(57)【要約】本発明は、処理ステップを最小とし、溶媒の用量を低減し、そのため本方法をより効率的および拡張可能とする方法による、メイタンシノールの調製について記載する。この方法は、メイタンシノールの架橋アセタールを、メイタンシノールに変換するステップを包含する。単純化された処理はまた、ヒトが化学物質に曝露される可能性を低下させる上で一助となる。単離された、メイタンシノールのＣ３からＣ９の架橋されたアセタールもまた提供する。【選択図】図１
2009514978.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メイタンシノールを調製するための方法であって、以下：
ａ）メイタンシノールのＣ３−エステルを、アルミニウム系水素化物の還元試薬で還元すること；
ｂ）還元反応を停止させること；および
ｃ）反応停止した混合物に保持ステップを行うこと；ここで前記保持ステップでは、Ｃ３からＣ９に架橋されたアセタールを、メイタンシノールに変換すること、
を包含する前記方法。
【請求項２】
保持ステップの後、反応停止した混合物のｐＨを約３と約９の間に調整し、そして水混和性でない溶媒を加えることをさらに包含し、その場合前記のｐＨの調整、および水混和性でない溶媒の添加は、同時にまたはいずれかの順に行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｐＨを、酸またはバッファー水溶液を加えることにより調整する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
酸が、酢酸、ギ酸、塩酸、リン酸、トリフルオロ酢酸、から成る群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
水混和性でない溶媒が、酢酸エチル、ジクロロメタン、および酢酸ブチルから成る群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
保持ステップの後、反応停止した混合物のｐＨを、約２またはそれ未満に調整することをさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
保持ステップが、反応停止した混合物を約−１５℃から約−５０℃の温度で、少なくとも約０．２５時間から約５時間の間維持することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
アルミニウム系水素化物の還元試薬が、ＬｉＡｌＨ４、ＬｉＡｌ(ＯＭｅ)３Ｈ、ＬｉＡｌ(ＯＭｅ)２．５Ｈ１．５、および水素化ビス(２−メトキシエトキシ)アルミニウムナトリウムから成る群より選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
アルミニウム系水素化物の還元試薬が、ＬｉＡｌ(ＯＭｅ)３Ｈである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
還元反応を、水を用いて停止させる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
還元反応を、塩の水溶液を用いて停止させる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
塩の水溶液が塩化ナトリウムの飽和溶液である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
Ｃ３からＣ９に架橋されたアセタールが、式（Ｉ）の化合物：
【化１】
2009514978.tif 000010
[式中、Ｒ１は、アルキル、ＣＨ(ＣＨ３)Ｎ(ＣＨ３)Ｑ、またはＣＨ(ＣＨ３)Ｎ(ＣＨ３)ＣＯＲ４を表し；Ｑは、Ｈまたはアミノ保護基を表し；そしてＲ４は、アルキル、アリール、または(ＣＨ２)ｎ(ＣＲ６Ｒ７)ｍＳＶを表し、ここでｎは０−９を表し、ｍは０−２を表すが、ただしｍおよびｎは同時に０ではなく、Ｒ６は、Ｈ、アルキル、またはアリールを表し、Ｒ７は、Ｈ、アルキル、またはアリールを表し、そしてＶは、Ｈまたはチオール保護基を表す。]
である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
Ｒ１により表される前記アルキルが、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ(ＣＨ３)２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)２、または (ＣＨ２)３ＣＨ３である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
Ｒ１がＣＨ(ＣＨ３)Ｎ(ＣＨ３)Ｑである場合の、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
Ｑが、スルフェンアミド基、カルバメート基、およびシリル基から成る群より選択されるアミノ保護基を表す、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
Ｒ１がＣＨ(ＣＨ３)Ｎ(ＣＨ３)ＣＯＲ４である場合の、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
Ｒ４が(ＣＨ２)ｎ(ＣＲ６Ｒ７)ｍＳＶである場合であって、ここでｎは０−９を表し、ｍは０−２を表すが、ただしｍおよびｎは同時に０ではなく、そしてＶは、アリール、Ｓ−アルキル、Ｓ−アリール、ＳｉＭｅ３、ＳｉＭｅ２−ｔＢｕ、ＡｒＮＯ２、Ａｒ(ＮＯ２)２、ＣＯ−アルキル、およびＣＯ−アリールから成る群より選択されるチオール保護基である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
Ｒ４が、ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＳＳＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)ＳＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)２ＳＳＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２Ｃ(ＣＨ３)２ＳＨ、またはＣＨ２ＣＨ２Ｃ(ＣＨ３)２ＳＳＣＨ３である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
式（Ｉ’）の化合物：
【化２】
2009514978.tif 000011
[式中、
Ｘ１はＨ、Ｃｌ、またはＢｒを表し；Ｘ２はＨまたはＭｅを表し；Ｘ３はＨ、Ｍｅ、またはＭｅ(ＣＨ２)ｐＣＯＯを表し、ここでｐは０−１０の間の数である；そして
Ｒ１は、アルキル、ＣＨ(ＣＨ３)Ｎ(ＣＨ３)Ｑ、またはＣＨ(ＣＨ３)Ｎ(ＣＨ３)ＣＯＲ４を表し；Ｑは、Ｈまたはアミノ保護基を表し；そしてＲ４は、アルキル、アリール、または(ＣＨ２)ｎ(ＣＲ６Ｒ７)ｍＳＶを表し、ここでｎは０−９を表し、ｍは０−２を表すが、ただしｍおよびｎは同時に０ではなく、Ｒ６は、Ｈ、アルキル、またはアリールを表し、Ｒ７は、Ｈ、アルキル、またはアリールを表し、そしてＶは、Ｈまたはチオール保護基を表す。]
である、単離された、メイタンシノールのＣ３−エステルのＣ３からＣ９に架橋されたアセタール。
【請求項２１】
式（Ｉ）の化合物：
【化３】
2009514978.tif 000012
[式中、Ｒ１は、アルキル、ＣＨ(ＣＨ３)Ｎ(ＣＨ３)Ｑ、またはＣＨ(ＣＨ３)Ｎ(ＣＨ３)ＣＯＲ４を表し；Ｑは、Ｈまたはアミノ保護基を表し；そしてＲ４は、アルキル、アリール、または(ＣＨ２)ｎ(ＣＲ６Ｒ７)ｍＳＶを表し、ここでｎは０−９を表し、ｍは０−２を表すが、ただしｍおよびｎは同時に０ではなく、Ｒ６は、Ｈ、アルキル、またはアリールを表し、Ｒ７は、Ｈ、アルキル、またはアリールを表し、そしてＶは、Ｈまたはチオール保護基を表す。]
である、請求項２０に記載の単離されたＣ３からＣ９に架橋されたアセタール。
【請求項２２】
Ｒ１により表される前記アルキルが、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ(ＣＨ３)２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)２、または(ＣＨ２)３ＣＨ３である、請求項２０または２１に記載の化合物。
【請求項２３】
Ｒ１がＣＨ(ＣＨ３)Ｎ(ＣＨ３)Ｑである場合の、請求項２０または２１に記載の化合物。
【請求項２４】
Ｑが、スルフェンアミド基、カルバメート基、およびシリル基から成る群より選択されるアミノ保護基を表す、請求項２０または２１に記載の化合物。
【請求項２５】
Ｒ１がＣＨ(ＣＨ３)Ｎ(ＣＨ３)ＣＯＲ４である場合の、請求項２０または２１に記載の化合物。
【請求項２６】
Ｒ４が(ＣＨ２)ｎ(ＣＲ６Ｒ７)ｍＳＶである場合であって、Ｖが、アリール、Ｓ−アルキル、Ｓ−アリール、ＳｉＭｅ３、ＳｉＭｅ２−ｔＢｕ、ＡｒＮＯ２、Ａｒ(ＮＯ２)２、ＣＯ−アルキル、およびＣＯ−アリールから成る群より選択されるチオール保護基である、請求項２５に記載の化合物。
【請求項２７】
Ｒ４が、ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＳＳＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)ＳＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)２ＳＳＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２Ｃ(ＣＨ３)２ＳＨ、またはＣＨ２ＣＨ２Ｃ(ＣＨ３)２ＳＳＣＨ３である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
単離された、メイタンシノールのＣ３−エステルのＣ３からＣ９に架橋されたアセタールを調製するための方法であって、以下：
ａ）メイタンシノールのＣ３−エステルを、アルミニウム系水素化物の還元試薬で還元すること；
ｂ）還元反応を停止させて、それにより前記のメイタンシノールのＣ３−エステルのＣ３からＣ９に架橋されたアセタールを形成すること；および 
ｃ）架橋アセタールを単離すること、
を包含する前記方法。
【請求項２９】
単離をクロマトグラフィーにより行う、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
クロマトグラフィーが順相クロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィーである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
架橋アセタールが、式（Ｉ）の化合物：
【化４】
2009514978.tif 000013
[式中、Ｒ１は、アルキル、ＣＨ(ＣＨ３)Ｎ(ＣＨ３)Ｑ、またはＣＨ(ＣＨ３)Ｎ(ＣＨ３)ＣＯＲ４を表し；Ｑは、Ｈまたはアミノ保護基を表し；そしてＲ４は、アルキル、アリール、または(ＣＨ２)ｎ(ＣＲ６Ｒ７)ｍＳＶを表し、ここでｎは０−９を表し、ｍは０−２を表すが、ただしｍおよびｎは同時に０ではなく、Ｒ６は、Ｈ、アルキル、またはアリールを表し、Ｒ７は、Ｈ、アルキル、またはアリールを表し、そしてＶは、Ｈまたはチオール保護基を表す。]
である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
アルミニウム系水素化物の還元試薬が、ＬｉＡｌＨ４、ＬｉＡｌ(ＯＭｅ)３Ｈ、ＬｉＡｌ(ＯＭｅ)２．５Ｈ１．５、および水素化ビス(２−メトキシエトキシ)アルミニウムナトリウムから成る群より選択される、請求項２８または３１に記載の方法。
【請求項３３】
アルミニウム系水素化物の還元試薬が、ＬｉＡｌ(ＯＭｅ)３Ｈである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
還元反応を、水を用いて停止させる、請求項２８または３１に記載の方法。
【請求項３５】
還元反応を、塩の水溶液を用いて停止させる、請求項２８または３１に記載の方法。
【請求項３６】
塩の水溶液が塩化ナトリウムの飽和溶液である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
塩の水溶液が酒石酸カリウムナトリウムの溶液である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
Ｒ１により表される前記アルキルが、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ(ＣＨ３)２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)２、または(ＣＨ２)３ＣＨ３である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
Ｒ１がＣＨ(ＣＨ３)Ｎ(ＣＨ３)Ｑである場合の、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
Ｑが、スルフェンアミド基、カルバメート基、およびシリル基から成る群より選択されるアミノ保護基を表す、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
Ｒ１がＣＨ(ＣＨ３)Ｎ(ＣＨ３)ＣＯＲ４である場合の、請求項３１に記載の方法。
【請求項４２】
Ｒ４が(ＣＨ２)ｎ(ＣＲ６Ｒ７)ｍＳＶである場合であって、Ｖが、アリール、Ｓ−アルキル、Ｓ−アリール、ＳｉＭｅ３、ＳｉＭｅ２−ｔＢｕ、ＡｒＮＯ２、Ａｒ(ＮＯ２)２、ＣＯ−アルキル、およびＣＯ−アリールから成る群より選択されるチオール保護基である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
Ｒ４が、ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＳＳＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)ＳＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)２ＳＳＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２Ｃ(ＣＨ３)２ＳＨ、またはＣＨ２ＣＨ２Ｃ(ＣＨ３)２ＳＳＣＨ３である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
架橋アセタールを酸または塩基と共にインキュベーションすることを包含する、メイタンシノールのＣ３−エステルのＣ３からＣ９に架橋されたアセタールを、メイタンシノールに変換するための方法。
【請求項４５】
酸が、塩酸、リン酸、トリフルオロ酢酸、酢酸、またはギ酸である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
塩基が、トリメチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ＮａＯＨ、または強塩基である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
インキュベーションを、約４０℃から約−４０℃の温度で行う、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
架橋アセタールが、以下の式の化合物：
【化５】
2009514978.tif 000014
である、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[01]本出願は、２００５年１１月８日に提出された米国仮特許出願第６０/７３４，３３０号に対する優先権を主張する。
【０００２】
（発明の技術分野）
[02]本発明は、メイタンシノールの調製のための改善された方法、および単離された、メイタンシノールのＣ３−エステルの架橋アセタールに関する。
【背景技術】
【０００３】
(発明の背景）
[03]メイタンシノイドは高い細胞毒性のある薬剤である。このクラスの最初のメンバーであるメイタンシンは、Kupchan らにより東部アフリカの低木、メイテナスセラタ(Maytenus serrata)より最初に単離され、メトトレキサート、ダウノルビシン、およびビンクリスチンのような従来の癌の化学療法薬より１００倍から１０００倍高い細胞毒性があることが示された（米国特許第３，８６９，１１１号）。その後、いくつかの微生物もまたメイタンシノイド、例えばメイタンシノールおよびメイタンシノールのＣ−３エステルを産生することが発見された（米国特許第４，１５１，０４２号）。メイタンシノールの合成Ｃ−３エステルおよびメイタンシノールの類似体についても報告された（Kupchan et al., 21 J. Med. Chem. 31-37 (1978); Hiashide et al. 270 Nature 721-722 (1977); Kawai et al., 32 Chem. Pharm. Bull. 3441-3451 (1984)）。Ｃ−３エステルが調製されたメイタンシノールの類似体の例は、芳香環上（例えばデクロロ）またはＣ−９、Ｃ−１４（例えばヒドロキシル化したメチル基）、Ｃ−１５、Ｃ−１８、Ｃ−２０およびＣ−４，５に修飾を伴うメイタンシノールを含む。
【０００４】
[04]メイタンシノールの天然に生成されるＣ−３エステルおよび合成Ｃ−３エステルは以下の２群に分類することができる：
（ａ）Ｎ−メチル−Ｌ−アラニン、またはＮ−メチル−Ｌ−アラニンの誘導体によるＣ−３エステルである、メイタンシンおよび上に記載したその類似体（米国特許第４，１３７，２３０号および４，２６０，６０８号；およびChem. Pharm. Bull.12: 3441 (1984)）ならびに
（ｂ）シンプルなカルボン酸によるＣ−３エステルであるアンサマイトシン（米国特許第４，２４８，８７０号；４，２６５，８１４号；４，３０８，２６８号；４，３０８，２６９号；４，３０９，４２８号；４，３１７，８２１号；４，３２２，３４８号；および４，３３１，５９８号）。
【０００５】
[05]アンサマイトシンは、主にアンサマイトシンＰ−２、アンサマイトシンＰ−３、アンサマイトシンＰ−３’、アンサマイトシンＰ−４、アンサマイトシンＰ−４’、から構成される化合物の混合物である、図１。アンサマイトシンのアンサマイトシンＰ−３成分は、典型的にはアンサマイトシン中の総材料の７０％以上を包含する。したがってこの混合物はしばしばアンサマイトシンＰ−３と言われる。アンサマイトシンは、米国特許第４，１６２，９４０号、４，３５６，２６５号、４，２２８，２３９号、および６，７９０，９５４号に記載されているように細菌の発酵により調製される。
【０００６】
[06]メイタンシン、その類似体、および各アンサマイトシン種は、その各々のエステル側鎖の開裂によりメイタンシノールに変換されることができる、メイタンシノールのＣ−３エステルである。メイタンシノールおよびいくつかのＣ３エステルの構造を、図１に示す。典型的にはエステル部分の開裂は、還元反応を通して達成される。したがって例えばメイタンシノールのＣ３−エステルは、米国特許第６，３３３，４１０号に記載されているように、水素化トリメトキシアルミニウムリチウム（lithium tri-methoxyaluminum hydride：ＬＡＴＨ）または他のアルカリ金属(alkali)アルコキシアルミニウム水素化物を用いて還元温度で用いて処理することにより開裂し、続いて水または塩の水溶液で反応を停止させ、有機溶媒で抽出して、メイタンシノールを得ることができる。メイタンシノールは、米国特許第４，３２２，３４８号、４，３３１，５９８号、および６，３３３，４１０号に記載されているように、様々なメイタンシノイド剤の調製のための共通の出発材料である。これまでに記載されているメイタンシノールの調製法は、アルミニウム系の（alminum-based）還元副生成物が、抽出しにくく、そして生成物の有意な量を保有し得る懸濁液またはゲルを形成する可能性があるため、作業は面倒で時間を浪費するものである。Anderson, N. “Practical Process Rsearch & Development” (2000) ISBN # 0-12-059475-7 ページ72。
【発明の開示】
【０００７】
（発明の概要）
[07]本発明は、メイタンシノールのＣ３−エステルの還元によりメイタンシノールを調製するための改善された方法に関連する。当該方法は、望ましくない副生成物の形成を最小とすることにより、結果としてメイタンシノールの改善された収量を得る。単純化された処理はまた、ヒトが有害な化学物質に曝露される可能性を低下させる一助となる。
【０００８】
[08]本発明を導いた驚くべき発見は、メイタンシノールのＣ３−エステル、例えばアンサマイトシンの、アルミニウム系水素化物(aluminum-based hydride)の還元試薬、例えばＬｉＡlＨ４またはＬｉＡl(ＯＭｅ)３Ｈを用いての還元時に形成される、主要な望ましくない副生成物が、メイタンシノールのＣ３からＣ９に架橋されたアセタールであることである。したがって本発明は、メイタンシノールのＣ３−エステル由来の架橋アセタールを実質的に含まないメイタンシノールを調製するための方法について記載する。メイタンシノールのＣ３−エステルの還元は、米国特許６，３３３，４１０号に記載されているように施行し、続いて水溶液で反応を停止させ、塩基性混合物を得る。反応停止に続いて、本発明では重要な保持ステップを加える。この保持ステップは、停止した混合物を適切な温度で適切な時間の間維持して、あらゆる架橋アセタールの、所望のメイタンシノールへの変換を促進することを包含する。
【０００９】
[09]架橋アセタールがメイタンシノールに変換された後、塩基性水溶液または水溶性バッファーを反応停止した混合物に加えることにより、メイタンシノールのいかなる分解も最小とすることができ、そして水混和性でない溶媒を加えて、望ましくない還元試薬のアルミニウム系の副生成物を沈殿させる。あるいは、あらゆる望ましくないアルミニウム系の副生成物を、ｐＨを約２またはそれより低くすることにより可溶化させることができる。
【００１０】
[10]本発明のもう１つの側面は、架橋アセタールの単離、そしてまた塩基性または酸性の条件下で、単離された架橋アセタールをメイタンシノールに変換する方法に関連する。
【００１１】
[11]したがって本発明の１つの側面は、以下：
ａ）メイタンシノールのＣ３−エステルを、アルミニウム系水素化物の還元試薬で還元すること；
ｂ）還元反応を停止させること；および
ｃ）反応停止した混合物に保持ステップを行うこと；ここで前記保持ステップでは、Ｃ３からＣ９に架橋されたアセタールをメイタンシノールに変換する、
を包含する、メイタンシノールを調製するための方法である。
【００１２】
[12]本発明のもう１つの側面は、単離された、メイタンシノールのＣ３−エステルのＣ３からＣ９に架橋されたアセタールである。
【００１３】
[13]本発明のさらなる側面は、以下：
ａ）メイタンシノールのＣ３−エステルを、アルミニウム系水素化物の還元試薬で還元すること；
ｂ）還元反応を停止させ、それにより前記のメイタンシノールのＣ３−エステルのＣ３からＣ９に架橋されたアセタールを形成すること；および
ｃ）架橋されたアセタールを単離すること、
を包含する、単離された、メイタンシノールのＣ３−エステルのＣ３からＣ９に架橋されたアセタールを調製するための方法である。
【００１４】
[14]本発明のなおさらなる側面は、式（Ｉ’） により表される化合物である、単離されたＣ３からＣ９に架橋されたアセタールを提供する。
【００１５】
【化１】
2009514978.tif 000003
式中：
Ｘ１はＨ、Ｃｌ、またはＢｒを表し；Ｘ２はＨまたはＭｅを表し；Ｘ３はＨ、Ｍｅ、またはＭｅ(ＣＨ２)ｐＣＯＯを表し、ここでｐは０−１０の間の数である；そして 
Ｒ１は、アルキル、ＣＨ(ＣＨ３)Ｎ(ＣＨ３)Ｑ、またはＣＨ(ＣＨ３)Ｎ(ＣＨ３)ＣＯＲ４を表し；Ｑは、Ｈまたはアミノ保護基を表し；そしてＲ４は、アルキル、アリール、または(ＣＨ２)ｎ(ＣＲ６Ｒ７)ｍＳＶを表し、ここでｎは０−９を表し、ｍは０−２を表すが、ただしｍおよびｎは同時に０ではなく、Ｒ６は、Ｈ、アルキル、またはアリールを表し、Ｒ７は、Ｈ、アルキル、またはアリールを表し、そしてＶは、Ｈまたはチオール保護基を表す。
【００１６】
[15]さらなる側面において、本発明は式（Ｉ）により表される化合物を提供する。
【００１７】
【化２】
2009514978.tif 000004
式中、Ｒ１は、アルキル、ＣＨ(ＣＨ３)Ｎ(ＣＨ３)Ｑ、またはＣＨ(ＣＨ３)Ｎ(ＣＨ３)ＣＯＲ４を表し；Ｑは、Ｈまたはアミノ保護基を表し；そしてＲ４は、アルキル、アリール、または(ＣＨ２)ｎ(ＣＲ６Ｒ７)ｍＳＶを表し、ここでｎは０−９を表し、ｍは０−２を表すが、ただしｍおよびｎは同時に０ではなく、Ｒ６はＨ、アルキル、またはアリールを表し、Ｒ７は、Ｈ、アルキル、またはアリールを表し、そしてＶは、Ｈまたはチオール保護基を表す。
【００１８】
（発明の詳細な説明）
[20]メイタンシノールのＣ３−エステル、例えばアンサマイトシン、メイタンシン、およびメイタンシンの誘導体は、米国特許第６，３３３，４１０号の図２に記載されているように、様々なアルミニウム系水素化物の還元試薬、例えばＬｉＡｌＨ４またはＬｉＡl(ＯＭｅ)３Ｈにより低温で還元して、メイタンシノールを得ることができる。これらの還元反応を水および塩の水溶液で停止させると、高塩基性、すなわち１１より高いｐＨの混合物が得られ、このことから、混合物が放置されて温められた場合に、生成物の有意な分解を引き起こす可能性がある。混合物が放置されて室温まで温められる前に、水を用いて反応を停止させ、直ちに酸を加えて、ｐＨを中和することにより、生成物のいかなる分解も回避する試みが行われた。アンサマイトシンの還元に関してこの方法を試みた時に、有意な量の、メイタンシノールのＣ３エステルのＣ３からＣ９に架橋アセタールが得られ、結果的に所望のメイタンシノールはより低い収量で得ることになった。メイタンシノールのＣ３−エステルの還元に由来する架橋アセタールの側鎖は、Ｃ−３エステルの側鎖と同一であり、メイタンシノールのＣ３−エステルの還元が、出発材料と同じ側鎖を持つ架橋されたアセタールを与えることを示した、図３。米国特許第６，３３３，４１０号に記載された方法を使用しての、アンサマイトシンの還元により生成された粗メイタンシノールサンプルの分析は、これらのサンプルもまた架橋アセタールを含有することを示した。
【００１９】
[21]本発明は、メイタンシノールのＣ３−エステルを還元し、続いて停止ステップおよび保持ステップを行い、それにより還元反応で形成されたあらゆる架橋アセタールを、メイタンシノールに変換することを可能にする方法について記載する。変換が完了した後、混合物のｐＨは、酸またはバッファー水溶液を加えて調整して、生成されたメイタンシノールの塩基性誘導による分解を回避し、そして水混和性でない溶媒を加えることによりアルミニウム系の副生成物の沈殿を可能にしてよい。
【００２０】
[22]メイタンシノールを作成する方法に関する出発材料は、天然に生成されるまたは合成のメイタンシノールのＣ３−エステル、および修飾された芳香環、またはＣ３位以外の位置に修飾を有するメイタンシノールの適切な類似体であることができる。修飾された芳香環を有するメイタンシノールの適切な類似体の特定の例として、以下を含む：
(１)Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，２５６，７４６号）（アンサマイトシンＰ２のＬＡＨ還元により調製）；
(２)Ｃ−２０−ヒドロキシ(またはＣ−２０−デメチル)＋/−Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，３６１，６５０号および４，３０７，０１６号）（ストレプトマイセス(Streptomyces)またはアクチノマイセス(Actinomyces)を使用しての脱メチル化、またはＬＡＨを使用しての脱塩素反応により調製）；ならびに
(３)Ｃ−２０−デメトキシ、Ｃ−２０−アシルオキシ(−ＯＣＯＲ)、＋/−デクロロ（米国特許第４，２９４，７５７号）（アシル塩化物を使用してのアシル化により調製）。
【００２１】
[23]他の位置の修飾を有するメイタンシノールの適切な類似体の特定の例として以下を含む：
(１)Ｃ−９−ＳＨ（米国特許第４，４２４，２１９号）（メイタンシノールとＨ２ＳまたはＰ２Ｓ５との反応により調製）；
(２)Ｃ−１４−アルコキシメチル（デメトキシ/ＣＨ２ＯＲ）（米国特許第４，３３１，５９８号）；
(３)Ｃ−１４−ヒドロキシメチルまたはアシルオキシメチル（ＣＨ２ＯＨまたはＣＨ２ＯＡｃ）（米国特許第４，４５０，２５４号）（ノカルジア(Norcardia)より調製）；
(４)Ｃ−１５−ヒドロキシ/アシルオキシ（（米国特許第４，３６４，８６６号）（ストレプトマイセスによるメイタンシノールの変換により調製）；
(５)Ｃ−１５−メトキシ（（米国特許第４，３１３，９４６号および４，３１５，９２９号）（Trewia nudifloraより単離）；
(６)Ｃ−１８−Ｎ−デメチル（（米国特許第４，３６２，６６３号および４，３２２，３４８号）（ストレプトマイセスによるメイタンシノールの脱メチル化により調製）；および
(７)４，５−デオキシ（（米国特許第４，３７１，５３３号）（メイタンシノールの三塩化チタン/ＬＡＨによる還元により調製）。
【００２２】
[24]本明細書において使用する場合、“メイタンシノールのＣ３−エステル”という語句は、メイタンシノールの類似体の適切なＣ３−エステル、例えば上に記載したものを含む。上に記載したあらゆる類似体、およびメイタンシノールのあらゆるその他の公知の類似体は、Ｃ３の位置での多数の公知のエステルのいずれかを有することができる。したがって当業者は、出発材料としての使用に適するメイタンシノールの類似体の多数の適切なＣ３エステルを、容易に思い描くことができよう。メイタンシノールのＣ３エステルの非限定的例として、Ｃ１８−Ｎ−デス−アンサマイトシンとしても知られている抗生物質Ｃ−１５００３ＰＮＤ（米国特許第４，３２２，３４８号）、２０−デメトキシ−２０−アシルオキシメイタンシン（米国特許第４，２９４，７５７号）、１９−デス−クロロメイタンシン、および２０−デメトキシ−２０−アセトキシ−１９デス−クロロメイタンシン（米国特許第４，２９４，７５７号）を含む。
【００２３】
[25]アルミニウム系水素化物の還元試薬を用いてメイタンシノールのＣ３−エステルを還元するステップは、当該技術分野において周知されている。適切なアルミニウム系水素化物の還元試薬の非限定的例として、ＬｉＡｌＨ４、ＬｉＡｌ(ＯＭｅ)３Ｈ、水素化ビス(２−メトキシエトキシ)アルミニウムナトリウム、ＬｉＡｌ(ＯＭｅ)２．５Ｈ１．５、アルカリ金属アルミニウム水素化物に非化学量論的量のアルコールを添加することにより調製された、その他のアルカリ金属アルミニウムアルコキシ水素化物、を含む。ＬｉＡｌ(ＯＭｅ)３Ｈが好ましい。
【００２４】
[26]メイタンシノールのＣ３−エステルの還元のための温度およびその他の条件は、米国特許第６，３３３，４１０号に記載されており、同文献をその全内容において本明細書にて参照として援用する。
【００２５】
[27]当業者により容易に決定される適切な時間の後、これもまた米国特許第６，３３３，４１０号に記載されているように、水または塩の水溶液を用いて還元反応を停止させる。この反応停止により、塩基性のｐＨの混合物を得る。
【００２６】
[28]次に、還元反応で形成されたＣ３からＣ９に架橋されたアセタールを、塩基性の反応停止した混合物を、保持時間の間放置することにより、メイタンシノールに変換することができる。保持ステップは、反応停止した混合物を適切な温度で、適切な時間の間維持して、あらゆる架橋アセタールの、所望のメイタンシノールへの変換を促進することを包含する。望ましくは保持ステップは、反応停止した混合物を約−１５℃から約−５０℃の温度で、少なくとも約０．２５および５時間またはそれより長い時間、維持することを包含する。塩基性条件下での保持ステップは、還元反応時に形成されたあらゆる架橋アセタールが、メイタンシノールに変換されることを可能にする。上に記載した条件下での保持ステップに必要な時間は、いくつかの因子、例えば反応のスケール、濃度、および抽出温度に依存し、架橋アセタールのメイタンシノールへの変換をモニタリングすることにより決定することができる。例えば反応のアリコートサンプルを採取し、分析する。当業者は、サンプルをいくつかの方法により調製し分析することができ、その方法の一部として、順相高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)、逆相ＨＰＬＣ、および薄層クロマトグラフィーを含むがこれに限定されないことを、理解するだろう。代表的な場合において、アンサマイトシンはＬｉＡｌ(ＯＭｅ)３Ｈで還元した後、水で反応を停止させる。停止させた反応の少量のアリコートを０．３：０．０５：１の水：酢酸：酢酸エチル（ｖ：ｖ：ｖ）の混合液に加える。この処置により、架橋アセタールのメイタンシノールへの変換を本質的に停止させる。検査サンプルの有機層を分析して、架橋アセタールのメイタンシノールへの変換が完了しているかどうか、または保持期間を延長しなければならないかどうかを決定する。アンサマイトシン、メイタンシノール、および架橋アセタールはすべて、薄層クロマトグラフィーおよび逆相ＨＰＬＣにより分離できる。ＴＬＣまたはＨＰＬＣのいずれかによる分析は、アンサマイトシンの架橋アセタールへの変換、および架橋アセタールのメイタンシノールへの変換の、双方のモニタリングが可能である。
【００２７】
[29]塩基性条件下で架橋アセタールからメイタンシノールに変換するのが最も便利であるが、架橋アセタールはまた、酸性条件下でも変換することができる。酸性条件下での架橋アセタールからメイタンシノールへの変換は、アセタール保護基の開裂が有機合成において一般的であるように、驚くほどのことではない。いかなる説明に拘束されることも望んではいないが、塩基性水溶液による架橋アセタールのメイタンシノールへの変換は、アルデヒドの脱離に伴う環式カルバメートの脱プロトン化によって起こると考えられる、図４。
【００２８】
[30]一度架橋アセタールがメイタンシノールに変換されれば、当業者に公知のいくつかの手段により、得られたメイタンシノールを単離することができる。得られたメイタンシノールの分解を防ぐため、酸またはバッファー水溶液を加えることにより塩基性の反応停止した混合物のｐＨを、約３と約９の間に、最も好ましくは約４と約７の間に調整することができる。適切な酸として、塩酸、リン酸、トリフルオロ酢酸、ギ酸、および酢酸を含む。アルミニウム系の副生成物の、容易に濾過できる沈殿物が得られることから、これらのうちの好ましい酸は、ギ酸および酢酸である。
【００２９】
[31]また単離を助けるため、水混和性でない溶媒、例えば酢酸エチル、酢酸ブチル、またはジクロロメタンを加えることにより、アルミニウム系の副生成物を調製したｐＨで沈殿させることができる。ｐＨを調製を調製するのと同時に水混和性でない溶媒を加えることができる、またはこれらのステップを別々にいずれかの順に行うこともできる。酸および水混和性でない溶媒は、０℃または０℃以下で、好ましくは−２０℃および−６０℃の間で、より好ましくは−２５℃および−５０℃の間で、最も好ましくは−３０℃および−４０℃の間で加えて、アルミニウム系の副生成物を沈殿させる。沈澱したアルミニウム系の副生成物は、当業者に公知のいくつかの手段により除去することができる。例えば沈澱物を簡単に濾過し、その濾液が、Ｃ３−エステルの出発材料の架橋アセタールを実質的に含んでいないことが見出されている。
【００３０】
[32]本明細書において使用する場合、本文脈における“実質的に含まない”は、重量で１０％未満の出発Ｃ３−エステルの架橋アセタールが残っていることを示す。より好ましくは、５％未満の架橋アセタールが残っている、そして最も好ましくは、２％未満の架橋アセタールが残っている。
【００３１】
[33]あるいは、アルミニウム系の副生成物を沈殿させる代わりに、強酸、例えば塩酸または硫酸を反応停止の後加えて、ｐＨを約２またはそれ以下に調整し、アルミニウム系の副生成物を溶解させることができる。アルミニウム系の副生成物を溶解させることで、水相の効率的な抽出を可能とする。アルミニウム系の副生成物を溶解させるために必要な酸の量は、使用する酸の濃度およびタイプに依存するが、これらの決定は当業者の技術の範囲内である。
【００３２】
[34]アルミニウム系の副生成物を溶解させるために必要な高度に酸性の条件は、有意な比率のメイタンシノールを潜在的に分解する可能性がある。しかし抽出が効率的であり、酸性条件下で固体のアルミニウム系の副生成物が溶解するため、迅速な抽出を容易に行うことができる。例えば遠心抽出機を使用すれば、ほんの数分間またはおそらく数秒間、高度の酸性条件に材料が曝露されている間に、抽出を行うことを可能とすることができる。代表的な酸性の遠心抽出は、ペニシリンの抽出に使用されている、Podbielniak, W. J., Kaiser, H. R., Ziegenhorn, G. J. (1970) ”Centrifugal solvent extraction In the History of Penicillin Production” Chem. Eng. Prog. Symp. Vol. 66 ページ44-50。当業者は、酸性条件下での生成物の分解の程度が曝露時間に依存し、迅速な抽出を行うために多くの方法を利用できることを、理解するだろう。抽出されるメイタンシノールは、Ｃ３−エステル出発材料の架橋アセタールを実質的に含まない。
【００３３】
[35]本発明のさらなる側面は、単離されたメイタンシノールのＣ３からＣ９に架橋されたアセタールを提供することである。架橋アセタールは事実上、Ｃ３およびＣ９のアルコール上に保護基を有するメイタンシノールの形であり、したがってこれを使用して合成メイタンシノイド誘導体を調製することができる。あらゆるメイタンシノール類似体、例えば本明細書に記載したものは、本明細書に記載したものを含む、多数の架橋構造のいずれかを有することができる。したがって当業者は、本発明によって包含される多数のＣ３−Ｃ９架橋アセタールを、容易に思い描くことができよう。
【００３４】
[36]代表的なＣ３−Ｃ９架橋アセタールとして式（Ｉ’）の化合物を含む：
【００３５】
【化３】
2009514978.tif 000005
式中：
Ｘ１はＨ、Ｃｌ、またはＢｒを表し；Ｘ２はＨ、またはＭｅを表し；Ｘ３はＨ、Ｍｅ、またはＭｅ(ＣＨ２)ｐＣＯＯを表し、ここでｐは０−１０の間の数である；そして 
Ｒ１は、アルキル、ＣＨ(ＣＨ３)Ｎ(ＣＨ３)Ｑ、またはＣＨ(ＣＨ３)Ｎ(ＣＨ３)ＣＯＲ４を表す。
【００３６】
[37]Ｒ１がアルキルである場合、好ましいアルキルはＣ１−Ｃ４アルキル基、例えばＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ(ＣＨ３)２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)２、および(ＣＨ２)３ＣＨ３である。
【００３７】
[38]Ｒ１がＣＨ(ＣＨ３)Ｎ(ＣＨ３)Ｑである場合、ＱはＨであるか、またはＱはアミノ保護基を表す。アミノ保護基の多くは ”Protective groups in organic synthesis” 第２版に記載されている。代表的なＱ基として、スルフェンアミド  例えばＳ−アルキルおよびＳ−アリール、カルバメート  例えばＣＯＯ−アルキル、ＣＯＯ−アリール、ＣＯＯＣＨ２ＣＨ２ＳｉＭｅ３、ＣＯＯＣＭｅ３、ＣＯＯＣＨ２ＣＣｌ３、およびＣＯＯＣＨ２ＣＦ３、ならびにシリル基  例えばＳｉＭｅ３、ＳｉＭｅ２−ｔＢｕを含むがこれに限定されない。Ｑの一部がアルキルである場合、適切なアルキル基としてＣ１−Ｃ１０アルキル基、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、tert−ブチル、シクロペンチル等、を含むがこれに限定されない。またＱの一部がアリールである場合、適切なアリール基は、Ｃ１−Ｃ１２の単純なまたは置換されたアリールまたは複素環式基、例えばフェニル、ピリジル、ナフチルを含むがこれに限定されない。
【００３８】
[39]Ｒ１がＣＨ(ＣＨ３)Ｎ(ＣＨ３)ＣＯＲ４である場合、Ｒ４は、アルキル、アリール、または(ＣＨ２)ｎ(ＣＲ６Ｒ７)ｍＳＶより選択され、ここでｎは０−９を表し、ｍは０−２を表すが、ただしｎおよびｍは同時に０ではなく；Ｒ６は、Ｈ、アルキル、またはアリールを表し、Ｒ７は、Ｈ、アルキル、またはアリールを表し、そしてＶは、Ｈまたはチオール保護基を表す。チオール保護基の多くは”Protective groups in organic synthesis” 第２版に記載されている。代表的なチオール保護基は、アリール、Ｓ−アルキル、Ｓ−アリール、ＳｉＭｅ３、ＳｉＭｅ２−ｔＢｕ、ＡｒＮＯ２、Ａｒ(ＮＯ２)２、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリールを含むがこれに限定されない。Ｖの一部がアルキルである場合、適切なアルキル基としてＣ１−Ｃ１０の直鎖アルキル、分枝鎖アルキル、または環式アルキル、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、tert−ブチル、シクロペンチル等、を含むがこれに限定されない。またＶの一部がアリールである場合、適切なアリール基は、Ｃ１−Ｃ１２の単純なまたは置換されたアリールまたは複素環式基、例えばフェニル、ピリジル、ナフチルを含むがこれに限定されない。当業者は、アセタール側鎖中にあるＲ１基が、対応するＣ３−エステル側鎖を有するメイタンシノールのＣ３−エステルの還元により変化し得ることを、理解するだろう。
【００３９】
[40]Ｒ４により表される基の目的のため、適切なアルキル基は、直鎖Ｃ１−Ｃ１０アルキル、および分枝鎖または環式のＣ３−Ｃ１０アルキル、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、tert−ブチル、シクロペンチル等、を含むがこれに限定されない。またＲ４により表される基の目的のため、適切なアリール基は、単純なまたは置換されたＣ３−Ｃ１２アリールまたは複素環式基、例えばフェニル、ピリジル、およびナフチルを含むがこれに限定されない。
【００４０】
[41]Ｒ６およびＲ７により表される基の目的のため、適切なアルキル基は、直鎖Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、tert−ブチル、シクロペンチル等、を含むがこれに限定されない。またＲ６およびＲ７により表される基の目的のため、適切なアリール基は、Ｃ３−Ｃ１２の単純なまたは置換されたアリールまたは複素環式基、例えばフェニル、ピリジル、およびナフチルを含むがこれに限定されない。
【００４１】
[42]もう１つの側面において架橋アセタールは、式(Ｉ)により表される：
【００４２】
【化４】
2009514978.tif 000006
式中Ｒ１は式（Ｉ’）について上に定義したとおりである。
【００４３】
[43]架橋アセタールは、上に記載したようにメイタンシノールのＣ３−エステルの還元の副生成物として調製することができ、クロマトグラフィー、例えばこれに限定されないが、順相クロマトグラフィー、シリカクロマトグラフィー、シアノ結合したシリカクロマトグラフィー、または逆相クロマトグラフィーにより単離することができる。単離の１つのそのような例を実施例３に示す。
【００４４】
[44]単離された架橋アセタールは、約４０℃から約−４０℃の間の範囲の温度で、酸または塩基と共にインキュベーションすることにより、メイタンシノールに変換される。典型的にはこの反応は周囲温度で行う。反応に必要な時間は、いくつかの因子、例えばｐＨ、温度、反応のスケール、および濃度に依存することになり、ＨＰＬＣによりモニタリングすることができる。適切な酸として、塩酸、リン酸、トリフルオロ酢酸、酢酸、およびギ酸を含む。適切な塩基として、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ＮａＯＨ、またはあらゆる強塩基を含む。酸性条件下での変換に関して、ｐＨは約１および約５の間、最適には約２および約４の間に調整する。塩基性条件下での変換に関して、ｐＨは約８および約１３の間、最適には約９および約１２の間に調整する。
【００４５】
[45]当業者は、本明細書に説明した方法、処理条件、および技術の機能的均等物をラージスケールで（例えば工業的に）使用することができることを、認識し理解するだろう。そのような公知の均等物はすべて、本発明により包括的に含まれることを意図する。
【００４６】
[46]本明細書および以下の実施例に引用したすべての参考文献は、その全内容において参照として明確に援用する。
【実施例】
【００４７】
材料および方法
[47]本発明を以下の実施例によりさらに記載するが、これら実施例は方法の説明であり、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。以下に示した方法のパラメータは、当業者の特定の必要性に適するように採り入れ、そして適用することができる。
【００４８】
[48]すべての反応は、マグネティックスターラーで撹拌しながらアルゴン雰囲気下で行った。冷却浴の温度は、溶媒としてアセトン、およびNesLab CC-100冷却ユニットを使用して維持した。テトラヒドロフランは、無水溶媒としてAldrichより購入した。メイタンシノールのＣ３エステル、例えばオシンは、米国特許第６，７９０，９５４号に記載されているように生成した。Ｄ−ＤＭ１−ＳＭｅは、米国特許第６，３３３，４１０号に記載されているように調製した。Ｄ−ＤＭ４−ＳＭｅは、米国特許公開第２００４０２３５８４０号に記載されているように調製した。核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、Bruker ＡＤＶＡＮＣＥ（登録商標）シリーズのＮＭＲを使用して、４００ＭＨｚで得た。Bruker ＥＳＱＵＩＲＥ（登録商標）３０００イオントラップ型質量分析計を使用して質量スペクトルを得、そしてAgilent １１００シリーズＨＰＬＣと連結して、または別々に使用した。適用可能な場合は、サンプルは、以下に記載する逆相分析用ＨＰＬＣ法を使用して分析した。また適用可能な場合は、サンプルは、以下に記載する調製用ＨＰＬＣ法を使用して精製した。分析用薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）アッセイは、シリカＴＬＣプレート、およびジクロロメタン：メタノール  ９５：５（ｖ：ｖ）の移動相を使用して行った。
【００４９】
[49]ＨＰＬＣ法：
Ａ．分析用逆相ＨＰＬＣ法：
カラム：Kromasil  Ｃ８  １５０×４．６ｍｍ、５ミクロン。温度：周囲温度。流速：１．０ｍＬ/分。注入容量：４．０マイクロリットル。
【００５０】
【表１】
2009514978.tif 000007
Ｂ．調製用逆相ＨＰＬＣ法：
カラム：Kromasil  Ｃ８  ２５０×２０ｍｍ、１０ミクロン。温度：周囲温度。流速：１９ｍＬ/分。注入容量：典型的には０．１−０．２ｍＬの間。
【００５１】
【表２】
2009514978.tif 000008
実施例１：０．６７Ｍ  ＬｉＡｌ(ＯＭｅ)３Ｈの調製
[50]２００ｍＬ三又フラスコにマグネティックスターラーと温度計をセットした。テトラヒドロフラン中のＬｉＡｌＨ４の１Ｍ  水素化リチウムアルミニウム溶液（７１ｍＬ、７１ｍｍｏｌ）、および２６．８ｍＬのテトラヒドロフランを、シリンジにてフラスコ内に移した。フラスコは−６０℃浴中で、撹拌しながら、内容物が−４３℃に達するまで冷却した。内容物の温度を−４０℃と−４５℃の間に維持しながら、８．０ｍＬのテトラヒドロフラン中の８．７ｍＬのメタノール（６．８５ｇ、２１４ｍｍｏｌ）の溶液を、シリンジにて滴下させながら加えた。溶液を−４５℃でさらに１０分間撹拌した。
【００５２】
実施例２：ＬｉＡｌ(ＯＭｅ)２．５Ｈ１．５の調製
[51]２００ｍＬ三又フラスコにマグネティックスターラーと温度計をセットした。テトラヒドロフラン中のＬｉＡｌＨ４の１Ｍ  水素化リチウムアルミニウム溶液（７１ｍＬ、７１ｍｍｏｌ）、および２８ｍＬのテトラヒドロフランを、シリンジにてフラスコ内に移した。フラスコは−６０℃浴中で、撹拌しながら、内容物が−４３℃に達するまで冷却した。内容物の温度を−４０℃と−４５℃の間に維持しながら、８．０ｍＬのテトラヒドロフラン中の７．２５ｍＬのメタノール（５．７１ｇ、１７８ｍｍｏｌ）の溶液を、シリンジにて滴下させながら加えた。溶液を−４５℃でさらに１０分間撹拌した。
【００５３】
実施例３：式（Ｉ）に示した架橋アセタールの調製、Ｒ１＝ＣＨ(ＣＨ３)２
[52]本実施例は、式（Ｉ）に示した架橋アセタール化合物の調製について記載する。ここでＲ１はＣＨ(ＣＨ３)２であり、ＬｉＡｌ(ＯＭｅ)３Ｈを用いての還元に続いて、ギ酸水溶液により反応を停止させる。アンサマイトシン（３．０ｇ、４．７２ｍｍｏｌ）を、温度計をセットした三又フラスコ内に量り採った。テトラヒドロフラン（１５ｍＬ）を撹拌しながらフラスコに加え、フラスコを−５７℃の冷却浴中で冷却した。フラスコの内容物が一度−３５℃に達したら、テトラヒドロフラン中の０．６７Ｍ  ＬｉＡｌ(ＯＭｅ)３Ｈの溶液（５６ｍＬ、３７．７ｍｍｏｌ）を、シリンジポンプを使用してシリンジにより滴下させながら加えた。反応物の温度は、添加の間ずっと−３０℃と−４０℃の間に維持した。添加が完了した後、反応物を−３４℃と−３７℃の間で２時間撹拌した。２３ｍＬの脱イオン水中の８８％ギ酸（１．８５ｍＬ、２．１６ｇ、４１．５ｍｍｏｌ）の溶液を、過剰な泡がたたない速度でフラスコに滴下させながら加え、その後６６ｍＬの酢酸エチルを加えた。冷却浴を外し、混合物を放置して室温まで温めた。混合物のｐＨをｐＨ試験紙で調べ、約ｐＨ６であることを認めた。沈澱したアルミニウム系の副生成物を真空濾過により除去し、真空下でロータリーエバポレーターにより、濾液から溶媒を除去した。酢酸ブチル（１０ｍＬ）を残渣に加え、その後残った水を除去するため溶媒を蒸発させた。残渣をシリカクロマトグラフィーにより、ジクロロメタン：メタノール  ９５：５（ｖ：ｖ）を使用して精製し、後出の溶出バンド（メイタンシノール）および前出の溶出バンドを得た。メイタンシノールバンドを集め、ロータリーエバポレーターにより溶媒を除去して、１．５５ｇのメイタンシノール（収率５８％、重量にて）を得た。前出の溶出バンドからも溶媒を除去し、材料を最小量のアセトニトリルに溶かした後、調製用逆相ＨＰＬＣにより精製した。式（Ｉ）の化合物（保持時間２６分）を回収し、ロータリーエバポレーターにより溶媒を除去して、４４０ｍｇ（収率１５％、重量にて）を得た。
【００５４】
【化５】
2009514978.tif 000009
実施例４：塩基性条件（ｐＨ１１）下、周囲温度での、Ｒ１＝ＣＨ(ＣＨ３)２の式（Ｉ）の化合物のメイタンシノールへの変換
[53]本実施例は、Ｒ１がＣＨ(ＣＨ３)２である式（Ｉ）の化合物の、塩基性条件（ｐＨ１１）下、周囲温度でのメイタンシノールへの変換について記載する。ジイソプロピルエチルアミンを、３０ｍＬのテトラヒドロフランおよび１０ｍＬの脱イオン水の溶液に、ｐＨメーターを使用してｐＨをモニタリングしながら、ｐＨ１１になるまで加えた。実施例３で調製した式（Ｉ）の化合物（３．０ｍｇ、ｍｍｏｌ）を、１．５ｍＬのｐＨ１１のテトラヒドロフラン/水の溶液に周囲温度で溶かし、よく混合した。この溶液を、様々なタイプポイントでＨＰＬＣ/ＭＳにより分析した。生成物の保持時間および質量スペクトルは、標準のメイタンシノールの値に合致した。変換は１５分後におよそ１/２完了した。
【００５５】
実施例５：酸性条件（ｐＨ２．０）下、周囲温度での、式（Ｉ）の架橋アセタールのメイタンシノールへの変換
[54]トリフルオロ酢酸を、３０ｍＬのテトラヒドロフランおよび１０ｍＬの脱イオン水の溶液に、ｐＨメーターを使用してｐＨをモニタリングしながら、ｐＨ２になるまで加えた。式（Ｉ）の化合物（３．０ｍｇ、ｍｍｏｌ）を、１．５ｍＬのｐＨ２のテトラヒドロフラン/水の溶液に周囲温度で溶かし、よく混合した。この溶液を、様々なタイプポイントでＨＰＬＣ/ＭＳにより分析した。生成物の保持時間および質量スペクトルは、標準のメイタンシノールの値に合致した。変換は１時間後におよそ１/２完了した。
【００５６】
実施例６：式（Ｉ）の架橋アセタールのメイタンシノールへの変換のパーセントを決定するためのアッセイ
[55]約０．２ｍＬの反応混合物を、０．３ｍＬ水、０．０５ｍＬ酢酸、１ｍＬ酢酸エチルを含有する試験管に素早く加え、よく混合した。得られた混合液は、相当の比率では式（Ｉ）の架橋アセタールからメイタンシノールに全く変換していなかった。標準のメイタンシノール、アンサマイトシン、および式（Ｉ）の化合物を含む有機層を、ジクロロメタン：メタノール  ９５：５（ｖ：ｖ）を使用して薄層クロマトグラフィーにより分析した。反応の進行した反応混合物のバンドについて、標準の化合物の１つと共に共移動したかどうかを同定した。有機層はまた、最初に等量のアセトニトリルで希釈し、逆相ＨＰＬＣで分析することにより分析した。標準のアンサマイトシン、メイタンシノール、および式（Ｉ）の化合物の保持時間は、各々、１６．２分、８．７分、および１６．９分と決定された。
【００５７】
実施例７：アンサマイトシンの、ＬｉＡｌ(ＯＭｅ)３Ｈを用いての還元、水の使用、続いてギ酸水溶液を用いて反応停止し、メイタンシノールを得る方法
[56]アンサマイトシン（３．０ｇ、４．７２ｍｍｏｌ）を、温度計をセットした三又フラスコ内に量り採った。テトラヒドロフラン（１５ｍＬ）を撹拌しながらフラスコに加え、フラスコを−５０℃の冷却浴中で冷却した。フラスコの内容物が一度−３５℃に達したら、テトラヒドロフラン中の０．６７Ｍ  ＬｉＡｌ(ＯＭｅ)３Ｈの溶液（５６ｍＬ、３７．７ｍｍｏｌ）を、シリンジポンプを使用してシリンジにより滴下させながら加えた。反応物の温度は、添加の間ずっと−３０℃と−４０℃の間に維持した。添加が完了した後、反応物を−３２℃と−３７℃の間で２時間撹拌した。脱イオン水（７．７ｍＬ）を、−３５℃の反応物に滴下させながら加えて、塩基性の反応停止した混合物を得た。この塩基性の反応停止した混合液を設定した保持時間の後、実施例６に記載の薄層クロマトグラフィーアッセイにより分析した。５分および１５分間の保持時間後には、式（Ｉ）の化合物が検出された。３０分後、塩基性の反応停止した混合物のサンプルを、薄層クロマトグラフィーにより再度分析した。式（Ｉ）の化合物はもはや検出されなかった。次にギ酸水溶液（脱イオン水  １５ｍＬ、および８８％ギ酸  １．８５ｍＬ）をフラスコに加え、続いて６６ｍＬの酢酸エチルを加えた。冷却ユニットのスイッチを切り、混合物を放置してゆっくり室温まで温めた。混合物のｐＨをｐＨ試験紙で調べ、約ｐＨ６であることを認めた。沈澱したアルミニウム副生成物を真空濾過により除去した。真空下でロータリーエバポレーターにより、濾液から溶媒を蒸発させた。酢酸ブチルを残渣に加え、その後あらゆる残存する水を除去するため溶媒を蒸発させた。残渣をシリカクロマトグラフィーにより、ジクロロメタン：メタノール  ９５：５（ｖ：ｖ）の移動相を使用して精製し、２．２ｇのメイタンシノール（収率８５％、重量にて）を得た。
【００５８】
実施例８：アンサマイトシンのＬｉＡｌ(ＯＭｅ)２．５Ｈ１．５を用いての還元、続いて水による反応停止、ギ酸を用いてのｐＨ中和
[57]本実施例は、アンサマイトシンのＬｉＡｌ(ＯＭｅ)２．５Ｈ１．５を用いての還元、水の使用、続いてギ酸水溶液を用いての反応停止について記載する。アンサマイトシン（１．０ｇ、１．５７ｍｍｏｌ）を、温度計をセットした三又フラスコ内に量り採った。テトラヒドロフラン（５ｍＬ）を撹拌しながらフラスコに加え、フラスコを−５０℃の冷却浴中で冷却した。フラスコの内容物が一度−３５℃に達したら、テトラヒドロフラン中の０．６７Ｍ  ＬｉＡｌ(ＯＭｅ)３Ｈの溶液（１８．５ｍＬ、１２．４ｍｍｏｌ）を、シリンジポンプを使用してシリンジにより滴下させながら加えた。反応物の温度は、添加の間ずっと−３０℃と−４０℃の間に維持した。添加が完了した後、反応物を−３２℃と−３７℃の間で２時間撹拌した。脱イオン水（２．５ｍＬ）を、−３５℃の反応物に滴下させながら加え、塩基性の反応停止した混合物を得た。この塩基性の反応停止した混合液を、実施例６に記載した薄層クロマトグラフィーアッセイにより分析した。式（Ｉ）の化合物が検出された。３０分後、塩基性の反応停止した混合物を、薄層クロマトグラフィー法により再度分析した。式（Ｉ）の化合物はもはや検出されなかった。次にギ酸水溶液（脱イオン水  ５ｍＬ、および８８％ギ酸  ０．６２ｍＬ）をフラスコに加え、続いて２２ｍＬの酢酸エチルを加えた。冷却ユニットのスイッチを切り、混合物を放置してゆっくり室温まで温めた。混合物のｐＨをｐＨ試験紙で調べ、約ｐＨ６であることを認めた。混合物を真空濾過し、真空下でロータリーエバポレーターにより、溶媒を除去した。酢酸ブチル（５ｍＬ）を残渣に加え、その後あらゆる残存する水を除去するため溶媒を蒸発させた。残渣をシリカクロマトグラフィーにより、ジクロロメタン：メタノール  ９５：５（ｖ：ｖ）の移動相を使用して精製し、０．６３ｇのメイタンシノール（収率７１％、重量にて）を得た。
【００５９】
実施例９：アンサマイトシンのＬｉＡｌ(ＯＭｅ)３Ｈを用いての還元、続いて水による反応停止、ＨＣｌを用いての酸性化
[58]本実施例は、アンサマイトシンのＬｉＡｌ(ＯＭｅ)３Ｈを用いての還元、水の使用、続いてのＨＣｌ水溶液の添加について記載する。アンサマイトシン（２００ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）を、２５ｍＬ丸底フラスコ内に量り採った。テトラヒドロフラン（１．０ｍＬ）を撹拌しながらフラスコに加え、フラスコを−４２℃の冷却浴中で冷却した。１０分後、テトラヒドロフラン中の０．６７Ｍ  ＬｉＡｌ(ＯＭｅ)３Ｈの溶液（３．８ｍＬ、２．５２ｍｍｏｌ）を、シリンジにより滴下させながら加えた。冷却浴の温度は、添加の間ずっと−３４℃と−４２℃の間に維持した。添加が完了した後、反応物を−３２℃と−３７℃の間で２時間撹拌した。１ｍＬの脱イオン水を、反応物に滴下させながら加えた。３０分の保持時間の後、２ｍＬの３Ｍ  ＨＣｌおよび１０ｍＬの酢酸エチルをフラスコに素早く加えた。冷却ユニットのスイッチを切り、ほとんどのアルミニウム副生成物は溶液中に溶解した。内容物を分別ロートに移し、よく混合した。有機層を残し、２ｍＬの飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒をロータリーエバポレーターにより除去した。残渣をシリカクロマトグラフィーにより、ジクロロメタン：メタノール  ９５：５（ｖ：ｖ）の移動相を使用して精製し、１１７ｍｇのメイタンシノール（収率６６％、重量にて）を得た。
【００６０】
実施例１０：Ｄ−ＤＭ１−ＳＭｅのメイタンシノールへの還元
[59]本実施例は、図２に示したＤ−ＤＭ１−ＳＭｅのメイタンシノールへの還元について記載する。Ｄ−ＤＭ１−ＳＭｅ（１０．０ｇ、１２．７ｍｍｏｌ）を、温度計をセットした三又フラスコ内に量り採った。テトラヒドロフラン（４０．５ｍＬ）を撹拌しながらフラスコに加え、フラスコを−５０℃の冷却浴中で冷却した。フラスコの内容物が一度−３５℃に達したら、テトラヒドロフラン中の０．６７Ｍ  ＬｉＡｌ(ＯＭｅ)３Ｈの溶液（１５０ｍＬ、１００ｍｍｏｌ）を、シリンジポンプを使用してシリンジにより滴下させながら加えた。反応物の温度は、添加の間ずっと−３０℃と−４０℃の間に維持した。添加が完了した後、反応物を−３２℃と−３７℃の間で２時間撹拌した。脱イオン水（２０ｍＬ）を、−３５℃の反応物に滴下させながら加え、塩基性の反応停止した混合物を得た。３０分後、ギ酸水溶液（脱イオン水  ４０ｍＬ、および８８％ギ酸  ５．０ｍＬ）をフラスコに加え、続いて１８０ｍＬの酢酸エチルを加えた。冷却ユニットのスイッチを切り、混合物を放置してゆっくり室温まで温めた。混合物のｐＨをｐＨ試験紙で調べ、約ｐＨ６であることを認めた。混合物を真空濾過し、真空下でロータリーエバポレーターにより、溶媒を除去した。酢酸ブチル（２５ｍＬ）を残渣に加えた後、あらゆる残存する水を除去するため溶媒を蒸発させた。残渣をシリカクロマトグラフィーにより、ジクロロメタン：メタノール  ９５：５（ｖ：ｖ）の移動相を使用して精製し、４．８３ｇのメイタンシノール（収率６７％、重量にて）を得た。
【００６１】
実施例１１：Ｄ−ＤＭ４−ＳＭｅのメイタンシノールへの還元
[60]本実施例は、図２に示したＤ−ＤＭ４−ＳＭｅのメイタンシノールへの還元について記載する。Ｄ−ＤＭ４−ＳＭｅ（５０１ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）を、温度計をセットした三又フラスコ内に量り採った。テトラヒドロフラン（２．０ｍＬ）を撹拌しながらフラスコに加え、フラスコを−５０℃の冷却浴中で冷却した。フラスコの内容物が一度−３５℃に達したら、テトラヒドロフラン中の０．６７Ｍ  ＬｉＡｌ(ＯＭｅ)３Ｈの溶液（７．１ｍＬ、４．７５ｍｍｏｌ）を、シリンジポンプを使用してシリンジにより滴下させながら加えた。反応物の温度は、添加の間ずっと−３０℃と−４０℃の間に維持した。添加が完了した後、反応物を−３２℃と−３７℃の間で２時間撹拌した。脱イオン水（１ｍＬ）を、−３５℃の反応物に滴下させながら加え、塩基性の反応停止した混合物を得た。３０分後、ギ酸水溶液（脱イオン水  ２．０ｍＬ、および８８％ギ酸  ０．２４ｍＬ）をフラスコに加え、続いて９ｍＬの酢酸エチルを加えた。冷却ユニットのスイッチを切り、混合物を放置してゆっくり室温まで温めた。混合物を真空濾過し、真空下でロータリーエバポレーターにより、溶媒を除去した。酢酸ブチル（２ｍＬ）を残渣に加えた後、あらゆる残存する水を除去するため溶媒を蒸発させた。残渣をシリカクロマトグラフィーにより、ジクロロメタン：メタノール  ９５：５（ｖ：ｖ）の移動相を使用して精製し、４４３ｍｇのメイタンシノール（収率６５％、重量にて）を得た。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
[16]
【図１】図１ａは、メイタンシノールの構造式を示し、図１ｂは、細菌の発酵から単離されたアンサマイトシンの混合物中に存在する主なアンサマイトシン種の構造式を示す。
【００６３】
[17]
【図２】図２は、メイタンシンおよびその類似体のいくつか、ならびに非天然のＮ−メチル−Ｄ−アラニン部分を有するメイタンシン類似体の構造式を示す。
【００６４】
[18]
【図３】図３は、アンサマイトシンＰ−３の還元により生成された、Ｃ３からＣ９に架橋されたアセタール種の構造式を示す。アンサマイトシンＰ−３の構造式もまた比較のため示す。架橋アセタールのアセタール側鎖、およびアンサマイトシンＰ−３のエステル側鎖を丸で囲んで示す。
【００６５】
[19]
【図４】図４は、メイタンシノールのＣ３からＣ９に架橋されたアセタールの、メイタンシノールへの変換に関する可能性あるメカニズムを示す。架橋アセタールは、本明細書に記載した一般式（Ｉ）の化合物により示す。
【図１】
2009514978.tif 000015
【図２】
2009514978.tif 000016
【図３】
2009514978.tif 000017
【図４】
2009514978.tif 000018
【手続補正書】
【提出日】平成20年7月10日(2008.7.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１９】
Ｒ４が、ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＳＳＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)ＳＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)ＳＳＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２Ｃ(ＣＨ３)２ＳＨ、またはＣＨ２ＣＨ２Ｃ(ＣＨ３)２ＳＳＣＨ３である、請求項１７に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２７】
Ｒ４が、ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＳＳＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)ＳＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)ＳＳＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２Ｃ(ＣＨ３)２ＳＨ、またはＣＨ２ＣＨ２Ｃ(ＣＨ３)２ＳＳＣＨ３である、請求項２５に記載の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４３】
Ｒ４が、ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＳＳＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)ＳＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)ＳＳＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２Ｃ(ＣＨ３)２ＳＨ、またはＣＨ２ＣＨ２Ｃ(ＣＨ３)２ＳＳＣＨ３である、請求項４１に記載の方法。
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
2009514978.tif 000019
【国際調査報告】
2009514978.tif 000020