(57)【要約】結腸直腸癌、類腱腫、膀胱癌、胃癌、及び乳癌から選択される癌の治療又は予防のための医薬の製造に用いるマクロライド抗生物質の使用であって、当該抗生物質が、タイロシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；エリスロマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；オレアンドマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；及びスピラマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体、の１又はそれ以上である。また、上記の癌の治療又は予防する薬学的組成物、及び上記癌の治療又は予防する方法、ほ乳類において突然変異ＡＰＣ遺伝子を発現する癌を治療又は予防する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
結腸直腸癌、類腱腫、膀胱癌、胃癌、及び乳癌から選択される癌の治療又は予防のための医薬製造のためのマクロライド抗生物質の使用において、マクロライド抗生物質が、
タイロシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；
エリスロマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；
オレアンドマイシン、薬学的に許容できるその塩、その誘導体；及び
スピラマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体の、１又はそれ以上であることを特徴とする、マクロライド抗生物質の使用。
【請求項２】
結腸直腸癌、類腱腫、膀胱癌、胃癌、及び乳癌から選択される癌の治療又は予防のための薬学的組成物であって、活性成分として治療上有効量の：
タイロシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；
エリスロマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；
オレアンドマイシン、薬学的に許容できるその塩、その誘導体；及び
スピラマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体、の１又はそれ以上のマクロライド抗生物質と、薬学的に許容し得るキャリアとを含むことを特徴とする、薬学的組成物。
【請求項３】
突然変異ＡＰＣ遺伝子を発現する癌の治療又は予防のために医薬製造するためのマクロライド抗生物質の使用において、マクロライド抗生物質が、
タイロシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；
エリスロマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；
オレアンドマイシン、薬学的に許容できるその塩、その誘導体；及び
スピラマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体、の１又はそれ以上であることを特徴とするマクロライド抗生物質の使用。
【請求項４】
前記癌が、結腸直腸癌、類腱腫、膀胱癌、胃癌、及び乳癌から選択されることを特徴とする、請求項３の使用。
【請求項５】
前記マクロライド抗生物質が、タイロシン又はタイロシン酒石酸塩であることを特徴とする、請求項１又は３に記載の使用。
【請求項６】
前記マクロライド抗生物質が、タイロシン又はタイロシン酒石酸塩であることを特徴とする、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
ほ乳類の結腸直腸癌、類腱腫、膀胱癌、胃癌、及び乳癌から選択される癌を治療又は予防する方法であって、
タイロシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；
エリスロマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；
オレアンドマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；及び
スピラマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体の１又はそれ以上の治療上有効量のマクロライド抗生物質を前記ほ乳類に投与し、それにより前記癌を治療又は予防するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
突然変異ＡＰＣ遺伝子を発現するほ乳類における癌を治療又は予防する方法において、当該方法が：
タイロシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；
エリスロマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；
オレアンドマイシン、薬学的に許容できるその塩、その誘導体；及び
スピラマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；の１又はそれ以上の 治療上有効量のマクロライド抗生物質をほ乳類に投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
ＡＰＣ遺伝子内の中途終止突然変異を抑制することによりほ乳類における癌を治療又は抑制する方法において、
タイロシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；
エリスロマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；
オレアンドマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；及び
スピラマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；の１又はそれ以上の治療上有効量のマクロライド抗生物質をほ乳類に投与し；それによりＡＰＣ遺伝子内の中途終止突然変異を抑制するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記癌が、結腸直腸癌、類腱腫、膀胱癌、胃癌、及び乳癌から選択されることを特徴とする、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記マクロライド抗生物質が、タイロシン又はタイロシン酒石酸塩であることを特徴とする、請求項７乃至９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の治療方法に関し、具体的には、結腸直腸癌、類腱腫、膀胱癌、胃癌、及び乳癌の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
結腸直腸癌（ＣＲＣ）は、大腸の癌であり、男性、女性ともに第三番目に多く、全癌の１３％を示す。患者の約２０％が、診断時に転移性疾患であり、全結腸直腸癌患者の約５０％が転移に発展し、最後はこれらの疾患のため死亡する。米国だけで約１３１，０００人が結腸直腸癌と診断され、５６，０００人が毎年死亡するようである。母集団における生涯のＣＲＣリスクは５％であるが、この数は年齢とともに劇的に上昇する。つまり７０歳では西欧人の約半数にアデノーマ（腺腫）に発現する。全ＣＲＣ例の８５％近くが、起源が散発性（体細胞性ＣＲＣ）であり、それ以外は、受け継いだ遺伝性変異（「遺伝性ＣＲＣ」）の結果生じたものである。
【０００３】
結腸直腸癌は、アデノーマ（腺腫）から発生し、結腸直腸の異形性であるが、非悪性前駆病変である。カルシノーマ（細胞腫）への進行は、多くの体細胞変異を経て起こり、最終的には、悪性に形質転換し、浸潤性癌が形成される。ＣＲＣへの進行で変異する最も重要な遺伝子は、腺腫性結腸ポリープ症（ＡＰＣ）抑制遺伝子である。ＡＰＣ変異は、アデノカルシノーマ配列の極めて最初に検出されるので、これは、ＡＰＣタンパク質は結腸直腸癌発癌の門番として働くことを示唆しており、ＡＰＣの機能喪失は、将来悪性腫瘍へ進行することと大変密接に関連していることを意味している。全ての散発性、遺伝性結腸直腸癌の約８５％がＡＰＣ機能を喪失している。遺伝性、体細胞性結腸直腸癌におけるそれらの役割に加えて、ＡＰＣにおける変異は、類腱腫（進行性線維腫症）（非特許文献９）、膀胱癌（非特許文献１０）、胃癌（非特許文献１１）及び乳癌（非特許文献１２）などのその他のタイプの癌でも示されている。
【０００４】
ＡＰＣは、多くの十分に特徴づけられた機能ドメインをもち、多くの他のタンパク質と相互作用をする大きなタンパク質（３１２ｋＤａ）である。しかしながら、腫瘍化における決定的な役割は、Ｗｎｔシグナル経路の負の制御因子として働く、β−カテニンの細胞内濃度の調整にあると思われる。ＡＰＣが変異すると、Ｗｎｔシグナル経路のエッフェクタータンパク質であるβ−カテニンが蓄積し、核へ移動する。これがＴｃｆ／ＬＥＦ転写因子へ結合すると、広く様々な遺伝子の転写が開始する。β−カテニンの転写活性化ターゲットの下流は、サイクリン（Ｃｙｃｌｉｎ）Ｄ１及び癌遺伝子ｃ−ｍｙｃを含む結腸直腸癌の発生と進行に関与する多くの遺伝子を含んでいる。Ｗｎｔシグナル経路におけるその役割に加えて、ＡＰＣ機能の喪失は、ＡＰＣ欠損癌細胞において細胞間接着性に混乱を生じる。
【０００５】
ＣＲＣにおけるＡＰＣ突然変異の大部分（９５％）は、ナンセンス変異又はフレームシフト変異であり、異常機能をもつ短縮タンパク質が生じる。ＡＰＣ変異部位は、通常は、ランダムではなく、ＡＰＣ短縮突然変異のために十分に特徴づけられたホットスポットがある。
【０００６】
ＣＲＣにおけるように、その他のヒトの遺伝性疾患の多数が、変異遺伝子によりコード化されたタンパク合成の中途終了による変異により生じ、このような疾病を治療する1つの方法は、野生型の複製で変異遺伝子を補うことであろう。
【０００７】
数年間にわたり、アミノグリコシド系抗生物質が、終止コドンの代わりにアミノ酸の取り込みを可能とすることにより疾病に付随する中途終止変異を抑制できることは公知となっており、このようにして、転写の正常終末まで翻訳が続くことを可能にしている。最近の研究は、アミノグリコシド類が機能性タンパク質の生理的に関連ある量を回復するレベルに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ共に、ほ乳類の転写における中途終止変異を抑制できることを示した（非特許文献１〜５）。このアプローチの有用性は、常染色体性の劣勢疾病である嚢胞性線維症（ＣＦ）及びナンセンス変異をもつデュシェンヌ型筋ジストロフィ（ＤＭＤ）患者で以前に明らかにされた。ＣＦ及びＤＭＤともに全例の５〜１０％のみが、コード配列におけるナンセンス変異に起因している。結腸直腸癌患者での比較においては、ＡＰＣ遺伝子における中途終止コドンは、全例の約８５％で見出されている（非特許文献６）。しかしながら、機能性のあるＡＰＣタンパク質を欠く細胞に全長のＡＰＣタンパク質の回復を目的とした研究は、今まで行われていない。
【０００８】
ゲンタミシンなどのアミノグリコシド類は、重要な用量規定毒性があり、静脈内投与を要するので、それらを癌の長期治療とする魅力はない。
【０００９】
終止コドン突然変異を抑制するアプローチは、重要な遺伝子（例えば、ＡＰＴＲ欠損、抗トロンビンIII、酸スフィンゴミエリン（ａｃｉｄ  ｓｐｉｎｇｕｍｙｅｌｉａｓ）、ヘイリ−ヘイリ病を患っている患者については非特許文献８で総説されている。）の終止コドン突然変異により生じた疾病を患っている他の患者にとっては、有益になるはずである。
【００１０】
近年、マクロライド系抗生物質が５０Ｓリボソームサブユニットを標的とし、原核生物系における終止コドンの読み過ごし（リードスル）を誘導することが示された（非特許文献７）。特許文献１及び２は、ある種のマクロライド抗生物質を用いた癌治療方法に関する。
【００１１】
以下は、先行技術のリストであり、これらは、本発明の分野における技術状態を記載に関連あると考えられている。本明細書におけるこれらの文献の確認は、以下のリストの括弧内の数字により指摘される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第５，３２４，７２０号
【特許文献２】米国特許出願公開公報第ＵＳ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２００５／０１７１０３２号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｂｅｄｗｅｌｌ，Ｄ．Ｍ．等（１９９７）．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ＣＦＴＲ  ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｓｔｏｐ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ．  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：１２８０−１２８４．
【非特許文献２】Ｗｉｌｓｃｈａｎｓｋｉ，Ｍ．，Ｙａｈａｖ，Ｙ．，Ｙａａｃｏｖ，  Ｙ．，Ｂｌａｕ，Ｈ．，Ｂｅｎｔｕｒ，Ｌ．，Ｒｉｖｌｉｎ，Ｊ．，Ａｖｉｒａｍ，Ｍ．，Ｂｄｏｌａｈ−Ａｂｒａｍ，Ｔ．，Ｂｅｂｏｋ，Ｚ．，Ｓｈｕｓｈｉ，Ｌ．，Ｋｅｒｅｍ，Ｂ．，  及びＫｅｒｅｍ，Ｅ．（２００３）．Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＦＴＲ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  ＣＦＴＲ  ｓｔｏｐ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．  Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１５：１４３３−１４４１．
【非特許文献３】Ｂａｒｔｏｎ−Ｄａｖｉｓ，Ｅ．Ｒ．，Ｃｏｒｄｉｅｒ，Ｌ．，Ｓｈｏｔｕｒｍａ，Ｄ．Ｉ．，Ｌｅｌａｎｄ，Ｓ．Ｅ．及びＳｗｅｅｎｅｙ，Ｈ．Ｌ．（１９９９）．Ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ｒｅｓｔｏｒｅ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅｓ  ｏｆ  ｍｄｘ  ｍｉｃｅ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０４：３７５−３８．
【非特許文献４】Ｐｏｌｉｔａｎｏ，Ｌ．，Ｎｉｇｒｏ，Ｇ．，Ｍｇｒｏ，Ｖ．，Ｐｉｌｕｓｏ，Ｇ．，Ｐａｐｐａｒｅｌｌａ，Ｓ．，Ｐａｃｉｅｌｌｏ，Ｏ．，及びＣｏｍｉ，Ｌ．Ｉ．（２００３）．Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ：Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｒｅｓｕｌｔｓ．Ａｃｔａ  Ｍｙｏｌ．１：１５−２１．
【非特許文献５】Ｋｅｒｅｍ，Ｅ．（２００４）．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｓｔｏｐ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ：ｈｏｗ  ｍｕｃｈ  ＣＦＴＲ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｓ  ｅｎｏｕｇｈ？  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ＰｕＩｍ．Ｍｅｄ．６：５４７−５２．
【非特許文献６】Ｌａｕｒｅｎｔ−Ｐｕｉｇ，Ｐ．，Ｂｅｒｏｕｄ，Ｃ，及びＳｏｕｓｓｉ，Ｔ（１９９８）．ＡＰＣ  ｇｅｎｅ：ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ａｎｄ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２６：２６９−２７０．
【非特許文献７】Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．，  Ｐｒａｔｔ，ｃ．ａ．，及びＤａｈｌｂｅｒｇ，Ａ．Ｅ．（２００４）．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｃｌａｓｓｅｓ  ｏｆ  ５ＯＳ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｎ  ｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ  ｒｅａｄｔｈｒｏｕｇｈ  ｄｕｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  １２：  ４８８９−４８９１．
【非特許文献８】Ａｔｋｉｎｓｏｎ，Ｊ及びＭａｒｔｉｎ，Ｒ．（１９９４）．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｎｏｎｓｅｎｓｅ  ｃｏｄｏｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｂｙ  ｎｏｎｓｅｎｓｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｔＲＮＡｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８：１３２７−１３３４．
【非特許文献９】Ａｌｍａｎ，Ｂ．Ａ．，Ｌｉ，Ｃ．Ｐａｊｅｒｓｋｉ，Ｍ．Ｅ．，  Ｄｉａｚ−Ｃａｎｏ，Ｓ．及びＷｏｌｆｅ，  ＨＪ．（１９９７）．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｓｏｍａｔｉｃ  ＡＰＣ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｓｐｏｒａｄｉｃ  ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｆｉｂｒｏｍａｔｏｓｅｓ  （ｄｅｓｍｏｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ）．  Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５１：３２９−３３４．
【非特許文献１０】Ｂｏｈｍ，Ｍ．，Ｋｉｒｃｈ，Ｈ．，Ｏｔｔｏ，Ｔ．，Ｒｕｂｂｅｎ，Ｈ．及びＷｉｅｌａｎｄ，Ｉ．（１９９７）．Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ＤＥＬ−２７，ＡＰＣ  ａｎｄ  ＭＴＳｌ  ｌｏｃｉ  ｉｎ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ：  ＬＯＨ  ａｔ  ｔｈｅ  ＤＥＬ−２７  ｌｏｃｕｓ  ｏｎ  ５ｐｌ３−１２  ｉｓ  ａ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ，ｈｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ７４：２９１−２９５．
【非特許文献１１】Ｏｈ，Ｓ．Ｔ．，Ｙｏｏ，ＮＪ．及びＬｅｅ，Ｊ．Ｙ．（１９９９）．  Ｆｒｅｑｕｅｎｔ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｆｏ  ｔｈｅ  ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ−ｔｙｐｅ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：４２５７−４２６０．
【非特許文献１２】Ｗｉｌｌｓ，Ｊ．Ｃ．等（２００２）．”Ｈｏｔ  ｓｐｏｔｓ”  ｃａｎ  ｂｕｍ  ｙｏｕ，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ９７（３）：  ７５７−７５８．
【非特許文献１３】Ｆｅａｒｎｈｅａｄ等（２００１）．  Ｔｈｅ  ＡＢＣ  ｏｆ  ＡＰＣ．Ｈｕｍ．ＭｏＩ．Ｇｅｎｅｔ．１０：７２１−７２３．
【非特許文献１４】Ｃｒａｂｔｒｅｅ等（２００３）．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：４２５７−４２６５．１７．Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ等（２００２）．Ｈｕｍ．ＭｏＩ．Ｇｅｎｅｔ．１１：１５４９−１５６０．
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、結腸直腸癌、類線維腫（ｄｅｓｍｏｉｄ  ｔｕｍｏｒ）、膀胱癌、胃癌、乳癌から選択される癌の治療又は予防の医薬の製造のためのマクロライド抗生物質の使用に関し、そのマクロライド系構成物質が、タイロシン、薬学的に許容できるその塩、その誘導体；エリスロマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；オレアンドマイシン、薬学的に許容できるその塩、その誘導体；及びスピラマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体、の１又はそれ以上である。
【００１５】
本発明は、さらに、結腸直腸癌、結腸直腸癌、類線維腫（ｄｅｓｍｏｉｄ  ｔｕｍｏｒ）、膀胱癌、胃癌、乳癌から選択される癌の治療又は予防のための薬学的組成物に関し、前記組成物は、タイロシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；エリスロマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；オレアンドマイシン、薬学的に許容できるその塩、その誘導体；及びスピラマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体、の１又はそれ以上の治療上有効量のマクロライド抗生物質を活性成分として；及び薬学的に許容できるキャリアを含む。
【００１６】
本発明は、さらに、突然変異ＡＰＣ（腺腫性結腸ポリープ症）遺伝子を発現する癌の治療又は予防の医薬の製造のためのマクロライド抗生物質の使用に関し、タイロシン、薬学的に許容できるその塩、その誘導体；エリスロマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；オレアンドマイシン、薬学的に許容できるその塩、その誘導体；及びスピラマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体、の１又はそれ以上のマクロライド抗生物質を含む。
【００１７】
本発明は、ほ乳類の結腸直腸癌、類線維腫（ｄｅｓｍｏｉｄ  ｔｕｍｏｒ）、膀胱癌、胃癌、乳癌から選択される癌の治療又は予防方法に関し、この方法が、タイロシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；エリスロマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；オレアンドマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；及びスピラマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体、の１又はそれ以上のである治療上有効量のマクロライド抗生物質をほ乳類に投与するステップ；それにより、前記癌の治療又は予防をするステップを含む。
【００１８】
本発明は、さらに、ほ乳類における突然変異ＡＰＣ遺伝子を発現する癌を治療又は予防する方法に関し、その方法が、タイロシン、薬学的に許容できるその塩、その誘導体；エリスロマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；オレアンドマイシン、薬学的に許容できるその塩、その誘導体；及びスピラマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体、の１又はそれ以上である治療上有効量のマクロライド抗生物質をほ乳類に投与するステップを含む。
【００１９】
さらに、本発明は、ＡＰＣ遺伝子内の中途終止変異を抑制することにより、ほ乳類において癌を治療又は予防する方法に関し、この方法が、タイロシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；エリスロマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；オレアンドマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；及びスピラマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体、の１又はそれ以上の治療上有効量のマクロライド抗生物質をほ乳類に投与するステップを含み、それにより前記ＡＰＣ遺伝子内の中途終止変異を抑制する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ＡＰＣ遺伝子における体細胞及び生殖細胞の突然変異のスペクトルを示す図である。コドン番号によるＡＰＣ遺伝子の体細胞（ｎ＝８２９）及び生殖細胞（ｎ＝９１５）突然変異の分布。データは、Ｔｈｉｅｒｒｙ  Ｓｏｕｓｓｉ（１９９８）、ＡＰＣ遺伝子：ヒト腫瘍及び培養細胞株における精力細胞及び体細胞突然変異のデータベースから得た。Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２６（１）：２６９−２７０。
【図２Ａ】図２Ａは、タイロシン誘導突然変異ＡＰＣ終止コドン読み過ごしを示す図ある（Ａ）。特定のＡＰＣ終止突然変異を読み過ごしする化合物をスクリーニングするために構築されたレポータプラスミドのスキームである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、この構築物を用いて得られた結果を示す図であり、タイロシンが、ＡＰＣホットスポット１０６１において、エリスロマイシンに比べて高レベルの読み過ごしを誘導することを示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、この構築物を用いて得られた結果を示す図であり、タイロシンが、ＡＰＣホットスポット１５５４において、スピラマイシンに比べて高い読み過ごしレベルを誘導することを示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、この構築物を用いて得られた結果を示す図であり、タイロシンが、ＡＰＣホットスポット１４５０において、ゲンタミシンに比べて高い読み過ごしレベルを誘導することを示す。
【図３】図３は、タイロシンが、β−カテニン／Tｃｆシグナリングを下方制御することを示す図である。対照又はタイロシン治療ＣＸ−１細胞は、ｐTOPFLASHを用いてトランスフェクトした。細胞は、トランスフェクト４８時間後に採取し、ルシフェラーゼ量を測定した。
【図４】図４は、タイロシン治療が、細胞の腫瘍形成能を抑制することを示す図である。５週齢ヌードマウスにＨＴ−２９ＣＲＣ細胞を注入した。注入２日後、０．４μｇ／ｍｌのタイロシンを治療群マウスの飲料水に加えた。この水は、２日毎に取り替えた。図４Ａ〜Ｄは、注入１０日後で、タイロシン治療マウス（Ｂ、Ｄ）の腫瘍サイズは、対照群（Ａ、Ｃ）のものに比べて小さいことを示す。図４Ｅはマウスを１６日後に犠牲死させ、腫瘍を切りだし、秤量し、対照及びタイロシン治療マウスの平均腫瘍塊をグラム（ｇ）で示すグラフである。
【図５】図５は、タイロシン治療が、腫瘍の組織学的特性が変化することを示す図である。腫瘍を対照及びタイロシン治療マウスから取り出し、腫瘍を固定した後、ヘマトキシリン・エオシン染色剤（Ｈ＆Ｅ）で染色したことを示す図である（図５Ａ〜図５Ｆ）。タイロシン治療は、血液供給に影響を与えることなく腫瘍壊死させたことを示す（血管を矢印で示した）。３匹の異なるタイロシン治療マウス（図５Ｄ〜図５Ｆ）と３匹の異なる対照マウス（図５Ａ〜図５Ｃ）の腫瘍の横断切片を示す。
【図６】図６は、タイロシン治療は、全長ＡＰＣを発現させる図である。対照（「ＮＴ」）及びタイロシン治療（０．８ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ）マウスから腫瘍を取り出した。腫瘍を溶解し、その物質を抗ＡＰＣ抗体で探査した。ＨＣＴ１１６細胞は、サイズマーカとして役立つ野生型ＡＰＣタンパク質を保有する。タイロシン処置では、全長ＡＰＣが発現し、タイロシン濃度の上昇につれて、全長タンパク質の発現は増加した。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、タイロシン、エリスロマイシン、オレアンドマイシン、スピラマイシン、ゲンタミシンのマクロライド系抗生物質の員が、ＡＰＣ遺伝子の中途終止コドン突然変異の読み過ごしを誘導できることの発見に基づく。
【００２２】
本発明者は、マクロライド抗生物質が、ＡＰＣ遺伝子の中途終止コドンの癌の原因となるホットスポットの読み過ごしをもたらし得る化合物として臨床使用できることを、今回見いだした。
【００２３】
本発明者らは、マクロライド類が、ＡＰＣにおける癌を引き起こす中途終止コドン突然変異を読み過ごすことができるか否かを検討した。マクロライド系抗生物質の一員であるタイロシン、及びさらなるマクロライド化合物（エリスロマイシン、スピラマイシンなど）は、ＡＰＣ遺伝子の中途終止コドンの読み過ごしを誘導することを示す証拠を本明細書で提示する。本発見は、ＡＰＣに対し終止コドン抑制遺伝子の効果を最大にし、副作用を最少にする臨床適用性を有する。
【００２４】
ＡＰＣ遺伝子内の中途終止突然変異を抑制する臨床上有用な方法を確認することは、ＣＲＣをもつ患者及び変異したＡＰＣを発現する様々なタイプの癌を患う他の患者に利益がある。例えば、ＡＰＣ突然変異は、類線維腫（ｄｅｓｍｏｉｄ  ｔｕｍｏｒ）、膀胱癌、胃癌及び乳癌などの他の癌種においても見られる。
【００２５】
したがって、本発明の１つの態様によれば、結腸直腸癌、類線維腫（ｄｅｓｍｏｉｄ  ｔｕｍｏｒ）、膀胱癌、胃癌及び乳癌から選択される癌の治療又は予防のための医薬の製造用のマクロライド抗生物質の使用を提供し、マクロライド抗生物質は、タイロシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；エリスロマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；オレアンドマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；及びスピラマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体の１又はそれ以上である。
【００２６】
本発明の別の態様によれば、結腸直腸癌、類線維腫（ｄｅｓｍｏｉｄ  ｔｕｍｏｒ）、膀胱癌、胃癌、乳癌から選択される癌の治療又は予防のための薬学的組成物を提供するものであって、この組成物は、タイロシン、薬学的に許容できるその塩、その誘導体；エリスロマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；オレアンドマイシン、薬学的に許容できるその塩、その誘導体；及びスピラマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体、の１又はそれ以上の治療上有効量のマクロライド抗生物質を活性成分として、及び及び薬学的に許容できるキャリアを含む。
【００２７】
本発明のさらなる別の態様によれば、突然変異ＡＰＣ遺伝子を発現する癌の治療又は予防の医薬を製造するためのマクロライド抗生物質の使用を提供することにおいて、そのマクロライド系抗生物質が、タイロシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；エリスロマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；オレアンドマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；及びスピラマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体、の１又はそれ以上である。
【００２８】
好ましい態様によれば、前記癌は、結腸直腸癌、類線維腫（ｄｅｓｍｏｉｄ  ｔｕｍｏｒ）、膀胱癌、胃癌、及び乳癌から選択される。
【００２９】
好ましくは、マクロライド抗生物質は、タイロシン又はタイロシン酒石酸塩である。
【００３０】
本発明のさらなる態様によれば、ヒトの結腸直腸癌、類線維腫（ｄｅｓｍｏｉｄ  ｔｕｍｏｒ）、膀胱癌、胃癌、及び乳癌から選択される癌を治療又は予防する方法が提供されており、その方法が、タイロシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；エリスロマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；オレアンドマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；及びスピラマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体であって、それにより前記癌を治療又は予防できる、１又はそれ以上の治療上有効量のマクロライドをほ乳類に投与するステップを含む。
【００３１】
本発明のさらなる態様によれば、ほ乳類において突然変異したＡＰＣ遺伝子を発現する癌を、治療又は予防する方法が提供されており、その方法が、タイロシン、薬学的に許容できるその塩、その誘導体；エリスロマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；オレアンドマイシン、薬学的に許容できるその塩、その誘導体；及びスピラマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体、の１又はそれ以上の治療上有効量のマクロライド抗生物質をほ乳類に投与するステップ、を含む。
【００３２】
本発明のさらなる態様によれば、ＡＰＣ遺伝子内の中途終止突然変異の抑制により、ほ乳類の癌を治療又は予防する方法が提供されており、この方法が、タイロシン、薬学的に許容できるその塩、その誘導体；エリスロマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；オレアンドマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；及びスピラマイシン、薬学的に許容できるその塩、及びその誘導体；の１又はそれ以上のマクロライド抗生物質をほ乳類に投与し、それによりＡＰＣ遺伝子内で中途突然変異を抑制するステップを含む。
【００３３】
本発明の好ましい態様によれば、前記癌は、結腸直腸癌、類線維腫（ｄｅｓｍｏｉｄ  ｔｕｍｏｒ）、膀胱癌、胃癌、及び乳癌から選択される。
【００３４】
好ましくは、マクロライド抗生物質は、タイロシン又はタイロシン酒石酸塩である。
【００３５】
マクロライド抗生物質は、単一の活性薬剤（即ち、単一のマクロライド抗生物質）又は２以上の活性薬剤の併用であり得る。
【００３６】
本明細書で用いた用語「医薬」は、薬学的組成物を指す。具体的には、本発明に記載した少なくとも１つのマクロライド抗生物質が適切な薬学的に許容できるキャリア（例えば、賦形剤又は希釈剤）中に含まれている薬学的組成物を指し、様々な投与経路を要する様々な製剤をも指す。例えば、前記医薬は、経口投与用に製剤化でき、又は非経口投与用に又は直腸投与用に製剤化できる。
【００３７】
本明細書で開示した薬学的組成物の活性成分は、少なくとも１つのマクロライド抗生物質、即ち、単一の活性薬剤（マクロライド抗生物質）、又は２又はそれ以上の活性薬剤を含む。
【００３８】
本明細書で用いたように、用語「ほ乳類」は、哺乳類綱のいずれかの員を指し、ヒトを含む。好ましくは本明細書の哺乳類は、ヒトである。
【００３９】
本明細書で用いた、疾病又は疾病（結腸直腸癌、結腸直腸アデノーマとアデノカルシノーマ、類腱腫、膀胱癌、胃癌、乳癌、上記の癌種の１つを伴うアデノーマとアデノカルシノーマ）の症状又は特性を「治療」又は「治療する」の用語は、次の１又はそれ以上のいずれかを含む：（１）疾病の予防、即ち、疾病にさらされるか、又は疾病になりやすい（例えば、体細胞又は生殖細胞での突然変異APC遺伝子を発現するほ乳類、又は疾病の家族歴を示すほ乳類）が、まだ疾病に罹患せず、症状や兆候が現れていないほ乳類を、臨床症状や兆候を進展させないようにすること；（２）疾病を阻止すること、即ち、疾病又は臨床症状又は兆候の進行を止めるか又は減少させること；（３）疾病を軽減すること、即ち、疾病又はその臨床症状、又はその兆候を部分的に又は完全に取り除くこと；（４）異なる臨床症状や兆候を包含する上記（１）、（２）又は（３）の組み合わせ。本明細書で用いた用語「治療する」又は「治療」は、根絶、除去、改善、又は原発、局所、若しくは転移癌組織の抑制；癌（結腸直腸癌など）の拡大（転移）の最小化又は遅延を含む。
【００４０】
本明細書で用いたように、用語「予防する」又は「予防」は、患者における癌の再発、拡大、又は発症を含む。
【００４１】
用語「予防する」又は「予防」は、上記で指摘したいずれの癌種にも関連するアデノーマ（腺腫）、及びアデノカルシノーマ（腺癌）の予防も含む。
【００４２】
本発明の癌の治療又は予防は、中途終止突然変異を抑制するメカニズムに関与することができる。中途終止コドンは、短縮された（変異）タンパク質を生じる。
【００４３】
本明細書で用いたように、用語「抑制」又は「抑制する」は、中途突然変異又は中途終止コドンに関連して用いるときは、突然変異対立遺伝子に存在するが、野生型遺伝子には存在しない終止コドンの読み過ごしのプロセスを意味する（例えば、ＡＰＣ遺伝子（ＳｅＱ．ＩＤ．ＮＯ：２））。
【００４４】
本明細書で用いたように、用語「読み過ごし」は、翻訳経過に関連して使われるときは、「センス」コドン（即ち、アミノ酸をコードするコドン）として終止コドン（「ナンセンス」コドン）を読むこと、又は前記終止コドンを回避することを意味する。
【００４５】
本明細書で用いたように、用語「中途」は、終止コドンとの関連で用いるときは、体細胞性、生殖細胞系列、又は散発性の変異（例えば、フレームシフト又はナンセンス変異）の結果、ＤＮＡ（ｍＲＮＡ）鎖において生じるが、野生型ＤＮＡ（ｍＲＮＡ）鎖には存在しない終止コドンを意味する。
【００４６】
「治療上有効量」は、疾病（例えば、結腸直腸癌、結腸直腸アデノーマ（腺腫）、アデノカルシノーマ（腺癌））の治療のためにほ乳類へ投与したときに、疾病の部分的又は全体的治療又は予防に十分な効果のある化合物（本発明で記載したマクロライド抗生物質）の量を意味する。本明細書で用いたように、「治療上有効量」は、原発、局所、又は転移癌細胞又は組織を破壊、改善、抑制、又は取り除く；癌の拡散を遅延させるか又は最少にする；又は癌の治療又は取り扱いにおいて治療上の利点を提供するに十分な本発明の化合物の量も含む。「治療上有効量」は、癌細胞死をもたらすに十分な本発明の化合物の量も含む。
【００４７】
「治療上有効量」は、さらに、ＡＰＣ遺伝子における中途終止突然変異の読み過ごしを誘導するに十分な本発明のマクロライド抗生物質の量をも含む。
【００４８】
「治療上有効量」は、さらに、ＡＰＣ遺伝子内で中途終止突然変異の抑制に十分なマクロライド抗生物質の量をも含む。
【００４９】
「治療上有効量」は、化合物、治療されるほ乳類の、疾病及びその状態又は重篤度、年齢、体重、他の医学的状態、などにより変動する。「治療上有効量」は、１又はそれ以上の過去に行った又は同時に行われる内科的、外科的又は放射線治療の介入により変動し得る。
【００５０】
本明細書で用いたように、用語「薬学的に許容できる塩」は、毒性のない有機又は無機酸の１又はそれ以上の分子と本発明の化合物との反応生成物を意味する。適当な塩を形成する例示的な無機酸には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、およびリン酸、ならびにオルトリン酸一水素ナトリウムおよび硫酸水素カリウムなどの酸金属塩が含まれる。適当な塩を形成する実例となる有機酸には、モノ、ジ、およびトリカルボン酸が含まれる。このような酸の例は、例えば、酢酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、ケイ皮酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、およびエタンスルホン酸である。
【００５１】
例えば、「タイロシン、又はその誘導体」；「エリスロマイシン、又はその誘導体」；「オレアンドマイシン、又はその誘導体」；及び「スピラマイシン、又はその誘導体」などに用いた用語「誘導体」は、親化合物から得た化学的に修飾された化合物を意味する。これは、「治療する」又は「予防する」の用語で定義した親化合物と同じ又は近似する生物学的特性 ／活性（例えば、腫瘍サイズ、腫瘍塊の減少、ＡＰＣ遺伝子の中途終止コドンの読み過ごしの誘導）などを、この誘導体が有するように、（誘導体は、）置換基及び／又は／又は官能基が、１又はそれ以上の要素だけ、親化合物（例えば、タイロシン、エリスロマイシン、オレアンドマイシン、スピラマイシン）と異なっている。
【００５２】
誘導体の例としては、そのエステル又はアミドなどの親化合物のプロドラッグであり、それらは、ほ乳類に投与して、本発明の化合物又はその活性代謝物を（代謝過程によるなどにより）提供し得る。
【００５３】
エリスロマイシン塩及び誘導体には、限定されないが、エリスロマイシンラクトビオン酸塩、エリスロマイシンエチルコハク酸塩、エリスロマイシンステアリン酸塩、エリスロマイシンエストレート、エリスロマイシンアシストラート、エリスロマイシングルセプタート、エリスロマイシンプロピオネート、エリスロマイシンサルナセジン、エリスロマイシンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ又はＥ、ロキシスロマイシン、クラリスロマイシン、アジスロマイシン、ジリスロマイシン、フルリスロマイシン、並びに参照により全内容が本明細書に取り込まれている米国特許第６７７７５４３号、米国特許第６８２５１７１号、及び米国特許第５６０２１０６号及びＷＯ２００２／０５００９３号に示す誘導体が含まれる。    
【００５４】
タイロシン誘導体の限定されない例としては、例えば、デスミコシン、タイロシンＢ、又は、それらの各々の全内容が本明細書に参照により取り込まれている米国特許第５６０２１０６号、第４０９２４７３号、第４２０５１６３号、及び第４２６８６６５号に記載されている誘導体などのタイロシン誘導体、をあげることができる。
【００５５】
オレアンドマイシン塩及び誘導体の限定されない例としては、例えば、オレアンドマイシンリン酸塩（マトロマイシン）、オレアンドマイシン２’−Ｏ−リン酸塩、トロレアンドマイシン、及びトリアセチルオレアンドマイシン、及び、全内容が本明細書に取り込まれている米国特許第５６０２１０６号、第４４２９１１６号、第４１２４７５５号及び４０６４１４３号に記載されている誘導体などがある。          
【００５６】
マクロライド抗生物質「スピラマイシン」は、参照により本明細書に取り込まれているメルクインデックス（Ａｎ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｄｒｕｇｓ，ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｅｌｅｖｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９、ｐａｒａｇｒａｐｈ  ８７０８）に記載されている、化合物スピラマイシンI、II、又はIIIのいずれかの１つ、又はそれらのいずれかの組み合わせ（例えば、スピラマイシンI、II、又はIIIの併用）をも包含することは自明である。
【００５７】
スピラマイシン誘導体の限定されないいくつかの例は、例えば、ネオスピラマイシン、ジハイドロスピラマイシン、及び全内容が参照により本明細書に取り込まれている米国特許第５６０２１０６号、及び第４１７４３９１号に記載の誘導体などである。
【００５８】
本発明で記載した前記活性成分（マクロライド抗生物質）は、その溶媒和物も含むことは自明である。
【００５９】
本明細書で用いられているように、用語「溶媒和物」は、溶質（この発明ではマクロライド抗生物質又はその塩又はその誘導体）と溶媒により形成された変動する化学量論的複合体）を意味する。本発明の目的に用いるこのような溶媒は、溶質の生物活性を妨げない。適当な溶媒の例としては、限定されないが、水、エタノール、及び酢酸を挙げられる。
【００６０】
治療上有効量のマクロライド抗生物質が、好ましくは薬学的組成物でほ乳類に投与される。
【００６１】
本明細書で用いたように、「薬学的組成物」は、薬学的に許容されるキャリアなどの他の不活性化学成分と共に本明細書に記載した１又はそれ以上の化合物（マクロライド抗生物質）の製剤を指す。薬学的組成物の目的は、ほ乳類へ活性成分の投与を容易にすることである。
【００６２】
本明細書で用いられているように、用語「薬学的に許容できるキャリア」は、被験者（ほ乳類）に著しい刺激をもたらさない、投与した活性成分の生物活性及び特性を無効にしない無毒のキャリア又は希釈剤を指す。
【００６３】
限定されないが、キャリアの例は、ラクトース、シュクロース、水、有機溶媒及びポリエチレングリコールである。
【００６４】
キャリアは、結合剤、崩壊剤、滑剤、表面活性化剤（界面活性剤）、乳化剤、保存剤及び香料などの更なる賦形剤を含むことがある。
【００６５】
本発明の文脈で用いる薬学的組成物は、意図した目的達成のための有効量のその活性成分が含まれている組成物を含む。
【００６６】
本発明の好ましい態様によれば、組成物の投与経路は、経口、非経口、又は直腸から選択される。
【００６７】
非経口投与は、例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、腫瘍内、及び皮下投与であり得る。
【００６８】
具体的態様は、経口経路の投与である。
【００６９】
経口投与に適する活性薬剤（活性成分）の剤型は、例えば、固体、半固体、液体、又はガス状の型を含む。具体例には、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤、及びエリキシル剤を含む。しかしながら、薬剤の型は、これらの型に限定されない。
【００７０】
剤型は、抗癌活性薬剤（マクロライド抗生物質）の速放出、持続放出、パルス放出を提供するように設計し得る。
【００７１】
その上、本発明の抗癌活性薬剤は、ガス状又は液体状のスプレイ剤と共に、液体又は微粉末の形で活性薬剤を装填して調製したエアロゾール又は吸入薬の剤型で投与でき、必要なら、膨張剤などの公知の助剤をエアロゾール容器又は噴霧器などの圧力をかけていない容器中に入れてもよい。スプレイ剤としては、例えば、ジクロロフルオロメタン、プロパン、又は窒素の圧縮ガスを使用することができる。
【００７２】
注射剤は、本発明の抗癌活性成分を水性又は、植物油、合成樹脂酸のグリセリド、高級脂肪酸のエステル、又はプロピレングリコールなどの非水性の溶媒中に、公知の方法により、溶解、懸濁、又は乳化させることにより調製することができ、必要なら、通常用いられている可溶化剤、浸透圧調整剤、乳化剤、安定化剤、又は保存剤をさらに添加してもよい。
【００７３】
直腸内投与では、坐薬を使用することができる。坐薬は、本発明の抗癌活性成分を、カカオ脂、カーボンワックス、又はポリエチレングリコールなどの体温で溶けるが、室温では固体である賦形剤と混合し、その結果得られた物を公知の方法で成形することにより調製することができる。
【００７４】
抗癌活性薬剤は、化学療法、放射線療法又は別の活性薬剤と同時に投与することができる。
【００７５】
本発明の抗癌性活性成分の投与量は、投与剤型、投与経路、標的疾病の程度と状態、及びそれと同類なものによって、適切に設定又は調整することができる。例えば、結腸直腸癌の治療には、本発明の化合物の有効な投与比率の一般的な範囲は、２〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日であり得る。好ましくは、活性成分の経口投与では２〜３０ｍｇ／ｋｇ体重／日に設定することができるが、この用量はこれに限定されない。
【００７６】
類線腱腫（ｄｅｓｍｏｉｄ  ｔｕｍｏｒ）、膀胱癌、胃癌、及び乳癌などの他の癌種の治療では、この用量は、２〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲であり得る。好ましくは、活性成分の経口投与では用量を２〜５０ｍｇ／ｋｇ／日に設定することができるが、この用量はこれに限定されない。
【００７７】
ほ乳類、特にヒトに投与する用量は、癌を予防し、発症を遅らせ、進行を遅らせるか（止める）に十分であるべきである。当業者は、投与量が、用いられる特定の化合物の強さ、並びに、ほ乳類の年齢、種、症状、体重を含む様々な要因に依存することを認識するであろう。投与量は、投与の経路、時期、頻度、並びに、特定の化合物の投与に伴うあらゆる副作用の存在、性質、程度、及び望ましい生理的効果により決定される。
【００７８】
適切な投与量と投与計画は、当業者に公知である従来の濃度範囲決定手法により決定できる。一般的には、治療は、化合物の至適用量以下の少用量で開始される。その後、用量は、その環境下で至適効果に達するまで、少量ずつ用量を増量させる。
【００７９】
有効な投与量と治療プロトコールは、実験動物において低用量で出発して、次いで、効果をみながら、用量を増加して、同様に体系的に投与計画を変更しながら、型どおりの従来の手法により決定することができる。動物試験、好ましくは、ほ乳類試験を、キログラム体重あたりの生物活性剤の最大耐量（ＭＴＤ）を決めるために通常用いる。当業者は、ヒトを含む多くの種において、毒性がなく有効性を示す量を、規定どおりに推定する。
【００８０】
したがって、上記により、治療の適用においては、本発明の活性薬剤の用量は、選択した用量に影響する他の要因の中で、活性薬剤、受け入れる患者の年齢、体重、及び臨床症状、及び治療を管理する臨床医又は開業医の経験と判断によって変動する。一般的には、用量は、腫瘍の増殖を遅延させ、好ましくは退縮させ、最も好ましくは癌の完全退縮をもたらすに十分であるべきである。活性成分（マクロライド抗生物質）の有効量は、臨床医又は他の資格のある観察者により指摘されるように客観的に確認できる改善がなされる量である。患者の腫瘍の退縮は、通常は腫瘍径を基準に測定される。腫瘍径の減少は、退縮を表している。退縮は、また治療を止めた後、腫瘍の再発がないことによっても表わせる。
【００８１】
投与は、１回又は２回以上の組み合わせでもよく、例えば、毎日、２日毎、１週間毎、毎月、又は、さもなければ、年齢、体重、疾病の重篤度、各投与の投与量などの要素を考慮して臨床医又は開業の判断による。
【００８２】
実施例
方法と材料
細胞の培養
ＨＣＴ１１６ＣＲＣ細胞（野生型ＡＰＣを担持する対照細胞）を、１０％仔牛胎児血清（ＦＣＳ）及びペニシリン又はストレプトマイシン１００ユニット／ｍｌ添加ダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。細胞は、３７℃、５％ＣＯ２、加湿下で維持した。ＪｅｔＰＥＩ（ＰｏｌｙＰｌｕｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を用いて細胞をトランスフェクションした。記載した構築物の０．５μｇで細胞をトランスフェクションし、４８時間後にルシフェラーゼ定量キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を用いて製造者の使用説明書にしたがってルシフェラーゼ量を測定した。
【００８３】
細胞は上記のように維持した。０．５μｇのｐＴＯＰＦＬＡＳＨ及び０．０５μｇのRｅｎｉｌｌａ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）で細胞をトランスフェクトした。４８時間後、ルシフェラーゼ量をルシフェラーゼ測定キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を用いて測定した。
【００８４】
インビボでのマウス試験
６匹の雌ヌードマウス（ＳＣＩＤ）に１ｘ１０７個のＨＴ−２９細胞を注射した。１４日間、治療群はマウス正常餌及び０．４ｍｇ／ｍｌのタイロシンを含有飲料水で飼育した。対照群は通常の飲料水を与えた。１４日後、マウスを犠牲死させ、腫瘍を取り出し秤量した。
【００８５】
対照及び治療マウスからの腫瘍切片は、Ｈ＆Ｅ染色剤で染色した。スライドを専門の病理学者が調べた。
【００８６】
対照及び治療マウスからの腫瘍を、溶解させて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動させ、ニトロセルロース膜上に移した。その膜を抗APC抗体（癌遺伝子ＡＰＣ  ＡＢ−２）でインキュベイトした。
【００８７】
ＡＰＣ遺伝子中の体細胞及び生殖細胞突然変異のスペクトル
散発性及び遺伝性のＡＰＣ突然変異の多くの部位を下記に示す。ＡＰＣ中の最も一般的な生殖細胞突然変異は、コドン１０６１及び１３０９で起こる。ＡＰＣ体細胞性突然変異の大部分は、コドン１３０９、１４５０及び１５５４のホットスポットをもつＭＣＲ（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ｒｅｇｉｏｎ；多変異領域）内に集まっている（図１）。それらのホットスポットの多くで突然変異をもつＣＲＣ細胞株（複数）は、商業上入手でき、研究室で増殖させた。
【００８８】
ＡＰＣホットスポット及び周辺配列
野生型ＡＰＣタンパク質配列の全長（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１）、及び野生型ＡＰＣＤＮＡ配列全長が提供されている。
【００８９】
次に示す表は、ＡＰＣ遺伝子の終止コドン及びＡＰＣ遺伝子の突然変異ホットスポット部位のそれらの周辺の配列を明示している。ホットスポット１０６１、１４５０及び１５５４でのフレームシフト又は形成されたナンセンス終止コドンは、ＴＧＡであり、ホットスポット１３０９における終止コドンはＴＧＡであることに注目すべきである（参照表１）。
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表１．この表は、ホットスポットで突然変異により生じた終止コドン及び周辺配列を示す。変異部位１０６１及び１３０９では、長方形で囲んだ部分は５−ｂｐの欠失を生じた突然変異部位を示しており、欠失直後の下流で終止コドンが形成されている。コドン１４５０では、長方形で囲んだ部分は、終止コドン（ナンセンス変異）を生じるミスセンス変異部位を示している。コドン１５５４の直後の三角形は、アデニンの挿入部位を示しており、終止コドンの下流形成を導いている。全てのケースで、太字のコドンは、ナンセンス又はフレームシフト突然変異により形成された終止コドンを表している。
【００９０】
実施例１
タイロシン−誘導突然変異ＡＰＣ終止コドン読み過ごし
以下の試験で用いたタイロシンは、シグマ化学、イスラエル（カタログＮｏ．Ｔ６１３４）から購入した市販のタイロシン酒石酸塩；スピラマイシンは、シグマ化学、イスラエル（カタログＮｏ．Ｓ−９１３２）から；及びエリスロマイシンは、フルカ（Ｆｌｕｋａ）、スイス（カタログＮｏ．４５６７３）から購入した。オレアンドマイシンは、シグマ化学、イスラエル（カタログＮｏ．Ｔ６５１４）から購入することができる。
【００９１】
デュアルルシフェラーゼレポータープラスミドシステムを用いて、結腸直腸癌組織培養細胞でＡＰＣホットスポットコドン変異の読み過ごしに対するタイロシンの効果を測定した。このシステムでは、レニラルシフェラーゼレポータ遺伝子は、ホットスポットの上流に位置し、ホタルルシフェラーゼレポータ遺伝子は、ＡＰＣ野生型又は変異配列の下流に位置し、両遺伝子は、ＡＰＣプロモータの転写制御下にある（図２ａ）。両酵素の翻訳は、同じ翻訳開始シグナルから開始するため、レニラルシフェラーゼレポータ遺伝子は、トランスフェクション効率、ｍＲＮＡの量、及び翻訳開始レベルに対する内部標準として役立つ。標準化に続いて、ホタルルシフェラーゼ活性における差異は、終止コドン読み過ごし頻度を反映する。野生型又はＡＰＣホットスポットコドン１０６１又は１５５４コドンでのＡＰＣ変異配列のいずれかを含む構築物を、種々の濃度のマクロライド系抗生物質存在下で培養したＨＣＴ１１６結腸直腸癌細胞中にトランスフェクトした。データは、細胞を種々の濃度（４〜８０μｇ／ｍｌ）のタイロンで処置したときに、有意なレベルのＡＰＣ終止コドン読み過ごしを示している（図２ｂ、２ｃ）。スピラマイシン、エリスロマイシン、ゲンタミシン（アミノグリコシド抗生物質）は、より緩やかなレベルで終止コドン読み過ごしを誘導した（図２２ｂ、２ｃ、２ｄ）。
【００９２】
実施例２
タイロシンは、β−カテニン／Ｔｃｆ−シグナルの下方制御をもたらす
結腸直腸細胞株は、Ｗｎｔシルナル経路の過剰な活性化をもたらす変異に起因する、高レベルのβ−カテニン／Ｔｃｆ−介在の転写を示している。β−カテニン／Ｔｃｆ−介在転写量に及ぼすタイロシンの影響を測定するため、Ｔｃｆ及びβ−カテニン（ルシフェラーゼに結合した多量体を形成したＴｃｆ−結合部位を含むｐＴＯＰＦＬＡＳＨ）の転写活性の測定に広く用いられているルシフェラーゼレポータプラスミド、ｐＴＯＰＦＬＡＳＨで、ＡＰＣホットスポット１５５４中に終止変異を含むＣＸ−１ＣＲＣ細胞をトランスフェクトした。このデータは、タイロシン８μｇ／ｍｌでＣＸ−１ＣＲＣ細胞の処置が、β−カテニン／Ｔｃｆ／ＬＥＦ転写シグナルを約５０％減少させたことを示す（図３）。同様な結果が、コドン１４５０でＡＰＣホットスポット変異を含むＳＷ１４１７細胞で示された（結果は示していない）。
【００９３】
実施例３
タイロシン治療は、細胞の腫瘍形成能を抑制する
ＡＰＣの切断は、腫瘍形成に関連する（非特許文献１３）。本発明者は、切断されたＡＰＣのみを含む細胞株での機能的な全長ＡＰＣタンパク質の回復は、腫瘍形成能の減少をもたらすであろうことを予測した。ＡＰＣのコドン１５５４にホットスポット突然変異を含む１ｘ１０７個のＨＴ−２９ＣＲＣ細胞を１２匹のＳＣＩＤヌードマウスに注入した。治療マウス群（マウス６匹）は、０．４μｇ／ｍｌタイロシンを含む飲料水を摂取した。腫瘍の成長を監視し、対照マウスとタイロシン治療マウスの間で腫瘍サイズに有意な差が見られた。治療マウスは、対照マウスに比べて腫瘍サイズが減少した（図４ａ）。タイロシンを含むまたは含まない飲料水を１４日間摂取した後、マウスを犠牲死させ、腫瘍を取り出した。腫瘍を秤量し、タイロシン治療マウスの腫瘍塊は、対照群のそれより平均で約４０％小さかった（図４ｂ）。
【００９４】
実施例４
腫瘍の組織学的特性は、対象マウスとタイロシン治療マウス間で相違する
対照およびタイロシン治療マウスからの腫瘍切片を、組織切片用に規定通りに用いられている染色剤であるヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色剤を用いて染色し、専門の病理学者が検査した。この染色は、タイロシン治療は、腫瘍細胞の壊死と細胞死をもたらすことを示し（図５）、治療マウスにおいて腫瘍サイズがより小さいことを説明できる。腫瘍への血液供給が影響を受けていないにもかかわらず、タイロシン治療マウスでの腫瘍壊死が生じたことは、タイロシンが腫瘍に到達して、細胞死をもたらすことを示唆する。
【００９５】
実施例５
寿命に対するマクロライド抗生物質の効果
ＡＰＣの１５５４コドンにホットスポット突然変異を含む１ｘ１０７個のＨＴ−２９ＣＲＣ細胞を１０匹の３週齢ＳＣＩＤヌードマウスに注入した。治療マウスは、０．３〜０．８μｇ／ｍｌのタイロシン、スピラマイシン、エリスロマイシン、又はオレアンドマイシンを含む飲料水を与えた。１０匹の対照マウスは、抗生物質を含まない飲料水を摂取した。治療マウスの平均寿命と対照マウスの寿命を比較した。
【００９６】
さらに、ＡＰＣ中に終止突然変異をもち、自然発生的に腫瘍が発生し、最後に死亡する、Ａｐｃ−１−マウス、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ＡｐｃＭｉｎ／Ｊ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｓｔｏｃｋ  Ｎｏ．００２０２０）を、マクロライド抗生物質の各々で治療した。治療したマウスの寿命を無治療対照マウスの寿命と比較した。
【００９７】
実施例６
結腸直腸癌モデルにおけるマクロライド塩および誘導体による治療
雌ＳＣＩＤヌードマウスを、ＡＰＣのコドン１５５４にホットスポット突然変異を含む１ｘ１０７個のＨＴ−２９ＣＲＣ細胞又はＡＰＣのコドン１４５０にホットスポット突然変異を含む１ｘ１０７個のＳＷ１４１７ＣＲＣ細胞を注入した。１４日間、治療マウス群は、正常マウスの餌と、タイロシンの塩又は誘導体；エリスロマイシンの塩又は誘導体；スピラマイシンの塩又は誘導体；オレアンドマイシンの塩又は誘導体の中の１つを、０．４μｇ／ｍｌを含む飲料水を与えた。対照群にも、１ｘ１０７個のＨＴ−２９ＣＲＣ細胞又はＳＷ１４１７ＣＲＣ細胞を注入し、マクロライド抗生物質の誘導体又は塩を含まない飲料水と同じ餌を与えた。全てのマウスを犠牲死させ、腫瘍を取り出し、秤量した。１０匹の対照マウスは、タイロシンの塩又は誘導体；エリスロマイシンの塩又は誘導体；スピラマイシンの塩又は誘導体；オレアンドマイシンの塩又は誘導体の各々で治療した各群１０匹のマウスからの腫瘍切片と同様に、Ｈ＆Ｅ染色剤で染色して、専門の病理学者が検査した。病理学者は、腫瘍壊死の腫瘍切片を検査する。投与量は、試験化合物、及び達成すべき所望の効果により変動する。
【００９８】
加えて、上記と同様の試験をＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ＡｐｃＭｉｎ／Ｊマウスについて、（癌をもたらす細胞の条件なしに）マクロライド抗生物質の治療又は治療しない（対照）マウスで行う。
【００９９】
考察
結腸直腸癌は、西欧諸国では、癌死の主要な原因の１つである。結腸大腸癌の進行は、治療薬及び診断薬の潜在的な標的を提供する分子変動に密接に関連している。結腸直腸癌のユニークな特徴は、単一の遺伝子における突然変異が多くの癌でみられることである。大腸腺腫症（ＡＰＣ）タンパク質をコードする遺伝子における切断変異が、散発性直腸癌腫瘍の８０％以上に見られており、これは、結腸直腸癌の遺伝型である、家族性大腸腺腫症（ＦＡＰ）の原因でもある。ＡＰＣタンパク質機能の喪失は、殆どの散発性結腸直腸腫瘍発生の極めて初期の事象であり、アデノーマの前駆体であるポリープ形成の前に生じる。このことは、ＡＰＣタンパク質が、腸管及び結腸直腸上皮の維持に必須であり、その発現は、しかるべき研究目的を提供することができる。
【０１００】
ＡＰＣ遺伝子は、Ｗｎｔ−シグナル経路及び細胞間接着において重要な役割を演じる大きな多ドメインタンパク質をコードする。切断されている生殖系列変異の大部分（９５％）が、ナンセンス又はフレームシフト突然変異であり、それは異常機能をもつ切断タンパク質産物を生じる。多くの共通する生殖細胞系列突然変異は、コドン１０６１と１３０９で起こり、その間で全ての生殖細胞系列突然変異の第３位を占める（図１）。
【０１０１】
ホットスポット１０６１と１３０９での突然変異は、フレームシフト及びナンセンス型の両方であること分かっている。したがって、１つの対立遺伝子が、コドン１０６１又は１３０９にフレームシフトを含むことがあり、また、その対立遺伝子は、コドン１０６１又は１３０９でナンセンス（中途終止）突然変異であることがある（非特許文献１４、１５）。同様に、ホットスポット１５５４での突然変異は、フレームシフト又はナンセンスタイプのいずれかである。しかしながら、これまでのところ、ナンセンス突然変異のみが、１４５０では確認されている。
【０１０２】
５ｍｍ以下のアデノーマ（腺腫）を含む、結腸直腸アデノーマ（腺腫）、カルシノーマ（腺癌）の  体細胞突然変異が、大半に見られる。ＡＰＣの全ての体細胞突然変異の６０％以上が、コドン１２８６と１５１３の間に位置する遺伝子のコード配列の１０％以下の範囲内で生じ、この領域は、突然変異クラスタ領域（ＭＣＲ）と呼ばれている。ＭＣＲ内では、コドン１３０９、１４５０及び１５５４に、体細胞突然変異の３つのホットスポットがある（図１）。Ｗｎｔ−シグナルにおけるＡＰＣの役割は、結腸直腸癌の発癌となる役割に関与すると考えられている。突然変異ＡＰＣは、細胞間接着と細胞骨格の安定性を混乱させ、両者は、癌の進行の一部を演じる。コドン１３０７での別のＡＰＣ突然変異は、結腸直腸癌や乳癌をもつ人、並びに、メラノーマ、皮膚癌、及び膀胱癌を２、３人に見られる（非特許文献１２）。
【０１０３】
結腸直腸癌と同様に、ヒト遺伝性疾患の多く（例えば、嚢胞性線維症（ＣＦ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィ（ＤＭＤ）（非特許文献８））は、突然変異遺伝子によりコードされるタンパク質の合成の中途末端をもたらす突然変異に起因しており、これらの疾病を治療する１つの方法は、野生型の複製でその細胞を補うことであろう。
【０１０４】
ここ数年、アミノグリコシド抗生物質が、ナンセンス終止コドンの代わりにアミノ酸の取り込みを許すことにより疾病に伴う中途終止突然変異を抑制でき、それにより、転写の正常終了に続き、翻訳を許容していることが公知になっており、。終止コドン抑制の感受性は、終止コドンのタイプ及び終止コドンを取り巻く局所配列の状況に依存する。ＵＧＡ及びＵＡＧは、ＵＡＡに比べてより高い翻訳読み過ごしを示す。終止コドンの配列並びに、ＡＰＣ遺伝子の突然変異ホットスポットにおけるそれを取り巻く配列が、明示されている。表１からわかるように、リストに掲げたＡＰＣホットスポットに形成された中途終止コドンのタイプは、ＴＧＡ又はＴＡＧである。
【０１０５】
このアプローチの有用性は、常染色体上の劣性遺伝子病、嚢胞性線維症（ＣＦ）およびナンセンス変異をもつデュシェンヌ（ＤＭＤ）患者の小集団において以前に示された。ＣＦとＤＭＤの両患者では、全例の５から１０％のみがコード配列中のナンセンス突然変異に起因している。相対的に、結腸直腸腫瘍患者ではＡＰＣ遺伝子に中途終止コドンは、全例の約８５％に見つかっている。正確な数はわかっていないが、結腸直腸癌例の８０％より少ない例が、ナンセンス突然変異のみをもち、他の例では、個体は、フレームシフト変異をもつ１の対立遺伝子と、ナンセンス変異をもつ他の対立遺伝子をもつ。
【０１０６】
機能的なＡＰＣタンパク質をもたない細胞中へ全長ＡＰＣタンパク質の回復を目的とした研究は、今までのところ行われていない。しかしながら、ゲンタミシンのようなアミノグリコシド類は、厳しい用量規定毒性があり、現在は、静脈内投与をしなければならず、したがって、このようなタイプの疾患にとって魅力のない長期間投与となっている。本発明者は、ＡＰＣ遺伝子にある癌源性終止コドンを読み過ごすことができ、機能性のない切断されたＡＰＣタンパク質産物を含んでいる結腸直腸癌細胞に機能的な全長ＡＰＣタンパク質を発現させる他の化合物をスクリーニングした。
【０１０７】
中途ＡＰＣ終止突然変異を読み過ごしできる化合物をスクリーニングするために、本発明者は、特定の中途ＡＰＣ終止コドンの読み過ごしレベルに対する様々な化合物の効果を効率良く迅速に測定できるレポータアッセイシステムを構築した。その結果は、以前に、原核生物の終止コドン読み過ごしのみを示していたマクロライド系抗生物質の一員である、タイロシンが、特定のＡＰＣホットスポット突然変異読み過ごしができることを示している。
【０１０８】
Ｗｎｔシグナル伝達レベルが、ＣＲＣ細胞の腫瘍原性の特性のマーカであるため、本発明者は、ＣＲＣ細胞でみられる高レベルのＷｎｔシグナル伝達をタイロシンが、減少させることができるかどうかを先ず試験した。その結果は、タイロシン処置が、被験ＣＲＣ細胞内でＴｃｆ／β−カテニン−依存転写レベルを減少させることを示した。
【０１０９】
次のステップでは、本発明者は、タイロシンがインビボで腫瘍の進展を減少させることができるか否かを検討した。この目的のために、ＡＰＣホットスポット突然変異（コドン１５５４）を含むＨＴ２９−ＣＲＣ細胞をヌードマウスに注入した。治療マウス群は、飲料水中のタイロシンを摂取した。データは、タイロシン治療によって、対照群に比べ、腫瘍サイズと塊を減少させたことを示す。さらに、タイロシン治療は、微小血管に影響を与えることなく腫瘍細胞死を強めた。
【０１１０】
中途終止コドンの読み過ごしは、初期の結腸直腸癌の患者又はこのタイプの癌の発生に遺伝的な背景をもつ患者にとって、可能性のある代替的治療である。まとめると、この結果は、タイロシン及び他のマクロライド抗生物質が、結腸直腸癌患者の圧倒的多数において変異しているＡＰＣ遺伝子におけるこの疾病の原因となっている中途終止コドンの読み過ごしをもたらすことを示している。この新しいアプローチは、重要なコード配列中の中途終止コドンから生じる結腸直腸癌及びその他の遺伝的なヒト疾病の臨床治療において新しい道を開くことができる。
【０１１１】
実施例７
乳癌、膀胱癌、胃癌、及び類腱腫モデルにおけるマクロライド抗生物質及びそれらの塩及び誘導体による治療
雌ＳＣＩＤヌードマウスに、マウスモデルで乳癌をもたらすことが知られているＡＰＣホットスポットに変異を含む細胞を注入した。１４日間、治療群は、タイロシン又はタイロシンの塩又は誘導体；エリスロマイシン又はエリスロマイシンの塩又は誘導体；スピラマイシン、又はスピラマイシンの塩又は誘導体；オレアンドマイシン、又はオレアンドマイシンの塩又は誘導体、の中の１つを０．３〜０．８μｇ／ｍｌ含む飲料水と通常マウスの餌を与える。対照群は、同様に同じ乳癌細胞を注入し、マクロライド抗生物質又はマクロライド抗生物質の塩又は誘導体を含まない飲料水と同じ餌を与える。全マウスを犠牲死させ、腫瘍を取り外し、秤量する。対照マウス及びタイロシン、又はエリスロマイシン、又はスピラマイシン、又はオレアンドマイシン、又はマクロライド抗生物質の塩又は誘導体の各々で治療したマウスの腫瘍切片をＨ＆Ｅ染色剤で染色し、病理学者が各腫瘍切片を腫瘍壊死の検査をする。
【０１１２】
それぞれの癌のマウスモデルを誘導する適切な細胞を治療群及び対照群に注入する点を除き、乳癌についての上記方法を繰り返して、膀胱癌、胃癌、及び類腱腫癌について試験薬剤の効果を決定した。
【０１１３】
実施例８
子宮内での細胞の腫瘍原性に対するマクロライド抗生物質の効果
胎児をもつ１０匹の妊娠ＡＰＣ−１−マウスに飲料水中に０．３〜０．８μｇ／ｍｌのタイロシン、スピラマイシン、エリスロマイシン、又はオレアンドマイシンを与えた。１０匹の対照妊娠マウスは、抗生物質を含まない飲料水を与える。出産後、治療群の新生仔マウスは、飲料水中の同じマクロライド抗生物質を摂取し続け、対照の新生仔マウスは、抗生物質を含まない飲料水を摂取する。誕生８週間後、その若いマウスを犠牲死させ、胃腸管から腫瘍を取り出して、秤量した。対照群の若いマウスの腫瘍塊を、若いマウスのタイロシン、スピラマイシン、エリスロマイシン、又はオレアンドマイシン治療群（子宮内及び誕生後の両方でマクロライドにさらした）の腫瘍塊と比較する。
【０１１４】
実施例９
腫瘍の組織学的特徴は対照マウス及びマクロライド抗生物質投与マウス間で異なる
上記試験での対照マウス及びマクロライド抗生物質−治療マウスの腫瘍切片を、組織切片用に規定通りに用いている染色剤であるヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色剤で染色し、専門の病理学者が検査した。染色した切片を０検査して、マクロライド治療が、腫瘍の壊死及び腫瘍細胞死を導いたか否かを決定する。
【０１１５】
本明細書で述べた全ての公開、特許及び特許出願は、各個別の公開、特許又は特許出願が、具体的に及び個別に参照により本明細書中に取り込まれたのと同程度に、それらの全内容が本明細書中へ参照により取り込まれている。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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