイン無添加ＤＭＥＭ中で１時間飢餓状態にし、培地１ｍＬあたりＥｘｐｒｅ３５Ｓ３５Ｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｍｉｘ（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）１００μＣｉを含有するメチオニン／システイン無添加ＤＭＥＭ０．６ｍＬで放射能標識した。放射能標識後、冷ＰＢＳで細胞を３回洗浄し、放射性免疫沈澱法（ＲＩＰＡ）緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００、０．１％ＳＤＳ、１％デオキシコール酸ナトリウム、及び１×プロテアーゼ阻害剤）３００μＬ中で細胞抽出物を調製した。ウサギ抗ＧＰ５抗体又は抗Ｍタンパク質抗体とともに、清澄化した細胞抽出物を４０℃で一晩温置した。１００μＬのＲＩＰＡ緩衝液中のタンパク質Ａセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）約４．０ｍｇのスラリーを添加し、更に２時間温置した。免疫沈降した複合体をＲＩＰＡ緩衝液５００μＬで３回洗浄し、更なる分析のために使用した。
【００８１】
エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ  Ｈ）処理のために、免疫沈降した複合体を１×変性緩衝液（０．５％ＳＤＳ、１．０％β−メルカプトエタノール）２０μＬ中に再懸濁し、１０分間煮沸した。上清を回収し、１×Ｇ５緩衝液（０．０５Ｍクエン酸ナトリウム  ｐＨ５．５）に調整し、Ｅｎｄｏ  Ｈ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）１００単位とともに３７℃で１６時間温置した。未消化の対照試料を同様に処理したが、Ｅｎｄｏ  Ｈは添加しなかった。Ｅｎｄｏ  Ｈ消化の後、試料を等容積の２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液と混合し、５分間煮沸し、タンパク質マーカー（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｉｎｃ）とともに変性条件下でのＳＤＳ−１２％ＰＡＧＥによって分離した。ゲルを１０％酢酸で１５分間固定し、水で３回洗浄し、０．５Ｍサリチル酸ナトリウムで３０分間処理し、乾燥させ、最後にＸ線フィルムへ−７０℃で曝露した。ペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ）消化のため、免疫沈降させた複合体を１×Ｇ７緩衝液（０．０５Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７．５、１．０％ＮＰ−４０）中に再懸濁し、酵素２単位とともに３７℃で１６時間温置することによって消化を行った。ツニカマイシン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在下でのＧＰ５の合成を検討するために、形質移入した細胞を、培地１ｍＬあたりツニカマイシン２．０μｇで１時間処理し、上述のとおり、薬物の存在下で放射能標識を３時間実施した。
【００８２】
放射能標識された細胞外ウィルス粒子又は細胞内ウィルスにより発現されたＧＰ５を得るため、ＭＡＲＣ−１４５細胞をｗｔ又は変異体のＰＲＲＳＶで感染させた。感染から４８時間後、細胞を１時間飢餓状態にし、９０％メチオニン／システイン無添加ＤＭＥＭ及び１０％標準ＤＭＥＭを含有する培地１ｍＬあたりＥｘｐｒｅ３５Ｓ３５Ｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｍｉｘ１００μＣｉで２４時間放射能標識した。標識後、培養上清を回収し、細胞細片を除去し、細胞外ウィルス粒子を４℃、１００，０００×ｇで３時間ペレットにした。ウィルスペレットをＲＩＰＡ緩衝液２００μＬ中に再懸濁し、抗ＧＰ５抗体で免疫沈降し、Ｅｎｄｏ  Ｈ処理のあり又はなしに、タンパク質を調べた。細胞内ウィルスによって発現されたＧＰ５の免疫沈降のために、上述のとおり感染を実施し、感染から２４時間後、細胞を１時間飢餓状態にし、上述のとおり２時間放射能標識した後、細胞抽出物を調製した。
【００８３】
ウィルス増殖動態及びプラークアッセイ
細胞あたり３．０ＰＦＵの感染効率で、変異体又はｗｔ  ＰＲＲＳＶでＭＡＲＣ−１４５細胞を感染させ、インキュベーター中、３７℃で温置した。感染後の多様な時点で、感染した細胞からの培養上清の一定分量を回収し、上清中のウィルス力価を測定し、１ｍＬあたり組織培養感染用量５０（ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）によって表した。ウィルス増殖動態実験を３回実施した。変異体ウィルスのプラーク形態を検討するために、ＭＡＲＣ−１４５細胞を使用してプラークアッセイを実施した。個々のウィルスの１０倍連続希釈で細胞を３７℃で１時間感染させた。感染した細胞の単層をＰＢＳで洗浄し、０．８％Ｓｅａｐｌａｑｕｅアガロース（ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ  ＵＳＡ）を含有するＤＭＥＭ−５％ＦＢＳで覆った。９６時間後、アガロースプラグを除去し、細胞の単層を染色溶液（２０％ホルムアルデヒド、９．０％エタノール、及び０．１％クリスタルバイオレット）とともに室温で３０分間温置した。細胞を水で穏やかに洗浄し、過剰の染色剤を除去し、空気乾燥させて、プラークを検討及び計数した。
【００８４】
トランス中でｗｔ  ＧＰ５を発現させることによるウィルス回収の補完
ＢＨＫ−２１細胞をｐｃＤＮＡ−ＧＰ５で形質移入した。形質移入から４０時間後に、細胞を回収し、ＧＰ５変異体をコードする完全長のＰＲＲＳＶ  ｃＤＮＡに由来するキャッピングされたインビトロ転写産物で電気穿孔した。電気穿孔された細胞を新鮮な培地で希釈し、６ウェルプレート中に播種した。電気穿孔された細胞に由来する上清を電気穿孔から４８時間後に回収し、遠心分離して細胞細片を除去し、未処理のＭＡＲＣ−１４５細胞を感染させるために使用した。感染から４８時間後に、上述のとおり、ＩＦＡによるＮタンパク質の発現に関して、感染したＭＡＲＣ−１４５細胞を検討した。正の細胞数を計数し、上清中に生じた偽の粒子の数を決定した。正の細胞の平均数を３つの独立した実験から算出し、細胞中へ形質移入したインビトロで転写したＲＮＡ１μｇあたりに生じた偽の粒子の数として表した。
【００８５】
血清中和（ＳＮ）アッセイ
血清試料中のＰＲＲＳＶ中和抗体の力価を、上述の蛍光焦点中和アッセイを使用して測定した。５％ウシ胎仔血清を含有するダルベッコ変法イーグル培地中のＦＬ１２（ｗｔ  ＰＲＲＳＶ）又は、ＧＰ５変異体をコードするウィルスであるＦＬ−Ｎ３４Ａ、ＦＬ−Ｎ５１Ａ、及びＦＬ−Ｎ３４／５１Ａの何れかからなる曝露ウィルスの２００  ＴＣＩＤ５０の存在下で、検査血清の連続希釈物を、３７℃で６０分間温置した。４８時間早く播種しておいた集密状態のＭＡＲＣ−１４５細胞を含有する９６ウェル微量滴定プレートへ混合物を添加した。５％ＣＯ２を含有する湿度のある大気中にて、３７℃で２４時間温置した後、５０％メタノール及び５０％アセトンの溶液で細胞を１０分間固定した。ＰＢＳによる全面的な洗浄の後、１：５００希釈を使用するモノクローナル抗体ＳＤＯＷ１７の後に、１：１００希釈でのＦＩＴＣが連結されたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）でＰＲＲＳＶのＮタンパク質の発現を検出した。対照ウェル中に存在する病巣の９０％を阻害した最大希釈の逆数として、中和力価を表した。
【００８６】
ＧＰ５変異体及びｗｔＰＲＲＳＶによるブタの実験的接種
ＧＰ５変異体ウィルス（ＦＬ−Ｎ３４Ａ、ＦＬ−Ｎ５１Ａ及びＦＬ−Ｎ３４／５１Ａ）及びＦＬ１２（ｗｔ  ＰＲＲＳＶ）の（ＭＡＲＣ１４５細胞中の３継代を通じて得られた）高い力価のストックを使用して、若齢ブタを感染させた。ＰＲＲＳＶ感染がないことを保証する記録を有する特定病原体除去の群れから近日中に離乳した２１日齢のブタを購入した。ＥＬＩＳＡ（Ｉｄｄｅｘ  Ｌａｂｓ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＭＥ）によって検査されたところによると、全ての動物は、抗ＰＲＲＳＶ抗体に関して陰性であった。１群あたり３匹のブタに、ＦＬ１２ｗｔ  ＰＲＲＳＶ又はＦＬ−Ｎ３４Ａ、ＦＬ−Ｎ５１Ａ、及びＦＬ−Ｎ３４／５１Ａ変異体の何れかを感染させた。全ての場合、種菌は、２ｍＬに希釈した１０５  ＴＩＣＤ５０からなり、頸部に筋肉内投与された。接種した動物の直腸温を、接種後（ＰＩ）１５日間モニターした。４、７及び１４ＰＩでＭＡＲＣ１４５細胞を定期的に単離することによって、ウィルス血症を測定した。血清試料を毎週採取し、その期間全体は感染後４９日間であった。血清試料を使用して、変異体及びｗｔ  ＰＲＲＳＶの各々に関する類似の及び異種性の交差中和力価を検出した。
【００８７】
結果
ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５の発現及び特徴
ＰＲＲＳＶ９７−７８９５系のＧＰ５は、３つのグリコシル化候補部位（Ｎ３４、Ｎ４４、及びＮ５１）を有する。ＧＰ５のグリコシル化パターンを検討するために、本発明者は、まず、ＥＭＣＶからのＩＲＥＳに隣接するＧＰ５及びＭタンパク質のコード領域が、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの調節下に配置されたバイシストロン性ベクターを作製した（図１Ａ）。バイシストロン性ベクターを構築するための論拠は、ＧＰ５及びＭタンパク質が互いに相互作用することが公知であり（ＬＤＶ及びＥＡＶの場合）又は（ＰＲＲＳＶの場合）推定されていること、並びに、このような相互作用は、ＧＰ５のタンパク質の折りたたみ、グリコシル化、細胞内輸送、及び／又は他の生物活性にとって重要であり得ることである。
【００８８】
バイシストロン性プラスミドの形質移入によるＧＰ５及びＭの一過性発現後の放射能標識及び抗ＧＰ５抗体による免疫沈降は、２つの主要なタンパク質種を明らかにした。約２５．５ｋＤａの質量で移動するタンパク質種は、ＧＰ５の完全にグリコシル化された形態である（図１Ｂ、レーン２）。Ｎ結合型各グリコシル化は、分子量約２．５ｋＤａをタンパク質に付加するので、このことは、３つのグリコシル化候補部位が全て、おそらく、ＧＰ５のグリコシル化のために使用されることを示す。前記タンパク質種も抗Ｍ抗体で免疫沈降したので（レーン７）、１９．０ｋＤａタンパク質種は、ウィルス性Ｍタンパク質である。本結果は、ＧＰ５及びＭタンパク質が、両タンパク質を発現する細胞中で互いに相互作用することを示す。高濃度マンノース種のオリゴ糖鎖を除去する酵素であるＥｎｄｏ  Ｈで処理すると、ＧＰ５のサイズは、約１８ｋＤａまで低下するのに対し、Ｍタンパク質のサイズは変化しないままであった（レーン３）。タンパク質主鎖から全ての種類の糖を除去する酵素であるＰＮＧａｓｅＦによるＧＰ５の処理（レーン４）又はツニカマイシンの存在下でのＧＰ５の合成（レーン５）は、Ｅｎｄｏ−Ｈ処理をしたタンパク質よりもわずかに迅速な電気泳動度で移動するタンパク質を生じた。ツニカマイシン処理又はＰＮＧａｓｅＦによる消化が、グリコシル化されていないタンパク質を生じるのに対し、Ｅｎｄｏ−Ｈ処理は、Ｎ結合型グリコシル化部位の各々にＮ−アセチルグルコサミン残基を保持するタンパク質を生じるので、これは予想される。約３０ｋＤａ分子量の主なタンパク質種が、抗Ｍ抗体で免疫沈降されたことには注目すべきである。このタンパク質の正体は不明であるが、Ｍタンパク質と相互作用する細胞内タンパク質であり得る。
【００８９】
上記研究から得られた結果は、ＧＰ５のグリコシル化されていない形態及び完全にグリコシル化された形態が、それぞれ、１８．０ｋＤａ及び２５．５ｋＤａの見かけの分子量を有することを示唆する。ＧＰ５の完全にグリコシル化した形態を生成するために、３つのグリコシル化候補部位が全て使用されるようである。前記部分がＥｎｄｏ  Ｈによる消化に対して高感度であるので、これらの部位へ付加されるグリカン部分は、高濃度のマンノース種である。更に、本結果は、ＧＰ５のグリコシル化されていない形態と完全にグリコシル化された形態の両者が、Ｍタンパク質と相互作用するようであることを示す。
【００９０】
ＧＰ５のグリコシル化に使用されるＮ結合型グリコシル化部位の分析
ＧＰ５中のＮ結合型グリコシル化候補部位の全て又は幾つかが糖部分の付加のために使用されるかどうかをより正確に決定するために、３つのグリコシル化候補部位Ｎ３４、Ｎ４４及びＮ５１（図２Ａ）が全て、個別に又は多様な組み合わせで、アラニンへ変化された（図２Ｂ）バイシストロン性プラスミド中に一連の変異体を作製した。プラスミドで形質移入された細胞において、前記タンパク質を放射能標識し、抗ＧＰ５抗体で免疫沈降した。免疫複合体は、Ｅｎｄｏ  Ｈで未処理のままとし、又は処理されるかの何れかであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検査した。図２Ｃにあるデータから明らかなように、単一の変異（Ｎ３４Ａ、Ｎ４４Ａ又はＮ５１Ａ）を有するＧＰ５変異体タンパク質は、約２３．０ｋＤａのタンパク質種として移動した（レーン４、６及び８、矢印）。Ｅｎｄｏ  Ｈで処理すると、これらのタンパク質は、Ｅｎｄｏ  Ｈ処理後のｗｔＧＰ５（レーン３）と同様、約１８．０ｋＤａのタンパク質種として移動した（それぞれレーン５、７及び９）。前記タンパク質の電気泳動による移動度のわずかな差異は、２つのＮ−アセチルグルコサミン残基を含有する単一変異体と比較して、ｗｔタンパク質は、Ｅｎｄｏ  Ｈ処理後に３つのＮ−アセチルグルコサミン残基を全て保持するという事実を反映している可能性が最も高い。二重変異体（Ｎ３４／４４Ａ、Ｎ４４／５１Ａ及びＮ３４／５１Ａ）は、約２０．５ｋＤａタンパク質近くに移動するタンパク質種を生じ（レーン１０、１２及び１４）、Ｅｎｄｏ  Ｈ処理の際、タンパク質のサイズが１８．０ｋＤａまで低下した（レーン１１、１３、及び１５）。三重変異体（Ｎ３４／４４／５１Ａ）は、１８．０ｋＤａタンパク質として移動するタンパク質を生じ（レーン１６）、Ｅｎｄｏ  Ｈ消化に対して耐性があった（レーン１７）。
【００９１】
従って、上述の変異性研究から、３つのグリコシル化候補部位が全てグリコシル化に使用され、完全に成熟したＰＲＲＳＶ  ＧＰ５を生じることが明らかである。３つのグリコシル化部位は全て、高濃度マンノース種のグリカン部分によって修飾されるようである。
【００９２】
ＧＰ５変異体による感染性ＰＲＲＳＶウィルスの回収
感染性ＰＲＲＳＶの産生におけるＮ結合型グリコシル化の重要性を評価するために、ＧＰ５変異体タンパク質のコード領域を完全長のｃＤＮＡクローン中に挿入した。クローンから生じたキャッピングされたインビトロ転写産物をＭＡＲＣ−１４５細胞中に電気穿孔し、感染性ＰＲＲＳＶの産生を検討した。この結果は、Ｎ３４、Ｎ５１及びＮ３４／５１に変異を含有する完全長の転写産物で電気穿孔された細胞から、感染性ウィルスが容易に回収されることを示した。回収されたウィルスの増殖動態は、ｗｔウィルスのものと同様であるが、Ｎ３４及びＮ５１に変異を含有するＦＬ−Ｎ３４Ａ及びＦＬ−Ｎ５１Ａウィルスの全体的な収量は、ＭＡＲＣ−１４５細胞では約１桁低いのに対し、二重変異（Ｎ３４／５１Ａ）を有するＦＬ−Ｎ３４／５１Ａは、ｗｔ  ＰＲＲＳＶよりもほぼ１．５対数低かった（図３Ａ）。感染した細胞からのＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅後のヌクレオチド配列決定は、これらのウィルスが安定であり、所望の変異を含有し、他の変異がＧＰ５領域全体に検出されなかったことを示した（データは示さず）。
【００９３】
ＭＡＲＣ−１４５細胞に対してウィルスプラークアッセイを実施し、変異体ウィルスのプラーク表現型をモニターした。ｗｔ  ＰＲＲＳＶによって生じたプラークは清澄であり、明瞭であったのに対し、変異体ウィルスは、異なる表現型を有するプラークを産生した。ＦＬ−Ｎ３４Ａ、ＦＬ−Ｎ５１Ａ及びＦＬ−Ｎ３４／５１Ａウィルスは、より明瞭でないプラークを生じ、前記プラーク内の細胞の多くが正常であるように見えた（図３Ｂ、塗りつぶされていない矢印）。更に、ＦＬ−Ｎ５１Ａ、ＦＬ−Ｎ３４／５１Ａは、ウィルスが細胞単層を排除できなかった幾つかのプラークを産生した（図３Ｂ、塗りつぶされた矢印）。本データは、ｗｔ  ＰＲＲＳＶと比較すると、回収された変異体ウィルスは、実際、細胞変性がより少ないことを示す。
【００９４】
本発明者は、変異体テンプレートＦＬ−Ｎ４４Ａ、ＦＬ−Ｎ３１／４４Ａ、ＦＬ−Ｎ４４／５１Ａ及びＦＬ−Ｎ３１／４４／５１Ａを用いて感染性ＰＲＲＳＶを回収することができなかったので、ＧＰ５コード領域中の変異が、ゲノムＲＮＡの粒子への充填等の、ＲＮＡテンプレートの幾つかの他の機能に影響を及ぼした可能性がある。これに対処するために、本発明者は、トランスでｗｔ  ＧＰ５を発現する細胞が、感染性ＰＲＲＳＶを生成することができない変異体ＲＮＡテンプレートの充填を補助し得るかどうかを検討した。ｐｃＤＮＡ−ＧＰ５で形質移入されたＢＨＫ−２１細胞をインビトロ転写産物で電気穿孔し、電気穿孔から４８時間後に、培養上清を回収し、未処理のＭＡＲＣ−１４５細胞を感染させるために使用し、ＰＲＲＳＶ偽粒子の産生を測定した。偽粒子が生じる場合、次に、これらの感染したＭＡＲＣ−１４５細胞中でＮタンパク質の発現を観察することが期待される。Ｎの発現は、偽粒子の細胞中への進入後に複製を設定するキャプシド形成された完全長変異体ＲＮＡゲノムを、ナイーブＭＡＲＣ−１４５細胞が受容する場合にのみ可能である。本発明者は、以前に回収できなかった全ての変異体のうち、２つの変異体の完全ゲノム（ＦＬ−Ｎ４４Ａ及びＦＬ−Ｎ３４／４４Ａ）を含有する偽粒子を回収することができた（図３Ｃ）。変異体ウィルスにより感染された培養物中の各緑色蛍光細胞は、１つの感染性偽粒子を表す。これらの粒子は、外被上には機能的ｗｔ  ＧＰ５のみを含有するが、ゲノム中に非機能性変異体ＧＰ５のためのコード配列を含有するので、周囲の細胞に拡散する感染性粒子を産生することができない。他の変異体テンプレート（ＦＬ−Ｎ４４／５１Ａ及びＦＬ−Ｎ３１／４４／５１Ａ）を有する偽感染性粒子を回収する複数の試みは成功しなかった。
【００９５】
これらの実験から産生された感染性偽粒子の数の定量的な概算は、細胞中へ電気穿孔された変異体ＲＮＡ１μｇあたり約１０００個の粒子が産生されることを示唆する（図３Ｄ）。これは、ｗｔ  ＧＰ５をコードするＲＮＡで得られるものより約１００倍低い。感染性偽粒子のこのような低レベルの産生は、ｗｔ  ＧＰ５を発現する細胞の約５ないし１０％が、これらの細胞中でのＮタンパク質の発現によって明らかなように、完全長の転写産物を受け取ったに過ぎないという事実によるものであり得る。形質移入された細胞中でのｗｔ  Ｇ５の発現の低いレベルは、これらの偽ウィルス粒子の産生の低いレベルに関与し得た可能性もある。
【００９６】
変異体ウィルス中に組み込まれたＧＰ５の検査及び感染した細胞中で発現された前記ウィルス
形質移入された細胞から産生された感染性ウィルス粒子中に組み込まれたＧＰ５タンパク質の性質を決定するために、本発明者は、ｗｔ及び変異体ウィルスで感染された細胞から得た放射能標識されたＰＲＲＳＶを作製した。培養上清中に存在する細胞外ウィルス粒子を、超遠心によりペレットにし、抗ＧＰ５抗体を使用する免疫沈降及びその後の電気泳動分析によって、これらのウィルス粒子中に存在するＧＰ５を調べた。結果は、ウィルス粒子中へ組み込まれたｗｔ  ＧＰ５が、ＥｎｄｏＨ消化に部分的に耐性のある（レーン２）、約２５ないし２７ｋＤａタンパク質種の広く拡散するバンドとして移動したことを示す（図４Ａ、レーン１）。ウィルス粒子中へ組み込まれたＧＰ５変異体（Ｎ３４Ａ及びＮ５１Ａ）は、ＥｎｄｏＨに対して感受性があった。ＥｎｄｏＨ消化後に生じた産物のサイズに基づくと、これらの単一部位の変異体中の１つのグリカン部分のみが感受性であるのに対して、その他は耐性があるように見受けられる。対照的に、ＧＰ５二重変異体（Ｎ４３／５１Ａ）は、Ｅｎｄｏ  Ｈに対して耐性であった。更に、変異体ウィルスからのＧＰ５のＥｎｄｏ  Ｈ消化は、ＧＰ５タンパク質主鎖の非常に少量も生じ、これらのウィルスは、Ｅｎｄｏ  Ｈ耐性部分及びＥｎｄｏ  Ｈ感受性グリカン部分を含有するＧＰ５タンパク質を組み込んでいることを示唆している。
【００９７】
バイシストロン性ベクターで形質移入された細胞中で、ｗｔ及び変異体のＧＰタンパク質は完全にＥｎｄｏ  Ｈ感受性であった（図１及び２）ので、本発明者は、ＰＲＲＳウィルス粒子におけるＧＰ５が広くＥｎｄｏ  Ｈ耐性形態を含有するという観察に驚いた。前記タンパク質のＥｎｄｏ  Ｈ耐性形態が、感染した細胞中でも合成されるかどうかを検討するために、ｗｔ又は変異体のＰＲＲＳＶに感染したＭＡＲＣ−１４５細胞を放射能標識し、ＧＰタンパク質を抗ＧＰ５抗体で免疫沈降し、Ｅｎｄｏ  Ｈ消化し又は消化せずに、電気泳動により分析した。このような実験の結果は、図４Ｂに示されている。ｗｔ  ＧＰ５の大部分は、３つの部位全てにＥｎｄｏ  Ｈ耐性グリカンを含有した（レーン２及び３）のに対し、２つの単一変異体は、１つの部位のみにＥｎｄｏ  Ｈ耐性グリカンを含有した（レーン４ないし７）。二重変異体中のグリカン部分の幾つかは耐性があるのに対し、その他はＥｎｄｏ  Ｈに対して感受性がある（レーン８及び９）。Ｅｎｄｏ  Ｈ耐性のパターンは、ウィルス粒子結合ＧＰ５に対して観察されるものと同様であるが、ＧＰ５タンパク質及びＭタンパク質の両者を発現する細胞において観察されるものとは異なる（図１及び２）。これらの結果は、他のウィルスタンパク質が、ＧＰ５上のグリカンの更なる修飾において役割を果たし得ることを示している。
【００９８】
特異的抗体によって中和されるＰＲＲＳＶの能力に対するＧＰ５の低グリコシル化の影響
ウィルス受容体との相互作用に関与するウィルス糖タンパク質のグリコシル化のレベルは、ウィルス中和抗体と反応するウィルス粒子の能力に影響することが知られている。この現象がＰＲＲＳＶの場合に生じるかどうかを調べるために、回復期の抗血清によって中和される能力において、グリコシル化パターンの変化したＰＲＲＳＶ  ＧＰ５変異体（ＦＬ−Ｎ３４Ａ、ＦＬ−Ｎ５１Ａ及びＦＬ−Ｎ３４／５１Ａ）をＰＲＲＳＶ  ｗｔ（ＦＬ１２）と比較した。このために、本発明者は、ｗｔ  ＰＲＲＳＶに感染した４匹の動物から得た回復期の抗血清（感染４７日後）を使用した。感染性ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５変異体（ＦＬ−Ｎ３４Ａ、ＦＬ−Ｎ５１Ａ及びＦＬ−Ｎ３４／５１Ａ）及び感染性クローン由来のｗｔ  ＰＲＲＳＶ（ＦＬ１２）の同様の用量（２０００ＴＣＩＤ５０）を、本発明者の標準的なアッセイプロトコールに従って、血清中和アッセイにおける曝露ウィルスとして使用し、４つの抗ｗｔ  ＰＲＲＳＶ（ＦＬ１２）血清のセットを参照として使用した。表３は、得られた異なる終点血清中和力価を示す。通常、感染４７ないし５４日後に回収されたＰＲＲＳＶ  ｗｔ回復期血清試料は、ｗｔ  ＰＲＲＳＶ中和活性の中程度のレベルを含有し（１：８ないし１：３２、表３及び４）、ｗｔ  ＰＲＲＳＶによる感染に典型的な、抗体中和反応の比較的弱く遅い特徴を反映した。しかしながら、ＳＮアッセイにおいて、低グリコシル化されたＰＲＲＳＶ変異体を、曝露ウィルスとして（ＧＰ５外部ドメイン中に１つ又は２つのグリカン部分を欠失する）使用することにより、参照血清の終点を有意に亢進したようであり、終点の力価の亢進は、６倍から２２倍までに及んだ（表３）。この観察は、グリカン部分の１つ、特に２つを除去することにより、特異的抗体への中和エピトープの到達性が増加することを明確に示唆する。これらの結果は、ｗｔＰＲＲＳＶに感染した回復期血清中に、ＰＲＲＳＶ中和抗体の有意な量が存在することを示すようであり、これは、ＳＮアッセイでは、完全にグリコシル化されたＧＰ５を含有するｗｔ  ＰＲＲＳＶを典型的に使用するために、本来検出できなかったものである。
【００９９】
【表３】
2009506129.tif 000007
【０１００】
インビボで中和抗体を誘導するＰＲＲＳＶの能力に対するＧＰ５の低グリコシル化の効果
宿主のインビボでの接種のために変異体ウィルスが使用されるときに、ウィルス外被糖タンパク質からの炭水化物の除去が、前記変異体に対する中和抗体の高い力価を生じるという１つの顕著な効果が報告されており、幾つかの事例では、ｗｔウィルス自体よりも高い、ｗｔウィルスに対する抗体力価も誘導する。本発明者は、ｗｔ  ＰＲＲＳＶ  ＦＬ１２又はグリコシル化パターンの変化した変異体の各々の同一用量にブタの群を感染させた。興味深いことに、感染後第４、７及び１０日目の直腸温の評価及びウィルス血症の評価による感染の臨床的／ウィルス学的評価は、変異体の何れかに対する病原性の減退又は憎悪の所見なしに、ＦＬ１２に関して既に記載されているとおり、全ての群において感染の同様のパターンを示した。しかしながら、４８日間の期間を通じてこれらの動物から血清を連続的にサンプリングすることによって、ＰＲＲＳＶ中和抗体反応の誘導の動態が、ｗｔ  ＰＲＲＳＶと変異体の間で顕著に異なることが示された（表４Ａ及び４Ｂ）。変異体の場合に、ＰＲＲＳＶ中和抗体反応に特徴的な緩慢で、不十分な性質が、補正されたように見受けられる点まで、前記変異体は、ｗｔ  ＰＲＲＳＶによって生じたものよりも早期により強い類似の中和抗体反応を生じた（表４）。変異体相同性中和抗体の出現の速度論（表４Ｂ）は、インフルエンザ又は仮性狂犬病ウィルス等の他のウィルス感染に関して記載のものと一致するが、ＰＲＲＳＶに関するものとは一致しないより定型的な中和抗体の抗体陽転を示す。最も重要なのは、ＧＰ５グリコシル化変異体による感染が、ｗｔ  ＰＲＲＳＶ自体による反応よりも有意に高いｗｔ  ＰＲＲＳＶ特異的中和抗体反応を誘導したという事実である。変異体ウィルスＦＬ−Ｎ３４及びＦＬ−Ｎ５１Ａは、ｗｔ  ＰＲＲＳＶ自体よりもｗｔ  ＰＲＲＳＶに対する中和抗体力価の５倍高いレベル（ｐ＜０．０５）を誘導したのに対し、変異体ＦＬ−Ｎ３４／５１は、ｗｔ  ＰＲＲＳＶ自体よりもｗｔ  ＰＲＲＳＶ中和抗体の６倍高い力価（ｐ＜０．０１）を誘導した（表４Ｂ）。
【０１０１】
【表４】
2009506129.tif 000008
【０１０２】
考察
本研究において、本発明者は、感染性ウィルスの回収におけるＰＲＲＳＶのＧＰ５のグリコシル化の影響、変異体ウィルスが抗体により中和される能力におけるその役割、インビボでの中和抗体を誘導する上でのその役割を検討した。本発明者は、ＧＰ５における３つのグリコシル化候補部位（Ｎ３４、Ｎ４４、及びＮ５１）全てが、グリカン部分の付加に使用されることを見い出した。我々は、Ｎ４４部位でのグリカン付加が、感染性ウィルスの回収に最も決定的であることを明らかにした。更に、我々は、ＧＰ５の低グリコシル化された形態を含有するＰＲＲＳＶが、抗体による中和に対して大変感受性があること、および変異体ウィルスが、類似の変異体ウィルスだけでなくｗｔ  ＰＲＲＳＶに対しても中和する抗体の有意により高いレベルを誘導することを示す。
【０１０３】
ＧＰ５中のグリカン付加に３つのＮ結合型グリコシル化候補部位が全て使用されるという確認が、単一又は複数の部位で変化した変異体を使用することによって与えられた（図２）。生化学的研究は、ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５タンパク質が、形質移入した細胞においてＭタンパク質とともに発現されたときに、Ｅｎｄｏ  Ｈ感受性の高濃度マンノース種のグリカンを含有することを示した。ウィルス粒子中に組み込まれたＧＰ５の大部分がＥｎｄｏ  Ｈに対して耐性がある（図４Ａ）のに対し、形質移入された細胞中のＭタンパク質の存在下で発現したＧＰ５は完全にＥｎｄｏ  Ｈ感受性であるという知見は興味深いものである。形質移入した細胞中のＭタンパク質の存在下で発現されたとき、ＧＰ５は、ほとんど小胞体中で又はシスゴルジ領域中で蓄積し、それゆえＥｎｄｏ  Ｈ感受性のままであることが可能である。しかしながら、ＰＲＲＳＶに感染した細胞中では、ＧＰ５は、更なるウィルスタンパク質と相互作用し得、小胞体若しくはシスゴルジを越えるＧＰ５の輸送は、他のウィルスタンパク質との複合体を形成することを通じて容易になる。この解釈に一致して、本発明者は、ｗｔ若しくは変異体のＰＲＲＳＶに感染した細胞中で、ＧＰ５タンパク質が、Ｅｎｄｏ  Ｈに対しても耐性があることを観察した。本発明者は、ＧＰ５分子の大部分がＥｎｄｏ  Ｈ耐性を獲得した後、ＰＲＲＳＶウィルス粒子中に組み込まれる内側及び／又はトランスゴルジ領域へ、感染した細胞中の小胞体中で合成されるＧＰ５が輸送されることを示唆する。ＰＲＲＳＶを含むアルテリウィルスを使用する幾つもの研究は、ＧＰ５及びＭタンパク質がヘテロ二量体を形成し、それがウィルス感染性における重要な役割を担い得ることを示唆する。ＥＡＶ及びＬＤＶにおいて、ジスルフィド架橋の形成を通じたＧＰ５及びＭタンパク質の直接的な相互作用が示されている。このような相互作用は、Ｎ結合型オリゴ糖側鎖の更なる処理の前に生じ得、おそらくはＧＰ５が小胞体若しくはシスゴルジ区画の外へ輸送される前に生じ得る。
【０１０４】
興味深いことには、ｗｔ及び変異体ウィルス粒子中へ組み込まれたＧＰ５のＥｎｄｏ  Ｈ耐性のパターンが異なることである。ｗｔ  ＰＲＲＳＶ中のＧＰ５分子の大部分は、Ｅｎｄｏ  Ｈ耐性であったのに対し、単一部位の変異体ウィルス粒子（ＦＬ−Ｎ３４Ａ及びＦＬ−Ｎ５１Ａ）中のＧＰ５分子のほとんどは、Ｅｎｄｏ  Ｈ感受性であった（図４Ａ）。更に、これらの変異体中の２つのグリカンのうち、１つのみが感受性であったのに対し、その他は耐性であった。二重変異体（ＦＬ−Ｎ３４／５１Ａ）ウィルス粒子も、グリカンを含有するＧＰ５を組み込み、そのうちの幾つかもＥｎｄｏ  Ｈに対して感受性があった。これらのデータは、ｗｔ及び変異体ＰＲＲＳＶウィルス粒子が、異なる部位で異なるグリカン部分を含有するＧＰ５分子の混合した集団を組み込むという解釈と一致する。ｗｔ  ＰＲＲＳＶウィルス粒子中へＧＰ５の別個にグリコシル化された形態を組み込むことを示す先行研究は、本発明者の解釈を更に強化する。ウィルス粒子中へ組み込まれたＧＰ５のＥｎｄｏ  Ｈ感受性のパターンから、Ｎ４４部位は、Ｅｎｄｏ  Ｈ耐性グリカンを含有し得ると推測したくなるが、この部位でＥｎｄｏ  Ｈ感受性グリカンを有する幾つかのＧＰ５分子が、ウィルス中へ組み込まれた。ＧＰ５中の多様な部位でのグリカンのこの独特なパターン及びウィルス粒子中へのＧＰ５の多様な形態の組み込みが、ＰＲＲＳＶ感染した動物において見られる免疫応答のパターンと何らかの関連性があるかどうかについては、研究の余地がある。
【０１０５】
最近の研究において、レリスタッドＰＲＲＳＶのＧＰ５中の２つのＮ結合型グリコシル化部位（Ｎ４６及びＮ５３）のうち、Ｎ４６残基のグリコシル化が、ウィルス粒子産生に強く必要とされることが示された。感染性ウィルス量は、Ｎ４６での変異で、約１００倍低下した。この結果は、（北米ＰＲＲＳＶに関して）Ｎ４４でのグリカン付加が、感染性ＰＲＲＳＶの回収のために絶対的に必須であることを示唆する。その結果、ＰＲＲＳＶの欧州及び北米単離株が、感染性ウィルスの産生に関し、Ｎ結合型グリコシル化のための必要条件において幾分異なり得る可能性がある。この点において、レリスタッドウィルスが、僅か２つのＮ結合型グリコシル化部位を含有するのに対し、本発明者が本研究において使用した北米単離株は、３つのこのような部位を含有することは注目されるべきである。
【０１０６】
ＧＰ５は、ＰＲＲＳＶ中和抗体の産生及び保護的免疫性に関与するＰＲＲＳＶの最も重要な糖タンパク質である。我々は、ＧＰ５外部ドメイン中の残基３４及び５１でのグリカンの欠如が、生存可能なＰＲＲＳＶ変異体を産生しながら、抗体による中和に対するこれらの変異体の感受性及び近隣の中和エピトープの免疫原性の両者を亢進させることを明らかにする。ＰＲＲＳＶ変異体のＧＰ５中にグリカンが存在しないことの直接の効果は、ｗｔ  ＰＲＲＳＶに感染したブタから得た回復期血清による中和に対するウィルスの増加した感受性であった（表３）。ＨＩＶ−１及びＳＩＶを用いた研究は、ｇｐ１６０の可変ループ中のグリカンの獲得又は除去が、中和に対するそれらの感受性を修飾することを示している。それゆえ、グリカンは、ウィルス外被糖タンパク質生合成の間に、不可欠な役割の少なくとも２種類を担うことが推定される。ある事例では、グリカンの欠如は、糖タンパク質の欠損を伴い、従って、ウィルス株の全体的な生存性の欠損を伴う。本発明者は、ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５のＮ４４でのグリカンが同様の役割を担うものと推測する。第二の事例では、グリカンは、抗体による中和に対してウィルスタンパク質を遮蔽するように機能する可能性を秘める。ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５の場合、Ｎ３４及びＮ５１でのグリカンは、同様の役割を有し得る。ＨＩＶの場合、「グリカン遮蔽」は、免疫応答の中和から回避することにより、ＨＩＶのインビボでの生存を保障することについて説明する主要な機序であることが推定される。これは、ＰＲＲＳＶと幾つかの平行的な比較を引き出す。各動物中で数ヶ月にわたって持続することが知られているＰＲＲＳＶによる感染は、ウィルス特異的な免疫応答の中和の誘導に関して、独特の挙動を示す。検出可能なＰＲＲＳＶ中和抗体反応を構築するために、ＰＲＲＳＶに感染した動物が、一般に、正常な時間よりも長い時間を要することは十分に確定されている。一度構築されると、このＰＲＲＳＶ中和反応は弱く、動物によって有意に異なる。抗体反応を中和する上での遅延は、近隣の免疫優性囮エピトープ（アミノ酸位置２７ないし３０）の存在によるものと推定されており、これは、中和するエピトープ（アミノ酸位置３７ないし４５）に対する反応を遮蔽及び／又は遅延させる頑強な初期の非保護的免疫応答を惹起する（２６、３８）。これは、ＰＲＲＳＶ中和抗体反応の非典型的な特徴に対して説得的な説明であるが、なお検討を要する。本発明者の研究室において、囮エピトープの欠失が、感染性ＰＲＲＳＶの回収に対して致死的であることが一貫して証明されており（Ａｎｓａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，未公開データ）、したがって、この仮説を検証することが困難なものになっている。
【０１０７】
ＰＲＲＳＶ中和反応の独特の性質を説明するための代替的又は補完的機序が、ＨＩＶ及びＳＩＶに関して提唱された「グリカン遮蔽」現象によって予測され得る可能性がある。ＳＮアッセイではｗｔ  ＰＲＲＳＶが使用されるので、本発明者の研究における１つ又は２つのグリカン部分を欠失するＰＲＲＳＶ変異体を使用することによって、別のアッセイでは検出不能であった、ｗｔＰＲＲＳＶ感染動物の血清中にＰＲＲＳＶ中和抗体が多量に存在するという証拠を始めて初めて提示する。ＰＲＲＳＶ中和抗体は、宿主の反応中に存在するものの、ＧＰ５上のグリカン部分による中和エピトープの遮断若しくは遮蔽のため、感染しているｗｔ  ＰＲＲＳＶウィルス粒子と反応することができない。
【０１０８】
アルテリウィルス中での糖タンパク質のグリコシル化による中和回避に関する１つの重要な前例が、乳酸脱水素酵素ウィルス（ＬＤＶ）に関して記載されている。ＬＤＶは、その主要糖タンパク質であるＶＰ−３が重度にグリカン遮蔽されているので、抗体中和に対して非常に耐性があるが、ＬＤＶの特定の天然株は、ＶＰ−３の外部ドメイン中の２つのグリコシル化部位を喪失しているので、中和に対して非常に感受性がある。興味深いことに、この中和感受性表現型は、これらの簡単に中和可能なＬＤＶ系によって獲得される宿主中での向神経性の高い程度と相関している。このような神経病原性の亢進は、おそらく、グリカン遮蔽の欠如によるものであるため、神経細胞中の受容体とのウィルス糖タンパク質の相互作用が促進されることを反映している。本発明者がＰＲＲＳＶによる接種に使用した若齢ブタモデルにおいて、本発明者は、本発明者の所見を温度及びウィルス血症の測定結果に限定したが、ＰＲＲＳＶ変異体の何れかとｗｔ  ＰＲＲＳＶの間に病原性の差異を検出できなかった。異なる実験条件下では（すなわち、妊娠中の雌ブタモデルにおいて）、これらのＰＲＲＳＶ変異体の病原性に幾らかの変化が観察されるかもしれないことはあり得る。天然の低グリコシル化されたＰＲＲＳＶ系という知見が、普遍的に存在するかどうかは不明であるが、先行報告は、前記系が存在することを示唆している。
【０１０９】
本発明者の実験において注目すべき所見は、インビボでブタを感染させた場合に、ＧＰ５変異体が、感染の後期相で大きなｗｔ  ＰＲＲＳＶ中和反応を開始する能力の点で、ｗｔ  ＰＲＲＳＶを凌駕し得ることであった。平行するシナリオにおいて、本発明者は、類似のＰＲＲＳＶ変異体に対するより高い中和力価のみならず、ｗｔ  ＰＲＲＳＶに対する大きな力価も観察した（表４Ａ）。更に、反応は比較的早期に生じ、中和力価は感染から１４日後に検出可能であり、これは、ｗｔ  ＰＲＲＳＶ感染では通例見られない観察であった（表４Ｂ）。ＰＲＲＳＶ変異体に感染したブタから得た血清によってｗｔ  ＰＲＲＳＶの中和が亢進したことは、グリカンが存在するときに、中和抗体を誘導しない中和エピトープをグリカンが遮蔽していたことを示唆する。この所見は、より優れた、より有効性のあるＰＲＲＳＶワクチンの設計に大きな重要性を有するものであり、合理的に設計される新しいワクチンが、中和抗体の産生を亢進させるために、ＧＰ５のグリコシル化パターンの修飾を有するべきであることを示唆する。更に、ＰＲＲＳＶの免疫学的に主要な糖タンパク質から炭水化物をこのように除去することによって、類似の免疫化系のみならず、関連性のない多様なＰＲＲＳＶ系のＳＮ力価の増強に対しても有する可能性があるこの効果を研究することが重要である。
【実施例２】
【０１１０】
北米及び欧州ＰＲＲＳＶ単離株中でのＮ結合型グリコシル化部位の同定
不活化可能であり、本発明の方法において使用できる配列番号１の参照ＧＰ５タンパク質中のアスパラギン３４又はアスパラギン５１に対応するＮ結合型グリコシル化部位を同定するために、所望の北米ＰＲＲＳＶ単離株（図５）または欧州ＰＲＲＳＶ単離株（図６）の何れかのＧＰ５タンパク質を、配列番号１（北米ＮＶＳＬ９７−７８９５系）の参照ＧＰ５タンパク質と並置する。本実施例では、並置のＪｏｔｕｎ−Ｈｅｉｎ法（Ｈｅｉｎ，Ｊ．Ｊ．Ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８３：ｐｐ．６２６−６４５，  １９９０）を使用するＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）製ＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムを使用して、並置を実施した。多重配列比較パラメータは、ギャップペナルティ１１及びギャップ長ペナルティ３であった。対で比較するために、Ｋｔｕｐｌｅ値２を使用した。
【０１１１】
図５において、配列番号１の参照ＧＰ５タンパク質のアスパラギン５１に対応するＮ結合型グリコシル化部位が、図示されている北米ＰＲＲＳＶ単離株の全てに存在し、Ｎ結合型グリコシル化部位「ＮＧＴ」を含むことが明白である。このＮ結合型グリコシル化部位は、対応するポリヌクレオチド配列において、グルタミン又はアラニン等の他のアミノ酸残基をコードするコドンをアスパラギン５１の代わりに使用することによって不活化することができる。これらの場合、低グリコシル化された北米ＰＲＲＳＶＧＰ５タンパク質変異体における対応するアミノ酸配列は、「ＱＧＴ」、「ＡＧＴ」又は「ＸＧＴ」等の配列を含む（Ｘは、アスパラギン以外の何れかのアミノ酸である。）。アスパラギン５１に対応するＮ結合型グリコシル化部位が不活化されている北米ＰＲＲＳＶ単離株のこれら又は他の低グリコシル化されたバリアントは、他のＮ結合型グリコシル化部位が不活化される他の低グリコシル化されたＧＰ５バリアントとも組み合わせられ得る。
【０１１２】
配列番号１の参照ＧＰ５タンパク質のアスパラギン３４に正確に対応するＮ結合型グリコシル化部位が、特定の北米ＰＲＲＳＶ単離株中にのみ存在することが、また図５から明らかである。より具体的に、北米ＰＲＲＳＶ単離株であるＩＡＦ−ＢＡＪ（配列番号３）、９４−３１８２（配列番号７）及び９４−２８７（配列番号８）のＧＰ５タンパク質は、配列番号１の参照ＧＰ５タンパク質のアスパラギン３４に正確に対応するＮ結合型グリコシル化部位を含有し、Ｎ結合型グリコシル化部位「ＮＳＳ」を含む。配列番号３、７及び８のこのＮ結合型グリコシル化部位は、対応するポリヌクレオチド配列において、グルタミン又はアラニン等の他のアミノ酸残基をコードするコドンをアスパラギン３４の代わりに使用することによって不活化することが可能である。これらの例では、低グリコシル化された北米ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５タンパク質変異体中の対応するアミノ酸配列は、「ＱＳＳ」、「ＡＳＳ」又は「ＸＳＳ」等の配列を含む（Ｘは、アスパラギン以外の何れかのアミノ酸である。）。
【０１１３】
配列番号１の参照ＧＰ５タンパク質のアスパラギン３４に正確に対応するＮ結合型グリコシル化部位を欠失する他の北米ＰＲＲＳＶ単離株において、残基３０（図５、配列番号２、３、４、６、７、８、９、１１、１３における「ＮＡＳ」）及び残基３３（図５、配列番号３における「ＮＮＳ」、図８、配列番号６における「ＮＳＳ」、図１０、配列番号１１、１３における「ＮＤＳ」）に位置する他のＮ結合型グリコシル化部位も不活化することが可能である。換言すれば、配列番号１の参照ＧＰ５タンパク質の残基３０及び３３に対応するアミノ酸の位置に存在する、他の北米単離株中のＮ結合型グリコシル化部位を不活化することも可能であり、本発明の方法において使用できる。
【０１１４】
図６において、配列番号１の参照ＧＰ５タンパク質のアスパラギン５１に対応するＮ結合型グリコシル化部位が、代表的な欧州ＰＲＲＳＶ単離株中にも存在し、Ｎ結合型グリコシル化部位「ＮＧＴ」を含むことは明白である。このＮ結合型グリコシル化部位は、対応するポリヌクレオチド配列において、グルタミン又はアラニン等の他のアミノ酸残基をコードするコドンを、アスパラギン５１の代わりに使用することによって不活化することが可能である。これらの例では、低グリコシル化された欧州ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５タンパク質変異体における対応するアミノ酸配列は、「ＱＧＴ」、「ＡＧＴ」又は「ＸＧＴ」等の配列を含む（Ｘは、アスパラギン以外の何れかのアミノ酸である。）。アスパラギン５１に対応するＮ結合型グリコシル化部位が不活化されている欧州ＰＲＲＳＶ単離株のこれら又は他の低グリコシル化されたバリアントは、他のＮ結合型グリコシル化部位が不活化された他の低グリコシル化されたＧＰ５バリアントとも組み合わせられ得る。
【０１１５】
上記の記述を考慮して、本発明の幾つもの利点が達成及び実現されることが明らかである。
【０１１６】
前記の実施形態は、本発明の原理及びその実際的な利用を最良に説明することによって、他の当業者が、様々な実施形態で本発明を最良に利用し、想定される具体的な使用に適合するように、様々な修飾を加えて本発明を最良に利用できるようにするために選択及び記載されたものである。
【０１１７】
本発明の範囲から逸脱することなく、記載及び例示されている本明細書中の構造及び方法に様々な変更を加えることが可能であるので、上述の記載に含有される又は後述の図面に示される全ての内容は、限定を加えるものではなく、例示として解釈されるべきであることが企図される。従って、本発明の広さ及び範囲は、上述の典型的な実施形態の何れによっても限定されるべきではなく、上述の特許請求の範囲及びその均等物に従ってのみ定義されるべきである。
【０１１８】
多様な特許及び非特許参考文献が本明細書に開示されており、その各々は、その全内容が全体として参照により本明細書に明確に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】図１は、ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５及びＭタンパク質の一過性発現を示す。
【図２】図２は、ＷＴ−ＧＰ５及びバイシストロン性プラスミドを使用するその変異体のグリコシル化分析を示す。
【図３】図３は、ＧＰ５変異体をコードする変異体ウィルスの特徴づけを示す。
【図４】図４は、変異体ウィルス粒子中へ組み込まれ、変異体ウィルスで感染した細胞中で合成したＧＰ５の検査を示す。
【図５】図５は、北米ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５のｎ末端アミノ酸配列と、北米ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５参照ｎ末端配列（配列番号１、ＮＶＳＬ９７−７８９５系）との配列比較を示す。
【図６】図６は、欧州ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５  Ｎ末端アミノ酸配列と北米ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５参照ｎ末端配列（配列番号１、ＮＶＳＬ９７−７８９５系）との配列比較を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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