(57)【要約】  タウロリジン、タウルルタム若しくはそれらの混合物を含む溶液、ゲル若しくは接着剤と共に放射線防護量のＰＶＰを含有する組合せ、又はタウロリジン、タウルルタム若しくはそれらの混合物のコラーゲンを含まない結晶を含む凝集体を電離放射線に曝すことによって形成される組成物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
放射線防護量のＰＶＰを含有し、且つタウロリジン、タウルルタム若しくはそれらの混合物をさらに含む溶液、ゲル若しくは接着剤を含む組合せ、又はタウロリジン、タウルルタム若しくはそれらの混合物のコラーゲンを含まない結晶を含む凝集体を電離放射線に曝すことによって形成される組成物。
【請求項２】
前記放射線のレベルが約０．０１Ｇｙ〜約１００ｋＧｙである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記放射線がＸ線又はγ線である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＰＶＰ、及び前記タウロリジン、タウルルタム又はそれらの混合物を含む前記溶液、ゲル又は接着剤を含む前記組合せを含む組成物であって、前記放射線のレベルが約０．０１〜１００Ｇｙであり、前記組合せ中の前記タウロリジン、タウルルタム又はそれらの混合物の存在量が約０．１〜１０重量％であり、前記ＰＶＰの平均分子量が約３０００〜１４０００ダルトンであり、前記組合せ中の前記ＰＶＰの存在量が約１〜１５重量％である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
タウロリジン、タウルルタム又はそれらの混合物のコラーゲンを含まない結晶を含む前記凝集体を含む組成物であって、前記放射線のレベルが約０．１〜１００ｋＧｙであり、且つ前記結晶の平均結晶径が約０．１〜１０００μｍの範囲内である、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
前記組合せ又は前記凝集体を電離放射線に曝すことを含む、請求項１に記載の組成物の製造方法。
【請求項７】
前記電離放射線がＸ線又はγ線である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記放射線のレベルが約０．０１Ｇｙ〜約１００ｋＧｙである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記放射線防護量のＰＶＰを含有し、且つタウロリジン、タウルルタム又はそれらの混合物を含む前記溶液、ゲル又は接着剤を癌患者に投与すること、及び該溶液、ゲル又は接着剤が該患者内に存在する間に、腫瘍増殖を抑制又は予防する量の電離放射線を該患者に投与することを含む、請求項１に記載の組成物を用いて腫瘍増殖を治療又は予防するための治療方法。
【請求項１０】
最初に前記溶液、ゲル又は接着剤が前記患者に投与され、続いて該患者に前記電離放射線が投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記溶液又はゲルが前記患者に投与され、且つ該患者への放射線投与中に該溶液又はゲルが該患者に投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記患者への前記放射線の投与前に前記溶液又はゲルが投与される工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
患者における腫瘍増殖を治療又は予防するための治療方法であって、タウロリジン、タウルルタム又はそれらの混合物のコラーゲンを含まない結晶を含む前記凝集体を含む、請求項１に記載の組成物の該患者への投与を含み、該凝集体の該患者への投与前、投与中又は投与後のうちの少なくとも１つである期間中に該凝集体が前記電離放射線に曝される治療方法。
【請求項１４】
患者における腫瘍増殖を治療又は予防するための組成物の調製におけるタウロリジン、タウルルタム又はそれらの混合物の使用であって、該組成物が、放射線防護量のＰＶＰ及びタウロリジン、タウルルタム若しくはそれらの混合物を含有する組合せ、又はタウロリジン、タウルルタム若しくはそれらの混合物のコラーゲンを含まない結晶を含む凝集体を電離放射線に曝すことによって製造される、タウロリジン、タウルルタム又はそれらの混合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、放射線照射された組成物、方法、及び癌の治療に関する。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本願は、２００６年１月６日に出願された米国特許仮出願第６０／７５６，５６９号、２００６年２月１日に出願された同第６０／７６３，９０９号、及び２００６年９月５日に出願された同第６０／８４２，１５６号の利益を主張する。
【背景技術】
【０００３】
抗菌薬及び抗毒素製剤であるタウロリジン及びその関連生成物であるタウルルタム等のメチロール転移剤は、とりわけ腫瘍の治療において使用される腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の毒性に対して修飾効果を発揮することが示されている。さらに、正常細胞株の増殖が有意には抑制されなかったという点でメチロール転移剤の作用が選択的であるということが示されている。
【０００４】
タウロリジンは作用部位で３つのメチロール基を転移させることによって作用し、中間代謝物であるタウルルタム自体が、非常に耐容性の高い化合物であるタウリナミドの遊離により単一のメチロール基を転移させる。したがって、２つの化合物は本質的に同じ機構によって作用する。なお、メチロール転移は、多くの毒性の高い抗腫瘍薬の特徴であるメチル転移と対比されるものである。タウロリジン及びタウルルタムは毒性が低く、且つ正常細胞に対する細胞毒性が無い。 
【０００５】
プログラム細胞死は、細胞数の調節における進化的に保存された生物学的原理である。感受性細胞は、適切なリガンドが隣接細胞から分泌されると活性化される細胞死受容体を含有する。プログラム細胞死における著名なシステムはＦａｓリガンド媒介アポトーシスである。ＣＤ  ９５／ＡＰＯ−１としても知られるＦａｓは細胞表面受容体であり、且つＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）によるオリゴマー形成時に感受性細胞におけるアポトーシスを媒介する腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーの一員である。
【０００６】
放射線も癌の治療に利用されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
当該技術分野において、癌の治療用の薬剤及び方法を改善する必要性が残っている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一実施の形態によれば、本発明は、ＰＶＰと共に、タウロリジン、タウルルタム若しくはそれらの混合物を含む溶液、ゲル若しくは接着剤を含む組合せ、又はタウロリジン、タウルルタム若しくはそれらの混合物のコラーゲンを含まない結晶を含む凝集体を電離放射線に曝すことによって形成される組成物に関する。本発明はまた、かかる組成物の形成方法、及び癌又は他の疾患の治療におけるかかる組成物の使用に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
一態様によれば、本発明は、腫瘍を抑制する量の放射線を被験体に投与することを含む併用療法において、タウロリジン及び／又はタウルルタム等のメチロール転移剤を被験体に投与することによる、被験体における癌及び腫瘍の治療に関する。
【００１０】
本発明はまた、放射線照射されたメチロール転移剤、及びメチロール転移剤を電離放射線に曝露することによるメチロール転移剤の滅菌方法に関する。メチロール転移剤は結晶質、非晶質であってもよく、ＰＶＰを含有する水溶液等の液体中に存在してもよい。
【００１１】
幾つかの実施形態において、メチロール転移剤は、タウロリジン及び／又はタウルルタムであり、より好ましくはコラーゲンを含まないタウロリジン結晶及び／又はタウルルタム結晶を含む組成物の形態である。好ましい実施形態において、放射線はＸ線（レントゲン）又はγ線である。
【００１２】
一実施形態によれば、放射線は約０．０１Ｇｙ〜約１００ｋＧｙの範囲内である。タウロリジン結晶及び／又はタウルルタム結晶の滅菌については、好ましい放射線量は約０．１〜１００ｋＧｙの範囲内である。他の実施形態において、放射線量は約１〜６０ｋＧｙ、約１０〜５０ｋＧｙ又は約２０〜３５ｋＧｙの範囲内である。
【００１３】
驚くべきことに、タウロリジン結晶及び／又はタウルルタム結晶が、放射線照射されていない対応物と比較して実質的に同一の特性及び安定性を有することが見出されている。
【００１４】
一実施形態によれば、本発明は、放射線との併用療法においてタウロリジン及び／又はタウルルタム等のメチロール転移剤が癌を治療可能であることに関する。タウロリジン及びその同属体であるタウルルタムは共に、それ自体が細胞生存度に対して事実上何らの効果も示さない薬物濃度で、癌細胞におけるＦａｓリガンドのアポトーシス効果を増強する。
【００１５】
組成物がタウロリジン及び／又はタウルルタムを含む溶液、ゲル又は接着剤を含む組合せである実施形態において、組合せはさらに放射線防護量のＰＶＰを含む。米国特許第６，０８０，３９７号明細書（参照により本明細書中に援用される）には、ＰＶＰと共にタウロリジン及び／又はタウルルタムを含む組成物が開示されている。組合せ中のＰＶＰの存在量は約１〜１５重量％、約４〜１０重量％又は約５〜６重量％の範囲内であり得る。組合せ中に存在するＰＶＰの平均分子量は、好ましくは約３０００〜１４０００ダルトンの範囲内である。好ましくは、組合せ中に存在するＰＶＰは約５００００ダルトンより高分子量を有するＰＶＰを実質的に含まない（例えば、かかるＰＶＰが１重量％未満）。好ましい実施形態において、ＰＶＰの平均分子量は約７０００〜１２０００ダルトン、例えば、約７０００〜１１０００ダルトンであるが、平均分子量１００００ダルトンのＰＶＰが最も好ましい。好ましい実施形態において、組合せはタウロリジン及び／又はタウルルタム並びにＰＶＰを含有する溶液又はゲルである。かかる好ましい組合せは、約０．１〜１０重量％、約０．５〜３重量％、約１〜３重量％の範囲内又は約２重量％の濃度でタウロリジン及び／又はタウルルタムを含む。
【００１６】
一実施形態によれば、組成物は、タウロリジン及び／又はタウルルタムのコラーゲンを含まない結晶を含む凝集体を電離放射線に曝すことによって形成される。一実施形態によれば、平均結晶径は約０．１〜１０００μｍ又は約１〜５００μｍであり得る。結晶は通常の結晶又は微粉化結晶であり得る。微粉化結晶の平均粒径は約１〜１０μｍ、例えば、約５μｍであり得る。通常の結晶の粒径は約１００〜５００μｍ、例えば、約１８０〜３００μｍの範囲内であり得る。
【００１７】
本発明はまた、上記で規定した組合せ又は凝集体を電離放射線に曝すことを含む、上記で規定した組成物の形成方法に関する。
【００１８】
本発明は、さらに上記で規定した組成物を利用する癌の治療方法に関する。
【００１９】
一実施形態によれば、癌の治療方法は癌患者に、ＰＶＰと共に、タウロリジン及び／又はタウルルタムを含む溶液、ゲル又は接着剤を投与することを含む。本実施形態によれば、溶液、ゲル、又は接着剤が患者内に存在する間に、癌患者はさらに腫瘍細胞の増殖を抑制又は予防する量の電離放射線を投与される。溶液、ゲル、又は接着剤を含む組合せは最初に腫瘍を抑制又は予防する量で癌患者に投与され、続いて腫瘍を抑制する、予防又は破壊する量の電離放射線を投与される。他の実施形態において、組合せは放射線治療中に投与され得る。他の実施形態において、組合せは放射線治療前及び放射線治療中に投与される。これらの実施形態のすべてにおいて、組合せは放射線治療後にも投与され得る。
【００２０】
幾つかの好ましい実施形態において、組合せは溶液又はゲルである。好ましい一実施形態において、組合せはタウロリジン及び／又はタウルルタム並びにＰＶＰを含有する溶液である。
【００２１】
放射線は電磁放射線又は粒子放射線であり得る。粒子放射線の例としては、α線、β線及び中性子線が挙げられる。好ましい実施形態において、電離電磁放射線が利用される。特に、好ましい実施形態では電離Ｘ線又は電離γ線が利用される。好ましい実施形態では約１０-8〜約１０-14ｍの範囲内の波長を有する電離放射線が利用される。概してＸ線の波長は約１０-8〜約１０-11ｍ（即ち、約１０〜０．０１ｎｍの範囲内）である。概してγ線の波長は約１０-11〜約１０-14ｍの範囲内である。
【００２２】
別の実施形態において、本発明による組成物を用いた癌の治療方法は、電離放射線に曝されたコラーゲンを含まないタウロリジン結晶及び／又はタウルルタム結晶を癌患者に投与することを含む。好ましくは、電離放射線はＸ線又はγ線の形態である。或る特定の実施形態においては、γ線が好ましい。一実施形態によれば、放射線照射された結晶は接着剤組成物中に存在し得る。好ましくは、接着剤組成物は腫瘍が切除された組織の領域に施用、接着する際、当初は液体又は半液体状態である。施用後、接着剤は組織に接着しながら粘度が増大するか、少なくとも部分的に固化するのが好ましい。好ましい実施形態において、利用される接着剤はフィブリンシーラントマトリクス（fibrin sealant matrix）（例えば、フィブリン糊）である。フィブリン糊はフィブリノーゲン及びトロンビンの別個の溶液の２成分系である。２溶液が組み合わされると、得られる混合物が接着剤を形成する。タウロリジン結晶及び／又はタウルルタム結晶は、２成分を組み合わせてフィブリン糊を形成する前にフィブリノーゲン成分及び／又はトロンビン成分の一方又は両方と混合される。好ましい実施形態において、タウロリジン結晶及び／又はタウルルタム結晶は、フィブリノーゲン成分及びトロンビン成分の混合前に、フィブリノーゲン成分と混合される。タウロリジン結晶及び／又はタウルルタム結晶を、一方及び／又は両方のフィブリン糊成分に添加する前及び／又は後に電離放射線に曝してもよく、フィブリン糊成分を一緒に混合した後に電離放射線に曝してもよい。
【００２３】
他の実施形態において、タウロリジン及び／又はタウルルタムを含有する溶液又はゲルは、患者への投与前に、上記フィブリンシーラントマトリクスのフィブリノーゲン成分及び／又はトロンビン成分の一方又は両方中のタウロリジン結晶及び／又はタウルルタム結晶に代替されるか、タウロリジン結晶及び／又はタウルルタム結晶を添加される。
【００２４】
さらなる実施形態において、電離放射線が癌患者に投与されるのは、電離放射線に曝されたタウロリジン結晶及び／又はタウルルタム結晶の患者への投与後である。
【００２５】
Ｘ線又はγ線を利用する際の放射線治療の線量は、約０．０１〜１００Ｇｙの範囲内、約０．１〜８０Ｇｙの範囲内、約１〜１０Ｇｙの範囲内、０．５〜１０Ｇｙの範囲内又は１〜５Ｇｙの範囲内であり得る。概して、治療期間中、患者には放射線の複数回の線量投与が行われる。治療終了までの放射線治療の全線量は１〜１００Ｇｙ又は１０〜７０Ｇｙの範囲内であり得る。
【００２６】
メチロール転移剤としては、タウロリジン及びタウルルタム並びにそれらの誘導体等のメチロール含有化合物が挙げられる。メチロール転移剤及びメチロール含有化合物という用語は本明細書において区別なく使用されることもある。米国特許第５，２１０，０８３号明細書には、タウロリジン及びタウルルタムという化合物が開示されている。他の好適なメチロール含有化合物としては、タウリナミド誘導体及び尿素誘導体が挙げられ得る。国際公開特許第ＷＯ０１／３９７６３Ａ２号には、本発明において有用であり得るタウロリジン、タウルルタム、タウリナミド及び尿素の誘導体の例が見出され得る。本発明による利用に特に好ましいメチロール転移剤は、タウロリジン、タウルルタム、それらの生物活性誘導体及びそれらの混合物である。
【００２７】
代替的には、化合物はタウリナミド誘導体又は尿素誘導体である。国際公開特許第ＷＯ０１／３９７６３Ａ２号には、本発明において有用であり得るタウロリジン、タウルルタム、タウリナミド及び尿素の誘導体の例が見出され得る。
【００２８】
好適であり得る他のメチロール含有化合物としては、限定するものではないが、１，３−ジメチロール−５，５−ジメチルヒダントイン、ヘキサメチレンテトラミン又はノキシチオリンが挙げられる。タウロリジン誘導体又はタウルルタム誘導体とはそれぞれ、タウロリジン又はタウルルタムの腫瘍活性の少なくとも１０％を保有するスルホンアミド化合物を意味する。スルホンアミド化合物はＲ2Ｎ−ＳＯ2Ｒ’式を有する化合物である。本明細書中に記載の化合物の誘導体は、参照化合物（例えば、タウロリジン又はタウルルタム）とは構造的に異なり得るが、好ましくは参照化合物の生物活性（例えばアポトーシス細胞死の誘導）の少なくとも５０％を保持し得る。好ましくは、誘導体は参照化合物の生物活性の少なくとも７５％、８５％、９５％、９９％又は１００％を有する。場合によっては、誘導体の生物活性は参照化合物の活性レベルを超過し得る。誘導体はまた、参照化合物によって保有されない特性又は活性を保有し得る。例えば、誘導体は毒性が低減されるか、臨床半減期が長くなるか、又は血液脳関門を通過する能力が向上する可能性がある。
【００２９】
本発明は本明細書中においてタウロリジン及び／又はタウルルタムに関して記載されることもあるが、他のメチロール転移剤及びメチロール含有化合物が均等に適用可能であり得ることは理解されるはずである。
【００３０】
本発明の併用療法は、腫瘍を抑制する、腫瘍を減少させる量又は腫瘍細胞を死滅させる量の放射線を患者に投与することを含む。本明細書において、「腫瘍を抑制する」という用語は腫瘍を減少させる量及び腫瘍細胞を死滅させる量を含むことを意図する。放射線はメチロール転移剤と同時に又は別個に投与され得る。放射線は任意の有効量、例えば、治療当たり約０．１〜１００Ｇｙ以上の範囲内、好ましくは約０．１〜５Ｇｙの範囲内の線量で、最も好ましくは約１〜４Ｇｙの線量範囲内で投与され得る。利用される放射線は任意の好適な腫瘍を抑制する放射線であり得るが、レントゲン線（Ｘ線）が好ましい。
【００３１】
メチロール転移剤及び放射線は被験体に同時投与されてもよく、逐次的又は周期的に投与されてもよい。
【００３２】
特に好ましい実施形態において、タウロリジン及び／又はタウルルタム等のメチロール転移剤並びにＰＶＰを含有する溶液が、放射線との併用療法において、患者における癌の治療のために投与される。本実施形態によれば、溶液中のＰＶＰ濃度は約１〜１５重量％の範囲内である。好ましい実施形態において、ＰＶＰ溶液は米国特許第６，０８０，３９７号明細書（参照により本明細書中に援用される）による。特に好ましい実施形態において、溶液中のＰＶＰの重量平均分子量は約７０００〜１２０００ダルトンの範囲である。１つの特に好ましいＰＶＰはポビドンである。好ましい実施形態において、ＰＶＰは溶液中に約４〜１０重量％の範囲、最も好ましくは約５重量％で存在する。本実施形態の特別な利点は、例えば、５％ポビドンを含有するタウロリジン溶液及び／又はタウルルタム溶液がγ線等の放射線に対して安定であることである。これはポビドンを含まない純粋なタウロリジン溶液及び／又はタウルルタム溶液を使用する場合には当てはまらない。ＰＶＰはタウロリジン溶液及び／又はタウルルタム溶液を、例えば、放射線によって引き起こされる酸化に対して安定化させる。タウロリジン及び／又はタウルルタムで前処理された患者は放射線照射され得る。放射線並びにタウロリジン及び／又はタウルルタムは同時に投与することができ、引き続きタウロリジン及び／又はタウルルタムによる処理を継続することができる。溶液は放射線に安定なので、患者から分解生成物が排出されるまで待機する必要がない。
【００３３】
好ましい実施形態において、方法は癌を患っている哺乳動物に活性メチロール含有化合物を含有する組成物を新生細胞の死又は増殖低下を誘導するのに十分な用量で投与することによって実施される。「メチロール含有化合物」又は「メチロール転移剤」とは、生理学的条件下でメチロール分子を含有又は生成することが可能な化合物を意味する。メチロール含有化合物はＲ−ＣＨ2−ＯＨ基（式中、Ｒはアルキル、アリール又はヘテロ基である）を有することを特徴とする。本発明はまた、Ｒ−ＣＨ2−ＯＨ構造を含有する化合物を生成すること又はＲ−ＣＨ2−ＯＨ構造を含有する化合物に変換することが可能な化合物の使用を含む。
【００３４】
本発明が適用可能であり得る癌としては、原発性且つ続発性の黒色腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、星状細胞腫、癌性髄膜炎、卵巣癌、前立腺癌、中枢神経系（ＣＮＳ）癌、肺癌、胃癌、食道癌、膀胱癌、白血病、リンパ腫、腎細胞癌、中皮腫並びにそれらの転移が挙げられる。本発明の方法が有効な他の癌としては、他の原発性且つ続発性の癌腫、肉腫若しくはリンパ腫、頭部及び頚部の癌、肝臓癌、乳癌並びに膵臓癌、又はそれらの転移が挙げられる。
【００３５】
特に好ましい実施形態は黒色腫及びその転移の治療を含む。
【００３６】
特に有益なのは、とりわけ腫瘍の外科的切除後に、癌細胞におけるアポトーシスを誘導するか、腫瘍細胞の増殖を抑制するか、又は転移の拡大を予防するのに十分な濃度でタウロリジン及び／又はタウルルタムを使用することである。哺乳動物の被験体は典型的にはヒトである。
【００３７】
本発明はまた、癌細胞におけるアポトーシスを誘導するのに十分な濃度でのタウロリジン及び／又はタウルルタムの使用、並びに哺乳動物の被験体における腫瘍の治療又は予防のための放射線の使用を含む。
【００３８】
本発明によるメチロール転移剤の有効用量は、約０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇ被験体体重、好ましくは１日当たり１５０〜４５０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは１日当たり３００〜４５０ｍｇ／ｋｇの範囲内の薬学的投薬単位を含み得る。代替的には、１日当たりのグラム数として約２〜６０ｇ／日の用量が投与され得る。好ましい用量は約２．５〜３０ｇ／日の範囲のタウロリジン、４〜６０ｇ／日の範囲のタウルルタム、又はそれらの混合物であり得る。最も好ましい用量は約１０〜２０ｇ／日の範囲のタウロリジン、２０〜４０ｇ／日の範囲のタウルルタム、又はそれらの混合物である。
【００３９】
注射又は注入に好適な製剤は、タウロリジン濃度又はタウルルタム濃度を高めた溶液を提供するために、１つ又は複数の可溶化剤（例えば、グルコース等のポリオール）を含有する等張溶液を含み得る。欧州特許第２５３６６２Ｂ１号明細書にはかかる溶液が記載されている。かかる溶液におけるタウロリジン又はタウルルタムの濃度は１〜６０ｇ／リットルの範囲であり得る。
【００４０】
メチロール転移剤は概して水に難溶である。したがって、タウロリジン又はタウルルタム（例えば、タウロリジン及び／又はタウルルタム１０ｇ〜３０ｇ）を含有する比較的大量の水溶液を投与することが必要となる場合が多い。本発明による投与に好ましい溶液は約０．５〜２％のタウロリジン及び／又はタウルルタムを含有する。比較的大量である点を考慮すると一日中都合良く間隔を空けてこれらの化合物を注入によって投与することは都合が良い可能性がある。
【００４１】
メチロール転移剤の合計日用量の好ましくは注入による投与は、２４時間にわたって一定速度で、又は部分用量のより速い注入スケジュールに従って実行され得る。本スケジュールには、各部分用量の間に中断があり、例えば２時間にわたって２％タウロリジン溶液２５０ｍｌ（５ｇ用量）を注入した後に４時間の短い中断があり、これが２４時間の注入期間にかけて繰り返されて、合計日用量２０ｇを達成する。代替的には、２％タウロリジン溶液２５０ｍｌが１時間にわたって注入され、各部分用量の間に１時間の中断があり、これを日用量に達するまで繰り返すことが可能である。その結果、合計日用量は２４時間未満（即ち、およそ半日）で提供されて、その日の残り時間には注入は行われない。
【００４２】
一実施形態によれば、４ボトル（各２５０ｍｌ）の２％タウロリジン溶液が、１分間につき４０滴、６時間毎に１ボトルの速度で癌患者へ静脈内投与される。療法サイクルは概して１週間毎日注入が行われる投与期と、その後の２週間の休止期である。全体の治療は概して少なくとも２つのかかるサイクルである。静脈内投与される２％タウロリジン溶液の有効性は、１サイクル当たり２５〜２８ボトルの２％タウロリジン溶液２５０ｍｌが点滴注入される場合に特に良好であることが見出された。
【００４３】
本発明の第２の実施形態によれば、投与期は、２％タウロリジン溶液２５０ｍｌが２時間にわたって投与され、その後４時間の中断が設けられ、これが２４時間繰り返されて合計日用量を達成する、１日のレジメンを含む。
【００４４】
本発明の第３の実施形態によれば、投与期は２％タウロリジン溶液２５０ｍｌが１時間にわたって注入され、その後１時間の中断があり、日用量が達成されるまでこれが繰り返される１日のレジメンを含む。全用量が（例えば）２０ｇである場合には、本レジメンは７時間のタイムスパンにわたって４ボトルの２％タウロリジン２５０ｍｌを注入することにより日用量を提供する。その日の残り時間には注入は行われない。患者が肝カウントの上昇を示す場合、注入速度は（例えば、９０又は１２０分にわたって２５０ｍｌを注入するものへと）延長することができる。
【００４５】
特に好ましい実施形態において、患者は少なくとも連続した３日〜連続した約８日の投与期を有する投薬サイクルにかけられる。各投与期にはその後、メチロール含有化合物が患者に投与されない、約１日〜約４週、例えば、１〜１４日の、又は３、４週又はそれ以上であってもよい非投与期がある。各投与期中にメチロール含有化合物が毎日投与される。例えば、３、４、５、６、７及び／又は８日の投与期が利用され得ると共に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３及び／又は１４日の非投与期が利用され得る。少なくとも２投薬サイクルが利用され、好ましくは５〜１０又はそれ以上の投薬サイクルが利用される。例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の逐次投薬サイクルが利用され得る。かかるレジメンによって患者に関する驚くべき且つ予期せぬ結果が示された。特に好ましい一実施形態において、６投薬サイクル（各投与期は５日であり、各投与期は２日の非投与期よって分離される）が利用される。好ましくは、投与中毎日、２％タウロリジン溶液２５０ｍｌが１日４回患者に静脈内投与される。
【００４６】
別の実施形態において、非投与期は１、２、３、４週又はそれ以上の長さ、例えば、約２〜４週間であり得る。例えば、胃及び膵臓等の再発癌患者においては、連続した３〜８日、例えば７日の投与期を有する逐次投薬サイクルで投与され得る。これには、例えば、２％タウロリジン溶液２５０ｍｌを１日４回注入され、その後１、２、３、４週又はそれ以上、例えば、３週の非投与期がある。先の実施形態と同様に、少なくとも２投薬サイクル、好ましくは５〜１０又はそれ以上の投薬サイクルが利用される。
【００４７】
腫瘍を抑制する放射線は例えば、１日複数回、１日１回、週１回、週２回、週３回、週４回、週５回、週６回、２週に１回、月１回、又は任意の好適な投与レジメンに従って投与され得る。放射線はメチロール転移剤に関する本明細書に記載の投薬サイクルで投与され得る。
【００４８】
流体及び電解質の置換が静脈内２％タウロリジン療法に関して行われ得る。
【００４９】
２５０ｍｌ量の完全電解質溶液が、好ましくは２％タウロリジン２５０ｍｌの注入と平行して同時に、且つ同一の注入速度で与えられる。電解質及び血球数を１日２回監視し、中心静脈圧を１日１回検査すべきである。
【００５０】
高ナトリウム血症が観察される場合、まず、脱水症がその原因であるか否かを判定すべきである。利尿剤は、脱水症がその理由でないことを確認したのと同時及び確認後に流体を置換する場合にのみ使用すべきである。
【００５１】
メチロール含有化合物は、単独又は１つもしくは複数のさらなる抗悪性腫瘍薬と併用して投与される。好ましい一実施形態において、補助的な薬剤はアポトーシス以外の機構によって腫瘍細胞を死滅させる。例えば、併用療法のレジメンにおいては、代謝拮抗物質、プリン類似体又はピリミジン類似体、アルキル化剤、架橋剤（例えば、白金化合物）及び挿入剤並びに／又は抗生物質が投与される。補助的な薬物はメチロール含有物質の前後又はメチロール含有物質と同時に与えられる。例えば、メチロール転移剤は５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）等のフルオロピリミジンと同時投与され得る。フルオロピリミジンの有効な日用量は薬学的投薬単位当たり約０．１〜１０００ｍｇの範囲であり得る。５−ＦＵの有効な日用量はまた、約１００〜５０００ｍｇ／ｍ2体表面積、好ましくは約２００〜１０００ｍｇ／ｍ2体表面積、より好ましくは約５００〜６００ｍｇ／ｍ2体表面積の範囲であり得る。５−ＦＵは典型的には注射用の２５０ｍｇ又は５００ｍｇアンプル、又は経口投与用の２５０ｍｇカプセルで提供される。
【００５２】
別の実施形態において、メチロール転移剤のアポトーシス効果はＦａｓリガンドとの同時投与によって増強され得る。米国特許第５，８５８，９９０号明細書には、Ｆａｓリガンドポリペプチドが開示されている。Ｆａｓリガンドの治療的有効量は概して約０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇ患者体重、好ましくは約０．１〜２００ｍｇ／ｋｇ患者体重、最も好ましくは約０．２〜２０ｍｇ／ｋｇ患者体重の範囲である。治療的有効量は１日１回、又は１日複数回（例えば、１日に２、３、４又はそれ以上の回数）の投薬で投与され得る。
【００５３】
本発明はまた、放射線と共にメチロール含有化合物を哺乳動物に投与することによって、哺乳動物における薬剤耐性腫瘍（例えば、多剤耐性（ＭＤＲ）腫瘍）を治療することを含む。薬剤耐性腫瘍は固形腫瘍、非固形腫瘍及びリンパ腫から成る群より選択される。例えば、薬剤耐性腫瘍は黒色腫、乳癌、卵巣癌、結腸癌、前立腺癌、膵臓癌、中枢神経系癌、肝臓癌、肺癌、膀胱癌、リンパ腫、白血病又は肉腫であり得る。
【００５４】
別の実施形態によれば、タウロリジン及び／又はタウルルタムを含有する溶液は約１〜２０ｇ／ｌの範囲内の量で、好ましくは約５ｇ／ｌでタウリンをさらに含有する。
【００５５】
さらなる実施形態は、メチロール転移剤を含有する溶液を肝血管に設けられたカテーテルを通して肝臓へ直接投与することによって、原発性肝腫瘍及びその転移の両方を治療する方法を提供する。肝機能及び非虚血状態の維持を手助けするメチロール転移剤を溶液で投与することによって、臓器を過度なストレスに過度に曝すことなく、罹患臓器を対象とした療法が実施される。
【００５６】
原発性肝腫瘍の治療のため、メチロール転移剤の溶液は、治療薬が最も有効に臓器へと運ばれるように肝動脈を通して投与され得る。代替的には、溶液は、肝動脈を通じて肝臓へ送達される代わりに、胃十二指腸動脈を介して供給され得る。本実施形態において使用するための好ましい溶液は、肝機能を維持する手助けをすると共に、大量のメチロール転移剤溶液の注入に関連した臓器へのストレスを最小化する手助けをする溶液である。
【実施例】
【００５７】
（実施例１）
２％タウロリジン等張溶液
静脈内への点滴注入に好適な１つの組成物を以下に示す。
等張滅菌溶液、１００ｍｌ：
２．０ｇ  タウロリジン
５．０ｇ  ＰＶＰ  １６  ＰＦ  ＵＰ  蒸留水を加えて１００ｍｌの溶液とする（aqua dest. ad solut. 100 ml）  ｐＨ  ７．２〜７．３ 
濾過滅菌及び放射線滅菌
【００５８】
（実施例２）
タウリン及び電解質を有する２％タウロリジン含有等張Ｔａｕｒｏｌｉｎ（登録商標）溶液
静脈内への点滴注入に好適な別の組成物を以下に示す。
等張滅菌溶液、１００ｍｌ：
２．０ｇ  タウロリジン
５．０ｇ  ＰＶＰ  １７  ＰＦ  ＵＰ
０．５ｇ  タウリン
０．３ｇ  塩化ナトリウム
濾過滅菌及び放射線滅菌
【００５９】
（実施例３）
タウリン及び電解質を有する２％タウロリジン含有等張Ｔａｕｒｏｌｉｎ（登録商標）リンゲル液
静脈内への点滴注入に好適な別の組成物を以下に示す。
等張滅菌溶液、１００ｍｌ：
２．０ｇ  タウロリジン
５．０ｇ  ＰＶＰ  １７  ＰＦ  ＵＰ
０．５ｇ  タウリン
０．２６ｇ  塩化ナトリウム
０．００３３ｇ  塩化カリウム
０．００４ｇ  塩化カルシウム・２Ｈ2Ｏ
０．００３ｇ  炭酸水素ナトリウム
濾過滅菌及び放射線滅菌
【００６０】
（実施例４）
タウリン及び電解質を有する２％タウロリジン含有Ｔａｕｒｏｌｉｎ（登録商標）乳酸リンゲル液
静脈内への点滴注入に好適な別の組成物を以下に示す。
等張滅菌溶液、１００ｍｌ：
２．０ｇ  タウロリジン
５．０ｇ  ＰＶＰ  １７  ＰＦ  ＵＰ
０．５ｇ  タウリン
０．２０ｇ  塩化ナトリウム
０．０１３ｇ  塩化カリウム
０．００９ｇ  塩化カルシウム・２Ｈ2Ｏ
０．００３３ｇ  乳酸ナトリウム５０％溶液（Pharmacopeia Europea）
濾過滅菌及び放射線滅菌
【００６１】
（実施例５）
タウルルタム溶液
１つの好ましい溶液は以下を含む：
ラクトビオン酸  ３５．８３０ｇ
アデノシン  １．３４０ｇ
ラフィノース５水和物  １７．８３０ｇ
ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）ＰＬ  ４０／０．５  ５０．０００ｇ
グルタチオン  ０．９２９ｇ
アロプリノール  ０．１３６ｇ
タウルルタム  １０．０００ｇ
ＫＣｌ  ５．２００ｇ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  １．２３０ｇ
２５％  ＮａＯＨ（重量体積百分率（GV））でｐＨ７．８にする
ＮａＯＨペレット  Merck  ６４８２
蒸留水  ９００ｍｌ
【００６２】
溶液を放射線で滅菌した。滅菌後のｐＨは７．２であり、すぐに使用可能な溶液のｐＨは７．４７である。
【００６３】
（実施例６）
黒色腫の治療
黒色腫は皮膚癌の一種であり、その発生率は近年急激に増加した。さらに、悪性黒色腫は放射線療法及び化学療法に対する反応が乏しい。本プロジェクトは新規な抗悪性腫瘍薬であるタウロリジンを単独で又は放射線と併用した場合の、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの黒色腫の腫瘍増殖に対する効果を評価するよう設計された。
【００６４】
マウス黒色腫Ｂ１６  ４Ａ５細胞及びＢ１６  Ｆ１０細胞を異なる時間タウロリジン（０〜２００μｇ／ｍｌ）、Ｘ線（レントゲン）放射（０〜４Ｇｙ）又はそれらの組合せで処理した。細胞周期をＦＡＣＳｃａｎ解析によって評価した。細胞のアポトーシス及び壊死をＦＡＣＳｃａｎ解析及びＭＴＴアッセイによって求め、さらにＤＮＡゲル電気泳動によって確認した。タウロリジン単独では、用量及び時間に依存して、Ｂ１６  ４Ａ５及びＢ１６  Ｆ１０の細胞周期はＧ0／Ｇ1期で停止した（サブＧ1集団が増加）。対照的に、タウロリジンと放射線の組合せは、Ｇ2／Ｍ期での細胞周期の停止を誘導した（サブＧ1集団なし）。Ｂ１６  ４Ａ５細胞及びＢ１６  Ｆ１０細胞を１０〜２００μｇ／ｍｌタウロリジンに曝露すると、用量及び時間に依存した細胞アポトーシスを生じた。さらに、０．５Ｇｙ放射線と併用した２５μｇ／ｍｌタウロリジンはＢ１６  ４Ａ５細胞において７０％のアポトーシスをもたらした一方、いずれか単独ではアポトーシスを誘導できなかった。
【００６５】
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８〜１０週齢）（ｎ＝１２０）の右側腹部にＢ１６  ４Ａ５細胞（マウス１匹当たり５×１０5)を注射し、対照、ＰＶＰ（タウロリジンの溶媒）、タウロリジン（５ｍｇ／マウス、腹腔内）、放射線（５Ｇｙ／マウス）及びタウロリジン＋放射線に区分した。腫瘍増殖率、腫瘍／体重比、肺転移、及び生存率を記録した。腫瘍内細胞の有糸分裂／アポトーシス指数、微小血管密度、並びに脾臓細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞媒介の細胞毒性活性にもアクセスした。タウロリジン＋放射線は、未処理動物と比較すると、原発性且つ転移性の黒色腫の腫瘍増殖を有意に減弱させた（ｐ＜０．００１）。さらに、タウロリジン＋放射線で処理したマウスは、タウロリジン単独（ｐ＜０．０１）又は放射線単独（ｐ＜０．０１）で処理したマウスよりも腫瘍増殖率、腫瘍／体重比、及び肺転移結節の大きな減少を示した。これはタウロリジン＋放射線の群において細胞有糸分裂／アポトーシス指数が有意に減少したことを反映している。タウロリジン＋放射線で処理したマウスはまた、生存率の向上並びにＣＴＬ及びＮＫ細胞の細胞毒性活性を増強することが示された。
【００６６】
タウロリジンは２つのマウス黒色腫細胞株において細胞周期の停止及びアポトーシスを誘導する。Ｉｎ  ｖｉｖｏで、タウロリジンは放射線照射と組み合わせると、原発性且つ転移性の黒色腫の腫瘍増殖を有意に減弱させるが、これはタウロリジンによる細胞アポトーシスの誘導及び放射線感受性の増強から生じ得る。
【００６７】
（実施例７）
２％タウロリジンの静脈内投与を使用する癌患者を治療するための２サイクル投薬スケジュール
２％タウロリジン溶液の４ボトル（各２５０ｍｌ）を、１分間につき４０滴、６時間毎に１ボトルの速度で癌患者に静脈内投与した。投薬サイクルは、１週間毎日注入が行われる投与期、続く２週間の非投与期、その後の先に示した１日当たり４ボトルという別の投与期から成る。静脈内投与される２％タウロリジン溶液の有効性は、１サイクル当たり２５〜２８ボトルの２％タウロリジン溶液２５０ｍｌが点滴注入される場合に特に良好であることが見出された。
【００６８】
（実施例８）
２％タウロリジンの静脈内投与を使用する悪性神経膠腫患者を治療するための４サイクル投薬スケジュール
治療は最低限４サイクルを含む。各サイクルは７日の長さであり、以下の通り構成される：
１．第１サイクル
ａ．注入時間６０分で中心静脈カテーテルを介して２％タウロリジン２５０ｍｌ及び完全電解質溶液２５０ｍｌを静脈内注入する。
ｂ．本療法が肝カウントの上昇を引き起こす場合には、注入時間を９０分又は１２０分に増大させることが必要である。
ｃ．６０分の中断
ｄ．ａ又はｂ及びｃでの療法を１日当たり合計６回繰り返す。
ｅ．タウロリジン２５０ｍｌ当たりの１日の注入プログラムの継続時間は、注入時間６０分では１１時間、９０分の注入時間では１４時間、１２０分の注入時間では１７時間である。残りの時間には薬物は何も投与されない。
ｆ．休止期
２．続くサイクル
ａ．注入時間６０分で中心静脈カテーテルを介して２％タウロリジン２５０ｍｌ及び完全電解質溶液２５０ｍｌを静脈内注入する。
ｂ．本療法が肝カウントの上昇を引き起こす場合には、注入時間を９０分又は１２０分に増大させることが必要である。
ｃ．６０分の中断
ｄ．ａ又はｂ及びｃでの療法を１日当たり合計４回繰り返す。
ｅ．タウロリジン２５０ｍｌ当たりの１日の注入プログラムの継続時間は、注入時間６０分では７時間、９０分の注入時間では９時間、１２０分の注入時間では１１時間である。残りの時間には薬物は何も投与されない。
【００６９】
（実施例９）
γ線処理及びタウロリジン処理
結晶性タウロリジン粉末
通常の結晶の平均粒径１８０〜３００μｍ
微粉化結晶の平均粒径＝５μｍ
【００７０】
通常の結晶性タウロリジン粉末２バッチを製造し、γ線によって滅菌した。タウロリジン結晶０．５ｇを、無菌状態及び層流下で５ｍｌのバイアルに秤量した。バイアルをゴム栓及びシールキャップによって閉じた。その後、閉じたバイアルを２５ｋＧｙのγ線で照射し（範囲認証（Range certification）２６〜３０ｋＧｙ））、引き続き分析した。
【００７１】
驚くべき結果：
安定性の評価によって、γ線による滅菌後のタウロリジン粉末の結晶が放射線照射されていない結晶と同一であり、且つ放射線照射されていない結晶の規格（標準タウロリジン）に対応する一方、ＰＶＰを含まない１％タウロリジン水溶液はγ線にそれほど安定でないことが示された。
【００７２】
以下の対照評価が実施され、放射線照射された結晶性タウロリジン粉末、及び放射線照射されていない結晶性タウロリジン粉末から同一の結果が示された：
融点：１７３〜１７５℃
赤外分光スペクトル：Philips  ＰＵ  ９７０６赤外分光光度計
スペクトル写真は放射線照射されていない標準タウロリジンに対応した。
溶解度：１％の清澄水溶液
無菌性：欧州薬局方第５版に従い、化合物は無菌であった。
エンドトキシン：エンドトキシンについての試験は陰性であった。
【００７３】
（実施例１０）
腫瘍巣の大きさに応じて、およそ０．５ｇ以上のタウロリジン結晶を、実施例９に従って製造した懸濁液として約３７℃の温度で二成分系（フィブリノーゲン／トロンビン）に直接挿入し、腫瘍の外科的切除後、手作業で又は噴霧装置を用いて腫瘍巣に局所的に留めた。腫瘍巣の表面への拡散によりタウロリジンを放出するフィブリン接着剤マトリクスを腫瘍巣の内表面上に形成する。
【００７４】
代替的には、結晶、好ましくは微粉化タウロリジンを、ダブルチャンバシリンジの１つのチャンバに充填し得る。ダブルチャンバシリンジは他のチャンバにフィブリン糊を含有し、使用前に続いて混合されるべきである。
【００７５】
（実施例１１）
γ線を受けたタウロリジンゲルの安定性
序論
本実験においては、タウロリジンゲルの粗粒を各最大照射線量３２ｋＧｙで２回γ線に曝露した。タウロリン（tauroline）含有量を、選択的ＨＰＬＣ法を用いて２回目のγ線照射前後で６回求めた（タウロリジンゲルについてのモノグラフ、４％タウロリジン）。
【００７６】
結果
【００７７】
【表１】
2009522347.tif 000002
【００７８】
【表２】
2009522347.tif 000003
【００７９】
考察
合計最大線量６４ｋＧｙの２回のγ線照射後であっても、タウロリジン含有量はなお特定の放出率３．８〜４．２％の範囲内である。通常のγ線照射の場合には最大線量３２ｋＧｙは決して超過されず、本実験で選択された６４ｋＧｙという線量がはるかに高いものであることが強調されるべきである。しかしながら、かかるストレス試験に曝露した場合であっても、活性成分の含有量は放出下限を割り込まない。
【００８０】
【化１】
2009522347.tif 000004
タウロリジン又はタウルルタム（Ａ）のラジカル酸化の最終生成物はタウリナミド、タウリン及びＣＯ2である。
【００８１】
デヒドロタウルルタム（ＨＧ  ４０）の決定
放射線照射後、１％タウロリジンの最終的なＵＶ吸収は２００〜２１０ｎｍ増加した。本プロセスにおいて、孤立二重結合を有する化合物を生成したに違いない。
【００８２】
質量ピーク１３５（ＨＰＬＣ／ＭＳ）
ＨＰＬＣ／ＭＳを用いてタウロリジンの結晶化由来の母液からの残渣を分析すると、タウルルタム、タウリナミド及びタウリンの質量ピークの他に、１３５（１３４）という質量ピークが求められた。本ピークはＨＧ  ４０のピークと一致した。
【００８３】
デヒドロタウルルタム（ＨＧ  ４０）の合成
タウリナミド塩基とギ酸の化学反応によって、Ｎ−ホルミルタウリナミドが良好な収率で生成する。そのＮ−ホルミルタウリナミドをポリリン酸中で加熱することによって、脱水及び閉環の結果として、デヒドロタウルルタム（ＨＧ  ４０）が得られる。アミジンとして、当該物質は孤立Ｃ＝Ｎ二重結合を含有する。
【００８４】
アルコールから再結晶した無色のプレートレット（融点：１７２〜１７４℃（Buechi融点測定装置５１０））
元素分析
分子量１３４
計算値：  Ｃ：２６．８９％  Ｈ：４．３１％  Ｎ：２０．９１％  Ｓ：２３．９３％
測定値：  Ｃ：２７．０５％  Ｈ：４．５４％  Ｎ：２０．５  ％  Ｓ：２３．７９％
【００８５】
赤外分光スペクトル
タウルルタムの典型的なバンドの他、Ｃ＝Ｎ二重結合に対応する新規のスペクトルバンドが出現する。
【００８６】
ＮＭＲ
ＮＭＲ分析によって構造を確認する。ＨＣｌによる加水分解を通じて、ＨＧ  ４０はさらにタウリナミドに変わる。
【００８７】
ＨＧ  ４０の互変異性型
【００８８】
【化２】
2009522347.tif 000005
【００８９】
二重結合の位置を変えることによって、ＨＧ  ４０の互変異性型を推測する。
【００９０】
総括及び結論
１％タウロリジン水溶液の放射線分解生成物についての検査
５００ｍｌガラスボトル中に含有される１％タウロリジン溶液のγ線照射（およそ２５ｇＫｙ）後、以下の生成物を単離し得るか、赤外分光法、ＨＰＬＣ／ＭＳ分析、アミノ酸分析を用いて定量的に求め得る：
１．タウロリジン含有量  ０．７８％  ３９００ｍｇ
２．デヒドロタウルルタム  ０．１５６％  ７８０ｍｇ※
３．タウリナミド  ０．０１７１％  ８５．５ｍｇ
４．タウリン  ０．０１０６％  ５３ｍｇ
５．メチレングリコール  ０．０１６０％  ８１ｍｇ※※
６．ＣＯ2  ０．００１９％  ９．７ｍｇ
※デヒドロタウルルタムの含有量を推定する（ＨＰＬＣ／ＭＳ）。ＨＧ  ４０の互変異性型も含有する。
【００９１】
タウロリジンのラジカル酸化は、タウロリジンをタウリナミド、タウリン及びＣＯ2にする既知の酸化的な細胞のバイオトランスフォーメーションと同様に起こる。本プロセスにおいて、デヒドロタウルルタムは中間生成物として生成する。
【００９２】
（実施例１２）
タウルルタム及びデヒドロタウルルタム間の急性毒性比較
序論
γ線を用いて含水タウロリン顆粒の滅菌についての措置を行った。既知の生成物であるタウリナミド及びタウルルタムの他、デヒドロタウルルタムの痕跡を放射線照射された試料において求めた。
【００９３】
本報告においては、デヒドロタウルルタムの急性毒性をタウルルタムと比較して評価した。このために、３つの異なる濃度の２つの試験物質と共に、２つの異なるカテゴリーの細胞（筋細胞及び繊維芽細胞）を異なる期間インキュベートした。試験物質の細胞に対する考えられる毒性効果を２０時間後に分析した。考えられる細胞損傷の判定基準は生存度及び細胞接着レベルとした。
【００９４】
試料
タウルルタム、Geistlich Wolhusen、バッチＥ／３９０２４／４（粉末）
デヒドロタウルルタム、Geistlich Wolhusen、ＨＧ  ４０、バッチ１２／２８／９８／ｉｂ（粉末）
ＤＭＥＭ（GIBCO BRL  バッチ１０８２９）、１０％  ＦＢＳ（ウシ胎仔血清、GIBCO BRL）及び２ｍＭグルタミンから成る培養培地
細胞：ＣＯＳ−７繊維芽細胞及びＣ２Ｃ１２筋芽細胞
【００９５】
方法
細胞培養：
ＣＯＳ−７細胞株及びＣ２Ｃ１２細胞株を４８ウェル皿上に５０％の集密度で平板培養し、３７℃で２４時間インキュベートした。その後、培地を変更した。このために、非改変培地（対照）、又は０．１％、０．２５％若しくは０．５％のタウルルタム若しくはデヒドロタウルルタムを含有する培地を使用した。細胞培養物を３７℃で５、１０、２０、６０及び１２０分間インキュベートし、その後、新鮮な培地で３回洗浄した。３７℃のインキュベータ内にさらに２０時間置いた後、細胞を評価した。
【００９６】
細胞生存度：
トリパンブルー染色によって細胞生存度の同定が可能となるのは、トリパンブルーは損傷細胞を透過し得るが、無傷細胞を透過し得ないからである。
【００９７】
接着：
生存度の指標として、細胞接着の程度を顕微鏡で評価した。
【００９８】
結果
タウルルタム及びデヒドロタウルルタムの細胞接着に対する影響
タウルルタム及びデヒドロタウルルタムをそれぞれ２０時間インキュベートした後、細胞接着を分析した。
【００９９】
筋細胞の試験（表３）
試験物質（０．１％濃度）：
５、１０又は２０分のインキュベーション期間では、タウルルタム及びデヒドロタウルルタムのいずれに関しても細胞接着の障害は何も示されなかった（１００％細胞接着）。２時間のインキュベーション後に、タウルルタムでは細胞損傷を観察することができた（６０％細胞接着）。しかしながら、デヒドロタウルルタムではずっと目立たなかった（９０％細胞接着）（表３）。
【０１００】
試験物質（０．２５％濃度）
この最大濃度であっても、２０分までのインキュベーションでは細胞接着における有意な変化は示されなかった。６０及び１２０分のインキュベーション期間でのみ、障害を検出でき、デヒドロタウルルタム（８０％接着）よりもタウルルタムでより顕著であった（６０〜７０％接着）（表３）。
【０１０１】
試験物質（０．５％濃度）：
この最大濃度であっても、２０分までのインキュベーション期間では接着性の有意な障害は見出されなかった。６０〜１２０分というより長いインキュベーション期間で、明瞭な接着に関連した問題（５０〜６０％接着）が発現した。しかしながら、デヒドロタウルルタム（８０〜９０％接着）ではこの程度までは観察されなかった（表３）。
【０１０２】
繊維芽細胞の試験（表４）
試験物質（０．１％濃度）：
ａ）２０分までのインキュベーション期間では、細胞接着はタウルルタム及びデヒドロタウルルタムのいずれに関しても有意には影響されなかった。しかしながら、より長期にわたるインキュベーション期間（６０及び１２０分）で、接着の制限がタウルルタムでは観察されたが、デヒドロタウルルタムでは検出されなかった（表４）。
ｂ）試験物質（０．２５％濃度）：
この濃度では、接着における変化は少なくとも２０分のインキュベーション期間でのみ起こった。しかしながら、接着に関連した問題はデヒドロタウルルタム（８０％接着）よりもタウルルタムで（６０％接着）ずっと顕著であった（表４）。
ｃ）試験物質（０．５％濃度）：
最高濃度でも、１０分のインキュベーション期間は事実上無効であった。しかしながら、より長期にわたるインキュベーション期間で、かなりの細胞接着障害がタウルルタム（４０％接着まで低下）では起こり、本効果はデヒドロタウルルタム（８０％接着）ではずっと目立たなかった（表４）。
【０１０３】
タウルルタム及びデヒドロタウルルタムの細胞生存度に対する影響 
トリパンブルーを用いた接着細胞の生死判別試験により、各群において細胞生存度は９５％より高いことが示された。これらの知見はインキュベーション期間、試験物質の濃度又は使用される試験物質とは無関係であった。このことは接着性を維持する事実上すべての細胞が完全に生存していることを意味する。一方、障害細胞は接着特性を失う。これらの知見により、細胞損傷を測定する高感度法として上述した接着試験の妥当性が支持される。
【０１０４】
考察
試験方法の妥当性
トリパンブルーを用いた生死判別試験により、すべての接着細胞が完全に生存し得ることが示された。これらの知見により、接着が障害細胞生存度の高感度マーカーであることが示される。接着試験は試験物質とのインキュベーションに続いてさらに２０時間の細胞インキュベーションを実施するように設計される。その結果、接着試験は試験物質の即時効果についての情報を提供するだけでなく、１回の曝露の結果として生じ得る細胞損傷も含む。
【０１０５】
細胞種類の比較
タウルルタム及びデヒドロタウルルタムの繊維芽細胞及び筋細胞の接着に対する最大効果は事実上同一である（表３及び表４、最大濃度、及び１２０分のインキュベーション期間）。これらの知見により、他の細胞も同様にタウルルタム又はデヒドロタウルルタムと反応すると想定することが可能である。
【０１０６】
タウルルタム及びデヒドロタウルルタムの効果の比較
２０分のインキュベーション期間では、タウルルタム及びデヒドロタウルルタムの最高濃度（０．５％）であっても、筋細胞において細胞接着の妨害はそれほど起こらない。６０〜１２０分のインキュベーション期間後でのみ細胞変化が起こるが、すべての濃度でタウルルタムよりもデヒドロタウルルタムの方が目立たない。２時間のインキュベーション期間では、タウルルタムでの５０〜６０％と比較して、デヒドロタウルルタムでの接着は８０〜９０％である。デヒドロタウルルタム及びタウルルタムの毒性に関する同様の差異が繊維芽細胞で見出された。１０分までのインキュベーション期間では最高濃度であっても何の変化も生じなかった一方、より長い曝露時間（６０〜１２０分）では細胞変化が生じたが、すべての濃度でタウルルタムよりもデヒドロタウルルタムの方がはるかに目立たなかった。最も極端な条件（０．５％、１〜２時間）下であっても、デヒドロタウルルタムでの接着が８０％を割らなかった一方、タウルルタムでの接着はほんの４０〜６０％であった。
【０１０７】
総括
タウルルタム及びデヒドロタウルルタムの筋細胞及び繊維芽細胞の生存度に対する効果を比較分析することにより、両物質が非常に低い毒性を示すことが時間及び濃度に依存した検討において明らかとなった。試験物質への急性曝露中に、細胞変化は何も観察されなかった。細胞損傷は長期にわたるインキュベーション期間でのみ検出された。試験した濃度及びインキュベーション期間のすべてで、デヒドロタウルルタムの毒性効果がタウルルタムよりも有意に低いことは注目に値する（表３、表４）。
【０１０８】
γ線に曝露された含水タウロリン顆粒において、デヒドロタウルルタムはタウルルタムと比較して非常に少量でしか存在しない。それをもって、デヒドロタウルルタムはヒトにおける含水タウロリン顆粒の毒性リスクを増大させないと仮定され得る。
【０１０９】
凡例
表３
筋細胞をタウルルタム又はデヒドロタウルルタム（０．１％、０．２５％、０．５％）と３７℃で５、１０、２０、６０及び１２０分間インキュベートした。通常培地で３回すすいだ後、培養物をもう２０時間インキュベートした。その後、細胞接着の程度を顕微鏡で観察した。結果を対照培養物の％で示す。接着細胞は生存可能であった。
【０１１０】
表４
繊維芽細胞をタウルルタム又はデヒドロタウルルタム（０．１％、０．２５％、０．５％）と３７℃で５、１０、２０、６０及び１２０分間インキュベートした。通常培地で３回すすいだ後、培養物をもう２０時間インキュベートした。その後、細胞接着の程度を顕微鏡で観察した。結果を対照培養物の％で示す。接着細胞は生存可能であった。
【０１１１】
【表３】
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【０１１２】
【表４】
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【国際調査報告】
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