(57)【要約】本発明は、ゲノムに付加された目的のポリペプチドをコードする少なくとも一つの配列を有する組換え体に関する。前記組換えノビラブドウイルスは、組換えタンパク質を生産するため、または魚もしくは高等脊椎動物用のワクチンを生産するために、遺伝子ベクターとして有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）  ノビラブドウイルス遺伝子の転写終結／ポリアデニル化配列を含む領域、
ｂ）  ノビラブドウイルス遺伝子の転写開始配列を含む領域、
ｃ）  目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む領域
を含む組換えＤＮＡ構築物であって、
前記領域ａ）の後または前記領域ｂ）の前にノビラブドウイルスの遺伝子間の非転写ジヌクレオチドがある、組換えＤＮＡ構築物。
【請求項２】
領域ａ）がノビラブドウイルスのＭ遺伝子に由来する転写終結／ポリアデニル化配列を含み、前記領域が、ＶＨＨＡＧＡＹＡＧＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号４）という配列により定義され（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｖ、ＨおよびＹは、ＩＵＰＡＣヌクレオチドコードにおけるそれらの通常の意味を有している）、領域ｂ）がノビラブドウイルスのＧ遺伝子に由来する転写開始領域を含み、前記領域が、ＧＣＡＣＤＷＫＷＧＴＧＹ（配列番号５）という配列により定義される（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、Ｄ、Ｗ、ＫおよびＹは、ＩＵＰＡＣヌクレオチドコードにおけるそれらの通常の意味を有している）、請求項１に記載の組換えＤＮＡ構築物。
【請求項３】
宿主ノビラブドウイルスの第一の内在性ＯＲＦの停止コドンと第二の内在性ＯＲＦの開始コドンとの間に含まれたアンチゲノムｃＤＮＡの一部分の中に挿入された、請求項１または２に記載の一つ以上の組換えＤＮＡ構築物を含むことを特徴とする、ノビラブドウイルスのゲノムのアンチゲノムｃＤＮＡ。
【請求項４】
請求項１に記載の二つの構築物を含む、請求項３に記載のアンチゲノムｃＤＮＡ。
【請求項５】
請求項１に記載の三つの構築物を含む、請求項３に記載のアンチゲノムｃＤＮＡ。
【請求項６】
請求項３または５に記載のアンチゲノムｃＤＮＡに相補的なゲノムＲＮＡを含む組換えノビラブドウイルス。
【請求項７】
請求項５に記載のアンチゲノムｃＤＮＡに相補的なゲノムＲＮＡを含む組換えノビラブドウイルス。
【請求項８】
組換えＩＨＮＶである、請求項６または７に記載の組換えノビラブドウイルス。
【請求項９】
培養中の魚の細胞中で目的のタンパク質を生産するための、請求項６〜８のいずれかに記載の組換えノビラブドウイルスの使用方法。
【請求項１０】
弱毒化生ワクチンとして使用するための、請求項７または８に記載の組換えノビラブドウイルス。
【請求項１１】
トリまたは哺乳動物のワクチン接種のための抗原送達系として使用するための、請求項６〜８のいずれかに記載の組換えノビラブドウイルス。
【請求項１２】
低温の発現系においてインビトロで目的の抗原タンパク質を発現させるための、目的の抗原タンパク質をコードする異種配列を含む組換えＩＨＮＶまたはＶＨＳＶの使用方法。
【請求項１３】
目的の抗原タンパク質をコードする少なくとも一つの異種配列を含む組換えＩＨＮＶまたはＶＨＳＶ、および前記組換えウイルスに感染しやすくかつ低温で成長し得る脊椎動物細胞を含むことを特徴とする、低温のインビトロでの発現系。
【請求項１４】
目的の抗原タンパク質をインビトロで発現させる方法であって、
−  目的の抗原タンパク質をコードする少なくとも一つの異種配列を含む組換えＩＨＮＶまたはＶＨＳＶを用いて、ＩＨＮＶまたはＶＨＳＶに感染しやすくかつ低温で成長し得る脊椎動物細胞を感染させる段階、
−  約１４℃〜約２０℃の温度で前記細胞を培養する段階、
−  前記細胞により生産された目的の抗原タンパク質を回収する段階
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えタンパク質を生産するため、または魚もしくは高等脊椎動物において有用なワクチンを生産するための、遺伝子ベクターとしてのノビラブドウイルスの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ノビラブドウイルスは、ラブドウイルス科のマイナス鎖ＲＮＡウイルスである。
【０００３】
ノビラブドウイルス属は、水生動物、特に魚にとってのさまざまな病原性種を含む。
【０００４】
ノビラブドウイルスゲノムの構造は、哺乳類ラブドウイルスの構造と類似しているが、現在のところ機能が未知のままであるＮＶ（“ｎｏｎ−ｖｉｒｉｏｎ”（「非ビリオン」）の略）タンパク質と呼ばれる非構造タンパク質をコードする付加的な遺伝子が存在するという点でそれと異なっている。
【０００５】
ノビラブドウイルスゲノムは六つの遺伝子を含み、その構成は図式的に
３’−Ｎ−Ｐ−Ｍ−Ｇ−ＮＶ−Ｌ−５’
と表すことができる。
なお式中、ＮはウイルスＲＮＡと会合した核タンパク質をコードする遺伝子を表し、Ｐはウイルスポリメラーゼと会合したリンタンパク質をコードする遺伝子を表し、Ｍはマトリクスタンパク質をコードする遺伝子を表し、Ｇはエンベロープ糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子を表し、ＮＶはＮＶタンパク質をコードする遺伝子を表し、ＬはＲＮＡ依存性ウイルスＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を表す。
【０００６】
これらの遺伝子は、遺伝子間領域により分離されており、当該遺伝子間領域の各々は、遺伝子間の非転写ジヌクレオチドにより分離された、個々のｍＲＮＡへの遺伝子の転写を可能にする、転写終結／ポリアデニル化シグナルおよび転写開始シグナルを含んでいる。
【０００７】
当該属の基準種は、サケ科魚類のいくつかの種、主としてマスの当歳魚における重大な疾病の病原因子である伝染性造血器壊死症ウイルス（ＩＨＮＶ）である。当該属におけるその他の種としては、ヒラメラブドウイルス（ＨＲＶ）、ウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）およびスネークヘッドラブドウイルス（ＳＫＲＶ）が含まれる。ＩＨＮＶの全ゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてＬ４０８８３という登録番号で入手可能であり、ＶＨＳＶの全ゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてＹ１８２６３という登録番号で入手可能であり、ＨＲＶの全ゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてＡＦ１０４９８５という登録番号で入手可能であり、ＳＫＲＶの全ゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてＡＦ１４７４９８という登録番号で入手可能である。
【０００８】
組換えノビラブドウイルスは、アンチゲノム相補ＤＮＡ（アンチゲノムｃＤＮＡ）、すなわちウイルスゲノムのプラスセンスコピーと、Ｎ、ＰおよびＬウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ分子とで宿主細胞を同時トランスフェクションすること（ＢＩＡＣＣＨＥＳＩら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、第７４号、１１２４７〜５３頁、２０００年）によって、逆遺伝学によって得ることができ、そのゲノムを修飾する。
【０００９】
このアプローチは同様に、ノビラブドウイルスゲノムに対する異なる修飾を可能にした。例えば、ＩＨＮウイルスのＮＶ遺伝子を欠失させ外来遺伝子で置換することができることが示されている（上記で引用したＢＩＡＣＣＨＥＳＩら、２０００年；ＴＨＯＵＬＯＵＺＥら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、第７８号、４０９８〜１０７頁、２００４年；ＰＣＴ国際公開第０３／０９７０９０号パンフレット）。同様に、ＩＨＮＶの主要な構造タンパク質（ＭおよびＧ）をＶＨＳＶのもので置換することが可能であることも示されている（ＢＩＡＣＣＨＥＳＩら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、第７６号、２８８１〜９頁、２００２年）。
【００１０】
ノビラブドウイルス内に付加的な遺伝子を挿入することも同様に試みられている（ＢＩＡＣＣＨＥＳＩ、博士論文：“ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ  ＤＥ  ＲＨＡＢＤＯＶＩＲＵＳ  ＡＱＵＡＩＱＵＥＳ  ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴＳ  ＰＡＲ  ＧＥＮＥＴＩＱＵＥ  ＩＮＶＥＲＳＥ”（「逆遺伝学による組換え水性ラブドウイルスの生成」）、パリ第ＸＩ大学オルセー校、２００２年４月５日）。ウイルスのＬポリメラーゼにより認識される転写終結／ポリアデニル化シグナルおよび転写開始シグナルに挟まれた外来遺伝子（ニジマスのＩＬ−１−βをコードする）を含むＤＮＡ構築物が、ＩＨＮＶのＭ遺伝子とＧ遺伝子との間の遺伝子間領域内で、ＩＨＮＶのｃＤＮＡ内に挿入された。より具体的には、この遺伝子は、ＭのＯＲＦの終りとＭ遺伝子の転写終結シグナルとの間にある、自然に存在するＥａｇＩ制限部位の中に導入されたことから、この構築物は、ＩＨＮＶのＭ遺伝子の予測された転写終結／ポリアデニル化部位（ＣＣＡＡＧＡＣＡＧＡＡＡＡＡＡＡ、配列番号２）とそれに続く遺伝子間の非転写ジヌクレオチドＴＧおよび転写開始配列ＧＣＡＣとから成る配列（ＣＣＡＡＧＡＣＡＧＡＡＡＡＡＡＡＴＧＧＣＡＣ、配列番号１）を含み、前記配列の直後には、５’側でＳｐｅＩ制限部位に、かつ３’側でＳｍａＩ制限部位に挟まれた、ＩＬ−１−βのＯＲＦが続いていた。
【００１１】
かくして得られた組換えウイルス（ＩＨＮＶ−ＩＬ−１）は、細胞培養物中で正常に増殖することができ、野生型ＩＨＮＶと同程度の病原性を幼ニジマスにおいて示した。しかしながら、感染した細胞内ではＩＬ−１−βのｍＲＮＡのみが検出され、ＩＬ−１−βタンパク質は検出されなかった。一方、同じ転写開始シグナルおよび同じ転写終結／ポリアデニル化シグナルを伴う緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子を含む類似の組換えＩＨＮＶが、感染細胞内でＧＦＰを発現することができた（ＢＲＥＭＯＮＴ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第２９２号：１１９〜１４１頁、２００５年）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
発明者らは今回、ＢＩＡＣＣＨＥＳＩまたはＢＲＥＭＯＮＴによって開示された転写開始配列ＧＣＡＣが配列ＧＣＡＣＴＴＴＴＧＴＧＣ（配列番号３）により置換された場合に、付加的な遺伝子はその性質とは無関係に、転写されるのみならず翻訳もされ、広範囲の外来タンパク質の発現を可能にするということを発見した。
【００１３】
かくして、本発明は、宿主ノビラブドウイルスのゲノムの遺伝子間領域のうちの少なくとも一つに挿入された一つ以上の付加的な転写単位を有する組換えノビラブドウイルスを提供する。本発明は、同様に、前記組換えノビラブドウイルスの獲得を可能にする組換えＤＮＡ構築物をも提供する。
【００１４】
（本書で「シストロン」とも呼称されている）「転写単位」は、本書では、転写開始シグナルと、それに続く、目的のタンパク質をコードするＯＲＦおよび転写終結／ポリアデニル化シグナルとを含むＤＮＡ構築物として定義づけされる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、
ａ）  ノビラブドウイルス遺伝子の転写終結／ポリアデニル化配列を含む領域、
ｂ）  ノビラブドウイルス遺伝子の転写開始配列を含む領域、
ｃ）  目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む領域
を含む組換えＤＮＡ構築物であって、
前記領域ａ）の後または前記領域ｂ）の前にノビラブドウイルスの遺伝子間の非転写ジヌクレオチドがある、組換えＤＮＡ構築物に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
領域ａ）の終結／ポリアデニル化配列および領域ｂ）の開始配列は、ノビラブドウイルスの一つの同じ遺伝子または二つの異なる遺伝子から誘導され得る。好ましくは、これらは、該構築物を挿入することが意図されているノビラブドウイルスの一つまたは二つの遺伝子から誘導される。
【００１７】
遺伝子間の非転写ジヌクレオチドは、好ましくは、ＴＧおよびＣＧの中から選択される。
【００１８】
好ましくは、本発明の対象は、
ａ）  ノビラブドウイルスのＭ遺伝子に由来する転写終結／ポリアデニル化配列を含み、ＶＨＨＡＧＡＹＡＧＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号４）という配列により定義される（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｖ、ＨおよびＹは、ＩＵＰＡＣヌクレオチドコードにおけるそれらの通常の意味を有している）領域、
ｂ）  ノビラブドウイルスのＧ遺伝子に由来する転写開始配列を含み、ＧＣＡＣＤＷＫＷＧＴＧＹ（配列番号５）という配列により定義される（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、Ｄ、Ｗ、ＫおよびＹは、ＩＵＰＡＣヌクレオチドコードにおけるそれらの通常の意味を有している）領域、
ｃ）  目的のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む領域、
を含む組換えＤＮＡ構築物であって、前記領域ａ）の後および／または前記領域ｂ）の前にジヌクレオチドＴＧがある組換えＤＮＡ構築物である。
【００１９】
好ましい実施形態に従うと、領域ａ）の終結／ポリアデニル化配列および領域ｂ）の開始配列は、構築物を挿入することが意図されているノビラブドウイルスに由来しており、好ましくは、それぞれ前記ノビラブドウイルスのＭ遺伝子およびＧ遺伝子に由来している。
【００２０】
例えば、ＩＨＮＶ内に構築物を挿入することが意図されている場合、終結／ポリアデニル化配列は、ＣＣＡＡＧＡＣＡＧＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２）であり、転写開始配列はＧＣＡＣＴＴＴＴＧＴＧＣ（配列番号３）である。
【００２１】
同様に、ＶＨＳＶ内に構築物を挿入することが意図されている場合、終結／ポリアデニル化配列はＡＴＴＡＧＡＴＡＧＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号６）であり、また転写開始配列はＧＣＡＣＡＴＴＴＧＴＧＴ（配列番号７）である。ＨＲＶ内に構築物を挿入することが意図されている場合、終結／ポリアデニル化配列はＡＴＣＡＧＡＴＡＧＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号８）であり、転写開始配列はＧＣＡＣＡＴＴＴＧＴＧＴ（配列番号７）である。ＳＫＲＶ内に構築物を挿入することが意図されている場合、終結／ポリアデニル化配列はＧＡＡＡＧＡＣＡＧＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号９）であり、また転写開始配列はＧＣＡＣＧＡＧＡＧＴＧＣ（配列番号１０）である。
【００２２】
領域ｃ）においては、目的のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームは、任意には、ノビラブドウイルスの構造タンパク質（すなわちＮ、Ｐ、ＭまたはＧ）、好ましくはタンパク質Ｎをコードするオープンリーディングフレームに融合されてよい。該融合は、ノビラブドウイルス粒子内への目的のポリペプチドの組み込みを可能にする。好ましくは、目的のポリペプチドのＮ末端は、前記ノビラブドウイルスの構造タンパク質のＣ末端に融合される。
【００２３】
ただし、本発明のノビラブドウイルス内で発現する目的のタンパク質が、エンベロープを有するウイルスの膜糖タンパク質といったような膜タンパク質である場合、それをノビラブドウイルスの構造タンパク質に融合することなく、ウイルス粒子内に組み込むことができる。
【００２４】
ＤＮＡ構築物における領域ａ）、ｂ）およびｃ）の順序は、宿主ノビラブドウイルスの遺伝子間領域内の、前記構築物を挿入しようとしている位置により左右される。
【００２５】
構築物を内在性ＯＲＦの末端と、対応する内在性遺伝子の転写終結／ポリアデニル化シグナルとの間に挿入すべきである場合には、この順序はａ−ｂ−ｃとなる。この場合、内在性遺伝子の転写は構築物の領域ａ）の終結／ポリアデニル化配列において終結され、目的のタンパク質をコードするＯＲＦの転写は、構築物の領域ｂ）の開始配列で開始され、内在性遺伝子の内在性終結／ポリアデニル化シグナルにおいて終結される。
【００２６】
構築物を内在性遺伝子の転写開始シグナルと開始コドンとの間に挿入すべきである場合には、順序はｃ−ａ−ｂとなる。この場合、目的のタンパク質をコードするＯＲＦの転写は、内在性遺伝子の開始シグナルにおいて開始され、領域ａ）の終結／ポリアデニル化配列において終結され、内在性遺伝子の転写は、構築物の領域ｂ）の開始配列で開始される。
【００２７】
構築物を、第一の内在性遺伝子の転写終結／ポリアデニル化シグナルと第二の内在性遺伝子の転写開始シグナルとの間に挿入すべきである場合には、順序はｂ−ｃ−ａとなる。この場合、目的のタンパク質をコードするＯＲＦの転写は、領域ｂ）の開始配列において開始され、構築物の領域ａ）の終結／ポリアデニル化配列により終結される。
【００２８】
本発明はまた、宿主ノビラブドウイルスの第一の内在性ＯＲＦの停止コドンと第二の内在性ＯＲＦの開始コドンとの間に含まれたアンチゲノムｃＤＮＡの一部分の中に挿入された本発明の一つ以上の組換えＤＮＡ構築物を含むことを特徴とする、ノビラブドウイルスのゲノムのアンチゲノムｃＤＮＡをも提供している。
【００２９】
好ましい実施形態に従うと、前記アンチゲノムｃＤＮＡは、第一の内在性ＯＲＦの停止コドンと第二の内在性ＯＲＦの開始コドンとの間に含まれた前記ｃＤＮＡの一部分の中に挿入された本発明の二つの構築物を含む。さらにもう一つの好ましい実施形態に従うと、前記アンチゲノムｃＤＮＡは、第一の内在性ＯＲＦの停止コドンと第二の内在性ＯＲＦの開始コドンとの間に含まれた前記ｃＤＮＡの一部分の中に挿入された本発明の三つの構築物を含む。
【００３０】
好ましくは、第一の内在性ＯＲＦはＭのＯＲＦであり、第二の内在性ＯＲＦはＧのＯＲＦである。
【００３１】
本発明は同様に、本発明のアンチゲノムＤＮＡに相補的なゲノムＲＮＡを含む組換えノビラブドウイルスをも提供する。
【００３２】
本発明は同様に、培養中の脊椎動物の細胞（好ましくは魚の細胞）中で目的のタンパク質を生産するため、および／またはワクチンを得るため、宿主ノビラブドウイルスのゲノムの遺伝子間領域のうちの少なくとも一つの中に挿入された一つ以上の付加的な転写単位を有する組換えノビラブドウイルスの使用にも関する。
【００３３】
発明者らは、一つの構築物を含む場合、本発明のノビラブドウイルスが培養中の魚の細胞の中で正常に増殖しそれらの病原性能力を保つことができるということを発見した。第二の構築物が付加された場合、細胞培養物中で増殖する能力は保たれる一方で、病原性は減少する。第三の構築物の付加は、細胞培養物中で増殖する能力に対する有意な効果を有さない。標準的には、一つ、二つまたは三つの構築物を含む本発明の組換えノビラブドウイルスは、１０８ＰＦＵ／ｍｌ超の力価で細胞培養物中で生産され得る。その一方で、三つの構築物を含む本発明の組換えノビラブドウイルスは、病原性が著しく低減している。
【００３４】
培養中の細胞内での目的のタンパク質の生産のためには、一つ以上の構築物、好ましくは二つまたは三つの構築物を含むノビラブドウイルスを使用することができる。
【００３５】
二つ以上の構築物を有する本発明のノビラブドウイルスの使用は、例えば一つの同じ酵素、または活性タンパク質の不活性前駆体、および前記前駆体を活性形態に変換することのできる第二のタンパク質のサブユニットといった、複数のポリペプチドを同時に発現させることを望む場合に特に有利である。ワクチンの開発においては、一部の防御エピトープは、二つ以上のポリペプチドが同時に発現した場合にのみ形成される。本発明のノビラブドウイルスを使用することにより、かかるポリペプチドを発現させて防御エピトープを形成させることが可能となる。
【００３６】
さらに、上記で開示した通り、発現したタンパク質をウイルス粒子内に組み込むことができるという事実は、ワクチンの生産にとって特に有利である。
【００３７】
三つ以上の構築物を含む本発明のノビラブドウイルスを、魚のワクチン接種、例えばＩＨＮＶおよびＶＨＳＶの場合にはサケ科魚類のワクチン接種のための、弱毒化生ワクチンとして使用することができる。それらは有利には浴療法によって、すなわち、免疫化すべき動物の入った繁殖槽内の水に単にワクチンを添加することによって、投与され得る。
【００３８】
代替的には、組換えノビラブドウイルスまたは当該ウイルスを生産する細胞を魚において不活化ワクチンとして使用することができる。
【００３９】
本発明の組換えノビラブドウイルス、特にＩＨＮＶおよびＶＨＳＶといったような低温で複製するものはまた、トリおよび哺乳動物といったような高等脊椎動物のワクチン接種のための非複製型抗原送達系としても使用可能である。発明者らは、外来抗原を発現する本発明の組換えＩＨＮＶが哺乳動物の体内に注射された場合、前記ウイルスは前記哺乳動物の体内で複製することが全くできず、その一方で、付加的なアジュバントが全くない状態で、ウイルス粒子内に組み込まれた外来抗原に対して強い免疫応答が発生するということを実際に観察した。
【００４０】
発明者らはまた、ＩＨＮＶおよびＶＨＳＶといったような低温（１４〜２０℃）で複製するノビラブドウイルスが、成長のために少なくとも２５〜３０℃の温度を一般に必要とする大腸菌、バキュロウイルス、酵母菌といったような従来の発現宿主の中で生産が困難である熱感受性タンパク質の生産に特に適しているということも発見した。これらは、例えばワクチンの構成成分として有用である免疫防御性タンパク質をインビトロで生産するために特に有利である。これらのタンパク質の多く、特に魚類の病原体に由来するものは、大部分の細菌、酵母菌、真核生物、およびバキュロウイルスに基づいた発現系の標準温度では発現され得ないか、または正しい構造へと折畳みされ得ない。
【００４１】
かくして、本発明の目的は、低温の発現系においてインビトロで目的の抗原タンパク質を発現させるための、前記タンパク質をコードする異種配列を含む組換えＩＨＮＶまたはＶＨＳＶの使用にある。
【００４２】
本発明は、かくして、目的の抗原タンパク質をコードする少なくとも一つの異種配列を含む組換えＩＨＮＶまたはＶＨＳＶ、および前記組換えウイルスに感染しやすくかつ低温で成長し得る脊椎動物細胞を含むことを特徴とする、低温のインビトロでの発現系を提供する。
【００４３】
本発明は同様に、目的の抗原タンパク質をインビトロで発現させる方法であって、
−  目的の抗原タンパク質をコードする少なくとも一つの異種配列を含む組換えＩＨＮＶまたはＶＨＳＶを用いて、ＩＨＮＶまたはＶＨＳＶに感染しやすくかつ低温で成長し得る脊椎動物細胞を感染させる段階、
−  約１４℃〜約２０℃の温度で前記細胞を培養する段階、
−  前記細胞により生産された目的の抗原タンパク質を回収する段階
を含む該方法をも提供する。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態に従うと、前記脊椎動物細胞は、例えばＥＰＣ細胞といった魚細胞である。
【００４５】
宿主ノビラブドウイルスの内在性配列の代わりに異種配列が挿入されている組換えＩＨＮＶまたはＶＨＳＶを使用することが可能である。しかしながら、好ましくは、宿主ノビラブドウイルスの内在性配列に加えて異種配列が挿入されている組換えＩＨＮＶまたはＶＨＳＶが使用される。さらに一層好ましくは、異種配列が、宿主ノビラブドウイルスの遺伝子間領域の一つに挿入された付加的な転写単位の一部分である、本発明の組換えノビラブドウイルスが使用される。好ましいノビラブドウイルスはＩＨＮＶである。
【００４６】
本発明は、本発明に従った組換えノビラブドウイルスの構築および使用の非制限的な実施例に言及している以下のさらなる記載から、より完全に理解されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】異なる構築物を概略的に表す図である。
【図２】ｐＩＨＮ−ＬＵＣ構築物を示す図である。
【図３】ＥＰＣ細胞培養物におけるさまざまな組換えウイルスのウイルス力価の例を示す図である。
【図４】睡眠病ウイルスの構造タンパク質を発現する組換えＩＨＮＶを示す図である。
【図５】伝染性サケ貧血ウイルス（ＩＳＡＶ）の血球凝集素（ＨＡ）糖タンパク質を発現する組換えＩＨＮＶを示す図である。
【図６】レポータータンパク質に融合されたウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）のＧ糖タンパク質を発現する組換えＩＨＮＶを示す図である。
【図７】ＩＨＮＶ−ＶＰ２ＩＢＤＶ感染細胞の細胞質におけるＶＰ２タンパク質の特異的標識を示す図である。
【図８】ＩＨＮＶ−Ｆ５ＩＳＡＶ感染細胞におけるＩＳＡＶのＦタンパク質の発現を示す図である。
【図９】ＩＳＡＶのＨＡおよびＩＰＮＶのＶＰ２を発現する組換えＩＨＮＶを示す図である。
【図１０】組換えＩＨＮＶウイルス粒子内への外来膜糖タンパク質の組み込みを示す図である。
【図１１】ＥＧＦＰのＮ末端部分と融合した状態でタンパク質Ｎ、Ｇ、ＭまたはＮＶを発現する組換えＩＨＮＶを示す図である。
【図１２】ルシフェラーゼのＮ末端部分と融合した状態でタンパク質Ｎ、Ｇ、ＭまたはＮＶを発現する組換えＩＨＮＶを示す図である。
【図１３】生きたマスにおける目的のタンパク質の発現を示す図である。
【図１４】一つまたは三つの付加的なシストロンを含む組換えノビラブドウイルスの病原性を示す図である。
【図１５】魚における本発明の組換えノビラブトウイルスのワクチン特性を示す図である。
【図１６】さまざまな種に由来する培養細胞物における組換えＩＨＮＶの複製を示す図である。
【図１７】ＩＳＡＶのＨＡ糖タンパク質に対するポリクローナル抗体および組換えＩＨＮＶ  ３Ｃ１を接種したマウスの血清でのウェスタンブロット法の結果を示す図である。
【実施例】
【００４８】
実施例１：Ｍ−Ｇ遺伝子間領域内に一つ、二つまたは三つの付加的なシストロンを含む組換えノビラブドウイルスの構築
図１は、以下で記載される、異なる構築物を概略的に表している。
【００４９】
図１の凡例
Ａ：ＩＨＮＶの完全長ｃＤＮＡゲノムを含む最初のｐＩＨＶ構築物である。以下のエレメントは、この構築物では表示され、その他の構築物を示す概略図の中では省略される。Ｔ７ｐｒｏｍ＝Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、δ＝デルタ肝炎ウイルスのリボザイム配列、Ｔ７ｔ＝Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼターミネーター配列。
Ｂ：ｐＩＨＮ−ＬＵＣ
Ｃ：ｐＩＨＮ−Ｘ
Ｄ：ｐＩＨＮ−ＬＵＣ−ΔＧ
Ｅ：ＥａｇＩでのｐＩＨＮ−Ｘの制限を通して生成されるインサート
Ｆ：ｐＩＨＮ−Ｘ−ＬＵＣ−ΔＧ
Ｇ：ＳｐｅＩ／ＮｓｉＩによるｐＩＨＮ−ＬＵＣの消化を通して生成されるインサート
Ｈ：ｐＩＨＮ−Ｘ−ＬＵＣ
Ｉ：ｐＩＨＮ−Ｙの消化を通して生成されるインサートＥａｇＩ／ＥａｇＩ
Ｊ：ｐＩＨＮ−Ｘ−Ｙ−ＬＵＣ
【００５０】
組換えｃＤＮＡの構築
構築は、ＢＩＡＣＣＨＥＳＩら（２０００年、上述）により記載されているプラスミドｐＩＨＮＶを用いて実施した。このプラスミドは、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＳＫベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中で、Ｔ７ファージＲＮＡポリメラーゼプロモーターの下流側そしてδ肝炎ウイルスのリボザイム配列およびＴ７ファージＲＮＡポリメラーゼ転写ターミネーターの上流側でクローニングされた、ＩＨＮウイルスゲノムの完全長ｃＤＮＡを含む。
【００５１】
ｐＩＨＮＶのｃＤＮＡゲノムは、Ｍ−Ｇ遺伝子間領域内に一つのＥａｇＩ制限部位を含む。この制限部位は、図１で図式化されているように、目的の遺伝子をコードする付加的なシストロンを挿入するために使用される。目的の遺伝子の最初および終りでは、ＳｐｅＩおよびＳｍａＩ制限酵素部位がそれぞれに導入されており、別の遺伝子による目的の遺伝子の置換を可能にしている。プラスミドｐＩＨＮＶを図１Ａに図式化する。
【００５２】
一つの付加的シストロンを用いた組換えアンチゲノムｃＤＮＡの構築
ｐＩＨＮ−ＬＵＣ（図１Ｂ）：
ウミシイタケルシフェラーゼ発現カセット遺伝子をｐＩＨＮＶのＥａｇＩ部位に挿入した結果、ｐＩＨＮ−ＬＵＣが得られる。
【００５３】
これは、以下のように得られる。
ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を、以下のオリゴヌクレオチドを用いてｐＢｉｎｄベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＧｅｎＢａｎｋ、登録番号ＡＦ２６４７２２）からＰＣＲ増幅させた。
【００５４】
ＥａｇＩ  ＳｐｅＩ  ＲｎＬｕｃ：
ｇｇｇｇＣＧＧＣＣＧＣＣＡＡＧＡＣＡＧＡＡＡＡＡＡＡＴＧＧＣＡＣＴＴＴＴＧＴＧＣＡＣＴＡＧＴＡＴＧＡＣＴＴＣＧＡＡＡＧＴＴＴＡＴＧＡＴＣＣＡ（配列番号１１）
このオリゴヌクレオチドは、ＥａｇＩ制限部位（ＣＧＧＣＣＧ）と、それに続くＭ遺伝子の転写終結／ポリアデニル化配列（ＣＣＡＡＧＡＣＡＧＡＡＡＡＡＡＡ、配列番号２）、ジヌクレオチドＴＧ、およびＧ遺伝子の転写開始配列（ＧＣＡＣＴＴＴＴＧＴＧＣ、配列番号３）と、それに続くウミシイタケルシフェラーゼの最後の２４個のヌクレオチドとを含む。
【００５５】
ＥａｇＩ  ＳｍａＩ  ＲｎＬｕｃ：
ｇｇｇｇＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＴＴＡＴＴＧＴＴＣＡＴＴＴＴＴＧＡＧＡＡＣＴＣＧ（配列番号１２）
このオリゴヌクレオチドはＥａｇＩ制限部位（ＣＧＧＣＣＧ）を含む。
【００５６】
ＰＣＲ産物をＥａｇＩ酵素で消化し、ｐＩＨＮＶのＥａｇＩ部位に挿入し、図２に示すｐＩＨＮ−ＬＵＣ構築物を得た。
【００５７】
最終的なプラスミドを配列決定して、挿入されたＥａｇＩフラグメントの方向および配列を確認した。
【００５８】
これらのプラスミドを全て配列決定して、挿入されたフラグメントの方向および配列を確認した。
【００５９】
ｐＩＨＮ−ＸまたはｐＩＨＮ−Ｚ（図１Ｃ）
これらの構築物は、その他のあらゆる目的の遺伝子でルシフェラーゼ遺伝子を置換した結果として得られる（ＸまたはＺにより例証）。これらは、一方の側にＳｐｅＩ部位を（またはＮｈｅＩといったような適合性を有する制限部位）、そして他方の側にＳｍａＩ部位（または適合性を有する平滑末端制限部位）を含む一組のプライマーセットを用いた目的の遺伝子のＰＣＲ増幅によって得られる。
【００６０】
ｐＩＨＮ−Ｘでは、ルシフェラーゼのオープンリーディングフレームを含むＳｐｅＩ／ＳｍａＩフラグメントは、目的の遺伝子Ｘを含む、適合性を有するＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＶのＰＣＲフラグメントで置換される。結果として得られたｐＩＨＮ−Ｘ構築物は、ＳｐｅＩおよびＳｍａＩ制限部位を喪失している。
【００６１】
同様にして、ｐＩＨＮ−Ｚ構築物は、Ｚ遺伝子を含むＳｐｅＩ／ＳｍａＩのＰＣＲフラグメントによりＬｕｃ遺伝子を含むＳｐｅＩ／ＳｍａＩフラグメントを置換することによって、ｐＩＨＮ−Ｌｕｃから得られる。この構築物をｐＩＨＮ−Ｚと呼ぶ。
【００６２】
二つの付加的なシストロンを用いた組換えアンチゲノムｃＤＮＡの構築
ｐＩＨＮ−Ｘ−ＬＵＣ（図１Ｄ〜１Ｈ）
ＳｍａＩ／ＡｇｅＩフラグメントがｐＩＨＮ−ＬＵＣプラスミドから除去され、結果として二つのＥａｇＩ部位のうちの一つが削除され、Ｇ遺伝子が欠失する。このようにして得られた中間構築物をｐＩＨＮ−ＬＵＣ−ΔＧと命名する（図１Ｄ）。
【００６３】
Ｘ発現カセットは、ｐＩＨＮ−ＸのＥａｇＩ制限酵素消化によって得られる（図１Ｅ）。
【００６４】
このインサートはＥａｇＩで消化されたｐＩＨＮ−ＬＵＣ−ΔＧとライゲーションされ、結果として構築物ｐＩＨＮ−Ｘ−ＬＵＣ−ΔＧをもたらす（図１Ｆ）。ちなみに、ｐＩＨＮ−Ｘ−ＬＵＣ−ΔＧ構築物をもたらした二つのＥａｇＩフラグメントのライゲーションの後、ＸとＬＵＣ発現単位との間に一つのＮｏｔＩ制限部位が生成される。
【００６５】
最後に、ｐＩＨＮ−Ｘ−ＬＵＣ−ΔＧ構築物のＳｐｅＩ／ＮｓｉＩフラグメントは、ＳｐｅＩ／ＮｓｉＩでの消化により、ｐＩＨＮ−ＬＵＣ構築物から得られたＧ遺伝子を含む対応するフラグメントと置換される（図１Ｇ）。結果として得られる構築物をｐＩＨＮ−Ｘ−ＬＵＣと呼ぶ（図１Ｈ）。
【００６６】
三つの付加的なシストロンを用いた組換えアンチゲノムｃＤＮＡの構築
ｐＩＨＮ−Ｘ−Ｙ−ＬＵＣ（図１Ｉおよび図１Ｊ）
プラスミドｐＩＨＮ−Ｙは、ｐＩＨＮ−Ｘについて記載したようにして得られる。
【００６７】
ｐＩＨＮ−ＹをＥａｇＩで消化し、インサートＥａｇＩ／ＥａｇＩを回収し（図１Ｉ）、ＮｏｔＩで予め消化されたｐＩＨＮ−Ｘ−ＬＵＣ内に挿入する。かくして得られた構築物をｐＩＨＮ−Ｘ−Ｙ−ＬＵＣと呼ぶ（図１Ｊ）。
【００６８】
ｐＩＨＮ−Ｘ−Ｙ−Ｚ
この構築物は、ｐＩＨＮ−Ｚから回収したＺ遺伝子を含むＳｐｅＩ／ＳｍａＩフラグメントで、Ｌｕｃ遺伝子を含むｐＩＨＮ−Ｘ−Ｙ−ＬＵＣのＳｐｅＩ／ＳｍａＩフラグメントを置換することにより得られる。
【００６９】
組換えウイルスの生産
それぞれが、ＩＨＮの核タンパク質Ｎをコードする遺伝子、リンタンパク質Ｐをコードする遺伝子、およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＬをコードする遺伝子を含む、三つの発現プラスミドを、ＢＩＡＣＣＨＥＳＩら（２０００年、先に言及した刊行物）により記載されている通りに構築した。これらの構築物をそれぞれｐＴ７−Ｎ、ｐＴ７−Ｐ、およびｐＴ７−Ｌと呼ぶ。
【００７０】
Ｔ７ファージＲＮＡポリメラーゼを発現する組換えワクチニアウイルスで予め感染させたＥＰＣ（ｅｐｉｔｈｅｌｉｏｍａ  ｐａｐｕｌｏｓｕｍ  ｃｙｐｒｉｎｉｄ）細胞中に、リポフェクタミン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）の存在下でのトランスフェクションにより、それぞれ０．２５μｇ、０．２μｇ、および０．２μｇの用量の三つのプラスミドｐＴ７−Ｎ、ｐＴ７−Ｐ、およびｐＴ７−Ｌと、１μｇの用量のプラスミドｐＩＨＮ−ＬＵＣ、ｐＩＨＮ−Ｘ、またはＺ、ｐＩＨＮ−Ｘ−ＬＵＣ、ｐＩＨＮ−Ｘ−Ｙ−ＬＵＣ、またはｐＩＨＮ−Ｘ−Ｙ−Ｚのいずれかとを導入する（ｖＴＦ７−３、ＦＵＥＲＳＴら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９２号、４４７７〜４４８１頁、１９８６年）。
【００７１】
トランスフェクションの後、細胞を３７℃で５時間インキュベートし、その後ＭＥＭ培地（血清なし）で洗浄し、２％ウシ胎児血清を含有するＭＥＭ培地内にて１４℃で７日間インキュベートする。細胞および上清を凍結／解凍し、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより清澄させる。上清を１／１０希釈で使用してＥＰＣ細胞層を感染させる。ウイルスは、感染から３〜４日後に上清内に生産される。
【００７２】
一つ、二つまたは三つの付加的なシストロンを有する異なる組換えＩＮＨウイルスを生産した。これらをそれぞれ、下表１、２および３に列挙する。
【００７３】
【表１】
2009539396.tif 000002
【００７４】
【表２】
2009539396.tif 000003
【００７５】
【表３】
2009539396.tif 000004
表の凡例
ＳＤＶ：睡眠病ウイルス
ＩＳＡＶ：伝染性サケ貧血ウイルス
ＶＨＳＶ：ウイルス性出血性敗血症ウイルス
ＩＢＤＶ：伝染性ファブリーキウス嚢病ウイルス、
ＩＰＮＶ：伝染性膵臓壊死症ウイルス
６ＫＥ１：ＳＤＶのＥ１糖タンパク質遺伝子
ＣＡＰ：ＳＤＶカプシド遺伝子
Ｅ３Ｅ２：ＳＤＶのＥ２糖タンパク質遺伝子
ＥＧＦＰ：増強型緑色蛍光タンパク質
Ｆ５：ＩＳＡＶのＦ遺伝子
ＧＶＨＳＶ：ＶＨＳＶのＧ糖タンパク質遺伝子
ＨＡ：ＩＳＡＶのＨＡ遺伝子
ＩＬ１β：ニジマス由来のインターロイキン１
ＬＵＣＦＦ：ホタルルシフェラーゼ  ＬＵＣＲＲ：ウミシイタケルシフェラーゼ
ＶＰ２：ＩＰＮＶのＶＰ２遺伝子
ΔＧ：ＩＨＮＶのＧ遺伝子の欠失
【００７６】
実施例２：一つ、二つまたは三つの付加的なシストロンを含む組換えノビラブドウイルスの細胞培養物における増殖
生産されたウイルスの各々のウイルスストックは、トランスフェクションから７日目に取った上清（上清ＰＯ）の（ＥＰＣ）細胞培養物における連続継代により構成される。細胞は、清澄した上清の１／１００希釈で感染させる。３回の継代後、ウイルスの細胞変性効果により細胞層が破壊された時点で、上清を取り出す。この破壊は、通常、感染後３〜６日目に発生する。ウイルスストックを次に、限界希釈法により滴定する。
【００７７】
図３は、ＥＰＣ細胞培養物におけるさまざまな組換えウイルスのウイルス力価の例を示す。全ての組換えウイルスについてのウイルス力価は同じ範囲（１０８ＰＦＵ／ｍｌ）内にあるが、三つの付加的な発現単位を含む組換えウイルスは、野生型ウイルスに比べて緩慢な成長を示す。一般に、完全な細胞変性効果を得るために、野生型ＩＨＮＶは三日を要するのに対し、ＥＰＣ細胞では六日間を要する。
【００７８】
実施例３：本発明の組換えノビラブドウイルスにおける目的のタンパク質の発現
目的のタンパク質を、表１、２および３に列挙する組換えＩＨＮＶを用いて生産した。
【００７９】
睡眠病ウイルスの構造タンパク質を発現する組換えＩＨＮＶ
ＥＰＣ細胞を、０．０２のＭＯＩ（感染多重度）（０．０２ＰＦＵ／細胞）で、野生型ＩＨＮＶ、ＩＨＮＶ−６ＫＥ１、ＩＨＮＶ−ＣａｐＥ３Ｅ２、またはＩＨＮＶ−Ｅ３Ｅ２６ＫＥ１で感染させる。細胞を感染から４８時間後に溶解し、溶解物を、ＳＤＶ−Ｅ１の糖タンパク質に対するモノクローナル抗体を用いてウェスタンブロット法により分析する。
【００８０】
結果を図４に示す。レーン１：ＩＨＮＶ−Ｅ３Ｅ２６ＫＥ１、レーン２：ＩＨＮＶ−ＣａｐＥ３Ｅ２、レーン３：ＩＨＮＶ−６ＫＥ１、レーン４：野生型ＩＨＮＶ。
【００８１】
伝染性サケ貧血ウイルス（ＩＳＡＶ）の血球凝集素（ＨＡ）糖タンパク質を発現する組換えＩＨＮＶ
ＥＰＣ細胞を、上述の通り、野生型ＩＨＮＶまたはＩＨＮＶ−ＨＡＩＳＡＶで感染させる。感染から２日後に細胞を溶解し、溶解物を抗ＨＡモノクローナル抗体で免疫沈降させ、ＩＳＡＶ−ＨＡ糖タンパク質に対するポリクローナル抗体を用いてウェスタンブロット法により分析する。
【００８２】
結果を図５に示す。レーン１：野生型ＩＨＮＶ、レーン２：ＩＨＮＶ−ＩＳＡＶ  ＨＡ。
【００８３】
レポータータンパク質に融合されたウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）のＧ糖タンパク質を発現する組換えＩＨＮＶ
ＥＰＣ細胞を、上述の通り、野生型ＩＨＮＶ、ＩＨＮＶ−ＧＶＨＳＶ、ＩＨＮＶ−ＧＶＨＳＶ／ＬＵＣＲＲ、ＩＨＮＶ−ＧＶＨＳＶ／ＥＧＦＰ、または非感染の（偽感染）ＥＰＣ細胞の上清で感染させる。細胞を感染から２日後に溶解し、溶解物を、ＶＨＳＶのＧ糖タンパク質に対するモノクローナル抗体を用いてウェスタンブロット法によって分析する。
【００８４】
結果を図６に示す。レーン１：野生型ＩＨＮＶ、レーン２：ＩＨＮＶ−ＧＶＨＳＶ、レーン３：ＩＨＮＶ−ＧＶＨＳＶ／ＬＵＣＲＲ、レーン４：ＩＨＮＶ−ＧＶＨＳＶ／ＥＧＦＰ。観察されたバンドはそれぞれ、ＶＨＳＶのＧ糖タンパク質ならびに融合タンパク質ＧＶＨＳＶ／ＬＵＣＲＲおよびＧＶＨＳＶ／ＥＧＦＰについて予想されたサイズと整合している。
【００８５】
伝染性ファブリーキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）のＶＰ２を発現する組換えＩＨＮＶ  ＥＰＣ細胞を、上述の通りに、ＩＨＮＶ−ＶＰ２ＩＢＤＶまたは野生型ＩＨＮＶで感染させる。感染から２４時間後に、ＶＰ２  ＩＢＤＶの発現を、間接的免疫蛍光法を用いて検出する。細胞を固定し、冷凍庫内で１５分間、−２０℃の５０％メタノール５０％アセトンの浴中で透過化させる。固定した細胞を次に、ＶＰ２  ＩＢＤＶに対するモノクローナル抗体の１：４００希釈物と共に一時間インキュベートし、洗浄段階の後、細胞を、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）と結合した抗マウスＩｇＧ抗体と共に４５分間インキュベートする。非結合の抗体を除去するための洗浄段階の後、紫外線顕微鏡でフルオレセイン染色について細胞を検査し、コンピュータと連結したカメラ（株式会社ニコン）で撮影する。
【００８６】
図７は、ＩＨＮＶ−ＶＰ２ＩＢＤＶ感染細胞の細胞質におけるＶＰ２タンパク質の特異的標識を示す。
【００８７】
ＩＨＮＶ感染細胞においてはいかなる蛍光も検出できない。
【００８８】
ＩＳＡＶのタンパク質Ｆを発現する組換えＩＨＮＶ
上述の通りに、ＥＰＣ細胞をＩＨＮＶ−Ｆ５ＩＳＡで感染させる。感染から３６時間後に、ＩＳＡＶのタンパク質Ｆに対する抗体を用いて、上述の通り、間接的免疫蛍光のために細胞を処理する。
【００８９】
図８に示した結果は、ＩＨＮＶ−Ｆ５ＩＳＡＶ感染細胞におけるＩＳＡＶのＦタンパク質の発現を実証している。
【００９０】
ＩＳＡＶのＨＡおよびＩＰＮＶのＶＰ２を発現する組換えＩＨＮＶ
上述の通りに、ＥＰＣ細胞をＩＨＮＣ−３Ｃ３（ＨＡ／ＶＰ２／ＬＵＣ）で感染させる。感染から３６時間後に、細胞を、ＩＳＡＶのタンパク質ＨＡに対するポリクローナル抗体およびＩＰＮＶのタンパク質ＶＰ２に対するモノクローナル抗体を用いて、上述の通りに処理する。一次モノクローナル抗体は、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）と結合した抗マウスＩｇＧ抗体で明らかにし、タンパク質ＨＡに対する一次ウサギポリクローナル抗体は、ＴＲＩＴＣと結合した抗ウサギ抗体で明らかにする。
【００９１】
結果を図９に示す。左パネル：抗ＩＰＮＶ  ＶＰ２ｍＡｂ、右パネル：抗ＩＳＡＶ  ＨＡポリクローナル抗体。
【００９２】
この二重免疫蛍光染色は、ＩＨＮＶ−３Ｃ３感染細胞が、ＩＳＡＶのＨＡおよびＩＰＮＶのＶＰ２を同時に発現するということを示している。
【００９３】
実施例４：組換えＩＨＮＶウイルス粒子内への外来膜糖タンパク質の組み込み
実施例３に記載した通り、ＥＰＣ細胞をＩＨＮＶ−Ｆ５ＩＳＡで感染させるか、または偽感染させる。
【００９４】
感染から３日後に、無細胞上清を回収し、ショ糖勾配を用いて前記上清から組換えウイルスを精製する。精製したウイルスをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードする。ＩＳＡＶ−Ｆ糖タンパク質に対するポリクローナル抗体を用いて、ウェスタンブロット法によりウイルスタンパク質を分析する。ポジティブコントロールとしてＩＳＡＶ感染細胞を使用した。
【００９５】
結果を図１０に示す。これらの結果は、ＩＳＡＶのＦタンパク質が組換えＩＨＮＶウイルス粒子内に組み込まれていることを実証している。
【００９６】
それぞれＩＳＡＶのＨＡおよびＶＳＨＶのＧ糖タンパク質を用いて組み込みの分析を行ったところ、精製されたＩＨＮＶ−ＩＳＡＶ  ＨＡ組換えウイルスおよびＩＨＮＶ−ＶＳＨＶ  Ｇ組換えウイルスにおいて類似の結果が得られた。
【００９７】
実施例５：組換えＩＨＮＶウイルス粒子内への外来非膜タンパク質の組み込み
ＩＨＮＶウイルス粒子内に非膜タンパク質を物理的に組み込む可能性を、ＥＧＦＰおよびウミシイタケルシフェラーゼという二つのレポーター非膜タンパク質を用いて評価する。
【００９８】
ＥＧＦＰまたはウミシイタケルシフェラーゼのＮ末端にＣ末端で融合された、ＩＨＮＶウイルスの構造タンパク質（Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇ）のいずれか一つまたは非構造タンパク質ＮＶをコードするキメラ遺伝子を構築した。
【００９９】
ｐＩＨＮＶ  ＬＵＣまたはｐＩＨＮＶ  ＥＧＦＰ構築物の一つのＳｐｅＩ制限部位内へのキメラ遺伝子の挿入を可能にするべく、各キメラ遺伝子の両端においてＳｐｅＩ制限酵素部位を導入した。
【０１００】
以下の構築物が得られた。ｐＩＨＮＶ  Ｎ−ＥＧＦＰ、ｐＩＨＮＶ  Ｇ−ＥＧＦＰ、ｐＩＨＮＶ  Ｍ−ＥＧＦＰ、またはｐＩＨＮＶ  ＮＶ−ＥＧＦＰ  ｐＩＨＮＶ  Ｎ−ＬＵＣ、ｐＩＨＮＶ  Ｇ−ＬＵＣ、ｐＩＨＮＶ  Ｐ−ＬＵＣ、ｐＩＨＮＶ  Ｍ−ＬＵＣ、またはｐＩＨＮＶ  ＮＶ−ＬＵＣ。
【０１０１】
組換えＩＨＮＶを、前述の実施例１において記載されている通りに、これらの構築物から得る。
【０１０２】
ＥＧＦＰのＮ末端部分と融合した状態でタンパク質Ｎ、Ｇ、ＭまたはＮＶを発現する組換えＩＨＮＶ
ＥＰＣ細胞を、ＩＨＮＶ  Ｎ−ＥＧＦＰ、ＩＨＮＶ  Ｇ−ＥＧＦＰ、ＩＨＮＶ  Ｍ−ＥＧＦＰ、またはＩＨＮＶ  ＮＶ−ＥＧＦＰで感染させる。感染から２４時間後に、細胞を、共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）を用いてＥＧＦＰ融合タンパク質の発現について直接検査する。
【０１０３】
結果を図１１に示す。Ａ：ＩＨＮＶ  Ｎ−ＥＧＦＰ、Ｂ：ＩＨＮＶ  Ｇ−ＥＧＦＰ、Ｃ：ＩＨＮＶ  Ｍ−ＥＧＦＰ、Ｄ：ＩＨＮＶ  ＮＶ−ＥＧＦＰ。Ｇ−ＥＧＦＰおよびＭ−ＥＧＦＰは、ＧおよびＭタンパク質の予想される局在化に従って、膜への局在を有し、一方ＮＶ−ＥＧＦＰは、感染した細胞の核内に蓄積するように思われ、Ｎ−ＥＧＦＰは細胞質性であることがわかる。
【０１０４】
ルシフェラーゼのＮ末端部分と融合した状態でタンパク質Ｎ、Ｇ、ＭまたはＮＶを発現する組換えＩＨＮＶ
ＥＰＣ細胞を、ＩＨＮＶ  Ｌｕｃ、ＩＨＮＶ  Ｎ−ＬＵＣ、ＩＨＮＶ  Ｇ−ＬＵＣ、ＩＨＮＶ  Ｍ−ＬＵＣ、またはＩＨＮＶ  ＮＶ−ＬＵＣで感染させる。感染から４日後に、無細胞上清を回収し、組換えウイルスを、ショ糖勾配を用いて前記上清から精製する。各々の精製したウイルスの総タンパク質濃度を、比色色素結合分析（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）を用いて測定した。その後、各々の精製したウイルス１マイクログラムをルシフェラーゼ活性について試験して、ウイルス粒子内へのルシフェラーゼの組み込みに最も適した構造タンパク質がどれであるかを決定した。
【０１０５】
図１２の結果は、Ｎタンパク質に対する外来非膜タンパク質（この場合ルシフェラーゼ）の融合が、ＩＨＮＶウイルス粒子内へのこのタンパク質の組み込みのための最良の戦略であることを示している。
【０１０６】
実施例５：生きたマスにおける目的のタンパク質の発現
以下の手順に従って、ｒＩＨＮＶＬＵＣを用いた浴浸漬により、魚を感染させる。繁殖槽内で少量の水中に（平均体重１ｇの１００匹の稚魚につき水３リットル）稚魚を入れる。５×１０４ＰＦＵ／ｍｌ（ＰＦＵ＝プラーク形成単位）の最終濃度で槽の水にｒＩＨＮＶＬＵＣを添加する。２時間インキュベートした後、槽を満杯にし、水循環を再度確立する。
【０１０７】
感染から４日後に、ルシフェラーゼ基質（ＥｎｄｕＲｅｎ（商標）Ｌｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を含む浴中に魚を浸漬させ、麻酔後にＣＣＤ画像化に付して、ルシフェラーゼ活性を評価する。
【０１０８】
結果を図１３に示す。
Ａ：ｉ：ｒＩＨＮＶＬＵＣ感染魚、ルシフェラーゼ基質浴、１：偽感染した魚、ルシフェラーゼ基質を含まない浴、２：偽感染した魚、ルシフェラーゼ基質浴、３：ｒＩＨＮＶ感染魚、ルシフェラーゼ基質浴、４：ｒＩＨＮＶＬＵＣ感染魚、ルシフェラーゼ基質を含まない浴。
Ｂ：ウミシイタケルシフェラーゼ基質セレンテラジンによるウミシイタケルシフェラーゼの酸化により生成される光の原画像。発光の強度は、生きたマスの体内におけるウミシイタケルシフェラーゼの発現レベルおよびＩＨＮＶ−ＬＵＣウイルスの複製と直接的に相関する。
Ｃ：画像Ａ上に重ね合わされた生物発光シグナル。
【０１０９】
実施例６：一つまたは三つの付加的なシストロンを含む組換えノビラブドウイルスの病原性
上記の実施例１で記載した通りに得られたノビラブドウイルスの病原性を、ニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｕｓ  ｍｙｋｉｓｓ）における実験的感染によって評価する。
【０１１０】
試験対象のウイルスは、以下の通りである。
ｒＩＨＮＶ：  ｗｔ
ｒＩＨＮＶ：  ６Ｋ−Ｅ１  ＳＤＶ
ｒＩＨＮＶ：  Ｅ３−Ｅ２  ＳＤＶ
ｒＩＨＮＶ：  Ｃａｐ−Ｅ３−Ｅ２  ＳＤＶ
ｒＩＨＮＶ：  Ｅ３−Ｅ２−６Ｋ−Ｅ１  ＳＤＶ
ｒＩＨＮＶ：  ＬＵＣＲＮ
ｒＩＨＮＶ：  Ｇ−ＶＳＨＶ
ｒＩＨＮＶ  ３Ｃ１：  ＨＡ／Ｆ５／ＬＵＣＲＮ；
ｒＩＨＮＶ  ３Ｃ２０：  ＨＡ／ＩＬＢ／ＬＵＣＲＮ；
ｒＩＨＮＶ  ３Ｃ１４：  ＨＡ／ＶＰ２／Ｃａｐ−Ｅ３−Ｅ２；
ｒＩＨＮＶ  ３Ｃ１５：  ＨＡ／ＶＰ２／Ｅ３−Ｅ２６ＫＥ１。
【０１１１】
マスの稚魚を、上記の実施例５で記載した手順に従って、５×１０４ＰＦＵ／ｍｌのこれらのウイルスのいずれかを用いた浴療法により感染させ、死亡率を観察する。
【０１１２】
結果を図１４に示す。
【０１１３】
これらの結果は、ウイルスの病原性が、付加的なシストロンの数と関連していることを示している。一つの付加的なシストロンが存在すると、大部分の場合において病原性のわずかなまたは中程度の減少が誘発されるにすぎないが、三つの付加的なシストロンが存在すると、病原活性の大幅な弱毒化が誘発される。
【０１１４】
実施例７：魚における本発明の組換えノビラブトウイルスのワクチン特性
三つの付加的なシストロンの存在により弱毒化した組換えウイルスをワクチン調製のために使用できるか否かを立証するために、病原性ＩＨＮＶウイルス分離株３２／８７を用いたその後の攻撃誘発（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）に対し稚魚を防御するそれらの能力を試験した。
【０１１５】
第一の実験では、実施例６で記載した病原性試験と同じ条件の下における、ｒＩＨＮＶ  ３Ｃ１、３Ｃ２０、３Ｃ１４または３Ｃ１５を用いた浴療法によって免疫化したマスの稚魚を、４６日後の浴療法または２ヵ月後の腹腔内注射によって、ＩＨＮＶ３２／８７で攻撃誘発する。５８日間にわたり、死亡率を観察する。
【０１１６】
浴療法による攻撃誘発：
ＩＨＮＶ  ３Ｃ１、３Ｃ２０、３Ｃ１４または３Ｃ１５を付与した後、または何も付与することなく、４６日後に魚を浴療法によって１０５ｐｆｕ／ｍｌのＩＨＮＶ３２／８７で感染させる。
【０１１７】
注射による攻撃誘発：
ＩＨＮＶ  ３Ｃ１または偽免疫のいずれかを付与してから２ヵ月後に、ワクチン候補の組換え体である２０匹のマス稚魚のバッチを、腹腔内注射により病原性ＩＨＮＶウイルス分離株３２／８７（魚一匹あたり１０６ｐｆｕ）で攻撃誘発する。
【０１１８】
結果を図１５に示す。
【０１１９】
浴療法による攻撃誘発の場合には、ＩＨＮＶ  ３Ｃ１、３Ｃ２０、３Ｃ１４または３Ｃ１５で免疫化され攻撃誘発を受けたマスの１００％、そしてＩＨＮＶ  ３Ｃ２０で免疫化されたマスの９８％がこの攻撃誘発後生存し、一方、偽免疫を受けたマスでは２０％しか生存しない。
【０１２０】
注射による攻撃誘発の場合、ＩＨＮＶ  ３Ｃ１で免疫化され攻撃誘発を受けたマスの１００％が生存し、偽免疫を受けたマスでは６％しか生存しない。
【０１２１】
実施例８：哺乳動物種におけるワクチンベクターとしての組換えＩＨＮＶ系の使用
さまざまな種に由来する培養細胞物における組換えＩＨＮＶの複製
ＥＰＣ細胞ならびにさまざまな高等脊椎動物種由来の細胞（ヒト肺上皮細胞Ａ５４９、ブタ腎細胞ＰＫ１５、ウサギ腎細胞ＲＫ１３、マウス線維芽細胞３Ｔ３、腸ニワトリ胚細胞ＣＥＶ−Ｉ（ＡＴＣＣＣＲＬ１０４９５））を、高い感染多重度（５ＰＦＵ／細胞）で組換えＩＨＮＶ−ＬＵＣで感染させる。１４℃および２８℃で３日間細胞をインキュベートする。
【０１２２】
インキュベーション時間の終了時に、メーカーの手順に従って、発光測定装置およびＲｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（ウミシイタケルシフェラーゼアッセイシステム）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ルシフェラーゼ発現を測定する。
【０１２３】
結果を図１６に示す。
【０１２４】
ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）でＹ軸に表す光強度は、細胞溶解物内のルシフェラーゼ濃度、ひいてはウイルス複製に比例している。
【０１２５】
非感染細胞において検出される発光は、ウミシイタケ基質セレンテラジンの非酵素酸化により生じるバックグラウンドの発光に対応する。
【０１２６】
これらの結果は、魚細胞ＥＰＣにおける複製と比べて、組換えＩＨＮＶ−ＬＵＣの有意な複製が１４℃で複数の細胞系において確かに生じているということを示している。しかしながら２８℃では、ＥＰＣ細胞を含む試験対象の細胞は、ＩＨＮＶ−ＬＵＣウイルスを複製することができない。
【０１２７】
マウスにおけるインビボでの組換えＩＨＮＶの投与
生きた哺乳動物におけるＩＨＮＶの複製を試験するために、大量の組換えＩＨＮＶ−ＬＵＣウイルス（５・１０８ｐｆｕ／マウス）をマウスに接種する。
【０１２８】
接種から２８日後に、マウスの血清におけるルシフェラーゼ活性を確認する。いかなるルシフェラーゼ活性も検出されず、細胞培養において得られた結果が裏付けられる。
【０１２９】
かくして、ＩＨＮＶは、実際に、高等脊椎動物において天然に不活性化されるウイルスである。
【０１３０】
第二の実験においては、１５頭のマウスに組換えＩＨＮＶ  ３Ｃ１（ＨＡ／Ｆ５／ＬＵＣ）（マウス１頭あたり精製されたウイルス１μｇ）を皮内接種し、５頭の対照マウスにはＴＮＥ緩衝液を与える。接種から４週間後に、接種を受けたマウス由来の血清を、精製されたＩＨＮウイルスがコーティングされたプレートでのＥＬＩＳＡ試験を用いて、野生型ＩＨＮウイルスに対する抗体応答の存在について試験した。
【０１３１】
組換えＩＨＮＶ  ３Ｃ１を接種した１５頭中１５頭のマウスがＩＨＮＶについて血清反応陽性であり、対照群の５頭のマウスはいずれも血清反応陽性ではなかった。
【０１３２】
さらに、１／５００に希釈した組換えＩＨＮＶ  ３Ｃ１を接種したマウスのうち１頭の血清を、ＩＳＡＶ感染細胞の溶解物、偽感染細胞の溶解物、および組換えＩＨＮＶ−ＨＡの全タンパク質抽出物に対してウェスタンブロット法において試験した。
【０１３３】
対照として、１／５００に希釈したＩＳＡＶのＨＡ糖タンパク質に対するポリクローナル抗体を、同じ抗原に対しウェスタンブロット法において試験した。
【０１３４】
結果を図１７に示す。
Ａ：ＩＳＡＶのＨＡ糖タンパク質に対するポリクローナル抗体でのウェスタンブロット法、
Ｂ：組換えＩＨＮＶ  ３Ｃ１を接種したマウスの血清でのウェスタンブロット法。
【０１３５】
これらの結果は、接種したマウスの血清が、ＩＨＮＶ  ３Ｃ１の異なるタンパク質に対する抗体を含み、特にＩＳＡウイルスのＨＡ糖タンパク質に対する抗体を含むことを示している。
【０１３６】
かくしてＩＨＮＶ系は、さまざまな病原体に対する哺乳類種のワクチン接種のための、天然の形態で安全に提示される高レベルの抗原を経済的に生産する可能性を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０１３７】
【特許文献１】ＰＣＴ国際公開第０３／０９７０９０号パンフレット
【非特許文献】
【０１３８】
【非特許文献１】ＢＩＡＣＣＨＥＳＩら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、第７４号、１１２４７〜５３頁、２０００年
【非特許文献２】ＴＨＯＵＬＯＵＺＥら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、第７８号、４０９８〜１０７頁、２００４年
【非特許文献３】ＢＩＡＣＣＨＥＳＩら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、第７６号、２８８１〜９頁、２００２年
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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