(57)【要約】血漿または全血サンプルにおける凝固を測定するための凝固検査要素であって、一定の距離を置いて互いに向かい合う、第１面（２ａ）および第２面（４ａ）を備え、上記両面には、略一致するように配置された高界面エネルギー領域および低界面エネルギー領域を形成する２つの実質的同一パターンが設けられており、上記高界面エネルギー領域は、少なくとも１つの検出領域（６ａ）を備えるサンプル分配系（６）を形成しており、第１面（２ａ）および第２面（４ａ）の上記検出領域（６ａ，６’ａ）には、少なくとも１種の凝固刺激剤が提供されている。凝固検査要素は、約０．５μＬの極少量のサンプル量と、乾燥薬剤検査帯状片仕様に適した、定性統合制御系を提供する。本発明の凝固検査要素の製造方法は、要素の安価な製造を可能とする、単純な製造工程を少ない工程数のみ含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
血漿または全血サンプルにおける凝固を測定するための凝固検査要素であって、
一定の距離を置いて互いに向かい合う、第１面（２ａ）および第２面（４ａ）を備え、
第１面および第２面には、略一致するように配置された高界面エネルギー領域および低界面エネルギー領域を形成する２つの実質的同一パターンが設けられており、
上記高界面エネルギー領域は、少なくとも１つの検出領域（６ａ）を備えるサンプル分配系（６）を形成しており、
第１面（２ａ）および第２面（４ａ）の上記検出領域（６ａ，６’ａ）には、少なくとも１種の凝固刺激剤が提供されていることを特徴とする凝固検査要素。
【請求項２】
上記サンプル分配系（６）は、少なくとも２つの凝固検出領域（６ａ１，６ａ２）を含むことを特徴とする請求項１に記載の凝固検査要素。
【請求項３】
少なくとも１つの凝固検出領域は、上記液体サンプル（陽性対照）の迅速かつ十分な凝固を促す凝固促進剤を含む製剤を備えることを特徴とする請求項２に記載の凝固検査要素。
【請求項４】
少なくとも１つの凝固検出領域は、上記液体サンプル（陰性対照）の凝固を抑制する凝固抑制剤を含む製剤を備えることを特徴とする請求項２に記載の凝固検査要素。
【請求項５】
上記サンプル分配系（６）は、少なくとも３つの凝固検出領域を備え、そのうち、少なくとも１つの凝固検出領域は、上記液体サンプル（陽性対照）の凝固を促進する製剤を備え、かつ少なくとも１つの凝固検出領域は、上記液体サンプル（陰性対照）の凝固を抑制する製剤を備えることを特徴とする請求項２に記載の凝固検査要素。
【請求項６】
上記凝固刺激剤は、トロンボプラスチンおよび／またはカルシウムイオンであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の凝固検査要素。
【請求項７】
上記液体サンプル（陽性対照）の上記凝固促進製剤は、ゲル化剤を含むことを特徴とする請求項２〜６のいずれか１項に記載の凝固検査要素。
【請求項８】
上記液体サンプル（陰性対照）の上記凝固抑制剤は、リチウムヘパリンおよび／またはＥＤＴＡを含むことを特徴とする請求項２〜７のいずれか１項に記載の凝固検査要素。
【請求項９】
上記検出領域（６ａ，６’ａ）における第１面（２ａ）および第２面（４ａ）のうち少なくとも一方は、透過率または吸光度測定による凝固反応の測定を可能にする化合物を備えることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の凝固検査要素。
【請求項１０】
上記検出領域（６ａ，６’ａ）における第１面（２ａ）および第２面（４ａ）のうち少なくとも一方は、凝固反応の蛍光測定を可能にする化合物を備えることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の凝固検査要素。
【請求項１１】
凝固反応の蛍光測定を可能にする上記化合物は、蛍光分子ローターであることを特徴とする請求項１０に記載の凝固検査要素。
【請求項１２】
凝固検査要素を製造する方法であって、以下の各工程を含むことを特徴とする方法：
少なくとも１つの所定の検出領域（６ａ）を備える親水性のサンプル分配系を形成する高界面エネルギー領域と、低界面エネルギー領域とを、基底層（２）の備える第１面（２ａ）上に生成する工程；
高界面エネルギー領域および低界面エネルギー領域の同一パターンを、被覆層（４）の備える第２面（４ａ）上に生成する工程；
第１面（２ａ）および／または第２面（４ａ）において所定の検出領域（６ａ）を、少なくとも１種の凝固刺激剤によって被覆する工程；および
サンプル分配系（６）用の空洞を形成する間隙を備える中央層（３）を間にして、第１面および第２面が向かい合うように各層を配置し、第１層（２）および第２層（４）の第１面（２ａ）および第２面（４ａ）に、高界面エネルギー領域によるサンプル分配系（６）を形成する工程。
【請求項１３】
下記の各工程をさらに含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法：
他の凝固検出領域（６ａ２）における第１面（２ａ）および第２面（４ａ）のうち少なくとも一方を、液体サンプル（陽性対照）の凝固を迅速かつ十分に促進する凝固促進剤を含む製剤によって被覆する工程；および
他の凝固検出領域（６ａ３）における第１面（２ａ）および第２面（４ａ）のうち少なくとも一方を、液体サンプル（陰性対照）の凝固を抑制する凝固抑制剤を含む製剤によって被覆する工程。
【請求項１４】
凝固検出領域における第１面（２ａ）および第２面（４ａ）のうち少なくとも一方を、凝固反応の蛍光測定を可能にする化合物によって被覆する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
上記高界面エネルギー領域は、第１面（２ａ）および第２面（４ａ）に不水溶性の親水性化合物を塗布することによって生成されることを特徴とする請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の凝固検査要素の製造方法。
【請求項１６】
上記低界面エネルギー領域は、第１面（２ａ）および第２面（４ａ）に疎水性化合物を塗布することによって生成されることを特徴とする請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の凝固検査要素の製造方法。
【請求項１７】
上記親水性化合物および／または上記疎水性化合物は、フレキソ印刷、リソグラフィー、グラビア印刷、墨塗法、またはインクジェット印刷によって、第１面（２ａ）および第２面（４ａ）に印刷されることを特徴とする請求項１５または１６に記載の凝固検査要素の製造方法。
【請求項１８】
凝固刺激剤、性質制御化合物、および／または蛍光検出補助剤は、ミクロ接触プリンティングまたは微量な投与によって、第１面（２ａ）および／または第２面（４ａ）の凝固検出領域（６ａ，６’ａ）に塗布されることを特徴とする請求項１２〜１７に記載の凝固検査要素の製造方法。
【請求項１９】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の凝固検査要素と、
所定の検出領域上の血清または全血の液体サンプルにおける、吸光度または蛍光の変化を検出するための検出手段と、
光検出手段からのデータを処理し、かつ凝固時間および／またはＩＮＲ値を計算するための処理手段と、
使用者へ出力値を示すための表示手段とを備えることを特徴とする、血漿または全血サンプルにおける凝固を測定するための凝固検査系。
【請求項２０】
血清または全血の液体サンプルにおける凝固を測定するための方法であり、以下の各工程を含むことを特徴とする方法：
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の凝固検査要素に対して、血清または全血の液体サンプルを導入する工程；
検出手段および処理手段を含む測定装置に、上記凝固検査要素を付加する工程；および
表示手段における出力値を読み込む工程。
【請求項２１】
血清または全血サンプルにおける凝固を測定するための凝固検査要素であって、
一定の距離を置いて互いに向かい合う第１面および第２面を備え、
上記第１面および上記第２面のうち一方には、親水性または疎水性のパターンが形成されており、もう一方の面は、疎水性領域によって囲まれた親水性領域の、相同パターンを備え、それゆえ、半親水性および半疎水性の性質を有する面を形成しており、
親水性および半親水性の領域は、少なくとも１つの検出領域を備えるサンプル分配系を形成しており、
第１面および第２面の検出領域には、少なくとも１つの凝固刺激剤が提供されていることを特徴とする凝固検査要素。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、生理学的流体サンプルにおいて血液の凝固を測定するための凝固検査系に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
血液凝固のプロセスは複雑であり、フィブリン繊維の生成を含む、多数の血液成分に関係している。この繊維は、フィブリノゲンというタンパク質分子の重合によって形成される。フィブリノゲンはトロンビンという酵素によって触媒され、トロンビン自体はプロトロンビンとう酵素によって触媒される。
【０００３】
一般に、病院、診療所、および研究所において血液サンプルの凝固能力を確かめるためには、プロトロンビン時間検査（ＰＴ検査）が利用されている。この検査は、例えば、手術前の診断を行う場合、および心臓病患者への抗凝固剤治療を施す場合に広く用いられる。このＰＴ検査は、例えばカルシウムおよびトロンボプラスチン等の、ある試薬の作用の下、血液サンプルが凝血するまでに要する時間の長さに基づいている。
【０００４】
同様に、心臓病および血管疾患を患っていたり、人工心臓弁を入れていたりする人々の治療では、一般に抗凝固剤と称される、血液の抗凝結薬が毎日処方されることが多い。抗凝血剤が効果を持つためには、血流中の抗凝固剤の量が、医師によって適切だと判断されたレベルで維持されなくてはならない。血流中の抗凝血剤の量が不適切であった場合には、脳梗塞や大出血などの深刻な事態が引き起こされる。
【０００５】
このバランスを保つために、患者は、血液の凝固能力を詳しくモニターできる病院へ通院し、頻繁な通院にかかる費用および不便さに耐えなければならない。モニタリングは、定期的に、国際標準比（ＩＮＲ）によって測定される、ＰＴ測定によって行われる。例えば、３より大きいＩＮＲでは、深刻な大出血の危険性が高くなり、さらに、ＩＮＲが６であると、深刻な出血に発展する危険性が、ＩＮＲが３以下である人の約７倍に増加する。一方、２以下のＩＳＲでは、脳梗塞の危険性が増加する。したがって、プロトロンビン時間のモニタリングは、服用レベルを治療域内に確実に収めるために推奨されている。
【０００６】
血液中のフィブリノゲンおよびプロトロンビのような成分のレベルをモニタリングすることによって、医者は、患者の血液の凝固能力、または他の臨床症状に関する重要なデータを取得することができる。凝血（凝固）のプロセスに伴われるタンパク質は、一般に因子とされる。この因子にはI〜ＸIIIの番号が付けられ、当業者は、因子の番号を参照することによって、対応するタンパク質を識別する。
【０００７】
プロトロンビンの活性化は、タンパク質分解の間に第Ｘ因子の活性によって形成される、血液凝固の第Ｘａ因子の作用による結果として起こる。第Ｘａ因子をもたらす第Ｘ因子の活性化を引き起こす経路には、一般に、外因性および内因性の血液凝固経路とされる２つの分子的経路がある。外因性の経路は、傷ついた細胞膜に特異的である組織因子のみを利用する。一方、内因性の経路は、循環血液内部の組織因子のみを利用する。これらの経路は２つとも、血液凝固のプロセスに伴われる酵素と、表面タンパク質およびリン脂質酵素との相互作用に端を発する。
【０００８】
患者の血液サンプルにおいて、外的および内的経路の２つの凝固プロセスを測定するために、様々な検査がある。例えば、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＴＰＰ）検査は、内的経路の凝固因子を測定する。これらの因子は、第XII、第XI、第Ｘ、第IX、第VIII、第Ｖ、第II、および第I因子を含んでおり、遺伝、病気、およびヘパリン療法の作用を原因とした異常を起こす可能性がある。したがって、ＡＴＴＰ検査は、手術前の検査として実用的であり、またヘパリン療法のモニタリングのために実用的である。同様に、フィブリノゲンの重合の検査は、トロンビン時間（ＴＴ）検査、フィブリノゲンの定量試験（商標：Ｃｏｕｍａｄｉｎｅ）、または薬学関連を用いて診断される。なお、フィブリノゲンの定量試験は、ワルファリン療法における患者の診断に関する有用なデータを提供する。
【０００９】
前述のように、通常、抗凝固療法のモニターに用いられる検査は、第１段階のプロトロンビン時間検査である。ＰＴ検査によって測定される反応は以下の通りである。
【００１０】
血液＋トロンボプラスチン＋Ｃａ＋＋→フィブリン塊
トロンボプラスチンは、血液の検査サンプル中の凝固を活性化するリン脂質−タンパク質製剤である。トロンボプラスチンは、一般に様々なメーカーから入手でき、肺、脳、または胎盤抽出物から採取でき、また、合成的に製造することもできる。通常、ＰＴ値は様々な研究所の間で一致していないため、この値によって抗凝固療法の治療域を定義することは好ましくない。
【００１１】
したがって、１９８０年代の初頭、世界保健機関によって、国際標準比（ＩＮＲ）が作成され、かつ採択された。この標準比の目的は、トロンボプラスチンおよび凝固の様々な分析器から得られる結果を標準化すること、かつ同等のものにすることである。その結果として、メーカーはこの比率の下で、トロンボプラスチンを国際的な標準トロンボプラスチンと比較し、各トロンボプラスチンの群に、その相対感受性に応じて国際感受性指標（ＩＳＩ）を割り当てている。例えば仮に、トロンボプラスチンが標準トロンボプラスチンと同じ感受性を持っていれば、そのＩＳＩは１．０となる。１．０よりも大きいＩＳＩ値は、トロンボプラスチンが標準トロンボプラスチンほど感受性のないことを示す。以下の方程式は、ＰＴ値およびＩＳＩ値を用いてＩＮＲ値を計算するために利用されている。
【００１２】
【数１】
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【００１３】
健常者のＰＴは、各研究所において健常者の固体数からＰＴ値を平均することによって、決定された。
【００１４】
フィブリン塊の形成の発見は１８５０年代の中頃にさかのぼり、その発見および初期の方法は、手作業で行われていた。１９１０年近くになって、凝固した血液サンプルの粘度変化を測定するための装置が開発された。
【００１５】
この装置は、凝固時間に対してプロットできる、直接的な指標である電圧をもたらした。１９２０年代に入ると、光電子技術は、検流計によって観察されたサンプルの光学透過性の変動で、凝固中の血液サンプルにおける光の透過性の変動を検出することに優れてきたさらに、１９３０年代の中頃、改良された光電子技術を用いた血漿凝固の研究が、凝固した血液の観察時における光学透過性の増加と共に調査された。これにより、凝血塊の形成時における透過性の増加を示す機器の発達が導かれた。
【００１６】
したがって、現在の光学透過性の検出系は、凝固サンプルの光密度の増加はサンプルを通った光の伝達を減少させるという原則に基づいて機能している。標準的な光学透過性の検出系において、血液検査サンプルは、透明なサンプル容器に収納されて、トロンボプラスチンのような凝固促進剤と反応させられる。サンプルが凝固する時、光、可視電磁放射線、または近赤外スペクトルを、血漿と試薬との混合物に通過させる。サンプル中ではフィブリン形成を導く生化学的な変化が起こり、サンプルの光学濃度は増加する。処理装置を用いた処理の後、サンプルの光学濃度に対応する出力電圧によって、サンプルの凝固を測定することが可能になる。
【００１７】
一方、フィブリノゲン（フィブリン）レベルと光学濃度との間の関係の存在は、長いこと認識されているが、その関係を測定するための本質と適切な手法とには、大幅な相違があった。そのため、光学濃度のデータを用いてフィブリノゲンのレベルを測定するために、多数のパラメータが考案された。
【００１８】
さらに、不規則な血液凝固時間の弊害についての認識が高まると、自己モニターおよび自己医療の受け入れは、数多くの血液凝固用モニター、個人的利用方法、および診療検査の重要な発展を導いてきた。しかし、これらの装置はいまだ、糖尿病患者のためのグルコース自宅監視システムに知られるような開発段階には至っておらず、値段の安さおよび利便性に欠けている。
【００１９】
血液凝固時間を測定するための典型的な方法および系が、米国特許4,２5２,536号に知られている。この方法は、血液サンプルと試薬との混合物を提供する工程と、その混合物に光を照射する工程と、典型的な電気信号を発生し、照射された混合物から散乱した光量を測定する工程とを含む。その後、電気信号の最も早い変動が発生し、その発生した最も早い変動の１／ｎの変動における最初の時よりも前のエンドポイントにおける電気信号を測定する。なお、ｎは１よりも大きい。凝固時間を測定する方法の大部分は、容器に入れられた血漿、および、長年にわたる凝固の性質の解析に基づいている。
【００２０】
欧州特許１,１6２,457は、所定量の血液を入れた３つのサンプルウェルを用いて、凝血機能を改善するための治療の時に患者へ投与する薬物が促進する、適切な凝固を測定するための検査システムを開示している。
【００２１】
米国特許6,066,504は、粘度の定量的測度を提供する電極集合体が、凝固または血液サンプルの溶解を信号で伝える時間間隔を切り替えることを開示している。
【００２２】
欧州特許974,840は、光学検出手段を用いて検体の濃度および体液の特性を測定するための流体診断装置を開示している。
【００２３】
PCT WO２0047/044560は、全血のサンプルを薄めずに入れるための容器、光を照射するための光源、および上述の容器から光量を測定するための光学検出器を備え、不希釈薄の全血における凝固時間の光度定量を開示している。
【００２４】
米国特許6,084,660は、一方にサンプルを取り込むためのサンプルポートを備え、もう一方には測定範囲へサンプルを取り出すための空気袋を備え、全血サンプルが上記装置に取り込まれたのをまず確認してから、検体濃度または全血の物理的性質、特には凝固時間を測定する流体医学診断装置を開示している。
【００２５】
PCT WO２00２/08647２は、環境の粘度に基づいた蛍光強度が異なる蛍光分子回転の利用を開示している。この発明は、さらに、細胞膜または液体粘度の測定を可能とする、炭化水素鎖または親水基を修飾された分子モーター類と関係する。
【００２６】
米国特許出願公報US ２00２/0１１0486Ａ１およびUS ２003/003１594Ａ１は、定性制御のために利用される複数の反応帯を包含する検査帯状片を開示している。この検査帯状片には血液が約２０μＬ必要である。しかし、仮に使用者が頻繁に検査を行う場合、このような多量のサンプルを必要とすることは、凝固治療を適切に管理するためには、非実用的であり不都合である。
【００２７】
PCT/EP ２00400２２84は、生理液中のグルコースや血液などの検体における光度検出および光度定量のための、乾燥試薬検査の原理を開示している。この光度検出および光度定量は、少なくとも２つの検出領域を有する標本分布系を備えており、当該系は、統合された検定系と共に運用され、サンプルの必要量は約０．５μＬと極少量である。
【００２８】
しかしながら、今まで、血液サンプルの凝固測定に適し、統合された定性制御手段と共に運用され、かつサンプルを少量しか必要としない検査システムというものは存在しない。
【００２９】
したがって、本発明の目的は、血液を帯状片へ導入するなどの極少ないステップのみを必要とし、帯状片上の定性制御手段を含む正確な検査の結果を連続自動計算し、かつ、サンプルを少量しか必要としない、全血の凝固を測定する検査システムを提供することである。
【００３０】
さらに、本発明の目的は、多数のおよび複雑な製造工程を含まず、それゆえ、安価であり、かつ製造物が血液凝固の自己モニタリングにおいて患者の役に立つ凝固検査要素の製造方法を提供することである。
【００３１】
〔本発明の要約〕
血漿または全血サンプルにおける凝固を測定するための検査要素を提供する本発明は、互いの間に所定の距離を有する第１面および第２面を備え、上記両面は、高界面エネルギー領域および低界面エネルギー領域を形成する、実質的に同一なパターンが形成され、かつ略一致に揃えられ、それにより高界面エネルギー領域は少なくとも１つの検出領域を備えるサンプル分配系を形成し、第１面および第２面における検出領域は、少なくとも１種の凝固刺激剤を備える。
【００３２】
また、本発明は、凝固検査要素を製造するために製造方法を提供する。
【００３３】
さらに、本発明は、凝固検査要素、および簡素な構造を用いて血液凝固の分析を行うための測定装置を含む、凝固検査系を提供する。これらは、帯状片上に定性制御を備えることによって、世界基準に基づいた様々な結果を提供する。
【００３４】
本発明の特徴および利点は、添付の図と併せて、実施例および実施形態についての以下の詳細な説明を参照することによって明らかとされる。
【００３５】
〔本発明の詳細な説明〕
図１および図２に示すように、本発明に係る凝固検査帯状片１は、基底層２、基底層２を覆う中央層３、および中央層３を覆う被覆層４を備える積層構造をしている。中央層３は間隙５を有し、間隙５は基底層４および被覆層４とともに、窪みのある空洞を形成している。上記空洞の内側には、サンプル分布系６が配置され、凝固検査帯状片の一端に配置されたサンプル導入領域９と繋がっている。使用者とのインターフェイスであるサンプル導入領域９は、サンプルを導入しやすくするため、凝固検査帯状片の第１の主要側面に広がる凸曲面１０に形成されるのが好ましい。凝固検査帯状片においてサンプル導入領域９および１０と反対側である第２の主要側面には、空気を排出させる空気孔１１が配置される。一方、予定検出領域６ａおよび６’ａには、生理液または水性の液体が分配される（図３参照）。上記構造について、凝固検査要素に用いられる予定検出領域の数に係らず、空気孔は１つあればよい。サンプル分配系の上記要素は、高界面エネルギー領域、サンプル導入領域、空気孔、中央層、および中央層の間隙を備えることによって、凝固検査要素が全て形成される。この凝固検査要素は、内部の毛管現象を引き起こすことによって、導入された生理液または水性の液体を予定検出領域へ分配する。
【００３６】
加えて、凝固検査帯状片は、プロトロンビン時間（ＰＴ）および活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）などの異なるパラメータを測定する際、様々な検査帯状片の種類を識別するために有用な登録特徴７および８を備える。これによって、複合的な検体測定器に対して、特別なプログラムを実行するよう指示したり、または、異なるパラメータを測定するために必要とされる帯状片を用いて各種パラメータの処理を実行するよう指示したりすることができる。図３は、図１および図２における積層構造を示す分解図であり、図３に示すように、基底層２は第１面２ａを備え、被覆層４は第２面４ａを備えている。第１面２ａおよび第２面４ａには、サンプル分配系６を形成する領域のパターンがかたどられている。このサンプル分配系６のパターンは、所定の数の検出領域６ａおよびサンプル経路６ｂを構成している。検出領域６ａおよびサンプル経路６ｂは、積層構造の集合体上に略一致するように配列され、かつ位置合わせされている。中央層３は、基底層２の第１面２ａと被覆層４の第２面４ａとの間の距離を決定する。また中央層３は間隙５を備えており、間隙５は、基底層２の第１面２ａおよび被覆層４の第２面４ａと共に窪みのある空洞を形成する。第１面２ａと第２面４ａとの間に形成されるサンプル分配系６は、中央層３の間隙５、基底層２の第１面２ａ、および被覆層４の第２面４ａによって形成される空洞の内側に配置される。窪みのある空洞は、意図的に、サンプル分配系よりも十分に大きいことが好ましい。
【００３７】
中央層の間隙５は、サンプル分配系６のための空洞を形成することができれば十分であるため、中央層の間隙５は、例えば図４に示されるような異なる形状であってもよい。図４（ａ）は、凝固検査要素である傘形状の空洞１２を示す図である。図４（ｂ）は、凝固検査要素である長方形の空洞１３を示す図であり、図４（ｃ）では、サンプルの空洞１４は円形である。中央層３の間隙５は、サンプル分配系６における所定の検出領域６ａのサイズ、および経路６ｂのサイズに対して影響を与えず、また必要なサンプル量に対しても影響を与えず、かつ変更させない。サンプル分配系６と比較して、図４に示される空洞の形状はシンプルであるため、簡単な穴あけ道具を利用することができ、さらにレジストレーション精度要求が少ないため、素早く加工することができる。
【００３８】
中央層３の間隙５、基底層２の第１面２ａ、および被覆層４の第２面４ａによって形成される空洞内に配置されたサンプル分配系６は、上述の面２ａおよび４ａにおいて、高界面エネルギー領域、および低界面エネルギー領域を生成することによって形成される。基底層２の第１面２ａおよび被覆層４の第２面４ａにおける、高界面エネルギー領域と低界面エネルギー領域とは、互いに略一致するように位置合わせされている。導入された生理液または他の水性サンプルは、高界面エネルギーを有する領域のみを湿潤させるため、サンプルは、サンプル分配系６における予定流体経路６ｂおよび検出領域６ａ、および基底層２の第１面２ａと被覆層４の第２面４ａとの間の内側に留められる。
【００３９】
図５ａは、疎水性の「誘導要素」を用いたサンプル分配系６の構成を示す図である。本発明に係る凝固検査要素の実施形態において、基底層２および被覆層４は、サンプル経路および検出領域を形成する領域を除いて、疎水層１６によって被覆されている。疎水層１６は、低界面エネルギー領域を形成する。その領域は、導入された液体サンプル１５に対して撥水性を示す。このため、液体サンプル１５は、サンプル分配系６を形成する高界面エネルギー領域に留められる。
【００４０】
疎水層は、生理液または水性液体によって湿潤する親水性の表面上に、皮膜されることが好ましい。上記処理は、親水性の表面を必要とし、親水性の表面は、セロファンやガラスなどの天然の親水性ポリマーから生成される。また同様に、一般的なポリマーの疎水性の面を、コーティング処理、または、真空中で気化される親水性モノマーの物理的または化学的なプラズマ蒸着を用いて、疎水性から親水性にすることによっても生成される。なお、一般的なポリマーとは、例えば、二酸化ケイ素、エチレンオキシド、エチレングリコール、ピロール酸、およびアクリル酸などである。次いで、「誘導要素」のパターンは、基底層および被覆層の親水性の表面上に、疎水性のインクを印刷することによって形成することができる。
【００４１】
疎水性のインクは、一般に、水との接触角が１００°以上であり、かつ界面エネルギーが２５ｍＮ／ｍ以下であることが好ましく、かつ疎水性機能、疎水性添加物、疎水性色素、または疎水性充填剤を有するモノマー、オリゴマー、またはポリマーを含むものが好ましい。
【００４２】
図５（ｂ）は、親水性の経路を用いたサンプル分配系の他の構成を示す図である。この実施形態の凝固試験要素においては、基底層２および被覆層４は親水層１７に皮膜され、それによって、高界面エネルギーを作り出している。
【００４３】
疎水性表面に印刷された親水層１７は、生理液または水性液体によって高く湿潤する。したがって、サンプル分配系の親水性経路を形成する高界面エネルギー領域は、導入された生理液または水性液体のサンプルに対して正の毛管力を発揮し、液体サンプルは個々の検出領域に運ばれる。
【００４４】
親水層１７は、疎水性の表面上に親水性物質または両親媒性物質を印刷することによって形成されることもできる。親水性機能を有するインクは、高分子量水、アルコール可溶ポリマー、およびそれらの混合物という広い選択肢から選んで形成することができる。特に、アルギン酸塩、セルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ガム、多価アルコール、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ビニルピロリドン、ポリスチレンスルホン酸、ポリスルホナート、アルキルホルホコリン誘導体などからの誘導体が利用できる。また、特に、有機修飾ポリシロキサンの架橋できる種類およびフッ素化界面活性剤である、シリコンアクリレートも利用できる。塗布物は、一般に水との接触角が３５°以下であり、かつ界面エネルギーが５０ｍＮ／ｍ以上であることが好ましい。
【００４５】
上記印刷処理の基材となる基底層および被覆層は、ガラス、ポリ酢酸ビニル、ポリメチルメタクリル樹脂、ポリジメチルシロキサン、ポリエステルおよびフルオレン環を含むポリエステルリジン、ポリスチレン、ポリカーボネートおよびポリカーボネートポリスチレングラフト共重合体、末端修飾ポリカーボネート、ポリオレフィン、シクロオレフィンおよびシクロオレフィン共重合体、および／またはオレフィンマレイミド共重合体などを材料として形成されることが好ましい。
【００４６】
同様に、基材が中間疎水性の性質を有する場合にも、例えば図５（ａ）および図５（ｂ）に示される構造の組み合わせのように、疎水性のパターンを周囲に配して親水性の経路を印刷することは可能である。
【００４７】
他の実施形態（図示しない）では、第１の面または第２面のどちらか一方が親水性／疎水性のパターンを備え、もう一方の面は、疎水性領域に囲われた親水性領域の同一パターンを備える。これによって、半親水性および半疎水性の性質（両親媒性）を備えた面が形成される。両親媒性であると、第１面の親水性および疎水性のパターンと、第２面の親水性および疎水性のパターンとを等しく揃える必要はなくなる。このような両親媒性の表面の性質は、親水性領域の幾何学的なパターン、および親水性領域と疎水性領域との全体的な比率によって、簡単に設計されることができる。本発明に開示された両親媒性の特徴において、親水性領域と疎水性領域との各比率は、向かい合った面が親水性の特徴を備えている場合にのみ、サンプルが親水性領域から親水性領域へと進むように設計されている。仮に、向かい合った面が疎水性の特徴を備えている場合、凝固検査要素の毛細管間隙内における液体は動きを止めてしまう。このメカニズムによって、上記方法は、第１面および第２面において、サンプル分配系のパターンを正確に一致するよう位置合わせするという厳しい条件なしに、凝固検査要素を機能的に形成することができる。しかしながら、第１面および第２面は、サンプル分配系の親水性経路内における液体サンプルの分配を迅速かつ確実にするために、高界面エネルギーおよび低界面エネルギーを有する同様のパターンを備えることが好ましい。
【００４８】
さらに言えば、第１面および第２面における高界面エネルギー領域は、エッチング、エンボス加工によって、または簡単に、第１面および第２面に親水性の膜を３回から５回程度印刷してその厚さを増加させることによって、低界面エネルギー領域から物理的にエネルギーを上昇させてもよい。この上昇によって、親水性経路の毛細管間隙は周囲の領域に関連して小さくなり、それにつれて、液体サンプルにおける毛管力は高くなる。
【００４９】
高および低界面エネルギー領域が、疎水性誘導要素、親水性経路、またはそれら両方の組み合わせのどれによって作り出されたとしても、好ましい本実施形態に係る凝固検査要素の備えるサンプル分配系のための必要量は、約０．５μＬから１．０μＬの極少量であり、検出領域当たりではたったの約１００ｎＬから１５０ｎＬである。しかしながら、サンプル分配系の量が、種々のデザインおよび所定の検出領域の採用数によって変化することは、当業者にとって明らかである。
【００５０】
図６は、サンプル分配系の異なるパターンを示す図であり、図５（ｂ）に図示された親水性経路、図５（ａ）に図示される疎水性の「誘導要素」、または親水性経路と疎水性誘導要素との組み合わせによって実現されることができる。サンプル分配系は、評価のための生理学的なパラメータ、および検出化学に適するものを選択することが必要である。
【００５１】
したがって、特定の血清または全血について、列IIからIVまでに示される実施形態において、サンプルの基本的な測定を再現することができる。同様に、プロトロンビン時間および活性部分トロンビン時間のような２つの凝固パラメータを評価するために、列IVにおける凝固検査を用いることができる。
【００５２】
上述によれば、フィブリン凝血塊は、次に示すように、トロンボプラスチンおよびカルシウムイオンが血液と反応する間の反応物による。
【００５３】
Thromboplastin＋Ｃａ＋＋＋Blood（or Plasma）→Fibrin clot （反応１）
反応１が起こると、基底層２の第１面２ａまたは被覆層４の第２面４ａにおける、サンプル分配系の検出領域６’ａは、図５（ａ）および図５（ｂ）に示すように、製剤１８および１９を被覆されることにおいて特徴付けられる。製剤１８および１９は、血液サンプルにおいて凝固反応の促進および検出を可能とする。
【００５４】
本発明の検査要素に係る一実施形態において、製剤１８はトロンボプラスチンのような凝固刺激剤（例えばDade Behring Holding GmbH, Hochster Strasse 70,65835 Liederbach, Germanyから入手可能）を含み、一方、製剤１９は、カルシウムイオンを含む。凝固刺激剤は、検出領域における全血の凝固のためのプロモーターであるため、透過率、吸光測定、または光拡散による光学特性の測定が可能である。
【００５５】
プロトロンビン時間または活性部分トロンビン時間は、吸光度または光拡散の変化によってモニターされる。凝固作用中に、フィブリノゲンはフィブリンに変換される。フィブリンは主に、赤血球細胞および血小板について、任意分配の前段階から関連段階へと推し進める。それによって、赤血球細胞および血小板は捕捉されてフィブリン繊維と結合し、その上で互いに凝血塊を形成する。これら血液サンプルの物理的整合性における変化は、散乱核の減少を引き起こし、それによって検査を受ける血液の吸光度および濁度は変化する。吸光度の変化を測定するためには、図７ａに示すような検出装置が好ましい。
【００５６】
図７ａは、図５ｂに示す凝固検査要素内におけるサンプルの光学濃度を測定するための、検出装置を示している。この装置は光源２０を備え、光源２０はサンプル検出領域の方向に一定の波長を有する光２４を照射する。光源２０から照射される光は、例えば拡散器またはレンズのような光学装置２１、アパーチャー２２、基底層２、サンプル１５、および検出領域における被覆層を通過し、装置の反対側における検出部２３によって検出される。
【００５７】
他の実施形態において、凝固検査要素は、さらに性質制御検査を行うために、１つ以上の測定を行うように設計されている。この場合、凝固検査要素は、少なくとも２つ、好ましくは３つの凝固測定領域を備える。第１面２ａにおける全ての検出領域６’ａは、フィブリン凝血塊を生成する化学成分間における反応を促進する凝固刺激剤１８（例えばトロンビン）によって被覆されている。一方、第２面４ａにおける１つのサンプル検出領域、例えば６ａ２は、素早くかつ完全な凝固（陽性対照）を促進する凝固促進剤を含む、化学製剤によって被覆されている。また、第２面４ａの他の検出領域、例えば６ａ３は、血液の凝固を抑制する（陰性対照）凝固抑制剤を含む化学製剤を備える。
【００５８】
反応（１）を起こすために、トロンボプラスチン、カルシウムイオン、および仮に必要であるならば、例えば凝固抑制剤や凝固促進剤などの性質制御剤の量を、上述のサンプル検出領域に正確に投薬する。投薬は、例えばインクジェット印刷などの技術は当業者によって周知であるが、塗布方法に応じた滴下によって行われることが好ましい。サンプル検出領域に塗布される凝固刺激剤の正確な投薬は、適切な反応の進行、ひいては凝固反応の終点の確実な計算のために重要である。例えば、実施形態の例において、トロンボプラスチンの量は各サンプル検出領域において一定とし、一方、例えばＥＤＴＡ等の凝固抑制剤の濃度を変更することができる。
【００５９】
本発明に係る検査要素のさらなる実施形態においては、トロンボプラスチン、カルシウムイオン、および凝固抑制剤や活性剤等の性質制御製剤に加えて、さらに、蛍光検出補助剤として機能する化合物を、第１面２ａおよび／または第２面４ａのサンプル検出領域に塗布してもよい。仮に上述の検出領域が蛍光分子ローターによって塗布される場合、凝固反応は蛍光によってモニターされる。
【００６０】
蛍光は任意の物質から照射される光であり、かつ分子の第１励起状態から発生する。初期過程において、上記分子は光の吸収によって励起される。数ナノセカンド後の過程では、分子は基底状態に戻る。さらに、蛍光と称される光の発光、または分子の中心の運動および回転によって、分子は励起エネルギーを除去される。
【００６１】
一般に、蛍光は芳香族分子から発生する。４００〜８００ｎｍの範囲の可視光を吸収する芳香族分子は着色して見える。さらに、全分子の吸光度および発光特性を決定する色素の構造は、発色団という。特定の発色団についての発光の量または強さは、蛍光量子収量によって定量化される。蛍光量子収量は、吸収された光子の数に対する、照射された光子の数として定義される。一般に、多くの蛍光色素は一定の量子収量を有し、例えばスルホローダミン１０１（別名テキサスレッド）等、１００％の発光効率に近い量子収量を有する全色素は、最も明るい発光を表す。
【００６２】
発色団の端部にフレキシブル基を持っている色素は、分子ローターとして知られており、かつ溶媒の粘度に対する蛍光量子収量に依存している。溶媒の粘度が増加すると、色素の蛍光量子収量は増加する。この作用は、粘度の増加によって発色団の端部における非剛性フレキシブル基の可動性が低下することに起因する。発色団の有する側基の可動性がさらに妨げられると、色素分子は分子足場の移動を経由して基底状態に緩和することができず、光の発光によって励起エネルギーが除去される。溶媒の粘度に敏感な蛍光色素の例は、キサンテン、オキサジン、およびカルボピロニンの色素類などである。
【００６３】
上記作用は、粘度の増加によって低下したジメチルアミノ基の可動性に起因する。例えばキサンテン類の色素は、下記の化学構造として示される。
【００６４】
【化１】
2009506332.tif 000004
【００６５】
その後、反応１の試薬との接触によって低下したジメチルアミノ基について、可動性の方向例を下記化学構造に示す。フィブリン凝血塊の形成、すなわち生理液の凝固を導く試薬によって、サンプルの粘度は増加し、次いで分子の蛍光が起こる。次に示された発色団の端部におけるジメチルアミノ基は、非剛性であり、印で示された原子結合の周りを回転する。この動きが、凝固により増加した粘度によって強く妨げられるとき、色素の蛍光発光が増大する。
【００６６】
【化２】
2009506332.tif 000005
【００６７】
本発明に関して、粘度の変化に敏感な蛍光プローブは最も有用である。さらに、分子ローターの例として、オーラミンＯ、クリスタル・バイオレット４、ｐ‐Ｎ,Ｎ‐ジメチルアミノ‐ベンゾニトリル５、ｐ‐Ｎ,Ｎ‐ジメチルアミノ−ベンゾニトリル６、ジュロリベンジリデン‐マロノニトリル、ローダミン１９、ローダミンＧ６、ローダミンＢ、オキサジン１、オキサジン４、およびオキサジン１７０などが挙げられる。これらの分子構造は図８に示される。
【００６８】
上記反応を蛍光によってモニターする場合、光源および検出手段を互いに向かい合わせずに配置することが有用である。さらに言えば、最大の感度を得るためには、図７に示すように約９０°の角度に配置することが最も有用である。この光源と検出手段との間の角度は、８０°から１２０°の間であることが好ましく、さらには約１０９°であることが最も好ましい。また、凝固検査系は、検出領域（さらに広く言えば凝固検査系）の異なる面における内面反射によるノイズを避けるために、基底層と光源との間、および被覆層と検出手段との間は約５４°とするような光学検出配置に設置される。完全な稼動のために、検出器２３は、励起と発光波長との間を識別するための、光学フィルター２１ａおよび２２ａを備える光学装置２１および２２を加えて構成される。したがって、検出手段は、光源に由来する光２４ａではなく、蛍光色素から発散された光２４のみを調べる。実際の角度は、特別な利用、つまり要求される感度および各検出装置の検出器における要件に対して最適化されなくてはならないことは、たとえ当業者であっても自明である。
【００６９】
凝固検査要素１は、正確なプロトロンビン時間の測定のために必要な、少なくとも１つの検出領域６ａを備えている。しかし、より好ましい実施形態では、３つの検出領域６a１〜６ａ３を利用してもよい。凝固検査要素１の物理的構造は、柔軟に様々な検出領域を利用した複合的な構成であってもよい。例えば、検出領域６a１〜６ａ３は、異なる濃度の凝固刺激剤を有してもよい。例えば、基底層２の第１面２ａにはトロンボプラスチンを塗布し、一方、被覆層４の第２面４ａにはカルシウムイオンおよび蛍光分子ローターを塗布してもよい。あるいは、全ての試薬は、凝固検査要素１における基底層２の第１面２ａまたは被覆層４の第２面４ａのどちらにでも塗布されてよい。
【００７０】
例えば血液または血漿等の生理液がサンプル導入領域９に導入され、毛細現象によって検出領域まで分配された後、第１面２ａの検出領域における製剤１８中に含まれる凝固刺激剤は溶解される。それと同時に、分子ローター、および／または第２面４ａの所定の検出領域における製剤１９中に含まれるＥＤＴＡ等の潜在凝固阻害剤は、血液または血漿、トロンボプラスチンなどの凝固刺激剤、およびカルシウムイオン、さらに第２面に備えられた追加の材料と混合物を形成する。
【００７１】
所定の検出領域に塗布された凝固刺激剤は、血液等の生理液に容易に溶解され、互いに近接して配置されることが好ましく、それによって、全ての成分が素早く拡散して混合される。したがって、検出領域に含まれる成分の素早い反応が、凝固反応形成の迅速な光度定量測定を可能にする。
【００７２】
仮に、２つ以上、好ましくは３つのサンプル検出領域がサンプル分配系に配置された場合、そのうちの１つである例えば６ａ１は、プロトロンビン時間または活性部分トロンボプラスチン時間を検出するために用いることができる。さらに、例えばサンプル検出領域６ａ２は、第２面４ａにおいて凝固阻害剤を用い、かつ第１面２ａにおいて凝固刺激剤を除くことによって、陰性対照を提供するための構成とすることができる。それによって、さらに例えばサンプル検出領域６ａ３は、例えばゲル化剤等の凝固促進剤を用いて、たとえ血液が凝固欠損症を有していたとしても、血液の凝固を模倣する陽性対照を提供するための構成とすることができる。このような測定装置によって、サンプルの測定結果を２つの基準と比較することができるため、明確な測定、または誤測定の発見を可能にする。
【００７３】
図９は、蛍光プローブおよび検出補助剤として、分子ローターを利用した凝固時間の予測および測定結果を示す概略図である。この図はまた、血液サンプル２７の測定シグナルを、凝血塊の十分な形成後に達成可能な最大蛍光の測定シグナルを示す陽性の基準２６と、不凝固血液サンプルにおいて最小の蛍光シグナルを示す陰性の基準２５と比較して示している。全血サンプルをサンプル導入領域９に導入した後、血液サンプル１５は、サンプル分配系によって形成される毛細現象によって、図３に示されるような異なるサンプル検出領域６ａ／６’ａに運ばれる。このサンプルは、サンプル検出領域６’ａ１に満たされた後、基底層２の第１層２ａに備えられる凝固刺激剤を溶かし、凝固反応を速やかにスタートさせる。導入された血液サンプルは測定装置の検出ユニットに留まることによって、検出装置は、凝固反応の時間分解された評価を行うことができる。
【００７４】
上述の通り、１つのサンプル検出領域、例えば６ａ２は、サンプル検出領域６ａ１における血液サンプルの測定シグナルと、凝固反応を示さない血液サンプルの測定シグナルとを比較するための手段を提供する陰性対照として構成されてもよい。このような構成は、サンプル検出領域６’ａ２に凝固刺激薬剤を塗布しないことか、またはサンプル検出領域６ａ２に凝固阻害剤を塗布することによって、実現させることができる。典型的な凝固阻害剤としては、リチウムヘパリン、およびナトリウム、特にエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が挙げられる。
【００７５】
一方、陽性対照は、凝固反応を促進すること、または異なる架橋結合剤により完全な凝血塊の粘度を模倣することによって実現されることができる。また陽性対照は、非病原性血液サンプルよりも早い反応時間を示すため、検出領域６ａ１における血液サンプルが凝固する前に、陽性の基準値まで達する。このような架橋結合は、第２層４の第２面４ａにおいて、適当な濃度のアルギン酸塩を備えることによって成すことができる。アルギン酸塩は血液と混ざり、かつ血液サンプル内のカルシウムイオン、および／または基底層の第１面に備えられたカルシウムイオンと反応することによって、それぞれ凝固したゲルになり始める。しかし、他のゲル化剤も同様にこの反応に有効に用いることは、当業者にとって自明である。
【００７６】
上記反応の間、測定装置のプロセスは、サンプル検出領域６ａ１のデータと、陰性の基準２５および陽性の基準２６とを比べてもよい。血液サンプルの測定シグナルがサンプル検出領域６ａ１によって与えられ、陽性の基準（図９の部材番号２９を参照）と等しい値に達するとすぐに、測定装置の処理ユニットはタイマーを止め、最終的な結果の値を求める。さらに、処理ユニットは、分析を正確にする検証のためにいくつか追加の性能検査を行ってもよく、それによって使用者または患者にとって意味のあるデータを提供することができる。この点において、処理ユニットは、陽性および陰性の基準の測定値を比較してもよい。陰性の基準の測定値は、プログラム化前の最小限値として、区別されることが必要である。仮に両方のシグナルの振幅が小さい場合、本装置は、測定が成功しなかったというエラーメッセージを出してもよい。さらに、本装置は、凝固反応の傾斜２７を計算し、それを再び、プログラム化前のいくつかの生理学的値と比較してもよい。なお、生理学的値は、臨床医学者によって観察された最極値を表す。
【００７７】
仮にサンプルの変化を吸光度によってモニタリングする場合光源として例えばハロゲンランプを用いて、サンプルの濁度をスペクトルの広範囲にわたってモニタリングする間、スペクトルの狭い範囲に対するモニタリングの時間枠を制限することが有用である。図１０は、５００ｎｍ〜７００ｎｍの全血のスペクトルを示す図である。一般的な特徴は、５２０ｎｍ〜６００ｎｍにおける、ヘモグロビンによる２つのピーク４０である。主に、凝固反応の処理は、与えられた全血のスペクトル範囲内のどこかの吸光度によって評価される。仮に、反応がヘモグロビンの吸光度範囲の波長外、すなわち４１によって示される６００ｎｍにてモニターされる場合、測定装置に対する技術上の要求は少ない。
【００７８】
図１１は、６００ｎｍにおける吸光度による凝固反応の典型的な評価を示す図である。血液がサンプル導入領域９を介して凝固検査要素に導入されると、光の透過率は急激に減少し、光の吸光度は、４２に示されるように、急激に増加する。次いで、基底層２の第１面２ａにおける検出領域６’ａ中に与えられた凝固製剤は溶かされ、凝固反応は、全血または血清のサンプルと組織因子（組織トロンボプラスチン）との反応によって開始される。この時をｔ＝０として定義し、処理ユニットは測定データの記録を始める事象４２および４３の間の期間は、反応の誘導期とされる。この期間に、試薬の十分な溶解、および血液または血漿との混合が行われる。組織トロンボプラスチンは外因性の経路における一連の凝固因子を誘発する。一連の活性化因子には、因子XII、因子Ｘ、因子Ｖ、因子IIが挙げられる。次々に起こる凝固の最後の段階は、フィブリノゲンがフィブリンへと変化する、現象４３と４４との間にモニターされる。多くの場合、フィブリン凝血塊は安定しておらず、安定期４４の後から低下が始まる。低下率および低下量は、凝血塊中のフィブリンファイバーの量に依存し、患者ごとによっても異なる。一般に、血液サンプルの粘度が低いときについて、血液サンプルの粘度が高くなると、上記低下は遅くなる。
【００７９】
一般的な測定結果および上記サンプルについてのプロトロンビン時間の結果は、現象４２−４３の間に示される時間ｔ１、および現象４３−４４の間に示される時間ｔ２から、次の一般式１によって計算される。
【００８０】
【数２】
2009506332.tif 000006
【００８１】
因子ａ，ｂは、時間ｔ１，ｔ２に比例値を与え、かつｆＰＴによって与えられるＰＴ値に対しての、通常異なる比例係数である。ｔ１は、主に組織因子の分解を左右する凝固製剤の不活性成分の種類によって影響を与えられ、ｔ２は、主に塗布された組織因子自体の活性とカルシウムイオンの濃度とによって、影響を与えられる。さらには、時間ｔ１，ｔ２の両方とも、反応温度によって変化するため、理想的な設定は約３７度である。それよりも低い温度の設定は、凝固時間を長引かせる。しかし、装置を手持ちサイズにする場合、通常、形態性、エネルギー消費、および実験室性能を鑑みた最適な解決法を見つけなければならない。
【００８２】
図１２は、本発明と共に用いるための計器８０を簡略化して示すブロック図である。計器８０は、例えばＭＡＸＱ２０００マイクロコントローラー（Dallas Semiconductor Corporation, 440１ South Beltwood Parkway, Dallas, Texas, USAから手に入る）のような処理ユニットの周囲に設計できる。処理ユニット８１は、以下の制御機能を果たす：（１）全ての装置の時間的調節；（２）光検出手段からのデータ処理；（３）測定データからのＰＴ時間の計算；および（４）ＰＴ時間またはＩＮＲ値の表示手段８３への出力。メモリー回路は、データ、および処理ユニットを実行するプログラムを蓄積することができる。表示装置８３は、例えば液晶またはＬＥＤディスプレイのような様々な形態をとることができる。計器８０は、スタート‐ストップスイッチも備え、仮に望むならば、サンプル導入や読み込みを行うことなどの指示を出力した時間を、聴力的または視覚的に提供することができる。
【００８３】
処理ユニット８１には、凝固測定装置である計器８０と連動するように、それを可能にするソフトウェアがプログラムされていてもよい。光源２０から照射された光は、光学装置２１を通過し、検出手段２３によって検出される。処理ユニット８１にプログラムされたソフトウェアはさらに、凝固時間を計算するためのアルゴリズムを含むことができる。なお、凝固時間は、異なるトロンボプラスチンから結果が得られた結果と、凝固解析とが同等になるように、ＰＴ値を規格化するための国際標準比として、１９８０年代中頃に制定された。この表現方法は、次のように表される。
【００８４】
【数３】
2009506332.tif 000007
【００８５】
上記式において、ＩＳＩは国際感受性指標、ＰＴ患者は患者の血液サンプルにおける凝固時間、およびＰＴ健常者は約２０人それぞれのＰＴ時間の平均を示す。ＩＳＩ値は、トロンボプラスチンの製造法によって異なる。
【００８６】
本発明に係る凝固検査要素１を用いた方法については、図１２に示される計器のブロック図を参照して理解することができる。使用者は、凝固検査要素１を計器８０の帯状片容器に挿入し、計器８０は、それ自身に統合されたスイッチを押すことによって自動的に作動する。要素１が正しい位置に配置されることを確実にするために、要素１の構造は、帯状片容器８２の構造にかみ合うように設計されている。このように要素を正しく配置することは、計器８０と帯状片１との複合体における処理を確実にするために、最も重要である。使用者がスイッチを押すことによって、計器８０は任意に作動することができる。それに応じて、使用者が指先穿刺を行い、全血を凝固検査装置１の導入領域９に注入する。
【００８７】
本発明に係る検査を実行するために必要とされる、血液の量は、１μＬである。疎水性表面において印刷された親水性物質は、生理液または水性の液体と高い可溶性を示すため、サンプル分配系の親水性経路を形成する高界面エネルギー領域は、陽性の毛細現象力を導入された生理的サンプルに対して発揮し、液体サンプルを分離した検出領域へと移動させる。したがって、生理学的サンプルは、各サンプル検出領域（６ａ〜６ｃ）へと分配され、そこで凝固刺激剤を活性化させる。
【００８８】
検出領域６ａ〜６ｃにおける薬剤が、凝固が行われるのを可能とするための凝固処理を補助するため、凝固検査時間が開始する。また、光学特性が凝固の起こるポイントを示すように処理される。
【００８９】
（凝固検査用素の製造方法）
本発明に係る凝固検査要素は、帯状片の形状で形成されることが好ましく、印刷、穴抜きおよび積層法における通常の周知技術によって、簡単に製造することができる。凝固検査要素の設計は、簡単かつ費用効率の高い製造工程を可能とするが、繰り返して使う必要はないことが好ましい。
【００９０】
製造方法の第１の工程では、サンプル分配系６のパターンは、基材の上に高界面エネルギー領域および低界面エネルギー領域を生成することによって形成される。第１の実施形態において、第１面２ａおよび第２面４ａにおけるサンプル経路６ａおよび検出領域６ａ，６ａ’を形成する高界面エネルギー領域は、基材の疎水性表面の上に親水性製剤が塗布されることによって、形成される。さらに述べれば、親水性表面に疎水性の「誘導素子」のパターンを塗布することによって、高界面エネルギー領域および低界面エネルギー領域を生成することもまた可能である。好ましくは、基材は、市販の透明高分子フィルムの性質である中間疎水性を有している。
【００９１】
サンプル分配系および検出領域の、高界面エネルギー領域および低界面エネルギー領域は、下記に記載の親水性経路の印刷によって生成され、疎水性誘導素子の親水性パターンによって囲われている。
【００９２】
基材は、ガラス、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルメタクリル樹脂、ポリジメチルシロキサン、ポリスチレン、ポリエステルおよびフルオレン環を含むポリエステル樹脂、ポリカーボネートおよびポリカーボネートポリスチレングラフト共重合体、末端修飾ポリカーボネート、ポリオレフィン、シクロオレフィンおよびシクロオレフィン共重合体、および／またはオレフィンマレイミド共重合体などの材料から形成されることが好ましい。
【００９３】
疎水性物質における親水性パターンの塗布、および／または親水性物質における疎水性「誘導要素」の塗布、またはそれらの組み合わせは、フレキソ印刷、リソグラフィー、グラビア印刷、墨塗法、またはインクジェット印刷によって、仕上げることができる。
【００９４】
しかしながら、製造方法は、輪転機において高解像度を可能とし、かつ高速生産を支援する、フレキソ印刷が好ましい。包装産業において広く用いられ、かつ高分子フィルム基材における印刷のための技術は、確立されている。図８ａおよび図８ｂに示される光学検出方法では、親水性パターンは、透明かつ光を透過するような低い濁度であることが必要である。低い濁度のインクは、約２〜４ミクロン程度に薄くされることが好ましい。インクの光学的な時間枠は、化学反応の光学検出のために、適した波長範囲にあることが望ましい。疎水性インクに対して要求されることは、疎水性であるということは別として、ほとんどなく、凝固検査要素はカラーで塗装される方がよい。したがって、この工程には、不透明なインクが好ましい。４色フレキソ印刷装置の操作は従来どおりであり、操作上の問題はない。リソグラフィーであっても同様である。
【００９５】
凝固検査要素の製造では、様々な製品の多様性を揃えた溶剤型インクの利用が最も簡便である。さらに、その利用可能な全てのインクは、添加物を追加することによって、細かく調整することができる。これらインクの多くは、ニトロセルロースエタノールまたはポリビニルブチラールエタノール混合物に基づいており、例えば、Sun Chemicals Inc.(35 Waterview Boulevard, Parsippany, NJ, USA)またはFlint Ink Inc.(4600 Arrowhead Drive, Ann Arbor, MI, USA)から手に入れることができる。
【００９６】
溶剤型または紫外線硬化インクは、凝固検査要素を製造するために適切ではあるが、電子線（ＥＢ）硬化インクの方が好ましい性質を有している。これらのインクは、構造的要因および化学的要因に対して高い抵抗性を備え、ポリマーを１００％含み、さらに色素を有する。しかし、化学センサーの感度に作用することが立証されている、揮発性有機溶剤および光開始剤ではない。動作特性における特長は、化共重合体のフィルムを形成、または表面へ浸透するための電子力に由来する。
【００９７】
ＥＢ硬化インクは、アクリルモノマーおよびアクリルオリゴマーの重合能力を利用する。アクリル化学は、今日のインクにおいて特別な意味を持っている（6J.T. Kunjappu. "The Emergence of Polyacrylates in Ink Chemistry." Ink World, February, １999, P.40.）。
【００９８】
最も簡素なアクリル化合物であるアクリル酸の構造は、化学式（Ｉ）に示される。
【００９９】
【化３】
2009506332.tif 000008
【０１００】
電子との相互作用によって、アクリルの一部にある二重結合が外れてフリーラジカルを生成し、他のモノマーと鎖を形成する結果、高分子量のポリマーが形成される。上述のように、放射線によって引き起こされる重合は、放射線自体がフリーラジカルを生成するため、外部の開始剤を必要としない。その結果、開始剤の類が被覆物中に残ることはない。
【０１０１】
例えば２−フェノキシエチルクリレートおよびイソオクチルアクリレート等の簡素なアクリレートから、ビスフェノールＡ、エポキシアクリル、およびポリエステル／ポリエーテルアクリレート等のプレポリマーまでの、様々なアクリルモノマーは、ＥＢ硬化に用いることができる（R. Golden. J. Coatings Technol., 69(１997), P.83）。この硬化技術は、他のインクに必要とされる、設計過程を複雑にする溶媒化学および硬化化学を必要とせずに、化学的および物理的な望ましい特徴に焦点を当てた“機能的なインク”の設計を可能にする。
【０１０２】
一般に、疎水性インクは、イソオクチルアクリレート、ドデシルアクリレート、スチレン誘導体、シリコン誘導体、一部フッ素化された炭素鎖系、およびその他、疎水化を行う添加剤および／または充填剤などの、疎水性機能を備えたモノマー、オリゴマー、およびプレポリマーを含むものが適切である。なお、上述添加剤および／または上記充填剤としては、例えば、TEGO Phobe Series （TEGO Chemie Service, Essen Germany）に属する疎水化試薬、銅フタロシアンなどの疎水性色素、炭素、グラファイト、または、ケイ素で修飾されたヒュームドシリカまたはＰＴＦＥパウダーおよびＰＴＦＥ粒などの、疎水性フィルターがある。添加剤、色素およびフィルターには多くの種類があるため、上記に提案された化合物は、典型的な性質を有するに過ぎない。
【０１０３】
親水性機能を備えたインクは、エタノール、水溶性ポリマー、水溶性ポリマーのポリマー混合物からなる広い選択肢から実現される。ポリマーおよびポリマー誘導体として、アルギン酸塩を基にした共重合体および化合物、セルロースおよびセルロースエステル、ヒドロキシエチルセルロース、ガム、アクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ビニルピロリドン、ポリスチレンスルホン酸、メチルビニルエーテル／マレイン酸重合体、ビニルピロリドン／トリメチルアンモニウム共重合体、およびアルキルホスホコリン誘導体が利用できる。さらには、有機修飾されたポリシロキサンの架橋体であり、かつフッ素化界面活性剤である有機修飾されたシリコンアクリレート誘導体が最適である。一般に被覆物は、標準水との接触角が３５°以下であり、かつ標準界面エネルギーが５０ｍＮ／ｍ以上であることが最適である。
【０１０４】
製造方法の第２の工程は、サンプル検出領域内に均一層を形成するために、印刷可能および／または投与可能なインクとして、凝固刺激剤およびその他の薬剤を含む凝固剤を塗布する工程を包含する。
【０１０５】
本実施形態においては、基底層２の第１面２ａにおけるトロンボプラスチンの量は、インクジェットプリントなどの適切な方法を用いて、正確に投与されることが好ましい。本発明の目的のために他の投与技術が利用できることは当業者に明らかである。
【０１０６】
上記と反対の面において対応する全サンプル検出領域には、アルギン酸塩または他の凝固促進剤、および、ＥＤＴＡまたは他の凝固抑制剤について適切な量を含む、定性制御剤が備えられることが必要である。なお、仮に検出方法のために検出補助物が必要と見込まれる場合には、定性制御剤は蛍光分子ローターも含む。
【０１０７】
濃度は個々に定められるため、所定のサンプル検出領域６’ａ１から６’ａ３に対して塗布される凝固刺激剤の総量は、多様に述べられた凝固検査要素の感度およびダイナミックレンジに関与する。同様に、塗布される定性制御化合物の濃度レベルおよび精度は、検査結果の精度に関与する。凝固検査要素に、上述の要素、化合物、および含有物の正確な用量を提供することは、塗布工程にとって重要なことである。このような正確な用量は、マイクロディスペンサシステム（例えばVermes Technik GmbH & Co. KG, Palnkamer Str. １8-２0, D-836２4 Otterfing, Germanyから入手可能）を用いて導入できる。液体サンプルの導入後、迅速かつ残留のない凝固を可能とするために、被覆製剤は、液体サンプル媒体に対して高溶解性に調合されていなければならない。
【０１０８】
次の工程は、サンプル分配系の第１面および第２面を備える、基底層および被覆層を中央層に積層する、積層処理を包含する。それにより、基底層の第１面と被覆層の第２面との間の距離が決定される。中央層は、基底層の第１面および被覆層の第２面上におけるサンプル分配系が形成された領域に、サンプル分配系のための空洞を形成する間隙を備える。基底層の第１面および被覆層の第２面上に生成された、高界面エネルギーおよび低界面エネルギーのパターンを、略同一に位置合わせすることによって、第１面および第２面の間にサンプル分配系を機能的に形成することができる。
【０１０９】
基底層および被覆層の、ＸＹ軸における正確な位置合わせは、要素の機能のための重大な課題となる。仮にこの位置あわせがされない場合、サンプル分配系は適切に機能せず、かつサンプルの規定量が大幅に変動してしまう。望ましい動作が実現されるためには、位置合わせの許容誤差が、親水性経路の幅について±５％以内に留まらなくてはならない。
【０１１０】
図１３は、凝固検査要素および位置合わせの精度による影響について示す俯瞰図（左）および断面図（右）である。図１３（ａ）の場合、サンプル分配系は、第１面２ａおよび第２面４ａの親水性経路が正常に配置されて、適切に製造されている。図１３（ｂ）は、凝固検査要素が不適切に配置された結果を示している。図１３（ａ）および図１３（ｂ）において、基底層２と被覆層４との間の空間は同一であるが、ｂの場合、液体サンプルがサンプル分配系の疎水性誘導素子の一部を覆うため、サンプル量は不当に増加される。このような作用は、最も好ましいエネルギー状態を得るために、空気にさらされる表面領域を最小化しようとする、凝固検査要素内の液体サンプルによって引き起こされる。したがって、この作用は、疎水性領域の作用に優先して起こる。
【０１１１】
図１３（ｃ）に示される他の実施形態においては、被覆層４のサンプル分配系は、基底層２のサンプル分配系よりも１０％小さく設計されている。凝固検査要素のサンプル総量は、基底層のサンプル分配系の広がりによって規定されるため、サンプルの必要量の精度を低下させることなく、製造中の位置合わせ工程において、大きな誤差を許容することができる。
【０１１２】
中央層の接着は、好ましくは８０ミクロンの厚さの両面接着テープ、または上記と等しい厚さのホットメルト接着剤で行われてもよい。親水性経路のサイズと比べて、基材における間隙は比較的大きいため、中央層の接着に対する条件は殆どない。位置合わせは、基材が最大で毎分数メートルから数十メートル処理される連続製造ラインでは、特に重要である。基材の拡張およびウェブ張力によって、Ｘ方向（ウェブ移動の方向）における位置合わせは、ウェブ移動と垂直なＹ方向よりも難しくなる。
【０１１３】
第１面および第２面のパターンの正確な位置合わせを提供する可逆性ポリマーフィルムの調整法は、連続ウェブ製造工程の一部を示す図１４に図示される。図１４による第１の製造工程では、基底層および被覆層のサンプル分配系６のパターンは、一方向へ長く延びた凝固検査要素の材料に相当する、１つのウェブ基材４９上に印刷される。図１４に示すように、印刷されるサンプル分配系６のパターンは、ウェブ基材４９上に２つのサンプル分配系が鏡面に対して互いに左右反対になるように配置される。さらに、サンプル分配系は、サンプル導入領域を形成する領域において接合されてもよい。したがって、所定の検出領域６ａ，６’ａの配置は、互いに相対的に配置され、基材の伸長およびウェブ張力によって影響を受けないままである。
【０１１４】
点線５０は、凝固検査要素を帯状片に分離するための切断予定線を示す。一方、点線５１は、帯状片の版下についての鏡面および、ウェブ基板の保持予定線を示す。
【０１１５】
凝固検査要の流体経路の印刷後、サンプル分配システムの検出領域６ａ，６’ａは望ましい構成に被覆される。例えば、ウェブ基材４９において、凝固検査要素の第２に面に相当する、上段の検出領域６ａは、定性制御構造を有して被覆される。定性制御構造のうちの一つ（例えば６’ａ１）は、凝固反応の制御を行うだけでなく促進を行い、かつ凝固解析の結果を決定付けるような活性化合物は含まない。そのため、ウェブ基材４９において、凝固検査要素の第１面に相当する、下段の検出領域６’ａは、凝固反応を開始するためのトロンボプラスチン組織を含む、凝固構造を有して被覆される。特別な場合には、トロンボプラスチン組織と異なる化合物をサンプル検出領域６’ａ上に被服し、他の凝固要素の機能性を決定するための異なる凝固経路を引き起こし、活性化させる。
【０１１６】
その後、図１４ｂに示されるように、凝固検査要素の中央層５２に相当する新たな層を、例えば基底層２の第２面などの、１つの表面上に被せる。中央層５２は、サンプル分配系６に空間的に接する貫通孔５を備える、両面テープまたはホットメルト接着剤から形成されてもよい。それによって、最終的な製造工程の後、凝固検査要素におけるサンプル分配系のための空洞が形成される。
【０１１７】
その後、本発明に係る凝固検査要素は、例えば、折りたたみ式のアイロンまたはその他の適切な道具の助けを持って、鏡面５１を境にした２つの側を折ることによって、製造される。図１４（ｃ）には、折りたたみ方法が示され、図１４（ｄ）には、重ねられた基材５３が示される。次いで、プレスローラーが、中央層と、基底層と、被覆層との間を、密着させる。
【０１１８】
最後に、重ねられたウェブ５３は、分離工程前にウェブ５３上に引かれ、かつ最終的に凝固検査帯状片となる適切な型を与える線５０によって、設計された構造形状に切断または打ち抜きされる。図１４に示される製造方法は、ウェブのＸ方向における一あわせがずれる危険なしに、基材の上部を下部に折り曲げることができ、かつ、単一のシート工程と比べて、サンプル分配系の形成される第１面と第２面とを正しく位置合わせを行うための、より簡単な方法とすることができる。
【０１１９】
当業者にとって、本実施形態における基底層と被覆層とは、発明の原理に影響を与えることなしに、交換可能であることは明白である。
【０１２０】
本発明は、凝固検査要素、および診療の場とする自宅または拠点に適した小さく簡単な携帯測定装置を構成する、血漿および全血サンプルの凝固特性を測定するための、検査系を提供する。凝固検査要素は、約０．５μＬという極少量のサンプル量を用いる、乾燥薬剤検査帯状片仕様に適した、定性統合制御系を提供する。本発明の凝固検査要素の製造方法は、要素の安価な製造を可能とする、単純な製造工程を少ない工程数のみ含む。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】本発明の一実施形態に係る凝固検査の要素である検査帯状片の形状を示す斜視図である。
【図２】図１に係る実施形態においるサンプル分布を詳しく示す斜視図である。
【図３】図１に係る装置を３層に分けて示す分解斜視図である。
【図４】第１および第２の表層と共にサンプル用空洞を形成する中層について、間隙の異なる形状を示す図である。
【図５】（ａ）は疎水性誘導要素によって構成されるサンプル分配系の検出領域を示す断面図であり、（ｂ）は疎水性経路を用いた、サンプル分配系の他の実施形態を示す断面図である。
【図６】他の実施形態に係る、経路が異なるパターンのサンプル分配系、および異なる展開方法に適した検出領域を示す図である。
【図７】（ａ）は、サンプルの吸光度における変化を評価するのに最適な配置である、発光体および検出器配置とともに、図５（ｂ）に係るサンプル分配系を示す断面図であり、（ｂ）は、サンプルに追加された分子ローターの蛍光信号における変化を評価するために構成された検出手段、または供給された液体サンプルの濁度を評価するために構成された検出手段とともに、図５（ｂ）に係るサンプル分配系を示す図である。
【図８】異なる分子ローターおよびそれらの分子構造を示す図である。
【図９】陽性対照および陰性対象における凝固の予測結果を示す略図である。
【図１０】５００〜７００ｎｍにおける全血の光学スペクトルを示す図である。
【図１１】６００ｎｍでモニターされた、Ｔｈｒｏｍｂｏｒｅｌ  Ｓ（登録商標）で誘発された血液凝固反応の過程を表すグラフである。
【図１２】本発明の方法に使用される計測器の例を示す簡単なブロック図である。
【図１３】検査要素のサンプル量によって、積層工程中の位置合わせの失敗の影響を示す図であり、かつ検査帯状片の質を妥協することなしに、基底層および被覆層の位置合わせのための高い許容誤差を可能とする他の実施形態の各断面図である。
【図１４】帯状片の形状と、凝固検査要素の製造工程とを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１４ｃ】
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【図１４ｄ】
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【国際調査報告】
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