(57)【要約】  本発明は、MTBEおよび/または好ましくはtert-ブチルアルコール(TBA)、2-メチル-1,2-プロパンジオール(2-M-1,2-PD)、ヒドロキシイソブチルアルデヒド、ヒドロキシイソ酪酸(HIBA)からなる群から選択されるMTBEの異化代謝産物中間体の少なくとも1つの分解経路で活性を有する単離または精製ポリペプチドであって、a)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8または配列番号10からなる群から選択されるアミノ酸の配列を含むポリペプチド、b)a)で定義したポリペプチドのアミノ酸の配列と少なくとも70%の同一性、好ましくは75%、80%、90%、95%、98%または99%の同一性を有するアミノ酸の配列を含むポリペプチド、そのアミノ酸の配列がその全長にわたり1個または数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加または突然変異を含む、a)またはb)で定義したポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
MTBEおよび/または好ましくはtert-ブチルアルコール(TBA)、2-メチル-1,2-プロパンジオール(2-M-1,2-PD)、ヒドロキシイソブチルアルデヒド、ヒドロキシイソ酪酸(HIBA)からなる群から選択されるMTBEの異化代謝産物の少なくとも1つの分解経路で活性を有する単離または精製ポリペプチドであって、
a)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8または配列番号10からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
b)a)で定義したポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも70%の同一性、好ましくは75%、80%、90%、95%、98%または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
c)アミノ酸配列がその全長にわたり1つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加または突然変異を含む、a)またはb)で定義したポリペプチド
からなる群から選択されるポリペプチド。
【請求項２】
MTBEの分解経路でのポリペプチドの活性がアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、好ましくはヒドロキシイソブチルアルデヒドからHIBAへの脱水素酵素活性であり、かつa)で定義したアミノ酸配列が配列番号2であることを特徴とする、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項３】
MTBEの分解経路でのポリペプチドの活性がアルコールデヒドロゲナーゼ活性、好ましくは2-M-1,2-PDからヒドロキシイソブチルアルデヒドへの脱水素酵素活性であり、かつa)で定義したアミノ酸配列が配列番号6であることを特徴とする、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項４】
MTBEの分解経路でのポリペプチドの活性がパーミアーゼ活性、好ましくはジ/トリペプチドパーミアーゼ活性であり、かつa)で定義したアミノ酸配列が配列番号8であることを特徴とする、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項５】
MTBEの分解経路でのポリペプチドの活性が転写制御活性であり、かつa)で定義したアミノ酸配列が配列番号10であることを特徴とする、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６】
請求項1から5のいずれか一項に記載の少なくとも1つのポリペプチドをコードすることを特徴とする、精製または単離核酸。
【請求項７】
MTBEまたはMTBEの異化代謝産物の少なくとも1つ、好ましくはTBA、2-M-1,2-PD、ヒドロキシイソブチルアルデヒド、HIBAの分解経路で活性を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする単離または精製核酸であって、
e)配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7または配列番号9、またはその相補配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくともいずれか1つを含む核酸、
f)e)で定義した核酸のヌクレオチド配列と少なくとも70%の同一性、好ましくは75%、80%、90%、95%、98%または99%の同一性を有する少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む核酸、
g)アミノ酸配列の配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8または配列番号10のいずれか1つを含むポリペプチドの少なくとも1つの変異体をコードする核酸であって、e)またはf)で定義した核酸の相補配列とハイブリダイズする核酸、
h)配列がその全長にわたり1つまたは複数のヌクレオチドの置換、欠失、挿入、付加または突然変異を含む、e)、f)またはg)で定義した核酸
からなる群から選択される核酸。
【請求項８】
e)、f)、g)またはh)で定義したヌクレオチド配列の配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7または配列番号9から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも2つ、好ましくは前記ヌクレオチド配列の3つ、より好ましくは前記ヌクレオチド配列の4つ、より好ましくは前記ヌクレオチド配列の5つを含むことを特徴とする、請求項7に記載の核酸。
【請求項９】
配列番号11のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする核酸。
【請求項１０】
ヌクレオチド配列がe)、f)、g)またはh)で定義した配列番号1および配列番号5、好ましくはe)、f)、g)またはh)で定義した配列番号1、配列番号3および配列番号5であることを特徴とする、請求項8に記載の核酸。
【請求項１１】
核酸の転写が単一プロモーターの制御下にあることを特徴とする、請求項6から10のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１２】
核酸の転写が、MTBEおよび/または好ましくはTBA、2-M-1,2-PD、ヒドロキシイソブチルアルデヒドおよびHIBAからなる群から選択されるMTBEの異化代謝産物の少なくとも1つの存在によって誘導されることを特徴とする、請求項6から11のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１３】
オペロンとして組織化されていることを特徴とする、請求項12に記載の核酸。
【請求項１４】
MTBEおよび/または好ましくはTBA、2-M-1,2-PD、ヒドロキシイソブチルアルデヒドおよびHIBAからなる群から選択されるMTBEの異化代謝産物の少なくとも1つを含む培地中で増殖することができる細菌菌株、その中で特に番号I-3401およびI-2532としてCNCMコレクションに寄託されたMycobacterium austroafricanum菌株から単離および/または精製されることを特徴とする、請求項1から5のいずれか一項に記載のポリペプチド、または請求項6から13のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１５】
請求項6から14のいずれか一項に記載の核酸を含むことを特徴とする組換え核酸。
【請求項１６】
請求項6から15のいずれか一項に記載の核酸を含むことを特徴とするベクター。
【請求項１７】
宿主細胞のゲノム中に存在する核酸配列と相同的であり、前記ゲノムへのその組み込みを確実にする少なくとも1つの配列を含むことを特徴とする、請求項16に記載のベクター。
【請求項１８】
請求項6から15のいずれか一項に記載の核酸が、宿主細胞中でのその発現を確実にするエレメントに隣接していることを特徴とするベクター。
【請求項１９】
請求項6から15のいずれか一項に記載の核酸の少なくとも1つ、または請求項16から18のいずれか一項に記載のベクターの少なくとも1つのいずれかを含む単離宿主細胞。
【請求項２０】
原核生物細胞、好ましくは細菌細胞、より好ましくはMycobacterium smegmatis mc2155、大腸菌、Rhodococcus ruberからなる群から選択される細菌細胞であることを特徴とする、請求項19に記載の単離宿主細胞。
【請求項２１】
配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7または配列番号9からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片、好ましくは15、17、20、23、25、27、30、35、40、45または50個の連続したヌクレオチドの断片、または前記断片の核酸配列と少なくとも70%の同一性、好ましくは75%、80%、90%、95%、98%または99%の同一性を有する配列を有する断片を含むことを特徴とする、オリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項２２】
配列番号12のヌクレオチド配列の少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片、好ましくは15、17、20、23、25、27、30、35、40、45または50個の連続したヌクレオチドの断片、または前記断片の核酸配列と少なくとも70%の同一性、好ましくは75%、80%、90%、95%、98%または99%の同一性を有する配列を有する断片を含むことを特徴とする、オリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項２３】
配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7または配列番号9からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片、好ましくは15、17、20、23、25、27、30、35、40、45または50個の連続したヌクレオチドの断片、または前記断片の核酸配列と少なくとも70%の同一性、好ましくは75%、80%、90%、95%、98%または99%の同一性を有する配列を有する断片と相補的であるヌクレオチド配列を含むことを特徴とするプローブ。
【請求項２４】
配列番号12のヌクレオチド配列の少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片、好ましくは15、17、20、23、25、27、30、35、40、45または50個の連続したヌクレオチドの断片、または前記断片の核酸配列と少なくとも70%の同一性、好ましくは75%、80%、90%、95%、98%または99%の同一性を有する配列を有する断片と相補的であるヌクレオチド配列を含むことを特徴とするプローブ。
【請求項２５】
591塩基対のmpdB遺伝子の断片を含み、その配列が、配列番号14の配列または前記断片の核酸配列と少なくとも70%の同一性、好ましくは75%、80%、90%、95%、98%または99%の同一性を有する配列であるプローブ。
【請求項２６】
MTBEおよび/または好ましくはTBA、2-M-1,2-PD、ヒドロキシイソブチルアルデヒドおよびHIBAからなる群から選択されるMTBEの異化代謝産物の少なくとも1つを分解することができる細胞または細胞の核酸を同定する方法であって、
場合によっては、MTBEおよび/または好ましくはTBA、2-M-1,2-PD、ヒドロキシイソブチルアルデヒド、HIBAからなる群から選択されるMTBEの異化代謝産物の少なくとも1つを補充した培地上に細胞を播種する段階、
前記細胞の核酸と請求項23から25のいずれか一項に記載のプローブの少なくとも1つとのハイブリダイゼーションによってスクリーニングする段階、および/または
前記細胞の少なくとも1つの核酸を請求項21および22のいずれか一項に記載の少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマーで増幅または重合させる段階を含む方法。
【請求項２７】
番号I-3401としてCNCMコレクションに寄託された細菌Mycobacterium austroafricanum菌株。
【請求項２８】
アルデヒドデヒドロゲナーゼとしての請求項2に記載の配列番号2のポリペプチドの、好ましくはヒドロキシイソブチルアルデヒドからHIBAへの脱水素化のための使用。
【請求項２９】
アルコールデヒドロゲナーゼとしての請求項3に記載の配列番号6のポリペプチドの、好ましくは2-M-1,2-PDからヒドロキシイソブチルアルデヒドへの脱水素化のための使用。
【請求項３０】
MTBE、ETBEおよび/または好ましくはTBA、2-M-1,2-PD、ヒドロキシイソブチルアルデヒド、HIBAからなる群から選択されるMTBEの異化代謝産物の少なくとも1つを含む廃水を処理して、その濃度を低下させる方法であって、請求項19、20、27のいずれか一項に記載の、または請求項26に記載の方法によって同定した少なくとも1つの細胞を前記廃水に播種する段階を含むことを特徴とする方法。
【請求項３１】
細胞が適切な支持体、好ましくは無機物支持体、より好ましくは少なくとも50重量%のパータイトを含む支持体と結合することを特徴とする、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
帯水層またはゾルの処理を可能にすることを特徴とする、請求項30および31のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
MTBEおよび/または好ましくはTBA、2-M-1,2-PD、ヒドロキシイソブチルアルデヒドおよびHIBAからなる群から選択されるMTBEの異化代謝産物の少なくとも1つで、汚染された場所の細菌を検出および/または定量するためのキットであって、請求項23から25のいずれか一項に記載の少なくとも1つのプローブ、および/または請求項21および22のいずれか一項に記載の少なくとも2つのプライマーを含み、前記プローブおよび/または前記プライマーを別々に、または組み合わせて使用することができることを特徴とするキット。
【請求項３４】
菌株M.austroafricanumの細菌の検出および/または定量を可能にすることを特徴とする、請求項33に記載のキット。
【請求項３５】
請求項25に記載のmpdB遺伝子の断片を含むプローブを含むことを特徴とするDNAチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は微生物学の分野、より詳細には化学汚染物質、特にメチルtert-ブチルエーテル(MTBE)および/またはこの化合物の異化代謝産物で汚染された廃水を処理するための微生物の使用に関する。
【０００２】
本発明は、新規のポリペプチドおよびその断片、ならびにこれらのポリペプチドをコードし、MTBEおよび/またはMTBEの異化代謝産物の少なくとも1つ、好ましくはtert-ブチルアルコール(TBA)、2-メチル-1,2-プロパンジオール(2-M-1,2-PD)、ヒドロキシイソブチルアルデヒド、ヒドロキシイソ酪酸(HIBA)を代謝することができる微生物から単離される核酸に関する。本発明はさらに、前記核酸を含むクローニングおよび/または発現ベクター、前記核酸または前記ベクターで形質転換した細菌細胞、およびそれらの使用に関する。
【０００３】
本発明はさらに、MTBEおよび/またはMTBEの異化代謝産物の少なくとも1つを代謝することができる微生物を同定する方法に関する。より詳細には本発明は、番号I-3401としてコレクションCNCMに寄託された新規の細菌菌株Mycobacterium austroafricanumに関する。
【０００４】
本発明はさらに、MTBEおよび/またはMTBEの異化代謝産物の少なくとも1つで汚染された廃水を処理する方法に関する。
【背景技術】
【０００５】
化合物MTBEは、無鉛石油への添加剤として使用されている。アルキル鉛の使用はその毒性のため禁じられているので、MTBEを石油に加えてそのオクタン価を増大させる。オクタン価は、燃料がエンジンの燃焼チャンバー内で空気との混合物として燃焼するとき、燃料の「ノック耐性」の尺度となる。MTBEは酸素含有化合物としても使用され、それは石油の酸素含有量を増大させ、したがってその燃焼効率を改善することができる。これによって、不燃炭化水素の放出および大気中への一酸化炭素の放出を減らすことができる。したがって、酸素含有燃料中に現在使用されているMTBE濃度は15%(v/v)に達する。MTBEは米国環境保護局(US E.P.A.、1997年12月、EPA/822/F-97/008.Office of Water、ワシントンDC、USA)によって考えられる発癌物質として分類されている。この化合物による環境の汚染は、非耐久性タンク中の石油の不充分な貯蔵、または事故による漏出によるものである可能性がある。この型の廃棄物は、地下帯水層の汚染などの重大な環境汚染問題をもたらす可能性がある。消費者がMTBEで汚染された供給源からの非飲料水を飲むとき、消費者は低濃度に曝される可能性がある。さらに、MTBEが水に与える不快な味および臭いは、低濃度でさえも、水を消費するのに適さないものにし、この生体異物化合物は重大な汚染物質となる。MTBEによる汚染は、それを環境から除去することが困難である事実に大部分は原因があるようである。MTBEはその乏しい生物分解性のため、およびそれが水に容易に溶けるという事実のために、持続的であることが証明される。帯水層中のMTBEの半減期は少なくとも2年であると推定され(Wilson J.T.、2003、19〜61: In E.E.Moyer and P.T.Kostecki (ed.)、MTBE Remediation Handbook. Amherst Scientific Publishers、Amherst、MA.)、比較すると、ベンゼンのこの値は同一条件下で2〜3カ月である。帯水層の汚染は、人々の健康に重大な危険をもたらす可能性がある。MTBEまたはMTBEの任意の他の異化代謝産物で汚染された帯水層の処理を可能にする有効な方法を開発することが、したがって必要である。
【０００６】
最近数年間で、MTBEの生物分解性の測定に関するいくつかの試験が着手されてきている。MTBEを完全または部分的に同化することができる数種の微生物が同定および単離されてきている。例えば、数種の微生物は、同時代謝によってMTBEを異化することができる。いずれもMTBEの初期酸化と関係がある2つの分解経路は、大抵の場合培地に蓄積するtert-ブチルアルコール(TBA)の生成をもたらす。細菌菌株Mycobacterium vaccae JOB5は、プロパン上で増殖させるとTBAを酸化することができるが、これがその増殖に利用することができる化合物の生成を可能にするわけではない。炭素およびエネルギー源としてMTBEを同化することができる微生物のいくつかの菌株が単離されている(Francois et al.、Appl.Environ.Microbiol.、2002、68: 2754〜2762 ; Hanson、J.R.et al.、Appl.Environ.Microbiol.、1999、65: 4788〜4792 ; Hatzinger、P.B.et al.、Appl.Environ.Microbiol.、2001、67: 5601〜560)。これらの細菌における酵素によるMTBEの最初の攻撃の機構は、依然として解明されていない。
【０００７】
細菌菌株Mycobacterium austroafricanum I-2562は、MTBEの存在下における好気的条件下で増殖できることが知られている細菌の1つである。この菌株は、MTBEを炭素およびエネルギー源に異化することができる(Francois et al.、Appl.Environ.Microbiol.、2002、68: 2754〜2762 ; 米国特許第6,849,445号)。いくつかの数のMTBEの分解産物または異化代謝産物、TBA、2-M-1,2-PD、ヒドロキシイソブチルアルデヒドおよびHIBAなどが同定されてきている。この細菌菌株におけるMTBEの分解経路は図1中に示す。
【０００８】
M.austroafricanum I-2562におけるMTBE分解の動態、およびそれに伴う増殖動態は、2つの明らかに異なる期を示す(図2)。MTBE分解の動態は最初の48時間中の非常に高い分解速度によって特徴付けられる。それは第2日〜第16日で低下する。MTBEがTBAに変換されるこの時期に、TBAは蓄積するが、増殖は観察されない。第16日〜第21日で蓄積したTBAが分解し、それが微生物の増殖を誘導する。
【０００９】
最初の分解ステップはCO2へのギ酸の無機化を含み、これは微生物がメタノール資化性であることを必要とすることを記さなければならない(Francois et al.、Appl.Environ.Microbiol.、2002、68: 2754〜2762)。NAD(P)+依存性ギ酸デヒドロゲナーゼ(すなわちFDH)は、メタノール資化性微生物のエネルギー生成において重要な役割を果たす酵素である。さらにこの酵素は、生物触媒反応中のNAD(P)+型補因子の再生において頻繁に使用される(Tishkov、V.I.et al.、Biochemistry(Moscow)、2004、69: 1537〜1554)。この最初の異化ステップはATPを生成しない。Francois et alは、M.austroafricanum I-2562においてTBFはMTBEの分解速度に対して負の影響を有することを実証している(Francois et al.、Appl.Microbiol.Biotechnol.2003、62: 256〜262)。還元補酵素相当物およびエネルギーの欠如が、酵素反応の速度低下の原因であることが示唆されてきている(Salanitro、Curr.Op. Biotechnol.、1995、6: 337〜340)。これらが何故MTBEの分解速度が低下するかの主な2つの理由である可能性は非常に高い。
【００１０】
2NAD(P)Hおよび2H+の純生産を可能にすることによって、したがって第二のステップは、好気生活中に最終電子受容体としてO2を用いる電子伝達鎖を供給する。したがって、このステップはMTBE代謝に必要不可欠であるようである。この電子伝達鎖の最終結果は、O2をH2Oに還元するためのNAD(P)Hから始まるNAD(P)+の再生であり、これによってプロトン伝達勾配が作製され、プロトンは酵素ATPシンターゼによるATPの形成のために使用される(プロトンポンプ)。これは酸化的リン酸機構に相当し、微生物のエネルギー化合物であるATPの合成を可能にする(30.5kJ生成物/高エネルギーレベルでの結合のため分解したATP1モル)。
【特許文献１】米国特許第6,849,445号
【非特許文献１】US E.P.A.、1997年12月、EPA/822/F-97/008. Office of Water、ワシントンDC、USA
【非特許文献２】Wilson J.T.、2003、19〜61: In E.E.Moyer and P.T.Kostecki (ed.)、MTBE Remediation Handbook. Amherst Scientific Publishers、Amherst、MA.
【非特許文献３】Francois et al.、Appl.Environ.Microbiol.、2002、68: 2754〜2762
【非特許文献４】Hanson、J.R.et al.、Appl.Environ.Microbiol.、1999、65: 4788〜4792
【非特許文献５】Hatzinger、P.B.et al.、Appl.Environ.Microbiol.、2001、67: 5601〜560
【非特許文献６】Tishkov、V.I.et al.、Biochemistry (Moscow)、2004、69: 1537〜1554
【非特許文献７】Francois et al.、Appl.Microbiol.Biotechnol. 2003、62: 256〜262
【非特許文献８】Salanitro、Curr.Op. Biotechnol.、1995、6: 337〜340
【非特許文献９】Sambrook et al.(Molecular Cloning: A Laboratory Manual.Cold Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、ニューヨーク、2001)
【非特許文献１０】Jones and Jenkins、Can.J. Microbiol.、1965、11: 127〜133
【非特許文献１１】Viallier and Viallier、Ann.Soc.Belge Med. Trop.、1973、53: 361〜371
【非特許文献１２】Piveteau et al.、Appi.Microbiol.Biotechnol.2001、55: 369〜373
【非特許文献１３】Laemmli、Nature、1970、227: 680〜685
【非特許文献１４】Jeno et al.、Analytical Biochemistry、1995、224: 75〜82
【非特許文献１５】Helman et al.、1995、William et al.、In: Techniques VIII、Marshak、D.、ed.Academic Press、サンディエゴ、1997、79〜90
【非特許文献１６】Hewick et al.(J.Biol.Chem.、1981、256: 7990〜7997)
【非特許文献１７】Cavener、J.Mol.Biol.、1992、223: 811〜814
【非特許文献１８】Pospiech and Neumann、Trends In Genetics、1995、11: 217〜218
【非特許文献１９】http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html
【非特許文献２０】Hanahan、D.et al.、Methods Enzymol.1991、204: 63〜113
【非特許文献２１】Ma et al.J.Bacteriol.、2002、184: 5733〜5745
【非特許文献２２】Picardeau et al.、Microbiology、2000、146: 305〜313
【非特許文献２３】Altschul et al.Nucleic Acids Res.、1997、25: 3389〜3402
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の1つの目的は、MTBEおよび/またはMTBEの異化代謝産物の少なくとも1つ、好ましくはTBA、2-M-1,2-PD、ヒドロキシイソブチルアルデヒド、HIBAを代謝することができる利用可能なポリペプチドを有すること、および適切な場合、それらを改変してMTBEおよび/またはMTBEの異化代謝産物の少なくとも1つ、好ましくはTBA、2-M-1,2-PD、ヒドロキシイソブチルアルデヒド、HIBAで汚染された廃水の処理用にそれらを使用することである。
【００１２】
Francois et alによる研究は、M.austroafricanum IFP2012(I-2562)中でMTBEまたはTBAの存在下においていくつかのポリペプチドが特異的に誘導されたことを実証している。これらの特異的に誘導されたポリペプチドを精製し、トリプシンで消化し、次いでマイクロシークエンシングした。アラインメントツールBlastおよびFastaによる生成した配列の分析によって、これらのポリペプチドは、MTBEおよびTBAの分解と関係がある酸化還元酵素に相当することが示唆されている。
【００１３】
本出願人は、MTBEの存在下において特異的に誘導されるポリペプチドに新規のペプチドシークエンシングを実施して、204塩基対の第一プローブを得ている。しかしながら204塩基対のこのプローブは、コロニーハイブリダイゼーションには短すぎることが証明されている。したがって、多数のBLASTアラインメントを、204bpのDNA断片から推定したアミノ酸配列と最大類似性を有するタンパク質を用いて実施した。これら全てのタンパク質において高度に保存されるアミノ酸配列を同定した後、縮重プライマーを用いて多数のPCR増幅を実施して、それによって604塩基対の新規のプローブを得ている。604塩基対のこのプローブは、mpdC遺伝子、orf1、mpdB遺伝子、orf2および推定トランスポーザスに相当する配列を含むDNA断片のクローニングを可能にしている。このDNA断片のクローニングは困難であると認められている。これは、最初のクローニング後、大腸菌への形質転換後に得たクローンは安定しておらず、それによってプラスミドDNAの抽出が困難となるからである。多数の実験の後、本出願人は、得られたクローンの不安定性はトランスポーザス遺伝子の発現の結果であるという仮説を立てており、トランスポーザス遺伝子が抑制されており配列番号11の配列に相当するDNA断片をしたがってクローニングしている。したがって、配列番号11の配列を含む安定したクローンを得ることができた。
【００１４】
したがって本出願人は、本発明によるポリペプチドを得るために、多数のクローニングおよびシークエンシングの困難を克服してこなければならなかった。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、MTBEおよび/またはMTBEの異化代謝産物の少なくとも1つ、好ましくはTBA、2-M-1,2-PD、ヒドロキシイソブチルアルデヒド、HIBAの分解経路で活性を有する任意の単離または精製ポリペプチドに関する。
【００１６】
ポリペプチドまたは少なくとも1つの本発明のポリペプチドをコードする核酸は「単離または精製されている」ことを明記することによって、それらが本来見られる環境とは異なる環境にそれらが置かれていることを意味する。MTBEおよび/または好ましくはTBA、2-M-1,2-PD、ヒドロキシイソブチルアルデヒド、HIBAからなる群から選択されるMTBEの異化代謝産物の少なくとも1つを含む培地中で増殖することができる細菌菌株、その中で特に番号I-3401およびI-2532としてCNCMコレクションに寄託されたMycobacterium austroafricanum菌株から、それらを単離または精製することができる。本発明により修飾されている分子も、「単離されている」として理解される。用語「単離または精製されている」は宿主細胞にも使用されることを記さなければならない。
【００１７】
本発明の文脈では、用語「ポリペプチド」、「酵素」および「タンパク質」は交換して使用可能であり、場合によっては化学的または生化学的に修飾されている任意の長さのアミノ酸配列によって特徴付けられる分子を指す。用語「ポリペプチド」は、少なくとも1つのアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加に相当する、本来存在し得る全ての突然変異ポリペプチド、または特にM.austroafricanum菌株の細菌における変異体も含む。置換の場合、1つまたは複数の連続または不連続アミノ酸を、「相当」アミノ酸によって置換することができる。ここで表現「相当」アミノ酸は、基本構造のアミノ酸の1つによって置換され得るが、しかしながら本発明のポリペプチドの生物活性は変えないアミノ酸を指す。これらの相当アミノ酸は、置換するアミノ酸とのその構造相同性に基づいて、あるいは異なるポリペプチドが与え得る生物学的交差活性の試験において得た結果に基づいて決定することができる。
【００１８】
好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、
a)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8または配列番号10からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
b)a)で定義したポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも70%の同一性、好ましくは75%、80%、90%、95%、98%または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
c)そのアミノ酸配列がその全長にわたり1つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加または突然変異を含む、a)またはb)で定義したポリペプチドからなる群から選択される。
【００１９】
ポリペプチドに突然変異を導入するための、当業者に知られている異なるプロトコルが記載されている。ポリペプチドのアミノ酸配列を改変するために、典型的にはこのポリペプチドをコードする核酸分子を操作する。本発明のポリペプチドをコードする核酸を改変するために、突然変異誘発物質、すなわちコドンの意味を変え、遺伝コードの結果としてアミノ酸配列を改変する突然変異を引き起こすことができる物理または化学物質で核酸を処理することができる。部位特異的突然変異誘発技法を利用し、遺伝子の少なくとも1つのポリペプチドおよび本発明のポリヌクレオチドのポリペプチドをコードする核酸のヌクレオチド配列を改変することが有利であり、したがって考慮中の核酸に1つまたは複数の突然変異を特異的に導入し、それは遺伝コードの結果として、突然変異ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド中の1つまたは複数の他のアミノ酸との1つまたは複数のアミノ酸の置換をもたらす。これらの突然変異を実施するのが興味深い理由は、MTBEおよび/または触媒中間体の少なくとも1つの分解経路の本発明のポリヌクレオチドの1つの生物活性の研究だけでなく、場合によってはそれを産業に適用することを鑑みた組換え形のポリペプチドの前記活性の最適化の研究にある。
【００２０】
「ポリペプチド断片」とは、少なくとも15個の連続したアミノ酸、好ましくは17、20、23、25、30、40、50、100、250または300個の連続したアミノ酸を含むポリペプチドを意味する。タンパク質分解酵素、化学試薬を用いて前記ポリペプチドを切断することにより、あるいは他には前記ポリペプチドを非常に酸性である環境中に置くことにより得ることができる本発明のポリペプチドの断片も、本発明の一部分である。
【００２１】
「生物活性断片」とは、特に、前記ポリペプチドがMTBEおよび/またはMTBEの異化代謝産物の少なくとも1つ、好ましくはTBA、2-M-1,2-PD、ヒドロキシイソブチルアルデヒド、およびHIBAの分解経路で活性を有する限り、本発明のポリペプチドの機能特性または性質の少なくとも1つを有する前記ポリペプチドのアミノ酸配列の断片と理解される。
【００２２】
好ましい実施形態によれば、MTBEおよび/またはMTBEの異化代謝産物の少なくとも1つを同化することができる細菌、その中で特に菌株M.austroafricanumの細菌、より好ましくは細菌I-2562またはI-3401がMTBEおよび/またはMTBEの異化代謝産物の少なくとも1つ、好ましくはTBA、2-M-1,2-PD、ヒドロキシイソブチルアルデヒド、およびHIBAを含む培地中に存在するとき、本発明のポリペプチドの発現が誘導される。その発現が高レベルで誘導されるポリペプチドは、図3中に示すa)、b)またはc)で定義したポリペプチド配列番号2、配列番号4および配列番号6であることが好ましい。
【００２３】
有利なことに、名称MpdCを有するa)、b)またはc)で定義したポリペプチド配列番号2は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する。MTBEの異化代謝産物経路では、本発明のポリペプチドMpdCは、ヒドロキシイソブチルアルデヒドを脱水素化してHIBAを与えることができることが好ましい。
【００２４】
有利なことに、名称MpdBを有するa)、b)またはc)で定義したポリペプチド配列番号6は、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する。MTBEの異化代謝産物経路では、本発明のポリペプチドMpdBは、2-M-1,2-PDを脱水素化してヒドロキシイソブチルアルデヒドを与えることができることが好ましい。
【００２５】
有利なことに、a)、b)またはc)で定義したポリペプチド配列番号8は、パーミアーゼ活性、好ましくはジ/トリペプチドパーミアーゼ活性を有する。前記ポリペプチドは、5つの膜貫通セグメントを含むことが好ましい。
【００２６】
有利なことに、名称MpdRを有するa)、b)またはc)で定義したポリペプチド配列番号10は、転写制御活性を有する。
【００２７】
本発明はさらに、少なくとも1つの本発明のポリペプチドをコードする任意の精製または単離核酸に関する。好ましくは本発明は、MTBEまたはMTBEの異化代謝産物の少なくとも1つ、好ましくはTBA、2-M-1,2-PD、ヒドロキシイソブチルアルデヒドおよびHIBAの分解経路で活性を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする任意の単離または精製核酸に関する。
【００２８】
本発明の文脈では、用語「核酸」と「DNA」は互換的に使用する。「核酸」とは、修飾または非修飾ヌクレオチドの正確な配列と理解され、これは、核酸の断片または領域の定義を可能にし、場合によっては非天然ヌクレオチドを含み、二本鎖DNA、一本鎖DNAまたは前記DNAの転写産物、および/またはRNA断片であってもよい。
【００２９】
好ましい実施形態では、本発明による核酸は、
e)配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7または配列番号9、またはその相補配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくともいずれか1つを含む核酸、
f)e)で定義した核酸のヌクレオチド配列と少なくとも70%の同一性、好ましくは75%、80%、90%、95%、98%または99%の同一性を有する少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む核酸、
g)アミノ酸配列の配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8または配列番号10のいずれか1つを含むポリペプチドの少なくとも1つの変異体をコードする核酸であって、e)またはf)で定義した核酸の相補配列とハイブリダイズする核酸、
h)その配列がその全長にわたり1つまたは複数のヌクレオチドの置換、欠失、挿入、付加または突然変異を含む、e)、f)またはg)で定義した核酸からなる群から選択される。
【００３０】
「相補配列」とは、そのヌクレオチドが配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7または配列番号9の配列のヌクレオチドと相補的であり、その配向が逆である任意の核酸が理解される。
【００３１】
2つの核酸配列またはアミノ酸配列間の「同一率」とは、本発明の目的で、比較する2つの配列間で同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸の割合が理解される。2つの核酸配列またはアミノ酸配列間の同一率は、有意にアラインメントするこれら2つの配列を比較することによって決定され、この場合比較する核酸配列またはアミノ酸配列は、これら2つの配列間で有意なアラインメントを生み出すための参照配列と比較して付加または欠失を含む可能性がある。ヌクレオチドまたはアミノ酸が2つの配列間で同一である同一位置の数を決定し、比較する位置の総数でこの同一位置の数を割り、および得られたこの結果に100を掛けてこれら2つの配列間の同一率を得ることによって、同一率を計算する。「有意なアラインメント」とは、本明細書において以下で決定する同一率が最高であるアラインメントが理解される。有意なアラインメントを得るためには、BLASTプログラムを使用することが好ましいはずである。
【００３２】
好ましい実施形態によれば、本発明の核酸は、e)、f)、g)またはh)で定義したヌクレオチド配列の配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7または配列番号9からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも2つ、好ましくは前記ヌクレオチド配列の3つ、より好ましくは前記ヌクレオチド配列の4つ、より好ましくは前記ヌクレオチド配列の5つを含む。
【００３３】
本発明の核酸は有利なことに、e)、f)、g)またはh)で定義した配列番号1および配列番号5、好ましくはe)、f)、g)またはh)で定義した配列番号1、配列番号3および配列番号5のヌクレオチド配列を含む。
【００３４】
本発明の核酸は有利なことに、配列番号11のヌクレオチド配列を含む。
【００３５】
好ましい実施形態では、本発明の核酸の転写は単一プロモーターの制御下にある。「プロモーター」とは、その5'端付近のオープンリーディングフレーム(ORF)の上流に位置する制御領域を意味する。本出願では、用語「ORF」と「遺伝子」は互換的に使用する。プロモーターはいくつかの特徴的なヌクレオチド配列を含み、これらの配列は転写開始複合体の結合を可能にし、転写制御エレメントの結合を可能にする。
【００３６】
他の好ましい実施形態によれば、本発明の核酸はその転写が、MTBEおよび/または好ましくはTBA、2-M-1,2-PD、ヒドロキシイソブチルアルデヒド、HIBAからなる群から選択されるMTBEの異化代謝産物の少なくとも1つの存在によって誘導されることを特徴とする。有利なことに本発明の核酸は、オペロンとして組織化されている。
【００３７】
好ましい実施形態では、本発明の核酸は、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7および配列番号9をコードする核酸を含むクラスターであり、ここで前記クラスターはmpdクラスターと呼ぶ。mpdクラスターは図7中に図式的に示す。
【００３８】
好ましい実施形態によれば、本発明の核酸は組換え核酸である。「組換え核酸」とは、本来の状態として存在しない配列の形で組み合わせたまたは並列する核酸の断片を含むように、ヒトの介入によって改変されている一本鎖または二本鎖核酸分子を意味する。
【００３９】
本発明はさらに、本発明の核酸を含む任意の発現および/またはクローニングベクターに関する。「ベクター」とは、自律的に複製し「宿主細胞」中に組み込むことができる、染色体外核酸分子、特にプラスミドを意味する。
【００４０】
クローニングベクターは典型的には、クローニングDNA断片の輸送を可能にするように設計し、核酸断片の挿入またはクローニングを可能にする1つまたは複数の制限酵素認識部位、および前記ベクターで形質転換される宿主細胞の同定および選択を可能にする遺伝子、抗生物質に耐性がある遺伝子などをコードする1つまたは複数のヌクレオチド配列を含む。
【００４１】
好ましい実施形態によれば、本発明の発現ベクターは、それがプロモーターの下流に挿入されるコードヌクレオチド配列を発現することができるような方法で設計する。挿入された配列または挿入体はここで転写され、次いでポリペプチドに翻訳されるはずである。本発明のベクターは有利なことに、宿主細胞中での少なくとも1つの本発明の核酸の発現を確実にするエレメントに隣接している。いくつかの発現ベクターは有利なことに、挿入部位またはクローニング部位の上流または下流にタグコード配列を有しており、挿入された核酸はここで転写され、次いで融合タンパク質の形に翻訳されるはずである。「融合タンパク質」とは、本発明の核酸によってコードされるポリペプチド、およびそれ自体が親和性マトリクスと結合することができる、かつ/あるいは融合するポリペプチドの検出および/または精製を可能にし得る抗体によって認識されるポリペプチドを含む、ハイブリッドポリペプチドを意味する。
【００４２】
他の好ましい実施形態によれば、本発明のベクターは、宿主細胞のゲノム中に存在する核酸配列と相同的であり、前記ゲノムへのその組み込みを確実にする、少なくとも1つの配列を含む。
【００４３】
本発明はさらに、少なくとも1つの本発明の核酸および/または少なくとも1つの本発明のベクターのいずれかを含む単離宿主細胞に関する。本発明の目的に使用することができる宿主細胞の中では、以下の細胞を述べることができる:原核細胞、好ましくは細菌細胞、より好ましくはMycobacterium smegmatis mc2155、大腸菌、Rhodococcus ruber(名称Gordonia terraeおよび番号CIPI-1885でCNCMコレクションに寄託された)からなる群から選択される細菌細胞。
【００４４】
本発明のポリペプチドは、当業者が熟知している任意の技法によって調製および/または入手することができる。特に、化学合成によってだけでなく、特にPCR、本明細書で前に記載したような発現ベクターおよび適切な宿主細胞を使用する分子生物学の技法によっても、本発明のポリペプチドを入手することができる。本発明のポリペプチドは好ましいことに、宿主細胞、特に細菌宿主細胞中でのその発現によって、MTBEおよび/または異化代謝産物の少なくとも1つの分解の要件を満たし、前記細菌の増殖を可能にすると考えられることを特徴とする。
【００４５】
本発明はさらに、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7または配列番号9からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片、好ましくは15、17、20、23、25、27、30、35、40、45または50個の連続したヌクレオチドの断片、または前記断片の核酸配列と少なくとも70%の同一性、好ましくは75%、80%、90%、95%、98%または99%の同一性を有する配列を有する断片を含むオリゴヌクレオチドプライマーに関する。
【００４６】
本発明はさらに、配列番号12のヌクレオチド配列の少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片、好ましくは15、17、20、23、25、27、30、35、40、45または50個の連続したヌクレオチドの断片、または前記断片の核酸配列と少なくとも70%の同一性、好ましくは75%、80%、90%、95%、98%または99%の同一性を有する配列を有する断片を含むオリゴヌクレオチドプライマーに関する。配列番号12の配列は、菌株M.austroafricanum I-2532の16SのrDNAのヌクレオチド配列に相当する。
【００４７】
本発明は、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7または配列番号9からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片、好ましくは15、17、20、23、25、27、30、35、40、45または50個の連続したヌクレオチドの断片、または前記断片の核酸配列と少なくとも70%の同一性、好ましくは75%、80%、90%、95%、98%または99%の同一性を有する配列を有する断片と相補的であるヌクレオチド配列を含むプローブに関する。
【００４８】
本発明はさらに、配列番号12のヌクレオチド配列の少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片、好ましくは15、17、20、23、25、27、30、35、40、45または50個の連続したヌクレオチドの断片、または前記断片の核酸配列と少なくとも70%の同一性、好ましくは75%、80%、90%、95%、98%または99%の同一性を有する配列を有する断片と相補的であるヌクレオチド配列を含むプローブに関する。
【００４９】
「プローブ」とは、放射性原子または蛍光基の取り込みによって標識され、その配列が目的とする核酸配列と実質的な相補性を有する核酸断片と理解され、後者はプローブとのハイブリダイゼーションによって検出されるはずであり、このハイブリダイゼーションは2つの相補配列が対形成すると生じる。「相補配列」とは、配列が連続した他の配列と相補的であり、したがってハイブリダイズすることができる一連の塩基で構成される、ヌクレオチド配列を意味する。200ヌクレオチドを超える大きさを有するプローブのハイブリダイゼーションは、Sambrook et al.(Molecular Cloning: A Laboratory Manual.Cold Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、ニューヨーク、2001)によって記載された修飾後に約60℃の温度で実施することが好ましい。
【００５０】
より詳細には本発明は、591塩基対のmpdB遺伝子の断片を含み、その配列が、配列番号14の配列または断片の核酸配列と少なくとも70%の同一性、好ましくは75%、80%、90%、95%、98%または99%の同一性を有する配列であるプローブに関する。
【００５１】
本発明はさらに、MTBEおよび/または好ましくはTBA、2-M-1,2-PD、ヒドロキシイソブチルアルデヒド、HIBAからなる群から選択されるMTBEの異化代謝産物の少なくとも1つを分解することができる細胞または細胞の核酸を同定する方法であって、
場合によっては、MTBEおよび/または好ましくはTBA、2-M-1,2-PD、ヒドロキシイソブチルアルデヒド、HIBAからなる群から選択されるMTBEの異化代謝産物の少なくとも1つを補充した培地上に細胞を播種する段階、
前記細胞の核酸と本発明のプローブの少なくとも1つとのハイブリダイゼーションによってスクリーニングする段階、および/または
前記細胞の少なくとも1つの核酸を少なくとも2つの本発明のオリゴヌクレオチドプライマーで増幅または重合させる段階を含む方法に関する。
【００５２】
好ましい実施形態によれば、MTBEおよび/またはMTBEの異化代謝産物の少なくとも1つを分解することができる新規の菌株の細胞は、それによって前記細胞の16SのrRNAを増幅させることができるオリゴヌクレオチドプライマーによって同定されるはずである。
【００５３】
有利なことに、プライマー対(5'-TGCACACAGGCCACAACCCA-3')および(5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')を、M.austroafricanum菌株の16SのrRNAのヌクレオチド配列の2つの可変領域を使用して設計している。このプライマー対は、それがMTBEおよび/またはMTBEの異化代謝産物の少なくとも1つを同化することができない他種の微生物、その中でも特に種Nocardiacaeの16SのrRNAを増幅させることができない限りは、種M.austroafricanumに特異的である(図12)。
【００５４】
本発明の方法を実施することによって、M.austroafricanumの新規の細菌菌株が同定されてきており、それは番号I-3401としてコレクションCNCMに寄託されている。その菌株は、MTBEを補充した石油の貯蔵タンクの底部から採取した表面水から単離されている。MTBEにおけるM.austroafricanum I-3401の増殖は、M.austroafricanum I-2562のそれと類似した分解経路をたどる(図10)。好ましいことに、新規の菌株M.austroafricanum I-3401は、それがMTBEおよび/または好ましくはTBA、2-M-1,2-PD、ヒドロキシイソブチルアルデヒドおよびHIBAからなる群から選択されるMTBEの異化代謝産物の少なくとも1つを同化することができるという事実によって特徴付けられる。さらに好ましいことに、新規の菌株I-3401は、配列番号13の配列を含む16SのrDNAの核酸配列によって特徴付けられる。
【００５５】
いずれもMTBEにおいて増殖することができ、2つの異なる遠隔の地理的起源(パリ地区の都市廃水プラントの精製単位由来の活性汚泥、およびフランスの南西に位置するMTBEを補充した石油の貯蔵タンクの底部から採取した表面水)から単離されている2つの菌株、M.austroafricanum、I-2562およびI-3401の個別の単離は、土壌および水サンプルから頻繁に単離される(Jones and Jenkins、Can.J. Microbiol.、1965、11: 127〜133 ; Viallier and Viallier、Ann. Soc.Belge Med.Trop.、1973、53: 361〜371)このような微生物は、汚染された帯水層中でのMTBEの分解において重要な役割を果たすことができることを実証する。
【００５６】
本発明はさらに、MTBEおよび/または好ましくはTBA、2-M-1,2-PD、ヒドロキシイソブチルアルデヒドおよびHIBAからなる群から選択されるMTBEの異化代謝産物の少なくとも1つで、汚染された場所の細菌、好ましくは菌株M.austroafricanumの細菌を検出および/または定量するためのキットであって、少なくとも1つの本発明のプローブおよび/または少なくとも2つの本発明のプライマーを含み、前記プローブおよび/または前記プライマーを、例えばDNAチップ(「マイクロアレイ」)において別々に、または組み合わせて使用することができるキットに関する。
【００５７】
より詳細には本発明は、その配列が配列番号14の配列、または配列番号14の配列と少なくとも70%の同一性、好ましくは75%、80%、90%、95%、98%または99%の同一性を有する配列であるプローブを含むDNAチップに関する。
【００５８】
本発明はさらに、アルデヒドデヒドロゲナーゼとしてのa)、b)またはc)で定義した配列番号2のポリペプチドの、好ましくはヒドロキシイソブチルアルデヒドからHIBAへの脱水素化のための使用に関する。
【００５９】
本発明はさらに、アルコールデヒドロゲナーゼとしてのa)、b)またはc)で定義した配列番号6のポリペプチドの、好ましくは2-M-1,2-PDからヒドロキシイソブチルアルデヒドへの脱水素化のための使用に関する。
【００６０】
最後に本発明は、MTBE、ETBEおよび/または好ましくはTBA、2-M-1,2-PD、ヒドロキシイソブチルアルデヒド、HIBAからなる群から選択されるMTBEの異化代謝産物の少なくとも1つを含む廃水を処理して、その濃度を低下させる方法であって、本発明の同定法によって同定した少なくとも1つの本発明の細胞を前記廃水に播種する段階を含む方法に関する。有利なことに、本発明の方法は、細胞が適切な支持体、好ましくは無機物支持体、より好ましくは少なくとも50重量%のパータイトを含む支持体と結合することを特徴とする。
【００６１】
本発明による方法は、MTBEおよび/またはMTBEの少なくとも1つの代謝産物で汚染されている帯水層または土壌の処理に非常に適している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６２】
本発明は以下の実施例によってさらに理解されるはずであり、これらの実施例は単なる例示的なものであり、決して本発明を制限するものとして理解すべきではない。
【００６３】
［実施例１］
MTBEにおける菌株M.austroafricanum I-2562の増殖後に誘導されたポリペプチドの同定
細胞質タンパク質をMTBEまたはグルコースにおける培養物から抽出して、MTBEを含む培地上でのM.austroafricanum細菌の増殖後に特異的に誘導されたタンパク質の存在を同定および検出した(図2)。
【００６４】
1.1.タンパク質抽出物の調製
菌株M.austroafricanum I-2562の細胞を、炭素源としてのMTBEまたはグルコースの存在下で、300mLの以前に記載された(Piveteau et al.、Appi.Microbiol.Biotechnol.2001、55: 369〜373)ミネラル培地(MM)において増殖させる。振とうしながら円錐形試験管中で30℃において、培養物を好気状態でインキュベートする。UV-1601分光光度計(Shimadzu Corporation、京都、日本)において吸光度(OD600nm)を測定することによって増殖を評価する。OD600nmが1であるとき、細胞を15分間20000×gでの遠心分離によって回収し、リン酸バッファー(20mM、pH7)で2回洗浄し、0.1Mジチオスレイトール(DTT)を含む5mLの50mMトリス-HClバッファー(pH=8.0)中に再懸濁させる。氷上に常に保ちながらフレンチプレス(20000psi)に3回通すことによって細胞を粉砕する。2分間1000×gでの2回の遠心分離によって細胞残骸を除去する。上清はタンパク質のプロファイルを分析するために使用する。全体のタンパク質濃度はBio-Radのキット(色素試薬、Bio-Rad laboratories GmbH、ミュンヘン、ドイツ)を使用して測定する。
【００６５】
1.2.可溶性タンパク質の分析
これらの抽出物の電気泳動は、移動条件(第一の時間中V=150ボルト、次に後の移動時間中は定数A=33mA)以外はLaemmliによって開発された方法に従い、SDSを含む10または15%ポリアクリルアミドを含むSDS-PAGEゲルにおいて実施する。12.5μgの全タンパク質をゲル上、試験する各炭素源用の各ウエル中に置く(Laemmli、Nature、1970、227: 680〜685)。
【００６６】
それぞれ10または15%アクリルアミドSDS-PAGEゲル上に示された高分子量および低分子量のタンパク質のプロファイルは、MTBEの存在によって特異的に誘導された異なる分子量の9個のタンパク質の検出を可能にした(図3)。
【００６７】
1.3.MTBEにおける増殖中に誘導されたポリペプチドMpdC(64kDa)の2つのペプチド配列の同定
内部シークエンシングプロトコル:
M.austroafricanum I-2562をMTBEにおいて増殖させた後のタンパク質のプロファイルにおいて特異的に誘導されたポリペプチドに相当する各ゲルのバンドを切除し、「ゲルにおいて」DTTでその後還元処理し、次いでジスルフィド架橋をヨードアセトアミドでアルキル化し(Jeno et al.、Analytical Biochemistry、1995、224: 75〜82)、次にトリプシンで消化する。使用した酵素は、Promegaからの「シークエンシンググレード」のトリプシンである(Helman et al.、1995、William et al.、In: Techniques VIII、Marshak、D.、ed.Academic Press、サンディエゴ、1997、79〜90)。このようにして生じるペプチドは、それぞれ100μLの1%TFAおよび60%アセトニトリルの存在下での60℃における30分間の3回の処理、次に10分間の超音波処理によって残りのゲル片から抽出する。最後の抽出は50μLの純アセトニトリルを用いて10分間実施する。4つの抽出物を混合し、液体体積を回転式エバポレータ(Savant AES1010)中で減少させて5μLの最終体積を得る。
【００６８】
ここでペプチドを、Applied Biosystems 130A分離システムを使用して、C18マイクロボアカラム(300Å;1×50mm No.218TP5105)でのHPLC(Vydac)によって分離する。3〜63分(0〜50%B)、63〜72分(50〜100%B)および72〜75分(100%B)のようにプログラムした溶媒混合物の勾配で、溶媒AとBの混合物を使用して100μL/minでペプチドを溶出させる。溶媒Aは0.1%TFA水溶液から構成され、溶媒Bは0.08%TFA70%アセトニトリルおよび水溶液から構成され、ペプチドは220nmでUV検出器によって検出する。異なる分画を1.5mLチューブ中に手作業で回収し、7μLのBiobrene(Applied Biosystems Inc.)を加えることによって前処理したガラスファイバーディスクに施す。Hewick et al.(J.Biol.Chem.、1981、256: 7990〜7997)によって記載されたプロトコルに従い、ディスクはProciseシークエンサー(モデル494cLC)においてエドマン分解に供する。
【００６９】
約1pmolに相当する量のペプチドをシークエンサーに供し、液相としてTFAを使用する標準プログラムをシークエンシングに使用する。フェニルチオヒダントインアミノ酸誘導体(PTH-aa)は標準(PTH-標準、ABI)と比較することによって決定し、シークエンシングの開始からキャピラリ分離システム(ABI140D)によってオンラインで分析する。
【００７０】
結果:
同定したタンパク質の中では、(MpdCという名称の)64kDaで移動するタンパク質が、最高誘導レベルを有するタンパク質である。相当するゲルバンドからの抽出、およびトリプシンを用いた消化、次に内部ペプチドのマイクロシークエンシングによって、このポリペプチドの2つの配列を得ることができた。
【００７１】
第一の内部配列(KQRGWAYDPNVRGLPE)のBLASTソフトウェアによる比較によって、有意な類似性は示されていない。対照的に、第二の内部配列(STEHGLEGTIDWPISYEELAPYYDENDAIY)のBLAST分析は、GMC酸化還元酵素ファミリーに属する多数のオキシダーゼおよびデヒドロゲナーゼと高度の類似性(93%)を示す(Cavener、J.Mol.Biol.、1992、223: 811〜814)。
【００７２】
［実施例２］
プローブの調製
2.1.ゲノムDNAの抽出
ゲノムDNAを異なる菌株から単離し、以下の50mLのLB培地を含む培養物(OD600nm0.7)を10000gおよび4℃における15分間の遠心分離によって採取する(Pospiech and Neumann、Trends In Genetics、1995、11: 217〜218)形式に改変したPospiechおよびNeumannのプロトコルに従って試験した。ペレットは5mlのSETバッファー(75mMのNaCl、25mMのEDTA、20mMのトリス-HCl、pH8)中に再懸濁させる。リソザイムは1mg.mL-1の最終濃度まで加え、リソスタフィンは112U.μL-1で加える(Sigma)。この反応混合物は37℃で1時間インキュベートする。混合物SDS/プロテイナーゼKを用いた処理後、抽出ステップを以下の反応混合物で実施し、この場合異なる反応物を連続的に加え:1/4体積の5MのNaCl、次に1/7.5体積の10%のCTAB-0.7MのNaCl(65℃に予め加熱)、この混合物は65℃で1時間インキュベートする。その後、1体積のクロロホルム(CHCl3)を加え、原型プロトコルに従い以下のステップを実施する。
【００７３】
2.2  204bpのプローブの調製
ポリペプチド配列中の配列対の2つの可能性を考慮に入れて、実施例1で得た2つのペプチド配列を使用して、共通の遺伝コードに従いいくつかの縮重プライマー対を作製した。これらのペプチド配列を知ることにより、遺伝コードによって相当するヌクレオチド配列を推定することができる。遺伝コードは、ヌクレオチド配列とペプチド配列の間の関係に相当する。したがって、ヌクレオチド配列、またはコドンの各ヌクレオチドトリプレットは1つ1つのアミノ酸に相当する。遺伝コードの縮重は、いくつかの同義コドンは同じアミノ酸の1つを指定することができることを意味する。結果として、いくつかのヌクレオチド配列を、遺伝コードによって1つのペプチド配列に関して推定することができる。この情報に基づいて、縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計および合成し、それらは目的とする核酸に対する高い特異性を有するプローブをもたらす増幅反応用のプライマーとして働く。
【００７４】
1つのプライマー対(MadF1/MadR1)は、M.austroafricanum I-2562の純粋なゲノムDNAから始めてPCRにより、204bpの核酸断片を得るのを可能にしている(図4)。
【００７５】
プライマーMadF1のヌクレオチド配列は、
5'-GGNTGGGCNTAYGAYCC-3'である。
【００７６】
プライマーMadR1のヌクレオチド配列は、
5'-GCRTCRTTYTCRTCSTAST-3'である。
【００７７】
ソフトウェアORFファインダー(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)によってアミノ酸配列を得ている。それは下記の配列によって表される。
【００７８】
【化１】
2009504140.tif 000002
【００７９】
このアミノ酸配列のBLAST分析によって、MpdCタンパク質がGMC酸化還元酵素のファミリーに属することを確認する。この分析により、いずれも同じファミリーに属する、Bradyrhizobium japonicum由来の推定コリンデヒドロゲナーゼとの62%の類似性(45のアミノ酸で44%の同一性)、Burkholderia cepaciaの菌株のグルコースデヒドロゲナーゼとの53%の類似性(76のアミノ酸で38%の同一性)、および酸化還元酵素との61%の類似性(47のアミノ酸で38%の同一性)が実証されるからである。
【００８０】
2.3.604bpのプローブの調製
この最初のPCR増幅中で得た情報の結果として、GMC酸化還元酵素のファミリーのタンパク質中に存在するいくつかの保存的モチーフを考慮に入れて、縮重プライマーを設計し合成した。プライマー対の1つ(MadF2/MadR2)は、604bpの新規の核酸を得るのを可能にしている。
【００８１】
プライマーMadF2のヌクレオチド配列は、
5'-TTCACCTTGTTGGAACCGCTGGG-3'である。
【００８２】
プライマーMadR2のヌクレオチド配列は、
5'-TCATTACCGAGCCGACCTGC-3'である。
【００８３】
これらのプローブはdUTP/ジゴキシゲニン(DIG DNA標識および検出キット;Roche Diagnostics、Lavalカナダ)で標識する。
【００８４】
［実施例３］
核酸配列番号11のクローニング
3.1.サザンブロット
サザンブロットの実験を、実施例1中で調製したのと同じ菌株M.austroafricanum I-2562のゲノムDNAを用いて実施した。5μgのゲノムDNAを、その制限部位BamHI、EcoRI、FspI、KnpI、NheI、Nru、PstI、PvuIIまたはSmaIに基づいて選択した制限酵素によって部分的に消化する(それぞれウエル2〜8、図5中)。ゲル中での移動後、消化されたDNAはナイロン膜に移す。dUTP/ジゴキシゲニン標識した204bpのプローブ(DIG DNA標識および検出キット;Roche Diagnostics、Lavalカナダ)によって、消化された核酸のハイブリダイゼーションによるスクリーニングをこれに続ける。この204bpのプローブは、2kbと12kbの間の核酸断片と特異的にハイブリダイズする(図5)。ジゴキシゲニン標識した分子量マーカーIII(Roche;ウエル1およびウエル9)のDNAの移動に相当する位置は、ルミノグラフの左側に示す。
【００８５】
3.2.ミニライブラリーの構築、スクリーニングおよびクローニング
これらの核酸断片を、SmaIによる消化後にプラスミドpBluescriptIIKS(pBKS)(+/-)にクローニングする。組換えプラスミドは、調製したコンピテント大腸菌DH10B細菌(Hanahan、D.et al.、Methods Enzymol.1991、204: 63〜113)を形質転換するのに使用する。組換えプラスミドを有する細菌クローンから得られる、それぞれの細菌コロニーをニトロセルロース膜に移し、実施例2.3.中で得た604bpのプローブを用いるコロニーハイブリダイゼーションによってスクリーニングする。それぞれの陽性クローン、すなわちプローブとハイブリダイズするそれぞれのクローンに関して、組換えプラスミド(pKS1)を抽出し、QIAprep Spin Miniprepキット(Qiagen、Mississauga、カナダ)によって精製する。様々な大きさを有するプラスミドの出現をもたらす、プラスミドpBKS内のSmaI断片の高度の不安定性を考慮して、10μgのプラスミドpBKS1をSmaIで消化し、次にゲル抽出した。SmaIバンドは低融点ゲル上での移動後に抽出によって抽出した。約600〜1000の塩基対をそれぞれの抽出中に得て、およびその後、約12の抽出物が完全な配列を得るのに必要であった。mpdC遺伝子の5'部分上流を欠く配列を分析した後、前と同じ技法を使用して、ただし第一挿入体と重複しプライマー対MF3/MR3によって得られる914bpのプローブを使用して、新たなミニライブラリーを樹立して5.6kbのPstI断片を得た。「コロニーハイブリダイゼーション」によって増大させた陽性クローンからプラスミドpKS3を単離した(図6)。プローブによって検出したPstI-PstI断片は、このようにして前と同じプロトコルに従いクローニングして、組換えプラスミドpKS3を得た。
【００８６】
このプラスミド中に存在するPstI挿入体の全体を、T7DNAポリメラーゼ(T7-DNAシークエンシングキット、Applied Biosystems、Foster City、CA)およびシークエンサー(ABTprism377自動式蛍光シークエンサー;Applied Biosystems、Foster City、CA)によってプライマーウォーキング技法に従いシークエンスした。ヌクレオチド配列および相当するアミノ酸は、National Center for Biotechnology Information(NCBI)のBLASTNおよびBLASTXソフトウェアを使用してEMBL、SwissprotおよびGenBankのデータベース中に存在するものと比較した。
【００８７】
［実施例４］
M.austroafricanum I-2562の配列番号11中の異なるオープンリーディングフレーム(ORF)の同定および特徴付け
実施例3中に記載した2つのクローニングステップから得た、PstI/SmaIのDNA配列の配列番号11中に存在するオープンリーディングフレームの分析は、「ORFファインダー」ソフトウェアによって実施した。5つのコード配列:配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7および配列番号9を同定しており、これらはポリペプチドの配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8および配列番号10をそれぞれコードする(本明細書の以下の表参照)。
【００８８】
【表１】
2009504140.tif 000003
【００８９】
したがって、64kDaのMpdBポリペプチドのアミノ酸配列の配列番号6と、第一ポリペプチド配列ならびに204および604bpのPCR増幅を関連付けることができている。このmpdB遺伝子は、3つの他のORF、それぞれ55、27および25kDaのタンパク質をコードするmpdC、orf1およびorf2を同じ方向に含む遺伝子配列中に存在する。このクラスターの上流で、第一クラスターと反対方向に位置し47kDaのタンパク質をコードする、新規の遺伝子を同定しmpdRと名付けた。この系の配列は図7中に図式的に示す。
【００９０】
4.1.ORF mpdC、配列番号1
本明細書で以下に図式的に示すBLASTソフトウェアによる分析によって、アルデヒドデヒドロゲナーゼのファミリーに属する多数のデヒドロゲナーゼとの高度の類似性を示す。このORFによってコードされるポリペプチドの配列番号2は、その発現がMTBEにおいて誘導される55kDaのポリペプチドに相当する。このポリペプチドは、ヒドロキシブチルアルデヒドを脱水素化してHIBAを得ることができる。
【００９１】
【化２】
2009504140.tif 000004
【００９２】
【表２】
2009504140.tif 000005
【００９３】
4.2.ORF orf1、配列番号3
このORFによってコードされるポリペプチドの配列番号4は、その発現がMTBEにおいて誘導される27kDaのポリペプチドに相当する。
【００９４】
4.3.ORF mpdB、配列番号5
このORFによってコードされるポリペプチドの配列番号6は、その発現がMTBEにおいて誘導される64kDaのポリペプチドに相当する。GMC(グルコース-メタノール-コリン)酸化還元酵素のファミリーに属する多数のオキシダーゼおよびデヒドロゲナーゼとの、高度の類似性が存在する。より正確には、「NCBI保存的ドメイン検索」ソフトウェアによる分析によって、同じファミリーに属するコリンデヒドロゲナーゼをコードするbetA遺伝子によってコードされる、タンパク質との類似性を検出している。推定アミノ酸配列は、MTBEにおいて特異的に誘導されヒドロキシブチルアルデヒドへの2-M-1,2-PDの変換を担う64kDaのタンパク質の、N-末端配列および2つの内部配列と関係がある可能性がある。
【００９５】
【化３】
2009504140.tif 000006
【００９６】
【表３】
2009504140.tif 000007
【００９７】
4.4.ORF orf2、配列番号7
このORFによってコードされるポリペプチドの配列番号8は、25kDaのポリペプチドに相当する。BLAST分析によって、ジ/トリペプチドパーミアーゼとの相同性を示している(COG3104:ジペプチド/トリペプチドパーミアーゼ[Rubrivivax gelatinosus PM1]長さ=372、期待値=2e-24)。ソフトウェア「Predict Protein」を用いた、このタンパク質のヒドロパシーの分析によって、その配列を本明細書で以下に図式的に示す5つの膜貫通セグメントの存在を明らかにしている。
【００９８】
このポリペプチドの発現は、おそらくMTBEの存在下で誘導される。
【００９９】
したがってこのタンパク質は、M.austroafricanum種の細菌の膜において見られる。
【０１００】
【化４】
2009504140.tif 000008
【０１０１】
4.5.ORF mpdR、配列番号9
このORFによってコードされるポリペプチドの配列番号10は、47kDaのポリペプチドに相当する。このORFは前の4つのORFの上流に位置し、図7中に示すように他の方向を向いている。BLAST分析によって、この配列の最初の半分と多数のσ54転写活性化因子、特にAcoR型転写活性化因子の類似性を明らかにする。
【０１０２】
【表４】
2009504140.tif 000009
【０１０３】
これらの分析によれば、このポリペプチドの発現がMTBEプロファイルにおいて特異的に誘導されるか、あるいはされないかを検出することはできないが、RT-PCR分析においてその発現を検出することはできる。おそらくそれは、mpd遺伝子の発現の制御において役割を果たす。
【０１０４】
［実施例５］
RT-PCRによるmpd遺伝子クラスターの発現
5.1.M.austroafricanum I-2562のmRNAの抽出
RNAの抽出実験用に、標準的な手順(Sambrook et al.、Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、ニューヨーク、2001)に従って、全てのツール、全ての溶液および容器は、RNaseによる汚染を避けるように調製した。
【０１０５】
M.austroafricanum I-2562の全RNAは、0.7のOD600nmを有する20mLの培養物と共に抽出した。氷上で30分間のインキュベーション後、細胞を遠心分離にかけ(4℃において10分間8000×g)、氷上に保った。その後、3mg.mL-1の濃度で600μLのリソザイム(Roche Diagnostics、Laval、カナダ)、および50μg.mL-1の濃度で600μLのリソスタフィン(Sigma、St-Louis、Missouri)を細胞ペレットに加え、混合物は37℃で10分間インキュベートする。その後、10mlのRNAwiz(商標)(Ambion、Austin、Texas)を加え、混合物は15秒間攪拌する。次いで混合物を250mgのジルコニウム-シリカビーズ(0.1mm径)を含む2mLチューブ(1400μL/チューブ)に分け、攪拌用アダプター(Ambion)中に置き、10分間攪拌する。遠心分離(4℃において5分間13000×g)後、各チューブの上清に相当する細菌溶解物を新たな2mLチューブに移し、0.2体積のCHCl3を各チューブに加える。次いでチューブを30秒間攪拌し、室温で10分間インキュベートし、次いで遠心分離にかけ(4℃において5分間13000×g)、次いで上清は新たな2mLチューブに移した。RNA抽出物は0.5体積のDEPC処理H20、1体積のイソプロパノールおよび1/50体積の無RNaseグリコーゲン(Ambion)を5mg.mL-1の濃度で連続的に加えることによって沈殿させ、完全に混合し、室温で10分間インキュベートする。RNAは遠心分離にかけ(4℃において5分間13000×g)、70%エタノールで2回洗浄し、30秒間乾燥させ(DNA Speed Vac、Savant)、DEPCH20中に再懸濁させる(25μL/チューブ)。RNAの質は、0.5×TBEバッファー(Trizma Base45mM、45mMのホウ酸、1mMのNa2EDTA、pH=8.3)中の1%強度の非変性アガロースゲルによる電気泳動によって決定した。RNAは1/10体積の3M酢酸ナトリウム、pH=7.0、および2.5体積の95%エタノールを用いて沈殿させ、次いで-80℃に保つ。
【０１０６】
5.2.DNaseを用いた処理、および逆転写酵素PCR(RT-PCR)
M.austroafricanum I-2562から抽出した2mgのRNAを、製造者の推奨に従い「DNA-Free」キット(Ambion、Austin、Texas)を用いて処理した。DNAの除去は、mpdクラスター内で作製した特異的プライマーを使用するPCR増幅によって、および1%アガロースゲル上での電気泳動によって確認した。最終RNA濃度は、Nanodrop(Nanodrop Technologies、Wilmington、USA)によって260nmで定量測定した。逆転写酵素PCR(RT-PCR)の実験は、製造者によって記載されたのと同様に、Qiagen(Qiagen、Mississauga、カナダ)からのキットの「ワンステップRT-PCR」プロトコルに従い実施した。M.austroafricanum I-2562由来の100ngのgDNAを用いる(あるいは用いない)陽性(および陰性)対照PCR増幅を平行して毎回実施しながら、120ngのRNAを各RT-PCR実験用に使用する。RT-PCRの条件は本明細書で以下に記載する。
-逆転写ステップ:
1)50℃で30分間
2)50℃で∞
-PCRステップ:
95℃で15分間
30〜40サイクル(シグナルの強度に依存する変数):
1)94℃で30秒間
2)55℃で1分間
3)72℃で1分間
-最終延長ステップ:
1)72℃で10分間
2)4℃で∞
【０１０７】
5.3.TBAにおけるM.austroafricanum I-2562の増殖中のRT-PCRによるmpd遺伝子クラスターの発現
mpd遺伝子の発現を、TBA、MTBE生物分解の主要中間体(図1参照)において細菌を増殖させた後に試験する。異なるmpd遺伝子と重複するプライマー対を作製して(本明細書の以下の表参照)、このクラスターに相当するmRNAはモノシストロンに転写されたことを確認した。全RNAをTBAにおける増殖後にクラスターから抽出し、RT-PCR反応を異なるプライマーを用いて実施する。これらの実験の結果は、図8中に示し、mpd遺伝子クラスターの転写は、モノシストロン性である可能性が非常に高く、これらの遺伝子はオペロンとして組織化されている(Ma et al.J.Bacteriol.、2002、184: 5733〜5745)ことを実証する。
【０１０８】
表:PCRおよびRT-PCR増幅実験の全てにおいて使用したプライマー:
【０１０９】
【表５】
2009504140.tif 000010
【０１１０】
［実施例６］
菌株M.SMEGMATIS MC2155の細菌中でのmpd遺伝子の発現
6.1.mpd遺伝子を含む発現ベクターの構築、および細菌の形質転換
遺伝子配列mpd中に含まれる遺伝子を、2ステップでベクターpCL4D中に挿入した(Picardeau et al.、Microbiology、2000、146: 305〜313)。最初に、プラスミドpKS1中に存在する4401塩基対の長さを有するNotI-NotI断片をNotI(NEB、Pickering、カナダ)で消化し、pCL4DのHincII部位にクローニングした。化学的にコンピテントな大腸菌DH10B細胞を形質転換、および20μg.mL-1のカナマイシンを含むLB培地における形質転換体の選択に使用した。組換えプラスミドp4D1を含む陽性クローンは、正方向および逆方向プライマーによるPCR増幅によって検出する(実施例5中の表)。第二ステップ中に、mpdC遺伝子、mpdR遺伝子およびorf3の欠失部分を含む5574bpのPstI断片を、酵素PstIでプラスミドpKS3を消化することによって抽出した。PstIで事前に消化したプラスミドp4D1中にこの断片を導入し、これによってプラスミドp4D1中に存在する914bpのプローブに相当するPstI断片を除去することができた。mpdクラスターの全てを含む組換えプラスミドp4D2中のPstI断片の方向は、PCRによって確認した。
【０１１１】
クローニングした遺伝子の全てを発現させるために、エレクトロポレーション技法を使用して、ベクターp4D2を菌株M.smegmatis mc2155のコンピテント細胞中に導入した。この形質転換中に得た1つの形質転換体(菌株M.smegmatis mc2155-クローン9)を、カナマイシン(20μg.mL-1)を含むLB皿上で単離した。挿入体を含まないプラスミドpCL4Dも、菌株M.smegmatis mc2155の細菌中に導入して(菌株M.smegmatis mc2155-pCL4D)、対照として働かせる。
【０１１２】
6.2.M.smegmatis mc2155中でのmpdBおよびmpdC遺伝子の機能的発現
M.smegmatis mc2155-クローン9の細菌(挿入体含む)、およびM.smegmatis mc2155-pCL4Dの細菌(対照)を、20μg.L-1のカナマイシンを含むLB培地上に保つ。この2つの菌株は、20μg.L-1のカナマイシンを含む200mLのLB培地において、30℃で72時間増殖させる。M.smegmatis mc2155-クローン9およびM.smegmatis mc2155-pCL4Dの細胞は遠心分離(13000gで15分間)によって採取し、2回洗浄し、密封120-mLバイアル中の試験する基質(MTBE、TBA、2-M-1,2-PDまたはHIBA)を含む40mLのリン酸バッファー(20mM、pH7)中に懸濁させる。播種後、バイアルは回転式攪拌機において37℃でインキュベートする。必要な場合、濾過滅菌した水溶液(0.22μm)からのクロラムフェニコールを加えて、400mg/L-1の最終濃度を得る。これらの培養物の濾過サンプルはGCまたはHPLCによって分析する。基質の分解は24時間の間に調べる。特異的活性(mg分解基質.g-1バイオマス.h-1)は、最高分解速度に基づいて計算する。
【０１１３】
6.3.M.austroafricanum I-2562から単離したmpd遺伝子クラスターのM.smegmatis mc2155中での発現
M.austroafricanum I-2562のmpd遺伝子クラスターを含む9.1kbの断片、配列番号11は、プラスミドpCL4Dにクローニングした(Picardeau et al.2000)。p4D2という名称のこのプラスミドは、M.smegmatis mc2155を形質転換するために後に使用した。この形質転換も、対照としてプラスミドpCL4Dを用いて実施した。2つの形質転換体:M.smegmatis mc2155-クローン9(p4D2を含む、およびしたがってmpd遺伝子を有する)およびM.smegmatis mc2155-pCL4D(ベクター、pCL4Dを有する)を選択した。2つの菌株はカナマイシンを含むLB培地上で増殖させ、MTBE、TBA、2-M-1,2-PDおよびHIBAを分解する静止細胞の能力の実験において後に試験した。M.smegmatis mc2155-クローン9およびM.smegmatis mc2155-pCL4Dに関して、MTBE、TBAまたはHIBAの分解は観察されなかった(表2)。
【０１１４】
2-M-1,2-PDの分解およびHIBAの化学量論的生成(それぞれ312.1±2.3μM分解、および311.6±4.5μM生成)は、菌株M.smegmatis mc2155-クローン9の存在下のみで観察された(図9)。菌株M.smegmatis mc2155-pCL4Dの存在下あるいは非生物対照において、2-M-1,2-PDの分解は観察されなかった。2つの菌株を完全LB培地上で増殖させると、相当する酵素を生成するために遺伝子の誘導が必要であった、このため2-M-1,2-PDの存在下での4時間のインキュベーション前に分解は起こらない。タンパク質へのmRNAの翻訳を阻害することが知られているクロラムフェニコールと2-M-1,2-PDの存在下で、M.smegmatis mc2155-クローン9の細胞をインキュベートすると、2-M-1,2-PDの分解は観察されない。
【０１１５】
菌株M.smegmatis mc2155-クローン9による2-M-1,2-PDの最大分解速度を計算した、それは2.34±0.41μmol.g-1(乾燥重量).min-1である。
【０１１６】
［実施例７］
MTBEにおいて増殖することができる新規の菌株M.AUSTROAFRICANUM I-3401の同定
MTBEを補充した石油の貯蔵タンクの底部から採取した表面水を、200mg.L-1のMTBEを含むMMミネラル培地の播種用に使用した。MTBEはゆっくりと、ただし完全に140日間で使用した。皿およびLB培地プレート上での画線培養後に、コロニーを形成した全ての細菌を個別に再度単離し、一炭素およびエネルギー源としてMTBEを含むMM上で増殖するそれらの能力を次いで試験した。桿体を形成しLB培地皿上で黄色いコロニーの形で増殖する1つの偏性好気性グラム陽性菌を単離し、これはMTBEにおいて増殖することができることが分かった。
【０１１７】
菌株I-3401の16SのrDNAを両鎖において完全にシークエンスし、遺伝子hsp65は部分的にシークエンスした。16SのrDNAの配列は、新規の菌株I-3401、配列番号13はM.austroafricanum I-2562に非常に近く、7個のヌクレオチドが異なる(I-3401中で5つの置換および2つの挿入)ことを実証する。この遺伝子hsp65の配列は、M.austroafricanumの典型的な菌株(参照)の遺伝子hsp65の配列と8ヌクレオチド異なる。MTBEにおいて増殖するM.austroafricanum I-3401の能力を実証した(図10)。
【０１１８】
［実施例８］
M.AUSTROAFRICANUMの16SのrDNAに対する特異性を有するプライマー、および特異的PCR条件の作製
8.1.菌株M.austroafricanum I-2562の16SのrDNAおよびhsp65遺伝子の分析
新規の菌株I-3401を同定するために、16SのrDNAのPCR増幅は、プライマー対Bott1正方向/Bott2逆方向(実施例5の表参照)を使用して実施した。増幅産物はQiagenキット(Qiagen、Mississauga、Ontario、カナダ)を使用して精製し、ヌクレオチドのシークエンシングはプライマー244(実施例5の表参照)を使用して実施した。hsp65遺伝子のPCR増幅は、正方向プライマーTb11および逆方向プライマーTb12(実施例5の表参照)を使用して実施した。増幅産物はQiagenキットを用いて精製し、シークエンシングはプライマーTb11を使用して実施した。シークエンシング反応は、ユーバクテリアの16SのrDNAのシークエンシング用に使用した25ngの精製DNAおよび15μmolの共通プライマーを使用して製造者によって記載されたのと同様に、BigDyeサイクルターミネーターシークエンシングキット(Version 3.1、Applied Biosystems、Foster City、CA、USA)を用いて実施する。反応は以下のようにプログラムする:96℃で10秒間、50℃で5秒間、および60℃で4分間の25サイクル。シークエンシング産物は製造者(Princeton Separations、Inc.、Adelphia、NJ、USA)によって記載されたのと同様にCentri-Sepカラムで精製して、過剰なターミネーターを除去する。シークエンシング反応は、ABTprism377自動式蛍光シークエンサー(Applied Biosystems、Foster City、CA)を使用して実施する。得られたヌクレオチド配列はEMBL/GenBank遺伝子データベース中の配列と比較し、同一性はBLASTアラインメントシステム(Altschul et al.、1997)を使用して評価する。
【０１１９】
8.2.PCR特異的条件およびプライマーの作製
M.austroafricanum I-2562および関連マイコバクテリウム種の16SのrDNAの配列をアラインメントをとり、保存配列と可変配列を比較する。これらの多数のアラインメントの分析に基づいて、種M.austroafricanumに特異的である様々なプライマー対を、BLASTデータベース検索プログラム(Altschul et al.Nucleic Acids Res.、1997、25: 3389〜3402)を使用して入手可能な16SのrDNAの配列と比較する。Amplifyソフトウェアを使用することによって、これらの配列をさらに分析して、それらの変性温度(TM)、二量体を形成する確率、およびそれらの(G+C)含有量を測定した。最も有効なプライマー対は、MaFV2正方向およびMaRV6逆方向(実施例5の表参照)であった。PCR産物の予想される大きさは331bpである。
【０１２０】
PCR反応は以下の形式で実施する:各チューブは、菌株の集合体、Mycobacterium austroafricanumの菌株を新たに画線培養した皿から単離したコロニーの溶解物の10分間の沸騰によって得た5μLのゲノムDNA、またはM.austroafricanum I-2562を播種したバイオバリア由来のサンプル、2.5単位のTaqDNAポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)、5μLの10倍希釈TaqDNAポリメラーゼバッファー(Amersham pharmacia biotech)、25pmolの各プライマー、4μLの2.5mMデオキシリボヌクレオチド三リン酸(それぞれ200μM:dATP、dGTP、dCTPおよびdTTP)、2μLの25mMMgCl2、および50μLの最終体積まで滅菌蒸留水を含む。陰性対照は本明細書で前に記載したのと同じ混合物を含む、ただしDNAは滅菌水に置き換える。サンプルはBio-Rad Thermal iCycler装置(Bio-Rad、Mississauga、オンタリオ、カナダ)中において95℃で3分間予め加熱し、サンプルを酵素混合物TaqDNAポリメラーゼ/10倍希釈バッファーに加える前に、次いで温度を80℃に低下させる。特異的増幅条件を得るために、増幅条件は以下の通りである:94℃で30秒間、68℃で1分間、72℃で1分間を30サイクル繰り返し、最終延長は72℃で7分間実施する。アガロースゲル電気泳動を実施する時間地点まで、PCRチューブは4℃に保つ。10μLの各PCR産物は、30%(v/v)グリセロール、0.15%(w/v)ブロモフェノールブルー、0.15%(w/v)キシレンシアノールを含む2μLのローディングバッファーと混合させる。このようにして調製した異なるPCR産物、および1kbのDNAマーカーGeneRuler(商標)(MBI Fermentas Inc.、Burlington、オンタリオ、カナダ)は、TAEで調製した1%(w/v)アガロースゲル上に施す。移動後、ゲルは臭化エチジウムで染色し、トランスイルミネーターで254nmにおいてUV線で現像する。ゲルはPolaroidフィルムタイプ57を使用して写真撮影する。
【０１２１】
［実施例９］
新規の菌株M.AUSTROAFRICANUM I-3401中のmpd遺伝子配列の存在の検出
菌株M.austroafricanum I-3401によるMTBEの生物分解はM.austroafricanum I-2562のそれと類似していたので、新規の菌株中のmpdクラスターの存在または不在を試験した。したがって、mpdクラスターの異なる遺伝子において特異的に増幅するプライマー対MF1/MR1、MF2/MR2、MF3/MR3およびMF4/MR4を作製した(実施例5の表)。M.austroafricanum I-3401またはI-2562(後者は陽性対照として)のゲノムDNAにおけるPCR増幅を実施し(図11)、全てのプライマー対に関して陽性増幅を示す。このことは、新規の菌株M.austroafricanum I-3401のゲノム中のM.austroafricanum I-2562のmpd遺伝子のそれと類似した、遺伝子配列の存在を実証する。したがって、この新規の菌株は、MTBEの異化中に2-M-1,2-PDを同化するために、同じ反応経路を使用する可能性がある。
【０１２２】
［実施例１０］
PCRによるM.AUSTROAFRICANUM I-2562およびI-3401の特異的検出
種M.austroafricanumに特異的であるプライマーMaFV2およびMaRV6を作製した(実施例5の表参照)。M.austroafricanum I-2562の16SのrDNAの2つの可変領域V2およびV6においてアニーリングする、これらのプライマーの特異性は、多かれ少なかれ密接に関連した菌株のゲノムDNAを使用して評価した。図12中に示す結果は、MTBEを代謝するM.austroafricanum、すなわちI-2562およびI-3401の2つの菌株のゲノムDNAのみが、陽性PCR増幅産物を得るのを可能にすることを実証する。これらのプライマーを用いて、この種の微生物を特異的に検出することがしたがって可能である。Nocardiaceae属の他の微生物はPCR増幅を示さない。
【０１２３】
［実施例１１］
菌株I-2562とI-3401の間の比較
【０１２４】
【表６】
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【０１２５】
菌株I-2562と菌株I-3401の間の重要な違いは、ETBEを分解するそれらの能力である。同等のETBE濃度(130mg/L)では、M.austroafricanum I-2562は100日以内でETBEを分解し、一方でI-3401は3倍速くこの分解を実施する。他方で、基質として直接使用したときの2-M-1,2-PDの分解速度は、I-3401中よりI-2562中で約7倍を超えて速い。最後に、この2-M-1,2-PDの分解速度の違いのために、I-3401中でのtert-ブチルアルコール(TBA)の分解中に2-M-1,2-PDの存在を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】M.austroafricanum I-2562によるMTBEの分解の代謝経路の図である。  本発明者らの実験中に同定した分解中間体は太字で示す。
【図２】MTBEにおけるM.austroafricanum I-2562の増殖の図である。増殖中、OD600nm(◇-◇)およびMTBE(■-■)、TBF(△-△)およびTBA(□-□)濃度を測定した。
【図３】ＡはグルコースまたはMTBE上での増殖後に得たM.austroafricanum I-2562由来の細胞抽出物のSDS(SDS-PAGE)の存在下での、10%のポリアクリルアミドゲル上での電気泳動の図である。分子量(kDa単位)は図の右側に示す。ＢはグルコースまたはMTBE上での増殖後に得たM.austroafricanum I-2562由来の細胞抽出物のSDS(SDS-PAGE)の存在下での、15%のポリアクリルアミドゲル上での電気泳動の図である。分子量(kDa単位)は図の右側に示す。
【図４】MTBEにおいて誘導した64kDaポリペプチドのペプチド内部配列を使用して作製した縮重プライマーを用いた、M.austroafricanum I-2562のゲノムDNAのPCR増幅の図である。
【図５】204bpプローブを使用した消化後の、M.austroafricanum I-2562のゲノムDNAのサザンブロットハイブリダイゼーションの図である。発達したバンドの大きさはkb単位で示す。5μgのM.austroafricanum I-2562のゲノムDNAは制限酵素BamHI、EcoRI、FspI、KnpI、NheI、Nru、PstI、PvuIIまたはSmaIで消化し(それぞれウエル2〜8)、および50ngの204bpプローブ(ウエル12)は、204bpプローブを使用してサザンブロットによって分析する。ジゴキシゲニン標識した分子量マーカーIII(Roche;ウエル1およびウエル9)のDNAの移動に相当する位置は、ルミノグラフの左側に示す。
【図６】左図は604bpのプローブを用いた大腸菌DH10Bの組換えクローンの「コロニーハイブリダイゼーション」の図である。  SmaIによるM.austroafricanum I-2562の消化の結果である第一クローンを含む膜のルミノグラフ。陽性クローン(黒い斑点)はジゴキシゲニン標識したmpdCプローブを用いて検出する。604bpのプローブを用いた大腸菌DH10Bの組換えクローンの「コロニーハイブリダイゼーション」の図である。  右図はPstIによるM.austroafricanum I-2562の消化の結果である第一クローンを含む膜のルミノグラフ。陽性クローン(黒い斑点)はジゴキシゲニン標識したmpdBプローブを用いて検出する。
【図７】↓図はMTBEの分解経路と関係がありM.austroafricanum I-2562のゲノムDNAから単離した、遺伝子のクラスターの編成の図である。  ORFmpdRは転写制御因子をコードし、ORFmpdCおよびmpdBは、それぞれアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素およびアルコールデヒドロゲナーゼ酵素をコードする。64、55および27kDaの3個のポリペプチドはいずれも、MTBEでのM.austroafricanum I-2562の増殖後高レベルで発現する。25kDaのポリペプチドはパーミアーゼである。プライマー対RT-PCR-F1/-R1、RT-PCR-F2/-R2およびRT-PCR-F3/-R3によって実施した増幅から得たPCR断片は、図7中に図式的に示す(I、IIおよびIIIで番号処理した断片)。上図はこれらの遺伝子の相当する制限地図である。  ORFmpdRは転写制御因子をコードし、ORFmpdCおよびmpdBは、それぞれアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素およびアルコールデヒドロゲナーゼ酵素をコードする。64、55および27kDaの3個のポリペプチドはいずれも、MTBEでのM.austroafricanum I-2562の増殖後高レベルで発現する。25kDaのポリペプチドはパーミアーゼである。プライマー対RT-PCR-F1/-R1、RT-PCR-F2/-R2およびRT-PCR-F3/-R3によって実施した増幅から得たPCR断片は、図7中に図式的に示す(I、IIおよびIIIで番号処理した断片)。
【図８】mpdクラスターに相当するプライマーを使用する、TBAでの増殖後のM.austroafricanum I-2562のRT-PCRの図である。  使用したプライマーは本明細書の以下の表中に述べる。キー:ウエル1:C-PCRI、ウエル2:C+PCRI、ウエル3:(-)RT-PCRI、ウエル4:(+)RT-PCRI、ウエル5:C+PCRII、ウエル6:(-)RT-PCRII、ウエル7:(+)RT-PCRII、ウエル8:C+PCRIII、ウエル9:(-)RT-PCRIII、ウエル10:(+)RT-PCRIII、ウエル11:DNAマーカー(100bp)。
【図９】M.smegmatis mc2155-クローン9細胞(四角形)およびM.smegmatis mc2155-pCL4D細胞(三角形)による2-M-1,2-PDの分解の動態の図である。  2-M-1,2-PDの分解(中実記号)およびHIBAの生成(中空記号)。非生物対照(◇-◇)。400mg.L-1のクロラムフェニコールの存在下でのM.smegmatis mc2155-クローン9の細胞(x-x)。  M.smegmatis mc2155-クローン9およびM.smegmatis mc2155-pCL4Dの細胞濃度は、それぞれ233.33±14.09および214.63±21.95mg.L-1であった。
【図１０】MTBEにおけるM.austroafricanum I-3401の増殖の図である。増殖中、OD600nm(◆-◆)および残留MTBE(□-□)、TBF(△-△)およびTBA(▲-▲)濃度を測定した。
【図１１】M.austroafricanum I-3401のゲノムDNAにおけるmpdクラスターのPCR増幅の図である。  キー:  MM:1kbのDNAマーカー、  ウエル1および6:47kDaのポリペプチドをコードする配列番号9の増幅。  ウエル2および7:55kDaのアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする配列番号1の増幅。  ウエル3および8:27kDaのタンパク質をコードする配列番号3の増幅。  ウエル4および9:64kDaのアルコールデヒドロゲナーゼをコードする配列番号5の増幅。  ウエル5および10:25kDaのタンパク質、推定パーミアーゼをコードする配列番号7の増幅。  C1およびC2:それぞれM.austroafricanum I-2562およびI-3401のゲノムDNAのプライマーを含まない陰性対照。
【図１２】様々な微生物における16SのrDNAの特異的配列の増幅の図である。  PCR産物の予想される大きさは331bpである。  Rhodococcus ruber(ウエル1)、Rhodococcus sp.B-1(ウエル2)、Pseudomonas resinovorans CA10(ウエル3)、Mycobacterium smegmatis mc2155(ウエル4)、大腸菌DH1OB(ウエル5)、Mycobacterium austroafricanum I-2562(ウエル6)、Mycobacterium austroafricanum I-3401(ウエル7)およびMTBEの分解用にM.austroafricanum I-2562を播種したパイロットバイオバリアのカセット1の中央部由来のサンプル(ウエル9)およびカセット2の中央部由来のサンプル(ウエル10)の菌株のゲノムDNAを、PCR増幅反応を実施するために使用した。GeneRuler(商標)の1kbのDNAラダーは、DNA分子量マーカーとして使用した(ウエル8)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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