(57)【要約】フィブリノゲン融合タンパク質、フィブリノゲン融合タンパク質の作製方法、およびフィブリノゲン融合タンパク質の使用方法が記載される。好ましい実施形態では、このフィブリノゲン融合タンパク質は、フィブリノゲンの切断されたＡα鎖を含む。このＡα鎖は切断部位を含み、これは、そのＣ末端領域におけるアミノ酸の欠失である。非フィブリノゲンタンパク質または非フィブリノゲンペプチドは、この切断部位に対してＣ末端側に付着される。これらのフィブリノゲン融合タンパク質は、単独で、または天然フィブリノゲンと混合して、フィブリノゲンポリマーを形成するために用いられ得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
切断されたフィブリノゲンＡα鎖をコードする核酸であって、該フィブリノゲンＡα鎖は、そのカルボキシ末端に、アミノ酸残基１７９に対してＣ末端側の切断部位を含む、核酸。
【請求項２】
前記Ａα鎖が、そのカルボキシ末端に、アミノ酸残基１８４に対してＣ末端側の切断部位を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記Ａα鎖が、そのカルボキシ末端に、アミノ酸残基１８９に対してＣ末端側の切断部位を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
非フィブリノゲンペプチドをコードする核酸が、前記切断部位に対してＣ末端側に連結している、請求項１に記載の核酸。
【請求項５】
前記ペプチドがタンパク質またはタンパク質のドメインである、請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
前記タンパク質が、接着タンパク質、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、抗接着タンパク質、免疫刺激タンパク質、免疫調節タンパク質、タンパク質結合タンパク質、核酸結合タンパク質、ヘパリン結合タンパク質、ウイルス結合タンパク質、細胞傷害性タンパク質、酵素活性のあるタンパク質、およびプロテアーゼ阻害剤からなる群より選択される、請求項５に記載の核酸。
【請求項７】
前記フィブリノゲンがヒトのフィブリノゲンである、請求項１に記載の核酸。
【請求項８】
前記フィブリノゲンが、機能にも構造にも実質的に影響を及ぼさない保存的な置換、付加または欠失を含む、請求項７に記載の核酸。
【請求項９】
請求項２、３、４、５、６、７または８のいずれか１項に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれかにより定義されたとおりの切断されたフィブリノゲンＡα鎖をコードする核酸を発現させる工程を包含する、フィブリノゲン融合タンパク質を作製する方法。
【請求項１１】
ｃ）請求項１〜８のいずれかに定義されたとおりの前記フィブリノゲンＡα鎖の切断部位の中に挿入された前記非フィブリノゲンペプチド、フィブリノゲンＢβ鎖、およびフィブリノゲンγ鎖をコードする発現ベクターで宿主細胞をトランスフェクトする工程であって、該宿主細胞が該Ａα融合鎖、該Ｂβ鎖、および該γ鎖を発現する、工程；ならびに
ｄ）該フィブリノゲン融合タンパク質を単離する工程
をさらに包含する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記フィブリノゲン融合タンパク質、前記Ｂβ鎖、および前記γ鎖が２つもしくはそれより多くの別々のベクター上にある、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ベクターが宿主細胞中に共トランスフェクトされる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜８または１１のいずれかに記載された核酸から発現される、フィブリノゲン融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、Ｊｅｆｆｒｅｙ  Ａ．  ＨｕｂｂｅｌｌおよびＴｈｏｍａｓ  Ａ．  Ｂａｒｋｅｒによって２００５年７月２９日に米国特許商標庁に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．  ６０／７０４，０７５の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本出願は、フィブリノゲンの改変体、およびタンパク質もしくはペプチドをドラッグデリバリーのためにもしくは組織工学において使用可能なフィブリンポリマー中に組み込むためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
フィブリノゲンは、進化的に高度に保存されており、止血（血管系への損傷後の適切な血流を制御して維持する身体能力）にとって重要な血餅を形成する血中フィブリン源として作用する可溶性血清タンパク質である。広範囲に研究されたヒトのフィブリノゲンは３４０，０００ダルトンのタンパク質であり、（Ａα）２ポリペプチド鎖、（Ｂβ）２ポリペプチド鎖およびγ２ポリペプチド鎖と名付けられた３対の関連するポリペプチド鎖を含む複雑なオリゴマー構造を持つ。化学的な構造解析および電子顕微鏡分析により、そのタンパク質が３節（ｔｒｉｎｏｄｕｌａｒ）構造を持つことが証明された。特に、２つのＡαサブユニット、２つのＢβサブユニットおよび２つのγサブユニットは、逆平行構造に配向する。６つの鎖のアミノ末端部分は中心の「Ｅ」ドメインにおいて一緒に束ねられている。２つのコイルドコイル鎖は、Ｅドメインの両脇から２つの末端の節「Ｄ」ドメインに向けて外側に広がる。これらのコイルドコイル領域は１１０アミノ酸長であり、そして３つ全ての鎖から構成される。Ｄドメインは２つの高親和性Ｃａ２＋結合部位を含み、そしてフィブリン重合においてＥドメインと密接な関係にある。広範囲のジスルフィド架橋が２つのサブユニットを共有結合により架橋し、そして球状ドメインを安定化する。Ａα鎖のカルボキシ末端部分は、Ｄドメインを超えたところで可撓性の延長部分を形成する。Ｄドメインは第ＸＩＩＩａ因子架橋部位を含み、そしてＤドメインは、線維素溶解中の主なプラスミン消化部位である。ヒトフィブリノゲンの個々のポリペプチド鎖はジスルフィド結合により広範囲に連結されて細長い２量体分子を形成する（概説については、例えば、非特許文献１、非特許文献２を参照のこと）。
【０００４】
フィブリンは幾つかの生物医学的応用を持つ天然のゲルである。フィブリンゲルは、多くの組織へと結合するというその能力および創傷治癒におけるその生来の役割から、シーラントとして使用されてきた。いくつかの特定の応用としては、血管移植片の接着、心臓弁の結合、骨折および腱の修復における骨の配置のためのシーラントとしての使用が挙げられる（非特許文献３）。加えて、これらのゲルは、ドラッグデリバリーデバイスとして、およびニューロン再生のために使用されてきた（非特許文献４）。フィブリンは組織再生および細胞の内部増殖（ｉｎｇｒｏｗｔｈ）のための固体支持体を提供するものの、このモノマー中にこれらのプロセスを直接高める活性配列はほとんどない。
【０００５】
フィブリノゲンが重合してフィブリンとなるプロセスもまた特徴付けられている。まず、プロテアーゼが２量体フィブリノゲン分子を２つの対称的な部位において切断する。トロンビン、レプチラーゼ、およびプロテアーゼＩＩＩを含め、フィブリノゲンを分割しうる可能なプロテアーゼはいくつかあり、そして各プロテアーゼはタンパク質を異なる部位において切断する（非特許文献５）。例えば、トロンビンはフィブリノゲンＡｏｃ鎖中のＡｒｇ１６−Ａｒｇ１７結合においておよびフィブリノゲンＢβ鎖上のＡｒｇ１４−Ｇｌｙ１５結合において切断する。一旦フィブリノゲンが切断されると、フィブリノゲンモノマーが一緒になって、非共有結合により架橋されたポリマーゲルを形成する自己重合工程が起こる（非特許文献３）。この自己集合は、プロテアーゼ切断が生じた後に結合部位が露出するので起こる。一旦結合部位が露出すると、分子の中央にあるこれらの結合部位は、フィブリノゲン鎖上の他の部位（ペプチド鎖の末端に存在する）に結合しうる（非特許文献６）。このようにして、ポリマーネットワークが形成される。第ＸＩＩＩａ因子（トロンビンタンパク質分解により第ＸＩＩＩ因子から活性化されるトランスグルタミナーゼ）はさらにポリマーネットワークを共有結合により架橋しうる。他のトランスグルタミナーゼが存在し、そしてこれは、フィブリンネットワークへの共有結合による架橋およびグラフト化にも関係しうる。
【０００６】
架橋されたフィブリンゲルが一旦形成されると、その後の分解はしっかりと制御される。フィブリン分解の制御における重要な分子の一つは２−プラスミンインヒビターである（非特許文献７）。この分子は第ＸＩＩＩａ因子の作用を通してフィブリン鎖に架橋することにより作用する（非特許文献８）。それ自身がゲルに付着することにより、高濃度のインヒビターがゲルに局所化されうる。このインヒビターはその後、フィブリンへのプラスミノゲンの結合を妨げ（非特許文献９）そしてプラスミンを不活性化する（非特許文献７）ことにより作用する。２−プラスミンインヒビターはグルタミン基質を含む。正確な配列がＮＱＥＱＶＳＰＬ（配列番号１）として同定されており、最初のグルタミンは架橋のための活性アミノ酸である。
【０００７】
フィブリンゲル作製のために必要とされる成分は２つの方法で得られうる。一つの方法はフィブリノゲンを血漿から寒冷沈降することであり、ここでは、第ＸＩＩＩ因子がフィブリノゲンと一緒に沈殿する。プロテアーゼは同様の方法を使い血漿から精製される。別の技術は、培養またはトランスジェニック動物のいずれかでこれらのタンパク質の組換え体を作製することである。この技術の利点は、純度がずっと高いこと、およびこれらの成分の各々の濃度を制御しうることである。
【０００８】
フィブリン中に送達されるべきであるかもしくは組み込まれるべき薬物を組み込むための現行の方法としては、フィブリノゲンに対する薬物の架橋、およびフィブリンマトリクス内への物理的な組み込みが挙げられる。後者は、制御が難しいが組み込みおよび放出が可変的であり、そして前者はゲルを形成するフィブリン架橋を妨げうる。
【非特許文献１】Ｈａｗｉｇｅｒ、Ｓｅｍｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ、１９９５年、第３２号、ｐ．９９−１０９
【非特許文献２】Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ、１９９６年、第１０号、ｐ．１４６４−１４７０
【非特許文献３】Ｓｉｅｒｒａ，Ｄ．Ｈ．、「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、１９９３年、第７号、ｐ．３０９−３５２
【非特許文献４】Ｗｉｌｌｉａｍｓら、「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、１９８７年、第２６４号、ｐ．２８４−２９０
【非特許文献５】Ｆｒａｎｃｉｓら、「Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ」、１９９３年、第１９号、ｐ．２９１−３０７
【非特許文献６】Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ、ＮＹ、１９７５年
【非特許文献７】Ａｏｋｉ，Ｎ．、「Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、１９７９年、第２１号、ｐ．２６７−２８６
【非特許文献８】Ｓａｋａｔａら、「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ」、１９８０年、第６５号、ｐ．２９０−２９７
【非特許文献９】Ａｏｋｉら、「Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ」、１９７８年、第３９号、ｐ．２２−３１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
それゆえ、本発明の目的は、フィブリンポリマー内への治療用タンパク質種もしくは治療用ペプチド種の組み込みを高めるための、フィブリノゲン融合タンパク質の作製方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の簡単な要旨）
フィブリノゲン融合タンパク質およびフィブリノゲン融合タンパク質を作製する方法が記載される。フィブリノゲン融合タンパク質は、保護的役割を果たす担体タンパク質と混合されてもよく、もしくは特定の方法で融合タンパク質と相互作用するタンパク質と混合されてもよい（例えば、ＤＮＡはＤＮＡ結合フィブリノゲン融合タンパク質と混合される）。フィブリノゲン融合タンパク質は、フィブリンポリマーを形成するために、単独で使用されてもよく、もしくは天然のフィブリノゲンと混合されてもよい。好ましい実施形態において、フィブリノゲン融合タンパク質は、切断されたフィブリノゲンＡα鎖を含む。Ａα鎖は、通常アミノ酸１から６４４よりなる。このＡα鎖は、そのＣ末端領域におけるアミノ酸の欠失である切断部位を含む。好ましくは、切断されたフィブリノゲンＡα鎖はアミノ酸１〜１８９からなり、より好ましくは切断されたフィブリノゲンＡα鎖はアミノ酸１〜１８４からなり、そして最も好ましくは切断されたフィブリノゲンＡα鎖はアミノ酸１〜１８０からなる。この分子改変がアミノ酸１７９に対してＣ末端側に生じる限り、フィブリノゲンＡα鎖に対して多くの可能な欠失がなされうることを理解するべきである。Ａα鎖のアミノ酸１〜１７９は、成熟したフィブリノゲンおよびフィブリンポリマーを形成するために必要である。
【００１１】
好ましい実施形態においては、非フィブリノゲンタンパク質もしくは非フィブリノゲンペプチドは、切断部位に対してＣ末端側に結合する。組み込まれうる代表的な非フィブリノゲンタンパク質としては、接着タンパク質、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、抗接着タンパク質、免疫刺激タンパク質、免疫調節タンパク質、タンパク質結合タンパク質、核酸結合タンパク質、ヘパリン結合タンパク質、ウイルス結合タンパク質、細胞傷害性タンパク質、酵素活性のあるタンパク質、およびプロテアーゼ阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質のドメインもしくはペプチド部分もまた、フィブリノゲンＡα鎖の切断部位に挿入されうる。
【００１２】
好ましい実施形態においては、改変されたフィブリノゲン融合タンパク質は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、もしくは哺乳類細胞のような宿主細胞に、フィブリノゲンＡα鎖融合タンパク質、フィブリノゲンＢβ鎖、およびフィブリノゲンγ鎖をコードするベクターをトランスフェクトすることにより、もしくは各鎖を別々にコードするベクターを共トランスフェクトすることにより生成される。その後、フィブリノゲン融合タンパク質はこれらの細胞から発現され、そして単離される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．改変されたフィブリノゲン融合タンパク質）
Ａ．切断されたフィブリノゲン
ヘテロ３量体（Ａα鎖、Ｂβ鎖、およびγ鎖）のホモ２量体であるフィブリノゲン、ならびにその天然の構造および機能をＡαの個々の鎖のカルボキシ末端において改変して、切断されたフィブリノゲン融合タンパク質もしくは切断されたフィブリノゲン融合タンパク質を生成しうることがわかっている。Ｂβ鎖およびγ鎖のアミノ末端もカルボキシ末端もいずれも改変されえない。なぜなら、ポリマー形成には、隣接するフィブリンモノマーのＢβ鎖とγ鎖との間の近接した会合、ならびにトロンビン活性化により露出したＡα鎖アミノ末端上およびＢβ鎖アミノ末端上の部位（別名「αノブおよびβノブ」）への直接結合（「ＡホールおよびＢホール」を通して）の両方が必要だからである。フィブリノゲンの構造を図１に図示する。
【００１４】
本明細書で用いられる場合、「フィブリノゲン」とは、（好ましくはヒト由来の）ヘテロ３量体のホモ２量体、ならびに天然の構造にも機能にも影響を与えない保存的な置換、付加および欠失を（カルボキシル領域以外の）その中に含むその改変体をいう。好ましい実施形態においては、フィブリノゲンは、下に述べられるようにカルボキシルドメインにおいて終了する天然のヒトフィブリノゲンである。本発明の範囲内に含まれるものは、このようなフィブリノゲンタンパク質の脱グリコシル化誘導体もしくは非グリコシル化誘導体、ならびに対立遺伝子を含む生物学的に活性なフィブリノゲンのアミノ酸配列改変体、およびフィブリノゲンタンパク質活性を示す、インビトロで作製されたフィブリノゲンタンパク質の共有結合誘導体である。
【００１５】
フィブリノゲンのアミノ酸配列改変体は３つのクラス（置換改変体、挿入改変体もしくは欠失改変体）のうちの１つもしくはそれより多くに分類される。挿入には、アミノ末端および／もしくはカルボキシル末端の融合、ならびに単一アミノ酸残基もしくは複数アミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。フィブリノゲン融合タンパク質としては例えば、成熟したフィブリノゲンと、フィブリノゲンに対して同種のポリペプチド（例えばヒトフィブリノゲンの場合、他のヒト分泌タンパク質からの分泌リーダー）とのハイブリッドが挙げられる。フィブリノゲンとしてはまた、フィブリノゲンと宿主細胞に対して同種であるがフィブリノゲンに対して同種ではないポリペプチドとのハイブリッド、ならびにフィブリノゲンと宿主細胞およびフィブリノゲンの両方に対して異種であるポリペプチドとのハイブリッドが挙げられる。本発明の範囲内における融合物は、原核生物のペプチド、または原核生物、酵母、ウイルスもしくは宿主細胞のシグナル配列のシグナルペプチドのいずれかとのアミノ末端融合物もしくはカルボキシ末端融合物である。
【００１６】
挿入はまた、フィブリノゲンの成熟したコード配列の中にも導入されうる。しかしながら、これらは通常、アミノ末端融合物もしくはカルボキシル末端融合物の挿入よりも小さな挿入であり、およそ１〜４残基である。他に述べないかぎり、本明細書に述べられる代表的なフィブリノゲンのバリエーションは、成熟したフィブリノゲン配列内でのバリエーションであり、これらはプレフィブリノゲン改変体ではない。
【００１７】
フィブリノゲンのアミノ酸配列挿入改変体は、標的フィブリノゲン中のあらかじめ決定された部位に一つもしくはそれより多くのアミノ酸残基が導入されるものである。最も一般的な挿入改変体は、フィブリノゲンのアミノ末端もしくはカルボキシル末端の、異種タンパク質もしくはポリペプチドの融合物である。免疫原性フィブリノゲン誘導体は、標的配列に免疫原性を付与するに十分に大きなポリペプチドをインビトロにおける架橋により融合することによって、もしくは融合物をコードするＤＮＡで形質転換された組換え細胞の培養により作製される。そのような免疫原性ポリペプチドは、ｔｒｐＬＥ、βガラクトシダーゼなどのような細菌のポリペプチドでありうる。
【００１８】
欠失改変体は、フィブリノゲンタンパク質配列からの一つもしくはそれより多くのアミノ酸残基の除去により特徴付けられる。これらの改変体は、通常、フィブリノゲンをコードするＤＮＡ中のヌクレオチドの部位特異的変異誘発を行い、それによって改変体をコードするＤＮＡを生成し、そしてその後に組換え細胞の培養においてＤＮＡを発現することにより調製される。しかし、改変体フィブリノゲンタンパク質の断片はインビトロ合成により便利に調製されうる。改変体はまたフィブリノゲンの特徴を改変するために選択されるが、改変体は代表的に、天然に存在するアナログと同じ性質の生物学的活性を示す。
【００１９】
アミノ酸配列の改変を導入する部位はあらかじめ決定されるが、変異それ自体があらかじめ決定される必要はない。例えば、所定の部位において変異誘発性能を最適化するために、ランダムな変異誘発が標的コドンまたは標的領域において行われ、そして発現されたフィブリノゲン改変体が、所望の活性の最適な組み合わせについてスクリーニングされうる。既知の配列を持つＤＮＡ中のあらかじめ決定された部位において置換変異を作製するための技術は周知であり、例えばＭ１３プライマー変異誘発である。
【００２０】
アミノ酸置換は代表的には１残基のものであり、挿入は通常おおよそ１〜１０アミノ酸残基であり、そして欠失はおおよそ１〜３０残基の範囲に及ぶ。挿入の欠失は好ましくは隣接対で行われる。すなわち、２残基の欠失もしくは２残基の挿入である。置換、欠失、挿入もしくはそれらの任意の組み合わせがあわさって、最終構築物に至りうる。明らかに、改変フィブリノゲンをコードするＤＮＡ中に作製される改変は、リーディングフレームを外して配列を配置してはならず、そして好ましくは、ｍＲＮＡの２次構造を生成しうる相補領域を作らない。
【００２１】
置換改変体は、少なくとも１残基の配列が取り除かれてその場所に異なる残基が挿入されるものである。機能もしくは免疫学的独自性の置換変化は、それほど保存されていない置換を選ぶこと、すなわち（ａ）例えばシート状立体配座もしくはらせん状立体配座のような、置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の大きさ、を維持することに対するそれらの影響がより著しく異なる残基を選ぶことによって作製されうる。フィブリノゲンタンパク質の特性において最大の変化を生成すると一般に期待される置換は、以下の置換である：（ａ）親水性残基（例えば、セリルもしくはトレオニル）が疎水性残基（例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルもしくはアラニル）を置換する（または親水性残基が疎水性残基によって置換される）置換、（ｂ）システインもしくはプラリンが任意の他の残基を置換する（もしくはシステインもしくはプラリンが任意の他の残基によって置換される）置換、（ｃ）電気陽性の側鎖を持つ残基（例えば、リシル、アルギニル、もしくはヒスチジル）が電気陰性の残基（例えば、グルタミルもしくはアスパルチル）を置換する（もしくは電気陽性の側鎖を持つ残基が電気陰性の残基によって置換される）置換、もしくは（ｄ）大きい側鎖を持つ残基（例えばフェニルアラニン）が側鎖を持たない残基（例えばグリシン）を置換する（もしくは大きい側鎖を持つ残基が側鎖を持たない残基により置換される）置換。
【００２２】
置換変異誘発もしくは欠失変異誘発を用いて、（例えば、Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒグリコシル化部位におけるアスパラギニル残基の欠失もしくは置換によって）Ｎ結合型グリコシル化部位もしくはＯ結合型グリコシル化部位を除去しうる。あるいは、非グリコシル化フィブリノゲンは組換え原核細胞の培養において生成されうる。例えば、フィブリノゲンの酸化的安定性の増大もしくは好ましいジスルフィド結合の配置の選択において、システインもしくは他の不安定残基の欠失もしくは置換もまた所望されうる。例えばＡｒｇ  Ａｒｇのような、タンパク質分解の可能性がある部位の欠失もしくは置換は、例えば塩基性残基のうちの１つを欠失させることにより、もしくはこれをグルタミニル残基もしくはヒスチジル残基で置換することにより、達成される。
【００２３】
ＤＮＡ単離物とは、３’隣接領域および／もしくは５’隣接領域を持つかもしくは持たない、化学合成されたＤＮＡ、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡを意味すると理解される。フィブリノゲンをコードするＤＮＡは、ａ）特定の動物のフィブリノゲンｍＲＮＡを含む組織からｃＤＮＡライブラリーを得ることにより、ｂ）相同配列を含むｃＤＮＡライブラリーの中からクローンを検出するために、ヒトフィブリノゲンもしくは（通常、１００ｂｐより大きい）その断片をコードする標識されたＤＮＡを用いたハイブリダイゼーション解析を実施することにより、およびｃ）制限酵素解析および核酸配列決定によりクローンを解析して全長クローンを同定することにより、ヒト以外の他の供給源からも得られうる。
【００２４】
フィブリノゲンＡα鎖のカルボキシ末端は、タンパク質の集合およびフィブリンポリマー形成プロセスの両方において比較的不活性であるので、融合改変についての最良の可能性のある場所を呈示する。フィブリノゲンＡα鎖のカルボキシ末端領域は成熟したタンパク質の生物的集合には必要とされないし、ポリマーの形成にも関係しない。この影響についての証拠は、フィブリノゲンＡαのＣ末端配列が選択して切断されたフィブリノゲンについての重合研究から得られる。この切断された産物は濁度アッセイにおいてポリマーを形成する能力があった。さらに、この切断された産物はトランスグルタミナーゼ第ＸＩＩＩ因子の作用を通して分子間架橋を受ける能力も持っていた。ニワトリ由来の（進化的に高度に保存されたタンパク質である）フィブリノゲンはＡα鎖のＣ末端領域を欠いており（Ｙａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０：１２５１５−１２５２３（２００１））、そして「フィブリノゲンＡα  ２５１」と呼ばれるヒトフィブリノゲンの切断変異体（Ｇｏｒｋｕｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：１５４３４−１５４４１（１９９８））もまたこのドメインのかなりの部分を欠いているが、なお十分に集合されそして活性があるという事実は、この分子のポリマー形成機能に対してほとんど影響を与えずに改変されうる領域がこのポリペプチド鎖に存在することを示している。以下でより詳細に示すように、全長Ａα鎖のカルボキシ末端への単純な付加も、遺伝子操作された切断変異物への融合も両方とも有用である。好ましい実施形態においては、切断変異は、フィブリノゲンの（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓフィブリノゲンＡα鎖のアミノ酸１〜１７９である）いわゆる「コイルドコイル」領域の２次環状ジスルフィド構造を通して延びるＡα鎖アミノ末端ドメインを含むように設計される。分子的改変がアミノ酸１７９に対してＣ末端側に生じる限り、多くの挿入および置換を適合させるためにＡα鎖に対して多くの可能な欠失がなされることを理解するべきである。他種に由来するフィブリノゲンのいわゆる「コイルドコイル」領域の２次環状ジスルフィド構造を通して延びるＡα鎖アミノ末端ドメインを含むアミノ酸は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ配列中のＣｙｓ１７９についての配列アライメントにより決定されうることもまた理解されるべきである。Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓにおいて天然に存在する（この重要な環状ジスルフィド構造を通るＡα鎖配列を含まない）切断変異は、不適切なフィブリン形成もしくはフィブリン形成の欠如により特徴付けられる状態である異常フィブリノゲン血症をもたらすことが証明されている。
【００２５】
好ましい実施形態においては、通常アミノ酸１〜６４４よりなるＡα鎖は、そのＣ末端領域におけるアミノ酸の欠失である切断部位を含む。好ましくは、切断されたフィブリノゲンＡα鎖はアミノ酸１〜１８９からなり、より好ましくは切断されたフィブリノゲンＡα鎖はアミノ酸１〜１８４からなり、そして最も好ましくは切断されたフィブリノゲンＡα鎖はアミノ酸１〜１８０からなる。分子的改変がアミノ酸１７９に対してＣ末端側に生じる限り、フィブリノゲンＡα鎖に対して多くの可能な欠失がなされうることを理解するべきである。Ａα鎖のアミノ酸１〜１７９は、成熟したフィブリノゲンおよびフィブリンポリマーを形成するために必要である。
【００２６】
Ｂ．切断されたフィブリノゲン中に組み込むための生物活性因子
本明細書に述べられる場合、Ｘとは、切断フィブリノゲンＡα鎖に対してＣ末端側に結合されうる生物活性因子を示す。Ｘの選択は所望の応用にある程度依存する。ペプチドＸもしくはタンパク質ドメインＸは、フィブリノゲンＡα鎖のＣ末端において作られた、Ｃ末端切断変異体が作られる空間に挿入される。換言すれば、フィブリノゲンＡα鎖のＣ末端が切断され、そしてタンパク質Ｘもしくはペプチド種ＸがＡα鎖の切断された末端に結合される。フィブリノゲンＡα鎖中に空の空間を残すことは有用でありうるが、より好ましくはその空間は、融合タンパク質として外因性のＸドメインによって埋められる。Ｘの例としては、以下に検討される例が挙げられるがそれらに限定されない。
【００２７】
接着ドメイン：多くの細胞外マトリクス分子およびマトリクス細胞（ｍａｔｒｉｃｅｌｌｕｌａｒ）のものは、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、トロンボスポンジン、Ｌ１、ＳＰＡＲＣファミリーメンバー、エラスチン、オステオポンチン（ｏｓｔｏｐｏｎｔｉｎ）、ＣＣＮファミリー、ＩＣＡＭ、ＣＡＭ、ジストロフィン、ジストログリカン（ｄｙｓｔｒｏｇｌｙａｎ）、プロテオグリカンなどを含め、それらの接着ドメインを通してシグナルを発する。細胞上の細胞接着レセプターに結合するタンパク質ドメインは、しばしば、これらのタンパク質のより小さなドメインに局在しうる。説明に役立つ例は、９番目および１０番目のＩＩＩ型繰り返しドメインが、単独でも同時にでも作動する２つの細胞結合ドメイン、すなわちＲＧＤ部位およびＰＨＳＲＮ（配列番号２）部位を含む、フィブロネクチンである。それゆえ、この場合は、Ｘは、配列ＲＧＤを含む短いペプチド、配列ＰＨＳＲＮ（配列番号２）を含む短いペプチド、もしくは両方でありうる。好ましい実施形態においては、タンパク質ドメイン全体が使用され、進化的に決定された構造の全てがフィブリノゲン改変体内に組み込まれることを可能にする。これらの接着ドメインは、遊走誘導、血管形成、そしてより一般的には形態形成という性質を、Ｘを含むフィブリノゲン融合タンパク質を含んで形成されるフィブリンゲル内に組み込むために有用でありうる。
【００２８】
増殖因子：多くの増殖因子は、血管内皮増殖因子、血小板由来増殖因子、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β、インスリン様増殖因子、副甲状腺ホルモン、アンギオポエチン、トロンボポエチン、結合組織増殖因子、神経成長因子、ニューロトロフィン、上皮成長因子などを含め、細胞表面のレセプターに結合することによりシグナルを発する。上記のリストはフィブリノゲン融合タンパク質として有用な多くの増殖因子の部分的なリストに過ぎない。例えば線維芽細胞増殖因子のような一部の増殖因子はモノマー性であり、そしてこれらは直接、そしてドメインＸとしての複雑さなしで融合タンパク質中に組み込まれうる。血管内皮増殖因子のような他のものは、ダイマー性である。そのような場合、１つのモノマーユニットをドメインＸとして融合タンパク質フィブリノゲン変異体に組み込むことが必要でありうるし、そしてこのモノマーを融合タンパク質中に存在するＸの複製物とダイマー化させるために、モノマーＸを（融合タンパク質内のドメインとしてではなく可溶性タンパク質として）共に発現することが必要でありうる。これは、従って、ＸおよびＸを含む融合タンパク質の両方を同時に、そして連続して発現することを含む。全長増殖因子またはこれらのタンパク質のレセプター結合ドメインのみのどちらでも、融合タンパク質内に組み込まれうる。
【００２９】
サイトカインおよびケモカイン：増殖因子が強力なモルフォゲンであるのと同じように、ケモカインおよびサイトカインは強力な細胞レギュレーターであり、かつモルフォゲンである。モルフォゲンは、組織のうちの制限された部位から生じてその供給源から拡散して濃度勾配を形成するシグナル伝達分子である。これらとしては、インターロイキン、血小板活性化因子、ＣＣＲ分子、ＣＸＣ分子、およびその他多くのファミリーのタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。全長タンパク質またはこれらのタンパク質の結合ドメインのみのどちらでも融合タンパク質に組み込まれうる。
【００３０】
抗接着ドメイン：一部のタンパク質は、細胞接着を誘導するというよりもむしろ細胞接着に抵抗する、細胞接着のネガティブレギュレーターとして機能する。これらの分子としては、トロンボスポンジンのドメイン（例えば、ＳＰＡＣドメイン）が挙げられる。抗接着ドメインは、瘢痕形成の防止において、細胞遊走および細胞浸潤の防止において、有用でありうる。全長タンパク質もしくはこれらのタンパク質の結合ドメインのみのどちらでも、融合タンパク質に組み込まれうる。
【００３１】
免疫刺激ドメインおよび免疫調節ドメイン：一部のタンパク質は、免疫刺激分子および免疫調節分子として作用する。一つの例はフラジェリンであり、そのドメインのうちの１つは、ｔｏｌｌ様受容体ファミリーのメンバーと結合して樹状細胞の成熟を活性化して、より効果的な抗原提示に至りそして免疫応答の成熟に至ることが知られている。この場合、タンパク質フラジェリン全体もしくはフラジェリンドメインのどちらでも、フィブリノゲン融合タンパク質内のドメインとしてのＸとして組み込まれうる。他の目的のタンパク質としては、細菌のコートタンパク質、マンノースレセプターリガンド、およびウイルスのコートタンパク質が挙げられるがそれらに限定されない。
【００３２】
タンパク質結合ドメイン：多くのタンパク質は、他のタンパク質に対する進化した結合ドメインを有する。例えば、トランスフォーミング増殖因子βファミリーのメンバーは、細胞外マトリクスタンパク質（例えば、コラーゲンファミリーのメンバー）に結合する。この場合、このようなコラーゲンドメインは、フィブリノゲン変異体中にドメインＸとして組み込まれうる。あるいは、タンパク質結合ドメインは、組み込みについての計算機方法もしくは組み合わせ方法により、ドメインＸとして同定されうる。タンパク質結合ドメインの具体例としては、細胞外マトリクス分子に結合するタンパク質が再生医学において特に目的とされるものであり、コラーゲンおよびトロンボスポンジンと結合するフィブロックネクチン、およびエラスチンおよびラミニンと結合するニドジェンが挙げられる。全長タンパク質もしくはこれらのタンパク質のドメインのみのどちらでも、融合タンパク質中に組み込まれうる。
【００３３】
核酸結合ドメイン：多くのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよびＲＮＡ結合ドメインを含む。そのようなタンパク質としては、転写因子およびヒストンタンパク質が挙げられる。さらに、ＤＮＡ結合ドメインは、計算機もしくは組み合わせにより同定され得、そしてリジン（ｌｙｉｎｅ）、アルギニン（ａｒｇｉｎｅ）、およびヒスチジンのオリゴマーおよびポリマーもまたＤＮＡと結合する。そのようなドメインは、遺伝子送達、アンチセンスオリゴヌクレオチド送達、およびｓｉ−ＲＮＡ送達においてＤＮＡと結合することを目的として、フィブリノゲン融合タンパク質中にドメインＸとして組み込まれうる。
【００３４】
ヘパリン結合ドメイン：多くのタンパク質は多糖結合ドメイン（例えば、ヘパリン親和性を持つもの、ヘパリン硫酸親和性を持つもの、コンドロイチン硫酸親和性を持つもの、およびデルマタン硫酸親和性を持つもの）を含む。これらのドメインは、多糖の活性な性質のためもしくは他のタンパク質と結合する能力のためのどちらでも、フィブリンマトリクス内に多糖を固定するために有用でありうる。
【００３５】
ウイルス結合ドメイン：一部のタンパク質は、ウイルスのコートタンパク質（例えばコクサッキーアデノウイルスレセプター）と結合する。そのようなウイルス結合ドメインの組み込みは遺伝子デリバリーにおいてウイルスベクターのより良い保持および送達によって達成されうる。
【００３６】
細胞傷害性ドメイン：一部のタンパク質は、細胞表面のレセプターに対してであり、そしてアポトーシスによって細胞死を誘導する。これらのタンパク質としては、ＦＡＳリガンドが挙げられる。このようなドメインの組み込みは、創傷形成、細胞浸潤、および細胞遊走の防止のために達成され得、そして腫瘍の局所的処置において有用でありうる。
【００３７】
酵素的に活性なドメイン：一部のタンパク質（例えば、プロテアーゼおよびトランスグルタミナーゼ）は、酵素活性を有する。これらのタンパク質は、得られるフィブリンゲルに対して、長期間の化学的に反応性の性質（フィブリノゲン融合タンパク質中でＸドメインとしてこのような酵素を含むフィブリンマトリクス内で、プロドラッグを活性薬物へと局所的に変換する能力を含む）を提供するように組み込まれうる。Ｘドメインとして組み込まれたプロテアーゼはフィブリンの分解速度に影響を与え得、トランスグルタミナーゼはこのフィブリンのネットワーク内で他の外因性タンパク質を組み込みうるか、または分解速度にも影響を与えうる。これらのタンパク質の全長タンパク質または結合ドメインのみのどちらでも、融合タンパク質に組み込まれうる。
【００３８】
プロテアーゼインヒビタードメイン：一部のタンパク質はプロテアーゼを阻害し、これらは、例えば、上記生じるフィブリンネットワークまたはこのフィブリンマトリクス内に共に組み込まれた他のマトリクスタンパク質の分解速度に影響を与えるように、フィブリノゲン融合タンパク質内にＸドメインとして組み込まれうる。全長タンパク質またはこれらのタンパク質の結合ドメインのみのどちらでも、融合タンパク質に組み込まれうる。
【００３９】
フィブリノゲン融合タンパク質内の、上記Ａα切断変異体を形成することにより作られる空間内にドメインＸとして組み込まれうるタンパク質の例の上記リストは、単に説明となるリストである。多くの場合、上記全長タンパク質、またはより小さいタンパク質切断物、またはこれらのタンパク質の活性ドメインを表すペプチドドメインですら組み込むことが可能でありうる。
【００４０】
（ＩＩ．改変された切断されたフィブリノゲンの発現）
当業者に周知である標準クローニング技術は、融合タンパク質を生成するために用いられうる。
【００４１】
増幅のためのプライマーおよびハイブリダイゼーションスクリーニングのためのプローブとして使用するためのオリゴヌクレオチドは、任意の公知のＤＮＡ配列に基づいて設計されうる。全長ｃＤＮＡの増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーは、好ましくは、５’端配列および３’端配列に由来する。特定領域の増幅のためのプライマーは、検出可能なサイズの産物を生じるように選択される。
【００４２】
増幅プライマーは、好ましくは、（プライマー二量体の形成を防ぐために）自己相補的な配列も有さないし、３’端で相補的な配列も有さない。好ましくは、プライマーは、約５０％のＧＣ含量を有し、そしてクローニングを容易にするための制限酵素認識部位を含みうる。増幅プライマーは、通常、少なくとも１５塩基であり、そして通常、５０塩基以下であるが、いくつかの状況および条件においては、より短い長さまたはより長い長さが用いられうる。通常、プライマーは、１７〜４０塩基長、１７〜３５塩基長、または２０〜３０塩基長である。これらのプライマーはｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに対してアニーリングされ、十分な増幅サイクル（一般的に、２０〜４０サイクル）が行われて、ゲル電気泳動および染色によるかまたはハイブリダイゼーションにより容易に視覚化される産物を生じる。この増幅された断片は精製され得、ベクターに挿入され得そして増幅され得、単離されそしてＤＮＡ配列解析に供され得、ハイブリダイゼーションなどに供されうる。
【００４３】
フィブリノゲン、変異体、または融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、宿主に適切な発現ベクターに導入される。特定の実施形態において、フィブリノゲンは、融合タンパク質が生成されるようにベクターに挿入される。好ましい合成手段は、上記タンパク質のコード領域または所望の一部分に隣接する１セットのプライマーを用いた、ｃＤＮＡからの遺伝子の増幅である。制限酵素認識部位は、典型的に、このプライマー配列に挿入され、ベクターのクローニング部位に関して選択される。必要である場合、翻訳開始コドンおよび翻訳終止コドンが、このプライマー配列について操作されうる。
【００４４】
最低限、ベクターは、プロモーター配列を含まなければならない。他の調節配列が、含まれうる。このような配列としては、転写終止シグナル配列、分泌シグナル配列、複製起点、選択可能なマーカーなどが挙げられる。これらの調節配列は、転写または翻訳を可能にするように、互いに作動可能に結合している。
【００４５】
フィブリノゲン融合タンパク質の発現のための本明細書中に用いられているプラスミドは、宿主細胞内でのこのタンパク質の発現のために設計されたプロモーターを含む。適切なプロモーターは、広く利用可能であり、当該分野において周知である。誘導可能なプロモーターおよび構成的なプロモーターが好ましい。真核生物細胞内での発現のためのプロモーターとしては、バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のＰ１０遺伝子プロモーターまたは多角体遺伝子プロモーター（例えば、米国特許第５，２４３，０４１号、同第５，２４２，６８７号、同第５，２６６，３１７号、同第４，７４５，０５１号、および同第５，１６９，７８４号を参照のこと）、ＭＭＴＶ  ＬＴＲ、ＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ＲＳＶ  ＬＴＲ、ＳＶ４０、メタロチオネインプロモーター（例えば、米国特許第４，８７０，００９号を参照のこと）および他の誘導可能なプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、このプロモーターは、伸長因子−１  Ａ（ＥＦ１Ａ）プロモーターである。これらのタンパク質の発現に関して、タンパク質は、フィブリノゲン融合タンパク質についてのコード領域と作動可能に連結して挿入される。
【００４６】
他の好ましい実施形態では、このベクターは、転写終結配列を含み、これは、選択されたプロモーターを認識するポリメラーゼによる転写を終結させるシグナルを提供する配列および／またはポリアデニル化のためのシグナル配列のいずれかを有する。
【００４７】
好ましくは、このベクターは、宿主細胞内で複製されうる。従って、宿主細胞が細菌である場合、このベクターは、好ましくは、細菌の複製起点を含む。好ましい細菌の複製起点としては、ｆｌ−ｏｒｉおよびｃｏｌ  Ｅ１複製起点、特にｐＵＣプラスミドから誘導されるｏｒｉが挙げられる。酵母においては、ＡＲＳ配列またはＣＥＮ配列を用いて複製が確実にされうる。哺乳動物細胞においてよく使用される系は、ＳＶ４０  ｏｒｉである。
【００４８】
これらのプラスミドはまた、好ましくは、宿主において機能的な少なくとも１つの選択マーカーを含む。選択マーカー遺伝子としては、形質転換された細胞が同定されて選択的に増殖するのを可能にする表現型を宿主に付与する任意の遺伝子が挙げられる。細菌宿主について適切な選択マーカー遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）、テトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｃｒ）およびカナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）が挙げられる。カナマイシン耐性遺伝子が現在好ましい。真核生物について適切なマーカーは、通常、宿主において相補欠損を必要とする（例えば、ｔｋ宿主におけるチミジンキナーゼ（ｔｋ））。しかし、薬物マーカー（例えば、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性およびハイグロマイシン耐性）もまた利用可能である。
【００４９】
真核生物細胞における発現に関して広範な種々の適切なベクターが利用可能である。このようなベクターとしては以下が挙げられるがこれらに限定されない：ｐＣＭＶＬａｃＩ、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）；ｐＣＤＮＡシリーズ、ｐＲＥＰシリーズ、ｐＥＢＶＨｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）。適切な真核生物細胞としては、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞が挙げられる。
【００５０】
好ましい実施形態では、ｍＲＮＡは、ヒト細胞から単離され、そして逆転写に供されて、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が作製される。ＰＣＲプライマーは、制限酵素部位を含みかつフィブリノゲンｃＤＮＡの５’末端および３’末端へとそれに応じてハイブリダイズするように設計される。当業者によれば、３’ＰＣＲプライマーが、生成される所望の切断されたフィブリノゲン産物に従って変動することが充分に理解される。ＰＣＲ産物は、精製され、制限酵素で消化され、そして発現ベクターへと連結される。好ましくは、切断されたフィブリノゲンをベクターに連結した後、マルチプルクローニング部位（ＭＣＳ）が、切断されたフィブリノゲンの３’末端に配置される。
【００５１】
これらのテンプレートを用いて、フィブリノゲンＡα鎖は、標準的なクローニング技術を用い、その鎖のカルボキシ末端において、タンパク質またはペプチドベースの任意の受容体リガンドおよび／またはタンパク質／ＤＮＡ結合パートナーへと融合されて、ｃＤＮＡ産物が作製され得、このｃＤＮＡ産物は、付加されるｃＤＮＡ配列が、フィブリノゲンＡα鎖をコードする先行配列に関して「インフレーム」であるように、提供されるＭＣＳへと連結されうる。用語「インフレーム」とは、融合タンパク質が適切に翻訳されるようなＤＮＡ翻訳コドンの方向をいう。得られるＡα−Ｘ導入遺伝子の「インフレーム」の性質（ここで、Ｘは、任意のタンパク質／ペプチドモチーフをコードするｃＤＮＡである）は、全長Ａα融合タンパク質産物を作製するための絶対的な必要要件である。フィブリノゲンＢβ鎖をコードするベクター（登録番号ＮＭ＿００５１４１）およびフィブリノゲンγ鎖をコードするベクター（Ｖａｒ  Ａ、ＮＭ＿０００５０９およびＶａｒ  Ｂ、ＮＭ＿０２１８７０）とともに、新たに作製されたベクターは、３つ全てのフィブリノゲン鎖を有する任意の哺乳動物細胞株へと共トランスフェクト（ＤＮＡを細胞へと組み込むプロセス）される。細胞へのＤＮＡのトランスフェクションは、当該分野で周知の方法のうちのいずれかによって達成されうる。細胞は、一過性様式または（ピューロマイシン抗生物質を用いた選択により）安定様式でトランスフェクトされうる。標準的な技術によって、安定なトランスフェクション細胞クローンが確立されうる。フィブリノゲンの分泌されるという性質により、タンパク質産物が細胞培養物の上清中にもたらされる。一過性培養物の充分なトランスフェクションまたは安定な細胞株の増幅後に、培養条件およびバイオリアクターとして選択された細胞株に依存して、充分な量のフィブリノゲンが、タンパク質精製のために生成され得る。
【００５２】
（ＩＩＩ．改変された切断されたフィブリノゲン融合タンパク質産物の精製）
フィブリノゲンＢβ鎖をコードするベクターおよびフィブリノゲンγ鎖をコードするベクターとともに、Ａαタンパク質融合物をコードするベクターは、哺乳動物細胞株へと共トランスフェクトされる。フィブリノゲンの分泌されるという性質により、細胞培養物の上清中にタンパク質産物がもたらされる。一過性培養物のトランスフェクションまたは安定な細胞株の増幅後に、培養条件およびバイオリアクターとして選択された細胞株に依存して、充分な量のフィブリノゲンが、タンパク質精製のために生成され得る。
【００５３】
フィブリノゲン融合タンパク質産物は、沈降またはサイズもしくはアフィニティーカラム精製を含めた多くの確立された手段によって精製され得る。１つの実施形態では、精製は、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）カラムに係留したペプチドＧＰＲＰＡＡからなるペプチドアフィニティー樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって実施される。任意の固体支持体マトリクスが充分であることが当業者によって理解される。フィブリノゲン分子は、生理的条件（好ましい実施形態では、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液）下で、γ鎖のＣ末端領域のドメイン（「Ａ−ホール」と称される）を介して、このペプチド配列へと特定の様式で結合する。フィブリノゲンＡα融合タンパク質は、この精製技術を妨害しない。なぜなら、用いられる活性結合部位が、隣接するポリペプチド鎖に位置するからである。次いで、フィブリノゲン分子は、中程度に酸性の条件（特に、ｐＨ５．３の５０ｍＭ  ＮａＡｃを含む１Ｍ  ＮａＢｒ溶液）においてアフィニティー樹脂から溶出される。溶出後、このフィブリノゲンは、生理学的な塩およびｐＨの値（好ましい実施形態では、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）を用いて、緩衝液へと迅速に再平衡化されなければならない。これらの条件下での精製により、架橋されたポリマーを形成する生来の能力を保持する、高度に精製されたフィブリノゲン溶液が得られる。
【００５４】
（ＩＶ．フィブリノゲンＡα融合タンパク質の処方物およびその使用）
精製されたフィブリノゲンＡα融合タンパク質は、可溶性タンパク質種として、およびアクチベーター（大部分の場合には、タンパク質トロンビン）の添加後のポリマー形態でを含め、使用のためのいくつかの処方を有する。可溶性タンパク質として、フィブリノゲン融合タンパク質は、保護的な役割を果たすキャリアタンパク質または特定の方法でフィブリノゲン融合タンパク質と相互作用するタンパク質と混合されうる。１つの実施形態では、このフィブリノゲン融合タンパク質は活性化されて、フィブリノゲンポリマーを形成する。好ましい実施形態では、フィブリノゲン融合タンパク質は、天然のフィブリノゲンと混合されて、フィブリンポリマーの生成のための混合物を形成する。混合条件が変わりうること、そして混合条件は生成されるフィブリノゲン融合タンパク質の治療用量に依存することが当業者によって理解される。この基本的な処方物に対するさらなる添加物としては、第ＸＩＩＩ因子（または第ＸＩＩＩａ因子）、ｐＨ緩衝剤、抗タンパク質分解剤、および特定の様式でフィブリノゲン融合タンパク質と相互作用する他の化学物質／生化学種（すなわち、ＤＮＡ結合フィブリノゲンＡα融合タンパク質を有するプラスミドＤＮＡ）が挙げられる。
【００５５】
フィブリノゲン融合タンパク質は、治療剤の持続提示のためのフィブリンポリマー中への治療用タンパク質種または治療用ペプチド種の取り込みを増強するために有用である。このような治療タンパク質／ペプチド種としては、受容体リガンド（例えば、増殖因子および細胞接着分子）および可溶性タンパク質結合ドメインまたは可溶性核酸結合ドメインが挙げられるがこれらに限定されない。フィブリンベースの治療剤送達系としてのフィブリノゲン融合タンパク質の使用は、ポリマー形成を可能にするフィブリノゲンの要素と送達可能なタンパク質種とを遺伝子レベルで結合することによって、治療剤組み込み形態を単純化する。この利点は、トロンビン活性化によるフィブリノゲン／フィブリン系の単純な重合を超えるさらなる工程なしで、送達可能なタンパク質種の全てが組み込まれることである。
【００５６】
これらの材料は、治癒および組織再生の促進において、細胞移植のための血管新生床の作製において、ならびに組織工学の他の局面において有用であり得る。
【００５７】
重合後、これらのフィブリノゲン融合タンパク質は、多孔性脈管移植片（例えば、皮膚、骨、神経または他の細胞増殖のための骨格）の形態をとりうる。さらに、この重合されたフィブリノゲン融合タンパク質は、手術用のシーラントまたは接着剤として用いられ得る。
【００５８】
これらのフィブリノゲン融合タンパク質はまた、細胞増殖または組織再生を促進するための方法において用いられ得る。この方法は、フィブリノゲン融合タンパク質のみまたは天然フィブリノゲンとこれらのフィブリノゲン融合タンパク質との混合物から構成されるフィブリンを生成する工程、ならびにこのフィブリンを細胞または組織に曝露して細胞増殖または組織再生を促進する工程を包含する。この方法は、種々の異なる細胞タイプおよび組織タイプとともに用いられ得る。このような細胞タイプとしては、神経細胞、皮膚細胞および骨細胞が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５９】
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに理解される。
【実施例】
【００６０】
（実施例１：フィブリノゲンＡα融合タンパク質産物の作製）
本明細書に記載された２つの塩基挿入物は、１）Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓのフィブリノゲンＡα鎖のＤＮＡの全長配列から固有の停止コドンを除いたもの（ＮＣＢＩ登録番号ＮＭ＿０２１８７１、３１塩基から１９６２塩基まで（アミノ酸１番目から６４４番目まで））、および２）３１塩基から５９７塩基（アミノ酸１番目から１８９番目）までに対応する、フィブリノゲンＡα鎖のモデル切断物である。これらのＤＮＡ配列にすぐ隣接したＥｃｏＲＶ、ＮｏｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＣｌａＩおよびＮｈｅＩからなるマルチプルクローニング部位（ＭＣＳ）を、以下の標準的なクローニング戦略によって構築した。
【００６１】
最初に、ｍＲＮＡをヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）から単離し、そして逆転写に供して相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作製した。上述の塩基挿入物を、両産物についての５’プライマー−ＣＡＧＣＣＡＣＴＡＧＴＴＴＡＧＡＡＡＡＧＡＴＧＴＴＴＴ（配列番号３）ならびに全長産物および切断した産物のそれぞれについての３’プライマー−ＧＧＧＣＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＡＴＣＴＴＡＧＴＣＴＡＧＧＧＧＧＡＣＡ（配列番号４）およびＧＧＧＣＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＡＴＣＡＧＣＴＡＡＡＧＣＣＣＴＡＣＴ（配列番号５）を使い、ＨｅｐＧ２のｃＤＮＡからポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。
【００６２】
得られたＰＣＲ産物を精製し、ＳｐｅＩおよびＸｂａＩ制限酵素で消化し、そしてフィブリノゲン全長および切断物の導入遺伝子を駆動するＥＦ１Ａプロモーターを含み、かつ抗生物質アンピリシンに対する耐性遺伝子および抗生物質ピューロマイシンに対する耐性遺伝子を含む発現ベクターのＳｐｅＩおよびＸｂａＩの部位の中に連結した。ただし、当業者は、発現ベクターの選択は生成される導入遺伝子の産物に対して影響を及ぼさないことを認める。得られた精製されたベクター（それぞれｐＭＹＣ．ＦＧＡｆｕｌｌおよびｐＭＹＣ．ＦＧＡ１０と名付けた）をその後、制限酵素ＥｃｏＲＶで消化し、そして２本鎖オリゴヌクレオチドＡＴＣＴＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＡＡＴＴＣＧＣＡＴＣＡＡＴＣＧＡＴＧＧＣ  ＧＣＴＡＧＣ（５’−３’配列）（配列番号６）をＥｃｏＲＶ部位中に連結して、それぞれ、ベクターｐＭＹＣ．ＦＧＡｆｕｌｌベースおよびｐＭＹＣ．ＦＧＡ１０ベースを得た。得られたベクターは、ｐＭＹＣｐｕｒｏベクター系に関して、記載された「ベース挿入物」に対応する。クローニング戦略の模式図を図３に示す。
【００６３】
上記の鋳型フィブリノゲンＡα鎖ベクター（ｐＭＹＣ．ＦＧＡｆｕｌｌベースおよびｐＭＹＣ．ＦＧＡ１０ベース）を使い、標準的なクローニング技術を用いて、付加されたｃＤＮＡ配列がフィブリノゲンＡα鎖をコードする先行する配列に関して「インフレーム」にあるように、提供されたＭＣＳの中に連結されうるｃＤＮＡ産物を作製することにより、任意のタンパク質またはペプチドに基づく受容体リガンドおよび／もしくはタンパク質／ＤＮＡ結合パートナーを基本のフィブリノゲンＡα鎖に融合しうる。得られたＡα−Ｘの導入遺伝子（Ｘは任意のタンパク質／ペプチドのモチーフをコードするｃＤＮＡである）が「インフレーム」にあるという性質は、全長Ａα結合タンパク質産物を作製するための絶対的な必要要件である。この新規に作製したベクターを、フィブリノゲンＢβ鎖をコードするベクター（登録番号ＮＭ＿００５１４１）ならびにフィブリノゲンγ鎖をコードするベクター（Ｖａｒ  Ａ、ＮＭ＿０００５０９およびＶａｒ  Ｂ、ＮＭ＿０２１８７０）とともに、３つ全てのフィブリノゲン鎖を使って、任意の確立した技術を用いて、ＣＨＯ細胞または任意の哺乳類細胞株中に共トランスフェクトする（ＤＮＡを細胞内に組み込むプロセス）。細胞は、一時的な様式もしくは（ピューロマイシン抗生物質による選択を通して）安定的な様式でトランスフェクトされてもよく、または標準的な技術によって確立された安定な細胞クローンであってもよい。フィブリノゲンを分泌する性質により、細胞培養物の上清中にタンパク質産物が得られる。一時的な培養物の十分なトランスフェクションもしくは安定した細胞株の増幅後、十分な量のフィブリノゲンは、培養条件およびバイオリアクターとして選択した細胞株に依存して、タンパク質精製のために生成されうる。
【００６４】
開示された発明は記載された特定の方法論、プロトコル、そして試薬に限定されるものではなく、これらは変わりうるものと理解される。本明細書で使用した用語は特定の実施形態を記載することのみが目的であり、添付の特許請求の範囲によってのみ制限される本発明の範囲を制限することを意図しないこともまた理解するべきである。当業者は本明細書に記載された本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、あるいは慣用実験にすぎないものを用いて確認できる。そのような均等物は特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１はフィブリノゲンの構造の説明図である（Ｙａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０：１２５１５−１２５２３（２００１））。
【図２】図２は典型的なフィブリノゲン融合タンパク質の説明図である。
【図３】図３は典型的クローニング戦略の模式図である。
【図４】図４はフィブリノゲンＡα融合タンパク質産物を作製するための典型的な方法の模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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