(57)【要約】  成熟したリソスタフィンをコードする遺伝子配列の一部または全体の前に大腸菌におけるリソスタフィンの分泌発現に適したシグナルペプチドをコードする配列をクローニングすることおよびクローニングされた配列をプロモーターとライゲートすることによって発現ベクターを構築すること、ならびに大腸菌を発現ベクターで形質転換すること、培養および発酵すること、ならびに次いで発酵ブロスの上清からリソスタフィンを単離することを含む、高レベルでの、大腸菌におけるリソスタフィンの分泌発現の方法。分泌発現の利点は、発現産物が、培地中に活性化形態で存在することができ、したがって封入体の再生のためのプロセスを必要としないこと、発酵ブロスの上清から高い回収率で精製するのがより容易であること、および宿主のタンパク質からの混入がより少ないこと、である。
2009502125.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）シグナルペプチドコードＤＮＡ配列を、成熟したリソスタフィンの遺伝子配列の一部または全体の前にクローニングすること、およびこのようにしてクローニングされた配列をプロモーターに連結することを含む、発現ベクターを構築する工程
（２）工程（１）において構築されたベクターで大腸菌を形質転換し、培養および発酵する工程
（３）発酵上清からリソスタフィンを単離する工程
を含むことを特徴とする、大腸菌におけるリソスタフィンの分泌発現のための方法。
【請求項２】
前記リソスタフィンがその変異体をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の大腸菌におけるリソスタフィンの分泌発現のための方法。
【請求項３】
工程（１）におけるシグナルペプチドがｐｈｏＡ、ＯｍｐＡ、ＬｙｓｎまたはｐｅｌＢの１つであることを特徴とする、請求項２に記載の大腸菌におけるリソスタフィンの分泌発現のための方法。
【請求項４】
工程（２）におけるリソスタフィンの発現が誘導性発現であることを特徴とする、請求項３に記載の大腸菌におけるリソスタフィンの分泌発現のための方法。
【請求項５】
前記ベクターが大腸菌における発現のためのベクターであることを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の大腸菌におけるリソスタフィンの分泌発現のための方法。
【請求項６】
大腸菌における発現のためのベクターがｐＵＣ系、ｐＥＴ系またはｐＧＥＸの１つであることを特徴とする、請求項５に記載の大腸菌におけるリソスタフィンの分泌発現のための方法。
【請求項７】
大腸菌における発現のためのベクターがｐＢＶ２２０であることを特徴とする、請求項５に記載の大腸菌におけるリソスタフィンの分泌発現のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えＤＮＡ技術を用いたタンパク質またはポリペプチド薬物の生成に関し、特に、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における分泌発現によってリソスタフィンを生成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リソスタフィンは、１９６４年に、スタフィロコッカス・シミュランス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｉｍｕｌａｎｓ）の培養物中で、ＳｃｈｉｎｄｌｅｒおよびＳｃｈｕｈａｒｄ（米国特許第３，２７８，３７８号、１９６６年）によって最初に見出され、２７ｋＤａの分子量を有し、２４６アミノ酸からなる。リソスタフィンは、エンドペプチダーゼであり、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）細胞壁ペプチドグリカン中のペンタグリシン架橋を溶解させ、それによって細胞壁の完全性を破壊し、細菌細胞体を溶解させることによって、機能する。リソスタフィン遺伝子は、１９８０年代から、中国および外国で、分子クローニング法を利用して、大腸菌、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｔｌｉｓ）およびバチルス・スファエリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）等において発現されている。細菌を死滅させる、その特有の機構のために、リソスタフィンは、スタフィロコッカスの細胞壁を、低濃度で迅速に溶解させることができ、そのため、細菌に対する即座の作用および強い活性を有する。また、耐性細菌株は、リソスタフィンによってめったに誘導されず、リソスタフィンは、特定の抗菌スペクトルを有する。現在では、中国および外国において、高い純度の組換えリソスタフィンを商業的に製造することができ、これは細菌学、消毒、および酵素学の研究において、ならびに臨床的に抗菌治療等において、広く使用されている。
【０００３】
スタフィロコッカス・シミュランスは病原体に属し、限られた量のリソスタフィンしか生成しないため、かつ分子生物学技術の最近の開発の目的で、米国のＲｅｃｓｅｉらは、１９８７年に、分子クローニング法を利用して、大腸菌ＪＭ  １０５、枯草菌およびバチルス・スファエリカスにおいてリソスタフィン遺伝子を発現させた。大腸菌ＪＭ  １０５において発現されたリソスタフィンの量は３ｕｇ／ｍｌであり、その６５％は培養物上清中、１５％は細胞ペリプラズム中、２０％が細胞質中に存在する。特許第４９３１３９０号で、１９９０年に特許が認められ、これは、１．５ｋｂのリソスタフィンコードＤＮＡ断片をベクターｐＵＣ８、ｐＢＣ１６、ｐＢＤ６４またはｐＳＰＶ１に挿入して、それぞれ組換えプラスミドｐＲＧ５、ｐＪＰ１、ｐＤＦ８またはｐＲＰ１を形成することを開示している。ｐＲＧ５を用いて、大腸菌ＪＭ  １０５が形質転換される。ｐＪＰ１、ｐＤＦ８、およびｐＲＰ１を用いて、種々のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（枯草菌ＢＤ１７０、バチルス・スファエリカス００）が形質転換され、それによって生成されたリソスタフィンは、免疫学的技術および電気泳動法によって同定され、次いで、Ｓ．シミュランス（Ｓ．Ｓｉｍｕｌａｎｓ）によって生成されたリソスタフィンと比較される。バチルス・スファエリカス形質転換体から生成されたリソスタフィンの量（１５０ｍｇ／Ｌ）は、Ｓ．シミュランスによって生成されるものの５倍である。この、参照された特許はまた、３８９アミノ酸のプロリソスタフィンの前駆体をコードする１．５ｋｂのＤＮＡ配列も提供し、この前駆体を、形質転換の後、成熟したリソスタフィンに処理する。最近、リソスタフィンが異種Ｎ末端を有し、そのほとんどが野生型リソスタフィンより短い２つのアミノ酸を有することが見出された。
【０００４】
ドイツのＷＡＬＴＥＲ  Ｐ．ＰＨＡＭＭＥＳらは、１９９６年に、ミート・ラクトバチルス（Ｍｅａｔ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）（ラクトバチルス）において前駆体を欠失させて、リソスタフィン遺伝子を発現させた。前駆体を欠失させる狙いは、ミート・ラクトバチルスにおいて安定した発現を得ることであり、欧州特許第０７５９４７３号、１９９７年を参照されたいが、この方法は、細胞内発現にとどまっている。
【０００５】
１９９９年に、インドの会社、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｍｉｔｅｄが、組換え成熟リソスタフィンに関する特許、公開番号国際公開第０１／２９２０１号を出願したが、ここで、リソスタフィン前駆体およびシグナルペプチド部分が欠失しており、組換え成熟リソスタフィン遺伝子の直前に開始コドンＡＴＧ（最初のアミノ酸、メチオニンをコードする）が付加されており、上述の操作された配列が、Ｔ７プロモーターの後ろに位置するｐＥＴ１１ｂにクローニングされ、次いでリソスタフィン発現がＩＰＴＧによって誘導される。この参照された特許出願において、リソスタフィンは、大腸菌において封入体として発現され、所望のタンパク質は細胞中に不溶性封入体として貯蔵され、タンパク質は、細菌細胞を破壊することによってのみ単離することができる。単離の間、タンパク質変性を用いなければならず、タンパク質は再生しなければならない。しかしながら、種々の分子が過ってとも結合し、再生において異常な構造を形成するであろう。同時に、細胞体レムナントは、遺伝子操作薬物製造プロセスにおいて一掃するのが困難であり、したがって、組換え生成物の品質に悪影響を与える。
【０００６】
大腸菌における、リソスタフィンの高度に効果的な分泌発現の様式はない。分泌発現は、以下の利点を有する：発現される産物は、培地中に、最終的な活性形態として存在するので、封入体の再生の必要がない；所望のタンパク質は、培養上清から高収量で単離するのが比較的容易である；および、宿主由来のタンパク質の混入がより少ない。
【特許文献１】米国特許第３，２７８，３７８号
【特許文献２】特許第４９３１３９０号
【特許文献３】欧州特許第０７５９４７３号
【特許文献４】国際公開第０１／２９２０１号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明によって解決される必要のある技術的問題は、分泌による、大腸菌における、リソスタフィンの高度に効果的な発現のための方法を提供して、当該分野における欠点を克服することである。
【０００８】
本発明の、一般的発明概念は、以下のとおりである。
１９６０年のリソスタフィンの発見以来、今までのところ、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、具体的には黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の薬物耐性株に対するこの酵素の優れた殺菌活性を考慮して、ヒトにおけるその医学的使用についての研究が、国内外で行われており、さらには、新薬承認申請の時期にきている。しかしながら、組換えリソスタフィンは、その後バチルス・スファエリカスにおいてしかうまく発現されていないが、この操作された細菌株は今までのところ薬物使用が承認されておらず、ヒト薬物に承認されている原核発現宿主は、大腸菌および酵母である。これは、世界中の全ての研究グループが、新薬を申請しようとする際に直面し、解決しようとしている問題である。
【０００９】
関心のある酵素の発現のために大腸菌を使用するために、何年も試みがなされているが、成功していない。１９９７年のドイツの科学者および２００３年の米国の科学者は、バチルス・スファエリカスの代わりにラクトバチルスを利用して、リソスタフィンを発現させたが、ラクトバチルスも薬物使用に承認されておらず、そのため、新薬申請の間にも問題が存在する。また、ラクトバチルスによる発現は、細胞内で可溶性の発現であり、かかる発現のコストは高い。
【００１０】
インドの科学者は、大腸菌を利用して、リソスタフィンを封入体の形態で発現させ、発現されたリソスタフィンタンパク質は、細胞中に不溶性の封入体として貯蔵された。タンパク質を単離するために、細菌細胞体は、予め破壊しなければならない。単離プロセスの間、タンパク質変性を使用しなければならず、次いで、タンパク質を最後に薬物使用のために再生させなければならない。しかしながら、再生において、誤った結合によって形成された異常な構造を有する多数の分子があろう。また、細胞体レムナントタンパク質は、遺伝子操作薬物の製造の間に一掃するのが困難な物質であり、したがって、組換え生成物の品質に悪影響を与える。
【００１１】
今までのところ、ヒト薬物のためのリソスタフィン発現系の分野において、国内でも国外でも、ブレークスルーはなく、産業化および新薬申請において、同じ問題が存在する。したがって、大腸菌におけるリソスタフィン遺伝子の分泌発現を達成することができれば、中国における専売のＩＰ権を有する新薬の申請のプロセスが促進され、莫大な経済的および社会的利益がもたらされる。
【００１２】
本発明は、成熟したリソスタフィンのコード配列の前に、大腸菌において、分泌発現を誘導するシグナルペプチド配列のセグメントを付加しようとし、大腸菌におけるリソスタフィンの分泌発現を狙いとする。当該分野で、プロリソスタフィンの存在なしでの大腸菌におけるリソスタフィンの分泌発現については報告がない。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の技術的解決策は以下のとおりである。
本発明は、
（１）成熟したリソスタフィンの遺伝子配列の一部または全体の前にシグナルペプチドコード配列をクローニングすること、および上述の操作された配列をプロモーターに連結させることを含む、発現ベクターを構築する工程
（２）大腸菌を、工程（１）の、構築されたベクターで形質転換し、形質転換大腸菌を発酵によって培養する工程、
（３）発酵ブロスの上清からリソスタフィンを単離する工程
を含む、大腸菌におけるリソスタフィンの分泌発現のための方法を提供する。
【００１４】
ここで、リソスタフィンは、野生型リソスタフィンと同じ配列を有し、Ｎ末端で２つのアラニンが欠失した変異体等の、その変異体もまた含まれる。
【００１５】
ここで、シグナルペプチドは、Ｏｍｐ  Ａ、ｐｈｏＡ、Ｌｙｓｎ、ｐｅｌＢの１つである。
【００１６】
ＯｍｐＡシグナルペプチドのアミノ酸配列は、以下のとおりである。
配列番号３：ＭＫＫＴＡＩＡＩＡＶ  ＡＬＡＧＦＡＴＶＡＱ  Ａ
【００１７】
ｐｈｏＡシグナルペプチドのアミノ酸配列は、以下のとおりである。
配列番号５：ＭＫＫＭＳＬＦＱＮＭ  ＫＳＫＬＬＰＩＡＡＶ  ＳＶＬＴＡＧＩＦＡＧ  Ａ
【００１８】
Ｌｙｓｎシグナルペプチドのアミノ酸配列は、以下のとおりである。
配列番号６：ＭＫＫＴＫＮＮＹＹＴ  ＲＰＬＡＩＧＬＳＴＦ  ＡＬＡＳＩＶＹＧＧＩ  ＱＮＥＴＨＡＳ
【００１９】
ｐｅｌＢシグナルペプチドのアミノ酸配列は、以下のとおりである。
配列番号７：ＭＫＲＬＣＬＷＦＴＶ  ＦＳＬＦＬＶＬＬＰＧ  ＫＡＬＧ
【００２０】
ここで、工程（２）におけるリソスタフィン発現の型は、誘導性発現である。
【００２１】
ここで、前記ベクターは、大腸菌のための発現ベクターであり、ｐＵＣ系、ｐＥＴ系もしくはｐＧＥＸ系、またはさらにはｐＢＶ２２０の１つから選択されてもよい。
【００２２】
ここで、プロモーターは、Ｔ７プロモーター、Ｐ１ＰｒプロモーターまたはｌａｃＵＶ５プロモーターの１つから選択されてもよい。
【００２３】
特に、工程は、以下のとおりである：まず、適したプライマーの対を合成し、次いで、ピロベスト酵素（高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ）および鋳型としてのスタフィロコッカス・シミュランスの全ＤＮＡ（ＮＲＲＬ  Ｂ−２６２８）を利用したＰＣＲ法によって、リソスタフィン配列を選択的に増幅した。増幅産物を、臭化エチジウムを含むアガロース上での電気泳動によって判定および回収した。精製された増幅産物を、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。消化されたセグメントを、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで同じように消化されたベクターに、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて、１６℃で２時間、ライゲートさせた。ライゲーション混合物を用いて大腸菌を形質転換し、このようにして、組換えプラスミドを得た。
【００２４】
自動化ＤＮＡシーケンサーによって、組換えプラスミドを配列決定した。その配列を、シグナルペプチドをコードする公知の配列および成熟したリソスタフィン遺伝子と比較し、比較結果から、これらの配列が同一であることが明らかになった。
【００２５】
大腸菌を、組換えプラスミドで形質転換した。陽性クローンを取り出し、５０ｍｌのＬＢブロス（３０ｍｇ／ｍｌカナマイシンを含む）に接種し、培養物のＯＤ６００が０．６になるまで、振とうしながら３７℃でインキュベートし、次いで、ＩＰＴＧを、０．０５ｍＭの終濃度まで加えて、関心のあるタンパク質の発現を誘導し、次いで、３時間培養を続けた。発酵ブロスを遠心分離し、次いで、分光学的アッセイによって、上清中のリソスタフィン活性を判定した。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によって提供される、高レベルでの、大腸菌におけるリソスタフィンの分泌発現の方法の利点は、発現産物が、培地中に、活性のある成熟したリソスタフィンの形態で存在するが、封入体のための再生工程が必要ない点；宿主細胞由来のタンパク質混入がより少なく、培養物上清から関心のあるタンパク質を精製するのが比較的容易かつ簡便である点；および発現産物量が、６０%を超える収率で、２００〜４００ｍｇ／Ｌまでになる場合がある点にある。
【実施例１】
【００２７】
組換えリソスタフィンの分泌発現ベクターの構築、すなわち、ＯｍｐＡシグナルペプチドおよび成熟したリソスタフィンの融合遺伝子のクローニング
【００２８】
まず、オリゴ−ヌクレオチド配列を設計し、以下のように合成した。
配列番号１
５’−ＴＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡＣＡＧＣＴＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＣＡＧＴＧＧＣＡＣＴＧＧＣＡＧＧＴＴＴＣＧＣＴＡＣＣＧＴＣＧＣＴＣＡＧＧＣＴＧＣＴＧＣＡＡＣＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＴＣＡＧＣＡＣ−３’
配列番号２
５’−ＣＣＡＡＡＧＣＴＴＣＡＡＣＴＴＴＡＧＧＡＡＴＧＡＧ−３’
【００２９】
配列番号１の設計において、５’末端に、ＮｄｅＩ制限酵素認識部位の遺伝子配列（イタリック部分）、ならびにＯｍｐＡシグナルペプチドをコードする遺伝子配列（下線部分）を付加した。
【００３０】
配列番号２の設計において、５’末端に、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位の遺伝子配列（イタリック部分）を付加した。
【００３１】
リソスタフィン配列を、ピロベスト酵素（高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ）、鋳型としてのスタフィロコッカス・シミュランスの全ＤＮＡ（ＮＲＲＬ  Ｂ−２６２８）、ならびにプライマーの対としての配列番号１および配列番号２を用いたＰＣＲ法によって、選択的に増幅した。臭化エチジウムを含むアガロース上での電気泳動によって、増幅産物を判定および回収した。図１に示されるように、Ｍは分子量マーカーのレーンを示し、レーン１は、鋳型としてのスタフィロコッカス・シミュランスの全ＤＮＡ（ＮＲＲＬ  Ｂ−２６２８）ならびにプライマーの対としての配列番号１および配列番号２を用いて増幅された、８８７ｂｐの大きさの生成物のバンドを示す。
【００３２】
精製された増幅産物を、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。消化されたセグメントを、同じようにＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたｐＥＴ３０ａベクターに、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて、１６℃で２時間ライゲートさせた。ライゲーション混合物を用いて、大腸菌ＤＨ５ａを形質転換し、そのようにして、図２に示されるような、組換えプラスミドｐＥＴ−ＯｍｐＡｌｓｓを得た。
【００３３】
自動化ＤＮＡシーケンサーによって、組換えプラスミドを配列決定した。その配列を、シグナルペプチドをコードする公知の配列および成熟したリソスタフィン遺伝子と比較し、比較結果から、これらの配列が同一であることが明らかになった。
【００３４】
構築された組換えプラスミドｐＥＴ−ＯｍｐＡｌｓｓの、ＯｍｐＡシグナルペプチドをコードするアミノ酸配列は、以下のとおりである。
配列番号３：ＭＫＫＴＡＩＡＩＡＶ  ＡＬＡＧＦＡＴＶＡＱ  Ａ
【００３５】
組換えプラスミドｐＥＴ−ＯｍｐＡｌｓｓの、成熟したリソスタフィンをコードするアミノ酸配列は、以下のとおりである。
配列番号４：
ＡＡＴＨＥＨＳＡＱＷ  ＬＮＮＹＫＫＧＹＧＹ  ＧＰＹＰＬＧＩＮＧＧ  ＭＨＹＧＶＤＦＦＭＮ  ＩＧＴＰＶＫＡＩＳＳ
ＧＫＩＶＥＡＧＷＳＮ  ＹＧＧＧＮＱＩＧＬＩ  ＥＮＤＧＶＨＲＱＷＹ  ＭＨＬＳＫＹＮＶＫＶ  ＧＤＹＶＫＡＧＱＩＩ
ＧＷＳＧＳＴＧＹＳＴ  ＡＰＨＬＨＦＱＲＭＶ  ＮＳＦＳＮＳＴＡＱＤ  ＰＭＰＦＬＫＳＡＧＹ  ＧＫＡＧＧＴＶＴＰＴ
ＰＮＴＧＷＫＴＮＫＹ  ＧＴＬＹＫＳＥＳＡＳ  ＦＴＰＮＴＤＩＩＴＲ  ＴＴＧＰＦＲＳＭＰＱ  ＳＧＶＬＫＡＧＱＴＩ
ＨＹＤＥＶＭＫＱＤＧ  ＨＶＷＶＧＹＴＧＮＳ  ＧＱＲＩＹＬＰＶＲＴ  ＷＮＫＳＴＮＴＬＧＶ  ＬＷＧＴＩＫ
【実施例２】
【００３６】
分泌によって組換えリソスタフィンを発現する、操作された細菌の樹立
大腸菌株ＴＯＰ１０、ＪＭ１０９（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）を、それぞれ組換えプラスミドｐＥＴ−ＯｍｐＡｌｓｓで形質転換した。陽性クローンを取り出し、５０ｍｌのＬＢブロス（３０ｍｇ／ｍｌカナマイシンを含む）に接種し、培養ブロスのＯＤ６００が０．６に上昇するまで、振とうしながら３７℃でインキュベートし、次いで、終濃度０．０５ｍＭまでＩＰＴＧを加えて、タンパク質発現を誘導し、さらに３時間インキュベートした。発酵培養物を遠心分離し、分光学的アッセイによって、上清中のリソスタフィン活性を判定した。
【実施例３】
【００３７】
分光学的アッセイによってリソスタフィン活性を判定する
実施例２の組換えプラスミドｐＥＴ−ＯｍｐＡｌｓｓを含む大腸菌株ＴＯＰ１０、ＪＭ１０９（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）を用いて、分光学的アッセイによって、リソスタフィン活性を判定した。具体的には、判定方法は以下のとおりである。
【００３８】
１．原理
リソスタフィンの定量的アッセイは、組み合わされた、ＫＮＲ淡青色染色黄色ブドウ球菌細胞壁ペプチドグリカン（ＫＮＲ−ＰＧ）を色供給源基質として用いた分光学的アッセイによって達成される。酵素作用プロセスの間に定量的に放出されるＫＮＲ色素部分を保有する可溶性セグメント生成物の低分子の量に従って、上清を比色的に判定して、酵素の活性を計算する。この方法は、高い感度および可視化を有し、容易かつ簡便である。
【００３９】
２．装置および試薬
２．１  装置
２．１．１  紫外線−可視分光光度計または酵素標識装置
２．１．２  高速凍結卓上遠心分離機
２．１．３  電子はかり
２．１．４  電子恒温水槽
２．１．５  １０μｌ、２０μｌ、２００μｌ、１０００μｌピペットおよびチップ
２．１．６  ボルテックス
【００４０】
２．２  試薬
２．２．１  出願人によって調製されたリソスタフィン作業試料
２．２．２  出願人によって調製され、後の使用のために０．２ｍｏｌ／Ｌ  Ｇｌｙ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ１０．０）中に１：５（ｍ／ｖ）の比で均質に懸濁された、色供給源基質ＫＮＲ−ＰＧ
２．２．３  グリシンおよびＮａＯＨは、分析グレードであり、後の使用のために、０．２ｍｏｌ／Ｌ  Ｇｌｙ−ＮａＯＨバッファーになるよう調製される（ｐＨ１０．０）
２．２．４  後の使用のために０．０５ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーになるよう調製されたＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）
２．２．５  ９５％エタノール、分析グレード。
【００４１】
３  実験工程
３．１  リソスタフィン作業試料の調製
較正の後、リソスタフィン作業試料を−２０℃で保存する。その使用の直前に、１．０ｍｌの０．０５ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）を正確に加え、溶解させて、９０．０  Ｕ／ｍｌの参照試料を得、次いで、いくつかのエッペンドルフチューブに、各チューブ５０μｌに等分し、冷蔵庫中、−３０℃未満で保存する。その使用の直前に、４５０μｌの０．０５ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）をかかるチューブの１つに加えて、希釈して９．０  Ｕ／ｍｌの参照溶液にする。各チューブは１回使用し、解凍と凍結の繰り返しを避ける。
【００４２】
３．２  標準曲線の調製
６つの清潔で乾燥したエッペンドルフチューブに番号をつけ、表１の配列に従って、対応する量のリソスタフィン参照溶液を加え、次いで、種々の量の０．２ｍｏｌ／Ｌ  Ｇｌｙ−ＮａＯＨバッファーを加える。
【００４３】
次いで、番号付けの順序に従って、１３０μｌの色供給源基質ＫＮＲ−ＰＧを加え、基質を加えた後、各チューブを迅速に混合して、チューブの内容物を均質化する。
【００４４】
次いで、上述の、加えられた溶液を含むエッペンドルフチューブを、３７℃水槽に移し、２０分インキュベートする。
【００４５】
エッペンドルフチューブを水槽から取り出し、番号付けの順序で３００μｌの９５％エタノールを加えて反応を停止させ、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、遠心分離後、０番のチューブをブランク対照として、上清の吸光度を５９５ｎｍで判定した。
【００４６】
判定された吸光度値および対応する参照試料濃度Ｃ（Ｕ／ｍｌ）に従って、直系の回帰曲線をプロットした。
Ａ＝ＫＣ＋Ｂ
式中、Ｋは標準的な勾配であり、Ｂは切片であり、Ａは吸光度であり、Ｃは濃度（Ｕ／ｍｌ）である。
【００４７】
【表１】
2009502125.tif 000003
【００４８】
３．３  試料アッセイ
アッセイ方法は、標準曲線についての方法と類似している。アッセイされる試料を、０．０５ｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ希釈バッファー（ｐＨ７．５）で予め希釈し、５０μｌをアッセイに使用し、各試料は２回アッセイし、結果は２回の測定の平均値である。
【００４９】
４．結果の計算
計算式
Ｃ０＝Ｎ×Ｃ測定×０．９／０．０５
式中、Ｃ測定は試料の測定値（Ｕ／ｍｌ）であり、Ｎは希釈倍数であり、Ｃ０は試料の元々の活性（Ｕ／ｍｌ）であり、０．９は反応体積（ｍｌ）であり、０．０５は加えられた試料体積（ｍｌ）である。
【００５０】
５  結果
組換えプラスミドｐＥＴ−ＯｍｐＡｌｓｓを含む大腸菌株ＴＯＰ１０、ＪＭ１０９（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）は、それぞれ５６Ｕ／ｍｌ、４５Ｕ／ｍｌ、７０Ｕ／ｍｌのリソスタフィン発現活性を有した。
【実施例４】
【００５１】
組換えリソスタフィンの同定
組換えプラスミドｐＥＴ−ＯｍｐＡｌｓｓを含むＴＯＰ１０を５０ｍｌのＬＢブロス（３０ｍｇ／ｍｌカナマイシンを含む）に接種し、振とうしながら３７℃で１６時間インキュベートし、次いで、３リットルのＬＢブロス（３０ｍｇ／ｍｌカナマイシンを含む）に再接種し、振とうしながら３７℃で５時間インキュベートし、次いで、０．０５ｍＭの終濃度までＩＰＴＧを加え、次いで、さらに３時間インキュベートして、タンパク質の発現を誘導した。次に、発酵ブロスを遠心分離し、陽イオンカラムクロマトグラフ、疎水性カラムクロマトグラフ、ゲルろ過によって、精製し、最終的に、純度が９５％を超え、比活性度が１１０３  Ｕ／ｍｇでＳｉｇｍａのリソスタフィンの比活性度に匹敵する、８３ｍｇのリソスタフィン生成物を得た。
【００５２】
レーン１〜４がそれぞれ発酵上清、陽イオンカラムクロマトグラフ精製試料、疎水性クロマトグラフ精製試料、ゲルろ過精製試料であり、レーン５がシグマ（Ｓｉｇｍａ）からのリソスタフィンかり、レーンＭが低分子量マーカーであり、レーン６−９がウェスタンブロット分析の結果を示す、図３および図４に示されるように、精製されたリソスタフィンを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法およびウエスタンブロットによって同定した。
【００５３】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（図５に示されるように）によって、精製されたリソスタフィンが、分子量２６９２７Ｄａであり、理論的に計算された分子量２６９２４Ｄａ、およびＳｉｇｕｍａリソスタフィンの分子量２６９１２Ｄａに非常に近いと判定した。
【００５４】
精製されたリソスタフィンのＮ末端アミノ酸残基アッセイ結果：Ｎ末端の最初の１５アミノ酸は、天然のリソスタフィンのもの、すなわちＡＡＴＨＥＨＳＡＱＷＬＮＮＹＫと同一であった。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】スタフィロコッカス・シミュランスの全ＤＮＡ（ＮＲＲＬ  Ｂ−２６２８）からＰＣＲによって増幅された、成熟したリソスタフィン遺伝子を示す図である。  レーン１：スタフィロコッカス・シミュランス（ＮＲＲＬ  Ｂ−２６２８）の全ＤＮＡを鋳型として、配列番号１および配列番号２をプライマーの対として用いた、増幅産物のバンド、サイズ８８７ｂｐ。  レーンＭ：標準タンパク質分子量マーカー
【図２】組換えリソスタフィンの分泌発現ベクターの構築を示す図である。
【図３】精製されたリソスタフィンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を示す図である。  レーン１：粗く精製された試料  レーン２〜３：さらに精製された試料  レーン４：精密な精製試料  レーンＭ：標準タンパク質分子量マーカー
【図４】精製されたリソスタフィンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動およびウエスタンブロット分析を示す図である。  レーンＡ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  レーンＢ：ウエスタンブロット  レーンＭ：標準タンパク質分子量マーカー
【図５】ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって分子量が２６９２７Ｄａであると判定された、精製されたリソスタフィンを示す図である。
【００５６】
［配列表］
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2009502125.tif 000005
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2009502125.tif 000007
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【図１】
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【図２】
2009502125.tif 000010
【図３】
2009502125.tif 000011
【図４】
2009502125.tif 000012
【図５】
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【配列表】
2009502125000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成20年7月11日(2008.7.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）シグナルペプチドコードＤＮＡ配列を、成熟したリソスタフィンの遺伝子配列の一部または全体の前にクローニングすること、およびこのようにしてクローニングされた配列をプロモーターに連結することを含む、発現ベクターを構築する工程
（２）工程（１）において構築されたベクターで大腸菌を形質転換し、培養および発酵する工程
（３）発酵上清からリソスタフィンを単離する工程
を含むことを特徴とする、大腸菌におけるリソスタフィンの分泌発現のための方法。
【請求項２】
前記リソスタフィンがその変異体をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の大腸菌におけるリソスタフィンの分泌発現のための方法。
【請求項３】
工程（１）におけるシグナルペプチドがｐｈｏＡ、ＯｍｐＡ、ＬｙｓｎまたはｐｅｌＢの１つであることを特徴とする、請求項２に記載の大腸菌におけるリソスタフィンの分泌発現のための方法。
【請求項４】
工程（２）におけるリソスタフィンの発現が誘導性発現であることを特徴とする、請求項３に記載の大腸菌におけるリソスタフィンの分泌発現のための方法。
【請求項５】
前記ベクターが大腸菌における発現のためのベクターであることを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の大腸菌におけるリソスタフィンの分泌発現のための方法。
【請求項６】
大腸菌における発現のためのベクターがｐＵＣ系、ｐＥＴ系またはｐＧＥＸの１つであることを特徴とする、請求項５に記載の大腸菌におけるリソスタフィンの分泌発現のための方法。
【請求項７】
大腸菌における発現のためのベクターがｐＢＶ２２０であることを特徴とする、請求項５に記載の大腸菌におけるリソスタフィンの分泌発現のための方法。
【請求項８】
プロモーター、シグナルペプチドコードＤＮＡ配列、および成熟したリソスタフィンの遺伝子配列の一部または全体を含む、発現ベクター。
【請求項９】
シグナルペプチドがｐｈｏＡ、ＯｍｐＡ、ＬｙｓｎまたはｐｅｌＢの１つであることを特徴とする、請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
プロモーターがＴ７プロモーター、Ｐ１ＰｒプロモーターまたはｌａｃＵＶ５プロモーターの１つであることを特徴とする、請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
ベクターがｐＵＣ系、ｐＥＴ系またはｐＧＥＸの１つであることを特徴とする、請求項８乃至１０のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
ベクターがｐＥＴ−ＯｍｐＡｌｓｓであることを特徴とする、請求項１１に記載の発現ベクター。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
組換えリソスタフィンの同定
組換えプラスミドｐＥＴ−ＯｍｐＡｌｓｓを含むＴＯＰ１０を５０ｍｌのＬＢブロス（３０ｍｇ／ｍｌカナマイシンを含む）に接種し、振とうしながら３７℃で１６時間インキュベートし、次いで、３リットルのＬＢブロス（３０ｍｇ／ｍｌカナマイシンを含む）を含む実験室振とうフラスコに再接種し、振とうしながら３７℃で５時間インキュベートし、次いで、０．０５ｍＭの終濃度までＩＰＴＧを加え、次いで、さらに３時間インキュベートして、タンパク質の発現を誘導した。次に、発酵ブロスを遠心分離し、陽イオンカラムクロマトグラフ、疎水性カラムクロマトグラフ、ゲルろ過によって、精製し、最終的に、純度が９５％を超え、比活性度が１１０３  Ｕ／ｍｇでＳｉｇｍａのリソスタフィンの比活性度に匹敵する、８３ｍｇのリソスタフィン生成物を得た。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
レーン１〜４がそれぞれ発酵上清、陽イオンカラムクロマトグラフ精製試料、疎水性クロマトグラフ精製試料、ゲルろ過精製試料であり、かつレーンＭが低分子量マーカーである、図３および図４に示されるように、精製されたリソスタフィンを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法およびウエスタンブロットによって同定した。
【国際調査報告】
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