(57)【要約】  本発明は、多様な標的と結合して、動物細胞のアルギニノコハク酸シンターゼの活性を増強し、及び／又は動物細胞中の細胞内二価カルシウムイオンを増大させることにより、哺乳動物細胞中の一酸化窒素（ＮＯ）の生成の増大及び維持をもたらすことができる、配列番号１〜１８で示すアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有するオリゴペプチドを提供する。本発明中に記載した１つ又は複数のペプチドの医薬組成物も開示する。本発明はさらに、これらのペプチドの使用に関する。
2009522314.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜１８で示すアミノ酸配列を含む群から選択される１つ又は複数のペプチドからなるプロリンリッチオリゴペプチドであって、動物細胞中の一酸化窒素の生成を実質的に増大及び維持し、及び／又は動物細胞のアルギニノコハク酸シンテターゼの活性を増強し、及び／又は動物細胞中の二価カルシウムイオンの細胞内濃度を増大させることができることを特徴とする、プロリンリッチオリゴペプチド。
【請求項２】
内皮細胞及び神経細胞のアルギニノコハク酸シンテターゼの活性を増強することができることを特徴とする、請求項１に記載のオリゴペプチド。
【請求項３】
内皮細胞及び神経細胞中の二価カルシウムイオンの細胞内濃度を増大させることができることを特徴とする、請求項１に記載のオリゴペプチド。
【請求項４】
腎細胞中の一酸化窒素シンテターゼの活性を増強することを特徴とする、請求項１に記載のオリゴペプチド。
【請求項５】
腎細胞中の一酸化窒素の生成を活性化及び維持することを特徴とする、請求項１に記載のオリゴペプチド。
【請求項６】
腎組織中で３時間より長い時間をかけて濃縮する、請求項１に記載のオリゴペプチド。
【請求項７】
アミノ末端、又はカルボキシ末端、又は両末端に化学修飾を含む、請求項１に記載のオリゴペプチド。
【請求項８】
配列番号１〜１８で示すアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１に記載のオリゴペプチド。
【請求項９】
動物細胞のアルギニノコハク酸シンターゼと結合することができることを特徴とする、配列番号１〜１８で示すアミノ酸配列を含むオリゴペプチド。
【請求項１０】
動物細胞のアルギニノコハク酸シンテターゼと結合し、その活性を増強することができることを特徴とする、請求項１及び９に記載のオリゴペプチド。
【請求項１１】
一酸化窒素の生成を活性化及び維持し、及び／又はアルギニノコハク酸シンターゼの活性を増強し、及び／又はカルシウム二価イオンの細胞内濃度を増大させることができる、配列番号１〜１８で示すアミノ酸配列を含む、０．０５μｇ〜１０ｍｇの請求項１に記載のオリゴペプチド、又は異なるプロリンリッチオリゴペプチドの混合物、又は薬剤として許容されるその塩と、薬剤として許容されるその賦形剤、希釈剤又は溶媒和物などのアジュバント物質とを含む医薬組成物。
【請求項１２】
０．５μｇ〜５ｍｇのオリゴペプチド、又は異なるプロリンリッチオリゴペプチドの混合物を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
０．１μｇ〜０．０１ｍｇのオリゴペプチド、又は異なるプロリンリッチオリゴペプチドの混合物を含むことを特徴とする、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
哺乳動物における、一酸化窒素生成の欠乏によって引き起こされる疾患、心臓血管疾患と同様に、神経系の障害、胃腸系の障害、免疫系の障害、全身、腎臓、及び冠血行動態の障害、神経変性病状、子癇前症、免疫応答及び／又は腫瘍増殖中のリンパ球機能障害、勃起機能障害、並びに胚芽細胞の生成の調節を治療又は予防するための医薬品の製造において用いられることを特徴とする、請求項１１から１３までに記載の医薬組成物。
【請求項１５】
高血圧哺乳動物の動脈血圧を３時間を超えて低下させることができることを特徴とする、請求項１１から１４までに記載の医薬組成物。
【請求項１６】
ヒトにおいて使用するための医薬品の生成において用いられることを特徴とする、請求項１１から１５までに記載の医薬組成物。
【請求項１７】
家畜において使用するための医薬品の生成において用いられることを特徴とする、請求項１１から１５までに記載の医薬組成物。
【請求項１８】
一酸化窒素の生合成を活性化し、及び／又はアルギニノコハク酸シンターゼの活性を増強し、及び／又は二価カルシウムイオンの細胞内濃度を増大させることができる、配列番号１〜１８で示すアミノ酸配列を含むオリゴペプチド、又は異なるプロリンリッチオリゴペプチドの混合物の使用方法であって、動物における一酸化窒素の欠乏によって引き起こされる障害を治療するために使用されることを特徴とする使用方法。
【請求項１９】
哺乳動物における、心臓血管疾患、神経系の障害、胃腸系の障害、免疫系の障害、全身、腎臓、及び冠血行動態の障害、神経変性病状、子癇前症、免疫応答及び／又は腫瘍増殖中のリンパ球機能障害、及び勃起機能障害などの障害、並びに胚芽細胞の生成の調節の治療において用いられることを特徴とする、請求項１８に記載の使用方法。
【請求項２０】
その治療効果を改善することができる１つ又は複数の医薬品と共に用いられることを特徴とする、請求項１９に記載の使用方法。
【請求項２１】
人間医学及び獣医学において用いられることを特徴とする、請求項１８、１９及び２０に記載の使用方法。
【請求項２２】
哺乳動物細胞中の一酸化窒素の生合成を活性化し、及び／又は哺乳動物細胞中のアルギニノコハク酸シンターゼの活性を増強し、及び／又は哺乳動物細胞中の二価カルシウムイオンの細胞内濃度を増大させることができるオリゴペプチド、又は異なるプロリンリッチオリゴペプチドの混合物を含む、請求項１１から１６までに記載の医薬組成物を投与することを特徴とする、哺乳動物における一酸化窒素の欠乏によって引き起こされる障害の治療方法。
【請求項２３】
治療が心臓血管疾患、神経系の障害、胃腸系の障害、免疫系の障害、全身、腎臓、及び冠血行動態の障害、神経変性病状、子癇前症、免疫応答及び／又は腫瘍増殖中のリンパ球機能障害、及び勃起機能障害、並びに胚芽細胞の生成の調節を対象とする、請求項２２に記載の障害の治療方法。
【請求項２４】
治療がヒトを対象とする、請求項２３に記載の障害の治療方法。
【請求項２５】
治療が獣医学を対象とする、請求項２３に記載の疾患の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明のペプチドは、多様な標的と結合して、哺乳動物細胞中の一酸化窒素（ＮＯ）の生成の増大及び維持を促進することができる。このように、本発明のペプチドは、アルギニノコハク酸シンターゼ（ＡｓＳ）の活性を増強し、及び／又はカルシウムイオンの細胞内濃度［Ｃａ２＋］ｉを増大させることによって、細胞中での一酸化窒素の生成において相乗的に作用する。その活性をＮＯの生成の維持に集中させることができるので、これらのペプチドは、特に心臓血管疾患を含めたＮＯの欠乏が関与する病状の治療及び／又は予防に有用である。
【背景技術】
【０００２】
近年の研究で、一酸化窒素（ＮＯ）濃度の低下が幾つかの病状、特に動脈性高血圧、冠動脈性疾患及びうっ血性心不全など心臓血管機能障害と関係があると示されている。
【０００３】
ＮＯは、重要なパラクリンメディエーターであるので、中枢神経系及び末梢神経系、排出、胃腸及び免疫系、並びに全身、腎臓、及び冠血行動態などの心臓血管以外の他の必須系の制御にも重要である。したがって、ＮＯの欠乏は、前に挙げた心臓血管疾患以外に、神経系、胃腸系、免疫系の障害、神経変性病状、子癇前症、免疫応答及び／又は腫瘍増殖中のリンパ球機能障害、さらに、勃起機能障害を含めた幾つかの病状と直接関係がある［Ｂｒｅｄｔ  Ｄ．Ｓ．「内因性の一酸化窒素合成：生物学的機能及び病態生理。（Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．）」Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｒｅｓ．３１：５７７〜５９６、１９９９］。
【０００４】
ＮＯの欠乏は、ＮＯ不活性化率の増大、ＮＯ合成の低下、又は両方の組合せの結果である可能性がある。心臓血管疾患を治療及び／又は予防するため、及びＮＯの欠乏と関係がある他の病状を治療するための、利用可能及び／又は生成ＮＯの量の増大を目的とする幾つかの薬剤及び治療剤が開発されている。内皮細胞によって生成されるＮＯは、例えば血管平滑筋細胞に急速に拡散し、血管拡張を助長する。中枢又は末梢神経組織もＮＯを生成することができる。神経系においてＮＯは神経伝達物質として機能し、例えば交感神経系活性の調節において重要な役割を果たし、したがって動脈血圧の調節の生理及び病理に関与する［Ｒａｍｃｈａｎｄｒａ  Ｒ、Ｂａｒｒｅｔｔ  ＣＪ、Ｍａｌｐａｓ  ＳＣ．「血圧の調節における一酸化窒素及び交感神経系活性。（Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ａｎｄ  ｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃ  ｎｅｒｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ．）」Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３２（５〜６）：４４０〜４４６、２００５．Ｒｅｖｉｅｗ］。
【０００５】
ＮＯはＬ−アルギニンから合成され、それは最初にニコチン−アデニン−ジヌクレオチド−リン酸−水素（ＮＡＤＰＨ）及び二価カルシウムイオン（Ｃａ２＋）の存在下で中間体ＮＧ−ヒドロキシ−Ｌ−アルギニンに変換される。その後ＮＧ−ヒドロキシ−Ｌ−アルギニンは、ＮＡＤＰＨ及び酸素（Ｏ２）、及び３個の一酸化窒素シンターゼアイソザイムの１個、ヘムタンパク質ＮＯＳの存在下でＬ−シトルリン及びＮＯに変換される。今日まで３個のアイソザイムが単離されてきており、そのうち２個は構成的に発現され（ＮＯＳ−イソ型Ｉ及びＩＩＩ）、且つ１個は誘導される（ｉＮＯＳ−イソ型ＩＩ）［Ｂｒｅｄｔ  Ｄ．Ｓ．「内因性の一酸化窒素合成：生物学的機能及び病態生理。（Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．）」Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｒｅｓ．３１：５７７〜５９６、１９９９］。
【０００６】
ＮＯの合成に必要な他の非常に重要な酵素はアルギニノコハク酸シンターゼ（ＡｓＳ）であり、これはアルギニン（ＮＯ合成の基質）への（ＮＯ合成中に生成される）シトルリンの循環における律速段階を触媒し、それによって内皮細胞中のＮＯの持続的生成を助長する［Ｐｅｎｄｌｅｔｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８０：２４２５２〜２４２６０（２００５）］。ＡｓＳと内皮ＮＯＳ（ｅＮＯＳ）の同時局在は、カベオラ、内皮細胞の細胞質膜の区画に存在したことが実証された。刺激の不在下では、循環レベルはこれらの細胞中で最小である。しかしながら、例えばＣａ２＋の細胞内濃度［Ｃａ２＋］ｉの増大によってＮＯＳが刺激されると、生成されるシトルリンの８０％より多くはシトルリン−ＮＯ経路によってアルギニンに循環され、それによってＮＯの持続的生成が活性化される。したがって、有効なカベオラ複合循環は、内皮ＮＯ生成の受容体介在性刺激を助長する［Ｓｏｌｏｍｏｎｓｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．２０６：２０８３〜２０８７（２００３）；Ｓｈｕｔｔｌｅｗｏｒｔｈら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、６８：１２９５〜１３０４（１９９５）］。
【０００７】
内皮中では、ＮＯは血管内皮保護物質として機能し、血管の平滑筋の収縮を遮断し、血小板の活性化を阻害し、白血球接着、及び好中球漏出を改変することによってインテグリンに作用する［Ｐｏｌｌｏｃｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１０４８０〜１０４８４、１９９１；Ｆｕｒｃｈｇｏｔｔ、ＪＡＭＡ、２７６：１１８６〜１１８８（１９９６）］。
【０００８】
動脈血圧の調節に関して、血管内皮によって合成されたＮＯは、哺乳動物における血管の緊張を制御するのに非常に重要であることが示されている［Ｖａｌｌａｎｃｅら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．、２３：１０５３〜１０５７（１９８９）］。他方で、長く続く血管拡張は内皮細胞によるＮＯ生成の持続的増大に依存し［（Ｈｕａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、３７７：２３９〜２４２（１９９５）；Ｓｈｅｓｅｌｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：１３１７６〜１３１８１（１９９６）］、これはカベオラ中でのＮＯ生成の唯一の基質であるアルギニンへのシトルリンの循環を必要とする。何故ならこれらの細胞は、他の細胞区画からのアルギニンを利用しないからである［Ｐｅｎｄｌｅｔｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８０：２４２５２〜２４２６０（２００５）；Ｓｏｌｏｍｏｎｓｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．、２０６：２０８３〜２０８７（２００３）］。
【０００９】
したがって、酵素ＡｓＳ及びＮＯＳに関する経路は、内皮、全身、腎臓、及び冠血行動態機能、血小板接着及び凝集、心筋細胞肥大、及び血管平滑筋細胞の増殖、及び繊維症の制御において重要な役割を有する［Ｇｏｖｅｒｓ及びｅＲａｂｅｌｉｎｋ、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２８０：Ｆ１９３〜Ｆ２０６（２００１）；Ｖａｌｌａｎｃｅ及びＣｈａｎ、Ｈｅａｒｔ、８５：３４２〜３５０（２００１）；Ｈｕａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、３７７：２３９〜２４２（１９９５）］。
【００１０】
他の機構中で、高レベルのＮＯの維持は、ＭａｘｉＫチャンネルの活性化による血管の弛緩を誘導し、膜過分極を引き起こすはずである。イオンチャンネルＭａｘｉＫと関係がある、この薬理機械的及び電気生理学的機構は、ＮＯによって誘導される血管の弛緩における重要な因子である（Ｔａｎａｋａら、Ｊ．Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｒｅｓ．、４０：１２５〜１５３（２００４）］。
【００１１】
細胞内Ｃａ２＋濃度［Ｃａ２＋］ｉは、ＭａｘｉＫチャンネルによる血管の弛緩とも関係がある。何故なら、チャンネルがＣａ２＋によって活性化されるＫ＋チャンネルファミリーに属する場合、細胞内Ｃａ２＋の増大は細胞のＭａｘｉＫチャンネルの活性化をもたらす可能性があるからである［（Ｔａｎａｋａら、Ｊ．Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｒｅｓ．、４０：１２５〜１５３（２００４）］。
【００１２】
例えばＣａ２＋の細胞内恒常性の制御としての細胞内事象のシグナル伝達に、ＮＯが影響を与えることはよく知られている。実際ＮＯは、イノシトール三リン酸介在性Ｃａ２＋動員を刺激することによって、筋小胞体／小胞体のＣａ２＋ＡＴＰａｓｅの阻害によるサイトゾルＣａ２＋の蓄積の増大によって、及びＣａ２＋チャンネルによる細胞外のＣａ２＋流入を刺激することによって、血管の［Ｃａ２＋］ｉを増大させる。言い換えると、ＮＯ生成の増大によって［Ｃａ２＋］ｉを介したＣａ２＋シグナル伝達が増大し、血管の収縮及び緊張を制御する［Ｔｏｕｙｕｚ、Ａｎｔｉｏｘｉｄ．Ｒｅｄｏｘ  Ｓｉｇｎａｌ．、７（９〜１０）：１３０２〜１３１４（２００５）］。
【００１３】
他方で、例えばブラジキニンのような循環エフェクターは、管腔表面で内皮細胞受容体と結合し、［Ｃａ２＋］ｉの増大を引き起こし、次いでカルシウム−カルモジュリン複合体形成によって内皮細胞一酸化窒素シンターゼ（ｅＮＯＳ）を活性化する。
【００１４】
したがって、［Ｃａ２＋］ｉを介した、及びＭａｘｉＫチャンネルを介した、その直接的又は間接的影響によって、内皮ＮＯは心臓血管の恒常性の制御に必要不可欠である。さらに、プロスタサイクリンと共に、ＮＯは強い抗催奇性、及び血小板凝集及び細胞接着を妨げることによる抗血栓耐性特性も有する［Ｆｕｒｃｈｇｏｔｔ、ＪＡＭＡ、２７６：１１８６〜１１８８（１９９６）；Ｚｈｏｕ  ｅ  Ｆｒｏｈｌｉｃｈ、Ａｍ．Ｊ．Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ、２５：１３８〜１５２（２００５）］。
【００１５】
利用可能なＮＯの量を増大させ、及び／又は生成するＮＯの量を増大させる幾つかの薬剤及び治療剤が、心臓血管疾患、及びＮＯの欠乏と関係がある他の疾患を治療又は予防するために開発されてきている。米国特許第６，４４７，７６８号は、ＮＯＳのコード配列を含むベクターを利用する遺伝子療法を使用して、酵素の利用性を高め、それによってＮＯ合成を増大させることを記載している。有望ではあるが、遺伝子療法は依然としてあまりよく知られておらず、それは侵襲性であり、先天的なリスクが高い。他方で、通常併用療法に基づく記載した従来の療法は、幾つかの薬剤を同時に利用する。米国特許第６，６３５，２７３号は、Ｌ−アルギニンからＬ−シトルリンへの酸化によってＮＯ合成を間接的に刺激する抗酸化剤、及びＡＣＥ阻害剤、及び／又はβ遮断薬及び／又はカルシウムチャンネルのアンタゴニストを使用する、心臓血管疾患の併用療法を記載している。
【００１６】
この療法の欠点は、抗酸化剤はＮＯ生成においてわずかな変化をもたらし、抗酸化剤それ自体では高血圧を有効に治療するのに充分でない可能性があり、したがって異なる標的に作用する他の抗高血圧剤を用いる併用療法を必要とする事実にある。
【００１７】
心臓血管疾患において内皮ＮＯの生成を増大させる他の間接的な方法は、ＡＣＥ阻害剤による方法である可能性がある。何故なら、これらの阻害剤の抗高血圧及び心臓保護効果は、内皮ＮＯの生成の増大［Ｚｈａｎｇら、Ｘ、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、２８８：７４２−７５１（１９９９）］、及び増大した内皮機能［Ｈｏｒｎｉｎｇら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、９５：１１１５〜１１１８（１９９７）］をもたらすブラジキニン分解の減少の結果として、少なくとも部分的には説明されているからである。しかしながら、このＮＯの生成の増大は間接的な効果であり、心臓血管疾患を適切に治療及び／又は予防するのに不充分である。さらに、ＡＣＥの阻害は副作用を引き起こす可能性がある。何故ならこの酵素は、他の生理的過程と関係があるからである［Ｚｈａｎｇら、Ｘ、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、２８８：７４２〜７５１（１９９９）］。
【００１８】
さらに近年、Ｋｅｅｆｅｒ及び共同研究者（米国特許第４，９５４，５２６号、米国特許第５，０３９，７０５号、米国特許第５，１５５，１３７号、米国特許第５，２０８，２３３号、米国特許第５，４０５，９１９号及び米国特許第６，９４９，５３０号）は、加水分解した後、又は酸の存在下で、又は分解した後、ＮＯを放出する幾つかの化合物の使用を記載した。これらの化合物は外因的にＮＯを放出し、内因性ＮＯの合成には作用しない。さらにこれらの化合物は、それらの崩壊及びＮＯの放出後に、発癌性ニトロソアミンの望ましくない放出という潜在的リスクを示す強烈な欠点を示す。
【００１９】
ブラジル特許出願ＢＲ０４００１９２は、Ｂｏｔｈｒｏｐｓ  ｊａｒａｒａｃａヘビの毒液から抽出したペプチドを含む医薬組成物を特許請求し、その組成物はアセチルコリン受容体のアゴニスト、部分的アゴニスト、アンタゴニスト又はアロステリック調節因子として作用し、その組成物はコリン作動性受容体の機能障害によって引き起こされる障害に作用する。さらに他のブラジル特許出願ＢＲ０２０５４４９は、Ｂｏｔｈｒｏｐｓ  ｊａｒａｒａｃａヘビの毒液から抽出したペプチドを含む医薬組成物を特許請求し、その組成物は血管ペプチダーゼを阻害することができ、エバシンと命名され、慢性退行性疾患を治療するための薬剤として使用される、医薬品クラスのアンギオテンシン変換酵素阻害剤に対する代替として示された。当業者により容易に立証されるように、いずれの特許出願も、本発明の化学的性質及び薬剤学的性質を示す、ＮＯの持続的生成におけるこれらの天然に存在するペプチドの関与を特許請求していない。
【００２０】
米国特許第３，８１９，８３１号は、Ｂｏｔｈｒｏｐｓ  ｊａｒａｒａｃａの毒液の抽出分画から得たオクタペプチドアンギオテンシンＩＩへのデカペプチドアンギオテンシンＩの変換を阻害する、アンギオテンシン変換酵素阻害剤に関する。米国特許第４，１０５，７７６号、米国特許第４，１２９，５７１号、及び米国特許第４，１５４，９６０号は、動脈性高血圧を治療するために使用される医薬品カプトプリル（Ｄ−３−メルカプト−２−メチル−ｌ−オキソプロピル−Ｌ−プロリン）、よく知られている活性部位特異的ＡＣＥ阻害剤を含むアミノ酸プロリンの合成誘導体、及び中でも特にその新たな誘導体エナラプリル及びリシノプリル（米国特許第４，３７４，８２９号）に関する。
【００２１】
これらのＡＣＥ阻害剤は、高血圧の治療、アテローム性動脈硬化症を有する高リスク患者における臨床兆候の減少、左心室機能障害の改善、心筋梗塞後の臨床兆候の減少、並びにうっ血性心不全患者における罹患率及び死亡率の低下において有効である［Ｙｕｓｕｆら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３４２：１４５〜１５３（２０００）］。
【００２２】
しかしながら、ＡＣＥ阻害剤の文書化された臨床効果にもかかわらず、相当数の高血圧患者はＡＣＥ阻害剤を使用する単剤療法によって適切に制御されず、利尿薬、β遮断薬、及び／又はカルシウムチャンネルのアンタゴニストを含む併用療法が必要とされる［Ｙｕｓｕｆら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２：１４５〜５３（２０００）］。ここで記載した事実にもかかわらず、罹患率及び死亡率はこれらの患者において依然として高い状態である［急性不完全骨折におけるラミプリルの有効性（ＡＩＲＥ）（Ｔｈｅ  Ａｃｕｔｅ  Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  Ｒａｍｉｐｒｉｌ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ（ＡＩＲＥ））］Ｓｔｕｄｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ、Ｌａｎｃｅｔ、３４２：８２１〜８２８（１９９３）；Ｋｏｂｅｒら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３３：１６７０〜１６７６（１９９５）］。
【００２３】
さらに、ＡＣＥ阻害剤の治療有効性に関して、必要とされる用量はｉｎ  ｖｉｖｏでのアンギオテンシンＩＩへのアンギオテンシンＩの変換を阻害することができ、ブラジキニンを不活性化することができる用量であることを言及することは重要である。したがって、抗高血圧効果を得るために、その用量は、例えば本発明で使用する抗高血圧用量より１０００倍高い。ＡＣＥはキニン−アンギオテンシン系と関係があるだけでなく、他の生理的機能を有することは周知であるので［Ｃｏｔｔｏｎら、「ブラジキニンペプチドを増強することによるアンギオテンシンＩ変換酵素のＣ−ドメインの選択的阻害（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃ−ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  Ｉ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｂｙ  ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４１：６０６５〜６０７１、２００２］、これらの阻害剤は非常に多くの副作用及び有害反応を引き起こし、そのうちの幾つかは血管神経性浮腫、皮膚発疹、空咳、低血圧、血液細胞機能障害、及び勃起機能障害などの重症である可能性があることは理解される。
【００２４】
したがって現在の治療戦略は、幾つかの疾患の過程を有意に改変するその能力は限られる。何故なら、それらは個々の独立した標的に影響を与え、通常一時的且つ不完全な利点を患者に与えるからである。例えば、幾つかの心臓血管疾患は、最終的に持続的なＮＯの生合成の制御に影響を与える多因子疾患であり、したがって、ＮＯの生合成を相乗的に上方制御する多数の標的に作用する薬剤は、治療戦略に対する来るべき有効な代替である可能性がある。
【００２５】
前記脱制御の１つは、例えば動脈性高血圧を引き起こす、ＮＯの持続的生成に影響を与える脱制御である。したがって、ＮＯの持続的生成は高血圧の治療及び予防、並びにＮＯの欠乏と関係がある他の疾患の治療及び予防に重要である。
【００２６】
現況技術において認めることができるように、現在まで、ＮＯの欠乏と関係がある障害を治療するために開発された製品は、それらの化学的性質に関する不都合、それらの入手、有効性及び副作用の難点を与える。
【００２７】
本明細書に記載するオリゴペプチド又は異なるプロリンリッチオリゴペプチドの混合物を含む、本発明中に記載した医薬組成物は、酵素ＡｓＳを活性化すること、又は内皮細胞中の［Ｃａ２＋］Ｉの増大を助長することなどによって、多数の機構により一酸化窒素の生合成を活性化することができる。したがって、本明細書に記載する方法によって治療することができる、ＮＯの欠乏によって引き起こされる疾患には、心臓血管疾患、神経系の障害、胃腸系の障害、免疫系の障害、全身、腎臓、及び冠血行動態の障害、神経変性病状、子癇前症、免疫応答及び／又は腫瘍増殖中のリンパ球機能障害、勃起機能障害、及び胚芽細胞の生成の調節がある。それらは人間医学及び獣医学において使用することができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
開示を鑑みると、本発明は、多様な標的と結合することができ、アルギニノコハク酸シンターゼ（ＡｓＳ）酵素を活性化し、及び／又は細胞内の二価カルシウムイオン（Ｃａ２＋）の濃度を増大させるなど、ＮＯ生合成を直接刺激することによって哺乳動物細胞中のＮＯの生成を相乗的に増大させることができるマルチリガンドオリゴペプチドを提供する目的を有する。
【００２９】
本発明の他の目的は、本発明中に記載したオリゴペプチドを利用する医薬組成物を提供することである。
【００３０】
本発明の第三の目的は、ＮＯの欠乏が関与する疾患において使用する医薬品を製造するための、本発明中に記載したオリゴペプチドの使用である。
【００３１】
本発明の他の目的は、本発明中に記載したオリゴペプチドを利用する、ＮＯの欠乏が関与する病状の治療方法及び／又は予防方法を提供することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明は、高血圧、糖尿病、血栓症、アンギナ、心臓病、及びアテローム性動脈硬化症などの一酸化窒素（ＮＯ）と関係がある機能障害及び状態を治療するためのプロリンリッチオリゴペプチドを提供する。本発明者らは、本発明中に記載した幾つかの合成プロリンリッチオリゴペプチド（Ｚ−プロ）は、体重１ｋｇ当たり約０．０１ｎｍｏｌ〜９００ｎｍｏｌ、好ましくは体重１ｋｇ当たり０．１ｎｍｏｌ〜２００ｎｍｏｌ、より好ましくは体重１ｋｇ当たり約０．５〜８０ｎｍｏｌの一回用量として静脈内注射すると、正常血圧ラットの平均動脈血圧ではなく、高血圧自然発症ラット（ＳＨＲ）の平均動脈血圧を低下させることを観察した。ＳＨＲにおいて実施したアッセイは、体重１ｋｇ当たり０．５〜８０ｎｍｏｌの用量の本発明のプロリンリッチオリゴペプチドはこれらの動物の動脈血圧を３０〜５０ｍｍＨｇ低下させることができたこと、及びこの効果は６時間を超えて持続したことを示した。図１１Ａ〜Ｅ中に例示するように、この型の平均動脈血圧の低下は急には起こらないが、本発明のペプチドを注射してから約６０分から１２０分後、好ましくは９０分後に始まる。
【００３３】
本発明の他の実施形態では、正常血圧ラットにおける血圧降下効果の欠如を示すが、実施例１４中に示すデータに限られない。したがって、ＳＨＲにおいて抗高血圧効果を示した用量より１０００倍高い用量を与えたときでさえ、正常血圧ラットは平均動脈血圧の著しい変化を受けない。
【００３４】
本発明者らは、ＳＨＲにおいて本発明のペプチドの抗高血圧効果を生み出すことができる用量は、ｉｎ  ｖｉｖｏでアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）を阻害するのに必要とされたペプチド濃度より少なくとも３桁低かったことも観察した。本発明のペプチドと対照的に、カプトプリル、ＡＣＥの部位特異的阻害剤は、約１０００倍高いモル用量、即ちｉｎ  ｖｉｖｏでＡＣＥの活性を阻害することができる用量でのみ抗高血圧活性を発揮することができた（例えば体重１ｋｇ当たり１０μｍｏｌ、図１１Ｅ）。実施例１２、図１１Ａ〜Ｅ中に例示したこれらの観察結果は、配列番号４及び配列番号８のペプチドを指すが、決してここに示した実施例に限られない。現況技術において広く見ることができるように、例えば動脈血圧を調節するために、大部分の薬剤によって用いられる代謝経路は、ＡＣＥ阻害剤によるブラジキニンの分解の直接的阻害である。実際我々は、本明細書に記載する化合物は、ＡＣＥを阻害する薬剤に関して記載された機構と完全に異なる機構によって作用し、これらは現在利用されていることを示す。したがって、本発明は薬学的関心を呼び覚ますはずである。何故ならＡＣＥ阻害剤はＡＣＥ阻害の結果である血管性浮腫、腎機能障害、咳、及び低血圧などの多数の副作用を示し、これらは現況技術において広く記載されているからである［Ｌｅｅｂ−Ｌｕｎｄｂｅｒｇら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖ．、５７：２７〜７７、（２００５）］。
【００３５】
本発明は、本明細書に記載するペプチドの影響と、腎臓による一酸化窒素（ＮＯ）の持続的生成の関連付けを可能にする方法も提供する。ＮＯは多数の生物学的効果、特に生理的機能、及び病状の制御に影響を与える効果を示す。本発明者らは、本発明のペプチドは、マウスに注射すると腎臓中に選択的に濃縮することを観察した。実施例８に限られないが、実施例８は配列番号８のペプチド／１２５Ｉの生物学的利用能を例示する。このペプチドをマウスに腹膜内注射すると、放射能は腎臓中に急速に濃縮し、注射用量の濃度の約１５％の等量が、３時間を超えてこの組織中に留まる。他のマウス組織と比較すると、腎臓は組織１グラム当たりで他の組織中において見られた濃縮より１０倍高い濃縮を示す。ペプチドは主に腎臓組織中では、通常は血液及び組織のペプチダーゼにより非常に急速に分解されるので、この事実は驚きである。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてプロリンリッチペプチドは、タンパク質分解に耐性があることは知られている。分解に対するこの耐性は、本発明のペプチドを腹膜内注射したマウスの尿中に見られる完全ペプチドの分布で表される。実施例９に限られないが、実施例９中に例示したように、ただ１つのＣ末端プロリンを示す配列番号１のペプチド以外は、全てのペプチドは大部分がその完全形で分泌されることは明らかである（実施例９、表２）。
【００３６】
腎臓が動脈血圧の調節において中心的役割を果たすこと、ＮＯ生成におけるその高い有効性と一致する事実は知られている。したがって、本発明の他の態様では、体重１ｋｇ当たり約０．１〜５ｍｇ、好ましくは体重１ｋｇ当たり０．８〜２．５ｍｇ、さらにより好ましくは体重１ｋｇ当たり約１ｍｇの配列番号８のペプチドは、マウス腎臓の一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）活性を約６０％活性化することができたことを、この分子に限らず一例として我々は示す（図９）。動物に体重１ｋｇ当たり０．２〜３．５ｍｇの濃度でカプトプリルを注射したとき、有意な腎臓ＮＯＳ活性は観察されなかった。ブラジキニンはこのプロセスに関与しないが、ブラジキニンは配列番号８によるＮＯＳの活性化に介在する可能性があることが明らかとなった。したがって、ブラジキニンのＢ２受容体の特異的阻害剤（ＨＯＥ１４０、１０μｇ／ｋｇ、１時間）は、例えば配列番号８のペプチドによりＮＯＳ活性において引き起こされた増大を妨げることはできなかった。この結果によって確認されたように、０．０１〜５０μｍｏｌ、好ましくは０．５〜２μｍｏｌの配列番号８のペプチドは、配列番号８のペプチドで処理したマウスの腎臓ホモジェネートにおいて（ＮＯから生じる）亜硝酸塩の生成を５倍増大させたことを、我々は示すことができた（図１０）。これらの結果は例として表し、決して使用したペプチドに制限されない。したがって本発明は、高血圧動物における動脈血圧の低下に有意に貢献するはずである、腎臓のＮＯ生成の増大、ＮＯＳの活性化のための、本発明のペプチドの使用を提供する。
【００３７】
本発明の他の実施形態では、配列番号８のペプチドは、ＮＯの持続的生成と関係があるマウス腎臓の粗製抽出物中に存在した酵素と、選択的に結合することができたことが分かった。アフィニティークロマトグラフィー及びリガンドとして配列番号７のペプチドを使用して、ウエスタンブロット及び質量分析により、アルギニノコハク酸シンターゼ（ＡｓＳ）、細胞へのＮＯの連続的送達に必要不可欠な尿素サイクルの酵素に相当する約４６ｋＤａの標的タンパク質を同定することができた［Ｈｕｓｓｏｎら、「尿素サイクルからシトルリン−ＮＯサイクルへのアルギニノコハク酸シンテターゼ（Ａｒｇｉｎｉｎｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｕｒｅａ  ｃｙｃｌｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ−ＮＯ  ｃｙｃｌｅ．）」Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：１８８７〜１８９９（２００３）］。
【００３８】
本発明の他の態様では、ＡｓＳは配列番号８のペプチドにより活性化されたことが示され、最大の活性化はおよそ０．０５〜１００μＭの濃度、好ましくは１〜５μＭの配列番号８のペプチドの濃度で起こった。７０〜８０％に達する可能性があるこの活性化は特異的である。何故なら、それは特異的ＡｓＳ阻害剤α−メチル−ＤＬ−アスパラギン酸（ＭＤＬＡ）によって完全に阻害されるからである。実施例４は例示として示し、この特性を配列番号８のオリゴペプチドに限定するわけではない。
【００３９】
したがって本発明は、本明細書に記載するプロリンリッチペプチドと、それ自体が代替的治療剤として示されるＡｓＳの相互作用を利用する方法を提供し、これらの方法は、持続的ＮＯ生成を増大させるための内因性経路として未だに治療目的で利用されていない、標的タンパク質（ＡｓＳ）の活性を使用する。本発明のこの態様は、ＮＯの欠乏によって引き起こされる機能障害を治療するための前例のない代替となる。
【００４０】
プロリンリッチオリゴペプチドは、Ｃａ２＋の細胞内濃度［Ｃａ２＋］ｉを増大させるために、本発明の範囲内でさらに有用である可能性がある。ＮＯの不充分な生成と関係がある病状及び機能障害は、［Ｃａ２＋］Ｉを制御するプロセスにおける障害から生じる可能性もある。何故ならこの二価イオンは、カルモジュリン、内皮（ｅＮＯＳ）及び神経ＮＯＳ（ｎＮＯＳ）の活性化を含む幾つかの細胞プロセスの「重要な制御物質」を活性化するからである。このプロセスの脱制御は、心臓血管、神経、内分泌及び免疫系の病状を悪化させる可能性がある。したがって、本発明の他の実施形態は、本発明のペプチドによる内皮及び神経細胞中でのＣａ２＋放出の活性化に関する。実施例５、図５は、決して試験したペプチド又は細胞に対する実施例に限定されないが、どのようにして配列番号１及び配列番号７のペプチドは神経細胞（ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、ヒト神経芽腫細胞）中で［Ｃａ２＋］Ｉを刺激するかを例示するものである。配列番号１及び配列番号７のペプチドは、０．１〜１００μＭの濃度で、好ましくは１〜１０μＭの濃度で、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞中において［Ｃａ２＋］ｉを増大することができたが、一方カプトプリル（１μＭ）は［Ｃａ２＋］ｉの如何なる変化も引き起こさなかった。［Ｃａ２＋］ｉの増大は瞬間的且つ一時的であった、即ちペプチドを加えた直後に、それぞれ配列番号１及び配列番号７のペプチドによる刺激に関して約３５０及び２５０ｎＭで応答のピークに達し、急速に低下し、ピーク後２０秒で停滞期に達した。
【００４１】
本発明の他の実施形態では、０．０１〜５００μＭの濃度で、又は好ましくは０．１〜１００μＭの濃度で、配列番号８のペプチドは、ＨＵＶＥＣ及びＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞においてＮＯ生成をほぼ１００％増大させることができた（実施例６、図６Ａ及び６Ｂ）。亜硝酸塩生成に対する前記活性効果は、０．１〜１００μＭの濃度、又は好ましくは１〜１０μＭの濃度の本明細書に記載するプロリンリッチペプチドを使用してグリア細胞（グリオーマ細胞Ｃ６）において得ることもできる。配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号１４、及び配列番号１５に限らないが、例として、活性化は約２０％と１３０％の間で変化し、配列番号８のペプチドが最も有効であった（実施例８、図７）。
【００４２】
したがって本発明中に記載したプロリンリッチペプチドは、腎臓中に選択的に濃縮し、ＮＯ生成用にアルギニンの送達を増大させる腎臓のＡｓＳの活性を増強させ、腎臓のＮＯＳを活性化し、及び腎組織中のＮＯ生成を増大させ、神経（ＳＫ−Ｎ−ＡＳ）、内皮（ＨＵＶＥＣ）、グリア（グリオーマＣ６）細胞中の［Ｃａ２＋］Ｉ及びＮＯ生成を増大させることができる。このように、本発明のペプチドはそれらの活動を集中させて、ＮＯの持続的生成に相乗的に作用する。カプトプリルの濃度より１０００倍まで低い濃度で実施される前記活動は、例えば、高血圧自然発症ラット（ＳＨＲ）において観察された長時間続く抗高血圧効果を説明できるはずである。したがって前記ペプチドは、特に心臓血管疾患を含めた、哺乳動物におけるＮＯの欠乏と関係がある病状の治療及び／又は予防に有用である。さらに本発明は、前記ペプチドは、動脈性高血圧などの病状に対する安全性及び選択性を動物に与える高用量で投与した場合でさえ、正常血圧動物には作用しないことを実証する。
【００４３】
他の実施形態は、異なる大きさのオリゴペプチドで、又は表１中に表される一覧中に示される配列番号１〜１８中に含まれる配列などの、異なるアミノ酸配列を示す前記オリゴペプチドで治療すると、量的及び質的差異が前記動物において示されるので、ＳＨＲにおける本発明のオリゴペプチドの抗高血圧効果に関する。１つのペプチドに関する、例えば配列番号８に関する用量効果の関係は実施例１２、図１２中に例示するが、それは本発明の前記ペプチドに限られない。前記ペプチドの抗高血圧活性の最適状態は体重１ｋｇ当たりおよそ７１ｎｍｏｌの用量で生じ、より高用量、及びより低用量では、この効果は低下する。本発明の他の態様は、ＳＨＲにおける体重１ｋｇ当たり７１ｎｍｏｌの用量での、本発明のペプチドのアミノ酸配列と抗高血圧効果の関係に関するものである。実施例１２、図１３だけに限らないが、これらは、ＳＨＲに対する本発明の４個のペプチドの抗高血圧作用は、ペプチドの大きさ、分子当たりのプロリンの数のいずれとも関係がないことを単に例示するものである。
【００４４】
他方で、ペントバルビトンは、ＳＨＲに対する本発明の幾つかのペプチドの抗高血圧作用を阻害する可能性があり、一方で本発明の他のペプチド、及びカプトプリルの抗高血圧作用はペントバルビトンによって阻害されない。前記効果は少なくとも２４時間持続し得る。実施例１３の図１４Ａ及び１４Ｂは、この影響を例示するが、決して示したペプチドに制限しない。この違いは、例えば配列番号８のペプチドの哺乳動物における使用において重要である。何故ならそれは、他の医薬品と共に投与すると抗高血圧効果をおそらく示さずペントバルビトンの作用を受けやすい、前記抗高血圧性化合物の使用を制限するからである。
【００４５】
総合すると本発明は、本明細書に記載するプロリンリッチペプチドは、動脈血圧の恒常性の制御機構に相乗的に作用することを実証する証拠を提供し、それはこの病状の治療において用いられる如何なる薬効分類によっても依然として調べられていない。
【００４６】
心臓血管疾患に罹患している患者は、１つの分子標的に作用するように開発された薬剤を利用している。しかしながら現在の薬理学的手法は、疾患の過程を有意に改変するそれらの能力が限られており、適時の不完全な利点を患者に与える。本発明中に記載した革新は新たな治療戦略を表し、多数の心臓血管系及び生化学的標的に作用し、心臓血管系機能障害、又はＮＯ生成などの一般的な変換機構に依存する他の病状の改善をもたらすペプチドを含む。これらの多機能性化合物は高い有効性を与え、心臓保護物質としてのその機能における薬剤の少ない副作用及び優れた使用、したがって疾患の予後の改変をもたらす可能性がある。
【００４７】
さらに、本発明の化合物によって示される相乗機構は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの分解に総じて耐性があり、今日使用されている抗高血圧性化合物よりはるかに低い濃度で作用する点で、及び組織中で数時間、特に腎臓中で活性ペプチドの実質濃度を維持するために有利である。特に、本発明の化合物の性質は、高血圧動物の動脈血圧の低下、動脈性高血圧の治療に関する非常に重要な要因を長期の時間維持するのに貢献する。
【００４８】
したがって、本発明のペプチドを使用して、ヒトにおける心臓血管の病状、特に動脈性高血圧を治療することができる。Ｚ−プロの抗高血圧効果は、ＡＣＥ阻害剤の有効性に必要とされる用量よりはるかに低い用量で得られるので（実施例１１）、本発明中に記載したペプチドは、咳、血管性浮腫、血液細胞生成における障害、患者の健康状態及び生命の危険因子である体外循環、血管新生促進的影響などに曝される患者に関するアクシデントなどの、ブラジキニン濃度の増大によって引き起こされる副作用を生み出さないことは予想される。ＡＣＥを阻害するこれら及び他の影響は、カプトプリル、並びにエナラプリル及びリシノプリルのようなその誘導体を摂取する患者について記載されてきている［Ｌｅｅｂ−Ｌｕｎｄｂｅｒｇら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖ．、５７：２７〜７７、（２００５）］。
【００４９】
本発明によれば、本明細書に記載するオリゴペプチドは５個と１３個の間のアミノ酸残基を表し、約６００Ｄａと１．５００Ｄａの間の分子量を示し、表１中の配列１〜１８を同定することによって記載する。
【００５０】
本発明のオリゴペプチドは、そのアミノ末端部分、又はそのカルボキシ末端部分、又はオリゴペプチドの両端に化学修飾を示す可能性があり、前記修飾は前記オリゴペプチドの合成プロセス中に導入される。前記修飾は、オリゴペプチドに高い安定性を与えるため、又はバイオマーカーにおいて前記オリゴペプチドを変換するためのいずれかで実施する。前記修飾は任意の種類であってよく、当業者に知られている任意の標識基を、アセチル化、ビオチン化、ヒドロキシプロリンなどの合成アミノ酸、及びフルオロフォア基を用いた標識などに利用することができる。
【００５１】
本発明のプロリンリッチペプチドは合成であり、当業者に知られている様々な方法によって調製することができる。本発明の場合、全てのペプチドは固相合成によって得た。前記技法はＳｔｅｗａｒｔ及びＹｏｕｎｇ［「固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．、Ｃａ、ＵＳＡ（１９６９）］に記載されており、米国特許第４，１０５，６０３号中に例示されている。ペプチド合成用のフラグメント縮合法は、米国特許第３，９７２，８５９号中に例示されている。ここで使用した技法は、保護物質としてフルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）を利用するために記載した。他の利用可能な合成手順は、米国特許第３，８４２，０６７号及び米国特許第３，８６２，９２５号中に例示されている。
【００５２】
ペプチドのアミノ末端基と結合させるために選択した化学基（基Ｚ）は、活性化試薬を使用して導入した。活性化試薬の条件を満たす例は、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド及びＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドなどのカルボジイミドである。他の活性化試薬及びペプチドカップリングにおけるそれらの使用は、Ｓｃｈｏｄｅｒ及びＬｕｂｋｅ［「ペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」中、１：７２〜７５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、ＵＳＡ（１９６５）］及びＫａｐｏｏｒ［Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、５９：１〜２７（１９７０）］によって記載されている。
【００５３】
最後に、基Ｚと結合しているか又は結合していないペプチドは、特に高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含めた従来の方法によって精製する。前記ペプチドの純度及び同一性は、特にアミノ酸組成分析、質量分析、分析ＨＰＬＣによって確認する。
【００５４】
合成ペプチドは、当技術分野において記載されている幾つかの方法によって精製することができる。最終的な脱保護ペプチドは優先的に、例えば二溶媒系：（Ａ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／Ｈ２Ｏ及び（Ｂ）ＴＦＡ／アセトニトリル（ＡＣＮ）／Ｈ２Ｏを異なる割合で使用して、逆相カラム、Ｃ−１８においてＨＰＬＣによって精製することができる。ＵＶ−ＶＩＳ検出器又は蛍光検出器と結合した、二成分勾配で溶媒系によって移動する逆相カラムにおける分析ＨＰＬＣ系によって、ペプチドの純度を確認する。精製ペプチドの質量は、ペプチドの質量分析及び／又はエドマン分解シークエンシングによって測定することができる。溶液中のその濃度は、酸加水分解、次に蛍光マーカーによる誘導体化後の、アミノ酸分析によって測定することができる。誘導体化アミノ酸の分析は、例えば蛍光測定によってモニタリングすることができる。表１中に表す精製した合成産物の化学的特性によって、本発明中で使用したペプチドの均質性を確認する。
【００５５】
本発明の他の実施形態は、哺乳動物の細胞中のＮＯ合成を活性化することができ、並びに細胞内環境中の二価カルシウムイオン（Ｃａ２＋）の増大を促進することができる、プロリンリッチオリゴペプチド、又はプロリンリッチオリゴペプチドの混合物、及び薬剤として許容されるその塩、さらには賦形剤、希釈剤又は溶媒和物などのアジュバント物質を含む医薬組成物に関する。本発明の前記医薬組成物は、哺乳動物において、ＮＯ生成における欠乏によって引き起こされる疾患、心臓血管疾患、神経系の障害、胃腸系の障害、免疫系の障害、胚芽細胞の生成の調節、全身、腎臓、及び冠血行動態の障害、神経変性病状、子癇前症、免疫応答及び／又は腫瘍増殖中のリンパ球機能障害、及び勃起機能障害などを治療又は予防するための医薬品の製造において使用されるはずである。
【００５６】
本発明中に記載したペプチドは、望ましい治療効果を改善又は補足するための他の医薬品とも関係がある可能性がある。
【００５７】
前記医薬組成物は、０．０５μｇ〜１０ｍｇの本明細書に記載のオリゴペプチド、又は異なるプロリンリッチオリゴペプチドの混合物を含むはずであり、好ましくは前記医薬組成物は、０．５μｇ〜０．００５ｍｇのオリゴペプチド、又はプロリンリッチオリゴペプチドの混合物を含むはずであり、及びさらにより好ましくは、前記医薬組成物は、０．１μｇ〜０．０１ｍｇのオリゴペプチド、又はプロリンリッチオリゴペプチドの混合物を含むはずである。
【００５８】
本発明の他の実施形態は、哺乳動物におけるＮＯの欠乏によって引き起こされる障害の治療において一酸化窒素（ＮＯ）の生合成を活性化することができる、プロリンリッチペプチドの使用に関する。本発明のプロリンリッチオリゴペプチドは、酵素アルギニノコハク酸シンターゼ（ＡｓＳ）を活性化することによって、又は二価カルシウムイオン（Ｃａ２＋）の細胞内濃度を増大させることによってなどの、多数の機構によってＮＯの生合成を促進することができるので、前記ペプチドは生物におけるＮＯの欠乏によって引き起こされる障害、例えば哺乳動物における勃起機能障害、心臓血管疾患、神経系の障害、胃腸系の障害、免疫系の障害、胚芽細胞の生成の調節、全身、腎臓、及び冠血行動態の障害、神経変性病状、子癇前症、免疫応答及び／又は腫瘍増殖中のリンパ球機能障害を治療するのに有用である。
【００５９】
本発明の最後の実施形態は、一酸化窒素の生合成を活性化することができるオリゴペプチド、又は異なるプロリンリッチオリゴペプチドの混合物を含む医薬組成物を動物に投与することに基づく、前記動物におけるＮＯの欠乏によって引き起こされる疾患の治療方法に関する。
【００６０】
人間医学及び獣医学において使用することができる本明細書に記載する方法によって治療することができる、動物におけるＮＯの欠乏によって引き起こされる疾患には、心臓血管疾患、神経系の障害、胃腸系の障害、免疫系の障害、胚芽細胞の生成の調節、全身、腎臓、及び冠血行動態の障害、神経変性病状、子癇前症、免疫応答及び／又は腫瘍増殖中のリンパ球機能障害、及び勃起機能障害がある。
【００６１】
本発明のＺ−プロペプチドを用いて実施したアッセイにおいて得た結果を記載した以下の実施例は、例示的な目的のみで示し、決して本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
【００６２】
本明細書中に挙げた全ての特許及び参照文献は、それらの全容が参照として本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００６３】
（実施例１）
合成Ｚ−プロペプチドの調製
簡潔に言うと、自動合成装置ＰＳＳＭ８（島津製作所、日本）においてペプチドを合成し、その中では、塩基不安定性の基フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）でＮ−αにおいて保護したアミノ酸残基を、不溶性ポリマー支持体（プロリン−２−クロロトリチル樹脂）に連続的に加えた。Ｆｍｏｃ保護基を除去した後、次の保護アミノ酸を、カップリング試薬又は予め活性化させたアミノ酸誘導体のいずれかを使用して加える。生成したペプチドは、そのＣ末端アミノ酸を介してリンカーによって樹脂と結合し、及びその後切断して酸性ペプチドが生成する。保護Ｎ−αＦｍｏｃ基の切断はピペリジンを用いて実施した。その後トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を、ペプチジル樹脂の最終的な切断、及びＦｍｏｃ基によって保護された側鎖の脱保護に使用する。ペプチドは逆相液体クロマトグラフィーによって精製し、ペプチドの同一性及び純度は高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分析し、質量分析によって確認した。
【００６４】
（実施例２）
ペプチドの精製及び特徴付け
本発明の合成ペプチドは、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製した。最終的な脱保護ペプチドは、Ｅｃｏｎｏｓｉｌ  Ｃ−１８カラム（１０μ、２２．５×２５０ｍｍ）及び二溶媒系：（Ａ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／Ｈ２Ｏ（１：１０００）、及び（Ｂ）ＴＦＡ／アセトニトリル（ＡＣＮ）／Ｈ２Ｏ（１：９００：１００）において精製した。カラムは５ｍｌ／分の流速で、１０（又は３０）〜５０（又は６０）％の勾配の溶媒Ｂで３０又は４５分間溶出した。精度の確認に使用した分析ＨＰＬＣ系は、ＳＰＤ−１０ＡＶ  Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＵＶ−ＶＩＳ検出器、又はＳｈｉｍａｄｚｕ  ＲＦ−５３５蛍光検出器と結合したＵｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ  Ｃ−１８カラム（５μ、４．６×１５０ｍｍ）を有するＳｈｉｍａｄｚｕからの二成分系であった。溶出は前に記載した溶媒Ａ及びＢを用いて、１ｍｌ／分の流速及び１０〜８０％の勾配で２０分間実施した。溶出液は２２０ｎｍでの吸光度によって、及び／又はλｅｘ３２０ｎｍでの励起後の、λｅｍ４２０ｎｍ励起でのそれらの蛍光によってモニタリングした。精製ペプチドの質量はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分光分析（Ｅｔｔａｎ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／Ｐｒｏ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、スウェーデン）、及び／又はペプチドのシークエンシング（ＰＰＳＱ−２３、島津製作所、東京、日本）によって測定した。酸加水分解後、４５０ｎｍでの発光、及び３５０ｎｍ励起での蛍光によってＯＰＡ−誘導体化をモニタリングした後に、ペプチドの濃度をＳｈｉｍａｄｚｕによるＨＰＬＣ系において実施したアミノ酸分析によって測定した。
【００６５】
本発明の合成ペプチドの特徴付けデータは、以下の表１中に与える。
【表１】
2009522314.tif 000003
【００６６】
（実施例３）
分子標的アルギニノコハク酸シンターゼ（ＡｓＳ）の同定
出発物質は、バッファー１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、２５ｍＭのサッカロース、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び１ｍＭのＰＭＳＦ（サイトゾル分画）、又は１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（原形質膜分画）中で均質化したマウス腎細胞のサイトゾル及び原形質膜の粗製抽出物であった。上清を０．２ＭのＮａＨＣＯ３、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．３中で透析し、アフィニティークロマトグラフィーカラムＨｉｔｒａｐ  ＮＨＳ−活性化（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に別々に施し、５ｍｇの配列番号７のペプチドと結合させた。
【００６７】
アフィニティーカラムの調製。配列番号７の均質な調製物（１ｍｌの０．２ＭのＮａＨＣＯ３、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．３中に５ｍｇ）を施す前に、２ｍｌの１ｍＭＨＣｌでカラムを３回洗浄した。室温で３０分のインキュベーション後、ペプチドが結合し、カラムはバッファーＡ（０．５Ｍのエタノールアミン、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．３）で不活性化し、０．２ＭのＮａＨＣＯ３、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．３で洗浄し、５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、０．１％、ＮａＮ３、ｐＨ７．０中に４℃で保存した。これらのカラムはＨｉＴｒａｐ−配列番号７と呼んだ。対照カラム（ペプチド含まず）は、ＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ−活性化ＨＰ及びバッファーＡ（Ｈｉ  Ｔｒａｐ−対照）をインキュベートすることによって調製した。
【００６８】
腎臓抽出物の調製。約３０ｇの重量であるＢａｌｂ−ｃマウスに５０μｌの１０％ケタミン及び２％キシラジン（１：１）で麻酔をかけ、２０ｍｌの生理食塩水（０．９％のＮａＣｌ）及び０．０１％のヘパリンナトリウムを用いて４ｍｌ／分の流量で、心臓内灌流（左心室を介した注入及び右心房を介した流出）を施した。腎臓はすぐに除去し重量を量り、各１ｇの組織に、１ｍｌのバッファー（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２５ｍＭのサッカロース、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び１ｍＭのＰＭＳＦ、ｐＨ７．５）を加えた。腎臓は組織ホモジェナイザー（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ  ＰＴ  ＭＲ  ３０００、Ｋｉｎｅｍａｔｉｃ  ＡＧ、Ｌｉｔｔａｕ）で細かく切り刻み、４℃において３５分間２９，０００ｒｐｍで遠心分離にかけた。サイトゾルタンパク質を含む上清を保存し、一方ペレットは、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む前に記載したのと同じバッファーに再度懸濁させた。ホモジェネートは前と同じ条件で遠心分離にかけた。上清は膜タンパク質を含んでいた。
【００６９】
アフィニティークロマトグラフィー及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる保持されたタンパク質の分析。ＨｉＴｒａｐ−配列番号７カラムは、２体積の２０ｍＭのトリス−ＨＣｌバッファー、ｐＨ８．０を用いて平衡状態にした。腎臓抽出物（１００ｍｇ／ｍｌの合計タンパク質）のサイトゾル及び膜分画を別のカラムに施し（１ｍｌ／分の流速）、１０体積の２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で洗浄した。配列番号７のペプチドとアフィニティーを有するタンパク質は、１００ｍＭのグリシン、０．５ＭのＮａＣｌバッファー、ｐＨ３．０を用いて、又は代替的に１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２５ｍＭのサッカロース、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ、ｐＨ７．５中での５ｍｇ／ｍｌの配列番号８のペプチドとの競合によって溶出させた。溶出液は１０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３、ｐＨ８．０中で４℃において１２時間透析した。タンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）は、Ｂｒａｄｆｏｒｄの方法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、Ｍ．Ｍ．「タンパク質−色素結合の原理を使用する、マイクログラム量のタンパク質を定量化するための迅速で感度の良い方法。（Ａ  ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｇｒａｍ  ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｙｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ．）」Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８〜２５４、１９７６）及びＢｉｏＲａｄからのタンパク質アッセイ試薬によって測定した。ウシアルブミンを標準として使用し、測定は分光光度計で５９５ｎｍにおいて実施した。溶出液は真空遠心分離によって１００μｌ体積に濃縮し、５μｌの等分試料は、Ｌａｅｍｍｌｉ（Ｌａｅｍｍｌｉ  Ｕ．Ｋ．「バクテリオファージＴ４の頭部の構築中の構造タンパク質の切断。（Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｄ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅＴ４．）」Ｎａｔｕｒｅ２２７：６８０〜６８５、１９７０）によって記載されたようにＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中での電気泳動に施した。結果は図１中に表す。
【００７０】
保持されたタンパク質の特徴付け
質量分析。ゲルの主なバンドを切断し、断片化し、７５ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３の４０％エタノール溶液に移した。室温での数回にわたる１時間のインキュベーションが、ゲルを脱色するために必要であった。ゲル中に含まれていたタンパク質は、６０℃において３０分間２５ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３中で５ｍＭのＤＴＴ（ジチオスレイトール）によって還元し、次に暗所中で室温において３０分間２５ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３中で５５ｍＭのヨードアセトアミドでアルキル化した。２５ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３を用いた一回の洗浄、及びアセトニトリルを用いた他の洗浄を実施した。ゲル断片の脱水は、アセトニトリルを用いた３回の１０分間の洗浄、次に１０分間の真空中での乾燥によって実施した。ゲルは４０μｇ／ｍｌのトリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｇｒａｄｅ、Ｓｉｇｍａ）を含む溶液中、氷上で４５分間５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３中で再水和し、３０℃において１６時間インキュベートした。タンパク質断片は、５０μｌの５０ｍＭＮＨ４ＨＣＯ３の添加及び１０分間の超音波浴、次に５０μｌのアセトニトリルの添加によってゲルから抽出した。この手順は３回繰り返した。溶出液（抽出したペプチド）は真空中で乾燥させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ｅｔｔａｎ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）による質量分析のためにアセトニトリル中に再度懸濁させた。タンパク質バンドは、酵素アルギニノコハク酸シンターゼ（ＡｓＳ）であるとして同定した。
【００７１】
ウエスタンブロット。電気泳動後、タンパク質は１２時間約３０Ｖの一定電圧下で、トランスファーバッファー（３８０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１８０ｍＭのグリシン、２０％メタノール）を使用して、ニトロセルロース膜に電気によって移動させた。移動手順の後、膜は５分間Ｐｏｎｃｅａｕ溶液で染色し、バンドを目に見える状態にして、それらのおよその分子質量を測定した。過剰なＰｏｎｃｅａｕ溶液は蒸留水を用いた洗浄によって除去し、膜は５％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）の溶液中、０．０５％のＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳ−Ｔ）及び０．０２％のアジド中で室温において１時間インキュベートした。ＢＳＡ溶液を廃棄し、ＴＢＳ−Ｔバッファーに希釈した（供給者により推奨されたように１：５００）一次モノクローナル抗ＡｓＳ抗体（ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加え、次いで室温において１時間インキュベートした。抗体溶液を除去し、膜は室温において１０分間ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。二次抗体、ＴＢＳ−Ｔバッファーに１：７５００で希釈したアルカリホスファターゼと結合した抗マウスＩｇＧ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えた。室温における１時間のインキュベーション後、膜を１０分間ＴＢＳ−Ｔバッファーで３回洗浄し、現像溶液（溶液ＡＰ［５ＭのＮａＣｌ、１Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．５、１ＭのＭｇＣｌ２］及びＢＣＩＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸）及びＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）を加え、これによって当該のバンドを目に見える状態にすることができた。結果は図２中に表す。
【００７２】
（実施例４）
アルギニノコハク酸シンターゼ（ＡｓＳ）活性の増強
配列番号８のペプチドによる実施例３のＡｓＳ酵素の活性化を、Ｈａｏら［Ｈａｏ  Ｇ．、Ｘｉｅ  Ｌ．、Ｇｒｏｓｓ  Ｓ．Ｓ．「アルギニノコハク酸シンテターゼはｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでＳ−ニトロシル化によって可逆的に不活性化される。（Ａｒｇｉｎｉｎｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｉｓ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  Ｓ−ｎｉｔｒｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．）」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７９：３６１９２〜３６２００（２００４）］に従いｉｎ  ｖｉｔｒｏで定量化した。この方法は、ピロホスファターゼを反応培地に加えたときの、ＡＴＰから生じるリン酸塩の量の測定に基づく。ピロホスファターゼの活性はＡｓＳの酵素活性と直接関係があるので、生成したピロリン酸塩の量はＡｓＳ活性の直接的な測定値である。
【００７３】
ＡｓＳ酵素（１μｇ）を、９６ウエルマイクロプレート中の最終体積２００μＬ中の、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、２ｍＭのＡＴＰ、２ｍＭのシトルリン、２ｍＭのアスパラギン酸、６ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのＫＣｌ、及び０．２単位のピロホスファターゼを含む反応混合物に加えた。増加量の配列番号８のペプチド（０．５、１〜８μＭ）を加え、サンプルは３７℃において６０分間インキュベートした。反応は２００μＬのモリブデン酸アンモニウムバッファー（１０ｍＭのアスコルビン酸、２．５ｍＭのモリブデン酸アンモニウム、２％の硫酸）を加えることによって中断させた。生成したリン酸は、無機リン酸を用いて得た標準曲線を使用して、分光光度法によって（吸光度６５０ｎｍで）サンプル中において測定した。結果は図３中に表す。
【００７４】
酵素活性の特異性をアッセイ中で実証し、その中でＡｓＳ酵素を、２μＭの配列番号８のペプチドを含む前に記載した反応培地に増加濃度（１〜８μｇ）で加えた。リン酸の生成率（ＡｓＳの酵素活性）は、２μＭの配列番号８のペプチドを加えることによって約２．５倍まで活性化した。この活性は特異的ＡｓＳ阻害剤ＭＤＬＡ（α−メチル−ＤＬ−アスパラギン酸）によって完全に阻害された［Ｓｈｅｎ  Ｌ．Ｊ．、Ｂｅｌｏｕｓｓｏｗ  Ｋ．、及びＳｈｅｎ  Ｗ．Ｃ．「細胞内シトルリン−アルギニン再生経路への内皮及び誘導性一酸化窒素シンターゼのアクセス性。（Ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ−ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ．）」Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６９：９７〜１０４、２００５］。これらの結果は図４中に表す。
【００７５】
（実施例５）
遊離状態の細胞内のＣａ２＋濃度の増大
これらの実験では、遊離状態の細胞内カルシウムの濃度［Ｃａ２＋］ｉの変化を、配列番号１又は配列番号８のペプチド１μｍｏｌ、又は１μｍｏｌのカプトプリルを加えた後にＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞（ヒト神経芽腫細胞、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−２１３７）において測定した。５％のＣＯ２雰囲気において、３７℃、及び９５％の相対湿度で、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％の非必須アミノ酸を補充したＤＭＥＭ（ダルベッコ改変培地）中に細胞を保った。細胞はトリプシンで処理し、適切な細胞濃度で複製させた。
【００７６】
遊離状態の濃度［Ｃａ２＋］ｉの変化の測定は、Ｍａｒｔｉｎｓら（Ｍａｒｔｉｎｓら、「Ｐ１９胚性癌腫細胞の神経分化は、キニンＢ２受容体遺伝子の発現及び機能を制御する。（Ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐ１９  ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｋｉｎｉｎ  Ｂ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．）」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：１９５７６〜１９５８６、２００５）によって記載されたのと同様に、共焦点顕微鏡ＬＳＭ５１０（Ｚｅｉｓｓ、Ｊｅｎａ、ドイツ）を用いて実施した。約５×１０４個のＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞を、測定前に２４時間６０ｍｍプレートに平板培養し、次いで４μＭのフルオ−３ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）０．５％ＤＭＳＯ中及び０．１％非イオン性界面活性剤プルロン酸Ｆ−１２７で、３７℃において３０分間処理した。細胞は１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで洗浄し、規定培地（５μｇ／ｍｌのインシュリン、３０μｇ／ｍｌのトランスフェリン、２０μＭのエタノールアミン、３０ｎＭの亜セレン酸ナトリウム、１μＭのピルビン酸ナトリウム、１％の非必須アミノ酸、１ｍＭのグルタミン、１００μｇ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４ＤＭＥＭ中）に移した。蛍光フルオ−３ＡＭは４８８ｎｍで励起させ、蛍光は５２６ｎｍで測定した。
【００７７】
［Ｃａ２＋］ｉの変化を、無刺激細胞中、及び配列番号１又は配列番号８のペプチド１μｍｏｌ、又はカプトプリル（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で刺激した細胞中で測定した。蛍光の増大を２分間モニタリングし、毎秒２５６×２５６ピクセルで画像を得た。それぞれの実験の最後に、Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚら、（１９８５）によって記載されたのと同様に、５μＭのイオノフォア（４−Ｂｒ−Ａ２３１８７）、次に１０ｍＭのＥＧＴＡ、又は２０μＭのジギトニンを加えて、それぞれ最大及び最小の蛍光、Ｆｍａｘ及びＦｍｉｎを測定した。
【００７８】
配列番号１又は配列番号８のペプチド１μｍｏｌを加えた後に得た蛍光（Ｆ）値と関連付けた、細胞内カルシウムの濃度［Ｃａ２＋］ｉを、フルオ−３ＡＭに関してＫｄ＝４５０ｎＭと仮定して、等式：［Ｃａ２＋］＝Ｋｄ（Ｆ−Ｆｍｉｎ）／（Ｆｍａｘ−Ｆ）を用いて計算した（Ｈａｌｌｅｔｔら、１９９０）。結果は図５中に表す。
【００７９】
（実施例６）
ヒト内皮及び神経芽腫細胞におけるＮＯ生成の活性化
ＨＵＶＥＣ細胞（ヒト臍帯静脈内皮細胞）を臍帯静脈から得た。これはｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓａｏ  Ｐａｕｌｏからの進物であった。９６％エタノールを用いて外部で血管を洗浄し、血管の末端で斜め切りした後、カテーテルを静脈血管に導入し、三方向バルブと結合させた。静脈は２０ｍｌの滅菌生理食塩水で洗浄し、血管の他端は結んだ。１ミリリットルのコラゲナーゼＩＶ型溶液を導入した（０．２ｍｇ／ｍｌ／臍帯静脈１ｃｍ）。血管をペトリ皿（１０ｃｍ２）に移し、３７℃において１５分間インキュベートした。帯中に含まれていた細胞はマッサージによって除去し、滅菌チューブに移した。ウシ胎児血清を１０％の最終濃度まで加え、懸濁液は４℃において３，０００ｇで１０分間遠心分離にかけ、細胞ペレットは２ｍｌの完全培地（４０％培地１９９、４０％のＤＭＥＭ、１８％のウシ胎児血清、１％のＬ−グルタミン、１％のペニシリン／ストレプトマイシン）中に再度懸濁させた。細胞懸濁液は、（４℃において３０分間）１％ゼラチン溶液で予め処理した容器に移し、５ｍＬの完全培地を加えた。容器は５％のＣＯ２雰囲気において３７℃でインキュベートした。培地は１２時間後に交換し、さらにその後３日毎に交換した。
【００８０】
ヒト神経芽腫細胞（ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、ＡＴＣＣ  ｎｏ．ＣＲＬ−２１３７）は、５％のＣＯ２雰囲気において、３７℃、及び９５％の相対湿度で、１０％のＦＢＳ（ウシ胎児血清）及び１％の非必須アミノ酸を補充したＤＭＥＭ中に細胞を保った。細胞はトリプシンで処理し、適切な細胞濃度に達したとき複製した。培地は１２時間後に交換し、さらにその後３日毎に交換した。
【００８１】
Ｆｅｅｌｉｓｃｈらの方法（Ｆｅｅｌｉｓｃｈら、「生物組織及び流体における同時Ｓ−、Ｎ−、及びヘム−ニトロシル化：ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＮＯの運命の意義。（Ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ  Ｓ−、Ｎ−、ａｎｄ  ｈｅｍｅ−ｎｉｔｒｏｓ（ｙｌ）ａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ａｎｄ  ｆｌｕｉｄｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｆａｔｅ  ｏｆ  ＮＯ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．）」ＦＡＳＥＢ  Ｊ  １６：１７７５〜１７８５、２０００）を利用して、前に記載した内皮細胞及び神経細胞においてＮＯ生成を分析した。
【００８２】
細胞はペトリ皿中で８０％の融合状態まで増殖させた。配列番号８のペプチドはＨＵＶＥＣ細胞には０〜８μＭの濃度範囲、及びＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞には０〜１００μＭの濃度範囲で加え、２４時間インキュベーションを続けた。その後、１ｍｌの培地を取り出し（細胞外培地）、１ｍｌの１０ｍＭのＮ−エチルマレイミドと交換した。細胞はＰＢＳで洗浄し、ＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭのトリスｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＮｏｎｉｄｅｔ  ｐ−４０（ＮＰ−４０）及び０．５％のデソキシコール酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＤＴＰＡ、及び１０ｍＭのＮ−エチルマレイミド）に溶かした。溶解物を回収し、２０分間氷上でインキュベートし、遠心分離にかけた。上清は−８０℃に保った（細胞内培地）。ＮＯ由来の亜硝酸の濃度を、細胞内及び細胞外培地において測定した。結果は図６（Ａ及びＢ）中に表す。
【００８３】
（実施例７）
Ｃ６グリア細胞（ラットグリオーマ）におけるＮＯ生成
細胞生物学実験用の全ての試薬はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。ラットグリオーマ由来のＣ６細胞は、１０％のウシ胎児血清、硫酸ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、及びペニシリンＧ（１００μｇ／ｍｌ）を補充したＤＭＥＭ中で培養した。培養物は５％のＣＯ２雰囲気中に３７℃で保った。ペプチドを加える２４時間前に、血清を含まないＤＭＥＭ培地を含む２４ウエルプレート（１．５×１０５個の細胞／ｍｌ／ウエル）に細胞を移した。ペプチドは１μＭの最終濃度まで培養物に加え、５％のＣＯ２雰囲気において３７℃で２４時間インキュベートした。培地は回収し−８０℃で保存した。
【００８４】
２４時間１０ｍＭの最終濃度でＮ−エチルマレイミドと共にインキュベートした１ｍｌの培養培地において、ＮＯ濃度を測定した。１，０００ｒｐｍでの遠心分離にかけた上清を、ＮＯ定量化用にＮＯＡ機器（一酸化窒素分析計−Ｓｉｅｖｅｒｓ）に注入した。結果は図７中に表す。
【００８５】
（実施例８）
マウス中での配列番号８のペプチドの生物学的利用能
１２５Ｉを用いた配列番号８の標識及びその精製
配列番号８のペプチドは、幾つかの改変［Ｂｉｓｃａｙａｒｔ  ＰＬ、Ｐａｌａｄｉｎｉ  ＡＣ、Ｖｉｔａ  Ｎ、Ｒｏｇｕｉｎ  ＬＰ。「長期の安定性を備える良質の結合性の１２５Ｉ標識したヒト成長ホルモンの調製。（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  １２５Ｉ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｅｎｄｏｗｅｄ  ｗｉｔｈ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．）」Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、１０、３７〜５６、１９８９；Ｒｉｂｅｌａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．、１８（２）：１１５〜２００、２０００］で、Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ及びＨｕｎｔｅｒ（Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ  ＦＣ及びＨｕｎｔｅｒ  ＷＭ。「高比放射能の１２５Ｉ標識したヒト成長ホルモンの調製。（Ｔｈｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  １２５Ｉ−ｌａｂｅｌｌｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ．）」Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、８９：１１４〜１２３、１９６３）に従い１２５Ｉを用いて標識した。一定攪拌下で、ＰＢＳに溶かした５μｇの合成配列番号８ペプチドを、１ｍＣｉの１２５Ｉ、及び０．８μｇのクロラミンＴと混合させた。５分後、１μｇのメタ重亜硫酸及び２００μｇのヨードカリウムを加えて標識反応を終了させた。標識産物の精製は、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅら［Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅら、「合成ペプチドｔｒｐ−ｌｙｓ−ｔｙｒ−ｍｅｔ−ｖａｌ−ｍｅｔ−ＮＨ２はＦＰＲＬ１／リポキシンＡ４受容体によって好中球を特異的に活性化し、オーファン単球発現走化性因子受容体ＦＰＲＬ２のアゴニストである。（Ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｒｐ−ｌｙｓ−ｔｙｒ−ｍｅｔ−ｖａｌ−ｍｅｔ−ＮＨ２  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＦＰＲＬ１／ｌｉｐｏｘｉｎ  Ａ４  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｉｓ  ａｎ  ａｇｏｎｉｓｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｏｒｐｈａｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＦＰＲＬ２．）」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２１５８５〜２１５９３、２００１］によって記載されたのと同様に、使い捨てマイクロカラム（Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８、Ｗａｔｅｒｓ）において逆相クロマトグラフィーによって実施した。反応産物は３倍体積の蒸留水に希釈し、蒸留水で予め処理したカラムに施した。ヨードカリウム（５ｍＭ、２０ｍＬ）を加え、カラムは２０ｍＬの蒸留水で二回洗浄した。標識ペプチドは２ｍＬの１００％メタノールで溶出し、５μｌの等分試料はＮｕｃｌｅａｒ  Ｃｈｉｃａｇｏ社のγ線測定器において分析した。
【００８６】
マウス中での配列番号８のペプチドの生物学的利用能
合成配列番号８のペプチドの分布速度論の分析を、Ｎａｓｃｉｍｅｎｔｏら（Ｎａｓｃｉｍｅｎｔｏら、「ヘビ毒に対するγ線の影響。（Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｇａｍｍａ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｓａｎｋｅ  ｖｅｎｏｍｓ．）」Ｒａｄｉａｔ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．５２：６６５〜６６９、１９９８）及びＣａｒｄｉら（Ｃａｒｄｉ  ＢＡ、Ｎａｓｃｉｍｅｎｔｏ  Ｎ、Ａｎｄｒａｄｅ  Ｊｒ  ＨＦ、「ｄｕｒｉｓｓｕｓ  ｔｅｒｒｉｆｉｃｕｓのクロトキシンへの６０Ｃｏγ線の照射は、スカベンジャー受容体を介したマクロファージによるその取り込みを誘導する。（Ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｒｏｔａｌｕｓ  ｄｕｒｉｓｓｕｓ  ｔｅｒｒｉｆｉｃｕｓ  ｃｒｏｔｏｘｉｎ  ｗｉｔｈ  ６０Ｃｏ  ｇａｍｍａ−ｒａｙｓ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｉｔｓ  ｕｐｔａｋｅ  ｂｙ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｃａｖｅｎｇｅｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．）」Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｂｉｏｌ．７３、５５７〜５６４、１９９８）に従い実施した。それぞれの実験に関して、１０匹の動物群に分けた約２０〜２５ｇの重量の８０匹のオスのアルビノスイスマウスに、平均１×１０６ｃｐｍの配列番号８／１２５Ｉペプチド、及び冷配列番号８ペプチドを含む５０μＬの生理食塩水を尾部静脈に接種し（静脈内注射）、体重１ｋｇ当たり０．９１ｍｇのペプチドに達した。
【００８７】
注射後１、５、１５、３０、４５、６０、１２０及び１８０分後に動物に麻酔をかけ、頸椎脱臼によって殺傷し、臓器（心臓、脾臓、肝臓、腎臓、腸、胃、甲状腺、精巣、及び脳）を除去し、０．９％生理食塩水で血液を洗浄し、重量を量った。各臓器の放射能をγ線測定器において測定した。尾部を回収し、線量修正に使用するために放射能測定に施した。
【００８８】
各臓器中に存在した線量百分率は、投与した標準線量を使用して測定した。線量百分率／組織１ｍｇで得た放射能値を記録した。結果は図８中に表す。
【００８９】
（実施例９）
マウス尿中のＺ−プロ代謝産物の測定
配列番号１、配列番号４、配列番号５、配列番号８、及び配列番号１５のペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ加水分解を、食料及び水を自由に与え１２時間周期の明−暗サイクルの下に保った、約２２〜２５ｇの重量のオスのスイスマウスにおいて調べた。
【００９０】
１０匹のマウス群を、２００μｌの生理食塩水に希釈した動物当たり０．９１ｍｇ／ｋｇの各プロリンリッチオリゴペプチドで腹膜内治療した。治療及び（治療しなかった）対照動物をメタボリックケージ中に保ち、それらの尿を２４時間後に回収した。溶媒Ａ（Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ）で予め平衡状態にした逆相Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８マイクロカラム（Ｗａｔｅｒｓ）において尿は予め精製した。サンプルは６０％溶媒Ｂ（９０％アセトニトリル／１０％溶媒Ａ）を用いて溶出し、凍結乾燥させ、１ｍｌの脱イオン水に再度懸濁して１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離にかけた。上清（５００μｌ）は分析ＨＰＬＣ系において分画した。勾配は１ｍｌ／分の流速を使用して３０分間５〜６５％溶媒Ｂであり、２１４ｎｍでモニタリングした。分画は凍結乾燥させ、０．２％ギ酸を含むアセトニトリル／Ｈ２Ｏ（１：１）に再度懸濁し、質量分析（Ｑ−ＴＯＦ−Ｐｒｏ）によって分析した。対照動物と治療動物からの尿分画を比較して、試験したペプチド由来の代謝産物の存在を測定した。結果は表２中に表す。
【表２】
2009522314.tif 000004
【００９１】
（実施例１０）
本発明のペプチドによる腎臓のＮＯＳの活性化
２２〜２５ｇの重量のオスのアルビノスイスマウスに、（１）５０μｌの０．９％ＮａＣｌ（基礎レベル対照）、又はＬＰＳ（２ｍｇ／ｋｇ）を補充した０．９％ＮａＣｌ（陽性対照）、（２）配列番号８（０．２１、０．９１、及び３．４７ｍｇ／ｋｇ）、（３）配列番号８（０．９１ｍｇ／ｋｇ）、Ｌ−ＮＡＭＥ（３ｍｇ／ｋｇ、１時間）を用いて腹膜内経由で予め治療した動物に注射した、（４）配列番号８（０．９１ｍｇ／ｋｇ）、ＨＯＥ１４０（１０μｇ／ｋｇ、１時間）を用いて腹膜内経由で予め治療した動物に注射した、（５）カプトプリル（０．２１、０．９１、及び３．４７ｍｇ／ｋｇ）を腹膜内注射した。５、１５、３０、６０、１２０、及び１８０分後、動物を殺傷し、それらの腎臓を除去し−７０℃で保存した。グループ３及び４の動物を、オリゴペプチドの投与後３０分で殺傷した。
【００９２】
ＮＯＳの活性はＢｒｅｄｔ及びＳｎｙｄｅｒ［Ｂｒｅｄｔ  ＤＳ及びＳｎｙｄｅｒ  ＳＨ。「一酸化窒素シンテターゼ、カルモジュリン要求酵素の単離。（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ａ  ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｒｅｑｕｉｒｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ．）」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７、６８２〜６８５、１９９０］に従い測定した、これは変換の参照として３Ｈ−アルギニンを使用するＬ−シトルリンへのＬ−アルギニンの変換の酵素活性の推定に基づく。
【００９３】
ＮＯＳ活性のアッセイ
腎臓はホモジェネートバッファー、ｐＨ７．４（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．３２Ｍのサッカロース、１ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ）中で粉砕し、超音波処理した。タンパク質用量測定をＢｒａｄｆｏｒｄ（１９７６）に従い実施し、次に３００μＬのＤｏｗｅｘ  ５０ＷＸ８−４００カラムにおいてクロマトグラフィーステップを実施した。
【００９４】
酵素アッセイ用に、各サンプルからの８０μｇの合計タンパク質を、２００μＬのバッファー（３０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１．２５ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＮＡＤＰＨ、１０μｇ／ｍＬのカルモジュリン、４μＭのＦＡＤ、４μＭのＦＭＮ、２５μＭのＢＨ４、１２０ｎＭのアルギニン、０．５μＣｉの３Ｈ−アルギニン）中で３７℃において６０分間インキュベートした。１ｍｌの２０ｍＭのＨＥＰＥＳを加えることによって反応を停止させ、氷浴中でインキュベートした。３Ｈ−シトルリンは、３００μＬのＤｏｗｅｘ  ５０ＷＸ８−４００カラムにおいてイオン交換クロマトグラフィーによって３Ｈ−アルギニンから分離した。溶出液の放射能はβ線測定器において測定した。ｃｐｍ（１分当たりのカウント数）をｄｐｍ（１分当りたの壊変）に変換した後、一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）の比放射能を以下の等式を使用して計算した：
【数１】
2009522314.tif 000005
【００９５】
上式で３Ｈ−アルギニンは、冷アルギニンと３Ｈ−アルギニン（１：１）の混合物の数に相当する。腎臓組織の粗製抽出物を加えたこと以外は、同じ手順を反応の陰性対照（ブランク）に使用した。結果は図９中に表す。
【００９６】
（実施例１１）
本発明のペプチドによって活性化される、全腎臓タンパク質抽出物におけるＮＯ生成
Ｗｕ及びＹｅｎ（Ｗｕ  ＣＣ及びＹｅｎ  ＭＨ。「高血圧自然発症ラットにおける高レベルの血漿中一酸化窒素。（Ｈｉｇｈｅｒ  ｌｅｖｅｌ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｉｎ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｒａｔｓ．）」Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ１２：４７６〜４８２、１９９９）によって記載されたのと同様に、ＮＯの放出を、３０〜３５ｇの重量のオスのスイスマウスの全腎臓タンパク質抽出物における硝酸及び亜硝酸の蓄積によって評価した。動物はヘパリンを含む０．９％生理食塩水溶液（１：１０００）を用いた灌流に施した。腎臓を回収し、冷５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ｍＭのＥＧＴＡ、１２ｍＭのβ−メルカプトエタノール、及び１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル、ｐＨ７．４バッファー中、ホモジェナイザー（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ  ＰＴ  ＭＲ  ３０００、Ｋｉｎｅｍａｔｉｃ  ＡＧ、Ｌｉｔｔａｕ）中で均質化した。ホモジェネートは、１時間５００μｌの最終体積で１０ｎＭ、１μＭ、又は１０μＭの配列番号８のペプチドと共にインキュベートした。トリクロロ酢酸（１％）を４℃で加え、２０分後、混合物を４℃において１３．０００ｇで７分間遠心分離にかけた。９０℃で１ＭのＨＣｌに溶かした塩化バナジウム（ＶＣｌ３）の飽和溶液を上清に加え、ＮＯ分析計（ＮＯＡＴＭ２８０；Ｓｉｅｖｅｒｓ  Ｉｎｃ．）においてＮＯとオゾンの反応による気体の化学発光によってＮＯの濃度を測定した。硝酸塩の濃度は、ＮａＮＯ３の標準曲線及びＢａｇソフトウェア２．２（Ｓｉｅｖｅｒｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）を使用して測定した。結果は図１０中に表す。
【００９７】
（実施例１２）
高血圧自然発症ラット（ＳＨＲ）に対する本発明中に記載したペプチドの抗高血圧効果
本発明のペプチドの影響に対するｉｎ  ｖｉｖｏ試験を、２５０〜３５０ｇの重量の成体のオスの高血圧自然発症ラット、及び正常血圧ウイスターラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｖｅｒｇｉｃｕｓ）に対して実施した。動物には食料（Ｎｕｖｉｌａｂ）及び水を自由に与え、それぞれ１２時間の明−暗サイクルに施した。動物及びそれらのケアに関する手順は、Ｇｉｌｅｓ［Ｇｉｌｅｓ  Ａ．Ｒ．「生物医学研究における動物の使用に関するガイドライン。（Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌｓ  ｉｎ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．）」Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．５８：１０７８〜１０８４、１９８７］に従い実施した。
【００９８】
ポリエチレンカテーテル（ＰＥ−５０と結合したＰＥ−１０）を、左大腿動脈を介して腹部動脈中に導入して心臓血管系パラメータを測定し、動物にトリブロモエタノール麻酔をかけた後に（体重１ｋｇ当たり２５０ｍｇ）静脈内注射用に右大腿静脈に導入した。カテーテル挿入後、動物は個々の実験用ケージ中に、手術後の回復期に２４時間中食料及び水を自由に与えながら保った。
【００９９】
心臓血管系パラメータ（動脈パルス圧（ＰＡＰ）、平均動脈血圧（ＭＡＰ）、及び心拍数（ＨＲ））は、データ収集システム（ＭＰ１００；ＢＩＯＰＡＣ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ、Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、Ｃａ、ＵＳＡ）によってコンピュータと結びつけた固体ひずみゲージ式変換器によってモニタリングした。ＰＡＰ、ＭＡＰ及びＨＲは異なるモニターチャンネルに絶えず示され、後の分析用にコンピュータのハードディスクに記録した。
【０１００】
薬剤の投与前に、ラットの心臓血管系パラメータを４０分間モニタリングした。ＡｎｇＩ（１００ｎｇ）の静脈内（Ｉ．Ｖ．）注射は、０．１ｍＬの合計体積で多量に実施した。記録の開始後６０分で、体重１ｋｇ当たり７１ｎｍｏｌの配列番号８のペプチド又は配列番号４又はカプトプリルを、０．９％ＮａＣｌ溶液０．５ｍＬの合計体積で静脈内投与した。ＡｎｇＩの注射は、実験の最初に行ったのと同様に、配列番号８のペプチド又は配列番号４、又はカプトプリルの投与後３〜１０分間繰り返した。対照として、配列番号８のペプチド又は配列番号４、又はカプトプリルの代わりに生理食塩水を注射した。動脈血圧及び心拍数を３６０分間絶えずモニタリングした。
【０１０１】
結果はＭＡＰの平均値±標準偏差として表した。実験の統計分析用に、一元配置ＡＮＯＶＡソフトウェアを使用した。次にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ．）を用いて実施した。結果は図１１Ａ〜Ｅ、１２、及び１３中に表す。
【０１０２】
（実施例１３）
ペントバルビトンで麻酔をかけたＳＨＲに対する、配列番号８のペプチド、配列番号１のペプチド、配列番号４のペプチド及びカプトプリルの抗高血圧作用
２５０〜３５０ｇの重量の成体のオスのＳＨＲを使用した。以下に記載したもの以外は、実施例１２中に記載した物質及び方法を使用した。
【０１０３】
２つの異なる実験セットを実施した：
１）群当たり５匹のＳＨＲに、体重１ｋｇ当たり６０ｍｇのペントバルビトンナトリウムを用いて腹膜内に麻酔をかけた。平均動脈血圧及び心拍数を、動脈血圧パルス（ＰＡＰ）から絶えず計算した。心臓血管系パラメータは、配列番号１、又は配列番号４、又は配列番号８のペプチド（体重１ｋｇ当たり７１ｎｍｏｌ）、又はカプトプリル（体重１ｋｇ当たり１０ｐｍｏｌ）を、０．９％ＮａＣｌ溶液０．５ｍＬの合計体積で静脈内投与する前の３０分間の間モニタリングした。対照は賦形剤（０．９％ＮａＣｌ）であった。ＰＡＭ及び心拍数を、抗高血圧化合物の投与後１８０分まで絶えずモニタリングした。結果は図１４Ａ中に表す。
２）測定の前日に、ＳＨＲに大腿動脈及び静脈へのカテーテル挿入のための手術を施した。体重１ｋｇ当たり６０ｍｇのペントバルビタールナトリウムを用いて麻酔を実施した。カテーテル挿入後、動物は個々の実験用ケージ中に、手術後の回復期に２４時間中食料及び水を自由に与えながら保った。ラットの心臓血管系パラメータは、配列番号１、又は配列番号４、又は配列番号８のペプチド（体重１ｋｇ当たり７１ｎｍｏｌ）、又はカプトプリル（体重１ｋｇ当たり１０ｐｍｏｌ）を、０．９％ＮａＣｌ溶液０．５ｍＬの合計体積で静脈内投与する前の６０分間の間モニタリングした。対照は賦形剤（０．９％ＮａＣｌ）であった。ＭＡＰ及び心拍数を、ペプチドの投与後３６０分まで絶えずモニタリングした。
【０１０４】
図１４Ｂ中に表す結果は平均±ＳＥＭとして表す。比較は適時にＳｔｕｄｅｎｔの不対ｔ検定又は一元配置ＡＮＯＶＡ及びＤｕｎｎｅｔｔの事後検定によって行った（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４．０、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。
【０１０５】
（実施例１４）
正常血圧ラットに対する高用量の本発明のペプチドの影響
２５０〜３５０ｇの重量の成体のオスのウイスター正常血圧ラットを、実施例１２中に記載したのと同様に配列番号８の血圧低下作用の実験評価において使用した。体重１ｋｇ当たり１０μｍｏｌの静脈内用量の配列番号８のペプチドを注射し、動脈血圧を６時間モニタリングした（結果示さず）。
【０１０６】
結果は、配列番号８のペプチドは体重１ｋｇ当たり１０μｍｏｌの用量において、これらの動物の動脈血圧を測定した６時間中、有意な血圧低下作用がなかったことを示した（結果示さず）。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】リガンドとして配列番号７のオリゴペプチドを含むアフィニティーカラムを介したマウス腎臓抽出物のクロマトグラフィー後の、配列番号７のオリゴペプチドと結合した約４６ｋＤａの１バンドの溶出を示すＳＤＳＰａｇｅゲルの図である。
【図２】マウス腎臓の精製膜及びサイトゾルタンパク質のウエスタンブロットの図である。２つの独立した実験のタンパク質を、配列番号７のペプチドを含むアフィニティーカラムによって精製した。レーン１及び２中のバンドは、実験１で得た膜及びサイトゾルのＡｓＳをそれぞれ同定し、レーン３及び４中のバンドは、実験２で得た膜及びサイトゾルのＡｓＳをそれぞれ同定する。
【図３】配列番号８のオリゴペプチドによる酵素アルギニノコハク酸シンターゼ（ＡｓＳ）の活性化の図である。結果は加えた配列番号８の量（μＭ単位）の関数としての吸光度（６５０ｎｍ）として表す。吸光度は反応混合物中に存在するリン酸塩の量と関係があり、したがってそれはＡｓＳ活性と関係がある。したがって、グラフは加えたオリゴペプチドの量の関数としてのＡｓＳの酵素活性の変動を表す。
【図４】配列番号８のペプチドによる酵素アルギニノコハク酸シンターゼ（ＡｓＳ）の活性化の図である。結果は加えた酵素ＡｓＳの量（μｇ単位）の関数としての吸光度（６５０ｎｍ）として表す。吸光度は反応混合物中に存在するリン酸塩の量と関係があり、したがってそれはＡｓＳ活性と関係がある。したがって、グラフは加えた酵素の量の関数としてのＡｓＳの酵素活性の変動を表す。菱形はＡｓＳの存在下での吸光度を表す。三角形は、配列番号８のペプチドを加えることによって活性化した、ＡｓＳの存在下で観察した吸光度を表す。四角形は、ＡｓＳ及びその特異的阻害剤ＭＤＬＡの存在下で観察した吸光度を表す。丸印は、配列番号８のペプチドを加えることによって活性化したＡｓＳの存在下、及びＡｓＳの特異的阻害剤、ＭＤＬＡの存在下での吸光度を表す。
【図５】配列番号１及び配列番号８のオリゴペプチドを加えた後の、時間の関数としてのＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞中での遊離状態の細胞内濃度［Ｃａ２＋］ｉの増大の図である（下図）。上図は、無刺激細胞中及びカプトプリルで処理した細胞中で、カルシウムの細胞内濃度の変化がないことを示す。
【図６】増大する配列番号８のオリゴペプチドの濃度（μＭ単位）の関数としての亜硝酸塩生成の図である。（Ａ）内皮細胞の細胞内及び細胞外環境中。（Ｂ）神経芽腫細胞の細胞内環境中、対照に関する割合の増大として表す。
【図７】多様なプロリンリッチペプチドと共にインキュベートしたＣ６細胞の細胞培養物中の、一酸化窒素のレベルの測定の図である。グラフ中に番号処理したペプチドの識別は、１−基礎レベル、２−Ｌ−ＮＡＭＥ（１ｍＭ）、３−ニトロシアン化物（１ｍＭ）、４−配列番号２、５−配列番号３、６−配列番号４、７−配列番号５、８−配列番号６、９−配列番号８、１０−配列番号１３、１１−配列番号１４である。
【図８】マウス組織中の１２５Ｉで標識した合成配列番号８の合成オリゴペプチドの生物学的利用能の図である。ペプチドの投与後１８０分で抽出した組織１ｍｇ当たりの、標識した配列番号８／１２５Ｉの用量の割合として結果を表す。
【図９】カプトプリル、配列番号８、Ｌ−ＮＡＭＥ、ＨＯＥ１４０、配列番号８／Ｌ−ＮＡＭＥ、及び配列番号８／ＨＯＥ１４０で治療した、スイスマウス腎組織のタンパク質抽出物において測定した全体のＮＯＳ活性（ｐｍｏｌ／ｍｇ×分単位）の図である。全てのサンプルを対照（未治療動物）と比較した。比較の有意性は、対照に対し（◆）ｐ＜０、０１、（＃）ｐ＜０、０５、及び対照／ＨＯＥ１４０に対し（＊）ｐ＜０、０５であった。５匹のマウスを各アッセイにおいて使用した（ｎ＝５）。グラフは以下の番号処理に従う：１−対照、２−カプトプリル、３−配列番号８、４−対照／Ｌ−ＮＡＭＥ、５−配列番号８／Ｌ−ＮＡＭＥ、６−対照／ＨＯＥ１４０、７−配列番号８／ＨＯＥ１４０。
【図１０】ｎＭ、１μＭ及び１０μＭの用量で配列番号８のペプチドと共にインキュベートした腎臓抽出物の全タンパク質中のＮＯレベル（μＭ）の評価の図である。対照は基礎レベル、ニトロシアン化物、陽性対照としてＮＯドナー、及びＬ−ＮＡＭＥ、陰性対照として特異的ＮＯＳ阻害剤である。グラフは以下の番号処理に従う：１−基礎レベル、２−ニトロシアン化物（１ｍＭ）、３−Ｌ−ＮＡＭＥ（１ｍＭ）、４−配列番号８（１０ｎＭ）；５−配列番号８（１μＭ）、６−配列番号８（１０μＭ）。
【図１１】時間の関数としての、正常血圧及び高血圧自然発症ラット（ＳＨＲ）の平均動脈血圧（ＭＡＰ）に対するプロリンリッチペプチド及びカプトプリルの影響の図である。全ての図中で、抗高血圧化合物の投与前後のアンギオテンシンＩＩへのアンギオテンシンＩの変換に関する試験を示し、次に３６０分中に平均動脈血圧を測定する。値は平均値を表し、各用量に関する５匹の動物の標準平均偏差を与える（ΔＭＡＰ、ｍｍＨｇ）。（Ａ）７１ｎｍｏｌ／ｋｇの配列番号８のペプチドを正常血圧ラットに投与した。（Ｂ）７１ｎｍｏｌ／ｋｇの配列番号８のペプチドをＳＨＲに投与した。（Ｃ）７１ｎｍｏｌ／ｋｇの配列番号４のペプチドをＳＨＲに投与した。（Ｄ）７１ｎｍｏｌ／ｋｇのカプトプリルをＳＨＲに投与した。（Ｅ）１０μｍｏｌ／ｋｇのカプトプリルをＳＨＲに投与した。
【図１２】ＳＨＲの平均動脈血圧における配列番号８のペプチドの用量効果の関係の図である。体重１ｋｇ当たり３ｎｍｏｌ、１５ｎｍｏｌ、７１ｎｍｏｌ、１４０ｎｍｏｌの用量を５匹のＳＨＲの群に投与した。値は平均値として表し（ΔＭＡＰ、ｍｍＨｇ）、抗高血圧活性の標準平均偏差を各用量に関して与える。
【図１３】ＳＨＲの平均動脈血圧に対する異なるプロリンリッチペプチドの抗高血圧効果の図である。数字はΔＭＡＰ（ｍｍＨｇ）に関する平均値を表し、体重１ｋｇ当たり７１ｎｍｏｌの用量の配列番号１、配列番号４、配列番号５、及び配列番号８のペプチドを与えた５匹のＳＨＲの群の標準平均偏差を与える。５匹のＳＨＲ（対照）には生理食塩溶液を注射した。
【図１４】ＳＨＲにおける配列番号１、配列番号４、配列番号８のペプチド、及びカプトプリルの抗高血圧活性に対するペントバルビトンの影響の図である。２群の２５匹のＳＨＲを試験し、１群はペントバルビトンで麻酔し、他方は同じ用量のペントバルビトンを２４時間前に与えた意識のあるＳＨＲであった。各群（麻酔済み及び意識あり）に関して、５匹の動物の群に体重１ｋｇ当たり７１ｎｍｏｌの用量の配列番号１、配列番号４、配列番号８のペプチド、及びカプトプリル（１０μｍｏｌ／ｋｇ）を与えた。両群に関して、５匹のＳＨＲに生理食塩溶液を注射した（対照）。値はΔＭＡＰ（ｍｍＨｇ）で表し、平均の標準偏差を与える。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年8月20日(2007.8.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一酸化窒素生成の欠乏によって引き起こされる疾患を治療又は予防するための医薬組成物の製造における、配列番号１〜１８のペプチドうちの１つ又は複数の使用。
【請求項２】
０．０５μｇ〜１０ｍｇの配列番号１〜１８で示す１つのアミノ酸配列、又はその混合物、又は薬剤として許容されるその塩を含むことを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
０．５μｇ〜５ｍｇの配列番号１〜１８で示す１つのアミノ酸配列、又はその混合物、又は薬剤として許容されるその塩を含むことを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
０．１μｇ〜０．０１ｍｇの配列番号１〜１８で示す１つのアミノ酸配列、又はその混合物、又は薬剤として許容されるその塩を含むことを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
心臓血管疾患を治療するための請求項１から４までに記載の医薬組成物の使用。
【請求項６】
神経系の障害を治療するための請求項１から４までに記載の医薬組成物の使用。
【請求項７】
胃腸系の障害を治療するための請求項１から４までに記載の医薬組成物の使用。
【請求項８】
免疫系の障害を治療するための請求項１から４までに記載の医薬組成物の使用。
【請求項９】
全身、腎臓、及び冠血行動態の障害を治療するための請求項１から４までに記載の医薬組成物の使用。
【請求項１０】
神経変性病状を治療するための請求項１から４までに記載の医薬組成物の使用。
【請求項１１】
子癇前症を治療するための請求項１から４までに記載の医薬組成物の使用。
【請求項１２】
免疫応答及び／又は腫瘍増殖中のリンパ球機能障害を治療するための請求項１から４までに記載の医薬組成物の使用。
【請求項１３】
勃起機能障害を治療するための請求項１から４までに記載の医薬組成物の使用。
【請求項１４】
雄胚芽細胞の生成を調節するための請求項１から４までに記載の医薬組成物の使用。
【請求項１５】
配列番号２、６〜１１、１７及び１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、動物細胞中の一酸化窒素の生成を実質的に増大及び維持し、動物細胞のアルギニノコハク酸シンテターゼの活性を増強し、動物細胞中の二価カルシウムイオンの細胞内濃度を増大させる少なくとも１つの活性を有することを特徴とする、オリゴペプチド。
【請求項１６】
請求項２から４までに記載の医薬組成物を投与することにより、内皮細胞を刺激して一酸化窒素を生成させることによって動脈平滑筋を弛緩させることを特徴とする、請求項１から４までに記載の動物における血流を制御する方法。
【国際調査報告】
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