(57)【要約】平衡反応の生産を向上させるための方法およびシステムを記載する。いくつかの実施形態においては、方法が、平衡が達成されたときに反応混合物から酵素を除去すること、生成物を形成する反応を生成物へと駆動すべく酵素および反応剤を選択的に再添加すること、ならびに安定化された中間体、副生成物、および／または副生成物を反応混合物へと任意でリサイクルすることを含んでいる。いくつかの実施形態においては、方法が、所望の生成物を反応混合物から精製すること、ならびに元の反応剤、中間体、副生成物、および／または副生成物などといった反応混合物の1つ以上の成分を、力価を改善するために望まれるとおりに反応混合物へと選択的にリサイクルすることを含んでいる。これらの方法を実施するためのシステムも提供する。いくつかの実施形態においては、これらの方法およびシステムを、多段階の平衡経路において生成されるモナチンおよびモナチン誘導体の生成を増加させるために実施する。
2009538145.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）１またはそれを超える反応剤および１またはそれを超える第１の促進剤を含む第１の組成物を反応させて多段階の平衡経路で一定量のモナチンおよび一定量の１またはそれを超える中間体を形成させ、ここに該経路はモナチン生成反応、およびモナチン生成反応に利用し得る１またはそれを超える中間体の少なくとも１の量を制限する制限反応を含み；
ｂ）第２の組成物を形成する望ましい時間の後に該１またはそれを超える促進剤を除去、阻害、不活性化または分解し；ついで、
ｃ）第２の促進剤を第２の組成物に加えることによってさらなる量のモナチンを生成し、ここに第２の組成物促進剤は該第１の促進剤のうちの少なくとも１と同じものとすることができ；または、モナチン生成反応に関与する１またはそれを超える第１の促進剤を阻害しないかまたは再活性化し；または、それらの組み合わせをし；ついで、モナチン生成反応を前に向けて駆動するための第２の組成物に成分を添加する
ことを含む方法。
【請求項２】
望ましい時間が、ａ）において平衡に達するのに必要な時間である請求項１記載の方法。
【請求項３】
該成分を、ａ）からの１またはそれを超える反応物の少なくとも１と同じものとすることができ、あるいは、工程ａ）において生成した化合物と同じものとすることができる請求項１記載の方法。
【請求項４】
さらに、
該第２の組成物から該モナチンを精製し、ついで反応精製混合物を形成することを含む請求項１記載の方法。
【請求項５】
該除去、阻害、不活性化または分解が、１またはそれを超える促進剤の全てを除去することを含む請求項１記載の方法。
【請求項６】
該除去が、濾過、クロマトグラフィおよび抽出の１またはそれを超えるものから選択される請求項１記載の方法。
【請求項７】
該濾過が限外濾過である請求項６記載の方法。
【請求項８】
該クロマトグラフィが、サイズ排除クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィおよび親和性クロマトグラフィから選択される請求項６記載の方法。
【請求項９】
１またはそれを超える反応物のうちの少なくとも１がアミノ酸であって、１またはそれを超える反応物のうちの少なくとも１がアミノ基受容体であり、該１またはそれを超える第１の促進剤が２またはそれを超える促進剤を含む請求項１記載の方法。
【請求項１０】
該アミノ酸がＬ−トリプトファン、Ｄ−トリプトファンまたはそれらの混合物である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
２またはそれを超える促進剤のうちの１が第２の促進剤である請求項９記載の方法。
【請求項１２】
該アミノ基受容体がピルビン酸、オキサロ酢酸、アルファ−ケトグルタル酸、またはそれらの混合物である請求項９記載の方法。
【請求項１３】
該アミノ基受容体が反応して、アラニン、アスパラギン酸およびグルタミン酸から選択されるアミノ基提供体を生成する請求項９記載の方法。
【請求項１４】
該１またはそれを超える第１の促進剤が、酵素、無機触媒およびＲＮＡから選択される請求項１記載の方法。
【請求項１５】
該酵素が、アミノトランスフェラーゼ、ラセマーゼおよびアルドラーゼから選択される請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
該アミノ基受容体がピルビン酸であり、該アミノ基受容体が反応してアラニンを生成し、ｃ）における成分もアラニンであり、さらに、反応精製混合物からのアラニンを第２の組成物に、および所望により第１の組成物にリサイクルすることを含む請求項４記載の方法。
【請求項１７】
該成分がアラニンである請求項３記載の方法。
【請求項１８】
さらに、所望の時間の後に第２の組成物からアラニンの少なくとも一部分を分離し、ついで該分離したアラニンを第１の組成物にリサイクルすることを含む請求項４記載の方法。
【請求項１９】
工程ｃ）の該促進剤がアミノトランスフェラーゼである請求項１記載の方法。
【請求項２０】
該モナチンがＲ,Ｒモナチン、Ｓ,Ｓモナチン、Ｒ,Ｓモナチン、Ｓ,Ｒモナチン、またはそれらの混合物である請求項１記載の方法。
【請求項２１】
該モナチンがＲ,Ｒモナチンである請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
多段階平衡経路でモナチンを製造する方法であって、
ａ）酵素によって促進される少なくとも２の反応工程を含む経路を介して反応混合物中のモナチンを生成し、ここに該少なくとも２の工程のうちの少なくとも１がモナチン生成工程であって、該少なくとも２の工程のうちの少なくとも１が望ましくない平衡を有し；
ｂ）少なくとも望ましくない平衡を有する反応を妥協して（compromising）、妥協した組成物を形成し；
ｃ）該妥協した組成物に少なくとも１の成分を加えてモナチン生成工程をモナチンの生成に向けて駆動する
ことを含む該方法。
【請求項２３】
該経路が少なくとも３の反応工程を含む請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
さらに、反応混合物から促進剤、促進剤の補助因子またはそれらの組み合わせを分離することによって少なくとも３の工程の全てを妥協することを含み、ここに少なくとも１の成分が少なくとも第１の成分および第２の成分であり、該第１の成分がモナチン−生成工程を促進する酵素であって該第２の成分がモナチン生成工程に関与する反応物であり、ここにモナチン生成工程を促進する酵素が経路におけるより安定性の低い成分から経路におけるより安定性の高い成分への変換も促進する請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
該より安定性の低い成分がインドール−３−ピルビン酸であって、該より安定性の高い成分がトリプトファンである請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
さらに、分離した酵素およびトリプトファンを反応混合物にリサイクルすることを含む請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
さらに、副生成物、同時生成物（coproduct）またはそれらの組み合わせを第１の組成物、妥協した組成物またはそれらの組み合わせにリサイクルすることを含む請求項２４記載の方法。
【請求項２８】
さらに、２−ヒドロキシ  ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸（「ＭＰ」）を生成する一連の初期成分を反応混合物に提供することを含み、ここに約９０％のＭＰがモナチンに変換する請求項２２記載の方法。
【請求項２９】
約９５％のＭＰがモナチンに変換する請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
約１００％のＭＰがモナチンに変換する請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
生成したモナチンの濃度が、妨害されていない（undisturbed）平衡経路で生成するよりも約１.５倍高い請求項２８記載の方法。
【請求項３２】
生成したモナチンの濃度が、妨害されていない平衡経路で生成するよりも約１.７倍高い請求項２８記載の方法。
【請求項３３】
生成したモナチンの濃度が、妨害されていない平衡経路で生成するよりも約２.０倍高い請求項２８記載の方法。
【請求項３４】
モナチンをアニオン交換クロマトグラフィ、ＳＤＶＢカラムクロマトグラフィ、またはカチオン交換クロマトグラフィを用いて精製する請求項４記載の方法。
【請求項３５】
多段階平衡経路で生成物を製造する方法であって、
ａ）該経路で一連の反応剤および一連の促進剤を含む第１の組成物を反応させて、該生成物および１またはそれを超える中間体を含む第２の組成物を形成させ；
ｂ）促進剤を除去、阻害、不活性化または分解して多段階経路を不活性化させるかまたはその速度を低下させ；
ｃ）生成物を生成する工程に競合的な反応を不活性または鈍化した状態に維持しながら、少なくとも生成物を生成する反応の速度を再活性化または増大させ、ついで、所望により生成物を生成する工程を生成物の生成に向けて駆動するのに十分な量で、生成物を生成する工程に関与する少なくとも１の成分を加え；ついで
ｄ）第２の組成物から生成物を精製する
ことを含む該方法。
【請求項３６】
多段階平衡経路で生成物を製造するシステムであって、
ａ）１またはそれを超える反応物および１またはそれを超える促進剤を含む第１の混合物の成分を受けるおよび保持するための第１の容器、ここに該成分は反応して望ましい生成物および中間体を生成することができ；
ｂ）促進剤から反応物、生成物および中間体を分離するための容器と繋がった第１の装置；
ｃ）促進剤を該容器に戻してリサイクルするための手段；
ｄ）第１の装置からの反応物、望ましい生成物および中間体を受ける該第１の装置と繋がった第２の容器、ここに該第２の容器は反応物および中間体の少なくとも１を含む望ましい生成物を生成する反応を活性化するのに有用な促進剤を受けるようにも適合され、かつ、生成物を生成する反応を駆動して望ましい生成物を形成するのに有用な成分を受けるように適合され；
ｅ）第２の容器と繋がった望ましい生成物を精製するための手段；
ｆ）精製するための手段からの反応物および所望により中間体を第１の容器にリサイクルするための手段；および、所望により、
ｇ）精製するための手段からの成分を第２の容器にリサイクルするための手段
を含む該システム。
【請求項３７】
新たな混合物を残しつつ元の反応混合物からモナチンを精製し、元の反応混合物からの少なくとも１の成分を新たな反応混合物に選択的にリサイクルし、ついで平衡プロセス単独によって生成するモナチンの量よりも多い元の量の反応物から一定量のモナチンを生成することを含み、ここに精製することが、少なくとも１の限外濾過工程および少なくとも１のクロマトグラフィ工程を含む方法。
【請求項３８】
少なくとも１のクロマトグラフィ工程が、カチオン交換クロマトグラフィ工程および非極性吸着剤樹脂上のクロマトグラフィを含む請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
さらに脱塩工程を含み、少なくとも１のクロマトグラフィ工程がカチオン交換クロマトグラフィ工程、アニオン交換クロマトグラフィ工程および非極性吸着樹脂上のクロマトグラフィを含む請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
少なくとも１のクロマトグラフィ工程が、非極性合成吸着樹脂を用いるクロマトグラフィを含む請求項３７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、2006年5月24日付の米国特許仮出願第60／803,105号の優先権を主張し、この米国特許仮出願の全内容が参照として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、平衡反応を含む多段階経路の所望の生成物の収量を増加させるための方法およびシステムに向けられている。いくつかの実施形態においては、所望の生成物は高甘味度甘味料であるモナチンである。
【背景技術】
【０００３】
背景
モナチンは、化学式
【０００４】
【化１】
2009538145.tif 000003
【０００５】
を有する高甘味度甘味料である
【０００６】
様々な命名法ゆえに、モナチンは、2−ヒドロキシ−2−（インド−ル−3−イルメチル）−4−アミノグルタル酸；4−アミノ−2−ヒドロキシ−2−（1H−インド−ル−3−イルメチル）ペンタン二酸；4−ヒドロキシ−4−（3−インドリルメチル）グルタミン酸；および3−（1−アミノ−1,3−ジカルボキシ−3−ヒドロキシブタ−4−イル）インド−ルなど、多くの別の化学名でも知られている。
【０００７】
モナチンは、4つの可能な立体異性配置をもたらす2つの不斉中心を含んでいる。すなわち、R,R配置（「R,R立体異性体」または「R,Rモナチン」）；S,S配置（「S,S立体異性体」または「S,Sモナチン」）；R,S配置（「R,S立体異性体」または「R,Sモナチン」）、およびS,R配置（「S,R立体異性体」または「S,Rモナチン」）である。
【０００８】
参照として本明細書に組み込まれるWO2003／091396  A2が、とりわけ、モナチンの生体内（in vivo）および生体外（in vitro）での生産のためのポリペプチド、経路、および微生物を開示している。WO2003／091396  A2（例えば、図1〜3および11〜13を参照）および米国特許出願公開第2005／282260号が、ポリペプチド（タンパク質）または酵素による生物学的変換を含む多段階の経路によるトリプトファンからのモナチンの製造を記載している。記載されている1つの経路は、生物学的に、例えば酵素を用いて、トリプトファンをインド−ル−3−ピルビン酸（「I−3−P」）へと変換すること（反応（1））、インド−ル−3−ピルビン酸を2−ヒドロキシ2−（インド−ル−3−イルメチル）−4−ケトグルタル酸（モナチン前駆体、「MP」）へと変換すること（反応（2））、およびMPをモナチンへと変換すること（反応（3））を含んでいる。
【０００９】
モナチンの特定の異性体形を、南アフリカのトランスバ−ル（Transvaal）地方に生育する植物Sclerochiton  ilicifoliusの根皮に見出すことができる。しかしながら、乾燥した根皮に存在するモナチンの濃度は、酸の形態のインド−ルとして表すと、約0.007質量％であることが明らかになっている。米国特許第4,975,298号を参照されたい。この植物においてモナチンが生産される正確な方法は、現在のところ未知である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
少なくとも一部にはその甘味特性ゆえ、モナチンの経済的な供給元を手にすることが望まれる。したがって、モナチンの合成経路など、上述の生物学的多段階経路を含む合成経路の効率を向上させるニ−ズが続いて存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（概要）
生物学的合成経路によって所望の最終生成物を合成するための方法およびシステムが提供される。一実施形態によれば、少なくとも1つの経路中間体の形で捕捉される炭素であって、通常であれば合成経路の終わりにおいて失われてしまう炭素が、そのような炭素を所望の最終生成物へと変換するように元の経路を変更することによって救出され、所望の最終生成物へと変換される。当業者であれば、用語「炭素」が、本明細書において該当の化合物の略記として使用されていることを理解すべきである。すなわち、「炭素が所望の生成物へと変換される」と述べた場合、炭素含有の化合物が所望の生成物へと変換されるという意味である。
【００１２】
一実施形態においては、中間体および未反応の成分が再使用のためにリサイクルされ、無駄が減り、生成物の炭素収量が改善される。すなわち、この生成物の正味の取り出しが平衡を乱すことができ、生成物が取り出されない場合に比べ、元の反応剤の所与の量あたりの生成物の生成をより多くすることができる。これは、生成の経済性を向上させることができる。
【００１３】
本発明の別の実施形態においては、反応混合物のうちの1つ以上の成分を、生成を平衡の生成量を超えて向上させるべくリサイクルすることができる。すなわち、所望の生成物を生成するために一連の反応が実行される場合に、望ましくない副反応（その一部は不可逆であり得、その他は可逆であり得る）も生じうる。副反応が不可逆または実質的に不可逆である場合、それらの副反応に使用される炭素は、所望の経路へと回収することが不可能である。換言すると、不可逆の副反応が抑制されない場合、最終的に所望の反応の速度を追い越す可能性がある。したがって、より変動性である中間体または副産物を、分解を防止するために安定化させることができる。したがって、本発明の実施形態においては、変動性または不安定な中間体および副生物が、元の反応剤の混合物へとリサイクルすることができるより安定な成分への変換によって安定化される。不安定な中間体を生成物またはより安定な化合物へと変換することで、炭素のさらなる維持をもたらすことができ、生成物の収量を改善することができる。
【００１４】
副反応が可逆である場合には、可逆の副反応の生成物を、元の反応剤が望ましくない副産物の生成へとさらに失われることを防止または軽減するために、元の反応剤の混合物へとリサイクルすることができる。例えば、望ましくない副生成物の平衡量を元の反応剤に加えることで、正味の結果は、望ましくない副反応が順方向に進むことがないという結果である。
【００１５】
特定の実施形態においては、モナチンのトリプトファンからの生成が、トリプトファンをインド−ル−3−ピルビン酸（「I3P」）へと変換し、I3Pをピルビン酸と反応させてα−ケト酸モナチン（「MP」）を形成し、次いでMPをモナチンを形成すべく反応させることによって行われ、反応のそれぞれが、1つ以上の酵素によって促進される。生成物の形成経路に沿った反応に加えて、競合の反応が生じる可能性がある。例えば、上記のモナチン生成プロセスにおいて、ピルビン酸が自身と反応して4−ヒドロキシ−4−メチル−2−オキソグルタル酸（「HMO」）を形成する可能性があり、さらにHMOがトリプトファンをI3Pへと変換する酵素と同じ酵素によって4−ヒドロキシ−4−メチルグルタミン酸（「HMG」）へと変換される可能性がある。したがって、経済性を改善するための方法は、モナチン生成に直接的に関与する化合物をリサイクルするだけでなく、副反応の副産物もリサイクルする。そのようにしてリサイクルされる副産物を、モナチンの生産に有用な化合物へと再び変換することができる。
【００１６】
一実施形態においては、より安定でない化合物が、分離および／またはリサイクルに先立ってより安定な化合物へと変換される。「より安定でない」および「より安定な」は、分離およびリサイクルのために選択される条件のもとでの化合物の分解の可能性を示している。モナチンが例えばトリプトファンから生成されるいくつかの実施形態においては、アルファ−ケト酸中間体が、分離およびリサイクルに先立って該当するアミノ酸へと変換される。モナチンが上述の経路によって生成される特定の実施形態においては、より安定でない化合物のより安定な化合物への変換を、最初にモナチン生成反応の平衡までの進行を可能にし、次にモナチン生成経路に関与する酵素を除去し、次いでMPの変換およびトリプトファンの変換を促進する1つ以上の酵素を追加のアラニンともに再添加することによって、達成することができる。適切な酵素の選択的な添加ならびにアラニン導入が、より安定でないMPが追加のより安定なモナチンを形成することを可能にし、より安定でないI3Pがより安定なトリプトファンへと変換されることを可能にし、このトリプトファンを、さらなるモナチン生成のためにリサイクルすることができる。
【００１７】
したがって、一実施形態において、本発明の方法は、いくつかの段階にて進行する。第1の段階において、合成経路は、初期の基質Xを経路の1つ以上の中間体（Y1〜Yn）へと変換することを含む（中間体Y1が中間体Y2へと変換され、中間体Y2が中間体Y3へと変換され、以下同様にして、最後の中間体である中間体Ynが生成される）。次いで、中間体Ynが、生成物Zへと変換される。XのY1〜Ynへの変換およびその後のZへの変換は、通常は少なくとも部分的に同時に、ただ1つの混合物または組成物において生じることができる。第2の段階では、第1の段階の開始後の所望の時点において、第1の段階における酵素的または化学的反応（すなわち、XをY1に変換し、Y1をY2に変換し、Y2をY3に変換し、以下同様にして最終的にY(n−1)をYnに変換し、次いでYnをZへと変換する反応）を促進した分子的実体のうちの少なくとも1つまたはすべてが、反応混合物から除去され、あるいは他の方法で抑制、分解、または不活化され、あるいは機能できなくされる。第3の段階においては、段階2の後の混合物に依然として存在している少なくとも1つの中間体Yが、中間体Ynの生成物Zへの変換を促進することができる分子的実体を添加または再添加することによって、生成物Zへと変換される。
【００１８】
さらなる実施形態においては、第3の段階において、中間体Ynが生成物Zへと変換される。
さらなる実施形態においては、生成物Zがモナチンである合成経路が提供される。
さらなる実施形態においては、経路の反応の促進を担当する分子的実体のすべてが、段階3の前に反応混合物から除去される。
さらなる実施形態においては、除去されるべき中間段階の反応（例えば、Yn−1をYnへと変換する反応）を促進した分子的実体のみが、反応混合物から除去され、あるいは他の方法で抑制、分解、または不活化される。
【００１９】
さらなる実施形態においては、経路内の1つ以上の反応を促進することができる2つ以上の分子的実体が、段階3において混合物へと再び加えられる。
特定の実施形態においては、本明細書に提示される方法を使用することで、多段階平衡プロセスの生成物の総量、または力価を、平衡プロセスのみに比べて改善することができる。例えば、生成物の濃度または力価について、1.7倍の改善が可能であり、特定の場合には、濃度または力価について、2.0倍の改善が可能である。所与の基質からの生成物のモル収量（生成された生成物のモル数を、供給した基質の初期のモル数で割ったもの）について、1.7倍の改善が可能であり、特定の場合には、2.0倍の改善が可能である。全体としての炭素収量（生成物に含まれる炭素の量を、供給した基質に含まれていた炭素の量で割ったもの）も、基質（とくには、段階3において追加される追加の基質）がリサイクルされる場合に、平衡プロセスのみに比べて改善することができる。
【００２０】
本発明は、本発明の方法を利用するモナチンの生成のためのシステム、ならびにそのような生成のための装置をさらに具現化する。いくつかの実施形態においては、多段階の経路にてモナチンを形成するための方法が、1つ以上の反応剤および1つ以上の促進剤を含む第1の組成物について、モナチンおよびモナチン生成経路の1つ以上の中間体を形成すべく反応できるようにすることを含んでいる。第1の組成物が、指定の期間にわたって（例えば、平衡に達するまで）反応可能にされる。指定の期間の後に、促進剤のうちの1つ以上が除去、抑制、不活化、または分解され、その後にモナチン生成の反応段階に関与する促進剤を組成物へと加え、あるいはモナチン生成の反応段階に関与する促進剤の抑制を解き、あるいはナチン生成の反応段階に関与する促進剤を再び活性化することによって、経路におけるモナチンの生成が向上する。いくつかの実施形態においては、適切な促進剤を追加し、適切な促進剤の抑制を解き、あるいは適切な促進剤を再活性化する他に、モナチン生成段階をモナチンの生成に向かって駆動することに関与する追加の化合物が、組成物へと追加される。
【００２１】
いくつかの実施形態においては、モナチンの生成方法が、少なくとも2つ、または少なくとも3つの反応段階を有する経路にてモナチンを生成することを含んでおり、反応段階のうちの1つがモナチンを生成し、反応段階のうちの別の1つが、モナチン生成の反応段階に利用することができるモナチン経路の中間体の量を制限している。このモナチンの生成方法は、経路のうちの少なくとも上記の制限的な段階を所望の期間の後で（例えば、経路が平衡に達した後で）妥協（compromise）し、その後にモナチン生成段階をモナチンの生成に向かって駆動するために、例えば促進剤または反応剤あるいは両者を再び経路へと導入することを含んでいる。「反応を妥協する」とは、反応を乱して生じることができないようにし、あるいは反応の働きを低下させることを意味する。
この概要は、添付の特許請求の範囲の技術的範囲に対して限定として機能するものでは決してない。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の実施形態によるモナチンの生成を例示するプロセスフロ−図である。
【図２】本発明の実施形態によるモナチンの生成を例示するシステムの概略のブロック図である。
【図３】本発明の種々の実施形態によるモナチンの生成における種々の成分の分離を例示するシステムの概略のブロック図である。
【図４】本発明の種々の実施形態によるモナチンの生成における種々の成分の分離を例示するシステムの概略のブロック図である。
【図５】本発明の種々の実施形態によるモナチンの生成における種々の成分の分離を例示するシステムの概略のブロック図である。
【図６】本発明の種々の実施形態によるモナチンの生成における種々の成分の分離を例示するシステムの概略のブロック図である。
【図７】本発明の種々の実施形態によるモナチンの生成における種々の成分の分離を例示するシステムの概略のブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書において使用されるとき、「・・・を含んでいる（including）」は、「・・・を含む（comprising）」を意味し、「含む（includes）」は、文脈から明らかでない限り、「・・・を含むが・・・だけに限られない」を意味する。本明細書において使用されるとき、「例えば」または「など」という表現は、非限定的であって、「例えば・・・であるが、・・・に限られない」および「・・・などであるが、・・・に限られない」を意味する。さらに、単数形の表現は、文脈から明らかでない限り、対象物が複数である場合を含む。例えば、「酵素を含む（comprising  an  enzyme）」とは、1つ以上の酵素を含んでいるという意味である。用語「約（about）」は、測定において生じる実験誤差の範囲を包含する。特に述べられていない限り、すべての測定数は、たとえ用語「約」が明示的に使用されていない場合でも、頭に「約」という用語を冠していると見なされる。
【００２４】
本明細書において使用されるとき、用語「分離（separating）」および「除去（removing）」は、入れ換え可能に使用される。すなわち、例えば、組成物からモナチンを分離することは、組成物からモナチンを除去することと同じである。当業者であれば、分離および除去が完全な分離および除去を必要とせず、例えば膜ろ過による分離などといったいくつかの分離においては、所望の成分の非所望の成分への或る程度の流出が生じうるため、粗い分離のみが達成されることを、理解できるであろう。したがって、「分離」および「除去」は、所望の成分が、分離されたときに分離または除去の前よりも純粋であることだけを意味する。
本明細書において使用されるとき、用語「モナチン」は、特に示されていない限りは、モナチンの特定の立体異性体に限られない。
【００２５】
「モナチン」のアッセイは、モナチンの存在について組成物を検定することを包含する。特に示されていない限りは、モナチン組成物中のモナチンは、特定の立体異性体に限定されない。したがって、「モナチン」を含む組成物は、特に示されていない限りは、例えばモナチンの4つの立体異性体のすべてを含んでいる組成物、モナチンの立体異性体の任意の組み合わせを含んでいる組成物（例えば、モナチンのR,RおよびS,S立体異性体のみを含んでいる組成物）、およびモナチンのただ1つの異性体のみを含んでいる組成物など、モナチンの4つの立体異性体のいずれかまたはすべてを含む組成物を含み、包含する。
【００２６】
明細書および特許請求の範囲において化学名（例えば、「モナチン」または「モナチン前駆体」）が特定される場合、とくにそのようでないと示されない限り、用語「・・・および／またはその（それらの）塩」が含まれていると理解すべきである。例えば、「インド−ル−3−ピルビン酸がモナチン前駆体へと変換される」という表現を、「インド−ル−3−ピルビン酸および／またはその塩が、モナチン前駆体および／またはその塩へと変換される」と理解しなければならない。当業者であれば、種々の典型的な反応条件のもとで、モナチン合成反応において、名前を挙げた反応剤、基質、中間物、および生成物を含む名前を挙げた化合物の塩が実際に存在し、あるいは存在しなくてもよいことを、理解できるであろう。
【００２７】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、入れ換え可能に使用される。用語「ポリペプチド」は、文脈から明らかでない限り、単一のポリペプチド鎖に限られず、鎖のマルチマ−（例えば、同種または異種のダイマ−、トリマ−、テトラマ−、など）を含む（このような多量形が、ポリペプチドの関与する反応を促進する（例えば、触媒する）ために必要である場合）。
【００２８】
「生物学的変換」は、化合物（基質）の別の化合物（生成物）への変換であって、例えばポリペプチドおよび以下の段落に記載される他の促進剤によって促進される変換である。生物学的変換は、酵素が1つ以上の基質の1つ以上の生成物への変換を促進する（触媒する）酵素反応を含む。「生物学的合成」または「生合成」は、少なくとも1つの生物学的変換が関与する合成である。
【００２９】
本明細書における説明では、生物学的合成の経路（例えば、モナチン合成のための典型的な合成経路）において反応を促進するために使用することができるポリペプチドの例として、酵素を挙げる。しかしながら、触媒抗体ならびに例えば触媒RNAまたはリボザイムなどといったRNA成分を有する促進剤など、他の分子的実体も、所望の反応を実行するための促進剤として使用可能であることを、理解すべきである。アルドラ−ゼ活性を有する触媒抗体が、市販されている（アルドラ−ゼ抗体38C2、Aldrich社カタログ番号47,995−0および48,157−2）。アルドラ−ゼ活性を有する触媒抗体の作成が、Wagner,  J.ら,  Science  15:  1797−1800  (1995)およびZhong,  G.ら,Angew  Chem.  Int.  Ed.  Engl.  16:  3738−3741  (1999)に記載されており、トランスアミナ−ゼ活性を有する触媒抗体が、Gramatikova,  S.  I.ら,  J.  Biol.  Chem.  271:  30583−30586  (1996)に記載されている。さらに、反応を触媒するための触媒抗体の使用が、米国特許第6,846,654号において検討されている。
【００３０】
多段階の経路は、後続の反応が先行する反応の少なくとも1つの生成物を利用するように互いに結び付けられた一連の反応である。例えば、そのような経路においては、第1の反応の基質が1つ以上の生成物へと変換され、それら生成物のうちの少なくとも1つを、第2の反応のための基質として利用することができる。次いで、第2の反応が1つ以上の生成物を生成し、それら生成物のうちの少なくとも1つを、第3の反応のための基質として利用することができ、以下同様である。多段階の経路においては、反応のうちの1つ、いくつか、またはすべてを、酵素によって触媒でき、あるいは触媒抗体または触媒RNAなどの分子的実体によって促進することができる。経路内の反応のうちの1つ、いくつか、またはすべては、可逆であってよい。生物学的合成は、酵素によって触媒され、あるいは触媒抗体または触媒RNAなどの分子的実体によって促進される少なくとも1つの反応段階を含んでいる合成である。多段階の平衡経路は、経路における反応（すなわち、段階）のうちの少なくとも1つが平衡または可逆反応である多段階の経路である。
【００３１】
本発明の実施形態によれば、モナチンの合成経路などの合成経路における反応のうちの1つ以上が、そのような合成経路が生成物（典型的には、生成物モナチン）の合成を開始させた後で改変される。経路は、促進剤のうちの少なくとも1つを取り除き、あるいは他の方法で経路を妥協する（例えば、促進剤の機能を妨げ、あるいは自身の機能を実行しようとする促進剤の能力を減じる）ことによって、改変または「破壊」される。例えば、経路を、経路内の特定の中間反応を促進する酵素を除去、抑制、または破壊することによって改変または「破壊」される。また、経路の改変は、本来は可逆であった反応が不可逆反応になるように、あるいはそのような反応の平衡を少なくともずらす（例えば、所望の生成物の合成（例えば、モナチンの合成）に向かって右側に）ように、反応条件を変更することを含むことができる（しかしながら、好ましくは元の経路の再現につながらないような方法で）。本明細書の実施例から理解できるとおり、元の経路の再現（または、元の経路の再生などといった同様の用語）は、モジュ−ルとの経路のすべての段階の再活性化を意味する。
【００３２】
一実施形態においては、改変により、供給される基質が経路の最初の反応のための基質だけである場合には、所望の最終生成物（例えば、モナチン）を合成する能力が大幅に減少し、あるいはもはや合成することができない経路がもたらされる。改変は、好ましくは、経路全体による最終生成物の合成を検出可能に減少させ、あるいは停止させる。改変が、生成物の合成が開始された後に生じるため、経路の改変の後に、元の反応が実行された混合物が、改変された好ましくは機能しない反応の生成物を含む経路の改変の時点での混合物に存在する経路の種々の中間生成物を特定の量で含む。
【００３３】
本発明の一実施形態によれば、少なくとも1つの中間生成物が捕捉され、そのような中間生成物の所望の最終生成物（例えば、モナチン）または所望の最終生成物の前駆体（例えば、モナチン前駆体（MP））への変換を促進する1つ以上の適切な促進剤（例えば、1つ以上の酵素）を反応混合物へと再び追加する（ただし、このような促進剤は、元の経路を生成することがなく、あるいは元の経路を再生することがない条件下で追加される）ことによって、所望の最終生成物（例えば、モナチン）へと変換される。一実施形態においては、不活化された反応の生成物が、この中間生成物の最終生成物（モナチンなど）への変換を促進するための成分を混合物へと再び追加する前に、当該生成物を生成した促進剤（例えば、酵素）から分離される。一実施形態においては、基質（例えば、反応剤、中間体、および生成物（が酵素から分離され、これらの基質が第2の反応混合物を形成し、酵素が第1の反応混合物へとリサイクルされる。少なくとも生成物を生成する工程（典型的には、多段階経路の最終段階）を促進することができる酵素が、第2の混合物へと追加または再導入される。さらなる実施形態においては、生成物の生成工程を生成物の生成にとって有利にする他の成分（例えば、反応剤）が、第2の混合物へと追加される。
【００３４】
当業者であれば理解できるとおり、成分の分離（促進剤の反応剤からの分離など）は、完璧でなくてもよく、促進剤の一部が反応混合物に残ってもよい。同様に、本明細書において使用されるとき、「精製」または同様の用語（「精製されたなど）は、対象の試料から混入物が除去されていることを示すが、絶対的な純度を必要とするわけではない。むしろ、「精製」は、文脈が示していない限り、相対的な用語として意図されている。したがって、例えば精製後のモナチンの混入物に対する濃度が、以前のモナチン含有組成物におけるモナチンの混入物に対する濃度よりも高い場合、モナチンがモナチン含有組成物から精製されている。
【００３５】
本発明の実施形態に例示されるように、所望の最終生成物（モナチンなど）の生成のための反応物質が、第1の混合物を形成すべく集められる。これらの反応物質は、適切な基質、共同因子、酵素、バッファ成分、などを含み、通常は、所望の最終生成物の生物学的合成（ここでは、モナチンの合成によって例示される）のための経路の反応に必要なすべての成分を含む。はじめに、少なくとも経路の第1の酵素のための基質が存在するが、所望であれば、他の中間基質を用意することができる。
【００３６】
この例示の実施形態においては、最終生成物（例えばモナチンなど、経路による生成が所望される最終生成物）の生成が、所望の時間にわたってこの経路によって進行可能にされる。最終生成物（例えば、モナチン）を、生成時にこの混合物から取り出すことができ、あるいは最終生成物を、例えば平衡に達するまで第1の混合物中に蓄積させてもよい。所望の時点において、上述の経路による最終生成物の合成を改変し、あるいは完全に停止させるために、特定の反応のうちの1つ以上について、酵素または促進剤のうちの1つ以上を抑制または他の方法で不活化し、あるいは取り除くことによって、上述の経路による最終生成物の合成が妥協される。除去、不活化、または抑制は、この1つ以上の促進剤の除去、不活化、または抑制ゆえに、元の経路による最終生成物の合成がもはや進行できず、あるいは比較的遅い速度でしか進行できないようなものである。除去、抑制、または不活化された促進剤によって実行される反応を、妥協されたということができる。反応を妥協する例として、これに限られるわけではないが、反応を促進する酵素を反応混合物から除去（あるいは、分離（この用語は、本明細書において除去と入れ換え可能に使用される）ことが挙げられる。反応を妥協する別の例として、これに限られるわけではないが、酵素の作用に必要な補助因子を反応混合物から除去することが挙げられる。マグネシウムまたはリン酸補助因子を有する酵素を利用する経路においてモナチンが生成される一実施形態においては、例えば脱塩カラムを使用してマグネシウムまたはリン酸を除去することによって酵素を不活化することで、反応を妥協することができる。
【００３７】
経路において中間化合物を生成する任意の反応を、妥協の対象とすることができる。一実施形態においては、経路において中間体を生成する可逆反応が、妥協される。一実施形態においては、少なくとも最低または低い平衡定数（例えば、1以下）を有する反応が、妥協される。一実施形態においては、妥協される反応が、少なくとも経路における最後から2番目の反応であるが、経路において1つ以上の中間生成物をもたらすことができる反応のうちの任意の1つ、任意の組、またはすべてを、改変または妥協することができる。いくつかの実施形態においては、反応が、不安定な中間体の濃度を減少させる方法で実行される。例えば、特定のモナチン生成経路においては、アルファ−カルボニルカルボン酸2−ヒドロキシ−2−（インド−ル−3イルメチル）−4−ケトグルタル酸を生成する反応が、この中間体の濃度を減少させるべく妨害される。特定のモナチン生成経路においては、反応が、アミノ供与体を高濃度で反応へと加えることによって、アルファ−カルボニルカルボン酸インド−ル−3−ピルビン酸、4−ヒドロキシ−4−メチル−2−オキソグルタル酸（「HMO」）、2−ヒドロキシ−2−（インド−ル−3イルメチル）−4−ケトグルタル酸をこれらの対応するアミノ酸へと変換するような方法で実行される。
【００３８】
所望の反応（例えば、所望の中間反応）を改変または妥協するために、1つ以上の促進剤（例えば、経路内の可逆の中間反応を触媒する1つ以上の酵素）を、組成物から除去でき、あるいは抑制することができる。その結果、とりわけ経路の中間体を含むが、この中間体の最終生成物（例えば、モナチン）への変換を触媒するために必要な酵素を含まない組成物がもたらされる。
【００３９】
所望の反応を妥協した後で（例えば、反応の促進剤を除去、抑制、または不活化した後で）、混合物に、反応の中間体のうちの1つ以上を最終生成物（例えば、モナチン）へと変換する成分を補うことができる。この追加の成分は、初期の経路が単純に元の有効な形で再生されることがないよう、組成物が中間反応が妥協された状態（すなわち、中間反応が欠けており、抑制され、あるいは不活化されている状態）を保つような成分である。欠けている促進剤の生成物（例えば、欠けている酵素の生成物）であった中間体の最終生成物または最終生成物の前駆体への変換を促進する「破壊された」経路の反応を再確立することによって、あるいはその中間段階またはその下流で捕捉される炭素を、最終生成物へと回収することができる。そのような変換は、元の経路のうちの当該中間生成物から最終生成物までの部分を再確立でき、あるいは中間生成物から最終生成物への別の反応経路を確立することができる。このようにして、所望の最終生成物（例えば、モナチン）の合成が、より効率的になり、経路における中間体の喪失または無駄が少なくなる。追加された追加の反応剤成分がリサイクルされるならば、収量の向上ゆえにより経済的な生成がもたらされる。
【００４０】
中間体の最終生成物への変換の後で生じる反応混合物を、好適な任意の所望の目的に、直接的に使用することができる。あるいは、最終生成物（例えば、モナチン）を含む組成物または調合物（液体または固体）を、最終生成物またはそのような最終生成物（例えば、モナチン）を含んでいる組成物を、この技術分野において公知の方法を使用して所望のとおりに第1および第2の反応混合物から抽出、生成、または単離することによって、さらに処理することができる。
【００４１】
本明細書での検討においては、3つの段階について述べるが、他の段階の追加を排除するものではなく、あくまで3つの段階は、本発明の方法の時間的側面についての検討を容易にするためのツ−ルにすぎない。
【００４２】
したがって、一実施形態においては、本発明を、いくつかの段階にて進行する化合物（例えば、モナチン）の合成の経路として記載することができる。第1の段階において、経路は、初期の基質Xを経路の1つ以上の中間体（Y1〜Yn）へと変換することを含む（中間体Y1が中間体Y2へと変換され、中間体Y2が中間体Y3へと変換され、以下同様にして、最後の中間体である中間体Ynが生成される）。次いで、中間体Ynが、生成物Z（例えば、モナチン）へと変換される。XのY1〜Ynへの変換およびその後のZへの変換は、通常は少なくとも部分的に同時に、ただ1つの混合物または組成物において生じることができる。第2の段階では、第1の段階の開始後の所望の時点において、第1の段階における酵素的または化学的反応（すなわち、XをY1に変換し、Y1をY2に変換し、Y2をY3に変換し、以下同様にして最終的にY(n−1)をYnに変換し、次いでYnをZへと変換する反応）を実行または促進した分子的実体が、機能できなくなるように、あるいは機能が大幅に衰えるように、反応混合物から除去され、あるいは他の方法で抑制、分解、または不活化され、あるいは他の方法で妥協される。第3の段階においては、段階2の後の混合物に依然として存在している1つ以上の中間体（例えば、中間体Yn）が、Ynの生成物（例えば、モナチン）への変換または生成物（例えば、モナチン）へと変換することができる中間体への変換を促進することができる1つ以上の分子的実体を添加または再添加することによって、生成物（例えば、モナチン）または生成物へと変換することができる中間体へと変換される。
【００４３】
上述されるように、例えば、モナチンが多段階の生合成反応にてトリプトファンから生成される特定の実施形態において、プロセスは、MPの蓄積を目標とすることができる。一実施形態においては、これを、I3PからMPを形成する反応を、例えば経路内の他の反応を促進する酵素を除去（抑制または不活化）することによって、あるいはすべての酵素を除去、抑制、または不活化した後でI3PのMPへの変換を促進する酵素を再添加、有効化、または再活性化することによって単離し、MP形成反応に反応基質のうちの1つを取り入れることによって達成できる。一実施形態においては、得られたMPが、反応混合物から精製される。
【００４４】
このように、一実施形態においては、最終生成物（例えば、モナチン）の合成が、3つの段階にて生じる。第1の段階において、合成経路のためのすべての成分が単一の混合物中に存在し、最終生成物（例えば、モナチン）の形成が可能にされる。第2の段階において、代謝産物（例えば、モナチンおよびモナチン合成経路における化学中間産物）のすべてまたは一部が、促進剤すなわち経路内の種々の反応を促進または触媒したペプチドまたは酵素などのより大きな巨大分子から分離され、あるいは他の方法でこれらの巨大分子の1つまたはすべての活性が妥協され、そのような1つまたはすべての促進剤の機能が妨げられる。第3の段階において、新たな促進剤または元の促進剤の一部（例えば、経路の酵素の一部）であって、合成経路のうちの特定の所望の反応のみを促進できる少なくとも1つの促進剤を含む促進剤が、代謝産物の混合物へと添加または再添加される。この新たな促進剤または促進剤の一部は、好ましくは、最終生成物（例えば、モナチンそのもの）の合成を促進する少なくとも1つの促進剤（例えば、酵素）を含んでいる。しかしながら、この新たな促進剤または促進剤の一部は、最終生成物（例えば、モナチン）の合成経路の少なくとも1つの先行の工程を促進する促進剤のうちの1つ以上を欠いている。このように、先行の促進剤の不在において、中間体として混合物中に存在していた炭素を利用して、そのような炭素を最終生成物（例えば、モナチン）へと変換できる新たな促進剤（例えば、経路における最終の酵素）を添加または再添加することで、経路の変換の全体としての収率が高められる。
【００４５】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、可逆の経路を利用するモナチン合成経路などの合成経路にとってきわめて有用である。そのような可逆の経路は、生成物の形成のために意図された炭素が、逆反応へと転用される空転サイクルを生じる可能性がある。したがって、可逆の反応が使用される場合、基質の生成物への変換を完了へと駆動するよりはむしろ、生成物の或る量が、基質へと再変換される可能性がある。
【００４６】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、通常であれば他の反応成分とともに廃棄され、あるいはリサイクルの試みにおいて分解される前駆体を、段階3において最終生成物（例えば、モナチン）へと変換することによって、このような炭素の損失を最小限にする。きわめて好ましい実施形態においては、最終生成物の中間前駆体の最終生成物への変換を触媒できる（例えば、モナチン前駆体をモナチンへと変換する）酵素が、段階3において添加される。
【００４７】
他の実施形態においては、経路の中間体のいずれかを最終生成物（例えば、モナチン）へと変換し、あるいは最終生成物（例えば、モナチン）へとつながるが元の経路を再生成することがない経路へと変換する酵素を、段階3において添加することができる。したがって、例えば、中間体Y1を経路内のブロックをバイパスする下流の中間体へと変換し、あるいは中間体を最終生成物へと（例えば、MPをモナチンへと）変換するが、Y1のY2への変換は許さない酵素を加えることができる。
【００４８】
最終の反応の最終生成物の合成の方向への駆動をさらに助けるために、最終の促進剤（最終の酵素など）を加えるときに、1つ以上の補基質または共同因子を加えることができる。また、同じ分類の別の酵素または別の分類の酵素など、1つ以上の促進剤（1つ以上の酵素など）を、所望のとおり段階1および／または段階3の各反応を促進、すなわち触媒するために使用することができる。同じ反応を促進する複数の促進剤（例えば、複数の酵素）を、別個に加えることができ、あるいは例えば所望の促進剤また酵素のすべてまたは一部を含む「ブレンド」（例えば、「酵素ブレンド」）またはセットとして、まとめて加えることができる。  本発明の経路において反応を促進する酵素などの促進剤は、反応混合物と共に溶液中にあってよい。溶液中の酵素などのタンパク質促進剤を、少なくとも反応混合物からの分離が所望される反応混合物中のタンパク質と同じ大きさの分子量を有する物質を保持する一方で、より小さな分子量の物質（とりわけ、経路における基質、生成物、および中間体）の通過を許容する膜を使用し、ろ過（とくには、限外ろ過）によって経路の混合物から容易に取り除くことができる。
【００４９】
また、タンパク質促進剤（例えば、溶液中の酵素）を、より低分子量の反応混合物中の基質、生成物、および中間体から、クロマトグラフィ、例えばカラム・クロマトグラフィ、例えばサイズ排除クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、または親和性クロマトグラフィ（そのようなタンパク質またはすべての促進剤を混合物から取り除くべく、親和剤が所望のとおりに酵素などの促進剤のうちの1つ以上に選択的に結合する）によって、容易に分離することも可能である。
【００５０】
あるいは、1つ以上の酵素などの1つ以上の促進剤を、所望のとおりに固体支持体へと結合させることができる。固体支持体上に備えられた促進剤を、経路混合物から、例えば固体支持体を混合物の残りの部分から分離することによって容易に取り除くことができる。例えば、実施例10、13、および16を参照されたい。
【００５１】
あるいは、1つ以上の酵素などの1つ以上の促進剤を、例えば促進剤（例えば、酵素）を保持する一方で基質、中間体および最終生成物などといった小さな分子量の分子ならびに他の反応成分の自由な流れを許す半透膜中に収容して、収容された方法でもたらすことが可能である。例えば膜によって収容された方法でもたらされる促進剤（例えば、酵素）を、経路混合物から、例えば膜を混合物の残りの部分から取り去ることによって容易に取り除くことができる。
【００５２】
一実施形態においては、段階3において欠落または大幅に抑制されるべき経路内の中間段階を触媒する促進剤（とくには、酵素）のみが、段階1において上述のような結合または収容された方法でもたらされる。
【００５３】
他の例では、段階3において欠落または大幅に抑制されるべき経路内の中間段階を触媒する促進剤（とくには、酵素）を、融合タンパク質としてもたらすことができる。融合タンパク質においては、融合パ−トナ−が、段階3における中間体Ynの最終生成物（例えば、モナチン）への変換の防止または大幅な抑制という結果を達成する方法で、融合タンパク質を除去、不活化、または抑制できるようにする特性を付与している。例えば、融合パ−トナ−が、融合パ−トナ−と融合パ−トナ−が親和性を示す物質との間の親和反応に依存する手順によって、融合タンパク質を除去する能力を付与することができる。
【００５４】
さらに、経路において、妥協されるべき1つ以上の反応を、そのような反応を促進する促進剤（例えば、酵素）を選択的に抑制することによって妥協することが可能である。抑制は、可逆または不可逆であってよい。好ましくは、抑制剤が、所望の反応条件において、抑制に関与する剤が存在する促進剤（または、酵素）のうちの1つ以上をやはり存在しうる他の促進剤（または、酵素）よりも優先して抑制するという意味で、選択的抑制剤である。さらに、抑制剤は、例えば特定の波長の光による抑制剤の劣化または不活化によって、あるいは例えば透析またはろ過（限外ろ過など）による抑制剤の除去などといった抑制剤の物理的な除去によって、反応混合物から除去することができる抑制剤であってよい。例えば、II型のアルドラ−ゼを、例えばEDTA（エチレンジアミン四酢酸）などの金属キレ−ト剤によって抑制することができる。
【００５５】
本発明の一実施形態の例では、生物学的変換の使用するモナチンの合成のための1つの経路が、少なくとも下記の3つの可逆の平衡反応を含む経路によって例示される。
【００５６】
【化２】
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【００５７】
式中、トリプトファン反応は、例えば出発の反応剤としてL−トリプトファンを使用することが望まれる場合に、さらなる酵素ラセマ−ゼを任意で含むことができるが、最終的には、R,Rモナチンを生成するためにD−トリプトファン（ラセマ−ゼを使用してL−トリプトファンから生成される）を使用することができる。
【００５８】
このようにして、反応1において、トリプトファンおよびピルビン酸が、可逆の反応で、酵素によってインド−ル−3−ピルビン酸（I−3−P）およびアラニンへと変換される。上記例示のとおり、酵素（ここでは、アミノトランスフェラ−ゼ）が、この反応を促進（触媒）するために使用される。反応（1）において、トリプトファンがアミノ基を（ピルビン酸）へと提供し、I−3−Pとなる。反応（1）において、アミノ基の受容体がピルビン酸であり、アミノトランスフェラ−ゼの作用の結果としてアラニンになる。反応（1）において好ましいアミノ基受容体が、ピルビン酸であり、反応（3）において好ましいアミノ基提供体が、アラニンである。反応（1）におけるインド−ル−3−ピルビン酸の形成を、アミノ基受容体として別のα−ケト酸（オキサロ酢酸およびα−ケト−グルタル酸など）を利用する酵素によって実行することも可能である。同様に、MPからのモナチンの形成（反応3）を、アミノ基提供体としてアラニン以外のアミノ酸を利用する酵素によって実行することが可能である。それらとして、これらに限られるわけではないが、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびトリプトファンが挙げられる。
【００５９】
反応（1）に関して有用な酵素のうちのいくつかは、反応（3）に関しても有用である。上記例示の反応においては、これらの反応（1）および（3）の両者について有用であるとして、アミノトランスフェラ−ゼが挙げられている。反応（2）、すなわちアルドラ−ゼの介在によってMPを形成するインド−ル−3−ピルビン酸の反応の平衡定数は、1未満であり、すなわちアルドラ−ゼ反応が、モナチンへのアルファ−ケト前駆体（すなわち、MP）を生成する付加反応よりもむしろ、インド−ル−3−ピルビン酸およびピルビン酸を生成する開裂反応を助ける。アミノトランスフェラ−ゼの介在によってインド−ル−3−ピルビン酸を形成するトリプトファンの反応（反応（1））およびアミノトランスフェラ−ゼの介在によってモナチンを形成するMPの反応（反応（3））の平衡定数は、それぞれほぼ1であると考えられる。したがって、生成されるモナチンの量を増し、モナチン生成の経済性を向上させるために、モナチンを形成するための反応に関して、1つ以上の生成物を除去すること、および／または基質の量を増やすことが、望ましいと考えられる。例えば、モナチンが形成されたときにモナチンを除去することで、アルドラ−ゼおよびアミノトランスフェラ−ゼ反応が平衡を達成した場合よりも多くのモナチンの形成が可能になり、さらには／あるいは反応（1）または反応（3）のための1つの基質の量を増すことで、反応（1）または反応（3）の第2の基質の変換を増すことができる。
【００６０】
いくつかの実施形態において、本発明は、平衡プロセスにおいて生成物濃度（または、力価）を、例えば平衡量の1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、または2倍まで向上させる新規な手法を提供する。いくつかの実施形態においては、これを、多段階経路の反応のうちの1つ以上を所望の方向に駆動することによって、達成することができる。いくつかの例では、反応が、より多くの生成物を蓄積する方向へと駆動され、別の例では、より多くの基質を蓄積する方向へと駆動される。本発明の一実施形態によれば、反応材料が、第1の混合物を形成すべく集められる。上記反応（1）において、これらの反応剤は、第1の反応について上記されたトリプトファン（L−トリプトファン、D−トリプトファン、またはこれらの組み合わせであってよい）、ピルビン酸、アミノトランスフェラ−ゼ、および例えばトリプトファンがL−トリプトファンである場合に任意でラセマ−ゼ（ただし、D−トリプトファンの使用が望ましい）、ならびに反応（2）について上記されたアルドラ−ゼを含む。反応（1）において形成されるアラニン（L−アラニン、D−アラニン、またはこれらの組み合わせであってよい）が、反応（2）において形成されるMPと反応し、反応（3）にてモナチンおよびピルビン酸を生み出すことができる。上記経路において、反応3を、第1の反応をもたらす同じアミノトランスフェラ−ゼによって触媒することができる。混合物を、平衡状態へと到達させることができ、この状態において、平衡量のモナチンが、第1の混合物に含まれた状態で形成される。この混合物からモナチンを取り去ることが可能であるが、この段階においてモナチンを単純に第1の混合物中に残すことができれば、より効率的であることができ、本来であれば利用可能な反応剤の喪失または無駄が少なくなる。本発明のこの実施形態によれば、第1の混合物のすべてまたは少なくとも一部が、滞留物（retentate）および透過物（permeate）を生成すべく限外ろ過される。限外ろ過のプロセスにおいてフィルタ−のしきい値分子量を適切に選択することで、第1の混合物の他の構成要素に比べて比較的分子量が大きい酵素、アミノトランスフェラ−ゼ、およびアルドラ−ゼは、フィルタ−を通過することができず、すなわちフィルタ−膜によって拒絶され、したがって滞留物中に残って滞留物を形成する。例えばトリプトファン、ピルビン酸、アラニン、MP、およびI−3−Pなどといった残りの構成成分は、フィルタ−を通過することができる分子量を有しており、透過物を形成する。
【００６１】
次いで、一実施形態においては、アミノトランスフェラ−ゼおよび任意でラセマ−ゼ（この場合には、アラニン・ラセマ−ゼ）が、アラニンの量が増えている限外ろ過の透過物へと加えられ、第2の混合物が生成される。例えば、D−トリプトファンが出発材料である場合、および過剰量のD−アラニン（L−アラニンとL−アラニンのD−アラニンへの変換を促進するアラニン・ラセマ−ゼとを添加することによって得ることができる）が望まれる場合、アラニン・ラセマ−ゼを使用することが望ましい可能性がある。アラニンは、過剰であるように添加されるべきであり、あるいは少なくとも制限的でないように添加されるべきである。好ましくは、アラニンが、少なくともトランスフェラ−ゼが所望の条件のもとで最大速度（Vmax）またはその付近で作用できる濃度とされる。酵素のKmを、アラニン濃度が酵素を飽和させていることを保証するために必要なアラニンの濃度を評価するために、使用することができる。この実施形態においては、酵素であるアミノトランスフェラ−ゼが、反応（1）および反応（3）を触媒する。しかしながら、アルドラ−ゼまたは同等の促進剤が存在しない場合、反応（2）が感知可能な速度で生じることが不可能であり、あるいは少なくとも反応の速度が低下する。さらに、過剰量のアラニンは、反応（3）をより多くのモナチンを生成する好ましい方向に駆動する。さらに、アラニンの濃度が高くなることで、反応（1）が、トリプトファンおよびピルビン酸を生成する逆方向に駆動される。これは、一部には、I−3−Pがきわめて不安定な反応剤であって、分解して不利な反応生成物となる可能性があるため、有用である。MPも、混合物において比較的不安定な構成要素である。正味の結果は、反応（3）がモナチンの生成に向かって正方向に駆動されること、反応（1）が最初の反応剤であるトリプトファンの生成へと逆方向に駆動されること、および反応（2）が選択的に抑制される（そうでない場合、全体の反応手順が逆方向に進行できてしまい、不都合にもMPがI−3−Pおよびピルビン酸へと変換されかねない）ことである。次いで、モナチンを、精製プロセスによって第2の混合物から取り出すことができる。
【００６２】
さらなる好ましい手順においては、アミノトランスフェラ−ゼおよびアルドラ−ゼ酵素を含んでいる滞留物を、第1の混合物へとリサイクルすることができ、あるいは「新しい」第1の混合物の反応が行われる容器または行われている容器へとリサイクルすることができる。これにより、全体としてのプロセスの効率が向上し、所与のモナチン産出量あたりのこれらの酵素の使用量が少なくなる。
【００６３】
さらなる好ましい手順においては、第2の混合物からモナチンを取り出すための精製プロセスが、他のアミノ酸の生成のために開発された方法を利用する。モナチンは、構造的および化学的にグルタミン酸に類似しているため、発酵もろみ液からアミノ酸（グルタミン酸）を精製するための技術分野において既知の方法を、使用することが可能である。複雑な生物学的媒体からのモナチンの単離が、WO  2003／091396の実施例6に記載されている。この実施例においては、2つのイオン交換クロマトグラフィ工程が利用されている。第1に、Bio−Rad社から入手できるAG50WX−8樹脂（H型）など、低pHでの強力なカチオン交換クロマトグラフィが、アミノ酸を有機酸から分離している。モナチンなどのアミノ酸化合物のアミノ基の構成員が、樹脂へと導入されて樹脂へと結合する。混入している有機酸は、低いpHにおいて樹脂へと結合せずに樹脂を通って流れる。次いで、カチオン交換樹脂から溶出した後のアミノ酸を、中性のpHにおいて例えばDEAE樹脂などのアニオン交換クロマトグラフィを使用して、互いに分離（トリプトファン、アラニン、およびモナチンの分離など）することができる。モナチンの除去後に残る構成要素を、第1の混合物および第2の混合物へとリサイクルすることができる。それらは、例えば、第1の混合物へのトリプトファン、ピルビン酸、ならびに少量のMPおよびI−3−Pを含み、第2の混合物へのアラニンを含む。少量とは、反応（3）が順方向に駆動され、反応（1）が逆方向に駆動されている状況を指す。これらの反応剤のリサイクルは、全体としてのプロセスの効率をさらに改善する。これは、反応混合物からのモナチンの精製または除去が典型的には酸性条件で行われることに注目するとき、より明らかである。MPおよびI−3−Pは、酸性の環境において分解する。したがって、この実施形態において、モナチンが、限外ろ過および第2の混合物の形成を行うことなく第1の反応混合物から除去される場合、これらの反応剤の少なくとも一部が失われ、モナチン生成の効率が低下し、反応副生物の形成ゆえに精製の困難が生じる。
【００６４】
これらの利益を、本発明のプロセスによって実現することができる。所与の量の原材料当たりのモナチンの産出量が増加し、反応剤のリサイクルがプロセスの効率を向上させ、不安定であって望ましくない反応副生物を生じさせかねない反応剤（例えば、α−カルボニル・カルボン酸）が、不都合な分解に先立って除去またはリサイクルされる。しかしながら、本発明のすべての実施形態が、上記の利益のすべてを含む必要はない。いくつかの実施形態は、本明細書に記載の利益を含まないかもしれず、一部の実施形態が、本明細書に記載の利益のうちの1つ以上を含み得る。
【００６５】
本発明の一実施形態によれば、トリプトファンからのインド−ル−3−ピルビン酸の生成、インド−ル−3−ピルビン酸からの2−ヒドロキシ2−（インド−ル−3イルメチル）−4−ケトグルタル酸（「モナチン前駆体」または「MP」）の生成、およびMPからのモナチンの生成を含んでいるモナチン生成のためのプロセスが提供される。例えば、L−トリプトファン（S−トリプトファンとも呼ばれる）が基質である場合、インド−ル−3−ピルビン酸を生成するための反応を、S−アミノ酸の基質選択性を有する酵素によって促進することができる。モナチンの2Sアイソマ−が望まれる場合には、MPのS−アイソマ−を形成するためのインド−ル−3−ピルビン酸のピルビン酸との反応を、S−選択アルドラ−ゼ活性を有する酵素によって促進することができる。同様に、モナチンの4Sアイソマ−が望まれる場合には、モナチンを生成するためのMPの反応を、L−アミノ酸基質について選択性を有する酵素によって促進することができる。同様に、他の異性体生成物を、異なる基質選択性を有する酵素を使用して、区別して生成することができる。例えば、いくつかの場合には、モナチンの2Rまたは4Rアイソマ−が好ましい生成物であり、R−基質について基質立体選択性を有する酵素を使用することで、好ましい生成物の形成を促進することができる。用語「立体選択性」は、酵素が、1つの立体異性体について、より高い選択性またはより大きな活性あるいは両方を有することを意味する。1つの立体異性体について他の立体異性体に比べて限られた活性を有する立体選択性酵素を使用することができる。「限られた」活性は、例えば実験によって判断されたときに最小限または知覚できない活性を意味する。
【００６６】
これまでの段落で述べた反応などの一連の反応に関して、本発明は、各段階を積極的に実行することを必要とせず、各段階を間接的に実行することができれば充分である。換言すると、例えば、トリプトファンからのインド−ル−3−ピルビン酸の生成、インド−ル−3−ピルビン酸からの2−ヒドロキシ2−（インド−ル−3イルメチル）−4−ケトグルタル酸（「モナチン前駆体」または「MP」）の生成、およびMPからのモナチンの生成を含んでおり、各反応が適切な酵素によって促進されるモナチン生成のためのプロセスを、トリプトファンを酵素に組み合わせ、上記の反応が生じることができるように条件を設定することによって、実行することができる。そのような場合、トリプトファンがインド−ル−3−ピルビン酸を生成すべく反応でき、トリプトファンの反応から生成されたインド−ル−3−ピルビン酸が、MPを形成すべく反応でき、インド−ル−3−ピルビン酸の反応から生成されたMPが、モナチンを形成すべく反応することができる。また、プロセスを、例えば、トリプトファンを生成できる化合物を、トリプトファンの生成が生じるために適した条件のもとで供給し、この化合物を上述の一連の反応を促進できる酵素に、そのような反応が生じるために適していると考えられる条件のもとで組み合わせることによって、実行することも可能である。例えば、大量のL−トリプトファン（または、D−トリプトファン）を天然に生成する微生物を、トリプトファンの供給源として用意することが可能である。例えば、D−トリプトファンを、L−トリプトファンと、幅広い特異性のアミノ酸ラセマ−ゼ活性またはトリプトファン・ラセマ−ゼ活性を有する酵素と、L−トリプトファンのD−トリプトファンへの変換が生じるために好適であると考えられる条件と、を用意することによって、供給することが可能である。
【００６７】
特定の実施形態においては、特定の置換（permutation）を、モナチン（例えば、R,Rモナチン）の生成をより経済的にするように設計することができる。例えば、D−トリプトファンあるいはLおよびD−トリプトファンの組み合わせと対照的に、L−トリプトファンが、出発材料として機能することができる。トリプトファンの特定の形態の選択は、モナチン組成物中の最終的なモナチン化合物のキラル性に影響しない（トリプトファンの反応によって、キラル性を持たないインド−ル−3−ピルビン酸が形成されるため）が、少なくともL−トリプトファンがD−トリプトファンよりも現時点においては安価であってより容易に入手できるため、出発材料としてL−トリプトファンを使用することが好まれる場合がありうる。
【００６８】
他の実施形態において、本発明は、L−トリプトファンからのD−トリプトファンの生成、D−トリプトファンからのインド−ル−3−ピルビン酸の生成、インド−ル−3−ピルビン酸からのR−MPの生成、およびR−MPからのR,R−モナチンの生成を含んでいるモナチン生成のためのプロセスを提供する。L−トリプトファンからのD−トリプトファンの生成を、トリプトファン・ラセマ−ゼおよびその機能的同等物によって促進することができる。同様に、インド−ル−3−ピルビン酸を形成するためのD−トリプトファンの反応、およびモナチンを形成するためのMPの反応を、この同じ酵素によって促進することができる。インド−ル−3−ピルビン酸の反応を、R−特異のアルドラ−ゼ活性を有する酵素によって促進でき、結果としてR−MPが形成される。インド−ル−3−ピルビン酸を形成するためのD−トリプトファンの反応、およびR,R−モナチンを形成するためのR−MPの反応を、この同じ酵素によって促進することができる。
【００６９】
いくつかの実施形態においては、本発明に従い、L−トリプトファンからのインド−ル−3−ピルビン酸の生成、インド−ル−3−ピルビン酸からの2−ヒドロキシ2−（インド−ル−3イルメチル）−4−ケトグルタル酸（「モナチン前駆体」または「MP」）の生成、およびMPからのモナチンの生成を含んでいるモナチン生成のためのプロセスが提供される。インド−ル−3−ピルビン酸を生成するためのL−トリプトファンの反応が、R−MPまたはR,R−モナチンあるいは両者よりも、基質としてのL−トリプトファンについてより大きな特異性またはより大きな活性あるいは両方を有する酵素によって促進される。MPまたはモナチンについてよりも、基質としてのL−トリプトファンについてより大きな活性および／またはより大きな特異性を有する酵素の例として、これらに限られるわけではないが、L−トリプトファン・アミノトランスフェラ−ゼ、L−芳香族アミノトランスフェラ−ゼ、L−アスパラギン酸アミノトランスフェラ−ゼ、およびL−アミノ酸オキシダ−ゼが挙げられる。特定の実施形態によれば、インド−ル−3−ピルビン酸の反応が、R−特異のアルドラ−ゼ活性を有する酵素によって促進され、結果としてR−MPが生成される。いくつかの実施形態によれば、D−アミノ酸に特異なアミノトランスフェラ−ゼ（D−アミノトランスフェラ−ゼと呼ばれる）も、インド−ル−3−ピルビン酸についてよりも、基質としてのR−MPについて、より大きな特異性またはより大きな活性あるいは両方を有する。他の特定の実施形態においては、D−アミノトランスフェラ−ゼが、基質としてのインド−ル−3−ピルビン酸について限られた活性を有する。
【００７０】
特定の実施形態によれば、或る異性体から別の異性体へのL−トリプトファンのアミノ基転移反応の副生物として形成される（あるいは、トリプトファン反応の副生物である別のアミノ酸から形成される）アミノ酸のエピ化を促進することができるラセマ−ゼ酵素を供給することができる。そのような酵素の例として、これらに限られるわけではないが、L−グルタミン酸のD−グルタミン酸への変換を促進できるグルタミン酸ラセマ−ゼ（EC  5.1.1.3）または機能的同等物、L−アスパラギン酸をD−アスパラギン酸へと変換するアスパラギン酸ラセマ−ゼ（EC  5.1.1.13）または機能的同等物、あるいはL−アラニンをD−アラニンへと変換するアラニン・ラセマ−ゼ（EC  5.1.1.1）または機能的同等物が挙げられる。
【００７１】
本発明による他の実施形態においては、モナチンを生成するためのプロセスであって、L−トリプトファンがインド−ル−3−ピルビン酸へと変換されるときにα−ケト酸基質がL−アミノ酸を形成し、インド−ル−3−ピルビン酸がMP（R−MPおよびL−MPの両方を含むことができるが、このましくはR−MPだけを含み、あるいは専らR−MPを含む）を形成すべく反応し、R−MPがR,R−モナチンへと変換されるときにL−アミノ酸がα−ケト酸基質を再生（「リサイクル」とも称される）すべく反応するプロセスが提供される。R,R−モナチンを形成するためのR−MPおよびL−アミノ酸の反応は、立体反転（stereoinverting）のアミノトランスフェラ−ゼによって促進される。この方法で、L−トリプトファン・アミノトランスフェラ−ゼ反応のL−アミノ酸生成物を、MPのモナチンへのアミノ基転移のための基質として使用することができ、MP−モナチン反応へと結び付けられた反応の生成物（すなわち、オキサロ酢酸、ピルビン酸、および／またはα−KG）を、L−トリプトファンからインド−ル−3−ピルビン酸への反応に結び付けられた反応のための出発材料として使用することができる。使用可能な立体反転アミノトランスフェラ−ゼの例として、これらに限られるわけではないが、D−フェニルグリシン・アミノトランスフェラ−ゼ（EC  2.6.1.72、D−4−ヒドロキシフェニルグリシン・アミノトランスフェラ−ゼとしても知られる）、D−メチオニン・アミノトランスフェラ−ゼ（EC  2.6.1.  41、D−met−アミノトランスフェラ−ゼおよびD−メチオニン−ピルビン酸・アミノトランスフェラ−ゼとしても知られる）、およびこれらの同族体から導出される変種が挙げられる。
【００７２】
さらなる実施形態を、その全体が参照として本明細書に組み込まれる2007年3月6日付の米国特許出願第11／714,279号に見出すことができる（例えば、図1および3を参照）。特定の実施形態においては、モナチンを生成するための全体としての経路が、インド−ル−3−ピルビン酸を形成するためのトリプトファンの反応、MPを生成するためのインド−ル−3−ピルビン酸の反応、およびR,Rモナチンを含むモナチンを生成するためのMPの反応を含むことができる。しかしながら、当業者に明らかであるとおり、本明細書の開示の全体的な範囲から外れることなく、この経路に対して様々な置換を行うことが可能である。
【００７３】
そのような1つの実施形態においては、モナチンのR,R形の生成をモナチンのS,S、R,S、およびS,R形と引き換えにして増加させるため、経路に対して置換を行うことができる。詳しくは、L−トリプトファン反応において利用されるアミノトランスフェラ−ゼ酵素が、この反応について、MPおよび4Sモナチンの反応に比べてより大きな活性および／または特異性を有し、あるいはオキシダ−ゼが、L−トリプトファンについて、4Rモナチンについてよりも大きな活性および／または特異性を有し、インド−ル−3−ピルビン酸の反応を促進する酵素が、R−特異アルドラ−ゼであり、MPの反応を促進する酵素が、広い特異性のD−酵素であり、好ましくはMPのRアイソマ−においてより効率的に機能するように発展している。次いで、特定の場合には、インド−ル−3−ピルビン酸を、L−トリプトファンから直接にではなく、間接的に生成することができる。より具体的には、L−トリプトファンがD−トリプトファンへと変換され、次いでD−トリプトファンがインド−ル−3−ピルビン酸へと変換される。
【００７４】
特定の実施形態においては、L−トリプトファンが、トリプトファン・ラセマ−ゼを使用してD−トリプトファンへと変換される。次いで、D−トリプトファンが、広い特異性のD−アミノトランスフェラ−ゼを介してピルビン酸と反応し、インド−ル−3−ピルビン酸およびD−アラニンが生成される。次いで、インド−ル−3−ピルビン酸がR−特異のアルドラ−ゼおよびピルビン酸と反応し、R−α−ケト酸モナチン（R−MP）が形成される。次いで、R−MPが広い特異性のD−アミノトランスフェラ−ゼおよびD−アラニンと反応し、R,Rモナチンおよびピルビン酸が生成される。L−トリプトファンのD−トリプトファンへの変換を、トリプトファン・ラセマ−ゼまたはその機能的同等物によって促進することができる。トリプトファン・ラセマ−ゼ活性を有する酵素の典型的な種類として、シュ−ドモナス（Pseudomonas）およびアエロモナス（Aeromonas）属からの広活性ラセマ−ゼ（Broad  Activity  Racemases）が挙げられる（Kino,  K.ら,  AppliedMicrobiology  and  Biotechnology  (2007),  73(6),  1299−1305;  Inagaki,  K.ら,  Agricultural  and  Biological  Chemistry  (1987),  51(1),  173−80）。ラセマ−ゼ、アルドラ−ゼ、およびアミノトランスフェラ−ゼのさらなる例については、例えば2007年3月6日付の米国特許出願第11／714,279号を参照されたい。
【００７５】
上述の経路は、R,Rモナチンが所望の生成物である場合にも、インド−ル−3−ピルビン酸を生成する反応において生成物としてのモナチンを生成する反応と同じ酵素を使用することができるなど、いくつかの利益を有することができる。例えば、いくつかの場合に、L−アミノトランスフェラ−ゼ（または、適切なL−酵素）が、インド−ル−3−ピルビン酸を生成する反応を促進できるが、D−アミノトランスフェラ−ゼは、モナチンを生成する反応を促進する。対照的に、インド−ル−3−ピルビン酸を生成する反応を促進する特定のD−アミノトランスフェラ−ゼは、モナチンを生成する反応も促進できる。結果として、広い特異性のD−アミノトランスフェラ−ゼは、インド−ル−3−ピルビン酸を形成する反応においてモナチンを形成する反応と同じ酵素を使用することが望まれる場合に、好ましいと考えられる。特定の場合に、R−MPに比べてインド−ル−3−ピルビン酸に限られた活性および／または特異性を有するD−アミノトランスフェラ−ゼが選択される場合に、モナチンの生成をさらに効率的にすることができる。
【００７６】
上記経路のさらなる利益は、インド−ル−3−ピルビン酸を生成する反応に結び付けられた反応のアミノ酸生成物を、モナチンを生成する反応に結び付けられた反応において基質として使用できる点にある。例えば、L−トリプトファンがインド−ル−3−ピルビン酸を生成すべく反応すると同時に、オキサロ酢酸、α−ケトグルタル酸、および／またはピルビン酸が、L−アミノ酸を生成すべく反応し、モナチンを形成するためのR−MPの反応が、基質としてD−アミノ酸を利用する反応に組み合わせられる場合、インド−ル−3−ピルビン酸を形成する反応のL−アミノ酸が、上述の条件のもとでは、R−MP反応に結び付けられた反応において使用するためにリサイクルされることがない。対照的に、インド−ル−3−ピルビン酸を形成するためのD−トリプトファンの反応が、D−アミノ酸生成物を形成する反応に結び付けられる場合、D−アミノ酸を、R−MP反応に結び付けられた反応において使用するためにリサイクルすることができる。これにより、第1の段階において化学量論でない量のアミノ受容体を使用することができ、第3の段階のために必要なアミノ提供体が、第1の段階において生成される。特定の実施形態においては、D−アミノ酸が、D−アラニンである。
【００７７】
当業者であれば、本明細書の開示から、種々の経路においてR,Rモナチンの収量を向上させるために本発明をどのように実施できるのかを、理解できるであろう。例えば、本明細書の開示から、本発明の実施形態が、R,Rモナチンの生成に適用されるとおり、反応剤および促進剤からなる第1の混合物をR,Rモナチンの生成を可能にする適切な条件下で供給すること；ならびに第1の反応が例えば平衡に達するまで所望の時間にわたって進んだ後で、少なくともモナチンを直接的に生成する経路内の段階（通常は、経路の最終段階）と競合する反応を促進する酵素を除去し、あるいは少なくとも不安定な中間体の濃度の減少をもたらす反応を乱す方法で酵素を除去し、あるいはすべての酵素を除去すること；を含んでおり、その後に経路のモナチン生成段階（通常は、経路の最終段階）において機能する少なくとも1つの酵素を追加し、さらに任意で他の成分（この成分の濃度が高くなることが、モナチン生成段階の平衡をモナチンの生成に向かって移動させるうえで役に立つ成分）を追加して、モナチンまたはR,Rモナチンの生成を増加させること；を含んでいることを、当業者であれば理解できるであろう。例えば、実施例9および14を参照されたい。
【００７８】
そのような1つの実施形態においては、L−トリプトファンが、トリプトファン・ラセマ−ゼを使用してD−トリプトファンへと変換される。次いで、D−トリプトファンが、広い特異性のD−アミノトランスフェラ−ゼを介してピルビン酸と反応し、インド−ル−3−ピルビン酸およびD−アラニンが生成される。次いで、インド−ル−3−ピルビン酸がR−特異のアルドラ−ゼおよびピルビン酸と反応し、R−α−ケト酸モナチン（R−MP）が形成される。次いで、R−MPが広い特異性のD−アミノトランスフェラ−ゼおよびD−アラニンと反応し、R,Rモナチンおよびピルビン酸が生成される。R,Rモナチンの生成を増すために、R,Rモナチンの生成と競合する反応を抑制し、あるいは減速させるために、酵素のうちの1つ以上（例えば、R−特異のアルドラ−ゼ）が反応から除去される。特定の実施形態においては、残りの反応混合物に、モナチンの生成を担当する酵素（例えば、D−アミノトランスフェラ−ゼ）が補われ、特定の場合には、アミノ提供体（例えば、D−アラニン）も追加される。
【００７９】
本発明によるプロセスフロ−図が図1に示されており、本発明による典型的なシステムのブロック図が図2に示されている。図2は、モナチン生成のための経路を示しているが、経路を実行するためのいかなる方法またはシステムへの限定も意図していない。例えば、生体外で実行される場合、経路のいずれの反応も、生きている全細胞の内部で行われることはない。あるいは、これらの方法を、生体外および生体内の方法の組み合わせを利用して実行することも可能である。例えば、反応（1）においてトリプトファンの脱アミノ化によって生成されるアミノ酸を、MPからモナチンを生成するために反応（3）において利用することができ、したがって、実行者が積極的に供給する必要がない。さらに、実務において、経路が将来的に進行できるために充分な成分または成分の供給源ならびに反応条件が用意され、あるいは存在するのであれば、実行者が上記成分（例えば、反応剤および酵素）のそれぞれを積極的に供給する必要はない。例えば、L−トリプトファンを出発材料として使用する経路の実施は、L−トリプトファンが供給される実施形態だけでなく、L−トリプトファンを生成できる化合物が、そのような化合物からのL−トリプトファンの生成が生じるために適した条件下で、そのような化合物をL−トリプトファンへと変換するための反応または一連の反応を促進できる酵素と組み合わて供給される実施形態も含むと考えられる。したがって、例えば、上記反応（1）、（2）、および（3）によって代表される実施形態において、反応混合物は、3つの反応の反応剤および生成物のみを積極的に含む必要はない。1つのピルビン酸分子の第2のピルビン酸分子とのアルドラ−ゼ触媒による付加など、二次反応および／または副生物がさらに存在してもよい（4−ヒドロキシ−4−メチル−2−オキソグルタル酸、または「HMO」）。HMOは、アミノ基転移反応を受けて4−ヒドロキシ−4−メチルグルタミン酸（「HMG」）を生成することもできる。HMGを、あるいはモナチンを生成するための反応に利用できるであろうピルビン酸およびアミノ基のさらなる喪失を防止するために、反応混合物1へとリサイクルすることができる。
【００８０】
ここで図1を参照すると、ブロック1に示されているとおり、少なくとも1つの反応剤および少なくとも1つの酵素が、第1の反応容器へと加えられる。図2を、図1に概説されるプロセスを実行するための典型的なシステムとして参照することができる。図2に典型的に示されているとおり、アミノトランスフェラ−ゼ酵素が、サブシステム10において生成および精製され、あるいは他の方法で供給される。アルドラ−ゼ酵素が、サブシステム12において生成および精製され、あるいは他の方法で供給される。これらの触媒を、導管16、18によって第1の反応容器14へと運ぶことができる。別の実施形態においては、必要な酵素を、ただ1つの供給源から導入でき、ただ1つの導管によって第1の反応容器へと送ることができる。起点材料としてのL−トリプトファン（あるいは、D−トリプトファンまたはL−およびD−トリプトファンの混合物）を、トリプトファン供給源20から導管22を通って第1の反応容器14へと運ぶことができ、起点材料としてのピルビン酸を、ピルビン酸供給源24から導管26を通って第1の反応容器14へと運ぶことができる。所望であれば、起点材料としてのL−アラニン（あるいは、D−アラニンまたはL−およびD−アラニンの混合物）を、L−アラニン供給源46から導管59を通って第1の反応容器14へと運ぶことができる。他の導管28、30を、さらなる反応剤または組成物を第1の反応容器14へと運ぶために利用することができる。図1のブロック2に示されているとおり、少なくとも1つの反応剤および少なくとも1つの酵素が、第1の反応混合物を形成すべく反応する。
【００８１】
図1のブロック3に示されるとおり、第1の反応混合物中に存在する少なくとも1つの酵素が、所定の時間の後に不活化される。酵素の不活化は、酵素の抑制または第1の反応混合物からの酵素の除去／分離を含むことができる。図2が、酵素が限外ろ過によって第1の反応混合物から分離される典型的なシステムを示している。この実施形態においては限外ろ過が使用されているが、例えば固定化された酵素など、当業者に公知の他の分離システムおよびプロセスも、酵素を第1の反応混合物から除去／分離するために利用することが可能である。第1の反応容器14が、導管34を介して限外ろ過システム32へと接続されている。平衡反応（1）、（2）、および（3）の構成要素を含んでいる第1の反応混合物を、所望の時点で、導管34を介して限外ろ過システム32へと運ぶことができる。限外ろ過システムが、第1の反応混合物を、より大きな分子量の酵素アミノトランスフェラ−ゼおよびアルドラ−ゼを含む滞留物と、第1の反応混合物の残りの構成要素を含む透過物とに分離する。酵素を、直接的または間接的に、導管36を介して第1の反応容器へとリサイクルすることができる。酵素を、例えば、互いに分離してリサイクルすることができ、あるいは他の方法で適切な量にて別個に使用することができる。透過物を、導管38を通って第2の反応容器40へと運ぶことができる。
【００８２】
ブロック4に示されているとおり、少なくとも1つの酵素の不活化の後に、この不活化混合物が、第2の反応容器へと送られる。ブロック5および6に示されるとおり、追加の酵素も第2の反応容器へと加えられ、構成要素が反応して、第2の反応混合物が形成される。図2に例示されているように、透過物として第2の反応容器40へと運ばれる構成要素は、トリプトファン、ピルビン酸、アラニン、MP、I−3−P、およびモナチンを含んでいる。入り口導管42、44が、追加の試薬または試薬量を第2の反応容器40へと運ぶ。これらの追加の試薬は、例えば、入り口導管42へと接続されたアラニン供給源46からのアラニン、ならびに入り口導管44へと接続されたアミノトランスフェラ−ゼ供給源48からのアミノトランスフェラ−ゼまたは他の酵素を含むことができる。第2の反応容器40内に存在する反応剤が、第2の反応混合物を形成し、平衡反応（1）および（3）に関与する反応剤であるが、アルドラ−ゼ酵素が存在していないため平衡反応（2）には関与しない。第2の反応混合物は、第1の反応混合物中のモナチン濃度に比べ、モナチンが濃縮されている。
【００８３】
次いで、第2の反応混合物が、ブロック7に示されているとおり、所望の生成物であるモナチンを取り出すために精製される。図2に例示されているとおり、第2の反応混合物を、導管50を通ってモナチン精製サブシステム52へと運ぶことができる。他の構成要素が、精製システムにおいて反応精製混合物を形成するために、例えば導管57を介して精製システムへと加えられる。モナチン精製サブシステムは広く知られており、典型的には酸性環境で動作する。1つの典型的なシステムは、カチオン交換クロマトグラフィを備えている。モナチンを、導管54によって精製システム52から取り出すことができる。他の構成要素の中でも、とりわけアラニンを、導管56を通って取り出すことができる。導管56を、アラニンをアラニン供給源46および第2の反応容器40へと（あるいは、導管58を通って第1の反応容器14へと）リサイクルするために使用することができる。トリプトファンおよびピルビン酸などの他の構成要素を、第1の反応容器14へとリサイクルすることができる。トリプトファンを、導管60を通ってトリプトファン供給源20へと運ぶことができ、ピルビン酸を、導管62を通ってピルビン酸供給源24へと運ぶことができる。
【００８４】
図2の反応精製混合物52に示されているような種々の精製方法の例は、図3〜7に見出すことができる。これらの図は、限外ろ過、カチオン交換クロマトグラフィ、アニオン交換クロマトグラフィ、非極性合成吸着剤クロマトグラフィ、および脱塩などといった種々の手順を示している。いくつかの限外ろ過の実施形態においては、膜が、約10kda、20kda、30kda、または50kdaの有効しきい値を有することができる。いくつかの実施形態においては、膜材料が、再生セルロ−ス、ポリスルホン・エ−テル、セラミック、ステンレス鋼、または他の任意の適切な材料からであってよい。いくつかのカチオン交換クロマトグラフィの実施形態においては、カチオン交換カラムが、スルホン酸で官能化され、約2〜12％からの架橋を含んでいるスチレン・ジビニルベンゼン・コポリマ−を有するH+型の強酸カチオン交換樹脂である。いくつかの実施形態においては、溶出が、KOH、NaOH、NH4OH、またはこれらの組み合わせの溶液などの苛性溶液によって行われ、その後にHCl、炭酸、硫酸、硝酸、ギ酸、クエン酸、または酢酸などの酸によって中和される。いくつかのアニオン交換クロマトグラフィの実施形態においては、アニオン交換カラムが、水酸化物、酢酸塩、または炭酸塩の形態での非特定の結合を最小限にするために、例えばポリメタクリル酸ポリマ−からなる強アニオン交換樹脂である。いくつかの実施形態においては、溶出が、水酸化カリウム、重炭酸アンモニウム、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、酢酸アンモニウム、水酸化アンモニウム、またはこれらの組み合わせによって行われ、その後に例えばHCl、炭酸、硫酸、硝酸、ギ酸、クエン酸、または酢酸などの酸によって中和される。いくつかの実施形態においては、非極性合成吸着剤樹脂が、少なくとも600m2／gまたは1000m2／g以上の比表面積、ならびに約150オングストロ−ム以下の孔半径を有するスチレン・ジビニルベンゼン・コポリマ−である。いくつかの実施形態においては、カラムが、水または15%（v／v）以下の濃度の水性エタノ−ルで洗浄される。いくつかの実施形態においては、脱塩が、塩が重炭酸アンモニウムなどの場合のように揮発性である場合に、蒸発を含むことができ、あるいは脱塩を、合成非極性吸着剤カラムに通すことによって行うことができる。図3を参照すると、反応混合物2が、限外ろ過システム（例えば、実施例17を参照）に通され、酵素を含んでいる滞留物と、基質、中間体、および生成物、ならびに第1の反応混合物の他の小さな分子を含んでいる透過物とが得られる。次いで、限外ろ過の透過物が、カチオン交換カラムに通される。ピルビン酸が分離され、第1の反応混合物へとリサイクルされる。カチオン交換の後で、混合物は脱塩され、アニオン交換カラムに通される（例えば、実施例18を参照）。アニオン交換カラムは、所望の生成物であるモナチンを、反応剤であるトリプトファンおよびアラニンから分離することができる。生成物モナチンは、SDVB樹脂を使用してさらに精製される（例えば、実施例20を参照）。反応剤であるトリプトファンおよびアラニンも、SDVB樹脂によって精製され、それぞれ反応混合物1または2へとリサイクルされる。
【００８５】
図4を参照すると、反応精製混合物を、図3に示したそれの変形にて精製することができる。図3と同様、反応混合物2が、最初に限外ろ過によって精製されるが、この場合には、透過物が、膜が小さな化合物を大きな化合物から分離するように設計されている特別膜生成工程（NP）（例えば、実施例19を参照）を使用して、最初に精製される。NPは、トリプトファンおよび所望の生成物であるモナチンを、反応混合物から分離することができる。モナチンおよびトリプトファンは、SDVB樹脂を使用して互いに分離される。NP分離の残りの成分は、電気透析によってさらに精製される（例えば、実施例21を参照）。このプロセスは、ピルビン酸およびアラニンのそれぞれを、リサイクルならびに反応混合物1および2におけるさらなる使用のために精製および分離する。
【００８６】
図5は、別の精製方法を示している。上述の例と同様、反応混合物2の精製の最初の段階は、限外ろ過である。限外ろ過に続いて、ピルビン酸が、アミノ酸を有機酸から分離することができるカチオン交換クロマトグラフィによって、透過物から除去される。次いで、この反応剤を、反応混合物1へとリサイクルすることができる。カチオン交換後の残りの反応混合物は、アラニンを反応混合物から分離すべく、NP膜によって処理される。次いで、上述のように、アラニンを反応混合物2へとリサイクルすることができる。残りの反応混合物が、トリプトファンおよび所望の生成物であるモナチンを分離および精製するために、SDVB樹脂によって処理される。
【００８７】
反応混合物2の精製の別の例を、図6に見ることができる。反応混合物2の最初の限外ろ過に続いて、やはりピルビン酸がカチオン交換クロマトグラフィを使用して除去され、反応混合物1へとリサイクルされる。カチオン交換の後で、残りの反応混合物が、アラニンおよびトリプトファン（リサイクルのため）ならびに所望の生成物であるモナチンを分離および精製するために、SDVB樹脂によって処理される。樹脂の負荷容量に応じて、プロセス（この図などに例示されているとおり）が、2つ以上のSDVB樹脂および／または2つ以上のSDVB樹脂処理工程を必要とする可能性があることを、当業者であれば理解できるであろう。アラニンのモナチンからの分離の例が、実施例20に示されている。
【００８８】
さらなる例において、図7が、反応混合物2の精製の別の置換を詳述している。限外ろ過に続いて、カチオン交換が、3つの部分を分離すべくステップ勾配バッファ溶出とともに使用される（例えば、実施例22を参照）。1つの部分、すなわちピルビン酸は、水洗浄に除去される。別の部分、すなわちアラニンおよびトリプトファンは、上述のとおり、反応混合物1および2へのリサイクルに先立って、SDVB樹脂によって除去され、さらに処理される。最後の部分も、反応混合物の塩および所望の生成物であるモナチンの両者を分離するために、SDVB樹脂によってさらに処理される。
【００８９】
反応混合物2の精製の別の例は、アニオン交換クロマトグラフィを使用し、次いで脱塩カラムを使用することである。反応混合物2の初期の限外ろ過に続いて、アニオン交換クロマトグラフィが、アラニンおよびトリプトファンが結合せず、したがって反応混合物1へとリサイクルできる条件のもとで実行される。結合した元の反応混合物1の有機酸およびモナチンを、勾配を使用して選択的に溶出させることが可能である。モナチンを、上述のとおりSDVB樹脂を使用して脱塩することができる。
【００９０】
図2に示されているようなブロック図を、酵素および基質を本発明の別の実施形態において有用な任意の酵素または酵素の組み合わせ、あるいは基質または基質の組み合わせで置き換えるように、必要に応じて変更することができる。例えば、サブシステム10によって供給される例示のトランスフェラ−ゼ酵素およびサブシステム12によって供給される例示のアルドラ−ゼ酵素を、合成経路の1つ以上の反応を促進するために有用な任意の酵素または組み合わせによって置き換えることができる。同様の方法で、L−トリプトファン供給源20およびピルビン酸供給源24が、サブシステム10および／または12に用意される酵素にとって適切な基質を供給することができる。例えば、「L−トリプトファン」は、「D−トリプトファン」またはD−トリプトファン供給源、あるいはL−およびD−トリプトファンの混合物であってよい。他の例として、「L−アラニン」は、「D−アラニン」、またはL−およびD−アラニンの混合物、あるいは種々のモナチン生成経路にとって適切な他のアミノ酸であってよい。
【００９１】
トリプトファンをインド−ル−3−ピルビン酸へと変換する（反応1）ために本発明の方法において有用な酵素の例として、酵素クラス（EC）2.6.1.27、1.4.1.19、1.4.99.1、2.6.1.28、1.4.3.2、1.4.3.3、2.6.1.5、2.6.1.−,2.6.1.1、2.6.1.21、および3.5.1.−の構成員が挙げられる。これらのクラスは、L−トリプトファンおよびα−KG（すなわち、α−ケトグルタル酸（2−オキソグルタル酸とも呼ばれる））をインド−ル−3−ピルビン酸およびL−グルタミン酸などのアミノ酸へと変換するトリプトファン・アミノトランスフェラ−ゼ（例えば、実施例7を参照）；D−トリプトファンおよび2−オキソ酸をインド−ル−3−ピルビン酸およびアミノ酸へと変換するD−トリプトファン・アミノトランスフェラ−ゼ；L−トリプトファンおよびNAD(P)をインド−ル−3−ピルビン酸およびNH3ならびにNAD(P)Hへと変換するトリプトファン・デヒドロゲナ−ゼ；D−アミノ酸およびFADをインド−ル−3−ピルビン酸およびNH3ならびにFADH2へと変換するD−アミノ酸デヒドロゲナ−ゼ；L−トリプトファンおよびフェニルピルビン酸をインド−ル−3−ピルビン酸およびL−フェニルアラニンへと変換するトリプトファン−フェニルピルビン酸・トランスアミナ−ゼ；L−アミノ酸およびH2OならびにO2を2−オキソ酸およびNH3ならびにH2O2へと変換するL−アミノ酸オキシダ−ゼ；D−アミノ酸およびH2OならびにO2を2−オキソ酸およびNH3ならびにH2O2へと変換するD−アミノ酸オキシダ−ゼ；およびトリプトファンおよびH2OならびにO2をインド−ル−3−ピルビン酸およびNH3ならびにH2O2へと変換するトリプトファン・オキシダ−ゼ；などのポリペプチドを含む。さらに、これらのクラスは、チロシン（芳香族）アミノトランスフェラ−ゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラ−ゼ、D−アミノ酸（または、D−アラニン）アミノトランスフェラ−ゼ、および複数のアミノトランスフェラ−ゼ活性（その一部が、トリプトファンおよび2−オキソ酸をインド−ル−3−ピルビン酸およびアミノ酸へと変換できる）を有する広い（複数基質の）アミノトランスフェラ−ゼを含む。さらに、これらのクラスは、水の存在においてトリプトファンをインド−ル−3−ピルビン酸およびアンモニウムへと変換できるフェニルアラニン・デアミラ−ゼを含む。
【００９２】
インド−ル−3−ピルビン酸をMPへと変換する（反応2）ために本発明の方法において有用な酵素の例として、酵素クラス4.1.3.−、4.1.3.16、4.1.3.17、および4.1.2.−の構成員が挙げられる。これらのクラスは、2つのカルボン酸基質の凝縮を触媒するアルドラ−ゼ（例えば、実施例8、11、および12を参照）などの炭素−炭素シンタ−ゼ／リア−ゼを含む。ポリペプチド・クラスEC  4.1.3.−が、オキソ酸基質（インド−ル−3−ピルビン酸など）を求電子剤として利用して炭素−炭素結合を形成するシンタ−ゼ／リア−ゼである一方で、EC  4.1.2.−は、アルデヒド基質（ベンズアルデヒドなど）を求電子剤として利用して炭素−炭素結合を形成するシンタ−ゼ／リア−ゼである。例えば、KHG［2−ケト−4−ヒドロキシグルタル酸］アルドラ−ゼ（EC  4.1.3.16）およびProAアルドラ−ゼ（EC  4.1.3.17）が、インド−ル−3−ピルビン酸およびピルビン酸をMPへと変換することが知られている。ProAアルドラ−ゼを、Comamonas  testosteroniから由来した4−ヒドロキシ−4−メチル−2−オキソグルタル酸（HMG）アルドラ−ゼのみを指すものと考えることができるが、本明細書においては、用語ProAアルドラ−ゼは、そのようでないと述べられない限りは、4−ヒドロキシ−4−メチル−2−オキソグルタル酸アルドラ−ゼ活性を有する任意のポリペプチドを意味して使用される。Proアルドラ−ゼの適切な例として、Comamonas  testosteroni  ProA（参照として本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2005／0282260号の配列ID番号65（核酸配列）および同じく米国特許出願公開第2005／0282号の配列ID番号66（アミノ酸配列）に関係している）およびSinorhizobiumMeliloti（HMGアルドラ−ゼ）ProA（NCBI  Accession  No.:  CAC46344）、あるいはComamonas  testosteroni  ProA（米国特許出願公開第2005／0282260号の配列ID番号65（核酸配列）および米国特許出願公開第2005／0282260号の配列ID番号66（アミノ酸配列）に関係している）および／またはSinorhizobium  Meliloti（HMGアルドラ−ゼ）ProA（NCBI  Accession  No.:  CAC46344）への相同性を呈する酵素、ならびに／あるいは配列ID番号1（核酸配列）または配列ID番号2（アミノ酸配列）によってコードされたアルドラ−ゼ、ならびに／あるいは実施例8に記載のアルドラ−ゼが挙げられる。例えば、適切な酵素は、Comamonas  testosteroni  ProA（米国特許出願公開第2005／0282260号の配列ID番号66）および／またはSinorhizobium  Meliloti  ProA（NCBI  Accession  No.:  CAC46344）および／または配列ID番号2および／または実施例8に記載のアルドラ−ゼに対し、少なくとも約40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、および／または99%のアミノ酸配列の同一性を有することができる。MPを、アルド−ル縮合などの化学反応を使用して生成することも可能である。
【００９３】
MPをモナチンへと変換（反応3）するために本発明の方法において有用な酵素の例として、以下の酵素クラス、すなわちトリプトファン・アミノトランスフェラ−ゼ（2.6.1.27）、トリプトファン・デヒドロゲナ−ゼ（1.4.1.19）、D−アミノ酸デヒドロゲナ−ゼ（1.4.99.1）、グルタミン酸デヒドロゲナ−ゼ（1.4.1.2−4）、フェニルアラニン・デヒドロゲナ−ゼ（EC  1.4.1.20）、トリプトファン−フェニルピルビン酸トランスアミナ−ゼ（2.6.1.28）の構成員が挙げられ、あるいはアスパラギン酸アミノトランスフェラ−ゼ（EC  2.6.1.1）、チロシン（芳香族）アミノトランスフェラ−ゼ（2.6.1.5）、D−トリプトファン・アミノトランスフェラ−ゼ、またはD−アラニン（D−アスパラギン酸またはD−アミノ酸としても知られる）アミノトランスフェラ−ゼ（2.6.1.21）など、アミノトランスフェラ−ゼ属（2.6.1.−）のより一般的な構成員が挙げられる（WO  03／091396  A2の図2を参照）。この反応を、化学反応を使用して実行することも可能である。ケト酸（MP）のアミノ化が、アンモニアおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウムの還元的アミノ化によって実行される。WO  2003／091396  A2の図11〜13が、MPのモナチンへの変換に使用することができ、インド−ル−3−ピルビン酸またはトリプトファンからのモナチンの収量の向上をもたらすことができるさらなるポリペプチドを示している。
【００９４】
本明細書においては、多段階の平衡反応において、生成物の全体としての収量を、平衡プロセスのみによって得られる収量を超えて向上させるための方法が提供される。特定の実施形態においては、そのような方法が、平衡反応の成分（例えば、反応剤および促進剤）についてある期間にわたる進行（例えば、平衡に達するまで）を許すことを含むことができる。この期間の後に、反応を、1つ以上の促進剤（例えば、酵素）の除去によって改変することができる。そのような促進剤として、生成物の生成と競合する反応を促進する促進剤を挙げることができる。例えば、そのような競合的な反応として、平衡プロセス内の任意の逆反応を挙げることができる。特定の場合には、競合的な反応のみが改変される一方で、他の場合には、反応のすべてが改変または破壊される。これらの反応が改変または破壊されたあとで、生成物を直接的に生成する反応が、生成物の生成を担当する促進剤を添加することによって再開され、例えば、通常は多段階経路の最終段階に関与する促進剤が混合物へと再び導入され、経路の最終段階が再開される。
【００９５】
当業者であれば、本明細書の開示を検討することで、同様の経路および酵素をモナチン誘導体の生成に使用できることから、本明細書に記載の方法をモナチンの誘導体の生成に適合させることができることを、理解できるであろう。例えば、そのような誘導体として、ここでの言及によってその全体が本明細書に取り入れられたものとされる2006年10月20日付の米国特許出願第11／58,4016号に記載の誘導体を挙げることができる。この誘導体は、以下の構造
【００９６】
【化３】
2009538145.tif 000005
【００９７】
を有することができ、式中、Ra、Rb、Rc、Rd、およびReはそれぞれ、水素原子、ヒドロキシル基、C1〜C3のアルキル基、C1〜C3のアルコキシ基、アミノ基、あるいはヨウ素原子、臭素原子、塩素原子、またはフッ素原子などのハロゲン原子から選択される任意の置換基を独立に表わしている。しかしながら、Ra、Rb、Rc、Rd、およびReのすべてが同時に水素となることはできない。あるいは、RbおよびRcならびに／あるいはRdおよびReが一緒に、C1〜C4のアルキレン基をそれぞれ形成してもよい。
【００９８】
本明細書に記載の本発明の方法のためのシステムは、自動化または半自動化が可能である。さらに、本発明は、本明細書に記載のとおりのモナチンの生成方法または生成システムを利用する装置、ならびにそのような装置を使用するための方法を提供する。そのような装置は、第1の反応容器、分離容器、および第2の反応容器を含む。第1の反応容器は、第1の反応容器に存在すべき混合物の構成要素（1つ以上の酵素、および／または1つ以上の基質、あるいは他の成分）を供給することができる1つ以上の供給部または導管を有することができる。分離容器は、第1の反応混合物を、所望の酵素、タンパク質、または促進剤を保持しつつ、第1の反応容器から第2の反応容器への所望の成分の移送を可能にする方法で収容する。第2の反応容器も、タンパク質／酵素または成分の追加のための1つ以上の供給部または導管を有することができ、第2の反応混合物の特定の成分の第1の反応容器へのリサイクルを容易にし、所望の最終生成物の収集を容易にするための1つ以上の出口をさらに有することができる。
【００９９】
分離容器は、第1の反応容器の一部であってよく、あるいは第2の反応容器の一部であってよく、あるいは第1および第2の反応容器とは別個独立の分離容器であってよい。
【０１００】
さらに装置は、容器への構成成分の送入または容器からの構成成分の送出のための制御部と、温度、pH、および他の物理的な反応条件を調節するための制御部と、装置全体の1つ以上の様相を制御するためのコンピュ−タとを備えることができる。
【０１０１】
本発明のいくつかのプロセスを、以下の実施例において説明する。本明細書に多数の実施形態が開示されているが、本発明のさらに別の実施形態が、本明細書の全体を検討することによって、当業者に明らかになるであろう。本明細書の記載から理解されるとおり、本発明の様々な側面についての変更が、いずれも本発明の技術的思想および技術的範囲から離れることなく可能である。したがって、図面および明細書の全体は、あくまで例示として理解すべきであり、本発明を限定するものとして理解すべきではない。
【実施例１】
【０１０２】
流加発酵でのHIS6−HEXaspCアミノトランスフェラ−ゼの生成
材料
微生物培養基の成分を、Difco、Fisher  Scientific、またはVWRからのものとし、他の試薬は、分析グレ−ドまたは市販の最高グレ−ドのものとした。発酵をNew  Brunswick  Scientific  (Edison,  NJ)  BioFlo  3000（登録商標）発酵槽にて行った。JLA−16.250またはJA−25.50ロ−タを備えるBeckman  (Fullerton,  CA)  Avanti（登録商標）J−25I遠心分離器を使用して、遠心分離を実行した。
【０１０３】
コ−ド配列に6つの変更を含んでいるE.  coli  aspCアミノトランスフェラ−ゼの誘導体をコードしている遺伝子（HEXaspC）のクロ−ニングが、参照として本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2005／0282260に記載されている。この酵素は、OnufferおよびKirschらによって最初に記載された(Protein  Science  4:  1750−1757  (1995))。アミノ酸変化が、元の酵素よりも広い基質特異性を有し、芳香族アミノ酸についてより高い活性を示す酵素をもたらしている。
【０１０４】
アミノ末端HIS6−生成タグを保持するアミノトランスフェラ−ゼHEXaspCを、2.5−L規模の培養槽において、高い細胞密度および所望のタンパク質の高い発現レベルを達成する流加プロセスにて生成した。E.coli株BL21(DE3)::HEXaspCpET30(Xa／LIC)の培養の手順および結果は、以下のとおりである。新鮮な培養皿（0.05mg／mLのカナマイシンを有するLB寒天）から出発し、細胞を、0.05mg／mLのカナマイシンを有する5mLのLuria−Bertani培養液（LB）において、37℃および225rpmで6〜8時間にわたって培養した。1mLの培養物を、同じ培地の2つの100−mLのアリコ−トへと移し、細胞を、37℃および225rpmで一晩（16〜18時間）にわたって培養した。（1リットルにつき）2.0g／Lの(NH4)2SO4、8.0g／LのK2HPO4、2.0g／LのNaCl、1.0g／Lのクエン酸ナトリウム・2H2O、1.0g／LのMgSO4・7H2O、0.025g／LのCaCl2・2H2O、0.05g／LのFeSO4・7H2O、0.4mL／LのNeidhardt微量栄養素、2.0g／Lのグルコ−ス、および0.5mg／mLのカナマイシンを含んでいる2.5リットルの培地を有する培養槽に、一晩の培養物を5%（v／v）で接種した。接種の2時間後に、指数関数的グルコ−ス供給を、60%（w／v）のグルコ−ス溶液を使用して開始した。供給は、0.15h−1の指数関数的速度での微生物の培養をサポ−トするために必要な速度で行った。二酸化炭素発生速度（CER）が100mモル／L／hという値に達したとき（接種の約20時間後、15〜16g  DCW／Lの細胞バイオマスに相当）、遺伝子の発現を、2g／Lのラクト−ス（20%の溶液として供給）のボ−ラス添加によって誘導した。供給を、60%（w／v）のグルコ−スから50%（w／v）のグルコ−ス＋10%（w／v）のラクト−スへと変化させる一方で、供給速度は、誘導の時点の速度に固定した。「50%（w／v）のグルコ−ス＋10%（w／v）のラクト−ス」の供給を、6時間にわたって維持した。発酵の終わりにおいて、細胞の濃度は31gDCW／Lであり、Bio−Rad  (Hercules,  CA)  Experion（商標）システムのソフトウェアから計算される推定の酵素発現レベルは、全タンパク質の38％であった（下記を参照）。細胞を、10分間にわたる5000−7000xgの遠心分離によって収穫し、-80℃で濡れ細胞ペ−ストとして冷凍した。
【実施例２】
【０１０５】
HIS6−HEXaspCアミノトランスフェラ−ゼの精製
細胞を、Microfluidics  (Newton,MA)  ホモジナイザ−を使用して破壊した。タンパク質の発現を、Bio−Rad  (Hercules,  CA)  Experion（商標）Pro260システム、またはMini  PROTEAN（登録商標）3  cell  装置を流れるBio−Rad  4−15%  SDS−ポリアクリルアミド勾配ゲルを使用して分析した。タンパク質を、Bio−Rad  Bio−Safe（商標）  G−250  Coomassie  stainを使用してゲルにおいて視覚化し、水で脱染した。HIS6−タグの酵素を、GE  Healthcare  (Piscataway,  NJ)  Chelating  Sepharose（商標）Fast  Flow樹脂にて精製した。GE  Healthcare  PD10カラムを、タンパク質溶液のバッファの交換に使用した。タンパク質溶液を、Millipore／Amicon  (Billerica,MA)  Centricon（登録商標）  Plus−70  遠心分離フィルタ−装置（MWCO（分子量しきい値）10kDa)によって濃縮した。タンパク質濃度を、ウシ血清アルブミンを標準とし、Pierce  (Rockford,  IL)  BCA（商標）アッセイ・キットを使用して割り出した。遠心分離を、JLA−16.250またはJA−25.50ロ−タを備えるBeckman  (Fullerton,  CA)  Avanti（登録商標）J−25I遠心分離器を使用して実行した。すべての試薬は、分析グレ−ドまたは市販の最高グレ−ドのものとした。
【０１０６】
HIS6−HEXaspCアミノトランスフェラ−ゼを含んでいる無細胞抽出物を作成するために、細胞を100mMのリン酸カリウム（pH  7.8、0.05mMのピリドキサル・リン酸（PLP）を含んでいる）の3〜4の体積に懸濁させ、懸濁液の温度を15℃未満に保ちつつ、Microfluidicsホモジナイザ−を使用（20,000psiで3回の通過）して破壊した。以後のすべての精製工程は、4℃で実行した。細胞抽出物を15,000xgで20分間にわたって遠心分離し、細胞残屑を除去した。無細胞抽出物の20−25mLのアリコ−トを、前もって100mMのリン酸カリウム（200mMの塩化ナトリウムおよび0.05mMのPLPを含んでいる）で平衡させたChelating  Sepharose（商標）  Fast  Flow樹脂（ニッケル（II）型）の45mLのカラムに加えた。樹脂のニッケル形を生成するために、樹脂を200mMのニッケル（II）硫酸六水和物（150mL）で洗浄し、次いで蒸留水（150mL）で洗浄した。試料の装填後に、25mMのイミダゾ−ルを含む150mLの平衡バッファ、50mMのイミダゾ−ルを含む150mLの平衡バッファ、および500mMのイミダゾ−ルを含む150mLの平衡バッファで、カラムの洗浄／溶出を行った。HIS6−HEXaspCタンパク質が、最後の洗浄において溶出した。500mMのイミダゾ−ルでの洗浄物を、Centricon（登録商標）  Plus−70遠心分離フィルタ−装置（MWCO  10kDa）によって、製造者の指示に従って15−20mLへと濃縮した。イミダゾ−ルおよび塩化ナトリウムを、前もって100mMのリン酸カリウム（pH  7.8、0.05mMのPLPを含んでいる）で平衡させた使い捨てのPD10カラム（カラム当たり2.5mLの試料）に通すことによって除去した。生成済みのアミノトランスフェラ−ゼが、同じバッファのカラムにつき3.5mLで溶出された。それぞれの部分のタンパク質濃度を、Pierce  BCA（商標）アッセイ・キットを使用して割り出した。それぞれの部分の純度および無細胞抽出物部分の発現のレベルを、Experion（商標）microcapillary  chip  systemを使用して割り出し、あるいは4−15%の勾配ゲルでSDS−PAGEによって割り出した。典型的には、この手順は、Experion（商標）ソフトウェアでの判定にて85−90%の純度である〜150mgの酵素を（600−700mgの総タンパク質から）もたらす。精製後の酵素のアリコ−ト（1−5mL）を、使用まで-80℃で保管した。
【実施例３】
【０１０７】
Comamonas  testosteroni  proAアルドラ−ゼの発現および精製
材料
細胞の培養および遺伝子の導入を、Overnight  Express（商標）System  II  (EMD  Biosciences／Novagen;Madison,  WI)を使用して行った。他のすべての材料は、HIS6−HEXaspCアミノトランスフェラ−ゼの精製に使用したものと同じである。
【０１０８】
C.  testosteroni  proAアルドラ−ゼの誘導体をコードしている遺伝子のクロ−ニングは、米国特許出願公開第2004／0063175号に記載されている。
アミノ末端HIS6−精製タグを有するproAアルドラ−ゼを、振盪フラスコに0.05mg／mLのカナマイシンを含んでいるOvernight  Express（商標）  System  II  (溶液1〜6)を使用して生成した。この発現システムは、細胞の培養を監視する必要なく、IPTG−誘導可能な系の発現を誘導する。BL21(DE3)::C.  testosteroni  proA  pET30(Xa／LIC)の液体培養物またはプレ−トからの培地のアリコ−ト（200mL）を（1Lのフラスコに）接種した後で、培養物を225rpmで振盪させつつ一晩にわたって30℃でインキュベ−トした。OD600が6という最小値に達したときに、細胞を上述のとおり遠心分離によって収穫した。
【０１０９】
発現したproAアルドラ−ゼを有する細胞抽出物を、100mMのリン酸カリウム（pH  7.8、200mMのNaClを含んでいる）を懸濁バッファとして使用して上述のとおりに作成した。いくつかの場合には、4mMのMgCl2もバッファに加えた。4つのフラスコの細胞から作成された細胞抽出物を、前もって100mMのリン酸カリウム（pH  7.8、200mMのNaClを含んでいる）で平衡させた45mLのChelating  Sepharos（商標）  Fast  Flow  樹脂(ニッケル(II)形)カラムに装填し、タンパク質を上述のとおり精製した。タンパク質は、平衡バッファに500mMのイミダゾ−ルを含んでいる留分に溶出した。この留分を上述のとおりに濃縮し、イミダゾ−ルを、100mMのリン酸カリウム（pH  7.8、200mMの塩化ナトリウムおよび4mMのMgCl2を有している）で平衡させたPD10カラムに通すことによって除去した。それぞれの留分のタンパク質濃度を、Pierce  BCA（商標）アッセイを使用して割り出した。それぞれの留分の純度および無細胞抽出物留分の発現のレベルを、BioRad  Experion（商標）microcapillary  chip  systemを使用して割り出し、あるいは4−15%の勾配ゲルでSDS−PAGEによって割り出した。典型的には、この手順は、Experion（商標）ソフトウェアでの判定にて85−90%の純度である200mg超の酵素をもたらす。精製後の酵素のアリコ−ト（1−5mL）を、使用まで-80℃で保管した。
【実施例４】
【０１１０】
生体触媒によるトリプトファンおよびピルビン酸からのS,S−モナチンの小規模生成
材料
すべての試薬は、分析グレ−ドまたは市販の最高グレ−ドのものとした。S,S−モナチンの形成を触媒するために使用される酵素を、実施例2および3に記載のとおりに精製した。
【０１１１】
方法および結果
L−トリプトファンおよびピルビン酸からS,S−モナチンを生体触媒によって生成するために、小規模な手順を開発した。酵素反応を、15mLのねじ口プラスチック管にて実行した。リン酸カリウム中の50mMのL−トリプトファン、200mMのピルビン酸、4mMのMgCl2、0.05mMのPLPの溶液（pH  7.8）を、標準的な手順において使用し、この溶液を収容してなる管を、穏やかに混合しつつ室温でインキュベ−トした。反応を開始させるために、酵素溶液を、精製Comamonas  testosteroni  proAアルドラ−ゼについて0.05g／LおよびHIS6−HEXaspCアミノトランスフェラ−ゼについて0.5g／Lの濃度まで加えた（10mLの最終的な体積）。最終的なリン酸カリウムの濃度は、酵素溶液からのバッファの寄与を含め、25mMであった。界面活性剤であるTween  80（登録商標）およびTriton（登録商標）X−100（0.01〜1%）の添加によって、酵素の沈殿を最小限にした。反応は、酵素の追加後に速やかに進行し、時間とともに速度が低下した。3〜5時間において、50mMのL−トリプトファンの第2のアリコ−トを追加し、反応を24時間まで続けた。反応の進行を、L−トリプトファン、L−アラニン、モナチン、モナチン前駆体（2−ヒドロキシ−2−（1H−インド−ル−3−イルメチル）−4−オキソ−ペンタン二酸）、およびピルビン酸の濃度を測定することによって見守った。モナチン、トリプトファン、およびアラニンの濃度は、実施例6に記載の蛍光ポスト・カラム誘導体化手順を使用して測定した。モナチン前駆体およびピルビン酸の分析方法は、実施例6に記載されている。10mL規模の実験からの典型的な結果が、表1に示されている。
【０１１２】
【表１】
2009538145.tif 000006
【実施例５】
【０１１３】
生体触媒によるトリプトファンおよびピルビン酸からのS,S−モナチンのベンチ規模の改善された生成
材料
すべての試薬は、分析グレ−ドまたは市販の最高グレ−ドのものとした。S,S−モナチンの形成を触媒するために使用される酵素を、実施例2および3に記載のとおりに生成した。ベンチ規模の生体触媒反応を、INFORS  (Bottmingen,  Switzerland)という0.7Lのバイオリアクタ−にて行った。タンパク質を、YM10膜を備えるAmicon  (Millipore;  Billerica,MA)限外ろ過攪拌セル(Model  8200)を使用し、あるいはMillipore  Pellicon（登録商標）50cm2  限外ろ過カ−トリッジ(MWCO  10,000)を使用して反応混合物から除去した。
【０１１４】
方法および結果
ベンチ規模の生体触媒反応を、0.7Lのリアクタ−において温度、pH、および攪拌を制御しつつ行った。チッ素雰囲気で反応を行うことによって、酸素触媒による中間体（インド−ル−3−ピルビン酸）の分解を最小限にした。
【０１１５】
混合物1（第1の反応混合物）：リン酸カリウム中の50mMのL−トリプトファン、200mMのピルビン酸、4mMのMgCl2、および0.05mMのPLPの溶液（pH  7.8、300mL）を、リアクタ−内に用意し、温度を30℃に、攪拌速度を250rpmに制御した。反応溶液の酸素濃度を最小限にするために、チッ素をリアクタ−の上部空間に供給し、あるいは液体内へとスパ−ジした。反応の経過におけるpHを監視したところ、7.5〜7.8の範囲であった。いくつかの実験においては、界面活性剤Tween（登録商標）80を、酵素の沈殿を最小限にするために加えた。反応を開始させるために、酵素溶液を、精製Comamonas  testosteroni  proAアルドラ−ゼについて0.05g／LおよびHIS6−HEXaspCアミノトランスフェラ−ゼについて0.5g／Lの濃度まで加えた。最終的なリン酸カリウムの濃度は、酵素溶液からのバッファの寄与を含め、25mMであった。3〜5時間において、50mMのL−トリプトファンの第2のアリコ−トをリアクタ−へと加えた。反応の進行を、L−トリプトファン、L−アラニン、モナチン、モナチン前駆体（2−ヒドロキシ−2−（1H−インド−ル−3−イルメチル）−4−オキソ−ペンタン二酸）、およびピルビン酸の濃度を測定することによって見守った。トリプトファン、モナチン、およびアラニンについては、蛍光ポスト・カラム誘導体化法を使用した。インド−ル−3−ピルビン酸の濃度は、ヒ酸−ホウ酸分光光度法を使用して分析した。この方法は、定量的ではないが、インド−ル−3−ピルビン酸の喪失または形成の定性的監視を可能にする。すべての分析方法は、実施例6に記載されている。
【０１１６】
限外ろ過：一晩（18〜24時間）のインキュベ−ションの後に、タンパク質を限外ろ過によって反応混合物から除去した。反応混合物を、嫌気的に限外ろ過攪拌セルへと移し、タンパク質が除かれた溶液を、前もって酸素をチッ素でパ−ジした閉ボトルに集めた。限外ろ過の工程の間、ボトル内にチッ素のブランケットを維持した。次いで、タンパク質が除かれた反応溶液のアリコ−ト（200mL）を、0.7Lの発酵槽へと嫌気的に移した。あるいは、反応混合物をカ−トリッジを通って再循環させ、透過物をチッ素でパ−ジした0.7Lの第2の閉じたリアクタ−に集めることによって、反応混合物からタンパク質を除くために、Pellicon（登録商標）限外ろ過カ−トリッジを使用した。
【０１１７】
混合物2（第2の反応混合物）：タンパク質を除いた溶液に、過剰なL−アラニン（L−アラニンの初期の濃度を、下記の表2に示されるとおり0.5Mまたは1.5Mにする）および0.5g／Lの精製HIS6−HEXaspCアミノトランスフェラ−ゼを加えた。温度を30℃に、pHを7.5〜7.8の間に、攪拌速度を250rpmに保った。嫌気環境を維持するために、チッ素を上部空間に連続的に供給した。反応の進行を、L−トリプトファン、L−アラニン、モナチン、モナチン前駆体（2−ヒドロキシ−2−（1H−インド−ル−3−イルメチル）−4−オキソ−ペンタン二酸）、およびピルビン酸の濃度を測定することによって見守った。インド−ル−3−ピルビン酸の喪失を、実施例6に記載のとおりヒ酸−ホウ酸分光光度法を使用して分析した。典型的な反応の結果が、表2に示されている。
【０１１８】
【表２】
2009538145.tif 000007
【０１１９】
表2の結果は、タンパク質を取り除いた反応混合物1へと過剰なアミノ基供与体（L−アラニン）およびアミノトランスフェラ−ゼ酵素を加えた場合に、S,S−モナチンの形成を、最大で1.7倍まで向上させることが可能であることを示している。反応1の混合物に存在するモナチン前駆体の多くが、このような条件下においてアミノ化されてモナチンを形成する一方で、インド−ル−3−ピルビン酸は、より安定なトリプトファンへと変換されている（表2にトリプトファン濃度の増加によって示されているとおり）。反応1について小規模と比べたベンチ規模におけるモナチンの力価の増加は、少なくとも部分的には、反応混合物からの酸素の排除および反応温度の上昇に起因している。界面活性剤の添加は、小規模およびベンチ規模の両プロセスにおいてタンパク質の沈殿を最小限にするが、界面活性剤が存在するとき、小規模のプロセスにおいて見られたような生成物濃度の大きな増加は、より大きな反応においては存在しなかった。
【実施例６】
【０１２０】
モナチン、モナチン前駆体、トリプトファン、アラニン、ピルビン酸、HMO、HMG、およびインド−ル−3−ピルビン酸の検出
モナチンおよびトリプトファンのLC／MS／MS多重反応モニタリング（MRM）分析
生化学的反応から由来するモナチンおよびトリプトファンの混合物の分析を、Waters  2795液体クロマトグラフを備え、Waters  996フォトダイオ−ド・アレイ（PDA）吸光モニタをクロマトグラフとMicromass（登録商標）Quattro  Ultima（登録商標）三連四重極質量分析計との間に直列に備えているWaters／Micromass（登録商標）液体クロマトグラフィ−タンデム質量分析（LC／MS／MS）計を使用して実行した。LC分離を、40℃でXterraMS  C8逆相クロマトグラフィ・カラム（2.1mm  x  250mm）を使用して行った。LC移動相は、A)（i）0.05%  (v／v)のトリフルオロ酢酸、または（ii）0.3%のギ酸および10mMのギ酸アンモニウムを含む水、ならびにB)（i）0.05%  (v／v)のトリフルオロ酢酸、または（ii）0.3%のギ酸および10mMのギ酸アンモニウムを含むメタノ−ルで構成されていた。
【０１２１】
LC移動相が、A)0.05%  (v／v)のトリフルオロ酢酸を含む水、およびB)  0.05%  (v／v)のトリフルオロ酢酸を含むメタノ−ルで構成されている場合、勾配溶出は、実行の間に2分間の再平衡期間を挟み、5%  B〜35%  Bまで線形（0〜4分）、35%  B〜60%  Bまで線形（4〜6.5分）、60%  B〜90%  Bまで線形（6.5〜7分）、90%  Bにおいてアイソクラチック（7〜11分）、90%  B〜95%  Bまで線形（11〜12分）、95%  B〜5%  Bまで線形（12〜13分）であった。流量は0.25mL／分であり、PDA吸光を200nm〜400nmまで監視した。ESI−MSのすべてのパラメ−タを、分析対象のプロトン化分子イオン([M  +  H]+)の生成および特徴的な断片イオンの生成にもとづいて最適化および選択した。以下の機器パラメ−タを、モナチンおよびトリプトファンのLC／MS／MS多重反応モニタリング（MRM）分析に使用した。すなわち、キャピラリ−：3.5kV；コ−ン：40V；ヘックス（Hex）1：20V；開口部：0V；ヘックス（Hex）2：0V；ソ−ス温度：100℃；脱溶媒温度：350℃；脱溶媒ガス：500L／h；コ−ンガス：50L／h；低質量分解能（Q1）：12.0；高質量分解能（Q1）：12.0；イオンエネルギ−：0.2；入口：50V；衝突エネルギ−：8；出口：1V；低質量分解能（Q2）：15；高質量分解能（Q2）：15；イオンエネルギ−（Q2）：3.5；増倍管：650。5つのモナチン特有の親−娘のMRMトランジッションを使用して、生体内反応におけるモナチンが特定的に検出される。監視されるトランジッションは、293.1〜158.3、293.1〜168.2、293.1〜211.2、293.1〜230.2、および293.1〜257.2である。トリプトファンは、204.7〜146.4のMRMトランジッションによって監視される。モナチンおよびトリプトファンの内部基準定量化のために、それぞれの分析対象のd5−トリプトファンおよびd5−モナチンに対する4つの異なる比を含んでいる4つの較正基準が分析される。これらのデ−タに線形最小二乗分析が加えられ、モナチンおよびトリプトファンの較正曲線が形成される。それぞれの試料に、固定の量のd5−トリプトファンおよびd5−モナチン（d5−モナチンは、WO  2003／091396  A2からの方法によってd5−トリプトファンから合成される）が加えられ、応答の比（モナチン／d5−モナチン；トリプトファン／d5−トリプトファン）が、混合物中のそれぞれの分析対象の量を計算すべく、上述の較正曲線とともに使用される。
【０１２２】
LC移動相が、A)0.3%のギ酸および10mMのギ酸アンモニウムを含む水、およびB)0.3%のギ酸および10mMのギ酸アンモニウムを含むメタノ−ルで構成されている場合、勾配溶出は、実行の間に4分間の再平衡期間を挟み、5%  B〜45%  Bまで線形（0〜8.5分）、45%  B〜90%  Bまで線形（8.5〜9分）、90%  B〜90%  Bまでアイソクラチック（9〜12.5分）、95%  B〜5%  Bまで線形（12.5〜13分）であった。流量は0.27mL／分であり、PDA吸光を210nm〜400nmまで監視した。ESI−MSのすべてのパラメ−タを、分析対象のプロトン化分子イオン([M  +  H]+)の生成および特徴的な断片イオンの生成にもとづいて最適化および選択した。この第2の移動相について使用した機器パラメ−タは、上述と同じである。4つのモナチン特有の親−娘のMRMトランジッションおよび1つのトリプトファン特有の親−娘のトランジッションを使用して、生体内および生体外反応におけるモナチンおよびトリプトファンが特定的に検出される。監視されるトランジッションは、293.1〜158.0、293.1〜168.0、293.1〜211.5、および293.1〜257.0である。トリプトファンは、205.2〜146.1のMRMトランジッションによって監視される。モナチンおよびトリプトファンの内部基準定量化のために、それぞれの分析対象のd5−トリプトファンおよびd5−モナチンに対する4つの異なる比を含んでいる4つの較正基準が分析される。これらのデ−タに線形最小二乗分析が加えられ、モナチンおよびトリプトファンの較正曲線が形成される。それぞれの試料に、固定の量のd5−トリプトファンおよびd5−モナチン（d5−モナチンは、WO  2003／091396  A2からの方法によってd5−トリプトファンから合成される）が加えられ、応答の比（モナチン／d5−モナチン；トリプトファン／d5−トリプトファン）が、混合物中のそれぞれの分析対象の量を計算すべく、上述の較正曲線とともに使用される。d5−トリプトファンおよびd5−モナチンについて監視される親−娘のマス・トランジッションは、それぞれ210.2〜151.1および298.1〜172.0である。
【０１２３】
モナチンのキラルLC／MS／MS（MRM）測定
生化学的反応におけるモナチンの立体異性体分布の割り出しを、1−フルオロ−2−4−ジニトロフェニル−5−Ｌ−アラニンアミド（FDAA）での誘導体化およびその後の逆相LC／MS／MSMRM測定によって行なった。
【０１２４】
FDAAによるモナチンの誘導体化
50μLの試料またはスタンダ−ドに、200μLの1％FDAAアセトン溶液を添加した。40μLの1.0M重炭酸ナトリウムを加え、混合物を、ときおり混合しつつ40℃で1時間にわたってインキュベ−トした。試料を取り出して冷却し、2.0MのHCl（20μL）で中和した（バッファされた生物学的混合物の中和を達成するためには、より多くのHClを要するであろう）。脱気の完了後に、試料はLC／MS／MSによる分析が可能になった。
【０１２５】
モナチンの立体異性体分布を割り出すためのLC／MS／MS多重反応モニタリング
上述のLC／MS／MS機器を使用して分析を行なった。モナチン（とくには、FDAA−モナチン）の4種類の立体異性体のすべてを分離することができるＬＣ分離をPhenomenexLuna（登録商標）C18逆相クロマトグラフィ・カラム（2.0  x  250mm（3μm））を用いて40℃にて行なった。ＬＣ移動相は、Ａ）0.05％（質量／体積）の酢酸アンモニウムを含む水、およびＢ）アセトニトリルで構成した。溶出は、実行の間に8分間の再平衡化時間を挟み、13%  Bでアイソクラチック（0〜2分）、13%  B〜30%  Bまで線形（2−15分）、30%  B〜80%  Bまで線形（15−16分）、80%  Bにおいてアイソクラチック（16−21分）、および80%  B〜13%  Bまで線形（21−22分）であった。流速は0.23mL／分であり、ＰＤＡ吸光度を200nm〜400nmまで監視した。ESI−MSのすべてのパラメ−タを、FDAA−モナチンのプロトン化分子イオン（[M  −  H]−）の生成および特徴的な断片イオンの生成にもとづいて最適化および選択した。
【０１２６】
以下の機器パラメ−タを、陰イオンESI／MSモ−ドでのモナチンのLC／MS分析に使用した。すなわち、キャピラリ−：2.0kV；コ−ン：25V；Hex  1：10V；開口部：0V；Hex  2：0V；ソ−ス温度：100℃；脱溶媒温度：350℃；脱溶媒ガス：500L／h；コ−ンガス：50L／h；低質量分解能（Q1）：12.0；高質量分解能（Q1）：12.0；イオンエネルギ−：0.2；入口：−5V；衝突エネルギ−：20；出口：1V；低質量分解能（Q2）：12；高質量分解能（Q2）：12；イオンエネルギ−（Q2）：3.0；増倍管：650。3つのFDAA−モナチン特有の親−娘のトランジッションを使用して、生体外および生体内反応におけるFDAA−モナチンを特定的に検出した。トランジッションは、543.6〜268.2、543.6〜499.2、および543.6〜525.2であった。FDAA−モナチンの立体異性体の同定を、精製モナチン立体異性体と比べたクロマトグラフィの保持時間、および質量スペクトルデ−タにもとづいて行った。
【０１２７】
トリプトファン、モナチン、アラニン、およびHMGを含むアミノ酸の液体クロマトグラフィ−ポスト・カラム蛍光検出
トリプトファン、モナチン、およびアラニンのための手順
生化学的反応においてアミノ酸を測定するために、ポスト−カラム蛍光検出を備える液体クロマトグラフィを、Waters  474走査型蛍光検出器に組み合わせられたWaters  2690LC  systemまたは同等物、およびWatersのポスト−カラム反応モジュ−ルにて実行した（LC／OPA法）。LC分離を、相互作用ナトリウム（Interaction−Sodium）が装填されたイオン交換カラムにおいて60℃で行った。移動相Aは、Pickering  Na  328バッファ（PickeringLaboratories,  Inc.;Mountain  View,  CA）とした。移動相Bは、Pickering  Na  740バッファとした。勾配溶出は、実行の間に20分間の再平衡期間を挟み、0%  B〜100%  Bまで〜20分であり、100%  Bにおいてアイソクラチック（20〜30分）および100%  B〜0%  Bまで線形（30〜31分）であった。移動相の流量は、0.5mL／分であった。OPAポスト−カラム誘導体化溶液の流量は、0.5mL／分であった。蛍光検出器の設定は、EX  338nmおよびEm  425nmであった。分析のための内部基準として、ノルロイシンを使用した。アミノ酸の同定を、精製済みの基準についてのクロマトグラフィ保持時間デ−タにもとづいて行った。
【０１２８】
HMGのための手順
生化学的反応からの試料を、充てん材料としてのC18および溶離剤としての0.6%酢酸を含んでいる固相抽出（SPE）カ−トリッジによって清浄化した。次いで、SPEからの留分を既知の体積まで集め、HPLCポスト−カラムOフタルアルデヒド（OPA）誘導体化を使用して蛍光検出器によって分析した。クロマトグラフィ分離を、Waters  2695液体クロマトグラフィ・システムおよび直列な2つのPhenomenex  AquaC18カラム（5μmの粒子を有する2.1mm  x  250mmのカラムおよび3μmの粒子を有する2.1mm  x  150mmのカラム）を使用して可能にした。カラムの温度を40℃とし、カラムのアイソクラチックな流速を、0.18mL／分とした。移動相は、0.6%の酢酸である。OPAポスト−カラム誘導体化および検出のシステムは、Waters  Reagent  Manager（RMA）、反応コイル・チャンバ、反応コイル・チャンバのための温度制御モジュ−ル、およびWaters  2847蛍光検出器で較正されている。OPA流量を0.16mL／分とし、反応コイル・チャンバを80℃とした。蛍光検出器を、348nmの励起波長および450nmの放射波長に設定した。信号の利得および減衰などといった検出器の感度を制御する他のパラメ−タは、実験の必要に合わせた。HMGの定量化を、グルタミン酸のモル応答にもとづいて行った。
【０１２９】
LC−UV／Visによるモナチン（2−ヒドロキシ−2−（1H−インド−ル−3−イルメチル）−4−アミノグルタル酸）およびトリプトファンの検出
液体クロマトグラフィ分離を、Waters  2690液体クロマトグラフィ・システムおよび2.1mm  x  150mmのAgilent  Eclipse  XDB−  C18  5.0μm逆相クロマトグラフィ・カラムを使用し、0.22mL／分の流量および以下の勾配条件で行った。
【０１３０】
【表３】
2009538145.tif 000008
【０１３１】
移動相Aは、10mMのギ酸アンモニウムを有する0.3%  (v／v)のギ酸であり、移動相Bは、50／50  (v／v)のメタノ−ル／アセトニトリル中の10mMのギ酸アンモニウムを有する0.3%  (v／v)のギ酸である。カラムの温度は、40℃とした。検出を、280nmで動作しているWaters  996  フォトダイオ−ド・アレイ（PDA）を使用して行った。典型的には、10〜500  ppmの較正範囲を使用した。
【０１３２】
LC／MSによるモナチン前駆体（2−ヒドロキシ−2−（1H−インド−ル−3−イルメチル）−4−オキソ−ペンタン二酸）の検出
液体クロマトグラフィ分離を、Waters  2690液体クロマトグラフィ・システムおよび2.1mm  x  50mmのAgilent  Eclipse  XDB−  C18  1.8μm逆相クロマトグラフィ・カラムを使用し、2.5mL／分の流量および以下の勾配条件で行った。
【０１３３】
【表４】
2009538145.tif 000009
【０１３４】
移動相Aは、10mMのギ酸アンモニウムを有する0.3%  (v／v)のギ酸であり、移動相Bは、50:50のメタノ−ル／アセトニトリル中の10mMのギ酸アンモニウムを有する0.3%のギ酸である。カラムの温度は、40℃であった。
【０１３５】
負の電気スプレイ・イオン化モ−ド（−ESI）にて動作するMicromass  ZQ四重極質量分析計のパラメ−タを、以下のように設定した。すなわち、キャピラリ−：2.2kV；コ−ン：35V；抽出器：4V；RFレンズ：1V；ソ−ス温度：120℃；脱溶媒温度：380℃；脱溶媒ガス：600L／h；コ−ンガス：オフ；低質量分解能：15.0；高質量分解能：15.0；イオンエネルギ−：0.2；増倍管：650。単一のイオンモニタリングMS実験装置を、m／z  290.3、210.3、184.3、および208.4の選択的な検出を可能にするように設定した。m／z  208.4が、内部基準d5−トリプトファンの脱プロトン化分子[M−H]−イオンである。
【０１３６】
LC／MS／MSによるモナチン前駆体の検出
LC分離を、Waters  HPLC液体クロマトグラフィ・システムおよび2.1mm  x  50mmのAgilent  Eclipse  XDB−C18  1.8μm逆相クロマトグラフィ・カラムを使用し、0.25mL／分の流量および以下の勾配条件で行った。
【０１３７】
【表５】
2009538145.tif 000010
【０１３８】
移動相Aは、10mMのギ酸アンモニウムを有する0.3%  (v／v)のギ酸であり、Bは、50:50のメタノ−ル／アセトニトリル中の10mMのギ酸アンモニウムを有する0.3%のギ酸である。カラムの温度は、40℃であった。
【０１３９】
負の電気スプレイ・イオン化モ−ド（−ESI）にて動作するLC／MS／MS多重反応モニタリング（MRM）実験のためのWaters  Premier  XE三連四重極質量分析計のパラメ−タを、以下のように設定した。すなわち、キャピラリ−：3.0kV；コ−ン：25V；抽出器：3V；RFレンズ：0V；ソ−ス温度：120℃；脱溶媒温度：350℃；脱溶媒ガス：650L／h；コ−ンガス：47L／hr；低質量分解能（Q1）：13.5；高質量分解能（Q1）：13.5；イオンエネルギ−（Q1）：0.5V；入口：1V；衝突エネルギ−：18V；出口  1：19；低質量分解能（Q2）：15；高質量分解能（Q2）：15；イオンエネルギ−（Q2）：2.0；増倍管：650。4つの親−娘のMRMトランジッションを監視して、モナチン前駆体（MP）およびd5−モナチン前駆体（d5−MP）を選択的に検出した。d5−MPを内部基準（I.S.）として使用した。4つのMRMトランジッションは、290.1〜184.1、290.1〜210.1、290.1〜228.1、および295.1〜189.1である。これらのトランジッションのうちの2つ、すなわちMPについての290.1〜184.1およびd5−MPについての295.1〜189.1を、較正曲線の生成および定量化の目的のために使用した。290.1〜210.1および290.1〜228.1のトランジッションを、MPの定性的な二次確認として使用した。
【０１４０】
屈折率の検出によるHPLCでのピルビン酸の測定
ピルビン酸およびα−ケトグルタル酸などの他の有機酸を、屈折率検出器を備える高性能液体クロマトグラフィ（HPLC）システムを使用して測定した。システムを、Waters  2690およびWaters  2414屈折率検出器で較正した。
【０１４１】
いくつかの場合において、化合物の分離を、Aminex（登録商標）HPX−87H（300  x  7.8mmのイオン交換カラム）を使用して、35−60℃で定組成溶離によって行った。溶離液を、水中の0.01  Nの硫酸とし、流量を0.5−0.6mL／分とした。分析対象の試料を、酸が解離していない形態であることを保証するため、移動相に溶出させた。試料を、0.2μmのフィルタ−でのろ過の後に分析した。注入体積は10μLであった。良好な線形性を有する基準曲線が、それぞれの酸について、0.6〜5g／Lの間のピルビン酸濃度について作成された。
【０１４２】
下流のプロセスを説明する実施例において、クロマトグラフィ分離を、Waters  2690液体クロマトグラフィ・システムおよび2つのRestek  Aqueous  Allure−C18  5.0μm逆相クロマトグラフィ・カラム（4.6mm  x  250mm）を使用して、0.8mL／分の流量で行った。移動相は、50mMリン酸バッファ（リン酸にてpH  2.5）とし、アイソクラチックな条件のもとで流した。これらのカラムを、50℃の温度に保持した。RI検出器を、32の感度設定にて50℃で動作させた。500〜2500  ppmの基準曲線を使用した。
【０１４３】
四ホウ酸ナトリウムを使用したインド−ル−3−ピルビン酸の検出
この手順は、インド−ル−3−ピルビン酸のエノ−ル型のホウ酸複合体を測定する。
標準液またはインド−ル−3−ピルビン酸を含んでいる反応混合物試料（0.005mL）を、96穴のマイクロ力価プレ−トにおいて、0.5mMのEDTAおよび0.5mMのヒ酸ナトリウムを含んでいる50mMの四ホウ酸ナトリウム（pH  8.5、0.2mL）へと加えた。次いで、マイクロ力価プレ−トを30℃でインキュベ−トし、327nmにおける吸光を測定した。生成される色が安定でないため、すべての測定を、インド−ル−3−ピルビン酸溶液の添加の正確に30分後に行った。100%のエタノ−ルに溶解させた0〜10mMのインド−ル−3−ピルビン酸を、標準曲線のために使用した。これらの溶液を、アッセイの間、−20℃で保存した。
【０１４４】
ヒドロキシアミン誘導体化法およびUPLC／MSを使用するHMO分析
HMO分析を、最初にアリコ−トをあらかじめ希釈した生化学的反応の試料から取り出し、次いで超音波室温水槽において25分にわたってp−ニトロベンジル・ヒドロキシルアミン（NBHA）塩酸塩（ピリジンにおいて作成）を使用することによって誘導体化することによって実行した。誘導体化プロセスの完了後に、反応混合物を既知の体積まで水でさらに希釈し、超性能液体クロマトグラフィ質量分析（UPLC／MS）を加えた。UPLC／MSシステムには、260nm〜499nmの波長領域を監視するように設定されたフォトダイオ−ド・アレイ（PDA）検出器が含まれている。LC分離を、上述のWatersUPLCシステムおよび2.1mm  x  100mmのAgilent  Eclipse  XDB−  C18  1.8μm逆相クロマトグラフィ・カラムを使用し、0.24mL／分の流量に設定し、以下の勾配条件を採用して行った。
【０１４５】
【表６】
2009538145.tif 000011
【０１４６】
*移動相Aは、10mMのギ酸アンモニウムを有する0.3%  (v／v)のギ酸であり、Bは、50:50のMeOH／アセトニトリル中の10mMのギ酸アンモニウムを有する0.3%のギ酸である。カラムの温度は45℃とした。
【０１４７】
負の電気スプレイ・イオン化モ−ド（−ESI）にて動作するLC／MS走査モ−ド実験のためのWaters  Premier  XE三連四重極質量分析計のパラメ−タを、以下のように設定した。すなわち、キャピラリ−：3.0kV；コ−ン：25V；抽出器：3V；RFレンズ：0V；ソ−ス温度：120℃；脱溶媒温度：350℃；脱溶媒ガス：650L／h；コ−ンガス：47L／hr；低質量分解能（Q1）：13.5；高質量分解能（Q1）：13.5；イオンエネルギ−（Q1）：0.5V；入口：30V；衝突エネルギ−：3V；出口  1：30；低質量分解能（Q2）：15；高質量分解能（Q2）：15；イオンエネルギ−（Q2）：2.0；増倍管：650。120M／z〜1000M／zのマス走査範囲のMS法を、HMO−NBHAおよび2−オキソグルタミン−NBHA誘導体の定性的同定のために使用した。HMO−NBHAの定量化を、275nm  の波長で測定される2−オキソグルタミン−NBHA誘導体のモル応答にもとづいて行った。
【実施例７】
【０１４８】
B.  sphaericus  D−アラニン・アミノトランスフェラ−ゼの発現および精製
細胞の培養および遺伝子の導入を、Overnight  Express  System  II(EMD  Biosciences／Novagen;Madison,  WI)を使用して行った。他のすべての材料は、HIS6−HEXaspCアミノトランスフェラ−ゼの精製に使用したものと同じである。
B.  sphaericus  D−アラニン・アミノトランスフェラ−ゼをコードしている遺伝子のクロ−ニングは、参照として本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2006／0252135号の実施例20に記載されている。
【０１４９】
アミノ末端HIS6−精製タグを有するB.  sphaericus  D−アラニン・アミノトランスフェラ−ゼを、振盪フラスコに50  μg／mLのカナマイシンを含んでいるOvernight  Express  System  II  (溶液1〜6)を使用して生成した。この発現システムは、細胞の培養を監視する必要なく、IPTG−誘導可能な系の発現を誘導する。BL21(DE3)::  B.  sphaericus  dat  pET30aの液体培養物またはグリセロ−ル・ストックからの培地のアリコ−ト（200mL）を（1Lのフラスコに）接種した後で、培養物を225rpmで振盪させつつ一晩にわたって30℃でインキュベ−トした。OD600が6を超えたときに、細胞を、JS−16.25ロ−タを備えるBeckman  (Fullerton,  CA)  J25II遠心分離器における10分間にわたる10,000rpmでの遠心分離によって収穫した。細胞ペレットを低温バッファで1回洗浄し、細胞を再び遠心分離した。洗浄後の細胞ペレットを収穫して速やかに使用し、あるいは精製に必要とされるまで−80℃で冷凍した。B.  sphaericus  HIS6−D−アラニン・アミノトランスフェラ−ゼ（HIS6−BsphDAT）タンパク質を含んでいる無細胞抽出物を作成するため、細胞を50mMのリン酸カリウム（pH  7.8、0.5μmのPLPを含んでいる）の3〜4体積に懸濁させ、懸濁液の温度を15℃未満に保ちつつ、Microfluidics  （Newton,MA）のホモジナイザ−を使用（20,000  psiで3回の通過）して破壊した。あるいは、細胞抽出物を、1μL／mLの  BenzonaseR  Nuclease  (EMD  Bioscience)、5μL／mLのProtease  Inhibitor  Cocktail  Set  II  (EMD  Bioscience)、および0.33μL／mL  rLysozyme（商標）(EMD  Bioscience)を含んでいるNovagen  BugBuster  (primary  amine−free)  Extraction  Reagent  (EMD  Bioscience;Madison,  WI)を使用し、製造者の指定に従って作成した。いずれの場合も、JS−25ロ−タを備えるBeckman  J25II遠心分離器において30分間にわたる15,000rpmでの遠心分離によって細胞残屑を除去し、無細胞抽出物を生成した。HIS6−標識タンパク質の以後のすべての精製工程は、4℃で実行した。600mLのOvernight  Express  II培養物からの無細胞抽出物を、前もって200mMの塩化ナトリウムおよび50μmのPLPを含んでいる100mMのリン酸カリウム（pH  7.8）で平衡させたGE  Healthcare  (Piscataway,  NJ)  Chelating  Sepharose（商標）  Fast  Flow樹脂（ニッケル（II）型）を含んでいる2つの40〜45mLのカラムに加えた。試料の装填後に、3−5体積の平衡バッファ、25mMのイミダゾ−ルを含んでいる3−5体積の平衡バッファ、50−100mMのイミダゾ−ルを含んでいる3−5体積の平衡バッファ、および500mMのイミダゾ−ルを含んでいる3−5体積の平衡バッファで順にカラムの洗浄／溶出を行った。HIS6−BsphDATが、最後の洗浄において溶出した。500mMのイミダゾ−ルでの洗浄物を、Amicon  (Billerica,MA)  Centricon−70またはUltra−15遠心分離フィルタ−装置（MWCO  10  kDa）で濃縮した。イミダゾ−ルおよび塩化ナトリウムを、前もって50μmのPLPを含んでいる100mMのリン酸カリウム（pH  7.8）で平衡させた使い捨てのGE  Healthcare  PD10脱塩カラムに通すことによって除去した。脱塩後の溶液のタンパク質濃度を、Pierce  BCAアッセイ・キット（Rockford,  IL）を使用して測定した。それぞれの留分の純度および無細胞抽出物留分の発現のレベルを、Bio  Rad  (Hercules,  CA)  Experion  Pro260Microcapillary  chip  systemを使用して測定し、あるいは4−15%の勾配ゲルでSDS−PAGEによって測定した。典型的には、この手順は、Experionソフトウェアでの判定にて約90%の純度である300ｍｇ超の酵素を（600mLのOvernight  Express  II培養物から）もたらす。精製後の酵素のアリコ−ト（1−5mL）を、使用まで-80℃で保存した。
【実施例８】
【０１５０】
アルドラ−ゼの発現および精製
材料
細胞の培養および遺伝子の導入を、Overnight  Express  System  II(EMD  Biosciences／Novagen;Madison,  WI)を使用して行った。他のすべての材料は、HIS6−HEXaspCアミノトランスフェラ−ゼの精製において使用したものと同じである。
【０１５１】
アルドラ−ゼをコードしている遺伝子のクロ−ニングが、参照としてその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2006／0252135号の実施例3に記載されている（本明細書のアルドラ−ゼは、この参考文献の配列ID番号：22に関連する）。
【０１５２】
アミノ末端HIS6−精製タグを有するアルドラ−ゼを、振盪フラスコに50μg／mLのカナマイシンを含んでいるOvernight  Express  System  II  (溶液1〜6)を使用して生成した。この発現システムは、細胞の培養を監視する必要なく、IPTG−誘導可能な系の発現を誘導する。コンストラクトの液体培養物またはグリセロ−ル・ストックからの培地のアリコ−ト（200mL）を（1Lのフラスコに）接種した後で、培養物を225rpmで振盪させつつ一晩にわたって30℃でインキュベ−トした。OD600が6を超えたときに、細胞を、JS−16.25ロ−タを備えるBeckman  (Fullerton,  CA)  J25II遠心分離器における10分間にわたる10,000rpmでの遠心分離によって収穫した。細胞ペレットを低温バッファで1回洗浄し、細胞を再び遠心分離した。洗浄後の細胞ペレットを収穫して速やかに使用し、あるいは精製に必要とされるまで−80℃で冷凍した。HIS6−標識アルドラ−ゼを含む無細胞抽出物を、1μL／mLの  BenzonaseR  Nuclease  (EMD  Bioscience)、5μL／mLのProtease  Inhibitor  Cocktail  Set  II  (EMD  Bioscience)、および0.33μL／mL  rLysozyme（商標）(EMD  Bioscience)を含んでいるNovagen  BugBuster  (primary  amine−free)  Extraction  Reagent  (EMD  Bioscience;Madison,  WI)を使用し、製造者の指定に従って作成した。JS−25ロ−タを備えるBeckman  J25II遠心分離器において30分間にわたる15,000rpmでの遠心分離によって細胞残屑を除去し、無細胞抽出物を生成した。HIS6−標識タンパク質の以後のすべての精製工程は、4℃で実行した。800mLのOvernight  Express  II培養物からの無細胞抽出物を、前もって200mMの塩化ナトリウムを含んでいる100mMのリン酸カリウム（pH  7.8）で平衡させたGE  Healthcare  (Piscataway,  NJ)  Chelating  Sepharose（商標）Fast  Flow樹脂（ニッケル（II）型）のカラムに加えた。試料の装填後に、3−5体積の平衡バッファ、25mMのイミダゾ−ルを含んでいる3−5体積の平衡バッファ、50−100mMのイミダゾ−ルを含んでいる3−5体積の平衡バッファ、および500mMのイミダゾ−ルを含んでいる3−5体積の平衡バッファで順にカラムの洗浄／溶出を行った。HIS6−タグを有するアルドラ−ゼが、最後の洗浄において溶出した。500mMのイミダゾ−ルでの洗浄物を、Amicon  (Billerica,MA)  Centricon−70またはUltra−15遠心分離フィルタ−装置（MWCO  10  kDa）で濃縮した。イミダゾ−ルおよび塩化ナトリウムを、前もって200mMの塩化ナトリウムおよび4mMのMgCl2を含んでいる100mMのリン酸カリウム（pH  7.8）で平衡させた使い捨てのGE  Healthcare  PD10脱塩カラムに通すことによって除去した。脱塩後の溶液のタンパク質濃度を、Pierce  BCAアッセイ・キット（Rockford,  IL）を使用して測定した。それぞれの留分の純度および無細胞抽出物留分の発現のレベルを、Bio  Rad  (Hercules,  CA)  Experion  Pro260Microcapillary  chip  systemを使用して測定し、あるいは4−15%の勾配ゲルでSDS−PAGEによって測定した。典型的には、この精製手順は、Experionソフトウェアでの判定にて85〜90%の純度である18〜20mg超の酵素を（800mLのOvernight  Express  II培養物から）もたらす。精製後の酵素のアリコ−ト（1mL）を、使用まで−80℃で保存した。
【実施例９】
【０１５３】
2つの反応段階を使用するD−トリプトファンおよびピルビン酸からのR,R−モナチンの生体触媒による小規模生成
材料
すべての試薬は、分析グレ−ドまたは市販の最高グレ−ドのものとした。R,R−モナチンの形成を触媒するために使用されるB.  sphaericus  HIS6−標識D−アラニン・アミノトランスフェラ−ゼおよびHIS6−標識アルドラ−ゼを、実施例7および8に記載のとおりに精製した。
【０１５４】
方法および結果
D−トリプトファンおよびピルビン酸からR,R−モナチンを生体触媒によって生成するための小規模な手順であって、反応混合物から酸素を排除することによって中間体であるインド−ル−3−ピルビン酸の酸素触媒による分解を最小限にする手順を開発した。酵素反応を、ストッパおよびアルミニウム・シ−ルを有する10−mLのガラス血清ボトルにおいて実行した。
【０１５５】
反応1：200mMのピルビン酸ナトリウム、4mMのMgCl2、および50μmのPLPのリン酸カリウム溶液（pH  7.8）を、100mLの血清ボトルに作成した。ボトルにストッパを取り付け、シ−ルを行い、次いで液体を数分間にわたってチッ素でパ−ジした。この溶液のアリコ−トを、固体D−トリプトファンを含んでいる10−mLの血清ボトルへと嫌気的に移した。これらの10−mLのボトルをストッパおよびアルミニウム・シ−ルで前もって閉じ、次いでチッ素でパ−ジした。酵素溶液を、精製HIS6−標識アルドラ−ゼについて0.05  g／LおよびHIS6−D−アラニン・アミノトランスフェラ−ゼについて0.5  g／Lの濃度まで加えた（7mLの最終的な体積）。最終的なリン酸カリウムの濃度は、酵素溶液からのバッファの寄与を含め、25mMであった。D−トリプトファンの最終濃度は、100mMであった。反応ボトルを、穏やかに混合しつつ室温でインキュベ−トし、酵素の添加の5時間および20時間後にサンプリングを行った。界面活性剤Tween−80の酵素安定化効果を、この界面活性剤を0.1%および0.01%で反応混合物の一部へと加えることによって測定した。反応の進行を、D−トリプトファン、D−アラニン、R,R−モナチン、R−モナチン前駆体（2−ヒドロキシ−2−（1H−インド−ル−3−イルメチル）−4−オキソ−ペンタン二酸）、およびピルビン酸を測定することによって見守った。トリプトファン、アラニン、およびモナチンの濃度を、蛍光ポスト・カラム誘導体化法を使用して測定した。すべての分析方法は、実施例6に記載されている。
一晩のインキュベ−ションの後で、Amicon  Ultra−15遠心分離フィルタ−装置（MWCO  10  kDa）を使用した限外ろ過によって、タンパク質を反応混合物から除去した。
【０１５６】
反応2：タンパク質を除いた溶液を、固体D−アラニンを含んでいる10−mLの血清ボトルへと加えた。これらの10−mLのボトルは、前もってストッパおよびアルミニウム・シ−ルで閉じて、チッ素でパ−ジしておいた。次いで、反応を開始させるため、HIS6−  D−アラニン・アミノトランスフェラ−ゼを0.5mg／mLの最終濃度で加えた（最終的な体積は5mL）。D−アラニンの最終的な濃度は、1500mMであった。反応ボトルを、穏やかに混合しつつ室温でインキュベ−トし、酵素の添加の4時間および20時間後にサンプリングを行った。反応の進行を、D−トリプトファン、D−アラニン、R,R−モナチン、R−モナチン前駆体（2−ヒドロキシ−2−（1H−インド−ル−3−イルメチル）−4−オキソ−ペンタン二酸）、およびピルビン酸を測定することによって見守った。トリプトファン、アラニン、およびモナチンの濃度を、蛍光ポスト・カラム誘導体化法を使用して測定した。ピルビン酸の濃度は、LC−RI法および分離のためのAminex（登録商標）カラムを使用して測定した。すべての分析方法は、実施例6に記載されている。
【０１５７】
【表７】
2009538145.tif 000012
【実施例１０】
【０１５８】
B.  sphaericus  D−アラニン・アミノトランスフェラ−ゼの固定
Bacillus  sphaericus  D−アラニン・アミノトランスフェラ−ゼを、実施例7に記載のようにHIS6−標識タンパク質として精製した。
酵素を、Mateoら（2002）の手順に従ってEupergit（登録商標）C250L樹脂ビ−ズに固定した。48ｍｇの精製済み酵素（9.3mg／mLで5.2mL）に、0.5Mの最終濃度および7.8のpHまでリン酸カリウムを加え、0.05mMの最終濃度までピリドキサル・リン酸（PLP）を加えた。得られた溶液を、Sigma−Alrich  (St.Louis,MO)から購入した0.4gのEupergit（登録商標）C250L樹脂と混合した。酵素−樹脂の懸濁を、穏やかに混合しつつ一晩のあいだ室温でインキュベ−トした。樹脂ビ−ズを、5分間にわたる4000xgの遠心分離によって酵素溶液から分離した。浮遊物を取り除き、樹脂を0.05mMのPLPを含むpH  7.8の3  x  5mLの100mMリン酸カリウムで洗浄した。洗浄の間に、混合物を5分間にわたって4000xgで遠心分離した。樹脂へと結合したタンパク質の量を、各洗浄においてタンパク質の量を測定し、合計を固定されるべきタンパク質の元の量から引き去ることによって割り出した。タンパク質の濃度を、ウシ血清アルブミンを標準としてPierce（Rockford,  IL）BCA（商標）タンパク質アッセイ・キットを使用して測定した。固定されて洗浄された酵素ビ−ズを、0.05mMのPLPを含んでいる3mLの100mMリン酸カリウム（pH  7.8）に最終的に懸濁させた。固定された酵素ビ−ズの未反応のエポキシ基を、穏やかに混合しつつ室温で1.4Mのグリシンでインキュべ−ションすることによってブロックした。24時間後に、ビ−ズを0.05mMのPLPを含んでいる4  x  10mLの50mM  EPPS（pH  8.4）で洗浄して余分なグリシンを取り除き、最後に、0.05mMのPLPを含んでいる5mLの50mM  EPPS（pH  8.4）に再び懸濁させた。固定された酵素の最終の濃度は、1gの樹脂ビ−ズにつき66mgのタンパク質であった。
【０１５９】
参考文献：Mateo,  C.,  Abain,  O.,  Fernandez−Lorente,  G.,  Pedroche,  J.,  Fernandez−Lafuente,  R.,  Guisan,  J.M.,  Tam,  A.,  and  Daminati,M.,  Biotechnology  Progress  18(3):  629−634  (2002).
【実施例１１】
【０１６０】
配列ID番号：2のアルドラ−ゼをコードする配列ID番号：1のアルドラ−ゼ遺伝子のクロ−ニング
配列ID番号：2のアルドラ−ゼをコードしている遺伝子（この遺伝子のDNA配列が、配列ID番号:1として示されている）を、酵素の精製を可能にするためのN−末端His−タグを備えるpET28b発現ベクタ−（EMD  Biosciences／Novagen,Madison,  WI）へとサブクロ−ンした。また、この遺伝子を、pET30a（タグなし）へもクロ−ンした。
【０１６１】
クロ−ニングに使用したプライマを以下に示す。
5'−ATAAGACATATGCCTATCGTTGTTACGAAG−3'（NdeI  制限酵素認識部位）（配列ID番号:5）、および
5'−ATAAGAGGATCCTTATTCCTCGGGCAGCCGCTC−3'（BamHI制限酵素認識部位）（配列ID番号:6）。
【０１６２】
配列ID番号:1を含んでいるクロ−ンを、Diversa  Corporation,  San  Diego,  CAから受け取り、PCRのテンプレ−トとして使用した。しかしながら、配列ID番号:1を、当業者に公知の他の方法によって再現することも可能である。例えば、配列ID番号:1を、アセンブリPCR法を利用して再現することができる。配列ID番号:1をPCRによって増幅し、制限酵素NdeIおよびBIによって消化し、アガロ−ス・ゲルから精製した（QIAquick（登録商標）Gel  extraction  Kit（Qiagen,  Valencia,  CA））。消化物を、NdeIおよびBamHIで消化したpET28b（EMD  Biosciences／NovagenMadison,  WI）およびpET30aへと結紮し、ゲルを精製した。結紮を、TOP10  E.  coli細胞へと変換した（Invitrogen,  Carlsbad,  CA）。コロニ−からのプラスミドDNAを、アガロ−ス・ゲルの電気泳動を使用したサイズ比較によって、インサ−トの存在について分析した。予測されたサイズのインサ−トを有する単離体を、DNA配列分析（Agencourt,  Beverly,MA）のために供した。
【０１６３】
配列ID番号：2のアルドラ−ゼをコードする遺伝子配列ID番号：1のDNA配列が、以下に示されている。
atgcctatcg ttgttacgaa gatcgaccga cccagcgcgg cggacgtcga aaggatcgcc gcctatggtg
tcgcgacctt gcatgaagcg caaggacgaa ccgggttgat ggcgtccaat atgcgcccaa tctatcgccc
tgcgcacatt gccgggcccg cggtgacctg ccttgtggcg cctggcgaca attggatgat ccatgtcgcc
gtcgaacagt gccagccggg agatgtcctg gtcgtggtac cgaccagccc ctgcgaagac ggctatttcg
gcgatctgct ggcgacctcg ctgcggtcgc gcggggtcaa aggtctgatc atcgaggccg gcgtacgcga
tatcgcgaca ttgaccgaga tgaaattccc ggtctggtcc aaggcggtgt tcgcgcaagg aacggtcaag
gagaccatcg ccagcgtcaa tgtgcccctc gtctgcgcgg gcgcccgcat cgtgccgggc gatctgatcg
ttgccgacga cgacggggtc gtcgtgattc caagacgttc cgttccggcg gtcctttcca gcgccgaggc
ccgcgaagag aaggaagccc gcaaccgcgc ccgcttcgaa gctggcgagc tgggcctcga cgtctacaac
atgcgccagc gcctggccga caagggcttg cgctatgtcg agcggctgcc cgaggaatag (配列ID番号:1)。
【０１６４】
配列ID番号:2のアルドラ−ゼのタンパク質配列は、以下のとおりである。
Met Pro Ile Val Val Thr Lys Ile Asp Arg Pro Ser Ala Ala Asp Val Glu ArgIle Ala Ala Tyr Gly Val Ala Thr Leu His Glu Ala Gln Gly Arg Thr Gly LeuMet Ala Ser Asn Met Arg Pro Ile Tyr Arg Pro Ala His Ile Ala Gly Pro AlaVal Thr CysLeu Val Ala Pro Gly Asp Asn Trp Met Ile His Val Ala Val Glu Gln Cys Gln Pro Gly Asp Val Leu Val Val Val Pro Thr Ser Pro Cys Glu AspGly Tyr Phe Gly Asp Leu Leu Ala Thr Ser Leu Arg Ser Arg Gly Val Lys GlyLeu Ile Ile Glu Ala Gly Val Arg Asp Ile Ala Thr Leu Thr Glu Met Lys PhePro Val Trp Ser Lys Ala Val Phe Ala Gln Gly Thr Val Lys Glu Thr Ile AlaSer Val Asn Val Pro Leu Val Cys Ala Gly Ala Arg Ile Val Pro Gly Asp LeuIle Val Ala Asp Asp Asp Gly Val Val Val Ile Pro Arg Arg Ser Val Pro AlaVal Leu Ser Ser Ala Glu Ala Arg Glu Glu Lys Glu Ala Arg Asn Arg Ala ArgPhe Glu Ala Gly Glu Leu Gly Leu Asp Val Tyr Asn Met Arg Gln Arg Leu AlaAsp Lys Gly Leu Arg Tyr Val Glu Arg Leu Pro Glu Glu (配列ID番号:2)。
【実施例１２】
【０１６５】
配列ID番号:2のアルドラ−ゼの精製
細胞の培養および遺伝子の導入を、Overnight  Express  System  II(EMD  Biosciences／Novagen;Madison,  WI)を使用して実行した。他のすべての材料は、HIS6−HEXaspCアミノトランスフェラ−ゼの精製において使用したものと同じである。
配列ID番号:2のアルドラ−ゼをコ−ドする遺伝子のクロ−ニングは、実施例11に記載されている。
【０１６６】
アミノ末端HIS6−精製タグを有する配列ID番号:2のアルドラ−ゼを、振盪フラスコに50μg／mLのカナマイシンを含んでいるOvernight  Express  System  II  (溶液1〜6)を使用して生成した。pET28bコンストラクトの液体培養物またはグリセロ−ル・ストックからの培地のアリコ−ト（200mL）を（1Lのフラスコに）接種した後で、培養物を225rpmで振盪させつつ一晩にわたって30℃でインキュベ−トした。OD600が6を超えたときに、細胞を、JS−16.25ロ−タを備えるBeckman  (Fullerton,  CA)  J25II遠心分離器における10分間にわたる10,000rpmでの遠心分離によって収穫した。細胞ペレットを低温バッファで1回洗浄し、細胞を再び遠心分離した。洗浄後の細胞ペレットを収穫して速やかに使用し、あるいは精製に必要とされるまで−80℃で冷凍した。HIS6−標識配列ID番号:2のアルドラ−ゼを含んでいる無細胞抽出物を、1μL／mLのBenzonase（登録商標）Nuclease(EMD  Bioscience)、5μL／mLのProtease  Inhibitor  Cocktail  Set  II  (EMD  Bioscience)、および0.33μL／mL  rLysozyme（商標）(EMD  Bioscience)を含んでいるNovagen  BugBuster  (primary  amine−free)  Extraction  Reagent  (EMD  Bioscience;Madison,  WI)を使用し、製造者の指定に従って作成した。細胞残屑を、JS−25ロ−タを備えるBeckman  J25II遠心分離器において30分間にわたる15,000rpmでの遠心分離によって除去し、無細胞抽出物を生成した。HIS6−標識タンパク質の以後のすべての精製工程は、4℃で実行した。2  x  200mLのOvernight  Express  II培養物からの無細胞抽出物を、前もって200mMの塩化ナトリウムを含んでいる100mMのリン酸カリウム（pH  7.8）で平衡させたGE  Healthcare  (Piscataway,  NJ)  Chelating  Sepharose（商標）  Fast  Flow樹脂（ニッケル（II）型）のカラムに加えた。試料の装填後に、25mMのイミダゾ−ルを含んでいる3−5体積の平衡バッファ、50−100mMのイミダゾ−ルを含んでいる3−5体積の平衡バッファ、および500mMのイミダゾ−ルを含んでいる3−5体積の平衡バッファで順にカラムの洗浄／溶出を行った。HIS6−タグ付けされた配列ID番号:2のアルドラ−ゼが、最後の洗浄において溶出した。500mMのイミダゾ−ルでの洗浄物を、Amicon(Billerica,MA)Centricon−70またはUltra−15遠心分離フィルタ−装置（MWCO  10  kDa）で濃縮した。イミダゾ−ルおよび塩化ナトリウムを、前もって100mMのリン酸カリウム（pH  7.8）で平衡させた使い捨てのGE  Healthcare  PD10脱塩カラムに通すことによって除去した。酵素は、4mMのMgCl2、200mMのNaCl、および／または0.01%のTween−80が溶出バッファへと加えられた場合、脱塩工程の後で可溶性（タンパク質溶液の混濁によって判断）が低くなった。脱塩後の溶液のタンパク質濃度を、Pierce  BCAアッセイ・キット（Rockford,  IL）を使用して測定した。それぞれの留分の純度および無細胞抽出物留分の発現のレベルを、Bio  Rad(Hercules,  CA)  Experion  Pro260Microcapillary  chip  systemを使用して測定し、あるいは4−15%の勾配ゲルでSDS−PAGEによって測定した。典型的には、この精製手順は、Experionソフトウェアでの判定にて85〜90%の純度である50〜80mgの酵素を（400mLのOvernight  Express  II培養物から）もたらす。精製後の酵素のアリコ−ト（1mL）を、使用まで−80℃で保存した。
【実施例１３】
【０１６７】
配列ID番号:2のアルドラ−ゼの固定
配列ID番号:2のアルドラ−ゼを、実施例12に記載のようにHIS6−標識タンパク質として精製した。
酵素を、Mateoら（2002）の手順に従ってEupergit（登録商標）C樹脂ビ−ズに固定した。20.4mgの精製済み酵素（1.45mg／mLで14.1mL）に、0.5Mの最終濃度および7.8のpHならびに1mMのMgCl2の最終濃度までリン酸カリウムを加えた。得られた溶液を、Sigma−Alrich  (St.Louis,MO)から購入した0.2gのEupergit（登録商標）C250L樹脂と混合した。酵素−樹脂の懸濁を、穏やかに混合しつつ一晩のあいだ室温でインキュベ−トした。樹脂ビ−ズを、5分間にわたる4000xgの遠心分離によって酵素溶液から分離した。浮遊物を取り除き、樹脂を1mMのMgCl2を含む3x5mLの100mMリン酸カリウム（pH  7.8）で洗浄した。洗浄の間に、混合物を5分間にわたって4000xgで遠心分離した。樹脂へと結合したタンパク質の量を、実施例10に記載したBacillus  sphaericusからのアミノトランスフェラ−ゼの固定について説明したように測定した。固定されて洗浄された酵素ビ−ズを、1mMのMgCl2を含んでいる3mLの100mMリン酸カリウム（pH  7.8）に最終的に懸濁させた。固定された酵素ビ−ズの未反応のエポキシ基を、穏やかに混合しつつ室温で1.4Mのグリシンでインキュべ−ションすることによってブロックした。24時間後に、ビ−ズを1mMのMgCl2を含んでいる4x10mLの50mM  EPPS（pH  8.4）で洗浄して余分なグリシンを取り除き、最後に、1mMのMgCl2を含んでいる5mLの50mM  EPPS（pH  8.4）に再び懸濁させた。固定された酵素の最終の濃度は、1gの樹脂ビ−ズにつき90mgのタンパク質であった。
【実施例１４】
【０１６８】
精製タグなしでクロ−ンされた配列ID番号:2のアルドラ−ゼの発現
配列ID番号:1の遺伝子を、標準的な分子生物学の手順を使用して、NgoMIV制限酵素認識部位およびベ−タ・ラクタマ−ゼ遺伝子（bla）の容易な除去のために追加された第2のpsiI制限酵素認識部位に挿入されたE.  coli  MetE遺伝子およびプロモ−タを含んでいるpET23dベクタ−（Novagen,Madison,  WI）の誘導体へとサブクロ−ンした。myo−イノシト−ル・オキシゲナ−ゼ遺伝子のためのインサ−トを含んでいるこのベクタ−の構成が、PCT  WO  2006／066072の実施例2および20に記載されている。このアルドラ−ゼ・インサ−トを、DNA配列決定（Agencourt  Bioscience  Corporation;  Beverly,MA）によって確認し、正しいインサ−ト配列を有するプラスミドを、E.  coli発現ホストBW30384(DE3)ΔompTΔmetEへと変換した。この発現ホストの構成および変換手順も、PCT  WO  2006／066072に記載されている（実施例21および22）。アルドラ−ゼ遺伝子を、3Lの培養槽においてラクト−スでの誘導によって発現させた。誘導の手順は、実施例1に記載されている。アルドラ−ゼを含んでいる無細胞抽出物を作成するために、細胞を、1mMのMgCl2を含んでいる3−4体積の100mMリン酸カリウム（pH  7.8）に懸濁させ、次いで実施例2に記載のとおりに破壊した。細胞残屑を、4℃での30分間にわたる20,000〜25,000xgでの遠心分離によって除去した。無細胞抽出物中の可溶性タンパク質を、Bio−RadLaboratories  Experion（商標）Automated  Electrophoresis  Station  (Bio−Rad,  Hercules,  CA)に分離し、Experionソフトウェアを使用し、あるいは4−15%の勾配ゲルを使用するSDSポリアクリルアミド・ゲル電気泳動によって、パ−セント可溶性タンパク質発現について分析した。
【実施例１５】
【０１６９】
2つの反応段階を使用するD−トリプトファンおよびピルビン酸からのR,R−モナチンの小さな発酵槽での生体触媒による生成
材料
すべての試薬は、分析グレ−ドまたは市販の最高グレ−ドのものとした。R,R−モナチンの生体触媒による生成に使用されるD−アラニン・アミノトランスフェラ−ゼを、Biocatalytics,  Inc.(Pasadena,  CA)(カタログ番号AT−103)から購入する一方で、生成に使用される配列ID番号:2のアルドラ−ゼを、実施例14に記載のとおりに作成した。
【０１７０】
方法および結果
2段階の反応を、0.7LのINFORS（Bottmingen,  Switzerland）バイオリアクタ−において250mLで実行した。反応を、チッ素の上部空間のもとでpH  8.4および25℃に維持した。
混合物1（第1の反応混合物）：25mMのEPPS（pH  8.4）、1mMのMgCl2、5mMのリン酸カリウム、および50μMのピリドキサル・リン酸（PLP）の溶液を、発酵槽内に用意した。この液体を、200mMのピルビン酸ナトリウムおよび100mMのD−トリプトファンの固体としての添加に先立ち、数分間にわたってチッ素でスパ−ジした。基質の追加後かつ酵素の添加の前に、pHを水酸化ナトリウムによって8.4へと調節した。D−アラニン・アミノトランスフェラ−ゼを、2mg／mLの最終濃度まで固体として添加し、アルドラ−ゼを、0.01mg／mLの最終濃度まで無細胞抽出物として添加した（酵素および基質の添加ごの最終的な体積は250mL）。反応混合物を、チッ素の上部空間のもとで250rpmで攪拌しつつ25℃でインキュベ−トした。反応の進行を、D−トリプトファン、D−アラニン、R,R−モナチン、R−モナチン前駆体（2−ヒドロキシ−2−（1H−インド−ル−3−イルメチル）−4−オキソ−ペンタン二酸）、およびピルビン酸を測定することによって見守った。トリプトファンおよびアラニンの濃度を、蛍光ポスト・カラム誘導体化法を使用して測定した。モナチンを、LC／MS／MS法を使用して定量化した。すべての分析方法は、実施例6に記載されている。
【０１７１】
限外ろ過：一晩のインキュベ−ションの後に、Millipore  Pellicon（登録商標）50cm2限外ろ過カ−トリッジ(MWCO  10,000)(GE  Healthcare,  Piscataway,  NJ)を使用した限外ろ過によって、タンパク質を反応混合物から除去した。プロセスにおいては、元の発酵槽および透過物を受け取る第2の発酵槽にチッ素雰囲気を維持することによって、酸素を排除した。
【０１７２】
混合物2（第2の反応混合物）:タンパク質を除いた溶液（ほぼ230mL）に、D−アラニンを1Mの最終濃度まで加え、D−アラニン・アミノトランスフェラ−ゼを2mg／mLの最終濃度まで加えた。反応を、チッ素の上部空間のもとで250rpmで攪拌しつつ25℃でインキュベ−トした。反応の進行を、混合物1について上述したとおりに見守った。
【０１７３】
【表８】
2009538145.tif 000013
【０１７４】
結果は、この2段階のプロセスが、250mLの規模で実行された場合にモナチンの力価を2倍を超えて向上させることを示している。
【実施例１６】
【０１７５】
2つの反応段階および固定された酵素を使用するD−トリプトファンおよびピルビン酸からのR,R−モナチンの生体触媒による小規模生成
材料
R,R−モナチンの形成を触媒するために使用B.  sphaericus  HIS6−標識D−アラニン・アミノトランスフェラ−ゼおよびHIS6−標識配列ID番号:2のアルドラ−ゼを、実施例10および13に記載のとおり固定した。反応中間体の酸素触媒による分解を最小限にするために、反応を、97−98%のチッ素および2−3%の酸素からなる雰囲気のCoy嫌気チャンバにおいて準備および実行した。
【０１７６】
方法および結果
反応1:  50mMのEPPS（pH  8.4）中の100mMのピルビン酸ナトリウム、1mMのMgCl2、および50μMのPLPの溶液を、脱気H2Oを使用してCoy嫌気チャンバに用意した。この溶液に、固体D−トリプトファンを50mMの最終濃度まで加えた。固定した酵素の溶液を、固定された配列ID番号:2のアルドラ−ゼについて0.05  g／Lかつ固定されたアミノトランスフェラ−ゼについて2  g／Lで反応へと加えた（最終的な体積4mL）。反応混合物を、穏やかに混合しつつ室温でインキュベ−トした。反応の進行を、D−トリプトファン、D−アラニン、R,R−モナチン、R−モナチン前駆体（2−ヒドロキシ−2−（1H−インド−ル−3−イルメチル）−4−オキソ−ペンタン二酸）、およびピルビン酸の濃度を測定することによって見守った。すべての分析方法は、実施例6に記載されている。モナチンについては、LC／MS／MS法を利用した。トリプトファンおよびアラニンについては、蛍光ポスト−カラム誘導体化法を利用した。ピルビン酸の分析には、Aminex（登録商標）カラムを分離のために使用した。
【０１７７】
一晩のインキュベ−ションの後で、固定されている酵素を、0.45ミクロンのシリンジ・フィルタ−によるろ過によって、反応混合物から除去した。
反応2:ろ過後の材料に、固体のD−アラニンを1Mの最終濃度まで加え、固定したアミノトランスフェラ−ゼを2  g／Lタンパク質の濃度へと加えた（最終的な体積は5.1mL）。この反応混合物を、穏やかに混合しつつ室温でインキュベ−トした。反応の進行を、HPLCおよび／またはLC−MS分析によって、D−トリプトファン、D−アラニン、R,R−モナチン、R−モナチン前駆体（2−ヒドロキシ−2−（1H−インド−ル−3−イルメチル）−4−オキソ−ペンタン二酸）、およびピルビン酸を測定することによって見守った。
【０１７８】
【表９】
2009538145.tif 000014
【０１７９】
結果は、2段階の反応プロセスが使用された場合に、モナチンの力価の2倍の増加を示している。余分なD−アラニンが追加されること、および第2の段階においてD−アミノトランスフェラ−ゼ酵素のみが存在することで、約5.3mMのモナチン前駆体がモナチンへと変換され、約28mMのインド−ル−3−ピルビン酸が、トリプトファンへと変換された。
【実施例１７】
【０１８０】
限外ろ過
材料
3リットルの量の反応混合物を、Sartorius  BBI  Systems(Bethlehem,  PA)からの5LのBiostat  B発酵槽において嫌気状態のもとで作成した。基準反応物は、25mMのリン酸カリウム（pH  7.8）、4mMの塩化マグネシウム、0.05mMのPLP、0.01%のTween  80、200mMのピルビン酸ナトリウム、および100mMのL−トリプトファンを含んでいた。上記溶液に、未精製のHEXaspCアミノトランスフェラ−ゼおよび生成したComamonas  testosteroni  proAアルドラ−ゼを、それぞれ0.5および0.05  g／Lで加えた。反応を、30℃および250rpmならびにpH  7.8で、チッ素の上部空間のもとで実行した。3−5時間の後に、さらなる100mMのピルビン酸ナトリウムおよび50mMのL−トリプトファンを加えた。反応を18-24時間後に停止させ、限外ろ過に先立って4℃で嫌気的に保持した。限外ろ過を、GE  Osmonicsによって製造されたEPA  CFII  クロスフロ−平坦シ−ト膜ユニットにて行った。試験した膜の種類の一例は、150cm2の表面積を有するNadir  C30  30  kDaMWCO  平坦シ−ト（Microdyn−Nadir  Gmbh,  Wiesbaden,  Germany）である。容器を、酸素に敏感な中間体の分解を最小限にすべく、チッ素によるフラッシングおよびブランケティングを促進するように設計した。
【０１８１】
方法および結果
モナチン、アラニン、トリプトファン、ピルビン酸、I3P、およびMPの分析を、UF作業の前および後で実行した。モナチンおよびトリプトファンの濃度を、実施例6に記載のLC−UV／Vis法を使用して測定した。MP分析は、同じLC−UV／vis法および基準曲線を使用して、半定量的であった。アラニンを、実施例6に記載の蛍光ベ−スのポスト−カラム誘導体化法を使用して定量化した。インド−ル−3−ピルビン酸の分析は、実施例6のトリプトファンと比べたインド−ル−3−ピルビン酸のピ−ク面積にもとづき、定性的であった。UF作業における流量は、およそ0.6  gpmに設定した。戻りの流れの背圧を、50−150  psiの範囲にとどまるように連続的に調節した。分析対象の濃度を、表6に挙げる。システムをすすいでより正確な分析を可能にするために、濃縮物の流れを水で再希釈した。
【０１８２】
【表１０】
2009538145.tif 000015
【０１８３】
供給が8倍に濃縮され、すべての成分の回収が優秀であった。透過物のSDS−PAGE分析により、タンパク質成分が完全に除去されていることが実証された。
【実施例１８】
【０１８４】
アニオン交換
材料
43mLの充てん体積のItochu  Chemicals  America,  Inc.からの樹脂ZGA313を、酢酸の形態でモナチンのアニオン交換生成に使用した。トリプトファン、アラニン、およびモナチンを生物学的反応物のカチオン交換処理後に観察される比に類似した比で含んでいる模擬の溶液を、原料として使用した。試薬グレ−ドの醋酸カリウムを、3M溶液にて溶離剤として使用した。
【０１８５】
方法および結果
溶液を装填し、2.5mL／分での溶離の前に2.5mL／分の脱イオン水ですすいだ。結果を表7に示す。控えめな単一バッチ装填能力が、充てんクされた樹脂1mLにつき0.1gのモナチンであると計算された。モナチンの優れた純度および回収が観察された。少量のモナチンが結合することなく洗い流され、アラニンの一部が、溶離の開始前にカラムから完全にすすぎ出されなかった。分析対象を、実施例17に記載のとおりに測定した。
【０１８６】
【表１１】
2009538145.tif 000016
【実施例１９】
【０１８７】
特殊膜精製
材料
3リットルのタンパク質なしの限外ろ過透過物を、原料として使用した。pHを、HClで7.36へと調節した。膜を、GE  Osmonicsによって製造されたEPA  CFII  クロスフロ−平坦シ−ト膜ユニット上で動作させた。試験した膜の種類の一例は、ITT  Aquios−PCIMembrane  Systems,  Inc.  (Basingstoke,  UK)によって製造されたNPという名前である。これを、150  cm2の表面積を有する平坦なシ−トとして試験した。容器を、酸素に敏感な中間体の分解を最小限にすべく、チッ素によるフラッシングおよびブランケティングを促進するように設計した。
【０１８８】
方法および結果
モナチン、アラニン、トリプトファン、ピルビン酸、I3P、およびMPの分析を、実施例17に記載の方法を使用して膜の動作の各段階において実行した。3つのダイアフィルトレ−ションを、初期の濃縮の後に実行した。膜の動作のための流量を、およそ0.4  gpmに設定した。戻りの流れの背圧を、100−400  psiの範囲にとどまるように連続的に調節した。分析対象の濃度を、表8に挙げる。システムをすすいでより正確な分析を可能にするために、濃縮物の流れを水で再希釈した。
【０１８９】
【表１２】
2009538145.tif 000017
【０１９０】
NP膜は、モナチンの強力な拒絶ならびにアラニンおよびピルビン酸などといったより小さな分子の速やかな洗い流しを示した。これが、NP膜を、下流の精製の選択肢においてアラニンの負担を大幅に少なくするための良好な候補としている。さらに、穏やかな条件が、種々の成分を分解を避けつつリサイクルするために理想的である。他に期待できる膜の選択肢として、NF270(Filmtec（商標）,the  Dow  Chemical  Company,Midland,Michigan)およびNFB(ITT  Aquios−PCIMembrane  Systems,  Inc.(Basingstoke,  UK)が挙げられる。
【実施例２０】
【０１９１】
SDVB分離
材料
供給材料を、表9に示した濃度でのモナチン、トリプトファン、アラニン、およびピルビン酸の模擬の溶液で構成した。この混合物からモナチンを精製するために、Mitsubishiによって製造された合成SDVB吸着剤樹脂HP21を使用した。試薬グレ−ドのエタノ−ルおよび脱イオン水を、溶離剤として使用した。カラムの充てん体積は、直径1.5cm×高さ55.9cmの寸法を有して98.7mLであった。
【０１９２】
方法および結果
280nmにおける吸光度を、溶離の追跡および留分の選択に使用した。流量は、2.5mL／分に設定した。樹脂を、水酸化ナトリウムでpH  8.5へと調節した水で平衡させた。4つの留分が分析のために集められ、表9に挙げられている。カラムを、最初の3つの留分を通じて脱イオン水で洗浄した。主としてトリプトファンを含んでいる最後の留分は、10%の水性エタノ−ルによって溶出された。
【０１９３】
【表１３】
2009538145.tif 000018
【０１９４】
第1の課題は、この筋書きにおいて、とくには反応をさらに駆動するために余分なアラニンが使用される2つの反応の仕組みに鑑みて、アラニンからモナチンを分離することにある。この分離のために、カラムを適切なサイズにすることが重要である。別の同様の種類のSDVB樹脂が、より良好な能力および優れた分離を提供する可能性がある。可能性として、どちらもMitsubishiからのSP70またはSP850、あるいは未だ試験されていない別の樹脂が挙げられる。10%のエタノ−ルの使用が、トリプトファンの溶出を早める。他の精製工程を除いてUF透過物を直接的にSDVBカラムへと装填することも可能であるが、カラムの相対の容量が犠牲になる。比較的に、アニオン樹脂溶離剤の脱塩のためにSDVB樹脂を使用することは、表10に見ることができるとおりきわめて高い装填速度を可能にする。
【０１９５】
【表１４】
2009538145.tif 000019
【０１９６】
脱塩の用途のために、MitsubishiからのSP70樹脂を、1.5cm×58.4cmの寸法を有する103mLのカラムに充てんした。優秀な回収および容量が観察された。最終の留分は、ピ−クの尾を減らすために50%の水性エタノ−ルで溶出させた。塩からの良好な分離が、きわめて純粋なモナチンの留分の収集および回収を可能にした。
【実施例２１】
【０１９７】
電気透析
材料
研究室規模の電気透析ユニットを、この試験のために使用した。すべての化学物質は、試薬グレ−ドであった。陽極液および陰極液は、1Mの重炭酸ナトリウム溶液とした。原液は、0.1%の塩化ナトリウム溶液とした。使用した膜は、AMXおよびCMXである。電極膜は、Nafion膜とした。供給圧力を、1  psi未満に設定した。動作を80分間続け、電圧が急激に上昇し始めたときに停止させた。電流を、動作の間に2回、電位を下げるために減らした。供給のpHが7.4に設定され、7.7へとわずかに上昇した一方で、原液のpHは7.2で終了した。供給に使用された4つの分析対象の濃度を、表11に挙げる（実施例17に記載のとりに測定した）。
【０１９８】
方法および結果
物質収支の最終的な分析が、ピルビン酸が有意な度合いで輸送される唯一の分子であることを示した。残りの3つの分析対象は、試験の際に膜へと吸着され、効率試験の段階の際に溶脱した。入手可能な最高の拡散性の膜での試験にもかかわらず、分子の大部分、とくにはモナチンが、膜を横切って運ばれるためには大きすぎると推測される。いくつかの他のpHおよび膜も試験され、同様の結果であった。それにもかかわらず、ピルビン酸のかなりの濃度を選択的に分離する能力が、これを下流の処理方法の設計における興味深い選択肢にしている。アラニンのサイズはピルビン酸にきわめて類似しているため、適切な条件下で膜を横切るアラニンの拡散を可能にする膜を見出すことができると予想される。
【０１９９】
【表１５】
2009538145.tif 000020
【実施例２２】
【０２００】
カチオン交換
強カチオン交換樹脂を使用して単一の工程でモナチンの他の反応成分（他のアミノ酸など）からの精製を可能にする方法を、想像することができる。酸の形態の強酸カチオン交換樹脂が、好ましい樹脂である。タンパク質を除いた反応混合物が装填され、有機酸化合物が洗い流され、アミノ酸のみがカラムへと結合して残される。等電点の相違にもとづいてアミノ酸を別々に溶出させるために、ステップ勾配が使用される。ステップ勾配を、pH  2.5、3、3.1、および4にステップを有するクエン酸バッファまたはリン酸バッファで構成できる。モナチンのpIが約3.9である一方で、トリプトファンおよびアラニンは、6により近いpIを有するため、モナチンが最初に溶出する。例えば、MCI  GEL（登録商標）Technical  Information  2004−2005,Mitsubishi  Chemical  Corporationの7頁を参照されたい。
【実施例２３】
【０２０１】
カチオン交換
材料：直径7.5  cmのカラムに、プロトン型のAG50Wx8カチオン交換樹脂の950mLの充てん体積を詰め込んだ。AG50Wx8は、Rohm  and  Haas  (Philadelphia,  PA)によって製造されており、Bio−Rad  (Hercules,  CA)から調達された。限外ろ過された1リットルの生物学的反応混合物を、140mL／分の流量でカラムへと供給した。脱イオン水を洗浄剤として使用した。カラムを、1Mの水酸化カリウムを使用して溶出させた。
【０２０２】
方法および結果：1リットルの供給の装填段階に続いて、44.6リットルの水を、280nmにおける吸光度が充分に減少するまでカラムを洗浄するために使用した。次いで、カラムを、14.7リットルの総収集体積のために1M  KOHで溶出させた。種々の分析対象の分析が、表12に挙げられている。
【０２０３】
【表１６】
2009538145.tif 000021
【実施例２４】
【０２０４】
アニオン交換
モナチンが、反応混合物（例えば、S,S−モナチンについて実施例17で説明した反応混合物）から、強アニオン交換樹脂を使用して単一の工程で精製される。重炭酸塩型のZGA313  (Itochu  Chemicals  America,  Inc)などの強アニオン交換樹脂が、好ましい樹脂である。タンパク質を除いた反応混合物が、pH  7−8で適切なサイズのカラムへと装填される。アラニンおよびトリプトファンなどといった非荷電のアミノ酸は結合せず、水で洗い流される。pH  7−8において負の電荷を有する分子は、カラムに保持される。それらとして、モナチン、4−ヒドロキシ−4−メチルグルタミン酸、4−ヒドロキシ−4−メチル−オキソグルタル酸、ピルビン酸、インド−ル−3−ピルビン酸、およびモナチン前駆体が挙げられる。pH  7−8において、線形塩勾配（0〜2Mの重炭酸アンモニウムなど）を使用して、モナチンが有機酸（例えば、ピルビン酸、4−ヒドロキシ−4−メチル−オキソグルタル酸、モナチン前駆体、インド−ル−3−ピルビン酸）よりも前に溶出すると予想される。モナチンのインド−ル部分と樹脂の骨格との間の疎水性相互作用が、モナチンの溶出を遅らせ、モナチンの4−ヒドロキシ−4−メチルグルタミン酸からの選択的分離を可能にする。クロマトグラフィ留分を、実施例6に記載の方法を使用して分析することができる。
【０２０５】
本明細書に記載した本発明について、本発明の技術的思想および技術的範囲から離れることなく、さらなる変更が当業者に明らかであろう。例えば、限外ろ過を本プロセスにおいて好ましい工程であるとして示したが、ゲルろ過またはサイズ排除クロマトグラフィなど、より分子量の大きい酵素を残りの反応構成要素から分離する他のろ過プロセスも可能である。また、特定の酵素および構成要素の選択は、本明細書で特定された酵素および構成要素の中で様々であってよい。反応剤の具体的な量も様々であってよく、全体としてのプロセス効率を改善するためのリサイクル量およびリサイクルの回数も、様々であってよい。
【図１】
2009538145.tif 000022
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2009538145.tif 000028
【国際調査報告】
2009538145.tif 000029