(57)【要約】  本発明は 支持細胞が底面に付着された多孔性膜を含むヒト胚芽幹細胞培養用培地中で、ヒト胚芽幹細胞を培養する方法、及びこれを利用したヒト胚芽幹細胞の回収方法に関する。
2009538617.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持細胞が底面に付着された多孔性膜を含むヒト胚芽幹細胞培養用培地中で、ヒト胚芽幹細胞を培養する方法。
【請求項２】
前記多孔性膜が、ポリエチレンテレフタレート、ポリエーテルスルホン、フッ化ポリビニリデン、セルロース、ナイロン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリアクリレート、ポリカプロラクトン及びそれらの共重合体からなる細胞粘着性重合体から選択されることを特徴とする請求項１に記載の培養方法。
【請求項３】
前記多孔性膜が０．１ないし３μｍの孔隙サイズを有することを特徴とする請求項１に記載の培養方法。
【請求項４】
前記支持細胞がマウス線維芽細胞、マウス胚芽線維芽細胞、ヒト胚芽線維芽細胞、ヒト骨髄細胞、または成体上皮細胞であることを特徴とする請求項１に記載の培養方法。
【請求項５】
前記多孔性膜がコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、またはメトリゲルによってコーティングされていることを特徴とする請求項１に記載の培養方法。
【請求項６】
請求項１から請求項５のうちいずれか１項に記載の方法でヒト胚芽幹細胞を培養する段階と、前記多孔性膜からヒト胚芽幹細胞を分離する段階とを含むヒト胚芽幹細胞の回収方法。
【請求項７】
前記多孔性膜からヒト胚芽幹細胞を分離する段階が、多孔性膜からヒト胚芽幹細胞を掻き出すことによって行われることを特徴とする請求項６に記載の回収方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト胚芽幹細胞の培養方法、及びこれを利用したヒト胚芽幹細胞の回収方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト胚芽幹細胞（ｈＥＳＣｓ）は、全分化能（totipotency）を有して、人体を構成する三胚葉（内胚葉、外胚葉、中胚葉）に分化されうる。従って、ｈＥＳＣｓについての研究は、人間分化の初期段階の根本的な側面に対する重要な端緒を提供し、難治病のような疾病に対する細胞治療研究において、重要な役割を果たせる。かかる観点から、ｈＥＳＣｓを利用した細胞治療は、多くの注目を集めてきた。しかし、マウス胚芽幹細胞の培養成功が報告されたにもかかわらず、ｈＥＳＣｓ培養は、その特異性によって成功を収められなかった。
【０００３】
１９９８年にトムソン（Ｔｈｏｍｓｏｎ）らがｈＥＳＣｓの培養成功を報告して以来(Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS, Jones JM, Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science (1998) 282: 1145-7)、ｈＥＳＣｓを利用した治療研究は重大な転換点を迎え、ｈＥＳＣｓの無限の可能性に多大な関心が集中している。
ｈＥＳＣｓの培養成功が報告されたにもかかわらず、臨床適用のためには、解決されねばならないいくつかの問題点がある。かかる問題点のうちの一つは、細胞培養時に伴うｈＥＳＣｓの汚染である。現在、トムソンの方法を基に開発された最も一般的なｈＥＳＣ培養方法によれば、白血病抑制因子（ＬＩＦ）で補充された組織培養培地中で、マウス胚芽線維芽細胞（ＭＥＦ）を支持細胞（feeder cell）として利用してｈＥＳＣｓを培養する。マウス胚芽幹細胞を培養する方法と異なり、単にＬＩＦの添加だけでｈＥＳＣｓの分化を抑制できない。従って、ｈＥＳＣｓの早い成長を防止できる支持細胞が今のところ絶対的に要求される(Reubinoff BE, PEra MF, Fong C, Trounson A, Bongso A, Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. (2000) 18(4): 399-404)。
【０００４】
新しい培養培地条件及び動物基質細胞との共培養を介して、ｈＥＳＣｓを培養するための多様な方法が研究されている。しかし、動物細胞及び動物細胞由来の栄養物質の使用によって引き起こされる問題点、及び特にｈＥＳＣｓ内への動物細胞の残留可能性によって、それらの方法の臨床適用は相変らず限界があると報告されている。従って、動物細胞による汚染及び感染を減らすために、支持細胞としてマウスの線維芽細胞を使用する代わりに、ヒト線維芽細胞、ヒト骨髄基質細胞、羊水細胞のようなヒト細胞を利用したｈＥＳＣｓを培養する方法が開発された。しかし、かかる方法は、長期間の継代培養を達成できないので、細胞治療のための多量の幹細胞を確保し難い。また、ヒト細胞を支持細胞として使用するとしても、培養された幹細胞だけを支持細胞から効果的に分離し難い。従って、臨床適用に適した培養及び分離方法が絶対的に要求されている。
従って、培養中及び培養後、細胞汚染及び損傷なしに培養されたｈＥＳＣｓを選択的に分離する方法は、ｈＥＳＣｓの臨床適用を可能にする非常に重要な核心技術として見なされている。
【０００５】
一般的に、支持細胞から幹細胞を効果的に分離し出すために、酵素処理方法と機械的方法とが使われる。
まず、酵素処理方法と関連し、コラゲナーゼ、トリプシン、またはディスパーゼのような酵素を含有する溶液を培養皿上で処理することによって、短時間に多量のｈＥＳＣｓを回収できる(Xu C, Inokuma MS, Denham J et al. Feeder free grwoth of undifferntiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol (2004), 19, 971-974; Richards M, Fong CY, Chan WK et al. Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cell. Nat Biotechnol (2002), 20, 933-936; Hovatta O, Mikkola M, Gertow K et al. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum Reprod (2003), 18, 1404-1409)。しかし、酵素処理過程でｈＥＳＣｓが汚染されたり、または悪影響を受けることがある（例えば、核型異常（Karyotypic abnormalities））。
【０００６】
一方、機械的方法は、ピペットを使用してｈＥＳＣｓだけを掻き出す機械的分離方法である(Heins  N, Englund MC, Sjoblom C et al. Derivation, characterization, and differentiation of human embryonic stem cells. STEM CELLS (2004), 22, 367-376; Oh SK, Kim HS, Park YB et al. Method for expansion of human embryonic stem cells, STEM CELLS (2005), 23, 605-609)。前記機械的方法は、薄くて尖ったピペットを使用し、顕微鏡で培養皿を観察しつつ、ｈＥＳＣｓだけを手作業で分離する方法である。かかる方法は、酵素処理によって発生する問題点を排除することはできるが、多くの手間と時間とが要求され、支持細胞が回収される幹細胞中に含まれていることがある。
かかる問題点を解決して多量のｈＥＳＣｓを確保するために、ｈＥＳＣｓと支持細胞との境界面をある程度機械的に分離した後、酵素で処理する組合わせ方法（combination technique）が最近開発された(Oh SK, Kim HS, Park YB et al. Method for expansion of human embryonic stem cells, STEM CELLS (2005), 23, 605-609)。しかし、前記組合わせ方法は処理時間（process duration）を短縮することはできるが、相変らず多くの手間及び時間がかかり、酵素に露出される点を解決できていない。
また、自動化システムを利用して培養されたｈＥＳＣｓを分離及び回収する方法は、前記分離及び回収の時間を有意性あるように短縮させることができる(Alexis J, Christelle F-H, Kristine W et al. Automated Mechanical Passaging: A Novel and efficient method for human embryonic stem cell expansion, STEM CELLS (2006), 24, 230-235)。しかし、自動化装置の正確度欠如によって、前記自動化方法は、酵素処理方法及び／または機械的方法よりさらに深刻な細胞汚染を引き起こしうる。
このように、現在まで開発された方法は、前記の根本的な問題点を解決できない。また、多量のｈＥＳＣｓを確保しても、得られたｈＥＳＣｓは、人間の治療のために臨床で適用するには不適である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、支持細胞による汚染を有意性あるように減らすことができ、かつたやすく分離の可能なｈＥＳＣｓの培養方法を研究している最中、支持細胞が底面に付着された多孔性膜上でｈＥＳＣｓを培養する場合、ｈＥＳＣｓをたやすく効果的に分離でき、高純度で得ることができるということを発見した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従って、本発明は、多孔性膜を使用したｈＥＳＣｓの培養方法を提供する。
本発明はまた、前記培養方法によって得られた培養液からｈＥＳＣｓを回収する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の一様態によって、支持細胞が底面に付着された多孔性膜を含むヒト胚芽幹細胞培養用培地中で、ヒト胚芽幹細胞を培養する方法が提供される。
本発明の他の様態によって、前記培養方法でヒト胚芽幹細胞を培養する段階と、前記多孔性膜からヒト胚芽幹細胞を分離する段階とを含むヒト胚芽幹細胞の回収方法が提供される。
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１０】
本発明の培養方法により、ヒト胚芽幹細胞（ｈＥＳＣｓ）が、支持細胞が底面に付着された多孔性膜を含む培養培地中で培養される。従って、培養されるｈＥＳＣｓと支持細胞との相互作用を持続的に維持でき、培養されたｈＥＳＣｓを未分化状態で維持しつつ、多孔性膜に粘着及び分布できるようにする。従って、培養完了後に、酵素処理なしに多孔性膜から培養されたｈＥＳＣｓのみを回収できるので、酵素処理及び支持細胞によって発生しうる汚染問題を解決できる。
用語「ヒト胚芽幹細胞（ｈＥＳＣｓ）」は、ヒト胚盤胞の内部細胞塊から由来した多能性細胞をいう。例えば、ｈＥＳＣｓは、ＣＨＡ−ｈＥＳ３(Ahn SE, Kim S, Park KH, Moon SH, Lee HJ, Kim GJ, Lee YJ, Park KH, Cha KY, Chung HM. Primary bone-derived cells induce osteogenic differentiation without exogenous factors in human embryonic stem cells. Biochem Biophys Res Commun. (2006) 10; 340(2): 403-408)などでありうるが、これに限定されるものではない。また、ｈＥＳＣｓは、当業者によって容易に構築されうる。
本発明の培養方法において、支持細胞の付着された多孔性膜が使われる。多孔性膜の孔隙を介して栄養分がｈＥＳＣｓに供給され、ｈＥＳＣｓは、未分化状態で維持されうる。ここで、前記多孔性膜は、支持細胞のような細胞が粘着されうる膜であり、従って多孔性膜の材質は、多孔性の性質を有する重合体ならば、制限なしに使われうる。本発明の培養方法で使用可能な多孔性膜は、ポリエチレンテレフタレート、ポリエーテルスルホン、フッ化ポリビニリデン、セルロース、ナイロン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリアクリレート、ポリカプロラクトンまたはそれらの共重合体のような細胞粘着性重合体で製造されうる。さらに望ましくは、前記細胞粘着性重合体は、ポリエチレンテレフタレートでありうる。また、培養用ウェル（well）の大きさに合うように製作された商業的に有用なＢＤ ＦａｌｃｏｎTM（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国）を使用することもできる。前記多孔性膜は、０．１ないし３μｍ、さらに望ましくは１ないし２．５μｍの孔隙サイズを有することができる。
【００１１】
支持細胞は、ｈＥＳＣｓの支持細胞として一般的に使われる支持細胞でありうる。例えば、前記支持細胞は、マウス線維芽細胞、マウス胚芽線維芽細胞、ヒト胚芽線維芽細胞、ヒト骨髄細胞、成体上皮細胞などでありうる。このうち、マウス胚芽線維芽細胞がｈＥＳＣｓの未分化状態及び成長をより安定的に維持させることができるので、マウス線維芽細胞が望ましい。
多孔性膜への支持細胞の付着は、多様な方法で達成できる。例えば、多孔性膜に支持細胞及び支持細胞培養用培地を加え、１２〜４８時間、望ましくは約２４時間培養することにより、支持細胞を多孔性膜に付着させることができる。前記支持細胞培養用培地は、使われる支持細胞によって異なるが、当業者は、公知の支持細胞及びその培養方法を考慮して適切に選択できる。例えば、ＳＴＯ細胞を支持細胞として使用する場合には、前記支持細胞培養用培地は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、メルカプトエタノール、非必須アミノ酸が補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ：Dulbecco’s modified Eagles medium）でありうる。前記支持細胞の付着された多孔性膜は、生理学的に適した緩衝液、例えばリン酸緩衝された食塩水で洗浄することにより、ＦＢＳなどの不要な物質を除去できる。多孔性膜に付着される支持細胞の密度は、ウェル（well）当たり１．０Ｘ１０５〜５．０Ｘ１０５セル、さらに望ましくは約２．５Ｘ１０５セルでありうる。
【００１２】
前記の通りに得られた多孔性膜は、支持細胞付着面が下に向くように、ｈＥＳＣ培養用培地に挿入される。
ｈＥＳＣ培養用培地は、公知のあらゆるｈＥＳＣ培養用培地から選択されうる。例えば、前記ｈＥＳＣ培養用培地は、血清代替物（ＳＲ）、メルカプトエタノール、非必須アミノ酸、及びｂＦＧＦで補充されたノックアウトＤＭＥＭ（ＫＯ−ＤＭＥＭ）でありうる。
本発明の培養方法において、必要な場合、前記多孔性膜は、多様な天然あるいは合成物質、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、またはメトリゲルなどでコーティングされることも可能である。例えば、支持細胞は、コラーゲン、フィブロネクチン、またはラミニンによってコーティングされた多孔性膜に付着されうる。このようにすることにより、支持細胞の存在下で、前記物質によってｈＥＳＣｓの培養を効率的に促進することができる。
本発明はまた、前記培養方法でヒト胚芽幹細胞を培養する段階と、前記多孔性膜からヒト胚芽幹細胞を分離する段階とを含むヒト胚芽幹細胞の回収方法を提供する。
【００１３】
前記多孔性膜からのｈＥＳＣｓの分離は、機械的分離方法、例えばピペットなどを使用して多孔性膜からｈＥＳＣｓを掻き出すことによって、行うことができる。すなわち、機械的分離方法を使用することによって、酵素処理を排除でき、従って酵素によって発生しうる汚染問題を防止できる。特に、前記多孔性膜は、培養された細胞を機械的に掻き出すことのできるほどの十分な強度を有しているので、簡単にｈＥＳＣｓを回収できる。
前記の通りに回収されたｈＥＳＣｓは、正常な核型及び未分化細胞の特徴を有している。すなわち、前記の通りに回収されたｈＥＳＣｓは、免疫化学染色法、ＲＴ−ＰＣＲなどを介して確認したとき、Ｏｃｔ−４を正常に発現し、ｈＥＳＣ性状をそのまま維持した。また前記ｈＥＳＣｓは、ｈＥＳＣマーカであるＡＰＬ（Alkaline Phosphatase）、ＳＳＥＡ（Stage Specific Embryo Antigen）、ＴＲＡなどを発現し、胚状体（embryoid body）形成にも全く問題がない。
以下、実施例を介して本発明についてさらに詳細に説明する。下記実施例は、単に本発明について説明するためのものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００１４】
実施例１．
１μｍの孔隙サイズを有する多孔性膜（ＢＤ ＦａｌｃｏｎTM、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国）を６ウェル培養皿に入れた。マイトマイシンＣで２時間処理して細胞増殖を抑制させたマウス胚芽線維芽細胞（ＳＴＯ細胞）２．５Ｘ１０５セル／ウェル及び支持細胞培養用培地（１０％ＦＢＳ、０．１ｍＭメルカプトエタノール、１％非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）の補充された９０％ＤＭＥＭ）を前記培養皿に加え、ＳＴＯ細胞を２４時間培養した。ＳＴＯ細胞の付着された膜を分離した後、リン酸緩衝された食塩水で２回洗浄し、ＳＴＯ細胞が下に向くようにしてｈＥＳＣ培養用培地（２０％ＳＲ、０．１ｍＭメルカプトエタノール、１％非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、及び４ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦで補充された８０％ＫＯ−ＤＭＥＭ）に十分に浸した。ｈＥＳＣｓ（ＣＨＡ−ｈＥＳ３）クランプを細かく砕いた後、前記ｈＥＳＣ培地上に約３０個ほど振りまいた。シーディング後４８時間後に、ｈＥＳＣｓが前記膜上に良好に付着されているか確認した。この後、前記ｈＥＳＣ培養用培地を５日間毎日新しいものに取り替えた。前記の方法で育ったｈＥＳＣクランプを細かく砕き、新しく準備された支持細胞が付着された多孔性膜上に振りまき、上のような方法で培養した。
【００１５】
実施例２．
フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、及びメトリゲルそれぞれがコーティングされた１μｍの孔隙サイズを有する多孔性膜（ＢＤ ＦａｌｃｏｎTM、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国）を培養容器に入れたことを除いては、実施例１と同じ方法でｈＥＳＣｓを培養した。
【００１６】
実施例３．
実施例１の培養培地中の多孔性膜上の培養されたｈＥＳＣｓを、酵素処理なしにピペットを使用して掻き出してｈＥＳＣｓを回収した。
【００１７】
比較例１．
それぞれ３μｍ及び８μｍの孔隙サイズを有するＢＤ ＦａｌｃｏｎTM（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国）インサートで支持細胞として使われるＳＴＯ細胞の移動を観察した。図１に図示したように、３μｍ及び８μｍの孔隙サイズを有する多孔性膜は、ＳＴＯ細胞の移動によってｈＥＳＣｓの汚染を誘発しうるが、１μｍの孔隙サイズを有する多孔性膜は、ＳＴＯ細胞の移動がなかった。
【００１８】
比較例２．
支持細胞として使われるＳＴＯ細胞の濃度を、それぞれ１．５Ｘ１０５、３．５Ｘ１０５及び４．５Ｘ１０５セル／ウェルに調節したことを除いては、実施例１と同じ方法でｈＥＳＣｓを培養した。図２に図示したように、ＳＴＯ細胞の濃度が２．５Ｘ１０５セル／ウェルであるとき、多孔性膜上へのｈＥＳＣｓの粘着率が最も高い。
【００１９】
比較例３．
マイトマイシンＣで２時間処理して細胞増殖を抑制させたマウス胚芽線維芽細胞（ＳＴＯ細胞）２．５Ｘ１０５セル／ウェルを６ウェル培養皿に加えた。支持細胞培養用培地（１０％ＦＢＳ、０．１ｍＭメルカプトエタノール、１％非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）が補充された９０％ＤＭＥＭ）を前記培養皿に加え、ＳＴＯ細胞を２４時間培養した。６ウェル培養皿をリン酸緩衝された食塩水で２回洗浄してＦＢＳを完全に除去した。ｈＥＳＣ培養用培地（２０％ＳＲ、０．１ｍＭメルカプトエタノール、１％非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、及び４ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦで補充された８０％ＫＯ−ＤＭＥＭ）を前記６ウェル培養皿に加え、１μｍの孔隙サイズを有する多孔性膜（ＢＤ ＦａｌｃｏｎTM、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国）を加えて６ウェル培養皿に固定させた。ｈＥＳＣｓ（ＣＨＡ−ｈＥＳ３）クランプを細かく砕いた後、前記ｈＥＳＣ培地上に約３０個ほど振りまいた。シーディング後４８時間後にｈＥＳＣが前記膜上に良好に付着されているかを確認した。その結果、前記多孔性膜上へのｈＥＳＣｓの付着がほとんどなされていなかった。
【００２０】
比較例４．
２０％ＳＲ、０．１ｍＭメルカプトエタノール、１％非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、及び４ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦで補充された８０％ＫＯ−ＤＭＥＭの培養培地を６ウェル培養皿に加え、１μｍの孔隙サイズを有する多孔性膜（ＢＤ ＦａｌｃｏｎTM、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国）を加えて６ウェル培養皿に固定させた。ｈＥＳＣｓ（ＣＨＡ−ｈＥＳ３）クランプを細かく砕いた後、前記ｈＥＳＣ培地上に約３０個ほど振りまいた。シーディング後４８時間後にｈＥＳＣｓが前記膜上に良好に付着されているか確認した。その結果、前記多孔性膜上へのｈＥＳＣｓの付着がほとんどなされていなかった。
比較例３及び４から分かるように、多孔性膜の底面に支持細胞が付着されていなければ、ｈＥＳＣｓが多孔性膜上に粘着されない。また、培養皿内部に位置した支持細胞も多孔性膜上のｈＥＳＣｓの粘着に有意性ある影響を与えられない。すなわち、かかる結果は、多孔性膜下に位置した支持細胞が多孔性膜の孔隙を介してｈＥＳＣｓの粘着及び培養において、重要な役割を果たすということを示す。
【００２１】
試験例１．
ｈＥＳＣｓが未分化状態にあるか否かを確認するために、実施例１の培養液中の多孔性膜上の移動しないｈＥＳＣｓを４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定させ、０．１％トリトンＸ−１００で５分間透過させ、室温で１％ヤギ正常血清（normal goat serum）で処理した。その後、前記ｈＥＳＣｓをヒト特異抗体であるＯｃｔ４（１：１００）、ＳＳＥＡ−４（１：１００）、Ｔｒａ−１−８１（１：１００）抗体と共に４℃で１２時間培養した。細胞サンプルを洗浄し、一次抗体を検出するために、ローダミン共役ヤギアンチ−マウスＩｇＧ（Rhodamine-conjugated goat anti-mouse ＩｇＧ）（１：８００）二次抗体と共に、室温で１時間培養した。染色されたサンプルをさらに洗浄し、ＤＡＰＩ（１：５，０００）と共に室温で５分間培養して細胞の核を染色した。イメージは、蛍光顕微鏡（ApoTome，Carl Zeiss，Jena，Germany）を介して分析した。図３は、支持細胞が付着された多孔性膜上で３日間培養した後のｈＥＳＣｓを示す写真である。図３のうち、（Ｂ）は、未分化標識であるＯｃｔ４（赤）及び核染色ＤＡＰＩ（青）で共染色されたｈＥＳＣｓを示す写真であり、（Ｃ）は、未分化標識であるＳＳＥＡ−４（赤）及びＤＡＰＩ（青）で共染色されたｈＥＳＣｓを示す写真であり、（Ｄ）は、未分化標識であるＴｒａ−１−８１（赤）及びＤＡＰＩ（青）で共染色されたｈＥＳＣsを示す写真である。図３の（Ｅ）は、蛍光顕微鏡を利用し、図３（Ｂ）の写真から由来した三次元構造を示す写真である。
【産業上の利用可能性】
【００２２】
本発明の培養方法により、ヒト胚芽幹細胞（ｈＥＳＣｓ）が、支持細胞が底面に付着された多孔性膜を含む培養培地中で培養される。従って、培養されるｈＥＳＣｓと支持細胞との相互作用を持続的に維持でき、培養されたｈＥＳＣｓを未分化状態で維持しつつ、多孔性膜に粘着及び分布できるようにする。従って、培養完了後に、酵素処理なしに多孔性膜から培養されたｈＥＳＣｓのみを回収できるので、酵素処理及び支持細胞によって発生しうる汚染問題を解決できる。また、本発明の培養方法は、従来のｈＥＳＣｓ培養及び分離方法より手間及び時間が少なくかかり、安定しており、かつ大規模のｈＥＳＣｓ生産を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】多孔性膜の孔隙を介した支持細胞の移動程度を示すグラフである。
【図２】多孔性膜に付着された支持細胞の濃度によるヒト胚芽幹細胞（ｈＥＳＣｓ）の付着率を示すグラフである。
【図３】支持細胞上の位置した多孔性膜上で培養されたｈＥＳＣｓを示す光学顕微鏡写真及び未分化細胞の発現を示す染色写真である。
【図１】
2009538617.tif 000003
【図２】
2009538617.tif 000004
【図３】
2009538617.tif 000005
【国際調査報告】
2009538617.tif 000006
2009538617.tif 000007
2009538617.tif 000008