(57)【要約】  本発明は、ヒトアミロイドβ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のカルボキシ末端断片を発現する遺伝子組換えハエ、ならびにＡＰＰおよびタウタンパク質の両方の断片を発現する二重遺伝子組換えハエを開示する。本発明の遺伝子組換えハエは、アルツハイマー病等の神経変性疾患のモデルを提供する。本発明はさらに、遺伝的改変因子を同定する方法に加え、遺伝子組換えハエを用いて神経変性疾患を治療するための治療化合物を同定するためのスクリーニング方法を開示する。
2009539406.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノムに配列番号１に示す第１のＤＮＡ配列、配列番号１６に示す第２のＤＮＡ配列およびＧａｌ４をコードする第３のＤＮＡ配列を含む遺伝子組換えショウジョウバエであって、前記第１のＤＮＡ配列が配列番号１５に示すＤＮＡ配列と結合し、および前記第３のＤＮＡ配列がｅｌａｖプロモーターと作動可能に連結している遺伝子組換えショウジョウバエ。
【請求項２】
ゲノムにヒトアミロイド前駆体タンパク質のカルボキシ末端断片をコードする第１のＤＮＡ配列、およびタウタンパク質をコードする第２のＤＮＡ配列を含む遺伝子組換えハエであって、前記第１のＤＮＡ配列および前記第２のＤＮＡ配列が、発現調節配列と作動可能に連結している遺伝子組換えハエ。
【請求項３】
前記第２のＤＮＡ配列がヒトタウタンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項２に記載の遺伝子組換えハエ。
【請求項４】
ショウジョウバエである、請求項２に記載の遺伝子組換えハエ。
【請求項５】
前記第１のまたは前記第２のＤＮＡ配列のいずれかと連結した発現調節配列が組織特異的である、請求項２に記載の遺伝子組換えハエ。
【請求項６】
前記第１のまたは前記第２のＤＮＡ配列のいずれかと連結した発現調節配列がＵＡＳ調節因子を含み、前記ハエがＧａｌ４をコードする第３のＤＮＡ配列をさらに含み、および前記第３のＤＮＡ配列が組織特異的プロモーターまたはエンハンサーと作動可能に連結している、請求項５に記載の遺伝子組換えハエ。
【請求項７】
前記プロモーターまたはエンハンサーが全神経発現について特異的である、請求項６に記載の遺伝子組換えハエ。
【請求項８】
前記プロモーターまたはエンハンサーが、眼または中枢神経系における発現に特異的である、請求項６に記載の遺伝子組換えハエ。
【請求項９】
前記プロモーターまたはエンハンサーが、ｅｌａｖ、ｓｃａ、Ｎｒｖ２、Ｄｍｅｆ２、Ｃｈａ、ＴＨ、Ｐ、ＣａＭＫＩＩ、ＧＭＲ、ＯＫ１０７、Ｃ１６４、ｗｉｎｇｌｅｓｓ、ｖｅｓｔｉｇｉａｌ、ｓｅｖｅｎｌｅｓｓ、ｅｙｅｌｅｓｓおよびｇｃｍからなる群より選択される、請求項６に記載の遺伝子組換えハエ。
【請求項１０】
前記第１のＤＮＡ配列がシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列と結合する、請求項２に記載の遺伝子組換えハエ。
【請求項１１】
前記シグナルペプチドが、ヒトＡＰＰ、ＡＰＰＬ、ｗｇ、ａｏｓ、ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ、ｗｉｎｄｂｅｕｔｅｌおよびＶｉｎｃからなる群より選択されるタンパク質由来である、請求項１０に記載の遺伝子組換えハエ。
【請求項１２】
胚形成期、幼虫期、蛹期または成虫期である、請求項２に記載の遺伝子組換えハエ。
【請求項１３】
変化した表現型を有する、請求項２に記載の遺伝子組換えハエ。
【請求項１４】
前記変化した表現型が、運動障害、行動表現型、形態的表現型および生化学的表現型からなる群より選択される、請求項１３に記載の遺伝子組換えハエ。
【請求項１５】
前記ヒトアミロイド前駆体タンパク質のカルボキシ末端断片が、前記ヒトアミロイド前駆体タンパク質の細胞内領域、膜貫通領域および細胞外領域の一部を含む、請求項２に記載の遺伝子組換えハエ。
【請求項１６】
請求項２に記載の、前記遺伝子組換えハエより調製される初代細胞培養物。
【請求項１７】
ゲノムにヒトアミロイド前駆体タンパク質の突然変異カルボキシ末端断片をコードするＤＮＡ配列を含む遺伝子組換えハエであって、前記ＤＮＡ配列が発現調節配列と作動可能に連結し、前記ヒトアミロイド前駆体タンパク質の突然変異カルボキシ末端断片がロンドン型突然変異ではない、遺伝子組換えハエ。
【請求項１８】
請求項１７に記載の、前記遺伝子組換えハエより調製される初代細胞培養物。
【請求項１９】
神経変性疾患において活性である薬剤を同定する方法であって、
ａ)候補薬剤を請求項２に記載の遺伝子組換えハエに接触させることと、
ｂ)前記遺伝子組換えハエの選択した表現型を観察することと、
を含み、
前記候補薬剤と接触させた前記遺伝子組換えハエと前記候補薬剤と接触させない対照の遺伝子組換えハエとの間で観察される表現型における違いが、神経変性疾患において活性である薬剤の指標となる方法。
【請求項２０】
前記遺伝子組換えハエがショウジョウバエである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記遺伝子組換えハエが、胚形成期、幼虫期、蛹期または成虫期である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記発現調節配列が組織特異的である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記発現調節配列がＵＡＳ調節因子を含み、前記ハエがＧＡＬ４をコードする第３のＤＮＡ配列をさらに含み、および前記第３のＤＮＡ配列が組織特異的プロモーターまたはエンハンサーと作動可能に連結する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記プロモーターまたはエンハンサーが、全神経発現について特異的である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記プロモーターまたはエンハンサーが、眼または中枢神経系における発現に特異的である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記プロモーターまたはエンハンサーが、ｅｌａｖ、ｓｃａ、Ｎｒｖ２、Ｄｍｅｆ２、Ｃｈａ、ＴＨ、Ｐ、ＣａＭＫＩＩ、ＧＭＲ、ＯＫ１０７、Ｃ１６４、ｗｉｎｇｌｅｓｓ、ｖｅｓｔｉｇｉａｌ、ｓｅｖｅｎｌｅｓｓ、ｅｙｅｌｅｓｓおよびｇｃｍからなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記遺伝子組換えハエの前記第１のＤＮＡ配列がシグナルペプチドをコードする配列と結合する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記表現型が、運動障害、行動表現型、形態的表現型および生化学的表現型からなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
神経変性疾患において活性である薬剤を同定する方法であって、
ａ)候補薬剤を、請求項１に記載の前記遺伝子組換えハエおよび対照の野生型のハエに接触させることと、
ｂ)前記遺伝子組換えハエおよび前記対照のハエにおける選択した表現型を観察することと、
を含み、前記遺伝子組換えハエと前記対照のハエとの間で観察される表現型における違いが、神経変性疾患において活性である薬剤の指標となる方法。
【請求項３０】
神経変性疾患において活性である薬剤を同定する方法であって、
ａ)候補薬剤を、請求項１６に記載の前記初代細胞培養物由来の遺伝子組換え細胞および野生型のハエより調製した培養物由来の対照の細胞に接触させることと、
ｂ)前記遺伝子組換え細胞および前記対照の細胞における選択した表現型を観察することと、
を含み、前記遺伝子組換え細胞と前記対照の細胞との間で観察される表現型における違いが、神経変性疾患において活性である薬剤の指標となる方法。
【請求項３１】
神経変性疾患において活性である薬剤を同定する方法であって、
ａ)候補薬剤を、請求項１６に記載の前記初代細胞培養物由来の遺伝子組換え細胞に接触させることと、
ｂ)前記遺伝子組換え細胞における選択した表現型を観察することと、
を含み、前記候補薬剤と接触させた前記遺伝子組換え細胞と前記候補薬剤と接触させない対照細胞との間で観察される表現型における違いが、神経変性疾患において活性である薬剤の指標となる方法。
【請求項３２】
前記表現型が、細胞形態、細胞の凝集状態、細胞内微小線維変化の存在または外見、細胞外斑の存在または外見、アミロイドポリペプチドの可溶性、タウのリン酸化状態および酸化的ストレスへの感受性からなる群より選択される、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
アルツハイマー病に作用し得る遺伝子を同定する方法であって、
a）請求項２に記載の前記遺伝子組換えハエまたは請求項２４に記載の前記遺伝子組換えハエを、選択した遺伝子において突然変異を含むゲノムであるハエと交雑させることと、
ｂ)請求項２に記載のハエの前記導入遺伝子または請求項１７に記載のハエの前記導入遺伝子、および前記選択した遺伝子を有する前記子孫を、請求項２に記載のハエの前記導入遺伝子または請求項１６に記載のハエの前記導入遺伝子と関連する表現型の変化について観察することと、
を含み、
前記表現型の変化が、選択した遺伝子がアルツハイマー病に作用し得ることを示唆する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００６年６月１６日出願の仮出願番号６０／８１４，２２７および２００６年６月２３日出願の仮出願番号６０／８１５，９８６に対する優先権を主張し、これらの内容は本明細書にこれらの全体を組み込む。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、ヒトにおいて最も一般的な神経変性疾患である。この疾患は、認知および記憶における進行性の機能障害を特徴とする。神経病理学レベルにおけるＡＤの特徴は、「老人」斑におけるアミロイドβペプチド（Ａβ）の細胞外蓄積および微小管結合タンパク質であるタウよりなる神経原線維変化の細胞内沈着である。ＡＤ患者の神経組織において、タウは高度にリン酸化され、構造依存的な抗体により明白な病的構造を取る。アミロイドβペプチドは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の切断産物である。正常な個体において、Ａβの多くは４０アミノ酸の構造であるが、４２アミノ酸長であるＡβ（Ａβ４２）も少量存在する。ＡＤの患者においては過剰なＡβ４２が存在し、これが主な毒性Ａβ構造であると考えられている。
【０００３】
多くの病原性突然変異は、ＡＤの遺伝型と関連したＡＰＰにおいて見出されており、そのいくつかはＡβ配列内に位置する。これらの突然変異はＡＤとは異なる表現型を生じ、脳血管壁での大量のアミロイド蓄積を伴う。２つの突然変異、つまりオランダ型（Ｇｌｕ２２Ｇｌｎ）突然変異およびフランドル型（Ａｌａ２１Ｇｌｙ）突然変異が報告されている（Ｌｅｖｙら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８， １１２４‐１１２６(１９９０)）、（ｖａｎ Ｂｒｏｅｃｋｈｏｖｅｎら(１９９０)）、(Ｈｅｎｄｒｉｋｓら， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ １， ２１８‐２２１(１９９２)）。これらの突然変異を有する患者は、脳出血および脳血管症状を患う。この血管症状は、血管壁でのＡβの凝集によって起こる（アミロイド血管症）。第３の病原性のＡβ内突然変異は、イタリアの家系で最近発見され（Ｇｌｕ２２Ｌｙｓ）、オランダ型患者と類似した臨床所見を有する（Ｔａｇｌｉａｖｉｎｉら， Ａｌｚ Ｒｅｐｏｒｔ ２， Ｓ２８(１９９９)）。さらに別のＡＰＰ内の病原性ＡＤ突然変異である北極型突然変異（Ｇｌｕ２２Ｇｌｙ）もまた、ＡＰＰ遺伝子のＡβペプチド領域内に位置する。この突然変異の保持者は、脳血管系疾患の症状を伴わず、ＡＤに典型的な臨床的特徴を伴う進行性の認知症を発症する。ＡＤは、野生型Ａβペプチドのプロトフィブリル形成と比較して、突然変異Ａβペプチド（Ａβ４０ＡＲＣおよび／またはＡβ４２ＡＲＣ）を含むプロトフィブリルの加速的形成によってはっきりと特徴付けられる。最後に、Ａβ内にＡｓｐ２３Ａｓｎ突然変異を有するアイオワ型突然変異の保持者は、重度の脳アミロイド血管症、広範囲におよぶ神経原線維変化および斑内でのＡβ４０の異常な大量分布を示す（Ｇｒａｂｏｗｓｋｉら， Ａｎｎ． Ｎｅｕｒｏｌ． ４９：６９１‐６９３(２００１)）。
【０００４】
Ａβ配列の外側のＡＰＰ遺伝子の突然変異もまたアルツハイマー病と関連付けられている。これらの突然変異は、ＡＰＰのＣ末端領域のアミノ酸置換をコードし、γセクレターゼによる切断によって、Ａβ４０に対するＡβ４２の割合が増加するように作用する。このような突然変異は、オーストリア型突然変異（Ｔｈｒ７１４Ｉｌｅ、ＡＰＰ７７０アイソフォームのコドン番号）、フロリダ型突然変異（Ｉｌｅ７１６Ｖａｌ）、フランス型突然変異（Ｖａｌ７１５Ｍｅｔ）、ドイツ型突然変異（Ｖａｌ７１５Ａｌａ）、インディアナ型突然変異（Ｖａｌ７１７Ｌｅｕ）およびロンドン型突然変異（Ｖａｌ７１７Ｉｌｅ）を含む。Ｄｅ Ｊｏｎｇｅら， Ｈｕｍ． Ｍｏｌｅｃ． Ｇｅｎ． １０：１６６５‐７１(２００１)を参照されたい。
【０００５】
野生型ヒトＡＰＰまたは突然変異ヒトＡＰＰを発現する多くの遺伝子組換えマウスモデルが作出されている。突然変異形態のＡＰＰは特異的に分解されて、Ａβ斑内のＡβ４２沈着量の増加をもたらす。これらの遺伝子組換えマウスは、記憶力および運動機能の低下等のアルツハイマー病の神経症状を示す（Ｊａｎｕｓ Ｃら, Ｃｕｒｒ． Ｎｅｕｒｏｌ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｒｅｐ １(５)：４５１‐４５７(２００１)）。突然変異ヒトＡＰＰおよび突然変異ヒトタウの両方を発現する遺伝子組換えマウスもまた作出されている（Ｊａｄａら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９３：１４８７‐１４９１(２００１)）。この二重遺伝子組換えマウスは、ＡＰＰまたはＡβのいずれかが神経原線維変化の形成に影響することを示唆する神経線維変性の促進を示す、ＡＤのげっ歯類モデルである。マウスモデルがＡＤ治療法の可能性を試験するのに非常に有用であることが証明されている一方、治療法の試験にそれらを使用するのは高価であり、かつ時間がかかる。よって、例えばセンチュウ（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）またはキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）等の非哺乳類モデルで、より安価かつアルツハイマー病に対する治療剤のためのスクリーニングに有効に使用できる別のモデルを見出すことが有益となるであろう。
【０００６】
モデル生物としてショウジョウバエを使用することが、ヒト神経変性経路の解明において１つの重要な手段となることが分かっている（Ｆｏｒｔｉｎｉ， Ｍ及びＢｏｎｉｎｉ， Ｎ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １６：１６１‐１６７(２０００)に概説される）のは、ショウジョウバエゲノムが、機能において非常によく保存されている多くの関連するヒト相同分子種を含むためである（Ｒｕｂｉｎ， Ｇ． Ｍ．ら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：２２０４‐２２１５(２０００)）。例えば、キイロショウジョウバエは、神経系機能に関与するヒトＡＰＰと相同的な遺伝子を有する。このＡＰＰ様(ＡＰＰＬ)遺伝子は、神経アイソフォームであるＡＰＰ６９５と約４０％の同一性を有し（Ｒｏｓｅｎら, Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８６：２４７８‐２４８２(１９８８)）、およびヒトＡＰＰ６９５のように、神経系においてのみ発現する。ＡＰＰＬ遺伝子を欠損するハエはヒトＡＰＰ遺伝子によって回復する行動異常を示し、このことは２つの遺伝子が２つの生物において類似の機能を有することを示唆する(Ｌｕｏら， Ｎｅｕｒｏｎ ９：５９５‐６０５(１９９２))。さらに、ポリグルタミンリピート病のショウジョウバエモデル（Ｊａｃｋｓｏｎ， Ｇ． Ｒ．ら， Ｎｅｕｒｏｎ ２１：６３３‐６４２(１９９８)；Ｋａｚｅｍｉ‐Ｅｓｆａｒａｎｉ， Ｐ及びＢｅｎｚｅｒ， Ｓ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：１８３７‐１８４０(２０００)；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ‐Ｆｕｎｅｚら， Ｎａｔｕｒｅ ４０８：１０１‐６(２０００))、パーキンソン病のショウジョウバエモデル（Ｆｅａｎｙ， Ｍ． Ｂ．及びＢｅｎｄｅｒ， Ｗ． Ｗ．， Ｎａｔｕｒｅ ４０４：３９４‐３９８(２０００)）および他の疾患のショウジョウバエモデルが確立されており、これらは細胞レベルおよび生理学的レベルでヒトにおける病状に厳密に類似しており、これらの疾患に関与し得る他の遺伝子を同定するのに用いることに成功している。ゆえに、モデル系としてのショウジョウバエの能力は、病状を示す能力および疾患の必須成分を同定するための大規模な遺伝子スクリーニングを実施する能力において実証されている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、ヒトＡＰＰのカルボキシ末端断片（ＣＴＦＡＰＰ）、例えばＣ末端の９９または１００アミノ酸（それぞれ「Ｃ９９」および「Ｃ１００」と呼ばれることが多い）を発現する遺伝子組換えハエを開示する。本発明の遺伝子組換えハエの体細胞および胚細胞は、発現調節配列と作動可能に連結したＣＴＦＡＰＰをコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、導入遺伝子の発現は変化した表現型を有するハエを生じる。特定の実施形態において、変化した表現型は神経変性の形態またはその性質に関連する。特定の実施形態において、遺伝子組換えハエはショウジョウバエである。ＣＴＦＡＰＰをコードするＤＮＡ配列は、例えばアミノ酸リンカーの配列を介して、シグナルペプチドのためのＤＮＡ配列と結合し得る。導入遺伝子は発現調節配列によって時間的または空間的に制御可能であり、組織特異的、時間特異的または発達段階特異的であり得る。いくつかの実施形態において、ＣＴＦＡＰＰは突然変異型または変異型である。
【０００８】
本発明のいくつかの実施形態において、遺伝子組換えハエはタウタンパク質をコードする第２の導入遺伝子を含む。第２の導入遺伝子は発現調節配列と作動可能に連結される。二重遺伝子組換えハエは、ＣＴＦＡＰＰ単独型で発現する遺伝子組換えハエによって示される変化した表現型と比較して、相乗的に変化した表現型を示す。いくつかの実施形態において、タウタンパク質はヒトタウであり、例えば、ヒトのタウの既知のスプライス変異型のうちの１つである。
【０００９】
本発明の発現調節配列は、組織特異的であり得る。いくつかの実施形態において、発現調節配列はＧＡＬ４をコードするＤＮＡ配列と機能的に連動したＵＡＳ調節エレメントを含む。ＧＡＬ４コード配列は、組織特異的プロモーター配列またはエンハンサー配列によって駆動する。特定の実施形態において、プロモーターまたはエンハンサーは全神経での発現または脳もしくは眼における発現に特異的である。
【００１０】
本発明はまた、本発明の遺伝子組換えハエより得られる初代細胞培養物を提供する。初代細胞培養物は、例えば神経変性疾患に活性である薬剤を同定するために使用され得る。遺伝子組換えハエより得られる遺伝子組換え細胞は、アルツハイマー病等の神経変性疾患に関連する変化した表現型を有し得る。遺伝子組換え細胞は、例えば、タウタンパク質の変化したリン酸化状態またはアミロイドポリペプチドの変化した可溶性などの、変化した形態または分子成分の変化した生化学的状態等の変化した表現型を有し得る。
【００１１】
別の態様において、本発明は神経変性疾患に活性である薬剤を同定するための方法に関する。本方法は、（１）候補薬剤と本発明の遺伝子組換えハエとを接触させるステップ、および（２）遺伝子組換えハエまたは遺伝子組換えハエから得た細胞の表現型を、候補薬剤と接触させない同様の（対照の）遺伝子組換えハエまたは細胞と比較して観察するステップを含む。対照のハエまたは細胞と比較した、候補薬剤と接触させた遺伝子組換えハエまたは細胞の、表現型における観察可能な違いは、神経変性疾患において活性を有する薬剤であることを示す。
【００１２】
本発明はまた、神経変性疾患において活性を有する薬剤を同定するための別の方法に関する。本方法は、（１）本発明の遺伝子組換えハエまたはこのようなハエから得られた細胞、および野生型の対照のハエまたは細胞に候補薬剤を接触させるステップ、ならびに（２）遺伝子組換えハエまたは細胞と、対照のハエまたは細胞との間の表現型における違いを観察するステップを含み、ここで、表現型における違いは神経変性疾患において活性を有する薬剤であることを示す。
【００１３】
さらなる態様において、本発明はＡＰＰ経路の遺伝的修飾因子、またはアルツハイマー病に作用し得る遺伝子を同定する方法に関する。本方法は、（１）野生型または前記の突然変異形態の１つのＣＴＦＡＰＰをコードする導入遺伝子を含み、そして場合によりタウタンパク質をコードする導入遺伝子を含む遺伝子組換えハエを、選択した遺伝子内に突然変異を含むゲノムを有するハエと交雑させるステップ、および（２）遺伝子組換えの表現型の変化について、子孫を観察するステップを含む。ＣＴＦＡＰＰおよび／またはタウの一種類をコードする導入遺伝子と関連した表現型の変化は、選択した遺伝子がＡＰＰ経路を修飾し得る、またはアルツハイマー病に作用し得ることを示す。ＣＴＦＡＰＰまたはタウの一種類をコードする導入遺伝子は、それぞれ組織特異的発現調節配列と作動可能に連結される。ＣＴＦＡＰＰの一種類をコードする導入遺伝子は、場合によりシグナル配列と結合される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ＣＴＦＡＰＰを発現する遺伝子組換えハエにおけるＡβペプチドの存在を示すイムノブロットを示す。実験の詳細は実施例１に記載する。
【図２】図２は、年齢に応じた、遺伝子組換えキイロショウジョウバエの運動能力の低下を図示する。キイロショウジョウバエに、実施例３に記載する登坂アッセイを受けさせた。ハエは、野生型（ｗｔ）または１つの導入遺伝子（タウまたはＣＴＦＡＰＰ）または２つの導入遺伝子（ＣＴＦＡＰＰ、タウ）を含む型のいずれかである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、ヒトＣ末端ＡＰＰ断片を、単独またはタウタンパク質と組み合わせて発現する遺伝子組換えハエを開示する。遺伝子組換えハエは神経変性を示し、これは、運動表現型、行動表現型（例えば、食欲、配偶行動および／または寿命）ならびに形態学的表現型（例えば、細胞、器官もしくは付属器の形状、サイズまたは位置；あるいはハエのサイズ、形状もしくは成長速度）を含む様々な変化した表現型を導き得る。
【００１６】
本明細書で用いる用語「遺伝子組換えハエ」は、その体細胞および胚細胞がプロモーターと作動可能に連結している導入遺伝子を含むハエを指し、ここで、導入遺伝子はヒトＣ末端ＡＰＰ断片をコードし、および神経系における前記導入遺伝子の発現が、神経変性の性質を有するハエまたは神経変性したハエを生じる。用語「二重遺伝子組換えハエ」は、その体細胞および胚細胞が少なくとも２つの導入遺伝子を含む遺伝子組換えハエを指し、ここで、導入遺伝子はタウおよびヒトＣ末端ＡＰＰ断片をコードする。例示した二重遺伝子組換えハエは、２つの単一の遺伝子組換えハエを交雑させることによって作出されるが、本発明の二重遺伝子組換えハエは、外来ＤＮＡを動物に導入するための当技術分野において知られるあらゆる方法を用いて作出され得る。用語「遺伝子組換えハエ」および「二重遺伝子組換えハエ」は、ハエのあらゆる発達段階、つまり胚形成期、幼生期、蛹期および成虫期を含む。特定のハエ、例えばショウジョウバエの発達は温度依存的である。ショウジョウバエの卵は、約０．５ｍｍ長である。受精後胚が発達し、およびミミズ様の幼虫に孵化するのに、約１日かかる。幼虫は摂食し、および成長し続け、孵化後１日、２日および４日で脱皮する（一齢、二齢および三齢）。三齢幼虫になって２日後に、幼虫はもう一度脱皮して動かない蛹を形成する。次の４日間の間に、体が完全に作り直されて成虫の有翼形態となり、次に蛹の殻から羽化し、翌日には繁殖力を有する（発達の時期は２５℃である；１８℃では発達は約２倍長くかかる）。
【００１７】
本明細書で用いる用語「神経変性」は、神経または感覚神経器官、組織もしくは細胞の形態的変化、機能的変化または発達的変化、行動欠陥、または運動欠陥を引き起こす中枢神経系における状態を意味し、ここで、そのような変化は、幼虫または成虫ハエのいずれかにおいて、定性的にまたは定量的に解析することができる。
【００１８】
本明細書で用いる「ハエ」は、羽を有する小型の昆虫、特に、例えばショウジョウバエ等の双翅類を指す。本明細書で用いる「ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）」は、ショウジョウバエ科類のあらゆるメンバーを指し、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｆｕｎｅｂｒｉｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｕｌｔｉｓｐｉｎａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｕｂｆｕｎｅｂｒｉｓ、ｇｕｔｔｉｆｅｒａ ｓｐｅｃｉｅｓ ｇｒｏｕｐ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｇｕｔｔｉｆｅｒａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ａｌｂｏｍｉｃａｎｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ａｎｎｕｌｉｐｅｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｃｕｒｖｉｃｅｐｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｆｏｒｍｏｓａｎａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｈｙｐｏｃａｕｓｔａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｉｍｍｉｇｒａｎｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｋｅｐｌａｕａｎａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｋｏｈｋｏａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｎａｓｕｔａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｎｅｏｈｙｐｏｃａｕｓｔａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｎｉｖｅｉｆｒｏｎｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｐａｌｌｉｄｉｆｔｏｎｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｐｕｌａｕａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｑｕａｄｒｉｌｉｎｅａｔａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｉａｍａｎａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｕｌｆｕｒｉｇａｓｔｅｒ ａｌｂｏｓｔｒｉｇａｔａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｕｌｆｕｒｉｇａｓｔｅｒ ｂｉｌｉｍｂａｔａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｕｌｆｕｒｉｇａｓｔｅｒ ｎｅｏｎａｓｕｔａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｔａｘｏｎ Ｆ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｔａｘｏｎ Ｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｕｓｔｕｌａｔａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｉｃａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｐａｒａｍｅｌａｎｉｃａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｔｓｉｇａｎａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｄａｒｕｍａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｐｏｌｙｃｈａｅｔａ、ｑｕｉｎａｒｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ ｇｒｏｕｐ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｆａｌｌｅｎｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｎｉｇｒｏｍａｃｕｌａｔａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｐｈａｌｅｒａｔａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｕｂｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｅｏｈｙｄｅｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｈｙｄｅｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｌａｃｅｒｔｏｓａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｒｏｂｕｓｔａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｏｒｄｉｄｕｌａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｒｅｐｌｅｔｏｉｄｅｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｋａｎｅｋｏｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｖｉｒｉｌｉｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍａｃｕｌｉｎａｔａｔａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｐｏｎｅｒａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ａｎａｎａｓｓａｅ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ａｔｒｉｐｅｘ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｂｉｐｅｃｔｉｎａｔａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｅｒｃｅｐｅａｅ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍａｌｅｒｋｏｔｌｉａｎａ ｍａｌｅｒｋｏｔｌｉａｎａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍａｌｅｒｋｏｔｌｉａｎａ ｐａｌｌｅｎｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｐａｒａｂｉｐｅｃｔｉｎａｔａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｐｓｅｕｄｏａｎａｎａｓｓａｅ ｐｓｅｕｄｏａｎａｎａｓｓａｅ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｐｓｅｕｄｏａｎａｎａｓｓａｅ ｎｉｇｒｅｎｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｖａｒｉａｎ���、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｅｌｅｇａｎｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｇｕｎｕｎｇｃｏｌａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｅｕｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｆｉｃｕｓｐｈｉｌａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｅｒｅｃｔａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍａｕｒｉｔｉａｎａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｏｒｅｎａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｅｃｈｅｌｌｉａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｉｍｕｌａｎｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｔｅｉｓｓｉｅｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｙａｋｕｂａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ａｕｒａｒｉａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｂａｉｍａｉｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｂａｒｂａｒａｅ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｂｉａｕｒａｒｉａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｂｉｒｃｈｉｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｂｏｃｋｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｂｏｃｑｕｅｔｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｂｕｒｌａｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｃｏｎｓｔｒｉｃｔａ（ｓｅｎｓｕ Ｃｈｅｎ及びＯｋａｄａ）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｊａｍｂｕｌｉｎａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｋｈａｏｙａｎａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｋｉｋｋａｗａｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｌａｃｔｅｉｃｏｒｎｉｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｌｅｏｎｔｉａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｌｉｎｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍａｙｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｐａｒｖｕｌａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｐｅｃｔｉｎｉｆｅｒａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｐｕｎｊａｂｉｅｎｓｉｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｑｕａｄｒａｒｉａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｒｕｆａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｅｇｕｙｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｅｒｒａｔａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｕｂａｕｒａｒｉａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｔａｎｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｔｒａｐｅｚｉｆｒｏｎｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｔｒｉａｕｒａｒｉａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｔｒｕｎｃａｔａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｖｕｌｃａｎａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｗａｔａｎａｂｅｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｆｕｙａｍａｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｂｉａｒｍｉｐｅｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｉｍｅｔｉｃａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｐｕｌｃｈｒｅｌｌａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｕｚｕｋｉｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｕｎｉｐｅｃｔｉｎａｔａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｐａｒａｌｕｔｅａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｐｒｏｓｔｉｐｅｎｎｉｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｔａｋａｈａｓｈｉｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｔｒｉｌｕｔｅａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｂｉｆａｓｃｉａｔａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｉｍａｉｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｐｓｅｕｄｏｏｂｓｃｕｒａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓａｌｔａｎｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｔｕｒｔｅｖａｎｔｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｎｅｂｕｌｏｓａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｐａｕｌｉｓｔｏｒｕｍおよびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｗｉｌｌｉｓｔｏｎｉを含むが、これらに限定されない。１つの実施形態において、ハエはキイロショウジョウバエである。
【００１９】
本明細書で用いる用語「ヒトＡＰＰのカルボキシ末端断片」、「カルボキシ末端ＡＰＰ断片」、「Ｃ末端ＡＰＰ断片」および「ＣＴＦＡＰＰ」はすべて、基本的にヒトＡＰＰのアイソフォームのβセクレターゼ切断から生じて、Ｃ９９またはＣ１００となる断片からからなるヒトＡＰＰの断片を指す。いくつかの実施形態において、ＣＴＦＡＰＰはＡＰＰの細胞内領域、膜貫通領域および細胞外領域の一部を含み、βセクレターゼ切断部位前後までおよぶ。好ましくは、本発明のＣＴＦＡＰＰは、Ｃ９９（配列番号：１のヌクレオチド配列でコードされる配列番号：２、遺伝コードの縮重のために、異なるヌクレオチド配列が同一のポリペプチド配列をコードし得ることが注目される。）またはＣＴＦＡＰＰ（配列番号３のヌクレオチド配列によってコードされる配列番号４）のいずれかであり、それぞれＣ末端からＮ末端にかけて、９９あるいは１００アミノ酸におよぶＡＰＰのＣ末端断片に相当する。本発明のＣＴＦＡＰＰは、野生型であるか、あるいは例えばアルツハイマー病の早期発症もしくは心血管系の合併症等の別の兆候を引き起こすことが知られるまたは疑われる、家族性突然変異などの突然変異、を有し得る。このような突然変異は、Ｅ６６５Ｄ、Ｋ／Ｍ６７０Ｎ／Ｌ、Ａ６７３Ｔ、Ｈ６７７Ｒ、Ｄ６７８Ｎ、Ａ６９２Ｇ、Ｅ６９３Ｇ、Ｅ６９３Ｑ、Ｅ６９３Ｋ、Ｄ６９４Ｎ、Ａ７１３Ｔ、Ａ７１３Ｖ、Ｔ７１４Ｉ、Ｔ７１４Ａ、Ｖ７１５Ｍ、Ｖ７１５Ａ、Ｉ７１６Ｖ、Ｉ７１６Ｔ、Ｖ７１７Ｆ、Ｖ７１７Ｇ、Ｖ７１７ＬおよびＬ７２３Ｐを含むが、これらに限定されない。タウをコードする導入遺伝子も有する二重遺伝子組換えハエは、野生型あるいはロンドン型突然変異（Ｖ７１７Ｉ）を有するＣＴＦＡＰＰを含み得る。タウ導入遺伝子を持たない遺伝子組換えハエは、野生型ＣＴＦＡＰＰおよびロンドン型突然変異以外のＣＴＦＡＰＰの突然変異のみを含む。
【００２０】
本明細書で用いる用語「アミロイド斑沈着」は、Ａβ４２等のアミロイドペプチドの蓄積によって細胞外に形成される、不溶性のタンパク質凝集体を指す。
【００２１】
本明細書で用いる用語「シグナルペプチド」は、一般的には２０アミノ酸長未満の短いアミノ酸配列を指し、タンパク質をハエの小胞体分泌経路に向けて、または経由するように導く。本発明で用いる「シグナルペプチド」は、ヒトＡＰＰ６９５（配列番号５）のシグナルペプチド、「ｗｉｎｇｌｅｓｓ(ｗｇ)シグナルペプチド」（配列番号６）と同義であるＤｉｎｔタンパク質のショウジョウバエシグナルペプチド、「ａｒｇｏｓ(ａｏｓ)シグナルペプチド」（配列番号７）、ショウジョウバエＡＰＰＬシグナルペプチド（配列番号８）、プレセニリンシグナルペプチド（配列番号９）およびｗｉｎｄｂｅｕｔｅｌシグナルペプチド（配列番号１０）を含むが、これらに限定されない。タンパク質を小胞体を経由するよう導き、およびγセクレターゼ切断に感受性となる膜においてＣＴＦＡＰＰの発現をもたらす、前記のシグナルペプチドの変異体を含むあらゆるシグナルペプチドが、本発明に使用され得る。
【００２２】
本明細書で用いる「アミノ酸リンカー」は、約２〜約１０アミノ酸長の短いアミノ酸配列を指し、２つの個別のペプチドが両側に並ぶ。
【００２３】
本明細書で用いる用語「タウタンパク質」は、微小管結合タンパク質タウを指し、微小管重合と安定化に関与する。アルツハイマー病患者の神経組織において、タウは神経原線維変化の細胞内沈着に見られる。多くのヒトタウ遺伝子配列が存在する。成人脳において、６種のタウアイソフォームが1つの遺伝子から別のｍＲＮＡスプライシングによって産生する(Ｇｏｅｄｅｒｔら， Ｎｅｕｒｏｎ．(１９８９) ３：５１９−２６)。遺伝子コードの縮重のために、異なるヌクレオチド配列が同一のポリペプチド配列をコードし得ることが注目される。ヒトタウタンパク質をコードするヒト遺伝子は、参照により本明細書に組み込まれるＡｎｄｒｅａｄｉｓ， Ａ．ら, Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３１(４３)：１０６２６‐１０６３３(１９９２)に記載されるように、１１のエキソンを含む。成人脳において、６種のタウアイソフォームが１つの遺伝子から選択的ｍＲＮＡスプライシングによって産生する。これらは互いに、アミノ末端半分に位置する２９または５８アミノ酸の挿入、およびカルボキシル末端半分に位置する３１アミノ酸のリピートが存在するかしないかによって異なる。タウ遺伝子のエキソン１０によってコードされる後者を含むものは、各々４つのリピートを有する３種のタウアイソフォームを生じさせる。本明細書で用いる用語「タウタンパク質」は、選択的ｍＲＮＡスプライシングによって産生する様々なタウアイソフォームに加えて、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４に記載されるヒトタウタンパク質の突然変異型も含む。１つの実施形態において、二重遺伝子組換えハエを作出するのに使用するタウタンパク質は、配列番号１５（アミノ酸配列）および配列番号１６（ヌクレオチド配列）に示される。このアイソフォームは、タウのエキソン２および３に加えて４つの微小管結合リピートを含む。正常なヒト大脳皮質において、４リピートのタウアイソフォームより３リピートのタウアイソフォームがわずかに優勢である。これらのリピートおよび一部の隣接配列が、タウの微小管結合領域を構成する(Ｇｏｅｄｅｒｔら， １９９８ Ｎｅｕｒｏｎ ２１， ９５５‐９５８)。アルツハイマー病患者の神経組織において、タウは高度にリン酸化されており、およびＭＣＩおよびＡＬＺ５０等の構造依存的な抗体を用いて検出可能な異常構造および／または病的構造をとる(Ｊｉｃｈａ Ｇ．Ａ．ら, Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４８：１２８‐１３２(１９９７))。従って、本明細書で用いる「タウタンパク質」は、これらの構造特異的抗体によって認識されるタウタンパク質を含む。
【００２４】
本発明はさらに、これらのタウ配列の同等物として、神経原線維変化を形成するタウの生物学的作用を保持する突然変異配列を企図する。従って、本明細書で用いる「タウタンパク質」はまた、突然変異および変異を含むタウタンパク質を含む。これらの突然変異体は：エキソン１０＋１２「Ｋｕｍａｍｏｔｏ ｐｅｄｉｇｒｅｅ」(Ｙａｓｕｄａら(２０００) Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ． ４７：４２２‐９)、Ｉ２６０Ｖ（Ｇｒｏｖｅｒら， Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ． ２００３ Ｎｏｖ； １８４：１３１−４０）、Ｇ２７２Ｖ（Ｈｕｔｔｏｎら， １９９８ Ｎａｔｕｒｅ ３９３：７０２‐５; Ｈｅｕｔｉｎｋら（１９９７） Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ． ４１：１５０‐９; Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉら， （１９９６） Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ（Ｂｅｒｌ）． １９９６ Ｊｕｌ； ９２：４２‐８）、Ｎ２７９Ｋ（Ｃｌａｒｋら, （１９９８） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５：１３１０３‐１３１０７; Ｄ’Ｓｏｕｚａら， （１９９９） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：５５９８‐５６０３; Ｒｅｅｄら， （１９９７） Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ. １９９７ ４２：５６４−７２; Ｈａｓｅｇａｗａら， （１９９９） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４４３：９３‐９６; Ｈｏｎｇら， （１９９８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１９１４‐１７）、ｄｅｌＫ２８０（Ｒｉｚｚｕら， （１９９９） Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ６４：４１４‐４２１; Ｄ’Ｓｏｕｚａら, （１９９９） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：５５９８‐５６０３）、Ｌ２８４Ｌ（Ｄ’Ｓｏｕｚａら， （１９９９） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：５５９８‐５６０３）、Ｐ３０１Ｌ（Ｈｕｔｔｏｎら， １９９８ Ｎａｔｕｒｅ ３９３：７０２‐５; Ｈｅｕｔｉｎｋら， （１９９７） Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ． ４１：１５０‐９； Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉら，（１９９６） Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ（Ｂｅｒｌ）（１９９６）９２：４２‐８; Ｈａｓｅｇａｗａら， （１９９８） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． １９９８ ４３７（３）：２０７−１０; Ｎａｃｈａｒａｊｕら，（１９９９） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４４７：１９５‐１９９）、Ｐ３０１Ｓ（Ｂｕｇｉａｎｉ（１９９９） Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ ５８：６６７−７７； Ｇｏｅｄｅｒｔら, （１９９９） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４５０： ３０６‐３１１）、Ｓ３０５Ｎ（Ｉｉｊｉｍａら， （１９９９） Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ １０：４９７‐５０１； Ｈａｓｅｇａｗａら，（１９９８） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． １９９８ ４３７：２０７−１０; Ｄ’Ｓｏｕｚａら，（１９９９） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：５５９８‐５６０３）、Ｓ３０５Ｓ（Ｓｔａｎｆｏｒｄら， Ｂｒａｉｎ， １２３， ８８０−８９３， ２０００）、Ｓ３０５Ｓ（Ｗｓｚｏｌｅｋら， Ｂｒａｉｎ． ２００１ １２４：１６６６‐７０）、Ｖ３３７Ｍ（Ｐｏｏｒｋａｊら， （１９９８） Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ． １９９８ ４３：８１５−２５; Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉら, （１９９８） Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １５３： １３５９‐１３６３; Ｓｕｍｉら， （１９９２） Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ． ４２：１２０���７; Ｈａｓｅｇａｗａら， （１９９８） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． １９９８ ４３７：２０７−１０）、Ｇ３８９Ｒ（Ｍｕｒｒｅｌｌら, Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ． （１９９９） ５８：１２０７‐２６； Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ‐Ｂｒｏｗｎら， Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ． （２０００） ４８：８５９−６７）、Ｒ４０６Ｗ（Ｈｕｔｔｏｎら， （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ ３９３：７０２‐５; Ｒｅｅｄら， （１９９７） Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ． ４２：５６４−７２; Ｈａｓｅｇａｗａら， （１９９８） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４３７：２０７−１０）、３’Ｅｘ１０＋３、 ＧｔｏＡ（Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉら， （１９９８） Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １５３：１３５９‐１３６３； Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉら， （１９９７） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ９４：４１１３‐８）、３’Ｅｘ１０＋１６（Ｂａｋｅｒら， （１９９７） Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ４２：７９４‐７９８; Ｇｏｅｄｅｒｔら， （１９９９ｂ） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５：４５４‐４５７; Ｈｕｔｔｏｎら， （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ ３９３：７０２‐７０５）、３’Ｅｘ１０＋１４（Ｈｕｔｔｏｎら，（１９９８） Ｎａｔｕｒｅ ３９３：７０２‐７０５； Ｌｙｎｃｈら，（１９９４） Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ４４：１８７８‐１８８４）、３’Ｅｘ１０＋１３（Ｈｕｔｔｏｎら，（１９９８） Ｎａｔｕｒｅ ３９３：７０２‐７０５）を含むが、これらに限定されない。
【００２５】
本発明はさらに、配列の多型を含むタウ遺伝子の使用を含む（例えば、表１を参照せよ）。
【００２６】
【表１】
2009539406.tif 000003
【００２７】
本発明はまた、マウス（Ｌｅｅら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：２８５‐８（１９８８））、ラット（Ｇｏｅｄｅｒｔら, Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８９：１９８３‐１９８７（１９９２））、ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）（Ｈｉｍｍｌｅｒら， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ９：１３８１‐１３８８（１９８９））、キイロショウジョウバエ（Ｈｅｉｄａｒｙ及びＦｏｒｔｉｎｉ， Ｍｅｃｈ． Ｄｅｖ． １０８：１７１‐１７８（２００１））およびアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）（Ｏｌｅｓｅｎら， Ｇｅｎｅ ２８３：２９９‐３０９（２００２））を含むがこれらに限定されない他の動物由来のタウタンパク質またはタウ遺伝子の使用を企図する。他の動物由来のタウ遺伝子は、上記と同等の突然変異をさらに含み得る。同等の位置は、配列アライメントによって特定することが可能で、および同等の突然変異は、部位特異的突然変異誘発手段または当技術分野において知られる他の手段を用いて導入することができる。
【００２８】
本明細書で用いる用語「神経原線維変化」は、細胞内で形成し、主にタウタンパク質から構成される不溶性のねじれた線維を指す。
【００２９】
本明細書で用いる用語「作動可能に連結した」は近位を指し、ここで、記載する成分はそれらが意図する様式で機能することを許容する関係にある。コード配列に「作動可能に連結した」発現調節配列は、コード配列の発現が調節配列の活性に対応する条件下で達成されるように連結される。
【００３０】
本明細書で用いる用語「発現調節配列」は、プロモーター、エンハンサーエレメントおよび特定の核酸配列の発現制御に寄与する他の核酸配列を指す。用語「プロモーター」は、転写開始の間にＲＮＡポリメラーゼによって認識されるＤＮＡ配列を指し、エンハンサーエレメントも含み得る。本明細書で用いる用語「エンハンサーエレメント」は、シス作用性核酸エレメントを指し、距離および位置と無関係に相同のプロモーターに加えて非相同のプロモーターからの転写開始を調節する。好ましくは、「エンハンサーエレメント」は、転写開始の組織的特異性および時間的特異性も調節する。特定の実施形態において、エンハンサーエレメントはＵＡＳ調節エレメントを含むが、これに限定されない。本明細書で用いる「ＵＡＳ」は、ＧＡＬ４転写活性化因子が認識および結合する上流活性化配列を指す。本明細書で用いる用語「ＵＡＳ調節エレメント」は、ＧＡＬ４転写制御タンパク質によって活性化するＵＡＳエレメントを指す。本発明の発現調節配列は、好ましくは組織特異的な様式で発現を駆動する能力に対して選抜される。あるいはまた、発現調節配列は、チューブリン、アクチンまたはユビキチンのように普遍的に発現する遺伝子由来であり得る。さらに他の実施形態において、発現調節配列はテトラサイクリン調節転写活性化因子（ｔＴＡ）応答性制御エレメントを含む。場合により、タウおよびＣＴＦＡＰＰ導入遺伝子を含む遺伝子組換えハエは、さらにｔＴＡ遺伝子を含む。
【００３１】
本明細書で用いる用語「組織特異的」発現調節配列は、ある組織または組織の一部において発現を駆動するが、少なくともある他の組織において実質的に不活性である発現調節配列を指す。「実質的に不活性」とは、組織特異的発現調節配列に作動可能に連結した配列の発現が、発現調節配列が活性である組織でのその配列の発現のレベルの５％未満であることを意味する。好ましくは、この組織での発現のレベルは、最大活性の１％未満、またはこの組織での配列の発現が検出されない。「組織特異的発現調節配列」は、眼、羽、胸背板、脳等の器官に加え、中枢神経系および末端神経系の組織に対して特異的であるものを含む。本発明の組織特異的発現調節配列は、ＧＡＬ４‐ＵＡＳ系の「ドライバー」として使用することができ、あるいはまた、シス作用様式でその発現を調節するために導入遺伝子の上流に挿入することができる。
【００３２】
組織特異的調節配列の例示は：ｓｅｖｅｎｌｅｓｓ（Ｂｏｗｔｅｌｌら， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ２：６２０−３４（１９８８））、ｅｙｅｌｅｓｓ（Ｂｏｗｔｅｌｌら, Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８８：６８５３‐７（１９９１））およびＧＭＲ／ｇｌａｓｓ（Ｑｕｉｒｉｎｇら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：７８５‐９（１９９４））等の眼の発達に重要なプロモーター／エンハンサー、眼での発現に有用なロドプシン遺伝子のいずれか由来のプロモーター／エンハンサー、羽での発現に有用なｄｐｐ、ｖｅｓｔｉｇｉａｌまたはｗｉｎｇｌｅｓｓ遺伝子由来のエンハンサー／プロモーター（Ｓｔａｅｈｌｉｎｇ‐Ｈａｍｐｔｏｎら， Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ． ５：５８５−９３（１９９４）; Ｋｉｍら， Ｎａｔｕｒｅ ３８２：１３３‐８（１９９６）; Ｇｉｒａｌｄｅｚら, Ｄｅｖ． Ｃｅｌｌ ２：６６７‐６７６（２００２））、例えば、有糸分裂後の神経細胞での全神経発現に対して特異的であるｅｌａｖなどの神経特異的プロモーター／エンハンサー（Ｙａｏ及びＷｈｉｔｅ， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ６３：４１‐５１（１９９４））、神経芽細胞から神経細胞での全神経発現に特異的であるｓｃａｂｒｏｕｓ（ｓｃａ）（Ｓｏｎｇら， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６２：１７０３‐２４（２００２））、ＡＰＰＬ（Ｍａｒｔｉｎ‐Ｍｏｒｒｉｓ及びＷｈｉｔｅ， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１０：１８５−９５（１９９０））、中枢神経系での発現に特異的なＮｅｒｖａｎａ２（Ｎｒｖ２）（Ｓｕｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：１０４３８‐４３（１９９９））、コリン作動性神経細胞に特異的なＣｈａ（Ｂａｒｂｅｒら， Ｊ． Ｃｏｍｐ． Ｎｅｕｒｏｌ． ２２：５３３−４３（１９８９））、ドーパミン作動性神経細胞に特異的なＴＨ（Ｆｒｉｇｇｉ‐Ｇｒｅｌｉｎら， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ５４：６１８−２７（２００３））、胚および幼虫の中枢神経系ならびに成虫の脳、胸部神経節および消化管に特異的なＣａＭＫＩＩ（Ｔａｋｍａｔｓｕら， Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ． ３１０：２３７−５２（２００２））、指節骨感覚神経細胞に特異的なＰ（Ｇｅｎｄｒｅら， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３１：８３‐９２（２００４））、脳のキノコ体に特異的なＤｍｅｆ２（Ｍａｏら， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０１：１９８−２０３（２００４）,ＧＡＬ４系統は「Ｐ２４７」と命名される）およびＯＫ１０７（Ｌｅｅら， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２６：４０６５‐４０７６（１９９９））、運動神経細胞に特異的なＣ１６４（Ｔｏｒｒｏｊａら， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １９：７７９３‐７８０３（１９９９））および他の神経特異的遺伝子由来のプロモーター／エンハンサー、ならびにグリア細胞に特異的なｇｃｍ（Ｄｕｍｓｔｒｅｉら， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２３：３３２５‐３５（２００３））を含むがこれらに限定されず、これらの参考文献のすべてを参照により本明細書に組み込む。発現調節配列の他の例示は、温度誘導性発現に有用なｈｓｐ７０およびｈｓｐ８３遺伝子由来の熱ショックプロモーター／エンハンサー、ならびにチューブリン、アクチンまたはユビキチン等の普遍的に発現する遺伝子由来のプロモーター／エンハンサーを含むが、これら限定されない。
【００３３】
遺伝子組換えハエについて本明細書で用いる用語「表現型」は、ハエの観察可能かつ／もしくは測定可能な物理的、行動的または生化学的特徴を指す。本明細書で用いる用語「変化した表現型」または「表現型における変化」は、野生型のハエの表現型と比較して測定可能なようにまたは観察可能なように変化した表現型を指す。変化した表現型の例としては、食欲、配偶行動および／または寿命等の行動表現型、ｒｏｕｇｈ ｅｙｅ表現型、ｃｏｎｃａｖｅ ｗｉｎｇ表現型、あらゆる異なる器官もしくは付属器の形状、サイズ、成長速度または位置、または対照のハエにおいて観察される同様の特徴と比較して組織もしくは細胞の異なる分布および／または特徴等の形態的表現型、および登坂能力の低下、歩行能力の低下、飛行能力の低下、速度または加速の低下、異常軌跡、異常旋回および異常なグルーミング等の運動機能障害表現型を含む。変化した表現型は、測定可能な量、例えば、少なくとも統計的に有意な量、好ましくは対照のハエの表現型と比較して少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％または５０％変化した表現型である。本明細書で用いる用語「相乗的な変化した表現型」または「相乗的な表現型」は、ハエの測定可能かつ／もしくは観察可能な物理的、行動的または生化学的特徴が、これらの要素の合計より上回る表現型を指す。
【００３４】
本発明の遺伝子組換えハエより得られた細胞、例えばそのようなハエから得た初代培養物中の細胞についての用語「表現型」は、細胞の観察可能かつ／または測定可能な物理的、生理学的または生化学的特徴を指す。細胞表現型は、例えばサイズ、形状、凝集状態等の細胞のあらゆる形態的特性、もしくはオルガネラもしくは分子集合体の分布または外見、細胞骨格の組織、細胞内微小線維変化の存在または外見、または細胞外斑の存在または外見等のあらゆる細胞内部の超微細構造特性であり得る。細胞の表現型はまた、細胞運動性、基質もしくは他の細胞への接着、軸索または樹状突起等の構造の伸長、軸索輸送、エキソサイトーシス、エンドサイトーシス、分泌、神経伝達物質の放出、巨大分子の合成または分解、代謝、酸化ストレスへの感受性、生化学物質または産物のレベル、タンパク質のリン酸化レベル（例えば、変化したタウのリン酸化またはβアミロイドが誘導した変化したタウのリン酸化）、輸送活性、電気物理学的特性、ＤＮＡ合成、遺伝子転写、タンパク質合成、細胞周期現象、生存能力等のあらゆる態様も含み得る。
【００３５】
本明細書で用いる「ｒｏｕｇｈ ｅｙｅ」表現型は、神経細胞の変性によって起こり得る感桿分体の消失、異常な個眼充填、偶発的な個眼融合および剛毛の欠損を特徴とする。眼は野生型のハエにおける外見と比較して凹凸のある外見となる可能性があり、および顕微鏡により容易に観察できる。神経変性はハエの複眼において容易に観察および定量され、何の試料調製をすることなく採点することが可能である（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ‐Ｆｕｎｅｚら, ２０００， Ｎａｔｕｒｅ ４０８：１０１‐１０６；Ｓｔｅｆｆａｎら, ２００１， Ｎａｔｕｒｅ ４１３：７３９−７４３；Ａｇｒａｗａｌら， ２００５, Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０２：３７７７‐３７８１）。この生物の眼は、各々のショウジョウバエの個眼の光受容体神経によって形成される７つの可視的な感桿分体の規則正しい台形配置から構成される。ショウジョウバエの眼において特異的な突然変異導入遺伝子の発現は、感桿分体の進行的な消失およびそれに続く凹凸のある外見の眼をもたらし、これは例えば個眼当たりの感桿分体の数として定量的に表すことができる（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ‐Ｆｕｎｅｚら， ２０００；Ｓｔｅｆｆａｎら， ２００１）。これらの生物に対する治療化合物の投与は光受容体変性を遅延させ、ｒｏｕｇｈ‐ｅｙｅ表現型を改善する（Ｓｔｅｆｆａｎら， ２００１）。
【００３６】
本明細書で用いる「ｃｏｎｃａｖｅ ｗｉｎｇ」表現型は、ハエの羽の折り畳みが異常であることによって、羽がそれらの長い周縁部に沿って上向きに曲がることを特徴とする。
【００３７】
本明細書で用いる「運動機能障害」は、対照のハエと比較して、ハエが運動活動、動作または刺激応答を欠損する表現型を指す（例えば、測定可能な要素において、少なくとも統計的に有意な差または１０％の差）。運動活動は、飛行、登坂、這いずりおよび旋回を含む。さらに、欠損が測定可能な動作特性は、ｉ）一定時間に移動した平均総距離、ｉｉ）一定時間に一方向に移動した平均距離、ｉｉｉ）平均速度（時間単位当たりに動いた平均総距離）、ｉｖ）時間単位当たりに一方向に動いた距離、ｖ）加速度（時間に対する速度変化の割合）、ｖｉ）旋回、ｖｉｉ）躓き、ｖｉｉｉ）特定の決められた区域または地点に対するハエの空間的位置、ｉｘ）動くハエの軌跡形状ならびにｘ）幼虫行動中のうねり、ｘｉ）幼虫頭部の生育または膨張およびｘｉｉ)幼虫尾部のフリッカーを含むが、これらに限定されない。空間的位置を特徴とする動作特性の例示は、（１）対象の区画内で過ごす平均時間（例えば、容器の底、中央または上端で過ごす時間、容器内の決められた区画への訪問回数）、および（２）ハエと対象の地点（例えば、区画の中央）との間の平均距離を含むが、これらに限定されない。軌跡形状特性の例示は、（１）角速度（動作の方向における変化の平均速度）、（２）旋回（２つの連続したサンプル間隔の動作ベクトル間の角度）、（３）旋回の頻度（時間単位当たりの平均旋回量）および（４）躓きまたは蛇行（距離に対する動作の方向の変化）を含む。旋回の要因は、円滑な旋回動作（小さな回転と定義する）および／または乱れた旋回動作（大幅な回転と定義する）を含み得る。運動表現型は、例えば米国特許出願番号２００４／００７６５８３、２００４／００７６３１８及び２００４／００７６９９９に記載される方法を用いて解析することができ、これらの各々を参照により本明細書にその全体を組み込む。
【００３８】
試験集団または参照集団の表現特性は、集団の特性を測定することによって決定する。本発明は、集団の複数の特性を同時に測定することができる。１つの特性を測定することができるが、複数の特性も測定することができる。例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも７又は少なくとも１０の特性を、集団に対して評価することができる。測定する特性は、動作特性のみ、行動特性のみ、形態的特性のみまたは複数の分野における特性の混合であり得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの動作特性および少なくとも１つの非動作特性が評価される。
【００３９】
本明細書で用いる「対照のハエ」は、比較される遺伝子組換えハエの遺伝子型と同一の幼虫または成虫のハエを指し、ここで対照のハエが、ｉ）遺伝子組換えハエに存在する導入遺伝子の1つまたは両方を含まない、ｉｉ）候補薬剤が投与されていない、またはｉｉｉ）ＧＡＬ４‐ＵＡＳ系に対する要因を有さない、ことのいずれかを除く遺伝子組換え。
【００４０】
本明細書で用いる用語「候補薬剤」は、生物学的化合物または化学的化合物を指し、これらは遺伝子組換えハエに投与した場合に、例えば、変化した表現型が野生型ハエの表現型へ一部または完全に復帰するなどのハエの表現型を改変する可能性を有する。本明細書で用いる「薬剤」は、あらゆる組換え、修飾または天然の核酸分子、組換え、修飾または天然の核酸分子のライブラリ、合成、修飾または天然のペプチド、合成、修飾または天然のペプチドのライブラリ、および小分子を含むあらゆる有機化合物または無機化合物、もしくは小分子を含む有機化合物もしくは無機化合物のライブラリを含む。
【００４１】
本明細書で用いる用語「小分子」は、分子量が３０００ダルトン未満、好ましくは２０００ダルトン又は１５００ダルトン未満、更に好ましくは１０００ダルトン未満および最も好ましくは６００ダルトン未満の分子量を有する化合物を指す。好ましくは、必須ではないが、低分子はオリゴペプチド以外の化合物である。
【００４２】
本明細書で用いる「治療剤」は、哺乳動物、特にヒトのアルツハイマー病等の神経変性疾患の１以上の症状が改善する薬剤を指す。治療剤は、疾患の１以上の症状を軽減する、１以上の症状の発症を緩和すること、または疾患を予防もしくは回復することができる。
〔発明の詳細な説明〕
【００４３】
Ｉ．遺伝子組換えショウジョウバエの作出
ＣＴＦＡＰＰをコードする導入遺伝子を有する遺伝子組換えハエ、ならびにタウタンパク質およびＣＴＦＡＰＰの両方をコードする導入遺伝子を有する二重遺伝子組換えハエを開示する。遺伝子組換えハエは、Ａβ４２ペプチドの細胞外凝集および微小管結合タンパク質タウの高度リン酸化型の細胞内沈着を特徴とする、アルツハイマー病等の神経変性疾患のためのモデルを提供する。本発明の遺伝子組換えハエは、アルツハイマー病の治療に有効な治療剤をスクリーニングするのに使用され得る。
【００４４】
ショウジョウバエなどのハエは、γセクレターゼ活性を有するが、βセクレターゼ活性を有しない。従って、遺伝子組換えハエ内のヒトＡＰＰのみの発現は、Ａβ４２またはＡβ４０ペプチドの形成をもたらさないだろう。しかし、ＣＴＦＡＰＰのＮ末端はβセクレターゼ切断から生じるＮ末端に近似するため、遺伝子組換えハエ内のＣＴＦＡＰＰのみの発現は、ＣＴＦＡＰＰを基質としたハエのγセクレターゼの作用のために、Ａβ４２、Ａβ４０および類似のペプチドの形成が生じる。従って、本発明のハエはＡβ４２の加工、輸送および蓄積ならびに生じる神経変性に加えて、ＡＰＰ遺伝子のＣＴＦＡＰＰがコードする領域における突然変異および変異の作用、またはタウ遺伝子の突然変異および変異の作用を研究するために適したモデルである。
【００４５】
本発明の遺伝子組換えハエは、当業者に知られるあらゆる手段によって作出することができる。遺伝子組換えショウジョウバエ株の産生および解析の方法は、十分に確立されており、Ｂｒｅｎｄら， Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４４：６３５‐６５４（１９９４）；Ｈａｙら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４（１０）：５１９５‐２００（１９９７）；及びＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ． Ｂ． Ｒｏｂｅｒｔｓ監修）， ｐｐ１７５‐１９７， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， ＵＫ（１９８６）に記載され、本明細書に参照によりこれらの全体を組み込む。
【００４６】
一般的に、遺伝子組換えハエを作出するために、目的の導入遺伝子は安定してハエのゲノムに組み込まれる。あらゆるハエが使用可能であるが、本発明の好ましいハエはショウジョウバエ科類のメンバーである。例示的なハエは、キイロショウジョウバエである。
【００４７】
様々な形質転換ベクターが、本発明の遺伝子組換えハエの作出に有用であり、およびゲノム内への導入遺伝子の無作為な組込みを媒介するトランスポゾン配列を含むベクター、および相同組換えに使用するベクター（Ｒｏｎｇ及びＧｏｌｉｃ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：２０１３‐２０１８（２０００））を含むが、これらに限定されない。本発明の好ましいベクターは、ハエのゲノム内への目的の導入遺伝子の挿入を仲介する転移Ｐエレメント由来の配列を含むｐＵＡＳＴ（Ｂｒａｎｄ及びＰｅｒｒｉｍｏｎ， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１８：４０１‐４１５（１９９３））である。別の好ましいベクターは、ドキシサイクリン依存性過剰発現を生じ得るＰｄＬ（Ｎａｎｄｉｓ， Ｂｈｏｌｅ及びＴｏｗｅｒ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４（Ｒ８）：１‐１４， （２００３））である。さらに別の好ましいベクターはｐＥｘＰ‐ＵＡＳであり、クローニングおよびゲノム位置解析が容易なためである。本発明で使用する２つの特定のベクターは、ｐＥｘＰ‐ＵＡＳ：ＣＴＦ‐Ｉ（配列番号１７）およびｐＥｘＰ‐ＵＡＳ：ＣＴＦ‐ＩＩ（配列番号１８）である。ｐＥｘＰ‐ＵＡＳ：ＣＴＦ‐Ｉは、ヒトＡＰＰのシグナル配列、ＣＴＦＡＰＰ及びｍｙｃタグをコードする。ｐＥｘＰ‐ＵＡＳ：ＣＴＦ‐ＩＩは、ショウジョウバエのクチクラタンパク質（Ｖｉｎｃ）のシグナル配列、ＣＴＦＡＰＰ及び３ｘＨＡタグをコードする。
【００４８】
Ｐエレメントトランスポゾンが媒介する形質転換は、通常遺伝子組換えハエの作出のために使用される技術であり、Ｓｐｒａｄｌｉｎｇ， Ｐ‐ｅｌｅｍｅｎｔ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ， ｉｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ． Ｂ． Ｒｏｂｅｒｔｓ監修）， ｐｐ１７５‐１９７， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， ＵＫ（１９８６）に詳細に記載されており、参照により本明細書に組み込む。転移エレメントに基づく他の形質転換ベクターは、例えば、ｈｏｂｏエレメント（Ｂｌａｃｋｍａｎら， Ｅｍｂｏ Ｊ． ８：２１１‐７（１９８９））、ｍａｒｉｎｅｒエレメント（Ｌｉｄｈｏｌｍら， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３４：８５９−６８（１９９３））、ｈｅｒｍｅｓエレメント（Ｏ’Ｂｒｏｃｈｔａら， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４２：９０７−１４（１９９６））、Ｍｉｎｏｓエレメント（Ｌｏｕｋｅｒｉｓら, Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：９４８５‐９（１９９５））またはＰｉｇｇｙＢａｃエレメント（Ｈａｎｄｌｅｒら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：７５２０‐５（１９９８））を含む。一般的に、転移に必要なトランスポゾンの末端反復配列は形質転換ベクター内に組み込まれ、および末端反復配列が目的の導入遺伝子の横にくるように配置される。形質転換ベクターは、遺伝子組換え動物を同定するために使用するマーカー遺伝子を含むことが好ましい。ショウジョウバエｗｈｉｔｅ遺伝子の誘導体（Ｐｉｒｒｏｔｔａ Ｖ．及びＣ． Ｂｒｏｃｋｌ， ＥＭＢＯ Ｊ． ３（３）：５６３‐８（１９８４））またはショウジョウバエｒｏｓｙ遺伝子の誘導体（Ｄｏｙｌｅ Ｗら, Ｅｕｒ． Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２３９（３）：７８２−９５（１９９６））等、ショウジョウバエの眼色に作用するマーカー遺伝子が一般的に使用される。遺伝子組換え動物において、確実かつ容易に測定される表現型変化を生じるあらゆる遺伝子が、マーカーとして使用され得る。形質転換に使用される他のマーカー遺伝子の例示は、剛毛およびクチクラ色素を変化させるｙｅｌｌｏｗ遺伝子（Ｗｉｔｔｋｏｐｐ Ｐら， Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ． １２（１８）：１５４７‐５６（２００２））、剛毛の形態を変化させるｆｏｒｋｅｄ遺伝子（ＭｃＬａｃｈｌａｎ Ａ， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６（１）：１‐６（１９８６））、Ａｄｈ‐株の形質転換のための選抜マーカーとして使用されるＡｄｈ＋遺伝子（ＭｃＮａｂｂ Ｓら， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４３（２）：８９７‐９１１（１９９６））、Ｄｄｃｔｓ２突然変異株を形質転換するのに使用するＤｄｃ＋遺伝子（Ｓｃｈｏｌｎｉｃｋ Ｓら， Ｃｅｌｌ ３４（１）：３７‐４５（１９８３））、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）のｌａｃＺ遺伝子；大腸菌トランスポゾンＴｎ５由来のネオマイシン（登録商標）遺伝子、および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｈａｎｄｌｅｒ及びＨａｒｒｅｌｌ， Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８：４４９‐４５７（１９９９））を含み、これらは例えば眼、触角、羽および脚特異的プロモーター／エンハンサーエレメントなどの異なるプロモーター／エンハンサーエレメント、またはポリユビキチンプロモーター／エンハン���ーエレメントの調節下であり得る。
【００４９】
所望の導入遺伝子を導入するためのプラスミド構築物は、適切な遺伝的背景を有するショウジョウバエの胚の中に、ゲノムＤＮＡ内に導入遺伝子を組み込むのに必要な特定の転移酵素を発現するヘルパープラスミドと共に同時注入する。注入した胚（Ｇ０成虫）から生じる動物を、マーカー遺伝子表現型の発現に基づいて遺伝子組換えモザイク動物を手作業で選抜またはスクリーニングし、続いて目的の導入遺伝子を１コピー以上安定して有する、完全な遺伝子組換え動物（Ｇ１および次の世代）を作出するために交雑させる。
【００５０】
ＵＡＳ／ＧＡＬ４系等のバイナリー系は、遺伝子組換えハエを作出するために一般的に用いられる。これは酵母ＧＡＬ４転写活性化タンパク質によるプロモーターの調節のためのＵＡＳ上流制御配列を採用する十分に確立した系であり、ＢｒａｎｄおよびＰｅｒｒｉｍｏｎ， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１８：４０１−１５（１９９３）ならびにＲｏｒｔｈら， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２５：１０４９‐１０５７（１９９８）に記載され、参照により本明細書にこれらの全体を組み込む。この手法において、「ターゲット」系統と呼ばれる遺伝子組換えショウジョウバエを作出し、これは目的の遺伝子（例えば、Ｃ末端ＡＰＰ断片またはタウをコードする導入遺伝子）がＵＡＳによって調節される適切なプロモーター（例えば、ｈｓｐ７０ ＴＡＴＡボックス、Ｂｒａｎｄ及びＰｅｒｒｉｍｏｎ， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１８：４０１−１５（１９９３））と作動可能に連結している。「ドライバー」系統と呼ばれる他の遺伝子組換えショウジョウバエ株を作出し、これはＧＡＬ４コード領域が、眼、触角、羽または神経系等の特定の組織において、ＧＡＬ４活性化タンパク質の発現を導くプロモーター／エンハンサーと作動可能に連結している。目的の遺伝子は、目的の遺伝子に結合したプロモーターから転写を「ドライブ」する転写活性化因子を欠損するため、「ターゲット」系統において発現しない。しかし、ＵＡＳ‐ターゲット系統がＧＡＬ４ドライバー系統と交雑すると、目的の遺伝子が誘導される。結果として生じた子孫は、ＧＡＬ４系統に特徴的な特定の発現様式を示す。
【００５１】
この手法の技術的な容易さは、目的の遺伝子を有する１つの遺伝子組換えターゲット系統を作出することにより、およびそのターゲット系統をすでに存在するドライバー系統の一団と交雑させることにより、幅広い組織における目的の遺伝子の直接の発現の効果を抽出することを可能とする。特定のドライバーを有する多くのＧＡＬ４ドライバーショウジョウバエ株は文献に記載されており、および他は確立された技術を用いて容易に調製され得る（Ｂｒａｎｄ及びＰｅｒｒｉｍｏｎ， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１８：４０１−１５（１９９３））。本発明で使用するドライバー株は、例えば、羽、脳および介在神経細胞における発現のためのａｐｔｅｒｏｕｓ‐ＧＡＬ４、有糸分裂後神経細胞における全神経発現のためのｅｌａｖ‐ＧＡＬ４、神経線維から神経細胞への発達中の神経系における全神経発現のためのｓｃａｂｒｏｕｓ‐ＧＡＬ４、眼における発現のためのｓｅｖｅｎｌｅｓｓ‐ＧＡＬ４、ｅｙｅｌｅｓｓ‐ＧＡＬ４及びＧＭＲ‐ＧＡＬ４、中枢神経系における発現のためのＮｅｒｖａｎａ ２‐ＧＡＬ４；コリン作動性神経細胞における発現のためのＣｈａ‐（コリンアセチルトランスフェラーゼ）ＧＡＬ４、ドーパミン作動性神経細胞における発現のためのＴＨ‐（チロシンヒドロキシラーゼ）、胚および幼虫ならびに成虫の脳、胸部神経節および消化管における発現のためのＣａＭＫＩＩ‐（カルモジュリン依存性キナーゼＩＩ）、咽頭（ｐｈａｒａｎｇｅａｌ）神経細胞における発現のためのＰ‐ＧＡＬ４；およびグリア細胞における発現のためのｇｅｍ‐ＧＡＬ４を含む。
【００５２】
本発明はゲノム中にＣＴＦＡＰＰをコードするＤＮＡ配列、場合によりシグナルペプチドに対するＤＮＡ配列を結合したＤＮＡ配列を組み込んだ遺伝子組換えハエを開示する。いくつかの実施形態は、タウタンパク質をコードするＤＮＡ配列およびＣＴＦＡＰＰをコードするＤＮＡ配列を含む二重遺伝子組換えハエである。
【００５３】
単一の導入遺伝子を含む遺伝子組換えハエの作出は、当業者に知られるあらゆる標準的な方法を用いて実施され得る。二重遺伝子組換えハエを作出するために、ＣＴＦＡＰＰまたはタウタンパク質のいずれかを発現する遺伝子組換えハエを独立して作出し、そして次に交雑させて両方のタンパク質を発現するハエを作出する。
【００５４】
遺伝子組換えハエの１以上の導入遺伝子は、直接選択したプロモーターにより、またはＵＡＳ／ＧＡＬ４系により駆動され得る。好ましい実施形態において、遺伝子組換えショウジョウバエを、ＵＡＳ／ＧＡＬ４調節系を用いて作出する。つまり、導入遺伝子（例えばＣＴＦＡＰＰ）を発現する遺伝子組換えハエを作出するために、ＤＮＡ配列がＧＡＬ４応答配列ＵＡＳと作動可能に連結するようなベクター内に、導入遺伝子をコードするＤＮＡ配列をクローニングする。転写領域の上流にＵＡＳ配列エレメントを配置するｐＵＡＳＴベクター（Ｂｒａｎｄ及びＰｅｒｒｉｍｏｎ， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１８：４０１‐４１５（１９９３））等のＵＡＳエレメントを含むベクターが市販されている。ＤＮＡは、標準的な方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ: Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ, Ｎ． Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら， Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ, Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｙ，（１９９５））を用いてクローニングされ、および本明細書の分子的技術の節にさらに詳細に記載する。ＤＮＡをｐＵＡＳＴ等の適切なベクター内にクローニングした後、ベクターをショウジョウバエ胚（例えばｙｗ胚）の中に標準的な手順（Ｂｒａｎｄら, Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４４：６３５‐６５４（１９９４）；Ｈａｙら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：５１９５‐２００（１９９７））により注入して、遺伝子組換えショウジョウバエを作出する。
【００５５】
バイナリーＵＡＳ／ＧＡＬ４系を使用する場合、遺伝子組換え子孫をショウジョウバエのドライバー株と交雑させることにより、変化した表現型の存在を評価することができる。好ましいショウジョウバエは、眼特異的ドライバー株ＧＭＲ‐ＧＡＬ４を含み、これはｒｏｕｇｈ ｅｙｅ表現型の程度に基づいた遺伝子組換えハエの同定および分類が可能である。例えば、ショウジョウバエ眼におけるタウの発現はｒｏｕｇｈ ｅｙｅ表現型を生じ、これは顕微鏡により容易に観察できる。遺伝子組換え系統により示されるｒｏｕｇｈ ｅｙｅ表現型の程度は、強度、中度、低度として分類できる。低度または中度の系統は、眼の腹側領域を覆う凹凸のある乱れた外見を有する。程度が中程度の系統は、眼全体に渡ってより強い凹凸を示すが、一方、程度の強い系統では、眼全体が多くの個眼および個眼内剛毛が損失／融合しているように見え、眼全体がなめらかで光沢のある外見を有し、さらに、壊死斑を眼全体に見ることができる。
【００５６】
ＣＴＦＡＰＰを発現する遺伝子組換えハエを作出するため、ＣＴＦＡＰＰを細胞膜内に挿入できるようにＣＴＦＡＰＰをコードするＤＮＡ配列をシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列にインフレームに連結する。シグナル配列は直接ＣＴＦＡＰＰコード配列に連結するか、または例えば３、６、９、１２又は１５ヌクレオチドのＤＮＡリンカー配列を用いて間接的に連結する。タンパク質をショウジョウバエの小胞体分泌経路に導くか、または経由させるシグナル配列を使用する。本発明の好ましいシグナルペプチドは、ヒトＡＰＰ由来のシグナルペプチド（配列番号５）、ｗｉｎｇｌｅｓｓ（ｗｇ）由来のシグナルペプチド（配列番号６）、ａｒｇｏｓ（ａｏｓ）由来のシグナルペプチド（配列番号７）、ショウジョウバエＡＰＰＬ由来のシグナルペプチド（配列番号８）、ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ（ｐｓｎ）由来のシグナルペプチド（配列番号９）ならびにｗｉｎｄｂｅｕｔｅｌ（配列番号１０）およびＶｉｎｃ由来のシグナルペプチドである。
【００５７】
ＣＴＤＡＰＰをコードするＤＮＡは、標準的なライゲーション技術によりシグナル配列に連結し、そして次に配列がＧＡＬ４応答配列ＵＡＳと作動可能に連結するように、ベクターにクローニングする。ＣＴＦＡＰＰ遺伝子組換えハエの作出のための好ましい形質転換ベクターは、ｐＵＡＳＴベクター（Ｂｒａｎｄ及びＰｅｒｒｉｍｏｎ， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１８：４０１‐４１５（１９９３））である。タウ遺伝子組換えハエの作出の項で記載したように、ベクターをショウジョウバエの胚（例えばｙｗ胚）の中に標準的な手順（Ｂｒａｎｄら， Ｍｅｔｈ． ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４４：６３５‐６５４（１９９４）；Ｈａｙら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：５１９５‐２００（１９９７））により注入し、そして次に子孫を選抜マーカー遺伝子の表現型に基づいて選抜および交雑させる。バイナリーＵＡＳ／ＧＡＬ４系を用いる場合、変化した表現型の存在を評価するために遺伝子組換え子孫をショウジョウバエドライバー株と交雑させることができる。好ましいショウジョウバエドライバー株は、ＧＭＲ‐ＧＡＬ４（ｅｙｅ）およびｅｌａｖ‐ＧＡＬ４（ＣＮＳ）である。
【００５８】
眼の表現型（例えばｒｏｕｇｈ ｅｙｅ表現型）を評価するために、ＧＭＲ‐ＧＡＬ４ドライバー株が交雑に使用され得る。ショウジョウバエの眼でのＣＴＦＡＰＰの異所性過剰発現は、個眼（ショウジョウバエの複眼を形成する均一の単一単位）の光受容細胞の標準的な台形配置を崩壊させると考えられており、その程度は、導入遺伝子のコピー数および発現レベルに依存すると考えられる。運動表現型および行動表現型（例えば登坂アッセイ）を評価するために、ｅｌａｖ‐ＧＡＬ４ドライバー株を交雑に用いる。ショウジョウバエの中枢神経系（ＣＮＳ）におけるＣＴＦＡＰＰの異所性過剰発現は、動作障害、登坂障害および飛行障害等の運動欠損をもたらすと考えられている。
【００５９】
単一遺伝子組換えハエを一度作出すると、ハエは交尾によって互いに交雑し得る。ハエは従来の方法によって交雑させる。バイナリーＵＡＳ／ＧＡＬ４系を用いる場合、ハエを適切なドライバー株と交雑させ、および変化した表現型を評価し、上記のように遺伝子組換えハエを表現型の程度によって分類する。例えば、本明細書に開示するように、タウ導入遺伝子とＣＴＦＡＰＰ導入遺伝子との組み合わせは、眼に相乗効果を生み出すと考えられている。
【００６０】
導入遺伝子発現の特異性および強度を変化させるために、いくつかの因子を変化させ得る。導入遺伝子または導入遺伝子の組み合わせの配列変異体が、表現型を変化させるのに使用され得る。例えば、単独またはＧＡＬ４系と結合して使用される組織特異的プロモーター等の異なる発現ドライバーは、発現の組織特異性または強度のどちらかに作用させるのに使用され得る。発達温度も変化させることができ、発現の組織分布または強度のどちらかに作用することが可能である。一般的に、より高い温度は、導入遺伝子のより強い発現を駆動する。
【００６１】
遺伝子組換えハエにおけるタウおよびＣＴＦＡＰＰタンパク質の発現は、以下に記載するウエスタンブロット解析またはハエ組織横断切片の免疫染色等の標準的な技術により確認する。
【００６２】
ウエスタンブロット解析は標準的な方法によって実施する。簡潔には、例として、ウエスタンブロット解析によってＣＴＦＡＰＰまたはタウの発現を検出するために、ハエ全体またはハエ頭部（例えば頭部８０〜９０個）を集め、１００μｌの２％ＳＤＳ、３０％ショ糖、０．７１８Ｍ Ｂｉｓ‐Ｔｒｉｓ、０．３１８Ｍ Ｂｉｃｉｎｅ、「Ｃｏｍｐｌｅｔｅ」プロテアーゼ阻害剤（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含むドライアイス上のエッペンドルフ管内に入れ、次に機械的ホモジナイザーを用いてすりつぶす。サンプルを５分間９５℃で加熱し、５分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離後、上清を新しいエッペンドルフ管内に移す。５％β−メルカプトエタノールおよび０．０１％ブロモフェノールブルーを添加後、分離ゲルにロードする前にサンプルを煮沸する。各サンプルに対し約２００ｎｇの総タンパク質抽出物を、８％尿素を含む１５％Ｔｒｉｃｉｎｅ／Ｔｒｉｓ ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル上にロードする。分離後、次にサンプルをＰＶＤＦ膜（ＢＩＯ‐ＲＡＤ， １６２−０１７４）に転写させ、続いて膜をＰＢＳ中で３分間煮沸する。抗タウ抗体（例えばＴ１４（Ｚｙｍｅｄ））およびＡＴ１００（Ｐｉｅｒｃｅ‐Ｅｎｄｏｇｅｎ）、抗ＡＰＰ抗体（例えば６Ｅ１０（Ｓｅｎｅｔｅｋ ＰＬＣ Ｎａｐａ， ＣＡ））または抗Ａβ４２を、一般的には１：２０００の濃度で、５％脱脂乳、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０を含む１×ＰＢＳ中で、９０分間室温でハイブリダイゼーションさせる。サンプルを、１×ＰＢＳ‐０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０中で各々５分、１５分および１５分間の３回洗浄する。標識した２次抗体（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈの抗マウスＨＲＰ、ＮＡ ９３１）を、一般的には１：２０００の濃度で、５％脱脂乳、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０を含む１×ＰＢＳ中、９０分間室温で調製する。次にサンプルを１×ＰＢＳ‐０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０中で各々５分、１５分及び１５分間の３回洗浄する。次に、適切な方法を用いてタンパク質を検出する。例えば、抗マウスＨＲＰを結合２次抗体として使用する場合、ＥＣＬ（ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ， Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， ＃ＲＰＮ ２２０９）を検出に用いる。
【００６３】
遺伝子組換えハエにおいてタンパク質の発現を確認する様式として、ショウジョウバエの器官横断切片または全載の免疫染色が実施される。このような方法は、非病変組織に存在するタウタンパク質の修飾型である高度リン酸化タウの存在を確認するのに特に有用である。高度リン酸化タウは、タウタンパク質と比較して病的構造変化を示し、およびアルツハイマー病等の特定の神経変性疾患を患う患者由来の病変組織に存在する。
【００６４】
ショウジョウバエ器官の横断切片は、Ｗｏｌｆｆ， Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（２０００）（参照により本明細書に組み込む）に記載される方法等の、あらゆる従来の凍結切片法によって作製され得る。次に凍結切片をタウおよびＣ末端ＡＰＰ断片ペプチドを検出するために、当技術分野によく知られる方法を用いて免疫染色する。好ましい実施形態において、ベクタステインＡＢＣキット（ビオチン化抗マウスＩｇＧ２次抗体、および酵素セイヨウワサビペルオキシダーゼＨに結合したアビジン／ビオチンを含む、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてタンパク質を同定する。他の実施形態において、２次抗体は蛍光色素分子に結合している。簡潔に言えば、ベクタステインＡＢＣキットのプロトコルに従って、凍結切片を正常なウマ血清を用いてブロッキングする。ＣＴＦＡＰＰまたはタウを認識する１次抗体は、一般的に１：３０００の希釈で使用し、および２次抗体でのインキュベーションは、１〜２％正常ウマ血清を含むＰＢＳ／１％ＢＳＡ中で、これもまたベクタステインＡＢＣキットのプロトコルに従って行う。ＡＢＣキットの手順は以下である；ＡＢＣ試薬によるインキュベーションをＰＢＳ／１％サポニン中で行い、次にＰＢＳ／０．１％サポニン中で４×１０分間洗浄する。次に切片をスライド当たり０．５ｍｌのセイヨウワサビペルオキシダーゼＨ基質溶液、４００μｇ／ｍｌ ３，３’-ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、ＰＢＳ／０．１％サポニン中の０．００６％ Ｈ２Ｏ２中でインキュベーションした後、３分後にＰＢＳ中の０．０２％アジ化ナトリウムで反応を停止する。切片をＰＢＳ中で数回リンス後、ＤＰＸ（Ｆｌｕｋａ）中に包埋する前にエタノール系を通して脱水する。
【００６５】
横断切片を免疫染色するために使用される例示的な抗体は、Ａβ４２ペプチドを認識するモノクローナル抗体６Ｅ１０（Ｓｅｎｅｔｅｋ ＰＬＣ Ｎａｐａ， ＣＡ．）ならびに抗タウ抗体ＡＬＺ５０及びＭＣＩ（Ｊｉｃｈａ ＧＡら， Ｊ． ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｒｅｓ． ４８：１２８‐１３２（１９９７））を含むが、これらに限定されない。
【００６６】
あるいはまた、本発明で使用するＣ末端ＡＰＰ断片およびタウを認識する抗体は、当技術分野に知られる標準的なプロトコルを用いて作製することができる（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ監修（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｅｒ Ｐｒｅｓｓ：１９８８）を参照せよ）。マウス、ハムスターまたはウサギ等の哺乳動物は、免疫原性型のタンパク質（例えば、Ａβ４２またはタウポリペプチドもしくは抗体反応を誘発することが可能な抗原性断片）で免疫することができる。抗体を生じるための免疫原は、ポリペプチド（例えば、単離した組換えポリペプチドまたは合成ペプチド）をアジュバントと混合して調製する。あるいはまた、Ｃ末端ＡＰＰ断片またはタウポリペプチドを、免疫原性タンパク質を大きくするために融合タンパク質として作出する。ポリペプチドはまた、キーホールリンペットヘモシアニン等の他のより大きな免疫原性タンパク質と共有結合し得る。あるいはまた、Ｃ末端ＡＰＰ断片またはタウあるいはこれらのタンパク質の断片をコードするプラスミドまたはウイルスベクターは、参照により本明細書に組み込まれるＣｏｓｔａｇｌｉｏｌａら， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １０５：８０３‐８１１（２０００）に記載されるように、ポリペプチドを発現させ、および動物において免疫反応を生じるのに使用することができる。抗体を生じるさせるために、免疫原は一般的に、ウサギ、ヒツジおよびマウス等の実験動物へ、皮内投与、皮下投与または筋肉内投与される。上記の抗体に加え、一本鎖抗体等の遺伝子操作された抗体誘導体を作製可能である。
【００６７】
免疫付与の進行は、血漿中のまたは血清中の抗体価の検出によってモニターすることができる。標準的なＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリーまたは他の免疫アッセイもまた、抗体レベルを評価するための抗原としての免疫原と共に使用され得る。抗体調製物は、免疫化動物由来の単なる血清であってよく、また所望であれば、ポリクローナル抗体を、例えば固定化免疫原を用いた親和性クロマトグラフィーによって血清から単離してもよい。
【００６８】
モノクローナル抗体を生成するために、抗体産生脾細胞を免疫化動物より採取後、標準的な体細胞融合手順によって、骨髄腫細胞等の不死化細胞と融合してハイブリドーマ細胞を得る。このような技術は当技術分野においてよく知られており、例えば、ハイブリドーマ技術（初めにＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５‐４９７（１９７５）より開発された）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂａｒら， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ， ４：７２（１９８３））、およびヒトモノクローナル抗体を生成するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら, Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． ｐｐ．７７‐９６（１９８５））を含む。ハイブリドーマ細胞は、Ｃ末端ＡＰＰ断片またはタウペプチドもしくはポリペプチドと特異的に反応する抗体の生成について、およびそのようなハイブリドーマ細胞を含む培養液から単離されたモノクローナル抗体について、免疫化学的にスクリーニングされ得る。
【００６９】
ＩＩ．遺伝子組換えショウジョウバエ由来の初代細胞培養物の調製
細胞は本発明のあらゆる遺伝子組換えハエから得ること、および初代培養物中で維持することができ、これらの表現型を評価することが可能であり、または神経変性において活性がある薬剤を同定するために使用することができる。当技術分野において知られるあらゆる技術を、遺伝子組換えハエからの細胞の単離、これらの培養物、場合によりこれらの分化を促進、およびこれらの表現型を研究するために適用することができる。
【００７０】
簡潔に言うと、１以上の細胞はハエの器官もしくは組織の切開および／または解離によって、あらゆる発達段階の遺伝子組換えハエより得られる。細胞を、これらの表現型を研究するのに十分長い、一般的には数時間〜数日または数週間に渡り生存能を維持するのに適した培養培地に置く。様々な技術がハエ組織の解離に利用可能である。例えば数個の胚を、余裕のあるＰｏｔｔｅｒ‐Ｅｌｖｅｈｊｅｍガラスホモジナイザーを使用してまとめてホモジナイズして、全胚細胞懸濁液を得ることができる。細胞をホモジナイズ後、１０％非加熱ウシ胎児血清を添加したＳｃｈｎｅｉｄｅｒ’ｓ Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ‐ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）等の滅菌培地中で培養し、そしてＣＯ２非存在下で２０〜３０℃の範囲の温度の恒温器内で維持することができる。例えば、Ｇｕｈａら， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． １１６：３３７３‐８６（２００３）を参照されたい。例えば、細胞形態または他の特徴により、個々の細胞型を培養物から選択する。例えば、全動物細胞選別は、所望の細胞型（例えば、神経前駆細胞または血球）を、例えばｌａｃＺ発現（Ｋｒａｓｎｏｗら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：８１‐８５（１９９１）を参照せよ）またはＧＦＰタグタンパク質の発現（Ｇｕｈａら， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． １１６：３３７３‐８６（２００３）を参照せよ）を用いた遺伝子型に基づいて単離するのに用いることができる。
【００７１】
初代培養物中の細胞は、神経および筋肉（Ｈａｙａｓｈｉら, Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ａｎｉｍ ３０Ａ：２０２‐８（１９９４））または神経および表皮（Ｌｕｅｒら， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１６：３７７−８５（１９９２））を含む様々な最終分化細胞に分化し得る。細胞はまた、後期の発達段階または成虫からも培養され得る。例えば、眼の成虫原基は幼虫または蛹から解離することができ、および蛹から採取した場合には神経突起伸長を研究するために使用でき、または初期段階からの有糸分裂細胞を得るのに使用できる（Ｌｉら， Ｊ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ ２８：３６３−８０（１９９５））。初代培養物中の細胞は、除去後直ちに、つまり除去した時の発達段階で研究してもよく、またはインビトロにおいて分化させ、および分化の後に研究してもよい。
【００７２】
ＣＴＦＡＰＰ又はＣＴＦＡＰＰおよびタウを含む遺伝子組換えハエ由来の培養細胞の表現型は、神経変性に関連した現象に対するこれらのポリペプチドの影響を研究するのに使用され得る。例えば、細胞外アミロイド斑または細胞内変化の生成を、例えばＣＴＦＡＰＰ、Ａβまたはタウのいずれかに特異的に結合する標識化抗体の分布を調べることによって、培養細胞を調べることができる。細胞骨格の組織の変化は、アクチン、微小管および結合タンパク質等の細胞骨格タンパク質に対する標識化抗体で調べることができる。神経機能は、イオンチャネル活性または神経伝達物質の放出を電気生理学的な測定を実施することによって、細胞レベルで研究され得る。細胞‐細胞相互作用および遺伝子発現もまた、アルツハイマー病等の神経変性疾患において活性のある病理学的機構への手掛かりを提供し得る。さらに、初代培養物は、遺伝子組換え細胞の表現型に対する候補薬剤の影響を調べることによって、神経変性疾患に薬効を有するような化学薬剤を同定するためのスクリーニング工程に使用され得る。
【００７３】
ＩＩＩ．分子的技術
本発明において、タウまたはヒトＡβ４２ＩｔａｌｉａｎをコードするＤＮＡ配列を、遺伝子組換えハエの作出に適した形質転換ベクター内にクローニングする。
【００７４】
タウおよびヒトＣ末端APP断片をコードするＤＮＡの作出
タウおよびＣ末端ＡＰＰ断片をコードするＤＮＡ配列は、ゲノムＤＮＡから得ること、または当技術分野においてよく知られる方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ: Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ, Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら， Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ, Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｙ，（１９９５））を用いた合成手段によって作出することができる。簡潔に言うと、ヒトゲノムＤＮＡは、フェノール抽出もしくはＱＬＡａｍｐ Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， Ｃａｌ．）、Ｗｉｚａｒｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．）及びＡＳＡＰ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， Ｉｎｄ．）等のキットでの抽出により、末梢血または粘膜剥離物から単離され得る。次に、タウおよびＣ末端ＡＰＰ断片をコードするＤＮＡ配列をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｍｕｌｌｉｓ及びＦａｌｏｏｎａ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １５５：３３５（１９８７））（参照により本明細書に組み込む）によってゲノムＤＮＡより増幅、および適切な組換えクローニングベクター内にクローニングすることができる。
【００７５】
あるいはまた、タウまたはヒトＣ末端ＡＰＰ断片をコードするｃＤＮＡは、ＲＴ‐ＰＣＲを用いてｍＲＮＡより増幅することができ、適切な組換えクローニングベクター内へクローニングされ得る。ＲＮＡは、当技術分野に知られるあらゆる方法によって調製することができ、その選択はサンプル源に依存し得る。ＲＮＡを調製する方法は、Ｄａｖｉｓら（ Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， ＮＹ， Ｃｈａｐｔｅｒ １１（１９８６））、Ａｕｓｕｂｅｌら（ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｈａｐｔｅｒ ４， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， ＮＹ（１９８７））Ｋａｗａｓａｋｉ及びＷａｎｇ（ ＰＣＲ Ｔｈｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｅｒｉｃｈ監修， Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ ＮＹ（１９８９））、Ｋａｗａｓａｋｉ（ ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ） Ｉｎｎｉｓら監修（ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９０））に記載され、これらすべてを参照により本明細書に組み込む。
【００７６】
ＰＣＲ又はＲＴ‐ＰＣＲによりタウまたはＣＴＦＡＰＰ断片をコードする配列を作出後に、クローニングした断片の配列を、好ましくはクローニングした断片の配列が両方向からの核酸シーケンスにより確認できるように、適切なシーケンスベクター内にクローニングする。
【００７７】
本発明で使用するのに適した組換えクローニングベクターは、ベクターが１以上の選択した宿主細胞内での複製を可能にする核酸配列を含む。一般的なクローニングベクターでは、この配列はベクターを宿主染色体ＤＮＡと独立して複製可能にし、および複製開始点または自己複製配列を含む。このような配列は様々な細菌、酵母およびウイルスについてよく知られている。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製開始点は、ほとんどのグラム陰性細菌に適しており、２ｍｉｃｒｏｎプラスミド複製開始点は、酵母に適しており、および様々なウイルス複製開始点（例えば、ＳＶ４０、アデノウイルス）は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般的に、ＣＯＳ細胞等の高レベルにＤＮＡを複製可能な哺乳動物細胞内で使用しない限り、複製開始点は哺乳動物発現ベクターには必要ない。
【００７８】
有利なことに、クローニングベクターまたは発現ベクターは選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含み得る。この遺伝子は、選択培養培地において生育する形質転換宿主細胞の生存または成長に不可欠なタンパク質をコードする。従って、選択遺伝子を含むベクターで形質転換されない細胞は培養培地中で生存しない。一般的な選択遺伝子は、抗生物質および他の毒物（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートまたはテトラサイクリン）に耐性を付与するタンパク質、栄養要求性欠損を補完するタンパク質、または成長培地では得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
【００７９】
クローニングは、大腸菌において実施するのが最も便利であるため、例えば抗生物質アンピシリンに対する耐性を付与するβラクタマーゼ遺伝子などの選択マーカーが有用である。これらは、ｐＢＲ３２２プラスミド又はｐＵＣ１８もしくはｐＵＣ１９等のｐＵＣプラスミド等の大腸菌プラスミドより得ることが可能である。
【００８０】
タウまたはヒトＣ末端ＡＰＰ断片をコードする配列はまた、転位エレメント間の配列挿入、またはｐＵＡＳＴ等のＵＡＳエレメントの下流への挿入を可能にするベクター等の、遺伝子組換えハエの作出に適した形質転換ベクター内に直接的にクローニングすることも可能である。遺伝子組換えハエの作出に適したベクターは、好ましくは遺伝子組換えハエを同定できるように、ｗｈｉｔｅ遺伝子、ｒｏｓｙ遺伝子、ｙｅｌｌｏｗ遺伝子、ｆｏｒｋｅｄ遺伝子および上記の他の遺伝子等のマーカー遺伝子を含む。適切なベクターはまた、眼における発現に有用なｓｅｖｅｎｌｅｓｓプロモーター／エンハンサー、ｅｙｅｌｅｓｓプロモーター／エンハンサー、ｇｌａｓｓ応答性プロモーター（ＧＭＲ）／エンハンサー、および羽における発現に有用なｄｐｐ又はｖｅｓｔｉｇｉａｌ遺伝子由来のエンハンサー／プロモーター等の、前記の組織特異的調節配列も含み得る。
【００８１】
タウまたはヒトＣ末端ＡＰＰ断片をコードする配列は、発現調節配列がコード配列と作動可能に連結するように、組換えベクター内に連結される。
【００８２】
ここで、タウまたはヒトＣ末端ＡＰＰ断片をコードするＤＮＡ配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、または次にＰＣＲに使用するｃＤＮＡを合成するためのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば逆転写酵素）を用いたＲＴ‐ＰＣＲを使用して作出され得る。
【００８３】
ＩＶ．表現型および変化した表現型を検出する方法
ハエのあらゆる観察可能なおよび／または測定可能な物理的または生化学的特徴は、本発明に従って評価され得る表現型である。例えば、スクリーニングアッセイに適した特性等の所望の特性を有する遺伝子組換えハエは、対照（例えば、野生型ハエまたは導入遺伝子が発現していないハエ）と比較して変化した表現型を示すハエを同定することによって作出され得る。治療剤は、候補薬剤を投与しない遺伝子組換えハエと比較して、投与によって遺伝子組換えハエの変化した表現型に変化をもたらす薬剤をスクリーニングすることによって同定され得る。
【００８４】
変化した表現型における変化は、表現型の完全な復帰または部分的な復帰のいずれかが観察されることを含む。完全な復帰は、変化した表現型の消失として、または表現型の対照のハエにおいて観察される表現型への１００％復帰として定義される。変化した表現型の部分的な復帰は、対照のハエにおいて観察される表現型への５％、１０％、２０％、好ましくは３０％、より好ましくは５０％および最も好ましくは５０％を超える復帰であり得る。例示的な測定可能な要素は、眼等の器官の形態、組織および器官の分布、行動表現型（食欲および交尾等）および運動能力を含むが、これらに限定されない。
【００８５】
いくつかの実施形態において、１つの表現型が決定される。他の実施形態においては、２つ以上の表現型が決定される。さらに他の実施形態においては、複数の表現型（形質）、例えば２、３、４、５、７、１０以上の形質が決定され、および「表現特性」を作製するのに使用される。測定した形質は、動作形質のみ、行動形質のみ、形態的形質のみ、または複数の分野における形質の混合であり得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの動作形質および少なくとも１つの非動作形質が評価される。表現型または表現特性は、個々のハエまたはハエの集団について比較され得る。ハエの集団を研究する場合、各々の形質に対する全体値を比較することができ、および集団の間で有意に異なる一部の形質を同定することができる。特定の集団（例えば親バエストック）に対する一部の形質および形質の値を、その集団の「フェノプリント（ｐｈｅｎｏｐｒｉｎｔ）」と呼ぶ。従って、対照の生物試料の集団と異なる生物試料の試験集団の形質は、試験集団の「フェノプリント」と呼ぶ。
【００８６】
記載する様々な形質要素の各々に対し、統計的測定が決定され得る。例えば、ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＯＦ ＢＩＯＳＴＡＴＩＳＴＩＣＳ第二版（２０００）Ｍａｓｃｅｌｌｏら， Ｄｕｘｂｕｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。形質要素ごとの統計値の例示は、分布、平均、分散、標準偏差、標準誤差、最大、最小、頻度、初回発生までの時間、最終発生までの時間、全持続時間（秒または％）、平均持続時間（該当する場合）を含む。
【００８７】
運動表現型
運動表現型を評価することができ、例えば米国特許出願番号２００４／００７６５８３、２００４／００７６３１８及び２００４／００７６９９９に記載され、これらは参照により本明細書にその全体を組み込む。例えば、運動能力は、ハエを容器中に入れ、それらを容器の底に叩き落し、次に規定時間の間に容器上の所定のマークを登り超えるハエの数を数えることによる登坂アッセイにおいて評価され得る。この例示において、対照のハエの１００％運動活性は、所定のマークを登り超えるするハエの数によって表され、一方、運動活性が変化したハエは、対照のハエ集団において観察される活性の８０％、７０％、６０％、５０％、好ましくは５０％未満又はより好ましくは３０％未満を有し得る。
【００８８】
１つの態様において、容器（例えばバイアル）内のハエの集団の動作を検出および連続的に解析することによって形質を測定する。ＣＣＤビデオカメラ等の記録装置によってハエの動作をモニターすることができ、得られた画像をデジタル化し、本明細書に記載するプロセッサ補助アルゴリズムにより解析し、および解析データはコンピューターが利用可能な様式で保存される。例えば、ハエの動作に関する形質の測定において、各々の動物の軌跡を動物に対する１以上の変数（例えば、速度、垂直のみの速度、垂直距離、旋回頻度、微小動作の頻度等）の計算によってモニターしてもよい。次に、このような変数の値をバイアル内の動物の集団について平均化し、および各々の集団（例えば、親ストックハエおよび遺伝子組換えハエ）に対する形質を表す全体値を得る。
【００８９】
本明細書で用いる「動作形質データ」は、１以上の動作形質から作成される測定値を指す。「動作形質データ」測定値の例示は、Ｘ‐ｐｏｓ、Ｘ‐速度、速度、旋回、躓き、サイズ、Ｔ‐カウント、Ｐ‐カウント、Ｔ‐長、クロスハイ（Ｃｒｏｓｓｈｉｇｈ）、ＣｒｏｓｓｌｏｗおよびＦ‐カウントを含むが、これらに限定されない。これらの特定の測定の詳細は、以下に提供する。
【００９０】
このような「動作形質」の例示は、
ａ）総距離（規定時間の間に移動した平均総距離）、
ｂ）Ｘ単独距離（規定時間の間にＸ軸方向に移動した平均距離）、
ｃ）Ｙ単独距離（規定時間の間にＹ軸方向に移動した平均距離）、
ｄ）平均速度（時間単位当たりに動いた平均総距離）、
ｅ）平均Ｘ単独速度（時間単位当たりにＸ軸方向に動いた距離）、
ｆ）平均Ｙ単独速度（時間単位当たりにＹ軸方向に動いた距離）、
ｇ）加速（時間に対する速度の変化の割合）、
ｈ）旋回、
ｉ）躓き、
ｊ）特定の決められた区域または地点に対する１匹のハエの空間的位置（空間的位置形質の例としては、（１）目的の区画内で費やす平均時間（例えば、容器の底、中央または上端で費やす時間、容器内の決められた区画への訪問回数）、（２）ハエと目的の地点（例えば、区画の中央）の間の平均距離、（３）２つのサンプル地点をつなぐベクトルの平均長（例えば、２匹のハエの間またはハエと決められた地点もしくは物体との間の直線距離）、（４）２つのサンプル地点をつなぐベクトルの長さが、実験者が定めた要素未満である、それより大きいまたはそれと同等である平均時間等、を含む）、
ｋ）動くハエの軌跡形状、すなわち、ハエが移動する軌跡の幾何学的形状（軌跡形状形質の例としては以下を含む：（１）角速度（動作の方向における変化の平均速度）、（２）旋回（２つの連続したサンプル間隔の動作ベクトル間の角度）、（３）旋回の頻度（時間単位当たりの平均旋回量）および（４）躓きまたは蛇行（距離に対する動作の方向の変化）等。これは上記のような躓きとは異なる。旋回要素は、円滑な旋回動作（小さな回転と定義する）および／または乱れた旋回動作（大幅な回転と定義する）を含み得る。）、
を含むが、これらに限定されない。
【００９１】
動作形質は、例えば以下の要素を用いて定量され得る。
【００９２】
Ｘ‐Ｐｏｓ：Ｘ‐Ｐｏｓスコアは、すべての軌跡に対するＸ‐位置のリストを連結させ、その後連結させたリスト中のすべての値の平均を計算することによって算出する。
【００９３】
Ｘ‐速度：Ｘ‐速度スコアは、まずＸ‐位置の次のフレーム間の絶対的な差異を得ることによって、速度ベクトルのＸ成分の長さを計算することにより算出する。次に、得られたすべての軌跡に対するｘ‐速度のリストを連結し、および連結したリストに対する平均ｘ‐ｓｐｅｅｄを計算する。
【００９４】
速度：速度スコアはＸ‐速度スコアと同様にして算出するが、速度ベクトルのｘ成分の長さを用いるのみである代わりに、全ベクトルの長さを用いる。つまり、「長さ」＝（（ｘ‐長）２＋（ｙ‐長）２）の平方根である。
【００９５】
旋回：旋回スコアは、速度スコアと同様にして算出するが、速度ベクトルの長さを用いる代わりに、現在の速度ベクトルと以前のものとの間の絶対角度を用い、０度から９０度の値を与える。
【００９６】
躓き：躓きスコアは、速度スコアと同様にして算出するが、速度ベクトルの長さを用いる代わりに、現在の速度ベクトルと身体方向の向きとの間の絶対角度を用い、０度から９０度の値を与える。
【００９７】
サイズ：サイズスコアは、速度スコアと同様にして算出するが、速度ベクトルの長さを用いる代わりに、検出されたハエのサイズを用いる。
【００９８】
Ｔ‐カウント：Ｔ‐カウントスコアは、映像中で検出される軌跡の数である。
【００９９】
Ｐ‐カウント：Ｐ‐カウントスコアは、映像中の地点の総数である（つまり、各々の軌跡における地点の数で、映像中のすべての軌跡の積算である）。
【０１００】
Ｔ‐長：Ｔ‐長スコアは、映像中のすべての速度ベクトルの長さの合計であり、映像中のすべてのハエの歩いた全長を与える。
【０１０１】
クロスハイ：クロスハイスコアは、映像中でバイアルの上半分において、値をセットしたラインを負のＸ方向（バイアルの底から上端）に横断した軌跡の数、または映像の開始時点ですでにラインの上にあったかのいずれかの軌跡の数である。後者の基準は、ハエが管の底に落下しない時もあるという事実を補うために含めた。要するに、このスコアは映像の時間内に、管に留まりきったハエまたはｘ軸を越えて登り詰めたハエを検出した数を測定する。
【０１０２】
クロスロー：クロスロースコアは、クロスハイスコアと同等であるが、代わりにバイアルの下半分におけるラインを用いる。
【０１０３】
Ｆ‐カウント：Ｆ‐カウントスコアは、個々のフレーム内に検出されたハエの数を数え、その後すべてのフレームのこれらの値の最大値を得る。従って、映像中のあらゆる単一フレームにおいて同時に観察可能であったハエの最大数を測定する。
【０１０４】
ＬＩＰ：ビデオ中で「留まる」（つまり、実験者が定めた一定時間中、ほとんど動かない）ハエの数を測定。
【０１０５】
最大高さ：すべてのフレームのｘ‐ｐｏｓｉｔｉｏｎの最大の合計を、ハエを数える測定基準によって推定されるバイアル内のハエの数で割る。
【０１０６】
ハエカウント：最大置の代わりに９７百分位数を用いることを除き、Ｆ‐カウント測定基準と同様である。
【０１０７】
ｆｃｒｏｓｓ ａｔ ｔ：特定の時間枠内（ｔ）に、設定した高さを同時に越えたハエの数。
【０１０８】
Ｘ‐Ｙ座標系における方向の指定は任意である。この開示のために、「Ｘ」は垂直方向（一般的にハエが維持される容器の長軸に沿う）を指し、そして「Ｙ」は水平方向の（例えば、バイアルの表面に沿った）動作を指す。
【０１０９】
眼の表現型
本発明の二重遺伝子組換えハエは、眼内に測定可能な形態的変化を引き起こす眼内の進行性の神経変性によって生じる、変化した眼の表現型を示し得る（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ‐Ｆｕｎｅｚら， Ｎａｔｕｒｅ ４０８：１０１‐１０６（２０００）；Ｓｔｅｆｆａｎら， Ｎａｔｕｒｅ ４１３：７３９−７４３（２００１））。ショウジョウバエの眼は、各々のショウジョウバエの個眼の光受容体神経によって形成される８つの感桿分体（１つの区域に７つの可視的な感桿分体）の規則正しい台形配置から構成される。本発明の表現型の眼突然変異体は、進行的な感桿分体の損失およびそれに続く凹凸のある外見の眼を導く。凹凸のある外見の眼の表現型は顕微鏡またはビデオカメラによって容易に観察される。この表現型を変化させる化合物に対するスクリーニングアッセイにおいて、光受容体分解の遅延およびｒｏｕｇｈ‐ｅｙｅ表現型の改善が観察され得る（Ｓｔｅｆｆａｎら， Ｎａｔｕｒｅ ４１３：７３９−７４３（２００１））。
【０１１０】
行動表現型
中枢神経系における神経変性は、運動障害を含むがこれに限定されない行動障害を生じ、これらは幼虫および成虫ショウジョウバエにおいてアッセイおよび定量され得る。例えば、標準的な登坂アッセイ（例えば、Ｇａｎｅｔｚｋｙ及びＦｌａｎｎａｇａｎ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ １３：１８９‐１９６（１９７８）；ＬｅＢｏｕｒｇ及びＬｉｎｔｓ， Ｊ． Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ ２８：５９‐６４（１９９２）を参照せよ）におけるショウジョウバエ成虫の登坂不能は定量可能であり、および動物が運動障害および神経変性を有する程度の指標となる。神経変性表現型は、例えば羽の進行性の神経筋調節損失、進行性の総合連携減退、進行性の運動減退、および進行性の食欲喪失を含むが、これらに限定されない。アッセイされ得るハエの行動の他の態様は、概日行動リズム、摂食行動、外部刺激に対する順化、および匂い条件付けを含むが、これらに限定されない。これらの表現型すべては、当業者によりハエの標準的な目視観察によって測定される。
【０１１１】
別の神経変性表現型は寿命低下であり、例えばショウジョウバエの寿命は１０％〜８０％、例えば約３０％、４０％、５０％、６０％又は７０％低下し得る。
【０１１２】
記憶表現型および学習表現型
ショウジョウバエにおいて、連想的学習および記憶について最も特徴付けられたアッセイは、臭気忌避行動課題（ｔａｓｋ）である（Ｔ． Ｔｕｌｌｙら， Ｊ． Ｃｏｍｐ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ａ１５７， ２６３‐２７７（１９８５）、参照により本明細書に組み込む）。この古典的な（パブロフ的な）条件付けは、一匹ずつ連続的にハエを２種類の匂い（条件刺激またはＣＳ）に曝露する。これらの匂いの１つ（ＣＳ＋）に曝露される間に、ハエは同時に電気ショック（無条件刺激またはＵＳ）を受け、一方、負の補強のない他の匂い（ＣＳ‐）へ曝露する。訓練に続いて、次にハエを匂いが反対方向から来る「選択地点」に置き、忌避する匂いを決定するのを待つ。慣例により、学習は、試験を訓練後直ちに行った場合のハエの能力と定義する。１回の訓練トライアルは強い学習を生む：一般的な反応は、＞９０％のハエがＣＳ＋を忌避する。この１サイクルの訓練を行った野生型ハエの能力は、ハエが再度２種類の匂いの間に満遍なく分布するようになるまで、約２４時間に渡り低下する。ハエはまた、長時間持続する連想的嗅覚記憶を形成するが、通常はこれは反復的な訓練管理を必要とする。
【０１１３】
Ｖ．遺伝子組換えハエの有用性
疾患モデル
本発明の遺伝子組換えハエは、グアム嗜銀性グレイン型認知症の筋萎縮性側索硬化症／パーキンソン認知症複合、大脳皮質基底核変性症、ボクサー認知症、石灰沈着を伴うびまん性神経原線維変化病、第１７番染色体に連鎖するパーキンソニズムを伴う前頭側頭葉型認知症（ＦＴＤＰ‐１７）、ピック病、進行性皮質下神経膠症、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）、認知症のみによるもつれ、クロイツフェルト・ヤコブ病、ダウン症、ゲルスマン・ストロイスラー・シャインカー病、ハラーホルデン・スパッツ病、筋強直性ジストロフィー、加齢性記憶障害、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、グアムの筋萎縮性側索／パーキンソン認知症複合、自己免疫疾患（例えば、ギラン・バレー症候群、狼瘡）、ビンスワンガー病、脳腫瘍および脊椎腫瘍（神経線維腫症を含む）、脳アミロイド血管症（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ｖｏｌ． ３， ６５‐７３（２００１)）、脳性麻痺、慢性疲労症候群、クロイツフェルト・ヤコブ病（変異型を含む）、大脳皮質基底核変性症、ＣＮＳ実質の発達機能障害による疾患、脳血管系の発達機能障害による疾患、認知症―多発梗塞性、認知症―皮質下、レビー小体型認知症、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）認知症、個別の組織構造を欠損する認知症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮、神経変性を含む眼、耳および前庭器官の疾患（黄斑変性症および緑内障を含む）、ダウン症、ジスキネジア（発作性）、筋緊張症、本態性振戦、ファー（Ｆａｈｒ’ｓ）症候群、フリードリヒ運動失調症、第１７番染色体に連鎖する前頭側頭葉型認知症およびパーキンソニズム（ＦＴＤＰ‐１７）、前頭側頭葉変性症、前頭葉型認知症、肝性脳症、遺伝性痙性対麻痺、ハンチントン病、水頭症、偽脳腫瘍およびＣＳＦ機能障害を含む他の疾患、ゴーシェ病、脊椎性筋萎縮症（平山病、ウエルドニッヒ・ホフマン病、クーゲルベルク・ヴェランダー病）、コルサコフ症候群、マシャド・ジョセフ病、軽度認知機能障害、単肢筋萎縮症、運動神経疾患、多系統萎縮症、多発性硬化症および他の脱髄性疾患（例えば、白質ジストロフィー）、筋痛性脳脊髄炎、筋強直性ジストロフィー、化学物質、薬剤および毒物によって誘発されるミオクローヌス神経変性、エイズ認知症を含むエイズの神経症状、ポリグルタミン伸長から生じる（あらゆる）神経疾患、神経症状／認知症状および、エンテロウイルスを含むがこれに限定されない細菌および／またはウイルス感染の結果、ニーマン・ピック病、神経原線維変化を伴う非グアム島人運動神経疾患、非ケトーシス型高グリシン血症、オリーブ橋小脳萎縮症、神経変性を含む眼および耳の疾患（黄斑変性症および緑内障を含む）、パーキンソン病、ピック病、非麻痺性ポリオを含む灰白髄炎、原発性側索硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、クールー病、致死性家族性不眠症およびゲルストマン・ストロイラー・シャインカー病を含むプリオン病、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、脳炎後パーキンソン病、ポリオ後症候群、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、進行性筋萎縮症、進行性球麻痺、進行性核上麻痺、下肢静止不能症候群、レット症候群、サンドホフ病、痙直、球脊髄性筋萎縮症（ケネディー病）、脊髄小脳失調症、孤��性前頭側頭葉型認知症、線条体黒質変性症、亜急性硬化性全脳炎、亜硫酸酸化酵素欠損症、シデナム舞踏病、認知症のみによるもつれ、テイ・サックス病、トゥレット症候群、伝染性海綿状脳症、血管性認知症およびウィルソン病等の、アルツハイマー病ならびにタウオパチー等のヒト神経疾患において見られるような神経変性のためのモデルを提供する。
【０１１４】
治療剤を同定する方法
本発明はさらに、本明細書に開示する遺伝子組換えハエを使用して神経変性疾患のための治療剤を同定する方法を提供する。本明細書で用いる「治療剤」は、医師によって診断されるような神経変性疾患の症状を改善する薬剤を指す。例えば、治療剤は神経変性疾患の１以上の症状を軽減する、１以上の症状の発症を遅延予防または治療することができる。
【０１１５】
神経変性疾患等の神経変性障害に対して有効な治療剤をスクリーニングするために、候補薬剤を遺伝子組換えハエに投与する。次に、遺伝子組換えハエの表現型の変化について、候補薬剤を投与していない対照の遺伝子組換えハエが示す表現型と比較してアッセイする。表現型において観察された変化は、疾患の治療に有用な薬剤の指標となる。
【０１１６】
候補薬剤は、種々の方法により投与され得る。例えば、候補薬剤をハエ培地に加えることによって、例えば、ハエ培養物に添加され得る酵母ペースト等のハエの餌に薬剤を混合することによって薬剤を投与することができる。または、候補薬剤を１％ショ糖水溶液中に調製することができ、およびこの水溶液を１０時間、１２時間、２４時間、４８時間または７２時間等の特定の時間にハエに与える。１つの実施形態において、２０００年６月２９日公開のＷＯ ００／３７９３８の記載のように、候補薬剤はハエの血リンパ中に顕微注入される。他の投与様式は、例えば候補薬剤の気化によるエアロゾル到達を含む。
【０１１７】
候補薬剤はハエの発達のあらゆる段階で投与することができ、受精卵期、胚形成期、幼虫期および成虫期を含む。好ましい実施形態において、候補薬剤を成虫ハエに投与する。さらに好ましくは、候補薬剤は幼虫期の間、例えば、眼の発達が起こる主な幼虫期である三齢幼虫期でハエ培養物に薬剤を添加することにより投与される。
【０１１８】
薬剤は、単回投与または複数回投与で投与され得る。適切な濃度は当業者が決定することができ、そして薬剤の生物学的および化学的特性に加えて、投与方法に依存するだろう。例えば、候補薬剤の濃度は経口または注射によって到達する場合０．０００１μＭ〜２０ｍＭの範囲であり、０．１μＭ〜２０ｍＭ、１μＭ〜１０ｍＭ又は１０μＭ〜５ｍＭである。
【０１１９】
候補薬剤をスクリーニングする効率のために、個々の候補薬剤をスクリーニングすることに加え、候補薬剤を薬剤の混合物または集団（例えば薬剤のライブラリ）として投与することができる。本明細書で用いる薬剤の「ライブラリ」は、２０、１００、１０３、１０４、１０５、１０６、１０８、１０１２又は１０１５種を超える個々の薬剤の混合物であることを特徴とする。「薬剤の集団」は、３、５、１０もしくは２０種未満の薬剤混合物等のライブラリまたは小集団であり得る。薬剤の集団を遺伝子組換えハエに投与すること、および遺伝子組換えハエによって示される表現型の完全な復帰または部分的な復帰について、ハエをスクリーニングすることができる。薬剤の集団が遺伝子組換えハエの表現型に変化をもたらす場合、次に集団の個々の薬剤を独立してアッセイし、目的とする特定の薬剤を同定することができる。
【０１２０】
好ましい実施形態において、候補薬剤のハイスループットなスクリーニングが実施され、多数の薬剤、少なくとも５０種の薬剤、１００種以上の薬剤が、複数のハエ集団において平行して個々に試験される。ハエ集団は、少なくとも２、１０、２０、５０、１００以上のハエの成虫または幼虫を含む。１つの実施形態において、運動表現型、行動表現型（例えば、食欲、配偶行動および／または寿命）または形態表現型（例えば、細胞、器官または付属器の形状、サイズまたは位置、もしくはハエのサイズ、形状もしくは成長速度）を、集団内のハエのデジタル化映像を作成することによって観察し、および映像をハエ表現型について解析する。
【０１２１】
候補薬剤
本発明のスクリーニングアッセイにおいて有用な薬剤は、遺伝子組換えハエに投与した場合に、変化した表現型を改変する、例えば表現型を部分的にまたは完全に復帰させる可能性を有する生物学的化合物または化学的化合物を含む。薬剤は、あらゆる組換え、修飾または天然の核酸分子、組換え、修飾まやは天然の核酸分子のライブラリ、合成、修飾または天然のペプチド、合成、修飾または天然のペプチドのライブラリ、有機化合物または無機化合物、もしくは小分子を含む有機化合物もしくは無機化合物のライブラリを含む。薬剤を治療剤の回収を容易にし得る共通のタグまたは固有のタグに連結することもできる。
【０１２２】
例示的な薬剤の供給源は、ランダムなペプチドライブラリならびにＤ‐および／またはＬ‐立体配置アミノ酸で作製されるコンビナトリアルケミストリー由来分子ライブラリ、リン酸化ペプチド（ランダムにまたは部分的に変性した、定方向リン酸化ペプチドライブラリのメンバーを含むがこれに限定されない；例えば、Ｓｏｎｇｙａｎｇら， Ｃｅｌｌ ７２：７６７‐７７８（１９９３）を参照されたい）；抗体（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体もしくは単鎖抗体ならびにＦＡｂ、Ｆ（ａｂ’）およびＦＡｂ発現ライブラリ断片、ならびにこれらのエピトープ結合断片を含むがこれらに限定されない）、および有機小分子または無機小分子を含むが、これらに限定されない。
【０１２３】
当技術分野に知られる多くのライブラリ、例えば、化学合成ライブラリ、組換えライブラリ（例えばファージによって産生する）およびインビトロ翻訳に基づくライブラリが使用され得る。化学合成ライブラリの例示は、Ｆｏｄｏｒら（ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：７６７−７７３（１９９１））、Ｈｏｕｇｈｔｅｎら（ Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８４‐８６（１９９１））、Ｌａｍら（Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２‐８４（１９９１）；Ｍｅｄｙｕｓｋｉ， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：７０９‐７１０（１９９４））、Ｇａｌｌｏｐら（Ｊ． Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７：１２３３‐１２５１（１９９４））、Ｏｈｌｍｅｙｅｒら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：１０９２２‐１０９２６（１９３３））、Ｅｒｂら（ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１１４２２‐１１４２６（１９９４））、Ｈｏｕｇｈｔｅｎら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２（１９９２））、Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１６１４‐１６１８（１９９４））、Ｓａｌｍｏｎら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：１１７０８‐１１７１２（１９９３））、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／２０２４２、およびＢｒｅｎｎｅｒ及びＬｅｒｎｅｒ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：５３８１‐５３８３（１９９２））に記載される。非ペプチドライブラリの例として、ベンゾジアゾピンライブラリ（例えば、Ｂｕｎｉｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：４７０８‐４７１２（１９９４）を参照されたい）が使用に適し得る。
【０１２４】
ペプトイドライブラリ（Ｓｉｍｏｎら,Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：９３６７‐９３７１（１９９２））もまた使用され得る。使用され得るライブラリの別の例は、化学的に変換したコンビナトリアルライブラリを作出するために、ペプチド内のアミド官能性を高度にメチル化したもので、Ｏｓｔｒｅｓｈｅｔら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１１１３８‐１１１４２（１９９４））に記載される。ペプチドライブラリを作製し得るファージディスプレイライブラリの例は、Ｓｃｏｔｔ及びＳｍｉｔｈ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６‐３９０（１９９０））、Ｄｅｖｌｉｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４９：４０４‐４０６（１９９０））、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２７：７１１‐７１８（１９９２））Ｌｅｎｓｋａ（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． １５２：１４９‐１５７（１９９２））、Ｋａｙら（Ｇｅｎｅ １２８：５９‐６５（１９９３））、および１９９４年８月１８日付けのＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／１８３１８に記載される。
【０１２５】
本明細書に記載される方法により試験および同定され得る薬剤は、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ， Ｗ１ ５３２３３）、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）、Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ（Ｂｕｃｈｓ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．（Ｒｏｎｋｏｎｋｏｍａ， ＮＹ；）、Ｅａｓｔｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｋｉｎｇｓｐｏｒｔ， ＴＮ）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ， ２５ Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｔａｋａｓａｇｏ（Ｒｏｃｋｌｅｉｇｈ， ＮＪ）、ＳＳＴ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃｌｉｆｔｏｎ， ＮＪ）、Ｆｅｒｒｏ（Ｚａｃｈａｒｙ， ＬＡ ７０７９１）、Ｒｉｅｄｅｌ‐ｄｅＨｅａｎ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ（Ｓｅｅｌｚｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＰＰＧ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ， ＰＡ １５２７２）を含むあらゆる市販の化合物を含み得るが、これらに限定されない。微生物、菌類、植物または動物抽出物を含むさらにあらゆる種類の天然産物が、本明細書に記載される方法を用いてスクリーニングされ得る。
【０１２６】
さらにまた、小分子試験化合物を含む試験薬剤の多様なライブラリが使用され得る。例えば、ライブラリは、Ｓｐｅｃｓ ａｎｄ ＢｉｏＳｐｅｃｓ Ｂ．Ｖ．（Ｒｉｊｓｗｉｊｋ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）、Ｃｏｎｔｒａｃｔ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｄｏｌｇｏｐｒｕｄｏｙ， Ｍｏｓｃｏｗ Ｒｅｇｉｏｎ， Ｒｕｓｓｉａ）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ ＵＳＡ Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ， ＮＪ）、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｌｔｄ．（Ｃｏｒｎｗａｌｌ ＰＬ３４ ＯＨＷ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）およびＡｓｉｎｅｘ（Ｍｏｓｃｏｗ， Ｒｕｓｓｉａ）より市販のものを入手してもよい。
【０１２７】
なおさらに、当技術分野において知られるコンビナトリアルライブラリ法を使用することができ、これは、生体ライブラリ、空間的にアドレス可能な平行固相または液相ライブラリ、デコンボリューションを必要とする合成ライブラリ法、「ｏｎｅ‐ｂｅａｄ ｏｎｅ‐ｃｏｍｐｏｕｎｄ」ライブラリ法、および親和性クロマトグラフィー抽出を用いる合成ライブラリ法を含むが、これらに限定されない。生物学的ライブラリ研究方法は、ペプチドライブラリに限定される一方、他の研究方法は、化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは小分子ライブラリに適用可能である（Ｌａｍ， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． １２：１４５（１９９７））。小分子試験化合物を含む試験化合物のコンビナトリアルライブラリを利用することができ、例えば、Ｅｉｃｈｌｅｒ及びＨｏｕｇｈｔｅｎ（Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． Ｔｏｄａｙ １：１７４‐１８０（１９９５））、Ｄｏｌｌｅ（Ｍｏｌ． Ｄｉｖｅｒｓ． ２：２２３‐２３６（１９９７））、およびＬａｍ（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． １２：１４５‐１６７（１９９７））に開示されるように作出することができる。
【０１２８】
分子ライブラリの合成する方法の例示は、当技術分野において、例えば：ＤｅＷｉｔｔら（ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：６９０９（１９９３））、Ｅｒｂら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１１４２２（１９９４））、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３７：２６７８（１９９４））、Ｃｈｏら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３（１９９３））、Ｃａｒｒｅｌｌら（Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ３３：２０５９（１９９４））、Ｃａｒｒｅｌｌら（Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ３３：２０６１（１９９４））、およびＧａｌｌｏｐら（１５ Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３７：１２３３（１９９４））において見出すことができる。
【０１２９】
薬剤のライブラリはまた、核酸分子、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはこれらの類似体のライブラリでもあり得る。例えばｃＤＮＡライブラリは、目的の細胞、組織、器官もしくは生物より収集したｍＲＮＡより構築することができ、または適当なサイズにした断片を生成するために、制限エンドヌクレアーゼもしくはゲノムＤＮＡをランダムに断片化する方法を用いてゲノムＤＮＡを処理することができる。ＲＮＡ分子を含むライブラリは、例えば細胞からＲＮＡを回集することまたは化学的にＲＮＡ分子を合成することによって構築することができる。核酸分子の多様なライブラリは、分子にランダム化した領域の生成を促進する固相合成を用いて作製することができる。所望であれば、ランダム化にバイアスをかけることにより、分子内のある部位に１以上のヌクレオチドを特定の割合で含む核酸分子のライブラリを生成することができる（米国特許第５，２７０，１６３号）。
【０１３０】
遺伝的改変因子を同定する方法
本明細書に記載する遺伝子組換えハエは、ＡＤ等の神経変性疾患に作用する遺伝子を同定するのに使用され得る。このような遺伝子は「遺伝的改変因子」と呼ばれ、ＣＴＦＡＰＰ又はＣＴＦＡＰＰ＋タウ等の１以上の導入遺伝子によって生成する表現型を変化させる能力を通して同定され得る。例えば、遺伝的改変因子候補である遺伝子内に突然変異を有する収集したハエは、ＣＴＦＡＰＰを発現する単一遺伝子組換えハエ系統、またはＣＴＦＡＰＰ＋タウを発現する二重遺伝子組換えハエ系統のいずれかと交雑することができる。特定の突然変異が、導入遺伝子または導入遺伝子の組み合わせに関連する表現型を変化させれば、突然変異を有する遺伝子は遺伝的改変因子として同定される。例えばＣＴＦＡＰＰを発現し、および眼の表現型（例えば変化した個眼充填）を示す遺伝子組換えハエは突然変異ハエと交雑させることができ、および正常な眼表現型の復帰によって遺伝的改変因子が同定される。あらゆる表現型、好ましくは目に見える表現型が、遺伝的改変因子を同定するためのスクリーニングに利用され得る。導入遺伝子または導入遺伝子の組み合わせは、プロモーターにより直接的に駆動され得るかまたはＵＡＳ／ＧＡＬ４系によって駆動され得る。遺伝的改変因子を含む突然変異株が一旦同定されると、欠失マッピング（Ｐａｒｋｓら， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ． ３６：２８８−９２（２００４））または一塩基多型と一致する減数分裂組換えマッピング（Ｈｏｓｋｉｎｓら， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １１：１１００‐１３（２００１））等の確立された技術を用いて改変因子の座位を決定することができる。遺伝的改変因子内に突然変異を有する遺伝子組換え株もまた、遺伝的改変因子と導入遺伝子または導入遺伝子の組み合わせとの間の相互作用を改変する薬を同定するための、上記の技術を用いたハイスループットスクリーニングの基盤を形成し得る。
【実施例】
【０１３１】
実施例１  ＣＴＦＡＰＰを発現する遺伝子組換えショウジョウバエの作出
キイロショウジョウバエの遺伝子組換え株は、ヒトＡＰＰ６９５のＣＴＦＡＰＰ断片を含むように調製した。ハエに、ＡＰＰ６９５のシグナルペプチドとインフレームに結合したヒトＡＰＰ６９５のアミノ酸５９６〜６９５をコードするｃＤＮＡを、ＳＰ６５／Ａ４ＣＴベクターの上流に位置する上流活性化配列（ＵＡＳ）と共に含む、Ｄｙｒｋｓら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３０９， ２０‐２４（１９９２））のＳＰ６５／Ａ４ＣＴベクターを含む構築物を注入した。次に遺伝子組換え株を、眼においてＣＴＦＡＰＰの発現をもたらすキイロショウジョウバエのＧＭＲ‐ＧＡＬ４ドライバー株と交雑させた。
【０１３２】
図１は、ＣＴＦＡＰＰ遺伝子組換えハエにおけるＡβ４２の産生を表すＣＴＦＡＰＰ遺伝子組換えハエからの抽出物のウエスタンブロットを示す。免疫沈降抗体は、ヒトＡＰＰ／アミロイドβに特異的な抗体４Ｇ８（Ｓｉｇｎｅｔ）とした。ウエスタンブロットのための１次抗体は６Ｅ１０（Ｓｉｇｎｅｔ）であり、これもまたヒトＡＰＰ／アミロイドβに特異的であるが、４Ｇ８よりわずかに異なるエピトープを有する。２次抗体はＨＲＰ結合ヤギ抗マウスとした。上記の手順によって作出した３つの個々の遺伝子組換え系統を、左から３番目までのレーンに示す。左から４番目のレーンに示されるＡβ４２対照ハエは、ａｒｇｏｓシグナル配列にインフレームで結合したＡβ４２をコードするｃＤＮＡを含む遺伝子組換えキイロショウジョウバエと、キイロショウジョウバエＧＭＲ‐ＧＡＬ４ドライバー株との交雑によって得られるＡβ４２遺伝子組換え株から得た。対照として提示された野生型ハエ抽出物（レーン５）は、Ａβ４２を発現しなかった。
【０１３３】
実施例２  ＣＴＦＡＰＰおよびタウを発現する遺伝子組換えショウジョウバエの作出
ヒトタウをコードする導入遺伝子を含む遺伝子組換えキイロショウジョウバエ株およびヒトＣＴＦＡＰＰをコードする導入遺伝子を含む遺伝子組換えキイロショウジョウバエ株を、本明細書に記載するように作出する。次に２種の遺伝子組換えハエを組換えて、ヒトタウおよびヒトＣＴＦＡＰＰの両方をコードする遺伝子を含む二重遺伝子組換えキイロショウジョウバエ株を得る。
【０１３４】
導入遺伝子構築物
ＵＡＳ／ＧＡＬ４系を用いて、ＣＴＦＡＰＰおよびタウの両方の遺伝子組換えハエを作出する。形質転換ベクターｐＵＡＳ‐２Ｎ４Ｒｔａｕｗｔを作出するために、最長のヒト脳のタウアイソフォームをコードするｃＤＮＡを、標準的なライゲーション技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ: Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ． Ｙ． １９８９）を用いて、ベクターｐＵＡＳＴ（Ｂｒｅｎｄ及びＰｅｒｒｉｍｏｎ， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１８：４０１‐４１５（１９９３））内へＥｃｏＲＩ断片としてクローニングする。タウアイソフォームは、配列番号１５（アミノ酸配列）および配列番号１６（核酸配列）によって表され、タウエキソン２および３に加えて４つの微小管結合リピートを含む。
【０１３５】
ＣＴＦＡＰＰをコードするＤＮＡ配列を有するｐＥｘＰ‐ＵＡＳ形質転換ベクターを作出する。ベクターはヒトＡＰＰシグナルペプチドおよびｍｙｃタグに結合したＣＴＦＡＰＰをコードする（ｐＥｘＰ‐ＵＡＳ‐ＣＴＦＡＰＰ‐Ｉ、配列は配列番号１７に示す）。ｐＥｘＰ‐ＵＡＳ‐ＣＴＦＡＰＰ‐Ｉを作出するために、まずＣＴＦＡＰＰをコードするＤＮＡ配列をｍｙｃタグをコードする合成オリゴヌクレオチドとインフレームに結合する。次にこのＤＮＡ断片を、ヒトＡＰＰシグナル配列をコードするＰＣＲ増幅した配列とインフレームに結合する。次に得られたＤＮＡ配列をｐＥｘＰ‐ＵＡＳベクター内にクローニングする。
【０１３６】
遺伝子組換え株
タウまたはＣＴＦＡＰＰのいずれかを発現する遺伝子組換えショウジョウバエ系統を作出するために、上記のｐＵＡＳＴまたはｐＥｘＰ構築物であるｐＥｘＰ‐ＵＡＳ‐ＣＴＦＡＰＰ‐ＩまたはｐＵＡＳ‐２Ｎ４Ｒｔａｕｗｔのどちらかを、ａｙ１ｗ１１１８又はｗ１１１８キイロショウジョウバエの胚内に、Ｒｕｂｉｎ及びＳｐｒａｄｌｉｎｇ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１８：３４８−３５３，（１９８２））に記載されるように注入する。
【０１３７】
ｐＵＡＳ‐２Ｎ４Ｒｔａｕ‐ｗｔの場合、６つの遺伝子組換え系統を作出し、および本明細書に記載されるように、ＧＭＲ‐ＧＡＬ４ドライバー株との交雑後に観察される眼の表現型の程度に基づき、目視検査によって強度、中度または低度として分類する。
【０１３８】
ｐＥｘＰ‐ＵＡｓ‐ＣＴＦＡＰＰ‐Ｉの場合、遺伝子組換え系統を作出し、ＧＭＲ‐ＧＡＬ４ドライバー株との交雑後に観察される眼の表現型の程度に基づき、強度、中度または低度として分類する。次に、ＧＭＲ‐ＧＡＬ４ドライバーおよびｐＥｘＰ‐ＵＡｓ‐ＣＴＦＡＰＰ‐ＩまたはｐＵＡＳ‐２Ｎ４Ｒｔａｕｗｔを有する中程度の眼の表現型の遺伝子組換えショウジョウバエ株を交雑して、タウペプチドおよびＣＴＦＡＰＰペプチドの両方を発現する二重遺伝子組換えショウジョウバエ系を作出する。中程度の眼の表現型の単一遺伝子組換えハエの交雑は、強度に分類される相乗的な眼の表現型を生じる。
【０１３９】
形質転換構築物ｐＥｘＰ‐ＵＡｓ‐ＣＴＦＡＰＰ‐ＩおよびｐＵＡＳ‐２Ｎ４Ｒｔａｕｗｔの場合、遺伝子組換え系統を、構築物をａｙ１ｗ１１１８またはｗ１１１８キイロショウジョウバエの胚内に、Ｒｕｂｉｎ及びＳｐｒａｄｌｉｎｇ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１８：３４８−３５３，（１９８２））の記載のように注入することにより作出し、および導入遺伝子のゲノムＤＮＡへの挿入について、眼の色を観察することによってスクリーニングする。ｐＥｘＰ及びｐＵＡＳＴベクターは、ｗｈｉｔｅ遺伝子マーカーの一部を有する。次に、ＣＴＦＡＰＰ導入遺伝子を有する遺伝子組換えショウジョウバエを、中枢神経系における導入遺伝子の発現のためのｅｌａｖ‐ＧＡＬ４ドライバー株と交雑する。交雑が測定可能な表現型を生じなければ、コピー数を拡大するためにＣＴＦＡＰＰ導入遺伝子を有するショウジョウバエと転移酵素源を有するショウジョウバエと交雑することにより、導入遺伝子を可動化する。転移エレメントの再可動化は、より強い表現型を伴うより強い挿入物を与え得る。代わりの挿入部位を含む他の遺伝子組換え系統との組換えにより増加した導入遺伝子のコピー数も、より強い表現型を与え得る。新規の／複数の挿入を伴うこの交雑からの子孫を、眼の色における変化を基にして選抜する。次に、より多くのコピー数のおよびより強いＣＴＦＡＰＰ導入遺伝子の挿入物を有するハエを、ｅｌａｖ‐ＧＡＬ４ドライバー株と交雑させ、および子孫の運動能力を登坂アッセイにおいて試験する。遺伝子組換え系統は運動表現型を示す可能性があり、およびハエをそれら同士でおよびｅｌａｖ‐ＧＡＬ４ドライバーの対照のハエと比較して、強度、中度、低度または非常に低度として分類する。
【０１４０】
次に、ＣＴＦＡＰＰ及びｔａｕｗｔ導入遺伝子を有する二重遺伝子組換えショウジョウバエを、ｔａｕｗｔ遺伝子組換えショウジョウバエとＣＴＦＡＰＰ遺伝子組換えショウジョウバエとの交雑または組換えによって作出する。運動能力が評価され、そしてｅｌａｖ‐ＧＡＬ４ドライバー対照ハエと比較して、強度、中度、低度または極低度として分類される。
【０１４１】
年齢の機能としての登坂能力を、種々の遺伝子型のハエの集団に対して、２５℃で測定する。登坂アッセイは、同年齢の約１０個体の群において実施する。
【０１４２】
次に、ショウジョウバエの脳を凍結切片化し、およびｅｌａｖ‐ＧＡＬ４；ｐＵＡＳ‐２Ｎ４Ｒｔａｕｗｔ／ｐＥｘＰ‐ＵＡＳ‐ＣＴＦＡＰＰハエの水平断片を、抗タウ構造依存性抗体ＡＬＺ５０及びＭＣＩで免疫染色する。神経細胞の陽性染色は、ＭＣＩ抗体及びＡＬＺ５０抗体の両方で観察され得る。結果は、ｅｌａｖ‐ＧＡＬ４；ｐＵＡＳ‐２Ｎ４Ｒｔａｕｗｔ／ｐＥｘＰ‐ＵＡＳ‐ＣＴＦＡＰＰ二重遺伝子組換えショウジョウバエの脳において発現するタウタンパク質が、アルツハイマー病に関与するタンパク質構造を示すことを明らかにする。
【０１４３】
チオフラビン‐Ｓ染色もまた、本明細書に記載する遺伝子組換えハエの細胞および神経突起において、アミロイドの存在を評価するために実施する。チオフラビン‐Ｓで染色した場合、蛍光顕微鏡下においてアミロイドは蛍光を発する。チオフラビン‐Ｓ染色の方法は当技術分野においてよく知られる。ハエを約２５℃で発達させる。チオフラビン‐Ｓ陽性細胞はタウのみを発現するハエにおいては観察されない。チオフラビン‐Ｓ陽性細胞はＣＴＦＡＰＰを発現するハエにおいてのみ観察される。しかしながら、チオフラビン‐Ｓ陽性細胞の数はタウおよびＣＴＦＡＰＰを発現するハエの方が多いと予測される。
【０１４４】
実施例３  ＣＴＦＡＰＰおよびタウの神経変性への作用
登坂表現型を、野生型ショウジョウバエに加えてＣＴＦＡＰＰまたはタウのいずれかの導入遺伝子もしくはは両方の導入遺伝子を含むショウジョウバエについて評価した。導入遺伝子は中枢神経系における導入遺伝子の選択的発現をもたらすｅｌａｖ‐ＧＡＬ４ドライバーの調節下にあった。ハエを２５℃で飼育した。登坂表現型は、上記の「クロスハイ」測定基準を用いて評価した。データを図２に示す。データは、年齢依存的神経変性は、ＣＴＦＡＰＰの発現により促進され、およびＣＴＦＡＰＰおよびタウ両方の発現によりさらに促進されることを示唆する。
【０１４５】
実施例４  治療剤のスクリーニング
アルツハイマー病に対して有効な治療剤をスクリーニングするために、ＧＭＲ‐ＧＡＬ４ドライバーおよび導入遺伝子ｐＥｘＰ‐ＵＡＳ‐ＣＴＦＡＰＰ‐ＩをｐＵＡＳ‐２Ｎ４Ｒｔａｕｗｔと共に有する、多数のｅｌａｖ‐ＧＡＬ４；ｐＵＡＳ‐２Ｎ４Ｒｔａｕｗｔ／ｐＥｘＰ‐ＵＡＳ‐ＣＴＦＡＰＰ‐Ｉ遺伝子組換えハエの幼虫に候補薬剤を投与する。候補薬剤を三齢の遺伝子組換えキイロショウジョウバエの幼虫（３〜５日齢の幼虫）内に微量注入する。幼虫は、クチクラを通して血リンパ内に、規定量の各々の化合物を皮下注射針を用いて注入される。注入後、幼虫をこれらの発達を完了させるためにバイアル内に置く。羽化後、成虫ハエをＣＯ２で麻酔し、および解剖顕微鏡を用いて視覚的に検査することにより、ショウジョウバエの眼の表現型の復帰について、候補薬剤を投与していない対照のハエと比較して評価する。ｅｌａｖ‐ＧＡＬ４；ｐＵＡＳ‐２Ｎ４Ｒｔａｕｗｔ／ｐＥｘＰ‐ＵＡＳ‐ＣＴＦＡＰＰ‐Ｉ遺伝子組換えハエの眼の表現型の、対照ＧのＭＲ‐ＧＡＬ４ドライバー株が示す表現型への観察可能な復帰は、ＡＤの治療に有用な薬剤の指標である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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