(57)【要約】本発明は、血栓溶解活性を有するＡＤＡＭＴＳ１３を含む薬学的組成物、ならびに１つもしくは１つよりも多い血栓の形成および／または存在に関連する障害を処置または予防するための方法、ならびに１つもしくは１つよりも多い血栓の崩壊を必要とする患者において１つもしくは１つよりも多い血栓を崩壊する方法に関する。さらに、本発明は、１つもしくは１つよりも多い血栓の形成および／または存在に関連する障害を処置または予防するため、ならびに１つもしくは１つよりも多い血栓の崩壊を必要とする患者において１つもしくは１つよりも多い血栓を崩壊するための薬学的組成物の調製のための、薬学的有効量のＡＤＡＭＴＳ１３の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬学的有効量のＡＤＡＭＴＳ１３またはその生物学的に活性な誘導体を含む、血栓溶解活性を有する薬学的組成物。
【請求項２】
前記ＡＤＡＭＴＳ１３が、組換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３またはその生物学的に活性な誘導体である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記生物学的に活性な誘導体が、ＡＤＡＭＴＳ１３もしくはその生物学的に活性な誘導体とＩｇもしくはその生物学的に活性な誘導体とを含むキメラ分子である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
１種もしくは１種よりも多いさらなる活性成分をさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記さらなる活性成分が、抗トロンビン因子；ＡＤＡＭＴＳ１３産生／分泌を刺激する因子；ＡＤＡＭＴＳ１３分解を阻害する因子；ＡＤＡＭＴＳ１３活性を増大する因子；および循環からのＡＤＡＭＴＳ１３クリアランスを阻害する因子からなる群より選択される、請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記抗トロンビン因子が、抗血小板物質、ｔ−ＰＡ、アスピリンおよびヘパリンからなる群より選択される、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
患者に請求項１に記載の組成物を投与する工程を包含する、１つもしくは１つよりも多い血栓の形成および／または存在に関連する障害を処置または予防する方法。
【請求項８】
前記障害が、遺伝性血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、後天性ＴＴＰ、動脈血栓症、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、卒中、敗血症、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、および深静脈血栓症もしくは肺塞栓症のような静脈血栓症からなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
１つもしくは１つよりも多い血栓の崩壊を必要とする患者において１つもしくは１つよりも多い血栓を崩壊する方法であって、該患者に請求項１に記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項１０】
１つもしくは１つよりも多い血栓の形成および／または存在に関連する障害を処置または予防するための薬学的組成物の調製のための、薬学的有効量のＡＤＡＭＴＳ１３またはその生物学的に活性な誘導体の使用。
【請求項１１】
前記障害が、遺伝性血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、後天性ＴＴＰ、動脈血栓症、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、卒中、敗血症、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、および深静脈血栓症もしくは肺塞栓症のような静脈血栓症からなる群より選択される、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
１つもしくは１つよりも多い血栓の崩壊を必要とする患者において１つもしくは１つよりも多い血栓を崩壊するための薬学的組成物の調製のための、薬学的有効量のＡＤＡＭＴＳ１３またはその生物学的に活性な誘導体の使用。
【請求項１３】
前記ＡＤＡＭＴＳ１３またはその生物学的に活性な誘導体の薬学的有効量が、体重１ｋｇあたり０．１ｍｇ〜２０ｍｇの範囲である、請求項１０または１２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、血栓溶解活性を有するＡＤＡＭＴＳ１３の薬学的有効量を含む薬学的組成物、１つもしくは１つよりも多い血栓の形成および／または存在に関連する障害を処置または予防する方法、ならびに１つもしくは１つよりも多い血栓の崩壊を必要とする患者において１つもしくは１つよりも多い血栓を崩壊するための方法に関する。さらに、本発明は、１つもしくは１つよりも多い血栓の形成および／または存在に関連する障害を処置または予防するため、ならびに１つもしくは１つよりも多い血栓の崩壊を必要とする患者において１つもしくは１つよりも多い血栓を崩壊するための薬学的組成物の調製のための、薬学的有効量のＡＤＡＭＴＳ１３の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）は、種々の程度の組織虚血および梗塞を引き起こし得る血栓性細小血管症、血小板減少および微小血管血栓症によって特徴付けられる障害である。臨床的に、ＴＴＰ患者は、血小板減少、分裂赤血球（赤血球の断片）および乳酸デヒドロゲナーゼレベルの増加のような症状によって診断される（Ｍｏａｋｅ  ＪＬ．  Ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｍｉｃｒｏａｎｇｉｏｐａｔｈｉｅｓ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  ２００２;３４７：５８９−６００；  Ｍｏａｋｅ  ＪＬ．  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ，ＡＤＡＭＴＳ−１３，ａｎｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ．  Ｓｅｍｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ．  ２００４；４１：４−１４；  Ｓａｄｌｅｒ  ＪＥ，Ｍｏａｋｅ  ＪＬ，Ｍｉｙａｔａ  Ｔ，Ｇｅｏｒｇｅ  ＪＮ．  Ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ．  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ（Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｅｄｕｃ  Ｐｒｏｇｒａｍ）．  ２００４：４０７−４２３；  Ｓａｄｌｅｒ  ＪＥ．  Ｎｅｗ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｉｎ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ．  ２００５；５６：１７３−１９１）。１９８２年に、Ｍｏａｋｅらは、慢性再発性ＴＴＰを有する患者の血漿中に、異常に大きいフォン・ビルブラント因子（ＵＬ−ｖＷＦ）マルチマーを見出した（Ｍｏａｋｅ  ＪＬ，Ｒｕｄｙ  ＣＫ，Ｔｒｏｌｌ  ＪＨ，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ  ＭＪ，Ｃｏｌａｎｎｉｎｏ  ＮＭ，Ａｚｏｃａｒ  Ｊ，Ｓｅｄｅｒ  ＲＨ，Ｈｏｎｇ  ＳＬ，Ｄｅｙｋｉｎ  Ｄ．  Ｕｎｕｓｕａｌｌｙ  ｌａｒｇｅ  ｐｌａｓｍａ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ:ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｒｅｌａｐｓｉｎｇ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  １９８２；３０７:１４３２−１４３５）。ＵＬ−ｖＷＦとＴＴＰとの間の関連は、ＴＴＰに罹患する患者のほとんどがｖＷＦを切断する血漿メタロプロテアーゼが不足しているという、Ｆｕｒｌａｎら、およびＴｓａｉおよびＬｉａｎによる独立した知見によって支持を得た（Ｆｕｒｌａｎ  Ｍ，Ｒｏｂｌｅｓ  Ｒ，Ｓｏｌｅｎｔｈａｌｅｒ  Ｍ，Ｗａｓｓｍｅｒ  Ｍ，Ｓａｎｄｏｚ  Ｐ，Ｌａｅｍｍｌｅ  Ｂ．  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ−ｃｌｅａｖｉｎｇ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｒｅｌａｐｓｉｎｇ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ．  Ｂｌｏｏｄ．  １９９７;８９：３０９７−３１０３；  Ｔｓａｉ  ＨＭ，Ｓｕｓｓｍａｎ，ＩＩ，Ｇｉｎｓｂｕｒｇ  Ｄ，Ｌａｎｋｈｏｆ  Ｈ，Ｓｉｘｍａ  ＪＪ，Ｎａｇｅｌ  ＲＬ．  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｔｙｐｅ  ２Ａ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  ｍｕｔａｎｔｓ  Ｒ８３４Ｗ  ａｎｄ  Ｒ８３４Ｑ：ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ  ａｎｄ  ｂｙ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＶＰ−１．  Ｂｌｏｏｄ．  １９９７；８９：１９５４−１９６２；  Ｔｓａｉ  ＨＭ，Ｌｉａｎ  ＥＣ．  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ−ｃｌｅａｖｉｎｇ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  １９９８；３３９：１５８５−１５９４）。ＡＤＡＭＴＳファミリーに属し、ＡＤＡＭＴＳ１３（Ａ Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｌｉｋｅ  Ａｎｄ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ  ｗｉｔｈ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｒｅｐｅａｔｓ）と称されるプロテアーゼは、肝臓によって主に産生される１９０ｋＤａのグリコシル化タンパク質である（Ｌｅｖｙ  ＧＧ，Ｎｉｃｈｏｌｓ  ＷＣ，Ｌｉａｎ  ＥＣ，Ｆｏｒｏｕｄ  Ｔ，ＭｃＣｌｉｎｔｉｃｋ  ＪＮ，ＭｃＧｅｅ  ＢＭ，Ｙａｎｇ  ＡＹ，Ｓｉｅｍｉｅｎｉａｋ  ＤＲ，Ｓｔａｒｋ  ＫＲ，Ｇｒｕｐｐｏ  Ｒ，Ｓａｒｏｄｅ  Ｒ，Ｓｈｕｒｉｎ  ＳＢ，Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋａｒａｎ  Ｖ，Ｓｔａｂｌｅｒ  ＳＰ，Ｓａｂｉｏ  Ｈ，Ｂｏｕｈａｓｓｉｒａ  ＥＥ，Ｕｐｓｈａｗ  ＪＤ，Ｊｒ．，Ｇｉｎｓｂｕｒｇ  Ｄ，Ｔｓａｉ  ＨＭ．  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＤＡＭＴＳ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｃａｕｓｅ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ２００１；４１３：４８８−４９４；  Ｆｕｊｉｋａｗａ  Ｋ，Ｓｕｚｕｋｉ  Ｈ，ＭｃＭｕｌｌｅｎ  Ｂ，Ｃｈｕｎｇ  Ｄ．  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ−ｃｌｅａｖｉｎｇ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｎｅｗ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ．  Ｂｌｏｏｄ．  ２００１；９８：１６６２−１６６６；  Ｚｈｅｎｇ  Ｘ，Ｃｈｕｎｇ  Ｄ，Ｔａｋａｙａｍａ  ＴＫ，Ｍａｊｅｒｕｓ  ＥＭ，Ｓａｄｌｅｒ  ＪＥ，Ｆｕｊｉｋａｗａ  Ｋ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ−ｃｌｅａｖｉｎｇ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  （ＡＤＡＭＴＳ１３），ａ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００１；２７６：４１０５９−４１０６３；  Ｓｏｅｊｉｍａ  Ｋ，Ｍｉｍｕｒａ  Ｎ，Ｈｉｒａｓｈｉｍａ  Ｍ，Ｍａｅｄａ  Ｈ，Ｈａｍａｍｏｔｏ  Ｔ，Ｎａｋａｇａｋｉ  Ｔ，Ｎｏｚａｋｉ  Ｃ．  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ：ｐｏｓｓｉｂｌｙ，  ｔｈｅ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ−ｃｌｅａｖｉｎｇ  ｐｒｏｔｅａｓｅ？  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  （Ｔｏｋｙｏ）．  ２００１；１３０：４７５−４８０；  Ｇｅｒｒｉｔｓｅｎ  ＨＥ，Ｒｏｂｌｅｓ  Ｒ，Ｌａｍｍｌｅ  Ｂ，Ｆｕｒｌａｎ  Ｍ．  Ｐａｒｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ−ｃｌｅａｖｉｎｇ  ｐｒｏｔｅａｓｅ．  Ｂｌｏｏｄ．  ２００１；９８：１６５４−１６６１）。ＡＤＡＭＴＳ１３遺伝子における変異はＴＴＰを引き起こすことが示されている（Ｌｅｖｙ  ＧＧ，Ｎｉｃｈｏｌｓ  ＷＣ，Ｌｉａｎ  ＥＣ，Ｆｏｒｏｕｎｄ  Ｔ，ＭｃＣｌｉｎｔｉｃｋ  ＪＮ，ＭｃＧｅｅ  ＢＭ，Ｙａｎｇ  ＡＹ，Ｓｉｅｍｉｅｎｉａｋ  ＤＲ，Ｓｔａｒｋ  ＫＲ，Ｇｒｕｐｐｏ  Ｒ，Ｓａｒｏｄｅ  Ｒ，Ｓｈｕｒｉｎ  ＳＢ，Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋａｒａｎ  Ｖ，Ｓｔａｂｌｅｒ  ＳＰ，Ｓａｂｉｏ  Ｈ，Ｂｏｕｈａｓｓｉｒａ  ＥＥ，Ｕｐｓｈａｗ  ＪＤ，Ｊｒ．，Ｇｉｎｓｂｕｒｇ  Ｄ，Ｔｓａｉ  ＨＭ．  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＤＡＭＴＳ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｃａｕｓｅ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ  ｐｕｒｐｕｒａ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ２００１；４１３：４８８−４９４）。ＡＤＡＭＴＳ−１３活性を阻害する自己抗体によってしばしば引き起こされる特発性ＴＴＰは、成人およびより年長の小児に生じるより一般的な障害であり、患者の１１％〜３６％で定期的な間隔で再発し得る（Ｔｓａｉ  ＨＭ，ｌｉａｎ  ＥＣ．  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ−ｃｌｅａｖｉｎｇ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  １９９８；３３９：１５８５−１５９４；  Ｆｕｒｌａｎ  Ｍ，Ｌａｍｍｌｅ  Ｂ．  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ−ｃｌｅａｖｉｎｇ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎ  ｆａｍｉｌｉａｌ  ａｎｄ  ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ．  Ｂａｉｌｌｉｅｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．  １９９８；１１：５０９−５１４）。非中和自己抗体もまた、循環からのクリアランスを誘発することによってＡＤＡＭＴＳ活性を阻害し得る（Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒ  Ｆ，Ｋｎｏｂｌ  Ｐ，Ｔｒａｔｔｎｅｒ  Ｂ，Ｐｌａｉｍａｕｅｒ  Ｂ，Ｍｏｈｒ  Ｇ，Ｄｏｃｋａｌ  Ｍ，Ｄｏｒｎｅｒ  Ｆ，Ｒｉｅｇｅｒ  Ｍ．  Ｎｏｎｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ＩｇＭ  ａｎｄ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ−ｃｌｅａｖｉｎｇ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  （ＡＤＡＭＴＳ−１３）  ｉｎ  ａ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ．  Ｂｌｏｏｄ．  ２００３；１０２：３２４１−３２４３）。健常な成人における血漿ＡＤＡＭＴＳ１３活性は、５０％〜１７８％に及ぶ（Ｍｏａｋｅ  ＪＬ．  Ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  ｕｒｅｍｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．  Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ．  ２００２；１２６：１４３０−１４３３）。家族性ＴＴＰまたは後天性ＴＴＰを有するほとんどの患者において、血漿ＡＤＡＭＴＳ１３活性は存在しないか、または正常の５％未満である。処置しない場合死亡率は９０％を超えるが、血漿療法により死亡率は約２０％に減少されている（Ｍｏａｋｅ  ＪＬ．  ��ｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  ｕｒｅｍｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．  Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ．  ２００２；１２６：１４３０−１４３３）。
【０００３】
巨核球および内皮細胞で合成されたｖＷＦは、それぞれ、血小板α−顆粒およびヴァイベル−パラーデ体に、ウルトララージｖＷＦ（ＵＬ−ｖＷＦ）として蓄えられる。(５．  Ｍｏａｋｅ  ＪＬ，Ｒｕｄｙ  ＣＫ，Ｔｒｏｌｌ  ＪＨ，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ  ＭＪ，Ｃｏｌａｎｎｉｎｏ  ＮＭ，Ａｚｏｃａｒ  Ｊ，Ｓｅｄｅｒ  ＲＨ，Ｈｏｎｇ  ＳＬ，Ｄｅｙｋｉｎ  Ｄ．  Ｕｎｕｓｕａｌｌｙ  ｌａｒｇｅ  ｐｌａｓｍａ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ：  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｒｅｌａｐｓｉｎｇ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  １９８２；３０７：１４３２−１４３５；  Ｗａｇｎｅｒ  ＤＤ，Ｏｌｍｓｔｅｄ  ＪＢ，Ｍａｒｄｅｒ  ＶＪ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  Ｗｅｉｂｅｌ−Ｐａｌａｄｅ  ｂｏｄｉｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １９８２；９５：３５５−３６０；  Ｗａｇｎｅｒ  ＤＤ，Ｂｏｎｆａｎｔｉ  Ｒ．  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ．  Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒｏｃ．  １９９１；６６：６２１−６２７；  Ｓｐｏｒｎ  ＬＡ，Ｍａｒｄｅｒ  ＶＪ，Ｗａｇｎｅｒ  ＤＤ．  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｌｅａｓｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｗｅｉｂｅｌ−Ｐａｌａｄｅ  ｂｏｄｉｅｓ  ｂｉｎｄｓ  ｍｏｒｅ  ａｖｉｄｌｙ  ｔｏ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｔｈａｎ  ｔｈａｔ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ．  Ｂｌｏｏｄ．  １９８７；６９：１５３１−１５３４；  Ｔｓａｉ  ＨＭ，Ｎａｇｅｌ  ＲＬ，Ｈａｔｃｈｅｒ  ＶＢ，Ｓｕｓｓｍａｎ，ＩＩ．  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｈｉｇｈ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓ  ｃｏｎｖｅｒｔｅｄ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍａ  ｍｕｌｔｉｍｅｒ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｂｙ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  １９８９；１５８：９８０−９８５；  Ｔｓａｉ  ＨＭ，Ｎａｇｅｌ  ＲＬ，Ｈａｔｃｈｅｒ  ＶＢ，Ｓｕｓｓｍａｎ，ＩＩ．  Ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ．  Ｂｌｏｏｄ．  １９８９；７３：２０７４−２０７６）。一旦内皮細胞から分泌されると、これらのＵＬ−ｖＷＦマルチマーは、循環中でＡＤＡＭＴＳ１３によって、そのｖＷＦ分子内の特定の切断部位において一連のより小さいマルチマーに切断される（Ｔｓａｉ  ＨＭ，Ｎａｇｅｌ  ＲＬ，Ｈａｔｃｈｅｒ  ＶＢ，Ｓｕｓｓｍａｎ，ＩＩ．  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｈｉｇｈ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓ  ｃｏｎｖｅｒｔｅｄ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍａ  ｍｕｌｔｉｍｅｒ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｂｙ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．  Ｂｉｏ��ｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  １９８９；１５８：９８０−９８５；  Ｄｅｎｔ  ＪＡ，Ｇａｌｂｕｓｅｒａ  Ｍ，ｒｕｇｇｅｒｉ  ＺＭ．  Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ  ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔ  ｓｕｂｕｎｉｔ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  ｉｎｖｅｓｔ．  １９９１；８８：７７４−７８２；  Ｆｕｒｌａｎ  Ｍ，Ｒｏｂｌｅｓ  Ｒ，Ａｆｆｏｌｔｅｒ  Ｄ，Ｍｅｙｅｒ  Ｄ，Ｂａｉｌｌｏｄ  Ｐ，Ｌａｍｍｌｅ  Ｂ．  Ｔｒｉｐｌｅｔ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｆｌｅｃｔｓ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １９９３；９０：７５０３−７５０７）。プロテアーゼは、成熟ｖＷＦサブユニットのセントラルＡ２ドメインにおけるＴｙｒ８４２−Ｍｅｔ８４３結合において切断し、活性のために亜鉛またはカルシウムを必要とする（Ｄｅｎｔ  ＪＡ，ｂｅｒｋｏｗｉｔｚ  ＳＤ，Ｗａｒｅ  Ｊ，Ｋａｓｐｅｒ  ＣＫ，Ｒｕｇｇｅｒｉ  ＺＭ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅ  ｄｉｒｅｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩＡ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １９９０；８７：６３０６−６３１０）。ｖＷＦは、電子顕微鏡で確認すると「糸状の玉」およびフィラメント状の形状で存在している（Ｓｌａｙｔｅｒ  Ｈ，Ｌｏｓｃａｌｚｏ  Ｊ，Ｂｏｃｋｅｎｓｔｅｄｔ  Ｐ，Ｈａｎｄｉｎ  ＲＩ．  Ｎａｔｉｖｅ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ａｎｄ  ｑｕａｓｉ−ｅｌａｓｔｉｃ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  １９８５；２６０：８５５９−８５６３）。さらに、原子間力顕微鏡により、ｖＷＦが静的条件下では球形の立体構造で存在し、剪断応力への曝露後はアンフォールディングしたフィラメント状の状態で存在することが確認されている（Ｓｉｅｄｌｅｃｋｉ  ＣＡ，Ｌｅｓｔｉｎｉ  ＢＪ，Ｋｏｔｔｋｅ−Ｍａｒｃｈａｎｔ  ＫＫ，Ｅｐｐｅｌｌ  ＳＪ，Ｗｉｌｓｏｎ  ＤＬ，Ｍａｒｃｈａｎｔ  ＲＥ．  Ｓｈｅａｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｔｉｏｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ．  Ｂｌｏｏｄ．  １９９６；８８：２９３９−２９５０）。これは、ｖＷＦフィラメントの一端がある表面に固定される場合にインビボでも起こり得る。
【０００４】
ヴァイベル−パラーデ体に存在するＵＬ−ｖＷＦマルチマーは、活性化内皮細胞によって放出された場合、血漿ｖＷＦよりもより固く（ＧＰＩｂαを介して）血小板と結合する（２７．  Ａｒｙａ  Ｍ，Ａｎｖａｒｉ  Ｂ，Ｒｏｍｏ  ＧＭ，Ｃｒｕｚ  ＭＡ，Ｄｏｎｇ  ＪＦ，ＭｃＩｎｔｉｒｅ  ＬＶ，Ｍｏａｋｅ  ＪＬ，Ｌｏｐｅｚ  ＪＡ．  Ｕｌｔｒａｌａｒｇｅ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ  ｏｆ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒｍ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｈｉｇｈ−ｓｔｒｅｎｇｔｈ  ｂｏｎｄｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｂ−ＩＸ  ｃｏｍｐｌｅｘ；  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｔｗｅｅｚｅｒｓ．  Ｂｌｏｏｄ．  ２００２；９９：３９７１−３９７）。血小板が内皮表面上の放出されたＵＬ−ｖＷＦにビーズとして整列することが、インビトロで示された（Ｄｏｎｇ  ＪＦ，Ｍｏａｋｅ  ＪＬ，Ｎｏｌａｓｃｏ  Ｌ，Ｂｅｒｎａｒｄｏ  Ａ，Ａｒｃｅｎｅａｕｘ  Ｗ，Ｓｈｒｉｍｐｔｏｎ  ＣＮ，Ｓｃｈａｄｅ  ＡＪ，ＭｃＩｎｔｉｒｅ  ＬＶ，Ｆｕｊｉｋａｗａ  Ｋ，Ｌｏｐｅｚ  ＪＡ．  ＡＤＡＭＴＳ−１３  ｒａｐｉｄｌｙ  ｃｌｅａｖｅｓ  ｎｅｗｌｙ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｕｌｔｒａｌａｒｇｅ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｕｎｄｅｒ  ｆｌｏｗｉｎｇ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．  Ｂｌｏｏｄ．  ２００２；１００：４０３３−４０３９）。これらの分泌されたＵＬ−ｖＷＦマルチマーは、長い糸状の構造として細胞表面に固定される。次いで、これらのマルチマーは、ＡＤＡＭＴＳ１３が刺激された内皮細胞から分泌されるにつれて、ＡＤＡＭＴＳ１３によって切断される（Ｄｏｎｇ  ＪＦ，Ｍｏａｋｅ  ＪＬ，Ｂｅｒｎａｒｄｏ  Ａ，Ｆｕｊｉｋａｗａ  Ｋ，Ｂａｌｌ  Ｃ，Ｎｏｌａｓｃｏ  Ｌ，Ｌｏｐｅｚ  ＪＡ，Ｃｒｕｚ  ＭＡ．  ＡＤＡＭＴＳ−１３  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｕｌｔｒａ−ｌａｒｇｅ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００３；２７８：２９６３３−２９６３９）。
【０００５】
ＴＴＰ患者の血栓は、フィブリンはほとんどなく、主にｖＷＦおよび血小板からなり、血栓症の一因としてｖＷＦ介在性血小板凝集を示唆する（３０．  Ａｓａｄａ  Ｙ，Ｓｕｍｉｙｏｓｈｉ  Ａ，Ｈａｙａｓｈｉ  Ｔ，Ｓｕｚｕｍｉｙａ  Ｊ，Ｋａｋｅｔａｎｉ  Ｋ．  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｌｅｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ，  ｗｉｔｈ  ｓｐｅｃｉａｌ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｔｏ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｒｅｌａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ．  １９８５；３８：４６９−４７９）。再発するＴＴＰを有する患者は、その血漿中にウルトララージマルチマーを有する。そのＵＬ−ｖＷＦマルチマーは時間とともに蓄積する。なぜなら、インヒビター（抗ＡＤＡＭＴＳ１３Ａｂ）の存続がＡＤＡＭＴＳ１３活性を低下させるからである。ＵＬ−ｖＷＦマルチマーは過度に活性であり、血小板凝集を引き起こす剪断応力の結果としてアンフォールディングし、血管内血栓症を生じる（非特許文献１；非特許文献２）。
【０００６】
ＡＤＡＭＴＳ１３欠乏に起因する血漿中の過度に反応性のＵＬ−ｖＷＦマルチマーの存在が、冠状動脈性心疾患と関係する動脈血栓症の危険性の増大に関連し得ると考えられる。
【非特許文献１】Ｔｓａｉ  ＨＭ．  Ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ，  ＡＤＡＭＴＳ１３，  ａｎｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．  ２００２；８０：６３９−６４７
【非特許文献２】Ｔｓａｉ  ＨＭ．  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ＡＤＡＭＴＳ−１３  ｉｎ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ａｎｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ．  Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．  ２００３；１：２０３８−２０４０；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ２０４０−２０３５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、患者において特定の障害によって引き起こされる血栓を予防および／または処置し得る新規組成物を提供することに対して強い必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明の１つの目的は、血栓溶解活性を有する薬学的組成物を提供することである。その薬学的組成物は、薬学的有効量のＡＤＡＭＴＳ１３またはその生物学的に活性な誘導体を含み、そして必要に応じて、１種もしくは１種よりも多い薬学的に受容可能なキャリアおよび／または希釈剤を含む。上記組成物はまた、１種もしくは１種よりも多いさらなる活性成分を含み得る。さらに、本発明は、１つもしくは１つよりも多い血栓の形成および／または存在に関連する障害を処置または予防する方法、ならびに１つもしくは１つよりも多い血栓の崩壊を必要とする患者において１つもしくは１つよりも多い血栓を崩壊する方法に関する。１つもしくは１つよりも多い血栓の形成および／または存在に関連する障害の例は、遺伝性血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、後天性ＴＴＰ、動脈血栓症、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、卒中、敗血症、および播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）である。したがって、１つもしくは１つよりも多い血栓の形成および／または存在に関連する障害を処置または予防するため、ならびに１つもしくは１つよりも多い血栓の崩壊を必要とする患者において１つもしくは１つよりも多い血栓を崩壊するための薬学的組成物の調製において、薬学的有効量のＡＤＡＭＴＳ１３またはその生物学的に活性な誘導体が使用され得る。上記ＡＤＡＭＴＳ１３またはその生物学的に活性な誘導体の薬学的有効量は、例えば、体重１ｋｇあたり０．１ｍｇ〜２０ｍｇの範囲であり得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（発明の詳細な説明）
本発明の一局面は、血栓溶解活性を有する、薬学的有効量のＡＤＡＭＴＳ１３またはその生物学的に活性な誘導体を含む薬学的組成物に関する。
【００１０】
用語「血栓溶解活性」とは、本明細書で使用される場合、１つもしくは１つよりも多い血栓の崩壊を意味する。血栓溶解活性の決定のための適切な方法は当該分野で周知である。例えば、適切な方法は、ｔＰＡまたはストレプトキナーゼを用いる全血餅の溶解の決定、あるいはインビボでの血栓溶解の決定である。
【００１１】
用語「崩壊（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）」は、本明細書で使用される場合、血栓の部分的もしくは完全な崩壊（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）、溶解（ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇ）、溶解（ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ）、破壊（ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）および／または溶解（ｌｙｓｉｓ）を包含する。
【００１２】
用語「血栓」は、本明細書で使用される場合、血餅（特に、血小板含有血餅）、微小血栓（ｍｉｃｒｏｔｈｒｏｍｂｕｓ）、および／または塞栓を含む。上記血栓は、動脈もしくは静脈の血管に付着していても付着していなくてもよく、そして動脈もしくは静脈の血管中の血流を部分的もしくは完全にブロックし得る。
【００１３】
用語「生物学的に活性な誘導体」とは、本明細書で使用される場合、ＡＤＡＭＴＳ１３と実質的に同一の生物学的機能を有する任意のポリペプチドを意味する。生物学的に活性な誘導体のポリペプチド配列は、１つもしくは１つよりも多いアミノ酸の欠失、付加および／または置換を含み得、そのアミノ酸の非存在、存在および／または置換は、それぞれ、ポリペプチドの生物学的活性にいかなる実質的な負の影響を有さない。上記ポリペプチドの生物学的活性は、例えば、内皮への血小板付着の減少もしくは遅延、血小板凝集の減少もしくは遅延、血小板糸状物（ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｓｔｒｉｎｇ）の形成の減少もしくは遅延、血栓形成の減少もしくは遅延、血栓成長の減少もしくは遅延、脈管閉塞の減少もしくは遅延、ｖＷＦのタンパク質分解性切断、および／または血栓の崩壊によって測定され得る。
【００１４】
用語「ＡＤＡＭＴＳ１３」および「生物学的に活性な誘導体」は、それぞれ、組換えＤＮＡ技術によって得られるポリペプチドも包含する。組換えＡＤＡＭＴＳ１３（「ｒＡＤＡＭＴＳ１３」）（例えば、組換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３（「ｒ−ｈｕ−ＡＤＡＭＴＳ１３」））は、当該分野で公知の任意の方法によって生成され得る。１つの特定の例は、ＷＯ０２／４２４４１に開示されており、このＷＯ０２／４２４４１は、組換えＡＤＡＭＴＳ１３を生成する方法に関して参考として本明細書に援用される。これは、（ｉ）遺伝子操作による（例えば、ＲＮＡの逆転写および／またはＤＮＡの増幅による）組換えＤＮＡの生成、（ｉｉ）トランスフェクションによる（すなわち、エレクトロポレーションもしくはマイクロインジェクションによる）原核細胞もしくは真核細胞への組換えＤＮＡの導入、（ｉｉｉ）（例えば、連続様式もしくは回分式の様式での）上記転換された細胞の培養、（ｉｖ）（例えば、構成的もしくは誘導時の）ＡＤＡＭＴＳ１３の発現、ならびに（ｖ）（例えば、培養培地からの、または転換された細胞を収集することによる）上記ＡＤＡＭＴＳ１３の単離を、（ｖｉ）（例えば、アニオン交換クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーによって）実質的に精製された組換えＡＤＡＭＴＳ１３を得る、ために行うことについて、当該分野で公知の任意の方法を含み得る。用語「生物学的に活性な誘導体」はまた、キメラ分子（例えば、生物学的／薬理学的特性（例えば、哺乳動物（特に、ヒト）の循環系におけるＡＤＡＭＴＳ１３の半減期）を改良するために、Ｉｇと組み合わせたＡＤＡＭＴＳ１３（もしくはその生物学的に活性な誘導体））も包含する。Ｉｇはまた、必要に応じて変異されたＦｃレセプターに対する結合部位も有し得る。
【００１５】
上記ｒＡＤＡＭＴＳ１３は、薬理学的に有効なＡＤＡＭＴＳ１３分子を生成することによって特徴付けられる適切な原核生物もしくは真核生物宿主系での発現によって生成され得る。真核細胞の例は、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＳＫ−Ｈｅｐ、およびＨｅｐＧ２）である。本発明に従ってＡＤＡＭＴＳ１３を生成または単離するために使用される試薬または条件に対する特定の制限はなく、当該分野で公知の、または市販の任意の系が利用され得る。本発明の一実施形態では、ｒＡＤＡＭＴＳ１３は、当該分野の状態において記載されるような方法によって得られる。
【００１６】
広範なベクターが、ｒＡＤＡＭＴＳ１３の調製のために使用され得、真核生物発現ベクターおよび原核生物発現ベクターから選択され得る。原核生物発現のためのベクターの例としては、ｐＲＳＥＴ、ｐＥＴ、ｐＢＡＤなどのようなプラスミドが挙げられ、ここで、原核生物発現で使用されるプロモーターとしては、ｌａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ａｒａＢＡＤなどが挙げられる。真核生物発現のためのベクターの例としては、（ｉ）酵母での発現用として、ＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＧＡＬ１、ＡＵＧ１などのようなプロモーターを用いるｐＡＯ、ｐＰＩＣ、ｐＹＥＳ、ｐＭＥＴのようなベクター；（ｉｉ）昆虫細胞での発現用として、ＰＨ、ｐ１０、ＭＴ、Ａｃ５、ＯｐＩＥ２、ｇｐ６４、ｐｏｌｈなどのようなプロモーターを用いるｐＭＴ、ｐＡｃ５、ｐＩＢ、ｐＭＩＢ、ｐＢＡＣなどのようなベクター；ならびに（ｉｉｉ）哺乳動物細胞での発現用として、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ−１、ＵｂＣ、ＲＳＶ、ＡＤＶ、ＢＰＶおよびβ−アクチンのようなプロモーターを用いるｐＳＶＬ、ｐＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＢＰＶなどのようなベクター、およびウイルス系（例えば、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスなど）に由来するベクターが挙げられる。
【００１７】
必要に応じて、本発明の薬学的組成物はまた、１種もしくは１種よりも多い薬学的に受容可能なキャリアおよび／または希釈剤を含む。
【００１８】
本発明の薬学的組成物はまた、１種もしくは１種よりも多いさらなる活性成分（例えば、抗トロンビン因子、処置された患者／個体によるＡＤＡＭＴＳ１３産生／分泌を刺激する因子、ＡＤＡＭＴＳ１３分解を阻害し、それゆえその半減期を延長する因子、（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３に結合し、それによって活性化立体構造変化を誘発することによって）ＡＤＡＭＴＳ１３活性を増大する因子、または循環からのＡＤＡＭＴＳ１３クリアランスを阻害し、それによってその血漿濃度を増加させる因子）を含み得る。抗トロンビン因子の例としては、抗血小板物質、ｔ−ＰＡ、アスピリンおよびヘパリンが挙げられる。
【００１９】
本発明はさらに、１つもしくは１つよりも多い血栓の形成および／または存在に関連する障害を処置または予防する方法に関し、この方法は、患者に本発明による組成物を投与する工程を包含する。上記障害は、遺伝性欠損症、炎症性疾患、卒中または敗血症性状態に起因し得る。１つもしくは１つよりも多い血栓の形成および／または存在に関連する障害の例は、遺伝性血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、後天性ＴＴＰ、動脈血栓症、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、卒中、敗血症、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、および深静脈血栓症もしくは肺塞栓症のような静脈血栓症である。
【００２０】
本発明の別の局面は、１つもしくは１つよりも多い血栓の崩壊を必要とする患者において１つもしくは１つよりも多い血栓を崩壊する方法に関し、この方法は、その患者に本発明による組成物を投与する工程を包含する。
【００２１】
本発明の組成物の投与経路は特定の制限を示さず、例えば、皮下または静脈内であり得る。用語「患者」は、本明細書で使用される場合、哺乳動物（特に、ヒト）を包含する。
【００２２】
さらに本発明は、１つもしくは１つよりも多い血栓の形成および／または存在に関連する障害を処置または予防するための薬学的組成物の調製における、薬学的有効量のＡＤＡＭＴＳ１３またはその生物学的に活性な誘導体の使用に関する。
【００２３】
本発明の別の局面は、１つもしくは１つよりも多い血栓の崩壊を必要とする患者において１つもしくは１つよりも多い血栓を崩壊するための薬学的組成物の調製のための、薬学的有効量のＡＤＡＭＴＳ１３またはその生物学的に活性な誘導体の使用である。
【００２４】
上記ＡＤＡＭＴＳ１３またはその生物学的に活性な誘導体の薬学的有効量は、例えば、体重１ｋｇあたり０．１ｍｇ〜２０ｍｇの範囲であり得る。
【００２５】
本発明は、以下の実施例においてさらに例示される。以下の実施例は、本発明に対するいかなる制限でもない。
【実施例】
【００２６】
（実施例１：Ａｄａｍｔｓ１３−／−マウスの微小細静脈中の血栓形成を生じる内皮活性化）
Ａｄａｍｔｓ１３−／−マウスにおいて、低いせん断速度（約１００Ｓ−１）でのカルシウムイオノフォアＡ２３１８７（Ｗｅｉｂｅｌ−Ｐａｌａｄｅ体Ｐａｌａｄｅ）で活性化された細静脈（２００〜２５０μｍ）中のより多くの粘着／転位が、ＷＴと比較して観察された。Ａ２３１８７による微小細静脈内皮の活性化が、血栓形成を生じる血小板凝集を生じ得るか否かを調査した。Ａ２３１８７は、内皮を剥がない（Ａｎｄｒｅ  Ｐ、Ｄｅｎｉｓ  ＣＶ、Ｗａｒｅ  Ｊ、Ｓａｆｆａｒｉｐｏｕｒ  Ｓ、Ｈｙｎｅｓ  ＲＯ、Ｒｕｇｇｅｒｉ  ＺＭ、Ｗａｇｎｅｒ  ＤＤ。血小板は、刺激された静脈で内皮によって提示されるｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子に付着し、そしてその上を転位する。Ｂｌｏｏｄ．２０００；９６：３３２２〜３３２８）。調査されたせん断速度（２００〜２５０ｓ−１）およびすべての細静脈の直径は、Ａｄａｍｔｓ１３−／−マウスおよびＷＴマウスで同様であった（表１）。Ａｄａｍｔｓ１３−／−マウスの微小細静脈では、Ａ２３１８７の局所灌流後４５秒〜１分で、血栓形成を生じる血小板凝集が観察された（図１）。この血栓は、不安定で、そして血流中に流され、頻繁な塞栓に至り、下流の閉塞を生じた。しかし、この閉塞はほんの３〜４秒継続し、そして細静脈は、その後再び開いた。血栓形成は、Ａ２３１８７灌流後２分で刺激の部位ではもはや観察されなかった。同一に処理されたＷＴマウスでは、血小板のストリングおよび非常に小さな血小板凝集が１秒間内皮に付着して観察できたが、これは、血栓形成を生じなかった。Ａｄａｍｔｓ１３−／−マウスまたはＷＴ中の細静脈と平行して走る細動脈は、任意の血小板凝集または血栓形成を示さなかった。細動脈中では血小板のストリングは観察されなかった。これらの観察は、ＡＤＡＭＴＳ１３が血小板凝集を阻害し、そしてそれ故、微小細静脈中の血栓形成を防ぐことを示す。
【００２７】
（実施例２：ＡＤＡＭＴＳ１３に対する抗体は、ＷＴマウスの細静脈中で血小板ストリングの形成を誘導する）
先の研究は、ＴＴＰの獲得形態を患う大部分の患者が、ＡＤＡＭＴＳ１３に対する自己免疫インヒビターを有することを示した（Ｔｓａｉ  ＨＭ、Ｌｉａｎ  ＥＣ。急性血栓特発性血小板減少性紫斑病におけるｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子切断性プロテアーゼに対する抗体。Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．１９９８；３３９：１５８５〜１５９４；Ｆｕｒｌａｎ  Ｍ、Ｒｏｂｌｅｓ  Ｒ、Ｇａｌｂｕｓｅｒａ  Ｍ、Ｒｅｍｕｚｚｉ  Ｇ、Ｋｙｒｌｅ  ＰＡ、Ｂｒｅｎｎｅｒ  Ｂ、Ｋｒａｕｓｅ  Ｍ、Ｓｃｈａｒｒｅｒ  Ｉ、Ａｕｍａｎｎ  Ｖ、Ｍｉｔｔｅｒ  Ｕ、Ｓｏｌｅｎｔｈａｌｅｒ  Ｍ、Ｌａｍｍｌｅ  Ｂ。血栓特発性血小板減少性紫斑病および溶血性−尿毒症症候群におけるｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子切断性プロテアーゼ。Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．１９９８；３３９：１５７８〜１５８４）。（ＰＢＳ中に溶解された）ポリクローナル抗−ヒトＡＤＡＭＴＳ１３  Ａｂは、手術の２時間前にＷＴ中に注入された。コントロールマウス（ＰＢＳを注入）および抗ＡＤＡＭＴＳ１３  Ａｂを注入されたマウスの両方のＡ２３１８７の局所灌流の後、多くの血小板が、内皮上に粘着／転位し、４５秒〜１分の間の血小板接着のピークに到達し、これは、時間とともに漸次減少した。しかし、より多くの血小板粘着が、コントロールと比較したとき、Ａｂ−注入ＷＴでＡ２３１８７適用後４分で観察された（図２Ａ）。観察されたこの現象は、Ａｄａｍｔｓ１３−／−と同様であった。２０〜４０μｍから変動する血小板のストリングが、内皮の１つの端部に付着し、そして血流中の波動が観察された。血小板のストリングは、ＰＢＳまたはコントロールＩｇを注入したマウスで観察されなかったか、または非常に短く残ったか（２秒未満）のいずれかであった。阻害抗体で処置された、高められたｖＷＦレベルによりマークされる遺伝的バックグラウンド上のＷＴマウス（ＣＡＳＡ／Ｐｋ）では、血小板のストリングは、なおより長く（３０〜６０μｍで変動）、これらは主にｖＷＦポリマーによって形成されたことを示した。（いく匹のマウスでは、これらの血小板ストリングは、１０秒まで内皮に係留し（図２Ｂ）、そして次に流された。）
（実施例３：ＡＤＡＭＴＳ１３インヒビターは、ＷＴマウス中の微小細静脈において血栓形成を生じる）
手術準備前２時間に抗−ヒトＡＤＡＭＴＳ１３−Ａｂを注入されたＷＴマウスでは、６匹のマウスのうち４匹でＡ２３１８７の局所灌流後４５秒〜１分で血管壁上に微小血栓が形成された（図３）。この微小血栓の外観は、Ａｄａｍｔｓ１３−／−マウスで観察されたの（図１）と同様であった。次いで、阻害抗体を、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド上のＷＴマウス中に注入した。５匹のマウスのうち３匹で微小血栓が形成された。コントロールＷＴマウスでは、微細な血小板凝集が内皮に接着して観察され得たが、血栓形成を生じなかった（ｎ＝３）。
【００２８】
（実施例４：ヒスタミンは、Ａｄａｍｔｓ１３−／−マウスの細静脈中で血小板ストリングを誘導するが、その一方、組み換えＡＤＡＭＴＳ１３は、その形成を阻害する）
炎症の間に産生されるヒスタミンは、Ｗｅｉｂｅｌ−Ｐａｌａｄｅ体の分泌促進剤であり、そして内皮を刺激する。内因性血小板は、手術の前にＲｈｏｄａｍｉｎｅ  ６Ｇを注入することにより標識された。１ｍＭ（２００μｌ）のヒスタミンを、Ａｄａｍｔｓ１３−／−マウス（ｎ＝５）およびＷＴマウス（ｎ＝５）中に手術準備の前１５分にｉ．ｐ．注入し、そして約１００−Ｓのせん断速度での細静脈を可視化した。ＷＴでは、血小板のストリングは観察されなかったか、または非常に短く存在し（５秒未満、図４Ａ）、その一方、Ａｄａｍｔｓ１３−／−マウスでは、２０〜１００μｍで変動する血小板ストリングが、約１分間内皮に係留されて観察された（図４Ｂ）。いく匹かのマウスでは、いくつかのストリングが癒着して見え、後に血流中に放出された凝集を形成した（図４Ｃ）。組み換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３（ｒ−ｈｕＡＤＡＭＴＳ１３）のＡｄａｍｔｓ１３−／−マウス中の注入（ｎ＝４、マウスあたり３細静脈）は、調べたすべての１２の細静脈で血小板ストリングを阻害し（図４Ｄ）、それ故、低せん断力におけるＡＤＡＭＴＳ１３の活性を示した。
【００２９】
（実施例５：内皮下層への血小板結合は、Ａｄａｍｔｓ１３−／−マウスで増加する）
塩化鉄（ＩＩＩ）損傷は、内皮剥離に至り、そして内皮下層を剥き出す（Ｎｉ  Ｈ、Ｄｅｎｉｓ  ＣＶ、Ｓｕｂｂａｒａｏ  Ｓ、Ｄｅｇｅｎ  ＪＬ、Ｓａｔｏ  ＴＮ、Ｈｙｎｅｓ  ＲＯ、Ｗａｇｎｅｒ  ＤＤ。ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子およびフィプリノーゲンの両方を欠くマウスの細動脈中の血小板血栓形成の持続。Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０００；１０６：３８５〜３９２）。動脈せん断での損傷後、血小板内皮下層相互作用は、ＧＰＩｂ−ｖＷＦ相互作用によって開始され、そして次にその他のレセプターによって伝播される（Ｎｉ  Ｈ、Ｄｅｎｉｓ  ＣＶ、Ｓｕｂｂａｒａｏ  Ｓ、Ｄｅｇｅｎ  ＪＬ、Ｓａｔｏ  ＴＮ、Ｈｙｎｅｓ  ＲＯ、Ｗａｇｎｅｒ  ＤＯ。ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子およびフィブリノーゲンの両方を欠くマウスの細動脈中の血小板血栓形成の持続。Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０００；１０６：３８５〜３９２）。ＷＴマウスおよびＡｄａｍｔｓ１３−／−マウスの両方において、血小板−血管壁相互作用は、細動脈への塩化鉄（ＩＩＩ）の付与後迅速に開始した。損傷後、１００以上の血小板が２〜３分で堆積された動物の数は、Ａｄａｍｔｓ１３−／−マウスでより高かった（図５Ａ）。Ａｄａｍｔｓ１３−／−では、１２匹のマウスのうち７匹が、ＷＴマウスでは１０匹のうちの３匹と比較して、血管壁上に堆積された１００を超える血小板を示した。これらの結果は、統計学的に有意であった（Ｐ＜０．０５、図５Ａ）。
【００３０】
（実施例６：Ａｄａｍｔｓ１３−／−マウスの損傷細動脈中の加速された血栓形成）
血漿中に存在するｖＷＦは、内皮細胞によって構成的に合成されるか、または活性化に際し、血小板α−顆粒および内皮Ｗｅｉｂｅｌ−Ｐａｌａｄｅ体から通常でない大きさのマルチマーの形態で分泌されるかのいずれかである。ＵＬ−ｖＷＦは、ｖＷＦの最も粘着性で、かつ活性な形態であり、そして血小板凝集に至り得、ＡＤＡＭＴＳ１３によってプロセッシングされなければ血栓を生じる。Ａｄａｍｔｓ１３−／−マウスにおける塩化鉄血栓形成モデルでは、血栓は、より速く成長した。なぜなら、３０μｍより大きい血栓が、ＷＴマウスにおける１０．７８±０．８０分と比較して、６．６４±０．９３分で観察され、そしてこれらの結果は、統計的に有意であったからである（Ｐ＜０．００５、図５Ｂ）。この血栓は、Ａｄａｍｔｓ１３−／−マウスで１０．５６±０．７２分で閉塞サイズまで成長し、その一方、ＷＴでは、なお、血管は、開放されたままであった（Ｐ＜０．０００５、図５Ｃおよび５Ｄ）。ＷＴでは、平均の血管閉塞時間は、損傷後、１６．６９±１．２５であった（Ｐ＜０．０００５）。すべの血管は、損傷の部位で閉塞した。研究された細動脈のせん断速度および直径は、Ａｄａｍｔｓ１３−／−マウスおよびＷＴマウスについて同様であった（表２）。注目すべきことに、Ａｄａｍｔｓ１３−／−マウスの細動脈では、血栓（＞３０μｍ）の形成のための平均時間および平均閉塞時間は、任意の個々のＷＴマウスについてより少なかった（図５Ｂおよび５Ｃ）。１０匹のＡｄａｍｔｓ１３−／−マウスのうち４匹（４０％）で血栓（＞３０μｍ）が形成され、その一方、ＷＴマウスにおいては１１匹のうち２匹（１８．２％）が塞栓形成を示したことが観察された。従って、Ａｄａｍｔｓ１３−／−血栓は、ＷＴよりわずかにわずかに不安定であるように見えた。Ａｄａｍｔｓ１３−／−マウス中で観察された塞栓形成は、下流閉塞には至らなかった。
【００３１】
（実施例７：ＡＤＡＭＴＳ１３−欠損は、αＩＩｂβ３インテグリン−依存様式で血栓成長を増大する）
インビトロフローチャンバー研究を、αＩＩｂβ３に対するブロッキング抗体（ＪＯＮ／Ａ）（Ｂｅｒｇｍｅｉｅｒ  Ｗ、Ｓｃｈｕｌｔｅ  Ｖ、Ｂｒｏｃｋｈｏｆｆ  Ｇ、Ｂｉｅｒ  Ｕ、Ｚｉｒｎｇｉｂｌ  Ｈ、Ｎｉｅｓｗａｎｄｔ  Ｂ。新規モノクローナル抗体での活性化マウスインテグリンαＩＩｂβ３のフローサイトメトリー検出。Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ２００２；４８：８０〜８６）の存在下または不在下で全血を用いて実施した。血栓のサイズを定量するために、蛍光標識された血小板によって覆われた表面領域を決定した。Ａｄａｍｔｓ１３−／−血液は、１５００ｓ−１のせん断速度で２分間コラーゲン上で灌流したとき、ＷＴより有意に大きい血栓を形成し（４４．６６±３．６３％対２０．２２±３．８８％、Ｐ＜０．０００５）、血栓生長を制限することにおけるＡＤＡＭＴＳ１３の鍵となる役割を再び示した。αＩＩｂβ３に対するブロッキング抗体の存在下では、単一の血小板のみがコラーゲン表面に接着し、そして血栓形成は、ＷＴおよびＡｄａｍｔｓ１３−／−マウス血液両方で完全に阻害された（３．０１±０．９７％対２．８２±０．３９％、Ｐ＞０．０５）。さらに、ＡＤＡＭＴＳ１３阻害性抗体のβ３インテグリン−欠損マウス（Ｈｏｄｉｖａｌａ−Ｄｉｌｋｅ  ＫＭ、ＭｃＨｕｇｈ  ＫＰ、Ｔｓａｋｉｒｉｓ  ＤＡ、Ｒａｙｂｕｒｎ  Ｈ、Ｃｒｏｗｌｅｙ  Ｄ、Ｕｌｌｍａｎ−Ｃｕｌｌｅｒｅ  Ｍ、Ｒｏｓｓ  ＦＰ、Ｃｏｌｌｅｒ  ＢＳ、Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍ  Ｓ、Ｈｙｎｅｓ  ＲＯ。β３−インテグリン−欠損マウスは、胎盤欠陥および減少した生存を示すグランツマン血小板無力症のモデルである）中への注入が、塩化物注入損傷の後に血栓形成を誘導し得るか否かを試験した。β３−／−マウスの損傷した細動脈（３匹のマウスが評価された）では、抗ＡＤＡＭＴＳ１３の存在にかかわらず血栓は検出できなかった（示されず）。これらの結果を一緒に考慮して、上記の動脈せん断速度では、超特大ｖＷＦがαＩＩｂβ３依存様式で血栓生長を増大することを示す。
【００３２】
（実施例８：Ａｄａｍｔｓ１３−／−マウスまたはＷＴマウス中の組み換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３の注入は、血小板凝集または血栓を不安定化することにより血栓生長を阻害する）
組み換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３（ｒ−ｈｕ  ＡＤＡＭＴＳ１３）によるｖＷＦサブユニットのタンパク質分解フラグメントへの切断がインビトロで示された（Ｐｌａｉｍａｕｅｒ  Ｂ、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  Ｋ、Ｖｏｌｋｅｌ  Ｄ、Ａｎｔｏｉｎｅ  Ｇ、Ｋｅｒｓｃｈｂａｕｍｅｒ  Ｒ、Ｊｅｎａｂ  Ｐ、Ｆｕｒｉａｎ  Ｍ、Ｇｅｒｒｉｔｓｅｎ  Ｈ、Ｌａｍｍｉｅ  Ｂ、Ｓｃｈｗａｒｚ  ＨＰ、Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒ  Ｆ．ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子−切断性プロテアーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）のクローニング、発現、および機能的特徴付け。Ｂｌｏｏｄ．２００２；１００：３６２６〜３６３２）。ｒ−ｈｕ  ＡＤＡＭＴＳ１３は、遺伝性ＴＴＰ血漿におけるｖＷＦ切断欠陥を矯正することが示された（Ａｎｔｏｉｎｅ  Ｇ、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  Ｋ、Ｐｌａｉｍａｕｅｒ  Ｂ、Ｇｒｉｌｌｏｗｉｔｚｅｒ  Ｍ、Ｓｔｕｄｔ  ＪＤ、Ｌａｅｍｍｉｅ  Ｂ、Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒ  Ｆ．構成的血栓性血小板減少性紫斑病をもつ２人の兄弟におけるＡＤＡＭＴＳ１３遺伝子欠陥。Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  ２００３；１２０：８２１〜８２４）。Ａｄａｍｔｓ１３−／−マウスにおける血栓の加速生長が観察されたので、ＡＤＡＭＴＳ１３が血栓生長を負に調節し、そしてそれ故、Ａｄａｍｔｓ１３−／−マウスにおけるｒ−ｈｕ  ＡＤＡＭＴＳ１３注入は、血栓形成を遅延し得ると仮定された。循環性ヒトタンパク質の濃度は、Ａｄａｍｔｓ１３−／−マウス中へのｒ−ｈｕ  ＡＤＡＭＴＳ１３の注入１７分後にはほぼ８．８Ｕ／ｍｌそして注入５３分後には１．１Ｕ／ｍｌであった。これらの時間は、ほぼ塩化鉄損傷の開始、および実験の終了に対応する。ｒ−ｈｕ  ＡＤＡＭＴＳ１３を注入したＡｄａｍｔｓ１３−／−マウスの１３匹のうち５匹において、損傷した細動脈は、実験が終了したときである４０分まで閉塞しなかった（図７Ａ）。注入されたｒ−ｈｕ  ＡＤＡＭＴＳ１３の効果は、ＷＴマウス中の内因性ＡＤＡＭＴＳ１３のそれよりも大きかった。なぜなら、この損傷モデルでは、すべてのＷＴの血管は、２４分未満で閉塞したからである（図５Ｃ）。平均閉塞時間は、緩衝液を注入したコントロールマウスと比較して有意に延長された（Ｐ＜０．０００５）。その細動脈が閉塞しなかったすべてのマウスにおいて、血栓は形成されたが、不安定で崩壊した（図７Ｃ）。血栓形成および崩壊のこの現象は、観察の全期間に間存在した。ＷＴマウス（Ｃ５７ＢＩ／６Ｊ）中の損傷前のｒ−ｈｕ  ＡＤＡＭＴＳ１３の注入は、閉塞時間における有意な遅延を引き起こし、細動脈の半分が４０分までに閉塞せず、その一方、ビヒクルを注入したＷＴマウスのすべての細動脈は１５分までに閉塞された（図７Ｂ、Ｐ＜０．００８）。従って、ＡＤＡＭＴＳ１３は、通常レベルの内因性ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をもつＷＴマウスにおいてさえ、有意な抗血栓能力を有するようである。
【００３３】
（実施例９：組み換えマウスＡＤＡＭＴＳ１３の注入は、ＷＴマウスにおける血栓生長を阻害する）
ｒ−マウスＡＤＡＭＴＳ１３（２．６／ｋｇマウス）を、塩化鉄損傷の５分前にＷＴマウスに注入した（ｉ．ｖ．）。先に記載されたモデルを、以下に記載のようにわずかに改変して用いた。図８は、ｒ−ＡＤＡＭＴＳ１３を注入した９匹のＷＴマウスのうち４匹が４０分の観察時間で損傷した細動脈を閉塞しなかったが（平均閉塞時間＝２７．０４±３．８４分）、その一方、緩衝液を注入したすべてのＷＴマウスが閉塞した（平均閉塞時間＝１５．１５±１．１８分、Ｐ＝０．００６）ことを示す。実験の終了時に採取された血漿サンプルのＷｅｓｔｅｒｎ分析は、ｒ−ＡＤＡＭＴＳ１３を注入されたマウスの数匹におけるより短い閉塞時間（ＷＴに類似）は、この組み換えタンパク質の増加したクリアランスに起因したことを示した。従って、マウスＡＤＡＭＴＳ１３は、通常レベルの内因性ＡＤＡＭＴＳタンパク質をもつＷＴマウス中のヒトＡＤＡＭＴＳ１３と同じ抗血栓能力を有するようである。
【００３４】
これらの結果は、ＡＤＡＭＴＳ１３が抗血栓形成および血栓溶解活性を有することを示す。
【００３５】
（実験手順）
（動物）
実験で用いたマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ／１２９Ｓｖバックグラウンド上のＡｄａｍｔｓ１３＋／−マウス（Ｍｏｔｔｏ  ＤＧ、Ｃｈａｕｈａｎ  ＡＫ、Ｚｈｕ  Ｇ、Ｈｏｍｅｉｓｔｅｒ  Ｊ、Ｌａｍｂ  ＣＢ、Ｄｅｓｃｈ  ＫＣ、Ｚｈａｎｇ  Ｗ、Ｔｓａｉ  ＨＭ、Ｗａｇｎｅｒ  ＤＤ、Ｇｉｎｓｂｕｒｇ  Ｄ。Ｓｈｉｇａｔｏｘｉｎは、遺伝的に感受性のＡｄａｍｔｓ１３−欠損マウスにおける血栓性血小板減少性紫斑病を誘引する。Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２００５；１１５：２７５２〜２７６１）の交配から得た同胞であった。純粋なＣ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドのマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥから購入し、そしてＢａｌｂ／Ｃバックグラウンド上のβ３インテグリン−／−マウスは、Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｈｙｎｅｓ（ＭＩＴ）から贈与された。生体内染色顕微鏡観察のために用いたマウスは、体重１４〜１８グラムの雄および雌両方の若いマウス（約４週齢）であった。注入された血小板は、同じ遺伝子型の４〜６月齢のマウスから単離された。動物は、ＣＢＲ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈで飼育および収容し、そしてすべての実験的手順は、Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって認可された。
【００３６】
（材料）
カルシウムイオノフォアＡ２３１８７および塩化鉄は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯからであった。
【００３７】
（血液サンプリングおよび血小板調製）
血液は、後方眼窩静脈叢から穿刺によって回収し、そして３００μｌのヘパリン（３０Ｕ／ｍｌ）を含む１．５ｍｌのポリプロピレンチューブ中に集めた。血小板リッチ血漿（ＰＲＰ）は、１２００ｒｐｍでの５分間の遠心分離によって得た。かなりのＲＢＣを含む血漿およびバフィコートを穏やかに新たなポリプロピレンチューブに移し、そして１２００ｒｐｍで５分間再度遠心分離した。ＰＲＰを、２μｌのＰＧＩ２（２μｇ／ｍｌ）を含む新たなチューブに移し、そして３７℃で５分間インキュベートした。２８００ｒｐｍでの遠心分離の後、ペレットを、２μｌのＰＧＩ２を含む１ｍｌの改変Ｔｙｒｏｄｅ’ｓ−ＨＥＰＥＳ緩衝液（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、０．３ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２ｍＭ  ＫＣｌ、１２ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、５ｍＭｍ  ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ  グルコース、０．３５％  ＢＳＡ）中に再懸濁し、そして３７℃で５分間インキュベートした。懸濁されたペレートを、２８００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ＰＧＩ２を除去するために、洗浄ステップを２回繰り返し、そして血小板を、カルセインＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）０．２５ｍｇ／ｍＬで１０分間室温で蛍光標識した。
【００３８】
（ポリクローナル抗−ＡＤＡＭＴＳ１３  ＩｇＧの生産および精製）
ポリクローナルウサギ抗−ヒトＡＤＡＭＴＳ１３  ＩｇＧは、Ｂａｘｔｅｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｉｅｎｎａ  Ａｕｓｔｒｉａによって生産された。この抗体は、Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ白ウサギの、精製されたＣ−末端を６つのＨｉｓ残基でタグ化したｒ−ｈｕ  ＡＤＡＭＴＳ１３の免疫化によって得た。２匹のウサギを、２００μｌの完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント中の２０μｇのｒ−ｈｕ  ＡＤＡＭＴＳ１３（６−Ｈｉｓ）の注入によって免疫化した。これらの動物は、２、４および６週に、２００μｌの完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント中の２０μｇのｒ−ｈｕ  ＡＤＡＭＴＳ１３（６−Ｈｉｓ）を注入することにより追加免疫した。８週後これらウサギを犠牲にし、そして放血した。ＩｇＧ抗体は、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＨＰカラム；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）により精製し、そしてＰＢＳ中に処方した＞
（微小細静脈中の血栓症）
生体内染色顕微鏡法は、Ｆｒｅｎｅｔｔｅ  ＰＳ、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＲＣ、Ｈｙｎｅｓ  ＲＯ、Ｗａｇｎｅｒ  ＤＤ．インビボにおけるシミュレートされた内皮上の血小板の役割：内皮Ｐ−選択により媒介される相互作用。Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９９５；９２：７４５０〜７４５４に記載のように行った。簡単に述べれば、マウスを２．５％トリブロモエタノールで麻酔し（０．１５ｍｌ／１０ｇ）、そして切開を腹壁を通って作製し、腸間膜を剥き出し、そして２５〜３０μｍ直径の腸間膜細静脈を調べた。剥き出た腸間膜を、３７℃に加温したＰＢＳ（Ｃａ２＋またはＭｇ２＋なし）を用いる周期的灌流により湿気を維持した。腸間膜を、１２Ｖ、１００Ｗ、ＤＣ安定化電源でトランスルミネートした。せん断速度は、Ｆｒｅｎｔｔｅ  ＰＳ、Ｍｏｙｎａ  Ｃ、Ｈａｒｔｗｅｌｌ  ＤＷ、Ｌｏｗｅ  ＪＢ、Ｈｙｎｅｓ  ＲＯ、Ｗａｇｎｅｒ  ＤＤ。炎症腸間膜細静脈における血小板−内皮相互作用。Ｂｌｏｏｄ．１９９８；９１：１３１８−１３２４。に記載のように、光学的Ｄｏｐｐｌｅｒ速度メーターを用いて算出した。細静脈は、ＳＶＨＳビデオレコーダー（ＡＧ−６７３０；Ｐａｎａｓｏｎｉｃ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）に接続された、Ｚｅｉｓｓ（Ｇｅｒｍａｎｙ）Ａｘｉｏｖｅｒｔ  １３５倒立顕微鏡（対物１０×および３２×）を用いて可視化した。１つの細静脈をマウスあたり選択し、そしてＡ２３１８７灌流（３０μｌの１０  Ｍｍｏｌ／Ｌ）の前にベースラインについて３分間撮影し、そして１０分間モニターした。
【００３９】
（大きな細静脈における血小板接着）
生体内染色顕微鏡法は、２００〜３００μｍ直径の腸間膜細静脈が調べれたのを除き、上記に記載のように行った。蛍光血小板（１．２５×１０９血小板／ｋｇ）を、尾静脈を通じて注入した。動物あたり１つの細静脈を、Ａ２３１８７灌流（３０μｌの１０μモル／Ｌ溶液）の前に３分間ベースラインのために撮影し、そして撮影は、血小板粘着およびうねり（ｒｏｌｌｉｎｇ）がベースラインに戻った後まで継続した。精製されたウサギポリクローナル抗−ヒトＡＤＡＭＴＳ１３抗体（５ｍｇ／ｋｇマウス）をＰＢＳ中に溶解した。コントロールウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）はＰＢＳ中であった。２００μｌの１ｍＭ  ヒスタミン（Ｓｉｇｍａ）をｉ．ｐ．注射し、内皮を刺激した。１００μｌ（０．２ｍｇ／ｍｌ）のＲｈｏｄａｍｉｎｅ  ６Ｇをｉ．ｖ．注入し、手術および画像化の前に内因性血小板および白血球を標識した。
【００４０】
（細動脈における血栓症）
Ｎｉ  Ｈ、Ｄｅｎｉｓ  ＣＶ、Ｓｕｂｂａｒａｏ  Ｓ、Ｄｅｇｅｎ  ＪＬ、Ｓａｔｏ  ＴＮ、Ｈｙｎｅｓ  ＲＯ、Ｗａｇｎｅｒ  ＤＤ．ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子およびフィブリノーゲンの両方を欠くマウスの細動脈における血小板血栓形成の持続。Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０００；１０６：３８５〜３９２に記載されるモデルを、わずかに改変して用いた（Ｎｉ  Ｈ、Ｄｅｎｉｓ  ＣＶ、Ｓｕｂｂａｒａｏ  Ｓ、Ｄｅｇｅｎ  ＪＬ、Ｓａｔｏ  ＴＮ、Ｈｙｎｅｓ  ＲＯ、Ｗａｇｎｅｒ  ＤＤ．ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子およびフィブリノーゲンの両方を欠くマウスの細動脈における血小板血栓形成の持続。Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０００；１０６：３８５〜３９２）。簡単に述べれば、マウスを２．５％トリブロモメタノールで麻酔し（０．１５ｍｌ／１０ｇ）そして蛍光血小板（１．２５×１０９血小板／ｋｇ）を眼の後方眼窩静脈叢を通じて注入した。切開を、腹壁を通って作製して腸間膜を剥き出し、そして約１００μｍの細動脈を調べた。剥き出た腸間膜を、３７℃に加温したＰＢＳ（Ｃａ２＋またはＭｇ２＋なし）を用いる周期的灌流により湿気を維持した。腸間膜を、上記のようにトランスルミネートし、そしてせん断速度を算出した。細動脈は、狭バンドフルオレセインイソチオシアナートフィルターセット（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ、ＶＴ）およびシリコン−強化チューブカメラＣ２４００（Ｈａｍａｍａｔｓｕ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を備えた１００−Ｗ  ＨＢＱ蛍光ランプ源（Ｏｐｔｉｃ  Ｑｕｉｐ、Ｈｉｇｈｌａｎｄ  Ｍｉｌｌｓ、ＮＹ）を装備する上記に記載されるのと同じ顕微鏡を用いて可視化した。塩化鉄（１０％）で飽和したＷｈａｔｍａｎ紙を局所的に付与し、これは、血管損傷および内皮の露出を誘導した。この紙は５分後に除去し、そして血管を損傷後４０分の間、または閉塞までモニターした。マウスあたり１つの細動脈を選択した。
【００４１】
（細動脈血栓症の定量的分析）
記録されたテープの分析は、遺伝子型を隠して実施した。血栓形成の特徴を説明するために適用されたパラメーターは：（１）１分間の間に（ビデオモニター上で観察される）２５０μｍ血管壁上に堆積された蛍光血小板の数として決定される、単一血小板−血管壁相互作用。（２）３０μｍより大きい血栓の形成のために必要な時間。（３）血管閉塞の前に視野から離れて塞栓を形成する３０μｍより大きい直径の血栓の数を決定することによる血栓安定性。（４）血管の閉塞時間、すなわち、１０秒の間血液が流れることを停止するために必要な時間、および（５）血管閉塞の部位、すなわち、損傷の部位または下流。
【００４２】
（組み換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３注入）
組み換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３は、Ｐｌａｉｍａｕｅｒ  Ｂ、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  Ｋ、Ｖｏｌｋｅｌ  Ｄ、Ａｎｔｏｉｎｅ  Ｇ、Ｋｅｒｓｃｈｂａｕｍｅｒ  Ｒ、Ｊｅｎａｂ  Ｐ、Ｆｕｒｌａｎ  Ｍ、Ｇｅｒｒｉｔｓｅｎ  Ｈ、Ｌａｍｍｌｅ  Ｂ、Ｓｃｈｗａｒｚ  ＨＰ、およびＳｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒ  Ｆ。ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子−切断性プロテアーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）のクローニング、発現、および機能的特徴付け。Ｂｌｏｏｄ．２００２；１００：３６２６〜３６３２に記載のような方法によって得られた。組み換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、１５０ｍｍｏｌ  ＮａＣｌ／２０ｍｍｏｌ  ヒスチジン／２％  シュークロース／０．０５％  Ｃｒｉｌｌｅｔ  ４ＨＰ（Ｔｗｅｅｎ  ８０）、ｐＨ７．４（Ｂａｘｔｅｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）中に溶解した。組み換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３は、ｉ．ｖ．注入した（３４６０Ｕ／ｋｇマウス）。ヒトＡＤＡＭＴＳ１３抗原のレベルは、Ｒｉｅｇｅｒ（Ｒｉｅｇｅｒ  Ｍ、Ｋｒｅｍｅｒ  Ｈｏｖｉｎｇａ  ＪＡ、Ｋｏｎｅｔｓｃｈｎｙ  Ｃ、Ｈｅｒｚｏｇ  Ａ、Ｋｏｌｌｅｒ  Ｌ、Ｗｅｂｅｒ  Ａ、Ｒｅｍｕｚｚｉ  Ｇ、Ｄｏｃｋａｌ  Ｍ、Ｐｌａｉｍａｕｅｒ  ＢおよびＳｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒ  Ｆ。健常ドナーおよび血栓性細小血管症（ＴＭＡ）の患者における、ＡＤＡＭＴＳ１３活性とＡＤＡＭＴＳ１３抗原レベルとの間の関係。Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ２００６；９５（２）：２１２〜２０）により記載されるＥＬＩＳＡ法をわずかに改変して用いて決定され、そしてｒ−ｈｕ  ＡＤＡＭＴＳ１３活性は、Ｇｅｒｒｉｔｓｅｎ（Ｇｅｒｒｉｔｓｅｎ  ＨＥ、Ｔｕｒｅｃｅｋ  ＰＬ、Ｓｃｈｗａｒｚ  ＨＰ、Ｌａｅｍｍｉｅ  Ｂ、およびＦｕｒｌａｎ  Ｍ。ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（ｖＷＦ）−切断性プロテアーゼの、分解ｖＷＦの減少したコラーゲン結合親和性に基づくアッセイ：血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）の診断のためのツール。Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  １９９９；８２：１３８６〜１３８９）に従って決定された。１Ｕは、プールされた通常ヒト血漿中のＡＤＡＭＴＳ１３活性のレベルに対応する。
【００４３】
（組み換えマウスＡＤＡＭＴＳ１３注入）
組み換えマウスＡＤＡＭＴＳ１３は、Ｂｒｕｎｏ  Ｋ、Ｖｏｌｋｅｌ  Ｄ、Ｐｌａｉｍａｕｅｒ  Ｂ、Ａｎｔｏｉｎｅ  Ｇ、Ｐａｂｌｅ  Ｓ、Ｍｏｔｔｏ  ＤＧ、Ｌｅｍｍｅｒｈｉｒｔ  ＨＬ、Ｄｏｒｎｅｒ  Ｆ、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  Ｋ、およびＳｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒ  Ｆ。完全長マウスＡＤＡＭＴＳ１３のクローニング、発現および機能的特徴付け。Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ２００５；３（５）：１０６４〜１０７３に記載のような方法によって得られた。組み換えマウスＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、１５０ｍｍｏｌ  ＮａＣｌ／２０ｍｍｏｌ  ヒスチジン／２％  シュークロース／０．０５％  Ｃｒｉｌｌｅｔ  ４ＨＰ（Ｔｗｅｅｎ  ８０）、ｐＨ７．４（Ｂａｘｔｅｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）中に溶解した。
【００４４】
（フローチャンバー研究）
フローチャンバー研究は、Ｂｅｒｇｍｅｉｅｒ（Ｂｅｒｇｍｅｉｅｒ  Ｗ、Ｂｕｒｇｅｒ  ＰＣ、Ｐｉｆｆａｔｈ  ＣＬ、Ｈｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒ  ＫＭ、Ｈａｒｔｗｉｇ  ＪＨ、Ｎｉｅｓｗａｎｄｔ  Ｂ、およびＷａｇｎｅｒ  ＤＤ。メタロプロテイナーゼインヒヒビターは、インビトロ−加齢または−損傷マウス血小板の回復および止血機能を改善する。Ｂｌｏｏｄ  ２００３；１０２：４２２９〜４２３５）に記載のように実施した。簡単に述べれば、血小板をヘパリン添加全血から単離し、改変Ｔｙｒｏｄｅ−ＨＥＰＥＳ緩衝液中で洗浄し、そして２．５μｇ／ｍＬカルセインで標識した。血小板が乏しい全血を、１００μｇ／ｍＬコラーゲンＨｏｒｍ（ＮＹＣＯＭＥＤ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で１時間室温で被覆された並行−プレートフローチャンバーシステム中の灌流前に標識血小板で再構築した。示される場合には、サンプルを３０μｇ／ｍｌ  ＪＯＮ／Ａ（ｅｍｆｒｅｔ  Ａｎａｌｌｙｔｉｃｓ、Ｗｕｅｒｚｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で灌流の前に１０分間予備処理した。血小板接着は、Ａｘｉｏｖｅｒｔ  １３５倒立顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）で可視化した。蛍光血小板によって被覆される表面領域の％をＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  １．６１ソフトウェアを用い、遺伝子型を隠した固体によって分析した。
【００４５】
（統計学的分析）
結果は、平均±ＳＥＭとして報告される。平均間の差異の統計学的有意差は、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定によって評価された。
【００４６】
（実験結果の論議）
実験結果は、活性化された微小細静脈における血栓形成、およびマウスの損傷細動脈中の過剰血栓形成を防ぐことにおけるＡＤＡＭＴＳ１３の重要な役割を規定した。生体内染色顕微鏡法を用い、インビボで、細静脈（２５〜３０μｍ）を活性化することが、微小血栓形成に至る血小板凝集を生じることをＡＤＡＭＴＳ１３−／−マウスで示された。微小血栓は、同じに処置されたＷＴマウスの細静脈では形成されない。活性化内皮から放出されるとき、これらの微小血栓は下流に移動し得、そしてそれらが通過できない小毛細血管中のいずれかで閉塞を引き起こし、それ故、器官虚血に至る。ＴＴＰを患う患者は、しばしば、脳、心臓、膵臓、脾臓、腎臓および腸間膜のような器官の微小血管系中に形成される微小血栓を有する。ウイルス、細菌ｓｈｉｇａトキシン、チクロピジンおよびクロピトドゲルのような薬物、抗体および免疫複合体を含む種々の因子が、おそらくは、Ｗｅｉｂｅｌ−Ｐａｌａｄｅ体放出を誘導する血管活性化を誘因し得る。Ａ２３１８７で同じく処置された（より高いせん断ストレスを有する）細動脈では、血栓は観察されなかった。これは、Ｗｅｉｂｅｌ−Ｐａｌａｄｅ体がこれらの血管では放出されなかったか、または、ｖＷＦが内皮表面から洗浄されるのが速過ぎて、血小板接着を促進する可能性が高い。
【００４７】
ヒトＡＤＡＭＴＳ１３を中和する自己抗体は、後天的タイプのＴＴＰの主要な原因である。ＷＴマウスにおける抗−ＡＤＡＭＴＳ１３抗体の注入は、Ａｄａｍｔｓ１３−／−マウスで観察されたのと類似であった、分泌ｖＷＦへの血小板の持続接着および刺激内皮上の血小板ストリング形成（図２Ａ）を生じた。長さが約２０〜７０μｍで変動する血小板のストリングは、内皮に係留されて観察され得る（図２Ｂ）。血小板ストリングおよび凝集は、ヒスタミン、炎症性サイトカインＴＮＦ−αおよび活性化血小板のようなＷｅｉｂｅｌ−Ｐａｌａｄｅ体の分泌促進剤で抗原投与されるときＡｄａｍｔｓ１３−／−マウスで頻繁に観察された。ヒスタミンで抗原投与されたＡｄａｍｔｓ１３−／−マウスにおけるｒ−ｈｕ  ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の注入は、血小板ストリング形成を阻害する。これらのストリングは、上流端部で切断される。
【００４８】
Ａ２３１８７での微小細静脈（２５〜３０μｍ）の活性化は、抗−ＡＤＡＭＴＳ１３−Ａｂを注入されたＡｄａｍｔｓ１３  ＷＴマウスにおいて血栓形成に至る血小板凝集を生じる（図３）。しかし、これらの血栓は、Ａｄａｍｔｓ１３−／−マウス中のそれらと同様に、迅速に閉塞した。微小血栓形成はまた、阻害性抗体を注入されたＣ５７ＢＬ／６バックグラウンド上のＷＴマウス中で誘導され得る。従って、抗−ＡＤＡＭＴＳ１３  Ａｂを注入されたマウスは、多くの局面で、後天的ＴＴＰの良好なモデルである。さらに、循環中で血小板凝集を防ぐことにおけるＡＤＡＭＴＳ１３の役割を示す。
【００４９】
そのレセプターを通じるｖＷＦ、ＧＰＩｂαおよびαＩＩｂβ３は、血小板凝集を開始すること、および血栓形成の進行における血小板機能に寄与する。血小板−内皮相互作用が持続され、しかも内皮活性化がＡｄａｍｔｓ１３−／−マウスにおいて微小血栓を生じるという実験観察は、ＡＤＡＭＴＳ１３欠損が損傷した細動脈中の血栓形成を加速し得るという仮説に至った。実際、ＡＤＡＭＴＳ１３の不在は、血栓生長のすべての局面を促進した。予期せぬことに、なおより多くの血小板が、ＷＴと比較したときＡｄａｍｔｓ１３−／−マウスにおける損傷の２〜３分後の裸にされた血管壁で堆積された（図５Ａ）。細動脈における初期の血小板堆積はｖＷＦ依存性であるので、それは、血漿ＡＤＡＭＴＳ１３が、それが血液に曝されるとき基底膜中へのｖＷＦ取り込みを低減するか、またはそれが細胞外マトリックス中にすでに存在するｖＷＦを消化するかのいずれかであることを意味する。Ａｄａｍｔｓ１３−／−マウスにおける急速な血栓生長および閉塞は、ＡＤＡＭＴＳ１３が血栓中に取り込まれたｖＷＦマチルマーを切断し得ることを示す。
【００５０】
ＶＷＦドメインＡ２のＡＤＡＭＴＳ１３による切断がＶＷＦのＧＰＩｂαの結合によって容易にされることが示唆された。それ故、血栓内のＶＷＦ−ＧＰＩｂ相互作用は血栓形成を負に調節し得る。静脈および動脈流れ状態下での血栓形成はまた、主要なインテグリンαＩＩｂβ３に依存する。動脈せん断速度における現在の実施例は、ＡＤＡＭＴＳ１３が、血栓中の血小板が活性なβ３インテグリンを発現するときのみ生長する血栓を調節することを示す。これらのインビトロおよびインビボ実験条件下では、ＡＤＡＭＴＳ１３−欠損は、主要な血小板インテグリンが存在しなかったか、または阻害されたとき血栓生長を促進しなかった（図６）。
【００５１】
Ａｄａｍｔｓ１３−／−マウスにおいて観察された速い血栓生長を阻害するために、ｒ−ｈｕＡＤＡＭＴＳ１３を損傷前にＡｄａｍｔｓ１３−／−マウスおよびＷＴマウスに注入した。ｒ−ｈｕＡＤＡＭＴＳ１３の抗−血栓形成効果は、高度に統計学的に有意ではあるけれども、動物間で変動した（図７Ａおよび７Ｂ）。あるマウスは、ｒ−ｈｕＡＤＡＭＴＳ１３処置に応答しなかった。これらのマウスでは、ｒ−ｈｕＡＤＡＭＴＳ１３が、トロンビンによるタンパク質分解によって不活性化され、そして血管損傷の部位でプラスミンが生成された可能性がある。ＩＬ−６および炎症または損傷後放出された多量のｖＷＦはまた、ＡＤＡＭＴＳ１３活性を低減し得る。閉塞しなかった血管では、血栓崩壊および改質の現象が観察される（図７Ｃ）。これらの知見は、ＡＤＡＭＴＳ１３が、抗−血栓形成活性および血栓分解活性の両方を有することを示す。可能な機構は、ＡＤＡＭＴＳ１３が、ＵＬ−ｖＷＦマルチマーを、より粘着性の少ないより小さなフラグメントに切断するか、または付着した血小板のストリングへの切断の場合でそうであるように、血栓中の血栓を架橋するｖＷＦ分子を直接切断することである。インビボでは、ＡＤＡＭＴＳ１３は、低い静脈せん断ストレス条件および高い動脈ストレス条件の両方で活性である。それは、血小板ストリングを切断し、そして細静脈内の「活性化された」血管壁との血小板相互作用を調節し、活性化微小細静脈中の血栓を防ぎ、そして損傷細動脈における血栓応答を調整する。
【００５２】
先天的ＴＴＰ患者は、目下のところ血清交換によって処置されており、その一方、後天的ＴＴＰ患者は、自己抗体が血漿から除去される血漿しゃ（瀉）血を受けている。ＡＤＡ
ＭＴＳ１３タンパク質の抗血栓形成および血栓溶解効果は、ＴＴＰの他に、例えば、組み換えＡＤＡＭＴＳ１３が、遺伝性欠損、炎症性疾患、敗血症状態、または例えば深部静脈血栓症または肺塞栓のような静脈血栓症に起因する血栓症障害を患う患者を処置するために用いられ得ることを示す。ＡＤＡＭＴＳ１３の血栓溶解活性は、このタンパク質が、詰まった動脈中、または軽脳卒中後に血栓を分解するためにその他の治療と組み合わせて用いられ得ることを示す。
【００５３】
要するに、上記実験データは、金属プロテアーゼＡＤＡＭＴＳ１３が血栓症を負に調節することを示し、これは、この分子が抗血栓形成活性を有することを示す。それ故、血栓溶解活性を有するその組み換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、血栓形成障害を処置するための治療剤として用いられ得る。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１．微小細静脈における血栓形成。腹壁を通る切開を行い、生きたマウスの腸間膜を曝露した後に、直径約２５μｍ〜３０μｍの腸間膜細静脈を視覚化した。Ａ２３１８７の局所投与の１分後、Ａｄａｍｔｓ１３  −／−マウス（ｎ＝５）において血栓形成を観察した。矢印は、微小血栓を示す。同じように処置したＷＴマウス（ｎ＝５）では微小血栓形成は観察されなかった。したがって、ヴァイベル−パラーデ体の刺激は、脈管損傷なしにＡｄａｍｔｓ１３  −／−マウスにおいて自発的な血栓形成をもたらし得る。
【図２】図２．ＡＤＡＭＴＳ１３インヒビターは脈管壁への血小板付着および糸状物形成を増大する。総血小板のうちの約２．５％に相当する蛍光標識した血小板を、Ａ２３１８７の灌流（ｓｕｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）前（ベースライン）および灌流後に、生きたマウスの腸間膜細静脈（２００μｍ〜２５０μｍ）において観察した。Ａ：灌流の３０秒〜４５秒後に血小板は内皮に付着し始めた。ＷＴ（抗ヒトＡＤＡＭＴＳ１３  Ａｂを注入した）マウス（ｎ＝４）では、ＷＴ（ＰＢＳを注入した）コントロール（ｎ＝４）と比べて、より多くの血小板が４分後に脈管壁に付着した。矢印は、内皮に一端が付着し、血流を波打たせる血小板の２０μｍ以上の糸状物を示す。右下端に挿入された時点は、Ａ２３１８７の灌流後の時間を示す。パネル中央に示したバーは、（約）５０μｍである。Ｂ：ＡＤＡＭＴＳ１３に対するインヒビターを注入した７匹のＷＴマウスのうち５匹において、μｍ〜約２５３５μｍ長の血小板糸状物が１０秒までの間に脈管壁に留まった。右下端に挿入された時点は、Ａ２３１８７の灌流後の時間を示す。パネル中央に示したバーは、（約）５２５ｍである。
【図３】図３．ＡＤＡＭＴＳ１３インヒビターを注入したＷＴマウスの微小細静脈における血栓形成。直径約２５μｍ〜３０μｍの腸間膜細静脈を観察した。Ａ２３１８７の局所灌流の１分後、ＡＤＡＭＴＳ１３インヒビターを注入した６匹のＡｄａｍｔｓ１３  ＷＴマウスのうち４匹において、血栓形成が観察された。微小血栓形成は、Ａｄａｍｔｓ１３  −／−マウスで確認されたもの（図１）と同様であった。矢印は、微小血栓を示す。ＰＢＳを注入したＷＴマウス（ｎ＝５）では微小血栓は形成されなかった。
【図４】図４．組換えＡＤＡＭＴＳ１３はＡｄａｍｔｓ１３  −／−マウスにおける血小板糸状物を阻害する。ローダミン６Ｇを使用して、内因性血小板および白血球を標識した。１ｍＭのヒスタミン（２００μｌ）を外科手術の１５分前にｉ．ｐ．投与し、１匹のマウスあたり直径約２００μｍ〜３００μｍの３つの腸間膜細静脈を視覚化した。Ａ：Ａｄａｍｔｓ１３  ＷＴマウス（ｎ＝５）では血小板糸状物は確認されなかった。Ｂ：Ａｄａｍｔｓ１３  −／−マウス（ｎ＝５）では血小板糸状物（矢印で示した）が確認された。Ｃ：矢印で示されるようにＡｄａｍｔｓ１３  −／−マウスでは血小板糸状物は血小板凝集物を形成し得る。Ｄ：組換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の注入はＡｄａｍｔｓ１３  −／−マウス（ｎ＝４）において血小板糸状物を阻害する。
【図５】図５．ＷＴマウスおよびＡｄａｍｔｓ１３  −／−マウスの小動脈における血小板付着および血栓形成の定量的分析。Ａ：１分間あたりに沈着した蛍光血小板の数を、損傷の２〜３分後血小板の総数を１分間隔でカウントした）。統計および平均のために、１００を超える血小板は１００と見なした。血漿中のＡＤＡＭＴＳ１３の非存在は、内皮下層との初期血小板相互作用にはっきりと影響を及ぼす。ＷＴと比較して、Ａｄａｍｔｓ１３  −／−では、より多くの血小板が脈管壁に沈着した（Ｐ＜０．０５）。Ｂ：血栓（＞３０μｍ）は、ＷＴ（平均＝１０．７８±０．８０）と比較して損傷後より早くにＡＤＡＭＴＳ１３  −／−マウス（平均＝６．６４±０．９３）で現れ、これは統計学的に有意である（Ｐ＜０．００５）。このことは、ＡＤＡＭＴＳ１３によるＵＬ−ｖＷＦマルチマーの切断が血栓形成を遅延させることを示す。Ｃ：血流が１０秒間完全に停止したときの閉塞時間を決定した。ＷＴマウスおよびＡｄａｍｔｓ１３  −／−マウスの両方が、損傷部位で閉塞した；しかし、閉塞時間は、ＷＴマウス（平均＝１６．６９±１．２５分）と比較して、Ａｄａｍｔｓ１３  −／−マウスではより短かった（平均＝１０．５６±０．７２）。この相違は、統計学的に非常に有意であった（Ｐ＜０．０００５）。Ｄ:塩化第２鉄損傷後に、総血小板のうちの約２．５％に相当する蛍光標識した血小板を、生きたマウスの腸間膜小動脈で観察した。血流は、左から右であった。右下端に挿入された時点は、損傷後の時間を示す。ＷＴでは単一の付着血小板が損傷の４分後に小動脈で確認されるが、Ａｄａｍｔｓ１３  −／−マウスの小動脈では同じ時点で血栓（約３０μｍ）が確認され得る。Ａｄａｍｔｓ１３  −／−マウスでは脈管は損傷部位において血栓によって１０分で閉塞されるが、ＷＴマウスの小動脈はその時点で開いたままであった。写真は、各遺伝子型の１０匹のマウスの代表的なものである。
【図６】図６．インテグリンαＩＩｂβ３の阻害は小動脈剪断速度条件下でのコラーゲンにおけるＡＤＡＭＴＳ１３  −／−血小板の血栓形成をブロックする。Ａｄａｍｔｓ１３  ＋／＋およびＡｄａｍｔｓ１３  −／−全血を、１５００ｓ−１の剪断速度でコラーゲン表面上を２分間灌流した。Ａ:代表的な画像が示される。上部パネル−非処理全血、下部パネル−αＩＩｂβ３に対するブロッキング抗体で前処理したもの（ＪＯＮ／Ａ）。Ｂ：２分間の灌流後に血小板によって覆われた表面積の定量。フローチャンバーの異なる領域からの４種のフレームを、各血液サンプルについて分析した。データは、蛍光血小板によって覆われた表面積の平均パーセンテージ±ＳＥＭを示す（ｎ＝３〜４）。
【図７】図７．組換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３の注入は血栓成長を阻害する。塩化第２鉄損傷の１５分前に、組換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３をＡｄａｍｔｓ１３  −／−マウスに注入（ｉ．ｖ．）した。閉塞時間（血流が１０秒間完全に停止する）を決定した。Ａ：組換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３を注入した１３匹のＡｄａｍｔｓ１３  −／−マウスのうち５匹は、４０分までの観察時間に小動脈で閉塞しなかった（平均閉塞時間＝２３．８０±３．７１分）が、組換え緩衝液のみを注入したＡｄａｍｔｓ１３  −／−マウスの１０匹すべては閉塞した（平均閉塞時間＝１１．１７±０．８７）；（Ｐ＝０．００５）。Ｂ：ｒ−ｈｕＡＤＡＭＴＳ１３（平均閉塞時間＝２７．９９±４．７２分）または緩衝液のみ（平均閉塞時間＝１３．１２±０．５５分）のいずれかを注入したＷＴ（Ｃ５７ＢＩ／６Ｊ）マウスの損傷した小動脈における閉塞時間。Ｃ：ｒ−ｈｕＡＤＡＭＴＳ１３で処置したＡｄａｍｔｓ１３  −／−マウスの損傷した小動脈の代表的な蛍光画像が示される。矢印は、崩壊する血栓を示す。
【図８】図８．組換えマウスＡＤＡＭＴＳ１３の注入はＷＴマウスにおいて血栓成長を阻害する。塩化第２鉄損傷の５分前に、組換えマウスＡＤＡＭＴＳ１３（マウス１ｋｇあたり２．６ｍｇ）を、ＷＴマウスに注入（ｉ．ｖ．）した。組換えマウスＡＤＡＭＴＳ１３を注入した９匹のＷＴマウスのうち４匹は、４０分の観察時間で損傷した小動脈を閉塞しなかった（平均閉塞時間＝２７．０４±３．８４分）が、緩衝液を注入したＷＴマウスすべては閉塞した（平均閉塞時間＝１５．１５±１．１８分、Ｐ＝０．００６）。
【図９】図９．表１：細動脈におけるＡ２３１８７の適用前および適用後の血行力学的パラメータ（図１）；表２：小動脈における塩化第２鉄の適用前および適用後の血行力学的パラメータ（図５）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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