(57)【要約】  本発明は、ナイセリアワクチン組成物、それらの製造、及びかかる組成物の医薬における使用の分野に関する。より具体的には、本発明は、ナイセリア（特に髄膜炎菌）の外膜小胞（すなわちブレブ）ワクチンの製造により好適な、新規な操作された髄膜炎菌の作製方法に関する。また、ヒト被験者における使用により安全でありかつより有効である新規なＬＯＳサブユニット又は髄膜炎菌外膜小胞（すなわちブレブ）ワクチンの使用に基づく有利な方法及びワクチン製品を記載する。【選択図】  図２Ａ
2009539923.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナイセリア株由来のＬ２  ＬＯＳ及びＬ３  ＬＯＳを含む免疫原性組成物であって、Ｌ２及びＬ３  ＬＯＳが、以下の構造：
【化１】
2009539923.tif 000029
〔Ｌ２  ＬＯＳについて、式中、
Ｒ１＝
【化２】
2009539923.tif 000030
であり、
Ｒ２＝Ｈ、ＰＥＡ、又はＧｌｃであり、
Ｒ３＝ＰＥＡであり、
Ｒ４＝Ｈ又はＯＡｃであり、
Ｒ５＝Ｈ、ＰＥＡ、又はＧｌｙであり、
Ｌ３  ＬＯＳについて、式中、
Ｒ１＝
【化３】
2009539923.tif 000031
であり、
Ｒ２＝ＰＥＡであり、
Ｒ３＝Ｈであり、
Ｒ４＝Ｈ又はＯＡｃであり、
Ｒ５＝Ｈ、ＰＥＡ、又はＧｌｙである。〕
を有する、上記免疫原性組成物。
【請求項２】
Ｌ２  ＬＯＳについて、Ｒ１＝
【化４】
2009539923.tif 000032
である、請求項１記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
Ｌ２  ＬＯＳについて、Ｒ２＝Ｈ、ＰＥＡ又はＧｌｃである、請求項１又は２記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
Ｌ２  ＬＯＳについて、Ｒ５＝Ｈ、ＰＥＡ又はＧｌｙである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
Ｌ２  ＬＯＳについて、Ｒ４＝Ｈ又はＯＡｃである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
Ｌ３  ＬＯＳについて、Ｒ１＝
【化５】
2009539923.tif 000033
である、請求項１〜５のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
Ｌ３  ＬＯＳについて、Ｒ４＝Ｈ又はＯＡｃである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
Ｌ３  ＬＯＳについて、Ｒ５＝Ｈ、ＰＥＡ又はＧｌｙである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
ナイセリア株由来のＬ１０  ＬＯＳ、場合により髄膜炎菌Ａ株、Ｂ株、Ｃ株、Ｗ１３５株又はＹ株から単離されたもの、をさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
以下の構造を有するＬ１０  ＬＯＳ：
【化６】
2009539923.tif 000034
〔式中、
Ｒ１＝ヘキソース−ヘキソース−であり、
Ｒ２＝Ｈ又はＰＥＡであり、
Ｒ３＝ＰＥＡであり、
Ｒ４＝ＯＡｃであり、
Ｒ５＝Ｈ又はＧｌｙである。〕
をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
Ｌ１０  ＬＯＳについて、Ｒ１＝Ｇａｌ−Ｇａｌ−、Ｇａｌ−Ｇｌｃ−、Ｇｌｃ−Ｇａｌ−、又はＧｌｃ−Ｇｌｃ−である、請求項１０記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
Ｌ１０  ＬＯＳについて、Ｒ１＝
【化７】
2009539923.tif 000035
である、請求項１１記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
Ｌ１０  ＬＯＳについて、Ｒ１の末端ヘキソースが、（場合によりα−Ｎｅｕ５Ａｃ−（２→３）基を介して）シアル化されている、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
Ｌ１０  ＬＯＳについて、Ｒ２＝Ｈ又はＰＥＡである、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
Ｌ１０  ＬＯＳについて、Ｒ５＝Ｈ又はＧｌｙである、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
Ｌ２  ＬＯＳが、Ｌ４免疫型を有するＬＯＳではない、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
Ｌ２  ＬＯＳがＲ２＝ＰＥＡ又はＧｌｃを有し、組成物が、以下の構造を有するＬ４  ＬＯＳ：
【化８】
2009539923.tif 000036
〔Ｌ４  ＬＯＳについて、式中、
Ｒ１＝
【化９】
2009539923.tif 000037
であり、
Ｒ２＝Ｈであり、
Ｒ３＝ＰＥＡであり、
Ｒ４＝ＯＡｃであり、
Ｒ５＝Ｇｌｙである。〕
をさらに含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
Ｌ４  ＬＯＳが、Ｒ４＝ＯＡｃの代わりにＨであり、及び／又はＲ５＝Ｇｌｙの代わりにＨである、請求項１７記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
Ｌ４  ＬＯＳが髄膜炎菌Ａ株、Ｂ株、Ｃ株、Ｗ１３５株又はＹ株から単離されたものである、請求項１７又は１８記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
Ｌ２  ＬＯＳが髄膜炎菌Ａ株、Ｂ株、Ｃ株、Ｗ１３５株又はＹ株から単離されたものである、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】
Ｌ３  ＬＯＳが髄膜炎菌Ａ株、Ｂ株、Ｃ株、Ｗ１３５株又はＹ株から単離されたものである、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２２】
Ｌ２  ＬＯＳ、Ｌ３  ＬＯＳ、Ｌ１０  ＬＯＳ、Ｌ４  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ３  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ３及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ４及びＬ２  ＬＯＳ、Ｌ４及びＬ３  ＬＯＳ、Ｌ４及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ３及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ３及びＬ４  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ４及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ３及びＬ４及びＬ１０  ＬＯＳ、又はＬ２及びＬ３及びＬ１０及びＬ４  ＬＯＳが、タンパク質キャリアとコンジュゲートされている、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】
Ｌ２  ＬＯＳ、Ｌ３  ＬＯＳ、Ｌ１０  ＬＯＳ、Ｌ４  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ３  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ３及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ４及びＬ２  ＬＯＳ、Ｌ４及びＬ３  ＬＯＳ、Ｌ４及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ３及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ３及びＬ４  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ４及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ３及びＬ４及びＬ１０  ＬＯＳ、又はＬ２及びＬ３及びＬ１０及びＬ４  ＬＯＳが、無毒化リピドＡ部分（例えばｍｓｂＢ（−）ナイセリア株から単離されたＬＯＳと一致する第２アシル鎖を欠損するもの）を有する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２４】
Ｌ２  ＬＯＳ、Ｌ３  ＬＯＳ、Ｌ１０  ＬＯＳ、Ｌ４  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ３  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ３及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ４及びＬ２  ＬＯＳ、Ｌ４及びＬ３  ＬＯＳ、Ｌ４及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ３及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ３及びＬ４  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ４及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ３及びＬ４及びＬ１０  ＬＯＳ、又はＬ２及びＬ３及びＬ１０及びＬ４  ＬＯＳが、ＬＯＳの毒性低減に適したリピドＡ結合ペプチド（ＳＡＥＰ２又はＳＡＥＰＩＩなど）と複合体化されている、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２５】
Ｌ２  ＬＯＳ、Ｌ３  ＬＯＳ、Ｌ１０  ＬＯＳ、Ｌ４  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ３  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ３及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ４及びＬ２  ＬＯＳ、Ｌ４及びＬ３  ＬＯＳ、Ｌ４及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ３及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ３及びＬ４  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ４及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ３及びＬ４及びＬ１０  ＬＯＳ、又はＬ２及びＬ３及びＬ１０及びＬ４  ＬＯＳが、免疫原性組成物中に精製ＬＯＳ調製物として存在する、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２６】
Ｌ２  ＬＯＳ、Ｌ３  ＬＯＳ、Ｌ１０  ＬＯＳ、Ｌ４  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ３  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ３及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ４及びＬ２  ＬＯＳ、Ｌ４及びＬ３  ＬＯＳ、Ｌ４及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ３及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ３及びＬ４  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ４及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ３及びＬ４及びＬ１０  ＬＯＳ、又はＬ２及びＬ３及びＬ１０及びＬ４  ＬＯＳが、免疫原性組成物中にリポソーム調製物として存在する、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２７】
Ｌ２  ＬＯＳ、Ｌ３  ＬＯＳ、Ｌ１０  ＬＯＳ、Ｌ４  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ３  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ３及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ４及びＬ２  ＬＯＳ、Ｌ４及びＬ３  ＬＯＳ、Ｌ４及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ３及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ３及びＬ４  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ４及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ３及びＬ４及びＬ１０  ＬＯＳ、又はＬ２及びＬ３及びＬ１０及びＬ４  ＬＯＳが、免疫原性組成物中にブレブ調製物として存在する、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２８】
ブレブ調製物（複数でもよい）が、０〜０．５、０．０２〜０．４、０．０４〜０．３、０．０６〜０．２、０．０８〜０．１５又は０．０９〜０．１１％の界面活性剤、好ましくはデオキシコーレートを用いる抽出ステップの後に各ナイセリア株から単離されたものである、請求項２７記載の免疫原性組成物。
【請求項２９】
Ｌ２  ＬＯＳ、Ｌ３  ＬＯＳ、Ｌ１０  ＬＯＳ、Ｌ４  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ３  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ３及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ４及びＬ２  ＬＯＳ、Ｌ４及びＬ３  ＬＯＳ、Ｌ４及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ３及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ３及びＬ４  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ４及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ３及びＬ４及びＬ１０  ＬＯＳ、又はＬ２及びＬ３及びＬ１０及びＬ４  ＬＯＳのブレブ調製物（複数でもよい）が、鉄塩の存在下における培養後の各ナイセリア株（複数でもよい）から単離されたものである、請求項２７又は２８記載の免疫原性組成物。
【請求項３０】
Ｌ２  ＬＯＳ、Ｌ３  ＬＯＳ、Ｌ１０  ＬＯＳ、Ｌ４  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ３  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ３及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ４及びＬ２  ＬＯＳ、Ｌ４及びＬ３  ＬＯＳ、Ｌ４及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ３及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ３及びＬ４  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ４及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ３及びＬ４及びＬ１０  ＬＯＳ、又はＬ２及びＬ３及びＬ１０及びＬ４  ＬＯＳのブレブ調製物（複数でもよい）が、鉄塩の不在下における培養後の各ナイセリア株（複数でもよい）から単離されたものである、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３１】
ブレブ調製物（複数でもよい）が、莢膜多糖を合成することができないナイセリア株（複数でもよい）から単離されたものである、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３２】
ナイセリア株（複数でもよい）が、それが由来する天然株（複数でもよい）と比較して、莢膜多糖遺伝子ｃｔｒＡ、ｃｔｒＢ、ｃｔｒＣ、ｃｔｒＤ、ｓｙｎＡ、ｓｙｎＢ、ｓｙｎＣ又は好ましくはｓｉａＤの１つの発現が下方制御されている、好ましくは欠失しており（機能的発現がない）、Ｌ２及びＬ３ブレブの両方が存在する場合には、それが由来する株は好ましくはそれぞれの株において同じ莢膜多糖遺伝子の発現が下方制御されている、請求項３１記載の免疫原性組成物。
【請求項３３】
ブレブ調製物（複数でもよい）が、それが由来する天然株（複数でもよい）と比較して、リピドＡ遺伝子ｍｓｂＢ又はｈｔｒＢの一方又は両方、好ましくは前者、の発現が下方制御されている、好ましくは欠失している（機能的発現がない）ナイセリア株（複数でもよい）から単離されたものであり、Ｌ２及びＬ３ブレブの両方が存在する場合には、それが由来する株は好ましくはそれぞれの株において同じリピドＡ遺伝子（複数でもよい）の発現が下方制御されている、請求項２７〜３２のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３４】
ブレブ調製物（複数でもよい）が、それが由来する天然株（複数でもよい）と比較して、外膜タンパク質遺伝子ｐｏｒＡ、ｐｏｒＢ、ｏｐＡ、ｏｐＣ、ｐｉｌＣ、ｌｂｐＡ又はｆｒｐＢの１以上の発現が下方制御されている、好ましくは欠失しているナイセリア株（複数でもよい）から単離されたものであり、Ｌ２及びＬ３ブレブの両方が存在する場合には、それが由来する株は好ましくはそれぞれの株において同じ外膜タンパク質遺伝子（複数でもよい）の発現が下方制御されている、請求項２７〜３３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３５】
鉄塩の存在下で培養されるナイセリア株のいずれか（複数でもよい）が、それが由来する天然株（複数でもよい）と比較して、以下の外膜タンパク質遺伝子の組合せ：ＰｏｒＡとＯｐＡ、ＰｏｒＡとＯｐＣ、ＯｐＡとＯｐＣ、ＰｏｒＡとＯｐＡとＯｐＣ、のいずれかの発現が下方制御されている、好ましくは欠失している、請求項３４記載の免疫原性組成物。
【請求項３６】
鉄塩の不在下で培養されるナイセリア株のいずれか（複数でもよい）が、それが由来する天然株（複数でもよい）と比較して、以下の外膜タンパク質遺伝子の組合せ：ＰｏｒＡとＯｐＡ、ＰｏｒＡとＯｐＣ、ＯｐＡとＯｐＣ、ＰｏｒＡとＯｐＡとＯｐＣ、ＰｏｒＡとＦｒｐＢ、ＯｐＣとＦｒｐＢ、ＯｐＡとＦｒｐＢ、ＰｏｒＡとＯｐＡ、ＯｐＣとＦｒｐＢ、ＰｏｒＡとＬｂｐＡ、ＦｒｐＢとＬｂｐＡ、ＰｏｒＡとＦｒｐＢとＬｂｐＡのいずれか、の発現が下方制御されている、好ましくは欠失している、請求項３４又は３５記載の免疫原性組成物。
【請求項３７】
ブレブ調製物（複数でもよい）が、外膜タンパク質抗原ＮｓｐＡ、ＴｂｐＡ  ｌｏｗ、ＴｂｐＡ  ｈｉｇｈ、Ｈｓｆ、Ｈａｐ、ＯＭＰ８５、ＰｉｌＱ、ＮａｄＡ、ＧＮＡ１８７０、ＭｌｔＡの１以上の発現が上方制御されているナイセリア株（複数でもよい）から単離されたものであり、Ｌ２及びＬ３ブレブの両方が存在する場合には、それが由来する株は好ましくはそれぞれの株において１以上の異なる外膜タンパク質抗原の発現が上方制御されている、請求項２７〜３６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３８】
ＮｓｐＡの発現が上方制御されているナイセリア株から単離されたＬ２及び／又はＬ３ブレブ調製物を含み、好ましくはナイセリア株が鉄塩の存在下で培養されたものである、請求項３７記載の免疫原性組成物。
【請求項３９】
Ｈｓｆの発現が上方制御されているナイセリア株から単離されたＬ２及び／又はＬ３ブレブ調製物を含む、請求項３７又は３８記載の免疫原性組成物。
【請求項４０】
Ｔｂｐ  ｈｉｇｈの発現が上方制御されているナイセリア株から単離されたＬ２及び／又はＬ３ブレブ調製物を含み、好ましくはナイセリア株が鉄塩の不在下で培養されたものである、請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４１】
Ｔｂｐ  ｌｏｗの発現が上方制御されているナイセリア株から単離されたＬ２及び／又はＬ３ブレブ調製物を含み、好ましくはナイセリア株が鉄塩の不在下で培養されたものである、請求項３７〜４０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４２】
請求項１〜４１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物の有効量と薬学的に許容される担体とを含むワクチン組成物。
【請求項４３】
アジュバント、例えば水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウム、をさらに含む、請求項４２記載のワクチン。
【請求項４４】
髄膜炎菌血清群Ａ、髄膜炎菌血清群Ｃ、髄膜炎菌血清群Ｗ−１３５、髄膜炎菌血清群Ｙ、及びインフルエンザ菌ｂ型の株に由来する、１以上のコンジュゲートした莢膜多糖又はオリゴ糖をさらに含む、請求項４２又は４３記載のワクチン。
【請求項４５】
髄膜炎菌血清群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５及びＹから選択される１以上によって引き起こされる疾患の予防又は治療のための医薬の製造における、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物又は請求項４２〜４４のいずれか１項に記載のワクチンの使用。
【請求項４６】
髄膜炎菌血清群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５及びＹから選択される１以上によって引き起こされる疾患の予防又は治療方法であって、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物又は請求項４２〜４４のいずれか１項に記載のワクチンの有効量をその必要があるヒト患者に投与するステップを含む方法。
【請求項４７】
予防又は治療が髄膜炎菌血清群Ａの疾患のものである、請求項４５又は４６記載の使用又は方法。
【請求項４８】
予防又は治療が髄膜炎菌血清群Ｂの疾患のものである、請求項４５〜４７のいずれか１項に記載の使用又は方法。
【請求項４９】
予防又は治療が髄膜炎菌血清群Ｃの疾患のものである、請求項４５〜４８のいずれか１項に記載の使用又は方法。
【請求項５０】
予防又は治療が髄膜炎菌血清群Ｗ１３５の疾患のものである、請求項４５〜４９のいずれか１項に記載の使用又は方法。
【請求項５１】
予防又は治療が髄膜炎菌血清群Ｙの疾患のものである、請求項４５〜５０のいずれか１項に記載の使用又は方法。
【請求項５２】
請求項１〜４１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物又は請求項４２〜４４のいずれか１項に記載のワクチンの製造方法であって、Ｌ２  ＬＯＳ及びＬ３  ＬＯＳを単離するステップ、Ｌ２及びＬ３  ＬＯＳを組み合わせるステップ、並びに薬学的に許容される賦形剤と共にＬ２及びＬ３  ＬＯＳを製剤化するステップを含む方法。
【請求項５３】
髄膜炎菌免疫型Ｌ２疾患の予防又は治療のための医薬の製造における、ナイセリア株由来のＬ３Ｖ  ＬＯＳを含む免疫原性組成物の、あるいは髄膜炎菌免疫型Ｌ３Ｖ疾患の予防又は治療のための医薬の製造における、ナイセリア株由来のＬ２  ＬＯＳを含む免疫原性組成物の使用。
【請求項５４】
髄膜炎菌免疫型Ｌ２疾患の予防又は治療方法であって、その必要があるヒト患者に、ナイセリア株由来のＬ３Ｖ  ＬＯＳを含む免疫原性組成物の有効量を投与するステップを含む方法、あるいは髄膜炎菌免疫型Ｌ３Ｖ疾患の予防又は治療方法であって、その必要があるヒト患者に、ナイセリア株由来のＬ２  ＬＯＳを含む免疫原性組成物の有効量を投与するステップを含む方法。
【請求項５５】
Ｌ３Ｖ  ＬＯＳが、以下の構造：
【化１０】
2009539923.tif 000038
〔式中、
Ｒ１＝
【化１１】
2009539923.tif 000039
であり、
Ｒ２＝ＰＥＡであり、
Ｒ３＝ＰＥＡであり、
Ｒ４＝Ｈ又はＯＡｃであり、
Ｒ５＝Ｈ、ＰＥＡ、又はＧｌｙである。〕
を有する、請求項５３又は５４記載の使用又は方法。
【請求項５６】
Ｒ１＝
【化１２】
2009539923.tif 000040
である、請求項５５記載の使用又は方法。
【請求項５７】
Ｒ５＝Ｈ、ＰＥＡ、又はＧｌｙである、請求項５５又は５６記載の使用又は方法。
【請求項５８】
Ｒ４＝Ｈ又はＯＡｃである、請求項５５〜５７のいずれか１項に記載の使用又は方法。
【請求項５９】
Ｌ２  ＬＯＳが、以下の構造：
【化１３】
2009539923.tif 000041
〔式中、
Ｒ１＝
【化１４】
2009539923.tif 000042
であり、
Ｒ２＝Ｇｌｃであり、
Ｒ３＝ＰＥＡであり、
Ｒ４＝Ｈ又はＯＡｃであり、
Ｒ５＝Ｈ、ＰＥＡ、又はＧｌｙである。〕
を有する、請求項５３又は５４記載の使用又は方法。
【請求項６０】
Ｒ１＝
【化１５】
2009539923.tif 000043
である、請求項５９記載の使用又は方法。
【請求項６１】
Ｒ５＝Ｈ、ＰＥＡ又はＧｌｙである、請求項５９又は６０記載の使用又は方法。
【請求項６２】
Ｒ４＝Ｈ又はＯＡｃである、請求項５９〜６１のいずれか１項に記載の使用又は方法。
【請求項６３】
Ｌ３Ｖ又はＬ２  ＬＯＳがタンパク質キャリアとコンジュゲートされている、請求項５３〜６２のいずれか１項に記載の使用又は方法。
【請求項６４】
Ｌ３Ｖ又はＬ２  ＬＯＳが、無毒化リピドＡ部分（例えばｍｓｂＢ（−）ナイセリア株から単離されたＬＯＳと一致する第２アシル鎖を欠損するもの）を含む、請求項５３〜６３のいずれか１項に記載の使用又は方法。
【請求項６５】
Ｌ３Ｖ又はＬ２  ＬＯＳが、ＬＯＳの毒性低減に適したリピドＡ結合ペプチド（ＳＡＥＰ２又はＳＡＥＰＩＩなど）との複合体化による無毒化リピドＡ部分を有する、請求項５３〜６４のいずれか１項に記載の使用又は方法。
【請求項６６】
Ｌ３Ｖ又はＬ２  ＬＯＳが、精製ＬＯＳ調製物として、リポソーム調製物として、又はブレブ調製物として免疫原性組成物中に存在する、請求項５３〜６５のいずれか１項に記載の使用又は方法。
【請求項６７】
ブレブ調製物が、０〜０．５、０．０２〜０．４、０．０４〜０．３、０．０６〜０．２、０．０８〜０．１５又は０．０９〜０．１１％の界面活性剤、好ましくはデオキシコーレートを用いる抽出ステップの後に各ナイセリア株から単離されたものである、請求項６６記載の使用又は方法。
【請求項６８】
ブレブ調製物が、莢膜多糖を合成することができないナイセリア株から単離されたものである、請求項６６又は６７記載の使用又は方法。
【請求項６９】
ナイセリア株が、それが由来する天然株と比較して、莢膜多糖遺伝子ｃｔｒＡ、ｃｔｒＢ、ｃｔｒＣ、ｃｔｒＤ、ｓｙｎＡ、ｓｙｎＢ、ｓｙｎＣ又は好ましくはｓｉａＤの１つの発現が下方制御されている、好ましくは欠失している（機能的発現がない）、請求項６８記載の使用又は方法。
【請求項７０】
ブレブ調製物が、それが由来する天然株と比較して、リピドＡ遺伝子ｍｓｂＢ又はｈｔｒＢの一方又は両方、好ましくは前者、の発現が下方制御されている、好ましくは欠失している（機能的発現がない）ナイセリア株から単離されたものである、請求項６６〜６９のいずれか１項に記載の使用又は方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナイセリアワクチン組成物、それらの製造、及びかかる組成物の医薬における使用の分野に関する。より具体的には、ナイセリア（特に髄膜炎菌）の外膜小胞（すなわち、ブレブ）ワクチンの製造により適した新規な操作された髄膜炎菌株の作製方法に関する。新規のＬＯＳサブユニット又は髄膜炎菌外膜小胞（すなわち、ブレブ）ワクチンの使用に基づく有利な方法及びワクチン製品もまた記載しており、これはヒト被験者における使用のために安全性及び有効性をより高めたものである。
【背景技術】
【０００２】
髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）は、しばしばヒト上気道より単離されるグラム陰性細菌である。この細菌は、菌血症及び髄膜炎等の重篤な侵襲性細菌性疾患の原因である。髄膜炎菌疾患の発生数は、地理的、季節的及び年次的な差異を示す（Schwartz, B., Moore, P.S., Broome, C.V.; Clin. Microbiol. Rev. 2(Supplement), S18-S24, 1989）。この細菌は通常、その莢膜多糖による血清群に従って分類される。
【０００３】
温暖な国々で最も多い疾患は、血清群Ｂ株によるものであり、発症率は総人口の１〜１０人／１００，０００人／年の間で変動し、それより高い値に達する場合もある（Kaczmarski, E.B. (1997), Commun. Dis. Rep. Rev. 7: R55-9, 1995；Scholten, R.J.P.M., Bijlmer, H.A., Poolman, J.T.ら Clin. Infect. Dis. 16:237-246, 1993；Cruz, C., Pavez, G., Aguilar, E.,ら Epidemiol. Infect. 105:119-126, 1990）。
【０００４】
血清群Ａ髄膜炎菌が優位を占める流行の大部分は中央アフリカで発生し、その発症率が１０００人／１００，０００人／年のレベルにまで達する場合もある（Schwartz, B., Moore, P.S., Broome, C.V. Clin. Microbiol. Rev. 2(Supplement), S18-S24, 1989）。全体として、髄膜炎菌疾患のほとんど全ての症例は、血清群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ−１３５及びＹの髄膜炎菌によって引き起こされ、四価のＡ、Ｃ、Ｗ−１３５、Ｙ莢膜多糖ワクチンが利用可能である（Armand, J., Arminjon, F., Mynard, M.C., Lafaix, C., J. Biol. Stand. 10:335-339, 1982）。
【０００５】
髄膜炎菌感染の頻度は、過去数十年、多くのヨーロッパの国々において増加してきている。これは、社会的活動の場（例えば、水泳プール、劇場等）の増加による伝染の増加に起因してきた。いくつかの標準的な抗生物質に対して感受性が低い又は耐性の髄膜炎菌株を単離することは、もはや珍しいことではない。この現象は、新たな抗菌剤、ワクチン、薬剤スクリーニング法、及びこれらの生物についての診断検査に対する、未だ満たされていない医学的ニーズ及び需要を生み出した。
【０００６】
利用可能な多糖ワクチンは、現在、それらをキャリアタンパク質に化学的にコンジュゲートする方法によって改良が行われている（Lieberman, J.M., Chiu, S.S.Wong, V.K.らJAMA 275:1499-1503, 1996）。
【０００７】
しかしながら、血清群Ｂワクチンは利用可能な状況にない。血清群Ｂ莢膜多糖は、免疫原性を示さないことが分かってきたが、それは恐らくそれが宿主成分との構造類似性を有するためであろう（Wyle, F.A., Artenstein, M.S., Brandt, M.L.ら J. Infect. Dis. 126:514-522, 1972；Finne, J.M., Leinonen, M., Makela, P.M. Lancet ii.:355-357, 1983）。従って、外膜小胞（すなわちブレブ）又はそれらから得た精製タンパク質成分から、血清群Ｂワクチンの開発を試みることに焦点を当てた努力がされてきた。
【０００８】
ワクチン開発のための別の髄膜炎菌抗原は、髄膜炎菌のリポオリゴ糖（ＬＯＳ）である。これらは外膜に結合した糖脂質であり、Ｏ側鎖を欠損しているという点で腸内細菌科（Enterobacteriaceae）細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）と異なり、従ってＬＰＳのラフ型と類似している（GriffissらRev Infect Dis 1988, 10:S287-295）。ＬＯＳのオリゴ糖部分の異質性は、異なる髄膜炎菌株における構造的な及び抗原性の多様性を生み出す（GriffissらInf. Immun. 1987, 55:1792-1800）。このことは、かかる株を１２種類の免疫型にさらに分類するために用いられている（ScholtanらJ Med Microbiol 1994, 41:236-243）。免疫型の決定は、通常、既知の免疫型のＬＯＳに対して生成された吸着ポリクローナル抗体を用いるオクタロニー法によって行われる（Poolman JT, Hopman CTP及びZanen HC, FEMS Microbiol Letters (1982) 13: 339-348）。免疫型Ｌ３、Ｌ７及びＬ９は、免疫学的に同一であり、かつ構造的に類似（若しくは全く同一）であり、従ってＬ３，７，９（又は、本明細書において総称的に「Ｌ３」）と呼ばれている。髄膜炎菌のＬＯＳ  Ｌ３，７，９（Ｌ３）、Ｌ２及びＬ５は、シアル化によって、又はシチジン５'−一リン酸−Ｎ−アセチルノイラミン酸の付加によって修飾されることがある。Ｌ２、Ｌ４及びＬ６  ＬＯＳは免疫学的に区別することができるが、しかしそれらは構造的に類似しており、本明細書でＬ２に言及する場合にはＬ４又はＬ６のいずれかと任意に置換することができ、これは本発明の範囲内となる。ＬＯＳに対する抗体は、実験用ラットにおいて感染に対し防御し、また髄膜炎菌に感染した小児において殺菌活性に寄与することが示されている（GriffissらJ Infect Dis 1984, 150:71-79）。
【０００９】
しかしながら髄膜炎菌ワクチンにおけるＬＯＳの使用に伴う問題は、その毒性（そのリピドＡ部分による毒性）にある。
【００１０】
またＬＯＳは髄膜炎菌のブレブの表面に存在する。髄膜炎菌の外膜小胞（すなわちブレブ）に基づいたワクチンの開発に焦点を当てて、長年にわたる努力がされてきた（de Moraes, J.C., Perkins, B., Camargo, M.C.らLancet 340:1074-1078, 1992、Bjune, G., Hoiby, E.A. Gronnesby, J.K.ら338:1093-1096, 1991）。そのようなワクチンは、宿主に投与した場合に防御免疫応答を誘発することのできる、正確に折り畳まれた立体構造をとったいくつかの完全な外膜タンパク質を含むという利点を有する。さらに、ナイセリア株（髄膜炎菌血清群Ｂ、すなわちｍｅｎＢを含む）は、工業的規模での製造を可能にするために十分な量の外膜ブレブを分泌する。しかしながら、ブレブは大抵、細菌細胞の０．５％界面活性剤（例えばデオキシコレート）抽出を含む方法により調製される（例えばＥＰ１１２４３）。それは上記のようなＬＯＳの毒性（内毒素とも呼ばれる）のために望ましいが、ワクチンからほとんどのＬＯＳ抗原を除去する作用もまたある。
【００１１】
ワクチン抗原としてのＬＯＳの使用に伴うさらなる問題は、多様な糖鎖構造を有する１２のＬＰＳ免疫型が存在することである（M.P.Jenningsら, Microbiology 1999, 145, 3013-3021；Mol Microbiol 2002, 43:931-43）。ある免疫型に対する抗体は、異なる免疫型を認識することができない。ＬＯＳ免疫型のオリゴ糖部分の共通「コア」領域を作製することに努力が集中されてきたが（例えばＷＯ９４／０８０２１号）、改変されたＬＯＳに対して生起された抗体の殺菌活性は失われる。従って、ワクチンは、有効であるために異なる免疫型の多くのＬＯＳ成分を有する必要があるだろう。
【００１２】
ヒトワクチンにおける抗原としてのＬＯＳ（ＬＰＳ又はリポ多糖としても知られる）の使用に伴うさらなる問題が存在し、それはすなわちそれらがヒト糖鎖構造（例えば、ヒト赤血球細胞上の）に類似した糖鎖構造を有しているため、それらの使用に伴う安全性の問題が突きつけられることである。さらにＬＯＳ構造の改変は、ＬＯＳ抗原の殺菌効果の構造的感受性のため、問題を含んでいる。
【００１３】
ＷＯ２００４／０１４４１７号は、これらの問題についてのいくつかの解決法を記載している。
【発明の概要】
【００１４】
本発明者はさらに以下の点を見出した：
−ＬＯＳ内部コアの修飾（decoration）は、免疫型の殺菌性エピトープの確定に重要である、
−異なる構造のＬＯＳの組合せが、髄膜炎菌血清群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５及びＹの髄膜炎菌疾患に対して有効であることが示された、
−既知の変異型免疫型Ｌ３Ｖは、抗Ｌ３血清によって殺菌されないが、抗Ｌ２血清によって殺菌される、
−Ｌ２  ＬＯＳをヘプトースＩＩに結合したＧｌｃＮＡｃ残基においてＯ−アセチル化修飾する酵素が見いだされ、それをコードする遺伝子がＯａｃ１である、
−Ｏ−アセチル化されているＬ３免疫型ＬＯＳが見出され（以前に報告されていない）、これはＬ３株に広範囲に存在すると考えられる、
−従来のＬ３  ＬＯＳに対する抗体はＯ−アセチル化Ｌ３株を死滅させることができるが、この殺菌は従来のＬ３株に対してそれほど有効ではない。
【００１５】
上記知見により、本発明者は、ナイセリアワクチン製剤の製造における、ナイセリアＬＯＳの新規かつ有益な使用を検討するに至った。
【００１６】
発明の概要
従って、本発明は、ナイセリア株由来のＬ２  ＬＯＳ及びＬ３  ＬＯＳを含む免疫原性組成物であって、該ＬＯＳが、以下の構造：
【化１】
2009539923.tif 000003
【００１７】
〔Ｌ２  ＬＯＳについて、式中、
Ｒ１＝
【化２】
2009539923.tif 000004
【００１８】
であり、
Ｒ２＝Ｈ、ＰＥＡ、又はＧｌｃであり、
Ｒ３＝ＰＥＡであり、
Ｒ４＝Ｈ又はＯＡｃであり、
Ｒ５＝Ｈ、ＰＥＡ、又はＧｌｙであり、
Ｌ３  ＬＯＳについて、式中、
Ｒ１＝
【化３】
2009539923.tif 000005
【００１９】
であり、
Ｒ２＝ＰＥＡであり、
Ｒ３＝Ｈであり、
Ｒ４＝Ｈ又はＯＡｃであり、
Ｒ５＝Ｈ、ＰＥＡ、又はＧｌｙである。〕
を有する、上記免疫原性組成物を提供する。
【００２０】
上記の用語はＬＯＳ分野の標準的な略語であり、例えばＧｌｃはグルコース（又はＤ−グルコピラノース）を表し、ＫＤＯは２−ケト−３−デオキシオクトネートを表し、ＨｅｐはＬ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトースを表し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを表し、Ｇａｌはガラクトースを表し、ＮｅｕＮａｃはシアル酸を表し、ＯＡｃはＯ−アセチルを表し、ＰＥＡはホスホエタノールアミン（又は２−アミノエチルホスフェート）を表し、Ｇｌｙはグリシンを表す、などである。
【００２１】
本明細書において「ナイセリア（neisserial）」は、いかなる場合にも、髄膜炎菌（N. meningitidis）、例えば血清群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５及びＹを示す。また、本発明のＬＯＳを産生しうる他の任意の株（例えば淋菌又はナイセリア・ラクタミカ（Neisseria lactamica））を示すこともある。
【００２２】
本発明のＬ２及びＬ３  ＬＯＳはそれぞれＬ２又はＬ３免疫型ではないＬＯＳを包含する場合がある（例えば本発明のＬ２  ＬＯＳは、Ｌ３免疫型のものとして現在知られているＬ３Ｖ  ＬＯＳを含むが、Ｌ３Ｖ  ＬＯＳを有する株は、Ｌ２免疫型を有するＬＯＳに対して生成された血清によって死滅する。下記参照）。よって、本発明の「Ｌ２  ＬＯＳ」及び「Ｌ３  ＬＯＳ」という用語の解釈は、この広い意味で解釈されるべきである。
【００２３】
本発明のＬ２又はＬ３  ＬＯＳは、髄膜炎菌Ａ株、Ｂ株、Ｃ株、Ｗ１３５株又はＹ株から単離することができる。
【００２４】
本発明のさらなる態様において、本発明の免疫原性組成物は、ナイセリア株由来のＬ１０  ＬＯＳ、例えば髄膜炎菌Ａ株、Ｂ株、Ｃ株、Ｗ１３５株又はＹ株から単離されたもの、をさらに含んでもよい。
【００２５】
例えば、本発明の免疫原性組成物はさらに、以下の構造を有するＬ１０  ＬＯＳ：
【化４】
2009539923.tif 000006
【００２６】
〔式中、
Ｒ１＝ヘキソース−ヘキソース−であり、
Ｒ２＝Ｈ又はＰＥＡであり、
Ｒ３＝ＰＥＡであり、
Ｒ４＝ＯＡｃであり、
Ｒ５＝Ｈ又はＧｌｙである。〕
を含んでもよい。
【００２７】
「Ｒ１＝ヘキソース−ヘキソース−」は、Ｇａｌ−Ｇａｌ−、Ｇａｌ−Ｇｌｃ−、Ｇｌｃ−Ｇａｌ−、又はＧｌｃ−Ｇｌｃ−残基、例えば：
Ｒ１＝
【化５】
2009539923.tif 000007
【００２８】
を包含する。
【００２９】
本発明のＬ１０  ＬＯＳにおけるＲ１末端ヘキソースは、シアル化されていてもよいし、されていなくてもよい（シアル化されている場合には、これは場合によりα−Ｎｅｕ５Ａｃ−（２→３）基を介していてもよい）。
【００３０】
本発明の一態様において、本発明の免疫原性組成物のＬ２  ＬＯＳは、Ｌ４免疫型を有するＬＯＳではない。
【００３１】
本発明の免疫原性組成物のＬ２  ＬＯＳがＲ２＝ＰＥＡ又はＧｌｃを有する場合には、本発明の免疫原性組成物はさらに、以下の構造を有する本発明のＬ４  ＬＯＳ：
【化６】
2009539923.tif 000008
【００３２】
〔Ｌ４  ＬＯＳについて、式中、
Ｒ１＝
【化７】
2009539923.tif 000009
【００３３】
であり、
Ｒ２＝Ｈであり、
Ｒ３＝ＰＥＡであり、
Ｒ４＝ＯＡｃであり、
Ｒ５＝Ｇｌｙである。〕
を含んでもよい。
【００３４】
あるいは、本発明のＬ４  ＬＯＳは、Ｒ４＝Ｈ及び／又はＲ５＝Ｈであってもよい。
【００３５】
本発明のＬ４  ＬＯＳは、髄膜炎菌Ａ株、Ｂ株、Ｃ株、Ｗ１３５株又はＹ株から単離することができる。
【００３６】
本明細書における「本発明の１以上のＬＯＳ」若しくは「本発明のＬＯＳ」又は類似の文言は、本発明のＬ２  ＬＯＳ、Ｌ３  ＬＯＳ、Ｌ１０  ＬＯＳ、Ｌ４  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ３  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ３及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ４及びＬ２  ＬＯＳ、Ｌ４及びＬ３  ＬＯＳ、Ｌ４及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ３及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ３及びＬ４  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ４及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ３及びＬ４及びＬ１０  ＬＯＳ、又はＬ２及びＬ３及びＬ１０及びＬ４  ＬＯＳを意味する。本明細書における「本発明のブレブ調製物」又は類似の文言は、本発明のＬ２  ＬＯＳ、Ｌ３  ＬＯＳ、Ｌ１０  ＬＯＳ、Ｌ４  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ３  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ３及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ４及びＬ２  ＬＯＳ、Ｌ４及びＬ３  ＬＯＳ、Ｌ４及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ３及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ３及びＬ４  ＬＯＳ、Ｌ２及びＬ４及びＬ１０  ＬＯＳ、Ｌ３及びＬ４及びＬ１０  ＬＯＳ、又はＬ２及びＬ３及びＬ１０及びＬ４  ＬＯＳを有する本発明の１又はそれ以上のブレブを意味する。本発明の細菌株は、それから本発明の１以上のＬＯＳを単離することができるものである。
【００３７】
本発明の１又はそれ以上のＬＯＳは、タンパク質キャリアとコンジュゲートされていてもよく、そのタンパク質キャリアは、Ｔヘルパーエピトープ源、例えば破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ１９７、又は髄膜炎菌ブレブ上の外膜タンパク質などである（下記参照）。その１又はそれ以上は、化学的に（下記参照）又は遺伝的に（例えばｍｓｂＢ（−）及び／又はｈｔｒＢ（−）であるナイセリア株から単離された場合。下記参照）、無毒化されたそのリピドＡ部分を有するものである。
【００３８】
本発明の１又はそれ以上のＬＯＳは、精製ＬＯＳ調製物として、リポソーム調製物（典型的には精製ＬＯＳを含む）として、又はブレブ調製物（下記参照）として、免疫原性組成物中に存在しうる。
【００３９】
本発明のブレブ調製物（複数でもよい）は、０〜０．５、０．０２〜０．４、０．０４〜０．３、０．０６〜０．２、０．０８〜０．１５又は０．０９〜０．１１％の界面活性剤、好ましくはデオキシコーレートを用いる抽出ステップの後に各ナイセリア株から単離することができる。それらの各ナイセリア株は、それが鉄を利用可能な条件下、又は鉄除去の条件下（例えば、デスフェラールなどの鉄キレート剤を添加する。下記参照）で培養されたものであってもよい。本発明のブレブ調製物は、莢膜多糖を合成することができないナイセリア株から単離されてもよい。例えば、その株は、それが由来する天然株と比較して、莢膜多糖遺伝子ｃｔｒＡ、ｃｔｒＢ、ｃｔｒＣ、ｃｔｒＤ、ｓｙｎＡ、ｓｙｎＢ、ｓｙｎＣ又は好ましくはｓｉａＤの１つの発現が下方制御されている、又は欠失している（すなわち、その遺伝子からの機能的発現がない）ものである。Ｌ２及びＬ３ブレブの両方が存在する（あるいは２以上の本発明のブレブ調製物が存在する）場合、それが由来する株はそれぞれの株において同じ莢膜多糖遺伝子の発現が下方制御されていることが好ましい。ナイセリア株は、それが由来する天然株と比較して、リピドＡ遺伝子ｍｓｂＢ又はｈｔｒＢの一方又は両方、好ましくは前者、の発現が下方制御されている、好ましくは欠失している（すなわち、その遺伝子からの機能的発現がない）ものであってもよい。Ｌ２及びＬ３ブレブの両方が存在する（あるいは２以上の本発明のブレブ調製物が存在する）場合、ブレブが由来する株はそれぞれの株において同じリピドＡ遺伝子（複数でもよい）の発現が下方制御されていることが好ましい。ナイセリア株は、それが由来する天然株と比較して、外膜タンパク質遺伝子ｐｏｒＡ、ｐｏｒＢ、ｏｐＡ、ｏｐＣ、ｐｉｌＣ、ｌｂｐＡ又はｆｒｐＢの１又はそれ以上の発現が下方制御されている、好ましくは欠失している（すなわち、その株の外膜上に遺伝子産物の発現がない）ものであってもよい。Ｌ２及びＬ３ブレブの両方が存在する（あるいは２以上の本発明のブレブ調製物が存在する）場合、これらの株は各ナイセリア株において同じ外膜タンパク質遺伝子（複数でもよい）の発現が下方制御されていることが好ましい。ナイセリア株は、外膜タンパク質抗原ＮｓｐＡ、ＴｂｐＡ  ｌｏｗ、ＴｂｐＡ  ｈｉｇｈ、Ｈｓｆ、Ｈａｐ、ＯＭＰ８５、ＰｉｌＱ、ＮａｄＡ、ＧＮＡ１８７０、ＭｌｔＡの１又はそれ以上の発現が上方制御されているものであってもよい。Ｌ２及びＬ３ブレブの両方が存在する（あるいは２以上の本発明のブレブ調製物が存在する）場合、それが由来する株はそれぞれの株において１又はそれ以上の異なる外膜タンパク質抗原の発現が上方制御されていることが好ましい。
【００４０】
さらに、有効量の本発明の免疫原性組成物及び薬学的に許容される担体を含むワクチン組成物を提供する。ワクチンは、アジュバント、例えば水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウム、をさらに含んでもよい。ワクチンは、以下の株：髄膜炎菌血清群Ａ、髄膜炎菌血清群Ｃ、髄膜炎菌血清群Ｗ−１３５、髄膜炎菌血清群Ｙ、及びインフルエンザ菌（H. influenzae）ｂ型に由来する、１又はそれ以上のコンジュゲートした莢膜多糖又はオリゴ糖をさらに含んでもよい。
【００４１】
以下のリスト：髄膜炎菌血清群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５及びＹから選択される１又はそれ以上によって引き起こされる疾患の予防又は治療のための医薬の製造における、本発明の免疫原性組成物又は本発明のワクチンの使用もまた提供する。さらに、以下のリスト：髄膜炎菌血清群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５及びＹから選択される１又はそれ以上によって引き起こされる疾患の予防又は治療方法であって、本発明の免疫原性組成物又は本発明のワクチンをその必要があるヒト患者に投与するステップを含む方法を提供する。
【００４２】
本発明の免疫原性組成物又はワクチンの製造方法であって、Ｌ２  ＬＯＳ及びＬ３  ＬＯＳを単離するステップ、Ｌ２及びＬ３  ＬＯＳを組み合わせるステップ、並びに薬学的に許容される賦形剤と共にＬ２及びＬ３  ＬＯＳを製剤化するステップを含む方法をさらに提供する。
【００４３】
本発明者は、Ｌ３Ｖ免疫型の菌株が驚くべきことにＬ２免疫型ＬＯＳに対して生起された血清による殺菌に感受性であることを見出した。本発明の目的のため、Ｌ３Ｖ免疫型は、免疫学的にはＬ２免疫型により類似しているため、Ｌ３株に分類されない。
【００４４】
従って、本発明のさらなる態様において、髄膜炎菌免疫型Ｌ２疾患の予防又は治療のための医薬の製造における、ナイセリア株由来のＬ３Ｖ  ＬＯＳを含む免疫原性組成物の使用、あるいは髄膜炎菌免疫型Ｌ３Ｖ疾患の予防又は治療のための医薬の製造における、ナイセリア株由来のＬ２  ＬＯＳを含む免疫原性組成物の使用を提供する。また、髄膜炎菌免疫型Ｌ２疾患の予防又は治療方法であって、その必要があるヒト患者に、ナイセリア株由来のＬ３Ｖ  ＬＯＳを含む免疫原性組成物の有効量を投与するステップを含む方法、あるいは髄膜炎菌免疫型Ｌ３Ｖ疾患の予防又は治療方法であって、その必要があるヒト患者に、ナイセリア株由来のＬ２  ＬＯＳを含む免疫原性組成物の有効量を投与するステップを含む方法を提供する。
【００４５】
本発明の上記使用又は方法において、Ｌ３Ｖ  ＬＯＳは、以下の構造：
【化８】
2009539923.tif 000010
【００４６】
〔式中、
Ｒ１＝
【化９】
2009539923.tif 000011
【００４７】
であり、
Ｒ２＝ＰＥＡであり、
Ｒ３＝ＰＥＡであり、
Ｒ４＝Ｈ又はＯＡｃであり、
Ｒ５＝Ｈ、ＰＥＡ、又はＧｌｙである。〕
を有する。
【００４８】
本発明のこの態様について、上記はまた、上記で参照した髄膜炎菌免疫型Ｌ３Ｖを引き起こす疾患によって担持されるＬＯＳの構造であってもよい。
【００４９】
本発明の上記使用又は方法において、Ｌ２  ＬＯＳは、以下の構造：
【化１０】
2009539923.tif 000012
【００５０】
〔式中、
Ｒ１＝
【化１１】
2009539923.tif 000013
【００５１】
であり、
Ｒ２＝Ｇｌｃであり、
Ｒ３＝ＰＥＡであり、
Ｒ４＝Ｈ又はＯＡｃであり、
Ｒ５＝Ｈ、ＰＥＡ、又はＧｌｙである。〕
を有する。
【００５２】
本発明のこの態様について、上記はまた、上記で参照した髄膜炎菌免疫型Ｌ２を引き起こす疾患によって担持されるＬＯＳの構造であってもよい。
【００５３】
本発明のＬＯＳについて本明細書中で説明するように、本発明のこの態様のＬ２又はＬ３Ｖ  ＬＯＳは、タンパク質キャリアとコンジュゲートしていてもよいし（さらなる説明については上記及び下記参照）、無毒化リピドＡ部分、例えばｍｓｂＢ（−）ナイセリア株から単離されたＬＯＳと一致する第２（secondary）アシル鎖を欠損している（及び／又は、ＬＯＳを以下に記載するリピドＡ無毒化ペプチドと複合体化することによる）もの、を含んでもよいし、精製ＬＯＳ調製物として、リポソーム調製物として、又はブレブ調製物として免疫原性組成物中に存在してもよい。ブレブ調製物の場合、ブレブ調製物は、０〜０．５、０．０２〜０．４、０．０４〜０．３、０．０６〜０．２、０．０８〜０．１５又は０．０９〜０．１１％の界面活性剤、好ましくはデオキシコーレートを用いる抽出ステップの後に各ナイセリア株から単離されたものとすることができる。ナイセリア株は、莢膜多糖を合成することができないものであってもよい、例えば、それが由来する天然株と比較して、莢膜多糖遺伝子ｃｔｒＡ、ｃｔｒＢ、ｃｔｒＣ、ｃｔｒＤ、ｓｙｎＡ、ｓｙｎＢ、ｓｙｎＣ又は好ましくはｓｉａＤの１つの発現が下方制御されている、好ましくは欠失している（機能的発現がない）ものとすることができる。ナイセリア株は、それが由来する天然株と比較して、リピドＡ遺伝子ｍｓｂＢ又はｈｔｒＢの一方又は両方、好ましくは前者、の発現が下方制御されている、好ましくは欠失している（機能的発現がない）ものとすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】Ｌ１〜Ｌ８免疫型の構造によって示される、髄膜炎菌ＬＯＳ構造の共通置換パターンである（Kahlerら Glycobiology 2005 15:409-419 / 2006 JBC 281:19939-19948より転載）。Ｌ７免疫型構造（示さない）は、Ｌ３免疫型構造の非シアル化形態である。保存されている内部コア領域をＲ１〜Ｒ５として示す可変付属基と共に示す。α鎖（Ｒ１）の組成は、ｌｇｔＡ−Ｅトランスフェラーゼ、及び末端α−Ｎｅｕ５Ａｃ（シアル酸）基を付加するシアリルトランスフェラーゼをコードするｌｓｔのフレーム変動的（phase-variable）発現によって制御される。内部コアへのグリシンの結合は第２のＨｅｐ残基の７位を介することに留意されたい。この略図に示されているＫＤＯ残基に結合する、全ての免疫型の内部コアに存在することが知られているさらなるＫＤＯ残基は示されていないことに留意されたい。
【図２Ａ】質量分析によって決定された、種々のＬ３髄膜炎菌株のＬＯＳ構造の概略である。興味深いことに、Ｈ４４／７６株由来血清によって殺菌される傾向が低いＬ３株のいくつかはＯ−アセチル化されている。
【図２Ｂ−１】種々の髄膜炎菌免疫型の共通ＬＯＳ構造である。ＬＯＳ構造の特定の部分を形成する酵素をコードする既知の遺伝子の名称を示している。
【図２Ｂ−２】図２Ｂの続き
【図３Ａ】Ｚ２４９１株由来の髄膜炎菌ＬＯＳ  Ｏ−アセチル化遺伝子ＮＭＡ２２０２を示す。オープンリーディングフレーム中の５つのＧ（大文字）の配列によってオープンリーディングフレームがフレーム内となることに留意されたい。
【図３Ｂ−１】ＭＣ５８株由来の髄膜炎菌ＬＯＳ  Ｏ−アセチル化遺伝子ＮＭＢ０２８５を示す。オープンリーディングフレームを大文字で、周囲の配列（例えばプロモーター配列）を小文字で示す。オープンリーディングフレーム中の６つのＧ（下線）の配列によってオープンリーディングフレームがフレーム外となることに留意されたい。
【図３Ｂ−２】図３Ｂの続き
【図３Ｃ】７６０６７６株由来の髄膜炎菌ＬＯＳ  Ｏ−アセチル化遺伝子（ＮＭＢ０２８５等価物）を示す。オープンリーディングフレームを大文字で、周囲の配列（例えばプロモーター配列）を小文字で示す。オープンリーディングフレーム中の５つのＧ（下線）の配列によってオープンリーディングフレームがフレーム内となることに留意されたい。
【図３Ｄ】（ＭｅｎＢ、Ｌ３）ＮＺ１２４株由来の髄膜炎菌ＬＯＳ  Ｏ−アセチル化遺伝子（ＮＭＢ０２８５等価物）を示す。オープンリーディングフレームを大文字で、周囲の配列（例えばプロモーター配列）を小文字で示す。オープンリーディングフレーム中の５つのＧ（下線）の配列によってオープンリーディングフレームがフレーム内となることに留意されたい。
【図４Ａ】（Ａ）ＬＯＳ６２７５からの内部コアオリゴ糖（ＥＳ−）；（Ｂ）ＬＯＳ６２７５からの内部コアオリゴ糖（ＭＳ／ＭＳ  ＥＳ＋ｍ／ｚ  １８０３．６）。３位及び６位におけるＰＥＡに連結したＨｅｐＩＩと、Ｏ−アセチル化された内部コアを示す構造の概略を示す。
【図４Ｂ】（Ａ）ＬＯＳ６２７５からの内部コアオリゴ糖（ＥＳ−）；（Ｂ）ＬＯＳ６２７５からの内部コアオリゴ糖（ＭＳ／ＭＳ  ＥＳ＋ｍ／ｚ  １８０３．６）。３位及び６位におけるＰＥＡに連結したＨｅｐＩＩと、Ｏ−アセチル化された内部コアを示す構造の概略を示す。
【図４Ｃ】（Ｃ）ＭｅｎＣ  Ｃ１１株からの内部コアオリゴ糖（ＥＳ−）を示す。
【図５】Ｌ２由来ＯＭＶワクチンによる交差反応性殺菌抗体の誘導に対するＬ２  ＬＯＳのシアル化の影響を示す。ＳＢＡ力価（５０％死滅のＧＭＴ）及びセロコンバージョン（％）を示す。
【図６】ＭｅｎＡ  ３１２５のＬ１０  ＬＯＳの質量分析構造解析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
発明の説明
本明細書中に記載される刊行物及び特許、又は特許出願の主題又はそこに開示される情報は、参照により本明細書に組み入れる。
【００５６】
「リポオリゴ糖」（又は「ＬＯＳ」）に関する言及は、「リポ多糖」又は「ＬＰＳ」にも言及するものとする。
【００５７】
本明細書中の用語「含む」（「comprising」「comprise」「comprises」）は、全ての場合に、任意に用語「からなる」（「consisting of」「consist of」「consist of」）に各々置き換えることができるものと発明者は意図している。
【００５８】
本発明者らは、ＬＯＳオリゴ糖構造の短縮が殺菌性免疫応答を誘発し得るエピトープの減少を導くことを見出した。あるいは、本発明者らは、ワクチン製剤においてＬＯＳを最も有効に使用するためには、ＬＯＳオリゴ糖構造をできるだけ保持するべきであるが、たった２種類（又は３若しくは４種類）のＬＯＳ抗原の組み合わせによって広範に有効なナイセリアの（好ましくは髄膜炎菌の）ワクチンを生成し得ることを見出した。本発明の第１の態様は、本発明のナイセリア（好ましくは髄膜炎菌）のＬ２及びＬ３（そして場合によりＬ１０及び／又はＬ４）ＬＯＳを含む、ナイセリア（好ましくは髄膜炎菌又は髄膜炎菌Ｂ型）疾患の予防又は治療のための免疫原性組成物である。ＬＯＳは、公知の精製法のいずれかにより単離してもよいし、あるいは例えばＬ２及びＬ３ナイセリア株由来の少なくとも２種類の外膜小胞（すなわちブレブ）調製物中に存在するものでもよい。ブレブ調製物から、毒性を有し緩く保持されたＬＯＳを除去するが、ブレブ内に組み込まれたＬＯＳ抗原は高レベルで保持するようにするために、ブレブを低濃度の界面活性剤、すなわち０〜０．３％、好ましくは０．０５〜０．２％、最も好ましくは約０．１％の、好ましくはデオキシコレート（すなわちＤＯＣ）、を用いて抽出することが好ましい。ＬＯＳ抗原のそのような組み合わせ（特にブレブワクチン中の）は、驚くべきことに９０％を超える髄膜炎菌株に対して有効であるという点で有利である。
【００５９】
本発明者らはまた、本発明の上記ブレブ免疫原性組成物、及び実際にはあらゆるナイセリア（好ましくは淋菌又は髄膜炎菌）由来のブレブ免疫原性組成物が、免疫優性外膜タンパク質の特定の組み合わせの発現が下方制御（好ましくは欠失）される場合に、それらの表面上の防御抗原（ＬＯＳを含む）の効果が増強されることを見出した。従って、本発明のさらなる態様は、天然の非改変株と比較して、発現が下方制御された、好ましくは欠失した、以下の外膜タンパク質：ＰｏｒＡ、ＰｏｒＢ、ＯｐＡ、ＯｐＣ又はＰｉｌＣ、を２つ以上有するナイセリア株由来の、本発明の１以上のナイセリアブレブ調製物である。好ましくは、ＰｏｒＡとＯｐＡ、ＰｏｒＡとＯｐＣ、ＯｐＡとＯｐＣ、又はＰｏｒＡとＯｐＡとＯｐＣが下方制御されているか又は欠失している。ＦｒｐＢの発現の下方制御（好ましくは欠失）はまた、交差防御抗原の効果の増強において有利であり、特に、鉄制限状態で増殖させたナイセリア株から作製したブレブ調製物中において有利であることが示されてきた。従って、この突然変異を有する株由来の本発明のナイセリアブレブは、上記の１又はそれ以上の下方制御とＦｒｐＢ下方制御との組み合わせから得られるブレブとしての、本発明のさらなる実施形態である。好ましくは、ＰｏｒＡが下方制御される場合にはＰｏｒＢは下方制御されるべきではなく、またその逆も同様である。
【００６０】
上記突然変異は、本発明のブレブ免疫原性組成物が由来することになるあらゆるナイセリア（好ましくは髄膜炎菌の、最も好ましくはｍｅｎＢ）株、特に本明細書に記載する株において有利であるが、しかしながらＬ２又はＬ３免疫型ナイセリア（好ましくは髄膜炎菌、最も好ましくはｍｅｎＢ）株を用いることが好ましく、典型的には本明細書中上記の低ＤＯＣ％抽出法で抽出する。好ましくは、本発明のブレブ免疫原性組成物は、Ｌ２及びＬ３ブレブを両方含み、その少なくとも一方（好ましくは両方）が上記の免疫優性外膜タンパク質（又はＯＭＰ）の組み合わせを欠損している。それらの遺伝子を下方制御するための技術はＷＯ０１／０９３５０号（参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている。４つの異なるＯｐａ遺伝子が髄膜炎菌ゲノム中に存在することが知られており（Ahoら1991 Mol. Microbiol. 5:1429-37）、ゆえにＯｐａの発現が下方制御されていると言われる場合、このことは好ましくは髄膜炎菌に存在する１、２、３つの遺伝子、又は（好ましくは）４つ全ての遺伝子がそのように下方制御されていることを意味する。そのような下方制御は、ＷＯ０１／０９３５０号に記載のように遺伝学的に達成するか、又は、容易に発見される天然の安定した髄膜炎菌株（Ｏｐａ座位からの発現がないか若しくは低いもの）を探索することによって達成し得る。そのような株は、Poolmanら（1985 J. Med. Micro. 19:203-209）に記載される技術を用いて見つけ出すことができ、その際、Ｏｐａ−である細胞は、プレート上又は顕微鏡下において細胞の外見を観察することによって見出されうるＯｐａ発現細胞とは異なる表現型を有する。一度見つけられれば、Ｏｐａの欠失を確立するための発酵操作の後に、細胞内容物についてウエスタンブロットを行うことによって、株が安定的にＯｐａ−であることを示すことができる。
【００６１】
上記ＬＯＳ免疫原性組成物の安全性
ヒトスフィンゴ糖脂質に存在するラクト−Ｎ−ネオテトラオースオリゴ糖基（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−、図１）と類似した構造が存在することから、Ｌ３又はＬ２  ＬＯＳに対して生起された抗体の安全性が問われてきている。多くの人々が残存量のＬ３  ＬＯＳを含むデオキシコレート抽出小胞ワクチンで安全にワクチン接種されてきているが（G. Bjuneら, Lancet(1991), 338, 1093-1096、GVG. Sierraら, NIPH ann(1991), 14, 195-210）、ＬＯＳが本明細書に記載されるように抗原として保持される場合、ＬＯＳ糖鎖構造の末端部分の欠失が、ヒト組織の表面に提示される構造との抗ＬＯＳ免疫応答の交差反応の阻止において有利であることが、本発明者らによって発見された。好ましい実施形態において、ｌｇｔＢ遺伝子の不活性化が末端ガラクトース残基及びシアル酸が欠損した中間体ＬＯＳ構造を生じる（図１及び２を参照、突然変異はＬ２及びＬ３及びＬ４  ＬＯＳに４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−構造を残存させる）。そのような中間体は、Ｌ３及び／又はＬ２（及び／又はＬ４）ＬＯＳ株において獲得され得る。別の及びあまり好ましくないＬＯＳの（短い）バージョンは、ｌｇｔＥ遺伝子のスイッチオフによって得ることができる。さらに別の及びあまり好ましくない型のＬＯＳは、ｌｇｔＡ遺伝子のスイッチオフによって得ることができる。そのようなｌｇｔＡ−突然変異を選択する場合、非免疫原性Ｌ１免疫型の形成を阻止するためにｌｇｔＣ発現をスイッチオフすることがまた好ましい。
【００６２】
ｌｇｔＢ−突然変異が最も好ましいのは、これが殺菌（及びさらに交差反応性殺菌）抗体反応を依然として誘導し得るＬＯＳ防御性オリゴ糖エピトープを保持したままで安全性の課題を解決するために最適な末端切断物であることを本発明者らが発見したためである。
【００６３】
従って、本発明の上記のＬ２及び／又はＬ３調製物（あるいは上述した本発明の１以上のＬＯＳ）（精製されたもの、又は単離したブレブ）あるいは一般的な本発明の髄膜炎菌のブレブ調製物（特にＬ２及び／又はＬ３）は、ｌｇｔＢ、ｌｇｔＡ又はｌｇｔＥ遺伝子由来の機能的遺伝子産物の発現が永続的に下方制御されるように、好ましくは遺伝子のスイッチオフにより、最も好ましくは当該遺伝子のプロモーター及び／又はオープンリーディングフレームの全体又は一部の欠失により、遺伝子操作したナイセリア株（好ましくは髄膜炎菌株）から、有利に得られる。
【００６４】
好ましくは、本発明のナイセリア株は、莢膜多糖の合成に欠損を有する。
【００６５】
本発明の上記ブレブ調製物を髄膜炎菌Ｂ株から得る場合、莢膜多糖（ヒト様糖鎖構造も含む）もまた除去されることが特に好ましい。これを達成するために多くの遺伝子がスイッチオフされ得るが、本発明者らは、ｓｉａＤ遺伝子由来の機能的遺伝子産物の発現を永続的に下方制御（すなわちα−２−８ポリシアリルトランスフェラーゼの活性を下方制御）するように、ブレブ産生株を、好ましくは遺伝子のスイッチオフにより、最も好ましくは遺伝子のプロモーター及び／又はオープンリーディングフレームの全体又は一部の欠失により、遺伝的に操作することが好ましいということを有利に示してきた。そのような不活性化はＷＯ０１／０９３５０号に記載されている。ｓｉａＤ（ｓｙｎＤとしても知られる）突然変異が、莢膜多糖からヒト類似エピトープを除去し得る多くの突然変異の中で最も有利であるのは、それが、ＬＯＳの防御エピトープの生合成に影響を及ぼさない最良の突然変異の１つであり、そのため、ＬＯＳを防御抗原として最終的に用いることを目的とし、かつ細菌の増殖に対して最小限の影響を与える方法において有利であるためである。従って、本発明の好ましい態様は、ｌｇｔＥ−  ｓｉａＤ−、ｌｇｔＡ−  ｓｉａＤ−又は好ましくはｌｇｔＢ−  ｓｉａＤ−髄膜炎菌Ｂ突然変異株由来のブレブ免疫原性調製物である。かかる株自体が、本発明のさらなる態様である。
【００６６】
ｓｉａＤ−突然変異は上記の理由のために好ましいが、髄膜炎菌Ｂ（又は一般的に髄膜炎菌）の莢膜多糖合成をスイッチオフする他の突然変異を用いることができる。従って、ブレブ産生株を、以下の遺伝子：ｃｔｒＡ、ｃｔｒＢ、ｃｔｒＣ、ｃｔｒＤ、ｓｙｎＡ（ｓｙｎＸ及びｓｉａＡと同等）、ｓｙｎＢ（ｓｉａＢと同等）又はｓｙｎＣ（ｓｉａＣと同等）遺伝子、の１つ以上に由来する機能的遺伝子産物の発現を永続的に下方制御するように、好ましくは遺伝子のスイッチオフにより、最も好ましくは遺伝子のプロモーター及び／又はオープンリーディングフレームの全体又は一部の欠失により、遺伝的に操作してもよい。ｌｇｔＥ−突然変異はこれらの突然変異の１以上と組み合わせてもよい。好ましくは、ｌｇｔＢ−突然変異はこれらの突然変異のうち１つ以上と組み合わされる。従って、本発明のさらなる態様は、髄膜炎菌Ｂ（又は一般的に髄膜炎菌）の突然変異株のそのような組み合わせから得られる上記ブレブ免疫原性調製物である。かかる株自体が、本発明のさらなる態様である。
【００６７】
ｌｇｔＢ及びｌｇｔＥなどの様々なｌｇｔ遺伝子を含むナイセリア遺伝子座、並びにその配列は、当技術分野において公知である（M.P.Jenningsら, Microbiology 1999, 145, 3013-3021及びそれに引用されている参考文献；J. Exp. Med. 180:2181-2190(1994)；ＷＯ９６／１００８６号を参照）。
【００６８】
最終産物として本発明の全長（非末端切断型）ＬＯＳを使用する場合、ＬＯＳがシアル化されていないことが望ましいが、そのようなＬＯＳは、最も危険な侵襲性髄膜炎菌Ｂ株（これも同様にシアル化されていない）に対する免疫応答を生じることがあるためである。そのような場合、ｓｙｎＡ（ｓｙｎＸ及びｓｉａＡと同等）、ｓｙｎＢ（ｓｉａＢと同等）又はｓｙｎＣ（ｓｉａＣと同等）遺伝子が欠失した莢膜陰性株の使用が有利であり、それはまたそのような突然変異によってｍｅｎＢ  ＬＯＳがシアル化され得ないようにするためである。本発明の一実施形態において、ｌｓｔ遺伝子（Gilbertら, JBC 1996, 271:28271-6）を機能的に不活性とする（例えば、その遺伝子の欠失若しくは破壊、又は発現の低減により）か、あるいはその遺伝子が天然に破壊されている株を本発明のために選択する（免疫型のＬ３ファミリーについては、そのような欠損株はＬ７免疫型と称されることが多い）。ｌｓｔは、末端シアル酸をＬＯＳα鎖に付加するα−２，３−シアリルトランスフェラーゼである（しかし、シアル酸産生には影響を及ぼさない）。一実施形態において、本発明の株はｌｓｔ（−）かつｓｉａＤ（−）である。
【００６９】
上記突然変異は、ブレブ免疫原性組成物が由来するあらゆるナイセリア（好ましくは髄膜炎菌の、最も好ましくはｍｅｎＢ）株、特に本明細書に記載する株において有利であるが、しかしＬ２又はＬ３免疫型ナイセリア（好ましくは髄膜炎菌の、最も好ましくはｍｅｎＢ）株、典型的には本明細書に記載した低ＤＯＣ％抽出法によって抽出されたものを使用するのが好ましい。好ましくは、本発明のブレブ免疫原性組成物が、Ｌ２及びＬ３ブレブの両方を含み、かつ、少なくとも一方（好ましくは双方）が上記遺伝子の発現が欠損した株に由来する。
【００７０】
ＬＯＳの毒性
本発明の上記の精製ＬＯＳ又はブレブ免疫原性組成物はまた、それらが由来する細菌性産生株における特定の遺伝子の発現の下方制御によって、毒性をより少なくすることができる。そのような無毒化は、天然のＯＭＶによる鼻腔内免疫には不必要であるだろうが（J.J Drabickら, Vaccine(2000), 18, 160-172）、非経口ワクチン接種における無毒化には有用であろう。好ましくは、本発明の精製ＬＯＳ又はブレブ免疫原性組成物は、リピドＡ生合成に関与する遺伝子（特にリピドＡへの第２アシル鎖（secondary acyl chain）の付加に関与する遺伝子）の突然変異／改変／不活性化により（特にｍｓｂＢ及び／又はｈｔｒＢ遺伝子由来の機能的遺伝子産物の発現の下方制御により、好ましくは遺伝子のスイッチオフにより、最も好ましくは遺伝子のプロモーター及び／又はオープンリーディングフレームの全体又は一部の欠失により）、ナイセリア産生株を遺伝的に操作することによって無毒化される。あるいはまた（又はさらに）、精製ＬＯＳ又はブレブ免疫原性組成物は、以下の遺伝子：ｐｍｒＡ、ｐｍｒＢ、ｐｍｒＥ及びｐｍｒＦのうちの１つ以上の遺伝子が（より強力なプロモーターの導入、又は遺伝子のさらなるコピーの組み込みによって）上方制御されるように遺伝子改変されたナイセリア株から得ることができる。あるいはまた（又はさらに）、精製ＬＯＳ又はブレブ免疫原性組成物は、ポリミキシンＢの機能的等価物である非毒性ペプチド［リピドＡに対して高いアフィニティの有する分子］を組成物に添加することにより無毒化され得る（以下参照、すなわち、本発明の１以上のＬＯＳが、ＬＯＳの毒性を低減させるために好適なリピドＡ結合ペプチド、例えばＳＡＥＰ２又はＳＡＥＰＩＩと複合体化されている）。
【００７１】
上記無毒化法並びに関連プロモーター／遺伝子配列、並びに上方制御方法及び下方制御方法については、より詳細についてＷＯ０１／０９３５０号を参照されたい。またナイセリアｍｓｂＢ及びｈｔｒＢ遺伝子は各々ｌｐｘＬ１及びｌｐｘＬ２とも呼ばれ（ＷＯ００／２６３８４号参照）、これらの遺伝子の欠失突然変異は、ｍｓｂＢ−突然変異ＬＯＳが野生型と比較して１つの第２アシル鎖を欠損する（並びに４つの第１アシル鎖（primary acyl chain）及び１つの第２アシル鎖を保持する）こと、そしてｈｔｒＢ−突然変異ＬＯＳが第２アシル鎖の両方を欠損することの、表現型としての特徴を有する。そのような突然変異は好ましくは、ブレブに対する無毒化ＬＯＳの最適な提示を確実にするため、又は無毒化サブユニットＬＯＳの精製を助けるために、ナイセリア産生株が莢膜多糖を欠損していること（上記参照）を確実にする突然変異と組み合わせて用いられる。
【００７２】
本発明の組成物中に使用することができるポリミキシンＢ（本発明のＬＯＳの毒性を低減させるために好適なリピドＡ結合ペプチド）の機能的等価物である非毒性ペプチドのさらなる詳細、特にペプチドＳＡＥＰ２（２つのシステインがジスルフィド架橋を形成するKTKCKFLKKC配列を有する）及びＳＡＥＰＩＩ（ＷＯ２００６／１０８５８６号の請求項１〜１０に記載されているペプチド二量体）の使用については、ＷＯ９３／１４１１５号、ＷＯ９５／０３３２７号、ＷＯ２００６／１０８５８６号、Velucchiら(1997)J Endotoxin Res 4:1-12及びＥＰ９７６４０２を参照されたい。本明細書におけるこのようなリピドＡ結合ペプチドは、上記引用した特許出願の特許請求の範囲又は実施例に記載されるペプチドの具体的な又は一般的な式のいずれかを指す。
【００７３】
本明細書において「機能的遺伝子産物の発現の下方制御」は、対象の遺伝子のプロモーター又はオープンリーディングフレームに対して付加、欠失又は置換が為され、それにより全遺伝子産物の生合成活性が低減（６０、７０、８０、９０、９５％若しくは最も好ましくは１００％低減）されることを意味する。明らかにフレームシフトする突然変異を導入してもよいし、又はより弱いプロモーターを置換してもよいが、最も好ましくは、オープンリーディングフレーム及び／又はプロモーターのほとんど又は全てを、（活性のある）遺伝子産物の永続的な下方制御を確実にするために欠失させる（ＷＯ０１／０９３５０号に記載）。
【００７４】
上記変異は、ブレブ免疫原性組成物が由来するあらゆるナイセリア（好ましくは髄膜炎菌の、最も好ましくはｍｅｎＢ）株、特に本明細書に記載する株において有用であるが、Ｌ２又はＬ３免疫型ナイセリア（好ましくは髄膜炎菌の、最も好ましくはｍｅｎＢ）株を用いることが好ましく、典型的には本明細書に記載の低ＤＯＣ％抽出法で抽出されることが好ましい。本発明のブレブ免疫原性組成物は、Ｌ２及びＬ３ブレブの両方（又は本発明のブレブ調製物）を含み、その少なくとも一方（及び好ましくは双方）が上記遺伝子の発現を欠損している株に由来することが好ましい。
【００７５】
本発明のさらなる態様は、本発明のＬＯＳ又はブレブ免疫原性調製物が由来する上記の遺伝子改変されたナイセリア（好ましくは髄膜炎菌又は淋菌又は髄膜炎菌Ｂ）株を含む。
【００７６】
本発明のＬＯＳ又はＬＯＳ含有ブレブ調製物
本発明のさらなる態様は、本発明のナイセリア株から単離されるＬＯＳ調製物（特に上述した任意のもの）である。好ましくは、単離されたＬＯＳ（又はＬＯＳ含有ブレブ）は、Ｌ２又はＬ３免疫型であり、好ましくは本発明の免疫原性組成物は本発明のＬ２及びＬ３  ＬＯＳ（又はブレブ）調製物を両方含む。
【００７７】
そのような調製物はまた、上記ＬＯＳ（精製されているものであれブレブ調製物に存在しているものであれ）のオリゴ糖部分をＴ細胞エピトープ源を含むキャリアにコンジュゲートする（従ってＬＯＳをより良好な（Ｔ依存的）免疫原とする）ことにより改良することができる。あるいはまた（又はさらに）本発明の精製ＬＯＳ調製物は、当技術分野で公知のリポソーム製剤中にそれを存在させることにより、より良好な抗原となり得る（例えばＷＯ９６／４００６３号及びそこに引用される参考文献を参照）。
【００７８】
細菌からＬＯＳを単離する方法は当技術分野で周知である（例えばWesphal及びJannの温水−フェノール法（Meth. Carbo. Chem. 1965, 5:83-91）を参照）。またGalanosら1969, Eur J Biochem 9:245-249及びWuら1987, Anal Bio Chem 160:281-289も参照されたい。単離されたＬＯＳをコンジュゲートするための技術もまた公知である（例えばＥＰ９４１７３８（参照により本明細書に組み入れる）を参照）。
【００７９】
本発明の目的のため、「Ｔ細胞エピトープ源を含むキャリア」とは、通常、ペプチド、又は好ましくはポリペプチド若しくはタンパク質である。コンジュゲーション技術は当技術分野で周知である。典型的なキャリアとしては、非定型インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）由来のプロテインＤ、破傷風トキシン、ジフテリアトキシン、ＣＲＭ１９７又は（特にナイセリア又は髄膜炎菌の）ブレブ調製物に存在する外膜タンパク質が挙げられる。
【００８０】
本発明の好ましい単離されたＬＯＳ組成物としては、各ＬＯＳのオリゴ糖部分がＴ細胞エピトープ源を含むキャリアに任意にコンジュゲートされていてもよいＬ２及びＬ３単離ＬＯＳを含有する組成物、ｌｇｔＢ−髄膜炎菌株由来のものに一致する構造を有し、各ＬＯＳのオリゴ糖部分がＴ細胞エピトープ源を含むキャリアに任意にコンジュゲートされていてもよいＬ２又はＬ３  ＬＯＳを含有する組成物、並びに最も好ましくは、ｌｇｔＢ−髄膜炎菌株由来のものに一致する構造を有し、各ＬＯＳのオリゴ糖部分がＴ細胞エピトープ源を含むキャリアに任意にコンジュゲートされていてもよいＬ２及びＬ３単離ＬＯＳを含有する組成物である。
【００８１】
好ましくは、本発明のＬＯＳ組成物（又は本発明の１以上のＬＯＳ）は無毒化されている。これは、分子からアシル鎖を除去する（しかし分子の防御効果は減少する可能性がある）ヒドラジン又はアルカリ加水分解化学処理の公知の技術によって行うことができるが、好ましくはｈｔｒＢ−若しくはｍｓｂＢ−髄膜炎菌突然変異株（上記のような、特に莢膜多糖欠損株）からＬＯＳを単離することにより、又はポリミキシンＢの機能的等価物である非毒性ペプチド（リピドＡに対して高いアフィニティを有する分子）、特にＳＡＥＰ２若しくはＳＡＥＰＩＩ（上記）の、組成物への添加により行われ得る。
【００８２】
本発明のＬＯＳは、単離された状態で（通常、リピドＡ部分が無傷のままであればミセル形態で）投与することができるし、又はリポソーム中に入れて投与することもできる。そのような場合、外膜タンパク質はリポソームに添加してもよく、そしてＬＯＳを、オリゴ糖がＴ依存的抗原となるようにリポソーム内部でそのような外膜タンパク質にコンジュゲートしてもよい。これは、後述するブレブ内ＬＯＳ架橋について記載されるものと同様の化学法によって行われ得る。
【００８３】
ＬＯＳのオリゴ糖部分の、ブレブの表面上に存在する外膜タンパク質とのブレブ内架橋（コンジュゲーション）
ＬＯＳ（特に本発明のＬＯＳ）がブレブ製剤中に存在する場合、ＬＯＳは好ましくは、ブレブ調製物上にも存在する１又はそれ以上の外膜タンパク質（例えば髄膜炎菌におけるＰｏｒＡ又はＰｏｒＢ）へのＬＯＳのコンジュゲーションを可能にする方法により、ｉｎ  ｓｉｔｕにおいてコンジュゲートされる。従って、本発明のさらなる態様は、その外膜中に、ＬＯＳとコンジュゲートされた外膜タンパク質が組み込まれるグラム陰性細菌株由来のブレブ調製物（本発明の１以上のブレブ調製物）である。ＬＯＳはコンジュゲートのためにブレブ調製物に添加してもよいが、ＬＯＳはブレブ調製物の表面に天然に存在することが好ましい。
【００８４】
この方法は、ブレブ製剤中のＬＯＳ抗原の安定性及び／又は免疫原性（Ｔ細胞の助けを提供する）、及び／又は抗原性を、外膜の表面上の天然環境にあるＬＯＳのように有利に増強し、それゆえその最も防御的な立体構造をとったＴ非依存的オリゴ糖免疫原に対し、Ｔ細胞の助けを与える。さらに、ブレブ内でのＬＯＳのコンジュゲーションは、ＬＯＳの無毒化を生じ得る（理論に縛られることは望まないが、コンジュゲートされると、リピドＡ部分はより安定的に外膜中に埋没し、従って毒性を生じるように利用されにくくなると考えられる）。従って、上記のｈｔｒＢ−若しくはｍｓｂＢ−変異株からのブレブの単離による無毒化法、又はポリミキシンＢの機能的等価物である非毒性ペプチドの組成物への添加による上記の無毒化法は、必要ではないこともある（しかしさらなる安全のために組み合わせて添加され得る）。
【００８５】
本発明のコンジュゲート化ブレブ調製物は、典型的には、ブレブ中のＬＯＳの毒性が同量の全くコンジュゲートしていないＬＯＳを有する同じブレブと比較して低減されている。ＬＯＳ毒性は当業者であれば容易に測定することができ、例えばヨーロッパ薬局方におけるＬＯＳウサギ発熱アッセイ（pyrogenicity assay）を用いることができる（ＷＯ２００４／０１４４１７号の実施例７参照）。
【００８６】
本発明のコンジュゲート化ブレブ調製物は、コンジュゲートしたＬＯＳが宿主内における免疫応答の誘発に適した立体構造を有し、それに由来する血清がコンジュゲートしていないＬＯＳ（好ましくはブレブ調製物が作製された由来の細菌上に存在し、最も好ましくはＳＢＡアッセイにおける殺菌性で存在する）との反応性を有する（結合可能である）ため、有利である。
【００８７】
ナイセリアブレブをＬＯＳにコンジュゲートする場合、そして本明細書に記載するように、ブレブが１以上の免疫優性外膜タンパク質が下方制御された株由来である場合、好ましくは、ＰｏｒＡが下方制御されている場合にはＰｏｒＢは下方制御されるべきではなく、かつその逆も同様である。このことによって、ＬＯＳの大部分を主要な外膜タンパク質と架橋することが可能になり、従ってブレブに存在する交差防御性の微量外膜抗原に対するコンジュゲートのあらゆる効果が最小化される。
【００８８】
特に、本発明者らは、ブレブに存在するＬＯＳがブレブ内で外膜タンパク質（これもまたブレブに存在する）にコンジュゲートしているブレブを含む組成物が、そのブレブが由来する生物によって引き起こされる疾患の治療又は予防のためのワクチンの基礎を形成しうることを見出した。ここでそのようなワクチンは毒性が低減しており（好ましくは実質的に無毒性であり）、及び／又はその天然環境におけるＬＯＳに対するＴ依存的殺菌反応を誘導することが可能である。
【００８９】
従って、本発明はそのようなブレブ内ＬＯＳコンジュゲート化ブレブ調製物をさらに提供する。「ブレブ内」とは、ブレブ中に天然に存在するＬＯＳが同じブレブ上に存在する外膜タンパク質とコンジュゲートしていることを意味する。
【００９０】
そのようなブレブ調製物は、対象の細菌より単離することができ（ＷＯ０１／０９３５０号参照）、次にＬＯＳのオリゴ糖部分の基（例えばＮＨ２又はＣＯＯＨ）をブレブ外膜タンパク質の基（例えばＮＨ２又はＣＯＯＨ）に結合するための、既知のコンジュゲーション化学法に供すればよい。グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒド／ホルムアルデヒド混合物を使用した架橋技術を用いることができるが、ＥＤＡＣ又はＥＤＡＣ／ＮＨＳ等のより選択的な化学法を用いるのが好ましい（J.V. Staros,R.W. Wright及びD.M. Swingle. Enhancement by N-hydroxysuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Analytical chemistry 156:220-222(1986)並びにBioconjugates Techniques. Greg T. Hermanson(1996)pp173-176）。本発明において使用することができるＬＯＳ及びタンパク質分子間の共有結合を生じることの可能な他のコンジュゲーション化学法又は処理は、ＥＰ９４１７３８に記載されている。
【００９１】
好ましくは、ブレブ調製物は莢膜多糖の非存在下でコンジュゲートされる。ブレブは莢膜多糖を産生しない株（天然の若しくは突然変異によるもの）から単離することができ、又は大半の混入莢膜多糖から精製（６０、７０、８０、９０若しくは９９％以上が除去された）、好ましくは全ての混入莢膜多糖から精製することができる。この方法において、ブレブ内ＬＯＳコンジュゲーション反応はさらに非常に効果的である。
【００９２】
好ましくはブレブ内に存在するＬＯＳの５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は９５％を超える割合が架橋／コンジュゲートされる。
【００９３】
好ましくは、本発明のブレブは、精製ＬＯＳを標準物質として使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動後の銀染色によって測定した場合に（Tsai, J. Biol. Standardization(1986) 14:25-33の方法を参照）、ブレブのＬＯＳ含量が、３〜３０、５〜２５、１０〜２５、１５〜２２、そして最も好ましくはおよそ又は正確に２０％ＬＯＳ含量となるように調製されたものである。髄膜炎菌ブレブにおける２０％ＬＯＳを０．１％低ＤＯＣ抽出法で達成することができ、これは緩く保持されたＬＯＳ分子を除去することができるが、抗原の大部分は保存するものである。
【００９４】
ブレブ内コンジュゲート化ブレブが髄膜炎菌由来である場合、それが由来する株が莢膜多糖を産生することができない突然変異株（例えば上記の突然変異株の１つ、特にｓｉａＤ−）であることが好ましい。髄膜炎菌疾患に対して有効な免疫原性組成物がＬ２及びＬ３ブレブの双方を含むこともまた好ましく、ここでＬ２及びＬ３  ＬＯＳは双方ともにブレブ外膜タンパク質にコンジュゲートしている。さらに、ブレブ内コンジュゲート化ブレブ中のＬＯＳ構造がｌｇｔＢ−髄膜炎菌株由来のものと一致していることが好ましい。最も好ましい免疫原性組成物は以下のブレブ内コンジュゲート化ブレブを含む：莢膜多糖を産生することができずｌｇｔＢ−である、Ｌ２若しくはＬ３突然変異髄膜炎菌株に由来するもの、莢膜多糖を産生することができない突然変異髄膜炎菌株由来のＬ２及びＬ３ブレブを含むもの、ｌｇｔＢ−である突然変異髄膜炎菌株由来のＬ２及びＬ３ブレブを含むもの、又は最も好ましくは莢膜多糖を産生することができずｌｇｔＢ−である突然変異髄膜炎菌株由来のＬ２及びＬ３ブレブを含むもの。
【００９５】
本発明に使用することができる典型的なＬ３髄膜炎菌株は、Ｈ４４／７６  ｍｅｎＢ株である。典型的なＬ２株は、Ｂ１６Ｂ６  ｍｅｎＢ株又は３９Ｅ髄膜炎菌Ｃ型株又は７６０６７６株である。典型的なＬ１０株は、３１２５  ｍｅｎＡ株である。Ｌ４株は、Ｃ１９  ＭｅｎＣ株である。
【００９６】
上述のように、本発明のブレブはコンジュゲーションの作用によってある程度無毒化されるので、さらなる無毒化を必要としないが、しかし、さらなる無毒化法をさらなる安全性のために用いてもよい。それは例えばｈｔｒＢ−若しくはｍｓｂＢ−である髄膜炎菌株由来のブレブを使用することによるか、又はポリミキシンＢの機能的等価物である非毒性ペプチド（リピドＡに対して高いアフィニティを有する分子）（好ましくはＳＥＡＰ２又はＳＥＡＰＩＩ）をブレブ組成物に（上記のように）添加することによる。このように、ＬＯＳの（特にブレブ内の）コンジュゲーションは、驚くべきことに同量のコンジュゲートしていないＬＯＳを含む調製物と比較して低いＬＯＳ毒性を示す。従って、（特に髄膜炎菌の）ブレブの無毒化のための一般的な方法は、さらにＬＯＳのブレブ外膜タンパク質へのブレブ内コンジュゲーションによって提供され、そしてＬＯＳの無毒化のための方法もまた、ブレブ外膜タンパク質へＬＯＳをコンジュゲートする手段によって提供される。
【００９７】
上記の方法において、髄膜炎菌ブレブ、及びブレブを含む免疫原性組成物が提供され、これらは、毒性が低減しており（好ましくは実質的に無毒性であり）、自己免疫の問題がなく、Ｔ依存的特徴を持ち、その天然環境に存在し、そして潜在的に９０％を超える髄膜炎菌株に対する殺菌性抗体反応（Ｌ２＋Ｌ３組成物の場合）を誘導することのできる、重要な抗原としてのＬＯＳを有する。
【００９８】
１以上のＭｅｎＡ、Ｃ、Ｙ又はＷ莢膜多糖又はオリゴ糖（好ましくは少なくともＭｅｎＣ、又はＭｅｎＡ及びＭｅｎＣ、又はＭｅｎＣ及びＭｅｎＹ）を、本発明のブレブの外膜タンパク質上に、同様にコンジュゲートすることができる。これはＬＯＳ架橋と同じ反応において行うことができるが、別々の（好ましくは後の）反応において行うことが好ましい。
【００９９】
最適なブレブ内ＬＯＳコンジュゲーションの方法は、本発明のさらなる態様である。かかる方法は、（好ましくは、本明細書に記載されるように低パーセンテージのＤＯＣを使用して）グラム陰性細菌からブレブを単離するステップ、ブレブに存在するＬＯＳを（好ましくはそのオリゴ糖部分を介して）同じブレブに存在する外膜タンパク質にコンジュゲートするのに適した化学法を行うステップ、ブレブ内コンジュゲート化ブレブ調製物を単離するステップ、並びに任意により、同じ方法によって作製されるが異なるＬＯＳ免疫型を有する、さらなるブレブ内コンジュゲート化ブレブ調製物と共にブレブ内コンジュゲート化ブレブ調製物を製剤化するステップ（好ましくはＬ２及びＬ３ナイセリア／髄膜炎菌ブレブを混合するステップ）、及び／又はワクチン組成物を製造するために薬学的に許容される賦形剤と共にブレブ調製物を製剤化するステップを含むべきである。
【０１００】
ブレブ内コンジュゲーションは、好ましくは以下の方法のステップの１若しくは２つ又は３つ全てを含むべきである：コンジュゲーションｐＨはｐＨ７．０を上回り、好ましくはｐＨ７．５以上（最も好ましくはｐＨ９以下）であるべきである；１〜５％、好ましくは２〜４％、最も好ましくは約３％ショ糖の条件が反応中維持されるべきである；コンジュゲーション反応におけるＮａＣｌは最小限にするべきであり、好ましくは０．１Ｍ、０．０５Ｍ、０．０１Ｍ、０．００５Ｍ、０．００１Ｍ以下であり、全く存在しないことが最も好ましい。これら全ての方法の特徴は、コンジュゲーション過程を通してブレブを安定にかつ溶液中に維持することを確実にするものである。
【０１０１】
ＥＤＡＣ／ＮＨＳコンジュゲーション法はブレブ内コンジュゲーションのために好ましい方法である。ＥＤＡＣ／ＮＨＳは、非常に高度な架橋が可能であるがゆえに濾過性に不利な影響を及ぼすホルムアルデヒドより好ましい。ＥＤＡＣはカルボン酸（ＬＯＳ中のＫＤＯ等）と反応して活性エステル中間体を生成する。アミン求核試薬（ＰｏｒＢ等の外膜タンパク質中のリジン等）存在下において、アミド結合はイソ尿素副生成物の放出を伴って形成される。しかしながら、ＥＤＡＣ仲介反応の効率は、スルホＮＨＳエステル中間体の形成により増大し得る。スルホＮＨＳエステルは、ＥＤＡＣのみとカルボキシレートとの反応より形成される活性エステルより長く水性溶液中に残存する。従って、この２段階の方法を用いて高収率のアミド結合形成を実現し得る。ＥＤＡＣ／ＮＨＳコンジュゲーションは、J.V. Staros,R.W. Wright及びD.M. Swingle. Enhancement by N-hydroxysuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Analytical chemistry 156:220-222(1986)並びにBioconjugates Techniques. Greg T. Hermanson(1996)pp173-176に記載されている。好ましくは、０．０１〜５ｍｇ  ＥＤＡＣ／ｍｇブレブ、より好ましくは０．０５〜１ｍｇ  ＥＤＡＣ／ｍｇブレブを反応に使用する。使用するＥＤＡＣの量はサンプル中に存在するＬＯＳの量に依存し、このＬＯＳの量はまたブレブを抽出するために使用するデオキシコレート（ＤＯＣ）％に依存する。低パーセンテージ（％）ＤＯＣ（例えば０．１％）においては多量のＥＤＡＣ（１ｍｇ／ｍｇ及びそれ以上）が使用されるが、しかし、高％ＤＯＣ（例えば０．５％）においては少量のＥＤＡＣ（０．０２５〜０．１ｍｇ／ｍｇ）が、過剰なブレブ内架橋を回避するために使用される。
【０１０２】
本発明の好ましい方法は、従って、ＥＤＡＣ／ＮＨＳ存在下において、ｐＨがｐＨ７．０からｐＨ９．０の間（好ましくは約ｐＨ７．５）で、１〜５％（好ましくは約３％）ショ糖中で、かつ任意に（上記のように）実質的にＮａＣｌを含まない条件において、ブレブをコンジュゲートするステップ、並びに反応混合物からコンジュゲート化ブレブを単離するステップを含む、ブレブ内コンジュゲート化ＬＯＳ（好ましくは髄膜炎菌のもの）を製造する方法である。
【０１０３】
この反応に続いて、反応時間の経過に伴いブレブ中のＬＯＳの割合の増加に応じてＬＯＳ分子量が増加することを示すために、抗ＬＯＳ（例えば抗Ｌ２又は抗Ｌ３）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を使用して反応混合物をウェスタン分離ゲルに供することができる。
【０１０４】
収量９９％のブレブがそのような技術を用いて回収され得る。
【０１０５】
ＥＤＡＣは、ＬＯＳのＴ依存的免疫原性を改善するために十分な、ＬＯＳをＯＭＰに架橋する点で優れたブレブ内架橋剤であることが見出されたが、しかしそれほど高度にそれを架橋しなかったのは、乏しい濾過性、凝集及びブレブ間架橋等の問題が発生したためであった。生じたブレブの形態は、コンジュゲートしていないブレブのものと類似している（電子顕微鏡による）。さらに上記のプロトコルは、過度に高度の架橋（ブレブの表面上に天然に存在する防御ＯＭＰ（例えばＴｂｐＡ又はＨｓｆ）の免疫原性を低減し得る）が生じることを回避した。
【０１０６】
ブレブ単離のための技術
本発明の外膜小胞（ＯＭＶ又はブレブ）は、多くの公知の技術により単離することができる（Fredriksenら, NIPH Annals(1991), 14, 67-79、Zollingerら, J. Clin Invest(1979), 63, 836-848、Saundersら, Infect Immun(1999), 67, 113-119、J.J. Drabickら, Vaccine(1999), 18, 160-172）。これらは２つの主要な群に分類される。すなわち、デオキシコレート（約０．５％）を使用して髄膜炎菌からブレブを抽出する技術と、低レベルのデオキシコレート（ＤＯＣ）を使用するか又は全くデオキシコレートを使用しない技術である。ＤＯＣを使用しない方法では、ブレブはＯＭＶ中に高レベルのＬＯＳを維持するという興味深い特徴を有する。このことはＬＯＳが防御抗原であるワクチンにおいて有利である。ＤＯＣ抽出ブレブと比較して、ＤＯＣを使用しない方法により得られるＯＭＶ中のＬ３抗原（Ａｇ）の濃度は約１０倍高い。界面活性剤を用いない（好ましくはＤＯＣを用いない）ブレブ調製法は、この理由により本発明の方法の目的にとって好ましいが、低レベルの界面活性剤（好ましくはＤＯＣ）を含むバッファーでの抽出もまた、ブレブ内で強固に相互作用するＬＯＳの大半を残す一方、より毒性があり緩く保持されたＬＯＳを除去するステップであるという点で有利であり得る。典型的には、０〜０．５％、好ましくは０．０２〜０．４％、０．０４〜３％又は０．０６〜２％界面活性剤（好ましくはＤＯＣ）がブレブ抽出に使用され、より好ましくは０．０８〜０．１５％、最も好ましくはおよそ又は正確に０．１％を用いて、最適な量のＬＯＳをブレブ中に安定に存在させて得る。ＬＯＳが１以上の上記の方法により無毒化されている場合には、ＤＯＣを用いない（又は低ＤＯＣ〜０．３％ＤＯＣ若しくはそれ以下の）抽出法が特に好ましい。
【０１０７】
本発明の全ての実施形態におけるブレブのＬＯＳ含量は、精製ＬＯＳを標準物質として使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動後の銀染色によって測定した場合に（Tsai, J. Biol. Standardization(1986) 14:25-33の方法を参照）、３〜３０、５〜２５、１０〜２５、１５〜２２％であることが好ましく、最も好ましくはおよそ又は正確に２０％ＬＯＳ含量である。ＮｍｅｎのＬ３  ＬＯＳをこの方法における標準物質として使用すると、一般的に、０．１％ＤＯＣで抽出されたＮｍｅｎ  Ｌ３免疫型ブレブ中のＬＯＳ含量は約２０％ＬＯＳであり、０．２％ＤＯＣで抽出した場合は約１５％ＬＯＳ、０．３％ＤＯＣでは約１０％ＬＯＳ、そして０．５％ＤＯＣでは約５％ＬＯＳである。
【０１０８】
ブレブの作製は、細胞又は細胞片からブレブを分離するための適当な技術のいずれかを用いて（例えば低速遠心分離により）行うことができる。ブレブ調製物は、超遠心分離を使用して（ブレブをペレット化する）、あるいはFrasch et al. （"Outer membrane protein vesicle vaccines for meningococcal disease" Methods in Molecular Medicine, vol 66, Meningococcal Vaccines: Methods and Protocols 2001 pp81-107 (A.J. Pollard及びM.C. Maiden編, Humana Press Totowa, NJ)）に記載されているように超遠心分離及び／又はダイアフィルトレーション（diafiltration）のより穏やかな技術を用いて、さらに精製することができる。
【０１０９】
ワクチン組成物
本発明の免疫原性組成物は、薬学的に許容される賦形剤の添加によってワクチン組成物として容易に製剤化することができる。
【０１１０】
さらに、上記の本発明の精製ＬＯＳ（好ましくはＬ２若しくはＬ３）を単離するステップ又は上記の本発明の単離ブレブ（好ましくはＬ２若しくはＬ３免疫型を有する）を作製するステップ、及びそのＬＯＳ又はブレブを薬学的に許容される賦形剤とともに製剤化するステップを含む、本発明のナイセリア（好ましくは髄膜炎菌）免疫原性組成物又はワクチンの製造方法を提供する。好ましくは、本発明の免疫型Ｌ２及びＬ３の両方の精製ＬＯＳ、又は本発明の免疫型Ｌ２及びＬ３の両方のブレブ、又はＬ２の精製ＬＯＳ及びＬ３のブレブ（若しくはその逆）を、混合ステップで混合する。好ましくは、本発明の精製ＬＯＳ又はブレブは、単離された後に上述のようにコンジュゲートされる。さらなるリポソーム製剤化ステップを精製ＬＯＳに対して追加してもよい（当技術分野で公知の技術を用いる。例えばＷＯ９６／４００６３号及びそこに引用される参考文献を参照のこと）。好ましくは、ブレブ調製物は低濃度のＤＯＣ（又はＤＯＣなし）での抽出によって（上記のように）単離される。
【０１１１】
このようなＬ２及びＬ３の組み合わせ（併用）方法は、ほとんど全ての髄膜炎菌Ｂ株に対して有効なワクチンをもたらすことができる。
【０１１２】
上記の免疫原性組成物（又は方法）は、血清群Ａ、Ｃ、Ｙ又はＷ由来の１以上（２、３又は４）の髄膜炎菌多糖又はオリゴ糖（上記のような、そのままの又はＴ細胞エピトープを含むキャリアにコンジュゲートしたもの）が該組成物に添加されたものであってもよい。好ましくは、少なくともＣが添加（最も好ましくはコンジュゲート）されたものであり、より好ましくはＡ及びＣ又はＹ及びＣが添加（好ましくは全てコンジュゲート化）されたものであり、最も好ましくはＡ、Ｃ、Ｙ及びＷが添加（好ましくは全てコンジュゲート化）されたものである。有利には、コンジュゲート化されたインフルエンザ菌Ｂ型莢膜多糖又はオリゴ糖も上記の組成物中に含有させて、広範な髄膜炎ワクチンを作製する。
【０１１３】
好ましくは、特にＷＯ９４／０８０２１号において個別に具体的に示した組成物からなる又はそれを含む組成物は、本発明において特許請求の範囲に含められていない。場合により、ＵＳ２００６／００４７１０６に具体的に特定されている組成物からなる又はそれを含む組成物は、本発明において特許請求の範囲に含められていない。
【０１１４】
本発明のワクチン製剤
本発明の免疫原性組成物は、適切なアジュバントとともに製剤化することで本発明のワクチン組成物を作製することができる。
【０１１５】
適切なアジュバントとしては、水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）又はリン酸アルミニウム（好ましくは水酸化アルミニウム）等のアルミニウム塩があるが、しかしカルシウム（特に炭酸カルシウム）、鉄又は亜鉛の塩でもよく、あるいはアシル化チロシン、若しくはアシル化糖、カチオン若しくはアニオン誘導体化多糖、又はポリホスファゼンの不溶性懸濁液でもよい。
【０１１６】
添加され得る適切なＴｈ１アジュバント系には、モノホスホリルリピドＡ、特に３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（又は他のＬＰＳの非毒性誘導体）、及びアルミニウム塩（好ましくはリン酸アルミニウム）とモノホスホリルリピドＡ、好ましくは３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）（又は非毒性ＬＰＳ誘導体）との組み合わせが含まれる。増強系は、モノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体の組み合わせ、特にＷＯ９４／００１５３号に記載されるようなＱＳ２１（若しくは他のサポニン）と３Ｄ−ＭＰＬ（若しくは非毒性ＬＰＳ誘導体）の組み合わせ、又はＷＯ９６／３３７３９号に記載されるような、ＱＳ２１（若しくはサポニン）がコレステロールによりクエンチされているより反応原性の低い組成物を用いる。水中油型エマルジョン中のＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬ及びトコフェロールを含む特に強力なアジュバント製剤は、ＷＯ９５／１７２１０号に記載されており、これは添加され得る好ましい製剤である。添加され得る他のアジュバントは、サポニン、より好ましくはＱＳ２１及び／又は水中油型エマルジョン及びトコフェロールを含む。オリゴヌクレオチドを含む非メチル化ＣｐＧ（ＷＯ９６／０２５５５号）もまた添加され得る。
【０１１７】
ワクチン調製物は一般的にVaccine Design（「The subunit and adjuvant approach」(Powell M.F.及びNewman M.J.編）(1995)Plenum Press New York)に記載されている。
【０１１８】
免疫防御用量のワクチンが、全身経路又は粘膜経路によって投与され得る。これらの投与には、筋肉内、腹腔内、皮内若しくは皮下経路による注入、又は口腔／消化器（好ましくは鼻腔内投与）、呼吸器、尿生殖路への粘膜投与による注入が挙げられる。典型的には、各ワクチン用量中のブレブの量は、典型的な被ワクチン接種者において著しく有害な副作用を引き起こすことなく免疫防御反応を誘導する量が選択される。そのような量は、どの特定の免疫原が使用され、かつそれをどのように提示するかによって変動する。一般的に、各用量は、本発明の各ブレブ又はＬＯＳを１〜１００μｇ、好ましくは５〜５０μｇ、最も典型的には５〜２５μｇの範囲内で含むことが予想される。
【０１１９】
本発明のブレブ免疫原性組成物に対するさらなる改良
本発明の上記のブレブ組成物は、それらが由来するナイセリア株（淋菌及び好ましくは髄膜炎菌、最も好ましくは髄膜炎菌Ｂを含む）が、ゲノム中への遺伝子のさらなるコピーを挿入することにより、又は既存の遺伝子の上流により強力なプロモーターを導入することにより、又は非改変株と比較して１．２、１．５、２、３、５若しくは１０倍を超える抗原レベルを生じるよう改変された株を誘導することが可能なＷＯ０１／０９３５０号に記載のあらゆる他の方法により、上方制御された１又はそれ以上の下記遺伝子（防御抗原をコードする遺伝子）を有する場合、本発明のワクチンにおける有効性がさらに改良され得る。すなわち、ＮｓｐＡ（ＷＯ９６／２９４１２号）、Ｈｓｆ又はその末端切断物（ＷＯ９９／３１１３２号及びＷＯ０１／５５１８２号、ＮｈｈＡとしても知られる）、Ｈａｐ（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０２７６６号）、ＯＭＰ８５（ＷＯ００／２３５９５号）、ＰｉｌＱ（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０３６０３号）、ＰｌｄＡ（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０６７１８号）、ＦｒｐＢ（ＷＯ９６／３１６１８号）、ＴｂｐＡ（ＷＯ９２／０３４６７号、米国特許第５９１２３３６号、ＷＯ９３／０６８６１号及びＥＰ５８６２６６）、ＴｂｐＢ（ＷＯ９３／０６８６１号及びＥＰ５８６２６６）、ＮａｄＡ（Comanducciら J. Exp. Med. 2002 195:1445-1454、NMB 1994）、ＦｒｐＡ／ＦｒｐＣ、又は５以上の反復配列を含むこれらの抗原間に共通の部分（ＷＯ９２／０１４６０号；Thompsonら,(1993) J. Bacteriol. 175:811-818; Thompsonら,(1993) Infect. Immun. 61:2906-2911）、ＬｂｐＡ、ＬｂｐＢ（ＰＣＴ／ＥＰ９８／０５１１７号）、ＦｈａＢ（ＷＯ９８／０２５４７号、配列番号３８（ヌクレオチド３０８３〜９０２５））、ＨａｓＲ（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０５９８９号）、ｌｉｐｏ０２（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０８３１５号）、Ｔｂｐ２（ＷＯ９９／５７２８０号；ＮＭＢ０４６０）、ＭｌｔＡ（ＷＯ９９／５７２８０号；ＮＭＢ００３３）、ＴｓｐＡ（ＷＯ００／０３００３号）、ＴｓｐＢ（ＷＯ００／０３００３号）、ｃｔｒＡ（ＰＣＴ／ＥＰ００／００１３５号）、ＭａｆＡ（ＮＭＢ０６５２）、ＭａｆＢ（ＮＭＢ０６４３）、Ｏｍｐ２６（ＮＭＢ０１８１）、アドヘシンＸ（ＮＭＢ０３１５）、アドヘシンＹ（ＮＭＢ０９９５）、アドヘシンＺ（ＮＭＢ１１１９）及びＯｓｔＡ（ＮＭＢ０２８０）である。ＮＭＢ配列の例は、www.neisseria.orgのデータベースで見出すことができる。本明細書でＨｓｆについて言及する場合、この用語はあらゆる場合においてＨｓｆ末端切断物（特にＷＯ０１／５５１８２号に開示されたもの）と置換可能である。
【０１２０】
Ｈｓｆ及びＴｂｐＡ（低若しくは高分子量形態、又は低及び高分子量形態の両方（ＥＰ５８６２６６））、又はＨｓｆ及びＯＭＰ８５、又はＯＭＰ８５及びＴｂｐＡ（低若しくは高分子量形態、又は低及び高分子量形態の両方）、又はＮｓｐＡ及びＨｓｆ、又はＮｓｐＡ及びＯＭＰ８５、又はＮｓｐＡ及びＴｂｐＡ（低若しくは高分子量形態、又は低及び高分子量形態の両方）の双方が、いずれも上方制御されている場合が特に好ましい。組成物中に２つのブレブが含まれている場合、各ブレブは異なる上方制御を受けていることが好ましい。高及び低分子量のＴｂｐＡがどちらも上方制御される場合、これらは２つの形態のＴｂｐＡを天然に含む２つの株由来の組成物中に存在する、２つの別々のブレブにおいて上方制御されていることが好ましい。最も好ましくは、かかる２つの株がＬ２及びＬ３  ＬＯＳ免疫型を有することである。ＴｂｐＡは遺伝子工学的に上方制御させるか、又はナイセリア／髄膜炎菌産生株を鉄制限条件（例えば５０〜７０μＭデスフェラール（メシル酸デフォロキサミン、Ｓｉｇｍａより入手可能）存在下）で増殖させることにより、上方制御させ得る。後者の方法を採用する場合、ＦｒｐＢ遺伝子発現を下方制御（好ましくは欠失）することが好ましいが、これはこの可変性抗原が鉄制限条件下で単離される髄膜炎菌株から単離されたブレブにおいて免疫優性になり得るためである。
【０１２１】
好ましい実施形態において、本発明の組成物は、好ましくは高分子量ＴｂｐＡ（ＴｂｐＡ  Ｈｉｇｈ）及びＨｓｆが上方制御されている、ｌｇｔＢ−（又はｌｓｔ−）莢膜多糖−ｍｓｂＢ−株由来のＬ３ブレブと、低分子量ＴｂｐＡ（ＴｂｐＡ  Ｌｏｗ）及びＯｍｐ８５が上方制御されている、ｌｇｔＢ−（又はｌｓｔ−）莢膜多糖−ｍｓｂＢ−株由来のＬ２ブレブとを含む。より好ましくは、どちらのブレブもさらにＰｏｒＡ及び／又はＦｒｐＢの発現、そして任意にＯｐＣ及び／又はＯｐＡ発現が、下方制御されている。ブレブは、最も好ましくは上記の低ＤＯＣ法によって単離され、両ブレブ中のＬＯＳは外膜タンパク質とブレブ内架橋されている。
【０１２２】
ゴースト又は死菌全細胞ワクチン
本発明者らは、ブレブに関わる上記組成物及びワクチンが、（同一の利点を有する）ゴースト又は死菌全細胞調製物及びワクチンに関する方法にまで容易に拡張できることを意図している。グラム陰性細菌株からゴースト調製物（完全なエンベロープを有する空の細胞）を製造する方法は当技術分野で周知である（例えばＷＯ９２／０１７９１号を参照）。全細胞を殺滅して、ワクチンに使用するための不活性化細胞調製物を作製する方法もまた周知である。従って、本明細書を通して記載されるブレブを含む組成物及びワクチンは、等価物である本発明のゴースト及び死菌全細胞調製物を含む同じ組成物又はワクチンにも当てはまることを意図している。
【０１２３】
本発明の組成物に関する血清殺菌アッセイ
血清殺菌アッセイは、本発明の免疫原性組成物中で組み合わせた場合に抗原間の相乗作用的な関係を評価するための好ましい方法である。
【０１２４】
そのような相乗反応は、抗原の組み合わせによって誘発されるＳＢＡにより、各抗原によって別個に誘発されるＳＢＡと比べて少なくとも５０％、２倍、３倍、好ましくは４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、最も好ましくは１０倍高いものとして特徴付けられ得る。好ましくはＳＢＡは、抗原が由来するのと同種の株、及びさらに好ましくは一群の異種の株に対して測定される（以下の代表的な群、例えばＡ−４クラスターに属するＢＺ１０（Ｂ：２ｂ：Ｐ１．２）、ＥＴ−３７複合体に属するＢ１６Ｂ６（Ｂ：２ａ：Ｐ１．２）、及びＨ４４／７６（Ｂ：１５：Ｐ１．７，１６）を参照）。ＳＢＡは、髄膜炎菌ワクチンの有効性を評価するための、最も一般的に受け入れられている免疫学的マーカーである（Perkinsら J Infect Dis. 1998, 177:683-691）。十分なＳＢＡはあらゆる公知の方法により確認することができる。ＳＢＡは、動物モデル又はヒト被験体から得た血清を用いて行うことができる。
【０１２５】
ヒト血清を用いてＳＢＡを行う好ましい方法は以下の通りである。血液サンプルは最初のワクチン接種の前、２回目のワクチン接種の２ヶ月後及び３回目のワクチン接種の１ヶ月後に採取する（３回のワクチン接種は１年以内に行い、通常のヒト第１期ワクチン接種計画では、例えば０、２及び４ヶ月、又は０、１及び６ヶ月の時点で投与される）。そのようなヒト第１期ワクチン接種計画は、１歳未満の幼児（例えばＨｉｂワクチン接種を実施するのと同時）に実施することができ、又は２〜４歳児若しくは青年もそのような第１期ワクチン接種計画でワクチン接種することによってＳＢＡを試験することができる。妥当であれば、さらなる血液サンプルは第１期ワクチン接種の６〜１２ヶ月後、及び追加免疫投与の１ヶ月後に採取され得る。
【０１２６】
（２〜４歳児若しくは青年における、しかし好ましくは生後１年以内の乳児における）（第１期ワクチン接種計画の）３回目のワクチン投与の１ヶ月後に、本発明の抗原が由来する髄膜炎菌株に対するＳＢＡ（抗体希釈率）力価が（ワクチン接種前の力価と比較して）４倍に増加する被験体の割合が、被験体の３０％を超え、好ましくは４０％を超え、より好ましくは５０％を超え、最も好ましくは６０％を超える場合、ＳＢＡは同種の殺菌活性を有する抗原又はブレブ調製物について十分であろう。
【０１２７】
当然ながら、異種の殺菌活性を有する抗原又はブレブ調製物は、それが由来する髄膜炎菌株に対して同様に十分なＳＢＡを誘導することができるならば、同種の殺菌活性を有するブレブ調製物を構成することもできる。
【０１２８】
（２〜４歳児若しくは青年における、しかし好ましくは生後１年以内の乳児における）（第１期ワクチン接種計画の）３回目のワクチン投与の１ヶ月後に、髄膜炎菌の３種の異種株に対するＳＢＡ（抗体希釈率）力価において（ワクチン接種前の力価と比較して）４倍に増加する被験体の割合が、被験体の２０％を超え、好ましくは３０％を超え、より好ましくは３５％を超え、最も好ましくは４０％を超える場合、ＳＢＡは異種の殺菌活性を有する抗原又はブレブ調製物について十分であろう。かかる試験は、異種の殺菌活性を有する抗原又はブレブ調製物が、様々な髄膜炎菌株に対する交差反応性殺菌抗体を誘導し得るか否かの優れた指標である。３種の異種株は、好ましくは互いに異なる電気泳動タイプ（ＥＴ）複合体、又は多座配列タイピング（ＭＬＳＴ）パターン（Maidenら PNAS USA 1998, 95:3140-5参照）を有し、好ましくはその異種殺菌活性を有する抗原又はブレブ調製物が作製されるか又は由来する起源の株とも異なるべきである。当業者は、髄膜炎菌間で観察される遺伝的多様性、特に、重篤な病苦の原因として認識されているか、及び／又は強い病原性が認識されているＭｅｎＢ系統（Maidenら  前述）である髄膜炎菌Ｂ型株において観察される遺伝的多様性を反映した、異なるＥＴ−複合体を有する３種の株を決定することは容易にできるであろう。例えば、使用され得る３種の株は以下のものである：Ａ−４クラスターに属するＢＺ１０（Ｂ：２ｂ：Ｐ１．２）、ＥＴ−３７複合体に属するＢ１６Ｂ６（Ｂ：２ａ：Ｐ１．２）、及びＥＴ−５複合体に属するＨ４４／７６（Ｂ：１５：Ｐ１．７，１６）、又は同じＥＴ／クラスターに属するあらゆる他の株。そのような株は、かかる株から作製された若しくはそれらに由来する異種殺菌活性を有する抗原又はブレブ調製物を試験するために使用することができ、例えば、ＥＴ−５複合体に属する髄膜炎菌ＣＵ３８５株（Ｂ：４：Ｐ１．１５）を使用することができる。使用され得る別のサンプル株は、系統３流行クローン（例えばＮＺ１２４（Ｂ：４：Ｐ１．７，４））由来のものである。別のＥＴ−３７株は、ＮＧＰ１６５（Ｂ：２ａ：Ｐ１．２）である。
【０１２９】
ＳＢＡ活性を測定するための方法は、当技術分野において公知である。例えば、使用され得る方法がＷＯ９９／０９１７６号の実施例１０Ｃに記載されている。一般的には、試験される株の培養物を対数増殖期まで増殖させる（好ましくは、増殖培地にＥＤＤＡ等の鉄キレート剤を添加することによる、鉄枯渇条件下で）。これを、ＢＳＡを加えた培地中（０．３％ＢＳＡを含むハンクス培地等）に懸濁し、約２００００ＣＦＵ／ｍｌに調整した標準（working）細胞懸濁液を得てもよい。一連の反応混合物は、試験される血清の一連の２倍希釈物（好ましくは５６℃で３０分間熱不活性化されたもの）（例えば、５０μｌ／ウェル容量）と試験される２００００ＣＦＵ／ｍｌの髄膜炎菌株の懸濁液（例えば、２５μｌ／ウェル容量）との混合により、作製することができる。反応バイアルをインキュベートし（例えば３７℃で１５分間）、振とう（例えば２１０ｒｐｍにて）するべきである。最終反応混合物（例えば容量１００μｌ）は、さらに補体源（例えば、最終容量の２５％の予備試験済みの仔ウサギ血清、又はヒト血清学のためのヒト血清）を含み、上記のように（例えば３７℃で６０分間）インキュベートする。滅菌ポリスチレンＵ底９６穴マイクロタイタープレートをこのアッセイに使用できる。マルチチャネルピペットを用いて、各ウェルからアリコート（例えば１０μｌ）を採取し、ミューラーヒントン寒天プレート（好ましくは、１％イソビタレックス（Isovitalex）及び１％熱不活性化ウマ血清を含む）に滴下し、それを（例えば、５％ＣＯ２中３７℃で１８時間）インキュベートしてもよい。好ましくは、個々のコロニーは、１アリコート当たり最大８０ＣＦＵまで計数することができる。以下の３つの試験サンプルを対照として使用し得る：バッファー＋細菌＋補体、バッファー＋細菌＋不活性化補体、血清＋細菌＋不活性化補体。回帰計算によって、５０％の細胞死滅に相当する希釈度の測定値を与えるようにデータを処理するプログラムを用いて、ＳＢＡ力価が直接算出され得る。
【０１３０】
本特許明細書中に引用される全ての文献又は特許出願は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１３１】
実施例
以下の実施例は、特に詳細に記載しない限りは当業者にとって周知でありルーチンである標準的な技術を用いて実施される。本実施例は例示的なものであり、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【０１３２】
髄膜炎菌（例えば、ＭｅｎＢ）の莢膜多糖産生に関わるタンパク質をコードする遺伝子の欠失を説明する例、ＰｏｒＡ遺伝子の欠失、髄膜炎菌ブレブの表面上の様々な防御外膜タンパク質の上方制御、免疫優性タンパク質又は生合成酵素の下方制御（例えば、ｓｉａＡ（−）突然変異）、及びブレブを単離する方法は、ＷＯ０１／０９３５０号に記載されている。さらなる情報が、ＷＯ２００４／０１４４１７号及びＷＯ２００４／０１４４１８号に記載されている。尚、本明細書におけるＮＭＢ及びＮＭＡ遺伝子配列の参照は、www.neisseria.orgからアクセス可能な配列の参照番号を指していることに留意されたい。ＬＯＳ免疫型の通常の構造を示す概略図を図１に示す（Kahlerら、2005 Glycobiology 15:409-419/2006 JBC 281: 19939-19948より）。また、図２Ｂも参照されたい。
【実施例２】
【０１３３】
内部コアＬＯＳ  Ｏ−アセチル化：殺菌力価に対する潜在的影響
要約
・ＭＳ−ＭＳ分析から、ＮＺ１２４（Ｌ３）株の内部コアＬＯＳのＮ−アセチル−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）はＯ−アセチル化されていることがわかっている。Ｈ４４／７６株及びＭ６８７株、並びにＨ４４／７６株由来のＬ３  ｌｇｔＢ（−）株及びＬ３  １ｓｔ（−）ワクチン株（それぞれ、Ｂ１８５４＝ＴｒＬ３及びＢ１９４８＝Ｌ７）についてはそうではない。  
・ＮＺ１２４株は、Ｈ４４／７６株及びＭ６８７株と比較して、抗体媒介性補体殺菌に対する抵抗性が高いわけではない。  
・露出が乏しい表面エピトープと殺菌抗体との接触性は、ＮＺ１２４株及びＨ４４／７６株で類似しているようである。  
・４つの動物種を用いた５つの動物モデルにおいて、どんな製剤を用いても、抗ＴｒＬ３及び抗Ｌ７ブレブ血清は、Ｈ４４／７６株及びＭ６８７株と比較して、ＮＺ１２４株の死滅を媒介する効果が低かった。  
・これらの結果は、内部コアＬＯＳのＧｌｃＮＡｃのアセチル化が、抗「非アセチル化ＬＯＳ」抗体により媒介される死滅の効力を低減する可能性があることを示唆している。
【０１３４】
概説
ＭＳ／ＭＳ分析に基づき、髄膜炎菌のＬ３  ＬＯＳの２つの異なる構造を説明する。これら２つの構造は、内部コアのＧｌｃＮＡｃ上にアセチル基が存在するかしないかによって区別される（図２Ａ）。文献には、この追加アセチル基なしでＬ３構造が記載されている。
【０１３５】
ＴｒＬ３及びＬ７ブレブの内部コアＬＯＳのＧｌｃＮＡｃはアセチル化されていない。このことは、野生型Ｈ４４／７６株及びＭ９７２５０６８７（Ｍ６８７）株についても同様である。対照的に、野生型ＮＺ１２４株は、アセチル化ＧｌｃＮＡｃを有する。これら３つの野生型血清群Ｂ髄膜炎菌株はＬ３としての免疫型を有する。ＮＺ１２４は、１９９８年に分離されたニュージーランド流行性菌株であり、ニュージーランド環境科学研究院（New Zealang Institute of Environmental Science and Research；ニュージーランド、ウェリントン）から入手可能である。
【０１３６】
ＴｒＬ３又はＬ７ブレブで免疫したマウス由来の血清は、Ｈ４４／７６株及びＭ６８７株に対する高レベルの殺菌抗体を含んでいる。しかし、これらの血清は、ＮＺ１２４株に対しては効果が劣る。実際、ＮＺ１２４株について抗Ｌ７／ＴｒＬ３ブレブ血清を用いて測定した殺菌力価は、Ｈ４４／７６株及びＭ６８７株について測定した力価より３〜２０倍低い。
【０１３７】
ＮＺ１２４株に対して測定された、低い殺菌抗体力価は、以下に挙げる少なくとも３つの仮定により説明することができる：
・この株は本来、抗体及び補体が媒介する殺菌に対して、Ｈ４４／７６株及びＭ６８７株より抵抗性が高い可能性がある；
・この株では、ＬＯＳエピトープは殺菌抗体との接触性が低い可能性がある；
・内部コアＬＯＳのアセチル化は、抗「非アセチル化」ＬＯＳ抗体が媒介する殺菌の効力にマイナスの影響を与える可能性がある。
【０１３８】
結果
ＮＺ１２４株は、抗体媒介性殺菌に対し、より抵抗性なのか？
この疑問に答えるために、本発明者らは、様々なＰｏｒＡ＋ブレブワクチンで免疫したマウス由来の血清をＳＢＡにおいて分析した。抗血清を相同及び異種ＰｏｒＡ株に対しＳＢＡで試験した。表１に示す結果は、２つの実験から得られたものである。
【０１３９】
Ｐ１．７，１６ブレブでマウスを免疫すると、相同ＰｏｒＡ  Ｐ１．７，１６株の死滅を媒介することができる殺菌抗体の産生が誘導された（Ｈ４４／７６に対して力価１／２３００）が、異種ＰｏｒＡ株（Ｍ６８７及びＮＺ１２４）に対してはそうではなかった。相同ＰｏｒＡ株に対する防御殺菌応答を誘導することだけができるＰ１．１９，１５ワクチンについても同様の観察結果が得られた（Ｍ６８７に対して力価１／９００）。Ｐ１．７，４  ＰｏｒＡを含むワクチンで免疫したマウスは、ＮＺ１２４株に対する高レベルの殺菌抗体（力価１／６２００）を有したが、Ｈ４４／７６株に対してはそうではなかった。
【表１】
2009539923.tif 000014
【０１４０】
これらの実験において、ＮＺ１２４株に対して最も高い殺菌抗体力価が測定されたが、これは、この株が、抗体及び補体媒介性殺菌に対し、Ｈ４４／７６株及びＭ６８７株より抵抗性が高くはないことを示唆している。
【０１４１】
ＮＺ１２４株のＬＯＳエピトープは抗体に十分接触可能なのか？
特に、ＮｓｐＡループは、例えば、ＰｏｒＡのＶＲ１及びＶＲ２ループと比較して、比較的小さいことから、莢膜の大きさがＮｓｐＡ表面エピトープと抗体との接触性を制限する可能性があることが以前から示唆されてきた。実際、莢膜の大きさと、抗ＮｓｐＡ血清が補体媒介性殺菌を誘導する能力との間には関係が証明されている（Moeら、1999 I&I 167:5664-75）。
【０１４２】
髄膜炎菌のＬＯＳは短い糖鎖を有するため、抗体によるその防御エピトープとの接触性は、莢膜の厚さのため損なわれる可能性がある。このような作用機構が、ＮＺ１２４株に対する抗ＬＯＳ抗体で測定された低い殺菌力価を説明できるかどうかを決定するために、ＮＺ１２４を含む異なる３つのＭｅｎＢ株に対して抗ＮｓｐＡ  ＭＡｂ（ＭＡｂ  Ｍｅ−７）を用いて、殺菌アッセイを実施した。
【０１４３】
１／２５６０を超える殺菌力価により示されるように、補体の存在下で、Ｈ４４／７６株及びＮＺ１２４株は、Ｍａｂ  Ｍｅ−７によって容易に死滅した。対照的に、Ｍ６８７株は、抗ＮｓｐＡ  ＭＡｂ媒介の死滅に対してより抵抗性が高く、わずか１／３４７の力価が測定された。
【０１４４】
結論として、防御ＮｓｐＡエピトープの接触性は、Ｈ４４／７６株及びＮＺ１２４株で類似している。従って、ＮＺ１２４株死滅の媒介に関して抗ＴｒＬ３ブレブ抗体の効力が低いのは、防御ＬＯＳエピトープの接触性が低いからではないと仮定することができる。
【０１４５】
内部コアＬＯＳのＧｌｃＮＡｃのアセチル化は抗「非アセチル化」ＬＯＳ殺菌抗体の効力を低減するのか？
マウス、ウサギ、モルモット、仔ラット及び成体ラットを、ｐｏｒＡ  ＫＯブレブで免疫した。実験の大部分は、ペンタ−アセチル化（penta-acylated）リピドＡ  ＬＯＳを産生する株から取得したブレブ（ｍｓｂＢ突然変異、Ｂ１８５３、Ｂ１８５４及びＢ１９４８ブレブ）を用いて行ったが、少数の実験では、ヘキサ−アセチル化（hexa-acylated）ＬＯＳ含有ブレブ（Ｂ１８２０ブレブ）を用いて実施した。アルミニウム塩（Ａｌ（ＯＨ）３若しくはＡｌＰＯ４）を用いて、又は用いずに（非吸収製剤）、またＣｐＧを用いて、様々な製剤を試験した。Ｈ４４／７６株、Ｍ６８７株及びＮＺ１２４株に対する仔ウサギ補体を用いて、抗ブレブ血清をＳＢＡにおいて試験した。
【０１４６】
ＴｒＬ３  Ｖ１８２０ブレブで免疫した動物由来の血清で測定した殺菌力価を表２に示す。動物種にかかわらず、ＮＺ１２４株で得られた殺菌力価は、Ｈ４４／７６株及びＭ６８７株で得られた殺菌力価より低い。
【表２】
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【０１４７】
また、ＴｒＬ３  ｍｓｂＢ  ＫＯブレブ（Ｂ１８５３若しくはＢ１８５４）、又はＬ７  ｍｓｂＢ  ＫＯブレブ（Ｂ１９４８）での免疫も、ＮＺ１２４株よりＨ４４／７６株及びＭ６８７株に対して高い血清殺菌力価を誘導する。これは、試験した５種の異なる動物モデル（マウス、仔ラット及び成体ラット（表３ａ）、モルモット及びウサギ（表３ｂ））のすべてにおいて、用いた製剤にかかわらず観察される。
【０１４８】
結論として、「非アセチル化ＬＯＳ」を含むブレブで動物を免疫すると、「非アセチル化株」（Ｈ４４／７６及びＭ６８７）よりも低く「アセチル化株」（ＮＺ１２４）に対して殺菌抗体応答が誘発される。
【表３】
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【０１４９】
論考、結論及び展望
ＴｒＬ３又はＬ７ブレブでマウスを免疫すると、Ｈ４４／７６株及びＭ６８７株の死滅を媒介する高レベルの殺菌抗体が誘発された。マウス血清を用いて測定したＳＢＡ力価は、Ｈ４４／７６株及びＭ６８７株に対するものと比較してＮＺ１２４株に対して３〜２０倍低かったことから、上記抗体は、ＮＺ１２４株に対しては殺菌力が低い。
【０１５０】
予備臨床データによれば、ＮＺ１２４株が、Ｈ４４／７６株及びＭ６８７株より、抗体−補体媒介性殺菌に対する抵抗性が高いわけではないことが示唆されている。加えて、ＮＺ１２４の表面露出が乏しい防御エピトープは、Ｈ４４／７６株の表面上の類似エピトープよりも、抗体への接触性が低いわけではないことを示唆する証拠もある。この知見を確認するために、電子顕微鏡検査及び／又はフローサイトメトリー分析を実施することができる。
【０１５１】
ＮＺ１２４株のＬＯＳとＨ４４／７６株及びＭ６８７株のＬＯＳとの違いの１つは、ＮＺ１２４  ＬＯＳにしか観察されない内部コアのＧｌｃＮＡｃのアセチル化である。この違いにより、Ｈ４４／７６株及びＭ６８７株と比較して、ＮＺ１２４株の死滅の媒介において抗ＴｒＬ３ブレブ血清及び抗Ｌ７ブレブ血清の効力が低いことの説明が可能である。確かに、防御糖エピトープのアセチル化が、抗体によるこのようなエピトープの認識にプラスに又はマイナスに影響しうることは知られている。しかし、ある動物種について記載された防御エピトープの免疫原性／抗原性に対するアセチル化／非アセチル化の影響が、他の動物種及びヒトに常に観察されるわけではない。
【０１５２】
免疫原性に対する糖エピトープのアセチル化の影響は、「動物種」に応じて、しかしまた抗原に応じても変動する。それにもかかわらず、ＭｅｎＢの場合には、試験した５種の動物モデルにおいて同様の観察結果が得られている。４種の異なる動物種に共通するこれらの観察結果から、「非アセチル化ＬＯＳ」での免疫により誘導された殺菌抗体は、ＮＺ１２４株のような「アセチル化」株の死滅の媒介において効力がより低いことが示唆される。
【０１５３】
この仮定を確認するために、第２のＬ３アセチル化株を用いた血清殺菌アッセイを実施することにする（ＢＺ１０株）。さらには、アセチル化Ｈ４４／７６株及び脱アセチル化ＮＺ１２４株などの遺伝子改変株を用いたＳＢＡの実施も計画する。その結果に基づき、新規Ｌ３ブレブ（アセチル化ＧｌｃＮＡｃを含む）を評価することができるだろう。
【実施例３】
【０１５４】
内部コアＬＯＳのＯ−アセチル化：ＬＯＳ内部コアのＯ−アセチル化のためのナイセリア遺伝子
α鎖の糖組成に加えて、ヘプトースＩＩの「修飾（decoration）」は、ＬＯＳ免疫原性に影響を与えるようである。ＰＥＡの数及び位置、３位におけるグルコースの存在、７位におけるグリシンの存在、並びにＧｌｃＮＡｃのＯ−アセチル化が、交差防御の重要な決定因子であるようだ。
【０１５５】
ｌｐｔ３遺伝子（MacKinnonら、2002 Mol Microbiol. 43: 931-943）は、ヘプトースＩＩの３位にＰＥＡを付加する酵素を発現する。この遺伝子（ＮＭＢ２０１０）はフレーム変動性（phase variable）ではない。
【０１５６】
ｌｇｔＧ遺伝子は、ヘプトースＩＩの３位にグルコースを付加する酵素である。この遺伝子は、フレーム変動性である（ＷＯ０４／０１５０９９号参照）。この遺伝子は、多数の髄膜炎菌株において、単独で、又はｌｐｔ６と一緒に欠失している。
【０１５７】
ｌｐｔ６遺伝子（Wrightら、2004 J Bact. 186: 6970-6982）は、ヘプトースＩＩの６位にＰＥＡを付加する酵素を発現する。この遺伝子（ＮＭＡ０４０８）は、多数の髄膜炎菌株において、単独で、又はｌｇｔＧと一緒に欠失している。この遺伝子は、フレーム変動性ではない。ｌｐｔ６及びｌｇｔＧは、ｌｇｔ３と称される染色体上の同じ領域に位置する。
【０１５８】
ヘプトースＩＩの７位にＰＥＡを付加する酵素は不明である。  
ヘプトースＩＩの７位にグリシンを付加する酵素は不明である。  
ＧｌｃＮＡｃにＯ−アセチルを付加する酵素は、本試験の時点まで不明であった。
【０１５９】
Ｏ−アセチル化遺伝子の同定
・翻訳されたナイセリアゲノム（ナイセリア・ゴノローエ（N.gonorrhoeae）、髄膜炎菌ＭｅｎＢ  ＭＣ５８、ＭｅｎＣ  ＦＡＭ１８及びＭｅｎＡ  Ｚ２４９１）上のＯａｆＡタンパク質（サルモネラ由来；ヘモフィルスＯ−アセチラーゼＨｉ０３９１＋Ｈｉ０３９２と相同）を用いたＢＬＡＳＴ研究後、ナイセリアにｏａｃ１（ＭＣ５８遺伝子ＮＭＢ０２８５に代表される）とｏａｃ２（ＭＣ５８遺伝子ＮＭＢ１８３６に代表される）と称される２つの遺伝子ファミリーが見出され、ｏａｃ２よりｏａｃ１ファミリーの方がＯａｆＡに近縁であった。  
・両遺伝子ともにフレーム変動性である：すなわち、ＯＲＦにポリＧ区間（stretch）が存在する。  
・ＭＣ５８（非Ｏ−アセチル化ＬＯＳ）において、ｏａｃ１遺伝子（ＮＭＢ０２８５）はフレーム外（out of phase）であるが、ｏａｃ２（ＮＭＢ１８３６）はフレーム内（in phase）である。  
・試験した各株について、ｏａｃ１及びｏａｃ２に対応するＰＣＲ産物を取得した。  
・ポリＧ区間による機能性を調べるためにポリＧ区間を配列決定した。
【０１６０】
ＳＢＡ髄膜炎菌株におけるＮＭＢ０２８５及びＮＭＢ１８３６遺伝子の存在及び機能性：ＭＳ−ＭＳ（質量分光法）を用いたＡＲＤにより得られた分析データ。分子生物学により決定した遺伝子の存在／機能性。かっこ内の数値は遺伝子ＯＲＦにおけるポリＧ区間内のＧの数である。
【０１６１】
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【０１６２】
結論
・ＮＭＢ０２８５遺伝子の機能性と、ＭＳ−ＭＳによるＯ−アセチル基の検出との間に完全な相関がある（１６／１６）。  
・ＮＭＢ１８３６遺伝子の機能性と、ＭＳ−ＭＳにより得られたデータとの間には相関がない（７／１６）。  
・ナイセリアにおけるＯ−アセチル化遺伝子はＮＭＢ０２８５であるという強力な証拠を得た。
【０１６３】
図３Ｂは、ＭＣ５８株由来の髄膜炎菌ＬＯＳ  Ｏ−アセチル化遺伝子ＮＭＢ０２８５（ｏａｃ１）（Ｈ４４／７６株オープンリーディングフレーム遺伝子配列と１００％同一）を示す。大文字でオープンリーディングフレームを、小文字で周囲配列（例えば、プロモーター配列）を示す。オープンリーディングフレーム中の６つのＧからなる配列（下線部）によってこのオープンリーディングフレームがフレーム外となることに留意されたい。図３Ａには、Ｚ２４９１株由来の等価遺伝子ＮＭＡ２２０２（ｏａｃ１）を示す。オープンリーディングフレーム（大文字）中の５つのＧからなる配列によってこのオープンリーディングフレームがフレーム内となることに留意されたい。
【０１６４】
1136-GGG GGG ATA TTG AA-1150            MC58
1136-GGG GGA TAT TGA A-1149      Z2491（NMA2202）
【０１６５】
また、７６０６７６株の場合もフレーム内となる（図３Ｃ）［Ｈ４４／７６及び７６０６７６のｏａｃ１のオープンリーディングフレーム遺伝子配列同士は９７％の同一性］。
【０１６６】
Ｗ３１９３株では、前述した領域に５つのＧを有するにもかかわらず、ＬＯＳはアセチル化されていなかった。これは、ＯＲＦのヌクレオチド３５４で開始する遺伝子における別のポリＧ区域（tract）によるものであることがわかった。ＭＣ５８株、７６０６７６株及びＮＺ１２４株の場合、この位置で、遺伝子に４つのＧが存在し（フレーム内、活性遺伝子）、Ｗ３１９３株には３つのＧが見とめられた（フレーム外であり、その脱Ｏ−アセチル化状態を説明している）。
【０１６７】
ＮＺ１２４におけるＯ−アセチル化遺伝子の不活性化
ＮＺ１２４、すなわち、Ｏ−アセチル化され（活性コンホメーションのｏａｃ１による）、Ｈ４４／７６（非アセチル化）由来のブレブにより誘導された血清に対してより抵抗性が高いＬ３株において、等価のＮＭＢ０２８５遺伝子（ｏａｃ１）をノックアウトした。質量分光分析によりＯ−アセチラーゼ遺伝子の不活性化が初めて確認されたため、ＫＯ突然変異株をＳＢＡ分析に用いて、ワクチン交差防御におけるＬＯＳ  Ｏ−アセチル化の関与をさらに詳しく調べることにする。
【０１６８】
・ＮＭＢ０２８５（ＮＺ１２４）遺伝子座を配列決定した（図４Ｄ）ところ、等価のＭＣ５８のＮＭＢ０２８５遺伝子座と９８．６％の同一性を有した（ＮＺ１２４において「フレーム内（ＩＮ  ＰＨＡＳＥ）」のＧの数の確認）。停止コドンの後に、ＩＳ１１０６に類似した別の配列があり、これは、ＭＣ５８及び７６０６７６にも存在したが、ＮＺ１２４には存在しなかった。  
・Ｏ−アセチル化遺伝子の５’及び３’フランキング領域に対応するＮＺ１２４組換え５’及び３’領域を含むＮＭＢ０２８５  ＫＯプラスミドを構築した（ｐＭＧ−Ｔ−ｅａｓｙベクター）。ＮＭＢ０２８５遺伝子の代わりにＫａｎＲマーカーを導入した。このプラスミドはｐＲＩＴ  １５５７４と称する。  
・ＮＺ１２４のｏａｃ１  ＫＯ株を構築した（これに由来するＬＯＳは脱Ｏ−アセチル化されている）ところ、ｏａｃ１はＮｍｅｎのＬＯＳ  Ｏ−アセチラーゼであることがさらに示された。
【０１６９】
新規のＬ３由来株におけるＯ−アセチル化遺伝子のオン
Ｈ４４／７６株由来のブレブはＬ３免疫型（非アセチル化）である。該ブレブは、Ｌ３  Ｏ−アセチル化株（例えば、ＮＺ１２４、ＢＺ１０）に対する殺菌抗体を誘導する能力が低減しているため、機能的Ｏ−アセチル化遺伝子（ｏａｃ１）をＨ４４／７６由来のブレブ産生株に再導入することが提案される。
【０１７０】
戦略：
・ＮＺ１２４遺伝子（Ｏ−アセチル化オン株）によるＨ４４／７６のＮＭＢ０２８５遺伝子の置換（遺伝子オフ）。  
・ＮＺ１２４プロモーター及び上流調節配列を含有させた（ＮＺ１２４オープンリーディングフレーム及びＮＺ１２４の４４８ｂｐ上流を挿入した）。  
・挿入は、センス配向のエリスロマイシン耐性遺伝子を用いて行なった。  
・ワクチン異種防御効力に関するブレブＬ３  ＬＯＳ  Ｏ−アセチル化の重要性を試験した（前述の方法で改変したＨ４４／７６ブレブによるＮＺ１２４の殺菌改善があったか否かを観察するため）。このＬ３ブレブとＯ−アセチル化Ｌ２株７６０６７６由来のブレブの組合せも試験することにより、異種殺菌抗体産生について調べることにする。
【０１７１】
結果
・前記のように実施したところ、質量分光測定により、改変Ｈ４４／７６株から得られたＬＯＳがＨｅｐＩＩにおいてＯ−アセチル化されていることがわかった。
【実施例４】
【０１７２】
オクタロニー法（免疫型決定）、ＭＳ／ＭＳ分析及び分子生物学分析による６２７５株及びＣ１１株のＬＯＳの特性決定
要約
・特異的なポリクローナル抗体を用いた免疫拡散法（オクタロニー法）により、６７２５株及びＣ１１株の免疫型を決定した。ＭＳ／ＭＳ分析により内部コアＬＯＳ組成を決定した。ＰＣＲ及び配列決定により、ＬＯＳ内部コア修飾に関与する酵素をコードする遺伝子を分析した。  
・ＭＳ／ＭＳ分析によれば、６２７５株はＨｅｐＩＩに２個のＰＥＡ残基を有する。この株はＬ３株として免疫型決定されたが、通常のＬ３株には（ＨｅｐＩＩの３位に）１個のＰＥＡしかない。  
・ＭＳ／ＭＳにより、Ｃ１１株の内部コアＬＯＳの２つの異なる組成が観察された。一方の集団はＨｅｐＩＩに１個のＰＥＡ残基を含むのに対し、他方の集団は２個のＰＥＡ残基を含む。この株は、抗Ｌ２血清と非常に弱い反応を有するＬ３株として免疫型決定した。
【０１７３】
概説
髄膜炎菌ＬＯＳの内部コアＬＯＳ組成は、これまでの記載より複雑であると思われる。近年まで、内部コアＬＯＳは、ＨｅｐＩＩにＰＥＡを含まないか、又は3若しくは6（7）位に1個だけＰＥＡ残基を含むと提唱されていた。しかし、近年、３位及び６（又は７）位に２個のＰＥＡを含む新規の内部コアＬＯＳが記載された。この新しいＬＯＳ構造は、これまでＬ３として免疫型決定された株由来のものと記載されていることから、この新規のＬＯＳ構造は、Ｌ３変異体にちなんで「Ｌ３ｖ」と名付けられた。
【０１７４】
Ｌ３ｖ構造の発見前に、ＬＯＳの免疫型決定に基づく疫学データから、約７０％の侵襲性血清群Ｂ株はＬ３であり（３位にＰＥＡを含む）、残りの株の大部分はＬ２（６位にＰＥＡを含む）であることが示されている。
【０１７５】
一連のＬ３及びＬ２株、並びにＬ３由来のブレブ又はＬ２由来のブレブのいずれかで免疫した動物から得た血清を用いて得られた殺菌データに基づき、本発明者らは、抗Ｌ３由来の血清のみがＬ３株の補体死滅を媒介することができ、また、抗Ｌ２血清のみがＬ２株を死滅させることができると結論付けた。しかし、興味深いことに、２つの新しいＬ３ｖ株について得られた殺菌データは、本発明者らの以前の結論と一致していない。確かに、これら２つの株の補体死滅は、抗Ｌ２由来の血清により媒介されるのであり、抗Ｌ３血清によってではない。これら２つの「非定型」株は血清群Ｂの６２７５株と血清群Ｃの標準株Ｃ１１である。
【０１７６】
免疫型と殺菌結果との間で相違する結果を理解するために、６２７５株及びＣ１１株の内部コア組成をＭＳ／ＭＳにより決定した。さらに、オクタロニー法（特異的ポリクローナル血清を用いた免疫拡散法）を用いて、これら株の免疫型決定を実施した。また、分子生物学的方法を用いて、機能的ｌｐｔ３、ｌｐｔ６及びｌｇｔＧ遺伝子の存在を分析した。これらの遺伝子は、ＨｅｐＩＩで、それぞれ、３位のＰＥＡ、６位のＰＥＡ、及び３位のグルコースの付加に関与する酵素をコードする。
【０１７７】
結果
１．ＭＳ／ＭＳ分析による内部コア組成
ＭＳ／ＭＳ分析（図４参照）により、以下のことが明らかになった：
・両方の株において、α鎖ＬＯＳは、末端シアル酸基を有するＬ２及びＬ３について記載された典型的ＬＮｎＴ四糖である。  
・６２７５株の内部コアＬＯＳは、ほぼ確実に３位及び６（７）位に２つのＰＥＡ残基を有するが、ＮＭＲ分析により確認する必要がある。  
・Ｃ１１株は、２つの異なる内部コア：
−１個のＰＥＡを含む（ＨｅｐＩＩでのその位置は明確にされていないが、ＨｅｐＩＩのグリシンに対し弱いシグナルが認められることから、７位のＰＥＡは排除される）第１集団と、
−２個のＰＥＡを含む（このＨｅｐＩＩでもグリシンが検出されたため、ほぼ確実に３位及び６位に含む）第２集団
から構成されていた。  
・いずれの株についても、ＨｅｐＩＩにグルコースは検出されない。
【０１７８】
２．ＬＯＳ免疫型決定
一連の特異的抗血清を用いて、免疫型決定を実施した。Ｌ３及びＬ２抗血清以外の抗血清（Ｌ１、Ｌ４、Ｌ５…）で得られた結果は、６２７５株及びＣ１１株に関して陰性であったため、Ｌ３抗血清及びＬ２抗血清を用いて得られた結果のみを以下に記載する。これらの実験では、ＧＳＫ  Ｂｉｏで現在用いられている６２７５株及びＣ１１株（ＧＳＫ６２７５−１＆２、及びＧＳＫ  Ｃ１１）を、アムステルダム大学で２０年以上フリーザー内に保存された類似株（Ｚｏｌ  ６２７５株及びＲＩＶ  Ｃ１１株）と比較した。
【０１７９】
２つの６２７５株（Ｚｏｌ  ６２７５とＧＳＫ６２７５−１＆２）は免疫型決定アッセイにおいて類似した挙動を有する。両者は抗Ｌ３血清と強力に反応するが、抗Ｌ２血清とはそうではなかった。
【０１８０】
ＧＳＫ  Ｃ１１株とＲＩＶ  Ｃ１１株も同じ結果を示す。いずれの株も、抗Ｌ３血清について陽性であり、抗Ｌ２血清については弱い陽性である。
【０１８１】
Ｃ１１株と抗Ｌ２血清を用いて得られた極めて弱い沈降を確認するため、１９８０年にＬ３，２として予め型決定された５人の患者の分離菌と組み合わせて、新たな免疫拡散実験を実施した。Ｃ１１の結果は、抗Ｌ２血清との極めて弱い沈降を再度示し、また５種の病原菌株の型決定を確認した。
【０１８２】
2009539923.tif 000018
【０１８３】
３．分子特性決定
３位にＰＥＡを付加する酵素が同定されており、これは、ｌｐｔ３遺伝子によりコードされる。ＨｅｐＩＩの３位のＰＥＡは、超毒性髄膜炎菌株の７０％に検出され、Ｗｒｉｇｈｔ及びその共同研究者らは、分析した株の８６％においてＰＣＲによりｌｐｔ３遺伝子を検出した。この遺伝子は、フレーム変動により調節されず、様々な血清群Ｃ及びＡ株において部分的に欠失していることがわかった。３位へのＰＥＡの付加は、同じ位置でのグルコースの付加と競合していると仮定されている。関与する酵素は、ｌｇｔＧ遺伝子によりコードされ（ＷＯ９４／０１５０９９号参照）、ＯＲＦ内のポリＧ区域でのフレーム変動により調節される。Ｍｏｘｏｎ研究所の仮定は、ｌｇｔＧのＯＲＦが存在し、かつフレーム内であれば、機能的酵素が産生され、３位にグルコースが付加されるため、この位置にＰＥＡは付加されないというものである。
【０１８４】
６位にＰＥＡを付加する酵素をコードする遺伝子は、ｌｇｔＧ遺伝子と並んで位置するｌｐｔ６である。この遺伝子は、フレーム変動による調節を受けやすい領域は含んでおらず、髄膜炎菌の４８％に検出された（Wrightら、2004）。ＨｅｐＩＩの７位にグリシンを付加する酵素をコードする遺伝子は不明である。
【０１８５】
ｍｅｎＢ  ６２７５株及びｍｅｎＣ  Ｃ１１株を、対応するＬ３及びＬ２標準株と並行して分析した。ＰＣＲ増幅及び配列決定実験を実施した：
・ｌｐｔ３遺伝子の完全コピーの存在を評価しながら（ＰＣＲ）、ｌｇｔＧ遺伝子の機能性についての研究を続行した（ＰＣＲによる存在、ＯＲＦ内のポリＣ区間の配列）
・ｌｐｔ６遺伝子の存在をＰＣＲにより評価した。遺伝子の完全コピーが存在すれば、この株が６位にＰＥＡを有するＬＯＳを含むことが推定される。
【０１８６】
2009539923.tif 000019
【０１８７】
これらのデータによれば、ｍｅｎＢ  ６２７５株及びｍｅｎＣ  Ｃ１１株はＬ２免疫型に関係しているようである。しかし、ＭＳ／ＭＳ分析は、いずれの株についても、２個のＰＥＡ基を示し、グルコースは示していない。＊は、ｌｇｔＧ遺伝子がフレーム変動領域に１１（活性遺伝子に見とめられる通常の数）ではなく１４の連続したＣヌクレオチドを有することを示す。これは、オープンリーディングフレームがフレーム内であり、従って、機能的タンパク質を産生しうることを意味するが、別のプロリン残基の付加により、このタンパク質構造、従って、その機能が破壊される可能性があることも考えられる。
【０１８８】
４．要約
次の表は、多様な方法を用いた様々な髄膜炎菌株の特性決定を要約したものである。
【０１８９】
2009539923.tif 000020
【０１９０】
論考
内部コアＬＯＳ組成の多様性は、これまで記載されているより複雑である。初めに、ＨｅｐＩＩに１個のＰＥＡ基を含まない又は含む（３位又は６／７位のいずれか）株が記載されたが、近年、２個のＰＥＡ基を含む株が記載された。このような株は、例えば、血清群Ｂの６２７５株及び血清群ＣのＣ１１株である。
【０１９１】
驚くべきことに、６２７５株及びＣ１１株で得られた免疫型決定結果と血清殺菌結果は一致しない。確かに、これらの２株はＬ３株として型決定されるが、その死滅は、抗Ｌ２由来のブレブ血清により媒介されるのであり、抗Ｌ３由来のブレブ血清によってではない（次の実施例を参照）。
【０１９２】
これら株の関連について、また、２個のＰＥＡ基の存在が、継続的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ継代培養による研究室の人工産物でありうるのか否かについて疑問が生じた。本発明者らは、６２７５株及びＣ１１株の様々なシード（seeds）を比較する機会を得た。各株について、現在本発明者らが用いたシードを、２０年以上保存されていた古いシード（アムステルダム大学）と比較した。各株について、２つのシードはオクタロニーアッセイにおいて同じ挙動を示したが、これは、少なくとも過去２０年間変化がなかったことを示唆する。それでも、２個のＰＥＡ残基の存在を確認するために、最も古いシードの内部コアＬＯＳ組成を決定する必要がある。
【０１９３】
文献によれば、約７０％の侵襲性髄膜炎菌株がＬ３である。Ｌ３ｖ株で得られたオクタロニー法の結果は、この方法がＬ３株とＬ３ｖ株を区別しないことを示唆するものであった。従って、両試験において「真のＬ３」株の数を過大評価する可能性がある。ｌｐｔ３及びｌｐｔ６遺伝子は、ＨｅｐＩＩのそれぞれ３位及び６位におけるＰＥＡ基付加に寄与している。約３６％の循環性株が両方の遺伝子を含み、５０％がｌｐｔ３のみを、また１２％がｌｐｔ６のみを有する（Wright JCら、2004）。従って、Ｌ３として型決定されたとしても、潜在的に３６％の株がＬ３ｖでありうる。しかし、様々な内部コアＬＯＳ構造に特異的な一連のＭＡｂを用いて得られた近年の疫学データは、２％以下の株がＨｅｐＩＩに２個のＰＥＡ基を有することを示唆していた（Gidney MAJら、Infect Immun. 2004 72:559-69）。これら２つの試験の差異（３６％対２％）は、６位に１個のＰＥＡ基を有する株のヒト補体に対する高い感受性により説明することができる（Ram Sら、J Biol Chem. 2003 278:50853-62）。以上すべてのデータを考え合わせると、侵襲性株の大部分が「真のＬ３」であることを示唆している。
【０１９４】
ｌｇｔＧとｌｐｔ−３はＨｅｐＩＩのＯ−３位について競合し、ＰＥＡ残基よりもＧｌｃ残基の付加に前記の偏りが生じることが示唆されている（Wright JCら、2004）。この仮定は、機能的ｌｇｔＧ遺伝子の存在下でも、６２７５株及びＣ１１株の内部コアＬＯＳに２つのＰＥＡが存在する（フレーム変動領域において１４のＣヌクレオチドを含むフレーム内ｌｇｔＧ遺伝子が活性ではない限り。前記参照）ことより証明されるように、普遍的な法則ではないと考えられる。Ｍｏｘｏｎ研究所の仮定に加えて、ＮｍＢ株のＬＯＳ内部コア構造の調節／組成に関与する別の系が近年記載された。この系は、ＭｉｓＲ／ＭｉｓＳ二成分調節系（Tzeng YLら、J Biol Chem. 2004 279: 35053-62）である。結論として、内部コアＬＯＳの組成に関与する機構は複合的であるようであり、十分に解明されていない。
【０１９５】
患者から単離した５つの株は、抗Ｌ３血清との優勢な沈降だけではなく、抗Ｌ２血清との弱い沈降も示すことから、意外なＬＯＳ免疫型を呈示した。これはまた、抗Ｌ２血清との沈降が非常に弱いにもかかわらず、Ｃ１１株についても同様である。Ｃ１１株の内部コアＬＯＳのＭＳ／ＭＳ分析も、Ｌ３及びＬ２  ＬＯＳの共発現と部分的に一致する２つの異なる内部コア組成を示している。免疫沈降により同定されたＬ３  ＬＯＳは、実際にはＬ３ｖ  ＬＯＳ（２個のＰＥＡ残基を含む）であると考えられるが、Ｌ２  ＬＯＳは、Ｃ１１株に明らかに機能的なｌｇｔＧ遺伝子が検出されているため、特定のＬＯＳ分子には存在するはずの検出可能なＧｌｃが存在しなくても、６位に１個のＰＥＡを有する（ＮＭＲ分析により確認する必要がある）内部コアＬＯＳに関連しているだろう。それでもやはり、これら患者分離菌の１以上の内部コアＬＯＳについて分析（ＭＳ／ＭＳ、分子特性決定及びＳＢＡ）を実施し、Ｌ３及びＬ２株がＬ３ｖ及びＬ２  ＬＯＳを共発現することを確認する必要がある。
【０１９６】
結論として、その内部コアに２個のＰＥＡを有する株はＬ３株として免疫型決定されるが、この免疫型決定は、ＳＢＡにおける生物学的反応性、並びに「機能的」ｌｇｔＧ、ｌｐｔ３及びｌｐｔ６遺伝子の存在の分析と一致しない。本発明者のデータは、これらＬ３ｖ株が恐らくＬ３株に由来するものではなく（ｌｐｔ６遺伝子の存在のため）、従って、その名称を改めるべきであることを示している。
【実施例５】
【０１９７】
髄膜炎菌ワクチン：ＬＯＳ濃縮ブレブをベースとするワクチンの二価組成物
2009539923.tif 000021
【０１９８】
デスフェラール（desferal）を用いて又は用いずに実施した培養からのブレブの作製
・デスフェラールの存在下で、Ｂ１８５４、Ｂ１９４８、Ｂ１９７１、Ｂ１９８４及びＢ１９８７ブレブを培養物から作製した。  
・Ｂ１９００ブレブは、デスフェラールを用いずに、培養物から作製した。
【０１９９】
方法
動物実験の手順：
３０匹のマウスの群を筋内経路（ＩＭ）によって３回、０、２１及び２８日目にＯＭＶ（約１５〜２０％の無毒化ＬＯＳを含む）で免疫した。毎回の接種材料は、５μｇ（タンパク質含量）の非吸着ＯＭＶからなるものであった。ＯＭＶは、莢膜多糖及びＰｏｒＡが下方制御され、ＬＯＳが無毒化される（ｍｓｂＢ突然変異）ように操作した髄膜炎菌（Ｎｍｅｎ）株から作製した。産生株（前記表を参照）は、遺伝子改変された野生型Ｈ４４／７６株（この場合、これらはＬ７  ＬＯＳ又はＴｒＬ３  ＬＯＳのいずれかを発現した）あるいは遺伝子改変された野生型７６０６７６株（この場合、これらは、シアル化された若しくはシアル化されていないＬ２  ＬＯＳ、又はＴｒＬ２  ＬＯＳを発現した）のいずれかに由来するものであった。前述した培養条件下で増殖させた株からブレブを単離した。４２日目に、一連の髄膜炎菌株（表１参照）を用いた血清殺菌アッセイ（ＳＢＡ）による分析のために血液サンプルを採取した。プールした血液サンプル又は個々の血清（１群につき１０〜３０の血清）のいずれかについてＳＢＡを実施した。
【０２００】
仔ラット実験を以下のように実施した。２０匹の７日齢ラットの群をＩＭ経路によって（０、１４、２８及び６３日目に）免疫した。毎回の接種材料は、１０μｇ（タンパク質含量）の非吸着ブレブからなるものであった。４回目の注射から１４日後に血液サンプルを採取した。
【０２０１】
モルモット実験を次のように実施した。２０匹のモルモットの群をＩＭ経路によって（０、１４、２８日目に）免疫した。毎回の接種材料は、２０μｇ（タンパク質含量）の非吸着ブレブからなるものであった。３回目の注射から１４日後に血液サンプルを採取した。
【０２０２】
ウサギ実験を次のように実施した。５匹のニュージーランドシロウサギの群をＩＭ経路によって（０、２１、４２日目に）免疫した。毎回の接種材料は、２０μｇ（タンパク質含量）の非吸着ブレブからなるものであった。３回目の注射から１４日後に血液サンプルを採取した。
【０２０３】
デスフェラールを含む液体培養物を用いたＳＢＡ：
３７℃＋５％ＣＯ２にて、ＭＨ＋１％Ｐｏｌｙｖｉｔｅｘ＋１％ウマ血清ペトリ皿上で髄膜炎菌株を一晩培養した。これらを振盪しながら、３７℃で５０μＭのデスフェラール（鉄キレート剤）を添加した液体ＴＳＢ培地において４７０ｎｍでのＯＤが０．５に達するまで３時間継代培養した。血清サンプルを５６℃で４０分かけて不活性化し、次にＰＢＳ−グルコース０．１％で１／１０又は１／５０希釈した後、平底マイクロプレートにおいて２５μｌの容量で２倍希釈（８希釈）した。細菌をＰＢＳ−グルコース０．１％で希釈することにより、５３００ＣＦＵ／ｍｌを達成し、この希釈物１８．８μｌを血清希釈物に添加した。また、ウサギ補体（６．２μｌ）も各ウェルに添加した。振盪しながら３７℃で７５分インキュベートした後、５０μｌのＭＨ＋０．９％寒天をウェルに添加し、約３０分後に５０μｌのＰＢＳ＋０．９％寒天を添加した。３７℃＋ＣＯ２で、マイクロプレートを一晩インキュベートした。ＣＦＵを計数し、死滅の割合（％）を計算した。ＳＢＡ力価は、５０％の死滅をもたらす希釈度とする。
【０２０４】
寒天培養物（デスフェラールを含まない）を用いたＳＢＡ：
３７℃＋５％ＣＯ２にて、ＢＨＩ＋１％ウマ血清ペトリ皿上で髄膜炎菌株を一晩培養した。これらを、３７℃＋５％ＣＯ２で、ＢＨＩ＋１％ウマ血清を用いて４時間継代培養した。血清サンプルを５６℃で４０分かけて不活性化し、次にＰＢＳ−グルコース０．１％で１／１０希釈した後、平底マイクロプレートにおいて２５μｌの容量で２倍希釈（８希釈）した。細菌をＰＢＳ−グルコース０．１％で希釈することにより、６４００ＣＦＵ／ｍｌを達成し、この希釈物１２．５μｌを血清希釈物に添加した。また、ウサギ補体（１２．５μｌ）も各ウェルに添加した。振盪しながら３７℃で７５分インキュベートした後、５０μｌのＴＳＢ＋０．９％寒天をウェルに添加し、約３０分後に５０μｌのＰＢＳ＋０．９％寒天を添加した。３５℃又は３７℃＋ＣＯ２で、マイクロプレートを一晩インキュベートした。ＣＦＵを計数し、死滅の割合（％）を計算した。ＳＢＡ力価は、５０％の死滅をもたらす希釈度とする。
【０２０５】
様々な免疫型の内部コアＬＯＳ組成
・Ｌ３＝ＨｅｐＩＩ（ほぼ確実に３位）に１個のＰＥＡを有し、内部コアＧｌｃＮＡｃに別のアセチルはない。  
・“Ｌ３”＝ＨｅｐＩＩ（ほぼ確実に３位）に１個のＰＥＡを有し、内部コアＧｌｃＮＡｃに１個の別のアセチルを有する。  
・Ｌ２＝ＨｅｐＩＩ（ほぼ確実に６位）に１個のＰＥＡを有し、内部コアＧｌｃＮＡｃに１個の別のアセチルを有する。  
・変異体＝ＨｅｐＩＩ（ほぼ確実に３位及び６位）に２個のＰＥＡを有し、内部コアＧｌｃＮＡｃに１個の別のアセチルを有する；しかし、Ｗ３１９３株においてはＨｅｐＩＩにＯａｃは一切存在しないことに留意されたい。  
・Ｌ１０及びＬ１１＝構造は決定されていない。  
・Ｌ３、“Ｌ３”、Ｌ２及び変異体は、ＬＮｎＴ四糖（シアル化又は非シアル化）を含む。
【０２０６】
結果
以下の表１に要約した結果及び図５から、以下のことがわかる：
・Ｌ２由来のブレブは、ＮｍｅｎＢ  Ｌ２株に対する殺菌抗体を誘導するが、ＮｍｅｎＢ  Ｌ３株（Ｍ９７２５０６８７を除く）に対するものは誘導しない。これに対し、Ｌ３由来のブレブは、ＮｍｅｎＢ  Ｌ３及び“Ｌ３”株に対して、また、血清群Ａの３１２５株（Ｌ１０）及び血清群ＹのＭ０１．０２４０５３９株（表ではＭ０１．５３９）に対して防御応答を誘導するが、Ｌ２株に対しては誘導しない。質量分光法による３１２５のＬ１０  ＬＯＳの構造を図６に示す。  
・加えて、Ｌ２由来のブレブは、変異型ＬＯＳを保有する株（ＮｍｅｎＢ  ６２７５株及びＮｍｅｎＣ  Ｃ１１株）に対して防御を誘導し、また、血清群Ｃ（Ｃ１９）、血清群Ｙ（Ｓ１９７５）、血清群Ａ（Ｆ８２３８、Ｌ１１）及び血清群Ｗ−１３５（Ｓ４３８３株及び３１９３株）由来の他の株に対しても誘導する。
【０２０７】
・Ｌ２及びＬ３株由来の濃縮ＬＯＳブレブをベースとする二価ワクチンは、試験したすべての株（どの血清群及びＬＯＳ免疫型でも）に対して防御応答（殺菌抗体）を誘導する（Ｌ２  ＮＳ及びＴｒＬ３  ＯＭＶを用いた二価ワクチンは試験しなければならない）。  
・非末端切断型Ｌ２  ＬＯＳは、ｌｇｔＢ突然変異体（＝ＴｒＬ２）より優れた「交差防御」を誘導する。これは、Ｌ３由来のブレブ（ＴｒＬ３＝Ｌ７）については、そうではない。  
・非シアル化Ｌ２ブレブは、シアル化Ｌ２ブレブと類似レベルの殺菌抗体を誘導する（少なくとも６２７５株に対して）。  
・ＳＢＡにおいて対象とした（ターゲティング）株によれば、二価ワクチンについて妨害が観察されたり、されなかったりするが、これは、試験した株のすべてに対して最も優れた効力（ＳＢＡ力価）を確実にするためには、二価製剤／組成物の微調整が必要であることを示している。  
・内部コアの修飾は、交差反応性殺菌抗体の誘導に大きな影響を与える。
【０２０８】
2009539923.tif 000022
【０２０９】
表２の結果から、以下のことがわかる：
・非血清群Ｂ株及び６２７５株に対し、Ｌ２由来のブレブ（末端シアル酸を含む又は含まないＬ２、及びＴｒＬ２）により付与される交差防御は、モルモット、ウサギ及び仔ラットにおいても観察される。  
・一般に、Ｌ２由来のブレブは、Ｍ９７２５０６８７（表ではＭ６８７）を除いて、Ｌ３株の補体死滅を媒介することができる有意なレベルの殺菌抗体を誘導することができない（仔ラット及びウサギ血清を用いたＨ４４／７６株に関するデータは、陰性血清について測定した活性のバックグランドにより、信頼性に欠けるため、反復しなければならない）。  
・モルモットでは、ＴｒＬ２ブレブは、Ｌ２  ｌｓｔ−ブレブ及びＬ２ブレブより高レベルの殺菌抗体を誘導するようであるが、仔ラット、マウス及びウサギでは、Ｌ２≧Ｌ２  ｌｓｔ−≧ＴｒＬ２の順位が観察される。  
・これらの結果から、殺菌抗体の誘導を誘発するためにＬ２  ＬＯＳのシアル化は必要ではないこと、また、ＴｒＬ２ブレブ（ｌｇｔＢ突然変異）も、殺菌抗体の産生を誘発することができる（ＴｒＬ３  ＬＯＳと同様に）ことがわかる。
【０２１０】
2009539923.tif 000023
【０２１１】
結論：Ｌ２及びＬ３ベースのＬＯＳワクチンを組み合わせると、Ｍｅｎ  Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５及びＹ株を死滅させうる抗体を誘発することができることが初めて証明された。Ｌ２ベースのワクチンは、Ｌ２株、変異（Ｌ３ｖ）株及びＬ１１株を死滅させることができる。また、Ｌ３ベースのワクチンはＬ３株、“Ｌ３”株（効力は劣る）、及びＬ１０株を死滅させることができる。末端切断型（ｌｇｔＢ（−））及び全長（又はｌｓｔ（−））α鎖は殺菌することができるが、末端切断型はＬ３ワクチンに有益であり、全長（又はｌｓｔ（−））はＬ２ワクチンに有益であるようだ。これら２つのＬＯＳベースのワクチンを組み合わせると、髄膜炎菌に対するワクチンとして非常に効力があることがわかる。
【実施例６】
【０２１２】
髄膜炎菌ワクチン：二価ＯＭＶ（Ｌ７由来及びＬ２由来）はＡＢＣＷＹ株に対して交差防御を誘導する
方法
動物実験の手順：
−３０匹のマウスの群を筋内経路（ＩＭ）によって３回、０、２１及び２８日目に、二価ＯＭＶ製剤（約１５〜２０％の無毒化ＬＯＳを含む、Ｌ３由来のＯＭＶ＋Ｌ２由来のＯＭＶ）で免疫した。毎回の接種材料は、０．８μｇ＋０．８μｇ（ＬＯＳ含量）の非吸着ＯＭＶからなるものであった。ＯＭＶは、莢膜多糖及びＰｏｒＡが下方制御され、ＬＯＳが無毒化される（ｍｓｂＢ突然変異）ように操作した髄膜炎菌（Ｎｍｅｎ）株から作製した。産生株は、遺伝子改変された野生型Ｈ４４／７６株（Ｌ３）又は遺伝子改変された野生型７６０６７６株（Ｌ２）のいずれかに由来するものであった（遺伝子改変及び培養条件を記載する以下の表を参照）。４２日目に、血清群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５（Ｗ）及びＹ由来の一連の２２種の髄膜炎菌株を用いた血清殺菌アッセイ（ＳＢＡ）による分析のために血液サンプルを採取した。プールした血液サンプルについてＳＢＡを実施した。血清は実験２００６０４２５及び２００６０４２６から得たものである。
【０２１３】
−以下のように仔ラット実験を実施した。７日齢のラット（１群につきｎ＝２０）をＩＭ経路によって（０、１４、２８及び６３日目に）免疫した。毎回の接種材料は、１．６μｇ＋１．６μｇ（ＬＯＳ含量）の非吸着ＯＭＶからなるものであった。４回目の注射から１４日後に血液サンプルを採取し、プールした（実験２００６０４８４）。
【０２１４】
−モルモット実験を次のように実施した。２０匹のモルモットの群をＩＭ経路によって（０、１４、２８日目に）免疫した。毎回の接種材料は、３．２μｇ＋３．２μｇ（ＬＯＳ含量）の非吸着ＯＭＶからなるものであった。３回目の注射から１４日後に血液サンプルを採取し、プールした（実験２００６０４８７）。
【０２１５】
−ウサギ実験を次のように実施した。５匹のニュージーランドシロウサギの群をＩＭ経路によって（０、２１、４２日目に）免疫した。毎回の接種材料は、３．２μｇ＋３．２μｇ（ＬＯＳ含量）の非吸着ＯＭＶからなるものであった。最初の注射の前及び３回目の注射から１４日後に血液サンプルを採取し、これらをＳＢＡで個々に試験した（実験２００６０４８６）。
【０２１６】
2009539923.tif 000024
【０２１７】
デスフェラールを用いて又は用いずに実施した培養からのＯＭＶの作製
デスフェラールを用いて実施した培養物からＢ１８５４及びＢ１９４８  ＯＭＶを作製した。
【０２１８】
デスフェラールを用いずに実施した培養物からＢ２０７１及びＢ２０８４  ＯＭＶを作製した。
【０２１９】
ＳＢＡ：
３７℃＋５％ＣＯ２にて、髄膜炎菌株をペトリ皿上で一晩培養した。次に、３７℃＋５％ＣＯ２にて、デスフェラール（鉄キレート剤）を含む又は含まないペトリ皿上で、上記株を４時間継代培養した。血清サンプルを５６℃で４０分かけて不活性化し、次にＰＢＳ−グルコース０．１％で１／１０又は１／５０希釈した後、平底マイクロプレートにおいて２５μｌの容量で２倍希釈した。次に、細菌（ＰＢＳ−グルコース０．１％で希釈することにより、１ウェル当たり約１００〜１５０ＣＦＵ／ｍｌを達成する）と、仔ウサギ補体（マイクロウェル中の最終濃度：１２．５％ｖ／ｖ）との混合物２５μｌを血清希釈物に添加した。振盪しながら３７℃で７５分インキュベートした後、２層の寒天（０．９％）をウェルに添加した。３５℃又は３７℃＋ＣＯ２で、マイクロプレートを一晩インキュベートした後、ＣＦＵを計数し、死滅の割合（％）を計算した。ＳＢＡ力価は、５０％の死滅をもたらす希釈度とする。
【０２２０】
様々な免疫型の内部コアＬＯＳ組成
・Ｌ３＝ＨｅｐＩＩ（ほぼ確実に３位）に１個のＰＥＡを有し、内部コアＧｌｃＮＡｃに別のアセチルはない。  
・“Ｌ３”＝ＨｅｐＩＩ（ほぼ確実に３位）に１個のＰＥＡを有し、内部コアＧｌｃＮＡｃに１個の別のアセチルを有する。  
・Ｌ２＝ＨｅｐＩＩ（ほぼ確実に６位）に１個のＰＥＡを有し、内部コアＧｌｃＮＡｃに１個の別のアセチルを有する。  
・変異体＝ＨｅｐＩＩ（ほぼ確実に３位及び６位）に２個のＰＥＡを有し、一般に内部コアＧｌｃＮＡｃに１個の別のアセチルを有する。  
・Ｌ１０及びＬ１１＝構造は完全には決定されていない。  
・Ｌ３、“Ｌ３”、Ｌ２及び変異体は、ＬＮｎＴ四糖（シアル化、又は非シアル化）を含む。
【０２２１】
結果
殺菌力価の４倍増加（対照動物由来のプール血清サンプル、又は比較物としてのワクチン前血清サンプルを用いた）に基づき、得られた結果（次の表を参照）から以下のことがわかる：
・Ｌ７＋ＮＳＬ２  ＯＭＶ又はＴｒＬ３＋ＴｒＬ２  ＯＭＶのいずれかを含む非吸着二価製剤は、血清群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ及びＹに属する髄膜炎菌株に対する交差防御を付与することができる。  
・この交差防御は、マウスだけではなく、仔ラット、モルモット及びウサギでも観察される。  
・しかし、上記製剤は、Ｌ４  ＬＯＳ免疫型を発現する株に対しては防御応答を誘発することができない。これらの実験において、血清はＬ１０株に対して殺菌性ではない。  
・Ｌ３又は“Ｌ３”又は変異体又はＬ２  ＬＯＳを発現する株のほとんどは、マウス、仔ラット及びモルモット血清により死滅する。これらの株に対し、交差防御の割合（％）は９０％近い。  
・交差防御は、ウサギにおいて、より低いようである。
【０２２２】
結論
Ｌ３及びＬ２髄膜炎菌株由来のＯＭＮをベースとする二価ワクチンは、Ｌ３又は“Ｌ３”又は変異体（Ｌ３ｖ）又はＬ２  ＬＯＳのいずれかを発現する髄膜炎菌株に対する防御を付与することができる。この防御は所与の血清群に制限されるわけではない。
【０２２３】
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【実施例７】
【０２２４】
Ｌ７  ＯＭＶの免疫原性に対するＯＡｃの影響
方法
動物実験の手順：
−３０匹のマウスの群を筋内（ＩＭ）経路によって３回、０、２１及び２８日目にＯＭＶ（約１５〜２０％の無毒化ＬＯＳを含む）で免疫した。毎回の接種材料は、０．８μｇ（ＬＯＳ含量）の非吸着ＯＭＶからなるものであった。ＯＭＶは、莢膜多糖及びＰｏｒＡが下方制御され、ＬＯＳが無毒化される（ｍｓｂＢ突然変異）ように操作した髄膜炎菌株から作製した。産生株は、遺伝子改変された野生型Ｈ４４／７６株に由来するものであった（遺伝子改変及び培養条件を記載する以下の表を参照）。４２日目に、髄膜炎菌株を用いた血清殺菌アッセイ（ＳＢＡ）による分析のために血液サンプルを採取した。個々の血清についてＳＢＡを実施した。血清は実験２００６０６３４から得たものである。
【０２２５】
−モルモット実験を次のように実施した。２０匹のモルモットの群をＩＭ経路によって（０、１４、２８日目に）免疫した。毎回の接種材料は、３．２μｇ（ＬＯＳ含量）の非吸着ＯＭＶからなるものであった。３回目の注射から１４日後に血液サンプルを採取した（実験２００６０６３６）。
【０２２６】
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【０２２７】
ＳＢＡ：
３７℃＋５％ＣＯ２にて、髄膜炎菌株（ＯＡｃ−であるＨ４４／７６及びＭ９７２５０６８７と、ＯＡｃ＋であるＮＺ１２４）をペトリ皿上で一晩培養した。次に、３７℃＋５％ＣＯ２にて、デスフェラール（鉄キレート剤）を含むペトリ皿上で、上記株を４時間継代培養した。血清サンプルを５６℃で４０分かけて不活性化し、次にＰＢＳ−グルコース０．１％で１／１０又は１／５０希釈した後、平底マイクロプレートにおいて２５μｌの容量で２倍希釈した。次に、細菌（ＰＢＳ−グルコース０．１％で希釈することにより、１ウェル当たり約１００〜１５０ＣＦＵ／ｍｌを達成する）と、仔ウサギ補体（マイクロウェル中の最終濃度：１２．５％ｖ／ｖ）との混合物２５μｌを血清希釈物に添加した。振盪しながら３７℃で７５分インキュベートした後、２層の寒天（０．９％）をウェルに添加した。３５℃又は３７℃＋ＣＯ２で、マイクロプレートを一晩インキュベートした。ＣＦＵを計数した後、死滅の割合（％）を計算した。ＳＢＡ力価は、５０％の死滅をもたらす希釈度とする。
【０２２８】
結果
マウスの場合、Ｌ７  ＯＡｃ＋ＯＭＶはＬ７  ＯＡｃ−ＯＭＶより免疫原性が高い（以下の表を参照）。確かに、Ｌ７  ＯＡｃ＋ＯＭＶで免疫したマウス由来の血清は、Ｌ７  ＯＡｃ−ＯＭＶで免疫したマウス由来の血清より高い補体媒介殺菌活性を示す。これは、ＯＡｃ−及びＯＡｃ＋野生型株に対して観察される。しかし、有意な差異はＯＡｃ−株（Ｈ４４／７６及びＭ９７２０５６８７）に対してしか観察されない。
【０２２９】
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【０２３０】
モルモットの場合には、ＳＢＡにおいてＯＭＶの両方の型がＯＡｃ＋及びＯＡｃ−野生型株に対して同様の免疫原性を示す（以下の表参照）。
【０２３１】
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【０２３２】
結論
内部コアＧｌｃＮＡｃのＯ−アセチル化は、マウスにおいてＯＭＶの免疫原性（ＳＢＡ力価）を増強するが、モルモットではそうではないことが証明された。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ−１】
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【図２Ｂ−２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ−１】
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【図３Ｂ−２】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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