(57)【要約】  本発明は、ウイルス疾患、真菌疾患及び細菌疾患の治療用の薬剤の製造に用いられる薬剤の調製に有用な、経時的に高効率で安定性が高いクルミの単離抽出物であって、ｉ）原材料としてクルミの未熟果の採取、ｉｉ）抽出のための原材料の調製、ｉｉｉ）前の工程で調製された原材料の凍結、ｉｖ）乾燥、ｖ）１０分未満の時間での抽出、ｖｉ）濾過、及びｖｉｉ）最終包装からなる方法から得られることを特徴とする、クルミの単離抽出物に関する。本発明は、細菌疾患、真菌疾患及びウイルス疾患を治療するのに用いられる薬剤の調製のためのクルミの単離抽出物の使用、並びにそれを含む組成物にも関する。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
クルミの単離抽出物であって、
ｉ）原材料としてのクルミの未熟果を採取する工程、
ｉｉ）抽出のための原材料を調製する工程、
ｉｉｉ）前記工程で調製された原材料を凍結する工程、
ｉｖ）乾燥する工程、
ｖ）１０分未満の時間で抽出する工程、
ｖｉ）濾過する工程、及び
ｖｉｉ）最終包装する工程
からなる方法から得られることを特徴とする、クルミの単離抽出物。
【請求項２】
前期（ｉｉ）抽出のための原材料を調製する工程が、機械的清浄、水洗浄及び空気乾燥を含む、請求項１に記載の単離抽出物。
【請求項３】
前記（ｉｉｉ）凍結する工程が、７０時間〜１７０時間、凍結チャンバ内で前記クルミを−１８℃〜−２０℃の温度に維持することを含む、請求項１に記載の単離抽出物。
【請求項４】
前記（ｉｖ）乾燥する工程が、初めに前記凍結クルミの殻を２ｍｍ〜３ｍｍの薄層に剥き、その後１０％未満の湿度が得られるまで乾燥させることを含む、請求項１に記載の単離抽出物。
【請求項５】
前記（ｖ）抽出する工程が、前記乾燥する工程で得られた乾燥させた塊を細かく砕き、１／２〜１／５の重量／体積比でアルコールを添加し、及び１０分未満の時間で、抽出を行うことを含む、請求項１に記載の単離抽出物。
【請求項６】
アルコールがエチルアルコール（９６％）である、請求項５に記載の単離抽出物。
【請求項７】
アルコールが１／３の重量／体積比である、請求項５に記載の単離抽出物。
【請求項８】
抽出時間が５分未満である、請求項５に記載の単離抽出物。
【請求項９】
抽出時間が２分未満である、請求項５に記載の単離抽出物。
【請求項１０】
抽出物の濾過工程が、一次浄化濾紙で行い、その後、薄孔の殺菌濾紙で行われる、請求項１に記載の単離抽出物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のクルミの単離抽出物を得る方法。
【請求項１２】
薬剤として用いられる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のクルミの単離抽出物を含む組成物。
【請求項１３】
液状、錠剤状又はクリーム状で投与されることを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
細菌疾患、真菌疾患及びウイルス疾患の治療用の薬剤の製造のための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抽出物の使用。
【請求項１５】
皮膚及び爪上のヘルペス、水痘及び真菌の治療用の薬剤の製造のための、請求項１４に記載の抽出物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス疾患、真菌疾患及び細菌疾患の治療のために考えられた薬剤の調製に有用な、経時的に高効率で安定性が高いクルミの単離抽出物に関する。
【０００２】
本発明は、上記のクルミの単離抽出物を得る方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
一般的な食事薬剤として長年、クルミ抽出物及びパップ（cataplasm）が使用されてきた。
【０００４】
クルミの木は、樹皮、葉又は果実に、没食子酸性タンニン、カテキン性タンニン、ユグロン、ユグランジン、カロテン、イノシトール、ピロガロール、ビタミンＣ及び他の物質を含有している。
【０００５】
クルミの木の樹皮（マンシュウグルミ）は主に、５−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン（ユグロン）、１，４，５−トリヒドロキシナフタレン（ヒドロユグロン）、ヒドロユグロンのグリコシド、ヒドロキシ−α−テトラロンのグリコシド、及びこれらのグリコシドの没食子酸誘導体を含有していることが実証されている。クルミの外皮はビタミンＣが非常に豊富であり、葉にはβカロテン、ビタミンＢ１、Ｂ２及びＢ６が見出されていることも知られている。
【０００６】
ユグロンは、抗菌作用、抗新生物作用及び抗寄生虫作用がある天然物と考えられ、抗真菌性及び殺菌性を有する。したがって、モミジバフウ（satin walnuts）の毛及び油の着色剤組成物を含む様々な市販品でユグロンを見出すことができる。クルミの外皮から調製したユグロンは、食事補助剤（complements）における活性成分である。
【０００７】
ユグロンが強い化学療法剤又は化学予防剤（chemopreventive agent)であることを示唆する証拠がある。国立癌研究所（ＮＣＩ）の治療開発プログラムが、ＨＩＶ−１に関する調査においてユグロンを評価した。
【０００８】
特許文献１は、真菌に感染したヒトの爪の治療及び予防用の局所に適用する抗真菌組成物に言及している。特に、特許文献１は、ユグロンのみの抽出物では、長い回復治療及び真菌毒性作用においてほんのわずかの効率しか示さなかったため、相乗効果がある抽出物は、１０％〜１５％のクルミの外皮由来のユグロン抽出物と、２０％〜３０％のスパイクナード（Nardostachys jatamansi）又はベチベルソウ（Vetiveria zizanioides）又はニチニチソウ（Catharanthus roseus）の粉砕根との混合物を含有することを開示している。
【０００９】
上記抽出物を得るために、クルミの外皮を分離し、水で洗浄して空気乾燥した。それから、それらを粉砕し、アセトン、アルコール及びブタノールから選択される溶媒でユグロンの抽出を行った。溶媒を抽出物から取り除き、ユグロンが部分的に分画されるように、ワックスが取り除かれるまで冷却した。
【００１０】
現行の技術水準で説明されるクルミの単離抽出物は、抗真菌の目的、抗菌の目的、又は抗ウイルスの目的で、活性成分が大量に見出される木の一部からの所定の活性成分の抽出に基づいている。
【００１１】
幾つかの最も知られたものの中で、クルミの外皮由来のユグロンの抽出物を含有する抗真菌組成物、又は大量のビタミンＣを有する組織であるクルミの木の葉から得られた高濃度のビタミンＣを有する組成物が存在する。
【００１２】
クルミの単離抽出物を含む組成物は、経時的にその有効性が低減するため、当該組成物の寿命は短く、調製の直後に投与しなければいけないという欠点がある。
【００１３】
したがって、クルミの単離抽出物の安定性が低いため、これらを含有する組成物は、治療の際に好適な有効性を与えるためには数日で製造し、投与しなければならない。
【００１４】
そのため、クルミの単離抽出物に基づく上記組成物は、抽出物中のユグロンの安定性が低いため、経時的に適用が制限され、これらの組成物は抗真菌型、抗菌型又は抗ウイルス型のものだけである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】米国特許第６，２９６，８３８号
【非特許文献１】Zdrodovski P.F., Sokolov M.I. - Rukovodstvo po laboratornoy diagnostike virusnikh i rikketsioznikh bolezney（Manual of analytical diagnostic of viral and rickettsian diseases）// M., "Meditsina", 1965, c396
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
したがって、経時的に安定であり、さらに調製時期とは無関係である、クルミだけから単離された抽出物は未だ存在しない。また、特性が経時的に安定であり、さらに抗真菌用途、抗菌用途及び抗ウイルス用途を同時にもたらす上記抽出物を含有する組成物は存在しない。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の第１の態様は、経時的に安定であり、調製された時期とは無関係である、クルミをベースとする単離抽出物を提供することである。
【００１８】
本発明の第２の態様は、真菌、細菌及びウイルスの治療に同時に効果的である、クルミをベースとする単離抽出物を提供することである。
【００１９】
本発明の第３の態様は、本発明の第１の態様及び第２の態様によってクルミの単離抽出物を得ることが可能な方法を提供することである。
【００２０】
本発明の第４の態様は、ウイルス疾患、真菌疾患及び細菌疾患の治療用の薬剤を調製するための本発明の第１の態様による抽出物の使用である。
【００２１】
本発明の第５の態様は、ウイルス疾患、真菌疾患及び細菌疾患の治療用の薬剤の製造に用いられる、本発明の上記第１の態様による抽出物を含む組成物を提供することである。
【００２２】
定義
本発明において、「クルミの未熟果」とは、クルミがラクティック−ワキシー（Lactic-Waxy）成熟状態であることを意味する。概して、果実が成熟する場所の天気に従って成熟日はわずかに変わる可能性があるとしても、この成熟状態になるには、１０年目の６月〜１５年目の９月、より正確には１０年目の７月〜１０年目の８月である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】１０分未満の抽出時間でクルミ抽出物が得られる場合の本発明による方法のフローチャートを示す。
【図２】抽出工程に用いられた時間による、その調製時間に対するクルミ抽出物中のユグロン含量（％）のグラフである。図２から、抽出時間が１０分未満である場合のみ（−■−）、ユグロン含量が経時的に安定性を維持したと考えることができる。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明者らは、クルミ抽出物を得るのに要した抽出時間が、得られた抽出物の最終特性における主条件であることを見出した。
【００２５】
好都合なことに、本発明の上記の第１の態様によるクルミの単離抽出物は、経時的に安定な抗真菌用途、抗細菌用途及び抗ウイルス用途のための特性を同時に示す。
【００２６】
本発明の上記３つの第１の態様によれば、
ｉ）原材料としてのクルミの未熟果を採取する工程、
ｉｉ）抽出のための原材料を調製する工程、
ｉｉｉ）前記工程で調製された原材料を凍結する工程、
ｉｖ）乾燥する工程、
ｖ）１０分未満の時間で抽出する工程、
ｖｉ）濾過する工程、及び
ｖｉｉ）最終包装する工程、
からなる方法から得られることを特徴とする、クルミの単離抽出物が提供される。
【００２７】
特に、好ましくは（ｉｉ）抽出のための原材料を調製する工程は、機械的清浄、公共水による洗浄、蒸留水による洗浄及び空気乾燥を含む。
【００２８】
好ましくは、（ｉｉｉ）凍結する工程が、７０時間〜１７０時間、さらに好ましくは、約１２０時間±５時間、凍結チャンバ内でクルミ果実を−１８℃〜−２０℃の温度に維持することを含む。
【００２９】
特に、（ｉｖ）乾燥する工程が、初めに凍結クルミの殻を２ｍｍ〜３ｍｍの薄層に剥き、その後トレイにそれらを置き、好ましくは太陽の下で、さらに、その後１０％未満の湿度が得られるまで、３８℃±２℃の温度の乾燥チャンバ内でそれらを乾燥させることを含む。
【００３０】
（ｖ）抽出する工程が、乾燥工程で得られた乾燥させた塊を細かく切り刻み、１／２〜１／５、好ましくは１／３の重量／体積の関係でエチルアルコール（９６％）を添加し、及び１０分未満、好ましくは５分未満、さらにより好ましくは２分未満の時間、抽出を行うことを含む。
【００３１】
好ましくは、抽出物を濾過する工程が、０．２５ＭＰａ±０．００５ＭＰａの圧力で、一次浄化濾紙で、その後、薄孔の殺菌濾紙で行われる。
【００３２】
当業者が、工程ｉ）〜工程ｉｖ）、工程ｖｉ）及び工程ｖｉｉ）で行うことができるこれらの修正も、本発明の発明概念対象から逸脱しない限り本発明の範囲内に含まれる。これまでに定められた本発明の方法の非限定的な図としては、図１を参照されたい。
【００３３】
本発明者らは、抽出時間が、クルミの単離抽出物の最終特性に極めて重要であることを見出した。抽出時間が増えると、抽出物が得られる際の安定性及び効率に干渉する可能性がある他の成分がクルミから取り除かれると考えられる。
【００３４】
驚くべきことに、本発明者らは、本発明の第１の態様によって得られたクルミの単離抽出物が、抗真菌用途、抗菌用途及び抗ウイルス用途のための特性を同時に維持し、経時的に安定であることを見出した。
【００３５】
したがって、本発明は、本発明の第１の態様によるクルミの単離抽出物を得る方法も提供する。
【００３６】
本発明者らは、（ｖ）抽出工程にかかる時間によってユグロンの安定性を評価した。
【００３７】
添付の表１において、工程ｖ）に用いられる抽出時間が長くなると、活性成分ユグロンの経時的な安定性が低くなることが分かり得る。
【００３８】
【表１】
2009538871.tif 000003
【００３９】
表１で示された結果から、工程ｖ）の抽出時間が増えると、最終抽出物中のユグロン含量が減少し、また調製後の経時的なユグロン抽出物の安定性が低下することが分かる。
【００４０】
驚くべきことに、１０分未満の抽出時間で得られたユグロン抽出物は、調製後、最大２４ヶ月間安定性を維持しており、したがってその効率は調製からの時間ではなく、抽出時間に用いられる時間に依存していた。分析番号１及び図２を参照されたい。
【００４１】
好都合なことに、本発明の第１の態様によるユグロンの単離抽出物によって、安定性が２年を超える抽出物が得られ、この抽出物の安定性は、およそ数日である現行の技術水準において開示されたクルミ抽出物と比べて大幅に長い。
【００４２】
本発明によるクルミの単離抽出物には、皮膚、爪等におけるヘルペス、水痘、真菌の治療用途、概して皮膚疾患の治療用途がある。
【００４３】
本発明による抽出物の投与は、局所適用、腹腔内適用、又は液状、クリーム若しくは錠剤等の経口適用によって行うことができるが、本発明による抽出物の他の適用方法も本発明の範囲に含まれる。
【００４４】
本発明者らは、分析番号１〜分析番号５の細菌、真菌及びウイルスにおいて、本発明の第１の態様による単離抽出物の効率も研究した（表１）。下記の表２を参照されたい。
【００４５】
【表２】
2009538871.tif 000004
2009538871.tif 000005
2009538871.tif 000006
【００４６】
先の表で示されたデータから、抽出時間が増えると、抽出物では、製造から経時的に効率が失われる。
【００４７】
示された結果によって、本発明の第１の態様によるクルミの単離抽出物が、調製から最大２４ヶ月、経時的に細菌、真菌及びウイルスにおける効率を維持し、この効率が抽出工程に用いられる時間に依存することが実証される（分析番号１）。
【００４８】
したがって、本発明の第４の態様によって、ウイルス疾患、真菌疾患及び細菌疾患の治療用の薬剤の調製に用いられるクルミの単離抽出物も提供される。
【００４９】
本発明は、本発明の第１の態様による抽出物を含む組成物、並びにウイルス疾患、真菌疾患及び細菌疾患の治療用の薬剤を製造するためのその使用にも関する。
【００５０】
以下の幾つかの細胞毒性（cytoxicity）研究で、本発明の第１の態様による抽出物はヒトに用いるのに好適であることが実証される。
【００５１】
一般的な毒性研究
第１の態様によるクルミの単離抽出物（以下、抽出物）の毒性評価を、様々な濃度の抽出物を胃内投与したラット及びマウスで行った。急性感染の場合及びまたウイルス保有者におけるヘルペスウイルスに対して、全身的な効果を得るため、胃内投与が提案された。したがって、抽出物は天然の抗ウイルス化学療法薬（remedy）であると考えることができる。しかし、抽出物が全身の吸収によって投与されたため、毒性の兆候が予測される恐れがあり、これはラット及びマウスによる亜急性研究でも確認された。しかし、最大用量を胃内投与した場合であっても、致死頻度は平均致死用量（ＬＣ５０等）を明らかにすることが不可能なほど低いことを指摘せねばならない。抽出物には、物質の蓄積特性も、骨髄細胞における突然変異作用もない。
【００５２】
一般的な毒性に関しては、ＳＮＣに対する作用、及び新生児の動物における体重増大に対する阻害作用を指摘する必要がある。肝臓の柔細胞の破壊、並びに脾臓及び副腎の腫瘤の変性に関する毒性は、３０日にわたる長期的な操作の結果のストレス状態を反映すると考えられる（表１.１、５％エタノールを参照されたい）。
【００５３】
さらに、ラットの標準指標の最小偏差をもたらす抽出物用量が明らかにされ、従来これは、３０日間０．５％溶液０．５ｍｌを投与する最大耐用量として摂取されている。ヒトにおいて、これは上記濃度の溶液２５０ｍｌ〜５００ｍｌに相当する。実際、よく知られているように、臨床条件下では、最小毒性用量の１／１００〜１／１０、又は「不活性」用量が測定され、これは１日で０．５％溶液２．５ｍｌ〜５．０ｍｌを表す。
【００５４】
そのため、何回か皮膚に適用した様々な濃度の抽出物溶液の毒性評価の結果は、５％溶液０．２ｍｌの用量の製剤は明らかな中毒作用を引き起こさないことを示す。しかし、組織学的に、表皮細胞の層が全く増加せず、及び皮膚（厳密に言えば真皮）の炎症作用もなく、表皮における角質化過程が幾らか増強することが分かる。
【００５５】
５０％抽出物溶液では、皮膚層（cutaneous folds）の明らかな過角質化、乾燥及び硬化が生じる。組織学的に、角質化過程の増強と共に、表皮において細胞層も増加するが、この場合であっても炎症作用は観察されていない。この用量では、（吸収による）全身毒性の兆候は観察されていない。
【００５６】
マウスによる２週間の実験において、この動物は、同じ濃度で溶液の約４倍を超える量を摂取した（５％及び５０％の溶液）。炎症作用もなく組織学的に確認された、皮膚層の脱落及び肥厚といった視覚的な皮膚反応が、抽出物を５％で用いる場合に既に見られる。齧歯類の特徴である、造血の際の「リンパ球」部の「顆粒球」部への変換において示される顆粒球形成反応も見られる。５％の濃度の製剤では、直腸の末節の粘膜において破壊部又は炎症部の変化は全く生じなかった。この用量までは、一般的な全身性の毒性作用の兆候は観察されなかった。極めて高い濃度（５０％）の抽出物の皮膚上への適用は、全身性の毒性作用を伴う。製剤の特徴的な特性、具体的には皮膚及び粘膜で炎症作用のない、角質化及び顆粒球形成（顆粒球増加）の刺激も観察される。
【００５７】
製剤の強い経皮吸収をシミュレートした場合、全身作用の最も特徴的な兆候は、最も一般的なＳＮＣ現象の低下を伴う神経毒性である。
【００５８】
根拠として、マウスにおける平均毒性用量等の決定を受けて（ＴＤ５０  −  動物において１７％±３．８％の溶液０．４ｍｌ、ＴＤ１６  −  １０％の溶液０．４ｍｌ、ＴＤ８４  −  ３５％の溶液０．４ｍｌ）、ラットにおける局所皮膚適用の条件下で非毒性用量を推測して、用量１．０ｍｌ／Ｋｇ〜１．５ｍｌ／Ｋｇの５％溶液を摂取させる。
【００５９】
５％〜５０％の濃度の抽出物溶液は、皮膚適用される場合、局所刺激性も感作性（アレルギー誘発性）も有しない。
【００６０】
抗ウイルス活性の研究
本研究の目的は、製剤を調製するのに用いられる第１の態様によるクルミの単離抽出物（以下、抽出物）を調べて、細胞培養物における抗ウイルス活性（抗ヘルペス）の存在を実証することであった。実験モデルとして、以下の細胞を用いた。骨肉種の連続細胞株ＤＲ（特に危険な感染症のジョージア国立ウイルス研究センター（the virology laboratory of the National Centre of Georgia）から得られた）及び筋皮由来のヒト線維芽細胞の一次培養物（ジョージア衛生部の産婦人科及び周産期医学研究所（the Institute of obstetrics, gynaecology and perinatal medicine of the Sanitary Ministry of Georgia）からの早産材料（abortive material））。ウイルス材料  −  ロシア連邦の公衆衛生庁のウイルス製剤のウイルス研究所博物館（the museum of the virology laboratory of the Institute of viral preparations of the Sanitary Ministry of the Russian Federation）（モスクワ）から得られた、Ｉ型単純ヘルペスウイルス。
【００６１】
実験を行うために、様々な濃度の抽出物（１：５〜１：８０）及び様々な希釈のウイルス（１：１０〜１：１０，０００，０００、従来は以下の方法で−１．０  ｌｇ〜−７．０  ｌｇと称される）の同時解析を含む交差評価（cross valuation）法を用いた。この方法によって、上記の製剤と用量との相互作用のほんのわずかの微妙な差異が示され、またウイルス感染に対して細胞を最大保護する最適な変異型も示される（非特許文献１）。
【００６２】
得られた結果の解析によって、製剤の調製に用いられる植物抽出物が、ＤＲ細胞培養物（骨肉種）及びヒト筋皮線維芽細胞において単純ヘルペスウイルスの複製を阻害することができると一義的に結論付けられた。この作用は、１：５の希釈で抽出物を用いた場合に強くなった（意図的に細胞に対する細胞毒性作用の可能性を考慮して、純粋な抽出物を分析しなかった）。細胞培養物における抽出物及びウイルスの交差評価法によって、抽出物の抗ヘルペス作用の保護が実証され、細胞における感染経路の幾つかの規則性が見出された。
【００６３】
抗ヘルペス活性の研究
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究において、第１の態様によるクルミの単離抽出物（以下、抽出物）は、白色マウスにおける抽出物の抗ウイルス作用を研究するのに必要であると考えられるような、ヒト線維芽細胞の細胞培養物における単純ヘルペスウイルス（ＶＥＳ）及びＤＲ骨肉種に対する保護特性を有することが実証された。
【００６４】
このために、白色マウスにおけるヘルペス感染モデルを用いて、動物の致死率及びウイルスの増殖指数を研究した。抗体産生、食菌及びインターフェロン活性に関して、生物の免疫系の状態を評価した。ヘルペスウイルスの胚毒性（embriotoxic）作用及び突然変異作用、並びに妊娠した雌マウスにおける抗酸化保護の状態も解析した。抽出物中で処理した感染マウスにおいて全てのこれらのパラメータを調べた。
【００６５】
結論として、この研究によって、ヘルペスウイルスの免疫抑制作用を選択的に中和するため、にこの抽出物を首尾よく用いることができることが確信的に実証された。我々は、我々が示している抽出物の特性の様々な機構を論じることができるが、最も許容可能なものは以下の通りである。ヘルペスウイルスの存在下で、生物においてホルモンの不平衡が生じ、発達プロセス及び破壊プロセスにおける一般的な細胞低酸素が中毒を引き起こす。全てのこれらの現象は、既存の免疫病理学に由来するか、又はそれら自体から生じる。言い換えれば、相互悪化作用と共に、ヘルペスウイルスの存在下で、少なくとも４つの次の要素全てが生じる。ホルモン不平衡、低酸素、中毒及び免疫病理学。
【００６６】
抽出物の保護作用機構の１つは抗酸化特性であり、これは細胞内レベルの休止の回復に好適である（免疫細胞が含まれる）。抽出物は、免疫担当細胞の機能的活性の強化に好適である、含有する生理学的に活性な物質（抗生物質、ユグロン及びフラボノイド、微量元素、ビタミンＣ、Ｅ、ＰＰの複合体）によってこれらの作用を生じると考えられる。
【００６７】
したがって、ウイルス感染及び細菌感染、化膿疾患及び炎症疾患、並びに、代謝過程及び適応過程の増強を必要とする、他の病理状態の予防及び治療に効果的に用いることができる活性のある自然療法薬の中に、確実に抽出物を組み込むことができる。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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2009538871.tif 000010
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