(57)【要約】  本発明は、アテローム性動脈硬化のような慢性血管障害に対して、治療および診断への適応の可能性を有する融合タンパク質、前記融合タンパク質をコードする核酸分子、前記融合タンパク質または核酸分子を含む医薬用および診断用の組成物、医薬用および診断用の組成物の製造のための前記融合タンパク質または核酸分子の使用、急性または慢性血管障害の診断方法、ならびに前記融合タンパク質の製造方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）  変性ＬＤＬに特異的に結合する第１のポリペプチド、および（ｂ）二量化を媒介する第２のポリペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項２】
変性ＬＤＬが、酸化ＬＤＬ（ｏｘＬＤＬ）であることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
第１のポリペプチドが、ＣＤ６８、好ましくはＣＤ６８の細胞外ドメイン、またはＣＤ６８のＬＤＬ結合機能を有するそれらのフラグメントもしくは変異体を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
第２のポリペプチドが、免疫グロブリンのＦｃドメイン、またはＦｃドメインの二量化機能を有する該Ｆｃドメインのフラグメントもしくは変異体を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項５】
Ｆｃドメインの変異体が、補体およびＦｃ受容体の結合領域に、融合タンパク質の免疫原性を減弱するような突然変異を含むことを特徴とする請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
融合タンパク質が、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとを接続するエレメントをさらに含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項７】
第１のポリペプチドが、添付の配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項８】
第１のポリペプチドが、添付の配列表の配列番号２もしくは３で示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはその変異体であって、遺伝コードの縮重により、同じポリペプチドをコードする変異体を含む核酸分子によって、コードされることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項９】
第２のポリペプチドが、添付の配列表の配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
第２のポリペプチドが、添付の配列表の配列番号５で示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはその変異体であって、遺伝コードの縮重により、同じポリペプチドをコードする変異体を含む核酸分子によって、コードされることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
添付の配列表の配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
添付の配列表の配列番号７もしくは８で示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはその変異体であって、遺伝コードの縮重により、同じ融合タンパク質をコードする変異体を含む核酸分子によって、コードされることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
融合タンパク質が、検出可能なマーカーをさらに含むことを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載の融合タンパク質を含むホモダイマー。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項１６】
（ａ）変性ＬＤＬ、好ましくは酸化ＬＤＬに特異的に結合するポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、および（ｂ）二量化を媒介するポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含む請求項１５に記載の核酸分子。
【請求項１７】
添付の配列表の配列番号２もしくは３で示されるヌクレオチド配列、またはその変異体であって、遺伝コードの縮重により、同じポリペプチドをコードする変異体を含むことを特徴とする請求項１５または１６に記載の核酸分子。
【請求項１８】
添付の配列表の配列番号５で示されるヌクレオチド配列、またはその変異体であって、遺伝コードの縮重により、同じポリペプチドをコードする変異体を含むことを特徴とする請求項１５〜１７のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項１９】
添付の配列表の配列番号７もしくは８で示されるヌクレオチド配列、またはその変異体であって、遺伝コードの縮重により、同じポリペプチドをコードする変異体を含むことを特徴とする請求項１５〜１８のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項２０】
請求項１〜１３のいずれかに記載の融合タンパク質、および／または請求項１４に記載のホモダイマーおよび／または請求項１５〜１９のいずれかに記載の核酸分子、ならびに、適用可能な場合、薬学的および／または診断的に許容される担体、および、適用可能な場合、薬学的および／または診断的に有効であるさらなる添加物を含む医薬用および／または診断用の組成物。
【請求項２１】
アテローム性動脈硬化とアテローム斑を含む急性または慢性血管障害の治療および／または診断に用いる医薬用および／または診断用の組成物を製造するための、請求項１〜１３のいずれかに記載の融合タンパク質、および／または請求項１４に記載のホモダイマーおよび／または請求項１５〜１９のいずれかに記載の核酸分子の使用。
【請求項２２】
（１）請求項１３に記載の融合タンパク質、および／または請求項１４に記載のホモダイマーの調製、
（２）融合タンパク質および／またはホモダイマーの生体内への導入、および
（３）撮像法を利用した、生体内に特異的に蓄積した融合タンパク質の視覚化
の工程を含む、生体における、アテローム性動脈硬化およびアテローム斑を含む急性または慢性血管障害の診断方法。
【請求項２３】
（１）変性ＬＤＬ、好ましくは酸化ＬＤＬに特異的に結合するポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列の調製、
（２）二量化を媒介するポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列の調製、
（３）融合タンパク質をコードする融合配列を得るための、第１および第２のヌクレオチド配列の連結、
（４）発現ベクターへの融合配列のクローニング、
（５）発現に適した細胞への発現ベクターの導入、
（６）細胞における融合タンパク質の発現、および
（７）融合タンパク質の細胞からの単離
の工程を含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の融合タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アテローム性動脈硬化のような慢性血管障害に対して、治療および診断への適応の可能性を有する融合タンパク質、前記融合タンパク質をコードする核酸分子、前記融合タンパク質または核酸分子を含む医薬用および診断用の組成物、医薬用または診断用の組成物の製造のための前記融合タンパク質または核酸分子の使用、急性または慢性血管障害の診断方法、ならびに前記融合タンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アテローム性動脈硬化は、患者の血液運搬を担う血管の壁で起こる炎症反応を中心とした、非常に複雑な進行性の病的過程である。アテローム性動脈硬化（いわゆるアテローム発生）の進行は、いくつかの段階に分けることができる。
【０００３】
アテローム発生の初期段階は、いわゆる内皮細胞の機能不全を特徴とする。喫煙、過体重、運動不足、高脂血症やＩＩ型糖尿病などの多くの様々な危険因子だけでなく、現在のところ未確認の様々な危険因子が、内皮損傷の原因になっている。これによって、血漿中のリポタンパク質および他の循環物質に対する内皮の透過性が増加する。その結果、内皮細胞が活性化し、細胞表面上で、いわゆる接着分子の発現が増大する。中でも特に、いわゆるセレクチンを介して、単球やＴリンパ球のような特定の血球と内皮との一時的な接触がまず始めに起こる。そして、別の種類の接着分子（いわゆる細胞接着分子（ＣＡＭ））によって、これらの細胞が血管壁に強固に付着する。
特に血管の分岐部（アテローム性動脈硬化の病変が高頻度に発症する部位）においては、機械力も補足的な役割を果たす。剪断力の増加により、内皮由来の窒素（ＮＯ）の産生が減少する可能性がある。ＮＯは、血管拡張剤として働き、抗炎症作用を有する。また、剪断力が増加すると、上記のような結果をもたらす接着分子の産生も増加する。
【０００４】
更に続いて、内膜下の空間に、特に単球が浸潤し、単球ほど多くはないが、Ｔリンパ球も浸潤する。例えば、ケモカイン単球遊走因子（ＭＣＰ−１）などの別の種類の分子を介して、このような浸潤が起こる。そして、内膜下の空間において、単球がマクロファージへと分化する。
【０００５】
さらに、傷害を受けた内皮で、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）が酸化し、酸化ＬＤＬ（ｏｘＬＤＬ）が形成される。酸化ＬＤＬは、内膜下の空間へ分泌され、単球から分化したマクロファージに取り込まれる。酸化ＬＤＬの取り込みによって、このマクロファージは、アテローム斑に特徴的に見られる細胞、いわゆる泡沫細胞に変化する。さらに、アテローム斑には、Ｔリンパ球と中膜から遊走した平滑筋細胞が含まれる。
【０００６】
このようなアテローム斑は、動脈壁に堆積し、平滑筋細胞と細胞間マトリックスから成る繊維性被膜が覆って安定化している。アテローム斑は、サイトカイン、ケモカイン、プロテアーゼなどの様々な炎症メディエータ産生をもたらす炎症反応の中心地である。このことから、近傍の炭酸カルシウムが沈着（石灰化）した組織は壊死する可能性がある。それによって、血管内腔は狭窄し、完全閉塞に至って血流が妨げられる可能性がある。
【０００７】
平滑筋細胞による細胞間マトリックスの形成が減少し、分解酵素によってますます細胞間マトリックスが分解されると、繊維性被膜が薄くなり、アテローム斑が不安定になる。このアテローム斑は、破裂する可能性があり、破裂すると、血管壁内に存在する凝固作用を有する脂質コアおよびコラーゲンが放出される。この結果、閉塞性および非閉塞性血栓形成につながる止血システムの活性化、つまり、いわゆる組織因子（ＴＦ）が中心的な役割を果たす凝固カスケードの活性化が起こる。血栓形成を伴うアテローム斑の破裂は、臨床症状として、不安定狭心症または急性心筋梗塞という形で現れる。
【０００８】
現在、アテローム性動脈硬化の治療には、通常、脂質低下薬またはスタチン類をそれぞれ適用している。これらは、最終的に内因性のコレステロール生合成を抑制する活性物質群に属する。スタチン類に属する物質としては、とりわけアトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン（メビノリン）、メバスタチン（コンパクチン）、プラバスタチンおよびシンバスタチンが挙げられる。これらの物質は、例えば、コレステロール生合成の主要酵素（３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ−還元酵素）の拮抗的阻害、肝臓中のコレステロール生合成の低下、肝細胞上のＬＤＬレセプターの増強、およびリポタンパク質組成の変換など様々な方法によって、脂質代謝に影響を与える。スタチン類は、血清脂質の組成に大きな影響を与え、とりわけ、いわゆる「高密度リポ蛋白質」（ＨＤＬ）の濃度をわずかに増加させるとともに、ＬＤＬ濃度を強力に減少させる。最終的に、スタチン類の作用によって、血液中に循環する脂肪の量が減少する。その結果、アテローム斑に蓄積される脂肪が減少し、それによって血栓症の危険性、および血栓症に伴う危険性が低減する。
【０００９】
スタチン類は、他にも多くの優れた特性を有するが、服用に関して、筋肉や腎臓に対してまれではあるが重大な副作用があるという情報がずいぶん集積されてきたため、批判を受けた。このような理由から、特に活性物質セリバスタチン（例えばＬｉｐｏｂａｙ（登録商標）、Ｚｅｎａｓ（登録商標））が、２００１年８月にドイツの市場から全回収された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
このような背景から、本発明の基礎となる目的は、アテローム性動脈硬化またはアテローム斑のような急性または慢性血管障害の治療および診断に関して、治療および診断への適応の可能性を有する新規物質であって、公知の脂質低下薬に関する前述の短所を大幅に軽減、あるいは回避することができる新規物質を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（ａ）変性ＬＤＬに特異的に結合する第１のポリペプチド、および（ｂ）二量化を媒介する第２のポリペプチドを含む融合タンパク質を提供することによって、この目的を達成する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明において、融合タンパク質とは、当技術分野で公知の分子生物学的方法によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで生成可能なハイブリッドタンパク質または人工タンパク質を意味する。この目的のために、本発明においては、融合タンパク質をコードする一般的な発現ベクターを用いるのが好ましい。この発現ベクターを、最終的に融合タンパク質を生成する適当な細胞に導入する。
【００１３】
変性低密度リポタンパク質（変性ＬＤＬ）に対して、親和性が高く、選択的に結合できる二次あるいは三次構造が形成されるように、適当なアミノ酸配列を選ぶことによって、第１のポリペプチドを設計する。これは、タンパク質合成の分野に精通している化学者にとっては容易である。というのも、変性ＬＤＬの三次元構造は、当技術分野においては公知だからである。
２つの別個のタンパク質またはサブユニットタンパク質の二量化の媒介に関与するタンパク質のセグメントが含まれるように、アミノ酸配列を考慮して、第２のポリペプチドを設計する。多くのタンパク質のペプチド二量体構造に関するアミノ酸配列などの微構造は、当技術分野において詳細な記載があるため、この設計も、当業者にとっては容易である。
配列や構造が知られている公知の二量体形成タンパク質としては、Ｇタンパク質、ヒストン、インターフェロン、インターロイキン２受容体、ｈｓｐ９０、チロシンキナーゼ、ＩｇＧ分子などが挙げられる。上記のタンパク質内の二量化を媒介するドメインは、それぞれ本発明の融合タンパク質の製造に直接用いることができる。しかしながら、融合タンパク質の生成量を上げるために、標的遺伝子突然変異や、Ｃ末端および／またはＮ末端に特定のアミノ酸を付加することによって、これらのドメインを修飾するのが好ましい。その結果、例えば融合タンパク質の免疫作用は低減するが、大方、二量化の機能を維持することができる。
【００１４】
本発明において、変性ＬＤＬとは、アテローム発生下の損傷内皮で生じる変異体に対応する、化学的に修飾された低密度リポタンパク質を意味する。これには、酸化ＬＤＬ（ｏｘＬＤＬ）、アセチル化ＬＤＬ（ａｃＬＤＬ）、酵素による酸化ＬＤＬ（ｅＬＤＬ）、および最小限に変性したＬＤＬ（ｍｍＬＤＬ）が当てはまる。
【００１５】
ここに、本発明の基礎となる目的が、完全に達成される。本発明者らは、本発明の融合タンパク質が、生体内へ適用された後、傷害を受けた血管野またはアテローム性動脈硬化を呈した血管野に、限定的に蓄積することが好ましいと認識している。その結果、起こり得る非特異的な全身性副作用を大幅に回避することができる。本発明の融合タンパク質は、変性ＬＤＬに対する高親和性により、変性ＬＤＬを吸着する。この作用は、第１のポリペプチドセグメントを介して起こる。さらに、融合タンパク質のモノマーでも、変性ＬＤＬを吸着できるが、第２のポリペプチドセグメントを介して、本発明の２つの融合タンパク質が二量化することによって、変性ＬＤＬへの親和性は何倍も高くなる。
【００１６】
この二量化した複合体は、変性ＬＤＬおよびマクロファージの取り込みを不活化するため、後に続くマクロファージの泡沫細胞化を回避または大幅に軽減することができる。従って、初期段階でアテローム発生に治療介入することができる。アテローム斑の形成、および前述した生体に対する重大な副作用を顕著に抑制するだけでなく、恐らく予防することも可能である。
他の重要な利点は、融合タンパク質と変性ＬＤＬとの複合体が、完全にヒト由来であるため、免疫原性は低いということである。従って、「排除」に関わるいずれの炎症反応も、極めて軽度であるか、あるいはまったく起こらない。
【００１７】
それゆえに、酸化ＬＤＬ（ｏｘＬＤＬ）に結合するように、第１のポリペプチドを設計することが好ましい。
【００１８】
この場合、マクロファージの泡沫細胞化に決定的な役割を果たすＬＤＬ変異体と厳密に結合し、これを吸着するような融合タンパク質が提供されるという利点がある。
本発明のさらなる発展形態において、アテローム発生の主要因としての酸化ＬＤＬは、機能が低下するか、あるいは選択的に除去される。
【００１９】
本発明のさらなる発展形態において、第１のポリペプチドは、スカベンジャー受容体ＣＤ６８、好ましくはＣＤ６８の細胞外ドメイン、またはＣＤ６８のＬＤＬ結合機能を有するＣＤ６８の細胞外ドメインのフラグメントもしくは変異体を含む。
【００２０】
この場合、第１のポリペプチドとして、変性ＬＤＬ、とりわけ酸化ＬＤＬに対して、特に選択的な高親和性を有するポリペプチドが提供されるという利点がある。
ｍａｃｒｏｓｉａｌｉｎまたはｇｐ１１０とも呼ばれるＣＤ６８は、単球または組織マクロファージで高レベルに発現している膜貫通型糖タンパク質である。そのアミノ酸配列とこれをコードするヌクレオチド配列は、当技術分野において開示されている。ＮＣＢＩ  ｄａｔａｂａｓｅ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＢ２５８１１またはＮＰ＿００１２４２（ヒト変異体のアミノ酸配列）、ｄａｔａｂａｓｅ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１２５１またはＡＡＨ１５５５７（ヒト変異体ｍＲＮＡのヌクレオチド配列）を参照のこと。すでに同定されているこのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列も、参照により本出願に援用する。
【００２１】
ＣＤ６８のヒト変異体は、分子量１１０ｋＤで、３５４個のアミノ酸から成るタンパク質である。自身の細胞外ドメインを介して変性ＬＤＬに結合することができるため、ＣＤ６８はいわゆるスカベンジャー受容体に属する。ＣＤ６８は、もともと大リンパ球だけでなく、単球、マクロファージ、好中球および好塩基球の細胞表面上にも発現している。
【００２２】
第１のポリペプチドは、ＣＤ６８の完全なアミノ酸配列ではなく、ＣＤ６８の細胞外ドメインを含んでいることがより好ましい。
【００２３】
特にこの場合、本発明の融合タンパク質の機能に必要でないペプチドセグメントが割愛されるという利点がある。
本発明の融合タンパク質は、変性ＬＤＬへの親和性を失うことなく、サイズが縮小されている。これにより、本発明の融合タンパク質の可溶性は、顕著に上昇する。本発明者らは、ＣＤ６８の細胞外ドメインが変性ＬＤＬへの結合に関与し、該ドメインがその結合に十分であるという科学上の発見を利用した。
ヒト変異体のＣＤ６８（ＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＡＡＨ１５５５７；Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇら）の細胞外ドメインは、全長タンパク質のほぼ２２〜３１９位に相当するアミノ酸残基を含む。ｍＲＮＡレベルでは、６６〜９６０位のヌクレオチドに相当する。当然のことながら、１つ１つのアミノ酸残基またはヌクレオチドに至るまで限定することは、本質的に不可能である。
【００２４】
本発明の機能を実現するために、融合タンパク質が、必ずしもＣＤ６８もしくはＣＤ６８の細胞外ドメインの全長のアミノ酸配列またはそれらと同一のアミノ酸配列を含む必要がないことは、当業者であれば、当然理解できるだろう。逆に、第１のポリペプチドが、サイズは縮小されていてもＣＤ６８のＬＤＬ結合機能を発揮するＣＤ６８もしくはＣＤ６８の細胞外ドメインのセグメントまたは配列変異体を含むならば、この場合も、本発明の融合タンパク質の機能は果たされる。
タンパク質原性アミノ酸は、極性、無極性、酸性および塩基性アミノ酸の４つのグループに分類できることが知られている。極性アミノ酸を他の極性アミノ酸に置換（例えばセリンをグリシンに置換）しても、概して生物活性に変化がなく、あるいはあっても些細なものである。すなわち、このようなアミノ酸の置換は、本発明の融合タンパク質の機能にほとんど影響を及ぼさない。
このような背景から、本発明は、上記のカテゴリーの１つに属するアミノ酸のうちの１つまたは複数個のアミノ酸が同じカテゴリーの別のアミノ酸で置換されているＣＤ６８またはその細胞外ドメインの変異体を第１のポリペプチドとして含む融合タンパク質も包含する。このような配列変異体は、ＣＤ６８またはＣＤ６８の細胞外ドメインのアミノ酸配列と、それぞれ好ましくは約７０％、より好ましくは約８０％、非常に好ましくは約９０〜９５％の相同性を有している。
【００２５】
第２のポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃドメイン、またはＦｃドメインの二量化機能を有する該Ｆｃドメインのフラグメントもしくは変異体を含むことが好ましい。
【００２６】
これにより、本発明の融合タンパク質が、２つの該融合タンパク質モノマーの二量化に十分なペプチドセグメントを含むことだけは有利な方法で確実となる。
「Ｆｃ」は「結晶化可能なフラグメント」を意味する。このフラグメントや２つのＦａｂフラグメントは、ＩｇＧ分子のパパイン消化によって生じる。Ｆｃドメインは、ヒンジ領域を含む一対のＣＨ２およびＣＨ３ドメインから成り、免疫グロブリンの二量化機能に関与する部分を含む。
さらに、当然のことながら、Ｆｃドメインのフラグメントまたは変異体が、それぞれサイズは縮小されていても抗体の二量化機能を有する限り、この場合も、本発明の融合タンパク質の機能を失わずに、該フラグメントまたは変異体を用いることができる。上述の、ＣＤ６８のフラグメントまたは変異体の説明（Ｆｃのフラグメントまたは変異体の説明として準用可能）を参照のこと。
【００２７】
本発明の好ましいさらなる発展形態において、Ｆｃドメインの変異体は、補体およびＦｃ受容体の結合領域に、本発明の融合タンパク質の免疫原性を減弱するような突然変異を含む。
【００２８】
この場合、本発明の融合タンパク質の免疫寛容性がさらに高くなるという利点がある。
本発明者らの知見によれば、第２のポリペプチドは、免疫系を活性化するエフェクター機能がなくても、抗体のＦｃドメインが有する二量化機能さえ含んでいれば、本発明の融合タンパク質の機能としては十分である。したがって、例えば、免疫系の活性化を大幅に抑制するように、あるいは活性化が全く起こらないように、補体およびＦｃ受容体の結合領域を変異させた合成Ｆｃフラグメントも用いることができる。
【００２９】
融合タンパク質は、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとを接続するエレメントを含むことが、更に好ましい。
【００３０】
この場合、様々な発現ベクターによる本発明の融合タンパク質の生成を可能にするための構造上の前提条件が提供されるという利点がある。
いかなる組成のアミノ酸配列でも、接続エレメントを構成しうるが、１〜１００個のアミノ酸を含んでいることが好ましい。２つのポリペプチドの連結による本発明の融合タンパク質の生成で生じたアミノ酸によっても、このような接続エレメントを実現できる。
【００３１】
好ましい変異体において、本発明の融合タンパク質の第１のポリペプチドは、添付の配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む。
【００３２】
これにより、変性ＬＤＬまたは酸化ＬＤＬに結合するポリペプチドが、それぞれ有利に提供される。配列番号１で示されるアミノ酸配列は、ヒトＣＤ６８タンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列由来である。
【００３３】
本発明の好ましいさらなる発展形態において、融合タンパク質は、添付の配列表の配列番号２または３で示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされる第１のポリペプチドを含む。
【００３４】
この場合、ヒトＣＤ６８タンパク質の細胞外ドメインのコード配列が、既に提供されているという利点がある。該コード配列は、発現ベクターへの導入後に、当技術分野で公知の方法により微生物を介して容易に生成できる。
配列番号２で示されるヌクレオチド配列は、ヒトＣＤ６８タンパク質変異体の細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列由来である。配列番号３で示されるヌクレオチド配列は、ヒトＣＤ６８タンパク質の細胞外ドメインにおいて、ｃａｇ塩基トリプレットがａａｇ塩基トリプレットで置換されている個体群に存在する多型を提供する。この多型の機能的な効果は、これまで知られていない。
【００３５】
当然のことながら、配列番号２または３で示されるヌクレオチド配列だけでなく、その変異体であって、遺伝コードの縮重により、同じポリペプチドをコードする変異体も、ＣＤ６８タンパク質の細胞外ドメインの生成に適している。
アミノ酸の数よりも、それに対応するコドンの数が多いことから、遺伝コードが縮重していることが知られている。ほとんどのアミノ酸には、１つより多くのコドンが存在し、例えばアルギニン、ロイシンおよびセリンは最大６つのコドンによってコードされている。概して、コドンの３番目のヌクレオチドは部分的に、または完全に置換することができる。
このような背景から、遺伝コードの縮重により、配列番号２または３で示されるヌクレオチド配列とは個々のヌクレオチドは異なるが、同等にＣＤ６８タンパク質の細胞外ドメインをコードする核酸分子によって、第１のポリペプチドがコードされている融合タンパク質も提供する。このような変異体は、配列番号２または３で示されるヌクレオチド配列と、好ましくは約７０％の相同性、より好ましくは約８０％の相同性、非常に好ましくは約９０〜９５％の相同性を有する。
【００３６】
第２のポリペプチドは、添付の配列表の配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【００３７】
これにより、ヒトＩｇＧ１変異体のＦｃフラグメント由来で、補体およびＦｃ受容体の結合領域に免疫原性を減弱するような突然変異を含み、二量化を媒介する第２のポリペプチドが有利に提供される。
標的遺伝子突然変異によって、３３１位のプロリンをセリンに置換した。また、アミノ酸２３４〜２３７位のテトラペプチドＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＧｌｙをＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａに置換した。上記のペプチドを、ヒトＩｇＧ１のＦｃフラグメントの天然配列と比較して、より容易に発現させるために、ＣＨＯ細胞用に、コドンに関してポリペプチドを最適化した。
【００３８】
本発明のさらなる発展形態において、第２のポリペプチドは、添付の配列表の配列番号５で示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされる。
【００３９】
この場合、ヒトＩｇＧ１分子のＦｃドメイン由来である前述の第２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、既に提供されているという利点がある。
発現ベクターへコード配列を導入し、当技術分野で公知の方法によって適当な細胞（例えばＣＨＯ細胞）を形質転換する。次いで、この細胞から目的の第２のポリペプチドを生成する。
当然のことながら、配列番号５で示されるヌクレオチド配列だけでなくその変異体も、第２のポリペプチドの生成に適している。遺伝コードの縮重により、配列番号５で示されるヌクレオチド配列とは個々のヌクレオチドは異なるが、同等に目的の第２のポリペプチドをコードする核酸分子も用いることができる。このような変異体は、配列番号５で示されるヌクレオチド配列と、好ましくは約７０％の相同性、より好ましくは約８０％の相同性、非常に好ましくは約９０〜９５％の相同性を有する。
【００４０】
本発明の融合タンパク質は、添付の配列表の配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むことが、特に好ましい。
【００４１】
これにより、好ましい本発明の融合タンパク質の全一次構造が既に提供されている。この一次構造は、直接ペプチド合成によって、あるいはコード配列への転写後に分子生物学的方法によって、狙い通りに容易に生成することができる。
配列番号６で示されるアミノ酸配列は、Ｎ末端にＣＤ６８の細胞外ドメインのセグメント、およびＣ末端にＦｃフラグメントのセグメントを含むだけではなく、ＦｃフラグメントとＣＤ６８の細胞外ドメインとを接続する３つのアミノ酸から成る中間エレメントも含む。
当然のことながら、配列番号６で示されるアミノ酸配列においては、上述の通り本発明の融合タンパク質の機能にほとんど影響を与えずに、１つのカテゴリーに属する個々のアミノ酸を、同じカテゴリーの別のアミノ酸で置換することができる。
当然のことながら、配列番号６で示されるアミノ酸配列は、Ｎ末端および／またはＣ末端にアミノ酸をさらに含んでもよい。このアミノ酸は、単に、発現細胞において、融合タンパク質の発現量を上げ、分泌させるという理由から、あるいは単に構造上の理由から存在する。このようなアミノ酸としては、例えばヒトＩｇＧκ鎖、またはマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）由来のものが挙げられる。
【００４２】
本発明の融合タンパク質として、添付の配列表の配列番号７または８で示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされるタンパク質を提供することがさらに好ましい。
【００４３】
この場合、本発明の融合タンパク質の特に好ましい形態をコードするコード配列が、当業者に既に提供されているという利点がある。
配列番号７で示されるヌクレオチド配列は、ＣＤ６８の細胞外ドメインと、Ｆｃフラグメント由来の第２のポリペプチドとをコードするコード配列だけではなく、前述の接続エレメントをコードし、３つの塩基トリプレットから成る中間セグメントも含む。
配列番号７で示されるヌクレオチド配列のｃａｇ塩基トリプレットがａａｇ塩基トリプレットで置換された配列番号８で示されるヌクレオチド配列は、ＣＤ６８の細胞外ドメインにおける前述の多型を提供する。
当技術分野で周知の方法によって、本発明の核酸分子を、発現ベクターに導入することができる。次いで、それを用いて適当な生物細胞（例えばＣＨＯ細胞）を形質転換し、該細胞で目的の融合タンパク質を生成する。
当然のことながら、配列番号７または８で示されるヌクレオチド配列の代わりに、遺伝コードの縮重により、同じ融合タンパク質をコードするその変異体も用いることができる。
【００４４】
本発明の好ましいさらなる発展形態において、本発明の融合タンパク質は、検出可能なマーカーを含む。
【００４５】
この場合、融合タンパク質をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの生成場所で、撮像法を利用して写すことができるという利点がある。したがって、例えばアテローム斑などの識別に特に適している。
本発明の検出可能なマーカーとは、撮像法を利用して識別することができる任意の構成要素を意味する。これには、ＡＭＰＰＤ、ＣＳＰＤのような蛍光、燐光または化学発光の特性を持つ着色剤を含む変色指示薬、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４Ｃ、３Ｈのような放射性指示薬、およびビオチンまたはジゴキシゲニン、アルカリフォスファターゼ、ホースラディシュ・ペルオキシダーゼなどのような非放射性指示薬が挙げられる。撮像法としては、マーカーの性質に応じて、オートラジオグラフィー、ブロッティング、ハイブリダイゼーションまたは顕微鏡を用いた手法が使用される。
【００４６】
本発明の別の主題は、すでに同定されている本発明の融合タンパク質を含むホモダイマーに関する。
【００４７】
本発明者らは、本発明の融合タンパク質の二量化によって、何倍も高い活性が得られることを認識している。このことは、次のような利点がある。例えば本発明の融合タンパク質をコードする発現ベクターによって形質転換されたＣＨＯ細胞株は、第２のポリペプチド領域（例えば、Ｆｃドメイン領域）同士がジスルフィド結合で架橋されている２つの融合タンパク質を含有する可溶性の二量体を分泌する。その結果として、そのようなホモダイマーでは、モノマーに比べて、変性ＬＤＬ、特に酸化ＬＤＬに対する親和性が、顕著に上昇することが判明した。
ホモダイマーを生体へ全身適用した後、ホモダイマーが急速にかつ特異的に、傷害を受けた血管野またはアテローム性動脈硬化を呈した血管野に限定的に蓄積すること、ならびにあらゆる非特異的な全身性副作用や血液中におけるホモダイマーの急速な分解を、大幅に回避できることを裏付ける証拠を、本発明者らは有している。さらに、本発明のホモダイマーは、生体中の天然のＣＤ６８受容体を不活性化また阻害することによって、マクロファージのＬＤＬ取込および泡沫細胞化をさらに防ぐことができるという証拠も、本発明者らは有している。
当技術分野においては、既にＳＲ−Ａ１のような他の可溶性スカベンジャー受容体で、そのような機構に関する記載がある。Ｇｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１），  Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ６８  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｔｏ  ｄｉｒｅｃｔ  ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌａｓｓ  Ａ  ｓｃａｖｅｎｇｅｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０３，  ｐａｇｅｓ  ３５１  ｔｏ  ３６１．  を参照のこと。本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ共存培養アッセイにおいて、本発明のホモダイマーの濃度を上げて添加すると、泡沫細胞の形成を有意に抑制し、例えばＭＭＰ−９の分泌といった泡沫細胞のいくつかの機能も抑制可能であることを実証することができた。
【００４８】
このような背景から、本発明による別の主題は、既に同定されている本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子に関する。本発明の核酸分子は、（ａ）変性ＬＤＬ、好ましくは酸化ＬＤＬに特異的に結合するポリペプチドをコードする第１の核酸配列、および（ｂ）二量化を媒介するポリペプチドをコードする第２の核酸配列を含むことが好ましい。本発明の核酸分子は、添付の配列表の配列番号２もしくは３、配列番号５、または配列番号７もしくは８で示されるヌクレオチド配列を含むことが好ましい。あるいはそれらの変異体であって、遺伝コードの縮重により、同じポリペプチドをコードする変異体を含むことも好ましい。
当然のことながら、本発明の核酸分子は、対応する形質転換細胞での発現または生成を可能にする、あるいは促進するヌクレオチドセグメントを、さらに含んでもよい。例えば、構造上の理由で、ＩｇＧ分子のκ鎖のリーダーセグメント、およびそれに接続しているマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）由来アミノ酸を５’末端に配置してもよい。しかし、これらの配列は、翻訳産物では、全長のコンストラクトから切り離される可能性があるので、本発明の融合タンパク質に必ずしも存在するわけではない。
【００４９】
本発明の別の主題は、本発明の融合タンパク質、本発明のホモダイマーおよび／または本発明の核酸分子に加えて、適用可能な場合、薬学的および／または診断的に許容される担体、ならびに適用可能な場合、薬学的および／または診断的に有効であるさらなる添加物を含む、医薬用および／または診断用の組成物に関する。
【００５０】
診断的におよび薬学的に許容される担体、および任意のさらなる添加物は、一般に当技術分野で公知であり、例えばＫｉｂｂｅ  Ａ．，  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ  ２０００の論文に記載されている。本発明において、添加物としては、本発明の組成物を診断用または治療用に使用する上で有利になるような任意の化合物または組成物が挙げられる。例えば、塩類、結合試薬、および製剤上のその他の物質などである。
【００５１】
本発明の別の主題は、アテローム性動脈硬化、アテローム斑、心筋梗塞、卒中および末梢動脈閉塞性疾患（ＰＡＯＤ）を含む急性または慢性血管障害の治療および／または診断に用いる医薬用および／または診断用組成物を製造するための本発明の融合タンパク質、本発明のホモダイマーおよび／または本発明の核酸分子の使用に関する。
【００５２】
前述の疾病の治療および／または診断に用いる医薬用および／または診断用組成物の製造方法において、本発明は、さらに実現される。該方法は、下記工程を含む。
（ａ）本発明の融合タンパク質、本発明のホモダイマーおよび／または本発明の核酸分子の調製、および（ｂ）薬学的および／または診断的に許容される担体による製剤化、および適用可能な場合（ｃ）薬学的および／または診断的に有効であるさらなる添加物の添加。
【００５３】
本発明の別の主題は、生体における、アテローム性動脈硬化、アテローム斑、心筋梗塞、卒中およびＰＡＯＤを含む急性または慢性血管障害の診断方法に関する。該方法は、下記工程を含む。
（１）検出可能なマーカーを含む本発明の融合タンパク質および／または本発明のホモダイマーの調製、（２）融合タンパク質および／またはホモダイマーの生体内への導入、および（３）ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）のような撮像法を利用した、生体内に特異的に蓄積した融合タンパク質の視覚化。
【００５４】
本発明の融合タンパク質または本発明のホモダイマーは、選択的に蓄積するため、前記方法により、アテローム斑または高濃度の変性ＬＤＬ（酸化ＬＤＬを含む）を検出することができる。これによって、関連の血管障害またはその兆候を、確実に診断することができる。これまでのところ、通常当技術分野で使用する血管造影法、造影剤の適用、および血管内腔サイズ測定では、アテローム斑の活性および安定性については、十分に知ることができていない。本発明は、有効な治療法を提供する。
【００５５】
本発明の別の主題は、本発明の融合タンパク質の製造方法に関する。該方法は、下記工程を含む。
（１）変性ＬＤＬ、好ましくは酸化ＬＤＬに特異的に結合するポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列の調製、（２）二量化を媒介するポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列の調製、（３）融合タンパク質をコードする融合配列を得るための、第１および第２のヌクレオチド配列の連結、（４）発現ベクターへの融合配列のクローニング、（５）発現に適した細胞への発現ベクターの導入、（６）細胞における融合タンパク質の発現、および（７）融合タンパク質の細胞からの単離。
【００５６】
この方法によって、本発明のホモダイマーも製造することができる。なぜなら、工程（５）で形質転換された適切な細胞（例えばＨＥＫ、ＣＨＯ細胞）は、工程（６）の発現後に、第２のポリペプチド間にジスルフィド架橋を含むホモダイマーを既に生成しているからである。このジスルフィド架橋によって、２つの本発明の融合タンパク質が互いに結合している。このホモダイマーは、細胞から細胞外の培地へ分泌される。
【００５７】
当然のことながら、前述の特徴および下記の特徴は、それぞれ示した組み合わせだけでなく、本発明の範囲から逸脱することなく他の組み合わせでも、またはそれぞれ単独でも用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
本発明を、実施例により詳細に説明するが、実施例は、単に例示的なもので、本発明の範囲を制限するものではない。以下の添付の図面を参照することとする。
【００５９】
【図１】ウエスタンブロット解析による、二量化したＣＤ６８−Ｆｃ融合タンパク質の検出。
【図２】１０日間の血小板との共存培養後における、ＣＤ３４＋幹細胞の泡沫細胞への分化。
【図３Ａ】泡沫細胞によるアセチル化ＬＤＬの取り込み。
【図３Ｂ】ＣＤ６８−Ｆｃホモダイマーによる泡沫細胞の形成阻害。
【図４】漸増濃度のＣＤ６８−Ｆｃ存在下で培養した際の泡沫細胞の上清中におけるＭＭＰ−９の発現阻害。
【図５】アテローム斑に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＦｃ特異的ＥＬＩＳＡ。
【図６】アテローム性動脈硬化症ＡｐｏＥ−マウス、および野生型マウスに対するヨウ素−１２４標識ＣＤ６８−Ｆｃの生体内への適用。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
１．  ヌクレオチドおよびアミノ酸配列
いずれの場合も、一般的な１文字コードを用いる。以下の表示において、アミノ酸配列は、左端にアミノ末端すなわち、Ｎ末端を有し、右端にカルボキシ末端すなわち、Ｃ末端を有する。ヌクレオチド配列は、左端に５’末端を有し、右端に３’末端を有する。
【００６１】
１．１  多型１（グルタミン）を含むＣＤ６８の細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号１（表１））
【表１】
2009537121.tif 000002
【００６２】
１．２  ＣＤ６８の細胞外ドメイン（多型１）をコードするヌクレオチド配列（配列番号２（表２））
【表２】
2009537121.tif 000003
【００６３】
多型１を太字で示す。
【００６４】
１．３  ＣＤ６８の細胞外ドメイン（多型２）をコードするヌクレオチド配列（配列番号３（表３））
【表３】
2009537121.tif 000004
【００６５】
多型２を太字で示す。
【００６６】
１．４  Ｆｃドメイン由来で、二量化を媒介する第２のポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号４（表４））
【表４】
2009537121.tif 000005
【００６７】
１．５  Ｆｃドメイン由来で、二量化を媒介する第２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（配列番号５（表５））
【表５】
2009537121.tif 000006
【００６８】
１．６  接続エレメントを含むＣＤ６８−Ｆｃコンストラクト全体のアミノ酸配列（配列番号６（表６））
【表６】
2009537121.tif 000007
【００６９】
接続エレメントを下線で示す。ＣＤ６８の細胞外ドメインのセグメントは、接続エレメントの上流（Ｎ末端方向）に位置し、Ｆｃドメイン由来で、二量化を媒介するポリペプチドのセグメントは、接続エレメントの下流（Ｃ末端方向）に位置する。
【００７０】
１．７  接続エレメントを含むコンストラクト（多型１）全体をコードするヌクレオチド配列  （配列番号７（表７））
【表７】
2009537121.tif 000008
【００７１】
接続エレメントのコード配列を下線で示す。ＣＤ６８の細胞外ドメインをコードするセグメントは、接続エレメントのコード配列の上流（Ｎ末端方向）に位置し、多型を太字で示す。Ｆｃフラグメント由来で、二量化を媒介する第２のポリペプチドをコードするセグメントは、接続エレメントのコード配列の下流（Ｃ末端方向）に位置する。
【００７２】
１．８  接続エレメントを含むコンストラクト（多型２）全体をコードするヌクレオチド配列（配列番号８（表８））
【表８】
2009537121.tif 000009
【００７３】
接続エレメントのコード配列を下線で示す。ＣＤ６８の細胞外ドメインをコードするセグメントは、接続エレメントのコード配列の上流（Ｎ末端方向）に位置し、多型２を太字で示す。Ｆｃフラグメント由来で、二量化を媒介する第２のポリペプチドをコードするセグメントは、接続エレメントのコード配列の下流（Ｃ末端方向）に位置する。
【００７４】
２．  ＣＤ６８−Ｆｃ融合タンパク質のクローニング
特異的プライマーを用い、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、新たに調製したマクロファージｃＤＮＡライブラリーからヒトＣＤ６８の細胞外ドメインを増幅した。上記フラグメントの両末端に、制限部位を新たに導入した。分泌量を上げるために、ヒトＩｇのκ鎖のリーダー配列を含むプラスミドに、このフラグメントをクローニングし、ＣＤ６８のリーダー配列を置換した。
ヒトＩｇＧ１のＦｃドメイン由来の人工遺伝子を合成し、標的遺伝子突然変異によって、３３１位のプロリンをセリンに置換した。また、アミノ酸２３４〜２３７位のテトラペプチドＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＧｌｙをＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａに置換した。ペプチドの発現を促進するために、コドンに関してＣＨＯ細胞用に、このポリペプチドを最適化した。
この２つのフラグメントを、それぞれ制限酵素で切断して、連結することによって、Ｆｃ部分とＣＤ６８部分を融合した。その結果、融合タンパク質の、この２つの部分の間に、特異的な接続配列が生じた。この配列は、３つのアミノ酸から成る。以下に、得られた融合ｃＤＮＡを示す（表９）。
【００７５】
【表９】
2009537121.tif 000010
【００７６】
分子の先端部に、構造上の理由から、ＩｇＧリーダー配列（ヒトＩｇκ鎖）が存在する。該配列はマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）上流に複数のアミノ酸を有する。リーダー配列を太字の大文字で示し、ＭＣＳを下線で示す。続いて、ヒトＣＤ６８の細胞外ドメインを小文字で示し、ｃａｇ−ａａｇ多型を太字で示す。続いて、接続セグメントを下線と太字で示す。接続セグメントは、９つのヌクレオチドを含む。さらに、コード配列としてＦｃフラグメント由来のポリペプチドを示す。これは、コドンに関してＣＨＯ用に最適化されており、補体およびＦｃ受容体結合領域が変異している。
【００７７】
下記に、コードされた融合タンパク質の概略を示す（表１０）。
【表１０】
2009537121.tif 000011
【００７８】
リーダーペプチドを、太字で示す（このセグメントは、本発明の融合タンパク質に存在しないことが好ましく、あったとしても一部分であることが好ましい）。続いて、ＭＣＳスペーサー（このセグメントもまた、本発明の融合タンパク質に存在しなくてもよいが、存在してもよい）を下線で示す。次に、ヒトＣＤ６８の細胞外ドメインが続き、さらに続いて、３つのアミノ酸を含む接続エレメントもまた下線で示す。
次に、コドンに関してＣＨＯ用に最適化され、補体およびＦｃ受容体の結合領域が変異しているヒトＩｇＧ１分子（ｈＩｇＧ１ｍｕｔ）のＦｃフラグメント由来のポリペプチドが続く。カルボキシ末端の「＊」は、終止コドンを表す。
【００７９】
再び制限酵素によって、融合ｃＤＮＡを切断し、慣用のクローニング方法によってｐｃＤＮＡ５プラスミドベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ導入した。得られたプラスミドベクターを、ｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ−ＣＤ６８−Ｆｃ−ｏｐｔとする。
【００８０】
３．  ＣＤ６８−Ｆｃ融合タンパク質を安定発現するＣＨＯ細胞の調製
７０％コンフルエントのＦｌｐ−Ｉｎ（登録商標）−ＣＨＯ細胞（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、プラスミドｐＯＧ４４：ｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ−ＣＤ６８−Ｆｃ−ｏｐｔ（共にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を９：１の比率でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を洗浄し、新鮮な培地を加えた。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を５００ｍｇ／ｍｌハイグロマイシン含有の新鮮培地に移して、２０倍希釈した。ハイグロマイシン耐性の細胞を単離し、増殖させた。
【００８１】
増殖した形質転換体における、ＣＤ６８−Ｆｃ融合タンパク質（図１：  ＣＤ６８−Ｆｃ）の発現について、ヒトＦｃ抗体を用い、ウエスタンブロット（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で解析した。抗ヒトＦｃ二次抗体を用いた。コントロール（図１：  Ｆｃ）として、ＣＤ６８の細胞外ドメインを含まないＦｃタンパク質を用いた。ＣＤ６８−Ｆｃは、非還元条件下では、１６０ｋＤａ（図１（左））に、還元条件下では、１１５ｋＤａ（図１（右））に特異的なバンドが見られた。
【００８２】
更に、ヒトＩｇＧ−ＥＬＩＳＡによって、定量的検出を行なった。その結果、ＣＤ６８−Ｆｃ産生ＣＨＯ細胞株の細胞培養上清で、約２ｍｇ／ｍｌのＣＤ６８−Ｆｃが検出された。しかし、野生株細胞では、ＣＤ６８−Ｆｃ融合タンパク質は、検出されなかった。
【００８３】
４．  ＣＤ６８融合タンパク質の精製
ＣＤ６８−Ｆｃ融合タンパク質を安定発現するＣＨＯ細胞を培養した。感染の３日後に、培養上清を、３８００×ｇで４℃、３０分間遠心分離し、孔径０．２μｍのフィルターで濾過した。１．２倍量の硫酸アンモニウム（７６１ｇ／ｌ）を加えて、４℃で一晩撹拌することにより、ＣＤ６８融合タンパク質を沈殿させた。
【００８４】
タンパク質は、３０００×ｇで、４℃、３０分間遠心分離してペレットにした後、０．１倍量のＰＢＳに溶解し、４℃で一晩ＰＢＳで透析した。１４０００×ｇで、４℃、３０分間遠心分離した後、孔径０．２μｍのフィルターでろ過することにより、タンパク質溶液を清澄化した。次いで、結合バッファー（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、０．０２％  ＮａＮ３）で平衡化したプロテインＡカラム（ＨｉＴｒａｐ（登録商標））プロテインＡ  ＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）に、清澄化したタンパク質溶液をロードした。ＯＤ２８０＜０．０１になるまで、カラムを結合バッファーで洗浄し、次いで溶出バッファー（１００ｍＭ  グリシン（ｐＨ２．７））で溶出した。
【００８５】
各９００μｌの溶出画分を、１００μｌの中和バッファー（１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９．０，  ０．０２％  ＮａＮ３）で中和して、プールした後、４℃で一晩ＰＢＳで透析した。次いで、分注して、−２０℃で凍結保存した。カラムを結合バッファーで中和した後、２０％（ｖ／ｖ）エタノールで洗浄し、冷蔵庫に保存した。
【００８６】
５．  血小板との共存培養によるＣＤ３４＋幹細胞の泡沫細胞への分化
ヒト血小板を分離するために、健常被検者の静脈から採血し、酸性のクエン酸デキストロース（ＡＣＤ）緩衝液に回収した。回収した血液を４３０×ｇで、２０分間遠心分離した後、多血小板血漿（ＰＲＰ）を採取し、ＨＥＰＥＳ緩衝タイロード液（２．５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ，  １ｍＭ  ＨＣｌ，  ２．５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３，  ０．３６ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，  ５．５ｍＭ  ｇｌｕｃｏｓｅ，  １ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ，  ｐＨ６．５）に加えた。次いで、９００×ｇで、１０分間遠心分離した。上清を除去し、ＨＥＰＥＳ緩衝タイロード液（ｐＨ７．４）で血小板を含むペレットを懸濁した。
【００８７】
この方法によって、測定上は多形体核細胞や単球の混入なく、高純度の血小板が得られる。上記細胞の混入がないことは、ＣＤ１４陰性によって確認できた（フローサイトメトリーおよびミエロペルオキシダーゼ−ＥＬＩＳＡを用いた）。前述の方法については、Ｌａｎｇｅｒ  Ｈ．ら（２００６；  電子上では  ２００５），  Ａｄｈｅｒｅｎｔ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ｒｅｃｒｕｉｔ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｍａｔｕｒｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ，  Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．  ９８（２）：  ｅ２−１０．に記載されている。
【００８８】
ヒトＣＤ３４＋細胞は、ヒト臍帯血から単離した。地元の倫理委員会の承認を得た後、出産直後の健常な女性から上記細胞を得た。それぞれ単離した後、フローサイトメトリー分析を行い、単離した細胞の少なくとも９５％はＣＤ３４陽性であることが確認された。臍帯血をバイコール分離溶液（ＢＩＯＣＲＯＭ  Ｂｅｒｌｉｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）に積層し、６００×ｇで１５分間密度勾配遠心分離を行うことによって、ヒト単核細胞も得られた。製造元のマニュアルに従い、免疫親和性選択法（ＣＤ３４始原細胞単離キット；  Ｍｉｌｔｅｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，  Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、ＣＤ３４＋細胞を濃縮した。
次いで、この細胞を、０．２％ゼラチンでコーティングした９６穴プレートで培養した。細胞培養用に、ｇｌｕｔａｍａｘ、ならびに５％の熱失活させたウシ胎仔血清、１００ｍｇ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン、１％ＭＥＭビタミンおよび１％非必須アミノ酸を添加したＩＭＤＭを使用した。すべて、Ｇｉｂｃｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。ＣＤ３４＋始原細胞（５０，０００個の細胞）と、血小板（２×１０８／ｍｌ）とを、０．２％ゼラチンでプレコーティングした９６穴プレートで、３７℃、５％ＣＯ２の条件下培養した。位相差顕微鏡によって、６つの枠の泡沫細胞の形成を計数した。
【００８９】
図２Ａに示すように、位相差顕微鏡によって、ＣＤ３４＋幹細胞から泡沫細胞への分化が示された。左図に、泡沫細胞の形成の見られないコントロールＣＤ３４＋細胞を示す。また、右図に、血小板（矢印）存在下における泡沫細胞の形成を示す。
スカベンジャー受容体ＣＤ６８陽性の免疫蛍光染色像（図２Ｂ）と泡沫細胞の透過型電子顕微鏡像（図２Ｃ）より、ＣＤ３４＋細胞と血小板との共存培養で生じた「巨大細胞」は、実際、泡沫細胞であることが、実証された。
【００９０】
６．  得られた泡沫細胞の機能的な特性評価
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成された泡沫細胞の機能的な特徴を調べるために、泡沫細胞がアセチル化ＬＤＬ（ａｃＬＤＬ）を取り込めるかどうか実験を行った。得られた泡沫細胞と、蛍光標識したａｃＬＤＬ（Ｄｉｌ−ＡｃＬＤＬ）とを培養し、次いでメパクリンで密顆粒を染色することにより、これを実施した。次いで、共焦点レーザー顕微鏡を用いて画像判定したところ、得られた泡沫細胞のａｃＬＤＬの取り込み、およびそれをもって泡沫細胞の機能性が、明らかに実証された。図３Ａを参照のこと、スケールバー２５μｍ。
【００９１】
さらに、ＲＯＳ（「活性酸素種」）測定法を用いた。一般的には、炎症の過程で、単球は血管壁を通して浸潤し、そこでマクロファージに分化し、サイトカイン、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）のようなプロテアーゼ、および補体因子だけでなく、酸化したフリーラジカル（ＲＯＳ）も産生する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで血小板とＣＤ３４＋幹細胞との共存培養から得られた泡沫細胞は、ＲＯＳを遊離し、さらに、マトリックスメタロプロテアーゼ９（ＭＭＰ−９）も産生することがわかった。このことから、機能的な泡沫細胞が得られたことがさらに実証された。
【００９２】
７．  ＣＤ６８−Ｆｃ融合タンパク質による、泡沫細胞の形成および機能の抑制
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで１０日間、血小板とＣＤ３４＋幹細胞とを共存培養することにより、泡沫細胞が得られた。培養した一部を、ＣＤ６８−Ｆｃホモダイマーで処理し、別の一部を、コントロールとしてＦｃ単体で処理した。次いで、ＣＤ６８−Ｆｃホモダイマーとの培養により、泡沫細胞の形成が抑制されるかどうかを顕微鏡を用いて解析した。結果を図３Ｂに示す。
Ｆｃで処理（左図）しても、泡沫細胞の形成に何ら効果はないが、ＣＤ６８−Ｆｃホモダイマーで処理（右図）した場合、泡沫細胞の形成が抑制されることが示された。
【００９３】
図３Ｃに、泡沫細胞の形成抑制は、ＣＤ６８−Ｆｃホモダイマーの添加量に依存することが示されている。４００μｇ／ｍｌのＣＤ６８−Ｆｃホモダイマーでは、ほぼ完全に泡沫細胞の形成が抑えられた。ここでも、コントロールとして、Ｆｃ単体を用いた。
【００９４】
さらに、別の実験では、ＣＤ６８−Ｆｃホモダイマーの濃度を上げて培養すると、コントロールタンパク質と比較して、泡沫細胞の上清中のＭＭＰ−９の発現が抑制されることが分かった。実験結果を図４に示す。バンドは、ＭＭＰ−９の発現レベルに相当する。以下のサンプルを、対応する番号のレーンにロードした。
１．  コントロールＣＤ３４、
２．  コントロールＣＤ３４、
３．  コントロールタンパク質１００ｇ／ｍｌ、
４．  コントロールタンパク質４００μｇ／ｍｌ、
５．  ＣＤ６８−Ｆｃホモダイマー１００ｇ／ｍｌ、
６．  ＣＤ６８−Ｆｃホモダイマー２００ｇ／ｍｌ、
７．  ＣＤ６８−Ｆｃホモダイマー４００ｇ／ｍｌ、
８．  フルバスタチン１μＭ。
非常に特徴的なスタチンであるフルバスタチン（レーン８）と同様に、ＣＤ６８−Ｆｃホモダイマー（レーン５、６および７）の存在下では、泡沫細胞によるＭＭＰ−９の形成が、明らかに抑制されることが示された。
【００９５】
８．  診断薬としてのＣＤ６８−Ｆｃ融合タンパク質
手術で患者の頸動脈から摘出したアテローム斑を、分解して、懸濁した後、培養プレートに移して、表面を乾燥した。次いで、ＣＤ６８もしくはＧＰＶＩのＦｃ部、またはＦｃ単体のそれぞれに対する特異的なＥＬＩＳＡを行なった。結果を図５Ａに示す。並行して、頸動脈の血栓内膜切除術の組織標本を用いて、ヒト組織の免疫組織学的な解析を行った。結果を図５Ｂに示す。
【００９６】
いずれの場合も、アテローム斑組織に対して全く特異的結合を示さないコントロールＦｃタンパク質（図中、Ｆｃ）と比較して、ＣＤ６８−Ｆｃ融合タンパク質では、アテローム斑組織への結合が、有意に起こることが示された。ポジティブコントロールとして、ヒトアテローム斑組織のコラーゲン構造に結合するタンパク質を用いた（図中、コントロール）。
【００９７】
更に、アテローム性動脈硬化症ＡｐｏＥマウス、および野生型マウスに対して、ヨウ素−１２４標識ＣＤ６８−Ｆｃを生体内に適用した。２４週齢のアテローム性動脈硬化症マウスと、有意なアテローム性動脈硬化のないコントロール野生型マウスに、ヨウ素−１２４標識ＣＤ６８−Ｆｃを投与した。次いで、臓器を摘出した。オートラジオグラフィーを用いて、左右の頸動脈および大動脈弓を、ｅｘ  ｖｉｖｏで分析した。結果を図６に示す。
【００９８】
部分図（Ａ）で示されるように、アテローム性動脈硬化のない血管と比較して、アテローム性動脈硬化の血管部分で、放射能の顕著な上昇が観察された。部分図（Ｂ）に、オイルレッドによる染色像およびそれに対応するオートラジオグラフィーを示す。部分図（Ｃ）は、オートラジオグラフィーの定量的評価を示す。
【００９９】
ＡｐｏＥマウスから摘出したアテローム性動脈硬化の血管（大動脈弓）では、野生型マウスから摘出したアテローム性動脈硬化のない血管と比較して、ヨウ素−１２４標識ＣＤ６８−Ｆｃ融合タンパク質の蓄積量が、大幅に増大することが示された。頸動脈の部分においては、野生型と比較して、ＡｐｏＥマウスで、ＣＤ６８−Ｆｃ融合タンパク質の蓄積量の有意な増大は観察されなかった。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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