(57)【要約】  本発明は、還元型のチオネインの治療可能性に基づく。従って本発明は、修飾メタロチオネイン又はチオネインタンパク質、例えば、少なくとも１個の硫黄原子がセレンと置換される（例えば、システインがセレノシステインと置換される）もの、及びその断片を特徴とする。本発明はまた、（ｉ）金属（例えば、亜鉛）のメタロチオネイン又はチオネインとの結合性を低下させるとともに、（ｉｉ）メタロチオネイン、チオネイン、又は別のタンパク質の酸化状態を変化させない候補化合物についてスクリーニングするための方法も特徴とする。また、金属親和性が低減した修飾チオネインタンパク質を生成するための方法、及び酸化ストレスに関連する疾患を患う患者を治療するための方法も特徴とする。
2009538271.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メタロチオネイン又はチオネインと実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、少なくとも１個の硫黄原子がセレンと置換されている、ポリペプチド。
【請求項２】
前記硫黄原子が前記ポリペプチドのシステイン残基中にある、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドの１０個のシステイン残基がセレノシステインと置換されている、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドの全てのシステイン残基がセレノシステインと置換されている、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項５】
メタロチオネイン又はチオネインの断片を含むポリペプチドであって、少なくとも１個の硫黄原子がセレンと置換され、前記断片が金属との結合能を有する、ポリペプチド。
【請求項６】
前記硫黄が前記ポリペプチドのシステイン残基中にある、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記ポリペプチドの全てのシステイン残基がセレノシステインと置換されている、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記断片がメタロチオネイン又はチオネインのα−ドメイン又はβ−ドメインを含む、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記金属が亜鉛である、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
酸化ストレスに関連する疾患の治療用候補化合物を同定するための方法であって、
（ａ）化合物をメタロチオネイン及び被酸化能を有するアミノ酸を含む第２のポリペプチドと接触させる工程と、
（ｂ）前記化合物の存在下における、前記メタロチオネインから放出された金属の量及び前記第２のポリペプチド上の酸化アミノ酸の形成を計測する工程と、
を含み、前記化合物の不在下と比較したとき（ｉ）メタロチオネインからの金属の放出を増加させ、および（ｉｉ）前記第２のポリペプチド中の前記酸化アミノ酸の量を実質的に増加させない化合物により、前記化合物が酸化ストレスに関連する疾患の治療用候補化合物であることが示される、方法。
【請求項１１】
前記化合物が化学ライブラリから選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記酸化アミノ酸がメチオニンスルホキシドである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記金属が、亜鉛、銅、カドミウム、鉛、銀、ガドリニウム、コバルト、カルシウム、金、セレン、ヒ素、タングステン、アルミニウム、マンガン、鉄、クロム、ニッケル、モリブデン、バリウム、ストロンチウム、ビスマス、ハフニウム、テクネチウム、又はランタンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記金属が亜鉛である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２のポリペプチドがメタロチオネイン又はチオネインである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記酸化アミノ酸がメチオニンスルホキシドである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、クロイツフェルトヤコブ病、筋萎縮性側索硬化症、呼吸窮迫症候群、筋ジストロフィー、白内障形成、関節リウマチ、早老症、ウェルナー症候群、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、本態性高血圧症、嚢胞性線維症、限局性回腸炎（クローン病）、黄斑変性症、卒中、虚血、及び潰瘍性大腸炎からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
酸化ストレスに関連する疾患の治療用候補化合物を同定するための方法であって、
（ａ）細胞又は細胞抽出物を化合物と接触させる工程と、  
（ｂ）前記細胞又は細胞抽出物についてメタロチオネイン又はチオネイン量及び酸化状態を計測する工程と、
を含み、前記化合物と接触していない細胞又は細胞抽出物と比較したとき（ｉ）チオネインの量を増加させるか、又はメタロチオネインの量を低下させるとともに（ｉｉ）前記細胞又は細胞抽出物の酸化状態を実質的に増進しない化合物により、前記化合物が酸化ストレスに関連する疾患の治療用候補化合物であることが示される、方法。
【請求項１９】
前記化合物が化学ライブラリから選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記酸化状態の計測が、酸化アミノ酸の存在の検出を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記酸化アミノ酸がメチオニンスルホキシドである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、クロイツフェルトヤコブ病、筋萎縮性側索硬化症、呼吸窮迫症候群、筋ジストロフィー、白内障形成、関節リウマチ、早老症、ウェルナー症候群、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、本態性高血圧症、嚢胞性線維症、限局性回腸炎（クローン病）、黄斑変性症、卒中、虚血、及び潰瘍性大腸炎からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
酸化ストレスに関連する疾患の治療用候補化合物を同定するための方法であって、
（ａ）化合物を、チオネインをコードするポリヌクレオチドを含む細胞又は細胞抽出物と接触させる工程と、
（ｂ）前記細胞又は細胞抽出物中のチオネインの発現を計測する工程と、
を含み、前記化合物の不在下と比較したときの存在下における発現の増加により、前記化合物が酸化ストレスに関連する疾患の治療用候補化合物であることが示される、方法。
【請求項２４】
前記化合物が化学ライブラリから選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、クロイツフェルトヤコブ病、筋萎縮性側索硬化症、呼吸窮迫症候群、筋ジストロフィー、白内障形成、関節リウマチ、早老症、ウェルナー症候群、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、本態性高血圧症、嚢胞性線維症、限局性回腸炎（クローン病）、黄斑変性症、卒中、虚血、及び潰瘍性大腸炎からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
金属に対する親和性の低減したチオネイン変異体を同定するための方法であって、
（ａ）点突然変異、挿入、又は欠失をチオネインに導入するか、又はチオネインを化学的に変性させることにより修飾チオネインを作成する工程と、
（ｂ）前記金属の前記修飾チオネインとの親和性を判定する工程と、
を含み、前記金属に対する親和性の低下により、前記修飾チオネインが金属に対する親和性の低減したチオネイン変異体であることが示される、方法。
【請求項２７】
前記判定工程（ｂ）が前記修飾チオネインの活性の低減を計測する工程をさらに含み、前記修飾チオネインの活性の低減について実質的な低下がないことにより、前記修飾チオネインが金属に対する親和性の低減した酸化還元活性のあるチオネイン変異体であることが示される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記点突然変異がシステインのセレノシステインへの点突然変異を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記金属が、亜鉛、銅、カドミウム、鉛、銀、ガドリニウム、コバルト、カルシウム、金、セレン、ヒ素、タングステン、アルミニウム、マンガン、鉄、クロム、ニッケル、モリブデン、バリウム、ストロンチウム、ビスマス、ハフニウム、テクネチウム、又はランタンである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記金属が亜鉛である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
酸化ストレスに関連する疾患を治療するための方法であって、請求項２６に記載の方法を使用して同定されたチオネイン変異体を、それを必要とする患者に対し投与する工程を含む、方法。
【請求項３２】
前記疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、クロイツフェルトヤコブ病、筋萎縮性側索硬化症、呼吸窮迫症候群、筋ジストロフィー、白内障形成、関節リウマチ、早老症、ウェルナー症候群、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、本態性高血圧症、嚢胞性線維症、限局性回腸炎（クローン病）、黄斑変性症、卒中、虚血、及び潰瘍性大腸炎からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
酸化ストレスに関連する疾患を有する患者を治療するための方法であって、前記方法がキレート剤を前記患者に投与する工程を含み、前記疾患が、クロイツフェルトヤコブ病、呼吸窮迫症候群、ジストロフィー、白内障形成、関節リウマチ、早老症、ウェルナー症候群、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、本態性高血圧症、嚢胞性線維症、限局性回腸炎（クローン病）、黄斑変性症、卒中、虚血、及び潰瘍性大腸炎からなる群から選択される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化ストレスに関連する疾患のための方法及び治療並びにかかる方法に有用であり得る修飾メタロチオネイン又はチオネインタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
メタロチオネインタンパク質のファミリーは、当初は亜鉛を含む金属結合タンパク質として同定された。しかしながら、亜鉛は酸化還元活性金属ではないものの、メタロチオネイン及びチオネインはその独自のシステイン残基の配置による金属結合能（例えば、亜鉛）により、酸化還元反応に関与し得る。従って、本発明より前から、メタロチオネインの酸化と結合した金属の放出とは密接に関連付けられている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
酸化ストレスに関連する疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、クロイツフェルトヤコブ病、筋萎縮性側索硬化症、呼吸窮迫症候群、筋ジストロフィー、白内障形成、関節リウマチ、早老症、ウェルナー症候群、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、本態性高血圧症、嚢胞性線維症、限局性回腸炎（クローン病）、黄斑変性症、卒中、虚血、及び潰瘍性大腸炎が挙げられる。こうした疾患の多くは治療法がないため、かかる疾患に対する治療を特定するための新しい方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、還元型のチオネインの治療可能性に基づく。
【０００５】
従って本発明は、１個又は複数の硫黄原子がセレンと置換されているメタロチオネイン、チオネイン、又はそれらの断片を特徴とする。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１個、又はそれ以上のシステインがセレノシステインと（例えば、本明細書に記載されるとおり、任意の、又は全てのシステイン又はメチオニンにおいて）置換されてもよい。一実施形態において、本発明は、金属（例えば、主族金属、遷移金属、ランタニド、及びアクチニドからなる群から選択されるか、又は、亜鉛、銅、カドミウム、鉛、銀、ガドリニウム、コバルト、カルシウム、金、セレン、ヒ素、タングステン、アルミニウム、マンガン、鉄、クロム、ニッケル、モリブデン、バリウム、ストロンチウム、ビスマス、ハフニウム、テクネチウム、又はランタンからなる群から選択される）との結合能を有するメタロチオネインの断片（例えば、メタロチオネインのα−ドメイン又はβ−ドメイン）を特徴とし、ここで少なくとも１個の（例えば、全ての）硫黄原子がセレンと置換される（例えば、本明細書に記載される任意の置換）。本明細書に記載される任意のポリペプチドにおける硫黄原子は、システイン中にあり得る。
【０００６】
本発明はまた、酸化ストレスに関連する疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、クロイツフェルトヤコブ病、筋萎縮性側索硬化症、呼吸窮迫症候群、筋ジストロフィー、白内障形成、関節リウマチ、早老症、ウェルナー症候群、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、本態性高血圧症、嚢胞性線維症、限局性回腸炎（クローン病）、黄斑変性症、卒中、虚血、及び潰瘍性大腸炎）の治療用候補化合物を同定するための方法も特徴とする。本方法は、（ａ）化合物（例えば、化学ライブラリから選択される化合物）をメタロチオネイン又はチオネイン及び被酸化能を有するアミノ酸を含む第２のポリペプチドと接触させる工程、及び（ｂ）その化合物の存在下における、メタロチオネイン又はチオネインから放出された金属（例えば、主族金属、遷移金属、ランタニド、及びアクチニドからなる群から選択されるか、又は、亜鉛、銅、カドミウム、鉛、銀、ガドリニウム、コバルト、カルシウム、金、セレン、ヒ素、タングステン、アルミニウム、マンガン、鉄、クロム、ニッケル、モリブデン、バリウム、ストロンチウム、ビスマス、ハフニウム、テクネチウム、及びランタンからなる群から選択される金属）の量、及び第２のポリペプチド（例えば、メタロチオネイン又はチオネイン）における酸化アミノ酸（例えば、メチオニンスルホキシド）の形成を計測する工程を含み、ここでその化合物の不在下と比較したとき（ｉ）メタロチオネイン又はチオネインからの金属の放出を増加させるとともに（ｉｉ）第２のポリペプチド中の酸化アミノ酸の量を実質的に増加させない化合物により、その化合物が酸化ストレスに関連する疾患の治療用候補化合物であることが示される。
【０００７】
本発明は、酸化ストレスに関連する疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、クロイツフェルトヤコブ病、筋萎縮性側索硬化症、呼吸窮迫症候群、筋ジストロフィー、白内障形成、関節リウマチ、早老症、ウェルナー症候群、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、本態性高血圧症、嚢胞性線維症、限局性回腸炎（クローン病）、黄斑変性症、卒中、虚血、及び潰瘍性大腸炎）の治療用候補化合物を同定するための別の方法を特徴とする。本方法は、（ａ）細胞又は細胞抽出物を化合物（例えば、化学ライブラリから選択される化合物）と接触させる工程、及び（ｂ）細胞又は細胞抽出物についてのメタロチオネイン又はチオネイン量及び酸化状態（例えば、メチオニンスルホキシドなどの酸化アミノ酸の存在）を計測する工程を含み、ここで化合物と接触していない細胞又は細胞抽出物と比較したとき（ｉ）チオネイン（例えば、無金属チオネイン）の量を増加させるか、又はメタロチオネインの量を減少させるとともに（ｉｉ）細胞又は細胞抽出物の酸化状態を実質的に増進しない化合物により、その化合物が酸化ストレスに関連する疾患の治療用候補化合物であることが示される。
【０００８】
本発明はまた、酸化ストレスに関連する疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、クロイツフェルトヤコブ病、筋萎縮性側索硬化症、呼吸窮迫症候群、筋ジストロフィー、白内障形成、関節リウマチ、早老症、ウェルナー症候群、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、本態性高血圧症、嚢胞性線維症、限局性回腸炎（クローン病）、黄斑変性症、卒中、虚血、及び潰瘍性大腸炎）の治療用候補化合物を同定するための第３の方法も特徴とする。本方法は、（ａ）化合物（例えば、化学ライブラリから選択される化合物）を、チオネインをコードするポリヌクレオチドを含む細胞又は細胞抽出物と接触させる工程、及び（ｂ）細胞又は細胞抽出物中のチオネインの発現を計測する工程を含み、ここで化合物の不在下と比較したときの存在下における発現の増加により、その化合物が酸化ストレスに関連する疾患の治療用候補化合物であることが示される。
【０００９】
別の実施形態において、本発明は、金属に対する親和性の低減したチオネイン変異体を同定するための方法を特徴とする。本方法は、（ａ）点突然変異、挿入、又は欠失をチオネインに導入するか、又はチオネインを化学的に変性させて、それにより修飾チオネインを作成する工程、及び（ｂ）金属（例えば、主族金属、遷移金属、ランタニド、及びアクチニドからなる群から選択されるか、又は、亜鉛、銅、カドミウム、鉛、銀、ガドリニウム、コバルト、カルシウム、金、セレン、ヒ素、タングステン、アルミニウム、マンガン、鉄、クロム、ニッケル、モリブデン、バリウム、ストロンチウム、ビスマス、ハフニウム、テクネチウム、又はランタンからなる群から選択される）の修飾チオネインとの親和性を判定する工程を含み、ここで金属に対する親和性の低下により、その修飾チオネインが金属に対する親和性の低減したチオネイン変異体であることが示される。この判定工程は、修飾チオネインの活性の低減を計測する工程をさらに含んでもよく、ここで修飾チオネインの活性の低減について実質的な低下がないことにより、その修飾チオネインが金属に対する親和性の低減した酸化還元活性のあるチオネイン変異体であることが示される。
【００１０】
本発明はまた、酸化ストレスに関連する疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、クロイツフェルトヤコブ病、筋萎縮性側索硬化症、呼吸窮迫症候群、筋ジストロフィー、白内障形成、関節リウマチ、早老症、ウェルナー症候群、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、本態性高血圧症、嚢胞性線維症、限局性回腸炎（クローン病）、黄斑変性症、卒中、虚血、及び潰瘍性大腸炎）を治療するための方法も特徴とする。一実施形態において、本方法は、前出の実施形態の方法を使用して同定されたチオネイン変異体を、それを必要とする患者に投与する工程を含む。別の実施形態において、本方法は、キレート剤を患者に投与する工程を含み、ここで患者は、クロイツフェルトヤコブ病、呼吸窮迫症候群、ジストロフィー、白内障形成、関節リウマチ、早老症、ウェルナー症候群、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、本態性高血圧症、嚢胞性線維症、限局性回腸炎（クローン病）、黄斑変性症、卒中、虚血、又は潰瘍性大腸炎から選択される疾患を有する。
【００１１】
本発明の方法のいずれも、任意のメタロチオネイン変異体、断片、又は誘導体（例えば、本明細書に記載されるもの）を用い得る。ある実施形態において、ＭＴ／Ｔ変異体は硫黄原子がセレン原子と置換されており、例えば、１つ又は複数の（例えば、全ての）システイン（例えば、本明細書に記載されるもの）のセレノシステインとの置換を含む点突然変異を有する。
【００１２】
本発明の組成物又は方法のいずれも、用いられるＭＴ又はＴは、１つ又は複数の非システイン残基の、種々のアミノ酸（例えば、天然に存在する、又は天然に存在しないアミノ酸）との置換を有してもよい。さらに、用いられるＭＴ又はＴは、１個又は複数の硫黄原子のセレンとの（例えば、システイン残基のセレノシステインとの）置換を有してもよい。本発明の方法及び組成物において有用なＭＴ／Ｔ変異体は、メタロチオネインのα又はβドメインの一次配列の１つ又は複数の反復（例えば、１つ又は複数のアミノ酸のスペーサー配列により分離される）を含む。さらにＭＴ／Ｔ変異体は、任意の順序で連結されるαドメイン（例えば、１、２、３、４、５、８、１０、１２個、又はそれ以上）又はβドメイン（例えば、１、２、３、４、５、８、１０、１２個、又はそれ以上）の任意の組み合わせを含み、場合によりドメイン間に１つ又は複数のスペーサーを伴う。ドメインは、任意の非システインアミノ酸又は硫黄原子のセレンとの（例えば、システインのセレノシステインとの）置換をさらに含み得る。
【００１３】
「メタロチオネイン」とは、配列番号１〜４のいずれかと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、又はさらに１００％の同一性を有するタンパク質、又はその相同体を意味し、このタンパク質には７個の金属原子が結合している。
【００１４】
「チオネイン」とは、配列番号１〜４のいずれかと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、又はさらに１００％の同一性を有するタンパク質、又はその相同体を意味し、６個以下の金属原子が結合している。「無金属チオネイン」とは、結合している金属原子が０個のチオネインを意味する。
【００１５】
「メタロチオネインからの金属の放出を増加させる」化合物とは、その化合物の不在下と比較したとき、チオネイン（例えば、無金属チオネイン）の量が少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、１００％、２００％、５００％、１０００％増加する化合物を意味する。あるいは、「メタロチオネインからの金属の放出を増加させる」化合物により、亜鉛に対するＭＴ／Ｔの結合定数が、少なくとも２、５、１０、５０、１００、１０００、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、又はｌ０１０倍に増加し得る（すなわち、親和性が低下し得る）。
【００１６】
「前記第２のポリペプチド中の前記酸化アミノ酸の量を実質的に増加させない」化合物とは、すなわち、その化合物の不在下と比較したとき、酸化アミノ酸量の増加が、１％、２％、５％、１０％、２５％、５０％、１００％、又は５００％未満である化合物を意味する。ある実施形態において、化合物により酸化アミノ酸量は変化しないか、又はさらには酸化アミノ酸の量は減少し得る。
【００１７】
細胞又は細胞溶解物の「酸化状態を実質的に増進させない」化合物とは、その化合物によっても細胞又は細胞溶解物の酸化還元電位が、０．０１、０．０５、０．１０、０．２０、０．４、０．５、０．７５、１、２、５、１０、２５、５０、１００、２００、５００、１０００、１５００、２０００、５０００、１０，０００、又は２０，０００ｍＶより多く増加しないことを意味する。
【００１８】
本発明の他の特徴及び利点が、以下の詳細な説明、図面、及び特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
ここで本出願人は、３つのメタロチオネイン／チオネイン種（すなわち、メタロチオネイン、酸化チオネイン、及び還元チオネイン）のうち、還元チオネインが酸化ストレスに関連する疾患において治療上重要な種であると考える。従って本発明は、メタロチオネイン及びチオネインポリペプチドの修飾、還元チオネインのレベルを増加させるための方法、金属結合を好まずかつ還元状態を好むチオネイン変異体を産生するための方法、及びチオネインとの金属結合性を低下させると同時に患者のにおいて利用可能な還元チオネインの量を増加させる、酸化ストレスに関連する疾患を治療するための方法を特徴とする。本発明のスクリーニング方法は、酸化ストレスに関連する疾患（例えば、本明細書に記載されるもの）の治療において有用な化合物を同定できる。
【００２０】
メタロチオネイン及びチオネイン
チオネインは、約２０個のシステインアミノ酸を含む６０個超のアミノ酸のタンパク質である。チオネインは芳香族残基もヒスチジン残基も含まない。メタロチオネインは１９５７年に発見された（Ｍａｒｇｏｓｈｅｓ及びＶａｌｌｅｅ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７９：４８１３−４８１４頁、１９５７年）。２つの極めて類似したＭＴ−１型とＭＴ−２型とが同定されたが、最近になって、第３のＭＴ−３型が成長阻害因子としてアルツハイマー患者の脳において同定された（Ｕｃｈｉｄａら、Ｎｅｕｒｏｎ  ７：３３７−３４７頁、１９９１年）。第４の変異体ＭＴ−４もまた、重層扁平上皮においてのみ発現することが分かった（Ｑｕａｉｆｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：７２５０−９頁、１９９４年）。さらなる（全部で１７個もの数の）ＭＴアイソフォームをコードする遺伝子もまた同定されている。
【００２１】
チオネインは２つのドメイン（β及びα）を有する。Ｎ末端のβドメインは３個の金属原子（例えば、亜鉛）を結合できる９個のシステインを含み、Ｃ末端のαドメインは４個の金属原子（例えば、亜鉛）を結合できる１１個のシステインを含み、これによりメタロチオネインを形成する（Ｍａｒｅｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：２２３３−２２３７頁、１９９７年）。ＧＡＬ４などの亜鉛酵素は二核亜鉛クラスター（図２Ｃ）として金属を結合するが、メタロチオネインは特異な様式で、三核亜鉛クラスター（βドメイン；図２Ｂ）、及び四核亜鉛クラスター（αドメイン；図２Ａ）により亜鉛を結合する。これらの特異な構造は、動態上は不安定性が高いものの熱力学的には安定であり、亜鉛調節におけるＭＴ／Ｔ細胞機能に関係しているものと思われる。本発明のある実施形態においては、このクラスターが、ドメインの一部として、或いは金属を結合するのに十分な数のアミノ酸（例えば、システイン）を含むいずれかのドメインのより小さい部分において、金属を取り込んだり、又は放出したりするその能力（例えば、本明細書に記載されるとおり）、又はその挙動を規定する平衡が評価され得る。このような測定で使用される金属としては、本明細書に記載される任意のものを含むことができる。結合は、同位体で標識された遷移金属又はＩＩｂ族金属を使用して測定されてもよい。かかる実験は、ＭＴ−１、ＭＴ−２、ＭＴ−３、ＭＴ−４、又は任意の他のＭＴ変異体、誘導体、若しくは断片（例えば、本明細書に記載されるもの）のいずれかにより行われ得る。さらなるＭＴ変異体が同定され得るとともに、当該技術分野において周知の任意の方法を使用して、これらの調節、発現、又は局在性が特性決定され得る。
【００２２】
細胞内亜鉛の調節
メタロチオネイン及びチオネインに依拠する機能の１つは、細胞内亜鉛レベルの調節である（Ｊａｃｏｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：３４８９−３４９４頁、１９９８年）。亜鉛は、数多くの酵素における重要な補因子である。ＭＴ／Ｔとの亜鉛結合は強力だが（ｐＨ７．４での結合定数が３．２×１０−１３Ｍ）、ＭＴ／Ｔは大腸菌（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）アルカリホスファターゼ及びウシカルボキシペプチダーゼＡなどの亜鉛酵素に対し亜鉛を提供できることが示されている。
【００２３】
亜鉛は酵素活性に必要とされることに加え、カスパーゼ３、フルクトース１，６−ジホスファターゼ、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、チロシンホスファターゼ、及び酵母エノラーゼを含むいくつかの酵素の活性を阻害する（Ｍａｒｅｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９６：１９３６−１９４０頁、１９９９年）。亜鉛により不活性化された酵素は、無金属チオネインを添加すると活性の回復を呈する。
【００２４】
細胞酸化
先行研究（Ｍａｒｅｔ及びＶａｌｌｅｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：３４７８−３４８２頁、１９９８年）から、亜鉛それ自体は酸化還元不活性だが、メタロチオネイン及びチオネインには酸化還元活性があることが示されている。酸化剤がＭＴ／Ｔ中でシステインを還元し、それによりタンパク質からの金属の同時放出が生じることが示されている。このように、ＭＴ／Ｔは細胞における酸化状態の維持に関与しているものと思われる。
【００２５】
ヌクレオチド三リン酸結合
ヌクレオチド三リン酸は、アデノシン５’［γ−チオ］三リン酸及びＡＭＰ−ＰＮＰなどのＡＴＰ、ＧＴＰ、及びＡＴＰ類似体を含め、ＭＴ／Ｔと結合するとＭＴ／Ｔからの金属の放出を生じさせる（Ｊｉａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：９１４６−９１４９頁、１９９８年）。この結合は、哺乳動物のメタロチオネイン及びチオネイン中に見られる８個の保存されたリシン残基により媒介される。
【００２６】
細胞中の非結合チオネインの同定
メタロチオネインは一般に金属と結合した形態で観察されるが、チオネインは生物学的材料中に検出され、およびそこから単離されており（Ｍａｒｅｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９６：１９３６−１９４０頁、１９９９年）、内因性キレート剤として作用する。
【００２７】
さらなるＭＴ／Ｔ適用
メタロチオネイン又はチオネインは、チオネインを自然に産生する任意の生物体又はチオネインを産生するよう改変された生物体から単離、精製又は分画できる。ある実施形態においては、ヒト、ウシ、又はウマチオネインを単離、精製又は分画できる。メタロチオネインはまた、その免疫学的特性、又はその反応特性（例えば、本明細書に記載される任意の金属、任意のヌクレオチド、ヌクレオシド、又は任意の他の化合物若しくはポリペプチドとの）について評価できる。ある実施形態において、ＭＴ／Ｔ又は本明細書に記載される任意の変異体の、ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ＧＳＨ、ＧＳＳＧ、又はこれらの任意の組み合わせとの相互作用が研究される。
【００２８】
ＭＴ／Ｔの金属負荷状態はまた、例えば、Ｒｉｃｈａｒｚ  ＡＮ、２００２年、「Ｓｐｅｚｉａｔｉｏｎｓａｎａｌｙｓｅ  ｖｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｇｅｂｕｎｄｅｎｅｎ  Ｅｌｅｍｅｎｔｅｎ  ｉｎ  Ｃｙｔｏｓｏｌｅｎ  ａｌｓ  ｂｉｏｌｏｇｉｓｃｈｅ  Ｍａｒｋｅｒ  ｆｕｅｒ  Ｌｅｂｅｎｓｐｒｏｚｅｓｓｅ  ｕｎｔｅｒ  ｂｅｓｏｎｄｅｒｅｒ  Ｂｅｒｕｅｃｋｓｉｃｈｔｉｇｕｎｇ  ｄｅｒ  Ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎｅ  ｉｍ  Ｇｅｈｉｒｎ（学位論文）」、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｅｒｌｉｎ  ｏｆ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ：ベルリン（Ｂｅｒｌｉｎ）（独国）に記載される方法を使用しても分析され得る。
【００２９】
さらに、異なる細胞環境中のＭＴ／Ｔ画分の検出は、細胞小器官を、例えば密度遠心法に基づき分離することにより実現できる。特に、リソソーム、ペルオキシソーム、ミトコンドリア、小胞体（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｃｔｉｃｕｌｕｍ）、ゴルジ体、リボソーム、核、又は任意の他の細胞内粒子が、本発明の方法において分析され得る。他の実施形態において、かかる細胞内粒子は、心臓、肝臓、脳、腎臓、又は任意の他の器官に由来して分析され得る。ＭＴ／Ｔ（例えば、本明細書に記載されるものなどの任意の変異体）と、ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ＧＳＨ、ＧＳＳＧ、又はこれらの任意の組み合わせとの相互作用が分析されてもよい。かかる方法は、セレノシステイン置換ＭＴ／Ｔ、ＭＴ／Ｔの任意のセレノ誘導体、又は本明細書に記載されるＭＴ／Ｔの任意の変異体若しくは断片を使用して用いられ得る。
【００３０】
セレン置換ＭＴ／Ｔ
一態様において、本発明は、１個又は複数の硫黄原子がセレンと置換されたメタロチオネイン又はチオネインを特徴とする。置換メタロチオネイン又はチオネインは、０、１、２、３、４、５、６、７個又はそれ以上の金属原子に結合し得る。ある実施形態において、システインがセレノシステインと置換される（例えば、本明細書に記載されるとおり、任意の、又は全てのシステインにおいて）。セレノシステインは既知の生理的分布を有し、非毒性で、耐容性が十分に高い。従って、セレノシステインを含有するタンパク質は、治療剤として（例えば、本明細書に記載されるものなどの酸化ストレスに関連する疾患の治療において）有用であり得る。
【００３１】
かかるタンパク質は、当該技術分野において周知の任意の方法により産生できる。例えば、Ｏｉｋａｗａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：３０５７−３０５９頁、１９９１年に記載されるように、ペプチド合成を使用して、セレノシステインをタンパク質配列中に導入できる。この例では、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）銅メタロチオネイン中のシステイン残基がセレノシステインと置換された。他の実施形態において、例えば、Ｈｏｎｄａｌら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２３：５１４０−５１４１頁、２００１年に記載されるとおりの、又はＤａｗｓｏｎ及びＫｅｎｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６９：９２３−９６０頁、２０００年に記載されるとおりの半合成方法を使用して、システインはセレノシステインと置換できる。他の手法としては、例えば、Ｗａｎｇ及びＳｃｈｕｔｚ、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．１−１１頁、２００２年及びＷａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８−５００頁、２００１年に記載されるとおり、生物体中のｔＲＮＡを修飾しているアミノ酸を別のアミノ酸に置換することを含む。これらの手法のいずれか、又は当該技術分野において周知の任意の他の手法を使用して、ＭＴ／Ｔのセレノシステイン誘導体は生成され得る。
【００３２】
他のＭＴ／Ｔ変異体
本発明はまた、１つ又は複数の非システイン残基の種々のアミノ酸（例えば、天然に存在する、又は天然に存在しないアミノ酸）との置換を伴うＭＴ又はＴ変異体も特徴とする。さらに、本発明はまた、１個又は複数の硫黄原子のセレン（例えば、システイン残基のセレノシステインとの）置換を伴うＭＴ又はＴも特徴とする。ＭＴ／Ｔ変異体は、メタロチオネインのα又はβドメインの一次配列の１つ又は複数の反復（例えば、１つ又は複数のアミノ酸のスペーサー配列により分離される）を含む。ＭＴ／Ｔ変異体は、任意の順序で連結されたαドメイン（例えば、１、２、３、４、５、８、１０、１２個、又はそれ以上）又はβドメイン（例えば、１、２、３、４、５、８、１０、１２個、又はそれ以上）の任意の組み合わせを含み、場合によりドメイン間に１つ又は複数のスペーサーを伴い得る。ドメインはさらに、任意の非システインアミノ酸又はシステインの、セレノシステインなどのセレンを含む残基との置換を含み得る。本発明に包含される変更を含むドメインは、参照により本明細書に援用される国際公開第００／５０４４８号パンフレットの１２頁４行目から１４頁５行目にかけて記載される。国際公開第００／５０４４８号パンフレットに記載される変更はまた同様に、完全長メタロチオネインタンパク質、その任意の断片、又は本明細書に記載される任意の他の変異体に導入されてもよい。
【００３３】
他の変異体としては、金属原子との結合能を有する任意のメタロチオネイン断片などの断片、例えば、βドメイン又はαドメインの部分を含み、ここでその断片は、ドメインのＣ末端から、ドメインのＮ末端から、又はそれらが混成した、１〜２５個のアミノ酸を欠いている。金属との結合能を有する欠失突然変異体は、当該技術分野において周知の分子生物学的技術を使用して同定でき、及び金属結合性は任意の方法（例えば、本明細書に記載されるとおりの）を使用して測定され得る。
【００３４】
候補治療化合物を同定するためのスクリーニング方法
ここで本出願人は、メタロチオネイン及びチオネインの亜鉛結合及び調節タンパク質としての同定、並びにＭＴ／Ｔ亜鉛結合を伴う細胞酸化におけるその役割に基づき、ＭＴ／Ｔの亜鉛結合活性の、ＭＴ／Ｔの酸化との分離を探る。従って、本発明は、（ｉ）金属のＭＴ／Ｔに対する結合性を低下させ、および（ｉｉ）ＭＴ／Ｔ又は第２のポリペプチドの酸化を実質的に増進しない、化合物を同定するためのスクリーニング方法を特徴とする。本発明の方法により同定された化合物により、メチオニンスルホキシド残基を含むメタロチオネイン又はチオネインなどの害を及ぼす可能性のある酸化種を還元するために利用可能なチオネインの利用能が増加し得る。酸化アミノ酸が疾患進行において役割を果たす疾患の具体例としてはメチオニンスルホキシドを含む酸化されたα−シヌクレインが同定されたパーキンソン病（Ｇｌａｓｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１７０３：１５７−６９頁、２００５年）、及びメチオニンスルホキシド残基を含む酸化されたβ−アミロイドタンパク質が同定されたアルツハイマー病（Ｓｃｈｏｎｅｉｃｈ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１７０３：１１１−９頁、２００５年）を含む。酸化ストレスに関連する疾患の他の例は、本明細書に記載される。このように、本発明のスクリーニング方法により同定される化合物は、酸化ストレスに関連する疾患の治療において有用であり得る。
【００３５】
ＭＴ／Ｔとの金属結合性を低下させるとともに、ＭＴ／Ｔ又は第２のポリペプチドの酸化を実質的に増進しない化合物を同定するためのスクリーニングアッセイは、標準的な方法により実施できる。本スクリーニング方法には、ハイスループット技術が関与し得る。加えて、こうしたスクリーニング技術は、培養細胞中、又は虫、ハエ、若しくは酵母などの生物中において実施できる。
【００３６】
メタロチオネイン
本発明のスクリーニング方法は、ヒトＭＴタンパク質（例えば、マウス、ラット、又はウサギ由来のＭＴタンパク質）と相同なタンパク質などの任意のＭＴ／Ｔタンパク質の使用を含み得る。任意の型のＭＴ／Ｔ（例えば、ＭＴ−３及び本明細書に記載されるもの）を本発明の方法において使用できる。詳細な実施形態において、本発明のスクリーニング方法に用いられるメタロチオネイン又はチオネインは、野生型タンパク質に見られる１個又は複数の硫黄原子の代わりにセレン（例えば、１つ又は複数のシステインアミノ酸の代わりにセレノシステイン）を含んでもよい。他の実施形態において、本明細書に記載されるメタロチオネイン又はチオネインの任意の変異体を使用するスクリーニング方法。金属放出の検出を可能にするＭＴ／Ｔの任意の濃度が本スクリーニング方法において用いられ得る。チオネインが結合能を有する任意の金属が、主族金属、遷移金属、ランタニド、及びアクチニドからなる群から選択されるもの、及び亜鉛、銅、カドミウム、鉛、銀、ガドリニウム、コバルト、カルシウム、金、セレン、ヒ素、タングステン、アルミニウム、マンガン、鉄、クロム、ニッケル、モリブデン、バリウム、ストロンチウム、ビスマス、ハフニウム、テクネチウム、及びランタンからなる群から選択されるものを含め、メタロチオネインを形成するために使用できる。いくつかの実施形態において、ＭＴ／Ｔの金属結合（例えば、亜鉛結合）断片（例えば、βドメイン又はαドメインを含む本明細書に記載される任意の断片）が本スクリーニング方法において使用される。本明細書に記載される任意のＭＴ／Ｔ変異体、誘導体、断片もまた、本発明の方法において使用され得る。
【００３７】
メタロチオネインとの金属結合性の低下の検出
本発明のスクリーニング方法は、ＭＴ／Ｔ又は本明細書に記載されるその任意の断片若しくは変異体からの金属の放出を判定する工程を含む。金属放出を判定するための当該技術分野において周知の任意の方法を使用できる。
【００３８】
一実施形態において、Ｍａｒｅｔ及びＶａｌｌｅｅ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：３４７８−３４８２頁、１９９８年）により記載される方法が用いられる。簡潔に言えば、亜鉛が結合するとそれらの色素のスペクトル特性が変わる４−（２−ピリジルアゾ）レソルシノール（ＰＡＲ）又は２−カルボキシ−２’−ヒドロキシ−５’−スルホホルマジルベンゼン（ジンコン）などの亜鉛複合色素を使用することで、亜鉛のＭＴ／Ｔからの放出を計測できる。特定の一例においては、１００μＭのＰＡＲ又はジンコンを含む緩衝液が、１．３μＭの亜鉛−ＭＴとともにインキュベートされる。試験化合物が溶液に添加されると、ＰＡＲに関しては５００ｎｍ、又はジンコンに関しては６２０ｎｍでの吸光度の変化が分光光度計を使用して計測され、試験化合物の不在下での吸光度と比較でき、ここで吸光度の増加はＭＴ／Ｔからの亜鉛の放出を示す。必要であれば、試験化合物により生成される吸光度は吸光度計測において補正できる。細胞内遊離亜鉛の検出に有用なさらなる分子としては、例えば、Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ及びＬｉｐｐａｒｄ、Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４５：５５５−５６１頁、２００６年、及びＷｏｏｄｒｏｏｆｅら、Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４４：３１１２−３１２０頁、２００５年に記載されるＺｉｎｐｙｒ−１類似体を含む。
【００３９】
別の実施形態においては、銅−ＭＴが本発明のスクリーニング方法に用いられる。ここでは、銅−ＭＴを試験化合物と接触させたうえ、４−（ｌ，４，７，１０−テトラチア−１３−アザ−シクロペンタデク−１３−イル）−ベンゼン（ＣＴＡＰ−１）を使用して銅の放出が測定される。ＣＴＡＰ−１は、銅の存在下では、銅の不在下と比較して３６５ｎｍで励起した場合の４８０ｎｍにおける発光の増加を呈し（Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０２：１１１７９−１１１８４頁、２００５年）、細胞又は細胞抽出物を用いるスクリーニング方法における使用にさらに好適である。
【００４０】
メタロチオネイン及びチオネインの相対量、及びチオネインに結合する金属原子の数の変化もまた、例えば、Ｒｉｃｈａｒｚ  ＡＮ、２００２年、「Ｓｐｅｚｉａｔｉｏｎｓａｎａｌｙｓｅ  ｖｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｇｅｂｕｎｄｅｎｅｎ  Ｅｌｅｍｅｎｔｅｎ  ｉｎ  Ｃｙｔｏｓｏｌｅｎ  ａｌｓ  ｂｉｏｌｏｇｉｓｃｈｅ  Ｍａｒｋｅｒ  ｆｕｅｒ  Ｌｅｂｅｎｓｐｒｏｚｅｓｓｅ  ｕｎｔｅｒ  ｂｅｓｏｎｄｅｒｅｒ  Ｂｅｒｕｅｃｋｓｉｃｈｔｉｇｕｎｇ  ｄｅｒ  Ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎｅ  ｉｍ  Ｇｅｈｉｒｎ（学位論文）」、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｅｒｌｉｎ  ｏｆ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ：ベルリン（Ｂｅｒｌｉｎ）（独国）に記載される方法を使用して分析され得る。試験化合物を接触させたときのメタロチオネイン又はチオネインの金属負荷状態の低下又は生体系における無金属チオネイン量の増加は、その化合物がＭＴ又はＴの金属を結合する能力を低下させることを示し得るとともに、記載される方法を使用して検出され得る。さらに、種々の細胞環境におけるＭＴ／Ｔ画分の検出は、細胞小器官を、例えば密度遠心法に基づき分離することにより実現できる。特に、リソソーム、ペルオキシソーム、ミトコンドリア、小胞体（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｃｔｉｃｕｌｕｍ）、ゴルジ体、リボソーム、核、又は任意の他の細胞内粒子が、本発明の方法において分析され得る。他の実施形態において、かかる細胞内粒子は、心臓、肝臓、脳、腎臓、又は任意の他の器官に由来して分析され得る。ＭＴ／Ｔ（例えば、本明細書に記載されるものなどの任意の変異体）の、ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ＧＳＨ、ＧＳＳＧ、又はこれらの任意の組み合わせとの相互作用が分析されてもよい。かかる方法は、セレノシステイン置換ＭＴ／Ｔ、又はＭＴ／Ｔの任意の他のセレノ誘導体を使用して用いられ得る。
【００４１】
アミノ酸酸化及び細胞酸化状態の検出
本発明のスクリーニング方法はまた、第２のポリペプチド（例えば、ＭＴ、Ｔ、又は本明細書に記載される任意の断片若しくは変異体）のアミノ酸の酸化を計測する工程、又は試験化合物の細胞の酸化状態（例えば、酸化アミノ酸又は活性酸素種の形成）が実質的に増進したかどうかを判定する工程も含む。
【００４２】
酸化アミノ酸の検出については、当該技術分野において周知の任意の方法が本発明のスクリーニング方法において用いられ得る。例示的な検出方法が、Ｓｈａｃｔｅｒ、Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｖ．３２：３０７−２６頁、２０００年に記載される。アミノ酸検出の具体的な方法は、検出される酸化アミノ酸の詳細な種類に依存し得る。
【００４３】
メチオニンの酸化は結果としてメチオニンスルホキシドの形成を生じ得るとともに、一実施形態においては、かかる残基が検出される。チオネイン及びメタロチオネインを含む実質的に全てのタンパク質がＮ末端メチオニン残基を有するため、メチオニンスルホキシドの検出は特に有用である。メチオニンスルホキシドは、Ｓｏｃｈａｓｋｉら（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：４６６２−７頁、２００１年）に記載される方法により検出され得る。ここでは、試料がメタンスルホン酸で加水分解される。加水分解された試料は次に、陽イオン交換カラム上で分離され、アミノ酸がそのトリメチルシリルエステルとして誘導体化される。次に試料中のメチオニンスルホキシドの存在が、当該技術分野において周知のとおり、選択イオンモニタリングガスクロマトグラフィー／質量分析法により検出される。ＭＴ／Ｔの金属（例えば、亜鉛）結合性を低下させるが、メチオニンスルホキシドの形成（例えば、ＭＴ／Ｔ中のＮ末端メチオニンにおける）を増進しない化合物が、本発明においては有用と見なされる。
【００４４】
細胞又は細胞抽出物を用いる本発明の方法においては、酸化還元電位の変化の検出もまた、当該技術分野において周知の任意の方法を使用して実施され得る。例えば、活性酸素種の存在もまた、市販のキット、例えば、Ｉｍａｇｅ−ｉＴ（商標）ＬＩＶＥ  Ｇｒｅｅｎ活性酸素種検出キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して測定できる。酸化還元電位をその場（ｉｎ  Ｓｉｔｕ）でで計測するためのさらなる方法が、Ｈａｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１３０４４−１３０５３頁、２００４年に記載される。ここでは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）はシステインを含むように修飾される。修飾ＧＦＰ中でジスルフィド結合が形成される結果として、酸化還元電位の変化に応じてタンパク質の蛍光に変化が生じる。こうした変化を使用することで、細胞環境中の酸化還元電位の変化を測定できる。
【００４５】
メタロチオネイン又はチオネインの金属（例えば、亜鉛）結合性は低減するが、メタロチオネイン又はチオネインの酸化還元化学反応に関与する能力は実質的に低減しない化合物が、本発明においては有用と見なされる。
【００４６】
チオネイン発現の増加についてのスクリーニング
チオネイン（例えば、ＭＴ−３）発現を増加させる化合物を同定するためのスクリーニングアッセイの実施にあたっては、あらゆる方法が利用可能である。一手法に従えば、メタロチオネインをコードするポリヌクレオチドを発現する細胞の培養培地に対し、候補化合物が様々な濃度で添加される。次に遺伝子発現が、例えば、標準的なノーザンブロット解析（Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９９７年）により、ポリヌクレオチド分子からハイブリダイゼーションプローブとして調製された任意の然るべき断片を使用して計測される。候補化合物の存在下での遺伝子発現レベルが、候補分子のない対照培養培地において計測されるレベルと比較される。チオネイン発現（例えば、ＭＴ−３）の増加を促進する化合物が、本発明においては有用と見なされる。かかる分子は、例えば、酸化ストレスに関連する疾患（例えば、本明細書に記載されるもの）用の治療剤として使用できる。
【００４７】
必要に応じて、代替例として、同じ一般的な手法及び例えばメタロチオネイン又はチオネインに特異的な抗体を伴うウエスタンブロッティング又は免疫沈降などの標準的な免疫学的技術を使用して、ポリペプチド産生のレベルに対する候補化合物の効果が計測されてもよい。例えば、免疫測定法を使用して、メタロチオネイン又はチオネインの発現を検出又は測定できる。かかるポリペプチドとの結合能を有するポリクローナル又はモノクローナル抗体を任意の標準的な免疫測定フォーマット（例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、又はＲＩＡアッセイ）で使用して、メタロチオネインのレベルを計測できる。メタロチオネイン又はチオネインの発現の増加を促進する化合物が、特に有用と見なされる。さらにかかる分子は、例えば、酸化ストレスに関連する疾患用の治療剤として使用できる。
【００４８】
試験化合物及び抽出物
一般に、酸化ストレスに関連する疾患の治療能を有する化合物は、当該技術分野において周知の方法に従い、天然産物又は合成（又は半合成）抽出物の双方の大型ライブラリ又は化学ライブラリから同定される。創薬及び新薬開発分野の当業者は、試験抽出物又は化合物の正確な供給源が本発明のスクリーニング方法にとって決定的に重要なものではないことは理解するであろう。従って、事実上、あらゆる化学的抽出物又は化合物が、本明細書に記載される方法を使用してスクリーニングされ得る。かかる抽出物又は化合物の例としては、植物、真菌、原核生物又は動物ベースの抽出物、発酵ブロス、及び合成化合物、並びに既存化合物の修飾物を含むが、これらに限定はされない。サッカリド、脂質、ペプチド、及びポリヌクレオチドベース（例えば、ｓｉＲＮＡ又はマイクロＲＮＡ）化合物を含むが、これらに限定はされないあらゆる化学的化合物のランダムな、又は特異的な合成（例えば、半合成又は全合成）を生じさせるためにもまた、数多くの方法が利用可能である。本発明のスクリーニング方法に使用され得るさらなる化合物としては、本明細書に記載される任意の化合物（例えば、キレート剤、修飾チオネイン、並びにセレン化合物（例えば、セレノシスタミン、塩化ベンゼンセレネニル、及びベンゼンセレニン酸））が含まれる。これらの化合物のいずれも、当該技術分野で標準的な方法を使用して化学的に修飾され得る。
【００４９】
合成化合物ライブラリは市販されている。あるいは、細菌、真菌、植物、及び動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリが市販されている。加えて、天然の、及び合成して産生されたライブラリが、必要に応じて、当該技術分野において周知の方法に従い、例えば標準的な抽出及び分画方法により作成される。さらには、必要に応じて、任意のライブラリ又は化合物は、標準的な化学的、物理的、又は生化学的方法を使用して容易に修飾される。
【００５０】
加えて、創薬及び新薬開発の当業者は、デレプリケーション（例えば、分類学的デレプリケーション、生物学的デレプリケーション、及び化学的デレプリケーション、又はそれらの任意の組み合わせ）又は酸化ストレスに関連する疾患の治療においてその活性が既知の材料の複製物又は複写物を除去するためのための方法は、可能であればいつでも用いなければならないことを容易に理解する。
【００５１】
粗抽出物が、金属のメタロチオネイン又はチオネインとの結合性の低下、又はチオネインの発現の増加など、所望の活性を有することが分かった場合、観察された効果の要因となる化学成分を単離するため、陽性のリード抽出物のさらなる分画が必要とされる。このように、抽出、分画、及び精製処理の目的は、酸化ストレスに関連する疾患の治療に有用であり得る活性を有する粗抽出物内の化学物質の特性決定及び同定である。かかる異種成分からなる抽出物の分画及び精製の方法は当該技術分野において周知である。必要に応じて、酸化ストレスに関連する疾患の治療に有用な薬剤として示される化合物は、当該技術分野において周知の方法に従い化学的に修飾される。
【００５２】
金属結合性の低下した修飾チオネイン
本発明はまた、金属（例えば、亜鉛）結合性の低減した修飾チオネイン（Ｔ）を生成するための方法も特徴とする。ある実施形態において、修飾チオネインは、野生型チオネインと比較した場合、酸化還元反応に関与する能力をさらに保持し得る。かかる修飾チオネイン分子は、酸化ストレスに関連する疾患の治療において有用であり得る。修飾は、当該技術分野において周知の任意の手段により実施され得る。配列の改変（例えば、点突然変異、挿入、欠失、又はこれらの任意の組み合わせ）を導入するための方法は、当業者に周知である。
【００５３】
チオネインの修飾
チオネインは、任意の残基において修飾されてもよく（例えば、化学的誘導体化又は点突然変異により）、１個又は複数の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、１０、１５、又は２０個の）アミノ酸の挿入又は欠失により修飾されてもよい。本明細書に記載されるチオネインへの任意の修飾が、本発明の方法において使用され得る。こうした修飾は、例えば、標準的な分子生物学的技術を使用することにより実施され得る。ある実施形態においては、リシン残基が改変されることにより金属（例えば、亜鉛）結合性の低下が生じる。かかる改変としては、チオール、スルフェン酸、スルフィン酸、スルホン酸、スルホン酸エステル、スルホキシド、又はスルホン部分の付加又は置換を含むことができる。これらのリシン残基としては、今のところは未知の機序でＡＴＰ結合（Ｊｉａｎｇら、上記を参照）に関与しているＭＴ１又はＭＴ２（配列番号１及び２）の２０、２２、２５、３０、３１、４３、５１、及び５６位における８個のリシン残基、ＭＴ３（配列番号３）の２１、２６、３１、３２、４４、４７、５２、及び６３位におけるリシン残基、又はＭＴ４（配列番号４）の２１、２８、３２、４４、５２、又は５７位におけるリシン残基を含む。上述のとおり、ＡＴＰ結合は、ＭＴの金属に対する親和性を低下させる。従って、チオネイン中のリシン残基（例えば、上述されるもの）若しくはリシン残基に隣接する残基、又はチオネインの三次元構造に基づいたリシン残基に近接している残基の修飾が、ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ＧＳＨ、又はＧＳＳＧ結合性、又はそれらの任意の組み合わせの亢進について修飾及び試験され得る。ＡＴＰ結合性、又は他のヌクレオチド三リン酸若しくはその類似体の結合性を増進する修飾は、チオネインの金属（例えば、亜鉛）に対する親和性を低下させ得るとともに、従って特に本発明の方法に有用であり得る。
【００５４】
さらなる例示的な修飾としては、任意の硫黄原子のセレンへの置換を含むことができる。例えば、ＭＴ／Ｔ中の１２個のシステイン残基のいずれかを、メチオニン又はセレノシステインのいずれかに置換してもよい。具体的には、ＭＴ１又はＭＴ２における残基５、７、１３、１５、１９、２１、２４、２６、２９、３３、３４、３６、３７、４１、４４、４８、５０、５７、５９、又は６０、ＭＴ３における残基６、８、１４、１６、２０、２２、２５、２７、３０、３４、３５、３７、３８、４２、４５、４９、５１、６４、６６、又は６７、又はＭＴ４における残基６、８、１４、１６、２０、２２、２５、２７、３０、３４、３５、３７、３８、４２、４５、４９、５１、５８、６０、又は６１が修飾され得る。かかる修飾は、チオネインの金属に対する親和性を低減できるが、ある実施形態においては、修飾チオネインタンパク質を酸化還元反応に関与させることができる。
【００５５】
ある実施形態において、全てのシステイン残基がセレノシステインと置換される。かかる修飾ＭＴ／Ｔタンパク質は、固相ペプチド合成を使用するか、又は当該技術分野において周知の、若しくは以下に記載されるとおりの任意の技術を使用して作成できる。また、かかる方法は、任意のＭＴ／Ｔ変異体（例えば、本明細書に記載されるもの）を用いてもよい。
【００５６】
金属結合性についての測定
金属親和性及び結合性についての測定は、本明細書に記載されるか、又は当該技術分野において周知のとおり行うことができる。かかる測定を使用して、非修飾チオネインと比較したとき、どのチオネイン変異体が、亜鉛、銅、カドミウム、鉛、銀、ガドリニウム、コバルト、カルシウム、金、セレン、ヒ素、タングステン、アルミニウム、マンガン、鉄、クロム、ニッケル、モリブデン、バリウム、ストロンチウム、ビスマス、ハフニウム、テクネチウム、又はランタンなどの金属の結合性の低減を呈するかを判定できる。
【００５７】
酸化還元活性についての測定
ある実施形態において、修飾チオネインはさらに、酸化還元活性について測定される。用いられる正確な方法は本発明にとって決定的に重要なものではなく、かかる計測は当該技術分野において周知の任意の方法を使用して行われ得る。Ｎ末端メチオニンの酸化還元状態は、例えば、修飾ＧＦＰ又は例えば本明細書に記載されるとおりの市販のキットを使用した酸化還元電位計測を含む上記の方法により判定され得る。他の実施形態においては、溶液中のタンパク質の酸化還元電位が、例えば、Ｂｒｏａｄｌｅｙ  Ｊａｍｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州アーバイン（Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆ．）から市販されている電極を使用して計測され得る。
【００５８】
ポリペプチド産生
修飾チオネインポリペプチドは、好適な発現媒体中のチオネインをコードするポリヌクレオチド分子の全部又は一部若しくはその断片による好適な宿主細胞の形質転換により産生できる。分子生物学分野の当業者は、多種多様な発現系のいずれを使用しても、チオネインポリペプチドを提供し得ることを理解するであろう。使用される正確な宿主細胞は本発明にとって決定的に重要なものではない。修飾チオネインは、原核生物宿主（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））又は真核生物宿主（例えば、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞、例えば、Ｓｆ２１細胞、又は哺乳動物細胞、例えば、ＮＩＨ  ３Ｔ３、ＨｅＬａ、又は好ましくはＣＯＳ細胞）において産生できる。かかる細胞は広範な供給源から入手可能である（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、メリーランド州ロックランド（Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｍｄ．）；また、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、上記も参照のこと）。形質転換又はトランスフェクションの方法及び発現媒体の選択は、選択される宿主系に依存し得る。形質転換及びトランスフェクション方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（上記）に記載され、発現媒体は、例えば、「Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（Ｐｏｕｗｅｌｓ，Ｐ．Ｈ．ら、１９８５年、補遺１９８７年）に提供されるものから選択されてもよい。
【００５９】
チオネイン及びチオネイン断片、特にセレノシステインなどのアミノ酸を含むものは、化学合成（例えば、「Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、第２版、１９８４年、Ｔｈｅ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．）に記載される方法）によってもまた産生できる。
【００６０】
特定の特性（例えば、亢進されたＡＴＰ結合性又は低減された金属（例えば、亜鉛）親和性）を伴う修飾チオネインは、側鎖基の誘導体化など、当該技術分野において周知のとおりの化学修飾をさらに含み得る。
【００６１】
酸化ストレスに関連する疾患の治療
本発明は、酸化ストレスに関連する疾患を有する対象者を治療するための方法を特徴とする。例えば、本発明の方法の治療において使用される化合物は、本明細書に記載されるスクリーニング方法を使用して同定される化合物、（例えば、本明細書に記載される）修飾チオネイン、又はキレート剤であってもよい。
【００６２】
酸化ストレスに関連する疾患
酸化ストレスに関連する疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、クロイツフェルトヤコブ病、筋萎縮性側索硬化症、呼吸窮迫症候群、筋ジストロフィー、白内障形成、関節リウマチ、早老症、ウェルナー症候群、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、本態性高血圧症、嚢胞性線維症、限局性回腸炎（クローン病）、黄斑変性症、卒中、虚血、及び潰瘍性大腸炎が挙げられる。
【００６３】
修飾チオネイン
修飾チオネインタンパク質（例えば、本発明の、又は本明細書に記載される方法により同定されるもの）が、酸化ストレスに関連する疾患を治療するため対象者に投与され得る。修飾チオネインを対象者に提供することにより、酸化ストレスの作用が低減して、酸化ストレスに関連するかかる疾患を治療できる。
【００６４】
遺伝子治療
修飾チオネインタンパク質の投与に加え、遺伝子ベクターを対象者に導入することによりチオネインをコードするポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載される修飾チオネイン）の発現を誘導してもまた、酸化ストレスに関連する疾患を治療できる。かかる投与には、任意の標準的な遺伝子治療ベクター及び方法を用いることができる。
【００６５】
金属結合剤／キレート剤
亜鉛などの金属をＭＴから除去する能力を有するキレート剤もまた、クロイツフェルトヤコブ病、呼吸窮迫症候群、ジストロフィー、白内障形成、関節リウマチ、早老症、ウェルナー症候群、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、本態性高血圧症、嚢胞性線維症、限局性回腸炎（クローン病）、黄斑変性症、卒中、虚血、及び潰瘍性大腸炎などの酸化ストレスに関連する疾患の治療において使用され得る。かかる薬剤は、ＭＴから金属を除去し、それによりアポタンパク質Ｔを酸化還元反応に関与させて酸化ストレスを軽減し得る。
【００６６】
ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、１，１０−フェナントロリン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス（２−ピリジルメチル）エチレンジアミン（ＴＰＥＮ）、ジエチルジチオカルバメート（ＤＥＤＴＣ）、１，１０−フェナントロリン、８−ヒドロキシキノリン、８−ヒドロキシキノリンスルホネート、ジエチルジチオカルバメートナトリウム、及び２，２’−ビピリジルを含む任意のキレート剤が、本発明の治療方法において使用され得る。さらなるキレート剤（例えば、亜鉛又は銅を結合する薬剤）は、Ｚｉｎｐｙｒファミリーのものを含め、例えば、Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ及びＬｉｐｐａｒｄ、Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４５：５５５−５６１頁、２００６年；Ｗｏｏｄｒｏｏｆｅら、Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４４：３１１２−３１２０頁、２００５年；Ｗｏｏｄｒｏｏｆｅ及びＬｉｐｐａｒｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：１１４５８−１１４５９頁、２００３年；Ｂｕｒｄｅｔｔｅら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：１７７８−１７８７頁、２００３年；Ｂｏｅｒｚｅｌら、Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４２：１６０４−１６１５頁、２００３年；Ｎｏｌａｎ及びＬｉｐｐａｒｄ、Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４３：８３１０−８３１７頁；２００４年；Ｎｏｌａｎら、Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４３：２６２４−２６３５頁、２００４年；及びＫｕｚｅｌｋａら、Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４３：１７５１−１７６１頁、２００４年に記載される。亜鉛との錯体を形成するビス（チオセミカルバゾン）剤（例えば、ジアセチルビス（４−ピロリジニル−３−チオセミカルバゾン））もまた本発明の方法において使用され得る。これらの試薬は、例えば、Ｃｏｗｌｅｙら（Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（Ｃａｍｂ）．２００５（７）：８４５−８４７頁、２００５年）によりさらに詳細に記載される。
【００６７】
医薬組成物の調合
本明細書に記載されるか、又は本発明のスクリーニング方法を使用して同定される任意の化合物の投与は、酸化ストレスに関連する疾患を治療するための化合物の濃度をもたらす任意の好適な手段により得る。化合物は、任意の然るべき量で任意の好適な担体物質中に含まれてもよく、一般的には、組成物の総重量の１〜９５重量％の量で存在する。組成物は、経口、非経口（例えば、静脈内、筋肉内、頭蓋内、髄腔内）、経直腸、経皮、経鼻、経膣、吸入、皮膚（パッチ）、眼内、又は頭蓋内の投与経路に好適な剤形で提供され得る。医薬組成物は、従来の薬務に従い調合できる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：「Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」、第２０版、２０００年、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、及び「Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ｊ．Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ及びＪ．Ｃ．Ｂｏｙｌａｎ編、１９８８−１９９９年、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照）。
【００６８】
医薬組成物は、投与直後に、又は投与後に任意の所定時間若しくは期間が経つと活性化合物を放出するよう調合できる。後者のタイプの組成物は一般に制御放出製剤として知られ、（ｉ）本発明の薬剤の実質的に一定した濃度を体内で長期間にわたり作り出す製剤、（ｉｉ）所定の遅滞時間後、本発明の薬剤の実質的に一定した濃度を体内で長期間にわたり作り出す製剤、（ｉｉｉ）薬剤の比較的一定した有効レベルを体内で維持することにより所定期間にわたり薬剤の作用を持続すると同時に薬剤の血漿濃度の変動（鋸歯状動態パターン）に付随する望ましくない副作用を最小化する製剤、（ｉｖ）例えば、制御放出組成物を罹患組織若しくは器官に隣接して、又はそのなかに空間的に配置することにより薬剤の作用を局在化させる製剤、（ｖ）例えば、組成物の１週間に１回、又は２週間に１回の投与などの、投薬の利便性を実現する製剤、及び（ｖｉ）担体又は化学的誘導体を使用して薬剤の作用を標的化して化合物を特定の標的細胞型に送達する製剤、を含む。制御放出製剤の形態での化合物の投与は、胃腸管における吸収ウィンドウが狭いか、又は生物学的半減期が比較的短い化合物に特に好ましい。
【００６９】
放出速度が当該化合物の代謝速度に勝る制御放出を得るため、あらゆる方策が探究され得る。一例において、制御放出は、様々な調合パラメータ及び成分、例えば、様々なタイプの制御放出組成物及びコーティングを適切に選択することにより得られる。このようにして化合物が然るべき賦形剤と共に医薬組成物中に調合され、この組成物は投与されると、制御された様式で化合物を放出する。例としては、単回又は複数回単位の錠剤又はカプセル組成物、油剤、懸濁剤、乳剤、マイクロカプセル、分子錯体、マイクロスフェア、ナノ粒子、パッチ、及びリポソームを含む。
【００７０】
非経口組成物
本明細書に記載された、又は本発明の方法を使用して同定される化合物を含む組成物は、注射、注入、又は埋め込み（皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、頭蓋内、髄腔内など）により、投薬形態で、製剤で、もしくは好適な送達器具又は従来の非毒性の薬学的に許容可能な担体及びアジュバントを含むインプラントを介して非経口的に投与できる。かかる組成物の調合及び調製は、医薬製剤分野の当業者に周知である。
【００７１】
本発明の方法で使用される非経口組成物は、無菌注射に好適な形態であり得る。かかる組成物を調製するため、好適な活性薬剤が、非経口的に許容可能な液体媒体中に溶解又は懸濁される。用いることのできる許容可能な媒体及び溶媒は、水、然るべき量の塩酸、水酸化ナトリウム又は好適な緩衝液の添加により好適なｐＨに調節された水、１，３−ブタンジオール、リンゲル液、デキストロース溶液、及び等張塩化ナトリウム溶液である。水性製剤はまた、１つ又は複数の防腐剤（例えば、メチル、エチル、又はｎ−プロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸）も含み得る。化合物の１つが水に溶けにくいか、又は僅かにしか溶けない場合、溶解を亢進するか、又は可溶化する薬剤が添加されてもよく、又は溶媒が１０〜６０％ｗ／ｗのプロピレングリコールなどを含んでもよい。
【００７２】
神経系投与
多くの場合、投与される化合物は、特定の疾患に侵されている対象者の１つ又は複数の組織に限定されることが望ましい。アルツハイマー病又はパーキンソン病などの神経系を侵す疾患の場合、神経系の罹患領域への送達は、例えば、以下に概略が述べられる方法により実現できる。
【００７３】
神経変性疾患の治療は、活性のある治療化合物が血液脳関門（ＢＢＢ）を通過できないことにより妨害され得る。かかる障害及び疾患において本発明の化合物（例えば、修飾チオネインタンパク質）を送達するための方策としては、ＢＢＢを迂回する方策（例えば、開頭術を介した頭蓋内投与及び髄腔内投与）、及びＢＢＢを通過させる方策（例えば、ＢＢＢの透過性を増進する化合物の、治療組成物の全身投与と併せた使用、及び血液脳関門を越える透過性又は輸送を増進するための化合物の修飾）を含む。
【００７４】
当該技術分野において周知の手技である開頭術は、治療組成物を脳に送達するために使用できる。この手法では、対象者の頭蓋に開口が設けられ、カテーテルを介して化合物が送達される。この手法を使用して化合物を脳の特定領域（例えば、パーキンソン病の治療については黒質、又はアルツハイマー病の治療については皮質）に標的化することができる。
【００７５】
髄腔内投与は、血液脳関門を迂回して薬物を送達するための別の手段を提供する。簡潔に言えば、薬物が脊髄に対し、例えば腰椎穿刺を介して、又はポンプなどの器具の使用によって投与される。腰椎穿刺は単回又は非複数回投与に好ましく、一方で持続及び／又は慢性投与は、脊髄内カテーテルに取り付けられた任意の市販のポンプ、例えばＭｅｄｔｒｏｎｉｃ（ミネソタ州ミネアポリス（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎ．））が製造するポンプ及びカテーテルを使用して実現され得る。
【００７６】
ＢＢＢを越えて送達できるようにするため、本発明の組成物は、血液脳関門の透過性の一時的な増進を誘発する１つ又は複数の化合物と共に投与され得る。かかる化合物としては、マンニトール、Ｃｅｒｅｐｏｒｔ（ＲＭＰ−７）、及びＫＢ−Ｒ７９４３、Ｎａ＋／Ｃａ＋＋交換阻害薬を含む。
【００７７】
別の実施形態において、化合物（例えば、本発明のスクリーニング方法を使用して同定される化合物）は、当該技術分野において標準的な化学修飾を使用して修飾（例えば、脂質付加、アセチル化）されることにより、全身投与（例えば、非経口）後の血液脳関門を越える輸送を増進し得る。一実施形態において、本発明の化合物は、ＢＢＢを越えて輸送されるペプチドベクターとコンジュゲートされる。例えば化合物は、Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．８７：９７−１０３頁、２００１年）により記載されるヒトインスリン受容体に対するモノクローナル抗体とコンジュゲートでき、これによって化合物の全身投与後のＢＢＢを越えた輸送が可能となる。化合物（例えば、本明細書に記載されるスクリーニング方法を使用して同定されるもの）は、かかるペプチドベクターと、例えば、ビオチン−ストレプトアビジン技術を使用してコンジュゲートできる。遺伝子治療ベクターを使用する治療の場合、ベクターの局所送達の代わりに、又はそれに加え、発現をニューロンの特定の亜集団に制限するプロモーターを用いることができる。例えば、ＰＤの治療における遺伝子治療ベクターの発現は、チロシンヒドロキシラーゼプロモーターの使用によってドーパミン作動性ニューロンに限定できる。
【００７８】
投薬量
本明細書に記載されるか、又は本明細書に記載される方法を使用して同定される任意の化合物の投薬量は、投与方法、治療される疾患、障害又は疾患の重症度、障害又は疾患が治療されるべきなのかまたは予防されるべきなのか、並びに治療対象者の年齢、体重、及び健康状態を含む、いくつかの要因に依存する。
【００７９】
本発明の治療方法に関して、化合物の対象者への投与が、特定の様式の投与、投薬量、又は投薬頻度に限定されることは意図していない。本発明は、頭蓋内、髄腔内、筋肉内、静脈内、腹腔内、膀胱内、関節内、皮下、又は酸化ストレスに関連する疾患を治療するのに適切な用量を提供するうえで十分な任意の他の経路を含む、全ての投与様式を企図する。化合物は対象者に対し、単回用量又は複数回用量で投与できる。例えば、本明細書に記載されるか、又は本発明のスクリーニング方法を使用して同定される化合物は、１週間に１回、例えば、２、３、４、５、６、７、８、１０、１５、２０週間、又はそれ以上にわたり投与できる。任意の特定の対象者について、個々の必要性、及び化合物を投与したり、又は化合物の投与を管理したりする専門家としての判断に応じて、特定の投与計画が時間に伴い調整されなければならないことは理解されるべきである。例えば、化合物の投薬量は、低い用量で十分な治療が提供されない場合には、増加させ得る。逆に、疾患が低減又は消失すれば、化合物の投薬量は減少させ得る。
【００８０】
最終的には主治医が然るべき量及び投与計画を決定し得るが、本明細書に記載される化合物（例えば、亜鉛結合性の低減した修飾チオネイン）又は本発明のスクリーニング方法を使用して同定される化合物の治療上の有効量は、例えば、０．００３５μｇ〜２０μｇ／体重１ｋｇ／日又は０．０１０μｇ〜１４０μｇ／体重１ｋｇ／週の範囲であり得る。望ましくは治療上の有効量は、０．０２５μｇ〜１０μｇ／ｋｇの範囲、例えば、少なくとも０．０２５、０．０３５、０．０５、０．０７５、０．１、０．２５、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、又は９．０μｇ／体重１ｋｇで、毎日、隔日、又は週２回投与される。加えて、治療上の有効量は、０．０５μｇ〜２０μｇ／ｋｇの範囲、例えば、少なくとも０．０５、０．７、０．１５、０．２、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、１０．０、１２．０、１４．０、１６．０、又は１８．０μｇ／体重１ｋｇで、毎週、隔週、又は月１回投与され得る。さらに、化合物の治療上の有効量は、例えば、１００μｇ／ｍ２〜１００，０００μｇ／ｍ２の範囲で、隔日、週１回、又は隔週で投与され得る。望ましい実施形態において、治療上の有効量は、１０００μｇ／ｍ２〜２０，０００μｇ／ｍ２の範囲、例えば、少なくとも１０００、１５００、４０００、又は１４，０００μｇ／ｍ２の化合物であり、毎日、隔日、週２回、毎週、又は隔週で投与される。
【００８１】
以下の実施例は、本発明を限定するのではなく、例示することを意図している。
【実施例】
【００８２】
修飾メタロチオネイン又はチオネインの合成
一例において、セレノシステイン置換メタロチオネインは、基本的に国際公開第００／５０４４８号パンフレットに記載されるとおり合成される。簡潔に言えば、この方法は、（ａ）固形担体と、脂肪族基を含有する側鎖（例えば、水素又はアルキル）を含むアミノ酸、芳香族基を含有する側鎖を含むアミノ酸、硫黄族を含有する側鎖（例えば、チオール又はチオエーテル）を含むアミノ酸、ヒドロキシル基を含有する側鎖を含むアミノ酸、アミン基を含有する側鎖を含むアミノ酸、グアニジニウム基を含有する側鎖を含むアミノ酸、カルボキシレート基を含有する側鎖を含むアミノ酸、及びアミド基を含有する側鎖を含むアミノ酸からなる群から選択されるαアミノ基を有する少なくとも２個のαアミノ酸とを使用して、ＭＴ又はＴを合成する工程を含む。αアミノ基は、Ｆｍｏｃ、ｔ−Ｂｏｃ、又はＣＢＺで保護される。カルボキシレート基は、ｔ−ブチルエステル又はベンジルエステルで保護される。ヒドロキシル基は、ｔ−ブチルエーテル又はジメチルホスフェートエステルで保護される。アミン基は、ｔ−Ｂｏｃ又はＣＢＺで保護される。チオール基は、アセトイミドメチル基で保護される。工程（ａ）に続くこの方法の工程（ｂ）は、工程（ａ）で固形担体から合成されたペプチドを切断するとともに非アセトイミドメチル保護基を除去する工程を含む。工程（ｃ）は工程（ｂ）から得られたペプチドを精製する工程を含み、及び工程（ｄ）は工程（ｃ）から得られたペプチドを沈殿させる工程を含む。工程（ｅ）はアセトイミドメチル保護基を銀（Ｉ）塩を含む溶液で除去する工程を含む。ＭＴ又はＴの一次アミノ酸配列は、野生型配列と異なり得る。例えば、このアミノ酸配列は、１つ又は複数の非システイン残基の、任意の天然に存在する、又は天然に存在しないアミノ酸との置換を含み得る。ある実施形態において、１つ又は複数のシステイン残基がセレノシステインと置換される。他の修飾としては、ＭＴのα又はβドメインの一次配列の１つ又は複数の反復の付加を含む。これらの反復は、α及びβドメインが順番に、又は任意に並んだ状態で共に融合され得る。ドメインは、１つ又は複数のアミノ酸のスペーサー配列により分離され得る。反復されたドメインにおいて、１つ又は複数のシステイン残基がセレノシステインと置換され得る。
【００８３】
方法工程（ａ）は、自動固相合成機を使用して達成され得る。αアミノ基はＦｍｏｃ保護基で保護されてもよく、カルボキシレート基はｔ−ブチルエステル保護基で保護されてもよく、ヒドロキシル基はｔ−ブチルエーテル保護基で保護されてもよく、及びアミン基はｔ−Ｂｏｃ保護基で保護されてもよい。
【００８４】
切断工程（ｂ）は、約７５重量部のフェノール、約２８重量部のエタンジチオール、約５３重量部のチオアニソール、約５０重量部の水、及び約１４２重量部のトリフルオロ酢酸を含む溶液を使用して達成され得る。さらに精製工程（ｃ）は、アルカリ性条件下でエピクロロヒドリンと架橋結合させたデキストランを含むビーズから調製されたゲルを使用するゲルろ過クロマトグラフィーにより達成され、乾燥ビーズの直径は約２０マイクロメートル〜約１５０マイクロメートルの範囲であり、且つゲルは０．１％のトリフルオロ酢酸を含む水溶液で調製及び溶出される。除去工程（ｅ）は、酢酸中に硝酸銀（Ｉ）を含む溶液により達成され得る。
【００８５】
生成されたメタロチオネイン又はチオネインは、金属を含むこともあれば、又は金属を含まないこともある。金属を含む場合、その金属は、主族金属、遷移金属、ランタニド、及びアクチニドからなる群から選択され得る。その金属はまた、亜鉛、銅、金、カドミウム、鉄、コバルト、カルシウム、セレン、マンガン、ニッケル、銀、ヒ素、モリブデン、タングステン、アルミニウム、バリウム、ストロンチウム、ビスマス、ハフニウム、テクネチウム、ランタン、又はこれらの組み合わせであってもよい。
【００８６】
本明細書において言及される全ての特許、２００６年３月３０日出願の米国仮特許出願第６０／７８７，４００号明細書、及び２００６年８月２３日出願の米国仮特許出願第６０／８３９，５８２号明細書を含む特許出願、及び刊行物は、各個別の特許、特許出願、又は刊行物が具体的且つ個別に参照により援用されることが明示されたのと同程度に、参照により本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】ヒトメタロチオネイン１、２、３、及び４の配列（配列番号１〜４）を含む１組の配列である。
【図２】図２Ａはメタロチオネインのα−ドメインにおける亜鉛クラスターの、図２Ｂはメタロチオネインのβ−ドメインにおける亜鉛クラスターの、および図２ＣはＧＡＬ４タンパク質における亜鉛クラスターの概略図である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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