(57)【要約】  本発明は、ＨＩＶ−１クレイドＡ抗原用のヌクレオチド及びタンパク質のコンセンサス配列に関する。本発明はまた、流行ＨＩＶ−１の野外分離株由来のクレイドＡ抗原のヌクレオチド及びタンパク質の配列に関し、前記抗原の配列は、前記コンセンサス配列と密接に関係していることを特徴とする。好ましい実施形態では、本発明は前記配列から誘導され、ＨＩＶ−１クレイドＡのＧａｇ、Ｐｏｌ（ＲＴ及びＩｎｔ）及びＮｅｆ（「ＧＲＩＮ」と呼称）、ＨＩＶ−１クレイドＡのＧａｇ、ＲＴ及びＮｅｆ（「ＧＲＮ」と呼称）、又はＨＩＶ−１クレイドＡのＥｎｖのいずれかをコードする、ＨＩＶ−１クレイドＡトランス遺伝子に関する。本発明はまた、前記トランス遺伝子を含むベクターに関する。前記ベクターの例としては、好ましい実施形態における前記トランス遺伝子を含むアデノウイルスベクターが挙げられる。本発明は、本発明のＨＩＶ−１クレイドＡ抗原、ヌクレオチド配列、ベクター又はトランス遺伝子を含む免疫原性組成物、及びこのような免疫原性組成物の有効量の投与により、対象においてＨＩＶに対する免疫応答を生成する方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶ−１クレイドＡのＧａｇ、Ｐｏｌ（ＲＴ及びＩｎｔ）及びＮｅｆ（「ＧＲＩＮ）、ＨＩＶ−１クレイドＡのＧａｇ、ＲＴ及びＮｅｆ（「ＧＲＮ」）、又はＨＩＶ−１クレイドＡのＥｎｖをコードするヌクレオチド配列を含む、ＨＩＶ−１クレイドＡ抗原用のコンセンサスヌクレオチド配列。
【請求項２】
コードされるＧａｇタンパク質が図１のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のコンセンサスヌクレオチド配列。
【請求項３】
コードされるＰｏｌタンパク質が図３のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のコンセンサスヌクレオチド配列。
【請求項４】
コードされるＥｎｖタンパク質が図５のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のコンセンサスヌクレオチド配列。
【請求項５】
コードされるＮｅｆタンパク質が図７のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のコンセンサスヌクレオチド配列。
【請求項６】
ＨＩＶ−１クレイドＡ抗原用コンセンサスアミノ酸配列に類似したアミノ酸配列を有するＨＩＶ−１の流行株又は野外分離株から、ＨＩＶ−１クレイドＡ抗原を同定する方法であって、ＨＩＶ−１の流行株又は野外分離株由来の抗原のアミノ酸配列を当該タンパク質用のコンセンサスアミノ酸配列と比較すること、及びＨＩＶ−１の流行株又は野外分離株から、前記コンセンサス配列とのタンパク質距離が近い抗原を選択することを含む方法。
【請求項７】
トランスジェニックＨＩＶ−１クレイドＡ抗原を産生する方法であって、請求項６に記載の方法により同定されたＨＩＶ−１クレイドＡ抗原を選択すること、及び前記抗原の機能を無効にするように、前記抗原をコードするヌクレオチド配列を変異させることを含む方法。
【請求項８】
ＨＩＶ−１に対して免疫応答を生成する方法であって、請求項１に記載のヌクレオチド配列又は抗原を含む組成物を対象に投与することを含む方法。
【請求項９】
ＨＩＶ−１に対して免疫応答を生成する方法であって、請求項２に記載のヌクレオチド配列又は抗原を含む組成物を対象に投与することを含む方法。
【請求項１０】
ＨＩＶ−１に対して免疫応答を生成する方法であって、請求項３に記載のヌクレオチド配列又は抗原を含む組成物を対象に投与することを含む方法。
【請求項１１】
ＨＩＶ−１に対して免疫応答を生成する方法であって、請求項４に記載のヌクレオチド配列又は抗原を含む組成物を対象に投与することを含む方法。
【請求項１２】
ＨＩＶ−１に対して免疫応答を生成する方法であって、請求項５に記載のヌクレオチド配列又は抗原を含む組成物を対象に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との交互参照
本出願は、２００６年６月２日に出願した米国仮特許出願第６０／８１０，８１６号の優先権を主張するものである。
【０００２】
前記出願、並びに前記出願にて又はその審査手続中に引用された全文書（「出願引用文書」）及び出願引用文書中で引用又は参照された全文書、並びに本明細書中で引用又は参照される全文書（「本明細書引用文書」）及び本明細書引用文書中で引用又は参照される全文書は、本明細書中又は参照により本明細書に組み込まれる任意の文書中に記載の任意の製品に対する、製造業者の任意の使用説明書、解説書、製品仕様書及び製品シートと共に、ここに参照により本明細書に組み込まれ、本発明の実施の際に使用し得る。
【０００３】
本発明は、ＨＩＶ−１クレイドＡ抗原用のヌクレオチド及びタンパク質のコンセンサス配列及び流行ＨＩＶ−１野外分離株由来のクレイドＡ抗原のヌクレオチド及びタンパク質の配列に関する。該抗原配列は、前記コンセンサス配列と密接に関係していることを特徴とする。好ましい実施形態では本発明は、このような配列から誘導され、ＨＩＶ−１クレイドＡのＧａｇ、Ｐｏｌ（ＲＴ及びＩｎｔ）及びＮｅｆ（「ＧＲＩＮ」と呼称）、ＨＩＶ−１クレイドＡのＧａｇ、ＲＴ及びＮｅｆ（（「ＧＲＮ」と呼称）、又はＨＩＶ−１クレイドＡのＥｎｖのいずれかをコードする、ＨＩＶ−１クレイドＡトランス遺伝子に関する。本発明は、このようなトランス遺伝子を含有するベクターにも関し、好ましい実施形態における前記ベクターの例として、アデノウィルスベクターが挙げられる。本発明は、本発明のＨＩＶ−１クレイドＡ抗原、ヌクレオチド配列、ベクター又はトランス遺伝子を含む免疫原組成物、及びこのような免疫原組成物の有効量の投与により、対象においてＨＩＶ−１に対する免疫応答を生成する方法にも関する。
【背景技術】
【０００４】
ＡＩＤＳ即ち後天性免疫不全症候群は、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）により誘発され、消耗症候群、中枢神経系変性、並びに日和見感染症及び悪性腫瘍を起こす甚大な免疫抑制を含む幾つかの臨床的特徴を呈する。ＨＩＶは、ヒツジのビスナウイルス、並びにウシ、ネコ及びサルの免疫不全ウィルス（ＳＩＶ）を包含する動物レトロウィルスのレンチウィルス科に属する。ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２と称する密接に関連した２型のＨＩＶが、これまでに同定されており、そのうちＨＩＶ−１がＡＩＤＳの圧倒的に一般的な原因である。しかし、ゲノム構造及び抗原性が異なるＨＩＶ−２も、類似の臨床的症候群を起こす。
【０００５】
感染性ＨＩＶ粒子は、同一の２本鎖のＲＮＡからなり、その各々が長さ約９．２ｋｂであってウィルスタンパク質のコア内に詰め込まれている。このコア構造は、ウィルスにコードされた膜タンパク質も含んだ宿主細胞膜に由来するリン脂質二重層エンベロープに取り囲まれている（Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 4th edition, W. B. Saunders Company, 2000, p.454）。ＨＩＶゲノムは、レトロウィルス科の特徴的な5'-LTR-Gag-Pol-Env-LTR-3' 編成を有する。該ウィルスゲノムの各末端にあるＬＴＲ（長い末端反復配列）は、宿主の転写調節タンパク質に対する結合部位として機能し、宿主ゲノム中へのウィルス組込み、ウィルス遺伝子発現及びウィルス複製を調節する。
【０００６】
ＨＩＶゲノムは幾つかの構造タンパク質をコードする。Ｇａｇ遺伝子は、ヌクレオキャプシドコアのコア構造タンパク質及びマトリックスをコードする。Ｐｏｌ遺伝子は、ウィルス複製に必要な逆転写酵素（ＲＴ）、インテグラーゼ（Ｉｎｔ）及びウィルスプロテアーゼの各酵素をコードする。ｔａｔ遺伝子は、ウィルス転写産物の伸長に必要なタンパク質をコードする。ｒｅｖ遺伝子は、スプライシング不完全又は未実施のウィルスＲＮＡの核輸送を促進するタンパク質をコードする。Ｖｉｆ遺伝子産物は、ウィルス粒子の感染力を増強する。ｖｐｒ遺伝子産物は、ウィルスＤＮＡの核輸送を促進し、Ｇ２細胞周期停止を調節する。ｖｐｕ及びｎｅｆ遺伝子は、宿主細胞のＣＤ４発現を下方調節し、感染細胞からのウィルス放出を促進するタンパク質をコードする。Ｅｎｖ遺伝子は、１６０キロダルトン（ｋＤａ）前駆体（ｇｐ１６０）として翻訳され、細胞プロテアーゼで切断されることにより、共に細胞の感染に必要である外部１２０ｋＤａエンベロープ糖タンパク質（ｇｐ１２０）と膜貫通４１ｋＤａエンベロープ糖タンパク質（ｇｐ４１）とを産生する、ウィルスエンベロープ糖タンパク質をコードする（Abbas, pp.454-456）。ｇｐ１４０は、外部１２０ｋＤａエンベロープ糖タンパク質及びｅｎｖのｇｐ４１成分の一部を含有し、ｇｐ１２０、ｇｐ４１双方の特性を有する。Ｎｅｆ遺伝子は、霊長類レンチウィルスの間で保存されており、感染後に転写される最初のウィルス遺伝子の１つである。インビトロでは、ＣＤ４及びＭＨＣクラスＩの表面発現の下方調節、Ｔ細胞のシグナル伝達及び活性化の変化、並びにウィルス感染力の増強を含めた幾つかの機能が記載されてきた。
【０００７】
ＨＩＶの感染は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞などの標的細胞の細胞膜上にあるＣＤ４及びケモカイン受容体分子（例えば、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５）に、ウィルス粒子上のｇｐ１２０が結合することで開始される。結合したウィルスは、標的細胞と融合し、そのＲＮＡゲノムを逆転写する。生成したウィルスＤＮＡは、細胞ゲノム中に組み込まれ、そこで新たなウィルスＲＮＡ、したがってウィルスタンパク質及び新たなビリオンの産生を指示する。これらのビリオンは、感染した細胞膜から出芽し、他の細胞において増殖感染を確立する。この過程により最初に感染した細胞の死滅も起こる。未感染Ｔ細胞上のＣＤ４受容体は、感染細胞の表面上に発現するｇｐ１２０に対して強い親和性を有するので、ＨＩＶは、間接的に細胞を死滅させることもできる。この場合には、未感染細胞が、ＣＤ４受容体−ｇｐ１２０の相互作用を介して感染細胞に結合し、融合して合胞体を形成するが、これは生存することができない。免疫防御にとって肝要なＣＤ４＋Ｔリンパ球の破壊は、ＡＩＤＳの疾患進行の特質となる進行性免疫機能不全の主因である。ＣＤ４＋Ｔ細胞の欠失は、大部分の侵入病原体に抗する生体能力の重大な損傷を起こすが、ウィルス、真菌、寄生虫、及びマイコバクテリアを含めた特定の細菌に対する防御力に特に重大な影響を及ぼす。
【０００８】
様々なＨＩＶ−１分離株は、３群：Ｍ（主要群）、Ｏ（異常群）及びＮ（非Ｍ非Ｏ群）に分類されてきた。ＨＩＶ−１のＭ群は、世界的なＨＩＶ流行病を支配している（Gaschen et al., (2002) Science 296: 2354-2360）。ＨＩＶ−１  Ｍ群は、大まかに７０年前人間において繁殖を開始して（Korber et al., Retroviral Immunology, Pantaleo et al., eds., Humana Press, Totowa, NJ, 2001, pp. 1-31）以来、急速に多様化してきた（Jung et al., (2002) Nature 418: 144）。ＨＩＶ−１  Ｍ群は、異なる多数のクレイド（サブタイプの名でも知られている）、並びに組換え型流行株（ＣＲＦ）の名で知られている、２種以上のクレイドの組合せから生じる変異体からなる。サブタイプは、少なくとも２５％特異であるゲノムを有すると定義される（AIDS epidemic update, December 2002）。１１種のクレイドがこれまで同定されており、１文字で各サブタイプが指定される。個人が２種のＨＩＶサブタイプに感染している場合に起こり得るように、クレイド同士が相互に組み合わさり、環境中での確立に成功すると、生成するウィルスはＣＲＦの名で知られる。これまでのところ、概数１３種のＣＲＦが同定されてきた。ＨＩＶ−１クレイドは地理学的な好みも示す。例えば、流行率２番目のクレイドであるクレイドＡは、東アフリカで流行しているが、クレイドＢは欧州、南北アメリカ及びオーストラリアで流行している。最も一般的なサブタイプのクレイドＣは、南部アフリカ、インド及びエチオピアで蔓延している（AIDS epidemic update, December 2002）。各クレイド内でさえ、異なる株及びウィルス分離株の間で変異性が見られる。
【０００９】
ＨＩＶのこの遺伝的変異性は、ワクチン開発にとって科学的な難問となる。これまで提案された一手法は、多種のＨＩＶ株の配列に基づいてコンセンサス配列を開発し、こうしたコンセンサス配列に基づいてワクチンを開発することである。このような手法を支える論理は、コンセンサス配列が、異なるＨＩＶ株の間で保存される抗原をコードすると思われ、したがってこのような抗原は、多種のＨＩＶ株に対する免疫応答の生成に恐らく有用であることである。ＨＩＶ−１クレイドＡのコンセンサス配列を作製してきた者がいる。例えば、クレイドＡのコンセンサス配列に由来するトランス遺伝子ＲＥＮＴＡ及びＨＩＶＡに関する、Nkolola et al. (2004) Gene Ther. 2004. Jul. 11 (13): 1068-80及び Korber B (eds) et al. Human Retroviruses and AIDS: A Compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences. Los Alamos National Laboratory: Los Alamos, New Mexico, USA, (1997) を参照されたい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 4th edition, W. B. Saunders Company, 2000, p.454
【非特許文献２】Gaschen et al., (2002) Science 296: 2354-2360
【非特許文献３】Korber et al., Retroviral Immunology, Pantaleo et al., eds., Humana Press, Totowa, NJ, 2001, pp. 1-31
【非特許文献４】Jung et al., (2002) Nature 418: 144
【非特許文献５】AIDS epidemic update, December 2002
【非特許文献６】Nkolola et al. (2004) Gene Ther. 2004. Jul. 11 (13): 1068-80
【非特許文献７】Korber B (eds) et al. Human Retroviruses and AIDS: A Compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences. Los Alamos National Laboratory: Los Alamos, New Mexico, USA, (1997)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかし、これらの論文に記載のコンセンサス配列は、Los Alamos Laboratoryから得たＨＩＶ−１クレイドＡのコンセンサス配列から誘導したものと思われ、本発明のコンセンサス配列と同じ方法で作製しなかった。その上、こうした参考文献では、実際に最近流行しているＨＩＶ株に由来する、前記コンセンサス配列と密接に合致している配列の使用を教示せず、コンセンサス配列自体の使用に関している。
【００１２】
本出願における任意の文書の引用又は特定は、このような文書が本出願に対する先行技術として利用可能であることを認めるものではない。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、ＨＩＶ−１クレイドＡ抗原用の新規で改良されたコンセンサス配列、及びこのような新規で改良されたコンセンサス配列を産生する方法を提供する。本発明のコンセンサス配列は、多数の異なるＨＩＶ−１クレイドＡ株の抗原配列に基づいており、また最近分離したＨＩＶ−１クレイドＡ株の抗原配列に基づいているので、特に有利である。したがって、本発明のコンセンサス配列は、以前に作製されたＨＩＶ−１クレイドＡコンセンサス配列と比較して優れた生物学的適合性を有している。
【００１４】
本発明の別の主要な利点は、天然のＨＩＶ−１クレイドＡ株に由来するＨＩＶ−１クレイドＡ抗原、及びそのような抗原を産生する戦略を提供することである。こうした抗原は、本発明のコンセンサス配列と密接に関係し、又はその配列との「タンパク質距離」が近くなるように選択される。人工的に生成したコンセンサス配列とは異なり、そのコンセンサス配列と最も密接に合致したこうした天然の配列を使用することの利点は、こうした配列の作製のほうが必要な遺伝子操作の方が少なくて済み、重要なことには生物学的適合性が確実となることである。
【００１５】
第１の態様では、本発明は、ＨＩＶ−１クレイドＡ抗原用のコンセンサスアミノ酸配列に関する。一実施形態では、本発明は、ＨＩＶ−１クレイドＡ抗原であるＧａｇ、Ｐｏｌ（ＲＴ及びＩｎｔを含む）、Ｎｅｆ並びにＥｎｖ用のコンセンサスアミノ酸配列に関する。好ましい実施形態では、本発明は、図１のＧａｇコンセンサスアミノ酸配列、図３のＰｏｌコンセンサスアミノ酸配列、図５のＥｎｖコンセンサスアミノ酸配列、及び／又は図７のＮｅｆコンセンサスアミノ酸配列に関する。
【００１６】
更なる態様では、本発明は、目的とするＨＩＶ−１クレイドＡ抗原用のコンセンサスアミノ酸配列を同定する方法であって、数種の流行ＨＩＶ−１株又は野外分離株において目的とする抗原のアミノ酸配列を決定し、そのような配列を整列させ、前記抗原用のコンセンサス配列を決定することを含む方法を対象とする。
【００１７】
別の態様では、本発明は、ＨＩＶ−１クレイドＡの流行株又は野外分離株からＨＩＶ−１クレイドＡ抗原を同定する方法に関し、かかる方法は、ＨＩＶ−１クレイドＡ抗原用のコンセンサスアミノ酸配列に類似したアミノ酸配列を有する抗原を同定する。好ましい実施形態では、ＨＩＶ−１クレイドＡ抗原は、前記コンセンサス配列との類似度に基づいて選択され、前記コンセンサス配列との類似度が最も高い配列、又はその配列との「タンパク質距離」が最も近い配列が好ましい。更に好ましい実施形態では、ＨＩＶ−１クレイドＡ抗原は、ＨＩＶ−１クレイドＡの最近の流行株又は野外分離株から選択される。更なる実施形態では、本発明は、このような方法を用いて同定されるＨＩＶ−１クレイドＡ抗原に関する。
【００１８】
別の態様では、本発明は、当該ＨＩＶ−１クレイドＡ抗原用のコンセンサスアミノ酸配列に類似したアミノ酸配列を有する、ＨＩＶ−１クレイドＡの流行株又は野外分離株からＨＩＶ−１クレイドＡ抗原を同定し、次いでその配列に変異を起こして、配列の生物学的機能を無効にする方法に関する。必要最低限手法を使用すること、即ち、機能を無効にし、行政当局の認可取得を促進するのに必要な変異だけを行い、元のＨＩＶ−１遺伝子配列の不必要な変更を回避するように、変異の回数を最低限に維持することが好ましい。例えば、一実施形態では、ＧＲＩＮのＮｅｆ成分を変更するのではなく、むしろＮｅｆのＮ末端をＩｎｔのＣ末端と融合することにより、Ｎｅｆの元のヌクレオチド配列を完全に維持しながら、Ｎｅｆ機能が無効化される。
【００１９】
更に別の態様では、本発明は、ＨＩＶ−１クレイドＡトランス遺伝子の遺伝子安定性を改善する方法に関する。ＰＲ（プロテアーゼ）成分をＧａｇ−全長Ｐｏｌ−Ｎｅｆ（全長Ｐｏｌは、ＰＲ並びにＩｎｔ及びＲＴを含有する）から除去することにより、ＰｏｌのＩｎｔ及びＲＴ部分だけが残される。これは、特にＡｄ３５及び／又はＡｄ１１を用いた、遺伝子安定性の改良、並びにクローニング及びウィルス救済特性の改良という利点を有する。このようなＰＲの除去は、ＰＯＬのこの最小の機能サブユニットだけを除去することにより、大型のＩＮ及びＲＴの機能サブユニットは保持されるので、必要最低限手法である。本発明は、このような方法を用いて選択、産生されるＨＩＶ−１クレイドＡ抗原にも関する。
【００２０】
一実施形態では該抗原は、表１及び図２に列挙した株の１つ由来のＧａｇ抗原である。好ましくは、Ｇａｇ抗原は、Ｇａｇコンセンサス配列からの「タンパク質距離」が、０．０７％未満、又はより好ましくは０．０６％未満、又はより好ましくは更に０．０５％未満である株から選択される。好ましい実施形態では、Ｇａｇ抗原は、ＨＩＶ−１クレイドＡのＴＺＡ１７３株、９７ＴＺ０２株、ＫＮＨ１１４４株、又はＳＥ７５３５ＵＧ株に由来する。
【００２１】
別の実施形態では、該抗原は、表２及び図４に列挙した株の１つ由来のＰｏｌ抗原である。好ましくは、Ｐｏｌ抗原は、Ｐｏｌコンセンサス配列からの「タンパク質距離」が、０．０３％未満、又はより好ましくは０．０２５％未満である株から選択される。好ましい実施形態では、Ｐｏｌ抗原は、ＨＩＶ−１クレイドＡのＭＳＡ４０７０株、ＳＥ７２４５ＳＯ株、又はＳＥ８５３８株に由来する。
【００２２】
更なる実施形態では、該抗原は、表３及び図６に列挙した株の１つ由来のＥｎｖ抗原である。好ましくは、Ｅｎｖ抗原は、Ｇａｇコンセンサス配列からの「タンパク質距離」が、０．１未満、又はより好ましくは０．０８％未満、又はより好ましくは０．０７％未満、又はより好ましくは更に０．０６５％未満である株から選択される。好ましい実施形態では、Ｅｎｖ抗原は、ＨＩＶ−１クレイドＡのＫＥＱ２３株、ＴＺＡ３４１株、又はＫＮＨ１０８８株に由来する。
【００２３】
別の実施形態では、該抗原は、表４及び図８に列挙した株の１つ由来のＮｅｆ抗原である。好ましくは、Ｎｅｆ抗原は、Ｇａｇコンセンサス配列からの「タンパク質距離」が、０．１％未満、又はより好ましくは０．０８％未満、又はより好ましくは０．０７％未満、又はより好ましくは０．０６未満、又はより好ましくは更に０．０５％未満である株から選択される。好ましい実施形態では、Ｎｅｆ抗原は、ＨＩＶ−１クレイドＡのＭＳＡ４０７０株、又はＫＮＨ１２１１株、又は９７ＴＺ０３株、又は９９ＵＧＡ０７０株、又はＳＥ８８９１ＵＧ株に由来する。
【００２４】
更に別の態様では、本発明は、本発明のＨＩＶ−１クレイドＡ抗原をコードするヌクレオチド配列を対象とする。本発明は、こうしたヌクレオチド配列を含むベクターにも関する。本発明のヌクレオチド配列、及びそれらを含むベクター、並びに本発明のヌクレオチド配列にコードされる抗原も、ＨＩＶクレイドＡ抗原に対して免疫応答をインビボで生成するのに有用であり、ＨＩＶ−１クレイドＡ株に対するワクチンの作製に有用である。本発明のヌクレオチド配列は、例えば細胞中又はインビトロでＨＩＶ−１クレイドＡ抗原を発現、産生し、それにより該抗原を生産、単離、及び／又は精製するのにも有用となり得る。
【００２５】
本発明のヌクレオチド配列は、ヌクレオチドコンセンサス配列と比較して、又はかかるコンセンサス配列と密接に関係する、流行ＨＩＶ−１分離株由来の配列と比較して、変化させてもよい。例えば一実施形態では、前記ヌクレオチド配列は、コードされるタンパク質のインビボでの活性が無効化されるように変異させてもよい。別の実施形態では、前記ヌクレオチド配列はコドンを最適化してもよい、例えば人間の使用向けにコドンを最適化してもよい。好ましい実施形態では、本発明のヌクレオチド配列は、コードされたタンパク質の正常なインビボ機能を無効化するために変異させ、また人間の使用向けにコドンの最適化も行う。例えば、本発明のＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、ＲＴ及びＩｎｔ配列は、このようにして各々変化させてもよい。
【００２６】
好ましい実施形態では、単一のヌクレオチド配列が、本発明のＧａｇ、ＲＴ（Ｐｏｌの一部）及びＮｅｆ抗原を含む融合タンパク質をコードする。本明細書で使用する場合、略号「ＧＲＮ」及び「ＧＲｔＮ」は、Ｇａｇ、ＲＴ及びＮｅｆ抗原を含むＨＩＶ−１クレイドＡ融合タンパク質を指す場合と、こうした融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を指す場合とがあり、互換的に使用される。更に好ましい実施形態では、ＧＲＮをコードするヌクレオチド配列は、ＧＲＮ融合タンパク質の発現の実現に適切なベクター中に挿入される。好ましくは、前記ベクターは、Ａｄ５、Ａｄ３５、Ａｄ１１、Ｃ６及びＣ７からなる群から選択されるアデノウィルスベクターである。
【００２７】
別の好ましい実施形態では、単一のヌクレオチド配列が、本発明のＧａｇ、Ｐｏｌ（ＲＴ及びＩｎｔを含む）並びにＮｅｆ抗原を含む融合タンパク質をコードする。本明細書で使用する場合、略号「ＧＲＩＮ」及び「ＧＲｔＩＮ」は、Ｇａｇ、Ｐｏｌ及びＮｅｆ抗原を含むＨＩＶ−１クレイドＡ融合タンパク質を指す場合と、こうした融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を指す場合とがあり、互換的に使用される。一層好ましい実施形態では、ＧＲＩＮは、図１６Ａ〜１６Ｊに例示したアミノ酸配列を有し、図１６Ａ〜１６Ｊに例示したヌクレオチド配列によりコードされる。更により好ましい実施形態では、ＧＲＩＮをコードするヌクレオチド配列は、ＧＲＩＮ融合タンパク質の発現の実現に適切なベクター中に挿入される。好ましくは、該ベクターは、アデノウィルスベクターであり、より好ましくは、Ａｄ５、Ａｄ３５、Ａｄ１１、Ｃ６及びＣ７からなる群から選択されるアデノウィルスベクターである。
【００２８】
更に別の好ましい実施形態では、本発明の単一のヌクレオチド配列が、本発明によるＨＩＶ−１クレイドＡのＥｎｖ抗原をコードする。好ましい実施形態では、Ｅｎｖ抗原は、図１７Ａ〜１７Ｄに例示したアミノ酸配列を有し、図１７Ａ〜１７Ｄに例示したヌクレオチド配列によりコードされる。更により好ましい実施形態では、Ｅｎｖをコードするヌクレオチド配列は、Ｅｎｖタンパク質の発現の実現に適切なベクター中に挿入される。好ましくは、該ベクターは、アデノウィルスベクターであり、より好ましくは、Ａｄ５、Ａｄ３５、Ａｄ１１、Ｃ６及びＣ７からなる群から選択されるアデノウィルスベクターである。
【００２９】
別の実施形態では、本発明は、ＨＩＶ−１クレイドＡ抗原に対する免疫応答を生成する方法であって、本発明によるヌクレオチド配列又は抗原を、対象に投与することを含む方法を提供する。好ましい実施形態では、ＨＩＶ−１クレイドＡに対する免疫応答を生成するその方法は、ＧＲＩＮ、ＧＲＮのいずれかをコードし、Ａｄ５、Ａｄ３５、Ａｄ１１、Ｃ６及びＣ７からなる群から選択されるアデノウィルスベクター中に含有されるヌクレオチド配列の投与を含む。更なる好ましい実施形態では、ＧＲＩＮ又はＧＲＮを含むベクターは、本発明のＥｎｖ抗原をコードするヌクレオチド配列を含むベクターと同時投与される。
【００３０】
更なる実施形態では、本発明は、本発明のヌクレオチド配列を含む免疫原組成物又はワクチン組成物を提供する。
【００３１】
本開示、特に特許請求の範囲及び／又は段落では、「comprises」、「comprised」、「comprising」などの用語は、米国特許法に規定した意味を有することができ、例えば、それらは「includes」、「included」、「including」などを意味することができ、また、「consisting essentially of」、「consists essentially of」などの用語は、米国特許法に規定した意味を有し、例えば、それらは明確に記載していない要素を受容するが、従来技術に見出される、又は本発明の基本若しくは新規の特性に影響する要素を除外する。
【００３２】
以上及び他の実施形態は、以下の詳細な説明から明白であり、その説明に包含される。
【００３３】
例証しているが、記載する特定の実施形態に本発明を限定する意図のない、以下の詳細な説明は、添付した図を共に用いて最も良く理解し得る。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】ＨＩＶ−１クレイドＡのＧａｇタンパク質のコンセンサスアミノ酸配列を示す図である。
【図２】循環ＨＩＶクレイドＡ株のＧａｇタンパク質配列の、ＨＩＶ−１クレイドＡのＧａｇタンパク質コンセンサス配列までの「距離」を例示するグラフである。
【図３】ＨＩＶ−１クレイドＡのＰｏｌタンパク質のコンセンサスアミノ酸配列を示す図である。
【図４】循環ＨＩＶクレイドＡ株のＰｏｌタンパク質配列の、ＨＩＶ−１クレイドＡのＰｏｌタンパク質コンセンサス配列までの「距離」を例示するグラフである。
【図５】ＨＩＶ−１クレイドＡのＥｎｖタンパク質のコンセンサスアミノ酸配列を示す図である。
【図６】循環ＨＩＶクレイドＡ株のＥｎｖタンパク質配列の、ＨＩＶ−１クレイドＡのＥｎｖタンパク質コンセンサス配列までの「距離」を例示するグラフである。
【図７】ＨＩＶ−１クレイドＡのＮｅｆタンパク質のコンセンサスアミノ酸配列を示す図である。
【図８】循環ＨＩＶクレイドＡ株のＮｅｆタンパク質配列の、ＨＩＶ−１クレイドＡのＮｅｆタンパク質コンセンサス配列までの「距離」を例示するグラフである。
【図９】ＧＲＩＮ及びＧＲＮトランス遺伝子の概略表示図である。
【図１０】Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ２５３３０５を有するＨＩＶ−１クレイドＡ  ＴＺＡ１７３株からのＧａｇタンパク質のアミノ酸配列を例示する図である。
【図１１】Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ４５７０８１を有するＨＩＶ−１クレイドＡ  ＭＳＡ４０７０株からのＰｏｌタンパク質のアミノ酸配列を例示する図である。
【図１２】Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ４５７０８１を有するＨＩＶ−１クレイドＡ  ＭＳＡ４０７０株からのＮｅｆタンパク質のアミノ酸配列を例示する図である。
【図１３】Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ２５３３１４を有するＨＩＶ−１クレイドＡ  ＴＺＡ３４１株からのＥｎｖタンパク質のアミノ酸配列を例示する図である。
【図１４Ａ】図１４Ａ〜１４Ｃは、Ａｄ３５ベクター中に挿入する際のＧＲＩＮの配列を示す図である。
【図１４Ｂ】図１４Ａ〜１４Ｃは、Ａｄ３５ベクター中に挿入する際のＧＲＩＮの配列を示す図である。
【図１４Ｃ】図１４Ａ〜１４Ｃは、Ａｄ３５ベクター中に挿入する際のＧＲＩＮの配列を示す図である。
【図１５Ａ】図１５Ａ〜１５Ｂは、Ａｄ３５ベクター中に挿入する際のＥｎｖの配列を示す図である。
【図１５Ｂ】図１５Ａ〜１５Ｂは、Ａｄ３５ベクター中に挿入する際のＥｎｖの配列を示す図である。
【図１６Ａ】図１６Ａ〜１６Ｊは、コドン最適化ＧＲＩＮトランス遺伝子のヌクレオチド及びアミノ酸の配列を示す図である。
【図１６Ｂ】図１６Ａ〜１６Ｊは、コドン最適化ＧＲＩＮトランス遺伝子のヌクレオチド及びアミノ酸の配列を示す図である。
【図１６Ｃ】図１６Ａ〜１６Ｊは、コドン最適化ＧＲＩＮトランス遺伝子のヌクレオチド及びアミノ酸の配列を示す図である。
【図１６Ｄ】図１６Ａ〜１６Ｊは、コドン最適化ＧＲＩＮトランス遺伝子のヌクレオチド及びアミノ酸の配列を示す図である。
【図１６Ｅ】図１６Ａ〜１６Ｊは、コドン最適化ＧＲＩＮトランス遺伝子のヌクレオチド及びアミノ酸の配列を示す図である。
【図１６Ｆ】図１６Ａ〜１６Ｊは、コドン最適化ＧＲＩＮトランス遺伝子のヌクレオチド及びアミノ酸の配列を示す図である。
【図１６Ｇ】図１６Ａ〜１６Ｊは、コドン最適化ＧＲＩＮトランス遺伝子のヌクレオチド及びアミノ酸の配列を示す図である。
【図１６Ｈ】図１６Ａ〜１６Ｊは、コドン最適化ＧＲＩＮトランス遺伝子のヌクレオチド及びアミノ酸の配列を示す図である。
【図１６Ｉ】図１６Ａ〜１６Ｊは、コドン最適化ＧＲＩＮトランス遺伝子のヌクレオチド及びアミノ酸の配列を示す図である。
【図１６Ｊ】図１６Ａ〜１６Ｊは、コドン最適化ＧＲＩＮトランス遺伝子のヌクレオチド及びアミノ酸の配列を示す図である。
【図１７Ａ】図１７Ａ〜１７Ｄは、コドン最適化Ｅｎｖトランス遺伝子のヌクレオチド及びアミノ酸の配列を示す図である。
【図１７Ｂ】図１７Ａ〜１７Ｄは、コドン最適化Ｅｎｖトランス遺伝子のヌクレオチド及びアミノ酸の配列を示す図である。
【図１７Ｃ】図１７Ａ〜１７Ｄは、コドン最適化Ｅｎｖトランス遺伝子のヌクレオチド及びアミノ酸の配列を示す図である。
【図１７Ｄ】図１７Ａ〜１７Ｄは、コドン最適化Ｅｎｖトランス遺伝子のヌクレオチド及びアミノ酸の配列を示す図である。
【図１８】ＩＦＮ−γのELIspot アッセイで測定した場合のマウスにおけるＡｄ５−ＧＲＩＮ及びＡｄ５−ＧＲＮの免疫原性を例示するグラフである。
【図１９】ＩＦＮ−γのELIspot アッセイで測定した場合のマウスにおけるＣ７−ＧＲＩＮ及びＣ７−ＧＲＮの免疫原性を例示するグラフである。
【図２０】ＩＬ−２のELIspot アッセイで測定した場合のマウスにおけるＣ７−ＧＲＩＮ及びＣ７−ＧＲＮの免疫原性を例示するグラフである。
【図２１】ＩＦＮ−γのELIspot アッセイで測定した場合のマウスにおけるＣ６−ＧＲＩＮ及びＣ６−ＧＲＮの免疫原性を例示するグラフである。
【図２２】ＩＬ−２のELIspot アッセイで測定した場合のマウスにおけるＣ６−ＧＲＩＮ及びＣ６−ＧＲＮの免疫原性を例示するグラフである。
【図２３Ａ】マカクザルにおける１月０〜６回の免疫スケジュール後のＡｄ３５−ＧＲＩＮ／ＥＮＶ１０１０ｖｐ用量でのＩＦＮ−γ  ELISpot 免疫原性を例示する図である。陽性応答の定義：単一試料の単一ペプチドプールに対して、応答＝（ペプチドカウント数平均値−非ペプチドカウント数平均値）。陽性となるためには、単一ペプチドの応答が、１．同じプレートに対して、ペプチドカウント数平均値＞非ペプチドカウント数平均値の４倍、２．反復カウント数間の変動係数≦７０％、及び３．応答＞５５ＳＦＣ／１０６。各抗原成分（Ｇａｇ、ＲＴ、ＩＮ及びＥＮＶ）に対するＰＢＭＣ百万個当たりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）の相乗平均応答が、ｙ軸上に示され、採血時点がｘ軸上に週単位で示されている。
【図２３Ｂ】マカクザルにおける１月０〜６回の免疫スケジュール後のＡｄ３５−ＧＲＩＮ／ＥＮＶ１０１１ｖｐ用量でのＩＦＮ−γ  ELISpot 免疫原性を例示する図である。陽性応答の定義：単一試料の単一ペプチドプールに対して、応答＝（ペプチドカウント数平均値−非ペプチドカウント数平均値）。陽性となるためには、単一ペプチドの応答が、１．同じプレートに対して、ペプチドカウント数平均値＞非ペプチドカウント数平均値の４倍、２．反復カウント数間の変動係数≦７０％、及び３．応答＞５５ＳＦＣ／１０６。各抗原成分（Ｇａｇ、ＲＴ、ＩＮ及びＥＮＶ）に対するＰＢＭＣ百万個当たりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）の相乗平均応答が、ｙ軸上に示され、採血時点がｘ軸上に週単位で示されている。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は、ＨＩＶ−１クレイドＡ抗原用のヌクレオチド及びタンパク質のコンセンサス配列、並びにこれらのコンセンサス配列と密接に合致する流行ＨＩＶ−１野外分離株に関する。本発明は、遺伝子産物のインビボでの機能を無効化するように変化させ得るこうした配列の変異型、本発明の配列を含む構築体及びベクター、並びに本発明の配列を使用して作製した免疫原、免疫原性組成物及びワクチンにも関する。本発明は、対象においてＨＩＶ−１クレイドＡ抗原に対する免疫応答を生成する方法、及びＨＩＶ−１の侵入に対して防御免疫を誘発する方法にも関する。本発明の多様な実施形態は、「課題を解決するための手段（"Summary of the Invention"）」と題する既出の項に概説されている。本発明の更なる詳細は、以下の詳細なる説明及び実施例、並びに図面において示される。
【００３６】
既出の「課題を解決するための手段（"Summary of the Invention"）」及び以下の「実施例」に記載のように、本発明は、ＨＩＶ−１クレイドＡのコンセンサス抗原を提供し、これらのコンセンサス配列と密接に合致する、流行ＨＩＶ−１クレイドＡ株由来の抗原も提供する。本発明は、ＨＩＶ−１トランス遺伝子、及びかかるトランス遺伝子がコードする抗原も提供する。こうしたトランス遺伝子は、本発明のＨＩＶ−１クレイドＡ抗原、例えば、本発明のＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、ＲＴ及びＩｎｔ各抗原をコードする配列を含む。例えば、好ましい一実施形態では、本発明は、本発明のＧａｇ、Ｐｏｌ（ＲＴ、Ｉｎｔの両方）及びＮｅｆ各抗原を含むＧＲＩＮ（ＧＲｔＩＮとも呼称される）トランス遺伝子を提供する。別の好ましい実施形態では、本発明は、本発明のＧａｇ、ＲＴ及びＮｅｆ各抗原を含むＧＲＮ（ＧＲｔＮとも呼称される）トランス遺伝子を提供する。別の実施形態では、本発明は、本発明のＥｎｖ抗原を含むＥｎｖトランス遺伝子を提供する。
【００３７】
用語「タンパク質」、「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「アミノ酸配列」は、長さ任意のアミノ酸残基の高分子を指すために、本明細書では互換的に使用される。前記高分子は、線状でも分岐してもよく、修飾アミノ酸又はアミノ酸類縁体を含んでもよく、アミノ酸以外の成分が割り込んでもよい。該用語は、自然に又は介入により、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は標識成分若しくは生物活性成分との複合などの他の任意の操作若しくは修飾により、修飾されたアミノ酸高分子も包含する。
【００３８】
本発明で使用する場合、用語「抗原」又は「免疫原」は、対象において免疫応答を誘発できる物質、通常はタンパク質を指すために、互換的に使用される。該用語は、対象に投与されると（直接的に、又はタンパク質をコードするヌクレオチド配列若しくはベクターを対象に投与することにより）、そのタンパク質に対する体液性及び／又は細胞性の免疫応答を誘発できるという意味において、免疫活性であるタンパク質も指す。
【００３９】
本発明のタンパク質及び抗原は、本明細書に例示し、記載する配列そのものとは異なり得ることを理解されたい。したがって、本発明では、示した配列が本発明の方法に従って機能する限り、その配列に対する欠失、付加及び置換を想定している。これに関しては、特に好ましい置換は、一般に特質が保存的、即ち、あるアミノ酸族の内部で起こる置換となろう。例えば、アミノ酸は、一般に４族：（１）酸性・・・アスパラギン酸及びグルタミン酸、（２）塩基性・・・リシン、アルギニン、ヒスチジン、（３）非極性・・・アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、並びに（４）非荷電極性・・・グリシン、アスパラギン、グルタミン、シスチン、セリン、スレオニン、チロシン、に区分される。フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは、芳香族アミノ酸と分類される場合もある。ロイシンをイソロイシン若しくはバリンで、又はその逆、アスパラギン酸をグルタミン酸で、又はその逆、スレオニンをセリンで、又はその逆に孤立させて置換すること、或いはあるアミノ酸を関連構造のアミノ酸で同様に保存的に置換することは、生物活性に大きな効果を及ぼすことはないとかなりの程度予測できる。したがって、例示し、記載する配列と実質的に同じアミノ酸配列を有するが、そのタンパク質の免疫原性に実質的に影響しない些細なアミノ酸置換を有するタンパク質は、本発明の範囲に入る。
【００４０】
一実施形態では、本発明は、ＨＩＶ−１クレイドＡ抗原用の「コンセンサス」アミノ酸配列に関する。一実施形態では、本発明は、ＨＩＶ−１クレイドＡの抗原Ｇａｇ、Ｐｏｌ（ＲＴ及びＩｎｔを含む）、Ｎｅｆ並びにＥｎｖ用のコンセンサスアミノ酸配列に関する。好ましい実施形態では、本発明は、図１のコンセンサスＧａｇアミノ酸配列、図３のコンセンサスＰｏｌアミノ酸配列、図５のコンセンサスＥｎｖアミノ酸配列、及び／又は図７のコンセンサスＮｅｆアミノ酸配列に関する。更なる態様では、本発明は、目的のＨＩＶ−１クレイドＡ抗原用のコンセンサスアミノ酸配列を同定する方法であって、数種の流行ＨＩＶ−１株又は野外分離株において目的抗原のアミノ酸配列を取得し、そのような配列を整列させ、その抗原用のコンセンサス配列を決定することを含む方法を対象とする。例えば、一実施形態では、ＨＩＶ−１クレイドＡの非組換え流行株のための利用可能な配列を用いてデータベースを生成し、次いで、そのデータベースにある全配列由来の個々のＨＩＶ−１遺伝子（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｎｅｆ及びｅｎｖ）を整列させ、その際、配列中の挿入又は欠失のある領域において整列を維持するために、破線を挿入し、次いで５０％コンセンサス配列を誘導することができる。
【００４１】
本発明は、天然のＨＩＶ−１クレイドＡ株から、その抗原のコンセンサスアミノ酸配列との「タンパク質距離」が近いアミノ酸配列を有する抗原を同定する方法にも関する。「タンパク質距離」とは、２つのアミノ酸配列間の類似性又は差異の程度の尺度である。非常に類似している２つのアミノ酸配列は、短いタンパク質距離を有する。非常に相違している２つのアミノ酸配列は、長いタンパク質距離を有する。タンパク質距離は、生化学的類似度に従って置換に加重するDayhoff ＰＡＭ２５０置換行列（M.O. Dayhoff, ed., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure, Vol. 5）を用いて計算するのが好ましい。しかし、タンパク質距離を決定する他の方法も使用することができる。
【００４２】
本明細書で使用する場合、用語「ヌクレオチド配列」及び「核酸配列」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）を指し、それだけに限らないが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、又は合成核酸を含む。該核酸は、１本鎖、又は部分的若しくは完全な２本鎖（２重鎖）の場合もある。２重鎖核酸は、ホモ２重鎖又はヘテロ２重鎖でもよい。
【００４３】
既出の「課題を解決するための手段（"Summary of the Invention"）」及び以下の「実施例」に記載のように、本発明は、ＨＩＶ−１クレイドＡのコンセンサス抗原、及びこれらのコンセンサス抗原をコードするヌクレオチド配列を提供する。本発明は、これらのコンセンサス配列、及びそうした配列をコードするヌクレオチド配列に密接に合致する、流行ＨＩＶ−１クレイドＡ株由来の抗原にも関する。本発明は、本発明のＨＩＶ−１クレイドＡ抗原をコードする配列を含むＨＩＶ−１クレイドＡトランス遺伝子も提供する。本明細書で使用する場合、用語「トランス遺伝子」は、本発明のＨＩＶ−１クレイドＡのコンセンサスヌクレオチド配列、又はこうしたコンセンサス配列に密接に合致すると確認された、最近の流行ＨＩＶ−１クレイドＡ株のいずれかに由来する、「組換え」ヌクレオチド配列を指すために使用される。用語「組換え」とは、「人間により」操作されたものであり、自然においては生じない、又は自然において別のヌクレオチド配列に連結され、若しくは異なる配置で見出されるヌクレオチド配列を意味する。「人間による」操作とは、機械、コドン最適化、制限酵素などの使用による操作を含め、何らかの人工的手段による操作を意味すると理解される。例えば、好ましい実施形態では、本発明はＧＲＩＮ、ＧＲＮ及びＥｎｖトランス遺伝子を提供する。
【００４４】
本発明のヌクレオチドは、コンセンサスヌクレオチド配列と比較して、又はこのようなコンセンサス配列に密接に関連する流行ＨＩＶ−１分離株由来の配列と比較して、変化させ得る。例えば、一実施形態では、該ヌクレオチド配列は、コードするタンパク質のインビボ活性が無効化されるように、変異させ得る。別の実施形態では、該ヌクレオチド配列に、コドン最適化を施し得る、例えば、人間用途向けにそのコドンを最適化し得る。好ましい実施形態では、本発明のヌクレオチド配列は、コードするタンパク質の正常なインビボ機能を無効化するために変異させ、さらにヒト用途向けにコドンを最適化させる。例えば、本発明のＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、ＲＴ及びＩｎｔ各配列は、このようにして変化させ得る。
【００４５】
抗原のインビボ機能を無効化するためになし得る変異の型には、それだけに限らないが、実施例７にも記載される以下の型：即ち、Ｇａｇ中のＧｌｙ２のＡｌａへの変異による、ミリスチル化部位の除去及びウィルス様粒子（ＶＬＰ）の形成防止；Ｇａｇの変異による自然フレームシフト配列におけるスリップの回避、それによる保存アミノ酸配列（ＮＦＬＧ）の完全性保持、及び全長ＧａｇＰｏｌタンパク質産物以外の翻訳排除；ＲＴ  Ａｓｐ１８５のＡｌａへの変異、及びＡｓｐ１８６のＡｌａへの変異による活性酵素残基の不活性化が挙げられる。Ｉｎｔ  Ａｓｐ６４のＡｌへの変異、及びＡｓｐ１１６のＡｌａへの変異、更にＧｌｕ１５２のＡｌａへの変異による活性酵素残基の不活性化が挙げられる。
【００４６】
コドン最適化に関しては、本発明の核酸分子は、本発明の抗原をコードするヌクレオチド配列を有し、その抗原を産生しようとする対象の遺伝子中で使用されるコドンを採用するように設計することができる。ＨＩＶ及び他のレンチウィルスを含む多くのウィルスは、多数の希少コドンを使用し、所望の対象において汎用されるコドンに一致するようにこれらのコドンを変化させることにより、該抗原の発現強化を実現することができる。好ましい実施形態では、使用するコドンは、「ヒト化」コドン、即ち、ＨＩＶが繁用するコドンの代わりに、高度に発現するヒト遺伝子（Andre et al., J. Virol. 72:1497-1503, 1998）中に頻繁に出現するコドンである。このようなコドンの使用は、ヒト細胞において、トランスジェニックＨＩＶタンパク質を効率的に発現する。任意の適当なコドン最適化法を使用し得る。例えば、実施例８に例示するように、ヒトの使用のためにコドンを最適化してもよい。しかし、他の任意の適当なコドン最適化法を使用してもよい。このような方法及びこのような方法の選択は、当業者に周知のことである。その上、Geneart社（geneart.com）のように配列のコドンを最適化すると見込まれる会社が数社存在する。したがって、本発明のヌクレオチド配列に、容易にコドン最適化を施すことができる。
【００４７】
本発明は更に、本発明の抗原に機能性及び／又は抗原性が等価な変異体及び誘導体をコードするヌクレオチド配列、並びに機能的に等価なその断片も包含する。こうした機能的に等価な変異体、誘導体及び断片は、抗原活性を保持する能力を示す。例えば、コードするアミノ酸配列を変化させないＤＮＡ配列の変化、並びに、アミノ酸残基の保存的置換、アミノ酸１個又は少数個の欠失又は付加、及びアミノ酸類縁体によるアミノ酸残基の置換を起こすＤＮＡ配列の変化は、コードされるポリペプチドの性質にさほど影響しないと思われる変化である。保存的アミノ酸置換は、グリシン／アラニン、バリン／イソロイシン／ロイシン、アスパラギン／グルタミン、アスパラギン酸／グルタミン酸、セリン／スレオニン／メチオニン、リシン／アルギニン、及びフェニルアラニン／チロシン／トリプトファンである。一実施形態では、変異体は、対象とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドと、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の相同性又は同一性を有する。
【００４８】
本発明の目的のために、配列の同一性又は相同性は、重複及び一致を最大限にすると同時に、配列ギャップを最小限にするように、配列同士を整列させたときに、配列同士を比較することにより決定される。特に、幾種もの数学アルゴリズムのいずれかを使用して、配列同一性を決定し得る。２つの配列を比較するために使用される数学アルゴリズムの非限定的一例は、Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990; 87: 2264-2268、及びその改良版であるKarlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993; 90: 5873-5877のアルゴリズムである。
【００４９】
配列の比較に使用される数学アルゴリズムの別の例は、Myers & Miller, CABIOS 1988;4: 11-17のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列整列ソフトウェアパッケージの一部をなすＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）中に組み込まれる。アミノ酸配列の比較のためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する際、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティー、及び４のギャップペナルティーを使用することができる。局所的な配列の類似性及び整列の領域を特定するための更に別の有用なアルゴリズムは、Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988; 85: 2444-2448に記載されるようなアルゴリズムである。
【００５０】
ＷＵ−ＢＬＡＳＴ（Washington University BLAST）バージョン２．０ソフトウェアは、本発明に従った使用にとって有利である。数種のＵＮＩＸ（登録商標）プラットフォーム用のＷＵ−ＢＬＡＳＴバージョン２．０の実行可能プログラムは、ftp://blast.wustl.edu/blast/executablesからダウンロードすることができる。このプログラムはＷＵ−ＢＬＡＳＴバージョン１．４に基づき、そのバージョンは、パブリックドメインのＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴバージョン１．４に順に基づいている（その全てが参照により本明細書に組み込まれる、Altschul & Gish, 1996, Local alignment statistics, Doolittle ed., Methods in Enzymology 266: 460-480; Altschul et al., Journal of Molecular Biology 1990; 215: 403-410; Gish & States, 1993;Nature Genetics 3: 266-272; Karlin & Altschul, 1993; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877）。
【００５１】
本発明の多様な組換えヌクレオチド配列及びトランス遺伝子は、標準的な組換えＤＮＡ及びクローニングの技法を用いて作製される。このような技法は当業者に周知のことである。例えば、"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al. 1989) を参照されたい。
【００５２】
本発明のヌクレオチド配列は「ベクター」中に挿入し得る。用語「ベクター」は、当業者により広範に使用され、理解されており、本明細書で使用する場合、用語「ベクター」は、当業者にとっての意味に合致して使用される。例えば、用語「ベクター」は、１つの環境から別の環境への核酸分子の移動を可能とし、若しくは促進する、又は核酸分子の操作を可能とし、若しくは促進する媒体を指すために、当業者に汎用されている。
【００５３】
本発明のＨＩＶ−１クレイドＡトランス遺伝子の発現を可能とする任意のベクターを、本発明に従って使用し得る。ある種の実施形態では、本発明のＨＩＶ−１クレイドＡトランス遺伝子は、インビトロ（無細胞発現系など）及び／又はインビトロで増殖した培養細胞で使用することにより、タンパク質性ワクチンの製造などの多様な用途に後で使用し得るコードされたＨＩＶ−１抗原を産生し得る。このような用途のために、インビトロ及び／又は培養細胞でＨＩＶ−１クレイドＡトランス遺伝子の発現を可能とする任意のベクターを使用し得る。
【００５４】
トランス遺伝子をインビボで発現させるのが望ましい用途のために、例えば、本発明のトランス遺伝子をＤＮＡワクチン又はＤＮＡ含有ワクチンに使用する場合、本発明のＨＩＶ−１クレイドＡトランス遺伝子の発現を可能とし、インビボでの使用にとって安全である任意のベクターを使用してもよい。好ましい実施形態では、使用するベクターは、人間、哺乳類及び／又は実験動物における使用にとって安全である。
【００５５】
本発明のトランス遺伝子を発現させるためには、そのタンパク質コード配列が、該タンパク質の転写及び翻訳を指示する調節配列又は核酸制御配列と、「作動可能に連結」されるべきである。本明細書で使用する場合、コード配列、及び核酸制御配列又はプロモーターは、コード配列の発現或いは転写及び／又は翻訳を核酸制御配列の影響下又は制御下に入るように共有結合で連結されるとき、「作動可能に連結」されると言われる。「核酸制御配列」には、それだけに限らないが、プロモーター、エンハンサー、ＩＲＥＳ、イントロン、及びこの配列に作動可能に連結される核酸配列又はコード配列の発現を指示する本明細書記載の他の要素などの任意の核酸要素がなり得る。用語「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの開始部位の回りに集合し、本発明のタンパク質コード配列と作動可能に連結されるとき、被コードタンパク質の発現を起こす、一群の転写制御モジュールを指すために、本明細書では使用するものとする。本発明のトランス遺伝子の発現は、限定することなく、テトラサイクリンなどの抗生物質、エクジソンなどのホルモン、又は重金属など、特定の何らかの外部刺激に曝された場合にしか転写を開始しない、構成プロモーター又は誘導プロモーターの制御下におくことができる。該プロモーターは、特定の細胞型、組織又は器官に特異的となることもできる。多数の適切なプロモーター及びエンハンサーが、当技術分野で知られており、本発明のトランス遺伝子を発現するために、このような任意の適切なプロモーター又はエンハンサーを使用し得る。例えば、適切なプロモーター及び／又はエンハンサーは、真核細胞プロモーターデータベース（ＥＰＤＢ）から選択することができる。
【００５６】
本発明に従って使用されるベクターは、プロモーター又はエンハンサーなどの適切な遺伝子調節領域を含有し、本発明のトランス遺伝子を発現できるように通常、選定すべきである。
【００５７】
例えば、その目的が、本発明のトランス遺伝子がコードするタンパク質（複数も）を産生するために、インビトロで、又は培養細胞で、又は任意の原核系若しくは真核系でそのトランス遺伝子を発現することである場合、その用途に応じて適切な任意のベクターを使用することができる。例えば、プラスミド、ウィルスベクター、細菌ベクター、原虫ベクター、昆虫ベクター、バキュロウィルス発現ベクター、酵母ベクター、哺乳動物細胞ベクターなどを使用することができる。適切なベクターは、ベクターの特性、及び確認した状況下でトランス遺伝子を発現する要件を考慮して、当業者が選択することができる。
【００５８】
その目的が、例えば、ＨＩＶ−１抗原に対する免疫応答、及び／又はＨＩＶ−１に対する防御免疫を生成するために、対象においてインビボで本発明のトランス遺伝子を発現することである場合、その対象上での発現に適切であり、インビボでの使用に安全である発現ベクターを選定すべきである。例えば、幾つかの実施形態では、本発明のＨＩＶ−１免疫原組成物及びワクチンを前臨床試験するなどのために、実験動物において本発明のトランス遺伝子を発現させることが望ましいこともある。他の実施形態では、本発明の免疫原組成物及びワクチンの臨床試験及び実際の臨床使用などのために、人間対象において本発明のトランス遺伝子を発現させることが望ましいこととなろう。このような使用に適している任意のベクターを使用することができ、適切なベクターを選択することは、当業者の能力内に十分入る。幾つかの実施形態では、こうしたインビボ用途に使用するベクターは、対象において増幅することから弱毒化されることが好ましいこともある。例えば、プラスミドベクターが使用される場合、対象におけるインビボ使用のために安全性を高めるように、それらのベクターは、対象において機能する複製起点を欠くことが好ましかろう。ウィルスベクターが使用される場合、対象におけるインビボ使用のために安全性をやはり高めるように、それらのベクターは、対象において弱毒化されるか、複製不良であることが好ましい。
【００５９】
本発明の好ましい実施形態では、ウィルスベクターが使用される。ウィルス発現ベクターは、当業者に周知であり、例えば、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）、アルファウィルス、ヘルペスウィルス、レトロウィルス、及びアビポックスウィルス、弱毒化ポックスウィルス、ワクシニアウィルス、特に修飾ワクシニアアンカラウィルス（ＭＶＡ；ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−１５６６）を含むポックスウィルスなどのウィルスを包含する。このようなウィルスは、発現ベクターとして使用される際、人間などの選択した対象において生来非病原性であり、又は選択した対象において非病原化するように修飾されてきた。例えば、複製不良のアデノウィルス及びアルファウィルスは、周知であり、遺伝子送達ベクターとして使用することができる。
【００６０】
特に好ましい実施形態では、アデノウィルスベクターが使用される。多くのアデノウィルスベクターが、当技術分野で公知であり、適当なこのような任意のベクターを使用し得る。好ましい実施形態では、使用するアデノウィルスベクターは、Ａｄ５、Ａｄ３５、Ａｄ１１、Ｃ６及びＣ７ベクターからなる群から選択される。
【００６１】
アデノウィルス５（「Ａｄ５」）ゲノムの配列は公表されてきた。（その内容が参照により本明細書に組み込まれる、Chroboczek, J., Bieber. F., and Jacrot, B. (1992) The Sequence of the Genome of Adenovirus Type 5 and Its Comparison with the Genome of Adenovirus Type 2, Virology 186, 280-285）。Ａｄ３５ベクターは、米国特許第６９７４６９５号明細書、第６９１３９２２号明細書、及び第６８６９７９４号明細書に記載されている。Ａｄ１１ベクターは、米国特許第６９１３９２２号明細書に記載されている。Ｃ６アデノウィルスベクターは、米国特許第６７８０４０７号明細書、第６５３７５９４号明細書、第６３０９６４７号明細書、第６２６５１８９号明細書、第６１５６５６７号明細書、第６０９０３９３号明細書、第５９４２２３５号明細書、及び第５８３３９７５号明細書に記載されている。Ｃ７ベクターは、米国特許第６２７７５５８号明細書に記載されている。
【００６２】
Ｅ１欠損若しくは欠失、Ｅ３欠損若しくは欠失、及び／又はＥ４欠損若しくは欠失をしているアデノウィルスベクターも、使用し得る。Ｅ１領域に変異を有するある種のアデノウィルスは、Ｅ１欠損アデノウィルス変異体が、非許容性細胞において複製不良であるか、又はごく控えめに言っても高度に弱度化されているので、改善された安全域を有する。Ｅ３領域に変異を有するアデノウィルスは、アデノウィルスがＭＨＣクラスＩ分子を下方調節する機構の破壊により、免疫原性を既に高めていることもある。Ｅ４変異を有するアデノウィルスは、後期遺伝子発現の抑制のために、アデノウィルスベクターの免疫原性が低下していることもある。このようなベクターは、同じベクターを利用する反復的再ワクチン接種が望ましい場合、特に有用となり得る。Ｅ１、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ１及びＥ３、並びにＥ１及びＥ４が欠失又は変異しているアデノウィルスベクターは、本発明に従って使用することができる。
【００６３】
更に、全てのウィルス遺伝子を欠失している「ガットレス（gutless）」アデノウィルスベクターも、本発明に従って使用することができる。このようなベクターは、複製のためにヘルパーウィルスを必要とし、自然環境中には存在しない条件である、Ｅ１ａ、Ｃｒｅの双方を発現する特殊なヒト２９３細胞系を必要とする。このような「ガットレス」ベクターは非免疫原性であり、したがって再ワクチン接種のためにそのベクターを何度も接種し得る。該「ガットレス」アデノウィルスベクターは、本発明のトランス遺伝子などの異種の挿入配列／遺伝子の挿入に使用することができ、多数の異種挿入配列／遺伝子の同時送達にさえ使用することができる。
【００６４】
本発明は、Ｅｎｖの導入が、細胞性免疫（ＣＭＩ）及び防御効果から見て有益又は有害であるかの評価を可能とするために、別々のベクター上にＥｎｖ及びＧＲＩＮを配置する設計も包含する。ＥｎｖのＣＭＩ及び防御効果に対する有益性及び／又は有害性は、ＨＩＶワクチン分野においてなお未解決の問題である。したがって、本発明は、ＥｎｖのＣＭＩ及び防御効果に関する評価を提供する。ＥｎｖのＣＭＩ及び防御効果に対する作用を決定するために、本発明のトランス遺伝子及びベクターを利用することは、当業者の範囲に入る。
【００６５】
本発明のヌクレオチド配列及びベクターは、例えばその目的が、細胞中にＨＩＶ−１抗原を発現させることにより、その発現タンパク質を産生し、培養物中に増殖した細胞などからそれを単離することである場合に、細胞に送達することができる。細胞中にトランス遺伝子を発現させるために、トランスフェクション、形質転換又は遺伝子送達の適当な任意の方法を使用することができる。このような方法は、当業者に周知されており、当業者であれば、使用するヌクレオチド配列、ベクター及び細胞型の特質に応じて適切な方法を容易に選択することができよう。例えば、トランスフェクション、形質転換、マイクロインジェクション、感染、電気穿孔、リポフェクション、又はリポソーム媒介送達を使用することができよう。抗原の発現は、細菌細胞、酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞などの適当な任意の型の宿主細胞中で実施することができる。本発明のＨＩＶ−１クレイドＡ抗原は、インビトロの転写／翻訳系を含めて使用して発現させることもできる。このような方法は全て、当業者に周知されており、当業者であれば、使用するヌクレオチド配列、ベクター及び細胞型の特質に応じて適切な方法を容易に選択することができよう。
【００６６】
発現の後、本発明の抗原は、当技術分野で公知の適当な任意の技法を使用して単離及び／又は精製或いは濃縮することができる。例えば、陰イオン若しくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、免疫アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、分子篩クロマトグラフィー、等電点電気泳動、ゲル電気泳動、又は他の任意の適当な方法、又は併用法を使用することができる。
【００６７】
好ましい実施形態では、本発明のヌクレオチド配列及び／又は抗原は、例えば、その目的が対象において免疫応答を生じることである場合に、インビボで投与される。本発明に関する「対象」には、任意の動物がなり得る。例えば、幾つかの実施形態では、本発明のＨＩＶ−１免疫原組成物及びワクチンの前臨床試験などのために、実験動物中に本発明のトランス遺伝子を発現させることが望ましいこともある。他の実施形態では、本発明の免疫原組成物及びワクチンの臨床試験及び実際の臨床使用などのために、人間対象中に本発明のトランス遺伝子を発現させることが望ましかろう。好ましい実施形態では、該対象は人間であり、例えば、ＨＩＶ−１に感染している、又は感染する危険性がある人である。
【００６８】
このようなインビボ用途に対して、本発明のヌクレオチド配列及び／又は抗原は、薬学的に許容される担体との混合物として本発明のヌクレオチド配列及び／又は抗原を含む、免疫原組成物の成分として投与するのが好ましい。本発明の免疫原組成物は、ＨＩＶ−１に対する免疫応答の刺激に有用であり、ＡＩＤＳを予防、改善又は治療するために、ＨＩＶ−１に対する予防又は治療ワクチンの１種又は複数の成分として使用し得る。本発明の核酸及びベクターは、人間などの対象に遺伝子ワクチン、即ち本発明のＨＩＶ−１クレイドＡ抗原をコードする核酸を送達するためのワクチンを提供し、その後免疫応答を誘発するように、ＨＩＶ−１クレイドＡ抗原を対象中で発現させるのに特に有用である。
【００６９】
本発明の組成物は、注射用の懸濁液、溶液、噴霧液、凍結乾燥粉末、シロップ、エリキシルなどとしてもよい。適切な任意形態の組成物を使用してもよい。このような組成物を調製するために、所望の純度を有する本発明の核酸及びベクターは、１種又は複数の薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤と混合される。この担体及び賦形剤は、組成物の他の成分に適合するという意味で「許容され」なければならない。許容される担体、賦形剤及び安定剤は、使用される用量及び濃度で受容対象に無毒であり、それだけに限らないが、水、塩水、リン酸緩衝塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール若しくはそれらの組合せ；リン酸、クエン酸及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸、メチオニンを含めた抗酸化剤；防腐剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール、メチル若しくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、ｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、デキストリンを含めた単糖類、二糖類及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、ソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）、及び／又はTWEEN（商標）、PLURONICS（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン界面活性剤を包含する。
【００７０】
免疫原又は免疫性組成物は、水中油乳濁液の形態でも製剤化することができる。水中油乳濁液は、例えば、軽質液体パラフィン油（欧州薬局方型）、スクアラン、スクアレン、ＥＩＣＯＳＡＮＥ（商標）、テトラテトラコンタンなどのイソプレノイド油；アルケン（複数も）、例えばイソブテン若しくはデセンのオリゴマー形成から生じる油；植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールジ（カプリレート／カプレート）、グリセリルトリ（カプリレート／カプレート）若しくはプロピレングリコールジオレエートなどの、直鎖アルキル基を含有する酸又はアルコールのエステル；分岐した脂肪酸又はアルコールのエステル、例えばイソステアリン酸エステルを基剤とすることができる。この油は、乳濁液を形成するために、乳濁剤と組み合わせて使用するのが有利である。該乳濁剤は、ソルビタン、マンニド（例えば、オレイン酸無水マンニトール）、グリセロール、ポリグリセロール、プロピレングリコール、及びオレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸若しくはヒドロキシステアリン酸のエステルで、エトキシ化されていてもよいエステル、並びにPluronic（登録商標）製品、例えばL121などのポリオキシプロピレンポリオキシエチレンコポリマーブロックなどの非イオン界面活性剤でもよい。アジュバントには、乳濁剤（複数も）と、ミセル形成剤と、Provax（登録商標）（IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA）の名で市販されているものなどの油との混合物がなり得る。
【００７１】
本発明の免疫原組成物は、湿潤剤若しくは乳濁剤、緩衝剤、又はワクチンの有効性を高めるためのアジュバントなどの追加の物質を含有することができる（Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Mack Publishing Company, (ed.) 1980）。
【００７２】
アジュバントも含め得る。アジュバントには、それだけに限らないが、無機塩（例えば、ＡｌＫ（ＳＯ４）２、ＡｌＮａ（ＳＯ４）２、ＡｌＮＨ（ＳＯ４）２、シリカ、ミョウバン、Ａｌ（ＯＨ）３、Ｃａ３（ＰＯ４）２、カオリン又は炭素）、ポリヌクレオチドの免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）入り又は無し（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチドで、Chuang, T.H. et al., (2002) J. Leuk. Biol. 71(3): 538-44; Ahmad-Nejad, P. et al (2002) Eur. J. Immunol. 32(7): 1958-68に記載のものなど、ポリＩＣ酸又はポリＡＵ酸、ポリアルギニンのＣｐＧ入り又は無し（ＩＣ３１の名でも当技術分野で知られている。Schellack, C. et al (2003) Proceedings of the 34th Annual Meeting of the German Society of Immunology; Lingnau, K. et al (2002) Vaccine 20(29-30): 3498-508を参照されたい）、Juva Vax（商標）（米国特許第６６９３０８６号明細書）、ある種の天然物質（例えば、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）のワックスＤ、コリネバクテリウム・パルブム（Corynebacterium parvum）、百日咳菌（Bordetella pertussis）又はブルセラ属の細菌種に見出される物質）、フラジェリン（Ｔｏｌｌ様受容体５のリガンド。McSorley, S.J. et al (2002) J. Immunol. 169(7): 3914-9を参照されたい）、ＱＳ２１、ＱＳ１７、ＱＳ７などのサポニン（米国特許第５０５７５４０号明細書、第５６５０３９８号明細書、第６５２４５８４号明細書、第６６４５４９５号明細書）、モノホスホリルリピドＡ、特に脱３−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）、イミキモド（ＩＱＭの名でも当技術分野で知られており、Aldara（登録商標）の名で市販されている。米国特許第４６８９３３８号明細書、第５２３８９４４号明細書；Zuber, A.K. et al (2004) 22(13-14): 1791-8）、及びＣＣＲ５阻害剤のＣＭＰＤ１６７（Veazey, R.S. et al (2003) J. Exp. Med. 198: 1551-1562を参照されたい）。
【００７３】
水酸化又はリン酸アルミニウム（ミョウバン）は、リン酸緩衝塩水中の０．０５〜０．１％溶液で通常使用される。特にＤＮＡワクチンと共に使用できる他のアジュバントは、コレラ毒素、特にＣＴＡｌ−ＤＤ／ＩＳＣＯＭ（Mowat, A.M. et al (2001) J. Immunol. 167(6): 3398-405を参照されたい）、ポリホスファゼン（Allcock, H.R. (1998) App. Organometallic Chem. 12(10-11): 659-666; Payne, L.G. et al (1995) Pharm. Biotechnol. 6: 473-93）、サイトカインとして、それだけに限らないが、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＧＦ−１、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γなど（Boyer et al., (2002) J. Liposome Res. 121:137-142; 国際公開第０１／０９５９１９号パンフレット）、免疫調節タンパク質として、ＣＤ４０Ｌ（ＡＤＸ４０、例えば国際公開第０３／０６３８９９号パンフレットを参照されたい）及びナチュラルキラー細胞のＣＤ１ａリガンド（ＣＲＯＮＹ又はα−ガラクトシルセラミドの名でも知られる。Green, T.D. et al, (2003) J. Virol. 77(3): 2046-2055を参照されたい）など、免疫刺激融合タンパク質として、免疫グロブリンのＦｃ断片に融合したＩＬ−２（Barouch et al., Science 290:486-492, 2000）など、並びに補助刺激分子Ｂ７．１及びＢ７．２（Boyer）であり、以上のいずれも、タンパク質として、又は本発明の抗原をコードするベクターと同じ発現ベクター、若しくは異なる発現ベクター上のＤＮＡの形態で投与することができる。
【００７４】
該免疫原組成物は、ＨＩＶ−１クレイドＡの抗原、核酸又は発現ベクターを所望の作用部位へ導入し、それを適当で制御可能な速度で放出するように、設計することができる。制御放出製剤を調製する方法は、当技術分野で公知である。例えば、制御放出製剤は、免疫原及び／又は免疫原組成物と複合又は吸収するためのポリマーの使用によって、作製することができる。制御放出製剤は、所望の制御放出特性又は放出プロファイルをもたらすことが知られている、適当な巨大分子（例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニル、ピロリドン、エチレンビニルアセテート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース又は硫酸プロタミン）を用いて調製することができる。制御放出製剤により作用期間を制御する別の考え得る方法は、例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、これらの酸のコポリマー、エチレンビニルアセテートコポリマーなどの高分子材料の粒子中に活性成分を導入することである。別法として、こうした活性成分をポリマー粒子中に導入する代わりに、例えばコアセルベーション法又は界面重合法により調製したマイクロカプセル中に、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチンのマイクロカプセル中、及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中に、コロイド薬物送達系（例えば、リボソーム、アルブミンミクロスフェア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルジョンにおいて、これらの物質を捕捉することも可能である。このような技法は、New Trends and Developments in Vaccines, Voller et al. (eds.), University Park Press, Baltimore,  Md., 1978及びRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th editionに開示されている。
【００７５】
本発明の免疫原組成物におけるＨＩＶ−１クレイドＡの抗原、核酸及び発現ベクター（免疫原と総称）の適切な用量は、当業者により容易に決定することができる。例えば、免疫原の用量は、投与経路及び対象のサイズに応じて変化することができる。適切な用量は、例えば、従来からの免疫学的技法を使用し、投与量を適宜調節しながら、実験動物などの対象の免疫応答を測定することによって、当業者により決定することができる。対象の免疫応答を測定するためのこのような技法には、それだけに限らないが、クロム放出アッセイ、四量体結合アッセイ、ＩＦＮ−γ ELISPOTアッセイ、ＩＬ−２ ELISPOTアッセイ、細胞内サイトカインアッセイ、並びに例えば、Ed Harlow及びDavid Laneによる教科書"Antibodies: A Laboratory Manual" に詳述されているような他の免疫学的検出アッセイが含まれる。
【００７６】
予防的に提供する場合、本発明の免疫原組成物は、特に危険性の高い対象におけるＨＩＶ感染若しくはＨＩＶ感染の証明の前に、又はＡＩＤＳによる何らかの症状の前に、対象に投与するのが理想的である。免疫原組成物の予防投与は、ＨＩＶ−１感染に対して対象を防御的に免疫し、又はＨＩＶ−１に既に感染した対象におけるＡＩＤＳの進行を予防若しくは軽減するために役立つことができる。治療的に提供する場合、該免疫原組成物は、ＡＩＤＳ症状を改善し、治療するのに役立つことができ、好ましくは何らかのＡＩＤＳ症状が出現する前に、感染後できる限り速やかに使用するのが有利であるが、疾患症状の開始時（又はその後）にも使用してもよい。
【００７７】
該免疫原組成物は、それだけに限らないが、筋肉内、静脈内、皮内、粘膜及び局所送達を含めた任意の適当な送達法を用いて投与することができる。このような技法は、当業者に周知のことである。送達法のより具体的な例は、筋肉内注射、皮内注射及び皮下注射である。しかし、送達を注射法に限定する必要はない。更に、動物組織へのＤＮＡの送達は、陽イオンリポソーム（Watanabe et al., (1994) Mol. Reprod. Dev. 38:268-274及び国際公開第９６／２００１３号パンフレット）、裸ＤＮＡの動物筋肉組織内への直接注射（Robinson et al., (1993) Vaccine 11:957-960; Hoffman et al., (1994) Vaccine 12:1529-1533; Xiang et al., (1994) Virology 199: 132-140; Webster et al., (1994) Vaccine 12:1495-1498; Davis et al., (1994) Vaccine 12:1503-1509及びDavis et al., (1993) Hum. Mol. Gen. 2: 1847-1851）、又は「遺伝子銃」技術を用いたＤＮＡの皮内注射（Johnston et al., Meth. Cell Biol. 43:353-365）により、実現されてきた。或いは、送達経路は、経口、鼻腔内、又は他の任意の適当な経路でもよい。肛門、膣又は口内粘膜などの粘膜表面を介しても、送達が実現される。
【００７８】
免疫接種スケジュール（又は計画）は、動物（人間を含め）に対して周知のことであり、特定の対象及び免疫原組成物に対して容易に決定することができる。したがって、免疫原を対象に１回又は複数回投与することができる。好ましくは、免疫原組成物の個別の投与間に時間間隔が設定される。この間隔は対象ごとに変動するが、通常は１０日から数週の範囲にあり、しばしば２週、４週、６週又は８週である。人間については、この間隔が通常２週から６週である。免疫接種計画は、免疫原組成物の投与を通常１〜６回有するが、１回又は２回又は４回しかないこともある。免疫応答を誘発する方法には、免疫原と共にアジュバントを投与することも含むことができる。幾つかの例では、毎年、隔年又は他の長期間隔（５〜１０年）のブースター免疫接種が、初期の免疫接種処方を補充することができる。
【００７９】
本方法は、多様なプライム・ブースト接種計画、特にＤＮＡプライム・アデノウィルスブースト接種計画も包含する。こうした方法では、１回又は複数回のプライム免疫接種の後、１回又は複数回のブースト免疫接種を行う。実際の免疫原組成物は、各免疫接種に対して同じでも異なってもよく、免疫原組成物の型（例えば、タンパク質又は発現ベクターを含有する）、経路、及び免疫原の製剤も変化することができる。例えば、プライム及びブースト段階のために発現ベクターを使用する場合、その型は同じでも異なってもよい（例えば、ＤＮＡ又は細菌又はウィルスの発現ベクター）。１つの有用なプライム・ブースト接種計画では、プライム免疫接種を４週間隔で２回した後、最後のプライム免疫接種から４週後及び８週後にブースト免疫接種を２回行う。プライム・ブースト接種計画を提供するために、本発明のＤＮＡ、細菌及びウィルス発現ベクターを用いて包含される順列及び組合せが幾つもあることも、当業者には容易に明らかとなるはずである。
【００８０】
本発明の特定の実施形態は、本発明のＨＩＶ−１クレイドＡ抗原（好ましくはＧＲＩＮ、ＧＲＮ若しくはＥｎｖ又はその組合せ）を１種又は複数コードするＤＮＡを含有するアデノウィルスベクターを好ましくは含む、本発明の免疫原組成物を対象に１回又は複数回投与し、その対象において特定の免疫応答を誘発するのに十分なレベルでＨＩＶ−１クレイドＡ抗原（複数も）を発現させることにより、対象において免疫応答を誘発する方法を提供する。このような免疫接種は、所望の免疫接種計画に従って少なくとも２週、４週若しくは６週（又は、より長い）の時間間隔で何回も繰り返すことができる。
【００８１】
本発明の免疫原組成物は、単独で投与することができ、或いは他のＨＩＶ免疫原及び／又はＨＩＶ免疫原組成物、例えば「他の」免疫性、抗原性若しくはワクチン性又は治療性組成物と共に同時投与又は逐次投与することにより、本発明の多価又は「カクテル」又は複合組成物、及びその組成物を使用する方法を提供することができる。成分、投与法（逐次又は同時投与）、並びに投与量は、やはり、その特定の対象の年齢、性別、体重、種別及び状態、並びに投与経路などの要因を考慮して決定することができる。
【００８２】
組み合わせて使用される場合、他のＨＩＶ免疫原は、全体的な免疫接種計画の一部、例えば、プライム・ブースト接種計画又は他の免疫接種処方の一部として、同時又は異なるときに投与することができる。他の多くのＨＩＶ免疫原が当技術分野で公知であり、そのような好ましい一免疫原は、ＨＩＶＡであり（国際公開第０１／４７９５５号パンフレットに記載）、タンパク質として、プラスミド（例えば、ｐＴＨｒ．ＨＩＶＡ）上で、又はウィルスベクター（例えば、ＭＶＡ．ＨＩＶＡ）中で投与することができる。別のそのようなＨＩＶ免疫原は、ＲＥＮＴＡであり（ＰＣＴ／ＵＳ第２００４／０３７６９９号に記載）、やはりタンパク質として、プラスミド（例えば、ｐＴＨｒ．ＲＥＮＴＡ）上で、又はウィルスベクター（例えば、ＭＶＡ．ＲＥＮＴＡ）中で投与することができる。
【００８３】
例えば、人間対象においてＨＩＶに対する免疫応答を誘発する一方法は、ＨＩＶ免疫原の少なくとも１プライム用量、及びＨＩＶ免疫原の少なくとも１ブースト用量の投与を含み、各用量中の免疫原は同じでも異なってもよいが、その免疫原の少なくとも一方は、本発明のＨＩＶ−１クレイドＡ抗原、本発明のＨＩＶ−１クレイドＡ抗原をコードする核酸、又は本発明のＨＩＶ−１クレイドＡ抗原をコードする発現ベクター、好ましくはアデノウィルスベクターであり、しかも該免疫原が、対象においてＨＩＶ特異的免疫応答を誘発するのに十分な量で投与され、又は十分なレベルで発現される投与を含む。ＨＩＶ特異的免疫応答は、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞免疫応答、又はＨＩＶ特異的Ｂ細胞免疫応答を含むことができる。このような免疫接種は、好ましくは、少なくとも２〜６週又はそれより長い週の間隔で行うことができる。
【００８４】
以上記載の通り及び下記実施例に記載の通りの発明原理における変更は、当業者がなし得ると理解し、予想すべきものであり、このような改変、変更及び置換えは、本発明の範囲内に含めるべきであると意図している。
【００８５】
以下の非限定的な実施例は、本発明の多様な実施形態を例示するために提示している。
［実施例］
【実施例１】
【００８６】
ＨＩＶクレイドＡのＧａｇのコンセンサス配列
【００８７】
【表１】
2009539353.tif 000002
【００８８】
非組換えＨＩＶクレイドＡ３９株のＧａｇタンパク質のアミノ酸配列を分析した。表１に使用した３９株を列挙し、各株をＧｅｎｂａｎｋ受託番号で示す。表１では、これらの３９株各々の分離国及び分離年も特定している。そのうち２０株はケニア、１２株はウガンダ、６株はタンザニア、及び１株はソマリアから得た。そのうち２０株は２０００〜２００２年の間に分離され、１０株は１９９７〜１９９９年の間に分離され、６株は１９９４〜１９９６年の間に分離され、及び３株は１９９３年以前に分離された。
【００８９】
Ｇａｇタンパク質配列は、挿入又は欠失のある領域で整列を維持するために、スペースを加えて整列させた。５０％コンセンサス配列を誘導した。そのコンセンサスアミノ酸配列を図１に示す。図１では、挿入又は欠失のある領域で整列を維持するために加えたスペースは、破線で表現し、５０％コンセンサスに到らなかった位置は、「Ｘ」で表現している。
【００９０】
コンセンサス配列の生成に使用した３９配列各々について、その配列のコンセンサス配列からの「距離」を、生化学的類似度に従って置換が加重されるDayhoff ＰＡＭ２５０置換行列を用いて計算した。表１に示すように、各株の配列のコンセンサス配列からの距離は４〜９％の範囲に亘っていた。
【００９１】
図２では、各株のアミノ酸配列のコンセンサスアミノ酸配列からの距離をグラフ形式で例示しており、コンセンサス配列に最も密接な配列を有する４株を特定している。これらの４株は、１９９７年、南西部タンザニアのＭｂｅｙａ地域の低リスク個人に由来し、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ３６１８７２を有する９７ＴＺ０２株と、２００１年、南西部タンザニアのＭｂｅｙａ地域の匿名供血者から採取し、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ２５３３０５を有するＴＺＡ１７３株と、２０００年、南部ケニアの匿名供血者から採取し、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ４５８７００６を有するＫＮＨ１１４４株と、ウガンダで感染したと考えられる個人からスウェーデンで１９９４年に採取し、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ０６９６７１を有するＳＥ７５３５株である。
【実施例２】
【００９２】
ＨＩＶクレイドＡのＰｏｌのコンセンサス配列
非組換えＨＩＶクレイドＡ３６株のＰｏｌタンパク質のアミノ酸配列を分析した。表２に使用した３６株を列挙し、各株をＧｅｎｂａｎｋ受託番号で示す。表２では、これらの３６株各々の分離国及び分離年も特定している。そのうち２０株はケニア、９株はウガンダ、６株はタンザニア、及び１株はソマリアから得た。そのうち１９株は２０００〜２００２年の間に分離され、１０株は１９９７〜１９９９年の間に分離され、４株は１９９４〜１９９６年の間に分離され、及び３株は１９９３年以前に分離された。
【００９３】
Ｐｏｌタンパク質配列を整列させた。挿入も欠失もなかった。５０％コンセンサス配列を誘導した。そのコンセンサスアミノ酸配列を図３に示す。図３では、５０％コンセンサスに到らなかった位置を「Ｘ」で表現している。このような位置が、アミノ酸残基９４７個のうち４個あった。コンセンサス配列の生成に使用した３６配列各々について、その配列のコンセンサス配列からの「距離」を、生化学的類似度に従って置換が加重されるDayhoff ＰＡＭ２５０置換行列を用いて計算した。表２に示すように、各株の配列のコンセンサス配列からの距離は１．５〜４．８％の範囲に亘っていた。
【００９４】
【表２】
2009539353.tif 000003
【００９５】
図４では、各株のアミノ酸配列のコンセンサスアミノ酸配列からの距離をグラフ形式で例示しており、コンセンサス配列に最も近似した配列を有する３株を特定している。これらの３株は、２０００年、南部ケニアの匿名供血者に由来するＭＳＡ４０７０株と、ソマリアで感染したと考えられる個人からスウェーデンで１９９４年に採取したＳＥ７２３５ＳＯ株と、タンザニアで感染したと考えられる個人からスウェーデンで１９９５年に採取したＳＥ８５３８株である。
【実施例３】
【００９６】
ＨＩＶクレイドＡのＥｎｖのコンセンサス配列
【００９７】
【表３】
2009539353.tif 000004
【００９８】
非組換えＨＩＶクレイドＡ３６株のＥｎｖタンパク質のアミノ酸配列を分析した。表３に使用した３６株を列挙し、各株をＧｅｎｂａｎｋ受託番号で示す。表３では、これらの３６株各々の分離国及び分離年も特定している。そのうち１８株はケニア、１１株はウガンダ、６株はタンザニア、及び１株はソマリアから得た。そのうち１７株は２０００〜２００２年の間に分離され、１０株は１９９７〜１９９９年の間に分離され、６株は１９９４〜１９９６年の間に分離され、及び３株は１９９３年以前に分離された。
【００９９】
Ｅｎｖタンパク質配列は、挿入又は欠失のある領域で整列を維持するために、スペースを加えて整列させた。挿入／欠失の長さ中に広範な異質性のある領域が多数存在した。５０％コンセンサス配列を誘導した。そのコンセンサスアミノ酸配列を図５に示す。図５では、挿入又は欠失のある領域で整列を維持するために加えたスペースは、破線で表現し、５０％コンセンサスに到らなかった位置は、「Ｘ」で表現している。５０％コンセンサスに到らなかったアミノ酸位置が多数あった。
【０１００】
コンセンサス配列の生成に使用した３６配列各々について、その配列のコンセンサス配列からの「距離」を、生化学的類似度に従って置換が加重されるDayhoff ＰＡＭ２５０置換行列を用いて計算した。表３に示すように、各株の配列のコンセンサス配列からの距離は６．３〜１２．７％の範囲に亘っていた。
【０１０１】
図６では、各株のアミノ酸配列のコンセンサスアミノ酸配列からの距離をグラフ形式で例示しており、コンセンサス配列に最も近似した配列を有する３株を特定している。これらの３株は、１９９４年、ケニアのＣＳＷに由来するＫＥＱ２３（ＣＳＷである）と、２００２年、タンザニアの匿名供血者から得たＴＺＡ３４１と、１９９９年、ケニアの匿名供血者から得たＫＮＨ１０８８であった。
【実施例４】
【０１０２】
ＨＩＶクレイドＡのＮｅｆのコンセンサス配列
非組換えＨＩＶクレイドＡ３８株のＮｅｆタンパク質のアミノ酸配列を分析した。表４に使用した３８株を列挙し、各株をＧｅｎｂａｎｋ受託番号で示す。これらの３８株各々の分離国及び分離年は、既出の実施例の表１〜３に記載してある。その半数強の株はケニアからで、相当数がウガンダに由来し、少数の株がタンザニアに由来した。その約半数の株は、２０００〜２００２年の間に分離された。
【０１０３】
【表４】
2009539353.tif 000005
【０１０４】
Ｎｅｆタンパク質配列は、挿入又は欠失のある領域で整列を維持するために、スペースを加えて整列させた。５０％コンセンサス配列を誘導した。そのコンセンサスアミノ酸配列を図７に示す。図７では、挿入又は欠失のある領域で整列を維持するために加えたスペースは、破線で表現し、５０％コンセンサスに到らなかった位置は、「Ｘ」で表現している。５０％コンセンサスに到らなかったアミノ酸位置が６個あった。
【０１０５】
コンセンサス配列の生成に使用した３８配列各々について、その配列のコンセンサス配列からの「距離」を、生化学的類似度に従って置換が加重されるDayhoff ＰＡＭ２５０置換行列を用いて計算した。表４に示すように、各株の配列のコンセンサス配列からの距離は３．２〜１６．１％の範囲に亘り、平均距離は９．３％であった。
【０１０６】
図８では、各株のアミノ酸配列のコンセンサスアミノ酸配列からの距離をグラフ形式で例示しており、コンセンサス配列に最も近似した配列を有する５株を特定している。これらの５株は、共に南部ケニアの匿名供血者に由来し、２０００年に採取したＭＳＡ４０７０及びＫＮＨ１２１１と、南西部タンザニアのＭｂｅｙａ地域の低リスク個人に由来し、１９９７年に採取した９７ＴＺ０３株と、ウガンダの個人に由来し、それぞれ１９９９年及び１９９５年に採取したＵＧＡ０７０及びＳＥ８８９１であった。
【実施例５】
【０１０７】
ＨＩＶクレイドＡ株中、ＨＩＶクレイドＡコンセンサス配列に最も近似した株
上記の実施例１〜４に記載し、表５に要約しているように、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ及びＮｅｆ配列を有し、その各配列がこれらのタンパク質各々のコンセンサス配列に最も類似している、ＨＩＶクレイドＡの株を特定した。その上、個々のタンパク質のコンセンサス配列に対する近似度に従って各株を順位付けすることにより、順位１番の株をそのタンパク質の配列がコンセンサス配列に最も近似した株とし、次いで各株の順位をタンパク質全４種（即ち、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ及びＮｅｆ）に亘って合計することによって、コンセンサス配列に総合的に最も近似している株を特定した。調査したタンパク質全４種に亘り、コンセンサス配列に総合的に最も近似していた６株を下記の表６に列挙してある。９７ＴＺ０２株は、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ及びＮｅｆ遺伝子各々のコンセンサス配列に総合的に最も近似した配列を有することが認識できる。
【０１０８】
【表５】
2009539353.tif 000006
【０１０９】
【表６】
2009539353.tif 000007
【実施例６】
【０１１０】
ＧＲＩＮ、ＧＲＮ及びＥｎｖトランス遺伝子の構築
最も近年に特定した流行ＨＩＶ−１野外分離株に由来し、対応する各タンパク質のＨＩＶクレイドＡコンセンサス配列に最も密接に合致するＨＩＶクレイドＡタンパク質配列を用いて、トランス遺伝子構築体を作製した。この戦略は、使用するＨＩＶクレイドＡ配列の生物学的適合性を最大限にするために開発された。他の配列、即ち本実施例に記載する特定の配列以外の配列も、本発明に従って使用できることを理解されたい。他の配列を使用する場合、その配列が最近の野外分離株に由来し、ここに記載のＨＩＶクレイドＡコンセンサス配列、又は今後生成し得るＨＩＶクレイドＡコンセンサス配列に近似した配列を有するように、その配列を選択するのが好ましい。
【０１１１】
ＧＲＩＮ及びＧＲＮと称する構築体を作製した。ＧＲＩＮ構築体は、Ｇａｇ、Ｐｏｌ（ＲＴ及びインテグラーゼ）並びにＮｅｆタンパク質をコードするＨＩＶクレイドＡ配列を含有していた。ＧＲＮトランス遺伝子は、Ｇａｇ、ＲＴ及びＮｅｆタンパク質をコードする配列を含有していた。ＧＲＩＮ及びＧＲＮ構築体は、図９に概略的に表現されている。ＧＲＩＮ及びＧＲＮトランス遺伝子は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ２５３３０５を有するＴＺＡ１７３株のＧａｇタンパク質配列、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ４５７０８１を有するＭＳＡ４０７０株のＰｏｌ（ＲＴ、Ｉｎｔの両配列を含む）配列、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ４５７０８１を有するＭＳＡ４０７０株のＮｅｆ配列を用いて作製した。これらの配列は、それぞれ、Ｇａｇ、Ｐｏｌ及びＮｅｆ各々のコンセンサス配列に最も密接に合致する、最も近年に特定した流行ＨＩＶ−１野外分離株に由来したので、選択された。これらの配列は、それぞれ図１０、１１及び１２に例示されている。
【０１１２】
Ｅｎｖコンセンサス配列に最も密接に合致する、最も近年に特定した流行ＨＩＶ−１野外分離株のＥｎｖコード配列、即ち、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ２５３３１４を有するＴＺＡ３４１株のＥｎｖタンパク質配列を含有するＥｎｖ構築体も作製した。この配列は、図１３に例示されている。
【０１１３】
次いで、全ての配列に対して、ヒトで発現させるためにコドン最適化がＧｅｎｅＡｒｔ（ドイツ）によりなされた。その最適化遺伝子配列は、ヒト又は他の哺乳類細胞において高度で安定なタンパク質発現を可能にする。コドン最適化法の更なる詳細は、実施例８に示されている。該トランス遺伝子には、遺伝子産物の正常機能をインビボで無効化するために、特定の変異を組み込むように操作すること、又は特定の順序に配置することもなされた。こうした変異の詳細、及び各変異の生物学的作用は、以下の実施例７に記載されている。
【０１１４】
ＧＲＩＮ及びＧＲＮトランス遺伝子については、Ｇａｇ、Ｐｏｌ（ＲＴ及びＩｎｔ）又はＲＴ、並びにＮｅｆタンパク質各々のコード配列を、トランス遺伝子構築体各々（即ちＧＲＩＮ、ＧＲＮのいずれか）が単一の融合タンパク質をコードするように、インフレームで結合した。ネオエピトープが連結部に形成されていないことを確認するために、Ｂｌａｓｔ検索を行った。本実施例では使用していないが、最適なタンパク質ドメインの折畳みができるように、最終的な融合タンパク質の個々の成分をコードする配列間にスペーサー配列を挿入することも可能であること、例えば、ＧａｇとＰｏｌとの間にスペーサー領域を加えることにより、タンパク質ドメインをより自然な立体配置で折畳むことを可能にし得ることに留意されたい。各配列相互の結合（例えば、Ｎｅｆの５”末端のＰｏｌの３’末端への結合など）を促進するために、独特な制限酵素部位も、各配列の５”末端及び３’末端に加えた。
【０１１５】
インビボで使用するために、ＧＲＩＮ、ＧＲＮ及びＥｎｖトランス遺伝子をＡｄ５、Ａｄ３５、Ａｄ１１、Ｃ６、Ｃ７いずれかのアデノウィルスベクター中に挿入した。これらのベクター中へのクローニングを促進するために、独特な制限酵素部位を、ＧＲＩＮ、ＧＲＮ又はＥｎｖ構築体の５”末端及び３’末端に加えた。図１４Ａ〜１４Ｃは、Ａｄ３５ベクター中に挿入する際のＧＲＩＮの配列を提示し、Ａｄ３５ベクター中にＧＲＩＮ配列をクローニングするために使用する制限酵素部位を示す（下線付き及び太字体）。示した配列には、ＧＲＩＮ配列の上流にあるＣＭＶプロモーター配列も含まれる。図１５Ａ〜１５Ｂは、Ａｄ３５ベクター中に挿入する際のＥｎｖの配列を提示し、Ａｄ３５ベクター中にＥｎｖ配列をクローニングするために使用する制限酵素部位を示す（下線付き及び太字体）。示した配列には、Ｅｎｖ配列の上流にあるＣＭＶプロモーター配列も含まれる。
【０１１６】
上記構築体の全てを生成するために、組換えＤＮＡ及びクローニングの標準技法を用いた。このような技法は当業者に周知のことである。例えば、"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al. 1989)を参照されたい。
【実施例７】
【０１１７】
ＨＩＶクレイドＡタンパク質の正常なインビボ機能を無効化するための変異
表７では、遺伝子産物のインビボ機能を無効化するために、ＧＲＩＮ及びＧＲＮ配列中へ作製される変異を要約している。こうした変異は、標準的な組換えＤＮＡ技法を用いて作製した。このような技法は当業者に周知のことである。
【０１１８】
【表７】
2009539353.tif 000008
【０１１９】
Ｇａｇタンパク質は、５５ｋＤａのポリプロテイン前駆体（Ｐｒ５５ｇａｇ）として発現され、ＨＩＶ−１ウィルスプロテアーゼにより切断される。この切断から４種の主要なタンパク質：マトリックス（ＭＡ）、キャプシド（ＣＡ）、ヌクレオキャプシド（ＮＣ）及びｐ６が生じ、更に、それぞれＣＡとＮＣとの間及びＮＣとｐ６との間の配列を表す、２種のスペーサーポリペプチドが生じる。
【０１２０】
ＭＡは、ウィルス粒子アセンブリーの決定的媒介、及びウィルス様粒子（ＶＬＰ）の形成を介した細胞形質膜からの発芽を含め、ウィルス複製の幾つかの段階で重要な役割を演じる（Gheysen, D., E. Jacobs, F. de Foresta, D. Thiriart, M. Francotte, D. Thines, and M. De Wilde. (1989). Assembly and release of HIV-1 precursor pr55gag virus-like particles from recombinant baculovirus-infected cells. Cell 59:103-112 を参照されたい）。
【０１２１】
Ｐｒ５５ｇａｇ、ＭＡ（ｐ１７）の双方ともミリスチル化される、即ち、ミリスチン酸へのアミド結合の形成を受ける。Veronese di Marzo, F., Copeland, T. D., Oroszlan, S., Gallo, R. C. & Sarngadharan, M. G. (1988). J. Virol. 62, 795-801 を参照されたい。ミリスチル化過程の完全な説明については実施例７内のＮｅｆに関する項も参照されたい。異なるＨＩＶ−１分離株により、ミリスチル受容体がＮ−末端グリシン残基（Ｇｌｙ２）であることが実証されている。Bryant & Ratner. (1990). Myristoylation-dependent replication and assembly of human immunodeficiency virus 1. Proc. Nadl. Acad. Sci. USA; 87: 523-527 を参照されたい。
【０１２２】
Bryant及びRatner（１９９０年）は、Ｇｌｙ２のＡｌａによる置換でＨＩＶ−１クローンのウィルス複製が排除されることを実証した。ミリスチル受容体を欠いたＰｒ５５ｇａｇは、感染Ｈｅｌａ細胞中に蓄積し、成熟ビリオンキャプシドへプロセシングされなかった。Ｇｌｙ２のミリスチル化は、形質膜との安定な結合及びその後のビリオンのアセンブリーに必要であると結論された。他のグループは、ＭＡにおけるＧｌｙ２のミリスチル化の重要性を同様に実証した。Gottlinger H G, Sodrosky J G, Haseltine W A. (1989). Role of capsid precursor processing and myristoylation in morphogenesis and infectivity of human immunodeficiency virus type 1. Proc Natl Acad Sci USA; 86: 5781-5785 及びPaul Spearman, Jaang-Jiun Wang, Nancy Vander Heyden and Lee Ratner. (1994). Identification of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Gag Protein Domains Essential to Membrane Binding and Particle Assembly. J. Virol; 68(5): 3232-3242を参照されたい。
【０１２３】
ＭＡ中にあるミリスチル受容体、Ｎ−末端グリシン（Ｇｌｙ２）が変異すると、膜結合が無効化され、粒子アセンブリーが防止される。したがって、クレイドＡのＧａｇは、Ｇｌｙ２→Ａｌａの変化を起こすように操作される。この結果、Ｇａｇの生物学的機能が失われる。
【０１２４】
逆転写酵素は（ＲＴ）は、複製に必須のウィルス酵素である。ＲＴは、ＲＮＡ依存性及びＤＮＡ依存性ポリメラーゼ並びに該酵素のＲＮａｓｅ  Ｈ活性の触媒作用を受けて、進入してくるウィルスＲＮＡ＋をｄｓＤＮＡに変換する。ＲＴは、ｐ６６及びｐ５１サブユニットタンパク質からなるヘテロ二量体である。Alfredo Jacobo-Molina et al. (1993). Crystal structure of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase complexed with double-stranded DNA at 3.0 A resolution shows bent DNA. Proc Natl Acad Sci USA; 90: 6320-6324を参照されたい。ｐ６６は２つのドメイン、ポリメラーゼ及びＲＮａｓｅ  Ｈを有する。ｐ５１は同じポリメラーゼドメインを有する。
【０１２５】
触媒的に必須のＡｓｐ−１１０、Ａｓｐ−１８５及びＡｓｐ−１８６残基は、高度に保存されたＤＮＡポリメラーゼ活性部位に配置されている。「触媒三つ組残基（catalytic triad）」と称するこれらの３残基は、触媒機能に必要な二価カチオンに結合すると考えられている。Alfredo Jacobo-Molina et al. (1993). Crystal structure of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase complexed with double-stranded DNA at 3.0 A resolution shows bent DNA. Proc Natl Acad Sci USA; 90: 6320-6324を参照されたい。
【０１２６】
１８５位及び１８６位残基にあるアスパラギン酸のアスパラギン、グルタミンいずれかへの変異は、触媒的に不活性な変異タンパク質を生じさせることが示された。Lowe DM, Parmar V, Kemp SD, Larder BA. (1991). Mutational analysis of two conserved sequence motifs in HIV-1 reverse transcriptase. FEBS Lett.; 6;282(2):231-4を参照されたい。
【０１２７】
クレイドＡ ＲＴにおけるＡｓｐ１８５→Ａｌａ及びＡｓｐ１８６→Ａｌａの変異は、「触媒三つ組残基」を破壊することによりＲＴポリメラーゼ酵素を不活性化することになろう。これによりクレイドＡ ＲＴの生物学的機能が失われよう。
【０１２８】
ＲＴが生成するプロウィルスｃＤＮＡは、ウィルスインテグラーゼ（Ｉｎｔ）酵素の作用を介して宿主細胞ゲノムに組み込まれる。Ｉｎｔは、異なる２種のエンドヌクレアーゼ型反応を触媒するＤＮＡリコンビナーゼドメインを含有する。その第１の反応、３’プロセシングは、ｃＤＮＡの各末端からジヌクレオチドを除き、両端に２ヌクレオチド５’伸長を生じる。第２の反応では、Ｉｎｔは、宿主細胞ＤＮＡを非特異的に切断し、ｃＤＮＡ末端の遊離３’基を切断した宿主細胞ＤＮＡの５’基へ結合する。細胞酵素はギャップを修復し、ウィルスゲノムを宿主細胞ＤＮＡ中に完全に組み込む。Fields, BN. & Knipe DM. 2nd Edition Fundamental Virology. Raven Press 中のCoffin JM. Retroviridae and their Replication. Chapter 27. p.645-708 & Wong-Staal F. Human Immunodeficiency viruses and Their Replication. Chapter 28. p.709-723を参照されたい。Engelman A, Mizuuchi K, Craigie R. (1991). HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer. Cell; 67(6):1211-1221も参照されたい。触媒ドメインの５０〜２１２位残基は、酵素活性部位を損なう残基Ａｓｐ−６４、Ａｓｐ−１１６及びＧｌｕ−１５２の三つ組残基（Ｄ，Ｄ−３５−Ｅモチーフと称する）を含有する。Esposito, D., and R. Craigie. (1999). HIV integrase structure and function. Adv. Virus Res. 52:319-333を参照されたい。Khan, E., J. P. G. Mack, R. A. Katz, J. Kulkosky, and A. M. Skalka. (1991). Retrovial integrase domains: DNA binding and the recognition of LTR sequences. Nucleic Acids Res. 19:851-860も参照されたい。
【０１２９】
多様な技法によって、各グループが、Ｄ，Ｄ−３５−Ｅモチーフ中のＡｓｐ−６４、Ａｓｐ−１１６及びＧｌｕ−１５２残基の部位特異的変異を介した、ＩＮのエンドヌクレアーゼ及び／又は組込み機能の無効化を示した。Drelich M, Wilhelm R, Mous J. (1992). Identification of amino acid residues critical for endonuclease and integration activities of HIV-1 IN protein in vitro. Virology; 188(2):459-468を参照されたい。LaFemina RL, Schneider CL, Robbins HL, Callahan PL, LeGrow K, Roth E, Schleif WA, Emini EA. (1992). Requirement of active human immunodeficiency virus type 1 integrase enzyme for productive infection of human T-lymphoid cells. J. Virol; 66(12):7414-7419も参照されたい。Leavitt AD, Shiue L, Varmus HE. (1993). Site-directed mutagenesis of HIV-1 integrase demonstrates differential effects on integrase functions in vitro. J. Biol. Chem; 268(3):2113-2119も参照されたい。
【０１３０】
クレイドＡ ＩｎｔにおけるＡｓｐ−６４→Ａｌａ、Ａｓｐ−１１６→Ａｌａ及びＧｌｕ−１５２→Ａｌａの変異は、肝要なＤ，Ｄ−３５−Ｅモチーフを破壊することにより、Ｉｎｔ活性酵素を不活性化することになろう。これによりクレイドＡ Ｉｎｔの生物学的機能が失われよう。
【０１３１】
ネガティブ因子（Ｎｅｆ）タンパク質（２７ｋＤａ）は、新たな感染細胞に蓄積する最も早期のウィルスタンパク質である。Haseltine, W. (1991). Molecular biology of the human immunodeficiency virus type 1. FASEB. Vol 5. 2349-2360を参照されたい。ミリスチル化を介して、Ｎｅｆは細胞膜のサイトゾル側に局在することができる。Yu G, Felsted RL. (1992). Effect of myristoylation on p27 nef subcellular distribution and suppression of HIV-LTR transcription. Virology. 187(1):46-55を参照されたい。Kaminchik, J., N. Bashan, A. Itach, N. Sarver, M. Gorecki, and A. Panet. (1991). Genetic characterization of human immunodeficiency virus type 1 nef gene products translated in vitro and expressed in mammalian cells. J. Virol. 65:583-588も参照されたい。タンパク質のミリスチル化は、同時翻訳的事象であり、酵素Ｎ−ミリスチルトランスフェラーゼ（ＮＭＴ）によるミリスチル補酵素Aからタンパク質のアミノ末端モチーフMGXXXへの転移を伴う。Towler, D.A., S. P. Adams, S. R. Eubanks, D. S. Towery, E. Jackson-Machelski, L. Glaser & J. I. Gordon (1987). Purification and characterization of yeast myristoyl CoA:protein N-myristoyltransferase. Proc Natl Acad Sci USA 84:2708-2712を参照されたい。該ポリペプチドの先導メチオニンが、翻訳中にメチオニンアミノペプチダーゼで切断され、約２０残基がリボソームから遊離した後、出現してくるペプチドの新たに生成したグリシン末端アミノ基が、ＮＭＴにより認識される。ＮＭＴは、ミリスチン酸をグリシン残基（ミリスチル受容体）へ転移させ、ミリスチル化が完了する。この末端から２番目のグリシンのミリスチル受容体を他の任意のアミノ酸残基で置換すると、ミリスチル化が阻害される。Towler, D.A., S. R. Eubanks, D. S. Towery, S. P. Adams & L. Glaser (1987). Amino-terminal processing of proteins by N-myristoylation. Substrate specificity of N-myristoyltransferase. J Biol Chem 262:1030-1036を参照されたい。
【０１３２】
Ｎｅｆは、感染細胞の幾種もの表面分子、ＣＤ４（Garcia, J. V., and A. D. Miller. (1991). Serine phosphorylation-independent downregulation of cell-surface CD4 by nef. Nature 350:508-511、及びMariani R and Skowronski J. (1993). CD4 down-regulation by nef alleles isolated from human immunodeficiency virus type 1-infected individuals Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 90, pp.5549-5553、及びAiken C, Konner J, Landau NR, Lenburg ME, Trono D (1994). Nef induces CD4 endocytosis: requirement for a critical dileucine motif in the membrane-proximal CD4 cytoplasmic domain. Cell. 11;76(5):853-64を参照されたい）、ＣＤ２８（Swigut, T., N. Shohdy, and J. Skowronski. (2001). Mechanism for down-regulation of CD28 by Nef. EMBO J. 20: 1593-1604を参照されたい）、ＭＨＣ−Ｉ（Schwartz, O., V. Marechal, S. Le Gall, F. Lemonnier, and J. M. Heard. (1996). Endocytosis of major histocompatibility complex class I molecules is induced by the HIV-1 Nef protein. Nat. Med. 2:338-342を参照されたい）、マクロファージ発現ＭＨＣ  １ｂタンパク質ＨＦＥ（Drakesmith H, Chen N, Ledermann H, Screaton G, Townsend A, Xu XN. (2005). HIV-1 Nef down-regulates the hemochromatosis protein HFE, manipulating cellular iron homeostasis. Proc Natl Acad Sci USA 102(31):11017-22を参照されたい）、ＭＨＣ−ＩＩ（Stumpnter-Cuvelette, P., S. Morchoisne, M. Dugast, S. Le Gall, G. Raposo, O. Schwartz, and P. Benaroch. (2001). HIV-1 Nef impairs MHC class II antigen presentation and surface expression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 12144-12149を参照されたい）などを調節し、並びにシグナル伝達経路を破壊する（Tolstrup. M., L. Ostergaard, A. L. Laursen, S. F. Pedersen, and M. Duch. (2004). HIV/SIV escape from immune surveillance: focus on Nef. Curr. HIV Res. 2:141-151を参照されたい）ことができる多機能タンパク質であるが、それは、細胞膜にある多数のキナーゼ及び他の細胞表面タンパク質との会合を介してなされる。こうした作用の機構及び関与するｎｅｆモチーフは、未だ完全には解明されていない。
【０１３３】
具体的には、Ｎ末端ミリスチル化シグナルを含め、Ｎ末端アミノ酸１９個を欠失したＮｅｆ変異体は、ＣＤ４及びＭＨＣ−Ｉの下方調節能を失ったが、同時に大部分のＣＴＬ、Ｔヘルパー及びＢ細胞のエピトープは維持していた（Peng B, Robert-Guroff M (2001). Deletion of N-terminal myristoylation site of HIV Nef abrogates both MHC-1 and CD4 down-regulation. Immunol. Lett. 78(3):195-200を参照されたい）。他のグループは、Ｎｅｆアミノ末端グリシン（Ｇｌｙ２）のアラニンへの変異でミリスチル化が防止されることを示した（Liang, X. et al. (2002). Development of HIV-1 Nef vaccine components: immunogenicity study of Nef mutants lacking myrystylation and dileucine motif in mice. Vaccine 20: 3413-3421及びKaminchik, J. et al. (1991). Genetic Characterization of Human Immunodeficiency Virus Type 1 nef Gene Products Translated in vitro and Expressed in Mammalian Cells. J. of Virol. 65(2): 583-588を参照されたい）。
【０１３４】
クレイドＡ  Ｎｅｆのアミノ末端モチーフMGXXXがＧＲＩＮ融合タンパク質内に埋め込まれているので、翻訳中にメチオニンアミノペプチダーゼによる切断を受けるメチオニンの発生は起こらない。したがって、グリシンのアミノ末端基は新たに生成せず、ＮＭＴはミリスチル化を実行することができない。結局、ＧＲＩＮ中のＮｅｆがミリスチル化を受けることができないので、Ｎｅｆの生物学的機能が無効化される。
【実施例８】
【０１３５】
ＧＲＩＮ（ＧａｇＰｏｌＮｅｆ）及びＥｎｖのコドン最適化
ＧＲＩＮ及びＥｎｖ各々に対するコドン使用は、ヒト遺伝子のコドン偏寄に適合させた。コドン最適化ＧＲＩＮ配列のヌクレオチド及びアミノ酸配列が、図１６Ａ〜１６Ｊに示されている。コドン最適化Ｅｎｖ配列のヌクレオチド及びアミノ酸配列が、図１７Ａ〜１７Ｄに示されている。
【０１３６】
ＧＣ含量が非常に高い（８０％超）、又は非常に低い（３０％未満）領域は、可能である場合回避した。最適化プロセス中では、以下のシス作用性モチーフを回避した。即ち、図１６及び１７に提示した配列に示した場合を除き、内部のＴＡＴＡボックス、カイ部位（chi-site）、リボソーム導入部位（ribosomal entry site）、富ＡＴ又は富ＧＣ配列ストレッチ、ＡＲＥ、ＩＮＳ又はＣＲＳ配列エレメント、反復配列、ＲＮＡ二次構造、潜在性のスプライス供与及び受容部位、分岐点、並びにHindIII、NcoI、BgIII及びBgII制限酵素部位である。また、翻訳開始を増加させるために、ＧＲＩＮ及びＥｎｖ各々の開始ATGの上流にKozak配列を導入し、効率的な終止を保証するために、ＧＲＩＮ及びＥｎｖ各々に２個の終止コドンを付加した。サブクローニングを促進するための制限酵素部位も、図１６及び１７に示すように付加した。
【実施例９】
【０１３７】
非ヒト霊長類試験
ヒトアデノウィルスタイプ３５（Ａｄ３５）ベクター送達系におけるＧＲＩＮ及びＥＮＶの免疫原性の評価を第１目的として、非ヒト霊長類（中国産アカゲザル）試験を行った。動物は、Ａｄ３５−ＧＲＩＮ／ＥＮＶの増加する用量（１０９、１０１０及び１０１１個のウィルス粒子［ｖｐ］を筋肉内経路で）の投与を受け、０ヶ月及び６ヶ月に２回の免疫接種を受けた（第１回の免疫接種には１群当たり動物８匹、第２回の免疫接種には１群当たり動物４匹）。様々な時点で（０週から５０週まで）、動物から採血し、免疫原性をＩＦＮ−γのELISpotで測定した（それぞれｖｐ用量１０１０及び１０１１個に対して図２３Ａ及び２３Ｂを参照されたい）。
【０１３８】
プライム後の応答動物のELISpot強度、頻度双方で（データは示していない）、用量応答が観察された（１０９個ｖｐのデータは示していない）。ＧＲＩＮ／ＥＮＶの全てのワクチン抗原成分に対して応答が認められ、６ヶ月での第２回免疫接種後にＩＦＮγのELISpot応答が増加した。
【０１３９】
本発明は、以下の付番段落により更に説明される。
【０１４０】
１．ＨＩＶ−１クレイドＡのＧａｇ、Ｐｏｌ（ＲＴ及びＩｎｔ）及びＮｅｆ（「ＧＲＩＮ）、ＨＩＶ−１クレイドＡのＧａｇ、ＲＴ及びＮｅｆ（「ＧＲＮ」）、又はＨＩＶ−１クレイドＡのＥｎｖをコードするヌクレオチド配列を含む、ＨＩＶ−１クレイドＡ抗原用のコンセンサスヌクレオチド配列。
【０１４１】
２．コードされるＧａｇタンパク質が図１のアミノ酸配列を有する、段落１に記載のコンセンサスヌクレオチド配列。
【０１４２】
３．コードされるＰｏｌタンパク質が図３のアミノ酸配列を有する、段落１に記載のコンセンサスヌクレオチド配列。
【０１４３】
４．コードされるＥｎｖタンパク質が図５のアミノ酸配列を有する、段落１に記載のコンセンサスヌクレオチド配列。
【０１４４】
５．コードされるＮｅｆタンパク質が図７のアミノ酸配列を有する、段落１に記載のコンセンサスヌクレオチド配列。
【０１４５】
６．ＨＩＶ−１クレイドＡ抗原用のコンセンサスアミノ酸配列に類似したアミノ酸配列を有するＨＩＶ−１の流行株又は野外分離株からＨＩＶ−１クレイドＡ抗原を同定する方法であって、ＨＩＶ−１の流行株又は野外分離株由来の抗原のアミノ酸配列を、当該タンパク質用のコンセンサスアミノ酸配列と比較すること、及びＨＩＶ−１の流行株又は野外分離株から、前記コンセンサス配列とのタンパク質距離が近い抗原を選択することを含む方法。
【０１４６】
７．段落６に記載の方法を用いて同定されるＨＩＶ−１クレイドＡ抗原。
【０１４７】
８．トランスジェニックＨＩＶ−１クレイドＡ抗原を産生する方法であって、段落６に記載の方法を用いてＨＩＶ−１クレイドＡ抗原を選択すること、及び該抗原の機能を無効にするように、該抗原をコードするヌクレオチド配列を変異させることを含む方法。
【０１４８】
９．ＨＩＶ−１に対して免疫応答を生成する方法であって、前記段落のいずれかに記載のヌクレオチド配列を含む組成物を対象に投与することを含む方法。
【０１４９】
本発明の好ましい実施形態をこのように詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲に規定する本発明は、その多くの明らかな変形が、その趣旨又は範囲から逸脱せずに可能であるので、以上の説明で示した特定の詳細によって限定されるべきでないことは理解されたい。
【受託番号】
【０１５０】
Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ２５３３０５
Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ４５７０８１
Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ２５３３１４
ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−１５６６
Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ３６１８７２
Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ４５８７００６
Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ０６９６７１
【図１】
2009539353.tif 000009
【図２】
2009539353.tif 000010
【図３】
2009539353.tif 000011
【図４】
2009539353.tif 000012
【図５】
2009539353.tif 000013
【図６】
2009539353.tif 000014
【図７】
2009539353.tif 000015
【図８】
2009539353.tif 000016
【図９】
2009539353.tif 000017
【図１０】
2009539353.tif 000018
【図１１】
2009539353.tif 000019
【図１２】
2009539353.tif 000020
【図１３】
2009539353.tif 000021
【図１４Ａ】
2009539353.tif 000022
【図１４Ｂ】
2009539353.tif 000023
【図１４Ｃ】
2009539353.tif 000024
【図１５Ａ】
2009539353.tif 000025
【図１５Ｂ】
2009539353.tif 000026
【図１５Ｃ】
2009539353.tif 000027
【図１６Ａ】
2009539353.tif 000028
【図１６Ｂ】
2009539353.tif 000029
【図１６Ｃ】
2009539353.tif 000030
【図１６Ｄ】
2009539353.tif 000031
【図１６Ｅ】
2009539353.tif 000032
【図１６Ｆ】
2009539353.tif 000033
【図１６Ｇ】
2009539353.tif 000034
【図１６Ｈ】
2009539353.tif 000035
【図１６Ｉ】
2009539353.tif 000036
【図１６Ｊ】
2009539353.tif 000037
【図１７Ａ】
2009539353.tif 000038
【図１７Ｂ】
2009539353.tif 000039
【図１７Ｃ】
2009539353.tif 000040
【図１７Ｄ】
2009539353.tif 000041
【図１８】
2009539353.tif 000042
【図１９】
2009539353.tif 000043
【図２０】
2009539353.tif 000044
【図２１】
2009539353.tif 000045
【図２２】
2009539353.tif 000046
【図２３Ａ】
2009539353.tif 000047
【図２３Ｂ】
2009539353.tif 000048
【配列表】
2009539353000001.app
【国際調査報告】
2009539353.tif 000049
2009539353.tif 000050
2009539353.tif 000051