(57)【要約】  本発明は、ＩＧＦからのＥ−ペプチドの天然の生理的切断が妨げられる、ＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２配列及びＥ−ペプチド配列を有する安定化されたポリペプチドに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼによるＩＧＦ−１からのＥ−ペプチドの切断が、非ヒト動物ＩＧＦ−１前駆タンパク質の修飾により減少する、非ヒト動物ＩＧＦ−１前駆タンパク質を含むポリペプチド。
【請求項２】
非ヒト動物ＩＧＦ−１前駆タンパク質が非ヒト脊椎動物種由来である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
非ヒト脊椎動物種が、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、鳥類、イヌ、ネコ又は魚類から選択される、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前駆タンパク質がＥａペプチドを含む、請求項１から請求項３の何れか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
Ｅａペプチドが図８Ａの非ヒト動物配列から選択される、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前駆タンパク質がＥｂペプチドを含む、請求項１から請求項３の何れか１項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
Ｅｂペプチドが図９Ａの非ヒト動物配列から選択される、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
Ｅｂの最後の７個のＣ末端アミノ酸が欠失している、請求項６又は請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前駆タンパク質がＥｃペプチドを含む、請求項１から請求項３の何れか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
Ｅｃが図１０Ａの非ヒト動物配列から選択される、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前駆タンパク質のＧ１が欠失している又は変異させられている、請求項１から請求項１０の何れかに記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前駆タンパク質のＰ２が欠失している又は変異させられている、請求項１から請求項１１の何れかに記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前駆タンパク質のＥ３が欠失している又は変異させられている、請求項１から請求項１２の何れかに記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前駆タンパク質のＲ３６が欠失している又は変異させられている、請求項１から請求項１３の何れかに記載のポリペプチド。
【請求項１５】
Ｒ３６がアラニンに変異させられている、請求項１から請求項１４の何れかに記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前駆タンパク質のＲ３７が欠失している又は変異させられている、請求項１から請求項１５の何れかに記載のポリペプチド。
【請求項１７】
Ｒ３７がアラニンに変異させられている、請求項１から請求項１６の何れかに記載のポリペプチド。
【請求項１８】
Ｎ−結合型グリコシル化コンセンサス配列ＮＸＳ／Ｔをさらに含む、請求項１から請求項１７の何れかに記載のポリペプチド。
【請求項１９】
Ｅｂのアミノ酸Ｎ９５とＴ９６との間に挿入されたＥａのアミノ酸９３−１０２をさらに含む、請求項６に記載のＥｂポリペプチド。
【請求項２０】
前駆タンパク質のアミノ酸側鎖に共有結合されたオリゴ糖をさらに含む、請求項１から請求項１９の何れかに記載のポリペプチド。
【請求項２１】
前駆タンパク質のアルギニン側鎖にオリゴ糖が共有結合されている、請求項２０に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
前駆タンパク質の残基が非天然アミノ酸により置換されている、請求項１から請求項２１の何れかに記載のポリペプチド。
【請求項２３】
非天然アミノ酸がアセチレン又はアジド基を含む、請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
前駆タンパク質の側鎖に共有結合されているポリ（エチレングリコール）部分をさらに含む、請求項１から請求項２３の何れかに記載のポリペプチド。
【請求項２５】
前駆タンパク質のＣ末端に連結されているさらなるＥ−ペプチドをさらに含む、請求項１から請求項２４の何れかに記載のポリペプチド。
【請求項２６】
Ｎ末端からＣ末端までにて、
第一のＥｂペプチドを含むＩＧＦ−１前駆タンパク質（このタンパク質中、Ｇ１、Ｐ１及びＥ１が欠失しており、Ｒ３６及びＲ３７が欠失しており、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、第一のＥｂペプチドの最後の７個のＣ末端アミノ酸が欠失している。）と；
第二のＥｂペプチド（このペプチド中、Ｒ７１、Ｓ７２及び第二のＥｂペプチドの最後の７個のＣ末端アミノ酸が欠失している。）と；
第三のＥｂペプチド（このペプチド中、Ｒ７１、Ｓ７２及び第三のＥｂペプチドの最後の７個のＣ末端アミノ酸が欠失している。）と；及び
第四のＥｂペプチド（このペプチド中、Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。）と、
を含むポリペプチド。
【請求項２７】
前駆タンパク質のＲ７１又はＳ７２が欠失している又は変異させられている、請求項１から請求項２６の何れかに記載のポリペプチド。
【請求項２８】
プロテアーゼによるＩＧＦ−２からのＥ−ペプチドの切断が、非ヒト動物ＩＧＦ−２前駆タンパク質の修飾により減少する、非ヒト動物ＩＧＦ−２前駆タンパク質を含むポリペプチド。
【請求項２９】
非ヒト脊椎動物種が、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、鳥類、イヌ、ネコ又は魚類から選択される、請求項２８に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
前駆タンパク質がＩＧＦ−２のＥペプチドを含む、請求項２８から請求項３９の１項に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
Ｅペプチドが図１２Ａからの配列から選択される、請求項３０に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
前駆タンパク質のＲ６８又はＤ６９が欠失している又は変異させられている、請求項２８から請求項３２の何れか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
請求項１から請求項３２の何れか１項に記載の本発明のポリペプチドの有効量を投与することを含む、非ヒト動物における成長の速度及び／又は程度を促進する方法。
【請求項３４】
非ヒト動物が、ブタ、ウシ、ヒツジ、家禽及び魚類を含む食肉生産動物である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１から請求項３２の何れか１項に記載の本発明のポリペプチドの有効量を投与することを含む、非ヒト動物における食物の身体組織への変換の効率を促進する方法。
【請求項３６】
非ヒト動物が、ブタ、ウシ、ヒツジ、家禽及び魚類を含む食肉生産動物である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
請求項１から請求項３２の何れか１項に記載の本発明のポリペプチドの有効量を投与することを含む、非ヒト泌乳動物において乳汁産生を促進する方法。
【請求項３８】
非ヒト動物が乳牛、ブタ、ヒツジ及びヤギを含む泌乳動物である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
請求項１から請求項３２の何れか１項に記載の本発明のポリペプチドの有効量を投与することを含む、悪液質、外傷性傷害又は他の消耗疾患に付随する消耗性の症状に対して非ヒト動物を治療する方法。
【請求項４０】
非ヒトが、イヌ、ネコ及びウマを含むペット動物である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
請求項１から請求項３２の何れか１項に記載の本発明のポリペプチドの有効量を投与することを含む、新生仔の健康を増進するために非ヒト泌乳動物を処置する方法。
【請求項４２】
非ヒト動物が、乳牛、ブタ、ヒツジ及びヤギを含む泌乳動物である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
請求項３３から請求項４２の何れか１項に記載の方法における使用のための動物用組成物の製造のための、請求項１から請求項３２の何れか１項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項４４】
前記動物用組成物が、経口用ドレンチ、経口飼料に対するサプリメント又は固形飼料に対するサプリメントである、請求項４３に記載のポリペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（背景技術）
インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）は、細胞がこれら細胞の生理的環境と情報伝達をするために使用する複合系の一部である。この複合系（インスリン様増殖因子軸と呼ばれることが多い。）は、２つの細胞表面受容体（ＩＧＦ−１Ｒ及びＩＧＦ−２Ｒ）、２つのリガンド（ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２）、６個の高親和性ＩＧＦ結合タンパク質のファミリー（ＩＧＦＢＰ１−６）及び関連するＩＧＦＢＰ分解酵素（プロテアーゼ）からなる。この系は、正常な生理の制御だけでなく、多くの病理的状態に対しても重要である（Ｇｌａｓｓ、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ５：８７−９０、２００３）。
【０００２】
ＩＧＦ軸は、細胞増殖の促進及び細胞死（アポトーシス）の抑制に関与することが示されている。ＩＧＦ−１は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）による刺激の結果として、主に、肝臓により分泌される。ヒトの身体における殆ど全ての細胞、特に筋肉、軟骨、骨、肝臓、腎臓、神経、皮膚及び肺における細胞は、ＩＧＦ−１により影響を受ける。インスリン様の効果に加えて、ＩＧＦ−１はまた細胞増殖を制御することもできる。ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２は、ＩＧＦ結合タンパク質として知られる遺伝子産物のファミリーにより制御される。これらのタンパク質は、ＩＧＦ受容体への結合を妨害することによるＩＧＦ作用の阻害ならびに受容体への送達促進及び血流中のＩＧＦ半減期の延長を通じたＩＧＦ作用の促進の両方に関与する複合的な方法でＩＧＦ作用の調節に寄与する。特性が分かっている少なくとも６種類の結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ１−６）がある。
【０００３】
その成熟型において、ソマトメジンとも呼ばれるヒトＩＧＦ−１（ｇｐｅｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒｒａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａ；配列番号１）は、培養において幅広い範囲の細胞の増殖を刺激することが示されている７０アミノ酸の小タンパク質である。成熟タンパク質は、最初に、３つの既知のスプライシング変異ｍＲＮＡによりコードされる。各ｍＲＮＡのオープンリーディングフレームは、特定のＩＧＦ−１ｍＲＮＡに依存して、７０アミノ酸ＩＧＦ−１及びＣ末端の特定のＥ−ペプチドを含有する前駆タンパク質をコードする。これらのＥ−ペプチドは、Ｅａ（ｒｓｖｒａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ；配列番号２）、Ｅｂ（ｒｓｖｒａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｙｑｐｐｓｔｎｋｎｔｋｓｑｒｒｋｇｗｐｋｔｈｐｇｇｅｑｋｅｇｔｅａｓｌｑｉｒｇｋｋｋｅｑｒｒｅｉｇｓｒｎａｅｃｒｇｋｋｇｋ；配列番号３）及びＥｃ（ｒｓｖｒａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｙｑｐｐｓｔｎｋｎｔｋｓｑｒｒｋｇｓｔｆｅｅｒｋ；配列番号４）ペプチドと呼ばれ、３５から８７アミノ酸長の範囲であり、Ｎ末端において共通配列領域及びＣ末端において可変配列領域を含む。例えば、ＩＧＦ−１−Ｅａに対する野生型オープンリーディングフレームは、１０５アミノ酸（ｇｐｅｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒｒａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａ  ｒｓｖｒａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ；配列番号５）のポリペプチドをコードする。生理的発現において、Ｅ−ペプチドは、内在性プロテアーゼにより前駆体から切断され、生物活性があることが知られている成熟７０アミノ酸ＩＧＦ−１が生じる。ある種の関連において、ＩＧＦ−１のＮ末端アミノ酸の１から３個は生理的条件下で切断され、これにより６７−７０の間のアミノ酸を有する活性型ＩＧＦ−１が生じることが知られている。ヒトＩＧＦ−２に対する１つのＥ−ペプチド
【０００４】
【化１】
2009539805.tif 000002
のみが１５６アミノ酸前駆体
【０００５】
【化２】
2009539805.tif 000003
に対して確認されていることを除き、ＩＧＦ−２遺伝子発現及びプロセシングは同様の特性を特徴とする。ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２の両方は、患者の血清中で内在性プロテアーゼにより急速に分解されるので、優れた薬物候補とはならないと思われる。意図されているあるストラテジーは、ＩＧＦ−１の結合タンパク質の１つと複合体を形成することにより、薬物としてＩＧＦ−１を安定化することである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｇｌａｓｓ、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ５：８７−９０、２００３
【発明の概要】
【０００７】
発明の要旨
本発明は、このＥ−ペプチドを実質的に含有する前駆ＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２タンパク質が生物活性を有し、血清の存在下で安定化され、その結果、医薬品として有用であるＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２ポリペプチドが得られるという事実に基づく。本発明の組成物において、例えば、Ｅ−ペプチドの位置１のアルギニン又は位置２のセリン（野生型前駆ＩＧＦ−１における位置７１及び７２に対応する。）の何れかの変異又は欠失によって、ＩＧＦ−１からのＥ−ペプチドの通常の切断が回避される。ＩＧＦ−２において、例えば、Ｅ−ペプチドの位置１のアルギニン又は位置２のアスパラギン酸（野生型前駆ＩＧＦ−２における位置６８及び６９に対応する。）の何れかの変異又は欠失によって、切断が回避される。ＩＧＦ前駆タンパク質の他の修飾によって、この切断を回避又は減少させることができる。
【０００８】
さらに、ＩＧＦ−１前駆アミノ酸配列のさらなる修飾は、さらなる医薬的有益性を与え得る。例えば、本発明のポリペプチドは、ＩＧＦ−１受容体に対する親和性の向上又は抑制性のＩＧＦ−１もしくはＩＧＦ−２結合タンパク質に対する結合能の低下を示し得る。
【０００９】
明確性及び一貫性のために、この明細書を通じて、及び特許請求の範囲において、ＩＧＦ−１もしくはＩＧＦ−２前駆体又は成熟タンパク質におけるアミノ酸残基の付番は、シグナルペプチドなしの野生型前駆タンパク質配列の付番に基づく。
【００１０】
従って、本発明は、プロテアーゼによるＩＧＦ−１からのＥ−ペプチドの切断がＩＧＦ−１前駆タンパク質の修飾により減少する、ＩＧＦ−１前駆タンパク質を含有するポリペプチドを含む。Ｅ−ペプチドは、Ｅａ、Ｅｂ又はＥｃペプチドであり得る。前駆体のＮ末端において、前駆タンパク質のアミノ酸Ｇ１、Ｐ２又はＥ３が、Ｒ３６（例えばＲ３６Ａ）及びＲ３７（例えばＲ３７Ａ）など、欠失又は変異させられ得る。
【００１１】
前駆タンパク質は、例えば、Ｅｂのアミノ酸Ｎ９５とＴ９６との間へのＥａのアミノ酸９３−１０２の挿入によって、Ｎ−結合型グリコシル化コンセンサス配列  ＮＸＳ／Ｔをさらに含み得る。一般に、前駆タンパク質は、前駆タンパク質のアルギニン側鎖など、前駆タンパク質のアミノ酸側鎖に共有結合されたオリゴ糖を含み得る。
【００１２】
さらに、非天然アミノ酸（例えば、アセチレン又はアジド基を含むもの）により前駆タンパク質の残基を置換することができる。このような非天然アミノ酸は、前駆タンパク質の側鎖へのポリ（エチレングリコール）部分の連結を促進することができる。通常のタンパク質ＰＥＧ化ストラテジーは当技術分野で周知である。
【００１３】
前駆タンパク質は、前駆タンパク質のＣ末端に連結された１以上のさらなるＥ−ペプチドをさらに含み得る。例えば、ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端まで、（１）第一のＥｂペプチドを有するＩＧＦ−１前駆タンパク質（このタンパク質中、Ｇ１、Ｐ１及びＥ１が欠失しており、Ｒ３６もしくはＲ３７の何れか又は両方が変異しており、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、第一のＥｂペプチドの最後の７個のＣ末端アミノ酸が欠失している。）；（２）第二のＥｂペプチド（このペプチド中、Ｒ７１、Ｓ７２及び第二のＥｂペプチドの最後の７個のＣ末端アミノ酸が欠失している。）；（３）第三のＥｂペプチド（このペプチド中、Ｒ７１、Ｓ７２及び第三のＥｂペプチドの最後の７個のＣ末端アミノ酸が欠失している。）；及び（４）第四のＥｂペプチド（このペプチド中、Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。）を含み得る。
【００１４】
ＩＧＦ−１からのＥ−ペプチドの切断を妨害する効率的な手段は、Ｒ７１又はＳ７２の欠失又は変異である。
【００１５】
同様に、本発明は、プロテアーゼによるＩＧＦ−２からのＥ−ペプチドの切断が、ＩＧＦ−２前駆タンパク質の修飾により減少する、ＩＧＦ−２前駆タンパク質を含む。特に、Ｒ６８又はＤ６９の欠失又は変異は、ＩＧＦ−２前駆タンパク質のプロテアーゼ消化を回避する有効な手段であり得る。
【００１６】
さらに、本明細書中に記載の有益性を与えるために、ＩＧＦ−１の何れかのＥ−ペプチドをＩＧＦ−２と組み合わせることができ、ＩＧＦ−２の何れかのＥ−ペプチドをＩＧＦ−１と組み合わせることができる。
【００１７】
本発明は、さらに、本発明のポリペプチドの治療的有効量を投与することにより、筋骨格疾患、糖尿病、神経細胞死を治療する方法を含む。同様に、本発明は、筋骨格疾患、糖尿病、神経細胞死又は貧血の治療用の医薬品の製造のための本発明のポリペプチドの使用を含む。
【００１８】
別の実施形態において、本発明は、Ｅ−ペプチドがないが、ＰＥＧ化の部位として非天然アミノ酸がそこに導入されている、ＰＥＧ化ＩＧＦ−１を含む。Ｅ−ペプチドがない、本明細書中に記載のような、非天然アミノ酸を含有する何れの修飾ＰＥＧ化ＩＧＦ−１もまた本発明に含まれる。
【００１９】
本発明はまた、所望の効果を得るために本発明のポリペプチドの有効量を投与する、獣医学の方法及び使用も含む。
【００２０】
獣医学での使用は、（ｉ）動物における増殖の速度及び／又は程度を促進すること、（ｉｉ）食物の身体組織への変換の効率を促進すること、（ｉｉｉ）泌乳動物において乳汁産生を促進すること、（ｉｖ）悪液質、外傷性傷害又は他の消耗疾患に付随する消耗性の症状に対して動物を治療すること及び（ｖ）新生仔の健康を増進するために泌乳非ヒト動物を処置することを含む。
【００２１】
全ての引用参考文献又は書類は、参照により本明細書中に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１Ａ−１Ｃは、１０％ヒト血清の存在下又は非存在下で３７℃にて０又は１６時間温置した後の、本発明のポリペプチド及び野生型ＩＧＦ−１前駆体のウエスタンブロットである。様々なＩＧＦ−１コンストラクトをコードする発現ベクターをＣｏｓ７細胞へと遺伝子移入し、条件培養液を得た。「３ｍｕｔ」は、次の３セットの修飾：Ｇ１、Ｇ２及びＥ３の欠失；ＡｌａへのＡｒｇ３７の変異（Ｒ３７Ａ）；及びＲ７１及びＳ７２の欠失を有する、ｈＩＧＦ−１−Ｅ−ペプチド前駆体を指す。図１Ａは、Ｅａを含有する、野生型及び３ｍｕｔ前駆体に対する（ＩＧＦ−１に対する抗体を用いた）ウエスタンブロットの結果を示す。図１Ｂは、Ｅｂを含有する、野生型及び３ｍｕｔ前駆体に対する（ｈＩＧＦ−１に対する抗体を用いた）ウエスタンブロットの結果を示す。図１Ｃは、Ｅｃを含有する、野生型及び３ｍｕｔ前駆体に対する（ｈＩＧＦ−１に対する抗体を用いた）ウエスタンブロットの結果を示す。
【図２Ａ】図２Ａ−２Ｄは、様々なＩＧＦ−１ポリペプチド（「リガンド」））の生物学的活性を示す線グラフである。Ｃｏｓ７により発現されたポリペプチドによるＣ２Ｃ１２筋芽細胞の刺激により、生物学的活性を測定した。次に、総ＡＫＴ及びリン酸化ＡＫＴの相対量について、刺激したＣ２Ｃ１２細胞をアッセイした。Ｌｏｎｇ−Ｒ３−ＩＧＦ−１は、Ｅ３Ｒ変異及びさらなる１３アミノ酸のＮ末端延長ペプチドを有する成熟ヒトＩＧＦ−１アミノ酸配列からなる市販の試薬（Ｓｉｇｍａ製品番号１−１２７１）である。図２ＡはＩＧＦ−１−Ｅａ３ｍｕｔの活性を示す。図２ＢはＩＧＦ−１−Ｅｂ３ｍｕｔの活性を示す。図２Ｃは、ＩＧＦ−１−Ｅａｂ３ｍｕｔ（Ｅａアミノ酸９３から１０２がＥｂのアミノ酸９５と９６との間に挿入されている、３ｍｕｔコンストラクト）の活性を示す。図２Ｄは、ＩＧＦ−１−Ｅｃ３ｍｕｔの活性を示す。
【図２Ｂ】図２Ａ−２Ｄは、様々なＩＧＦ−１ポリペプチド（「リガンド」））の生物学的活性を示す線グラフである。Ｃｏｓ７により発現されたポリペプチドによるＣ２Ｃ１２筋芽細胞の刺激により、生物学的活性を測定した。次に、総ＡＫＴ及びリン酸化ＡＫＴの相対量について、刺激したＣ２Ｃ１２細胞をアッセイした。Ｌｏｎｇ−Ｒ３−ＩＧＦ−１は、Ｅ３Ｒ変異及びさらなる１３アミノ酸のＮ末端延長ペプチドを有する成熟ヒトＩＧＦ−１アミノ酸配列からなる市販の試薬（Ｓｉｇｍａ製品番号１−１２７１）である。図２ＡはＩＧＦ−１−Ｅａ３ｍｕｔの活性を示す。図２ＢはＩＧＦ−１−Ｅｂ３ｍｕｔの活性を示す。図２Ｃは、ＩＧＦ−１−Ｅａｂ３ｍｕｔ（Ｅａアミノ酸９３から１０２がＥｂのアミノ酸９５と９６との間に挿入されている、３ｍｕｔコンストラクト）の活性を示す。図２Ｄは、ＩＧＦ−１−Ｅｃ３ｍｕｔの活性を示す。
【図２Ｃ】図２Ａ−２Ｄは、様々なＩＧＦ−１ポリペプチド（「リガンド」））の生物学的活性を示す線グラフである。Ｃｏｓ７により発現されたポリペプチドによるＣ２Ｃ１２筋芽細胞の刺激により、生物学的活性を測定した。次に、総ＡＫＴ及びリン酸化ＡＫＴの相対量について、刺激したＣ２Ｃ１２細胞をアッセイした。Ｌｏｎｇ−Ｒ３−ＩＧＦ−１は、Ｅ３Ｒ変異及びさらなる１３アミノ酸のＮ末端延長ペプチドを有する成熟ヒトＩＧＦ−１アミノ酸配列からなる市販の試薬（Ｓｉｇｍａ製品番号１−１２７１）である。図２ＡはＩＧＦ−１−Ｅａ３ｍｕｔの活性を示す。図２ＢはＩＧＦ−１−Ｅｂ３ｍｕｔの活性を示す。図２Ｃは、ＩＧＦ−１−Ｅａｂ３ｍｕｔ（Ｅａアミノ酸９３から１０２がＥｂのアミノ酸９５と９６との間に挿入されている、３ｍｕｔコンストラクト）の活性を示す。図２Ｄは、ＩＧＦ−１−Ｅｃ３ｍｕｔの活性を示す。
【図２Ｄ】図２Ａ−２Ｄは、様々なＩＧＦ−１ポリペプチド（「リガンド」））の生物学的活性を示す線グラフである。Ｃｏｓ７により発現されたポリペプチドによるＣ２Ｃ１２筋芽細胞の刺激により、生物学的活性を測定した。次に、総ＡＫＴ及びリン酸化ＡＫＴの相対量について、刺激したＣ２Ｃ１２細胞をアッセイした。Ｌｏｎｇ−Ｒ３−ＩＧＦ−１は、Ｅ３Ｒ変異及びさらなる１３アミノ酸のＮ末端延長ペプチドを有する成熟ヒトＩＧＦ−１アミノ酸配列からなる市販の試薬（Ｓｉｇｍａ製品番号１−１２７１）である。図２ＡはＩＧＦ−１−Ｅａ３ｍｕｔの活性を示す。図２ＢはＩＧＦ−１−Ｅｂ３ｍｕｔの活性を示す。図２Ｃは、ＩＧＦ−１−Ｅａｂ３ｍｕｔ（Ｅａアミノ酸９３から１０２がＥｂのアミノ酸９５と９６との間に挿入されている、３ｍｕｔコンストラクト）の活性を示す。図２Ｄは、ＩＧＦ−１−Ｅｃ３ｍｕｔの活性を示す。
【図３Ａ】図３Ａ−３Ｄ及び図４Ａ−４Ｄは、リガンド結合に反応する受容体リン酸化についてアッセイすることによって、本発明のＩＧＦ−１前駆ポリペプチドが適切な受容体に対する選択性を維持するか否かを示す線グラフである。図３Ａ及び図３Ｂは、ＩＧＦ−１受容体（図３Ａ）及びインスリン受容体（図３Ｂ）に対する、ＩＧＦ−１−Ｅａ３ｍｕｔの受容体選択性を試験する。図３Ｃ及び３Ｄは、ＩＧＦ−１受容体（図３Ｃ）及びインスリン受容体（図３Ｄ）に対する、ＩＧＦ−１−Ｅｂ３ｍｕｔの受容体選択性を試験する。
【図３Ｂ】図３Ａ−３Ｄ及び図４Ａ−４Ｄは、リガンド結合に反応する受容体リン酸化についてアッセイすることによって、本発明のＩＧＦ−１前駆ポリペプチドが適切な受容体に対する選択性を維持するか否かを示す線グラフである。図３Ａ及び図３Ｂは、ＩＧＦ−１受容体（図３Ａ）及びインスリン受容体（図３Ｂ）に対する、ＩＧＦ−１−Ｅａ３ｍｕｔの受容体選択性を試験する。図３Ｃ及び３Ｄは、ＩＧＦ−１受容体（図３Ｃ）及びインスリン受容体（図３Ｄ）に対する、ＩＧＦ−１−Ｅｂ３ｍｕｔの受容体選択性を試験する。
【図３Ｃ】図３Ａ−３Ｄ及び図４Ａ−４Ｄは、リガンド結合に反応する受容体リン酸化についてアッセイすることによって、本発明のＩＧＦ−１前駆ポリペプチドが適切な受容体に対する選択性を維持するか否かを示す線グラフである。図３Ａ及び図３Ｂは、ＩＧＦ−１受容体（図３Ａ）及びインスリン受容体（図３Ｂ）に対する、ＩＧＦ−１−Ｅａ３ｍｕｔの受容体選択性を試験する。図３Ｃ及び３Ｄは、ＩＧＦ−１受容体（図３Ｃ）及びインスリン受容体（図３Ｄ）に対する、ＩＧＦ−１−Ｅｂ３ｍｕｔの受容体選択性を試験する。
【図３Ｄ】図３Ａ−３Ｄ及び図４Ａ−４Ｄは、リガンド結合に反応する受容体リン酸化についてアッセイすることによって、本発明のＩＧＦ−１前駆ポリペプチドが適切な受容体に対する選択性を維持するか否かを示す線グラフである。図３Ａ及び図３Ｂは、ＩＧＦ−１受容体（図３Ａ）及びインスリン受容体（図３Ｂ）に対する、ＩＧＦ−１−Ｅａ３ｍｕｔの受容体選択性を試験する。図３Ｃ及び３Ｄは、ＩＧＦ−１受容体（図３Ｃ）及びインスリン受容体（図３Ｄ）に対する、ＩＧＦ−１−Ｅｂ３ｍｕｔの受容体選択性を試験する。
【図４Ａ】図４Ａ及び４Ｂは、ＩＧＦ−１受容体（図４Ａ）及びインスリン受容体（図４Ｂ）に対する、ＩＧＦ−１−Ｅｃ３ｍｕｔの受容体選択性を試験する。図４Ｃ及び４Ｄは、ＩＧＦ−１受容体（図４Ｃ）及びインスリン受容体（図４Ｄ）に対する、ＩＧＦ−１−Ｅａｂ３ｍｕｔの受容体選択性を試験する。「ＩＧＦ１−Ｒ３」は、上述のＬｏｎｇ−Ｒ３−ＩＧＦ−１を指す。「ＩＧＦ１Ｅａｂ」として挙げられたポリペプチドは、Ｅａアミノ酸９３から１０２がＥｂのアミノ酸９５と９６との間に挿入されたコンストラクトを指す。
【図４Ｂ】図４Ａ及び４Ｂは、ＩＧＦ−１受容体（図４Ａ）及びインスリン受容体（図４Ｂ）に対する、ＩＧＦ−１−Ｅｃ３ｍｕｔの受容体選択性を試験する。図４Ｃ及び４Ｄは、ＩＧＦ−１受容体（図４Ｃ）及びインスリン受容体（図４Ｄ）に対する、ＩＧＦ−１−Ｅａｂ３ｍｕｔの受容体選択性を試験する。「ＩＧＦ１−Ｒ３」は、上述のＬｏｎｇ−Ｒ３−ＩＧＦ−１を指す。「ＩＧＦ１Ｅａｂ」として挙げられたポリペプチドは、Ｅａアミノ酸９３から１０２がＥｂのアミノ酸９５と９６との間に挿入されたコンストラクトを指す。
【図４Ｃ】図４Ａ及び４Ｂは、ＩＧＦ−１受容体（図４Ａ）及びインスリン受容体（図４Ｂ）に対する、ＩＧＦ−１−Ｅｃ３ｍｕｔの受容体選択性を試験する。図４Ｃ及び４Ｄは、ＩＧＦ−１受容体（図４Ｃ）及びインスリン受容体（図４Ｄ）に対する、ＩＧＦ−１−Ｅａｂ３ｍｕｔの受容体選択性を試験する。「ＩＧＦ１−Ｒ３」は、上述のＬｏｎｇ−Ｒ３−ＩＧＦ−１を指す。「ＩＧＦ１Ｅａｂ」として挙げられたポリペプチドは、Ｅａアミノ酸９３から１０２がＥｂのアミノ酸９５と９６との間に挿入されたコンストラクトを指す。
【図４Ｄ】図４Ａ及び４Ｂは、ＩＧＦ−１受容体（図４Ａ）及びインスリン受容体（図４Ｂ）に対する、ＩＧＦ−１−Ｅｃ３ｍｕｔの受容体選択性を試験する。図４Ｃ及び４Ｄは、ＩＧＦ−１受容体（図４Ｃ）及びインスリン受容体（図４Ｄ）に対する、ＩＧＦ−１−Ｅａｂ３ｍｕｔの受容体選択性を試験する。「ＩＧＦ１−Ｒ３」は、上述のＬｏｎｇ−Ｒ３−ＩＧＦ−１を指す。「ＩＧＦ１Ｅａｂ」として挙げられたポリペプチドは、Ｅａアミノ酸９３から１０２がＥｂのアミノ酸９５と９６との間に挿入されたコンストラクトを指す。
【図５】図５は、様々なリガンドによる（Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞の３から４日の分化の結果としての）Ｃ２Ｃ１２筋管の刺激における相対的ＡＫＴリン酸化を示すウエスタンブロットである。ＩＧＦ−１Ｅｂ−マルチマーは、図６Ａで図式的に示されるコンストラクトを指す。
【図６】図６Ａ及び６Ｂは、本発明の２つのポリペプチドの概略図である。図６Ａは、４セットの修飾：Ｇ１、Ｇ２及びＥ３の欠失；Ｒ３７のＡへの変異；Ｒ７１及びＳ７２の欠失；及び最後の７個のＣ末端アミノ酸の欠失を有するＩＧＦ−１−Ｅｂ前駆ポリペプチドを示す。さらに、本ポリペプチドのＣ末端での、２個のさらなるＥｂペプチドの付加（しかしＲ７１及びＳ７２はなく、最後の７個のＣ末端アミノ酸がない。）及び最後のＥｂペプチドの付加（しかしＲ７１及びＳ７２がない。）により、本ポリペプチドを長くする。このコンストラクトはＩＧＦ−１−Ｅｂマルチマーと呼ぶことが多い。図６Ｂは、４セットの修飾：Ｇ１、Ｐ２及びＥ３の欠失；Ｒ３７のＡへの変異；Ｒ７１及びＳ７２の欠失；及びＥｂのアミノ酸９５と９６との間へのＥａアミノ酸９３から１０２の挿入があるＩＧＦ−１−Ｅａｂ前駆ポリペプチドを示す。
【図７Ａ】図７Ａは、対応する動物ＩＧＦ−１とのヒトＩＧＦ−１（配列番号１）の配列アラインメントである。分析した全ての動物種及びその配列に対するそれらの対応するＧｅｎＢａｎｋ登録番号を与える。コチョウザメ（Ｓ２はＰ２に取って代わる。）を除く分析した全ての種においてＧ１、Ｐ２、Ｅ３は保存されている。Ｒ３６及びＲ３７は分析した全ての種において保存されている。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ヒトＩＧＦ−１（配列番号１）と比較した、分析したアミノ酸配列の系統発生を示すグラフである。系統樹の下は、タンパク質配列に対する１００残基あたりの「アミノ酸置換」の数を示すスケールである。非ギャップミスマッチの数からの、サイレント置換について補正された距離値を計算するために、Ｋｉｍｕｒａの距離式を使用する。計算した値は、部位あたりの相違数の平均数であり、０から１の間となる。０は完全に同一であることを表し、１は同一性がないことを表す。系統樹のスケールは、これらの値に１００を掛けたものを使用する。
【図８Ａ】図８Ａは、様々な動物ＥａペプチドとのヒトＥａペプチド（配列番号２）の配列アラインメントである。分析した全動物種及びその配列に対するそれらの対応するＧｅｎＢａｎｋ登録番号を与える。Ｒ７１及びＳ７２は分析した全ての種で保存されている。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ヒトＩＧＦ−１  Ｅａペプチド（配列番号２）と比較した、分析したアミノ酸配列の系統発生を示すグラフである。
【図９Ａ】図９Ａは、様々な動物ＥｂペプチドとのヒトＥｂペプチド（配列番号３）の配列アラインメントである。分析した全動物種及びその配列に対するそれらの対応するＧｅｎＢａｎｋ登録番号を与える。Ｒ７１及びＳ７２は分析した全ての種で保存されている。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ヒトＩＧＦ−１  Ｅｂペプチド（配列番号３）と比較した、分析したアミノ酸配列の系統発生を示すグラフである。
【図１０Ａ】図１０Ａは、様々な動物ＥｃペプチドとのヒトＥｃペプチド（配列番号４）の配列アラインメントである。分析した全動物種及びその配列に対するそれらの対応するＧｅｎＢａｎｋ登録番号を与える。Ｒ７１及びＳ７２は分析した全ての種で保存されている。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ヒトＩＧＦ−１  Ｅｃペプチド（配列番号４）と比較した、分析したアミノ酸配列の系統発生を示すグラフである。
【図１１Ａ】図１１Ａは、対応する動物ＩＧＦ−２とのヒトＩＧＦ−２（配列番号７）の配列アラインメントである。分析した全動物種及びその配列に対するそれらの対応するＧｅｎＢａｎｋ登録番号を与える。Ｒ６８は分析した全ての種で保存されており；Ｄ６９はチンパンジー（その位置はヒスチジン残基になっている。）を除き保存されている。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ヒトＩＧＦ−２（配列番号７）と比較した、分析したアミノ酸配列の系統発生を示すグラフである。
【図１２Ａ】図１２Ａは、様々な動物ＩＧＦ−２Ｅ−ペプチドとのヒトＩＧＦ−２Ｅ−ペプチド（配列番号６）の配列アラインメントである。分析した全動物種及びその配列に対するそれらの対応するＧｅｎＢａｎｋ登録番号を与える。Ｒ６８は分析した全ての種で保存されており；Ｄ６９はチンパンジー（その位置はヒスチジン残基になっている。）を除き保存されている。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ヒトＩＧＦ−２Ｅペプチド（配列番号６）と比較した、分析したアミノ酸配列の系統発生を示すグラフである。
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明は、活性型ＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２をそのＥ−ペプチドから放出することに関与する典型的なプロテアーゼ切断を妨害、減少又は回避するために修飾されているＥ−ペプチドを実質的に含有する新規のＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２前駆ポリペプチドに関する。本発明のポリペプチドの有用性は、このような前駆ポリペプチドが生物学的に活性であり、安定であり、医薬品として有益であるという驚くべき発見に基づく。
【００２４】
活性ＩＧＦ前駆ポリペプチドについてのスクリーニング
次のアッセイを用いて本発明の何れかのポリペプチドの有用性を評価することができる。
【００２５】
安定性
本発明のポリペプチドは、有効な薬物であるために、ヒト血清中など、内在性プロテアーゼ存在下で十分な安定性を有しなければならない。安定性を評価するために、１０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ培地中で本ポリペプチドをコードする発現ベクターをＣｏｓ７細胞（ＡＴＣＣ）に遺伝子移入することができる。分泌されたポリペプチドを含有する培地をさらなる分析に供する、又は、代って、この発現ベクターは、Ｃｏｓ７培養において発現されたポリペプチドの効率的な精製を促進するために、ポリペプチド中でヘキサ−ヒスチジンタグなどの容易に利用可能なタグをコードすることができる。いかに調製しても、ポリペプチド試料を正常ヒト血清（Ｓｉｇｍａ）又はＰＢＳ中で様々な時間（例えば、０、１、５、１０及び１６時間）温置し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、ニトロセルロース上にブロットし、ヒトＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２に対する一次抗体及び二次抗体（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ標識されたもの）を用いて関連のあるタンパク質を可視化する。いくつもの同様のブロッティング及び検出技術（蛍光色素又は放射性核種を使用するものものある。）を使用することができる。ＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２バンドの強度に対する前駆体バンドの強度から、様々な条件下で前駆ポリペプチドが切断される度合いが示されるはずである。本発明のポリペプチドが３７℃で１６時間ヒト血清に曝露されると、切断された成熟ＩＧＦに対する非切断前駆体の比が約１：２から１：０．１、例えば約１：１から１：０．５、特に約１：１の比又は約１：０．５の比となり得る。
【００２６】
ＡＫＴリン酸化
本発明のポリペプチドは、ＩＧＦ−１受容体を通じて信号を送る能力を維持しなければならない。（ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２の両者ともＩＧＦ−１受容体を通じて信号を送る。）。このシグナリング能を調べるために、下流の細胞内標的であるＡＫＴが細胞表面でのリガンド結合に反応してリン酸化されるか否かを評価することができる。ＡＫＴリン酸化の分析のために、血清不含培地中でＣ２Ｃ１２筋芽細胞を飢餓状態にし、次いで、様々なリガンドで刺激する。細胞を溶解し、遠心により透明化する。ＰａｔｈＳｃａｎ  ｐｈｏｓｐｈｏ  ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）サンドイッチＥＬＩＳＡキット及びＰａｔｈＳｃａｎ  ＡＫＴサンドイッチＥＬＩＳＡキット（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）をそれぞれ用いて、ＥＬＩＳＡによって、ＡＫＴリン酸化及び総ＡＫＴレベルを分析する。
【００２７】
ＩＧＦ−１受容体特異性
本発明のポリペプチドは、好ましくは、ＩＧＦ−１受容体に対して特異性を維持し、関連するインスリン受容体への結合は低親和性でなければならない。受容体特異性を評価するために、ＩＧＦ−１受容体又はインスリン受容体を過剰発現する血清飢餓状態のＮＩＨ３Ｔ３細胞にポリペプチド試料を添加し、細胞を溶解し、ＤｕｏＳｅｔ  ＩＣヒト蛍光体−ＩＧＦ−１受容体及びインスリン受容体ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたＥＬＩＳＡに溶解液を供することによって、ＩＧＦ−１受容体リン酸化又はインスリン受容体リン酸化のレベルを調べる。
【００２８】
肥大のマウスモデルにおけるインビボ試験
既に筋肉肥大が誘発されている状況下で本発明のポリペプチドが骨格筋量を増加させるように作用し得るか否かを調べるために、処置及び未処置動物を運動させ、本ポリペプチドを投与された動物の筋肉が未処置動物よりも大きくなるか否かを調べることができる。
【００２９】
運動モデル
当技術分野で公知のあるモデルは、使用者が荷重を変化させることができる自発運動用の回し車の使用に基づく（例えば、Ｋｏｎｈｉｌａｓら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２８９：Ｈ４５５−Ｈ４６５、２００５を参照。）。自発運動用かご型車輪は、強制運動モデルに共通する心身の損傷を排除し、従って、筋肉量の増加が所望される比較的健康な個体において使用される候補薬物を評価するのにより適している。
【００３０】
何れかの適切なマウス系統を使用することができる。例えば、雄Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウスを無作為に実験（例えばＩＧＦ前駆ポリペプチドを投与される。）及び対照群に振り分けることができる。運動用回し車を含むケージに動物を１匹ずつ収容し；あまり運動しない対照動物を回し車のない同一ケージに収容する。運動用回し車は、Ａｌｌｅｎら、Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ９０：１９００−１９０８、２００１に記載されている。簡潔に述べると、このシステムは、車輪の回転により起動されるデジタル電磁カウンタ（モデルＢＣ６００、Ｓｉｇｍａ  Ｓｐｏｒｔ、Ｏｌｎｅｙ、ＩＬ）を備えた５．０ｃｍの幅のランニング面のある１１．５ｃｍの直径の車輪（モデル６２０８、Ｐｅｔｓｍａｒｔ、Ｐｈｏｅｎｉｘ、ＡＺ）からなる。さらに、各車輪は、荷重の調整ができる抵抗機構により作製されている。これは、ステンレススチールの釣り糸をケージの上に連結し、車輪荷重に関与しないように、回転軸でケージ車輪に固定された固定滑車の周りにワイヤを巻きつけることにより行われる。このワイヤを再びスプリングと螺子でケージの上に固定する。この設計によって、車輪荷重を細かく調整することが可能となり、車輪荷重が車輪の回転全体に均一に分布される。運動期間の持続時間を通じて、各運動動物に対して、走った時間及び距離について毎日の運動値を記録する。全動物に水及び標準的な硬いげっ歯類用の餌を随意に給餌した。自発運動（かご型車輪を与えるもの）は、全群に対して約１２週齢の平均週齢で開始することができる。各群は、５０日間、動物が約１９週齢になるまで、実験群に依存して、様々な抵抗下で走行を続ける。車輪が僅かに動くまで車輪に既知の重量を吊り下げることにより、車輪の荷重を決定する。全ての運動群は、最初の週、かご型車輪に荷重をかけずに開始する。しかし、「荷重なし」状態は実際には２ｇであり、これは、車輪内部及び摩擦荷重を維持するのに必要な荷重として測定される。１週間の車輪順化期間を考慮し、より大きい荷重の場合（この場合は２週間後に変化させることができる。）を除き１週間間隔で車輪荷重を変化させることができる。荷重の範囲は、２ｇから１２ｇの何れかであり得る。特定の運動期間の終了直後に吸入麻酔下での頸椎脱臼によって運動及び静止対照動物を安楽死させる。体重を測定し、特定の筋肉を迅速に切り出し、洗浄し、後日の組織学的又は生化学的アッセイのために凍結する。
【００３１】
別の運動肥大モデルも当業者にとって利用可能である。例えば、Ｌｅｒｍａｎら、Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ９２：２２４５−２２５５、２００２に記載のトレッドミル運動モデルを参照のこと。
【００３２】
クレンブテロール注入モデル
クレンブテロールは、筋肉量が増加することが確認されている増殖促進特性を有するβ２−アドレナリン作動性アゴニストである。クレンブテロール作用の正確な作用機構は不明であるが、筋肉タンパク質分解の低下が提案されている。病院において、クレンブテロールは抗喘息薬として使用されているが、殆ど、ヒト及びショー動物の両方において筋肉量を増加させるための筋肉増強剤として誤用されていると思われる。
【００３３】
筋肉肥大を誘発するために、３、７又は１４日間、５匹のマウスに毎日、クレンブテロール（３ｍｇ／ｋｇ、皮下（ｓ．ｃ．））を注射する。ＰＢＳを注射したマウスを陰性対照とする。治療に対する何らかの有害反応（即ち、毛並みの悪さ、嗜眠性）について動物を毎日監視する（目視）。クレンブテロール処置は、マウスがより恐怖を感じるか又は攻撃的になる可能性があるので、群で飼育する場合、特に闘争についてマウスを監視すべきである。マウスは動くことができ、普通に飲食可能である。第３、７又は１４日に安楽死させるまでマウスを毎日監視し、さらなる分析のために組織を回収する。
【００３４】
筋肉萎縮モデルにおけるインビボ試験
様々な骨格筋萎縮モデルにおいて、通常筋肉量が低下する条件下で筋肉量を維持する能力について本発明のＩＧＦ前駆ポリペプチドを試験することができる。ＩＧＦ前駆ポリペプチドが筋肉量を増加させることができるか否かを調べるために、下記に記載の実施例モデルにを用いて、当業者は、ＩＧＦ前駆ポリペプチドの投与及び使用を含む制御実験を容易に設計し、実施することができる。
【００３５】
例えば、Ｃ５７Ｂ１６／２雄マウスをＴｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入する。各実験の開始時にマウスが約９週齢となるようにマウスを購入する。一般に、通常のげっ歯類用飼料付きのマイクロアイソレーターケージにマウスを収容する。各実験の開始時にマウスの体重を測定する。各実験の終了時に、通常、ＣＯ２吸入の後に頸椎脱臼を行い、マウスを安楽死させ、さらなる処理のために筋肉組織を回収する。「最後の体重」を得るためにマウスの体重を測定する。回収することができる骨格筋は、前脛骨筋、長趾伸筋、ヒラメ筋及び腓腹筋である。場合によって回収する他の組織は、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、精巣及び脳である。全ての筋肉及び組織を完全に切り出し、０.０００１ｇまで測定可能な秤で重量を測定する。次に、後のＲＮＡ及びタンパク質抽出のために組織を液体窒素中で瞬間凍結するか又はコルクディスク上でＯＣＴ中で瞬間凍結物を包埋する。後の凍結切片作製のためにコルクディスク上で凍結させた筋肉を、液体窒素により濃厚なスラッシュ状になるまで冷却したイソペンタンに浸漬する。全試料を−８０℃で保存する。
【００３６】
デキサメタゾン処置
マウスにおいて筋肉萎縮を誘導する薬理学的方法は、毎日デキサメタゾン２０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与することである。デキサメタゾンは、ホルモンの糖質コルチコイドクラスの合成メンバーである。これは、抗炎症剤及び免疫抑制剤として作用し、ヒドロコルチゾンの約４０倍の効力を有する。例えば、関節リウマチなど、多くの炎症及び自己免疫状態を治療するためにデキサメタゾンが使用される。これはまた、抗腫瘍治療のある種の副作用を軽減するために、化学治療を行っている癌患者にも投与される。デキサメタゾンは、マウス及びヒト患者の両方において筋肉萎縮を引き起こす。
【００３７】
３、７又は１４日間、マウスにデキサメタゾンを腹腔内（ｉｐ）注入する。最終日に、ＣＯ２を用いて被験動物を安楽死させ、足の筋肉を回収する。治療に対する何らかの有害反応（即ち、毛並みの悪さ、嗜眠性）について動物を毎日監視する（目視）。マウスは通常動くことができ、普通に飲食可能である。ＰＢＳを注入したマウスが陰性対照である。
【００３８】
ギブス固定
様々な筋肉群を物理的に非活動性にした結果、これらの筋肉の萎縮が起こる。足首関節固定（「ピンヒール」又はギブス）は、ラット及びマウスの後肢筋肉組織の身体拘束を誘発するのに非常に有用で再現性のある方法であることが分かっている。
【００３９】
固定化のためにイソフルオランでマウスに麻酔をかける。関節の周囲に軽量ギブス材料（ＶＥＴ−ＬＩＴＥ）を用いて足首及び膝関節を９０°に固定する。この材料を温水に浸し、次いで肢周囲に巻き付け、踵及び股関節は自由にする。ギブス材料が乾燥するまで関節を９０°の位置に維持する。反対側の肢を対照とする。次に、マウスを麻酔から回復させ、普通のマイクロアイソレーターケージに収容する。観察によるとギブスは過剰ストレスを引き起こさず、動物はケージ中を自由に動き回り、飲食する。しかし、体重、活動性及び過敏性に影響を与える何らかの有害反応についてマウスを毎日監視する。
【００４０】
マウスにギブスを嵌めたら、咀嚼する可能性があるので、ギブスがずれていないことを確認するためにその動物を毎日監視する。麻酔の回復後、動物は、動き、飲食することができ、特別なベッディング、ケージ収容又は他の支援は必要ない。
【００４１】
除神経
一般に、除神経のためにイソフルオランガスでマウスに麻酔をかける。無菌の手術手順を用いて（ベタジン洗浄を３回行い、最後の洗浄はエタノール）、右坐骨神経を大腿の中ほどで切り離し、２から５ｍｍの小片を切り出す。反対側の肢を対照とする。
【００４２】
より具体的には、クリップ縫合で皮膚切開を閉じ、麻酔から回復させる前に動物にブプレノルフィンを１回投与する。手術から３、７又は１４日後、ＣＯ２吸入後に頸椎脱臼を行い動物を安楽死させ、組織学的及び生化学的分析のために筋肉（腓腹筋複合体、前脛骨筋、長趾伸筋、ヒラメ筋）を取り出す。
【００４３】
坐骨神経を横に切断する場合、関与する筋肉の骨格筋萎縮を誘発するために、手術を行った肢を固定化する。他は、麻酔の回復後、動物は動き、飲み、食べることができ、特別なベッディング、ケージ収容又は他の支援は必要ない。
【００４４】
しかし、手術直後及び回復期（１−２時間）を通じて、動物を監視する。さらに、切開部位及び一般的な動物の健康状態を手術後３日間監視する。手術後７−１０日後にクリップ縫合を除去する。
【００４５】
遺伝学的モデル
筋肉萎縮のモデルとして、遺伝子操作したトランスジェニックマウスを使用することもできる。例えば、いわゆるＭｉｎｉ  Ｍｉｃｅ（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ストック番号００３２５８）は、ＩＧＦ−１遺伝子においてノックアウト変異があり、その結果、出生後の成長が異常に低下し、体重及び身長が低い。さらなる情報に関しては、Ｐｏｗｅｌｌ−Ｂｒａｘｔｏｎ、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ７：２６０９−２６１７、１９９３を参照のこと。さらに、いわゆるＭｉｄｉ  Ｍｉｃｅ（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ストック番号００３２５９）は、ＩＧＦ−１遺伝子において異なる変異があり、その結果、成獣で低体重となり、他の心血管表現型を示す矮小体型となる。さらなる情報に関しては、Ｌｅｍｂｏら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９８：２６４８−２６５５、１９９６を参照のこと。
【００４６】
ＩＧＦ前駆体における重要及び最適な変異又は修飾
重要な変異
本発明は、一部分において、そのＥ−ペプチドを実質的に含有するＩＧＦ前駆ポリペプチドが生物活性を有し、血清の存在下で安定であるという観察に基づく。二塩基性のプロテアーゼ部位を標的とする内在性プロテアーゼによりＥ−ペプチドが切断されないことを確認するために、一般に、前駆体のＥ−ペプチドの２個のＮ末端二塩基性アミノ酸の何れかを欠失させるか、変異させる又は隠蔽する。ＩＧＦ−１のある例において、これらの２個のアミノ酸はＲ７１及びＳ７２であり、一方、ＩＧＦ−２の別の例において、これらの第一の２個のアミノ酸はＲ６８及びＤ６９である。
【００４７】
様々な修飾によってこの切断の妨害が可能となる：
（１）１又は両方の二塩基性残基の欠失
（２）１又は両方の二塩基性残基の、アラニンなどの非塩基性アミノ酸への変異
（３）二塩基性残基の間への１以上の非塩基性アミノ酸の挿入
（４）プロテアーゼ部位を隠蔽するのに二塩基性残基に十分近い位置にグリコシル化部位を置くこと
（５）下記に記載のような、非天然アミノ酸による、何れかの二塩基性残基の置換又は二塩基性残基付近もしくはその間への挿入を用いた部位特異的ＰＥＧ化。
【００４８】
さらに、残基Ｋ６８及びＫ６５は、ＩＧＦ−１／Ｅ−ペプチド切断に関与すると考えられ、従って、上述のような二塩基性アミノ酸に対する何らかの方策にこれらの残基の変異又は欠失を組み込むことができる。
【００４９】
成熟ＩＧＦのＮ末端での変異
本発明のある実施形態において、ＩＧＦ前駆ポリペプチドは、最初の数個のＮ末端アミノ酸の欠失又は変異を有する。ＩＧＦ−１の場合、最初の３個のＮ末端アミノ酸の何れかを欠失させる又は変異させることができ、一方、ＩＧＦ−２の場合、最初の６個のＮ末端アミノ酸の何れかを欠失させる又は変異させることができる。ある種のＮ末端アミノ酸がインビボで天然に切断されることが観察されており、これらの変異又は欠失を導入することによって、ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）との本発明のポリペプチドのインビボでの会合が最小限に抑えられる。ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２のＩＧＦ−１受容体との相互作用はＩＧＦＢＰにより制御される。全ての６個のＩＧＦＢＰが、ＩＧＦ作用（特にＩＧＦＢＰ５）を阻害することが示されているが、いくつかの例においては促進作用が観察されている。循環中のＩＧＦの少なくとも９９％が通常はＩＧＦＢＰに結合している。新生仔期間後、循環中で最も豊富なＩＧＦＢＰはＩＧＦＢＰ３であり、これは同様の親和性でＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２の両方に結合できる。天然の短縮型ＩＧＦ−１（Ｇ１、Ｇ２及びＥ３が欠失している。）は、ＩＧＦＢＰ３に結合するが、天然のＩＧＦ−１よりも数倍親和性が低い。さらに、Ｇ３はＩＧＦＢＰ結合に重要であり、Ｇ６はＩＧＦ−２ペプチドにおいて同様の役割を果たす。
【００５０】
従って、ＩＧＦ−１前駆体のある実施例において、Ｇ１、Ｐ２又はＥ３の何れかを欠失させる又は変異させる（何れかのみ又は組み合わせて）ことができる。変異が所望される場合、アラニンへの変異を導入することができる。別の実施例において、ＩＧＦ−２前駆体の別の例で、Ｐ４、Ｓ５及びＥ６の何れかを欠失させる又は変異させる（何れかのみ又は組み合わせて）ことができる。変異が所望される場合、アラニンへの変異を導入することができる。
【００５１】
残基３６及び３７での変異
ＩＧＦ−１をセリンプロテアーゼで切断することができる。Ｒ３６又はＲ３７の何れかのＡへの変異によって、Ｒ３６とＲ３７との間のこの予想される切断部位におけるＩＧＦ−１の切断を妨げることができる。ＩＧＦ−２のある例において、この有害な切断を妨げるために、Ｒ３８を変異させる又は欠失させることができる。
【００５２】
グリコシル化の使用
哺乳動物又はＮ−結合型グリコシル化が可能な他の真核細胞で発現される場合、ＩＧＦ又は前駆体のＥ−ペプチド部分の何れかにＮ−結合型グリコシル化部位を付加することによって、本発明のポリペプチドのインビボ半減期を延長させることができる。Ｅａのこれらの部分は、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ（式中、Ｘは何れかのアミノ酸であり得、この３残基の第三のアミノ酸はＳ又はＴの何れかである。）のコンセンサスＮ−結合型グリコシル化配列に適合するので、インビトロで、ＩＧＦ−１ＥａがＮ９２及びＮ１００でグリコシル化されることが分かっている。また、コンセンサスの隣接アミノ酸の状況が、アスパラギンがどの程度強くグリコシル化されるかに影響することも分かっている。従って、Ｅｂ又はＥｃにグリコシル化部位を導入するためのあるストラテジーは、Ｅｂ又はＥｃのほぼ同じ部分にコンセンサス配列周囲のＥａアミノ酸を挿入することである。このストラテジーの特定の実施を下記実施例で例示する。何らかの事象において、当業者にとって公知の周囲環境のアミノ酸を含む何れかの他のコンセンサスＮ−結合型グリコシル化部位を本発明の前駆ポリペプチドに挿入することができる。さらに、本発明のポリペプチドの産生のために使用される特定の宿主を選択することによって、本発明のポリペプチドのＯ−結合型グリコシル化を行うことができる。例えば、ＩＧＦ−１発現のためにある種の酵母株を使用すると、セリン又はスレオニンにおいてオリゴ糖が付加される。例えば、米国特許第５，２７３，９６６号を参照のこと。
【００５３】
ポリ（エチレングリコール）の付加
ポリ（エチレングリコール）への連結（ＰＥＧ；ＰＥＧ化）は、治療用タンパク質薬の半減期を延長させるのに有益であることが証明されている。本発明のＩＧＦ前駆ポリペプチドのＰＥＧ化の結果、同様の医薬的長所が得られ得ると予想される。ＩＧＦ−１のＰＥＧ化の方法は当技術分野で周知である。例えば、米国特許出願公開２００６／０１５４８６５（これは、リジン−モノＰＥＧ化ＩＧＦ−１の有用な特性について述べている。）を参照のこと。このようなリジン−モノＰＥＧ化を本発明の前駆ＩＧＦポリペプチドに適用することができる。さらに、非天然アミノ酸を導入することによって、本発明のポリペプチドの何れかの部分においてＰＥＧ化を行うことができる。Ｄｅｉｔｅｒｓら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２５：１１７８２−１１７８３、２００３；Ｗａｎｇ及びＳｃｈｕｌｔｚ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：９６４−９６７、２００３；Ｗａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８−５００、２００１；Ｚｈａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３：３７１−３７３、２００４又は米国特許第７，０８３，９７０号に記載の技術によって、ある種の非天然アミノ酸を導入することができる。簡潔に述べるとこれらの発現系のいくつかは、本発明のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームに、アンバーＴＡＧなど、ナンセンスコドンを導入するための部位特異的変異誘発を含む。次に、導入されたナンセンスコドンに特異的なｔＲＮＡを使用することができる宿主にこのような発現ベクターを導入し、最適な非天然アミノ酸を入れる。本発明のポリペプチドに対して部分を連結するために有益な特定の非天然アミノ酸には、アセチレン及びアジド側鎖を有するものが含まれる。次に、タンパク質のこれらの選択部位において、これらの新規アミノ酸を含有するＩＧＦ前駆ポリペプチドのＰＥＧ化を行うことができる。さらに、Ｅ−ペプチドがないこのようなＰＥＧ化ＩＧＦ分子もまた治療薬として有用である。
【００５４】
Ｅ−ペプチドのマルチマー
ある種の薬理学的関連において、薬物が血液脳関門又の一方又は他方に残ることを確実にするためにペプチド又はタンパク質のサイズを大きくすることは有益である。Ｅ−ペプチドが結合されたままである場合でも成熟ＩＧＦ分子は比較的短いペプチドなので、本発明のポリペプチドのサイズを大きくすることは有益であり得る。これを行うある手段は、下記のある実施例で例示されるように、ＩＧＦ前駆ポリペプチドのＣ末端においてＥ−ペプチドのマルチマーを提供することである。
【００５５】
Ｅ−ペプチドのＣ末端の欠失
Ｅｂの位置８１のフリーのシステインによって、ホモ二量体形成又は、本発明のポリペプチドに存在する場合、薬物の活性が低下し得る他の影響が起こり得ることが疑われる。このように、ＥｂのＣ８１の欠失又は変異によって、薬物活性を最適化することができる。特定の例において、Ｅｂの最後の７個のアミノ酸（即ちアミノ酸８１−８７）の欠失は有益である。
【００５６】
他の変異又は修飾
本発明のＩＧＦ前駆ポリペプチドに組み込まれ得るＩＧＦのさらなる変異又は修飾は米国特許第５，０７７，２１６号；及び米国特許出願公開２００５／０２８７１５１、２００６／０２１１６０６及び２００６／０１６６３２８に記載されている。
【００５７】
本発明は、実質的にそのＥ−ペプチドを含有する全ての既知及び未知の非ヒト動物前駆ＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２配列を含むことが意図され、本発明の修飾により、Ｅ−ペプチドの通常の切断が回避される又は減少する。
【００５８】
使用されるべきＩＧＦの好ましい型は、治療を受ける対象の種に依存する。
【００５９】
ＩＧＦは種が適合することが好ましく、例えば、ウシを治療する場合、ＩＧＦの好ましい型はウシＩＧＦである。
【００６０】
配列相同性が高いためＩＧＦの全ての型が様々な対象において有効であると思われるが、種が合致することにより、異種由来のＩＧＦに対する免疫反応の誘導から引き起こされる有害な免疫学的合併症の可能性が回避される。
【００６１】
本発明のある実施形態において、修飾非ヒト動物前駆ＩＧＦ−１配列が提供される。
【００６２】
Ｅ−ペプチドの通常の切断が脊椎動物由来の本発明の修飾により回避又は減少される、Ｅ−ペプチドを実質的に含有する前駆ＩＧＦ−１配列が好ましい。
【００６３】
例えば、このような配列には、以下に限定されないが、天然、合成又は組み換えの何れかの何らかのソースからの、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、鳥類、イヌ、ネコ、魚類など由来の配列が含まれる。
【００６４】
本発明の別の実施形態において、修飾非ヒト動物前駆ＩＧＦ−２配列が提供される。
【００６５】
そのＥ−ペプチドの正常な切断が脊椎動物由来の本発明の修飾により回避されるか又は減少する、Ｅ−ペプチドを実質的に含有する前駆ＩＧＦ−２配列が好ましい。
【００６６】
例えば、このような配列には、以下に限定されないが、天然、合成又は組み換えの何れかの何らかのソースからの、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、鳥類、イヌ、ネコ、魚類など由来の配列が含まれる。
【００６７】
ＩＧＦ前駆ポリペプチドの治療用途
適応症例
本発明はまた、筋骨格疾患の治療又は予防用の医薬品の製造における本発明のＩＧＦ前駆ポリペプチドの使用も含む。さらに、本発明は、このような個体が筋骨格系疾患のリスクを有する又はその疾患に罹患しているにせよそうでないにせよ、個体において筋肉又は骨量を増加させるためのＩＧＦ前駆ポリペプチドの使用を含む。
【００６８】
特に、筋骨格系疾患は筋萎縮であり得る。コルチゾール、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン又はプレドニゾロンなどの糖質コルチコイドでの治療によるものを含め、筋萎縮には多くの原因がある。筋萎縮はまた、神経外傷性傷害による除神経の結果又は変性、代謝性もしくは炎症性ニューロパシーの結果（例えば、ギリアン−バレー症候群、末梢性ニューロパシー又は環境有害物質もしくは薬物への曝露）でもあり得る。さらに、筋萎縮は、成人の運動ニューロン疾患、小児脊髄性筋萎縮症、若年性脊髄性筋萎縮症、多発性導体ブロックを伴う自己免疫性運動神経障害、発作又は脊髄損傷による麻痺、外傷性傷害による骨格の不動化、長期にわたる床上安静、故意の不活発、不随意の不活発、代謝性ストレス又は栄養失調、癌、ＡＩＤＳ、飢餓、横紋筋融解症、甲状腺疾患、糖尿病、良性先天性低血圧、セントラルコア病、ネマリンミオパシー、筋管（中心核）ミオパシー、熱傷、慢性閉塞性肺疾患、肝臓疾患、敗血症、腎不全、うっ血性心不全又は加齢の結果であり得る。
【００６９】
筋骨格系疾患はまた、デュシェンヌ型、ベッカー型、筋強直性、顔面肩甲上腕筋、エメリー・ドレフュス型、眼咽頭筋、肩甲上腕、肢帯、先天型筋ジストロフィー又は遺伝性末梢性ミオパシーなどの筋ジストロフィー症候群でもあり得る。筋骨格系疾患はまた、骨粗しょう症、骨折、低身長又は小人症でもあり得る。
【００７０】
ＩＧＦ−１はまたＩＧＦ−１受容体及びインスリン受容体のヘテロ二量体と結合することもできるので、ＩＧＦ−１は、インスリン非依存性糖尿病の治療薬として示唆されている。従って、糖尿病を治療するために本発明のポリペプチドを使用することができる。
【００７１】
ＩＧＦ−１は、神経栄養性であり、ニューロンの生存を促進する。筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脳萎縮、加齢及び認知症でみられるような、運動ニューロン死の症例を治療するためにＩＧＦ−１を使用することができることが示唆されている。従って、ＡＬＳ、脳萎縮又は認知症など、ニューロン死と関連する状態を治療するために本発明のポリペプチドを使用することができる。
【００７２】
ＩＧＦ−１は、白血球及び赤血球細胞集団両方を増加させ、エリスロポエチンの投与に対して付加的効果がある。従って、貧血を治療するために、本発明のポリペプチドを使用することができる。
【００７３】
ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２はユビキタスであり、細胞分裂及び脊椎動物の成長の必須の制御因子なので、動物における成長を外部から促進又は維持するために様々な獣医学的方法においてこれらを有利に使用し得る。ある一部の例には、以下に限定されないが、
（ｉ）動物における成長の速度及び／又は程度を促進すること（例えば、ブタ、ウシ、家禽及び魚類において筋肉成長を促進すること）、
（ｉｉ）例えばブタ、ウシ、家禽及び魚類において、食物の身体組織への変換の効率を促進すること（脂肪に対するやせの割合）及び
（ｉｉｉ）泌乳動物、例えば、乳牛、ヒツジ、ヤギなどにおいて乳汁産生を促進することが含まれる。他の獣医学的治療適用には、以下に限定されないが、
（ｉｖ）例えばイヌ、ネコ及びウマなどのペット動物において、悪液質、外傷性傷害又は他の消耗疾患に付随する消耗性の症状に対して動物を治療すること及び
（ｖ）新生仔の状態を向上させるために例えば泌乳雌ブタにおいて、新生仔の健康を増進するために泌乳動物を処置することが含まれる。
【００７４】
投与方法
遺伝子送達ビヒクルの使用を含む様々な方法において本発明のポリペプチドを送達することができる。本発明のポリペプチドの治療のための送達、例えば、細胞の遺伝子移入、遺伝子治療、送達ビヒクル又は医薬的に許容可能な担体による直接投与、本ポリペプチドをコードする核酸を含有する組み換え細胞を提供することによる間接的送達のために、タンパク質又は核酸などの物質の治療的送達のための当技術分野で公知の方法を使用することができる。
【００７５】
様々な送達系が公知であり、本発明のポリペプチドを投与するために、例えばリポソーム中でのカプセル封入、微小粒子、マイクロカプセル、タンパク質を発現させることができる組み換え細胞、受容体介在エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ及びＷｕ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６２：４４２９−４４３２、１９８７）、レトロウイルス、アデノ関連ウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス（例えば、アビポックスウイルス、特に鶏痘ウイルス）又は他のベクターなどの一部としての核酸のコンストラクトなどを使用することができる。導入方法は、腸内又は非経口であり得、以下に限定されないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、肺、鼻内、眼内、硬膜外及び経口経路が含まれる。何れかの従来の経路により、例えば点滴又はボーラス注射により、上皮又は皮膚粘膜層（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など）を通じた吸収により本ポリペプチドを投与することができ、他の生物学的に活性のある物質とともに投与し得る。投与は全身的又は局所であり得る。さらに、脳室内及び鞘内注入を含む何らかの適切な経路により、中枢神経系に本発明の医薬組成物を導入することが所望され得；例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバーなどのリザーバーに連結した脳室内カテーテルにより脳室内注射を促進し得る。例えば、吸入器又はネブライザー及びエアロゾル化剤による処方物の使用により、肺投与を使用することもできる。
【００７６】
具体的な実施形態において、治療を必要とする部位に局所的に本発明の医薬組成物を投与することが所望され得；例えば、限定されないが、術中の局所点滴、局所適用により、例えば注射によって、カテーテルによって、又はインプラントによって、多孔、非多孔又はゼラチン性材料であるインプラント（シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜などの膜を含む。）、繊維又は市販の皮膚代替物によって、これを遂行し得る。
【００７７】
別の実施形態において、小胞、特にリポソームにおいて、活性物質を送達することができる（Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３、１９９０参照）。さらに別の実施形態において、制御放出系において活性物質を送達することができる。ある実施形態において、ポンプを使用し得る。別の実施形態において、ポリマー材料を使用することができる（Ｈｏｗａｒｄら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  ７１：１０５、１９８９）。別の実施形態において、本発明の活性物質が本発明のポリペプチドをコードする核酸である場合、適切な核酸発現ベクターの一部としてそれを構築すること及び、例えばレトロウイルスベクターを使用することによって又は直接注入によって又は微小粒子ボンバーメント（例えば遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）によって又は脂質もしくは細胞表面受容体での被覆又は遺伝子移入剤によって又は核に入ることが知られているホメオボックス様ペプチドへ連結してそれを投与することによって（例えば、Ｊｏｌｉｏｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８６４−１８６８、１９９１）など、細胞内に入るようにそれを投与することによって、そのコードされるタンパク質の発現を促進するためにインビボで核酸を投与することができる。あるいは、細胞内に核酸を導入し、相同組み換えによって、発現のために宿主細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる。
【００７８】
細胞の遺伝子移入及び遺伝子治療
本発明は、インビトロ及びインビボでの細胞の遺伝子移入のための本発明のポリペプチドをコードする核酸の使用を包含する。標的細胞及び生物の遺伝子移入のために、多くの周知のベクターの何れかにこれらの核酸を挿入することができる。ベクター及び標的細胞の相互作用を通じて、エクスビボ及びインビボで細胞に核酸を遺伝子移入する。治療反応を誘発するのに十分な量で対象に本組成物を（例えば筋肉への注射により）投与する。
【００７９】
別の態様において、本発明は、標的部位、即ち標的細胞又は組織、動物を処置する方法（本発明のポリペプチドをコードする核酸を細胞に遺伝子移入することを含む。）を提供するが、この核酸は、標的融合ポリペプチドをコードする核酸に操作可能に連結された誘導可能なプロモーターを含む。
【００８０】
併用療法
多くの実施形態において、１以上のさらなる化合物又は治療と組み合わせて本発明のポリペプチドを投与することができる。例えば、１以上の治療用化合物とともに複数のポリペプチドを同時投与することができる。併用療法は、同時に行うか又は交互に行う投与を包含し得る。さらに、この組み合わせは、急性投与は長期投与を包含し得る。テストステロン又は特異的アンドロゲン受容体調節因子（ＳＡＲＭ）などの同化剤と組み合わせて本発明のポリペプチドを投与することができる。さらなる同化剤には、成長ホルモン（ＧＨ）又は、ＧＨ放出を誘導する分子が含まれる。グレリンは食欲を増進させ得るので、悪液質に対する併用療法においてグレリンは特に有用である。同様に、同化作用を向上させるために本発明のポリペプチドをタンパク質サプリメントと組み合わせることができるか又は体重を増加させるために理学療法又は運動と組み合わせることができる。ミオスタチンを阻害する何らかの分子も併用療法に対する候補である。
【００８１】
医薬組成物
本発明はまた、本発明のＩＧＦ前駆タンパク質及び医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物も提供する。「医薬的に許容可能な」という用語は、連邦もしくは州政府の監督官庁により承認されている又は米国薬局方又は動物もしくはヒトでの使用に関する他の一般に認められている薬局方に列挙されていることを意味する。「担体」という用語は、治療薬と一緒に投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤又はビヒクルを指す。このような医薬担体は、水及び油（石油、動物、植物又は合成起源の油を含む。ピーナツ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油など）などの滅菌液であり得る。適切な医薬賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。必要に応じて、本組成物はまた、少量の湿潤もしくは乳化剤又はｐＨ緩衝剤も含有し得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル、粉末、徐放製剤などの形態を取り得る。伝統的な結合剤及びトリグリセリドなどの担体とともに坐薬として本組成物を処方することができる。経口製剤は、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的担体を含み得る。適切な医薬担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。
【００８２】
いくつかの実施形態において、静脈内投与に適した医薬組成物として常法に従い本組成物を処方する。必要な場合、本組成物は、可溶化剤及び注射部位の痛みを緩和するためのリドカインなどの局所麻酔も含み得る。本組成物を点滴により投与すべき場合、医薬グレードの滅菌水又は食塩水を含有する点滴ボトルを用いて投与することができる。本組成物を注射により投与すべき場合、投与前に成分を混合することができるように、注射用滅菌水又は食塩水のアンプルを提供し得る。
【００８３】
中性又は塩の形態で本発明のポリペプチドを処方することができる。医薬的に許容可能な塩には、例えば塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸など由来ものなどの遊離アミノ基とともに形成されるもの、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなど由来のものなどの遊離カルボキシル基とともに形成されるものなどが含まれる。
【００８４】
現在の記述に基づく標準的な臨床技術により、状態又は疾病の治療に有効である本発明のポリペプチドの量を決定することができる。さらに、最適投与量範囲の決定を促進するためにインビトロアッセイを場合によっては使用し得る。処方において使用すべき正確な用量もまた、投与経路及び状態の重症度に依存し、医師の判断及び各対象の事情に従い決定すべきである。しかし、静脈内投与のための適切な投与量範囲は通常、体重１ｋｇあたり活性化合物約２０−５０００ｍｇである。鼻内投与のための適切な投与量範囲は通常、約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重から１ｍｇ／ｋｇ体重である。有効用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から得られた用量反応曲線から推定し得る。特に、可能性がある用法用量は、約６０から１２０μｇ／ｋｇ体重で、皮下注射で１日２回であり得る。
【００８５】
動物への使用
健康な動物に投与する場合、疾患に罹患している動物と投与量が異なり得る。例えば下記のような筋芽細胞増殖アッセイ（実施例７９）又は哺乳動物上皮組織アッセイ（実施例８０）など、当技術分野で公知のアッセイを用いて、適切な投与量の評価が当業者により容易に行われ得る。ＩＧＦを測定するための一般的なアッセイも実施例８１におけるものなど、当技術分野で公知である。
【００８６】
当業者にとって当然のことながら、ある種の動物は、光周期の長さにより影響を受ける季節性の妊孕性を示す。獣医学における方法又は使用の何らかの実施形態は、場合によっては、所望の効果を達成するために、その動物の生殖サイクル内の特定の時間に治療法を開始することを含み得る。当業者は、生殖状態及びサイクルを容易に決定することができること、必要に応じて、適切な方法の使用により同調させることができることを知っている。
【００８７】
動物への適応のために使用する場合、本発明のＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２ペプチドを経口用ドレンチ又は動物に対する経口もしくは固形飼料に対するサプリメントとして使用することもできる。
【００８８】
本発明はさらに、次の実施例を記載するが、これに限定されない。
【実施例】
【００８９】
（実施例１）
次の修飾を含有するｈＩＧＦ−１−Ｅａ前駆ポリペプチドをコードするＤＮＡ発現ベクターを構築した：Ｇ１の欠失、Ｐ２の欠失及びＥ３の欠失；Ｒ３７のＡへの変異；及びＲ７１の欠失及びＳ７２の欠失。これらの変異を、本開示を通じて「３ｍｕｔ」と呼ぶことがある。この結果、次の分泌タンパク質配列が得られる：
【００９０】
【化３】
2009539805.tif 000004
【００９１】
１０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中でＣｏｓ７細胞（ＡＴＣＣより入手可能）を維持し、１０ｃｍプレートあたり１ｘ１０６個の細胞の密度で播種した。これらの細胞培養物に対して、製造者の説明書に従い、Ｆｕｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて発現プラスミド８μｇを遺伝子移入した。遺伝子移入から２４時間後、細胞を１度洗浄し、血清不含培地中で４８時間培養した。上清を回収し、−８０℃で保存した。
【００９２】
ヒト血清中でのポリペプチドの安定性を評価するために、野生型（ｗｔ）ｈＩＧＦ−１Ｅａ及びｈＩＧＦ−１Ｅａ３ｍｕｔで遺伝子移入したＣｏｓ７細胞から回収した上清を１０％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ）非存在下又は存在下の何れかで３７℃で１６時間温置した。１８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより試料を分離し、ヒトＩＧＦ−１に対するヤギポリクローナル抗体を用いて免疫ブロッティングを行った。図１Ａの結果から、１６時間、血清とともに温置後、ｈＩＧＦ−１Ｅａが実質的に分解された一方、ｈＩＧＦ−１Ｅａ３ｍｕｔは安定であったことが示された。密度測定から、切断されたＩＧＦ−１に対する非切断ＩＧＦ−１の比が約１：６．２であり、一方ｈＩＧＦ−１Ｅａ３ｍｕｔの場合の比は約１：０．６８であることが示され、このことから、これらの変異の結果、ポリペプチドが安定化されることが分かる。
【００９３】
ｈＩＧＦ−１Ｅａ３ｍｕｔがＩＧＦ−１Ｒを通じてシグナルを送ることができることを確認するために、本ポリペプチドと接触させた細胞のＡＫＴリン酸化を測定した。Ｃ２Ｃ１２をＡＴＣＣから購入し、１０％ウシ胎仔血清（ＡＭＩＭＥＤ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び２ｍＭグルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する高グルコース入りのダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で維持した。ＡＫＴリン酸化の分析のために、６ウェルプレートのウェルあたり０．１５ｘ１０６個の細胞密度でＣ２Ｃ１２細胞を播種し、増殖培地中で７２時間培養した。血清不含培地中で細胞を４時間飢餓状態にし、次いで３７℃で３０分間、様々なリガンドで刺激した。様々なプロテアーゼ阻害剤を含有するＰｈｏｓｐｈｏＳａｆｅ緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）で細胞を溶解し、４℃で１４，０００ｘｇで１５分間遠心することにより透明化した。ＰａｔｈＳｃａｎ  ｐｈｏｓｐｈｏ  ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）サンドイッチＥＬＩＳＡキット及びＰａｔｈＳｃａｎ  ＡＫＴサンドイッチＥＬＩＳＡキット（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）をそれぞれ用いてＥＬＩＳＡによって、ＡＫＴリン酸化及び総ＡＫＴレベルを分析した。ＡＫＴリン酸化の結果を図２Ａでまとめるが、これから、ｈＩＧＦ−１Ｅａ３ｍｕｔが、ｌｏｎｇ−Ｒ３−ＩＧＦ１陽性対照試薬及び組み換えＩＧＦ−１と同程度にＩＧＦ−１Ｒ細胞経路を活性化できることが示される。さらに、図５のデータから、ｈＩＧＦ−１Ｅａ３ｍｕｔがＡＫＴリン酸化へと導いたことが直接示される。
【００９４】
次に、ｈＩＧＦ−１Ｅａ３ｍｕｔの受容体特異性がＩＧＦ−１Ｒで残っていることを確認するために、ＩＧＦ−１Ｒ又はインスリン受容体（ＩｎｓＲ）の何れかを過剰発現するＮＩＨ３Ｔ３の培養物に様々なリガンドを添加した。Ｃｏｓ７細胞に対して上記で述べたものと同じ条件下でこれらの細胞を培養した。ＩＧＦ−１Ｒ及びＩｎｓＲリン酸化の分析のために、６ウェルプレートのウェルあたり０．２ｘ１０６個の細胞密度でＮＩＨ３Ｔ３−ＩＧＦ１Ｒ及びＮＩＨ３Ｔ３−ＩｎｓＲ細胞を播種し、増殖培地中で２４時間培養した。血清不含培地中で１８時間細胞を飢餓状態にし、次いで３７℃で１０分間、様々なリガンドで刺激した。ＡＫＴ実験のために上記で述べたように細胞を溶解し、ＤｕｏＳｅｔ  ＩＣヒト蛍光体−ＩＧＦ１Ｒ及び−ＩｎｓＲ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＥＬＩＳＡによってＩＧＦ−１Ｒ及びＩｎｓＲリン酸化レベルを分析した。図３Ａ及び３Ｂでまとめた結果から、このＩＧＦ−１前駆ポリペプチドがＩＧＦ−１受容体に対して特異性を保持し、関連するインスリン受容体と低親和性で結合するはずであることが示される。
【００９５】
（実施例２）
次の変異：Ｇ１の欠失、Ｐ２の欠失及びＥ３の欠失；Ｒ３７のＡへの変異；及びＲ７１の欠失及びＳ７２の欠失（即ち「３ｍｕｔ」）を含有するｈＩＧＦ−１−Ｅｂ前駆ポリペプチドをコードするＤＮＡ発現ベクターを構築した。この結果、次の分泌タンパク質配列が得られる：
【００９６】
【化４】
2009539805.tif 000005
【００９７】
上記実施例１に記載の手順に従い、このポリペプチドをアッセイした。図１Ｂ及び密度測定の使用から、切断されたＩＧＦ−１に対する非切断ＩＧＦ−１の比が約１：９であり、ｈＩＧＦ−１Ｅｂ３ｍｕｔの場合の比が約１：１であることが示され、このことから、これらの修飾の結果、ポリペプチドが安定化されることが分かった。図２Ｂから、ｈＩＧＦ−１Ｅｂ３ｍｕｔがｌｏｎｇ−Ｒ３−ＩＧＦ１陽性対照試薬及び組み換えＩＧＦ−１と同程度にＩＧＦ−１Ｒ細胞経路を活性化できたことが示される。さらに、図５のデータから、ｈＩＧＦ−１Ｅｂ３ｍｕｔがＡＫＴリン酸化へと導いたことが直接示される。図３Ｃ及び３Ｄでまとめた結果から、このＩＧＦ−１前駆ポリペプチドがＩＧＦ−１受容体に対して特異性を保持しており、関連するインスリン受容体と低親和性で結合するはずであることが示される。
【００９８】
（実施例３）
次の変異：Ｇ１の欠失、Ｐ２の欠失及びＥ３の欠失；Ｒ３７のＡへの変異；及びＲ７１の欠失及びＳ７２の欠失（即ち「３ｍｕｔ」）を含有するｈＩＧＦ−１−Ｅｃ前駆ポリペプチドをコードするＤＮＡ発現ベクターを構築した。この結果、次の分泌タンパク質配列が得られる：
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｒａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｙｑｐｐｓｔｎｋｎｔｋｓｑｒｒｋｇｓｔｆｅｅｒｋ（配列番号１０）
【００９９】
上記実施例１に記載の手順に従い、このポリペプチドをアッセイした。図１Ｃ及び密度測定の使用から、切断されたＩＧＦ−１に対する非切断ＩＧＦ−１の比が約１：５であり、ｈＩＧＦ−１Ｅｃ３ｍｕｔの場合の比が約１：０．９６であることが示され、このことから、これらの修飾の結果、ポリペプチドが安定化されることが分かった。図２Ｄから、ｈＩＧＦ−１Ｅｃ３ｍｕｔがｌｏｎｇ−Ｒ３−ＩＧＦ１陽性対照試薬及び組み換えＩＧＦ−１と同程度にＩＧＦ−１Ｒ細胞経路を活性化できたことが示される。さらに、図５のデータから、ｈＩＧＦ−１Ｅｃ３ｍｕｔがＡＫＴリン酸化へと導いたことが直接示される。図４Ａ及び４Ｂでまとめられた結果から、このＩＧＦ−１前駆ポリペプチドがＩＧＦ−１受容体に対して特異性を保持しており、関連するインスリン受容体と低親和性で結合するはずであることが示される。
【０１００】
（実施例４）
ｈＩＧＦ−１−Ｅｂペプチドに対して次の修飾：Ｇ１の欠失、Ｐ２の欠失及びＥ３の欠失；Ｒ３７のＡへの変異；及びＲ７１の欠失及びＳ７２の欠失（即ち「３ｍｕｔ」）；及びＥｂのアミノ酸９５と９６との間のＥａアミノ酸９３から１０２の挿入を含有するｈＩＧＦ−１−Ｅａｂキメラ前駆ポリペプチドをコードするＤＮＡ発現ベクターを構築した。この挿入によって、Ｎ９２に推定Ｎ−結合型グリコシル化シグナルが生成する。この結果、次の分泌タンパク質配列が得られる。
【０１０１】
【化５】
2009539805.tif 000006
【０１０２】
上記実施例１に記載の手順のいくつかに従い、このポリペプチドをアッセイした。図２Ｃから、ｈＩＧＦ−１Ｅａｂ３ｍｕｔがｌｏｎｇ−Ｒ３−ＩＧＦ１陽性対照試薬及び組み換えＩＧＦ−１と同程度にＩＧＦ−１Ｒ細胞経路を活性化できたことが示される。図４Ｃ及び４Ｄでまとめられた結果から、このＩＧＦ−１前駆ポリペプチドがＩＧＦ−１受容体に対して特異性を保持しており、インスリン受容体を活性化しないことが示される。
【０１０３】
（実施例５）
次の変異：Ｇ１の欠失、Ｐ２の欠失及びＥ３の欠失、Ｒ３６の欠失、Ｒ３７の欠失、Ｒ７１の欠失、Ｓ７２の欠失、Ｅｂの最後の７個のＣ末端アミノ酸の欠失；及び、２つのさらなるＥｂペプチド（両方とも、Ｒ７１及びＳ７２及び最後の７個のＣ末端のアミノ酸がない。）及び４番目及び最後のＥｂペプチド（Ｒ７１及びＳ７２がない。）のこの前駆体のＣ末端への挿入を含有するｈＩＧＦ−１−Ｅｂマルチマー前駆ポリペプチドをコードするＤＮＡ発現ベクターを構築した。図６Ａは、このコンストラクトの概略図を示す。この結果、次の分泌タンパク質配列が得られる。
【０１０４】
【化６】
2009539805.tif 000007
【０１０５】
実施例１に記載のようにこのポリペプチドをＡＫＴリン酸化アッセイに供した。図５から、このｈＩＧＦ−１−ＥｂマルチマーがＩＧＦ−１Ｒ経路を通じてシグナルを送ることができたことが示される。
【０１０６】
（実施例６）
図６Ｂで概略が示されるような本発明のｈＩＧＦ−１−Ｅｂ前駆ポリペプチドを発現させることができる。このコンストラクトは、次の修飾：Ｇ１の欠失、Ｐ２の欠失及びＥ３の欠失、Ｒ３６の欠失、Ｒ３７の欠失、Ｒ７１の欠失、Ｓ７２の欠失；及びＥｂのアミノ酸９５と９６との間のＥａアミノ酸９３−１０２の挿入（これにより、位置Ｎ９２及びＮ１００でＮ結合型グリコシル化部位が生じる。）を含有する。この結果、次の分泌タンパク質配列が得られる。
【０１０７】
【化７】
2009539805.tif 000008
【０１０８】
（実施例７）
次の修飾：Ｐ４の欠失、Ｓ５の欠失及びＥ６の欠失；Ｒ３８のＡへの変異；及びＲ６８の欠失及びＤ６９の欠失を有する本発明のｈＩＧＦ−２−Ｅ前駆ポリペプチドを発現させることができる。この結果、次の分泌タンパク質配列が得られる。
【０１０９】
【化８】
2009539805.tif 000009
【０１１０】
（実施例８）
次の変異：Ｇ１の欠失及びＰ２の欠失；Ｅ３のＸへの変異（Ｘは、ＰＥＧ化された非天然アミノ酸である。）；Ｒ３７のＡへの変異；及びＲ７１の欠失及びＳ７２の欠失を有する本発明のｈＩＧＦ−１−Ｅａ前駆ポリペプチドを発現させることができる。この結果、次の分泌タンパク質配列が得られる。
【０１１１】
【化９】
2009539805.tif 000010
【０１１２】
（実施例９−７８）
（△＝欠失）
９）ｈＩＧＦ−１−Ｅａ：△Ｇ１、△Ｐ２、△Ｅ３；Ｒ３６Ａ；△Ｒ７１
【０１１３】
【化１０】
2009539805.tif 000011
【０１１４】
１０）ｈＩＧＦ−１−Ｅａ：△Ｇ１、△Ｐ２、△Ｅ３；Ｒ３６Ａ；△Ｓ７２
【０１１５】
【化１１】
2009539805.tif 000012
【０１１６】
１０）ｈＩＧＦ−１−Ｅａ：△Ｇ１、△Ｐ２、△Ｅ３；Ｒ３６Ａ；△Ｒ７１、△Ｓ７２
【０１１７】
【化１２】
2009539805.tif 000013
【０１１８】
１１）ｈＩＧＦ−１−Ｅａ：△Ｇ１、△Ｐ２、△Ｅ３；Ｒ３７Ａ；△Ｒ７１
【０１１９】
【化１３】
2009539805.tif 000014
【０１２０】
１２）ｈＩＧＦ−１−Ｅａ：△Ｇ１、△Ｐ２、△Ｅ３；Ｒ３７Ａ；△Ｓ７２
【０１２１】
【化１４】
2009539805.tif 000015
【０１２２】
１３）ｈＩＧＦ−１−Ｅａ：△Ｇ１、△Ｐ２、△Ｅ３、△Ｒ３７；△Ｒ７１
【０１２３】
【化１５】
2009539805.tif 000016
【０１２４】
１４）ｈＩＧＦ−１−Ｅａ：△Ｇ１、△Ｐ２、△Ｅ３、△Ｒ３７；△Ｓ７２
【０１２５】
【化１６】
2009539805.tif 000017
【０１２６】
１５）ｈＩＧＦ−１−Ｅａ：△Ｇ１、△Ｐ２、△Ｅ３；△Ｒ３７；△Ｒ７１、△Ｓ７２
【０１２７】
【化１７】
2009539805.tif 000018
【０１２８】
１６）ｈＩＧＦ−１−Ｅｂ：△Ｇ１、△Ｐ２、△Ｅ３；Ｒ３６Ａ；△Ｒ７１
【０１２９】
【化１８】
2009539805.tif 000019
【０１３０】
１７）ｈＩＧＦ−１−Ｅｂ：△Ｇ１、△Ｐ２、△Ｅ３；Ｒ３６Ａ；△Ｓ７２
【０１３１】
【化１９】
2009539805.tif 000020
【０１３２】
１８）ｈＩＧＦ−１−Ｅｂ：△Ｇ１、△Ｐ２、△Ｅ３；Ｒ３７Ａ；△Ｒ７１
【０１３３】
【化２０】
2009539805.tif 000021
【０１３４】
１９）ｈＩＧＦ−１−Ｅｂ：△Ｇ１、△Ｐ２、△Ｅ３；Ｒ３７Ａ；△Ｓ７２
【０１３５】
【化２１】
2009539805.tif 000022
【０１３６】
２０）ｈＩＧＦ−１−Ｅｂ：△Ｇ１、△Ｐ２、△Ｅ３；Ｒ３７Ａ；△Ｒ７１、△Ｓ７２
【０１３７】
【化２２】
2009539805.tif 000023
【０１３８】
２１）ｈＩＧＦ−１−Ｅｂ：△Ｇ１、△Ｐ２、△Ｅ３、△Ｒ３７；△Ｒ７１
【０１３９】
【化２３】
2009539805.tif 000024
【０１４０】
２２）ｈＩＧＦ−１−Ｅｂ：△Ｇ１、△Ｐ２、△Ｅ３、△Ｒ３７；△Ｓ７２
【０１４１】
【化２４】
2009539805.tif 000025
【０１４２】
２３）ｈＩＧＦ−１−Ｅｂ：△Ｇ１、△Ｐ２、△Ｅ３、△Ｒ３７；△Ｒ７１、△Ｓ７２
【０１４３】
【化２５】
2009539805.tif 000026
【０１４４】
２４）ｈＩＧＦ−１−Ｅｃ：△Ｇ１、△Ｐ２、△Ｅ３；Ｒ３６Ａ；△Ｒ７１
【０１４５】
【化２６】
2009539805.tif 000027
【０１４６】
２５）ｈＩＧＦ−１−Ｅｃ：△Ｇ１、△Ｐ２、△Ｅ３；Ｒ３６Ａ；△Ｓ７２
【０１４７】
【化２７】
2009539805.tif 000028
【０１４８】
２６）ｈＩＧＦ−１−Ｅｃ：△Ｇ１、△Ｐ２、△Ｅ３；Ｒ３６Ａ；△Ｒ７１、△Ｓ７２
【０１４９】
【化２８】
2009539805.tif 000029
【０１５０】
２７）ｈＩＧＦ−１−Ｅｃ：△Ｇ１、△Ｐ２、△Ｅ２；Ｒ３７Ａ；△Ｒ７１
【０１５１】
【化２９】
2009539805.tif 000030
【０１５２】
２８）ｈＩＧＦ−１−Ｅｃ：△Ｇ１、△Ｐ２、△Ｅ３；Ｒ３７Ａ；△Ｓ７２
【０１５３】
【化３０】
2009539805.tif 000031
【０１５４】
２９）ｈＩＧＦ−１−Ｅｃ：△Ｇ１、△Ｐ２、△Ｅ３；Ｒ３７Ａ；△Ｒ７１、△Ｓ７２
【０１５５】
【化３１】
2009539805.tif 000032
【０１５６】
３０）ｈＩＧＦ−１−Ｅｃ：△Ｇ１、△Ｐ２、△Ｅ３、△Ｒ３７、△Ｒ７１
【０１５７】
【化３２】
2009539805.tif 000033
【０１５８】
３１）ｈＩＧＦ−１−Ｅｃ：△Ｇ１、△Ｐ２、△Ｅ３、△Ｒ３７、△Ｓ７２
【０１５９】
【化３３】
2009539805.tif 000034
【０１６０】
３２）ｈＩＧＦ−１−Ｅａｂ：△Ｇ１、△Ｐ２、△Ｅ３；Ｒ３６Ａ；△Ｒ７１；Ｅｂのａａ９５と９６との間のＥａ  ａａ９３−１０２の挿入（即ち「Ｅａｂ」）
【０１６１】
【化３４】
2009539805.tif 000035
【０１６２】
３３）ｈＩＧＦ−１−Ｅａｂ：△Ｇ１、△Ｐ２、△Ｅ３；Ｒ３７Ａ；△Ｒ７１
【０１６３】
【化３５】
2009539805.tif 000036
【０１６４】
３４）ｈＩＧＦ−１−Ｅａｂ：△Ｇ１、△Ｐ２、△Ｅ３、△Ｒ３７、△Ｒ７１
【０１６５】
【化３６】
2009539805.tif 000037
【０１６６】
３５）ｈＩＧＦ−１−Ｅａｂ：△Ｇ１、△Ｐ２、△Ｅ３；Ｒ３６Ａ；△Ｓ７２
【０１６７】
【化３７】
2009539805.tif 000038
【０１６８】
３６）ｈＩＧＦ−１−Ｅａｂ：△Ｇ１、△Ｐ２、△Ｅ３；Ｒ３７Ａ；△Ｓ７２
【０１６９】
【化３８】
2009539805.tif 000039
３７）ｈＩＧＦ−１−Ｅａｂ：△Ｇ１、△Ｐ２、△Ｅ３、△Ｒ３７、△Ｓ７２
【０１７０】
【化３９】
2009539805.tif 000040
【０１７１】
３８）ｈＩＧＦ−１−Ｅａｂ：△Ｇ１、△Ｐ２、△Ｅ３；Ｒ３６Ａ；△Ｒ７１、△Ｓ７２
【０１７２】
【化４０】
2009539805.tif 000041
【０１７３】
３９）ｈＩＧＦ−１−Ｅａｂ：△Ｇ１、△Ｐ２、△Ｅ３、△Ｒ３７、△Ｒ７１、△Ｓ７２
【０１７４】
【化４１】
2009539805.tif 000042
【０１７５】
４０）ｈＩＧＦ−１−Ｅａ：△Ｐ２、△Ｅ３；Ｒ３７Ａ；△Ｒ７１、△Ｓ７２
【０１７６】
【化４２】
2009539805.tif 000043
【０１７７】
４１）ｈＩＧＦ−１−Ｅｂ：△Ｐ２、△Ｅ３；Ｒ３７Ａ；△Ｒ７１、△Ｓ７２
【０１７８】
【化４３】
2009539805.tif 000044
【０１７９】
４２）ｈＩＧＦ−１−Ｅｂマルチマー：（△Ｇ１、△Ｐ２、△Ｅ３；Ｒ３７Ａ）−３ｘＥｂ（△Ｒ７１、△Ｓ７２、△Ｃ末端７ａａ）−Ｅｂ（△Ｒ７１、△Ｓ７２）
【０１８０】
【化４４】
2009539805.tif 000045
【０１８１】
４３）ｈＩＧＦ−１−Ｅｂマルチマー：（△Ｐ２、△Ｅ３；Ｒ３７Ａ）−３ｘＥｂ（△Ｒ７１、△Ｓ７２、△Ｃ末端７ａａ）−Ｅｂ（△Ｒ７１、△Ｓ７２）
【０１８２】
【化４５】
2009539805.tif 000046
【０１８３】
４４）ｈＩＧＦ−１−Ｅｃ：△Ｐ２、△Ｅ３；Ｒ３７Ａ；△Ｒ７１、△Ｓ７２
【０１８４】
【化４６】
2009539805.tif 000047
【０１８５】
４５）ｈＩＧＦ−１−Ｅａ：△Ｅ３；Ｒ３７Ａ；△Ｒ７１、△Ｓ７２
【０１８６】
【化４７】
2009539805.tif 000048
【０１８７】
４６）ｈＩＧＦ−１−Ｅｂ：△Ｅ３；Ｒ３７Ａ；△Ｒ７１、△Ｓ７２
【０１８８】
【化４８】
2009539805.tif 000049
【０１８９】
４７）ｈＩＧＦ−１−Ｅｂマルチマー：（△Ｇ１、△Ｐ２、△Ｅ３；Ｒ３７Ａ）−３ｘＥｂ（△Ｒ７１、△Ｓ７２、△Ｃ末端７ａａ）−Ｅｂ（△Ｒ７１、△Ｓ７２）
【０１９０】
【化４９】
2009539805.tif 000050
【０１９１】
４８）ｈＩＧＦ−１−Ｅｂマルチマー：（△Ｅ３；Ｒ３７Ａ）−３ｘＥｂ（△Ｒ７１、△Ｓ７２、△Ｃ末端７ａａ）−Ｅｂ（△Ｒ７１、△Ｓ７２）
【０１９２】
【化５０】
2009539805.tif 000051
【０１９３】
４９）ｈＩＧＦ−１−Ｅｃ：△Ｅ３；Ｒ３７Ａ；△Ｒ７１、△Ｓ７２
【０１９４】
【化５１】
2009539805.tif 000052
【０１９５】
５０）ｈＩＧＦ−１−Ｅａ：△Ｅ３；Ｒ３７Ａ；△Ｒ７１、△Ｓ７２
【０１９６】
【化５２】
2009539805.tif 000053
【０１９７】
５１）ｈＩＧＦ−１−Ｅｂ：△Ｅ３；Ｒ３７Ａ；△Ｒ７１、△Ｓ７２
【０１９８】
【化５３】
2009539805.tif 000054
【０１９９】
５２）ｈＩＧＦ−１−Ｅｃ：△Ｅ３；Ｒ３７Ａ；△Ｒ７１、△Ｓ７２
【０２００】
【化５４】
2009539805.tif 000055
【０２０１】
５３）ｈＩＧＦ−１−Ｅａｂ：△Ｅ３；Ｒ３７Ａ；△Ｒ７１、△Ｓ７２
【０２０２】
【化５５】
2009539805.tif 000056
【０２０３】
５４）ｈＩＧＦ−１−Ｅｂマルチマー：（△Ｅ３；Ｒ３７Ａ）−３ｘＥｂ（△Ｒ７１、△Ｓ７２、△Ｃ末端７ａａ）−Ｅｂ（△Ｒ７１、△Ｓ７２）
【０２０４】
【化５６】
2009539805.tif 000057
【０２０５】
５５）ｈＩＧＦ−１−Ｅａ：Ｅ３Ａ；Ｒ３７Ａ；△Ｒ７１、△Ｓ７２
【０２０６】
【化５７】
2009539805.tif 000058
【０２０７】
５６）ｈＩＧＦ−１−Ｅｂ：Ｅ３Ａ；Ｒ３７Ａ；△Ｒ７１、△Ｓ７２
【０２０８】
【化５８】
2009539805.tif 000059
【０２０９】
５７）ｈＩＧＦ−１−Ｅｃ：Ｅ３Ａ；Ｒ３７Ａ；△Ｒ７１、△Ｓ７２
【０２１０】
【化５９】
2009539805.tif 000060
【０２１１】
５８）ｈＩＧＦ−１−Ｅａｂ：Ｅ３Ａ；Ｒ３７Ａ；△Ｒ７１、△Ｓ７２
【０２１２】
【化６０】
2009539805.tif 000061
【０２１３】
５９）ｈＩＧＦ−１−Ｅｂマルチマー：（Ｅ３Ａ；Ｒ３７Ａ）−３ｘＥｂ（△Ｒ７１、△Ｓ７２、△Ｃ末端７ａａ）−Ｅｂ（△Ｒ７１、△Ｓ７２）
【０２１４】
【化６１】
2009539805.tif 000062
【０２１５】
６０）ｈＩＧＦ−１−Ｅａ：△Ｐ２、△Ｅ３；Ｒ３７Ａ；△Ｒ７１、△Ｓ７２
【０２１６】
【化６２】
2009539805.tif 000063
【０２１７】
６１）ｈＩＧＦ−１−Ｅｂ：△Ｐ２、△Ｅ３；Ｒ３７Ａ；△Ｒ７１、△Ｓ７２
【０２１８】
【化６３】
2009539805.tif 000064
【０２１９】
６２）ｈＩＧＦ−１−Ｅｃ：△Ｐ２、△Ｅ３；Ｒ３７Ａ；△Ｒ７１、△Ｓ７２
【０２２０】
【化６４】
2009539805.tif 000065
【０２２１】
６３）ｈＩＧＦ−１−Ｅａｂ：△Ｐ２、△Ｅ３；Ｒ３７Ａ；△Ｒ７１、△Ｓ７２
【０２２２】
【化６５】
2009539805.tif 000066
【０２２３】
６４）ｈＩＧＦ−１−Ｅｂマルチマー：（△Ｐ２、△Ｅ３；Ｒ３７Ａ）−３ｘＥｂ（△Ｒ７１、△Ｓ７２、△Ｃ末端７ａａ）−Ｅｂ（△Ｒ７１、△Ｓ７２）
【０２２４】
【化６６】
2009539805.tif 000067
【０２２５】
６５）ＭＧＦ−１−Ｅｂ：△Ｇ１、△Ｐ２；Ｅ３Ｘ；Ｒ３７Ａ；△Ｒ７１、△Ｓ７２
【０２２６】
【化６７】
2009539805.tif 000068
【０２２７】
６６）ｈＩＧＦ−１−Ｅｃ：△Ｇ１、△Ｐ２；Ｅ３Ｘ；Ｒ３７Ａ；△Ｒ７１、△Ｓ７２
【０２２８】
【化６８】
2009539805.tif 000069
【０２２９】
６７）ｈＩＧＦ−１−Ｅａｂ：△Ｇ１、△Ｐ２；Ｅ３Ｘ；Ｒ３７Ａ；△Ｒ７１、△Ｓ７２
【０２３０】
【化６９】
2009539805.tif 000070
【０２３１】
６８）ｈＩＧＦ−１−Ｅｂマルチマー：（△Ｇ１、△Ｐ２；Ｅ３Ｘ；Ｒ３７Ａ）−３ｘＥｂ（△Ｒ７１、△Ｓ７２、△Ｃ末端７ａａ）−Ｅｂ（△Ｒ７１、△Ｓ７２）
【０２３２】
【化７０】
2009539805.tif 000071
【０２３３】
６９）ｈＩＧＦ−１−Ｅａ：△Ｇ１、△Ｐ２、△Ｅ３；Ｒ３７Ａ；△Ｒ７１；Ｓ７２Ｘ
【０２３４】
【化７１】
2009539805.tif 000072
【０２３５】
７０）ｈＩＧＦ−１−Ｅｂ：△Ｇ１、△Ｐ２、△Ｅ３；Ｒ３７Ａ；△Ｒ７１；Ｓ７２Ｘ
【０２３６】
【化７２】
2009539805.tif 000073
【０２３７】
７１）ｈＩＧＦ−１−Ｅｃ：△Ｇ１、△Ｐ２、△Ｅ３；Ｒ３７Ａ；△Ｒ７１；Ｓ７２Ｘ
【０２３８】
【化７３】
2009539805.tif 000074
【０２３９】
７２）ｈＩＧＦ−１−Ｅａｂ：△Ｇ１、△Ｐ２、△Ｅ３；Ｒ３７Ａ；△Ｒ７１；Ｓ７２Ｘ
【０２４０】
【化７４】
2009539805.tif 000075
【０２４１】
７３）ｈＩＧＦ−１−Ｅｂマルチマー：（△Ｇ１、△Ｐ２、△Ｅ３；Ｒ３７Ａ）−Ｅｂ（△Ｒ７１；Ｓ７２Ｘ；△Ｃ末端７ａａ）−２ｘＥｂ（△Ｒ７１、△Ｓ７２、△Ｃ末端７ａａ）−Ｅｂ（△Ｒ７１、△Ｓ７２）
【０２４２】
【化７５】
2009539805.tif 000076
【０２４３】
７４）ｈＩＧＦ−１−Ｅａ：△Ｇ１、△Ｐ２、△Ｅ３；Ｒ３７Ａ；△Ｒ７１、△Ｓ７２；Ｎ９２Ｘ
【０２４４】
【化７６】
2009539805.tif 000077
【０２４５】
７５）ｈＩＧＦ−１−Ｅｂ：△Ｇ１、△Ｐ２、△Ｅ３；Ｒ３７Ａ；△Ｒ７１、△Ｓ７２；Ｃ１４２Ｘ
【０２４６】
【化７７】
2009539805.tif 000078
【０２４７】
７６）ｈＩＧＦ−１−Ｅａｂ：△Ｇ１、△Ｐ２、△Ｅ３；Ｒ３７Ａ；△Ｒ７１、△Ｓ７２；Ｃ１５１Ｘ
【０２４８】
【化７８】
2009539805.tif 000079
【０２４９】
７８）ｈＩＧＦ−１−Ｅｂマルチマー（△Ｇ１、△Ｐ２、△Ｅ３；Ｒ３７Ａ）−３ｘＥｂ（△Ｒ７１、△Ｓ７２、△Ｃ末端７ａａ）−Ｅｂ（△Ｒ７１、△Ｓ７２；Ｃ７１Ｘ）
【０２５０】
【化７９】
2009539805.tif 000080
【０２５１】
（実施例７９）
筋芽細胞増殖アッセイ
筋芽細胞増殖アッセイは、信頼できるＩＧＦ活性のインビトロ指標を与え、胚性筋芽細胞及び成体衛星細胞に影響を与える因子に対するモデルとして使用される。この系において活性のある因子は、筋芽細胞の初代培養において同様に作用する。本発明のペプチドによるインビトロでの筋芽細胞増殖の促進から、筋芽細胞増殖を向上させること及び、従って子宮内での最終的な筋繊維数を向上させることにおいて、その活性が示される。さらに、筋芽細胞増殖の同様の促進から、（例えば衛星筋肉細胞増殖の刺激を介して）成体の筋肉肥大を促進するために本発明のペプチドを使用することができることが示される。
【０２５２】
（実施例８０）
哺乳動物上皮組織アッセイ
泌乳動物において、乳房上皮組織は乳汁を産生し分泌する細胞なので、この組織の量は、乳汁産生の制限要因である。インビトロ系を用いて、増殖させ乳成分の産生量を向上させるために、本発明の修飾ＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２により、動物の乳線から得られる上皮細胞を刺激することができる。さらに、あるこのようなインビトロ細胞系で増殖させるために刺激した乳房上皮細胞を、除去した乳房脂肪体に再移植し、雌泌乳動物において増殖及び／又は乳汁を産生させるために刺激することができる。
【０２５３】
（実施例８１）
血液又は他の体液中のＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２の測定
用量反応曲線によって投与につき非経口投与されるペプチドの有効量を測定することができる。例えば、投薬を決定するために、処置すべき対象の血液又は体液中の本発明の修飾ＩＧＦペプチドを測定することができる。あるいは、対象にペプチドの漸増量を投与し、修飾ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２に対する対象の血清レベルを調べることができる。修飾ＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２のこれらの血清レベルに基づくモル基準で、使用すべきペプチドの量を計算することができる。
【０２５４】
ペプチドの適切な投薬を決定するためのある方法は、体液又は血液などの生体液中の本発明のＩＧＦペプチドを測定することを伴う。ＲＩＡ及びＥＬＩＳＡを含む何らかの手段によって、このようなレベルの測定を行うことができる。ＩＧＦレベルを測定した後、単回投与又は複数回投与を用いて本ペプチドと生体液を接触させる。この接触段階の後、生体液中のＩＧＦレベルを再測定する。生体液ＩＧＦレベルが、所望の効率（そのためにこの分子が投与されるべきである。）を得るのに十分な量低下した場合、最大効率が得られるようにその分子の用量を調整することができる。インビトロ又はインビボでこの方法を行い得る。好ましくは、インビボで、即ち、生体液を対象から採取した後にこの方法を行い、ＩＧＦレベルを測定し、単回又は複数回投与により本明細書中のペプチドを哺乳動物に投与し（即ち、動物に投与することによりこの接触段階を行う。）、次いで動物から採取した生体液からＩＧＦレベルを再測定する。
【０２５５】
投薬を決定するための別の方法は、本ペプチドに対する抗体又はＬＩＦＡ形式でのペプチドに対する別の検出方法を使用することである。
【０２５６】
（実施例８２）
ｈＩＧＦ−１−Ｅｃ  ３ｍｕｔのインビボ薬物動態
１ｍｇ／ｋｇのｒｈＩＧＦ−１及び１．５５ｍｇ／ｋｇのｈＩＧＦ−１−Ｅｃ  ３ｍｕｔ（実施例３に記載）を、成熟雄マウス（ｎ＝３／群）に静脈内（ｉ．ｖ．）ボーラス注射した。試験物質の投与から５、１５、３０及び６０分後、連続血液検体を回収した。ｒｈＩＧＦ−１及びｈＩＧＦ−１−Ｅｃ  ３ｍｕｔの血清濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。このアッセイはｈＩＧＦ−１に特異的である。
【０２５７】
ｒｈＩＧＦ−１及びｈＩＧＦ−１−Ｅｃ  ３ｍｕｔの等モル用量をマウスにｉ．ｖ．投与した。この結果から、試験した全ての時間点で、ｒｈＩＧＦ−１と比較して、ｈＩＧＦ−１−Ｅｃ  ３ｍｕｔタンパク質のレベルが有意に高いことが分かり、このことから、ｈＩＧＦ−１−Ｅｃ  ３ｍｕｔは７０アミノ酸−ｌｏｎｇ  ＩＧＦ−１よりも代謝的に安定であることが示される。
【０２５８】
【表１】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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