(57)【要約】本発明は１個以上の他の生物学的薬剤と組み合わせたリンホトキシンベータ受容体シグナリングを活性化する組成物を包含する複合療法、並びに、治療方法を特徴とする。本発明は部分的には癌の治療のための方法及び製品を提供する。より詳細には、リンホトキシンベータ受容体（ＬＴ−β−Ｒ）結合分子、例えば抗ＬＴ−β−Ｒ抗体及びリンホトキシン受容体結合分子ではない少なくとも１つの別の薬剤（例えば血管形成を抑制する薬剤、又は生物学的薬剤）の使用は、何れかの薬剤単独よりも、特定の腫瘍、例えば固形腫瘍の大きさを低減する場合により効果的であることがわかった。【特許請求の範囲】
【請求項１】
約２ｍｍ×２ｍｍ超の大きさの腫瘍を有する対象における腫瘍の大きさを低減するための方法であって、該腫瘍の大きさが低減されるように、抗リンホトキシンベータ受容体（ＬＴ−β−Ｒ）結合分子又はその抗原結合フラグメント、及び少なくとも１つの別の薬剤を該対象に投与することを含む、方法。
【請求項２】
固形腫瘍を有する対象における固形腫瘍の脈管形成を低減するための方法であって、該固形腫瘍の脈管形成が低減されるように、抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子又はその抗原結合フラグメント、及び少なくとも１つの別の薬剤を該対象に投与することを含む、方法。
【請求項３】
固形腫瘍を有する対象における固形腫瘍の透過性を増大させるための方法であって、抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子又はその抗原結合フラグメントに対する該固形腫瘍の透過性が増大するように、該抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子又はその抗原結合フラグメント、及び少なくとも１つの別の薬剤を対象に投与することを含む、方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの別の薬剤が、前記抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子又はその抗原結合フラグメントの投与の前、又は該抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子又はその抗原結合フラグメントと同時の何れかで、前記対象に投与される、請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの別の薬剤が血管形成を抑制する、請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
血管形成を抑制する前記薬剤が、ゲフィチニブ、イマチニブメシレート、エルロチニブ及びボルテゾミブよりなる群から選択される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
血管形成を抑制する前記薬剤が生物学的薬剤、例えば抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項５記載の方法。
【請求項８】
血管形成を抑制する前記生物学的薬剤が、抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＥＧＦＲ抗体である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記生物学的薬剤が、ベバシツマブ、セツキシマブ、リツキシマブ、トラスツズマブ、トシツモマブ、イブリツモマブ、アレルムツズマブ、エプラツズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、オブリメルセン及びパニツムマブよりなる群から選択される、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子又はその抗原結合フラグメントが、ヒト化結合分子、例えばｈｕＣＢＥ１１、又は多価抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子である、請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記腫瘍が、結腸腫瘍、子宮頚部腫瘍、胃の腫瘍、癌腫及び膵臓腫瘍よりなる群から選択される、請求項１〜１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記腫瘍の大きさが少なくとも約１ｍｍ×１ｍｍ、少なくとも約２ｍｍ×２ｍｍ、及び少なくとも約１ｃｍ３の体積よりなる群から選択される、請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記対象に化学療法剤を投与することを更に含む、請求項１〜１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記化学療法剤が、ゲムシタビン、アドリアマイシ、カンプトサール、カルボプラチン、シスプラチン、及びタキソールよりなる群から選択される、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記抗リンホトキシンベータ受容体（ＬＴ−β−Ｒ）結合分子又はその抗原結合フラグメント及び少なくとも１つの血管形成を抑制する薬剤の投与が、約５８％以上の％腫瘍抑制をもたらす、請求項５記載の方法。
【請求項１６】
下記成分：
ａ）パッケージング材料；
ｂ）抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子又はその抗原結合フラグメント；及び、
ｃ）該抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子又はその抗原結合フラグメントを少なくとも１つの別の薬剤と共に投与できることを示す、該パッケージング材料内に含まれるラベル又はパッケージインサート；
を含む製品。
【請求項１７】
下記成分：
ａ）パッケージング材料；
ｂ）少なくとも１つの別の薬剤；及び、
ｃ）該少なくとも１つの別の薬剤を抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子又はその抗原結合フラグメントと共に投与できることを示す、該パッケージング材料内に含まれるラベル又はパッケージインサート；
を含む製品。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの別の薬剤が血管形成を抑制する、請求項１６又は１７記載の製品。
【請求項１９】
下記成分：
ａ）パッケージング材料；
ｂ）ｈｕＣＢＥ１１抗体又はその抗原結合フラグメント；及び、
ｃ）該ｈｕＣＢＥ１１抗体又はその抗原結合フラグメントをベバシツマブ又はセツキシマブと共に投与できることを示す、該パッケージング材料内に含まれるラベル又はパッケージインサート；
を含む製品。
【請求項２０】
下記成分：
ａ）パッケージング材料；
ｂ）ベバシツマブ又はセツキシマブ；及び、
ｃ）ベバシツマブ又はセツキシマブをｈｕＣＢＥ１１抗体又はその抗原結合フラグメントと共に投与できることを示す、該パッケージング材料内に含まれるラベル又はパッケージインサート；
を含む製品。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（関連出願）
本願は、２００６年６月１５日に出願された「Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ  Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ  Ｂｅｔａ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ａｇｅｎｔｓ」という発明の名称の、米国仮特許出願第６０／８１４，３５７号の利益を請求する。上記の仮特許出願の全内容が、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の背景）
癌は合衆国においてほぼ５人に１人が罹患している現在世界中で最も蔓延している健康問題の１つである。多くの分子が抗体系療法のための潜在的標的として腫瘍細胞上で発見されている。
【０００３】
例えばリンホトキシンベータ受容体（本明細書においては、ＬＴ−β−Ｒと称する）は免疫系の発達において、そして濾胞樹状細胞を包含する免疫系の多くの細胞及び多くの支質細胞型の機能的維持において、十分解明された役割を有する腫瘍壊死因子ファミリーのメンバーである（Ｃｒｏｗｅ等（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６４：７０７；Ｂｒｏｗｎｉｎｇ等（１９９３）７２：８４７；Ｂｒｏｗｎｉｎｇ等（１９９５）１５４：３３；Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ等（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１５６：１３７）。ＬＴ−β−Ｒの活性化はインビボで特定の癌細胞系統のアポトーシス死を誘導することが分かっている（ＰＣＴ／ＵＳ９６／０１３８６）。特定のヒト化抗ＬＴ−β−Ｒ抗体のようなＬＴ−β−Ｒ活性化剤の抗腫瘍作用を増強する方法は対象（例えばヒト）における新生物の進行、重症度又は影響を治療又は低減する場合に有用であると考えられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要旨）
本発明は部分的には癌の治療のための方法及び製品を提供する。より詳細には、リンホトキシンベータ受容体（ＬＴ−β−Ｒ）結合分子、例えば抗ＬＴ−β−Ｒ抗体及びリンホトキシン受容体結合分子ではない少なくとも１つの別の薬剤（例えば血管形成を抑制する薬剤、又は生物学的薬剤）の使用は、何れかの薬剤単独よりも、特定の腫瘍、例えば固形腫瘍の大きさを低減する場合により効果的であることがわかった。本明細書に記載する通り、本発明の複合療法による樹立された固形腫瘍の治療は何れかの薬剤単独による腫瘍野治療と比較して、有意の腫瘍生育抑制（％抑制）をもたらす。更に又、抗体と第２の薬剤との組み合わせが固形腫瘍の脈管形成を低減及び／又は固形腫瘍の透過性を増大する場合により効果的であることがわかった。
【０００５】
更に又、本発明の複合療法は別の利益も有する。本発明の１つの実施形態において、本発明の複合療法は向上した安全性のプロファイルを有する。別の実施形態においては、本発明の複合療法は、複合療法の成分の何れか又は両方を、それらが単独で使用された場合よりも低い用量において使用可能とする。
【０００６】
従って、１つの態様において、本明細書は約２ｍｍ×２ｍｍ超の大きさの腫瘍を有する対象における腫瘍の大きさを低減するための方法であって、腫瘍の大きさが低減されるように抗リンホトキシンベータ受容体（ＬＴ−β−Ｒ）結合分子及び少なくとも１つの別の薬剤を対象に投与することを含む方法を提供する。
【０００７】
本発明は又、固形腫瘍を有する対象における固形腫瘍の脈管形成を低減するための方法であって、固形腫瘍の脈管形成が低減されるように抗リンホトキシンベータ受容体（ＬＴ−β−Ｒ）結合分子及び少なくとも１つの別の薬剤を対象に投与することを含む方法を提供する。
【０００８】
本発明は又、固形腫瘍を有する対象における固形腫瘍の透過性を増大させるための方法であって、抗リンホトキシンベータ受容体（ＬＴ−β−Ｒ）抗体に対する固形腫瘍の透過性が増大するように抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子及び少なくとも１つの別の薬剤を対象に投与することを含む方法を提供する。
【０００９】
本発明は又、抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子で腫瘍細胞を感作すること、及び化学療法剤及び少なくとも１つの別の薬剤を投与することを含む癌の治療方法を包含する。
【００１０】
その少なくとも１つの別の薬剤は抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子の投与の前に対象に投与することができ、或いは、その少なくとも１つの別の薬剤は抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子の投与と同時に対象に投与することができる。
【００１１】
１つの実施形態において、その少なくとも１つの別の薬剤は血管形成を抑制する。１つの実施形態において、その少なくとも１つの別の薬剤は生物学的薬剤である。１つの実施形態において、血管形成を抑制する生物学的薬剤は抗体又はその抗原結合フラグメントである。別の実施形態において、生物学的薬剤は抗ＶＥＧＦ抗体である。１つの実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体はベバシツマブである。別の実施形態においては、生物学的薬剤は抗ＥＧＦＲ抗体である。１つの実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体はセツキシマブである。
【００１２】
更に別の実施形態においては、生物学的薬剤はリツキシマブ、トラスツズマブ、トシツモマブ、イブリツモマブ、アレルムツズマブ、エプラツズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、オブリメルセン及びパニツムマブよりなる群から選択される。
【００１３】
１つの実施形態において、生物学的薬剤はインターフェロン又はインターロイキンである。
【００１４】
本発明の１つの実施形態において、ＬＴ−β−Ｒ結合分子はヒト化結合分子である。本発明の１つの実施形態において、ヒト化結合分子はヒト化ＣＢＥ１１である。
【００１５】
本発明の別の実施形態において、抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子は多価抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子である。１つの実施形態において、多価抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子はＣＢＥ１１抗体誘導された抗原結合部位少なくとも１つを含む。
【００１６】
更に別の実施形態において、抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子は化学療法剤又は免疫毒素にコンジュゲートされる。
【００１７】
本発明の１つの実施形態において、腫瘍は癌腫、例えば腺癌又は扁平上皮癌腫である。
【００１８】
別の実施形態において、腫瘍は結腸腫瘍、子宮頚部腫瘍、胃の腫瘍、又は膵臓の腫瘍よりなる群から選択される。
【００１９】
更に別の実施形態においては、腫瘍は病期Ｉ、病期ＩＩ、病期ＩＩＩ、病期ＩＶよりなる群から選択される病期にある。
【００２０】
１つの実施形態において、腫瘍は少なくとも約１ｍｍ×１ｍｍである。別の実施形態において、腫瘍は少なくとも約２ｍｍ×２ｍｍである。更に別の実施形態において、腫瘍は少なくとも約１ｃｍ３の体積を有する。
【００２１】
１つの実施形態において、腫瘍は転移性である。
【００２２】
１つの実施形態において、本発明の方法は更に対象に化学療法剤を投与することを含む。１つの実施形態において、化学療法剤はゲムシタビン、アドリアマイシ、カンプトサール、カルボプラチン、シスプラチン、及びタキソールよりなる群から選択される。
【００２３】
本発明は約２ｍｍ×２ｍｍ超の大きさの腫瘍を有する対象における腫瘍の大きさを低減するための方法であって、腫瘍の大きさが低減されるように抗リンホトキシンベータ受容体（ＬＴ−β−Ｒ）結合分子及び血管形成を抑制する少なくとも１つの別の薬剤を対象に投与することを含む方法を提供する。
【００２４】
本発明は又、固形腫瘍を有する対象における固形腫瘍の脈管形成を低減するための方法であって、固形腫瘍の脈管形成が低減されるように抗リンホトキシンベータ受容体（ＬＴ−β−Ｒ）結合分子及び血管形成を抑制する少なくとも１つの別の薬剤を対象に投与することを含む方法を提供する。
【００２５】
本発明は又、固形腫瘍を有する対象における固形腫瘍の透過性を増大するための方法であって、抗リンホトキシンベータ受容体（ＬＴ−β−Ｒ）結合分子に対する固形腫瘍の透過性が増大されるように抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子及び血管形成を抑制する少なくとも１つの別の薬剤を対象に投与することを含む方法を提供する。
【００２６】
血管形成を抑制する少なくとも１つの別の薬剤は抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子の投与の前に対象に投与することができ、或いは、血管形成を抑制する少なくとも１つの別の薬剤は抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子と同時に対象に投与することができる。
【００２７】
１つの実施形態において、血管形成を抑制する少なくとも１つの別の薬剤は生物学的薬剤である。１つの実施形態において、血管形成を抑制する生物学的薬剤はゲフィチニブ、イマチニブメシレート、及びボルテゾミブよりなる群から選択される。
【００２８】
本発明の１つの実施形態においてＬＴ−β−Ｒ結合分子はヒト化結合分子である。本発明の１つの実施形態において、ヒト化結合分子はヒト化ＣＢＥ１１である。本発明の別の実施形態において、抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子は多価抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子である。１つの実施形態において、多価抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子はＣＢＥ１１抗体から誘導された抗原結合部位少なくとも１つを含む。
【００２９】
更に別の実施形態において、抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子は化学療法剤又は免疫毒素にコンジュゲートされる。
【００３０】
本発明の１つの実施形態において、腫瘍は癌腫、例えば、腺癌又は扁平上皮癌腫である。
【００３１】
本発明の別の実施形態において、腫瘍は結腸腫瘍、子宮頚部腫瘍、胃の腫瘍、又は膵臓腫瘍よりなる群から選択される。
【００３２】
更に別の実施形態においては、腫瘍は病期Ｉ、病期ＩＩ、病期ＩＩＩ、病期ＩＶよりなる群から選択される病期にある。
【００３３】
１つの実施形態において、腫瘍は少なくとも約１ｍｍ×１ｍｍである。別の実施形態において、腫瘍は少なくとも約２ｍｍ×２ｍｍである。更に別の実施形態において、腫瘍は少なくとも約１ｃｍ３の体積を有する。
【００３４】
１つの実施形態において、腫瘍は転移性である。
【００３５】
１つの実施形態において、本発明の方法は更に対象に化学療法剤を投与することを含む。１つの実施形態において、化学療法剤はゲムシタビン、アドリアマイシ、カンプトサール、カルボプラチン、シスプラチン、及びタキソールよりなる群から選択される。
【００３６】
１つの実施形態において、抗リンホトキシンベータ受容体（ＬＴ−β−Ｒ）結合分子又はその抗原結合フラグメント及び少なくとも１つの血管形成を抑制する薬剤の投与は約５８％以上の％腫瘍抑制をもたらす。
【００３７】
本発明は又、約２ｍｍ×２ｍｍ超の大きさの結腸腫瘍を有する対象における腫瘍の大きさを低減するための方法であって、腫瘍の大きさが低減されるようにヒト化ＣＢＥ１１抗体（ｈｕＣＢＥ１１）及びベバシツマブを対象に投与することを含む方法を提供する。
【００３８】
本発明は又、約２ｍｍ×２ｍｍ超の大きさの結腸腫瘍を有する対象における腫瘍の大きさを低減するための方法であって、腫瘍の大きさが低減されるように抗リンホトキシンベータ受容体（ＬＴ−β−Ｒ）結合分子及び少なくとも１つのＥＧＦＲ抑制剤を対象に投与することを含む方法を提供する。
【００３９】
１つの実施形態において、ＥＧＦＲ抑制剤はセツキシマブ又はエルロチニブである。
【００４０】
１つの実施形態において、抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子はｈｕＣＢＥ１１である。
【００４１】
本発明は更に、パッケージング材料、抗リンホトキシンベータ受容体（ＬＴ−β−Ｒ）結合分子、及び抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子を少なくとも１つの別の薬剤と共に投与できることを示すパッケージング材料内に含有されるラベル又はパッケージインサートを含む製品を提供する。
【００４２】
本発明は更に、パッケージング材料、第２の薬剤、及び少なくとも１つの別の薬剤を抗リンホトキシンベータ受容体（ＬＴ−β−Ｒ）結合分子と共に投与できることを示すパッケージング材料内に含有されるラベル又はパッケージインサートを含む製品を提供する。
【００４３】
１つの実施形態において、製品における少なくとも１つの別の薬剤は血管形成を抑制する薬剤である。１つの実施形態において、製品における薬剤は生物学的薬剤である。１つの実施形態において、製品における生物学的薬剤はベバシツマブ又はセツキシマブである。
【００４４】
１つの実施形態において、製品における抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子はｈｕＣＢＥ１１である。
【００４５】
本発明は更に、パッケージング材料、ｈｕＣＢＥ１１抗体、及びｈｕＣＢＥ１１抗体をベバシツマブ又はセツキシマブと共に投与できることを示すパッケージング材料内に含有されるラベル又はパッケージインサートを含む製品を提供する。
【００４６】
本発明は更に、パッケージング材料、ベバシツマブ又はセツキシマブ、及び生物学的薬剤をｈｕＣＢＥ１１抗体と共に投与できることを示すパッケージング材料内に含有されるラベル又はパッケージインサートを含む製品を提供する。
【００４７】
本発明の他の特徴及び利点は以下の詳細な説明から、及び特許請求の範囲から明確になる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１はベヒクル対照と比較した場合の投与過程を通したＫＭ−２０Ｌ２ヒト結腸腺癌モデルにおける腫瘍重量（長さ×幅２／２）に対する０．２ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、及び２０ｍｇ／ｋｇにおけるｈｕＣＢＥ１１の作用を示すグラフである。投与は異種移植片腫瘍が約６５ｍｇになった時点で開始した。初回用量は矢印で示す。
【図２】図２はベヒクル対照と比較した場合の投与過程を通したＫＭ−２０Ｌ２ヒト結腸腺癌モデルにおける腫瘍重量（長さ×幅２／２）に対する１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、及び４ｍｇ／ｋｇのベバシツマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）の作用を示すグラフである。投与は異種移植片腫瘍が約７５ｍｇになった時点で開始した。初回用量は矢印で示す。
【図３】図３はベヒクル対照と比較した場合の投与過程を通したＫＭ−２０Ｌ２ヒト結腸腺癌モデルにおける腫瘍重量（長さ×幅２／２）に対する１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、及び４ｍｇ／ｋｇのベバシツマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）の作用を示すグラフである。投与は異種移植片腫瘍が約１００ｍｇになった時点で開始した。初回用量は矢印で示す。
【図４】図４はベヒクル対照と比較した場合の投与過程を通したＫＭ−２０Ｌ２ヒト結腸腺癌モデルにおける腫瘍重量（長さ×幅２／２）に対するｈｕＣＢＥ１１と組み合わせたベバシツマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）の作用を示すグラフである。投与は異種移植片腫瘍が約６５ｍｇになった時点で開始した。各薬剤の初回用量は矢印で示す。
【図５】図５はベヒクル対照と比較した場合の試験の第５１日におけるＫＭ−２０Ｌ２ヒト結腸腺癌モデルにおける腫瘍重量（長さ×幅２／２）に対するｈｕＣＢＥ１１と組み合わせたベバシツマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）の作用を示す散布図である。投与は異種移植片腫瘍が約６５ｍｇになった時点で開始した。
【図６】図６はＫＭ−２０Ｌ２ヒト結腸腺癌モデルにおけるｈｕＣＢＥ１１と組み合わせたベバシツマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）の腫瘍生育抑制（％Ｔ／Ｃ）の評価を示すグラフである。投与は異種移植片腫瘍が約６５ｍｇになった時点で開始した。
【図７】図７はベヒクル対照と比較した場合の投与過程を通したＫＭ−２０Ｌ２ヒト結腸腺癌モデルにおける腫瘍重量（長さ×幅２／２）に対するｈｕＣＢＥ１１と組み合わせたベバシツマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）の作用を示すグラフである。投与は異種移植片腫瘍が約２００ｍｇになった時点で開始した。各薬剤の初回用量は矢印で示す。
【図８】図８はベヒクル対照と比較した場合の試験の第５７日におけるＫＭ−２０Ｌ２ヒト結腸腺癌モデルにおける腫瘍重量（長さ×幅２／２）に対するｈｕＣＢＥ１１と組み合わせたベバシツマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）の作用を示す散布図である。投与は異種移植片腫瘍が約２００ｍｇになった時点で開始した。
【図９】図９はＫＭ−２０Ｌ２ヒト結腸腺癌モデルにおけるｈｕＣＢＥ１１と組み合わせたベバシツマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）の腫瘍生育抑制（％Ｔ／Ｃ）の評価を示すグラフである。投与は異種移植片腫瘍が約２００ｍｇになった時点で開始した。
【図１０】図１０はベヒクル対照と比較した場合の投与過程を通したＷｉＤｒ腺癌モデルにおける腫瘍重量（長さ×幅２／２）に対する０．２ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、及び２０ｍｇ／ｋｇにおけるｈｕＣＢＥ１１の作用を示すグラフである。投与は異種移植片腫瘍が約６５ｍｇになった時点で開始した。初回用量は矢印で示す。
【図１１】図１１はベヒクル対照と比較した場合の投与過程を通したＷｉＤｒ腺癌モデルにおける腫瘍重量（長さ×幅２／２）に対する０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、及び８ｍｇ／ｋｇのベバシツマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）の作用を示すグラフである。投与は異種移植片腫瘍が約１００ｍｇになった時点で開始した。初回用量は矢印で示す。
【図１２】図１２はベヒクル対照と比較した場合の投与過程を通したＷｉＤｒ腺癌モデルにおける腫瘍重量（長さ×幅２／２）に対するｈｕＣＢＥ１１と組み合わせたベバシツマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）の作用を示すグラフである。投与は異種移植片腫瘍が約６５ｍｇになった時点で開始した。各薬剤の初回用量は矢印で示す。
【図１３】図１３はベヒクル対照と比較した場合の試験の第５４日におけるＷｉＤｒ腺癌モデルにおける腫瘍重量（長さ×幅２／２）に対するｈｕＣＢＥ１１と組み合わせたベバシツマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）の作用を示す散布図である。投与は異種移植片腫瘍が約６５ｍｇになった時点で開始した。
【図１４】図１４はＷｉＤｒ腺癌モデルにおけるｈｕＣＢＥ１１と組み合わせたベバシツマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）の腫瘍生育抑制（％Ｔ／Ｃ）の評価を示すグラフである。投与は異種移植片腫瘍が約６５ｍｇになった時点で開始した。
【図１５】図１５はベヒクル対照と比較した場合の投与過程を通したＷｉＤｒ腺癌モデルにおける腫瘍重量（長さ×幅２／２）に対するｈｕＣＢＥ１１と組み合わせたベバシツマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）の作用を示すグラフである。投与は異種移植片腫瘍が約２００ｍｇになった時点で開始した。各薬剤の初回用量は矢印で示す。
【図１６】図１６はベヒクル対照と比較した場合の試験の第５４日におけるＷｉＤｒ腺癌モデルにおける腫瘍重量（長さ×幅２／２）に対するｈｕＣＢＥ１１と組み合わせたベバシツマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）の作用を示す散布図である。投与は異種移植片腫瘍が約２００ｍｇになった時点で開始した。
【図１７】図１７はＷｉＤｒ腺癌モデルにおけるｈｕＣＢＥ１１と組み合わせたベバシツマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）の腫瘍生育抑制（％Ｔ／Ｃ）の評価を示すグラフである。投与は異種移植片腫瘍が約２００ｍｇになった時点で開始した。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
１．定義
都合上、本発明を更に説明する前に、明細書、実施例及び添付の特許請求の範囲において使用する特定の用語をここで定義する。
【００５０】
単数表記「Ａ」「Ａｎ」及び「Ｔｈｅ」は文脈により明確に別様に記載されない限り複数に言及する場合を包含する。
【００５１】
「投与する」という用語は対象の系内へ、又は対象中又は対象上の特定の領域への、医薬組成物又は治療薬の送達の何れかの方法を包含する。「全身投与」、「全身に投与する」、「末梢投与」、及び「末梢に投与する」という表現は、本明細書においては、それが対象の系内に進入し、そしてそれにより代謝及び他の同様のプロセスに付されるような、中枢神経系に直接行う以外の化合物、薬物又は他の物質の投与、例えば皮下投与を意味する。「非経口投与」及び「非経口に投与する」とは通常は注射による経腸的及び局所的な投与以外の投与の様式を意味し、そして限定しないが静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、及び胸骨内の注射及び注入を包含する。
【００５２】
「リンホトキシンβ受容体」（「ＬＴ−β−Ｒ」）という用語は生得及び適応型の免疫応答の機能の広範な範囲を媒介する分子の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーの当該技術で知られたメンバーを指す（例えば、その内容が参照により本明細書に組み込まれるＧｏｍｍｅｒｍａｎ及びＢｒｏｗｎｉｎｇ（２００３）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  ３：６４２参照）。
【００５３】
「結合分子」という用語は標的分子（例えば抗原）に特異的に結合する結合部位を含む少なくとも１つの結合ドメインを含む分子を指す。例えば、１つの実施形態において、本発明の方法における使用のための結合分子は免疫グロブリン抗原結合部位又は受容体結合を担うリガンド分子の部分を含む。
【００５４】
１つの実施形態において、結合分子は結合部位少なくとも２つを含む。１つの実施形態において、結合分子は結合部位２つを含む。１つの実施形態において、結合分子は結合部位３つを含む。別の実施形態においては、結合分子は結合部位４つを含む。
【００５５】
「ＬＴ−β−Ｒ結合分子」という用語はリンホトキシンβ受容体（ＬＴ−β−Ｒ）結合分位少なくとも１つを含む分子を指す。本発明の方法及び製品において使用できるＬＴ−β−Ｒ結合分子の例は限定しないが、各々が参照により全体が本明細書に組み込まれるＷＯ９６／２２７８８、ＷＯ０２／３０９８６、及びＷＯ０４／００２４３１に記載されている結合分子を包含する。
【００５６】
１つの実施形態において、本発明の結合分子は「抗体」又は「免疫グロブリン」の分子、例えば天然に存在する抗体又は免疫グロブリンの分子であるか、又は抗体分子と同様の態様において抗原に結合する遺伝子操作された抗体分子である。本明細書においては、「免疫グロブリン」という用語は自身が何れかの該当する特異的な免疫反応性を保有するか否かにかかわらず、２つの重鎖および２つの軽鎖の組み合わせを有するポリペプチドを包含する。「抗体」とは、抗原に対する有意な知られた特異的な免疫反応性の活性を有するそのような組立物を指す。抗体及び免疫グロブリンは軽鎖及び重鎖を含み、その間に鎖間共有結合連結部を有する場合と有さない場合がある。脊椎動物系における基本的な免疫グロブリンの構造は相対的に十分理解されている。
【００５７】
包括的な用語である「免疫グロブリン」は生化学的に区別できる抗体の５種類の異なるクラスを含む。抗体の全５クラスは明確に本発明の範囲に包含され、以下の考察は一般的に免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスを意図したものとなる。ＩｇＧに関しては、免疫グロブリンは分子量約２３，０００ダルトンの２つの同一の軽鎖ポリペプチド鎖及び分子量約５３，０００〜７０，０００の２つの同一の重鎖を含む。４つの鎖は「Ｙ字」の配置においてジスルフィド結合により連結され、ここで、「Ｙ字」の開口部を起点として可変領域を通じて継続している重鎖を軽鎖が包囲する。
【００５８】
軽鎖及び重鎖の両方が構造的及び機能的に相同の領域に分割される。「定常」及び「可変」という用語は機能的に使用される。この点に関し、当然ながら、軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）の部分の両方の可変ドメインが抗原認識及び特異性を決定する。逆に、軽鎖（ＣＬ）及び重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３）の定常ドメインは重要な生物学的特性、例えば分泌、経胎盤運動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合等を付与する。慣例として、定常領域ドメインのナンバリングは、それらが抗原結合部位又は抗体のアミノ末端から遠位となるに従って増大する。Ｎ末端は可変領域であり、そしてＣ末端は定常領域であり；ＣＨ３及びＣＬドメインは実際にはそれぞれ重鎖及び軽鎖のカルボキシ末端を含む。
【００５９】
軽鎖はカッパ又はラムダ（κ、λ）の何れかに分類される。各重鎖クラスはカッパ又はラムダ軽鎖の何れかと結合してよい。一般的に軽鎖及び重鎖は相互に共有結合し、そして２つの重鎖の「テール」部分は、ハイブリドーマ、Ｂ細胞又は遺伝子操作された宿主細胞の何れかにより免疫グロブリンが形成される場合に、共有結合ジスルフィド結合又は非共有結合的連結により相互に結合する。重鎖において、アミノ酸配列はＹ字配置のフォーク型末端におけるＮ末端から、各鎖の底部におけるＣ末端まで伸長している。当業者に知られる通り重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタ又はイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）及びそれらのうちの幾つかのサブクラス（例えばγ１〜γ４）として分類される。抗体の「クラス」をそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ又はＩｇＥと決定するものはこの鎖の性質である。免疫グロブリンサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１等もまた十分特性化されており、そして、機能的特殊性を付与するものとして知られている。これらのクラス及びアイソタイプの各々の修飾された型は本明細書の開示内容を鑑みれば当業者が容易に判別できるものであり、従って本発明の範囲内である。
【００６０】
可変領域は抗体が抗原上のエピトープを選択的に認識して特異的に結合できるようにする。即ち抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメインは組み合わせられて３次元の抗原結合部位を定義する可変領域を形成する。この第４型の抗体構造はＹ字の各アーム部の末端に存在する抗原結合部位を形成する。より詳細には、抗原結合部位はＶＨ及びＶＬ鎖の各々の上にある３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）により定義される。
【００６１】
「抗体」という用語は本明細書においては、例えば何れかのアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ等）の全抗体を包含し、そしてその抗原結合フラグメントを包含する。例示的な抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、及び多価抗体を包含する。抗体は従来の手法を用いてフラグメント化してよい。即ち、抗体という用語は特定の抗原に能動的に結合することができる抗体分子の蛋白質分解的に切断された、又は組み換えにより製造された部分のセグメントを包含する。蛋白質分解性及び／又は組み換えの抗原結合フラグメントの非限定的な例は、ペプチドリンカーにより連結されたＶ［Ｌ］及び／又はＶ［Ｈ］ドメインを含有するＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ及び単鎖抗体（ｓＦｖ）を包含する。
【００６２】
本明細書においては、「ヒト化抗体」という用語は１つの種に由来する抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）がヒトの可変領域のフレームワーク領域上にグラフトされている抗体又は抗体コンストラクトを指す。そのような抗体は抗原結合を最適化するためのフレームワーク突然変異、復帰突然変異、及び／又はＣＤＲ突然変異を包含してもしなくてもよい。
【００６３】
「多重特異的」という用語は１つより多い標的抗原に対する特異性を有する結合分子を包含する。そのような分子は１つより多い結合部位を有しており、そしてその場合、各結合部位は異なる標的分子又は同じ標的上の異なる抗原部位に特異的に結合する（例えば免疫反応する）。
【００６４】
１つの実施形態において、本発明の多重特異性結合分子は少なくとも２つの標的、例えば１つより多い標的分子、又は同じ標的分子上の１つより多いエピトープに対して結合特異性を有する二重特異性分子（例えば抗体、ミニボディー、ドメイン欠失抗体、又は融合蛋白質）である。
【００６５】
１つの実施形態において、抗体の修飾された形態は当該分野で知られた手法を用いて全体の前駆体又は親抗体から作成できる。例示的な手法は後により詳細に考察する。特に好ましい実施形態においては、本発明のポリペプチドの可変及び定常領域の両方がヒト型である。１つの実施形態において、完全ヒト型の抗体は、当該分野で知られた手法を用いることにより作成できる。例えば、特定の抗原に対する完全ヒト型抗体は、抗原攻撃に応答してそのような抗体を生産するように修飾されているが、自身の内因性の遺伝子座は不能化されているトランスジェニック動物に抗原を投与することにより製造できる。抗体を作成するために使用できる例示的な手法は米国特許第６，１５０，５８４；６，４５８，５９２；６，４２０，１４０に記載されている。他の手法は当業者の知る通りである。
【００６６】
１つの実施形態において、本発明の結合分子は抗体分子、例えば未損傷の抗体分子、又は抗体分子のフラグメントを含む。別の実施形態においては、本発明の結合分子は修飾された、又は合成の抗体分子である。１つの実施形態において、本発明の結合分子はモノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、又は組み換え的に製造された抗体（に由来する抗原結合部位少なくとも１つ、由来するＣＤＲ少なくとも１つ）の全て又は一部分を含む。
【００６７】
結合分子が抗体又は修飾された抗体である実施形態において抗原結合部位及び重鎖部分は同じ免疫グロブリン分子から誘導される必要はない。この点に関し、可変領域は、液性の応答を生じさせ、そして所望の抗原に対する免疫グロブリンを形成するように誘導することができる動物の何れかの型から誘導してよい。即ち、ポリペプチドの可変領域は、例えば哺乳類起源であってよく、例えばヒト、ネズミ、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル、マカクザル等）、オオカミ、ラクダ類（例えばラクダ、ラマ及び関連の種）型であってよい。別の実施形態においては、可変領域は起源においてｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ（例えばサメ由来）であってよい。
【００６８】
１つの実施形態において、本発明の結合分子は修飾された抗体である。本明細書においては、「修飾された抗体」という用語はそれらが天然には存在しないように改変されている抗体、例えば完全な重鎖を含まない抗体（例えばドメイン欠失抗体又はミニボディー）の合成形態；２つ以上の異なる抗原に対して、又は単一の抗原上の異なるエピトープに対して結合するように改変された抗体の多重特異性形態（例えば二重特異性、三重特異性等）；ｓｃＦｖ分子に連結された重鎖分子等を包含する。ｓｃＦｖ分子は当該分野で知られており、例えば米国特許５，８９２，０１９に記載されている。更に又、「修飾された抗体」という用語は抗体の多価の形態（例えば３価、４価等、同じ抗原の３つ以上のコピーに結合する抗体）を包含する。
【００６９】
１つの実施形態において、「修飾された抗体」という用語は、本発明によれば、免疫グロブリン、抗体、又はその免疫反応性フラグメント又は組み換え体であって、定常領域ドメインの１つ以上の少なくとも画分が欠失しているか、あるいは改変されていることにより、概ね同じ免疫原性の完全な未改変の抗体と比較して所望の生化学的特性、例えば非共有結合的に２量化する能力、腫瘍の部位に局在する増大した能力、又は低減した血清中半減期を与えるものを包含する。好ましい実施形態においては、本発明のポリペプチドは免疫グロブリン重鎖と同様のポリペプチド鎖を含むが重鎖ドメイン１つ以上の少なくとも一部分を欠いているドメイン欠失抗体である。より好ましくは修飾された抗体の定常領域の完全ドメインの１つが欠失することになり、そして更に好ましくはＣＨ２ドメインの全て又は部分が欠失することになる。
【００７０】
好ましい実施形態においては、本発明の結合分子はヒトにおいて有害な免疫応答を誘発しない。本明細書に適合する定常領域の修飾は、ドメイン１つ以上におけるアミノ酸１つ以上の付加、欠失又は置換を包含する。即ち、本発明の結合分子は重鎖定常ドメインの３つ（ＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３）及び／又は軽鎖定常領域ドメイン（ＣＬ）の１つ以上に対する改変又は修飾を含んでよい。
【００７１】
１つの実施形態において、本発明の結合分子は当該分野で知られた手法を用いてその免疫原性を低減するために修飾してよい。例えば、本発明の抗体又はポリペプチドはヒト化、脱免疫化することができ、又はキメラ抗体を作成することができる。抗体のこれらの型は親抗体の抗原結合特性を保持するか実質的に保持しているが、ヒトにおいて低免疫原性である非ヒト抗体、典型的にはネズミ抗体から誘導される。これは種々の方法、例えば（ａ）ヒト定常領域上に完全な非ヒト可変ドメインをグラフトしてキメラ抗体を形成すること；（ｂ）重要なフレームワーク残基の保持を伴うか伴うことなく、ヒトフレームワーク及び定常領域内に非ヒトの相補性決定領域（ＣＤＲ）の１つ以上の少なくとも一部分をグラフトすること；又は（ｃ）完全な非ヒト可変ドメインを移植するが、表面残基の置き換えによりヒト様のセクションでそれらを「クローキング」することにより達成してよい。そのような方法はＭｏｒｒｉｓｏｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１−５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：６５−９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９−４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．３１：１６９−２１７（１９９４）、及び米国特許５，５８５，０８９、５，６９３，７６１及び５，６９３，７６２に記載されており、これら全ては参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【００７２】
「血管形成を抑制する薬剤」とは、例えば血管形成の開始、血管の発達、及び／又は血管の維持を抑制する何れかの薬剤である。
【００７３】
１つの実施形態において、血管形成を抑制する薬剤は生物学的薬剤である。
【００７４】
「生物学的物質」又は「生物学的薬剤」という用語は、治療薬としての使用を意図する、生物から作成した何れかの薬学的に活性な薬剤、及び／又はそれらの製品を指す。本発明の１つの実施形態において、抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子と組み合わせて使用できる生物学的薬剤は、限定しないが、抗体、核酸分子、例えばアンチセンス核酸分子、ポリペプチド又は蛋白質を包含する。そのような生物学的物質は、生物学的薬剤を例えば抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子の投与の前に、抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子と同時に、又は抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子の後に投与することにより、抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子と組み合わせて投与できる。
【００７５】
１つの実施形態において、対象由来の細胞を抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子及び／又は生物学的薬剤にインビトロで接触させ、そして次に対象内に導入することができる。次に対象を複合療法の第２の相、例えば抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子及び／又は生物学的薬剤により治療してよい。
【００７６】
「複合療法」という用語は本明細書においては、例えば抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子及び第２の薬剤、例えば血管形成を抑制する薬剤、又は生物学的薬剤を含む治療用法を指す。抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子及び第２の薬剤は別個の投与のために製剤してもよく、或いは、共に投与するために製剤してもよい。
【００７７】
「癌」又は「新生物形成」という用語は一般的に何れかの悪性の新生物又は細胞の自発的生育又は増殖を指す。例えば「癌」を有する対象は白血病、リンパ腫、又は他の悪性の血液細胞を有する場合がある。特定の実施形態においては、本方法は固形腫瘍を治療するために使用される。例示的な固形腫瘍は限定しないが、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、精巣癌、肺癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚部癌、膵臓癌、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、乳癌、並びに前立腺、胃、皮膚、腹部、食道、及び膀胱の癌を包含する。本発明の１つの実施形態においては、固形腫瘍は結腸腫瘍である。本発明の別の実施形態においては、固形腫瘍は結腸腫瘍、子宮頚部腫瘍、胃腫瘍、及び膵臓腫瘍よりなる群から選択される。
【００７８】
本発明の特定の実施形態においては、本方法は樹立された腫瘍を治療（例えば腫瘍の大きさを低減、脈管形成を低下、及び／又は腫瘍の透過性を増大）するために使用される。本明細書においては、「樹立された腫瘍」とは、栄養、即ち酸素が浸透圧により対象の脈管から腫瘍の中心にまでもはや透過することができないため、腫瘍が栄養を受け取るためにそれ自身の血管供給を必要とするような十分な大きさの固形腫瘍である。
【００７９】
１つの実施形態において、本方法は脈管形成腫瘍を治療するために使用される。脈管形成腫瘍は樹立された脈管の特徴を有する腫瘍を包含する。そのような腫瘍はそれらの大きさにより、及び／又は血管又は血管形成のマーカーの存在により、発見される。
【００８０】
別の実施形態において、本方法は休止期になく、活発に指数的生育を進行させている固形腫瘍を治療するために使用される。
【００８１】
「癌腫」という用語は上皮細胞、例えば腺細胞（「腺腫」又は「腺癌」）又は扁平上皮細胞（「扁平上皮細胞癌」）から誘導される悪性の新生物の種々の型の何れかを指す。癌腫は隣接組織に浸潤し、そして遠隔の臓器、例えば骨、肝臓、肺又は脳に拡張（転移）する場合が多い。
【００８２】
本明細書においては、「子宮頚癌」とは、子宮頚部、即ち子宮の下部の狭小な部分に生じる腫瘍を指す。本明細書においては、子宮頚癌という用語は子宮頚部の扁平上皮細胞癌、腺癌、及び混合型の癌腫、即ち腺扁平上皮癌腫を包含する。
【００８３】
ＦＩＧＯシステムに基づけば、子宮頚癌は「病期０〜ＩＶ」であることができる。「病期０」は「インサイチュ癌腫」とも称され、子宮頚部の管壁である上皮細胞のみに検出され、より深部の組織を侵襲していない腫瘍である。「病期Ｉ」の子宮頚癌とは、子宮頚部に限定される腫瘍である。「病期ＩＡ」においては、極めて少量の腫瘍が顕微鏡下に観察できる。「病期ＩＡ１」においては、腫瘍は深度３ミリメートル未満、幅７ミリメートル未満の区域に浸透している。「病期ＩＡ２」においては、腫瘍は深度３〜５ミリメートル、幅７ミリメートル未満の区域に浸透している。「病期ＩＢ」においては、腫瘍は顕微鏡を使用することなく観察できる。病期ＩＢは又、顕微鏡を用いなくては観察できないが幅７ミリメートル超であり、子宮頚部の結合組織に５ミリメートル超浸透している腫瘍を包含する。「病期ＩＢ１」は４センチメートル以下の腫瘍である。「病期ＩＢ２」の腫瘍は４センチメートル超であり、子宮頚部外の臓器及び組織に拡張しているが骨盤区域のみになお限定されている。「病期ＩＩ」の子宮頚癌は子宮頚部及び／又は膣上部３分の２を超えて伸長しているが骨盤壁上には至っていない腫瘍を指す。「病期ＩＩＡ」においては、腫瘍は子宮頚部を超えて膣上部まで拡張している。「病期ＩＩＢ」においては、腫瘍は子宮頚部の次の組織にまで拡張している。「病期ＩＩＩ」の子宮頚癌は膣下部３分の１まで、又は骨盤壁上にまで拡張している腫瘍を指し；腫瘍が腎臓から膀胱への尿の流動を遮蔽する場合がある。「病期ＩＩＩＡ」においては、腫瘍は膣下部３分の１まで拡張している。「病期ＩＩＩＢ」においては、腫瘍は骨盤壁部まで拡張しており、及び／又は腎臓から膀胱への尿の流動を遮蔽している。「病期ＩＶ」の子宮頚癌は身体の他の部分、即ち、膀胱又は直腸（「病期ＩＶＡ」）又はその他、例えば肝臓又は肺（「病期ＩＶＢ」）に拡張（転移）している腫瘍を指す。
【００８４】
本明細書においては、「結腸癌」又は「結腸直腸癌」とは大腸又は結腸の内管壁から生じる腫瘍を指す。これらの癌の全てではないが大部分は結腸ポリープから生じる。「結腸癌」という用語は又、結腸の癌腫、リンパ腫、カルチノイド腫、黒色腫、及び肉腫を指す。
【００８５】
結腸直腸癌は病期０〜ＩＶに分割できる。「病期０」の結腸直腸癌は結腸又は直腸の最内層の管壁にのみ存在する。インサイチュの癌腫は病期０結腸直腸癌に対する別の名称である。「病期Ｉ」結腸直腸癌は結腸又は直腸の内壁内部に成長している腫瘍を指す。腫瘍は結腸の外壁には到達しておらず、また結腸外部に伸長していない。「デュークスＡ」とは病期Ｉの結腸直腸癌に対する別の名称である。「病期ＩＩ」の結腸直腸癌においては、腫瘍は結腸又は直腸の壁部の内部に、又はそれを通過してより深部まで伸長している。侵襲された近傍組織を有する場合があるが、癌細胞はリンパ節にまでは拡張していない。「デュークスＢ」は病期ＩＩ結腸直腸癌の別の名称である。「病期ＩＩＩ」の結腸直腸癌は近傍のリンパ節にまで拡張しているが、身体の他の部分には至っていない腫瘍である。「デュークスＣ」は病期ＩＩＩ結腸直腸癌の別の名称である。「病期ＩＶ」の結腸直腸癌においては、腫瘍は身体の他の部分、例えば肝臓又は肺にまで拡張している。「デュークスＤ」は病期ＩＶ結腸直腸癌の別の名称である。
【００８６】
本明細書においては、「胃腸癌」又は「ＧＩ癌」とは、胃腸管の臓器、又は消化管の臓器、即ち口腔、食道、胃、十二指腸、小腸、大腸又は結腸、直腸、及び肛門の何れかの癌である。
【００８７】
「胃癌」又は「胃新生物」という用語は「腹部の癌」とも称され、本明細書においては、腹部の腺癌、リンパ腫、支質腫瘍、扁平上皮細胞腫瘍、腺扁平上皮癌腫、カルチノイド、及び平滑筋肉腫を包含する。胃癌は、本明細書においては、胃管壁（粘膜）に生じる腫瘍、胃下部（幽門）、胃中央部（体部）に生じる腫瘍、上部（噴門）に生じるもの、並びに胃一か所より多くに生じる腫瘍を指す。胃癌は他の発生源（例えば結腸）から「転移」したものであってよく、或いは、「原発」（胃細胞起源の腫瘍）であってもよい。例えば、胃癌は食道又は小腸に転移することができ、そして胃壁を通過して近傍のリンパ節及び臓器（例えば肝臓、膵臓及び結腸）まで伸長することができる。胃癌は又身体の他の部分（例えば肺、卵巣、骨）に転移することができる。
【００８８】
胃癌は病期０〜ＩＶであることができる。「病期０」の胃癌は「インサイチュ癌腫」とも称され、胃の壁部の粘膜層の内部管壁にのみ存在する腫瘍である。「病期Ｉの胃癌」は癌が拡張している場所に応じて「病期ＩＡ」及び「病期ＩＢ」に分割される。病期ＩＡにおいては、癌は胃壁の粘膜層を完全に通過して拡張している。病期ＩＢにおいては、癌は胃壁の粘膜層を完全に通過して拡張し、そして腫瘍近傍の６リンパ節以下で観察されるか；又は胃壁の筋層に至る。「病期ＩＩ胃癌」においては、癌は胃壁の粘膜層を完全に通過して拡張し、そして腫瘍近傍の７〜１５リンパ節で観察されるか；又は胃壁の筋層に至り、そして腫瘍近傍の６リンパ節以下で観察されるか；又は胃壁の漿膜層に至っているがリンパ節や他の臓器には至らない。「病期ＩＩＩの胃癌」は癌が拡張している場所に応じて「病期ＩＩＩＡ」及び「病期ＩＩＩＢ」に分割される。病期ＩＩＩＡは胃壁の筋層に拡張し、そして腫瘍近傍の７〜１５リンパ節で観察されるか；又は胃壁の漿膜層に至っており、そして腫瘍近傍の１〜６リンパ節で観察されるか；又は胃の次の臓器に至っているが、リンパ節又は身体の他の部分には至っていない癌を指す。病期ＩＩＩＢは胃壁の漿膜層に拡張しており、腫瘍近傍の７〜１５リンパ節で観察される癌を指す。「病期ＩＶ胃癌」においては、癌は胃の次の臓器に、そして少なくとも１つのリンパ節に；又は１５リンパ節より多くに；又は身体の他の部分に拡張している。
【００８９】
本明細書においては、「膵臓癌」という用語は膵臓に生じる腫瘍を指し、そして「導管腺癌」及び「島細胞癌腫」を包含する。
【００９０】
膵臓癌は「病期Ｉ〜ＩＶ」であることができる。「病期Ｉ」の膵臓癌においては、癌は膵臓に限定され、そして「切除可能」とみなされる場合が多い。「病期ＩＡ」においては、腫瘍は膵臓に限定され、そして大きさは２ｃｍ未満であり；近傍のリンパ節や遠隔部位に拡張していない。「病期ＩＢ」においては、腫瘍は膵臓に限定され、そして大きさは２ｃｍ超であり、近傍のリンパ節や遠隔部位に拡張していない。「病期ＩＩ」の膵臓癌はもはや切除可能ではない。「病期ＩＩＡ」においては、腫瘍は膵臓の外部まで成長しているが、膵臓にすぐ隣接する臓器内、例えば胆管又は十二指腸には至っておらず、近傍のリンパ節にも拡張していない。「病期ＩＩＢ」においては、腫瘍は膵臓に限定されるか、膵臓の外部に成長しているが、膵臓にすぐ隣接する臓器内、例えば胆管又は十二指腸には至っていないものの、近傍のリンパ節には拡張している。「病期ＩＩＩ」においては、腫瘍は膵臓の外部に成長して結腸、胃、又は脾臓のような近傍臓器内に至っており、そして近傍リンパ節への拡張はある場合とない場合がある。「病期ＩＶ」においては、腫瘍は身体の他の部分、例えば肝臓又は肺にまで拡張している。
【００９１】
「化学療法剤」という用語は、悪性疾患を治療するために使用される分子又は組成物を指す。そのような薬剤は抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子と組み合わせて、又は本発明の複合療法と共に使用してよい。化学療法剤は抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子とコンジュゲートすることができるか、及び／又は未コンジュゲート形態において複合療法と組み合わせて使用してよい薬剤を包含する。例示的な化学療法剤は後に考察する。
【００９２】
「有効量」という用語は癌性の細胞又は腫瘍に対して望ましい結果、例えば限定しないが腫瘍の大きさの低減、腫瘍の体積の低減、固形腫瘍の脈管形成の低下、及び／又は薬剤に対する固形腫瘍の透過性の増大をインビトロ又はインビボの何れかで可能とするために十分な複合療法剤の量を指す。本発明の特定の実施形態においては、複合療法剤の有効量は約５８％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％超の％腫瘍抑制をもたらす量である。用語は又、所望の臨床的結果、例えば限定しないが疾患の緩解、患者の安定化、患者における癌の発症又は進行の防止又は遅延を達成するために十分な複合療法剤の量を包含する。複合療法剤の有効量は１回の投与又は反復投与に基づいて決定できる。上記した指標の検出及び測定のための方法は当業者の知る通りである。そのような方法は限定しないが、全身腫瘍組織量の低減、腫瘍の大きさの低減、腫瘍の体積の低減、二次腫瘍の増殖の低減、固形腫瘍脈管形成の低下、腫瘍組織における遺伝子の発現、バイオマーカーの存在、リンパ節の関与、組織学的等級、及び核の等級を測定することを包含する。
【００９３】
本発明の１つの実施形態において、全身腫瘍組織量を測定する。「全身腫瘍組織量」はまた「腫瘍負荷」とも称され、身体全体に渡って分布した腫瘍物質の総量を指す。全身腫瘍組織量はリンパ節及び骨髄を包含する身体全体に渡る癌細胞の総数、又は腫瘍の全体的大きさを指す。全身腫瘍組織量は当該分野で知られた種々の方法により、例えば腫瘍の寸法を、対象からの除去時に例えばカリパスを用いて、或いは身体内にある時点で画像化手法、例えば超音波、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、又は磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）スキャンを用いて計測することにより、測定することができる。
【００９４】
本発明の１つの実施形態において、腫瘍の大きさを測定する。「腫瘍の大きさ」という用語は腫瘍の長さ及び幅として測定できる腫瘍の全体的大きさを指す。腫瘍の大きさは当該分野で知られた種々の方法により、例えば腫瘍の寸法を、対象からの除去時に例えばカリパスを用いて、或いは身体内にある時点で画像化手法、例えば超音波、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、又は磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）スキャンを用いて計測することにより、測定することができる。
【００９５】
本発明の１つの実施形態において、腫瘍の大きさは腫瘍の重量を測定することにより測定される。１つの実施形態において、腫瘍重量は腫瘍の長さを計測し、それを腫瘍の幅の二乗とかけ、そしてその総和を２で割ることにより求められる（後述する実施例のセクションにおいて説明）。
【００９６】
本発明の１つの実施形態において、腫瘍の大きさは腫瘍の体積を測定することにより測定される。「腫瘍の体積」という用語は腫瘍の全体的大きさを指し、これは腫瘍そのもの＋罹患リンパ節を適宜包含する。腫瘍体積は当該分野で知られた種々の方法により、例えば腫瘍の寸法を、対象からの除去時に例えばカリパスを用いて、或いは身体内にある時点で画像化手法、例えば超音波、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、又は磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）スキャンを用いて計測すること、及び、例えばｚ軸直径に基づくか、又は標準的な形状、例えば球形、楕円形、又は立方体に基づく方程式を用いて体積を計算することにより、測定することができる。１つの実施形態において、腫瘍体積（ｍｍ３）は２次元腫瘍計測から得られる長球楕円形に関して、即ち腫瘍体積（ｍｍ３）＝（長さ×幅２［Ｌ×Ｗ２］）÷２で計算される。単位密度を仮定して腫瘍体積を腫瘍重量に変換する（即ち１ｍｍ３＝１ｍｇ）。
【００９７】
「固形腫瘍の脈管形成」という用語は固形腫瘍における血管の形成を指す。腫瘍の脈管形成を抑制する薬剤は血管の創生、発達及び／又は維持を抑制し、例えば腫瘍内の血管の数及び／又は密度の低減をもたらす。
【００９８】
「固形腫瘍の透過性」という用語は、治療薬に対する固形腫瘍の透過性を指す。固形腫瘍は治療薬が腫瘍の中心部において細胞に到達することができる場合に、治療薬に対して透過性といってよい。腫瘍の透過性を増大させる薬剤は例えば固形腫瘍の脈管を正常化、例えば維持してよい。腫瘍の脈管形成及び／又は腫瘍の透過性は当該分野で知られた種々の方法により、例えば生検標本の免疫組織学的分析により、又は腫瘍の超音波撮影、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、又は磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）スキャンのような画像化手法により測定してよい。
【００９９】
「％Ｔ／Ｃ」という用語は投与群（Ｔ）の平均腫瘍重量を対照群（Ｃ）の平均腫瘍重量で割ったものに１００を掛けたパーセント値である。４２％以下の％Ｔ／Ｃ値はＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＵＳＡ）により有意の活動性を示すものとみなされている。
【０１００】
「％抑制」という用語は１００−％Ｔ／Ｃである。５８％以上の％抑制値はＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＵＳＡ）により有意の活動性を示すものとみなされている。
【０１０１】
「統計学的に有意」又は「統計学的有意性」という用語は、ある独立変数が有効でないか、推定ゼロ仮説が真である場合に、ある結果が偶然に起こる確率を指す。統計学的有意性は確率の値を示す「Ｐ値」（Ｐ）を求めることにより調べることができる。ｐ値は実験により得られた結果が偶然のみに起因することがどの程度可能性があるかを示す。本発明の１つの実施形態において、統計学的有意性は両側１標本Ｔ検定のｐ値を得ることにより調べることができる。０．０５未満のｐ値は統計学的に有意、即ち偶然のみに起因する可能性は低いとみなされる。或いは、統計学的に有意なｐ値は約０．０５〜約０．０４；約０．０４〜約０．０３；約０．０３〜約０．０２；約０．０２〜約０．０１であってよい。一部の場合においてはｐ値は０．０１未満である。ｐ値は、複合療法を用いて腫瘍、例えば固形腫瘍を有する対象を治療する場合に、腫瘍の大きさ及び／又は固形腫瘍の脈管形成の統計学的に有意な低減及び／又は固形腫瘍の透過性における統計学的に有意な増大があるか否かを調べるために使用してよい。偶発的な１日ではなく一連の治療の日々に渡って統計学的有意性が観察される場合に、Ｐ値に対する生物学的関連性がある。
【０１０２】
「癌を治療する」又は「癌を有する対象を治療する」とは、癌細胞の複製の抑制、癌の拡張の抑制、腫瘍の大きさの低減、身体内の癌性の細胞の縮小又は数の低減、及び／又は癌の症状の緩解又は軽減を包含する。治療は、死亡率、及び／又は罹患率の低下がある場合に治療であると見なされ、そして予防的に、又は治療的に実施してよい。
【０１０３】
「免疫毒素」という用語は完全な毒素又は毒素のＡ鎖を結合分子にカップリングさせることにより形成されるハイブリッド分子を指す。得られる分子は結合分子の特異性を有し、そして毒素により付与される毒性を有する。そのような毒素は抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子又は生物学的薬剤にコンジュゲートしてよい。毒素の非限定的な例は、例えばマイタンシノイド、ＣＣ−１０６５類縁体、カリケアマイシン誘導体、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、リシン、ジフテリア毒素及びシュードモナスのエキソトキシンを包含する。例示的な免疫毒性生物学的薬剤は、限定しないがカリケアマイシンにコンジュゲートした抗ＣＤ３３抗体、即ちゲムツズマブオゾガマイシン、及びトランケーションされたシュードモナスエキソトキシンに融合された抗ＣＤ−２２可変ドメイン（Ｆｖ）、即ちＲＦＢ４（ｄｓＦｖ）−ＰＥ３８（ＢＬ２２）、及びジフテリア毒素を含むインターロイキン−２（ＩＬ−２）融合蛋白質、即ちデニロイキンジフチトックスを包含する。
【０１０４】
「患者」又は「対象」又は「宿主」とはヒト又は非ヒト動物の何れかを指す。
【０１０５】
「植物アルカロイド」という用語は生物学的に活性であり細胞毒性である植物から誘導されたアルカリ性の窒素含有分子のファミリーに属する化合物を指す。植物アルカロイドの例は限定しないが、タキサン類、例えばドセタキセル及びパクリタキセル及びビンカ類、例えばビンブラスチン、ビンクリスチン、及びビノレルビンを包含する。１つの実施形態においては、植物アルカロイドはタキソールである。
【０１０６】
２．抗リンホトキシン−β−受容体（ＬＴ−β−Ｒ）結合分子
本発明の好ましい抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子はＬＴ−β−Ｒを活性化し、即ち、ＬＴ−β−Ｒのアゴニストである。内容が参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許６，３１２，６９１及びＷＯ９６／２２７８８は、癌細胞の死滅をトリガーするためにＬＴ−β−Ｒアゴニスト、例えば抗体を用いる癌の治療のための方法及び組成物を記載している。例えば米国特許６，３１２，６９１は膜結合ＬＴ−α／β複合体、可溶性ＬＴ−α／β複合体、及び抗ＬＴ−β−Ｒ抗体を包含する発明において使用するためのＬＴ−β−Ｒアゴニスト、及びそれらの製造および精製のための方法を記載している。
【０１０７】
好ましい実施形態においては、ＬＴ−β−Ｒ結合分子は抗ＬＴ−β−Ｒ抗体である。抗ＬＴ−β−Ｒ抗体の種々の形態が標準的な組換えＤＮＡ手法を用いて作成できる（Ｗｉｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３４９，ｐｐ．２９３−９９（１９９１））。
【０１０８】
特定の実施形態においては、抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子はポリクローナル抗体であってよい。例えば、抗体は該当する抗原及びアジュバントの多数回の皮下又は腹腔内注射により哺乳類内に発生させてよい。この免疫化は典型的には活性化された脾細胞又はリンパ球からの抗原反応性抗体の生産を含む免疫応答を誘発する。得られた抗体を動物の血清から回収し、ポリクローナルの調製品を得てよい。
【０１０９】
別の実施形態においては抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子はモノクローナル抗体である。特定の実施形態においては、本発明のモノクローナル抗体は各々がＷＯ９６／２２７８８に記載されているＢＫＡ１１、ＣＤＨ１０、ＢＣＧ６、ＡＧＨ１、ＢＤＡ８、ＣＢＥ１１及びＢＨＡ１０よりなる群から選択される。
【０１１０】
本発明において使用するためのモノクローナル抗体は表１の細胞系よりなる群から選択される細胞系により特定の実施形態において生産してよい。
【０１１１】
【表１】
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モノクローナル抗体の製造はよく知られたプロセス（Ｋｏｈｌｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５））であり、ここで、抗原を注射してある哺乳類に由来する比較的短い寿命又は非不朽化のリンパ球を不朽化された腫瘍細胞系（例えば骨髄腫細胞系）に融合し、これによりともに不朽化されておりＢ細胞の遺伝子的にコーディングされている抗体を生産することができるハイブリッド細胞又は「ハイブリドーマ」を作成する。得られたハイブリッドは、選択、希釈、及び単一の抗体の形成のための特異的遺伝子を含む各個々の系統と共に再生育させることにより単一の遺伝子系統に分離する。それらは所望の抗原に対して同種である抗体を生産し、そしてそれらの純粋な遺伝子的パーセンテージを指して、「モノクローナル」と称される。
【０１１２】
このようにして製造されたハイブリドーマ細胞を、好ましくは未融合の親骨髄腫細胞の生育又は生存を抑制する物質１つ以上を含有する適当な培地中に播種して生育させる。当業者の知る通り、ハイブリドーマの形成、選択及び生育のための試薬、細胞系及び培地は多くの入手元より市販されており、標準的なプロトコルが確立されている。一般的にハイブリドーマ細胞を生育させる培地は所望の抗原に対するモノクローナル抗体の生産に関して試験される。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により生産されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降により、又はインビトロの試験、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素連結免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）により測定される。所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を生産するハイブリドーマが発見された後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、そして標準的な方法により生育させてよい（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。やはり当然ながら、サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、従来の精製操作法、例えばプロテインＡ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーにより、培地、腹水、又は血清から分離してよい。
【０１１３】
別の実施形態において、所望のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは従来の操作法を用いて（例えばネズミ抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離され、そして配列決定される場合がある。単離され、サブクローニングされたハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい原料として機能する。単離後はＤＮＡを発現ベクター内に入れ、次にこれを原核生物又は真核生物の宿主細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は免疫グロブリンを生産しない骨髄腫細胞内にトランスフェクトする。より詳細には、単離されたＤＮＡ（本明細書に記載する通り修飾されていてよい）を用いて参照により本明細書に組み込まれる１９９５年１月２５日に出願されたＮｅｗｍａｎ等の米国特許５，６５８，５７０に記載の通り製造抗体のための定常及び可変領域の配列をクローニングしてよい。本質的には、これは選択された細胞からのＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡへの変換、及びＩｇ特異的プライマーを用いたＰＣＲによる増幅を包含する。この目的のための適当なプライマーも又、米国特許５，６５８，５７０に記載されている。後により詳細に考察する通り、所望の抗体を発現する形質転換された細胞を比較的大量に生育させることにより、免疫グロブリンを臨床用及び商業用に供給してよい。
【０１１４】
やはり当業者の知る通り、抗体又は抗体フラグメントをコードするＤＮＡは又、抗体ファージライブラリから、例えばｐｄファージ又はＦｄファージミド技術を用いて誘導してよい。例示的な方法は例えば各々が参照により本明細書に組み込まれるＥＰ３６８６８４  Ｂ１；米国特許５，９６９，１０８，Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．及びＣｈａｍｅｓ．２０００．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２１：３７１；Ｎａｇｙ等、２００２．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：８０１；Ｈｕｉｅ等、２００１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８：２６８２；Ｌｕｉ等、２００２．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１５：１０６３に記載されている。幾つかの出版物（例えばＭａｒｋｓ等Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：７７９−７８３（１９９２））は鎖シャフリングによる高親和性ヒト抗体の製造、並びに大型ファージライブラリを構築するための方策としてのコンビナトリアルな感染及びインビボの組み換えを記載している。別の実施形態において、リボソームディスプレイを用いることによりディスプレイプラットホームとしてのバクテリオファージを置き換えることができる（例えばＨａｎｅｓ等、２０００．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１２８７；Ｗｉｌｓｏｎ等、２００１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８：３７５０；又はＩｒｖｉｎｇ等、２００１Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２４８：３１参照）。更に別の実施形態においては、細胞表面ライブラリを抗体に関してスクリーニングできる（Ｂｏｄｅｒ等、２０００．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７：１０７０１；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ等、２０００  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４３：２１１）。このような操作法はモノクローナル抗体の単離及びその後のクローニングのための伝統的なハイブリドーマ手法の代替となりえる。
【０１１５】
本発明の更に別の実施形態は、ヒト免疫グロブリントランスジーン１つ以上を保有しているトランスジェニック動物のような非ヒト動物におけるヒト型又は実質的にヒト型の抗体の形成を含む。そのような動物は参照により本明細書に組み込まれる米国特許５，５６９，８２５、ＷＯ０００７６３１０、ＷＯ０００５８４９９及びＷＯ０００３７５０４に記載の通り、ハイブリドーマを製造するための脾細胞のための原料として使用してよい。
【０１１６】
組み換え抗体を形成するための更に別の高効率の手段は、Ｎｅｗｍａｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１４５５−１４６０（１９９２）に記載されている。特記すれば、この手法はサルの可変ドメイン及びヒトの定常配列を含有する霊長類化された抗体の形成をもたらす。この参考文献は参照により全体が本明細書に組み込まれる。更に又、この手法は共通譲渡されている各々が参照により本明細書に組み込まれる米国特許５，６５８，５７０、５，６９３，７８０及び５，７５６，０９６にも記載されている。
【０１１７】
別の実施形態において、リンパ球はマイクロマニピュレーションにより選択することができ、そして可変遺伝子を単離する。例えば、末梢血液単核細胞を免疫化動物から単離し、インビトロで約７日間培養することができる。培養物をスクリーニング基準に合致する特定のＩｇＧに関してスクリーニングできる。陽性ウェル由来の細胞を単離する。個々のＩｇ産生Ｂ細胞は、ＦＡＣＳによるか、又は補体媒介溶血プラーク試験においてそれらを識別することにより単離することができる。Ｉｇ産生Ｂ細胞を試験管内にマイクロマニピュレートし、そしてＶｈ及びＶｌの遺伝子を例えばＲＴ−ＰＣＲを用いて増幅することができる。ＶＨ及びＶＬ遺伝子は抗体発現ベクターにクローニングし、そして発現のために細胞（例えば真核生物又は原核生物の細胞）にトランスフェクトすることができる。
【０１１８】
或いは、抗体産生細胞系を当業者に良く知られている手法を用いて選択し、培養してよい。そのような手法は種々の実験室マニュアル及び主要な出版物に記載されている。この点に関し、後に記載する通り本発明における使用に適する手法は、補遺を含めて参照により全体が本明細書に組み込まれるＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎ等、Ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）に記載されている。
【０１１９】
可変及び定常領域ドメインは何れかの原料（例えば本明細書に記載する抗ＬＴ−β−Ｒ抗体１つ以上から）から得ることができ、そして本発明の修飾された結合分子内に取り込むことができる。例えば、抗体をクローニングするためには、ｍＲＮＡをハイブリドーマ、脾臓又はリンパ細胞から単離し、ＤＮＡに逆転写し、そして抗体遺伝子をＰＣＲ増幅することができる。ＰＣＲはコンセンサス定常領域プライマーによるか、又は公開されている重鎖及び軽鎖のＤＮＡ及びアミノ酸の配列に基づいたより特異的なプライマーにより、開始してよい。上記した通りＰＣＲはまた抗体の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離するために使用してもよい。この場合、ライブラリはコンセンサスプライマー又はより大型の相同プローブ、例えばマウス定常領域プローブによりスクリーニングしてよい。抗体遺伝子の増幅に適する多くのプライマーセットが当該分野で知られている（例えば精製された抗体のＮ末端配列（（Ｂｅｎｈａｒ及びＰａｓｔａｎ．１９９４．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ７：１５０９）；ｃＤＮＡ末端の急速増幅（Ｒｕｂｅｒｔｉ，Ｆ．等、１９９４．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１７３：３３）；抗体リーダ配列（Ｌａｒｒｉｃｋ等、１９８９  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６０：１２５０）に基づいた；又はＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ等、１９９１．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ：ＪＳ  Ｄｅｐ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｈｕｍ．Ｓｅｒｖ．第５版）の既知の可変領域フレームワークアミノ酸配列、又はＶ塩基データベース（例えばＯｒｌａｎｄｉ等、１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：３８３３；Ｓｂｌａｔｔｅｒｏ等、１９９８．Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：２７１；又はＫｒｅｂｂｅｒ等、１９９７．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１：３５）に基づいた５’プライマー）。定常領域ドメインは特定のエフェクター機能を有する（又は特定のエフェクター機能を欠いた）もの、又は免疫原性を低下させる特定の修飾を有するものを選択できる。可変又は定常ドメインは例えばポリメラーゼ連鎖反応及び目的のドメインを増幅するために選択されたプライマーを用いてクローニングすることができる。ＰＣＲ増幅方法は米国特許４，６８３，１９５；４，６８３，２０２；４，８００，１５９；４，９６５，１８８；及び例えば「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」Ｉｎｎｉｓ等、編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）；Ｈｏ等、１９８９．Ｇｅｎｅ  ７７：５１；Ｈｏｒｔｏｎ等、１９９３．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２７０に記載されている。
【０１２０】
或いは、Ｖドメインは選択された動物に由来するＶ遺伝子配列のライブラリから得ることができる。ドメイン、例えばＶＨ及びＶＬドメインのランダムな組み合わせを発現するライブラリを所望の抗原でスクリーニングすることにより、所望の結合特性を有するエレメントを発見することができる。そのようなスクリーニングの方法は当該分野で良く知られている。例えば抗体遺伝子レパートリーをλバクテリオファージ発現ベクター内にクローニングすることができる（Ｈｕｓｅ，ＷＤ等、１９８９．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７６：１２７５）。更に又、自身の表面上に抗体を発現する細胞（Ｂｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｔｔｒｕｐ．１９９７．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：５５３；Ｄａｕｇｔｈｅｒｔｙ，Ｐ．等、２０００．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２４３：２１１；Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ等、１９９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：１０４４４；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ等、１９９７．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１５：２９）又はウィルス（例えばＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，ＨＲ．１９９８Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ４：１Ｗｉｎｔｅｒ等、１９９４．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ＡＤ．１９９８．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：１０２）もスクリーニングできる。リポソームディスプレイもまた抗体ライブラリをスクリーニングするために使用できる（Ｈａｎｅｓ  Ｊ．等、１９９８．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：１４１３０；Ｈａｎｅｓ，Ｊ．ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ．１９９９．Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４３：１０７；Ｈｅ，Ｍ．ａｎｄ  Ｔａｕｓｓｉｇ．１９９７．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５：５１３２）。
【０１２１】
スクリーニングのために好ましいライブラリはヒトＶ遺伝子ライブラリである。非ヒト原料由来のＶＬ及びＶＨドメインも使用してよい。１つの実施形態において、そのような非ヒトＶドメインは当該分野で知られた手法を用いてその免疫原性を低減するために改変することが出来る。
【０１２２】
ライブラリはナイーブ、免疫化対象由来、又は半合成であることができる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ．１９９２．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ＡＤ等、ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：３２４５；ｄｅ  Ｋｒｕｉｆ，Ｊ．等、１９９５．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８：９７；Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．等、１９９２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：４４５７）。
【０１２３】
更に又、多くの抗体のＶ及びＣドメインの配列が知られており、そしてそのようなドメインは当該分野で良く知られている方法を用いて合成できる。１つの実施形態において、突然変異を免疫グロブリンドメインに対して行うことにより大きい異種性を有する核酸分子のライブラリを作成できる（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．等、１９９６．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５６：７７；Ｌａｍｍｉｎｍａｋｉ，Ｕ．等、１９９９．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９１：５８９；Ｃａｌｄｗｅｌｌ，Ｒ．Ｃ．及びＪｏｙｃｅ  ＧＦ．１９９２．ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．２：２８；Ｃａｌｄｗｅｌｌ  ＲＣ及びＪｏｙｃｅ  ＧＦ．１９９４．ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．３：Ｓ１３６）。高親和性の変異体を選択するためには標準的なスクリーニングの操作法を使用できる。別の実施形態においては、ＶＨ及びＶＬ配列の変化は例えば当該分野で知られた手法を用いて結晶構造から得られる情報を用いて抗体のアビディテイーを増大するために行うことができる。
【０１２４】
抗原認識部位又は全体としての可変領域は、親抗体１つ以上から誘導してよい。親抗体は天然に存在する抗体又は抗体フラグメント、天然に存在する抗体から適応させた抗体又は抗体フラグメント、ＬＴ−ベータ受容体に特異的であることが分かっている抗体又は抗体フラグメントの配列を用いて新規に構築された抗体を包含できる。親抗体から誘導してよい配列は重鎖及び／又は軽鎖の可変領域及び／又はＣＤＲ、フレームワーク領域、それらの他の部分を包含する。
【０１２５】
１つの実施形態において、抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子はヒト化抗体である。ヒト化抗体を作成するためには、動物を所望の抗原で免疫化し、相当する抗体を単離し、そして特定の抗原結合を担っている可変領域配列の部分を取り出す。次に動物から誘導された抗原結合領域を抗原結合領域が欠失しているヒト抗体遺伝子の適切な部分内にクローニングする。例えばＪｏｎｅｓ，Ｐ．等（１９８６），Ｎａｔｕｒｅ３２１，５２２−５２５又はＴｅｍｐｅｓｔ等（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９，２６６−２７３を参照できる。更に又トランスジェニックマウス、又は他の哺乳類を使用してヒト化抗体を発現させてよい。そのようなヒト化は部分的又は完全であってよい。ヒト化抗体はヒト抗体における非相同（種間）の配列の使用を最小限にし、そして治療対象において免疫応答を誘発する可能性が低い。本発明で使用するためのヒト化抗体は特定の実施形態においてはＥ４６．４（ｈｕＣＢＥ１１：ＡＴＣＣ特許寄託名称ＰＴＡ−３３５７）又は細胞系Ｅ７７．４（ｈｕＣＢＥ１１：ＡＴＣＣ特許寄託名称３７６５）よりなる群から選択される細胞系により生産されてよい。
【０１２６】
一部の実施形態においては、ヒト化抗体は、ＰＣＴ公開ＷＯ０２／３０９８６及び米国特許出願１０／４１２，４０６にそのヌクレオチド及びアミノ酸配列も含めて記載されているヒト化ＣＢＥ１１（ｈｕＣＢＥ１１）である。別の実施形態においては、ヒト化抗体はＰＣＴ公開ＷＯ／０４００２４３１及び米国特許出願１１／０２１８１９にそのヌクレオチド及びアミノ酸配列も含めて記載されているヒト化ＢＨＡ１０（ｈｕＢＨＡ１０）である。内容が参照により全体が本明細書に組み込まれる上記した出願人の出願は癌の細胞死をトリガーするためにｈｕＣＢＥ１１及びｈｕＢＨＡ１０を使用した癌の治療のための方法及び組成物を記載している。
【０１２７】
別の実施形態においては、動物の結合分子由来の抗原結合ドメインがヒト定常ドメインに連結されている「キメラ」結合分子を構築できる（例えばＣａｂｉｌｌｙ等、米国特許４，８１６，５６７；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１，ｐｐ．６８５１−５５（１９８４））。キメラ結合分子はヒトの臨床治療に用いられる場合に動物抗体により誘発される観察される免疫原性応答を低減する。組み換え抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子の異なるクラスの構築も又、抗ＬＴ−β−Ｒ可変ドメイン及び免疫グロブリンの異なるクラスから単離されたヒト定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）を含むキメラ又はヒト化結合分子を作成することにより行うことができる。例えば増大した抗原結合部位の価数を有する抗ＬＴ−β−ＲＩｇＭ結合分子はヒトμ鎖定常領域を担持したベクター内に抗原結合部位をクローニングすることにより組み換え生産することができる（Ａｒｕｌａｎａｎｄａｍ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７７，ｐｐ．１４３９−５０（１９９３）；Ｌａｎｅ等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２２，ｐｐ．２５７３−７８（１９９３）；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ，３３９，ｐｐ．６８−７０（１９８９））。更に又、標準的な組み換えＤＮＡ手法を使用しながら、組み換え結合分子のその抗原との結合親和性の改変を、抗原結合部位の近接部におけるアミノ酸残基の改変により行うことができる。例えばＱｕｅｅｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６，ｐｐ．１００２９−３３（１９８９）；ＷＯ９４／０４６７９を参照できる。
【０１２８】
本発明の抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子は又修飾された結合分子であってよい。例示的な修飾された結合分子は、例えばミニボディー、ダイアボディー、ＣＨ３分子に融合されたダイアボディー、４価の抗体、イントラダイアボディー（例えばＪｅｎｄｒｅｙｋｏ等、２００３．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：４７８１３）、二重特異性抗体、融合蛋白質（例えば抗体サイトカイン融合蛋白質、Ｆｃ受容体の少なくとも一部分に融合された蛋白質）、二重特異性抗体を包含する。他の免疫グロブリン（Ｉｇ）及びその特定の変異体は例えば米国特許４，７４５，０５５；ＥＰ２５６，６５４；Ｆａｕｌｋｎｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ２９８：２８６（１９８２）；ＥＰ１２０，６９４；ＥＰ１２５，０２３；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１２３：７９３（１９７９）；Ｋｏｈｌｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：２１９７（１９８０）；Ｒａｓｏ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４１：２０７３（１９８１）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：２３９（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：６８５１（１９８４）；ＥＰ２５５，６９４；ＥＰ２６６，６６３；及びＷＯ８８／０３５５９に記載されている。再分類された免疫グロブリン鎖もまた知られている。例えば米国特許４，４４４，８７８；ＷＯ８８／０３５６５；及びＥＰ６８，７６３及びその引用文献を参照できる。
【０１２９】
１つの実施形態において、本発明の抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子は野生型と比較してアミノ酸少なくとも１つの欠失又は置換を有する免疫グロブリン重鎖を含む。例えばＣＨ２ドメインの選択された区域における単一のアミノ酸の１つ以上の突然変異はＦｃ結合を実質的に低減し、これにより腫瘍の局在化を増大させるために十分である場合がある。同様に、モジュレートすべきエフェクター機能（例えば補体結合）を制御する定常領域ドメイン１つ以上のそのような部分を単に欠失させることが望ましい場合がある。定常領域のそのような部分的欠失は抗体の選択された特性（血清中半減期）を向上させつつ、対象定常領域ドメインに関連する他の望ましい機能は未損傷のままとする。従って、１つの実施形態において、本発明の結合分子はＣＨ２ドメインの全て又は部分を欠いている。更に又、本発明の抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子の定常領域は得られるコンストラクトのプロファイルを増強するアミノ酸１つ以上の突然変異又は置換により修飾してよい。この点に関し、保存された結合部位により与えられる活性（例えばＦｃ結合）を途絶しつつ、修飾された結合分子の配置及び免疫原性のプロファイルを実質的に維持することが可能となる。更に別の好ましい実施形態はエフェクター機能のような望ましい特性を増強するため、又はより多くの細胞毒又は炭水化物の結合を可能にするための定常領域へのアミノ酸１つ以上の付加を含む。そのような実施形態においては、選択された定常領域ドメインから誘導された特定の配列を挿入又は複製することが望ましい場合がある。
【０１３０】
別の実施形態において、天然に存在するヒンジ領域に対する突然変異を行うことができる。本発明による定常領域へのそのような修飾は、当該分野で知られている既知の生化学又は分子操作手法を用いて容易に行える。
【０１３１】
１つの実施形態において、本発明の抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子はドメイン１つ以上が部分的又は完全に欠失している修飾された定常領域を含む（「ドメイン欠失抗体」）。特に好ましい実施形態においては、適合する修飾された結合分子はＣＨ２ドメイン全体が除去されているドメイン欠失コンストラクト又は変異体を含むことになる。
【０１３２】
１つの実施形態において、本発明の修飾された結合分子はミニボディーである。ミニボディーは例えば連結ペプチドを介してＣＨ３ドメインに融合されたＶＨドメインにフレキシブルリンカーにより連結されたＶＬドメインのような抗原結合部位１つ以上を含む単一のポリペプチドであるＳｃＦｖ分子を各々含むポリペプチド鎖２つから構成されている２量体分子である。
【０１３３】
ＳｃＦｖ分子はＶＨ−リンカー−ＶＬの方向において、又はＶＬ−リンカー−ＶＨの方向において構築できる。
【０１３４】
抗原結合部位を構成するＶＬ及びＶＨドメインを連結するフレキシブルヒンジは好ましくは約１０〜５０アミノ酸残基を含み、例えばＨｕｓｔｏｎ等、１９８８．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９を参照できる。
【０１３５】
単鎖抗体を作成する方法は当該分野で良く知られており、例えばＨｏ等、１９８９．Ｇｅｎｅ７７：５１；Ｂｉｒｄ等、１９８８  Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３；Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏ等、１９９１．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３０：１０１１７；Ｍｉｌｅｎｉｃ等、１９９１．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５１：６３６３；Ｔａｋｋｉｎｅｎ等、１９９１．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４：８３７を参照できる。
【０１３６】
ミニボディーは当該分野で知られた方法を用いてＳｃＦｖ成分を構築し、そしてペプチド−ＣＨ３成分を連結することにより作成できる（例えば米国特許５，８３７，８２１又はＷＯ９４／０９８１７Ａ１参照）。これらの成分は制限フラグメントとして別個のプラスミドから単離し、そして次に適切なベクター内にライゲーションして再クローニングすることができる。適切な組立物は制限消化及びＤＮＡ配列分析により確認できる。
【０１３７】
別の実施形態においては、４価のミニボディーを構築できる。４価のミニボディーはＳｃＦｖ分子２つをフレキシブルリンカーを用いて連結する以外は、ミニボディーと同様の態様において構築できる。
【０１３８】
別の実施形態において、本発明の修飾された抗体はＣＨ２ドメイン欠失抗体である。ドメイン欠失コンストラクトはＩｇＧ１ヒト定常ドメインをコードするベクター（例えばＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏより入手）から誘導できる（例えばＷＯ０２／０６０９５５Ａ２及びＷＯ０２／０９６９４８Ａ２参照）。
【０１３９】
全定常領域ドメインの欠失のほかに、当然ながら、本発明の抗体は数個のアミノ酸、更には単一のアミノ酸を部分的に欠失又は置換するように操作することができる。例えば、ＣＨ２ドメインの選択された区域の単一のアミノ酸の突然変異はＦｃ結合を実質的に低減し、これにより腫瘍の局在化を増大させるために十分である場合がある。同様に、エフェクター機能（例えば補体Ｃ１Ｑ結合）を制御する定常領域ドメイン１つ以上のそのような部分を単に欠失させることが望ましい場合がある。定常領域のそのような部分的欠失は抗体の選択された特性（血清中半減期）を向上させつつ、対象定常領域ドメインに関連する他の望ましい機能は未損傷のままとする。
【０１４０】
ＣＨ２ドメイン欠失型の創生はオーバーラッピングＰＣＲ突然変異誘発により達成できる。ガンマ１定常ドメインはプラスミドコードＮｈｅＩ部位により開始し、免疫グロブリン配列を有する翻訳読み枠内にある。５’ＰＣＲプライマーはＮｈｅＩ部位並びに直ぐ下流の配列をコードするように構築されている。３’ＰＣＲプライマーメイトはそれが免疫グロブリンヒンジ領域に３’末端でアニーリングし、そしてガンマ１ＣＨ３ドメインの最初の数個のアミノ酸をインフレームにコードするように構築されている。第２のＰＣＲプライマー対はＣＨ３ドメイン内のＢｓｒＧＩ制限部位に渡っている遺伝子座においてアニーリングする５’プライマー及び３’プライマーとしての第１の対（上記）に由来する３’ＰＣＲプライマーのリバース相補体よりなるものとしている。各ＰＣＲ増幅の後、得られた産物をそれぞれＮｈｅＩ及びＢｓｒＧＩの５’及び３’プライマーと共に鋳型として利用している。次に増幅産物をＮ５ＫＧ１に戻しクローニングすることによりプラスミドＮ５ＫＧ１ΔＣＨ２を創生した。この構築により未損傷のＣＨ３ドメインが未損傷ヒンジ領域の直ぐ下流でインフレームに置かれることになる。同様の操作法を用いることにより、ＣＨ３ドメインが連結ペプチドの直ぐ下流にあるドメイン欠失コンストラクトを創生することができる。例えばＣ２Ｂ８抗体のドメイン欠失型は、各々が参照により本明細書に組み込まれる米国特許５，６４８，２６７及び５，７３６，１３７に記載されている態様において創生されている。
【０１４１】
１つの実施形態においては、４価のドメイン欠失抗体は、ＳｃＦｖ分子にドメイン欠失抗体をコードするＤＮＡ配列を組み合わせることにより製造できる。例えば、１つの実施形態においてはこれらの配列を、ＳｃＦｖ分子がフレキシブルリンカーを介してドメイン欠失抗体のＣＨ３ドメインにそのＮ末端において連結されるように組み合わせる。
【０１４２】
別の実施形態においては、４価の抗体は連結ペプチドにＳｃＦｖ分子を融合することにより作成でき、これをＣＨ１ドメインに融合することによりＳｃＦｖ−Ｆａｂ４価分子が構築される（Ｃｏｌｏｍａ及びＭｏｒｒｉｓｏｎ．１９９７．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１５：１５９；ＷＯ９５／０９９１７）。
【０１４３】
別の実施形態においては、本発明の修飾された抗体はダイアボディーである。ダイアボディーはｓｃＦｖ分子と同様であるが、通常は、同じポリペプチド鎖上のＶＬ及びＶＨドメインが相互作用できないように両方のＶドメインを連結している短鎖（１０及び好ましくは１〜５）アミノ酸残基リンカーを有する。むしろ、１つのポリペプチド鎖上のＶＬ及びＶＨドメインは第２のポリペプチド鎖上のＶＨ及びＶＬドメインと（それぞれ）相互作用する（ＷＯ０２／０２７８１）。１つの実施形態において、本発明の結合分子は重鎖部分少なくとも１つに融合したダイアボディーである。好ましい実施形態においては、本発明の結合分子はＣＨ３ドメインに融合したダイアボディーである。
【０１４４】
１つの実施形態において、本発明の修飾された抗体は軽鎖のＮ末端に付加されたｓｃＦｖを有する４価又は二重特異性４価のＣＨ２ドメイン欠失抗体を含む。本発明の別の実施形態においては、結合分子は重鎖のＮ末端に付加されたｓｃＦｖを有する４価又は二重特異性４価のＣＨ２ドメイン欠失抗体を含む。１つの実施形態において、Ｎ末端へのｓｃＦｖの結合はｓｃＦｖがカルボキシ末端において結合している分子と比較して、分子の凝集が低減される。修飾された結合分子の他の形態は本発明の範囲内である（例えばＷＯ  ０２／０２７８１Ａ１；５，９５９，０８３；６，４７６，１９８Ｂ１；ＵＳ２００２／０１０３３４５Ａ１；ＷＯ００／０６６０５；Ｂｙｒｎ等、１９９０．Ｎａｔｕｒｅ．３４４：６６７−７０；Ｃｈａｍｏｗ及びＡｓｈｋｅｎａｚｉ．１９９６．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：５２）。
【０１４５】
更に別の実施形態において、抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子は多価抗ＬＴ−β−Ｒ抗体である。１つの実施形態において、多価抗体はＬＴ−β−Ｒエピトープに対して特異的な抗原認識部位少なくとも１つを含む。特定の実施形態においては、抗原認識部位の少なくとも１つはｓｃＦｖドメイン内に位置し、別の実施形態においては、全ての抗原認識部位がｓｃＦｖドメイン内に位置する。
【０１４６】
結合分子は２価、３価、４価、又は５価であってよい。特定の実施形態においては、結合分子は単一特異性である。１つの実施形態において、結合分子はＣＢＥ１１が結合するエピトープに対して特異的である。別の実施形態においては、本発明の結合分子はＣＢＥ１１抗原認識部位４つを含む単一特異性の４価のＬＴ−β−Ｒアゴニスト抗体である。別の実施形態においては、結合分子はＢＨＡ１０エピトープに対して特異的であり、そして一部の実施形態においては４価である。これらの実施形態の何れかにおいて、抗原認識部位少なくとも１つはｓｃＦｖドメイン上に位置してよく、そしてこれらの実施形態の特定のものにおいては、全ての抗原認識部位がｓｃＦｖドメイン上に位置してよい。結合分子は多重特異性であってよく、ここで、本発明の結合分子はヒトＬＴ−β受容体上の異なるエピトープに結合する。
【０１４７】
特定の実施形態においては、抗ＬＴ−β−Ｒ多価結合分子は多重特異性であってよく、即ち、ＬＴ−β−Ｒ又はＬＴ−β−Ｒのエピトープに結合する結合部位少なくとも１つ、及び、第２の異なる分子に、又はＬＴ−β−Ｒの第２の異なるエピトープに結合する第２の結合部位少なくとも１つを有する。
【０１４８】
多価の多重特異性の結合分子は可変領域２つ以上を含む重鎖及び／又は可変領域１つ以上を含む軽鎖を含有してよく、ここで、可変領域の少なくとも２つはＬＴ−ベータ受容体上の異なるエピトープを認識する。
【０１４９】
１つの実施形態において、多価結合分子はリンホトキシン−ベータ受容体のアゴニストであり、そして、受容体に結合してＬＴ−β−Ｒシグナリングを誘導することができるドメイン少なくとも２つを含む。これらのコンストラクトはＬＴ−ベータ受容体への結合に関して特異的な抗原認識部位を含む可変領域２つ以上を含有する重鎖、及び、可変領域１つ以上を含有する軽鎖を包含することができ、或いは、ＬＴ−ベータ受容体の結合のために特異的なＣＤＲを含む可変領域２つ以上を含有する重鎖又は軽鎖のみを含むように構築することができる。
【０１５０】
本発明の特定の実施形態においては、結合分子は以下の抗体：ＢＫＡ１１、ＣＤＨ１０、ＢＣＧ６、ＡＧＨ１、ＢＤＡ８、ＣＢＥ１１及びＢＨＡ１０の１つが結合するエピトープよりなるリンホトキシンベータ受容体（ＬＴ−β−Ｒ）エピトープの群のメンバー少なくとも２つに対して特異的である。１つの実施形態において、結合分子はＣＢＥ１１及びＢＨＡ１０抗体が結合するエピトープに対して特異的であり、そして特定の実施形態においては、４価である。１つの実施形態において、結合分子は２つのＣＢＥ１１特異的抗原認識部位及び２つのＢＨＡ１０特異的認識部位を有し、ここで、結合分子は二重特異性の４価のＬＴ−β−Ｒアゴニスト結合分子である。多重特異性結合分子の何れかにおいて、少なくとも１つの抗原認識部位はｓｃＦｖドメイン上に位置してよく、そして特定の実施形態においては、全ての抗原認識部位がｓｃＦｖドメイン上に位置する。
【０１５１】
特定の実施形態においては、結合分子は二重特異性である。二重特異性分子は例えば同じ標的分子上、又は異なる標的分子上の２つの異なる標的部位に結合できる。例えば抗体の場合、二重特異性分子は例えば同じ抗原上、又は２つの異なる抗原上の２つの異なるエピトープに結合できる。二重特異性分子は又、例えば細胞毒性を特定の標的に施行させることにより、（例えば病原体又は腫瘍細胞に、そして細胞毒性トリガー分子、例えばＴ細胞受容体又はＦｃγ受容体に結合することにより）ヒトの治療のために使用できる。二重特異性抗体は又、例えば線維溶解剤又はワクチンアジュバントとしても使用できる。
【０１５２】
１つの実施形態において、本発明の二重特異性結合分子はＬＴ−β−Ｒに対して指向されたアーム部（即ち結合部位）少なくとも１つ、及び細胞表面分子又は可溶性分子に対して指向されたアーム部少なくとも１つを包含する。例示的な細胞表面分子は腫瘍又は新生物細胞の表面上に過剰発現される受容体又は腫瘍細胞抗原を包含する。例示的な可溶性分子は抗腫瘍剤（例えば毒素、化学療法剤、及びそれらのプロドラッグ）、及び可溶性酵素（例えばプロドラッグ変換酵素）を包含する。
【０１５３】
１つの実施形態において、本発明の二重特異性結合分子が結合する可溶性分子は、ＴＮＦファミリーの可溶性リガンドである。ＴＮＦファミリーリガンドの例は限定しないが、ＬＴＡ（ＴＮＦＲ１／ＴＮＦＲＳＦ１Ａに結合）、ＴＮＦ（ＣＤ１２０ｂ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂに結合）、ＬＴＢ（ＬＴＢＲ／ＴＮＦＲＳＦ３に結合）、ＯＸ４０Ｌ（ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４に結合）、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５に結合）、（Ｆａｓ／ＴＮＦＲＳＦ６及びＤｃＲ３／ＴＮＦＲＳＦ６Ｂに結合）、ＣＤ２７Ｌ（ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７に結合）、ＣＤ３０Ｌ（ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８に結合）、４−１−ＢＢ−Ｌ（４−１−ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９に結合）、ＴＲＡＩＬ（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１／ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、及びＴＲＡＩＬ−Ｒ４／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄに結合）、ＲＡＮＫＬ（ＲＡＮＫ／ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ及びＯｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｒｉｎ／ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂに結合）、ＡＰＯ−３Ｌ（ＡＰＯ−３／ＴＮＦＲＳＦ１２及びＤＲ３Ｌ／ＴＮＦＲＳＦ１２Ｌに結合）、ＡＰＲＩＬ（ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂに結合）、ＢＡＦＦ（ＢＡＦＦＲ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ａに結合）、ＬＩＧＨＴ（ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４に結合）、ＮＧＦリガンド（ＬＮＧＦＲ、例えばＮＧＦ−β、ＮＧＦ−２／ＮＴＦ３、ＮＴＦ５、ＢＤＮＦ、ＩＦＲＤ１に結合）、ＧＩＴＲＬ（ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８に結合）、ＥＤＡＲ１＆ＸＥＤＡＲリガンド、Ｆｎ１４リガンド、及びＴｒｏｙ／Ｔｒａｄｅリガンドを包含する。
【０１５４】
別の実施形態においては、本発明の二重特異性結合分子が結合する可溶性分子はＴＮＦファミリーの受容体、即ちＬＴ−β−Ｒ以外のＴＮＦ受容体である。単一特異性ＴＮＦＲ結合分子を用いた腫瘍の治療における制限因子は腫瘍のサブセットのみがこの治療薬に感受性であると考えられる点である。二重特異性ＴＮＦＲ結合分子はＴＮＦＲを特異的に活性化し、そして、例えば１つより多くのＴＮＦＲ又はＴＮＦＲ型をターゲティングしてシグナリングを増強できるような近接部にまでＴＮＦＲを運搬することにより受容体シグナリングを増強し、これにより癌の治療の進歩した方法を与える。１つの実施形態において、二重特異性ＴＮＦＲ結合分子は同じ型のＴＮＦＲ２つ以上に結合し、集合するＴＮＦＲの数を増大させることによりシグナル強度を増大させる。別のより好ましい実施形態においては、二重特異性ＴＮＦＲ結合分子はＴＮＦファミリーの２つの異なる受容体に結合することができる。
【０１５５】
１つの実施形態において、二重特異性結合分子が結合するＴＮＦＲはデスドメインを含有する。「デスドメイン」という用語はＴＮＦファミリー受容体の細胞質領域を指し、これはＴＮＦ媒介細胞死又はアポトーシスのシグナリング及びこれらの受容体により媒介される細胞毒性の誘導に関与している。この領域はアダプター蛋白質を介したカスパーゼの活性化に受容体をカップリングさせることにより、外因性の死滅経路を活性化する。
【０１５６】
デスドメインを含有するＴＮＦ受容体の例は、限定しないが、ＴＮＦＲ１（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ）、Ｆａｓ（ＴＮＦＲＳＦ６）、ＤＲ−３（ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ）、ＬＮＧＦＲ（ＴＮＦＲＳＦ１６）ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ）、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ）及びＤＲ６（ＴＮＦＲＳＦ２１）を包含する。これらの受容体のアポトーシスシグナリングは同族体リガンドの結合及び以下の受容体−リガンド対：ＴＮＦＲ１／ＴＮＦα、Ｆａｓ／ＦａｓＬ、ＤＲ−３／ＤＲ−３ＬＧ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１／ＴＲＡＩＬ、又はＴＲＡＩＬ−Ｒ２／ＴＲＡＩＬ何れかの形成によりモジュレートされる。
【０１５７】
デスドメインを含有するＴＮＦファミリー受容体をターゲティングする二重特異性結合分子は、この型のＴＮＦＲが腫瘍細胞上で過剰発現される場合が多く、そして受容体の刺激が腫瘍細胞アポトーシスを活性化できることから、癌の治療のために有用である。好ましい実施形態においては、本発明の二重特異性結合分子が結合するＴＮＦＲを含有するデスドメインはＴＲＡＩＬ−Ｒ２である。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２は、その活性化が肝細胞のアポトーシスをトリガーせず、従って低減された毒性を有するはずであることから、ヒトの腫瘍の治療のために好ましい。
【０１５８】
デスドメイン含有受容体、例えばＴＮＦＲ１又はＦａｓの一部の活性化はインビボの用途においては毒性であったが、これらの受容体を他のＴＮＦ受容体に係留させることは毒性を減衰させ、そしてこれにより毒性の抗体をより低毒性とすると考えられる。
【０１５９】
デスドメイン含有ＴＮＦ受容体に対しては多くの抗体が形成されており、当該分野で良く知られている。そのような抗体は抗ＴＮＦ−Ｒ１モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ抗ＴＮＦ−Ｒ１；ＴｕｌａｒｉｋｍＡｂ＃９８５、米国特許６，１１０，６９０；６，４３７，１１３），抗Ｆａｓ受容体ｍＡｂＣＨ−１１（米国特許６，３１２，６９１；ＷＯ９５／１０５４０）、抗ＤＲ３抗体（米国特許５，９８５，５４７；Ｊｏｈｎｓｏｎ等（１９８４）ＩｍｍｕｎｏＢｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＨＬＡ，編集Ｄｕｐｏｎｔ、Ｂ．Ｏ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；米国特許６，４６２，１７６；６，４６９，１６６）、及び抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ抗体（米国特許５，７６３，２２３；６，０７２，０４７；６，２８４，２３６；６，５２１，２２８；６，５６９，６４２；６，６４２，３５８；及び米国特許６，４１７，３２８）を包含する。
【０１６０】
腫瘍形成において役割を有する他の標的ＴＮＦファミリー受容体は種々の腫瘍上に存在するか、又は理想的に過剰発現されるＴＮＦファミリー受容体を定義することを可能にする種々の細胞型における受容体の発現の既存のＲＮＡデータベースを用いて発見できる。更に又、既存のＲＮＡデータベースは本発明の二重特異性ＴＮＦＲ結合分子が結合するＴＮＦファミリー受容体の対は、腫瘍の型又は腫瘍のサブセット上でよりユニークに発現されるが、正常組織、特に肝臓及び脈管上には豊富ではない受容体対を発見することにより最適化され得るという点において追加的利点を与える。そのような態様において、腫瘍には強力なシグナルを送達し、正常組織には影響しない受容体対（又はそれ以上のもの）が発見される。
【０１６１】
本発明の多重特異性結合分子は各特異性に関して１価、又は各特異性に対して多価であってよい。１つの実施形態において、本発明の二重特異性結合分子は第１の標的分子、即ちＬＴ−β−Ｒと反応する結合部位１つ、及び、第２の標的分子と反応する結合部位１つを含んでよい（例えば二重特異性抗体分子、融合蛋白質、又はミニボディー）。別の実施形態においては、本発明の二重特異性結合分子は第１の標的分子、即ちＬＴ−β−Ｒと反応する結合部位２つ、及び、第２の標的分子と反応する結合部位２つを含んでよい（例えば二重特異性ｓｃＦｖ２の４価抗体、４価ミニボディー、又はダイアボディー）。
【０１６２】
１つの実施形態において、本発明の多重特異性結合分子の結合部位の少なくとも１つは抗ＬＴ−β−Ｒ抗体又はその抗原結合フラグメントの抗原結合領域である。
【０１６３】
別の実施形態において、多重特異性結合分子の結合部位の少なくとも１つは単鎖Ｆｖフラグメントである。１つの実施形態において、本発明の多重特異性結合分子は第１の標的分子、即ちＬＴ−β−Ｒに指向されたｓｃＦｖフラグメントを含有するアーム部１つ、及び、第２の標的分子に指向されたｓｃＦｖを含有する第２のアーム部を有する２価のミニボディーである。
【０１６４】
別の実施形態において、本発明の多重特異性結合分子はｓｃＦｖ４価ミニボディーであり、ｓｃＦｖ４価ミニボディーの各重鎖部分は第１及び第２のｓｃＦｖフラグメントを含有する。該第２のｓｃＦｖフラグメントは第１のｓｃＦｖフラグメントのＮ末端に連結していてよい（例えば二重特異性ＮＨｓｃＦｖ４価ミニボディー又は二重特異性ＮＬｓｃＦｖ４価ミニボディー）。或いは、第２のｓｃＦｖフラグメントは該第１のｓｃＦｖフラグメントを含有する該重鎖の部分のＣ末端に連結してよい（例えば二重特異性Ｃ−ｓｃＦｖ４価ミニボディー）。１つの実施形態において、第１及び第２のｓｃＦｖフラグメントは同じかまたは異なる標的分子に結合してよい。二重特異性４価ミニボディーの第１の重鎖部分の第１及び第２のｓｃＦｖフラグメントが同じ標的分子に結合する場合、二重特異性４価ミニボディーの第２の重鎖部分の第１及び第２のｓｃＦｖフラグメントの少なくとも１つは異なる標的分子に結合する。
【０１６５】
別の実施形態において、本発明の多重特異性結合分子は二重特異性ダイアボディーであり、ダイアボディーの各アーム部は縦列のｓｃＦｖフラグメントを含んでいる。１つの実施形態において、二重特異性ダイアボディーは第１の結合特異性を有する第１のアーム部及び第２の結合特異性を有する第２のアーム部を含んでよい。別の実施形態において、ダイアボディーの各アーム部は第１の結合特異性を有する第１のｓｃＦｖフラグメント及び第２の結合特異性を有する第２のｓｃＦｖフラグメントを含んでよい。
【０１６６】
別の実施形態において、本発明の多重特異性結合分子はｓｃＦｖ２の４価抗体であり、ｓｃＦｖ２の４価抗体の各重鎖部分はｓｃＦｖフラグメントを含有する。ｓｃＦｖフラグメントは重鎖部分の可変領域のＮ末端に連結してよい（例えば二重特異性ＮＨｓｃＦｖ２の４価抗体又は二重特異性ＮＬｓｃＦｖ２の４価抗体）。或いは、ｓｃＦｖフラグメントはｓｃＦｖ２の４価抗体の重鎖部分のＣ末端に連結してよい（例えば二重特異性Ｃ−ｓｃＦｖ２の４価抗体）。ｓｃＦｖ２の４価抗体又の各重鎖部分は同じか又は異なる標的分子に結合する可変領域及びｓｃＦｖフラグメントを有してよい。二重特異性ｓｃＦｖ２の４価抗体の第１の重鎖部分のｓｃＦｖフラグメント及び可変領域が同じ標的分子に結合する場合、二重特異性４価ミニボディーの第２の重鎖部分の第１及び第２のｓｃＦｖフラグメントの少なくとも１つは異なる標的分子に結合する。
【０１６７】
別の実施形態においては、本発明の多重特異性結合分子はｓｃＦｖ２の４価ドメイン欠失抗体であり、ｓｃＦｖ２の４価抗体の各重鎖部分はｓｃＦｖフラグメントを含有している。ｓｃＦｖフラグメントは重鎖部分の可変領域のＮ末端に連結されていてよい（例えば二重特異性ＮＨｓｃＦｖ２の４価ドメイン欠失抗体又は二重特異性ＮＬｓｃＦｖ２の４価抗体）。或いは、ｓｃＦｖフラグメントはｓｃＦｖ２の４価抗体の重鎖部分のＣ末端に連結してよい（例えば二重特異性Ｃ−ｓｃＦｖ２の４価抗体）。
【０１６８】
多価の多重特異性抗体を作成するための方法は当業者の知る通りである。完全長二重特異性抗体の伝統的製造は２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づいており、その場合、２つの鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ等、Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のランダムな分類のために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内僅か１つのみが正しい二重特異性構造を有する。通常はアフィニティークロマトグラフィーにより行われる正しい分子の精製は面倒であり、そして生成物の収率は低い。同様の操作法はＷＯ９３／０８８２９及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ等、ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：３６５５−３６５９（１９９１）において開示されている。
【０１６９】
多価の抗ＬＴ−β−Ｒ抗体はネズミ又はヒト化ＢＨＡ１０（Ｂｒｏｗｎｉｎｇ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：３３（１９９５）；Ｂｒｏｗｎｉｎｇ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：８６７（１９９６））及び／又はネズミ又はヒト化ＣＢＥ１１（米国特許６，３１２，６９１）を包含する親抗ＬＴ−β−Ｒ抗体から誘導された種々の異なる配列を用いて、種々の異なる方法において構築してよい。
【０１７０】
二重特異性分子を製造する方法は当該分野で良く知られている。例えば組み換え手法を用いて二重特異性分子、例えばダイアボディー、単鎖ダイアボディー、縦列ｓｃＦｖ等を製造できる。二重特異性分子を製造するための例示的な方法は当該分野で知られている（例えばＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．２４８：Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｐｐ２２７−２４２  ＵＳ２００３／０２０７３４６Ａ１及びその引用文献）。１つの実施形態において、多量体二重特異性分子はＵＳ２００３／０２０７３４６Ａ１又は米国特許５，８２１，３３３又はＵＳ２００４／００５８４００に記載のもののような方法を用いて製造される。
【０１７１】
別の実施形態において、本発明の多重特異性結合分子は多重特異性融合蛋白質である。本明細書においては、「多重特異性融合蛋白質」という表現は少なくとも２つの結合特異性を有する、即ち２つ以上の結合ドメインを組み合わせた融合蛋白質を指す。多重特異性融合蛋白質は、本質的にはＷＯ８９／０２９２２（１９８９年４月６日公開）、ＥＰ３１４，３１７（１９８９年５月３日公開）、及び１９９２年５発２日発行の米国特許５，１１６，９６４に開示されている通りヘテロ２量体、ヘテロ３量体、又はヘテロ４量体として組み立てることができる。好ましい多重特異性融合蛋白質は二重特異性である。
【０１７２】
１つの実施形態において、要件となる二重特異性分子は抗体分子を発現するために使用される発現系、例えば哺乳類細胞、酵母、例えばＰｉｃｃｈｉａ、Ｅ．ｃｏｌｉ、バキュロウィルスなどにおいて発現される。１つの実施形態において、要件となる二重特異性分子はＮＥＯＳＰＬＡベクター系において発現される（例えば米国特許６，１５９，７３０参照）。このベクターはサイトメガロウィルスのプロモーター／エンハンサー、マウスベータグロビン主要プロモーター、ＳＶ４０複製起点、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼエクソン１及びエクソン２、ジヒドロホレート還元酵素遺伝子及びリーダー配列を含有する。
【０１７３】
種々の他の多価の抗体コンストラクトが類型的な組み換えＤＮＡ手法、例えばＰＣＴ国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；欧州特許出願１８４，１８７；欧州特許出願１７１，４９６；欧州特許出願１７３，４９４；ＰＣＴ国際特許公開ＷＯ８６／０１５３３；米国特許４，８１６，５６７；欧州特許出願１２５，０２３；Ｂｅｔｔｅｒ等（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕ等（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕ等（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎ等（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ等（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄ等（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６−４４９；Ｓｈａｗ等（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉ等（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４；米国特許５，２２５，５３９；Ｊｏｎｅｓ等（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ等（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：１５３４；Ｂｅｉｄｌｅｒ等（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０；及びＷｉｎｔｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３４９，ｐｐ．２９３−９９（１９９１）に記載されているものを用いて当業者により開発されてよい。好ましくは、非ヒト抗体は非ヒト抗原結合ドメインをヒト定常ドメインと連結することにより「ヒト化」される（例えばＣａｂｉｌｌｙ等、米国特許４，８１６，５６７；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１，ｐｐ．６８５１−５５（１９８４））。
【０１７４】
多価抗体コンストラクトを製造するために使用してよい他の方法は以下の公開物：Ｇｈｅｔｉｅ，Ｍａｒｉａ−Ａｎａ等（２００１）Ｂｌｏｏｄ  ９７：１３９２−１３９８；Ｗｏｌｆｆ，Ｅｄｉｔｈ  Ａ．等（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：２５６０−２５６５；Ｇｈｅｔｉｅ，Ｍａｒｉａ−Ａｎａ等（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：７５０９−７５１４；Ｋｉｍ，Ｊ．Ｃ．等（２００２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ９７（４）：５４２−５４７；Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋａ，Ａｎｅｔａ等（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８：４７−６６；Ｃｏｌｏｍａ  Ｍ．Ｊ．等（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：１５９−１６３；Ｚｕｏ，Ｚｈｕａｎｇ等（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｓｕｐｐｌ．）１３（５）：３６１−３６７；Ｓａｎｔｏｓ  Ａ．Ｄ．，等（１９９９）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５：３１１８ｓ−３１２３ｓ；Ｐｒｅｓｔａ，Ｌｅｏｎａｒｄ  Ｇ．（２００２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３：２３７−２５６；ｖａｎ  Ｓｐｒｉｅｌ，Ａｎｎｅｍｉｅｋ等（２０００）Ｒｅｖｉｅｗ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ２１（８）３９１−３９７に記載されている。
【０１７５】
一部の実施形態においては、本発明の結合分子及び結合分子フラグメントは所望の作用を与えるために化学的に修飾してよい。例えば、本発明の抗体及び抗体フラグメントのＰＥＧ化は、例えば以下の参考文献：Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ３：４−１０（１９９２）；ＥＰ０１５４３１６；及びＥＰ０４０１３８４（これらの各々は参照により全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているような、当該分野で知られたＰＥＧ化反応の何れかにより実施してよい。好ましくは、ＰＥＧ化は反応性のポリエチレングリコール分子（又は類似の反応性の水溶性重合体）を用いたアシル化反応又はアルキル化反応を介して実施される。本発明の結合分子及び結合分子フラグメントのＰＥＧ化のための好ましい水溶性重合体はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。本明細書においては、「ポリエチレングリコール」とはモノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ又はアリールオキシ−ポリエチレングリコールのような他の蛋白質を誘導体化するために使用されているＰＥＧの形態の何れかを包含する意味を有する。
【０１７６】
本発明のＰＥＧ化結合分子及び結合分子フラグメントを製造するための方法は一般的に（ａ）結合分子又は結合分子フラグメントがＰＥＧ基１つ以上に結合されるような条件下でＰＥＧの反応性エステル又はアルデヒド誘導体のようなポリエチレングリコールに結合分子又は結合分子フラグメントを反応させること、及び（ｂ）反応産物を得ること、という工程を含むことになる。既知のパラメーター及び所望の結果に基づいて最適な反応条件又はアシル化反応を選択することは当業者の知る通りである。
【０１７７】
ＰＥＧ化結合分子及び結合分子フラグメントは一般的に本明細書に記載する結合分子及び結合分子フラグメントの投与により軽減又は調整される可能性のある状態を治療するために使用してよい。一般的に、ＰＥＧ化結合分子及び結合分子フラグメントは非ＰＥＧ化の結合分子及び結合分子フラグメントと比較して増大した半減期を有する。ＰＥＧ化結合分子及び結合分子フラグメントは単独で、合同で、又は他の医薬組成物と組み合わせて使用してよい。
【０１７８】
本発明の別の実施形態において、結合分子又はその抗原結合フラグメントは当該分野で知られた手法を用いてアルブミンにコンジュゲートされる。
【０１７９】
本発明の別の実施形態においては、結合分子又はそのフラグメントは潜在的なグリコシル化部位を低減又は排除するために修飾される。そのような修飾された抗体は頻繁には「アグリコシル化」結合分子と称される。結合分子又はその抗原結合フラグメントの結合親和性を向上させるためには結合分子のグリコシル化部位を例えば突然変異誘発（例えば部位指向性突然変異誘発）により改変することができる。「グリコシル化部位」とは糖残基の結合のための位置として真核生物細胞により認識されるアミノ酸残基を指す。炭水化物、例えばオリゴ糖が結合しているアミノ酸は典型的にはアスパラギン（Ｎ連結部）、セリン（Ｏ連結部）、及びスレオニン（Ｏ連結部）の残基である。結合分子又は抗原結合フラグメント内部の潜在的グリコシル化部位を発見するためには、結合分子の配列を例えば、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｎ連結グリコシル化部位に関してはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＮＧｌｙｃ／参照）及びＯ連結グリコシル化部位に関してはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＯＧｌｙｃ／参照）により提供されるウエブサイトのような公的に使用できるデータベースを用いて調べる。結合分子のグリコシル化部位を改変するための追加的方法は米国特許６，３５０，８６１及び５，７１４，３５０に記載されている。
【０１８０】
本発明の更に別の実施形態において、結合分子又はその抗原結合フラグメントは、未修飾の結合分子と相対比較して少なくとも１つの定常領域媒介生物学的エフェクター機能が低減されるように結合分子の定常領域が修飾されるように改変できる。本発明の結合分子をそれがＦｃ受容体（ＦｃＲ）に対して低減された結合を示すように修飾するためには、結合分子の免疫グロブリン定常領域セグメントをＦｃＲ相互作用のために必要な特定の領域において突然変異させることができる（例えばＣａｎｆｉｅｌｄ等（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１４８３；及びＬｕｎｄ，Ｊ．等（１９９１）Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：２６５７参照）。結合分子のＦｃＲ結合能力の低減は又、ＦｃＲ相互作用に依存している他のエフェクター機能、例えばオプソニン作用及び貪食作用及び抗原依存性細胞性細胞毒性も低減する場合がある。
【０１８１】
特定の実施形態においては、本発明は更に、例えばエフェクター細胞上の補体又は受容体のようなエフェクター分子に結合する能力のようなエフェクター機能の改変された結合分子を特徴とする。特に本発明のヒト化結合分子は改変された定常領域、例えばＦｃ領域の少なくとも１つのアミノ酸残基が異なる残基又は側鎖により置き換えられていることにより結合分子のＦｃＲに結合する能力が低減されているＦｃ領域を有している。結合分子のＦｃＲ結合能力の低減は又、ＦｃＲ相互作用に依存している他のエフェクター機能、例えばオプソニン作用及び貪食作用及び抗原依存性細胞性細胞毒性も低減する場合がある。１つの実施形態において、修飾されたヒト化結合分子はＩｇＧクラスのものであり、ヒト化結合分子が例えば未修飾のヒト化結合分子と比較して改変されたエフェクター機能を有するようにＦｃ領域における少なくとも１つアミノ酸残基の置き換えを含む。特定の実施形態においては、本発明のヒト化結合分子は、それが低免疫原性となるように（例えば望ましくないエフェクター細胞活性、溶解、又は補体結合を惹起しないように）、及び／又はＬＴ−β−Ｒ又はそのリガンドに対する特異性を保持しつつより望ましい半減期を有するように改変されたエフェクター機能を有する。
【０１８２】
或いは、本発明はＦｃＲ結合、例えばＦｃγＲ３結合を増強するように改変された定常領域を有するヒト化結合分子を特徴とする。そのような結合分子はエフェクター細胞機能を調製するため、例えばＡＤＣＣ活性を増大するため、例えば特に本発明の腫瘍学的用途における使用のために有用である。
【０１８３】
本明細書においては、「抗体依存性細胞媒介性細胞毒性」及び「ＡＤＣＣ」とは、ＦｃＲを発現する非特異的細胞毒性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が標的細胞上の結合した結合分子を認識し、そして後に標的細胞の溶解を誘発する細胞媒介性の反応を指す。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球は例えば結合分子と他の薬剤又は結合分子のコンジュゲートのような抗体のＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。
【０１８４】
更に別の実施形態において、本発明の抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子又は生物学的薬剤は本発明の方法における使用のための化学療法剤又は毒素にコンジュゲートできる。本発明の抗体にコンジュゲートできる化学療法剤の例は限定しないが、ラジオコンジュゲートを包含する（９０Ｙ、１３１Ｉ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１８６Ｒｈ等）。
【０１８５】
腫瘍上のＬＴ−β−Ｒ結合分子の細胞毒性作用はＬＴ−β−Ｒ活性化剤、特にＩＦＮガンマの存在により増強してよい。インターフェロン、好ましくはＩＦＮガンマを誘導することができ、そして腫瘍細胞上のＬＴ−アルファ／ベータヘテロマー複合体及び抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子の細胞毒性作用を強化する何れかの薬剤は、ＬＴ−β−Ｒ結合分子のグループに属する。例えば、臨床試験により２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）投与によるインターフェロンの誘導が明らかにされている。従ってポリリボグアニル／ポリリボシチジル酸（ポリ−ｒＧ／ｒＣ）及び他の形態のｄｓＲＮＡはインターフェロン誘導物質として有効である（Ｊｕｒａｓｋｏｖａ等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２２１，ｐｐ．１０７−１１（１９９２））。
【０１８６】
上記した通り製造されたＬＴ−β−Ｒ結合分子は医薬組成物としての使用のために適当な純度にまで精製してよい。一般的に精製された組成物は組成物中に存在する全ての物質種の約８５％超、存在する全ての物質種の約８５％超、９０％超、９５％超、９９％超、又はそれより高値に相当する１つの物質種を有することになる。対象となる物質種は組成物が単一の物質種より本質的になるような本質的均質性（従来の検出方法によっては組成物中に夾雑物質種が検出できない）にまで精製してよい。当業者は本明細書の教示を鑑みながら蛋白質の精製のための標準的な手法を用いて本発明のポリペプチドを精製してよい。ポリペプチドの純度は当業者に知られた多くの方法、例えばアミノ末端アミノ酸配列分析、ゲル電気泳動、及び質量スペクトル分析により測定してよい。
【０１８７】
３．生物学的薬剤
生物学的薬剤（生物学的物質とも称する）は生物学的な系、例えば生物、細胞、又は組み換え系の産物である。そのような生物学的薬剤の例は核酸分子、例えばアンチセンス核酸分子、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、抗体、例えばモノクローナル抗体、及びサイトカインを包含する。例示的な生物学的薬剤を以下により詳細に考察する。
【０１８８】
インターフェロン（ＩＦＮ）は身体内に天然に存在する型の生物学的薬剤である。インターフェロンは実験室においても生産され、そして生物学的治療において癌患者に投与されている。それらは癌患者の免疫系が癌細胞に対抗して作用する態様を向上させることが分かっている。インターフェロンは癌細胞に直接作用することにより、その生育を遅らせる場合があり、或いは、それらは癌細胞をより正常な挙動を示す細胞に変化させる場合もある。一部のインターフェロンは又、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞、及びマクロファージ、即ち癌細胞と戦うことを支援する血流中の白血球の型も刺激する場合がある。
【０１８９】
インターロイキン（ＩＬ）は多くの免疫細胞の生育及び活性を刺激する。それらは身体内に天然に存在するが、実験室において作成することもできる蛋白質（サイトカイン及びケモカイン）である。一部のインターロイキンは免疫細胞、例えば癌細胞を破壊するために作用するリンパ球の生育及び活性を刺激する。
【０１９０】
コロニー刺激因子（ＣＳＦ）は骨髄内の幹細胞により多くの血球を生産させるために患者に投与される蛋白質である。身体は常時新しい白血球、赤血球、及び血小板を、特に癌が存在する場合に、必要としている。ＣＳＦは化学療法剤とともに投与されることにより免疫系のブーストを支援している。癌患者が化学療法剤を投与されると、新しい血球を生産する骨髄の能力が抑制され、患者はより感染症を発症しやすくなる。免疫系の一部は血球非存在下では機能することができず、従ってコロニー刺激因子が骨髄幹細胞に白血球、血小板、及び赤血球を生産させている。適切な細胞生産があれば、他の癌治療を継続することができ、より高用量の化学療法剤を安全に患者に投与できるようになる。
【０１９１】
抗体、例えばモノクローナル抗体は、癌細胞に結合する実験室において製造される薬剤である。癌破壊剤が身体内に導入されると、それらは抗体を発見し、癌細胞を殺傷する。モノクローナル抗体剤は健康な細胞は破壊しない。モノクローナル抗体は種々の機序を介してその治療作用を達成する。それらはアポトーシス又はプログラムされた細胞死をもたらすことにおいて直接の作用を有することができる。それらは成長因子受容体をブロックすることができ、腫瘍細胞の増殖を効果的に停止させる。モノクローナル抗体を発現する細胞においては、それらは抗イディオタイプ抗体形成をもたらすことができる。
【０１９２】
本発明の複合投与において使用してよい抗体の例は抗ＣＤ２０抗体、例えば限定しないが、セツキシマブ、トシツモマブ、リツキシマブ、及びイブリツモマブを包含する。抗ＨＥＲ２抗体もまた癌の治療のために抗ＬＴ−β−Ｒ抗体と組み合わせて使用してよい。１つの実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体はトラスツズマブ（ヘルセプチン）である。癌の治療のために抗ＬＴ−β−Ｒ抗体と組み合わせて使用してよい抗体の別の例は、抗ＣＤ５２抗体（例えばアレルムツズマブ）、抗ＣＤ２２抗体（例えばエプラツズマブ）、及び抗ＣＤ３３抗体（例えばゲムツズマブオゾガマイシン）を包含する。特定の実施形態においては、生物学的薬剤は血管形成を抑制する抗体であり、抗ＶＥＧＦ抗体、例えばベバシツマブである。他の実施形態においては、生物学的薬剤は抗ＥＧＦＲ抗体である抗体、例えばセツキシマブである。別の例は抗糖蛋白質１７−１Ａ抗体エドレコロマブである。
【０１９３】
サイトカイン治療は対象の免疫系が癌性である細胞を認識して破壊することを支援するために蛋白（サイトカイン）を使用する。サイトカインは免疫系により身体内で天然に生産されるが、実験室で製造することもできる。この療法は進行した黒色腫において、及び、アジュバント療法において使用される（治療薬は主要な癌治療の後に、又はそれに追加的に与えられる）。サイトカイン療法は身体の全ての部分に到達して癌細胞を殺傷し、腫瘍の生育を防止する。
【０１９４】
融合蛋白質も使用してよい。例えば、組み換えヒトＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を複合療法において使用してよい。Ａｐｏ２／ＴＲＡＩＬはアポトーシス（プログラムされた細胞死）の調節に関与しているプロアポトーシス受容体ＤＲ４及びＤＲ５の両方を活性化するために設計された最初の二元的なプロアポトーシス受容体アゴニストである。
【０１９５】
アンチセンス核酸分子もまた本発明の方法において使用してよい。本明細書においては、「アンチセンス」核酸は例えば２本鎖ｃＤＮＡ分子のコーディング鎖に相補、ｍＲＮＡ配列に相補であるか、又は遺伝子のコーディング鎖に相補である蛋白質をコードする「センス」核酸に相補なヌクレオチド配列を含む。従って、アンチセンス核酸はセンス核酸に水素結合できる。
【０１９６】
１つの実施形態において、生物学的薬剤は例えばｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ及びＥＧＦＲのような血管形成を増強する分子のｓｉＲＮＡ分子である。１つの実施形態において、血管形成を抑制する生物学的薬剤はＲＮＡｉを媒介する。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は転写後のターゲティングされた遺伝子サイレント化の手法であり、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）と同じ配列を含有するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分解するためにｄｓＲＮＡを使用している（Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ａ．及びＺａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．２８７，２４３１−２４３２（２０００）；Ｚａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．等、Ｃｅｌｌ  １０１，２５−３３（２０００）．Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．等、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３，３１９１−３１９７（１９９９）；Ｃｏｔｔｒｅｌｌ  ＴＲ及びＤｏｅｒｉｎｇ  ＴＬ．２００３．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１：３７−４３；Ｂｕｓｈｍａｎ  Ｆ．２００３．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ．７：９−１０；ＭｃＭａｎｕｓ  ＭＴ及びＳｈａｒｐ  ＰＡ．２００２．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．３：７３７−４７）。プロセスは内因性リボヌクレアーゼがより長いｄｓＲＮＡを切断してより短い、例えば２１又は２２ヌクレオチド長のＲＮＡ、即ち短鎖干渉ＲＮＡ又はｓｉＲＮＡと称されるものにする場合に起こる。その後、より小型のＲＮＡセグメントは標的ｍＲＮＡの分解を媒介する。ＲＮＡｉの合成のためのキットは例えばＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ又はＡｍｂｉｏｎから市販されている。１つの実施形態においてアンチセンスＲＮＡにおいて使用するための本明細書に記載する化学的特性の１つ以上はＲＮＡｉを媒介する分子において使用することができる。
【０１９７】
細胞における特定の蛋白質の発現をダウンレギュレートするためのアンチセンス核酸の使用は当該分野で良く知られている（例えばＷｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｈ．等、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｓ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１（１）１９８６；Ａｓｋａｒｉ，Ｆ．Ｋ．及びＭｃＤｏｎｎｅｌｌ，Ｗ．Ｍ．（１９９６）Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３４：３１６−３１８；Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｍ．Ｒ．及びＳｃｈｗａｒｔｚ，Ｓ．Ｍ．（１９９５）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９２：１９８１−１９９３；Ｍｅｒｃｏｌａ，Ｄ．及びＣｏｈｅｎ，Ｊ．Ｓ．（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：４７−５９；Ｒｏｓｓｉ，Ｊ．Ｊ．（１９９５）Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．５１：２１７−２２５；Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．Ｗ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：３３３−３３５参照）。アンチセンス核酸分子は別の核酸分子のコーディング鎖（例えばｍＲＮＡ配列）に相補であるヌクレオチド配列を含み、従って他の核酸分子のコーディング鎖に水素結合することができる。ｍＲＮＡの配列に相補なアンチセンス配列はｍＲＮＡのコーディング領域、ｍＲＮＡの５’又は３’未翻訳領域、又はコーディング領域と未翻訳領域を架橋している領域（例えば５’未翻訳領域及びコーディング領域の接合部）に存在する配列に相補であることができる。更にまた、アンチセンス核酸は例えば転写開始配列又は調節エレメントのようなｍＲＮＡをコードしている遺伝子の調節領域に対して配列において相補であることができる。好ましくは、アンチセンス核酸はｍＲＮＡのコーディング鎖上の開始コドンに先行するかそれに渡っている領域に対し、又は３’未翻訳領域において相補であるように設計される。
【０１９８】
血管形成を増強する分子のコーディング鎖配列がある場合、本発明のアンチセンス核酸はワトソンとクリックの塩基対形成の規則に従って設計できる。アンチセンス核酸分子はｍＲＮＡの全コーディング領域に相補であることができるが、より好ましくはｍＲＮＡのコーディング又は非コーディング領域の一部分のみに対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドはｍＲＮＡの翻訳開始部位の周囲の領域に対して相補であることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは例えば約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０ヌクレオチド長であることができる。本発明のアンチセンス核酸は当該分野で知られた操作法を用いた化学合成及び酵素的ライゲーション反応を用いて構築できる。例えばアンチセンス核酸（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）は天然に存在するヌクレオチドを用いて化学合成することができ、或いは、例えばホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチドのように、分子の生物学的安定性を増大させるため、又はアンチセンスとセンス核酸の間に形成されるデュプレックスの物理的安定性を増大させるために設計された多様に修飾されたヌクレオチドを使用できる。アンチセンス核酸を形成するために使用できる修飾されたヌクレオチドの例は、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ウイブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、及び２，６−ジアミノプリンを包含する。細胞内での発現を抑制するためにはアンチセンスオリゴヌクレオチド１つ以上を使用できる。或いは、アンチセンス核酸はアンチセンス方向に核酸がサブクローニングされている（即ち挿入された核酸から転写されたＲＮＡが、後述するセクションにおいて更に説明する通り目的の標的核酸に対してアンチセンス方向となることになる）発現ベクターを用いて生物学的に製造できる。
【０１９９】
更に別の実施形態においては、本発明のアンチセンス核酸分子はα−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は相補ＲＮＡと特異的な２本鎖ハイブリッドを形成し、ここで、通常のβ−ユニットとは逆に、鎖は相互に平行となる（Ｇａｕｌｔｉｅｒ等（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１）。アンチセンス核酸分子は又２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅ等、（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８））又はキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類縁体（Ｉｎｏｕｅ等、（１９８７）ＦＥＢＳＬｅｔｔ．２１５：３２７−３３０）を含むことができる。
【０２００】
別の実施形態において本発明のアンチセンス核酸はＲＮＡｉを媒介する化合物である。ＲＮＡ干渉剤は、限定しないが、核酸分子、例えば標的の遺伝子又はゲノム配列に相同であるＲＮＡ分子、「短鎖干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）、「短鎖ヘアピン」又は「小型ヘアピンＲＮＡ」（ｓｈＲＮＡ）、及びＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により標的遺伝子の発現を妨害又は抑制する小分子を包含する。ＲＮＡ干渉は２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を用いることによりｄｓＲＮＡと同じ配列を含有するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分解する転写後のターゲティングされた遺伝子サイレント化手法である（Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ａ．及びＺａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．２８７，２４３１−２４３２（２０００）；Ｚａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．等、Ｃｅｌｌ  １０１，２５−３３（２０００）．Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．等、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３，３１９１−３１９７（１９９９））。プロセスは内因性リボヌクレアーゼがより長いｄｓＲＮＡを切断してより短い、例えば２１又は２２ヌクレオチド長のＲＮＡ、即ち短鎖干渉ＲＮＡ又はｓｉＲＮＡと称されるものにする場合に起こる。その後、より小型のＲＮＡセグメントは標的ｍＲＮＡの分解を媒介する。ＲＮＡｉの合成のためのキットは例えばＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ又はＡｍｂｉｏｎから市販されている。１つの実施形態においてアンチセンスＲＮＡにおいて使用するための上記した化学的特性の１つ以上を使用できる。
【０２０１】
血管形成を抑制する分子をコードする核酸分子は対象の細胞内におけるコードされた蛋白質の発現のために適する形態で対象内に導入してよく、本明細書の方法においても使用してよい。例示的な血管形成を抑制する分子は、ＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、アンジオスタチン、エンドスチン、ツマスタチン、カンスタチン、ＶＥＧＩ、ＰＥＤＦ、バソヒビン、及びプロラクチン２−メトキシエストラジオールの１６ｋＤａのフラグメントを包含する（Ｋｅｒｂｅｌ（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１４：８８４参照）。
【０２０２】
例えば完全長又は部分的なｃＤＮＡの配列を標準的な分子生物学の手法を用いながら組み換え発現ベクターにクローニングし、そしてベクターを細胞にトランスフェクトする。ｃＤＮＡは例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた増幅によるか、又は適切なｃＤＮＡライブラリをスクリーニングすることにより得ることができる。ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、標準的なＰＣＲ法によるｃＤＮＡの増幅を可能にするＰＣＲプライマーの設計のため、又は標準的なハイブリダイゼーション方法を用いたｃＤＮＡライブラリのスクリーニングのために使用できるハイブリダイゼーションプローブの設計のために使用することができる。ｃＤＮＡの単離又は増幅の後、ＤＮＡフラグメントを適当な発現ベクター内に導入する。
【０２０３】
当然ながら１種より多い生物学的薬剤を抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子と組み合わせて投与しておい。
【０２０４】
即ち、本発明は癌を治療するため、即ち腫瘍の大きさ及び／又は腫瘍の脈管形成を低減するため、及び／又は腫瘍の透過性を増大するための複合療法及び少なくとも１つの追加的薬剤の使用を可能にする。
【０２０５】
本発明は又、例えば透過性を増大すること、例えば脈管を正常化すること、例えば維持することにより例えば固形腫瘍の脈管が増大するように抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子で腫瘍細胞を感作すること、そして次いでその後別の薬剤少なくとも１つを投与することによる癌の治療の方法を包含する。１つの実施形態において、化学療法剤は複合療法に追加的に投与される。
【０２０６】
好ましい実施形態においては、第２の薬剤は血管形成を抑制する。特定の好ましい実施形態においては、血管形成を抑制する薬剤は生物学的薬剤である。血管形成を抑制する生物学的薬剤は抗体又はその抗原結合フラグメントであってよい。特定の実施形態においては、血管形成を抑制する生物学的薬剤は抗ＶＥＧＦ抗体、例えばベバシツマブである。別の実施形態においては、生物学的薬剤は抗ＥＧＦＲ抗体、例えばセツキシマブである。
【０２０７】
本発明の１つの実施形態において、少なくとも１つの生物学的薬剤はリツキシマブ、トラスツズマブ、トシツモマブ、イブリツモマブ、アレルムツズマブ、エプラツズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、オブリメルセン及びパニツムマブよりなる群から選択される。
【０２０８】
別の実施形態において、血管形成を抑制する薬剤は小分子である。１つの実施形態において、小分子は表皮成長因子１型／表皮成長因子受容体（ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ）抑制剤、例えばエルロチニブである。
【０２０９】
本発明の別の実施形態において、生物学的薬剤はインターフェロン又はインターロイキンである。
【０２１０】
生物学的薬剤の種々の形態を使用してよい。それらには、限定しないが、プロフォルム分子、未荷電の分子、分子複合体、塩、エーテル、エステル、アミド等のような形態が包含され、これらは腫瘍内に移植、注射、あるいは挿入された場合に生物学的に活性化される。
【０２１１】
４．治療方法
本発明は更に、約２ｍｍ×２ｍｍ超の大きさの腫瘍を有する対象における腫瘍の大きさを低減する、固形腫瘍を有する対象における固形腫瘍、例えば約２ｍｍ×２ｍｍ超の大きさの腫瘍の脈管形成を低下させる、及び／又は、固形腫瘍を有する対象における固形腫瘍、例えば約２ｍｍ×２ｍｍ超の大きさの腫瘍の透過性を増大する、新しい治療方法を提供する。本方法では一般的に複合療法を対象に対して行う。本発明の特定の実施形態においては、方法は更に化学療法剤を対象に投与することを含んでよい。
【０２１２】
本発明の方法は癌を治療するため、例えば限定しないが固形腫瘍、例えば癌腫を治療するために使用してよい。本発明の化合物により治療できる固形腫瘍、例えば癌腫の例は、限定しないが、乳癌、精巣癌、肺癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚癌、膵臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、結腸癌、並びに前立腺癌、胃癌、皮膚癌、腹部癌、食道癌及び膀胱癌を包含する。１つの実施形態において、腫瘍は結腸腫瘍である。別の実施形態においては、腫瘍は結腸腫瘍、子宮頚部腫瘍、胃の腫瘍、又は膵臓の腫瘍よりなる群から選択される。別の実施形態においては、腫瘍は病期Ｉ、病期ＩＩ、病期ＩＩＩ、及び病期ＩＶの腫瘍よりなる群から選択される。
【０２１３】
本発明の１つの実施形態において、要件となる複合療法は樹立された腫瘍、例えば栄養が浸透圧により対象の脈管から腫瘍の中心にまでもはや透過することができないため、腫瘍が栄養を受け取るためにそれ自身の血管供給を必要とするような十分な大きさの腫瘍、即ち脈管形成腫瘍を治療するために使用される。１つの実施形態において、複合療法は少なくとも約１ｍｍ×１ｍｍの寸法を有する腫瘍を治療するために使用される。本発明の別の実施形態においては、複合療法は少なくとも約２ｍｍ×２ｍｍである腫瘍を治療するために使用される。本発明の更に別の実施形態においては、複合療法は少なくとも約５ｍｍ×５ｍｍである腫瘍を治療するために使用される。本発明の別の実施形態において、腫瘍は少なくとも約１ｃｍ３の体積を有する。１つの実施形態において、本発明の複合療法は触診により、又は当該分野で良く知られている画像化手法、例えばＭＲＩ、超音波、又はＣＡＴスキャンにより発見されるために十分大きい腫瘍を治療するために使用される。
【０２１４】
本発明の特定の実施形態においては、要件となる方法は約５８％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％超の％腫瘍抑制をもたらす。１つの実施形態において、抗リンホトキシン−ベータ受容体（ＬＴ−β−Ｒ）結合分子、又はその抗原結合フラグメント、及び少なくとも１つの血管形成を抑制する薬剤の投与は、約５８％以上の％腫瘍抑制をもたらす。
【０２１５】
特定の実施形態においては、方法は対象に有効量の抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子及び第２の薬剤を非経口投与することを含む。１つの実施形態において、方法は対象への抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子及び少なくとも１つの追加的薬剤の動脈内投与を含む。別の実施形態において、方法は有効量の抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子及び少なくとも１つの追加的薬剤を直接対象の腫瘍の供給動脈血に投与することを含む。１つの実施形態において、方法は有効量の抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子及び少なくとも１つの追加的薬剤を、直接カテーテルを用いて癌性腫瘍の供給動脈血に投与することを含む。抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子及び少なくとも１つの追加的薬剤を投与するためにカテーテルを使用する実施形態においては、カテーテルの挿入は、蛍光測定、又はカテーテルの挿入を観察及び／又は誘導する当該分野で知られた他の方法により、誘導又は観察してよい。別の実施形態においては、方法は化学塞栓形成法を含む。例えば化学塞栓形成法は油脂基剤（例えばエチオドール中のポリビニルアルコール）及び１つ以上の生物学的薬剤と混合した樹脂様物質を含む組成物で癌性腫瘍に供給している血管をブロックすることを包含してよい。更に別の実施形態においては、方法は対象への抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子及び少なくとも１つの追加的薬剤の全身投与を含む。
【０２１６】
一般的に、本明細書の医薬組成物を利用した化学塞栓形成法又は直接の動脈内又は静脈内の注射による療法は、典型的には部位にかかわらず同様の態様において実施される。慨すれば、血管造影法（血管のロードマップ）、又は特定の実施形態においてより詳細には、塞栓すべき区域の血管造影法を、先ず、Ｘ線を撮りながら動脈又は静脈（塞栓形成又は注射すべき部位による）内に挿入したカテーテルを介して放射線不透明性の造影剤を注射することにより実施してよい。カテーテルは経皮的に、又は手術により挿入してよい。次に流動の停止が観察されるまでカテーテルを介して本発明の医薬組成物を還流させることにより血管を塞栓させる。閉塞は血管造影法を反復することにより確認してよい。直接の注射を使用する実施形態においては、次に血管に所望の用量の本発明の医薬組成物を注入する。
【０２１７】
塞栓形成法による療法は一般的に治療すべき腫瘍又は血管塊の間質全体に渡る抑制剤を含有する組成物の分布をもたらす。動脈管腔を詰まらせる塞栓粒子の物理的な嵩は血液供給の閉塞をもたらす。この作用に加えて、抗血管形成因子の存在により腫瘍又は血管塊に供給するための新しい血管の形成が防止され、血液供給を遮断する不活性化の作用が増強される。直接の動脈内又は静脈内投与は一般的にやはり、治療すべき腫瘍又は血管の塊の間質全体に渡る抑制剤を含有する組成物の分布をもたらす。しかしながら、血液供給はこの方法では閉塞されるとは一般的には期待されない。
【０２１８】
本発明の１つの特徴において、肝臓又は他の組織の原発及び二次腫瘍は塞栓形成又は直接の動脈内又は静脈内の注射療法を利用しながら治療してよい。慨すれば蛍光測定ガイダンスの下に動脈系を通過させながらカテーテルを操舵することにより、これを大腿又は上腕動脈経由により挿入し、肝動脈に進行する。腫瘍に供給している血管の完全なブロックを可能にするために必要な限り肝動脈樹内にカテーテルを進め、その際正常な構造に供給している動脈支部は可能な限り多く温存しておく。理想的にはこれは肝動脈の区分的な支部であるが、腫瘍及びそれぞれの血液供給の程度に応じて胃十二指腸動脈の起点に対して遠位の全肝動脈、或いは更に複数の別個の動脈をブロックする必要が生じる場合がある。所望のカテーテル位置が達成された後、ブロックすべき動脈における血流が好ましくは５分間観察後にも停止しているようになるまで、動脈カテーテルを介して組成物（上記）を注射することにより動脈を塞栓する。動脈の閉塞は、放射線不透明の造影剤をカテーテルを介して注射し、そして先に造影剤を充填されていた血管がもはやそうではないことを蛍光測定又はＸ線フィルムにより明らかにすることにより、確認してよい。直接の注射を用いる実施形態においては、所望の用量において動脈カテーテルを介して組成物（上記）を注射することにより動脈に注入する。閉塞すべき各供給動脈に対し同じ操作法を反復してよい。
【０２１９】
大部分の実施形態において、複合療法は、治療有効量の配合治療薬又は他の物質を予防的又は施療的な治療の部分として患者に送達するために十分な量で送達すべき物質を配合することになる。粒子中の活性化合物の所望濃度は薬物の吸収、不活性化、及び排出の速度、並びに化合物の送達速度に応じたものとなる。当然ながら用量の値は更に軽減すべき状態の重症度により変動してよい。更に又、何れかの特定の対象に対し、個々のニーズ及び組成物投与を管理又は監督している人物の専門的判断に応じて経時的に特定の投薬用法を調節する必要がある。典型的には投薬量は当業者に知られた手法を用いて決定される。選択される用量レベルは種々の要因、例えば使用する本発明の特定の化合物、又はそのエステル、塩又はアミドの活性、投与経路、投与時間、使用する特定の化合物の排出又は代謝の速度、治療の継続期間、使用する特定の化合物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、及び／又は物質、治療すべき患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康度、及び病歴、及び医学分野でよく知られている類似の要因に依存する。
【０２２０】
用量は患者の体重のｋｇあたりの組成物の量に基づいてよい。他の量は当業者の知る通りであり、容易に決定できる。或いは、本発明の用量は組成物の血漿中濃度を参照することにより決定してよい。例えば最大血漿中濃度（Ｃｍａｘ）及びゼロ時から無限大までの血漿中濃度−時間の曲線の下部面積（ＡＵＣ（０−４））を使用してよい。本発明に関する用量はＣｍａｘ及びＡＵＣ（０−４）に関する上記数値をもたらすもの、及び、これらのパラメーターのより高値又は低値をもたらす他の用量を包含する。
【０２２１】
当業者である医師又は獣医師は必要な医薬組成物の有効量を容易に決定して処方することができる。例えば、医師又は獣医師は医薬組成物中で使用される本発明の化合物の用量を所望の治療効果を達成するために必要なものより低値のレベルにおいて開始し、そして所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増大させることができる。
【０２２２】
一般的に、抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子及び少なくとも１つの追加的薬剤の複合療法の適当な１日当たり用量は治療効果をもたらすために有効な最低用量である複合療法の量となる。そのような有効用量は一般的に上記した要因に依存する。
【０２２３】
１つの実施形態において、本発明の複合療法における各薬剤の有効用量はその薬剤単独について有効であることが分かっている用量である。１つの実施形態において、抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子の有効用量は約１６ｍｇ／ｍ２である。別の実施形態においては、抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子の有効用量は約２０ｍｇ／ｍ２である。１つの実施形態において、血管形成を抑制する薬剤、例えば抗ＶＥＧＦ抗体の有効用量は約０．２５〜８ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約４ｍｇ／ｋｇである（約０．７５〜２４ｍｇ／ｍ２）。当業者の知る通り、マウスモデルにおいて有効であることがわかった用量は数学的変換を用いてヒト対象における使用に適切である用量に容易に変換でき、例えば、ｍｇ／ｋｇ単位のマウスにおける用量を１２．１で割り、そして次に３７を掛ければヒトに対して適切であるｍｇ／ｍ２単位の用量が得られる。
【０２２４】
別の実施形態においては、複合療法の一方又は両方の薬剤の有効用量は各薬剤単独について有効であることが分かっているよりも低値の用量となる。
【０２２５】
所定の患者において最も有効な治療をもたらすことになる何れかの特定の化合物の厳密な投与時間及び量は、特定の化合物の活性、薬物動態、及び生体利用性、患者の生理学的条件（例えば年齢、性別、疾患の型および病期、全身状態、所定の用量に対する応答性、及び医薬の型）、投与経路等に依存する。本明細書に示した指針を用いて治療を最適化、例えば投与の最適な時期及び／又は量の決定を行ってよく、それは対象をモニタリングし、そして用量及び／又は時期を調節することからなる類型的な実験を超えるものを必要としない。
【０２２６】
対象を治療している間、患者の健康状態は２４時間の期間の所定の時期において該当する指標１つ以上を計測することによりモニタリングしてよい。栄養補給を包含する治療、量、投与回数及び製剤はそのようなモニタリングの結果に従って最適化してよい。同じパラメーターを計測することにより改善の程度を調べるために患者を周期的に再評価してよく、そのような再評価の初回は典型的には治療開始から４週間の終わりに行われ、そしてその後の再評価は治療中の各４〜８週毎、そしてその後は３カ月毎に行われる。治療は数カ月、更には数年間継続する場合があり、最低１カ月がヒトの場合の典型的な治療期間である。投与する薬剤の量、及び場合によって投与時期の調節は、これらの再評価に基づいて行われる。
【０２２７】
治療は化合物の最適用量より低値であるより少量の用量から開始してよい。その後、最適な治療効果が達成されるまで少量ずつ用量を増量してよい。
【０２２８】
これを知ることにより腫瘍学者はどの薬物が共同して功を奏するかを決定しやすくなり、そして、１種より多い薬物を使用する場合には薬物の各々の投与すべき時期（順序及び頻度）を厳密に計画しやすくなる。
【０２２９】
本発明の１つの実施形態においては、化学療法剤を更に本発明の複合療法において使用する。使用してよい化学療法剤の例は限定しないが、以下のもの：白金類（即ちシスプラチナ類）、アントラサイクリン類、ヌクレオシド類縁体（プリン及びピリミジン）、タキサン類、カンプトテシン類、エピポドフィロトキシン類、ＤＮＡアルキル化剤、フォレート拮抗剤、ビンカアルカロイド類、リボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤、エストロゲン抑制剤、プロゲステロン抑制剤、アンドロゲン抑制剤、アロマターゼ抑制剤、インターフェロン、インターロイキン、モノクローナル抗体、タキソール、カンプトサール、アドリアマイシン（ドックス）、５−ＦＵ及びゲムシタビンを包含する。このような化学療法剤は複合療法と化学療法剤の同時投与による本発明の実施において使用してよい。１つの実施形態において、抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子は少なくとも１つの追加的薬剤及びゲムシタビン、アドリアマイシン、カンプトサール、カルボプラチン、シスプラチン、及びタキソールよりなる群から選択される化学療法剤と組み合わせて投与される。抗リンホトキシンベータ受容体（ＬＴ−β−Ｒ）結合分子及び少なくとも１つの化学療法剤を投与することを含む癌を治療するための方法は又、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願１１／１５６１０９にも記載されている。
【０２３０】
１つの実施形態において、抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子又は生物学的薬剤は化学療法剤にコンジュゲートされる。１つの実施形態において抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子又は生物学的薬剤は化学療法剤にコンジュゲートされない。本発明の別の実施形態においては、生物学的薬剤と抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子の両方がコンジュゲートされる。
【０２３１】
本明細書に記載する抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子と少なくとも１つの第２の薬剤の複合使用（任意に他の化学療法剤及び／又は生物学的薬剤と組み合わせる）は例えば異なる成分の作用の発生および持続期間が補足的である場合には、何れかの個々の成分に関する必要用量を低減してよい。そのような複合療法において、異なる活性剤を共に、又は別個に、そして同時に、又はその日の異なる時間に送達してよい。要件化合物の毒性及び治療効果は例えばＬＤ５０及びＥＤ５０を測定するための細胞培養又は実験動物における標準的な薬学的操作法により測定してよい。大きい治療指数を示す組成物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物も使用してよいが、副作用を低減するために所望の部位に化合物をターゲティングする送達系を設計するように留意する。
【０２３２】
細胞培養試験及び動物試験から得られたデータをヒトにおける使用のための用量の範囲を製剤する場合に使用してよい。何れかの栄養補給物、又は代替としてのその何れかの成分の用量は好ましくは毒性を殆ど又は全く伴わないＥＤ５０を含む循環系中濃度の範囲にある。用量はこの範囲において使用する剤型及び利用する投与経路に依存して変動してよい。本発明の薬剤については、治療有効用量はまず細胞培養試験から推定してよい。ある用量を、細胞培養において決定されたＩＣ５０（即ち症状の５０％最大抑制を達成する被験化合物の濃度）を包含する循環血漿中濃度範囲を達成するために、動物モデルにおいて製剤してよい。そのような情報はヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用してよい。血漿中のレベルは例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定してよい。
【０２３３】
血管形成を抑制する薬剤少なくとも１つがアンチセンス核酸分子である本発明の方法において、アンチセンス核酸分子は細胞性ｍＲＮＡ及び／又はゲノムＤＮＡにハイブリダイズ又は結合することにより、例えば転写及び／又は翻訳を抑制することによる蛋白質の発現の抑制が達成されるように、対象への投与又はその形成は典型的にはインサイチュである。ハイブリダイゼーションは従来のヌクレオチド相補性により安定なデュプレックスを形成することによるか、又は例えばＤＮＡデュプレックスに結合するアンチセンス核酸分子の場合は、二重らせんの深いほうの溝における特定の相互作用を介するものであることができる。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例は組織部位への直接の注射を包含する。或いは、アンチセンス核酸分子は選択された細胞をターゲティングするように修飾し、そして次に全身投与することができる。例えば、全身投与のためには、アンチセンス分子は、それらが選択された細胞の表面上に発現される受容体又は抗原に特異的に結合するように、例えばアンチセンス核酸分子を細胞表面受容体又は抗原に結合するペプチド又は抗体に連結することにより、修飾することができる。アンチセンス核酸分子は又、当業者に知られたベクターを用いて細胞に送達することもできる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するためには、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌＩＩ又はｐｏｌＩＩＩプロモーターの制御下に置かれているベクターコンストラクトが好ましい。
【０２３４】
対象への核酸分子の投与はインビトロ又はインビボの何れかにおいて実施できる（後者は後述するサブセクションにおいて更に考察する）。インビトロで方法を実施するためには、細胞を標準的な方法で対象から取得し、そして核酸分子と共にインビトロでインキュベート（即ち培養）し、そしてその後対象に投与することができる。免疫細胞を単離するための方法は当業者の知る通りである。細胞のエクスビボの遺伝子修飾とそれに続く対象への再投与の更なる考察については、Ｗ．Ｆ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ等により米国特許５，３９９，３４６を参照。
【０２３５】
他の実施形態においては、核酸分子は対象にインビボで、例えば対象の関節部位に直接、投与される。例えば、核酸（例えば組み換え発現ベクター又はアンチセンスＲＮＡ）はインビボで細胞内に核酸（例えばＤＮＡ）を導入するための当該分野で知られた方法を用いて対象の細胞内に導入できる。そのような方法の例は以下を包含する。
【０２３６】
直接注射：ネイキッドのＤＮＡは、細胞内にＤＮＡを直接注射することにより、インビボで細胞内に導入することができる（例えばＡｃｓａｄｉ等（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ３３２：８１５−８１８；Ｗｏｌｆｆ等（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７：１４６５−１４６８参照）。例えばインビボで細胞内にＤＮＡを注射するための送達装置（例えば「遺伝子銃」）を使用できる。そのような装置は市販されている（例えばＢｉｏＲａｄから）。
【０２３７】
受容体媒介ＤＮＡ取り込み：ネイキッドのＤＮＡは又、細胞表面受容体に対するリガンドにカップリングされたポリリジンのようなカチオンにＤＮＡを複合体化することにより、インビボで細胞内に導入できる（例えばＷｕ，Ｇ．及びＷｕ，Ｃ．Ｈ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１；Ｗｉｌｓｏｎ等（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−９６７；及び米国特許５，１６６，３２０参照）。受容体へのＤＮＡ−リガンド複合体の結合は受容体媒介エンドサイトーシスによるＤＮＡの取り込みを促進する。エンドソームを天然に破壊することにより物質を細胞質中に放出するアデノウィルスキャプシドに連結したＤＮＡ−リガンド複合体は、細胞内リソソームによる複合体の分解を回避するために使用できる（例えばＣｕｒｉｅｌ等（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８８５０；Ｃｒｉｓｔｉａｎｏ等（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：２１２２−２１２６参照）。
【０２３８】
レトロウィルス：欠損性レトロウィルスは遺伝子療法目的のための遺伝子転移における使用に関して十分特性化されている（例えばＭｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｂｌｏｏｄ  ７６：２７１参照）。レトロウィルスゲノム内に取り込まれた目的のヌクレオチド配列を有する組み換えレトロウィルスを構築できる。更に又、レトロウィルスゲノムの部分を除去してレトロウィルスを複製欠損とすることができる。複製欠損レトロウィルスを次に、標準的方法によりヘルパーウィルスの使用を介して標的細胞を感染させるために使用できるビリオン内にパッケージする。組み換えレトロウィルスを製造するため、及びそのようなウィルスでインビトロ又はインビボで細胞を感染させるためのプロトコルはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．等（編）Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９），Ｓｅｃｔｉｏｎｓ９．１０−９．１４及び他の標準的な実験室マニュアルに記載されている。適当なレトロウィルスの例は当業者に良く知られているｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥ及びｐＥＭを包含する。適当なパッケージングウィルス系の例はΨＣｒｉｐ、ΨＣｒｅ、Ψ２及びΨＡｍを包含する。レトロウィルスはインビトロ及び／又はインビボにおいて上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、筋芽細胞、肝細胞、骨髄細胞を包含する多くの異なる細胞型内に種々の遺伝子を導入するために使用されている（例えばＥｇｌｉｔｉｓ等（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３９５−１３９８；Ｄａｎｏｓ及びＭｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：６４６０−６４６４；Ｗｉｌｓｏｎ等（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：３０１４−３０１８；Ａｒｍｅｎｔａｎｏ等（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：６１４１−６１４５；Ｈｕｂｅｒ等（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８０３９−８０４３；Ｆｅｒｒｙ等（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８３７７−８３８１；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ等（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１８０２−１８０５；ｖａｎ  Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍ等（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７６４０−７６４４；Ｋａｙ等（１９９２）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：６４１−６４７；Ｄａｉ等（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０８９２−１０８９５；Ｈｗｕ等（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４１０４−４１１５；米国特許４，８６８，１１６；米国特許４，９８０，２８６；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０７１３６；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０２４６８；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０５３４５；及びＰＣＴ出願ＷＯ９２／０７５７３参照）。レトロウィルスベクターはレトロウィルスゲノム（及びそれに挿入されている外来核酸）がホストゲノムに組み込まれて安定に核酸を細胞に導入するためには標的細胞の分裂を必要とする。即ち、標的細胞の複製を刺激することが必要となる。
【０２３９】
アデノウィルス：アデノウィルスのゲノムは、それが目的の遺伝子産物をコードして発現するが正常な溶解性のウィルスの生命周期において複製するその能力の点においては不活性化されているように操作することができる。例えばＢｅｒｋｎｅｒ等（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ等（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１−４３４；及びＲｏｓｅｎｆｅｌｄ等（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６８：１４３−１５５を参照。アデノウィルス株Ａｄ型５ｄ１３２４又はアデノウィルスの他の株（例えばＡｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７等）から誘導した適当なアデノウィルスベクターは当業者に良く知られている。組み換えアデノウィルスはそれらが効果的な遺伝子送達ベヒクルであるために分裂細胞を必要とせず、そして広範な種類の細胞型、例えば気道上皮（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ等（１９９２）上記引用）、内皮細胞（Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄ等（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６４８２−６４８６）、肝細胞（Ｈｅｒｚ及びＧｅｒａｒｄ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２８１２−２８１６）及び筋肉細胞（Ｑｕａｎｔｉｎ等（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：２５８１−２５８４）を感染させるために使用できる点において好都合である。更に又、導入されたアデノウィルスＤＮＡ（及びそれに含有される外来ＤＮＡ）は宿主細胞のゲノム内に組み込まれないが、エピソームとして残存することにより、導入されたＤＮＡがホストゲノム（例えばレトロウィルスＤＮＡ）内に組み込まれることになった状況において挿入突然変異の結果として生じる場合がある潜在的問題を回避することができる。更に又、外来性ＤＮＡに対するアデノウィルスゲノムの担持容量は、他の遺伝子送達ベクターと相対比較して大きい（８キロ塩基まで）（Ｂｅｒｋｎｅｒ等、上記引用；Ｈａｊ−Ａｈｍａｎｄ及びＧｒａｈａｍ（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７）。現在使用されている大部分の複製欠損アデノウィルスベクターはウィルスＥ１及びＥ３遺伝子の全て又は部分について欠失されているが、アデノウィルスの遺伝子物質の８０％をも保持している。
【０２４０】
アデノ随伴ウィルス：アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）は効率的な複製及び生産性の生命周期のためにはヘルパーウィルスとしてアデノウィルス又はヘルペスウイルスのような別のウィルスを必要とする天然に存在する欠損性のウィルスである（考察については例えばＭｕｚｙｃｚｋａ等、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８：９７−１２９参照）。これはまた自身のＤＮＡを非分裂細胞に組み込む場合があり、そして安定な組み込みを高頻度で示す数少ないウィルスの１つである（例えばＦｌｏｔｔｅ等（１９９２）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９−３５６；Ｓａｍｕｌｓｋｉ等（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８；及びＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ等（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１９６３−１９７３参照）。ＡＡＶの僅か３００塩基対のみ含有するベクターもパッケージされ、そして組み込むことができる。外因性ＤＮＡのためのスペースは約４．５ｋｂまでに限定される。Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ等（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０に記載のもののようなＡＡＶベクターも細胞にＤＮＡを導入するために使用できる。種々の核酸がＡＡＶベクターを用いて異なる細胞型内に導入されている（例えばＨｅｒｍｏｎａｔ等（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６４６６−６４７０；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ等（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１；Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄ等（１９８８）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２：３２−３９；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ等（１９８４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６１１−６１９；及びＦｌｏｔｔｅ等（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３７８１−３７９０参照）。
【０２４１】
特定の発現ベクター系及び細胞内に核酸を導入する方法の有効性は当該分野で類型的に使用されている標準的な方策により評価できる。例えば細胞に導入されたＤＮＡはフィルターハイブリダイゼーションの手法（例えばサザンブロッティング）により検出でき、導入されたＤＮＡの転写により生産されたＲＮＡは例えばノーザンブロッテイング、ＲＮａｓｅ保護、又は逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により検出できる。遺伝子産物は適切な試験により、例えば生産された蛋白質の例えば特異的抗体を用いた免疫学的検出により、又は、酵素試験のような遺伝子産物の機能的活性を検出するための機能的試験により、検出することができる。
【０２４２】
５．製品
本発明は本発明の方法の使用のためのキット及び製品を提供する。本発明は又、癌の治療のために本発明において使用される抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子を投与するためのパッケージされた医薬組成物又はキットにも関する。本発明の１つの実施形態において、キット又は製品は抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子、及び、少なくとも１つの追加的薬剤、例えば血管形成を抑制する薬剤、例えば生物学的薬剤と組み合わせて、癌の治療のための投与に関する説明書を含む。別の実施形態においては、キットは抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子と共に複合療法において使用するための少なくとも１つの追加的薬剤を含む第２の容器を含む。説明書は、どのように、例えば静脈内、そして何時、例えば第０週及び第２週、異なる用量の抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子及び少なくとも１つの追加的薬剤を治療のために対象に投与すべきかを記載してよい。更に別の実施形態においては、キットは化学療法剤及び／又は化学療法剤を投与するための説明書を含む。
【０２４３】
或いはパッケージ又はキットは抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子を含有することができ、そしてこれはパッケージ内において、又は添付の情報を介して、使用又は本明細書に記載する障害の治療に関して、使用を宣伝することができる。パッケージされた医薬品又はキットは更に、第２の薬剤（本明細書に記載のもの、例えば血管形成を抑制する薬剤、例えば生物学的薬剤）を、第１の薬剤、例えば抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子と共に、第２の薬剤、例えば血管形成を抑制する薬剤、例えば生物学的薬剤の使用に関する説明書と共にパッケージされた、又は共同宣伝された状態で包含することができる。
【０２４４】
例えば製品はパッケージング材料、上記した通り、抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子１つ以上、及び追加的薬剤少なくとも１つ、そして任意にラベル又はパッケージインサートを含んでよい。更に別の実施形態においては、本発明は抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子１つ以上、及び追加的薬剤少なくとも１つ、及びそのような組成物の投与を達成するための装置１つ以上を含む製品を提供する。例えばキットは抗ＬＴ−β−Ｒ結合分子を含む医薬組成物及び固形腫瘍内への組成物の直接の動脈内注射を行うためのカテーテルを含んでよい。製品は任意に、製薬上許容しうる緩衝液及び組成物の使用に関する説明書を含む第２の容器のような付属成分を包含する。
【実施例】
【０２４５】
本発明は以下の実施例により更に説明するが、これらは如何なる点においても限定的とは見なされない。
【０２４６】
材料及び方法
ＷｉＤｒマウスモデル
ｈｕＣＢＥ１１と組み合わせた生物学的薬剤の作用を調べるために、ＷｉＤｒ異種移植片モデルを使用した。ＣＢＥ１１は重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）を有するマウスにおいて異種移植片として生育させたＷｉＤｒ腫瘍に対して抗腫瘍活性を示すことがわかっている（Ｂｒｏｗｎｉｎｇ等（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：８６７）。治療薬、即ちＬＴ−β−Ｒ抗体及び生物学的薬剤を、ＷｉＤｒ腫瘍細胞を移植してある無胸腺ヌードマウスに投与した。抗腫瘍活性は、治療を樹立された予備形成された腫瘍塊に対して開始するＷｉＤｒ異種移植片ヒト結腸直腸腫瘍の生育に従って調べた。
【０２４７】
ＷｉＤｒ細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。細胞は９０％Ｅａｇｌｅ最小必須培地中で、２ｍＭＬ−グルタミン、及びＥａｒｌｅ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＳＳ）と共に、１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、及び１ｍＭピルビン酸ナトリウムを含有するように調節し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加しながら、抗生物質無添加においてインビトロで生育させた（５％ＣＯ２）。移植後２４及び４８時間の両方において細菌の汚染に関して全ての培養物が陰性であることを確認するために、マウス内に移植した腫瘍ホモジネートプレパレーションの小分量に対して細菌の培養を実施した。
【０２４８】
血清非含有の２００μＬのＲＰＭＩ１６４０中の２×１０６ＷｉＤｒ細胞の接種物を第０日において右脇腹区域に皮下移植した。腫瘍の重量及び体重の測定は第３日に開始し、週２回記録した。腫瘍が長さ約５ｍｍ幅約５ｍｍと計測された時点で、マウスを投与群及び対照群に無作為に割りつけた。体重の測定は第０日に開始し、週２回記録した。
ＫＭ−２０Ｌ２マウスモデル
ｈｕＣＢＥ１１と組み合わせた生物学的薬剤の作用を調べるために、ＫＭ−２０Ｌ２異種移植片モデルを使用した。治療薬、即ちＬＴ−β−Ｒ抗体及び生物学的薬剤を、ＫＭ−２０Ｌ２腫瘍細胞を移植してある無胸腺ヌードマウスに投与した。抗腫瘍活性は、治療を樹立された予備形成された腫瘍塊に対して開始するＫＭ−２０Ｌ２異種移植片の生育に従って調べた。
【０２４９】
ＫＭ−２０Ｌ２はＮＣＩ腫瘍レポジトリから入手した。細胞は９０％ＲＰＭＩ−１６４０中、１０％ウシ胎児血清と共に、抗生物質非存在下で生育させた。移植後２４及び４８時間の両方において細菌の汚染に関して全ての培養物が陰性であることを確認するためにマウス内に移植した腫瘍細胞ホモジネートプレパレーションの小分量に対して細菌の培養を実施した。
【０２５０】
血清非含有の培地中の２×１０６又は３×１０６のＫＭ−２０Ｌ２細胞の接種物を第０日においてマウスの右脇腹区域に皮下移植した。腫瘍の大きさの計測を定期的に記録した。腫瘍が長さ約５ｍｍ幅約５ｍｍ（６５ｍｇ）と計測された時点で、マウスを投与群及び対照群に無作為に割りあてた。
【０２５１】
腫瘍の計測
腫瘍の計測はＶｅｒｎｉｅｒカリパスを用いて測定した。腫瘍の大きさの計測は試験終了時まで試験に従って定期的に記録した。長球楕円に関する体積を計算する式を用いて２次元の腫瘍計測から腫瘍の体積（ｍｍ３）を推定：腫瘍体積（ｍｍ３）＝（長さ×幅２［Ｌ×Ｗ２］）÷２とした。単位密度を仮定すれば腫瘍体積は腫瘍重量に変換される（即ち１ｍｍ３＝１ｍｇ）。腫瘍生育の抑制は％Ｔ／Ｃとし、ここでＴは投与群の平均腫瘍重量、及びＣは対照群の平均腫瘍重量である。このタイプの試験についての４２％以下の％Ｔ／Ｃ値は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＵＳＡ）により有意の活動性を示すものとみなされている。動物は適宜屠殺した。
【０２５２】
統計学的分析
腫瘍重量計測の統計学的分析は標準的な統計学的方法に従って実施した。平均、標準偏差（ＳＤ）、及び平均の標準誤差（ＳＥＭ）を全評価時において全用量群につき体重及び腫瘍重量に関して求めた。各試験終了時を含む各評価時に平均腫瘍重量に対してスチューデントのｔ検定を行うことにより、各投与群とベヒクル対照群の間、及び各複合投与群と対応するｈｕＣＢＥ１１群との間に統計学的有意差があるかどうか調べた。
【０２５３】
治療の有効性は各投与群の腫瘍重量を対照群の腫瘍重量と比較することにより調べた。その他の統計学的分析も適宜実施した。
【０２５４】
実施例１：生物学的薬剤と組み合わせたＬＴ−β−Ｒ抗体を用いた腫瘍の大きさの低減
Ａ．ＫＭ−２０Ｌ２ヒト結腸腺癌異種移植片モデルにおけるｈｕＣＢＥ１１とベバシツマブの組み合わせを用いた腫瘍の大きさの低減
ｈｕＣＢＥ１１と組み合わせた生物学的薬剤、例えば血管形成を抑制する生物学的物質、例えば抗ＶＥＧＦ抗体、例えばベバシツマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）の投与が腫瘍の大きさの低減において各化合物単独より有効であるかどうかを調べるために、ＫＭ−２０Ｌ２（ヒト結腸腺癌）異種移植片モデルを用いてｈｕＣＢＥ１１と組み合わせてベバシツマブを投与した。
【０２５５】
用量範囲試験を実施することによりベバシツマブ及びｈｕＣＢＥ１１の抗腫瘍作用を検討するための適切なベバシツマブ及びｈｕＣＢＥ１１の用量を求めた。用量試験では又、独立して腫瘍生育を抑制することに関し、各薬剤の抗腫瘍の薬効を調べた。約６５ｍｇのＫＭ−２０Ｌ２腫瘍（移植後約６〜７日）を担持した無胸腺ヌードマウスに食塩水（対照）（ｎ＝１５；２００μＬ腹腔内、週２回）又はｈｕＣＢＥ１１（用量当たりｎ＝１０；０．２ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、又は２０ｍｇ／ｋｇを腹腔内、週２回）の何れかを投与した。同様に、約７５ｍｇのＫＭ−２０Ｌ２腫瘍又は１００ｍｇのＫＭ−２０Ｌ２腫瘍（移植後約６〜７日）を担持した無胸腺ヌードマウスに食塩水（対照）（ｎ＝１５；２００μＬ腹腔内、週２回）又はベバシツマブ（用量当たりｎ＝１０；１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、又は４ｍｇ／ｋｇを腹腔内、週２回）の何れかを投与した。腫瘍の重量は第５日、及びその後は動物屠殺時まで定期的に計測した。
【０２５６】
０．２ｍｇ／ｋｇ及び２０ｍｇ／ｋｇのｈｕＣＢＥ１１用量群における腫瘍重量は移植後第３５日において食塩水対照群と有意差がなかった。しかしながら、ｈｕＣＢＥ１１は２ｍｇ／ｋｇ又は４ｍｇ／ｋｇの用量においてはヌードマウスのＫＭ−２０２Ｌ２ヒト結腸腺癌腫瘍重量の有意な抑制をもたらした（Ｐ＜０．０５）（図１）。並行した試験において、第３８日にベバシツマブが４ｍｇ／ｋｇの用量において投与開始時に約７５ｍｇ（Ｐ＜０．０１）（図２）又は投与開始時に１００ｍｇ／ｋｇ（Ｐ＜０．００１）（図３）の何れかの重量であった腫瘍に対して、腫瘍重量の有意な抑制をもたらしたことがわかった。
【０２５７】
ベバシツマブ及びｈｕＣＢＥ１１の複合投与が腫瘍重量の抑制において有意な増大を有するかどうかを調べるために、約６５ｍｇのＫＭ−２０Ｌ２腫瘍を担持した無胸腺ヌードマウスに対して複合試験を実施した。この試験ではｈｕＣＢＥ１１（２ｍｇ／ｋｇ）及びベバシツマブ（４ｍｇ／ｋｇ）の作用を比較することにより薬効を調べた。
【０２５８】
複合試験の結果（図４〜６に示す）はベヒクル又はベバシツマブ単独投与と比較してベバシツマブと組み合わせたｈｕＣＢＥ１１は投与開始時に約６５ｍｇのＫＭ−２０Ｌ２腫瘍を担持していた投与マウスにおいて腫瘍重量を有意に低下させたことを示している（Ｐ＝＜０．００１）。しかしながらｈｕＣＢＥ１１単独投与と比較してベバシツマブと組み合わせたｈｕＣＢＥ１１は投与開始時に約６５ｍｇのＫＭ−２０Ｌ２腫瘍を担持していた投与マウスにおいて腫瘍重量を有意に低下させなかった。
【０２５９】
意外にも、ベヒクル投与又はｈｕＣＢＥ１１又はベバシツマブ単独投与と比較して、ｈｕＣＢＥ１１とベバシツマブの組み合わせは投与開始時に約２００ｍｇのＫＭ−２０Ｌ２腫瘍を担持していた投与マウスにおいて腫瘍重量を有意に低下させた（図７及び８）。図９に示す通り、ｈｕＣＢＥ１１とベバシツマブによる２００ｍｇのＫＭ−２０Ｌ２腫瘍の複合治療は２６％の％Ｔ／Ｃ（即ち７４％の％腫瘍抑制）を有しており、これは有意な４２％のレベルより十分低値であり、そしてｈｕＣＢＥ１１及びベバシツマブの何れか単独による大型の腫瘍の治療で観察された％Ｔ／Ｃより低値である。このように大型腫瘍の腫瘍の大きさの低減が増強されたことは、ベバシツマブが大型腫瘍の大きさの低減においては有効でないことが先の分析で示されていたことから、予期されないものであった。
【０２６０】
Ｂ．ＷｉＤｒヒト結腸結腸直腸異種移植片モデルにおけるｈｕＣＢＥ１１とベバシツマブの組み合わせを用いた腫瘍の大きさの低減
ｈｕＣＢＥ１１と組み合わせた生物学的物質、例えば血管形成を抑制する生物学的物質、例えば抗ＶＥＧＦ抗体、例えばベバシツマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）の投与が腫瘍の大きさの低減において有効であるかどうかを調べるために、ＷｉＤｒ（ヒト結腸直腸）異種移植片モデルを用いてｈｕＣＢＥ１１と組み合わせてベバシツマブを投与した。
【０２６１】
用量範囲試験を実施することによりベバシツマブ及びｈｕＣＢＥ１１の抗腫瘍作用を検討するための適切なベバシツマブ及びｈｕＣＢＥ１１の用量を求めた。用量試験では又、独立して腫瘍生育を抑制することに関し、各薬剤の抗腫瘍の薬効を調べた。約６５ｍｇのＷｉＤｒ腫瘍（移植後約６〜７日）を担持した無胸腺ヌードマウスに食塩水（対照）（ｎ＝１５；２００μＬ腹腔内、週２回）又はｈｕＣＢＥ１１（用量当たりｎ＝１０；０．２ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、又は２０ｍｇ／ｋｇを腹腔内、週２回）の何れかを投与した。同様に、約１００ｍｇのＷｉＤｒ腫瘍又は１００ｍｇのＷｉＤｒ腫瘍（移植後約６〜７日）を担持した無胸腺ヌードマウスに食塩水（対照）（ｎ＝１５；２００μＬ腹腔内、週２回）又はベバシツマブ（用量当たりｎ＝１０；１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、又は４ｍｇ／ｋｇを腹腔内、週２回）の何れかを投与した。腫瘍の重量は第５日、及びその後は動物屠殺時まで定期的に計測した。
【０２６２】
０．２ｍｇ／ｋｇ及び２０ｍｇ／ｋｇのｈｕＣＢＥ１１用量群における腫瘍重量は移植後第３５日において食塩水対照群と有意差がなかった。しかしながら、ｈｕＣＢＥ１１は２ｍｇ／ｋｇ又は４ｍｇ／ｋｇの用量においてはヌードマウスのＷｉＤｒヒト結腸腫瘍重量の有意な抑制をもたらした（Ｐ＜０．０５）（図１０）。並行した試験において、第３８日にベバシツマブが４ｍｇ／ｋｇの用量において投与開始時に約１００ｍｇ／ｋｇの何れかの重量であった腫瘍に対して、腫瘍重量の有意な抑制をもたらしたことがわかった（Ｐ＜０．０１）（図１１）。
【０２６３】
ベバシツマブ及びｈｕＣＢＥ１１の複合投与が腫瘍重量の抑制において有意な増大を有するかどうかを調べるために、約６５ｍｇのＷｉＤｒ腫瘍を担持した無胸腺ヌードマウスに対して複合試験を実施した。この試験ではｈｕＣＢＥ１１（２ｍｇ／ｋｇ）及びベバシツマブ（４ｍｇ／ｋｇ）の作用を比較することにより薬効を調べた。
【０２６４】
複合試験の結果（図１２〜１４に示す）はベヒクル又はｈｕＣＢＥ１１又はベバシツマブ単独投与と比較して、ベバシツマブと組み合わせたｈｕＣＢＥ１１は投与開始時に約６５ｍｇのＷｉＤｒ腫瘍を担持していた投与マウスにおいて腫瘍重量を有意に低下させたことを示している。しかしながらｈｕＣＢＥ１１単独投与と比較してベバシツマブと組み合わせたｈｕＣＢＥ１１は投与開始時に約６５ｍｇのＷｉＤｒ腫瘍を担持していた投与マウスにおいて腫瘍重量を有意に低下させなかった。
【０２６５】
ＫＭ−２０Ｌ２を用いた場合に得られた結果と同様に、ベヒクル投与又はｈｕＣＢＥ１１又はベバシツマブ単独投与と比較して、ｈｕＣＢＥ１１とベバシツマブの組み合わせは投与開始時に約２００ｍｇのＷｉＤｒ腫瘍を担持していた投与マウスにおいて腫瘍重量を有意に低下させた（図１５及び１６）。図１７に示す通り、ｈｕＣＢＥ１１とベバシツマブによる２００ｍｇのＷｉＤｒ腫瘍の複合治療は３７％の％Ｔ／Ｃ（即ち６３％の％腫瘍抑制）を有しており、これは有意な４２％のレベルより十分低値であり、そしてｈｕＣＢＥ１１又はベバシツマブの何れかを単独による大型の腫瘍の治療で観察された％Ｔ／Ｃより低値である。このように大型腫瘍の腫瘍の大きさの低減が増強されたことは、ベバシツマブが大型腫瘍の大きさの低減においては有効でないことが先の分析で示されていたことから、予期されないものであった。
【０２６６】
（等価物）
本発明は特にＬＴ−β−Ｒ抗体の関与する複合療法を提供する。本発明の特定の実施形態を考察したが、上記明細書は説明であり、限定ではない。本発明の多くの変形例は本明細書を鑑みれば当業者には自明である。本発明の完全な範囲は特許請求の範囲、並びにその完全な範囲の等価物、及び明細書、並びにその変形例を参照することにより決定されるものである。
【０２６７】
本明細書において言及した全ての公開物及び特許は、以下に列挙する対象物を含めて、各々の個々の公開物又は特許が特定的及び個別に参照により取り込まれることが示されるが如く、参照により全体が本明細書に組み込まれる。矛盾がある場合は、本明細書における何れかの定義を含めて本出願が優先する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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