(57)【要約】  抗原特異的記憶T細胞の希少集団を増殖、検出または単離するインビトロ方法が記載されている。遺伝子改変された記憶T細胞集団を得るインビトロ方法も記載されている。こうして得られた細胞の使用も開示されている。
2009504151.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の抗原特異的記憶T細胞の希少集団を増殖させるインビトロ方法であって、前記抗原特異的記憶T細胞の希少集団を選択的に増殖させることができる少なくとも1種のサイトカイン受容体アゴニストの有効量に、前記試料を曝露するステップを含む方法。
【請求項２】
サイトカイン受容体アゴニストが、サイトカインまたはこの誘導体である、請求項1に記載のインビトロ方法。
【請求項３】
少なくとも1種のサイトカイン受容体アゴニストが、IL-7受容体アゴニストまたはIL-15受容体アゴニストである、請求項1または2に記載のインビトロ方法。
【請求項４】
IL-15受容体アゴニストまたはIL-7受容体アゴニストもそれぞれ存在している、請求項3に記載のインビトロ方法。
【請求項５】
前記抗原特異的記憶T細胞の希少集団が、CD4+および/またはCD8+および/またはγδおよび/またはNKT T細胞集団を含む、請求項1から4に記載のインビトロ方法。
【請求項６】
前記試料が、血液および生物起源の他の液体試料、固形組織試料、これら由来の細胞の組織培養物およびこの子孫、生物試料からの単離細胞からなる群に属する生物試料である、請求項1から5に記載のインビトロ方法。
【請求項７】
試料中の抗原特異的記憶T細胞の希少集団を検出するインビトロ方法であって、
a)前記請求項1から6のいずれか一項に記載の、抗原特異的記憶T細胞の希少集団を選択的に増殖させることができる少なくとも1種のサイトカイン受容体アゴニストの有効量に、前記試料を曝露するステップと、
b)前記抗原特異的記憶T細胞の増殖した希少集団の1つに特異的なリガンドである、少なくとも1つのリガンドと共に、前記試料をインキュベートするステップと、
c)特異的リガンドに結合した抗原特異的記憶T細胞の増殖した希少集団を検出するステップと
を含む方法。
【請求項８】
前記特異的リガンドが、前記抗原特異的記憶T細胞の希少集団の1つに特異的な抗原またはこの誘導体である、請求項7に記載のインビトロ方法。
【請求項９】
特異的抗原が、マイコバクテリウム、ニューモシスティスカリニ、熱帯熱マラリア原虫、カンジダ、トキソプラズマ、CMV、EBV、BPV、HCV、HBV、HIVを含むが、これらに限定されない微生物病原体に関連している、請求項8に記載のインビトロ方法。
【請求項１０】
抗原が、腫瘍関連抗原である、請求項8に記載のインビトロ方法。
【請求項１１】
抗原が、アレルゲンである、請求項8に記載のインビトロ方法。
【請求項１２】
抗原が、自己抗原である、請求項8に記載のインビトロ方法。
【請求項１３】
特異的抗原が、抗原MHC複合体またはこの誘導体として存在する、請求項8から12に記載のインビトロ方法。
【請求項１４】
前記抗原特異的記憶T細胞の増殖した希少集団の検出が、結合アッセイにより行われる、請求項7から13に記載のインビトロ方法。
【請求項１５】
前記抗原特異的記憶T細胞の増殖した希少集団の検出が、サイトカイン放出アッセイにより行われる、請求項7から13に記載のインビトロ方法。
【請求項１６】
前記抗原特異的記憶T細胞の増殖した希少集団の検出が、増殖アッセイにより行われる、請求項7から13に記載のインビトロ方法。
【請求項１７】
細胞が、試料を特異的リガンドと共にインキュベートする前に、蛍光生体染色色素で標識され、検出ステップが、色素希釈アッセイにより行われる、請求項7から13に記載のインビトロ方法。
【請求項１８】
請求項7から17に記載の、試料中の抗原特異的記憶T細胞の希少集団を検出する方法を実施するためのキットであって、少なくとも1種のサイトカイン受容体アゴニスト、抗原特異的記憶T細胞の希少集団に特異的な少なくとも1種のリガンド、検出手段を含むキット。
【請求項１９】
試料中の抗原特異的記憶T細胞の希少集団を単離するインビトロ方法であって、
a)前記請求項1から6のいずれか一項に記載の、抗原特異的記憶T細胞の希少集団を選択的に増殖させることができる少なくとも1種のサイトカイン受容体アゴニストの有効量に、前記試料を曝露するステップと、
b)前記抗原特異的記憶T細胞の増殖した希少集団の1つに特異的なリガンドである、少なくとも1つのリガンドと共に、前記試料をインキュベートするステップと、
c)特異的リガンドに結合した抗原特異的記憶T細胞の増殖した希少集団を単離するステップと
を含む方法。
【請求項２０】
前記特異的リガンドが、前記抗原特異的記憶T細胞の希少集団の1つに特異的な抗原またはこの誘導体である、請求項19に記載のインビトロ方法。
【請求項２１】
特異的抗原が、マイコバクテリウム、ニューモシスティスカリニ、熱帯熱マラリア原虫、カンジダ、トキソプラズマ、CMV、EBV、BPV、HCV、HBV、HIVを含むが、これらに限定されない微生物病原体に関連している、請求項19に記載のインビトロ方法。
【請求項２２】
抗原が、腫瘍関連抗原である、請求項19または20に記載のインビトロ方法。
【請求項２３】
抗原が、アレルゲンである、請求項19または20に記載のインビトロ方法。
【請求項２４】
抗原が、自己抗原である、請求項19または20に記載のインビトロ方法。
【請求項２５】
特異的抗原が、抗原MHC複合体またはこの誘導体として存在する、請求項19から24に記載のインビトロ方法。
【請求項２６】
前記抗原特異的記憶T細胞の増殖した希少集団の単離が、結合ステップにより行われる、請求項19から25に記載のインビトロ方法。
【請求項２７】
前記抗原特異的記憶T細胞の増殖した希少集団の単離が、IL-2、IFN-g、IL-4、IL-5、IL-10、TNF-アルファ、TGF-ベータ、グランザイムに関するELISPOTアッセイ、ELISAアッセイ、フローサイトメトリーサイトカイン検出アッセイを含むがこれらに限定されない、サイトカインおよびサイトトキシン産生物の測定により行われる、請求項19から25に記載のインビトロ方法。
【請求項２８】
免疫、感染、癌、アレルギー、自己免疫に関連した病態の診断的および/または予後的臨床試験のための、請求項1から27のいずれかに記載のインビトロ方法。
【請求項２９】
免疫、感染、癌、アレルギー、自己免疫に関連した病態の治療および/または予防のための、請求項18から26に記載の方法により単離された希少T細胞集団の使用。
【請求項３０】
前記希少T細胞集団が、遺伝子改変されている、請求項29に記載の希少T細胞集団の使用。
【請求項３１】
遺伝子改変された記憶T細胞集団を得るインビトロ方法であって、
a)リンパ球活性化を誘導することができる、アゴニスト抗体、組換えリガンドおよびこの誘導体を含むがこれらに限定されない、少なくとも2種の特異的活性化受容体アゴニストでリンパ球を活性化するステップと、
b)記憶T細胞集団を選択的に増殖させることができる、少なくとも1種のサイトカイン受容体アゴニストの有効量に、活性化リンパ球を曝露するステップと、
c)b)で得られた細胞に、適切なベクターを用いて外来遺伝子を挿入し発現させるステップと
を含む方法。
【請求項３２】
前記記憶T細胞の集団が、CD4+および/またはCD8+および/またはγδおよび/またはNKT T細胞集団を含む、請求項31に記載のインビトロ方法。
【請求項３３】
前記リンパ球が、血液および生物起源の他の液体試料、固形組織試料、これら由来の細胞の組織培養物およびこの子孫、生物試料からの単離細胞からなる群に属する生物試料由来である、請求項31または32に記載のインビトロ方法。
【請求項３４】
特異的リンパ球活性化受容体アゴニストが、細胞模倣担体に結合している、請求項31から33に記載のインビトロ方法。
【請求項３５】
細胞模倣担体が、常磁性ビーズである、請求項31から34に記載のインビトロ方法。
【請求項３６】
リンパ球活性化受容体アゴニストの1つが、CD3ポリペプチドに特異的である、請求項31から35に記載のインビトロ方法。
【請求項３７】
リンパ球活性化受容体アゴニストの1つが、共刺激受容体、すなわちCD28に特異的である、請求項31から36に記載のインビトロ方法。
【請求項３８】
少なくとも1種のサイトカイン受容体アゴニストが、IL-7受容体アゴニストまたはIL-15受容体アゴニストである、請求項31から37に記載のインビトロ方法。
【請求項３９】
IL-15受容体アゴニストまたはIL-7受容体アゴニストもそれぞれ存在している、請求項31から38に記載のインビトロ方法。
【請求項４０】
ベクターがウイルスベクターである、請求項31から39に記載のインビトロ方法。
【請求項４１】
外来遺伝子が、自殺遺伝子、および/またはマーカー遺伝子、および/または生物活性分子、および/または受容体、および/または細胞内に維持されるもしくは細胞外に放出される可溶性因子、および/またはプロドラッグに耐性を与える遺伝子をコードする、請求項31から40に記載のインビトロ方法。
【請求項４２】
癌、感染症、免疫不全もしくは自己免疫の治療および/または予防のための、または造血前駆細胞もしくは固形臓器の移植のための、請求項31から41に記載の方法により生成された遺伝子改変記憶T細胞集団の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
抗原(Ag)特異的T細胞のレパートリーは、抗原が存在しなくてもその持続性および機能性を確保するホメオスタシス機構により厳重に制御されている。ナイーブT細胞は、Agに遭遇した後、急速にクローン増殖を起こし、エフェクターT細胞に分化する(1、2)。エフェクターT細胞の寿命は、さらにAgに遭遇すると生じうる細胞死(活性化誘導細胞死)により、または生存因子の欠如により制限される。免疫応答中に、記憶T細胞も産生される。記憶T細胞は、一生を通じて生存することができるため、再生病原体に対する長期防御をもたらす(3)。しかし、ほとんどの生物試料では抗原特異的記憶T細胞の発生頻度は、細胞内サイトカイン染色およびELISPOTなどの、Ag/MHC(主要組織適合複合体)四量体染色および機能アッセイの検出限界以下にとどまっている(4、5)。特にAg特異的CD4+ T細胞は、エクスビボではほとんどが検出不能であるため、インビトロでのAg誘導T細胞増殖を複数回行った後に分析される。しかし、インビトロでの再刺激は、細胞の末端分化を支持する可能性があり、その長期生存を妨害する。その結果、インビトロでAg再刺激されたT細胞は、インビボで見出される表現型を完全に代表しているとはいえない表現型を示す可能性もある。このため、Ag特異的T細胞のエクスビボでの検出を改善する代替戦略は、進行中の免疫応答をよりうまく特性化し、免疫関連障害患者の免疫能力を評価することが必要とされる。
【０００２】
幾つかの研究は、T細胞記憶の確立および維持が、細胞関連(Ag/MHC複合体)および可溶性(サイトカイン)誘導シグナルにより制御されることを示している(3、6、7)。自己および非自己Ag/MHC複合体によるTCRのトリガリングにより、ナイーブ細胞から記憶細胞への移行、記憶細胞の生存および増殖が制御される。記憶リンパ球のプールは、きわめて不均一である可能性がある。最近、2種類の記憶T細胞が同定された。エフェクター記憶T細胞(CD45RA-、CCR7-、CD62L-)、ならびに二次リンパ器官のT細胞領域へのホーミングに必要な2つの分子CCR7およびCD62Lの発現を特徴とする、CD45RA陰性細胞であるセントラル記憶T細胞である。抗原刺激があると、セントラル記憶T細胞は、IL-4およびIFN-γなどの低レベルのエフェクターサイトカインを産生するが、セントラル記憶T細胞の迅速で一貫した増殖を維持することができる、高レベルのIL-2を産生する。セントラル記憶T細胞は、抗原に遭遇すると、1)セントラル記憶T細胞のプールを増加させるための自己再生過程をもたらす増殖と、2)低増殖能を特徴とするが、刺激された非リンパ組織に移動し、免疫応答のエフェクター相を媒介することができる、エフェクター記憶T細胞の産生をもたらす分化とを起こす(8)。Agの除去は、過剰なTCR刺激および活性化誘導細胞死を回避するため、およびセントラル記憶T細胞の産生に重大な意味を持つ。適切なT細胞ホメオスタシスは、ヒトおよびマウスのTリンパ球の生存、増殖およびアポトーシスを厳重に制御するサイトカインにより、確保される。可溶性因子のうち、IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15およびIL-21などの共通γ鎖結合サイトカインは、細胞の生存およびホメオスタティック増殖を促進する(2)。特に、IL-2は、抗原に遭遇すると、T細胞の増殖およびアポトーシスの両方を持続させる。TCRならびにIL-7により生成されたシグナルは、ナイーブ細胞および記憶細胞の増殖および生存を制御する(7、9〜14)。IL-7は、TCRと結合しないと、成熟したヒトナイーブCD4+ T細胞および記憶CD4+ T細胞のFas誘導細胞死に対する感受性を低下させる(15)。さらに、Bcl-2のアップレギュレーションを誘導することで、IL-7は、Agを経験したCD4+ T細胞の静止記憶細胞への移動を支持する(9、11)。最後に、IL-15は、抗アポトーシス活性を、ナイーブT細胞および記憶T細胞の増殖を促進する一貫した効果と組み合わせる(16)。このため、共通γ鎖結合サイトカインは、Ag特異的T細胞系のインビトロでの維持および増殖のため、Ag誘導細胞増殖と併用して以前から使用されてきた。幾つかの例では、共通γ鎖結合サイトカインは、Ag特異的T細胞の検出を改善するのにも使用された。
【０００３】
米国特許出願US2005/0074822は、共通γ鎖結合サイトカインの存在下、細胞が抗原に曝露される、抗原特異的T細胞集団の検出方法に言及している。この方法は、Ag特異的記憶細胞を増殖、または濃縮させることができない。
【特許文献１】米国特許出願US2005/0074822
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
反対に、本発明では、本発明者らは、IL-7および/またはIL-15が、以下を可能にするかどうか調べた。
1)記憶T細胞のAgフリーの環境での蓄積を可能にし、病原体/腫瘍/アレルゲン/自己特異的T細胞を同定できるようにするかどうか(したがって、Ag誘導細胞増殖の非存在下で短期のインビトロ培養に使用して、インビボで初回抗原刺激された抗原特異的T細胞(それぞれがインビボで遭遇する抗原に特異的)の希少集団を濃縮することができるかどうか)。2)セントラル記憶細胞を、この機能表現型を維持しつつ増殖させることができるかどうか(したがって、ウイルスベクターによるセントラル記憶リンパ球の遺伝子改変を促進するのに使用することができるかどうか)。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明を検証するため、本発明者らは、3つの無関係な前臨床動物モデルを利用し、さらにヒト試料での検証を行った。最初の2つのモデルは、腫瘍疾患と関連して、単一細胞レベルでのAg特異的T細胞(17)、および樹状細部ベースのワクチン接種(18)の計数を可能にする。これらのモデルは、Agフリーの環境におけるインビトロでのT細胞蓄積の概念検証を可能にする。第3のモデルは、免疫不全マウスにおけるヒトT細胞移植に基づくため、遺伝子改変されたセントラル記憶T細胞の免疫能を評価することができる。
【０００６】
モデル1。腫瘍特異的T細胞応答を試験するため、本発明者らは、最近開発された動物モデルを利用した(17)。このモデルでは、TS/A-LACK腫瘍(大形リーシュマニア由来抗原タンパク質LACKを発現するTS/A腺癌性腫瘍細胞)は、同系BALB/cマウスで増殖され、およびLACK特異的T細胞は、抹消リンパ器官(リンパ節、脾臓または血液)で、蛍光LACK-ペプチド/MHCクラスII多量体によるフローサイトメトリーにより試験された。このモデルでは、LACK特異的T細胞は、Ag誘導細胞内サイトカイン放出を独自に特徴とすることもできる。TS/A-LACK特異的T細胞は、LACK特異的CD4 T細胞応答のより容易な特性づけを可能にする、LACKに特異的なトランスジェニックTCR β鎖を発現する、BALB/cマウスおよび16.2β TCRトランスジェニックマウスにおいて追跡することができる。さらに、TS/A細胞は、本来、内因性MuLVのエンベロープタンパク質gp70を発現する。エンベロープタンパク質gp70の免疫優勢エピトープについては、以前に記述されている(AH-1、(19))。故に、LACK特異的CD4 T細胞応答に加えて、AH-1特異的T細胞応答も、TS/A-LACK腫瘍を有するマウスにおいて追跡することができる。
【０００７】
モデル2。ワクチン特異的T細胞応答を試験するため、本発明者らは、ウイルスのSV40由来抗原ペプチドTag IVでパルスした骨髄由来樹状細胞(DC)を使用し、同系C57BL/6マウスをワクチン接種した(18)。このモデルでは、Tag IV特異的CD8 T細胞応答を計数するため、Tag IV特異的T細胞もエクスビボの抗原特異的サイトカインアッセイにより特性化された。
【０００８】
Ag特異的CD4(LACK)およびCD8(AH-1、Tag IV)T細胞応答の試験は、Ag誘導細胞刺激の非存在下、IL-7の存在下で、提案された短期インビトロ培養を行った後にエクスビボで行われた。IL-7および、比較としてIL-2、またはIL-15、ならびに陰性対照として、IL-6、IL-10およびTNF-αの最適量が使用された。全実験条件において、本発明者らは、IL-7最適量での簡単な短期培養は、Ag誘導細胞増殖の必要性を回避しリンパ球本来の表現型を維持しつつ、インビボで初回抗原刺激されたAg特異的Tリンパ球を蓄積させることを見出した。最も重要なことは、幾つかの例ではIL-7における短期培養が、従来のアッセイでは検出できなかったAg特異的T細胞の希少集団を明らかにした点である。
【０００９】
ヒト試料における結果検証では、Tリンパ球は、健常ドナーおよびヒト型結核菌に感染した患者由来であり、抗原特異的サイトカインの放出によるIL-7誘導短期培養後にエクスビボで分析された。全例で、IL-7は、記憶T細胞のインビトロでの増殖および生存を持続させることで、抗原特異的なIL-2およびIFN-γを産生する中間記憶T細胞の蓄積を支持した。IL-7の効力は、インビボでの抗原遭遇、最適サイトカイン量、および高細胞濃度条件に依存し、抗LFA-1抗体およびシクロスポリンAにより抑制された。IL-7は、CD4記憶T細胞増殖に関して、IL-2およびIL-15より著しく効率的であった。
【００１０】
試験結果から以下のことが示される。
1)高細胞密度での短期培養、および最適IL-7、またはIL-15量は、インビボで初回抗原刺激された記憶CD4およびCD8T細胞集団の維持および選択的増殖に適している。これらの細胞は、IL-2およびIFN-g分泌能、ならびにIL-7(CD4)またはIL-15(CD8)に反応した急速な増殖能として最もよく定義される。
【００１１】
2)IL-7(およびある程度IL-15またはIL-2)での短期培養は、インビトロでのAg誘導増殖の必要性を回避しつつ、従来の方法では検出できない可能性のある、インビボで初回抗原刺激された希少なAg特異的CD4+またはCD8+T細胞の検出を可能にする。
【００１２】
3)IL-7(およびある程度IL-2またはIL-15)での培養は、Ag非依存的な方法で、インビボで初回抗原刺激されたAg特異的T細胞の頻度および合計数の両方を増強する。
【００１３】
4)IL-7(およびIL-2ではない)での短期培養は、リンパ球サブセットの全てを活性化状態から独自に保護し、細胞の末端分化を支持することなく、インビボで初回抗原刺激されたT細胞本来の表現型を維持する。
【００１４】
5)Ag非存在下でのIL-7での短期培養は、Ag特異的応答および長期生存できるCD4+エフェクターTリンパ球およびセントラル記憶Tリンパ球の蓄積を可能にする。
【００１５】
6)IL-7/IL-15増殖細胞は、ナイーブ動物に移された場合、腫瘍増殖を遅らせることができるため、臨床的関連がある。
【００１６】
既存のプロトコルに勝る本戦略案の利点は、以下の通りである。
A)TCRとの結合(すなわち、Agによる刺激)なしに、抗原特異的記憶T細胞用の生物試料を濃縮する可能性。既存の戦略とは異なり、このプロトコルは、細胞の表面表現型および機能表現型を変化させることはない。この新規なアプローチをペプチド/MHC IまたはMHC II多量体染色の普及している方法と併せることで、生物試料中のAg特異的T細胞を計数し、このインビボでの頻度を評価することが可能となろう。
【００１７】
B)従来の方法ではエクスビボで検出することができない、希少な抗原特異的T細胞を明らかにする可能性。これは、希少で抗原特異的な、インビボで初回抗原刺激されたCD4およびCD8 T細胞の計数が、診断および予後目的であるような、ならびに現在、頻回で時間のかかるインビトロでのAg誘導細胞増殖に依存しているような全ての臨床条件にとって、重大な意味を持つであろう。
【００１８】
C)エフェクター、セントラルおよび中間記憶Tリンパ球を増殖する可能性。現在、インビトロでのセントラル記憶リンパ球の維持に利用可能なプロトコルはない。本発明は、養子免疫療法戦略に対する影響を有する。実際、利用可能な戦略は、多数の短命エフェクター細胞の移植を必要とするのに対し、同等または改善した臨床結果が、限られた数の、再生可能な長命記憶IL-7/IL-15培養細胞の移植により実現される可能性がある。
【００１９】
全般に、本発明は、診断的および治療的意味の双方を有する。本発明は、一方では臨床的関連のある病原体/腫瘍特異的T細胞の希少集団の同定を目的とし、他方では現行の養子免疫療法戦略も改善するであろう。
【００２０】
確定したインビトロ培養は、HIV、CMV、RSV、インフルエンザ、HBV、HPV、癌、糖尿病、関節リウマチ、ライム病関節炎、多発性硬化症、セリアック病など、幾つかの感染症および免疫介在性疾患の研究に適用されることが期待される。
【００２１】
モデル3。本発明の別の態様は、セントラル記憶細胞が、共刺激およびガンマ-サイトカインによる培養物の存在下でのTCRのトリガリングにより、インビトロで増殖することができ、機能表現型を維持しつつウイルスベクターにより遺伝子改変することができるという概念を利用する。
【００２２】
Tリンパ球による細胞療法は、癌、感染症、免疫不全および自己免疫を治療する多大な可能性を有すると考えられる。さらに、Tリンパ球による細胞療法は、移植と関連して発生する免疫応答を調節するのに使用することができる。遺伝子改変は、Tリンパ球の治療間隔を、この効力増加および/または毒性制限により広げることを目的としている。これは、新規受容体、生物活性産物、耐性因子および制御因子をコードする遺伝子の移植により実現される。制御因子は、毒性/望ましくない効果が生じる場合は、遺伝子改変細胞をインビボで選択的に除外/不活化することが期待される。同種造血細胞移植(allo-HCT)と関連した自殺遺伝子療法は、制御因子によるT細胞の遺伝子改変が、いかに治療的利点をもたらすかの最も明白な例である。allo-HCTでは、ドナーT細胞による宿主抗原の免疫認識は、「諸刃の剣」であり、特定の有益な効果をもたらす:T細胞は、1)直接的な抗腫瘍効果を媒介し(移植片対白血病(GvL))、2)造血前駆細胞の移植を促進し、3)移植患者にインタクトな免疫システムを提供するため、移植後感染の発生および重症度を低減することができる。不幸なことに、ドナーT細胞は、健常な宿主組織に対して反応することもありえるため、致命的な移植片対宿主病(GvHD)につながる(20)。単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(TK)自殺遺伝子を発現するレトロウイルスによるT細胞の遺伝子改変は、選択的感受性をプロドラッグのガンシクロビル(GCV)に与える。患者では、TK+リンパ球の注入、およびそれに続くGCV投与は、T細胞効果を維持するための抗宿主反応性の時間的調節、およびGvHDの選択的制御をもたらす(21〜23)。
【００２３】
T細胞療法およびT細胞遺伝子療法の成功は、T細胞のインビボでの増殖能および長期生存能に依存する。この目的を達成するためには、T細胞が、二次リンパ器官へ正しくホーミングする必要がある。二次リンパ器官では、抗原との適切な遭遇が起こり、T細胞を誘導してエフェクター機能を獲得する。これらの特質は、成熟T細胞分化の初期段階で、および特にセントラル記憶区分で分離する傾向にあることがますます認識されるようになっている。ウイルスベクターによる遺伝子改変は、T細胞の生理機能を変更させうる。特に、レトロウイルスベクター(RV)を介した遺伝子改変は、細胞増殖を必要とする。これは、現在、多クローン刺激による活性化、および大量の組換えヒトIL-2の存在下での培養により実現される。本発明者らは、現行のプロトコル、すなわち、可溶性抗CD3抗体による活性化、およびIL-2存在下での培養により生成された遺伝子改変ヒトTリンパ球は、主にエフェクター記憶細胞であること、インビトロではエフェクター機能を容易に示すが、条件付けされた免疫不全宿主では生着不良であることを見出した。ヒトT細胞の増殖および持続は、効果的なT細胞ベースの遺伝子療法の重大な前提条件であるため、本発明は、遺伝子改変セントラル記憶T細胞を生成することができる、T細胞の培養および形質導入方法を提供する。この目的のため、本発明者らは、以下を組み合わせた。
-抗CD3抗体および抗CD28抗体結合ビーズによるT細胞の活性化
-少量でのIL-7およびIL-15による培養
-レトロウイルスベクターによる形質導入
【００２４】
結果は、IL-7およびIL-15存在下でビーズにより遺伝子改変されたリンパ球の産生は、実現可能であること、これらの細胞は、i)CD45RA発現の非存在、およびCD62L発現の存在、ii)分子CD27およびCD28の共発現、ならびにiii)IFN-γおよび/またはIL-4の非存在下でのIL-2産生により定義される、生理学的なCD4/CD8比およびセントラル記憶機能表現型を有することを示している。
【００２５】
さらに、本発明者らは、条件付けされた免疫不全宿主に注入された遺伝子改変セントラル記憶T細胞は、i)エフェクター記憶遺伝子改変T細胞よりも有意に高レベルで生着および増殖し、ii)宿主抗原に対する免疫応答の誘導において、エフェクター記憶遺伝子改変リンパ球よりも強力であることを観察した。
【００２６】
これらの結果は、十分に機能的なセントラル記憶組換えリンパ球を、ヒト疾患治療のために入手および活用することができることを示している。
【００２７】
本発明では、十分に機能的なセントラル記憶組換えリンパ球は、末梢リンパ器官にホーミングし、インビボで抗原に再遭遇するとエフェクター細胞に分化することができる、長期生存能を有するセントラル記憶T細胞を意味する。
【００２８】
したがって、本発明の目的は、試料中の抗原特異的記憶T細胞の希少集団を増殖させるインビトロ方法であって、前記抗原特異的記憶T細胞の希少集団を選択的に増殖させることができる少なくとも1種のサイトカイン受容体アゴニストの有効量に、前記試料を曝露するステップを含む方法を提供することである。好ましくは、サイトカイン受容体アゴニストは、サイトカインまたはこの誘導体である。
【００２９】
好ましい実施形態では、少なくとも1種のサイトカイン受容体アゴニストは、IL-7受容体アゴニストまたはIL-15受容体アゴニストであり、好ましくは、IL-15受容体アゴニストまたはIL-7受容体アゴニストもそれぞれ存在している。
【００３０】
好ましい実施形態では、前記抗原特異的記憶T細胞の希少集団が、CD4+および/またはCD8+および/またはγδおよび/またはNKT T細胞集団を含む。
【００３１】
好ましい実施形態では、前記試料が、血液および生物起源の他の液体試料、固形組織試料、これら由来の細胞の組織培養物およびこの子孫、生物試料(すなわち、PBMCなど)からの単離細胞からなる群に属する生物試料である。
【００３２】
本発明のさらなる目的は、試料中の抗原特異的記憶T細胞の希少集団を検出するインビトロ方法であって、
a)上記に記載の通り、抗原特異的記憶T細胞の希少集団を選択的に増殖させることができる少なくとも1種のサイトカイン受容体アゴニストの有効量に、前記試料を曝露するステップと、
b)前記抗原特異的記憶T細胞の増殖した希少集団の1つに特異的なリガンドである、少なくとも1つのリガンドと共に、前記試料をインキュベートするステップと、
c)特異的リガンドに結合した抗原特異的記憶T細胞の増殖した希少集団を検出するステップとを含む方法を提供することである。
【００３３】
好ましくは、前記特異的リガンドは、前記抗原特異的記憶T細胞の希少集団の1つに特異的な抗原またはこの誘導体であり、より好ましくは、特異的抗原は、マイコバクテリウム、ニューモシスティスカリニ、熱帯熱マラリア原虫、カンジダ、トキソプラズマ、CMV、EBV、BPV、HCV、HBV、HIVを含むが、これらに限定されない微生物病原体に関連している。あるいは、抗原は腫瘍関連抗原である。あるいは、抗原はアレルゲンである。あるいは、抗原は自己抗原である。
【００３４】
好ましい実施形態では、特異的抗原は、抗原MHC複合体またはこの誘導体として存在する。
【００３５】
好ましい実施形態では、前記抗原特異的記憶T細胞の増殖した希少集団の検出は、結合アッセイにより行われる。あるいは、前記抗原特異的記憶T細胞の増殖した希少集団の検出は、サイトカイン放出アッセイにより行われる。あるいは、前記抗原特異的記憶T細胞の増殖した希少集団の検出は、増殖アッセイにより行われる。
【００３６】
好ましい実施形態では、細胞は、試料を特異的リガンドと共にインキュベートする前に、蛍光生体染色色素で標識され、検出ステップは、色素希釈アッセイにより行われる。
【００３７】
上記に記載の通り、試料中の抗原特異的記憶T細胞の希少集団を検出する方法を実施するためのキットであって、少なくとも1種のサイトカイン受容体アゴニスト、抗原特異的記憶T細胞の希少集団に特異的な少なくとも1種のリガンド、検出手段を含むキットを提供することが、本発明のさらなる目的である。
【００３８】
試料中の抗原特異的記憶T細胞の希少集団を単離するインビトロ方法であって、
a)上記に記載の通り、抗原特異的記憶T細胞の希少集団を選択的に増殖させることができる少なくとも1種のサイトカイン受容体アゴニストの有効量に、前記試料を曝露するステップと、
b)前記抗原特異的記憶T細胞の増殖した希少集団の1つに特異的なリガンドである、少なくとも1つのリガンドと共に、前記試料をインキュベートするステップと、
c)特異的リガンドに結合した抗原特異的記憶T細胞の増殖した希少集団を単離するステップとを含む方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【００３９】
好ましくは、前記特異的リガンドは、前記抗原特異的記憶T細胞の希少集団の1つに特異的な抗原またはこの誘導体であり、より好ましくは、特異的抗原は、マイコバクテリウム、ニューモシスティスカリニ、熱帯熱マラリア原虫、カンジダ、トキソプラズマ、CMV、EBV、BPV、HCV、HBV、HIVを含むが、これらに限定されない微生物病原体に関連している。あるいは、抗原は腫瘍関連抗原である。あるいは、抗原は、アレルゲンである。あるいは、抗原は自己抗原である。
【００４０】
好ましい実施形態では、特異的抗原は、抗原MHC複合体またはこの誘導体として存在する。
【００４１】
好ましい実施形態では、前記抗原特異的記憶T細胞の増殖した希少集団の単離は、結合ステップにより行われる。あるいは、前記抗原特異的記憶T細胞の増殖した希少集団の単離は、IL-2、IFN-g、IL-4、IL-5、IL-10、TNF-アルファ、TGF-ベータ、グランザイムに関するELISPOTアッセイ、ELISAアッセイ、フローサイトメトリーサイトカイン検出アッセイを含むがこれらに限定されない、サイトカインおよびサイトトキシン産生物の測定により行われる。
【００４２】
免疫、感染、癌、アレルギー、自己免疫に関連した病態の診断的および/または予後的臨床試験のための、上記に記載のインビトロ方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【００４３】
免疫、感染、癌、アレルギー、自己免疫に関連した病態の治療および/または予防のための、上記に記載の方法により単離された希少T細胞集団の使用を提供することが、本発明のさらなる目的である。特定の実施形態では、前記希少T細胞集団は遺伝子改変されている。
【００４４】
本発明のさらなる目的は、遺伝子改変された記憶T細胞集団を得るインビトロ方法であって、
a)リンパ球活性化を誘導することができる、アゴニスト抗体、組換えリガンドおよびこの誘導体を含むがこれらに限定されない、少なくとも2種の特異的活性化受容体アゴニストでリンパ球を活性化するステップと、
b)記憶T細胞集団を選択的に増殖させることができる、少なくとも1種のサイトカイン受容体アゴニストの有効量に、活性化リンパ球を曝露するステップと、
c)b)で得られた細胞に、適切なベクターを用いて外来遺伝子を挿入し発現させるステップとを含む方法を提供することである。
【００４５】
好ましくは、記憶T細胞集団は、CD4+および/またはCD8+および/またはγδおよび/またはNKT T細胞集団を含む。
【００４６】
好ましくは、リンパ球は、血液および生物起源の他の液体試料、固形組織試料、これら由来の細胞の組織培養物およびこの子孫、生物試料からの単離細胞(すなわち、PBMCなど)からなる群に属する生物試料由来である。
【００４７】
好ましくは、特異的リンパ球活性化受容体アゴニストは、細胞模倣担体に結合しており、より好ましくは、細胞模倣担体は、常磁性ビーズである。
【００４８】
好ましい実施形態では、リンパ球活性化受容体アゴニストの1つは、CD3ポリペプチドに特異的であり、好ましくは、リンパ球活性化受容体アゴニストのもう1つは、共刺激受容体、すなわちCD28に特異的である。
【００４９】
好ましい実施形態では、少なくとも1種のサイトカイン受容体アゴニストは、IL-7受容体アゴニストまたはIL-15受容体アゴニストであり、好ましくは、IL-15受容体アゴニストまたはIL-7受容体アゴニストもそれぞれ存在している。
【００５０】
好ましい実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。
【００５１】
好ましい実施形態では、外来遺伝子は、自殺遺伝子、および/またはマーカー遺伝子、および/または生物活性分子、および/または受容体、および/または細胞内に維持されるもしくは細胞外に放出される可溶性因子、および/またはプロドラッグに耐性を与える遺伝子をコードする。
【００５２】
本発明のさらなる目的は、癌、感染症、免疫不全もしくは自己免疫の治療および/または予防のため、または造血前駆細胞もしくは固形臓器の移植のため、上記に記載の方法により生成された、遺伝子改変記憶T細胞集団の使用を提供することである。
【００５３】
本発明を、以下の図面を参照し、非限定的な例によって説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５４】
材料および方法
実験プロトコルは、サンラファエロ科学研究所倫理委員会(the Ethical Committee of the San Raffaele Scientific Institute)で承認され、このガイドラインに従って実施された。
【００５５】
マウスおよび腫瘍細胞
7〜8週齢のBALB/cマウスおよびCD45.2+ C57BL/6マウスは、Charles River (Charles River Italia社、ミラノ、イタリア)から購入した。CD45.1+ C57BL/6、DO11.10および16.2βトランスジェニック(Tg)(BALB/cバックグラウンド)(25)マウスは、研究所の特定病原体のいない施設で飼育した。TS/AおよびTS/A-LACKマウス乳腺癌は、以前に記載されている(17、19、26)。対数増殖期の4×105腫瘍細胞を、同系マウス(BALB/c)の右側のPBS 100μlに皮下注射した。典型的には、実験ごとに1群あたり5匹のマウスが使用された。
【００５６】
T細胞初代培養
腫瘍細胞注入後20日目に、マウスを屠殺し、腫瘍増殖部位につながる、および遠位(非所属LN)の腋窩、上腕および鼠径抹消リンパ節(LN)を回収した。樹状細胞(DC)のワクチン接種実験では、マウスをDC投与後14日目に屠殺し、腋窩、上腕および鼠径LNを外科的に切除した。LN細胞は、組換えマウスIL-7(200ng/ml)、IL-2(20ng/ml)、IL-6(45ng/ml)、またはIL-15(100ng/ml)(全てPeprotech社製)の非存在下または存在下、完全培地において密度5×106にて24ウェルプレート中で培養した。並行培養では、細胞を、LACK由来MHC II制限ペプチド(5μm、(25))、および5×106の照射同系脾臓細部によりインビトロで刺激した。対照として、同様の培養を同系ナイーブマウスから用意した。幾つかの実験では、LN細胞を、メーカーの使用説明書に従い、最終濃度1μΜにて蛍光色素CFSE(5-(-6)-カルボキシフルオレセインジアセテート、スクシニミジルエステル)で標識した。
【００５７】
樹状細胞(DC)の調製
骨髄由来DCは、以前に記載した通りに得た(18)。簡単には、CD45.2+ C57BL/6骨髄前駆細胞を、25ng/ml組換えマウスGM-CSFおよび5ng/ml組換えマウスIL-4を含有するイスコフ完全培地(Pharmingen社、サンディエゴ、CA)において7日間増殖した。次いで、BMDCをLPS(1μg/ml、Sigma社、ミラノ、イタリア)の存在下、8時間、37℃で成熟させ、ラージT Ag由来Tag IVペプチド10μg/mlで1時間パルスした(18)。DCの成熟度および純度は、mAbを認識するCD11c、MHCクラスII、B7.1、B7.2およびCD40分子(全てPharmingen社製)で染色した後、フローサイトメトリーによりルーチンに評価した。2×105パルス成熟DCを、同系C57BL/6マウスの右側のPBS 200μlに皮下注射した。
【００５８】
フローサイトメトリー分析
I-Ad/LACK多量体染色は、以前に記載されている。簡単には、I-Ad/LACK二量体(MHC II-ペプチド複合体、3μg/試料)を、室温で30分間、PBS中でアレクサ488結合タンパク質A(Molecular Probes Inc.社、ユージン、3μg/試料)を添加して多量体化する。遊離タンパク質A結合部位は、全(total)IgG(1μg/試料)を添加して飽和させた。6×105細胞を、先ず、ブロッキング緩衝液でインキュベートし(5%ラット血清+2.4G2抗-FcR mAb産生ハイブリドーマ細胞の95%培養上清、20分間)、次いで、多量体で染色した(0.5% BSAを補充したPBS中、4℃で1時間)。次いで、細胞を、抗CD4、抗CD44、抗CD11b、抗B220、抗CD8a mAb(PharMingen社、サンディエゴ、CA、USA)およびTO-PRO-3(1nM、Molecular Probes社)で染色した。3×105 CD4+または 103 CD4+ I-Ad/LACK+イベントを、全ての抗CD11b+、抗B220+、抗CD8a+およびTO-PRO-3+イベントを除外して回収した。指示された細胞を、抗CD4または抗CD8 mAb、ならびに抗CD44、抗CD127、抗CD25、抗CD132および抗CD62L mAb(抗CD127 Ab、A7R34クローン(Bioscience社製)以外全てPharMingen社製)で表面染色し、固定化し、透過処理し、メーカーの使用説明書に従って抗Bcl-2 mAbでさらに染色した。
【００５９】
LACK特異的人工抗原提示細胞(aAPC)およびサイトカイン分泌アッセイ
5μmポリエチレンサルフェートラテックスビーズ(Interfacial Dynamics社)を、I-Ad/LACK多量体(20μg/ml)および抗CD28 mAb(37.51;2μg/ml)(LACK aAPC)で、または抗CD28 mAb単独(対照aAPC)でコーティングした。タンパク質のコーティングをフローサイトメトリー分析によりモニターした。典型的には、5×105LN細胞を、37℃にて5時間、5×106 aAPCと共に培養した。ブレフェルジンA(5μg/ml、Sigma社)を少なくとも2時間培養物に添加した。LACK aAPCにより誘導されたサイトカイン放出は、LACKをパルスした同系脾臓細胞により誘導されたものと同程度であった(不図示)。AH-1およびTag IV誘導サイトカイン産生の場合、脾臓細胞は、DO11.10およびCD45.1+ C57BL/6マウスから得られ、抗原提示細胞として使用された。脾臓細胞(3×107細胞/ml)を、1μM AH-1(19)および10μg/ml Tag IV(18)ペプチドで37℃にて1時間パルスし、次いで、腫瘍を有するマウスおよびDCワクチン接種マウスそれぞれのLN由来の同系LN細胞を刺激するのに使用した。その後、細胞を、上述の通りに抗CD8、およびIL-2およびIFN-γで染色し、APCオリジンのT細胞を除外するため抗クローン型KJ 1.26 mAb、および抗CD45.1+マーカーで染色した。次いで、CD4+、KJ 1.26-またはCD8+ CD45.1-イベントを、FACS Caliburで回収した。Ag特異的IL-2+/IFN-γ+ T細胞の合計数は、パーセンテージをトリパンブルー陰性LN細胞の合計数に乗じて決定した。
【００６０】
ヒトT細胞培養およびELISPOTアッセイ
抹消血単核細胞(PBMC)は、結核患者(TB)および健常ドナーからFycoll-Hypaque密度勾配での血液遠心分離により得て、直ちに分析するかまたは今後の分析用に凍結した。必要であれば、細胞をCFSE(1μM)で染色した。細胞は、ヒトIL-7(200ng/ml)、IL-2(20ng/ml、IL-15(100ng/ml)もしくはIL-6(45ng/ml)の非存在下または存在下で7日間培養した。必要であれば、シクロスポリンA(CsA)(0.5μg/ml)または抗LFA-1(5μg/ml)ブロッキング抗体を添加した。次いで、細胞を回収し、CD4、CD8、CD3、CD56、CD45RA、CD62L mAbs(全てPharMingen社製)で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。
【００６１】
IFN-γ分泌に関するELISPOTアッセイは、以前に報告されているように行った(28)。簡単には、空気プラス5%CO2中で37℃にて18時間、自己照射PBMC(5×104細胞/ウェル)の存在下の抗IFN-γ捕捉mAb(B-B1; Diaclone社、ブザンソン、フランス)、およびMTPペプチドプールでプレコーティングした96ウェルプレート(MAIPS4510; Millipore社、ベッドフォード、マサチューセッツ州)に、細胞を5×104細胞/ウェルで二組播種した。ビオチン化抗IFN-γ検出mAb(B-G1; Diaclone社)を4時間添加した後、ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼコンジュゲート(Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH、フライブルグ、ドイツ)を1時間添加した。洗浄工程後、ニトロブルーテトラゾリウム-BCIP(5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート; Sigma社、セントルイス、ミズーリ州)発色基質を添加した。個々のスポット形成細胞(SFC)を、自動画像分析システムELISPOTリーダー(AID-GmbH、ストラスバーグ、ドイツ)を用いて計数した。特異的反応を検出するため、ヒト型結核菌のESAT-6およびCFP-10分泌タンパク質配列由来の、20アミノ酸長、70%超精製された6つの合成ヒト型結核菌ペプチド(MTP; Primm srl社、ミラノ、イタリア)プールを、ペプチドあたり最終濃度2μg/mlで使用した(28)。培地中のPBMC単独またはフィトヘマグルチニン(PHA-P; Sigma社)5μg/mlで刺激したPBMCを、陰性および陽性対照としてそれぞれ使用した。
【００６２】
幾つかの例では、MTP特異的IFN-γ放出を、細胞内サイトカイン分泌アッセイにより単一細胞レベルで分析した。簡単には、0.6×106 CFSE標識細胞を、HLA-DR制限MTP(4μg/ml)でパルスしたヒト抗CD28刺激mAb(2μg/ml)および3×106自己照射(5000rad)PBMCの存在下で、または陰性対照ではパルスせずに6時間再刺激した。最後の5時間で、ブレフェルジンA(10μg/ml)を細胞に添加した。その後、細胞を固定し、透過処理し、抗CD4、抗IL-2および抗IFN-γ mAbで染色し、FACS Caliburで分析した。
【００６３】
TB患者の分類
活動性TBを有するHIV血清反応陰性患者5例(臨床および培養により確認)を、サンラファエロ病院、感染症クリニック(the Clinic of Infectious Diseases、S. Raffaele Hospital)で回収した。患者は、Biocinetest-PPDツベルクリン(Chiron Italia srl社、ミラノ、イタリア)0.1ml(5ツベルクリン単位)を用いるマントー法により投与されたツベルクリン皮膚テスト(TST)を受けた。硬化径を48〜72時間後に評価した(硬化≧10mmを陽性に分類した)。治療を開始する前に、事前に書面によるインフォームドコンセントを得て、抹消血を回収した。健常ドナー(n=8)は、TB曝露、感染の既往がなく、TSTに陰性反応を示すHIV血清反応陰性者から選択した。
【００６４】
ヒトT細胞の活性化、培養およびレトロウイルス導入
抹消血単核細胞(PBMC)を、インフォームドコンセント後に得られた健常ドナーの軟膜からリンフォプレップ傾斜分離により単離した(Fresenius社、オスロ、ノルウェー)。PBMCは、抗生剤、グルタミンおよび10%加熱不活化FBS(BioWhittaker-Italia社、ミラノ、イタリア)を補充したRPMI1640培地(GIBCO-BRL, Gaitherburg, MD)で培養した。PBMCを、6ウェルプレート(1×106/ml)に播種し、抗aCD3(OKT3 30ng/ml、OrthoBiotech社、ラリタン、NJ)または常磁性baCD3/CD28(3:1 ビーズ/T細胞)(Dynabeads、Dynal Biotech社、またはXcyte Therapies Inc.社、ワシントン州シアトル、USA、Invitrogen社)で活性化した。T細胞を、培養前にbaCD3/CD28で濃縮した。抗aCD3により活性化した細胞は、ヒト組換えIL-2と共に600IU/mlで培養した(Chiron社、エメリービル、カリフォルニア州)。
【００６５】
baCD3/CD28により活性化した細胞を、1.サイトカイン非存在下、2.最小濃度5ng/mlのヒト組換えIL-7(Peprotech社、ロンドン、UK)を用いて、3.それぞれ最小濃度5ng/mlのヒト組換えIL-7およびIL-15(Peprotech社、ロンドン、UK)の両方を用いて、培養した。2日目および3日目に、細胞を、8μg/mlポリブレン(Sigma社、セントルイス、ミズーリ州)を用いて37℃で2時間、2400rpmにてスピノキュレーション(spinoculation)によりSFCMM3(39〜40)レトロウイルス上清を用いて導入した。SFCMM3レトロウイルスベクターは、LTRプロモーター下でTK自殺遺伝子を、およびSV40プロモーター下で神経成長因子の低親和性受容体(ΔLNGFR)の切断型をコードする(27)。レトロウイルス上清は、Molmed s.p.a.社より提供された。T細胞活性化後6日目に、刺激に使用した細胞大のビーズを、メーカー使用説明書に従ってT細胞から除去した。幾つかの実験では、T細胞活性化後7日目に、導入リンパ球を、以下のプロトコルにより陽性選択した(プロトコル名:導入リンパ球の陽性免疫選択)。
【００６６】
細胞は最大14日間培養した。14日目に、増殖(倍)を、トリパンブルー数を用いてフローサイトメトリーにより測定したLNGFR+細胞のパーセンテージを乗じて算出した。培地およびサイトカインは、当初のプロトコルに従い、3〜4日ごとに交換した。選択した時点で、増殖(倍)を、トリパンブルー数を用いてフローサイトメトリーにより測定したΔLNGFR+細胞のパーセンテージを乗じて算出した。
【００６７】
導入リンパ球の陽性免疫選択
細胞活性化後7日目に、導入リンパ球を陽性選択した。導入細胞は、この表面にΔLNGFrを発現したため、電磁ビーズで覆われた抗LNGFr抗体を用いて導入細胞を非導入リンパ球から分離した。
【００６８】
細胞を、プレートからチューブに回収し、洗浄し(1500rpm、室温RTにて10分間)、WB中で最終濃度5×106/mlで再懸濁した。次いで、抗LNGFr抗体20.1を細胞懸濁液に添加し(1□g/20×106)、細胞をRTにて30分間、10rpmで回転させた。次いで、T細胞を1度洗浄し、WB中で25×106/mlで再懸濁した。次いで、ダイナビーズM-450ヒツジ抗マウスIgGを添加し(5×106ビーズ/106陽性細胞)、細胞を室温にて30分間、10rpmで回転させた。次いで、導入細胞を磁気選択した。このため、チューブを3分間磁石の近くに置き、陰性画分は廃棄した。この手順を合計3回繰り返した。最後に、ビーズに結合した細胞画分を磁石から除去し、洗浄し、濃度1×106細胞/mlで適切なサイトカインカクテルと共に新鮮培地において再懸濁した。
【００６９】
導入T細胞のフローサイトメトリー
表面表現型、導入効率、細胞周期、およびサイトカイン産生の分析には、フローサイトメトリーを用いた。以下の抗体(Pharmingen社)が使用された:ヒトCD4、CD8、CD45RA、CD27およびIFN-γに対してはFITC結合mAb、ヒトCD4、CD8、LNGFR、CD62L、CD28およびIL-4に対しては(PE)結合mAb、マウスCD45(Ly5.1)に対してはペリジニンクロロフィルタンパク質(PerCP)結合mAb、およびヒトCD3に対してはアロフィコシアニン(APC)結合mAb。アイソタイプをマッチングした蛍光色素に結合した無関係なmAb染色対照、およびデータをCellQuest Software(Becton Dickinson社)を用いて分析した後、試料は、Facscaliburフローサイトメーター(Becton Dickinson社、マウンテンビュー、カリフォルニア州)をくぐらせた。
【００７０】
CD127、CD122、CCR7、およびマウスCD45に対する蛍光色素結合抗体(Pharmingen社、サンディエゴ、CA、USA)も、リンパ球を染色するのに使用された。
【００７１】
サイトカイン産生
サイトカイン産生を測定するため、細胞を、24ウェルプレート(1×106/ml)に播種し、50ng/ml PMA(Sigma社)および1μg/mlイオノマイシン(Sigma社)で刺激した。4時間後、ブレフェルジンA(Sigma社)をさらに2時間添加した(10μg/ml)。次いで、細胞を適切な蛍光色素結合抗表面マーカー抗体で染色し、1%パラホルムアルデヒドで10分間4℃にて固定した。細胞内染色は、0.05%サポニン含有PBS 2% FBS(Sigma社)中でRTにて20分間インキュベートした後、適切な蛍光色素抗サイトカイン抗体により行った。
【００７２】
CFSE希釈アッセイおよび混合リンパ球反応(MLR)
T細胞同種反応性の分析は、リンパ球の初期培養後10日目に行った。導入T細胞を、CFSEで10日目に染色し、次いで、照射した同種PBMCと共に培養した。CFSEは、スクシニミジルエステル官能基および2つのアセテート部分を含有する蛍光分子からなる。CFSEは、細胞内に自由に拡散し、細胞内エステラーゼが、酢酸基を切断してこれを蛍光の、膜非透過性色素に変換する。色素は、隣接細胞に移動しない。CFSEは、細胞質において細胞により保持され、細胞機能に悪影響を及ぼさない。細胞分裂をするごとに、色素の相対強度は半減する。
【００７３】
CFSE染色法:
細胞をPBS中(血清非存在下)で2度洗浄し、2×107/mlに調節した。CFSEをPBS中で1μMに調節し、細胞懸濁液と1:1比で混合した。細胞を素早くボルテックスし、8分間RTにて混合した。次いで、FBSを1:1比で添加し、1分後、細胞を2000rpmで2分間遠心分離した。次いで、上清を捨て、細胞を10%FBS含有溶液(PBSまたは培地)で2度洗浄した。
【００７４】
MLR
本方法の最後に、CFSE染色した導入T細胞(レスポンダー)を、2000 cGyを照射した同種PBMC(刺激因子)と共に1:1比にて24ウェルプレートで培養した。サイトカインは、細胞培養に添加しなかった。刺激因子の非存在下で培養したCFSE染色導入T細胞は、陰性対照として使用した。可溶性抗CD3抗体と共に培養した細胞は、陽性対照として使用した。
【００７５】
読み出し
刺激後、選択した時点で、細胞試料を回収し、蛍光色素結合抗表面マーカーモノクローナル抗体で染色した。FACS獲得直前に、1μl To-Pro-3溶液を、各FACS試料に添加した。To-Pro-3は、蛍光4において検出することができる、強い赤色の挿入DNA色素であり、FITC、PEおよびAPC結合抗体で細胞を共染色する可能性をもたらす。To-Pro-3の機能は、死細胞画分を明らかにすることである。
【００７６】
インビボ分析
インビボでのヒトリンパ球の生物学を試験するには、通常、養子コンパートメント(scid、組換え活性化遺伝子-/-)ならびに先天性コンパートメント(NOD、共通γ鎖-/-)に免疫欠損を有するマウスが使用される。本発明者は、NOD/scidマウスを用いてインビボでのセントラル記憶遺伝子改変リンパ球の活性をテストした。6〜8週齢のメスのNOD/scidマウスは、Charles-River Italia社(カルコ、イタリア)から入手した。実験プロトコルは、本発明者の研究所の動物試験内部委員会(Institutional Animal Care and Use Committee [IACUC])により承認された。マウスは、以下のプロトコルに従い処理した。
【００７７】
異種移植片対宿主疾患モデル
6〜8週齢のメスのNOD/scidマウスは、Charles-River Italia社(カルコ、イタリア)から入手した。注入1週間前に、マウスを層流アイソレーターから通常のケージへ移し、滅菌水および照射ペレットを適宜摂取する特定の病原体フリー条件下で維持した。実験前日、マウスに1mgブロッキング抗マウスIL-2Rβモノクローナル抗体を腹腔内投与し、残留NK活性を中和した。抗IL-2Rβ抗体は、Tanaka教授(大阪大学、日本)の好意により提供されたTMβ-1ハイブリドーマから、記述された通りに作製した。0日目、マウスに、単回線量350cGy(線形加速器からのガンマ線照射)を全身照射し、未修飾PBL、またはSFCMM3レトロウイルスベクターを導入されたヒトリンパ球を直ちに注入した(28)。未修飾PBLは、汚染単球、B細胞およびNK細胞をPan T細胞分離キット(Miltenyi社、ベルギッシュグラッドバッハ、ドイツ)で枯渇した後のPBMCから得た。細胞を、500μl X-VIVO15培地において再懸濁し、腹腔内に注入した。次いで、マウスを、体重減少の算出によりGvHDについてモニターした。瀕死のマウスは、道義上屠殺した。ヒトキメラ化を、尾静脈からの出血後、フローサイトメトリーにより週ごとに測定した。ヒトキメラ化は、以下のように算出した:ヒトキメラ化(%)=[huCD3+/(huCD3++mCD45+)]×100。
【００７８】
異種GvHDの分析
T細胞注入後1、2および3週間目に、マウスを秤量し、以下のスコアにより異種GvHDについて評価した:体重減少(体重減少<10%は0、10〜25%は1、>25%は2)、ハンチング(0〜2)、活動性(0〜2)、毛並み(0〜2)、および皮膚の完全性(0〜2)、最大インデックス10。体重減少は、最も客観的な基準であるとみなされたため、独立変数としても評価した(表1)。
【００７９】
【表１】
2009504151.tif 000003
【００８０】
同種GvHDモデル
同種GvHDモデルでは、マウスにヒト皮膚を移植し、同種遺伝子改変リンパ球を注入して、ヒト皮膚へホーミングし同種GvH反応を媒介する能力を評価した。移植1週間前に、マウスを層流アイソレーターから通常のケージへ移し、滅菌水および照射ペレットを適宜摂取する特定の病原体フリー条件下で維持した。ヒトT細胞の注入約3週間前、マウスに12〜18mgアバチン/マウスで腹腔内麻酔を行った。次いで、マウスの背中の毛を剃り、背中の両側水平切開を行った。次いで、皮下ポケットを開き、ヒト腹部表皮の小片(皮膚脂肪および結合組織由来)を導入した。処置の最後に、創傷を縫合した。術中、マウスの体温は徐々に低下するため、加熱した箱の中に30分間入れ、最後にケージへ移した。
【００８１】
ヒトT細胞注入
ヒトリンパ球のNOD/scidマウスへの移植を促進するため、本発明者は、リンパ球移植の前に抗マウスIL-2受容体β(TMβ-1)抗体でNK細胞を機能的に不活性化した。抗体は、Tanaka教授(大阪大学、日本)の好意により提供されたTMβ-1ハイブリドーマから作製した。0日目、マウスに、単回線量300cGy(線形加速器からのガンマ線照射)を全身照射した。次いで、マウスを秤量し、初回刺激後9日目に収集した導入ヒトリンパ球を直ちに注入した。細胞は250μL食塩水で静注した。
【００８２】
T細胞移植の分析
T細胞注入後1、2および3週目に、約300μl血液/マウスを尾静脈の小切開から収集し、ヘパリン含有チューブに回収した。赤血球細胞を、ACKに3分間曝露して溶解し、次いで、パラグラフ「表面マーカーおよび細胞蛍光分析のための染色」に記載の通り、細胞蛍光分析のため染色した。
【００８３】
同種GvHDの分析
T細胞注入後3週間目、または重度のGvHDの場合はこれ以前に、マウスを屠殺し、2片のヒト皮膚を両側から除去した。形態評価のため、ホルマリンで固定しパラフィンに包埋した皮膚を4μm厚の切片にカットし、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。ヒトTリンパ球の存在については、Dako自動免疫染色装置を用いるアビジン/ビオチンペルオキシダーゼ複合体法により、1:100希釈でモノクローナル抗ヒトCD3抗体(Dako社、グロストラップ、デンマーク)による免疫組織化学的評価を実施した。染色反応を、四塩酸塩色素原法により明らかにし、切片をヘマトキシリンで対比染色した。画像は、Zeiss Axicam HRCで撮影した。
【００８４】
統計分析
本研究で検討した変数ごとに、平均、中央値および標準偏差を算出した。統計分析は全て、Microsoft Excel 2003(Microsoft社、レドモンド、ワシントン州)およびこのアドイン型Statcel2(OMS出版、埼玉、日本)を用いて行った。パラメトリックデータについては、分散分析(ANOVA)後にシェッフェのF検定を実施し、ノンパラメトリックデータについては、クラスカルワリス検定後にマンホイットニーのU検定を実施した。
【００８５】
結果および考察
IL-7は、Ag誘導細胞増殖を必要とすることなく、希少な腫瘍特異的CD4+T細胞の検出を支持する
Ag特異的T細胞の計数は、Ag特異的T細胞の存在が、診断目的および予後目的であるような幾つかの臨床条件にとって重大な意味を持つ可能性がある。本発明者は、最近、大形リーシュマニア由来モデルAg LACKを発現するTS/A細胞(TS/A-LACK)を用いる、腫瘍疾患の前臨床マウスモデルを開発した。LACK特異的ナイーブCD4+T細胞は、未操作BALB/cマウスでは同定することができないのに対し(29)、本発明者は、最近、蛍光MHCクラスII/Ag多量体染色ならびにLACK特異的IL-2およびIFN-γ細胞内放出により、TS/A-LACK腫瘍を有するマウスにおいてLACK特異的Ag経験CD44high CD4+Tリンパ球を同定した(20)。
【００８６】
Ag特異的T細胞の検出およびクローニングを改善するため、本発明者は、記憶CD4+T細胞の生存を支持することが知られている(7、9〜14)IL-7は、腫瘍特異的CD4+T細胞の頻度を高めるかどうかを調べた。対照のTS/AおよびTS/A-LACK腫瘍細胞を、BALB/cマウスに皮下注射した。腫瘍細胞注入後20日目、全てのマウスが、測定可能な腫瘍を発現していた。マウスを屠殺し、腫瘍所属および腫瘍非所属LNを外科的に切除した。前者は、IL-2およびIFN-γを産生できる、LACK特異的Ag経験CD44high CD4+Tリンパ球集団を含有していたのに対し、後者は、腫瘍に気づかず、LACK特異的ナイーブCD4+Tリンパ球を示すままであった(31)。LACK特異的CD4+T細胞の頻度は、さらなるAg刺激を行わずに組換えIL-7の存在下で培養した7日後、エクスビボで分析した(図1)。エクスビボでは、TS/A-LACK腫瘍を有する動物の所属LNは、高レベルのCD44を発現するCD4+ I-Ad/LACK+細胞の低いながら有意な頻度を示し(図1A)、LACK刺激するとIL-2およびIFN-γを産生することができた(図1B)。IL-7単独で培養した7日後、CD4+ I-Ad/LACK+ CD44highおよびLACK特異的サイトカイン産生細胞の頻度(図1A、B)、ならびにこれらの合計数(不図示、および図2、4)は、著しく増加した。サイトカイン分泌細胞のうち、IL-2およびIFN-γ産生細胞(以前に多機能性として記載されている中間記憶Tリンパ球(30〜33)を代表している可能性のある)は、ほとんどが濃縮されていた。TS/A腫瘍を有する対照マウスの腫瘍所属LNにおけるLACK特異的T細胞、ならびにTS/AおよびTS/A-LACKマウスの非所属LN由来のLACK特異的T細胞の頻度は、エクスビボでナイーブBALB/cマウスにおいて見られたものと同程度であり(図1C、Dおよび不図示)、IL-7での培養後のバックグラウンド基準内にとどまっていた(図1C、D)。故に、IL-7は、インビボで初回刺激した腫瘍特異的Ag経験CD4+T細胞のLN培養物を濃縮し、それ故に、これらの計数を、インビトロでのAg誘導細胞増殖を必要とすることなく支持する。
【００８７】
IL-7およびIL-2は、腫瘍特異的CD4+T細胞の蓄積を支持するが、抗原刺激は腫瘍特異的CD4+T細胞の蓄積を支持しない
Agによる再刺激は、増殖のため、および幾つかの例ではAg特異的CD4+T細胞を同定するために最も多く使用されている。さらに、IL-7に加え、IL-2およびIL-15も、記憶T細胞増殖を制御する(13、35〜37)。故に、TS/A-LACK腫瘍を有するマウス由来のLN細胞を、非パルスの照射同系APC(APC)もしくはLACK由来ペプチドでパルスした照射同系APC(Ag/APC)の存在下、または対照として、最適量のIL-7、IL-2、IL-15およびIL-6の存在下で培養し、フローサイトメトリーにより分析した。CD4+ I-Ad/LACK+ CD44high T細胞の頻度は、エクスビボで見られるものと比較した場合、培養細胞でわずかに高かった(図1A)が、対照(APC)とAg刺激培養(Ag/APC)との間に差は検出されなかった(図2A)。反対に、IL-7における細胞の培養は、対照で見られたもの(不図示)およびIL-6誘導培養物を上回り、LACK特異的CD4+T細胞の頻度(図2A、B)および合計数(図2C、D)を増加させた。IL-7と同様、IL-2も、CD4+ I-Ad/LACK+ CD44high T細胞のLN培養物(図2A、C)、ならびにAg特異的刺激時にIL-2およびIFN-γを分泌することができるCD4+細胞のLN培養物を濃縮した(図2B、D)。IL-15誘導培養では、CD4+ I-Ad/LACK+ CD44high T細胞の頻度は、対照培養物の1つと同程度にとどまったが、幾つかの独立した実験では、サイトカインを分泌することができるLACK特異的CD4+T細胞を濃縮した。この場合もやはり、LACK特異的サイトカイン産生細胞のなかでは、IL-2/IFN-γ分泌CD4+T細胞が最も濃縮され、IL-7誘導培養をより支持した(図2C、D)。
【００８８】
IL-7およびIL-2は、インビボで初回刺激した腫瘍特異的CD4+T細胞のAg非依存性自発的増殖および生存を維持する
本発明者は、次に、IL-7およびIL-2が、インビボで初回刺激したLACK特異的CD4+T細胞の蓄積を支持するメカニズムを調べた。先ず、本発明者は、インビトロでこれらの細胞の増殖を支持するこれらのサイトカインの能力を分析した。LN細胞をCFSE生体染色色素で標識し、組換えサイトカインの非存在下または存在下で1週間培養した。外因性サイトカインの非存在下では、ナイーブマウス由来LN細胞は、増殖せず、当初のCFSE含量を保持した(図3A、左のパネル)。反対に、TS/A-LACK腫瘍を有するマウス由来のCD4+ LN細胞の検出可能な集団は、増殖し、追加刺激の非存在下でインビトロでのCFSE含量を希釈した(図3A、右のパネル)。インビトロでのLACK再刺激時にIL-2およびIFN-γを分泌する能力により同定されるLACK特異的記憶T細胞は、主に急速増殖CFSEdim細胞において含有された(図3B、なし、MFI:66)。これは、最近のインビボでの腫瘍Ag遭遇による増殖に関与したことを示唆すものである。IL-7の存在下では、腫瘍所属LN由来の高頻度の細胞は、1〜3細胞分裂を終え、LACK特異的再刺激時にIL-2およびIFN-gを分泌する能力により同定されるLACK特異的T細胞は、著しく濃縮され、CFSE含量は低下していた(MFI:44)(図3BおよびC)。実際、LACK特異的CD4+T細胞は、3〜4回を超える細胞周期を繰り返していた。これは、LACK特異的CD4+T細胞と、緩徐な恒常的細胞分裂をしている細胞(4細胞周期未満)とを区別するものである。IL-7に誘導された恒常的細胞分裂は、ナイーブ対照マウスのLNにおいても見られた(図5C)。しかし、LACK特異的CD4+T細胞は、これらの培養物においては濃縮されなかった(不図示)。インビトロで自発的増殖すること、および再刺激時にIL-2およびIFN-gの両方を産生する能力があることから、腫瘍所属LNにおいて見られ、IL-7に反応してインビトロで蓄積するLACK特異的T細胞は、慢性感染患者のインビボでも見られる、最近初回刺激された非極性中間記憶T細胞を代表している可能性がある(32)。
【００８９】
IL-7に加え、IL-2も、CD4+T細胞画分のインビトロでの増殖を支持し、LACK特異的記憶リンパ球数を増加した。反対に、IL-15およびIL-6は、CD4+T細胞増殖も、またはLACK特異的CD4+T細胞の蓄積も、対照(なし)培養物において見られるもの以上に支持することはなかった(図3B、およびD)。故に、IL-7およびIL-2は、インビボでAgを経験した記憶T細胞のインビトロでの増殖を支持することができる。
【００９０】
並行実験では、本発明者は、かなりの頻度のI-Ad/LACK+ CD44+ナイーブT細胞を含有する、TS/AおよびTS/A-LACK腫瘍を有する16.2βトランスジェニックマウス由来のLN培養物を分析して、同様の結果が得られることを示した(25)。実際、腫瘍を有するBALB/cマウス由来培養物の場合のように、16.2βマウス由来の培養物は、高レベルのCD44を発現するLACK特異的CD4+を含有し(図4A)、IL-2およびIFN-γのLACK特異的放出が可能である(図4B、4C)。IL-7、IL-2および程度は下がるがIL-15は、これらの細胞培養物を濃縮したが、IL-6、TNF-αおよびIL-10は濃縮しなかった。IL-2およびIFN-γのLACK特異的放出が可能なLACK特異的CD4+T細胞は、この場合もやはりCFSE dim細胞内に含有されていた(図4E)。
【００９１】
この非関連モデルであっても、IL-7およびIL-2は、Ag経験CD4+T細胞のLN培養物を、Ag刺激を必要とすることなく、これらのインビトロでの増殖を維持することで濃縮する。
【００９２】
Ag経験CD4+T細胞の蓄積を促進するIL-7およびIL-2の相対力をさらに特性化するため、CFSE標識細胞を、増殖細胞の生細胞および死細胞を同定することができる、蛍光色素TO-PRO-3で染色した。IL-7は、培養物の生存能力を最もよく維持し、1週間後のTO-PRO-3+、死細胞は15%のみであった。IL-2において維持された細胞の最大47%、外因性サイトカインの非存在下、またはIL-15およびIL-6の存在下で培養された細胞の、それぞれ60%、57%、および73%で、TO-PRO-3+の結果が得られた(図5A)。さらに、IL-2存在下では、CFSE dim細胞の40%のみが色素を除外したのに対し、IL-7存在下では、CFSE dim細胞の最大72%がTO-PRO-3-のままであった。これは、IL-7単独存在下で活発に増殖している細胞は、IL-2単独において培養されたものと比較した場合、より生存能力があり、細胞死に対し低感受性である可能性があることを示している。
【００９３】
IL-7およびIL-2のT細胞生存を支持する能力は、抗アポトーシス因子Bcl-2発現を制御する能力に関連している(10、38)。故に、本発明者は、組換えサイトカインの非存在下または存在下で維持したCFSE標識LN培養物におけるBcl-2レベルを分析した。IL-15を除き、どの培養条件においても、CFSE dim細胞は、最適レベルのBcl-2を発現し(図5B)、インビボで初回刺激された細胞が、生存促進(pro-survival)シグナルを受け取ったことを示した。しかし、IL-7はCFSE dim細胞およびCFSE bright細胞の両方の生存を支持する点で独特であった。実際、CD4+T細胞の最大82.5%が、IL-7の存在下で最適なBcl-2レベルを発現したのに対し、対照培地、IL-2、IL-15およびIL-6において培養された細胞のそれぞれ41.3%、16.7%、38%、および10.5%のみが、高いBcl-2発現を維持した(図5B、C)。IL-2およびIL-15存在下では、大半の細胞においてBcl-2発現の減少すら見られた(図5C)。これらをまとめた所見は、IL-2またはIL-15と比較した場合、CD4+Tリンパ球の生存を支持するIL-7の優れた能力を支持し、IL-7が、CD4+Tリンパ球の全サブセットをこの活性化状態とは無関係に維持する点で独特でありうることを示唆している。
【００９４】
本発明者はさらに、IL-7が、インビボで産生された腫瘍特異的CD4T+細胞の全サブセットの維持においてIL-2より強力であるかどうか、その結果、IL-7は、希少なインビボAg経験CD4T+細胞を追跡し検出するための主要な興味深いツールとなるかどうかを評価するため、腫瘍所属LN由来培養物の表面表現型を分析した。TS/A-LACK腫瘍所属LN細胞を、CFSE生体染色色素で標識し、IL-7単独またはIL-2単独の存在下で1週間培養した。IL-7単独で維持されたCFSE dim細胞のうち、エクスビボで見られるものと同程度のCD4+T細胞画分が、CD44およびCD62Lの高発現または低発現を保持した(図6A、B)。これらの細胞は、ナイーブな、エフェクターリンパ球およびセントラル記憶リンパ球の代表である可能性がある(8、39〜41)。IL-7で処置したCFSE dim細胞は、以前に報告されたように、中間レベルのCD25およびCD132を発現し、CD127の表面発現をダウンレギュレートした(42)。IL-2単独で維持されたCFSE dim細胞のほとんどは、それぞれ十分に活性化された表面表現型を発現し(CD44high、CD25high、CD62Llow、Bcl-2low、図6A)、培養物は、CD44high T細胞が濃縮された(図6Bおよび7B)。16.2βトランスジェニックマウス由来の培養物では、IL-7およびIL-2の両方が、エクスビボで見られるものと同程度の表面表現型を有する、Ag経験CD4+T細胞を濃縮し(図7A)、IL-7のみが、I-Ad/LACK+およびI-Ad/LACK- CD4+T細胞のうちCD44 highとCD44 low細胞間の当初の比を維持した(図7B)。リンパ球の相対的発現量を維持する能力は、生物試料におけるAg特異的T細胞の頻度を測定するため、短期培養を利用しようとする場合に関係する可能性がある。さらに、Bcl-2+細胞のほとんどが、IL-2と共に培養された細胞では低レベルのLNホーミング分子CD62Lを発現したのに対し、IL-7存在下では、CFSE dim CD4+T細胞の最大53%が、Bcl-2およびCD62Lの最適発現を維持した(図6C)。
【００９５】
IL-7、IL-2およびIL-15は、Ag特異的記憶CD8+T細胞をAg非依存的なかたちで増殖する
インビボで産生されたAg特異的T細胞を明らかにするための、IL-7におけるAg非依存性短期培養の一般的有用性にさらに取り組むため、本発明者は、Ag特異的CD8+Tリンパ球を、腫瘍疾患とは異なる文脈で追跡できるかどうかを調べた。この主な目的は:1)インビボでAgを経験したCD8+T細胞(インビボでAgを経験したCD4+T細胞だけでなく)を追跡するための本発明の適用性を評価すること、2)抗腫瘍免疫応答の診断とは異なる、臨床状況(積極的ワクチン接種)において本発明の適用性を評価すること、である。
【００９６】
IL-7が、前記1つの腫瘍疾患とは異なる臨床状況において、Ag特異的T細胞を明らかにするのに用いることができるかどうかを調べるため、本発明者は、樹状細胞(DC)ベースのワクチンにより誘導されたペプチド特異的CD8+T細胞を分析した。C57BL/6マウスに、SV40ラージT抗原由来のMHC-クラスI制限Tag IVペプチドでパルスした骨髄由来DC(DC-Tag)をワクチン接種した(18)。14日後、サイトカインで誘導した培養後のエクスビボでのAg特異的細胞内サイトカイン放出により、LN細胞を分析した。対照として、LN細胞を、ナイーブ未ワクチン接種C57BL/6マウスからも得た。Ag再刺激後にIFN-γのみまたはIL-2およびIFN-γを産生することができる、エクスビボ、Tag IV特異的CD8+T細胞は、ナイーブマウスでは検出できず、DCワクチン接種マウスでは低頻度で検出可能であった(それぞれ0%、0.37%)。Ag再刺激の非存在下で、IL-7、IL-2およびIL-15による培養7日後、Tag IV特異的CD8+T細胞の頻度(それぞれ、3.94%、1.83%および1.95%)および合計数は、DCワクチン接種マウス由来の培養物において著しく増加したが、ナイーブマウス由来の培養物では有意に増加することはなかった(不図示)。
【００９７】
同じ培養物において、本発明者は、合計CD8+T細胞と比較したTag IV特異的CD8+T細胞の相対的濃縮を分析した(図9)。全ての異なる条件のうち、IL-7、IL-2およびIL-15での培養は、CD8+T細胞の合計計数を増加し、エクスビボでの分析と比較した場合、絶対数は2倍になったが、IL-6単独または単純培地での培養は、CD8+T細胞の合計計数を増加しなかった(図9)。一方、CD8+T細胞の2倍の増加にもかかわらず、Tag IV特異的CD8+T細胞は、5〜7倍に増加した(図8)。これは、インビボでTag IVワクチンを経験したCD8T細胞が、他のCD8+T細胞集団のなかで大きな利点を有すること、IL-7、IL-2またはIL-15などの生存促進的サイトカイン存在下での培養により、選択的に濃縮されることを意味する。故に、IL-7は、Ag再刺激非存在下であっても、腫瘍誘導およびワクチン誘導CD8+T細胞反応を明らかにするのに使用することができる。
【００９８】
IL-7は、本来エクスビボでは検出できない抗原特異的CD8+T細胞を明らかにする
TS/A細胞は、自然には、免疫優勢エピトープが以前に記載された(AH-1、(19))、内因性MuLVのエンベロープタンパク質gp70を発現する。IL-7での培養が、希少なAg特異的CD8+T細胞の同定も助けるかどうかにさらに取り組むため、本発明者は、AH-1特異的CD8+T細胞反応を、Ag再刺激非存在下でIL-7、IL-2、IL-15およびIL-6を用いて、または用いずに培養した1週間後にエクスビボで比較した。リンパ球は、非パルスおよびAH-1パルス同系脾臓細胞による刺激時の、細胞内サイトカイン放出により分析した(図10)。腫瘍を有するマウスでは、サイトカイン産生細胞の頻度が、バックグラウンドレベル内にとどまり、ナイーブマウスにおいて見られるものと同程度であったため(不図示)、AH-1特異的CD8+T細胞はエクスビボでは検出できなかった(図10A)。7日後、TS/A-LACK腫瘍を有するLN由来の、組換えサイトカインを用いてまたは用いずに維持したLN培養物は、AH-1再刺激とは独立にIFN-γを産生する細胞の可変頻度を含有していた(図10B)。IL-7の存在下では、培養物は、Ag再刺激時にIFN-γのみ、またはIL-2およびIFN-γを産生することができるAH-1特異的CD8+T細胞が濃縮された(図10B)。IL-2もAH-1特異的CD8+T細胞の頻度および合計数を増加したのに対し(図10BおよびC)、頻度が、ナイーブマウス由来の培養物において見られるものと同程度、およびバックグラウンドレベル内にとどまったIL-15およびIL-6によって、これらが増加することはなかった(不図示)。故に、IL-7、およびIL-2は、インビトロでのAg誘導細胞増殖を必要とすることなく、エクスビボでは検出できない腫瘍特異的CD8+T細胞を明らかにすることができる。
【００９９】
インターロイキン-7は、記憶CD4+T細胞の選択的増殖に対しシクロスポリンA感受性シグナルとの相乗作用をもたらす
インビボでの記憶CD4+T細胞の増殖および生存は、IL-7およびTCR誘導イベントの両方に依存する(9)。インビトロでは、ヒト記憶T細胞のTCR誘導増殖は、インタクトなERK活性を必要とするのに対し、サイトカインに誘導された恒常的細胞分裂は、p38に依存し、シクロスポリンA(CsA)に非感受性である(13)。故に、本発明者は、中間記憶T細胞のIL-7誘導蓄積に関する要件を、ブロッキング抗体または選択されたシグナル伝達経路阻害剤の存在下でリンパ球を培養して分析した。細胞は、ナイーブマウスまたはTS/A-LACK腫瘍を有する16.2βマウス(かなりの頻度のLACK特異的ナイーブCD4+T細胞を有するトランスジェニックマウス(25))のLNから得て、CFSEで標識し、IL-7最適量、および指示された阻害剤の存在下で培養した。対照として、ナイーブT細胞を、選択した阻害剤の非存在下または存在下、LACKでパルスした抗原提示細胞(APC)により刺激した(図11A、B)。Ag誘導T細胞増殖は、抗MHCクラスII mAb、およびCsAにより有意に阻害され、抗ICAM-1、抗LFA-1 mAbにより部分的に阻害された(図11A、B)。予想通り、ラパマイシン(mTOR阻害剤)のみが、Ag誘導T細胞分裂を遅延させた(図11A、B)のに対し、SB202190(p38阻害剤)は、以前に報告された通り(13)、Ag刺激T細胞分裂を阻害しなかった。IL-7存在下では、対照ナイーブマウス由来培養物におけるCD4+T細胞画分は、1〜2回の緩徐な恒常的細胞分裂を行っていた(図11C、なし、細線)のに対し、急速増殖するCD4+ CFSEdim細胞集団は、腫瘍所属LN由来培養物において蓄積した(図11C、なし、太線)。この場合もやはり、IFN-γ(図11E)およびIL-2(不図示)を放出可能なLACK特異的T細胞は、主に急速増殖CD4 T細胞で見られた。抗MHCクラスII mAbの、腫瘍所属LNのIL-7誘導培養物への添加は、急速増殖するCD4+ CFSEdim細胞の蓄積に若干の効果があり(図11D、太線)、LACK特異的IFN-γ産生細胞の頻度を50%低下させた(図11E)。抗ICAM-1、またはLFA-1 mAb、およびCsAは、急速分裂するCFSEdim CD4+T細胞、およびLACK特異的IFN-γ産生細胞のIL-7誘導蓄積を阻害し、IL-7誘導恒常的細胞分裂を変化させることなかった(図11D、太線および図11E)。SB202190、またはPP2のみが、急速増殖するLACK特異的CD4+TのIL-7誘導蓄積を部分的に阻害したのに対し(図11D、E)、ラパマイシンは、IL-7に誘導された緩徐および急速な細胞分裂(図11D、太線)、およびLACK特異的T細胞のIL-7誘導蓄積を完全に阻害した(図11E)。
【０１００】
これらをまとめた所見は、IL-7は、接着分子および/または自己ペプチド/MHC相互作用により媒介される可能性のある、細胞誘導CsA感受性シグナルとの相乗作用により、急速増殖するIL-2/IFN-γ+中間記憶CD4+T細胞の蓄積を誘導することができることを示している。
【０１０１】
IL-7は、急速分裂する抹消血のヒトCD4記憶Tリンパ球の選択的蓄積を維持する
IL-7およびIL-15が、セントラル記憶およびエフェクターヒト記憶T細胞の緩徐な恒常的細胞分裂を維持することは、以前に報告されている(13)。本発明者は、高密度の培養条件およびIL-7最適量が、代わりに、抹消血由来Tリンパ球のうち急速に分裂する中間体記憶T細胞集団を明らかにするかどうかを調べた。このため、PBMCを、健常ドナーから得て、CFSEで標識し、IL-7最適量の非存在下または存在下、異なる細胞密度で7日間培養した(図12)。低い細胞密度(24ウェルあたり106細胞/ml)、およびIL-7非存在下では、全細胞が増殖せず、当初のCFSE含量を保持した。高い細胞密度(24ウェルあたり5×106細胞/ml)では、培養7日目に4回を超える細胞分裂を行うことができる急速増殖CFSEdim CD4+T細胞の、小さいが測定可能な集団が、ウシ胎児血清(図12、なし、上のパネル)または自己血清(図13)において維持された対照培養物中に現れた。IL-7存在下では、より高いCD4 T細胞画分が増殖し、1〜6細胞分裂を終えていた(図12、IL-7、下のパネル)。5回を超える細胞周期を繰り返すことができる急速増殖細胞は、高細胞密度の培養物(図12B)、およびIL-7最適量(図14)で最も明らかになった。これらの急速分裂細胞は、これらの大部分が、PMAおよびイオノマイシン刺激時にIFN-γ(図15)およびIL-2(不図示)を産生したため、中間体記憶細胞を大半が含有していた。IL-2/IFN-γ+T細胞は、50ng/mlより上の濃度で頻度(図16)、および合計数(不図示)のいずれにおいても最もよく蓄積した。
【０１０２】
IL-7に加え、IL-2およびIL-15も、他でも報告されているように(13)、ヒトCD4+T細胞のインビトロでの増殖(図17A)、およびBcl-2発現のアップレギュレーション(図18)を維持した。しかし、IL-2およびIL-15に反応して増殖する細胞のほとんどが、緩徐な恒常的細胞分裂を1〜4回終えており、急速増殖記憶T細胞が蓄積することはなかった。CD8+T細胞を、同じ培養物において分析した場合、IL-7は大半が、CD8+Tリンパ球の一部分の緩徐な恒常的分裂を支持したのに対し、IL-2およびIL-15は、急速分裂CD8+Tリンパ球集団の蓄積を可能にし(図17B)、2つの異なるT細胞サブセットにおけるこれらのサイトカインの類似した役割を示した。
【０１０３】
抹消血ヒトTリンパ球のIL-7に誘導されたT細胞増殖は、シクロスポリンAに感受性である
ヒト記憶T細胞の、IL-7およびIL-15に誘導された緩徐な恒常的細胞分裂は、CsAに感受性であり、代わりに、p38依存性シグナル伝達に依存することが報告された(13)。
【０１０４】
本発明者は、次に、中間記憶急速増殖ヒトT細胞のIL-7誘導増殖に必要なシグナル伝達を調べた。マウス細胞の場合のように、急速増殖CD4+T細胞のIL-7誘導蓄積は、CsA、およびRAPA、および程度は低いもののSB(図19A)およびPP2(不図示)に感受性であった。CsAは、以前の報告(13)と一貫して、サイトカインに誘導された緩徐な増殖を妨げた。急速増殖記憶細胞の増殖も、抗LFA-1 mAbの添加が、これらの蓄積を阻害したため、LFA-1依存性相互作用に依存していた(図19B)。高細胞密度条件、およびIL-7誘導培養物において増殖する急速増殖CD4 T細胞は、CD45RA-、CD62L-Tリンパ球(エフェクター記憶)、およびCD45RA-、CD62L+(セントラル記憶)CD4 T細胞リンパ球に代表された。注目すべきは、自発的に増殖するCD4 T細胞の最大画分であると思われるCD45RA-、CD62L+記憶T細胞は、ほとんどが、エクスビボでの増殖プロトコルにより濃縮され、CsA阻害に対し最も感受性であった(図19BおよびC)。
【０１０５】
故に、本発明者は、健常ドナーの抹消血において、自発的にインビトロで急速増殖することができるCD45RA-、CD62L+記憶CD4+T細胞集団を同定した。これらの記憶CD4+T細胞の蓄積は、IL-7により支持され、細胞密度依存性であり、CsA感受性であった。
【０１０６】
IL-7誘導短期培養は、ヒト被験者におけるヒト型結核菌特異的CD4+T細胞の計測を助ける
IL-7が、インビトロで増殖するようにインビボでプログラムされる可能性のある急速増殖記憶T細胞の、インビトロでの増殖を維持することを測定したことから、本発明者は、これが、免疫関連病態の臨床研究に利用されうるかどうかを調べた。このため、ヒト型結核菌感染(TB)患者の凍結保存されたPBMC試料を、解凍時またはIL-7最適量で培養した1週間後に、MTP特異的ELISPOT分析により分析した(43)。患者は、臨床歴および急性TB徴候(臨床および培養による確定)、TSTに対する陽性反応、ならびにELISPOT-IFN-γアッセイでのMTPに対する反応能力をもとに選択した。非感染健常ドナー由来の凍結保存PBMCも、対照として分析した。Pt#1は、(凍結保存:950 SFC×106PBMCの)解凍時に、MTP特異的再刺激した際、かなりの数のIFN-γ+スポットを示した(図20A)。対照培地(なし)で細胞を培養すると、IFN-γ+MTP特異的細胞数は倍増し(1890 SFC×106PBMC)、培養細胞におけるCD4+ T細胞の頻度の増加を反映していた(図20Aの括弧内の数字)。IL-7存在下では、IFN-γ+MTP特異的細胞数(3930 SFC×106PBMC)は、凍結保存/解凍試料において見られるものより4倍多く、対照培養物と比較した場合は2倍多かった。Pt#2およびPt#3は、試料採取時に検出可能なMTP特異的T細胞を有していたが(不図示)、凍結保存/解凍試料には有していなかった(図20B、20C)。代わりに、IL-7誘導培養すると、IFN-γ+MTP特異的スポットが明らかになった。IL-7は、分析した全てのTB患者でMTP特異的T細胞の絶対数の増加をもたらし、この結果、健常ドナーおよびTB患者の間の、MTP特異的IFN-γ産生細胞数の差は、有意性を得た(図21)。IL-2に反応して蓄積するMTP特異的T細胞は、ほとんどが、MTP誘導細胞内サイトカイン分泌により測定される、IL-2/IFN-γ+記憶CD4 T細胞に代表された(図22)。さらに、MTP特異的IL-2/IFN-γ+記憶CD4 T細胞の増殖は、CsA存在下で防がれた(図23)。
【０１０７】
IL-7誘導短期培養は、カンジダ抗原特異的ヒトTリンパ球の計測を助ける
MTP特異的T細胞に加え、本発明者は、IL-7が、カンジダアルビカンス由来抗原に特異的なTリンパ球の同定を増大することができるかどうかも調べた。このため、Pt#1由来のPBMCを、非パルスまたはC.アルビカンス由来Agでパルスした照射自己PBMCで行ったELISPOTアッセイにより、解凍時または単純培地もしくはIL-7存在下での培養7日後に分析した。M.結核菌特異的T細胞反応の場合のように、IFN-γを放出することができるC.アルビカンス特異的T細胞も、IL-7での短期培養により濃縮された(図24A、B)。
【０１０８】
IL-7/IL-15と共に培養した記憶T細胞による養子細胞療法は、インビボでの腫瘍増殖を遅延させる
IL-7が、インビボで初回刺激した記憶CD4 T細胞の蓄積を決定すること、IL-15が、CD8記憶T細胞の増殖を最もよく誘導することを測定したことから、本発明者は、増殖した集団が臨床的関連を有するかどうか評価した。この点に取り組むため、リンパ節を、TS/A-LACK腫瘍を有するマウスから得て、最適細胞密度(5×106細胞/ml)および最適サイトカイン量(50ng/ml)で7日間培養した。対照として対照マウス由来のナイーブT細胞も、同じ条件で培養した。その後、CD4およびCD8 T細胞の同程度の頻度を有する107培養細胞を、ナイーブBALB/cマウスに養子移入した。48時間後、マウスを300,000TS/A-LACK細胞で曝露し、腫瘍増殖を経時的にモニターした。図25に示された通り、TS/A-LACK腫瘍は、対照マウスおよびサイトカインで処置したナイーブT細胞を養子移入したマウスにおいて急速に発症した。反対に、腫瘍増殖は、サイトカインで処置した腫瘍を有するマウス由来のT細胞を養子移入したマウスにおいて、有意に遅延した(図25)。これは、IL-7/IL-15由来培養物が、臨床的関連のある記憶T細胞集団の増殖を決定したことを示すものである。
【０１０９】
遺伝子改変セントラル記憶ヒトT細胞の産生
細胞増殖は、Tリンパ球のレトロウイルス導入に必要とされる。本発明者は、aCD3またはbaCD3/CD28でPBMCを活性化した。細胞を、baCD3/CD28で活性化しIL-7およびIL-15と共に培養、またはaCD3で活性化しIL-2と共に培養した(図27A)。細胞に、SFCMM3レトロウイルス性ベクターを、スピノキュレーションにより2日目に導入した。導入は、同時に同じプロトコルに従って実施した。IL-7およびIL-15存在下でのbaCD3/CD28による活性化は、IL-2存在下でのaCD3による活性化よりも高いT細胞増殖を促し(図27A)、高い導入効率をもたらした(図27B)。さらに、培養期間の最後に、生理学的CD4/CD8比を分析し、aCD3で活性化しIL-2と共に培養した細胞よりも、baCD3/CD28で活性化しIL-7およびIL-15と共に培養した導入細胞でよく維持されることを見出した(図27C)。
【０１１０】
Tリンパ球のレトロウイルス導入に必要とされる多クローン活性化は、記憶細胞を濃縮する
レトロウイルス性ベクターを導入したヒトT細胞における記憶サブセットの相対分布を測定するため、本発明者は、CD45RA/CD62L共発現を分析した。14日目、aCD3で活性化しIL-2と共に培養した導入T細胞は、主にCD45RA-CD62L-、すなわちエフェクター記憶細胞であった。反対に、baCD3/CD28で活性化しIL-7およびIL-15と共に培養した導入CD4+T細胞は、CD45RA-CD62L+、すなわちセントラル記憶細胞が高度に濃縮されていた(図28A)。baCD3/CD28により活性化しIL-7およびIL-15と共に培養した細胞の場合、CD45RA-CD62L+セントラル記憶細胞の濃縮は、導入CD8+細胞についても観察された(図28B)。記憶表現型の定義を改善するため、本発明者は、CD28/CD27共発現も分析した。導入CD4+細胞では、2つの条件間でサブセットの相対分布に差はなかったが(図28C)、導入CD8+細胞では、baCD3/CD28による活性化ならびにIL-7およびIL-15による培養は、CD28+CD27+T細胞を促進した(図28D)。
【０１１１】
遺伝子改変セントラル記憶ヒトT細胞の機能的相関
表面表現型により同定されるセントラルおよびエフェクター記憶ヒトTリンパ球は、エフェクターサイトカインを産生する能力に差がある。14日目、本発明者は、2つの遺伝子改変T細胞集団を再刺激し、サイトカイン産生についてこれらを分析した。aCD3で活性化しIL-2と共に培養したCD4+T細胞は、プロトタイプのエフェクターサイトカインIFN-γを効率的に産生した。著しく対照的に、baCD3/CD28、IL-7およびIL-15で刺激したCD4+T細胞の大多数は、非極性化細胞であり、IFN-γもIL-4も産生しなかった(図29A)。類似の結果は、CD8+T細胞で得られた(図29B)。
【０１１２】
遺伝子改変セントラル記憶ヒトT細胞のGvHD能
さまざまな異種移植モデルが、ヒトリンパ球により誘導されるGvHDを研究するため提案されている。インビボでの2種類の自殺遺伝子改変セントラルおよびエフェクター記憶Tリンパ球の、相対的な抗宿主反応性を評価するため、これらの集団を、非致死的照射および抗NK抗体で馴化したNOD/scidマウスに注入した。対照マウスには、ヒト精製同系PBLを注入した。本発明者は、セントラル記憶遺伝子改変リンパ球が、このエフェクター記憶対応物よりも生着に有効であることを観察した(1週間目のヒトキメラ化:エフェクター記憶遺伝子改変細胞では平均0.45%、範囲0.2〜1.1vsセントラル記憶遺伝子改変細胞では平均4.5%、範囲4.1〜5.2、表2)。エフェクター記憶遺伝子改変T細胞を注入したマウス6例中5例が、1週間後にヒトキメラ化の低下を示し、GvHDを示さなかった。一方、持続的ヒトキメラ化は、セントラル記憶自殺遺伝子改変T細胞を注入したマウスの大半で観察され、6例中4マウスが重度のGvHDを発症した。
【０１１３】
【表２】
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【０１１４】
遺伝子改変セントラル記憶ヒトT細胞の産生
臨床適用に適した幾つかの遺伝子改変セントラル記憶ヒトT細胞を得るための最低要件を決めるため、本発明者は、以下の5つのT細胞導入条件を比較した:
1.可溶性抗CD3抗体(OKT-3)+高用量のインターロイキン2(600UI/ml)、
2.サイトカインなしの抗CD3/CD28細胞大ビーズ、
3.抗CD3/CD28細胞大ビーズ+低用量のIL-2(200IU/ml)、
4.抗CD3/CD28細胞大ビーズ+低用量のIL-7(5ng/ml)、
5.抗CD3/CD28細胞大ビーズ+低用量のIL-7(5ng/ml)+低用量のIL-15(5ng/ml)。
【０１１５】
細胞は、材料および方法に記載されたプロトコルに従って導入し、培養した。これらの実験は、以下の結果を生んだ。
【０１１６】
1.抗CD3/CD28ビーズによる活性化は、可溶性抗CD3抗体による活性化よりも高い導入効率を可能にする
図30Aに示された通り、レトロウイルス導入効率は、可溶性抗CD3抗体による刺激後よりも細胞大電磁ビーズによる刺激後に有意に高かった。この結果は、培養カクテルでのサイトカインの使用とは無関係であった。
【０１１７】
2.CD3/CD28ビーズによる活性化に続くサイトカイン(IL2、IL7+IL15またはIL7)存在下での培養は、導入Tリンパ球の生理学的CD4/CD8比を維持する
本発明者の導入プロトコルの、生理学的CD4/CD8比を維持する能力を評価するため、本発明者は、初回刺激後10日目に、異なるプロトコルで作製した導入細胞のCD4/CD8比を分析した。図30Bに示された通り、電磁ビーズによる刺激に続くサイトカイン(IL2、IL7またはIL7+IL15)での培養のみが、導入T細胞の生理学的CD4/CD8比を維持したのに対し、他の培養条件で観察された平均CD4/CD8比は、1/1を超えることはなかった。
【０１１８】
3.CD3/CD28ビーズによる活性化に続くサイトカイン(IL2、IL7+IL15またはIL7)存在下での培養は、他の培養条件よりも導入細胞の有意に高い増殖率を誘導する
臨床適用のためにデザインされたエクスビボでの遺伝子導入プロトコルは、実現可能性に関する関連基準を満たさなければならない。遺伝子療法アプローチの臨床解釈における主な実現可能性問題の1つは、インビトロでの細胞数および細胞発現に関する。図30Cに示された通り、統計的有意差は、他の条件(ビーズ単独およびOKT3+IL-2)と比べて、ビーズで刺激し、サイトカインで培養した遺伝子改変細胞の間で得られた細胞数において観察された。これらの結果は、抗CD3/CD28結合ビーズにより得られ、IL7、IL7+IL15またはIL2と共に培養された導入リンパ球が、臨床適用に適した数までインビトロで急速に増殖することを示している。
【０１１９】
4.抗CD3/CD28ビーズによる活性化は、主にセントラル記憶CD8+およびCD4+導入リンパ球を産生する
本発明者は、異なる培養条件で得られた導入細胞の免疫表現型を、初回刺激後10日目にCD3、CD4、CD8、CD45RAおよびCD62LについてFACS染色を介して調べた。本発明者は、抗CD3/CD28ビーズで刺激されたCD8+およびCD4+T両細胞のきわめて高い画分(約80%)が、CD45RA-CD62L+であることを観察した。このパターンは、セントラル記憶Tリンパ球と一致するものである。反対に、OKT3で刺激されたT細胞は、60% CD8+および45% CD4+エフェクター記憶T細胞(CD45RA-CD62L-)対30% CD8+および50% CD4+セントラル記憶TK+リンパ球を示した(図31)。
【０１２０】
導入リンパ球培養間のγ鎖受容体発現
サイトカイン受容体発現は、T細胞刺激の間、厳重に制御されている。本発明者は、T細胞の機能および能力の指標として、異なるT細胞培養および導入プロトコル間のγ鎖サイトカイン受容体の発現動態を分析した。このため、本発明者は、初回刺激後異なる時点で、CD122(IL-2/15受容体共通β鎖)、CD25(IL-2受容体α鎖)およびCD127(IL-7受容体α鎖)に対する蛍光色素標識抗体で導入細胞を染色した後に、細胞蛍光分析を行った。
【０１２１】
1.IL-2/IL-15受容体β鎖(CD122)発現は、異なる導入プロトコル間で変化することはない
免疫応答の過程で、IL-2/IL-15受容体β発現は、T細胞活性化後に増加し、次いで、記憶-細胞分裂相を通じて保持される中間レベルの発現まで減少する(13)。
【０１２２】
図32は、培養13日間の導入リンパ球におけるCD122の発現動態を示す。本発明者は、5つのプロトコル間で培養されたT細胞におけるCD122発現に関し、いかなる違いも観察しなかった。全てのケースで、T細胞は、および特にCD4+細胞は、活性化後CD122をアップレギュレートし、約4日目にピークに達し、ほぼ100%の遺伝子改変細胞が分子を発現した。次いで、細胞はCD122発現を徐々にダウンレギュレートし、T細胞培養開始後13日目に刺激前に観察されたのと同じ発現レベルに達し、細胞は休止期に達した。
【０１２３】
2.CD3/CD28ビーズによる刺激は、導入T細胞におけるIL-2受容体α発現を強化し延長させる
IL-2受容体α(CD25)は、Tリンパ球に関連のある活性化マーカーである。生理学的状態では、ナイーブT細胞はCD25を発現しないが、T細胞活性化によりこの発現は急速にアップレギュレートされ、通常は反応の増殖ピーク前に減少する。
【０１２４】
ビーズにより活性化した導入細胞では、その後の培養条件とは関係なく、フローサイトメトリー分析は、刺激後2日目にT細胞の大半でIL-2受容体α発現が有意に増加したことを示した。反対に、可溶性OKT3で活性化した導入細胞の40%のみが、受容体をアップレギュレートした(図33)。これは、T細胞の大半が、この刺激法では適切に活性化されなかったことを示すものである。CD25が発現される限り、T細胞は、IL-2に対して増殖することができるため、免疫応答に積極的に参加する。ビーズ活性化後に産生された導入細胞では、CD25発現は、最大13日まで細胞の大半で高いままであった。反対に、可溶性抗CD3抗体による刺激後にCD25をアップレギュレートした細胞は、ビーズで活性化した細胞より2日遅れて発現のピークに達し、次いでCD25分子を急速にダウンレギュレートした。
【０１２５】
3.抗CD3/CD28ビーズ+IL-7で活性化した導入細胞は、長期生存記憶T細胞のマーカーである、IL-7受容体αの最大発現を示す
生理学的状態では、IL-7受容体α(CD127)は、ナイーブT細胞により構成的に発現される。この発現は、T細胞活性化によりダウンレギュレートされ(CD25と比べて鏡面的なかたちで)、このようなダウンレギュレーションが、細胞死を促進している可能性がある。反対に、CD127発現は、免疫応答が進むにつれて増加し、記憶T細胞において高レベルに達する。IL-7は、記憶Tリンパ球の強力な生存因子であり、IL-7による受容体の誘発が、T細胞の生存および増殖を促進し、さまざまな細胞内シグナル経路を介したアポトーシスから細胞を保護する。本発明者は、本発明者の導入細胞におけるCD127発現動態を分析した。IL-7受容体αは、刺激後強いダウンレギュレーションを起こした(約1日目〜6日目)。7日目から、この発現は徐々に増加し、興味深いことに、本発明者は、他の全ての条件と比較して、ビーズCD3/CD28およびIL-7により得られたCD127+導入細胞の割合に有意差を観察した(図34)。9日目から、細胞大ビーズおよびIL-7で刺激した、CD8+およびCD4+ TK+両細胞の80%超が、IL-7受容体α陽性であった。これは、IL-7が、活性化後、T細胞の大半で高レベルのD127発現の維持を担っており、故に、独占的な長期生存の利点を導入細胞にもたらすことを示唆するものである。
【０１２６】
ビーズ+IL-7により産生された導入リンパ球は、最も高い自己反応性能を有する
以前に示された結果から、抗CD3/CD28電磁ビーズによる活性化およびサイトカイン(特にIL-7)のアジュバント効果は、高い生存能を有する、セントラル記憶導入Tリンパ球の産生にとって重要な因子であることが分かっている。本発明者の次なる目的は、これらのCM導入Tリンパ球が、実際に、強力で有効な免疫応答を引き出すことができるかどうかを調べることであった。本発明者は、導入細胞を同種抗原で刺激して、インビトロでこの問題に取り組み、以下の結果を得た。
【０１２７】
1.ビーズ+IL-7により産生された導入リンパ球は、同種抗原で刺激した場合、最も高い増殖能を有する
各5つの条件により産生された導入T細胞を、CFSEで染色し、照射した同種PBMCで共培養した。1週間後、本発明者は、細胞数を計数し、FACSによるCFSE希釈を分析して分裂細胞の割合を評価した。図35Aに示された通り、本発明者は、CD3+およびCD8+T細胞において、IL-7含有条件と他のプロトコルとの間に統計的有意差を見出した。実際、ビーズCD3/CD28+IL-7により産生された導入細胞の高い割合(40%)が、同種刺激後1週間で分裂した。反対に、OKT3-により産生された導入細胞の20%のみが、同じ培養条件で分裂した。
【０１２８】
2.ビーズ+IL-7により産生された導入リンパ球は、死に対する感受性が低い
Tリンパ球の恒常性を維持するため、同種抗原曝露に反応した大量のT細胞活性化は、通常、大規模なアポトーシスプログラムが続いて起こり、いわゆる「活性化誘導細胞死」(AICD)においてIL-2が中心的な役割を果たす。初回免疫応答後の有効で長期にわたる免疫記憶を開発するには、AICDに対抗するメカニズムが必要とされる。導入細胞のAICDに対する感受性を調べるため、本発明者は、死細胞に選択的に結合する蛍光色素、To-Pro 3により同種刺激CFSE+リンパ球を染色した。本発明者は、活性化誘導細胞死およびネグレクトによる死をそれぞれ評価するため、分裂および非分裂導入細胞集団における死細胞数を算出した(図35B)。IL-2において(活性化シグナルとは無関係に)培養した導入細胞は、AICDおよびネグレクトによる死に対し高い感受性をもたらした。反対に、ビーズCD3/CD28およびIL-7により産生された導入細胞は、未修飾リンパ球の死亡率と同程度の最も低い死亡率を示した。この観察は、ビーズCD3/CD28+IL-7により産生された遺伝子改変リンパ球の高い割合(CD8+の33%、CD4+の52%)におけるCD127の持続的発現と関係している可能性がある。
【０１２９】
この観察により、細胞死に対する高感受性をもたらす、ビーズCD3/CD28およびIL-2により産生された導入リンパ球は、CD127+細胞発現細胞の最も低い割合を示した(30%)。図36AのFACSプロットは、同種刺激後10日目のCFSE染色導入Tリンパ球におけるCD127検出の代表例を示す。
【０１３０】
3.ビーズ+IL-7により産生された導入リンパ球は、同種刺激後にセントラル記憶表現型を維持する
免疫記憶は、抗原再遭遇時に、分裂し、病原体を直接除去することのできるエフェクター、および宿主を長期に防御することのできる記憶細胞の両方を産生する記憶細胞の、自己再生能により確保される。セントラル記憶遺伝子改変リンパ球が、この自己再生能を有するかどうかを検証するため、本発明者は、CFSE染色細胞におけるCCR7(セントラル記憶細胞マーカー)発現を、同種刺激後10日目に分析した。図36Aに示された通り、本発明者のデータは、ビーズCD3/CD28およびIL-7により産生されたCD3+遺伝子改変リンパ球(少なくとも1回分裂している)の59%が、CCR7発現陽性であったことを示している。反対に、OKT3により産生されたCD3+遺伝子改変リンパ球の17%のみが、CCR7を発現した。IL-7の存在下での培養は、ビーズCD3/CD28およびIL-2により産生されたCD3+遺伝子改変リンパ球の36%しか、同種刺激後のCCR7発現を維持しないため、セントラル記憶リンパ球の自己再生能の維持に不可欠であった。この結果により、初回刺激に使用したのと同じ培養条件に従って、細胞を、同じ同種刺激因子によりインビトロで再曝露した場合、CD3/CD28ビーズおよびIL-7により産生された導入細胞の70%超、およびOKT3により産生された導入細胞の50%のみが、翌週に増殖した(図36B)。
【０１３１】
ビーズ+IL-7により産生された導入細胞は、インビボで最も高い自己反応性能を有する
インビボでのセントラル記憶導入T細胞の有効性を評価するため、本発明者は、ヒト皮膚を移植されたNOD/Scidマウスをもとに、新規のキメラモデルを確立した。インビトロで得られた結果をもとに、本発明者は、ビーズCD3/CD28+IL-7、ビーズCD3/CD28+IL-2により産生された遺伝子改変セントラル記憶リンパ球の効力を調べること、ならびにOKT-3およびIL-2により産生された、および臨床試験で現在使用されている、遺伝子改変エフェクター記憶リンパ球によるこれらの細胞の機能的活性を比較することにした。導入細胞注入後、異種T細胞の反応性を、臨床的観察により判定したのに対し、同種GvHDは、組織学的に評価し、導入細胞によるヒト皮膚浸潤の分析と相関させた。これらの研究結果を以下にまとめる。
【０１３２】
CD3/CD28およびIL-7により産生された遺伝子改変細胞は、皮膚移植されたNOD/Scidマウスにおいて急速に生着する
マウス抹消血におけるヒトTリンパ球数は、注入後1週間から2週間で増加した。ビーズにより産生された導入細胞は、OKT-3で産生された導入細胞より高度に生着した。この差は、T細胞注入後2週間目により明白であった(図37)。
【０１３３】
ビーズCD3/CD28およびIL-7刺激による活性化は異種抗原に対する最も高い反応性を導入細胞にもたらす。異種GvVDは、材料および方法に記載された臨床スコアに従い、体重減少を測定することでモニターした。注入されたNOD/Scidマウスは、徐々に体重が減少し、何例かは、実際に異種GvHDのため死亡し、または倫理的理由のため屠殺された。ほとんどの異種反応性T細胞は、抗CD3/CD28ビーズで刺激され、IL-7による培養後にCD3/CD28ビーズおよびIL-2により産生された導入細胞により培養されたものであった。可溶性抗CD3抗体による刺激は、これらのリンパ球を注入されたマウスが、著しい体重減少も、他の臨床的異種GvHD徴候も示さなかったため、異種反応性T細胞を強力に産生することはなかった(図38)。
【０１３４】
ビーズCD3/CD28およびIL-7刺激による活性化は、同種抗原に対する最も高い反応性を導入細胞にもたらす
本発明者のNOD/Scidヒト皮膚キメラマウスモデルは、マウスの背中の2つの皮下ポケットに2片のヒト腹部表皮を挿入する皮膚移植を受け、続いて、遺伝子改変細胞を静注されたNOD/Scidマウスからなる。ヒト皮膚移植は、同種抗原に対するT細胞の反応性を、組織学的試験により調べることを可能にする。移植されたヒト皮膚は、実際、表皮細胞および間質細胞だけでなく、幾つかの抗原提示細胞も含有する。抗原提示細胞は、循環リンパ球を引きつけ、恐らくこの活性化を促進することができる。ヒトT細胞注入後3週間目に、本発明者は、NOD/Scidキメラマウスを屠殺し、ヒト皮膚を両側から除去した。続いて、生検は全て、ヘマトキシリン-エオシン(EE)染色および抗ヒトCD3染色を介して病理医により盲検分析された。本発明者は、「ビーズ+IL-7」で刺激したTリンパ球を注入されたマウスでのみ、ヒト皮膚の状況において大量のヒトT細胞浸潤を観察した。「OKT-3」条件では、T細胞の組織浸潤レベルは、あったとしても明らかにわずかであった。図39は、これらの結果の代表例を示す。
【０１３５】
結論
T細胞は、一般に、病原体、腫瘍、および免疫不全に対する、および自己免疫障害における免疫産生に中心的な役割を果たすと認識されているが、ヒトにおける免疫能力の診断マーカーおよび予後マーカーとしてこれを使用することは困難であった。さらに、非極性多機能中間体およびセントラル記憶リンパ球の増殖に適した方法は、現在欠如している。
【０１３６】
本発明の報告に記載された結果は、
A)インビボで初回刺激された記憶T細胞のAg非依存的蓄積を可能にする、
B)リンパ球ポリクローナル刺激および遺伝子操作にもかかわらず、セントラル記憶リンパ球の増殖を導く
新たな培養条件を同定する。
【０１３７】
結果は、IL-7およびIL-15が、インビボで初回刺激されたAg(腫瘍/病原体/アレルゲン/自己抗原)特異的CD4+またはCD8+T細胞のために、抹消LN、血液および腫瘍などの生物試料を濃縮するのに使用できることを示している。IL-2と比較した場合、IL-7は、リンパ球本来の表現型および発現量をよく維持し、Tリンパ球サブセット全ての生存をよく支持し、希少なCD4+T記憶リンパ球の検出および増殖を可能にした。
【０１３８】
慢性ウイルス感染、自己免疫疾患、ワクチン接種または免疫療法の状況において、Ag特異的CD4+またはCD8+T細胞を計数する能力は、患者の免疫能力または疾患の直接的指標を提供し、最適な治療を選択するうえで臨床家を助けるであろう。さらに、インビボで初回刺激された記憶T細胞を、この表現型を変えることなく濃縮する可能性は、インビボで初回刺激された記憶T細胞の特性化、および養子免疫療法戦略における免疫応答のためのこれらの利用を改善しうる。最後に、遺伝子改変セントラル記憶T細胞は、CD3/CD28活性化および恒常的なサイトカインによる培養に際し得ることができる。条件付けされた免疫不全宿主に注入された場合、遺伝子改変セントラル記憶T細胞は、i)エフェクター記憶遺伝子改変T細胞よりも有意に高いレベルで生着し増殖し、ii)宿主および同種抗原に対する免疫応答の誘導において、エフェクター記憶遺伝子改変リンパ球よりも強力である。
【０１３９】
これらの結果は、十分に機能的なセントラル記憶遺伝子改変リンパ球は、ヒト疾患治療のために得ることができ、利用することができることを示すものである。
(参考文献)
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【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】IL-7は、Ag刺激を必要とすることなく腫瘍特異的記憶CD4+ T細胞の蓄積を支持する。BALB/cマウス(1群につき5匹)を、3×105 TS/A-LACKまたはTS/A腫瘍細胞に曝露し、21日後に屠殺した。腫瘍所属LN(A〜D)、および非所属LN(E〜H)プールからの細胞を、IL-7単独による培養7日後にエクスビボで分析した。A、C、E、G)細胞は、材料および方法に記載の通り染色した。CD4+、B220-、CD8-、CD11b-、TOPRO-3-生存細胞についてゲーティングした後の代表的なフローサイトメトリープロフィールが示されている。CD44high I-Ad/LACK+ CD4+細胞の頻度が示されている。B、D、F、H)リンパ球は、LACK aAPCで刺激し(材料および方法参照)、固定し、透過処理し、抗CD4 mAb、抗IL-2および抗IFN-γ mAbで染色し、フローサイトメトリーで分析した。CD4+によるIL-2およびIFN-γ産生を示す代表的なドットプロットが示されている。サイトカイン産生細胞の頻度は、各四分円内に報告されている。実験は、6つの独立した測定の代表である。一部の例では、LACK特異的IFN-γ放出が、TS/A腫瘍を有するマウスのIL-7で処置したLN培養において検出された。これらの細胞の性質は、依然として不明であっても、これらの細胞は、LACKホモログ哺乳類RACKに特異的である可能性がある(24)。
【図２】IL-7およびIL-2、IL-15およびIL-6は、腫瘍特異的CD4+ T細胞の蓄積を誘発する(ただし、Agは誘発しない)。TS/A-LACK腫瘍を有するBALB/cマウス(n=5)から回収したLN細胞プールを、LACKペプチドの非存在下(APC)または存在下(Ag/APC)またはIL-7、IL-2、IL-15およびIL-6単独で、照射した脾臓細胞と共に培養した。7日後、細胞を回収および表面染色してAgを経験したLACK特異的T細胞の頻度を測定し(A、C)、または図1に記載の通りLACK aAPCで刺激してLACK特異的細胞内サイトカイン放出を評価した(B、D)。A) CD4+、B220-、CD8-、CD11b-、TO-PRO-3-生存細胞についてゲーティングした後の代表的なフローサイトメトリープロフィールが示されている。CD4+細胞におけるCD44high I-Ad/LACK+ CD4+細胞の頻度(A)および合計数(C)が示されている。B)代表的なドットプロットは、CD4+ TによるIL-2およびIFN-γ産生を示す。CD4+ T細胞におけるLACK特異的サイトカイン産生細胞の頻度(B)および合計数(D)が報告されている。実験は、3〜5の独立した測定の代表である。
【図３】IL-7およびIL-2は、インビボで初回抗原刺激された腫瘍特異的CD4+ T細胞のAg非依存性増殖を維持する。A)ナイーブまたはTS/A-LACK腫瘍を有するBALB/cマウス(n=5)から回収したLN細胞プールを、CFSE生体染色色素で標識し、単純培地で1週間培養した。CD4+ T生存細胞の代表的なドットプロットを示す。B〜D)TS/A-LACK腫瘍所属LN由来のCFSE標識LN細胞を、IL-7、IL-2、IL-15およびIL-6なしで(なし)またはIL-7、IL-2、IL-15およびIL-6と共に7日間培養した。次いで、細胞をLACK aAPC(B、D)または対照aAPC(C)で刺激し、図1に記載の通り細胞内サイトカイン放出をフローサイトメトリーで分析した。CFSE含量およびCD4+ T生存細胞によるIL-2またはIFN-γ産生を示す代表的なドットプロットを、BおよびCに示す。Dには、IL-2および/またはIFN-γを産生するCFSEdim CD4+ T細胞の合計数を示す。実験は、3つの独立した測定の代表である。
【図４】IL-2、およびIL-6、IL-10、TNF-αはIL-7を模倣し、Ag非存在下で腫瘍特異的記憶CD4+ T細胞用の細胞培養物を濃縮する(ただし、IL-15およびIL-6はしない)。16.2βトランスジェニックマウス由来のTS/A-LACKおよびTS/A-腫瘍所属LNを、指示された組換えサイトカイン単独の非存在下(-)または存在下で1週間培養し、図1に記載の通りフローサイトメトリーで分析した。A) CD4+、B220-、CD8-、CD11b-、TOPRO-3-生存細胞についてゲーティングした後の代表的なドットプロットが示されている。I-Ad/LACK+ CD4+細胞の頻度が示されている。B〜D)TS/A-LACK-(B、C)およびTS/A-(D)腫瘍所属LN培養から得られたリンパ球を、LACK aAPC(B、D)または対照aAPC(C)で刺激し、細胞内IL-2、IFN-γおよびIL-4を検出した。CD4+によるIL-2およびIFN-γ産生を示す代表的なドットプロットを示す。IL-4+細胞は、全実験でバックグラウンドレベル内であった。IL-2+、IFN-γ+サイトカイン産生細胞の頻度は、各四分円内に報告されている。E)TS/A-LACK腫瘍を有する16.2βマウス由来の腫瘍所属LN細胞を、CFSEで標識し、指示されたサイトカイン非存在下(-)または存在下で1週間培養した。その後、細胞をLACK aAPCで刺激し、フローサイトメトリーで分析したCFSE含量およびCD4+によるIL-2、およびIFN-γ産生を示す代表的なドットプロットを示す。実験は、3つの独立した測定の代表である。
【図５】IL-7およびIL-2はT細胞の生存およびBcl-2の最適な発現を支持する。TS/A-LACK腫瘍所属LN由来細胞を、CFSE生体染色色素で標識し、IL-7、IL-2、IL-15およびIL-6単独の非存在下(-)または存在下で培養した。7日後、細胞を回収し、抗CD4 mAbおよびTO-PRO-3(A)ならびに抗Bcl-2 mAb(B、C)で染色した。A)合計CD4+細胞の代表的なドットプロットが示されている。合計CD4+ TOPRO-3+(括弧)の頻度およびCFSE dim、TO-PRO-3-細胞(太字)が報告されている。B〜C)CD4+ T生存リンパ球について物理的なゲーティングをした後のイベントが示されている。C)細線:対照アイソタイプ;細線で囲まれたプロフィール:抗Bcl-2 Ab、培地で培養した細胞;太線:抗Bcl-2 Ab、サイトカインと共に培養した細胞。実験は、2つの独立した測定の代表である。
【図６】IL-7およびIL-2で維持されたリンパ球の表現型およびサブセットの代表。CFSEで標識したTS/A-LACK腫瘍所属LN培養物を、IL-7またはIL-2の存在下で1週間維持した。その後、細胞を、抗CD4、CD44、CD25、CD127、およびCD132 mAbで染色した。A)代表的なドットプロットは、生存CD4+のCD44、CD62L、CD25、CD127、およびCD132の発現レベルを報告している。B)Ag刺激非存在下でIL-7(細線)およびIL-2(太線)培養から得られたCD4+、CFSE dim細胞のオーバーレイが示されている。C)CFSEで標識した細胞を、CD4およびCD62L表面レベル、ならびに細胞内Bcl-2について表面染色した。CD4+、CFSE dim細胞についてゲーティングした後のドットプロットが示されている。実験は、3つの独立した測定の代表である。
【図７】IL-7と共に培養した細胞は、屠殺時に見られたものと同程度である。16.2βトランスジェニックマウス由来のTS/A-LACK腫瘍所属LNを、Ag刺激非存在下でIL-7またはIL-2における短期培養後、エクスビボで図1に記載の通りI-Ad/LACK染色により分析した。A)代表的なドットプロットは、CD4+、B220-、CD8-、CD11b-、TOPRO-3-生存細胞のCD44、CD25、CD127、およびCD132の発現レベルを報告している。B)B220-、CD8-、CD11b-、TOPRO-3-リンパ球についてゲーティングした後のCD4+、I-Ad/LACK+およびCD4+、I-Ad/LACK-のオーバーレイが示されている。エクスビボ:点線;細線:IL-7;太線:IL-2。
【図８】IL-7、IL-2またはIL-15誘発培養物を、インビボで初回抗原刺激されたTAG IV特異的記憶CD8+ T細胞用に濃縮する。C57BL/6マウスを、Tag IVペプチドでパルスした骨髄由来樹状細胞で免疫した。14日後、腋窩、上腕および鼠径LN細胞を回収し、IL-7、IL-2、IL-15、IL-6の非存在下または存在下で培養後1週間目にエクスビボで分析した。Tag IV特異的サイトカイン産生CD45.1- CD8+ T細胞の合計数が報告されている。実験は、2つの独立した測定の代表である。
【図９】IL-7、IL-2またはIL-15誘発培養物は、同程度の数のCD8+ T細胞を救出する。C57BL/6マウスを、Tag IVペプチドでパルスした骨髄由来樹状細胞で免疫した。14日後、腋窩、上腕および鼠径LN細胞を回収し、IL-7、IL-2、IL-15、IL-6の非存在下または存在下で培養後1週間目にエクスビボで分析した。Tag IV特異的サイトカイン産生CD45.1- 8CD8+ T細胞の合計数が報告されている。実験は、2つの独立した測定の代表である。
【図１０】IL-7は、本来ならエクスビボでは検出できない腫瘍特異的記憶CD8+ T細胞の蓄積を支持する。A)BALB/cマウス(1群につき5マウス)を、3×105 TS/A-LACK腫瘍細胞に曝露し、21日後に屠殺した。腫瘍所属LN(A〜C)のプールの細胞を、エクスビボで(A)、IL-7、IL-2、IL-15、IL-6の非存在下または存在下で(B〜C)で培養後7日目に分析した。A)代表的なドットプロットは、KJ1.26- CD8+ T細胞によるIL-2およびIFN-γ産生を示す。AH-1特異的サイトカイン産生KJ1.26- CD8+ T細胞の頻度(A、B)および合計数(C)が報告されている。
【図１１】中間記憶CD4+ T細胞は、IL-7の存在下、細胞密度依存性の、CsA感受性な様式で蓄積する。ナイーブ(A、B)およびTS/A-LACK腫瘍を有する(C〜E)16.2βマウスの腋窩、上腕および鼠径LN由来の細胞を、CFSEで標識し、LACKペプチド(Ag)(A、B)またはIL-7(C〜E)の存在下、指示されたインヒビターの非存在下(なし)または存在下、単純培地で7日間それぞれ培養した。培養の最後に、細胞をL/28 aAPCで5時間刺激し、細胞内サイトカイン放出を測定した。A〜D)ヒストグラムは、同等数の(7×104)CD4+ T細胞のCFSE希釈プロフィールを示す。AおよびCでは、細線は、単純培地で培養したCD4+T細胞のCFSEプロフィールを反映し、一方、太線は、AgまたはIL-7中で培養したCD4+T細胞のCFSEプロフィールを示す。BおよびDでは、細線:インヒビター非存在下で培養した細胞、太線:インヒビター存在下で培養した細胞。E)CD4+ T生存細胞についてゲーティングした後のドットプロットが示されている。パーセンテージは、LACK特異的サイトカイン分泌細胞の頻度を示す。
【図１２】IL-7は、ヒト抹消血CD4+ T細胞画分の急速な、Ag非依存性増殖を維持する。健常ドナー由来のヒトPBMCを、CFSE生体染色色素で標識し、指示された細胞濃度で組換えヒトIL-7(100ng/ml)の非存在下(なし)または存在下で7日間培養した。CD4+ T生存細胞の代表的なドットプロットが示されている。CFSEdim CD4+ T細胞の頻度が示されている。B)ヒストグラムは、指示された細胞密度で培養したCD4+ T細胞のオーバーレイを示す(N:非増殖細胞、SおよびF:緩徐および急速に増殖する細胞)。
【図１３】IL-7は、自己血清中の急速に分裂する細胞の蓄積を維持する。健常ドナー由来のヒトPBMCを、CFSE生体染色色素で標識し、指示された細胞濃度で組換えヒトIL-7(100ng/ml)の非存在下(なし)または存在下、10%自己血清を添加した培養培地において7日間培養した。CD4+ T生存細胞の代表的なドットプロットが示されている。非増殖(N)、ならびに緩徐(S)および急速(F)増殖CFSEdim CD4+ T細胞の頻度が示されている。
【図１４】急速に分裂するCD4 T細胞のIL-7誘導蓄積は用量依存的である。健常ドナー由来のヒトPBMCを、CFSE生体染色色素で標識し、指示量の組換えヒトIL-7の存在下で7日間培養した。CD4+ T生存細胞の代表的なドットプロットが示されている。非増殖(N)、ならびに緩徐(S)および急速(F)増殖CFSEdim CD4+ T細胞の頻度が示されている。
【図１５】IL-7は、急速に分裂するI1FN-γ産生記憶CD4+ T細胞の蓄積を維持する。健常ドナー由来のヒトPBMCを、CFSE生体染色色素で標識し、指示量の組換えヒトIL-7の存在下で7日間培養した。7日後、細胞を回収し、PMAおよびイオノマイシンで6時間再刺激した。次いで、細胞を表面染色し、固定し、抗IFN-γ mAbで染色した。CD4+ T生存細胞の代表的なドットプロットが示されている。
【図１６】IL-2/IFN-γ+ CD4+ T細胞のIL-7誘導蓄積は用量依存的である。健常ドナー由来のヒトPBMCを、指示量の組換えヒトIL-7の存在下で7日間培養した。7日後、細胞を回収し、PMAおよびイオノマイシンで6時間再刺激した。次いで、細胞を表面染色し、固定し、抗IFN-γ mAbで染色した。CD4+ T生存細胞の代表的なドットプロットが示されている。
【図１７】IL-7は急速分裂記憶CD4+ Tリンパ球を最もよく増殖し、一方、IL-15は急速分裂記憶CD8+ Tリンパ球の蓄積を誘導する。CFSE標識ヒトPBMCを、単純培地(なし)でまたはヒト組換えIL-7、IL-2、IL-15、およびIL-6の存在下で7日間培養し、次いで、抗CD4および抗CD8 mAbで染色し、フローサイトメトリーで分析した。ヒストグラムのオーバーレイは、同じ数のCD4+(A)およびCD8+(B)リンパ球内のCFSE含量を示す。急速(F)、緩徐(S)、および非(N)増殖細胞が示されている。
【図１８】IL-7、IL-2またはIL-15は、培養ヒト細胞での最適Bcl-2発現を誘導する。健常ドナー由来のヒトPBMCを、CFSE生体染色色素で標識し、ヒト組換えIL-6、IL-7、IL-2およびIL-15の非存在下(なし)または存在下で7日間培養した。次いで、細胞を抗CD4 mAbで染色し、固定し、および細胞内Bcl-2レベルを、細胞内染色で測定した。CD4+ T細胞についてゲーティングした後のイベントが示されている。
【図１９】ヒト末梢血記憶CD4 T細胞のIL-7誘導CD4 T細胞増殖はCsAおよびLFA-1/ICAM依存性シグナル伝達に依存する。健常ドナー由来のヒトPBMCを、CFSE生体染色色素で標識し、指示されたインヒビターの非存在下(なし)または存在下、ヒト組換えIL-7の存在下で7日間培養した。次いで、細胞を、抗CD4、抗CD45RAおよび抗CD62L mAbで染色し、フローサイトメトリーで分析した。A)ヒストグラムは、CD4+T生存細胞のCFSEプロフィールのオーバーレイを示す。B)ドットプロットは、CD4+ T生存細胞を示す。急速(F)、緩徐(S)、および非(N)増殖細胞が、電子的に定義され、Cに示されている。ナイーブおよび記憶T細胞の相対的な代表が図に示されている。結果は、2つの独立した測定の代表である。
【図２０−１】ヒト型結核菌特異的CD4+ T細胞は、IL-7誘導培養により濃縮される。3名のTB患者由来のPBMC(Pt. #1、図20A;Pt#2、図20B;およびPt#3、図20C)を、MTP特異的IFN-γ放出について、ヒト組換えIL-7(培養)の非存在下(なし)または存在下で7日間培養した後、解凍(凍結保存されている)時にELISPOTアッセイで分析した。バックグラウンドIFN-γ放出を、パルスした対照ウェル(ctr)において測定した。B)MTP特異的IFN-γ産生細胞の合計数が示されている。
【図２０−２】ヒト型結核菌特異的CD4+ T細胞は、IL-7誘導培養により濃縮される。3名のTB患者由来のPBMC(Pt. #1、図20A;Pt#2、図20B;およびPt#3、図20C)を、MTP特異的IFN-γ放出について、ヒト組換えIL-7(培養)の非存在下(なし)または存在下で7日間培養した後、解凍(凍結保存されている)時にELISPOTアッセイで分析した。バックグラウンドIFN-γ放出を、パルスした対照ウェル(ctr)において測定した。B)MTP特異的IFN-γ産生細胞の合計数が示されている。
【図２１】IL-7誘導培養は、ヒト型結核菌特異的CD4+T細胞の同定を促進する。健常ドナー8例およびTB患者5例由来の凍結保存PBMCおよびIL-7培養PBMCによるMTP特異的IFN-γ産生物を、ELISPOTにより分析した。統計的有意性を、対応のある両側T検定(paired two-tail T-test)により評価した。
【図２２】ヒト型結核菌特異的IL-2/IFN-γ+ CD4+T細胞はIL-7誘導培養物において蓄積する。Pt#1細胞を、ヒト組換えIL-7(培養)の非存在下(なし)または存在下で培養した。A)ELISPOTにより検出されたMTP特異的IFN-γ放出(図20Aにも図示)。B)並行する培養細胞セットも、MTPパルスした自己照射PBMCで6時間再刺激し、抗CD4 mAbで表面染色し、固定し、さらに抗IFN-γmAbで染色した。CD4+ T生存リンパ球についてゲーティングした後のイベントが示されている。
【図２３】ヒト型結核菌特異的CD4+T細胞はIL-7誘導培養物において増殖する。A)Pt#1細胞を、ヒト組換えIL-7(培養)の非存在下(なし)または存在下で培養した。ELISPOTにより検出されたMTP特異的IFN-γ放出(図20Aにも図示)。B)並行培養物を、CFSE標識PBMCによりセットした。7日後、細胞を、MTPパルスした自己照射PBMCで刺激し、細胞内IFN-γ放出をフローサイトメトリーにより測定した。CD4+ T生存細胞についてゲーティングした後のイベントが示されている。
【図２４】カンジダアルビカンス特異的IFN-γ+記憶T細胞はIL-7誘導培養物において蓄積する。A)凍結保存したPt#1細胞、またはヒト組換えIL-7の非存在下(なし)または存在下で7日間培養したPt#1細胞によるELISPOTアッセイにより検出されたC.アルビカンス特異的IFN-γ放出が示されている。バックグラウンドIFN-γ放出を、非パルス対照ウェル(ctr)において測定した。B)IFN-γ産生細胞の合計数が示されている。
【図２５】IL-7/IL-15で培養した記憶細胞はインビボでの養子細胞移入時に腫瘍増殖を遅らせる。対照(ナイーブ)マウスおよびTS/A-LACK腫瘍を有するマウス由来のリンパ節細胞を、IL-7およびIL-15(いずれも50ng/ml)の存在下、高細胞密度(5×106細胞/ml)で7日間培養した。その後、107培養細胞をナイーブBALB/Cマウスに養子移入した。48時間後、マウスを300.000 TS/A-LACK細胞で曝露し、腫瘍増殖を経時的にモニターした。統計的有意性を、対応のある両側T検定により評価した。
【図２６】戦略案ならびにこの診断的および治療的影響の概略図。
【図２７】抗CD3抗体および抗CD28抗体結合ビーズによる活性化(baCD3/CD28)ならびにIL-7およびIL-15による培養は、T細胞増殖を促進し、CD4/CD8比を維持したまま遺伝子改変ヒトリンパ球を効率的に産生する。5×106PBMCを、aCD3で刺激しIL-2と共に培養、またはbaCD3/CD28で刺激しIL-7およびIL-15と共に培養した。14日目に細胞をトリパンブルー排除法により計数した。(A)2つの刺激および培養条件における平均T細胞増殖(倍)が示されている(n=4ドナー)。初回刺激後48時間および72時間目に、細胞をSFCMM3レトロウイルスベクターにより導入した。6日目に、遺伝子改変細胞を抗LNGFR抗体で染色した後、フローサイトメトリーにより定量した。(B)2つの刺激および培養条件における平均導入効率(%)が報告されている(n=4ドナー)。14日目に、ΔLNGFR発現ならびにCD4およびCD8発現について、細胞をフローサイトメトリーにより分析した。(C)2つのプロトコルで生成した遺伝子改変細胞における平均CD4/CD8比が報告されている(n=4ドナー)。
【図２８】baCD3/CD28による活性化ならびにIL-7およびIL-15による培養はセントラル記憶表現型を有するTK+ヒトリンパ球を産生する。14日目に、aCD3により産生されIL-2と共に培養したTK+細胞、またはbaCD3/CD28により産生されIL-7およびIL-15と共に培養したTK+細胞を、記憶表現型により分析した。ΔLNGFR発現についてゲーティングした後、CD45RAおよびCD62L共発現について細胞をフローサイトメトリーにより分析した。n=4ドナー由来の(A)CD4+細胞および(B)CD8+細胞について、CD45RA+CD62L+(黒いバー)、CD45RA-CD62L+(濃いグレーのバー)、CD45RA-CD62L-(薄いグレーのバー)またはCD45RA+CD62L-(白いバー)の平均相対分布(y軸、%)が報告されている。CD27およびCD28共発現についても細胞をフローサイトメトリーにより分析した。n=4ドナー由来の(C)CD4+細胞および(D)CD8+細胞について、CD28+CD27+(黒いバー)、CD28-CD27+(濃いグレーのバー)、CD28-CD27-(薄いグレーのバー)またはCD28+CD27-(白いバー)の平均相対分布(y軸、%)が報告されている。
【図２９】セントラル記憶TK+ヒトリンパ球は非極性細胞である。14日目に、aCD3により産生されIL-2と共に培養したTK+細胞、またはbaCD3/CD28により産生されIL-7およびIL-15と共に培養したTK+細胞を、サイトカイン産生について分析した。ΔLNGFR発現についてゲーティングした後、IFN-γおよびIL-4産生について細胞をフローサイトメトリーにより分析した。(A)CD4+細胞および(B)CD8+細胞について、IL-4+IFN-γ-(白いバー)、IL-4+IFN-γ+(グレーのバー)またはIL-4-IFN-γ+(黒いバー)の平均相対分布(y軸、%)が報告されている。
【図３０】抗CD3抗体および抗CD28抗体結合ビーズによる活性化ならびにIL-7+/-IL-15またはIL-2による培養は、T細胞増殖を促進し、CD4/CD8比を維持したまま遺伝子改変ヒトリンパ球を効率的に産生する。PBMCを、抗CD3および抗CD28(「B」と呼ぶ)結合ビーズで刺激し、サイトカインなし、IL-7+IL-15、IL-2、もしくはIL-7と共に培養、または可溶性抗CD3で刺激しIL-2と共に培養した。初回刺激後48時間および72時間目に、細胞をSFCMM3レトロウイルスベクターにより導入した。A)6日目に、遺伝子改変細胞を抗LNGFR抗体で染色した後、フローサイトメトリーにより定量した。異なる刺激および培養条件における平均導入効率(%)が報告されている。B)10日目に、ΔLNGFR発現ならびにCD4およびCD8発現について、細胞をフローサイトメトリーにより分析した。異なるプロトコルで生成した遺伝子改変細胞における平均CD4/CD8比が報告されている。C)6日目および9日目に、細胞をトリパンブルー排除法により計数した。異なる刺激および培養条件における平均T細胞増殖(倍)が報告されている(n=5ドナー)。*=p<0.05 **=p<0.01。
【図３１】抗CD3抗体および抗CD28抗体結合ビーズによる活性化ならびにIL-7+/-IL-15またはIL-2による培養はセントラル記憶表現型を有する導入ヒトリンパ球を産生する。10日目に、抗CD3および抗CD28結合ビーズにより産生され、サイトカインなし、IL-7+IL-15、IL-2、もしくはIL-7と共に培養した導入リンパ球、または可溶性抗CD3で刺激しIL-2と共に培養した導入リンパ球を、記憶表現型について分析した。CD45RAおよびCD62L共発現について細胞をフローサイトメトリーにより分析した。CD3+ΔLNGFR+細胞について、CD45RA+CD62L+(ナイーブ細胞)、CD45RA-CD62L+(セントラル記憶細胞)、CD45RA-CD62L-(エフェクター記憶細胞)またはCD45RA+CD62L-(最終分化エフェクター)の平均相対分布(y軸、%)が報告されている。(n=6ドナー)。*=p<0.05 **=p<0.01。
【図３２】IL-2/15受容体β(CD122)発現の動態は活性化、培養および導入法に依存しない。初回刺激後、0、2、4、9および13日目に、抗CD3および抗CD28結合ビーズにより産生され、サイトカインなし、IL-7+IL-15、IL-2、もしくはIL-7と共に培養した導入リンパ球、または可溶性抗CD3で刺激しIL-2と共に培養した導入リンパ球を、CD122発現について分析した。A)CD8+細胞およびB)CD4+細胞について、さまざまな時点でのCD122を発現するCD3+細胞(0、2および4日目)および導入細胞(9および13日目)の%が報告されている。(n=4ドナー)。
【図３３】抗CD3抗体および抗CD28抗体結合ビーズによる活性化ならびにIL-7+/-IL-15またはIL-2による培養は、導入リンパ球上のIL-2受容体α(CD25)の発現を強化および延長させる。初回刺激後、0、2、4、9および13日目に、抗CD3および抗CD28結合ビーズにより産生され、サイトカインなし、IL-7+IL-15、IL-2、もしくはIL-7と共に培養した導入リンパ球、または可溶性抗CD3で刺激しIL-2と共に培養した導入リンパ球を、CD25発現について分析した。A)CD8+細胞およびB)CD4+細胞について、さまざまな時点でのCD25を発現するCD3+細胞(0、2および4日目)および導入細胞(9および13日目)の%が報告されている。(n=4ドナー)。*=p<0.05 **=p<0.01。
【図３４】抗CD3抗体および抗CD28抗体結合ビーズによる活性化ならびにIL-7による培養は、導入リンパ球上のIL-7受容体α(CD127)の発現を強化および延長させる。初回刺激後、0、2、4、9および13日目に、抗CD3および抗CD28結合ビーズにより産生され、サイトカインなし、IL-7+IL-15、IL-2、もしくはIL-7と共に培養した導入リンパ球、または可溶性抗CD3で刺激しIL-2と共に培養した導入リンパ球を、CD127発現について分析した。A)CD8+細胞およびB)CD4+細胞について、さまざまな時点でのCD127を発現するCD3+細胞(0、2および4日目)および導入細胞(9および13日目)の%が報告されている。(n=4ドナー)。*=p<0.05 **=p<0.01。
【図３５】抗CD3抗体および抗CD28抗体結合ビーズによる活性化ならびにIL-7による培養は、導入細胞における高いアロ反応性増殖能およびアポトーシスシグナルに対する低感受性を維持する。抗CD3および抗CD28結合ビーズにより産生され、IL-7もしくはIL-2と共に培養した導入T細胞、または可溶性抗CD3による活性化により産生され、IL-2と共に培養した導入T細胞を、初回刺激後9日目にCFSEで染色し、照射した同種PBMCで共刺激した。同じドナー由来の未操作の抹消血リンパ球(PBL)をCFSEで染色し、同じ照射した同種PBMCで共刺激し、対照として使用した。7日後、細胞を計数し、To-pro3で染色し、FACSにより分析して分裂細胞および/または死細胞のパーセンテージを評価した。A)分裂細胞のパーセンテージ。B)死細胞の合計数。活性化により導入された細胞死を、分裂細胞で算出し(ヒストグラムの白い下部)、ネグレクトのための死(death for neglect)を、非分裂細胞で算出した(ヒストグラムの黒い上部)。*=p<0.05 **=p<0.01。
【図３６】同種刺激後の、抗CD3抗体および抗CD28抗体結合ビーズにより産生され、IL-7と共に培養したセントラル記憶遺伝子改変細胞の自己再生能。A)図35に記載の通りに処置した細胞を、MLR開始後7日目のCCR7およびIL-7Ra発現について分析した。CCR7+分裂細胞(上のパネル)およびIL-7Ra+分裂細胞(下のパネル)のパーセンテージが、左上四分円に示されている。B)次いで、細胞を、初回刺激で使用されたのと同じ培養条件に従って、インビトロで同じ同種刺激因子に再曝露した。二次刺激後の分裂細胞のパーセンテージが示されている。
【図３７】ビーズCD3/CD28抗体により産生された導入リンパ球はNOD/scidマウスにおいて急速に生着する。NOD/scidマウスを調節し、ヒト皮膚を移植し、ビーズCD3/CD28により産生され、IL-7もしくはIL-2と共に培養した20×106導入リンパ球、またはOKT3により産生され、IL-2と共に培養した20×106導入リンパ球を静注した。ヒトキメラを、ヒトCD3およびマウスCD45について、染色後フローサイトメトリーにより毎週評価した。四分円およびパーセンテージは、アイソタイプコントロール染色により決定した。ヒトキメラの動態が示されている(n=4ドナー)。
【図３８】ビーズCD3/CD28抗体により産生されIL-7と共に培養された導入リンパ球はNOD/scidマウスにおいて重度の異種GvHDを誘発する。NOD/scidマウスを調節し、ヒト皮膚を移植し、ビーズCD3/CD28により産生され、IL-7もしくはIL-2と共に培養した20×106導入リンパ球、またはOKT3により産生され、IL-2と共に培養した20×106導入リンパ球を静注した。マウスを、1)体重減少、2)GvHD臨床スコア(材料および方法に記載)により、異種GvHDについてモニターした。対照:リンパ球の注入を受けなかった動物。
【図３９】ビーズCD3/CD28抗体により産生されIL-7と共に培養された導入リンパ球はNOD/scidマウスにおいて重度の同種GvHDを誘発する。ヒトT細胞注入後3週間目に、NOD/scidキメラマウスを屠殺し、ヒト皮膚を両側性に除去した。続いて、生検は全て、ヘマトキシリン-エオシン染色(EE)および抗ヒトCD3染色(αhCD3)を介して病理医により盲検分析された。代表的な切片が報告されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年4月8日(2008.4.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子改変された記憶T細胞集団を得るインビトロ方法であって、
a)リンパ球活性化を誘導することができる、アゴニスト抗体、組換えリガンドおよびこれらの誘導体を含むがこれらに限定されない、少なくとも2種の特異的活性化受容体アゴニストでリンパ球を活性化するステップと、
b)記憶T細胞集団を選択的に増殖させることができる、少なくとも1種のサイトカイン受容体アゴニストの有効量に、活性化リンパ球を曝露するステップと、
c)b)で得られた細胞に、適切なベクターを用いて外来遺伝子を挿入し発現させるステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記記憶T細胞の集団が、CD4+および/またはCD8+および/またはγδおよび/またはNKT T細胞集団を含む、請求項1に記載のインビトロ方法。
【請求項３】
前記リンパ球が、血液および生物起源の他の液体試料、固形組織試料、これら由来の細胞の組織培養物およびこの子孫、生物試料からの単離細胞からなる群に属する生物試料由来である、請求項1または2に記載のインビトロ方法。
【請求項４】
特異的リンパ球活性化受容体アゴニストが、細胞模倣担体に結合している、請求項1から3に記載のインビトロ方法。
【請求項５】
細胞模倣担体が、常磁性ビーズである、請求項1から4に記載のインビトロ方法。
【請求項６】
リンパ球活性化受容体アゴニストの1つが、CD3ポリペプチドに特異的である、請求項1から5に記載のインビトロ方法。
【請求項７】
リンパ球活性化受容体アゴニストの1つが、共刺激受容体、すなわちCD28に特異的である、請求項1から6に記載のインビトロ方法。
【請求項８】
少なくとも1種のサイトカイン受容体アゴニストが、IL-7受容体アゴニストまたはIL-15受容体アゴニストである、請求項1から7に記載のインビトロ方法。
【請求項９】
IL-15受容体アゴニストまたはIL-7受容体アゴニストもそれぞれ存在している、請求項1から8に記載のインビトロ方法。
【請求項１０】
ベクターがウイルスベクターである、請求項1から9に記載のインビトロ方法。
【請求項１１】
外来遺伝子が、自殺遺伝子、および/またはマーカー遺伝子、および/または生物活性分子、および/または受容体、および/または細胞内に保持されるもしくは細胞外に放出される可溶性因子、および/またはプロドラッグに対する耐性を与える遺伝子をコードする、請求項1から10に記載のインビトロ方法。
【請求項１２】
癌、感染症、免疫不全もしくは自己免疫の治療および/または予防のための、または造血前駆細胞もしくは固形臓器の移植のための、請求項1から11に記載の方法により生成された遺伝子改変記憶T細胞集団の使用。
【国際調査報告】
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