(57)【要約】  ＲａｃからＳＯＤなどのＧＴＰアーゼの結合を変化させることによって、ＲＯＳを抑制する薬剤を特定する方法と、該方法によって特定される薬剤と、神経細胞変性疾患を抑制または治療するために、ＲＯＳを抑制する化合物を使用する方法とを提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＴＰアーゼのＳＯＤへの結合を抑制する１つ以上の薬剤を検出または判断する方法であって、
ａ）ＧＴＰアーゼのＳＯＤへの結合を可能にする条件下で、１つ以上の薬剤、単離されたＧＴＰアーゼ、およびＳＯＤタンパク質を接触させるステップと、
ｂ）前記１つ以上の薬剤が、前記単離されたＧＴＰアーゼの前記ＳＯＤタンパク質への結合を抑制するかどうかを検出または判断するステップと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記単離されたＧＴＰアーゼまたは前記ＳＯＤタンパク質は固定化される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記単離されたＧＴＰアーゼは、組み換えＧＴＰアーゼである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記単離されたＧＴＰアーゼは、ＲａｃまたはＲｈｏＡである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記単離されたＲａｃタンパク質は、ＴＶＦＤＮＹＳＡＮＶＭＶＤＧＫＰＶＮＬＧＬＷＤＴＡＧＧＥＤＹＤＲＬＲＰＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＳＯＤタンパク質は、組み換えＳＯＤタンパク質である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＳＯＤタンパク質は、単離されたＳＯＤタンパク質である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記単離されたＳＯＤタンパク質は、融合タンパク質である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記単離されたＳＯＤタンパク質は標識化される、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＳＯＤタンパク質は、前記ＧＴＰアーゼとの結合を増強させる野生型ＳＯＤに対する置換を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
１つ以上の薬剤が結合を抑制するかどうかを特定するために、抗体が採用される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記単離されたＧＴＰアーゼは、融合タンパク質である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記単離されたＧＴＰアーゼは標識化される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記標識はフルオロフォアである、請求項９または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記１つ以上の薬剤は、前記ＳＯＤタンパク質より前に前記単離されたＧＴＰアーゼと接触する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
薬剤のライブラリは、前記単離されたＧＴＰアーゼおよび前記ＳＯＤタンパク質と接触する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ＧＴＰアーゼのＳＯＤへの結合を抑制する１つ以上の薬剤を特定する方法であって、
ａ）１つ以上の薬剤とＧＴＰアーゼおよびＳＯＤタンパク質を含む試料とを含む混合物を提供するステップと、
ｂ）前記ＧＴＰアーゼの前記ＳＯＤへの結合を可能にする条件に前記混合物を晒すステップと、
ｃ）前記１つ以上の薬剤が、前記ＧＴＰアーゼの前記ＳＯＤタンパク質への結合を抑制するかどうかを特定するステップと、
を含む、方法。
【請求項１８】
前記試料は溶解細胞を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記試料は膜画分を含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記試料は、Ｎｏｘを含む単離されたエンドソームまたはエンドソーム膜を含む、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｎｏｘは、Ｎｏｘ１またはＮｏｘ２である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記試料は無傷細胞を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＧＴＰアーゼは、融合タンパク質である、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＧＴＰアーゼは標識化される、請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＧＴＰアーゼは、ＲａｃまたはＲｈｏＡである、請求項１７〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＳＯＤタンパク質は、融合タンパク質である、請求項１７〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＳＯＤタンパク質は標識化される、請求項１７〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記Ｒａｃタンパク質は、Ｒａｃ１またはＲａｃ２である、請求項４または２５に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法によって特定される、１つ以上の薬剤。
【請求項３０】
ＳＯＤを結合する単離されたペプチドであって、前記ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と少なくとも９０％の同一性を有し、前記ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（全長のＲａｃ１）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基１から１７７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（全長のＲａｃ２）、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４（全長のＲｈｏＡ）ではない、単離されたペプチド。
【請求項３１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を含む、請求項３０に記載の単離されたペプチド。
【請求項３２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基１から８８に対応する残基を含む、請求項３０に記載の単離されたペプチド。
【請求項３３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基１から１１６に対応する残基を含む、請求項３０に記載の単離されたペプチド。
【請求項３４】
融合タンパク質を得るために異種ペプチドに融合する、請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の単離されたペプチド。
【請求項３５】
固定化される、請求項３０〜３４のいずれか１項に記載の単離ペプチド。
【請求項３６】
ＳＯＤ結合領域を含むＧＴＰアーゼを含む融合タンパク質と、ＧＴＰアーゼ結合領域を含むＳＯＤを含む融合タンパク質、またはそれらの組み合わせを含む、キット。
【請求項３７】
前記ＧＴＰアーゼまたは前記ＳＯＤは、前記融合タンパク質を固定化するのに適したペプチドまたはタンパク質に融合する、請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
前記ＧＴＰアーゼまたは前記ＳＯＤは、蛍光タンパク質に融合する、請求項３６または３７に記載のキット。
【請求項３９】
前記融合タンパク質は、請求項３４に記載の融合タンパク質である、請求項３６に記載のキット。
【請求項４０】
前記ＧＴＰアーゼは、ＲｈｏまたはＲａｃである、請求項３６〜３８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項４１】
哺乳類における神経細胞変性疾患を抑制または治療する方法であって、それを必要としている哺乳類に、有効量のＮＡＤＰＨオキシダーゼの阻害剤を含む組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項４２】
前記阻害剤は、式（Ｉ）の化合物である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記疾患はＡＬＳである、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記組成物は植物抽出物を含む、請求項４１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記植物はピクロルヒザ植物である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記阻害剤は、ＳＯＤのＧＴＰアーゼへの結合を抑制する、請求項４１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記哺乳類はヒトである、請求項４１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記阻害剤はｐ４７ｐｈｏｘを抑制する、請求項４１〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記阻害剤は経口投与される、請求項４１〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記投与は連日投与である、請求項４１〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００５年１２月３０日に出願された米国出願第６０／７５５，３３７号の出願日の利益を主張するものであり、その開示は、参照により本願明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府の権利の記述
本発明は、少なくとも一部分においてアメリカ合衆国政府からの許可（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ａｎｄ  Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅｓの許可番号ＤＫ０６７９２８およびＤＫ５１３１５）を得てなされたものである。政府は、本発明における一定の権利を有することができる。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ＧＴＰアーゼ  Ｒａｃ１による活性酵素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ：ＲＯＳ）生成の調節は、シグナル変換（Ｓｕｌｃｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、アクチン細胞骨格再構成（Ｋｈｅｒａｄｍａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）、細胞移動（Ｙａｍａｏｋａ−Ｔｏｊｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、増殖（Ｉｒａｎｉ
ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、および分化（Ｐｕｃｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）に関与する多くの細胞過程において重要である。ＲＯＳ除去酵素は、ＲＯＳ、つまり
【０００４】
【化１】
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【０００５】
およびＨ２Ｏ２のレベルを制御することによって細胞酸化還元ホメオスタシスを維持する上で重要な役割を担う。銅／亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）は、
【０００６】
【化２】
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【０００７】
の変換を介して細胞内のＲＯＳを調節する細胞質内酵素を一様に発現させる（ＭｃＣｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９６９）。細胞のＲＯＳの重要源は、７つの既知のＮＡＤＰＨオキシダーゼ触媒サブユニット（Ｎｏｘ１、Ｎｏｘ２ｇｐ９１ｐｈｏｘ、Ｎｏｘ３、Ｎｏｘ４、Ｎｏｘ５、Ｄｕｏｘ１、およびＤｕｏｘ２）が存在するＮＡＤＰＨ−オキシダーゼである（Ｌａｍｂｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ＮＡＤＰＨオキシダーゼは、電子をＮＡＤＰＨから酸素分子に移動させることによってスーパーオキシド
【０００８】
【化３】
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【０００９】
を生成する。最も広く特徴を明らかにされたＮＡＤＰＨオキシダーゼは、食細胞ｇｐ９１ｐｈｏｘ（Ｎｏｘ２）であり、これは種々の他の非食細胞型内でも発現する。Ｒａｃ１は、Ｎｏｘ２の中心的な活性化因子であり、Ｎｏｘ複合体の３つの他のサブユニット（ｐ４０ｐｈｏｘ、ｐ４７ｐｈｏｘ、およびｐ６７ｐｈｏｘ）を伴う（Ｌａｍｂｅｔｈ  ｅｔ  
ａｌ．，２００４）。ＲＯＳ異化作用および同化作用に関与する多数の要因の特定にかかわらず、細胞が酸化還元ホメオスタシスを維持できる機構は依然として不明なところが多い。
【００１０】
ＲＯＳのレベルを変化させる薬剤を特定する方法が必要である。
【００１１】
発明の開示
本発明は、ＳＯＤによるＧＴＰアーゼ、例えばＲａｃの調節に関連するＲＯＳの生成を抑制する１つ以上の薬剤を特定する方法を提供する。本明細書において記述されるように、ＳＯＤ１は、直接的な酸化還元調節された相互作用を介して、Ｒａｃ１による内因性およびＧＡＰ刺激されたＧＴＰ加水分解を抑制するＲａｃ１を活性化させることによって、Ｎｏｘ２ｇｐ９１ｐｈｏｘを介した細胞の
【００１２】
【化４】
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【００１３】
生成を活発に調節することが分かった。したがって、ＲＯＳ感受性結合により制御されるＲａｃ１のＳＯＤ１媒介による活性化は、Ｎｏｘ２依存性
【００１４】
【化５】
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【００１５】
生成のための自己調節酸化還元センサを生成する。Ｒａｃ１の３５アミノ酸セグメントは、特にＳＯＤ１に結合することが特定され、その領域は、Ｒａｃ１とＳＯＤ１との相互作用を調節する薬剤を特定するのに有用であり得る。さらに、ＳＯＤは、別のＧＴＰアーゼであるＲｈｏＡを結合する。したがって、ＳＯＤは、Ｎｏｘ１、Ｎｏｘ２、Ｎｏｘ３、Ｎｏｘ４、Ｎｏｘ５、Ｄｕｏｘ１、Ｄｕｏｘ２を含むが、これらに限定されない１つ以上のＮＡＤＰＨオキシダーゼを調節できる。さらに、ＳＯＤはＧＤＰを結合し（図１０参照）、ＳＯＤにおいてグアニンヌクレオチド結合モチーフは保存されるため（図１１参照）、ＳＯＤへのヌクレオチド結合、例えばグアニンヌクレオチド結合を阻止する（防止または抑制あるいは変化させる）薬剤もまた、ＲＯＳ生成の調節において有用な場合がある。
【００１６】
一実施形態において、本発明は、例えばＲａｃなどのＳＯＤのＧＴＰアーゼへの結合を調節、例えば防止、抑制または増強する１つ以上の薬剤を特定する方法を提供する。本明細書において使用される「ＳＯＤ」は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６（ヒト  ＳＯＤ１）またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７（ヒト  ＳＯＤ２）と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％以上、例えば１００％のアミノ酸配列同一性を有し、スーパーオキシドジスムターゼ活性を任意に有する、ＳＯＤ１およびＳＯＤ２を含むタンパク質またはポリペプチドである。ＳＯＤタンパク質またはポリペプチドは、ＮｏｘまたはＤｕｏｘを調節するＲａｃまたは別のＧＴＰアーゼ（図１２Ａ参照）を結合し、その相互作用はＮＡＤＰＨオキシダーゼを調節する。一実施形態において、該方法は、１つ以上の薬剤と、ＳＯＤ結合領域を含むＲａｃタンパク質などの単離または精製されたＧＴＰアーゼと、例えばＲａｃまたはＲｈｏＡなどのＧＴＰアーゼ結合領域を含むＳＯＤタンパク質とを含有するステップを含む。別の実施形態において、該方法は、１つ以上の薬剤と、ＳＯＤ結合領域を含むＲａｃなどのＧＴＰアーゼと、ＧＴＰアーゼ結合領域を含む単離または精製されたＳＯＤタンパク質とを含有するステップ含む。別の実施形態において、該方法は、１つ以上の薬剤と、ＳＯＤ結合領域を有する、例えば単離または精製されたＲａｃなどの単離または精製されたＧＴＰアーゼと、ＧＴＰアーゼ結合領域を含む単離または精製されたＳＯＤタンパク質と
を含有するステップを含む。好ましくは、該結合領域は、より小さな断片も想定されるが、少なくとも１０、例えば２０、２５、３０、または３５の野生型ＧＴＰアーゼまたはＳＯＤ内の残基に対応する近接残基を含む。制御反応は、構成的活性化ＧＴＰアーゼ、例えばＲａｃと相互作用し、例えば神経細胞においてＮｏｘを活性化できるドミナントネガティブＲａｃまたはａｌｓｉｎを採用してもよい。
【００１７】
一実施形態において、本発明は、Ｒａｃ（または別のＳＯＤ結合ＧＴＰアーゼ）とＳＯＤとの相互作用を特に抑制する薬剤を特定する体外方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、Ｒａｃまたは別のＳＯＤ結合ＧＴＰアーゼとＳＯＤとの相互作用を特に増強させる薬剤を特定する体外方法を提供する。一実施形態において、本発明は、ＳＯＤ結合ＧＴＰアーゼのＳＯＤへの結合を可能にする条件下で、１つ以上の薬剤、単離されたＲａｃタンパク質または別のＳＯＤ結合ＧＴＰアーゼ、およびＳＯＤタンパク質を含有するステップを含む方法を提供する。その後、１つ以上の薬剤が、単離されたＲａｃタンパク質または別のＳＯＤ結合ＧＴＰアーゼのＳＯＤタンパク質への結合を抑制するかどうかを検出または判断される。結合、またはその抑制もしくは増強の検出または判断は、種々の方法によって達成でき、その一部が本明細書において記述される。例えば、ＲａｃもしくはＳＯＤ結合領域を含むその一部、またはＳＯＤもしくはＧＴＰアーゼ結合領域を含むその一部などのＧＴＰアーゼは、標識化されてもよく、または標識抗体として検出可能な標識に結合してもよく、および／または異種ペプチドに融合してもよく、例えば、ＧＳＴまたはヒスチジンタグに融合してもよく、これは融合タンパク質の単離および任意に検出を容易にする。あるいは、または加えて、１つ以上の薬剤は標識化されてもよく、または検出可能な標識に結合してもよい。故に、蛍光共鳴エネルギー移動アッセイ、発光共鳴エネルギー移動アッセイ、開裂アッセイ（プロテアーゼまたはヌクレアーゼ開裂）、架橋アッセイ、シンチレーション近接アッセイ、蛍光摂動アッセイ、核磁気共鳴等のアッセイ法は、薬剤が、例えばＲａｃまたはＲｈｏＡなどのＧＴＰアーゼのＳＯＤへの結合を抑制または増強するかどうかを検出または判断するために採用されてもよい。該方法は、細胞全体、細胞可溶化物を含んでもよく、または無細胞であってもよく、例えば、単離または精製されたＧＴＰアーゼおよび／またはＳＯＤを使用してもよい。具体的には、該方法は、治療上有益または薬物の合理的設計の候補であってもよい薬剤を特定するように化学ライブラリを選別するために使用されてもよい。
【００１８】
別の実施形態において、該方法は、１つ以上の薬剤と、例えばＲａｃおよびＳＯＤなどのＳＯＤを結合するＧＴＰアーゼを含む試料とを含む混合物を提供するステップを含む。該混合物は、ＧＴＰアーゼのＳＯＤへの結合を可能にする条件に晒され、１つ以上の薬剤は、ＧＴＰアーゼのＳＯＤタンパク質への結合を抑制または増強するかどうか決定される。
【００１９】
また、本発明の方法によって特定される１つ以上の薬剤を提供する。下記に記述するように、これらの薬剤を使用する方法をさらに提供する。
【００２０】
ＳＯＤを結合する単離されたペプチドをさらに提供し、ペプチドは、全長のＲａｃ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、全長のＲａｃ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）または全長のＲｈｏＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）とではなく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と少なくとも９０％の同一性を有し、例えば、Ｒａｃに対して、単離されたＲａｃペプチドは１７７アミノ酸残基の長さ未満であり、ＲｈｏＡに対して、単離されたＲｈｏＡペプチドは１９３アミノ酸残基の長さ未満である。特に、選別方法において有用なペプチドは、少なくとも２０、例えば、少なくとも３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０以上、例えば、１００、１２０または１５０アミノ酸残基のＧＴＰアーゼを含む。また、Ｒａｃもしくはその融合物などのＧＴＰアーゼ、またはＲａｃペプチドもしくはその融合物などのＧＴＰアーゼペプチドをコード化する発現カセットと、ＳＯＤもしく
はその融合物、またはＳＯＤペプチドもしくはその融合物をコード化する発現カセットと、本発明の発現カセットを含むベクターまたは宿主細胞と、ＧＴＰアーゼもしくはＳＯＤ、またはＳＯＤもしくはＧＴＰアーゼをそれぞれ結合できるそのペプチドを含む融合タンパク質を含む単離または精製されたＧＴＰアーゼまたはＳＯＤタンパク質と、を提供する。
【００２１】
また、本明細書において記述されるように、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ＡＬＳ）の原因になることが知られる特定のＳＯＤ１変異体において、Ｎｏｘ２活性化は正常に機能しない。ＡＬＳ  ＳＯＤ１変異体は、単離された小胞およびＡＬＳ遺伝子導入マウスにおいて、高レベルのＮｏｘ２由来のスーパーオキシド生成を示した。したがって、Ｎｏｘ２の活性化過剰は、ＡＬＳ  Ｇ９３Ａ−ＳＯＤ１遺伝子導入マウスにおいて運動ニューロン変性の一因となる場合がある。さらに、ＡＬＳに関連する特定のＳＯＤ１変異体は、ＳＯＤ１のＲａｃ１への高度酸化還元非感受性結合のために、体外および体内においてより持続的なＮｏｘ活性化を導くことが分かった。さらに、Ｎｏｘ２欠損は、運動ニューロン変性を遅延させ、ＡＬＳマウスを延命させることが分かり、例えば、ＳＯＤ変異体の寿命はほぼ２倍となり、初発症状からの機能低下率はＮｏｘ２遺伝子ノックアウトを背景に顕著に伸びた。興味深いことに、Ｎｏｘ２ヘテロ接合体マウスも寿命が延長し、麻痺の発現が遅延したため、Ｎｏｘ２機能の小さな変化は実質的に疾患を遅延させ得ることを示す。また、Ｎｏｘ１ノックアウトマウスも平均余命が向上したが（図１３参照）、Ｎｏｘ２ノックアウトマウスと比べて顕著ではなかった。Ｒａｃ１は、Ｎｏｘ１を調節することが証明されており、変異体ＳＯＤ１によるＮｏｘ２とＮｏｘ１のそのように組み合わされた異常調節は、ＡＬＳの進行の一因となる場合がある。
【００２２】
アポシニンは、ｐ４７ｐｈｏｘ（Ｎｏｘ複合体の活性化補助因子）のＮｏｘ複合体への補充を抑制する。Ｎｏｘ２は、ＡＬＳ変異体ＳＯＤが存在する場合に疾患の進行を制御するようであると考慮し、アポシニンにそれらの変異体を有するマウスの延命および発病開始の遅延を試験した。アポシニンの最低試験量は、平均余命を延長し、発病開始を遅延させることが分かった（図１４および１７〜１８参照）。
【００２３】
したがって、ＳＯＤ間の、例えばＳＯＤ１とＲａｃ１（食細胞Ｒａｃ２も同様の相互作用を有する）などのＧＴＰアーゼとの分子間相互作用を調節する薬剤、あるいはＮＡＤＰＨオキシダーゼ、例えばアポシニンなどのＮｏｘを抑制する薬剤は、運動ニューロン変性疾患や変異体ＳＯＤに関連する疾患などのニューロン変性疾患を含み、Ｎｏｘ２および可能性としてＮｏｘ１（これもＲａｃ１によって調節される）、または他のＮＡＤＰＨオキシダーゼを介する過剰なＲＯＳに関連する、または起因する疾患において治療上有用な場合がある。したがって、本発明は、ＡＬＳなどの疾患もしくはＳＯＤ１／ＲａｃによるＮｏｘ２またはＳＯＤ／ＧＴＰアーゼによるＮＡＤＰＨオキシダーゼの異常調節の結果として過剰なＲＯＳ生成が生じる他の疾患、または変異体ＳＯＤに関連する、例えば、Ｒａｃまたは別のＧＴＰアーゼとの変化した、例えば増強した結合、または変化したヌクレオチド結合を有する変異体に関連する疾患において、これらの薬剤と、例えば運動ニューロン欠損および麻痺の進行を遅延させるのに有効な量、および／または運動ニューロン生存を促進するのに有効な量の治療量でこれらの薬剤を採用する方法と、を含む。例えば、薬剤は、関節炎などのアルツハイマー、パーキンソンおよびハンチントンの炎症性疾患、または他の後天性もしくは遺伝性疾患、例えば、脳虚血、脳卒中、プリオン認知症を含む認知症、ダウン症候群、多発性硬化症、メチルマロン酸血症、ｄ−２ヒドロキオキシグルタル酸尿症、網膜変性症、ピック病、レヴィー小体関連疾患、フリードライヒ失調症および神経セロイドリポフスチン症に制限されないがこれらを含む疾患の予防、抑制または治療のために有用である。
【００２４】
例えばアポシニンなどのＮＡＤＰＨオキシダーゼを抑制する薬剤は、マウスを延命させ、疾患の発現を遅延させるため、これらの薬剤は、神経細胞変性を有するマウスの繁殖コロニーにおいて、特にこれらの薬剤を有する水を用いてまたは水中で製剤された固体飼料において有用である。
【００２５】
さらに、ａｌｓｉｎもＮｏｘ活性化およびスーパーオキシドの調節を制御し、ＳＯＤと同一のＲａｃ領域を結合できるため、ａｌｓｉｎのＲａｃへの結合を変化させる、例えば抑制する薬剤は、Ｎｏｘ活性化を変化させることができる。
【００２６】
哺乳類における神経細胞変性疾患を抑制または治療する方法をさらに提供する。該方法は、それを必要としている哺乳類に、有効量のＮＡＤＰＨオキシダーゼの活性の阻害剤を含む組成物、例えば式（Ｉ）の化合物を投与するステップを含む。
【００２７】
また、哺乳類におけるＲＯＳを増強させる方法も提供する。該方法は、それを必要としている哺乳類、例えば癌を有する哺乳類に、相互作用ＧＴＰアーゼとＳＯＤ、例えば上記の構成的活性化ＲａｃまたはＳＯＤ変異体との相互作用を高める有効量の薬剤を含む組成物を投与するステップを含む。
【００２８】
したがって、本発明は、例えば、過剰なＲＯＳ生成が生じる疾患において運動ニューロン欠損および麻痺の進行を遅延させるのに有効な量または運動ニューロン生存を促進するのに有効な量で、例えば、過剰なＲＯＳによって特徴付けられ、例えばＮｏｘ２のＲａｃ／ＳＯＤ１制御などのＧＴＰアーゼ／ＳＯＤの異常調節に起因する神経細胞変性疾患を抑制または治療するための薬物療法において有用である。また、運動ニューロン欠損および麻痺の進行を遅延させるための、あるいは過剰なＲＯＳによって特徴付けられる神経細胞変性疾患または変異体ＳＯＤに関連する、例えば増強などの変化した結合、または変化したヌクレオチド結合を有する変異体に関連する疾患を抑制または治療するための薬物の製造用に、そのような薬剤の使用を提供する。さらに、例えば癌を抑制あるいは治療するために、有効量でＲＯＳを高めるか、Ｎｏｘ２のＲａｃ／ＳＯＤ１制御を無調整する薬剤を提供する。
【００２９】
図面の簡単な説明
図１Ａ〜Ｆ。Ｒａｃ１は、酸化還元依存的にＳＯＤ１に結合する。Ａ）Ｒａｃ１は、ｓｏｄ１＋／＋またはｓｏｄ１−／−マウスの心臓、腎臓、肝臓および／または脳組織から免疫沈降し、続いてＳＯＤ１およびＲａｃ１に対してウエスタンブロッド法（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ：ＷＢ）を行った。Ｂ）精製されたウシＳＯＤ１が存在する場合における、精製されたＨｉｓタグ付きＲａｃ１およびＣｄｃ４２の体外ＩＰに続いて、ＳＯＤ１、Ｒａｃ１およびＣｄｃ４２に対してＷＢを行った。Ｈｉｓタグ付きＧＴＰアーゼは、ＳＯＤ１とのインキュベーションに先立って、指示されたヌクレオチド類似体を前負荷した。Ｃ）精製されたＳＯＤ１が存在する場合における、指示されたヌクレオチド負荷のＧＳＴタグ付きＲａｃ１変異体（または遊離ＧＳＴ）の体外ＩＰと、それに続くＳＯＤ１およびＧＳＴに対するＷＢ。Ｄ）精製された、未変性の、脱メタル化された、または再メタル化されたウシＳＯＤ１が存在する場合における、精製されたＨｉｓタグ付きＲａｃ１の体外ＩＰと、それに続く、ＳＯＤ１およびＲａｃ１に対するＷＢ。Ｈｉｓタグ付きＲａｃ１は、ＳＯＤ１とのインキュベーションに先立って、指示されたヌクレオチド類似体を前負荷した。さらに、未処置のＨｉｓタグ付きＲａｃ１および３００μＭ  ＤＴＴ前還元のＨｉｓ−Ｒａｃ１は、ＳＯＤ１の各３つの形状を用いて体外プルダウンアッセイに使用した。Ｅ）Ｈｉｓ−Ｒａｃ１を前還元し（３００μＭ  ＤＴＴ）、ＧＴＰγＳを負荷し、その後、ＳＯＤ１を用いてプルダウンアッセイを行う前に指示濃度の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）で処置した。Ｆ）ＤＴＴの指示濃度を、（Ｅ）に示すように、３００ｐＭのＨ２Ｏ２処置したＨｉｓ−Ｒａｃ１試料に加え、ＳＯＤ１でプルダウンアッセイを行った。
【００３０】
図２Ａ〜Ｈ。ＳＯＤ１は、酸化還元依存のの物理的相互作用を介して、Ｒａｃ１活性化を調節する。Ａ）ＳＯＤ１結合ドメインを画定するために使用されたＧＳＴ−Ｒａｃ１欠失変異体の模式図。Ｂ）精製されたウシＳＯＤ１が存在する場合における、種々のＧＳＴ１１タグ付きＲａｃ１欠失変異体の体外ＩＰ。各レーン上部の数は、パネルＡのＧＳＴ−Ｒａｃ１融合構成の数に対応する。上部パネルは、ＧＳＴのＩＰに続くＳＯＤ１に対するＷＢであり、下部パネルは、ＩＰに使用した精製された融合ペプチドのクーマシィー染色されたゲルである。Ｃ）ＧＳＴタグ付きＰＡＫ結合ドメイン（ＧＳＴ−ＰＢＤ）は、ｓｏｄ１＋／−またはｓｏｄ１−／−マウス脳溶解物においてＧＴＰ−Ｒａｃ１を定量化するために、プルダウンアッセイにおいて使用された。ウエスタンブロットは、ＧＴＰ−Ｒａｃ１およびＧＳＴ−ＰＢＤ後のグルタチオン沈殿と、粗溶解物におけるＳＯＤ１およびＲａｃ１の合計レベルを示す。Ｄ）１３ｓｏｄ１＋／−および７ｓｏｄ１−／−マウス脳からのＧＴＰ−Ｒａｃ１レベルの定量化は、有意差（ｐ＜０．００１、スチューデントｔ−検定）を示した。Ｅ、Ｆ）Ｒａｃ１  ＧＴＰアーゼアッセイは、（Ｅ）ウシＳＯＤ１または（Ｆ）大腸菌ＳＯＤおよび／またはＧＳＴタグ付きｐ２９−ＧＡＰが存在する場合において行われた。Ｈｉｓタグ付きＲａｃ１は、γＰ３２−ＧＴＰで前付加し、反応物の一定分量は、Ｒａｃ１から遊離した％３２Ｐｉを評価することによって、薄層クロマトグラフィーを用いて様々な時点でＧＴＰ加水分解を分析した。Ｇ）ＳＯＤ１および／またはｐ２９−ＧＡＰが存在しない場合における、Ｒａｃ１およびＣｄｃ４２に対するＧＴＰアーゼアッセイ。γＰ３２−ＧＴＰからの３２Ｐｉ遊離率がプロットされる。Ｈ）ＳＯＤ１および／または１００μＭのキサンチン／１００ｍＵのキサンチンオキシダーゼ（Ｘ／ＸＯ）が存在する場合、または存在しない場合における、Ｒａｃ１  ＧＴＰアーゼアッセイ。Ｉ）１５分のＸ／ＸＯ由来のＲＯＳへの暴露の有無にかかわらず、ＳＯＤ１が存在する場合におけるＧＴＰγＳ負荷されたＨｉｓ−Ｒａｃ１のプルダウンアッセイ。本アッセイで使用された条件は、（Ｈ）に示されるＧＴＰアーゼアッセイと同一であった。（Ｈ）すべてのパネルにおけるデータは、少なくとも３つの独立した実験の代表的なものである。
【００３１】
図３Ａ〜Ｅ。ＳＯＤ１は、エンドソーム区画においてＮＡＤＰＨオキシダーゼによる
【００３２】
【化６】
2009521928.tif 000008
【００３３】
生成を活性化する。Ａ）エンドソームは、イオジキサノール密度勾配分画を使用して１次マウス皮膚線維芽細胞（ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｏｕｓｅ  ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ：ＰＭＤＦ）から単離させ、画分は、ルシゲニンベースの発光アッセイ（上部パネル）を使用して、またＮｏｘ２ｇｐ９１ｐｈｏｘ、Ｒａｃ１、ＳＯＤ１およびＥＥＡ１に対するウエスタンブロット（下部パネル）によって、ＮＡＤＰＨ依存性のスーパーオキシド生成を評価した。Ｂ）Ｎｏｘ２ｇｐ９１ｐｈｏｘ野生型およびノックアウト（ＫＯ）ＰＭＤＦからの指示された細胞成分分画における、ＳＯＤ１に対するウエスタンブロット。Ｃ）ルシゲニンアッセイは、ＳＯＤ１および／またはＤＰＩ（一般的なＮｏｘ阻害剤）が存在する場合または存在しない場合の、Ｎｏｘ２野生型およびＫＯ  ＰＭＤＦからの分画番号１０小胞におけるＮＡＤＰＨ依存性の
【００３４】
【化７】
2009521928.tif 000009
【００３５】
生成率を評価するために使用された（ｎ＝６）。Ｄ）ウシＳＯＤ１（Ｂｏｖ．ＳＯＤ１）または大腸菌ＳＯＤ（Ｂａｃ．ＳＯＤ）が存在する場合または存在しない場合における、
１次マウス胎児線維芽細胞（ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ：ＰＭＥＦ）からの小胞の分画のＮＡＤＰＨ依存性の
【００３６】
【化８】
2009521928.tif 000010
【００３７】
産出率を評価した（ｎ＝３）。Ｅ）ルシゲニンベースのアッセイにおいて、Ｘ／ＸＯ由来の
【００３８】
【化９】
2009521928.tif 000011
【００３９】
を分解するためのＢｏｖ．ＳＯＤ１およびＢａｃ．ＳＯＤの能力。Ｆ）ｓｏｄ１＋／＋、ｓｏｄ１＋／−またはｓｏｄ１−／−マウスから単離したＰＭＮによるＰＭＡ誘導の
【００４０】
【化１０】
2009521928.tif 000012
【００４１】
産出を、シトクロムｃ還元アッセイを使用して評価した。＊ｓｏｄ１＋／＋マウス（ｐ＜０．０５、スチューデントｔ−検定）と比べると有意差が見られた。
【００４２】
図４Ａ〜Ｇ。ＡＬＳに関連するＳＯＤ１変異体は、向上した酸化還元非感受性、Ｒａｃ１との結合およびＲａｃ１−ＧＴＰ加水分解を抑制するための向上した能力を示し、エンドソームＮＡＤＰＨ依存性の
【００４３】
【化１１】
2009521928.tif 000013
【００４４】
生成を活性化する。Ａ）精製され、細菌で発現されたＳＯＤ１タンパク質のクーマシィー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ。ウシＳＯＤ１を基準対照として使用した。これはヒトＳＯＤ１よりも通常早く移動する（データ図示せず）。各ＳＯＤ１タンパク質のＣｕ／Ｚｎ含有量はゲルを下回る。Ｂ）１：１０モル比（Ｒａｃ１：ＳＯＤ１）で指示されたヒトＳＯＤ１タンパク質（ｗｔ、Ｌ８ＱまたはＧ１０Ｖ）が存在する場合における、精製された前還元のＨｉｓタグ付きＲａｃ１−ＧＴＰγＳの体外ＩＰ。その後、Ｒａｃ１／ＳＯＤ１複合体を、２つの部分に分割し、半分を、ＨｉｓタグのＩＰに先立って室温で１５分間Ｘ／ＸＯ由来のＲＯＳで処置した。Ｘ／ＸＯ条件は、１００μＭの最終キサンチン濃度を有する１００ｍ単位のキサンチンオキシダーゼ酵素を含んだ。ＩＰに続いて、ＳＯＤ１およびＲａｃ１に対してウエスタンブロットを行った。ＳＯＤ１ブロットの長いおよび短い暴露は、ＳＯＤ１からＲａｃ１への各突然変異型の向上した結合を明らかにすることを示す。Ｃ）未変性のウシＳＯＤ１または指示された細菌で発現および精製されたヒトＳＯＤ１タンパク質（ｗｔ、Ｌ８ＱまたはＧ１０Ｖ）を使用して、Ｒａｃ１ＧＴＰアーゼアッセイを行った。Ｒａｃ１：ＳＯＤ１のモル比が示される。Ｈｉｓタグ付きＲａｃ１をγＰ３２−ＧＴＰを前負荷した。各型のＳＯＤ１の増加濃度が存在する場合において、γＰ３２−ＧＴＰからの３２Ｐｉ遊離率がプロットされる。Ｄ）単離されたＰＭＥＦエンドソームによるＮＡＤＰＨ依存性の
【００４５】
【化１２】
2009521928.tif 000014
【００４６】
産出の経時変化を、ヒトＷＴ−ＳＯＤ１またはＬ８Ｑ−ＳＯＤ１が存在する場合または存在しない場合において測定した。パネルＣおよびＤの結果は、３つの実験の代表的なものである。Ｅ）Ｒａｃ１をＧ９３Ａ−ＳＯＤ１遺伝子導入マウスまたは対照同腹子の脳組織から免疫沈降（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ：ＩＰ）し、その後ＳＯＤ１およびＲａｃ１に対してウエスタンブロット法（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ：ＷＢ）を行った。ＦおよびＧ）Ｇ９３Ａ−ＳＯＤ１または対照遺伝子導入同腹子の指定された年齢での、Ｆ）脳および（Ｇ）肝臓組織に由来する全内膜によるＮＡＤＰＨ依存性の
【００４７】
【化１３】
2009521928.tif 000015
【００４８】
生成である（各実験点に対してＮ＝３）。
【００４９】
図５Ａ〜Ｃ。Ａ）未変性のウシＳＯＤ１に対するＳＯＤ１活性ゲル（レーン１）、脱メタル化されたウシＳＯＤ１（レーン２）および再メタル化されたウシＳＯＤ１（レーン３）。ウシＳＯＤ１の各型のＺｎおよびＣｕ含有量は、タンパク質のモル毎の金属のモルにおいてゲルを上回る。Ｂ）Ｈｉｓ沈殿とＲａｃ１、ＳＯＤ１およびＣｄｃ４２に対するウエスタンブロット法とに先立って、３００μＭ  ＤＴＴで前還元し、ＧＴＰγＳを前負荷し、その後ウシＳＯＤ１とともにインキュベートしたＨｉｓ−Ｒａｃ１またはＨｉｓ−Ｃｄｃ４２の体外プルダウンアッセイ。Ｃ）Ｒａｃ１ポリペプチドバックボーンの３次元構造の略画（Ｈｉｒｓｈｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。左パネルは、スイッチＩ領域（青）、スイッチＩＩ領域（赤）、Ｇ２領域（赤紫）およびＧ３領域（緑）を示す。右パネルは、スイッチＩ、スイッチＩＩ、Ｇ２およびＧ３領域に及ぶ、強力にＳＯＤ１（赤）を結合する最小Ｒａｃ１  ペプチドを示す。
【００５０】
図６Ａ−Ｂ。ＳＯＤ１は、Ｒａｃ１のＧＴＰ負荷に影響せず、Ｒａｃ１  ＧＴＰアーゼ活性に酵素的に活性でなければならない。Ａ）Ｈｉｓタグ付きＲａｃ１を、ＳＯＤ１が存在する場合または存在しない場合において、３５Ｓ−ＧＴＰγＳを負荷した。タンパク質をニトロセルロース膜に結合し、過剰な非結合放射性ヌクレオチドを洗浄して除去した。残存する（結合）３５Ｓ−ＧＴＰγＳを液体シンチレーション分光で定量化した。結果は、Ｎ＝３の独立した実験に対する平均＋／−ＳＥＭを示す。Ｂ）精製され、未変性の、脱メタル化または再メタル化されたウシＳＯＤ１が存在する場合において、Ｒａｃ１ＧＴＰアーゼアッセイを行った。Ｈｉｓタグ付きＲａｃ１をγＰ３２−ＧＴＰを前負荷した。γＰ３２−ＧＴＰからの３２Ｐｉ遊離率はプロットされる。結果は２つの実験の代表的なものである。
【００５１】
図７。Ｒａｃを介するＮｏｘ２  ＲＯＳ生成のＳＯＤ１媒介の調節に対する酸化還元センサモデル。還元条件下において、ＳＯＤ１をＲａｃ−ＧＴＰに結合し、内因性およびＧＡＰ媒介のＧＴＰ加水分解を抑制することでＲａｃ活性化を安定化させる。増加したＲａｃ−ＧＴＰレベルは、Ｎｏｘ２の活性化および
【００５２】
【化１４】
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【００５３】
の生成をもたらす。Ｎｏｘ２複合体によって産出された
【００５４】
【化１５】
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【００５５】
は、ＳＯＤ１により、または自発的不均化を介してＨ２Ｏ２に変換される。Ｈ２Ｏ２の局所濃度が上昇するため、Ｒａｃの酸化はＳＯＤ１の解離をもたらす。Ｒａｃ−ＧＴＰともはや結合しないＳＯＤ１では、Ｒａｃ−ＧＤＰへの加水分解がより早急に発生し、Ｎｏｘ２複合体の不活性化に繋がる。その後、Ｒａｃ／Ｎｏｘ２が再活性化すると、ＳＯＤ１は工程を繰り返すように再循環できる。この機構を通じて、ＳＯＤ１は、Ｒａｃ／Ｎｏｘ２複合体活性化の部位においてＲＯＳの局所濃度を検知でき、複合体の活性を制御できることを提案する。
【００５６】
図８。種々の指示された遺伝子型の回転棒の失敗までの時間。回転棒の失敗後、通常１週間以内に死亡する。動物は、あおむけに置かれた後２０秒間以内に直立できなかった場合に、臨床的に死亡および安楽死したと見なされる。
【００５７】
図９。指示された遺伝子型の同年齢の同胞の脊髄中の運動ニューロン。各グループには３匹の動物がおり、動物は、ＡＬＳ＋／Ｎｏｘ２＋／＋グループの臨床死時に安楽死した。これは約１２５〜１３５日の範囲で、４つの遺伝子型それぞれからの１匹のマウスは同日に採取された。
【００５８】
図１０。ＳＯＤ１は体外ＧＴＰおよびＧＤＰを結合する。Ａ）Ｓ３５放射性標識  ＧＴＰγＳは、異なる濃度の塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）を用いて、室温で２時間ＳＯＤ１とともにインキュベートした。結合反応物は、ＳＤＳ含有緩衝液内で５分間沸騰させて中止した。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで走行させ、その後ニトロセルロース膜に移動した。オートラジオグラフィーを使用して、ＳＯＤ１と結合した放射性標識ヌクレオチドを示した。Ｂ）ＳＯＤ１グアニンヌクレオチド結合（ＧＴＰおよびＧＤＰが示される）の表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：ＳＰＲ）分析。ＳＰＲチップ表面をウシＳＯＤ１タンパク質で被覆する。ＧＴＰまたはＧＤＰ（５ｍＭ）を含有する試料は表面を流れ、ヌクレオチド−タンパク質結合キネティクスは監視される。
【００５９】
図１１。ＳＯＤ１における保存グアニンヌクレオチド結合モチーフ。カンジダアルビカンスからホモサピエンスまでの異なる生物からのＳＯＤ１の配列が配置される。グアニンヌクレオチドを結合する保存された潜在配列を標識化する。ＳＯＤ１上の配列は、１つのみのアミノ酸でグアニンヌクレオチドにおけるグアニジンカ輪結合モチーフのコンセンサスＮ／ＴＫｘＤから逸脱する。また、ＳＯＤ１上の配列ＧＤＮｘｘＧＣＴも保存され、１つのアミノ酸でリン酸塩結合ループコンセンサスＧｘｘｘｘＧＫＴ／Ｓから逸脱する。両モチーフは、ＳＯＤ１結晶構造および利用可能な溶質の表面に露出する。
【００６０】
図１２Ａ〜Ｂ。Ｒａｃ１、Ｒａｃ２、ＲｈｏＡおよびＣｄｃ４２配列間の比較とＲａｃ１およびＲｈｏＡのＳＯＤ１への異なる結合。Ａ）Ｒａｃ２、ＲｈｏＡおよびＣｄｃ４２と比較した、Ｒａｃ１上のＳＯＤ１結合領域のアミノ酸配列アラインメント。Ｒａｃ２は、ＳＯＤ１結合領域のＲａｃ１と比べて９７％より高い同一のアミノ酸配列を有する。一方、ＲｈｏＡは、７７．７％の同一配列を有し、Ｃｄｃ４２はその領域でＲａｃ１と７５％の同一配列を有する。Ｂ）Ｒａｃ１、ＲｈｏＡまたはＣｄｃ４２を電磁ビーズ上で固定化し、その後、グアニンヌクレオチド（標識化したように）を負荷し、または負荷せずに、ＳＯＤ１に結合した。非結合タンパク質の洗浄後、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し
、ＳＯＤ１に対して免疫ブロット法を行った。Ｒａｃ１は、ＧＤＰβＳ結合状態でのみＳＯＤ１を結合し、一方、Ｃｄｃ４２は負荷したヌクレオチドにかかわらず、ＳＯＤ１を結合しなかった。その一方、ＲｈｏＡは、ＧＴＰγＳ結合状態でのみＳＯＤ１を結合した。
【００６１】
図１２Ｃ。ヒトＲａｃ１のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ヒトＲａｃ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ヒトＲｈｏＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４および５）、ヒトＳＯＤ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、ヒトＳＯＤ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、およびヒトａｌｓｉｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）。
【００６２】
図１３。ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウスの生存に関するＮｏｘ１およびＮｏｘ２遺伝子ノックアウト（ＫＯ）の比較。Ａ）Ｎｏｘ１を欠くＡＬＳマウス（Ｎ＝６）は、そのＮｏｘ１含有同腹子（１２７日、Ｎ＝８）よりも長く生存した（１６３日）。＊＊ｐ＜０．００３９。Ｂ）Ｎｏｘ２ＫＯ背景でのＡＬＳマウスの生存は、Ｎｏｘ１  ＫＯ背景での生存よりもさらに顕著だった。
【００６３】
図１４。ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウスにおける生存および疾患進行のアポシニン（３０ｍｇ／Ｋｇ）効果。Ａ）アポシニン処置（１８５日）マウス（＊＊＊ｐ＜０．０００１）と比較した、無処置（１２５日）での生存の可能性。Ｂ）アポシニン処置マウスと比較した未処置での歩行分析。１１４日齢で、未処置のマウスは歩行障害を呈示し、一方、アポシニン処置マウスは正常歩行であった。Ｃ）アポシニン処置（１５６．５日、ｎ＝６）マウスと比較した、未処置（１１７．５日、ｎ＝２０）での後肢衰弱の初観察によって判断される発病開始の平均年齢。Ｄ）生存指標は、発病開始から臨床死までの時間であり、疾患進行のマーカである。疾患進行は、アポシニン処置マウス（３２日、ｎ＝６）の方が未処置のマウス（１１日、ｎ＝２０）よりも遅かった。
【００６４】
図１５。野生型（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ：ＷＴ）ＳＯＤ１ではないＳＯＤ１変異体の発現は、細胞Ｎｏｘ活性の活性化をもたらす。Ａ）ＷＴ−ＳＯＤ１またはＧ９３Ａ−ＳＯＤを過剰に発現する非遺伝子導入または遺伝子導入マウスの脳、脊髄および肝臓からの全内膜におけるＮＡＤＰＨ依存性のスーパーオキシド生成（各グループにおいてＮ＝３動物）。Ｂ）ＷＴ−ＳＯＤ１またはＧ９３Ａ−ＳＯＤ１を過剰に発現する１２０日の非遺伝子導入または遺伝子導入マウスからの腰髄切片におけるスーパーオキシドのジヒドロエチジウム（Ｄｉｈｙｄｒｏｅｔｈｉｄｉｕｍ：ＤＨＥ）蛍光検出。ＤＡＰＩ染色は、下部パネルにおいて核を画定する。Ｃ、Ｄ）スーパーオキシド生成の尺度（Ｃ）または、細胞死の尺度としてのトリパンブルー排除であり、（Ｄ）ＬａｃＺ、ＷＴ−ＳＯＤ１または指示された変異体ＳＯＤ１を発現させるアデノウイルスベクターに感染したＳＨ−ＳＹ（神経細胞）またはＭＯ５９Ｊ（グリア）細胞におけるもの。Ｅ）指示されたアデノウイルスベクターに感染し、その後アポシニン（１００μＭ）を用いて、または用いず７２時間処置した後のＳＨ−ＳＹまたはＭＯ５９Ｊ細胞におけるスーパーオキシド生成および細胞死の割合。Ｆ）１２０日齢の非遺伝子導入（対照）またはＧ９３Ａ−ＳＯＤ１遺伝子導入マウスからの脊髄細胞可溶化物を使用し、ＧＳＴ−Ｐａｋ１との関連によって判断されたＲａｃ−ＧＴＰ活性化。対照は、Ｐａｋ１プルダウンアッセイに先立って、ＧＴＰγＳ（＋）またはＧＤＰβＳ（−）とともにインキュベートされた対照マウスからの溶解物を含む。
【００６５】
図１６。半接合体のＧ９３Ａ−ＳＯＤ１遺伝子導入マウスのＡＬＳ脳および脊髄組織のＮＡＤＰＨ依存性スーパーオキシド生成の増加。スーパーオキシド生成は、ＤＰＩ（１０μＭ）で抑制されたが、ロテノン（１００μＭ）では抑制されず、Ｎｏｘが向上したＲＯＳ生成に関与することを示す。
【００６６】
図１７。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤アポシニンでの処置は、Ｇ９３Ａ−ＳＯＤ１導入遺伝子に対して半接合であるマウスにおいて、寿命を増加させ、疾患進行を遅らせる。
Ａ）１４日齢から開始する、水中の異なる投与量のアポシニンで処置したマウスの生存曲線。各処置グループのマウスの数（Ｎ）は、日数のメディアン生存時間とともに示される。Ｂ）アポシニンの各一定投与量に対する雄性および雌性マウスの生存データ。抗生物質を使用して眼感染症の処置を受けたマウスを四角形でマークする。処置に失敗および眼感染症により死亡したマウスは、四角形内にＸ印を付ける。円形は、眼感染症に一度もかからなかった動物を表す。各グループにおけるマウスの数（Ｎ）は、各投与量のアポシニンに対する平均生存日数を上回る。Ｃ）発病開始の年齢（１週間の間に５％の体重減少で判断）とアポシニン投与量との関係。Ｄ）生存指標は、各一定量のアポシニンに対し、発病開始から動物が臨床死に至るまでの時間として測定した。Ｅ）分析前に５日間アポシニン（３００ｍｇ／ｋｇ）で処置または処置されていない、最終段階Ｇ９３Ａ−ＳＯＤ１遺伝子導入マウス（約１２０日齢）からの腰髄の全膜において、ＮＡＤＰＨ依存性のスーパーオキシド生成を測定した（各グループにおいてＮ＝５）。Ｆ）同一のマウスの腰髄におけるジヒドロエチジウム蛍光を（Ｅ）に示す。
【００６７】
図１８。出生後異なる年齢における、アポシニン（３００ｍｇ／ｋｇ）を用いた半接合体のＧ９３Ａ−ＳＯＤ１遺伝子導入マウスの処置。１４、６０および８０日齢で、飲料水にアポシニンを加えたマウスの生存時間（各グループに対してＮ＝６）。すべてのマウスは、３匹の導入遺伝子陰性同胞雌と１匹のＧ９３Ａ−ＳＯＤ１半接合体の雄から派生した。各雌からの２匹の連続同腹仔を分析した。
【００６８】
図１９。異なる濃度のアポシニンを用いたＧ９３Ａ−ＳＯＤ１遺伝子導入マウスの処置および１２０日目の腰髄における運動ニューロンの数。
【００６９】
発明の詳細な説明
Ｉ．活性酸素種およびＮＡＤＰＨオキシダーゼ
一般的に、脊椎動物は、感染、先天性および後天性免疫系に反応する２つの基本的機構を有する（Ｆｅａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。先天性または自然免疫は、以前に宿主を侵入性薬剤に曝したかどうかににかかわらず、感染性の問題に早急に反応するための能力である。先天性系の要素は、食細胞、すなわち、多形核白血球（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ：ＰＭＮ）および単核食細胞系（例えば、マクロファージ）と、循環可溶性プレ酵素タンパク質の補体カスケードとを含む。これらの要素は、植物（Ｅｎｙｅｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）および昆虫（Ｈｏｆｆｍａｎｎ
ｅｔ  ａｌ．，１９９９）などの多種多様な多細胞生物の免疫系において機能的類似体を有する比較的非特異的な「パターン認識」を構成する。そのようなものとして、これらの進化的な古代の要素は、生物が宿主の免疫系による以前の「目に見えない」侵入する微生物に直面した場合に、敏速で鋭敏な宿主防衛の監視機構を示す。先天性系とは対照的に、適応免疫は、脊椎動物に制限され、また、宿主細胞が病原体または腫瘍細胞の特性を特に決定する精密に調整された系を示す（Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。しかし、かかる精度は、抗原を処置する時間および特異的リンパ球および抗体を産出する時間を必要とする。したがって、適応系は、特異性を欠く先天性系よりも新規問題への反応が遅い（Ｆｅａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。
【００７０】
顆粒球は、骨髄内にある多能性幹細胞から生じ、好酸球、好塩基球および好中球を含む。ＰＭＮは、ヒト末梢循環において最も数の多い白血球であり、通常多葉性の核からその名称を得ている。成人健常者における成熟ＰＭＮの日々の生成は、ほぼ１０１１細胞相当である。急性感染または他の炎症ストレス時に、ＰＭＮは、最大１０倍の通常日常で必要な好中球を含有する骨髄の貯蔵所から能動化される（Ｎａｕｓｅｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。ＰＭＮは、それらを炎症の部位へ移動させることができる運動性および非常に可塑性の細胞であり、感染性の微生物に対する第１線防御として機能する。この目的のため、ＰＭＮは、タンパク質分解および他の細胞傷害性酵素で充填された顆粒を含有する（
Ｓｃｈｅｔｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１、Ｂｏｒｒｅｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。酵素の遊離に加えて、ＰＭＮは、酸素を高度な活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ：ＲＯＳ）に貪食および変換することもできる。貪食後、摂取した微生物は、酵素活性とＲＯＳ生成との組み合わされた作用によってファゴソーム内部で死滅され得る。
【００７１】
活性化されると、ＰＭＮは、ＲＯＳに変換される膨大な酸素を消費し始め、これは、呼吸または酸化的バーストとして既知の工程である（Ｂａｂｉｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７６、Ｂａｂｉｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８）。本工程は、酵素ＮＡＤＰＨオキシダーゼの活性に依存する。このオキシダーゼは、受容体媒介および受容体非依存性の両工程によって活性化され得る。一般的な受容体依存性の刺激は、補体成分Ｃ５ａ、Ｃ３ｂおよびｉＣ３ｂ（Ｏｇｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）、細菌由来の走化性トリペプチドＮ−ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（ｆＭＬＰ）（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７）、レクチンコンカナバリンＡ（Ｗｅｉｎｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０）、ならびにオプソニン化ザイモサン（ｏｐｓｏｎｉｚｅｄ  ｚｙｍｏｓａｎ：ＯＰＺ）（Ｗｈｉｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）である。受容体非依存性の刺激は、長鎖の不飽和脂肪酸およびホルボール１２−ミリスチン酸１３−アセテート（ｐｈｏｒｂｏｌ  ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  ａｃｅｔａｔｅ：ＰＭＡ）を含む（Ｓｃｈｎｉｔｚｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。活性化されると、オキシダーゼは、摂取した微生物を含有する細胞の外側またはファゴソーム内のいずれか一方で、膜の細胞質側でＮＡＤＰＨから電子を受け入れ、これらを膜の他方側で酸素分子に提供する。本方法において、スーパーオキシドアニオン（・Ｏ２−）への酸素の一電子還元は、下記の式に示すようなＮＡＤＰＨの犠牲によって触媒される。
【００７２】
【化１６】
2009521928.tif 000018
【００７３】
本方法において消費された酸素の多くは、・Ｏ２−としては表されないが、スーパーオキシドラジカルの不均化により形成される過酸化水素として相当し得る（Ｈａｍｐｔｏｎ、１９９８、Ｒｏｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）。
【００７４】
【化１７】
2009521928.tif 000019
【００７５】
しかし、その制限された膜透過性のために、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）は高濃度でのみ殺菌性であり（Ｈｙｓｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、一方、外因的に産出されたスーパーオキシドは細菌を直接的に死滅させない（Ｂａｂｉｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７５、Ｒｏｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９）。したがって、種々の二次的な酸化体が、ＰＭＮの破壊能力を担うように提案されている。
【００７６】
鉄触媒されたフェトン反応によって形成されたヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）は、作用範囲は制限されるが、ほとんどの生体分子と極度に反応する（Ｓａｍｕｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）。
【００７７】
【化１８】
2009521928.tif 000020
【００７８】
一重項酸素（１Ｏ２）は、酸素の電子的に励起された状態として見られることが多く、過酸化を開始する膜脂質と反応してもよい（Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ、１９７８）。ＰＭＮによって産出されたＨ２Ｏ２の多くは、ミエロペルオキシダーゼ（ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ：ＭＰＯ）よって消費され、酵素は刺激されたＰＭＮにより遊離される（Ｋｅｔｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７、Ｎａｕｓｅｅｆ、１９８８、Ｚｉｐｆｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７、Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ、１９９９）。このヘムを含有するペルオキシダーゼは、アズール顆粒の主な成分であり、塩素イオンを強力な非ラジカル酸化体次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）に酸化させるのためのＨ２Ｏ２使用において独特である（Ｈａｒｒｉｓｏｎ
ｅｔ  ａｌ．，１９７６）。ＭＰＯの他の基質は、ヨウ化物、臭化物、チオシアナイト、および亜硝酸塩を含む（Ｖａｎ  Ｄａｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７、Ｖｌｉｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。
【００７９】
【化１９】
2009521928.tif 000021
【００８０】
ＨＯＣｌは、ＰＭＮにより生成されることが知られる最も殺菌性の酸化体であり、細菌の多くの種はＭＰＯ／Ｈ２Ｏ２／塩化物系で容易に死滅する（Ａｌｂｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２）。
【００８１】
実験的な設定において、活性化した食細胞によるＲＯＳ生成は、ルミノールまたはルシゲニンなどのエンハンサを使用して検出できる（Ｆａｕｌｋｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。ＲＯＳ検出において、ルシゲニンは最初に還元される必要があり、一方、ルミノールは不安定なエンドペルオキシドを産出するために一電子酸化される必要があり、その分解によって、光子放出による光が生成される（Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。ルミノールは概してＨＯＣｌを検出し、これはルミノールの検出は、主にＭＰＯ／Ｈ２Ｏ２系に依存し（ＭｃＮａｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、一方、ルシゲニンを使用する検出は、ＭＰＯ非依存性および・Ｏ２−に対してより特異的（Ａｎｎｉａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）であることを意味する。ルミノールは細胞に入ることができるため、細胞内および細胞外に生成されたＲＯＳを検出し（Ｄａｈｌｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）、一方、ルシゲニンは細胞膜を事実上通過できないため、細胞外での諸現象のみを検出する（Ｄａｈｌｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）。しかし、実際の特異性は、これらの光放射を向上させる化合物のいずれを用いても決して推測できないため、結果は注意して解釈されるべきである（Ｌｉｏｃｈｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。
【００８２】
・Ｏ２−の生成は、ある程度Ｏ２濃度に依存し、すべての好気性細胞内で発生するようである。ミトコンドリアにおいて、１〜３％の電子が・Ｏ２−を形成するように考えられている。また、ＲＯＳは、好気的代謝の量的に有意な生成物であることを下記の計算で示す。安静時の正常成人（体重７０ｋｇと想定）は３．５ｍＬ  Ｏ２／ｋｇ／分を活用し、これは３５２．８ｌ／日または１４．７モル／日と同一である。１％が・Ｏ２−を作る場合、これは０．１４７モル／日もしくは５３．６６モル／年を得、または１年あたり約１．７ｋｇの・Ｏ２−を得る。呼吸バースト中のＯ２取り込みの増加は、好中球の静止時Ｏ２消費の１０から２０倍となることができる（Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９
９８）。
【００８３】
ＲＯＳ生成に関与するＮＡＤＰＨオキシダーゼは、静止時ＰＭＮにおける集合されていない（したがって、不活性の）多成分酵素系である。しかし、例えば、オプソニン化微生物の細胞表面受容体への結合による食細胞の活性化は、原形質膜上の活性酵素複合体の集合をもたらす（Ｃｌａｒｋ、１９９０、Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。正常な宿主防衛における機能的ＮＡＤＰＨオキシダーゼの決定的な重要性は、オキシダーゼが構成タンパク質成分のうちの１つが欠乏するために機能しない障害である、慢性肉芽腫症（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：ＣＧＤ）を有する個人においてみられる、細菌および真菌感染症により最も顕著に例証される（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１、Ｄｉｎａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３、Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９、Ｄｉｎａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７、Ｖｏｌｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）。機能的に適格なオキシダーゼを欠くそのような患者からのＰＭＮは、刺激時の・Ｏ２−産出に失敗する。刺激されたＰＭＮによるＲＯＳの形成は、宿主に有利な生理学的反応であり得るが、これらのラジカルが過剰な組織損傷を生じさせる場合のある多くの炎症状態において不利益ともなり得る（Ｗｅｉｓｓ、１９８９、Ｆａｎｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）。
【００８４】
ＮＡＤＰＨオキシダーゼの必須成分は、原形質膜および細胞質タンパク質を含む。重要な原形質膜成分は、９１−ｋＤａ糖タンパク質（ｇｐ９１ｐｈｏｘ）および２２−ｋＤａタンパク質（ｐ２２ｐｈｏｘ）で構成されているヘテロ二量体フラボチトクロムｂである（Ｒｏｔｒｏｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２、Ｓｅｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。フラボチトクロムｂは、電子をＮＡＤＰＨから酸素分子に移動させる役目を果たし、・Ｏ２−の産出をもたらす。ＰＭＮ膜において、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質、Ｒａｐ１Ａは、フラボチトクロムｂと付随し、体内ＮＡＤＰＨオキシダーゼ調節において重要な役割を果たす（Ｑｕｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９、Ｇａｂｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。さらに、細胞質タンパク質ｐ４７ｐｈｏｘ、ｐ６７ｐｈｏｘ、および第２の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質、Ｒａｃ２は、機能的ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０、Ｈｅｙｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１、Ｑｕｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３、ＤｅＬｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）を形成するために、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性（Ｖｏｌｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８、Ｌｏｍａｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９ａ、Ｌｏｍａｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９ｂ）およびフラボチトクロムｂと付随するこれらの３つのタンパク質に必要である。さらに、細胞質タンパク質、ｐ４０ｐｈｏｘが特定されているが、オキシダーゼ機能におけるその役割は完全に明らかではない（Ｗｉｅｎｔｊｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ集合の現モデルによると、ｐ４７ｐｈｏｘおよびｐ６７ｐｈｏｘは、ＰＭＮ活性化中にフラボチトクロムｂと付随するようにｅｎ  ｂｌｏｃを転座させる（ＤｅＬｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６、Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２、Ｉｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。Ｒａｃ２は、膜結合したフラボチトクロムｂと付随するように他の２つの細胞質成分を同時に、しかし独立して転座させる（Ｈｅｙｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４、Ｄｏｒｓｅｕｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。種々の形態のＣＧＤを有する患者のＰＭＮにおけるオキシダーゼ集合の研究は、ｐ４７ｐｈｏｘがフラボチトクロムｂに直接結合し（Ｈｅｙｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）、ｇｐ９１ｐｈｏｘ上の４つの部位およびｐ２２ｐｈｏｘ上の２つの部位を含む、フラボチトクロムｂの少なくとも６つの領域が、ｐ４７ｐｈｏｘと相互作用する推定部位として特定されていることを示す（Ｋｌｅｉｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０、Ｌｅｕｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４、Ｌｅｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４、Ｌｅｕｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４、Ｎａｋａｎｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２、ＤｅＬｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５、Ｓｕｍｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４、Ｆｉｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。
【００８５】
ＩＩ．スクリーニングアッセイのための試薬の調製および本発明のスクリーニングアッセイ
本発明は、概して、ＳＯＤ１を結合する領域に対応するＲａｃなどのＧＴＰアーゼの領域において、アミノ酸配列に特に結合する薬剤をスクリーニングする方法を提供する。該方法は、領域を含む単離または精製されたペプチド、ポリペプチまたは融合タンパク質を用いてもよく、ペプチド、ポリペプチドまたは融合タンパク質は、非組み換え細胞（ペプチドおよびポリペプチドに対し）から、またはペプチド、ポリペプチドまたは融合タンパク質をコード化する発現カセットを有する外因性核酸を形質移入された、または化学合成によって調製された組み換え細胞である体外転写／翻訳系から遊離される。また、方法は、組み換え細胞を得るように、過渡的または安定的に細胞に導入された発現カセットからペプチド、ポリペプチドまたは融合タンパク質を発現させる細胞を用いてもよい。発現カセットは、ペプチド、ポリペプチドまたは融合タンパク質の発現を促進するプロモータを含む。プロモータは、構造性のプロモータまたは、例えば誘導性の調節可能なプロモータであってもよい。
【００８６】
したがって、スクリーニング方法に用いられるＧＴＰアーゼおよびＳＯＤタンパク質は、組み換えまたは内因性（自然）であってもよく、アッセイは、例えば、単離または精製されたＲａｃおよび単離または精製されたＳＯＤを用いるものや、例えばエンドソーム分画などのＲａｃおよび／またはＳＯＤを供給するために細胞成分分画を用いるものなどの無細胞アッセイであってもよく、または、例えば細胞全体もしくは細胞可溶化物などの細胞ベースのアッセイであってもよい。溶解物または細胞成分分画を用いる一部のアッセイにおいて、単離された、例えば組み換えＧＴＰアーゼまたはＳＯＤを、ＧＴＰアーゼ、ＳＯＤ、またはＧＴＰアーゼおよびＳＯＤのどちらをも含む溶解物または細胞成分分画に加えてもよい。
【００８７】
一実施形態において、検査薬または薬剤のライブラリは、ＲａｃおよびＳＯＤと接触するその混合物と接触する。別の実施形態において、検査薬またはライブラリは、ＳＯＤおよびＧＴＰアーゼと接触するその混合物と接触する。一実施形態において、検査薬または薬剤のライブラリは、ＧＴＰアーゼおよびＳＯＤと、例えば、組み換えＧＴＰアーゼもしくはＳＯＤまたは適切な結合領域を含むその部分と接触する。
【００８８】
一実施形態において、ＳＯＤに結合するＲａｃ１の領域に対応する、またはＲａｃ１を結合するＳＯＤの領域に対応するアミノ酸配列を有するペプチド、ポリペプチドまたは融合タンパク質は、カラム，ビーズまたは他の個体の担体、例えばマルチウェルプレートのウェルと結合する。一実施形態において、ペプチドまたはポリペプチドは、他の配列、例えばグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＧＳＴ）配列、Ｈｉｓタグ、カルモデュリン結合ペプチド、タバコエッチウイルスプロテアーゼ、タンパク質Ａ  ＩｇＧ結合ドメイン等、もしくは連結されたＲａｃまたはＳＯＤ  ポリペプチドを単離、精製または検出するのに有用な配列の組み合わせに融合する。一実施形態において、ＧＳＴ−Ｒａｃ１は、担体、例えばマルチウェルプレート上に固定化され、１つ以上の薬剤および緑色蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＧＦＰ）−ＳＯＤを、固定化されたＲａｃ融合タンパク質に同時にまたは連続して加える。ウェル当たりのＧＦＰの量または存在を検出または判断し、および試薬添加のない対応する試料においてＧＦＰの量または存在を任意に比較する。
【００８９】
ＧＴＰアーゼとＳＯＤの結合を調節する薬剤は、ＲＯＳ精製を調節してもよい。ＲＯＳの生成を検出する方法および過剰ＲＯＳに関連する疾患の動物モデルは、当技術分野において既知である。具体的には、ＲａｃとＳＯＤの結合の阻害剤は、過剰ＲＯＳ、例えば運
動ニューロン障害により特徴付けられる疾患治療の候補である。
【００９０】
Ａ．定義
用語「外因性」は、細胞または生物におけるタンパク質、遺伝子、核酸、またはポリヌクレオチドとの関連で使用される場合、人工的または自然な手段により細胞内または生物内に導入されたタンパク質、遺伝子、核酸、またはポリヌクレオチドを言う。外因性核酸は、異なる生物または細胞からのものであってもよく、生物または細胞内で自然に発生する核酸の１つ以上の付加的な複製物であってもよい。非限定的な例として、外因性核酸は、自然細胞とは異なる染色体位置にあり、あるいは、例えば、一遺伝子からのプロモータを、異なる遺伝子からの遺伝子生成物の読み取り枠に連結する発現カセットなどの、自然界に見られるものとは異なる核酸配列によって配置される。
【００９１】
用語「単離された」は、核酸、ペプチド、またはポリペプチとの関連で使用される場合、少なくとも１つの混入物核酸、ポリペプチド、またはその自然源と通常関係がある他の生物学的成分から同定および分離された核酸配列、ペプチド、またはポリペプチドを言う。単離された核酸、ペプチドまたはポリペプチドは、自然界に見られるものとは異なる形態または設定で示され、例えば、一定のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子）は、隣接遺伝子に近接して宿主細胞染色体上で見られ、特異的タンパク質をコード化する特異的ｍＲＮＡ配列などのＲＮＡ配列は、多数のタンパク質をコード化する多くの他のｍＲＮＡを有する混合物として細胞内に見られる。単離された核酸分子は、一本鎖または二本鎖の形態で示されてもよい。単離された核酸分子がタンパク質の発現に活用される場合、分子は、最小限でもセンス鎖またはコード鎖（つまり、分子は一本鎖であってもよい）を含むが、センス鎖およびアンチセンス鎖（つまり、分子は二本鎖であってもよい）の両方を含んでもよい。
【００９２】
本明細書において使用される用語「組み換えＤＮＡ分子」は、分子の生物学的技術により連結されたＤＮＡのセグメントを含むＤＮＡ分子を言う。
【００９３】
本明細書において使用される用語「組み換えタンパク質」または「組み換えポリペプチド」は、組み換えＤＮＡ分子から発現するタンパク質分子を言う。
【００９４】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、特に区別されない限り本明細書において同一の意味で使用され、「ペプチド」は、概して全長のポリペプチドもしくはタンパク質の一部、または連結された配列を単離、精製または検出するのに有用なアミノ酸配列を言う。
【００９５】
本明細書における「形質移入」、「形質転換された」または「遺伝子導入」は、少なくとも１つの組み換えＤＮＡ配列の存在によって変換または増大した任意宿主細胞または株化細胞を含むように使用される。本発明の宿主細胞は、通常、単離された線状ＤＮＡ配列としてのプラスミド発現ベクターにおけるＤＮＡ配列の形質移入または組み換えウイルスベクターとの感染によって生成される。
【００９６】
用語「配列相同性」は、２つの核酸配列間の塩基一致の比率または２つのアミノ酸配列間のアミノ酸一致の比率を意味する。配列相同性を、例えば５０％などのパーセンテージを表す場合、パーセンテージは、何らかの他の配列と比較された選択配列の長さに対して一致する比率を示す。ギャップ（２つの配列のいずれか一方において）は、一致を最大化させることができ、１５塩基以下のギャップ長が通常使用され、６塩基以下が好ましく、塩基以下はより好ましい。オリゴヌクレオチドをプローブまたは処置として使用する場合、標的核酸とオリゴヌクレオチド配列の配列相同性は、概して、２０個の可能なオリゴヌクレオチド塩基対一致（８５％）のうちの１７個の標的塩基一致より少なくならず、好ましくは、１０個の可能な塩基対一致（９０％）のうちの９個の一致より少なくならず、よ
り好ましくは、２０個の可能な塩基対一致（９５％）のうちの１９個の一致より少なくならない。
【００９７】
２つのアミノ酸配列は、それらの配列間に部分的または完全な同一性がある場合に相同である。例えば、８５％の相同性は、２つの配列が最大一致となるように整列されたときに、アミノ酸の８５％が同一であることを意味する。ギャップ（２つの配列のいずれか一方における）は一致を最大化させることができ、５以下のギャップ長が好ましく、２未満がより好ましい。あるいは、または好適には、変異データ行列および６以上のギャップペナルティを用いるプログラムＡＬＩＧＮを使用して、５より大きいアラインメントスコア（標準偏差単位で）を有する場合に、２つのタンパク質配列（または、少なくとも３０アミノ酸長のそれらに由来するポリペプチド配列）は、この用語が本明細書で使用される場合に、相同である。Ｄａｙｈｏｆｆ、１９７２を参照。２つの配列またはその部分は、より好ましくは、ＡＬＩＧＮプログラムを使用して最適に整列されたときに、それらのアミノ酸が５０％の同一性よりも大きいまたは等しい場合に相同である。
【００９８】
本明細書における用語「に対応する」は、ポリヌクレオチド配列が基準ポリヌクレオチド配列のすべてまたは一部に構造的に関連すること、または、ポリペプチド配列が基準ポリペプチド配列のすべてまたは一部に構造的に関連することを意味し、例えば、それらは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％以上、例えば９９％または１００％の配列同一性を有する。対照的に、本明細書における用語「と相補的な」は、相補的な配列が基準ポリヌクレオチド配列のすべてまたは一部と相同であることを意味する。例示として、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は、基準配列「ＴＡＴＡＣ」に相当し、基準配列「ＧＴＡＴＡ」と相補的である。
【００９９】
用語「基準配列」、「比較窓」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」、および「実質的に同一性」は、２つ以上のポリヌクレオチド間の配列関係を説明するために使用される。「基準配列」は、配列比較の基準として使用される定義された配列であり、基準配列は、例えば、全長のｃＤＮＡのセグメントまたは配列表に示される遺伝子配列としての、より大きな配列のサブセットであってもよく、または完全なｃＤＮＡもしくは遺伝子配列を含んでもよい。概して、基準配列は、少なくとも２０ヌクレオチドの長さであり、高い頻度で少なくとも２５ヌクレオチドの長さであり、多くの場合少なくとも５０ヌクレオチドの長さである。２つのポリヌクレオチドはそれぞれ、（１）２つのポリヌクレオチ間で類似の配列（つまり、完全なポリヌクレオチド配列の一部）を含んでもよく、（２）２つのポリヌクレオチド間で相違する配列をさらに含んでもよいため、２つ（または２つ以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は、通常、配列類似性の局所領域を特定および比較するために、「比較窓」上の２つのポリヌクレオチドの配列を比較することによって行われる。
【０１００】
本明細書において使用される「比較窓」は、少なくとも２０個の連続したヌクレオチドの概念的セグメントを言い、比較窓におけるポリヌクレオチド配列の一部は、２つの配列の最適なアラインメントに対する基準配列（付加または欠失を含まない）と比べて、２０パーセント以下の付加または欠失（つまり、ギャップ）を含んでもよい。比較窓を整列する配列の最適なラインメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのｌｏｃａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（１９８１）、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎのｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｍｅｔｈｏｄ（１９８８）、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実現（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ。）、または検査によって行われてもよく、および種々の方法により生成された最良のアライメント（つまり、比較窓上
で最高パーセンテージの相同性をもたらす）が選択される。
【０１０１】
用語「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列が、比較窓上で同一である（つまり、ヌクレオチドごとのヌクレオチドベースで）ことを意味する。用語「配列同一性のパーセンテージ」は、比較窓上で最適に整列された２つの配列を比較し、一致した位置数を産出するために同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が両配列内で発生する位置数を判断し、一致した位置数を比較窓（つまり、窓サイズ）における合計位置数で割り、配列同一性のパーセンテージを産出するためにその結果を１００で乗することによって計算される。本明細書において使用される用語「実質的に同一性」は、ポリヌクレオチド配列の特性を示し、ポリヌクレオチドは、少なくとも８５パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも９０から９５パーセントの配列同一性、より一般的には、少なくとも２０個のヌクレオチド位置の比較窓上、高い頻度では、少なくとも２０〜５０個のヌクレオチドの窓上での基準配列と比べて、少なくとも９９パーセントの配列同一性を有する配列を含み、配列同一性のパーセンテージは、比較窓上で合計２０パーセント以下の基準配列の欠失または付加を含んでもよいポリヌクレオチド配列と、基準配列を比較することによって計算される。
【０１０２】
ポリペプチドに適用される用語「実質的に同一性」は、２つのペプチド配列が、規定値のギャップ重量を使用するプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適に整列された場合に、少なくとも約８０パーセントの配列同一性、好ましくは、少なくとも約９０パーセントの配列同一性、より好ましくは、少なくとも約９５パーセントの配列同一性、および最も好ましくは、少なくとも約９９パーセントの配列同一性を共有することを意味する。
【０１０３】
本明細書において使用される「実質的に純粋」または「精製された」は、対象種が存在する優勢種であることを意味し（つまり、モル基準で、組成物における任意の他の個々の種よりもさらに豊富である）、好ましくは実質的に精製された分画は組成物であって、対象種は、存在する少なくとも約５０パーセント（モル基準で）のすべての巨大分子種を含む。概して、実質的に純粋な組成物は、組成物内に存在する約８０パーセントより大きいすべての巨大分子種を含み、より好ましくは、約８５％、約９０％、約９５％、および約９９％より大きい。最も好ましくは、対象種は必須の同種に精製され（混入物種は、従来の検出方法では組成物内で検出できない）、組成物は、基本的に単一巨大分子種から成る。
【０１０４】
Ｂ．発現カセットの調製
例えば、Ｒａｃ、ＳＯＤ、そのペプチド、またはその融合物などのＧＴＰアーゼをコード化する発現カセットを調製するには、形質転換のために、組み換えＤＮＡ配列またはセグメントは、環状もしくは線状、または二本鎖もしくは一本鎖であってもよい。関心遺伝子生成物をコード化するｍＲＮＡ配列と実質的に相補的なＲＮＡ配列をコード化するＤＮＡ配列は、通常、逆の配向で（つまり、５’から３’よりはむしろ３’から５’）カセットクローン化された「センス」ＤＮＡ配列である。概して、ＤＮＡ配列またはセグメントは、細胞内においてＤＮＡの発現を促進する対照配列によって配置されたコード領域も含有できる、プラスミドＤＮＡなどのキメラＤＮＡの形態である。本明細書において使用される「キメラ」は、ベクターが少なくとも２つの異種からのＤＮＡを含むこと、または、「未変性の」または野生型の種においては発生しない方法で連結または付随した同種からのＤＮＡを含むことを意味する。
【０１０５】
転写単位またはその部分として機能するＤＮＡ配列に加えて、ＤＮＡの部分は、転写されなくてもよく、制御的または構造的な機能を果たす。例えば、ＤＮＡ自体は、真核細胞において、例えば哺乳類細胞または特定の細胞種において活性であるプロモータを含んでもよく、リンパ球向性ウイルスの形質転換標的であるゲノム内にすでに存在するプロモー
タを活用してもよい。かかるプロモータは、ＣＭＶプロモータならびにＳＶ４０の遅いプロモータとレトロウイルスＬＴＲ（末端反復配列要素）を含むが、例えば、本発明の実践においてＭＭＴＶ、ＲＳＶ、ＭＬＶまたはＨＩＶ  ＬＴＲなどの、当業者には既知である多くの他のプロモータ要素を用いてもよい。
【０１０６】
また、イントロン、エンハンサ、ポリアデニル化配列等の宿主細胞において機能的な他の要素は、組み換えＤＮＡの一部であってもよい。かかる要素は、ＤＮＡの機能に必要であってもなくてもよいが、転写、ｍＲＮＡの安定性等に影響を及ぼすことによってＤＮＡの向上した発現を提供できる。かかる要素は、細胞内において最適な性能の形質転換ＤＮＡを取得するために、上記のようなＤＮＡ内に含まれてもよい。
【０１０７】
細胞内に導入される組み換えＤＮＡは、形質転換されるよう標的された細胞集団からの、形質転換された細胞の同定および選択を容易にするため、選択可能なマーカ遺伝子またはレポータ遺伝子のいずれか一方または両方を含有してもよい。あるいは、選択可能なマーカは、ＤＮＡの別々の断片上に運ばれてもよく、同時形質転換工程で使用されてもよい。選択可能なマーカおよびレポータ遺伝子はどちらも、宿主細胞における発現を可能にするように適切な制御配列で配置されてもよい。有用な選択可能なマーカは、当業者には既知であり、例えば、ｎｅｏ、ｈｐｔ、ｄｈｆｒ、ｂａｒ、ａｒｏＡ、ｐｕｒｏ、ｈｙｇ、ｄａｐＡ等の抗生物質および除草剤抵抗性遺伝子を含む。また、Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔらの表１に記載の遺伝子も参照。（米国特許第５，８４８，９５６号）。
【０１０８】
レポータ遺伝子は、潜在的に形質転換された細胞を同定するため、および制御配列の機能性を評価するために使用される。タンパク質を容易に分析可能なようにコード化するレポータ遺伝子は、当業者には既知である。概して、レポータ遺伝子は、受容生物または組織内に存在しない、またはそれらによって発現されない遺伝子であって、例えば酵素活性などの何らかの容易に検出可能な特性によって発現が現れるタンパク質をコード化する遺伝子である。例示的なレポータ遺伝子は、大腸菌のＴｎ９からのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｃａｔ）、大腸菌のｕｉｄＡ座β−グルクロニダーゼ遺伝子（ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ：ｇｕｓ）、緑色、赤色または青色蛍光タンパク質遺伝子、およびルシフェラーゼ遺伝子を含む。レポータ遺伝子の発現は、ＤＮＡの受容細胞内への導入後、適切な時間に分析される。
【０１０９】
標的細胞を形質転換できる組み換えＤＮＡを構成する一般的な方法は、当業者には既知であり、同一の組成物および同一の構成方法が本明細書において有用なＤＮＡを生成するために活用されてもよい。
【０１１０】
関心ＤＮＡ配列が宿主細胞によって発現されるように、組み換えＤＮＡを有する形質転換された（遺伝子導入）細胞を産出するため、例えば物理的または生物学的方法などの特定の細胞への導入に有用な任意の工程によって、組み換えＤＮＡを、宿主細胞に、例えば哺乳類、細菌、酵母もしくは昆虫細胞、または原核細胞内に容易に導入することができる。一実施形態において、組み換えＤＮＡは、細胞のゲノム内へ安定に組み込まれる。
【０１１１】
組み換えＤＮＡを宿主細胞内へ導入する物理的方法は、カルシウム媒介の方法、リポフェクション法、粒子衝突、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等を含む。関心ＤＮＡを宿主細胞内へ導入する生物学的方法は、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスベクターの使用を含む。例えばレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターは、哺乳類細胞、例えばヒト細胞などの真核細胞内に遺伝子を挿入するために広く利用される方法となっている。他のウイルスベクターは、ポックスウイルス、例えばワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス等に由来することができる。
【０１１２】
宿主細胞における組み換えＤＮＡ配列の存在を確認するため、種々のアッセイが行われてもよい。かかるアッセイは、例えば、サザンおよびノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲなどの当業者には既知である分子生物学的アッセイと、例えば、免疫学的な手段（ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット）による、または他の分子アッセイより特定の遺伝子生成物有無の検出などの生化学的アッセイとを含む。
【０１１３】
導入された組み換えＤＮＡセグメントから生成されたＲＮＡを検出および定量するために、ＲＴ−ＰＣＲが用いられてもよい。ＰＣＲのこの利用において、まず、逆転写酵素などの酵素を使用してＲＮＡをＤＮＡに逆転写し、その後、従来のＰＣＲ技術を用いてＤＮＡを増幅する必要がある。大抵の場合、ＰＣＲ技術は、有用ではあるが、ＲＮＡ生成物の完全性を示さない。ＲＮＡ生成物の性質に関するさらなる情報は、ノーザンブロット法で取得することができる。本技術は、ＲＮＡ種の存在を実証し、そのＲＮＡの完全性に関する情報を提供する。また、ＲＮＡ種の有無は、ドットまたはスロットブロットノーザンハイブリダイゼーションを使用して実証することもできる。これらの技術は、ノーザンブロット法の改良であり、ＲＮＡ種の有無のみを実証する。
【０１１４】
サザンブロット法およびＰＣＲは、問題になっている組み換えＤＮＡセグメントを検出するために使用できるが、組み換えＤＮＡセグメントが発現するかどうかに関する情報は提供しない。発現は、導入されたＤＮＡ配列のペプチド生成物を特に特定することによって、または宿主細胞内の導入されたＤＮＡセグメントの発現によってもたらされる表現型の変化を評価することによって評価されてもよい。
【０１１５】
Ｃ．ペプチド、ポリペプチドおよび融合タンパク質
本発明のペプチド、ポリペプチドまたは融合タンパク質は、例えば固相ペプチド合成法または組み換えＤＮＡアプローチ（上記参照）によって、体外で合成できる。固相ペプチド合成法は、確立された広く利用されている方法である。これらのポリペプチドは、免疫親和性またはイオン交換カラム、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上またはＤＥＡＥなどのアニオン交換樹脂上のクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、例えばＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５を使用するゲルろ過、またはリガンド親和性クロマトグラフィーでの分別によりさらに精製されることができる。
【０１１６】
単離され、特徴付けられると、一定のペプチド、ポリペプチド、またはその融合物の化学的に修正された誘導体は、容易に調製できる。また、例えば、本発明のペプチド、ポリペプチド、またはその融合物のアミドは、カルボン酸基または前駆物質をアミドに変換する当技術分野では既知の技術によって調製されてもよい。Ｃ末端カルボキシル基でアミドを形成する好適な方法は、適切なアミンを有する個体の担体からペプチド、ポリペプチド、またはその融合物を開裂させること、またはアルコールの存在下で開裂させてエステルを得、所望のアミンによるアミノリシスを行うことである。
【０１１７】
ペプチド、ポリペプチド、またはその融合物のカルボキシル基の塩は、例えば、水酸化ナトリウムなどの金属水酸化物塩基、例えば、炭酸ナトリウムまたは炭酸水素ナトリウムなどの金属炭酸塩基または重炭酸塩基、または例えば、トリエチルアミン，トリエタノールアミン等などのアミン塩基などの所望の塩基の１つ以上の等価物を有するペプチド、ポリペプチド、またはその融合物を含有することによって通常の方法で調製されてもよい。
【０１１８】
ペプチド、ポリペプチド、またはその融合物のアミノ基のＮ−アシル誘導体は、最終的な縮合のためのＮ−アシル保護アミノ酸を活用することによって、または保護もしくは非保護のペプチド、ポリペプチド、またはその融合物をアシル化することによって調製されてもよい。Ｏ−アシル誘導体は、例えば、遊離ヒドロキシポリペプチドまたはポリペプチ
ド樹脂のアシル化によって調製されてもよい。どちらのアシル化も、ハロゲン化アシル、無水物、アシルイミダゾール等などの標準的なアシル化試薬を使用して行うことができる。Ｎ−およびＯ−アシル化は、所望に応じて両方一緒に行ってもよい。
【０１１９】
ホルミルメチオニン、ピログルタミンおよびトリメチルアラニンは、ポリペプチドのＮ末端残基で置換されてもよい。他のアミノ末端修飾は、アミノオキシペンタン修飾を含む。
【０１２０】
一実施形態において、ＲａｃもしくはＲｈｏペプチド、ポリペプチドまたはそれらとの融合は、実質的に同一性、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に対応する野生型ＲａｃまたはＲｈｏタンパク質配列と、例えば、少なくとも８０％以上、例えば、８５％、９０％または９５％および最大１００％のアミノ酸配列同一性、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の約残基３５から約残基７０の残基と実質的に同一性を有し、および任意に、ＳＯＤに結合する野生型ＲａｃまたはＲｈｏの能率性と比較して、少なくとも１％、２０％、５０％以上、例えば、１００％、１１０％以上の能率性を有するＳＯＤを結合する。故に、ＲａｃもしくはＲｈｏまたは置換ＲａｃもしくはＲｈｏのペプチドは、野生型（全長の）ＲａｃまたはＲｈｏと比較して、低減した、実質的に同一、または向上した能率性を有する野生型ＳＯＤ（または変異体ＳＯＤ）を結合してもよい。特定の残基に関連して本明細書において使用される「約」は、指定された残基の５残基以内、例えば、特定の配列における残基「Ｘ」に対応する残基「Ｘ」の１、２、３、４または５残基以内を意味する。一実施形態において、本発明のＲａｃペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、例えば、ＴＶＦＤ／ＥＮＹＳ／ＶＡＮ／ＤＶ／ＩＭ／ＥＶＤＧ／ＳＫＰ／ＱＶＮ／ＥＬＧ／ＡＬＷＤＴＡＧＱＥＤＹＤＲＬＲＰＬを有するペプチドまたはそれと８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有し、ＳＯＤを結合するアミノ酸配列である。
【０１２１】
Ｒａｃにおけるアミノ酸の置換は、ＤよりはむしろＬ形態を活用し、他の既知のアミノ酸類似体、例えば、α，α−二置換アミノ酸などの非天然アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸等を活用する置換を含む。これらの類似体は、リン酸化セリン、リン酸化スレオニン、ホスホチロシン、ヒドロキシプロリン、γカルボキシグルタミン酸、馬尿酸、オクタヒドロインドール−２−カルボン酸、スタチン、１，２，３，４，−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、ペニシラミン、オルニチン、シトルリン、α−メチル−アラニン、パラ−ベンゾイル−フェニルアラニン、フェニルグリシン、プロパギルグリシン、サルコシン、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、ω−Ｎ−メチルアルギニン、ならびに他の同様のアミノ酸とイミノ酸およびｔｅｒｔ−ブチルグリシンを含む。
【０１２２】
保守的なアミノ酸置換が好ましく、つまり、例えば、酸性アミノ酸としてのアスパラギン−グルタミン、極性の塩基性アミノ酸としてのリジン／アルギニン／ヒスチジン、ロイシン／イソロイシン／メチオニン／バリン／アラニン／プロリン／グリシン無極性または疎水性アミノ酸、極性または親水性アミノ酸としてのセリン／スレオニンである。また、保守的なアミノ酸置換は、側鎖に基づく分類を含む。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびスレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンであり、および硫黄
含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンである。例えば、イソロイシンまたはバリンとロイシンの置換、グルタミン酸とアスパラギン酸の置換、セリンとスレオニンの置換、または構造的に関連するアミノ酸とアミノ酸の同様の置換は、結果として得られるペプチド、ポリペプチドまたは融合ポリペプチドの特性に大きな影響を及ぼさないと予測することが妥当である。アミノ酸変化が機能的ペプチドに繋がろうとなかろうと、ポリペプチドまたは融合ポリペプチドは、ペプチド、ポリペプチドまたは融合ポリペプチドの特異的活性を分析することで用意に判断できる。
【０１２３】
本発明の範囲内のアミノ酸置換は、概して、（ａ）置換の領域におけるペプチドバックボーンの構造（ｂ）標的部位での分子の変化または疎水性、または（ｃ）大部分の側鎖を維持することへの影響の点で有意差のない置換を選択することによって実現される。自然発生的な残基は、一般的な側鎖特性に基づいて、
（１）疎水性：ノルロイシン、メチ、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンと、
（２）中性疎水性：システイン、セリン、スレオニンと、
（３）酸性：アスパラギン酸、グルタミン酸と、
（４）塩基性：アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、アルギニンと、
（５）鎖配向を左右する残基：グリシン、プロリンと、
（６）芳香族：トリプトファン、チロシン、フェニルアラニンと、の群に分割される。
【０１２４】
また、本発明は、非保守的な置換を有するペプチド、ポリペプチドまたは融合ポリペプチドも想定する。非保守的な置換は、上記のクラスのうちの１つのメンバの別のものへの交換を伴う。
【０１２５】
ペプチド、ポリペプチドまたは融合ポリペプチドの酸付加塩、またはペプチド、ポリペプチドまたは融合ポリペプチドのアミノ残基の酸付加塩は、例えば塩酸などの所望の無機酸または有機酸の１つ以上の等価物を有するポリペプチドまたはアミンを含有することによって調製されてもよい。また、ポリペプチドのカルボキシル基のエステルは、当業者には既知である任意の通常の方法によって調製されてもよい。
【０１２６】
本発明のペプチドまたはポリペプチドは、例えば、フルオロフォアもしくは他の検出可能な部分を用いて標識化されてもよく、および／またはＲａｃおよびＳＯＤ結合の検出を容易にし得るＧＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰおよびＹＦＰなどのペプチドまたはポリペプチドに融合してもよい。検出（または単離および精製）を容易にし得る標識およびペプチドは、核酸分子、つまり、例えばオリゴヌクレオチドなどのＤＮＡまたはＲＮＡ、タンパク質、例えば発光タンパク質、ペプチド、例えば、リガンドによって認識可能なペピトーブ、例えばマルトースおよびマルトース結合タンパク質、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジンならびにＨｉｓタグおよびコバルト、亜鉛、ニッケルまたは銅などの金属、キーホールリンペットヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍａｃｙａｎｉｎ：ＫＬＨ）などの免疫原性を増強させるのに有用な分子などのハプテン、例えば、光化学開裂可能なビオチン、フルオロフォア、発色団などの開裂可能な標識等に限定されないがそれらを含む。
【０１２７】
ＩＩＩ．本発明の治療方法において有用な例示的な化合物
Ａ．定義
本明細書において使用される「薬学的に許容可能な塩」は、開示した化合物の誘導体を言い、親化合物は、酸または基塩、その塩を作製することによって修飾される。薬学的に許容可能な塩の例は、アミンなどの塩基性残基のミネラルまたは有機酸塩、カルボン酸などの酸性残基のアルカリまたは有機酸塩等を含むが、これらに限定されない。薬学的に許容可能な塩は、例えば、無毒性の無機または有機酸から形成された親化合物の従来の無毒性の塩または四級アンモニウム塩を含む。例えば、かかる従来の無毒性の塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸等などの無機酸に由来するもの、酢酸、
プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸などの有機酸から調製される塩等を含む。
【０１２８】
本発明において有用な化合物の薬学的に許容可能な塩は、従来の化学的方法によって、塩基性または酸性部分を含有する親化合物から合成することができる。概して、かかる塩は、水または有機溶媒、または２つの混合物において化学量論量の適切な塩基または酸を有する、これらの化合物の遊離酸または塩基形態と反応させることによって調節でき、概して、エーテル、エチルアセテート、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルなどの非水媒体が好ましい。適切な塩の一覧は、参照によりその開示全体が本願明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８５）に記載される。
【０１２９】
本明細書において使用される語句「薬学的に許容可能な」は、過度の毒性、刺激作用、アレルギー反応または妥当な利点／リスク比に見合った他の問題や複雑性なく、健全な医療的判断の範囲内で、ヒトおよび動物の組織との接触用途に適するこれらの化合物、材料、組成物および／または剤形を言う。
【０１３０】
本明細書において開示される化合物の１つのジアステレオマーは、その他のものと比べて優れた活性を示してもよい。必要に応じて、ラセミ材料の分離は、キラルカラムを使用したＨＰＬＣによって、またはＴｕｃｋｅｒら（１９９４）において見られるような分割剤を使用した分割によって達成できる。また、式Ｉのキラル化合物は、例えばＨｕｆｆｍａｎら（１９９５）のキラル触媒またはキラルリガンドを使用して直接合成されてもよい。
【０１３１】
「治療上有効な量」は、本明細書において有用な化合物の量と、例えば、宿主における疾患または障害を治療または予防または疾患または障害の症状を治療すると主張される化合物の組み合わせの量とを含むことが意図される。化合物の組み合わせは、好ましくは相乗的組み合わせである。例えばＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙ（１９８４）により記述されるような相乗作用は、組み合わせで投与された場合の化合物の効果が、単剤として単独で投与された場合の化合物の相加効果を上回る場合に発生する。概して、相乗効果は準最適濃度の化合物で最も明確に示される。相乗作用は、個々の成分と比べて、組み合わせのより低い細胞毒性、増加活性または何らかの他の有益な効果となり得る。
【０１３２】
本明細書において使用される「治療する」または「治療」は、（ｉ）病態の発生を予防すること（例えば、予防法）、（ｉｉ）病態を抑制またはその進行を阻止すること、（ｉｉｉ）病態を軽減および／または病態に関連する症状を減少させることを含む。
【０１３３】
本明細書において使用される用語「患者」は、本発明の方法によって治療される生物を言う。かかる生物は、ヒトなどの哺乳類を含むがそれに限定されない。本発明との関連で、用語「対象」は、概して疾患または障害の治療のために、治療を受けるまたは受けた個人を言う。
【０１３４】
「安定化合物」および「安定構造」は、反応混合物から有用な純度への単離、および有効な治療剤への製剤に耐えるのに十分頑強な化合物を示すことを意味する。安定化合物のみが本発明において意図される。
【０１３５】
「置換」は、指示された原子の通常の原子価を超えない場合、および置換が安定化合物
をもたらす場合において、指示された群からの選択と置換された「置換」の表現を使用して表される原子上の１つ以上の水素を示すことが意図される。適切に指示された群は、例えば、アルキル、アルケニルアルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよび／またはＣＯＯＲｘを含み、ＲｘおよびＲｙはそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキルまたはヒドロキシである。置換がケト（つまり、＝Ｏ）またはチオキソ（つまり、＝Ｓ）基の場合、原子上の２つの水素が置換される。
【０１３６】
「分断化された」は、指示された原子の通常の原子価を超えない場合、および分断化によって安定化合物をもたらす場合において、指示された群からの選択と挿入された「分断化された」の表現を使用して表される２つ以上の隣接炭素原子と、それらが結合された水素原子（例えば、メチル（ＣＨ３）、メチレン（ＣＨ２）またはメチン（ＣＨ））との中間を示すことが意図される。かかる適切に指示された群は、例えば、非過酸化オキシ（−Ｏ−）、チオ（−Ｓ−）、カルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、カルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）−）、イミン（Ｃ＝ＮＨ）、スルホニル（ＳＯ）またはスルホキシド（ＳＯ２）を含む。
【０１３７】
ラジカル、置換基および範囲に対して下記に記載した特異的および好適な値は、例証にすぎず、ラジカルおよび置換基の定義範囲内における他の定義値または他の値を除外するものではない。
【０１３８】
「アルキル」は、通常の、第２、第３または環状炭素原子を含有するＣ１−Ｃ１８炭化水素を言う。例として、メチル（Ｍｅ、−ＣＨ３）、エチル（Ｅｔ、−ＣＨ２ＣＨ３）、１−プロピル（ｎ−Ｐｒ、ｎ−プロピル、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−プロピル（ｉ−Ｐｒ、ｉ−プロピル、−ＣＨ（ＣＨ３）２）、１−ブチル（ｎ−Ｂｕ、ｎ−ブチル、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−メチル−１−プロピル（ｉ−Ｂｕ、ｉ−ブチル、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３３）２）、２−ブチル（ｓ−Ｂｕ、ｓ−ブチル、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、２−メチル−２−プロピル（ｔ−Ｂｕ、ｔ−ブチル、−Ｃ（ＣＨ３）３）、１−ペンチル（ｎ−ペンチル、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２）、２−メチル−２−ブチル（−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ３）、３−メチル−２−ブチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）２）、３−メチル−１−ブチル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、２−メチル−１−ブチル（−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、１−ヘキシル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−ヘキシル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３−ヘキシル（−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３））、２−メチル−２−ペンチル（−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３−メチル−２−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、４−メチル−２−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、３−メチル−３−ペンチル（−Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）２）、２−メチル−３−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）２）、２，３−ジメチル２−ブチル（−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ（ＣＨ３）２）、３，３−ジメチル２−ブチル（−ＣＨ（ＣＨ３）Ｃ（ＣＨ３）３が挙げられる。
【０１３９】
アルキルは、任意に、１つ以上のアルケニルアルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、
ＮＲｘＲｙおよび／またはＣＯＯＲｘと置換でき、ＲｘおよびＲｙはそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキルまたはヒドロキシルである。アルキルは、任意に、１つ以上の非過酸化オキシ（−Ｏ−）、チオ（−Ｓ−）、カルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、カルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）、スルホニル（ＳＯ）またはスルホキシド（ＳＯ２）で分断化されることができる。さらに、アルキルは、任意に、少なくとも部分的に不飽和であることができるため、アルケニルを提供する。
【０１４０】
「アルケニル」は、少なくとも１つの不飽和部位を有する通常の、第２、第３または環状炭素原子を含有するＣ２−Ｃ１８炭化水素を言い、つまり、炭素−炭素、ｓｐ２二重結合などである。例として、エチレンまたはビニル（−ＣＨ＝ＣＨ２）、アリル（−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）、シクロペンテニル（−Ｃ５Ｈ７）および５−ヘキセニル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）を含むが、これらに限定されない。
【０１４１】
アルケニルは、任意に、１つ以上のアルキルアルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよび／またはＣＯＯＲｘと置換でき、ＲｘおよびＲｙはそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキルまたはヒドロキシルである。さらに、アルケニルは、任意に、１つ以上の非過酸化オキシ（−Ｏ−）、チオ（−Ｓ−）、カルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、カルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）、スルホニル（ＳＯ）またはスルホキシド（ＳＯ２）で分断化されることができる。
【０１４２】
「アルキレン」は、親アルカンの同一または異なる炭素原子から２つの水素原子の除去により誘導される２つの１価ラジカルセンターを有する、１〜１８炭素原子の飽和、分枝もしくは直鎖または環状炭化水素ラジカルを言う。代表的なアルキレンラジカルは、メチレン（−ＣＨ２−）１，２−エチル（−ＣＨ２ＣＨ２−）、１，３−プロピル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、１，４−ブチル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）等を含むが、これらに限定されない。
【０１４３】
アルキレンは、任意に、１つ以上のアルキル、アルケニルアルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよび／またはＣＯＯＲｘで置換することができ、ＲｘおよびＲｙはそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキルまたはヒドロキシルである。さらに、アルキレンは、任意に、１つ以上の非過酸化オキシ（−Ｏ−）、チオ（−Ｓ−）、カルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、カルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）、スルホニル（ＳＯ）またはスルホキシド（ＳＯ２）で分断化されることができる。さらに、アルキレンは、任意に、少なくとも部分的に不飽和であり得るため、アルケニレンを提供する。
【０１４４】
「アルケニレン」は、親アルカンの同一または２つの異なる炭素原子から２つの水素原子の除去により誘導される２つの１価ラジカルセンターを有する、２〜１８炭素原子の不飽和、分枝もしくは直鎖または環状炭化水素ラジカルを言う。代表的なアルケニレンラジカル１，２−エチレン（−ＣＨ＝ＣＨ−）を含むが、これに限定されない。
【０１４５】
アルケニレンは、任意に、１つ以上のアルキル、アルケニルアルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよび／またはＣＯＯＲｘで置換することができ、Ｒｘおよびｙはそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキルまたはヒドロキシルである。さらに、アルケニレンは、任意に、１つ以上の非過酸化オキシ（−Ｏ−）、チオ（−Ｓ−）、カルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、カルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）、スルホニル（ＳＯ）またはスルホキシド（ＳＯ２）で分断化されることができる。
【０１４６】
用語「アルコキシ」は、基アルキル−Ｏ−を言い、アルキルは本明細書において定義される。好適なアルコキシ基は、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉｓｏ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｎ−ペントキシル、ｎ−ヘキソキシ、１，２−ジメチルブトキシ等を含む。
【０１４７】
アルコキシは、任意に、１つ以上のアルキルハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよびＣＯＯＲｘで置換することができ、ＲｘおよびＲｙはそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキルまたはヒドロキシルである。
【０１４８】
用語「アリール」は、単環（例えば、フェニル）または複数の縮合（融合）環を有する６から２０の炭素原子の不飽和芳香族炭素環式基を言い、少なくとも１つの環が芳香族（例えば、ナフチル、ジヒドロフェナンチレニル、フルオレニル、またはアントリル）である。好適なアリールは、フェニル、ナフチル等を含む。
【０１４９】
アリールは、任意に、１つ以上のアルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよびＣＯＯＲｘで置換することができ、ＲｘおよびＲｙはそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキルまたはヒドロキシルである。
【０１５０】
用語「シクロアルキル」は、環状の単環または複数の縮合環を有する３から２０の炭素原子の環状アルキル基を言う。かかるシクロアルキル基は、一例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロオクチル等などの単環構造、またはアダマンタニル等などの複数の環構造を含む。
【０１５１】
シクロアルキルは、任意に、１つ以上のアルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよびＣＯＯＲｘで置換することができ、ＲｘおよびＲｙはそれぞれ独立し
て、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキルまたはヒドロキシルである。
【０１５２】
シクロアルキルは、任意に、少なくとも部分的に不飽和であり得るため、シクロアルケニルを提供する。
【０１５３】
用語「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを言う。同様に、用語「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を言う。
【０１５４】
「ハロアルキル」は、同一または異なってもよい、本明細書において定義されるような１〜４のハロ基によって置換される、本明細書において定義されるようなアルキルを言う。代表的なハロアルキル基は、一例として、トリフルオロメチル、３−フルオロドデシル、１２，１２，１２−トリフルオロドデシル、２−ブロモオクチル、３−ブロモ−６−クロロヘプチル等を含む。
【０１５５】
用語「ヘテロアリール」は、１つ、２つ、または３つの芳香族環を含有し、少なくとも１つの窒素、酸素または硫黄原子を含有する単環式、２環式または３環式環系として本明細書において定義され、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ハロアルキル、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アルキルチオ、アルキルスルフィニルおよびアルキルスルホニルなどの、例えば１つ以上の、具体的には１つから３つの置換基と非置換または置換されることができる。ヘテロアリール基の例は、２Ｈ−ピロリル、３Ｈ−インドリル、４Ｈ−キノリジニル、４ｎＨ−カルバゾリル、アクリジニル、ベンゾ［ｂ］チエニル、ベンゾチアゾリル、β−カルボリニル、カルバゾリル、クロメニル、シナノリニル、ジベンゾ［ｂ，ｄ］フラニル、フラザニル、フリル、イミダゾリル、イミジゾリル、インダゾリル、インドリシニル、インドリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、ナフチリジニル、ナフト［２，３−ｂ］、オキサゾリル、ペリミジニル、フェナントリジニル、フェナントロリニル、フェナルサジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキチイニル、フェノキサジニル、フタルアジニル、プテリジニル、プリニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピリミジニル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノキサリニル、チアジアゾリル、チアントレニル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリルおよびキサンテニルを含むが、これらに限定されない。一実施形態において、用語「ヘテロアリール」は、炭素を含有する５または６つの環原子または非過酸化酸素、硫黄およびＮ（Ｚ）基から独立して選択された１、２、３または４個のヘテロ原子を含有する単環式芳香族環を示し、Ｚは存在しないか、Ｈ、Ｏ、アルキル、フェニルまたはベンジルである。別の実施形態において、ヘテロアリールは、特にベンズ誘導体またはプロピレンまたはテトラメチレンジラジカルをそこに融合することにより由来するものの、そこに由来する約８から１０の環のオルト融合２環式複素環を示す。
【０１５６】
ヘテロアリールは、任意に、１つ以上のアルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよびＣＯＯＲｘで置換することができ、ＲｘおよびＲｙはそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキルまたはヒドロキシルである。
【０１５７】
用語「複素環」は、酸素、窒素および硫黄基から選択され、任意にアルキルまたはＣ（
＝Ｏ）ＯＲｂで置換された少なくとも１つのヘテロ原子を含有する、飽和または部分的に不飽和環系を言い、Ｒｂは、水素またはアルキルである。一般的に、複素環は、酸素、窒素および硫黄基から選択された１つ以上のヘテロ原子を含有する単環式、２環式または３環式基である。また、複素環基は、環と結合されたオキソ基（＝Ｏ）を含有できる。複素環基の非限定的な例として、１、３−ジヒドロベンゾフラン、１、３−ジオキソラン、１、４−ジオキサン、１、４−ジチアン、２Ｈ−ピラン、２−ピラゾリン、４Ｈ−ピラン、クロマニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、インドリニル、イソクロマニル、イソインドリニル、モルホリン、ピペラジニル、ピペリジン、ピペリジル、ピラゾリジン、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピロリジン、ピロリン、キヌクリジンおよびチオモルホリンが挙げられる。
【０１５８】
複素環は、任意に、１つ以上のアルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよびＣＯＯＲｘで置換することができ、ＲｘおよびＲｙはそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキルまたはヒドロキシルである。
【０１５９】
窒素複素環およびヘテロアリールの例は、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチルピリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、イソチアゾール、フェナジン、イソオキサゾール、フェノキサジン、フェノチアジン、イミダゾリドン、イミダゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドリン、モルホリノ、ピペリジニル、テトラヒドロフラニル等ならびにＮ−アルコキシ−窒素含有複素環を含むが、これらに限定されない。本発明の１つの特定の実施形態において、窒素複素環は、３−メチル−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピラジノ［３，２，１−ｊｋ］カルバゾール−３−イウムヨウ化物であることができる。
【０１６０】
複素環の別のクラスは、「クラウン化合物」として既知であり、式［−（ＣＨ２−）ａＡ−］の１つ以上の反復単位を有する複素環化合物の特定のクラスを言い、ａは２と等しい、または２より大きく、それぞれ別々の発生のＡは、Ｏ、Ｎ、ＳまたはＰとなり得る。クラウン化合物の例は、ほんの一例として、［−（ＣＨ２）３−ＮＨ−］３、［−（（ＣＨ２）２−Ｏ）４−（（ＣＨ２）２−ＮＨ）２］等を含む。一般的に、かかるクラウン化合物は、４から１０個のヘテロ原子および８から４０個の炭素原子を有することができる。
【０１６１】
用語「アルカノイル」は、Ｃ（＝Ｏ）Ｒを言い、Ｒは、前述のようなアルキル基である。
用語「アシルオキシ」は、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）Ｒを言い、Ｒは、前述のようなアルキル基である。アシルオキシ基の例は、アセトキシ、プロパノイルオキシ、ブタノイルオキシおよびペンタノイルオキシを含むが、これらに限定されない。上記で定義したような任意のアルキル基は、アシルオキシ基を形成するために使用されることができる。
用語「アルコキシカルボニル」は、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲを言い、Ｒは、前述のようなアルキル基である。
用語「アミノ」は、−ＮＨ２を言い、用語「アルキルアミノ」は、−ＮＲ２を言い、少なくとも１つのＲはアルキルであり、第２のＲはアルキルまたは水素である。用語「アシルアミノ」は、ＲＣ（＝Ｏ）Ｎを言い、Ｒはアルキルまたはアリールである。
用語「イミノ」は、−Ｃ＝ＮＨを言う。
用語「ニトロ」は、−ＮＯ２を言う。
用語「トリフルオロメチル」は、−ＣＦ３を言う。
用語「トリフルオロメトキシ」は、−ＯＣＦ３を言う。
用語「シアノ」は、−ＣＮを言う。
用語「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」は、-ＯＨを言う。
用語「オキシ」は、−Ｏ−を言う。
用語「チオ」は、−Ｓ−を言う。
用語「チオキソ」は、（＝Ｓ）を言う。
用語「ケト」は、（＝Ｏ）を言う。
用語「炭水化物」は、動物の生細胞およびエネルギー源の必須構造的成分を言い、小分子および巨大分子物質を有する単糖を含み、それらが含有する単糖類基の数に従って分類される。用語は、変数の水素および酸素原子と一体になるが、後者２つはブドウ糖｛Ｃ６Ｈ１２Ｏ６｝としての水の形成に関しては常に比例している、６つ（または６の何らかの倍数）の炭素原子を含有する糖、澱粉および粘性物質を含む化合物の基のうちの１つを言う。用語は、比率２Ｈ：１Ｃ：１Ｏの炭素、酸素および水素を含む化合物または分子を言う。炭水化物は、ショ糖および果糖などの単糖またはキチンおよび澱粉などの複合体多糖ポリマーであることができる。
【０１６２】
炭水化物は、任意に、１つ以上のアルキル、アルケニルアルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよび／またはＣＯＯＲｘで置換することができ、ＲｘおよびＲｙはそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキルまたはヒドロキシである。
【０１６３】
糖は、単糖類、２糖、オリゴ糖または多糖であることができる。糖は、ベータ（β）またはアルファ（α）立体化学を有することができ、（Ｒ）または（Ｓ）相対配置を有することができ、（＋）または（−）異性体として存在することができ、およびＤまたはＬ配置内に存在することができる。例えば、糖は、β−Ｄグルコースであることができる。
【０１６４】
用語「糖類」は、任意の糖または他の炭水化物、特に単糖または炭水化物を言う。糖類は、生細胞の必須構造的成分であり、動物のエネルギー源である。用語は、小分子ならび
に巨大分子物質を有する単糖を含む。糖類は、それらが含有する単糖類基の数に従って分類される。
【０１６５】
用語「多糖」は、化学的に、つまりグリコシド結合を介してともに連結される糖分子を含有する炭水化物の種類を言う。用語は、単糖の鎖で構成されている炭水化物である炭水化物の任意のクラスを言う。ポリ糖類は、単糖類（単糖）の複数単位で構成されているポリマーである。
【０１６６】
用語「オリゴ糖類」は、２から１０の単糖類単位を含有する化合物を言う。
【０１６７】
適切な例示的な糖は、例えば、リボース、グルコース、果糖、マンノース、イドース、グロース、ガラクトース、アルトロース、アロース、キシロース、アラビノース、トレオース、グリセルアルデヒドおよびエリトロースを含む。
【０１６８】
本明細書において使用される「澱粉」は、α−（１，４）−Ｄ−グルコース繰り返しサブユニットおよびα−（１，６）−グルコシド結合から成る植物内に存在する複合体多糖を言う。
【０１６９】
本明細書において使用される「デキストリン」は、熱、酸、酸素またはそれらの組み合わせによる澱粉の部分的な分解によって生成される中間鎖長を有するグルコースのポリマーを言う。
【０１７０】
本明細書において使用される「マルトデキストリン」または「グルコースポリマー」は、主にα，−１，４結合によって連結されたＤ−グルコース単位から成り、２０未満のＤＥ（ブドウ糖等価物）を有する甘味のない栄養糖類ポリマーを言う。例えば、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（２１
Ｃ．Ｆ．Ｒ．項１８４．１４４４）を参照。マルトデキストリンは、部分的に加水分解された澱粉生成物である。澱粉加水分解生成物は、一般的に、乾燥重量ベースでブドウ糖として計算された糖減少のパーセンテージである、ブドウ糖等価物（ｇｌｕｃｏｓｅ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ：ＤＥ）として表される加水分解の度合いによって特徴付けられる。
【０１７１】
１つ以上の置換基を含有する上記基のいずれかに関して、かかる基は、立体的に非実用的なおよび／または合成的に不可能な任意の置換または置換パターンを含まないことを、当然理解されたい。さらに、本発明の化合物は、これらの化合物の置換により生じるすべての立体化学的異性体を含む。
【０１７２】
本明細書において記述される化合物内で選択された置換基は、再帰的な程度に存在する。これに関連して、「再帰的置換基」は、置換基がそれ自体の別の例を挙げてもよいことを意味する。かかる置換基の再帰的性質のため、理論上、大数が任意の請求項に存在する場合がある。医療化学の当業者は、かかる置換基の合計数は、対象とする化合物の所望された特性により制限されることを理解されたい。かかる特性は、一例としてであり限定されないが、分子量などの物理的特性、溶解度またはｌｏｇ  Ｐ、対象とする標的に対する活性などの適用性、および合成の容易さなどの実用的特性を含む。
【０１７３】
再帰的置換基は、本発明の対象とする側面である。医療および有機化学の当業者は、かかる置換基の多用途性を理解されたい。再帰的置換基が本発明の請求項に存在する範囲において、合計数は上記のように判断される。
【０１７４】
本明細書において記述される化合物は、親化合物、親化合物のプロドラッグ、または親化合物の活性代謝物であることができる。
【０１７５】
「プロドラッグ」は、かかるプロドラッグが対象哺乳類に投与された場合、活性親薬物もしくは体内の本発明の他の式または化合物を遊離する共有結合された任意の物質を含むことが意図される。本発明の化合物のプロドラッグは、修飾が、通常のいずれかの体内操作において親化合物に開裂するように、化合物内に存在する機能的基を修飾することによって調製される。プロドラッグは、本発明の化合物を含み、カルボニル、カルボン酸、ヒドロキシまたはアミノ基は、プロドラッグが哺乳類対象に投与された場合に遊離カルボニル、カルボン酸、ヒドロキシまたはアミノ基を形成するように開裂させる、任意の基に結合する。プロドラッグの例は、本発明の化合物におけるアルコールおよびアミン機能的基のアセテート、ギ酸および安息香酸誘導体等を含むが、これらに限定されない。
【０１７６】
「代謝物」は、活性親薬物もしくは本発明の他の式または化合物が、哺乳類対象に投与された場合に、かかる活性親薬物もしくは体内の本発明の他の式または化合物と、生細胞が相互作用する生化学的工程から生じる任意の物質を言う。代謝物は、生成物または任意の代謝経路からの中間体を含む。
【０１７７】
「代謝経路」は、１つの化合物を別の化合物へ形質転換し、中間体および細胞機能へのエネルギーを提供する酵素媒介の反応物の配列を言う。代謝経路は、線状または環状であることができる。明白に、本発明の多数の修正および変形は、上記の教示を考慮して可能である。したがって、付属の特許請求の範囲内で、本発明は、本明細書において特に記述されない限り実施してもよいことを理解されたい。
【０１７８】
Ｂ．例示的なＮｏｘ阻害剤
本発明は、例えば、そのサブユニットを抑制することによってＮｏｘを直接的に抑制する、またはＲａｃもしくは別のＧＴＰアーゼのＳＯＤへの結合を抑制することによってＮｏｘを間接的に抑制する１つ以上の薬剤を採用することによって、ＲＯＳを抑制する方法を提供する。
【０１７９】
式（Ｉ）の化合物は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼの適切な強力および選択可能な阻害剤であり、
【０１８０】
【化２０】
2009521928.tif 000022
【０１８１】
式中、
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙまたはＣＯＯＲｘであって、ＲｘおよびＲｙはそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキルまたはヒドロキシであり、
Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙまたはＣＯＯＲｘであって、ＲｘおよびＲｙはそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキルまたはヒドロキシであり、
Ｒ３は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、Ｏ−Ｒｚ、ＮＲｘＲｙまたはＣＯＯＲｘであって、ＲｘおよびＲｙはそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキルまたはヒドロキシであり、Ｒｚは、炭水化物の１価ラジカルである。
【０１８２】
Ｒ４は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙまたはＣＯＯＲｘであって、ＲｘおよびＲｙはそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキルまたはヒドロキシであり、
Ｒ５は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙまたはＣＯＯＲｘであって、ＲｘおよびＲｙはそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキルまたはヒドロキシであり、
Ｒ６は、Ｈ、アルキル、アルコキシ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、またはＮＲｘＲｙであって、ＲｘおよびＲｙはそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキルまたはヒドロキシであり、
またはその薬学的に許容可能な塩である。
【０１８３】
式（Ｉａ）の化合物は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼの適切な強力および選択可能な阻害剤であり、
【０１８４】
【化２１】
2009521928.tif 000023
【０１８５】
式中、
Ｒ１は、Ｈであり、
Ｒ２は、アルコキシであり、
Ｒ３は、ヒドロキシル、アルコキシまたはＯ−Ｒｚであって、Ｒｚは、炭水化物の１価ラジカルであり、
Ｒ４は、Ｈ、アルコキシまたはアルキルであり、
Ｒ５は、Ｈまたはヒドロキシルであり、
Ｒ６は、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アミノ、アルキルアミノまたはＮＲｘＲｙ、であって、ＲｘおよびＲｙはそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキルまたはヒドロキシであり、
または、その薬学的に許容可能な塩である。
【０１８６】
式（Ｉｂ）の化合物は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼの適切な強力および選択可能な阻害剤であり、
【０１８７】
【化２２】
2009521928.tif 000024
【０１８８】
式中、
Ｒ１は、Ｈであり、
Ｒ２は、アルコキシであり、
Ｒ３は、ヒドロキシル、アクロキシＯ−Ｒｚであって、Ｒｚは、炭水化物の１価ラジカルであり、
Ｒ４は、Ｈ、アルキルまたはアルコキシであり、
Ｒ５は、Ｈまたはヒドロキシルであり、
Ｒ６は、アルキルであり、
または、その薬学的に許容可能な塩である。
【０１８９】
特定範囲および値：
式（Ｉ）の化合物に関し、Ｒ１の特定値はＨ、Ｒ２の特定値はアルコキシ、Ｒ２の別の
特定値はメトキシ、Ｒ３の特定値はヒドロキシル、Ｒ３の別の特定値はヒドロキシルと置換されたアルコキシ、Ｒ３の別の特定値は２−ヒドロキシル−エトキシ、Ｒ３の別の特定値はヒドロキシル、Ｒ４の特定値はＨ、Ｒ４の別の特定値はアルコキシ、Ｒ４の別の特定値はメトキシ、Ｒ４の別の特定値はアルキル、Ｒ４の別の特定値はメチル、Ｒ５の特定値はＨ、Ｒ５の別の特定値はヒドロキシル、Ｒ６の特定値はアルキル、およびＲ６の別の特定値はメチルである。
【０１９０】
式（Ｉａ）の化合物に関して、Ｒ２の特定値はアルコキシである。Ｒ２の別の特定値はメトキシである。Ｒ６の特定値はアルキルである。Ｒ６の別の特定値はメチルである。
【０１９１】
式（Ｉｂ）の化合物に関して、Ｒ２の特定値はアルコキシである。Ｒ２の別の特定値はメトキシである。Ｒ６の特定値はメチルである。
【０１９２】
式（Ｉ）、（Ｉａ）および（Ｉｂ）の特定の化合物は、アポシニンである。細胞透過性フェノールであるアポシニン（４−ヒドロキシ−３−メトキシアセトフェノン、アセトバニロン、式ＩＩの化合物）は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼの適切な強力および選択可能な阻害剤である。
【０１９３】
【化２３】
2009521928.tif 000025
【０１９４】
アポシニンは、乾燥根茎およびピクロルヒザ種の根において見られ、例えば、Ｐ．ｋｕｒｒｏｏａおよびＰ．ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉｉｆｌｏｒａであり、後者は、Ｎｅｏｐｉｃｒｏｒｈｉｚａ  ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉｉｆｌｏｒａとしても知られる。また、アポシニンは、例えば、カナダの麻の根茎（Ａｐｏｃｙｍｕｍ  ｃａｎｎａｂｉｎｕｍ）または他のＡｐｏｃｙｎｕｍ種（例えば、Ａ．ａｎｄｒｏｓａｅｍｉｆｏｌｉｕｍ）から、または抽出物がの多量の心臓性配糖体を含有しない場合においてＩｒｉｓ種の根茎からなど、他の源から得てもよい。ピクロルヒザｋｕｒｒｏａ  Ｒｏｙｌｅ  ｅｘ  Ｂｅｎｔｈは、多年生木質薬草であり、その粗抽出物はアポシニンを含む。
【０１９５】
ピクロルヒザ抽出物は、ピクロルヒザ種の根茎を抽出し、抽出物をカラムクロマトグラフィーに晒すことによって得ることが出来る。あるいは、多量のフェノール化合物を有する抽出物は、配糖体をそれらの各アグリコンに変換するように、植物材料をミネラルで事前処置することによって得ることができる。所望に応じて、材料は、その後、ワックスおよび他の高度に脂溶性物質を除去するために脱脂されてもよい。材料は、例えば、エチルアセテートおよび／またはエタノールで抽出される。有機溶媒を除去し、水溶液を得る。抽出物のｐＨは、フェノール化合物を脱プトロン化し、水相内でそれらを保持するために、例えば水酸化ナトリウムを用いて１０まで増加させる。その後、例えばジエチルエーテルを用いて水溶液を洗浄し、ククルビタシンを除去する。その後水相を、フェノール化合物を中和するために再酸性化し、例えばジエチルエーテルで再び抽出する。有機相を採取し、溶媒を除去する。
【０１９６】
式（Ｉ）のさらなる適切な化合物は、例えば、以下の式の化合物を含む。
【０１９７】
【化２４】
2009521928.tif 000026
【０１９８】
ＲＯＳを抑制する治療的または予防的方法において有用な他の化合物は、抗酸化物質、概して、アゼルニジピンまたは他のカルシウム拮抗薬、オルメサルタンまたは他のＡＴ１受容体遮断薬、コルチコステロイドまたはグルココルチコイド、例えば、デキサメタゾンまたはヒドロコルチゾン、β−アドレナリン受容体刺激薬、例えば、イソプロテレノール、リポコルチン、ピリジン、ポリフェノール、例えば、バニリン、４−ニトログアヤコール、葉酸およびその代謝拮抗物質、ならびにイミダゾール、また、ＲＮＡｉ（実施例２を参照、またはその組み合わせ）および４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオライドを含むが、これらに限定されない。
【０１９９】
一実施形態において、薬剤は、スタチン、ＡＣＥ阻害剤、エイコサノイド、ホスホジエステラーゼ阻害剤、食細胞フィラム属、抗菌ペプチド、例えばＰＲ−３９、または、参照によりその開示全体が本願明細書に組み込まれる、米国特許第６，７１３，６０５号、第６，１８４，２０３号、第６，０９０，８５１号、第５，９９０，１３７号、第５，９３９，４６０号、第５，９０２，８３１号、第５，７６３，４９６号、第５，７２６，５５１号、および第５，２４４，９１６号、米国公開出願第２００６０１５４８５６号、第２００６０１３５６００号、第２００４００４３９３４号、および第２００４０００１８１８号、ならびにＣｉｆｕｅｎｔｅｓらの（Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．＆  Ｈｙｐｅｒｔｅｎ．，１５：１７９（２００６））に開示されるもののうちの１つである。
【０２００】
Ｃ．製剤および投与量
本発明の薬剤は、薬学的組成物として製剤することができ、静脈、局所または皮下経路によって、選択された投与経路、つまり、経口または非経口に適応する種々の形態において、ヒト患者などの哺乳類宿主に投与できる。
【０２０１】
薬剤は、不活性希釈剤または吸収可能な可食キャリアなどの薬学的に許容可能な賦形剤を併用して、全身的に投与、例えば経口投与されてもよい。これらは、硬または軟シェルゼラチンカプセル内で封入されてもよく、錠剤内に圧縮されてもよく、患者の食事の食物に直接取り込んでもよい。経口投与では、活性薬剤は、１つ以上の賦形剤と組み合わせてもよく、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハ等の形態で使用してもよい。かかる組成物および調製は、少なくとも０．１％の活性薬剤を含有すべきである。組成物および調製のパーセンテージは、当然異なってもよく、便宜的に、一定の単位剤形の重量の約２から約６０％であってもよい。かかる有用な組成物における活性薬剤の量は、有効な投与量レベルが得られる量である。
【０２０２】
また、錠剤、トローチ、丸剤、カプセル剤等は、ゴムトラガカント、アカシア、コーンスターチまたはゼラチンなどの結合剤、第２リン酸カルシウムなどの賦形剤、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸等などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの滑剤、およびショ糖、果糖、乳糖またはアスパルテームなどの甘味剤を含有してもよく、またはペパーミント、冬緑油、またはサクランボ香味などの香味料が加えられてもよい。単位剤形がカプセル剤の場合、上記種類の材料に加えて、植物油またはポリエチレングリコールなどの液体キャリアを含有してもよい。種々の他の材料は、コーティングとして、あるいは固体の単位剤形の物理的形態を修正するために存在してもよい。例えば、錠剤、丸剤またはカプセル剤は、ゼラチン、ワックス、セラックまたは糖等で皮膜されてもよい。シロップまたはエリキシル剤は、活性化合物、甘味剤としてのショ糖または果糖、保存剤としてのメチルおよびプロピルパラベン、色素およびサクランボまたはオレンジ香味などの香味料を含有してもよい。当然ながら、任意の単位剤形の調製に使用される任意の材料は、採用される量において薬学的に許容可能であり、実質的に無毒性であるべきである。さらに、活性化合物は、徐放性調製および装置に取り込まれてもよい。
【０２０３】
また、活性薬剤は、注入または注射により静脈内または腹腔内投与されてもよい。活性薬剤の溶液またはその塩は、任意に無毒性の界面活性物質と混合して、水中で調整されることができる。また、分散は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチンおよびその混合物内で、ならびに油内で調製されることができる。保存および使用の通常の条件下において、これらの調製は、微生物の増殖を防ぐための保存剤を含有する。
【０２０４】
注射または注入に適した薬学的剤形は、任意にリポソーム内に被包される、滅菌注射剤または注入可能な溶液または分散の即時調製に適した活性成分を含む、滅菌水溶液または分散もしくは滅菌粉末を含むことができる。すべての場合において、最終的な剤形は、製造および保存の条件下において、滅菌、液体および安定であるべきである。液体キャリアまたは賦形剤は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、植物油、無毒性のグリセリルエステルおよび適切なその混合物を含む溶媒または液体分散媒体であることができる。適した流動性は、例えばリポソームの製剤によって、分散の場合に必要な粒径の維持によって、または界面活性物質の使用によって維持できる。微生物作用の防止は、種々の抗細菌性および抗真菌性薬剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によってもたらされ得る。大抵の場合、例えば糖、緩衝液または塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが好ましい。注入可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤の組成物、例えば、アルミニウム、モノステアレートおよびゼラチンの使用によってもたらされ得る。
【０２０５】
滅菌注射剤は、上記に挙げた種々の他の成分を有する適切な溶媒内に適切な量で活性薬剤を取り込むことによって、必要な場合は、その後のろ過滅菌により調製される。滅菌注射剤を調製するための滅菌粉末の場合において、好適な調製方法は、活性成分の粉末に加え、以前に滅菌ろ過された溶液内に存在する任意の付加的な所望成分を産出する、真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【０２０６】
局所性投与では、薬剤は、その物質だけを、つまり液体であるときに加えてもよい。しかし、固体または液体であり得る皮膚科学的に許容可能なキャリアを併用して、それらを組成物または製剤として肌に投与することが概して望ましい。
【０２０７】
有用な固体キャリアは、滑石、粘土、微結晶性セルロース、シリカ、アルミナ等などの微粉化した固体を含む。有用な液体キャリアは、任意に、無毒性の界面活性物質を活用して、本発明の化合物が有効なレベルで溶解または分散される、水、アルコールもしくはグリコールまたは水−アルコール／グリコール混合物を含む。芳香および付加的な抗菌薬剤などのアジュバントは、一定の使用の特性を最適化するために加えることができる。結果として得られる液体組成物は、包帯または他の包滞剤を含浸させるために使用される吸収性パッドから適用、またはポンプ型またはエアゾール噴霧器を使用して患部上に噴霧することができる。
【０２０８】
また、合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩およびエステル、脂肪アルコール、修飾セルロースまたは修飾ミネラル材料などの増粘剤は、ユーザの肌に直接塗布するように、塗布可能な糊状剤、ゲル、軟膏剤、セッケン等を形成するために液体キャリアとともに用いることができる。
【０２０９】
薬剤の有用な投与量は、動物モデルにおける体外活性および体内活性を比較することによって判断できる。マウスおよび他の動物からヒトまでの、有効な投与量の外挿方法は、当業者には既知であり、例えば米国特許第４，９３８，９４９号を参照されたい。
【０２１０】
概して、水薬などの液体組成物における薬剤の濃度は、約０．１−２５ｗｔ−％から、好ましくは約０．５−１０ｗｔ−％からである。ゲルまたは粉末などの半固体または固体組成物における濃度は、約０．１−５ｗｔ−％であり、好ましくは約０．５−２．５ｗｔ−％である。
【０２１１】
単独使用または他の薬剤との併用に必要とされる薬剤、または活性塩もしくはその誘導体の量は、選択した特定の塩によってのみならず、投与経路、治療される状態の性質および患者の年齢および状態によって様々であり、最終的には付き添いの医師または臨床医の判断による。
【０２１２】
薬剤は、例えば、５から１０００ｍｇ、便宜的には１０から７５０ｍｇ、最も便宜的には５０から５００ｍｇの単位剤形当りの活性成分を含有する、単位剤形で便宜的に投与されてもよい。
【０２１３】
しかし、概して、適切な用量は、約０．５から約１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり、例えば、１日当り受取人の体重のキログラム当り３から約５０ｍｇなどの、１日当り体重の約１０から約７５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは６から９０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲、最も好ましくは１５から６０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。アポシニン含有組成物は、日常摂取ベースで、少なくとも５０μｇ、好ましくは少なくとも１００μｇ、最大１０００ｍｇのアポシニンを含有してもよい。日常摂取の例は、１から１００ｍｇのアポシニン、好ましくは少なくとも１５ｍｇ／日の投与量である。例えば、アポシニンは、植物の根のアルコール抽
出物の毎日の筋肉注射によって（４０ｍｇ／ｋｇ）、または合計２ｍｇの８用量で投与されるエアロゾール送達によって、１日３回３７５ｍｇの投与量で根粉末として経口投与されてもよい。例示的な製剤および投与量は、３００から５００ｍｇの根粉末ｂ．ｉ．ｄ．／ｔ．ｉ．ｄを含む。さらに、アポシニンの類似体は、アポシニンの代わりに、またはアポシニンに加えて使用されてもよい。具体的には、かかる類似体は、特に２−ヒドロキシエチル、２，３−ジヒドロキシプロピルまたは糖部分などのヒドロキシル化アルキル基を用いて、４−ヒドロキシル基がエテール化されたものである。糖部分がβ−Ｄ−グルコースである後者の類似体は、一般的にアンドロシンとして既知である。これは、アポシニンが新鮮な植物に存在する通常の形態である。
【０２１４】
活性成分は、約０．５から約７５μＭ、好ましくは約１から５０μＭ、最も好ましくは約２から約３０μＭの活性化合物のピーク血漿濃度を実現するために投与されてもよい。これは、活性成分の０．０５から５％溶液の静脈注射によって、任意に生理食塩水内で、または約１〜１００ｍｇの活性成分を含有する急速投与としての経口投与によって実現されてもよい。所望の血液レベルは、約０．０１〜５．０ｍｇ／ｋｇ／時間を提供するための継続注入によって、または活性成分の約０．４〜１５ｍｇ／ｋｇを含有する間欠的注入によって維持されてもよい。
【０２１５】
所望の用量は、単回投与で、または例えば、１日当り２、３、４回以上の副投与として適切な間隔で投与される分割量として、便宜的に示されてもよい。副投与自体は、例えば、吸入器からの複数吸入または複数回の点眼の適用によってなど、離散的に大まかに間隔を空けた投与にさらに分割されてもよい。
【０２１６】
本発明を以下の限定されない実施例によってさらに説明する。
【実施例１】
【０２１７】
ＳＯＤ１は、Ｒａｃ１媒介のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性化のための酸化還元センサである
材料および方法
材料。シトクロムＣ、ホルボールミリスチン酸アセテート（ｐｈｏｒｂｏｌ  ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  ａｃｅｔａｔｅ：ＰＭＡ）、ＧＴＰ、ＧＤＰ、キサンチン、キサンチンオキシダーゼ、イミダゾールセルロースＰＥＩ充填材ＴＬＣプレート、ルシゲニン、β−ＮＡＤＰＨおよび大腸菌スーパーオキシドジスムターゼを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。ダルベッコ修飾イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕ：ＤＭＥＭ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ：Ｐ／Ｓ）、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ、ウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）、アンフォテリシンＢおよびコラゲナーゼを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入した。放射性ヌクレオチド、液体シンチレーション流体、Ｄｅｘｔｒａｎ５００およびニトロセルロースタンパク質転写膜を、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から購入した。プロテーゼ阻害剤カクテル（Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ：ＰＩＣ）、ＥＤＴＡを含まないＰＩＣ、ＧＴＰγＳおよびＧＤＰβＳを、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から購入した。ヒスチジンタグ付きＲａｃ１（Ｈｉｓ−Ｒａｃ１）、Ｈｉｓ−Ｃｄｃ４２、グルタチオン  トランスフェラーゼタグ付き（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｔａｇｇｅｄ：ＧＳＴ）ｐ５０−Ｒｈｏ−ＧＡＰ触媒ドメイン（ｐ２９−ＧＡＰ）、ＧＳＴタグ付き野生型Ｒａｃ１、Ｖ１２Ｒａｃ１およびＮ１７Ｒａｃ１変異体融合タンパク質を、Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ  Ｉｎｃ．（Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ）から購入した。ウシ銅／亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）を、Ｏｘｉ
ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）から購入した。ダイナビーズタロン、ダイナビーズタンパク質−Ａおよびタンパク質−Ｇを、Ｄｙｎａｌ  ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｌａｋｅ  Ｓｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ）から購入した。イオジキサノールおよびＮｙｃｏｐｒｅｐ１．０７７を、Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐ．Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）から購入した。
【０２１８】
免疫沈降（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ：ＩＰ）およびウエスタンブロット法。ＳＯＤ１ヌルマウス（Ｓｏｄ１ｔｍ１Ｌｅｂ）を、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｍａｔｚｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８））から購入した。すべての動物実験は、実験動物の注意および使用のＮＩＨガイドラインにおいて概説される原則および手順に従って行われた。野生型およびＳＯＤ１ノックアウト同腹子からの組織溶解物は、氷冷ＰＢＳにおいて均質化により生成し、その後、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１００ｍＭ  ＮａＦ、８０ｍＭ  β−グリセロリン酸、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤を含有する同量の２Ｘ溶解緩衝液を追加した。タンパク質濃度を、ブラッドフォード分析で測定した。５００μｌの溶解緩衝液において、６００μｇの総タンパク質を４μｇの１次抗Ｒａｃ１抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）とともにインキュベートすることによって、Ｒａｃ１タンパク質のＩＰを行った。ＩＰ反応物を４℃で２時間回転させた。（溶解緩衝液で２回洗浄）したタンパク質Ａダイナビーズを加え、４℃で一晩回転させ、その後、沈降した複合体を磁気除去した。ビーズを溶解緩衝液で４回洗浄した。その後、ローディング緩衝液を減少させるＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、沈殿物を再懸濁し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離前に５分間９８℃でインキュベートした。分離ゲル内の１０％（ｗ／ｖ）アクリルアミドおよび積層ゲル内の４％アクリルアミドを含有する０．７５ｍｍゲルスラブでＭｉｎｉ  Ｐｒｏｔｅａｎ  ＩＩ  Ｂｉｏ−Ｒａｄ単位を使用して、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−グリシン緩衝液（ｐＨ  ８．３）内で電気泳動を行った。転写タンパク質を有するニトロセルロース膜を、４％ｗ／ｖ無脂肪粉乳およびＰＢＳ内の０．３％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有する遮断緩衝液内で４℃で一晩遮断し、その後、ＳＯＤ１（Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ  Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）およびＲａｃ１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）に対する１次抗体とともに、その後、赤外色素共役第２抗体とともにインキュベートした。タンパク質バンドを、Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外イメージングシステム（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｎｃｏｌｎ，Ｎｅｂｒａｓｋａ）で検出した。
【０２１９】
ＧＳＴおよびＨｉｓタグ付きタンパク質でのプルダウンアッセイ。スチジンタグ付きタンパク質へのダイナビーズタロンを、１００ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１００ｎＭ  ＣａＣｌ２を含有するリン酸カリウム緩衝液（ＰＰＨＢ）で洗浄した。２５ピコモルのＨｉｓ−Ｒａｃ１またはＨｉｓ−Ｃｄｃ４２を、穏やかな断続的撹拌で、３０分間室温でＰＰＨＢ中のビーズとともにインキュベートした。ＧＴＰアーゼを、ＧＴＰγＳまたはＧＤＰβＳのいずれか一方を直接使用または負荷して洗浄した。その後２５０ピコモルのＳＯＤ１を、ＰＰＨＢ中の各チューブに加えた。試料を、穏やかな断続的撹拌で、３０分間室温（ＲＴ）でインキュベートした。その後、非結合のＳＯＤ１を除去するためにビーズをＰＰＨＢで３回洗浄した。４回目の洗浄は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ６．８中で行った。タンパク質を２０μｌの１２５ｍＭイミダゾールを使用して溶出し、その後試料を、ローディング緩衝液を減少させるＳＤＳ−ＰＡＧＥと混合して、ウエスタンブロット法のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。ＧＳＴ−Ｒａｃ１、ＧＳＴ−Ｖ１２Ｒａｃ１およびＧＳＴ−Ｎ１７Ｒａｃ１プルダウンアッセイでは、抗ＧＳＴ抗体と共役したダイナビーズタンパク質Ｇ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を用いて、同様の
工程を使用した。
【０２２０】
Ｒａｃ１活性化アッセイ。Ｒａｃ１活性化アッセイを、Ｓａｎｌｉｏｇｌｕら（２００１）に記述される変更を加えて前述の手順を使用して行った。簡単に言えば、このアッセイは、ＧＴＰＲａｃ１（ＰＢＤがＰａｋ１のｐ２１結合ドメインをコード化する）を特異的に結合するために、ＰＡＫのＧＳＴ−ＰＢＤ結合ドメイン（細胞骨格）を活用する。脳組織溶解物を、野生型およびＳＯＤヌル同腹子マウスから生成し、ブラッドフォード分析を使用してタンパク質濃度のために規準化した。抗ＧＳＴ抗体と共役したダイナビーズタンパク質Ｇを使用して、ＧＴＰ結合Ｒａｃ１を、２ｍｇの脳組織溶解物からＧＳＴ−ＰＢＤで沈殿させた。免疫沈降したペレットを、Ｒａｃ１およびＧＳＴへのウエスタンブロット法で評価した。Ｒａｃ１免疫反応性の強度は、試料のＧＴＰ結合Ｒａｃ１レベルと相関する。赤外色素共役第２抗体およびＯｄｙｓｓｅｙ赤外イメージングシステム（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、Ｎｅｂｒａｓｋａ）を使用して、ＧＴＰ−Ｒａｃへのウエスタンブロットの定量化を１３ヘテロ接合体および７ＳＯＤヌル動物に行った。
【０２２１】
グアニンヌクレオチド交換（Ｇｕａｎｉｎｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ：ＧＥＦ）アッセイ。ＧＥＦ活性は、精製されたＨｉｓタグ付きＲａｃ１への３５Ｓ−ＧＴＰγＳの取り込みを測定することによって、Ｍａｎｓａｒら（１９９８）において前述したように分析した。簡単に言えば、７５０ピコモルの精製されたウシＳＯＤ１の有無にかかわらず、１μＣｉの３５Ｓ−ＧＴＰγＳを、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ジチオスレイトール、５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有するＧＥＦ緩衝液中の２５０ピコモルのＨｉｓタグ付きＲａｃ１とともに、穏やかな撹拌で３０分間３０℃でインキュベートした。試料を、ニトロセルロース膜でろ過し、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、および３０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する洗浄緩衝液で４回洗浄した。Ｒａｃ１上に取り込まれた３５Ｓ−ＧＴＰγＳを、液体シンチレーション分光を用いて測定した。
【０２２２】
Ｒａｃ１  ＧＴＰアーゼアッセイ。Ｒａｃ１  ＧＴＰアーゼアッセイを、変更（Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）を加えて前述のように行った。２５ピコモルのＨｉｓ−Ｒａｃ１またはＨｉｓ−Ｃｄｃ４２を、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．６、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＧＴＰ結合緩衝液中の２５ピコモルのＧＴＰおよび２．５ピコモルのＰ３２標識付きγ−ＧＴＰとともに、室温で１０分間インキュベートし、その後氷水中に置いた。１μｌの一定分量を、このＧＴＰアーゼ反応物の時間０として薄層クロマトグラフィー（ｔｈｉｎ−ｌａｙｅｒ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＴＬＣ）のために摂取した。３つのタンパク質を、種々の組み合わせで、ウシＳＯＤ１、大腸菌ＳＯＤ１および／またはｐ２９−ＧＡＰを含有する各反応物に加えた。ｐ２９−ＧＡＰに対するＲａｃ１またはＣｄｃ４２の比率は、１：１であった。ＳＯＤ１に対するＲａｃ１またはＣｄｃ４２の比率は、１：１０であった。ＧＴＰアーゼ反応を開始するため、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．６、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する等容量の２Ｘ  ＧＴＰアーゼ緩衝液を、各条件に１５℃で加えた。指示された場合、１００ｍＵのキサンチンオキシダーゼを、反応混合物内で１００μＭの最終キサンチン濃度とともにインキュベートした。１μｌの一定分量を、異なる時点で各試料からＴＬＣプレート上に滴下した。ＴＬＣを、０．８Ｍ  ＬｉＣｌ泳動用緩衝液を用いて、１Ｍ  酢酸において室温で９０分間行った。ＧＴＰ加水分解を定量化するため、遊離リン酸塩（Ｐｉ）バンドを、対応するＧＴＰバンドに沿って取り除いた。それぞれを液体シンチレーション流体内に入れ、液体シンチレーション分光で数えた。加水分解されたＧＴＰのパーセンテージを方程式Ｐｉ／（Ｐｉ＋ＧＴＰ）ｘ１００で計算した。
【０２２３】
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＧＳＴ−Ｒａｃ１  ａｎｄ  ＧＳＴ−ＳＯＤ１融合タンパク質の構成。ＧＳＴ−Ｒａｃ１および／またはＧＳＴ−ＳＯＤ１の野生型、欠失変異体および／または点突然変異体に対する細菌発現コンストラクトを、ｐＧｅｘ−２Ｔベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）へのＰＣＲ媒介クローニングによって生成した。すべての細菌融合コンストラクトを、完全配列決定により確認した。ＡＬＳ変異Ｌ８Ｑ（Ｂｅｒｅｚｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）およびＧ１０Ｖ（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）を、Ｇｅｎｅ  Ｅｄｉｔｏｒ体外部位特異的変異誘発システム（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用してＧＳＴ−ＳＯＤ１内に導入した。Ｌ８Ｑ変異体の生成に使用されたプライマー配列は、５’−ＡＡＧＧＣＣＧＴＧＴＧＣＧＴＧ  ＣＡＧＡＡＧＧＧＣＧＡＣＧＧＣＣＣＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）であった。Ｇ１０Ｖ変異体の生成に使用されたプライマー配列は、５’−ＡＡＧＧＣＣＧＴＧＴＧＣＧＴＧＣＴＧＡＡＧＧＴＴＧＡＣＧＧＣＣＣＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）であった。
【０２２４】
細菌ＧＳＴタグ付きタンパク質の発現および精製。ＧＳＴタグ付き発現コンストラクトを、アンピシリン選択を使用して大腸菌に形質転換した。野生型および変異体コンストラクトを宿す細菌集落を、１リットルフラスコ内の１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢ培地内で、３７℃でＡ６００＝０．６の細胞密度まで成長させた。その後、ＧＳＴタグ付きタンパク質の発現を誘発させるため、イソプロピル−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ：ＩＰＴＧ）を１ｍＭまで加え、培養物を３７℃で６時間成長させた。細菌を４℃で１５分間の４０００ｘｇスピンにより採集し、氷上のＰＢＳにおいて再懸濁した。その後細菌を、Ｖｉｒｓｏｎｉｃ細胞破壊器（ＶｉｒＴｉｓ  Ｇａｒｄｉｎｅｒ，ＮＹ）を使用して、５回の３０秒ソニケーターパルスにより氷上で溶解した。その後、細菌溶解物を、ペレット細片までに３０，０００ｘｇで３０分間遠心分離した。融合タンパク質を、製造業者の仕様に従いグルタチオン−セファロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、細胞抽出物から精製し、ＧＳＴ−融合タンパク質を１０ｍＭ  グルタチオン、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５および１２０ｍＭ  ＮａＣｌで溶出した。融合タンパク質の純度をクーマシィー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価し、タンパク質濃度を、ブラッドフォード方法を使用して規準化した。Ｒａｃ１のＮ−末端の８８または１１６アミノ酸を含有するＧＳＴ−Ｒａｃ１融合タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中のその予測分子量よりも一貫して高速に移動し、これらの欠失変異体内に含有されるドメインの変化した折り畳み特性によるものである可能性が高いことに留意すべきである。ＧＳＴタグ付きＳＯＤ１タンパク質は、トロンビン開裂捕獲キット（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｅｎｃｅｓ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用してＧＳＴから開裂した。開裂後、ＦＰＬＣグルタチオン−セファロースカラムを使用して、ＳＯＤ１タンパク質を、開裂したＧＳＴタグから分離した。
【０２２５】
ＳＯＤ１の脱メタル化。精製されたウシＳＯＤ１の脱メタル化を、変更（ＭｃＣｏｒｄ
ｅｔ  ａｌ．，１９６９）を加えて上述のように行った。銅および亜鉛は、精製されたウシＳＯＤ１をｐＨ３．０のＰＢＳ、２ｍＭのＥＤＴＡに晒し、４℃で６０分間攪拌することによって除去した。その後タンパク質を、５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．４に対して一晩透析した。Ｚｎの４０倍モル過剰、それに続くＣｕの４倍モル過剰が存在する場合、脱メタル化されたウシＳＯＤ１の分画を、１００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．５に対する透析によって再メタル化した。その後、非結合金属を除去するため、ＳＯＤタンパク質をＰＢＳｐＨ７．４に対して数回透析した。未変性の、脱メタル化および再メタル化されたウシＳＯＤ１のＣｕ／Ｚｎ含量を、Ｇｈｅｚｚｏ−Ｓｃｈｏｎｅｉｃｈら（２００１）において記述するように判断した。簡単に言えば、１０μｇ  ＳＯＤ１を、１００ｍＭホウ酸ナトリウム、ｐＨ７．８、２％ＳＤＳおよび１００μＭ  ＰＡＲを含有する１ｍｌアッセイ緩衝液と混合した。反応混合物を１００℃で２０分間加熱した。０．８ｍＭ  ＮＴ
ＡおよびＥＤＴＡをそれぞれ添加した後、ＺｎおよびＣｕレベルを、ＳｈｉｍａｄｚｕＵＶ−１６０分光光度計で測定した５００ｎｍ読みの減少として計算した。ＳＯＤ１におけるＺｎまたはＣｕ含量は、ＳＯＤ１へのＺｎまたはＣｕのモル比で報告される。ＳＯＤ１酵素活性ゲルを、Ｚｗａｃｋａら（１９９８）において記述したように行った。簡単に言えば、１０μｇの未変性の、脱メタル化または再メタル化されたＳＯＤ１を、未変性の１２％ポリアクリルアミドゲル上で作用させた。ＳＯＤ１活性を、ニトロブルーテトラゾリウム還元を使用して判断した。酵素活性を、黒色沈殿物の背景におけるクリアランスゾーンとして定義した。
【０２２６】
細胞下分画。浮遊密度遠心分離法を、Ｎｏｘ２活性を含有するエンドソームの細胞成分分別および単離に使用した。細胞を、氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、同一の緩衝液を使用して１．５ｍｌミクロチューブ内に擦り入れた。０．２５Ｍのショ糖、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ
ｐＨ７．４、１ｍＭのＥＤＴＡおよびＥＤＴＡを含まないプロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する細胞を均質化緩衝液（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ：ＨＭＢ）内でペレットして再懸濁した。細胞を、細胞破壊高圧チャンバ（Ｐａｒｒ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍｏｌｉｎｅ、ＩＬ）内で窒素キャビテーショを使用して均質化した。圧力を５分間６５０−ｐｓｉまで上昇させて突然解放させた。未破壊細胞、核および重ミトコンドリアをペレットするために、ホモジネートを３０００ｘｇで１５分間遠心分離した。重ミトコンドリア浮遊物（ｈｅａｖｙ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ：ＨＭＳ）を、前述の方法を使用して変更（Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）を加え、１２．５ｍｌＳＷ４１Ｔｉ超遠心分離チューブにおけるイオジキサノール不連続勾配へ底面負荷した。不連続勾配は、ＥＤＴＡを有さない１．２５ｍｌ  ＨＭＢと、続いて１．０ｍｌ  ２．５％、１．０ｍｌ  ５％、１．５ｍｌ  ９％、１．５ｍｌ  １４％、２．５ｍｌ  １９％、１．５ｍｌ  ２６％のイオジキサノールステップの連続な底面負荷と、最後に２ｍｌ  ３２％におけるＨＭＳとで構成される。イオジキサノール濃度は、ＥＤＴＡを有さないＨＭＢで希釈された５０％イオジキサノール希釈標準溶液（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＷＳ）を使用して新たに調製した。０．２５Ｍショ糖および１２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４を含有する１分割緩衝液を、５分割のイオジキサノール６０％原液に加えて、ＷＳを調製した。ＳＷ４１Ｔｉスウィングローターを使用して、勾配を１００，０００ｘｇで一晩４℃で遠心分離した。分画を、氷上の５００μｌ画分における分画コレクタ（Ｌａｂｃｏｎｃｏ，Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ，ＭＯ）を使用して、チューブ上部から収集した。密度勾配は、過去の研究（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４、Ｂｉｌｌｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、Ｐｌｏｒｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）に基づいて以下の区画を最適に分離するように設計された。画分番号１〜５原形質膜（密度１．０３〜１．０５ｇ／ｍｌ）、画分番号７〜１３エンドソーム区画（密度１．０５５〜１．１１ｇ／ｍｌ）、画分番号８〜１０ゴルジ体（密度１．０６〜１．０９ｇ／ｍｌ）、画分番号１０〜１３軽小胞体（密度１．０９〜１．１１ｇ／ｍｌ）、画分番号１３〜１８リソゾーム（密度１．１１〜１．１３ｇ／ｍｌ）、画分番号１８〜２１軽ミトコンドリア（密度１．１３〜１．１５ｇ／ｍｌ）、画分番号１９〜２０重小胞体（密度１．１４５ｇ／ｍｌ）、画分番号２１〜２４ペルオキシソーム（密度１．１８〜１．２ｇ／ｍｌ）および画分番号２２−２４細胞質タンパク質（密度１．２６ｇ／ｍｌ）。
【０２２７】
ＮＡＤＰＨ依存性のスーパーオキシド（・Ｏ２）生成のためのルシゲニン化学発光（ｌｕｃｉｇｅｎｉｎ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ：ＬＣＬ）アッセイ。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を、ルシゲニンベース系である化学発光（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）を使用して
【０２２８】
【化２５】
2009521928.tif 000027
【０２２９】
の比率を測定することにより分析した。各細胞成分分画の５０μｌ中の５μＭルシゲニンを、１５分間室温で暗所においてインキュベートした。ＬＣＬを、単一チューブＬｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ  ＴＤ２０−２０（Ｔｕｒｎｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎｓ  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して測定した。適応があれば、ＤＰＩおよび／またはＳＯＤ有りまたは無しで、β−ＮＡＤＰＨを１００μＭの最終濃度まで加えて反応を開始させた。ＬＣＬを５分間に及び測定した。発光曲線（ＲＬＵ／分）の最初の勾配は、発光正生物形成の比率を計算するために使用され、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の指標として試料が比較された。ＮＡＤＰＨが存在しない場合、発光はごく僅かで、経時的に変化しなかった。
【０２３０】
１次マウス皮膚線維芽細胞（Ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｏｕｓｅ  ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ：ＰＭＤＦ）単離。ＰＭＤＦをｇｐ９１ｐｈｏｘ（Ｎｏｘ２）ＫＯヘテロ接合体つがい（Ｐｏｌｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）から単離した。１日齢の子を安楽死させ、滅菌ＰＢＳで清潔にして、それらの皮膚を早急に除去した。各子の皮膚を、皮膚を下にして滅菌３５ｍｍペトリ皿内に別々に置き、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ上で４℃で一晩浮遊させた。翌日、表皮を真皮から剥がした。その後、真皮をＤＭＥＭ中の０．２％コラゲナーゼ中で１時間３７℃でインキュベートした。線維芽細胞を遊離するために真皮を振盪させ、この混合された細胞集団をペレットし、１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ、２．５単位／ｍｌアンフォテリシンＢおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを有するＤＭＥＭ内に蒔いた。カルシウム依存性の分化および混入ケラチノサイトの脱離を誘発するために、カルシウムを６ｍＭまで上昇させた。ＰＭＤＦの増大後、Ｎｏｘ２遺伝子型同定のために、各分離株からの細胞のサブセットでゲノムＤＮＡを生成した。
【０２３１】
１次マウス胎児線維芽細胞（Ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ：ＰＭＥＦ）単離。ＰＭＥＦを、ＳＯＤ１  ＫＯヘテロ接合体つがい（Ｍａｔｚｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）から単離した。胎児を、性交後１４日齢の妊娠中の雌性マウスから回収した。頭部および内部器官の除去後、胎児をＰＢＳ内ですすぎ、分割して０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ内で一晩４℃でインキュベートした。１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび５５μＭ  β−メルカプトエタノールを有するＤＭＥＭを加えることによって、トリプシンを不活性化させた。細胞を洗浄し、同一の媒体内に蒔いた。ＰＭＥＦの増大後、ＳＯＤ１遺伝子型同定のために、各分離株からの細胞のサブセットでゲノムＤＮＡを生成した。
【０２３２】
マウス血液からの多形核白血球（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ：ＰＭＮ）の単離。ＰＭＮを、Ｆｒｅｅｍａｎら（１９９１）において記述したように単離した。簡単に言えば、０．８５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭヘペス−ＮａＯＨ  ｐＨ７．４を含有する１ｍｌの血液希釈緩衝液を前負荷したシリンジにおける心穿刺によって、１ｍｌの血液をマウスから採取した。０．８５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、１０ｍＭヘペス−ＮａＯＨ、ｐＨ７．４中の０．７５容積の２０％（ｗ／ｖ）ポリスクロース（デキストラン５００）を用いて、３０分間室温で希釈血液をインキュベートすることにより、デキストラン凝集を使用して赤血球を沈降させた。その後、白血球に富む浮遊物を除去し、０．５容積のＮｙｃｏｐｒｅｐ１．０７７上で層状にし、６００ｘ  ｇで２０分間遠心分離した。浮遊物を処分し、ＰＭＮを血液希釈緩衝液内で再懸濁して早急に使用した。
【０２３３】
マウス多形核白血球（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ：ＰＭＮ）による・Ｏ２産出のための呼吸バーストアッセイ。無傷ＰＭＮによる・Ｏ２産出を
、変更（Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）を加えて前述のように測定した。簡単に言えば、ＰＭＮを１０６細胞／ｍｌへ調節した。１２５μＭフェリシトクロムｃが存在する場合において、細胞を５００ｎＭホルボールミリスチン酸アセテート（ＰＭＡ）または賦形剤（血液希釈緩衝液内のＤＭＳＯ最終濃度０．００５％）で、１時間３７℃で処置した。
【０２３４】
【化２６】
2009521928.tif 000028
【０２３５】
産出を、フェリシトクロムｃのＳＯＤ抑制可能な還元として、１時間にわたり経時的に即時測定した。各実験試料に対して２つのウェル（３０μｇ細菌ＳＯＤを有する１つのウェルおよびＳＯＤを有さない１つのウェル）を有する９６ウェルプレートでアッセイを行った。フェリシトクロムｃのＳＯＤ抑制可能な還元を計算するために基準ウェルを使用した。フェリシトクロムｃの還元を、５５０ｎｍでの吸光度変化によって検出した。曲線の線状部分をは、すべての試料に対し、０．９０を超えるＲ−二乗値で線状回帰分析することによって反応率を計算するために使用された。
【０２３６】
結果
ＮＡＤＰＨオキシダーゼによる細胞ＲＯＳの調節に重要なＲａｃ１結合パターンを特定するための試行において、マウスの肝臓から異所的に発現したＨＡタグ付きＲａｃ１を免疫沈降し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて見られる特異的なバンドにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を行った。意外にも、ＳＯＤ１は、Ｒａｃ１への潜在的な結合パートナーとして特定された。Ｒａｃ１／ＳＯＤ１相互作用が体内で発生したことを確認するため、脳、肝臓、腎臓および心臓を含む幾つかのマウス器官から、同時免疫沈降実験を行った。実際、Ｒａｃ１の免疫沈降は、ｓｏｄ１−／−マウスの器官からではなく、ｓｏｄ１＋／＋マウスのこれらの各器官からＳＯＤ１を破壊した（図１Ａ）。Ｒａｃ１に付随するＳＯＤ１の量は、脳で著しく最も高く、心臓で最も低かった。この相互作用が直接的なものかどうかをテストするため、精製されたタンパク質を用いる体外プルダウンアッセイを活用した。Ｒａｃ１がＧＴＰγＳを前負荷した場合ではなく、Ｒａｃ１がＧＤＰβＳを前負荷した場合、またはヌクレオチドが存在しない場合に、固定化したＨｉｓタグ付きＲａｃ１は明らかにＳＯＤ１を結合させた（図１Ｂ）。対照的に、遊離されたＲｈｏ  ＧＴＰアーゼ、Ｃｄｃ４２は、ＳＯＤ１を結合させなかった（図１Ｂ）。これらの結果により、Ｒａｃ１のＧＤＰ結合形態がＳＯＤ１を結合させることが示唆される。
【０２３７】
潜在的なヌクレオチド結合立体配座状態がＳＯＤ１との結合に影響したかをさらに検討するため、ＧＴＰ（Ｒａｃ１Ｇ１２Ｖ）またはＧＤＰ（Ｒａｃ１  Ｔ１７Ｎ）結合立体配座においてＲａｃ１を固定する２つのＲａｃ１変異体を評価した。しかし、ＧＳＴ−Ｒａｃ１Ｇ１２ＶまたはＧＳＴ−Ｒａｃ１Ｔ１７Ｎは、ＳＯＤ１を弱くのみ結合させ、ＳＯＤ１のいずれかの変異体への結合は、Ｒａｃ１へ負荷されたヌクレオチドの種類によって影響を受けなかった（図１Ｃ）。対照的に、Ｈｉｓタグ付きｗｔ−Ｒａｃ１で上記に示したように、ＧＳＴｗｔ−Ｒａｃ１は、Ｒａｃ１がＧＴＰγＳではなくＧＤＰβＳを負荷した場合に、強力にＳＯＤ１を結合させる。
【０２３８】
Ｒａｃ１がＮＡＤＰＨオキシダーゼを介して
【０２３９】
【化２７】
2009521928.tif 000029
【０２４０】
生成を調節し（Ｉｒａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７、Ａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１
）、ＳＯＤ１が
【０２４１】
【化２８】
2009521928.tif 000030
【０２４２】
を不均化させることを考慮すると、ＳＯＤ１酵素活性は、Ｒａｃ１との相互作用のために根本的に重要であり得ることが仮定された。ＳＯＤ１の活性部位で結合する銅（Ｃｕ）は、その酵素活性に必要であり、特異的Ｃｕシャペロン（ＣＣＳ）は、体内においてＳＯＤ１に銅を負荷するために必要とされる（Ｒａｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。体外プルダウンアッセイを使用して、Ｒａｃ１とＳＯＤ１との相互作用の酸化還元調節、およびこの相互作用へのＳＯＤ１の金属含有の影響を調査した。興味深いことに、Ｒａｃ１の還元は、ＳＯＤ１への結合に必要なヌクレオチド優先度を切り替えた（図１Ｄ）。非還元の細菌で発現されたＲａｃ１は、ＧＤＰβＳが存在する場合において最も効果的にＳＯＤ１に結合する。対照的に、還元したＲａｃ１は、ＧＤＰβＳではなくＧＴＰγＳを負荷した場合にＳＯＤ１に結合した。さらに、ＳＯＤ１の未変性の（メタル化された）および再メタル化された形態のみがＲａｃ１に結合し、一方で、脱メタル化された（酵素的に不活性）ＳＯＤ１は、Ｒａｃ１の結合に失敗した（図１Ｄおよび図５Ａ）。対照的に、還元されたＣｄｃ４２−ＧＴＰγＳまたはＣｄｃ４２−ＧＤＰβＳのいずれもＳＯＤ１を結合しなかった（図５Ｂ）。これらの所見により、還元条件下においてＳＯＤ１が実際にＲａｃ１−ＧＴＰを結合できることを示し、Ｒａｃ１の酸化還元状態が、ＧＴＰ対ＧＤＰ結合状態においてＳＯＤ１のその親和性に影響を及ぼすことが示唆される。
【０２４３】
これらの結果から興味深いことに、ＧＴＰ結合Ｒａｃ１の逐次還元および酸化は、Ｒａｃ１をＳＯＤ１結合および非結合状態にそれぞれ循環し得るかどうかを決定した。このため、Ｒａｃ１（ＤＴＴおよび前負荷されたＧＴＰγＳで還元）を、Ｈ２Ｏ２の異なる濃度に晒し、過剰Ｈ２Ｏ２をした後、ＳＯＤ１を結合させるその能力を評価した。これらの研究結果は、５０ｐＭほどに低いＨ２Ｏ２濃度が、ＳＯＤ１に対するＲａｃ１の結合親和性を有意に増加させたことを実証した（図１Ｅ）。Ｒａｃ１タンパク質に対するＨ２Ｏ２媒介の不可逆的な損傷の可能性を除外するため、異なる濃度のＤＴＴを、３００ｐＭ  Ｈ２Ｏ２へ晒された酸化Ｒａｃ１に戻し入れ、同一の実験を繰り返した。実際、Ｒａｃ１／ＳＯＤ１結合のＨ２Ｏ２媒介の抑制は、５０−３００μＭ  ＤＴＴでのＲａｃ１の処置によって逆転した（図１Ｆ）。これらの体外結合データは、Ｒａｃ１／ＳＯＤ１結合は、酸化還元抑制され、Ｒａｃ１の酸化還元状態に応じて結合および非結合状態を循環できることを実証した。
【０２４４】
ＳＯＤ１に付随するＲａｃ１のドメインを判断するため、Ｒａｃ１のＧＳＴタグ付き欠失変異体（図２Ａ）を構築し、体外プルダウンアッセイを行った。ＳＯＤ１は、アミノ酸３５から７０（図２Ｂ）内に含有されるＲａｃ１の領域を最も効果的に結合した。このＲａｃ１の領域は、ヌクレオチド結合に重要な幾つかのドメイン（つまり、スイッチＩ、Ｇ２、スイッチＩＩおよびＧ３ドメイン）（Ｈｉｒｓｈｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７、Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７、Ｓｐｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）に及ぶ（図５Ｃ）。また、Ｒａｃ１上のＳＯＤ１のこの領域への結合は、ＳＯＤ１およびＧＴＰγＳ対ＧＤＰβＳ結合Ｒａｃ１との結合において観察された差異と、Ｒａｃ１Ｔ１７ＮおよびＲａｃ１Ｇ１２Ｖ変異体（どちらもＲａｃ１のヌクレオチド−結合ドメインに変異を有する）のＳＯＤ１を結合させるための能力の低下と一致する（図１Ｃ）。
【０２４５】
興味深いことに、Ｒａｃ１グアニンヌクレオチド交換因子（ｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｆａｃｔｏｒ：ＧＥＦ）Ｔｉａｍ１は、ＳＯＤ１との相互作用ドメインに及ぶＲａｃ１の領域に結合する（Ｗｏｒｔｈｙｌａｋｅ  ｅｔ  ａｌ
．，２０００）。その上、２つの関連Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼ（ＲｈｏＡおよびＣｄｃ４２）上スイッチ領域は、ＲｈｏＧＡＰへの結合に関与する（Ｒｉｔｔｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７ａ、Ｒｉｔｔｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７ｂ）。したがって、ＳＯＤ１は、ＧＥＦまたはＧＡＰとして作用することによってＲａｃ１活性に影響を及ぼし得ると仮定した。この仮説をテストするため、まず、ＳＯＤ１が存在しない場合にＧＴＰ−Ｒａｃ１レベルが変化するかどうかを判断した。この目的のために、ＧＳＴ−ＰＤＢ（ＧＴＰ−Ｒａｃ１に結合するＰＡＫドメイン）プルダウンアッセイを行い、ｓｏｄ１＋／−およびｓｏｄ１−／−マウスにおけるＧＴＰ−Ｒａｃ１の程度を評価した。脳組織が体内のＳＯＤ１およびＲａｃ１間で最も結合を示したため（図１Ａ）、これらのＲａｃ１活性化アッセイを脳組織溶解物において行った。これらの実験結果は、ＧＴＰ結合（活性）Ｒａｃ１のレベルが、ｓｏｄ１−／−よりもｓｏｄ１＋／−マウス脳組織で有意に高かったことを実証した（図２ＣおよびＤ）。しかし、脳内のＲａｃ１の合計レベルは、ＳＯＤ１の有無に影響されなかった（図２Ｃ）。これらの所見は、ＧＴＰ結合Ｒａｃ１のレベルを増強させることによって、ＳＯＤ１発現が体内のＲａｃ１活性化に影響を及ぼすことを実証した。予想外にも、ＳＯＤ１は、体外のＲａｃ１にかかるＧＴＰ負荷に有意に影響しなかった（図６Ａ）。したがって、ＳＯＤ１は、ＧＴＰ結合Ｒａｃ１のレベルを増加させるように従来のＧＥＦとして機能しないようであった。
【０２４６】
Ｒａｃ１が、異例に高い内因性ＧＴＰアーゼ活性を有するため（Ｍｅｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）、ＳＯＤ１がＲａｃ１によるＧＴＰ加水分解を抑制するかどうかを判断した。図２Ｅに示すように、これは実際にそのようになった。ＳＯＤ１は、Ｒａｃ１の内因性ＧＴＰアーゼを有意に抑制し、また、ｐ２９Ｒｈｏ−ＧＡＰがＲａｃ１によるＧＴＰ加水分解を活性化することも防いだ。しかし、Ｒａｃ１  ＧＴＰアーゼ活性の抑制は、体外のＲａｃ１（データ図示されず）を結合させない細菌ＳＯＤでは見られなかった（図２Ｆ）。また、ＧＴＰ加水分解を抑制するＳＯＤ１の能力は、Ｒａｃ１に特異的であり、密接に関連する小さなＧＴＰアーゼＣｄｃ４２では見られなかった（図２Ｇ）。さらに、Ｒａｃ１を結合させない（図１Ｄ）脱メタル化された（酵素的に不活性）ＳＯＤ１も、Ｒａｃ１  ＧＴＰアーゼ活性を抑制しなかった（図６Ｂ）。これらの所見は、そのＧＴＰアーゼ活性を抑制することによって、ＳＯＤ１がＲａｃ１−ＧＴＰを特に安定化させるように作用することを実証した。
【０２４７】
Ｒａｃ１のＳＯＤ１への結合が、Ｒａｃ１の酸化還元状態により制御されるのであれば、Ｒａｃ１  ＧＴＰアーゼ活性の調節も酸化還元調節される場合がある。ＲＯＳがＲａｃ１によるＧＴＰ加水分解を抑制するＳＯＤ１の能力を変化させるかどうかを直接評価するため、キサンチン／キサンチンオキシダーゼ（Ｘ／ＸＯ）
【０２４８】
【化２９】
2009521928.tif 000031
【０２４９】
遺伝子評価体系が存在する場合にＧＴＰアーゼアッセイを行った。Ｒａｃ１が特定のＮＡＤＰＨオキシダーゼによる
【０２５０】
【化３０】
2009521928.tif 000032
【０２５１】
生成を調節するのであれば、かかる問題は、体内のＲＯＳ生成を調節する工程に関連する可能性があった。興味深いことに、ＳＯＤ１は、このＲＯＳ遺伝子評価体系が存在する場合においてＲａｃ１によるＧＴＰ加水分解を抑制するその能力を失った（図２Ｈ）。しかし、実験的条件下で生じたＲＯＳのレベルは、ＳＯＤ１が存在しない場合における内因性Ｒａｃ１ＧＴＰアーゼ活性に影響しなかった（図２Ｈ）。ＧＴＰアーゼアッセイ条件を使用したＲａｃ１−ＧＴＰγＳ／ＳＯＤ１複合体の免疫沈降は、Ｘ／ＸＯ由来のＲＯＳへの暴露が、Ｒａｃ１からＳＯＤ１を解離させることを実証した（図２Ｉ）。これらの所見は、これらの２つのタンパク質間の物理的相互作用を制御することによって、ＲＯＳがＲａｃ１  ＧＴＰアーゼ活性を調節するＳＯＤ１の能力を変化させることを実証した。これらの所見は、ＳＯＤ１／Ｒａｃ１相互作用を分裂させるＨ２Ｏ２の能力と一致する（図１Ｅ）。
【０２５２】
Ｒａｃ１は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼＮｏｘ２ｇｐ９１ｐｈｏｘとのその相互作用を介した細胞
【０２５３】
【化３１】
2009521928.tif 000033
【０２５４】
を抑制するその能力がよく知られている（Ｌａｍｂｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。この相互作用は、
【０２５５】
【化３２】
2009521928.tif 000034
【０２５６】
および／またはＨ２Ｏ２（
【０２５７】
【化３３】
2009521928.tif 000035
【０２５８】
の不均化生成物）によって制御される、ＲＯＳ調節した細胞過程のメンバーの中心にＲａｃ１を位置付けた。（Ｓｕｌｃｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６、Ｋｈｅｒａｄｍａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、Ｙａｍａｏｋａ−Ｔｏｊｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｉｒａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７、Ｐｕｃｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。興味深いことに、ＳＯＤ１は、ＩＬ−１β活性化後にＮｏｘ２依存性の
【０２５９】
【化３４】
2009521928.tif 000036
【０２６０】
を生成するエンドソームの表面へ補充される（実施例２）。これは、Ｒａｃ１のＧＴＰアーゼ活性を抑制することによって、
【０２６１】
【化３５】
2009521928.tif 000037
【０２６２】
を生成するためにエンドソーム区画においてＲａｃ１／Ｎｏｘ２複合体をＳＯＤ１が活性化させ得るという仮説をもたらした。この目的のために、エンドソームを含有する未刺激のＮｏｘ２を、１次マウス皮膚線維芽細胞（ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｏｕｓｅ  ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ：ＰＭＤＦ）から単離し、ＳＯＤ１補充がこの区画によるＮＡＤＰＨ依存性の
【０２６３】
【化３６】
2009521928.tif 000038
【０２６４】
産出を活性化させるかどうかを判断した。エンドソーム
【０２６５】
【化３７】
2009521928.tif 000039
【０２６６】
が実際にＮｏｘ２に由来したかどうかを確認するため、Ｎｏｘ２ｇｐ９１ｐｈｏｘＫＯ（−／−）マウスまたは野生型対照同腹子から単離されたＰＭＤＦを使用した。野生型重ミトコンドリア浮遊物からの小胞分画のイオジキサノール密度勾配分離は、ＮＡＤＰＨ依存性の
【０２６７】
【化３８】
2009521928.tif 000040
【０２６８】
生成および初期エンドソームマーカーＥＥＡ１で重畳する、Ｎｏｘ２ｇｐ９１ｐｈｏｘ、Ｒａｃ１およびＳＯＤ１タンパク質（分画番号１０および１２）を含有する２つの主なピーク分画を示した（図３Ａ）。興味深いことに、Ｎｏｘ２ｇｐ９１ｐｈｏｘＫＯ細胞は、これらの分画へＳＯＤ１を補充できず（図３Ｂ）、Ｎｏｘ２は、ＳＯＤ１の補充を容易にするようにエンドソーム内に存在する必要があることが示唆された。これらの単離されたエンドソームへの精製されたウシＳＯＤ１の添加は、ＮＡＤＰＨ依存性の
【０２６９】
【化３９】
2009521928.tif 000041
【０２７０】
を生成するためのそれらの能力を著しく向上させた（図３Ｃ）。このエンドソーム
【０２７１】
【化４０】
2009521928.tif 000042
【０２７２】
の向上は、ＤＰＩ（ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤）に対して感受性があり、Ｎｏｘ２ｇｐ９１ｐｈｏｘＫＯ  ＰＭＤＦでは見られなかったため（図３Ｃ）、
【０２７３】
【化４１】
2009521928.tif 000043
【０２７４】
は実際にＮｏｘ２に由来することが示唆された。第２の野生型細胞型、１次マウス胎児線維芽細胞（ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ：ＰＭＥＦ）を使用して、外因性ウシＳＯＤ１の単離されたエンドソームへの追加が、ＮＡＤＰＨ依存性の
【０２７５】
【化４２】
2009521928.tif 000044
【０２７６】
を生成する能力を向上させることを確認した（図３Ｄ）。このＰＭＥＦエンドソームによる
【０２７７】
【化４３】
2009521928.tif 000045
【０２７８】
の誘導は、
【０２７９】
【化４４】
2009521928.tif 000046
【０２８０】
を不均化させる両酵素の同等の能力（図３Ｅ）にもかかわらず、大腸菌ＳＯＤではなく、ウシＳＯＤ１で見られた（図３Ｄ）。
【０２８１】
内膜のＮｏｘ２によるその基質
【０２８２】
【化４５】
2009521928.tif 000047
【０２８３】
の生成を向上させるＳＯＤ１の能力に関心を持ち、生細胞内で同様の機能的効果が見られるかどうかを判断した。Ｎｏｘ２依存性の
【０２８４】
【化４６】
2009521928.tif 000048
【０２８５】
生成のモデルとして、多形核白血球（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ  ｌｅｕｋｅｕｃｙｔｅ：ＰＭＮ）のホルボールミリスチン酸アセテート（ｐｈｏｒｂｏｌ  ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  ａｃｅｔａｔｅ：ＰＭＡ）刺激後に見られる、よく特性化された呼吸バーストを使用した。ＳＯＤ１は、ＰＭＡ刺激を受けてＮｏｘ２活性化および
【０２８６】
【化４７】
2009521928.tif 000049
【０２８７】
呼吸バーストの減少をもたらすことが仮定された。この目的のため、末梢血ＰＭＮをｓｏｄ１＋／＋、ｓｏｄ１＋／−またはｓｏｄ１−／−マウスから単離し、それらの呼吸バーストの大きさを評価した。ＳＯＤ１欠乏は、ＰＭＮによるＰＭＡ誘導の
【０２８８】
【化４８】
2009521928.tif 000050
【０２８９】
産出を実際に有意に抑制した（図３Ｆ）。さらに、ｓｏｄ１＋／−マウス由来のＰＭＮは、ｓｏｄ１＋／＋およびｓｏｄ１−／−ＰＭＮと比較して、ＰＭＡ誘導のスーパーオキシド産出において中間還元を示した（図３Ｆ）。総体的に、これらの結果は、ＳＯＤ１が体内のＮｏｘ２活性化を調節し、Ｒａｃを調節するＳＯＤ１の能力に対する機能的背景を提供できることを実証する。Ｒａｃ２は、ＰＭＮにおけるＲａｃの主なアイソフォームであり、また免疫沈降したＲａｃ２も、ＳＯＤ１に効果的に結合することに留意すべきである（データ図示せず）。
【０２９０】
ＳＯＤ１における変異は、遺伝性の筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌ
ａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ＡＬＳ）の優性型、運動ニューロンの進行性消失に関連する致命的な神経変性障害、ならびにその後の筋衰弱および麻痺をもたらす可能性がある（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。ＳＯＤ１変異に起因する優性ＡＬＳの特定の家族型は、依然として不明のところが多い機能の中毒性獲得を介して疾患を促進させると考えられる。この目的のため、ＳＯＤ１変異体によるＲａｃ１調節を評価した。野生型ヒトＳＯＤ１および２つのヒトＡＬＳ変異体ＳＯＤ１タンパク質（Ｌ８ＱおよびＧ１０Ｖ）が細菌内に発現および細菌から精製された（図４Ａ）。興味深いことに、ヒトＳＯＤ１変異体タンパク質のどちらもが、ヒト野生型ＳＯＤ１と比べて、Ｒａｃ１を結合する能力を増強させた（図４Ｂ）。ヒト野生型ＳＯＤ１とは異なり、これらのＳＯＤ１変異体のＲａｃ１への結合は、Ｘ／ＸＯ由来のＲＯＳによって分裂されなかったため（図４Ｂ）、ＳＯＤ１／Ｒａｃ１相互作用の酸化還元−調節は、ＳＯＤ１におけるＬ８ＱおよびＧ１０Ｖ変異によって変化することが示唆された。重要なことに、Ｌ８ＱおよびＧ１０ＶヒトＳＯＤ１変異体タンパク質も、ヒト野生型ＳＯＤ１と比べてＲａｃ１−ＧＴＰ加水分解を抑制する能力向上を実証した（図４Ｃ）。細菌由来のヒト野生型ＳＯＤ１のメタル化減少（図４Ａ）は、精製されたウシＳＯＤ１（図４Ｃ）と比べてＲａｃ１−ＧＴＰアーゼ活性を抑制する効果を減少させ、これは図１Ｄに示すように、Ｒａｃ１に対する結合親和性の減少に起因する可能性があった。しかし、メタル化の程度は、Ｒａｃ１を結合し、ＧＴＰアーゼ活性を抑制する細菌由来のヒト変異体ＳＯＤ１タンパク質の能力にあまり影響を及ぼさないように思われた。
【０２９１】
上記の結果により、ＳＯＤ１における特定のＡＬＳ変異は、Ｒａｃ１のそれらのより永続性の酸化還元非感受性活性化のために、エンドソーム区画におけるＮｏｘ２活性化を調節しない場合があると仮定した。この目的のため、ヒト野生型ＳＯＤ１またはＬ８Ｑ−ＳＯＤ１タンパク質の追加後に、ＮＡＤＰＨ依存性の
【０２９２】
【化４９】
2009521928.tif 000051
【０２９３】
生成の経時変化を単離されたエンドソーム分画において評価した。上記で観察されたように（図３Ｄ）、野生型ＳＯＤ１は、単離されたＰＭＥＦエンドソームによるＮＡＤＰＨ依存性の
【０２９４】
【化５０】
2009521928.tif 000052
【０２９５】
の生成を活性化させた（図４Ｄ）。この
【０２９６】
【化５１】
2009521928.tif 000053
【０２９７】
生成における活性化は１５分でピークとなり、１時間で基準に戻った。かかる過渡の活性化は、ＳＯＤ１／Ｒａｃ１相互作用を抑制し、Ｒａｃ１によるＧＴＰ加水分解を活性化させるＮｏｘ由来のＲＯＳと一致し、Ｎｏｘ活性化において自己調節式還元をもたらした。対照的に、ＰＭＥＦエンドソームにＬ８Ｑ−ＳＯＤ１を加えることは、持続的なＮＡＤＰＨ依存性の
【０２９８】
【化５２】
2009521928.tif 000054
【０２９９】
生成を１時間まで上昇させた（図４Ｄ）。総体的に、これらの結果により、ＳＯＤ１の特定のＡＬＳ変異体は、Ｒａｃ１との相互作用に敏感な変化した酸化還元のために、Ｎｏｘ２を活性化させる能力を調節しないことが示唆される。
【０３００】
また、通常ＡＬＳに付随するＳＯＤ１の変異が、体内のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性向上をもたらすことを確認するため、後肢麻痺および約週齢１８〜１９週齢での死亡を生じる、よく特性化されたＧ９３Ａ−ＳＯＤ１遺伝子導入マウスが使用された。Ｌ８Ｑ−およびＧ１０Ｖ−ＳＯＤ１変異体への体外結合データから予測されるように（図４Ｂ）、Ｇ９３Ａ−ＳＯＤ１遺伝子導入マウスからのＳＯＤ１は、導入遺伝子陰性同腹子と比べて、脳溶解物からの免疫沈降したＲａｃ１をより強力に結合させた（図４Ｅ）。興味深いことに、Ｇ９３Ａ−ＳＯＤ１遺伝子導入マウスにおけるＲａｃ１とＳＯＤ１との結合は、年齢とともに増加し、麻痺発症時（約１８週）で最大となった。Ｇ９３Ａ−ＳＯＤ１遺伝子導入マウスで見られたこのＲａｃ１／ＳＯＤ１相互作用における増加は、脳および肝臓から単離された総内膜内のＮＡＤＰＨ依存性のスーパーオキシド生成における有意な年齢依存性の増加と類似した（図４Ｆ、Ｇ）。Ｇ９３Ａ−ＳＯＤ１遺伝子導入マウスにおけるＮｏｘ活性化の向上を示すこれらの体内データは、他のＡＬＳ結合ＳＯＤ１変異体が存在する場合における、Ｒａｃ１／Ｎｏｘ活性化向上の体外所見を具体化する（図４Ｂ〜Ｄ）。
【０３０１】
本明細書における所見は、細胞内の
【０３０２】
【化５３】
2009521928.tif 000055
【０３０３】
変換を遍在的に方向付ける酵素であるＳＯＤ１が、酸化還元依存の方法において、Ｒａｃ１との物理的相互作用を介してＲａｃ１／Ｎｏｘ２活性化を制御する能力を有することを実証する。さらに、このＳＯＤ１依存性の機構は、ＰＭＮにおけるＲａｃ２／Ｎｏｘ２活性化のために一定に保たれるように思われる。本明細書における所見に基づき、ＳＯＤ１は、Ｒａｃ−ＧＴＰ加水分解のそのＲＯＳ感受性制御を介してＮｏｘ２依存性の
【０３０４】
【化５４】
2009521928.tif 000056
【０３０５】
生成を調節してもよい（図７）。刺激後、活性化されたＲａｃ−ＧＴＰは、ＳＯＤ１とともに集合膜結合されたＮｏｘ２複合体に補充される。細胞質の還元条件下において、ＳＯＤ１は、Ｒａｃ−ＧＴＰに効果的に結合し、その内因性ならびにＧＡＰ促進されたＧＴＰアーゼ活性を抑制する。この効果は、活性状態でのＲａｃ維持およびＮｏｘ２由来の
【０３０６】
【化５５】
2009521928.tif 000057
【０３０７】
の生成増加をもたらす。Ｈ２Ｏ２の局所的蓄積（自発的または
【０３０８】
【化５６】
2009521928.tif 000058
【０３０９】
のＳＯＤ１促進された不均化による）は、ＳＯＤ１のＲａｃ−ＧＴＰからの解離およびＧＴＰ加水分解を介したＲａｃの不活性化をもたらす。Ｒａｃ−ＧＤＰは、Ｎｏｘ２活性化を支持できないため、この現象は、Ｎｏｘ２複合体の不活性化およびＲＯＳ生成の現象をもたらす。これは、内膜によるＮｏｘ由来の
【０３１０】
【化５７】
2009521928.tif 000059
【０３１１】
の活性化過剰に繋がる、ＳＯＤ１の特定のＡＬＳ変異体における機能障害であるように思われる、ＲａｃからのＳＯＤ１の酸化還元感受性の未結合である。ＳＯＤ１をＲａｃ−ＧＴＰから遊離させ、ＧＴＰ加水分解を発生させるＨ２Ｏ２のｐＭ量の能力により、体内の調節機構が、細胞ＲＯＳの小さな変化に極めて敏感な場合があることが示唆される。この機構は、Ｈ２Ｏ２へのＳＯＤ１酵素的変換を介する細胞
【０３１２】
【化５８】
2009521928.tif 000060
【０３１３】
の空間的に関連した変化を、Ｒａｃ１に感じさせることが可能である。
【０３１４】
また、これらの所見は、Ｒａｃ１／Ｎｏｘ２活性化の異常調節がＡＬＳ疾患の発症に起因し得るため、ＡＬＳなどの神経細胞変性疾患において特に重要である。また、興味深いことに、Ｒａｃ１に対して最近特定されたＧＥＦ（Ｔｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）であるＡｌｓｉｎ遺伝子の変異は、ＡＬＳの劣性型（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）をもたらすことも示している。故に、ＡＬＳの家族型として現れる観察された表現型に関与する、ＳＯＤ１とＡｌｓｉｎ変異との機能的連結があってもよい。
【実施例２】
【０３１５】
材料および方法
組み換え型発現ベクターおよびｓｉＲＮＡ。ＭＣＦ−７細胞を、前述のように、組み換えアデノウイルス（５００粒子／細胞）に感染させ、細胞を感染後４８時間での実験に活用した。ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、すべてのプラスミド形質移入に使用し、細胞を形質移入後４８時間での実験に活用した。下記のＥ１除去された組み換えアデノウイルスベクターを使用した。１）グルタチオンペルオキシダーゼ１をコードし、細胞質のＨ２Ｏ２を分解させるＡｄ．ＧＰｘ−１（Ｄｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）、２）ダイナミンのドミナントネガティブ変異体（Ｋ４４Ａ）をコードし、エンドサイトーシスを抑制するＡｄ．Ｄｙｎ（ＤＮ）（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、３）ルシフェラーゼ発現を促進するＮＦκＢ反応性プロモーターをコードし、体内のＮＦκＢ転写活性化を評価するために使用されるＡｄ．ＮＦκＢＬｕｃ（Ｓａｎｇｌｉｏｇｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、および４）挿入断片のない空ベクターであるＡｄ．ＢｇｌＩＩを、ウイルス感染症の対照として使用した（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。２つの組み換えアデノウイルスの感染を活用するＮＦκＢ転写アッセイには、僅かに変更された連続感染方法を使用した（Ｓａｎｇｌｉｏｇｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。この事例において、細胞を、Ａｄ．ＮＦκＢＬｕｃの感染２４時間前の実験的ベクター（つまり、Ａｄ．Ｄｙｎ（ＤＮ）またはＡｄ．ＧＰｘ１）に感染させ、細胞を、初回感染後４８時間の実験に活用した。Ａｄ．ＣＭＶ−ＧＦＰレポーター遺伝子発現で評価した場合、組み換えアデノウイルスとの形質導入効果は通常８０〜９０％であった。
【０３１６】
下記のプラスミドを過渡の形質移入実験に使用した。１）初期エンドソームの免疫親和性単離のためのＰＣＲ増幅によって生成された、Ｒａｂ５のＮ末端ＨＡ−融合をコードす
る組み換えプラスミド、および２）Ｄｒ．Ｊ．Ｄ．Ｌａｍｂｅｔｈ（Ｅｍｏｒｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）からの贈呈品である、Ｎｏｘ２  ｃＤＮＡをコードする発現プラスミド。
【０３１７】
ＭｙＤ８８、Ｒａｃ１およびＮｏｘ２対するｓｉＲＮＡを、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈから取得し、製造会社の説明する方法および試薬を使用して、形質移入を行った。ｓｉＲＮＡに使用された配列は独占的であり、企業から提供されなかった。
【０３１８】
サイトカイン処置および小胞単離。ＭＣＦ−７細胞を、すべての小胞単離前に、指示された濃度で２０分間組み換えＩＬ−１βで処置した。エンドソーム負荷実験には、精製されたウシＣｕ／ＺｎＳＯＤ（Ｏｘｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）および／またはカタラーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）タンパク質を、新鮮な培地（０．１から１ｍｇタンパク質／ｍｌ）に加えて、ＳＯＤおよび／またはカタラーゼが継続的に存在する場合に、サイトカイン処置前に１０分間細胞へ適用させた。細胞を洗浄し、氷冷ＰＢＳ内へ削り入れた。その後、細胞ペレットを、０．５ｍｌの均質化緩衝液（０．２５Ｍ  ショ糖、１０ｍＭ  トリエタノールアミン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦおよび１００ｕｇ／ｍｌ  アプロチニン）内で再懸濁し、Ｄｕａｌｌ組織粉砕器（Ｄｕａｌｌ）において均質化して、２０００ｘｇで４℃で１０分間遠心分離した。浮遊物を核後の浮遊物（ｐｏｓｔ−ｎｕｃｌｅａｒ  ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ：ＰＮＳ）と名付けた。その後、３２％の最終濃度を得るため、ＰＮＳを６０％イオジキサノール（ＯｐｔｉＰｒｅｐＴＭ、Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ）溶液と組み合わせ、ｓｗ５５Ｔｉ遠心分離機チューブ内に負荷した。その後、ＰＮＳを、均質化緩衝液内の２４％と２０％  イオジキサノールの２段階勾配下で底面負荷した。試料を、３０、５００ｒｐｍで２時間４℃で遠心分離した。分画を、４℃で遠心分離機チューブの上部から下部まで採取し（分画当り約３００μｌ）、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性、免疫単離または凍結に即座に活用してウエスタンブロット分析を行った。
【０３１９】
ＮＦκＢおよびＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性アッセイ。前述のＮＦκＢ−誘導性のルシフェラーゼレポータベクター（Ａｄ．ＮＦκＢＬｕｃ）を使用して、ＮＦκκＢ転写活性を評価した（Ｓａｎｇｌｉｏｇｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。５μｇの細胞可溶化物を使用して、ルシフェラーゼ活性をサイトカイン処置後６時間で評価した。ルシゲニンベース系である化学発光を使用して、
【０３２０】
【化５９】
2009521928.tif 000061
【０３２１】
産出率を測定することによりＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を分析した（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。アッセイ開始前に、５μｇの小胞のタンパク質をＰＢＳ中の５μＭのルシゲニン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と組み合わせ、１０分間室温暗所でインキュベートした。１００μＭのＮＡＤＰＨ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えて反応を開始し、３分間（５読み／秒）にわたって発光の変化を測定した。発光カーブ（分当りの相対光単位［ＲＬＵ］）（ｒ＞０．９５）の傾斜を、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の指標として
【０３２２】
【化６０】
2009521928.tif 000062
【０３２３】
形成率を計算するために使用した（ＲＬＵ／分μｇタンパク質）。ＮＡＤＰＨが存在しない場合において、ルシゲニン依存性の発光の背景レベルは、常に、ＮＡＤＰＨが存在する場合の最大誘導値未満の＞１０００倍だった。さらに、ＮＡＤＰＨが存在しない場合の発光の背景レベルは、試料間で有意に異ならず、変化率は無かった。
【０３２４】
電子スピン共鳴分光法（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｓｐｉｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＥＳＲ）を、単離されたエンドソームによるＮＡＤＰＨ依存性の
【０３２５】
【化６１】
2009521928.tif 000063
【０３２６】
生成を確認するために使用した。ＢｒｕｋｅｒモデルＥＭＸ  ＥＳＲスペクトロメータ（Ｂｒｕｋｅｒ）を使用して、ＥＳＲアッセイを室温で行った。各試料からの小胞分画を、総質量５００μｌのＰＢＳ、ｐＨ７．４中５０ｍＭのＤＭＰＯ（５，５−ジメチル１−ピロリンＮ−オキシド）のスピントラップと混合した。この溶液は、イミノ２酢酸−キレート樹脂（１０ｍｌ／ｌ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有した。１００μＭまでＮＡＤＰＨを加えて反応を開始し、早急にＥＳＲスペクトロメータ内へ配置した。ＤＭ
ＰＯ−ヒドロキシルラジカル付加体形成を１０分間分析した。機器設定は、受信機獲得：１ｘ１０６、変調周波数：１００ｋＨｚ、マイクロ波電力：４０．１４ｍＷ、振幅変調：１．０Ｇ、および掃引速度：１Ｇ／ｓであった。
【０３２７】
小胞の免疫単離。Ｒａｂ５含有のエンドソームを、前述の方法（Ｔｒｉｓｃｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）に従って単離した。細胞に、ＩＬ−１β処置前４８時間のＨＡ−Ｒａｂ５ａまたはＧＦＰ発現プラスミドを形質移入した。細胞内小胞のイオジキサノール単離後、組み合わされたピーク小胞分画の一方の半分を、生化学的分析に直接使用し、他方の半分を、抗ＨＡ抗体で被覆されたＤｙｎａビーズＭ−５００（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、免疫親和性単離に使用した。使用前にビーズを下記の通りに抗体で被覆した。第２抗体（抗ラット）を、０．１Ｍのホウ酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）中のＤｙｎａビーズ（４ｘ１０８ビーズ／ｍｌ）に、遅い振動で２４時間２５℃で共役させた。その後、ビーズを３分間磁石中に置き、０．１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ／ＰＢＳ中において５分間４℃で洗浄した。０．２ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．５）／ＢＳＡ中で最終洗浄を２４時間行った。最後に、ビーズをＢＳＡ／ＰＢＳ中で再懸濁し、１０７ビーズにつき４μｇの１次抗ＨＡ抗体に一晩４℃で共役させ、その後、ＢＳＡ／ＰＢＳ中で洗浄した。小胞分画を、２ｍＭのＥＤＴＡ、５％のＢＳＡおよびプロテアーゼ阻害剤を含有するＰＢＳ中の７００μｌの被覆したビーズと混合した。混合物を、遅い振動で６時間４℃でインキュベートし、続いて磁気捕捉を行い、同一チューブ内で３回（各１５分）洗浄した。その後、ＨＡ濃縮エンドソームを有するビーズをＰＢＳ中で再懸濁し、浮遊物を分析用に保存した。
【０３２８】
ウエスタンブロット法、免疫沈降および体外キナーゼアッセイ。一般的な手順を使用してウエスタンブロット法を行い（Ｇｏｌｉｇａｎ、１９９１）、ＢｉｏＲａｄタンパク質定量化キットを使用してタンパク質の濃度を判断した。免疫反応性タンパク質を、向上した化学発光ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して検出し、Ｘ線フィルムに曝露した。ウエスタンブロット法に使用した抗体は以下の通りである。抗ＥＥＡ１、抗ＨＡ、抗Ｒａｂ５および抗Ｒａｂ１１抗体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、抗ｐ４７ｐｈｏｘ、抗ＴＲＡＦ６、抗ＩＫＫα、抗Ｎａ＋／Ｋ＋  ＡＴＰａｓｅ（α３）、抗ＭｙＤ８８および抗ＧＳＴ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、抗ＩＬ−１Ｒ１（ＱＥＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．）、抗Ｃｕ／ＺｎＳＯＤおよび抗カタラーゼ抗体（Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ，Ｉｎｃ．）ならびに、抗ｍｔＨＳＰ７０（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ）。Ｎｏｘ２抗体は、Ｄｒ．Ａ．Ｊｅｓａｉｔｉｓ（Ｍｏｎｔａｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）からの贈呈品であった（Ｂｕｒｒｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。
【０３２９】
免疫沈降では、細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、ＲＩＰＡ緩衝液中において４℃で３０分間溶解させた。５００μｇの細胞タンパク質および５μｌの１次抗体を、１ｍｌのＲＩＰＡ緩衝液と４℃で１時間混合させた。その後、５０μｌのタンパク質Ａアガロースビーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を混合物に加え、４時間回転させた。実験的分析に先立って、ビーズを氷冷ＰＢＳで洗浄した。基質としてのＧＳＴ−ＩκＢαを使用して、免疫沈降されたＩＫＫαおよび／または単離された小胞を用いて体外キナーゼアッセイを行った。１μｇのＧＳＴ−ＩκＢα、０．３ｍＭの冷ＡＴＰおよび１０μｌのキナーゼ緩衝液（４０ｍＭのヘペス、１ｍＭのβ−グリセロリン酸、１ｍＭのニトロフェノールフォスフェイト、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、１０ｍＭのＭｇＣｌ２および２ｍＭのＤＴＴ）中の１０μのＣｉ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを用いて、キナーゼ反応を行った。その後、反応物を３０℃で３０分間インキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質負荷緩衝液を加えて反応を終了させ、９８℃で５分間沸騰させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ゲルをニトロセルロース膜に移動させ、抗ＧＳＴ抗体を用いたプローブ前にＸ線フィルムに曝露した。
【０３３０】
酸化還元活性エンドソームの体内局所化およびＲＯＳ生成。ＯｘｙＢＵＲＳＴ  Ｇｒｅｅｎ  Ｈ２ＨＦＦ−ＢＳＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を使用して、エンドソーム内スーパーオキシドの体内局所化を行った。原液（１ｍｇ／ｍｌ）を、窒素下でＰＢＳ中にＨ２ＨＦＦ−ＢＳＡを溶解することにより使用直前に生成し、光から保護した。細胞を、５０μｇ／ｍｌのＯｘｙＢｕｒｓｔ  Ｇｒｅｅｎ  Ｈ２ＨＦＦ−ＢＳＡが存在する場合に２分間３７℃でインキュベートし、その後、ＩＬ−１β（１ｎｇ／ｍｌ）を加えて刺激した。刺激後の異なる時間（１〜１０分）で、細胞を４％のパラホルムアルデヒド中に固定し、蛍光顕微鏡法で評価した。種々の化合物（１ｍｇ／ｍｌ  ＳＯＤまたは１０μＭのＤＰＩ）をＩＬ−１β刺激時に加えた。抗ＥＥＡ１モノクローナル抗体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ−Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、Ｈ２ＨＦＦ−ＢＳＡおよびＥＥＡ１の共局所化を、固定後試料において免疫蛍光局所化により行った。Ｈ２ＤＣＦＤＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を使用して、総細胞ＲＯＳ（主に、Ｈ２Ｏ２）の体内局所化を行った。Ｈ２ＤＣＦＤＡの原液を、使用直前に濃度５０μｇ／ｍｌでＤＭＳＯ中に生成した。Ｈ２ＤＣＦＤＡ（１０μＭ）およびＩＬ−１β（１ｎｇ／ｍｌ）を、暗所においてＰＢＳ中３７℃で２０分間同時処置する前に、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。アデノウイルスベクターに感染した試料では、これは、ＩＬ−１βでの刺激前４８時間で行われた。ＳＯＤ／カタラーゼタンパク質を培地に加えた場合、これは、ＩＬ−１β刺激時に１ｍｇ／ｍｌの濃度で行われた。４％パラホルムアルデヒドにおける１０分間の洗浄および固定後、アンチフェーデントを含有するＤＡＰＩ中に細胞を載せ、ＤＣＦシグナルのための蛍光顕微鏡法で検査した。
【０３３１】
結果
エンドサイトーシスおよびエンドソームＲＯＳは、ＩＬ−１β媒介のＮＦκＢ活性化において重要な役割を担う。酸化還元感受性のシグナル変換を研究するため、ＮＦκＢのＩＬ−１β誘導を、モデルとしての上皮株化細胞（ＭＣＦ−７）において評価した。このモデルは、転写ＮＦκＢルシフェラーゼレポータのＩＬ−１β誘導が、組み換えアデノウイルス媒介のＧＰｘ１（細胞質中Ｈ２Ｏ２→Ｈ２Ｏ分解する）の過剰発現によって有意に抑制（約５０％）されたことを実証した。これらの研究において、ＧＦＰレポーターを使用して判断された組み換えアデノウイルスで、約８５％の細胞を形質導入した。同様に、ドミナントネガティブダイナミンＫ４４Ａ（Ａｄ．Ｄｙｎ（ＤＮ））の過剰発現によるエンドサイトーシスの部分的抑制（Ｃｏｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）も、同様の程度までＮＦκＢを抑制した。これらの所見は、ＲＯＳ生成およびエンドサイトーシスが、ＩＬ−１βによるかなりの割合のＮＦκＢ活性化を等価に必要としたことを示唆した。
【０３３２】
リガンド結合受容体のエンドサイトーシスは、細胞内シグナルの処理および伝播と複雑に連結することが多い（Ｓｏｒｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。しかし、エンドソーム内の受容体処理と酸化還元依存の活性化との連結の可能性は、過去に検討されていない。この結果に基づき、ＩＬ−１β後のエンドソーム由来のＲＯＳ生成は、酸化還元依存の工程を介して受容体／エフェクタ活性化を増幅させる原因となる場合があることを仮定された。この目的のため、エンドソーム区画からのＲＯＳクリアランスがＮＦκＢ活性化に影響を及ぼし得るかどうかを検討した。精製されたＣｕ／ＺｎＳＯＤおよびカタラーゼタンパク質を、１ｍｇ／ｍｌ濃度で培地に加えた際にＭＣＦ−７細胞により効果的に取り込んだ。実際に、ＭＣＦ−７細胞によるＣｕ／ＺｎＳＯＤおよびカタラーゼの細胞の取り込みは、用量依存性の方法において、ＩＬ−１βによるＩＫＫおよびＮＦκＢ活性化のどちらをも有意に減少させた。どちらかの単独よりもより効果的に、ＩＫＫおよびＮＦκＢ活性化をともに抑制するためのＣｕ／ＺｎＳＯＤおよびカタラーゼの相乗的能力により、エンドソーム
【０３３３】
【化６２】
2009521928.tif 000064
【０３３４】
およびＨ２Ｏ２の両方がＩＬ−１Ｒ１複合体活性化に関与した可能性が示唆された。さらに、細胞質ｉｃ  ＧＰｘ−１の過剰発現もＮＦκＢ活性化を抑制し、Ｈ２Ｏ２がＮＦκＢ経路の酸化還元−２次メッセンジャーであった可能性を示した。ＧＰｘ−１発現およびＣｕ／ＺｎＳＯＤ／カタラーゼの細胞負荷の両方によりＩＬ−１β処置後の細胞ＲＯＳが減少したことを確認するため、ＲＯＳ−感受性色素（Ｈ２ＤＣＦＤＡ）を使用して、種々の処置条件下で細胞ＲＯＳのレベルを評価した。ＩＬ−１β処置は、細胞ＲＯＳを刺激し、ＧＰｘ−１の発現またはＣｕ／ＺｎＳＯＤ／カタラーゼの細胞負荷はどちらもＤＣＦ蛍光を抑制した。これらの所見は、エンドソーム区画内のＲＯＳ産出の機構の検討、およびＩＬ−１Ｒ１複合体がＩＫＫ複合体活性化に適任となるように、かかるＲＯＳがどのように影響を及ぼし得たかを導いた。
【０３３５】
ＩＬ−１βは、ＴＲＡＦ６補充に必要なエンドソームＮＡＤＰＨ依存性の
【０３３６】
【化６３】
2009521928.tif 000065
【０３３７】
生成を刺激する。リガンド活性されたエンドソーム内のＮｏｘ複合体は、ＩＬ−１β媒介のＮＦκＢ活性化に必要なＲＯＳの源として機能する場合があることが仮定された。この目的のため、ＩＬ−１βがＭＣＦ−７細胞の小胞分画において、ＮＡＤＰＨ依存性の
【０３３８】
【化６４】
2009521928.tif 000066
【０３３９】
生成を刺激し得るかどうかを判断した。イオジキサノール密度勾配遠心分離によって単離されたピーク小胞分画は、それぞれ初期および回収エンドソームの小胞マーカーであるＲａｂ５およびＲａｂ１を発現させた（Ｚｅｒｉａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。また、これらは、この区画に対して予期されたような内在的ビオチン−トランスフェリンも含有した。しかし、小胞分画には、もしあれば、これらの区画からの少量の混入を示すミトコンドリアｍｔＨＳＰ７０、原形質膜Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰアーゼまたはペルオキシソームカタラーゼがない。対照的に、ピークＲａｂ５／１１小胞分画は、この単離戦略から予期されるようなＥＲ、ゴルジおよびリソソーム酵素との著しい重畳を示した。
【０３４０】
種々のイオジキサノール分画における
【０３４１】
【化６５】
2009521928.tif 000067
【０３４２】
生成を検出するためにルシゲニンベースの化学発光アッセイを使用して、ＮＡＤＰＨ依存性の
【０３４３】
【化６６】
2009521928.tif 000068
【０３４４】
生成率をＮｏｘ活性の指標として評価した。仮定されたように、ＩＬ−１β刺激は、ピーク小胞分画番号３〜４におけるＮＡＤＰＨ依存性の
【０３４５】
【化６７】
2009521928.tif 000069
【０３４６】
生成を有意に増加させた。ＩＬ−１βが、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性エンドソームの形成を誘発することを確証し、次に、ＩＫＫ／ＮＦκＢ活性化を抑制するための取り込まれたＲＯＳ除去酵素の能力によって予測されるように、
【０３４７】
【化６８】
2009521928.tif 000070
【０３４８】
が単離されたＩＬ−１β活性化されたエンドソームの管腔内で生成されたかどうかを確証することを目指した。この疑問に対応するため、エンドソーム内に取り込まれ、単離されたエンドソーム内部から
【０３４９】
【化６９】
2009521928.tif 000071
【０３５０】
を分解させる培地中Ｃｕ／ＺｎＳＯＤタンパク質の能力を評価した。Ｃｕ／ＺｎＳＯＤタンパク質ではなく、ルシニゲンが膜透過性であるため、エンドソーム内部で
【０３５１】
【化７０】
2009521928.tif 000072
【０３５２】
が生成された程度をルシゲニンベースの化学発光アッセイを使用して判断することができた。生化学的研究により、Ｃｕ／ＺｎＳＯＤタンパク質を培地［ＳＯＤ（ｍ）］に加えた場合、実際に単離されたエンドソーム内に取り込まれ、プロナーゼ消化に依然として抵抗性を有することが確認された。対照的に、無負荷の単離されたエンドソーム［ＳＯＤ（ｖ）］の外部に加えられたＣｕ／ＺｎＳＯＤは、プロナーゼによって効果的に分解された。予期されたように、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を用いたエンドソーム膜の破壊は、管腔内Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ［ＳＯＤ（ｍ）］をプロナーゼ分解に対して感作にさせた。したがって、培地中のＣｕ／ＺｎＳＯＤタンパク質は、実際にエンドソーム区画内に取り込まれた。このウシＣｕ／ＺｎＳＯＤ（ｂＳＯＤ）エンドソーム負荷実験からの予期されない所見は、内因性細胞ヒトＣｕ／ＺｎＳＯＤ（ｈＳＯＤ）タンパク質の小胞膜へのＩＬ−１β依存性の補充であった。この細胞ヒトＣｕ／ＺｎＳＯＤは、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００が存在しない場合にプロナーゼ消化に対して感受性があり、エンドソーム表面上に存在したことを示した。これらの所見により、Ｃｕ／ＺｎＳＯＤは、ＩＬ−１β刺激後のＲＯＳ代謝においてエンドソームレベルで積極的役割を担う場合があるという興味深い可能性が示唆される。
【０３５３】
単離された小胞によるＩＬ−１β誘導の
【０３５４】
【化７１】
2009521928.tif 000073
【０３５５】
生成を抑制する管腔内Ｃｕ／ＺｎＳＯＤの能力により、
【０３５６】
【化７２】
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【０３５７】
の大部分が、単離されたエンドソーム内部で生成されたことが示唆された。ルシゲニン反応物へのＫＣＮ（Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ阻害剤）の添加は、この抑制を完全に逆転させ、抑制効果が酵素的Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ活性に特に起因したことを実証した。また、ＩＬ−１β活性されたエンドソームによる
【０３５８】
【化７３】
2009521928.tif 000075
【０３５９】
のＮＡＤＰＨ依存性の生成向上も、電子スピン共鳴分光法（ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｓｐｉｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＥＳＲ）を用いて確認した。このような状況において、ＤＭＰＯ付加体形成は、小胞の単離およびＥＳＲ分析前に、カタラーゼではなくＣｕ／ＺｎＳＯＤのエンドソーム負荷によって完全に抑制された。この所見は、Ｈ２Ｏ２ではなく
【０３６０】
【化７４】
2009521928.tif 000076
【０３６１】
がＥＳＲシグナルをもたらす優性ＲＯＳであったことが実証した。また、ピーク小胞分画におけるＮＡＤＰＨ依存性の
【０３６２】
【化７５】
2009521928.tif 000077
【０３６３】
生成は、ジフェニレンヨードニウム（ｄｉｐｈｅｎｙｌｅｎｅ  ｉｏｄｏｎｉｕｍ：ＤＰＩ）（ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤）に対して感受性があったが、ロテノンまたはアンチマイシンＡ（それぞれ、ミトコンドリア電子伝達鎖状錯体ＩまたはＩＩＩの特異的阻害剤）に対しては感受性がなかった。これらの所見は、小胞分画におけるＲＯＳ産出源としての著しいミトコンドリア混入は除外した。また、エンドソーム
【０３６４】
【化７６】
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【０３６５】
のＩＬ−１β刺激は、後の空ベクター制御アデノウイルスとの感染ではなく、Ａｄ．Ｄｙｎ（ＤＮ）感染の存在を７５％減少させることによって示されるように、エンドサイトーシスに依存した。かかる減少は、Ａｄ．Ｄｙｎ（ＤＮ）感染後のランスフェリン取り込みの抑制程度を密接に反映した。累積的に、これらの研究およびＣｕ／ＺｎＳＯＤ／カタラーゼのエンドソーム負荷により、ＩＬ−１β刺激されたＤＣＦ蛍光が有意に減少されたため、ＩＬ−１βは、受容体エンドサイトーシス後に、主にエンドソーム区画内のＭＣＦ−７細胞において
【０３６６】
【化７７】
2009521928.tif 000079
【０３６７】
およびＨ２Ｏ２生成を誘発することが示唆される。
【０３６８】
ＩＬ−１βによるＩＫＫおよびＮＦκＢ活性化を抑制するための、エンドソーム区画内部からのＲＯＳクリアランスの能力を考慮すると、酸化還元活性エンドソームは、ＩＬ−１Ｒ複合体の空間的に制御された酸化還元依存の活性化に対する細胞内フレームワークを提供し得ることが仮定された。ＭｙＤ８８は、リガンド結合後にＩＬ−１Ｒ１へ補充される第１のエフェクタのうちの１つとして認識されている。この工程は、エフェクタおよびアダプターの順序付けられた補充（ＩＬ−１Ｒ１→ＭｙＤ８８→ＩＲＡＫ→ＴＲＡＦ６）を刺激し、最終的に、ＮＦκＢを活性化させることが可能な活性ＩＫＫキナーゼ複合体の形成をもたらす（Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。ＳＯＤおよびカタラーゼのエンドソーム負荷を使用して、ＭｙＤ８８の酸化還元依存性およびＩＬ−１β刺激後のエンドソーム区画へのＴＲＡＦ６補充を、精製された小胞分画において評価した。これらの実験結果は、ＩＬ−１β刺激後のエンドソーム区画へのＴＲＡＦ６補充が、ＳＯＤ／カタラーゼのエンドソーム負荷によって約５０％減少されたことを示し、その所見は同様の条件下における総細胞ＩＫＫキナーゼ活性の減少を密接に反映した。対照的に、ＲＯＳクリアランス酵素のエンドソーム負荷は、ＩＬ−１β刺激後のエンドソーム区画へのＭｙＤ８８補充を変化させなかった。これらの所見により、ＴＲＡＦ６のＩＬ−１Ｒ１への補充は、酸化還元依存の方法においてエンドソームレベルで発生し得ることが示唆された。
【０３６９】
ＩＬ−１βは、エンドソーム区画におけるＮｏｘ２複合体活性化を誘発する。ＩＬ−１βが、ＮＡＤＰＨ依存性の方法においてエンドソーム区画による
【０３７０】
【化７８】
2009521928.tif 000080
【０３７１】
生成を誘発することを確証し、エンドソーム
【０３７２】
【化７９】
2009521928.tif 000081
【０３７３】
生成に関与する場合のある候補Ｎｏｘ酵素を特定した。エンドソーム区画におけるＮｏｘ活性化は、概してエンドサイトーシスに依存するため、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ複合体の特異的サブユニットは、リガンド刺激後にエンドソーム内へ補充される可能性が仮定された。ＭＣＦ−７細胞におけるＮｏｘ１、２、３、４、５ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析は、Ｎｏｘ２およびＮｏｘ５  ｍＲＮＡ発現のみがこの株化細胞内で検出可能であったことを実証した。精製されたエンドソームのその後の分析は、ＩＬ−１β刺激が、３つの既知のＮｏｘ２活性化因子（Ｒａｃ１、ｐ６７ｐｈｏｘおよびｐ４７ｐｈｏｘ）の内膜への補充を促進したことを実証した。さらに、ダイナミン（Ｋ４４Ａ）の発現を介してエンドサイトーシスを抑制することは［つまり、Ａｄ．Ｄｙｎ（ＤＮ）感染後］、小胞分画へのＲａｃ１、ｐ６７ｐｈｏｘおよびｐ４７ｐｈｏｘのＩＬ−１β媒介の補充を有意に軽減させた。これらの所見は、ＩＬ−１β刺激後の膜内在化が活性エンドソームＮｏｘ複合体の形成に必要であったことを示した。また、これらは、エンドサイトーシスがエンドソーム区画による
【０３７４】
【化８０】
2009521928.tif 000082
【０３７５】
のＩＬ−１β誘導に必要であるという以前の所見も立証した。
【０３７６】
次に、リガンド刺激後のエンドソーム区画への種々のＩＬ−１Ｒ１（ＭｙＤ８８、ＴＲＡＦ６）またはＮｏｘ（Ｒａｃ１、ｐ６７ｐｈｏｘ、ｐ４７ｐｈｏｘ）エフェクタの補充に、どのようにエンドソーム
【０３７７】
【化８１】
2009521928.tif 000083
【０３７８】
および／またはＨ２Ｏ２が影響を及ぼし得るかを評価した。この目的のため、ＳＯＤまたはＳＯＤ／カタラーゼを培地に加えることによって、ＩＬ−１β刺激時にエンドソームを負荷し、これらの種々のエフェクタの単離されたエンドソームへの補充を評価した。これらの実験結果は、ＳＯＤ／カタラーゼの組み合わせのみが、ＩＬ−１β刺激後にＴＲＡＦ６のエンドソームへの補充を抑制したことを実証した。ＳＯＤ負荷単独での機能的効果の欠如により、Ｈ２Ｏ２は、ＴＲＡＦ６のエンドソームへの補充に必要な１次ＲＯＳエフェクタであることが示唆された。対照的に、ＩＬ−１β活性化されたエンドソームへのＭｙＤ８８、Ｒａｃ１、ｐ６７ｐｈｏｘまたはｐ４７ｐｈｏｘの補充は、ＳＯＤまたはＳＯＤ／カタラーゼ負荷による影響を受けないままだった。エンドソーム内へのＩＬ−１Ｒ１、Ｎｏｘ２、ＭｙＤ８８およびＴＲＡＦ６補充の動態解析は、ＭｙＤ８８補充と一致し、最大エンドサイトーシスがＩＬ−１処置後１５〜３０分までに発生したことを実証した。Ｎｏｘ２由来のＲＯＳがＩＬ−１Ｒ１エンドソーム複合体への結合を容易にするために必要であるかどうか予想されたとおり、エンドソームへのＴＲＡＦ６補充は、エンドソーム区画におけるＮｏｘ２の最大レベルを遅延させた。興味深いことに、Ｎｏｘ２は、ＩＬ−１Ｒ１よりもエンドソーム区画からより早急に排除され、ＴＲＡＦ６の最大補充が行われた後に、エンドソーム処理はＮｏｘ２を除去することが示唆された。ＳＯＤ／カタラーゼの負荷は、すべての時点において、エンドソームへのＴＲＡＦ６補充を減少させたが、エンドソームにおけるＩＬ−１Ｒ１、Ｎｏｘ２またはＭｙＤ８８レベルには影響を与えなかった。累積的に、これらの研究により、ＩＬ−１β刺激後のエンドソームＮｏｘ複合体の活性化は、原形質膜からのエンドサイトーシスに依存し、またこの工程は、そのエンドソームリガンド活性化された受容体複合体へのＴＲＡＦ６の酸化還元依存の補充に影響を及ぼすことが示唆される。
【０３７９】
Ｒａｃ１、ｐ６７ｐｈｏｘおよびｐ４７ｐｈｏｘはすべて、Ｎｏｘ３、４または５ではなくＮｏｘ１および２の活性化補助因子として結合している（Ｌａｍｂｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。Ｎｏｘ５およびＮｏｘ２  ｍＲＮＡ発現のみがＭＣＦ−７細胞内で検出されたとすれば、Ｎｏｘ２は、ＩＬ−１β刺激後のエンドソーム区画によるＲＯＳ生成に関与する場合がある。この仮説に対応するために２つのアプローチを使用した。第１のアプローチは、過渡の形質移入を用いてＮｏｘ２を異所的に過剰発現させることにより、エンドソームＲＯＳ生成を調節する試みを含んだ。不適切なｐｃＤＮＡプラスミドの形質移入と比べて、Ｎｏｘ２の異所性発現は、単離されたＩＬ−１β刺激されたエンドソームによるＮＡＤＰＨ依存性の
【０３８０】
【化８２】
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【０３８１】
生成を有意に向上させた。さらに、Ｎｏｘ２の過剰発現は、ＩＬ−１β刺激後のみにエンドソーム内へのＮｏｘ２の取り込みを有意に向上させた。内因性Ｎｏｘ２のレベルは、ＭＣＦ−７細胞において極めて低かったが、またこれらの研究は、ＩＬ−１β刺激後のみに内因性Ｎｏｘ２のエンドソームへの補充を向上させたことも実証した。第２のアプローチを使用して、不適切なスクランブルｓｉＲＮＡではなく、Ｎｏｘ２  ｓｉＲＮＡが、ＭＣＦ−７細胞におけるＮｏｘ２タンパク質発現と、単離されたＩＬ−１β刺激されたエンドソームによるＮＡＤＰＨ依存性の
【０３８２】
【化８３】
2009521928.tif 000085
【０３８３】
生成とを有意に抑制したことを実証した。さらに、Ｎｏｘ２  ｓｉＲＮＡは、ＩＬ−１β刺激後のエンドソームへの異所的に発現された、および内因性Ｎｏｘ２の両方の補充を有意に減少させた。また、スクランブルｓｉＲＮＡではなくＮｏｘ２  ｓｉＲＮＡは、ＩＬ−１β誘導のＮＦκＢ転写活性化およびエンドソームＮＡＤＰＨ依存性のスーパーオキシド生成も同様の程度まで軽減させた。累積的に、これらの研究は、Ｎｏｘ２複合体がＬ−１β刺激されたエンドソームにおいて活性化されるという、強力な分子および機能的立証を提供する。
【０３８４】
ＩＬ−１βは、初期エンドソームにおいてＮｏｘ２複合体活性化を誘発する。リガンド刺激されたエンドサイトーシスが、エンドソーム区画におけるＮｏｘ２活性化に必要とされたという所見に基づいて、次に、これらの酸化還元活性エンドソームの形成が初期エンドソームのレベルで開始した可能性が仮定された。この仮説を検討するため、膜不浸透性のＢＳＡ共役された蛍光色素ジヒドロ−２’，４，５，６，７，７’−ヘキサフルオロフルオレセイン（Ｈ２ＨＦＦ−ＢＳＡ）を使用して、初期エンドソーム区画におけるＲＯＳ生成をプローブした。Ｈ２ＨＦＦ−ＢＳＡが存在する場合に細胞をインキュベートすることにより、エンドソーム区画に、この色素および緑色蛍光シグナルによって検出された
【０３８５】
【化８４】
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【０３８６】
を負荷させた。この研究は、１０分間のＩＬ−１β処置後にＨ２ＨＦＦ−ＢＳＡエンドソーム蛍光が飛躍的に増加したことを実証した。ＩＬ−１β誘導のＨ２ＨＦＦ−ＢＳＡ蛍光は、ＤＰＩで細胞を負荷することにより、またはエンドソーム区画内へ精製されたＣｕ／ＺｎＳＯＤタンパク質を負荷することにより有意に抑制された。これらの所見により、Ｎｏｘ由来の
【０３８７】
【化８５】
2009521928.tif 000087
【０３８８】
は、エンドソーム区画においてＨ２ＨＦＦ−ＢＳＡにより検出された主要なＲＯＳであったことが確認された。Ｈ２ＨＦＦ−ＢＳＡおよびＥａｒｌｙ  Ｅｎｄｏｓｏｍａｌ  Ａｎｔｉｇｅｎ−１（ＥＥＡ１）を用いた共局所化研究は、刺激されていない細胞と比較すると、ＩＬ−１βが、ＥＥＡ１およびＨ２ＨＦＦ−ＢＳＡ共陽性エンドソームの存在量を有意に増加させたことを実証した。さらに、ＩＬ−１β刺激は、ＥＥＡ１を含有しなかったＨ２ＨＦＦ−ＢＳＡ陽性エンドソームの増加をもたらした。しかし、この集団は、刺激後の初期時点ではあまり豊富ではなく、時間とともに増加した。これらの所見は、リガンド刺激された
【０３８９】
【化８６】
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【０３９０】
を生成する酸化還元活性エンドソームがＥＥＡ１区画内で生じ、その一方で、下流エンドソーム区画内へ処理された後に
【０３９１】
【化８７】
2009521928.tif 000089
【０３９２】
を生成する何らかの能力を保持する概念と一致する。
【０３９３】
ＩＬ−１β刺激後の初期エンドソーム区画における酸化還元活性エンドソーム形成に対して、さらなる生化学的立証を提供するため、免疫親和性単離手順を用いて初期Ｒａｂ５陽性エンドソームを精製した。初期エンドソーム特異的ＧＴＰアーゼであるＲａｂ５は、初期エンドソームの輸送および膜融合において重要な役割を担う。この区画の精製は、Ｄｙｎａビーズに連結した抗ＨＡ抗体を使用して、組み換えＨＡタグ付きＲａｂ５の過剰発現と、イオジキサノール単離されたエンドソームからの免疫親和性単離とにより促進された。これらの免疫親和性単離実験の結果は、Ｎｏｘ活性（つまり、ＮＡＤＰＨ依存性の
【０３９４】
【化８８】
2009521928.tif 000090
【０３９５】
生成）の大部分が、ＩＬ−１β刺激後にＨＡ−Ｒａｂ５区画（Ｄｙｎａｂｅａｄ  ｐｅｌｌｅｔ）に付随したことを実証した。この活性は、開始分画における総ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の約１／３を表した。この単離工程の特異性は、幾つかの基準により確認された。まず、精製されたＲａｂ５エンドソーム分画において、Ｒａｂ１１回収エンドソームの有意な混入は見られなかった。次に、第２の抗体単独で被覆された、または１ｏおよび２ｏ抗体で対照のＧＦＰ形質移入された細胞から単離されたＤｙｎａビーズは、ビーズに付随した低背景レベルのＮｏｘ活性のみを示した。また、Ｒａｂ５単離されたエンドソームの完全性も、ＩＬ−１β処置時に負荷された小胞内ビオチン−トランスフェリンの保持率によって確認された。ＨＡ親和性−単離（約７５％）の有効性を考えると、これらの結果により、少なくとも半分の酸化還元活性エンドソームは、評価された時点（２０分）でＲａｂ５と付随した初期エンドソームであったことが示唆された。Ｒａｂ５区画が、その後の受容体エンドサイトーシを形成するための最も早いエンドソーム区画であることを考慮すると、これらの研究は、Ｎｏｘ２が原形質膜から酸化還元活性エンドソーム内へ補充されるという仮説も支持する。
【０３９６】
Ｒａｃ１およびＭｙＤ８８はどちらも、酸化還元活性エンドソームの形成、ＩＬ−１Ｒ１へのＴＲＡＦ６補充、およびＩＬ−１β刺激後のＮＦκＢ活性化を制御する。これまで
のデータは、ＩＬ−１β刺激がＮｏｘ２複合体サブユニット（Ｎｏｘ２、Ｒａｃ１、ｐ４７ｐｈｏｘおよびｐ６７ｐｈｏｘ）を含有する酸化還元活性エンドソームの形成をもたらすことを実証している。これらのＮｏｘ２活性エンドソームによるＲＯＳ産出は、ＭｙＤ８８ではなくＴＲＡＦ６の小胞膜への補充に重要であった。エンドソーム区画におけるＮｏｘ２活性化が、活性エンドサイトーシスを必要としたことを考慮すると、ＩＬ−１Ｒ１を結合したＩＬ−１βの内部移行は、Ｎｏｘ２触媒サブユニットのエンドソーム内への補充を調整することが推論された。しかし、現在、リガンド結合後のＩＬ−１Ｒ１内部移行のための分子決定要因を説明する報告はない。例えば、ＭｙＤ８８は、リガンド結合後にＩＬ−１Ｒ１へ補充するための第１のエフェクタのうちの１つとして知られ、ＩＬ−１Ｒ１によるＮＦκＢ活性化に必須であるが（Ａｋｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、ＭｙＤ８８がリガンド結合後の受容体内部移行に必須であるかどうかは不明である。さらに、過去の研究により、Ｒａｃ１は、ＭｙＤ８８との相互作用を介してＩＬ−１Ｒ１複合体と付随することが示されている（Ｊｅｆｆｒｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。Ｒａｃ１は、活性Ｎｏｘ２複合体の一部であることが既知であるため、Ｒａｃ１は、原形質膜で受容体複合体とのその相互作用を介して、エンドソームを含有するＩＬ−１Ｒ１内へＮｏｘ２を補充し得ることが推論された。ＩＬ−１β刺激がＥＥＡ１／Ｒａｂ５陽性初期エンドソームにおける
【０３９７】
【化８９】
2009521928.tif 000091
【０３９８】
生成を促進させることを実証する本発明の所見は、また、Ｎｏｘ２（内在性膜タンパク質）が原形質膜から非常に初期にエンドソーム区画に介入する仮説も支持する。
【０３９９】
ＩＬ−１Ｒ１の内部移行および酸化還元活性エンドソームの形成におけるＭｙＤ８８およびＲａｃ１の貢献を検討するため、ＭｙＤ８８およびＲａｃ１発現のどちらも抑制するためのＲＮＡ抑制（ＲＮＡｉ）戦略を探求した。ＭｙＤ８８またはＲａｃ１のいずれか一方を標的にするｓｉＲＮＡの形質移入は、それらの発現をタンパク質レベルで効果的に抑制した。かかる抑制は、スクランブルｓｉＲＮＡ対照では観察されなかった。ＭｙＤ８８欠損細胞における過去の研究から予測されるように（Ａｋｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、ＮＦκＢ活性化は、ＭｙＤ８８  ｓｉＲＮＡによって有意に抑制された。興味深いことに、Ｒａｃ１  ｓｉＲＮＡも、ＭｙＤ８８  ｓｉＲＮＡで見られるものと同様の程度までＮＦκＢ活性化を抑制した。しかし、ＭｙＤ８８およびＲａｃ１  ｓｉＲＮＡ両方の同時形質移入は、いずれかのｓｉＲＮＡ単独と比較してＮＦκＢの付加的な抑制を提供しなかったため、２つの要因は、ＩＬ−１βによりＮＦκＢを活性化させるために同一の経路で作用することが示唆された。さらに、ＭｙＤ８８またはＲａｃ１  ｓｉＲＮＡは、ＩＬ−１β接種後にエンドソーム区画による
【０４００】
【化９０】
2009521928.tif 000092
【０４０１】
生成を抑制したが、Ｒａｃ１  ｓｉＲＮＡは僅かに大きなレベルの抑制を提供した。これらの所見により、ＭｙＤ８８およびＲａｃ１はどちらも、ＩＬ−１β刺激後のエンドソーム区画におけるＮＦκＢ活性化およびＮｏｘ２活性化にとって重要であったことが示唆された。
【０４０２】
次に、Ｒａｃ１が実際にＩＬ−１Ｒ１と結合したかどうか、またその場合、この相互作用がＭｙＤ８８に依存したかどうかを検討した。実際に、Ｒａｃ１は、リガンドシミュレーション後の免疫沈降したＩＬ−１Ｒ１と付随することが観察された。しかし、ＩＬ−１Ｒ１複合体と結合するＲａｃ１がＭｙＤ８８に依存したことを示す過去の報告とは対照的に（Ｊｅｆｆｒｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、ＭｙＤ８８レベルがＲＮＡｉによって有意に減少した場合に、ＩＬ−１Ｒ１と付随するＲａｃ１の非常に僅かな減少が観察された。同様に、Ｒａｃ１  ｓｉＲＮＡは、ＩＬ−１Ｒ１と付随する、ＭｙＤ８８ではなくＲａｃ１を減少させた。これらの所見により、ＭｙＤ８８およびＲａｃ１は、リガンド刺激後に独立にＩＬ−１Ｒ１と付随することが示唆される。しかし、ＭｙＤ８８またはＲａｃ１のいずれか一方のＲＮＡｉ抑制は、受容体複合体へのＴＲＡＦ６補充を抑止した。この所見は、ＭｙＤ８８またはＲａｃ１に対するＲＮＡｉが、酸化還元活性エンドソームの形成およびＮＦκＢ活性化を抑制した事実と一致する。エンドソームＲＯＳがＩＬ−１β刺激後のエンドソームへのＴＲＡＦ６補充にとって重要であったことを考慮すると、これらの研究により、ＭｙＤ８８およびＲａｃ１が、酸化還元活性エンドソームの形成、ＩＬ−１Ｒ１へのＴＲＡＦ６の酸化還元依存の補充、およびＮＦκＢ活性化に関与する２つの重要な要因であることが示される。
【０４０３】
酸化還元活性エンドソームの形成においてＭｙＤ８８およびＲａｃ１が担う役割を判断するため、これら２つの要因の、酸化還元活性エンドソームへの受容体およびＮｏｘ２の内部移行に関する貢献を分析した。ＭｙＤ８８は、リガンド結合後に受容体のエンドサイトーシスを開始するための主要な役割を担い、一方で、Ｒａｃ１は、リガンド結合受容体を内部に持っているエンドソーム内へのＮｏｘ２の補充に関与していたことが推論された。ＭＣＦ−７細胞にＭｙＤ８８またはＲａｃ１を形質移入し、内膜画分へのＩＬ−１Ｒ１、ＭｙＤ８８、ＴＲＡＦ６、ＲａｃｌおよびＮｏｘ２の補充をウエスタンブロット法で評価した。これらの研究からの所見により、ＲＮＡｉによるＭｙＤ８８抑制は、ＩＬ−１Ｒ１の内部移行および内膜へのＭｙＤ８８、ＴＲＡＦ６、Ｒａｃ１およびＮｏｘ２の補充を有意に減弱させたことが実証された。これらの所見は、エンドソーム区画へのＲａｃ１／Ｎｏｘ２複合体の受容体媒介のエンドサイトーシスを抑制することによって、ダイナミンＫ４４Ａと同様の方法でＩＬ−１β刺激後に酸化還元活性エンドソームの形成を、ＭｙＤ８８の抑制が抑止することを実証する。ＭｙＤ８８  ｓｉＲＮＡとは対照的に、Ｒａｃ１  ｓｉＲＮＡは、リガンド刺激後にＩＬ−１Ｒ１／ＭｙＤ８８内部移行を抑制しなかったが、むしろエンドソーム区画へのＲａｃ１、Ｎｏｘ２およびＴＲＡＦ６の補充を有意に抑制した。エンドソーム区画へのＴＲＡＦ６補充の酸化還元依存性とともに、これらの所見により、Ｒａｃ１が、エンドソーム区画におけるＮｏｘ２の補充／活性化を促進することによって、エンドソームリガンド活性化されたＩＬ−１Ｒ１へＴＲＡＦ６補充するための重要な役割を担うことが示唆される。累積的に、これらの研究は、ＭｙＤ８８およびＲａｃ１がどちらも、受容体のエンドサイトーシスおよびＮｏｘ２の補充をそれぞれ調整することによって、酸化還元活性エンドソームの形成を確立するために重要な役割を担うことを示す。両工程は、ＩＬ−１β刺激後のエンドソーム区画におけるリガンド活性化されたＩＬ−１Ｒ１へのＴＲＡＦ６の効果的な補充およびＩＫＫ／ＮＦκＢ活性化にとって重要である。
【０４０４】
ＭｙＤ８８は、原形質膜でＩＬ−１Ｒ１に結合し、一方、ＴＲＡＦ６は、Ｈ２Ｏ２依存性の方法でエンドソームＩＬ−１Ｒ１へ補充される。これらの所見により、ＭｙＤ８８はエンドソーム区画内へのＩＬ−１Ｒ１内部移行にとって必須であることが初めて実証され、また、ＭｙＤ８８は、リガンド結合後および受容体内部移行前に原形質膜へ補充されることが示唆される。さらに、ＩＬ−１β活性化されたエンドソームへのＭｙＤ８８の補充は、エンドソーム酸化還元状態に依存しなかった。対照的に、本発明の研究は、ＩＬ−１β活性化されたエンドソームへのＴＲＡＦ６補充が、エンドソーム区画によるＲＯＳ生成に依存したことを実証する。これらの所見により、ＴＲＡＦ６のＩＬ−１Ｒ１補充が、酸化還元依存の方法においてエンドソームレベルで発生する可能性が示唆された。さらに、カタラーゼおよびＳＯＤエンドソーム負荷は、ＩＬ−１β媒介のＴＲＡＦ６エンドソーム補充およびＩＫＫ活性化を効果的に阻止するために必要であったため、Ｎｏｘ２由来のＨ２Ｏ２は、ＴＲＡＦ６のエンドソームへの補充に必要であったことが仮定された。この仮説を検討するため、ＭｙＤ８８およびＴＲＡＦ６が、リガンド結合後に原形質膜およびエンドソーム区画においてＩＬ−１Ｒ１へ補充される程度、およびこれらの工程がにＨ２Ｏ２依存した程度を評価した。
【０４０５】
原形質膜におけるＩＬ−１Ｒ１へのＭｙＤ８８およびＴＲＡＦ６の補充を評価するため、エンドサイトーシスが阻止された（４℃で）またはダイナミン（Ｋ４４Ａ）発現により有意に抑制された条件下で実験を行った。これらの実験結果は、エンドサイトーシスを抑制することにより、免疫沈降したリガンド活性化されたＩＬ−１Ｒ１へのＭｙＤ８８ではなくＴＲＡＦ６の補充が有意に損なったことを立証した。例えば、４℃でエンドサイトーシスが存在しない場合において、ＴＲＡＦ６は、ＩＬ−１β刺激後にＩＬ−１Ｒ１に結合することができず、一方で、ＭｙＤ８８結合は３７℃で見られたものと同様であった。興味深いことに、ＴＲＡＦ６→ＩＬ−１Ｒ１の酸化還元依存の補充は、外因性Ｈ２Ｏ２の添加によってエンドサイトーシスが存在しない場合に原形質膜で再構成されることができた。５００μＭのＨ２Ｏ２は、４℃の原形質膜でリガンド活性化されたＩＬ−１Ｒ１へのみ、ＴＲＡＦ６の補充を促進した。そのような所見は、ＩＬ−１Ｒ１活性化の幾つかの側面に新しい見識を提供する。まず、リガンド活性化されたＩＬ−１Ｒ１へのＴＲＡＦ６エフェクタ補充は、エンドソームレベルで主に発生することを実証する。次に、Ｈ２Ｏ２は、リガンド活性化されたＩＬ−１Ｒ１へのＴＲＡＦ６補充を容易にするＲＯＳであり得ることを実証する。最後に、この補充工程へのＨ２Ｏ２の源としての、エンドソームにおけるＮｏｘ２活性化の生理学的フレームワークを提供する。
【０４０６】
エンドソームＲＯＳは、エンドソーム区画によるＩＫＫのＩＬ−１β依存性の活性化を増強させる。ＩＬ−１Ｒ１のリガンド活性化は、その受容体と付随したエフェクタ複合体への少なくとも２つの潜在的なＩＫＫキナーゼ（ＴＡＫ１および／またはＮＩＫ）を介してＩＫＫ活性化を促進する（Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。ＩＫＫ複合体が、活性化された受容体複合体によってリン酸化されると、ＩＫＫは、ＩκＢα／βをリン酸化するように活性化され、ＮＦκＢは核に動員される。酸化還元活性エンドソームがどのようにＮＦκＢ活性化を機能的に調節するかをより理解するため、次に、単離されたＩＬ−１β刺激されたエンドソームが直接的にＩＫＫ複合体を活性化できるかどうかを検討した。この体外再構成アッセイは、キナーゼ活性化源としての単離された小胞分画および免疫沈降されたＩＫＫ複合体と、ＩＫＫ活性化の分子マーカーとしてのＧＳＴ−ＩκＢαのリン酸化とを活用した。まず、ＩＬ−１β処置された細胞から単離されたエンドソームは、自然細胞からの免疫沈降されたＩＫＫ複合体を活性化できることが立証された。ＩＬ−１β処置されていない細胞からの免疫沈降されたＩＫＫ複合体は、ＩＬ−１β活性化されたエンドソームが存在する場合にＧＳＴ−ＩκＢαをリン酸化するように活性化された。刺激されていないエンドソームが存在する場合において活性化は見られなかった。さらに、ＩＬ−１β活性化されたエンドソームへの両ＳＯＤおよびカタラーゼの負荷は、ＩＫＫを活性化させる能力を有意に抑制し、一方、単独のＳＯＤ負荷はあまり影響を及ぼさなかった。これらの所見は、ＩＫＫの活性化におけるエンドソーム由来のＲＯＳの重要性に対する直接的な確証を提供し、Ｈ２Ｏ２が受容体複合体へのＴＲＡＦ６補充に必要とされる１次ＲＯＳであることと一致する。同様に、ダイナミン（Ｋ４４Ａ）が酸化還元活性エンドソームの形成およびＩＬ−１Ｒ１へのＴＲＡＦ６の補充を抑制したことから予期されるように、ダイナミン（Ｋ４４Ａ）の発現も、小胞のＩＫＫ活性化を抑制した。興味深いことに、低レベルのＧＳＴ−ＩκＢαリン酸化は、免疫沈降された自然ＩＫＫ複合体が存在しない場合にＩＬ−１β活性化されたエンドソームで観察された。この所見により、ＩＫＫ複合体が、酸化還元活性エンドソーム上の活性化された受容体複合体を過渡的にのみ付随させる可能性が示唆される。かかる所見は、ＩκＢαが、Ｓ４２／Ｓ４６上でリン酸化されると、ＩＫＫ複合体から解離することを実証する、ＩκＢα／ＩＫＫ複合体相互作用と同様である（Ｒｅｇｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。
【０４０７】
考察
エンドサイトーシスは、原形質膜で受容体媒介のシグナル伝達を下方調節する伝統的な機構として長い間みなされている。しかし、増大する確証により、エンドサイトーシスはまた、膜開始された受容体シグナルの活性化、増幅および分類において重要な役割を担うことが指摘されている（Ｓｏｒｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。ここで、Ｎｏｘ２活性化に連結した受容体活性化および初期エンドソーム区画によるＲＯＳ  生成の新しい酸化還元依存の機構を説明する。ＩＬ−１β刺激後のＮｏｘ２活性エンドソームの特定は、ＲＯＳがどのようにＮＦκＢの受容体活性化に影響を及ぼすことができるかを理解するためのフレームワークを提供した。ＮＦκＢの活性化におけるＲＯＳ関与の概念は依然として議論の余地があるが、（Ｈａｙａｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、幾つかの報告は、過剰発現したグルタチオンペルオキシダーゼでの抑制を実証することにより、ＩＬ−１βおよびＮＦκＢのＴＮＦα活性化における主要なメディエーターとしてのＨ２Ｏ２を含意している（Ｋｒｅｔｚ−Ｒｅｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。本発明の研究からの所見は、リガンド結合後のＩＬ−１Ｒ１エンドサイトーシスと、それに続く、エンドソーム区画におけるＭｙＤ８８／ＩＬ−１Ｒ１  複合体へのＴＲＡＦ６のＨ２Ｏ２依存性の補充とを制御する一連の諸現象を明らかにしている。この酸化還元依存の工程は、ＩＫＫ複合体およびＮＦκＢの効率的な活性化に必要であった。
【０４０８】
研究は、ＩＬ−１β刺激後にエンドソーム区画においてＮｏｘ２活性化を制御する分子諸現象を判断することに焦点を当てている。これに関連して、リガンド活性化されたＩＬ−１Ｒ１のエンドサイトーシスは、効率的なＮｏｘ２複合体活性化およびエンドソーム区画によるＲＯＳの生成に必要であった。この工程は、リガンド活性化されたエンドソームＩＬ−１Ｒ１エフェクタ複合体へのＴＲＡＦ６の酸化還元依存の補充およびその後のＩＫＫ活性化に関与する主要な制御諸現象であった。ＩＬ−１Ｒ１に結合するＲａｃ１は、ＩＬ−１β刺激後のエンドソーム区画内へのＮｏｘ２補充を媒介するための中心的役割を担うようであった。Ｒａｃ１は、Ｎｏｘ複合体へｐ６７ｐｈｏｘを補充することによるＮｏｘ２活性化において必須の役割を担うと主に考えられている（Ｄｉｅｋｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。これらの研究は、Ｒａｃ１が、リガンド活性化された受容体を用いてＮｏｘ２を適切な細胞区画へ局在化させるように機能することもできることを初めて実証する。ＭｙＤ８８とは対照的に、Ｒａｃ１は、リガンド結合後のエンドサイトーシスに必要であるとは考えられなかった。しかし、両エフェクタは、エンドソーム区画におけるＮｏｘ活性化に貢献し、したがて、ＩＬ−１Ｒ１へのＴＲＡＦ６の酸化還元依存の補充に貢献した。要約すれば、ＭｙＤ８８の抑制は、リガンド活性化されたＩＬ−１Ｒ１のエンドサイトーシスを抑制することによって、エンドソーム区画におけるＮｏｘ２活性化およびＴＲＡＦ６補充を減少させた（ダイナミンＫ４４Ａと同様の方法で）。対照的に、Ｒａｃ１抑制は、リガンド活性化されたＩＬ−１Ｒ１に繋留するＮｏｘ２を阻止することによって、エンドソーム区画におけるＮｏｘ２活性化を恐らく減少させた。しかし、Ｒａｃ１が受容体に直接結合するのか、または第２の不明エフェクタ（ＭｙＤ８８以外）を介して結合するかどうかは現在のところ明らかではない。
【０４０９】
チオール基の酸化は、タンパク質機能の酸化還元依存的変化を誘発する機構として把握されている（Ｇｅｏｒｇｉｏｕ、２００２、Ｋａｍａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。原形質膜（４℃で）でリガンド活性化されたＩＬ−１Ｒ１へのＴＲＡＦ６補充を直接的に促進し、酸化還元活性エンドソームのエンドサイトーシス形成の必要性を本質的に回避するＨ２Ｏ２の能力を考慮すれば、ＴＲＡＦ６、またはＩＲＡＫなどの上流エフェクタにおけるチオール基の酸化は、ＩＬ−１Ｒ１／ＭｙＤ８８複合体へのエフェクタ補充を可能にするタンパク質構造の酸化還元依存的変化をもたらし得る。ＩＲＡＫ／ＴＲＡＦ６複合体の効率的なドッキングを容易にするＭｙＤ８８および／またはＩＬ−１Ｒ１の酸化還元依存的変化など、他のシナリオも可能である。あるいは、ＩＬ−１Ｒ１と付随するＩＲＡＫ／ＴＲＡＦ６も、キナーゼまたは触媒的システインを有するホスファターゼのＲＯＳ調節を介して間接的に制御され得る。この後者の仮説を支持して、ＰＫＣによるＩＲＡＫリン酸化が、ＩＲＡＫ自動リン酸化およびＩＬ−１βによるＮＦκＢ活性化にとって重要であることが示されている（Ｍａｍｉｄｉｐｕｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【０４１０】
Ｎｏｘタンパク質は、種々の環境刺激後の細胞内におけるＲＯＳの主な源であることが既知である（Ｌａｍｂｅｔｈ、２００４）が、細胞のシグナル伝達を調節するそれらの機能は、最近になってようやく把握されている。例えば、Ｎｏｘ４は、ＲＯＳ媒介のインスリンシグナル伝達において重要であるように思え（Ｍａｈａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、Ｎｏｘ１は、アンジオテンシンＩＩ酸化還元−感受性シグナル伝達経路を媒介する（Ｈａｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、Ｌａｓｓｅｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。ここで、初めて、Ｎｏｘ２がＩＬ−１βシグナル伝達を調節できることが示され、ＮＦκＢ活性化との関係におけるこの酸化還元依存的調節に関与する機構を説明する。また、本発明の所見は、Ｎｏｘ活性化が発生し、エンドソーム区画においてＨ２Ｏ２依存性の受容体活性化に選択的に影響を及ぼす、細胞内構成に新しい見解も提供する。また、エンドソームＮｏｘ由来のＲＯＳのＩＬ−１Ｒ１活性化に対する影響を定義する、現在研究されている機構は、他の酸化還元依存の受容体シグナル伝達経路と重複する性質を有する場合もあると妥当に思われる。例えば、ＰＤＧＦシグナル伝達は、Ｈ２Ｏ２と、受容体の部位としてＨ２Ｏ２を除去し、ＰＤＧＦＲホスファターゼに影響を及ぼすように作用するペルオキシレドキシンＩＩを付随した受容体とによって制御される（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。また、ＰＤＧＦ刺激後のＲＯＳ生成は、Ｒａｃ１によって制御され、ＮＡＤＰＨオキシダーゼに伴って生じることが示唆されている（Ｂａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。したがって、乳房上皮細胞における本発明の研究は、ＩＬ−１βシグナル伝達におけるエンドソームＮｏｘ２を含意しているが、Ｒａｃ１依存性のＮｏｘアイソフォームとともに、他の酸化還元調節されたシグナル変換経路のために、他の細胞型がこの機構を活用することも可能である。
【実施例３】
【０４１１】
運動ニューロンおよびミクログリアにおける変異体ＳＯＤ１の制御された発現を用いた最近の研究は、２つの細胞型が、ＡＬＳ疾患進行の異なる段階、発病開始の初期段階における運動ニューロンおよび後期段階疾患進行におけるミクログリアに役立つことを実証している（Ｂｏｉｌｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。これらの所見は、変異体ＳＯＤ１発現の結果としてのミクログリア機能における１次欠陥を含意する。したがって、ＡＬＳ中の増加した脊髄ミクログリアは、酸化還元媒介の炎症性損傷の可能性を恐らく増強させるが、変異体ＳＯＤ１がミクログリアの機能を変化させ、この炎症過程に役立つ機構は依然として不明である。
【０４１２】
変異体ＳＯＤ１は、ＲＯＳを生成するミクログリアの能力に直接的に影響を与えることが仮定された。Ｎｏｘ２ｇｐ９１ｐｈｏｘが、ＡＬＳのマウスモデルにおいて脊髄酸化還元ストレスに貢献することが示されていることを考慮すれば、（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、ＡＬＳ  ＳＯＤ１変異体は、Ｎｏｘ由来のスーパーオキシドの異常調節を直接的にもたらす場合がある。実際、ＷＴ−ＳＯＤ１またはＧ９３Ａ−ＳＯＤを過剰発現させる遺伝子導入マウスの分析は、ＳＯＤ１の突然変異型のみが脳および脊髄内膜におけるＮＡＤＰＨ依存性のスーパーオキシドを増強させ（図１５Ａ−Ｂ）、これは、フラビンタンパク質阻害剤ジフェニレンイオジオニウムクロライド（ｄｉｐｈｅｎｙｌｅｎｅｉｏｄｉｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ：ＤＰＩ）で抑制されたが、ミトコンドリア複合体Ｉ阻害剤ロテノンでは抑制されなかった（図１６）ことを実証した。興味深いことに、ＡＬＳで顕著な病変を示さない臓器の肝臓（図１５Ａ）も、Ｎｏｘ活性において同様のＳＯＤ１変異体付随した増加を示した。対照的に、脊髄および脳内のＷＴ−ＳＯＤ１過剰発現は、内膜におけるＮＡＤＰＨ依存性のスーパーオキシドを変化させなかった。興味深いことに、肝臓におけるＷＴ−ＳＯＤ１発現は、９および１８週齢で肝臓中のＮｏｘ活性を有意に増加させたが、Ｇ９３Ａ−ＳＯＤ１よりははるかに少ない程度であった。
【０４１３】
ＡＬＳマウスにおいて体内で見られる疾患関連炎症過程が存在しない場合に、変異体ＳＯＤ１タンパク質が直接的にＮｏｘ活性を増強できるかどうかを評価するため、組み換えアデノウイルスを使用して、ＳＯＤ１のＷＴ、Ｌ８ＱおよびＧ９３Ｃ形態を、ＭＯ５９Ｊグリア細胞およびＳＨ−ＳＹ神経細胞の両方に発現させた。変異体ＳＯＤ１タンパク質の過剰発現のみが、グリアおよび神経細胞型の両方から内膜におけるＮＡＤＰＨ依存性の
【０４１４】
【化９１】
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【０４１５】
生成を向上させ（図１５Ｃ）、細胞死を有意に増加させた（図１５Ｄ）。これらの所見は、向上したＮｏｘ活性化および細胞障害をもたらすＳＯＤ１変異体における機能の上昇を含意する。ｐ４７ｐｈｏｘ調節されたＮＡＤＰＨオキシダーの既知の阻害剤であるアポシニン（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｆｕｋｕｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）は、細胞生存における対応する増加を有するグリア細胞においてのみＮＡＤＰＨ依存性の
【０４１６】
【化９２】
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【０４１７】
生成が促進されたＳＯＤ１変異体を抑止した（図１５Ｅ）。対照的に、アポシニンは、ＳＨ−ＳＹ神経細胞のＮｏｘ活性を抑制できず、また、変異体ＳＯＤ１媒介の細胞障害のための保護を行わなかった。
【０４１８】
アポシニンは、Ｎｏｘ複合体へのｐ４７ｐｈｏｘの補充を妨げることによってＮＡＤＰＨオキシダーゼを抑制する（Ｓｔｏｌｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。３つの既知のＮｏｘ  触媒サブユニットは、（Ｎｏｘ１、Ｎｏｘ２およびＮｏｘ３）によって調節され（Ｕｅｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｌａｍｂｅｔｈ，２００４）、これらのＮｏｘ  アイソフォームも小ＧＴＰアーゼＲａｃによって調節される（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。実際、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ変異体を過剰発現するＡＬＳ遺伝子導入マウスの両脊髄は、Ｐａｋ１プルダウンアッセイで判断されたとおり、向上したＲａｃ１−ＧＴＰレベル（つまり、活性化されたＲａｃ１）を示した（図１５Ｆ）。ＳＯＤ１変異体発現による向上したＲａｃ１活性化のこれらの所見は、この複合体からの活性化された形態を安定させるために、ＳＯＤ１がＲａｃ１および／または他のＮｏｘ複合体成分と直接的に相互作用し得るという仮説をもたらした。この仮説を支持して、ＳＯＤ１およびＲａｃ１はどちらもサイトカイン刺激後にＮｏｘ２活性初期エンドソームに補充される（実施例２）。
【０４１９】
Ｎｏｘ活性化の１次欠陥に繋がる、ＳＯＤ１変異を付随した特定のＡＬＳにおける機能上昇の可能性は、この疾患における潜在的な病理学的機構に対して新しい見解を与える。最近の研究により、Ｎｏｘ２の欠失は、ＡＬＳマウスの生存を延長させることが示唆されている（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。しかし、他のＲａｃ調節されたＮｏｘ複合体（Ｎｏｘ１およびＮｏｘ３など）もまた、ＡＬＳにおけるＲＯＳ生成の変化に貢献し得るかどうかは未だ不明である。ＡＬＳ疾患の病態進行に対して直接的なＮｏｘ抑制を行う治療的可能性をテストするため、体内のアポシニン抑制研究をＧ９３Ａ−ＡＬＳマウスに行った。実際、２週齢からの飲用水へのアポシニン投与は、用量依存性の方法においてＧ９３Ａ−ＳＯＤ１マウスを延命させた。最も高い用量（３００ｍｇ／ｋｇ）で、５０％生存時間が１２５日から２３９日に増加した（図１７Ａ）。また、この用量は、腰髄における運動ニューロン数も１２０日で有意に増加させた（図１９）。
【０４２０】
５％の体重減少（図１７Ｃ〜Ｄ）および歩行運動（データ図示せず）で判断されたとおり、発病開始の年齢および生存指標（症状の最初の兆候から死亡までの時間）において明確な用量反応があった。アポシニン処置が体内のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を有意に抑制したことを確認するため、最終段階のＡＬＳマウスを水中のアポシニンで５日間処置し、ルシゲニンおよびＤＨＥアッセイでＮｏｘ活性を評価した。これらの研究は、ミクログリオーシスおよびＮｏｘ２発現増加を伴う疾患の後期段階で体内のＮｏｘ由来のスーパーオキシド生成（図１７Ｅ〜Ｆ）を効果的抑制したことを実証した（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【０４２１】
興味深い一発見は、延命されたＡＬＳマウスは、未処置のままの場合、眼感染症を発症し、通例の運動異常なく急死したことであった。全身性抗生物質を用いた眼感染症の処置により、約５０％の事例が解決された（図１７Ｂ）。重要なことには、抗生物質を用いたＡＬＳマウスの処置は、アポシニンが存在しない場合に生存を増加させず、アポシニンで処置されなかったＡＬＳマウスは眼疾患を発達させなかった。したがって、Ｇ９３Ａ−ＳＯＤ１マウスモデルにおける眼疾患は、後年にのみ発症するこのモデルに関連する以前は観察されなかった特性のようである。この眼疾患の病理学的特性は、黄色ブドウ球菌を含有する浸出液増加を含む。しかし、組織切片において炎症の兆候は観察されず、死の病因論の判断を困難にさせた（データ図示せず）。
【０４２２】
酸化還元依存の方法でＮＡＤＰＨオキシダーゼによるＲａｃ１依存性のスーパーオキシド生成を調節するようにＳＯＤ１が機能するという所見は、ＡＬＳと、アポシニンなどの標的された抗酸化物質治療の発達とにおいて重要な意味を持つ。Ｒａｃ−ＧＴＰからＳＯＤ１を遊離させ、ＧＴＰ加水分解を発生させるためのｐＭ量のＨ２Ｏ２能力により、Ｎｏｘの体内調節機構は、細胞ＲＯＳの小さな変化に対して極めて高い感受性があり得ることが示唆される。この機構は、Ｈ２Ｏ２へのＳＯＤ１の酸素的変換を介して、Ｒａｃ１が細胞
【０４２３】
【化９３】
2009521928.tif 000095
【０４２４】
の変化を感知および調節でき得るようにする。かかる空間的調節は、酸化還元センサとしてのＳＯＤ１機能の主要な側面であってもよく、無調節のＮｏｘ複合体を直接的に抑制するようにアポシニンの治療的効果であってもよい。さらに、５、８および１２週齢のＡＬＳマウスに対してアポシニン処置を開始する研究は、疾患の初期段階中のＮＯＸの抑制がアポシニンの治療的効果において重要であることを実証する（図１８）。かかる疾患の初期段階は、変異体ＳＯＤ１の運動ニューロン発現によって最も有意に影響を受けるようである（Ｂｏｉｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。グリア細胞中のＮｏｘ２発現（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）および変異体ＳＯＤ１発現（Ｂｏｉｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）の抑制は、炎症性ミクログリオーシスに関連する疾患の後期状態に影響を及ぼすようであるため、他のＲａｃ１調節されたＮｏｘタンパク質は、さらなる酸化還元ストレスをもたらす炎症性ミクログリオーシスの後期段階を開始させる、運動ニューロンにおける酸化還元初期状態の発達に対する鍵となり得る。
【０４２５】
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Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１６：３０５０（２００６）．
【０４２６】
すべての公報、特許および特許出願は、参照により本願明細書に組み込まれる。前述の本明細書において、本発明は、その特定の好適な実施形態に関連して記述され、多くの詳細は例証目的のために説明されているが、本発明は、追加の実施形態を受け入れる余地があり、本明細書において記述される特定の詳細は、本発明の基本原理から逸脱することなく大幅に変更できることが当業者には明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０４２７】
【図１Ａ−Ｆ】Ｒａｃ１は、酸化還元依存的にＳＯＤ１に結合する。Ａ）Ｒａｃ１は、ｓｏｄ１＋／＋またはｓｏｄ１−／−マウスの心臓、腎臓、肝臓および／または脳組織から免疫沈降し、続いてＳＯＤ１およびＲａｃ１に対してウエスタンブロッド法（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ：ＷＢ）を行った。Ｂ）精製されたウシＳＯＤ１が存在する場合における、精製されたＨｉｓタグ付きＲａｃ１およびＣｄｃ４２の体外ＩＰに続いて、ＳＯＤ１、Ｒａｃ１およびＣｄｃ４２に対してＷＢを行った。Ｈｉｓタグ付きＧＴＰアーゼは、ＳＯＤ１とのインキュベーションに先立って、指示されたヌクレオチド類似体を前負荷した。Ｃ）精製されたＳＯＤ１が存在する場合における、指示されたヌクレオチド負荷のＧＳＴタグ付きＲａｃ１変異体（または遊離ＧＳＴ）の体外ＩＰと、それに続くＳＯＤ１およびＧＳＴに対するＷＢ。Ｄ）精製された、未変性の、脱メタル化された、または再メタル化されたウシＳＯＤ１が存在する場合における、精製されたＨｉｓタグ付きＲａｃ１の体外ＩＰと、それに続く、ＳＯＤ１およびＲａｃ１に対するＷＢ。Ｈｉｓタグ付きＲａｃ１は、ＳＯＤ１とのインキュベーションに先立って、指示されたヌクレオチド類似体を前負荷した。さらに、未処置のＨｉｓタグ付きＲａｃ１および３００μＭ  ＤＴＴ前還元のＨｉｓ−Ｒａｃ１は、ＳＯＤ１の各３つの形状を用いて体外プルダウンアッセイに使用した。Ｅ）Ｈｉｓ−Ｒａｃ１を前還元し（３００μＭ  ＤＴＴ）、ＧＴＰγＳを負荷し、その後、ＳＯＤ１を用いてプルダウンアッセイを行う前に指示濃度の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）で処置した。Ｆ）ＤＴＴの指示濃度を、（Ｅ）に示すように、３００ｐＭのＨ２Ｏ２処置したＨｉｓ−Ｒａｃ１試料に加え、ＳＯＤ１でプルダウンアッセイを行った。
【図２Ａ−Ｈ】ＳＯＤ１は、酸化還元依存のの物理的相互作用を介して、Ｒａｃ１活性化を調節する。Ａ）ＳＯＤ１結合ドメインを画定するために使用されたＧＳＴ−Ｒａｃ１欠失変異体の模式図。Ｂ）精製されたウシＳＯＤ１が存在する場合における、種々のＧＳＴ１１タグ付きＲａｃ１欠失変異体の体外ＩＰ。各レーン上部の数は、パネルＡのＧＳＴ−Ｒａｃ１融合構成の数に対応する。上部パネルは、ＧＳＴのＩＰに続くＳＯＤ１に対するＷＢであり、下部パネルは、ＩＰに使用した精製された融合ペプチドのクーマシィー染色されたゲルである。Ｃ）ＧＳＴタグ付きＰＡＫ結合ドメイン（ＧＳＴ−ＰＢＤ）は、ｓｏｄ１＋／−またはｓｏｄ１−／−マウス脳溶解物においてＧＴＰ−Ｒａｃ１を定量化するために、プルダウンアッセイにおいて使用された。ウエスタンブロットは、ＧＴＰ−Ｒａｃ１およびＧＳＴ−ＰＢＤ後のグルタチオン沈殿と、粗溶解物におけるＳＯＤ１およびＲａｃ１の合計レベルを示す。Ｄ）１３ｓｏｄ１＋／−および７ｓｏｄ１−／−マウス脳からのＧＴＰ−Ｒａｃ１レベルの定量化は、有意差（ｐ＜０．００１、スチューデントｔ−検定）を示した。Ｅ、Ｆ）Ｒａｃ１  ＧＴＰアーゼアッセイは、（Ｅ）ウシＳＯＤ１または（Ｆ）大腸菌ＳＯＤおよび／またはＧＳＴタグ付きｐ２９−ＧＡＰが存在する場合において行われた。Ｈｉｓタグ付きＲａｃ１は、γＰ３２−ＧＴＰで前付加し、反応物の一定分量は、Ｒａｃ１から遊離した％３２Ｐｉを評価することによって、薄層クロマトグラフィーを用いて様々な時点でＧＴＰ加水分解を分析した。Ｇ）ＳＯＤ１および／またはｐ２９−ＧＡＰが存在しない場合における、Ｒａｃ１およびＣｄｃ４２に対するＧＴＰアーゼアッセイ。γＰ３２−ＧＴＰからの３２Ｐｉ遊離率がプロットされる。Ｈ）ＳＯＤ１および／または１００μＭのキサンチン／１００ｍＵのキサンチンオキシダーゼ（Ｘ／ＸＯ）が存在する場合、または存在しない場合における、Ｒａｃ１  ＧＴＰアーゼアッセイ。Ｉ）１５分のＸ／ＸＯ由来のＲＯＳへの暴露の有無にかかわらず、ＳＯＤ１が存在する場合におけるＧＴＰγＳ負荷されたＨｉｓ−Ｒａｃ１のプルダウンアッセイ。本アッセイで使用された条件は、（Ｈ）に示されるＧＴＰアーゼアッセイと同一であった。（Ｈ）すべてのパネルにおけるデータは、少なくとも３つの独立した実験の代表的なものである。
【図３Ａ−Ｅ】ＳＯＤ１は、エンドソーム区画においてＮＡＤＰＨオキシダーゼによる
【化９４】
2009521928.tif 000096
生成を活性化する。Ａ）エンドソームは、イオジキサノール密度勾配分画を使用して
１次マウス皮膚線維芽細胞（ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｏｕｓｅ  ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒ
ｏｂｌａｓｔ：ＰＭＤＦ）から単離させ、画分は、ルシゲニンベースの発光アッセイ
（上部パネル）を使用して、またＮｏｘ２ｇｐ９１ｐｈｏｘ、Ｒａｃ１、ＳＯＤ１お
よびＥＥＡ１に対するウエスタンブロット（下部パネル）によって、ＮＡＤＰＨ依存
性のスーパーオキシド生成を評価した。Ｂ）Ｎｏｘ２ｇｐ９１ｐｈｏｘ野生型および
ノックアウト（ＫＯ）ＰＭＤＦからの指示された細胞成分分画における、ＳＯＤ１に
対するウエスタンブロット。Ｃ）ルシゲニンアッセイは、ＳＯＤ１および／またはＤ
ＰＩ（一般的なＮｏｘ阻害剤）が存在する場合または存在しない場合の、Ｎｏｘ２野
生型およびＫＯ  ＰＭＤＦからの分画番号１０小胞におけるＮＡＤＰＨ依存性の
【化９５】
2009521928.tif 000097
生成率を評価するために使用された（ｎ＝６）。Ｄ）ウシＳＯＤ１（Ｂｏｖ．ＳＯＤ
１）または大腸菌ＳＯＤ（Ｂａｃ．ＳＯＤ）が存在する場合または存在しない場合に
おける、１次マウス胎児線維芽細胞（ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎ
ｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ：ＰＭＥＦ）からの小胞の分画のＮＡＤＰＨ依存性の
【化９６】
2009521928.tif 000098
産出率を評価した（ｎ＝３）。Ｅ）ルシゲニンベースのアッセイにおいて、Ｘ／ＸＯ
由来の
【化９７】
2009521928.tif 000099
を分解するためのＢｏｖ．ＳＯＤ１およびＢａｃ．ＳＯＤの能力。Ｆ）ｓｏｄ１＋／
＋、ｓｏｄ１＋／−またはｓｏｄ１−／−マウスから単離したＰＭＮによるＰＭＡ誘
導の
【化９８】
2009521928.tif 000100
産出を、シトクロムｃ還元アッセイを使用して評価した。＊ｓｏｄ１＋／＋マウス（
ｐ＜０．０５、スチューデントｔ−検定）と比べると有意差が見られた。
【図４Ａ−Ｇ】ＡＬＳに関連するＳＯＤ１変異体は、向上した酸化還元非感受性、Ｒａｃ１との結合およびＲａｃ１−ＧＴＰ加水分解を抑制するための向上した能力を示し、エンドソームＮＡＤＰＨ依存性の
【化９９】
2009521928.tif 000101
生成を活性化する。Ａ）精製され、細菌で発現されたＳＯＤ１タンパク質のクーマシ
ィー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ。ウシＳＯＤ１を基準対照として使用した。これは
ヒトＳＯＤ１よりも通常早く移動する（データ図示せず）。各ＳＯＤ１タンパク質の
Ｃｕ／Ｚｎ含有量はゲルを下回る。Ｂ）１：１０モル比（Ｒａｃ１：ＳＯＤ１）で指
示されたヒトＳＯＤ１タンパク質（ｗｔ、Ｌ８ＱまたはＧ１０Ｖ）が存在する場合に
おける、精製された前還元のＨｉｓタグ付きＲａｃ１−ＧＴＰγＳの体外ＩＰ。その
後、Ｒａｃ１／ＳＯＤ１複合体を、２つの部分に分割し、半分を、ＨｉｓタグのＩＰ
に先立って室温で１５分間Ｘ／ＸＯ由来のＲＯＳで処置した。Ｘ／ＸＯ条件は、１０
０μＭの最終キサンチン濃度を有する１００ｍ単位のキサンチンオキシダーゼ酵素を
含んだ。ＩＰに続いて、ＳＯＤ１およびＲａｃ１に対してウエスタンブロットを行っ
た。ＳＯＤ１ブロットの長いおよび短い暴露は、ＳＯＤ１からＲａｃ１への各突然変
異型の向上した結合を明らかにすることを示す。Ｃ）未変性のウシＳＯＤ１または指
示された細菌で発現および精製されたヒトＳＯＤ１タンパク質（ｗｔ、Ｌ８Ｑまたは
Ｇ１０Ｖ）を使用して、Ｒａｃ１ＧＴＰアーゼアッセイを行った。Ｒａｃ１：ＳＯＤ
１のモル比が示される。Ｈｉｓタグ付きＲａｃ１をγＰ３２−ＧＴＰを前負荷した。
各型のＳＯＤ１の増加濃度が存在する場合において、γＰ３２−ＧＴＰからの３２Ｐ
ｉ遊離率がプロットされる。Ｄ）単離されたＰＭＥＦエンドソームによるＮＡＤＰＨ
依存性の
【化１００】
2009521928.tif 000102
産出の経時変化を、ヒトＷＴ−ＳＯＤ１またはＬ８Ｑ−ＳＯＤ１が存在する場合また
は存在しない場合において測定した。パネルＣおよびＤの結果は、３つの実験の代表
的なものである。Ｅ）Ｒａｃ１をＧ９３Ａ−ＳＯＤ１遺伝子導入マウスまたは対照同
腹子の脳組織から免疫沈降（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ：ＩＰ）し、その
後ＳＯＤ１およびＲａｃ１に対してウエスタンブロット法（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏ
ｔｔｉｎｇ：ＷＢ）を行った。ＦおよびＧ）Ｇ９３Ａ−ＳＯＤ１または対照遺伝子導
入同腹子の指定された年齢での、Ｆ）脳および（Ｇ）肝臓組織に由来する全内膜によ
るＮＡＤＰＨ依存性の
【化１０１】
2009521928.tif 000103
生成である（各実験点に対してＮ＝３）。
【図５Ａ−Ｃ】Ａ）未変性のウシＳＯＤ１に対するＳＯＤ１活性ゲル（レーン１）、脱メタル化されたウシＳＯＤ１（レーン２）および再メタル化されたウシＳＯＤ１（レーン３）。ウシＳＯＤ１の各型のＺｎおよびＣｕ含有量は、タンパク質のモル毎の金属のモルにおいてゲルを上回る。Ｂ）Ｈｉｓ沈殿とＲａｃ１、ＳＯＤ１およびＣｄｃ４２に対するウエスタンブロット法とに先立って、３００μＭ  ＤＴＴで前還元し、ＧＴＰγＳを前負荷し、その後ウシＳＯＤ１とともにインキュベートしたＨｉｓ−Ｒａｃ１またはＨｉｓ−Ｃｄｃ４２の体外プルダウンアッセイ。Ｃ）Ｒａｃ１ポリペプチドバックボーンの３次元構造の略画（Ｈｉｒｓｈｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。左パネルは、スイッチＩ領域（青）、スイッチＩＩ領域（赤）、Ｇ２領域（赤紫）およびＧ３領域（緑）を示す。右パネルは、スイッチＩ、スイッチＩＩ、Ｇ２およびＧ３領域に及ぶ、強力にＳＯＤ１（赤）を結合する最小Ｒａｃ１  ペプチドを示す。
【図６Ａ−Ｂ】ＳＯＤ１は、Ｒａｃ１のＧＴＰ負荷に影響せず、Ｒａｃ１  ＧＴＰアーゼ活性に酵素的に活性でなければならない。Ａ）Ｈｉｓタグ付きＲａｃ１を、ＳＯＤ１が存在する場合または存在しない場合において、３５Ｓ−ＧＴＰγＳを負荷した。タンパク質をニトロセルロース膜に結合し、過剰な非結合放射性ヌクレオチドを洗浄して除去した。残存する（結合）３５Ｓ−ＧＴＰγＳを液体シンチレーション分光で定量化した。結果は、Ｎ＝３の独立した実験に対する平均＋／−ＳＥＭを示す。Ｂ）精製され、未変性の、脱メタル化または再メタル化されたウシＳＯＤ１が存在する場合において、Ｒａｃ１ＧＴＰアーゼアッセイを行った。Ｈｉｓタグ付きＲａｃ１をγＰ３２−ＧＴＰを前負荷した。γＰ３２−ＧＴＰからの３２Ｐｉ遊離率はプロットされる。結果は２つの実験の代表的なものである。
【図７】Ｒａｃを介するＮｏｘ２  ＲＯＳ生成のＳＯＤ１媒介の調節に対する酸化還元センサモデル。還元条件下において、ＳＯＤ１をＲａｃ−ＧＴＰに結合し、内因性およびＧＡＰ媒介のＧＴＰ加水分解を抑制することでＲａｃ活性化を安定化させる。増加したＲａｃ−ＧＴＰレベルは、Ｎｏｘ２の活性化および
【化１０２】
2009521928.tif 000104
の生成をもたらす。Ｎｏｘ２複合体によって産出された
【化１０３】
2009521928.tif 000105
は、ＳＯＤ１により、または自発的不均化を介してＨ２Ｏ２に変換される。Ｈ２Ｏ２
の局所濃度が上昇するため、Ｒａｃの酸化はＳＯＤ１の解離をもたらす。Ｒａｃ−Ｇ
ＴＰともはや結合しないＳＯＤ１では、Ｒａｃ−ＧＤＰへの加水分解がより早急に発
生し、Ｎｏｘ２複合体の不活性化に繋がる。その後、Ｒａｃ／Ｎｏｘ２が再活性化す
ると、ＳＯＤ１は工程を繰り返すように再循環できる。この機構を通じて、ＳＯＤ１
は、Ｒａｃ／Ｎｏｘ２複合体活性化の部位においてＲＯＳの局所濃度を検知でき、複
合体の活性を制御できることを提案する。
【図８】種々の指示された遺伝子型の回転棒の失敗までの時間。回転棒の失敗後、通常１週間以内に死亡する。動物は、あおむけに置かれた後２０秒間以内に直立できなかった場合に、臨床的に死亡および安楽死したと見なされる。
【図９】指示された遺伝子型の同年齢の同胞の脊髄中の運動ニューロン。各グループには３匹の動物がおり、動物は、ＡＬＳ＋／Ｎｏｘ２＋／＋グループの臨床死時に安楽死した。これは約１２５〜１３５日の範囲で、４つの遺伝子型それぞれからの１匹のマウスは同日に採取された。
【図１０】ＳＯＤ１は体外ＧＴＰおよびＧＤＰを結合する。Ａ）Ｓ３５放射性標識  ＧＴＰγＳは、異なる濃度の塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）を用いて、室温で２時間ＳＯＤ１とともにインキュベートした。結合反応物は、ＳＤＳ含有緩衝液内で５分間沸騰させて中止した。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで走行させ、その後ニトロセルロース膜に移動した。オートラジオグラフィーを使用して、ＳＯＤ１と結合した放射性標識ヌクレオチドを示した。Ｂ）ＳＯＤ１グアニンヌクレオチド結合（ＧＴＰおよびＧＤＰが示される）の表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：ＳＰＲ）分析。ＳＰＲチップ表面をウシＳＯＤ１タンパク質で被覆する。ＧＴＰまたはＧＤＰ（５ｍＭ）を含有する試料は表面を流れ、ヌクレオチド−タンパク質結合キネティクスは監視される。
【図１１】ＳＯＤ１における保存グアニンヌクレオチド結合モチーフ。カンジダアルビカンスからホモサピエンスまでの異なる生物からのＳＯＤ１の配列が配置される。グアニンヌクレオチドを結合する保存された潜在配列を標識化する。ＳＯＤ１上の配列は、１つのみのアミノ酸でグアニンヌクレオチドにおけるグアニジンカ輪結合モチーフのコンセンサスＮ／ＴＫｘＤから逸脱する。また、ＳＯＤ１上の配列ＧＤＮｘｘＧＣＴも保存され、１つのアミノ酸でリン酸塩結合ループコンセンサスＧｘｘｘｘＧＫＴ／Ｓから逸脱する。両モチーフは、ＳＯＤ１結晶構造および利用可能な溶質の表面に露出する。
【図１２Ａ−Ｂ】Ｒａｃ１、Ｒａｃ２、ＲｈｏＡおよびＣｄｃ４２配列間の比較とＲａｃ１およびＲｈｏＡのＳＯＤ１への異なる結合。Ａ）Ｒａｃ２、ＲｈｏＡおよびＣｄｃ４２と比較した、Ｒａｃ１上のＳＯＤ１結合領域のアミノ酸配列アラインメント。Ｒａｃ２は、ＳＯＤ１結合領域のＲａｃ１と比べて９７％より高い同一のアミノ酸配列を有する。一方、ＲｈｏＡは、７７．７％の同一配列を有し、Ｃｄｃ４２はその領域でＲａｃ１と７５％の同一配列を有する。Ｂ）Ｒａｃ１、ＲｈｏＡまたはＣｄｃ４２を電磁ビーズ上で固定化し、その後、グアニンヌクレオチド（標識化したように）を負荷し、または負荷せずに、ＳＯＤ１に結合した。非結合タンパク質の洗浄後、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ＳＯＤ１に対して免疫ブロット法を行った。Ｒａｃ１は、ＧＤＰβＳ結合状態でのみＳＯＤ１を結合し、一方、Ｃｄｃ４２は負荷したヌクレオチドにかかわらず、ＳＯＤ１を結合しなかった。その一方、ＲｈｏＡは、ＧＴＰγＳ結合状態でのみＳＯＤ１を結合した。
【図１２Ｃ】ヒトＲａｃ１のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ヒトＲａｃ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ヒトＲｈｏＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４および５）、ヒトＳＯＤ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、ヒトＳＯＤ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、およびヒトａｌｓｉｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）。
【図１３】ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウスの生存に関するＮｏｘ１およびＮｏｘ２遺伝子ノックアウト（ＫＯ）の比較。Ａ）Ｎｏｘ１を欠くＡＬＳマウス（Ｎ＝６）は、そのＮｏｘ１含有同腹子（１２７日、Ｎ＝８）よりも長く生存した（１６３日）。＊＊ｐ＜０．００３９。Ｂ）Ｎｏｘ２ＫＯ背景でのＡＬＳマウスの生存は、Ｎｏｘ１  ＫＯ背景での生存よりもさらに顕著だった。
【図１４】ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウスにおける生存および疾患進行のアポシニン（３０ｍｇ／Ｋｇ）効果。Ａ）アポシニン処置（１８５日）マウス（＊＊＊ｐ＜０．０００１）と比較した、無処置（１２５日）での生存の可能性。Ｂ）アポシニン処置マウスと比較した未処置での歩行分析。１１４日齢で、未処置のマウスは歩行障害を呈示し、一方、アポシニン処置マウスは正常歩行であった。Ｃ）アポシニン処置（１５６．５日、ｎ＝６）マウスと比較した、未処置（１１７．５日、ｎ＝２０）での後肢衰弱の初観察によって判断される発病開始の平均年齢。Ｄ）生存指標は、発病開始から臨床死までの時間であり、疾患進行のマーカである。疾患進行は、アポシニン処置マウス（３２日、ｎ＝６）の方が未処置のマウス（１１日、ｎ＝２０）よりも遅かった。
【図１５】野生型（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ：ＷＴ）ＳＯＤ１ではないＳＯＤ１変異体の発現は、細胞Ｎｏｘ活性の活性化をもたらす。Ａ）ＷＴ−ＳＯＤ１またはＧ９３Ａ−ＳＯＤを過剰に発現する非遺伝子導入または遺伝子導入マウスの脳、脊髄および肝臓からの全内膜におけるＮＡＤＰＨ依存性のスーパーオキシド生成（各グループにおいてＮ＝３動物）。Ｂ）ＷＴ−ＳＯＤ１またはＧ９３Ａ−ＳＯＤ１を過剰に発現する１２０日の非遺伝子導入または遺伝子導入マウスからの腰髄切片におけるスーパーオキシドのジヒドロエチジウム（Ｄｉｈｙｄｒｏｅｔｈｉｄｉｕｍ：ＤＨＥ）蛍光検出。ＤＡＰＩ染色は、下部パネルにおいて核を画定する。Ｃ、Ｄ）スーパーオキシド生成の尺度（Ｃ）または、細胞死の尺度としてのトリパンブルー排除であり、（Ｄ）ＬａｃＺ、ＷＴ−ＳＯＤ１または指示された変異体ＳＯＤ１を発現させるアデノウイルスベクターに感染したＳＨ−ＳＹ（神経細胞）またはＭＯ５９Ｊ（グリア）細胞におけるもの。Ｅ）指示されたアデノウイルスベクターに感染し、その後アポシニン（１００μＭ）を用いて、または用いず７２時間処置した後のＳＨ−ＳＹまたはＭＯ５９Ｊ細胞におけるスーパーオキシド生成および細胞死の割合。Ｆ）１２０日齢の非遺伝子導入（対照）またはＧ９３Ａ−ＳＯＤ１遺伝子導入マウスからの脊髄細胞可溶化物を使用し、ＧＳＴ−Ｐａｋ１との関連によって判断されたＲａｃ−ＧＴＰ活性化。対照は、Ｐａｋ１プルダウンアッセイに先立って、ＧＴＰγＳ（＋）またはＧＤＰβＳ（−）とともにインキュベートされた対照マウスからの溶解物を含む。
【図１６】半接合体のＧ９３Ａ−ＳＯＤ１遺伝子導入マウスのＡＬＳ脳および脊髄組織のＮＡＤＰＨ依存性スーパーオキシド生成の増加。スーパーオキシド生成は、ＤＰＩ（１０μＭ）で抑制されたが、ロテノン（１００μＭ）では抑制されず、Ｎｏｘが向上したＲＯＳ生成に関与することを示す。
【図１７】ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤アポシニンでの処置は、Ｇ９３Ａ−ＳＯＤ１導入遺伝子に対して半接合であるマウスにおいて、寿命を増加させ、疾患進行を遅らせる。Ａ）１４日齢から開始する、水中の異なる投与量のアポシニンで処置したマウスの生存曲線。各処置グループのマウスの数（Ｎ）は、日数のメディアン生存時間とともに示される。Ｂ）アポシニンの各一定投与量に対する雄性および雌性マウスの生存データ。抗生物質を使用して眼感染症の処置を受けたマウスを四角形でマークする。処置に失敗および眼感染症により死亡したマウスは、四角形内にＸ印を付ける。円形は、眼感染症に一度もかからなかった動物を表す。各グループにおけるマウスの数（Ｎ）は、各投与量のアポシニンに対する平均生存日数を上回る。Ｃ）発病開始の年齢（１週間の間に５％の体重減少で判断）とアポシニン投与量との関係。Ｄ）生存指標は、各一定量のアポシニンに対し、発病開始から動物が臨床死に至るまでの時間として測定した。Ｅ）分析前に５日間アポシニン（３００ｍｇ／ｋｇ）で処置または処置されていない、最終段階Ｇ９３Ａ−ＳＯＤ１遺伝子導入マウス（約１２０日齢）からの腰髄の全膜において、ＮＡＤＰＨ依存性のスーパーオキシド生成を測定した（各グループにおいてＮ＝５）。Ｆ）同一のマウスの腰髄におけるジヒドロエチジウム蛍光を（Ｅ）に示す。
【図１８】出生後異なる年齢における、アポシニン（３００ｍｇ／ｋｇ）を用いた半接合体のＧ９３Ａ−ＳＯＤ１遺伝子導入マウスの処置。１４、６０および８０日齢で、飲料水にアポシニンを加えたマウスの生存時間（各グループに対してＮ＝６）。すべてのマウスは、３匹の導入遺伝子陰性同胞雌と１匹のＧ９３Ａ−ＳＯＤ１半接合体の雄から派生した。各雌からの２匹の連続同腹仔を分析した。
【図１９】異なる濃度のアポシニンを用いたＧ９３Ａ−ＳＯＤ１遺伝子導入マウスの処置および１２０日目の腰髄における運動ニューロンの数。
【図１Ａ】
2009521928.tif 000106
【図１Ｂ】
2009521928.tif 000107
【図１Ｃ】
2009521928.tif 000108
【図１Ｄ】
2009521928.tif 000109
【図１Ｅ】
2009521928.tif 000110
【図１Ｆ】
2009521928.tif 000111
【図２Ａ】
2009521928.tif 000112
【図２Ｂ】
2009521928.tif 000113
【図２Ｃ】
2009521928.tif 000114
【図２Ｄ】
2009521928.tif 000115
【図２Ｅ】
2009521928.tif 000116
【図２Ｆ】
2009521928.tif 000117
【図２Ｇ】
2009521928.tif 000118
【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２ＣＡ】
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【図１２ＣＢ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図１７Ｂ】
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【国際調査報告】
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