(57)【要約】  本発明は、概して幹細胞の機能を増強する方法及び組成物を特徴としている。特に、本発明は血液及び／又は幹細胞移植中の生存、生育又は増殖を増大でき、そして損傷している幹細胞を保護することができる治療又は予防の方法を提供する。【選択図】図１ａ−１ｂ【特許請求の範囲】
【請求項１】
方法が、幹細胞をＰ２Ｙ１４受容体の発現又は生物学的活性を抑制する薬剤に接触させ、それによって幹細胞の増殖を増大させることを含有してなる、幹細胞の増殖を増大させる方法。
【請求項２】
幹細胞をインビボ又はエキソビボで接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
幹細胞を、幹細胞への傷害を受けている対象においてインビボで接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
薬剤が、Ｐ２Ｙ１４受容体ポリヌクレオチド又はポリペプチドの発現を減少させる抑制性核酸分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
抑制性核酸分子が、アンチセンス分子、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、又は低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
薬剤が、Ｐ２Ｙ１４受容体の活性化を抑制する抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
抗体が、リガンドが受容体に結合することを遮断する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
方法が、造血幹細胞への傷害を受けた対象において、対象の造血幹細胞を、Ｐ２Ｙ１４受容体の発現又は生物学的活性を抑制する薬剤の有効量と接触させ、それによって対象における血液細胞の損傷を治療することを含有してなる、対象における血液細胞の損傷を治療する方法。
【請求項９】
薬剤が、リガンドのＰ２Ｙ１４受容体への結合を遮断する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
薬剤が、Ｐ２Ｙ１４受容体の活性化を遮断する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
傷害が化学療法剤の投与である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
薬剤が、Ｐ２Ｙ１４受容体ポリヌクレオチド又はポリペプチドの発現を減少させる抑制性核酸分子である、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
抑制性核酸分子が、アンチセンス分子、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、又は低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
薬剤が、Ｐ２Ｙ１４受容体の活性化を抑制する抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
抗体が、リガンドのＰ２Ｙ１４受容体への結合を遮断する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
薬剤が小分子である、請求項８に記載の方法。
【請求項１７】
方法が、Ｐ２Ｙ１４受容体の発現又は生物学的活性を抑制する薬剤の有効量を対象に投与し、それによって対象の血液細胞の量を増大させることを含有してなる、それを必要とする対象における血液細胞の量を増大させる方法。
【請求項１８】
薬剤が、リガンドのＰ２Ｙ１４受容体への結合を遮断する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
薬剤が、Ｐ２Ｙ１４受容体の活性化を遮断する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
対象が、造血幹細胞に傷害を受けている、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
薬剤が、Ｐ２Ｙ１４受容体ポリヌクレオチド又はポリペプチドの発現を減少させる抑制性核酸分子である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
抑制性核酸分子が、アンチセンス分子、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、又は低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
薬剤が、Ｐ２Ｙ１４受容体の活性化を抑制する抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
抗体が、リガンドのＰ２Ｙ１４受容体への結合を遮断する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
薬剤が小分子である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
対象が、骨髄に異常細胞を有している、請求項１７に記載の方法。
【請求項２７】
対象が、白血病又は骨髄異形成を有すると診断されている、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
方法が、Ｐ２Ｙ１４受容体を発現する幹細胞又は前駆細胞を、Ｐ２Ｙ１４受容体の発現又は生物学的活性を抑制する薬剤の有効量と接触させ、それによって幹細胞の生存又は増殖を増大させることを含有してなる、幹細胞の生存、生育又は増殖を増大させる方法。
【請求項２９】
幹細胞が、間葉、皮膚、神経、腸、肝臓、心臓、前立腺、乳腺、腎臓、膵臓、網膜及び肺の幹細胞よりなる群から選ばれる、請求項１又は２８に記載の方法。
【請求項３０】
幹細胞が造血幹細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前駆細胞が造血前駆細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
増殖が幹細胞自己再生によるものである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
造血幹細胞が骨髄にある、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
方法がインビボで行われる、請求項１又は２８に記載の方法。
【請求項３５】
幹細胞への傷害を受けている対象において、幹細胞をインビボで接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
方法がインビトロで行われる、請求項１又は２８に記載の方法。
【請求項３７】
幹細胞又は幹細胞前駆体を生育させることを更に含有してなる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
薬剤が、Ｐ２Ｙ１４受容体ポリヌクレオチド又はポリペプチドの発現を減少させる抑制性核酸分子である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３９】
抑制性核酸分子が、アンチセンス分子、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、又は低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
Ｐ２Ｙ１４受容体の発現を抑制する薬剤が、Ｐ２Ｙ１４受容体の転写を減少させる、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
Ｐ２Ｙ１４受容体の発現を抑制する薬剤が、Ｐ２Ｙ１４受容体の翻訳を減少させる、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
Ｐ２Ｙ１４受容体の生物学的活性を抑制する薬剤が、Ｐ２Ｙ１４受容体の活性化を抑制する、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
Ｐ２Ｙ１４受容体の生物学的活性を、カルシウム流入の測定によって、リガンド結合の測定によって、又は造血幹細胞の機能の測定によって観察する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
カルシウム流入が減少する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
リガンド結合が減少する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
Ｐ２Ｙ１４受容体の発現又は生物学的活性を抑制する薬剤が、小分子、ポリペプチド、又は核酸分子である、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
ポリペプチドが、リガンドのＰ２Ｙ１４受容体との相互作用を特異的に遮断する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
リガンドが、ウリジン二リン酸グルコース−グルコース又は別のＵＤＰ−糖である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
ポリペプチドが、Ｐ２Ｙ１４受容体と特異的に結合する抗体である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
方法が、段階：
幹細胞を含有している単離された細胞集団を、Ｐ２Ｙ１４受容体抑制剤と接触させること；及び
この細胞を対象に投与し、それによって対象における自己再生する幹細胞の量を増大させること：
を含有してなる、それを必要とする対象における、自己再生する幹細胞の数を増大させる方法。
【請求項５１】
幹細胞が、間葉、皮膚、神経、腸、肝臓、心臓、前立腺、乳腺、腎臓、膵臓、網膜及び肺の幹細胞よりなる群から選ばれる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
対象が幹細胞傷害を受けている、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
単離された細胞集団群が対象から得られる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
対象がヒトである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
単離された細胞集団群を、骨髄移植の間に対象へ投与する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５６】
単離された細胞集団群が骨髄から得られる、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
骨髄細胞が造血幹細胞を含有している、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
骨髄細胞が、Ｌｉｎ−ｃＫｉｔ＋Ｓｃａｌ＋を含有している、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
幹細胞が造血幹細胞である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
方法が：
（ａ）Ｐ２Ｙ１４受容体を発現する細胞を候補化合物と接触させること；及び
（ｂ）ＯＰＮの発現又は活性の減少を検出すること（この減少が、幹細胞の生存又は増殖を促進する候補化合物を同定する）：
を含有してなる、幹細胞の生存、生育又は増殖を促進する候補化合物を同定する方法。
【請求項６１】
幹細胞数の増大を同定する段階を更に含有する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
細胞におけるＰ２Ｙ１４受容体の発現を減少させるＰ２Ｙ１４受容体抑制性核酸分子を含有してなる、単離された骨髄由来細胞。
【請求項６３】
細胞が造血幹細胞である、請求項６２に記載の骨髄由来細胞。
【請求項６４】
Ｐ２Ｙ１４受容体抑制性核酸分子が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡである、請求項６２に記載の骨髄由来細胞。
【請求項６５】
Ｐ２Ｙ１４受容体抑制剤、及びこの抑制剤を幹細胞の生存、生育又は増殖の促進に使用するための使用説明書を含有してなる、幹細胞の生存、生育、又は増殖を促進するためのキット。
【請求項６６】
Ｐ２Ｙ１４受容体の発現又は生物学的活性を抑制する薬剤、及びこの薬剤を幹細胞の増殖の増大に使用するための使用説明書を含有してなる、幹細胞の増殖を増大させるためのキット。
【請求項６７】
薬剤を得ることを更に含む、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
抑制剤を得ることを更に含む、請求項５０〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願／特許、及び参照による取り込み）
本出願は、２００６年６月１２日出願の米国特許出願第６０／８１３，２７４号に対する優先権を主張し、その内容を参照して本明細書に取り込む。
本明細書に引用されるそれぞれの出願及び特許、更にこの出願及び特許のそれぞれに引用される文献又は引例（各登録特許の審査過程での、「出願の引用文献」を含む）、及びこの出願及び特許に対応している及び／又はこれを優先権主張しているそれぞれのＰＣＴ及び外国への出願又は特許、及びそれぞれの出願の引用文献中で引用されたか又は参照されたそれぞれの文献は、参照して本明細書に明確に取り込まれていて、本発明の実施に用いることができる。より一般的には、文献又は引例が、本明細書に、特許請求の範囲の前の引例一覧（Reference List）、又は本明細書自体中の何れかに引用されていて、それぞれの文献又は引例（「本明細書で引用された引例」）更には本明細書で引用されたそれぞれの引例中で引用されたそれぞれの文献又は引例（製造者の仕様書、使用説明書などを含む）は、参照して本明細書に明確に取り込まれている。
【０００２】
（連邦支援研究でなされた発明に対する権利の陳述）
本研究は米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）の次の助成（助成金番号第Ｒ０１ＤＫ５０２３４及びＨＬ７０９８９号）に支援された。この発明において政府はある特定の権利を有している。
【背景技術】
【０００３】
大部分の化学療法剤は、活性に増殖しているガン細胞を殺生する。化学療法に関連する有害な副作用は、白血球及び赤血球の生成に大きく関与している骨髄の幹細胞を含む、健全な幹細胞に対するこのような薬剤の毒性に起因している。低い白血球数（顆粒球減少症又は好中球減少症とも称する）は、化学療法に伴う主な用量限定因子であって、化学療法による感染という重度な副作用の要因である。低い赤血球数、又は貧血も、化学療法を受けている対象にとって重大な懸念の原因となりうる。低い血小板数（血小板減少症とも称する）は化学療法に伴う別の用量限定因子であって、化学療法による出血という重度な副作用の要因である。好中球減少症及び血小板減少症は、造血系の細胞を生み出す幹細胞の劇的な減少によって、化学療法を遅延させ、用量の減少をもたらし、更には薬物治療の変更をももたらしうる。幹細胞を傷害から保護する方法が至急求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
Ｐ２受容体は、ヌクレオチドアデニン（ＡＤＰ、ＡＴＰ）及びウリジン（ＵＤＰ、ＵＴＰ）を結合する、機能的に異なった細胞表面受容体である。受容体のＰ２ファミリーは、イオンチャンネル型のリガンド依存性イオンチャンネルであるＰ２Ｘ受容体と、代謝調節型のＧタンパク質７回膜貫通型共役受容体であるＰ２Ｙ受容体に細分類できる。機能的に、Ｐ２Ｙ受容体は損傷に対する血管及び免疫応答に関与することが分かっている。Ｐ２Ｙ１４は、最初はヒト未成熟骨髄細胞株、ＫＧ１からクローンとして作られ、その後同種の分子がラット及びマウスで同定されている。静止ヒト１次骨髄（ＢＭ）造血幹細胞（ＨＳＣｓ）からのＰ２Ｙ１４のクローン化については既に、骨髄造血幹細胞のホーミングにおけるその機能を特徴付けて報告されている（Lee, B.C. et al. Genes Dev. 17, 1592-1604 (2003)）。損傷に対する幹細胞の応答を調節するＰ２Ｙ１４受容体の機能については今まで知られていなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、ある側面で、Ｐ２Ｙ１４受容体の活性化が、損傷後の幹細胞の保護を妨げるという発見からもたらされている。下記のように、本発明は幹細胞の生存、生育、増殖及び増大を増強する方法及び組成物を特徴としている。
【０００６】
一態様では、本発明は幹細胞の増殖を増大させる方法を提供し、その方法は、幹細胞をＰ２Ｙ１４受容体の発現又は生物学的活性を抑制する薬剤の有効量と接触させ、それによって幹細胞の増殖を増大させることを含んでいる。
【０００７】
本発明の幹細胞は、これに限定されないが、間葉、皮膚、神経、腸、肝臓、心臓、前立腺、乳腺、腎臓、膵臓、網膜及び肺の幹細胞を包含している。
一態様では、幹細胞をインビトロ又はエキソビボで接触させる。
その他の態様では、幹細胞を、幹細胞の傷害を受けている対象にインビボで接触させる。
【０００８】
更なる別の態様では、薬剤はＰ２Ｙ１４受容体ポリヌクレオチド又はポリペプチドの発現を減少させる抑制性核酸分子である。
特定の態様では、抑制性核酸分子はアンチセンス分子、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、又は低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。
更なる別の態様では、薬剤はＰ２Ｙ１４受容体の活性化を抑制する抗体である。
特定の態様では、抗体はリガンドが受容体に結合することを遮断する。
【０００９】
その他の態様では、本発明は対象における血液細胞の損傷を治療する方法を提供し、その方法は、造血幹細胞への傷害を受けた対象において、対象の造血幹細胞を、Ｐ２Ｙ１４受容体の発現又は生物学的活性を抑制する薬剤の有効量と接触させ、それによって対象における血液細胞の損傷を治療することを含む。
【００１０】
一態様では、薬剤はＰ２Ｙ１４受容体の活性化を抑制する抗体である。
特定の態様では、抗体はリガンドが受容体と結合することを遮断する。
その他の態様では、傷害は化学療法剤の投与である。
更なる別の態様では、薬剤はＰ２Ｙ１４受容体ポリヌクレオチド又はポリペプチドの発現を減少する抑制性核酸分子である。
特定の態様では、抑制性核酸分子はアンチセンス分子、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、又は低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。
更なる別の態様では、薬剤は小分子である。
【００１１】
更なる別の態様では、本発明は増大を必要とする対象における血液細胞の量を増大させる方法を提供し、その方法は、Ｐ２Ｙ１４受容体の発現又は生物学的活性を抑制する薬剤の有効量を対象に投与し、それによって対象における血液細胞の量を増大させることを含む。
【００１２】
一態様では、薬剤はＰ２Ｙ１４受容体の活性化を抑制する抗体である。
特定の態様では、抗体はリガンドが受容体と結合することを遮断する
その他の態様では、対象は造血幹細胞に傷害を受けている。
更なる別の態様では、薬剤はＰ２Ｙ１４受容体ポリヌクレオチド又はポリペプチドの発現を減少させる抑制性核酸分子である。
【００１３】
特定の態様では、抑制性核酸分子はアンチセンス分子、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、又は低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。
更なる別の態様では、薬剤は小分子である。
更なる別の態様では、対象は骨髄に異常細胞を有している。
更なる別の態様では、対象は白血病又は骨髄異形成を有すると診断されている。
【００１４】
更なる別の態様では、本発明は幹細胞の生存、生育又は増殖を増大させる方法を提供し、その方法は、Ｐ２Ｙ１４受容体を発現する幹細胞又は前駆細胞を、Ｐ２Ｙ１４受容体の発現又は生物学的活性を抑制する薬剤の有効量と接触させ、それによって幹細胞の生存又は増殖を増大させることを含んでいる。方法は更に、幹細胞又は幹細胞前駆体を生育させることを含んでいてもよい。
【００１５】
特定の態様では、前駆細胞は造血前駆細胞であって、そして／又は幹細胞は造血幹細胞である。一態様では、増殖は幹細胞の自己再生によるものである。
その他の態様では、幹細胞を幹細胞傷害を受けている対象にインビボで接触させる。
【００１６】
更に別の態様では、幹細胞は骨髄中にある。
更に別の態様では、薬剤はＰ２Ｙ１４受容体ポリヌクレオチド又はポリペプチドの発現を減少させる抑制性核酸分子である。
特定の態様では、抑制性核酸分子はアンチセンス分子、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、又は小分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。
多くの態様では、Ｐ２Ｙ１４受容体の発現を抑制する薬剤は、Ｐ２Ｙ１４受容体の転写を減少し、そして／又はＰ２Ｙ１４受容体の翻訳を減少させる。
【００１７】
多くの態様では、Ｐ２Ｙ１４受容体の生物学的活性を抑制する薬剤は、Ｐ２Ｙ１４受容体の活性化を減少減少させる。生物学的活性は、カルシウム流入の測定によって、リガンド結合の測定によって、又は造血幹細胞の機能の測定によって観察できる。リガンドは、例えばウリジン二リン酸グルコース−グルコース又はその他のＵＤＰ−糖であってよい。
【００１８】
更なる別の態様では、本発明は、増大を必要とする対象における自己再生する幹細胞の数を増大させる方法を提供し、その方法は、幹細胞を含有する単離された細胞集団をＰ２Ｙ１４受容体抑制剤と接触させること；及びこの細胞を対象に投与し、それによって対象における自己再生する幹細胞の量を増大させる：段階を含んでいる。単離された細胞集団は対象（例えば、ヒト対象）から得ることができる。
【００１９】
一態様では、単離された細胞集団を骨髄移植中の対象に投与する。
その他の態様では、単離された細胞集団は骨髄から得られる。
特定の態様では、骨髄細胞はＬｉｍ−ｃＫｉｔ＋Ｓｃａｌ＋を含んでいる。
更なる別の態様では、幹細胞は造血幹細胞である。
【００２０】
更なる別の態様では、増大が必要な対象組織における幹細胞の移植を増大させる方法を提供し、その方法は、
（ａ）幹細胞をＰ２Ｙ１４受容体の発現又は生物学的活性を抑制する薬剤と接触させること；及び
（ｂ）この幹細胞を組織に供給し、それによって組織における幹細胞の移植を増大させること：
を含んでいる。
【００２１】
一態様では、幹細胞を幹細胞傷害を受けている対象中でインビボ接触させる。
多くの態様では、本発明の方法はこの薬剤又は抑制剤を得ることを更に含んでいる。
【００２２】
更なる別の態様では、本発明は、細胞の生存、生育又は増殖を促進する候補化合物を同定する方法を提供し、その方法は、
（ａ）Ｐ２Ｙ１４受容体を発現する細胞を候補化合物と接触させること；及び
（ｂ）ＯＰＮの発現又は活性の減少を検出すること（ここで、この減少は幹細胞の生存又は増殖を促進する候補化合物を同定する）：
を含んでいる。この方法は、幹細胞数の増大を同定する段階を更に含んでいてもよい。
【００２３】
更なる別の態様では、本発明は、Ｐ２Ｙ１４受容体抑制性核酸分子を含有している単離された骨髄由来細胞を提供し、このＰ２Ｙ１４受容体抑制性核酸分子は細胞におけるＰ２Ｙ１４受容体の発現を減少させる。
一態様では、Ｐ２Ｙ１４受容体抑制性核酸分子はｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡである。
【００２４】
更なる別の態様では、本発明は、Ｐ２Ｙ１４受容体抑制剤及びこの抑制剤を幹細胞の生存、生育、又は増殖の促進に使用するための使用説明書を含有している、幹細胞の生存、生育、又は増殖を促進するためのキットを提供する。
更なる別の態様では、本発明は、Ｐ２Ｙ１４受容体の発現又は生物学的活性を抑制する薬剤、及びこの薬剤を幹細胞の増殖の増大に使用するための使用説明書を含有してなる、幹細胞の増殖を増大させるためのキットを提供する。
【００２５】
本発明の他の特徴及び利点は詳細な説明から、そして特許請求の範囲から明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
本発明の更なる目的、特徴及び利点は、本発明の具体的態様を示す添付図面と併せて下記の詳細な説明から明らかとなるだろう。
【図１ａ−１ｂ】図１は、化学損傷後に相対的休眠の導入を介してアポトーシスから原始造血細胞をＰ２Ｙ１４が保護することを表している。シクロホスファミド（ＶＴＸ）２００ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与後４日目にＢＭ単核細胞中のＬＫＳ＋のパーセント（ａ）及びＣＤ３４ｌｏ／−ＬＫＳ＋のパーセント（ｂ）を測定した。ＬＫＳ＋（ｃ）及びＣＤ３４ｌｏ／−ＬＫＳ＋（ｄ）のアポトーシス分画も定量した。これらはＣＴＸによるＢＭ損傷後のＰ２Ｙ１４−／−原始ＨＳＣにおいてより高い程度のアポトーシスを示している。０日目（矢印）に５−フルオロウラシル（５ＦＵ）１５０ｍｇ／ｋｇの単回腹腔内投与後、ＰＢ白血球数（ｅ）及びＰＢＧｒ−１＋白血球数（ｆ）を９週間、毎週測定した。これらは、５ＦＵ処理後の末梢血細胞数の回復の間９週間まで持続する、正常の顆粒球数より大きい逆戻り応答を示している。Ｐ２Ｙ１４−／−及び＋／＋ＢＭ由来のＬＫＳ＋細胞を分類して、細胞周期を促進するサイトカイン中インビトロで３日間培養し、次いで培養物にＵＤＰ−グルコース１００ｍＭを添加して１６時間培養した。次いで細胞をＢｒＤＵで４５分間パルスして、パルス後６時間目及び２４時間目にＢｒＤＵの取り込み量を測定した（ｇ）。これはＵＤＰ−グルコースがＰ２Ｙ１４＋／＋原始ＨＳＣの細胞周期の進行を抑制することを示している。
【図１ｃ−１ｄ】図１は、化学損傷後に相対的休眠の導入を介してアポトーシスから原始造血細胞をＰ２Ｙ１４が保護することを表している。シクロホスファミド（ＶＴＸ）２００ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与後４日目にＢＭ単核細胞中のＬＫＳ＋のパーセント（ａ）及びＣＤ３４ｌｏ／−ＬＫＳ＋のパーセント（ｂ）を測定した。ＬＫＳ＋（ｃ）及びＣＤ３４ｌｏ／−ＬＫＳ＋（ｄ）のアポトーシス分画も定量した。これらはＣＴＸによるＢＭ損傷後のＰ２Ｙ１４−／−原始ＨＳＣにおいてより高い程度のアポトーシスを示している。０日目（矢印）に５−フルオロウラシル（５ＦＵ）１５０ｍｇ／ｋｇの単回腹腔内投与後、ＰＢ白血球数（ｅ）及びＰＢＧｒ−１＋白血球数（ｆ）を９週間、毎週測定した。これらは、５ＦＵ処理後の末梢血細胞数の回復の間９週間まで持続する、正常の顆粒球数より大きい逆戻り応答を示している。Ｐ２Ｙ１４−／−及び＋／＋ＢＭ由来のＬＫＳ＋細胞を分類して、細胞周期を促進するサイトカイン中インビトロで３日間培養し、次いで培養物にＵＤＰ−グルコース１００ｍＭを添加して１６時間培養した。次いで細胞をＢｒＤＵで４５分間パルスして、パルス後６時間目及び２４時間目にＢｒＤＵの取り込み量を測定した（ｇ）。これはＵＤＰ−グルコースがＰ２Ｙ１４＋／＋原始ＨＳＣの細胞周期の進行を抑制することを示している。
【図１ｅ−１ｆ】図１は、化学損傷後に相対的休眠の導入を介してアポトーシスから原始造血細胞をＰ２Ｙ１４が保護することを表している。シクロホスファミド（ＶＴＸ）２００ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与後４日目にＢＭ単核細胞中のＬＫＳ＋のパーセント（ａ）及びＣＤ３４ｌｏ／−ＬＫＳ＋のパーセント（ｂ）を測定した。ＬＫＳ＋（ｃ）及びＣＤ３４ｌｏ／−ＬＫＳ＋（ｄ）のアポトーシス分画も定量した。これらはＣＴＸによるＢＭ損傷後のＰ２Ｙ１４−／−原始ＨＳＣにおいてより高い程度のアポトーシスを示している。０日目（矢印）に５−フルオロウラシル（５ＦＵ）１５０ｍｇ／ｋｇの単回腹腔内投与後、ＰＢ白血球数（ｅ）及びＰＢＧｒ−１＋白血球数（ｆ）を９週間、毎週測定した。これらは、５ＦＵ処理後の末梢血細胞数の回復の間９週間まで持続する、正常の顆粒球数より大きい逆戻り応答を示している。Ｐ２Ｙ１４−／−及び＋／＋ＢＭ由来のＬＫＳ＋細胞を分類して、細胞周期を促進するサイトカイン中インビトロで３日間培養し、次いで培養物にＵＤＰ−グルコース１００ｍＭを添加して１６時間培養した。次いで細胞をＢｒＤＵで４５分間パルスして、パルス後６時間目及び２４時間目にＢｒＤＵの取り込み量を測定した（ｇ）。これはＵＤＰ−グルコースがＰ２Ｙ１４＋／＋原始ＨＳＣの細胞周期の進行を抑制することを示している。
【図１ｇ】図１は、化学損傷後に相対的休眠の導入を介してアポトーシスから原始造血細胞をＰ２Ｙ１４が保護することを表している。シクロホスファミド（ＶＴＸ）２００ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与後４日目にＢＭ単核細胞中のＬＫＳ＋のパーセント（ａ）及びＣＤ３４ｌｏ／−ＬＫＳ＋のパーセント（ｂ）を測定した。ＬＫＳ＋（ｃ）及びＣＤ３４ｌｏ／−ＬＫＳ＋（ｄ）のアポトーシス分画も定量した。これらはＣＴＸによるＢＭ損傷後のＰ２Ｙ１４−／−原始ＨＳＣにおいてより高い程度のアポトーシスを示している。０日目（矢印）に５−フルオロウラシル（５ＦＵ）１５０ｍｇ／ｋｇの単回腹腔内投与後、ＰＢ白血球数（ｅ）及びＰＢＧｒ−１＋白血球数（ｆ）を９週間、毎週測定した。これらは、５ＦＵ処理後の末梢血細胞数の回復の間９週間まで持続する、正常の顆粒球数より大きい逆戻り応答を示している。Ｐ２Ｙ１４−／−及び＋／＋ＢＭ由来のＬＫＳ＋細胞を分類して、細胞周期を促進するサイトカイン中インビトロで３日間培養し、次いで培養物にＵＤＰ−グルコース１００ｍＭを添加して１６時間培養した。次いで細胞をＢｒＤＵで４５分間パルスして、パルス後６時間目及び２４時間目にＢｒＤＵの取り込み量を測定した（ｇ）。これはＵＤＰ−グルコースがＰ２Ｙ１４＋／＋原始ＨＳＣの細胞周期の進行を抑制することを示している。
【図２ａ−２ｂ−２ｃ】図２は、Ｐ２Ｙ１４−／−ＷＢＭの優れた生着可能性及び自己再生能力を表している。致死的放射線を照射された雌性ＣＤ４５．１移植マウスに、それぞれの遺伝子型から得たＣＤ４５．２＋全ＢＭ単核細胞を、雄性ＣＤ４５．１競合マウスから得た同数の全ＢＭ単核細胞と共に静脈内投与した。第１（ａ）、第２（ｂ）及び第３（ｃ）移植マウスにおいて、Ｐ２Ｙ１４−／−全ＢＭ細胞の移植が、Ｐ２Ｙ１４−／−ＨＳＣの優れた生着及び自己再生の能力を示唆する、より大きいＰＢ中のＣＤ４５．２単核細胞パーセントをもたらした。ＣＤ４５．２＋Ｐ２Ｙ１４−／−又は＋／＋全ＢＭとＣＤ４５．１＋全ＢＭ細胞を１：１、１：２及び１：４の比で用いて、限界希釈の競合連続移植を行った（ｄ、ｅ）。第１（ｄ）及び第２（ｅ）移植マウスの両方で、Ｐ２Ｙ１４−／−全ＢＭが、＋／＋と比べて統計学的に有意に大きい競合的再構築単位（ＣＲＵ）当量を示した。
【図２ｄ−２ｅ】図２は、Ｐ２Ｙ１４−／−ＷＢＭの優れた生着可能性及び自己再生能力を表している。致死的放射線を照射された雌性ＣＤ４５．１移植マウスに、それぞれの遺伝子型から得たＣＤ４５．２＋全ＢＭ単核細胞を、雄性ＣＤ４５．１競合マウスから得た同数の全ＢＭ単核細胞と共に静脈内投与した。第１（ａ）、第２（ｂ）及び第３（ｃ）移植マウスにおいて、Ｐ２Ｙ１４−／−全ＢＭ細胞の移植が、Ｐ２Ｙ１４−／−ＨＳＣの優れた生着及び自己再生の能力を示唆する、より大きいＰＢ中のＣＤ４５．２単核細胞パーセントをもたらした。ＣＤ４５．２＋Ｐ２Ｙ１４−／−又は＋／＋全ＢＭとＣＤ４５．１＋全ＢＭ細胞を１：１、１：２及び１：４の比で用いて、限界希釈の競合連続移植を行った（ｄ、ｅ）。第１（ｄ）及び第２（ｅ）移植マウスの両方で、Ｐ２Ｙ１４−／−全ＢＭが、＋／＋と比べて統計学的に有意に大きい競合的再構築単位（ＣＲＵ）当量を示した。
【図３ａ】図３は、損傷に応答するＢＭにおけるＰ２Ｙ１４の提案する役割を表している。ＢＭ造血細胞及びＢＭ微小環境の両方を化学損傷した急性期（ａ）及び回復期（ｂ）、及びＢＭ微小環境のみを損傷させてＨＳＣ移植を行っている時（ｃ）、におけるＰ２Ｙ１４の提案する役割を図解している。
【図３ｂ】図３は、損傷に応答するＢＭにおけるＰ２Ｙ１４の提案する役割を表している。ＢＭ造血細胞及びＢＭ微小環境の両方を化学損傷した急性期（ａ）及び回復期（ｂ）、及びＢＭ微小環境のみを損傷させてＨＳＣ移植を行っている時（ｃ）、におけるＰ２Ｙ１４の提案する役割を図解している。
【図３ｃ】図３は、損傷に応答するＢＭにおけるＰ２Ｙ１４の提案する役割を表している。ＢＭ造血細胞及びＢＭ微小環境の両方を化学損傷した急性期（ａ）及び回復期（ｂ）、及びＢＭ微小環境のみを損傷させてＨＳＣ移植を行っている時（ｃ）、におけるＰ２Ｙ１４の提案する役割を図解している。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
（発明の詳細な説明）
（定義）
「薬剤」とは、抗体、核酸分子、又はポリペプチド、又はそれらの断片の何れか、更にはステロイド又は小分子化合物のような化学物質を意味する。
「同種の」とは、同じ種の細胞を意味する。
【００２８】
「アンチセンス」とは、長さに関わらず、核酸配列のコード鎖又はｍＲＮＡに相補的な核酸配列を意味する。一態様では、アンチセンスＲＮＡは個々の細胞、組織、臓器に又は動物全般に導入される。アンチセンス核酸は、修飾された骨格、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、又は当該技術分野で公知の他の修飾骨格を含有していてもよく、また非天然型のヌクレオシド間結合を含有していてもよい。修飾核酸及び核酸類縁体は、例えば、米国特許出願公開第２００３０１９０６５９号に記載されている。
【００２９】
「抗体」とは、免疫結合能を有している何れかの免疫ポリペプチド又はその断片を意味する。
「自家の」とは、同じ対象由来の細胞を意味する。
「骨髄由来細胞」とは、骨髄で自然発生する何れかの細胞型を意味する。
【００３０】
「血液細胞損傷」とは、赤血球、白血球、血液前駆細胞、又は血液幹細胞（例えば、造血幹細胞）の生存、生育、又は増殖の何れかの崩壊を意味する。
【００３１】
本明細書の開示における、「含む」、「含んでいる」、「含有している」及び「有している」等は、米国特許法でみなされている意味を有していて、「包含する」、「包含している」等を意味することができ；「実質的によりなっている」、「実質的になる」等は、米国特許法でみなされている意味を有していて、この用語には制約がなく、列挙されている基本的若しくは新規な特徴が、列挙されているものよりも多くの存在によって変えられない限り、列挙されているものより多くのものの存在を許容しているが、先行技術の態様は除外する。
【００３２】
「二本鎖ＲＮＡ」とは、長さに関わらず、センス及びアンチセンスＲＮＡｓの相補対を意味する。一態様では、これらのｄｓＲＮＡは、個々の細胞、組織、臓器に又は動物全般に導入される。例えば、これらは血流を介して全身に導入される。望ましくは、二本鎖ＲＮＡは、核酸又はアミノ酸の配列の発現又は生物学的活性を減少減少させることができる。一態様では、この発現又は生物学的活性の減少は、コントロールと比較して、少なくとも１０％であり、より望ましくは２５％、最も望ましくは５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又はそれ以上である。このｄｓＲＮＡは修飾骨格、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、又は当該技術分野で公知の他の修飾骨格を含有していてもよく、また非天然型のヌクレオシド間結合を含有していてもよい。
【００３３】
「有効量」とは、単独で又は更なる用量と組合わせるかの何れかで、望ましい治療応答を引き起こす（すなわち、幹細胞の生存、生育又は増殖を増強する）、Ｐ２Ｙ１４受容体阻害剤又はＰ２Ｙ１４受容体阻害剤で処理した幹細胞の量を意味する。
【００３４】
「移植する」又は「移植」とは、インビボで組織に存在している細胞と接触させて目的の組織へ幹細胞を取り込む過程を意味する。
「増殖」とは、末端の分化がない細胞（複数を含む）の繁殖を意味する。
【００３５】
「断片」とは、ポリペプチド又は核酸分子の部分を意味する。この部分は、参照する核酸分子又はポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％を含有していることが好ましい。断片は１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００、２００、３００、４００，５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００個のヌクレオチド又はアミノ酸を含有していてもよい。
【００３６】
「造血前駆細胞」とは、造血系に関与していく能力を有している、多能性細胞を意味する。
「造血幹細胞」とは、造血系を含む、多系統に関与する能力を有している、多能性細胞を意味する。
【００３７】
「抑制性核酸」とは、二本鎖ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、若しくはアンチセンスＲＮＡ、又はそれらの部分、或いはそれらの模倣薬を意味し、これを哺乳動物の細胞に投与すると、標的遺伝子の発現の減少をもたらす。典型的には、核酸抑制剤は、標的核酸分子又はその相同分子の少なくとも一部分を含むか、又は標的核酸分子の相補鎖の少なくとも一部を含んでいる。典型的には、標的遺伝子の発現が、１０％、２５％、５０％、７５％、又は９０〜１００％も減少する。
【００３８】
「傷害」とは、細胞に負わせる自然の又は人工的な（例えば、化学的な）損傷を意味する。
「造血幹細胞への傷害」とは、造血幹細胞の正常機能の崩壊を意味する。造血幹細胞の機能の崩壊は、これに限定されないが、生存、生育又は増殖の減少を包含する。
【００３９】
「単離された」とは、その自然状態で見出されるような通常それに付随している成分がさまざまな程度に存在していない物質を意味する。「単離する」は元の供給源又は環境からのある程度の分離を意味する。
【００４０】
「得る」とは、購入、合成、又はその他の取得を意味する。
「操作可能に連結されている」とは、適切な分子（例えば、転写活性化因子タンパク質）が第二ポリヌクレオチドに結合すると第一ポリヌクレオチドの転写を指令するような、第二ポリヌクレオチドの近傍に第一ポリヌクレオチドが位置していることを意味する。
【００４１】
「腫瘍」とは、細胞又は組織の病理学的な増殖及びそれに続く他の組織若しくは臓器への移動又は浸潤によって特徴付けられる疾患を意味する。腫瘍の生育は、一般に制御不能であって、進行性であり、そして正常細胞の増殖を誘発できないか、又は中止させるであろう状態の下に起こる。腫瘍は多種の細胞型、組織又は臓器に影響を及ぼすことができる。この臓器は、これに限定されないが、膀胱、骨、脳、胸部、軟骨、神経膠、食道、卵管、胆嚢、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、神経組織、卵巣、膵臓、前立腺、骨格筋、皮膚、脊髄、脾臓、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、気管、尿生殖器、尿管、尿道、子宮、及び膣、又はこれらの組織又は細胞型よりなる群から選ばれる臓器を包含している。腫瘍は、肉腫、癌腫、又は形質細胞腫（形質細胞の悪性腫瘍）のような、癌を包含する。
【００４２】
「正常血液細胞量」とは、正常なコントロール対象の平均血液細胞数を意味する。
「Ｐ２Ｙ１４ポリヌクレオチド」とは、Ｐ２Ｙ１４ポリペプチドをコードする核酸配列を意味する。典型的な核酸配列はGenbank Accession No.Ｄ１３６３１を含有する。  
【００４３】
「Ｐ２Ｙ１４受容体」とは、GenBank Accession No._０５５６９４又はその断片に対して少なくと８５％又はそれ以上のアミノ酸同一性を有していて、Ｐ２Ｙ１４受容体の少なくとも１つの生物学的活性を有しているアミノ酸配列を意味する。ヒトＰ２Ｙ１４受容体は、例えば、Lee et al., "P2Y-like receptor, GPR105 (P2Y１４), identifies and mediates chemotaxis of bone-marrowhematopoietic stem cells" GENES & DEVELOPMENT 17:1592-1604, 2003 に記載されていて、これはその全てを参照して本明細書に組み入れる。他の典型的なＰ２Ｙ１４受容体アミノ酸配列は、例えばGenBank Accession No.Ｑ１５３９１及びＢＡＡ０５０３９を含む。Ｐ２Ｙ１４受容体はＧＰＲ １０５及びＳＣ−ＧＰＲとしても当該技術分野で知られている。
【００４４】
「Ｐ２Ｙ１４受容体の生物学的活性」とは、カルシウム流入、ウリジン５’−二リン酸グルコース（ＵＤＰ−グルコース）結合、骨髄造血細胞の走化性の媒介、又は造血幹細胞の生育、増殖若しくは生存に関する他の活性のような、Ｇタンパク質受容体の活性化を意味する。
【００４５】
「Ｐ２Ｙ１４受容体抑制剤」とは、Ｐ２Ｙ１４受容体の発現又は生物学的活性を減少若しくは消去する薬剤の何れかを意味する。
「発現のために位置付けられた」とは、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ分子）が、配列の転写及び翻訳を指令するＤＮＡ配列の近傍に位置づけられていることを意味する。
【００４６】
「前駆細胞」とは、幹細胞由来の系統確約細胞を意味する。前駆細胞は、その分化能における多分化能を保持しているが、顕著に減少した自己再生能を有している。
「参照」とは、標準又はコントロール条件を意味する。
【００４７】
本明細書で用いられる用語「自己再生」とは、それにより、幹細胞が分裂して、母細胞のそれと区別ができない発生能を備えた１個（非対称分裂）又は２個（対称分裂）の姉妹細胞を産生する過程を示す。自己再生は増殖及び未分化状態の保持の両方を包含する。
【００４８】
「ｓｉＲＮＡ］とは、二本鎖ＲＮＡを意味する。最適には、ｓｉＲＮＡは長さが１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４個のヌクレオチドであり、その３’末端に２個の塩基突出を有する。これらのｄｓＲＮＡは、個々の細胞に又は動物全般に導入することができ、例えば血流を介して全身に導入することができる。このようなｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡレベル又はプロモーター活性を下方制御するために用いられる。
【００４９】
用語「幹細胞」は、自己再生する能力及び多細胞系へ分化する能力を有する多能性細胞を意味する。
「幹細胞の産生」とは、幹細胞を生じさせる生物学的過程の何れかを意味する。このような過程は、存在する細胞の増殖、又は幹細胞の自己再生を包含する。
【００５０】
「対象」とは、これに限定されないが、ヒト、又はウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、若しくはネコのような非ヒト哺乳動物を包含する、哺乳動物を意味する。
本明細書で用いられる「同系の」とは、比較した細胞と遺伝学的に同一である異なった対象の細胞を意味する。
【００５１】
本発明で用いられる用語「治療」、「治療すること」等は、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを示す。この効果は、疾患又はその症状を完全に又は部分的に阻止するという観点からは予防的であってよく、そして／又は疾患及び／又はその疾患に起因する副作用を部分的に又は完全に治すと言う観点からは治療的であってもよい。本明細書で用いられる「治療」は、哺乳類、特にヒトにおける疾患の治療の何れもを対象としていて、（ａ）その疾患に罹りやすいが、未だその疾患を有していると診断されていない対象において発病を予防すること；（ｂ）疾患を抑制すること、すなわち、進展を阻止すること；そして（ｃ）疾患を緩和すること、例えば疾患の退行をもたらすこと、例えば疾患の症状を完全に又は部分的に取り除くこと：を包含する。
【００５２】
本明細書で用いられる用語「異種の」とは、比較した細胞と異なった種の細胞を示す。
他の定義は本開示全体にわたる文中に記載される。
【００５３】
（本発明の方法）
以下に記載するように、本発明は幹細胞を保護する方法及び組成物を特徴としている。特に、本発明は幹細胞の生存、生育及び／又は増殖を増大させることができて、そして更に損傷の環境（化学療法）に置かれている内在性幹細胞を保護できる治療若しくは予防の方法を提供する。このような方法及び組成物は、それらの骨髄に存在する幹細胞数の増大を必要としている、移植者又は異常な血液細胞疾患（例えば、白血病又は骨髄異形成）に罹っている対象のような、患者を治療するために有用である。本発明は、ある部分で、Ｐ２Ｙ受容体−１４（Ｐ２Ｙ１４）が不足している幹細胞（Ｐ２Ｙ１４−／−幹細胞と称する）が、放射線照射された宿主骨髄の再増殖に対する明白な利点を示すという発見に基づいている。
【００５４】
従って、幹細胞におけるＰ２Ｙ１４受容体ポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現を減少させる組成物及び方法を提供する。このような組成物及び方法は、再増殖を必要とする患者、例えばその骨髄が化学療法によって造血幹細胞を減損している、血液及び／又は幹細胞移植患者において、骨髄を再増殖する既存の技術を改善するものである。一態様では、多種の幹細胞型を包含する幹細胞を調節する方法は、エキソビボ又はインビボにおいて幹細胞の増殖を増大させるのに有用である。本発明は、造血幹細胞の増殖を増大させる方法に限定されず、各種の幹細胞に広く適用可能である。Ｐ２Ｙ１４受容体の発現又は活性を抑制する組成物及び方法は、インビボ及びインビトロにおいて幹細胞集団の増大に有用である。
【００５５】
（Ｐ２Ｙ１４）
ヌクレオチド及びその複合体は、細胞外に位置すると高度に局在化したシグナル伝達物質としての機能を果たして、７−膜貫通性（Ｐ２Ｙ）又はＡＴＰ依存性イオンチャンネル（Ｐ２Ｘ）の何れかであるＰ２受容体を介する、ストレス又は損傷の応答に関与する。Ｐ２Ｙ１４受容体は、ＵＴＰ−グルコース、−ガラクトース及び−ガラクトサミンを結合することが示されており、そしてヒト成人骨髄においてＧ０ＣＤ３４＋ＣＤ３８−静止造血幹細胞（ＨＳＣｓ）の発現に限定されている、高度に制限された発現を有している（GENES & DEVELOPMENT 17:1592-1604, 2003）。
【００５６】
Ｐ２Ｙ１４は、ケモカイン受容体ファミリーのモチーフに類似した、及び既に同定されている遺伝子、ＫＩＡＡ０００１（GenBank accession 番号Ｄ１３６２６又は ＮＭ１３０１４８７９、U.S.S.N.10/433,146 の配列番号１０；アミノ酸配列は U.S.S.N.10/433,146 の配列番号１に示される）と同一な核酸配列を伴う、シグネチャーモチーフを有している。ＫＩＡＡ０００１は最初、ヒト未成熟骨髄細胞株ＫＧ−１（Numura,N. et al. DNA Research, 1994, 1:47-56）のｃＤＮＡライブラリーから単離されて、Ｇ−タンパク質結合受容体として特徴付けられた。最近までこの分子に機能が割り当てられていなかった（Chambers, JK et al., J. Biol. Chem.,2000, 275:1067-71）。
【００５７】
（幹細胞）
以下に記載されている特定の実施例は造血幹細胞の生育、増殖及び生存を骨髄においてＰ２Ｙ１４受容体の発現を減少させることによって増強する方法に関しているが、本発明はこれに限定されない。Ｐ２Ｙ１４受容体は、各種の幹細胞プールの規模を調節するように機能していると思われる。本発明の幹細胞（例えば、胚幹細胞、間葉幹細胞、造血幹細胞）は、哺乳動物の臓器又は組織で同定されている当該技術分野で公知の全てのものを包含する。最も特徴付けられているものは造血幹細胞である。骨髄、血液、臍帯血、胎児肝臓及び卵黄嚢から単離された、造血細胞は、血液細胞を生成するか又は移植後に多数の造血系を再開して、移植者の生命のための造血を再開することができる。米国特許第５，６３５，３８７号（Fei, R., et al.）；米国特許第５，４６０，９６４号（McGlave, et al.）；米国特許第５，６７７，１３６号（Simmons, P., et al.）；米国特許第５，７５０，３９７号（Tsukamoto, et al.）；米国特許第５，７５９，７９３号（Schwartz, et al.）；米国特許第５，６８１，５９９号（DiGuisto, et al.）；米国特許第５，７１６，８２７号（Tsukamoto, et al.）；Hill, B., et al. 1996 を参照のこと。致死的な放射線を浴びた動物又はヒトに移植されると、造血幹細胞は、赤血球、好中球マクロファージ、巨核球及びリンパ造血細胞のプールを再生息させることができる。インビトロにおいては、造血幹細胞は、少なくともある程度の自己再生する細胞の分裂を受けるように、そしてインビボで観察される同じ系に分化するように誘発することができる。
【００５８】
造血細胞が、多能性幹細胞、多能性前駆細胞（例えば、リンパ幹細胞）、及び／又は特異的な造血系に確約されている前駆細胞を包含するということは、当該技術分野において公知である。特異的な造血系に確約されている前駆細胞は、Ｔ細胞系、Ｂ細胞系、樹枝状細胞系、ランゲルハンス細胞系及び／又はリンパ組織に特異的なマクロファージ細胞系であってよい。
【００５９】
造血幹細胞は血液製剤から得ることができる。本発明で用いられる「血液製剤」は、造血系由来の細胞を含有している生体又は生体の臓器から得られる産物と定義する。そのような供給源には、未分画の骨髄、臍帯、末梢血、肝臓、胸腺、リンパ及び脾臓を包含する。上記の粗製の又は未分画の血液製剤を、多くの方法で「造血幹細胞」特性を有する細胞に富ませることができることは、当業者に明らかであろう。例えば、より分化した子孫から血液製剤を枯渇させることができる。それに対して、より成熟し、分化した細胞を、それらが発現する細胞表面分子を介して選択することができる。また、ＣＤ３４＋細胞を選択するために血液製剤を分画することができる。ＣＤ３４＋細胞が自己再生能及び多能性を有する細胞の亜集団を包含していると、当該技術分野では考えられている。このような選択は、例えば、市販の磁性抗−ＣＤ３４ビーズ（Dynal, Lake Success,NY）を用いて実施することができる。未分画の血液製剤は、提供者から直接得るか又は低温保存貯蔵から回収することができる。
【００６０】
本発明の好ましい態様では、造血幹細胞を、Ｐ２Ｙ１４受容体阻害剤で処理する前に採取することができる。造血前駆細胞を「採取する」とは、マトリックスから細胞を取り除くこと又は分離することと定義される。これは、酵素的、非酵素的、遠心分離、電気的、又はサイズを基準にした方法のような、多くの方法を用いて、又は好ましくは、培養基（例えば、細胞を培養する培地）を用いる細胞の洗浄によって、実施することができる。細胞は、更に採取、分離そして更に分化した子孫のより大きな集団を生成するために増殖することができる。
【００６１】
造血幹細胞の単離方法は当該技術分野で公知であり、一般に、細胞表面マーカー及び機能特性に基づいた引き続く精製技術を含んでいる。造血幹細胞及び前駆細胞は、骨髄、血液、臍帯血、胎児肝臓及び卵黄嚢から単離することができ、そして多数の造血系を発生させて、移植者の生命のために造血を再開することができる。米国特許第５，６３５，３８７号（Fei, R., et al.）；米国特許第５，４６０，９６４号（McGlave, et al.）；米国特許第５，６７７，１３６号（Simmons, P. et al.）；米国特許第５，７５０，３９７号（Tsukamoto, et al.）；米国特許第５，７５９，７９３号（Schwartz, et al.）；米国特許第５，６８１，５９９号（DiGuisto, et al.）；米国特許第５，７１６，８２７号（Tsukamoto, et al.）；Hill, B., et al, 1996 を参照のこと。例えば、末梢血から造血幹細胞及び前駆細胞を単離するために、ＰＢＳ中の血液を、フィコルのチューブ（Ficoll-Paque, Amersham）に入れて１５００ｒｐｍで２５〜３０分間遠心分離する。遠心分離した後、造血幹細胞を含んでいるものとして白色の中心環を採取する。
【００６２】
本発明の幹細胞は胚幹細胞も包含する。胚幹細胞（ＥＳ細胞）は、無制限の自己再生及び多能性分化能を有している（Thomson, J. et al. 1995; Thomson, J. A. et al. 1998; Shamblott, M. et al. 1998; Williams, R. L. et al. 1988; Orkin, S. 1998; Reubinoff, B. E., et al. 2000）。これらの細胞は、移植前の胚盤胞の内細胞塊（ＩＣＭ）由来である（Thomson, J. et al. 1995；Thomson, J.A. et al. 1998; Martin, G.R. 1981）か、又は移植後の胚由来の始原生殖細胞（胚性生殖細胞又はＥＧ細胞）から得ることができる。ＥＳ及び／又はＥＧ細胞は、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタを含む多くの種から、より最近にはヒト並びにヒト及び非ヒトの霊長類から得られている（米国特許第５，８４３，７８０号及び同第６，２００，８０６号）。
【００６３】
胚幹細胞は当該技術分野で公知である。例えば、米国特許第６，２００，８０６号及び同５，８４３，７８０号は、ヒトを含む霊長類の胚幹細胞を示している。米国特許出願第２００１００２４８２５号及び同第２００３０００８３９２号はヒト胚幹細胞を記載している。米国特許出願第２００３００７３２３４号はクローン化ヒト胚幹細胞株を記載している。米国特許第６，０９０，６２５号及び米国特許出願第２００２０８１７２４号は、多能性であると示される未分化の細胞を記載している。米国特許出願第２００３０１６６２７５号は、細胞培養由来の胚幹細胞であるために何を提示すべきかを記載している。
【００６４】
本発明の幹細胞は間葉幹細胞も包含する。間葉幹細胞、又は「ＭＳＣｓ」は当該技術分野で公知である。元来胎児性中胚葉に由来し、成体骨髄から単離されたＭＳＣは、分化して、筋肉、骨、軟骨、脂肪、骨髄基質、及び腱を形成することができる。胚形成期に、中胚葉は、肢芽中胚葉；骨、軟骨、脂肪、骨格筋を生成する組織；及び内皮に進化する。中胚葉は、心筋、平滑筋、又は内皮及び造血前駆細胞から成る血島を発生させることができる内臓中胚葉にも分化する。従って、未発達の中胚葉又はＭＳＣは多数の細胞及び組織タイプ用の供給源を提供できるであろう。多数のＭＳＣが単離されている（例えば、米国特許第５，４８６，３５９号（Caplan, A., et al.）；米国特許第５，８２７，７３５号（Young, H., et al.）；米国特許第５，８１１，０９４号（Caplan, A., et al.）；米国特許第５，７３６，３９６号（Bruder, S., et al.）；米国特許第５，８３７，５３９号（Caplan, A., et al.）；米国特許第５，８３７，６７０号（Masinovsky, B.）；米国特許第５，８２７，７４０号（Pittenger, M.）；Jaiswal, N., et al., (1997). J. Cell Biochem. 64(2):295-312; Cassiede P., et al., (1996). J Bone Miner Res. 9:1264-73; Johnstone, B., et al., (1998). Exp Cell Res. 1:265-72; Yoo, et al., (1998) J Bon Joint Surg Am. 12:1745-57; Gronthos, S., et al., (1994). Blood 84:4164-73; Pittenger, et al., (1999). Science 284:143-147 を参照されたい）。
【００６５】
間葉幹細胞は骨髄から移動して特異的な組織と結合し、そこで最終的に多数の系統に分化すると考えられている。インビトロ及びエキソビボで間葉幹細胞の生育及び生存を増強することは、胸部、皮膚、筋肉、内皮細胞、骨、呼吸器、尿生殖器、胃腸管結合の又は繊維芽の組織を含む新規な組織を生成するために用いることができる増大した集団を提供するだろう。
【００６６】
ある態様では、幹細胞がＰ２Ｙ１４受容体を発現する場合には、インビトロ又はエキソビボで幹細胞をＰ２Ｙ１４受容体阻害剤で処理することができる。生体試料は細胞の混合集団を含むことができ、これを望ましい効果を生み出すのに十分な程度まで精製することができる。当業者は、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）のような各種の公知方法を用いて、細胞集団中の幹細胞又はその前駆体の割合を容易に測定することができる。幹細胞の純度は、細胞集団内の遺伝子マーカーのプロファイルによって測定できる。用量は当業者によって容易に調節できる（例えば、純度が減少すると用量の増大が必要であろう）。
【００６７】
いくつかの態様では、最初に細胞を精製することが望ましい。本発明の幹細胞は、約５０〜５５％、５５〜６０％、６０〜６５％及び６５〜７０％の純度を有する細胞の集団（例えば、その集団から非幹細胞及び／又は非前駆細胞が除かれているか又は存在していない）から成っていることが好ましい。より好ましくは、この純度が約７０〜７５％、７５〜８０％、８０〜８５％であり；そして最も好ましくはこの純度が約８５〜９０％、９０〜９５％、そして９５〜１００％である。本発明の幹細胞の精製された集団を精製段階の前、後又は同時にＰ２Ｙ１４受容体阻害剤と接触させて、対象に投与することができる。
【００６８】
（幹細胞の培養）
望ましい供給源から得た時点で、幹細胞のＰ２Ｙ１４受容体抑制剤との接触は、所望により、培養物中で行ってもよい。以下により詳細に記載されている培養条件を用いると、本発明の幹細胞を保存すること及び幹細胞数及び／又はコロニー形成単位能力の増大を促進することが可能である。本発明による全てのインビトロ及びエキソビボ培養方法においては、別段の定めがない限り、使用する培地は細胞を培養する従来の培地である。適切な培養培地は、既知組成培地ＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ、イスコーブ（Iscove's）などのような既知組成の無血清培地、又はいわゆる「完全培地（complete media）」であってよい。一般的に、無血清培地にはヒト又は動物の血漿又は血清を追加する。このような血漿又は血清は少量の造血成長因子を含有していてもよい。しかしながら、本発明で用いられる培地は、従来技術で通常用いられているものから逸脱していてもよい。適切な既知組成の無血清培地は、米国特許出願第０８／４６４，５９９号及び国際公開第ＷＯ９６／３９４８７号公報に記載されており、そして「完全培地」は米国特許第５，４８６，３５９号に記載されている。
【００６９】
本発明の幹細胞のＰ２Ｙ１４受容体抑制剤による処理は、用いる抑制剤の特定な型に応じて、可変パラメーターを含むことができる。例えば、エキソビボでの幹細胞（例えば、骨髄由来細胞）のＰ２Ｙ１４受容体の発現を抑制するＲＮＡｉ構築物による処理は、化学物質による処理が長期培養時間（例えば、２４〜４８時間）を必要とするのに対して、迅速に効果（例えば、トランスフェクション後１〜５時間以内）を発揮することができる。本発明に従って処理される幹細胞を、幹細胞の保持及び増大を促進する追加薬剤と共培養することも可能である。従って、パラメーターを変えることは当業者のレベル内で十分に可能である。
【００７０】
本発明に特に関連する目的の成長物質は、造血成長因子である。造血成長因子とは、造血幹細胞の生存又は増殖に影響を及ぼす因子を意味する。生存及び増殖のみに影響を及ぼすが、分化を促進するとは考えられていない成長物質は、インターロイキン３、６及び１１、幹細胞因子及びＦＬＴ−３リガンドを包含する。前記の因子は当業者にとって公知であって、殆どのものは市販されている。これらは、精製により、組み換え技術法により得ることができるか、又は合成的に誘導若しくは合成できる。
【００７１】
従って、前記薬剤の何れをも加えずに細胞を培養する場合は、本明細書では、血清、通常の栄養培地を存在させてもよいことを除いてこのような薬剤を追加せずに、又は造血幹細胞及び前駆細胞を含有する、未分画の又は分画された、血液産物の単離物中で細胞を培養することを意味する。
【００７２】
遺伝子的に変化した幹細胞を作成する方法
幹細胞の遺伝子変化は、外来性の遺伝物質を加えることによって作成される細胞性遺伝物質の一過性の又は安定な変化の全てを包含する。一態様では、幹細胞ニッチに存在する細胞を含む細胞集団をＰ２Ｙ１４受容体の抑制性核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド）でトランスフェクトする。このような核酸分子はＰ２Ｙ１４受容体の発現を抑制する。一方法では、細胞において抑制性核酸分子がＰ２Ｙ１４受容体の発現を減少するように、抑制性核酸分子を骨髄由来細胞のような標的細胞中へ直接取り入れる。別の方法では、標的細胞は、抑制性核酸分子をコードする発現ベクターで形質導入される。標的細胞中でのＰ２Ｙ１４受容体の抑制性核酸分子の発現は、Ｐ２Ｙ１４受容体の発現を減少させる。他の典型的な遺伝子変化は、突然変異遺伝子又は非発現遺伝子に置き換える機能遺伝子の導入、ドミナントネガティブ遺伝子産物をコードするベクターの導入、リボザイムを発現するように組み換えられたベクターの導入及び治療遺伝子産物をコードする遺伝子の導入のような、何れかの遺伝子治療方法を包含する。何れの薬剤も導入しないＴ細胞受容体遺伝子の自然転位のような、自然の遺伝子変化はこの態様に包含されない。外来性の遺伝物質は、幹細胞に導入される、天然の又は合成の何れかの、核酸又はオリゴヌクレオチドを包含する。外来性の遺伝物質は、細胞中に自然に存在しているもののコピー、又は細胞中には自然に見出されないものであってよい。これは一般に、ベクター構築物中のプロモーターの操作可能な制御下に置かれている天然由来の遺伝子の少なくとも一部分である。
【００７３】
核酸を細胞に導入するために多種の技術を利用することができる。このような技術は、核酸−ＣａＰＯ４沈殿物のトランスフェクション、ＤＡＥＡに関連する核酸のトランスフェクション、目的の核酸を含むレトロウィルスによるトランスフェクション、リポソーム介在のトランスフェクションなどを包含する。ある特定の使用に対しては、特定の細胞に対して核酸を絞ることが好ましい。そのような場合には、本発明の核酸を細胞（例えば、レトロウィルス、又は他のウィルス；リポソーム）へ送達するのに用いられる担体がそれに付着する標的分子を有していてもよい。例えば、標的細胞の表面膜タンパク質に特異的な抗体又は標的細胞上の受容体に対するリガンドのような分子を、核酸の送達担体に結合若しくは組み入れることができる。例えば、本発明の核酸を送達するためにリポソームを利用する場合には、エンドサイトーシスに関連する表面膜タンパク質に結合するタンパク質を、標的及び／又は取り込みの促進のために、リポソーム製剤中に組み入れることができる。そのようなタンパク質は、特定の細胞型に指向しているタンパク質又はその断片、循環において内在化を受けるタンパク質に対する抗体、細胞内の局在性を標的として細胞内半減期を増強するタンパク質などを包含する。当業者に公知のように、ポリマーの送達システムも核酸を細胞に送達するために首尾よく用いられている。そのようなシステムは、核酸の経口による送達でさえも許容する。
【００７４】
外来性の遺伝物質を細胞へ導入する一つの方法は、複製欠損レトロウィルスを用いる、マトリクス上での細胞のin situでの 形質導入を含む。複製欠損レトロウィルスは、全てのウィルス粒子タンパク質の合成を誘導できるが、感染粒子を形成することができない。従って、これらの遺伝子的に変化したレトロウィルスベクターは、培養細胞における遺伝子の高効率的な形質導入に対する一般的な有用性、及び本発明の方法で用いるための特異的な有用性を有している。レトロウィルスは、遺伝物質を細胞へ伝達するために広く用いられている。複製欠損レトロウィルスを産生するための標準的なプロトコル（外来性の遺伝物質のプラスミドへの組み入れ、パッケージング細胞株のプラスミドによるトランスフェクション、パッケージング細胞株による組み換えレトロウィルスの産生、組織培養培地からのウィルス粒子の採取、及び標的細胞のウィルス粒子による感染を含む）は、当該技術分野に提供されている。
【００７５】
ウィルスは、治療薬をコードする遺伝子の単一コピーを宿主細胞ゲノムへ効率的に挿入するので、レトロウィルスは、外来性の遺伝物質が細胞の分裂時に細胞の子孫へ伝わることを可能にする。また、ＬＴＲ領域中の遺伝子プロモーター配列が、多種の細胞型において挿入されたコード配列の発現を増強するということが報告されている。しかしながら、レトロウィルス発現ベクターの使用は、（１）挿入突然変異、すなわち、例えば無秩序な細胞の生育をもたらすような標的細胞ゲノムの望ましくない位置への治療遺伝子の挿入、及び（２）ベクターによって運ばれた治療遺伝子が標的ゲノムに組み込まれるように標的細胞の増殖の必要性をまねき得る。これらの明確な限定にも関わらず、形質導入の効率が高くそして／又は形質導入に使用可能な標的細胞の数が多ければ、レトロウィルスを介する治療有効量の治療薬の送達は効果的になる。
【００７６】
細胞を形質転換するための発現ベクターとして有用な更に別のウィルス候補は、二本鎖ＤＮＡウィルスである、アデノウィルスである。レトロウィルスと同様に、アデノウィルスのゲノムは遺伝子形質導入のための、すなわちウィルス自体の産生を制御する遺伝子情報を除去することによって、発現ベクターとしての使用に適合性がある。アデノウィルスは一般に染色体外様式で機能するので、組み換えアデノウィルスは挿入突然変異に関する理論上の問題を有していない。一方、標的細胞のアデノウィルス形質転換は、安定な形質導入をもたらさない。しかしながら、最近になって、ある種のアデノウィルス配列が染色体内組み込み特異性を運搬配列に与えることによって、外来性遺伝物質の安定な形質導入をもたらすことが報告された。
【００７７】
従って、当業者にとって明らかなように、外来性遺伝物質を細胞へ移送するたに、多種の適切なベクターを入手できる。物質を送達する適切なベクターの選択、及び選択した発現ベクターを細胞へ挿入するための条件の最適化は、過度な実験を必要としない、当業者の技術の範囲内である。プロモーターは特徴的に、転写の開始に必要な特異的なヌクレオチド配列を有している。外来性遺伝物質は、望ましい遺伝子転写活性を得るのに必要な追加の配列（すなわち、エンハンサー）を更に含んでいてもよい。この検討のための「エンハンサー」は単に、コード配列（イン シス）と連続して働いて、プロモーターによって決まる基礎転写レベルを変える、非翻訳ＤＮＡ配列の何れかである。好ましくは、外来性遺伝物質は、プロモーターのすぐ下流の細胞ゲノムに導入され、コード配列の転写を可能とするように、プロモーターとコード配列を動作可能に結合させる。好ましいレトロウィルス発現ベクターは、挿入された外来性遺伝子の転写を制御するための外来性プロモーターエレメントを包含する。そのような外来性プロモーターは構成的プロモーター及び誘導プロモーターの両方を包含する。
【００７８】
天然由来の構成的プロモーターは必須の細胞機能の発現を制御する。その結果、構成的プロモーターの制御下にある遺伝子は、細胞生育の全ての条件下で発現する。構成的プロモーターの例は、ある特定の構成的又は「ハウスキーピング」機能をコードする以下の遺伝子のためのプロモーターを包含する：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、ジヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＦＲ）（Sharfmann et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:4626-4630）、アデノシンデアミナーゼ、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）、ピルビン酸キナーゼ、ホスホグリセロールムターゼ、アクチンプロモーター（Lai et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10006-10010）、及び当業者に公知の他の構成的プロモーター。また、多くのウィルス性プロモーターは、真核細胞中で構成的に働く。これらは、多数ある中でも、ＳＶ４０の早期及び後期プロモーター；モロニー白血病ウィルス（Moloney Leukemia Virus）及びその他のレトロウィルスの長い末端反復（ＬＴＲＳ）；及び単純ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼプロモーターを包含する。従って、上記の構成的プロモーターを、異種遺伝子挿入物の転写を制御するために用いることができる。
【００７９】
誘導プロモーターの制御下にある遺伝子は、誘発剤が存在するときだけ又はそのときにより多く発現する（例えば、メタロチオネインプロモーターの制御下にある転写はある特定の金属イオンの存在下で大きく増大する）。誘導プロモーターは、それらの誘発因子が結合したときに転写を促進する応答素子（ＲＥｓ）を包含する。例えば、血清因子、ステロイドホルモン、レチノイン酸及びサイクリックＡＭＰに対するＲＥｓがある。誘導性応答を得るために特定のＲＥを含有しているプロモーターを選択することができ、そしてある場合は、ＲＥ自体が異なったプロモーターに結合することにより、組み換え遺伝子に誘発能をもたらすことができる。従って、適切なプロモーターを選択することにより（構成的対誘導的；強力対微力）、遺伝的に改変した細胞において薬剤の発現の存在及び程度を制御することができる。物質を送達するためのこれらの因子の選択及び最適化は、上で開示した因子を考慮すると、過度の実験をせずに当業者の知識の範囲内であると思われる。
【００８０】
少なくとも１つのプロモーター及び少なくとも１つの異種核酸に加えて、発現ベクターは、発現ベクターで形質転換又は形質導入されている細胞の選択を促進するために、選択遺伝子、例えばネオマイシン耐性遺伝子を含有していることが好ましい。あるいは、少なくとも１つのベクターが治療薬（複数を含む）をコードする遺伝子（複数を含む）を含有していて、別のベクターが選択遺伝子を含有している、２つ又はそれ以上の発現ベクターで細胞を形質転換する。適切なプロモーター、エンハンサー、選択遺伝子及び／又はシグナル配列の選択は、過度の実験をせずに当業者の知識の範囲内であると思われる。
【００８１】
抑制性核酸及び抗体を使用する方法
本発明の抑制性核酸分子は、Ｐ２Ｙ１４受容体発現のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）介在ノックダウンのための二本鎖ＲＮＡｓとして用いることができる。一つの方法では、幹細胞においてＰ２Ｙ１４受容体の発現が減少する。一つの典型的な方法では、造血幹細胞においてＰ２Ｙ１４受容体の発現が減少する。ＲＮＡｉは、目的の特異的なタンパク質の細胞発現を減少させる方法である（Tuschl,Chembiochem 2:239-245, 2001; Sharp, Genes & Devel. 15:485-490, 2000; Hutvagner and Zamore, Curr. Opin. Genet. Devel. 12:225-232, 2000; 及び Hannon, Nature 418:244-251, 2002 に概説されている）。ｄｓＲＮＡの形質転換によるか、又はプラスミドベースの発現システムを用いるｓｉＲＮＡの発現を介して行うかの何れかによる、ｓｉＲＮＡの細胞内への導入は、哺乳動物細胞において機能損失の表現型を作製するためにますます用いられるようになっている。
【００８２】
本発明の一態様では、本発明の核酸塩基オリゴマーの８個〜２５個の連続的な核酸塩基を含有している二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を作成する。ｄｓＲＮＡは、二重になっているＲＮＡの２つの異なった鎖であるか、又は自体が二重になっている一本のＲＮＡ鎖（低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））であってよい。一般に、ｄｓＲＮＡは約２１個又は２２個の塩基対であるが、所望によりより短くてもより長くてもよい（最大約２９の核酸塩基まで）。ｄｓＲＮＡは標準的な技術（例えば、化学合成又はインビトロ転写）を用いて作成できる。キットが、例えば Ambion (Austin,Tex.) 及び Epicentre (Madison, Wis.) から入手できる。哺乳動物細胞においてｄｓＲＮＡを発現する方法は、Brummelkamp et al. Science 296:550-553, 2002; Paddison et al. Genes & Devel. 16:948-958, 2002; Paul et al. Nature Biotechnol. 20:505-508, 2002; Sui et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5515-5520, 2002; Yu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6047-6052, 2002; Miyagishi et al. Nature Bitechnol. 20:497-500, 2002; 及び Lee et al. Nature Bitechnol. 20:500-505, 2002 に記載されており、これらのそれぞれは参照として本明細書に組み込まれる。
【００８３】
低分子ヘアピン型ＲＮＡｓは、随意に３’ＵＵ−突出部を有するステムループ構造からなっている。変形があるが、ステムは２１〜３１ｂｐ（望ましくは２５〜２９ｂｐ）の範囲であって、ループは４〜３０ｂｐ（望ましくは４〜２３ｂｐ）の範囲でよい。細胞中でのｓｈＲＮＡの発現のために、ポリメラーゼＩＩＩ Ｈ１−ＲＮＡ又はＵ６プロモーターの何れか、ステムループ型ＲＮＡ挿入物のためのクローニング部位、及び４．５−チミジン転写終止コドンを含有しているプラスミドベクターを用いることができる。ポリメラーゼＩＩＩプロモーターは通常、明確な開始及び停止部位及びそれらの転写産物欠失のポリ（Ａ）尾部を有している。これらプロモーターへの終止シグナルは、ポリチミジン区域によって規定され、そして転写は通常第二ウリジンの後に開裂する。この位置での開裂は、発現されたｓｈＲＮＡ中に３’ＵＵ突出部を形成し、これは合成ｓｉＲＮＡの３’突出部と類似している。哺乳動物細胞においてｓｈＲＮＡを発現させる更なる方法は上で引用した引例に記載されている。
【００８４】
本発明方法の実施で使用するための、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡのような、Ｐ２Ｙ１４受容体を標的とする抑制性核酸分子は、例えば Santa Cruz Biotechnology Inc、OriGene Technlogies 及び Sigma Aldrich から市販されている。抑制性オリゴヌクレオチドは、例えば米国特許出願公開第ＵＳ２００７／００９２９１３号に記載されており、この内容は参照として本明細書に組み込まれる。
【００８５】
Ｐ２Ｙ１４受容体の結合を遮断する抗体も、例えば Lee BC et al. (2003) Genes Dev; 17:1592-604 に記載されていて、この内容は参照として本明細書に組み込まれる。Ｐ２Ｙ１４受容体のような、標的受容体に対する抗体を作成する方法は、当該技術分野において公知であって、本発明の方法に従って使用するために抗体の作成が必要なときに実施することができる。
【００８６】
核酸塩基オリゴマーの送達
裸の抑制性核酸分子又はその類似物は、哺乳動物細胞に入って目的遺伝子の発現を抑制することができる。それにも関わらず、オリゴヌクレオチド又は他の核酸塩基オリゴマーを細胞へ送達するのに役立つ製剤の使用が望ましいだろう（例えば、米国特許第５，６５６，６１１号、同第５，７５３，６１３号、同第５，７８５，９９２号、同第６，１２０，７９８号、同第６，２２１，９５９号、同第６，３４６，６１３号、及び同第６，３５３，０５５号を参照されたい（これらはそれぞれ参照として本明細書に組み込まれている）。
【００８７】
幹細胞の増殖に関連する治療方法
一態様では、本発明の方法は、幹細胞の量を増大させて幹細胞の保持又は生存を支援することが望ましい何れかの病気又は疾患を治療するために用いることができる。好ましくは、幹細胞が造血幹細胞である。
【００８８】
しばしば、本発明の治療方法が必要な対象は、化学療法のような免疫細胞が破壊される治療を受けているか又は受けることを待ってる対象である。用いられる殆どの化学療法剤は細胞分裂している細胞を殺生することによって作用する。骨髄は体内で最も多産系の組織であるので、最初に化学療法剤によって損傷を受ける臓器であることが多い。その結果、化学療法で治療中に血液細胞の生産が急速に破壊されて、対象が化学療法で再治療される前に造血系が血液細胞を再供給できるように、化学療法を中止しなければならない。
【００８９】
従って、本発明の方法は、例えば、化学及び／又は放射線療法を受けている癌患者のような、骨髄移植又は造血幹細胞移植を必要としている患者を治療するために用いることができる。本発明の方法は、骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、又は白血病に罹っている患者を含む、癌のための化学療法又は放射線療法を受けている患者の治療に特に有用である。
【００９０】
本発明の方法で治療される疾患は、望ましくない副作用又は、放射線療法、化学療法又は、例えばジドバジン（zidovadine）、クロラムフェニカル（chloramphenical）又はガングシクロビル（gangcicrovir）といった骨髄抑制剤による治療のような、別の一次治療の合併症の結果であってもよい。このような疾患は、好中球減少症、貧血症、血小板減少症、及び免疫機能障害を包含する。また、本発明の方法は、毒物又は放射線への意図しない暴露によって生じた骨髄への損傷を治療するために用いることができる。
【００９１】
本発明の方法は更に、造血幹細胞由来の成熟細胞（例えば、赤血球）の量を増大させる手段として用いることができる。例えば、血液細胞の欠乏、又は血液細胞中の欠陥によって特徴付けられる疾患又は病気は、造血幹細胞のプールを増大させることによって治療することができる。このような疾患は、血小板減少症（血小板欠乏症）、及び再生不良性貧血、鎌状赤血球貧血、ファンコニー貧血、急性リンパ性貧血のような貧血を包含する。上記のものに加えて、本発明の方法を用いる治療によって恩恵をもたらされる更なる疾患は、これに限定されないが、リンパ球減少症、リンパ漏、リンパうっ滞、赤血球減少症、赤血球変性疾患、赤芽球減少症、白赤芽球症；赤血球崩壊、サラセミア、骨髄線維症、血小板減少症、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、免疫性（自己免疫性）血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＨＩＶ誘導ＩＴＰ、骨髄異形成；血小板増多疾患（thrombocytotic disease）、血小板増加症、先天性好中球減少症（コストマン症候群及びシュバックマン−ダイアモンド症候群のような）、腫瘍関連好中球減少症、小児性及び成人性周期性好中球減少症；感染後好中球減少症；骨髄異形成症候群、及び化学療法及び放射線療法に関連する好中球減少症を包含する。
【００９２】
治療される疾患は、幹細胞の傷害をもたらす感染（例えば、ウィルス感染、細菌感染又は真菌感染）の結果であってもよい。
【００９３】
Ｔ及び／又はＢリンパ球欠損症のような免疫不全、又は関節リューマチ及び狼瘡のような他の免疫疾患も本発明の方法に従って治療することができる。そのような免疫不全は、感染（例えば、ＡＩＤＳを誘引するＨＩＶによる感染）、又は放射線、化学療法剤又は毒物への暴露の結果であるかもしれない。
【００９４】
健康であるが、本明細書に記載されている病気又は疾患の何れかに罹る危険性のある個人（「危険な状態」にある個人）も、本発明による治療から利益をもたらされる。危険性のある個人には、これに限定されないが、血球減少症又は免疫不全になる母集団よりも大きい可能性を有している個人が包含される。免疫不全になる危険性がある個人には、これに限定されないが、ＨＩＶ感染者との性的行為によるＨＩＶ感染の危険性がある個人；静注薬物使用者；ＨＩＶに感染した血液、血液製剤、又は他のＨＩＶに汚染された体液に暴露されたかもしれない個人；ＨＩＶに感染した母親から授乳された乳幼児；例えば化学療法又は放射線療法で以前に癌を治療された個人、及び以前治療された癌の再発について観察されている個人；及び骨髄移植又は他の何れかの臓器移植を受けた個人、及び化学療法又は放射線療法を受けるか若しくは移植のための幹細胞提供者になることになっている患者が包含される。
【００９５】
正常な対象と比較した免疫機能レベルの減少は、白血病、腎不全による免疫抑制疾患；これに限定されないが、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、自己免疫性甲状腺炎、強皮症、炎症性大腸炎を含む、自己免疫疾患；多種の癌及び腫瘍；これに限定されないが、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）を含む、ウィルス感染；細菌感染；及び寄生虫感染；を含む多種の疾患、病気、感染又は状態に起因している。
【００９６】
正常な対象と比較した免疫機能レベルの減少は、遺伝的要因の又は加齢による免疫不全疾患又は病気にも起因している。加齢に関連するもの及び遺伝的要因によるものであるこれらの免疫不全疾患の例は、これに限定されないが、高免疫グロブリンＭ症候群、ＣＤ４０リガンド不全症、ＩＬ−２受容体不全症、γ鎖不全症、分類不能免疫不全症、チェディアック・東症候群（Chediac-Higashi syndrome）、及びウィスコット・アルドリッチ症候群（Wiscott-Aldririch syndrome）を含む。
【００９７】
正常な対象と比較した免疫機能レベルの減少は、これに限定されないが、癌を治療するための化学療法剤；ある種の免疫療法薬；放射線療法；骨髄移植と併用した免疫抑制剤；及び臓器移植と併用した免疫抑制剤；を包含する特異的な薬剤による治療にも起因している。
【００９８】
このような治療が必要な対象に提供する幹細胞が造血幹細胞である場合、それらは最も一般的にその対象又は適合するドナーの骨髄から得られる。骨髄細胞は当該技術分野で公知の方法を用いて容易に単離することができる。例えば、骨髄幹細胞は骨髄吸引によって単離することができる。参照として本明細書に明確に取り込まれている、米国特許第４，４８１，９４６号は、骨髄の吸引方法及び装置を記載しており、それによると意図する除去部位に一対の吸引針を挿入してドナーからの骨髄の効率的な回収を実施できる。一対の注射器を連結して、一方の吸引針を介して骨髄及び類洞血を選択的に除去するために圧力を調節でき、一方の吸引針を介して陽圧をかけ骨髄を除去した部位へ静脈溶液を確実に送り込むことができる。骨髄及び類洞血を他の静脈溶液と混合するためにチャンバー中へ引き込みその後回収バッグへ送り込むことができる。異種細胞集団を、細胞表面マーカーの同定によって更に精製して、目的の再生臓器に投与するための骨髄由来生殖系幹細胞組成物を得ることができる。
【００９９】
米国特許第４，４８６，１８８号は骨髄吸引の方法及び装置を記載していて、それはチャンバー部分から静脈溶液の供給源、吸引針、静脈溶液の第２供給源、及び適切な分離もしくは回収部へ繋がっている一連のラインが記載されている。チャンバー部分はラインを準備してそこから空気を除くために静脈溶液源に通じている溶液ラインへ陰圧を連続的に供給することができる。次いで溶液ラインを閉じて、静脈溶液をドナーの方へ向きを変えるために陽圧が適用され、他方で静脈溶液と混合するために骨髄物質をチャンバーへ引き込む陰圧が適用される。これに続いて、静脈溶液と骨髄物質の混合物を分離又は回収部へ移送するために陽圧が適用される。
【０１００】
粗製又は未分画の骨髄を、望ましい「幹細胞」特性を有する細胞に濃縮できるということは当業者に明らかであろう。濃縮方法のあるものは、例えばより分化した子孫から骨髄を枯渇させることを含む。より成熟し、分化した細胞を、それらが発現する表面分子によって選択することができる。濃縮骨髄免疫表現型亜集団は、これに限定されないが、それららのＬｉｎ、ｃＫｉｔ及びＳｃａｌ−１（例えば、ＬＫ＋Ｓ＋（Ｌｉｎ−ｃＫｉｔ＋Ｓｃａｌ＋）、ＬＫ−Ｓ＋（Ｌｉｎ−ｃＫｉｔ＋Ｓｃａｌ＋）、及びＬＫ＋Ｓ−（Ｌｉｎ−ｃＫｉｔ＋Ｓｃａｌ＋））の表面発現によって分類された集団を含む。
【０１０１】
骨髄は対象の生涯の間に採取できる。しかしながら、病気（例えば、癌）前の採取が好ましく、そして細胞傷害性の方法（例えば、放射線照射又は化学療法）による治療前の採取は収率を高めるのでこれも望ましい。
【０１０２】
従って、本発明は、本明細書に記載のように処理した幹細胞を含有する医薬組成物の治療有効量を対象（例えば、ヒトのような哺乳動物）に投与することを含有してなる、病気及び／又は疾患又はそれらの症状を治療する方法を提供する。よって、一つの態様は、血液細胞の欠如を特徴とする疾患を有する対象を治療する方法である。この方法は、病気又は疾患を治療する条件下で、幹細胞（例えば造血幹細胞）、又は本明細書に記載されているようなＰ２Ｙ１４受容体抑制剤で処理したそのような細胞型を含有する混合物の、病気又は疾患又はそれらの症状を治療するのに十分な治療有効量を哺乳動物に投与する段階を含んでいる。
【０１０３】
本発明の方法は、対象（このような治療が必要であると同定された対象を含む）に、本明細書に記載されているようなＰ２Ｙ１４受容体抑制剤で処理された幹細胞、又はそのような効果を生じさせるための本明細書に記載の組成物の有効量を投与することを包含する。このような治療が必要な対象の同定は、対象又は医療専門家の判断においてなされ、そして主観的（例えば、見解）又は客観的（例えば、試験又は診断方法で測定可能な）なものであってよい。
【０１０４】
本明細書で用いられる用語「治療する」、「治療」、「治療法」等は、疾患又はそれに関連する症状を緩和又は改善することを示す。これに妨げられないが、病気又は疾患を治療することは、病気、疾患又はそれらに関連する症状を完全に除去することを必要としていないことを理解されたい。
【０１０５】
本明細書で用いられる用語「予防する」、「予防」、「予防法」、「予防的治療法」等は、病気又は疾患を有していないが、病気又は疾患を発症する危険性があるか又は罹病性がある対象において、病気又は疾患を発症する可能性を低減することを示す。
【０１０６】
本発明の治療方法（予防的治療を含む）は一般に、本明細書に記載の化合物のような、本明細書のＰ２Ｙ１４受容体抑制剤で処理した幹細胞を含有している医薬組成物の治療有効量を、哺乳動物、特にヒトを包含する、治療を必要としている対象へ投与することを含んでいる。このような治療薬は、病気、疾患又はそれらの症状を患っているか、有しているか、罹病性があるか、又はその危険性がある対象、特にヒトへ適切に投与できる。「危険性がある」対象の判定は、診断試験又は対象若しくは医療供給者の見解（例えば、遺伝子検査、酵素又はタンパク質マーカー、マーカー（本明細書で特定されるような）、家族歴等）による客観的又は主観的な判定によって行うことができる。本明細書の化合物は、血液細胞の欠如が関わっていると見なされる他の疾患の何れかの治療においても使用できる。
【０１０７】
一態様では、本発明は治療経過を監視する方法を提供する。この方法は、対象が疾患又はその症状を治療するのに十分な本明細書の化合物の治療有効量を投与されていて、減少した幹細胞数を有することに関連する疾患又はその症状に罹っているか又は罹りやすい対象における、診断マーカー（Marker）（例えば、本明細書の化合物によって調節される本明細書に示される何れかの標的、タンパク質又はその指標など）又は診断的測定(例えば、スクリーン、アッセイ)のレベルを測定する段階を包含している。この方法で測定されたマーカーのレベルを、健康で正常なコントロール又は他の患者におけるマーカーの公知レベルと比較して対象の病状を明らかにすることができる。好ましい態様では、最初のレベルの測定時よりも遅い時点で対象のマーカーの２回目のレベルを測定して、２つのレベルを比較して疾患の経過又は治療の効果を監視する。ある好ましい態様では、本発明による治療を開始する前に、対象におけるマーカーの治療前レベルを測定して；このマーカーの治療前レベルを、治療開始後の対象におけるマーカーのレベルと比較して治療の効果を判定することができる。
【０１０８】
幹細胞の投与
適切なＰ２Ｙ１４受容体抑制剤で処理した後、当該技術分野で公知の方法に従って幹細胞を投与する。このような組成物は、注射又は長時間漸進的輸液を含む、何れかの通常の経路で投与することができる。投与は、投与する組成物に依存して、例えば、肺内、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、皮下、又は経皮であってよい。幹細胞は、「治療有効量」で、又は単独若しくは更なる投与との併用のどちらかで望ましい治療応答を生ずる量で投与される。
【０１０９】
投与された本発明の細胞は、自家移植（「自己移植」）又は非自家移植（「非自己移植」、例えば同種、同系又は異種）されてもよい。一般に、細胞の投与は、Ｐ２Ｙ１４受容体で処理後の短期間内（例えば、処理の１、２、５、１０、２４，又は４８時間後）に行うことができ、各々の望ましい治療計画の必要に応じて決まる。例えば、投与前に放射線療法または化学療法を実施する場合は、本発明の幹細胞の処理及び移植を、治療の休止の約１ヶ月以内に実施することが最適である。しかしながら、治療が休止された後のより遅い時点で、誘導可能な臨床転帰と同時に移植を行うことができる。
【０１１０】
幹細胞関連医薬組成物
採取及び適切なＰ２Ｙ１４受容体抑制剤での処理に続いて、幹細胞を、投与前の細胞の保存及び保持を増強するために、当該技術分野で公知の医薬賦形剤と混合することができる。ある態様では、本発明の細胞組成物は、選択したｐＨに緩衝できる、滅菌液体製剤、例えば等張水性溶液、懸濁液、乳剤、分散剤又は粘性組成物として便利に提供することができる。液体製剤は通常、ゲル、他の粘性組成物、及び固体組成物よりも容易に製剤化される。また、液体組成物は、特に注射によって、いくらかより容易に投与される。一方、粘性組成物は、特定組織へのより長期の接触時間をもたらす適切な粘度範囲内で製剤化することができる。液体又は粘性組成物は、例えば水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、流動ポリエチレングリコール、等）及びそれらの適切な混合物を含有する、溶媒又は分散性媒体であってよい、担体を含有することができる。
【０１１１】
滅菌注射剤は、本発明を実施するために用いられる細胞を、必要量の適当な溶媒中に、所望により、各種の量のその他の成分と共に組み込むことによって調製することができる。このような組成物は、滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロース、等のような適切な担体、希釈剤又は賦形剤との混合物であってよい。組成物を凍結乾燥してもよい。組成物は、投与経路及び望まれる製剤に応じて、湿潤、分散、又は乳化剤（例えば、メチルセルロース）、ｐＨ緩衝剤、ゲル化又は粘度増強添加剤、保存剤、着香剤、色素等のような補助物質を含有していてよい。参照として本明細書に組み込まれている、"REMINGTON'S PHRMACEUTICAL SCIENCE", 17th edition, 1985, のような標準的なテキストを、過度な実験を行わずに、適切な製剤を調製するために参考とすることができる。
【０１１２】
抗微生物性保存剤、抗酸化剤、キレート化剤、及び緩衝剤を包含する、組成物の安定性及び滅菌性を増強する各種添加物を加えることができる。微生物の作用の阻害を各種の抗微生物及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等で確保することができる。
組成物を等張にできる、すなわちこれらが血液及び涙液と同じ浸透圧を有するようにすることができる。本発明の組成物の望ましい等張性は、塩化ナトリウム、又はデキストロース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコール、又は他の無機又は有機溶質のような薬学的に許容される薬剤を用いて得ることができる。塩化ナトリウムは特にナトリウムイオンを含有している緩衝液に対して好ましい。
【０１１３】
細胞を必要とする対象に細胞を導入した時に細胞の生存を潜在的に増大させる方法は、目的の幹細胞をバイオポリマー又は合成ポリマーに組み入れることである。対象の症状に依存するが、注射部位は、瘢痕化又は他の傷害を理由として、細胞の蒔種及び生育に不適切であるかもしれない。バイオポリマーの例は、これに限定されないが、フィブロネクチン、フィブリン、フィブリノーゲン、トロンビン、コラーゲン、及びプロテオグリカンと混合した細胞を包含する。これは増殖又は分化因子を含めて又は含めないで構築できる。また、これらは懸濁液中にあってもよいが、流される部位における滞留時間は僅かであろう。別の代替え手段は、細胞とバイオポリマーの混合物のすき間に細胞を封入した三次元のゲルである。ここでも増殖又は分化因子を細胞とともに包含していてよい。これらは、本明細書に記載されている各種の経路を介する注射によって、送達することができる。
【０１１４】
組成物の成分は、化学的に不活性であるものを選択すべきであり、本発明で述べられている幹細胞又はその前駆細胞の生存能力又は有効性に影響を及ぼさないであろうことを当業者は認識するだろう。化学及び薬学原理における当業者には問題が存在しないか、又問題を、本願の開示及び本明細書で引用している文献から、標準的なテキストを参照して、又は単純な実験（過度な実験を含まない）によって容易に回避することができるであろう。
【０１１５】
幹細胞の治療的使用に関する１つの検討材料は、適切な効果を達成するのに必要な細胞の量である。目的となる組織へ注射する細胞の量を最適化するために異なったシナリオが必要であろう。従って、投与する細胞の量は治療される対象によって変化する。有効用量と考えられるものの正確な判定は、彼らの体格、年齢、性、体重、及び特定患者の症状を含む、各患者で異なる因子に基づくだろう。わずか１００〜１０００個の細胞を選択された患者におけるある望ましい適用のために投与することができる。従って、用量は、この開示及び当該技術分野の知見から、当業者によって容易に確定することができる。
【０１１６】
当業者は、組成物に存在させて本発明方法で投与される細胞及び最適な添加剤、賦形剤、及び／又は担体の量を容易に決定することができる。勿論、動物又はヒトに投与される何れかの組成物、及び投与するための何れかの特定な方法のために、適切な動物モデル、例えばマウスのような齧歯動物において致死用量（ＬＤ）及びＬＤ５０を測定することによるような、毒性；並びに組成物の用量、そこに含有されている成分の濃度及び適切な応答を引き出す、組成物を投与するタイミングを決定することが好ましい。このような決定は、当業者の知識、本開示、及び本明細書に引用されている文献からなされ、過度な実験を必要としていない。そして、連続投与の時間を過度な実験なしで確定できる。
【０１１７】
医薬組成物
本発明は、細胞死する危険性がある幹細胞集団を保護するための、例えば化学療法を受けている患者の幹細胞を保護するための治療薬又は予防薬として作用可能な組成物（核酸、ペプチド、小分子阻害剤、及び模倣薬を含有する）を同定する単純な方法を提供する。特に、本発明は化学療法を受けている患者の造血幹細胞を保護するのに、又は幹細胞移植後の細胞生育増殖又は生存を増強するのに有用である、Ｐ２Ｙ１４受容体の抑制剤を提供する。
【０１１８】
Ｐ２Ｙファミリーの拮抗薬は、これに限定されないが、スラミン（Suramin: Yitzhaki et al., Biochem Pharmacol. 69(8):1215-23; 2005; Lambrecht et al., Curr Pharm Des. 8(26):2371-99, 2002; 及び von Kugelgen, Pharmacol Ther. 110(3):415-32, 2006）、ピリドキサール−５’−ホスフェート−６−アゾフェニル−２，４−ジスルホネート（ＰＰＡＤＳ）（Yitzhaki et al., Biochem Pharmacol. 69(8):1215-23; 2005; Lambrecht et al., Curr Pharm Des. 8(26):2371-99, 2002）、リアクティブ ブルー（Reactive blue (RB-2): Yitzhaki et al., Biochem Pharmacol. 69(8):1215-23; 2005; von Kugelgen, Pharmacol Ther. 110(3):415-32, 2006）、モンテルカスト（Montelukast： Mamedova Biochem Pharmacol. 71(1-2):115-25, 2005）、及びプランルカスト（Pranlukast: Mamedova Biochem Pharmacol. 71(1-2):115-25, 2005）を包含する。
【０１１９】
従って、本明細書に記載の方法を用いて医療価値があることが見出された化学物質は、医薬として又は既存化合物の構造修飾（例えば、合理的薬物設計による）の情報として有用である。治療に用いるために、本明細書に開示されている方法を用いて同定された組成物又は薬剤は、例えば、生理食塩水のような薬学的に許容される緩衝液中で製剤化して、全身投与することができる。好ましい投与経路は、例えば、連続、持続した薬物レベルを患者にもたらす皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、又は皮内注射を包含する。ヒト患者又は他の動物の治療は、生理学的に許容される担体中の治療有効量の治療薬を用いて実施できるであろう。適切な担体及びそれらの製剤は、例えば、Remington's Pharmacerutical Sciences by E. W. Martin に記載されている。投与される治療薬の量は、投与方法、患者の年齢及び体重によって、そして腫瘍性疾患の臨床症状によって変わる。
【０１２０】
スクリーニングアッセイ
本発明のスクリーニング方法は、幹細胞集団の生存若しくは増大を促進するＰ２Ｙ１４受容体抑制剤の同定を含むことができる。このような方法は一般に、幹細胞及びＰ２Ｙ１４受容体を発現する細胞を含む細胞集団を被検抑制剤と培養物中で接触させること、及びその結果とした産生された長期再増殖細胞の数を測定することを含んでいる。限界希釈分析と組み合わせた競合再増殖に基づく定量的インビボアッセイ（長期再増殖幹細胞の相対頻度を確認するための）は、Schneider, T.E., et al. (2003) PNAS 100(20):11412-11417 に既に記載されている。同様に、Zhang J., et al. (2005 Gene Therapy 12:1444-1452）は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへｓｉＲＮＡで処理したレンチウィルス形質導入ヒトＣＤ３４＋細胞を注入した後、マウスを屠殺して骨髄単核細胞を採取することを記載している。その後細胞を、抗−ヒト白血球マーカー抗体で染色してＦＡＣＳ分析を行い、マーカーを検出した（それによって、目的の細胞を定量）。未処理のコントロールとの比較を同時に判定できる。コントロールと比較して長期再増殖細胞数の増大が検出されれば、被検抑制剤は所望の活性を有していると確定される。
【０１２１】
ＰＣＴ出願第ＷＯ９９／５７２４５号公開公報（SmithKline Beecham Corporation）は、ヒトＫＩＡＡ０００１受容体とそのリガンド間の相互作用のアゴニスト及びアンタゴニストをスクリーニングする方法を開示している。上で述べたように、ＫＩＡＡ０００１受容体はヒトＰ２Ｙ１４受容体と同じ配列を有している。当業者は、ＰＣＴ出願第ＷＯ９９／５７２４５公開公報に記載されている方法を用いて、ヒトＰ２Ｙ１４受容体アンタゴニストを使用することができる。
【０１２２】
Ｐ２Ｙ１４受容体活性を阻止する遮断剤又は他の結合剤である、ヒトＰ２Ｙ１４受容体アンタゴニストは、既に記載しているようにして同定でき、そしてその後本明細書に記載しているか又は当該技術分野で公知の何れかのアッセイ方法を用いて、造血幹細胞機能に対するそれらの効果を試験することができる。例えば、造血幹細胞動員の増大に関するインビトロ及びインビボアッセイ、ＵＤＰグルコース処理に対する応答におけるカルシウム流入についてのアッセイ、又は細胞生存、生育又は増殖アッセイ。このような試験は当業者に公知である。
【０１２３】
本発明のスクリーニング方法の実施においては、幹細胞を含んでいる細胞集団を用いることが望ましい。一態様では、幹細胞の精製した集団が用いられる。他の方法では、精製した幹細胞集団よりむしろ生体試料を用いて試験薬剤をアッセイする。用語「生体試料」は、対象から単離した組織、細胞及び生体液を、更に対象体内に存在している組織、細胞及び体液も包含する。好ましい生体試料は骨髄及び末梢血を包含する。
【０１２４】
長期再増殖細胞の増大した量は、これに限定されないが、Ｈｅｓ−１、Ｂｍｉ−１、Ｇｆｉ−１、ＳＬＡＭ遺伝子、ＣＤ５１、ＧＡＴＡ−２、Ｓｃｌ、Ｐ２ｙ１４及びＣＤ３４を包含するある特定マーカーの遺伝子発現の増大によって検出することができる。これらの細胞は、分化に関連する遺伝子の減少した又は低下した発現によっても特徴付けられる。目的遺伝子の発現レベルは、これに限定されないが、遺伝子によってコードされるｍＲＮＡを測定すること；遺伝子によってコードされるタンパク質の量を測定すること；または遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を測定することを包含する、多くの方法で測定することができる。
【０１２５】
目的遺伝子に対応するｍＲＮＡのレベルは、ｉｎ ｓｉｔｕによって及びインビトロ形式によっての何れでも測定することができる。単離されたｍＲＮＡは、これに限定されないが、サウザン又はノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応分析及びプローブアレイを包含するハイブリダイゼーション又は増幅アッセイにおいて使用することができる。ｍＲＮＡレベルを検出する一つの診断方法は、単離したｍＲＮＡを、検出されている遺伝子によってコードされるｍＲＮＡとハイブリダイズできる核酸分子（プローブ）と接触させることを含んでいる。核酸プローブは、ストリンジェントな条件下でｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡと特異的にハイブリダイズするのに十分である。このプローブは、アレイ、例えば以下に記載のアレイのアドレス上に配置させることができる。診断アッセイで使用するための他の適切なプローブは本明細書に記載されている。
【０１２６】
一つの方式では、ｍＲＮＡ（又はｃＤＮＡ）を、例えば単離したｍＲＮＡを寒天ゲル上に流して、ｍＲＮＡをゲルから、ニトロセルロースのような膜へ転移させることによって、表面に固定してプローブと接触させる。それに代わる方式では、例えば、以下に記載の二次元遺伝子チップアレイにおいて、プローブを表面に固定して、ｍＲＮＡ（又はｃＤＮＡ）をプローブと接触させる。当業者は、公知のｍＲＮＡ検出方法を、本明細書に記載の目的遺伝子によってコードされるｍＲＮＡのレベルを検出するための使用に適合させることができる。
【０１２７】
試料中のｍＲＮＡのレベルは、核酸増幅、例えば逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ｒｔＰＣＲ）（Mullis (1987）米国特許第４，６８３，２０２号）、リガーゼ連鎖反応（Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193）、自己持続性配列複製（self sustained sequence replication; Guatelli et al. (1990)  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878）、転写増幅システム（Kwoh et al. (1989)  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177）、Ｑ−ベータ レプリカーゼ（Q-Beta Replicase; Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6:1197）、ローリング・サイクル複製（Lizardi et al. 米国特許第５，８５４，０３３号）又は他の核酸増幅方法の何れか、それに続く当該技術分野で公知の方法を用いる増幅された分子の検出によって評価することができる。本明細書で用いられる増幅プライマーは、遺伝子の５’又は３’領域（それぞれがプラス鎖及びマイナス鎖、又はその逆）にアニールできて、その間に短い領域を含有している、核酸分子の対であると定義される。一般に、増幅プライマーは、長さが約１０〜３０ヌクレオチドで、長さが約５０〜２００ヌクレオチドの領域に隣接している。適切な条件下で適切な試薬を用いると、このようなプライマーはプライマーに隣接しているヌクレオチド配列を含んでいる核酸分子の増幅を可能にする。
【０１２８】
ｉｎ ｓｉｔｕ方法のために、細胞又は組織試料を調製／処理して支持体、一般にはスライドガラスに固定し、次いで分析する目的の遺伝子をコードするｍＲＮＡ分子とハイブリダイズできるプローブと接触させることができる。
【０１２９】
試験化合物及び抽出物
一般に、Ｐ２Ｙ１４受容体ポリペプチドの発現又は活性を減少できる化合物は、当該技術分野で公知の方法に従って、天然産物又は合成（又は半合成）抽出物の両方の大きなライブラリー若しくは化学ライブラリーから、又はポリペプチド若しくは核酸ライブラリーから同定される。薬剤の発見及び開発分野における当業者は、試験抽出物又は化合物の正確な供給源が、本発明のスクリーニング方法では重大ではないことを理解されるだろう。スクリーニングで用いられる化合物は公知化合物（例えば、他の病気又は疾患で用いられている公知の治療薬）を含んでいてもよい。また、事実上あらゆる未知の化学抽出物又は化合物を本明細書に記載の方法を用いてスクリーニングすることができる。このような抽出物又は化合物の例は、これに限定されないが、植物−、真菌−、原核生物−又は動物を原料とする抽出物、発酵液及び合成化合物を、更に既存化合物の修飾体も包含する。
【０１３０】
これに限定されないが、サッカリド、脂質−、ペプチド−及び核酸−系の化合物を包含する、あらゆる化合物のランダム又は有方向性合成（例えば、半合成又は全合成）をもたらすために多数の方法も使用可能である。合成化合物のライブラリーは Brandon Associates (Merrimack, N.H.）及び Aldrich Chemical (Milwaukee, Wis.) から市販されている。また、候補化合物として用いられる化学化合物を、標準的な合成技術及び当業者に公知の方法を用いて、容易に入手できる出発物質から合成することができる。本明細書に記載の方法で同定される化合物を合成するのに有用な、合成化学変換及び保護基方法（保護及び脱保護）は、当該技術分野で公知であって、例えば、R. Larock, Comprehensive Organic Transformation, VCH Publishers (1989); T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Syntehsis, 2nd ed., John Wiley and Sons (1991); L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); 及び L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Syntesis, John Wiley and Sons (1995)、及びこれらの続刊に記載されているものを包含する。
【０１３１】
また、細菌、真菌、植物、及び動物の抽出物の形態である天然化合物のライブラリーは、Biotics (Sussex, UK)、Xenova (Slough, UK)、Harbor Branch Oceangraphics Institute (Ft. Pierce, Fla.)、及び PharmaMar, U.S.A. (Cambridge, Mass.) を含む、多数の供給元から市販されている。更に、天然に又は合成的に産生されたライブラリーが、所望により、当該技術分野で公知の方法に従って、例えば、標準的な抽出及び分画方法によって作られる。分子ライブラリーを合成する方法の例は、当該技術分野で、例えば：DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909, 1993; Erb et al.,  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37:2678, 1994; Cho et al., Science 261:1303, 1993; Carrell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059, 1994;   Carrell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061, 1994; 及びGallop et al., J. Med. Chem. 37:1233, 1994 に見出すことができる。更に、所望により、何れのライブラリー又は化合物も標準的な化学、物理、又は生化学方法を用いて容易に修飾される。
【０１３２】
化合物のライブラリーは、溶液中（例えば、Houghten, Biotechniques 13:412-421, 1992）又はビーズ上（Lam, Nature 354:82-84, 1991）、チップ（Fodor, Nature 364:555-556, 1993）、細菌（Ladner, 米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（Ladner, 米国特許第５，２２３，４０９号）、プラスミド（Cull et al., Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869, 1992）又はファージ上（Scott and Smith, Science 249:386-390, 1990; Devlin, Science 249:404-406, 1990; Cwirla et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382, 1990; Felici, J. Mol. Biol. 222:301-310, 1991; Ladner supra.）に存在していてもよい。
【０１３３】
また、薬剤の発見及び開発分野における当業者は、その活性が公知の物質を脱複製する（例えば、分類学的脱複製、生物学的脱複製、及び化学的脱複製、又はこれらの組合わせ）又は複製若しくは繰り返しを消去する方法を、可能な限り用いることができるということを容易に理解するだろう。
【０１３４】
粗製の抽出物がＰ２Ｙ１４受容体ポリペプチドの発現または活性を減少させると見出される場合、観察する効果に関与している化学成分を単離するために、陽性にリードする抽出物の分画が必要である。従って、抽出、分画及び精製工程の目標は、Ｐ２Ｙ１４受容体ポリペプチドの発現又は活性を減少させる粗製抽出物中にある化学物質の慎重な特徴付け及び同定である。このような異種抽出物の分画及び精製の方法は当該技術分野で公知である。所望により、幹細胞の増殖を促進する治療薬として有用であることが示された化合物は、当該技術分野で公知の方法によって化学的に修飾される。
【０１３５】
キット
本発明は、対象の組織内の幹細胞の生存、生育、又は増殖を促進するキットを提供する。一態様では、キットは、単位剤型で有効量のＰ２Ｙ１４受容体抑制剤を含有する治療組成物を含んでいる。一実施例では、Ｐ２Ｙ１４受容体抑制剤の有効量は、幹細胞を包含する細胞型の混合物を含有している培養物中の幹細胞の生存又は自己再生を促進するのに十分な量である。他の態様では、キットは、治療又は予防ワクチンを入れた無菌容器を含有していて、そのような容器は、箱、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、袋、ブリスターパック、又は当該技術分野で公知の他の適切な容器形態であってよい。そのような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔、又は薬剤を保持するのに適している他の物質で作られていてもよい。
【０１３６】
所望により、Ｐ２Ｙ１４受容体抑制剤は、それを幹細胞培養物又は対象の組織へ投与するための使用説明書と共に提供される。この使用説明書は通常、幹細胞集団を増殖するための、又は組織における幹細胞集団の生育、増殖又は生存のための組成物の使用に関する情報を含んでいる。他の態様では、使用説明書は次のうちの少なくとも１つを含んでいる：Ｐ２Ｙ１４受容体抑制剤の説明；幹細胞集団の増殖のための用量計画及び用法；使用上の注意；警告；適応症；禁忌；過剰摂取情報；副作用；動物についての薬効薬理；臨床試験；及び／又は参考文献。使用説明書は容器（存在する場合に）に直接印刷しても、容器に貼るラベルとして、又は容器中又は容器と共に入れた、独立した書面、パンフレット、カード又はフォルダーとしてであってもよい。
【０１３７】
別の態様では、本発明は、Ｐ２Ｙ１４受容体ポリペプチド又は核酸分子を特徴とするキットを提供する。このような組成物は一般に、細胞死を受ける危険性のある幹細胞集団（例えば、化学療法を受けている患者の造血幹細胞集団）を保護するために、又は幹細胞の移植を増強する（例えば、移植された幹細胞の生存、生育又は増殖を増大させて）ために有用である。
【０１３８】
幹細胞の機能を増強する治療
幹細胞の機能を増強する薬剤は、幹細胞の生存、生育及び増殖を増大させるものを包含する。そのような薬剤は本発明の方法において有用である。細胞の生育及び増殖をアッセイする方法は当該技術分野において公知である。例えば、Kittler et al. (Nature. 432(7020):1036-40, 2004)及び Miyamoto et al. (Nature. 416(6883):865-9, 2002)を参照されたい。細胞増殖のアッセイは一般に、細胞複製中におけるＤＮＡ合成の測定を包含する。一態様では、［３Ｈ］−チミジン又は５−ブロモ−２＊−デオキシウリジン［ＢｒｄＵ］のような、標識化ＤＮＡ前駆体を用い、これを細胞（又は動物）に添加してから、細胞周期のＳ期（複製）中にこれらの前駆体のゲノムＤＮＡ中への取り込みを検出することによって、ＤＮＡの合成を検出する（Ruefli-Brasse et al., Science 302(5650):1581-4, 2003; Gu et al., Science 302(5644):445-9, 2003)。
【０１３９】
細胞の生存能力を測定するアッセイは当該技術分野において公知であって、例えば、Crouch et al. (J. Immunol. Meth. 160,81-8); Kangas et al. (Med. Biol. 62, 338-43, 1984); Lundin et al., (Meth. Enzymol. 133, 27-42, 1986); Petty et al. (Comparison of J. Biolum. Chemilum. 10, 29-34, 1995) 及び Cree et al. (AntiCancer Drugs 6:398-404,1995) によって記述されている。細胞の生存能力は、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾリル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）（Barltrop, Bioorg. & Med. Chem. Lett. 1:611, 1991; Cory et al., Cancer Comm. 3, 207-12, 1991; Paull J. Heterocyclic Chem. 25, 911, 1988) を含む多種の方法を用いてアッセイすることができる。細胞生存能力のアッセイは市販もされている。これらのアッセイは、これに限定されないが、ＡＴＰの検出及び培養物中の細胞の状態及び数を定量するためにルシフェラーゼを用いる、CELLTITER-GLO（登録商標）Luminescent Cell Viab1ility Assay (Promega)、及び乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）細胞毒性アッセイである、CellTiter-Glo（登録商標）Luminescent Cell Viablity Assay (Promega) を包含する。
【０１４０】
幹細胞死を減少させる（例えば、アポトーシスを減少させる）候補薬剤も本発明の方法における治療薬として有用である。細胞のアポトーシスを測定するアッセイは当業者に公知である。アポトーシス細胞は、光学顕微鏡を用いて明確に観察できる、クロマチン濃縮、細胞収縮及び膜ブレブ形成を包含する特徴的な形態変化によって、特徴付けられる。アポトーシスの生化学的特徴は、ＤＮＡの断片化、特異的部位におけるタンパク質切断、増加したミトコンドリアの膜透過性、及び細胞膜表面上にホスファチジルセリンの出現を包含する。アポトーシスのアッセイは当該技術分野において公知である。例示的なアッセイは、ＴＵＮＥＬ（Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling) アッセイ、カスパーゼ活性（特にカスパーゼ−３）アッセイ、及びｆａｓリガンド及びアネクシンＶについてのアッセイを包含する。アポトーシスを検出するための市販製品は、例えば、Apo-ONE（登録商標）Homogeneous Caspase-3/7 Assay; FragEL TUNEL キット(ONCOGENE RESEARCH PRODUCTS, San Diego, CA); the ApoBrdU DNA Fragmentation Assay (BIOVISION, Mountain View, CA) 及び the Quick Apoptotic DNA Ladder Detection Kit (BIOVISION, Mountain View, CA) を包含する。
【０１４１】
所望により、本明細書に記載のスクリーニング方法の何れかを用いて選択された候補薬剤を、動物モデルを用いてその有効性について試験する。一態様では、マウスを化学療法したヒト細胞で処理して、造血幹細胞の数を減少させる。次いでマウスに、担体（ＰＢＳ）又は候補化合物（例えば、Ｐ２Ｙ１４受容体の抑制剤）を、実験的に決定された期間毎日、投与（例えば腹腔内）する。次いでマウスを安楽死させ、造血幹細胞を含有する組織（例えば、骨髄）を採取して、本明細書に記載の方法を用いて分析する。コントロールのレベルに比べて、造血幹細胞の死を減少させる組成物は、対象（例えば、ヒト患者）における化学療法の副作用を治療するための治療薬又は予防薬として有効であることが期待できる。
【０１４２】
併用治療
随意に、本発明の治療薬を、幹細胞の生存を増強する他の標準的な治療の何れかと併用して投与することができる。そのような治療は、幹細胞の自己再生、生存、又は生成を促進する因子の投与を包含する。
【０１４３】
Ｐ２Ｙ１４受容体抑制剤は、他の標準的な腫瘍治療の何れかと併用して投与でき、そのような方法は当業者に公知であって（例えば、Wadler et al., Cancer Res. 50:3473-86, 1990）、及びこれに限定されないが、化学療法、ホルモン療法、免疫療法、放射線療法、及び腫瘍の治療に用いられる他の治療方法の何れかを包含する。
【０１４４】
本発明及び本発明の多くの利点のより良い理解をもたらす、以下の説明的な、限定されない実施例によって、本発明を更に記述する。
（実施例）
【実施例１】
【０１４５】
Ｐ２Ｙ１４ヌルマウスは発生的に正常である
造血幹細胞制御におけるＰ２Ｙ１４受容体の明確な機能をここで報告する。Ｐ２Ｙ１４ヌルマウスを用いてこの機能を明らかにした。Ｐ２Ｙ１４−／−マウスを、正常に発生して野生型の同腹仔と比較して同様な出生率及び体重を有するＣ５７Ｂ１／６へ戻し交配した。９週齢のＰ２Ｙ１４−／−、＋／−及び＋／＋同腹仔の間に、末梢血球数、骨髄細胞又は幹細胞に富むｃＫｉｔ＋Ｓｃａｌ＋（ＬＫＳ）及びＬＫＳ ＣＤ３４−系の細胞の相違は見られなかった。同様に、細胞周期状態、インビトロにおけるコロニー形成細胞（ＣＦＣ）生産能、６時間のインビボ帰巣能及びインビボ脾コロニー形成細胞（colony-forming unit-spleen(CFU-S)）機能の全てが類似していた。
【実施例２】
【０１４６】
Ｐ２Ｙ−／−幹細胞は骨髄移植の増強を示した
幹細胞を、放射線照射された宿主骨髄のストレス状態に曝すと、Ｐ２Ｙ−／−幹細胞の効果は野生型のコントロールを凌いだ。細胞比が１：１のＣＤ４５．２＋Ｐ２Ｙ１４−／−又は＋／＋同腹仔骨髄と、競合させる雄性ＣＤ４５．１＋Ｂ６．ＳＪＬの、放射線照射された雌性ＣＤ４５．１＋Ｂ６．ＳＪＬへの移植を、競合再増殖アッセイで比較した。Ｐ２Ｙ−／−幹細胞は１８週時点で、明確な移植効果を示した（％ＣＤ４５．２：４９．８２％対２７．１０％；１群当たりｎ＝８、ｐ＝０．００７９、マンホイットニー検定）。全ての成熟系への分化が維持された。放射線照射された受容動物への、定量的、限定希釈競合再増殖では、Ｐ２Ｙ１４−／−骨髄中に多数の機能性幹細胞を示した（１／２３，１２０対１／６３，８７６ポアゾン；ｐ＝０．０３５９）。更に２次移植では、１８週時点でＰ２Ｙ−／−細胞の再増殖効果が明らかになった（４１．５５％対２２．５４％；１群当たりｎ＝１６、ｐ＝０．００２２）。これらの知見は、Ｐ２Ｙ１４が、細胞外ヌクレオチドの幹細胞プールを調節する役割を反映して、骨髄のストレス条件下で幹細胞の数及び機能を調節したことを示唆している。
【実施例３】
【０１４７】
ＵＤＰ−グルコースを検出することができない、Ｐ２Ｙ１４−／−造血幹細胞（Ｐ２Ｙ１４−／−  ）ＨＳＣｓは、高度に増殖した環境に応答する。
ヌクレオチド受容体が炎症性損傷への応答において重要であることが示されているので、Ｐ２Ｙ１４の作用のメカニズムを骨髄（ＢＭ）損傷のモデルで検討した。
【０１４８】
最初に、シクロホスファミド（ＣＴＸ）損傷モデルを用いた。マウスにＣＴＸを注射して、実験用にＢＭを注射４日後に採取した。ＣＴＸ損傷モデルに、滅菌ＰＢＳあるいは最終濃度が２００ｍｇ／マウスの体重のＣＴＸのどちらかを腹腔内注射した。注射４日後に、マウスを安楽死させて、ＢＭを各マウス（１群当たりｎ＝５）の大腿骨及び脛骨から得た。
【０１４９】
このモデルを用いて、ＣＴＸが活発に分裂している細胞を優先的に消去して、休眠ＨＳＣがＣＴＸの効果から相対的に保護されるので、予想通り、野生型（ＷＴ）マウスにおいてＢＭの未成熟ＨＳＣ分画の増加があることを確認した（図１ａ及び１ｂ）。対照的に、Ｐ２Ｙ１４−／−ＢＭにおいてＣＴＸからのそのような保護がないので、未成熟ＨＳＣ分画の増加を妨げる結果がもたらされた（図１ｃ及び１ｄ）。
【０１５０】
５−フルオロウラシル（５ＦＵ）を用いてマウスにＢＭ損傷を与えると、同様な結果が得られた（データは示されていない）。５ＦＵ損傷モデルでは、１５０ｍｇ／マウスの体重ｋｇの５ＦＵを０日目に腹腔内に注射し、０日目から開始して週に１回末梢血（ＰＢ）を分析するためにＰＢを尾静脈採血によって得た（１群当たりｎ＝１０）。これらの結果は、Ｐ２Ｙ１４の存在がアポトーシスからの保護をもたらすということを示唆している。
【０１５１】
次に、ＢＭ損傷からの長期造血回復におけるＰ２Ｙ１４の役割を検討した。マウスに５ＦＵを単回注射し、次いでフローサイトメトリーによって、末梢血（ＰＢ）の白血球数を、更にＰＢの顆粒球、Ｂ細胞及びＴ細胞含量をカウントした。ＬＫＳ＋及びＣＤ３４１０／−ＬＫＳ＋細胞についてのＢＭの、及びＢ細胞、Ｔ細胞及び顆粒球サブセットについてのＰＢの染色及びサイトメトリー分析については既に記述されている（Yuan, Y. et al. Nat. Cell Biol. 6, 436-442 (2004); Walkley, C. R. et al.  Nat. Cell Biol. 7, 172-178 (2005)）。アポトーシスは、Cheng, T. et al. Nat. Med. 6, 1235-1240 (2000) に既述されているようにアネクシンＶ及び７ＡＡＤ染色によって測定した。
【０１５２】
総ＰＢ白血球数を調べると、５ＦＵ投与後の−／−及び＋／＋マウスの両方で予想通りの動態が見られた。すなわち、注射後７日目に最低になる白血球数の急速な減少、次いで１４日目に白血球数がピークとなる逆戻り、そして３〜４週間で基準白血球数への緩やかな回復が見られた（図１ｅ）。同様に、ＰＢのＧｒ−１＋顆粒球数の実験では、Ｐ２Ｙ１４−／−マウスの５ＦＵ処置が顆粒球数の予想通りの減少及び最低値もたらすことが明らかになった。
【０１５３】
しかしながら、最低値に続いて、注射の９週間後まで続くＧｒ−１＋の過剰回復をもたらす、Ｐ２Ｙ１４−／−マウスのＰＢにおけるＧｒ−１＋細胞のより急速な逆戻りが見られる（図１ｆ）。このことは、化学損傷後のＰ２Ｙ１４−／−ＢＭに骨髄造血が増強されたことを示唆している。ＢＭ  ＨＳＣ及び間質成分の両方を損傷することが知られている、２．５及び４．０Ｇｙでの亜致死照射では、照射後４日及び７日目に同様な割合及び数の未成熟ＨＳＣがもたらされたので、これらの効果は化学損傷に特異的であると思われる。
【０１５４】
化学損傷に対するＰ２Ｙ１４−／−及び＋／＋ＢＭの応答の間のこれらの相違についての可能性のあるメカニズムは、Ｐ２Ｙ１４の、その特異的なリガンドである、ＵＤＰ−グルコースへの結合による、ＨＳＣ休眠の誘発及び維持によるものである。この仮説を検証するために、インビトロの細胞周期促進培養条件下にある、ＢＭ ＨＳＣに対するＵＤＰ−グルコースの効果を検討した。グループ分けしたＢＭ ＬＫＳ＋細胞をサイトカインを含有する培養物に入れると、これらは２４時間の間に少なくとも１回細胞分裂する。３日後に、細胞を１６時間ＵＤＰ−グルコースに曝し、次いでＢｒ−ＤＵの取り込みを行った。それぞれの遺伝子型の３匹のマウスから細胞分類法によって１×１０５個のＢＭ ＬＫＳ＋細胞を得て、そして１０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、１０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ３Ｌ及び１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ３を補完したＸ−ＶＩＶＯ１０培地（Stem Cell Technolgies, Vancouver）中で培養した。３日後に、培地をＩＬ３以外の同じサイトカインを補完した新鮮なＸ−ＶＩＶＯ１０培地に置き換えて、各ウェルに１００ｍＭのＵＤＰ−グルコース又はＰＢＳを添加した。１６時間後に各ウェルの細胞を洗浄して、ＢｒＤＵ（BD BioScience, San Jose）と４５分間パルスさせた。６時間目及び２４時間目に各ウェルから１×１０５個の細胞を採取して、ＢｒＤＵの取り込みを、FITC BrDU Flow Kit の使用説明書（BD BioScience, San Jose）のようにしてフローサイトメトリーで測定した。全群で３回行った。
【０１５５】
予想したように、サイトカイン促進細胞周期で刺激されると、Ｐ２Ｙ１４−／−及び＋／＋ＬＫＳ＋細胞の両方がＢｒＤｕの高レベルの取り込みを示す（図１ｇ）。同様に、Ｐ２Ｙ１４−／−ＬＫＳ＋周期細胞をＵＤＰ−グルコースに曝すと、ＢｒＤＵの取り込みに変化がない。しかしながら、Ｐ２Ｙ１４＋／＋ＬＫＳ＋周期細胞をＵＤＰ−グルコースに曝すと、ＢｒＤＵパルス後６時間及び２４時間の両方の時点での低いレベルのＢｒＤＵ取り込みから分かるように、細胞周期の顕著な遅延が見られる（図１ｇ）。これらの結果から、化学損傷後のアポトーシスからのＰ２Ｙ１４による保護には、相対的な休眠の維持が介在するということが断定できる。
【０１５６】
ＢＭ傷害の上記モデルは、ＢＭ造血細胞及びＢＭ環境の両方に傷害をもたらす。ＨＳＣ移植アッセイによる非傷害ＨＳＣに対する傷害ＢＭ環境の効果を検討した。移植アッセイは、既述の手順（Cheng, T. et al. Nat. Med. 6,1235-1240 (2000); Cheng, T. et al. Science 289, 1804-1808 (2000)）に従う。すなわち、雌性ＣＤ４５．１＋Ｃ５７ＳＪＬ移植マウスに、分割線量の１０Ｇｙ照射を用いて致死的に放射照射した。１：１の競合連続移植のために、それぞれの遺伝子型（ＣＤ４５．２＋）から及び雄性ＣＤ４５．１＋Ｃ５７ＳＪＬ競合相手から得た２×１０５個の全ＢＭ単核細胞を混合して、移植マウス（１群当たりｎ＝１０）に静脈内注射した。移植後６週目に開始して３週間毎に、既述（Calvi, L.M. et al. Nature 425, 841-846 (2003)）のようにしてＣＤ４５．１及び２並びにＢ細胞、Ｔ細胞及び顆粒球及び単核白血球系統についてのＰＢフローサイトメトリーによって、生着検査を行った。１８週目に、マウスを安楽死させてそれぞれのマウスから得た２×１０５個のＢＭ単核細胞を、雌性ＣＤ４５．１＋Ｃ５７ＳＪＬ第２移植マウス（１群当たりｎ＝１０）に移植した。第３移植を同様の方法で実施した。ウィルコクソン検定を用いて統計的有意性を判定した。限界希釈連続移植のために、Ｐ２Ｙ１４−／−又は＋／＋全ＢＭ単核細胞を、雄性ＣＤ４５．１＋Ｃ５７ＳＪＬ全ＢＭ単核細胞と１：１、１：２及び１：４の比率で混合して致死的放射線照射した雌性ＣＤ４５．１＋Ｃ５７ＳＪＬマウスに注射した。ＣＤ４５．２＋ＰＢ単核細胞のパーセント及びＣＤ４５．２＋ＰＢ Ｇｒ−１＋顆粒球のパーセントの両方が＞２５％であることで定義される、生着を１８週目に評価した。Ｌ−Ｃａｌｃソフトウェア（Stem Cell Technologies, Vancouver）を用いてＣＲＵ当量を計算した。
【０１５７】
競合移植におけるＰ２Ｙ１４−／−と＋／＋全ＢＭ細胞を比べると、Ｐ２Ｙ１４−／−全ＢＭが、末梢血ＣＤ４５．２＋白血球のパーセントを測定して、致死的放射線照射した第１移植マウスの優れた生着をもたらした（図２ａ）。更に、Ｐ２Ｙ１４−／−全ＢＭ ＨＳＣは、Ｐ２Ｙ１４−／−ＨＳＣの優れた自己再生能を示して、連続移植の間により良く機能した（図２ｂ及び図２ｃ）。限界希釈競合移植では、致死的放射線照射した第１移植マウスにおいて、Ｐ２Ｙ１４−／−全ＢＭが、＋／＋全ＢＭと比べて約３倍大きい当量の生着能を有していることが示された（表１、図２ｄ）。この効果は、第２移植において持続されるが、減弱する（表１、図２ｅ）。これらの結果から、損傷したＢＭ環境に導入されると、Ｐ２Ｙ１４−／−ＨＳＣは、＋／＋ＨＳＣと比べて大きい生着及び自己再生の能力を有していると推論できる。
【０１５８】
【表１】
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【０１５９】
これらの知見から、ＢＭ損傷におけるＰ２Ｙ１４の役割についての以下のモデルを作成した（図３）。ＢＭ ＨＤＣ及びＢＭ間質成分の両方を損傷する毒物が存在している、ＢＭの急性化学損傷の間に、Ｐ２Ｙ１４を発現するＨＳＣはＵＤＰ−グルコースへの結合により「危険信号」を感知して、毒物が引き起こすアポトーシスへの相対的な耐性を誘導する相対的な休眠の維持をもたらす（図３ａ）。これに続いて、ＢＭ中に有害な毒物がもはや存在しない、回復期がある。重要なことは、この期間において、Ｐ２Ｙ１４−／−細胞が化学損傷に続き分化した子孫の損失よって生じた増殖刺激に対してより簡単に応答するので、Ｐ２Ｙ１４の欠如が、より活発で、過度な逆戻りの骨髄造血をもたらすことである（図３ｂ）。損傷があるときに、新たに導入されたＰ２Ｙ１４＋／＋ＨＳＣはＵＤＰ−グルコースの存在を感知して相対的な休眠を維持するのに対し、ＵＤＰ−グルコースを検出できないＰ２Ｙ１４−／−ＨＳＣｓは、移植アッセイにおける優れた能力によって示されるように、より大きい分化／増殖及び自己再生によって、致死的放射線照射及び、天然ＨＳＣ及びそれらの分化子孫の両方の損失によってもたらされる増殖環境に強く応答する（図３ｃ）。
【０１６０】
従って本発明は、移植者又は異常血液細胞疾患（例えば、白血病又は骨髄異形成）を有する対象における幹細胞発現及び総血液細胞回復を改善するために、Ｐ２Ｙ１４受容体を発現する造血幹細胞に対する、Ｐ２Ｙ１４受容体（ＧＰＲ１０５及びＳＣ−ＧＰＲとしても知られている）の抑制剤を提供する。例示的な抑制剤はＰ２Ｙ１４受容体に対するｓｉＲＮＡである。小分子抑制が意図されている。
【０１６１】
その他の態様
前記により、多種の用途及び条件に適用するために本明細書に記載の発明に変更及び修飾を行うことができることは明らかである。このような態様も以下の特許請求の範囲の範囲内である。
本明細書の可変な用語の定義の何れかにおけるその要素のリストの記述には、何れかの単一の要素又はリストされている要素の組合わせ（又はサブコンビネーション）として可変であるものの定義を包含する。本明細書の態様の記述には、何れかの単一の態様又は他の態様又はそれの部分の何れかとの組合わせとしての態様を包含する。
この明細書中に記述する全ての特許及び刊行物は、それぞれの独立した特許及び刊行物を明確に且つ独立して参照として取り込むよう指示されると同じ範囲で、参照として本明細書に取り込まれる。
【図１ａ−１ｂ】
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【図１ｃ−１ｄ】
2009539992.tif 000004
【図１ｅ−１ｆ】
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【図１ｇ】
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【図２ａ−２ｂ−２ｃ】
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【図２ｄ−２ｅ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【国際調査報告】
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