(57)【要約】  本発明は、遺伝子発現プロフィール、遺伝子発現プロフィールを示す核酸配列を含むマイクロアレイならびに新規診断キットおよび方法に関する。本発明はさらに、例えば、その遺伝子発現プロフィールにより特性評価された、Mage発現腫瘍を患う癌患者の特定の集団の治療に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者が免疫療法に対する応答者または非応答者である可能性が高いことを示す、患者由来サンプルからの遺伝子プロフィールであって、少なくとも1個の免疫活性化遺伝子の示差的調節を含む、前記プロフィール。
【請求項２】
免疫療法が癌免疫療法である、請求項１に記載の遺伝子プロフィール。
【請求項３】
癌免疫療法がMage抗原特異的癌免疫療法である、請求項２に記載の遺伝子プロフィール。
【請求項４】
少なくとも1個の免疫活性化遺伝子が、表1、2、3、4、7、9、11、12および／または13に列挙される遺伝子から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子プロフィール。
【請求項５】
少なくとも1個の免疫遺伝子が、5個以上の遺伝子である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の遺伝子プロフィール。
【請求項６】
少なくとも1個の遺伝子が、表1、2、3、4、7、9、11、12および／または13に列挙される遺伝子の少なくとも10％である(列挙される遺伝子の40、50、60または70％など)、請求項４に記載の遺伝子プロフィール。
【請求項７】
少なくとも1個の遺伝子が、少なくとも表1、2、3、4、7、9、11、12および／または13にある、請求項６に記載の遺伝子プロフィール。
【請求項８】
少なくとも1個の遺伝子が、表1、2、3、4、7、9、11、12および／または13に列挙される遺伝子の80、90または100％である、請求項７に記載の遺伝子プロフィール。
【請求項９】
少なくとも1個の遺伝子が上方調節される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の遺伝子プロフィール。
【請求項１０】
前記プロフィールが応答者を示すものである、請求項９に記載の遺伝子プロフィール。
【請求項１１】
免疫療法に対する応答者または非応答者の同定のための、請求項１〜１０のいずれか１項で定義されたプロフィールの使用。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のプロフィールを同定する方法であって、
a)1個以上の免疫応答遺伝子の示差的発現について患者由来サンプルを分析する工程、および
b)工程(a)の結果に基づいて、サンプルが由来した患者を、応答者または非応答者として特性評価する工程、
を含み、必要に応じて、該特性評価を参照または標準物との比較により実施する、前記方法。
【請求項１３】
標準物が公知の臨床結果を有するサンプルである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
比較を、アルゴリズムを用いて実施する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のプロフィールが、患者由来サンプル中に存在するかどうかを確立するための、免疫活性化遺伝子の少なくとも1個の産物の示差的発現の同定のためのプローブの使用。
【請求項１６】
示差的発現が上方調節である、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のプロフィールが、患者由来サンプル中に存在するかどうかを確立するための、免疫活性化遺伝子の少なくとも1個の産物の示差的発現の同定のためのマイクロアレイキットの使用。
【請求項１８】
示差的発現が上方調節である、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
1個以上の免疫活性化遺伝子の示差的発現の検出にとって好適な1個以上のプローブを含むマイクロアレイ。
【請求項２０】
免疫活性化遺伝子が、表1、2、3、4、7、9、11、12および／または13の遺伝子の一覧を含む群から選択される、請求項１９に記載のマイクロアレイ。
【請求項２１】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のプロフィールを同定するための患者由来サンプル上での分析であって、その結果を用いて、サンプルが由来した患者を、免疫療法に対する応答者または非応答者として指定することができる前記分析を実施するための少なくとも1つの成分を含む診断キット。
【請求項２２】
第1に、少なくとも1個の免疫活性化遺伝子の示差的活性化に基づいて、患者を免疫療法に対する応答者として特性評価した後、治療上有効量の好適な免疫療法を施すことを含む、患者を治療する方法。
【請求項２３】
前記療法が癌免疫療法である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記療法がMage癌免疫療法である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記患者を、請求項１〜１０のいずれか１項に定義されたプロフィールに基づいて、応答者として特性評価する、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
免疫療法が抗原および好適なアジュバントを含む、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
少なくとも1個の免疫活性化遺伝子が上方調節される、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
患者における全身性免疫応答または炎症性応答を刺激する工程を含む、非応答者として特性評価された患者において応答者遺伝子プロフィールを誘導する方法。
【請求項２９】
全身性応答を、放射線療法により誘導するか、または有効量のインターフェロンを投与することにより誘導する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
必要に応じて、患者を分析して、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の遺伝子プロフィールを同定し、該患者を応答者として特性評価した後、有効量の好適な免疫療法、例えば、Mage免疫療法などの好適な癌免疫療法を施す、請求項２８または２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子発現プロフィール；例えば、患者由来サンプルを分析することにより、該プロフィールを同定するための核酸配列を含むマイクロアレイ；それを同定するための新しい診断キットおよび方法に関する。本発明はさらに、特定の集団の患者、例えば、Mageを発現する腫瘍に罹患する患者などのその遺伝子発現プロフィールによる応答者であると特性評価された、癌患者の治療に関する。本発明はさらに、非応答者として最初に、または元々指定された患者において応答者のプロフィールを誘導する方法を含む。
【背景技術】
【０００２】
メラノーマは、表皮中のメラニン形成細胞から生じる腫瘍である。遠隔転移における悪性メラノーマを有する患者(American Joint Commision on Cancer (AJCC)分類に従う段階IV)のメディアン生存期間は1年であり、長期間の生存率は5％に過ぎない。段階IVのメラノーマに関する標準的な化学療法でさえ、治療応答率は8〜25％に過ぎないが、生存全体に対する効果はない。局所転移を有する患者(段階III)のメディアン生存期間は2〜3年であり、一次転移および局所転移の十分な外科的制御後でさえ、長期間の生存の機会は非常に低い(Balchら、1992)。段階I〜IIIのメラノーマを有する多くの患者は、その腫瘍が外科的に除去されているが、これらの患者は再発の実質的な危険性を維持している。かくして、依然としてメラノーマの進行を防止し、転移性メラノーマのための改善された治療計画および原発性腫瘍が除去された患者のためのアジュバント治療を有する必要性がある。2つの型の肺癌：非小細胞肺癌(NSCLC)および小細胞肺癌(SCLC)が存在する。この名称は単に、該腫瘍中に認められる細胞の型を記載するものである。NSCLCは、扁平上皮細胞癌、腺癌、および大細胞癌を含み、肺癌の約80％を占める。NSCLCは、治癒させるのが困難であり、利用可能な治療は、できる限り寿命を延長させ、疾患の兆候を軽減することを目的とする傾向がある。NSCLCは、最も一般的な型の肺癌であり、貧弱な成果と関連している(Gatzmeierら、1994)。全てのNSCLC患者のうち、約25％のみが、診断の時点で局所領域疾患を有し、依然として外科的切除の影響を受けやすい(AJCC分類に従う段階IB、IIAまたはIIB)。しかしながら、これらの患者の50％以上は、完全な外科的切除後2年以内に再発するであろう。従って、これらの患者のためのより良好な治療を提供する必要がある。
【０００３】
伝統的な化学療法は、患者への毒性物質の投与および、部分的には、腫瘍／癌細胞による該毒性薬剤の積極的な取込みへの依存に基づいている。これらの毒性物質は、患者の免疫系に有害に作用し、個体は肉体的に弱くなり、感染に罹りやすくなる。
【０００４】
全てではないが、癌を有する患者は現在の癌治療に応答することが知られている。癌に罹患する30％以下の人のみが、任意の所与の治療に応答するであろうと考えられる。治療に応答しない癌は、耐性であると記載される。多くの例においては、患者が治療に応答する場合に確立するための信頼できる方法は存在していなかった。しかしながら、それらを識別することができないため、両方とも応答者であり、非応答者である患者に治療を施すことは、資源の不十分な使用であり、さらに悪いことに、既に考察されている通り、多くの癌治療が、重篤な免疫抑制、嘔吐および／または脱毛症などの有意な副作用を有するため、患者に対して損傷的であり得る。いくつかの場合においては、それが必要ではないか、またはそれが有効ではない場合でも患者は治療を受けると考えられる。
【０００５】
癌／腫瘍細胞を含む細胞は、数百個から数千個の遺伝子を発現する。癌患者の診断および予後を助ける、例えば、さらなる治療を必要としない患者を同定するために、多くの研究が近年行われてきたが、これは、彼らには該疾患の転移、再発または進行の危険性がないからである。WO 2006/124836は、いくつかの癌遺伝子経路に渡って特定の遺伝子発現特性を同定し、それによって、患者の予後およびこれらの経路を標的化する治療剤に対する感受性を定義している。特異的な癌遺伝子は、Myc、Ras、E2、S3、Srcおよびβ-カテニンである。
【０００６】
米国特許公開第2006/0265138号は、一般的には、好適な治療を与えることができるように原発性腫瘍を同定するための、遺伝子プロフィールを作製する方法を開示している。
【０００７】
米国特許公開第2006/0240441号および第2006/0252057号は、特定の遺伝子の示差的発現に基づいて肺癌を診断する方法を記載している。
【０００８】
米国特許公開第2006/0234259号は、前立腺癌と関連する特定の遺伝子発現プロフィールの同定および使用に関する。
【０００９】
WO 2006/103442は、タモキシフェンなどの特定のホルモン療法およびまた特定の化学療法に対する応答のための予測特性として働く、エストロゲン受容体(ER)陽性腫瘍のサブセットにおいて発現される遺伝子発現プロフィールを記載している。
【００１０】
WO 2006/093507は、結腸直腸癌を有する患者を、良好な予後または不良な予後を有するものと特性評価するのに有用な遺伝子プロフィールを記載しており、良好な予後を有する患者は化学療法にとって好適である。
【００１１】
WO 2006/092610は、特定の遺伝子の示差的発現に基づいてメラノーマ進行をモニターする方法および該疾患のための新規マーカー、特に、TSBY1、CYBAおよびMT2Aを記載している。
【００１２】
WO 2005/049829は、ゲフィチニブなどのerbB受容体キナーゼ阻害剤である、化学療法剤に対する特定の癌の感受性を予測するのに用いることができるマーカー遺伝子の単離されたセットを記載している。
【００１３】
一般的には、これらの事例は、癌の同定および／または進行のための生物学的マーカーに基づく1種以上の癌のマーカーに関する。いくつかの例においては、これらの経路は、いわゆる癌遺伝子により調節される。上記技術を用いる診断により、再発し、および／または転移を患う可能性のある患者を同定し、さらなる治療のために標的化することができる。他の例においては、特定の治療に対する耐性と関連する特異的マーカーを同定する。
【００１４】
抗原、ペプチド、DNAなどに基づく癌治療法の新しい作製が、現在いくつかのグループにより精査を受けている。癌免疫療法とも呼ばれることが多い、多くのこれらの療法の背後にある戦略は、癌との闘いにおいて患者の免疫系を刺激することである。これらの療法は、そのような治療を取る際の副作用が、癌治療を受ける患者が現在遭遇している副作用と比較して、最小的であると予想されるため、有利である可能性がある。癌免疫療法において用いられる抗原を、ASCIと呼ぶことができる、すなわち、抗原特異的癌免疫療法剤である。
【００１５】
1980年代前半に、Van PelおよびBoonは、腫瘍細胞上に存在する抗原に対する細胞傷害性T細胞の発見を公開した。これは、初めての腫瘍特異的な共通抗原：メラノーマAGE-1 (MAGE-1、その後MAGE-A1と改名された)の特性評価をもたらした。次いで、同じ発現パターンを有する多数の遺伝子が同定された：それらは、メラノーマ、肺癌、膀胱癌、乳癌、頭部癌および頸部癌などの様々な腫瘍型において発現される。それらは、精巣以外の正常な細胞中では発現されない。しかしながら、精巣におけるこの発現は、これらの生殖腺細胞がMHCクラスI分子を発現しないため、通常は抗原発現をもたらさない。それらの特異な発現プロフィールから、癌精巣(CT)遺伝子の名称がこれらの遺伝子について提唱された。
【００１６】
MAGE抗原は、メラノーマ関連抗原遺伝子(MAGE)のファミリーによりコードされる抗原である。MAGE遺伝子は、主にメラノーマ細胞(悪性メラノーマを含む)ならびにNSCLC(非小細胞肺癌)、頭部および頸部の扁平上皮細胞癌、膀胱移行上皮癌および食道癌などのいくつかの他の癌において発現されるが、精巣および胎盤以外の正常組織では検出されない(Gauglerら、「ヒト遺伝子MAGE-3は、自己細胞傷害性Tリンパ球によりメラノーマ上で認識される抗原をコードする(Human gene MAGE-3 codes for an antigen recognized on a melanoma by autologous cytolytic T lymphocytes)」、J Exp Med. 1994 Mar 1;179(3):921-930); Weynantsら、「非小細胞肺癌によるmage遺伝子の発現(Expression of mage genes by non-small-cell lung carcinomas)」、Int. J Cancer. 1994 Mar 15;56(6):826-829, Patardら、Int J. Cancer 64: 60, 1995)。MAGE-A3は、メラノーマの69％において発現され(Gaugler, 1994)、NSCLCの44％(Yoshimatsu, 1988)、頭部および頸部の扁平上皮細胞癌の48％、膀胱移行上皮癌の34％、食道癌の57％、結腸癌の32％および乳癌の24％においても検出することができる(Van Pelら、「細胞傷害性Tリンパ球により認識される腫瘍抗原をコードする遺伝子(Genes coding for tumor antigens recognized by cytolytic T lymphocytes)」、Immunological Reviews 145, 229-250, 1995, 1995.); Inoue 1995; Fujie 1997; Nishimura 1997)。MAGEタンパク質を発現する癌は、Mage関連腫瘍として知られる。
【発明の概要】
【００１７】
一態様においては、本発明は、生物学的サンプルにおける、癌免疫療法などの免疫療法に対する応答者または非応答者であることを示す、遺伝子特性の検出のための方法を提供する。かくして、本発明は、患者が、例えば、癌免疫療法を用いる治療にとって好適であるかどうかを確立するために患者をスクリーニングする方法を提供する。
【００１８】
一態様においては、本発明は、前記プロフィールと関連する1個以上の免疫活性化遺伝子のmRNAまたはcDNAにハイブリダイズすることができる1個以上のヌクレオチドプローブを含む診断キットを提供する。
【００１９】
一態様においては、本発明は、前記プロフィールと関連する1個以上の免疫活性化遺伝子を同定するための1個以上のプローブを提供する。
【００２０】
一態様においては、本発明は、前記遺伝子／プロフィールの検出にとって好適な前記プローブのマイクロアレイを提供する。
【００２１】
別の態様においては、本発明は、前記免疫遺伝子／プロフィールの同定のための、公知のマイクロアレイなどのマイクロアレイの使用を提供する。
【００２２】
一態様においては、本発明は、1個以上の前記遺伝子の示差的発現(上方調節など)の同定のためのPCR(または他の公知の技術)の使用を提供する。
【００２３】
一態様においては、本発明は、好適な免疫療法に対する応答者として患者を同定するためのスクリーニング後に、該療法を用いて該患者を治療する方法を提供する。
【００２４】
別の態様においては、本発明は、1個以上の免疫遺伝子／プロフィールの示差的発現について、患者集団をスクリーニングする第1工程、および応答者または非応答者として該患者を特性評価する第2工程を含む、該患者集団における免疫療法の効率を増加させる方法を提供する。
【００２５】
さらなる態様においては、本発明は、免疫療法に対する応答者または非応答者であることを示す、示差的に発現される免疫遺伝子の一覧(すなわち、免疫遺伝子のプロフィール)を作成する方法を提供する。
【００２６】
図面、配列および表の簡単な説明(図面の簡単な説明については別節を参照)
図面に記載のヒートマップにおいては、上方調節される遺伝子は赤色で示され、グレースケールにおいてはより暗い影により示される傾向がある。グレースケール中のより明るい影は、ヒートマップ上で緑色を表す傾向がある(上方調節されない遺伝子)。
【００２７】
配列番号１は、第6染色体オープンリーディングフレーム190である。
【００２８】
配列番号２は、造血細胞特異的Lyn基質1である。
【００２９】
配列番号３は、インターロイキン2受容体,γ(重症複合免疫不全)である。
【００３０】
配列番号４は、CD52抗原(CAMPATH-1抗原)///CD52抗原(CAMPATH-1抗原)である。
【００３１】
配列番号５は、CD2抗原(p50),ヒツジ赤血球受容体///CD2抗原(p50),ヒツジ赤血球受容体である。
【００３２】
配列番号６は、ユビキチンDである。
【００３３】
配列番号７は、シグナル伝達因子および転写活性化因子4(Signal transducer and activator of transcription 4)である。
【００３４】
配列番号８は、グランザイムK(グランザイム3；トリプターゼII)///グランザイムK(グランザイム3；トリプターゼII)である。
【００３５】
配列番号９は、CD3G抗原,γポリペプチド(TiT3複合体)である。
【００３６】
配列番号１０は、Gタンパク質共役受容体171である。
【００３７】
配列番号１１は、タンパク質キナーゼC,β1である。
【００３８】
配列番号１２は、主要組織適合複合体,クラスII,DRα///主要組織適合複合体,クラスII,DRαである。
【００３９】
配列番号１３は、主要組織適合複合体,クラスII,DQβ1///主要組織適合複合体,クラスII,DQβ1である。
【００４０】
配列番号１４は、アルコールデヒドロゲナーゼIB(クラスI),βポリペプチドである。
【００４１】
配列番号１５は、T細胞受容体α定常///T細胞受容体α定常である。
【００４２】
配列番号１６は、CD69抗原(p60,初期T細胞活性化抗原)である。
【００４３】
配列番号１７は、タンパク質キナーゼC,θである。
【００４４】
配列番号１８は、T細胞受容体β可変19///T細胞受容体β定常1である。
【００４５】
配列番号１９は、T細胞受容体α遺伝子座///T細胞受容体δ可変2///T細胞受容体α可変20///T細胞受容体α連結17///T細胞受容体α定常である。
【００４６】
配列番号２０は、T細胞受容体γ定常2である。
【００４７】
配列番号２１は、T細胞受容体β可変21-1///T細胞受容体β可変19///T細胞受容体β可変5-4///T細胞受容体β可変3-1///T細胞受容体β定常1である。
【００４８】
配列番号２２は、T細胞受容体α遺伝子座である。
【００４９】
配列番号２３は、T細胞受容体β可変19///T細胞受容体β可変19///T細胞受容体β定常1///T細胞受容体β定常1である。
【００５０】
配列番号２４は、CD3D抗原,δポリペプチド(TiT3複合体)である。
【００５１】
配列番号２５は、T細胞受容体γ定常2///T細胞受容体γ可変9///T細胞受容体γ鎖C領域PT-γ-1/2と類似///T細胞受容体γ鎖V領域PT-γ-1/2前駆体と類似///TCRγ代替リーディングフレームタンパク質である。
【００５２】
配列番号２６は、ピリンおよびHINドメインファミリー,メンバー1である。
【００５３】
配列番号２７は、T細胞受容体関連膜貫通アダプター1である。
【００５４】
配列番号２８は、SLAMファミリーメンバー7である。
【００５５】
配列番号２９は、第4染色体オープンリーディングフレーム7である。
【００５６】
配列番号３０は、主要組織適合複合体,クラスII,DQα1である。
【００５７】
配列番号３１は、転写される遺伝子座である。
【００５８】
配列番号３２は、アンフィフィシン(乳癌128 kDa自己抗原を有するStiff-Man症候群)である。
【００５９】
配列番号３３は、樹状細胞関連レクチン-1である。
【００６０】
上記の各配列を、以下の表1Aに示す。
【００６１】
配列番号３４は、リポタンパク質D断片、Mage3断片、およびヒスチジン尾部の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列である。
【００６２】
配列番号３５は、リポタンパク質D断片、Mage3断片、およびヒスチジン尾部の融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【００６３】
配列番号３６〜４３(説明中に認められる)は、MAGE A3と関連するペプチド配列である。
【００６４】
配列番号４４〜４８は、CpGモチーフを含むオリゴヌクレオチド配列の例である。
【００６５】
配列番号４９〜８４(表1Bに列挙される)は、表1に列挙される遺伝子にハイブリダイズさせるのに好適なプローブセットである。
【００６６】
配列番号８５〜９７(表3Aに列挙される)は、表3に列挙される遺伝子の配列である。
【００６７】
表1〜4、11および12は、本発明に従って示差的に調節される遺伝子の一覧を提供する。
【００６８】
表1Aは、表1に列挙される遺伝子の各々に関するヌクレオチド配列一覧を提供する。
【００６９】
表1Bは、各プローブが表1に列挙される特定の遺伝子を同定するのに好適であるプローブ(およびその配列)のプローブセット識別番号(プローブに関するユニークな参照番号)を提供する。
【００７０】
表3Aは、表3の遺伝子(およびその配列)と該遺伝子を同定するのに好適なプローブとを結びつける。
【００７１】
表5は、PCR分析における使用にとって好適な遺伝子、プライマーおよびプローブの一覧を提供する。
【００７２】
表6は、TaqMan(登録商標)(Q-PCR)免疫プロファイリングアレイに含まれる遺伝子の一覧である。
【００７３】
表7は、本発明の一態様に従う遺伝子の一覧を提供する。
【００７４】
表7Aは、表7に列挙される遺伝子に関する応答者群と非応答者群との間の幾何平均比を提供する。
【００７５】
表8は、30種の遺伝子の相関マトリックスを提供する。
【００７６】
表9は、本発明の一態様に従う遺伝子の一覧を提供する。
【００７７】
表9Aは、表9に列挙される特定の遺伝子に関するロジスティック回帰結果である。
【００７８】
表10は、表9に列挙される遺伝子に関するロジスティック回帰モデルを用いる正確な分類の割合を示す。
【００７９】
表11は、本発明の一態様に従う遺伝子の一覧を提供する。
【００８０】
表11Aおよび11Bは、様々な患者に関する遺伝子発現のレベル(41種のプローブセットの結果に基づく)を示す。
【００８１】
表12および13は、本発明のさらなる態様を形成する遺伝子一覧を示す。
【００８２】
表14は、前記患者に関する臨床結果と表11Aおよび11Bに与えられる遺伝子発現レベルとの間の相関を提供する。
【００８３】
添付物A〜Cは、サンプルの統計分析を補助するためのコンピューターコードである。MAGE-1遺伝子は、X染色体上に位置し、そのコード配列において互いに64〜85％の相同性を有する、12個の密接に関連する遺伝子、MAGE1、MAGE2、MAGE3、MAGE4、MAGE5、MAGE6、MAGE7、MAGE8、MAGE9、MAGE10、MAGE11、MAGE12のファミリーに属する(De Plean, 1994)。これらは、時にはMAGE A1、MAGE A2、MAGE A3、MAGE A4、MAGE A5、MAGE A6、MAGE A7、MAGE A8、MAGE A9、MAGE A10、MAGE A11、MAGE A12(MAGE Aファミリー)として知られる。
【００８４】
2つの他の群のタンパク質も、MAGEファミリーの一部であるが、関連性はより遠い。これらは、MAGE BおよびMAGE C群である。MAGE Bファミリーは、MAGE B1(MAGE Xp1、およびDAM 10としても知られる)、MAGE B2(MAGE Xp2およびDAM 6としても知られる)、MAGE B3およびMAGE B4を含み、MAGE Cファミリーは、現在MAGE C1およびMAGE C2を含む。
【００８５】
一般的な用語では、MAGE Aタンパク質を、該タンパク質のC末端に向かって位置するコア配列特性を含むものとして定義することができる(例えば、MAGE A1の309個のアミノ酸タンパク質に関しては、コア特性はアミノ酸195〜279に対応する)。
【００８６】
腫瘍が、例えば、Mageを発現する場合、その患者はMage抗原に基づく免疫療法に応答するであろうと単純になるわけではない。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】図1は、マイクロアレイ分析により同定され、148個のトッププローブセットを用いる遺伝子プロフィールに関する、MAGE008臨床試験におけるMage免疫療法に対する、応答者(本明細書では応答者、混合応答者および安定疾患を含むと定義される)または非応答者であることが判明した31人の患者の臨床結果に関連するSpotfire分析を用いた階層的クラスター化の図式表示である。
【図２】図2は、図1と同じ分析の図式表示であるが、階層的クラスター化を、100個のプローブセットを用いるBaldiBH分析を用いて実施した。
【図３】図3は、図1と同じ分析の図式表示であるが、階層的クラスター化を、Arrayminer Classmaker遺伝子一覧を用いて実施した。
【図４】図4は、図1、図2および図3において用いられた遺伝子一覧の比較を表すベン図である。
【図５】図5は、30人の異なる患者の種々の遺伝子(36個のプローブセット)の発現プロフィールの視覚的表示である(患者はX軸、種々のプローブセットはY軸に示される)。
【図５Ａ】図5Aは、30人の異なる患者(患者はX軸に示される)の2種の遺伝子の発現の視覚的表示である。
【図６】図6は、PRF1、GZMB、GNLY、CD8A、PRKCQ、FOXP3、IFNG、CCL5、GPR171およびTRBV19遺伝子を用いる主成分分析を示す。
【図７】図7は、アジュバントAS15を用いるMAGE008臨床試験からの33人の異なる患者(患者識別番号はX軸に示される)に関する種々の遺伝子(41個のプローブセット)の発現プロフィールの視覚的表示である。
【図８】図8は、MAGE008臨床試験のAS15アームにおける患者に関する階層的クラスター化の図式表示である。
【図９】図9は、アジュバントAS02bを用いるMAGE008臨床試験からの33人の異なる患者(患者識別番号はX軸に示される)に関する種々の遺伝子(41個のプローブセット)の発現プロフィールの視覚的表示である。
【図１０】図10は、MAGE008臨床試験のAS02bアームにおける患者に関する階層的クラスター化の図式表示である。
【発明を実施するための形態】
【００８８】
Mage免疫療法などの免疫療法を受ける前に、患者から得た癌／腫瘍に対して実施された分析により、免疫療法に応答しなかった患者と比較して、該治療に良好に応答した患者において、特定の遺伝子が示差的に発現されることが同定された。本発明者らは、好適な免疫療法に患者が応答する可能性を予測する遺伝子特性／プロフィールを見出した。より具体的には、本発明者らは、Mage抗原特異的免疫療法を用いる治療後に改善された生存率を予測する遺伝子特性を見出した。
【００８９】
かくして、本発明は、患者が、免疫療法、例えば、Mage免疫療法などの癌免疫療法に対する応答者(またはあるいは、非応答者)である可能性が高いことを示す、患者由来サンプルから得られた、遺伝子プロフィールであって、少なくとも1個の免疫活性化遺伝子の示差的発現を含む、前記プロフィールを提供する。本発明は、患者が免疫療法、例えば、Mage免疫療法などの癌免疫療法に対する応答者である可能性が高いことを示す、患者由来サンプルから得られた、遺伝子プロフィールであって、少なくとも1個の免疫活性化遺伝子の上方調節を含む、前記プロフィールを提供する。
【００９０】
本発明は、診断または予後プロフィールとは対照的に、予測プロフィールを提供する。
【００９１】
理論によって束縛されることを望むものではないが、同定される遺伝子特性は、実際のところ、応答者であると指定された患者におけるT細胞浸潤／活性化応答などの免疫／炎症を示し、例えば、この特性はT細胞活性化マーカーであると仮定される。この応答の存在は、免疫療法の実施後に、患者の身体が癌などの疾患と闘うのを補助し、それによって、患者を該免疫療法に対してより応答性にすると考えられる。
【００９２】
かくして、本発明の特性は、関連する疾患、例えば、癌遺伝子などの癌の診断および／または予後に特異的に関連するマーカー／遺伝子に焦点を当てるものではなく、むしろ患者が癌免疫療法などの好適な免疫療法に対して応答するかどうかを予測するものである。
【００９３】
癌について本明細書で同定される遺伝子プロフィールおよびそれを同定する方法は、腫瘍の微小環境を示唆すると考えられる。腫瘍の正確な微小環境は、患者が好適な癌免疫療法に応答するかどうかに対する鍵となるようである。
【００９４】
本発明の文脈における免疫療法は、一般的には、抗原に対する免疫応答であって、それと関連する疾患の治療、軽減および／または進行の遅延をもたらす前記応答の刺激に基づく治療を意味する。この文脈における治療は、通常、予防的治療を含まないであろう。
【００９５】
本明細書の文脈における癌免疫療法は、癌の治療のための免疫療法を意味する。一態様においては、免疫療法は、Mageなどの癌精巣抗原に基づく(以下により詳細に考察される)。
【００９６】
本発明を、好適な免疫療法に応答する可能性が高い癌患者、例えば、MAGEを発現する癌を有する患者などの、メラノーマ、乳癌、膀胱癌、肺癌、NSCLC、頭部および頸部の癌、扁平上皮癌、結腸癌および食道癌を有する患者を同定するのに用いることができる。一実施形態においては、本発明を、そのような癌、特に、肺癌およびメラノーマにおけるアジュバント(術後、例えば、疾患を有さない)設定において用いることができる。本発明はまた、転移設定における癌の治療においても有用である。
【００９７】
かくして、第1の態様において、本発明は、好適な免疫療法を用いる治療に対する応答者または非応答者であると指定された、癌患者などの患者であることを示す特性であって、免疫活性化／免疫応答／炎症応答遺伝子から選択される1個以上の遺伝子、例えば、列挙される遺伝子(または表1もしくは2などの表1、2、3、4、7、9、11、12および／もしくは13に列挙されるものを含むか、もしくはそれからなる遺伝子一覧)などのT細胞浸潤／活性化を示す遺伝子群の示差的発現を含む、前記特性を提供する。本発明の文脈における示差的発現とは、遺伝子が、その正常な発現と比較して上方調節されるか、または下方調節されることを意味する。遺伝子分化を算出するための統計学的方法を、以下に考察する。
【００９８】
免疫活性化遺伝子は、好適な免疫応答を容易にし、増加させるか、または刺激する遺伝子を意味すると意図される。免疫応答遺伝子および免疫活性化遺伝子は、本明細書では互換的に用いられる。
【００９９】
癌／腫瘍細胞などの細胞により発現される遺伝子の分析のための重要な技術は、数百個以上のプローブ配列(55,000個のプローブセットなど)をガラス表面に付着させる、DNAマイクロアレイ(遺伝子チップ技術としても知られる)である。このプローブ配列は、一般的には、全て25マーまたは60マーであり、公知の遺伝子に由来する配列である。一般的には、これらのプローブを11種の個々のプローブのセット(プローブセット)中に配置し、ガラス表面上に所定のパターンで固定する。一度、好適に生物学的サンプルに曝露されたら、これらのプローブは特定の遺伝子の関連するRNAまたはDNAにハイブリダイズする。洗浄後、チップを、好適な方法により「読み取り」、色の強度などの量を記録する。特定の遺伝子の示差的発現は、記録される測定値／強度に比例する。この技術を、以下でより詳細に考察する。
【０１００】
一度、標的遺伝子／プロフィールを同定したら、該遺伝子が示差的に発現されるかどうかを測定するためのいくつかの分析方法が存在する。これらの分析技術としては、サンプル中に存在する所与のDNA分子の特定の部分を同時に定量し、増幅するのに用いられる、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応とも呼ばれる、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(QRT-PCRまたはQ-PCR)が挙げられる。
【０１０１】
この手順は、一般的なパターンのポリメラーゼ連鎖反応を行うが、それぞれのラウンドの増幅後にDNAを定量する(「リアルタイム」態様)。定量の2つの一般的方法は、二本鎖DNAと共に挿入された蛍光染料、および相補的DNAにハイブリダイズした場合、蛍光を発する改変されたDNAオリゴヌクレオチドプローブの使用である。
【０１０２】
リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応の背後にある基本的な考えは、サンプル中に存在する特定のcDNA(およびかくしてmRNA)の量が豊富になるほど、増幅の反復サイクルの間にそれが検出されるのが早くなるであろうということである。DNAの増幅を行うことができる様々な系が存在し、それらはリアルタイム増幅の間に新しく合成されたDNA分子に組み込まれる蛍光染料の使用を含むことが多い。次いで、サーモサイクリングプロセスを制御するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応装置は、蛍光DNAの量、かくして所与のサンプルの増幅の進行を検出することができる。典型的には、所与のcDNAの増幅は、時間と共に、最初の平坦期、次いで指数期を有する曲線を示す。最終的に、実験試薬が用いられるにつれて、DNA合成はゆっくりになり、指数曲線はプラトーに平坦化する。
【０１０３】
あるいは、標的遺伝子のmRNAまたはタンパク質産物を、ノーザンブロット分析、ウェスタンブロットおよび／または免疫組織化学により測定することができる。
【０１０４】
一態様においては、前記プロフィール／特性を同定するための分析を、癌精巣抗原が発現される患者サンプル上で実施する。
【０１０５】
遺伝子が、応答者(またはあるいは、非応答者)であると見なされる患者において常に上方調節されるか、または常に下方調節される場合、この単一の遺伝子を用いて、患者が応答者または非応答者であるかどうかを確立することができる。一度、閾値が確立され、提供されたら、2つの群の分離は十分である。
【０１０６】
単一の遺伝子を、例えば、Q-PCRにより分析した場合、その遺伝子発現を、一定のままである遺伝子、例えば、記号H3F3A、GAPDH、TFRC、GUSBまたはPGK1を有する遺伝子を参照することにより正規化することができる。この正規化を、考慮下にある遺伝子について得られた値から、一定の遺伝子について得られた値を差し引くことにより実施することができる。それぞれの患者について関連する遺伝子の発現の測定値をプロットすることにより、閾値を確立することができる。一般的には、応答者および非応答者を、異なる軸／焦点についてクラスター化することができる。古典的統計学的方法により、または単に「最良適合線」をプロットして、2群間の妥協点を確立することにより、クラスター間のギャップ中で閾値を確立することができる。例えば、所定の閾値を超える値を、応答者として指定し、例えば、予め指定された閾値を下回る値を非応答者として指定することができる。
【０１０７】
一態様においては、本発明は、50、60、70、80、85、90、95、99または100％の遺伝子が上方調節される1個以上の前記遺伝子を含む応答者を同定するための遺伝子プロフィールを提供する。
【０１０８】
一般的には、表1、2、3、4、7、9、11、12および／または13、例えば、表1、2および／または3に列挙される遺伝子が、応答者において上方調節される。
【０１０９】
本発明の予測方法の強固性を、表1、2、3、4、7、9、11、12および／または13、例えば、表1または2に由来する2、3、4、5、6個などの遺伝子を用いることにより、より大きいサンプルサイズについてさらに改良することができる。
【０１１０】
さらに、一度、少なくとも2種の示差的に発現される遺伝子が前記特性中に含まれたら、統計的クラスター化方法を用いて、応答者と非応答者を識別することができる。統計的クラスター化のための方法およびそれを行うためのソフトウェアを以下に考察する。
【０１１１】
遺伝子の示差的発現を定量するのに用いられる1つのパラメーターは、2つの異なる実験条件間で遺伝子のmRNA発現レベルを比較するための測定基準である倍数変化である。その演算定義は研究者間で異なる。しかしながら、倍数変化が高くなるほど、関連する遺伝子の示差的発現を十分に分離することができる可能性が高くなり、どのカテゴリー(応答者または非応答者)に患者が入るかを決定するのが容易になる。
【０１１２】
倍数変化は、例えば、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20または30であってよい。
【０１１３】
また、示差的発現を定量するのに用いられる別のパラメーターは、「p」値である。p値が低くなるほど、遺伝子がより示差的に発現される可能性が高くなり、本発明のプロフィールにおける使用のための良好な候補になる。P値は、例えば、0.1以下、例えば、0.05以下、特に、0.01以下を含んでもよい。本明細書で用いられるP値は、補正された「P」値および／または補正されていない「P」値をも含む。
【０１１４】
本発明は、生物学的サンプル中の遺伝子特性の検出のための方法であって、表1に記載の少なくとも5個の遺伝子の発現の分析を含む前記方法を提供する。あるいは、1個以上の遺伝子を、表1、2、3、4、7、9、11、12および／または13、例えば、表1または2から選択することができる。
【０１１５】
かくして、一態様においては、本発明は、癌患者が免疫療法に対する応答者または非応答者であるかどうかを同定する方法であって、
1. 例えば、表1、2、3、4、7、9、11、12および／もしくは13、例えば、表1もしくは2に列挙される遺伝子を含むか、もしくはそれからなる群より選択される、T細胞浸潤／活性化を示唆する1個以上の遺伝子の示差的発現について、癌細胞の遺伝子または癌細胞に由来するDNAもしくはその断片により発現されるmRNAもしくはその断片を含むサンプルを分析すること、ならびに
2. 工程1の結果に基づいて、応答者または非応答者として患者を特性評価すること、
を含む、前記方法を提供する。
【０１１６】
本発明の文脈における応答者は、癌／腫瘍が根絶、減少もしくは改善された人(混合応答者もしくは部分的応答者)または疾患が進行しないように単に安定化された人を含む。癌が安定化された応答者においては、安定化の期間は、生活の質および／または患者の平均余命が、治療を受けない患者と比較して増加する(例えば、6ヶ月間を超えて安定な疾患)ようなものである。
【０１１７】
癌に関する部分的臨床応答は、全ての腫瘍／癌がある程度まで治療に応答し、例えば、前記癌が30、40、50、60％以上減少する。癌に関する混合臨床応答者は、いくらかの腫瘍／癌が治療に応答し、他のものは未変化のままであるか、または進行するものとして定義される。
【０１１８】
標準的な定義が、癌治療に対する応答者、部分的応答者および混合応答者にとって利用可能である。これらの標準的な定義は、それらが適用されないことが明らかである限り、文脈から本明細書で適用される。
【０１１９】
本明細書で用いられる場合、好ましい臨床応答を予測するか、または治療に対して応答する可能性がより高い被験者を同定する方法は、100％の予測能力を含むことを意味しないが、特定の特徴を有する被験者が、そのような特徴を欠く被験者よりも特定の治療に対する好ましい臨床応答を経験する可能性がより高いことを示唆することを意味する。しかしながら、当業者には明らかであるように、好ましい臨床応答を経験する可能性がより高いと同定されたいくらかの個人は、それにも関わらず前記治療に対する測定可能な臨床応答を示すことができないかもしれない。同様に、非応答者であると予測されたいくらかの個人は、それにも関わらず該治療に対する好ましい臨床応答を示すかもしれない。
【０１２０】
本明細書で用いられる、例えば、抗癌治療に対する「好ましい応答」(または「好ましい臨床応答」)とは、代替的な治療を用いるか、または任意の治療の非存在下で起こる腫瘍増殖と比較して、腫瘍増殖の速度が低下したことを示唆するものとして当業者により認識される生物学的または身体的応答を指す。本明細書で用いられる「好ましい臨床応答」は、治癒と同義語ではないが、部分的応答、混合応答または安定疾患を含む。治療に対する好ましい臨床応答としては、被験者により経験される兆候の減少、予想されるか、もしくは達成される生存時間の増加、腫瘍増殖速度の低下、腫瘍増殖の停止(安定疾患)、転移性病変の数もしくは質量の回帰、および／または全体の腫瘍質量の回帰(それぞれ、治療の非存在下で起こるか、または代替的な治療に応答するものと比較して)が挙げられる。
【０１２１】
腫瘍細胞が「応答者」特性として本明細書に記載される遺伝子特性を有する、例えば、Mageを発現する腫瘍のための治療を必要とする患者は、Mage特異的免疫療法を用いて治療した場合、腫瘍細胞が「非応答者」特性として本明細書に記載される遺伝子特性を示す患者と比較して、好ましい臨床応答を有する可能性がより高い。
【０１２２】
本発明の文脈における非応答者は、兆候、すなわち、癌／腫瘍が改善または安定化されていない人を含む。
【０１２３】
必要に応じて、応答者または非応答者としての患者の特性評価を、「標準物」または訓練セットを参照することにより実施することができる。この標準物は、応答者もしくは非応答者であることが知られる人／患者のプロフィールであってよく、またはあるいは、数値であってよい。そのような所定の標準物を、印刷された一覧もしくは図面、コンピューターソフトウェアプログラム、または他の媒体などの任意の好適な形態で提供することができる。
【０１２４】
本明細書の文脈における訓練セットは、臨床結果を遺伝子プロフィールと相関させることができ、また新しいサンプルについて応答者および／または非応答者を同定するための好適な統計モデル／プログラムの訓練に用いることができるサンプル群を指すことが意図される。表11A、11Bおよび14は、実施例4に記載の41個のプローブセットモデルと関連する訓練セット情報を含む。
【０１２５】
一態様においては、数学モデル／アルゴリズム／統計方法を用いて、患者を応答者または非応答者として特性評価する。
【０１２６】
一態様においては、本発明は、5個以上のそのような遺伝子などの1個以上の免疫活性化遺伝子に基づくプロフィールを提供する。
【０１２７】
一態様においては、本発明は、表1、2、3、4、7、9、11、12および／または13、例えば、表1または2に記載の遺伝子に基づくプロフィールを提供する。
【０１２８】
一態様においては、本発明は、489個のプローブ(表4Aに列挙される)および／または表4に列挙される約480個の遺伝子に基づくプロフィールを提供する。
【０１２９】
一態様に従えば、本発明は、Mage特異的免疫療法を用いる治療後にMageを発現する癌を有する患者の生存率が改善されたことを示す遺伝子特性を提供する。表1に開示される遺伝子に由来する、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30または31個の遺伝子のこの遺伝子特性は、Mage抗原特異的癌免疫療法に応答しないMAGEを発現する腫瘍患者の遺伝子特性と比較して、示差的発現を特徴とする。患者が実際に応答者である場合、改善された生存は、施される免疫療法に対する応答の当然の結果である可能性がある。
【０１３０】
遺伝子一覧を含む表
一態様においては、本発明は、表1に列挙される1個以上の遺伝子に関する。
【０１３１】
2009538607.tif 000002
2009538607.tif 000003
【０１３２】
本明細書の最後にある表1Aは、上記遺伝子のそれぞれに関する完全なヌクレオチド配列を与える。
【０１３３】
一態様においては、本発明は、免疫浸潤および活性化に関する、文献で同定された、62個の遺伝子の1個以上の示差的発現に基づくプロフィールを提供する。
【０１３４】
一態様においては、本発明は、表2に列挙される遺伝子に基づくプロフィールを提供する。
【０１３５】
2009538607.tif 000004
【０１３６】
一態様においては、本発明は、表3に遺伝子の一覧を提供する。
【０１３７】
2009538607.tif 000005
【０１３８】
一態様においては、本発明は、表4の1個以上の遺伝子に基づくプロフィールを提供する。
【０１３９】
2009538607.tif 000006
2009538607.tif 000007
2009538607.tif 000008
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【０１４０】
本明細書に列挙された表においては、所与の遺伝子を、例えば、特定の遺伝子または遺伝子クラスターとして、2回以上列挙することができる。上記の表4を、以下の表4Aに列挙されるプローブセットから作製する。各遺伝子につき複数のプローブセットが存在することが多く、かくして、2個以上のプローブセットを用いて特定の遺伝子を同定した場合、該遺伝子は表4中に2回以上現れる。表4中に2回以上現れる遺伝子を通してスコアリングすることにより、重複を除去する試みが為された。
【０１４１】
一態様においては、本発明は、本明細書に記載の様々な実施形態に渡って、その組合せを含む表1、2、3、4、7、9、11、12および／または13から選択される1個以上の遺伝子を提供する。さらなる態様においては、本発明は、表1、2、3、4、7、9、11、12もしくは13の全ての遺伝子または実際にその組合せを提供する。
【０１４２】
さらなる態様においては、本発明は、表1、2、3、4、7、9、11、12および／または13に列挙される遺伝子の少なくとも10％、例えば、その少なくとも40％、50％、60％または70％、例えば、80％、90％または100％を提供する。
【０１４３】
1個以上の遺伝子は、好適なものとして、1-5、6-10、11-15、16-20、21-25、26-30、31-35、36-40、41-45、46-50、51-55、56-60、61-65、66-70、71-75、76-80、81-85、86-90、91-95、96-100、101-105、106-110、111-115、116-120、121-125、126-130、131-135、136-140、141-145、146-150、151-155、156-160、161-165、166-170、171-175、176-180、181-185、186-190、191-195、196-200、201-205、206-210、211-215、216-220、221-225、226-230、231-235、236-240、241-245、246-250、251-255、256-260、261-265、266-270、271-275、276-280、281-285、286-290、291-295、296-300、301-305、306-310、311-315、316-320、321-325、326-330、331-335、336-340、341-345、346-350、351-355、356-360、361-365、366-370、371-375、376-380、381-385、386-390、391-395、396-400、401-405、406-410、411-415、416-420、421-425、426-430、431-435、436-440、441-445、446-450、451-455、456-460、461-465、466-470、471-475、476-480およびその組合せを含む。
【０１４４】
1つ以上の態様において、本発明は、以下の項目1〜430のいずれか1つに記載された実施形態を提供する。
【０１４５】
1)かくして、本発明は表4に由来する1個以上の遺伝子を用いることができる。
【０１４６】
2)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.2〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号FLJ20647を有する、項目1に記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１４７】
3)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.3〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号NAV1を有する、項目1または2に記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１４８】
4)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.4〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号GPR171を有する、項目1〜3のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１４９】
5)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.5〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CCL14を有する、項目1〜4のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１５０】
6)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.6〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号C1Sを有する、項目1〜5のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１５１】
7)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.7〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CXCL2を有する、項目1〜6のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１５２】
8)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.8〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号TRBV3-1を有する、項目1〜7のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１５３】
9)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.9〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号TRDV2を有する、項目1〜8のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１５４】
10)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.10〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号RUFY3を有する、項目1〜9のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１５５】
11)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.11〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号DOCK8を有する、項目1〜10のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１５６】
12)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.12〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号GCH1を有する、項目1〜11のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１５７】
13)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.13〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CENTD3を有する、項目1〜12のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１５８】
14)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.14〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号ACSL5を有する、項目1〜13のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１５９】
15)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.15〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号AMICA1を有する、項目1〜14のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１６０】
16)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.16〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号IL2RGを有する、項目1〜15のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１６１】
17)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.17〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号TNFAIP3を有する、項目1〜16のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１６２】
18)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.18〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号PSCDBPを有する、項目1〜17のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１６３】
19)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.19〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号ESR1を有する、項目1〜18のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１６４】
20)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.20〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号TRBC1を有する、項目1〜19のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１６５】
21)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.21〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CD52を有する、項目1〜20のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１６６】
22)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.22〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号LOC442535を有する、項目1〜21のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１６７】
23)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.23〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号TRBV19を有する、項目1〜22のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１６８】
24)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.24〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号IL7Rを有する、項目1〜23のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１６９】
25)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.25〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号TRACを有する、項目1〜24のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１７０】
26)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.26〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号NCF2を有する、項目1〜25のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１７１】
27)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.27〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号LOC92689を有する、項目1〜26のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１７２】
28)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.28〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号GZMKを有する、項目1〜27のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１７３】
29)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.29〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、プローブセット235831により同定された遺伝子である、項目1〜28のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１７４】
30)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.30〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号RAB34を有する、項目1〜29のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１７５】
31)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.31〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号DPTを有する、項目1〜30のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１７６】
32)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.32〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号PVT1を有する、項目1〜31のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１７７】
33)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.33〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号TRGC2を有する、項目1〜32のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１７８】
34)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.34〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号GIMAP5を有する、項目1〜33のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１７９】
35)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.35〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CD52を有する、項目1〜34のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１８０】
36)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.36〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CD3Dを有する、項目1〜35のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１８１】
37)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.37〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号TMEM132Cを有する、項目1〜36のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１８２】
38)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.38〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号NFKBIAを有する、項目1〜37のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１８３】
39)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.39〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号TRA@を有する、項目1〜38のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１８４】
40)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.41〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号TRAT1を有する、項目1〜39のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１８５】
41)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.42〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号RAB34を有する、項目1〜40のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１８６】
42)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.43〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CD69を有する、項目1〜41のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１８７】
43)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.44〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号DOCK8を有する、項目1〜42のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１８８】
44)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.46〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号IRF8を有する、項目1〜43のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１８９】
45)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.47〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号KLRB1を有する、項目1〜44のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１９０】
46)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.48〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、プローブセット番号236280_atにより同定可能である、項目1〜45のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１９１】
47)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.49〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号ITGA3を有する、項目1〜46のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１９２】
48)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.50〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号MAP3K8を有する、項目1〜47のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１９３】
49)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.51〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号Clorf162を有する、項目1〜48のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１９４】
50)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.52〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号UBDを有する、項目1〜49のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１９５】
51)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.54〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号TRGV9を有する、項目1〜50のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１９６】
52)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.54〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号NAV1を有する、項目1〜51のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１９７】
53)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.55〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号ARHGAP9を有する、項目1〜51のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１９８】
54)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.56〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号TIFAを有する、項目1〜53のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０１９９】
55)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.58〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、プローブ番号1569942_atにより同定される、項目1〜54のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２００】
56)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.59〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号GIMAP4を有する、項目1〜55のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２０１】
57)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.60〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号HCLS1を有する、項目1〜56のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２０２】
58)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.61〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号PRKCHを有する、項目1〜57のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２０３】
59)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.62〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号STAT4を有する、項目1〜58のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２０４】
60)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.63〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号HLA-DQA1を有する、項目1〜59のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２０５】
61)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.64〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号ADRB2を有する、項目1〜60のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２０６】
62)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.65〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、プローブセット番号239237_atにより同定可能である、項目1〜61のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２０７】
63)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.66〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CTSWを有する、項目1〜62のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２０８】
64)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.67〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号MYH11を有する、項目1〜63のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２０９】
65)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.68〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号GIMAP6を有する、項目1〜64のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２１０】
66)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.69〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号HLA-DQB1を有する、項目1〜65のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２１１】
67)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.70〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CD8Aを有する、項目1〜66のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２１２】
68)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.71〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号TNFAIP3を有する、項目1〜67のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２１３】
69)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.72〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CPを有する、項目1〜68のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２１４】
70)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.73〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号SMOC2を有する、項目1〜69のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２１５】
71)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.74〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号C20orf24を有する、項目1〜70のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２１６】
72)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.75〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号C16orf54を有する、項目1〜71のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２１７】
73)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.76〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CD2を有する、項目1〜72のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２１８】
74)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.77〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号SLIT3を有する、項目1〜73のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２１９】
75)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.78〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号BAALCを有する、項目1〜74のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２２０】
76)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.79〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号TRIB3を有する、項目1〜75のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２２１】
77)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.80〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号LOC440160を有する、項目1〜76のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２２２】
78)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.81〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号C6orf190を有する、項目1〜77のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２２３】
79)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.82〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号TAGAPを有する、項目1〜78のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２２４】
80)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.83〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号FAM92A1を有する、項目1〜79のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２２５】
81)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.84〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号PSTRIP2を有する、項目1〜80のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２２６】
82)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.85〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号PTPRCを有する、項目1〜81のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２２７】
83)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.86〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号HLA-DRAを有する、項目1〜82のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２２８】
84)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.87〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号EFCAB2を有する、項目1〜83のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２２９】
85)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.88〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号TNFAIP8を有する、項目1〜84のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２３０】
86)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.89〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号SLIC1を有する、項目1〜85のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２３１】
87)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.90〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CD1Cを有する、項目1〜86のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２３２】
88)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.91〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号TRAF3IP3を有する、項目1〜87のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２３３】
89)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.96〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号IGJを有する、項目1〜88のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２３４】
90)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.98〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号PLEKを有する、項目1〜89のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２３５】
91)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.100〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号TMEM44を有する、項目1〜90のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２３６】
92)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.101〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号EBI2を有する、項目1〜91のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２３７】
93)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.102〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号SAMSN1を有する、項目1〜92のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２３８】
94)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.103〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号KIAA1794を有する、項目1〜93のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２３９】
95)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.104〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号ALDH2を有する、項目1〜94のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２４０】
96)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.105〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CDC42SE2を有する、項目1〜95のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２４１】
97)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.106〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号GFRA1を有する、項目1〜96のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２４２】
98)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.107〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号ITKを有する、項目1〜97のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２４３】
99)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.109〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号GIMAP7を有する、項目1〜98のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２４４】
100)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.110〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号FLJ20273を有する、項目1〜99のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２４５】
101)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.111〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号PTPN6を有する、項目1〜100のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２４６】
102)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.112〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号PTGER3を有する、項目1〜101のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２４７】
103)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.113〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号RAI2を有する、項目1〜102のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２４８】
104)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.114〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号LGALS2を有する、項目1〜103のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２４９】
105)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.115〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号HMOX1を有する、項目1〜104のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２５０】
106)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.116〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、プローブセット番号227995_atにより同定可能である、項目1〜105のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２５１】
107)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.117〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号ZNFN1A1を有する、項目1〜106のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２５２】
108)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.118〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CSF2RBを有する、項目1〜107のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２５３】
109)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.119〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号PCSK5を有する、項目1〜108のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２５４】
110)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.120〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CCDC69を有する、項目1〜109のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２５５】
111)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.121〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CDC42SE2を有する、項目1〜110のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２５６】
112)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.122〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号GZMAを有する、項目1〜111のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２５７】
113)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.123〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号C3を有する、項目1〜112のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２５８】
114)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.125〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号C15orf48を有する、項目1〜113のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２５９】
115)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.126〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号RARRES3を有する、項目1〜114のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２６０】
116)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.127〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号LOC283537を有する、項目1〜115のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２６１】
117)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.129〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CXCL12を有する、項目1〜116のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２６２】
118)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.130〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、プローブセット番号231882_atにより同定可能である、項目1〜117のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２６３】
119)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.131〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号SOD2を有する、項目1〜118のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２６４】
120)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.132〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CTSSを有する、項目1〜119のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２６５】
121)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.133〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CTBP2を有する、項目1〜120のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２６６】
122)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.134〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号BCL11Bを有する、項目1〜121のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２６７】
123)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.135〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CCL22を有する、項目1〜122のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２６８】
124)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.136〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号ACSL5を有する、項目1〜123のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２６９】
125)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.137〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号DOC1を有する、項目1〜124のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２７０】
126)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.138〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号SLC31A2を有する、項目1〜125のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２７１】
127)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.139〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号POPDC3を有する、項目1〜126のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２７２】
128)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.141〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号SQRDLを有する、項目1〜127のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２７３】
129)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.142〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号RASGEF1Bを有する、項目1〜128のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２７４】
130)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.143〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号FGL2を有する、項目1〜129のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２７５】
131)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.144〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号C10orf128を有する、項目1〜130のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２７６】
132)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.145〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号IL10RAを有する、項目1〜131のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２７７】
133)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.146〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号EGFL6を有する、項目1〜132のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２７８】
134)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.147〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号IL18を有する、項目1〜133のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２７９】
135)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.148〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号ARHGAP30を有する、項目1〜134のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２８０】
136)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.149〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号PALMDを有する、項目1〜135のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２８１】
137)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.150〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号RASSF5を有する、項目1〜136のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２８２】
138)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.151〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号GATA3を有する、項目1〜137のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２８３】
139)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.152〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号DKFZP564O0823を有する、項目1〜138のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２８４】
140)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.154〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号TXNIPを有する、項目1〜139のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２８５】
141)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.155〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号DTX4を有する、項目1〜140のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２８６】
142)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.156〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号DARCを有する、項目1〜141のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２８７】
143)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.157〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号RNASE6を有する、項目1〜142のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２８８】
144)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.158〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CD86を有する、項目1〜143のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２８９】
145)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.159〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号ZFP36を有する、項目1〜144のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２９０】
146)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.160〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号BASP1を有する、項目1〜145のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２９１】
147)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.161〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CKAP1を有する、項目1〜146のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２９２】
148)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.162〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号HCP5を有する、項目1〜147のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２９３】
149)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.163〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号GRB14を有する、項目1〜148のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２９４】
150)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.164〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号GJA7を有する、項目1〜149のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２９５】
151)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.165〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号FLJ14054を有する、項目1〜150のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２９６】
152)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.166〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号VNN1を有する、項目1〜151のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２９７】
153)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.167〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号ADCY7を有する、項目1〜152のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２９８】
154)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.168〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号MS4A6Aを有する、項目1〜153のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０２９９】
155)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.169〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CPA3を有する、項目1〜154のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３００】
156)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.170〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号PIM1を有する、項目1〜155のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３０１】
157)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.171〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CCL19を有する、項目1〜156のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３０２】
158)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.172〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号SYKを有する、項目1〜157のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３０３】
159)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.174〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号SIT1を有する、項目1〜158のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３０４】
160)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.175〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、プローブセット番号228812_atにより同定可能である、項目1〜159のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３０５】
161)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.176〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号NAP1L2を有する、項目1〜160のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３０６】
162)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.177〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CCL13を有する、項目1〜161のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３０７】
163)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.178〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号SLAを有する、項目1〜162のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３０８】
164)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.179〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号NOD3を有する、項目1〜163のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３０９】
165)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.180〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号PRKCHを有する、項目1〜164のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３１０】
166)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.181〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号TRD@を有する、項目1〜165のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３１１】
167)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.182〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号BAALCを有する、項目1〜166のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３１２】
168)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.183〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号RP1-93H18.5を有する、項目1〜167のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３１３】
169)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.184〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号FLJ20701を有する、項目1〜168のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３１４】
170)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.185〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号SH3TC2を有する、項目1〜169のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３１５】
171)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.186〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CCR2を有する、項目1〜170のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３１６】
172)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.187〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CCL5を有する、項目1〜171のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３１７】
173)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.189〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号HLA-DPA1を有する、項目1〜172のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３１８】
174)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.190〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号PECAM1を有する、項目1〜173のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３１９】
175)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.192〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号AMIGO2を有する、項目1〜174のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３２０】
176)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.193〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CLEC7Aを有する、項目1〜175のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３２１】
177)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.194〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号P2RY14を有する、項目1〜176のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３２２】
178)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.195〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号PIK3AP1を有する、項目1〜177のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３２３】
179)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.196〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号ADH1Bを有する、項目1〜178のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３２４】
180)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.197〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号TOP1MTを有する、項目1〜179のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３２５】
181)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.199〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CD276を有する、項目1〜180のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３２６】
182)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.200〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号JAM2を有する、項目1〜181のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３２７】
183)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.202〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号C1Sを有する、項目1〜182のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３２８】
184)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.203〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号TGFBR3を有する、項目1〜183のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３２９】
185)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.204〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号ITGALを有する、項目1〜184のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３３０】
186)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.206〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号IL1R1を有する、項目1〜185のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３３１】
187)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.207〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号HLA-DRB1を有する、項目1〜186のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３３２】
188)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.208〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号GIMAP2を有する、項目1〜187のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３３３】
189)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.209〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号ZC3H12Dを有する、項目1〜188のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３３４】
190)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.210〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号PCDH9を有する、項目1〜189のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３３５】
191)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.211〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号SLAMF7を有する、項目1〜190のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３３６】
192)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.212〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号MGC7036を有する、項目1〜191のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３３７】
193)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.214〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号RGS18を有する、項目1〜192のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３３８】
194)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.215〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CD53を有する、項目1〜193のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３３９】
195)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.216〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号MPEG1を有する、項目1〜194のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３４０】
196)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.217〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号SSBP4を有する、項目1〜195のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３４１】
197)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.218〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、プローブセット番号231262_atにより同定可能である、項目1〜196のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３４２】
198)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.219〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CDH19を有する、項目1〜197のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３４３】
199)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.221〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CTBP2を有する、項目1〜198のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３４４】
200)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.222〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号FAM107Bを有する、項目1〜199のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３４５】
201)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.223〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号IGKCを有する、項目1〜200のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３４６】
202)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.224〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号ITGAMを有する、項目1〜201のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３４７】
203)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.227〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CKAP1を有する、項目1〜202のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３４８】
204)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.228〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号MGC16291を有する、項目1〜203のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３４９】
205)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.229〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号DDEF2を有する、項目1〜204のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３５０】
206)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.230〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号TNFAIP2を有する、項目1〜205のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３５１】
207)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.231〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CXCL14を有する、項目1〜206のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３５２】
208)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.232〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CD209を有する、項目1〜207のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３５３】
209)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.233〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号COL9A3を有する、項目1〜208のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３５４】
210)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.234〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号ANKRD22を有する、項目1〜209のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３５５】
211)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.235〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号NCKAP1Lを有する、項目1〜210のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３５６】
212)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.236〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CMKOR1を有する、項目1〜211のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３５７】
213)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.237〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号HLA-DRB5を有する、項目1〜212のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３５８】
214)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.239〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号LCP1を有する、項目1〜213のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３５９】
215)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.240〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CXXC5を有する、項目1〜214のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３６０】
216)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.241〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号GJA7を有する、項目1〜215のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３６１】
217)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.242〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号FGD2を有する、項目1〜216のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３６２】
218)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.243〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号MAN1A1を有する、項目1〜217のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３６３】
219)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.245〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号C6orf115を有する、項目1〜218のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３６４】
220)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.247〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CXCL9を有する、項目1〜219のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３６５】
221)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.248〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号NPR3を有する、項目1〜220のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３６６】
222)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.249〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号FYBを有する、項目1〜221のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３６７】
223)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.250〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号VCAM1を有する、項目1〜222のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３６８】
224)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.251〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号FLI1を有する、項目1〜223のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３６９】
225)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.252〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CXXC5を有する、項目1〜224のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３７０】
226)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.254〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号TRAM2を有する、項目1〜225のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３７１】
227)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.255〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号SHC4を有する、項目1〜226のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３７２】
228)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.256〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号SLC9A9を有する、項目1〜227のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３７３】
229)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.257〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号PTPRCを有する、項目1〜228のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３７４】
230)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.258〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号PTGER4を有する、項目1〜229のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３７５】
231)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.259〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号LILRB1を有する、項目1〜230のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３７６】
232)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.261〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号PRDM1を有する、項目1〜231のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３７７】
233)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.262〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号ARHGAP15を有する、項目1〜232のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３７８】
234)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.263〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号SLC5A3を有する、項目1〜233のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３７９】
235)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.264〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号DOCK9を有する、項目1〜234のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３８０】
236)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.265〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号GPSM1を有する、項目1〜235のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３８１】
237)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.266〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CCL5を有する、項目1〜236のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３８２】
238)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.267〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号GLIPR1を有する、項目1〜237のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３８３】
239)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.268〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号APOL3を有する、項目1〜238のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３８４】
240)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.269〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号HLA-DMBを有する、項目1〜239のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３８５】
241)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.270〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号SYNPO2を有する、項目1〜240のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３８６】
242)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.271〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、プローブセット番号221651_x_atにより同定可能である、項目1〜241のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３８７】
243)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.273〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、プローブセット番号231929_atにより同定可能である、項目1〜242のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３８８】
244)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.274〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CASP1を有する、項目1〜243のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３８９】
245)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.275〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号PRKCQを有する、項目1〜244のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３９０】
246)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.276〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号IL1R2を有する、項目1〜245のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３９１】
247)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.277〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CARD15を有する、項目1〜246のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３９２】
248)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.278〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号ARHGDIBを有する、項目1〜247のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３９３】
249)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.279〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号HLA-DRB4を有する、項目1〜248のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３９４】
250)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.280〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号SART2を有する、項目1〜249のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３９５】
251)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.281〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号LSP1を有する、項目1〜250のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３９６】
252)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.282〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号AMPD3を有する、項目1〜251のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３９７】
253)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.283〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号SEMA4Fを有する、項目1〜252のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３９８】
254)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.285〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号ISOC1を有する、項目1〜253のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０３９９】
255)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.288〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号HPS3を有する、項目1〜254のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４００】
256)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.290〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号HOXB7を有する、項目1〜255のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４０１】
257)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.291〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号ZNFN1A1を有する、項目1〜256のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４０２】
258)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.292〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号ARHGAP9を有する、項目1〜257のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４０３】
259)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.293〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号GATA2を有する、項目1〜258のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４０４】
260)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.294〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号AP2B1を有する、項目1〜259のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４０５】
261)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.295〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CTSCを有する、項目1〜260のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４０６】
262)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.296〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号PLK2を有する、項目1〜261のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４０７】
263)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.297〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CD4を有する、項目1〜262のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４０８】
264)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.298〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号GGTA1を有する、項目1〜263のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４０９】
265)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.300〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号GADD45Bを有する、項目1〜264のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４１０】
266)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.301〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号FLJ10847を有する、項目1〜265のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４１１】
267)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.302〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号KIF21Bを有する、項目1〜266のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４１２】
268)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.303〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CCND2を有する、項目1〜267のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４１３】
269)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.304〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号PRG1を有する、項目1〜268のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４１４】
270)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.307〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号SLC40A1を有する、項目1〜269のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４１５】
271)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.308〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CRIP1を有する、項目1〜270のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４１６】
272)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.309〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号LOC283070を有する、項目1〜271のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４１７】
273)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.310〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号SIGLEC1を有する、項目1〜272のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４１８】
274)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.311〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号ZNF11Bを有する、項目1〜273のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４１９】
275)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.312〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CXCR4を有する、項目1〜274のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４２０】
276)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.313〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号HLA-DMAを有する、項目1〜275のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４２１】
277)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.315〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号MRC1を有する、項目1〜276のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４２２】
278)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.315a〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号LMO2を有する、項目1〜277のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４２３】
279)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.316〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号DENND2Dを有する、項目1〜278のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４２４】
280)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.317〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CCL18を有する、項目1〜279のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４２５】
281)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.319〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号P2RY13を有する、項目1〜280のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４２６】
282)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.320〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号ANGPTL1を有する、項目1〜281のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４２７】
283)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.322〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、プローブセット番号230391_atにより同定可能である、項目1〜282のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４２８】
284)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.323〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号C8orf51を有する、項目1〜283のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４２９】
285)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.324〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号GIMAP8を有する、項目1〜284のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４３０】
286)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.325〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、プローブセット番号2277880_s_atにより同定可能である、項目1〜285のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４３１】
287)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.326〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号JAK2を有する、項目1〜286のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４３２】
288)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.327〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号TNFSF10を有する、項目1〜287のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４３３】
289)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.328〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号C1Rを有する、項目1〜288のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４３４】
290)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.329〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号ACPL2を有する、項目1〜289のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４３５】
291)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.331〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号TNFRSF19を有する、項目1〜290のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４３６】
292)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.332〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号LRP12を有する、項目1〜291のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４３７】
293)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.334〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、プローブセット番号1557116_atにより同定可能である、項目1〜292のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４３８】
294)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.335〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号PRKCB1を有する、項目1〜293のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４３９】
295)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.336〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号IPO11を有する、項目1〜294のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４４０】
296)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.337〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号DLGAP1を有する、項目1〜295のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４４１】
297)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.338〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号PRKAR2Bを有する、項目1〜296のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４４２】
298)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.339〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号MAP3K8を有する、項目1〜297のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４４３】
299)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.340〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号EVI2Bを有する、項目1〜298のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４４４】
300)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.341〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号GBP1を有する、項目1〜299のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４４５】
301)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.342〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CXCL10を有する、項目1〜300のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４４６】
302)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.343〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CAMK2N1を有する、項目1〜301のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４４７】
303)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.344〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号MED12Lを有する、項目1〜302のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４４８】
304)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.345〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号ID2を有する、項目1〜303のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４４９】
305)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.346〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CTBP2を有する、項目1〜304のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４５０】
306)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.347〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号IGLJ3を有する、項目1〜305のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４５１】
307)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.348〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号GBP4を有する、項目1〜306のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４５２】
308)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.349〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号LOC439949を有する、項目1〜307のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４５３】
309)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.350〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号FBXO16を有する、項目1〜308のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４５４】
310)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.351〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号PRF1を有する、項目1〜309のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４５５】
311)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.352〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号TRAM2を有する、項目1〜310のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４５６】
312)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.353〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号LYNを有する、項目1〜311のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４５７】
313)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.355〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CENTD1を有する、項目1〜312のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４５８】
314)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.356〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号FLJ20273を有する、項目1〜313のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４５９】
315)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.357〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号TFECを有する、項目1〜314のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４６０】
316)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.358〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号PPP1R16Bを有する、項目1〜315のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４６１】
317)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.359〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CD48を有する、項目1〜316のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４６２】
318)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.361〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号HLA-DPB1を有する、項目1〜317のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４６３】
319)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.362〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号GTPBP5を有する、項目1〜318のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４６４】
320)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.363〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号GBP5を有する、項目1〜319のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４６５】
321)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.364〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号MAP1Bを有する、項目1〜320のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４６６】
322)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.365〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号EXTL3を有する、項目1〜321のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４６７】
323)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.366〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CORO1Aを有する、項目1〜322のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４６８】
324)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.367〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号PDGFRLを有する、項目1〜323のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４６９】
325)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.368〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号RP9を有する、項目1〜324のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４７０】
326)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.369〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号RHOUを有する、項目1〜325のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４７１】
327)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.370〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号MTAC2D1を有する、項目1〜326のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４７２】
328)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.371〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CCL8を有する、項目1〜327のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４７３】
329)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.373〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CECR1を有する、項目1〜328のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４７４】
330)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.374〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号SLC40A1を有する、項目1〜329のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４７５】
331)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.375〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号ADCY6を有する、項目1〜330のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４７６】
332)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.376〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CPを有する、項目1〜331のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４７７】
333)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.377〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号EDG1を有する、項目1〜332のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４７８】
334)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.379〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号RGS3を有する、項目1〜333のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４７９】
335)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.380〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、プローブセット番号228339_atにより同定可能である、項目1〜334のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４８０】
336)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.381〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号ABHD5を有する、項目1〜335のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４８１】
337)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.382〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号MS4A7を有する、項目1〜336のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４８２】
338)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.384〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号PRKCHを有する、項目1〜337のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４８３】
339)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.385〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号LOC286071を有する、項目1〜338のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４８４】
340)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.386〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号BLNKを有する、項目1〜339のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４８５】
341)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.387〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、プローブセット番号242546_atにより同定可能である、項目1〜340のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４８６】
342)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.390〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号PCDHGC3を有する、項目1〜341のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４８７】
343)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.391〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CAMSAP1L1を有する、項目1〜342のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４８８】
344)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.392〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号NPY1Rを有する、項目1〜343のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４８９】
345)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.393〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CD274を有する、項目1〜344のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４９０】
346)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.394〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号PGM5を有する、項目1〜345のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４９１】
347)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.395〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号PLCG2を有する、項目1〜346のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４９２】
348)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.397〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号TNFSF10を有する、項目1〜347のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４９３】
349)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.398〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号BTG2を有する、項目1〜348のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４９４】
350)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.399〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号LAMP3を有する、項目1〜349のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４９５】
351)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.400〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号IGLC1を有する、項目1〜350のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４９６】
352)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.401〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号SIPA1L1を有する、項目1〜351のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４９７】
353)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.402〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号AIF1を有する、項目1〜352のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４９８】
354)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.403〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号IGLC2を有する、項目1〜353のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０４９９】
355)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.404〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号B2Mを有する、項目1〜354のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５００】
356)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.405〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CLEC7Aを有する、項目1〜355のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５０１】
357)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.406〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号MGC17330を有する、項目1〜356のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５０２】
358)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.407〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号IGF1Rを有する、項目1〜357のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５０３】
359)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.408〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号HIVEP1を有する、項目1〜358のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５０４】
360)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.409〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号FKBP14を有する、項目1〜359のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５０５】
361)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.410〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号LAPTM5を有する、項目1〜360のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５０６】
362)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.411〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号AB13BPを有する、項目1〜361のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５０７】
363)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.412〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号HLA-Eを有する、項目1〜362のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５０８】
364)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.413〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号ARL4Cを有する、項目1〜363のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５０９】
365)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.415〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号ASSを有する、項目1〜364のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５１０】
366)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.417〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号ITGB3を有する、項目1〜365のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５１１】
367)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.417〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号SYKを有する、項目1〜366のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５１２】
368)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.418〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号RAC2を有する、項目1〜367のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５１３】
369)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.419〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、プローブセット1557222_atにより同定可能である、項目1〜368のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５１４】
370)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.420〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CD3Gを有する、項目1〜369のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５１５】
371)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.421〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号IGF1を有する、項目1〜370のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５１６】
372)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.422〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、プローブセット番号228858_atにより同定可能である、項目1〜371のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５１７】
373)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.423〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CYB5Aを有する、項目1〜372のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５１８】
374)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.424〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号TTC25を有する、項目1〜373のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５１９】
375)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.425〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号SLAMF6を有する、項目1〜374のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５２０】
376)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.426〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号ARHGAP21を有する、項目1〜375のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５２１】
377)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.428〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号FLOT1を有する、項目1〜376のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５２２】
378)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.429〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号IBRDC2を有する、項目1〜377のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５２３】
379)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.430〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号KIAA1794を有する、項目1〜378のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５２４】
380)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.431〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号OLFML1を有する、項目1〜379のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５２５】
381)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.432〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号GMFGを有する、項目1〜380のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５２６】
382)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.433〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号TNFRSF1Bを有する、項目1〜381のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５２７】
383)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.434〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、プローブセット番号217629_atにより同定可能である、項目1〜382のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５２８】
384)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.436〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号DEF6を有する、項目1〜383のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５２９】
385)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.437〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号MAP4K4を有する、項目1〜384のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５３０】
386)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.438〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CMKOR1を有する、項目1〜385のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５３１】
387)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.439〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、プローブセット番号1563461_atにより同定可能である、項目1〜386のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５３２】
388)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.440〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CHKAを有する、項目1〜387のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５３３】
389)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.441〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、プローブセット番号226865_atにより同定可能である、項目1〜388のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５３４】
390)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.442〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号HS3ST3B1を有する、項目1〜389のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５３５】
391)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.443〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CXorf9を有する、項目1〜390のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５３６】
392)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.445〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号EVI2Aを有する、項目1〜391のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５３７】
393)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.446〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号NFAM1を有する、項目1〜392のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５３８】
394)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.447〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、プローブセット番号242874_atにより同定可能である、項目1〜393のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５３９】
395)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.450〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号ATP5Jを有する、項目1〜394のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５４０】
396)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.451〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号CYLDを有する、項目1〜395のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５４１】
397)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.452〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号GIMAP6を有する、項目1〜396のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５４２】
398)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.453〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号MFAP4を有する、項目1〜397のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５４３】
399)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.454〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号TUBB2Bを有する、項目1〜398のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５４４】
400)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.455〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号NELL2を有する、項目1〜399のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５４５】
401)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.456〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、プローブセット番号236583_atにより同定可能である、項目1〜400のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５４６】
402)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.457〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号IL1RNを有する、項目1〜401のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５４７】
403)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.459〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号KIAA1211を有する、項目1〜402のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５４８】
404)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.460〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号ADAMDEC1を有する、項目1〜403のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５４９】
405)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.461〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号AOC3を有する、項目1〜404のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５５０】
406)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.463〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号SAMHD1を有する、項目1〜405のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５５１】
407)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.465〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号SLC22A3を有する、項目1〜406のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５５２】
408)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.466〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号IGLV3-25を有する、項目1〜407のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５５３】
409)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.467〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、プローブセット番号1556185_a_atにより同定可能である、項目1〜408のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５５４】
410)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.468〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号RAB11FIP1を有する、項目1〜409のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５５５】
411)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.469〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号PER2を有する、項目1〜410のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５５６】
412)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.470〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号TTLを有する、項目1〜411のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５５７】
413)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.472〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号SIAHBP1を有する、項目1〜412のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５５８】
414)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.473〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号FLJ22536を有する、項目1〜413のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５５９】
415)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.474〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号RP6-213H19.1を有する、項目1〜414のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５６０】
416)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.475〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、プローブセット番号235804_atにより同定可能である、項目1〜415のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５６１】
417)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.476〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号NCF4を有する、項目1〜416のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５６２】
418)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.477〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号EPSTI1を有する、項目1〜417のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５６３】
419)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.478〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号LOC441212を有する、項目1〜418のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５６４】
420)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.479〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号ANK3を有する、項目1〜419のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５６５】
421)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.480〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号PCDH9を有する、項目1〜420のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５６６】
422)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.481〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号C21orf86を有する、項目1〜421のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５６７】
423)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.482〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号DHRS9を有する、項目1〜422のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５６８】
424)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.483〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号ARHGAP25を有する、項目1〜423のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５６９】
425)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.484〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号TRAF4を有する、項目1〜424のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５７０】
426)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.485〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号LST1を有する、項目1〜425のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５７１】
427)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.486〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号PALMDを有する、項目1〜426のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５７２】
428)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.487〜4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号TAP1を有する、項目1〜427のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５７３】
429)別の態様においては、本発明は、必要に応じて、表4に同定された4.488として標識された1個以上の遺伝子と組み合わせた、記号MSX2を有する、項目1〜428のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５７４】
430)別の態様においては、本発明は、記号SIRPGを有する、項目1〜429のいずれか1つに記載の1個以上の遺伝子を用いる。
【０５７５】
一態様においては、本発明は、表7に列挙される遺伝子を用いる。
【０５７６】
2009538607.tif 000021
【０５７７】
一態様においては、本発明は、表9より選択される1個以上の遺伝子を用いる。
【０５７８】
2009538607.tif 000022
【０５７９】
一態様においては、本発明は、表11より選択される1個以上の遺伝子を用いる。
【０５８０】
2009538607.tif 000023
2009538607.tif 000024
【０５８１】
一態様においては、本発明は、表12より選択される1個以上の遺伝子を用いる。
【０５８２】
2009538607.tif 000025
【０５８３】
一態様においては、本発明は、表13より選択される1個以上の遺伝子を用いる。
【０５８４】
2009538607.tif 000026
【０５８５】
PCRは、マイクロアレイよりも感度の高い技術であり、従って、より低レベルの示差的に発現される遺伝子を検出することができる。
【０５８６】
特に、以下の遺伝子が、PCR分析にとって好適である：IL7R、CD3D、CD3E、CD52、UBD、GPR171、GMZK、PRKCQ、STAT4、TRDV2、TRAT1、TRBV19、CD69、INDO、CD45R、CD45RO、FOXP3、CD20、CCL5、FASLG、GNLY、GZMB、PRF1、IFNG、ICOS、TBX21、CD8A、CD3E、CXCL10、CXCL11、IRF1、TLR7およびCXCR3。
【０５８７】
一態様においては、用いられる遺伝子を、CCL5、TRAT1、STAT4、PRKCQ、GPR171、UBD、CD52、CD3D、PRF1、CD8A、CXCL10、CD69、TRBV19、TRDV2、IL7R、GZMKおよびCD45Rを含むか、またはそれからなる群より選択する。
【０５８８】
一態様においては、用いられる遺伝子を、FASLG、GNLY、GZMB、IFNG、ICOS、TBX21、CD3E、CXCL11、CXCR3、CD20、FOXP3、INDO、IRF1およびTLR7を含むか、またはそれからなる群より選択する。
【０５８９】
遺伝子FOXP3および／またはPRF1が、本発明に従うPCR分析にとって特に好適である。
【０５９０】
免疫組織化学のための好適な標的としては、CD3、CD8、CD86、LAMP、CD20、CD45RO、CXCR3、CXL10/11、CD69、グランザイムB、IDO、B細胞ならびにNKファミリー、HLAファミリー、T細胞受容体ファミリーおよび／もしくは活性化T細胞に由来する1個以上の遺伝子に由来する遺伝子産物が挙げられる。
【０５９１】
本発明のさらなる態様においては、例えば、本明細書に列挙されるものなどの1個以上の免疫遺伝子が、示差的に発現されず、および／または下方調節され、および／または上方調節される場合、非応答者であることを示す遺伝子特性が提供される。
【０５９２】
一態様においては、前記遺伝子はFOXP3ではない。
【０５９３】
さらなる態様に従えば、本発明は、患者が、好適な免疫療法に対して好ましく応答する可能性が高く、次いで、例えば、Mage特異的免疫療法を用いる治療後にMageを発現する癌を有する患者の生存率の改善をもたらす可能性があることを示す遺伝子特性を提供する。表1に開示される遺伝子に由来する、少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、30または31個の遺伝子のこの遺伝子特性は、Mage抗原特異的癌免疫療法に応答しないMageを発現する腫瘍患者の遺伝子特性と比較して、示差的発現を特徴とする。
【０５９４】
一態様においては、本発明は、免疫浸潤および活性化に関する62個の公知の遺伝子のうちの1個の示差的発現に基づくプロフィールを提供する。
【０５９５】
予測される遺伝子は、主に免疫浸潤および活性化に関連する遺伝子の発現および頻繁には上方調節に対応する。これらの遺伝子は、HLAクラスII、インターロイキン-2受容体γ、T細胞受容体遺伝子(TRBV19、TRAT1、TRGC2)、グランザイム、およびCD69が挙げられる。
【０５９６】
一実施形態においては、例えば、MAGEを発現する腫瘍を有する患者、1個以上、例えば、少なくとも5個、好適には、6、7、8、9、10個の表2の遺伝子が示差的に発現される治療に応答する患者中に存在する遺伝子特性を提供する。以下の図5aに示されるように、応答者および非応答者の特性評価は、TCR、CD3および／またはIL-7などの1個または2個のみの遺伝子上での示差的発現に基づいてもよい。1個または2個のみの遺伝子を用いる方法において特に好適であると考えられる他の遺伝子としては、IL7R、CD3D、CD3E、CD52、UBD、GPR171、GMZK、PRKCQ、STAT4、TRDV2、TRAT1、TRBV19、CD69、INDO、CD45R、CD45RO、FOXP3、CD20、CCL5、FASLG、GNLY、GZMB、PRF1、IFNG、ICOS、TBX21、CD8A、CD3E、CXCL10、CXCL11、TRF1、TLR7およびCXCR3が挙げられ、好適な感度の分析技術の使用を必要としてもよい。
【０５９７】
本発明は、本明細書で、前記特性／プロフィールの同定のための本明細書に列挙される遺伝子の全ての順列の使用に拡張される。
【０５９８】
本発明はまた、記載の成分／エレメントを含み、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、本明細書に記載の本発明に従う実施形態に拡張される。本発明は、例えば、Hongwei Wuら、2007(「原核生物における等価遺伝子の階層的分類(Hierarchical classification of equivalent genes in prokaryotes)」、Nucliec Acid Research Advance Access)により記載されたような遺伝子の階層的分類により特性評価されるものなどの、本明細書に列挙される遺伝子の機能的等価物に拡張される。
【０５９９】
理論によって束縛されることを望むものではないが、それは必ずしも前記特性に特徴的である前記遺伝子自体ではないが、むしろそれは基礎的に重要である遺伝子機能であると考えられる。かくして、上記、例えば、表1、2、3、4、7、9、11、12または13に列挙されたものなどの免疫活性化遺伝子に対する機能的等価遺伝子を、前記特性において用いることができる。例えば、Journal of the National Cancer Institute Vol 98, No. 7 April 5 2006を参照されたい。
【０６００】
前記遺伝子は特異的プローブにより同定されたものであり、かくして、当業者であれば、上記遺伝子の説明が、該プローブにハイブリダイズするものの現在の理解に基づく説明であることを理解するであろう。しかしながら、指定された条件下で、関連するプローブへのハイブリダイゼーションを繰り返すことにより、該遺伝子のために用いられる命名法に関係なく、必要な遺伝子を同定することができる。
【０６０１】
本発明は、癌免疫療法、例えば、癌精巣免疫療法などの免疫療法に対する応答者または非応答者として、患者を予測するか、または同定するための本発明に従うプロフィールの使用に拡張される。
【０６０２】
かくして、本発明は、患者由来サンプルが免疫療法に対する応答者または非応答者として誘導される患者を特性評価するために、本発明に従うプロフィール／遺伝子の示差的発現に基づいて、該サンプルを分析する方法を含む。
【０６０３】
一態様においては、本発明は、本発明に従うプロフィールを同定する方法であって、下記工程：
a)患者由来サンプルを、1個以上の免疫応答遺伝子の示差的発現について分析する工程、および
b)工程a)の結果に基づいて、該サンプルが由来する患者を好適な免疫療法に対する応答者または非応答者として特性評価する工程であって、必要に応じて、参照もしくは標準物との比較により実施する、前記工程、
を含む、前記方法を提供する。
【０６０４】
好適な標準物は上記されている。
【０６０５】
従って、本発明は、一般的には、一態様において、生物学的サンプル中での遺伝子特性の検出のための方法であって、表1、2、3、4、7、9、11、12または13の1個以上の遺伝子、例えば、少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30または31個の遺伝子(例えば、表1に記載の遺伝子)の発現の分析を含む、前記方法に関する。一実施形態においては、前記分析は、表2に記載の少なくとも5個、好適には、6、7、8、9または10個の遺伝子の発現を含む。
【０６０６】
一態様においては、本発明は、サンプルが由来する患者が、癌免疫療法などの免疫療法に対する応答者または非応答者である可能性があるかどうかを同定するための該サンプル中の、表1、2、3、4、7、9、11、12および／または13に列挙された1個以上の遺伝子などの免疫活性化遺伝子に由来するポリヌクレオチドの発現レベルを測定する方法であって、
該サンプルからRNAを単離する工程、
必要に応じて、前記遺伝子に関するサンプルからcDNAのコピーを増幅させ、該サンプル中のcDNAのレベルを定量する工程、
を含む、前記方法を提供する。
【０６０７】
一実施形態においては、診断方法は、被験者が、例えば、表1などに記載の遺伝子の遺伝子産物の対応するmRNAのレベルおよび／もしくはタンパク質レベルを検出することにより、例えば、ノーザンブロット分析、逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)、in situハイブリダイゼーション、免疫沈降法、ウェスタンブロットハイブリダイゼーション、または免疫組織化学法などによる技術を用いることにより、表1または本明細書に記載の本発明の任意の他の実施形態に記載の遺伝子の遺伝子産物のいずれかを発現するかどうかを決定することを含む。この方法に従って、細胞を被験者から取得し、分析された遺伝子のタンパク質、またはmRNAのレベルを、非応答者の患者のものと比較することができる。表1または本発明の別の実施形態から選択される1個以上、例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30もしくは31個の遺伝子を示差的に発現する患者は、免疫療法、例えば、Mage抗原特異的癌免疫療法などの癌免疫療法に由来する利益を予測することができるものである。例えば、マイクロアレイ上の所与の位置にハイブリダイズする核酸分子を、ハイブリダイゼーションシグナルが、例えば、Mage特異的免疫療法に臨床的に応答しない被験者から得た核酸サンプルにハイブリダイズした同一のアレイ上の同じ位置のハイブリダイゼーションシグナルよりも高い場合、示差的に発現されると言う。
【０６０８】
遺伝子プロファイリングにかけた30人の患者の結果を、図5に示す。これは、本発明の遺伝子特性が、MAGE抗原特異的抗原免疫療法に対する臨床応答と共に整列されることを写真を用いて証明する。
【０６０９】
あるいは、癌患者を、癌または腫瘍から誘導された組織切片の目視から、免疫療法に対する応答者または非応答者として特性評価することができる。応答者は、癌／腫瘍微小環境への免疫応答細胞の浸潤を有する患者である可能性がある。
【０６１０】
本発明はまた、患者が、好適な免疫療法、例えば、Mage免疫療法などの癌免疫療法に対する応答者または非応答者である可能性があるかどうかを示すために、1個以上の免疫応答／活性化遺伝子の示差的発現に基づいて、本明細書に特異的に列挙されない新しい遺伝子プロフィールを作製する方法であって、
a)1個以上の免疫活性化遺伝子の示差的発現について、少なくとも2つの患者由来サンプルであって、該サンプル群が、好適な免疫療法に対する応答者および非応答者の両方を含む、前記サンプルを分析する工程、ならびに
b)該サンプルが由来する患者の好適な治療後に、同じものを臨床結果と相関させる工程、ならびに
c)応答者および／または非応答者において示差的に発現される1個以上の遺伝子を同定する工程、
を含む、前記方法も提供する。
【０６１１】
新しいプロフィールを同定した後、本発明はまた、以前には特性評価されていないサンプルの分析、それを応答者または非応答者として指定すること(必要に応じて)および必要に応じて、治療上有効量の好適な免疫療法、例えば、Mage免疫療法などの癌免疫療法を、応答者として指定された1人以上の患者に施すことにも拡張される。
【０６１２】
本発明はまた、患者が免疫療法に対する応答者または非応答者である可能性があるかどうかを示すために、表1、2、3、4、7、9、11、12および／または13に記載の1個以上の遺伝子配列の示差的発現に基づいて遺伝子プロフィールを作製する方法であって、
a)(i)表1、2、3、4、7、9、11、12および／もしくは13に記載の1個以上の遺伝子配列ならびに(ii)必要に応じて、表1、2、3、4、7、9、11、12および／もしくは13に記載されていない1個以上の遺伝子配列の示差的発現について、サンプル群が好適な免疫療法に対する応答者および非応答者の両方を含む、少なくとも2つの患者由来サンプルを分析する工程；
b)該サンプルが由来する患者の好適な治療後に、前記1個以上の遺伝子配列の示差的発現を、臨床結果と相関させる工程、ならびに
c)応答者および非応答者において示差的に発現される1個以上の遺伝子を同定する工程、
を含む、前記方法を提供する。
【０６１３】
前記プロフィールを同定した後、本発明はまた、以前には特性評価されていないサンプルの分析、それを応答者または非応答者として指定すること(必要に応じて)および必要に応じて、治療上有効量の好適な免疫療法、例えば、Mage免疫療法などの癌免疫療法を、応答者として指定された1人以上の患者に施すことにも拡張される。
【０６１４】
本発明は、本発明に従うプロフィールを同定するための患者由来サンプル上で分析を実施するための少なくとも1つの成分を含む診断キットを提供し、その結果を用いて、該サンプルが由来する患者を、免疫療法に対する応答者または非応答者として指定することができる。
【０６１５】
このキットは、PCR(QPCRなど)、マイクロアレイ分析、免疫組織化学または1個以上の遺伝子の示差的発現を評価するのに用いることができる他の分析技術のための材料／試薬を含んでもよい。
【０６１６】
本発明はまた、表1またはあるいは表2、3、4、7、9、11、12および／もしくは13に記載の少なくとも5個の遺伝子などの1個以上の遺伝子のmRNAもしくはcDNAにハイブリダイズすることができるプローブのセットを含む診断キット、例えば、表1に記載の少なくとも6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30または31個の遺伝子のmRNAまたはそのcDNAにハイブリダイズすることができるプローブのセットを含む診断キットを提供する。
【０６１７】
別の実施形態においては、本発明は、診断キット、例えば、マイクロアレイ基質と、例えば、表1または本発明の遺伝子特性を示すことができる本発明の任意の他の実施形態に由来する、例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30または31個の遺伝子から発現されるmRNAまたはcDNAにハイブリダイズすることができるプローブを含むそのようなマイクロアレイを含む診断キットに関する。
【０６１８】
一態様においては、本発明は、本発明に従う特性の同定に適合させたマイクロアレイを提供する。
【０６１９】
本発明はまた、例えば、表1、2、3、4、7、9、11、12または13に由来する、本発明において用いられる1個以上の遺伝子から発現されるmRNAまたはcDNA部分にハイブリダイズするのに好適な基質およびプローブに拡張される。
【０６２０】
市販のマイクロアレイは、分析の正確性を補助するために、常に考慮下で遺伝子の示差的発現を特性評価するのに必要とされるよりも多くのプローブを含む。かくして、1個以上のプローブセットが、同じ遺伝子を認識してもよい。
【０６２１】
かくして、一実施形態においては、複数のプローブまたはプローブセットを用いて、免疫活性化遺伝子が、示差的に発現される、例えば、上方調節されるかどうかを同定する。
【０６２２】
前記診断キットは、例えば、マイクロアレイ中に整列されたプローブを含んでもよい。具体的には、例えば、本明細書に記載の1個以上のプローブを含む、調製されたマイクロアレイを、Affimetrixなどの会社により容易に調製し、それによって、本発明に従う前記プロフィールを同定するための特異的試験および必要に応じて、試薬を提供することができる。
【０６２３】
一実施形態においては、マイクロアレイまたは診断キットは、Mage遺伝子などの関連する癌精巣抗原発現遺伝子の存在または非存在についてさらに試験することができるであろう。かくして、一態様においては、本発明は、好適な条件下で、前記ハイブリダイゼーションにとって好適なプローブおよび／またはプローブセットを提供する。本発明はまた、本発明に従う遺伝子プロフィールの同定のための、例えば、本明細書に記載のようなプローブまたはその機能的等価物の使用に拡張される。
【０６２４】
本明細書に記載の本発明は、前記特性の同定のための本明細書に列挙されるプローブ(またはその機能的類似体)の全ての順列の使用に拡張される。
【０６２５】
一態様においては、本発明は、本発明に従う遺伝子プロフィールが患者由来サンプル中に存在するかどうかを確立するための、免疫活性化遺伝子の少なくとも1個の遺伝子産物の示差的発現の同定のためのプローブの使用を提供する。
【０６２６】
表1Bは、典型的には長さ25マーのプローブを設計することができ、例えば、表1(またはあるいは、表2、3、4、7、9、11、12もしくは13)の遺伝子から発現されるmRNA(またはそのcDNA)を同定するのに好適であるプローブセットを開示している。そのようなプローブおよびプローブセットは、本発明の一態様である。典型的には、各プローブセットは、プローブセットに由来する配列に正確に一致する、約25または正確に25ヌクレオチドの約または正確に11個の個々の配列を含んでもよい。
【０６２７】
従って、一態様においては、本発明は、表1(またはあるいは、表2、3、4、7、9、11、12もしくは13)に由来する遺伝子から発現されるmRNA(またはそのcDNA)を認識することができるオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーならびにこれらのプローブおよびプライマーに基づく診断キットに関する。そのようなキットは、Mage遺伝子の検出のためのプローブまたはキットを含んでもよい。
【０６２８】
一態様においては、本発明は、以下の13個のプローブ：204661_at、205890_s_at、206118_at、206666_at、207651_at、210038_at、210972_x_at、211144_x_at、211796_s_at、213193_x_at、213539_at、217147_s_at、34210_atの1個以上により同定可能な表3の1個以上の遺伝子の示差的発現に基づくプロフィールを提供する。
【０６２９】
これらのプローブおよびその標的遺伝子のさらなる詳細を、以下の表3Aに与える。一般的には、ハイブリダイゼーションを、50℃の3X SSC、0.1％SDSなどのストリンジェントな条件下で実施することができる。
【０６３０】
一度、標的遺伝子／プロフィールが同定されたら、その標的にハイブリダイズする代替的なプローブを設計することは、当業者の能力の範囲内にある。従って、本発明はまた、好適な条件下で、本発明の遺伝子の同じ示差的発現を測定して、記載の特性／プロフィールを提供するプローブに拡張される。
【０６３１】
本発明はまた、癌患者が好適な免疫療法を用いる治療に対する応答者または非応答者であるかどうかの分析における関連するプローブの使用に拡張される。本発明はまた、前記特性の同定のための公知のマイクロアレイの使用(およびそれを用いるプロセス)に拡張される。
【０６３２】
核酸プローブは、長さ少なくとも10、15、20、25、30、35、40、50、75、100個以上のヌクレオチドであってよく、完全長遺伝子を含んでもよい。本発明における使用のためのプローブは、ストリンジェントな条件下で表1(または表2、3、4、7、9、11、12もしくは13)に列挙される遺伝子から発現されるmRNA(またはそのcDNA)に特異的にハイブリダイズすることができるものである。
【０６３３】
本発明はさらに、薬剤治療の前後に、表1または本明細書に記載の本発明の任意の他の実施形態から選択される、例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30または31個の遺伝子の発現プロフィールを分析する工程を含む、組織または細胞サンプル上の薬剤の効果をスクリーニングする方法に関する。従って、本発明は、遺伝子プロフィールを、患者が、例えば、Mage抗原特異的癌免疫療法から利益を得ることができるように、例えば、Mage抗原特異的癌免疫療法を用いる治療後に、生存率が改善された患者のものに変化させる(すなわち、遺伝子プロフィールを応答者のものに変化させる)ことができる薬剤のスクリーニング方法を提供する。
【０６３４】
本発明はさらに、表1または本明細書に記載の本発明の任意の他の実施形態から選択される、例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30または31個の遺伝子の発現プロフィールを分析し、それを標準物と比較して、患者がMage特異的免疫療法から利益を得ることができるかどうかを診断する工程を含む、患者の診断方法を提供する。
【０６３５】
本発明は、患者により与えられる腫瘍組織サンプルからの、表1または本発明の他の実施形態から選択された少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30または31個の遺伝子の発現プロフィールを分析し、該遺伝子の5個以上が発現されるかどうかを評価する工程を含む、患者の診断方法を含む。
【０６３６】
かくして、臨床適用においては、ヒト患者から得た組織サンプルを、表1または本明細書に記載の本発明の任意の他の実施形態から選択される、例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30または31個の遺伝子の発現の存在および／または非存在についてスクリーニングすることができる。
【０６３７】
本発明の文脈においては、前記サンプルは、潜在的に治療を必要とする患者から誘導された任意の生物組織または液体のものであってよい。このサンプルを、唾液、血液、尿、または原発性腫瘍もしくは転移からの生検などの固形組織、または以前に除去された組織の切片から誘導することができる。
【０６３８】
サンプルは、例えば、針生検コア、外科切除サンプルもしくはリンパ節組織を含むか、またはそれからなってもよい。これらの方法は、生検を取得し、必要に応じて、クリオスタット切片により分画して、全細胞集団の約80％まで腫瘍細胞を富化することを含む。特定の実施形態においては、これらのサンプルから抽出される核酸を、当業界でよく知られた技術を用いて増幅することができる。選択されたマーカー(例えば、表1の遺伝子産物)のレベルを検出し、例えば、Mage陽性の非応答患者の統計的に妥当な群と比較することができる。
【０６３９】
癌については、生物学的サンプルは、癌もしくは腫瘍細胞を含み、例えば、新鮮なサンプル(凍結サンプルなど)もしくはパラフィン中で保存されたサンプルなどの癌もしくは腫瘍から誘導することができる。かくして、パラフィン中で保存されたサンプルは、分解を受けてもよく、観察されるプロフィールを改変することができる。当業者であれば、前記プロフィールのパラメーターを再補正することにより、観察されたこれらの変化を補うことができるであろう。
【０６４０】
マイクロアレイ
マイクロアレイは、互いに分離した、個別の領域、典型的には、核酸のアレイであり、典型的には、約100/cm2〜1000/cm2の密度で配置するが、10000/cm2などのより大きい密度で配置することもできる。マイクロアレイ実験の原理は、所与の細胞系または組織に由来するmRNAを用いて、標識されたサンプル、典型的には、「標的」と呼ばれる、標識されたcDNAを作製し、これを、順序化されたアレイ中の固相表面上に固定された、多数の核酸配列、典型的には、DNA配列に同時にハイブリダイズさせることである。数万個の転写物種を、同時に検出および定量することができる。多くの異なるマイクロアレイ系が開発されてきたが、今日最も一般的に用いられる系を、配置される材料に従って2つの群に分けることができる：相補的DNA(cDNA)およびオリゴヌクレオチドマイクロアレイ。配置される材料を、一般的にはプローブと呼ぶが、これはそれがノーザンブロット分析において用いられるプローブと等価であるからである。cDNAアレイのためのプローブは、通常、ベクター特異的もしくは遺伝子特異的プライマーを用いて、cDNAライブラリーもしくはクローン集合体から作製されたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の産物であり、これを規定の位置にスポットとしてガラススライドもしくはナイロン膜上に印刷する。スポットは、典型的には、10〜300μmの大きさであり、同じ距離間隔で配置される。この技術を用いて、30,000個を超えるcDNAからなるアレイを、従来の顕微鏡スライドの表面上に固定することができる。オリゴヌクレオチドアレイについては、短い20〜25マーを、シリコンウェハース上でのフォトリソグラフィー(Affymetrix社製高密度オリゴヌクレオチドアレイ)によるか、またはインクジェット技術(Rosetta Inpharmaticsにより開発され、Agilent Technologiesにライセンス供与された)により、in situで合成する。あるいは、予め合成されたオリゴヌクレオチドを、ガラススライド上に印刷することができる。合成オリゴヌクレオチドに基づく方法は、配置しようとするDNAを作製するためには配列情報のみで十分であり、cDNA資源の時間を消費する取り扱いが必要ではないため、利点を提供する。また、所与の転写物の最もユニークな部分を表すようにプローブを設計し、密接に関連する遺伝子またはスプライス変異体を検出することができる。短いオリゴヌクレオチドは、少ない特異的ハイブリダイゼーションおよび感度の低下をもたらし得るが、最近、これらの欠点を無効化する予め合成されたより長いオリゴヌクレオチド(50〜100マー)の配置が開発された。かくして、患者が本発明の遺伝子特性を提供するかどうかを確認するためのマイクロアレイの実施においては、以下の工程を実施する：サンプルからmRNAを取得し、核酸標的を調製し、典型的には、マイクロアレイの製造業者により提唱される条件(好適には、3X SSC、0.1％SDS、50℃などのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件)下でアレイを接触させて、対応するプローブを該アレイ上に結合させ、必要に応じて、未結合の核酸標的を洗浄除去し、結果を分析する。
【０６４１】
プライマー特異的cDNA合成などの当業界で公知の方法により、表1もしくは2(または本発明の他の実施形態)に記載のものなどの目的の配列について、mRNAを富化することができることが理解されるであろう。この集団を、例えば、PCR技術を用いることにより、さらに増幅することができる。標的またはプローブを、標的分子のマイクロアレイへのハイブリダイゼーションの検出が可能になるように標識する。好適な標識としては、プローブ中に組み込むことができる放射性同位体または蛍光標識が挙げられる。
【０６４２】
代替的な実施形態においては、PCR技術、特に、定量的PCRに基づく診断キットを用いて、患者の腫瘍が本発明の遺伝子特性を発現するかどうかを確認するために、男性／女性を診断することができる(総論については、Ginzinger D Experimental haematology 30 ( 2002) p 503-512およびGiulietteら、Methods, 25 p 386 (2001)を参照されたい)。
【０６４３】
代替的な態様においては、本発明は、腫瘍由来サンプルを分析して、どの抗原が該腫瘍により発現されるかを決定し、かくして、治療上有効量の好適な抗原特異的癌免疫治療剤の投与を可能にする工程をさらに含む方法を提供し、例えば、腫瘍がMAGE(Mage A3など)陽性であることが見出された場合、好適な治療は、例えば、Mage A3抗原特異的免疫療法の実施を含んでもよい。
【０６４４】
患者の腫瘍組織などのサンプルは、表1、2、3、4、7、9、11、12および／もしくは13の1個以上の遺伝子が示差的に発現され(上方調節されるなど)、例えば、表1もしくは本発明の他の実施形態に由来する、例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30もしくは31個の遺伝子が発現され、例えば、本明細書に記載のマイクロアレイ分析もしくは他の好適な分析により検出することができる。腫瘍組織は、好ましくは、表1、2、3、4、7、9、11、12および／または13から選択される少なくとも5個の遺伝子、より好ましくは、10個の遺伝子、特に、表1、2、3、4、7、9、11、12または13に由来する5、6、7、8、9または10個の遺伝子の発現を示す。
【０６４５】
免疫治療剤
さらなる態様においては、本発明は、患者を応答者として同定した後、好適な免疫療法、例えば、癌精巣免疫療法などの癌免疫療法を用いて、応答者である患者を治療する方法を提供する。
【０６４６】
かくして、本発明は、第1に、例えば、患者から誘導されたサンプルの好適な分析により示されるように、少なくとも1個の免疫活性化遺伝子の示差的発現に基づいて、該患者を応答者として特性評価した後、治療上有効量の好適な免疫療法(例えば、Mage癌免疫療法などの癌免疫療法)を施す工程を含む、患者を治療する方法を提供する。特に、患者を、本明細書に記載の1つ以上の実施形態に基づいて応答者として特性評価する。一態様においては、免疫療法は、好適なアジュバント(免疫刺激剤)を含む。以下の記載を参照されたい。
【０６４７】
本発明のさらなる実施形態においては、例えば、Mageを発現する腫瘍を患う患者を治療する方法であって、該患者が、本発明の遺伝子特性を発現するかどうかを決定した後、例えば、Mage特異的免疫治療剤を投与することを含む、前記方法を提供する。さらなる実施形態においては、患者を、第1に、任意の腫瘍の外科手術または他の化学療法剤または放射線治療による切除などの治療を受けた後、例えば、Mage特異的免疫療法を用いて治療して、疾患の再発を防止するか、または軽減する。
【０６４８】
本発明のさらなる態様は、Mageを発現する腫瘍を患う患者を治療する方法であって、患者の腫瘍が、患者により与えられる腫瘍組織サンプルに由来する、表1(または本発明の他の実施形態)から選択される少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30または31個の遺伝子を発現するかどうかを決定した後、該患者にMage特異的免疫治療剤を投与することを含む、前記方法である。
【０６４９】
また、Mageを発現する腫瘍を除去／処理するように治療されたMageを発現する腫瘍の再発に罹りやすい患者を治療する方法であって、患者の腫瘍が、患者により与えられる腫瘍組織サンプルに由来する、表1(または本発明の他の実施形態)から選択される少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30または31個の遺伝子を発現するかどうかを決定した後、Mage特異的免疫治療剤を投与することを含む、前記方法も提供される。
【０６５０】
本発明はまた、
・MAGE抗原またはそのペプチドを含むMAGE特異的免疫治療剤、
・MAGE-A3タンパク質またはペプチドを含むMAGE抗原、
・ペプチドEVDPIGHLYを含むMAGE抗原、
・例えば、担体タンパク質を、プロテインD、NS1もしくはCLytAまたはその断片から選択する担体タンパク質に融合または結合させたMAGE抗原またはペプチド、ならびに／または
・アジュバントが、3D-MPL；アルミニウム塩；CpG含有オリゴヌクレオチド；QS21もしくはISCOMなどのサポニン含有アジュバント；水中油乳濁液；およびリポソームの1つ以上の組合せを含む、アジュバントをさらに含むMAGE特異的免疫治療剤、
を用いる治療または使用の方法も提供する。
【０６５１】
本発明はまた、応答者として指定された癌患者などの患者の治療のための医薬の製造における、癌免疫療法、特に、Mage免疫療法などの免疫療法の使用に拡張される。
【０６５２】
次いで、非応答者として最初に特性評価された1人の患者が、放射線療法後に応答者として特性評価されることが観察された。興味深いことに、本発明者らはまた、例えば、患者を放射線療法に供するか、またはインターフェロン(例えば、局所投与されるイミキモッド)もしくはTLR 3(例えば、WO 2006/054177に記載)、4、7、8もしくはTLR 9アゴニスト(例えば、CpGモチーフを含む、特に、例えば、週に、投与されるKg体重あたり0.1〜75 mgなどの高用量で投与する)などの炎症刺激剤を投与することにより、少なくとも数人の非応答者において、応答者プロフィールを誘導することができると考えている。例えば、Krieg, A. M., Efler, S. M., Wittpoth, M., Al Adhami, M. J. & Davis, H. L.「CPG 7909、合成BクラスCpGオリゴデオキシヌクレオチドTLR9アゴニストの静脈内投与ではなく、皮下投与後の正常なボランティアにおける全身性TH1様自然免疫の誘導(Induction of systemic TH1-like innate immunity in normal volunteers following subcutaneous but not intravenous administration of CPG 7909, a synthetic B-class CpG oligodeoxynucleotide TLR9 agonist.)」、J. Immunother. 27, 460-471 (2004)を参照されたい。
【０６５３】
高用量のCpGを、例えば、吸入させるか、または皮下的に与えることができる。
【０６５４】
理論により束縛されることを望むものではないが、放射線療法は、全身性炎症応答／免疫応答を刺激し、一度誘発されたら、患者(またはその腫瘍組織)は免疫療法に対してより応答性になると仮定される。
【０６５５】
従って、本発明はさらに、例えば、免疫刺激剤を投与することにより、全身性免疫応答を刺激することにより応答者プロフィールを誘導する方法を提供する。本発明はさらに、Mageを発現する腫瘍を患う患者またはMageを発現する腫瘍を除去／処理するための治療(例えば、外科手術、化学療法もしくは放射線療法)を受けた患者であって、本発明の遺伝子特性を発現する前記患者の治療のための医薬の製造における、Mage特異的免疫療法の使用を提供する。
【０６５６】
次いで、一度、応答者プロフィールが誘導されたら、免疫療法を施すことができる。一態様においては、本発明は、Mageを発現する腫瘍を患う患者であって、表1、またはあるいは本発明の他の実施形態から選択される、少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30または31個の遺伝子を発現するその腫瘍を特徴とする前記患者の治療のための医薬の製造における、Mage特異的免疫療法の使用を提供する。
【０６５７】
本発明はまた、Mageを発現する腫瘍からの再発に罹りやすい患者であって、表1、またはあるいは本発明の他の実施形態から選択される、少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30または31個の遺伝子を発現するその腫瘍を特徴とする前記患者の治療のための医薬の製造における、Mage特異的免疫療法の使用を提供する。
【０６５８】
有利には、本発明は、医師が、好適な免疫療法を受けることから臨床的な利益を得るであろう患者の集団を標的化することを可能にする。スクリーニング後、応答者として見なされた／特性評価された70、75、80、85％以上の患者などの少なくとも60％の患者が、免疫療法から、一般的には、癌療法などの療法を用いて観察された現在のレベルを超える有意な増加である臨床的利益を受けるであろうと予想される。
【０６５９】
有利には、癌免疫療法が、化学療法と共に、またはその後に与えられる場合、それは、化学療法により枯渇した、患者の免疫応答を上昇させるのを助けることができる。
【０６６０】
本発明における使用にとって好適な抗原特異的癌免疫療法剤(ASCI)としては、例えば、Mage特異的免疫応答を上昇させることができるものが挙げられる。そのような免疫療法剤は、Mage遺伝子産物、例えば、Mage-A3などのMage-A抗原に対する免疫応答を上昇させることができる。一般的には、免疫療法剤は、Mage遺伝子産物に由来する少なくとも1個のエピトープを含むであろう。そのようなエピトープは、必要に応じて、担体に共有結合したペプチド抗原として、必要に応じて、アジュバントの存在下で存在してもよい。あるいは、より大きいタンパク質断片を用いることができる。例えば、本発明における使用のための免疫療法剤は、MAGE-A1のアミノ酸195-279に対応するか、またはそれを含む抗原を含んでもよい。しかしながら、使用のための断片およびペプチドは、好適に提供された場合、Mage特異的免疫応答を上昇させることができなければならない。本発明において用いることができるペプチドの例としては、MAGE-3.A1ノナペプチドEVDPIGHLY(配列番号36)(Marchandら、International Journal of Cancer 80(2), 219-230を参照)、ならびに以下のMAGE-A3ペプチド：
FLWGPRALV;(配列番号37)
MEVDPIGHLY;(配列番号38)
VHFLLLKYRA;(配列番号39)
LVHFLLLKYR;(配列番号40)
LKYRAREPVT;(配列番号41)
ACYEFLWGPRALVETS;(配列番号42)および
TQHFVQENYLEY;(配列番号43)
が挙げられる。
【０６６１】
代替的なASCIとしては、PRAME、LAGE 1、LAGE 2などの癌精巣抗原が挙げられ、例えば、その詳細は、www.cancerimmunity.org/CTdatabaseから取得することができる。癌免疫療法剤は、例えば、以下に考察される1個以上の抗原に基づいていてもよい。
【０６６２】
本発明の一実施形態においては、用いられる抗原は、MAGE腫瘍抗原、例えば、MAGE 1、MAGE 2、MAGE 3、MAGE 4、MAGE 5、MAGE 6、MAGE 7、MAGE 8、MAGE 9、MAGE 10、MAGE 11またはMAGE 12からなるか、またはそれを含んでもよい。これらのMAGE抗原をコードする遺伝子は、X染色体上に位置し、そのコード配列(De Plaen, 1994)において互いに64〜85％の相同性を有する。これらの抗原は、時にはMAGE A1、MAGE A2、MAGE A3、MAGE A4、MAGE A5、MAGE A6、MAGE A7、MAGE A8、MAGE A9、MAGE A 10、MAGE A11および／またはMAGE A12 (MAGE Aファミリー)として公知である。一実施形態においては、前記抗原は、MAGE A3である。
【０６６３】
一実施形態においては、2つのさらなるMAGEファミリーのうちの1つに由来する抗原：MAGE BおよびMAGE C群を用いることができる。MAGE Bファミリーとしては、MAGE B1(MAGE Xp1およびDAM 10としても知られる)、MAGE B2(MAGE Xp2およびDAM 6としても知られる)、MAGE B3ならびにMAGE B4が挙げられ、Mage Cファミリーとしては、現在MAGE C1およびMAGE C2が挙げられる。
【０６６４】
一般的な用語では、MAGEタンパク質を、タンパク質のC末端に向かって位置するコア配列特性を含むものとして定義することができる(例えば、MAGE A1の309アミノ酸タンパク質に関しては、コア特性はアミノ酸195-279に対応する)。
【０６６５】
かくして、コア特性の共通パターンは、以下のように記載される(式中、Xは、任意のアミノ酸であり、小文字の残基は保存され(保存的変異体を可能にする)、大文字の残基は完全に保存される)。
【０６６６】
コア配列特性：
LixvL(2x)I(3x)g(2x)apEExiWexl(2x)m(3-4x)Gxe(3-4x)gxp(2x)llt(3x)VqexYLxYxqVPxsxP(2x)yeFLWGprA(2x)Et(3x)kv。
【０６６７】
保存的置換はよく知られており、一般的には、配列アラインメントコンピュータープログラム中のデフォルトスコアリングマトリックスとして設定される。これらのプログラムとしては、PAM250(Dayhoft M.O.ら(1978)、「タンパク質における進化的変化のモデル(A model of evolutionary changes in proteins)」、「タンパク質の配列および構造の地図表(Atlas of Protein sequence and structure)」、5(3) M.O. Dayhoft (編), 345-352)、National Biomedical Research Foundation, Washington、ならびにBlosum 62 (Steven HenikoftおよびJorja G. Henikoft (1992)、「タンパク質ブロックに由来するアミノ酸置換マトリックス(Amino acid substitution matricies from protein blocks)」), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (Biochemistry): 10915-10919が挙げられる。
【０６６８】
一般的な用語では、以下の群内の置換は、保存的置換であるが、群間の置換は非保存的であると考えられる。当該群は、
i)アスパラギン酸／アスパラギン／グルタミン酸／グルタミン
ii)セリン／トレオニン
iii)リジン／アルギニン
iv)フェニルアラニン／チロシン／トリプトファン
v)ロイシン／イソロイシン／バリン／メチオニン
vi)グリシン／アラニン
である。
【０６６９】
一般的に、および本発明の文脈においては、MAGEタンパク質は、このコア領域中で、MAGE A1のアミノ酸195-279と約50％以上同一であり、例えば、70、80、90、95または99％同一であろう。
【０６７０】
MAGEタンパク質誘導体も当業界で公知であり、WO 99/40188を参照されたい。そのような誘導体は、一定範囲の腫瘍型の治療にとって好適である治療用ワクチン製剤(免疫療法剤)における使用にとって好適である。
【０６７１】
いくつかのCTLエピトープがMAGE-3タンパク質上で同定されている。1つのそのようなエピトープであるMAGE-3.A1は、MHCクラスI分子HLA.A1と結合させて提供された場合、CTLにとって特異的なエピトープを構成するMAGE-3タンパク質のアミノ酸168と176の間に位置するノナペプチド配列である。最近、2つのさらなるCTLエピトープが、メラノーマ細胞と自己リンパ球との混合培養物中でCTL応答を増加させる能力により、MAGE-3のペプチド配列上で同定された。これらの2種のエピトープは、それぞれ、HLA.A2 (Van der Bruggen, 1994)およびHLA.B44 (Herman, 1996)対立遺伝子のための特異的結合モチーフを有する。
【０６７２】
本発明のさらなる実施形態においては、腫瘍抗原は、以下の抗原：SSX-2; SSX-4; SSX-5; NA17; MELAN-A; チロシナーゼ; LAGE-1; NY-ESO-1; PRAME; P790; P510; P835; B305D; B854; CASB618 (WO00/53748に記載); CASB7439 (WO01/62778に記載); C1491; C1584;およびC1585のうちの1個、または該抗原に対する免疫応答を指令することができるその免疫原性部分を含むか、またはそれからなってもよい。
【０６７３】
一実施形態においては、前記抗原は、P501S(プロステインとしても知られる)を含むか、またはそれからなってもよい。P501S抗原は、P501Sタンパク質の多くを、破傷風トキソイドのP2共通Tヘルパーペプチドが挿入された肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)のLytAタンパク質のC末端部分を含む細菌融合タンパク質、すなわち、WO03/104272に記載のような、CLytA-P2-CLytaを含む融合物(「CPC」融合パートナー)と組み合わせた組換えタンパク質であってよい。一実施形態においては、前記抗原は、ウィルムス腫瘍遺伝子により発現されるWT-1、もしくはほぼアミノ酸1〜249を含むそのN末端断片WT-1F；Her-2/neu遺伝子により発現される抗原、もしくはその断片を含むか、またはそれからなってもよい。一実施形態においては、Her-2/neu抗原は、WO00/44899に記載された以下の融合タンパク質の1つであってよい。
【０６７４】
さらなる実施形態においては、前記抗原は、HER-2/neuタンパク質の細胞外ドメイン(またはその断片)および細胞内ドメイン(またはその断片)を含む融合タンパク質(またはその断片)を指す、「ECD-ICD」または「ECD-ICD融合タンパク質」とも呼ばれる、「HER-2/neu ECD-ICD融合タンパク質」を含むか、またはそれからなってもよい。一実施形態においては、このECD-ICD融合タンパク質は、HER-2/neu膜貫通ドメインの実質的な部分を含まないか、またはHER-2/neu膜貫通ドメインのいずれも含まない。
【０６７５】
さらなる実施形態においては、前記抗原は、「ECD-PD」もしくは「ECD-PD融合タンパク質」とも呼ばれる「HER-2/neu ECD-PD融合タンパク質」またはHER-2/neuタンパク質の細胞外ドメイン(またはその断片)およびリン酸化ドメイン(またはその断片、例えば、ΔPD)を含む融合タンパク質(またはその断片)を指す、「ECD-ΔPD」もしくは「ECD-ΔPD融合タンパク質」とも呼ばれる「HER-2/neu ECD-ΔPD融合タンパク質」を含むか、またはそれからなってもよい。一実施形態においては、ECD-PDおよびECD-ΔPD融合タンパク質は、HER-2/neu膜貫通ドメインの実質的な部分を含まないか、またはHER-2/neu膜貫通ドメインのいずれも含まない。
【０６７６】
一実施形態においては、前記抗原は、Mageまたは免疫学的融合または発現エンハンサーパートナーに連結された他の好適なタンパク質を含んでもよい。融合タンパク質は、所与の疾患に関連する2個以上の抗原を含むハイブリッドタンパク質を含んでもよく、または抗原と発現エンハンサーパートナーのハイブリッドであってもよい。
【０６７７】
抗原およびパートナーを、化学的に結合させるか、または組換え融合タンパク質として発現させることができる。抗原およびパートナーを組換え融合タンパク質として発現させる実施形態においては、これは、非融合タンパク質と比較して、発現系において産生されるレベルを増加させることができる。かくして、融合パートナーは、Tヘルパーエピトープ(免疫学的融合パートナー)、好ましくは、ヒトにより認識されるTヘルパーエピトープの提供を援助し、および／または天然の組換えタンパク質よりも高い収率での該タンパク質(発現エンハンサー)の発現を援助することができる。一実施形態においては、融合パートナーは、免疫学的融合パートナーと発現増強パートナーの両方であってよい。
【０６７８】
本発明の一実施形態においては、用いることができる免疫学的融合パートナーを、プロテインD、グラム陰性細菌、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenza)B (WO 91/18926)の表面タンパク質、またはその誘導体から誘導する。プロテインD誘導体は、該タンパク質の最初の1/3、または該タンパク質のほぼ最初の1/3を含んでもよく、特に、それは最初のN末端の100〜110アミノ酸またはほぼ最初のN末端の100〜110アミノ酸を含んでもよい。
【０６７９】
一実施形態においては、融合タンパク質は、プロテインDの最初の109残基(もしくはそのうちの108残基)またはアミノ酸20〜127を含む。
【０６８０】
用いることができる他の融合パートナーとしては、インフルエンザウイルスに由来する非構造タンパク質、NS1(ヘマグルチニン)が挙げられる。典型的には、NS1のN末端の81アミノ酸を用いることができるが、それらがTヘルパーエピトープを含む限り、異なる断片を用いてもよい。
【０６８１】
別の実施形態においては、免疫学的融合パートナーは、LytAとして知られるタンパク質である。LytAは、N-アセチル-L-アラニンアミダーゼ、アミダーゼLytA(LytA遺伝子によりコードされる(Gene, 43 (1986) page 265-272))、ペプチドグリカン主鎖中の特定の結合を特異的に分解するオートリシンを合成する肺炎連鎖球菌から誘導される。LytAタンパク質のC末端ドメインは、コリンまたはDEAEなどのいくつかのコリン類似体への親和性を担う。この特性は、融合タンパク質の発現にとって有用な大腸菌のC-LytA発現プラスミドの開発のために活用されてきた。そのアミノ末端にC-LytA断片を含むハイブリッドタンパク質の精製が記載されている(Biotechnology: 10, (1992) page 795-798)。一実施形態においては、前記分子のC末端部分を用いることができる。この実施形態は、残基178で開始するC末端に認められるLytA分子の反復部分を利用することができる。一実施形態においては、LytA部分は、残基188-305を含んでもよい。
【０６８２】
本発明の一実施形態においては、Mageタンパク質は、誘導体化された遊離チオールを含んでもよい。そのような抗原はWO 99/40188に記載されている。具体的には、カルボキシアミド化またはカルボキシメチル化された誘導体を用いることができる。
【０６８３】
本発明の一実施形態においては、腫瘍関連抗原は、Mage-A3-プロテインD分子を含む。この分子のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列番号35に示されている。この抗原および以下にまとめたものは、WO 99/40188により詳細に記載されている。
【０６８４】
本発明のさらなる実施形態においては、腫瘍関連抗原は、以下の融合タンパク質のいずれかを含んでもよい：
リポタンパク質D断片、MAGE1断片、およびヒスチジン尾部の融合タンパク質；NS1-MAGE3、およびヒスチジン尾部の融合タンパク質；CLYTA-MAGE1-ヒスチジンの融合タンパク質；CLYTA-MAGE3-ヒスチジンの融合タンパク質。
【０６８５】
本発明のさらなる実施形態は、本明細書に記載のMage特異的腫瘍関連抗原をコードする核酸分子を含む、核酸免疫療法剤を使用することを含む。そのような配列を、好適な発現ベクター中に挿入し、DNA/RNAワクチン接種に用いることができる。前記核酸を発現する微生物ベクターを、ベクター化された誘導体化免疫療法剤として用いることもできる。そのようなベクターとしては、例えば、ポックスウイルス、アデノウイルス、アルファウイルスおよびリステリアが挙げられる。
【０６８６】
核酸配列を取得するための従来の組換え技術、および発現ベクターの製造は、Maniatisら、Molecular Cloning -  A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982-1989に記載されている。
【０６８７】
タンパク質に基づく免疫療法剤については、本発明のタンパク質を液体形態または凍結乾燥形態で提供する。
【０６８８】
一般的には、それぞれのヒト用量は、1〜1000μgのタンパク質、および好ましくは、30〜300μgのタンパク質を含むと予想される。
【０６８９】
本明細書に記載の方法は、ワクチンアジュバント、および／または免疫刺激サイトカインもしくはケモカインをさらに含む組成物を含んでもよい。
【０６９０】
本発明における使用のための好適なワクチンアジュバントは、例えば、Freund's Incomlete AdjuvantおよびComplete Adjuvant (Difco Laboratories, Detroit, MI)；Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ)；AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, PA)；水酸化アルミニウムゲル(ミョウバン)もしくはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩；カルシウム、鉄もしくは亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アシル化糖類；陽イオンもしくは陰イオン誘導体化多糖類；ポリホスファゼン；生分解性ミクロスフェア；モノホスホリルリピドAおよびクイルAなどの市販のものである。GM-CSFまたはインターロイキン-2、-7、もしくは-12などのサイトカイン、およびケモカインをアジュバントとして用いることもできる。
【０６９１】
製剤中では、アジュバント組成物は主にTh1型の免疫応答を誘導するのが望ましい。高レベルのTh1型サイトカイン(例えば、IFN-γ、TNFα、IL-2およびIL-12)は、投与される抗原に対する細胞媒介性免疫応答の誘導を好む傾向がある。応答が主にTh1型である、一実施形態に従えば、Th1型サイトカインのレベルは、Th2型サイトカインのレベルよりも高い程度まで増加するであろう。これらのサイトカインのレベルを、標準的なアッセイを用いて容易に評価することができる。サイトカインのファミリーに概説については、MosmannおよびCoffman, Ann. Rev. Immunol. 7:145-173, 1989を参照されたい。
【０６９２】
従って、主にTh1型応答を引き出すのに用いることができる好適なアジュバントとしては、例えば、3-デ-O-アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL)などのモノホスホリルリピドAと、アルミニウム塩との組合せが挙げられる。3D-MPLまたはWO 98/50399、WO 01/34617およびWO 03/065806に開示されたようなアミノアルキルグルコサミニドホスフェートなどの他のtoll様受容体(TLR4)リガンドを単独で用いて、主にTh1型応答を生成させることもできる。
【０６９３】
主にTH1型免疫応答を誘導し得る他の公知のアジュバントとしては、非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドなどのTLR9アゴニストが挙げられる。このオリゴヌクレオチドは、CpGジヌクレオチドがメチル化されていないことを特徴とする。そのようなオリゴヌクレオチドはよく知られており、例えば、WO 96/02555に記載されている。
【０６９４】
好適なオリゴヌクレオチドとしては、
OLIGO 1: TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826)(配列番号44)
OLIGO 2: TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758) (配列番号45)
OLIGO 3: ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG(配列番号46)
OLIGO 4: TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006, CpG 7909) (配列番号47)
OLIGO 5: TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668) (配列番号48)
が挙げられる。
【０６９５】
CpG含有オリゴヌクレオチドを、単独で、または他のアジュバントと組み合わせて用いてもよい。例えば、増強された系は、CpG含有オリゴヌクレオチドとサポニン誘導体の組合せ、特に、WO 00/09159およびWO 00/62800に開示されたCpGとQS21の組合せを含む。
【０６９６】
この製剤はさらに、水中油乳濁液および／またはトコフェロールを含んでもよい。
【０６９７】
別の好適なアジュバントは、サポニン、例えば、QS21(Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA)であり、単独で、または他のアジュバントと組み合わせて用いることができる。例えば、増強された系は、モノホスホリルリピドAとサポニン誘導体の組合せ、例えば、WO 94/00153に記載されたQS21と3D-MPLの組合せ、またはWO 96/33739に記載された、QS21がコレステロールでクエンチされた低反応性組成物を含む。他の好適な製剤は、水中油乳濁液およびトコフェロールを含む。例えば、水中油乳濁液中の、QS21、3D-MPLおよびトコフェロールを含む特に強力なアジュバント製剤は、WO 95/17210に記載されている。
【０６９８】
別の実施形態においては、前記アジュバントを、リポソーム組成物中で製剤化することができる。用いる3D-MPLの量は一般的には少ないが、免疫療法製剤に応じて、1〜1000μg／用量、好ましくは1〜500μg／用量、およびより好ましくは1〜100μg／用量の範囲にあってよい。
【０６９９】
一実施形態においては、アジュバント系は、WO 95/17210に記載のものなどのリポソーム製剤または水中油乳濁液中で提供された、3種の免疫刺激剤：CpGオリゴヌクレオチド、3D-MPL、およびQS21を含む。
【０７００】
本発明のアジュバントまたは免疫療法剤中のCpGまたは免疫刺激オリゴヌクレオチドの量は一般的には少ないが、免疫療法製剤に応じて、1〜1000μg／用量、好ましくは1〜500μg／用量、およびより好ましくは1〜100μg／用量の範囲にあってよい。
【０７０１】
本発明のアジュバントにおける使用のためのサポニンの量は、1〜1000μg／用量、好ましくは1〜500μg／用量、より好ましくは1〜250μg／用量、および最も好ましくは1〜100μg／用量の範囲にあってよい。
【０７０２】
一般的には、各ヒト用量は、0.1〜1000μg、好ましくは0.1〜500μg、好ましくは0.1〜100μg、最も好ましくは0.1〜50μgの抗原を含むと予想される。特定の免疫療法剤の最適量を、ワクチン接種された被験者における好適な免疫応答の観察を含む標準的な試験により確認することができる。最初のワクチン接種後、被験者は、十分に間隔を空けた1回または数回の追加免疫を受けてもよい。
【０７０３】
他の好適なアジュバントとしては、Montanide ISA 720 (Seppic, France)、SAF (Chiron, California, United States)、ISCOMS (CSL)、MF-59 (Chiron)、Ribi Detox、RC-529 (GSK, Hamilton, MT)および他のアミノアルキルグルコサミニド4-リン酸 (AGP)が挙げられる。
【０７０４】
従って、本明細書に開示される抗原と、3D-MPL、QS21、CpGオリゴヌクレオチド、ポリエチレンエーテルもしくはエステルの1種以上またはこれらのアジュバントの2種以上の組合せを含むアジュバントとを含む本発明の方法における使用のための免疫原性組成物が提供される。免疫原性組成物内の抗原を、水中油もしくは油中水乳濁液ビヒクルまたはリポソーム製剤中で提供することができる。
【０７０５】
一実施形態においては、前記アジュバントは、3D-MPL、QS21および免疫刺激CpGオリゴヌクレオチドのうちの1種以上を含んでもよい。一実施形態においては、3種全部の免疫刺激剤が存在する。別の実施形態においては、3D-MPLおよびQS21を、水中油乳濁液中、CpGオリゴヌクレオチドの非存在下で提供する。
【０７０６】
本発明の方法における使用のための組成物は、製薬上許容し得る賦形剤中の、本明細書に記載の腫瘍関連抗原、または融合タンパク質を含む医薬組成物を含んでもよい。
【０７０７】
(実施例)
【実施例１】
【０７０８】
MAGE008 Mageメラノーマ臨床試験：
この実施中の試験においては、recMAGE-A3タンパク質(配列番号35に示される組換えmage融合タンパク質)を、2種の異なる免疫学的アジュバント：AS02B (QS21、MPL)またはAS15 (QS21、MPLおよびCpG7909)と組み合わせる。この課題は、安全性プロフィール、臨床応答および免疫学的応答の点でアジュバント間を区別することであった。
【０７０９】
この実験においては、2種のアジュバント組成物は、2種の免疫刺激剤：
1. QS21(南アフリカの樹木キラヤ・サポナリア・モリナ(Quillaja Saponaria Molina)に由来する、精製された、天然のサポニン)、および
2. MPL(3-デ-O-アセチル化モノホスホリルリピドA-S. minnesotaのLPSから誘導された、リピドAの解毒された誘導体)
の混合物から構成される。
【０７１０】
AS02Bは、QS21およびMPLの水中油乳濁液である。
【０７１１】
動物モデルにおいては、これらのアジュバントは、IFNαを産生するCD4およびCD8 T細胞などの、体液性およびTH1型の細胞媒介性免疫応答の両方を誘導することが成功裏に示された(Mooreら、1999；Gerardら、2001)。さらに、この型のアジュバント中で製剤化された組換えタンパク質の注入は、全身性抗腫瘍応答の誘導をもたらす：実際、ワクチン接種された動物は、腫瘍抗原を発現するように遺伝子操作されたマウス腫瘍細胞を用いるチャレンジに対して保護されることが示され、退行している腫瘍は、CD8、CD4およびNK細胞ならびにマクロファージにより高度に浸潤されることが示された。
【０７１２】
第2のアジュバント系は、AS15である：それは、リポソーム製剤中に、MPLおよびQS21に加えて、CpG7909(さもなければ上掲のCpG2006として知られる)という名称の第3の免疫刺激剤を含む。動物モデル(主にマウス)においては、CpG7909の添加が、誘導された免疫応答および抗腫瘍応答をさらに含むことが示された(KriegおよびDavis, 2001; Renら、2004)。CpGオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)は、TLR9誘発を介して樹状細胞活性化を直接刺激する。さらに、マウスにおいては、CpG7909の全身適用は、腫瘍中へのトランスフェクトされたT細胞の浸潤を大きく増加させる(Meidenbauerら、2004)。
【０７１３】
試験概要
1. 設計
MAGE008試験は、
・オープン
・無作為化
・2群試験(AS02B 対 AS15)
・合計68人の患者
である。
【０７１４】
上記のように、recMAGE-A3タンパク質を、AS02BまたはAS15アジュバント系と組み合わせる。
【０７１５】
2. 患者集団
recMAGE-A3タンパク質を、局所もしくは遠位皮膚および／またはリンパ節病変(切除不能な段階IIIおよび段階IV M1a)を有する進行性転移性メラノーマを有する患者に投与する。腫瘍によるMAGE-A3遺伝子の発現を、定量的PCRにより評価した。選択された患者は、メラノーマのための以前の治療(recMAGE-A3を一次治療として与える)を受けておらず、内臓疾患も有していなかった。
【０７１６】
3. 免疫の計画
治療計画の方法
アジュバント設定
アジュバント(術後)設定における疾患における使用のための治療計画の方法は、以下の計画に従う本明細書に記載の抗原の投与を含んでもよい：最初の5〜8回のワクチン接種については、3週間間隔、次いで、次の8、9回以上のワクチン接種については、3ヶ月間隔での抗原の投与。
【０７１７】
抗原を、指示された正確な時間枠で投与するか、または必要に応じて、もしくは実際に、正確な間隔の1、2、3もしくは4日前後に与えてもよい。
【０７１８】
誘導：
3週間の間隔で5回のワクチン接種、例えば、第0、3、6、9、12週または第0、6、9、12週。
【０７１９】
維持：
3ヶ月の間隔で9回のワクチン接種。
【０７２０】
あるいは、ワクチン接種を、最初に2週間間隔で与え、例えば、2週間間隔で6回注入し、次いで、好適な維持療法を行うことができる。
【０７２１】
活動性疾患
活動性または切除不能な疾患、例えば、メラノーマ癌における使用のための治療計画の方法は、治療の最初の6ヶ月〜1年について、2または3週間間隔での本明細書に記載の抗原の投与を含む。計画は、以下のパターンの注入を含んでもよい：抗原を、最初の4〜10回のワクチン接種については2週間間隔で、次いで、次の4〜10回のワクチン接種については3週間間隔で、次いで、次の3〜7回のワクチン接種については、6週間間隔で与えることができる。次いで、3〜5回のワクチン接種については3ヶ月間隔、次いで、次の3〜5回のワクチン接種については6ヶ月間隔でのワクチン接種を用いて、長期間の治療を係属することができる。
【０７２２】
抗原を、指示された正確な時間枠で投与するか、または必要に応じて、もしくは実際に、正確な間隔の1、2、3もしくは4日前後に与えてもよい。
【０７２３】
この計画の例を以下の表に示す：
サイクル1：    2週間間隔で6回のワクチン接種(第1、3、5、7、9、11週)
サイクル2：    3週間間隔で6回のワクチン接種(第15、18、21、24、27、30週)
サイクル3：    6週間間隔で4回のワクチン接種(第34、40、46、52週)
長期間の治療：  3ヶ月間隔で4回のワクチン接種、例えば、次いで6ヶ月間隔で4回のワクチン接種
【０７２４】
上記治療計画の両方に関して、追加のワクチン接種を、必要に応じて治療後に与えることができる。
【０７２５】
上記臨床試験において潜在的な参加者をスクリーニングするために、本発明者らは、凍結された腫瘍サンプルとして、任意の免疫の前に、腫瘍の生検を受領した。これらのサンプルから、本発明者らは、定量的PCRのためにRNAを抽出した。この精製されたRNAの量は非常に多く、マイクロアレイ分析にとって好適であった。従って、本発明者らは、マイクロアレイにより腫瘍サンプルを分析した。目的は、この抗原特異的癌免疫療法剤から利益を受ける可能性がある患者が適切に同定および選択されるように、臨床応答に関連する遺伝子のセットを同定することであった。遺伝子プロファイリングを、マイクロアレイ分析に関して同意書に署名した患者から得た生検に対してのみ実施した。
【０７２６】
材料および方法
腫瘍標本
30個の腫瘍標本(ワクチン接種前)を、Mage008 Mage-3メラノーマ臨床試験から用いた。これらのものを、RNA安定化溶液RNAlater中で新鮮に凍結保存した。
【０７２７】
RNA精製
腫瘍の全RNAを、Tripure方法-Tripure抽出(Roche社のカタログ番号1 667 165)を用いて精製した。続いて、提供されたプロトコルを、DNAse処理を用いるRNeasy Miniキット-クリーンアッププロトコル(Qiagen社のカタログ番号74106)により行った。  
http://www1.qiagen.com/literature/handbooks/PDF/RNAStabilizationAndPurification/FromAnimalAndPlantTissuesBacteriaYeastAndFungi/RNY_Mini/1035969_HB.pdf
www.roche-applied-science.com/PROD_INF/MANUALS/napi_man/pdf/chapter4/page_152-158.pdf
【０７２８】
RNA品質管理
最初に、RNAの定量を、260 nmの光密度およびQuant-IT RiboGreen RNAアッセイキット(Invitrogen - Molecular probes R 11490)を用いて完了させた。  
http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp11490.pdf
【０７２９】
28sおよび18sリボソームRNAピークの品質を、Agilent生体分析装置の使用により評価した。
【０７３０】
マイクロアレイ分析のためのRNA標識および増幅
臨床試験の間に受領した小さい生検サイズに起因して、マイクロアレイ分析のためのRNAの標識化と共に、増幅方法を用いた。
【０７３１】
Nugen 3' ovation biotin kit(50 ngのRNAの標識化-Ovation biotin系カタログ番号2300-12, 2300-60) http://www.nugeninc.com/html/03_products2.html。
【０７３２】
50 ngの全RNAの出発入力を用いた。
【０７３３】
マイクロアレイチップ
Affymetrix HU-U133.Plus 2.0遺伝子チップは、供給業者から入手可能な最新式チップ(ヒトゲノムプロジェクトに基づく)であるため、これらを用いた。これらのチップは、約47,000個の潜在的な遺伝子転写物をカバーする。
【０７３４】
マイクロアレイハイブリダイゼーションおよび走査
ハイブリダイズしたチップを洗浄し、標準的なAffymetrixプロトコルに従って走査した：Affymetrix遺伝子チップ発現分析プロトコルを、http://www.affymetrix.com/support/technical/manual/expression_manual.affxからダウンロードすることができる。Affymetrixマイクロアレイワークステーションと共に用いなければならないスキャナーは、http://www.affymetrix.com/products/instruments/specific/scanner_3000.affxである。
【０７３５】
データの正規化
次いで、蛍光走査されたデータを、個々のチップ間の比較が可能になるように、RMAを用いて正規化した。以下の参考文献がこの方法を記載している。Irizarry RA, Hobbs B, Collin F, Beazer-Barclay YD, Antonellis KJ, Scherf U, Speed TP.「高密度オリゴヌクレオチドアレイプローブレベルデータの探査、正規化、および概要(Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data.)」、Biostatistics. 2003 Apr;4(2):249-64。
【０７３６】
データ分析
3種の独立した方法を用いて、非応答患者から応答者を区別するための遺伝子一覧を作成した。この方法は、1. Spotfire, 2. Baldi BHおよび3. Arrayminerである。
【０７３７】
Baldi分析法は、以下のウェブサイトから入手可能である。  
http://www.igb.uci.edu/~pfbaldi/software_and_servers.htm
【０７３８】
spotfireソフトウェアを、このサイト：http://www.spotfire.comから購入することができる。arrayminerソフトウェアは、http://www.optimaldesign.com/ArrayMiner/ArrayMiner.htmで購入することができる。
【０７３９】
全てのデータ分析を、R統計ソフトウェア(www.r-project.orgで入手可能)および種々のR用Bioconductorパッケージ(www. bioconductor.orgで入手可能)を用いて実施した。生データを、RMAによるバックグラウンド補正、正規化およびプローブ要約のための予備処理した(Irizarry RA, Hobbs B, Collin F, Beazer-Barclay YD, Antonellis KJ, Scherf U, Speed TP.「高密度オリゴヌクレオチドアレイプローブレベルデータの探査、正規化、および概要(Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data.)」、Biostatistics. 2003 Apr;4(2):249-64)。
【０７４０】
任意の2群間の示差的遺伝子発現を、2つの異なる統計学的方法、RankProduct (Breitling, R., Armengaud, P., Amtmann, A., およびHerzyk, P. (2004) 「Rank Products：反復マイクロアレイ実験において示差的に調節される遺伝子を検出するための、単純であるが強力な新規方法(Rank Products: A simple, yet powerful, new method to detect differentially regulated genes in replicated microarray experiments)」、FEBS Letter, 57383-92)ならびにCyberT (P. BaldiおよびA.D. Long,「マイクロアレイ発現データの分析のためのBayesian Framework：遺伝子変化の正規化t検定および統計学的推理(A Bayesian Framework for the Analysis of Microarray Expression Data: Regularized t-Test and Statistical Inferences of Gene Changes)」、Bioinformatics, 17, 6, 509-519, (2001))方法により計算した。
【０７４１】
これらのそれぞれにおいては、複数の検定のための補正を、Benjamini-Hochberg (Y. BenjaminiおよびY. Hochberg、「偽陽性率の制御：複数検定に対する実用的かつ強力な手法(Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing)」、J. Roy. Stat. Soc. B 57 (1995))の方法を用いて行い、5％の閾値を、偽陽性率のために選択した；かくして、遺伝子は示差的に発現されると考えられる0.05以下の補正されたp値を有する必要があった。
【０７４２】
Baldi-BHは、Benjamini-Hochberg補正の後のCyberTと等価である。
【０７４３】
1. Spotfire分析
患者サンプル(Mage008と命名された臨床研究プログラムから得たもの)の分析の結果を、図1にまとめる。
【０７４４】
第1の工程として、管理された比較を実施して、クラスター化することができる遺伝子群を見出した。臨床応答を示した2人の患者(患者67および59)は、非応答者のクラスター内にあった。非応答者であった2人の患者(患者3および39)は、応答者として指定されたクラスター内にあった。また、応答する患者は、交差クラスター(すなわち、図面中の重複の領域)内にも見出される。しかしながら、この重複領域内にある非応答者である2人の患者が存在する。
【０７４５】
図1においては、「応答者」は、患者27および38(完全な臨床応答者)、患者2、10、20、26-1、59および67(混合応答者)ならびに患者19、23、65および75(安定疾患)であった。図1中の「非応答者」は、患者3、5、8、9、13、14、15、16、28、30、36、37、39、52、55、56、60および66であった。
【０７４６】
2. Baldi BH分析
このソフトウェアは、マイクロアレイ実験における統計学的な管理された遺伝子分類のために設計されたものである。2つの群を定義する100個の最も有意な遺伝子の一覧を同定した。以下の図2を参照されたい。クラスター化は、応答者クラスター中に見出された応答者の多くに関して、spotfireよりも有効である。しかしながら、本発明者らは、依然として、同じ患者を非応答性であると見ており(患者3、39)、応答する患者(67および59)が間違ったクラスター内に位置すると見ている。
【０７４７】
図2においては、「応答者」は、患者27および38(完全な臨床応答者)、患者2、10、20、26-1、26-2、59および67(混合応答者)、ならびに患者19、23、65および75(安定疾患)であった。図2中の「非応答者」は、患者3、5、8、9、13、14、15、16、28、30、36、37、39、52、55、56、60および66であった。
【０７４８】
3. Arrayminer分析
このソフトウェアは、「訓練および試験」方法を用いることにより遺伝子を分類する。この方法においては、ソフトウェアは第1に、古典的相互確認試験と類似する、訓練クラスのためのマーカーの判別式セットを同定する。
【０７４９】
ここで、分析に起因して、重複領域を有さない、応答者または非応答者のみが存在する。ここで再び、サンプル、特に、両方とも治療に応答したが、この分析では非応答者のクラスター内にあった患者59および67の誤分類が存在する。患者3、14、39、52および66は、非応答者であったが、この分析を用いる場合、応答者のクラスター中に位置していた。
【０７５０】
図3においては、「応答者」は患者27および38(完全な臨床応答者)、患者10、20、26-1、26-2、59および67(混合応答者)ならびに患者19、23、65および75(安定疾患)であった。図3における「非応答者」は、患者3、5、8、9、13、14、15、16、28、30、36、37、39、52、55、56、60および66であった。
【０７５１】
3種の方法の組合せ
高い有意性で特性を定義する遺伝子プローブの共通セットを見出すために、3種の方法を一緒に用いた。全ての結果を比較するベン図を作製した。図4を参照されたい。3種全部のプログラムについて共通である36個のプローブセットの一覧を見出した(表1B)。次いで、これらの36個のプローブセットを、応答する患者および応答しない患者の管理されたクラスター化に用いた。36個のプローブセットにより同定される遺伝子は、本発明の特定の態様を形成する。
【０７５２】
倍数変化の定義
Arrayminerなどのプログラムにおいては、遺伝子発現の倍数変化を算出することができる。これは、表1Bに示されるが、例えば、応答者対非応答者などの2群間での平均遺伝子発現における変化である。倍数変化に結合した統計値を算出し、これは発現レベルが各群中の患者間で変動性が低く、群間の差異がより大きい場合、遺伝子においてより有意である。
【０７５３】
ヒートマップ上に示される遺伝子発現
図5は、色付きの囲みによるY軸で表される遺伝子の個々の発現およびX軸中の患者を認めることができるヒートマップ(所与の患者についての種々の遺伝子の発現レベルの図表示)である。全サンプル中の各遺伝子の発現値を、ゼロ平均および1の標準偏差に対して正規化し、これらの正規化された値を色の勾配中に符号化する。
【０７５４】
Affymetrixアレイは、各遺伝子を問い合わせるのに利用可能な11個のプローブ対を有する。理想的には、これらの11個のプローブの全部に由来するシグナル強度は、それら全部が同じ遺伝子を問い合わせるため、等しいものであるべきである。しかしながら、プローブセット中の個々のプローブ間には大きな差異が存在する。プローブセット中のプローブシグナルのパターンを、「プローブ応答パターン」と呼ぶ。「Robust Multi-array Average」(RMA)ソフトウェアは、遺伝子の発現を算出するために複数のマイクロアレイからの情報を組込むモデルに基づくアルゴリズムを使用する。バックグラウンドに関する適切な補正、およびプローブ強度の変位値正規化の後、プローブ応答パターンをRMAソフトウェア中の付加モデルの複数のアレイ上に対して適合させる。これらのアルゴリズムは、適合されたモデルを用いて、異常に振る舞うプローブを検出し、続いて、遺伝子発現を算出するために排除する。従って、これらのモデルに基づくアルゴリズムに由来する遺伝子発現を、より再現性の高い結果を提供すると期待することができる。RMAは、遺伝子発現を評価するより良い方法である可能性がある遺伝子発現を評価するための確率論的モデルである。アルゴリズムをRMAソフトウェア中に実装する。
【０７５５】
図4：
推定される36個のプローブセットは、免疫浸潤および活性化に関連する遺伝子の主に上方調節に対応する。これらの遺伝子としては、HLAクラスII、インターロイキン-2受容体γ、T細胞受容体遺伝子(TRBV19、TRAT1、TRGC2)、グランザイム、およびCD69が挙げられる。
【０７５６】
治療効果の増加
本明細書に記載のように、遺伝子プロファイリングは、recMAGE-A3治療に応答する可能性がある患者のサブセットの同定を可能にした。このサブセットは、約30％の患者集団に対応する。この遺伝子プロフィールを有する患者は、取得することができるさらにより高い効果レベルを示す。実際、抗MAGE-A3免疫化に対して影響を受けやすい患者の早期同定と共に、治療の効果は、おそらく、他の現在の癌治療よりもさらに高いレベルに増加するであろう。これはまた、患者によるより良好な承諾をもたらすかもしれない。例えば、メラノーマを有する100人の患者においては、60人がMAGE-A3を発現することが認められるであろう。これらの患者が全てrecMAGE-A3注入を受ける場合、そのうち10人が応答するであろう；15％の有効率をもたらす。しかしながら、遺伝子プロフィールを60人のMAGE-A3を発現する患者に対して実施する場合、この治療に影響を受けやすいと予測されるそのうちの14人のみが、recMAGE-A3注入を受けるであろう。他の46人の患者は、別の治療を受けるであろう。これらの14人の患者のうちの10人は、この治療に応答し、71％の有効率をもたらすであろう。
【０７５７】
他の腫瘍型における遺伝子プロフィール
また、この遺伝子プロファイリングをNSCLC試験において実施した。しかしながら、この試験は盲検であるため、予備データのみが利用可能である。メラノーマにおいて観察される特性も、NSCLC、段階IBおよびIIに存在すると考えられる。予備データは、約30％の患者が、免疫応答および免疫細胞浸潤に特徴的な遺伝子プロフィール特性を提供し、彼らがASCI治療に応答するであろうことを示唆している。
【０７５８】
図5は、いくつかの遺伝子に関する30人の個々の患者の発現プロフィールを示す。
【０７５９】
図5aは、2個の遺伝子の31人の患者に関する発現プロフィールを示す。
【実施例２】
【０７６０】
機械学習手法を用いる患者の臨床結果の予測
材料および方法
腫瘍標本、RNA精製、品質管理、マイクロアレイ分析のための標識および増幅
腫瘍標本(ワクチン接種前)を、Mage-3メラノーマ臨床試験(MAGE008)から用いた。上記の実施例1に記載のように、これを保存し、RNAを調製し、標識および増幅した。RNAサンプルの品質を調べた後、遺伝子チップにハイブリダイズさせた。遺伝子チップに十分にハイブリダイズすると見なされたサンプルに由来するデータのみを、この実施例において用いた(合計61個のサンプル)。
【０７６１】
マイクロアレイチップ、ハイブリダイゼーションおよび走査
上記の最初の実施例(本明細書では実施例1と呼ぶ)の材料および方法の節に記載のように、Affymetrix HG-U133.Plus2.0遺伝子チップを用い、そこに記載のようにハイブリダイズさせ、走査した。
【０７６２】
データの処理および正規化
蛍光走査されたデータ画像を、GCRMAアルゴリズム[2,3]のR 2.3.1 [1]実施を用いて処理し、正規化した。
【０７６３】
遺伝子発現マトリックスの非特異的フィルタリング
示差的発現の算出の前に、遺伝子発現マトリックスを、非特異的(すなわち、実験群とは関係なく)様式でフィルタリングした。4つのプロセスを用いた：
1. panpフィルタリング：遺伝子が所与のサンプル中で発現される(存在コール、P)か、または発現されない(非存在コール、A)かを示す細胞を、panp Rパッケージ[4]中に実装されたpanp方法を用いて全てのアレイ測定値について誘導した。実験サンプルを通して少なくとも1回のPコールを示すプローブセットのみを、その後の計算のために保持した。
【０７６４】
2. SDフィルタリング：各プローブセットの標準偏差(SD)を、サンプルを通して算出し、全SDの第三四分位数を超えるSDを有するプローブセットのみを保持した。
【０７６５】
3. IQRフィルタリング：各プローブセットの四分位範囲(IQR)を、サンプルを通して算出し、全IQRの7番目の変位値を超えるIQRを有するプローブセットのみを保持した。
【０７６６】
4. SHフィルタリング：各プローブセットのSDを、サンプルを通して算出し、SD shorthの中点(全データを含む最も短い間隔)を、R 2.3.1の下で遺伝子フィルターパッケージ[5]のshorth関数を用いて算出し、shorthを超えるSDを有するプローブセットのみをその後の計算のために保持した。
【０７６７】
示差的発現の算出
ワクチン接種後に臨床利益を示す患者群または示さない患者群(次いで、応答者(R)または非応答者(NR)群と呼ばれる)間の示差的発現を、2つの統計学的手順に従ってR 2.3.1プログラムにおいて算出した：
1. 遺伝子フィルターパッケージ中に実装された正規t検定、および
2. LPE Rパッケージ[7]中に実装されたJainらの方法[6]、またはlimma Rパッケージ[9]中に実装されたSmythの方法[8]、またはCyber-T[11]としても知られるBaldiおよびLongの方法[10]などの、標準t検定下での遺伝子特異的変動の小さい見積もり値の原因となる改変(正規化、中程度)t検定。
【０７６８】
偽陽性率(FDR)を5％に制御することによる複数の試験に関する補正を、multtestパッケージ[13]中に実装されたBenjamini-Hochbergの方法[12]を含むR 2.3.1の下で行った。
【０７６９】
遺伝子プロフィールの正規化
低レベルおよび高レベルの発現を有するプローブセットを比較可能にするため、ならびに絶対プロフィールよりも示差的プロフィールに重点を置くために、データをプローブセットレベルでさらに正規化した。2つの遺伝子レベル正規化スキームを用いた：
1. 各プローブセット測定値を、サンプルに対してその中央値により差し引き、そのIQRにより割る、IQR正規化、
2. 各プローブセット測定値を、サンプルに対してその平均値により差し引き、そのSDにより割る、Zスコア正規化。
【０７７０】
機械学習アルゴリズム
R 2.3.1プログラムの下で実行するMLInterfacesパッケージ[14]中に接続された14個の機械学習アルゴリズム(または予測規則)を用いて、非特異的フィルタリング、示差的発現、遺伝子正規化プロセスにより算出されたリポーター一覧の下で、臨床結果予測モデルを訓練し、Mage008患者臨床結果を予測した。これらのアルゴリズムは、knn (k-近傍法、kNN、クラスパッケージの関数)、nnet (神経ネットワーク)、gbm (一般化ブースト回帰)、lvq1 (学習ベクトル量子化1)、naiveBayes (単純ベイズ分類子)、svm (サポートベクターマシン)、lda (線形判別アルゴリズム)、rpart (再帰的分割)、stat.diag.da (診断判別分析)、randomforest (ランダム森)、bagging、ipredknn (knn型分類パッケージと等価な、k近傍法関数型ipredパッケージ)、slda (安定化線形判別分析)、pamr (最短収縮重心分類子としても知られる、PAM(partition around medoids))であった。1〜7の範囲のk値をさらに試験したkNN規則について以外は、全てのアルゴリズムについてデフォルトパラメーターを用いた。
【０７７１】
xval関数中で符号化されたMLinterfacesのLeave-one-out (LOO)スキームを、好適な場合、それぞれの交差確認ループでリポーター一覧を再計算せずに、交差確認のために用いた。各患者群またはクラス(RまたはNR)のサンプルの総数に対して誤って予測されたサンプル数を平均することにより、誤分類率を算出した。
【０７７２】
いくつかのMLInterfaces接続予測規則(nnet, lda, naiveBayes)を、モデルを訓練するのに用いられるデータとは無関係に外部データセット上で使用可能な関連分類子を作製する直接コーリングとして、MLInterfacesパッケージ外で用いた。
【０７７３】
MiPP Rライブラリー中に実装され、R 2.3.1の下で実行されるMiPPアルゴリズム[15, 16]を用いて、リポーター一覧に含まれるプローブセット数を減少させた。提出された一覧のうちの最良のリポーターを、訓練セットの線形判別分析予測の10倍交差確認を最適化するものとして選択し、試験セットの線形判別分析予測の最適化された全体の誤分類誤差を与えるリポーターにさらに減少させた。全体の誤分類誤差または誤分類率を、誤分類された患者の総数とセット患者の合計との比として算出した。
【０７７４】
結果
訓練および試験セクション定義の患者サンプル階層化
第1の試みにおいて、全61サンプルデータの31サンプルのサブ部分を用いて、分類モデルを訓練および試験した；残りの30サンプルを、その後のモデル評価のために保持した。いくつかの訓練および試験セクションを、31サンプルデータセットのサブ部分から定義した。訓練セクションを用いて、リポーター一覧(すなわち、患者サンプルの臨床結果予測において用いられる示差的に発現される遺伝子)を算出し、臨床結果予測のために機械学習アルゴリズム重を設定した。試験セクションにより、予測モデルを構築するのに用いられる患者とは関係なくモデル性能の評価が可能になった。また、モデル評価を、交差確認手順に従って訓練セクション上で行った。
【０７７５】
31サンプルデータセットのサブ部分からの訓練および試験セクションを、以下のように定義した：
1. 5人の応答者および5人の非応答者を含み、試験セクションのために21人の患者を除く第1の訓練セクション；
2. 試験セクションのために10人の患者を除く、10人の応答者および11人の非応答者の第2の訓練セクション；
3. 全部で31人の患者(13人の応答者および18人の非応答者)を含む最後の訓練セクション。この最後の階層化においては、試験セクションのために残された患者は存在せず、分類モデルは交差確認手順によってのみ評価されるであろう。
【０７７６】
分類のために最良に機能する示差的発現算出プロセスの同定
遺伝子発現データを、完全なデータセットを考慮に入れて「材料および方法」に従って予備処理し、正規化した。応答者群と非応答者群との間の示差的発現(DE)を、様々なプロセスに従って各訓練／試験セクションについて算出した。
【０７７７】
DE算出の枠組みを、以下のように構築した：
1. 遺伝子発現マトリックスの非特異的フィルタリング：panpフィルタリング、またはなし、次いで、SD、IQRもしくはSHフィルタリングのいずれか、またはなし、
2. DEの算出：t-検定または改変(正規化、中程度)t-検定、例えば、LPE Rパッケージ中に実装された、Jainらの方法、またはlimma Rパッケージ中に実装された、Smythの方法、またはBaldiおよびLongの方法(Cyber-T)、次いで、複数の試験補正、またはなし、
3. 遺伝子プロフィール正規化：IQRもしくはZ-スコア正規化、またはなし。
【０７７８】
3種の利用可能な訓練／試験階層化のうちの少なくとも2種において、訓練および試験セクションの両方における全体の誤分類率を最小化するプロセスを選択した。kNN予測規則により与えられる予測される臨床結果を、所与の臨床結果と比較することにより、誤分類率を得た。
【０７７９】
7つのDEプロセスが、kNN規則に従って全体の誤分類率を最小化するものと見出された：
・複数の試験のための補正を用いず、panpフィルタリングに関係ないt-検定；
・SHフィルター、複数の試験のための補正を用いないt-検定；
・SDフィルター、複数の試験のための補正を用いないt-検定；
・SDフィルター、複数の試験のための補正を用いないt-検定、Z-スコア正規化；
・IQRフィルター、複数の試験のための補正を用いないt-検定、IQR正規化。
【０７８０】
これらのプロセスに関する最小化された全体の誤分類率は以下の通りであった：
・leave-one-out交差確認により評価されるように、5人の応答者と5人の非応答者の階層においては0％。従って、全患者は正確に分類された。
【０７８１】
・5人の応答者と5人の非応答者の訓練セットから定義されたモデルからのこれらの患者の直接的予測により与えられた、21人の患者の試験セクションにおいては20％。80％の患者が正確に予測された。
【０７８２】
・交差確認により評価されるように、13人の応答者と18人の非応答者については12％であり、88％の患者が正確に予測された。
【０７８３】
他の訓練／試験階層化の性能は、情報を与えるものではない(すなわち、最小化された誤分類率に集中するDEプロセスがない)ことが判明したので、言及しなかった。他の6種のプロセス(k=3)よりも高いk値(k=5)を有する最小化された誤分類率が得られたため、最後のプロセス、IQRフィルター、複数の試験のための補正を用いないt-検定、IQR正規化が好ましい。高いk値は訓練セットに対する偏りが小さいと提唱されたより単純なモデルを作成するため、より高いk値を有する操作はさらなる設定における予測モデルの転位を容易にすると予想された。
【０７８４】
このプロセスは、489個のAffymetrixプローブセットのリポーター一覧を作成した。このリポーター一覧を、遺伝子名および記号と共にAffymetrixプローブセット識別として、表4Aに示す。
【０７８５】
外部検証：最良の臨床結果予測モデルの独立評価
最良のDE算出および遺伝子発現処理プロセス(IQRフィルター、複数の試験のための補正を用いないt-検定、IQR正規化)を用いて、13人の応答者／18人の非応答者訓練セクションからkNN予測モデル(k=5)を構築した。
【０７８６】
次いで、以前には放置された独立した患者の臨床結果を、このモデルから直接予測した。これらの30人の独立した患者のうち、15人のみが情報を与えるものであった(すなわち、特性評価された臨床結果を有する)。モデル評価のためにこれらの15人の情報を与える患者に基づいて、誤分類率を算出した。
【０７８７】
この予測モデルに従えば、誤分類率は34％であり、従って、66％の独立した患者が正確に予測された臨床結果を有していた。
【０７８８】
他の分類規則を介する臨床結果予測モデルの改良
kNN規則を用いて選択された最良のDE(および発現正規化)プロセスに基づいて、さらなる分類(予測)規則を、最終的に予測モデル性能を増加させることを試みた。kNNとは別に、13種の他の規則を評価した。kNN規則のために実行した各選択されたDEプロセスについて、それぞれのさらなる規則を、データセットの13人の応答者／18人の非応答者セクション上で訓練し、その予測性能を、交差確認による訓練セット上で、かつ直接的予測による30人の患者のサンプルの無関係なセット上で評価した。さらなる分類規則は、訓練セット上での交差確認により評価されたように、誤分類率を改善せず、最も低い残りは、誤って予測された12％のサンプルで未変化であった(88％の患者がその正確な臨床結果を割り当てられた)。
【０７８９】
しかしながら、上記の好ましいDEプロセスについては、神経ネットワーク規則は、訓練セットの交差確認評価上でそれを最低に保ちながら、KNN規則により与えられたように、それを34％から30％に減少させることにより(すなわち、1人のさらなる患者が正確に予測された)、利用可能な30人のうち15人の情報を与える患者の独立セット上での誤分類率を改善しなかった。次いで、神経ネットワーク規則により、モデルを訓練するのに用いられたものとは無関係に70％の患者の正確な予測が可能になる。
【０７９０】
さらに、予測モデル性能のさらなる評価において、臨床結果が全部で30人の外部患者サンプルについて利用可能であった場合、すなわち、全ての独立した患者が、誤分類率算出について情報を与えた場合、最も低い誤分類誤差は26％になり、74％の患者が正確に分類された。情報を与えるサンプル数の点でより幅広いデータセット上で得られたこの最良の性能を、lda規則により与えた。また、naiveBayes規則は、28％の誤分類率、72％の患者の臨床結果の正確な予測を与えることができた。しかしながら、kNNおよびnnet規則を用いる誤分類率は、それぞれ35％および41％になった。この性能は、表4Aの遺伝子一覧およびプローブの使用に基づく。
【０７９１】
さらなる患者生検の臨床結果を予測する、好ましい分類子の実装
15個の情報を与えるサンプル外部セット上での30％の誤分類をもたらす、例示される神経ネットワーク分類子のさらなる転移性メラノーマサンプルを利用するために、以下のRコードをRセッション(統計プログラム)において用いることができる：
library(nnet)
set.seed(1234)
predict(nn, data, type="class")
ここで、
・データ(data)は、分類するサンプルの489個のリポーター(表4A)の発現データを含むデータ枠(正規化されたGCRMAサンプルおよび正規化されたIQR遺伝子)である。サンプルを列に整列し、リポーターを行に整列する；
・nnは添付物Aに示されるクラスnnetのR対象である。
【０７９２】
lda(線形判別分析)分類子を、以下のRコードチャンクをプログラミングすることにより再生することができる：
library(MASS)
predict(lda, data, type="class")
ここで、
・データ(data)は上記に記載の通りであり；
・ldaは添付物Bに示されるクラスldaのR対象である。
【０７９３】
単純ベイズ(naive Bayes)分類子は、以下のRコーディングの下で機能する：
library(e1071)
predict(nb, data, type="class")
ここで、
・データ(data)は上記に記載の通りであり；
・nbは添付物Cに示されるクラス単純ベイズのR対象である。
【０７９４】
同一の分類性能を維持しながらの489個のプローブセットリポーター一覧のダウンサイジング
MiPPアルゴリズムを用いて、同じ誤分類率を維持しながら、予測モデルに基づいて、IQRフィルター、複数の試験のための補正を用いないt-検定、IQR正規化に関与するリポーター数を減少させることができるかどうかを決定した。実際、より短いリポーター一覧の下での操作は、例えば、マイクロアレイに基づく形式から定量的RT-PCR形式への転位などの分類子追跡目的にとってより都合がよいであろう。
【０７９５】
489個のプローブセットのマイクロアレイデータをMiPPプロセスに提出した：11個の分類用プローブセットを、最も低い全体の誤分類誤差を達成するのに十分なものであるとして13R/18NR訓練セクション上で選択し、これらのうちの4個のプローブセットを、独立した患者について最も低い全体の誤分類率を得るための30個の情報を与える外部サンプルデータセット上で最小なものとしてさらに同定した。
【０７９６】
次いで、4個のプローブセットリポーター一覧を、訓練セットとして13R/18NR階層のデータのleave-one-out交差確認予測において用い、全部で14種の予測規則の下で外部試験セットとして30個の情報を与える患者のセクションを直接予測した。多くの規則についてLOO性能が増加したが(特に、ldaおよびnaiveBayesについて、3％の高さの誤分類率である)、svmおよびgbm規則の下での外部データ上では誤分類率は28％に留まった。
【０７９７】
以下の表は、4個のプローブセットモデルに含まれる遺伝子の同定を記載するものである。
【０７９８】
2009538607.tif 000027
【実施例３】
【０７９９】
定量的ポリメラーゼ連鎖反応(Q-PCR)を用いる患者の臨床結果の予測
材料および方法
腫瘍標本およびRNA精製
30個の腫瘍標本(予備ワクチン接種)を、MAGE-A3メラノーマ臨床試験(MAGE008)から用いた。これらのものを、上記の実施例1に記載のように保存し、RNA抽出した。
【０８００】
cDNA合成および定量的PCR増幅
2μgの全RNAを、M-MLV逆転写酵素(Invitrogen)およびオリゴ(dT)またはランダムプライマーを用いて、cDNA中に逆転写した。
【０８０１】
TaqMan化学および7900配列検出系(Applied Biosystems)を用いて、定量的PCRにより異なる目的の遺伝子を増幅した。
【０８０２】
遺伝子を、標準的な96穴プレートまたはTaqMan(登録商標)Immune Profiling Array (TaqMan低密度アレイ、TLDA、Applied Biosystems)を用いて増幅した。TLDAは、即時使用可能な、プライマーおよびプローブで予めコーティングされた384穴プレートである。
【０８０３】
7900装置は、96穴もしくはTLDAサーマルサイクラー、蛍光を誘導するためのレーザー、電荷結合装置検出器、コンピューターおよびリアルタイム配列検出ソフトウェアを含む、PCRのリアルタイム検出のための完全に統合された系である。
【０８０４】
標準的な96穴プレート中で、50 ngの全RNAに対応するcDNAを、TF,TAQMAN,PCR REAGENT CORE KIT (Applied Biosystems)を用いるポリメラーゼ連鎖反応により増幅した。プライマーおよびプローブを表5に列挙する。
【０８０５】
TaqMan(登録商標)Immune Profiling Arrayのために、わずか1 ngのRNAに対応するcDNAを、TF,TAQMAN,PCR CORE REAGENT KIT (Applied Biosystems)を用いるポリメラーゼ連鎖反応により増幅した。アレイ中に含まれる遺伝子を表6に列挙する。
【０８０６】
データ処理および正規化
全てのPCRデータを、H3F3A(標準的な96穴プレート)またはGUSBおよびPGK1 (TLDA)ハウスキーピング遺伝子(定常遺伝子とも呼ぶ)の幾何平均に対して正規化した。
【０８０７】
後に発現値をlog変換した。
【０８０８】
単変量統計分析
分散分析(ANOVA1)を、SASソフトウェアを用いて実施して、非応答者群から応答者を区別することができる遺伝子を有意に選択した。第1群は、14人の応答患者から構成され、第2群は15人の非応答患者から構成されていた。各遺伝子を互いに独立に分析した。
【０８０９】
IL7R、CD3D、CD52、UBD、GPR171、GMZK、PRKCQ、STAT4、TRDV2、TRAT1、TRBV19、CD69、INDO1、CD45R、CD45RO、FoxP3、CD20、CCL5、FASLG、GNLY、GZMB、PRF1、IFNG、ICOS、TBX21、CD8A、CD3E、CXCL10、CXCL11、IRF1、TLR7およびCXCR3遺伝子を、両群を区別するその能力について選択した。全ての遺伝子について、p値は0.0001未満であった。全ての遺伝子について、平均間(応答者／非応答者)で有意差が証明された。両群間の幾何平均比を全ての遺伝子(表7A)について算出し、それは3.4〜21.2の範囲にあった。
【０８１０】
相関分析
相関マトリックス(表8)を、30個の遺伝子間で算出したところ、全てのこれらの遺伝子がかなりよく相関していることが示された。
【０８１１】
ロジスティック回帰モデル
ロジスティック回帰による分析を、Proc logistic (SAS Software)を用いて実施した。ロジスティック回帰分析は、バイナリー応答と説明変数のセットとの関係を調査するのに用いられることが多い。
【０８１２】
予測変数(predictor)の数は大きすぎ、全ての可能な回帰の使用は実行可能ではない。従って、段階的選択を用いた。この手順は、特定の基準：カイ二乗スコアについて良好な値(高い)を有するモデルを与える。これは、多重線形回帰におけるSSEまたはR2の使用と類似している。
【０８１３】
このモデルの情報は、
データ：29人の患者および111個の遺伝子、
応答変数：臨床状態
応答レベル数：2(応答者-非応答者)
モード：バイナリーロジット
最適化技術：Fisherのスコアリング
である。
【０８１４】
カイ二乗スコアの最良値(カイ二乗＝16およびp値＜0.0001)を与えるモデルは、
ロジット(p)＝7.69 + 5.07 log(PRF1)(pは応答者である確率である)
共係数B0 (7.69)およびB1 (5.07)は有意である(p＜0.005)。
【０８１５】
他の基準を用いて、適合度を検定することができる：
尤度比：23.1429(カイ二乗)および＜0.001(p値)
ワルド検定：6.9250(カイ二乗)および＜0.001(p値)。
【０８１６】
線形回帰と同様、R2を計算する：0.55。
【０８１７】
111個の遺伝子から、18個(1個の予測変数のみ)を表9に列挙する。R2(％)およびカイ二乗スコアが高くなるほど、モデル／遺伝子が良好になる。
【０８１８】
PRF1モデルを用いて、正確に86.6％の患者を分類することができる。
【０８１９】
表10は、いくつかの他の遺伝子に関するロジスティック回帰モデルを用いて算出された正確な分類の割合を与える。
【０８２０】
2個以上の遺伝子を組み合わせることにより、分類性能は改善されなかった。
【０８２１】
Genex分析
また、PCA(主成分分析)およびGenexソフトウェア社製神経ネットワークを遺伝子PRF1、GZMB、GNLY、CD8A、PRKCQ、FOXP3、IFNG、CCL5、GPR171およびTRBV19と共に用いて、30人の患者を分類した。
【０８２２】
神経ネットワーク分析のために、5人の応答患者(患者番号27、53、65、119、127)および5人の非応答患者(患者番号8、60、66、81、160)を訓練セットとして用いた。残りの20人の患者を、試験セットとして用いた。
【０８２３】
図6は、PRF1、GZMB、GNLY、CD8A、PRKCQ、FOXP3、IFNG、CCL5、GPR171およびTRBV19遺伝子を用いる主成分分析を示す。
【０８２４】
応答者は図6の左手側にクラスター化され、非応答者は図面の右手側にクラスター化されていることが認められる。患者番号85、3および154は誤分類されている。従って、「正確な」分類の割合は、PCAを用いる場合85％である。神経ネットワーク手法は、85％の正確な分類範囲を確認する。
【０８２５】
比較：マイクロアレイとQ-PCRデータ。
【０８２６】
Q-PCR技術により評価された17個の遺伝子(表12)は、マイクロアレイ遺伝子一覧中に既に存在していた。従って、これらの遺伝子は、それらを検出するのにどんな技術を用いても、非応答患者から応答者を区別することができる。これらの遺伝子は、本発明の特定の態様を形成する。
【０８２７】
2009538607.tif 000028
【０８２８】
14個の遺伝子(表13)が、Q-PCR技術を用いる場合、非応答者から応答者を区別することができたが、マイクロアレイ遺伝子一覧中には存在しなかった。これは、マイクロアレイと比較して、Q-PCR技術の感度が高いことに起因するかもしれない。
【０８２９】
2009538607.tif 000029
【０８３０】
マイクロアレイ特性中に存在しないいくつかの遺伝子は免疫細胞により発現されることが知られているが、かくして、患者の臨床結果を予測することもできる。
【０８３１】
腫瘍組織への免疫浸潤の存在は、遺伝子の限定的な一覧のみよりも患者の臨床結果を予測するのに最も重要な生物学的事象であるようである。
【０８３２】
例えば、PRF1およびCD8Aは、マイクロアレイ遺伝子一覧中に存在し、CD8 Tリンパ球により発現される。また、CD8 Tリンパ球は、マイクロアレイ遺伝子一覧中に存在しないIFNGも発現する。にもかかわらず、臨床応答の良好な予測が、Q-PCRによってこの遺伝子を用いて達成された。
【０８３３】
q-PCRデータを用いて誤分類された患者数は、マイクロアレイデータを用いるクラスタリングおよびKNN手法と同じ範囲にある。従って、様々な技術およびソフトウェアを用いて、患者を分類することができる。
【実施例４】
【０８３４】
階層的クラスター化手法を用いる患者の臨床結果の予測
材料および方法
腫瘍標本およびRNA精製
67個の腫瘍標本(ワクチン接種前)を、MAGE-A3メラノーマ臨床試験(MAGE008)から用いた。これらのものを、上記の実施例1に記載のように、保存し、RNAを調製し、品質を管理し、標識し、増幅した。RNAサンプルの品質を調べた後、遺伝子チップにハイブリダイズさせた。
【０８３５】
マイクロアレイチップ、ハイブリダイゼーションおよび走査
上記の最初の例(本明細書では実施例1と呼ぶ)の材料および方法の節に記載のように、Affymetrix HG-U133.Plus2.0遺伝子チップを用い、ならびに実施例1に記載のようにハイブリダイズさせ、走査した。
【０８３６】
データ処理および正規化
蛍光走査したデータ画像を、実施例2に記載のGCRMAアルゴリズムのR 2.3.1実装を用いて処理および正規化した。
【０８３７】
遺伝子一覧の選択
41個のプローブセットを選択して、実施例1に記載のArrayminerソフトウェアを用いて非応答患者から応答者を区別した。
【０８３８】
分析パラメーターは、
・訓練および試験評価
・2つのクラスの予備定義
a. 応答者クラス：PID2、PID65、PID75、PID20、PID10、PID19、PID23、PID26、PID27、PID38、PID67
b. 非応答者クラス：PID14、PID52、PID66、PID37、PID16、PID13、PID55、PID56、PID5、PID60、PID8（ここで、PIDは患者識別番号(すなわち、患者に与えられる数字標識)である）
・クラスあたりのマーカーの最大数：25
・カップルあたりのマーカー数：1
・多クラスマーカーを可能にする：はい
・KNN分類を使用する：いいえ(所有者投票方法を用いた)
であった。
【０８３９】
50個のプローブの一覧が得られた。全サンプル中の非存在状態に起因して、9個のプローブセットを除去した。上記に列挙された22人の患者に関する41個のプローブセットの強度を、表11Aおよび11Bに列挙する。
【０８４０】
臨床状態の予測
67人の患者の臨床状態を、Spotfireソフトウェアの階層的クラスター化手法を用いて予測した。
【０８４１】
階層的クラスター化を実施する前に、Spotfire中で利用可能なZスコア計算を用いて、データを遺伝子に関して正規化した。
【０８４２】
階層的クラスター化の計算オプションは、
・クラスター化方法：完全結合
・類似性尺度：ユークリッド距離
・指定関数：平均値
であった。
【０８４３】
このクラスター化を、AS15(図7および8)またはAS02B(図9および10)アーム中に含まれる患者について行った。
【０８４４】
階層的クラスター化手法を用いる場合、約58％の患者が、アジュバント群がどんなものでも応答者特性を有する。
【０８４５】
臨床利益を有する100％および87.5％の患者が、それぞれAS15およびAS02b群において良好にクラスター化される。
【０８４６】
進行性疾患を有する71％および52％の患者が、それぞれAS15およびAS02b群において良好にクラスター化される。
【０８４７】
臨床利益クラスターにおいては、28％および55％の患者が、それぞれAS15およびAS02b群において進行性疾患を有する。AS15アジュバントを用いる場合、MAGE-A3ワクチン接種に対して臨床利益を達成した本発明に従う応答者遺伝子プロフィールを有する患者の割合は、AS02bアジュバントを製剤中で用いる場合、MAGE-A3ワクチン接種に対して臨床利益を達成した割合よりも大きかった。
【実施例５】
【０８４８】
応答者プロフィールの誘導
患者59の最初の生検(照射前にサンプリング)は応答者特性を有さなかったが、当該患者の第2の生検(照射後にサンプリング)は応答者特性を有し(データは示さない)、これは病変の照射が応答者特性を誘導することができることを示唆している。
【０８４９】
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【０８５０】
2009538607.tif 000030
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【０８５１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図５Ａ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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