(57)【要約】本発明は、所定の組織内の全ての転写物（mRNA）を過剰発現させる組織プロテオームライブラリーの構築手法に関する。組織内で着目する転写物は、これまで、発現タンパク質の精製を可能にするために、そして当該タンパク質の構造−機能解析をするために、個別に複製されたり過剰発現されたりしてきた。組織内の新規な転写物および極微量の転写物の同定方法はなく、特に、検体標本、卵母細胞および初期胚では、組織を入手しにくいこともかなりの障害になっている。組織内の全ての転写物、特に新規な転写物は、組織内の全ての転写物を発現させ当該組織と適切なコントロール試料とにおける全発現タンパク質のプロファイルの比較によって同定できる。本発明による新規なプロテオームライブラリーの構築手法によれば、1度の操作によって組織内の全ての転写物を発現でき、プロテオミクスやその他の適切な手法を用いて全ての発現タンパク質を解析できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織プロテオームライブラリーの構築方法であって、
ａ． 組織から全RNAおよびmRNAを分離するステップａと、
ｂ． 前記ステップａで得た前記mRNAから、全cDNAプールを合成するステップｂと、
ｃ． 前記ステップｂによって得た回収済みcDNAを、特異的な制限酵素サイトを有するプライマーを使用して増幅するステップｃと、
ｄ． 前記ステップｃで得たPCR増幅済みcDNAを、対応する制限酵素で消化するステップｄと、
ｅ． 前記ステップｄによって得た消化済みcDNAを、発現ベクターの全ての5’→3’方向のフレームで複製するステップｅと、
ｆ． 前記ステップｅで得たプラスミドプールを、電気穿孔法によってバクテリア内に形質転換するステップｆと、
ｇ． 前記ステップｆで得たバクテリアの培養液を培養し、タンパク質の発現を誘導するステップｇと、
ｈ． 前記ステップｇによって得た、前記バクテリアに発現した複数の前記タンパク質を分離するステップｈと、
ｉ． 当該複数の分離済みタンパク質を分割し、当該分離済みタンパク質を構成する個々のタンパク質を同定する、そして前記ステップｈによって得た全タンパク質の発現レベルを同定するステップｉと、
を含む、組織プロテオームライブラリーの構築方法。
【請求項２】
前記制限酵素が、5つ以上の塩基配列を識別する制限酵素によって構成されるII型制限酵素（Rsa 1、Sfi 1、Sgf 1、Pme 1、Not 1など）であって、突出末端の切り口を形成するものである、請求項１に記載の組織プロテオームライブラリーの構築方法。
【請求項３】
市販のcDNAライブラリーまたは合成した全cDNAライブラリーを、発現ベクターに存在し得る3つのフレームの1つまたは全てで一方向的に複製する、請求項１に記載の組織プロテオームライブラリーの構築方法。
【請求項４】
前記ステップｇからの前記タンパク質を過剰発現させ、前記組織からタンパク質の全ライブラリーを作成する、請求項１に記載の組織プロテオームライブラリーの構築方法。
【請求項５】
前記cDNAプールが、真核生物の細胞、植物の細胞、昆虫の細胞、ほ乳類の組織、臨床検体標本、組織培養によって成長させた細胞、卵母細胞、接合子、胚子、および精製した細胞小器官からなる群に属する生体材料、組織または生物全体に由来する、請求項１に記載の組織プロテオームライブラリーの構築方法。
【請求項６】
母集団が正規化された状態にあるcDNAプールを複製する、組織プロテオームライブラリーの構築方法。
【請求項７】
プロテアーゼ抑制剤またはタンパク質安定剤と共複製および／または共発現された発現ベクターで、cDNAプールを複製／発現させる、請求項１に記載の組織プロテオームライブラリーの構築方法。
【請求項８】
請求項１〜７に記載の方法によって作成された組織プロテオームライブラリーであって、“真性の”発現タンパク質について個別にライブラリーを作成すること、そして所定の組織に存在する膨大な数の転写物（mRNA）を過剰発現させること、に有用である、組織プロテオームライブラリー。
【請求項９】
前記ライブラリーが、前記組織に存在するmRNAから前記タンパク質を全て、過剰産生させること、電気泳動分離すること、プロテオーム解析すること／同定すること、からなる群から選ばれる種々の用途に有用である、請求項８に記載の組織プロテオームライブラリー。
【請求項１０】
前記ライブラリーが、バクテリアからタンパク質を精製する過程においてcDNAの短縮型産物が複製され、そして当該産物が発現した場合であっても、または前記過程において10kDaを超える一部分解型タンパク質が産生した場合であっても、新規なタンパク質を同定することに有用である、請求項８に記載の組織プロテオームライブラリー。
【請求項１１】
前記ライブラリーが、前記組織に存在する新規なタンパク質／転写物の同定に有用である、請求項８に記載の組織プロテオームライブラリー。
【請求項１２】
前記ライブラリーが、前記組織に存在する極微量のタンパク質／転写物の同定に有用である、請求項８に記載の組織プロテオームライブラリー。
【請求項１３】
cDNAが、5つ以上のヌクレオチドを識別する制限酵素によって、構築したcDNAライブラリー、市販のcDNAライブラリーまたは既製のcDNAライブラリーから制限消化された状態にある、請求項８に記載の組織プロテオームライブラリー。
【請求項１４】
前記ライブラリーが、mRNA／cDNA／タンパク質／ペプチドといった生体分子プールを作成することであって、当該プールの研究および／または応用を含む産業目的、治療目的、生物医学目的、健康関連目的、バイオテクノロジー目的、食品製造技術目的および化粧品目的といった調査やその他の目的で当該プールを作成すること、からなる群から選ばれる種々の用途に有用である、請求項８に記載の組織プロテオームライブラリー。
【請求項１５】
前記ライブラリーが、組織に発現した全細胞タンパク質の解析であって、膜タンパク質、DNA結合タンパク質、リポタンパク質、核タンパク質、転写制御因子、シグナルタンパク質、リボソームタンパク質、ミトコンドリアタンパク質、その他のグループのタンパク質のような発現タンパク質の全てもしくはいずれかのサブグループの発現および／または分離／同定、からなる群から選ばれる解析に有用である、請求項８に記載の組織プロテオームライブラリー。
【請求項１６】
前記ライブラリーが、クロマトグラフィー、一次元のまたは二次元のポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）、等電点電気泳動（IEF）、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化・飛行時間型法（MALDI TOF）、エレクトロスプレー・イオン化質量解析法（ESI MS）からなる群から選ばれる、発現タンパク質の種々の解析用途に有用である、請求項８に記載の組織プロテオームライブラリー。
【請求項１７】
前記ライブラリーが、宿主細胞中の発現タンパク質であって、分子量が少なくとも10kDaである当該タンパク質の同定に有用である、請求項８に記載の組織プロテオームライブラリー。
【請求項１８】
前記ライブラリーが、請求項５に記載の生体材料に由来する特定の生体ペプチド／当該生体ペプチドのプールについての作成、同定、使用および応用に有用である、請求項８に記載の組織プロテオームライブラリー。
【請求項１９】
実施例および図面を参照しながら明細書に実質的に記載された、組織プロテオームライブラリーおよびその構築方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、“真性の”発現タンパク質について個別にライブラリーを作成すること、そして所定の組織に存在する膨大な数の転写物（mRNA）を過剰発現させること、に有用な、組織プロテオームライブラリーの構築方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物細胞は、それが植物のどの部分に由来する細胞であっても、完全体の植物へと再生させることができる。しかし、脊椎動物の細胞には、こうした再生能力がない。完全体の生物に発達できる能力は、新規に形成された接合子のみが有するとされている。非常に低い確率ではあるが、成長休止状態にある成体の体細胞核を成熟状態にある卵母細胞内に移植することによって、ほ乳類の複製に成功した研究者もいる。しかし、ほ乳類の複製手法は開発段階にあり、当該複製を妨げる技術的要因や生物学的要因が未だに解明されていない（Solter、2000年）。脊椎動物が完全体へと発達するには、その生殖過程で複雑な分化を経る必要がある。近年、ほ乳類の複製の成功例を通じ、成長休止状態にある正常体細胞核を成熟状態にある除核卵母細胞内に移植することによって、当該正常体細胞核を完全体の動物にまで発達させ得ることが明らかにされてきた（Campbellら、1996年、Wilmutら、1997年）。こうした研究成果から、分化後の細胞核を退行分化させ再プログラミングさせるために必要かつ十分な因子が、成熟状態にある卵母細胞の卵質に存在していることが示唆され、細胞核の再プログラミング、刷込み、胚分化および胚発生といった複雑な過程に関する研究が始動している（Coleman、2002年、TsunodaとKato、2002年）。こうした技術は、家畜の生殖的複製や、自己の幹細胞移植によるヒトに対する治療的複製に適用できる（Campbellら、2001年、Westhusinら、2001年）。ほ乳類の複製の成功率を高めるには、細胞核の再プログラミング、胚分化および胚発生を分子レベルで理解する必要がある。卵母細胞内の母系タンパク質や母系mRNAは、接合子の再プログラミング、胚分化および胚発生に関与すると考えられており、こうした過程で必要な別の因子は接合子核から転写されると考えられている（Liebら、1998年、Paynton、1998年、Ryabova、1994年）。現実的、倫理的および実利的に入手可能なほ乳類の卵母細胞や初期胚組織の量はミリグラムオーダーに過ぎないため、当該組織にある注目のタンパク質を分離したり、同定したり、特徴付けしたりするには十分でない。
【０００３】
種々のヒト組織でみられ制御不能な細胞分裂をする癌腫は、現代人における最大の健康障害の一つである。研究者達は、DNAマイクロアレイやプロテオミクスといった手法を用い、腫瘍の状態を当該腫瘍中の分子に基づいて理解し、分類し、定義しようと懸命の努力を続けている（Wulfkuhleら、2003年）。こうした研究は、腫瘍治療のための診断、予後および療法に有用なバイオマーカーの同定を目的としている（Amatschekら、2004年、Vaibhavら、2005年）。注目の物質、特に健康障害に関連する極微量のタンパク質、を分離／同定するために十分な量の腫瘍検体を癌患者から得ることは、かなり制約が多く容易でない。こうした事情から、利用可能な組織からcDNAライブラリーを構築し、当該ライブラリー内の転写物をマイクロアレイ法で解析することがなされている。マイクロアレイによれば、標的組織のcDNAライブラリー内の転写物レベルと、コントロール組織のcDNAライブラリー内の転写物のレベルとから、標的組織に発現した重要な遺伝子を定量化することができる。たいていの生物学的作用にはタンパク質が機能分子として関与するので、生理機能に直接的に関与するタンパク質を分離し、構造解析することが得策であるように思われる。
【０００４】
組織からcDNAライブラリーを構築する方法（Ravassardら、1997年）や、そうしたライブラリー内の転写物をマイクロアレイによって解析する方法（GiltnaneとRimm、2004年）が文献で報告されている。こうした解析法では、転写物の量は、マイクロアレイのスライド上に配列した当該転写物の遺伝子に基づき、適切なコントロール組織のcDNAライブラリーから得られるものの量に対する相対量として決定されるに過ぎない。このことは、マイクロアレイでは、マイクロアレイのスライド上に配列しているもの以外の個々の遺伝子の転写物（mRNAs）、とりわけ未知のもの、を同定したり、それらの量を特定したりすることができないことを意味する。遺伝形質の機能単位は遺伝子であるが、細胞過程に実際に寄与するものは、遺伝子からmRNAを経て発現するタンパク質である。このため、mRNAから翻訳されたタンパク質そのものを研究することが、細胞機能を理解するために有用であると思われる。生物学的システムにおける機能性分子とは、細胞内のmRNAから産生されるタンパク質である。このため、タンパク質における構造と機能との関係を調べることは、当該タンパク質が関与する経路や細胞過程の制御を把握するために必須である。タンパク質は公知の精製技術を用いて組織から分離できる。なお、当該技術は、組織中の特定のタンパク質に限って適用されるものでもないし、特定の組織に限って適用されるものでもない。重要なタンパク質の多くは組織に含まれる量が少ないため、たとえ当該組織の入手が容易であるとしても、組織内の全てのタンパク質を高頻度に同定すること自体が簡単でない。卵母細胞、初期胚、癌腫／患者から採取した組織検体標本などの重要な組織の多くは極少量しか入手できない。このため、タンパク質の構造および機能に関してどのような研究をするにしても、組織内で着目する転写物を増幅し、複製し、タンパク質を発現させ、当該タンパク質を同定および精製しなければならない。組織内の全ての転写物を過剰発現させ得る技術が開発されれば、当該組織で発現した重要な転写物を同定することは少なくとも可能になるであろう。
【０００５】
ポストゲノム時代の到来により、プロテオームワイドな研究を進めやすくなっている。遺伝子の機能性評価に関する最新の技術革新に、マイクロアレイおよびプロテオミクスがある。プロテオミクスは、こうした研究を推進させ得る強力な技術である。最近、自動かつ高処理能力なプロテオミクスが可能になり、膨大な数のタンパク質を、当該タンパク質が極微量しかなくても、解析／同定できるようになった。プロテオミクスでは、タンパク質プールの解析に二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（2D PAGE）が使用され、ペプチド混合物を得るために個々のタンパク質がゲル内で酵素消化され、タンパク質のペプチド質量指紋（PMF）のデータを得るためにマトリックス支援レーザー脱離／イオン化・飛行時間型法（MALDI TOF）が使用される。PMFデータは、組織におけるタンパク質発現プロファイルに関する情報を提供するタンパク質データベースに保存され、当該データベース上でやりとりされる（Hochstrasserら、2002年）。2D PAGEは、細胞、組織または生物全体におけるタンパク質プロファイルの変化を定量的に比較するために適用できる唯一の検査方法である（Nordhoffら、2001年、Mannら、2001年）。
【発明の開示】
【０００６】
以上のことから、組織内の全ての転写物を過剰発現させ、所定の生理学的条件下で組織に発現した重要因子を同定することに使用できる、cDNA発現ライブラリー構築技術の開発が求められている。入手できる量が少ない組織では、ライブラリー内の重要かつ極微量の転写物を分離し同定するために、mRNAプールをPCR増幅してからcDNAへ逆転写することによって全cDNAライブラリーの構築および全ライブラリーの発現を促進させることとする。バクテリア（E. coli）は、単純な微生物であって、種々のタンパク質を過剰発現させるために大々的に使用されるものである（Panda、2003年）。バクテリアは、自律的に分割する細胞によって構成されており、適切な誘導物質の存在下において、プラスミドによって複製された遺伝子が当該細胞に発現する。本発明者は、バクテリアでは、cDNAプールが複製された場合もタンパク質が過剰発現し、当該過剰発現によってライブラリーの全ての複製済み転写物からタンパク質が過剰産生されると予測した。高い処理能力を有するプロテオミクス法を使用できるようになったため、ライブラリーで過剰発現した多数のタンパク質について調べることができると思われる。細胞や組織に産生した全てのタンパク質を分離および同定することによって、プロテオームワイドな研究が可能になり、生命過程の基礎に関連するメカニズムの理解を深めることができる。cDNAの全ライブラリーを複製および発現させ、当該ライブラリーで発現した新規な因子をプロテオミクス解析で同定して組織プロテオームライブラリーを構築する本発明の方法は、プロテオーム研究、特に、タンパク質の分離／同定に足る量の組織を入手することが困難な場合において、特に有用である。
【０００７】
発現ベクターの3つのフレーム全てを用いて組織のcDNAプールを複製することによって、組織プロテオームライブラリーを構築するための基礎となる理論：
発現ベクター（フレームａ、フレームｂまたはフレームｃ）において組織のcDNAプールを複製する場合、発現フレームは3つしかないので、複製される転写物のうちの3つに1つが自動的に特定の発現フレームに配置されることになる。同一のcDNAプールをその他の2つのフレームで複製することで、3つの複製物のうちの残りの2つをも適切な発現フレームに導入させ得る。本発明者は、発現ベクターのフレームａ、フレームｂまたはフレームｃで複製されたプラスミドプールを寄せ集めることによって、組織にある全ての転写物を全てのタンパク質についての適切な発現フレームに導入して、当該転写物からライブラリーを得ることにした。当該ライブラリーは“組織プロテオームライブラリー”として設計されているため、誘導時に、当該ライブラリーから全組織cDNAが発現し、全細胞タンパク質が産生することになる（詳しくは後述する）。ここで、特定の（不適切な）発現リーディングフレームで複製されないcDNAには何が生じているのか検討する。
【０００８】
三塩基組であるコドンは64個しかなく、そのうち3個は終止コドンである。このため、不適切な発現フレームで複製されたcDNAでは、21種類の正常コドンごとに1個の終止コドンが存在することになる。生物学的システムでは、転写物のコード領域の途中に終止コドンが存在することはありえないからである。アミノ酸の平均質量が115Daであることを考慮すると、不適切な発現フレームで複製された転写物は、質量が約2.42kDa（21×115）である約21種類のアミノ酸のペプチドへと短縮されることになる。ストップコドンの存在確率が300％低下したとしても、短縮ペプチドの質量は約9.66kDaに収まることなる。不適切なフレームで発現したタンパク質は10KDa未満のペプチドを産生するので、組織プロテオームライブラリー（上述のように発現ベクターの3つ全てのフレームで組織cDNAプールを複製して構築したもの）に発現した質量が10KDaを超える全てのタンパク質は、理論的に、生理学上のタンパク質となる。プロテオミクスでは、質量が10〜100kDaの範囲にあるタンパク質を解析するために、通常、10〜15％の二次元ポリアクリルアミドゲルが使用される。こうしたタンパク質は、当該ゲルを用いてしか解析できない。したがって、組織プロテオームライブラリーで過剰発現し当該ゲルで解析されるタンパク質は全て、必然的に、生理学上のタンパク質である。
【０００９】
バクテリアは自律的に分割する細胞によって構成されており、適切な誘導物質の存在下において、プラスミドによって複製された遺伝子が当該細胞に発現する。このため、本発明者は、バクテリアでは、cDNAプールが複製された場合であってもタンパク質が発現し、複製済み転写物の全ライブラリーが過剰産生するものと予測した。なんといっても、当該ライブラリーは、たったの2〜3時間で誘導されるからである。バクテリアに発現するタンパク質のサイズは幅広く、プラスミドベクターで複製された転写物と元の転写物とは区別されないことから、複製されたcDNAのサイズに関係なくタンパク質が発現することとなる。以上のことから、組織プロテオームライブラリーを構築し発現させることで、組織に未知のタンパク質があったとしても全てのcDNAをたった1度の操作で発現させることができる魅力的な方法や有用な指針を確立できるし、発現した全てのタンパク質についての解析をプロテオミクス法によって促進することもできる。さらに、プロテオミクス法を用いることで、解析対象のタンパク質が全長型であるか短縮型であるかにかかわらず、当該タンパク質を解析および同定することができる。このように、当該技術は、バクテリアからタンパク質を精製する過程において、cDNAの短縮産物が複製され発現した状態（プロトコールを参照のこと）であっても、10〜100kDaの一部分解型タンパク質が産生された場合であっても、新規なタンパク質を同定することに有用なものである。
【００１０】
発明の要旨：
cDNAライブラリーを構築することで、組織にある全ての転写物（mRNA）をプロファイリングすることができ、マイクロアレイのような技術を用いて当該転写物を解析することができる。ただ、各転写物には特異的なタンパク質がコードされているが、当該タンパク質は、発現ベクターにおける適切なフレームで転写物が複製され、バクテリア／イーストといった適切な宿主において発現／精製された場合にのみ、これを同定し解析することができるものである。こうした大がかりな作業における第1のステップは、組織にある全ての転写物／新規な転写物を同定することであるが、これを実行できる単純で明快な方法は未だ存在しない。複製フレームは3つあるが発現に適切なフレームは1つであることから、cDNAプールを複製したときに、それぞれの転写物がどのフレームで複製され複製物が発現することになるのか不確定であるし、不適切なリーディングフレームで発現した転写物からは非生理学上のタンパク質／仮想的なタンパク質が翻訳されることになる。組織にある全ての転写物を適切な発現フレームで自動的に複製できる方法も存在しない。組織にある全ての転写物を適切なフレームで複製および発現させ、発現したタンパク質を、電気泳動法またはクロマトグラフィー法で解析して同定することができるように精製することは、かなり有効なようではある。こうした方法は、患者から接種した検体標本、卵母細胞および初期胚といった稀少な組織中の全ての転写物（極微量のものを含む）を同定することにも有用であると考えられる。本発明者は、新規な複製方法を開発し、発現ベクターにおける3つのフレームの全てで組織内の全ての転写物を発現させることができる原理を見出すことによって、組織プロテオームライブラリーを構築した。
【００１１】
本発明は、所定の組織内の全ての転写物（mRNA）を過剰発現させることによって、組織プロテオームライブラリーを構築する新規な方法に関するものである。これまで、組織内の注目する転写物については、個別に複製したり過剰発現したりすることによって、発現タンパク質が精製され、当該タンパク質の構造および機能が解析されてきた。ここで、組織内の新規な転写物および極微量の転写物を同定する方法はなく、特に、検体組織標本、卵母細胞および初期胚といった組織を入手しにくいことは、かなりの障害になっている。組織内の全ての転写物、とりわけ新規な転写物は、組織内の全ての転写物を発現させ、当該組織と適切なコントロール試料とにおける全発現タンパク質のプロファイルを比較することによって同定できる。本発明による新規なプロテオームライブラリーの構築方法によれば、1度の操作によって組織内の全ての転写物を発現させることができ、プロテオミクスおよび／またはその他の適切な手法を用いて全ての発現タンパク質を解析することもできる。
【００１２】
図面および表の簡単な説明：
図１は、等電点（pI）と質量に基づく発現タンパク質の分散度について示す図である。
図２は、精製したDNA結合タンパク質のプロファイルについて示す図である。
図３は、同定した4つのDNA結合タンパク質（SSP番号:1405、1955、6601、7303）のMALDI TOFスペクトルについて示す図である。
図４は、調べた4つのタンパク質のESI MSスペクトルについて示す図である。
表１は、ExPASyプロテオミクスサーバーにて利用可能である翻訳ツールや等電点／分子量算出ツールによって解析した25個のcDNA（NCBIより入手）についてのデータを示す表である。このデータには、こうした解析で得られた、当該cDNA内のストップコドンと、タンパク質／ペプチドの質量とが含まれている。
表２は、プロテオミクス解析試験で同定したDNA結合タンパク質についてのデータを示す表である。
表３は、利用できる配列モチーフによって同定したヘビ卵母細胞のDNA結合タンパク質と、当該タンパク質の予測生理機能とについて示す表である。
表４は、ESI MS配列タグを用いたPMF解析によって得たタンパク質アイデンティティーと、NCBI BLASTで特定したタンパク質アイデンティティーとを比較したものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
上記のとおり、組織内のcDNAプールを発現ベクターにある3つのフレーム（フレームａ、フレームｂおよびフレームｃ）で複製し、複製物を蓄えることによって、組織プロテオームライブラリーを得ることができる。こうしたライブラリーを発現させることで、組織内のほとんどのタンパク質の発現を認識できるし、発現したタンパク質は全て生理学上のタンパク質となる。
【００１４】
１．組織からの組織プロテオームライブラリーの構築：組織プロテオームライブラリーは、組織を主発原料に用い、次のようにして構築することができる。まず、総量で10〜100ng程度の少量の組織、または5’末端に特異的なプライマーと3’末端に特異的なプライマーとを用いて組織から分離した2〜50ng程度の少量のmRNAプール、を出発原料として全cDNAを合成する。こうして得られたcDNAプールは、互いに相違するとともに5’末端および3’末端に対応する6つ以上の特定の塩基配列からなる制限酵素サイト（こうした配列は、遺伝子内では極まれにしか生じないことが知られている）を有する5’末端プライマーと3’末端プライマーとを用いて、PCR増幅することができる（同様にしてライブラリーを構築できるキットは、大手のバイオテクノロジー企業から入手できる）。cDNAの5’末端および3’末端は、対応する制限酵素によって特異的に消化され得るし、得られたcDNAプールは、発現ベクターのフレームａ、フレームｂおよびフレームｃの3つ全てにおいて複製され得る。ベクターの選択については下記の項目３で説明する。こうして得たプラスミドは、複製された転写物を発現する適切なバクテリア宿主内に形質転換され得る。CCMBの研究者は、過去に、複製された転写物のほとんどが可溶性になる塩誘導型発現システム（宿主GJ1158、特許番号：5830690、1998年11月3日）を構築した（BhandariとGowrishankar、1997年）。当該宿主における過剰発現の誘発剤として必要であるものは、たった300mMの塩化ナトリウム（これは高価なものではない）である。GJ1158は、複製済み転写物からタンパク質を過剰発現させる。通常、当該タンパク質は可溶性である。こうして得たプラスミドプールは、エレクトロコンピテントなGJ1158バクテリア内に電気穿孔法によって形質転換させることができるし、こうして得られた複製物は、塩化ナトリウム非含有ルリア寒天培地（LBON）プレート上で生育するものであった。ライブラリー中の複製物を増加させるには、プラスミドプールを、フレームａ、フレームｂおよびフレームｃにおいて、それぞれの発現フレームに独立して結合させて複製する形質転換を何度か実施する必要がある。ライブラリーは、プラスミドプールａ、プラスミドプールｂおよびプラスミドプールｃとともに、GJ1158バクテリアおよびDH5αバクテリアについてそれぞれ用意する必要があるし、当該ライブラリーは、発現宿主中のプラスミドが不安定であることから-80℃のグリセロールストックの状態で保存する必要がある。複製されたcDNAの5’末端に6xHisタグが付けられた配列を有するベクターは、タンパク質のＮ末端に6xHisアミノ酸タグを産生するために利用できるものであり、当該アミノ酸タグは、ライブラリーから発現した当該タンパク質を、NiNTAアガロースクロマトグラフィーを用いて精製する際に有用である。
【００１５】
２．既存の組織cDNAライブラリーから組織プロテオームライブラリーを構築する手順：
既存のcDNAライブラリーからcDNAライブラリーを構築してもよい。組織プロテオームライブラリーを得るには、代表的なcDNAを取得し、そこから適切な制限酵素を用いて全てのcDNAを取り出し、当該cDNAを発現ベクターの3つの全てのフレーム（ａ、ｂおよびｃ）に結合させるとよい。なお、組織プロテオームライブラリーを得るためには、複製済みcDNAを3つのリーディングフレームの全てで発現させるベクターを使用する必要があるし、cDNAを3つのフレーム全てで複製させ、かつ複数のライブラリーを寄せ集める必要がある。ベクターの選択については下記の項目３で詳しく説明する。上記の目的を達成するには、複製済み転写物を3つのフレーム全てで発現させ得る構造（ａ、ｂおよびｃ）をとり得る発現ベクターを選択しなければならない。cDNAライブラリーでは、複製済みcDNAの5’末端および3’末端の双方に、異なる制限酵素サイトが存在することになる。複製済みcDNAの5’末端および3’末端に存在する、6つ以上の特定の塩基配列からなる2つの異なる制限酵素サイトを特定する必要もある。当該サイトは、発現ベクター（対応するcDNAが複製されることになるもの）の5’→3’方向においても存在している必要がある。そうした2つの制限酵素でライブラリーを消化すると、互いに相違するとともに特異的な5’末端および3’末端を有する全てのcDNAが取り出される。その後、ライブラリーから取り出したcDNAを、対応するベクターの3つ全ての構造（ａ、ｂおよびｃ）において複製し、かつ複数のライブラリーを寄せ集めることによって、組織プロテオームライブラリーを得ることができる。
【００１６】
6つ以上の特定の塩基配列からなる制限酵素サイトを利用しているため（6つの塩基配列のみを識別する制限酵素の使用を前提とする）、これと同一の6つの塩基配列は、転写物において46（4x4x4x4x4x4=4096）個のヌクレオチドの１箇所にしかないことになる。組織にあるタンパク質の多くは10〜100KDaであり、10〜15％の2D PAGEによってのみ適切に解析することができる。アミノ酸の平均質量は115Daであることから、当該タンパク質は最大で870個のアミノ酸で構成されていることになる。このため、対応するcDNAは、通常、2.61kb以上にはならない。cDNAにおける6つの塩基配列からなる制限酵素サイトの存在割合は4096個のヌクレオチドに1回でしかなく、cDNAの内部短縮が生じる機会は極端に低い。したがって、代表的な組織cDNAライブラリーから“6つ以上の塩基配列を識別する2種類の制限酵素によって消化された”cDNAプールを得ることができるし、組織プロテオームライブラリーを構築するための発現ベクターの全てのフレームにある同一の制限酵素サイトで転写物を複製することもできる。
【００１７】
３ａ．組織を出発原料に用いる場合の、既存のcDNAライブラリーから分離したcDNAの複製ベクターの選択と、cDNAをPCR増幅するための代替法の選択：
上述の手順１および手順２によって得たcDNAを複製する際、ライブラリーの誘導過程において、(a)マルチクローニングサイト（MCS）の5’末端にフュージョンタンパク質タグを含有する発現ベクター、(b)複製されたcDNAを3つのリーディングフレームの全てで発現させる3つの状態を取り得る発現ベクター、の少なくとも一方を使用できる。バイオテクノロジー市場では種々のベクターが市販されている。その一例はpET28である。ただし、組織プロテオームライブラリーを構築する場合、pET28の3つのフレーム全てでcDNAを複製することは必須ではないし、これに限定されることでもない。
【００１８】
組織から得たcDNAは、相違する2種類の方法によってPCR増幅することができる。PCR増幅操作では、通常、5’末端および3’末端に特異的なプライマーを使用することによって、回収済みcDNAが、3つの発現フレームの全てで複製済み転写物を発現させる3つの発現ベクターで複製され得る。別の方法では、複製済みcDNA転写物の5’末端に1つ、2つおよび3つのヌクレオチドを付加する5’末端特異的な3つのプライマーを使用することによって、全PCR反応によって得た寄せ集めcDNAプールが5’末端にフュージョンタンパク質タグを含有する如何なる発現ベクターにおいても複製され得るし、複製済み転写物が自動的に3つのリーディングフレームの全てで発現し得るものである。
【００１９】
３ｂ．上述の組織プロテオームライブラリーの構築において生じ得るもののほとんど解明および解決されてこなかった問題：
利用可能な方法で構築したライブラリーのcDNAは、3’末端は完全であるものの5’末端はかなり不完全な状態にあるものがほとんどである。このため、本発明者は、こうした方法を用いることで、cDNAのコード領域のみをベクターのMCSに複製することにした。cDNAの5’末端の非翻訳領域は、通常、複製されないからである。これにより、タンパク質を発現させるフレームにおいて不確定要素を生じさせるcDNAの5’末端の非翻訳領域が複製および発現することがない。しかも、こうしてcDNAを発現させることで産生するＮ末端短縮型タンパク質であっても、プロテオミクスによって解析し同定することができる。
【００２０】
いくつかの方法では、cDNAの5’末端を完全に合成できるとされてはいるが、cDNAの5’末端の非翻訳領域は、開始コドンATGの上流にある10〜20個のヌクレオチドを超えて増幅されることはない。多数のcDNAの5’末端の非翻訳領域について調べたところ、ヌクレオチドが30個までであれば、通常、当該領域にストップコドンが含有されないことが分かった。このため、5’末端の非翻訳領域の10〜20個のヌクレオチドが合成され、ベクターのMCSに複製されて発現したとしても、そうして発現したタンパク質にストップコドンに起因する短縮が生じることもないし、当該タンパク質によってプロテオミクスによるタンパク質の同定が阻害されることもない。ベクターで複製され発現したcDNAは、通常、約30個のアミノ酸からなるペプチドであって、フュージョンペプチドタグ（Hisタグ／GSTタグ／トロンビン）を含有し、プロテオミクスによるタンパク質の同定において問題が生じることのないペプチドを産生する。間違ったフレームで発現したペプチドおよび短縮型のタンパク質の期待質量は約2.3KDaしかないが（組織プロテオームライブラリーを構築するための基礎となる前述の理論を参照のこと）、ほぼ確実に発生するこうしたペプチドやタンパク質を取り除くために、上記のとおり、閾値を10KDaに設定している。したがって、当該方法も、巨大なタンパク質を発現させ同定する上で、適切で有用な手法を構成するものである。
【００２１】
４．組織プロテオームライブラリーの過剰発現と、タンパク質の精製：これらの方法は、cDNAライブラリーの構築に用いるベクターに基づいて設計するべきものではあるが、ここでは、GJ1158バクテリアを用いてする組織プロテオームライブラリーの過剰発現（上述してきたもの）について説明する。GJ1158バクテリア内のライブラリー（ａ、ｂおよびｃ）のグリセロールストックを、カナマイシンを添加したLBONに播種し、100rpmで連続して振とうさせながら37℃でオーバーナイトすることで、バクテリアを生育させる。翌日、カナマイシンを添加したLBON中で1:100に希釈した状態でバクテリアを二次培養し、600nmでの培養液の吸光度が0.6〜0.8の範囲になるまで生育させる。培養液に300mMの塩化ナトリウムを加えて3時間保持し、タンパク質の発現が定常状態に達する頃合いで、細胞分割を停止させるために温度を4℃に引き下げて1時間保存する。バクテリアを5000xg、4℃で10分間遠心した後、バクテリアのペレットを回収し、タンパク質の精製に使用するまで-80℃で保存する。8Mの尿素を含有するpH8.0であり100mMのリン酸ナトリウムバッファーにバクテリアを不均一な状態で懸濁させ（バクテリア１湿重量グラムあたり5mlのバッファーである）、室温で60分間緩やかにボルテックスして細胞を撹拌する。懸濁液を10000xg、室温で30分間遠心させた後、上清（clear lysate）を回収する。NiNTAアガロースカラムを用いるクロマトグラフィーによって、通常の手順（QIAexpressionist user manual、2001年）に従って上清を処理し、6xHisタグが付けられた全てのタンパク質を精製する。精製したタンパク質は、10mMのEDTA、3mMのベンズアミジン、1mMのPMSF、1mMのロイペプチンおよび1mMのアプロチニンを含むミリＱ水で透析することによりタンパク質の分解を防止した状態で、タンパク質の懸濁液を凍結乾燥させる。なお、タンパク質が分解すると、ほとんどのタンパク質が変性した状態で沈殿することになる。
【００２２】
５．組織における全タンパク質の精製：組織内の全てのタンパク質は、組織タンパク質プールの2D PAGE解析法で規定されている通常の手順（Vaibhavら、2005年）に従って精製できる。
【００２３】
６．組織プロテオームライブラリーおよび組織から精製したタンパク質の電気泳動：NiNTAアガロースカラムで精製された後に凍結乾燥された上記のタンパク質を、等電点電気泳動（IEF）用のサンプルバッファーに溶解させ、通常の手順（Joubert-Caronら、1999年）に従ってIEFおよび2D PAGEを実施する。なお、標準的なタンパク質の分子量を有するマーカーを、適切なレーンに流す必要がある。そうして分離した全組織タンパク質を、再度、同一のIEF用ゲルおよび2D PAGE用ゲル内で電気泳動させる。
【００２４】
７．組織から精製したタンパク質と発現したプロテオームライブラリーとの比較、およびプロテオミクス解析：当該比較の成否は、ライブラリーの構築に、そして当該ライブラリー内の全長cDNA／短縮型cDNAの表示に使用する方法に大きく依存する。組織には、多数のタンパク質および当該タンパク質の全てのmRNAが含有されている。ここで、全組織cDNAを複製し発現させていることから、組織から精製したタンパク質の2D PAGEパターンと、ライブラリーで発現したタンパク質の2D PAGEパターンとは同様になるようにも思われる。しかし、cDNAの消化およびベクターへの複製の際に使用される制限酵素サイトは転写物および短縮型転写物の短縮物の中央部分に配列し得るので、ライブラリーで発現したタンパク質の2D PAGEプロファイルにおいて低質量側にシフトするタンパク質スポットは、組織タンパク質についてのプロファイルにおけるものと比較すると、ほとんどないはずである。さらに、ライブラリーで発現したタンパク質は、Ｎ末端およびＣ末端にベクター配列から翻訳された共通アミノ酸および余剰アミノ酸の存在に起因して質量が増加しpIが変化するので、組織タンパク質についての2D PAGEでみられる位置よりも外縁にシフトするはずである。ライブラリーで発現したタンパク質を含むゲルからタンパク質スポットを切り出し、トリプシンを用いてゲルのまま消化し、ペプチドを抽出し、通常の手順（Mannら、2001年）に従ってMALDI TOFで解析する。組織プロテオームライブラリーで発現したタンパク質スポットと、組織タンパク質のタンパク質スポットとを比較することは、通常、可能ではあるが、これら２つのパターン間で対応づけた比較をすることはできないようにも思われる。しかし、患者の組織から構築された組織プロテオームライブラリーで発現したタンパク質のプロファイルと、正常人の組織から構築された組織プロテオームライブラリーで発現したタンパク質のプロファイルとを比較することは可能であり、こうした比較を医療バイオテクノロジーに興味深くかつ迅速に適用することが可能である。
【００２５】
８．上記の方法において制約や効率低下を生じ得るパラメーター：組織内の個々のmRNAのレベルは、通常、mRNAおよびタンパク質の代謝率に依存すると考えられている。ただ、こうしたmRNAは、種々の未知なる理由によって未翻訳の状態にある組織内のタンパク質成分に対応するものであり得る。このため、組織にある個々のタンパク質の相対量が当該組織にあるそれぞれのmRNAに実際に対応するものであるか否かは、不明である。したがって、こうした方法は、mRNAから翻訳されたタンパク質の検出というよりは、組織にある全てのmRNAを検出することに有用なものである。組織に存在するmRNAおよび対応するタンパク質は多量であるものの、特定のタンパク質のmRNAが実際に当該組織で翻訳されるのか否かは、個別に調べる必要がある。
【００２６】
この方法における決定因子としては、(a)組織mRNAプールを反映するcDNAの絶対的／相対的な合成、(b)発現ベクター内にcDNAをライゲーションする効率、(c)プラスミドを宿主バクテリア内に形質転換する効率、(d)タンパク質の発現レベルが定常状態に達するまでに要するライブラリー誘導時間、および(e)バクテリアでのプロテアーゼの合成／ライブラリー内の複製物から翻訳されたプロテアーゼの合成、といった種々の因子がある。なお、プロテアーゼは、過剰発現したタンパク質を分解し得る。タンパク質の精製におけるいくつかの重要なステップの際にタンパク質が分解されると、特に、複製され過剰発現したcDNAのいくつかが未知の強力なプロテアーゼである場合には、当該精製の全過程で制約が生じることがある。こうした制約のほとんどは、ライブラリー構築法における通常の制約に対応するものおよび／または使用する組織の種類に依存するものに過ぎない。このため、こうした制約事項はそれぞれの組織に応じて規格化する必要があり、汎用的な注意事項として記述することはできない。
【００２７】
本発明の実施形態の一例は、組織プロテオームライブラリーの構築方法であって、
ａ． 組織から全RNAおよびmRNAを分離するステップａと、
ｂ． ステップａで得たmRNAから、全cDNAプールを合成するステップｂと、
ｃ． ステップｂによって得た回収済みＤＮＡを、プライマー（特異的な制限酵素サイトを有するもの）を使用して増幅し、当該増幅済みcDNAに当該制限酵素サイトを組み入れるステップｃと、
ｄ． ステップｃで得たPCR増幅済みcDNAを、特異的な制限酵素で消化するステップｄと、
ｅ． ステップｄによって得た消化済みcDNAを、発現ベクターにある3つ全ての5’→3’方向のフレームで複製するステップｅと、
ｆ． ステップｅで得たプラスミドプールを電気穿孔法によってバクテリア内に形質転換し、当該バクテリアを培養し、タンパク質を発現させるためのライブラリーを得るステップｆと、
ｇ． ステップｆによって得たバクテリアに発現したタンパク質を分離するステップｇと、
ｈ． ステップｇによって得た全タンパク質の発現レベルを解析するステップｈと、を含む、組織プロテオームライブラリーの構築方法を提供するものである。
【００２８】
本発明の実施形態の別例は、制限酵素が、5つ以上の塩基配列を識別する制限酵素によって構成されるII型制限酵素（Rsa 1、Sfi 1、Sgf 1、Pme 1、Not 1など）であって、突出末端の切り口を形成するものである。
【００２９】
本発明の実施形態の別例は、全cDNAライブラリーを、発現ベクターに存在し得る3つのフレームの1つまたは全てで一方向的に複製する状態にある。
【００３０】
本発明の実施形態の別例は、タンパク質を過剰発現させることによって、タンパク質の全ライブラリーを作成する状態にある。
【００３１】
本発明の実施形態のさらに別例は、cDNAプールが、ウイルス、原核生物の細胞、真核生物の細胞、植物の細胞、昆虫の細胞、ほ乳類の組織、臨床検体標本、組織培養で成長させた細胞、卵母細胞、接合子、胚子、および精製した細胞小器官といった生体材料、組織または生物全体に由来する状態にある。
【００３２】
本発明の実施形態のさらに別例は、組織mRNAプールから逆転写された、または既存のライブラリーから取り出された、母集団が正規化された状態にあるcDNAプールを、1つのまたは複数の発現ベクターにおける3つのフレームのうちの1つまたは全てで複製する状態にある。
【００３３】
本発明の実施形態のさらに別例は、プロテアーゼ抑制剤またはタンパク質安定剤と共複製および／または共発現された発現ベクターで、cDNAプールを複製／発現させる状態にある。
【００３４】
本発明の実施形態のさらに別例は、“真性の”発現タンパク質について個別にライブラリーを作成すること、そして所定の組織に存在する膨大な数の転写物（mRNA）を過剰発現させること、に有用である、組織プロテオームライブラリーを用意するものである。
【００３５】
本発明の実施形態のさらに別例は、ライブラリーが、組織に存在するmRNAからタンパク質を全て、過剰産生させること、電気泳動分離すること、プロテオーム解析すること／同定することに有用な状態にある。
【００３６】
本発明の実施形態のさらに別例は、ライブラリーが、バクテリアからタンパク質を精製する過程においてcDNAの短縮型産物が複製され、そして当該産物が発現した場合であっても、または当該過程において10〜100kDaの一部分解型タンパク質が産生した場合であっても、新規なタンパク質を同定することに有用な状態にある。
【００３７】
本発明の実施形態のさらに別例は、ライブラリーが、組織に存在する極微量の新規なタンパク質／転写物を同定することに有用な状態にある。
【００３８】
本発明の実施形態のさらに別例は、cDNAが、5つ以上のヌクレオチドを識別する制限酵素によって、構築したcDNAライブラリー、市販のcDNAライブラリーまたは既製のcDNAライブラリーから制限消化された状態にある。
【００３９】
本発明の実施形態のさらに別例は、ライブラリーが、mRNA／cDNA／タンパク質／ペプチドといった生体分子プールを作成することであって、当該プールの研究および／または応用を含む産業目的、治療目的、生物医学目的、健康関連目的、バイオテクノロジー目的、食品製造技術目的および化粧品目的といった調査やその他の目的で当該プールを作成すること、からなる群から選ばれる種々の用途に有用な状態にある。
【００４０】
本発明の実施形態のさらに別例は、ライブラリーが、組織に発現した全細胞タンパク質の解析であって、膜タンパク質、DNA結合タンパク質、リポタンパク質、核タンパク質、転写制御因子、シグナルタンパク質、リボソームタンパク質、ミトコンドリアタンパク質、その他のグループのタンパク質のような発現タンパク質の全てもしくはいずれかのサブグループの発現および／または分離／同定、からなる群から選ばれる解析に有用な状態にある。
【００４１】
本発明の実施形態のさらに別例は、ライブラリーが、クロマトグラフィー、一次元のまたは二次元のポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）、等電点電気泳動（IEF）、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化・飛行時間型法（MALDI TOF）、エレクトロスプレー・イオン化質量解析法（ESI MS）からなる群から選ばれる、発現タンパク質の種々の解析用途に有用な状態にある。
【００４２】
本発明の実施形態のさらに別例は、ライブラリーが、宿主細胞中の発現タンパク質であって、分子量が少なくとも10kDaである当該タンパク質の同定に有用な状態にある。
【００４３】
本発明を、組織プロテオームライブラリーを構築するための基礎および方法を示す次の実施例に基づき説明する。なお、本発明の範囲は、当該実施例によって制限されない。
【００４４】
実施例１
種々のタンパク質のmRNAをNCBIデータベースから集め、ExPASyプロテオミクスサーバーで利用できるmRNA／DNA→タンパク質翻訳ツールを用い、集めたmRNAを全て5’→3’方向のフレームで翻訳した。表１に、25個のmRNA、当該mRNAにおけるストップコドン、タンパク質／ペプチドの理論質量のデータについてまとめたものを示す。
【００４５】
データベースで見つけた100個のタンパク質（サイズが10〜100kDaの範囲にあるもの）のmRNA配列を集め、ExPASyプロテオミクスサーバーで利用できる上記の翻訳ツールを用い、当該mRNAを全て5’→3’方向のフレームで翻訳したところ、全長タンパク質は1つのフレームのみで産生されていた。その他の２つの不適切なタンパク質リーディングフレームでは、平均して16〜24個のアミノ酸毎にストップコドンが存在していた。この結果は、発現ベクターにおける不適切なリーディングフレームでcDNAが複製され発現すると、16〜24個のアミノ酸からなる、または1.84〜2.76KDaの範囲にある、短縮型のペプチドが産生することを示唆している。また、この結果は、上述した“発現ベクターの3つのフレーム全てを用いて組織のcDNAプールを複製することによって、組織プロテオームライブラリーを構築するための基礎となる理論”に完全に一致する。
【００４６】
発現ベクターの不適切なリーディングフレームでcDNAが複製された場合、最初のストップコドンに遭遇して翻訳が停止するまでポリペプチドが産生することになる。そして、不規則に複製され発現するcDNAライブラリーで所望しない仮想タンパク質（人工物）およびペプチドが産生することが組織プロテオームライブラリーの構築における大きな障害になっている。このため、NCBIから集めた一連のmRNA（質量が10〜100kDaの範囲にあるタンパク質を産生すると考えられるもの）を解析し、不適切な発現リーディングフレームで当該mRNAが複製され発現することで産生する全てのペプチドを得ることとした。不適切なフレームで複製されたcDNAから仮想タンパク質／ペプチドがこうした条件下で産生され得るかを見極めるためには、cDNAから産生された第1のポリペプチドの質量についての情報で必要かつ十分である。ただ、発現ベクターの不適切なリーディングフレームで複製された転写物から産生した、質量が10KDaを超えるポリペプチドの個数および当該ポリペプチドの最大質量についての知見を得るために、一連のmRNAからも当該情報を算出することとした。その結果を表１に示す。組織プロテオームライブラリーで複製された転写物は、断片的な（5’末端短縮型）cDNAのみを有することがときおりある。当該cDNAからは、全長型cDNAから産生されるポリペプチドよりも、互いに異なる一連の翻訳停止型ポリペプチドが産生されやすくなる（不適切なフレームで複製され発現したcDNAの中央部分にあるストップコドンに起因するものである）。組織プロテオームライブラリーにおいて10KDaを超えるポリペプチドは全て排除されると考えられるため（このような閾値を設定した理由は英文明細書第6頁第2段落の説明を参照のこと）、この方法は、発現ベクターの不適切なリーディングフレームで全長型cDNAおよび5’末端短縮型cDNAの双方が複製され発現した場合にも有用なはずである。
【００４７】
上記の25個のmRNAから得られる10KDaを超える質量のペプチドは全て、不適切なフレームで翻訳されたものであり、ストップコドンに起因して形成される1021個のペプチドのうち、たった24個がこれに該当する、すなわちその相対存在量は2.35％に過ぎない。なお、タンパク質中のペプチドの平均値は約20である（1021/(2x25)=20）。こうしたペプチドは5個のタンパク質に1個の割合で生じ得るものであり、cDNAの翻訳開始時点でこうしたペプチドが生じる確率は極端に低いはずである。“不適切なフレームで発現したcDNA”のタンパク質合成は最初のストップコドンで停止するため、質量が10KDaを超える短縮型ペプチドが合成される可能性も極端に低いはずである。そして、E. coli、Mus musculus、Homo sapiens、Drosophilae、c. eleganceといった種々の生物についてのゲノムシークエンスは既に完了しており、これらの遺伝子／タンパク質データベースが利用可能な状態にあることから、発現した全ライブラリーでこうしたペプチドが少数産生したとしても、当該ペプチドは仮想タンパク質としてこれらの生物から容易に検出することができる。不適切な（間違った）発現リーディングフレームで複製された転写物から発現する大型のペプチドはほとんどないので、組織プロテオームライブラリーの構築および発現には、制約／欠陥が生じないはずである。NCBIデータベースから得た100個のタンパク質のmRNAを解析したが、そのうちの25個のmRNAのデータのみを提示する（表１）。当該25個のデータは、100個のmRNAから得た全てのデータが示す傾向に一致するものである。
【００４８】
実施例１によって支持されるデータ：
種々のタンパク質のcDNAをNCBIデータベースから集め、ExPASyプロテオミクスサーバーで利用できるDNA→タンパク質翻訳ツールを用い、集めたmRNAを全て5’→3’方向のフレームで翻訳した。表１に、25個のcDNA、それらにあるストップコドン、タンパク質／ペプチドの理論質量のデータについてまとめたものを示す：
表１に示すデータでは、１つのストレッチにある複数のストップコドンを、全部で１つのストップコドンとして取り扱っている。ストップコドンの数とペプチドの数が一致している状態は、リーディングフレームにおいて配列の先頭にストップコドンが存在することを意味する。表１おいて、第１および最大のペプチド質量が一致している状態は、第１のペプチドが最大のペプチドであることを意味する。cDNAの先頭にストップコドンがある場合には、もっと大きなサイズのペプチドが産生されやすく、そして不適切なフレームで転写物が発現しやすくするためだけに、その隣にある即時型のペプチドを考慮に入れることにした。
【００４９】
【表１−１】
2009523022.tif 000002
【００５０】
【表１−２】
2009523022.tif 000003
【００５１】
実施例２：
“実施例１”の結果を考慮して興味深い実験を実施した。当該実験は、下記の“実施例３”で詳述する“実験材料と方法”を用いて、精製済みのヘビ卵母細胞mRNAから全cDNAを合成し、こうして回収したcDNAプールをpT7T3D指向性複製ベクターで複製した。電気穿孔法を用いて塩誘導性GJ1158バクテリア内にプラスミドプールを形質転換させ、転写物の全ライブラリーを発現させた。複製されたcDNAの約33％は発現ベクターの適切なリーディングフレームに配置され真性タンパク質が産生されることになるが、不適切なリーディングフレームで複製されるその他のcDNAからは短縮型ペプチドが産生される。発現の際にこうしたライブラリーからバクテリアがタンパク質の全ライブラリーを産生させ得るとすると、発現したタンパク質の等電点（pI）および質量（KDa）の範囲は、バクテリアのタンパク質に近似するものと考えられる。‘非誘導型’および‘誘導型’ライブラリーの全タンパク質を12％の2D PAGEで解析し、タンパク質プロファイルを比較した（図１Ａおよび図１Ｂ）。‘非誘導型’の場合におけるタンパク質スポットのパターンと、‘誘導型’の場合におけるパターンとを比較した図１から明らかなように、等電点（pI）および質量についての発現タンパク質の拡散の範囲（2Dタンパク質泳動パターンにおいて紫色の円で示す）は、残余の（E. coliの）タンパク質の拡散範囲と非常によく対応していた。この結果は、１つの発現ベクターで複製および誘導がなされたときに、バクテリアがタンパク質ライブラリーを発現させ得ることを実証するものである。バクテリアは、転写物タンパク質について自己のものと複製されたものとを区別せず、タンパク質の発現に際してサイズによる偏りを生じさせることもない。ところが、本発明者は、ここで使用したライブラリーから全長タンパク質を発現するものが、ライブラリーの適切な発現リーディングフレームで複製され発現した転写物のうちのたったの1/3であることに注目した。そして、上記の結果に基づき、発現ベクターの3つ全てのフレームにおいて全cDNAライブラリーが一方向的に複製され得るものであり、そして本明細書で“組織プロテオームライブラリー”と表示するタンパク質の全ライブラリーを得る過程で当該ライブラリーが過剰発現され得るものと予想した。
【００５２】
発現ベクターの適切なフレームで1つのcDNAを複製および過剰発現させて誘導した200μgの全タンパク質をゲルで解析すると、当該ゲルで解析した全タンパク質の約30〜40％を占める程度までに巨大である単一のタンパク質スポットが、複製済みのcDNAから生じると考えられる。ところが、cDNAライブラリーを複製および過剰発現させ、200μgの全タンパク質を解析してみると、複数のタンパク質スポットが発生し、適切なフレームで発現した組換タンパク質は、上記の単一のタンパク質スポットうちたったの約10〜13％（1/3）に過ぎないことがわかった。なお、残余の20〜27％は、不適切なフレームで発現したタンパク質であって最終的にはペプチドになるものであり、質量が小さいことに起因してゲルから流出する。‘非誘導型’と‘誘導型’のゲルの双方において、強度が一致した主要なタンパク質スポットが若干存在することが確認された（図１）。この結果は、これらのゲルに含まれるタンパク質の量が同一であるという解析結果に一致するものである。そして、この結果は、バクテリアがcDNAライブラリーを発現し得ること、そして適切な発現フレームで複製された全長タンパク質がヘビ卵母細胞cDNA発現ライブラリーから発現し得ることを実証するものである。
【００５３】
【表２−１】
2009523022.tif 000004
【００５４】
【表２−２】
2009523022.tif 000005
【００５５】
【表２−３】
2009523022.tif 000006
【００５６】
実施例３：
バクテリアがタンパク質のライブラリーを発現し得るという上記の知見を受け、本発明者は、プロテオミクス法を用いて、ヘビ卵母細胞cDNAライブラリーで発現したタンパク質から、バックグラウンドレベルにある極微量のタンパク質（DNA結合タンパク質）の分離を試み、これを成功させた。本発明者は、これがうまくいけば、“組織プロテオームライブラリー”の構築が成功したことの証拠および基礎になると考えたのである。ヘビ卵母細胞cDNAライブラリーで発現するDNA結合タンパク質は、非常に小さな組織タンパク質断片を形成するものである。こうしたタンパク質は極微量であるため、分離には大量のライブラリー発現タンパク質が必要になる。バクテリアのカルチャーを10リットルずつ合計90リットル用意し、タンパク質の発現量が適切なレベル（吸光度）に到るまで当該カルチャーを培養した。接種したバクテリアを、非変性条件に適切に制御された状態にあるバッファーによってホスファターゼ阻害剤の存在下で均質化し、可溶性タンパク質を保存した。不溶性タンパク質は、変性用溶液に溶解させ、リフォールドさせて可溶性にすることによって、ほぼ全てを回収した。ヘビDNA−セファロースカラムを用いたクロマトグラフィーによって、全ての可溶性タンパク質からDNA結合タンパク質を分離した。回収したDNA結合タンパク質を12％の2D PAGEで解析し、タンパク質スポットをプロテオミクス法で解析してタンパク質を同定した。ヘビDNA結合タンパク質は、興味深いことに種々のものが得られた。分離されたDNA結合タンパク質は、全ライブラリータンパク質450mgのうち1.80mgであり、全ライブラリータンパク質の0.40％であった。得られたDNA結合タンパク質の量は、組織タンパク質から得られると予測された量に一致するものであった。全ヘビ卵母細胞cDNAプールの複製、全タンパク質ライブラリーの過剰発現、DNA結合タンパク質の精製、プロテオミクス法によるタンパク質の同定、に使用した方法および得られた結果を次に示す。
【００５７】
【表３−１】
2009523022.tif 000007
【００５８】
【表３−２】
2009523022.tif 000008
【００５９】
ヘビ卵母細胞cDNAライブラリーを構築するために、そして当該ライブラリーで発現したタンパク質からDNA結合タンパク質を発現させ分離するために使用する方法：
実験材料：アクリルアミド、ビスアクリルアミド、TEMED、クマシーブルーR-250、2-メルカプトエタノールおよびジチオトレイトールといった電気泳動用の化学物質と、トリゾール、尿素、塩酸グアニジンおよびSDSといった試薬とを、シグマ・ケミカル社（St. Louis、MO、USA）から入手した。ロイペプチン、ベンズアミジンおよびアプロチニンといったプロテアーゼ阻害剤を、ベーリンガー・マンハイム社（Germany）から購入した。CNBr活性型セファロース、TimeSaver cDNA合成キット、指向性複製ツールボックスおよびPT7T3D複製ベクターを、ファーマシア・バイオテック社（Sweden）に発注した。即時使用可能な等電点電気泳動用ストリップ（IPGストリップ）をバイオラッド・ラボラトリーズ社（USA）から購入した。DynaビーズmRNA精製キットをDynal社（USA）から購入した。その他の解析用試薬は地元業者、Qualigens、E. MerckおよびBDHから調達した。
【００６０】
実験方法：
ａ．ヘビ卵母細胞の採取：繁殖期のネズミヘビ（Ptyas mucosus）から卵母細胞を採取し、液体窒素によって瞬間凍結させ、これを使用するまで-80℃で保存した。
【００６１】
ｂ．ヘビ卵母細胞cDNAライブラリーの構築：トリゾール抽出法（ChomczynskiとSacchi、1987年）に従って、ヘビ卵母細胞から全RNAを分離した。卵母細胞の組織1gを、1mlあたり0.2mlのクロロホルムを含有する市販のトリゾール試薬10ml中で、ごく簡単に均質化した。クロロホルムを使用することによって、タンパク質が効率的に変性され、タンパク質が混入しない状態でRNAが産出されることになる。1mlあたり0.5mlのイソプロパノールを用いて液体からRNAを析出させ、70％エタノールで繰り返し洗浄することによって脱塩処理した。DynaビーズmRNA精製システムを用い、全RNAからポリアデニル化（poly-A）RNA（mRNA）を精製した。Time-Saver cDNA合成キットを用いpoly-A・RNAをcDNAに転換し、精製された0.5〜4.5kbのcDNA断片を、製造元のプロトコールに従って、PT7T3Dファージミド指向性複製ベクターにおけるEcoR1制限酵素サイトとNot1制限酵素サイトとの間に挿入した。こうして得た組換ファージミドを、電気穿孔法によって、E.coliの塩誘導株であるGJ1158（BhandariとGowrishankar、1997年）に形質転換した。分離したmRNAは完全体であり、cDNAの合成によって、広範囲の分子量を有するタンパク質を産生すると予測される0.5〜4.5kbの転写物が得られた。
【００６２】
ｃ．ヘビ卵母細胞cDNAライブラリーの誘導：ライブラリーのグリセロールストックと、コントロールであるGJ1158バクテリアのグリセロールストックとを、アンピシリンとともにLBON培地（NaCl非含有ルリアブロス）に播種した状態で、100rpmで連続して振とうさせながら37℃でオーバーナイトさせた。翌日、カナマイシンを添加したLBON中で1:100に希釈した状態でバクテリアを二次培養し、600nmでの培養液の吸光度（OD）が0.6〜0.8の範囲になるまで生育させた（BhandariとGowrishankar、1997年）。培養液に300mMの塩化ナトリウムを加えて3時間保持すると共に、非誘導型の培養液を同一の条件下で3時間保持した。細胞分割を停止させるために、それぞれの培養液の温度を4℃に引き下げて1時間保存した。その後、バクテリアを5000xg、4℃で10分間遠心した後、バクテリアのペレットを回収し、タンパク質の精製に使用するまで-80℃で保存した。
【００６３】
ｄ．バクテリアペレットからのタンパク質の抽出：2リットルの培養液から得たバクテリアのペレット（12g）を、0.1％のトライトンX-100、100μg／mlのリゾチーム、3mMのベンズアミジン、1mMのEDTA、1mMのPMSF、1mMのアプロチニンおよび1mMのロイペプチンを含むpH8.0であり50mMである40mlのTris-HClに均一に懸濁させ、室温で1時間培養した。懸濁液を4℃で徹底的に超音波処理することによってバクテリアを溶菌させ、バクテリアDNAを切断し、溶液の粘度を低下させ、そして10000xg、4℃で30分間遠心することによって可溶性タンパク質を回収した。8Mの塩酸グアニジンと1mMのDTTとを含むpH8.0であり50mMである20mlのTris-HClに沈殿物を溶解させ、これを5mMのシステイン、15mMのシスチンおよび2Mの尿素を含むpH8.0である50mMのTris-HClで12時間、そして当該尿素を含まないこと以外は同様のTris-HClで4時間、透析することによって、当該沈殿物からタンパク質をリフォールドさせた（Andersonら、1999年）。透析したタンパク質を上記のように遠心し、不溶性タンパク質を事前に保存しておいた可溶性タンパク質に組み合わせて、ヘビDNA−セファロースを用いてクロマトグラフィー処理した。
【００６４】
ｅ．DNA−セファロース親和性材料の調製：Hinf1で消化した雌ヘビ（Ptyas mucosus）のゲノムDNAを製造元のプロトコールに基づきCNBr活性型セファロース（ファーマシア社製）に結合させるという通常の手順に従って、DNA−セファロース親和性材料を調製した。雌ヘビの腎臓または肝臓から、通常の手順（KodanagaとTjian、1986年）に従って、分子量の大きなゲノムDNAを分離し、セファロース1mlあたり100μgのDNAを結合に用いた。
【００６５】
ｆ．親和力を利用したDNA結合タンパク質の精製：2リットルのバクテリア培養液から抽出しプールした全タンパク質を、25mlのヘビDNA−セファロースカラムを用いてクロマトグラフィー処理した。非結合タンパク質を2〜3度繰り返してカラムに通すことによって、当該タンパク質とヘビタンパク質との結合を促進させ、結合タンパク質の回収率を高めた。1mMのEDTA、1mMのDTTおよび100mMのNaClを含むpH8.0であり50mMであるTris-HClをカラム50個分使用してカラムを洗浄し、さらに100mMのNaClに代えて300mMのNaClを含むこと以外は同様のTris-HClをカラム50個分以上使用して洗浄することによって、微弱に結合していたタンパク質を除去した。1MのNaClを含む同様のバッファーを用いて、当該カラムからDNA結合タンパク質を溶出させた。溶出したタンパク質を、10KDaのカットオフ膜を有するアミコン社製フィルターを用いて濃縮した後、3mMのベンズアミジン、1mMのPMSF、1mMのEDTA、1mMのロイペプチンおよび1mMのアプロチニンを含むpH8.0である50mMのTris-HClで、操作毎に若干の変化はあるが100体積量を使用して徹底的に透析した。透析したタンパク質を、スピードバッグ濃縮機を用いて濃縮し、IEF用のサンプルバッファーに溶解させた。
【００６６】
ｇ．1D PAGE、2D PAGE、ゲルイメージング、画像解析：通常の手順（Laemmli、1970年）に従い、12.5％のSDSポリアクリルアミドゲルを用いてタンパク質を一次元SDS PAGE解析した。解析対象のタンパク質の分子量を見積もるために、標準的なタンパク質マーカーを適切なレーンに流した。通常の手順（Joubert-Cartonら、1999年、O’Farrell、1975年）に従い、2D PAGE解析を実施した。バイオラッド社から入手したIPGストリップ（11cm、pH5〜8）内で、第1の方向に等電点電気泳動させた。なお、2D PAGEについての先行試験でIPGストリップを使用したところ、分離したDNA結合タンパク質の分解能に優れていたため、これを用いることとした。第2の方向については、12％のポリアクリルアミドと5％のスペーサーゲルとから構成されるSDS PAGEを、バイオラッド社製の標準的な電気泳動装置内に設置して解析した。精製したDNA結合タンパク質について、IEF用のサンプルバッファー［7Mの尿素、2Mのチオ尿素および1％のC7BzO｛3-(4-ヘプチル)-フェニル-3-ヒドロキシ-プロピル-ジメチルアンモニオ-プロパンスルホン酸塩｝を含む、pH10である40mMのTris］に溶解させ、ブラッドフォード反応後に分光光度的に評価した。それぞれのIPGストリップを、200μgのDNA結合タンパク質と事前に混合しておいた再水和バッファー（pH3〜10であって、8Mの尿素、2％のCHAPS、50mMのDTTおよび0.2％の両性担体からなる；バイオラッド社製）を用いて再水和した。IEFは、Protean IEF cell（バイオラッド社製）において、終止電圧10000、20℃、平均60000Vhの条件で実施した。当該IEFを実施した後、二次元方向への泳動に用いるまで、IPGストリップを-80℃で保存した。一次元方向に電気泳動したIPGストリップを、2.5mMのDTTと2.3％（w/v）のSDSとを含むpH6.8である125mMのTris-HCl内で、室温で15分間保温した。なお、この際、スペーサーゲルの上部を、当該Tris-HClに1％の溶融状態のアガロースを添加したもので封止した。40mAの定常電流を用い、積層したブロモフェノールブルー色素がゲルの下端に到達するまで2D PAGEゲルを泳動した。SDSゲルおよび2D PAGEゲルを、通常通り、メタノールと酢酸とミリＱ水とを5:1:4の割合で含む溶液に0.2％のクマシーブリリアントブルーR-250を添加したものに一晩浸漬して染色した後、当該溶液において脱色した。二次元のゲル画像を、Fluor S Multiimager（バイオラッド社製）および可視光源を用いて取得した。画像解析は、PDQuest画像解析ソフトウェア（バイオラッド社製）を用いて実施した。画像は全て一定の条件下で取得し、3〜4個の主要なスポットに基づいてゲル上のエリア座標を設定した。ゲル間の染色度合いの微少な揺らぎは、タンパク質スポットの吸光度の総量に基づいて補正した。タンパク質スポットにはSSP（スタンダードスポット）番号を割り当て、異なるゲルにあるタンパク質スポットを手作業で排除し、そのSSP番号に応じてプールした。
【００６７】
ｈ．MALDI TOF解析用の試料の調製：ゲルを連続して泳動し、全てのゲルからそれぞれのタンパク質のゲルスポットをプールし、トリプシンで消化した。通常の手順に従い、MALDI TOF解析用の試料を調製した。クマシーブルー染色された状態にあるタンパク質スポットを含有したゲル切片を、50mMの炭酸水素アンモニウムでごく簡単に洗浄した後、当該バッファーに少しの間浸漬させた。ゲル切片を、50mMの炭酸水素アンモニウムと50％アセトニトリルとを1:1で混合したものでさらに洗浄した。ゲル切片を、必要量のトリプシンを含有するアセトニトリル中で再水和させ、必要量のトリプシンを含有する20mMの炭酸水素アンモニウム中で再肥大化させた。ゲル内での消化は、キモトリプシン活性がない状態にあるシーケンスグレード鳥類トリプシン（シグマ社製）を用いて、1:10〜1:30（トリプシン:タンパク質）の終濃度で、37℃でオーバーナイトすることによって実施した。5％のトリフルオロ酢酸（TFA）が添加された50％アセトニトリルを2度使用して、ゲル内消化物からペプチドを抽出した。抽出したペプチドをプールし、スピードバッグで濃縮し、0.1％のTFAが添加された50％アセトニトリル8μlで再編し、ZipTip C18カラム（ミリポア社製、USA）を用いて脱塩した。精製したペプチド（0.1％のTFAと50％アセトニトリルとの中にある）を、MALDI TOFプレート上に析出させ、空気乾燥させ、α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸（10mg/mlの濃度になるように同様の培養液を用いて調製したもの）のマトリックスを用いて積層させ、空気乾燥させ、MALDI TOF解析に使用した。
【００６８】
ｉ．MALDI TOF試験およびスペクトル解析：ボイジャーモデル：DE STR MALDI TOF 質量スペクトロメーター（パーセプティブバイオシステムズ社製、Framingham、MA、USA）を用い、反射率モードで遅延抽出によってMALDI質量スペクトルを記録し、次のパラメーターを用いて各測定を実施した：加速電圧20kV、グリッド電圧72％、ディレイタイム175〜220ns、低質量ゲート750。スペクトルは、100回のレーザー照射によって蓄積した。ペプチド質量の基準値合わせは、外部質量標準器（アプライドバイオシステムズ社製Calmix 1および2）を用いて実施した。MALDI TOFスペクトルにつき、通常の手順に従って、基準線の補正、ノイズの除去、ピークの検出を実施した。トリプシン、ケラチンおよびキャリブレーション混合物に関連するペプチド質量を、データに基づいて除去し、最終的なペプチドの質量リストを得た。ほとんどのタンパク質において、平均して10〜15個のペプチドが、当該タンパク質における10KDaごとの領域から得られた。
【００６９】
ｊ．PMF検索解析：利用可能なヘビタンパク質のデータベースは未だ存在していない。そこで、本発明者は、ヘビ卵母細胞タンパク質をPMF検索すれば、他のデータベースにある相同性のタンパク質を同定できるものと予想し、残存切断部位（missed cleavage）を1〜2個とし、“メチオニンの一部が酸化された状態”とし、さらに質量の偏差を200ppmとして、“全分類法”モードでPMF検索を開始した。ここで、利用可能なヘビPMFデータベースがないことから、多くのタンパク質については、タンパク質アイデンティティーを明確にするために、質量の偏差を300〜400ppmに引き上げざるを得なかった。ただ、Mascotの平均自乗根（RMS）におけるppmのエラー（タンパク質の同定には質量データの実誤差を用いる）のばらつきは、たったの65〜250ppmであった。長期にわたる近年の研究（Danielら、2004年）において、種々のPMF検索パラメーターが比較検討され、タンパク質の同定を有益に実施するには質量の偏差を400ppmにする必要があることが示唆されている。これは、本発明のPMF検索において採用する質量偏差パラメーターが妥当な範囲にあることを裏付けるものである。本発明者は、NCBInrデータベースで利用できる範囲およびサイズ、そして利用可能なヘビタンパク質データベースがないことを考慮して、PMF解析には、NCBInrを常時利用し、さらにMascotおよびProfound検索ツールを用いることとした。PMF検索は質量偏差を200ppmにして開始し、有意なタンパク質スコアを有するタンパク質を同定する必要に応じて、当該質量偏差を300〜400ppmまで増加させた。タンパク質の質量およびpIを考慮して、残存切断部位が1〜2個あるものとし、タンパク質の質量10KDaごとに１個の残存切断部位を許容することとした。基本的なタンパク質ほど、Ｃ末端側がトリプシンで切断される基本アミノ酸であるアルギニン／リジンを多く含むことになるため、当該タンパク質の加水分解の際には、多くの残存切断部位が存在することを考慮する必要がある。
【００７０】
Profoundで同定されるタンパク質のEstd Zスコアは、検索パラメーターのうち質量およびpIの範囲に大きく影響される。機能が同一であって分類が異なる相同性タンパク質の質量およびpIが大幅に異なっていることはよくある。利用可能なヘビタンパク質データベースがないために他のデータベースにある相同性タンパク質を同定する必要があることで、本発明におけるPMF検索の結果に影響が生じ得るし、タンパク質／Estd Zスコアの低いものしか得られないことが予想される。そこで、全てのPMF検索において、実験で観察したタンパク質のpIおよび質量については、1ユニットのpIおよび5KDaの質量を許容することにした。そして、実験で観察したタンパク質に最も近似する質量およびpIを有するタンパク質アイデンティティーを探索することにした。いくつかの例において、ここで調べたヘビ卵母細胞タンパク質に十分に近似した質量およびpIを有するタンパク質アイデンティティーを見出すことができた。ただ、タンパク質／Estd Zスコアが最良であるアイデンティティーをMascotおよびProfoundの双方で同定することが最善である場合は、質量およびpIのゆらぎを許容することが必要になる例も少しあった。いくつかの例では、高いタンパク質スコアを有するものとしてMascotで同定されたタンパク質と同じものがProfoundでも同定され、許容範囲内のスコアを有するものとしてMascotで同定されたタンパク質と異なるものがProfoundで同定される場合があった。こうした場合は、これらの解析で同定された、許容範囲内のスコアを有する全てのタンパク質について検討および報告することにした。多くの例では、まず、適度なタンパク質スコア（50/76〜65/76）を有するタンパク質の質量、pIおよび生物をMascotで見つけ出し、当該情報に基づき、データに示すような許容範囲内のEstd Zスコアを有するタンパク質をProfoundで同定することとした。タンパク質のPMF検索において、‘分類法’に代えてE.Coliを用いた場合は、‘分類法’で検索したE.Coliのタンパク質と同一のタンパク質／Estd Zスコアが得られた（実験結果を参照のこと）。なお、他の場合は、まったく有意でないタンパク質スコアしか得られなかった。これは、本発明者が回収したタンパク質がE.Coliに由来しないことを証明するものである。E.Coliのゲノムは完全に配列解析がなされており、E.Coliのタンパク質はデータベースで利用可能であるからである。
【００７１】
ｋ．エレクトロスプレー・イオン化質量解析法（ESI MS）：ESI MS解析に十分なペプチドが、タンパク質の消化によって産生することはほとんどない。そこで、本発明者は、内部の配列タグに到達するまでタンパク質が消化されるようにしてESI MS解析を実施した。MS/MS断片スペクトルは、ナノスプレー源を装備したPE Sciex社（Toronto、Canada）製のQSTAR Pulsar（ESI-Q-TOF）を用いて得た。TOF MSは、スプレー電圧を1000Vにして得た。MS/MSにおける多価イオンの衝突エネルギーは、30〜50eVの範囲に設定した。
【００７２】
ｌ．NCBI BLAST解析：ESI MS測定によって、タンパク質のAA配列タグがたった10〜15個得られた。NCBI protein BLASTの“Search for Short, Nearly Exact Matches”ツールで当該配列タグをBLAST検索した。なお、ESI MSではAAの“L & I”と“K & Q”とを区別できないので、想定される全てのアミノ酸の組合せをBLAST検索しなければならなかった。BLAST検索で同定したタンパク質のうちスコアが最も大きいもののなかから、MascotおよびProfoundによるPMF検索によって事前に同定しておいたタンパク質を探索し、その結果をまとめた。
【００７３】
実験結果：
この実験では、‘実験方法’に記載したように、ヘビ卵母細胞から全RNAを分離し、mRNAを精製し、cDNAに転換させた。分離したmRNAは完全体であり、cDNA合成によって、広範なサイズを有するタンパク質を産生するものと予想される0.5〜4.5kbの転写物が得られた。したがって、本発明によるライブラリーの構築方法は有効であり、当該ライブラリーから広範な分子量を有するタンパク質が発現することになる。これまでに、GJ1158バクテリアにおけるタンパク質の過剰発現は、誘導開始から3時間で平衡に達することが報告されている（BhandariとGowrishankar、1997年）。これを考慮して、ヘビ卵母細胞cDNAライブラリーは、培養開始から3時間かけて600nmでのODユニットが0.2〜0.8の範囲にある種々のレベルになるまで誘導してから、全タンパク質を12.5％のSDS PAGEで解析するようにした。タンパク質の発現は、培養によるODの増加に付随して増加し、ODが約0.6になるまでに平衡に達し、3時間の誘導によってODが0.6〜0.8の範囲になったときには過剰発現した状態が認められる。ライブラリーの誘導のためにする以降の全ての実験も、こうした条件で実施した。誘導したライブラリーのタンパク質プロファイルでは、非誘導型であるコントロールに比べて有意な変化が認められたが、ファージミドを有していない非誘導型および誘導型のコントロールのGJ1158バクテリアのタンパク質プロファイルと、ファージミドを有する非誘導型ライブラリーのタンパク質プロファイルとは、近似するものであった。
【００７４】
非誘導型および誘導型のヘビ卵母細胞cDNAライブラリーから得たタンパク質を、可溶性画分と不溶性画分とに分画し、SDS PAGEで解析した。ライブラリーで発現したタンパク質は、可溶性画分により多く含まれていた。これは、GJ1158によって発現したタンパク質のほとんどが可溶性であるとの報告に一致するものである（BhandariとGowrishankar、1997年）。誘導型ライブラリータンパク質のうちの不溶性タンパク質は、‘実験方法’に記載したようにして、変性溶液に溶解させ、当該タンパク質をリフォールドさせた。残余の不溶性タンパク質についてタンパク質を抽出するステップとリフォールドさせるステップとをくり返すことによって、可溶性画分中の発現タンパク質のほとんどを回収した。こうして、タンパク質を抽出することおよびリフォールドさせることによって、ライブラリーで発現したタンパク質のほとんどを、可溶状態で、ほぼ定量的に回収した。図１に、ヘビ卵母細胞cDNAライブラリーから得た“非誘導型”および“誘導型”のタンパク質の2D PAGEプロファイルを示す。“誘導型”におけるタンパク質プロファイルには、“非誘導型”であるコントロールにはない、いくつかの新規なタンパク質スポットが存在していた（紫色の円で示す）。当該“誘導型”のタンパク質プロファイルは、複製されたcDNAから、誘導によって種々のタンパク質が全ヘビ卵母細胞cDNAライブラリーに発現したことを実証するものである。これは、ライブラリーの構築、全cDNAライブラリーの発現、およびタンパク質の抽出のためにここで用いた方法が、いずれも成功したことを意味する。
【００７５】
‘実験方法’に記載したようにヘビDNA−セファロースカラムを用い、全ライブラリー発現タンパク質からDNA結合タンパク質を分離した。非誘導型ライブラリーまたはコントロールであるGJ1158バクテリアタンパク質を同一条件下でDNA−セファロースカラムを用いてクロマトグラフィー処理することによっては、いかなる結合タンパク質をも回収することが難しかった。競合的E. coli DNAの存在下または非存在下でのクロマトグラフィー処理によってDNA結合タンパク質を精製すると、それぞれの2D PAGEパターンはほぼ同じになった。このことは、クロマトグラフィー処理の条件に応じて、ヘビDNA結合タンパク質がヘビDNA−セファロースに特異的に結合され得ることを示唆するものである。ライブラリー発現タンパク質を抽出し可溶化する際、バクテリアDNA断片も可溶性画分内に抽出される。こうしたE. coli DNA断片は、E. coli DNA結合タンパク質との結合過程において、おそらく、ヘビDNA−セファロースと激しく競合する。このことから、ヘビDNA結合タンパク質とDNA−セファロースとの間に観察される特異的な相互作用を説明できるように思われる。ライブラリーが誘導された状態にある培養液90リットルから、ヘビDNA−セファロースカラムを介して全タンパク質を回収することを、複数のバッチで実施し、当該ライブラリーで発現した約1.8mgのDNA結合タンパク質を回収した。GJ1158バクテリアからは、培養液1リットルあたり約5mgの過剰発現タンパク質が得られるものと考えられる。このため、90リットルの培養液からは、約450mgの過剰発現タンパク質が産生されることとなる。全ライブラリー発現タンパク質から、当該全ライブラリー発現タンパク質中の割合が非常に少ない状態にあるDNA結合タンパク質のみを分離したので、当該タンパク質の回収量が少ないこと（過剰発現タンパク質のうち約0.4％）は当然のことである。当該タンパク質をIEFで解析し、次いで2D PAGEを実施し、そしてクマシーブリリアントブルーR-250でゲルを染色した。図2は、精製済みDNA結合タンパク質のプロファイルについて示す図であり、質量が約15〜100KDaの範囲およびpIが約5〜9の範囲に、いくつもの明確なスポットが存在していることが読み取れる。これにより、DNA結合タンパク質の抽出および精製のためにここで使用した方法が、成功を収めたことが分かる。DNA結合タンパク質のスポットを2D PAGEから取り出し、トリプシンでゲル内消化し、回収したペプチドをMALDI TOF解析およびESI MS解析した。
【００７６】
MALDI TOF解析に十分な量を有した状態にある80個のDNA結合タンパク質スポットを集めたところ、37個のタンパク質について適度なスペクトルが得られた。図３は、当該タンパク質のうちの4つについてのMALDI TOFスペクトルを示す図である。本発明者は、当該タンパク質についてのPMFデータを取得し、適度なタンパク質／Estd Zスコアを有する全てのタンパク質アイデンティティーを確立した。表２は、当該解析によって得た23個のヘビ卵母細胞DNA結合タンパク質のアイデンティティーを示す表である。残余のタンパク質は、バクテリアに由来するものではあったが、非DNA結合型であった。こうしたものが得られた理由は後述する。同定したそれぞれのヘビDNA結合タンパク質について、“全分類法”に代えて“E. coli”を用い、上述の手順で使用したパラメーターでPMF解析したところ、いずれの解析によってもタンパク質アイデンティティーは非常にスコアが低いものしか得られなかった（表２）。これは、当該タンパク質がE. coliタンパク質ではないことを示唆するものである。E. coliタンパク質が存在すると、こうした結果にはならない。E. coliゲノムは完全に配列が解明されていてデータベースが利用可能な状態にあるので、何らの障害もなしにE. coliタンパク質をPMF解析で同定できるからである。
【００７７】
いくつかの例では、Mascot／Profoundの一方または両方によって、質量誤差200ppmでタンパク質を明確に同定できた。その他の例では、質量誤差を300〜400ppmにしなければタンパク質アイデンティティーを確立できなかった。多くの例で、MascotまたはProfoundによるスコアが有意であるタンパク質について、アイデンティティーを確立した。その他の例では、有意なスコアレベルよりも低いスコアを有するタンパク質しか同定されなかった。当該タンパク質は、スコアの横に“(*)”を付した状態で表２に表示した。同定したタンパク質は、タンパク質スコアおよび／またはEstd Zスコアが“有意なスコア”よりも若干低い例も少しあったが、MascotおよびProfoundの一方または両方が適度なタンパク質スコア／Estd Zスコアである同一のアイデンティティーを有することから、これらを許容することにした。多くの例では、Profoundを一度操作しただけでは、有意なスコアを有するタンパク質を同定できなかった。こうした場合は、まず、Mascotによって適度なタンパク質スコアを有するタンパク質を特定した後、Profoundによって当該タンパク質の質量およびpI、ならびに／または分類に基づき同定した（実験方法を参照のこと）。アイデンティティーに付されたマークの意味は表２の下部に表示した。こうした解析によって、種々のヘビ卵母細胞タンパク質を明確に同定できる。これまで、ProfoundのPMF検索によって明確なタンパク質アイデンティティーを得ることは比較的困難であり、タンパク質アイデンティティーをもっと正確に予測する必要があると考えられてきた（Danielら、2004年）。ただ、本発明者はその経験に基づき、Mascotによるタンパク質の明確な同定は難しいものであるがゆえに、Mascotによってさらに正確にタンパク質を予測が可能なのではないかという印象をもっている。利用可能なヘビタンパク質データベースがなくPMF検索が困難であることが、こうした印象を抱くに至った要因であるかも知れない。
【００７８】
PMF解析で同定したタンパク質について、当該タンパク質が有し得る生理機能を知るために、NCBIの“保存ドメインデータベース”検索を実施した。同定したタンパク質についての最も近しい生理機能を表３に示す。同定したタンパク質のほとんどにおいて検索結果の生理機能はDNA結合能であり（表３）、これらが真性／機能性DNA結合タンパク質であることを示唆する結果であったことは興味深い。そして、当該表に示すように、同定したタンパク質が、細菌、害虫、植物、ハエおよびほ乳類といった種々の生物に関連するものであったことも興味深い。ヘビ卵母細胞から異なる生物のタンパク質が同定される状態とは、ヘビ卵母細胞が実際に他の生物のタンパク質を有した状態にある必要はなく、分離したヘビ卵母細胞タンパク質が、他の生物に由来する前述のタンパク質と相同性を有する状態にあることを意味する。こうして同定したDNA結合タンパク質は、転写／シグナル伝達メカニズム、DNAの複製／組換および修復、細胞分割、染色体の分離／分配、mRNA前駆体の処理、ヌクレアーゼおよびDNA結合タンパク質に関与する因子を含むものであった。
【００７９】
クロマトグラフィー処理の条件を厳密に定めたため、明らかにDNA結合能が欠如しているにもかかわらずDNA−セファロースカラム内に保持された状態になって、DNA結合タンパク質の群に分類されてしまうようなタンパク質は、ほとんどなかった（データ未提示）。タンパク質のライブラリーを全て発現させ、ほとんどのライブラリー発現タンパク質を溶解させ、ネイティブコンディション（native condition）でDNA−セファロースカラムを介してクロマトグラフィー処理した。生理学的な条件下にある細胞では、細胞の種々の機能および当該機能に必要なタンパク質が厳密に細分化されている。それゆえ、生物システムではタンパク質同士が非機能的に連携することはありえない。DNA−セファロース親和性クロマトグラフィー処理の際、全ての天然タンパク質は溶液内に共存した状態にあった。このため、タンパク質同士の相互作用を促進させるモチーフを介した、非DNA結合タンパク質とDNA結合タンパク質との相互作用が誘導されることになる。こうしたタンパク質の1つであって、加水分解したアンピシリンをバクテリアの選別マーカーとして用いた状態でGJ1158バクテリアにおいて発現するPT7T3D複製ベクターを起源とするものに、β−ラクタマーゼがある。DNA結合タンパク質も、タンパク質同士を相互作用させるモチーフを（DNA結合ドメインに加えて）有しており、同様のモチーフを有する他の機能性タンパク質とともにタンパク質複合体を形成し、細胞内の標的遺伝子と連携してその機能を発揮させる。このように、DNA結合タンパク質は他のタンパク質と相互作用し得るし、親和性クロマトグラフィーのような非生理学的システムにおいて、DNA結合能が欠如したタンパク質が、DNA結合タンパク質と強く連携しDNA結合タンパク質の群に紛れ込むことがあり得る。さらに、バッファーの塩濃度を増加させることによって、クロマトグラフィー処理における洗浄ステップおよび溶出ステップの際に、こうしたタンパク質同士の相互作用（疎水的なものである）が安定することになる。こうした見解の信憑性は、タンパク質同士の／タンパク質とアミノ酸との相互作用そして周辺質の（通常は疎水的なものである）局在性に関与するタンパク質を回収することで高めることができるし、DNA結合能の欠如したタンパク質がDNA結合タンパク質の精製過程で回収されることに関して最も可能性が高そうな理由を得ることもできる。
【００８０】
ペプチドの量が十分である場合、ESI MS解析を実施し、6つのタンパク質の配列タグを回収した。図４に、解析した4つのタンパク質のESI MSスペクトルをそれぞれ示す。“実験方法”に記載したように、NCBI BLAST解析によって配列タグをデータベース検索した。3601、4401、6403および7305をPMF解析して得たタンパク質のアイデンティティーは、NCBI BLASTで同定した最良のスコアを有するタンパク質に含まれるものであった。1405および7303をPMF解析して得たタンパク質アイデンティティーは、NCBI BLASTで同定したタンパク質には含まれていなかった。図３に示すように、1405タンパク質および7303タンパク質から、良質のMALDI TOFスペクトルが得られた。これらをPMF解析したところ、少なくともProfound検索のスコアが高く、Mascot検索とProfound検索との間で別個のアイデンティティーを有したものが得られた（表２）。PMF解析によって同定した1405タンパク質および7303タンパク質はDNA結合性のものであり（表２）、当該タンパク質はDNA−セファロース・クロマトグラフィーによって回収されたものであることから、本発明者は、当該タンパク質についてのアイデンティティーはPMF解析によって得たものの方がより信頼性が高いと考えている。この見解は、全長タンパク質から得た情報に基づいて実施されるPMF解析がNCBI BLAST解析と違って信頼性が高いことによっても、支持される。表４に、EMS MSで調べたタンパク質から得た配列タグ、PMF解析およびNCBI BLAST解析によって得たタンパク質のアイデンティティー、同定したタンパク質の質量および2D PAGEによって得た対応する実験値を示す。
【００８１】
【表４−１】
2009523022.tif 000009
【００８２】
【表４−２】
2009523022.tif 000010
【００８３】
稀少組織を出発材料にして、全cDNAライブラリー発現タンパク質から極微量のタンパク質を分離し、プロテオミクス技術を用いて当該タンパク質を分類した。タンパク質の量が制限されていることや利用可能なデータベースがないことで困難になることはいくらかあるものの、本発明者は、このような制限がある同様の多くの解析に有用な新規な方法を用いることによって、こうした困難さを克服できる証拠を集めた。本発明の方法が実施可能なものであり強力な適応可能性を有するものであることは、ヘビ卵母細胞cDNAライブラリーを構築し、全ライブラリーを発現させ、プロテオミクス技術を用いてタンパク質を精製／同定することで実証される。全組織cDNAライブラリーで発現したバックグラウンドレベルのタンパク質の分離および同定に成功したことは、新規な技術的思想である“組織プロテオームライブラリー”を構築するための強力な基礎になるものである。
【００８４】
既存の方法に比べた本発明の方法の利点：現在の技術では、タンパク質の過剰発現には長時間を要するし、ストレスも多い。組織cDNAプールからタンパク質のcDNAをそれぞれPCR増幅させ、発現ベクターの適切なリーディングフレームに組み込み、適切な宿主細胞にプラスミドを形質転換させてタンパク質の発現を誘導することになる。cDNAプールを発現させ個々のタンパク質プールを過剰産生でき、全ての転写物を個別に発現させる労力および時間を削減できる方法は、先行文献に記載されていない。本発明の方法の原理や実施例1〜3は、本発明による技術的思想が完全に新規である証拠を提示するものである。本発明の方法によれば、複製したcDNAのプールを過剰発現させて、対応するタンパク質のプールを得ることができる。DNA結合タンパク質のような非常に重要なクラスの分子は細胞内に極微量でしか存在しないので、当該分子を同定することはもちろん、細胞内や組織内に存在することを証明することですら非常に難しい。このような分子を細胞や組織から分離することは非常に難しく、極微量でしか存在しないことや組織が入手しにくいことに起因して、ときには分離が不可能ですらある。患者、卵母細胞および初期胚から得た組織検体標本のような組織／細胞は、少ししか使用できないものがある。本発明の方法によれば、組織／ライブラリーにmRNA／cDNAが存在していれば、多数のタンパク質を過剰発現させることができる。さらに、こうしたタンパク質を、組織プロテオームライブラリーで過剰発現させたタンパク質プールから分離し同定することができる。これも、本発明の方法が重要かつ新規なものであることを証明するものである。
【００８５】
これまでに、生体活性を有し臨床適用が可能な特異的な物質を、ペプチドの組合せライブラリーを合成することによって探索する試みが、研究者によって進められてきた。本発明の方法は、不適切なリーディングフレームで翻訳された短縮型の多数のペプチドを発現させ得るものである。病気との闘いのために、生物学的システムにおいて、不適切なフレームでいくつかのタンパク質が発現し、生体活性を有し臨床適用が可能である有用なペプチドが産生されることは、かなりありそうなことではある。こうしたペプチドは、生体プロセスの制御剤になり得る。現在のところ、生物学的に重要／臨床適用可能なペプチドを発現／合成／過剰発現させることができる方法はない。不適切なフレームにおけるタンパク質の発現は翻訳が（ストップコドンに起因して）途中で停止し、重要な生物学的特性／臨床適用性を有し得る多数の生体ペプチドプールが生じることになる（後述する記載を参照のこと）。このように、本発明の方法は、新規な方法であり、重要なペプチドのプールを得るためにライブラリーを構築するための出発材料の作成に適用できるものである。なお、ライブラリーの構築には、種々の改良型の方法を使用してよい。10個程度の少数の細胞または組織検体標本に存在する転写物は、タンパク質を発現させ、PCRによるcDNAプールの増幅や発現ライブラリーを構築するプロテオミクス解析によって解析してもよい。極微量の転写物の度数を増加させるために、減算によって正規化したライブラリーを構築してもよい。全cDNAライブラリーの複製と誘導とを組合せ、減算状態のライブラリーを構築し、極微量の転写物をも過剰発現させ、プロテオミクス法によって当該転写物を解析／同定してもよい。
【００８６】
発現ベクターの全てのフレームで全組織cDNAが複製され過剰発現するように特異的に設計された、プラスミドベクターまたはファージミドベクターを、開発することは可能である。こうしたベクターに必要な配列因子としては、複製されるcDNAの5’末端および3’末端にある特定の6〜8塩基からなる制限酵素サイト（Rsa 1、Sfi 1、Sgf 1、Pme 1、Not 1など）と、抗生物質の遺伝子と、発現した全てのタンパク質の精製に有用である5’末端にある特定のアミノ酸タグ（HisタグまたはGST-fusionタグなど）と、複製済みcDNAの増幅などに必要になる、複製されるcDNAの両端部にある一般的なプライマー配列（T7およびT3）とが挙げられる。ファージ発現ベクターを用いるcDNAライブラリー構築キットは、BDバイオサイエンス社からSMARTとして販売されている。当該ベクターは、3つある全てのフレームでタンパク質を発現するとされている。ただ、この場合、ファージに組み込まれた複製済みcDNAは、それぞれファージミドとして放出されなければ、発現できる状態にならない。これには、それぞれの複製物についてする規格化が大量に必要になるため、全ての複製済みcDNAを1度の操作で発現させるためには有用ではない。したがって、全ての複製済みcDNAを1度の操作で発現させることができ、かつ組織プロテオームライブラリーの構築に有用な特別なベクターを開発する必要がある。
【００８７】
プロテオミクスは、既に、自動かつ高効率な処理能力を有しているため、膨大な数のタンパク質を含有する混合物中のタンパク質を解析し同定することにさえも、好適に適用できる。上記のとおり、全ライブラリーを発現させる方法をプロテオミクスと組み合わせることで、臨床組織検体、卵母細胞および初期胚といった少量しか使用できない試料に存在する転写物さえも解析することができる。これにより、そうした検体標本と適切なコントロールとにおけるタンパク質プロファイルを比較し、タンパク質パターンの変化を評価すると共に検体標本内の未知のタンパク質を同定することが容易になる。本発明の方法によれば、プロテオミクス、生理学、生化学および分子生物学といった研究分野における研究のペースが確実に速まるため、細胞核の再プログラミング、胚分化、発達、老化および疾患といった現在の生物学上の重要な研究課題をより迅速に解決することができる。
【００８８】
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【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１は、等電点と質量に基づく発現タンパク質の分散度について示す図である。
【図２】図２は、精製したDNA結合タンパク質のプロファイルについて示す図である。
【図３】図３は、同定した4つのDNA結合タンパク質（SSP番号:1405、1955、6601、7303）のMALDI TOFスペクトルについて示す図である。
【図４】図４は、調べた4つのタンパク質のESI MSスペクトルについて示す図である。
【図１】
2009523022.tif 000011
【図２】
2009523022.tif 000012
【図３】
2009523022.tif 000013
【図４】
2009523022.tif 000014
【国際調査報告】
2009523022.tif 000015
2009523022.tif 000016