(57)【要約】  本発明は、増幅プライマーおよび検出プローブのためのオリゴヌクレオチド配列、ならびに生物学的試料中のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの選択的かつ特異的検出のための核酸増幅法におけるそれらの使用に関する。本発明は、クラミジア感染の検出および診断のためのキットの形態のオリゴヌクレオチドプライマーセットおよびプライマー／プローブセットもまた提供する。本発明のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓと、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａなどの他のターゲット生物との同時検出のために、他の特異的オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブと共に使用することもできる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜４１、その活性フラグメント、およびその組み合わせからなる群より選択される核酸配列を含む、単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
被験試料中のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓを検出するための、請求項１記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項３】
配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、その活性フラグメント、およびその組み合わせからなる群より選択される核酸配列を含む、単離されたオリゴヌクレオチド増幅プライマー。
【請求項４】
配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号８、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４１、その活性フラグメント、およびその組み合わせからなる群より選択される核酸配列を含む、単離されたオリゴヌクレオチド検出プローブ。
【請求項５】
検出可能なラベルをさらに含む、請求項４記載のオリゴヌクレオチド検出プローブ。
【請求項６】
検出可能なラベルがオリゴヌクレオチドに直接結合している、請求項５記載のオリゴヌクレオチド検出プローブ。
【請求項７】
検出可能なラベルがオリゴヌクレオチドに間接的に結合している、請求項５記載のオリゴヌクレオチド検出プローブ。
【請求項８】
検出可能なラベルが直接検出可能である、請求項５記載のオリゴヌクレオチド検出プローブ。
【請求項９】
検出可能なラベルが間接的に検出可能である、請求項５記載のオリゴヌクレオチド検出プローブ。
【請求項１０】
検出可能なラベルが、オリゴヌクレオチドの５’末端に結合した蛍光部分を含む、請求項５記載のオリゴヌクレオチド検出プローブ。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドが、３’末端に結合したクエンチャー部分をさらに含む、請求項１０記載のオリゴヌクレオチド検出プローブ。
【請求項１２】
蛍光部分が６−カルボキシフルオレセインを含み、そしてクエンチャー部分がＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒを含む、請求項１１記載のオリゴヌクレオチド検出プローブ。
【請求項１３】
プライマーセット１、プライマーセット２、プライマーセット３、プライマーセット４、プライマーセット５、プライマーセット６、プライマーセット７、プライマーセット８、プライマーセット９、プライマーセット１０、プライマーセット１１、およびプライマーセットＣＴ（ｍｐｘ）からなる群より選択されるプライマーセットを含む、被験試料中のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓを検出するためのオリゴヌクレオチドのコレクションであって：
プライマーセット１が、配列番号１またはその任意の活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号２またはその任意の活性フラグメントを含むリバースプライマーとを含み；
プライマーセット２が、配列番号５またはその任意の活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号６またはその任意の活性フラグメントを含むリバースプライマーとを含み；
プライマーセット３が、配列番号９またはその任意の活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号１０またはその任意の活性フラグメントを含むリバースプライマーとを含み；
プライマーセット４が、配列番号１３またはその任意の活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号１４またはその任意の活性フラグメントを含むリバースプライマーとを含み；
プライマーセット５が、配列番号１６またはその任意の活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号１７またはその任意の活性フラグメントを含むリバースプライマーとを含み；
プライマーセット６が、配列番号２０またはその任意の活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号２１またはその任意の活性フラグメントを含むリバースプライマーとを含み；
プライマーセット７が、配列番号２３またはその任意の活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号２４またはその任意の活性フラグメントを含むリバースプライマーとを含み；
プライマーセット８が、配列番号２６またはその任意の活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号２７またはその任意の活性フラグメントを含むリバースプライマーとを含み；
プライマーセット９が、配列番号２９またはその任意の活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号３０またはその任意の活性フラグメントを含むリバースプライマーとを含み；
プライマーセット１０が、配列番号３２またはその任意の活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号３３またはその任意の活性フラグメントを含むリバースプライマーとを含み；
プライマーセット１１が、配列番号３５またはその任意の活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号３６またはその任意の活性フラグメントを含むリバースプライマーとを含み；かつ
プライマーセットＣＴ（ｍｐｘ）が、配列番号３８またはその任意の活性フラグメントを含む第１フォワードプライマーと、配列番号３９またはその任意の活性フラグメントを含む第２フォワードプライマーと、配列番号４０またはその任意の活性フラグメントを含むリバースプライマーとを含む、コレクション。
【請求項１４】
プライマー／プローブセットＣＴ１、プライマー／プローブセットＣＴ２−Ｐ１、プライマー／プローブセットＣＴ２−Ｐ２、プライマー／プローブセットＣＴ３、プライマー／プローブセットＣＴ４、プライマー／プローブセットＣＴ５、プライマー／プローブセットＣＴ６、プライマー／プローブセットＣＴ７、プライマー／プローブセットＣＴ８、プライマー／プローブセットＣＴ９、プライマー／プローブセットＣＴ１０、プライマー／プローブセットＣＴ１１、およびプライマー／プローブセットＣＴ（ｍｐｘ）からなる群より選択されるプライマー／プローブセットを含む、被験試料中のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓを検出するためのオリゴヌクレオチドのコレクションであって：
プライマー／プローブセットＣＴ１が、配列番号１またはその活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号２またはその活性フラグメントを含むリバースプライマーと、配列番号３またはその活性フラグメントを含む相補的検出プローブと、配列番号４またはその活性フラグメントを含む逆相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセットＣＴ２−Ｐ１が、配列番号５またはその活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号６またはその活性フラグメントを含むリバースプライマーと、配列番号７またはその活性フラグメントを含む相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセットＣＴ２−Ｐ２が、配列番号５またはその活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号６またはその活性フラグメントを含むリバースプライマーと、配列番号８またはその活性フラグメントを含む相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセットＣＴ３が、配列番号９またはその活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号１０またはその活性フラグメントを含むリバースプライマーと、配列番号１１またはその活性フラグメントを含む相補的検出プローブと、配列番号１２またはその活性フラグメントを含むリバース相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセットＣＴ４が、配列番号１３またはその活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号１４またはその活性フラグメントを含むリバースプライマーと、配列番号１５またはその活性フラグメントを含む相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセットＣＴ５が、配列番号１６またはその活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号１７またはその活性フラグメントを含むリバースプライマーと、配列番号１８またはその活性フラグメントを含む相補的検出プローブと、配列番号１９またはその活性フラグメントを含むリバース相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセットＣＴ６が、配列番号２０またはその活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号２１またはその活性フラグメントを含むリバースプライマーと、配列番号２２またはその活性フラグメントを含む相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセットＣＴ７が、配列番号２３またはその活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号２４またはその活性フラグメントを含むリバースプライマーと、配列番号２５またはその活性フラグメントを含む相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセットＣＴ８が、配列番号２６またはその活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号２７またはその活性フラグメントを含むリバースプライマーと、配列番号２８またはその活性フラグメントを含む相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセットＣＴ９が、配列番号２９またはその活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号３０またはその活性フラグメントを含むリバースプライマーと、配列番号３１またはその活性フラグメントを含む相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセットＣＴ１０が、配列番号３２またはその活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号３３またはその活性フラグメントを含むリバースプライマーと、配列番号３４またはその活性フラグメントを含む相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセットＣＴ１１が、配列番号３５またはその活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号３６またはその活性フラグメントを含むリバースプライマーと、配列番号３７またはその活性フラグメントを含む相補的検出プローブとを含み；かつ
プライマー／プローブセットＣＴ（ｍｐｘ）が、配列番号３８またはその活性フラグメントを含む第１フォワード増幅プライマーと、配列番号３９またはその活性フラグメントを含む第２フォワード増幅プライマーと、配列番号４０またはその活性フラグメントを含むリバース増幅プライマーと、配列番号４１またはその活性フラグメントを含む検出プローブとを含む、コレクション。
【請求項１５】
少なくとも一つの検出プローブが、検出可能なラベルを含む、請求項１４記載のオリゴヌクレオチドのコレクション。
【請求項１６】
検出可能なラベルが、少なくとも一つの検出プローブに直接結合している、請求項１５記載のオリゴヌクレオチドのコレクション。
【請求項１７】
検出可能なラベルが、少なくとも一つの検出プローブに間接的に結合している、請求項１５記載のオリゴヌクレオチドのコレクション。
【請求項１８】
検出可能なラベルが、直接検出可能である、請求項１５記載のオリゴヌクレオチドのコレクション。
【請求項１９】
検出可能なラベルが、間接的に検出可能である、請求項１５記載のオリゴヌクレオチドのコレクション。
【請求項２０】
検出可能なラベルが、少なくとも一つの検出プローブの５’末端に結合した蛍光部分を含む、請求項１５記載のオリゴヌクレオチドのコレクション。
【請求項２１】
少なくとも一つの検出プローブが、３’末端に結合したクエンチャー部分をさらに含む、請求項２０記載のオリゴヌクレオチドのコレクション。
【請求項２２】
蛍光部分が６−カルボキシフルオレセインを含み、そしてクエンチャー部分がＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒを含む、請求項２１記載のオリゴヌクレオチドのコレクション。
【請求項２３】
増幅反応試薬と、プライマーセット１、プライマーセット２、プライマーセット３、プライマーセット４、プライマーセット５、プライマーセット６、プライマーセット７、プライマーセット８、プライマーセット９、プライマーセット１０、プライマーセット１１、およびプライマーセットＣＴ（ｍｐｘ）からなる群より選択される少なくとも一つのプライマーセットとを含む、被験試料中のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓを検出するためのキットであって：
プライマーセット１が、配列番号１またはその任意の活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号２またはその任意の活性フラグメントを含むリバースプライマーとを含み；
プライマーセット２が、配列番号５またはその任意の活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号６またはその任意の活性フラグメントを含むリバースプライマーとを含み；
プライマーセット３が、配列番号９またはその任意の活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号１０またはその任意の活性フラグメントを含むリバースプライマーとを含み；
プライマーセット４が、配列番号１３またはその任意の活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号１４またはその任意の活性フラグメントを含むリバースプライマーとを含み；
プライマーセット５が、配列番号１６またはその任意の活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号１７またはその任意の活性フラグメントを含むリバースプライマーとを含み；
プライマーセット６が、配列番号２０またはその任意の活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号２１またはその任意の活性フラグメントを含むリバースプライマーとを含み；
プライマーセット７が、配列番号２３またはその任意の活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号２４またはその任意の活性フラグメントを含むリバースプライマーとを含み；
プライマーセット８が、配列番号２６またはその任意の活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号２７またはその任意の活性フラグメントを含むリバースプライマーとを含み；
プライマーセット９が、配列番号２９またはその任意の活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号３０またはその任意の活性フラグメントを含むリバースプライマーとを含み；
プライマーセット１０が、配列番号３２またはその任意の活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号３３またはその任意の活性フラグメントを含むリバースプライマーとを含み；
プライマーセット１１が、配列番号３５またはその任意の活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号３６またはその任意の活性フラグメントを含むリバースプライマーとを含み；かつ
プライマーセット１２が、配列番号３８またはその任意の活性フラグメントを含む第１フォワード増幅プライマーと、配列番号３９またはその任意の活性フラグメントを含む第２フォワード増幅プライマーと、配列番号４０またはその任意の活性フラグメントを含むリバース増幅プライマーとを含む、キット。
【請求項２４】
増幅反応試薬と、プライマー／プローブセットＣＴ１、プライマー／プローブセットＣＴ２−Ｐ１、プライマー／プローブセットＣＴ２−Ｐ２、プライマー／プローブセットＣＴ３、プライマー／プローブセットＣＴ４、プライマー／プローブセットＣＴ５、プライマー／プローブセットＣＴ６、プライマー／プローブセットＣＴ７、プライマー／プローブセットＣＴ８、プライマー／プローブセットＣＴ９、プライマー／プローブセットＣＴ１０、プライマー／プローブセットＣＴ１１、およびプライマー／プローブセットＣＴ（ｍｐｘ）からなる群より選択される少なくとも一つのプライマー／プローブセットとを含む、被験試料中のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓを検出するためのキットであって：
プライマー／プローブセットＣＴ１が、配列番号１またはその活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号２またはその活性フラグメントを含むリバースプライマーと、配列番号３またはその活性フラグメントを含む相補的検出プローブと、配列番号４またはその活性フラグメントを含むリバース相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセットＣＴ２−Ｐ１が、配列番号５またはその活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号６またはその活性フラグメントを含むリバースプライマーと、配列番号７またはその活性フラグメントを含む相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセットＣＴ２−Ｐ２が、配列番号５またはその活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号６またはその活性フラグメントを含むリバースプライマーと、配列番号８またはその活性フラグメントを含む相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセットＣＴ３が、配列番号９またはその活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号１０またはその活性フラグメントを含むリバースプライマーと、配列番号１１またはその活性フラグメントを含む相補的検出プローブと、配列番号１２またはその活性フラグメントを含むリバース相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセットＣＴ４が、配列番号１３またはその活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号１４またはその活性フラグメントを含むリバースプライマーと、配列番号１５またはその活性フラグメントを含む相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセットＣＴ５が、配列番号１６またはその活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号１７またはその活性フラグメントを含むリバースプライマーと、配列番号１８またはその活性フラグメントを含む相補的検出プローブと、配列番号１９またはその活性フラグメントを含むリバース相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセットＣＴ６が、配列番号２０またはその活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号２１またはその活性フラグメントを含むリバースプライマーと、配列番号２２またはその活性フラグメントを含む相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセットＣＴ７が、配列番号２３またはその活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号２４またはその活性フラグメントを含むリバースプライマーと、配列番号２５またはその活性フラグメントを含む相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセットＣＴ８が、配列番号２６またはその活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号２７またはその活性フラグメントを含むリバースプライマーと、配列番号２８またはその活性フラグメントを含む相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセットＣＴ９が、配列番号２９またはその活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号３０またはその活性フラグメントを含むリバースプライマーと、配列番号３１またはその活性フラグメントを含む相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセットＣＴ１０が、配列番号３２またはその活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号３３またはその活性フラグメントを含むリバースプライマーと、配列番号３４またはその活性フラグメントを含む相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセットＣＴ１１が、配列番号３５またはその活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号３６またはその活性フラグメントを含むリバースプライマーと、配列番号３７またはその活性フラグメントを含む相補的検出プローブとを含み；かつ
プライマー／プローブセットＣＴ（ｍｐｘ）が、配列番号３８またはその活性フラグメントを含む第１フォワードプライマーと、配列番号３９またはその活性フラグメントを含む第２フォワードプライマーと、配列番号４０またはその活性フラグメントを含むリバースプライマーと、配列番号４１またはその活性フラグメントを含む検出プローブとを含む、キット。
【請求項２５】
少なくとも一つの検出プローブが、検出可能なラベルを含む、請求項２４記載のキット。
【請求項２６】
検出可能なラベルが、少なくとも一つの検出プローブに直接結合している、請求項２５記載のキット。
【請求項２７】
検出可能なラベルが、少なくとも一つの検出プローブに間接的に結合している、請求項２５記載のキット。
【請求項２８】
検出可能なラベルが直接検出可能である、請求項２５記載のキット。
【請求項２９】
検出可能なラベルが間接的に検出可能である、請求項２５記載のキット。
【請求項３０】
検出可能なラベルが、少なくとも一つの検出プローブの５’末端に結合した蛍光部分を含む、請求項２５記載のキット。
【請求項３１】
少なくとも一つの検出プローブが、３’末端に結合したクエンチャー部分をさらに含む、請求項３０記載のキット。
【請求項３２】
蛍光部分が６−カルボキシフルオレセインを含み、そしてクエンチャー部分がＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒを含む、請求項３１記載のキット。
【請求項３３】
被験試料中のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓを検出するための方法であって、以下の工程：
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸を有すると疑われる被験試料を提供する工程；
請求項１記載の少なくとも一つのオリゴヌクレオチドと該被験試料を接触させることによって、該被験試料中に存在するならば、該少なくとも一つのオリゴヌクレオチドが該Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸にハイブリダイゼーションできるようにする工程；および
該Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸にハイブリダイゼーションした任意のオリゴヌクレオチドを検出する工程であって、該Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸にハイブリダイゼーションしたオリゴヌクレオチドの該検出が、該被験試料中のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの存在を示す工程
を含む方法。
【請求項３４】
被験試料中のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓを検出するための方法であって、以下の工程：
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸を有すると疑われる被験試料を提供する工程；
請求項１３記載のオリゴヌクレオチドのコレクションのうち少なくとも一つのプライマーセットと該被験試料を接触させることによって、該被験試料中に存在するならば、該プライマーセットの該少なくとも一つのプライマーが該Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸にハイブリダイゼーションできるようにする工程；および
該Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸にハイブリダイゼーションした任意のプライマーを検出する工程であって、該Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸にハイブリダイゼーションしたプライマーの該検出が、該被験試料中のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの存在を示す工程
を含む方法。
【請求項３５】
被験試料中のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓを検出するための方法であって、以下の工程：
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸を有すると疑われる被験試料を提供する工程；
請求項１４記載のオリゴヌクレオチドのコレクションのうち少なくとも一つのプライマー／プローブセットと該被験試料を接触させることによって、該被験試料中に存在するならば、該プライマー／プローブセットの少なくとも一つのプライマーまたはプローブが該Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸にハイブリダイゼーションできるようにする工程；および
該Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸にハイブリダイゼーションした任意のプライマーまたはプローブを検出する工程であって、該Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸にハイブリダイゼーションしたプライマーまたはプローブの該検出が、該被験試料中のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの存在を示す工程
を含む方法。
【請求項３６】
検出する工程が、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓアンプリコンを得るためにＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸の全てまたは部分を増幅させる工程、および任意のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓアンプリコンを検出する工程を含む、請求項３３、３４または３５記載の方法。
【請求項３７】
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸の全てまたは部分を増幅させる工程が、適切な増幅条件下で適切な増幅反応試薬の存在下で実施される核酸増幅反応に被験試料を供する工程を含む、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、またはＴａｑ−Ｍａｎ（商標）アッセイを使用して実施される、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
被験試料が、尿、精液、唾液、眼球水晶体液（ocular lens fluid）、リンパ液、子宮頸管試料、尿道試料、直腸試料、膣試料、外陰−膣試料、および鼻咽頭試料からなる群より選択される体液を含む、請求項３３、３４または３５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００５年１１月７日に提出された「Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ特異的オリゴヌクレオチド配列」という標題の仮出願第６０／７３４，１５５号から優先権を主張する。この仮出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の背景
クラミジアは多種多様の重大なヒト感染症および動物感染症の原因となる、広範囲におよぶ細胞内細菌病原体である。クラミジアは、機能的および形態的に異なる２形態を有する独特の二相性生活環を特徴とする偏性非運動性グラム陰性細菌である。クラミジア科の四つの主要種の一つであるＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓは、ほぼ例外なくヒト病原体であり、世界中で最も多くみられる、性行為感染症および予防可能な失明の原因である。Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓは、トラコーマ（主にアフリカ、中東およびアジアで４億人超を苦しめる両側性角結膜炎の一形態）を起こす血清型Ａ、Ｂ、ＢａおよびＣ；封入体結膜炎および生殖器感染症の原因である血清型ＤからＫ；ならびに鼠径リンパ肉芽腫(欧米でまれであるが、熱帯諸国では性器潰瘍疾患を有する患者の２〜１０%を占めることがある性行為感染症)と関連する血清型Ｌ１からＬ３を含む、異なる１５血清型として存在する。
【０００３】
生殖器クラミジア感染症は、西洋世界で最も多くみられる性行為感染症（ＳＴＤ）であり、米国で最も蔓延している細菌性ＳＴＤである。２００２年には、性器クラミジアの８００，０００を超える新症例がＣＤＣに報告され、これは米国での他の全ての届出疾患を超えていた（Centers for Disease Control and Prevention, "Sexually Transmitted Disease Surveillance, 2002", U.S. Department of Health and Human Services, Atlanta, GA, September 2003）。女性における感染の７０〜８０%および男性における約５０%が臨床的に無症候性であることから、実質的には過少報告である（H.D. Davies et al., CMAJ, 1996, 153: 1631-1644; S.D. Hillis et al., Sex. Transm. Dis., 1995, 22: 197-202; A.C. Gerbase et al., Sex. Transm. Infect, 1998, 74: S12-S14; A.C. Gerbase et al., Lancet, 1998, 351: 2-4）。無認識および未処置ならば、この細菌は数ヶ月宿主に感染したままになるおそれがある。Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ感染の無症候性は、リスクのある集団でのその蔓延を容易にし、感染の保有を促進するおそれがある（S .E. Thompson and A.E. Washington, Epidemiol. Rev., 1983, 5: 96-123; T. Ripa, Scand. J. Infect. Dis. Suppl., 1990, 69: 157-167）。
【０００４】
この細菌が存在する場合の、女性におけるクラミジア感染の症状には、腟分泌物の増加、性交後および／または月経中の出血、下腹部痛、ならびに排尿障害がある（B.A. Cromer and F.P. Head, Sex. Transm. Dis., 1987, 14: 125-129; S.M. Garland and B. Johnson, Med. J. Austral., 1989, 150: 174-177; G.R. Scott et al., Br. J. Obstet Gynaecol., 1989, 96: 473-477; C.K. Malotte et al., Am. Public Health, 1990, 80: 469-471; P. Oakeshott et al., Fam. Pract., 1992, 9: 421-424; J.T. Humphreys et al., Sex. Transm. Dis., 1992, 19: 47-53）。感染した母親に生まれた乳児には、結膜炎および肺炎のリスクが含まれる。男性では、症状には尿道分泌物および排尿障害が含まれる（J. Schachter, N. Engl. J. Med., 1978, 298: 428-435）。未処置の場合、クラミジア感染症は、短期的および長期的帰結の両方を有する深刻な生殖問題および他の健康問題に進行することがある。この疾患自体のように、クラミジアが起こす損傷は多くの場合「無症候性」である。女性では、未処置の感染は、子宮および／または卵管に拡大し、骨盤炎症性疾患を起こすことがある（N.S. Padian and A.E. Washington, Ann. Epidemiol., 1994, 4: 128-132）。これは、未処置クラミジアを有する女性の最大４０%に起こる。骨盤炎症性疾患（ＰＩＤ）は、卵管、子宮および周辺組織に永続的な損傷を起こすおそれがあり、それにより慢性骨盤痛、不妊、および場合によっては致死的子宮外妊娠に至るおそれがある（W. Cates Jr. et al., Am. J. Obstet. Gynecol., 1991, 164: 1771-1781; J. Coste et al., Fertil. Steril., 1994, 62: 289-295; L. Westrom and P. Wolner-Hansen, Genitourin. Med., 1993, 69: 9-17）。男性では、未処置のクラミジアにより、前立腺炎、尿道の瘢痕化、不妊および精巣上体炎に至るおそれがある。任意の性行為感染症を有する患者は、別のＳＴＤに同時感染するリスクが増大しているが、クラミジアおよび淋疾の同時感染が最も多くみられる。クラミジア感染を有する女性の４０%および男性の２０%は、淋疾と同時感染している。クラミジア感染は、子宮頸癌の発生についてのリスク増大と関連しているとも報告された（S. Hillis et al., Sex. Transm. Dis., 1995, 22: 197-202; T. Anttila et al., JAMA, 2001, 286: 47-51）。
【０００５】
クラミジア感染のための治療的抗生物質療法は、容易に利用でき、安価であることから、早期診断は、これらの感染症をコントロールする公衆衛生プログラムの不可欠な要素である。早期検出の目標には、伝染の連鎖の妨害および長期後遺症の予防が含まれる（J. Paavonen et al., Obstet. Gynecol., 1998, 92: 292-298）。性器クラミジア感染を有する患者は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に曝露されたときに感染するリスクもまた増大している。早期診断処置により感染性の継続を短縮することは、ＨＩＶ感染についてのリスク低減に大きな影響を有しうる。
【０００６】
細胞培養でのＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの単離は、検査室診断のための従来方法であり、その特異性が原因で、相変わらず法医学標本についてのえり抜きの方法である。しかしこの方法は、高価な装置、技術的熟練、および標本の生存性を保存するための厳密な輸送条件を必要とし；この方法は、所要時間が２から３日でもある。様々な設定で、細胞培養は、輸送の要求が厳しくなく、その日に結果を提供することができる直接蛍光抗体染色、エンザイムイムノアッセイ、および酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）による抗原検出に基づく迅速試験に置き換えられた。しかし、これらの方法はまだ手間および時間がかかり、さらに重要なことには、特に無症候性患者についてのスクリーニングアッセイとしては感度に欠ける。
【０００７】
さらに最近になって、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの直接検出のために、核酸に基づくハイブリダイゼーションプローブ検査が開発された（R. Warren et al., J. Clin. Microbiol., 1993, 31: 1663-1666）。これらの検査は高い特異性を与えるが、感度には実質的な改善をもたらさない。さらに、これらの検査の大部分は、侵襲性試料採取手順を使用して得られる子宮頸管内または尿道標本を用いて行われる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、分岐ＤＮＡ、または転写媒介性増幅（ＴＭＡ）技法に基づく核酸増幅アッセイを現在利用することができる（M. Buimer et al., J. Clin. Microbiol., 1996, 34: 2395-2400; M. A. Chernesky et al., Mol. and Cell Probes, 1996, 11: 243-249; T.C. Quinn et al., J. Clin. Microbiol., 1996, 34: 1401-1406; G.L. Ridgway et al., J. Clin. Pathol., 1996, 49: 116-119; CM. Black, Clin. Microbiol. Rev., 1997, 10: 160-184; K.A. Crotchfelt et al., J. Clin. Microbiol., 1997, 35: 1536-1540; P.O. Davies and G.L. Ridgway, Int. J. STD AIDS, 1997, 8: 731-738; L. Grun et al., NMJ, 1997, 315: 226-230; K.A. Crotchfelt et al., J. Clin. Microbiol., 1998, 36: 391-394; C.A. Gaydos et al., J. Infect. Dis., 1998, 177: 417-424; R. Pastenack et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 1999, 18: 142-144）。環境条件での標本輸送、バッチ処理自動化および迅速な加工時間に関する非培養検査の全ての利点をもたらすことに加えて、これらのアッセイは、１００%に近い高い特異性および感度を提供する。さらに、これらのアッセイは、尿などの侵襲性の低い臨床標本に対して行うことができる（J.E. Bauwens et al., J. Clin. Microbiol., 1993, 31: 3013-3116; M. Domeika et al., J. Clin. Microbiol., 1994, 32: 2350-2352; M.A. Chernesky et al., J. Clin. Microbiol, 1994, 32: 2682-2685; H.H. Lee et al., Lancet, 1995, 345: 213-216; M. Bassiri et al., J. Clin. Microbiol., 1995, 33: 898-900; T.C. Quinn et al., J. Clin. Microbiol., 1996, 34: 1401-1406; R. Pasternack et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 1999, 18: 142-144; K. Templeton et al., Int. J. STD AIDS, 2001, 12: 793-796; R.A. McCartney et al., Br. J. Biomed. Sci., 2001, 58: 235-238; L.A. Cosentino et al., J. Clin. Microbiol., 2003, 41: 3592-3596）。これらの利点の全ては、無症候性クラミジア感染の検出に、およびスクリーニングツールとして、核酸増幅アッセイを特に適したものにする。
【０００８】
しかし、クラミジア検出のための現存する核酸増幅アッセイは、依然としてある欠点および限界を示す。これらのアッセイは混入を最小にするように設計されているが、感度の低い検査をこの比較的新しい技法に置き換えるのは幾分不本意である。一番の懸念は、ある標本における増幅阻害物質の存在により起こる偽陰性の結果と、厳密な品質管理手順が適用されていないとすれば相互汚染による擬陽性の結果とに関わる。その他の懸念には、全ての血清型のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓを等しい効率で検出できないこと、コスト、および試料の処理量が含まれる。明らかに、クラミジア感染の検出のための改良された核酸増幅アッセイの開発が依然として高く望まれる。
【０００９】
発明の概要
本発明は、生物学的試料中のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの迅速、選択的および特異的な検出のためのシステムに関する。特に、本発明は、クラミジア感染の検出および診断のための核酸増幅検査を開発するために使用することができる試薬を包含する。さらに具体的には、本発明は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの潜在プラスミドにおけるターゲット核酸配列のいずれかの鎖を検出するための増幅プライマーおよび検出プローブについてのオリゴヌクレオチド配列を提供する。本発明のオリゴヌクレオチド配列のあるものは、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの１５血清型全てを認識する利点を有する。
【００１０】
ある態様では、リアルタイムおよび多重検出を伴うアッセイを含む多様な核酸増幅アッセイのいずれかに使用することができるプライマーセットおよびプライマー／プローブセットとしてのオリゴヌクレオチド配列が提供される。
【００１１】
本発明は、被験試料中のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓを検出するための方法もまた提供する。一般に当該方法は、少なくとも一つの本発明のオリゴヌクレオチドと、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸を有すると疑われる被験試料を接触させることによって、試料中に存在するならば、そのオリゴヌクレオチドがそのＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸にハイブリダイゼーションできるようにする工程；およびそのＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸にハイブリダイゼーションした任意のオリゴヌクレオチドを検出する工程であって、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸にハイブリダイゼーションしたオリゴヌクレオチドの検出が、試料中のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの存在を示す工程を含む。
【００１２】
本発明の他の方法は、本明細書に記載される少なくとも一つのプライマーセットまたはプライマー／プローブセット、および増幅反応試薬と、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸を有すると疑われる被験試料を接触させて反応混合物を形成させる工程を含む。次に、被験試料中に存在するならば、そのＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸が増幅し、増幅産物を産生するように、この反応混合物を増幅条件に置く。結果として生じた増幅産物は、多様な検出技法を使用して検出することができる。ある態様では、本発明の検出プローブを使用して増幅産物／プローブハイブリッドを形成させ、当該ハイブリッドの検出は、被験試料中のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの存在を示す。
【００１３】
その上、増幅プライマーおよび検出プローブのための本発明のオリゴヌクレオチド配列は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓおよび他のターゲット生物を同時検出するために、核酸増幅形式において他の特異的プライマーおよびプローブと共に使用することができる。ある態様では、本発明の増幅プライマーおよび検出プローブは、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａを同時検出するためにＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａ特異的なプライマーおよびプローブと共に使用する。
【００１４】
本発明による増幅プライマーおよび検出プローブと、所望により増幅反応試薬とを含むキットもまた、被験試料におけるクラミジア感染の検出のために提供される。
【００１５】
本発明のこれらおよび他の目的、利点および特徴は、以下の好ましい態様の詳細な説明を読んだ当業者に明らかとなるであろう。
【００１６】
定義
本明細書を通じて、以下の節に定義されるいくつかの用語が採用される。
【００１７】
「個体」、「対象」および「患者」という用語は、本明細書において相互交換可能に使用される。これらの用語は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの宿主になりうるが、この細菌に感染していることも感染していないこともあるヒトを表す。これらの用語は、特定の年齢を意味せず、したがって成人、小児、新生児、および胎児を包含する。
【００１８】
本明細書に使用する「被験試料」という用語は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸を有すると疑われる任意の液体または固体物質を表す。被験試料は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸を有しうる任意の生体組織または生体液であってもよいし、それから得てもよい。高い頻度で、この試料は「臨床試料」、すなわちクラミジア感染について検査される患者から得られたか、または単離された試料であろう。当該試料には、細胞性物質を有する体液であって、細胞を有することも有さないこともある体液、例えば血液、血漿、血清、尿、精液、唾液、眼球水晶体液（ocular lens fluid）、リンパ液、羊水など；子宮頸管試料、尿道試料、直腸試料、膣試料、外陰−膣試料、鼻咽頭試料および肺試料；ならびに公知の診断を有する永久保存用試料が含まれるが、それに限定されるわけではない。被験試料には、凍結切片などの組織切片もまた含まれうる。「被験試料」という用語は、生物学的試料の加工によって誘導される任意の物質もまた包含する。誘導された物質には、試料から単離された細胞（またはその子孫）、細胞構成要素、および試料から抽出された核酸分子が含まれるが、それに限定されるわけではない。被験試料を得るための生物学的試料の加工は、濾過、蒸留、遠心分離、抽出、濃縮、希釈、精製、妨害構成要素の不活性化、試薬の添加などのうち一つまたは複数を含むことがある。
【００１９】
「核酸」、「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において相互交換可能に使用される。これらの用語は、一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを表し、別に述べない限り天然ヌクレオチドと同様に機能することができる天然ヌクレオチドの公知のアナログを包含する。この用語は、合成主鎖を有する核酸様構造、および増幅産物を包含する。
【００２０】
本明細書に使用する「オリゴヌクレオチド」という用語は、増幅プライマーまたは検出プローブとして使用することができる短鎖デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを表す。これらの短配列の核酸配列は、多くの場合化学的に合成されるが、それらを他の任意の適切な方法により調製することができる。当業者に認識されているように、オリゴヌクレオチドの長さ（すなわちヌクレオチドの数）は、意図されるその機能または使用に応じて、多くの場合大きく変動することがある。一般に、オリゴヌクレオチドは５から３００ヌクレオチド、例えば約１５から約１００ヌクレオチドまたは約１５から約５０ヌクレオチドを含む。
【００２１】
オリゴヌクレオチドに関する場合の「単離された」という用語は、オリゴヌクレオチドの起源または操作に基づいて、自然に関連する少なくとも一部の構成要素から分離されたオリゴヌクレオチドを意味する。「単離された」により、対象となるオリゴヌクレオチドがヒトの手によって産生または合成されたことを代替的にまたは追加的に意味する。
【００２２】
オリゴヌクレオチド（例えば本明細書に提供されるオリゴヌクレオチド配列）に関して本明細書に使用される「活性フラグメント」という用語は、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列と十分に相同であるか、またはその配列から誘導されたヌクレオチド配列を含む任意の核酸分子を表し、この核酸分子は、完全長オリゴヌクレオチドよりも少ないヌクレオチドを含み、配列全体の少なくとも一つの生物学的性質を保持する。典型的には、活性フラグメントは、完全長オリゴヌクレオチドの少なくとも一つの活性を有する配列を含む。本発明のオリゴヌクレオチド配列の活性フラグメントまたは部分は、例えば１０、１５、２０、２５、３０個以上のヌクレオチド長の核酸分子のことがあり、生物学的試料中のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの検出のための増幅プライマーおよび／または検出プローブとして使用することができる。
【００２３】
オリゴヌクレオチドの活性フラグメントに関して本明細書において使用する場合の「十分に相同」という用語は、オリゴヌクレオチドに比べて少なくとも３５%の配列相同性を有する核酸分子を表す。ある態様では、配列相同性は、少なくとも４０%、少なくとも５０%、少なくとも６０%、少なくとも７０%、少なくとも８０%、少なくとも９０%、または少なくとも９５%である。
【００２４】
「相同性」および「同一性」という用語は、本明細書において相互交換可能に使用され、二つの核酸分子の間の配列類似性を表す。二つの核酸配列の相同率または同一率の計算は、最適の比較目的のために二つの配列をアライメントすることによって行うことができる（例えば最適のアライメントのために第一および第二核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、比較目的のために非相同配列を無視することができる）。ある態様では、比較目的のためにアライメントされた配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０%、少なくとも４０%、少なくとも５０%、少なくとも６０%、少なくとも７０%、少なくとも８０%、少なくとも９０%、少なくとも９５%、または１００%である。次に、対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドを比較する。第一配列における位置が、第二配列における対応する位置と同じヌクレオチドにより占有されているならば、これらの分子はその位置で同一（または相同）である。二つの配列の間の同一率は、その二つの配列の最適なアライメントのために導入される必要のあるギャップ数および各ギャップの長さを考慮した、これらの配列に共通の同一位置数の関数である。
【００２５】
配列の比較および二つの配列の間の同一率の決定は、数学的アルゴリズムを使用して実現することができる。例えば、二つのヌクレオチド配列の間の同一率は、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップ長ペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を使用したＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたＭｅｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム（CABIOS, 1989, 4: 11-17）を使用して決定することができる。または、二つのヌクレオチド配列の間の同一率は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを使用したＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで入手できる）の中のＧＡＰプログラムを使用して決定することができる。
【００２６】
「ハイブリダイゼーション」という用語は、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型塩基対形成または非カノニカル塩基対形成により複合体を形成するために十分なほど相補的なヌクレオチド配列間の複合体の形成を表す。プライマーがターゲット配列（テンプレート）と「ハイブリダイゼーション」する場合、当該複合体（またはハイブリッド）は、ＤＮＡ合成を開始するために例えばＤＮＡポリメラーゼに必要なプライミング機能に役立つために十分なほど安定である。安定なハイブリッドを提供するために、ハイブリダイゼーションする配列が完全な相補性を有する必要のないことは認識されているであろう。約１０%未満の塩基がミスマッチである多くの状況で、安定なハイブリッドが形成するものである。したがって、本明細書に使用するような「相補的」という用語は、一般に約９０%以上の相同性がある場合に、アッセイ条件で相補体と安定な二本鎖を形成するオリゴヌクレオチドを表す。当業者は、少なくとも所望のレベルの相補性を有する配列が安定にハイブリダイゼーションするが、低い相補性を有する配列はハイブリダイゼーションしないように、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを推定および調整する方法を了解している。ハイブリダイゼーション条件およびパラメータの例については、例えばJ. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 1989, Second Edition, Cold Spring Harbor Press: Plainview, NY; F.M. Ausubel, "Current Protocols in Molecular Biology", 1994, John Wiley & Sons: Secaucus, NJを参照されたい。
【００２７】
本明細書に使用する「増幅」という用語は、試料中における特定の核酸配列の集団の提示を増加させる方法を表す。（ポリメラーゼ連鎖反応すなわちＰＣＲなどの）増幅法は、当技術分野において公知であり、下にさらに詳細に論じる。
【００２８】
本明細書に使用する「ターゲット配列」という用語は、検出される特定の核酸配列を表す。好ましくはターゲット配列には、オリゴヌクレオチドプライマーが複合体を形成する核酸配列が含まれる。ターゲット配列には、プローブが所望の条件で安定なハイブリッドを形成するプローブハイブリダイゼーション領域もまた含まれうる。当業者は認識しているであろうが、ターゲット配列は一本鎖であっても二本鎖であってもよい。本発明に関連して、対象となるターゲット配列は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの潜伏プラスミド内にある。
【００２９】
「プライマー」および「増幅プライマー」という用語は、本明細書において相互交換可能に使用される。これらの用語は、ヌクレオチドおよび核酸重合のための薬剤（例えばＤＮＡ依存性ポリメラーゼまたはＲＮＡ依存性ポリメラーゼ）の存在下で適切な条件（例えば緩衝液、塩、温度およびｐＨ）に置かれた場合に、プライマー伸長産物の合成開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを表す。プライマーは、最大効率の増幅のために好ましくは一本鎖であるが、代わりに二本鎖であってもよい。二本鎖ならば、プライマーは最初に処理して（例えば変性させて）、その鎖を分離させてから伸長産物の調製に使用することができる。そのような変性工程は、典型的には熱を使用して行われるが、代わりにアルカリに続いて中和を使用して実施することもできる。典型的なプライマーは、ターゲット配列に実質的に相補的な約１０から約３５ヌクレオチド長の配列を有する。しかし、プライマーは追加の配列もまた有することがある。例えば、鎖置換増幅（SDA）に使用される増幅プライマーは、好ましくはターゲット結合配列に対して５’側の部位に制限エンドヌクレアーゼ認識を含む（例えばU.S.Pat.Nos. 5,270,184および5,455,166を参照されたい)。核酸配列増幅法（ＮＡＳＢＡ）、自動継続配列複製（Self Sustaining Sequence Replication）（３ＳＲ）、および転写媒介性増幅（ＴＭＡ）のプライマーには、好ましくはプライマーのターゲット結合配列に連結したＲＮＡポリメラーゼプロモーターが含まれる。選択された増幅反応に使用するための結合ターゲット配列にそのような特別の配列を連結するための方法は、当技術分野において周知である。
【００３０】
「フォワードプライマー」および「フォワード増幅プライマー」という用語は、本明細書において相互交換可能に使用され、リバースプライマーに対して５’側でターゲット配列とハイブリダイゼーション（またはアニーリング）するプライマーを表す。「リバースプライマー」および「リバース増幅リバースプライマー」という用語は、本明細書において相互交換可能に使用され、フォワードプライマーに対して３’側でターゲット配列とハイブリダイゼーション（またはアニーリング）するプライマーを表す。
【００３１】
本明細書において使用する「増幅条件」という用語は、プライマー配列のアニーリングおよび／または伸長を促進する条件を表す。そのような条件は、当技術分野において周知であり、選択された増幅方法に依存する。このように例えばＰＣＲ反応において、増幅条件は、一般に熱サイクル、例えば二つ以上の温度の間の反応混合物のサイクルを含む。等温増幅反応では、反応を開始するために最初の温度増加が必要なことがあるが、増幅は熱サイクルなしに起こる。増幅条件は、温度および温度サイクル、緩衝液、塩、イオン強度、およびｐＨなどを非限定的に含む全ての反応条件を包含する。
【００３２】
本明細書において使用する「増幅反応試薬」という用語は、核酸増幅反応に使用される試薬を表し、その試薬には、緩衝液、逆転写酵素活性および／もしくはポリメラーゼ活性またはエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素；マグネシウムまたはマンガンなどの酵素補因子；塩；ニコチンアミドアデニンジヌクレアーゼ（ＮＡＤ）；ならびにデオキシアデノシン三リン酸、デオキシグアノシン三リン酸、デオキシシチジン三リン酸、およびチミジン三リン酸などのデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）が含まれうるが、それに限定されるわけではない。増幅反応の試薬は、使用する増幅方法に応じて当業者により容易に選択されることができる。
【００３３】
「プローブ」および「検出プローブ」という用語は、本明細書において相互交換可能に使用され、適切な条件でターゲット配列の少なくとも部分に選択的にハイブリダイゼーションすることができるオリゴヌクレオチドを表す。一般にプローブ配列は、コード鎖もしくはセンス鎖に「相補的」であるか、またはコード鎖もしくはセンス鎖に「リバース相補的」のいずれかであると確認される。ある好ましい態様では、検出プローブは検出可能な部分でラベルされる。
【００３４】
「ラベルされた」および「検出可能な薬剤（または部分）でラベルされた」という用語は、実体（例えばオリゴヌクレオチド検出プローブ）が、例えば別の実体（例えば増幅反応産物またはアンプリコン）への結合後に視覚化することができることを特定するために、本明細書において相互交換可能に使用される。好ましくは、測定することができ、強度が結合した実体の量に関係（例えば比例）するシグナルを発生するように、検出可能な薬剤または部分は選択される。核酸分子をラベルおよび／または検出するための多種多様なシステムは、当技術分野において周知である。ラベルされた核酸は、分光、光化学、生化学、免疫化学、電気、光学または化学的手段により直接または間接的に検出することができるラベルの組み込みまたはそのラベルとのコンジュゲーションにより調製することができる。適切な検出可能な薬剤には、放射性核種、フルオロフォア、化学ルミネセンス剤、ミクロパーティクル、酵素、呈色ラベル、磁気ラベル、ハプテン、分子ビーコンおよびアプタマービーコンが含まれるが、それに限定されるわけではない。
【００３５】
「フルオロフォア」、「蛍光部分」および「蛍光色素」という用語は、本明細書において相互交換可能に使用される。これらの用語は、一波長で電磁波放射の量子を吸収し、それに応答して典型的には異なる長波長で一つまたは複数の光子を放射する分子を表す。多種多様な構造および特徴をもつ多数の蛍光色素が、本発明の実施における使用に適する。核酸分子を蛍光ラベルするための方法および物質は公知である（例えば、R.P. Haugland, "Molecular Probes: Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals 1992-1994", 5th Ed., 1994, Molecular Probes, Inc.を参照されたい）。好ましくは蛍光部分は、高い効率で光を吸収して放射し（すなわち蛍光部分は、使用する励起波長で高いモル吸収係数および高い蛍光量子収量を有し）、光安定性である（すなわち蛍光部分は、分析を行うために必要な時間内に光励起された際に有意な分解を受けない）。一部の蛍光色素は、それ自体直接検出可能であるというよりはむしろ、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の過程で別の蛍光色素にエネルギーを移動し、第２の色素が検出されるシグナルを生じる。そのようなＦＲＥＴ蛍光色素対もまた、「蛍光部分」という用語に包含される。物理的に連結した蛍光レポーター／クエンチャー部分の使用もまた、本発明の範囲内に属する。これらの態様では、蛍光レポーターおよびクエンチャー部分が、核酸プローブの末端などに近接して保持される場合、クエンチャー部分はレポーター部分からの蛍光シグナルの検出を防止する。例えばＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによる切断後などにこれらの二つの部分が物理的に分離されると、レポーター部分からの蛍光シグナルは検出可能になる。
【００３６】
ラベルまたは検出可能な部分に関して本明細書に使用される場合の「直接検出可能な」という用語は、そのラベルまたは検出可能な部分が、検出可能であるためにさらなる反応も操作も必要としないことを意味する。例えば蛍光部分は、蛍光分光法により直接検出可能である。ラベルまたは検出可能な部分に関して本明細書に使用される場合の「間接的に検出可能な」という用語は、そのラベルまたは検出可能な部分が、さらなる反応または操作の後で検出可能になることを意味する。例えば、ハプテンは、蛍光色素などのレポーターと結合した適切な抗体との反応後に検出可能になる。
【００３７】
ある好ましい態様の詳細な説明
上に言及したように、本発明は、生物学的試料中のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓを特異的および選択的に検出するための方法および試薬に関する。ある態様では、本発明の方法は、少量のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓを有する試料中であってもその細菌の検出を可能とする、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ特異的オリゴヌクレオチド配列および高感度な核酸増幅に基づく技法を使用する。
【００３８】
Ｉ  −  増幅プライマーおよび検出プローブのためのオリゴヌクレオチド配列
本発明のオリゴヌクレオチド配列
一局面では、本発明は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの潜在プラスミドにおけるターゲット配列のいずれかの鎖を特異的に検出するための核酸増幅検査に使用することができるオリゴヌクレオチド配列を提供する。
【００３９】
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの７４３９塩基対の潜在プラスミドは、この生物に特異的で、１ゲノムあたり約７〜１０コピーで本質的に全ての臨床株に見出されることから、ＤＮＡに基づくクラミジア感染の診断のための絶好のターゲットである（J.E. Tam et al., Plasmid, 1992, 27: 231-236）。ヒトＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ単離物からの全てのプラスミドは極めて類似しており、１%未満のヌクレオチド変動を有する。Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの潜在プラスミドの含有ＤＮＡ全体は、配列決定され（K.S. Sriprakash and E.S. Macavoy, Plasmid, 1987, 18: 205-214; C. Hatt et al., Nucleic Acids Res., 1988, 16: 4053-4067; M. Comanducci et al., Mol. Microbiol., 1988, 2: 531-538; M. Comanducci et al., Plasmid, 1990, 23: 149-154; N.S. Thomas and I.N. Clarke, Proc. 2nd Meeting Eur. Soc. Chlamydia Res. 1992, p.42, Societa Editrice Esculapio: Bologna, Italy）、ＧｅｎＢａｎｋに寄託された（アクセッション番号Ｘ０６７０７）。
【００４０】
本発明のオリゴヌクレオチド配列は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの潜在プラスミドにおけるターゲット配列に特異的である。さらに具体的には、本発明は、一つまたは複数の血清型のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓを認識する増幅プライマーおよび検出プローブについてのオリゴヌクレオチド配列を提供する。ある態様では、本発明のオリゴヌクレオチド配列は、１５血清型全てのＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓを認識する。本発明の例示的なオリゴヌクレオチド配列を図１および図２（配列番号１から４１）に、それらに対応するマップ位置と共に表示する。これらの配列は、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ、ＡＢＩ  ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｐｒｅｓｓ、およびＯｌｉｇｏ６ソフトウェアプログラムを使用してＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ潜在プラスミドｐＬＧＶ４４０配列を用いた配列アラインメントにより本出願人により同定された。
【００４１】
当業者に認識されているであろうが、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの増幅、検出または定量のための、本明細書に開示された任意のオリゴヌクレオチド配列（またはその活性フラグメント）は、意図された使用またはアッセイ形式に応じて検出プローブまたは増幅プライマーのいずれかとして採用することができる。例えば、一つのアッセイにおいて増幅プライマーとして使用される本発明のオリゴヌクレオチド配列は、別のアッセイにおいて検出プローブとして使用することができる。所与の配列は、例えば選択された増幅法に必要とされる特定の配列（例えばプロモーター配列）を本発明のオリゴヌクレオチド配列に結合させることによって、または検出を容易にするために蛍光色素を結合させることによって改変することができる。本発明によるオリゴヌクレオチドには、スペーサーか、リンカーか、酵素をラベルまたは酵素に結合するための配列か、あるいは分解過程に付加的な安定性もしくは感受性を、またはオリゴヌクレオチドに他の所望の性質を与えることができる配列として作用することができる一つまたは複数の配列が含まれうることも了解されたい。
【００４２】
本発明により提供されるオリゴヌクレオチド配列に基づき、一つまたは複数のオリゴヌクレオチドアナログを調製することができる（下記参照）。当該アナログは、ペプチド核酸すなわち「ＰＮＡ」（すなわち天然核酸の糖リン酸エステル主鎖の代わりにペプチド様主鎖を有する分子）などの代替構造を有してもよい。本発明の配列を表すこれらの代替構造も、同様に本発明の部分である。同様に、本発明の配列からなるオリゴヌクレオチドは、核酸塩基の欠失、付加および／または置換がその核酸分子の性質に負の影響を与えない程度に、そのような変更を有してもよい。特に、それらの変更は、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション性質に有意な低下を招いてはならない。
【００４３】
プライマーセットおよびプライマー／プローブセット
別の局面では、本発明は、生物学的試料中のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓを検出するための、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド配列の組み合わせに関する。さらに具体的には、本発明はプライマーセットおよびプライマー／プローブセットを提供する。
【００４４】
本明細書に使用する「プライマーセット」という用語は、対象となるヌクレオチド配列（例えばＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの潜在プラスミド内のターゲット配列）の増幅を一緒にプライミングすることができる二つ以上のプライマーを表す。ある態様では、「プライマーセット」という用語は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含むプライマー対を表す。当該プライマーセットまたはプライマー対は、ＰＣＲ増幅反応に特に有用である。
【００４５】
フォワード増幅プライマーおよびリバース増幅プライマーを含むプライマーセットの例には以下が含まれる：
配列番号１
【００４６】
【表１】
2009514549.tif 000002
【００４７】
またはその任意の活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号２
【００４８】
【表２】
2009514549.tif 000003
【００４９】
またはその任意の活性フラグメントを含むリバースプライマーとを含むプライマーセット１；
配列番号５
【００５０】
【表３】
2009514549.tif 000004
【００５１】
またはその任意の活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号６
【００５２】
【表４】
2009514549.tif 000005
【００５３】
またはその任意の活性フラグメントを含むリバースプライマーとを含むプライマーセット２；
配列番号９
【００５４】
【表５】
2009514549.tif 000006
【００５５】
またはその任意の活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号１０
【００５６】
【表６】
2009514549.tif 000007
【００５７】
またはその任意の活性フラグメントを含むリバースプライマーとを含むプライマーセット３；
配列番号１３
【００５８】
【表７】
2009514549.tif 000008
【００５９】
またはその任意の活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号１４
【００６０】
【表８】
2009514549.tif 000009
【００６１】
またはその任意の活性フラグメントを含むリバースプライマーとを含むプライマーセット４；
配列番号１６
【００６２】
【表９】
2009514549.tif 000010
【００６３】
またはその任意の活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号１７
【００６４】
【表１０】
2009514549.tif 000011
【００６５】
またはその任意の活性フラグメントを含むリバースプライマーとを含むプライマーセット５；
配列番号２０
【００６６】
【表１１】
2009514549.tif 000012
【００６７】
またはその任意の活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号２１
【００６８】
【表１２】
2009514549.tif 000013
【００６９】
またはその任意の活性フラグメントを含むリバースプライマーとを含むプライマーセット６；
配列番号２３
【００７０】
【表１３】
2009514549.tif 000014
【００７１】
またはその任意の活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号２４
【００７２】
【表１４】
2009514549.tif 000015
【００７３】
またはその任意の活性フラグメントを含むリバースプライマーとを含むプライマーセット７；
配列番号２６
【００７４】
【表１５】
2009514549.tif 000016
【００７５】
またはその任意の活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号２７
【００７６】
【表１６】
2009514549.tif 000017
【００７７】
またはその任意の活性フラグメントを含むリバースプライマーとを含むプライマーセット８；
配列番号２９
【００７８】
【表１７】
2009514549.tif 000018
【００７９】
またはその任意の活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号３０
【００８０】
【表１８】
2009514549.tif 000019
【００８１】
またはその任意の活性フラグメントを含むリバースプライマーとを含むプライマーセット９；
配列番号３２
【００８２】
【表１９】
2009514549.tif 000020
【００８３】
またはその任意の活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号３３
【００８４】
【表２０】
2009514549.tif 000021
【００８５】
またはその任意の活性フラグメントを含むリバースプライマーとを含むプライマーセット１０；
配列番号３５
【００８６】
【表２１】
2009514549.tif 000022
【００８７】
またはその任意の活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号３６
【００８８】
【表２２】
2009514549.tif 000023
【００８９】
またはその任意の活性フラグメントを含むリバースプライマーとを含むプライマーセット１１。
【００９０】
本発明は、多重形式アッセイに使用することができるプライマーセットもまた提供する。当該プライマーセットの例は、以下である：
配列番号３８
【００９１】
【表２３】
2009514549.tif 000024
【００９２】
またはその任意の活性フラグメントを含む第１フォワードプライマーと、配列番号３９
【００９３】
【表２４】
2009514549.tif 000025
【００９４】
またはその任意の活性フラグメントを含む第２フォワードプライマーと、配列番号４０
【００９５】
【表２５】
2009514549.tif 000026
【００９６】
またはその任意の活性フラグメントを含むリバースプライマーとを含むプライマーセットＣＴ（ｍｐｘ）である。
【００９７】
これらのプライマーセットは、（下に論じる）ターゲット配列を増幅するために二つ以上のオリゴヌクレオチドを採用する任意の核酸増幅技法により使用することができる。本発明のプライマーセットを使用して産生された増幅産物は、当技術分野において周知の多様な検出方法を使用して検出することができる。例えば、増幅産物は、アガロースゲル電気泳動ならびに臭化エチジウム染色および紫外線（ＵＶ）曝露による視覚化を使用して、またはＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの同一性の確認のための増幅産物の配列分析により検出することができる。
【００９８】
または、プローブ配列は、増幅産物を検出するために多様な相同または非相同法を使用して採用することができる。そのような方法の全てで一般に、プローブは、増幅産物の鎖（すなわちアンプリコン）にハイブリダイゼーションして、増幅産物／プローブハイブリッドを形成する。次に、プライマー、プローブ、またはプライマーおよびプローブの両方にラベルを使用して、ハイブリッドを直接または間接的に検出することができる。
【００９９】
本明細書に使用する「プライマー／プローブセット」という用語は、対象となるヌクレオチド配列（例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの潜在プラスミド内のターゲット配列）の増幅を一緒にプライミングすることができる二つ以上のプライマーと、ターゲット配列を検出することができる少なくとも一つのプローブとを含む組み合わせを表す。そのプローブは、増幅産物の鎖（すなわちアンプリコン）にハイブリダイゼーションし、アンプリコンを検出させる増幅産物／プローブハイブリッドを形成することができる。
【０１００】
したがって本発明は、被験試料中のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓターゲット配列を特異的に増幅および検出するための核酸増幅手順により使用することができるプライマー／プローブセットを提供する。本発明のプライマー／プローブセットは、上記のようなプライマーセットおよび少なくとも一つの検出プローブを含む。検出プローブは検出可能な部分を含んでもよい。ある態様では、検出プローブは、５’末端に結合した蛍光部分と、３’末端に結合したクエンチャー部分とを含む。
【０１０１】
プライマー／プローブセットの例には以下のものが含まれる：
配列番号１
【０１０２】
【表２６】
2009514549.tif 000027
【０１０３】
またはその活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号２
【０１０４】
【表２７】
2009514549.tif 000028
【０１０５】
またはその活性フラグメントを含むリバースプライマーと、配列番号３
【０１０６】
【表２８】
2009514549.tif 000029
【０１０７】
またはその活性フラグメントを含む相補的検出プローブと、配列番号４
【０１０８】
【表２９】
2009514549.tif 000030
【０１０９】
またはその活性フラグメントを含むリバース相補的検出プローブとを含むプライマー／プローブセットＣＴ１；
配列番号５
【０１１０】
【表３０】
2009514549.tif 000031
【０１１１】
またはその活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号６
【０１１２】
【表３１】
2009514549.tif 000032
【０１１３】
またはその活性フラグメントを含むリバースプライマーと、配列番号７
【０１１４】
【表３２】
2009514549.tif 000033
【０１１５】
またはその活性フラグメントを含む相補的検出プローブとを含むプライマー／プローブセットＣＴ２−Ｐ１；
配列番号５
【０１１６】
【表３３】
2009514549.tif 000034
【０１１７】
またはその活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号６
【０１１８】
【表３４】
2009514549.tif 000035
【０１１９】
またはその活性フラグメントを含むリバースプライマーと、配列番号８
【０１２０】
【表３５】
2009514549.tif 000036
【０１２１】
またはその活性フラグメントを含む相補的検出プローブとを含むプライマー／プローブセットＣＴ２−Ｐ２；
配列番号９
【０１２２】
【表３６】
2009514549.tif 000037
【０１２３】
またはその活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号１０
【０１２４】
【表３７】
2009514549.tif 000038
【０１２５】
またはその活性フラグメントを含むリバースプライマーと、配列番号１１
【０１２６】
【表３８】
2009514549.tif 000039
【０１２７】
またはその活性フラグメントを含む相補的検出プローブと、配列番号１２
【０１２８】
【表３９】
2009514549.tif 000040
【０１２９】
またはその活性フラグメントを含むリバース相補的検出プローブとを含むプライマー／プローブセットＣＴ３；
配列番号１３
【０１３０】
【表４０】
2009514549.tif 000041
【０１３１】
またはその活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号１４
【０１３２】
【表４１】
2009514549.tif 000042
【０１３３】
またはその活性フラグメントを含むリバースプライマーと、配列番号１５
【０１３４】
【表４２】
2009514549.tif 000043
【０１３５】
またはその活性フラグメントを含む相補的検出プローブとを含むプライマー／プローブセットＣＴ４；
配列番号１６
【０１３６】
【表４３】
2009514549.tif 000044
【０１３７】
またはその活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号１７
【０１３８】
【表４４】
2009514549.tif 000045
【０１３９】
またはその活性フラグメントを含むリバースプライマーと、配列番号１８
【０１４０】
【表４５】
2009514549.tif 000046
【０１４１】
またはその活性フラグメントを含む相補的検出プローブと、配列番号１９
【０１４２】
【表４６】
2009514549.tif 000047
【０１４３】
またはその活性フラグメントを含むリバース相補的検出プローブとを含むプライマー／プローブセットＣＴ５；
配列番号２０
【０１４４】
【表４７】
2009514549.tif 000048
【０１４５】
またはその活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号２１
【０１４６】
【表４８】
2009514549.tif 000049
【０１４７】
またはその活性フラグメントを含むリバースプライマーと、配列番号２２
【０１４８】
【表４９】
2009514549.tif 000050
【０１４９】
またはその活性フラグメントを含む相補的検出プローブとを含むプライマー／プローブセットＣＴ６；
配列番号２３
【０１５０】
【表５０】
2009514549.tif 000051
【０１５１】
またはその活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号２４
【０１５２】
【表５１】
2009514549.tif 000052
【０１５３】
またはその活性フラグメントを含むリバースプライマーと、配列番号２５
【０１５４】
【表５２】
2009514549.tif 000053
【０１５５】
またはその活性フラグメントを含む相補的検出プローブとを含むプライマー／プローブセットＣＴ７；
配列番号２６
【０１５６】
【表５３】
2009514549.tif 000054
【０１５７】
またはその活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号２７
【０１５８】
【表５４】
2009514549.tif 000055
【０１５９】
またはその活性フラグメントを含むリバースプライマーと、配列番号２８
【０１６０】
【表５５】
2009514549.tif 000056
【０１６１】
またはその活性フラグメントを含む相補的検出プローブとを含むプライマー／プローブセットＣＴ８；
配列番号２９
【０１６２】
【表５６】
2009514549.tif 000057
【０１６３】
またはその活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号３０
【０１６４】
【表５７】
2009514549.tif 000058
【０１６５】
またはその活性フラグメントを含むリバースプライマーと、配列番号３１
【０１６６】
【表５８】
2009514549.tif 000059
【０１６７】
またはその活性フラグメントを含む相補的検出プローブとを含むプライマー／プローブセットＣＴ９；
配列番号３２
【０１６８】
【表５９】
2009514549.tif 000060
【０１６９】
またはその活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号３３
【０１７０】
【表６０】
2009514549.tif 000061
【０１７１】
またはその活性フラグメントを含むリバースプライマーと、配列番号３４
【０１７２】
【表６１】
2009514549.tif 000062
【０１７３】
またはその活性フラグメントを含む相補的検出プローブとを含むプライマー／プローブセットＣＴ１０；および
配列番号３５
【０１７４】
【表６２】
2009514549.tif 000063
【０１７５】
またはその活性フラグメントを含むフォワードプライマーと、配列番号３６
【０１７６】
【表６３】
2009514549.tif 000064
【０１７７】
またはその活性フラグメントを含むリバースプライマーと、配列番号３７
【０１７８】
【表６４】
2009514549.tif 000065
【０１７９】
またはその活性フラグメントを含む相補的検出プローブとを含むプライマー／プローブセットＣＴ１１。
【０１８０】
本発明は、多重検出形式に使用することができるプライマー／プローブセットもまた提供する。当該プライマー／プローブセットの例は、以下である：
配列番号３８
【０１８１】
【表６５】
2009514549.tif 000066
【０１８２】
またはその活性フラグメントを含む第１フォワード増幅プライマーと、配列番号３９
【０１８３】
【表６６】
2009514549.tif 000067
【０１８４】
またはその活性フラグメントを含む第２フォワード増幅プライマーと、配列番号４０
【０１８５】
【表６７】
2009514549.tif 000068
【０１８６】
またはその活性フラグメントを含むリバース増幅プライマーと、配列番号４１
【０１８７】
【表６８】
2009514549.tif 000069
【０１８８】
またはその活性フラグメントを含む検出プローブとを含むプライマー／プローブセットＣＴ（ｍｐｘ）。
【０１８９】
オリゴヌクレオチドの調製
本発明のオリゴヌクレオチドは、多様な方法のうち任意のものにより調製することができる（例えば、J. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 1989, 2nd Ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press: New York, NY; "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", 1990, M.A. Innis (Ed.), Academic Press: New York, NY; P. Tijssen "Hybridization with Nucleic Acid Probes - Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (Parts I and II)", 1993, Elsevier Science; "PCR Strategies", 1995, M.A. Innis (Ed.), Academic Press: New York, NY;および"Short Protocols in Molecular Biology", 2002, F.M. Ausubel (Ed.), 5th Ed., John Wiley & Sons: Secaucus, NJを参照されたい）。例えば、オリゴヌクレオチドは、例えばS. A. Narang et al., Meth. Enzymol. 1979, 68: 90-98; E.L. Brown et al., Meth. Enzymol. 1979, 68: 109-151; E.S. Belousov et al., Nucleic Acids Res. 1997, 25: 3440-3444; D. Guschin et al., Anal. Biochem. 1997, 250: 203-211; M.J. Blommers et al., Biochemistry, 1994, 33: 7886-7896;およびK. Frenkel et al., Free Radic. Biol. Med. 1995, 19: 373-380;ならびにU.S.Pat.No. 4,458,066に記載されているような）例えば化学合成およびテンプレートに基づく重合を含む、当技術分野において周知の多様な化学的技法のうち任意のものを使用して調製することができる。
【０１９０】
例えば、オリゴヌクレオチドは、ホスホルアミダイトアプローチに基づく自動化固相手順を使用して調製することができる。そのような方法では、各ヌクレオチドは、３’末端で固相に結合した成長中のオリゴヌクレオチド鎖の５’末端に個別に付加される。付加されたヌクレオチドは、５’位のジメトキシトリイル（またはＤＭＴ）基による重合から保護されている３価３’−ホスホルアミダイトの形態である。塩基に誘導されるホスホルアミダイトの結合後の、５価ホスホトリエステル中間体を与える弱酸化およびＤＭＴ除去は、オリゴヌクレオチド伸長のための新しい部位を提供する。次に、そのオリゴヌクレオチドを固体支持体から切断し、ホスホジエステル基および環外アミノ基を水酸化アンモニウムで脱保護する。これらの合成は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．（Foster City, CA）、ＤｕＰｏｎｔ（Wilmington, DE）、またはＭｉｌｌｉｇｅｎ（Bedford, MA）から市販されているようなオリゴ合成装置で行うことができる。またはオリゴヌクレオチドは、特別注文することができるし、例えばｔｈｅ  Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Midland, TX）、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ，  Ｉｎｃ．（Chicago, IL）、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．（Huntsville, AL）、およびその他多数を含めた、当技術分野において周知の多様な販売元に注文することができる。
【０１９１】
必要または所望ならば、本発明のオリゴヌクレオチドの精製は、当技術分野において周知の多様な方法のうち任意のものにより実施することができる。オリゴヌクレオチドの精製は、典型的にはネイティブなアクリルアミドゲル電気泳動、例えばＪ．Ｄ．  ＰｅａｒｓｏｎおよびＦ．Ｅ．  Ｒｅｇｎｉｅｒ（J. Chrom., 1983, 255: 137-149）により記載されているような陰イオン交換ＨＰＬＣ、または逆相ＨＰＬＣ（G.D. McFarland and P.N. Borer, Nucleic Acids Res., 1979, 7: 1067-1080）のいずれかにより行われる。
【０１９２】
オリゴヌクレオチドの配列は、化学分解（A.M. Maxam and W. Gilbert, Methods of Enzymology, 1980, 65: 499-560）、マトリックス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析（U. Pieles et al., Nucleic Acids Res., 1993, 21: 3191-3196）、アルカリホスファターゼ消化およびエキソヌクレアーゼ消化の組み合わせ後の質量分析（H. Wu and H. Aboleneen, Anal. Biochem., 2001, 290: 347-352）などを非限定的に含む任意の適切な配列決定法を使用して検証することができる。
【０１９３】
上にすでに言及したように、改変オリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知のいくつかの手段のうち任意のものを使用して調製することができる。当該改変の非限定的な例には、メチル化、「キャップ」、一つまたは複数の天然ヌクレオチドからアナログへの置換、および例えば非荷電結合（例えばホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメートなど）または荷電結合（例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を有する改変などのヌクレオチド間改変が含まれる。オリゴヌクレオチドは、例えばタンパク質（例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシンなど）、インターカレーター（例えばアクリジン、ソラレンなど）、キレート剤（例えば金属、放射性金属、鉄、酸化的金属（oxydative metal）など）、およびアルキル化剤などの共有結合した一つまたは複数の追加の部分を有することがある。オリゴヌクレオチドは、メチルホスホトリエステルまたはエチルホスホトリエステルまたはアルキルホスホルアミデート結合の形成により誘導体化されることもある。さらに、本発明のオリゴヌクレオチド配列は、ラベルで改変されることもある。
【０１９４】
オリゴヌクレオチド配列のラベル
ある態様では、検出プローブもしくは増幅プライマー、またはプローブおよびプライマーの両方は、増幅／検出アッセイに使用される前に検出可能な薬剤または部分でラベルされる。ある態様では、検出プローブは検出可能な薬剤でラベルされる。検出可能な薬剤の役割は、増幅されたターゲット配列を視覚化および検出させることである。好ましくは検出可能な薬剤は、測定することができ、強度が分析される試料中の増幅産物の量に関係（例えば比例）するシグナルを生成するように選択される。
【０１９５】
オリゴヌクレオチドおよび検出可能な薬剤の間の結合は、共有的または非共有でありうる。ラベルされた検出プローブは、検出可能な部分の組み込みまたはコンジュゲーションにより調製することができる。ラベルは核酸配列に直接結合していることもあるし、間接的に（例えばリンカーを介して）結合していることもある。様々な長さのリンカーまたはスペーサーアームは、当技術分野において公知であり、市販されており、立体障害を減少させるために、または結果として生じるラベルされた分子に他の有用な性質もしくは所望の性質を付与するために選択することができる（例えばE. S. Mansfield et al., Mol. Cell Probes, 1995, 9: 145-156参照）。
【０１９６】
核酸分子をラベルするための方法は、当技術分野において周知である。当技術分野におけるラベルプロトコール、ラベル検出技法および近年の開発の総説については、例えばL.J. Kricka, Ann. Clin. Biochem. 2002, 39: 114-129; R.P. van Gijlswijk et al., Expert Rev. Mol. Diagn. 2001, 1: 81-91;およびS. Joos et al., J. Biotechnol. 1994, 35: 135-153を参照されたい。標準的な核酸ラベル法には：放射性薬剤の組み込み、蛍光色素（L.M. Smith et al., Nucl. Acids Res., 1985, 13: 2399-2412）または酵素（B.A. Connoly and O. Rider, Nucl. Acids. Res., 1985, 13: 4485-4502）の直接結合；核酸分子を免疫化学的または他の親和性反応により検出可能にする核酸分子の化学的改変（T.R. Broker et al., Nucl. Acids Res. 1978, 5: 363-384; E.A. Bayer et al., Methods of Biochem. Analysis, 1980, 26: 1-45; R. Langer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, 78: 6633-6637; R.W. Richardson et al., Nucl. Acids Res. 1983, 11: 6167-6184; D.J. Brigati et al., Virol. 1983, 126: 32-50; P. Tchen et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1984, 81: 3466-3470; J.E. Landegent et al., Exp. Cell Res. 1984, 15: 61-72;およびA.H. Hopman et al., Exp. Cell Res. 1987, 169: 357-368)；ならびにランダムプライミング、ニックトランスレーション、ＰＣＲ、および末端トランスフェラーゼを用いたテーリングなどの酵素媒介性ラベル法が含まれる（酵素ラベルに関する総説については、例えばJ. Temsamani and S. Agrawal, Mol. Biotechnol. 1996, 5: 223-232を参照されたい）。最近になって開発された核酸ラベルシステムには：単反応性シスプラチン誘導体とＤＮＡのグアニン部分のＮ７位との反応に基づくＵＬＳ（Universal Linkage System）（R.J. Heetebrij et al., Cytogenet. Cell. Genet. 1999, 87: 47-52）、核酸にインターカレーションし、ＵＶ照射するとヌクレオチド塩基に共有結合するようになるソラレン−ビオチン（C. Levenson et al., Methods Enzymol. 1990, 184: 577-583;およびC. Pfannschmidt et al., Nucleic Acids Res. 1996, 24: 1702-1709）、光反応性アジド誘導体（C. Neves et al., Bioconjugate Chem. 2000, 11: 51-55）、およびＤＮＡアルキル化剤（M.G. Sebestyen et al., Nat. Biotechnol. 1998, 16: 568-576）が含まれるが、それに限定されるわけではない。
【０１９７】
多種多様な検出可能な薬剤のうち任意のものを本発明の実施に使用することができる。適切な検出可能な薬剤には、多様なリガンド、放射性核種（例えば３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ、１３１Ｉなど）；蛍光色素（特定の例の蛍光色素については下記参照）；化学ルミネセンス剤（例えばアクリジニウムエステル、安定化ジオキセタンなど）；スペクトル分解可能な無機蛍光半導体ナノ結晶（すなわち量子ドット）、金属ナノパーティクル（例えば金、銀、銅、およびプラチナ）、またはナノクラスター；酵素（例えばＥＬＩＳＡに使用される酵素、すなわちホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼなど）；呈色ラベル（例えば色素、コロイド状金など）；磁気ラベル（例えばＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）など)；ならびにビオチン、ジオキシゲニン、または抗血清もしくはモノクローナル抗体を得ることができる他のハプテンおよびタンパク質が含まれるが、それに限定されるわけではない。
【０１９８】
ある好ましい実施形態では、本発明の検出プローブは蛍光ラベルされる。多種多様な化学構造および物理的性質の多数の公知の蛍光ラベル部分が、本発明の実施における使用に適する。適切な蛍光色素には、フルオレセインおよびフルオレセイン色素（例えばフルオレセインイソチオシアニンすなわちＦＩＴＣ、ナフトフルオレセイン、４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシ−フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、またはＦＡＭ）、カルボシアニン、メロシアニン、スチリル色素、オキソノール色素、フィコエリトリン、エリトロシン、エオシン、ローダミン色素（例えばカルボキシテトラメチルローダミンすなわちＴＡＭＲＡ、カルボキシローダミン６Ｇ、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、リッサミンローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、テトラメチルローダミンすなわちＴＭＲ）、クマリンおよびクマリン色素（例えばメトキシ−クマリン、ジアルキルアミノクマリン、ヒドロキシクマリンおよびアミノメチルクマリンすなわちＡＭＣＡ）、オレゴングリーン色素（例えばオレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４）、テキサスレッド、テキサスレッド−Ｘ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｒｅｄ（商標）、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｇｒｅｅｎ（商標）、シアニン色素（例えばCy-3（商標）。Cy-5（商標）、Cy-3.5（商標）、Cy-5.5（商標）)、アレクサフルオル色素（例えばアレクサフルオル３５０、アレクサフルオル４８８、アレクサフルオル５３２、アレクサフルオル５４６、アレクサフルオル５６８、アレクサフルオル５９４、アレクサフルオル６３３、アレクサフルオル６６０、およびアレクサフルオル６８０）、ＢＯＤＩＰＹ色素（例えばＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ６５０／６６５）、ＩＲＤｙｅ（例えばＩＲＤ４０、ＩＲＤ７００、ＩＲＤ８００）などが含まれるが、それに限定されるわけではない。適切な蛍光色素、および核酸分子に蛍光色素を連結または組み込むための方法のさらなる例については、例えば"The Handbook of Fluorescent Probes and Research Products", 9th Ed., Molecular Probes, Inc., Eugene, ORを参照されたい。蛍光色素およびラベルキットは、例えばＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．（Piscataway, NJ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．（Eugene, OR）およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．（Berverly, MA）から市販されている。
【０１９９】
一部の蛍光基（ドナー）は、それ自体直接検出可能であるよりもむしろ、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の過程でエネルギーを別の蛍光基（アクセプター）に移動させ、この第２の基が検出される蛍光シグナルを生成する。これらの態様では、オリゴヌクレオチド検出プローブは、例えば増幅されたターゲット配列にハイブリダイゼーションしたときに検出可能になりうる。本発明における使用に適したＦＲＥＴのアクセプター／ドナー対の例には、フルオレセイン／テトラメチルローダミン、ＩＡＥＤＡＮＳ／ＦＩＴＣ、ＩＡＥＤＡＮＳ／５−（ヨードアセトミド）フルオレセイン（5-(iodoacetomido)fluorescein）、ＥＤＡＮＳ／ダブシル、およびＢ−フィコエリトリン／Ｃｙ−５が含まれるが、それに限定されるわけではない。
【０２００】
物理的に連結した蛍光レポーター／クエンチャー分子対の使用もまた本発明の範囲内に含まれる。（例えばU.S. Pat. Nos. 5,210,015; 5,804,375; 5487,792、および6214,979に記載されている）ＴａｑＭａｎ（商標）アッセイにおける、または（例えばS. Tyagi and F.R. Kramer, Nature Biotechnol. 1996, 14: 303-308; S. Tyagi et al., Nature Biotechnol. 1998, 16: 49-53; L.G. Kostrikis et al., Science, 1998, 279: 1228-1229; D.L. Sokol et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95: 11538-11543; S.A. Marras et al., Genet. Anal. 1999, 14: 151-156; ならびにU.S. Pat. Nos. 5,846,726、5,925,517、6,277,581、および6,235,504に記載されている）分子ビーコンとしてのそのようなシステムの使用は、当技術分野において周知である。ＴａｑＭａｎ（商標）アッセイ形式を用いた増幅反応の産物は、その産物が形成したときに、すなわちいわゆる「リアルタイム」方式で検出することができる。結果として、反応混合物が増幅条件にある間に、増幅産物／プローブハイブリッドが形成および検出される。
【０２０１】
本発明のある好ましい態様では、ＰＣＲ検出プローブは、５’末端を蛍光部分で、そして３’末端をクエンチャー部分でラベルされたＴａｑＭａｎ（商標）様プローブである。ＴａｑＭａｎ（商標）様プローブを用いた使用に適したフルオロフォアおよびクエンチャーは、例えばU.S. Pat. Nos. 5,210,015、5,804,375、5,487,792、および6,214,979、ならびにWO 01/86001に開示されている。クエンチャーの例には、ダブシル（すなわち、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）−安息香酸）スクシンイミジルエステル、ジアリールローダミンカルボン酸スクシンイミジルエステル（すなわちＱＳＹ−７）、および４’，５’−ジニトロフルオレセインカルボン酸スクシンイミジルエステル（すなわちＱＳＹ−３３）（全て例えばMolecular Probesから入手できる）、クエンチャー１（Ｑ１；Epoch Biosciences, Bothell, WAから入手できる)、または「Ｂｌａｃｋ  ｈｏｌｅ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ」ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２およびＢＨＱ−３（BioSearch Technologies, Inc., Novato, CAから入手できる）が含まれるが、それに限定されるわけではない。本発明のある態様では、ＰＣＲ検出プローブは、５’末端をＦＡＭで、そして３’末端をＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  ＱｕｅｎｃｈｅｒでラベルされたＴａｑＭａｎ（商標）様プローブである。
【０２０２】
正常ヌクレオチドまたは改変ヌクレオチドの「テール」もまた、検出可能目的のためにオリゴヌクレオチドプローブに付加してもよい。テールに相補的で、一つまたは複数の検出可能なラベル（例えば放射性ラベルされたフルオロフォア、酵素または塩基）を有する核酸との第２のハイブリダイゼーションは、アンプリコン／プローブハイブリッドを視覚化させる（例えばEnzo Biochem. Inc., New York: NYから市販されているシステム参照）。本発明のオリゴヌクレオチドが有用であるアッセイの別の例は、U.S. Pat. Nos. 5,124,246（その全体が参照により本明細書に組み入れられる）に記載されているようなシグナル増幅法である。この方法では、シグナルは、オリゴヌクレオチドプローブに付加された「テール」に特異的にハイブリダイゼーションする第１セグメントと、ラベルされたプローブに特異的にハイブリダイゼーションする複数の同一の第２セグメントとを有するように構築された増幅マルチマーであるポリヌクレオチドの使用によって増幅される。増幅度は、理論的に第２セグメントの反復数に比例する。マルチマーは直鎖または分岐のどちらであってもよい。分岐マルチマーはフォークまたは櫛の形状であってもよい。
【０２０３】
特定の核酸ラベル技法の選択は、状況に依存するものであり、ラベル法の容易さおよびコスト、所望の試料ラベルの質、ハイブリダイゼーション反応（例えばハイブリダイゼーション過程の速度および／または効率）に及ぼす検出可能な部分の効果、使用する増幅法の性質、検出システムの性質、検出可能なラベルにより発生するシグナルの性質および強度などのいくつかの因子に支配されるものである。
【０２０４】
本発明のプライマーを使用したＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓターゲット配列の増幅
被験試料中のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓターゲット配列を増幅するための本発明のオリゴヌクレオチド配列の使用は、任意の特定の核酸増幅技法またはその任意の特定の改変に限定されない。実際に、本発明のオリゴヌクレオチド配列は、当技術分野において周知の多様な核酸増幅法のうち任意のものに採用することができる（例えばA.R. Kimmel and S.L. Berger, Methods Enzymol. 1987, 152: 307-316; J. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 1989, 2nd Ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press: New York, NY; "Short Protocols in Molecular Biology", F.M. Ausubel (Ed.), 2002, 5th Ed., John Wiley & Sons: Secaucus, NJ)。
【０２０５】
そのような周知の核酸増幅法には、ポリメラーゼ連鎖反応（すなわちＰＣＲ、ＰＣＲは例えば"PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications" , M.A. Innis (Ed.), 1990, Academic Press: New York; "PCR Strategies", M.A. Innis (Ed.), 1995, Academic Press: New York; "Polymerase chain reaction: basic principles and automation in PCR: A Practical Approach", McPherson et al. (Eds.), 1991, IRL Press: Oxford; Saiki et al., Nature, 1986, 324: 163;ならびにU.S. Pat. Nos. 4,683,195、4,683,202、および4,889,818に記載されており、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）；ならびにＴａｑＭａｎ（商標）に基づくアッセイ（Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1991, 88: 7276-7280）および逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（すなわちＲＴ−ＰＣＲ、例えばU.S. Pat. Nos. 5,322,770および5,310,652に記載されている）を含むその変形が含まれるが、それに限定されるわけではない。
【０２０６】
ＰＣＲでは、過剰のプライマー対を採用し、ターゲット核酸の相補鎖にハイブリダイゼーションさせる。プライマーは、テンプレートとしてターゲット配列を使用してＤＮＡポリメラーゼによりそれぞれ伸長される。伸長産物は、本来のターゲット鎖から解離（変性）後に、それ自体ターゲットになる。次に、新しいプライマーをハイブリダイゼーションさせ、ポリメラーゼにより伸長し、このサイクルを繰り返して、ターゲット配列分子のコピー数を指数的に増加させる。ＰＣＲ反応においてプライマー伸長産物を産生することができるＤＮＡポリメラーゼの例には：Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、多様な販売元（例えばPerkin Elmer）から入手することができる、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓから、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから（United States Biochemicals）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅｒｅｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから（Bio-Rad）、またはＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓから（「Ｖｅｎｔ」ポリメラーゼ、New England Biolabs)単離された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ）が含まれるが、それに限定されるわけではない。ＲＮＡターゲット配列は、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、次に上記のようにＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を行うことにより増幅することができる。または、U.S. Pat. Nos. 5,322,770に記載されているように両工程について単一の酵素を使用することができる。
【０２０７】
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーを使用してＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓターゲット配列を増幅するために、上記の酵素的熱増幅以外に周知の等温酵素的増幅反応を採用することができる（S.C. Andras et al., Mol. Biotechnol., 2001, 19: 29-44）。これらの方法には、転写媒介性増幅（すなわちＴＭＡ、例えばD.Y. Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86: 1173-1177; C. Giachetti et al., J. Clin. Microbiol., 2002, 40: 2408-2419;およびU.S. Pat. Nos. 5,399,491に記載されている）；自動継続配列複製（すなわち３ＳＲ、例えばJ.C. Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87: 1874-1848；およびE. Fahy et al., PCR Methods and Applications, 1991, 1: 25-33に記載されている）；核酸配列に基づく増幅法（すなわちＮＡＳＢＡ、例えばT. Kievits et al., J. Virol, Methods, 1991, 35: 273-286；およびU.S. Pat. Nos. 5,130,238に記載されている）；および鎖置換増幅（すなわちＳＤＡ、例えばG.T. Walker et al., PNAS, 1992, 89: 392-396；EP0500224 A2に記載されている）が含まれるが、それに限定されるわけではない。この節に引用された参照のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２０８】
鎖置換増幅（ＳＤＡ）は制限エンドヌクレアーゼがそのターゲットＤＮＡの未改変鎖にニックを入れる能力と、エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼがそのニックで３’末端を伸長する作用とを組み合わせ、一定温度で下流のＤＮＡ鎖を置換する（G.T. Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89: 392-396）。ＳＤＡに使用されるプライマーは、ターゲット結合配列に対して５’側に制限エンドヌクレアーゼ認識部を含み（U.S. Pat. Nos. 5,270,184および5,344,166）、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２０９】
核酸配列に基づく増幅法（ＮＡＳＢＡ）は、低い等温度、一般には４１℃で協調して作用する三つの酵素、例えばＲＮａｓｅ  Ｈ、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用する（J. Compton, Nature, 1991, 350: 91-92; A.B. Chan and J.D. Fox, Rev. Med. Microbiol., 1999, 10: 185-196）。ＮＡＳＢＡ反応の産物は主に一本鎖ＲＮＡである。自動継続配列複製（３ＳＲ）反応は、ターゲットＤＮＡまたはＲＮＡ配列の等温増幅に非常に効率的な方法である。３ＳＲシステムは、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅ  Ｈ、およびＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（例えばＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ）の総合活性を必要とする。転写媒介性増幅（ＴＭＡ）は、プライマー領域に設計されたプロモーターからＲＮＡを作製するためにＲＮＡポリメラーゼを、ＲＮＡテンプレートから相補的ＤＮＡを産生するために逆転写酵素を、およびｃＤＮＡからＲＮＡを除去するためにＲＮａｓｅ  Ｈを使用する（J.C. Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87: 1874-1878）。
【０２１０】
ＮＡＳＢＡプライマー、３ＳＲプライマー、およびＴＭＡプライマーは、そのプライマーのターゲット結合配列に連結したＲＮＡポリメラーゼプロモーターを必要とする。プライマーに組み込むためのプロモーターまたはプロモーター配列は、ＲＮＡポリメラーゼによって特異的に認識される（天然、合成産生、または制限消化の産物のいずれかの）核酸配列であり、そのＲＮＡポリメラーゼは核酸配列を認識してそれに結合し、転写過程を開始させ、その転写過程によりＲＮＡ転写物が産生する。有用なプロモーターの例には、バクテリオファージＴ３、Ｔ７もしくはＳＰ６由来ポリメラーゼなどのある種のバクテリオファージポリメラーゼにより認識されるプロモーター、またはＥ．ｃｏｌｉ由来プロモーターが含まれる。
【０２１１】
増幅されたＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓターゲット配列の検出
本発明のある態様では、増幅反応により産生された増幅産物（すなわち増幅されたＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓターゲット配列）を検出するためにオリゴヌクレオチドプローブ配列を使用する。本発明のプローブ配列は、多様な周知の相同または非相同法を使用して採用することができる。
【０２１２】
相同検出法には、ターゲット配列の存在下でシグナルを発生するプローブである分子ビーコンに結合したＦＲＥＴラベル（S. Tyagi and F.R. Kramer, Nature Biotechnol. 1996, 14: 303-308; S. Tyagi et al., Nature Biotechnol. 1998, 16: 49-53; L.G. Kostrikis et al., Science, 1998, 279: 1228-1229; D.L. Sokol et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95: 11538-11543; S.A. Marras et al., Genet. Anal. 1999, 14: 151-156;ならびにU.S. Pat. Nos. 5,846,726、5,925,517、6,277,581、および6,235,504）、およびいわゆるＴａｑＭａｎ（商標）アッセイ（U.S. Pat. Nos. 5,210,015、5,804,375、5,487,792、および6,214,979、ならびにWO 01/86001）の使用が含まれるが、それに限定されるわけではない。これらの検出技法を使用して、増幅反応の産物は、その産物が形成したときに、すなわちいわゆるリアルタイムで検出することができる。結果として、増幅産物／プローブハイブリッドは、反応混合物が増幅条件にある間に形成および検出される。
【０２１３】
ある好ましい態様では、本発明の検出プローブはＴａｑＭａｎ（商標）アッセイに使用される。蛍光発生５’ヌクレアーゼアッセイとも知られているＴａｑＭａｎ（商標）アッセイは、核酸ターゲットのための強力で多用途の、ＰＣＲに基づく検出システムである。分析は、蛍光シグナルの発生をモニタリングすることによって、熱サイクルと共に行われる。このアッセイシステムは、ターゲットコピー数を決定させる定量的データを発生する能力を有する。例えば、標準曲線は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの予め定量された懸濁液を系列希釈したものを使用して結ぶことができ、その標準曲線に未知試料を対比させることができる。ＴａｑＭａｎ（商標）アッセイは、例えば上記の蛍光レポーター色素およびクエンチャー部分でラベルされたオリゴヌクレオチドプローブを消化する内因性５’ヌクレアーゼ活性を有するＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（商標）ＤＮＡポリメラーゼを使用して好都合に行われる。蛍光部分およびクエンチャー部分の結合を離しながら、かつターゲット配列の増幅に比例する蛍光シグナルの増加を起こしながらプローブが消化される増幅サイクルの間に起こる蛍光変化を測定することによって、アッセイの結果が得られる。
【０２１４】
相同検出法の他の例には、ハイブリダイゼーションプロテクションアッセイ（ＨＰＡ）がある。当該アッセイでは、プローブは、ヌクレオチドに基づかないリンカーアーム化学反応を使用して、高度化学ルミネセンス分子であるアクリジニウムエステル（ＡＥ）（Weeks et al., Clin. Chem., 1983, 29: 1474-1479; Berry et al., Clin. Chem., 1988, 34: 2087-2090）でラベルされる（U.S. Pat. Nos. 5,585,481および5,185,439）。化学ルミネセンスは、アルカリ性過酸化水素を用いたＡＥ加水分解により誘発される。この加水分解は励起Ｎ−メチルアクリドンを生じ、これはその後、光子の放射と共に不活性化する。ターゲット配列の不在下では、ＡＥの加水分解は急速である。しかし、ＡＥの加水分解速度はプローブがターゲット配列に結合している場合には大きく減少する。したがって、ハイブリダイゼーションした、およびハイブリダイゼーションしていないＡＥラベルプローブは、物理的分離の必要なしに溶液から直接検出することができる。
【０２１５】
異種検出システムは、当技術分野において周知であり、一般に増幅された配列を反応混合物中の他の物質から分離するために捕捉剤を採用する。捕捉剤は、典型的には一つまたは複数の特異的結合配列で被覆された固体支持体物質（例えばマイクロタイターウェル、ビーズ、チップなど）を含む。結合配列は、本発明のオリゴヌクレオチドプローブに付加されたテール配列と相補的であってもよい。または、結合配列は、本発明のオリゴヌクレオチドプローブのテール配列に相補的な配列をそれ自体含む、捕捉オリゴヌクレオチドの配列に相補的であってもよい。残りの反応混合物から、捕捉剤に結合した増幅産物／プローブハイブリッドを分離した後で、増幅産物／プローブハイブリッドは、上記の任意の検出法を使用して検出することができる。
【０２１６】
ＩＩ  −  被験試料中のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの検出法
別の局面では、本発明は、被験試料中のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの存在を検出するための方法を提供する。本発明の方法は、例えばクラミジア感染もしくはその続発症の症状を示すこともあるし、示さないこともある被験患者に、および／またはリスクのある集団をスクリーニングするために使用することができる。
【０２１７】
典型的には、本発明の方法は：Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸（例えばＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの潜在プラスミド内の配列を含む核酸）を有すると疑われる被験試料を提供する工程；本明細書に開示された少なくとも一つのオリゴヌクレオチドとその被験試料を接触させることによって、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸が被験試料中に存在する場合にはそのオリゴヌクレオチドがＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸にハイブリダイゼーションすることができるようにする工程；およびＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸にハイブリダイゼーションした任意のオリゴヌクレオチドを検出する工程を含み、ここで、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸にハイブリダイゼーションしたオリゴヌクレオチドの検出は、被験試料中のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの存在を示す。
【０２１８】
ある態様では、オリゴヌクレオチドは、本発明のプライマーセットのオリゴヌクレオチド増幅プライマーである。他の態様では、オリゴヌクレオチドは、本発明のプライマー／プローブセットのオリゴヌクレオチド増幅プライマーまたはオリゴヌクレオチド検出プローブである。
【０２１９】
ある態様では、検出する工程は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸の全てまたは部分を増幅してＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓアンプリコンを得る工程、および任意のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓアンプリコンを検出する工程を含む。
【０２２０】
試料の調製
本発明の方法によると、被験試料中のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの存在は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの潜在プラスミド内の配列を含む任意のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸を検出することにより決定することができる。したがって、そのようなＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓターゲット配列を含むと疑われる任意の液体または固体生物学的材料は、適切な被験試料でありうる。好ましい被験試料には、尿（例えば初尿）、精液、唾液、眼球水晶体液、リンパ液、子宮頸管試料、尿道試料、直腸試料、膣試料、外陰−膣試料、鼻咽頭試料がある。
【０２２１】
被験試料は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓに感染していると疑われる患者から得るか、または単離することができる。すでに言及したように、被験試料は単離後にさらに処理／加工せずに使用してもよいし、または分析前に加工してもよい。例えば、被験試料は、その試料が含有するおそれのある任意のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ細胞から核酸を放出させるように処理することができる。核酸抽出方法は当技術分野において周知であり、それには、化学法、温度法、および機械的方法が含まれる（例えばJ. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 1989, 2nd Ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press: New York, NYを参照されたい）。生物学的試料から核酸を抽出するために使用することができる多数の異なる多用途のキットもまたあり、それらのキットは、例えばＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Piscataway, NJ）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Palo Alto, CA）、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Madison, WI）、Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．（Minneapolis, MN）、ＭｉｃｒｏＰｒｏｂｅ  Ｃｏｒｐ．（Bothell, WA）、Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ（Durham, NC）、およびＱｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．（Valencia, CA）から市販されている。守るべきプロトコールを非常に詳細に説明しているユーザガイドが、通常これらのキットに含まれる。感度、加工時間、およびコストはキット相互に異なりうる。当業者は、特定の状況に最も適するキットを容易に選択することができる。
【０２２２】
抽出前に、例えば濾過または遠心分離により、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ細胞を精製し、濃縮し、さもなければ本来の生物学的試料の他の構成要素から分離することができる。
【０２２３】
試料の分析
当業者に認識されているであろうが、本発明の方法によるＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓターゲット配列の増幅および増幅されたＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸の検出は、本明細書に記載されている任意の増幅／検出方法を使用して行うことができる。ある好ましい態様では、被験試料中のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの検出は、ＴａｑＭａｎ（商標）アッセイを使用して行われ、増幅産物の形成は蛍光によりリアルタイムでモニタリングされる。これらの態様では、上記のように５’末端を蛍光レポーターで、３’末端をクエンチャー部分でラベルされたプローブが使用される。増幅条件の最適化およびＴａｑＭａｎ（商標）アッセイ形式に適した増幅反応試薬の選択は、当技術分野における技術の範囲内である。
【０２２４】
ある態様では、内部対照または内部標準は、抽出および／またはターゲットの増幅のための対照として役立つために生物学的試料（またはその生物学的試料から抽出された精製核酸）に添加される。好ましくは、内部対照には、ターゲット配列と異なる配列を含み、ターゲットであるＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸を増幅させるために使用されるプライマーにより増幅することができる。内部対照の使用は、抽出過程、増幅反応、および検出のモニタリング、ならびにアッセイ性能の制御を可能にする。増幅された対照および増幅されたターゲットは、典型的には対照およびターゲットの抽出のために（例えば異なる検出可能な薬剤でラベルされた）異なるプローブを使用することにより、検出工程で識別される。
【０２２５】
被験試料中のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの存在は、同一の生物学的被験試料の異なる分割量を使用して、または異なる被験試料（例えば分析された第１試料が尿試料であるならば子宮頸管内部スワブ、または異なる時間に収集された尿試料）を使用して、本発明によるアッセイを繰り返すことにより確認することができる。またはもしくは追加的に、被験試料中のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの存在は、異なるアッセイを行うことにより確認することができる（すなわち異なる方法に基づくアッセイ）。例えば、最初の分析がＴａｑＭａｎ（商標）アッセイを使用して行われたならば、２番目の分析は転写媒介性増幅（ＴＭＡ）反応を使用して実施してもよい。
【０２２６】
または、被験試料中のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの存在は、非発明的アッセイにより確認することができる。
【０２２７】
ＩＩＩ  −  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓおよび他の生物の同時検出
すでに言及したように、本発明のプライマー／プローブセットは、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓに特異的である。本出願人は、図４に挙げた７４株の密接に関係した生物を用いた多重アッセイ形式でプライマー／プローブセットＣＴ５を厳密に調べたが、相互相関を見出さなかった（実施例１参照）。
【０２２８】
したがって、本発明は、少なくとも二つのプライマー／プローブセットの組み合わせを使用して、被験試料中のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓおよび別の生物の存在を同時に検出するための方法もまた提供する（すなわち一つは本明細書に開示されるＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ特異的プライマー／プローブセットから選択され、もう一つは、試験されるもう一方の生物に特異的なプライマー／プローブセットから選択される）。
【０２２９】
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓと同時に検出することができる他の生物には、図４に挙げられる任意の生物が含まれるが、それに限定されるわけではない。ある態様では、もう一つの生物はＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａである。
【０２３０】
特に本発明は、被験試料中のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓおよび／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａの検出のための方法を提供し、その方法は：Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸および／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａ核酸を有すると疑われる被験試料を提供する工程；プライマー／プローブセットＣＴ（ｍｐｘ）と被験試料を接触させることによって、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸が被験試料中に存在する場合にはプライマー／プローブセットＣＴ（ｍｐｘ）の少なくとも一つのプライマーまたはプローブがＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸にハイブリダイゼーションすることができるようにする工程；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａに特異的な少なくとも一つのプライマー／プローブセットと被験試料を接触させることによって、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａ核酸が被験試料中に存在する場合にはＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａに特異的なプライマー／プローブセットの少なくとも一つのプライマーまたはプローブがＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａ核酸にハイブリダイゼーションできるようにする工程；Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸にハイブリダイゼーションしたプライマー／プローブセットＣＴ（ｍｐｘ）の任意のプライマーまたはプローブを検出する工程であって、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸にハイブリダイゼーションしたプライマーまたはプローブの検出が、被験試料中のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの存在を示す工程；ならびにＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａ核酸にハイブリダイゼーションしたＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａに特異的なプライマー／プローブセットの任意のプライマーまたはプローブを検出する工程であって、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａ核酸にハイブリダイゼーションしたプライマーまたはプローブの検出が、被験試料中のＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａの存在を示す工程を含む。ある態様では、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａに特異的なプライマー／プローブセットは、２００６年４月７日に提出された、「Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ特異的オリゴヌクレオチド配列」という標題の仮出願第６０／７９０，１９７号に記載されているプライマー／プローブセットから選択される。
【０２３１】
ＩＶ  −  キット
別の局面では、本発明は、本明細書に記載される方法によるクラミジアの検出に有用な材料を含むキットを提供する。本発明のキットは、診断検査室、実験研究室、または専門家により使用されうる。
【０２３２】
本発明によるＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの検出に必要な基本的な材料および試薬は、キットに一緒に集めることができる。ある態様では、キットは、本発明の少なくとも一つのプライマーセットまたはプライマー／プローブセットと、所望により増幅反応試薬とを備える。各キットは、好ましくは手順を特異的にする試薬を備える。したがって、ＮＡＳＢＡで使用するために適合されたキットは、好ましくはターゲット結合配列に連結したＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有するプライマーを包含するが、ＳＤＡで使用するために適合されたキットは、好ましくはターゲット結合配列に対して５’側に制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むプライマーを包含する。同様に、キットがＴａｑＭａｎ（商標）アッセイなどの５’ヌクレアーゼアッセイでの使用に適合される場合、検出プローブは、好ましくは少なくとも一つの蛍光レポーター部分および少なくとも一つのクエンチャー部分を有する。
【０２３３】
適切な増幅反応試薬には、例えば：緩衝液、試薬、逆転写酵素および／もしくはポリメラーゼ活性またはエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素；マグネシウムまたはマンガンなどの酵素補因子；塩；ニコチンアミドアデニドジヌクレアーゼ（nicotinamide adenide dinuclease）（ＮＡＤ）；ならびに増幅反応の実施に適したデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、例えばデオキシアデノシン三リン酸、デオキシグアノシン三リン酸、デオキシシチジン三リン酸、およびチミジン三リン酸などのうち一つまたは複数が含まれる。例えば、ＮＡＳＢＡで使用するために適合されたキットは、適切な量の逆転写酵素、ＲＮａｓｅ  Ｈ、およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを有することがある。ＮＡＳＢＡなどの転写増幅反応に適合されたキットには、例えば増幅反応を高めることが知られているＤＭＳＯを含有する緩衝液が含まれることがある。
【０２３４】
キットは、手順に応じてさらに：洗浄緩衝液および／または試薬、ハイブリダイゼーション緩衝液および／または試薬、ラベル緩衝液および／または試薬、ならびに検出手段のうち一つまたは複数を備えることがある。キットに含まれる緩衝液および／または試薬は、好ましくはそのキットが意図された特定の増幅／検出技法のために最適化される。これらの緩衝液を使用するためのプロトコールおよびその手順の種々の工程を行うための試薬もまたキットに含まれることがある。
【０２３５】
さらに、キットには、増幅手順のチェックとしての、および増幅手順の失敗が原因の偽陰性検査結果の発生を防止するための内部対照が提供されることがある。最適の対照配列は、（上記のように）増幅反応においてターゲット核酸配列と競合しないように選択される。
【０２３６】
キットは、増幅前に生物学的標本から核酸を単離するための、および／または核酸抽出前にＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ細胞を精製もしくは分離するための試薬もまた包含することがある。
【０２３７】
試薬は、固体（例えば凍結乾燥）形態または液体形態で供給することができる。本発明のキットは、所望により各個別の緩衝液および／または試薬のための異なる容器（例えばバイアル、アンプル、試験管、フラスコまたはボトル）を備える。各構成要素は、一般にそのそれぞれの容器に分割されることに適するか、または濃縮された形態で提供されるものである。増幅／検出アッセイのある工程を行うために適する他の容器もまた提供されることがある。キットの個別の容器は、好ましくは市販用に密閉されて維持される。
【０２３８】
キットは、増幅反応試薬および本発明によるプライマーセットまたはプライマー／プローブセットを使用するための説明書もまた備えることがある。本発明の一つまたは複数の方法によりキットを使用するための説明書は、生物学的試料を加工し、核酸分子を抽出し、かつ／または検査するための説明書；結果を解釈するための説明書；および医薬品または生物学的製品の製造、使用、または販売を規制している政府機関（例えばＦＤＡ）により指示された形式の通知を含むことがある。
【０２３９】
実施例
以下の実施例は、本発明を作製および実施する好ましい様式のいくつかを記載する。しかし、この実施例は、単に例示目的であり、本発明の範囲を限定することを意図しないことを了解すべきである。さらに、この実施例の記載は過去形で提示されているが、明細書の残りと同様に、その文は、実験が実際に行われたことも、データが実際に得られたことも示唆することを意図しない。
【０２４０】
実施例１：Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ／Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａ多重アッセイの特異性
１５個の異なるＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（ＣＴ）血清型亜型（すなわちＡ、Ｂ、Ｂａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌｌ、Ｌ２およびＬ３）および４６個の異なるＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａ（ＧＣ）単離物を検査するために、多重ＴａｑＭａｎ  ｋＰＣＲアッセイを使用した。
【０２４１】
ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＭｘ３０００Ｐ（商標）  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Stratagene Inc., San Diego, CA）を使用して、単一の密閉反応ウェル中の増幅および／または検出を行った。これらの実験で使用したアッセイマスターミックスは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA）またはＱＩＡＧＥＮ（Hilden, Germany）からのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、参照色素（ＲＯＸ）、およびＭｇＣｌ２、ＡｍｐＥｒａｓｅ（商標）ＵＮＧ（１ユニット/μL）を含有し；ＴａｑＭａｎ（登録商標）オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは社内で合成するか、またはＢｉｏＳｅａｒｃｈ  Ｉｎｃから購入した。ｋＰＣＲ反応ミックスは、マスターミックス２５μLおよび精製ＤＮＡ２５μLを含んでいた。
【０２４２】
得られた結果を図３に報告する。これらの結果は、ＣＴ／ＧＣ多重アッセイが広範囲のＣＴ血清型亜型およびＧＣ単離物を検出できることを示している。
【０２４３】
ＣＴ／ＧＣ多重ＰＣＲマスターミックスに、７４個の密接に関係する生物（図４に挙げる）由来のゲノムＤＮＡの１０７コピーもまた曝露したが、交差反応性を示さなかった。
【０２４４】
他の態様
本発明の他の態様は、本明細書に開示された本発明の明細書または実施の考察から当業者に明らかであろう。明細書および実施例は単なる例示とみなされ、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲のより示されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０２４５】
【図１】Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ潜在プラスミドＬ１血清型亜型から誘導された本発明のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ特異的増幅プライマー配列および検出プローブ配列の例を示す図である。各オリゴヌクレオチドのマップ位置および配列番号を図に示す。
【図２】多重検出形式アッセイに使用することができるＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ特異的増幅プライマー配列および検出プローブの例を示す図である。
【図３】１５個の異なるＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（ＣＴ）血清型亜型および４６個の異なるＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａ（ＧＣ）単離株を検査するために使用した多重ＴａｑＭａｎ  ｋＰＣＲアッセイの結果を示す図である（アッセイ実験の詳細については実施例１を参照されたい）。
【図４】ＣＴ／ＧＣ多重ＰＣＲマスターミックスが交差反応性を示さなかった７４株の密接に関係する生物のリストを示す図である。
【図１】
2009514549.tif 000070
【図２】
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【図３】
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【図４】
2009514549.tif 000073
【配列表】
2009514549000001.app
【国際調査報告】
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