(57)【要約】本発明はポリカチオン錯化タンパク質結晶およびヒアルロン酸を含む組成物に関する。有利には、本発明の組成物は、安定かつ長時間作用型であり、注射部位での局所的な反応を回避する。本発明による組成物には、徐放性のヒト成長ホルモン組成物が含まれる。こうした組成物は、ヒト成長ホルモン欠乏に関連する障害、またはヒト成長ホルモン治療によって改善する障害を有する被験者を治療するのに有用である。本発明はまた、ポリカチオン錯化タンパク質結晶およびヒアルロン酸を含む組成物を調製する方法を提供する。
2009521486.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリカチオン錯化タンパク質結晶およびヒアルロン酸を含む組成物。
【請求項２】
ポリカチオン錯化タンパク質結晶およびヒアルロン酸を含む組成物であって、前記結晶がカチオン結晶である組成物。
【請求項３】
ポリカチオン錯化タンパク質結晶およびヒアルロン酸を含む組成物であって、前記結晶が一価カチオン結晶である組成物。
【請求項４】
前記タンパク質が成長ホルモンまたは成長ホルモン誘導体である、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記成長ホルモンがヒト成長ホルモンである、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記一価カチオンがナトリウムである、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
前記ポリカチオンが、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、ポリリシン、ポリリシン−グラフト−イミダゾール酢酸、プロタミン、ヒストン、ミエリン塩基性タンパク質、硫酸ポリミキシンＢ、ブラジキニン、スペルミン、プトレシン、ポリアリルアミン、直鎖ポリ（エチレンイミン）、分枝ポリ（エチレンイミン）、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリオルニチン、キトサン、およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記ポリカチオンがポリアルギニンである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
アミノ酸、塩、アルコール、炭水化物、タンパク質、脂質、界面活性剤、ポリマー、ポリアミノ酸、およびこれらの混合物からなる群から選択される賦形剤をさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
徐放性の組成物である、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
２７以上のゲージを有する針による注射に適した形態である、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
３０以上のゲージを有する針による注射に適した形態である、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
タンパク質治療を必要とする哺乳動物の治療方法であって、治療上有効な量の請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物を前記哺乳動物に投与するステップを含む方法。
【請求項１４】
ヒト成長ホルモン欠乏に関連した障害を有する哺乳動物の治療方法であって、治療上有効な量の請求項４に記載の組成物を前記哺乳動物に投与するステップを含む方法。
【請求項１５】
前記障害が、成人の成長ホルモン欠乏症、小児の成長ホルモン欠乏症、プラーダー・ヴィリ症候群、ターナー症候群、短腸症候群、慢性腎不全、特発性の低身長、小人症、下垂体機能低下の小人症、骨再生、女性の不妊症、子宮内発育遅延、ＡＩＤＳ関連の悪液質、クローン病、嚢胞性繊維症およびやけどからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物が注射によって前記哺乳動物に投与される、請求項１３から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記注射が２７以上のゲージを有する針によるものである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記注射が３０以上のゲージを有する針によるものである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
哺乳動物の注射部位耐性を改善する方法であって、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物を前記哺乳動物に投与するステップを含む方法。
【請求項２１】
前記組成物が週１回の単回注射によって前記哺乳動物に投与される、請求項１３から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
治療上有効な量の前記組成物を前記哺乳動物に投与することによって、投与後約０．５時間と約４０日との間、約０．３ｎｇ／ｍＬと約２，５００ｎｇ／ｍｌとの間のヒト成長ホルモン生体内血清濃度が提供される、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項２３】
ポリカチオン錯化タンパク質結晶上の表面電荷を減らす方法であって、前記ポリカチオン錯化タンパク質結晶にヒアルロン酸を加えるステップを含む方法。
【請求項２４】
タンパク質の徐放性組成物を調製する方法であって、
（ａ）タンパク質結晶を形成するステップと；
（ｂ）前記タンパク質結晶をポリカチオンと錯体形成させてポリカチオン錯化タンパク質結晶を形成するステップと；
（ｃ）前記ポリカチオン錯化タンパク質結晶をヒアルロン酸と調合するステップと
を含む方法。
【請求項２５】
タンパク質の徐放性組成物を調製する方法であって、
（ａ）タンパク質結晶をポリカチオンと錯体形成させてポリカチオン錯化タンパク質結晶を形成するステップと；
（ｂ）前記ポリカチオン錯化タンパク質結晶をヒアルロン酸と調合するステップと
を含む方法。
【請求項２６】
前記タンパク質結晶がヒト成長ホルモン結晶である、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記結晶がヒト成長ホルモンの一価カチオン結晶である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記一価カチオンがナトリウムである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ポリカチオンが、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、ポリリシン、ポリリシン−グラフト−イミダゾール酢酸、プロタミン、ヒストン、ミエリン塩基性タンパク質、硫酸ポリミキシンＢ、ブラジキニン、スペルミン、プトレシン、ポリアリルアミン、直鎖ポリ（エチレンイミン）、分枝ポリ（エチレンイミン）、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリオルニチン、キトサン、およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項２４または２５に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ポリカチオンがポリアルギニンである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
タンパク質の徐放性組成物を調製する方法であって：
（ａ）タンパク質をポリカチオンと共結晶化させて共結晶を形成するステップと；
（ｂ）前記共結晶をヒアルロン酸と調合するステップと
を含む方法。
【請求項３２】
ポリカチオン錯化タンパク質結晶の投与によって引き起こされる哺乳動物の注射部位反応の減少または防止方法であって、前記ポリカチオン錯化タンパク質結晶をヒアルロン酸と調合するステップと、前記調合物を前記哺乳動物に注射するステップとを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明はポリカチオン錯化タンパク質結晶およびヒアルロン酸を含む組成物に関する。有利には、本発明の組成物は、安定かつ長時間作用型であり、注射部位での局所的な反応を回避する。本発明による組成物には、例えば、徐放性のヒト成長ホルモン組成物が含まれる。こうした組成物は、ヒト成長ホルモン欠乏に関連する障害、またはヒト成長ホルモン治療によって改善する障害を有する被験者を治療するのに有用である。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
医薬品において使用されるタンパク質（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、エリトロポイエチン（「ＥＰＯ」）、ヒト成長ホルモン（「ｈＧＨ」））は、毎日の、または少なくとも規則的な、皮下または他の型の注射によって患者に送達される。繰り返し注射されることのつらさを和らげるためには、長時間作用型（例えば、週１回注射の製品）で、注射部位において非刺激性のタンパク質調合物があれば、患者（特に子供）は非常に恩恵を受けるであろう。
【０００３】
ヒトのｈＧＨ欠乏症の現行治療法は、例えば、主として皮下注射によるｈＧＨの送達に基づくものである。ｈＧＨは、細胞および組織の成長の調節、ならびに発達および老化の様々な段階における生理学的機能に重要な役割を果たす。例えば、ｈＧＨの過剰産生は、子供の巨人症および大人の先端巨大症をもたらす。一方、過少産生は、子供の小人症［Ｍａｕｒａｓら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、８５巻（１０号）、３６５３〜３６６０頁（２０００年）；Ｆｒｉｎｄｉｋら、Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５１巻（１号）、１５〜１９頁（１９９９年）；Ｌｅｇｅｒら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、８３巻（１０号）、３５１２〜３５１６頁（１９９８年）］、ターナー症候群（女性だけ）［Ｂｒａｍｓｗｉｇ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ、１５巻（１号）、５〜１３頁（２００１年）；Ｐａｓｑｕｉｎｏら、Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４６巻（６号）、２６９〜２７２頁（１９９６年）］、および慢性腎不全［Ｃａｒｒｏｌｌら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、１１巻（６号）、２３１〜２３８頁（２０００年）；Ｕｅｌａｎｄら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、８７巻（６号）、２７６０〜２７６３頁（２００２年）；  Ｓｉｍｐｓｏｎら、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  ＆  ＩＧＦ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２巻、１〜３３頁（２００２年）］をもたらす。大人では、ｈＧＨの欠乏は、タンパク質、炭水化物、脂質、ミネラルおよび結合組織の代謝処理に影響する可能性があり、筋肉、骨または皮膚の萎縮をもたらす可能性がある［ＭｅｈｌｓおよびＨａａｓ、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  ＆  ＩＧＦ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｂ、Ｓ３１〜Ｓ３７頁（２０００年）；Ｆｉｎｅら、Ｊ．  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、１３６巻（３号）、３７６〜３８２頁（２０００年）；Ｍｏｔｏｙａｍａら、Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ、２巻（２号）、１６２〜１６５頁（１９９８年）］。成長不全または異常を特徴とするその他のｈＧＨ欠乏に関連する障害としては、ＡＩＤＳ消耗症候群［Ｈｉｒｓｃｈｆｅｌｄ、Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４６巻、２１５〜２２１頁（１９９６年）；Ｔｒｉｔｏｎら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１０５巻（１号）、４４〜５７頁（１９９８年）；Ｍｕｌｌｉｇａｎら、Ｊ．  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｔｅｒａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ、２３巻（６号）、Ｓ２０２〜Ｓ２０９頁（１９９９年）；ＴｏｒｒｅｓおよびＣａｄｍａｎ、ＢｉｏＤｒｕｇｓ、１４巻（２号）、８３〜９１頁（２０００年）］およびプラーダー・ヴィリ症候群［Ｒｉｔｚｅｎ、Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５６巻（５〜６号）、２０８頁（２００２年）；Ｅｉｈｏｌｚｅｒら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、１５７巻（５号）、３６８〜３７７頁（１９９８年）］が挙げられる。
【０００４】
ｈＧＨ治療の必要性に対処しようとして、安定かつ長時間作用性であり、したがって、より低頻度の注射スケジュールで送達することができる多くの製品が開発されている。この目的に対して、様々なドラッグデリバリー技術、例えば、ヒドロゲル［Ｋａｔａｋａｍら、Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、４９巻（１号）、２１〜２６頁（１９９７年）；ＫｉｍおよびＰａｒｋ、Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、８０巻（１〜３号）、６９〜７７頁（２００２年）］、リポソーム［Ｗｅｉｎｅｒら、Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．、７４巻（９号）、９２２〜９２５頁（１９８５年）］、油乳剤［Ｙｕら、Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．、８５巻（４号）、３９６〜４０１頁（１９９６年）；［Ｚｈａｏら、Ｊ．  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．、７５巻（１１号）、３１２２〜３１３０頁（１９９２年）］］および生分解性高分子ミクロスフェア［Ｊｏｓｔｅｌら、Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  （Ｏｘｆ）、６２巻（５号）：６２３〜６２７頁（２００５年）；Ｓｕｎら、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．、２８９巻（３号）：１５２３〜１５３２頁（１９９９年）；Ｊｏｎｅｓら、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ、２８巻（１号）：７１〜８４頁（１９９７年）；Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、２巻（７号）：７９５〜７９９頁（１９９６）］が使用されている。しかし、得られたｈＧＨ調合物は、しばしば望ましくない突発的な薬の放出を示すか、またはこれを製造するのが困難である恐れがある。
【０００５】
例えば、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ  Ｄｅｐｏｔ（登録商標）は、遺伝子組み換え型ヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）含有乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧ）ミクロスフェアの注射可能な懸濁液である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅ．ｃｏｍを参照）。この製品は余りにも製造原価が高いので市場から撤退せざるを得なかった（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｗｏｒｌｄ．ｃｏｍ／ｓｅｒｖｌｅｔ／ｃｏｍ．ａｃｃｕｍｅｄｉａ．ｗｅｂ．Ｄｉｓｐａｔｃｈｅｒ？ｎｅｘｔ＝ｂｉｏＷｏｒｌｄＨｅａｄｌｉｎｅｓ  ａｒｔｉｃｌｅ＆ｆｏｒｃｅｉｄ＝３５７５４を参照）。さらに、小児患者へのＮｕｔｒｏｐｉｎ  Ｄｅｐｏｔ（登録商標）の投与を含む研究の結果、有害な注射部位反応がもたらされ、小結節、紅斑、痛み、挫傷、かゆみ、脂肪組織萎縮および腫れを生じることが分かった（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｒｕｇｓ．ｃｏｍ／ＰＤＲ／Ｎｕｔｒｏｐｉｎ  Ｄｅｐｏｔ  ｆｏｒ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ．ｈｔｍｌを参照）。
【０００６】
現在、ＬＧ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．（韓国）によって開発されている別の製品は、ｈＧＨ、ヒアルロン酸塩、レシチンおよびトリグリセリドを含む微粒子懸濁液調合物である。この製品の欠点としては、処理時の噴霧および真空乾燥などの長い製造工程、ならびに不利な送達手段、具体的には、送達流体を２６ゲージの注射針によって注射しなければならないことが挙げられる［非特許文献１；米国特許出願第２００５／０１００６０５号；特許文献１］。
【０００７】
参照としてその全体が本明細書に組み込まれた特許文献２および特許文献３は、ｈＧＨ調合物、例えば、高分子電解質（すなわち、ポリカチオン）と錯体を形成したｈＧＨの結晶を含むｈＧＨ調合物に言及している。こうした組成物は安定しており、１週間までのｈＧＨの徐放が可能である。これらの組成物はポリカチオン錯化ｈＧＨ結晶成分により安定かつ長時間作用型になっているが、ある患者には、この錯化結晶表面の帯電性が局所反応をもたらす恐れがある。これは注射部位に軽度の赤みおよび腫れを引き起こす。
【０００８】
ヒアルロン酸（「ＨＡ」）は、生体適合性かつ生体吸収性の天然のグリコサミノグリカンである［Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏ−Ｔｈｏｒａｃｉｃ  Ｓｕｒｇｅｒｙ、８巻、１４９〜１５２頁（１９９４年）］。ヒアルロン酸は、並外れた潤滑性を有する非常に高い粘性の流体を形成するものであり、製剤に使用されてきた［Ｗｏｂｉｇら、Ｃｌｉｎ．  Ｔｈｅｒ．、２１巻（９号）、１５４９〜１５６２頁、１９９９年；Ｃａｎｏｓｏら、Ａｎｎ．  Ｒｈｅｕｍ．  Ｄｉｓ．、４２巻（２号）、１７１〜１７５頁、１９８３年４月］。現在まで、ヒアルロン酸は、薬物と均一に混ぜ、溶液中に可溶化し、引き続き処理して、溶液、ゲル、固形微粒子またはマトリックスを形成している。
【０００９】
さらに、米国特許第５，４１６，０７１号に記載されているように、ヒアルロン酸は、エリトロポイエチンを徐放するためのゲル送達系として使用されている。徐放性調合物は、架橋ヒアルロン酸ヒドロゲル中にカプセル化されたタンパク質もベースにしている［Ｙｕｎら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２５巻（１号）、１４７〜１５７頁（２００３年）；ＰＣＴ特許出願ＷＯ２００４／０５０７１２号；Ｙｕｉら、Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、２５巻、１３３〜１４３頁（１９９３年）；ＰＣＴ特許出願ＷＯ２０００／０７８３５７号］。あるいは、薬物をヒアルロン酸ミクロスフェア中にカプセル化して徐放性を得ている［Ｋｉｍａら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、１０４巻、３２３〜３３５頁、（２００５年）；Ｈａｈｎら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２１巻（８号）、２００４年８月；欧州特許第０９１８５３５号、およびＰＣＴ特許出願ＷＯ１９９８／０４３６６４号］。
【００１０】
ヒアルロン酸の臨床応用および安全性は、様々な他の治療分野で確立されている。例えば、  Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ら、Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  Ｓｕｒｇ．、２８巻（６号）、４９１頁、２００２年６月；  Ｄｕｒａｎｔｉら、Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  Ｓｕｒｇ．、２４巻（１２号）、１３１７〜１３２５頁、１９９８年１２月；Ａｋｅｒｍａｒｋら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、２２巻（３号）、１５７〜１６６頁、２００２年３月１日；およびＷｏｂｉｇら、Ｃｌｉｎ．  Ｔｈｅｒ．、２０巻（３号）、４１０〜４２３頁、１９９８年５〜６月を参照されたい。例えば、Ｌａｌｅｎｔｉ（Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ、３巻：４号、２８７〜２８９頁、１９９４年）は、ポリ−Ｌ−リジンまたはポリ−Ｌ−リジン／ＨＡのいずれかを含む食塩水を、オスのウィスターラットの足に注射することによって引き起こされた浮腫を減少させるヒアルロン酸の効果を研究した。
【特許文献１】欧州特許第０９１８５３５号明細書
【特許文献２】国際公開第２００４／０６０３１０号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００４／０６０９２０号パンフレット
【非特許文献１】Ｋｉｍら、Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、１０４巻：３２３〜３３５頁（２００５年）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の要旨
本発明は、ポリカチオン錯化タンパク質結晶およびヒアルロン酸を含む組成物を提供する。本発明の好ましい実施形態によれば、このタンパク質はヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体であり、このポリカチオンはポリアルギニンであり、この組成物は徐放性、長時間作用型の組成物である。本発明による好ましい組成物は、ヒト成長ホルモン欠乏に関連する障害、またはヒト成長ホルモンを用いた治療によって改善する障害を有する被験者を治療する方法に有用である。
【００１２】
本発明は、ポリカチオン錯化タンパク質結晶およびヒアルロン酸を含む組成物を調製する方法を提供する。
【００１３】
当分野の技術者は、本明細書中の開示に鑑みて、本発明の他の目的を理解されよう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明はポリカチオン錯化タンパク質結晶およびヒアルロン酸を含む組成物を対象とする。本発明の組成物にヒアルロン酸を使用すると、有利には、ポリカチオン錯化ｈＧＨ結晶などのポリカチオン錯化タンパク質結晶の投与が引き起こす可能性のある局所的な注射部位反応が減少または防止される。
【００１５】
より詳細には、理論によって拘束されることはないが、負に帯電したヒアルロン酸はタンパク質結晶と錯体を形成したポリカチオンの過剰正電荷を減少させるように作用し、この結晶と治療を受ける被験者の皮膚の外面および内面のタンパク質結晶との親和性を改善すると考えられる。医薬品に使用するために結晶の過剰電荷を中和することが、ヒアルロン酸の第１の使用目的であると考えられる。
【００１６】
（定義）
本明細書で使用される「ポリカチオン」とは、適切なｐＨ環境下で正味の正電荷を有する高分子鎖を指す。ポリカチオンの例としては、それだけに限らないが、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、ポリリシン、ポリリシン−グラフト−イミダゾール酢酸、プロタミン、ヒストン、ミエリン塩基性タンパク質、硫酸ポリミキシンＢ、ブラジキニン、スペルミン、プトレシン、ポリアリルアミン、直鎖ポリ（エチレンイミン）、分枝ポリ（エチレンイミン）、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリオルニチン、キトサン、上記の変性誘導体、およびこれらの混合物が挙げられる。本発明の好ましい実施形態では、ポリカチオンはポリアルギニンである。
【００１７】
「共結晶化」とは、２つの異なる物質が同一の結晶格子内に結晶化することとして定義される。例えば、一価カチオン、二価カチオンまたはポリカチオンは、負に帯電した側鎖を有するタンパク質と同一の結晶格子内に結晶化することができる。
【００１８】
「錯体形成」または「錯体」とは、２つの構成要素間の相互作用を指すと同時にこうした相互作用を可能にするプロセスを指す。例えば、錯体形成は、タンパク質残基の負に帯電した側鎖と、一価カチオン、二価カチオンまたはポリカチオンの正に帯電した基との静電的相互作用である可能性がある。本発明の好ましい実施形態では、錯体形成は、タンパク質結晶の表面に見られる負に帯電したアミノ酸側鎖と、ポリカチオンの正に帯電した基との静電的相互作用を指す（すなわち、ポリカチオンは静電的相互作用によってタンパク質結晶に吸着されている）。
【００１９】
本発明による「ポリカチオン錯化タンパク質結晶」（例えばポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶）という用語には、（１）一価または二価カチオンなどのカチオンと共にまたはこれらのカチオンなしで調製され、ポリカチオンと錯体を形成したタンパク質結晶、および（２）一価または二価カチオンなどのカチオンと共にまたはこれらのカチオンなしでポリカチオンと共結晶化したタンパク質が含まれる。
【００２０】
本発明の組成物に有用な「タンパク質」結晶は、一般に正味負の表面を担持している。負電荷を担持しているタンパク質の例としては、それだけに限らないが、ヒト成長ホルモン（「ｈＧＨ」）、エリトロポイエチン（「ＥＰＯ」）、エタネルセプト（エンブレル）、インシュリン、顆粒細胞コロニー刺激因子（「ＧＭＣＳＦ」）、ＴＮＦ−α、フィブロレーズ、ＩＬ−１Ｐ、組み換え組織プラスミノーゲン活性化因子、オルソクローンＯＫＴ３、要因ＶＩＩＩ、牛のソマトトロピンおよびインターロイキン２が挙げられる。本発明の組成物に有用なタンパク質結晶は、帯電したアミノ酸側鎖、グリコシル化、または分子の他の化学的変化もしくは遺伝的変化により、あるいはｐＨまたはイオン強度などの錯体形成条件の調節により、正味負の表面電荷を担持することができる。
【００２１】
タンパク質「結晶」とは、三次元結晶格子を有する物質の固体状態の１つの形であり、無定形または半結晶状態とは異なるものである。結晶は、格子構造、特徴的な形状、および複屈折などの光学的性質を含めた独特の特徴を示す。タンパク質が結晶状態にあるかどうかの判定は、当技術分野で既知の任意の方法、例えば、Ｘ線回折、粉末Ｘ線回折、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって行うことができる。
【００２２】
本明細書中で使用される「ヒアルロン酸」（「ＨＡ」）は、当技術分野において「ヒアルロン」または”「ヒアルロナン」としても知られており、ヒアルロン酸およびその塩、例えば「ヒアルロン酸ナトリウム」が含まれる。ＨＡは、通常の手法で測定したとき、好ましくは５０ｋＤ〜３，０００ｋＤ、より好ましくは１，０００ｋＤ〜２，５００ｋＤ、さらに好ましくは１，４００ｋＤ〜１，８００ｋＤの分子量を有する。本発明の好ましい実施形態によれば、このＨＡをヒトまたは動物源から精製することはない。この好ましいＨＡは、所望のＨＡを生成する細胞を使用して、組み換えＤＮＡ技術、または通常の発酵および精製技術によって生成することができる。
【００２３】
「賦形剤」または「担体」としては、アミノ酸、アルコール、炭水化物、タンパク質、脂質、界面活性剤、ポリマー、ポリアミノ酸、緩衝物質、塩または電解質、およびこれらの混合物が挙げられる。完全なリストではないが、賦形剤または担体としては、以下のものが挙げられる：１）グリシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アスパラギン、グルタミンおよびプラリネなどのアミノ酸、ならびにポリアルギニン、ポリリシンなどのポリアミノ酸；２）炭水化物、例えばグルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、アラビノース、キシロース、リボースなどの単糖類；３）ラクトース、トレハロース、マルトース、スクロースなどの二糖類；４）マルトデキストリン、デキストラン、デンプン、グリコーゲンおよびヒアルロン酸などの多糖類；５）マンニトール、キシリトール、ラクチトール、ソルビトールなどのアルジトール；６）グルクロン酸、ガラクツロン酸；７）メチルシクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなどのシクロデキストリン；８）塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、ナトリウムおよびカリウムのリン酸塩、ホウ酸、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、亜鉛塩、コロイダルシリカ、マグネシウムおよび三ケイ酸塩などの無機分子；９）酢酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸、乳酸塩などの有機分子；１０）アカシア、ジエタノールアミン、モノステアリン酸グリセリン、レシチン、モノエタノールアミン、オレイン酸、オレイルアルコール、ポロクサマー、ポリソルベート、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノステアレートおよび他のソルビタン誘導体、ポリオキシル誘導体、ワックス、ポリオキシエチレン誘導体、ソルビタン誘導体などの乳化または可溶化／安定化剤；ならびに１１）寒天、アルギン酸およびその塩、グアーゴム、ペクチン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、セルロースおよびその誘導体、炭酸プロピレン、ポリエチレングリコール、ヘキシレングリコール、チロキサポールなどの粘度上昇剤。こうした化合物の塩も使用することができる。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態では、賦形剤は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ポリエチレングリコール、酢酸ナトリウム、ポリアルギニン、ヒアルロン酸およびこれらの混合物からなる群から選択される。
【００２５】
「成長ホルモン」（「ＧＨ」）とは、自然界において哺乳動物の脳下垂体によって分泌される成長ホルモンを指す。完全なリストではないが、こうした哺乳動物の例としては、ヒト、サル、ウシ、ウマおよびブタを含む。本発明の好ましい実施形態では、この哺乳動物はヒトである。本明細書で使用されるＧＨは、任意の通常の方法で製造することができる。組み換えによって製造することが好ましい。
【００２６】
ヒト成長ホルモン（「ｈＧＨ」）とは、天然ヒト成長ホルモンのアミノ酸配列、構造および機能的な特徴を有するタンパク質を意味する。本明細書で使用されるヒト成長ホルモンには、さらに、天然ヒト成長ホルモンの任意のアイソフォームも含まれ、これには、分子量５、１７、２０、２２、２４、３６、および４５ｋＤａを有するアイソフォームが含まれるが、これらに限定されない［Ｈａｒｏら、Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ、７２０巻、３９〜４７頁（１９９８年）］。したがって、ｈＧＨという用語には、天然ｈＧＨ（ソマトトロピン）の１９１個のアミノ酸配列、およびＮ末端メチオニン（Ｍｅｔ−ｈＧＨ）およびソマトレムを含む１９２個のアミノ酸配列が含まれる［米国特許第４，３４２，８３２号および第５，６３３，３５２号］。本発明の好ましい実施形態によれば、このｈＧＨ（または任意のＧＨ）をヒトまたは動物源から精製することはない。ただし、このｈＧＨは、培養でトランスフェクトされた細胞から得ることができる。このｈＧＨ（あるいは任意のＧＨ）は、組み換えＤＮＡ技術によって、通常のペプチド合成技術によって、またはこれらの組み合わせによって生成することができる。組み換えＤＮＡ技術によって生成した場合、ｈＧＨは、遺伝子組み換え型ヒト成長ホルモン（「ｒｈＧＨ」）と呼ばれる。Ｍｅｔ−ｈＧＨは、通常、組み換えＤＮＡの方法によって調製される。ｈＧＨの異なるＤＮＡ配列をコード化する遺伝子の例としてはｈＧＨ−ＮおよびｈＧＨ−Ｖが挙げられる［Ｈａｒｏら、Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ、７２０巻、３９〜４７頁（１９９８年）；Ｂｅｎｎａｎｉ−Ｂａｉｔｉら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２９巻、６４７〜６５２頁（１９９５年）］．ｈＧＨタンパク質鎖は、ＧＨ中に、モノマー、ダイマーおよび高次構造として存在することができる。
【００２７】
「ヒト成長ホルモン誘導体」とは、天然のヒト成長ホルモンのアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するタンパク質を指す。「相当する」という用語は、ｈＧＨの１９１のアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を指す。本発明の様々な実施形態では、ヒト成長ホルモン誘導体には、ｈＧＨまたはＭｅｔ−ｈＧＨの置換、欠失および挿入変異体、脱アミド化、リン酸化、糖鎖形成、アセチル化、凝集および酵素劈開反応を含めた翻訳後変性ｈＧＨおよびＭｅｔ−ｈＧＨタンパク質［Ｈａｒｐら、Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ、７２０巻、３９〜４７頁（１９９８年）］、化学変性ｈＧＨまたはＭｅｔ−ｈＧＨタンパク質、ポリペプチド類似体、ならびにｈＧＨまたはＭｅｔ−ｈＧＨのアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有する化学合成ペプチドが含まれる。
【００２８】
可溶状態のｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー高性能液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）および疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を含めた様々な方法によって研究することができる［Ｗｕら、Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、５００巻、５９５〜６０６頁（１９９０年）；「Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｄｒｕｇｓ」、ＦＤＡ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、（１９８２年）］。一方、結晶状態のｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体は、光学顕微鏡検査、Ｘ線回折またはＴＥＭによって研究することができる。一般に、結晶化の条件により、タンパク質結晶の形状、すなわち球体、針状、桿状、板状（六角形および正方形）、菱形、立方体、両錐体および角柱からなる群から選択される形状が決まる。
【００２９】
「ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体のカチオン結晶」とは、一価または二価カチオンの存在下で結晶化したヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体を指す。「カチオン」という用語は、正に帯電した原子または原子団を指す。
【００３０】
「原子価」という用語は、他の元素と結合する元素の能力として定義される。これは、原子の最外殻の電子の数によって規定され、その原子と結合（または置換）することができる水素（または他の標準的な一価元素）の原子の数として表される［Ｗｅｂｓｔｅｒ’ｓ  Ｎｅｗ  Ｗｏｒｌｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｌｉｎｄｌｅｙ，  Ｄ．およびＭｏｏｒｅ  Ｔ．Ｈ．編集、Ｍａｃｍｉｌｌａｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９８年］。「一価カチオン」という用語は、一価の原子価状態を有する正電荷を担持するイオンを指し、性質は有機でも無機でもよい。一価の無機カチオンの例としては、アンモニウム（ＮＨ４＋）および周期表のＩ族元素（Ｈ＋、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋およびＦｒ＋）が挙げられる。
【００３１】
有機一価カチオンの例としては、それだけに限らないが、第四アンモニウムカチオンが挙げられる。第四アンモニウムカチオンは、構造式ＮＲ４＋（ただし、Ｒはアルキル基である）を有する正に帯電した多原子イオンである。
【００３２】
「治療上有効な量」とは、治療中の病気または疾患の１つまたは複数の症状の治療、防止、重症度の低下、発症の遅延、または発生の減少に十分な組成物の量を指す。
【００３３】
「調合すること」または「調合物」とは、２つ以上の成分を合わせることを指す。例えば、本発明のタンパク質結晶を調合することは、温度、ｐＨおよびイオン強度などの適切な条件下で、１種もしくは複数種の溶液を１種もしくは複数種の懸濁液と混合すること、ある懸濁液を１種もしくは複数種の他の懸濁液と混合すること、あるいは１種もしくは複数種の固相成分を１種もしくは複数種の溶液または１種もしくは複数種の懸濁液と混合することを含む。
【００３４】
本発明による「徐放性組成物」という用語は、医薬品が徐放性組成物の一部としてではなく投与された場合の持続時間より長い持続時間、その医薬品が哺乳動物において活性である組成物のことである。
【００３５】
本発明による「活性」という用語は、生物系（例えば動物または人体）に対する医薬品の効果のことである。活性は、生物学的活性、薬力学的効果または効能であってもよい。例えば、本発明のｈＧＨの活性は、組成物が哺乳動物に投与された後の様々な時点で、血清ＧＨ濃度に起因する血清インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）レベルの上昇、あるいは体重増加または脛骨（骨）成長の量によって測定することができる。
本発明による組成物
本発明によれば、ポリカチオン錯化タンパク質結晶およびヒアルロン酸を含む組成物は安定かつ長時間作用型であり、これを投与した被験者の注射部位の局所的な反応を低下させた点で有利である。
【００３６】
本発明によれば、ポリカチオン錯化タンパク質結晶は、一価または二価カチオンと共に調製されたか、またはこれらを使用しないで調製されたかによらず、ポリカチオンと錯体を形成したタンパク質結晶である。あるいは、ポリカチオン錯化タンパク質結晶は、一価または二価カチオンと共にまたはこれらなしでポリカチオンと共結晶化したタンパク質である。
【００３７】
本発明の組成物は、賦形剤、好ましくは薬理的に許容される賦形剤を含むことができる。本発明の組成物は、注射に適した任意の形、好ましくは懸濁液の形をとすることができる。より好ましくは、この組成物は、２７以上のゲージ、または３０以上のゲージを有する針を使用した注射に適した形である。
【００３８】
本発明の組成物中に存在するタンパク質結晶とポリカチオンのモル比は、好ましくは約１：２５０〜約１００：１、より好ましくは約１：２５０〜約１：２０、約１：２０〜約１０：１、または約１０：１〜約１００：１である。より好ましい実施形態では、タンパク質結晶とポリカチオンのモル比は約３：１〜１０：１である。さらに好ましい実施形態では、ポリカチオンはポリアルギニンである。
【００３９】
ポリカチオン錯化ｈＧＨ結晶およびヒアルロン酸を含む組成物は、ｈＧＨ濃度が約０．１ｍｇ／ｍＬより高いことを特徴とする。例えば、ｈＧＨ濃度は、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬとすることができる。あるいは、この組成物は、ｈＧＨ濃度が約１０ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、または約５０ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬであることを特徴とすることができる。
【００４０】
ポリカチオンがポリアルギニンである場合、ポリアルギニン濃度は、ｈＧＨ：ポリアルギニン比（ｗ／ｗ）をほぼ５：１に維持するのに十分であり、かつ約５ｎｇ／ｍＬという低いｈＧＨ溶解度および放出を維持するのに十分であるように調節できることが好ましい。ポリカチオンがプロタミンである場合、プロタミン濃度は、ｈＧＨ：プロタミン比（ｗ／ｗ）をほぼ３：１に維持するのに十分であり、かつ約５ｎｇ／ｍＬという低いｈＧＨ溶解度および放出を維持するのに十分であるように調節できることが好ましい。本発明の組成物中に存在するＨＡの最終濃度は、結局はタンパク質結晶の表面に錯化したポリカチオンの過剰正電荷に左右される。これはまた、この組成物に含まれたタンパク質結晶およびポリカチオンの量に左右される。本発明の最終調合物中に存在するＨＡの量は、好ましくは約０．０１％〜約０．５％（ｗ／ｖ）、特に好ましくは約０．０５％〜約０．２％（ｗ／ｖ）である。
【００４１】
ポリカチオン錯化ｈＧＨ結晶およびヒアルロン酸を含む組成物はさらに下記の構成要素を含むことができる：マンニトール−約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ；酢酸ナトリウム−約５ｍＭ〜約５００ｍＭ（好ましくは約２５ｍＭ〜約１５０ｍＭ）；Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−約５ｍＭ〜約１００ｍＭ；ｐＨ約６．０〜約９．０（好ましくは、約６．５〜約８．５）；ＰＥＧ（ＭＷ８００〜８，０００、好ましくは３，３５０、４，０００、６，０００または８，０００）−約５０％（ｗ／ｖ）以下。
【００４２】
あるいは、こうした組成物は任意選択で次のものを含むことができる：スクロース−約１００ｍｇ／ｍＬ以下；アミノ酸（例えばアルギニンおよびグリシン）−約５０ｍｇ／ｍＬ以下；防腐剤（抗菌剤、フェノール、メタクレゾール、ベンジルアルコール、パラ安息香酸エステル（パラベン））−約５％以下（好ましくは約０．９％以下）；およびポリソルベート−約１０ｍｇ／ｍＬ以下。
【００４３】
本発明の好ましい実施形態は、ポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶およびヒアルロン酸の注射可能な組成物を構成する。本組成物は、約１ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬの範囲、好ましくは約２５ｍｇ／ｍＬのｈＧＨ結晶と、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの範囲、好ましくは約５ｍｇ／ｍＬのポリアルギニンと、調合媒体とを含む。この調合媒体は、（１）ｐＨ約６〜約９の範囲、好ましくは約７．５で、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、好ましくは２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌと、（２）約１０ｍＭ〜約５００ｍＭのＮａＯＡｃ、好ましくは１００ｍＭのＮａＯＡｃと、（３）約１％〜約５０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ−６０００、好ましくは約５％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ−６０００と、（４）約０．０１％〜約０．５％（ｗ／ｖ）のヒアルロン酸、好ましくは約０．２％（ｗ／ｖ）のヒアルロン酸とを含む。
【００４４】
本発明の別の好ましい実施形態では、ポリアルギニン−ｈＧＨ共結晶が使用される。本共結晶の調合組成物は、約１ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬの範囲、好ましくは約２５ｍｇ／ｍＬのｈＧＨと、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの範囲、好ましくは約５ｍｇ／ｍＬのポリアルギニンと、調合媒体とを含むポリアルギニン−ｈＧＨ共結晶を含む。
【００４５】
好ましい実施形態では、ｈＧＨ結晶およびヒアルロン酸を含む組成物の調合媒体は、ｐＨ７．５で、酢酸ナトリウム約１００ｍＭ、ＰＥＧ−６０００約５％（ｗ／ｖ）、およびＴｒｉｓ−ＨＣｌ約２５ｍＭを含み、かつＨＡ０．２％（ｗ／ｖ）を含む。こうした媒体を使用して調製されたｈＧＨ組成物は、結晶性ｈＧＨ約２５ｍｇ／ｍＬ、およびポリアルギニン約５ｍｇ／ｍＬ（またはプロタミン約８．３ｍｇ／ｍＬ）を含むことができる。
【００４６】
当分野の技術者が理解するように、本発明による組成物のｈＧＨ濃度を約１ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬとすることができるならば、ポリアルギニン（またはプロタミン）濃度は、本発明のより好ましい実施形態においては、ｈＧＨ：ポリアルギニン比（ｗ／ｗ）をほぼ５：１に、またはｈＧＨ：プロタミン比（ｗ／ｗ）をほぼ３：１に維持するのに十分であり、かつ約５ｎｇ／ｍＬという低いｈＧＨ溶解度および放出を維持するのに十分であるように調節することが望ましい。例えば、上記の調合物については、所望のｈＧＨ結晶濃度が約２０ｍｇ／ｍＬの場合、ポリアルギニン濃度は約４ｍｇ／ｍＬ（またはプロタミン濃度は約６．７ｍｇ／ｍＬ）となる筈である。
【００４７】
週１回の注射として投与される本発明のｈＧＨ含有組成物は、哺乳動物において、毎日注射される可溶性ｈＧＨの相対的生物学的利用能と同等の相対的生物学的利用能を示す。本発明の組成物に含まれるｈＧＨは、同一経路（例えば皮下または筋肉内注射）で送達されたとき、可溶性ｈＧＨの相対的生物学的利用能と比べて少なくとも１０％以上高い相対的生物学的利用能を有する。ただし、上記の生物学的利用能は、上記の可溶性ｈＧＨおよび上記の結晶錯体の生体内血清ｈＧＨ濃度の合計の曲線下面積（ＡＵＣ）で測定する。したがって、こうしたｈＧＨ結晶錯体は、有利な生体内放出プロフィルを特徴とする。
本発明による組成物の製造方法
ポリカチオン錯化タンパク質結晶の具体的な調製方法は、本明細書の実施例１〜４ならびにＰＣＴ特許出願ＷＯ２００４／０６０３１０およびＷＯ２００４／０６０９２０に記載されている。これらは、参照としてその全体が本明細書に組み込まれる。
【００４８】
本発明の一実施形態は、ポリカチオン、好ましくはポリアルギニンと錯体を形成したｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の一価または二価カチオン結晶に関する。本実施形態によれば、ｈＧＨの結晶化は、一般に、ｈＧＨの緩衝溶液を調製し、この溶液を精製および／または脱塩し、透析し、濃縮し、この溶液にカチオンを加えることにより行われる。好ましい実施形態では、カチオンは一価である。より好ましい実施形態では、この一価カチオンは、リチウム、ナトリウム、カリウムおよびアンモニウムからなる群から選択される。特に好ましい実施形態では、一価カチオンはナトリウムである。一価カチオンを添加すると、ｈＧＨと結合したまたはこれと共結晶化した一価の有機または無機カチオンが形成される。結晶化用のｈＧＨ出発物質は凍結乾燥または冷凍された液体の状態で市販されており、通常、組み換えＤＮＡの方法によって製造される。
【００４９】
この実施形態では、次いで、上記のｈＧＨの一価または二価カチオン結晶をポリカチオンと錯化または共結晶化する。例えば、ｈＧＨの一価または二価カチオン結晶は、とりわけ、硫酸プロタミンまたはポリアルギニンなどのポリカチオンを含む溶液に、上記の好ましい比または実施例２〜４において例証する比の１つで示すように再懸濁することができる。
【００５０】
好ましい実施形態では、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶は、酢酸ナトリウムで結晶化させ、その後、ポリアルギニンまたは別のポリカチオンと共結晶化または錯化する。通常、ポリアルギニンは、約１，５００〜約９０，０００ダルトンの分子量を有する。好ましくは、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体とポリアルギニンの結晶は、ｈＧＨ：ポリアルギニン比が約５：１〜約４０：１（ｗ／ｗ）で存在する。この比は、約１０：１〜約２０：１（ｗ／ｗ）の範囲とすることもできる。最も好ましくは、この比は、約３：１〜約１２：１（ｗ／ｗ）の範囲である。別の実施形態によれば、この比は約５：１〜約１：５０（ｗ／ｗ）である。別の実施形態では、この比は約１２：１〜約１５：１（ｗ／ｗ）である。さらに別の実施形態では、この比は約５：１（ｗ／ｗ）である。
【００５１】
次いで、このようにして調製されたｈＧＨのポリカチオン結晶をヒアルロン酸と結合させる。溶液からｈＧＨのポリカチオン結晶、例えば上述の結晶を（例えば、遠心分離によって）単離したら、この結晶を、約０．０１％〜約０．５％（ｗ／ｖ）の濃度範囲のＨＡを含む別の溶液に加える。この懸濁液を、約１６〜約３２のゲージサイズを有する針を通し、次いで静電的相互作用が平衡に達するように、温度約２℃〜８℃で０．５時間を超える時間インキュベートする。好ましくは、これらのｈＧＨのポリカチオン結晶を含む懸濁液中のＨＡの最終濃度は、好ましくは約０．０１％〜約０．５％、特に好ましくは約０．０５％〜約０．２％である。
【００５２】
こうした１つの方法は、（ａ）タンパク質結晶を形成するステップと；（ｂ）このタンパク質結晶をポリカチオンと錯化または共結晶化させてポリカチオン錯化タンパク質結晶を形成するステップと；（ｃ）このポリカチオン錯化タンパク質結晶をヒアルロン酸と調合するステップとを含む。別の実施形態では、この方法は、（ａ）このカチオンタンパク質結晶をポリカチオンと錯化してポリカチオン錯化タンパク質結晶を形成するするステップと；（ｂ）このポリカチオン錯化カチオンタンパク質結晶をヒアルロン酸と調合するステップとを含む。さらに別の実施形態では、この方法は、（ａ）タンパク質またはカチオンタンパク質結晶をポリカチオンと共結晶化させて共結晶を形成するステップと；（ｂ）この共結晶をヒアルロン酸と調合するステップを含む。こうした方法の好ましい実施形態では、このタンパク質はｈＧＨであり、ポリカチオンはポリアルギニンまたはプロタミンである。
【００５３】
本発明の方法によれば、ポリカチオン錯化または共結晶化ｈＧＨ結晶へのＨＡの添加により、様々な有利な特徴が得られる。これらの特徴の一部を以下に挙げるが、これがすべてではない：（１）ポリカチオン錯化または共結晶化ｈＧＨ結晶の投与後の哺乳動物の注射部位反応の低下、（２）哺乳動物に投与した後にポリカチオン錯化または共結晶化ｈＧＨ結晶の徐放性プロフィルを維持する能力、（３）非常に細いゲージの針（例えば３０ゲージの針）を通して哺乳動物にポリカチオン錯化または共結晶化ｈＧＨ結晶を注射する能力、および（４）ｈＧＨの結晶度およびポリカチオン錯化または共結晶化ｈＧＨ結晶中の錯体の完全性が所定期間にわたって維持されること。
本発明による組成物の使用
本発明の組成物を使用して被験者を治療する方法は、この治療を必要とする被験者に、ポリカチオン錯化タンパク質結晶およびヒアルロン酸を含む治療上有効な量の組成物を投与するステップを含む。本明細書で使用される用語「被験者」は、ヒトを含めた哺乳動物を含んでいる。好ましい実施形態によれば、本発明の方法は、被験者にポリカチオン錯化ｈＧＨ結晶およびヒアルロン酸を含む治療上有効な量の組成物を投与するステップを含む。
【００５４】
さらに好ましい実施形態によれば、本発明は、タンパク質治療を必要とする被験者の注射部位耐性を改善する方法であって、被験者にポリカチオン錯化タンパク質結晶およびヒアルロン酸を含む組成物を投与するステップを含む方法に関する。さらに好ましい実施形態では、本発明は、ヒト成長ホルモン治療を受けるヒトの注射部位耐性を改善する方法であって、ヒトにポリカチオン錯化タンパク質結晶およびヒアルロン酸を含む治療上有効な量の組成物を投与するステップを含む方法に関する。
【００５５】
本発明によって治療することができるｈＧＨ不足と関係する障害としては、それだけに限らないが、成人の成長ホルモン欠乏症、小児の成長ホルモン欠乏症、プラーダー・ヴィリ症候群、ターナー症候群、短腸症候群、慢性腎不全、特発性の低身長、小人症、下垂体機能低下の小人症、骨再生、女性の不妊症、子宮内発育遅延、ＡＩＤＳ関連の悪液質、クローン病、嚢胞性繊維症、やけど、ならびに他の遺伝および代謝異常が挙げられる。本発明の一実施形態では、障害は小児の成長ホルモン欠乏症であり、治療成績としては、治療を受けている子供の年率換算の発育速度が約７ｃｍ〜約１１ｃｍという成績が得られている。
【００５６】
本発明の組成物は、任意の通常の投与経路、例えば、非経口、経口、肺、鼻、耳、肛門、皮膚、目、静脈内、筋肉内、動脈内、腹腔内、粘膜、舌下、皮下、経皮的、局所的、口腔内、または頭蓋内の経路を含めた経路により投与することができる。
【００５７】
好ましい実施形態では、この組成物は、皮下または筋肉内経路によって投与される。
【００５８】
さらに好ましい実施形態では、本発明の組成物は、２７以上のゲージを有する針を使用して皮下経路によって投与される。好ましくは、針ゲージは３０より大きいものである。この組成物は、事前充填した注射器または可変用量輸液ポンプから投与することができる。
【００５９】
本発明は、有利には、本発明のポリカチオン錯化タンパク質結晶／ヒアルロン酸組成物のタンパク質成分の徐放性を可能にする。本発明の一実施形態では、ポリカチオン錯化タンパク質結晶／ヒアルロン酸は、ｈＧＨ活性の徐放性を提供する。本発明のポリカチオン錯化ｈＧＨ結晶／ヒアルロン酸は、好ましくは少なくとも約２４時間持続したｈＧＨ活性を提供する。より好ましくは、本発明のポリカチオン錯化ｈＧＨ結晶／ヒアルロン酸は、少なくとも約４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間または１４４時間持続したｈＧＨ活性を提供する。さらにより好ましくは、本発明のポリカチオン錯化ｈＧＨ結晶／ヒアルロン酸は、少なくとも約１週間、２週間、３週間または４週間持続したｈＧＨ活性を提供する。
【００６０】
本発明の一実施形態では、徐放性組成物は、ポリカチオン錯化ｈＧＨ結晶およびヒアルロン酸を含む徐放性組成物を含めて、２日に１回投与される。別の実施形態では、本発明による組成物は、３日または４日に１回投与される。さらに別の実施形態では、本発明による組成物は、週に１回投与される。別の実施形態では、本発明による組成物は、２週間毎に１回投与される。さらに別の実施形態では、本発明による組成物は、毎月１回投与される。当分野における技術者は、特定の治療方法が、治療すべき疾患、治療を受ける被験者の年齢および体重、被験者の一般的な健康状態、治療する医師の判断などの要因に左右されることを理解するであろう。
【００６１】
本発明の好ましい実施形態では、様々なｈＧＨ不足、疾患状態または症候群に苦しむ大人または子供は、本発明によるポリカチオン錯化ｈＧＨ結晶およびヒアルロン酸を含む組成物を使用して外因的に送達されるｈＧＨの様々な投与計画によって治療することができる。例えば、内分泌科医は、服用量約０．２ｍｇ／ｋｇ／週を使用して子供の治療を始め、数週間または数か月間の治療後にこの服用量を約０．３ｍｇ／ｋｇ／週に増加させ、思春期頃この服用量をさらに約０．７ｍｇ／ｋｇ／週に増加させることができる。当分野の技術者が理解するように、ｈＧＨ送達を必要とする大人または子供に投与される、こうした外因的に送達されるｈＧＨのレベルは、現時点のｈＧＨの生理的レベルまたは濃度にも左右される。
【００６２】
大人または子供へのｈＧＨの投与計画は、しばしばｍｇ／ｋｇまたは国際単位（ＩＵ／ｋｇ）によって表される。こうした投与計画は、一般に一日または一週間についての計画、すなわちｍｇ／ｋｇ／日またはｍｇ／ｋｇ／週である。用量は、主として成人の成長ホルモン欠乏症においては、固定の用量（すなわち、ｍｇ／日またはｍｇ／週）とすることもできよう。このようなことを考慮して、本発明の一実施形態によれば、ポリカチオン錯化ｈＧＨ結晶およびヒアルロン酸を含む徐放性組成物の単回投与は、例えば、３０ｋｇの子供についてｈＧＨ約９ｍｇの週１回の単回投与を含んでおり、得られる生体内の血清ｈＧＨ濃度は、投与後１日および２日で約１０ｎｇ／ｍＬより高く、投与後３日および４日で約５ｎｇ／ｍＬより高く、投与後５日〜７日で約０．３ｎｇ／ｍＬである。
【００６３】
あるいは、ポリカチオン錯化ｈＧＨ結晶およびヒアルロン酸を含む徐放性組成物の単回投与では、上記の哺乳動物に投与後約０．５時間〜約４０日の間、好ましくは投与後約０．５時間〜約１０日、７日または１日のいずれか１つの間、得られる生体内の血清ｈＧＨ濃度は、ｈＧＨ約０．３ｎｇ／ｍＬ〜約２，５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくはｈＧＨ約０．５ｎｇ／ｍＬ〜約１，０００ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくはｈＧＨ約１ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬである。同様に、ポリカチオン錯化ｈＧＨ結晶およびヒアルロン酸を含む組成物の単回投与では、上記の哺乳動物に投与後約０．５時間〜約４０日の間、好ましくは投与後約１０日、７日または１日のいずれか１つの間、得られる生体内の血清ｈＧＨ濃度は、ｈＧＨ約２ｎｇ／ｍＬより高く、好ましくはｈＧＨ約５ｎｇ／ｍＬより高く、特に好ましくはｈＧＨ約１０ｎｇ／ｍＬより高い。本発明のより好ましい実施形態においては、ポリカチオン錯化ｈＧＨ結晶およびヒアルロン酸を含む組成物の単回投与では、哺乳動物に投与後約０．５時間〜約４０日の間、好ましくは投与後約１０日、７日または１日のいずれか１つの期間、得られる生体内の血清ｈＧＨ濃度はｈＧＨ約０．３ｎｇ／ｍＬより高い。
【００６４】
本発明の一実施形態によれば、ポリカチオン錯化ｈＧＨ結晶およびヒアルロン酸を含む組成物の週１回の単回投与では、得られる生体内の血清ｈＧＨ濃度は、投与後１日および２日でｈＧＨ約１０ｎｇ／ｍＬより高く、投与後３日および４日でｈＧＨ約５ｎｇ／ｍＬより高く、投与後５日〜７日でｈＧＨ約０．３ｎｇ／ｍＬより高い。さらに別の実施形態においては、ポリカチオン錯化ｈＧＨ結晶およびヒアルロン酸を含む組成物の単回投与では、投与後約０．５時間〜約１０日の間、生体内の血清ｈＧＨ濃度はｈＧＨ約０．３ｎｇ／ｍＬより高い。
【００６５】
本発明によれば、単回投与は、本発明の組成物、例えばポリカチオン錯化ｈＧＨ結晶およびヒアルロン酸を含む組成物約０．０１ｍｇ／ｋｇ／週〜約１００ｍｇ／ｋｇ／週として定義される。ただし、投与量は０．１ｍＬ〜約１．５ｍＬである。例えば、小児の成長ホルモン欠乏症には、ポリカチオン錯化ｈＧＨ結晶およびヒアルロン酸を含む組成物を約０．３ｍｇ／ｋｇ／週（例えば、３０ｋｇの子供ではｈＧＨ約９ｍｇ）投与することができる。ターナー症候群には、ポリカチオン錯化ｈＧＨ結晶およびヒアルロン酸を含む組成物を約０．３７５ｍｇ／ｋｇ／週（例えば、３０ｋｇの子供ではｈＧＨ約１１ｍｇ）投与することができる。さらに、成人の成長ホルモン欠乏症には、ポリカチオン錯化ｈＧＨ結晶およびヒアルロン酸を含む組成物を約０．２ｍｇ／ｋｇ／週（例えば、８０ｋｇの大人では約１６ｍｇ）投与することができる。ＡＩＤＳ消耗病には、６ｍｇ／日（例えば４２ｍｇ／週）のポリカチオン錯化ｈＧＨ結晶およびヒアルロン酸を含む組成物を投与することができる。
【００６６】
本発明をよりよく理解してもらうために、以下の実施例を記載する。これらの実施例は例証のみを目的とするものであり、いかなる方法でも本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。
【実施例】
【００６７】
本明細書で例証するように、ヒアルロン酸は、ウサギの急性耐性モデルにおける、ポリアルギニン錯化ｈＧＨの注射部位耐性および安全性プロフィルを改善する。ヒアルロン酸ポリアルギニン錯化物を使用した生体内の結果は、注射部位反応の著しい減少を実証した。
【００６８】
ポリカチオン錯化ｈＧＨの高い表面電荷が被験者に注射部位反応を引き起こす可能性があるので、正に帯電したポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶の表面に結合させるために、負に帯電した小さな分子グリセロリン酸（ＧＰ）を使用した比較試験を行った。驚いたことに、ＨＡ−ポリアルギニン錯化ｈＧＨ生成物は、ＧＰ−錯化相当物より高い注射部位耐性にもたらした。これにより、ポリカチオン錯化タンパク質結晶で治療した被験者の注射部位耐性の向上にヒアルロン酸が有用であるのは、ヒアルロン酸の電荷だけではなく、その生物学的適合性および高分子性、あるいはこれらの組み合わせであることが実証された。
【００６９】
（実施例１）
酢酸ナトリウムを用いたｈＧＨの結晶化
解凍したｒｈＧＨ供給溶液約３．３ｍＬ（ｒｈＧＨ１０〜２０ｍｇ／ｍＬ、リン酸緩衝液で供給）を、１ＯＤＧ脱塩カラム（ＢｉｏＲａｄ）を使用して精製し、濃縮器（ＭＷＣＯ１０，０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮した。２８０ｎｍの吸光度／０．７５（ｈＧＨ１ｍｇ／ｍＬの吸光度単位Ａ２８０＝０．７５）によって測定されたｈＧＨの濃度は２５ｍｇ／ｍＬの範囲にあった。脱イオン水を加え、かつＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、ＰＥＧ−６０００および酢酸Ｎａを、合わせた溶液中の最終濃度がそれぞれ１００ｍＭ、６％（ｗ／ｖ）および５００ｍＭとなるように加え、最終タンパク濃度を１５ｍｇ／ｍＬとして結晶を成長させた。次いで、この溶液を静かにかき混ぜ、３３℃で１２〜１６時間インキュベートした。長さ２〜２５μｍの針状または棒状の結晶が得られた。この結晶は、３３℃〜１５℃の温度でも形成できるが、結晶化時間を長くする必要がある。
【００７０】
（実施例２）
ナトリウムｈＧＨ結晶とカチオン性高分子添加剤との錯体形成
結晶化収率を測定した後（実施例１参照）、ナトリウムｒｈＧＨ結晶の最終濃度が２１ｍｇ／ｍＬになるように、ナトリウムｒｈＧＨ結晶を母液（ＮａＯＡｃ２５０ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）１００ｍＭ、ＰＥＧ−６０００  ６％、および硫酸プロタミン７ｍｇ／ｍＬまたはポリアルギニン４．２ｍｇ／ｍＬ）に再懸濁した。タンパク質と添加剤との比は、ｒｈＧＨと硫酸プロタミンについては約３：１（ｍｇ：ｍｇ）であり、ｒｈＧＨとポリアルギニンについては約５：１（ｍｇ：ｍｇ）であった。これらの比をモル比で計算すると、ｒｈＧＨ：プロタミンでは約１：１．７、ｒｈＧＨ：ポリアルギニンでは約１：０．６である。上記のｒｈＧＨペレットは、ＮａＯＡｃ１００ｍＭ、ＰＥＧ−６０００  ５％（ｗ／ｖ）およびＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）２５ｍＭを含み４℃で保存されたアイソトニック母液（イオン性高分子添加剤なし）に均一に再懸濁した。
【００７１】
ｒｈＧＨを同じく２１ｍｇ／ｍＬに再懸濁しながら、母液の添加濃度（ｍｇ／ｍＬ）を変えることにより、その他のｒｈＧＨ：イオン性高分子添加剤比を得ることができる。例えば、母液中の硫酸プロタミン（１０．５ｍｇ／ｍＬ）濃度を高くして、再懸濁液時のｒｈＧＨ：添加剤比を２：１とすることができる。
【００７２】
（実施例３）
酢酸ナトリウムおよび硫酸プロタミンを用いたｈＧＨの共結晶化
解凍したｒｈＧＨ供給溶液約３．３ｍＬ（ｒｈＧＨ１０〜２０ｍｇ／ｍＬ、リン酸緩衝液で供給）を、１ＯＤＧ脱塩カラム（ＢｉｏＲａｄ）を使用して精製し、濃縮器（ＭＷＣＯ１０，０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮した。２８０ｎｍの吸光度／０．７５（ｈＧＨ１ｍｇ／ｍＬの吸光度単位Ａ２８０＝０．７５）によって測定されたｈＧＨの濃度は２５ｍｇ／ｍＬの範囲にあった。脱イオン水を加え、かつＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、ＰＥＧ−４０００、プロラミン硫酸塩および酢酸Ｎａを、合わせた溶液中の最終濃度がそれぞれ１００ｍＭ、６％（ｗ／ｖ）、２ｍｇ／ｍＬおよび５００ｍＭとなるように加え、最終タンパク質濃度を１６ｍｇ／ｍＬとして結晶を成長させた。次いで、この溶液を静かにかき混ぜ、３３℃で１２〜１６時間インキュベートした。長さが約２〜２５μｍの針状結晶が得られた。
【００７３】
（実施例４）
酢酸ナトリウムおよびポリアルギニンＨＣｌを用いたｈＧＨの共結晶化
解凍したｒｈＧＨ供給溶液約３．３ｍＬ（ｒｈＧＨ１０〜２０ｍｇ／ｍＬ、リン酸緩衝液で供給）を、１ＯＤＧ脱塩カラム（ＢｉｏＲａｄ）を使用して精製し、濃縮器（ＭＷＣＯ１０，０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮した。２８０ｎｍの吸光度／０．７５（ｈＧＨ１ｍｇ／ｍＬの吸光度単位Ａ２８０＝０．７５）によって測定されたｈＧＨの濃度は２５ｍｇ／ｍＬの範囲にあった。脱イオン水を加え、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、ＰＥＧ−４０００、ポリアルギニンＨＣｌおよび酢酸Ｎａを、合わせた溶液中の最終濃度がそれぞれ１００ｍＭ、２％（ｖ／ｖ）、２ｍｇ／ｍＬおよび５００ｍＭとなるように加え、最終タンパク質濃度を１６ｍｇ／ｍＬとして結晶を成長させた。次いで、この溶液を静かにかき混ぜ、３３℃で１２〜１６時間インキュベートした。  長さが約２〜２５μｍの針状結晶が得られた。
【００７４】
（実施例５）
ＨＡ−ポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶の調製
ヒアルロン酸ナトリウムは、Ｎｏｖａｍａｔｒｉｘ（Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）から入手した。固有粘度データから計算した分子量は１，４００，０００〜１，８００，０００ｇ／モルの範囲であった。メーカーの製品仕様書によれば、この塩は、ストレプトコッカスズーエピデミクスから発酵され、採取されて、非常に高い純度に精製されたものである。その結果、この市販のヒアルロン酸塩は、投与に先立ってアレルゲンのテストを行う必要がなく直接生体内で使用することができる。
【００７５】
ＨＡポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶を調製するために、適当量のヒアルロン酸ナトリウムを水（ＷＦＩ）に混ぜ、ヒアルロン酸の０．５％（ｗ／ｖ）保存水溶液を得た。容器を激しく振り混ぜ、回転ラック上に４〜６時間置いて、均質の混合物を得た。次いで、この溶液を０．２μｍの膜を通して濾過した。使用に先立って、この溶液を５℃で保管した。
【００７６】
ポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶は、Ｂｅｃｋｍａｎ遠心分離機ＧＳ６Ｒまたはベンチトップ遠心分離機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機、モデル５４１５Ｄ相当）を使用して、４℃で１０分間、３５００ｒｐｍで遠心分離機にかけ、母液から結晶を分離した。この結晶ペレットは、２５ｍｇ／ｍＬの最終ｒｈＧＨ濃度が得られるように、Ｔｒｉｓ２５ｍＭ、ＮａＯＡｃ１００ｍＭ、ＰＥＧ−６０００  ５％（ｗ／ｖ）、ＨＡ０．０１〜０．３％（ｗ／ｖ）および水（ＷＦＩ）からなる最終調合媒体（ＦＶ）に再懸濁した。次いで、この懸濁液を２０Ｇの針を通して塊を壊し均一な懸濁液を得た。引き続き、この懸濁液を２〜８℃で一晩インキュベートした。次いで、ＨＡ−ポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶をバイアルに入れるか、または冷却条件下で保管した。
【００７７】
（実施例６）
β−グリセロリン酸（「ＧＰ」）−ポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶の調製
ＧＰポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶を調製するために、適当量のｐ−グリセロリン酸二ナトリウム塩ペンタハイドレード（ＭＷ３０６、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓカタログ番号１９５２０６）を水（ＷＦＩ）に混ぜ、ＧＰの２０％（ｗ／ｖ）保存水溶液を得た。溶解後、この混合物を０．２μｍの膜を通して濾過し、５℃で保管した。
【００７８】
ポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶は、Ｂｅｃｋｍａｎ遠心分離機ＧＳ６Ｒまたはベンチトップ遠心分離機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機、モデル５４１５Ｄ相当）を使用して、４℃で１０分間、３５００ｒｐｍで遠心分離機にかけ、母液から結晶を分離した。この結晶ペレットは、２５ｍｇ／ｍＬの最終ｒｈＧＨ濃度が得られるように、Ｔｒｉｓ２５ｍＭ、ＮａＯＡｃ１００ｍＭ、ＰＥＧ−６０００  ５％（ｗ／ｖ）、ＧＰ１０％（ｗ／ｖ）および水（ＷＦＩ）からなる最終調合媒体に再懸濁した。次いで、この懸濁液を２０Ｇの針を通して塊を壊し均一な懸濁液を得た。引き続き、この懸濁液を２〜８℃で一晩インキュベートした。次いで、ＧＰ−ポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶をバイアルに入れるか、または冷却条件下で保管した。
【００７９】
（実施例７）
ポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶に対するＨＡの効果
溶解プロフィルおよび表面電荷
溶解率および表面電荷を３種の試料で検討した：（１）対照としてのポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶、（２）ＨＡ−ポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶（ＨＡ０．０１％を使用した錯体形成）、および（３）ＨＡ−ポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶（ＨＡ０．１％を使用した錯体形成）。ＨＡ−ポリアルギニン錯化ｈＧＨ試料は、残った非錯化ＨＡを遠心分離で除去した後試験した。次いで、結晶は、実施例５に記載した、ＨＡを含んでいない元の調合媒体（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２５ｍＭ、ＮａＯＡｃ１００ｍＭ、ＰＥＧ−６０００  ５％（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．５）に再懸濁した。
【００８０】
溶解率は、サイズ排除高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で測定した。例えば、ポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶およびＨＡ−ポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶は、懸濁液中の結晶の最終濃度が２ｍｇ／ｍＬになるように、２５ｍＭのクエン酸Ｎａ（ｐＨ２．５）、２５ｍＭのクエン酸Ｎａ（ｐＨ５．０）、または２５ｍＭのクエン酸Ｎａ（ｐＨ７．０）に再懸濁した。次いで、この懸濁液を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒを使用して、１０００ｒｐｍの一定撹拌下、３７℃で１５分間インキュベートした。インキュベーションの後、懸濁液全体のアリコットを採取し、酸性にしたｄＨ２Ｏ（ｐＨ２．６）で１：１に希釈した。次いで、残りの試料を遠心分離してペレットを採取し、懸濁液全体から取った同一量を、得られた上澄み液から取り出し、酸性にした水（ｐＨ２．６）で１：１に希釈した。次いで、各試料５マイクロリットル（ｌ）をＨＰＬＣに注入した。溶解量は、上澄み試料から得られたｈＧＨピーク面積の積分値を全懸濁液試料中のｈＧＨ面積で除算することにより求めた。積分にはすべての分解ピークが含まれていた。
【００８１】
粒子表面電荷は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ−Ｚ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．，ＵＫ）を使用して測定した。ゼータ電位変換標準を使用してこの計器（Ｍａｌｖｅｒｎカタログ＃ＤＴＳ１０５０）を較正した。各試料について、１２ｐＬの結晶アリコット（濃度１０〜３０ｍｇ／ｍＬ）を５８８ｐＬのランニングバッファー（Ｔｒｉｓ２０ｍＭ、ｐＨ７．５）に加えた。その後、室温で３回の測定を行った。
【００８２】
溶解および表面電荷の実験結果は表１に報告した。これらのデータは、ｐＨ２．５およびｐＨ７．０においては、ＨＡポリアルギニン錯化ｈＧＨ試料の溶解割合がポリアルギニン錯化ｈＧＨの対照の溶解割合に類似していることを示した。しかし、ＨＡ−ポリアルギニン錯化ｈＧＨ試料は、対照と比較した場合ＨＡ−錯化試料が低い溶解割合を示した点で、ｐＨ５．０においてはポリアルギニン錯化ｈＧＨ対照と異なっていた。ゼータ電位の結果は、ＨＡ０．０１％の錯体形成によってポリアルギニン錯化ｈＧＨの表面電荷のわずかな減少を示したが、一方、ＨＡ０．１％が結晶表面と錯形成した場合は、ポリアルギニン錯化ｈＧＨ表面の電荷は著しく減少した。
【００８３】
【表１】
2009521486.tif 000003
【００８４】
その他の濃度のＨＡを使用してポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶を調合し、溶解および表面電荷を試験した。結果を表２に示した。ｐＨ５．０において、溶解したポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶の量は、ＨＡ濃度の上昇と共に減少した。さらに、ゼータ電位の結果はこの傾向と相互に関連していた。つまり、ＨＡの添加量が増加するにつれて、このＨＡ濃度範囲内の結晶粒子の表面電荷は減少した。
【００８５】
【表２】
2009521486.tif 000004
【００８６】
（実施例８）
動物注射時のポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶へのＨＡ錯体形成の効果
ポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶を、実施例５に記載のプロトコルに従ってＨＡ０．２％と錯体形成させた。この錯体について、実施例７に示した溶解率および表面電荷を試験した。生体外の溶解データによれば、これら特定のＨＡ−ポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶から、ｐＨ５．０において（その程度は小さいがｐＨ７．０においても）、ポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶の溶解性が低下することが分かった。ゼータ電位データから、ＨＡ０．２％−ポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶試料の表面電荷は、ポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶対照試料よりも低いことが分かった。
【００８７】
ウサギ（オスのニュージーランドホワイト、群当たり８匹および１６匹、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ）の背中（胸〜腰部）の毛を剃り、２５ｍｇ／ｍＬの以下の試料のうちの１つを３０Ｇの針で１ｍＬ皮下注射した：
（ａ）媒体対照（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２５ｍＭ、ｐＨ７．５、ＮａＯＡｃ１００ｍＭ、ＰＥＧ−６０００  ５％（ｗ／ｖ））；
（ｂ）ポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２５ｍＭ、ｐＨ７．５、ＮａＯＡｃ１００ｍＭ、ＰＥＧ−６０００  ５％（ｗ／ｖ）、およびポリアルギニン５ｍｇと錯体を形成した２５ｍｇ／ｍＬの結晶化ｒｈＧＨ）；ならびに
（ｃ）０．２％ＨＡポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２５ｍＭ、ｐＨ７．５、ＮａＯＡｃ１００ｍＭ、ＰＥＧ−６０００  ５％（ｗ／ｖ）、ヒアルロン酸０．２％（ｗ／ｖ）、およびポリアルギニン５ｍｇと錯体を形成した２５ｍｇ／ｍＬの結晶化ｒｈＧＨ）。次いで、注射部位の腫れおよび／または赤みの有無を、１〜４のスケールで７日間にわたって検査した。この注射部位は、潰瘍形成、引掻き、および出血の有無も検査した。しかし、これらの症状はどれも観察されなかった。
【００８８】
表３および表４、ならびに図１に示したように、注射部位反応を示す動物の割合は、ポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶の対照群と比較して、ＨＡ−ポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶群では著しく低かった。例えば、２４時間の時間ポイントでは、ＨＡ０．２％−ポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶群で注射部位が腫れたウサギの割合は１２．５％であり、これに対して、ポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶群は４３．８％であり、媒体対照群は１２．５％であった。この観察期間中、時間と共に腫れまたは赤みを示す動物の割合の低下は、ＨＡ０．２％−ポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶群の方がポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶群より速かった。例えば、注射後９６時間（すなわち４日）で、ＨＡ０．２％−ポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶群は腫れまたは赤みの症状を示さなかったが、ポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶群は注射部位反応を示し続けた。上記の観察は、腫れおよび赤みの発生、ならびに腫れおよび赤みが低下する速度の両方について、ＨＡ調合物の注射部位耐性が改善されていることを示す。
【００８９】
【表３】
2009521486.tif 000005
【００９０】
１反応は、腫れまたは赤みのいずれかあるいは両方があった動物の％として定義される。
【００９１】
【表４】
2009521486.tif 000006
【００９２】
２ポリアルギニンを含有せず。
【００９３】
（実施例９）
ＨＡ−ポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶の薬物動態
ヨークシャーランドレースブタ（Ｍｉｄｗｅｓｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、群当たりブタ５匹、オス）を使用した薬物動態（ＰＫ）研究を行った。一定用量のＨＡ０．２％−ポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶およびポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶を、首の後部への皮下注射によって投与した。注射後の各時間ポイントにおいて、前大静脈から血液サンプルを採取し、そのｈＧＨ濃度を試験した。
【００９４】
具体的には、各群（各々ｎ＝５）は、０．３ｍｇ／ｋｇで１回量のＨＡ０．２％−ポリアルギニン錯化ｈＧＨまたはポリアルギニン錯化ｈＧＨの結晶性調合物のいずれかの投与を受けた。図２に示すように、ＨＡ０．２％−ポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶群およびポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶群は、同様のＰＫプロフィル（血清ＧＨレベル対時間）を示した。また、ｈＧＨ放出の長さは両方の群でほぼ同じであった。血清ＧＨレベル対時間と矛盾しない同様の薬力学の結果が、ＨＡ−ポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶およびポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶について、血清ＩＧＦ−１レベル対時間（データは図示せず）で観察された。
【００９５】
（実施例１０）
ＧＰ−ポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶の効果
実施例６に示したように、ポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶をＧＰ１０％と錯体形成した。実施例７に示したように、この錯体の溶解率および表面電荷を試験した。表５に示したように、ＧＰ−ポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶は５．４５ｍＶの低いゼータ電位を達成した。また、生体外の溶解プロフィルはＧＰ錯体形成によって著しく影響を受けることはなかった。
【００９６】
【表５】
2009521486.tif 000007
【００９７】
実施例８に記載のウサギ研究を行った。表６および表７、ならびに図３に示したように、ＧＰ−ポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶のゼータ電位の絶対値はＨＡ０．２％−ポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶より低かったにもかかわらず、注射部位のＧＰ−ポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶に対する耐性は、ＨＡ０．２％−ポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶ほど著しく改善されていなかった。この結果により、ＨＡが注射部位反応を大幅に低下させる能力は単に電荷中和の結果だけではないことが分かった。実際、これはＨＡのユニークな特性のためでもあろう。このように、ポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶にＨＡを含有させることにより、ｈＧＨ放出プロフィルを変化させることなく安全性プロフィルが向上する。
【００９８】
【表６】
2009521486.tif 000008
【００９９】
【表７】
2009521486.tif 000009
【０１００】
３ポリアルギニンなし。
【０１０１】
（実施例１１）
下垂体が切除されたウィスターラットに投与されたＨＡ−ポリアルギニン錯化ｈＧＨの効能
下垂体が切除されたオスのウィスターラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、群当たりラット９匹、オス）における効能研究を行った。一定用量のＨＡ０．２％−ポリアルギニン錯化ｈＧＨまたはポリアルギニン錯化ｈＧＨを、脊柱のいずれかの側の胸腰部に皮下注射によって投与した。被験物質（ＨＡ０．２％−ポリアルギニン錯化ｈＧＨ、およびポリアルギニン錯化ｈＧＨ）を、０．３ｍＬの注射器（ＢＤ部品番号３２０４３８）に取り付けた３０ゲージ、８ｍｍの針を使用して投与した。これは、ＨＡを添加しても、細い注射針を通してポリアルギニン錯化ｈＧＨを投与する容易さは影響されないことを示している。
【０１０２】
具体的には、各群（各ｎ＝９）は、５．６ｍｇ／ｋｇ（０．５６ｍｇ／体重約０．１ｋｇの動物）で、１回量のＨＡ０．２％−ポリアルギニン錯化ｈＧＨまたはポリアルギニン錯化ｈＧＨの結晶性ｈＧＨ調合物のいずれかの投与を受けた。対照群（ｎ＝９）は、７日間毎日、結晶性ｈＧＨ調合物の週１回の用量（５．６ｍｇ／ｋｇ）に等しい量の可溶性ｈＧＨ（Ｎｕｔｒｏｐｉｎ  ＡＱ）の投与を受けた。体重は、投与開始前は毎週測定し、−７日目（投与７日前）から１５日目の観察期間終了までは毎日測定した。試験したすべてのラットについて、１日目（被験薬注射の第１日）の平均重量は約１００ｇである。
【０１０３】
ＨＡ０．２％−ポリアルギニン錯化ｈＧＨ群およびポリアルギニン錯化ｈＧＨ群は、８日目（１週間の成長）に同じような成長を示した：体重は、ＨＡ０．２％−ポリアルギニン錯化ｈＧＨの１１５±６ｇに対してポリアルギニン錯化ｈＧＨは１１４±１０ｇであった。さらに、週１回の用量５．６ｍｇ／ｋｇに等しくなるように毎日投与した成長ホルモン（Ｎｕｔｒｏｐｉｎ  ＡＱ）も同じような成長（１１８±５ｇ）をもたらした。この結果は、本発明のＨＡ０．２％−ポリアルギニン錯化ｈＧＨの週１回の注射が、ポリアルギニン錯化ｈＧＨ結晶の週１回の注射、または可溶性成長ホルモンの毎日のｈＧＨ注射と同じような成長効能を有していることを示した。
【０１０４】
（実施例１２）
ＨＡ−ポリアルギニン錯化ｈＧＨの完全性および効能
実施例５と同様にして、ＨＡ０．２％−ポリアルギニン錯化ｈＧＨの試料を調製した。調製した後、試料は、冷却（２〜８℃）条件で長期間（例えば約４か月以上）保管した。保管後、試料は、実施例１１と同様に、その成長効能を試験した。この効能テストにより、この保管されたＨＡ０．２％−ポリアルギニン錯化ｈＧＨ試料が、８日目（１週間の成長）に、調製したばかりのＨＡ０．２％−ポリアルギニン錯化ｈＧＨと同様の成長をもたらしたことが分かった：体重は１１３±７ｇに対して１１５±６ｇであった。このデータにより、ＨＡ−ポリアルギニン錯化ｈＧＨは、保管中に結晶性または錯体の完全性を失わなかったことが分かった。したがって、本発明の組成物は、ポリアルギニン錯化ｈＧＨの完全性および効能を維持していた。また、この発明で製造されたヒアルロン酸は、製造工程中、長期保管中、または使用中、ｈＧＨ結晶のポリアルギニン錯体形成を妨害しなかった。
【０１０５】
上述の発明を、理解の明瞭さを目的として例証および実施例を用いてある程度詳細に記述したが、当分野の技術者には、本発明の教示に鑑みて、添付の実施形態を含めた本明細書の開示の精神または範囲から逸脱せずにこれに一定の変更および修正を行うことができることが明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】図１は、媒体対照またはポリアルギニン錯化ｈＧＨまたはＨＡポリアルギニン錯化ｈＧＨを投与した後の注射部位反応を示した全被験動物の割合を経時的に示した図である。実施例８を参照されたい。
【図２】図２は、ポリアルギニン錯化ｈＧＨまたはＨＡポリアルギニン錯化ｈＧＨの投与後、１群当たり５匹の被験動物中に存在するｈＧＨ（ｎｇ／ｍＬ）の平均値（平均±標準誤差）を経時的に示した図である。実施例９を参照されたい。
【図３】図３は、媒体対照またはポリアルギニン錯化ｈＧＨまたはβ−グリセロリン酸−ポリアルギニン錯化ｈＧＨを投与した後の注射部位反応を示した全被験動物の割合を経時的に示した図である。実施例１０を参照されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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