(57)【要約】  幼虫の酵素、特にキモトリプシンの使用が本明細書に記載されている。創傷郭清のための及び細胞再生のための創傷の治療において、この酵素を使用することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
昆虫の幼虫から得られる単離されたキモトリプシン又はその合成様式。
【請求項２】
キモトリプシンが図１若しくは図１３の配列を有し、又は図１、２若しくは１２のＤＮＡ配列によってコードされる、請求項１に記載のキモトリプシン。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載のキモトリプシンと同じ活性を有するキモトリプシンの断片。
【請求項４】
キモトリプシンがルシリア・セリカータの幼虫から得られる、請求項１から３の何れか一項に記載のキモトリプシン。
【請求項５】
キモトリプシンがルシリア・セリカータの幼虫の排泄物／分泌物から得られる、請求項１から４の何れか一項に記載のキモトリプシン。
【請求項６】
幼虫が新たに孵化されている、請求項１から５の何れか一項に記載のキモトリプシン。
【請求項７】
幼虫が初齢である、請求項１から５の何れか一項に記載のキモトリプシン。
【請求項８】
幼虫が無菌環境中で育てられる、請求項１から７の何れか一項に記載のキモトリプシン。
【請求項９】
創傷の治療において使用するための、請求項１から８の何れか一項に記載のキモトリプシンを含む組成物。
【請求項１０】
創傷の治療用医薬の調製における、請求項１から８の何れか一項に記載のキモトリプシンの使用。
【請求項１１】
キモトリプシンが図１、図２若しくは図１３の配列を有し、又は図１、２若しくは１２のＤＮＡ配列によってコードされる、請求項９又は請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
キモトリプシンの活性な断片が使用される、請求項９から１１の何れかに記載の使用。
【請求項１３】
キモトリプシンが合成である、請求項９から１２の何れか一項に記載の使用。
【請求項１４】
キモトリプシンがルシリア・セリカータから得られる、請求項９から１３の何れか一項に記載の使用。
【請求項１５】
創傷が、切り傷、刺し傷、術創、潰瘍、褥瘡、やけど（熱、凍結、化学物質、電気及び放射線によって引き起こされたやけどを含む。）、皮膚の擦過又は暴行、骨髄炎並びに整形外科的創傷を含む群から選択される、請求項９から１４の何れか一項に記載の使用。
【請求項１６】
創傷が感染状態である、請求項９から１５の何れか一項に記載の使用。
【請求項１７】
創傷が慢性的である、請求項９から１６の何れか一項に記載の使用。
【請求項１８】
創傷が繊維芽細胞遊走の促進によって治療される、請求項９から１７の何れか一項に記載の使用。
【請求項１９】
創傷がマトリックス再構築の促進によって治療される、請求項９から１７の何れか一項に記載の使用。
【請求項２０】
創傷が繊維芽細胞形態の修飾によって治療される、請求項９から１７の何れか一項に記載の使用。
【請求項２１】
創傷がキモトリプシンによって郭清される、請求項９から２０の何れか一項に記載の使用。
【請求項２２】
請求項１から８の何れか一項に記載のキモトリプシンを含む、創傷用の包帯。
【請求項２３】
請求項１から８の何れか一項に記載のキモトリプシンを含む医薬組成物。
【請求項２４】
治療を必要としている創傷に、請求項１から８の何れか一項に記載のキモトリプシンを適用することを含む、創傷を治療する方法。
【請求項２５】
請求項２２に記載の包帯、請求項９に記載の組成物又は請求項２３に記載の医薬組成物を、治療を必要としている創傷に適用する段階を含む、創傷を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幼虫の酵素に関する。より具体的には、本発明は、ルシリア・セリカータ（Ｌｕｃｉｌｉａ  ｓｅｒｉｃａｔａ）から取得することができる１つ又はそれ以上の幼虫の酵素に関し、該酵素は組織再生及び創傷治癒において有用である。
【背景技術】
【０００２】
幾つかの創傷の幼虫の繁殖の有益な効果が長年にわたって観察されてきた。しかしながら、感染の抗生物質耐性株の蔓延が、医学、特に創傷治癒の分野において問題となるまで、このプロセスに関与する機序についてのさらなる調査は実施されなかった。
【０００３】
以前の研究は、旧来の抗生物質への添加物又は補助剤としての、創傷郭清（創傷から壊死性物質、被感染物質又は外来物質を除去すること）、感染管理（感染の予防又は治療）における幼虫の酵素の役割、より最近では、創傷中の新しい組織を増殖させ、創傷を閉じさせる（治癒）ための組織の再生の促進における幼虫の役割を観察してきた。使用される幼虫の酵素は、予め幼虫を洗浄して又は洗浄せずに、完全な幼虫の血リンパから又はホモジネートから、幼虫の表面上に見出されるあらゆる排出産物又は分泌産物を除去するために、幼虫を洗浄することによって取得し得る。以前の研究は、無菌又は非無菌条件で幼虫を育てることの効果、幼虫のホモジネート、血リンパ又は排泄／分泌を使用することの効果及び幼虫の年齢（新たに孵化した、又は第一若しくは第二齢）の効果についても調査した。これらの要因の全ては、幼虫から得られた産物の性質又は活性に影響を与えることが見出されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【表１】
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【発明の概要】
【０００５】
本発明者らは、最近、組織増殖を促進することによって創傷の閉鎖を促進する幼虫の産物の成分である幼虫の産物、特に酵素の創傷治癒特性に焦点を当ててきた。驚くべきことに、本発明者らは、ルシリア・セリカータの幼虫の排泄物／分泌物（表面洗浄）中に見出される１つ又はそれ以上のキモトリプシン酵素が組織形成において重大な役割を果たしていることを見出した。このような酵素は、通常、組織の破壊に関連している。
【０００６】
従って、本発明は、昆虫の幼虫由来の単離されたキモトリプシン又はその類縁体若しくは合成様式を提供する。
【０００７】
有利なことに、本発明のキモトリプシンは、プロテアーゼの予想される特性であり得る創傷郭清（壊死性物質、被感染物質又は外来物質の除去）において有用であるのみならず、繊維芽細胞の接着（すなわち、組織増殖）を促進する上でも有用である（これは、プロテアーゼ酵素に関しては、全く予想されない特性である。）という点で、相反する二重の特性を発揮することが示された。本発明のキモトリプシンは選択的な活性を有する。本発明のキモトリプシンは、創傷痂皮などの幾つかの組織を除去又は分解するが、健康な組織又は新たな組織など、全ての組織を除去又は分解するわけではない。このプロテアーゼ又は各プロテアーゼが、壊死性組織と健康な組織が分解されるルシリア・キュプリナによって引き起こされるハエ幼虫症で起こるような、種類に関わらずに組織を分解又は除去することが合理的に予想され得る。同じ酵素における創傷郭清と細胞増殖の促進という二重の特性は一般的でなく、これらの特性は相反することが予想されるので、当業者にとって驚くべきものである。
【０００８】
本明細書において使用される「痂皮」という用語は、やけど、壊疽、潰瘍（特に、褥瘡）、感染（特に、真菌感染）、炭そ菌又は他の何れかの壊死性組織への後期曝露後のものなど、皮膚の表面から排出されたあらゆる死亡した組織を定義するものとする。
【０００９】
昆虫は、好ましくは、クロバエ類であるルシリア・セリカータである。
【００１０】
本発明のキモトリプシンは、好ましくは、昆虫の幼虫の排泄物／分泌物から取得され、又は取得可能である。しかしながら、同じ成分が血リンパ中に又はホモジネート中に存在し得、これらの採取源から取得できる可能性がある。キモトリプシンは、例えば、幼虫を洗浄し、洗浄媒体を集めることによって取得され得る。本発明者らは、昆虫の幼虫の排泄物／分泌物（ＥＳ）が、酵素、ホルモンなどを含む恒常的に発現される成分と誘導性成分の両方を含むことを以前に見出した。この理由のために、幼虫の増殖条件は一定に保たれることが好ましい。本発明の最も好ましい実施形態において、無菌条件中で増殖された新たに孵化した幼虫から排泄物／分泌物が収集され、使用される。
【００１１】
キモトリプシンは、図１、図２若しくは図１３中に示されている配列又は天然の若しくは完全なキモトリプシンの活性を保持する生物学的に活性なこれらのペプチド断片を有することが好ましく、図１、２及び１３中には、活性部位が特定されている。好ましくは、断片は図１、２及び１３に特定されている活性部位に対して、又はキモトリプシンのペプチド断片をコードするＤＮＡと高い相同性を有し、例えば、活性部位に対する相同性は少なくとも９０％、好ましくは９５％超、より好ましくは９９％の相同性であるべきである。理想的には、断片は、ペプチドの活性部位と同一性を有するべきであり、又はキモトリプシンのペプチド断片をコードするＤＮＡと同一性を有するべきである。関連するＤＮＡ配列が、図１、２及び１２に示されている。
【００１２】
これらの配列のキモトリプシンは、組織再生特性及び創傷郭清活性を有するが、健康な組織又は生きた組織を分解又は消化せず、これは、ルシリア・キュプリナに由来するキモトリプシン（健康な組織又は生きた組織に対してさえ周知の組織分解特性を有する、ハエ幼虫症（組織変性性のプロセス）の原因因子）に対するその高い相同性に鑑みれば特に驚くべきである。この相同性は、図１及び２にも示されている。
【００１３】
本発明者らは、トリプシン様及びキモトリプシン様セリンプロテイナーゼを阻害するセリンプロテイナーゼ阻害剤であるフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）とともに温置した後に、ＥＳの組織再構築及び再生特性が喪失又は阻害されるが、トリプシン様セリンプロテイナーゼを阻害するに過ぎない４−（アミジノフェニル）メタンスルホニルフルオリド（ＡＰＭＳＦ）との温置後には喪失／阻害されないことを見出した。
【００１４】
従って、細胞外マトリックスの再構築又は組織再構築及び組織再生活性に必要なＥＳの重要な成分又は不可欠でさえある成分はキモトリプシン又はキモトリプシン様酵素であると結論付けられた。これは、以下に記載されているように、二重特性を有するキモトリプシンの配列が同定された配列決定によって確認された。実施例が示すように、このキモトリプシンが除去されると、ＥＳの組織再生特性は失われ、このキモトリプシンは創傷の痂皮を郭清するので、同じキモトリプシン酵素が組織再生及び創傷郭清という二重活性を有する。
【００１５】
本発明のキモトリプシンは、創傷郭清又は創傷郭清の改善によるのみならず、繊維芽細胞の遊走、マトリックス再構築及び繊維芽細胞形態の修飾を促進することによっても、創傷の治癒を促進するために創傷の治療において使用することができる。特に、壊死性組織と生きた組織の両方を破壊する疾病であるハエ幼虫症を引き起こすルシリア・セリカータ由来のキモトリプシンに対する高い相同性に鑑みれば、これらの反対の効果（タンパク質分解及びタンパク質生成）が同じ酵素中に存在するという事実は当業者にとって驚くべきことであり、従来技術からは予測することができない。
【００１６】
従って、本発明は、創傷を治癒するための組成物におけるキモトリプシンの使用を提供する。
【００１７】
本発明は、創傷の治癒のための医薬の調製におけるキモトリプシンの使用及びキモトリプシンを用いて創傷を治療する方法も提供する。好ましくは、組成物又は医薬中で使用されるキモトリプシンは、図１、図２若しくは図１３の配列を有し、図１、２若しくは１２のＤＮＡ配列によってコードされる。
【００１８】
あるいは、キモトリプシンの活性断片をこのような組成物又は医薬中に使用し得る。キモトリプシン又はその断片は、天然又は合成であり得る。キモトリプシン又はその断片は、ルシリア・セリカータの幼虫から好ましく取得される。本発明の創傷は以下に定義されており、感染していてもよく、又は感染していなくてもよい。好ましくは、創傷は慢性的な創傷であり、旧来の治療に対して抵抗性であり得る。
【００１９】
創傷は繊維芽細胞の遊走の促進によって、マトリックス再構築の促進によって、又は繊維芽細胞の形態の修飾によって治療され得る。好ましくは、創傷は、本発明のキモトリプシンによって創傷郭清される。
【００２０】
さらなる態様において、本発明は、創傷に対する包帯も提供し、該包帯は本発明の一部を形成するものとして記載されているキモトリプシンを含有する。従って、本発明は、治療を必要としている創傷に上記包帯を適用する工程を含む、創傷を治療する方法も包含する。
【００２１】
本発明者らは、大豆のトリプシン阻害剤（ＳＴＩ）とともにＥＳを温置することによって、繊維芽細胞の遊走を増強するＥＳの能力及び細胞外マトリックスタンパク質を分解するＥＳの能力が除去されることを見出した。同様に、キモトリプシン活性が除去されると、タンパク質分解（創傷郭清）活性は変化したが、以下に示されているように、いくらかのトリプシン活性は残存していた。ＳＴＩによって除去されたタンパク質の配列を決定した。配列は図１、２及び１３に示されているキモトリプシン又はキモトリプシン様配列であることが見出され、この酵素及びその相同体が本明細書に記載されている活性のために必要であることを確認する。
【００２２】
従って、本発明は、図１、図２又は図１３中に示されている配列を有するキモトリプシンも提供する。本発明は、図１、２及び１３に示されているキモトリプシンをコードするＤＮＡ配列並びにｐＢａｃ−３ベクター多重クローニング部位ＤＮＡ配列中のＬ．セリカータキモトリプシノーゲン配列を示すＤＮＡ配列（図１２）も提供する。キモトリプシンの活性部位をコードするＤＮＡの断片（図１３参照）も、本発明の一部を構成する。
【００２３】
本明細書において使用される「創傷」という用語は、傷害によるか又は疾病によるかを問わず、皮膚、表皮又は結合組織に対するあらゆる損傷を定義することが意図され、従って、切り傷、刺し傷、術創、潰瘍、褥瘡、やけど（熱、凍結、化学物質、電気及び放射線によって引き起こされたやけどを含む。）、皮膚の擦過又は暴行（ａｓｓａｕｌｔ）、骨髄炎並びに整形外科的創傷が含まれるが、これらに限定されるものではない。創傷は、感染された状態であり得る。さらに、創傷は、慢性又は急性であり得る。慢性的な創傷は、様々な症状に起因し、糖尿病性の足部潰瘍、静脈性下腿潰瘍、感染性手術創、整形外科的創傷、骨髄炎及び褥瘡が含まれる。
【００２４】
本発明のキモトリプシンは天然であり得、又は図１３に示されているものなど、天然の酵素の合成様式であり得る。酵素の合成様式は、例えば、組み換えベクター発現系を用いて、又は以下の実施例中に示されているように何れかの公知のペプチド合成法又は装置の使用によって、慣用の様式で、与えられた配列から作製され得る。酵素の活性な断片（すなわち、酵素の機能を維持する酵素の断片、特に、図１３に特定されている活性部位を含む断片）も、これらをコードするＤＮＡ断片と同様に、本発明の一部であると考えられる。
【００２５】
本発明のキモトリプシンは、未精製であり得若しくは精製され得る抽出物として使用され得、又は溶媒、希釈剤、緩衝剤、ビヒクル、安定化剤、保湿剤、賦形剤、結合剤、補助剤、防腐剤、抗ケーキ剤、酸性化剤、ゲル化剤、乳化剤、着色剤、香料などの、特に局所製剤中で使用されるものなど、慣用の添加物を含む医薬組成物中へ取り込まれ得る。好ましい実施形態において、キモトリプシンは局所的に適用されるが、本発明の範囲から投与の経口様式又は他の非経口様式が除外されることを意図するものではない。従って、投与の好ましい様式、局所投与において、本発明のキモトリプシンは、洗浄溶液、懸濁液、洗浄液、クリーム、ローション、ゲル、軟膏（ｕｎｇｕｅｎｔ）、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、粉末又は固体又は流体送達ビヒクル中に存在し得る。あるいは、キモトリプシンは、徐放様式で、又は調節された放出様式で、キモトリプシンを創傷中に送達することができる適切な材料中に取り込まれ、又は封入され得る。このような適切な材料の例は、調節された放出様式でペプチドを放出するように調合され得るポリ（ラクチド−コグリコリド）又はＰＬＧＡ粒子である。最も好ましくは、キモトリプシンは、創傷に適用されるべき包帯中に取り込まれ得る。このような包帯の例には、キモトリプシンを含有する徐放性親水コロイド粒子を取り込んだ段階化された又は層状化された包帯又は旧来の包帯によって場合によって重層されたキモトリプシンを含有するスポンジが含まれる。例えば、Ｓｍｉｔｈら２００６に記載されているものを参照されたい。現在使用されているこの種の親水コロイド包帯、例えば、「Ｇｒａｎｕｆｌｅｘ」の商品名で販売されているものは、キモトリプシンを創傷中に放出するように改変され得る。
【００２６】
本発明のキモトリプシンは未精製であり得、又は慣用のタンパク質精製法を用いて精製され得る。キモトリプシンは、例えば、ＣＯＯＨでのアミド化、非コード異常アミノ酸を用いた置換及び／又は同配体（ｉｓｏｔｅｒｅ）によるＣＯ−ＮＨアミド結合の置換によって、アミノペプチダーゼ又はその他の酵素活性に対して保護され得る。さらに、キモトリプシン、特に合成されたキモトリプシン又はその他の新生キモトリプシンは、特に、ヒドロキシル化、グリコシル化、硫酸化、リン酸化され得、又は、特に二次若しくは三次プロセシングが酵素に安定性を与え、若しくは酵素に改善された溶解度若しくは他の望ましい特性を与える場合には、その他二次若しくは三次プロセッシングを受け得る。二次又は三次プロセシングを施すことが酵素の活性を低減しなければ、酵素の合成様式は、天然酵素の立体構造に近い立体構造に到達させるために、二次又は三次プロセシングを施されることが特に好ましい。
【００２７】
さらに、本発明者らは、細胞を維持するために、組織培養又は組織マトリックスモデル化において、昆虫の幼虫、特にルシリア・セリカータの排泄／分泌産物を使用できることを見出した。すなわち、ルシリア・セリカータの排泄／分泌産物は、細胞の生存性を維持するために、ウシ血清などの血清の代わりに使用することができる。これは、血清を使用する必要性をなくすことによって、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）に関連するプリオンなどの潜在的感染源又は潜在的な疾病転移源を除去するので、このような細胞が創傷上に又は創傷中に移植され又は植えつけられるべき場合に、これは特に重要である。
【００２８】
従って、本発明は、昆虫の幼虫の排泄／分泌産物を含む、生きた細胞の維持において使用するための培地も提供する。好ましくは、幼虫はルシリア・セリカータの幼虫である。
【００２９】
典型的には、ルシリア・セリカータの幼虫又はクロバエ類のウジは、旧来の治療が奏効しない慢性的な創傷に適用される。臨床的な観察は、ウジが壊死性組織を除去し（創傷郭清）、消毒を促進し、肉芽組織の形成を加速するという証拠を提供する（Ｓｈｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，２０００；Ｗｏｌｌｉｎａ  ｅｔ  ａｌ，２００２）。これらの効果の背後に存在する機序を解明するために、本発明者らは、ウジの分泌物及び／又は排泄物（ＥＳ）（ウジが継続的に滲出する物質は分泌及び／又は排泄物を起源とし得るので、このように称される。）内に存在する別の研究が示した酵素活性が創傷中に放出されることを調べた（Ｓｃｈｍｉｄｔｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２００３）。セリンプロテイナーゼ、メタロプロテイナーゼ及びアスパルチルプロテイナーゼ活性の証拠が見出された（Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ，２００３）。さらに、ＥＳ内に存在するセリンプロテイナーゼ活性は、様々な一般的な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分を分解することが示された（Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ，２００３）。
【００３０】
本発明者らは、ウジのＥＳが組織形成において重大な役割を果たすので（Ｅｃｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ，２０００）、ヒト皮膚の繊維芽細胞及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分間の相互作用に対するウジのＥＳの効果も調べた。細胞膜受容体（Ｇｉａｎｃｏｔｔｉ  ａｎｄ  Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，１９９９）との結合を通じて、細胞外マトリックスは接触を誘導するための足場を提供し、繊維芽細胞の接着を調節し、細胞の遊走を誘導する（Ｃｌａｒｋ，１９９６；Ｇｒｅｉｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｌａｒｋ，１９９７）。繊維芽細胞を含む多くの源から得られるプロテアーゼは、このような相互作用を調節する。これは、繊維芽細胞の増殖（Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ，２０００；Ｄｅｒｙ  ａｎｄ  Ｂｕｎｎｅｔｔ，１９９９）及び血管新生（Ｂｌａｉｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９７）に影響を与える細胞表面受容体の直接的な活性化を介するものであり得、又は細胞外マトリックス成分（最も顕著なものは、フィブロネクチン）のタンパク分解性分解産物が繊維芽細胞の遊走及び走化性（Ｇｒｅｉｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｌａｒｋ，１９９７；Ｌｉｖａｎｔ  ｅｔ  ａｌ，２０００）、再上皮化（Ｇｉａｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９７）及び組織再構築（Ｇｏｕｌｄ  ｅｔ  ａｌ，１９９７；Ｗｅｒｂ  ｅｔ  ａｌ，１９８０）を誘導する間接的な方法によるものであり得る。本発明者らの結果は、ＥＳの存在下で、フィブロネクチン及びコラーゲンに被覆された表面への繊維芽細胞の接着が低下することを示した（Ｈｏｒｏｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ，２００３）。より最近になって、二次元インビトロアッセイを用いて、本発明者らは、ＥＳ内に存在するセリンプロテイナーゼによって、フィブロネクチンを横切る繊維芽細胞の遊走が加速されることを示した（Ｈｏｒｏｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ，２００５）。すなわち、本発明者らは、平面を横切る強化された繊維芽細胞の遊走とこのような酵素活性を関連付けた。しかしながら、記載されているものなどの証拠は、二次元内において、細胞は、細胞の一般的な三次元インビボ環境内とは異なる挙動を示すことを示唆する（Ａｂｂｏｔｔ，２００３；Ｃｕｋｉｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，２００１；Ｆｒｉｅｄｌ  ａｎｄ  Ｂｒｏｃｋｅｒ，２０００）。例えば、平面上で、細胞は平坦な層状の外観を呈する。これに対して、原位置で観察される細胞は星状の形状を採り、伸長突起の樹状ネットワークを突出する。細胞は三次元マトリックス接着と名付けられた、周囲のマトリックスへの異なる付着も示す（Ｃｕｋｉｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，２００１）。平面上の前進する細胞体に対する抵抗が欠如しているので、二次元では、表面を横切る遊走は、主に、接着及び脱接着現象の関数である。しかしながら、三次元内では、マトリックス障壁は細胞がそれらの形態を採るように強制し、運動を促進するために、細胞に形状を変化させ、及び／又は細胞外マトリックス成分を酵素的に分解させる。従って、本発明者らは、ＥＳに応答した繊維芽細胞の遊走及び形態を観察するための三次元インビトロアッセイを開発した。
【００３１】
従って、本発明者らは、ＥＳに応答した繊維芽細胞の遊走及び形態を観察するための三次元インビトロアッセイの推進を目指して研究を行った。細胞がインビボで存在する微小環境により近いこのようなモデルの確立は、創傷治癒プロセス中での細胞外マトリックス、常在性細胞及びＥＳ間の相互作用の重要性のよりよい理解を与える。このようなモデルの確立は、治癒を促進するために、支持性の、水和された、生物分解性の及び生物活性な組織様マトリックス内に保たれた生きた皮膚及び上皮細胞が開放創へ送達されるシステムを開発するための基礎も与える。（何れも、遊走に最適と考えられる濃度の）コラーゲン及びフィブロネクチンから構成されるゲル内に包埋された初代ヒト包皮繊維芽細胞（ＨＦＦ）の単離された集団を含有するアッセイが開発された（Ｇｒｅｉｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｌａｒｋ，１９９７；Ｆｒｉｅｄｌ  ａｎｄ  Ｂｒｏｃｋｅｒ，２０００）。コラーゲンゲルはインビボ様の細胞培養に対して広く使用されており、表皮の生物物理学的構造を正しく再生したものであると考えられている（Ｆｒｉｅｄｌ  ａｎｄ  Ｂｒｏｃｋｅｒ，２０００）。さらに、コラーゲンゲル内に包埋された細胞は、原位置様形態と幾分の類似性を共有する伸長突起の樹状ネットワークを採ることが示されている（Ｃｕｋｉｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，２００１）。フィブロネクチンは創傷空間中に細胞遊走を誘導する上で主要な役割を果たしているので、フィブロネクチンが含められた（Ｇｒｅｉｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｌａｒｋ，１９９７）。結果は、用量依存的な様式で、ＥＳがゲルを通じた繊維芽細胞の遊走を加速することを示した。これは、マトリックス再構築の強化及びより十分に広がった細胞形態の誘導によって促進された可能性がある。以下の実施例中に示されているように、適切な対照と比較して、１及び５μｇ／ｍＬのＥＳ濃度は遊走している細胞の数及びそれらが細胞小滴から移動した距離をともに著しく増加させた。ＥＳのこれらの濃度は十分に広がった細胞形態も誘導し、低い集団密度で、５μｇ／ｍＬのＥＳは細胞間のマトリックス原繊維の並列を促進した。これに対して、１０μｇ／ｍＬのＥＳ（検査された最高濃度）は細胞の遊走を阻害したが、細胞の形態を変化させた。０．１μｇ／ｍＬの濃度のＥＳは、調べた温置期間にわたって、ほとんど効果を示さなかった。
【００３２】
これらの観察から、ＥＳはマトリックスの再構成及び細胞の牽引力の発揮を促進したと結論付け得る。遊走アッセイの中で、牽引が生じたことは、５μｇ／ｍＬのＥＳを含有するゲルの剥離後における及び１０μｇ／ｍＬのＥＳに曝露されたゲルの液状化の間における細胞小滴サイズの収縮によって表される。より低い播種密度で細胞が観察される場合には、牽引力の存在は、反対方向の牽引力の発揮によって、おそらくこのようにして組織化された、細胞間で緊張した状態に保たれた真っ直ぐな整列されたマトリックス原繊維の出現によって示される。牽引力の存在は、十分に広がった細胞形態によっても示される。Ｈａｒｒｉｓ及び共同研究者（１９８１）は、「・・・繊維芽細胞が細胞周囲のコラーゲンを圧縮及び伸展するにつれて、細胞は短縮されずに伸長するので」、コラーゲンゲル内に包埋された繊維芽細胞では、繊維芽細胞の牽引は、「筋肉の収縮のような単純な収縮とは異なる」ことを観察した。
【００３３】
ＥＳが繊維芽細胞によるマトリックス再構築を強化したこと、及びこのようにすることによって、遊走の促進を実施することは、おそらく、Ｂｅｌｌｏｗｓら（１９８１）によって提案されたゲル圧縮のモデルによって明らかにされる。異なる細胞種がコラーゲンゲルを収縮し、組織化する能力を比較する際に、これらの研究者は、表１に示されているように、ゲル圧縮の一連の連続する段階を同定した。本発明者らの観察から、ＥＳが、細胞付着及び広がりを促進し、並びにマトリックス（コラーゲンである可能性が最も高い）繊維の整列を促進するというゲル圧縮の最初の３つの段階を開始させることが明らかである。このようにすることにより、細胞遊走の第四段階に到達した。マトリックス再構築と細胞遊走間の関連は、コラーゲンゲル内に包埋された細胞の集団間でのコラーゲン「ストラップ」（整列されたコラーゲン原繊維のパターン）形成が細胞の前進を引き起こし、細胞遊走を隣接する細胞集団の方向に誘導する（接触誘導）ことを見出したＳａｗｈｎｅｙ及びＨｏｗａｒｄ（２００２）の研究によってさらに強化される。
【００３４】
【表２】
2009538611.tif 000010
【００３５】
これらの比較から、ＥＳの存在下にある細胞は、他の研究者によって、コラーゲンゲル内に包埋された細胞について観察されたものと類似の形態特性及びマトリックスの再構成を示した。他の研究はウジ由来の産物を含んでいなかったので、ＥＳが存在しない本発明者らの対照中の細胞に対してこのような挙動が観察されなかった理由が問われなければならない。比較研究は血清を含有するアッセイを含んでいたのに対して、ここでは、血清が除外されたので、答えは血清と関連している可能性がある。血清による細胞−マトリックス相互作用の促進に対する証拠は、係留された繊維芽細胞が集合したコラーゲンゲルの放出の直前に血清を除去することが、常在性細胞によるその後のゲル収縮の程度を阻害することを見出したＴｏｍａｓｅｋら（１９９２）によって与えられている。一旦ゲルが放出された後にゲルに血清を添加することによって、直ちに収縮が引き起こされた。他の研究者らも、マトリックスの再構成に関して、血清への依存を観察している（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ，１９８０；Ｇｕｉｄｒｙ  ａｎｄ  Ｇｒｉｎｎｅｌｌ，１９８５）。血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）及び生物活性脂質媒介物質リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）が血清中に見出されており、全て、マトリックス再構成の刺激に関与していると推定されている（Ｍｏｎｔｅｓａｎｏ  ａｎｄ  Ｏｒｃｉ，１９８８；Ｇｒｉｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ，１９９９；Ｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ，１９９９；Ｔｏｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ，２００２；Ｋｏｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ，２００４）。
【００３６】
従って、ウジのＥＳが血清中にも見出される活性成分を含有している可能性がある。別の可能性は、本発明者らが以前に繊維芽細胞の遊走を加速することを示したＥＳ内に存在するセリンプロテイナーゼ（Ｈｏｒｏｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ，２００５）は、膜結合型プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）の切断を通じて寄与し得ることである。Ｇタンパク質共役型受容体のこのファミリーは、トロンビン及びトリプシン様酵素などのセリンプロテイナーゼによるそれらの酵素的切断後に活性化される。このような作用は、受容体上のＮ末端係留されたリガンドを露出させ、次いで、露出されたリガンドは切断された受容体を結合し、活性化させる。活性化されたＰＡＲは、細胞の形状、分泌、インテグリン活性化、代謝性応答、転写応答及び細胞の移動性に影響を与えるシグナル伝達カスケードに共役している（Ｃｏｔｔｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ，２００２）。以前の研究は、ＰＡＲのプロテイナーゼ活性化を通じて、トロンビンがコラーゲンゲル中の胎児性ニワトリ繊維芽細胞内の等尺性張力の発生を促進することを示している（Ｋｏｌｏｄｎｅｙ  ａｎｄ  Ｗｙｓｏｌｍｅｒｓｋｉ，１９９２；Ｐｉｌｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９４；Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００１）。ＥＳ内に存在するセリンプロテイナーゼは、トロンビンとプラスミン基質であるトシル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＡＭＣに対して活性を示し（Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ，２００３）、これは、ＥＳがトロンビンと同様の効果を繊維芽細胞に対して発揮し得ることを意味することに注目するのが興味深い。プラスミンは細胞によって分泌される様々なマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）のチモーゲン前駆体を活性化させ、従って、局所化されたマトリックス再構成に寄与する（Ｍｉｇｎａｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９６）ことが示されているので、何らかのプラスミン様活性が関連している可能性もあり得る。
【００３７】
ウジのＥＳは、ウロキナーゼ様活性に対して不安定なペプチドに対して活性を有することも示されている。ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）の別称でも知られるセリンプロテイナーゼであるウロキナーゼは、その活性形態であるプラスミンへとプラスミノーゲンを転化させる。ウロキナーゼはプラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）とも結合し、この研究は繊維芽細胞によって発現されることを示した（Ｍｉｇｎａｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９６；Ｅｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９３；Ｂｅｈｒｅｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ，１９９３）。一旦結合されると、ｕＰＡＲは局所的な接着部位に局在化し、インテグリンによって媒介される機能を調節し（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，１９９５；Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｅｉ，２００１；Ｐｏｒｔｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏｇｇ，１９９８）、従って、より誘導性が高い細胞表現型を誘導するための機序を与える。実際に、ｕＰＡＲは細胞遊走、接着及び走化性において、シグナル伝達の役割を有することが報告されている（Ｏｄｅｋｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９２；Ｗａｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ，１９９３；Ｇｙｅｔｋｏ  ｅｔ  ａｌ，１９９４）。従って、ＥＳ内のウロキナーゼ様活性は細胞挙動の変化にも寄与している可能性があると推測することは合理的である。
【００３８】
繊維芽細胞−マトリックス相互作用を促進した可能性があるＥＳの他の作用は、ゲルマトリックス成分を分解するその能力と関連し得る。これは、存在するＥＳの濃度が高いほど、ゲルがその外観をより素早く変化させ、より半透明の状態となり、最高のＥＳ濃度では液体様になるという観察によって示される。これは、ＥＳ内のセリンプロテイナーゼがコラーゲン及びフィブロネクチンを分解することを本発明者らが示した以前の研究によっても示されている（Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ，２００３）。マトリックス原繊維と組織培養皿表面間の接触が侵食され、原繊維ネットワークが破壊されるにつれて、ゲルの分解は機械的張力の緩和をもたらしたであろう。緊張性の培養力モニターを開発した研究者による多数の研究は、コラーゲンゲル内に包埋された繊維芽細胞が機械的張力の変化を感知し、機械的張力の変化に対して反応することができるという証拠を与えている。これらの研究者は、繊維芽細胞が活性な張力性ホメオスタシスを維持し、外的に適用された負荷とは反対方向に内在性マトリックスの張力を修飾するように反応する（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９８；Ｅａｓｔｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ，１９９４）。従って、適用された負荷の増加は細胞によって媒介される収縮の減少を引き起こし、逆も同様である。おそらく、この応答に寄与しているのは、機械的張力がＭＭＰ産生のレベルに影響を与え、従って、周囲のマトリックスを再構築するためにプロテイナーゼを放出することによって細胞を反応させるという知見である（Ｌａｍｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ，２００１）。従って、ゲルのタンパク分解性分解によって引き起こされる機械的張力の緩和は、細胞周囲のマトリックスを収縮及び再構築し、より高い移動性の表現型を採るように細胞を刺激した可能性がある。別の帰結は、繊維芽細胞の接着と遊走に影響を与えることが示されている分解されたコラーゲンとフィブロネクチンからの生物活性ペプチドの放出であった可能性がある（Ｇｒｅｉｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｌａｒｋ，１９９７；Ｌｉｖａｎｔ  ｅｔ  ａｌ，２０００）。
【００３９】
繊維芽細胞は機械的張力の変化を検出し、この変化に応答することができるので、マトリックスを再構築するために、ＥＳがどれだけ繊維芽細胞を刺激しても、細胞間の連絡の強化がもたらされ得ることは本発明者らの観察から明らかである。これは、マトリックス原繊維の配列を引き起こす別の細胞からの反対方向の牽引力によって、各細胞がマトリックスの機械的張力の局所的な差を検出することができたからである。隣接する細胞のこのような増強された認識は、比較的長距離に対してさえ、細胞間の作用の改善された協調をもたらし、増強された遊走に寄与した可能性がある。実際には、Ｓｈｅｅｔｚ、Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ及びＧａｂｒａｉｔｈ（１９９８）は、細胞外マトリックスタンパク質繊維の配向及び硬直性に従って、細胞がその運動を誘導するという協調された細胞遊走の同様の機序を提案している（Ｓｈｅｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ，１９９８）。
【００４０】
遊走及びマトリックス再構築を強化する上でのＥＳの利点にも関わらず、ＥＳ内に存在するプロテイナーゼの作用はマトリックスの広範囲な破壊を引き起こすので、ＥＳ内に存在するプロテイナーゼの活性は過剰なものではないことは重要である。接触誘導及び転位を促進するために、十分な原繊維構造が残存する必要があることは、１０μｇ／ｍＬという最高のＥＳ濃度を含有した本発明者らのアッセイによって示される。ここでは、ＥＳは遊走を阻害したのみならず、粘性のある液体状態へゲルを素早く分解した。従って、明らかに、創傷治癒に貢献し得る細胞の活動を促進するためのＥＳの最適な濃度が存在する。
【００４１】
要約すれば、本発明者らの結果は、第一に、ＥＳが繊維芽細胞の遊走を促進することを見出した。第二に、血清の不存在下において、細胞が十分に広がった形態を維持し、拡張するのを補助するためにＥＳが必要であった。第三に、同じく血清の不存在下において、ＥＳは、特に細胞間での細胞外マトリックスの再構成を促進した。第四に、ＥＳは、細胞外マトリックスの直接的なタンパク分解性修飾によって、及び／又は細胞の受容体との相互作用による繊維芽細胞表現型の表現型の直接的な変化により、血清を不要とすることによってこれらの効果を付与した。本発明者らは、ＥＳから活性な要素を単離するための技術的能力を有しており（Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ，２００３；Ｈｏｒｏｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ，２００３，２００５）、従って、関与する活性及び機序の同定に進む。
【００４２】
実施例２のデータが示すように、創傷の痂皮中のタンパク質を溶解する点で、幼虫のＥＳから抽出されたキモトリプシンは創傷郭清活性を有している（図２１参照）。阻害剤研究によって、及び配列決定によって、これはキモトリプシンであることが明らかとなっている。
【００４３】
ここで、添付の図面を参照しながら、添付の図面によって例示されているように、本発明の実施例を記載する。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、タンパク質翻訳及びＬ・キュプリナのキモトリプシノーゲンに対する相同性とともに、Ｌ．セリカータ遺伝子配列を示す完全な（１）及び部分的な（２）配列表を示している。ここで、ＤＮＡコドンは小文字で記載されている。タンパク質の翻訳は大文字で記載されている。下線が付された大文字は、最も近い相同性のＬ．キュプリナ配列と比較した場合の、Ｌ．セリカータ配列に特有なアミノ酸残基を示している。太字は活性部位の残基を示している。斜字体はシグナル伝達ペプチドを示している。矢印は切断部位の候補を示しており、切断可能なシグナル伝達ペプチドを示している。アスタリスクは停止コドンを表している。下線が付された小文字は非翻訳領域（ＵＴＲ）を示している。下線が付された太字の小文字はポリアデニル化尾部を示しており、下線が付された斜字体はポリアデニル化シグナルを示している。
【図２】図２は、タンパク質翻訳及びＬ・キュプリナのキモトリプシノーゲンに対する相同性とともに、Ｌ．セリカータ遺伝子配列を示す完全な（１）及び部分的な（２）配列表を示している。ここで、ＤＮＡコドンは小文字で記載されている。タンパク質の翻訳は大文字で記載されている。下線が付された大文字は、最も近い相同性のＬ．キュプリナ配列と比較した場合の、Ｌ．セリカータ配列に特有なアミノ酸残基を示している。太字は活性部位の残基を示している。斜字体はシグナル伝達ペプチドを示している。矢印は切断部位の候補を示しており、切断可能なシグナル伝達ペプチドを示している。アスタリスクは停止コドンを表している。下線が付された小文字は非翻訳領域（ＵＴＲ）を示している。下線が付された太字の小文字はポリアデニル化尾部を示しており、下線が付された斜字体はポリアデニル化シグナルを示している。
【図３】図３は、三次元インビトロアッセイがどのようにして組み立てられたかの図解である。１．１．５ｍｇ／ｍＬコラーゲンと３０μｇ／ｍＬフィブロネクチンを含有するダルベッコの改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）を５８ｍｍの組織培養皿の中に注ぎ、薄い均一な層中に３７℃でゲル化した。２．１×１０７個のＨＦＦ細胞／ｍＬを含有するＤ−ＭＥＭ／コラーゲン／フィブロネクチンの小滴を第一のゲル層の上に置き、３７℃でゲル化した。３．Ｄ−ＭＥＭ／コラーゲン／フィブロネクチン溶液の第二の層を細胞小滴の上に注ぎ、３７℃でゲル化した。４．次いで、ＦＣＳ−遊離細胞培地をゲルの上に注いだ。５．完全に組み立てられたアッセイが断面図で示されており、小滴中の全ての細胞がマトリックスゲルによってどのようにして完全に取り囲まれているか、従って、三次元に遊走しなければならないかについて図示している。
【図４】図４は、三次元インビトロアッセイ内の２μＬのゲル小滴からの繊維芽細胞の遊走が、位相差顕微鏡画像からどのようにして定量されたかの図解である。１．アッセイ組み立ての直後における、繊維芽細胞が播種された小滴（０時間の温置）。２．２４時間の温置後の同じ小滴。３．コントラストを付けるために黒で着色され、２４時間の温置から得られた画像に対して重ね合わせられた、繊維芽細胞が播種された０時間温置時点での小滴。４．２４時間にわたって小滴から遊走した細胞のみが示されたままとなっており、従って、それらを計数することが可能となる。各細胞の先端から重ね合わされた０時間画像の周囲へ引かれたベクトルの長さを測定することによって、各細胞が移動した距離を計算した。０時間の温置時における繊維芽細胞が播種された小滴の周囲距離も、重ね合わされた０時間画像周囲に線を引くことによって測定された。ミクロンのバーは、３００μｍに相当する。
【図５ａ】図５は、ａ．ＥＳの不存在下（０ＥＳ）若しくは０．１μｇ／ｍＬＥＳ（０．１ＥＳ）若しくは５μｇ／ｍＬＥＳ（５ＥＳ）の存在下で、又はｂ．ＥＳの不存在下（０ＥＳ）若しくは１μｇ／ｍＬＥＳ（１ＥＳ）若しくは１０μｇ／ｍＬＥＳ（１０ＥＳ）の存在下で、アッセイ組み立て直後に（０時間）又は２４時間若しくは４８時間の温置後における、三次元インビトロアッセイ内の繊維芽細胞が播種されたゲル小滴２μＬの代表的な位相差画像を示している。全ての事例で、ミクロンのバーは、３００μｍに相当する。
【図５ｂ】図５は、ａ．ＥＳの不存在下（０ＥＳ）若しくは０．１μｇ／ｍＬＥＳ（０．１ＥＳ）若しくは５μｇ／ｍＬＥＳ（５ＥＳ）の存在下で、又はｂ．ＥＳの不存在下（０ＥＳ）若しくは１μｇ／ｍＬＥＳ（１ＥＳ）若しくは１０μｇ／ｍＬＥＳ（１０ＥＳ）の存在下で、アッセイ組み立て直後に（０時間）又は２４時間若しくは４８時間の温置後における、三次元インビトロアッセイ内の繊維芽細胞が播種されたゲル小滴２μＬの代表的な位相差画像を示している。全ての事例で、ミクロンのバーは、３００μｍに相当する。
【図６ａ】図６は、三次元インビトロアッセイ内の繊維芽細胞が播種されたゲル小滴２μＬの先端の代表的な画像を示しており、細胞形態の差を強調表示している。別段の記載がなければ、画像は位相差である。ａ．ＥＳが存在しない（０ＥＳ）対照中の細胞と、２４時間の温置後に５μｇ／ｍＬのＥＳに曝露された細胞（５ＥＳ）との比較；ｂ．対照中の細胞（０ＥＳ）と、４８時間の温置後に１μｇ／ｍＬのＥＳに曝露された細胞（１ＥＳ）との比較−ｚシリーズ光学断面の共焦点最大起強度投影、ＦＩＴＣ−ファロイジン（アクチン）及びヨウ化プロピジウム（核）で染色された細胞；対照中の細胞（０ＥＳ）と２４時間（ｃ）又は４８時間の温置後に１０μｇ／ｍＬＥＳに曝露された細胞（１０ＥＳ）との比較。（ｄ）ａ、ｃ、ｄ中のミクロンのバーは５０μｍ（上）又は２０μｍ（下）を表し、ｂでは、５０μｍを表す。
【図６ｂ】図６は、三次元インビトロアッセイ内の繊維芽細胞が播種されたゲル小滴２μＬの先端の代表的な画像を示しており、細胞形態の差を強調表示している。別段の記載がなければ、画像は位相差である。ａ．ＥＳが存在しない（０ＥＳ）対照中の細胞と、２４時間の温置後に５μｇ／ｍＬのＥＳに曝露された細胞（５ＥＳ）との比較；ｂ．対照中の細胞（０ＥＳ）と、４８時間の温置後に１μｇ／ｍＬのＥＳに曝露された細胞（１ＥＳ）との比較−ｚシリーズ光学断面の共焦点最大起強度投影、ＦＩＴＣ−ファロイジン（アクチン）及びヨウ化プロピジウム（核）で染色された細胞；対照中の細胞（０ＥＳ）と２４時間（ｃ）又は４８時間の温置後に１０μｇ／ｍＬＥＳに曝露された細胞（１０ＥＳ）との比較。（ｄ）ａ、ｃ、ｄ中のミクロンのバーは５０μｍ（上）又は２０μｍ（下）を表し、ｂでは、５０μｍを表す。
【図６ｃ】図６は、三次元インビトロアッセイ内の繊維芽細胞が播種されたゲル小滴２μＬの先端の代表的な画像を示しており、細胞形態の差を強調表示している。別段の記載がなければ、画像は位相差である。ａ．ＥＳが存在しない（０ＥＳ）対照中の細胞と、２４時間の温置後に５μｇ／ｍＬのＥＳに曝露された細胞（５ＥＳ）との比較；ｂ．対照中の細胞（０ＥＳ）と、４８時間の温置後に１μｇ／ｍＬのＥＳに曝露された細胞（１ＥＳ）との比較−ｚシリーズ光学断面の共焦点最大起強度投影、ＦＩＴＣ−ファロイジン（アクチン）及びヨウ化プロピジウム（核）で染色された細胞；対照中の細胞（０ＥＳ）と２４時間（ｃ）又は４８時間の温置後に１０μｇ／ｍＬＥＳに曝露された細胞（１０ＥＳ）との比較。（ｄ）ａ、ｃ、ｄ中のミクロンのバーは５０μｍ（上）又は２０μｍ（下）を表し、ｂでは、５０μｍを表す。
【図６ｄ】図６は、三次元インビトロアッセイ内の繊維芽細胞が播種されたゲル小滴２μＬの先端の代表的な画像を示しており、細胞形態の差を強調表示している。別段の記載がなければ、画像は位相差である。ａ．ＥＳが存在しない（０ＥＳ）対照中の細胞と、２４時間の温置後に５μｇ／ｍＬのＥＳに曝露された細胞（５ＥＳ）との比較；ｂ．対照中の細胞（０ＥＳ）と、４８時間の温置後に１μｇ／ｍＬのＥＳに曝露された細胞（１ＥＳ）との比較−ｚシリーズ光学断面の共焦点最大起強度投影、ＦＩＴＣ−ファロイジン（アクチン）及びヨウ化プロピジウム（核）で染色された細胞；対照中の細胞（０ＥＳ）と２４時間（ｃ）又は４８時間の温置後に１０μｇ／ｍＬＥＳに曝露された細胞（１０ＥＳ）との比較。（ｄ）ａ、ｃ、ｄ中のミクロンのバーは５０μｍ（上）又は２０μｍ（下）を表し、ｂでは、５０μｍを表す。
【図７】図７は、２４時間にわたる、三次元インビトロアッセイ内の細胞が播種されたゲル小滴２μＬからの繊維芽細胞の遊走を示している。結果は、小滴の周囲ｍｍ当りの遊走細胞の平均数±平均値の標準誤差（ｎ＝５）として表されている。ａ．ＥＳの不存在下（対照）又は０．１μｇ／ｍＬＥＳ（０．１ＥＳ）若しくは５μｇ／ｍＬＥＳ（５ＥＳ）の存在下での遊走。ｂ．ＥＳの不存在下（対照）又は１μｇ／ｍＬＥＳ（１ＥＳ）若しくは１０μｇ／ｍＬＥＳ（１０ＥＳ）の存在下での遊走。
【図８】図８は、三次元インビトロアッセイ内の細胞が播種された各２μＬのゲル小滴から遊走する繊維芽細胞が移動した距離の中央値を示している。５つの反復小滴から得られた値が示されている。黒塗りの記号（実験１）は、ＥＳの不存在下（対照＃１）又は０．１μｇ／ｍＬＥＳ若しくは５μｇ／ｍＥＳの存在下で移動した距離を表している。白い記号（実験２）は、ＥＳの不存在下（対照＃２）又は１μｇ／ｍＬＥＳ若しくは１０μｇ／ｍＥＳの存在下で移動した距離を表している。
【図９】図９は、アッセイ組み立て直後（０時間の温置）又は２４時間若しくは４８時間の温置後における、２０μＬのゲル小滴内の、３×１０５細胞／ｍＬの播種密度の繊維芽細胞を示す代表的な位相差画像を示す。ＥＳの不存在下（０ＥＳ）又は１μｇ／ｍＬＥＳ（１ＥＳ）若しくは５μｇ／ｍＬＥＳ（５ＥＳ）の存在下での細胞の外観。黒い矢印は、並列されている場合、細胞間の鎖状結合性原繊維が可視的になっていることを示している。全ての事例で、ミクロンのバーは、２０μｍに相当する。
【図１０】図１０は、２４時間の温置後における、各酵素濃度のタンパク質分解活性に関連した、ＦＮ被覆された表面への繊維芽細胞接着に対するＥＳ、トリプシン、キモトリプシン及びトリプシン／キモトリプシン混合物の効果を示す２つのグラフである。このような活性は、ａ．トリプシン又はｂ．キモトリプシンに対する合成ペプチド基質からの７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）の放出をモニタリングすることによって評価された。細胞の接着は、蛍ルシフェラーゼをベースとする発光アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）アッセイを用いて測定された。結果は、対照の平均％細胞接着±１ＳＤとして表した（ｎ＝３）。
【図１１】図１１は、３７℃で２４時間の温置後のフィブロネクチンのゲル電気泳動の写真である。値は、分子量標準（ｋＤａ）を示している。１．ＦＮ単独。２．ＦＮ＋ｔｒｙ／ｃｈｙ。３．ＦＮ＋ｃｈｙ。４．ＦＮ＋ｔｒｙ。５．ＦＮ＋ＥＳ。各酵素濃度は、適切なトリプシン又はキモトリプシン基質に対する活性の同じレベルを示した。Ｔｒｙ＝０．３２μｇ／ｍＬトリプシン。Ｃｈｙ＝０．０２μｇ／ｍＬキモトリプシン。ＥＳ＝１μｇ／ｍＬ。
【図１２】図１２は、ｐＢａｃ−３ベクター多重クローニング部位ＤＮＡ配列中のＬ．セリカータキモトリプシノーゲン配列を示すＤＮＡ配列表であり、ｐｂａｃ−３ベクターの配列に下線が付されている。
【図１３】図１３は、活性部位の残基が太字で示されている図１２のＤＮＡ配列の予想されるタンパク質配列である。
【図１４】図１４は、Ｓ３００ゲルろ過後のトリプシン／キモトリプシン活性を示すグラフである。
【図１５】図１５は、ゼラチンＳＤＳ−ＰＡＧＥ基質ゲル分析によって測定された活性の各ピークに対して典型的なタンパク質分解特性を示す一連の写真である。
【図１６】図１６は、Ｃ１プールの適用後の大豆トリプシン阻害剤アガロースアフィニティークロマトグラフィーのタンパク質特性を示すグラフである。
【図１７】図１７は、Ｃ１プールの適用後の大豆トリプシン阻害剤アガロースに結合されたタンパク質のタンパク質分解活性及び阻害剤の性質決定を示すゲルの写真である。
【図１８】図１８は、Ｔ２プールの適用後の大豆トリプシン阻害剤アガロースアフィニティークロマトグラフィーのタンパク質特性を示すグラフである。
【図１９】図１９は、Ｔ２プールの適用後の大豆トリプシン阻害剤アガロースに結合されたタンパク質のタンパク質分解活性及び阻害剤の性質決定を示すゲルの写真である。
【図２０】図２０は、Ｌ．セリカータのＥＳ産物で処理した後に生じ得る創傷痂皮のタンパク質特性の変化を示す２つのゲルを示す写真である。変化が生じる可能性がある領域が円で囲まれている。図２０ａは処理されていない痂皮を示しており、図２０ｂは一晩処理された痂皮を示している。
【図２１】図２１は、Ｌ．セリカータのＥＳ産物で処理した後に生じ得る創傷痂皮のタンパク質特性の変化を示す４つのゲルを示す写真である。変化が生じる可能性がある領域が円で囲まれている。図２１ａは処理されていない痂皮を示しており、２０ｂはキモトリプシンピーク（Ｃ１）で処理され、２０ｃは第一のトリプシンピーク（Ｔ１）で処理され、２０ｄは第二のトリプシンピーク（Ｔ２）で処理された。
【実施例】
【００４５】
（実施例１）
組織の再生
繊維芽細胞の接着の促進
ルシリア・セリカータの幼虫の排泄物／分泌物の収集及び性質決定
排泄物／分泌物（ＥＳ）を、以前に記載されているとおりに（Ｈｏｒｏｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ，２００３）、孵化した直後の無菌のルシリア・セリカータの幼虫（ＬａｒｖＥＴＭ，Ｚｏｏｂｉｏｔｉｃ  Ｌｔｄ，ＵＫ）から収集した。簡潔に述べると、ＥＳ産物を回収するために、無菌のリン酸緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）１ｍＬ中において、室温で（ＲＴ）３０分間、４００個の生きた幼虫を洗浄した。それぞれ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）タンパク質アッセイキット及びフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）−カゼイン消化アッセイ（Ｈｏｒｏｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ，２００３）を用いて、ＥＳのタンパク質濃度及びタンパク質分解活性を測定した。ともに、これらは、１６１．７４μｇ／ｍＬのタンパク質濃度及び６．０４×１０６相対蛍光単位／ｍｇＥＳタンパク質の比活性であることを明らかにした。
【００４６】
初代ヒト包皮繊維芽細胞（ＨＦＦ）細胞培養
ダルベッコの改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）（ＧｉｂｃｏＴＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｔｄ，ＵＫ）、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｓｉｇｍａ（Ｒ），ＵＫ）、抗生物質／抗真菌溶液（Ｓｉｇｍａ（Ｒ））（１００単位／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び０．２５μｇ／ｍＬアムフォテリシンＢ）及び２ｍＭＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ（Ｒ））を含有するＴ７５フラスコ（Ｎｕｎｃ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ，ＵＫ）内で、ＨＦＦ細胞（ＴＣＳ  Ｃｅｌｌｗｏｒｋｓ（Ｒ），ＵＫ）を単層培養した。５％ＣＯ２を含有する加湿された雰囲気中において、細胞を３７℃に維持した。
【００４７】
三次元インビトロアッセイ−繊維芽細胞遊走
通常の細胞培養（上記参照）に対して使用した濃度の２倍のＤ−ＭＥＭ、抗生物質／抗真菌物質及びＬ−グルタミンを含有する原液を作製した。冷蔵後、１：１の比で、３ｍｇ／ｍＬウシコラーゲンＩ型（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ）、６０μｇ／ｍＬウシフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ（Ｒ））及び幼虫のＥＳ又はＰＢＳブランクを含有する冷溶液と原溶液を氷上で混合した。１×Ｄ−ＭＥＭ、１．５ｍｇ／ｍＬコラーゲン及び３０μｇ／ｍＬフィブロネクチンの最終濃度を得た。幼虫のＥＳの最終タンパク質濃度は、表記されているように、０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ又は１０μｇ／ｍｌであった。図３に示されているように、及びここに記載されているように、アッセイを組み立てた。すなわち、上述のように、５８ｍｍ組織培養皿（Ｎｕｎｃ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ）の中に、Ｄ−ＭＥＭ−コラーゲン／フィブロネクチン混合物１０００μＬを注ぎ、均一な薄い連続層の中に３７℃でゲル化した。ＨＦＦ細胞（継代６）をトリプシン処理し、トリプシンを中和するために、１０％ＦＣＳを含有するＤ−ＭＥＭ中に懸濁した。次いで、遠心によってそれらを沈降させ、ＦＣＳを含まないＤ−ＭＥＭ中に再懸濁した。血球計数器を用いた細胞数の推定後に、細胞を再び沈降させ、１×１０７細胞／ｍＬの密度で、Ｄ−ＭＥＭ／コラーゲン／フィブロネクチンゲル混合物内に再懸濁した。次いで、皿の中のゲル層の上に、それぞれ、この細胞懸濁物２μＬを含有する５つの小滴を配置し、ゲル化されるまで、３７℃で温置した。次いで、細胞小滴を完全に覆うために、細胞小滴の上に、Ｄ−ＭＥＭ／コラーゲン／フィブロネクチン混合物をさらに１０００μＬに注ぎ、ゲル化させるために３７℃で放置した。最後に、上部ゲル層を覆うために、ゲル中と同じ濃度で抗生物質／抗真菌物質、Ｌ−グルタミン及びＰＢＳブランク又は幼虫のＥＳを含有する、ＦＣＳを含まないＤ−ＭＥＭを添加した。次いで、表記の時間、加湿された５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で、組み立てられたアッセイを温置した。この間、無菌条件を維持した。
【００４８】
各実験を通じて、計４８時間の期間にわたって、位相差を用いる倒立Ｌｅｉｃａ（ＵＫ）ＤＭＩＲＢ顕微鏡を通して、細胞を観察した。２４時間の温置後に細胞遊走を定量するために、各ゲル内に包埋された各細胞小滴の領域全体を示す低倍率画像を使用した。ここで、２４時間の温置後の同じ小滴の画像上に０時間の時点での各細胞小滴の画像を重ね合わせるために、ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＰａｉｎｔＳｈｏｐＰｒｏ６を使用した。図４に示されているように、次いで、ＬｅｉｃａＱＵＩＰＳソフトウェアを用いて、これらの複合画像を分析した。最初に、０時間での、各細胞小滴を取り囲む周囲の距離を計算した。この後、２４時間の期間にわたって、元の細胞小滴周囲を横切り、元の細胞小滴周囲から離れるように遊走した細胞の数を計数した。変動する小滴周囲距離を補正するために、遊走する細胞の数は、元の細胞小滴境界のｍｍ周囲長当りの細胞として表された。各細胞が周囲から離れるように遊走した直線距離も測定した。
【００４９】
４８時間の温置後、４％パラホルムアルデヒド（ＴＡＡＢ，Ａｌｄｅｒｍａｓｔｏｎ，ＵＫ）中に、２０分間、完全な状態のゲルを固定した後、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ（Ｒ））を含有するＰＢＳで３回洗浄した。次いで、２０ｍＭＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）；４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３００ｍＭスクロース、５０ｍＭＮａＣｌ、３ｍＭＭｇＣｌ２及び０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（全てＳｉｇｍａ（Ｒ）から）を含有する氷冷した透過溶液（ｐＨ７．４）を添加し、１０分間放置した。再度、１％ＢＳＡでゲルを洗浄した。（エタノール中の）０．０８％ＦＩＴＣ−ファロイジン（Ｓｉｇｍａ（Ｒ））溶液を１％ＢＳＡで１：１００希釈し、次いで、ゲルに添加した。３０分後、先述のように、ゲルを洗浄した。１０μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｓｉｇｍａ（Ｒ））を含有するＢＳＡ（１％）を添加し、ゲルを再度洗浄する前に、１分間放置した。
【００５０】
ＦＩＴＣ−ファロイジン／ＰＩ染色後、過剰な液体を除去するために、ゲルを慎重に吸収転移させ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ蛍光搭載培地及びカバーガラスを載せた。ＬｅｉｃａＤＭＲＢＥ直立蛍光顕微鏡を内蔵した共焦点ＬｅｉｃａＴＣＳ４Ｄシステムを用いてゲルを可視化した。遊走している細胞の形態を観察するために、細胞小滴の縁の最大強度画像を撮影した。ゲルの光学的断面のＺシリーズも撮影し、組み立て直後に固定及び染色された別のアッセイの撮影された光学的断面（０時間温置）と比較した。これは、小滴から全ての方向に細胞遊走が起こったことを示すために行われた。
【００５１】
統計解析
各処理内において各細胞小滴反復のｍｍ周囲当りの遊走する細胞数に相当する値を平方根に変換した。次いで、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍＴＭソフトウェアを用いて、これらを一元配置の分散分析（ＡＮＯＶＡ）及びダネットの多重比較検定にかけた。各処理内の各小滴反復下で、細胞によって達成された直線遊走距離をまとめた。次いで、正常な分布を確保するために、それらを対数変換し、適切な処理カテゴリー下において、幾何平均を順に並べた。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍＴＭソフトウェア内で使用できる一元配置のＡＮＯＶＡ及びダネットの多重比較検定を用いて、順に並べられた平均を解析した。全ての事例で、各分散を確認し、統計的な有意性をＰ＜０．０５と定義した。
【００５２】
三次元インビトロアッセイ−繊維芽細胞の形態及びマトリックスの組織化Ｉ
別の実験において、僅かな修飾を加えて、上述のように三次元インビトロアッセイを組み立てた。ここで、３×１０５細胞／ｍＬのより低い細胞密度を含有する１つの２０μＬ小滴を各アッセイ中に組み込んだ。１μｇ／ｍＬＥＳ、５μｇ／ｍＬＥＳ又はＰＢＳブランク（対照）の何れかでアッセイを処理した。位相差顕微鏡を用いて、０、２４及び４８時間の温置後に、細胞の形態を観察した。ゲルマトリックスの外観にも着目した。
【００５３】
三次元インビトロアッセイ−繊維芽細胞遊走
繊維芽細胞の遊走を調べるために、三次元インビトロアッセイを組み立てた。アッセイ組み立て直後（０時間）又は４８時間の温置後（４８時間）に固定されたゲルの共焦点顕微鏡画像は、第一に、０時間の温置の時点で細胞小滴の外側に細胞が全く観察されなかったこと、第二に、４８時間にわたって細胞小滴からの細胞の遊走が水平及び垂直の両配向で起こることを確認し、遊走の三次元の性質を確認した（ＨｏｒｏｂｉｎＡＪＰｈＤｔｈｅｓｉｓ，２００４）。
【００５４】
幼虫のＥＳに応答する細胞の遊走を定量する上で、２つの別個の実験を行った。一方の実験は、ＥＳが存在しない対照に対して０．１μｇ／ｍＬＥＳ及び５μｇ／ｍＬＥＳの効果を比較した。他方の実験は、別の対照と比較した場合の１μｇ／ｍＬＥＳ及び１０μｇ／ｍＬＥＳの効果を調べた。各実験において、同じフラスコ及び継代からの細胞を使用した。
【００５５】
各小滴からの細胞遊走を調べるために画像を撮影した。２４時間の温置で、５μｇ／ｍＬのＥＳの存在下での細胞の遊走が最も大規模であるように見受けられることが視覚的観察によって明らかとなった（図５ａ）。形態的には、これらの細胞は、対照内の細胞より十分に広がっているようにも見受けられ、周囲のゲル中に、より長く、より多数の伸長突起を突出させていた（図６ａ）。４８時間の温置までに、５μｇ／ｍＬＥＳに曝露されたゲルは半透明であり、皿の表面から剥離された状態となった。細胞小滴は収縮し、マトリックスを内側に引っ張り、小滴間のマトリックス内の張力を増加させた。この時点までに、１μｇ／ｍＬＥＳに曝露された細胞は、それぞれの対照よりさらに遊走するように見受けられ（図５ｂ）、周囲のゲル中に長い伸長突起を有する十分に広がった形態も採っていた（図６ｂ）。これに対して、１０μｇ／ｍＬＥＳの存在下の細胞小滴はサイズが低下し、細胞の幾つかの領域は緊密な暗い塊へ収縮していた（図５ｂ）。これは、予めゲル化された溶液の、この時点で、透明な粘性のある液体状態と関連していた可能性がある。対照と比較すると、１０μｇ／ｍＬＥＳに曝露された細胞の形態は明確に異なっていた。ここでは、２４時間の温置において、細胞は多数の細い伸長突起を呈し、それらの幾つかは極めて長かった（図６ｃ）。４８時間の温置では、細胞は収縮して、丸くなるが、長く、細い細胞間伸長突起の突出を通じた他の細胞との直接的な物理的接触を維持していた（図６ｄ）。
【００５６】
各小滴の全体を見ることができる低倍率画像を用いて、各小滴からの細胞遊走の合計を定量した。２４時間の温置で、適切な対照と比べて、遊走している細胞の数（Ｐ＜０．０１）（図７）及び移動した距離（Ｐ＜０．００１）（図８）の両方の観点で、５μｇ／ｍＬＥＳは細胞の遊走を有意に増強したことが分析によって確認された。１μｇ／ｍＬのＥＳも、その対照を上回って、細胞遊走を有意に増強した（細胞数に関してＰ＜０．０１及び移動した距離に関してＰ＜０．０５）（図７、８）。これに対して、１０μｇ／ｍＬのＥＳは、その対照と比べて、細胞遊走を有意に阻害した（細胞数に関してＰ＜０．０１及び移動した距離に関してＰ＜０．００１）（図７、８）。０．１μｇ／ｍＬＥＳへの曝露は、遊走する細胞の数を僅かに阻害するように見受けられた（対照に対してＰ＜０．０５）（図７）。しかしながら、０．１μｇ／ｍＬＥＳは、対照と比べて、遊走距離に対して有意な影響を有さず（Ｐ＞０．０５）（図８）、細胞の形態にも影響を与えないように見受けられた（データは示さず）。実験１の対照（図７ａ）中で遊走する細胞の数は実験２の対照（図７ｂ）中より高いことにも注目し得る。実験間のこのような差は、血球計測器を用いて細胞数を推定する場合に避けることができない誤差水準によってもたらされる細胞小滴内の細胞密度の僅かな差によるものであり得る。しかしながら、このような潜在的な変動源は実験間に存在するに過ぎず、（各実験内の各アッセイを組み立てるために、多数の細胞の計数に同じものが使用されたので）実験内には存在しない。従って、各実験内で結果を比較することはなお妥当であるが、実験間で結果を比較することは妥当でない。
【００５７】
三次元インビトロアッセイ−繊維芽細胞の形態及びマトリックスの組織化ＩＩ
繊維芽細胞の形態及びマトリックスの組織化を調べるために、繊維芽細胞のより低い密度を含有する三次元インビトロアッセイを組み立てた。アッセイを組み立てた直後には、ＥＳの存在下又は不存在下の細胞は同じように見えた（図９）。しかしながら、２４時間の温置までに、１μｇ／ｍＬＥＳ、特に５μｇ／ｍＬＥＳの存在下の細胞は、ＥＳの不存在下の細胞より、より長い細胞質伸長突起を有するより十分に広がった形態を採った。５μｇ／ｍＬのＥＳが存在する場合には、細胞間の並列された鎖様結合性マトリックス原繊維が観察された。４８時間の温置では、アッセイ間の差はより顕著であった。この時点までに、ＥＳの不存在下では、細胞はより丸い状態となった（図９）。一方、１μｇ／ｍＬのＥＳ又は５μｇ／ｍＬのＥＳに曝露された細胞は十分に広がった形態を維持していた。５μｇ／ｍＬのＥＳに曝露された細胞間で観察された、並列された鎖様結合性原繊維は、より見やすく、数が多かった。さらに、マトリックスはより透明であるように見え、原繊維の無作為な網目構造はより目立たなかった。
【００５８】
（比較例１）
本発明者らは、ＥＳキモトリプシンの効果を市販のウシキモトリプシンと比較するためにさらなる実験を行った。従って、フィブロネクチンへの繊維芽細胞の接着に対するＥＳの効果をトリプシン及びキモトリプシンの市販の調製物と比較した。これは、ＥＳ、市販のトリプシン又は市販のキモトリプシンの様々な濃度の存在下で、フィブロネクチンで被覆された表面上に繊維芽細胞を播種することによって達成された。最大４８時間の温置期間後に、全ての培地から試料を吸引し、穏やかに洗浄して、表面に付着することができなかった細胞を除去した。次いで、検出されたＡＴＰの濃度に従って、表面上に残存する細胞の相対数を定量するためにアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）アッセイを行った。トリプシン特異的な基質に対する活性の同等のレベルを含有するＥＳ及びトリプシンの効果を比較すると、ＥＳは、表面への繊維芽細胞の接着を低下させる上でより効果的であった。例えば、２４時間の温置後、５μｇ／ｍＬのＥＳは、対照の１６．６％まで細胞接着を低下させた（図１０ａ）。トリプシン特異的な蛍光発生基質トシル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＡＭＣに対するＥＳの活性の１０３．２％を示した市販のトリプシン（１．６μｇ／ｍＬ）は、対照の３４．９％まで細胞接着を低下させた。４８時間の温置後、５μｇ／ｍＬＥＳの存在下での細胞接着は対照の９．３％まで減少したのに対して、１．６μｇ／ｍＬの市販のトリプシンは細胞の接着を対照の２４．７％まで低下させた。
【００５９】
キモトリプシン特異的な蛍光発生基質（Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＡＭＣ）に対する５μｇ／ｍＬのＥＳの活性の９４．１％を示した市販のキモトリプシン（０．１μｇ／ｍＬ）は、繊維芽細胞の接着を修飾する能力を示さなかった（図１０ｂ）。キモトリプシン特異的な基質に対する５μｇ／ｍＬのＥＳの活性の２０４．９％を示す０．２μｇ／ｍＬの市販のキモトリプシンでさえ、繊維芽細胞接着に対して効果を有していなかった。市販のトリプシンと市販のキモトリプシンの両方に曝露された繊維芽細胞は、市販のトリプシンのみの同様の濃度に曝露された細胞を上回る接着の修飾を同時に一切示さなかった。
【００６０】
これらの結果は、繊維芽細胞接着を修飾する上で、ＥＳ内に存在するキモトリプシンなどの酵素が市販のトリプシン若しくは市販のキモトリプシン単独又は組み合わせより有効であることを示している。ＥＳが繊維芽細胞の接着を修飾する能力が、タンパク質分解を介して、フィブロネクチンで被覆された表面を修飾するその能力と関連していることが以前の研究によって示されている（Ｈｏｒｏｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ２００３、上記）。従って、これらの結果は、細胞外マトリックスタンパク質を分解する上で、ＥＳは、市販のトリプシン又は市販のキモトリプシンより有効であり得ることを示唆している。これは、ゲル電気泳動を用いて確認される。ここでは、トリプシン特異的又はキモトリプシン特異的な基質に対して類似の活性を有する溶液を得るために、幼虫のＥＳ、市販のトリプシン、市販のキモトリプシン又は市販のトリプシンと市販のキモトリプシンの組み合わせの試料を希釈した。次いで、１２％ポリアクリルアミドゲル上で分離する前に、２４時間、ウシフィブロネクチン（１００μｇ／ｍＬ）を、３７℃で、これらの溶液に曝露した。図示されているように、ＥＳは、市販の両酵素と比較した場合に、フィブロネクチンを主により小さな断片へより大規模に分解した（図１１）。さらに、ＥＳ内に存在するタンパク質分解性酵素は繊維芽細胞の遊走を強化することが示された（Ｈｏｒｏｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ２００５上記）。これは、繊維芽細胞の接着の変化と関連し得る。創傷の中で、繊維外細胞の遊走の加速は、創傷空間中への肉芽組織増殖を促進し得る。このように、ＥＳ由来の酵素は、現在市販されている酵素より有効な創傷郭清因子であることが明らかとなり得るのみならず、創傷治癒応答も同時に増強し得る。
【００６１】
（実施例２）
創傷郭清
ウジのキモトリプシンの精製
Ｌ．セリカータＥＳ産物のＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ３００クロマトグラフィー。
【００６２】
ガラスクロマトグラフィーカラム（１．５ｃｍ×５０ｃｍ）にＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−３００ＨＲを充填し、ＰＢＳで平衡化した（流速０．３３ｍＬ／分）。幅広い範囲のゲルろ過標準物質（２００−１２．５ｋＤａ，Ｓｉｇｍａ）を用いて、カラムを較正し、空隙容量を求めた。Ｌ．セリカータのＥＳ産物約２ｍＬ（０．５ｍｇ）をカラムにかけ、空隙容量５０画分の溶出後（２ｍＬ／画分）を集め、それぞれ、蛍光性基質Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＡＭＣ及びトリス−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＡＭＣを用いて、キモトリプシン及びトリプシン活性に関してアッセイを行った。Ｓ３００ゲルろ過後のキモトリプシン／トリプシン活性を示す図１４及び１５を参照されたい。典型的には、トリプシンが濃縮された２つのピーク（Ｔ１及びＴ２と名付けられた。）及びキモトリプシン活性が濃縮された１つのピーク（Ｃ１と名付けられた。）というタンパク質分解活性の３つのピークが観察された。図１５は、ゼラチンＳＤＳ−ＰＡＧＥ基質ゲル分析によって測定された活性の各ピークに対して典型的なタンパク質分解特性も示す。
【００６３】
蛍光性合成ペプチド基質を用いたキモトリプシン／トリプシン活性のアッセイ
７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）の、Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＡＭＣ（キモトリプシン）及びトシル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＡＭＣ（トリプシン）からの放出をモニタリングすることによって、キモトリプシン／トリプシン活性を評価した。ＰＢＳ中に希釈された基質１５０μＬ（５μＭ）とともに各画分５０μＬを温置した。３７℃で３０分間、試料を温置し、その後、ＤｙｎｅｘＭＦＸマイクロプレート蛍光光度計を用いて蛍光を測定した（励起３６５ｎｍ、発光検出４６５ｎｍ）。ゼロ時点の読み取りの推測後、３０分にわたって発せられた蛍光単位の数として、タンパク質分解活性を表す。
【００６４】
ゼラチン基質ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いたキモトリプシン／トリプシン活性のアッセイ
Ｋｕｍａｒ＆Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ（１９９２）によって記載された方法を用いて、基質ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。分離ゲル中に０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチンを含めて、１２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを調製した。ゼラチンを溶解するために、ゲルを５５℃まで加温した。各画分１０μＬを非還元試料緩衝液（０．５ＭＴｒｉｓ、ｐＨ６．８、５％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）、２０％グリセロール（ｗ／ｖ）、０．０１  ％ブロモフェノールブルー）の等容量と混合し、３７℃で３０分間温置した。次いで、スタッキングゲル中に形成された各ウェルに画分を適用し、２０ｍＡの定常電流で試料を電気泳動した。電気泳動後、Ｌａｃｋｓ＆Ｓｐｒｉｎｇｈｏｒｎ（１９８０）によって記載されたように酵素を再生するために、室温で２０分間、２．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中でゲルを洗浄した。次いで、水の中で２０分間、ゲルを洗浄し、最後に、ＰＢＳ中において、３７℃で一晩温置した。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅＲ２５０でゲルを染色することによって、タンパク分解活性を検出し、青の背景に対する透明なバンドの領域として観察される。
【００６５】
大豆トリプシン阻害剤アガロース上でのアフィニティークロマトグラフィーによるキモトリプシンの精製
キモトリプシン活性のＣ１プールの塩濃度を０．５ＭＮａＣｌに調整し、ＰＢＳ、０．５ＭＮａＣｌで平衡化された大豆トリプシン阻害剤アガロースカラム３ｍＬ（流速０．２ｍＬ／分）にかけた。カラムを通過する緩衝液の２８０ｎｍでの吸光度がゼロになるまで、ＰＢＳ、０．５ＭＮａＣｌでカラムを洗浄した。０．７％エタノールアミンによって、結合されたタンパク質を溶出し、１ｍＬ画分を集め、２ＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（１：１ｖ／ｖ）で直ちに中和し、プールし、ＰＢＳに対して一晩透析した（図１６）。蛍光性基質及びゼラチンＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いるタンパク分解活性に関して、溶出されたタンパク質をアッセイした（図１７）。
【００６６】
図１７は、Ｃ１プールの適用後に大豆トリプシン阻害剤アガロースに結合されたタンパク質のタンパク質分解活性及び阻害剤の性質決定を示している。大豆トリプシン阻害剤アガロースカラムから溶出するタンパク質はキモトリプシンの基質Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＭＣを切断し、ＰＭＳＦによってのみ阻害され得ることが示された。トリプシンの基質トシル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＡＭＣに対しては、活性が見られなかった。ゼラチン基質ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析すると、タンパク質分解活性の少なくとも３つの異なる領域が観察された（矢印が付されている。）。
【００６７】
大豆トリプシン阻害剤アガロース上でのアフィニティークロマトグラフィーによるトリプシンの精製
同様に、大豆トリプシン阻害剤カラムにトリプシン画分のＴ２プールを通した。カラムから溶出する画分を直ちに中和し、プールし、ＰＢＳに対して一晩透析した（図１９）。
【００６８】
図１９は、Ｔ２プールの適用後に大豆トリプシン阻害剤アガロースに結合されたタンパク質のタンパク質分解活性及び阻害剤の性質決定を示している。大豆トリプシン阻害剤アガロースカラムから溶出するタンパク質はトリプシンの基質トシル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＡＭＣを切断し、ＰＭＳＦ及びＡＰＭＳＦによって阻害され得ることが示された。キモトリプシンの基質Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＭＣに対しては、活性が見られなかった。ゼラチン基質ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析すると、タンパク質分解活性の少なくとも１つの明瞭な領域が観察された（矢印が付されている。）。
【００６９】
創傷痂皮に対するＥＳ産物の効果
Ｌ．セリカータＥＳ産物１０μｇとともに、創傷痂皮の約１ｍｇを一晩温置した。温置後、Ｂｉｏｒａｄ等電点電気泳動再水和緩衝液（８Ｍ尿素、２％ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭＤＴＴ、０．２％Ａｍｐｈｏｌｙｔｅｓ）中に処理された痂皮及び処理されていない痂皮を溶解した。Ｂｉｏｒａｄ２Ｄタンパク質「クリーンアップ」キットを用いて、タンパク質をさらに精製し、得られた沈降物を等電点電気泳動再水和緩衝液中に再度可溶化した。
【００７０】
次いで、二次元ゲル分析によって、創傷痂皮に対するＥＳ産物の効果を調べた。製造業者によって記載された条件下で、「ＲｅａｄｙＳｔｒｉｐ」７ｃｍＩＰＧ片ｐＨ３から１０（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて、タンパク質約１００μｇを一次元に集中させた。１０％トリセンゲルを用いて、二次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した（Ｓｃｈａｇｇｅｒ  ａｎｄ  Ｖｏｎｊａｇｏｗ，１９８７）。ＣｏｏｍａｓｓｉｅブルーＲ２５０でゲルを染色した。図２０。
【００７１】
創傷痂皮に対するキモトリプシン／トリプシンプールの効果
Ｌ．セリカータＣ１、Ｔ１又はＴ２プール１００μＬとともに、創傷痂皮の約１ｍｇを一晩温置した。温置後、処理された痂皮及び処理されていない痂皮を上記のように処理した。
【００７２】
次いで、二次元ゲル分析によって、創傷痂皮に対するＣ１、Ｔ１又はＴ２プールの効果を調べた。上記のように、タンパク質約１００μｇを二次元に集中させた。ＣｏｏｍａｓｓｉｅブルーＲ２５０でゲルを染色した。図２１。
【００７３】
Ｌ．セリカータのキモトリプシン遺伝子をクローニングする
ＮｃｏＩ制限部位（５’−ＣＴＧＣＣＡＴＧＧＴＣＡＴＧＡＡＡＴＴＣＴＴＡＡＴＡＧＴＴ−３’）を付加するフォワードプライマー及びＮｈｅＩ部位（５’−ＧＡＣＧＣＴＡＧＣＡＴＡＡＧＡＡＡＴＴＣＣＧＧＴＧＴＧ−３’）を付加するリバースプライマーを使用するＰＣＲによって、ｃＤＮＡライブラリーからＬ．セリカータキモトリプシノーゲンの完全長翻訳領域（ＯＲＦ）を増幅した。生じた断片をｐＢａｃ−３中のポリヘドリンプロモーターの下流にクローニングさし、配列決定し（図１２）、アミノ酸配列を予想した（図１３）。
【００７４】
従って、ルシリア・セリカータのＥＳが本明細書に示されているアミノ酸及びＤＮＡ配列を有するキモトリプシン酵素を含有し、この酵素は創傷を郭清するとともに、繊維芽細胞の遊走の促進によって、マトリックス再構築の促進によって、及び繊維芽細胞の形態の修飾によって創傷の治癒を促進すると結論付けることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2009538611.tif 000029
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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