(57)【要約】本発明は、所望のレベルで標的遺伝子、例えばＶＥＧＦを発現する前駆細胞を産生するための方法であって、同じｍＲＮＡからの標的遺伝子およびマーカー遺伝子の翻訳に適合するＩＲＥＳ配列を介して細胞表面マーカー遺伝子、例えばトランケートされたＣＤ８／ＣＤ８ａに連結された標的遺伝子で前駆細胞を安定に形質導入すること、次いで標的遺伝子の発現レベルを細胞表面マーカー遺伝子の発現レベルと相関させること、標的遺伝子を所望の閾値で発現する培養前駆細胞の参照クローンを選択すること、および該参照クローンと同じかまたは類似したレベルの標的遺伝子の発現を有する前駆細胞を単離することを含む方法に関する。
2009537127.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望のレベルで標的遺伝子を発現する前駆細胞を産生するための方法であって、
（ａ）培養前駆細胞の不均一集団を提供すること；
（ｂ）同じｍＲＮＡからの（ｉ）標的遺伝子および（ｉｉ）細胞表面マーカー遺伝子の翻訳に適合する配列を介して（ｉｉ）細胞表面マーカー遺伝子に連結された（ｉ）標的遺伝子で該前駆細胞を安定に形質導入すること；
（ｃ）標的遺伝子の発現レベルを細胞表面マーカー遺伝子の発現レベルと相関させること；
（ｄ）該標的遺伝子を所望の閾値で発現する培養前駆細胞の参照クローンを選択すること；および
（ｅ）（ｉ）該参照クローンと同じかもしくは該参照クローンより低いレベルまたは（ｉｉ）該参照クローンと同じかもしくは該参照クローンより高いレベルの該標的遺伝子の発現を有する前駆細胞を、該細胞表面マーカーを介して単離すること、
を含む方法。
【請求項２】
工程（ｄ）においてそれぞれ下方閾値および上方閾値で前記遺伝子を発現する２つの参照クローンを選択し、そして２つの参照クローンの発現のレベルの間の該標的遺伝子の発現のレベルを有する前駆細胞を工程（ｅ）において単離する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｄ）において異なるレベルで前記遺伝子を発現する２つ以上の参照クローンを選択し、該参照クローンを使用して、標的遺伝子発現の下方閾値および上方閾値を規定し、そして発現の下方閾値レベルと上方閾値レベルとの間の任意の所望のレベルの該標的遺伝子の発現のレベルを有する前駆細胞を工程（ｅ）において単離する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｄ）における前記細胞表面マーカーの発現レベルを、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）を介して定量する、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｄ）における前記標的遺伝子の発現レベルを、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡ、ウエスタンブロットおよび表面プラズモン共鳴から選択される方法を介して定量する、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項６】
前記標的遺伝子が、転写因子もしくは成長因子レセプターをコードする、決定された閾値レベルを上回って宿主微小環境において発現されるときに毒性効果を有する、または効力もしくは効力の増加のために最小発現レベルが所望される遺伝子である、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項７】
前記標的遺伝子が、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記標的遺伝子が、構成的活性型ＨＩＦ−１α、ＰＤＧＦＲβまたはＰＤＧＦｂである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞表面マーカー遺伝子が、本来の生物学的活性のないトランケートされた形態の、容易に定量可能な内在性細胞表面化合物である、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞表面マーカー遺伝子が、ＣＤ８／ＣＤ８ａのトランケートされた型である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｂ）において同じｍＲＮＡからの翻訳に適合する配列がリボソーム内部進入部位（ＩＲＥＳ）である、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項１２】
培養前駆細胞の不均一集団が、初代筋芽細胞、骨髄由来間葉幹細胞、脂肪組織由来間葉幹細胞または心臓幹細胞から選択される、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項１３】
所望のレベルで宿主において標的遺伝子を発現する前駆細胞を産生するためのシステムであって、
（ａ）同じｍＲＮＡからの（ｉ）標的遺伝子および（ｉｉ）細胞表面マーカーの翻訳に適合する配列を介して（ｉｉ）細胞表面マーカーに連結された（ｉ）標的遺伝子を提供する宿主ゲノムに組み込む構築物；および
（ｂ）
（１）前駆細胞を該構築物で安定に形質導入すること；および
（２）該前駆細胞において該標的遺伝子の発現レベルを該細胞表面マーカーを介して評価することができるように標的遺伝子の発現レベルを細胞表面マーカーの発現レベルと相関させること、
のための説明書；
を含むシステム。
【請求項１４】
前記構築物がレトロウイルス構築物である、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
インビボ遺伝子治療のためのシステムであって、
同じｍＲＮＡからの（ｉ）標的遺伝子および（ｉｉ）細胞表面マーカーの翻訳に適合する配列を介して（ｉｉ）細胞表面マーカーに連結された（ｉ）標的遺伝子を提供する構築物で安定に形質導入された前駆細胞の均一集団を含み、該均一集団は、該前駆細胞を導入しようとする宿主微小環境において該標的遺伝子の発現レベルが所望されるとおりであるように、該細胞表面マーカーを介して選択されている、システム。
【請求項１６】
制御されたレベルの発現の遺伝子治療の方法であって、
（ａ）患者からの前駆細胞の不均一集団を得ること；
（ｂ）該前駆細胞を培養し、そして同じｍＲＮＡからの（ｉ）標的遺伝子および（ｉｉ）細胞表面マーカーの翻訳に適合する配列を介して（ｉｉ）細胞表面マーカーに連結された（ｉ）標的遺伝子で該前駆細胞を安定に形質導入すること；
（ｃ）該前駆細胞のクローンにおいて標的遺伝子の発現レベルを細胞表面マーカー遺伝子の発現レベルと相関させること；
（ｄ）該患者のために所望される閾値を規定するレベルで該標的遺伝子を発現する（ｃ）のクローンを参照クローンとして選択すること；および
（ｅ）（ｉ）該参照クローンと同じかもしくは該参照クローンより低いレベルまたは（ｉｉ）該参照クローンと同じかもしくは該参照クローンより高いレベルの該標的遺伝子の発現を有する細胞を該細胞表面マーカーを介して単離すること；
（ｆ）（ｅ）の細胞を該患者に再導入すること；
を含む方法。
【請求項１７】
工程（ｄ）においてそれぞれ下方閾値および上方閾値で前記遺伝子を発現する２つの参照クローンを選択し、そして２つの参照クローンの発現のレベルの間の該標的遺伝子の発現のレベルを有する前駆細胞を工程（ｅ）において単離する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｃ）および（ｄ）を省略し、そして別の患者の前駆細胞に対する方法の適用から工程（ｃ）および（ｄ）において得られた情報をその代わりに使用する、請求項１６または１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、細胞ベースの遺伝子治療のために有用な、ＦＡＣＳによって特定レベルのトランスジーンを安定に発現する形質導入前駆細胞の均一集団を迅速に単離するための方法に関する。
【０００２】
発明の背景
血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は、虚血性疾患における治療的血管新生を達成するために研究されている魅力的な候補であるが、それは異常な血管構造およびアンギオーマの成長を誘導し得、このことはその治療的有用性に疑いをはさみうる（M.L. Springer et al., Mol. Cell 2:549-558, 1998; P. Carmeliet, Nat. Med. 6:1102-1103, 2000; S.Ylae-Herttuala et al., J. Am. Coll. Cardiol. 49: 1015-1026, 2007）。それより下では正常で安定な毛細管が誘導され、そしてそれより上ではアンギオーマの成長が起こる、ＶＥＧＦ投薬量における分離した閾値が存在することが最近示された。しかし、毒性効果を予測可能に回避するためには、各々の形質導入筋線維の周囲の微小環境における均一な発現を確実にすることが必要である（C.R. Ozawa, A. Banfi et al., J. Clin. Invest. 113:515-527,20004）。実際、ＶＥＧＦはそれを産生する細胞の周囲の組織中に堅固に局在化されたままであるので、異なる成長因子濃度は、隣接する筋線維間でさえ、互いに平均化されない。それゆえ、たとえ総ＶＥＧＦ用量がむしろ低くても、少数の高発現の「ホットスポット」が、血管腫（hemangioma）の成長を引き起こすのに十分である。この知見は、ＶＥＧＦ遺伝子治療の臨床試験における管理可能な治療ウインドウ（therapeutic window）を達成することの見かけ上の困難性の説明の助けになる（A. Banfi et al., Curr. Atheroscl. Rep. 7:227-234, 2005）。実際、現在用いられている遺伝子治療方法、例えば構成的アデノウイルスおよびプラスミドベクターの直接注射は、送達される遺伝子の総用量（力価）の制御を可能とするのみであるが、インビボで達成される微小環境レベルの分布の制御は可能としない。それゆえ、まれな発現の「ホットスポット」さえも回避するためには、総用量は低く保たれなければならず、そして効力は浪費される。
【０００３】
発明の概要
本発明は、所望のレベル、例えば有効なレベル、より有効なレベル、または微小環境的に毒性水準下のレベルで標的遺伝子を発現する前駆細胞を産生するための方法であって、
（ａ）培養前駆細胞の不均一集団を提供すること；
（ｂ）同じｍＲＮＡからの（ｉ）標的遺伝子および（ｉｉ）細胞表面マーカー遺伝子の翻訳に適合する配列を介して（ｉｉ）細胞表面マーカー遺伝子に連結された（ｉ）標的遺伝子で該前駆細胞を安定に形質導入すること；
（ｃ）標的遺伝子の発現レベルを細胞表面マーカー遺伝子の発現レベルと相関させること；
（ｄ）該遺伝子を所望の閾値で、例えば（ｉ）該遺伝子の有効な発現、（ｉｉ）該遺伝子の増加した有効な発現または（ｉｉｉ）該遺伝子の微小環境的に毒性水準下の発現の閾値で発現する培養前駆細胞の参照クローンを選択すること；および
（ｅ）（ｉ）該参照クローンと同じかもしくは該参照クローンより低いレベルまたは（ｉｉ）該参照クローンと同じかもしくは該参照クローンより高いレベルの該標的遺伝子の発現を有する前駆細胞を、該細胞表面マーカーを介して単離すること、
を含む方法に関する。
【０００４】
この方法の変形において、工程（ｄ）においてそれぞれ下方閾値および上方閾値で前記遺伝子を発現する２つの参照クローンを選択し、そして２つの参照クローンの発現のレベルの間の該標的遺伝子の発現のレベルを有する前駆細胞を工程（ｅ）において単離する。さらなる変形において、工程（ｄ）において異なるレベルで該遺伝子を発現する２つ以上、例えば３つ、４つまたは５つの参照クローンを選択し、複数のクローンを使用して、標的遺伝子発現の下方閾値および上方閾値を規定し、そして発現の下方閾値レベルと上方閾値レベルとの間の任意の所望のレベルの該標的遺伝子の発現のレベルを有する前駆細胞を工程（ｅ）において単離する。
【０００５】
（ｄ）における前記細胞表面マーカーの発現レベルは、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）を介して定量されうる。（ｄ）における前記標的遺伝子の発現レベルは、それらに限定されないが、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡ、ウエスタンブロットまたは表面プラズモン共鳴などの方法を介して定量されうる。
【０００６】
標的遺伝子は、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）または任意の他の遺伝子、例えば、それらに限定されないが、転写因子もしくは成長因子レセプターをコードする、決定された閾値レベルを上回って宿主微小環境において発現されるときに毒性効果を有する、または効力もしくは効力の増加のために最小発現レベルが所望される遺伝子、例えば、それらに限定されないが、構成的活性型ＨＩＦ−１α、ＰＤＧＦＲβまたはＰＤＧＦｂでありうる。
【０００７】
前記細胞表面マーカーは、容易に定量可能な、好ましくは本来の生物学的活性のないトランケートされた形態の、任意の内在性細胞表面化合物、例えばＣＤ８／ＣＤ８ａのトランケートされた型でありうる。
【０００８】
同じｍＲＮＡからの（ｂ）（ｉ）および（ｂ）（ｉｉ）の翻訳に適合する配列はリボソーム内部進入部位（ＩＲＥＳ）でありうる。
【０００９】
前記前駆細胞は、初代筋芽細胞、骨髄由来間葉幹細胞、脂肪組織由来間葉幹細胞または心臓幹細胞でありうる。
【００１０】
本発明はまた、微小環境的に所望のレベル、例えば毒性水準下のレベルで宿主において標的遺伝子を発現する前駆細胞を産生するためのシステムであって、
（ａ）同じｍＲＮＡからの（ｉ）標的遺伝子および（ｉｉ）細胞表面マーカーの翻訳に適合する配列を介して（ｉｉ）細胞表面マーカーに連結された（ｉ）標的遺伝子を提供する宿主ゲノムに組み込む構築物、例えば、それらに限定されないが、レトロウイルス構築物；および
（ｂ）
（１）前駆細胞を該構築物で安定に形質導入すること；および
（２）該前駆細胞において該標的遺伝子の発現レベルを該細胞表面マーカーを介して評価することができるように標的遺伝子の発現レベルを細胞表面マーカーの発現レベルと相関させること、
のための説明書；
を含むシステムに関する。
【００１１】
本発明はまた、インビボ遺伝子治療のためのシステムであって、
同じｍＲＮＡからの（ｉ）標的遺伝子および（ｉｉ）細胞表面マーカーの翻訳に適合する配列を介して（ｉｉ）細胞表面マーカーに連結された（ｉ）標的遺伝子を提供する構築物で安定に形質導入された前駆細胞の均一集団を含み、該均一集団は、該前駆細胞を導入しようとする宿主微小環境において、該標的遺伝子の発現レベルが所望の範囲にある、例えば有効である、より有効である、または微小環境的に毒性水準下であるように、該細胞表面マーカーを介して選択されている、システムに関する。
【００１２】
本発明はまた、制御されたレベルの発現の遺伝子治療であって、
（ａ）患者からの前駆細胞の不均一集団を得ること；
（ｂ）該前駆細胞を培養し、そして同じｍＲＮＡからの（ｉ）標的遺伝子および（ｉｉ）細胞表面マーカーの翻訳に適合する配列を介して（ｉｉ）細胞表面マーカーに連結された（ｉ）標的遺伝子で該前駆細胞を安定に形質導入すること；
（ｃ）該前駆細胞のクローンにおいて標的遺伝子の発現レベルを細胞表面マーカー遺伝子の発現レベルと相関させること；
（ｄ）該患者のために所望される閾値を規定するレベル、例えば（ｉ）毒性水準下のまたは（ｉｉ）より高い効力のレベルで該標的遺伝子を発現する（ｃ）のクローンを参照クローンとして選択すること；
（ｅ）（ｉ）該参照クローンと同じかもしくは該参照クローンより低いレベルまたは（ｉｉ）該参照クローンと同じかもしくは該参照クローンより高いレベルの該標的遺伝子の発現を有する細胞を該細胞表面マーカーを介して単離すること；および
（ｆ）（ｅ）の細胞を該患者に再導入すること；
を含む遺伝子治療に関する。
【００１３】
この方法の変形において、工程（ｄ）においてそれぞれ下方閾値および上方閾値で前記遺伝子を発現する２つの参照クローンを選択し、そして２つの参照クローンの発現のレベルの間の該標的遺伝子の発現のレベルを有する前駆細胞を工程（ｅ）において単離する。
【００１４】
さらに、制御されたレベルの発現の遺伝子治療において、前記工程（ｃ）および（ｄ）を省略し得、そして別の患者の前駆細胞に対する方法の適用から工程（ｃ）および（ｄ）において得られた情報、すなわち、細胞表面マーカー遺伝子の発現レベルとの標的遺伝子の発現レベルの相関および参照クローンの選択をその代わりに使用しうる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】微小環境分布に対する制御は虚血筋肉におけるＶＥＧＦ遺伝子送達の効力を増強する。  ビヒクルのみ（ＢＳＡ）、コントロール細胞（ｌａｃＺ）または示すＶＥＧＦレベル（５、６０または１００ng／１０６細胞／日）を発現する筋芽細胞集団を、虚血マウス後肢に移植した。２週間後の分析は、クローン集団（Ｃ）によって達成される微小環境における発現レベルの均一な分布が、ポリクローン集団（ＰＣ）によって不均一レベルの平均として送達された同じ総用量（６０ng／１０６細胞／日）に比較して、相対的血流（ａ）および側副動脈数（ｂ）の両方を有意に改善することを示す。Ｒ．Ｂ．Ｆ（%）＝相対的血流（非虚血の%）。Ｎｏ．Ｃｏｌｌ＝側副枝数。ＰＣ＝ポリクローン、Ｃ＝クローン。
【図２】ＶＩＣＤ８レトロウイルス構築物の構造。  マウスＶＥＧＦ１６４遺伝子（ｍＶＥＧＦ１６４）の発現を、ＦＡＣＳソーティング可能な細胞表面マーカーであるトランケートされたＣＤ８ａ（ｔｒ．ｍＣＤ８ａ）の発現にＩＲＥＳ配列を介して連結した。２つの遺伝子の安定な発現が標的細胞のゲノムへの組み込み後に達成されるように、このカセットをレトロウイルス構築物に挿入した。ＬＴＲ＝レトロウイルス長末端反復配列；Ψ＝レトロウイルスパッケージングシグナル。
【図３】標準集団における蛍光量とのＶＥＧＦ産生の相関。  異なるレベルのＶＥＧＦを均一に発現する個々のクローンを、ｍＣＤ８ａに対する蛍光標識抗体での染色の後にＦＡＣＳで分析した。ＣＤ８染色の強度およびＶＥＧＦの産生（ＥＬＩＳＡによって測定）は、Ｒ２＝０．８９６９の値で相関することが見出された。Ｘ軸：ＶＥＧＦ産生（ng／１０６細胞／日）、Ｙ軸：ＣＤ８発現（蛍光強度単位）。
【図４】ＣＤ８発現レベルに基づく所望の集団のＦＡＣＳソーティング。  初代形質導入集団におけるほとんどすべての細胞は、ネガティブコントロール（２×１０１未満）に比較してＣＤ８（およびＶＥＧＦ）を発現するが、発現レベルのスペクトルは非常に不均一である（２×１０１〜１０４）。参照クローン（２００カウントに達する１０２〜１０３の曲線）において検出された蛍光の範囲に基づいて、より低い（Ａ）またはより高い（Ｂ）ＣＤ８レベルを発現する２つの異なるポリクローン亜集団をソーティングした。ソーティングした集団の純度を、ＦＡＣＳでの再分析によって決定し（パネルｂおよびｃにおける暗色プロット）そしてそれらはそれぞれのソーティングゲート内に完全に含まれることが見出された。Ｘ軸：ＣＤ８発現（蛍光強度単位）、Ｙ軸：細胞数。
【図５】インビトロでの拡大の間のソーティングした集団におけるＣＤ８およびＶＥＧＦの発現の安定性。  図４に記載のソーティングした集団（ＡおよびＢ）を、インビトロで約２５の集団倍加で拡大した。ＣＤ８ａの発現（ＦＡＣＳによって測定、パネルａ）およびＶＥＧＦの発現（ＥＬＩＳＡによって測定、パネルｂ）は、ソーティングの直後および約１×１０７倍の拡大（２３の倍加）後に同様な値を有して、安定であることが見出された。Ｄｂ＝集団倍加；ＣＤ８＝ＣＤ８発現（蛍光強度単位）；ＶＥＧＦ＝ＶＥＧＦ産生（ng／１０６細胞／日）
【図６】精製ＶＥＧＦ発現筋芽細胞の移植後のインビボでの血管新生。  そのＣＤ８発現に基づいて不均一集団から単離した細胞（図４ａのＡおよびＢゲート）は、それらをソーティングするために参照として使用したクローン（Ｒｅｆ．）と同様に、しかしクローニング工程をバイパスして、正常な血管新生を誘導する（Ｓ１およびＳ２）。ソーティングしていない集団（Ｎ．Ｓ．）は、むしろ血管腫の広範な成長を引き起こす。上部パネルでは、血管構造をレクチンで染色し、そして移植した筋芽細胞をＸ−ｇａｌ反応を使用してＬａｃＺ発現について染色した。下部パネルでは、血管直径（Ｄｉａ．（μm））分布を移植区域において定量化し、そして最も近いマイクロメートルに概算したマイクロメートル（μm）での所与の直径を有する血管の百分率（%）として表わす。Ｃ−＝コントロール細胞；Ｎ．Ｓ．＝ソーティングしていない集団；Ｒｅｆ＝参照クローン；Ｓ１＝ゲートＡでソーティング（図４参照）；Ｓ２＝ゲートＢでソーティング（図４参照）。
【図７】誘導された血管新生の形態学的特徴付け。  迅速に精製した集団は、参照クローンと同様に、コントロールに比較して血管長密度（vessel length density）（ＶＬＤ）の倍増および分枝指数（Ｂ．Ｉ．）の増加を誘導し、ソーティングしていない集団は、移植区域における血管数を実際に減少させる。ＶＬＤ＝血管長密度（血管長のmm／mm２）；Ｂ．Ｉ．＝分枝指数（分枝点数／１００μm血管長）；Ｃ−＝コントロール細胞；Ｎ．Ｓ．＝ソーティングしていない集団；Ｒｅｆ＝参照クローン；Ｓ１＝ゲートＡでソーティング；Ｓ２＝ゲートＢでソーティング。
【００１６】
発明の詳細な説明
本明細書中上記および下記で使用する用語は以下の意味を有する。
【００１７】
前駆細胞は、インビトロでの拡大および／または遺伝子改変の後に、インビボで分化した子孫を生じることができる細胞である。例は、筋芽細胞および筋肉衛星細胞、心臓前駆細胞、骨髄または脂肪組織由来間葉前駆細胞（間葉幹細胞とも呼ばれる）、多能性成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）、神経幹細胞、表皮幹細胞、角膜幹細胞および結膜幹細胞を含む。
【００１８】
微小環境とは、全集団による平均発現に対して、インビボでその周囲の微小環境に蓄積する遺伝子産物の量を決定する、各個の形質導入細胞におけるトランスジーンの発現のレベルを指す。集団が、すべての細胞が同じレベルを産生する単一クローンの子孫である場合、２つの発現（全体および微小環境）は一致する。
【００１９】
毒性水準下（sub-toxic）とは、毒性がないかまたは毒性が非常に低く、いかなる持続的な損傷も引き起こさないことを指す。血管新生を支持する標的遺伝子に関しては、毒性水準下は、異常でない血管新生の誘導として定義される。これは、特に糸球体様、球状またはアンギオーマ様構造、血管腫および慢性的透過性亢進（hyperpermeable）血管を含む、正常な毛細管、動脈または静脈とは構造および／または機能が異なる、欠陥のある血管構造の検出可能は形成がほとんどまたは全くない新たな血管の成長としてさらに定義されうる。
【００２０】
不均一集団は、いくつかの異なるクローン亜集団から構成され、その各々が広範な値にわたる異なるレベルのトランスジーンを発現する、形質導入細胞の集団である。
【００２１】
標的遺伝子は、その遺伝子産物が、毒性効果を回避しながら、所望の機能的効果を達成するために、そのコード配列で形質導入された個々の細胞における堅固な発現制御を必要とする遺伝子である。例は、（１）分泌成長因子／サイトカイン；（２）膜および細胞内レセプター；ならびに（３）転写因子を含む。血管新生のプロセスに関係するものとして、各カテゴリーの例は、（１）ＶＥＧＦ／ＰＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−βまたはアンギオポエチンファミリーのメンバー；（２）それらそれぞれのレセプター；（３）天然のまたは改変された、構成的活性型低酸素症誘導因子（ＨＩＦ）分子（K.A. Vincent et al., Circulation 102:2255-2261, 2000）、または血管新生因子活性化操作転写因子（angiogenic factors-activating engineered transcription factors）（E.J. Rebar et al., Nat. Med. 8: 1427-1432, 2002）を含みうる。
【００２２】
細胞表面マーカーは、（１）抗体染色およびＦＡＣＳ検出によって定量されうるように、細胞表面上に位置しており；（２）免疫反応を誘発しないように、ヒト遺伝子の産物であり；そして（３）その発現がインビトロでの細胞拡大およびインビボでの分化を妨害しないように、安定に形質導入された細胞において生物学的機能を有しないタンパク質である。例は、リンパ球特異的分子であるＣＤ８およびＣＤ４を含み、Ｔ細胞レセプター複合体におけるそれらの必要なパートナーは、Ｔリンパ球においてのみ発現される。いかなる生物学的機能もさらに回避するために、細胞内シグナル伝達ドメインは除去されるが、それぞれ細胞表面局在化および抗体認識を担う膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインは保持されるように、該分子は、膜貫通ドメインと細胞質内ドメインとの間の接合部でそれらをトランケートするように改変される。
【００２３】
翻訳に適合する配列は、第１コード配列と第２コード配列との間に配置され、同じ転写単位（単一のｍＲＮＡ分子）からの両方のコード配列の翻訳を可能にするポリヌクレオチド配列である。例は、種々の天然のまたは合成のリボソーム内部進入部位（ＩＲＥＳ）、例えば、下記の実施例の部に記載する脳心筋炎ウイルスＩＲＥＳを含む。あるいは、ライノウイルス、アフトウイルス、カルジオウイルス、脳心筋炎ウイルス、エンテロウイルス、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、ＨＩＶ、メンゴウイルス、ウシウイルス性下痢症ウイルス、Ａ型、Ｂ型またはＣ型肝炎ウイルス、ＧＴＸ、Ｃｙｒ６１ａ、Ｃｙｒ６１ｂ、ポリオウイルス、ピコルナウイルス、マウス脳心筋炎ウイルス、ポリオウイルス、および口蹄疫ウイルスに由来するＩＲＥＳ配列を使用しうる。それがＩＲＥＳの３’側に位置する作動可能に連結されたコード配列の翻訳を開始する能力を保持しているのであれば、天然のＩＲＥＳ配列のフラグメント、突然変異体および変異体を用いてもよい。
【００２４】
相関は、クローン集団（各細胞が同じレベルを発現する）中の各々を測定することによって、各々の形質導入細胞における標的遺伝子の発現レベルと細胞表面マーカーの発現レベルとの間の量的関係を確立し、それにより第２の測定値が不均一集団における個々の細胞における第１の値に関する情報を与えうることを意味する。
【００２５】
本発明の方法の論理的根拠は以下のとおりである：微小環境発現レベルの分布は、細胞当たりの異なる均一レベルのＶＥＧＦを安定に発現するクローン筋芽細胞集団を移植することによって信頼性を有して制御されうる（C.R. Ozawa, A. Banfi et al., J. Clin. Invest. 113:515-527, 2004）。ＶＥＧＦレベルの微小環境分布を制御することの治療的潜在力は、後肢虚血のマウスモデルにおいて示される。平均で６０ng／１０６細胞／日でＶＥＧＦ１６４を発現するポリクローン筋芽細胞集団の移植は、血流を中程度にのみ増加させ（図１ａ）、そして血管漏洩および異常な前血管腫（pre-angiomatous）血管が常に誘導される。しかし、モノクローン集団を移植することによって同じ総ＶＥＧＦ用量が筋肉中に均一に分布すると、血流は非虚血レベルに完全に回復し（図１ａ）、小動脈および側副の成長（図１ｂ）ならびに減少した虚血組織損傷が伴われる。異常な血管構造および血管腫は回避され、そして正常な、血管周囲細胞で覆われた血管のみが誘導され、これは１５か月にわたって持続する。制御されたレベルでのＶＥＧＦ遺伝子送達によって与えられる治療的改善の説得力のある概念の証明は提供されるが、このアプローチは、臨床実施において実行可能ではない。実際、それは、形質導入された自己筋芽細胞の複数のクローン集団の単離および特徴付けを伴い、これは各患者について過度の時間および資源の両方を必要とする。この概念を臨床的に適用可能にするために、すべての患者についてクローンを産生することなく、ランダムに形質導入された自己集団から所望のＶＥＧＦレベルを発現する細胞を迅速に精製することができることが所望される。
【００２６】
本発明の特定の態様においては、骨格筋への制御された遺伝子送達を達成するために、初代筋芽細胞を、ＶＥＧＦ１６４遺伝子がリボソーム内部進入部位（ＩＲＥＳ）を介してＣＤ８ａ（マウスＬｙ２遺伝子）のトランケートされた型に連結されているレトロウイルス構築物（ｍＶＩＣＤ８）で形質導入する（図２）。このリンパ球特異的分子の細胞内ドメインは除去され、その結果、それは生物学的機能を保持しておらずそして純粋に細胞表面レポーター遺伝子として作用する。ＩＲＥＳ配列は、ｍＲＮＡ上でのリボソームアセンブリーおよびキャップ非依存性様式での翻訳の開始を可能にする（I.R. Ghattas et al., Mol. Cell. Biol. 11:5848-5859,1991）。それゆえ、それは同じｍＲＮＡからの２つの遺伝子の翻訳を可能にする：第１は古典的機構により、そして第２はＩＲＥＳを介する。このようにして、ＶＥＧＦの発現レベルの変化は、ＣＤ８ａの細胞表面発現の平行した変化によって反映され、これは蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）によって生存細胞上で検出および定量されうる。
【００２７】
本発明のこの態様の基礎をなす基本的概念は、細胞表面上でのＣＤ８の発現へのＶＥＧＦ発現の関連付けが、ＦＡＣＳによるＣＤ８レベルの定量によって、ＶＥＧＦの発現レベルの予測を細胞毎に可能にするということである。しかし、これは直接的には可能でない。なぜなら、ＦＡＣＳによって検出される蛍光の絶対強度は、とりわけ、抗体染色の効率、レーザー強度および検出器の設定を含む多くの変量に依存するからである。それゆえ、不均一な初代形質導入集団において所望のＶＥＧＦレベルを発現する細胞を再現性よく同定するためには、そのレベルを安定かつ均一に発現しそして初代細胞とともに染色されそして分析される参照集団を有することが必要である。ＦＡＣＳプロット上で参照集団と共存する細胞は、同等なＶＥＧＦレベルを発現し、そして純粋にソーティングされうる。
【００２８】
初代マウス筋芽細胞をｍＶＩＣＤ８レトロウイルス構築物で形質導入して、非常に不均一なポリクローン集団を生じさせた。ＶＥＧＦ産生とＣＤ８発現のレベルとの間の関係を確立するために、異なる均一なＶＥＧＦおよびＣＤ８のレベルを安定に発現する、単一クローンをこの集団から単離した（図３）。
【００２９】
また、誘導された血管表現型を評価するために、以前に記載されたように（C.R. Ozawa, A. Banfi et al., J. Clin. Invest. 113:515-527, 2004）、異なるレベルのＶＥＧＦを発現する８つのクローンの組を免疫不全ＳＣＩＤマウスの後耳介筋にインビボで注射した。同時に異常な血管新生を完全に回避しながら、最も高いＶＥＧＦ量（〜４０ng／１０６細胞／日）を発現した集団を参照クローンとして選択した。このクローンによるＶＥＧＦおよびＣＤ８発現の安定性を試験し、そして少なくとも２６の集団倍加（population doubling）にわたって一定であることが見出された。
【００３０】
図４に示すように、参照クローンを使用して、初代不均一集団から目的の２つの異なるポリクローン亜集団を同定した。それらのＣＤ８発現のレベルに基づいて、参照クローンの全幅（図４における大ゲートＢ）かまたはちょうどその下半分（狭ゲートＡ）に対応する１つの群の細胞をソーティングした。
【００３１】
２つのソーティングした集団をインビトロで培養して、臨床適用のために十分な細胞を達成するのに必要な拡大をシミュレートした。ＣＤ８発現およびＶＥＧＦ産生（それぞれ狭集団および大集団について〜２０および〜３０ng／１０６細胞／日）の両方が、少なくとも２３の集団倍加にわたって安定であることが見出された（図５）。この拡大の程度は、１００万の開始ソートから８×１０１３を超える細胞を生じ、これは臨床送達のために必要とされる量（１０９細胞の範囲にあると見積もられる）を数桁上回っている。ＳＣＩＤマウスの後耳介筋にインビボで移植すると、ソーティングした集団は、所望のＶＥＧＦレベルを発現する細胞の高度に有意な濃縮が達成されたことを示した。図６に示すように、不均一なポリクローン集団は、異常な球状構造を常に誘導し、これは、予想どうり、進行性海綿状血管腫に発展する。しかし、この同じ集団からそれらのＣＤ８発現に基づいてソーティングした細胞（狭ゲートおよび大ゲートの両方）は、参照クローンと同様に、正常な均一なサイズの毛細管の成長を引き起こした。血管直径分布の分析により、正常な毛細管は、５〜１５μmの間に含まれるサイズを有し、ピークは１０μmより低くにあることが示される（図６、コントロール  Ｃ−）。不均一な高レベルのＶＥＧＦによって誘導される球状構造は、しばしば３０μmより大きい異常に拡張した直径を有する（図６、ソーティングしていない  Ｎ．Ｓ）。両方のソーティングした集団は、参照クローンと同様に、正常な直径分布を有する血管新生を誘導する（図６、Ｓ１、Ｓ２およびＲｅｆ）。
【００３２】
両方のソーティングした集団は、正常な毛細管表現型を保持するが、新たな血管成長も効率的に誘導する。実際、血管長密度（ＶＬＤ）（これは、規定された区域における血管の全長を測定し、そして直径によって影響されない）は、参照クローンの効果と同様に、コントロールと比較して両方のソーティングした集団を移植した区域において倍増する（図７、左パネル）。興味深いことに、ソーティングしていない集団によって発現される不均一な高いＶＥＧＦレベルはＶＬＤを実際に減少させる。なぜなら、それらは、新たな毛細管の発芽よりむしろ、既存の血管の過剰融合（hyperfusion）および球状構造の周辺成長を誘導するからである（図７、左パネル）。
【００３３】
ＶＬＤのこの増加は、血管数の実際の増加を表し、単に既存の毛細管の伸張を表すのではない。このことは、分枝点数／１００μm血管長を測定する分枝指数（branching index）の定量によって示される。図７（右パネル）に示すように、両方のソーティングした集団はコントロールと比較してＶＬＤを増加させるのみならず、分枝点の頻度も増加させる。それゆえ、生じた血管（２つの分枝点間の血管セグメントとして定義される）は、わずかにより短く（より多くの分枝）そしてコントロールと比較して数が２倍より多い。また、これらの特徴は、参照クローンの移植の効果と全く類似している。
【００３４】
耳介筋における移植後４週間目に、正常な血管新生のみが、２つのソーティングした集団の各々を注射された５匹の動物のうち４匹において誘導された。
【００３５】
当業者には理解されるように、上記のプロトコールの変形が可能である。例えば、ソーティングゲートは、異なるサイズを取り得（参照クローンの全サイズに対して幅の半分にわたりそしてピークに中心を置くより堅固なゲート）、そして一回のソーティングの他に、例えば２〜３回の連続した複数回のソーティングを行いうる。さらに、ソーティングゲートの中心を、２つ以上の異なる参照クローンの値から得られる「参照線」に基づいて予め算出された異なる発現値上に配置してもよく、それによりポリクローン集団の範囲内の標的遺伝子の任意の所望のレベルを発現する集団が得られうる。したがって、均一で安全かつ有効な集団を再現性よく生じる最小必要条件の正確な規定が可能である。
【００３６】
上記の実験はＶＥＧＦ遺伝子送達による治療的血管新生の分野において行われているが、本発明は、他の目的の遺伝子、特に各個の形質導入細胞における発現レベルを堅固に制御することが必要な遺伝子、例えば他の分泌成長因子、転写因子および膜または細胞内レセプターに容易に適用可能であることにも留意すべきである。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【国際調査報告】
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