(57)【要約】  本発明は、Clp1はRNAキナーゼ活性を有するという発見に基づく。したがって、Clp1はsiRNA活性のエンハンサーとして有用である。前記はそれ自体キットにおいて使用することができるが、また細胞株で発現させてもよい。Clp1トランスジェニック及びClp1ノックアウト非ヒト動物は、siRNAの機能の研究に有用である。Clp1はまた、治療用siRNAの有効性を強化するために遺伝子治療で有用である。
2009538608.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
RNAキナーゼとしての、Clp1分子の使用。
【請求項２】
ATPのγ-ホスフェートをssRNA、dsRNA、又はRNA/DNAハイブリッドのRNA鎖の5'末端に移転させるための、請求項1記載の使用。
【請求項３】
前記Clp1が組換え体である、請求項1又は2記載の使用。
【請求項４】
前記Clp1が、配列番号:2に示されるアミノ酸配列を有するか、又は配列番号:1に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと、若しくはその中に含まれるHsClp1をコードする領域とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を有するヒトClp1（HsClp1）、或いは前記RNAキナーゼ活性を有するその変異体若しくはフラグメントである、請求項１から3のいずれか1項記載の使用。
【請求項５】
前記Clp1分子がキットの成分である、請求項1から4のいずれか1項記載の使用。
【請求項６】
以下のａ−ｃを含むキット：
ａ．前記RNAキナーゼ活性を有する組換えClp1；
ｂ．γ-ATP；及び
ｃ．緩衝液成分及び、約1−10mMの最終濃度範囲で使用するために、Mg2+、Mn2+、Ni2+又はその混合物から選択される1つ以上の金属イオンを含む反応緩衝液。
【請求項７】
金属イオンの前記濃度範囲が2−5mMである、請求項6記載のキット。
【請求項８】
γ-ATPが放射能標識された形体として存在する、請求項6又は7記載のキット。
【請求項９】
γ-ATPが、[γ-32P]ATP、[γ-33P]ATP、[γ-18O]ATP又は[γ-35S]ATPとして存在する、請求項8記載のキット。
【請求項１０】
前記Clp1が請求項4に定義した組換えヒトClp1である、請求項6から9のいずれか1項記載のキット。
【請求項１１】
前記Clp1分子が動物細胞で外因的に発現され、前記細胞内でそのキナーゼ活性を示す、請求項１から5のいずれか1項記載の使用。
【請求項１２】
前記動物細胞が哺乳動物細胞である、請求項11記載の使用。
【請求項１３】
前記細胞が細胞株に由来する、請求項12記載の使用。
【請求項１４】
Clp1を発現するように遺伝的に操作された動物細胞株。
【請求項１５】
内因的にClp1を発現しない、請求項13記載の細胞株。
【請求項１６】
さらにsiRNA分子を発現する、請求項14又は15記載の細胞株。
【請求項１７】
前記siRNA分子が、前記Clp1分子と同じプロモーターによって制御される、請求項16記載の細胞株。
【請求項１８】
Clp1トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１９】
前記非ヒト動物がマウスである、請求項18記載のトランスジェニック動物。
【請求項２０】
Clp1ノックアウトマウス。
【請求項２１】
目的とする疾患関連遺伝子に対する治療用siRNAをコードするDNA及び前記RNAキナーゼ活性を有するヒトClp1分子をコードするDNAを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は分子生物学のツールの分野、特に核酸リン酸化の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
RNA干渉（RNAi）は真核細胞の進化の途上で保存されたプロセスであり、前記は小さな二重鎖（ds）RNAを利用して同族の標的遺伝子の発現を特異的にサイレンシングする（1,2）。RNAiは本来、可動性遺伝エレメント、例えばトランスポゾン又はウイルス（前記はdsRNA中間体を介して細胞内で複製し増殖する）に対する防御系として進化し、したがってRNAiはゲノムの完全性を維持するために機能していると考えられる。RNAiは、カエノルハブディチス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）に外因的に導入されたdsRNAが配列特異的遺伝子サイレンシングをもたらすという観察により、ほんの8年前に初めて正式に報告された（3）。それ以来、RNAi現象は、通常の逆遺伝学的アプローチに大変革をもたらし、これまでのところ広範囲の後生動物（ヒトを含む）における遺伝子不活化研究のためのツールとして広く用いられている。さらにまた前記は、癌及び他の疾患の治療を目的とする施療技術として極めて有望である（4）。
RNAi経路は、天然にはdsRNA前駆体によって始動される。この前駆体はRNase III酵素ダイサーによるプロセッシングを受け、2ヌクレオチド（nt）の3'オーバーハングをもつ21−23ntの短いデュープレックス（図1）となる（5,6）。これらのデュープレックスは、相補性一本鎖（ss）RNA、例えばメッセンジャーRNA（mRNA）の認識及び最終的には切断を、したがってその破壊又は翻訳抑制を先導する。前記デュープレックスが完全に相補性であり、長いdsRNA（例えばウイルス及びトランスポゾン）から生じ、さらに一般的にmRNA切断を先導する場合は、それらは小干渉性RNA（siRNA）と称される。前記デュープレックスが、不完全なステム-ループ構造をもつdsRNAを形成する内因性の非コード性転写物から生じる場合は、それらはミクロRNA（miRNA）と称される（7）。動物では、miRNAは、mRNAの3' UTR（非翻訳領域）中の部分的に相補的な配列を標的とすることによってもっぱら翻訳を阻害する。これまで1600を超えるmiRNAが動植物及びウイルスで同定され、これまでのところmiRNAは、膨大な数のmRNA遺伝子発現における重要な調節因子であり、したがって発生の制御で主要な役割を果たすと考えられている（8）。
【０００３】
両者、siRNA及びmiRNAによる遺伝子サイレンシングは、RNA誘導サイレンシング複合体（RISC）へのそれらの取り込みによって開始し（9−11）、この場合、前記デュープレックスは鎖に特異的な態様で解ける（12,13）。このとき、一方の鎖（“パッセンジャー”鎖と称される）はRISCから排除されるが、他方の鎖（“ガイド”と称される）は、RISC内のアルゴナウテ（Argonaute（Ago））ファミリータンパク質のメンバーとしっかりと結合したままで、同族RNA標的の認識のための鋳型として機能する。miRNAによる翻訳阻害の正確な分子的メカニズムは不明のままであるが、siRNAガイド鎖はAgo2タンパク質をmRNA標的（前記標的はAgo2のエンドヌクレオリティック分解活性によって切断される）に補充する（17,18）。
ダイサー切断によるdsRNAのプロセッシングによって、siRNA及びmiRNAの両者に5'モノホスフェート及び3'ヒドロキシル基が残される。小RNA上の5'ホスフェートは効率的なRNAiのための絶対要件である。なぜならば5'ホスフェートが5'メトキシ基又はアミノ基で置換されたsiRNAガイド鎖は、in vitro並びにキイロショウジョウバエ（Drosophila）及びHeLa細胞のmRNA標的のin vivo切断を始動させなかったからである（19−21）。この説明は、非リン酸化siRNAデュープレックスはアッセンブリングできず活性なRISCを生じないことを示したサイズ排除クロマトグラフィー及び未変性ゲル電気泳動からもたらされた（19,22,23）。さらにまた、組換えAgo2及びsiRNAを含むin vitro系を用いたとき、5'ホスフェートはRISCアッセンブリーに重要であるだけでなく、5'ホスフェートは、Ago2-siRNA複合体の安定性に寄与することによって活性なRISCそれ自体の内部において役割を有することが示された（18）。5'ホスフェートはまたAgo2が標的RNA（前記はガイドsiRNAの5'末端から計算されることが以前に示された（24））を正確に切断するための決定因子でもある（18）。
5'ホスフェートがRNAiに必須であったとしても、5'ヒドロキシル基を有する合成siRNAはまた、in vitroで並びにキイロショウジョウバエ及び培養HeLa細胞によるin vivoでRNAiを効率的に仲介することができる。これは、5'ヒドロキシル基を迅速にリン酸化する内因性“siRNA-キナーゼ”活性によるものである（19,21）。これまでのところ、siRNA-キナーゼの正体は明らかになっていない。ヒトRNAキナーゼ活性の精製は25年も前から既に取り組まれていたが、このタンパク質配列は明らかにできなかった。
【発明の概要】
【０００４】
核酸のリン酸化のメカニズムを解明することが本発明の目的であった。特に、siRNAをリン酸化するヒトRNAキナーゼ（“siRNAキナーゼ”）活性を同定することが本発明の目的であった。
本発明の下に横たわる問題を解決するために、極めて骨の折れる生化学的アッセイが用いられ、通常のクロマトグラフィーと組み合わせた前記アッセイによって、本発明者らは、“siRNA-キナーゼ”としてヒトClp1（HsClp1）（RNAをリン酸化することができるヒトで発見された最初のキナーゼ）を精製及び同定することができた。
HsClp1は進化の途上で保存されたタンパク質である。前記は本来、染色体転座後のAF10遺伝子との融合転写物として同定され、推定上のC.エレガンスタンパク質とのその相同性によって、HEAB（仮説的カエノルハブディチス・エレガンスATP/GTP結合タンパク質のヒトホモローグ）と称された（26）。Clp1ホモローグは、ウォーカーA及びおそらくウォーカーBモチーフを含む（前記はともにATP/GTP結合に関与している（27,28））。
Clp1タンパク質は、前駆体mRNA（プレ-mRNA）をプロセッシングするタンパク質機構の部分であることが以前に示された。プレ-mRNAは、細胞質にそれらが輸送される前に種々の成熟工程を経る。これら工程には、5'末端へのキャップ構造の付加、イントロンスプライシング及び3'末端におけるエンドヌクレオリティック切断とそれに続くポリアデニル化が含まれる。Clp1の機能は最初サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）で知られ、ここで、Clp1は、プレ-mRNAの3'末端におけるエンドヌクレオリティック切断に必要であることが示された（29）。酵母と同様に、HsClp1は切断因子IIm（CF IIm）複合体（プレ-mRNAの3'切断に必須である）の部分として同定された（30）。この因子はマルチタンパク質複合体の部分であり、このうち、切断とポリアデニル化特異性因子（CPSF）及び切断刺激因子（CstF）は切断部位の上流及び下流の特異的配列を認識する（31,32）。他の成分、例えば切断因子CF Im及びCF IImは実際の切断工程のために要求される。切断時に、ポリ(A)ポリメラーゼ（PAP）の酵素活性がポリ(A)テールの付加に必要である。
【０００５】
興味深いことに、mRNA3'-末端のプロセッシング機構とtRNAスプライシング経路とのつながりが最近ヒトで示された。真核生物のtRNAイントロンは通常プレ-tRNAのアンチコドンループに位置し、それらの除去は多数の酵素活性を必要とし、前記酵素活性については、サッカロミセス・セレビシアエで重点的に性状が調べられている（33）。さて、Sen2、Sen15、Sen34及びSen54タンパク質で構成されるエンドヌクレアーゼ複合体は、プレ-tRNAをその5'及び3'スプライシング部位で切断し、2つのtRNAエキソン二分分子を生じる。続いて前記5'及び3'エキソンはtRNAリガーゼによって連結される（tRNAリガーゼは多機能性酵素であり、そのホスホジエステラーゼ、RNAキナーゼ及びRNAリガーゼ活性が、最終的に成熟tRNAを生成するために要求される）。ヒト細胞抽出物からプレ-tRNAエンドヌクレアーゼ複合体を単離することによって、HsClp1タンパク質がmRNA3'-末端プロセッシング装置の他の成分と一緒に、HsSenタンパク質と結合することが見出された（34）。しかしながら、tRNAスプライシングにおけるHsClp1の機能は不明のままである。
本発明の実験では、HsClp1の基質にはdsRNA、dsDNA、dsDNA/RNAハイブリッド及びssRNAが含まれることが見出された。興味深いことに、ssDNAはHsClp1によってリン酸化されない（このことは通常のポリヌクレオチドキナーゼ（PNK）との大きな違いである）（35）。
【０００６】
HsClp1のキナーゼ活性の同定は、分子生物学におけるツールとして（例えば核酸リン酸化のための研究ツールとして及びRNAi技術における試薬として）、及び遺伝子スプライシング効率の強化にHsClp1が有用な治療法において、HsClp1を利用するための前提条件である。
Clp1ホモローグはほとんど全ての生物に（細菌及び酵母にさえも）存在する。ヒトClp1に加えて、HsClp1のキナーゼ活性を有するホモローグ、例えばネズミ（Mus musculus）Clp1（AAH03237）、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）Clp1（AAH70530）、ニワトリ（Gallus gallus）Clp1（AJ720420.1）、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）Clp1（AE003808.4）、カエノルハブディチス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）Clp1（Z83114.1；CAA84329）、サッカロミセス・セレビシアエ（AAH00446、Q08685）もまた、RNAi技術における研究ツールとして及び試薬として有用である。以下では、特段の記載がなければ、“Clp1”という用語は、ヒトClp1（HsClp1と称される）のキナーゼ活性に一致する活性を有する任意の哺乳動物又は後生動物ホモローグについて相互に用いられる。
本発明の実験では、ポリヌクレオチドキナーゼ活性は、Clp1のH.サピエンス型で最初に同定された（実施例1を参照されたい）。さらに別の実験で、他の生物由来のClp1ホモローグも核酸に対して同様なリン酸化活性を強く出現させることが示された。特に、メタノカルドコッカス・ジャナスキー（Methanocaldococcus janaschii（NP_24831；DSM2661））及びカエノルハブディチス・エレガンス由来のClp1ホモローグはRNA-キナーゼ活性を明示することが示された。サッカロミセス・セレビシアエのClp1はRNAキナーゼ活性を含むが、ただし一本鎖（ss）RNAでのみ作用し（図11C、右パネル）、二本鎖（ds）RNAでは作用しない（図11C、左パネル）こともまた示すことができた。前記は、ss-及びds-RNAプールで優先的にかつ選択的にssRNAのRNAリン酸化を所望する場合に有益な応用を提供する。
【０００７】
同様な態様で、他の生物のClp1ホモローグのキナーゼ活性は、それぞれのタンパク質のコードDNA配列を、例えば全cDNA又はcDNAクローンからPCRで増幅させた後でHisタグ又はGSTタグ融合物として通常の細菌発現ベクターでクローニングすることによって明らかにすることができる。大腸菌（Escherichia coli）で発現させた後、Clp1タンパク質をクロマトグラフィーの方法を用いて抽出物から精製し、続いて実施例に示すように核酸でキナーゼ活性を試験する。
Clp1の利点は、このタンパク質は、少なくともdsRNA中に存在するときは種々の5'ヌクレオチドを同じ効率でリン酸化するということである（図5C）。対照的に、T4 PNKキナーゼ活性は、ある種のオリゴヌクレオチド、特に5'-シチジン末端をもつものに対して効率が悪い。前記に関連して、Clp1（特にHsClp1）は、オプチキナーゼ（USB corporation）（T4 PNKの改変型）と類似するかもしれない（オプチキナーゼもまた種々のオリゴヌクレオチドをほとんど又は全く差別しない）。しかしながら、一方のT4 PNKの全タイプ（天然に存在するもの及び改変オプチキナーゼ）と他方のHsClp1との間には大きな違いが存在する。すなわちssRNAとssDNA間の識別能力であって、後者はリン酸化されず、このことは、分子生物学的アプローチで特殊な問題を強調するために重要である。
【０００８】
本発明の実験では、Clp1はRNA 3'ホスファターゼ活性を示さないこともまた示されている。したがって、Clp1（例えば組換えHis6-タグ付加HsClp1形である）は、同時に3'末端での脱リン酸化事象を所望しないときには、RNAの5'リン酸化のために用いることができる。そのような5'及び3'末端リン酸化RNAは、その後のT4 RNAリガーゼ反応のための基質としてそれらを使用する場合（この場合はRNAの環状化または自己付加の防止が要求される）に有益である（58）。3'ホスフェートはT4 RNAリガーゼ反応で封鎖基として機能し、したがって特有の分子間生成物が担保される。3'ホスファターゼ活性が全く存在しないことは、市場で入手可能なT4 PNK、例えばRoche Applied Scienceによって提供されるものを超える利点を提供する（前記市販のT4 PNKは“ホスファターゼ不含”と宣伝されているが漏出3'ホスファターゼ活性を常時示す）。本発明の趣旨では、 Clp1の関係で“キナーゼ活性”という用語の使用は、dsRNA、dsDNA、dsDNA/RNAハイブリッド及びssRNAをリン酸化するClp1の上記記載の活性を指す。
したがって、第一の特徴では、本発明は、ATPのγ-ホスフェートをssRNA、dsRNAの5'末端、又はRNA/DNAハイブリッドの部分としてのRNA鎖の5'末端へ移転させるためにClp1を使用することに関する。
好ましい特徴では、本発明は組換えClp1の使用に関する。
さらに別の特徴では、本発明は組換えHsClp1の使用に関する。
HsClp1は配列番号:2に示すアミノ酸配列を有し、前記は配列番号:1に示すDNA配列によってコードされる。
【０００９】
組換え（又は類似の態様の）HsClp1（又は任意の哺乳動物若しくは後生動物のHsClp1のホモローグ）は、調節DNA配列（異種調節配列でもよい）、例えばプロモーター又はエンハンサーに作動できるように連結された1つ以上のClp1 DNA配列を含む遺伝的構築物を、宿主細胞、好ましくは細菌、菌類（酵母を含む）、植物又は動物（昆虫又は哺乳動物を含む）細胞で発現させることによって容易に入手することができる。そのような構築物（そのデザインは実験室マニュアル（例えば（37）参照）に記載されてあり、さらに当業者には日常的である）では、前記調節配列は、成熟Clp1ポリペプチド又はその変異体をコードするポリヌクレオチドに作動できるように連結することができる。天然に存在する配列に一致するヌクレオチド配列を有するDNA分子の他に、本発明で有用なClp1ポリペプチドを得るために、実質的に異なる配列を有するDNA分子（遺伝暗号の縮退のために、前記はなお所望のキナーゼ活性を有するClp1ポリペプチドをコードする）を用いることができる。遺伝暗号は当分野では周知であるので、甚だしい実験を行うことなく上記記載の縮退変異体を作製することは当業者にとって容易である。
したがって、Clp1ポリペプチドはまた、天然に存在するDNA分子（HsClp1の場合は、その配列は配列番号:１に示されている）によってコードされるものから逸脱した変異体もまた包含する。そのような逸脱はアミノ酸の保存的交換によって引き起こされえるが、ただしそれらは所望のキナーゼ活性を有するClp1誘導体又はフラグメント若しくはペプチドに限られ、したがって、それらの配列内に天然に存在するDNA配列とは変化したポリヌクレオチド配列を有するそのような誘導体又はフラグメントをコードする単離DNA分子は、組換えClp1を生成するために宿主細胞での発現に用いることができる。変異体又はフラグメントClp1候補配列は、本発明の実施例に記載するアッセイでそのキナーゼ活性について日常的に試験することができる。
【００１０】
Clp1ポリペプチドをコードする配列をマーカー配列、例えば融合ポリペプチドの精製を促進するペプチドをコードする配列と融合させることができる。前記マーカーアミノ酸配列は、6ヒスチジンペプチド（例えばpQEベクター（Qiagen, Inc.）で供給されるタグ）でもよいが、他のタグ（それらの多くは市場で入手できる）の中では特に、“HA”タグのような精製に有用なまた別のタグがある（前記はインフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来エピトープに一致する）。Clp1の精製促進のためのさらに別の有用なマーカーペプチドは、pGEX融合ベクター（例えば（38）参照）によってコードされるグルタチオンS-トランスフェラーゼである。他のそのような融合タンパク質には、免疫グロブリンFcとそのN-又はC-末端で融合したClp1が含まれる。
好ましい特徴では、Clp1は配列番号:2に示されるアミノ酸配列を有するか、又は配列番号:1に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド若しくはその中に含まれるhsClp1をコードする領域（ヌクレオチド724から2001）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を有するヒトHsClp1ペプチドである。
【００１１】
本発明にしたがえば、Clp1はそれ自体で提供されてもよい。また別には、Clp1はキットの成分として用いられてもよい。
したがって、さらに別の特徴では、本発明は、Clp1を、前記の最適なキナーゼ活性を担保する試薬と一緒に含むキットに関する。本発明のこの実施態様では、キットは以下を含む：
a）組換えClp1；
b）γ-ATP；及び
c）約1−10mMの最終濃度範囲、好ましくは2−5mMの濃度範囲で使用される、Mn2+、Mn2+、Ni2+から選択される1つ以上の金属イオン又はその混合物を含む反応緩衝液。
上記記載の金属イオンの他に、キットの緩衝液は当業者に公知の通常の緩衝液成分を含む。すなわち、これらの成分は本発明の実験で用いられる組合せで存在することができるが（KCl、Hepes（pH7.4）、グリセロール、DTT、AEBSF（4-(2-アミノエチル)ベンゼンスルホニルフロリド））、又それらはT4 PNK反応に用いられる反応緩衝液と類似又は同一であってもよい（例えば70mMトリス-HCl、10mMのMgCl2、5mMのジチオスレイトール（DTT））。キナーゼアッセイで良好に試験することができた他の可能な別の緩衝液系は、50mMのKH2PO4／K2HPO4（pH7.2）である。一般的には、キナーゼは、pH6.0（50mMのMES（モルホリンエタンスルホン酸））からpH9.0（50mMのCHES（N-シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸））までの範囲の緩衝液中で活性を有し、さらに10−200mMの範囲のKClの塩濃度で活性を示す（実施例5を参照されたい）。
【００１２】
本発明のキットが放射能標識核酸用に用いられる場合は、γ-ATPは放射能標識された形体、例えば[γ-32P]ATP、[γ-33P]ATP、[γ-18O]ATP又は[γ-35S]ATPとして存在しえる。
好ましくは、キットに含まれるClp1はHsClp1である。
組換えClp1又は前記を含むキットはとりわけ、RNAプロセッシングモニター用放射性RNAプローブの調製又はハイブリダイゼーション（例えばノザンブロッティング）用に一般的に用いられる全てのタイプの反応について有用である。活性なキナーゼとしてClp1を用いることにより得られるリン酸化核酸（例えばsiRNA分子）は、例えばノックダウン実験の有効性の決定を目的とする実験で有用である。未リン酸化siRNA分子の割合を変化させながら混合物中でリン酸化させることによって、所望のノックダウン効果のために最適なリン酸化の程度を決定することができる。
以前の研究で、RNAi経路に参入するために5'-ヒドロキシル基を含む合成外因性siRNAのリン酸化のための潜在的な“siRNA-キナーゼ”の要件が精査された（19−21）。Clp1はまた、siRNAデュープレックス上での5'-ホスフェート基の維持に役割を有するかもしれない。この役割は、RNase III酵素ダイサーが、長いdsRNA又は前駆体-miRNAから切断することによりそれぞれ5'リン酸化内因性siRNA及びmiRNAを生成するので生理学的に妥当である。5'-ホスフェートを定常状態で維持するために、Clp1は、RNAデュープレックスを容易に脱リン酸化する仮説的ホスファターゼ活性を凌駕する必要があろう。実際、キイロショウジョウバエの胚溶解物はそのようなsiRNA-ホスファターゼ活性を含むことが報告された（19）。
【００１３】
ヒト“siRNA-ホスファターゼ”（種の間でのこれらメカニズムの高い保存度のために、前記の存在は極めて高い確率で予想されえる）は、Clp1の細胞性siRNA-キナーゼ活性の速度を低下させる可能性がある。これは、RNAiを問題の遺伝子をノックダウンするための実験室ツールとして用いるときと同様に、効率的な内因性RNAiのための速度制限工程となりえよう。RNAiの使用による哺乳動物の組織培養での一過性遺伝子サイレンシングは変動することが示された（前記は、siRNAデザインのために選択された配列、細胞のトランスフェクション効率及びタンパク質安定性にほぼ起因する欠点である）。これまでのところ、siRNAの5'-ホスフェートの細胞内安定性は、良好なRNAiに寄与する因子として軽視されてきた。
したがって、Clp1の細胞レベルの増加（例えば哺乳動物細胞でのClp1の過剰発現による）は、siRNA（又は短いヘアピンRNA（shRNA）をコードするベクター）を用いる場合にRNAiの有効性改善のために所望される。Clp1の細胞レベルの制御はまた、前記酵素を発現する安定な哺乳動物細胞株を作製することによって提供することができる（前記細胞株にsiRNA（又は短いヘアピンRNA（shRNA）をコードするベクター）をトランスフェクトすることが可能であろう）。
【００１４】
したがって、さらに別の実施態様では、本発明は、Clp1を発現するように遺伝的に操作された細胞株、好ましくはHsClp1を安定的に発現するヒト細胞株に関する。安定な発現は、プロモーター（好ましくは誘導性プロモーター）の制御下にあるClp1 DNAを細胞ゲノムに挿入することによって達成される。前記は、市場で入手可能であるか及び／又は文献に記載の一般的な方法、例えばテトラサイクリン誘導性システム（例えばT-Rexシステム（Invitrogen））又はエストロゲン誘導性システム（39）によって達成することができる。そのような細胞株は、当該細胞株内の問題の遺伝子のノックダウンの影響を調べるために、siRNAベクター（市場で入手可能ないわゆる“ヘアピン”ベクター（例えばOligoengineのpSUPERIORベクター））との組合せで有用である。細胞株に関して制限はなく、前記は、腫瘍細胞株（MCF7、MDA-MB-468、PC-3、HeLa、SAOS-2、U2OS、A172、U87MG、Colo5、HCT116、NCI-H460）でも、不朽化初代細胞株、例えばBJ1-hTERTのような線維芽細胞株、乳腺上皮細胞株、ケラチノサイト細胞株、T若しくはB細胞株、マスト細胞株、マクロファージ細胞株及び他の造血細胞株、ニューロン細胞株、肝細胞株、又は任意の他の器官若しくは組織に由来する細胞株、又は初代細胞（例えば新しく単離されたT細胞若しくは心筋細胞）でもよい。市場で入手できる多数の細胞株（例えばATCC（American Type Culture Collection; P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108, USA）又はDMSZ（Deutsch Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, GERMANY）から入手できる）がある。
また別には、遺伝的に操作された細胞株は、そのゲノム内に組み込まれたDNA配列からClp1を発現しないが、プロモーター（好ましくは上記に記載の誘導性プロモーター（例えばテトラサイクリン誘導性システム））の制御下でClp1配列を保持する通常のベクター（例えばInvitrogen由来のpcDNA系）から一過性にClp1を発現させる。
【００１５】
別の実施態様では、Clp1 DNA配列（ゲノムに挿入されているか又はベクターに存在する）は、細胞質局在シグナル（例えばミリスチル化シグナル、例えばsrc-タンパク質ミリスチル化膜局在シグナル（N末端-MGSSKSKPKDPSQRR-C末端））をコードする配列と融合される。図9に示されているように、過剰発現されたHsClp1は核内に顕著に局在し、ここで前記は、プレ-mRNAの3'-末端プロセッシングで必要とされるタンパク質複合体中でtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼと一緒に存在する。内因性Clp1の核内機能との干渉を回避するために、内因的にClp1を発現する細胞株の場合には過剰発現Clp1を人工的に細胞質内に保持させることが所望されえる。siRNAをリン酸化するClp1の機能は細胞質で生じるように思われるので、細胞質局在はClp1の機能を高め、それによってRNAiを強化する。したがって、Clp1を細胞質局在シグナル（すなわちミリスチル化シグナル）と融合させることによって達成される細胞質局在は、Clp1タンパク質の細胞質膜への固定を生じ、上記に記載した全てのClp1の適用でRNAiの改善に有利でありえる。
ヘアピンベクターによってコードされるsiRNA分子はまた、誘導性プロモーター（好ましくはClp1の発現を制御するものと同一のもの）の制御下にあってもよい。これは、Clp1及びsiRNA分子の発現が、ただ1つの誘導物質の添加によって同時に誘導されえるという利点を提供する。
さらに別の実施態様では、細胞は遺伝的に操作され、内因的にClp1を発現しない細胞株内でClp1を発現する。
【００１６】
そのような細胞は、第一の工程でClp1ノックアウト細胞株、すなわちClp1を発現しない細胞株を作製することによって得ることができる。そのような細胞株は、通常の方法、例えばアデノ関連ウイルスベクターによるヒト染色体へのトランスジーンのターゲッティング挿入のために記載され、ヒト体細胞遺伝子ノックアウトの作製のために用いられた方法によって得ることができる（40−42）。さらにまた、そのような細胞は、マウスES細胞及びノックアウト変異体マウスから作製することができる（この場合、Clp1の両者のコピーは、通常の遺伝子ターゲッティング又はフロックスされた（floxed）対立遺伝子を用いる組織特異的遺伝子ターゲッティング戦法のいずれかによって破壊される）。フロックスされた対立遺伝子は、マウス胚の規定組織内でClp1を欠失させ、さらに成熟マウスでも同様にCre含有ベクターのトランスフェクションを用いてこれらのマウスに由来する細胞でClp1を欠失させる。前記Cre含有ベクターは、例えばadenomCreウイルスで、フロックスされたClp1遺伝子をケラチノサイト、線維芽細胞、又はそのようなアプローチに由来する任意の他の細胞で欠失させる。
本発明はさらにClp1ノックアウトマウスに関する。さらに別の実施態様では、本発明はノックアウト細胞株に関する。
Clp1ノックアウトマウス及びClp1ノックアウト細胞株を作製するための典型的なアプローチは、相同組換えによる遺伝子ターゲッティングを用いて人工DNAをマウス胚幹細胞（ES細胞）に含まれる染色体DNAに挿入する通常的な方法を利用し、前記は実施例7に記載されている。
Clp1ノックアウト細胞株を遺伝的に操作して、そのゲノムから又はベクターから上記に記載したようにClp1を安定的に発現させることができる。内因的にClp1を発現しない細胞株は、siRNAノックダウン実験を厳密に管理した態様で実施することができるという利点を提供する。
【００１７】
さらに別の特徴では、本発明はClp1トランスジェニック非ヒト動物に関する（前記動物はRNAi仲介遺伝子機能実験に有用である）。
ある実施態様では、前記非ヒト動物はマウスである。通常的でかつ誘導性の組織特異的ノックアウトマウスは、野生型又は構成的に活性化Clp1を発現するトランスジェニックマウスと同様に、目的とする標的遺伝子に対するsiRNAのin vivo機能の試験の改善のために貴重なツールである。例示すれば、新規なsiRNAの機能（例えば新規な標的遺伝子に対する機能）は、例えば誘導性プロモーターの下で発現するトランスジェニックマウスで、Clp1をその有効性又は標的遺伝子によってコードされる完全なタンパク質の欠失から生じる副作用に関して試験することができる。そのような情報は、標的遺伝子の阻害に起因しえる最大の影響の同定及び説明のための基礎を提供する。そのような系はまた、いわゆる“オフターゲット効果”（すなわち標的とは無関係の化合物の効果、特に望ましくない毒性効果）の同定に用いることができる。したがって、特定の標的遺伝子に対するsiRNAで処理されたトランスジェニックClp1マウスから得られる情報は、薬剤スクリーニングで同定されたある標的遺伝子の小分子阻害剤候補の模範的最適化及びプロファイリングの観点から貴重である。他方、siRNA分子はClp1ノックアウトマウスで機能しないか否かを試験することができる（前記は特異性の非常に有用なコントロールを提供する）。
さらに別の実施態様では、非ヒト動物は後生動物である。さらに別の実施態様では、後生動物はC.エレガンスである。C.エレガンスのClp1トランスジーンを得るために、一般的なプロトコル（例えばPraitisらが記載したようなもの）に従うことができる。さらに別の実施態様では、後生動物はキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）である。Clp1トランスジェニックキイロショウジョウバエは、文献（45,46）に記載されているP-エレメントベクターによる形質転換によって得ることができる。
【００１８】
別の実施態様では、本発明は、HsClp1をコードするDNA分子（配列番号:1のコード領域）又はそのフラグメント若しくは誘導体の使用に関する（前記発現生成物は、RNAiによる遺伝子療法アプローチにおいて上記記載のHsClp1のキナーゼ活性を示す）。この実施態様では、HsClp1は、治療用siRNA分子と一緒に、ただ1つのベクターから又はそれぞれ別個にsiRNAベクターから発現される。
文献（47,48）では、短い干渉性RNAの安定な発現を目指すベクター使用系が報告されている。これらの系はベクターを使用し、この系では、siRNAをコードする合成の遺伝子特異的標的配列が、小さい非コードRNAの転写に適したプロモーターの制御下で発現される。したがってsiRNAは、標準的トランスフェクションプロトコル（例えばエレクトロポレーション、リポフェクション）によって哺乳動物細胞へのその導入に続いて前記ベクターから産生される。もっとも一般的に用いられるベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ関連ベクター又はレンチウイルスベクターである。RNAi-仲介in vivo遺伝子スプライシングの例は文献（49）に、siRNA治療の概論は文献（50）に提供されている。標的に関する制限はなく、阻害性siRNA分子をデザインするために疾患に応じて任意の標的を考察することができる（例えば、乳癌のEGFR、CMLのBCR-Abl、関節リウマチのTNFアルファ、T細胞のPKCシータ、メラノーマのB-Raf、種々のPTEN-欠損腫瘍のAKT又はPI3K、X連鎖筋細管筋障害のような神経筋疾患のミオチュブラリン）。しかしながら、いずれの疾患原因遺伝子及びいずれの細胞タイプ又は組織も潜在的に標的となりえる。治療用siRNAと併用してClp1 DNAを使用することは、疾患に対応する変異対立遺伝子のターゲッティングに特に有用である。このアプローチでは、特定の変異を阻害するためにデザインされたsiRNAはベクター上でhClp1 DNAと組み合わされ、前記ベクターは、組織特異的プロモーターを含むとき前記治療用siRNAの組織特異的発現を可能にする。そのような応用例は、非小細胞肺癌又はBCR-Ablにおけるアミノ酸858位のEGFR変異である。
【００１９】
さらに別の特徴では、本発明は、試験化合物がClp1、特にHsClp1のアゴニストであるか否かを決定する方法に関する。
そのようなアッセイは、Clp1の基質としてdsRNA、dsDNA、dsDNA/RNAハイブリッド及びssRNAを含む特殊化キナーゼアッセイフォーマットで、上記に記載の緩衝液及び他の試薬を用いて実施することができる。そのようなキナーゼアッセイが実施例10に記載するスクリーニングアッセイ様式であるときは、Clp1を介するsiRNA及びマイクロRNAプロセッシングを増強又は低下させるClp1のアクチベーター又はインヒビターである小分子を同定することができる。Clp1機能のエンハンサーとして同定された化合物は、併用療法又は補助療法としてsiRNA分子とともに用いることができる。Clp1活性を強化する化合物はまた、実験的設定（例えばRNAiライブラリーの使用による遺伝子機能のための大規模スクリーニング）で又は治療的設定で、RNAi又はマイクロRNAプロセッシングの効率強化に用いることができ、この場合、薬剤として使用されるsiRNA分子又はマイクロRNA分子の有効性は、Clp1機能を強化する（又は低下させる）ことによって改変することができる。
要約すれば、Clp1は、RNAiの有効性を試験するための、又は多様な／初代哺乳動物細胞での一般的な大規模スクリーニングのための完全体生物（例えばマウス）又は細胞株の感度の改善に有用である（前記は有効性が改変されたsiRNA/マイクロRNAを薬剤として開発するための基礎である）。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】RNAi経路の模式図である。
【図２】siRNAキナーゼ活性を測定するアッセイである。siRNAデュープレックスのガイド鎖は3'末端で放射能標識され、相補性RNAオリゴヌクレオチドにアニールされる。前記siRNAデュープレックスは、ATP及びMg2+を含む反応混合物中で基質として供される。キナーゼ活性画分（例えばHeLaS100抽出物）とともにインキュベートした後、ガイド鎖の5'末端のリン酸化が、反応生成物の15％変性シークエンシングゲル上での分離とそれに続くホスファーイメージングによって検出される。
【図３】ヒト“siRNAキナーゼ”としてのHsClp1の精製及び同定を示す。Ａ．HeLaS100抽出物からsiRNAキナーゼ活性を単離するための精製模式図。Ｂ．最終工程（5％−30％グリセロールグラディエント）で得られた画分を7.5％SDS-PAGEで泳動させ、銀染色に付す。画分の活性アッセイを平行して実施する（下段パネル）。45kDaのタンパク質と一致する銀染色バンド（活性と一緒に精製される（画分7））が星印で示されている。Ｃ．サイズ排除クロマトグラフィー後の半精製キナーゼ画分の活性アッセイ。ピーク活性は画分20−24で検出される。
【図４】“siRNAキナーゼ”としてのHsClp1タンパク質の正体の確証を示す。Ａ．HeLa細胞にHsClp1と相補的なsiRNA又はGFPコントロール-siRNAをトランスフェクトする。細胞抽出物を調製し、タンパク質濃度を等しくし、この抽出物をキナーゼ活性についてアッセイする。Ｂ．HeLa細胞にmyc-タグ付加HsClp1タンパク質（wt）をコードするか又はウォーカーA部位に点変異を有するmyc-タグ付加HsClp1変型をコードする発現ベクターをトランスフェクトするか、又はトランスフェクトせずにおいた（コントロール）。α-myc抗血清を用いた抽出物の免疫沈澱をキナーゼ活性について試験するか（上段パネル）、又はウェスタンブロットに付してmyc-タグ付加タンパク質の存在を確認する（下段パネル）。Ｃ．組換えHsClp1タンパク質をグルタチオンS-トランスフェラーゼ融合物として大腸菌での発現によって生成し、グルタチオンセファロースを用いて精製する。精製時に得られるアリコットをクーマシー染色によって分析し（上段パネル）、HsClp1を含む溶出液画分をキナーゼ活性についてアッセイする（下段パネル）。
【図５】HsClp1はssRNAとssDNAを区別することを示す。HeLa抽出物から精製した“内因性”HsClp1（A−C）又は組換えHsClp1（D−F）を、表示した二本鎖及び一本鎖オリゴヌクレオチド基質をリン酸化するそれらの能力について試験した。T4ポリヌクレオチドキナーゼ（New England Biolabs）の基質特異性を平行反応で試験する。星印は放射能標識の位置を示す。
【図６】dsRNA末端におけるHsClp1の基質特異性を示す。HsClp1のキナーゼ活性は、オーバーハングのタイプ（A）、オーバーハングのヌクレオチド組成（B）及びsiRNAの5'-末端のヌクレオチド（C）に左右されない。HeLaS100抽出物を表示のsiRNAデュープレックスとインキュベートし、続いてキナーゼ活性アッセイを実施する。星印は放射能標識の位置を示す。
【図７】HsClp1のキナーゼ活性のために二価金属イオンが要求されることを示す。HeLa抽出物由来の半精製“内因性”HsClp1画分（Qセファロースクロマトグラフィーから得られる活性なプール（図3A参照））（A）及び組換えHsClp1（B）を、金属イオンを欠く緩衝液に対して透析し、EDTAで処理し、さらに金属イオンを欠く緩衝液に対して再度透析する。表示の濃度で二価金属イオンを補充した反応混合物中でキナーゼ活性をアッセイする。種々のフォントによって、キナーゼ活性が高い反応（太字）、狭い活性ウィンドウしか示さない反応（斜字体）、又はキナーゼ活性が存在しない反応（通常書体）を示す。
【図８】HsClp1のキナーゼ活性のためにATP及びGTPが要求されることを示す。HeLa抽出物由来の半精製“内因性”HsClp1（Qセファロースクロマトグラフィーから得られる活性なプール（図3A参照））及び組換えHsClp1（B）を、表示の濃度のATP及びGTPを含む反応混合物中で試験する。
【図９】HsClp1が核にもっぱら局在することを示す。HeLa細胞にHsClp1タンパク質のmyc-タグ付加変型をコードする発現ベクターをトランスフェクトする。細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、α-mycポリクローナル抗体を用いて免疫染色する（右）。核はDAPIで可視化する（左）。
【図１０】組換えHis6-タグ付加HsClp1は一本鎖及び二本鎖RNAの3'ホスファターゼ活性を欠くことを示す。Ａ．siRNAデュープレックス（そのガイド鎖は3'32pCp-末端標識され、続いて脱リン酸化された）を、3'ホスファターゼ活性を含むT4 PNK（NEB）、3'ホスファターゼを含まないT4 PNK（Roche）及び組換えHis6-タグ付加HsClp1とともにATPの存在下でインキュベートする。表示の時間後に、サンプルを採取し、5'リン酸化活性を変性ゲル電気泳動によって評価し、ホスファーイメージングによってモニターする。Ｂ．siRNAデュープレックス（そのガイド鎖は3'32pCp-末端標識され、さらに5'リン酸化された）を、上記に記載の3つの酵素とともにインキュベートする。3'ホスファターゼ活性をタイムコース実験で判定する。Ｃ．3'32pCp-末端標識し、さらに5'リン酸化した一本鎖RNA（ガイド鎖）を基質として用い、3'ホスファターゼ活性を試験する。
【図１１】メタノカルドコッカス・ジャナスキー、カエノルハブディチス・エレゲンス及びサッカロミセス・セレビシアエのClp1ホモローグはRNAキナーゼ活性を表出することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本実施例では、特段の記載がなければ、下記の材料及び方法が用いられる。
１．ヒト抽出物においてsiRNA-キナーゼ活性を検出するアッセイ
ショウジョウバエのルシフェラーゼ遺伝子から誘導されるRNAオリゴヌクレオチド（5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGU-3'、ガイド鎖）を化学的に合成し（Dharmacon）、3'末端32pCp標識反応に付す。前記標識は、20μLの反応物（100pmolのRNAオリゴヌクレオチド、3.3μMシチジン3'、5'-ビス[α-32p]ホスフェート（GE healthcare）、15％DMSO、40UのT4 RNAリガーゼ（New England Biolabs， NEB）、及び1xのNEB供給反応緩衝液）中で37℃にて1時間実施される。標識RNAをゲル精製し、エタノールで沈殿させ、さらに37℃で30分脱リン酸化する（120μLの反応物、１Uのアルカリホスファターゼ（Roche）、及びRoche供給緩衝液）。続いて、前記反応物をプロテイナーゼKによってタンパク質を除き、その後フェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿を実施する。続いて10pmoleの標識RNAを10pmoleの相補的オリゴヌクレオチド（5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAAA-3'、Dharmacon）と200μLの反応緩衝液（100mMのKCl、5mMのMgCl2、10％グリセロール、0.5mMのDTT、0.1mMのAEBSF）中にて90℃で1分アニールさせ、続いて37℃で1時間インキュベートし、50nMのsiRNAデュープレックスを生成する。DNA標識のためには、上記のショウジョウバエルシフェラーゼ配列に対応する4pmolのDNAオリゴヌクレオチドを、24ユニットの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Promega）、1ｘのPromega供給反応緩衝液及び0.5μMの[α-32p]コルジセピン-5'-トリホスフェート（Perkin Elmer）を含む反応混合物中にて37℃で30分インキュベートする。この標識DNAをゲル精製し、エタノールで沈殿させ、H2Oに20nMの最終濃度で溶解する。RNA又はDNAオリゴヌクレオチドとのアニーリングは上記に記載したように実施する。
活性アッセイは、問題のサンプルの2.5μLを、5nMの標識siRNAを含む2.5μLの反応混合物R（100mMのKCl、5mMのMgCl2、10mMのDTT、2mMのATP、0.4mMのGTP及びRNasin（Promega））に添加し、続いて30℃でインキュベートすることによって実施される。キナーゼ反応は、5μLの8M尿素溶液を添加することによって停止させる。反応生成物を15％の変性アクリルアミドゲルで分離し、siRNAのリン酸化はホスファーイメージング（Phosphorimaging）によってモニターする。
【００２２】
２．ヒト抽出物からsiRNA-キナーゼ活性の精製
2.1  HeLa細胞からS100抽出物の調製
HeLa細胞の細胞質抽出物は、HeLa細胞核の単離のために設計されたDigmanプロトコルにしたがって調製される。細胞質画分には最終濃度100mMのKCl、2mMのMgCl2、及び10％グリセロールを補充し、液体窒素で急速冷凍し、-70℃で保存する。S100抽出物は、Sorval T-1250ローターを用いて4℃にて29000rpmで1時間超遠心することによって調製される。HeLaS100抽出物のタンパク質濃度は通常は3−5mg/mＬである。
2.2  精製方法
siRNA-キナーゼ活性としてのHsClp1の精製は図3Aで模式的に示される。全ての方法は4℃で実施される。カラムの画分は上記に記載したようにsiRNA-キナーゼ活性についてアッセイされる。500mLのHeLaS100抽出物（4mg/mL）を、緩衝液BA100（100mMのKCl、30mMのHepes（pH7.4）、5mMのMgCl2、10％グリセロール、0.5mMのDTT、0.1mMのAEBSF）で平衡させたヘパリンセファロース6FFカラム（XK26、100mLベッド容積、GE Healthcare）にロードする。タンパク質は、1MのKClを含む緩衝液BA1000のリニアグラディエントで5x CV（カラム容積）にわたって溶出させる。120mM−360mMの画分（160mL、260mgのタンパク質）を緩衝液BB100（100mMのKCl、30mMトリス（pH8.0）、5mMのMgCl2、10％グリセロール、0.5mMのDTT、0.1mMのAEBSF）に対して一晩透析し、緩衝液BB100で平衡させたHiTrap QセファロースFFカラム（20mLベッド容積、GE Healthcare）に適用する。このカラムで1MのKClを含む緩衝液BB1000に対して15x CVにわたってグラディエントを形成する。活性プール（160−370mM、60mL、70mgのタンパク質）に25％の硫酸アンモニウム（8.8g）を補充し、氷上に15分置き、Sorvall SS34ローターを用いて4℃で20分16000rpmにて遠心する。上清に3.8gの硫酸アンモニウム（35％）を添加し、この溶液を再度氷上に15分置き、4℃で20分16000rpmにて遠心する。ペレットの半分（10mgのタンパク質）を緩衝液BC500（500mMの(NH4)2SO4、100mMのKCl、30mMのHepes（pH7.4）、5mMのMgCl2、10％グリセロール、0.5mMのDTT、0.1mMのAEBSF）に溶解し、緩衝液BC500で平衡させたHiTrapフェニルセファロースHPカラム（5mLベッド容積、GE Healthcare）にロードする。タンパク質は緩衝液BC0（(NH4)2SO4を欠く）に対し12x CVに及ぶグラディエントにより溶出させる。活性プール（260−20mMの(NH4)2SO4、測定可能量を超えるタンパク質量）を緩衝液BD10（10mMのKPi（pH7.2）、50mMのKCl、10％グリセロール、0.5mMのDTT、0.1mMのAEBSF）に対して一晩透析し、さらに緩衝液BD10で平衡させたヒドロキシアパタイトCHT-IIカラム（5mLベッド容積、Biorad）に適用する。このカラムで緩衝液BD500（500mMのKPiを含む）に対して12x CVにわたってグラディエントを形成する。画分（80−210mM）をプールし、緩衝液BB100に対して一晩透析し、緩衝液BB100で平衡させたHiTrap ANX FFカラム（1mLベッド容積、GE Healthcare）にロードする。タンパク質を緩衝液BB1000に対し12x CVに及ぶグラディエントにより溶出させる。活性プール（220−480mM）を緩衝液BE50（50mMのKCl、30mMのHepes（pH7.4）、5mMのMgCl2、3％グリセロール、0.5mMのDTT、0.1mMのAEBSF）に対して2時間透析し、0.5mLのポリ(U)-セファロース（GE Healthcare）とバッチにて90分間4℃で、回転ホィール上で結合させる。このセファロースを3回、それぞれ5mLのBE50洗浄し、0.5mLの緩衝液BE1000（1MのKClを含む）で2回ステップ溶出させる。両方の溶出液をプールし、透析膜（Millipore V'シリーズメンブレン）を用いて緩衝液BE50に対して1時間透析する、このサンプルを12mLのリニア5％−30％（w/w）グリセロールグラディエント（50mMのKCl、30mMのHepes（pH7.4）、5mMのMgCl2、0.5mMのDTTに調整）の最上部に重層する。遠心は、Sorvall TH641ローターを用い37000rpmにて4℃で20時間実施する。標準タンパク質（ウシ血清アルブミン（BSA）、アルドラーゼ、カタラーゼ（方法の第3節を参照されたい））を同様なグラディエントで泳動させる。0.6mLの20画分を最上部から連続して採集する。各画分の0.2mLを1mLのアセトンで一晩沈殿させる。この沈殿物をローディ��グ緩衝液に溶解し、サンプルをSDS-PAGEとそれに続く銀染色で分析する。活性画分（8.6S、図3Bの画分7）にもっぱら存在するタンパク質バンドを切り出し、液体画分7と一緒に質量分析法によって分析する。このために、タンパク質サンプルをDTTで還元し、ヨウ素アセトアミドによってアルキル化し、さらにトリプシン消化する。ペプチドをナノ-HPLCクロマトグラフィーで分離し、LTQイオントラップ質量分析計で分析する。全ての質量データをMASCOT-ソフトウェア（Matrix Science）を用いて分析する。
【００２３】
３．HsClp1の分子量の測定
HsClp1複合体の分子量を測定するために、半精製キナーゼ活性画分について、Superdex 2000カラム（Highload 16/60カラム、GE Healthcare）及び泳動緩衝液として緩衝液BB100を用いてサイズ排除クロマトグラフィーを実施する。カラムの目盛り設定のために、標準タンパク質を用いる（タイログロブリンrs＝8.5nm、19.0S；カタラーゼrs＝5.2nm、11.3S；アルドラーゼrs＝4.8nm、7.3S；ウシ血清アルブミンrs＝3.6nm、4.6S）。HsClp1タンパク質複合体の自然状態の分子量は、以下の等式を用いSiegel and Monty（52）の方法により、サイズ排除クロマトグラフィーとともにグリセロールグラディエント遠心の結果と併せて算出する：M＝S N0(6πηrs)／(1-v2ρ)（M=分子量（Da）、S=沈降係数（ｘ10-13秒）、N0=アボガドロ数（6.022ｘ1023）、η=溶媒の粘度（水の0.01g/[cm x秒]）、rs＝ストークス半径（nm x 10-7）、v2=部分比容（0.73cm3/g、タンパク質の推定平均）、ρ=溶媒の密度（水の1.0g/ cm3））。
４．哺乳動物細胞培養
HeLa細胞は37℃、95％湿度及び5％CO2で培養する。増殖培養液は、10％ウシ胎児血清、3mMグルタミン、100U/mLのペニシリン及び100μg/mLの硫酸ストレプトマイシンを補充したダルベッコー改変イーグル培地（DMEM）である（全試薬がGibco BRL由来である）。
【００２４】
５．siRNA-仲介ノックダウン実験
HsClp1タンパク質を枯渇させるために、6-ウェルディッシュの30％コンフルエンシーのHeLa細胞に、HsClp1に対する200nMのSMARTプール-siRNAデュープレックス（Dharmacon）又はGFPに対するコントロールsiRNAをトランスフェクトする。トランスフェクションは、リポフェクタミン2000（Invitrogen）を製造業者の指示にしたがって用いて実施する。トランスフェクションの64時間後に、細胞をM-PER哺乳動物タンパク質抽出試薬（Pierce）中で溶解し、サンプルを緩衝液BA（100mMのKCl、30mMのHepes（pH7.4）、5mMのMgCl2、10％グリセロール、0.5mMのDTT、0.1mMのAEBSF）に対して透析する。続いて、タンパク質アッセイ用のBioRad色素試薬濃縮物を用いてBradfordによってタンパク質濃度を測定し均等化する。その後、サンプルのキナーゼ活性を判定する（方法の第1節を参照されたい）。
６．HsClp1タンパク質のクローニング
HsClp1タンパク質のオープンリーディングフレーム（ORF）を、鋳型としてHeLa cDNA及びKOD High Fidelityポリメラーゼ（Novagen）を用いポリメラーゼ連鎖反応によってクローニングする。プライマーオリゴヌクレオチド（プライマー1、5'-AAA AAG CAG GCT CTA TGG GAG AAG AGG CTA ATG ATG-3'、プライマー2、5'-AGA AAG CTG GGT GCT ACT TCA GAT CCA TGA ACC GG-3'）は、HsClp1遺伝子（ジーンバンクアクセッション番号NM_006831）のフランキング末端を含むように設計される。HsClp1遺伝子のクローニングのために、Gatewayシステム（Invitrogen）を用いる。ORFは、gcDNA3.1プラスミド（当該遺伝子の5'末端でmyc-タグをコードする真核細胞発現ベクター）にて組換えを実施する。
K127A及びS128Aを交換してPCR位置特異的変異導入によって、HsClp1のウォーカー-A変異体型を作製し、変異PCRフラグメントをgcDNA3.1プラスミドで組み換える。
【００２５】
７．免疫沈澱実験
myc-タグ付加野生型又はHsClp1のウォーカー-A変異体型（K127A及びS128A）をコードするgcDNA3.1プラスミドを、リポフェクタミン2000（Invitrogen）を用いてHeLa細胞にトランスフェクトするか、又はトランスフェクトせずにおく。トランスフェクション後48時間して、細胞を溶解緩衝液（100mMのKCl、30mMのHepes（pH7.4）、5mMのMgCl2、1％NP40、10％グリセロール、0.5mMのDTT、0.1mMのAEBSF）で処理し、13000rpmで10分遠心後に細胞抽出物を回収する。2μgのα-c-myc抗体（Sigma）を40μLのプロテインAセファロース4FF樹脂（GE healthcare）と、回転ホィール上で90分4℃にてインキュベートすることによって結合させる。この樹脂を3回溶解緩衝液で洗浄する。細胞抽出物をビーズに添加し、続いて回転ホィール上で4℃にて90分インキュベートする。この樹脂を洗浄緩衝液（NP40を欠く溶解緩衝液と同じ）で3回洗浄し、免疫沈澱物を二分する。半分をウェスタン分析に付し、もう半分（20μLの樹脂）を10μLの洗浄緩衝液及び10μLの反応混合物に再懸濁し、続いて上記に記載のキナーゼアッセイを実施する。
【００２６】
８．大腸菌から組換えHsClp1の精製
組換えHsClp1を得るために、hClp1野生型又はK127A変異型のORFを、N-末端グルタチオンS-トランスフェラーゼタグをコードするpDEST15プラスミド（Invitrogen）にて組換えを実施し、続いて前記を用い大腸菌（Rossetta株、Novagen）を形質転換する。LB培地の100mLの一晩培養を1.2LのLB培地にOD600nm＝0.1に希釈し、さらにインキュベートした後、OD600nm＝0.4で0.1mMのイソプロピルβ-D-チオガラクトシド（IPTG; Sigma）を添加することによってHsClp1タンパク質を37℃で2時間発現させる。遠心（4000rpmで20分）により細胞を採集し、細胞ペレットを20mLの抽出緩衝液（50mMトリス/HCl（pH8）、100mMのNaCl、5mMのMgCl2、0.1％Tween-20、1mMのDTT、0.1mMのAEBSF）に再懸濁する。細胞を超音波で溶解し、16000rpmで30分遠心する。上清を1mLのグルタチオン-セファロースFF（GE Healthcare）に添加し、回転ホィール上にて4℃で2時間インキュベートする。この樹脂をクロマトグラフィーカラム（BioRad）に移し、洗浄緩衝液（Tween-20を欠く抽出緩衝液と同じ）で洗浄する。樹脂を1mLの溶出緩衝液（20mMの還元グルタチオン（Sigma）を加えた洗浄緩衝液と同じ）と10分間インキュベートすることによってタンパク質を溶出させる。最後にタンパク質濃度をBradford（BioRad Bradford試薬）によって測定する。1.2Lの細菌培養から回収されたHsClp1の総収量は0.3mgである。
９．金属イオン枯渇
HsClp1のキナーゼ活性のための二価金属イオンの要求を試験するために、問題のサンプルを緩衝液A（100mMのKCl、30mMのHepes（pH7.4）、10％グリセロール、0.5mMのDTT、0.1mMのAEBSF）に対して1時間、透析膜（Millipore V'シリーズメンブレン）を用いて透析する。EDTAを10mMに添加し、このサンプルを氷上で10分間インキュベートし、続いて緩衝液Aに対して1時間透析する。続いて、種々の二価金属イオンを種々の濃度で含む反応混合物R（上記に記載）にこのサンプルを添加し、キナーゼアッセイを実施する。
【００２７】
10．免疫蛍光顕微鏡法
HeLa細胞を6-ウェルディッシュ中のガラスのカバースリップに置く。コンフルエンシーに達する手前で、リポフェクタミン2000を用いて、myc-タグ付加HsClp1をコードするgcDNA3.1プラスミドを細胞にトランスフェクトするか、又はトランスフェクトせずにおく。トランスフェクションから36時間して、細胞をPBS（137mMのNaCl、2.7mMのKCl、4.3mMのNa2HPO4.7H2O、1.4mMのKH2PO4、pH7.3）で2回洗浄し、氷上で5分間3％のトリトンX-100により透過性にする。細胞を3回PBSで再度洗浄し、さらにPBS中の3％BSA（Sigma）で1時間ブロッキングする。続いて湿潤チャンバー内で細胞を室温で45分α-c-myc抗体（Sigma、3％BSA/PBSにて0.8ng/μL）とともにインキュベートし、0.1％BSA/PBSで3回洗浄し、さらにAlexa 488ヤギα-ウサギ（Molecular Probes、3％BSA/PBSにて1:1000）とともにインキュベートする。細胞を0.1％BSA/PBSで3回洗浄し、DAPI（4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール）溶液（1μg/mL）とともに5分インキュベートし、さらに3回脱イオン水で洗浄する。最後にカバースリップをVectashieldマウンティングメジウム（Vector）でスライドにマウントする。顕微鏡検査のために、Zeiss Axioplan2イメージング顕微鏡及びCoolsnap HQ CCDデジタルカメラを用い、画像はアドビフォトショップソフトウェアを用いて処理する。
【００２８】
11．組換えClp1タンパク質の生成
a）ヒトClp1（HsClp1）
HsClp1のオープンリーディングフレームを、C-末端His6-タグをコードするpET30aベクター（Novagen）にてクローニングする。続いて、前記で大腸菌（Rossetta株、Novagen）を形質転換する。LB培地の100mLの一晩培養を5LのLB培地にOD600nm＝0.1に希釈し、さらにOD600nm＝0.4までインキュベートした後、0.1mMのイソプロピルβ-D-チオガラクトシド（IPTG; Sigma）を添加することによってhClp1タンパク質を20℃で14時間発現させる。遠心（4000rpmで20分）により細胞を採集し、細胞ペレットを60mLの抽出緩衝液（50mMトリス（pH8）、300mMのNaCl、5mMのベータ-メルカプトエタノール、0.1mMのAEBSF）に再懸濁する。細胞を超音波で溶解し、16000rpmで30分遠心する。上清を抽出緩衝液で平衡させた5mLのHisTrap FFカラム（GE-Healthcare）に適用し、タンパク質を25カラム容積にわたって溶出させる。画分をsiRNA-キナーゼ活性について試験し、プールし、さらにHiLoad 16/60Superdex 75カラム（GE Healthcare）を用いてサイズ排除クロマトグラフィーに付す。siRNA-キナーゼ活性を示す画分を再びプールし、クーマシー染色によって純度をチェックする。His6-タグ付加HsClp1のタンパク質収量は1mg/5L細菌培養である。
b）メタノカルドコッカス・ジャナスキーClp1及びサッカロミセス・セレビシアエClp1
メタノカルドコッカス・ジャナスキー及びサッカロミセス・セレビシアエのClp1のオープンリーディングフレームを、C-末端His6-タグ融合物としてpET21ベクター（Novagen）にてクローニングする。前記ベクターで大腸菌BL21株を形質転換し、0.3mMのIPTGを用いてタンパク質を18℃で一晩発現させる。細胞溶解物をHisTrap FFカラム（GE-Healthcare）に適用し、続いてSuperdex 200カラム（GE Healthcare）を用いてサイズ排除クロマトグラフィーに付す。
c）カエノルハブディチス・エレガンスClp1
組換えカエノルハブディチス・エレガンスClp1を生成するために、そのオープンリーディングフレームをpGEX-4T1ベクター（GE Healthcare）にてクローニングする。大腸菌BL21株を形質転換した後、細胞抽出物をGST-Trapカラム（GE-Healthcare）に適用する。GSTタグはトロンビンを用いて切断し、PD-10カラムを用いて画分を脱塩し、さらにGSTタグをGST-Trapカラムに結合させる。続いて、Clp1タンパク質を含むフロースルーをSuperdex 200カラム（GE Healthcare）を用いてさらに精製する。
【００２９】
12．5'RNAキナーゼ及び3'RNAホスファターゼ活性を試験するための酵素アッセイ（実施例8）
5nMの標識siRNA（また別にはssRNA、上記参照）を、1ユニットのT4 PNK（NEB）又は2ユニットの3'ホスファターゼフリーT4 PNK（Roche Applied Science）、10x反応緩衝液（製造業者によって供給）、及び1mMのATPを含む反応混合物中でインキュベートする。同じ量の標識RNAを1μMの組換えHis6-タグHsClp1とともに、100mMのKCl、5mMのMgCl2、10mMのDTT、2mMのATP及び0.4mMのGTPを含む反応混合物中でインキュベートする。反応物を37℃でインキュベートし、表示の時点でアリコットを採取し、8M尿素溶液と1：1（vol/vol）で混合する。反応生成物を15％変性アクリルアミドゲルで分離し、RNA5'リン酸化又は3'脱リン酸化をホスファーイメージングによってモニターする。
【実施例】
【００３０】
実施例1：HsClp1の“siRNAキナーゼ”としての同定
a）ヒト細胞質抽出物からsiRNAキナーゼ活性の精製
ヒトの細胞でsiRNAをリン酸化する酵素活性を同定するために、siRNAデュープレックス内のガイド鎖の5'リン酸化状態のモニターを可能にするアッセイを確立する（19）。ガイド鎖（5'-ヒドロキシル基を含む）を、シチジン3',5'-ビス[α-32P]ホスフェートと連結することによって3'-末端標識し、さらに末端ホスフェート基をアルカリ性ホスファターゼで処理することによって除去する。続いて、標識RNAを相補鎖とアニールさせる。ATPの存在下でHeLa細胞質（S100）抽出物中で数分間インキュベートした後、siRNAの電気泳動時の移動シフトによって、キナーゼ活性によるガイド鎖の5'-末端リン酸化が示される（図2）。主要目的は、古典的なクロマトグラフィーを用いてHeLaS100抽出物からキナーゼを精製することである。本発明者らは、その全体を通してただ1つのキナーゼ活性を追跡する8精製工程を確立した。精製流れ図は図3Aに示されている。最終精製工程（グリセロールグラディエント遠心）の画分は、SDS-PAGEとそれに続く銀染色に付される（図3B）。ほぼ45kDaのポリペプチドが、キナーゼ活性と同じ画分に分画されるのが見出される（図3B、画分7）。このバンドをゲルから切り出し、質量分析によって分析する。HsClp1タンパク質（TREMBLアクセッション番号Q92989）と一致するポリペプチドがもっぱらこのバンドに存在することが認められる。興味深いことに、HsSenエンドヌクレアーゼサブユニットHsSen2及びHsSen54もまた画分7の銀染色ゲル上で確認され（図3B）、さらに液体サンプルでの質量分析による分析によってHsSen15及びHsSen34タンパク質がさらに別に検出され、HsSen複合体のすべての既知のサブユニットの存在が明らかである。このことは、HsClp1は細胞抽出物においてHsSen複合体と結合しているという観察と一致する。
【００３１】
b）siRNAをリン酸化する酵素としてのHsClp1の評価
HsClp1タンパク質はATP/GTP結合モチーフ（ウォーカーAモチーフ）を含むので（30）、キナーゼであると推測される。本発明者らは、3つの異なるアプローチを用いて、この候補タンパク質の有効性を実証することを試みた。第一に、本発明者らは、そのコード配列と相補的なsiRNAをトランスフェクトすることによって、HeLa細胞からHsClp1を枯渇させ、続いて、得られた抽出物をタイムコース実験でキナーゼ活性についてアッセイする。図4Aに示されるように、そのような抽出物は、コントロールGFP-siRNAで処理した細胞由来の抽出物と比較したとき、はるかに遅い5'-末端リン酸化カイネティクスを示す。第二のアプローチでは、HsClp1のコード配列（1278nt）をHeLa cDNAから増幅させ、myc-タグ付加融合物として発現プラスミドにてクローニングする。本発明者らはまた、キナーゼのウォーカーAモチーフ変異体型（リジン127−＞アラニン）を作製した（なぜならばこのモチーフはリン酸化反応に必須である確立が極めて高いからである（53）。HeLa細胞にこのプラスミドをトランスフェクトし、続いてα-myc抗血清を用いて抽出物の免疫沈澱を実施する。図4Bに示すように、HsClp1タンパク質の野生型を含む免疫沈澱物は効率的な5'-末端リン酸化を示すが、変異型は示さず、タンパク質とキナーゼ活性との間の直接的リンクを明示している。第三に、本発明者らは組換えHsClp1タンパク質の潜在的キナーゼ活性をアッセイした。このために、本発明者らはHsClp1を大腸菌でグルタチオンS-トランスフェラーゼ融合物として発現させ、グルタチオンセファロースでのアフィニティークロマトグラフィーを用いて前記融合物をさらに精製する。組換えタンパク質をクーマシー染色によって確認されるようにほぼ均質にまで精製する（図4C、上段パネル）。溶出させた組換えHsClp1タンパク質は独立してsiRNAキナーゼ活性を示し、したがって、HsClp1はキナーゼ反応で自動的に作用する触媒であると結論される（図4C、下段パネル）。総合すれば、これら3系統の証拠は、HsClp1は実際“siRNAキナーゼ”であることを明示している。
【００３２】
実施例2：HsClp1はタンパク質複合体の部分である
次に、HsClp1は細胞抽出物においてモノマータンパク質として存在するか、又はタンパク質複合体の部分であるかを調べる。HsClp1の沈降係数（最終精製工程のグリセロールグラディエント遠心によって決定）は8.6Sである（図3B）。HsClp1のストークス半径（Superdex 200カラムを用いるゲル排除クロマトグラフィーによって測定）は5.6−6.4nmである（図3C）。これらの値からSiegel and Montyの等式を用いて誘導されるこのキナーゼの分子量は200−230kDaである（52）。これらのデータは、HsClp1は細胞抽出物中のタンパク質複合体の部分であり、おそらくは上述のHsSen複合体の部分であることを示唆している。
【００３３】
実施例3：HsClp1はssRNAとssDNAとを区別する
続いて、HsClp1はもっぱらデュープレックスsiRNAをリン酸化するのか、又は前記に加え他の核酸を基質として用いるのかを判定する。これは、種々の一本鎖及び二本鎖RNA並びにDNA分子、又はRNA/DNAハイブリッドを、HeLa抽出物から精製した“内因性”HsClp1（精製HsClp1、図5A−C）とともに、又は組換えHsClp1タンパク質とともにインキュベート（図5D−F参照）することによって試験し、その生化学的活性が“内因性”精製タンパク質の活性を反映することを確認する（図5D−F）。平行して、全ての基質を組換えT4 PNKによるリン酸化に付し、基質特異性をHsClp1と比較する。DNA“ガイド鎖”をα-32P-コルジセピン5'三リン酸で3'-末端標識し、相補的なDNAオリゴヌクレオチドとアニールさせる。図5A及び5D（右パネル）に示されるように、このdsDNAは、dsRNA（図5A及び5D、左パネル）と類似のカイネティクスで、精製及び組換えHsClp1タンパク質の両者によってその5'-末端でリン酸化される。続いて、RNA/DNAハイブリッドデュープレックスのHsClp1によるリン酸化を調べる。RNA/DNAハイブリッドデュープレックス内のガイドRNAの効率的な5'-末端リン酸化とは対照的に、RNA/DNA内のガイドDNAの5'-末端は、HsClp1にとって利用されるとしても非常に貧弱な基質である（図5B及び5E）。これらのデータは、HsClp1はdsRNAだけでなくdsDNA及びRNA/DNAデュープレックス内のRNAもまた効率的にリン酸化することを示している。
一本鎖ガイドRNA（ssRNA）はまたHsClp1のための良好な基質である（図5C及び5F）。興味深いことに、ssDNAは、T4ポリヌクレオチドキナーゼの良好な基質であるにもかかわらず全くリン酸化されない（図5C及び5F）。どの程度にデオキシリボヌクレオチドがキナーゼの基質であるかを決定するために、本発明者らは、最も5'側のヌクレオチドを2'デオキシチミジン（dT）で置き換えたssRNAを設計する。HsClp1との2時間のインキュベーション後でさえ、そのようなオリゴヌクレオチドのリン酸化は検出されない。これらのデータは、HsClp1はたとえ2'デオキシ-と2'ヒドロキシル-リボヌクレオチドとをそれらがデュープレックスとして提示されるとき識別しないとしても、識別は一本鎖レベルで生じることを示唆している。さらにまた、総合すればこれらの分析によってまた、“内因性”HsClp1の基質特異性は組換えタンパク質によって完全に再現されることが確認される。
次に、HsClp1タンパク質がsiRNA内の種々のオーバーハングを識別するか否かをHeLa S100抽出物を用いて調べる。2ヌクレオチドの5'-オーバーハング及び平滑端のリン酸化は、正規のsiRNAの2ヌクレオチド3'-オーバーハングと同じ効率で生じる（図6A）。さらにまた、キナーゼ活性は、2ヌクレオチド3'-オーバーハングのヌクレオチド組成に左右されず、2ヌクレオチドのデオキシチミジンオーバーハングを含むsiRNAさえリン酸化する（図6B）。siRNAの5'位はヌクレオチド組成に無関係にリン酸化される（図6C）。驚くべきことに、キナーゼは、一本鎖RNAの5'末端でデオキシチミジンをリン酸化することができないが（図5C及び5F）、前記キナーゼは、dsRNAに存在するときにはデオキシチミジンをリン酸化することができる（図6C）。
【００３４】
実施例4：HsClp1のキナーゼ活性のための二価金属イオン及びATP/GTPの必要性
HsClp1の生化学的性状決定が進められ、二価金属イオンに対するキナーゼ活性の要求が分析される。HeLa抽出物の半精製HsClp1画分又は組換えHsClp1（図4C参照）を、金属イオンを欠く緩衝液に対して透析し、続いてEDTAで処理して残留金属イオンのキレート化合物を形成し、最後に金属イオンを欠く緩衝液に対して透析して、Me2+-EDTA複合体を除去する。続いてsiRNAに対するHsClp1のキナーゼ活性を、種々の二価金属イオンを種々の濃度で補充した反応混合物で判定する。図7Aに示すように、金属（例えばCa2+、Co2+、Mn2+及びMg2+）は、広い濃度範囲（1−20mM）で“内因性”キナーゼ活性の刺激に非常に有効であるが、Fe2+、Ni2+及びZn2+は2mMの狭い濃度枠でキナーゼ活性を刺激する。このキナーゼはCu2+を補助因子として全く利用しない。対照的に、組換えHsClp1は、2−5mMのMg2+及びMn2+、並びに2mMのNi2+の存在下でキナーゼ活性を示すが、他の金属イオンとでは活性を示さない（図7B）。
次に、“内因性”半精製HsClp1又は組換えHsClp1はもっぱらATPをホスホドナーとして利用するか、又はGTPを用いてsiRNAをリン酸化することができるかを調べる。反応混合物に種々の濃度のATP又はGTPを補充し、キナーゼ活性を判定する。組換えHsClp1タンパク質はATPを用いてsiRNAをリン酸化することができるだけであるが、“内因性”キナーゼは、ATP及びGTPの両方の存在下でsiRNAのリン酸化を示す（図8）。
総合すれば、これらのデータは、種々の金属イオンを用いて“内因性”HsClp1と同様に組換えHsClp1のキナーゼ活性を刺激することができ、さらにATPの他にGTPも“内因性”HsClp1活性のための補助因子であることを示している。しかしながら、これらのデータはまた、補助因子の有用性における“内因性” HsClp1及び組換えHsClp1の間の矛盾を示し、細胞抽出物に存在する構成パートナー又は結合パートナーが核酸のリン酸化のメカニズムに寄与しえることを示唆している。
【００３５】
実施例5：HsClp1のイオン及びpH要件
HsClp1がキナーゼ活性を示す緩衝液の条件を分析する。本発明者らは、HeLaS100抽出物を、10mMから2MまでのKClを含む緩衝液、又は5mMのMES（モルホリンエタンスルホン酸）緩衝液（pH6.0）若しくは50mMのCHES（N-シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸）緩衝液（pH9.0）に対して透析し、続いてキナーゼアッセイを実施する。効率的なキナーゼ活性は、10−200mMの範囲のKClで観察され、pH6.0又はpH9.0で等しく検出され（データは示されていない）、HsClp1の生化学的活性は対応する緩衝液組成を用いて回収されえることが示唆される。
【００３６】
実施例6：HsClp1はもっぱら核に局在する
HsClp1の細胞内局在を分析するために、myc-タグ付加タンパク質をHeLa細胞で一過性に過剰発現させる。細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、ポリクローナルα-myc抗血清を用いて免疫染色する。HsClp1はもっぱら核に局在する（図9）。さらにまた、小キナーゼプールが細胞質全体に分散して分布する。興味深いことには、核染色は、核斑点と称される特殊化された核内構造物で見出されるタンパク質に特徴的なパターンを示す（図9、矢印）（54）。
【００３７】
実施例7：Clp1ノックアウトマウス及び細胞株の作製
Clp1ゲノムDNAをターゲッティングするために、Clp1ゲノムDNA（BACクローンRP23-387F9に由来する、BACPAC Resources）のエキソン1−3を含むターゲッティングベクターを構築する。Clp1のエキソン2は欠失させるために適した標的である。なぜならば、前記はATP/GTP結合部位を含み、したがって非機能性タンパク質を生じるからである。そのようなエキソン2ターゲッティングベクターはエキソン1の上流部分を含み、その後にエキソン1（組換え部位1）が続き、その後にLoxP部位が続き、前記はエキソン2の上流部分に組み込まれる。エキソン2の下流には、どちらかの末端でFRT（Flp仲介組換えのため）-LOxP（Cre-仲介組換えのため）部位とフランキングするネオマイシン耐性カセットが組み込まれ、その後にエキソン3の上流のゲノムストレッチ（組換え部位2）が続く。続いて、ネオマイシンカセットの下流の制限部位によってこのベクターを直線化し、マウスのES細胞にエレクトロポレートする。組換え部位1と部位2との間で相同組換えを経たES細胞（PCR及びサザンブロッティングによってチェック）を、ネオマイシンの存在下でそれら細胞を数日培養することによって選別し、その後、初期マウス胚に注入する。前記胚を雌マウスの子宮に移植し、子マウスに成長させる。得られたマウスキメラを野生型C57BL/6マウス株と交配して、ヘテロ接合体のFloxマウスを得る。前記をFlpリコンビナーゼトランスジェニックマウスと交配してFRT部位の間でネオマイシン耐性カセットを除去する。得られた株は、LoxP部位にフランキングしたエキソン2を含み、前記を組織特異的Creリコンビナーゼトランスジェニックマウスと交配し、さらに交配育種した後でホモ接合体のフロックスされたClp1マウスが得られる。Clp1エキソン2は組織特異的態様で欠失させることができる。
Clp1ノックアウト細胞株（好ましくはマウス胚線維芽細胞（MEF））は、文献（55）で用いられた通常の方法によってClp1エキソン2をLoxP部位にフランキングさせたマウスから誘導することができる。また別には、ES細胞をそのようなマウスから誘導し、Clp1ノックアウト細胞株を入手することができる。続いて、高力価のCre-アデノウイルスを組織培養で感染させることによって、Clp1のCre-仲介欠損を達成することができる。
【００３８】
実施例8：HsClp1はRNA3'ホスファターゼ活性を示さない
実施例1a及びより具体的には実施例3で、HsClp1は一本鎖及び二本鎖RNA分子の5'末端をリン酸化することが示されている。したがって、HsClp1は、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（T4 PNK）の5'リン酸化活性と類似する（56）。しかしながら、T4 PNKとは対照的に（57）、HsClp1はRNA3'脱リン酸化活性を含まない（このことは本実施例で示される（図10））。siRNAデュープレックスのガイド鎖をその3'末端において32PCpで放射能標識し、脱リン酸化し、さらに相補的なRNAオリゴヌクレオチドとアニールさせる（材料と方法を参照されたい）（図10A、左パネル）。続いて、このsiRNA基質を、New England Biolabsから市場で入手可能なT4 PNK（NEB, カタログ番号M0201）（3'ホスファターゼ活性を含む）、Roche Applied ScienceのT4 PNK（カタログ番号709557）（3'ホスファターゼ活性を欠くように改変されてある）、又は組換えHis6-タグ付加HsClp1とともにインキュベートする。タイムコース分析によって、3つの酵素の全てが、siRNAデュープレックス内の放射能標識RNA鎖の5'末端のリン酸化に等しく有効であることが示される（前記はゲル電気泳動時のリン酸化ガイド鎖のより速い移動によって示される）（図10、右パネル）。HsClp1はT4 PNKと同様なRNA3'脱リン酸化活性を含むか否かを判定するために、siRNAのガイド鎖を再度その3'末端において32PCpで放射能標識するが、脱リン酸化工程は省略して3'ホスフェートを維持し、前記ガイド鎖を5'末端でリン酸化し、続いて相補的RNA鎖とアニールさせる（図10B、左パネル）。この基質は、特に3'末端のホスフェートの潜在的低下をモニターすることを可能にする。このsiRNAを上記記載の3つの酵素と再度インキュベートする。T4 PNK（NEB）の3'ホスファターゼ活性による3'ホスフェートの予想される低下は、ガイド鎖のより遅い移動を生じる（図10、右パネル）。興味深いことに、T4 PNKの3'-ホスファターゼフリー型（Roche）もまた、製造業者の推奨する条件下で顕著な3'ホスファターゼ活性を示す。対照的に、組換えHis6-タグ付加HsClp1は全く3'ホスファターゼ活性を示さない。同様な実験で、一本鎖（ss）RNA基質に対する潜在的な3'ホスファターゼ活性を試験する（アニーリング工程は省略される、図10C、左パネル）。dsRNAを用いて得られた結果と全く同じように、T4 PNK（NEB）は3'末端においてssRNAを脱リン酸化し、3'ホスファターゼフリーT4 PNK（Roche）は相当なホスファターゼ活性を示すが、一方、His6-タグ付加HsClp1は完全に3'ホスファターゼ活性を欠く（図10C、右パネル）。
【００３９】
実施例9
実施例1に記載したように、他のClp1ホモローグのsiRNA-キナーゼ活性を判定するタイムコース分析を実施する。メタノカルドコッカス・ジャナスキーの結果は図11Aに、カエノルハブディチス・エレガンスの結果は図11Bに示される。サッカロミセス・セレビシアエClp1のRNAキナーゼ活性をテストするために、二本鎖RNA（siRNA）（図11C、左パネル）又は一本鎖RNA（図11C、右パネル）をアッセイで用いる。
【００４０】
実施例10
HsClp1のキナーゼ活性の小分子アゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニングアッセイ
HsClp1のキナーゼ活性の小分子アゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニングを実施するために、以下のアッセイを行うことができる。ビオチニル化siRNA（文献（11）に記載されているように、2ヌクレオチドの3'オーバーハング又は平滑末端を有する）をストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレート（例えばSigmaScreen, Sigma）に結合させる。活性を有する組換えhClp1タンパク質（例えば方法の第8節で得られるもの）を、[γ-32P]ATP及びライブラリーの部分としての小分子候補物質とともにウェルに移す。インキュベーションしてsiRNAをリン酸化させ、続いて徹底的に洗浄した後、siRNAへの[γ-32P]の取り込み量（通常のオートラジオグラフィーによって検出される）は、小分子を欠くコントロールウェルと比較して[γ-32P]の取り込みが多いか又は少ないかに応じて、小分子がhClp1のキナーゼ活性に対してそれぞれアゴニスト又はアンタゴニスト特性を示すか否かの基準として役立つ。[γ-32P]ATPの代わりに、蛍光標識したATP又はATP-アナローグ（Jena Bioscience）を、キナーゼ活性の読み取りに測光的な測定と組み合わせて用いることができる。また別には、そのようなマイクロタイタープレート系アッセイで、結合させたビオチニル化siRNAをATPとともに組換えHsClp1及び小分子候補物質をインキュベートしてもよい。徹底的な洗浄後に、siRNAの5'リン酸化形と非リン酸化形とを識別する組換え抗体（MorphoSys）によってリン酸化効率を検出することができる。洗浄後、蛍光標識二次抗体の結合効率（測光的方法によって検出される）は、hClp1のキナーゼ活性に対する小分子のアゴニスト活性又はアンタゴニスト活性の大きさである。
【００４１】
文献
1. Meister, G., and Tuschl, T. (2004). Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA. Nature 431, 343-349.
2. Tomari, Y., and Zamore, P.D. (2005). Perspective: machines for RNAi. Genes Dev 19, 517-529.
3. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M.K., Kostas, S.A., Driver, S.E., and Mello, C.C. (1998). Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806-811.
4. Hannon, G.J., and Rossi, J.J. (2004). Unlocking the potential of the human genome with RNA interference. Nature 431, 371-378.
5. Bernstein, E., Caudy, A.A., Hammond, S.M., and Hannon, G.J. (2001). Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature 409, 363-366.
6. Elbashir, S.M., Lendeckel, W., and Tuschl, T. (2001). RNA interference is mediated by 21 and 22 nt RNAs. Genes Dev 15, 188-200.
7. Bartel, D.P. (2004). MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 116, 281-297.
8. Ambros, V. (2004). The functions of animal microRNAs. Nature 431, 350-355.
9. Hammond, S.M., Bernstein, E., Beach, D., and Hannon, G.J. (2000). An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells. Nature 404, 293-296.
10. Hutvagner, G., and Zamore, P.D. (2002). A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex. Science 297, 2056-2060.
11. Martinez, J., Patkaniowska, A., Urlaub, H., Luhrmann, R., and Tuschl, T. (2002). Single-stranded antisense siRNAs guide target RNA cleavage in RNAi. Cell 110, 563-574.
12. Schwarz, D.S., Hutvagner, G., Du, T., Xu, Z., Aronin, N., and Zamore, P.D. (2003). Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex. Cell 115, 199-208.
13. Khvorova, A., Reynolds, A., and Jayasena, S.D. (2003). Functional siRNAs and miRNAs exhibit strand bias. Cell 115, 209-216.
14. Matranga, C., Tomari, Y., Shin, C., Bartel, D.P., and Zamore, P.D. (2005). Passenger-strand cleavage facilitates assembly of siRNA into Ago2-containing RNAi enzyme complexes. Cell 123, 607-620.
15. Rand, T.A., Petersen, S., Du, F., and Wang, X. (2005). Argonaute2 cleaves the anti-guide strand of siRNA during RISC activation. Cell 123, 621-629.
16. Leuschner, P.J.F., Ameres, S.L., Kueng, S., and Martinez, J. (2006). Cleavage of the siRNA passenger strand during RISC assembly in human cells. EMBO Rep in press.
17. Liu, J., Carmell, M.A., Rivas, F.V., Marsden, C.G., Thomson, J.M., Song, J.J., Hammond, S.M., Joshua-Tor, L., and Hannon, G.J. (2004). Argonaute2 Is the Catalytic Engine of Mammalian RNAi. Science 305, 1437-1441.
18. Rivas, F.V., Tolia, N.H., Song, J.J., Aragon, J.P., Liu, J., Hannon, G.J., and Joshua-Tor, L. (2005). Purified Argonaute2 and an siRNA form recombinant human RISC. Nat Struct Mol Biol 12, 340-349.
19. Nykanen, A., Haley, B., and Zamore, P.D. (2001). ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway. Cell 107, 309-321.
20. Chiu, Y.L., and Rana, T.M. (2002). RNAi in human cells. Basic structural and functional features of small interfering RNA. Mol Cell 10, 549-561.
21. Schwarz, D.S., Hutvagner, G., Haley, B., and Zamore, P.D. (2002). Evidence that siRNAs function as guides, not primers, in the Drosophila and human RNAi pathways. Mol Cell 10, 537-548.
22. Pham, J.W., and Sontheimer, E.J. (2005). Molecular requirements for RNA-induced silencing complex assembly in the Drosophila RNA interference pathway. J Biol Chem 280, 39278-39283.
23. Pellino, J.L., Jaskiewicz, L., Filipowicz, W., and Sontheimer, E.J. (2005). ATP modulates siRNA interactions with an endogenous human Dicer complex. Rna 11, 1719-1724.
24. Elbashir, S.M., Martinez, J., Patkaniowska, A., Lendeckel, W., and Tuschl, T. (2001). Functional anatomy of siRNAs for mediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate. Embo J 20, 6877-6888.
25. Shuman, S., and Hurwitz, J. (1979). 5'-Hydroxyl polyribonucleotide kinase from HeLa cell nuclei. J Biol Chem 254, 10396-10404.
26. Tanabe, S., Bohlander, S.K., Vignon, C.V., Espinosa, R., Zhao, N., Strissel, P.L., Zeleznik-Le, N.J., and Rowley, J.D. (1996). AF10 is split by MLL and HEAB, a human homologue to a putative Caenorhabditis elegans ATP/GTP-binding protein in an invins (10;11)(p12;q23q12). Blood 88, 3535-3545.
27. Walker, J.E., Saraste, M., Runswick, M.J., and Gay, N.J. (1982). Distantly related sequences in the a- and b-subunits of ATP synthase, myosin, kinases and other ATP-requiring enzymes and a common nucleotide binding fold. EMBO J 1, 945-951.
28. Saraste, M., Sibbald, P.R., and Wittinghofer, A. (1990). The P-loop - a common motif in ATP- and GTP-binding proteins. Trends Biochem Sci 15, 430-434.
29. Minvielle-Sebastia, L., Preker, P.J., Wiederkehr, T., Strahm, Y., and Keller, W. (1997). The major yeast poly(A)-binding protein is associated with cleavage factor IA and functions in premessenger RNA 3'-end formation. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 7897-7902.
30. deVries, H., Ruegsegger, U., Hubner, W., Friedlein, A., Langen, H., and Keller, W. (2000). Human pre-mRNA cleavage factor II(m) contains homologs of yeast proteins and bridges two other cleavage factors. EMBO J 19, 5895-5904.
31. Wahle, E., and Ruegsegger, U. (1999). 3'-end processing of pre-mRNA in eukaryotes. FEMS Microbiol Rev 23, 277-295.
32. Zhao, J., Hyman, L., and Moore, C. (1999). Formation of mRNA 3' ends in eukaryotes: mechanism, regulation, and interrelationships with other steps in mRNA synthesis. Microbiol Mol Biol Rev 63, 405-445.
33. Abelson, J., Trotta, C.R., and Li , H. (1998). tRNA splicing. J Biol Chem 273, 12685-12688.
34. Paushkin, S.V., Patel, M., Furia, B.S., Peltz, S.W., and Trotta, C.R. (2004). Identification of a human endonuclease complex reveals a link between tRNA splicing and pre-mRNA 3' end formation. Cell 117, 311-321.
35. Richardson, C.C. (1965). Phosphorylation of nucleic acid by an enzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A 54, 158-165.
36. van Houten, V., Denkers, F., van Dijk, M., van den Brekel, M., and Brakenhoff, R. (1998). Labeling efficiency of oligonucleotides by T4 polynucleotide kinase depends on 5'-nucleotide. Anal Biochem 265, 386-389.
37. Sambrook, J., Fritsch, E., and Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning, 2nd Edition (Plainview, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press).
38. Winnacker, E.L. (1987). From genes to clones : introduction to gene technology. VCH publishers, New York, 451-481.
39. Braselmann, S., Graninger, P., and Busslinger, M. (1993). A selective transcriptional induction system for mammalian cells based on Gal4-estrogen receptor fusion proteins. Proc Natl Acad Sci U S A 90, 1657-1661.
40. Kohli, M., Rago, C., Lengauer, C., Kinzler, K.W., and Vogelstein, B. (2004). Facile methods for generating human somatic cell gene knockouts using recombinant adeno-associated viruses. Nucleic Acids Res 32, p. e3.
41. Hirata, R., Chamberlain, J., Dong, R., and Russell, D.W. (2002). Targeted transgene insertion into human chromosomes by adeno-associated virus vectors. Nat Biotechnol 20, 735-738.
42. Samuels, Y., Diaz, L.A., Jr., Schmidt-Kittler, O., Cummins, J.M., Delong, L., Cheong, I., Rago, C., Huso, D.L., Lengauer, C., Kinzler, K.W., Vogelstein, B., and Velculescu, V.E. (2005). Mutant PIK3CA promotes cell growth and invasion of human cancer cells. Cancer Cell 7, 561-573.
43. Nagy, A. (2000). Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring. Genesis 26, 99-109.
44. Praitis, V., Casey, E., Collar, D., and Austin, J. (2001). Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics 157, 1217-1226.
45. Ashburner, M., Golic, K.G., and Hawley, R.S. (2005). Drosophila - a laboratory handbook. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2nd edition.
46. Spradling, A.C., and Rubin, G.M. (1982). Transposition of cloned P elements into Drosophila germ line chromosomes. Science 218, 341-347.
47. Brummelkamp, T.R., Bernards, R., and Agami, R. (2002). A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science 296, 550-553.
48. Sui, G., Soohoo, C., Affar el, B., Gay, F., Shi, Y., and Forrester, W.C. (2002). A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 5515-5520.
49. Xia, H., Mao, Q., Paulson, H.L., and Davidson, B.L. (2002). siRNA-mediated gene silencing in vitro and in vivo. Nat Biotechnol 20, 1006-1010.
50. Ryther, R.C., Flynt, A.S., Phillips, J.A., 3rd, and Patton, J.G. (2005). siRNA therapeutics: big potential from small RNAs. Gene Ther 12, 5-11.
51. Dignam, J.D., Lebovitz, R.M., and Roeder, R.G. (1983). Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Res 11, 1475-1489.
52. Siegel, L.M., and Monty, K.J. (1966). Determination of molecular weights and frictional ratio of proteins in impure systems by use of gel filtration and density gradient centrifugation. Biochim Biophys Acta 112, 346-362.
53. Wang, L.K., and Shuman, S. (2001). Domain structure and mutational analysis of T4 polynucleotide kinase. J Biol Chem 276, 26868-26874.
54. Lamond, A.I., and Spector, D.L. (2003). Nuclear speckles: a model for nuclear organelles. Nat Rev Mol Cell Biol 4, 605-612.
55. Dodge, E.J., Okano, M., Dick, F., Tsujimoto, N., Chen, T., Wang, S.L., ueda, Y., Dyson, N., and Li, E. (2005). Inactivation of Dnmt3b in mouse embryonic fibroblasts results in DNA hypomethylation, chromosomal instability, and spontaneous immortalization. J Biol Chem 280, 17986-17991.
56. Richardson, C. C. (1972) Procedures in Nucleic Acid Research (Cantoni, G.L. and Davies D.R., Eds) 2, 815-828
57. Cameron, V., and Uhlenbeck, O. (1977) Biochemistry 16, 5120-5126
58. Uhlenbeck, O., and Cameron, V. (1977) Nuc Acid Res 4, 85-98
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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