(57)【要約】  特に、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）のコロニー形成を特徴とする炎症性皮膚症状を治療または予防するための方法であって、オーレオリシン阻害剤を局所投与することを含む方法が提供される。
2009506098.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）のコロニー形成を特徴とする炎症性皮膚症状を治療または予防するための方法であって、オーレオリシン阻害剤を局所投与することを含む方法。
【請求項２】
前記方法がアトピー性皮膚炎の治療または予防のためのものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記オーレオリシン阻害剤が、サーモリシンの既知の阻害剤から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記オーレオリシン阻害剤が、１以上の内在性メトジンシンメタロプロテアーゼも阻害する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記オーレオリシン阻害剤が、さらなる薬剤との組み合わせで投与される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記さらなる薬剤が抗生剤である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記さらなる薬剤が、ステロイド性および非ステロイド性抗炎症剤を含む炎症反応を調節する薬剤である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記さらなる薬剤が免疫抑制剤である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
黄色ブドウ球菌のコロニー形成を特徴とする前記炎症性皮膚症状を治療または予防するための局所用薬剤の製造に、オーレオリシン阻害剤を用いる使用。
【請求項１０】
前記使用がアトピー性皮膚炎の治療または予防のためのものである、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記オーレオリシン阻害剤が、サーモリシンの公知の阻害剤から選択される、請求項９または１０に記載の使用。
【請求項１２】
オーレオリシンの前記阻害剤が、１以上の内在性メトジンシンメタロプロテアーゼも阻害する、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
前記オーレオリシン阻害剤が、さらなる薬剤との組み合わせで投与される、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
前記さらなる薬剤が抗生剤である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記さらなる薬剤が、ステロイド性および非ステロイド性抗炎症剤を含む炎症反応を調節する薬剤である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１６】
前記さらなる薬剤が免疫抑制剤である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１７】
黄色ブドウ球菌のコロニー形成を特徴とする前記炎症性皮膚症状の治療に用いられる、オーレオリシン阻害剤ならびに薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む、局所用製薬組成物。
【請求項１８】
前記アトピー性皮膚炎の治療に用いられる、請求項１７に記載の局所用製薬組成物。
【請求項１９】
前記オーレオリシン阻害剤が、サーモリシンの公知の阻害剤から選択される、請求項１７または１８に記載の局所用製薬組成物。
【請求項２０】
オーレオリシンの前記阻害剤が、１以上の内在性メトジンシンメタロプロテアーゼも阻害する、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の局所用製薬組成物。
【請求項２１】
前記オーレオリシン阻害剤が、さらなる薬剤との組み合わせで投与される、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の局所用製薬組成物。
【請求項２２】
前記さらなる薬剤が抗生剤である、請求項２１に記載の局所用製薬組成物。
【請求項２３】
前記さらなる薬剤が、ステロイド性および非ステロイド性抗炎症剤を含む前記炎症反応を調節する薬剤である、請求項２１に記載の局所用製薬組成物。
【請求項２４】
前記さらなる薬剤が免疫抑制剤である、請求項２１に記載の局所用製薬組成物。
【請求項２５】
前記オーレオリシン阻害剤が、内在性メトジンシンメタロプロテアーゼを著しく阻害しない、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法、使用または組成物。
【請求項２６】
前記オーロリシン阻害剤が内在性メトジンシンメタロプロテアーゼを著しく阻害する、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法、使用または組成物。
【請求項２７】
前記オーレオリシン阻害剤が、化合物１〜１７およびその薬学的に許容される塩および溶媒和物から選択される、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法、使用または組成物。
【請求項２８】
前記オーレオリシン阻害剤が、化合物１２またはその薬学的に許容される塩または溶媒和化合物である、請求項２７に記載の方法、使用または組成物。
【請求項２９】
前記オーレオリシン阻害剤が、化合物１６またはその薬学的に許容される塩または溶媒和化合物である、請求項２７に記載の方法、使用または組成物。
【請求項３０】
（Ｒ）−Ｎ１−（（Ｓ）−３，３−ジメチル−１−（メチルアミノ）−１−オキソブタン−２−イル）−Ｎ４−ヒドロキシ−２−イソブチルスクシンアミド（化合物１１）またはその薬学的に許容される塩または溶媒和化合物である、化合物。
【請求項３１】
（Ｓ）−Ｎ１−（（Ｓ）−３，３−ジメチル−１−（メチルアミノ）−１−オキソブタン−２−イル）−Ｎ４−ヒドロキシ−２−イソブチルスクシンアミド（化合物１２）またはその薬学的に許容される塩または溶媒和化合物である、化合物。
【請求項３２】
（Ｓ）−Ｎ４−ヒドロキシ−２−イソブチル−Ｎ１−（（Ｓ）−１−（メチルアミノ）−１−オキソ−４−フェニルブタン−２−イル）スクシンアミド（化合物１６）またはその薬学的に許容される塩または溶媒和化合物である、化合物。
【請求項３３】
（Ｒ）−Ｎ４−ヒドロキシ−２−イソブチル−Ｎ１−（（Ｓ）−１−（メチルアミノ）−１−オキソ−４−フェニルブタン−２−イル）スクシンアミド（化合物１７）またはその薬学的に許容される塩または溶媒和化合物である、化合物。
【請求項３４】
請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の化合物を薬学的に許容される希釈剤または担体と一緒に含む、製薬組成物。
【請求項３５】
製薬として用いられる、請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３６】
黄色ブドウ球菌のコロニー形成を特徴とする前記炎症性皮膚症状の治療または予防に用いられる作用物質のスクリーニング方法であって、
（ｉ）前記作用物質をオーレオリシンと接触させ、
（ｉｉ）前記オーレオリシンが阻害されたか否かを判断すること
を含む方法。
【請求項３７】
黄色ブドウ球菌のコロニー形成を特徴とする前記炎症性皮膚症状の治療または予防に用いられる作用物質のスクリーニング方法であって、
（ｉ）患者から皮膚洗液を得て、
（ｉｉ）前記作用物質を皮膚洗液と接触させ、
（ｉｉｉ）タンパク質分解活性が阻害されたか否かを判断すること
を含む、方法。
【請求項３８】
工程（ｉｉｉ）におけるタンパク質分解活性の阻害を、酵素電気泳動または酵素アッセイによって判断する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
黄色ブドウ球菌のコロニー形成を特徴とする、哺乳動物における炎症性皮膚症状に関連する皮膚病変を治療するための方法であって、（ｉ）前記皮膚病変部位から皮膚洗液を得て、メタロプロテアーゼ活性の存在が確認されたら、（ｉｉ）オーレオリシン阻害剤を前記皮膚病変に局所投与すること、を含む方法。
【請求項４０】
黄色ブドウ球菌のコロニー形成を特徴とする、哺乳動物における炎症性皮膚症状に関連する前記皮膚病変を治療するための方法であって、（ｉ）前記皮膚病変部位における黄色ブドウ球菌の存在を判断し、前記黄色ブドウ球菌の存在が確認されたら、（ｉｉ）オーレオリシン阻害剤を前記皮膚病変に局所投与すること、を含む方法。
【請求項４１】
黄色ブドウ球菌のコロニー形成を特徴とする、哺乳動物における炎症性皮膚症状に関連する前記皮膚病変を治療するための局所用薬剤の製造にオーレオリシン阻害剤を用いる使用であって、前記皮膚病変が黄色ブドウ球菌を含むことを予め判断してある使用。
【請求項４２】
黄色ブドウ球菌のコロニー形成を特徴とする哺乳動物における炎症性皮膚症状に関連する前記皮膚病変を治療するための局所用薬剤の製造にオーレオリシン阻害剤を用いる使用であって、前記皮膚病変がメタロプロテアーゼ活性を有することを予め判断してある、使用。
【請求項４３】
前記オーレオリシン阻害剤が、内在性メトジンシンメタロプロテアーゼ阻害剤でもある、請求項３９〜４２のいずれか１項に記載の使用または方法。
【請求項４４】
前記オーレオリシン阻害剤が、オーレオリシンＩＩ阻害剤である、請求項１〜２９および３６〜４３のいずれか１項に記載の使用、方法または組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）のコロニー形成を特徴とする炎症性皮膚症状の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
湿疹とも呼ばれることがあるアトピー性皮膚炎（ＡＤ）は、掻痒症（ｐｕｒｉｔｕｓ）、紅斑、皮膚乾燥および炎症を特徴とする慢性再発性の症状である。
【０００３】
ＡＤの病原体については、いまだ完全には解明されていないが、抗原刺激の応答によるＴ細胞の過剰活性化とアトピー型のランゲルハンス細胞によるＴ細胞の過剰刺激とが重要な因子であると言われている。この疾患の重症度にはＩｇＥの産生レベルが大きく相関しており、また多くの患者にアレルゲン特異的ＩｇＥが観察される場合があるとはいえ、この所見が特定のアレルゲンに対する感作を示すことが明らかなわけではない。
【０００４】
この機能障害の羅患率には大きな幅があるが、西欧諸国の中には子どもの２０％にものぼる国があると推定されている。ＡＤは、アトピー性疾患（喘息、アレルギー性鼻炎およびＡＤ）の病歴を持つ家族に見られることが多い。
【０００５】
抗生物質であるムピロシンを局所塗布すると、コントロール不良（Ｐｏｏｒｌｙ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ）のＡＤ患者の症状が大幅に改善されてきたことから、この機能障害の永続化に細菌が関与しているのではないかと考えられている（レバー（Ｌｅｖｅｒ），Ｒら、Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１９：１８９〜１９８頁、１９８８年）。
【０００６】
ＡＤ患者では、９０％を超える患者の皮膚病変で黄色ブドウ球菌のコロニー形成が認められているのに対し、健常な被験者で黄色ブドウ球菌が存在するのはわずか５％にすぎない（レイデン（Ｌｅｙｄｅｎ），ＪＥ、マープルス（Ｍａｒｐｌｅｓ），ＲＲおよびクリグマン（Ｋｌｉｇｍａｎ）ＡＭ、Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．９０：５２５〜５３０頁、１９７４年）。細菌は、毒素（エンテロトキシンＡ、Ｂ、ＣおよびＤ、毒素性ショック症候群の毒素など）を放出することからＡＤの悪化と慢性化に重要であり、その多くが本来は極めて抗原性の高いものであるため、皮膚での炎症反応を悪化させることが明らかになっている（ラング（Ｌｅｕｎｇ），ＤＹＭら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２  １３７４〜８０頁、１９９３年）。子どもを対象とした特定の一研究で、患者の８１％に黄色ブドウ球菌のコロニー形成（対照群では４％）が認められたことから、疾患の重症度が毒素産生菌によるコロニー形成と相関している可能性が示された（ブニコウスキ（Ｂｕｎｉｋｏｗｓｋｉ），Ｒら、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０５（４）：８１４〜８１９頁、２０００年）。
【０００７】
エンテロトキシンＢおよびイエダニ抗原Ｄｅｒ  ｐとに曝露したマウスが相加的な炎症反応を生じた際に、食物アレルゲンまたは空気アレルゲンを含む環境要因の役割を示唆する一連の証拠と、黄色ブドウ球菌コロニー形成の関与を示唆している文献との間に、統合的な関連性が見いだされた（ヘルツ（Ｈｅｒｚ），Ｕ、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔ．１１０（３）：２２４〜２３１頁、１９９９年）。さらに、黄色ブドウ球菌は、Ｔｈ−２型炎症が関与する皮膚部位に優先的に結合することが明らかになっている（チョー（Ｃｈｏ），Ｓ−Ｈら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔ．１１６（５）：６５８〜６６３頁、２００１年）。
【０００８】
現行の治療では一般に多数の手法、すなわち（ｉ）バッチおよび保湿剤の使用を含む皮膚の水和、（ｉｉ）ステロイド（糖質コルチコイド）および免疫抑制剤（シクロスポリンＡ、タクロリムスおよびピメクロリムスなど）といった、免疫応答を低減または調節する薬剤の使用、（ｉｉｉ）刺激物、アレルゲン、情動ストレス因子および感染因子といった寄与因子の除去、を必要とする。現行の治療であっても、この機能障害の急性期に対しては効果的に対処することができるが、これを長期間にわたって使用することには、ステロイドや免疫抑制剤の使用期間の長期化に伴う重篤な副作用の可能性がゆえに疑問の余地がある。重複感染の治療には経口抗生剤が用いられることが多いが、抗生剤、特に局所用抗生剤を広く一般に利用すると抗生剤耐性細菌株が育つ危険性があることから、こうした一般利用は通常控えられている。
【０００９】
黄色ブドウ球菌が分泌するメタロプロテアーゼに、オーレオリシン（ａｕｒｅｏｌｙｓｉｎ）（ＥＣ  ３．４．２４．２９）がある（ダビン（Ｄｕｂｉｎ），Ｇ．、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８３：１０７５〜１０８６頁、２００２年）。オーレオリシンはサーモリシンタンパク質ファミリーのメンバーであり、その活性が亜鉛とカルシウムとに依存し、基質特異性が低い。１９９８年に、オーレオリシンの結晶構造が公開され、このタンパク質が３０１個のアミノ酸の単鎖からなることが明らかになった（バンビューラ（Ｂａｎｂｕｌａ），Ａら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ６（９）：１１８５〜１１９３頁、１９９８年）。オーレオリシンはａｕｒ遺伝子によってコードされ、これを遺伝子解析したところ、このタンパク質は高度に保存されるため、細菌のライフサイクルで重要な役割を果たしている可能性があることが分かっている（サバト（Ｓａｂａｔ），Ａら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８（２）：９７３〜９７６頁、２０００年）。本願発明者らは、オーレオリシンの阻害剤が、アトピー性皮膚炎での黄色ブドウ球菌の病原性およびコロニー形成の可能性を下げることを発見した。この阻害剤は、オーレオリシンと宿主との相互作用を乱すことで、生物体の病原性（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）を制限する。
【００１０】
オーレオリシンの正確な機能は明らかではないが、Ｖ８プロテアーゼ（分泌されたセリンプロテアーゼ）のプロセシングに関与しており、ヒトプロテアーゼ阻害剤であるα１−抗キモトリプシンおよびα１−プロテイナーゼ阻害剤を試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）にて不活性化することが明らかになっている。相当量のオーレオリシンを産生する黄色ブドウ球菌株は、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）に対する強力な活性を有するヒト殺菌ペプチドのカテリシジンＬＬ−３７に対する感受性が低い（シエプラウスカ−ルーパ（Ｓｉｅｐｒａｗｓｋａ−Ｌｕｐａ），Ｍら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４８（１２）：４６７３〜４６７９頁、２００４年）。しかしながら、今のところ抗菌ペプチドのタンパク質分解が、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での細菌耐性の一機序であることは証明されていない（ブローゲン（Ｂｒｏｇｄｅｎ），ＫＡ、Ｎａｔｕｒｅ３：２３８〜２５０頁、２００５年）。分泌毒素は一般的に重要な病原性因子として知られているが、オーレオリシンが確かな病原性因子であるとはみなされていない（スプラン（Ｓｕｐｕｒａｎ），ＣＴ、スコザファヴァ（Ｓｃｏｚｚａｆａｖａ），Ａおよびクレア（Ｃｌａｒｅ），ＢＷ、Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．２２（４）：３２９〜３７２頁、２００２年；ダビン（Ｄｕｂｉｎ），Ｇ、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８３：１０７５〜１０８６頁、２００２年）。
【００１１】
ＡＤ患者から得たさまざまな黄色ブドウ球菌株のタンパク質分解活性について検討したところ、中程度から高いタンパク質分解活性を示す菌株では、タンパク質分解活性の２５〜１００％をオーレオリシンが担っていることが明らかになった（ミエゾブロズキ（Ｍｉｅｄｚｏｂｒｏｄｚｋｉ），Ｊら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２１：２６９〜２７６頁、２００２年）。
【００１２】
国際公開第０２／０８９７３０号パンフレットには、ＣＤ１５４活性を調節するための化合物および方法が開示されており、この方法は、内在性ヒトメタロプロテアーゼによる細胞表面からのＣＤ１５４の動員をブロックするために、メタロプロテアーゼ阻害剤を投与してＣＤ１５４の放出を減らすことを含むものである。主に抗血栓療法などの手法についてＡＤの治療が示唆されているが、この主張を裏付ける証拠はない。さらに、オーレオリシンまたはＡＤにおけるオーレオリシンの役割のどちらについても論じられていない。
【００１３】
また、国際公開第０２／０８９７３０号パンフレットには、メタロプロテアーゼの阻害について開示されているが、説明または例による定義は何らなされていない。ここに定義されている阻害剤は、マトリクスメタロプロテアーゼすなわちＭＭＰ（Ｃｌａｎ  ＭＡ（Ｍ）、Ｍ１０ファミリー）阻害剤として知られているものであり、広域スペクトルのＭＭＰ阻害剤またはＭＭＰ２／９ゼラチナーゼ阻害剤の５つの例があげられている。結果として、これらの例はＭＭＰがＣＤ１５４を切断可能であることを間接的に示してはいるが、どのメタロプロテアーゼがＣＤ１５４を切断させるのかについては明確にしていない。また、前記明細書ではシェダーゼ（ｓｈｅｄｄａｓｅ）（メタロプロテアーゼのアダマリシン（ａｄａｍａｌｙｓｉｎ）ファミリー、Ｍ１２ファミリー）に言及しているが、ＣＤ１５４の脱落の役割については何ら証拠があげられていない。
【００１４】
グロベルニー（Ｇｒｏｂｅｌｎｙ）ら（１９９２年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３１、７１５２〜７１５４頁）は、ペプチドヒドロキサム酸によるヒト皮膚コラゲナーゼ、サーモリシンおよびシュードモナス・エルギノーサム（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓｕｍ）エラスターゼの阻害について論じている。
【００１５】
癌および炎症性疾患における薬物標的として長いあいだ関心が持たれてきたことから、相当数のＭＭＰが従来技術において公知である。メタロプロテアーゼのＭＭＰ（Ｍ１０）およびアダマリシン（Ｍ１２）ファミリーは、メトジンシン（ｍｅｔｚｉｎｃｉｎ）（亜鉛結合モチーフ付近の「メトジンシン」折り畳みを特徴とする（ボーデ（Ｂｏｄｅ）ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ、３３１、１３４〜４０頁、１９９３年））であり、オーレオリシン（Ｍ４）がメンバーであるグルジンシン（ｇｌｕｚｉｎｃｉｎ）（亜鉛結合ドメインにＧｌｕ残基が存在することが特徴である）とは異なる。よって、オーレオリシンはＭＭＰとしては分類されない。また、ＭＭＰ、特にアダマリシンが活性分子（ＴＮＦα、Ｆａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ４０など）を放出する膜タンパク質を切断可能であることも、以前から知られている。
【発明の開示】
【００１６】
要約すると、従来技術でＡＤ悪化における黄色ブドウ球菌の役割を認識していながら、治療案では、基礎疾患と黄色ブドウ球菌のコロニー形成との組み合わせに起因する炎症反応の制御または黄色ブドウ球菌の直接的な制御のいずれかを対象としていた。オーレオリシンなどの分泌されたタンパク質を阻害することは、従来技術においては想定されていなかった。また従来技術では、ＡＤの治療に際していくつかのメタロプロテアーゼの阻害が果たす役割を認識していながら、これはあくまで内在性マトリクスメタロプロテアーゼおよびアダマリシンの阻害との関連におけるものであって、コロニーを形成している細菌由来の外来性メタロプロテアーゼとの関連におけるものではなかった。
【００１７】
ＡＤなどの、黄色ブドウ球菌のコロニー形成を特徴とする炎症性皮膚症状を治療する新規な方法に、明確な必要性がある。さらに、従来の抗菌治療に対する耐性の獲得に関する周知の論点を踏まえると、黄色ブドウ球菌のコロニー形成を特徴とする炎症性皮膚症状を治療するための新規な方法が、新規な作用機序を伴うものであると望ましい。
【００１８】
本発明は、黄色ブドウ球菌のコロニー形成を特徴とする哺乳動物における炎症性皮膚症状を治療または予防するための方法であって、オーレオリシン阻害剤の局所投与を含む方法である。
【００１９】
本発明の第２の態様は、黄色ブドウ球菌のコロニー形成を特徴とする哺乳動物における炎症性皮膚症状の治療または予防用の局所用薬剤の製造に、オーレオリシン阻害剤を用いる使用である。
【００２０】
また、黄色ブドウ球菌のコロニー形成を特徴とする炎症性皮膚症状の治療に用いられる、オーレオリシン阻害剤と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む局所用製薬組成物も提供する。
【００２１】
上記の方法、使用および組成物は、獣医学的な用途（すなわち、哺乳動物が、ネコ、イヌ、ウマ、ブタなどの家畜または畜産哺乳動物である場合）において有用であると予想される。しかしながら、予想される主な使用または方法は、製薬用途におけるもの（すなわち、哺乳動物がヒトの場合）である。
【００２２】
本発明の方法、使用および組成物の利点は、治療の標的がオーレオリシンである限り、前記治療では細菌の生存にとって明らかに重要ではない分泌タンパク質を標的とするため、従来の抗生剤を使用する手法に比して細菌の耐性変異体の発生につながりかねない選択圧を生じる可能性がはるかに少ないことにある。さらに、外来性タンパク質（すなわち、哺乳動物には存在しないタンパク質）を標的とするため、機序関連の副作用（すなわち、阻害因子自体ではなく阻害機序が原因の副作用）につながらないと予想される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
「黄色ブドウ球菌のコロニー形成を特徴とする炎症性症状」という表現は、多くの事例で皮膚に黄色ブドウ球菌のコロニーが形成され、コロニー形成または皮膚感染が増すと基礎症状が悪化して炎症反応が増える、アトピー性皮膚炎などの症状を意味する。
【００２４】
別の炎症性症状に、魚鱗癬様紅皮症、アトピー（アトピー性皮膚炎および極めて高いＩｇＥレベル）および重積性裂毛を特徴とする重篤な常染色体劣性遺伝皮膚機能障害であるネザートン症候群がある。この場合、ほとんどの患者が再発性または持続性の細菌感染を経験する。
【００２５】
「アトピー性皮膚炎」または「ＡＤ」という用語は、ＩｇＥおよび好酸球の血清濃度上昇に関連する激しい掻痒症および皮膚過敏症を特徴とする慢性・再発性・炎症性の皮膚疾患を意味する。
【００２６】
好ましい実施形態では、本発明の方法または使用は、アトピー性皮膚炎の治療または予防である。
【００２７】
オーレオリシン阻害剤は、オーレオリシンのタンパク質分解活性を阻害できるものであれば、どのようなメタロプロテアーゼ阻害剤であってもよい。この阻害剤は、好ましくは対立遺伝子のＩＩ型を阻害し、より好ましくは両方の対立遺伝子の形態すなわちＩ型およびＩＩ型オーレオリシンを阻害するものであり、皮膚疾患ではＩＩ型が優勢である（サバト（Ｓａｂａｔ）Ａ、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６８、９７３〜６頁、２０００年）。この阻害剤は、たとえば、ＭＭＰ（Ｍ１０）（ＭＭＰ１、２、８、９など）および／またはアダマリシン（Ｍ１２）などの内在性メトジンシンメタロプロテアーゼも直接的に阻害するものであってもよいし、そうでなくてもよい。以下、オーレオリシン対立遺伝子のＩ型およびＩＩ型を、それぞれ「オーレオリシンＩ」および「オーレオリシンＩＩ」と呼ぶ。
【００２８】
特定の物質がオーレオリシンを阻害する能力については、後述の実施例の「オーレオリシン酵素阻害アッセイ」を用いて判断することが可能である。
【００２９】
本願発明者らの意味する「オーレオリシンの阻害」または「オーレオリシン阻害剤」によって、オーレオリシン酵素アッセイ（オーレオリシンＩＩ酵素アッセイなど）で５０マイクロモル未満、好ましくは５マイクロモル未満、特に好ましくは０．５マイクロモル未満のＩＣ５０値が得られる。
【００３０】
本願発明者らの意味する「内在性メトジンシンメタロプロテアーゼの阻害」または「内在性メトジンシンメタロプロテアーゼ阻害剤」によって、対応する内在性メトジンシンメタロプロテアーゼアッセイで５０マイクロモル未満、好ましくは５マイクロモル未満、特に好ましくは０．５マイクロモル未満のＩＣ５０値が得られる。
【００３１】
よって、本発明の一実施形態では、オーレオリシン阻害剤は、ＭＭＰ−９などの内在性メトジンシンメタロプロテアーゼを著しくは阻害しない。「著しくは阻害しない」とは、内在性メトジンシンメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ−９など）に対する阻害剤の阻害強度（ＩＣ５０で測定したものなど）が、オーレオリシン（オーレロイシンＩＩなど）に対する阻害剤の阻害強度よりも少なくとも５分の１の弱さ、好ましくは少なくとも１０分の１（少なくとも５０分の１など）の弱さであるという意味である。本発明のもうひとつの実施形態では、オーレオリシン阻害剤は、内在性メトジンシンメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ−９など）を著しく阻害する。「著しく阻害する」とは、内在性メトジンシンメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ−９など）に対する阻害剤の阻害強度（ＩＣ５０で測定したものなど）が、オーレオリシン（オーレロイシンＩＩなど）に対する阻害剤の阻害強度の少なくとも０．５倍（例えば、少なくとも１倍）であるという意味である。内在性メトジンシンメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ−９など）に対する阻害剤の阻害強度（ＩＣ５０で測定したものなど）は、たとえば、オーレオリシン（オーレロイシンＩＩなど）に対する阻害剤の阻害強度の少なくとも１０倍であってもよく、おそらくは１００倍またはさらには１０００倍であってもよい。
【００３２】
内在性ＭＭＰの公知の例については、ハンデ（Ｈａｎｄｅ）ら（２００４年、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ１０、９０９〜９１５頁）に論じられている。これには、ＭＭＰ−２（ゼラチナーゼＡ）、ＭＭＰ−９（ゼラチナーゼＢ）およびＭＭＰ−１４（ＭＴ−ＭＭＰ−１、膜結合酵素）ＭＭＰ−１（コラゲナーゼ−１）、ＭＭＰ−３（ストロメライシン−１）、ＭＭＰ−７（マトリリシン）、ＭＭＰ−１１（ストロメライシン−３）およびＭＭＰ−１３（コラゲナーゼ−３）が含まれる。もうひとつの例がＭＭＰ−８（コラゲナーゼ−２）である。アダマリシンの例としては、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ３３があげられる。上述したように、これらの酵素の多くがすでに癌や炎症と関連付けられており、ＡＤＡＭ３３は遺伝的に喘息と関連付けられている。
【００３３】
また、オーレオリシン阻害剤は、皮膚中における他の組織障害プロテアーゼを間接的に阻害するものであってもよい。プロテアーゼは、活性化にタンパク質分解による切断を必要とする不活性なチモーゲンとして発現されることが多い。特に、オーレオリシン自体は、黄色ブドウ球菌によって分泌される細胞外プロテアーゼの活性化の開始を担うと考えられている（ショー（Ｓｈａｗ）ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１５０、２１７〜２８頁、２００４年）。このため、オーレオリシンは、皮膚に存在する内在性宿主プロテアーゼも活性化し、よって、ＡＤなどの疾患を悪化させることが多い。たとえば、Ｍ４ファミリーの他の３つのメンバー（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エラスターゼ、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ）プロテイナーゼおよびサーモリシン）が、ヒトＭＭＰを活性化可能であることが知られている（岡本ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２、６０５９〜６６頁、１９９７年）。オーレオリシンと近縁の酵素のひとつであるバシロリシンが、プラスミノーゲンをプラスミンに変換するプロウロキナーゼを活性化することが知られている（ナラサキら、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０、１４２７８〜８７頁、２００５年）。この参考資料には、バシロリシンが、プラスミノーゲンを、プラスミンへの変換感受性がさらに高いミニプラスミノーゲン様分子に変換することについても開示されている。本願発明者らのデータは、オーレオリシンがプロウロキナーゼを活性化し、オーロリシンを阻害すればこの活性化を防止できることを示している。プロウロキナーゼの活性化は、プラスミノーゲン経路の活性化につながり、これが炎症促進性プラスミンの産生を引き起こす。本願発明者らは、オーレオリシンがプロＭＭＰ−１を活性化し、オーロリシンを阻害すればこの活性化を防止できることも示している。ＭＭＰ−１の活性化は、正常な皮膚のバリア機能を乱して、皮膚におけるコラーゲンの分解増加につながる。
【００３４】
オーレオリシン阻害剤は、たとえば、公知のサーモリシン阻害剤などのサーモリシン阻害剤から選択できるものであり、たとえば、全体として本願明細書に援用するマルコット（Ｍａｒｃｏｔｔｅ）ら（Ｊ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ１４、４２５〜４３５頁、１９９９年）（特に表１参照）に開示されているような非環式スクシニルヒドロキサマートがある。
【００３５】
特定のオーレオリシン阻害剤がＭＭＰなどの他の酵素を阻害する能力についても、精製酵素を用いる標準的なアッセイで判断することが可能である。
【００３６】
オーレオリシン阻害剤は、以下の化合物すなわち、イロマスタット（化合物１；米国特許第５，１８３，９００号明細書参照）、マリマスタット（化合物３、国際公開第９４／０２４４７号パンフレット参照）、化合物５（国際公開第９５／１９９５７号パンフレット参照）、ソリマスタット（化合物７、ＥＰ１０３０８４２号明細書参照）、化合物９（国際公開第９５／１９９５６号パンフレット参照）、化合物１１（Ｒｏ  ３１−９７９０、ＥＰ０６６４２８４号明細書ならびに、ウィッテイカー（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）ら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ、９９、２７３５〜２７７６頁、１９９９年参照）およびそれらのジアステレオ異性体（化合物２、化合物４、化合物６、化合物８、化合物１０および化合物１２）、化合物１３（カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））およびその立体異性体、化合物１４（カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））およびホスフォラミドン（化合物１５）（以下の表１参照）を含むか、含むと予想される。その他の例としては、化合物１６および１７があげられる。
【００３７】
【表１】
2009506098.tif 000003
2009506098.tif 000004
2009506098.tif 000005
【００３８】
化合物１１、１２、１６および１７は新規であり、本発明の第一の発明として、薬学的に許容される塩ならびにその溶媒和物とともに、それ自体が権利請求の対象となっている。前記化合物は、すべての多形性を含む非結晶または結晶形のいずれかの固体として権利請求の対象となっている。結晶形については、適当な溶媒から化合物を再結晶化して調製すればよい。非晶質形は、たとえば化合物の溶液を噴霧乾燥させるなどの方法で調製することができる。これらの化合物を調製するには、たとえば、実施例に記載したようにすればよい。
【００３９】
実施例中のデータから明らかなように、オーレオリシンならびにＭＭＰ（特にＭＭＰ１、２、８および９）に対する阻害のバランスが極めてよいことから、化合物１２が特に興味深い。これは、オーレオリシンを阻害すべきレベルで投与すると、これらの他のＭＭＰに対する効果も同様に期待できることを意味する。よって、腱炎の減少、有意なＭ１０阻害活性を有する多くの化合物（化合物３、７、１１など）に共通する全身への毒物学的影響の観点で、利点が得られると予想される。
【００４０】
また、実施例中のデータから明らかなように、著しく強いオーレオリシン阻害活性を有することから、化合物１６が特に興味深い。事実、この化合物はオーレオリシン阻害剤として、試験対象の他のどの化合物よりもかなり強力であった。
【００４１】
これらの新規な化合物それ自体を権利請求することに加え、本願発明者らは、これらの調製方法、製薬としての使用、化合物を薬学的に許容される（特に、局所用として許容される）希釈剤または担体とともに含有する製薬組成物ならびに、これらを用いた炎症性皮膚疾患の治療方法、炎症性皮膚疾患治療用薬剤の製造の用いる使用についても権利請求している。
【００４２】
阻害剤については、局所投与向けに処方すると好ましく、治療対象となる部分１平方メートルあたり０．００００１から１０ｇ、好ましくは０．０００１から１ｇの活性成分が送られるような量で、患者に投与すればよい。
【００４３】
一般に、阻害剤の総量は、製剤の総重量に対して０．００１から１２ｗｔ％、たとえば０．００１８から１１．６ｗｔ％、好ましくは０．００８８から１．４ｗｔ％（０．０１〜１．０ｗｔ％など）、さらに好ましくは０．０５から０．２ｗｔ％（たとえば約０．１ｗｔ％）である。
【００４４】
局所用製剤は、たとえば、ゲル、軟膏、クリームまたはローションの形をとる。他の例をあげると、浸透性包帯材、ペースト、散布剤、噴霧剤、オイル、経皮デバイスなどがある。
【００４５】
局所用製剤は、好ましくは活性成分に対する表面曝露を最大限にし、全身曝露を最小限に抑えるものである。
【００４６】
前記製剤がゲルの場合、一般的に、架橋ポリエチレングリコール、架橋澱粉またはポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマーを含む。
【００４７】
軟膏、クリームまたはローションは一般に、水性相と油性相とを混合状態で含有する。これらは一般に、水中油型乳濁液または油中水型乳濁液を特徴とすることがある。
【００４８】
特にクリームまたは軟膏である場合に、製剤にはさらに、１種以上の皮膚軟化薬、乳化剤、増粘剤および／または保存剤を含んでもよい。
【００４９】
クリームまたは軟膏に包させるのに適した皮膚軟化薬は一般に、長鎖アルコール、たとえば、セチルアルコール、ステアリルアルコールおよびセテアリルアルコールなどのＣ８〜Ｃ２２アルコール、ワセリンおよび軽油などの炭化水素あるいはアセチル化ラノリンである。製剤中の皮膚軟化薬の総量は、製剤の総重量に対して好ましくは約５ｗｔ％から約３０ｗｔ％、より好ましくは約５ｗｔ％から約１０ｗｔ％である。
【００５０】
乳化剤は一般に、ポリソルベート６０（ＩＣＩ・アメリカス（ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｓ）から入手可能）、モノステアリン酸ソルビタン、オレイン酸ポリグリセリル−４、ポリオキシエチレン（４）ラウリルエーテルなどの非イオン性界面活性剤である。通常、乳化剤の総量は、製剤の総重量に対して約２ｗｔ％から約１４ｗｔ％であり、より好ましくは約２ｗｔ％から約６ｗｔ重量％である。
【００５１】
ビーガム・ＴＭ．Ｋ（Ｖｅｅｇｕｍ．ＴＭ．Ｋ）（Ｒ．Ｔ．ヴァンダービルト・カンパニー・インコーポレイテッド（Ｒ．Ｔ．Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．）から入手可能）などの薬学的に許容される増粘剤ならびに、長鎖アルコール（すなわち、セチルアルコール、ステアリルアルコールおよびセテアリルアルコールなどのＣ８〜Ｃ２２アルコール）を利用することが可能である。増粘剤の総含有量は、製剤の総重量に対して好ましくは約３ｗｔ％から約１２ｗｔ％である。
【００５２】
メチルパラベン、プロピルパラベンおよびベンジルアルコールなどの保存剤を製剤中に存在させることができる。他の保存剤例としては、フェノキシエタノールおよびクロロクレゾールがある。このような保存剤の適量は当業者間で公知である。
【００５３】
任意に、ベンジルアルコール、乳酸、酢酸、ステアリン酸または塩酸などの可溶化剤を別途製剤に含むことも可能である。可溶化剤を別途用いる場合、その含有量は、製剤の総重量に対して好ましくは約１ｗｔ％から約１２ｗｔ％である。
【００５４】
任意に、グリセリンなどの湿潤剤や、ステアリン酸ブチル、尿素およびＤＭＳＯなどの皮膚浸透エンハンサーを製剤に含有させることも可能である。
【００５５】
単一の成分がクリーム中で１つ以上の機能を発揮し得ること、たとえばセチルアルコールが皮膚軟化薬と増粘剤の両方として機能し得ることは、当業者間で公知である。
【００５６】
好ましくは、前記製剤または薬剤はクリームである。クリームは一般に、エマルションを形成すべく混合された油相と水相とからなる。好ましくは、クリームは水中油型エマルションを含む。好ましくは、本発明のクリーム中の水含有量は、クリームの総重量に対して約４５ｗｔ％から約８５ｗｔ％である。
【００５７】
製剤または薬剤が軟膏である場合、これは一般に、ワセリンあるいは、ポリエチレングリコール３３５０（ユニオンカーバイド（Ｕｎｉｏｎ  Ｃａｒｂｉｄｅ）から入手可能）との併用でのポリエチレングリコール４００（ユニオンカーバイドから入手可能）などの薬学的に許容される軟膏基剤を含む。本発明の軟膏中の軟膏基剤含有量は、好ましくは軟膏の総重量に対して約６０ｗｔ％から約９５ｗｔ％である。
【００５８】
製剤の一例としては、精製水で１００％にした軟性白色パラフィン、乳化ワックス、流動パラフィンを含み、保存剤（フェノキシエタノールなど）を含む乳化軟膏（例えば３０ｗｔ％前後）を含むクリームがある。この製剤を、所望のｐＨまで緩衝しておいてもよい（例えばクエン酸およびリン酸ナトリウムを用いる）。活性剤の濃度は一般に、０．０１から１．０ｗｔ％である。
【００５９】
好ましい実施形態では、製剤は、イソステアリン酸、セチルアルコール、ステアリルアルコール、白色ワセリン、ポリソルベート６０、モノステアリン酸ソルビトン（ｓｏｒｂｉｔｏｎ）、グリセリン、キサンタンガム、精製水、ベンジルアルコール、メチルパラバンおよびプロピル−パラバンを含む水中油型クリーム基剤を含むクリームである。このようなクリームは、５％イミキモドを含有するアルダラ（Ａｌｄａｒａ）イミキモドクリームの形をとるものであってもよい。
【００６０】
化合物１２は、特に固体が非晶質形である場合には、水に対する可溶性が特に高いことが明らかになっている。この化合物は、油相（パラフィンなど）と乳化する前に水相に取り込まれることがあるため、水中油型または油中水型エマルションに上手く処方できる。
【００６１】
オーレオリシン阻害剤については、たとえば抗生剤、ステロイド（ヒドロコルチゾン、酪酸クロベタゾン、吉草酸ベタメタゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、プロピオン酸クロベタゾール、プロピオン酸フルチカゾン、フランカルボン酸モメタゾンおよびデキサメタソンなど）、非ステロイド性抗炎症薬、マクロライド免疫抑制剤（シクロスポリンＡ、タクロリムスおよびピメクロリムスなど）、ロイコトリエンアンタゴニストおよびホスホジエステラーゼ阻害薬などの、炎症性皮膚症状の治療または予防用の従来の治療薬などの別の薬剤と併せて投与してもよい。
【００６２】
これらの別の治療薬については、従来の任意の経路で投与することができる。局所経路および経口経路が好ましい。
【００６３】
活性剤は、これを用いることが適している場合に、薬学的に許容される塩または水和物などの溶媒和物の形で投与することができるものである。
【００６４】
したがって、黄色ブドウ球菌のコロニー形成を特徴とする炎症性皮膚症状を治療または予防するための方法であって、別の薬剤の投与との併用で、オーレオリシン阻害剤を局所投与することを含む方法も提供する。
【００６５】
本発明の別の態様では、別の薬剤との併用で、黄色ブドウ球菌のコロニー形成を特徴とする炎症性皮膚症状の治療または予防用の局所用薬剤の製造にオーレオリシン阻害剤を用いる使用を提供する。
【００６６】
組み合わせの治療薬については、同一または異なる経路で同時、逐次的または別々に投与してもよい。一例としての実施形態では、別の薬剤を経口投与することができる。もうひとつの例としての実施形態では、別の薬剤を、例えばオーレオリシン阻害剤との併用調製物で、局所投与することができる。
【００６７】
たとえば、別の薬剤は、黄色ブドウ球菌の殺菌薬であって、経口または局所投与される抗生物質であってもよい。
【００６８】
ＡＤにおけるオーレオリシンの役割の認識は、ＡＤ治療用のオーレオリシン阻害剤である新規な物質を同定するための新規なスクリーニング方法を可能にする。
【００６９】
よって、本発明のもうひとつの態様では、黄色ブドウ球菌のコロニー形成を特徴とする炎症性皮膚症状の治療または予防に用いられる作用物質の試験管内でのスクリーニング方法であって、
（ｉ）前記作用剤をオーレオリシンと接触させ、
（ｉｉ）オーレオリシンが阻害されたか否かを判断すること
を含む方法を提供する。
【００７０】
オーレオリシンの阻害については、たとえば、実施例で説明するオーレオリシン阻害アッセイあるいはミルク寒天プレートアッセイによる、標準的な試験で判断することができる。
【００７１】
また、黄色ブドウ球菌のコロニー形成を特徴とする炎症性皮膚症状の治療または予防に用いる作用剤のスクリーニング方法であって、
（ｉ）患者から皮膚洗液を得て、
（ｉｉ）前記作用剤を皮膚洗液と接触させ、
（ｉｉｉ）（酵素電気泳動または蛍光酵素アッセイなどによって）タンパク質分解活性が阻害されたか否かを判断すること
を含む方法も提供する。この活性は、オーレオリシンによるものであってもよく、任意に内在性メトジンシンメタロプロテアーゼによるものであってもよい。
【００７２】
「作用物質」とは、「小分子」（例えば分子量１０００Ｄａ未満、特に６００Ｄａ未満の分子）、ペプチド、タンパク質または抗体を問わず、あらゆる化学物質を意味する。小分子（例えば分子量６００Ｄａ未満のもの）が好ましい。小ペプチド（例えば１６未満のアミノ酸残基を含有する）が好ましい。これらのペプチドは、直鎖ペプチドであっても環状ペプチドであってもよい。
【００７３】
本発明による方法および使用を実施する好ましい一方法では、ＡＤまたは他の炎症性症状に関連する皮膚病変におけるメタロプロテアーゼ活性の存在を、治療の前に確認する。よって、本発明のこの態様では、黄色ブドウ球菌のコロニー形成を特徴とする哺乳動物における炎症性皮膚症状に関連する皮膚病変を治療するための方法であって、（ｉ）前記皮膚病変の部位からの皮膚洗液におけるメタロプロテアーゼ活性の存在を判断し、メタロプロテアーゼ活性の存在が確認されたら、（ｉｉ）オーレオリシン阻害剤を前記皮膚病変に局所投与することを含む方法を提供する。
【００７４】
前記皮膚病変がメタロプロテアーゼ活性を有することを予め判断してある、黄色ブドウ球菌のコロニー形成を特徴とする哺乳動物における炎症性皮膚症状に関連する皮膚病変を治療するための局所用薬剤の製造にオーレオリシン阻害剤を用いる使用もまた提供する。
【００７５】
特定の実施形態では、オーレオリシン阻害剤が内在性メトジンシンメタロプロテアーゼ阻害剤でもある。
【００７６】
本発明による方法および使用を実施するもうひとつの好ましい方法では、ＡＤまたは他の炎症性症状に関連する皮膚病変における黄色ブドウ球菌の存在を、治療の前に確認する。よって、本発明のこの態様では、黄色ブドウ球菌のコロニー形成を特徴とする哺乳動物における炎症性皮膚症状に関連する皮膚病変を治療するための方法であって、（ｉ）前記皮膚病変のローカスにおける黄色ブドウ球菌の存在を判断し、黄色ブドウ球菌の存在が確認されたら、（ｉｉ）オーレオリシン阻害剤を前記皮膚病変に局所投与することを含む方法を提供する。
【００７７】
前記皮膚病変が黄色ブドウ球菌を含有することを予め判断してある、黄色ブドウ球菌のコロニー形成を特徴とする哺乳動物における炎症性皮膚症状に関連する皮膚病変を治療するための局所用薬剤の製造にオーレオリシン阻害剤を用いる使用もまた提供する。
【００７８】
特定の実施形態では、オーレオリシン阻害剤が、内在性メトジンシンメタロプロテアーゼ阻害剤でもある。
【００７９】
実際には、本発明の第１の態様による方法および使用の前に、前記皮膚病変のローカスにおける黄色ブドウ球菌の存在を確認することを含む段階が先行する。
【００８０】
「前記皮膚病変の部位」は、皮膚病変内および内部または周辺領域内を意味する。
【００８１】
黄色ブドウ球菌の存在については、患者の皮膚をサンプリングし、微生物学的方法または遺伝的方法で黄色ブドウ球菌の存在を判断すれば、直接的に判断することができる。最も単純な形のアッセイでは、冒された皮膚を擦過採取し、このスワブを血液寒天プレートに接種し、黄色ブドウ球菌のコロニーを標準的な微生物学的手法で同定する。コロニー形成レベルの判定には定量的な方法論を適用してもよい。定量的ＰＣＲなどの遺伝的方法を利用して、黄色ブドウ球菌の存在を示すようにしても構わない。
【００８２】
また、たとえば患者の皮膚洗液中のメタロプロテアーゼ活性の存在を判断して、黄色ブドウ球菌の存在を間接的に判断してもよい。
【００８３】
メタロプロテアーゼおよびメタロプロテアーゼ活性の存在については、ゼラチン酵素電気泳動または酵素アッセイによって、患者からの皮膚洗液で検出することができる。
【実施例】
【００８４】
合成例
１．化合物１１および１２の合成
相互に入れ換え可能な２つの合成経路を用いて、化合物１１および１２を生成した。第１の経路は、（Ｒ）−２−（２−メトキシ−２−オキソエチル）−４−メチルペンタン酸からの化合物１１の合成によって例示された。第２の経路は、Ｌ−ロイシンからの化合物１２の合成によって例示された。第１の経路を利用して（Ｓ）−２−（２−メトキシ−２−オキソエチル）−４−メチルペンタン酸で化合物１２を合成してもよいし、第２の経路を利用して、Ｌ−ロイシンの代わりにＤ−ロイシンで化合物１１を合成してもよい。
【００８５】
Ａ．（Ｒ）−Ｎ１−（（Ｓ）−３，３−ジメチル−１−（メチルアミノ）−１−オキソブタン−２−イル）−Ｎ４−ヒドロキシ−２−イソブチルスクシンアミド（化合物１１）の合成
ｉ）（Ｒ）−２−（２−メトキシ−２−オキソエチル）−４−メチルペンタン酸（０．５ｇ、２．４ｍｍｏｌ）と、ＤＣＣ（１．２ｅｑ、０．６１ｇ）と、ＨＯＢＴ（１．０２ｅｑ、０．３４ｇ）とをジクロロメタン（５ｍｌ）に入れた混合物を、室温にて１０分間攪拌した。（Ｓ）−２−アミノ−Ｎ，３，３−トリメチルブタンアミド（１．１ｅｑ、０．３９ｇ）を加え、混合物を室温にて一晩攪拌した。このようにして得られた白色の沈殿物を濾過し、濾液を減圧下にて乾固するまで濃縮して、油を得た。この粗油を酢酸エチル（５０ｍｌ）に溶解させ、２Ｎの塩酸（２×５０ｍｌ）、飽和重炭酸ナトリウム（２×５０ｍｌ）およびブライン（ｂｒｉｎｅ）（５０ｍｌ）を用いて連続的に抽出し、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）で乾燥させ、乾固するまで濃縮した。この残渣をジエチルエーテルから再結晶化させて、（Ｒ）−メチル３−（（Ｓ）−３，３−ジメチル−１−（メチルアミノ）−１−オキソブタン−２−イルカルバモイル）−５−メチルヘキサノエートを白色の固体（０．６０ｇ、７４％）として得た。（Ｒ）−２−（２−メトキシ−２−オキソエチル）−４−メチルペンタン酸１．０５ｇからの第２の反応では、生成物１．０６ｇ（６５％）が得られた。
【００８６】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：０．８３（ｄ，３Ｈ），０．８７（ｄ，３Ｈ），０．９６（ｓ，９Ｈ），１．２２（ｍ，１Ｈ），１．５１（ｍ，２Ｈ），２．４０（ｄ，１Ｈ，ｊ＝１４．５Ｈｚ），２．６５（ｍ，２Ｈ），２．７７（ｓ，３Ｈ），３．６３（ｓ，３Ｈ），４．２２（ｄ，１Ｈ，ｊ＝９．１５），６．１５（ｄ，１Ｈ，ｊ＝４．３９），６．４０（ｄ，１Ｈ，ｊ＝９．５２）。
【００８７】
ｉｉ）レビー（Ｌｅｖｙ）ら（Ｊ．  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ４１：１９９〜２２３頁、１９９８年）の方法を用いて、（Ｒ）−メチル３−（（Ｓ）−３，３−ジメチル−１−（メチルアミノ）−１−オキソブタン−２−イルカルバモイル）−５−メチルヘキサノエートを化合物１２に変換した。塩酸ヒドロキシルアミン（７．２ｅｑ、０．９１ｇ）をメタノール（８．８ｍｌ）に溶解させ、０℃まで冷却した。水酸化カリウム（１１．４ｅｑ、１．１７ｇ）のメタノール（５．８ｍｌ）溶液を加え、混合物を０℃で１時間攪拌した。この混合物を濾過し、濾液を（Ｒ）−メチル３−（（Ｓ）−３，３−ジメチル−１−（メチルアミノ）−１−オキソブタン−２−イルカルバモイル）−５−メチルヘキサノエートのメタノール（０．６ｇ、３．６ｍｌ）溶液に加えて、混合物を室温にて３０分間攪拌した。反応混合物を減圧下で乾固するまで濃縮し、水（７ｍｌ）に溶解させ、６Ｎの塩酸を用いてｐＨ５まで酸性化した後、飽和重炭酸ナトリウムでｐＨ７に中和した。このようにして得られた沈殿物を濾過により回収し、５％メタノール／ジクロロメタンから１０％メタノール／ジクロロメタンで溶出するフラッシュクロマトグラフィで精製した。生成物を含有する画分同士を合わせ、減圧下にて乾固するまで濃縮した。固体をイソプロピルアルコール：酢酸エチル（１：１）中にて微粉化し、濾過して（Ｒ）−Ｎ１−（（Ｓ）−３，３−ジメチル−１−（メチルアミノ）−１−オキソブタン−２−イル）−Ｎ４−ヒドロキシ−２−イソブチルスクシンアミドを白色の固体（６８ｍｇ、７％）として得た。濃縮反応混合物をフラッシュクロマトグラフィで直接精製する、（Ｒ）−メチル−３−（（Ｓ）−３，３−ジメチル−１−（メチルアミノ）−１−オキソブタン−２−イルカルバモイル）−５−メチルヘキサノエート１．０６ｇを用いる第２の反応では、生成物０．２５ｇ（２４％）が得られた。
【００８８】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：０．７６（ｄ，３Ｈ），０．８０（ｄ，３Ｈ），０．８６（ｓ，９Ｈ），１．０５（ｍ，１Ｈ），１．４０（ｍ，２Ｈ），２．０９（ｍ，２Ｈ），２．５４（ｓ，３Ｈ），２．８２（ｍ，１Ｈ），４．１３（ｍ，１Ｈ，ｊ＝９．５Ｈｚ），７．６４（ｄ，１Ｈ，ｊ＝９．８９），７．８４（ｄ，１Ｈ，ｊ＝４．７６），８．６８（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），１０．３５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）。
【００８９】
Ｂ．（Ｓ）−Ｎ１−（（Ｓ）−３，３−ジメチル−１−（メチルアミノ）−１−オキソブタン−２−イル）−Ｎ４−ヒドロキシ−２−イソブチルスクシンアミド（化合物１２）の合成
ｉ）Ｌ−ロイシン（１００ｇ、０．７６２ｍｏｌ）を４８％臭化水素水溶液（ＨＢｒ）（８３６ｇ）および水（３６０ｍｌ）に入れた氷冷溶液に、亜硝酸ナトリウム（８４．２ｇ、１．２２ｍｏｌ）を０℃で段階的に加えた。添加終了時、反応物を１時間０℃に保持した後、一晩室温まで温めた。次に、この反応混合物を再度０℃まで冷却し、反応混合物のｐＨが４．５に達するまで炭酸ナトリウム（約１３５ｇ）を加えて段階的に急冷した。続いて、混合物をジクロロメタン（２×５００ｍｌ）に抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、真空内で溶媒を除去し、（Ｓ）−２−ブロモ−４−メチルペンタン酸を橙色の油（１１５．８ｇ、収率８０％）として得たが、この色は放置しておいたら抜けた。
【００９０】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ０．９２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），０．９６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），１．８０（１Ｈ，ｍ），１．９１（２Ｈ，ｍ），４．２８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８５Ｈｚ），１１．７６（１Ｈ，ｂｒ  ｓ）。
αＤ−３９．６°、ＭｅＯＨ中ｃ＝２．１１８。
【００９１】
ｉｉ）（Ｓ）−２−ブロモ−４−メチルペンタン酸（１０８ｇ、０．５５９ｍｏｌ）の酢酸ｔｅｒｔ−ブチル（４５０ｍｌ）溶液に、三フッ化ホウ素ジエーテル塩（ｄｉｅｔｈｅｒａｔｅ）（７．９ｇ、０．０５５９ｍｏｌ）を加え、反応混合物を窒素下にて室温で一晩攪拌した。この混合物を飽和重炭酸ナトリウムに注ぎ、さらに重炭酸ナトリウムを加えて塩基性のｐＨを維持した。有機相を分離し、ブラインで洗浄（２×２００ｍｌ）し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、乾固するまで水分を蒸発させて、粗油１３５ｇを得た。この油を真空蒸留（４ｍｂａｒで５５℃にて、理論上の沸点１９０℃を得る）で精製した。（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−ブロモ−４−メチルペンタノエートを無色の油（９１．７ｇ、収率６６％）として回収した。
【００９２】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ０．８９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），０．９３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），１．４６（９Ｈ，ｓ），１．７２（１Ｈ，ｍ），１．８４（２Ｈ，ｍ），４．１５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６５Ｈｚ）。
αＤ−２９．９１°、ＭｅＯＨ中ｃ＝１．９０６。
【００９３】
ｉｉｉ）マロン酸ジベンジル（９８．３ｇ、０．３４６ｍｏｌ）の乾燥ジメチルホルムアミド（１６９ｍｌ）溶液に、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（３８．８ｇ、０．３４６ｍｏｌ）を窒素下にて０℃で溶解するまで段階的に加えた。この溶液を０℃に保持し、（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−ブロモ−４−メチルペンタノエート（８６．８ｇ、０．３４６ｍｏｌ）の乾燥ジメチルホルムアミド（１６０ｍｌ）溶液を１時間かけて滴加した後、０℃で４日間攪拌した。反応物を室温まで温め、酢酸エチル（６００ｍｌ）で希釈し、飽和塩化アンモニウム水溶液（４００ｍｌ）を加えた。有機層を分離し、水層を酢酸エチル（４００ｍｌ）で再抽出した。有機層を合わせ、１０％塩化ナトリウム溶液（５００ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させた。溶媒を除去して淡い黄色の油１９５ｇを得た。この油をフラッシュカラムクロマトグラフィ（１０：１ヘプタン：酢酸エチル）で精製し、（Ｓ）−１，１−ジベンジル２−ｔｅｒｔ−ブチル４−メチルペンタン−１，１，２−トリカルボキシレート６３ｇ（収率４０％）を透明な油として得たが、この油は放置しておいたら固化して白色の固体になった。
【００９４】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ０．８２（６Ｈ，ｍ），１．３７（９Ｈ，ｓ），１．５０（３Ｈ，ｍ），３．０３（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ１＝４．２８Ｈｚ，Ｊ２＝１０．３２Ｈｚ），３．７３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．２０Ｈｚ），５．１１（４Ｈ，ｍ），７．２９（１０Ｈ，ｍ）。
αＤ−１５．９３°、ＭｅＯＨ中ｃ＝１．６９５。
【００９５】
ｉｖ）（Ｓ）−１，１−ジベンジル２−ｔｅｒｔ−ブチル４−メチルペンタン−１，１，２−トリカルボキシレート（６０ｇ、０．１３２ｍｏｌ）のジクロロメタン（５００ｍｌ）溶液に、ＴＦＡ（１００ｍｌ）を加え、反応物を室温にて一晩攪拌した。溶媒を真空下で除去し、得られた油をジクロロメタン（３００ｍｌ）に再溶解させた。次に、この物質を水（３００ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、溶媒を除去して淡い橙色の油（５１．１ｇ、αＤ−７．４４°、ＭｅＯＨ中ｃ＝２．５５４）を得た。この油をジエチルエーテル１８０ｍｌに溶解させ、ｎ−ヘキサン５２０ｍｌを加え、溶液を氷浴中にて冷却した。得られた沈殿物を濾過し、真空内で濾液を濃縮して、（Ｓ）−２−（１，３−ビス（ベンジルオキシ）−１，３−ジオキソプロパン−２−イル）−４−メチルペンタン酸を淡い色の油（３１．０６ｇ、収率６０％）として得た。
【００９６】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ０．８１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４７Ｈｚ），０．８３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４７Ｈｚ），１．１６（１Ｈ，ｍ），１．５９（２Ｈ，ｍ），３．１８（１Ｈ，ｍ），３．７９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．７９Ｈｚ），５．１４（４Ｈ，ｍ），７．３１（１０Ｈ，ｍ）。
αＤ−４０．１０°、ＭｅＯＨ中ｃ＝２．３１９。
【００９７】
ｖ）（Ｓ）−２−（１，３−ビス（ベンジルオキシ）−１，３−ジオキソプロパン−２−イル）−４−メチルペンタン酸（３０ｇ、０．０７５ｍｏｌ）の酢酸エチル（２００ｍｌ）およびジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）溶液に、ＨＯＢＴ（１１．２ｇ、０．０８３ｍｏｌ）を加えた。反応物を０℃まで冷却し、ＤＣＣ（１９．２ｇ、０．０９３ｍｏｌ）の酢酸エチル（４０ｍｌ、２容量）溶液を１５分間かけて加えた。反応物を室温まで温め、１時間攪拌した。ＤＣＵを濾過により除去し、反応物を再度０℃まで冷却し、（Ｓ）−２−アミノ−Ｎ，３，３−トリメチルブタンアミド（１０．８６ｇ、０．０７５ｍｏｌ）の酢酸エチル（２０ｍｌ、２容量）溶液を加え、反応物を室温にて２日間攪拌した。次に、この反応物を、２Ｍの炭酸ナトリウム（２００ｍｌ）、水（２００ｍｌ）、再度２Ｍの炭酸ナトリウム（２００ｍｌ）、ブライン（２００ｍｌ）および水（２００ｍｌ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空内で濃縮して、淡い黄色のワックス状固体３５ｇを得た。この固体をジエチルエーテル中にてスラリー化し、ジベンジル２−（（Ｓ）−１−（（Ｓ）−３，３−ジメチル−１−（メチルアミノ）−１−オキソブタン−２−イルアミノ）−４−メチル−１−オキソペンタン−２−イル）マロネートを白色の固体（２４．６４ｇ、収率６２％）として濾別した。
【００９８】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ０．８１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．０６Ｈｚ），０．８２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．０６Ｈｚ），０．９８（９Ｈ，ｍ），０．９９（１Ｈ，ｍ），１．５７（１Ｈ，ｍ），１．６９（１Ｈ，ｍ），２．６７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．９０Ｈｚ），２．９４（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ１＝３．６７Ｈｚ，Ｊ２＝１０．２０Ｈｚ），３．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．２０Ｈｚ），４．１３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７７Ｈｚ）５．０８（４Ｈ，ｍ），６．２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．４９Ｈｚ），６．３３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７７Ｈｚ）７．２９（１０Ｈ，ｍ）。
αＤ−３６．００°、ＭｅＯＨ中ｃ＝１．７５０。
Ｍ．Ｐ．９８〜９９℃。
【００９９】
ｖｉ）ジベンジル２−（（Ｓ）−１−（（Ｓ）−３，３−ジメチル−１−（メチルアミノ）−１−オキソブタン−２−イルアミノ）−４−メチル−１−オキソペンタン−２−イル）マロネート（２４．５ｇ、０．０４７ｍｏｌ）をエタノール（３００ｍｌ）に溶解させ、この溶液を窒素でパージした。フラスコを脱気し、窒素で再度パージし、１０％パラジウム−炭素触媒（２．４５ｇ、１０％ｗｔ）を加えた。フラスコを再度脱気し、もう一度窒素でパージした後、脱気して水素でのパージを３回行った。反応物を水素雰囲気下に放置し、室温にて週末をとおして攪拌した。触媒を濾別し、溶媒を真空下にて除去して、２−（（Ｓ）−１−（（Ｓ）−３，３−ジメチル−１−（メチルアミノ）−１−オキソブタン−２−イルアミノ）−４−メチル−１−オキソペンタン−２−イル）マロン酸１５ｇを白色の固体（収率１００％）として得た。
【０１００】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：δ  ０．８２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５３Ｈｚ），０．９０（１２Ｈ，ｍ），１．０５（１Ｈ，ｍ），１．５１（２Ｈ，ｍ），２．５７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．４９Ｈｚ），３．０９（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ１＝３．８８Ｈｚ，Ｊ２＝８．３２Ｈｚ），３．３３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．２０Ｈｚ），４．０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１８Ｈｚ），７．５５（１Ｈ，ｍ）８．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１８Ｈｚ）。
αＤ−８０．５０°、ＭｅＯＨ中ｃ＝１．９１３。
Ｍ．Ｐ．１０１℃。
【０１０１】
ｖｉｉ）２−（（Ｓ）−１−（（Ｓ）−３，３−ジメチル−１−（メチルアミノ）−１−オキソブタン−２−イルアミノ）−４−メチル−１−オキソペンタン−２−イル）マロン酸（１４．５ｇ）をエタノールに溶解させ、炭素（１．４５ｇ）を加え、反応物を８０℃にて一晩攪拌した。炭素を濾別し、真空内で溶媒を除去し、（Ｓ）−３−（（Ｓ）−３，３−ジメチル−１−（メチルアミノ）−１−オキソブタン−２−イルカルバモイル）−５−メチルヘキサン酸１１．５１ｇを淡い灰色の固体として得た。
【０１０２】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：δ  ０．８１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３２Ｈｚ），０．８７（１２Ｈ，ｍ），１．０９（１Ｈ，ｍ），１．４５（２Ｈ，ｍ），２．１９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ１＝６．５３Ｈｚ，Ｊ２＝１６．１２Ｈｚ），２．３６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ１＝７．７５Ｈｚ，Ｊ２＝１６．１２Ｈｚ），２．５４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．４９Ｈｚ），２．９１（１Ｈ，ｍ），４．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１８Ｈｚ），７．７８（１Ｈ，ｍ）７．９５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１８Ｈｚ）。
αＤ−４２．２１°、ＭｅＯＨ中ｃ＝１．９１９。
Ｍ．Ｐ．２０４〜２０５℃。
【０１０３】
ｖｉｉｉ）Ｏ−ベンジル塩酸ヒドロキシルアミン（９．３０ｇ、０．０５８ｍｏｌ）と、ＮＭＭ（５．９３ｇ、０．０５９ｍｏｌ）と、ＨＯＢＴ（６．４２ｇ、０．０４８ｍｏｌ）と、ＥＤＡＣ（９．１１ｇ、０．０４８ｍｏｌ）とを、（Ｓ）−３−（（Ｓ）−３，３−ジメチル−１−（メチルアミノ）−１−オキソブタン−２−イルカルバモイル）−５−メチルヘキサン酸（１１．５１ｇ、０．０３８ｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（１６１ｍｌ）およびジクロロメタン（２０５ｍｌ）に入れた攪拌溶液に、０℃にて加えた。反応混合物を放置して室温まで温め、一晩攪拌した。続いて、これをジクロロメタン（５００ｍｌ）で希釈し、水（５００ｍｌ）、０．６ＮのＨＣｌ（５００ｍｌ）、飽和炭酸ナトリウム（５００ｍｌ）および水（４×５００ｍｌ）で連続的に洗浄した。有機層を乾燥させ、真空内にて溶媒を除去して、（Ｓ）−Ｎ４−（ベンジルオキシ）−Ｎ１−（（Ｓ）−３，３−ジメチル−１−（メチルアミノ）−１−オキソブタン−２−イル）−２−イソブチルスクシンアミドを白色の固体（７．３５ｇ、収率４３％）として得た。
【０１０４】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：δ  ０．８１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３２Ｈｚ），０．８７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５３Ｈｚ），０．９０（９Ｈ，ｍ），１．００（１Ｈ，ｍ），１．４２（２Ｈ，ｍ），１．９７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ１＝７．３４Ｈｚ，Ｊ２＝１４．４Ｈｚ），２．１１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ１＝７．１４Ｈｚ，Ｊ２＝１５．４４Ｈｚ），２．５２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．４９Ｈｚ），２．９６（１Ｈ，ｍ），４．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３８Ｈｚ），４．７３（２Ｈ，ｑ，Ｊ１＝１１．０２Ｈｚ，Ｊ２＝９．７Ｈｚ），７．３８（５Ｈ，ｍ），７．８５（１Ｈ，ｍ），７．９７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１８Ｈｚ）。
αＤ−１９．３７°、ＭｅＯＨ中ｃ＝１．４９７。
Ｍ．Ｐ．１２８〜１２９℃。
【０１０５】
ｉｘ）（Ｓ）−Ｎ４−（ベンジルオキシ）−Ｎ１−（（Ｓ）−３，３−ジメチル−１−（メチルアミノ）−１−オキソブタン−２−イル）−２−イソブチルスクシンアミド（７．３５ｇ）をエタノール（１００ｍｌ）に溶解させ、溶液を窒素でパージした。フラスコを脱気し、窒素で再度パージし、１０％パラジウム−炭素触媒（７３５ｍｇ、１０％ｗｔ）を加えた。フラスコを再度脱気し、もう一度窒素でパージした後、脱気して水素でのパージを３回行った。反応物を水素雰囲気下に放置し、室温にて週末をとおして攪拌した。触媒を濾別し、溶媒を真空下にて除去して、（Ｓ）−Ｎ１−（（Ｓ）−３，３−ジメチル−１−（メチルアミノ）−１−オキソブタン−２−イル）−Ｎ４−ヒドロキシ−２−イソブチルスクシンアミド（化合物１２）５．１２ｇを白色の固体（収率９８％）として得た。
【０１０６】
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ４−ＭｅＯＨ）：δ  ０．８９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５３Ｈｚ），０．９４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３２Ｈｚ），１．０１（９Ｈ，ｓ），１．１７（１Ｈ，ｍ），１．５７（２Ｈ，ｍ），２．１４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ１＝６．１２Ｈｚ，Ｊ２＝１４．６８Ｈｚ），２．３３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ１＝８．３６Ｈｚ，Ｊ２＝１４．６８Ｈｚ），２．７１（３Ｈ，ｓ），２．９３（１Ｈ，ｍ），４．１０（１Ｈ，ｓ））。
αＤ−３３．１°、ＭｅＯＨ中ｃ＝１．６０。
【０１０７】
２．化合物１６および１７の合成
（Ｓ）−２−アミノ−Ｎ−メチル−４−フェニルブタンアミドを以下のようにして調製した。
ｉ）（Ｓ）−２−アミノ−４−フェニルブタン酸（５．０ｇ、２７．９ｍｍｏｌ）をメタノール（２５ｍｌ）に入れた攪拌溶液に、塩化チオニル（２．２６ｍｌ、３０．６９ｍｍｏｌ）を０℃にて加えた。混合物を室温まで温めた後、６５℃で２時間加熱した。真空内にて濃縮した後、残渣をジエチルエーテル（１０ｍｌ）で微粉化し、吸引濾過によって固体を回収し、ジエチルエーテル（５ｍｌ）で洗浄し、空気乾燥させて、（Ｓ）−メチル２−アミノ−４−フェニルブタノエートをその塩酸塩（６．１１ｇ、９５％）として得た。
【０１０８】
ＬＣＭＳ（３分）純度＝９７％、ｔｒ＝１．０８、ｍ／z  １９４［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１０９】
ｉｉ）８Ｍメチルアミンのエタノール（８．７ｍｌ、６９．６ｍｍｏｌ）溶液に、（Ｓ）−メチル２−アミノ−４−フェニルブタノエート塩酸塩（４．０ｇ、１７．４ｍｍｏｌ）を室温にて加えた。攪拌を一晩継続した。反応混合物を真空内にて濃縮し、ジエチルエーテル（５ｍｌ×３）を加え、蒸発を繰り返した。固体をジクロロメタン（３０ｍｌ）に懸濁させ、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（１０ｍｌ）および水（１０ｍｌ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、真空内にて濃縮して、（Ｓ）−２−アミノ−Ｎ−メチル−４−フェニルブタンアミドを白色の固体（２．７７ｇ、８３％）として得た。
【０１１０】
ＬＣＭＳ（３分）純度＝９４％、ｔｒ１．０５、ｍ／ｚ  １９３［Ｍ＋Ｈ］、１Ｈ  ＮＭＲ（ＭｅＯＤ）δ  １．６５（１Ｈ，ｍ），１．８５（１Ｈ，ｍ），２．５５（２Ｈ，ｍ），２．６０（３Ｈ，ｓ，ＣＯＮＨＭｅ），３．１５（１Ｈ，ｍ），７．００−７．２０（５Ｈ，ｍ，Ａｒ）。
【０１１１】
この物質を、後述のようにして化合物１６および１７の両方の合成に利用した。
【０１１２】
Ａ．（Ｓ）−Ｎ４−ヒドロキシ−２−イソブチル−Ｎ１−（（Ｓ）−１−（メチルアミノ）−１−オキソ−４−フェニルブタン−２−イル）スクシンアミド（化合物１６）の合成
経路Ａおよび経路Ｂで示す、化合物１６への２つの合成経路を用いた。
【０１１３】
化合物１６への経路Ａ
ｉ）（Ｓ）−３−（メトキシカルボニル）−５−メチルヘキサン酸（２５０ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ）と、ＥＤＣ（３３１ｍｇ、１．７２６ｍｍｏｌ）と、ＨＯＢＴ（２３３ｍｇ、１．７２６ｍｍｏｌ）とをＴＨＦ（５ｍｌ）に入れた混合物に、（Ｓ）−２−アミノ−Ｎ−メチル−４−フェニルブタンアミド（２８１ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ）を加え、続いてトリエチルアミン（０．４６ｍｌ、３．３０ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を室温にて一晩攪拌した。揮発性物質の除去後、残渣を酢酸エチル（１０ｍｌ）に取り、１０％クエン酸（５ｍｌ）で洗浄した後、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（５ｍｌ）および水（５ｍｌ）で洗浄した。酢酸エチル層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、真空内にて濃縮して、（Ｓ）−メチル４−メチル−２−（２−（（Ｓ）−１−（メチルアミノ）−１−オキソ−４−フェニルブタン−２−イルアミノ）−２−オキソエチル）ペンタノエート（３８０ｍｇ、７９％）を得た。
【０１１４】
ＬＣＭＳ（３分）純度＝９３％、ｔｒ１．９７、ｍ／ｚ  ３６３［Ｍ＋Ｈ］＋、７２５［２Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１１５】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＭｅＯＤ）δ  １．８０（６Ｈ，ｍ，イソブチル），１．２０（１Ｈ，ｍ，イソブチル），１．５５（２Ｈ，ｍ，イソブチル），１．８０（１Ｈ，ｍ），２．０５（１Ｈ，ｍ），２．３０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１４．９１および５．６２Ｈｚ），２．４０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１４．９１および９．２９Ｈｚ），２．４５（２Ｈ，ｍ），２．６０（３Ｈ，ｓ，ＣＯＮＨＭｅ），２．８５（１Ｈ，ｍ），３．５５（３Ｈ，ｓ，ＣＯ２Ｍｅ），４．１５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．５４および４．８９Ｈｚ），７．００−７．２０（５Ｈ，ｍ，Ａｒ）。
【０１１６】
ｉｉ）（Ｓ）−メチル４−メチル−２−（２−（（Ｓ）−１−（メチルアミノ）−１−オキソ−４−フェニルブタン−２−イルアミノ）−２−オキソエチル）ペンタノエート（２５０ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２．０ｍｌ）とメタノール（２．０ｍｌ）との混合物に入れた溶液に、２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（１．０ｍｌ）を室温にて加えた。室温にて１時間攪拌後、反応混合物を約０．５ｍｌまで濃縮し、１Ｍの塩酸溶液を用いて慎重に酸性化した。水層を酢酸エチル（２×３ｍｌ）で抽出し、合わせた有機層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、真空内にて濃縮して、（Ｓ）−５−メチル−３−（（Ｓ）−１−（メチルアミノ）−１−オキソ−４−フェニルブタン−２−イルカルバモイル）ヘキサン酸（異性体Ａ）と（Ｓ）−４−メチル−２−（２−（（Ｓ）−１−（メチルアミノ）−１−オキソ−４−フェニルブタン−２−イルアミノ）−２−オキソエチル）ペンタン酸（異性体Ｂ）との混合物（２１０ｍｇ、８７％）を得た。これを工程（ｉｉｉ）で直接利用した。
【０１１７】
ＬＣＭＳ（３分）純度＝７２％（異性体Ａ、ｔｒ＝１．６９）＋１０％（異性体Ｂ、ｔｒ＝１．６７）、ｍ／ｚ  ３４９［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１１８】
ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られたカルボン酸（２１０ｍｇ、０．６０３ｍｍｏｌ）の混合物に、ＥＤＣ（１５０ｍｇ、０．７８４ｍｍｏｌ）とＨＯＢＴ（１０５ｍｇ、０．７８４ｍｍｏｌ）とをＴＨＦ（５ｍｌ）に入れたものを加え、続いてＯ−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル−ヒドロキシルアミン（９２ｍｇ、０．７８４ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．２０ｍｌ、１．５０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温にて一晩攪拌した。揮発性物質の除去後、残渣を酢酸エチル（１０ｍｌ）に取り、１０％クエン酸（５ｍｌ）で洗浄した後、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（５ｍｌ）および水（５ｍｌ）で洗浄した。酢酸エチル層を乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）させ、濾過し、真空内にて濃縮して、（２Ｓ）−２−イソブチル−Ｎ１−（（Ｓ）−１−（メチルアミノ）−１−オキソ−４−フェニルブタン−２−イル）−Ｎ４−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）スクシンアミド（異性体Ａ）および（２Ｓ）−２−イソブチル−Ｎ４−（（Ｓ）−１−（メチルアミノ）−１−オキソ−４−フェニルブタン−２−イル）−Ｎ１−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）スクシンアミド（異性体Ｂ）（２４０ｍｇ、８９％）を得た。
【０１１９】
ＬＣＭＳ（３分）純度＝６１％、（異性体Ａ、ｔｒ＝１．７７）＋１３％（異性体Ｂ、ｔｒ＝１．７４）、ｍ／ｚ  ４４８［Ｍ＋Ｈ］＋、３６４  ［Ｍ＋Ｈ−ＴＨＰ］＋。
【０１２０】
ｉｖ）（２Ｓ）−２−イソブチル−Ｎ１−（（Ｓ）−１−（メチルアミノ）−１−オキソ−４−フェニルブタン−２−イル）−Ｎ４−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）スクシンアミドおよび（２Ｓ）−２−イソブチル−Ｎ４−（（Ｓ）−１−（メチルアミノ）−１−オキソ−４−フェニルブタン−２−イル）−Ｎ１−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）スクシンアミド（２４０ｍｇ、０．５３７ｍｍｏｌ）をメタノール（７ｍｌ）に入れた溶液に、アンバーリスト（Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ）Ｈ−１５樹脂（２００ｍｇ）を加えた。この混合物を室温にて３時間攪拌し、濾過し、真空内にて濃縮した。続いて、分取逆相ＨＰＬＣで所望の化合物を単離した。粗生成物を２：１のジメチルスルホキシド：アセトニトリル（１．６ｍｌ）に入れたものをサーモハイパーシル−キーストーンハイパープレップ（ＴｈｅｒｍｏＨｙｐｅｒｓｉｌ−Ｋｅｙｓｔｏｎｅ  Ｈｙｐｅｒｐｒｅｐ）  ＨＳ  Ｃ１８カラム（１２μｍ、１００×２１．２ｍｍ）に注入し、２１５ｎｍでのＵＶ検出を用いて、２０〜１００％勾配のアセトニトリル／０．１％ＴＦＡ（溶媒Ｂ）水溶液／０．１％ＴＦＡ（溶媒Ａ）で９．５分（３０ｍｌ／分）溶出し、化合物１６を白色の固体（６０ｍｇ、３２％）として得た。
【０１２１】
【化１】
2009506098.tif 000006
【０１２２】
ＬＣＭＳ（７分）純度＝１００％（ｔｒ＝３．４８）、ｍ／ｚ  ３６４［Ｍ＋Ｈ］＋。１Ｈ  ＮＭＲ（ＭｅＯＤ）δ  ０．８０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３６Ｈｚ，Ｈ−２３），１．９０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３６Ｈｚ，Ｈ−２３），１．１５（１Ｈ，ｍ，Ｈ−２１），１．４５（２Ｈ，ｍ，Ｈ−２１およびＨ−２２），１．７５（１Ｈ，ｍ，Ｈ−８），２．１０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．１６および４．１５Ｈｚ，Ｈ−１６），２．１５（１Ｈ，ｍ，Ｈ−８），２．３５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．５および１５．１６Ｈｚ，Ｈ−１６），２．５０（１Ｈ，ｍ，Ｈ−７），２．６５（１Ｈ，ｍ，Ｈ−７），２．６５（３Ｈ，ｓ，Ｈ−２０），２．７０（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１５），４．１５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１，３．６６，Ｈ−９Ｈｚ），７．０５−７．２０（５Ｈ，ｍ，Ａｒ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＭｅＯＤ）δ  ２３．２９，２４．７４，２７．５２，２８．０４，３４．４３，３５．１９，３７．７０，４３．２０，４４．１８，５５．５３，１２８．１８，１３０．５０，１３０．５２，１４３．１９，１７２．１３（Ｃ−１７），１７５．９３（Ｃ−１３），１７９．１７（Ｃ−１１）。
【０１２３】
化合物１６への経路Ｂ
ｉ）（Ｓ）−３−（メトキシカルボニル）−５−メチルヘキサン酸（１００ｍｇ、０．５３２ｍｍｏｌ）とＢｏｃ２Ｏ（１３９ｍｇ、０．６３８ｍｍｏｌ）をｔ−ＢｕＯＨ（９９％、１．５ｍｌ）に入れた攪拌混合物に、ＤＭＡＰ（１９．５ｍｇ、０．１５９ｍｍｏｌ）を室温にて加えた。１．５時間攪拌後、反応混合物を真空内にて濃縮し、酢酸エチル（５ｍｌ）で希釈し、飽和クエン酸水溶液（２×２ｍｌ）で洗浄した後、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（２×２ｍｌ）および水（２ｍｌ）で洗浄した。酢酸エチル層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、真空内にて濃縮して、（Ｓ）−４−ｔｅｒｔ−ブチル１−メチル２−イソブチルスクシナートを黄色の粘性油（１００ｍｇ）として得た。この化合物をさらに精製することなく次の工程で利用した。
【０１２４】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ  ０．７５（６Ｈ，ｍ，ｉ−ブチル），１．１５（１Ｈ，ｍ，ｉ−ブチル），１．２０（９Ｈ，ｓ，ｔ−ブチル），１．３５（２Ｈ，ｍ，ｉ−ブチル），２．１５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．２８および５．２１Ｈｚ），２．３５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．２８，９．３３Ｈｚ），２．６５（１Ｈ，ｍ），３．４０（３Ｈ，ｓ，ＣＯ２Ｍｅ）。
【０１２５】
ｉｉ）（Ｓ）−４−ｔｅｒｔ−ブチル１−メチル２−イソブチルスクシナート（１００ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）をメタノール（０．８ｍｌ）に入れた溶液に、炭酸カリウム（６８ｍｇ、０．４９２ｍｍｏｌ）および水（０．２ｍｌ）を加えた。この混合物を５５℃で１８時間加熱した。次に、反応混合物を濃縮し、酢酸エチル（５ｍｌ）に再溶解させ、１Ｍの塩酸溶液で慎重に酸性化した。水層を酢酸エチル（２ｍｌ）および合わせた酢酸エチル層で抽出し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、真空内にて濃縮して、（Ｓ）−２−（２−ｔｅｒｔ−ブトキシ−２−オキソエチル）−４−メチルペンタン酸を粗生成物（６０ｍｇ）として得て、これを工程（ｉｉｉ）で直接利用した。
【０１２６】
ｉｉｉ）粗（Ｓ）−２−（２−ｔｅｒｔ−ブトキシ−２−オキソエチル）−４−メチルペンタン酸（９０ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）と、ＥＤＣ（９７ｍｇ、０．５０７ｍｍｏｌ）と、ＨＯＢＴ（６８ｍｇ、０．５０７ｍｍｏｌ）とをＤＭＦ（１ｍｌ）に入れた混合物に、（Ｓ）−２−アミノ−Ｎ−メチル−４−フェニルブタンアミド（９０ｍｇ、０．４６８ｍｍｏｌ）を加え、続いてトリエチルアミン（０．１３５ｍｌ、０．９７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温にて一晩攪拌した。揮発性物質の除去後、残渣を酢酸エチル（５ｍｌ）に取り、１０％クエン酸（２ｍｌ）で洗浄した後、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（２ｍｌ）および水（２ｍｌ）で洗浄した。酢酸エチル層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、真空内にて濃縮して、（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル５−メチル−３−（（Ｓ）−１−（メチルアミノ）−１−オキソ−４−フェニルブタン−２−イルカルバモイル）ヘキサノエート（６５ｍｇ、７９％）を得た。これを工程（ｉｖ）で直接利用した。
【０１２７】
ＬＣＭＳ（３分）純度＝４７％、ｔｒ＝２．１６、ｍ／ｚ  ４０５［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１２８】
ｉｖ）（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル５−メチル−３−（（Ｓ）−１−（メチルアミノ）−１−オキソ−４−フェニルブタン−２−イルカルバモイル）ヘキサノエート（６５ｍｇ、０．１６１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（０．６ｍｌ）溶液に、ＴＦＡ（０．２４ｍｌ）を室温にて加えた。４５分間放置した後、反応混合物から蒸発乾固させた。ジクロロメタン（２×０．５ｍｌ）を加え、蒸発を繰り返して（Ｓ）−５−メチル−３−（（Ｓ）−１−（メチルアミノ）−１−オキソ−４−フェニルブタン−２−イルカルバモイル）ヘキサン酸を黄色の粘性油（５８ｍｇ、定量）として得た。
【０１２９】
ＬＣＭＳ（３分）純度＝４９％、ｔｒ＝１．６９、ｍ／ｚ  ３４９［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１３０】
ｖ）（Ｓ）−５−メチル−３−（（Ｓ）−１−（メチルアミノ）−１−オキソ−４−フェニルブタン−２−イルカルバモイル）ヘキサン酸（５８ｍｇ、０．１６７ｍｍｏｌ）と、ＥＤＣ（６６ｍｇ、０．３４４ｍｍｏｌ）と、ＨＯＢＴ（４６ｍｇ、０．３４４ｍｇ）とをＴＨＦ（２ｍｌ）に入れた混合物に、Ｏ−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル−ヒドロキシルアミン（４０．３ｍｇ、０．７８４ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．０８４ｍｌ、０．６０ｍｍｏｌ）を加えた。室温にて１８時間攪拌後、反応混合物から水分を蒸発させ、酢酸エチル（２ｍｌ）に再溶解させ、１０％クエン酸（０．５ｍｌ）で洗浄した後、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（０．５ｍｌ）および水（０．５ｍｌ）で洗浄した。酢酸エチル層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、真空内にて濃縮して、粗（２Ｓ）−２−イソブチル−Ｎ１−（（Ｓ）−１−（メチルアミノ）−１−オキソ−４−フェニルブタン−２−イル）−Ｎ４−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）スクシンアミド（５０ｍｇ、６７％）を得た。
【０１３１】
ＬＣＭＳ（３分）純度＝４４％、ｔｒ＝１．７７、ｍ／ｚ  ４４８［Ｍ＋Ｈ］＋、３６４［Ｍ＋Ｈ−ＴＨＰ］＋。
【０１３２】
ｖｉ）経路Ａで説明した手法を用いて、（２Ｓ）−２−イソブチル−Ｎ１−（（Ｓ）−１−（メチルアミノ）−１−オキソ−４−フェニルブタン−２−イル）−Ｎ４−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）スクシンアミド（５０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を脱保護し、化合物１６を得た。収率＝１．８ｍｇ、４．５％（６工程で）。
【０１３３】
ＬＣＭＳ（７分）純度＝１００％（ｔｒ＝３．４８）、ｍ／ｚ  ３６４［Ｍ＋Ｈ］。１Ｈ  ＮＭＲは経路Ａで調製したものと同一であった。
【０１３４】
Ｂ．（Ｒ）−Ｎ４−ヒドロキシ−２−イソブチル−Ｎ１−（（Ｓ）−１−（メチルアミノ）−１−オキソ−４−フェニルブタン−２−イル）スクシンアミド（化合物１７）の合成
ｉ）（Ｒ）−３−（メトキシカルボニル）−５−メチルヘキサン酸（２５０ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ）と、ＥＤＣ（３３２ｍｇ、１．７３ｍｍｏｌ）と、ＨＯＢＴ（２３４ｍｇ、１．７３ｍｍｏｌ）とをＴＨＦ（５ｍｌ）に入れた混合物に、Ｏ−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル−ヒドロキシルアミン（２０２ｍｇ、１．７３ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（０．４６ｍｌ、３．３０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温にて一晩攪拌した。揮発性物質の除去後、残渣を酢酸エチル（１５ｍｌ）に取り、１０％クエン酸（５ｍｌ）で洗浄した後、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（５ｍｌ）および水（５ｍｌ）で洗浄した。酢酸エチル層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、真空内にて濃縮して、（２Ｒ）−メチル４−メチル−２−（２−オキソ−２−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシアミノ）エチル）ペンタノエートを無色の粘性油（０．３３ｇ、８５％）として得た。
【０１３５】
ＬＣＭＳ（３分）純度＝６７％、ｔｒ＝１．８４、ｍ／ｚ  ２８８［Ｍ＋Ｈ］＋、２０４［Ｍ＋Ｈ−ＴＨＰ］＋。
【０１３６】
ｉｉ）（２Ｒ）−メチル４−メチル−２−（２−オキソ−２−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシアミノ）エチル）ペンタノエート（３２０ｍｇ、１．１１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（３．０ｍｌ）とメタノール（１．５ｍｌ）との混合物に入れた溶液に、２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（１．５ｍｌ）を室温にて加えた。室温にて１時間攪拌後、反応混合物を約０．５ｍｌまで濃縮し、１Ｍの塩酸溶液で慎重に酸性化した。水性層を酢酸エチル（２×５ｍｌ）で抽出し、合わせた有機層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、真空内にて濃縮して、（２Ｒ）−４−メチル−２−（２−オキソ−２−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシアミノ）エチル）ペンタン酸と（３Ｒ）−５−メチル−３−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシカルバモイル）ヘキサン酸（２６０ｍｇ、８６％）との混合物を得て、これを工程（ｉｉｉ）で直接利用した。
【０１３７】
ＬＣＭＳ（３分）純度＝７０％、ｔｒ＝１．５９（異性体同時溶出）、ｍ／ｚ  ２７４［Ｍ＋Ｈ］＋、１９０［Ｍ＋Ｈ−ＴＨＰ］＋。
【０１３８】
ｉｉｉ）（２Ｒ）−４−メチル−２−（２−オキソ−２−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシアミノ）エチル）ペンタン酸と、（３Ｒ）−５−メチル−３−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシカルバモイル）ヘキサン酸（１２０ｍｇ、０．４３９ｍｍｏｌ）と、ＥＤＣ（１０９ｍｇ、０．５７１ｍｍｏｌ）と、ＨＯＢＴ（７７ｍｇ、０．５７１ｍｍｏｌ）とをＤＭＦ（３ｍｌ）に入れた混合物に、（Ｓ）−２−アミノ−Ｎ−メチル−４−フェニルブタンアミド（１０２ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）を加えた後、トリエチルアミン（０．１５１ｍｌ、１．０９ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温にて一晩攪拌し、続いて酢酸エチル（１０ｍｌ）で希釈し、１０％クエン酸（５ｍｌ）で洗浄した後、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（５ｍｌ）および水（５ｍｌ）で洗浄した。酢酸エチル層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、真空内にて濃縮して、（２Ｒ）−２−イソブチル−Ｎ１−（（Ｓ）−１−（メチルアミノ）−１−オキソ−４−フェニルブタン−２−イル）−Ｎ４−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）スクシンアミド（異性体Ａ）と、（２Ｒ）−２−イソブチル−Ｎ４−（（Ｓ）−１−（メチルアミノ）−１−オキソ−４−フェニルブタン−２−イル）−Ｎ１−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）スクシンアミド（異性体Ｂ）と、（３Ｒ）−３−イソブチル−１−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）ピロリジン−２，５−ジオン（８０ｍｇ）との混合物を得た。
【０１３９】
ＬＣＭＳ（３分）では、異性体ＡおよびＢ（ｔｒ＝１．７７で同時溶出）、ｍ／ｚ  ４４８［Ｍ＋Ｈ］＋、３４６［Ｍ＋Ｈ−ＴＨＰ］＋が２３％と、副生物（３Ｒ）−３−イソブチル−１−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）ピロリジン−２，５−ジオン（ｔｒ＝２．０）、ｍ／ｚ  ３１９［Ｍ＋Ｎａ＋ＭｅＣＮ］＋、５３３［２Ｍ＋Ｎａ］＋が６９％を示した。サーモハイパーシル−キーストーンハイパープレップ  ＨＳ  Ｃ１８カラム（１２μｍ、１００×２１．２ｍｍ）に注入した、２：１のジメチルスルホキシド：アセトニトリル（１．６ｍｌ）に入れた粗生成物の分取逆相ＨＰＬＣ精製によって、異性体ＡとＢの混合物を含有する画分を単離した。２１５ｎｍでのＵＶ検出を用いて、２０〜１００％勾配のアセトニトリル／０．１％ＴＦＡ（溶媒Ｂ）水溶液／０．１％ＴＦＡ（溶媒Ａ）で、カラムを３０ｍｌ／分で９．５分間溶出した。
【０１４０】
ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得られた（２Ｒ）−２−イソブチル−Ｎ１−（（Ｓ）−１−（メチルアミノ）−１−オキソ−４−フェニルブタン−２−イル）−Ｎ４−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）スクシンアミドおよび（２Ｒ）−２−イソブチル−Ｎ４−（（Ｓ）−１−（メチルアミノ）−１−オキソ−４−フェニルブタン−２−イル）−Ｎ１−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）スクシンアミドを含有する画分を、室温にて一晩静置した。真空内にて濃縮して、脱保護生成物（１０ｍｇ）を得て、ここから工程（ｉｉｉ）の方法を用いる分取ＨＰＬＣで化合物１７（１．１ｍｇ）を精製した。
【０１４１】
ＬＣＭＳ（７分）純度＝８６％、ｔｒ＝３．２１、ｍ／ｚ  ３６４［Ｍ＋Ｈ］＋、３８６［Ｍ＋Ｎａ］＋、１Ｈ  ＮＭＲ（ＭｅＯＤ）δ  １．７５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３５Ｈｚ，イソブチル），１．８５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３５Ｈｚ，イソブチル），１．１５（１Ｈ，ｍ，イソブチル），１．４５（２Ｈ，ｍ，イソブチル），１．９０（１Ｈ，ｍ），２．１０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１４．４５および５．８５Ｈｚ），２．２５（１Ｈ，ｍ），２．４０−２．６０（２Ｈ，ｍ），２．６０（３Ｈ，ｓ，ＣＯＮＨＭｅ），２．７５（１Ｈ，ｍ），４．１０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．１５および５．２１Ｈｚ），７．００−７．１５（５Ｈ，ｍ，Ａｒ）。
【０１４２】
生物学的実施例
１．オーレオリシンおよびＭＭＰ酵素阻害アッセイ
９０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．８）、４．５ｍＭの塩化カルシウム、０．０４５％のＢｒｉｊ  ３５、１０μＭのＭｃａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄａｐ（Ｄｎｐ）−Ａｌａ−Ａｒｇ−アミド（バッケム（Ｂａｃｈｅｍ））、オーレオリシンおよび２％ジメチルスルホキシド賦形剤を含有する混合物（０．１ｍｌ）にて、阻害剤を用いる場合と用いない場合とで、精製オーレオリシンＩ型およびＩＩ型（バイオセントラム・リミテッド（ＢｉｏＣｅｎｔｒｕｍ  Ｌｔｄ））に対する化合物阻害活性を判定した。ヒトＭＭＰ１、２、８および９（カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））に対する化合物の活性についても、使用した緩衝液が、９０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．５、２５℃）、９０ｍＭの塩化ナトリウム、９ｍＭの塩化カルシウム、０．０４５％Ｂｒｉｊ  ３５であること以外は同じようにして判定した。反応物を３７℃で１時間インキュベートし、０．５Ｍの酢酸０．１ｍｌで停止して、３２０ｎｍでの励起と４０５ｎｍでの発光を用いて蛍光を測定した。アッセイ条件下で酵素活性の５０％減少に至る化合物濃度（ＩＣ５０値）をカーブフィッティング（ＸＬｆｉｔ、ＩＤＢＳ・リミテッド（ＩＤＢＳ  Ｌｔｄ））によって判断した。結果を表２に示す。
【０１４３】
【表２】
2009506098.tif 000007
【０１４４】
２．湿疹患者の皮膚洗液のプロテアーゼ活性：
皮膚洗液のプロテアーゼ活性を評価する方法が開発されている。急性湿疹患者からの皮膚洗液を得るには、滅菌した使い捨てのプラスチック製パスツールピペットを用いて、皮膚表面上で０．５ｍｌの滅菌生理食塩水を吸引すればよい。底の抜けた滅菌プラスチックシリンダーで皮膚部分（約１ｃｍ２）を画定する。試料を、０．５５ＭのＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）０．０５ｍｌ、５５ｍＭの塩化カルシウムおよび０．２％のＢｒｉｊ  ３５に移し、混合し、遠心処理して残渣を除去し、分析まで−７０℃で冷凍した。
【０１４５】
試料のプロテアーゼ含有量の酵素電気泳動分析を行うには、３７．５％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有する０．２容量の０．２Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）と２．５％ドデシル硫酸ナトリウムを混合した後、ゼラチン酵素電気泳動像ゲル（インビトロジェン・コーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））を製造業者の指示に従って用いて電気泳動すればよい。２．５％（ｗ／ｖ）トリトンＸ−１００を２５ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７）に加えたもので、化合物１１（５０μＭ）を用いる場合と用いない場合とでゲルを洗浄し、５ｍＭの塩化カルシウムを含有する０．１ＭのＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７）中にて、化合物１１（５０μＭ）を用いる場合と用いない場合とで、３７℃で一晩展開させた。クーマシーブリリアントブルーＲで染色した後、４０％（ｖ／ｖ）メタノール／１０％（ｖ／ｖ）酢酸で脱色すれば、タンパク質分解活性による透明帯（ｚｏｎｅ  ｏｆ  ｃｌｅａｒ）を同定することができる。このタンパク質分解活性は、分子量分析の後にウェスタンブロットで確認するなどの当業者間で公知の適当な方法で、オーレオリシンまたはメトジンシンによって生じている可能性がある。
【０１４６】
急性ＡＤ部位から採取した６つの皮膚洗浄試料で得られた代表的なゲルを図１に示す。
【０１４７】
図１の凡例：（Ａ）急性ＡＤ患者からの６つの皮膚洗浄試料の酵素電気泳動分析；（Ｂ）５０μＭの化合物１１を用いてインキュベートした同じ皮膚洗浄試料の酵素電気泳動分析。（Ａ）および（Ｂ）について、レーン１＝サイズマーカー（ｋＤａ）；レーン２＝皮膚洗浄試料７；レーン３＝試料１４；レーン４＝試料１７；レーン５＝試料３７；レーン６＝試料４０；レーン７＝試料４８；レーン８＝４ｎｇの精製オーレオリシン。
【０１４８】
９０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、４．５ｍＭの塩化カルシウム、０．０４５％のＢｒｉｊ  ３５、１０μＭのＭｃａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄａｐ（Ｄｎｐ）−Ａｌａ−Ａｒｇ−アミド（バッケム）および２％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド賦形剤中、化合物１１（５０μＭ）を用いる場合と用いない場合とで、３７℃にてインキュベート（９μｌ）することによる皮膚洗浄試料のプロテアーゼ活性を測定した。試料をポーラスター・オプティマ（ＰＯＬＡＲｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ）プレートリーダー（ＢＭＧ・ラボテック・リミテッド（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ  Ｌｔｄ．））にて３７℃でインキュベートし、蛍光示度数（３２０ｎｍ励起／４０５ｎｍ発光）を１５分ごとに６時間取得した。活性については、蛍光の増加率を時間の関数で表した。表３に得られた結果を示す。
【０１４９】
【表３】
2009506098.tif 000008
【０１５０】
どちらのアッセイでも、急性ＡＤ患者からの皮膚洗浄試料で化合物１１によるプロテアーゼ活性の有意な阻害が認められる。
【０１５１】
化合物１２についても、ＡＤ患者からの８つの皮膚洗浄試料の組でプロテアーゼ活性の阻害を試験した。以下の表４から、皮膚洗浄試料でプロテアーゼ活性の有意な阻害があったことを示す。
【０１５２】
【表４】
2009506098.tif 000009
【０１５３】
３．培養物中での黄色ブドウ球菌プロテアーゼ活性。
９０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．８）、４．５ｍＭの塩化カルシウム、０．０４５％のＢｒｉｊ  ３５、１０μＭのＭｃａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄａｐ（Ｄｎｐ）−Ａｌａ−Ａｒｇ−アミド（バッケム）、４μｌの黄色ブドウ球菌培養上清および２％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド賦形剤を含有する混合物（０．１ｍｌ）中にて、阻害剤を用いる場合と用いない場合とで、黄色ブドウ球菌８３２５−４培養物上清におけるメタロプロテアーゼ（オーレオリシン）活性の化合物阻害を判定した。１０％スキムミルクを含有するトリプシン大豆ブロス５ｍｌに黄色ブドウ球菌８３２５−４を接種し、振盪しながら３７℃で６〜８時間インキュベートして、黄色ブドウ球菌培養上清を調製した。この培養物を遠心処理して細胞を除去し、上清を以後の使用に備えて−７０℃で保管した。反応物をポーラスター・オプティマプレートリーダー（ＢＭＧ・ラボテック・リミテッド）にて３７℃でインキュベートし、蛍光示度数（３２０ｎｍ励起／４０５ｎｍ発光）を１５分ごとに６時間取得した。活性については、蛍光の増加率を時間の関数で表した。アッセイ条件下で酵素活性の５０％減少に至る化合物濃度（ＩＣ５０値）をカーブフィッティング（ＸＬｆｉｔ、ＩＤＢＳ・リミテッド）によって判断した。得られた結果を表５に示す。これらの値が精製オーレオリシン（表２）で得られた値と同様であることから、上清のメタロプロテアーゼ活性がオーレオリシン活性によるものではないかと考えられる。
【０１５４】
【表５】
2009506098.tif 000010
【０１５５】
黄色ブドウ球菌プロテアーゼ活性を直接的に測定する第２のアッセイでは、黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ  ２７７３３または８３２５−４を、２％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯを含有する１０％（ｖ／ｖ）スキムミルク寒天プレートにて、化合物を用いる場合と用いない場合とで培養した。ＤＭＳＯに溶解させた化合物については、注ぐ直前に固体培地に取り込んだ。寒天プレートを３７℃で２４〜４８時間インキュベートし、個々のコロニー周囲のクリアランスゾーン（ｚｏｎｅ  ｏｆ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ）を測定してタンパク質分解活性を判定した。このアッセイの一例を図２に示す。
【０１５６】
図２の凡例。グラフは、ミルク寒天プレートアッセイでの化合物３によるタンパク質分解活性の阻害を示している。結果はミルクタンパク質のクリアランスゾーンを示している。
【０１５７】
４．オーレオリシンによるプロテアーゼ活性化
オーレオリシンが内在性プロテアーゼを活性化する能力を試験するには、塩化カルシウム、塩化ナトリウムおよびＢｒｉｊ  ３５を含有する好ましい緩衝液中、３７℃にて、標的プロテアーゼをオーレオリシンと一緒にインキュベートすればよい。これについては、オーレオリシン活性を阻害するためのＥＤＴＡの存在下、発色性基質を用いる酵素アッセイ（ナラサキら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２４０：１４２７８〜８７頁、２００５年）によって直接的に示されるプロウロキナーゼの活性化ならびに、適当な画像形成システムを使用してのコラーゲンα１（Ｉ）鎖の３／４長切断生成物の生成を測定して示されるプロＭＭＰ−１の活性化を例に以下に示す。
【０１５８】
試料のプロテアーゼ含有量については、３７．５％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有する０．２容量の０．２Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）と２．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳとを混合した後、ゼラチン酵素電気泳動像ゲル（インビトロジェン・コーポレーション）を製造業者の指示に従って用いて電気泳動を行う酵素電気泳動で判断してもよい。クーマシーブリリアントブルーＲで染色した後、４０％（ｖ／ｖ）メタノール／１０％（ｖ／ｖ）酢酸中にて脱色して、タンパク質分解活性による透明帯を同定する。
【０１５９】
４（ｉ）．オーレオリシンによるプロ−ｕＰＡの活性化と化合物１３によるその阻害
単鎖プロ−ｕＰＡ（アメリカン・ダイアグノスティカ・インコーポレイテッド（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｉｎｃ））を、生理学的ｐＨ（７．５）および角質層の自然な状態でのｐＨ（オーマン（Ｏｈｍａｎ），Ｈおよびバールクイスト（Ｖａｈｌｑｕｉｓｔ），Ａ、Ａｃｔａ．Ｄｅｒｍ．Ｖｅｎｅｒｅｏｌ．７４：３７５〜９頁、１９９４年）であるｐＨ５．６の両方のオーレオリシンと一緒にインキュベートし、オーレオリシンがウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）を活性化する能力を試験した。インキュベーション混合物は、１．４μＭ（７５μｇ／ｍｌ）のプロ−ｕＰＡ、０．１Ｍのトリス塩酸（ｐＨ７．５）または０．１ＭのＭＥＳ（ナトリウム）緩衝液（ｐＨ５．６）、０．１Ｍの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、０．０５％のＢｒｉｊ  ３５およびオーレオリシンを、最終容量１０μｌ（表６、Ｅｘｐｔ．１）中に含有していた。第２の実験では、化合物１３（２０μＭ）のある状態とない状態とで、最終容量２０μｌ（表６、Ｅｘｐｔ．２）でｐＨ５．６での活性化を試験した。試料はいずれも、３７℃で２．５時間インキュベートした後、２４容量の６０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、５０ｍＭの塩化ナトリウム、２．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％のＴＷＥＥＮ−８０を加えて停止させた。この緩衝液には、Ｅｘｐｔ．２で賦形剤の対照試料に添加した際に０．８３μＭの化合物１３も含まれていた。停止混合物の試料を、０．５ｍＭのＳ−２４４４（クロモゲニクス・インストゥルメンテーション・ラボラトリー・ＳｐＡ（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＳｐＡ））を含有する同じ緩衝液０．１ｍｌ中、３７℃で０．５時間インキュベートして、ウロキナーゼ活性を測定した。０．５Ｍの酢酸を同容量で用いて反応を停止させ、４０５ｎｍで生成物を測定した。
【０１６０】
プロ−ｕＰＡの非存在下でインキュベートした対照試料は、このアッセイでは活性を示さなかった。
【０１６１】
【表６】
2009506098.tif 000011
【０１６２】
表６のデータから、ａ）オーレオリシンはｐＨ５．６および７．５のどちらでもプロ−ｕＰＡを活性化し、ｂ）この活性化は、角質層の自然なｐＨで一層効果的であり、ｃ）２０μＭ（約３０×ＩＣ５０）の化合物１３によって、この活性が≧８２％まで阻害されることが分かる。
【０１６３】
４（ｉｉ）．化合物１２によるプロ−ｕＰＡ活性化の阻害
１．５μＭ（７８μｇ／ｍｌ）のプロ−ｕＰＡ、０．１ＭのＭＥＳ緩衝液（ナトリウム）（ｐＨ５．６）、０．１Ｍの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、０．０５％のＢｒｉｊ  ３５、オーレオリシン（７５ｎｇ／ｍｌ）および２％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ±化合物１２を含有する反応混合物（２０μｌ）にて、化合物１２によるプロ−ｕＰＡ活性化の阻害についての用量応答関係を判断した。混合物を３７℃で２．５時間インキュベートし、７容量の６０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．８）、５０ｍＭの塩化ナトリウム、２．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％のＴＷＥＥＮ−８０まで希釈して停止した。これらの条件下、ｕＰＡ活性で判定されるプロ−ｕＰＡ切断の度合いが、アッセイ中のオーレオリシン濃度に正比例した。ｕＰＡ活性については、Ｓ−２４４４を用いて４（ｉ）で上述したようにして測定した。ｕＰＡ活性の５０％減少に至る化合物濃度（ＩＣ５０値）をカーブフィッティング（ＸＬｆｉｔ、ＩＤＢＳ・リミテッド）によって判断したところ、２．４μＭであった。これは、オーレオリシン活性を判定するための蛍光ペプチド基質を用いて判断した表２の値と十分に一致している。
【０１６４】
１．５μＭ（７８μｇ／ｍｌ）のプロ−ｕＰＡ、０．１ＭのＭＥＳ緩衝液（ナトリウム）（ｐＨ５．６）、０．１Ｍの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、０．０５％のＢｒｉｊ  ３５、オーレオリシン（１μｇ／ｍｌ）および２％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ±化合物１２を含有する反応混合物（２０μｌ）にて、化合物１２がさらに高いオーレオリシン濃度でプロ−ｕＰＡの活性化を阻害する能力を判断した。混合物を３７℃で２．５時間インキュベートし、２０容量の６０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．８）、５０ｍＭの塩化ナトリウム、２．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％のＴＷＥＥＮ−８０で希釈して停止し、Ｓ−２４４４を用いて４（ｉ）で上述したようにしてｕＰＡ活性を測定した。表７の結果から、予想通り、化合物１２は（１０×および１３０×ＩＣ５０値で）オーレオリシンによるプロ−ｕＰＡ活性化を用量依存的に阻害することが確認できる。このアッセイでは、化合物１２（３１７μＭ）はｕＰＡ活性に影響しなかった。
【０１６５】
【表７】
2009506098.tif 000012
【０１６６】
皮膚表面でのオーレオリシン活性を阻害することに依るプロ−ｕＰＡの活性化の阻害は、ＡＤ患者でのプロ炎症性ドライブ（ｄｒｉｖｅ）を低減させるのではないかと思われる。
【０１６７】
４（ｉｉｉ）．オーレオリシンによるプロＭＭＰ−１の活性化
ＭＭＰ活性化因子であるアミノ酢酸フェニル水銀（ＡＰＭＡ）を加える場合と加えない場合との両方で、ｐＨ７．５でヒトリウマチ滑膜線維芽細胞コラゲナーゼのプロ酵素（カルバイオケム）をオーレオリシンと一緒にインキュベートして、オーレオリシンが線維芽細胞コラゲナーゼ（ＭＭＰ−１）を活性化する能力を試験した。
【０１６８】
ＴＣＮＢ緩衝液（０．１Ｍのトリス塩酸、ｐＨ７．５、１０ｍＭの塩化カルシウム、０．１Ｍの塩化ナトリウム、０．０５％のＢｒｉｊ  ３５）中の活性化混合物には、プロＭＭＰ−１（２５μｇ／ｍｌ）およびオーレオリシン（３μｇ／ｍｌ）および／または１ｍＭのＡＰＭＡが表記のように含まれていた。混合物を３７℃で１．２５時間インキュベートし、氷冷ＴＣＮＢによる希釈により急冷した。続いて、０．１μｇ／ｍｌの（プロ）ＭＭＰ−１と０．１６ｍｇ／ｍｌのブタＩ型コラーゲン（ＭＤ・バイオサイエンシーズ（ＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））とを含むＴＣＮＢ中、２５℃でのインキュベーションによって試料のコラゲナーゼ活性を判断した。各混合物の一部を一定間隔で０．２容量の５×ゲルローディング緩衝液（０．２Ｍのトリス塩酸、ｐＨ６．８／３７．５％（ｖ／ｖ）グリセロール／２．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ／５％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール）に取り出し、９５℃で２．５分間加熱した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析（４〜１２％ＮｕＰＡＧＥビス−トリス（ＭＥＳ）、インビトロジェン・コーポレーション）に続いて、アルファイーズ（ＡｌｐｈａＥａｓｅ）（商標）ＦＣソフトウェア（アルファ・イノテック・コーポレーション（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐ．））が実装されたフルオロケム（ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ）（商標）８８００画像形成システムを用いてα１（Ｉ）鎖の３／４長の生成物のバンド密度を推定し、コラーゲン切断を定量化した。曲線の線形部分から切断率を推定し、未処理の対照に対する比率を計算した。データを以下の表８に示す。オーレオリシンそれ自体はコラゲナーゼではないというという事実と一致して、このアッセイでは、オーレオリシンのみ±ＡＰＭＡを含有する対照インキュベーションで活性は示されなかった。
【０１６９】
【表８】
2009506098.tif 000013
【０１７０】
これらのデータから、オーレオリシンは、ＡＰＭＡなどの認識されたＭＭＰ活性化因子に匹敵する程度にプロＭＭＰ−１を活性化するだけでなく、ＡＰＭＡと併用するとＭＭＰ−１を「過活性化する」能力を有することが分かる。したがって、たとえば黄色ブドウ球菌がコロニー形成したＡＤ患者の皮膚などの同じ部位にある場合に、オーレオリシンを阻害するとプロＭＭＰ−１の活性化も阻害されることになる。
【０１７１】
５．オーレオリシンによるケラチノサイト活性化
活性化されたケラチノサイトは、炎症誘発性ケモカインであるＩＬ−８を産生する。多くの細菌生成物は、ケラチノサイトの活性化を引き起こす。このケラチノサイトによるＩＬ−８産生に対するオーレオリシンの影響を評価することができる。ヒト皮膚上皮ケラチノサイト（ＴＣＳ・セルワークス（ＴＣＳ  Ｃｅｌｌｗｏｒｋｓ））を取扱説明書に従って維持する。増殖培養物をトリプシン処理し、収集し、トリプシン阻害剤で処理し、成長培地に細胞約５０，０００個／ウェルで再懸濁させ、９６ウェルのプレートにコンフルエントな単層膜を得る。３７℃で５％ＣＯ２にて細胞を一晩インキュベートして回収可能なようにし、使用済みの培地をウェルから吸引して新鮮な成長培地と交換する。この細胞を、オーレオリシンまたは緩衝液対照と一緒に、３７℃で５％ＣＯ２にてさらに２４時間または４８時間インキュベートする。
【０１７２】
各ウェルから上清を除去し、Ｒ＆Ｄ・システムズ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）から入手したヒトＩＬ−８  ＥＬＩＳＡデベロップメントキット（カタログ番号：ＤＹ２０８）を製造業者の取扱説明書に従ってＩＬ−８の濃度を判断する。
【０１７３】
実験結果を表９に示す。これらの実験では、細胞を、オーレオリシンまたは緩衝液対照と一緒に、３７℃で５％ＣＯ２にて４８時間インキュベートする。ケラチノサイトでのＩＬ−８産生を刺激するポリＩＣおよびリポテイコ酸（ＬＴＡ）を正の対照として利用した。
【０１７４】
【表９】
2009506098.tif 000014
【０１７５】
この実験から、オーレオリシンは、オーレオリシン緩衝液対照（４９３ｐｇ／ｍｌ）に加えてケラチノサイト（６８７ｐｇ／ｍｌ）でのＩＬ−８の産生を刺激することができることが分かる。ＬＴＡ（４５４ｐｇ／ｍｌ）ならびに、程度は少ないがポリＩＣ（２８２ｐｇ／ｍｌ）は、未刺激の対照（１９９ｐｇ／ｍｌ）に比してＩＬ−８の産生を刺激した。
【０１７６】
６．化合物１１および１２が黄色ブドウ球菌の成長と生存度に対して及ぼす影響
液体培養物中で黄色ブドウ球菌を増殖させ、続いてこれを固体培地に蒔いて生存可能な細胞を計数すれば、この生物の成長および生存度に対する作用化合物を判定することができる。あるいは、９６ウェルのマイクロタイタープレートでの比濁法によって成長を推定してもよい。
【０１７７】
１０％スキムミルクおよび１％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ賦形剤±５０μＭの化合物を含有するブレインハートインフュージョン培地（５ｍｌ；ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．））に、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）８３２５−４（トリプシン大豆ブロス中、細胞約１０７個）を接種し、３７℃／２２０ｒｐｍで１６時間インキュベートした。増殖した（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）サンプル（０．１ｍｌ）を各培養から取り出し、ＰＢＳに希釈し、ブレインハートインフュージョン寒天（１．５％）に塗布して、３７℃でインキュベートした。表１０に示すようにコロニー数から生存可能な細胞数を判断した。
【０１７８】
【表１０】
2009506098.tif 000015
【０１７９】
平底の透明ポリスチレン製９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルで、黄色ブドウ球菌８３２５−４（細胞約１０５個）を含有するトリプシン大豆ブロス（０．１８ｍｌ）を２０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ賦形剤２０μｌ±化合物と混合した。プレートを３７℃／２２０ｒｐｍで一晩インキュベートし、翌日に６２０ｎｍの吸光度を測定した。賦形剤対照を参照することにより成長阻害を判断し、終点吸光度の５０％減少に至るアクチノニン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））濃度（ＩＣ５０値）を、表１１に示すようにカーブフィッティング（ＸＬｆｉｔ、ＩＤＢＳ・リミテッド）によって判断した。
【０１８０】
【表１１】
2009506098.tif 000016
【０１８１】
表１０および１１のデータから、化合物１１および１２は抗細菌性ではないのに対し、正の対照化合物であるアクチノニン（シグマ）、すなわちヒドロキサメートベースのペプチドデホルミラーゼ阻害剤（クレメンツ（Ｃｌｅｍｅｎｔｓ），ＪＭら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５：５６３〜５７０頁、２００１年）は、このアッセイでの見かけのＩＣ５０値が２．６μＭであることが分かる。
【０１８２】
７．化合物１２が黄色ブドウ球菌プロテアーゼ活性に対して及ぼす影響
オーレオリシンは、ブドウ球菌のセリンプロテアーゼグルタミルエンドペプチダーゼ（Ｖ８プロテアーゼ）の活性化を担い、ブドウ球菌のシステインプロテアーゼであるスタフォパイン  Ｂ（ｓｔａｐｈｏｐａｉｎ  Ｂ）の活性化を間接的に担う（ショー（Ｓｈａｗ），Ｌら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１５０：２１７〜２２８頁、２００４年）。このため、どちらもメタロプロテアーゼ阻害剤の見込みのある標的ではないにもかかわらず、オーレオリシンを阻害すれば、これらのプロテアーゼの活性に影響がおよぶと考えられる。化合物がこれらのブドウ球菌のプロテアーゼの活性に対して及ぼす全体としての影響を試験するには、化合物の存在下にて黄色ブドウ球菌を増殖させ、その化合物の同じ濃度を維持しつつ細胞−条件培地のプロテアーゼ活性をアッセイすればよい。
【０１８３】
１０％スキムミルクおよび２％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ賦形剤±化合物１２を含有するブレインハートインフュージョン培地（５ｍｌ；ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー）の増殖サンプルに、黄色ブドウ球菌８３２５−４（トリプシン大豆ブロス中、細胞約１０７個）を接種し、３７℃／２２０ｒｐｍで１６時間インキュベートした。培養を遠心処理して細菌を除去し、プロテアーゼ活性の分析まで培養上清を−７０℃で保管した。
【０１８４】
９０ｍＭのＭＯＰＳ（ナトリウム）緩衝液（ｐＨ７．０）（０．１ｍｌ）、０．０４５％のＢｒｉｊ  ３５、２％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ賦形剤±化合物１２および培養上清（４μｌ）を含む混合物にて、酵素活性を測定した。使用した化合物の濃度は、アッセイ試料の培養に用いた濃度と同じにした。反応混合物への追加は以下のとおりである。オーレオリシンアッセイ：４．５ｍＭの塩化カルシウム、９μＭのＥ−６４（システインプロテアーゼ活性を阻害するため）、１０μＭのＭｃａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄａｐ（Ｄｎｐ）−Ａｌａ−Ａｒｇ−アミド（バッケム）；Ｖ８プロテアーゼアッセイ：１０μＭのＭｃａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ（Ｄｎｐ）−アミド（バッケム）；システインプロテアーゼアッセイ：１．８ｍＭのシステイン−塩酸（ＮａＯＨでｐＨを調整）、９ｍＭのＥＤＴＡおよび０．１ｍＭのＺ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＭＣ塩酸塩（バッケム）。ポーラスター・オプティマプレートリーダー（ＢＭＧ・ラボテック・リミテッド）を使用して、オーレオリシンおよびＶ８アッセイでは３２０ｎｍ励起／４０５ｎｍ発光、システインプロテアーゼアッセイでは３９０ｎｍ励起／４６０ｎｍ発光で、１５分間隔で示度数を取りながら３７℃での生成物形成速度を６時間にわたってモニターした。蛍光増大の線形速度から酵素活性を判断し、賦形剤対照試料を参照することで阻害率に変換した。表１２に示す結果から、化合物１２は、Ｖ８プロテアーゼの活性レベルをほぼ完全に抑制し、システインプロテアーゼの活性レベルを有意に抑制することが分かる。
【０１８５】
【表１２】
2009506098.tif 000017
【０１８６】
このように、黄色ブドウ球菌がコロニー形成したＡＤ患者の皮膚でのオーレオリシン活性の阻害に化合物１２を使用すると、他の細胞外ブドウ球菌プロテアーゼの活性低下というさらなる利点が得られるものと思われる。
【０１８７】
８．化合物１２の選択性プロファイル
化合物１２は、広いスペクトル活性と、これに見合うオーレオリシンおよびＭＭＰに対する力価を有していた（表２）。触媒クラスの異なるものを含む他のプロテアーゼに対する阻害活性は、オーレオリシンに対して上記で用いたものと類似の適宜構成した生化学的アッセイを利用して判断できる。さまざまな精製酵素に対する化合物１１および１２の阻害活性を、後述のようにして試験した。
【０１８８】
２％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ賦形剤±化合物に以下の添加物を含有する反応混合物（０．１ｍｌ）を加えて、阻害活性を試験した。Ｖ８プロテアーゼ：９０ｍＭのＭＯＰＳ（ナトリウム）緩衝液（ｐＨ７．０）、４．５ｍＭの塩化カルシウム、０．０４５％のＢｒｉｊ  ３５、１０μＭのＭｃａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ（Ｄｎｐ）−アミド（バッケム）およびＶ８（バイオセントラム・リミテッド；３０ｎｇ）。スタフォパイン  Ａ（ｓｔａｐｈｏｐａｉｎ  Ａ）およびＢ：９０ｍＭのＭＯＰＳ（ナトリウム）緩衝液（ｐＨ７．０）、１．８ｍＭのシステイン−塩酸（ＮａＯＨでｐＨ調整）、０．０４５％のＢｒｉｊ  ３５、０．１ｍＭのＺ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＭＣ塩酸塩（バッケム）およびスタフォパイン  ＡまたはＢ（バイオセントラム・リミテッド；３０ｎｇ）。ヒトカリクレイン５：０．１Ｍのナトリウムリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、０．０４５％のＢｒｉｊ  ３５、０．１ｍＭのＢｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＡＭＣ（シグマ）および組換えヒトカリクレイン５（Ｒ＆Ｄ・システムズ・インコーポレイテッド（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ）；６ｎｇ）。ヒトカリクレイン７：７２ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．０）、０．０３３％のＢｒｉｊ  ３５、１．２ｍＭのＳ−２５８６（クロモゲニクス・インストゥルメンテーション・ラボラトリー・ＳｐＡ）ならびに、製造業者の取扱説明書に基づいてサーモリシン活性化した組換えヒトカリクレイン７（Ｒ＆Ｄ・システムズ・インコーポレイテッド；０．６μｇ）。ヒトアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）：４５ｍＭのＭＥＳ（ナトリウム）緩衝液（ｐＨ６．５）、０．０４５％のＢｒｉｊ  ３５、１０μＭのＭｃａ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｄｎｐ）−ＯＨ（Ｒ＆Ｄ・システムズ・インコーポレイテッド）、組換えヒトＡＣＥ（Ｒ＆Ｄ・システムズ・インコーポレイテッド；１．３ｎｇ）。
【０１８９】
ヒトカテプシンＤ：０．１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）、０．２Ｍの塩化ナトリウム、０．０４５％のＢｒｉｊ  ３５、１０μＭのＭｃａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄａｐ（Ｄｎｐ）−Ａｌａ−Ａｒｇ−アミド（バッケム）ならびに、製造業者の取扱説明書に基づいて活性化した組換えヒトカテプシンＤ（Ｒ＆Ｄ・システムズ・インコーポレイテッド；８ｎｇ）。ヒトＡＤＡＭ１７：２５ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ９．０）、２．５μＭの硫酸亜鉛、０．００５％のＢｒｉｊ  ３５、１０μＭのＭｃａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｄｐａ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−アミド（Ｒ＆Ｄ・システムズ・インコーポレイテッド）および組換えヒトＡＤＡＭ１７（Ｒ＆Ｄ・システムズ・インコーポレイテッド；２．５ｎｇ）。すべての反応物を３７℃で１時間インキュベートし、０．１５Ｍのトリス塩基０．１ｍｌを用いて停止したカテプシンＤアッセイ以外は０．５Ｍの酢酸０．１ｍｌを用いて停止した。賦形剤対照を参照して０．１ｍＭでの阻害率を算出し、適切な場合は、ＩＣ５０値をカーブフィッティング（ＸＬｆｉｔ、ＩＤＢＳ・リミテッド）によって判断した。表１３のデータは、化合物１２がアスパルチルプロテアーゼカテプシンＤ、セリンプロテアーゼカリクレイン５および７およびＶ８を阻害せず、ブドウ球菌のシステインプロテアーゼスタフォパイン  ＡおよびＢも阻害しないことを示している。また、化合物１２は、ＡＣＥ（メタロプロテアーゼファミリーＭ２）を阻害せず、ＡＤＡＭ１７の極めて弱い阻害剤であるのみであることから、「シェダーゼ」阻害剤ではないことが分かる。これは、そのジアステレオ異性体であって、ＡＤＡＭ１７の強力な阻害剤である化合物１１とは、極めて対照的である。
【０１９０】
【表１３】
2009506098.tif 000018
【０１９１】
特許および特許出願を含む、本件出願に引用した参考文献を、できるだけ完全に本願明細書に援用する。
【０１９２】
明細書および特許請求の範囲全体をとおして、文脈上特に必要がない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語ならびに、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などのその活用形は、記載された整数、工程、整数群または工程群を含む（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）ものであり、他のどのような整数、工程、整数群または工程群を除外するものではない旨を理解されたい。
【０１９３】
略語
ＡＣＥ    アンジオテンシン変換酵素
ＡＤ      アトピー性皮膚炎
ＡＰＭＡ  ４−アミノ酢酸フェニル水銀
ＤＣＣ    Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＣＵ    Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシル尿素
ＤＭＡＰ  ４−ジメチルアミノピリジン
ＤＭＳＯ  ジメチルスルホキシド
Ｅ−６４  Ｌ−トランス−エポキシスクシニル−ロイシルアミド−（４−グアニジノ）−ブタン
ＥＤＡＣ  Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩
ＥＤＣ    Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド
ＥＤＴＡ  エチレンジアミンテトラ酢酸
ＨＯＢＴ  １−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物
ＬＴＡ    リポテイコ酸
ＭＥＳ    ４−モルホリンエタンスルホン酸
ＭＯＰＳ  ４−モルホリンプロパンスルホン酸
ＮＭＭ    Ｎ−メチルモルホリン
ＰＢＳ    ホスフェート緩衝生理食塩水
ＴＣＮＢ  ０．１Ｍのトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭの塩化カルシウム、０．１Ｍの塩化ナトリウム、０．０５％のＢｒｉｊ  ３５
ＴＦＡ    トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ    テトラヒドロフラン
ｕＰＡ    ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子
【図面の簡単な説明】
【０１９４】
【図１】急性ＡＤ部位から採取した皮膚洗浄試料について得られたゲルを示す（化合物１１のある場合とない場合の酵素電気泳動分析）。
【図２】ミルク寒天プレートアッセイでの化合物３によるタンパク質分解活性の阻害を示す。
【図１】
2009506098.tif 000019
【図２】
2009506098.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】平成20年4月25日(2008.4.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）のコロニー形成を特徴とする炎症性皮膚症状の治療または予防における局所塗布用の、オーレオリシン阻害剤である化合物。
【請求項２】
アトピー性皮膚炎の治療または予防における局所塗布用の、オーレオリシン阻害剤である化合物。
【請求項３】
本願明細書に規定するオーレオリシンＩＩアッセイでのＩＣ５０値が５０μＭ未満であり、本願明細書に規定するＭＭＰ−９アッセイでのＩＣ５０値が０．５μＭ以上である、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
前記オーレオリシンアッセイでのＩＣ５０値が５μＭ未満である、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
（Ｓ）−Ｎ１−（（Ｓ）−３，３−ジメチル−１−（メチルアミノ）−１−オキソブタン−２−イル）−Ｎ４−ヒドロキシ−２−イソブチルスクシンアミド（化合物１２）またはその薬学的に許容される塩または溶媒和化合物である、化合物。
【請求項６】
（Ｓ）−Ｎ４−ヒドロキシ−２−イソブチル−Ｎ１−（（Ｓ）−１−（メチルアミノ）−１−オキソ−４−フェニルブタン−２−イル）スクシンアミド（化合物１６）またはその薬学的に許容される塩または溶媒和化合物である、化合物。
【請求項７】
黄色ブドウ球菌のコロニー形成を特徴とする前記炎症性皮膚症状の治療に用いられる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む局所用製薬組成物。
【請求項８】
前記アトピー性皮膚炎の治療に用いられる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む局所用製薬組成物。
【請求項９】
抗生剤と、ステロイド性および非ステロイド性抗炎症剤を含む、炎症反応を調節する作用剤と、免疫抑制剤と、から選択されるさらなる薬剤をさらに含む、請求項７または８に記載の組成物。
【請求項１０】
黄色ブドウ球菌のコロニー形成を特徴とする前記炎症性皮膚症状を治療または予防するための局所用薬剤の製造に、オーレオリシン阻害剤を用いる使用。
【請求項１１】
前記アトピー性皮膚炎の治療または予防のためのものである、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記化合物が、抗生剤と、ステロイド性および非ステロイド性抗炎症剤を含む炎症反応を調節する作用物質および免疫抑制剤から選択される、さらなる薬剤との組み合わせで投与される、請求項１０または１１に記載の使用。
【請求項１３】
黄色ブドウ球菌のコロニー形成を特徴とする前記炎症性皮膚症状の治療または予防に用いられる作用剤のスクリーニング方法であって、
（ｉ）前記作用剤をオーレオリシンと接触させ、かつ
（ｉｉ）前記オーレオリシンが阻害されたか否かを判断すること
を含む方法。
【請求項１４】
黄色ブドウ球菌のコロニー形成を特徴とする前記炎症性皮膚症状の治療または予防に用いられる作用剤のスクリーニング方法であって、
（ｉ）患者から皮膚洗液を得て、
（ｉｉ）前記作用剤を皮膚洗液と接触させ、かつ
（ｉｉｉ）タンパク質分解活性が阻害されたか否かを判断すること
を含む、方法。
【請求項１５】
前記判断が、酵素電気泳動または酵素アッセイによるものである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
黄色ブドウ球菌のコロニー形成を特徴とする、哺乳動物における炎症性皮膚症状に関連する皮膚病変を治療するための局所用薬剤の製造にオーレオリシン阻害剤を用いる使用であって、（ｉ）前記皮膚病変の部位から皮膚洗液を得て、メタロプロテアーゼ活性の存在が確認されたら、（ｉｉ）オーレオリシン阻害剤を前記皮膚病変に局所投与することを含む、使用。
【請求項１７】
黄色ブドウ球菌のコロニー形成を特徴とする、前記哺乳動物における炎症性皮膚症状に関連する皮膚病変を治療するための局所用薬剤の製造にオーレオリシン阻害剤を用いる使用であって、（ｉ）前記皮膚病変の部位における黄色ブドウ球菌の存在を判断し、前記黄色ブドウ球菌の存在が確認されたら、（ｉｉ）オーレオリシン阻害剤を前記皮膚病変に局所投与することを含む、使用。
【請求項１８】
前記オーレオリシン阻害剤が、請求項３〜６のいずれか１項に記載の化合物である、請求項１６または１７に記載の使用。
【請求項１９】
黄色ブドウ球菌のコロニー形成を特徴とする、ヒトを除く前記哺乳動物における炎症性皮膚症状に関連する皮膚病変を治療するための方法であって、（ｉ）前記皮膚病変の部位から皮膚洗液を得て、メタロプロテアーゼ活性の存在が確認されたら、（ｉｉ）オーレオリシン阻害剤を前記皮膚病変に局所投与することを含む、方法。
【請求項２０】
黄色ブドウ球菌のコロニー形成を特徴とする、ヒトを除く哺乳動物における前記炎症性皮膚症状に関連する前記皮膚病変を治療するための方法であって、（ｉ）前記皮膚病変の部位における黄色ブドウ球菌の存在を判断し、前記黄色ブドウ球菌の存在が確認されたら、（ｉｉ）オーレオリシン阻害剤を前記皮膚病変に局所投与することを含む、方法。
【請求項２１】
前記オーレオリシン阻害剤が、請求項３〜６のいずれか１項に記載の化合物である、請求項１９または２０に記載の方法。
【国際調査報告】
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