(57)【要約】  本発明は全般的に対象において特定の細胞型を維持する光線処理を用いる方法に関する。具体的には、本発明は光線の特定のパラメータを用いた細胞の増殖、遊走、分化および生存を促進する方法に関する。これらの方法はＣＮＳあるいはＰＮＳ損傷などの組織損傷における細胞再生および置換、および臓器、組織および細胞の移植に特に有用である。
2009506794.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象に対する光線刺激によって疾患および状態を治療する方法であって、前記方法が：
幹細胞あるいは前駆細胞を細胞分化あるいは増殖を促進する光線刺激に曝露し、
前記光線刺激細胞を前記幹細胞あるいは前駆細胞から分化した細胞を必要とする前記対象に移植する手順を含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、さらに
前記細胞が分化あるいは増殖することを可能とする状態にあるｉｎ  ｖｉｔｒｏで光線刺激細胞を培養することを含む方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記光線刺激が２００〜１５００ｎｍの波長、０．００１〜５００ｍＷ／ｃｍ２の出力密度、および０．００１〜１００Ｊの総光量を有する光線で実施される方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、前記光線刺激が４００〜１２００ｎｍの波長、０．５〜１５０ｍＷ／ｃｍ２の出力密度、および０．０１〜１０Ｊの総光量を有する光線で実施される方法。  
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記光線刺激が７５０〜１０００ｎｍの波長、０．１〜２００ｍＷ／ｃｍ２の出力密度、および０．２〜１０Ｊの総光量を有する光線で実施される方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、前記光線刺激が約８１０ｎｍの波長、約１ｍＷ／ｃｍ、約５０ｍＷ／ｃｍ２、あるいは約１００ｍＷ／ｃｍ２の出力密度、および約０．０２Ｊの総光量を有する光線で実施される方法。  
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、前記幹細胞あるいは前駆細胞が神経前駆細胞、骨髄間質細胞、間葉幹細胞、骨髄間葉幹細胞、胎盤間葉幹細胞、末梢血由来間葉幹細胞、臭覚器由来幹細胞、脂肪由来幹細胞、内皮前駆細胞および幹細胞、毛包真皮幹細胞、定住心臓幹細胞および前駆細胞、胎児肝幹／前駆細胞および胚幹細胞からなる群から選択される細胞を含む方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、前記前駆細胞が正常ヒト神経前駆細胞を含む方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、前記疾患あるいは状態が中枢神経系（ＣＮＳ）損傷あるいは末梢神経系（ＰＮＳ）損傷を含む方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、前記ＣＮＳ損傷あるいはＰＮＳ損傷が脊髄損傷、脳卒中あるいは外傷性脳損傷である方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、前記疾患あるいは状態が神経変性疾患、糖尿病あるいは心疾患である方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記神経変性疾患がパーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、多発性硬化症およびＡＬＳからなる群から選択される方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法であって、前記心疾患が急性心筋梗塞である方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、前記対象が哺乳類である方法。
【請求項１５】
対象に対する光線刺激によって疾患および状態を治療する方法であって、前記方法が：
前記疾患あるいは状態を有する前記対象の幹細胞あるいは前駆細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで光線刺激に曝露する方法であって、前記光線刺激が前記幹細胞あるいは前駆細胞の分化あるいは増殖を促進する方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、前記幹細胞あるいは前駆細胞が神経前駆細胞、骨髄間質細胞、間葉幹細胞、骨髄間葉幹細胞、胎盤間葉幹細胞、間葉幹細胞由来末梢血、臭覚器由来幹細胞、脂肪由来幹細胞、内皮前駆細胞および幹細胞、毛包真皮幹細胞、定住心臓幹細胞および前駆細胞、胎児肝幹／前駆細胞および胚幹細胞からなる群から選択される細胞を含む方法。
【請求項１７】
ＣＮＳ損傷あるいはＰＮＳ損傷を治療する方法であって、前記方法が
細胞分化あるいは増殖を促進する光線刺激にヒト神経前駆細胞を曝露すること、および
光線刺激されたヒト神経前駆細胞を前記ＣＮＳ損傷あるいはＰＮＳ損傷を有する患者に移植することを含む方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、さらに
前記ヒト神経前駆細胞を細胞の分化あるいは増殖を可能とする状態でｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養することを含む方法。
【請求項１９】
請求項１７に記載の方法であって、前記光線刺激が約８１０ｎｍの波長、約１ｍＷ／ｃｍ、約５０ｍＷ／ｃｍ２、あるいは約１００ｍＷ／ｃｍ２の出力密度、および約０．０２Ｊの総光量を有する光線で実施される方法。
【請求項２０】
請求項１７に記載の方法であって、前記ＣＮＳ損傷あるいはＰＮＳ損傷が脊髄損傷、脳卒中あるいは外傷性脳損傷である方法。
【請求項２１】
光線刺激によって疾患および状態を治療する方法であって、前記方法が：
組織あるいは臓器を前記組織あるいは臓器における細胞分化あるいは増殖を促進することのできる光線刺激にｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境で曝露すること、および
前記組織あるいは臓器を前記疾患あるいは状態を有する哺乳類に移植する方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、前記光線刺激が２００〜１５００ｎｍの波長、０．００１〜５００ｍＷ／ｃｍ２の出力密度、および０．００１〜１００Ｊの総光量を有する光線で実施される方法。
【請求項２３】
請求項２１に記載の方法であって、前記疾患あるいは状態がＣＮＳ損傷、ＰＮＳ損傷、神経変性疾患、糖尿病あるいは心疾患である方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、前記神経変性疾患がパーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、多発性硬化症およびＡＬＳからなる群から選択される方法。
【請求項２５】
請求項２３に記載の方法であって、前記心疾患が急性心筋梗塞である方法。
【請求項２６】
請求項２１に記載の方法であって、前記臓器移植が肝臓移植である方法。
【請求項２７】
光線刺激によって疾患および状態を治療する方法であって、前記方法が：
組織あるいは臓器を前記組織あるいは臓器において細胞分化あるいは増殖を促進することのできる光線刺激にｉｎ  ｖｉｖｏ環境で曝露することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は２００５年３月３１日に提出された米国暫定特許明細書出願番号第６０／６６６，５８２号からの優先権を主張する。当該暫定特許明細書の全文はその全文を本明細書に援用する。
【０００２】
本発明は米国政府の援助によってなされた。政府は発明に一定の権利を有することがある。
【０００３】
本発明は全般的に細胞分化および医学的処置に関する。具体的には、光線の特定のパラメータを用いて細胞の増殖、遊走、分化および生存を促進する方法に関する。これらの方法は組織損傷における細胞再生および置換、および臓器、組織および細胞の移植に特に有用である。
【背景技術】
【０００４】
分裂促進因子（mitogenic factor）は多細胞生物の増殖、遊走、分化、維持および生存の要件である。たとえば増殖、遊走、分化あるいは他の細胞との相互作用などの多くの個別細胞の運命は、典型的には他の細胞および／あるいは近接環境より受容する情報に支配される。この情報はしばしば分裂促進因子などの分泌ポリペプチドによって伝達される。
【０００５】
幹細胞は（ａ）増殖、（ｂ）自己維持、（ｃ）大量の分化した機能性子孫細胞の産生、（ｄ）損傷後の組織の再生および／あるいは（ｅ）これらの選択肢の使用における適応の能力がある未分化細胞である。幹細胞は、挿入された遺伝子が幹細胞移植を受ける個体の健康を促進する遺伝子療法の重要かつ理想的な標的である。さらに、幹細胞はたとえば肝再生および皮膚移植などの臓器あるいは組織の移植において重要な役割を果たすこともある。
【０００６】
たとえば、神経幹細胞（ＮＣＳ）は自己再生および神経およびグリア表現型への分化の能力を有する未分化細胞である。幹細胞研究における主な懸念は、臨床的に意味のある数のＮＳＣに拡大すると同時に正常核型および一定した分化能力を維持するための至適条件を決定することである。幹細胞分化の概念は図１に示す（Ｓｈｉｈａｂｕｄｄｉｎ他、Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ＴｏｄａｙＶｏｌ．５，（１９９９））。現在のところ、ＮＳＣの拡大を達成する唯一の方法は、不死化細胞株を確立するための遺伝子修飾によるか、あるいは線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および上皮増殖因子（ＥＧＦ）などの外因性分裂促進因子により細胞を刺激することによる。しかし、分裂促進因子を治療薬として使用する費用は高い。
【０００７】
光線療法（ＬＴ）は、光生体変調あるいは低出力レーザー照射（ＬＰＬＩ）としても知られる、光線の吸収によって生物学的効果を惹起する非侵襲的治療法である。ＬＰＬＩは末梢神経系における神経の生存および再生を高めることが示されている（Ａｎｄｒｅｓ他、Ｓｕｒｇ．Ｍｅｄ  １３：７２−８２（１９９３）、Ｓｎｙｄｅｒ他、Ｓｕｒｇ．Ｍｅｄ，３１：２１６−２２２（２００２））。研究により、ＬＴは細胞の加熱ではなく細胞光受容体による光線の吸収を通じ（Ａｎｄｅｒｓ他、Ｓｕｒｇ．Ｍｅｄ．１３：７２−８２（１９９３）およびＭｏｃｈｉｚｕｋｉ−Ｏｄａ他、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．３２３：２０７−２１０（２００２））、適用された治療パラメータに依存して（Ｓａｐｅｒｉａ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１３８：１１２３−１１２８（１９８６）、Ｇｒｅｃｏ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６３：１４２８−１４３４（１９８９）、Ｌａｍ他、Ｌａｓｅｒｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．１：６１−７７（１９８６）、  Ｆｕｎｋ他、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．Ｂ：ＢＢｔｏｌ．１６：３４７−３５５、（１９９２）、Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉｌｄ−Ｏｄａ他、前掲（２００２））ＡＴＰ、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質合成を増加あるいは低下させることができると示されている。
【０００８】
しかしＬＴは細胞の生存性、増殖、分化および遊走を維持する分裂促進因子の代替としては使用されていない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の１つの態様は、細胞分化、増殖および遊走の促進において分裂促進因子の代替として光線処理を用いることに向けられる。これらの方法は多様な臨床的用途において有用である。１つの実施形態において、これらの方法は中枢神経系（ＣＮＳ）損傷、末梢神経系（ＰＮＳ）損傷、神経変性疾患などの組織損傷における細胞再生および置換、および臓器、組織および細胞の移植に有用である。
【００１０】
１つの実施形態において、細胞および前駆細胞の増殖、分化、および遊走を促進するための方法は波長、出力密度および線量を含むことのある特定の光線パラメータを用いることによって達成される。 
【００１１】
他の実施形態においては、方法は幹細胞あるいは前駆細胞を光線刺激に曝露する手順を含む。光線刺激は、紫外線領域、可視領域あるいは赤外線領域に波長を有する光源を用いて、０．００１〜５００ｍＷ／ｃｍ２の出力密度および０．００１〜１００Ｊの総光量（total light dosage）で実施される。光線刺激はｉｎ  ｖｉｔｒｏあるいはｉｎ  ｖｉｖｏ環境のいずれでも実施することができる。
【００１２】
好ましい実施形態においては、光線刺激は２００〜１５００ｎｍの範囲内の波長、０．５〜１５０ｍＷ／ｃｍ２のいずれかの出力密度、および０．１〜５０Ｊの総光量を有する光源で実施される。
【００１３】
より好ましい実施形態においては、光線刺激は約８１０ｎｍの波長、約１Ｗ／ｃｍ２、５０Ｗ／ｃｍ２あるいは１００Ｗ／ｃｍ２の出力密度および約０．２〜１０Ｊの総光量を有する光源で実施される。
【００１４】
本発明の他の態様は、光線刺激された細胞、組織あるいは臓器を用いて哺乳類あるいは非哺乳類における疾患を治療するための方法に関する。
【００１５】
１つの実施形態においては、細胞、組織あるいは臓器は上述の条件下においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで光線により刺激される。次に処理された細胞、組織あるいは臓器を罹患した哺乳類あるいは非哺乳類に移植する。
【００１６】
他の実施形態においては、罹患した哺乳類或いは非哺乳類の細胞、組織あるいは臓器はｉｎ  ｖｉｖｏで光線により刺激される。
【００１７】
本発明の他の態様は光線処理された細胞、組織および臓器に関する。光線処理された細胞、組織および臓器は研究にも臨床用途にも用いることができる。
【００１８】
本発明のより好ましい理解、そのいくつかの態様、およびその利点は、単に本発明の実施を意図して最良に作られた例示によって本発明の好ましい実施形態が提示および記載されている付属の図面と共に、以下の詳細な説明により当業者に明らかとなるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下にさらに詳細を記載する実施形態の実践は、特に示さない限り、従来の微生物学、分子生物学および免疫学の方法を先行技術の範囲内で採用する。このような技術は文献において完全に説明される。本明細書において引用する全ての刊行物、特許および特許明細書は、上記であれ下記であれ、その全文を参照文献として本明細書に援用する。
【００２０】
本発明の１つの態様は細胞分化、増殖および遊走の促進において分裂促進因子の代替として光線処理を用いることに向けられている。
【００２１】
光線処理は、幹／前駆細胞などの非哺乳類および哺乳類細胞の生存、神経突起の発芽および遊走を維持する。特定の波長における光線刺激によって神経幹細胞／前駆細胞の各神経表現形への分化も促進される。従って、光線処理は１）細胞増殖と組織培養の生存性を維持し、２）幹／前駆細胞の各細胞型への分化を引き起こし（例：骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）は骨、軟骨、脂肪、腱、筋肉および神経細胞を生成することができる）、かつ３）幹／前駆細胞の特定の細胞表現形（例：グルタミン作動性ニューロン、ドパミン作動性ニューロンなどの特定のニューロン表現形を生成する神経前駆細胞など）への分化を引き起こすための増殖因子の代替として使用することができる。本発明は多様な医療用途にｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで用いることもできる。たとえば、組織損傷の治療などである。臨床環境において移植技術と共に採用して人体における特定の細胞型の置換を補助することもできる。
【００２２】
従って、本発明の１つの態様は波長、出力密度および線量を含むことのある特定の光線パラメータを用いて細胞および前駆細胞の増殖、分化、および遊走を促進するための方法に関する。光線処理された細胞は多様な研究および臨床用途に用いることができる。
【００２３】
１つの実施形態においては、方法は幹細胞あるいは幹細胞あるいは前駆細胞を光線刺激に曝露する手順を含む。幹細胞あるいは前駆細胞は神経前駆細胞、骨髄間質細胞、間葉幹細胞、骨髄間葉幹細胞、胎盤間葉幹細胞、間葉幹細胞由来末梢血、臭覚器由来幹細胞、脂肪由来肝細胞、内皮前駆細胞および幹細胞、毛包真皮肝細胞、定住心臓幹細胞および前駆細胞、胎児肝幹／前駆細胞および胚幹細胞などの分離された幹あるいは前駆細胞であっても良い。光線刺激はｉｎ  ｖｉｔｒｏあるいはｉｎ  ｖｉｖｏ環境のいずれでも実施することができる。
【００２４】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境においては、典型的には特に設計された培養培地、ＣＯ２に富み湿度の高い環境および約３７℃のインキュベーション温度を必要とする適切な組織培養条件で細胞を増殖させる。始原／幹細胞はいずれもマイトジェンあるいは増殖因子を必要とするが、培養条件は細胞によって異なることもある。多様な幹／前駆細胞の具体的な培養条件はＦｒｅｄ  Ｇａｇｅ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ２８７：１４３３−１４３８（２０００）およびwww.Worldhealth.net/p/1053,2161で確認することもでき、その全文が本明細書に参照文献として援用されている。培養された細胞は次に適切な密度でプレート作成するかあるいは懸濁し、光線刺激を施す。 
【００２５】
光線刺激は、紫外線領域、可視領域、赤外線領域の波長を有する光源を用いて、出力密度０．００１〜５００ｍＷ／ｃｍ２において、総光量０．００１〜１００Ｊで実施される。
【００２６】
好ましい実施形態においては、光線刺激は２００〜１５００ｎｍの範囲内の波長、出力密度０．５〜１５０ｍＷ／ｃｍ２、および総光量０．１〜５０Ｊを有する光源を用いて実施される。
【００２７】
より好ましい実施形態においては、光線刺激は約８１０ｎｍの波長、約１Ｗ／ｃｍ２、５０Ｗ／ｃｍ２あるいは１００Ｗ／ｃｍ２の出力密度および約０．２〜１０Ｊの総光量を有する光源を用いて実施される。
【００２８】
光線刺激を受けた細胞を細胞分化および増殖が可能な条件下でインキュベートする。次に分化細胞をハーベストし、適切な濃度で懸濁し、このような細胞移植により利益を受けると思われる対象に移植することができる。細胞移植の方法および条件は文献において十分に確立されている。１つの実施形態においては、光線処理を受けた細胞はヒト神経前駆細胞であり、かつ対象は脊髄損傷、脳卒中および外傷性脳損傷などの中枢神経系（ＣＮＳ）損傷あるいは末梢神経系（ＰＮＳ）損傷を有する対象である。他の実施形態においては、患者は神経変性疾患および他の疾患あるいは状態を有する対象である。神経変性疾患はパーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、多発性硬化症およびＡＬＳを含むが、これに限定されない。光線刺激細胞移植より利益を受けると思われる他の疾患あるいは状態は肝臓移植、糖尿病、および急性心筋梗塞などの心疾患が含まれるが、これに限定されない。
【００２９】
他の実施形態においては、幹および／あるいは前駆細胞はｉｎ  ｖｉｖｏ環境でも光線刺激に曝露されることがある。光源はカテーテルあるいは外科的処置により治療部位まで導入される。波長、出力密度および総光線量は刺激を必要とする細胞の位置および種類に応じて最適化することがある。
【００３０】
本発明の他の態様は光線刺激された組織あるいは臓器を用いた哺乳類あるいは非哺乳類の疾患を治療するための方法に関する。１つの実施形態では、本発明によって治療することのできる疾患および状態は脊髄損傷、脳卒中および外傷性脳障害などのＣＮＳ損傷およびＰＮＳ系損傷、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、多発性硬化症あるいはＡＬＳなどの神経変性疾患、および急性心筋梗塞などの心疾患を含むが、これに限定されない。
【００３１】
１つの実施形態においては、組織あるいは臓器を上述の条件下でｉｎ  ｖｉｔｒｏで光線により刺激する。次に光線処理された組織あるいは臓器を罹患した哺乳類あるいは非哺乳類に移植する。
【００３２】
他の実施形態においては、疾患哺乳類あるいは非哺乳類の組織あるいは臓器をｉｎ  ｖｉｖｏで光線により刺激する。
【００３３】
本発明の他の態様は光線処理された細胞、組織および臓器に関する。光線処理された細胞、組織および臓器は臨床用途に用いることができる。
【００３４】
本発明の長所は以下のものを含むが、これに限定されない。 
【００３５】
細胞調製：光線により高価な増殖因子が不要になる／その代替となる。
【００３６】
特定の波長の光線は内因性増殖因子の生成を引き起こすことがある。これはＣＮＳあるいはＰＮＳ損傷などの組織損傷および組織損傷に関係する他の疾患における再生および細胞置換の分野で重要である。また臓器、組織および細胞移植の分野にとっても重要である。
【００３７】
光線の特定の波長により分化多能細胞が特定の種類の細胞に「させられ」、これもやはりＣＮＳあるいはＰＮＳの損傷および疾患などの組織損傷の再生および細胞置換の領域、および臓器、組織および細胞の移植の領域で重要になると思われる。
【００３８】
本発明は制限と解釈すべきでない以下の実施例によってさらに例示される。本明細書を通じて引用された全ての参照文献、特許および公表された特許明細書さらに図および表は参照文献として本明細書に組み入れる。
【実施例１】
【００３９】
（材料と方法）
（（ａ）ＮＨＮＰ細胞培養の調製）
ＮＨＮＰ培養手順を図２に示す。全般的に、正常ヒト神経前駆細胞（ＮＨＮＰＣ）にはヒト組換え（ｈｒ）ＥＧＦ、ｈｒＦＧＦ−２，および神経生存因子−１を含む因子含有培地（ＦＭ）あるいは因子を含まない培地（Ｍ）を与えた。いずれの種類の培地も抗生物質を含有した。細胞は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）あるいはラミニンでコーティングした２−チャンバースライド上で播種密度約２５，０００個／ｃｍ２としてプレート作成した。
【００４０】
簡単に言うと、ＮＰＮＰ細胞を３７℃の水浴で１〜２分間解凍し、温（３７℃）神経前駆細胞維持培地（ＮＰＭＭ）に再懸濁し、インキュベートした（２４時間、３７℃、５％ＣＯ２）。ＮＰＭＭは硫酸ゲンタマイシン、ヒト組換え（ｈｒ）ＥＧＦ、ｈｒＦＧＦ−２および神経生存因子−１（ＮＦＳ−１）を含有した。細胞を５０ｍＬプラスチック試験管に移して遠心分離した（１０００ｒｐｍ、５分）。上清を取り除きペレットを神経前駆細胞基本培地（ＮＰＢＭ）（対照および光線処理用スライド）あるいはＮＰＭＭ（因子スライド）に再懸濁した。ＮＰＢＭは増殖因子およびＮＳＦ−１を除いてＮＰＭＭと同じ成分を含有した。細胞はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）あるいはラミニンでコーティングした２−チャンバースライド上で播種密度約２５，０００個／ｃｍ２としてプレート作成した。全ての製品はＣａｍｂｒｅｘ（メリーランド州ウォーカーズビル）で購入した。
【００４１】
（（ｂ）光学パラメータ評価：波長、出力密度および線量）
ＮＨＮＰＣのスライドを作成し、以下の条件を用いて３つの実験に分けて１日１回３日間光線処理しかつ合計７日間増殖させた。１）波長：４５８．６、４７７、４８８．７、５１５、６４６、６６０、７８０、８０７、８１０、および９７５ｎｍ、２）線量（８１０ｎｍ光線）：０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．５、１、２、４、および６Ｊ／ｃｍ２、および３）出力密度（８１０ｎｍ光線、０．２Ｊ／ｃｍ２）：１、３、１０、３０、５０、および１００ｍＷ／ｃｍ２。３つの実験には、直径は１０ｍｍのレーザースポットサイズ、面積０．７８５３９８ｃｍ２、かつ実験毎に最低２枚のＮＨＮＰＣ含有スライドをそれぞれ用いた。さらに、各実験には２つの対照（光線なし、増殖因子なし）および因子（増殖因子のみ、光線なし）スライドがあった。面積分析を用いて各実験終了後のＮＨＮＰＣの増殖を評価した。固定後に、ニコン（日本、東京）の顕微鏡を用いて低倍率（対物１０×）で各群の各スライドより２０領域を無作為に選択して定量した。データは平均値±標準偏差で表す。
【００４２】
（（ｃ）光線処理）
ＮＨＮＰＣは対照（光線なし増殖因子なし）、因子（増殖因子のみ、光線なし）、５０ｍＷ／ｃｍ２（光線のみ、増殖因子なし）、および１００ｍＷ／ｃｍ２（光線のみ、増殖因子なし）の４群に分けた。全ての光線処理ＮＰＮＰＣに８１０ｎｍ１５０ｍＷダイオードレーザーを線量０．２Ｊ／ｃｍ２、出力密度５０ｍＷ／ｃｍ２で４秒間あるいは１００ｍＷ／ｃｍ２で２秒間として３日間毎日照射した。
【００４３】
（（ｄ）細胞増殖活性評価）
ＮＨＮＰＣの細胞増殖をＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ細胞増殖分析（ＭＴＳ）（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マジソン）およびＣｙｑｕａｎｔ細胞増殖分析キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、オレゴン州ユージーン）を用いてメーカーに従って測定した。ＰｒｏｍｅｇａおよびＣｙｑｕａｎｔ増殖分析用いた細胞は以下の通りに増殖させた。標準培地群の細胞は標準培地（ＮＰＢＭ＋硫酸ゲンタマイシン）で増殖させた。標準培地＋血清群の細胞は標準培地＋ＮＳＦ−１（血清）で増殖させた。標準培地＋因子＋血清群の細胞は標準培地＋ｈｒＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、ｈｒＦＧＦ−２（２０ｎｇ／ｍＬ）および神経生存因子−１の中で増殖させた。標準培地＋光線群の細胞は、標準培地内でかつ３日連続光線処理（８１０ｎｍ、０．２Ｊ／ｃｍ２，５０ｍＷ／ｃｍ２）して増殖させた。ＰｒｏｍｅｇａおよびＣｙｑｕａｎｔ分析の細胞はいずれも非コーティング２４ウェルプレート上に播種密度約２５，０００個／ｃｍ２でプレート作成した。
【００４４】
（（ｅ）遊走分析）
ＱＣＭ２４ウェル比色定量細胞遊走分析（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カリフォルニア州テメキュラ）をメーカーに従って用いた。未処理ＮＨＮＰＣは、増殖因子、血清あるいは光線に曝露しなかったＮＨＮＰ細胞と定義される。これらの細胞は分析前１８〜２４時間血清および因子を含まない培地内で飢餓化した。細胞懸濁液を取り除いてインサートの中に入れた後、ウェルに以下の４種類の接着培地のうち１つが入った２４ウェルプレートウェルにインサートを入れた。１）飢餓培地：増殖因子を含有しない、２）増殖因子培地：ＥＧＦおよびＦＧＦ−２を含有する、３）光調節細胞培地：８１０ｎｍ、５０ｍＷ／ｃｍ２、０．２Ｊ／ｃｍ２の光線に３日連続曝露した細胞より採取した培地、あるいは４）光線処理飢餓培地：８１０ｎｍ、５０ｍＷ／ｃｍ２、０．２Ｊ／ｃｍ２の光線で３日間連続処理した飢餓培地。次にプレートをＣＯ２インキュベーター内で（ＣＯ２４〜６％）３７℃で２４時間インキュベートした。インサート上側より残りの細胞懸濁液をピペットで吸い取り、細胞／培地を取り除いた。次に遊走インサートをＣｅｌｌ  Ｓｔａｉｎの入った清浄なウェルに入れ２０分間室温でインキュベートした。インサートを細胞染色液より取り出し、滅菌水に数回浸してすすぎ、先端に綿の付いたスワブを用いてインサートの内側より非遊走細胞を取り除き、乾燥した。次に染色したインサートを抽出緩衝液の入ったウェルに移し室温で１５分間インキュベートした後取り除いた。色素混合物を９６μタイタープレートに移し５６０ｎｍで光学密度を測定した。
【００４５】
（（ｆ）統計分析）
統計ソフトウェアプログラムＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖｅｒ．３．０２  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（ＯｒａｐｌｉＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州サンディエゴ、www.graphpad.com）を用いてデータ分析した。統計的比較は一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）の後Ｔｕｋｅｙ事後検定を用いて実施し、各群を比較した。データは平均値±標準偏差で表す。
【００４６】
（（ｇ）免疫染色）
培養したＮＨＮＰＣを、光線処理最終日より４日後に４％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で室温で１０分間固定した。細胞をＰＢＣですすいで保存した。免疫染色については、細胞をダブルコルチンについて４℃の一次抗体で１時間処理するか、あるいは他の抗体について４℃で一晩処理した。採用した一次抗体およびその希釈は以下の通りである。ネスチンモノクローナル（１：１００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カリフォルニア州テメキュラ）、ムサシポリクローナル（１：２００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カリフォルニア州テメキュラ）、グリア線維酸性タンパク（ＧＦＡＰ）ポリクローナル（１：３００、ＤＡＫＯ、カリフォルニア州カーピンテリア）、抗β−チューブリンアイソタイプＩＩＩ（ＴＵＪ１）モノクローナル（１：７５、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）、ＦＧＦ−２ポリクローナル（１：１００，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、カリフォルニア州サンタクルス）およびダブルコルチン（ＤＣＸ）ポリクローナル（１：３０００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カリフォルニア州テメキュラ）。一次抗体の検出については、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）−あるいはＣＹ３−標識二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ペンシルバニア州ウエストグローブ）をメーカーの規定に従って用いた。ＤＡＰＩマウント培地（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州バーリンゲーム）を用いてスライドを蛍光用にベクタシールドにマウントし、カバースリップを付けた。陰性対照スライドには一次抗体を添加しなかった。ニコン（日本、東京）Ｌａｂｏｐｏｔｏ蛍光顕微鏡を用いてスライドの写真を撮影し、ソニー（日本、東京）ＤＫＣ５０００Ｃａｔｓｅｙｅデジタルスチールカメラを用いて画像をキャプチャした。
【００４７】
（（ｈ）ＲＴ−ＰＣＲ）
ＮＨＮＰＣは対照、因子、光線（３日間）および光線（７日間）の４群に分けた。光線処理したスライドは３日連続して処理した（８１０ｎｍ光線、５０ｍＷ／ｃｍ２、０．２Ｊ／ｃｍ２）。光線群（３日間）を除き、いずれの群も合計７日間増殖させた。Ｆｉｒｓｔ−ＳｔｒａｎｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓビーズ（Ｍａｒｓｈａ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いて、メーカーのプロトコルに従い総細胞ＲＮＡを抽出して逆転写した（Ｎｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッドおよびＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ）。簡単に言うと、ＴＲＩｚｏｌを添加することにより細胞を溶解した。クロロホルム／イソプロパノール法を用いてＲＮＡを抽出し、再懸濁する前に７５％エタノールで精製した。ＲＮＡをＦｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）およびＲａｎｄｏｍ  Ｈｅｘａｍｅｒｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の入った試験管に写し、３７℃で１時間インキュベートした。残りのｃＤＮＡは以下のプライマーを用いて増幅した：ＦＧＦ−２（５’−ＧＣＣ  ＡＣＡ  ＴＣＴ  ＡＡＴ  ＣＴＣ  ＡＴＴ  ＴＣＡ  ＣＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、５’−ＣＴＧ  ＧＧＴ  ＡＡＣ  ＡＧＣ  ＡＧＡ  ＴＧＣ  ＡＡ  −３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）），ＥＧＦ（５’−ＣＴＡ  ＡＴＣ  ＡＣＣ  ＴＡＣ  ＴＣＡ  ＡＴＧ  ＣＣＴ  ＧＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、５’−ＴＧＡ  ＴＴＣ  ＴＣＣ  ＣＡＧ  ＴＡＣ  ＴＣＴ  ＴＡＣ  ＴＴＧ  Ｇ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４））、ＢＤＮＦ（５’−ＡＧＣ  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＴＴＣ  ＴＣＴ  ＴＴＣ  ＴＧＣ  ＴＧＧ  Ａ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、５’−ＣＴＴ  ＴＴＧ  ＴＣＴ  ＡＴＧ  ＣＣＣ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＣＣＴ  Ｔ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）），ＮＧＦ（５’ＣＣＡ  ＡＧＧ  ＧＡＧ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＴＣＴ  ＡＴＣ  ＣＴＧ  Ｇ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、５’ＧＧＣ  ＡＧＴ  ＧＴＣ  ＡＡＧ  ＧＧＡ  ＡＴＧ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  Ｔ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８））およびβ−アクチン（５’−ＧＴＧ  ＧＣＡ  ＴＣＣ  ＡＣＣ  ＡＡＡ  ＣＴＡ  ＣＣＴ  Ｔ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、５’−ＧＧＡ  ＣＴＣ  ＧＴＣ  ＡＴＡ  ＣＴＣ  ＣＴＧ  ＣＴＴ  Ｇ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０））。
【００４８】
（（ｉ）神経突起発芽の定量）
４群における各処置の適用の神経突起発芽に対する効果をダブルコルチン（ＤＣＸ）免疫化学分析に従って分析した。ＤＣＸはＣＮＳにおいて幅広く発現するリンタンパク質でありかつ遊走および分化中の幼弱ニューロンに存在する。スライドはＩｍａｇｅ  Ｊ（http://rsb.info.nih.gov/ij/)のＮｅｕｒｏｎ  Ｊで分析した。各スライドについて、最低５個のニューロスフィアを無作為に選択してニコンＬａｂｏｐｏｔｏ蛍光顕微鏡を用いて撮像し、ソニー（日本、東京）ＤＫＣ５０００  Ｃａｔｓｅｙｅデジタルスチールカメラを用いて画像をキャプチャした。全ての突起を測定した。データは平均値±標準偏差で表す。
【実施例２】
【００４９】
（ＮＨＮＦ細胞における光線処理パラメータの最適化） 
正常ヒト神経始原（ＮＨＮＰ）細胞をＣａｍｂｒｅｘ（メリーランド州ウォーカーズビル）より低温保存で入手した。ＮＨＮＰ細胞を用いた一連の実験によって至適光線処理パラメータを特定した。これらのパラメータは最適な１）波長、２）出力密度、および３）線量を判定することを含んだ。全ての実験における全てのスライドはＮＨＮＦ細胞を含み、特定の光線パラメータで１日１回３日連続処理した。連続処理終了後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、ＰＢＳ中で保存してさらに処理および分析した。対照スライドは光線処理を受けず、また増殖因子も血清も全く含有しなかった。因子スライドは光線処理に曝露しなかったが、増殖因子（線維芽細胞増殖因子―２（ＦＧＦ−２）および上皮増殖因子（ＥＧＦ））および血清を含有した。ＦＧＦ−２およびＥＧＦはいずれも細胞を刺激して細胞増殖を引き起こすが、いずれも分化には必要とされない。他のスライドは全て光線処理スライドであり、増殖因子は含有しなかった。
【００５０】
各処理条件下のＮＨＮＰ細胞の評価に用いた分析は面積カウントであった。スライドは、連続処理終了時に出願者のニコン顕微鏡の倍率１０×でレチクルを用いて分析した。倍率１０×のレチクルボックスのサイズは１ｍｍ２であった。各スライドより２０測定を得た。レチクルボックス内でＮＨＮＰ細胞に被覆された面積（ｍｍ２）を測定し、一元ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙ事後検定を用いて統計分析を実施した。
【００５１】
（至適パラメータ）
被覆面積により各波長、出力密度、および線量のＮＨＮＰＣへの影響を評価した。図３Ａ〜３Ｅでは、１０種類の光線波長を試験して維持した増殖面積の量を測定した。一元ＡＮＯＶＡとＴｕｋｅｙ事後分析を用いた統計分析により全群を比較したものの、対照と比較した統計学的な差は因子および８１０ｎｍ群について示された。因子あるいは８１０ｎｍ光線を施された細胞は対照群よりも被覆する面積が有意に大きかった（＊ｐ＜０．００１）。５１５ｎｍ光線を施された細胞は因子群（ｐ＜０．００１）および対照群（ｐ＜０．０００２）よりも被覆する面積が有意に大きかった。８１０ｎｍ光線処理を受けたＮＨＮＰＣは最適な波長であると判定された。図４においては、細胞を出力密度１、３、１０、３０、５０および１００ｍＷ／ｃｍ２の８１０ｎｍ光線で処理した。結果より１（＊ｐ＜０．００１）、５０（＊＊＊ｐ＜０．００７）、１００ｍＷ／ｃｍ２（ｐ＜０．０１）および因子で処理された細胞（＊＊ｐ＜０．００１）は、対照群よりも被覆する面積が有意に大きかった。従って、１、５０および１００ｍＷ／ｃｍ２により因子処理細胞の増殖と匹敵する細胞増殖に導かれるので、ＮＨＮＰＣの至適出力密度はこれらの３出力密度と判定された。図５Ａ〜５Ｇに示すように、因子（Ｂ、Ｇ）と０．２Ｊ／ｃｍ２群（Ｅ、Ｇ）群の間には統計的有意性がなかった。因子処理および０．２Ｊ／ｃｍ２処理ＮＨＮＰＣはいずれも対照群（Ａ、Ｇ）よりも被服面積が有意に大きかった（＊ｐ＜０．００１）。３つの実験に基づき、ＮＨＮＰＣは光線量０．２Ｊ／ｃｍ２かつ出力密度１、５０あるいは１００ｍＷ／ｃｍ２の８１０ｎｍ光線に最も良好に反応すると判定された。
【実施例３】
【００５２】
（光線処理は神経の増殖を促進する）
ＮＨＮＰＣの特徴を判定するために、ネスチン（緑色、図６Ａ）、ムサシ（緑色、図６Ｂ）、ＴＵＪ１（赤色）およびＧＦＡＰ（緑色）（図６Ｃ、Ｄ）の発現を検討した。細胞は増殖因子の存在下でメーカーに従って発育させ、続いて前駆細胞マーカーネスチンおよびムサシを免疫標識した。ＮＨＮＰＣは両前駆細胞マーカーで標識され（図６ＡおよびＢ）、ニューロスフィア中に幹／前駆細胞が存在することを示した。 
【００５３】
光線がＮＨＮＰＣをマイトジェンの存在下で増殖させたＮＨＮＰＣと異なる特定の細胞表現型に導くか否か判定するために、神経およびグリアマーカーの免疫細胞化学を実施した。増殖因子の存在下で増殖させたＮＨＮＰＣは神経およびグリアマーカーを標識した（図６Ｃ）。増殖因子の非存在化で増殖させた８１０ｎｍ光線（５０ｍＷ／ｃｍ２，０．２Ｊ／ｃｍ）に曝露したＮＨＮＰもＴＵＪ１およびＧＦＡＰを標識した。通常条件下では、ＮＨＮＰＣ培養は典型的には同等量のＧＦＡＰおよびＴＵＪ１を共発現した。因子および５０ｍＷ／ｃｍ２群ともに同等量の神経およびグリア標識（図６ＣおよびＤ）が認められ、光線によってこれらのパラメータでのＮＨＮＰＣの表現型形態は変化しないことが示された。
【００５４】
図７Ａ〜７Ｄは各出力密度の光線で細胞を処理するための実験デザインを示す模式図である。図７Ａは標準培地で増殖させた対照群である（神経前駆細胞基本培地（ＮＰＢＭ）＋硫酸ゲンタマイシン）。対照群は増殖因子、血清あるいは光線処理を受けなかった。因子群（Ｂ）のＮＨＮＰＣは標準培地＋ヒト組換え（ｈｒ）ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、ｈｒＦＧＦ−２（２０ｎｇ／ｍＬ）、および神経生存因子−１（ＮＳＦ−１）と呼ばれるＣａｍｂｒｅｘ社（メリーランド州ウォーカーズビル）より提供された特許血清内で増殖させた。５０ｍＷ／ｃｍ２（Ｃ）および１００ｍＷ／ｃｍ２（Ｄ）の光線群の細胞は、標準培地内で０．２Ｊ／ｃｍ２光線量の８１０ｎｍ光線で３日連続処理して発育させた。
【実施例４】
【００５５】
（神経突起発芽および遊走に対する光線処理の影響）
プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）増殖分析を実施して、生存細胞数と正比例するテトラゾリン塩ＭＴＳのホルマザンへの生体還元に基づき生存細胞の代謝活性を測定した。図８Ａに示すように、各群由来の細胞を用いてプレートを作成した。標準培地＋光線群は３日連続処理し、さらに４日間増殖させ、また実験の終了まで週に１回処理した。測定値は１、２、３および４週目に３回ずつ測定した。一元ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙ事後検定を用いて統計分析を実施した。１、２、３および４週目には、標準培地＋光線群は標準培地＋因子＋血清、標準培地および標準培地＋血清群と比較して増殖／代謝活性が有意に増加した（ｐ＜０．００１）。標準培地＋因子＋血清群は、全４測定時において標準培地＋血清群よりも増殖が有意に高かった（ｐ＜０．００１）。データは平均値±標準偏差で表す。標準培地＋因子＋血清および標準培地＋血清群は、４週間にわたり残り２群よりも低下した。
【００５６】
シークアント（Ｃｙｑｕａｎｔ）増殖分析を実施してサンプル中のＤＮＡ含有量に基づく細胞増殖を測定した。図８Ｂに示すように、測定値は１、２、３および４週目に３回ずつ測定した。一元ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙ事後検定を用いて統計分析を実施した。１、２および３週目は、４群いずれの間にも増殖に統計的な差は見られなかった。４週目までに、標準培地＋光線の増殖は標準培地群と比較して有意に増加した（ｐ＜０．０１）。データは平均値±標準偏差で表す。細胞のメーカーは、これらの細胞の増殖率は非常に低い〜無視できると確認している。
【００５７】
光線がＮＨＮＰＣの神経突起発芽に影響したか否か判定するために、神経細胞遊走マーカーダブルコルチンの免疫細胞化学を実施した（図９Ａ〜Ｅ）。神経突起発芽を評価し、各群毎にプロットした（図９Ｆ）。陰性対照スライド（図９Ａ）はいずれのＤＣＸ標識も含有していなかった。ＮＨＮＰＣは対照、因子および光線処理の３群に分けた。因子群（Ｄ、Ｆ）および光線処理群（Ｅ，Ｆ）は、対照群（Ｃ、Ｆ）と比較して神経突起発芽が有意に長かった（＊ｐ＜０．００１）。因子および光線処理群は互いに有意差がなかった。バー＝２００μｍ。これらの結果は、光線が分裂促進因子非存在下でＮＨＮＰＣの神経突起発芽を誘導することができることを裏付ける。
【００５８】
光線のＮＨＮＰＣ遊走に与える影響を判定するために、未処理ＮＨＮＰＣを１）飢餓培地、２）因子培地（増殖因子および血清を含有）、３）８１０ｎｍ、５０ｍＷ／ｃｍ２、０．２Ｊ／ｃｍ２で３日連続処理した培地より採取した光線調節飢餓培地、あるいは４）光線処理飢餓培地（５０ｍＷ／ｃｍ２，０．２Ｊ／ｃｍ２の８１０ｎｍ光線で処理した飢餓培地、細胞を入れずに３日連続処理）のいずれかにさらに２４時間曝露して分析した。
【００５９】
図１０に示すように、因子培地（＊＊ｐ＜０．０５）および光線調節飢餓培地（＊ｐ＜０．０１）に曝露した未処理ＮＨＮＰＣは飢餓培地および光線処理飢餓培地と比較して遊走が有意に増加した（一元ＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．００２）。因子培地群および光線調節飢餓培地群間の遊走は同様であった。これらのデータより、細胞より８１０ｎｍ光線で処理された培地に不明因子が分泌され、かつ遊走を維持できることが示唆される。
【実施例５】
【００６０】
（光線処理はＮＨＮＦ細胞においてマイトジェン産生を誘導する）
研究の最後にＦＧＦ−２の産生を検討し、免疫細胞化学を用いて処理後に分裂促進因子のアップレギュレーションあるいはダウンレギュレーションがあるか否かを判定した。
【００６１】
初回の免疫化学は群内の内因性ＦＧＦ−２の同定を目的として実施した。光線の増殖および分化への影響について考えられるメカニズムを評価するために、初回免疫化学を実施して内因性マイトジェンＦＧＦ−２の産生を判定した。図１１に示すように、マイトジェンＦＧＦ−２およびＥＧＦの存在下で増殖させた因子群はＦＧＦ−２標識量の上昇を示した。マイトジェン非存在下であるが８１０ｎｍ光線で処理した光線処理群の内因性ＦＧＦ−２発現は、対照群と比較して増加したものの因子群よりは低かった。５０ｍＷ／ｃｍ２のレベルは因子群とほぼ同じであり、対照群および１００ｍＷ／ｃｍ２群よりも高いことが確認された。光線処理群でＦＧＦ−２が存在したことは、これらの細胞内で光線が内因性ＦＧＦ−２の産生を誘導するよう作用し、生存と増殖を促進していることを示す。
【００６２】
初回ＲＴ−ＰＣＲを実施して、ＦＧＦ−２、ＥＧＦ、ＢＤＮＦおよびＮＧＦを含む数種類の増殖因子のｍＲＮＡを発現しているか否かを判定した。図１２に示すように、ＮＨＮＰＣは対照、因子、光線処理（３日間）および光線処理（７日間）の４群に分けた。対照群の細胞は標準培地（ＮＰＢＭ＋硫酸ゲンタマイシン）で増殖させた。因子群の細胞は標準培地＋ヒト組換え（ｈｒ）ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、ｈｒＦＧＦ−２（２０ｎｇ／ｍＬ）およびＮＳＦ−１内で増殖させた。光線群の細胞は、標準培地内でかつ３日連続光線処理（８１０ｎｍ、０．２Ｊ／ｃｍ２，５０ｍＷ／ｃｍ２）して増殖させた。全ての細胞はラミニンコーティングしたチャンバースライド上で播種密度約２５，０００個／ｃｍ２としてプレート作成した。対照、因子および光線処理（７日間）細胞は７日目にｉｎ  ｖｉｔｒｏでハーベストしたのに対し、光線処理（３日間）細胞は３日目にｉｎ  ｖｉｔｒｏでハーベストし、その後ＲＴ−ＰＣＲを実施した。プライマーはＦＧＦ−２、ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＧＦおよびβ−アクチン用に設計した。
【００６３】
図１２ＡはＦＧＦ−２、ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＧＦおよびβ−アクチンについてのＰＣＲ遺伝子発現である。図１２Ｂ〜ＥはＦＧＦ−２、ＥＧＦ、ＢＤＮＦおよびＮＧＦの半定量測定値である。各バンドの任意の強度単位の測定値は、Ｍｕｌｔｉ  Ｇａｕｇｅ（www.lifescience.fujifilm.com）を用いて測定し、数値はアクチンサンプルに基づいて標準化した。この実験を２回繰り返した。グラフは２つとも各増殖因子の比率である。結果より全ての群がＥＧＦｍＲＮＡを発現したことが示される（図１２Ｃ）。２つの光線群および因子群はＢＤＮＦ発現が対照群よりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）（図１２Ｄ）。図１２Ｅに示すように、７日間光線群のＮＧＦ発現は残りの３群よりも高い一方で（ｐ＜０．００１）、３日間光線群のＮＧＦ発現は対照および因子群よりも有意に高かった（ｐ＜０．００１）。表１は半定量法に基づく増殖因子発現レベルの要約である。
【００６４】
【表１】
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【００６５】
ＮＨＮＰＣにおけるＦＧＦ−２、ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、およびＮＧＦタンパク質の発現を図１３に示す。ＮＨＮＰＣは対照群、因子群および光線処理群の３群に分けた。光線処理したスライドは８１０ｎｍ光線で３日連続して処理した。７日目に群のＮＨＮＰＣをｉｎ  ｖｉｔｒｏで固定して免疫組織化学用に処理した（縮尺バー＝２００μｍ）。
【００６６】
上記は当業者に本発明を実践する方法を教示することを目的としており、かつ当業者が当該記述を読むとき明らかになるそれら全ての明らかな修正およびその変法を詳述することを意図していない。しかし、このような全ての明らかな修正および変法が、以下の請求項によって定義される本発明の範囲内に含まれることを意図する。請求項は、文脈上特に逆のことが示されない限り、請求された要素および意図されている目的に合致するために有効なあらゆる進行の手順を対象とすることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】幹細胞分化の模式図である。
【図２】光線処理のパラメータを最適化するための全般的な実験デザインを例示する。
【図３】各波長の光線刺激のＮＨＮＰＣ表面増殖に対する影響を例示する。図３Ａ〜３Ｄは図に示された各処理条件の下でのＮＨＮＰＣの画像である。図３ＥはＮＨＮＰＣの各波長の影響を要約したグラフである。面積分析を用いてＮＨＮＰＣの増殖を評価した。固定後に低倍率（対物１０×）で各群の各スライドより２０領域を無作為に選択して定量した。データは平均値±標準偏差で表す。
【図４】各出力密度のＮＨＮＰＣ面積増殖に対する効果を例示する。ＮＨＮＰＣを１ｍＷから１００ｍＷの出力密度で８１０ｎｍの光線に１日１回連続３日間曝露した。
【図５】各総光量のＮＨＮＰＣ面積増殖に対する効果を例示する。ＮＨＮＰＣを０．００５Ｊ／ｃｍ２から６Ｊ／ｃｍ２の範囲の光線量で８１０ｎｍの光線に１日１回連続３日間曝露した。図５Ａ〜５Ｆは図に示す各処理条件の下でのＮＨＮＰＣの画像である。図５Ｇは各光線量のＮＨＮＰＣ増殖に対する影響を要約したグラフである。
【図６】７日間通常条件下（Ａ〜Ｃ）（増殖因子ＦＧＦ−２およびＥＧＦの存在下）でプレート作成して発育させたか、あるいは８１０ｎｍ光線で処理しかつ因子なしとした（Ｄ）ＮＨＮＰＣである。固定し、ムサシ（Ａ）およびネスチン（Ｂ）を用いた単標識免疫細胞化学、あるいはＴＵＪ１およびＧＦＡＰを用いた二重標識免疫細胞化学で処理し、さらにＤＡＰＩ（青色）で対比染色して核を可視化した。因子で処理したＮＨＮＰＣ（Ｃ）および８１０ｎｍ光線処理したＮＨＮＰＣ（Ｄ）をＴＵＪ１（赤色）およびＯＦＡＰ（緑色）で標識した。バー＝１００μｍ（Ａ、Ｂ）;２００μｍ（Ｃ、Ｄ）。
【図７】各出力密度の光線で細胞を処理するための実験デザインを示す模式図である。図７Ａは、標準培地で増殖させた対照群である（神経前駆細胞基本培地（ＮＰＢＭ）＋硫酸ゲンタマイシン）。対照群には増殖因子、血清あるいは光線処理を与えなかった。因子群（Ｂ）のＮＨＮＰＣは標準培地＋ヒト組換え（ｈｒ）ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、ｈｒＦＧＦ−２（２０ｎｇ／ｍＬ）、および神経生存因子−１（ＮＳＦ−１）と呼ばれるＣａｍｂｒｅｘ社（メリーランド州ウォーカーズビル）の特許血清内で発育させた。５０ｍＷ／ｃｍ２（Ｃ）および１００ｍＷ／ｃｍ２（Ｄ）の光線群の細胞は標準培地内で０．２Ｊ／ｃｍ２光線量で３日間連続８１０ｎｍ光線処理して発育させた。
【図８】は代謝（Ａ）あるいはＤＮＡ含有量（Ｂ）に基づくＮＨＮＰＣの細胞増殖のグラフである。
【図９】増殖因子および光線処理のＮＨＮＰＣ神経突起伸長に対する影響を示す。ＮＨＮＰＣは陰性対照群（Ａ）、ＤＣＸ対照群（Ｂ）、因子群（Ｃ）５０ｍＷ／ｃｍ２（Ｄ）および１００ｍＷ／ｃｍ２（Ｅ）に分けた。光線処理したスライドは８１０ｎｍ光線で３日連続して処理した。全群の細胞を全７日間発育させ、固定し、ＤＣＸ免疫細胞化学で処理し（赤色）、さらにＤＡＰＩ（青色）で対比染色して核を視覚化した。陰性対照スライド（Ａ）はいずれのＤＣＸ標識も含有していなかった。バー＝２００μｍ。
【図１０】増殖因子、血清あるいは光線処理に曝露していないＮＨＮＰＣと定義される未処理ＮＨＮＰＣの遊走を示すグラフである。これらの細胞は分析前１８〜２４時間飢餓化した。次に、１）飢餓培地：増殖因子を含有しない、２）増殖因子培地：ＥＧＦおよびＦＧＦ−２を含有する、３）光調節細胞培地：８０１ｎｍ、５０ｍＷ／ｃｍ２光線に３日間連続曝露した細胞より採取した培地、あるいは４）光線処理飢餓培地：８１０ｎｍ、５０ｍＷ／ｃｍ２の光線で３日間連続処理した飢餓培地の４種類のうち１つに２４時間入れた。データは、光学密度の平均値±標準誤差−ブランク対照の光学密度を飢餓培地データの平均で割って対照％で表示した。
【図１１】ＮＨＮＰＣ中のマイトジェンＦＧＦ−２の免疫細胞特性決定を示す画像群である。ＮＨＮＰＣは対照群、因子群、５０ｍＷ／ｃｍ２群および１００ｍＷ／ｃｍ２群に分けた。光線処理したスライドは８１０ｎｍ光線で３日連続して処理した。全群の細胞を全７日間発育させ、この時点で固定し、ＦＧＦ−２免疫細胞化学で処理し（緑色）、さらにＤＡＰＩ（青色）で対比染色して核を視覚化した。対照群は最小量の内因性ＦＧＦ−２標識を有していた。バー＝１００μｍ（対照）、２００μｍ（因子、５０および１００ｍＷ／ｃｍ２）。
【図１２Ａ】一連のＦＧＦ−２，ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＧＦおよびβ−アクチンのｍＲＮＡ発現である。ＮＨＮＰＣは陰性対照群、因子群、５０ｍＷ／ｃｍ２（３日間）群および５０ｍＷ／ｃｍ２（７日間）群に分けた。光線処理したスライドは３日連続して処理した。（８１０ｎｍ光線、５０ｍＷ／ｃｍ２、０．２Ｊ／ｃｍ２）５０ｍＷ／ｃｍ２（３日間）を除き、いずれの群も合計７日間増殖させた。総細胞ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。（Ａ）ＮＨＮＰＣ  ｍＲＮＡ発現はＦＧＦ−２、ＥＧＥ、ＢＤＮＦおよびＮＧＦの４群で一様であった。
【図１２】（Ｂ）３日間および７日間光線群はＦＧＦ−２発現が対照（ｐ＜０．０１）および因子群（それぞれｐ＜０．０１、ｐ＜０．０５）よりも有意に高かった。（Ｃ）いずれの群もＥＧＦｍＲＮＡを発現した。（Ｄ）２つの光線群および因子群はＢＤＮＦ発現が対照群よりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）。（Ｅ）７日間光線群のＮＧＦ発現は残りの３群よりも高い一方で（ｐ＜０．００１）、３日間光線群のＮＧＦ発現は対照および因子群よりも有意に高かった（ｐ＜０．００１）。
【図１３】３群のＮＨＮＰＣにおける増殖因子のたん白質発現の複合である。ＮＨＮＰＣは対照、因子および光線処理の３群に分けた。光線処理したスライドは８１０ｎｍ光線、５０ｍＷ／ｃｍ２、０．２Ｊ／ｃｍ２で３日連続して処理した。全群の細胞を全７日間発育させ、この時点で固定してＦＧＦ−２、ＥＧＦ、ＢＤＮＦおよびＮＧＦ（赤色）免疫細胞化学で処理し、さらにＤＡＰＩ（青色）で対比染色して核を視覚化した。
【図１４】ＮＨＮＰ培養手順の概要である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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