(57)【要約】  本発明は、移植のための臓器、特に心臓の保存、灌流、及び／又は再灌流のための溶液に関する。前記溶液は、タンパク質キナーゼＣε（ＰＫＣε）のペプチドインヒビターを含有する。本発明の溶液を使用するための方法も開示し、移植のための臓器の保存のため、虚血臓器を損傷から保護するため、虚血後の臓器不全を緩和するため、窒素酸化物放出を維持するため及び／又は虚血臓器における超酸化物放出を阻害するため、並びに循環系から単離する際に臓器を損傷から保護するための方法を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質キナーゼＣε（ＰＫＣε）の少なくとも１つのペプチドインヒビターを含む、臓器の保存のための、臓器の灌流、保存、及び／又は再灌流のための溶液。
【請求項２】
前記少なくとも１つのペプチドインヒビターが生理食塩水溶液に溶解されている、請求項１に記載の溶液。
【請求項３】
塩化カリウムを更に含む、請求項１に記載の溶液。
【請求項４】
前記ＰＫＣεの少なくとも１つのペプチドインヒビターが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の溶液。
【請求項５】
前記ＰＫＣεの少なくとも１つのペプチドインヒビターの濃度が、約１から１０μＭである、請求項１に記載の溶液。
【請求項６】
前記臓器が心臓である、請求項１に記載の溶液。
【請求項７】
前記臓器が哺乳動物の臓器である、請求項１に記載の溶液。
【請求項８】
前記哺乳動物がヒトである、請求項７に記載の溶液。
【請求項９】
前記臓器が移植のための保存される、請求項１に記載の溶液。
【請求項１０】
移植のための臓器を保存するため、虚血臓器を保護するため、虚血後の臓器不全を緩和するため、又は循環系から単離した後の損傷から臓器を保護するための方法であって、前記臓器を請求項１に記載の溶液で灌流する工程を含む方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのペプチドインヒビターが生理食塩水溶液に溶解されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
塩化カリウムを更に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つのペプチドインヒビターが、配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＰＫＣεの少なくとも１つのペプチドインヒビターの濃度が、約１から１０μＭである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記臓器が心臓である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記臓器が哺乳動物の臓器である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記臓器が移植のために保存される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
前記ペプチドインヒビター／アクチベーターがミリストイル化されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１に記載の溶液に臓器を沈める工程を更に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項２１】
前記灌流工程を、約２０ｍＬ／分未満の速度で実施する、請求項１０に記載の方法。
【請求項２２】
前記灌流工程を、約１ｍＬ／分の速度で実施する、請求項１０に記載の方法。
【請求項２３】
前記灌流工程が逆行性灌流である、請求項１０に記載の方法。
【請求項２４】
前記灌流工程が約５分間持続する、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、移植のための臓器、特に心臓の保存、灌流、及び／又は再灌流のための溶液に関する。前記溶液は、タンパク質キナーゼＣε（ＰＫＣε）のペプチドインヒビターを含有する。
【背景技術】
【０００２】
臓器移植の成功は、多くの場合において、虚血／再灌流損傷により制限される。単離されたヒトの心臓が４時間を超えて酸素が奪われた状態になると、次第に活力を失くし、多くの場合にはレシピエント（ホスト）において生存しない。腎臓、肝臓、膵臓、及び肺などの他の臓器も、移植の前にホストから取り出した際に組織及び細胞損傷を受ける。この損傷は、通常は生理学的濃度の酸素及び栄養を送達し、かつ、臓器の細胞により先産された毒性化合物を除去する循環の欠如及び低酸素条件によるものである。臓器移植は、ホストから切除した直後に実施すると高い頻度で成功する。
【０００３】
近年の進歩により、臓器移植及び臓器手術、例えば、冠状動脈バイパス形成手術の成功率は向上している。まず、臓器の保存及び臓器の灌流溶液が挙げられる。第二に、臓器に対する臓器灌流溶液の送達方法及び装置の改善が挙げられる。
【０００４】
短期間の心筋の保存は、現在では、心筋保護下の心停止後に低温貯蔵することによって為される。しかしながら、使用する溶液の組成、保存温度、及び投与プロトコルによって異なる各種の方法が存在する。心臓を停止及び保存するための各種の溶液が開発されて、心臓手術において心筋を保護している。これらの溶液の例は、クレブス−ヘンゼルライト溶液（Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、ＵＷ溶液、Ｓｔ．トーマスＩＩ溶液（Ｓｔ．  Ｔｈｏｍａｓ  ＩＩ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、コリンズ溶液（Ｃｏｌｌｉｎｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、及びスタンフォード溶液（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を含む（米国特許第４，７９８，８２４号及び米国特許第４，９３８，９６１号、Ｓｏｕｔｈａｒｄ  ａｎｄ  Ｂｅｌｚｅｒ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．４６：２３５−２４７（１９９５）；及びＤｏｎｎｅｌｌｙ  ａｎｄ  Ｄｊｕｒｉｃ，Ａｍ．Ｊ．Ｈｏｓｐ．Ｐｈａｒｍ．４８：２４４４−２４６０（１９９１））。それにもかかわらず、臓器拒絶は、取り出した時間とレシピエントにおいて血流が回復する時間との間で移植臓器の状態が劣化するために依然として存在する。
【０００５】
血流の回復は、例えば移植の間に、長期の虚血を経た臓器組織の治療の主な目的である。しかしながら、血流の再灌流は、内皮損傷及び筋細胞損傷を誘導し、臓器不全を生じさせる（Ｂｕｃｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２６６：Ｈ１２８−１３６，１９９４；Ｌｕｃｃｈｅｓｉ  ａｎｄ  Ｍｕｌｌａｎｅ，Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ２６：２０１１−２０２４，１９８６；及びＬｕｃｃｈｅｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ２１：１２４１−１２５１，１９８９）。再灌流損傷と関連し、連続して起こる事象は、再灌流の２．５から５分後以内の窒素酸化物（ＮＯ）の基礎的な内皮細胞放出の低減によって特徴付けられる内皮不全によって引き起こされる（Ｔｓａｏ  ａｎｄ  Ｌｅｆｅｒ，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２５９：Ｈ１６６０−１６６６，１９９０）。内皮由来のＮＯの低減は、内皮及び多形核（ＰＭＮ）白血球細胞膜における接着分子の上方調節と関連する（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ７２：４０３−４１２，１９９３；及びＷｅｙｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｌｅｕｋｏ  Ｂｉｏｌ  ５７：４５−５５，１９９５）。この事象は、ＰＭＮ／内皮相互作用を促進し、再灌流の１０から２０分後に発生する。その後に続く、ＰＭＮの心筋への浸潤が、再灌流の３０分後に観察される（Ｌｅｆｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｙｗａｒｄ，Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  ｉｎ  Ｉｓｃｈｅｍｉａ−Ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ：Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，Ｌｏｓｃａｌｚｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，ｐｐ．３５７−３８０，２０００；Ｌｅｆｅｒ  ａｎｄ  Ｌｅｆｅｒ，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ３２：７４３−７５１，１９９６；Ｔｓａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８２：１４０２−１４１２，１９９０；並びにＷｅｙｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｌｅｕｋｏ  Ｂｉｏｌ  ５７：４５−５５，１９９５）。
【０００６】
再灌流した組織から放出される走化性物質及び血漿因子は、ＰＭＮを活性化して、細胞毒性物質（例えば、超酸化物アニオン）のＰＭＮ放出を増加させ、虚血／再灌流後の臓器不全に寄与する（Ｌｕｃｃｈｅｓｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ２１：１２４１−１２５１，１９８９；Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ６９：９５−１０６，１９９１；Ｔｓａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８２：１４０２−１４１２，１９９０；及びＴｓａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ  １２３：１４６４−１４７１，１９９２）。超酸化物がＮＯと結合して、過酸化窒素アニオンを生じさせ、ＮＯの生物学的利用能を低減させ、心筋の虚血／再灌流後の内皮不全及びＰＭＮ浸潤を促進する（Ｃｌａｎｃｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９０：１１１６−１１２１，１９９２；Ｈａｎｓｅｎ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ：１８７２−８５，１９９５；Ｌｕｃｃｈｅｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ２１：１２４１−１２５１，１９８９；Ｒｕｂａｎｙｉ  ａｎｄ  Ｖａｎｈｏｕｔｔｅ，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２５０：Ｈ８１５−８２１，１９８６；Ｔｓａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ  １２３：１４６４−１４７１，１９９２；並びにＷｅｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３２０：３６５−３７５，１９８９）。
【特許文献１】米国特許第４，７９８，８２４号
【特許文献２】米国特許第４，９３８，９６１号
【非特許文献１】Ｓｏｕｔｈａｒｄ  ａｎｄ  Ｂｅｌｚｅｒ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．４６：２３５−２４７（１９９５）
【非特許文献２】Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ａｎｄ  Ｄｊｕｒｉｃ，Ａｍ．Ｊ．Ｈｏｓｐ．Ｐｈａｒｍ．４８：２４４４−２４６０（１９９１）
【非特許文献３】Ｂｕｃｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２６６：Ｈ１２８−１３６，１９９４
【非特許文献４】Ｌｕｃｃｈｅｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ２１：１２４１−１２５１，１９８９
【非特許文献５】Ｔｓａｏ  ａｎｄ  Ｌｅｆｅｒ，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２５９：Ｈ１６６０−１６６６，１９９０
【非特許文献６】Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ７２：４０３−４１２，１９９３
【非特許文献７】Ｗｅｙｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｌｅｕｋｏ  Ｂｉｏｌ  ５７：４５−５５，１９９５
【非特許文献８】Ｌｅｆｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｙｗａｒｄ，Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  ｉｎ  Ｉｓｃｈｅｍｉａ−Ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ：Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，Ｌｏｓｃａｌｚｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，ｐｐ．３５７−３８０，２０００
【非特許文献９】Ｌｅｆｅｒ  ａｎｄ  Ｌｅｆｅｒ，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ３２：７４３−７５１，１９９６
【非特許文献１０】Ｔｓａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８２：１４０２−１４１２，１９９０
【非特許文献１１】Ｗｅｙｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｌｅｕｋｏ  Ｂｉｏｌ  ５７：４５−５５，１９９５
【非特許文献１２】Ｌｕｃｃｈｅｓｉ  ａｎｄ  Ｍｕｌｌａｎｅ，Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ２６：２０１１−２０２４，１９８６
【非特許文献１３】Ｌｕｃｃｈｅｓｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ２１：１２４１−１２５１，１９８９
【非特許文献１４】Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ６９：９５−１０６，１９９１
【非特許文献１５】Ｔｓａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８２：１４０２−１４１２，１９９０
【非特許文献１６】Ｔｓａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ  １２３：１４６４−１４７１，１９９２
【非特許文献１７】Ｃｌａｎｃｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９０：１１１６−１１２１，１９９２
【非特許文献１８】Ｈａｎｓｅｎ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ：１８７２−８５，１９９５
【非特許文献１９】Ｌｕｃｃｈｅｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ２１：１２４１−１２５１，１９８９
【非特許文献２０】Ｒｕｂａｎｙｉ  ａｎｄ  Ｖａｎｈｏｕｔｔｅ，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２５０：Ｈ８１５−８２１，１９８６
【非特許文献２１】Ｔｓａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ  １２３：１４６４−１４７１，１９９２
【非特許文献２２】Ｗｅｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３２０：３６５−３７５，１９８９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、移植のための臓器の保存時間を延ばすことができ、かつ、虚血後の再灌流から臓器を保護して、血流の回復後に臓器が適切な機能を取り戻すことができるような、改善された品質の溶液が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、タンパク質キナーゼＣε（ＰＫＣε）のペプチドインヒビターを含有する、臓器、特に心臓の保存、灌流、及び／又は再灌流のための溶液を提供する。前記溶液は、臓器組織及び細胞を損傷から保護しながら、循環系から臓器を単離するか又は低減された血流（虚血）を経る。本発明者は、ＰＫＣεのペプチドインヒビターが虚血／再灌流を経た臓器における保護効果を奏することを発見した。
【０００９】
１つの実施態様では、前記溶液は、約１から１０μＭ、好ましくは１から５μＭのＰＫＣεのペプチドインヒビターを溶液、好ましくは生理食塩水溶液に溶解して含有する。
【００１０】
本発明の溶液は、灌流溶液又は保存溶液として使用して良い。灌流溶液としては、臓器の脈管構造に供給し、臓器組織及び細胞を保護する。保存溶液としては、臓器を沈める浴液として役立つ。好ましくは、臓器を、本発明の溶液を使用して灌流するか又は本発明の溶液に沈める。さらに、本発明の溶液は、虚血後の臓器に対する血流の回復における再灌流溶液としても役立つ。
【００１１】
本発明は、本発明の溶液を使用する方法も含む。これらは、移植のために臓器を保存するため、虚血臓器を損傷から保護するため、虚血後における臓器不全を緩和するため、並びに循環系から単離する際に臓器を損傷から保護するための方法を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、臓器、特に心臓の保存、灌流、及び／又は再灌流のための溶液を提供する。前記溶液は、タンパク質キナーゼＣε（ＰＫＣε）のペプチドインヒビターを含有する。好ましくは、前記ＰＫＣεのペプチドインヒビターは、約１から１０μＭ、より好ましくは約１から５μＭの量で前記溶液中に存在する。
【００１３】
好ましい実施態様では、１から１０μＭ、より好ましくは約３から５μＭのペプチドインヒビターは、ＥＡＶＳＬＫＰＴ（配列番号１）のアミノ酸配列を有する。また、他の実施態様では、前記ペプチドインヒビターがミリストイル化されて、臓器の細胞により良好に吸収され易くすることが好ましい。ミリストイル化は、ペプチドインヒビターのＮ末端であることが好ましい。
【００１４】
好ましい実施態様では、ペプチドインヒビターは、生理食塩水溶液、好ましくは通常の生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）に溶解する。ペプチドインヒビターは、既知の保存溶液、例えば、クレブス−ヘンゼルライト溶液、ＵＷ溶液、Ｓｔ，トーマスＩＩ溶液、コリンズ溶液、及びスタンフォード溶液などに溶解しても良い。前記溶液は、ナトリウム（Ｎａ＋）、カリウム（Ｋ＋）、カルシウム（Ｃａ２＋）、マグネシウム（Ｍｇ２＋）、グルタメート、アルギニン、アデノシン、マニトール、アロプリノール、グルタチオン、ラフィノース、及びラクトビオン酸の１つ又は複数を約４から７ｍＭ、約０．２から０．３ｍＭ、約１０８から１３２ｍＭ、約１３から１６ｍＭ、約１８から２２ｍＭ、約２から４ｍＭ、約０．５から１ｍＭ、約２７から３３ｍＭ、約０．９から１．１ｍＭ、約２．７から３．３ｍＭ、約２５から３５ｍＭ、及び約８０から１２０ｍＭの各々の濃度で含んでも良い。Ｎａ＋は、ＮａＯＨの形態であって良く、Ｋ＋はＫＣｌ及び／又はＫＨ２ＰＯ４、最も好ましくは約２から３．５ｍＭ ＫＣｌと約２から３．５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４との比率である形態であって良く、Ｍｇ２＋はＭｇＣｌ２の形態であって良い。前記溶液は、タンパク質キナーゼＣβＩＩ（ＰＫＣβＩＩ）、タンパク質キナーゼＣζ（ＰＫＣζ）のペプチドインヒビター及びタンパク質キナーゼＣδ（ＰＫＣδ）のペプチドアクチベーターの１つ又は複数を含有しても良い。前記溶液は、好ましくは、約７．０から７．５、より好ましくは７．２から７．４の生理学的ｐＨで維持される。
【００１５】
本発明の溶液は、１）ドナーからの臓器の単離（心筋保護液）；２）臓器の保存（低温保存／輸送）；並びに３）レシピエントにおける臓器の再移植（再灌流溶液）を含むが、それらに限らない、臓器、特に心臓の移植の全ての段階の間に使用されて良い。
【００１６】
特に心臓の灌流又は再灌流の間において、臓器を約１ｍＬ／分の速度で約５分間灌流することが好ましい。灌流速度は変化して良いが、約２５ｍＬ／分を超えるべきではない。概して、灌流速度は、臓器の脈管構造に対して過度の圧力をかける程高くあるべきではない。
【００１７】
本発明の溶液は、１）ペプチドインヒビター及び各種の成分を蒸留水に溶解及び希釈し；２）ｐＨを約７．２から７．４に、例えばＮａＯＨを使用して調節し；並びに３）溶液を、例えば０．２μｍフィルターで濾過して滅菌することによって調製されて良い。滅菌溶液を、次いで、環境における汚染から隔離し続けて良い。
【００１８】
更なる説明なしで、当業者が、以下の実施例及び前述の記載を用いて、本発明の化合物を製造及び利用し、特許請求の範囲に記載の方法を実施し得ると解される。以下の実施例を、本発明を説明するために挙げる。本発明は、この実施例に記載された特定の条件又は詳細に限定されるべきではないことが理解されるべきである。
【実施例】
【００１９】
オスのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（２７５から３２５ｇ，Ａｃｅ  Ａｎｉｍａｌｓ，Ｂｏｙｅｒｔｏｗｎ，ＰＡ）に６０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタルナトリウム（ｉ．ｐ．）を腹腔内で麻酔した。ナトリウムヘパリン（１０００Ｕ）も腹腔内投与した。心臓を即時に摘出して、上行大動脈をカニューレ処置し、心臓の逆行性灌流を、３７℃に維持した修飾クレブス緩衝液で８０ｍｍＨｇの一定の圧力において開始した。クレブス緩衝液は、以下の組成（単位はｍｍｏｌ／ｌ）：１７デキストロース、１２０ＮａＣｌ、２５ＮａＨＣＯ３、２．５ＣａＣｌ２、０．５ＥＤＴＡ、５．９ＫＣｌ、及び１．２ＭｇＣｌ２を有した。灌流液は、９５％Ｏ２及び５％ＣＯ２を使用して曝気し、７．３から７．４のｐＨに平衡化した。心臓流入カニューレの近くの灌流ラインにおける２つのサイドアームは、ＰＭＮ、ＰＫＣεペプチドインヒビターなしの血漿（対照の心臓）、又はＰＫＣεペプチドインヒビターを各種の濃度（１又は５μＭ）で含有する血漿を冠状動脈流入ラインに直接注入することを可能にする。冠状動脈流入は、流量計（Ｔ１０６，Ｔｒａｎｓｏｎｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｃ．，Ｉｔｈａｃａ，ＮＹ）によって観察した。ＬＶＤＰ及び＋ｄｐ／ｄｔｍａｘは、左心室に位置する圧力トランスデューサー（ＳＰＲ−５２４，Ｍｉｌｌａｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を用いて観察した。心臓は、３７℃に維持した１６０ｍＬのクレブス緩衝液を含有する水ジャケット容器に浸した。冠血流、ＬＶＤＰ、及び＋ｄＰ／ｄｔｍａｘは、Ｐｏｗｅｒｌａｂ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ，ＣＯ）をコンピュータと組み合わせて用いて記録した。
【００２０】
ＬＶＤＰ、＋ｄＰ／ｄｔｍａｘ、及び冠血流は、１５分の間に５分毎に測定して、心臓を平衡化し、ベースラインを得た。ＬＶＤＰは左心室収縮末期圧−左心室拡張末期圧として規定した。１５分後、クレブス緩衝液の流量を２０分間で０まで低減させて、全身の虚血を誘導した。再灌流では、心臓は、１ｍＬ／分の速度で、５ｍＬの血漿を加えた５ｍＬのクレブス緩衝液に再懸濁した２００×１０６ＰＭＮを用いて、５分間に亘って灌流した。幾つかの実験では、ＰＫＣεペプチドインヒビター（Ｇｅｎｅｍｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｓｉｓｃｏ，ＣＡ）を１又は５μＭの終濃度で血漿に添加した。偽Ｉ／Ｒ心臓は虚血に供せず、ＰＭＮで灌流しなかった。
【００２１】
単離して灌流したラット心臓の以下の群を使用した：
第１群:偽Ｉ／Ｒ心臓は虚血に供せず、ＰＭＮで灌流しなかったが、灌流３５分で５ｍＬの血漿（１ｍＬ／分）を用いて灌流した（同じ時点で、Ｉ／Ｒ心臓は５ｍＬの血漿を与えられ、１５分のベースラインの記録に加え２０分の虚血）。これらの心臓は、単離したラットの心臓が、８０分のプロトコルに亘ってＬＶＤＰ及び＋ｄＰ／ｄｔｍａｘを維持できるかどうかを決定するための対照群であった（ｎ＝６）。
第２群：偽Ｉ／Ｒ＋ＰＫＣεペプチドインヒビター（５μＭ）心臓は、虚血に供せず、且つ、ＰＭＮで灌流しなかった。これらの心臓に、灌流３５分で、ＰＫＣεペプチドインヒビター（５μＭ、Ｈ２Ｏ中の５ｍＭストックから血漿に溶解した）を投与した。この群を使用して、ＰＫＣεペプチドインヒビターが強心作用又は心抑制作用を生じるかどうかを決定した（ｎ＝６）。
第３群：Ｉ／Ｒ心臓は２０分間の虚血に供して、再灌流の最初の５分の間に５ｍＬの血漿で灌流したが（１ｍＬ／分）、ＰＭＮで灌流しなかった。これらの心臓は、２０分の虚血に続いて再灌流をすることが心臓に衝撃を与えるかどうかを決定するための対照群を表わしたが、ＬＶＤＰ及び＋ｄＰ／ｄｔｍａｘは、再灌流期間の４５分の終わりまでにベースラインの値（初期値）に回復するであろう（ｎ＝７）。
第４群：Ｉ／Ｒ＋ＰＫＣεペプチドインヒビター（５μＭ、血漿に溶解）心臓は、２０分の虚血に供され、ＰＭＮで灌流はされなかった。これらの心臓は、再灌流の最初の５分の間に、５ｍＬの血漿＋ＰＫＣεペプチドインヒビターで灌流された。この群を使用して、ＰＫＣεペプチドインヒビターが、ＰＭＮ無しのＩ／Ｒの設定で心抑制作用を生じるかどうかを決定した（ｎ＝６）。
第５群：Ｉ／Ｒ＋ＰＭＮ心臓は、２０分の虚血に供され、再灌流の最初の５分の間に、５ｍＬの血漿（１ｍＬ／分）及びＰＭＮ（５ｍＬのクレブス緩衝液に再懸濁）を用いて灌流した。これらの心臓は、２０分の虚血に続くＰＭＮ（２００×１０６）の存在下における４５分の再灌流が、初期のベースラインの値と比較して、４５分の再灌流期間の全体に亘って持続的な心臓収縮不全を生じるかどうかを決定するための対照群であった（ｎ＝７）。
第６群：Ｉ／Ｒ＋ＰＭＮ＋ＰＫＣεペプチドインヒビター（１μＭ）心臓は、２０分の虚血に供して、再灌流の最初の５分の間に、１μＭのＰＫＣεペプチドインヒビター（血漿に溶解）及びＰＭＮ（２００×１０６）を用いて灌流した。これらの心臓は、心臓収縮不全のＰＭＮによる誘導を緩和するＰＫＣε阻害効果を測定するための群であった（ｎ＝６）。
第７群：Ｉ／Ｒ＋ＰＭＮ＋ＰＫＣεペプチドインヒビター（５μＭ）心臓は、２０分間の虚血に供され、再灌流の最初の５分間の間に、５μＭのＰＫＣεペプチドインヒビター（血漿に溶解）及びＰＭＮ（２００×１０６）を用いて灌流した。これらの心臓は、心臓収縮不全のＰＭＮによる誘導を緩和するＰＫＣεペプチドインヒビターのより高い濃度におけるＰＫＣε阻害の効果を測定するための群であった。
【００２２】
図１は、偽Ｉ／Ｒ、Ｉ／Ｒ、Ｉ／Ｒ＋ＰＭＮ、及びＩ／Ｒ＋ＰＭＮ＋ＰＫＣεペプチドインヒビター（５μＭ）の群についての心臓収縮関数（ＬＶＤＰ）の経時変化を示し、８０分の灌流期間の間におけるＬＶＤＰの変化を表わした。偽Ｉ／Ｒ群における心臓は、灌流期間の全体に亘ってＬＶＤＰの最初のベースラインの値の１００±２％のままであった。Ｌ／Ｒ群の心臓は、再灌流の初期段階の間にＬＶＤＰの下降を経るが、再灌流の終わりまでには初期のベースラインの値の９２±３％に回復した。しかしながら、Ｌ／Ｒ＋ＰＭＮ群の心臓は、重度の心臓収縮不全を示し、再灌流の終わりまでに初期のベースラインの値の５５±５％にのみ回復した。対照的に、Ｉ／Ｒ＋ＰＭＮ＋ＰＫＣεペプチドインヒビター（５μＭ）における心臓は、再灌流の１５分後までにはＬＶＤＰが顕著に回復しており（初期のベースラインの値の８８±９％）、４５分の再灌流期間全体に亘って改善され続け、初期のベースラインの値の９９±６％まで回復した。
【００２３】
ＬＶＤＰ経時変化において認められた、ＰＫＣεインヒビターで治療した心臓と対照のＩ／Ｒ＋ＰＭＮ心臓との間の有意な差は、主に拡張末期血圧（ＬＶＥＤＰ）による。図２は、偽Ｉ／Ｒ、Ｉ／Ｒ、Ｉ／Ｒ＋ＰＭＮ、及びＩ／Ｒ＋ＰＭＮ＋ＰＫＣεペプチドインヒビター（５μＭ）の群におけるＬＶＥＤＰ経時変化である。初期のＬＶＥＤＰには有意な差は存在しなかった（５から８ｍｍＨｇ）。しかしながら、有意な差が、対照のＩ／Ｒ＋ＰＭＮで治療した心臓とＩ／Ｒ＋ＰＭＮ＋ＰＫＣεインヒビターで治療した心臓との間において、再灌流の１５分後に早くも認められ、この差は４５分の再灌流の全体に亘って持続した。対照のＩ／Ｒ＋ＰＭＮ心臓は、最終的に４２±７ｍｍＨｇのＬＶＥＤＰを有しており、それと比較して、Ｉ／Ｒ＋ＰＭＮ＋ＰＫＣεインヒビターで治療した心臓は、最終的に１６±２ｍｍＨｇのＬＶＥＤＰを有しており、この差は有意であった（ｐ＜０．０１）。
【００２４】
ＰＫＣεペプチドインヒビターが心臓収縮機能に対して何らかの直接的に影響を与える作用を生じるかどうかを確立するために、偽Ｉ／Ｒ心臓はＰＫＣεペプチドインヒビター（５μＭ）を使用して灌流した。この群は、試験の対照の１つとして役立った。これらの心臓は、８０分の再灌流期間の終わりにおいて、ＬＶＤＰ（図３）又は＋ｄＰ／ｄｔｍａｘ（図４）において有意な差を全く示さず、かくして、当該用量では、ＰＫＣεペプチドインヒビターは心臓収縮機能に対して直接的な作用を有さなかった。図３及び４は、単離して灌流した心臓に由来する卯ＬＶＤＰ及び＋ｄＰ／ｄｔｍａｘの各々についての初期値及び最終値を示した。試験した全ての群の初期のベースラインの値の間に有意な差は存在しなかった。偽Ｉ／Ｒ、Ｉ／Ｒ，偽Ｉ／Ｒ＋ＰＫＣεペプチドインヒビター、及びＩ／Ｒ＋ＰＫＣεペプチドインヒビター（５μＭ）の群について、ＬＶＤＰ及び＋ｄＰ／ｄｔｍａｘの初期値と最終値との間にも有意な差は存在しなかった。しかしながら、Ｉ／Ｒ＋ＰＭＮの群については、ＬＶＤＰ及び＋ｄＰ／ｄｔｍａｘの初期値と最終値との間に有意な差が存在した。再灌流の４５分後において、ＬＶＤＰが初期のベースラインの値の５５±５％であり、＋ｄＰ／ｄｔｍａｘが初期のベースラインの値の４７±４％から有意な差（ｐ＜０．０１）が観察された。５μＭの用量は、Ｉ／Ｒ＋ＰＭＮ＋ＰＫＣεペプチドインヒビター（５μＭ）における心臓が、ＬＶＤＰ及び＋ｄＰ／ｄｔｍａｘの各々について、４５分の再灌流期間で初期のベースラインの値の９９±６％及び８７±５％まで回復したため最も心臓保護的であった。これらの値は、再灌流の４５分におけるＩ／Ｒ＋ＰＭＮとは有意に異なった（Ｐ＜０．０１）。１μＭの用量のＰＫＣεペプチドインヒビターは、Ｉ／Ｒ＋ＰＭＮ＋ＰＫＣεペプチドインヒビター（１μＭ）の群における心臓は、ＬＶＤＰ及び＋ｄＰ／ｄｔｍａｘの各々について６６±９％及び５９±９％にのみ回復したことから心臓保護的ではなかった。１μＭの用量の群におけるＬＶＤＰ及び＋ｄＰ／ｄｔｍａｘの最終的な値は、Ｉ／Ｒ＋ＰＭＮの群の最終的な値と有意に異なるものではなかった。
【００２５】
図５は、心臓の機能の実験における７つの群の間の冠血流を示す。初期の冠血流における有意な差は存在しなかった（１６から２１ｍｌ／分）。対照のＩ／Ｒ＋ＰＭＮの群は、初期のベースラインの値の３４±８％にのみ回復したが、Ｉ／Ｒ＋ＰＭＮ＋ＰＫＣεインヒビターで治療した心臓は、初期のベースラインの値の６２±３％まで回復し、この差は有意であった（ｎ＜０．０１）。
【００２６】
図６は、心臓機能実験における７つの群の間の心拍数を表わす。初期の心拍数における有意な差は存在しなかった（２９５から２６５拍／分）。対照のＩ／Ｒ＋ＰＭＮの群は、初期のベースラインの７２±７％にのみ回復したが、Ｉ／Ｒ＋ＰＭＮ＋ＰＫＣεペプチドインヒビターで治療した心臓は、初期のベースラインの値の８５±４％まで回復し、この差は有意であった（ｐ＜０．０５）。
【００２７】
図７は、ＰＫＣεペプチドインヒビターで治療した群（１から１０μＭ）と比較した未治療の群（基礎）におけるラット大動脈の内皮からのＮＯ放出を示す。アセチルコリン（Ａｃｈ）（１０μＭ）を正の対照として使用した。基礎的なＮＯ放出を２．１２±０．３９ピコモル／ｍｇ組織から、０．６６±０．２８（５μＭ；ｐ＜０．０５）及び０．２６±０．４２（１０μＭ）ピコモル／ｍｇ組織にまで有意に阻害するという、ＰＫＣεペプチドインヒビターで治療した群の用量応答効果が存在した。内皮由来ＮＯの増加が多くの場合にＩ／Ｒ後の心臓保護効果と関連するが、内皮ＮＯ放出（ｅＮＯＳ）に寄与する酵素が、基質（Ｌアルギニン）又はコファクター（ＮＨ４）が再灌流の初期に容易に利用可能ではない際に、超酸化物の放出を生じさせるように生成物のプロフィールを変化させ得ることが推察される。
【００２８】
本発明のある好ましい実施態様を特に本明細書に記載したが、当業者には、本明細書に示し且つ記載した各種の実施態様の変形例及び修飾例が、本発明の範囲及び精神を逸脱すること無く作製され得ることが明らかであろう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲及び適用される法の規則によって必要とされる程度にのみ限定されることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、偽Ｉ／Ｒ、Ｉ／Ｒ、Ｉ／Ｒ＋ＰＭＮ、及びＩ／Ｒ＋ＰＭＮ＋ＰＫＣεペプチドインヒビター（５μＭ）灌流ラット心臓における、ＬＶＤＰ（最大左心室圧＝左心室収縮末期圧（ＬＶＥＳＰ）−左心室拡張末期圧（ＬＶＥＤＰ））の経時変化を示すグラフである。
【図２】図２は、偽Ｉ／Ｒ、Ｉ／Ｒ、Ｉ／Ｒ＋ＰＭＮ、及びＩ／Ｒ＋ＰＭＮ＋ＰＫＣεペプチドインヒビター（５μＭ）の群におけるＬＶＥＤＰの経時変化を示すグラフである。
【図３】図３は、虚血（Ｉ）前（開始時）及び再灌流の４５分後（終了時）の単離して灌流したラット心臓の開始時及び終了時のＬＶＤＰ（ｍｍＨｇ）を示すグラフである。心臓は、ＰＭＮの存在又は不在下で灌流した。ＰＭＮは有意な収縮不全を誘導し、これはＰＫＣεペプチドインヒビターによって緩和された。全ての値は平均値±ＳＥＭとして表わす。測定した心臓の数はバーの下にある。
【図４】図４は、虚血前（開始時）及び再灌流後（終了時）の単離して灌流したラット心臓におけるＬＶＤＰ（＋ｄＰ／ｄｔ  ｍａｘ）（ｍｍＨｇ）の開始時及び終了時の最大速度を示すグラフである。心臓は、ＰＭＮの存在下又は不在下において灌流した。ＰＭＮは、有意な収縮不全を誘導し、これはＰＫＣεペプチドインヒビターに緩和された。全ての値は平均値±ＳＥＭとして表わす。試験した心臓の数はバーの下にある。
【図５】図５は、心臓機能実験における７つの群の冠血流を示すグラフである（偽Ｉ／Ｒ、偽Ｉ／Ｒ＋ＰＫＣεペプチドインヒビター（５μＭ）、Ｉ／Ｒ、Ｉ／Ｒ＋ＰＫＣεペプチドインヒビター（５μＭ）、ＩＲ＋ＰＭＮ、及びＩ／Ｒ＋ＰＭＮ＋ＰＫＣεペプチドインヒビター（１μＭ及び５μＭ））。
【図６】図６は、心臓機能実験における７つの群（偽Ｉ／Ｒ、偽Ｉ／Ｒ＋ＰＫＣεペプチドインヒビター（５μＭ）、Ｉ／Ｒ、Ｉ／Ｒ＋ＰＫＣεペプチドインヒビター（５μＭ）、ＩＲ＋ＰＭＮ、及びＩ／Ｒ＋ＰＭＮ＋ＰＫＣεペプチドインヒビター（１μＭ及び５μＭ））の心拍数を示すグラフである。
【図７】図７は、ＰＫＣεペプチドインヒビターで治療した群と比較した、未治療の（ベースラインの値）群におけるラットの大動脈内皮からのＮＯ放出を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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