(57)【要約】本開示は、Ｌｅｆｔｙ誘導体、及び例えばＮｏｄａｌ、ＧＤＦ−８（ミオスタチン）及びＧＤＦ−１１等の特定のリガンドの機能の拮抗物質としてのＬｅｆｔｙポリペプチドの使用に関する。これらの誘導体は、例えばＩｇＧ、特にＩｇＧのＦｃ部分のようなその他の機能性異種タンパク質に融合される場合がある。本開示によれば、Ｌｅｆｔｙポリペプチドは、例えばニューロン疾患、筋肉及び骨の状態、並びに代謝障害を含む種々の障害の処置に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学式−Ａ−Ｘ−Ｂ−で示されるようなアミノ酸配列を含み、
Ａが、配列番号１の領域２の配列と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列から本質的に構成され；
Ｂが、配列番号１の領域４の配列と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列から本質的に構成され；
Ｘが、０個、１個又は複数個のアミノ酸から構成され；且つ
Ｎｏｄａｌ、ミオスタチン及びＧＤＦ−１１の１つ以上に結合する、組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチド。
【請求項２】
ヒトＬｅｆｔｙポリペプチドのシステインノット部分と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１のアミノ酸２２〜３５３、及び配列番号２のアミノ酸２２〜３５３からなる群から選択されるヒトＬｅｆｔｙポリペプチド配列と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含み、
ＲＸＸＲ開裂配列の１つ又は両方が、改変された配列における開裂を防止するように改変される、請求項１に記載の組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチド。
【請求項４】
Ａが、配列番号１の領域２の配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列から構成され、Ｂが、配列番号１の領域４の配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列から構成される、請求項１に記載の組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチド。
【請求項５】
Ａが、ＣＲＱＥＭＹＩＤＬＱＧＭＫＷＡＫＮＷＶＬＥＰＰＧ  ＦＬＡＹＥＣＶＧＴ（配列番号５）、及びＣＲＱＥＭＹＩＤＬＱＧＭＫＷＡＥＮＷＶＬＥＰＰＧＦＬＡＹＥＣＶＧＴ（配列番号７）からなる群から選択され、Ｂが、ＣＩＡＳＥＴＡＳＬＰＭＩＶＳＩＫＥＧＧＲＴＲＰＱＶＶＳＬＰＮＭＲＶＱＫＣ（配列番号６）、及びＣＩＡＳＥＴＤＳＬＰＭＩＶＳＩＫＥＧＧＲＴＲＰＱＶＶＳＬＰＮＭＲＶＱＫＣ（配列番号８）からなる群から選択される、請求項１に記載の組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチド。
【請求項６】
Ｘが免疫原性の低いアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチド。
【請求項７】
Ｘがグリコシル化部位を含む、請求項１に記載の組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチド。
【請求項８】
Ｘの長さが０〜５０アミノ酸である、請求項１に記載の組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチド。
【請求項９】
Ｘが二量体化ドメインを含む、請求項１に記載の組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチド。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが更なるドメインに融合している、請求項１〜８の何れか１項に記載の組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチド。
【請求項１１】
前記更なるドメインが二量体化ドメインである、請求項１０に記載の組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチド。
【請求項１２】
前記更なるドメインが、前記Ｌｅｆｔｙポリペプチドのカルボキシル又はアミノ末端に融合している、請求項１０に記載の組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチド。
【請求項１３】
前記二量体化ドメインがＬｅｆｔｙプロペプチド配列を含む、請求項９又は１１に記載の組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチド。
【請求項１４】
前記二量体化ドメインが免疫グロブリンＦａｂ定常ドメインを含む、請求項９又は１１に記載の組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチド。
【請求項１５】
前記免疫グロブリンＦａｂ定常ドメインが、免疫グロブリン重鎖定常領域、及び免疫グロブリン軽鎖定常領域から選択される、請求項１４に記載の組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチド。
【請求項１６】
前記二量体化ドメインがロイシンジッパードメインである、請求項９又は１１に記載の組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチド。
【請求項１７】
前記ロイシンジッパードメインが、少なくとも４つのロイシンヘプタドを含む、請求項１６に記載の組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチド。
【請求項１８】
前記ロイシンジッパードメインが、Ｆｏｓ及びＪｕｎロイシンジッパードメインからなる群から選択される、請求項１７に記載の組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチド。
【請求項１９】
前記Ｌｅｆｔｙポリペプチドと前記二量体化ドメインの間に介在し、且つ該Ｌｅｆｔｙポリペプチドと二量体化ドメインを共有結合させるリンカー配列を更に含む、請求項１１に記載の組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチド。
【請求項２０】
Ｘが、Ｎｏｄａｌ、ミオスタチン及び／又はＧＤＦ−１１を結合するドメインを含む、請求項１に記載の組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチド。
【請求項２１】
前記更なるドメインが、Ｎｏｄａｌ、ミオスタチン及び／又はＧＤＦ−１１を結合するドメインである、請求項１に記載の組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチド。
【請求項２２】
Ｎｏｄａｌ、ミオスタチン及び／又はＧＤＦ−１１を結合する前記ドメインが、Ｉ型受容体へのＮｏｄａｌ、ミオスタチン及び／又はＧＤＦ−１１の結合を阻害する、請求項２０又は２１に記載の組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチド。
【請求項２３】
Ｎｏｄａｌ、ミオスタチン及び／又はＧＤＦ−１１を結合する前記ドメインが、ＡＬＫ４及びＡＬＫ７からなる群から選択されるＩ型受容体へのＮｏｄａｌ、ミオスタチン及び／又はＧＤＦ−１１の結合を競合的に阻害する、請求項２２に記載の組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチド。
【請求項２４】
Ｎｏｄａｌ、ミオスタチン及び／又はＧＤＦ−１１を結合する前記ドメインが、
（ａ）ＡＬＫ４の細胞外部分；
（ｂ）ＡＬＫ７の細胞外部分；
（ｃ）Ｎｏｄａｌ、ミオスタチン及び／又はＧＤＦ−１１を結合する抗体の抗原結合部分；並びに
（ｄ）Ｎｏｄａｌ、ミオスタチン及び／又はＧＤＦ−１１に結合するように選択されたランダム化ポリペプチド
からなる群から選択される、請求項２２に記載の組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチド。
【請求項２５】
前記修飾されたＬｅｆｔｙポリペプチドが、細胞内で、ＡｃｔＲＩＩ受容体、ミオスタチン、Ｎｏｄａｌ、及びＧＤＦ−１１から選択されるタンパク質により媒介されるシグナル伝達を阻害する、請求項１〜２４の何れか１項に記載の組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチド。
【請求項２６】
前記修飾されたＬｅｆｔｙポリペプチドが、前記組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチドの分泌を媒介する異種配列を含む、請求項１〜２５の何れか１項に記載の組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチド。
【請求項２７】
前記組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチドの分泌を媒介する前記異種配列が、蜜蜂メラチンリーダー配列である、請求項２６に記載の組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチド。
【請求項２８】
請求項１〜２７の何れか１項に記載のＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、組換えポリヌクレオチド。
【請求項２９】
前記Ｌｅｆｔｙ誘導体ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列に操作可能に結合したプロモーター配列を更に含む、請求項２８に記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項３０】
請求項２９に記載の組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞。
【請求項３１】
哺乳動物細胞である、請求項３０に記載の細胞。
【請求項３２】
ヒト細胞である、請求項３１に記載の細胞。
【請求項３３】
組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチドを製造する方法であって、
ａ）請求項３０に記載の細胞を、該組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチドの発現に好適な条件下で培養する工程；
ｂ）このようにして発現された該組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチドを回収する工程
を包含する、方法。
【請求項３４】
ａ）第１のＬｅｆｔｙポリペプチド；及び
ｂ）第２のＬｅｆｔｙポリペプチド
を含み、
該第１及び第２のＬｅｆｔｙポリペプチドが複合体を形成するように会合し、該複合体が、ミオスタチン、Ｎｏｄａｌ及びＧＤＦ−１１からなる群から選択されるＴＧＦ−βファミリーメンバーに結合する、単離されたＬｅｆｔｙポリペプチド複合体。
【請求項３５】
前記ポリペプチド複合体がホモ二量体である、請求項３４に記載のＬｅｆｔｙポリペプチド複合体。
【請求項３６】
請求項１〜２６又は請求項３４〜３５の何れか１項に記載の修飾されたＬｅｆｔｙポリペプチドを含む、薬学的製剤。
【請求項３７】
ｉｎ  ｖｉｖｏでＧＤＦ−１１及び／又はミオスタチンの活性を阻害する方法であって、有効量のＬｅｆｔｙポリペプチドを被験体に投与することを含む、方法。
【請求項３８】
筋肉損失又は筋肉増殖不全に関連した障害を有する被験体を処置するための方法であって、Ｌｅｆｔｙポリペプチドを含む有効量の組成物を該被験体に投与することを含む、方法。
【請求項３９】
前記被験体が、筋萎縮、ＡＬＳ、及び筋肉消耗疾患から選択される状態を有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記筋肉消耗疾患が、悪液質、食欲不振、ＤＭＤ症候群、ＢＭＤ症候群、ＡＩＤＳ消耗症候群、筋ジストロフィー、神経筋疾患、運動ニューロン疾患、神経筋接合部の疾患、及び炎症性筋障害からなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
神経変性に関連した障害を有する被験体を処置するための方法であって、Ｌｅｆｔｙポリペプチドを含む有効量の組成物を該被験体に投与することを含む、方法。
【請求項４２】
前記障害が、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病（ＨＤ）からなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＧＤＦ−１１及び／又はミオスタチンの活性を阻害するための方法であって、有効量のＬｅｆｔｙポリペプチドを該細胞に投与する工程を包含する、方法。
【請求項４４】
被験体の体脂肪量を減少させる、又は体脂肪量の増加速度を低下させるための方法であって、該処置を必要とする被験体に有効量のＬｅｆｔｙポリペプチドを投与することを含む、方法。
【請求項４５】
被験体の望ましくない体重増加に関連した障害を処置するための方法であって、該処置を必要とする被験体に有効量のＬｅｆｔｙポリペプチドを投与することを含む、方法。
【請求項４６】
前記障害が、肥満症、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、心血管系疾患、癌、高血圧、変形性関節症、卒中、呼吸障害、及び胆嚢疾患からなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記Ｌｅｆｔｙポリペプチドが、野生型Ｌｅｆｔｙポリペプチド又はその断片、組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチド、及び二量体化Ｌｅｆｔｙポリペプチドから選択される、請求項３７〜４６の何れか１項に記載の方法。
【請求項４８】
筋肉組織の異常な量、発達又は代謝活性に関連した障害を処置する医薬品の製造のためのＬｅｆｔｙポリペプチドの使用。
【請求項４９】
神経変性に関連した障害を処置する医薬品の製造のためのＬｅｆｔｙポリペプチドの使用。
【請求項５０】
望ましくない体脂肪量に関連した障害を処置する医薬品の製造のためのＬｅｆｔｙポリペプチドの使用。
【請求項５１】
前記障害が、肥満症及びインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）からなる群から選択される、請求項５０に記載の使用。
【請求項５２】
前記Ｌｅｆｔｙポリペプチドが、野生型Ｌｅｆｔｙポリペプチド又はその断片、組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチド、及び二量体化Ｌｅｆｔｙポリペプチドから選択される、請求項４８〜５１の何れか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
ミオスタチン、即ち、増殖／分化因子８（ＧＤＦ−８）は、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーに属する（非特許文献１）。ヒトのミオスタチン遺伝子は、既にクローニングされている（非特許文献２）。ミオスタチンは、ヒト骨格筋の１型及び２型線維の両方に存在する。ミオスタチンは、骨格筋の増殖及び発達を負に調節する（非特許文献２）。
【０００２】
ミオスタチンノックアウトマウスは、野生型マウスよりも有意に大きく、骨格筋量が多く且つ広範囲に及んでいる（非特許文献１）。筋肉量の増大により特徴付けられる２品種の牛は、ミオスタチンコード配列内に突然変異を有する（非特許文献３）。免疫反応性ミオスタチンの血清及び筋内濃度は、健康なヒトよりも、筋肉消耗を伴うＨＩＶ感染のヒトにおいて増大しており、除脂肪量指数と逆相関している（非特許文献２）。最近、ミオスタチンに明らかな機能喪失型突然変異を伴うヒトの子供が同定された（非特許文献４）。この幼児は、骨格筋量が顕著に増大していた。総じて、これらのデータは、ミオスタチンがヒトの骨格筋増殖の負の調節因子であり、ＨＩＶ感染のヒトにおける筋肉消耗の一因であるという遺伝学的及び生理学的証拠を示している。
【０００３】
上記の所見に鑑みて、特に例えば加齢、自己免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、多発性硬化症及び癌等の病態又は疾患状態により筋肉消耗を経験する個体において、ミオスタチン活性を調節する方法が必要とされている。更に、ＧＤＦ−１１は、ミオスタチンと密接に関連し、神経機能に関与するタンパク質である。従って、ミオスタチンの調節因子は、ＧＤＦ−１１の調節だけでなく、神経プロセスの調節においても用途を見出す可能性がある。
【０００４】
本発明は、ミオスタチン及びＧＤＦ−１１を含めたＴＧＦ−βファミリーメンバーにより媒介される、シグナル伝達に関連した種々の病態を有する個体の支援に使用される場合がある方法及び組成物を提供する。
【非特許文献１】ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９７）３８７：８３−９０
【非特許文献２】Ｎｅｓｔｏｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９８）９５：１４９３８−４３
【非特許文献３】ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９７）９４：１２４５７−６１
【非特許文献４】Ｓｃｈｕｅｌｋｅら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  ２００４  Ｊｕｎ  ２４；３５０（２６）：２６８２−８
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本開示内容は、Ｌｅｆｔｙポリペプチドの新たな用途を提供し、種々のＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチドを提供する。一部において、本開示内容は、ミオスタチン及び／又はＧＤＦ−１１の拮抗物質としてＬｅｆｔｙポリペプチドを使用する方法を提供する。従って、本開示内容は、筋肉又は神経機能に関連する障害の宿主の処置にＬｅｆｔｙポリペプチドを使用する方法を提供する。一部において、本開示内容は又、Ｎｏｄａｌ、ミオスタチン及び／又はＧＤＦ−１１の阻害において機能的に重要となるＬｅｆｔｙポリペプチドの領域、並びにＮｏｄａｌ、ミオスタチン及び／又はＧＤＦ−１１の阻害に実質的な影響を与えることなく容易に修飾される場合がある領域も提供する。従って、本開示内容は、Ｎｏｄａｌ、ミオスタチン及び／又はＧＤＦ−１１の拮抗物質機能を保持したＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチドを提供する。Ｌｅｆｔｙ誘導体ポリペプチドは又、溶解性又は薬物動態の向上といった望ましい特徴を示す場合もある。
【０００６】
特定の態様において、本開示内容は、組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチドを提供する。Ｌｅｆｔｙ誘導体ポリペプチドは、天然のＬｅｆｔｙポリペプチドとの構造的及び機能的関連性を有するが、マウスＬｅｆｔｙ−１及びＬｅｆｔｙ−２ポリペプチド又はヒトＬｅｆｔｙ−Ａ又はＬｅｆｔｙ−Ｂポリペプチドとは同一でないアミノ酸配列を有するポリペプチドである。Ｌｅｆｔｙ誘導体ポリペプチドは、Ｎｏｄａｌ、ミオスタチン及び／又はＧＤＦ−１１の１つ以上と結合する能力を保持する。より具体的には、本開示内容は、Ｌｅｆｔｙタンパク質が５つの領域、即ち、領域１〜５を含むと考えられる場合があることを示す。図１〜５を参照されたい。一般的なシステインノット構造（主に一連の架橋されたシステイン残基により保持される）、並びに領域２及び領域４は、主にＮｏｄａｌ、ミオスタチン及びＧＤＦ−１１へのＬｅｆｔｙの結合に関与することが予想される。領域１、３及び５、並びに特に領域１及び領域３のＣ−末端部分は、全体として、結合には有意に関与しないことが予想され、従って、これらの領域は、Ｌｅｆｔｙタンパク質のアミノ酸配列修飾の魅力的な標的である。好ましくは、組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチドは、生化学的結合試験又は細胞ベースの試験において、例えばＡｃｔＲＩＩ受容体、ミオスタチン、Ｎｏｄａｌ及び／又はＧＤＦ−１１等のタンパク質により媒介されるシグナル伝達を阻害するように選択される。
【０００７】
特定の実施形態において、組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチドは、化学式−Ａ−Ｘ−Ｂ−で示されるようなアミノ酸配列を含み、式中、ＡはヒトＬｅｆｔｙ  Ａ又はＬｅｆｔｙ  Ｂの領域２の配列（それぞれ配列番号５及び配列番号７）と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％又は１００％同一のアミノ酸配列からなり；Ｂは、ヒトＬｅｆｔｙ  Ａ又はＬｅｆｔｙ  Ｂの領域４の配列（それぞれ配列番号６及び配列番号８）と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％又は１００％同一のアミノ酸配列からなる。Ｌｅｆｔｙ  Ａの領域２は、配列ＣＲＱＥＭＹＩＤＬＱＧＭＫＷＡＫＮＷＶＬＥＰＰＧ  ＦＬＡＹＥＣＶＧＴ（配列番号５）を有する。Ｌｅｆｔｙ  Ｂの領域２は、配列ＣＲＱＥＭＹＩＤＬＱＧＭＫＷＡＥＮＷＶＬＥＰＰＧＦＬＡＹＥＣＶＧＴ（配列番号７）を有する。Ｌｅｆｔｙ  Ａの領域４は、配列ＣＩＡＳＥＴＡＳＬＰＭＩＶＳＩＫＥＧＧＲＴＲＰＱＶＶＳＬＰＮＭＲＶＱＫＣ（配列番号６）を有し、Ｌｅｆｔｙ  Ｂの領域４は、配列ＣＩＡＳＥＴＤＳＬＰＭＩＶＳＩＫＥＧＧＲＴＲＰＱＶＶＳＬＰＮＭＲＶＱＫＣ（配列番号８）を有する。
【０００８】
組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチドは、Ｎｏｄａｌ、ミオスタチン及びＧＤＦ−１１の１つ以上と、好ましくは１０−６、１０−７、１０−８又は１０−９未満のＫＤで結合するのが好ましい。Ｘは、Ｌｅｆｔｙ誘導体ポリペプチドの機能的活性を維持するように選択する必要がなければ、０個、１個又は複数個のアミノ酸から構成される場合がある。Ｘは、免疫原性の低いアミノ酸配列を含む場合がある。Ｘは、翻訳後修飾、好ましくはグリコシル化のための部位を含む場合がある。Ｘは、５００個、４００個、３００個、２００個、１００個、５０個又は２５個未満のアミノ酸である場合がある。Ｘは、更なるドメイン、例えば二量体化ドメイン、Ｎｏｄａｌ、ミオスタチン及び／又はＧＤＦ−１１に結合するドメイン、又は溶解性若しくは薬物動態の向上等の望ましい特性を別様でもたらすドメインを含む場合がある。
【０００９】
組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチドは、化学式−Ａ−Ｘ−Ｂ−のＡ部分のＮ−末端であるアミノ酸を含む場合もあれば、含まない場合もあり、又、化学式−Ａ−Ｘ−Ｂ−のＢ部分のＣ−末端であるアミノ酸を含む場合もあれば、含まない場合もある。従って、化学式−Ａ−Ｘ−Ｂ−の配列を含むＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチドは、場合による実施形態として、ＡのＮ−末端である配列、及び／又はＢのＣ−末端である配列を含むものとして理解されなければならない。これらの部分の具体的な言及が必要な場合は、このような領域が「Ｗ」及び「Ｙ」と呼ばれる場合がある。従って、誘導体Ｌｅｆｔｙポリペプチドは、Ｗ−Ａ−Ｘ−Ｂ、Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｙ又はＷ−Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｙとして表される配列から本質的に構成される場合がある。Ｗ及びＹの配列は、それらの配列が実際に含まれる場合、比較的制約を受けず、Ｌｅｆｔｙ誘導体ポリペプチドの望ましい機能的活性の何れかを保持するように選択される。Ｗ及びＹは、免疫原性の低いアミノ酸配列を含む場合がある。Ｗ及びＹは、翻訳後修飾、好ましくはグリコシル化のための部位を含む場合がある。Ｗ及びＹは、５００個、４００個、３００個、２００個、１００個、５０個又は２５個未満のアミノ酸である場合がある。Ｗ及びＹは、更なるドメイン、例えば二量体化ドメイン、Ｎｏｄａｌ、ミオスタチン及び／又はＧＤＦ−１１に結合するドメイン、又は溶解性若しくは薬物動態の向上等の望ましい特性を別様でもたらすドメインを含む場合がある。一実施形態において、Ｗは、Ｌｅｆｔｙタンパク質の最もＮ−末端のＲＸＸＲプロペプチド開裂部位の開裂後に得られる配列に対応する「長い」領域１の配列を含む。一実施形態において、Ｗは、第２のＲＸＸＲプロペプチド開裂部位の開裂後に得られる配列に対応する「短い」配列を含む。更なる実施形態において、Ｗは、幾つか又は全てのプロペプチド配列を含む場合があり、この場合、Ｗは一般的に、開裂が低減又は排除されるように第１及び／又は第２のＲＸＸＲ開裂部位が改変されるように改変される。ＲＸＸＲ開裂部位を改変する好ましい方法は、ＲＸＸＲ部位の配列を改変するか、又は開裂部位を閉塞するグリコシル化を起こすか、又は別様で開裂を阻害する、グリコシル化のための部位を含める方法である。部分Ｗ、Ｘ又はＹの何れも、天然のＬｅｆｔｙポリペプチド、特にヒトＬｅｆｔｙ  Ａ又はＬｅｆｔｙ  Ｂの領域１、３又は５それぞれと少なくとも８５％同一である場合があり、又、このような配列と少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％同一である場合もある。
【００１０】
組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチドは、ヒトＬｅｆｔｙポリペプチドのシステインノット部分と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む場合がある。組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２２〜３５３及び配列番号２のアミノ酸２２〜３５３からなる群から選択されるヒトＬｅｆｔｙポリペプチド配列と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む場合があり、この場合、ＲＸＸＲ開裂配列の一方又は両方は、改変された配列における開裂を防止するように改変される。
【００１１】
本明細書に示す通り、第１のＲＸＸＲ開裂部位又は第２のＲＸＸＲ開裂部位から開始する成熟Ｌｅｆｔｙ  Ａポリペプチド、及びそれらのＮ−又はＣ−末端Ｆｃ融合物は、ミオスタチン結合活性を有する。従って、組換えＬｅｆｔｙポリペプチドは、プロペプチド開裂部位とシステインノットドメイン開始部との間の、領域１に対応する配列の大きさに応じて、「長い」形態（例えば、３４ｋＤａ形態）又は「短い」形態（例えば、２８ｋＤａ形態）である場合がある。長い形態は、開裂を排除し、より長い形態を一貫して生成するように第２のＲＸＸＲ開裂部位が改変されているＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチドである場合がある。長い形態は、細胞系内に第２のＲＸＸＲ開裂部位を保持する配列の発現、又は開裂活性を欠いた培養条件により生成される場合もある。
【００１２】
Ｌｅｆｔｙ誘導体ポリペプチドは、翻訳後修飾のための１つ以上の部位を導入する配列改変を１つ以上含む場合がある。グリコシル化は、好ましい翻訳後修飾であり、このような修飾が、好ましくはＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチドの部分Ｗ、Ｘ又はＹに配置される。
【００１３】
上述の通り、Ｌｅｆｔｙ誘導体ポリペプチドは、アミノ若しくはカルボキシ末端に、又は領域Ｗ、Ｘ若しくはＹの何れかの中に融合した１つ以上の更なるドメインを含む場合がある。本明細書に記載の通り、Ｌｅｆｔｙは、二量体又は多量体形態の強力な拮抗物質であるため、更なるドメインは、二量体化又は多量体化ドメインである場合がある。又、プロペプチドはＬｅｆｔｙ二量体化を媒介する天然の機能を有することから、二量体化ドメインは、短い又は長い形態何れかのＬｅｆｔｙプロペプチド配列を含む場合がある。二量体化ドメインは、Ｆｃドメインである場合がある。二量体化ドメインは、免疫グロブリンＦａｂ定常ドメインを含む場合があり、Ｆａｂ定常ドメインは、例えば免疫グロブリン重鎖定常領域、及び免疫グロブリン軽鎖定常領域から選択される場合がある。例えばロイシンジッパードメイン等のようなその他の二量体化又は多量体化ドメインが選択される場合がある。ロイシンジッパードメインは、少なくとも４つのロイシンヘプタドを含む場合があり、例えばＦｏｓ又はＪｕｎロイシンジッパードメインである場合がある。何れかのＬｅｆｔｙアミノ酸配列と何れかの更なるドメイン（１つ又は複数）の間に、アミノ酸リンカーを介在させる場合がある。更なるドメインは、Ｎｏｄａｌ、ミオスタチン及び／又はＧＤＦ−１１に結合して、好ましくはこれらを阻害するドメインである場合がある。例えば、Ｌｅｆｔｙは、ＢＭＰタンパク質のＩＩ型受容体結合部位を遮断することが予想されることから、Ｉ型受容体（例えば、ＡＬＫ４又はＡＬＫ７）結合部位を遮断する第２のドメインは、Ｌｅｆｔｙ分子の拮抗特性を改善するのに有用であると思われる。Ｎｏｄａｌ、ミオスタチン及び／又はＧＤＦ−１１とＡＬＫ４又はＡＬＫ７との結合を競合的に阻害するドメインは、例えば、（ａ）ＡＬＫ４の細胞外部分；（ｂ）ＡＬＫ７の細胞外部分；（ｃ）Ｎｏｄａｌ、ミオスタチン及び／又はＧＤＦ−１１を結合する抗体の抗原結合部分；並びに（ｄ）Ｎｏｄａｌ、ミオスタチン及び／又はＧＤＦ−１１に結合するように選択されたランダム化ポリペプチドである場合がある。
【００１４】
特定の態様において、組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチドは、例えば蜜蜂メラチンリーダー配列のような、組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチドの分泌を媒介する異種配列を含む。
【００１５】
本開示内容は更に、本明細書に開示したＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換えポリヌクレオチドも提供する。組換えポリヌクレオチドは、Ｌｅｆｔｙ誘導体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に操作可能に結合したプロモーター配列を含む場合がある。このような核酸は、例えば哺乳動物細胞（例えば、ヒト又はＣＨＯ細胞）等の細胞内に導入される場合がある。このような細胞は、組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチドを製造する方法であって、ａ）組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチドをコードする細胞を、該組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチドの発現に好適な条件下で培養して；ｂ）このようにして発現された組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチドを回収することを含む方法で、使用される場合がある。
【００１６】
上述の通り、Ｌｅｆｔｙは、二量体又は多量体形態の強力な拮抗物質として作用することが現在予想されている。このため、第１のＬｅｆｔｙポリペプチド及び第２のＬｅｆｔｙポリペプチドを含み、第１及び第２のＬｅｆｔｙポリペプチドが複合体を形成するように会合し、複合体が、ミオスタチン、Ｎｏｄａｌ及びＧＤＦ−１１からなる群から選択されるＴＧＦ−βファミリーメンバーに結合する、単離されたＬｅｆｔｙポリペプチド複合体が調製される場合がある。Ｌｅｆｔｙポリペプチド複合体は、ヘテロ二量体（若しくは多量体）又はホモ二量体（若しくは多量体）である場合がある。
【００１７】
特定の態様において、本開示内容は、種々のＬｅｆｔｙ誘導体又は二量体Ｌｅｆｔｙポリペプチドの何れかを含む薬学的製剤を提供する。
【００１８】
特定の態様において、本開示内容は、本明細書に開示したＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチドを含むＬｅｆｔｙポリペプチドの新たな使用を提供する。一実施形態において、本開示内容は、筋肉損失又は筋肉増殖不全に関連した障害を有する被験体を処置する方法であって、Ｌｅｆｔｙポリペプチドを含む有効量の組成物を被験体に投与することを含む方法を提供する。別の実施形態において、本開示内容は、神経変性に関連した障害を処置する方法であって、Ｌｅｆｔｙポリペプチドを含む有効量の組成物を被験体に投与することを含む方法を提供する。更なる実施形態において、Ｌｅｆｔｙポリペプチドは、体重減少を促進し、体脂肪量又は体重に関連した障害、例えば肥満症及びＩＩ型糖尿病を処置するのに使用される場合がある。特定の実施形態において、Ｌｅｆｔｙポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでＮｏｄａｌ、ミオスタチン及び／又はＧＤＦ−１１に結合し、及び／又はこれらの活性を阻害するのに使用される場合がある。Ｌｅｆｔｙポリペプチドは、野生型Ｌｅｆｔｙポリペプチド又はその断片、組換えＬｅｆｔｙ誘導体ポリペプチド、並びに二量体化Ｌｅｆｔｙポリペプチドである場合がある。
【００１９】
本開示内容は更に、筋肉組織の異常な量、発達若しくは代謝活性に関連した障害、又は神経変性に関連した障害、又は体脂肪量若しくは体重に関連した障害を処置する医薬品の製造へのＬｅｆｔｙポリペプチドの使用も提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
（発明の詳細な説明）
１．概要
本開示内容は、Ｌｅｆｔｙタンパク質が、ＮｏｄａｌだけでなくＧＤＦ−１１に結合するという発見に関する。ミオスタチンとＧＤＦ−１１の間の配列保存を考慮すると、Ｌｅｆｔｙタンパク質は、ミオスタチン及びＧＤＦ−１１の両方に結合して、これらを阻害することが予想される。本開示内容は又、Ｌｅｆｔｙタンパク質が二量体化又は多量体化した場合に、有力な結合剤なるという驚くべき洞察にも関する。従って、本開示内容は、Ｌｅｆｔｙポリペプチド、並びに二量体又は多量体を形成する融合タンパク質を提供する。更に、本開示内容は、Ｎｏｄａｌ、ミオスタチン及び／又はＧＤＦ−１１を阻害する能力を保持する場合があるＬｅｆｔｙ誘導体を得る際に修飾される場合がある種々のＬｅｆｔｙポリペプチドの領域を提供する。このような誘導体は、例えばタンパク質発現の向上、溶解性の向上、表面に対する非特異的な吸収傾向の低下（「取扱い」の向上）、血清半減期の改善、組織分布の改善、及び免疫原性の低下を含めた、１つ以上の望ましい特徴を示す場合がある。
【００２１】
マウスＬｅｆｔｙ−１及びＬｅｆｔｙ−２遺伝子は、左右（ＬＲ）の解剖学的差が現れる前に、非対称的に発現される（Ｍｅｎｏ  Ｃら、１９９６，  Ｎａｔｕｒｅ  ３８１  ：１５１−１５５；  Ｍｅｎｏ  Ｃら、１９９７，  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ２：５１３−５２４；  Ｍｅｎｏ  Ｃら、１９９８，  Ｃｅｌｌ，  ９４：２８７−２９７）。何れも、胚の左側の底板内及び側板中胚葉内に発現し；Ｌｅｆｔｙ−２は、底板内よりも側板中胚葉内でより強力に発現するのに対して、Ｌｅｆｔｙ−１はこれと逆になる。２つのヒトＬｅｆｔｙタンパク質であるＬｅｆｔｙ−Ａ及びＬｅｆｔｙ−Ｂは、マウスタンパク質と相同であることが同定されている（Ｋｏｓａｋｉら、１９９９，  Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ，  ６４：７１２−７２１）。ヒトにおいて、Ｌｅｆｔｙ−Ａの２つの突然変異は、左右軸形成異常に関連する。Ｌｅｆｔｙ−Ａは又、Ｅｂａｆ（子宮内膜出血関連因子）とも呼ばれる（Ｋｏｔｈａｐａｌｌｉら、１９９７，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，  ９９：２３４２−２３５０）。ヒトＬｅｆｔｙ−Ａ及びＬｅｆｔｙ−Ｂは、アミノ酸配列において９６％同一である。マウスｌｅｆｔｙ−１及びｌｅｆｔｙ−２は、アミノ酸配列において９０％同一である。ヒトＬｅｆｔｙ−Ａは、各マウスｌｅｆｔｙタンパク質と８１％同一であり、ヒトＬｅｆｔｙ−Ｂは、各マウスｌｅｆｔｙタンパク質と８２％同一である。
【００２２】
ＴＧＦ−βファミリーメンバーは、一般的にプレプロタンパク質としてコードされる。これらのタンパク質では、分泌と開裂が行われてシグナル配列が除去され、更に二塩基性又はＲＸＸＲ部位にて開裂して、成熟カルボキシ末端部分とアミノ末端プロペプチド領域の間のペプチド結合が破断する。Ｌｅｆｔｙタンパク質は、カルボキシ末端成熟タンパク質を放出する開裂部位を、推定では１つではなく２つ有しており、細胞培養物中にＬｅｆｔｙの開裂形態が複数見出される。本明細書に示す通り、成熟Ｌｅｆｔｙの長い（３４ｋＤａ）及び短い（２８ｋＤａ）形態は何れも、特定の鍵となる活性を保持する。ＴＧＦ−βファミリーメンバーの中でも、プロペプチドは、異なる機能的属性を有する。プロペプチド部分は、開裂時に放出されて、更なる機能的役割を果たさない場合もあれば、成熟タンパク質と会合して、一般的には成熟部分の生体適合性を向上させる、及び／又は成熟部分の活性を阻害する場合もある。Ｌｅｆｔｙプロペプチドの役割は、現在のところ提案されていない。しかし、本開示内容を鑑みると、Ｌｅｆｔｙポリペプチドのプロペプチド領域は、生理学的条件において、成熟部分と会合して、二量体の形成を媒介する場合があることが予想される。
【００２３】
ＴＧＦ−βファミリーメンバーの成熟部分は一般的に、保存システインノット構造を含む。この構造を、解明されたＢＭＰ−７の構造から推定して、図１に示す。システインノットは、ループ１及びループ２と呼ばれる、ＩＩ型受容体結合に関与する２つのループを含む。第三の領域は、Ｉ型受容体結合に関与するアミノ酸、α−ヘリックス、並びにホモ又はヘテロ二量体の形成及びこのような二量体の共有結合安定化に通常必須となる保存システインを含む（Ｔｈｉｓｓｅ  Ｃら、１９９９，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  １２６：２２９−２４０；  Ｍｅｎｏ  Ｃら、１９９６，  Ｎａｔｕｒｅ  ３８１  ：１５１−１５５；  Ｍｅｎｏ  Ｃら、１９９７，  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ２：５１３−５２４）。通常の場合、ＴＧＦ−βリガンドとＩ型及びＩＩ型受容体との結合によって、標準的なＴＧＦ−βシグナル伝達経路が活性化され、これは一般的に１つ以上のＳＭＡＤタンパク質の活性化により特徴付けられる。Ｌｅｆｔｙタンパク質は、ＴＧＦ−βファミリーの非定型メンバーである。他の殆どのＴＧＦ−βファミリーメンバーとは異なり、Ｌｅｆｔｙタンパク質は、α−ヘリックス、及び二量体化を媒介する保存システインを有さない。そのため、発表されている殆どの報告では、Ｌｅｆｔｙタンパク質が単量体であると記載されている（例えば、Ｓａｋｕｍａら、２００２を参照）。従って、Ｌｅｆｔｙタンパク質が二量体形態の標的分子に結合し、天然において二量体構造の生理学的役割を果たす場合があるいう本開示内容の洞察は驚くべきものである。
【００２４】
ＴＧＦ−βファミリーのメンバーは数多くが、標準的なＴＧＦ−β受容体リガンドシグナル伝達経路の拮抗物質として作用する。拮抗物質のＤａｎファミリーは、保存システインノットドメインを有する。これらのタンパク質は二量体化して、ＴＧＦ−βファミリーの標的リガンドに結合し、そのリガンドにより媒介されるシグナル伝達を阻害する。別の拮抗物質であるＮｏｇｇｉｎも同様に機能する。これらの拮抗物質を本明細書では「トラップ」と呼ぶ。
【００２５】
Ｌｅｆｔｙは拮抗物質としても作用する。遺伝学的証拠では、ＬｅｆｔｙがＮｏｄａｌの拮抗物質として機能することが示唆されている。胚のパターン形成において、ＬｅｆｔｙはＮｏｄａｌ活性の範囲及び持続時間を制限すると考えられている（例えば、Ｍｅｎｏ  Ｃら、１９９９，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ，  ４：２８７−２９８）。Ｌｅｆｔｙにより誘導されるＮｏｄａｌシグナル伝達の阻害は、過剰なＡｃｔＲＩＩＡ又はＡｃｔＲＩＩＢにより救済されており、Ｌｅｆｔｙが、共通する受容体であるＡｃｔＲＩＩＡ又はＡｃｔＲＩＩＢへの競合的結合を介してＮｏｄａｌシグナル伝達に拮抗することが示唆されている（Ｓａｋｕｍａら、２００２，  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ７：４０１−４１２）。この拮抗作用様式は、Ｌｅｆｔｙの推定される単量体的性質と一致しており、「トラップ」タンパク質において提案される機序とは異なる拮抗作用のモデルを示す。１つの報告書では、ＬｅｆｔｙがＮｏｄａｌに直接結合することが報告されている（Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｓｈｅｎ，  ２００４，  Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．  １４：  ６１８−６２４）。
【００２６】
本開示内容では、ＬｅｆｔｙがＴＧＦ−βファミリーの多数のリガンドに直接結合して、これらと拮抗し、これを二量体として行う場合があるという発見を報告する。従って、本開示内容は、Ｎｏｄａｌ、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）及び／又はＧＤＦ−１１の機能を阻害するＬｅｆｔｙポリペプチドを提供する。本開示内容は更に、Ｎｏｄａｌ、ミオスタチン及び／又はＧＤＦ−１１を阻害する能力を保持する天然のＬｅｆｔｙポリペプチドの変異体及び断片である、Ｌｅｆｔｙポリペプチド誘導体を提供する。このような誘導体の例には、ＬｅｆｔｙのＮ−末端切断バージョン、領域１、３及び５の何れか又は全てに改変を含むＬｅｆｔｙポリペプチド（図１〜４を参照）、Ｌｅｆｔｙのグリコシル化（又はその他の翻訳後修飾）形態、並びに本明細書に開示する種々のＬｅｆｔｙポリペプチドの何れかを含む融合タンパク質を含む。これらのいわゆる「Ｌｅｆｔｙ誘導体」は、Ｎｏｄａｌ、ミオスタチン及び／又はＧＤＦ−１１活性の望ましくないレベルにより少なくとも部分的に特徴付けられる病態の重症度を軽減するのに使用してもよい。例えば、本開示内容に記載の薬学的製剤は、神経又は筋肉機能に関連した種々の障害を予防若しくは回復する、又はこれらの重症度を軽減するのに有効な量で投与してもよい。
【００２７】
本明細書で使用される用語は一般的に、本開示内容の文脈、及び各用語が使用される特定の文脈において、当該技術分野で通常使用される意味を有する。本開示内容の組成物及び方法並びにそれらの製造及び使用方法を実践者が説明するに当たっての更なる手引きとして、特定の用語を以下又は本明細書の他の箇所で考察する。用語の任意の使用の範囲及び意味は、該用語が使用される特定の文脈から明らかとなるであろう。
【００２８】
「約」及び「およそ」とは一般的に、測定の性質又は精度を鑑みて、測定された量で許容される誤差の程度を意味するものとする。一般的に、代表的な誤差の程度は、所定の値又は値の範囲の２０パーセント（％）以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内である。
【００２９】
或いは、特に生体系において、「約」及び「およそ」という用語は、所定の値の１オーダー以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内の値を意味する場合がある。本明細書に示される数多くの数量は、特に指示がない限り近似値であり、明示的な記載がなくても「約」又は「およそ」の用語を想定してもよいことを意味する。
【００３０】
本開示内容の方法は、１つ以上の突然変異／配列変異体の野生型配列を含めた、互いの配列を比較する手順を含む場合がある。このような比較は一般的に、例えば当該技術分野で周知の配列アラインメントプログラム及び／又はアルゴリズム（例えば、数例を挙げるとＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びＭＥＧＡＬＩＧＮ）を使用して、ポリマー配列をアラインすることを含む。当業者であれば、このようなアラインメントにおいて、突然変異が残基の挿入又は削除を含む場合に、配列アラインメントでは、挿入又は削除された残基を含まないポリマー配列内に、「ギャップ」（通常、ダッシュ又は「Ａ」で表される）を導入することを容易に理解することができる。
【００３１】
「相同」とは、同じ生物種内のスーパーファミリーに由来するタンパク質、並びに異なる生物種に由来する相同タンパク質を含めた、共通する進化的起源を有する２つのタンパク質又は核酸の間の関係を指す。このようなタンパク質（及びそれらをコードする核酸）は、同一性パーセント、又は特定の残基若しくはモチーフ及び保存された位置の存在の何れかの点から、それらの配列類似性により反映される配列相同性を有する。
【００３２】
「配列類似性」という用語は、共通する進化的起源を共有する場合もあれば、共有しない場合もある核酸又はアミノ酸配列間の同一性又は一致の程度を指す。
【００３３】
核酸分子は、温度及び溶液イオン強度の適切な条件下で、核酸分子の一本鎖形態が他の核酸分子に対してアニールできる場合、別の核酸分子、例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はＲＮＡに「ハイブリダイズ可能」である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９８９）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．  Ｙ．を参照）。温度及びイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。相同核酸の予備スクリーニングでは、５５℃のＴｍ（融点）に対応する低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件（例えば、５×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、０．２５％ミルク、及びホルムアミドなし；又は３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ）を使用してもよい。
【００３４】
中ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、より高いＴｍに対応する（例えば、４０％ホルムアミド、５×又は６×ＳＳＣ）。高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、最高のＴｍに対応する（例えば、５０％ホルムアミド、５×又は６×ＳＳＣ）。ＳＳＣは、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａである。
【００３５】
「高ストリンジェンシー条件」とは、構造的に関連するが、構造的に異種ではない核酸のハイブリダイゼーションが可能なハイブリダイゼーション条件を包含するものとして理解される。「ストリンジェンシー」という用語は、高い相補性を有する核酸のみアニーリングが可能な、幾つかの代替となるハイブリダイゼーション及び洗浄条件の何れかを説明するものとして当業者により理解される、当該技術分野の用語である。
【００３６】
代表的な高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約１Ｍの塩中で形成されるＤＮＡ二重鎖の融点（Ｔｍ）よりも約２０〜２７℃低い温度に相当する。同等な手順は数多く存在しており、幾つかの著名な分子クローニングの手引き書において、ストリンジェントなハイブリダイゼーションに好適な条件が解説されおり、更にこれらの条件下で安定していると予想されるハイブリッドの長さの計算式も示されている（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎ．Ｙ．  （１９８９），  ６．３．１−６  ｏｒ  １３．３．６；又はＳａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  ｐａｇｅｓ  ９．４７−９．５７を参照）。
【００３７】
ハイブリダイゼーションでは、２つの核酸が相補的な配列を含むことが必要とされているが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基の不一致も許容される。核酸のハイブリダイズに適切なストリンジェンシーは、当該技術分野で周知の変数である、核酸の長さ及び相補性の程度により異なる。２つのヌクレオチド配列間の類似性又は相同性が大きいほど、これらの配列を有する核酸のハイブリッドのＴｍ値も大きくなる。（より高いＴｍに対応する）核酸ハイブリダイゼーションの相対的な安定性は、以下の順に低くなる：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。１００ヌクレオチド長を超えるハイブリッドに関しては、Ｔｍの計算式が導き出されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ｓｕｐｒａ，  ９．５１を参照）。より短い核酸、即ちオリゴヌクレオチドを使用したハイブリダイゼーションの場合には、不一致の位置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ｓｕｐｒａ，  １１．８を参照）。ハイブリダイズ可能な核酸の最小長さは、少なくとも約１０ヌクレオチド；好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチド；より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドである。
【００３８】
指示がない限り、「標準的なハイブリダイゼーション条件」という用語は、約５５℃のＴｍを指し、上述のような条件を使用する。好ましい実施形態において、Ｔｍは６０℃にてあり；より好ましい実施形態において、Ｔｍは６５℃にてある。特定の実施形態において、「高ストリンジェンシー」とは、０．２×ＳＳＣ中６８℃の、又は５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ中４２℃のハイブリダイゼーション及び／若しくは洗浄条件、又はこれら２つの何れかの条件下で観察されるものと等価のハイブリダイゼーションレベルが得られる条件を指す。
【００３９】
オリゴヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマー）に好適なハイブリダイゼーション条件は、オリゴヌクレオチドの融点がより低いため、一般的には完全長の核酸（例えば、完全長ｃＤＮＡ）と幾分異なる。オリゴヌクレオチドの融点は、関与するオリゴヌクレオチド配列の長さにより異なるため、好適なハイブリダイゼーション温度は、使用するオリゴヌクレオチド分子により異なる。代表的な温度は、３７℃（１４塩基オリゴヌクレオチドの場合）、４８℃（１７塩基オリゴヌクレオチドの場合）、５５℃（２０塩基オリゴヌクレオチドの場合）及び６０℃（２３塩基オリゴヌクレオチドの場合）である場合がある。オリゴヌクレオチドに適切な代表的なハイブリダイゼーション条件には、６×ＳＳＣ、０．０５％ピロリン酸ナトリウム中での洗浄、又は等価なハイブリダイゼーションレベルが得られるその他の条件が含まれる。
【００４０】
酵素を含むタンパク質又はポリペプチドは、これらが天然に生じることを意味する「天然」若しくは「野生型」である場合もあれば；これらが予め製造、改変、誘導されているか、又は天然のタンパク質若しくは別の突然変異とは何らかの点で異なるか、若しくはこれらから変化していることを意味する「突然変異」、「変異体」、若しくは「修飾体」である場合もある。
【００４１】
「Ｌｅｆｔｙタンパク質」又は「Ｌｅｆｔｙポリペプチド」とは、例えばマウスＬｅｆｔｙタンパク質又はヒトＬｅｆｔｙタンパク質等の哺乳動物Ｌｅｆｔｙタンパク質、及び何れかのＬｅｆｔｙ誘導体を含めた、哺乳動物Ｌｅｆｔｙタンパク質の配列相同性及び機能的属性を共有するその他のタンパク質を指す。Ｌｅｆｔｙタンパク質の代表的なアミノ酸配列には以下が含まれる。
【００４２】
マウスＬｅｆｔｙ−１タンパク質（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ  ＮＰ＿０３４２２４）（配列番号３）：
【００４３】
【化１】
2009502121.tif 000002
マウスＬｅｆｔｙ−２タンパク質（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ  ＮＰ＿７９６０７３）（配列番号４）：
【００４４】
【化２】
2009502121.tif 000003
ヒトＬｅｆｔｙ−Ａタンパク質（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ  ＮＰ＿００３２３１）（配列番号１）：
【００４５】
【化３】
2009502121.tif 000004
ＲＸＸＲ開裂部位には、下線が引いてある。システインノットドメインには、二重下線が引いてある。
【００４６】
ヒトＬｅｆｔｙ−Ｂタンパク質（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ  ＮＰ＿０６６２７７）（配列番号２）：
【００４７】
【化４】
2009502121.tif 000005
ＲＸＸＲ開裂部位には、下線が引いてある。システインノットドメインには、二重下線が引いてある。
【００４８】
マウスＬｅｆｔｙ−１  ｃＤＮＡ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ  ＮＭ＿０１００９４）（配列番号１３）：
【００４９】
【化５】
2009502121.tif 000006
マウスＬｅｆｔｙ−２  ｃＤＮＡ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ  ＮＭ＿１７７０９９）（配列番号１４）：
【００５０】
【化６】
2009502121.tif 000007
【００５１】
【化７】
2009502121.tif 000008
ヒトＬｅｆｔｙ−Ａ  ｃＤＮＡ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ  ＮＭ＿００３２４０）（配列番号１５）：
【００５２】
【化８】
2009502121.tif 000009
【００５３】
【化９】
2009502121.tif 000010
ヒトＬｅｆｔｙ−Ｂ  ｃＤＮＡ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ  ＮＭ＿０２０９９７）（配列番号１６）：
【００５４】
【化１０】
2009502121.tif 000011
Ｌｅｆｔｙタンパク質は、全ての哺乳動物を含めたその他の種にも存在することが予想される。
【００５５】
特に明記されない限り、「Ｌｅｆｔｙポリペプチド」には、野生型（天然の対立遺伝子を含む）、及び例えばＮｏｄａｌ、ミオスタチン又はＧＤＦ−１１等のＴＧＦ−βファミリーメンバーの活性を阻害する能力を保持する、Ｌｅｆｔｙの種々の切断バージョン及び変異体バージョンを含めた改変（「誘導体」）Ｌｅｆｔｙ形態の両方が含まれる。
【００５６】
本明細書で使用される「Ｌｅｆｔｙ活性」という用語は、本開示内容のＬｅｆｔｙタンパク質により示される１つ以上の活性を指す。より具体的には、「Ｌｅｆｔｙ活性」は、Ｎｏｄａｌ、ミオスタチン及びＧＤＦ−１１の１つ以上に結合する能力を含む。
【００５７】
「特異的に結合する」という用語は、標的分子を含まない組成物に関する、リガンドの全て又は一部と特定の標的分子（即ち、「結合パートナー」又は「結合部分」）との優先的な会合の言及を含む。勿論、本発明のＬｅｆｔｙポリペプチドとその他の非標的タンパク質との間に、ある程度の非特異的な相互作用が生じる場合があることが認められる。一般的には、特異的な結合によって、Ｌｅｆｔｙポリペプチドと標的タンパク質（例えば、Ｎｏｄａｌ、ミオスタチン及び／又はＧＤＦ−１１）の間に、Ｌｅｆｔｙポリペプチドと他のタンパク質の間よりも強い会合が生じる。
【００５８】
２．  Ｌｅｆｔｙ誘導体
本開示内容は、Ｌｅｆｔｙタンパク質の新規の誘導体を提供する。「Ｌｅｆｔｙ誘導体」という用語には、既知のＬｅｆｔｙタンパク質の改変された形態、例えば変異誘発、挿入又は削除により誘導される変異体、及びＬｅｆｔｙタンパク質の断片が含まれ、これらの変異体は、Ｎｏｄａｌ、ミオスタチン及び／又はＧＤＦ−１１の結合活性を保持する。Ｌｅｆｔｙ誘導体には、本明細書で詳述するタンパク質を含めた、既知のＬｅｆｔｙタンパク質と構造的及び／又は機能的類似性を共有するタンパク質も含まれる。このようなタンパク質は、ヒト若しくはマウスＬｅｆｔｙの完全長、成熟部分、又は少なくとも領域２及び領域４内において、ヒト又はマウスＬｅｆｔｙタンパク質と有意な配列同一性（例えば、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％又はそれ以上）を共有するアミノ酸配列を有する場合がある。Ｌｅｆｔｙ誘導体には又、ヒト又はマウスＬｅｆｔｙのコード配列、特に成熟部分、特に領域２及び領域４のコード配列の部分とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質も含まれる。「Ｌｅｆｔｙ誘導体」という用語からは、配列番号１〜４の何れも除外される。
【００５９】
図１〜５に示す通り、Ｌｅｆｔｙタンパク質は、シグナル配列、プロペプチド及び成熟部分を含む部分に分割される場合がある。成熟部分は、５つの領域を有すると考えられる。領域１は、Ｃ１（システインノットドメインの第１システイン）のＮ−末端である成熟ポリペプチドの部分である。領域２及び領域４は、ループＡ及びループＢに対応し、リガンド結合（例えばＮｏｄａｌ、ミオスタチン及びＧＤＦ−１１等のリガンド）に関与する。Ｌｅｆｔｙタンパク質の領域３は、αヘリックス、及び分子間架橋に関与するシステインを有さない。領域５は、システインノットドメインの最終システインのＣ−末端である部分である。プロペプチドは、上流（Ｎ−末端）又は下流ＲＸＸＲ開裂部位のどちらが使用されるかによって、それぞれ長くなるか短くなる。反対に、成熟部分は、プロペプチドと共に発現した場合、どちらのＲＸＸＲ開裂部位が使用されるかによって、それぞれ短くなるか長くなる。
【００６０】
領域２及び領域４は、Ｎｏｄａｌ、ミオスタチン及びＧＤＦ−１１への結合を媒介することから、リガンド結合が保持される限りは、領域１、領域３及び領域５の何れかが改変される場合があることが予想される。又、リガンド結合活性を保持するＬｅｆｔｙ誘導体において、基本的なシステインノット構造が一般的に保存されることも予想される。
【００６１】
その他の種に由来するＬｅｆｔｙタンパク質、特に哺乳動物のＬｅｆｔｙタンパク質は、例えばＰＣＲ、低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション、又は標的の種内で同定されたＬｅｆｔｙホモログと抗体とを交差反応させる、発現ライブラリーの抗体媒介によるスクリーニングといった、標準的な分子生物学のプロトコルにより容易に得られる。
【００６２】
特定の実施形態において、Ｌｅｆｔｙポリペプチドの単離された断片は、Ｌｅｆｔｙポリペプチドをコードする核酸の対応する断片から組換えにより生成したポリペプチドをスクリーニングすることによって得られる（例えば、配列番号１３〜１６）。更に、断片は、例えば従来のＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄによる固相ｆ−Ｍｏｃ又はｔ−Ｂｏｃ法といった、当該技術分野で既知の技法を使用して、化学的に合成することもできる。断片は（組換え又は化学合成により）製造することができ、且つＮｏｄａｌ、ミオスタチン及び／又はＧＤＦ−１１に結合する作用を有するペプチジル断片を同定する試験、又は例えば筋肉増殖の刺激といった細胞ベースの活性に関する試験を行うことができる。
【００６３】
特定の実施形態において、Ｌｅｆｔｙ誘導体は、配列番号１〜４、９、１０、１１、１２又は２２の何れかに示すようなアミノ酸配列と少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を有する。特定の場合において、Ｌｅｆｔｙ誘導体は、配列番号１〜４、９、１０、１１、１２又は２２の何れかに示すようなアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を有する。好ましくは、このような変異体は、Ｎｏｄａｌ、ミオスタチン及び／又はＧＤＦ−１１に結合する能力を保持する。
【００６４】
特定の実施形態において、本発明は、Ｌｅｆｔｙポリペプチドの構造を修飾することによって機能性Ｌｅｆｔｙ誘導体を製造することを考慮する。このような修飾は、例えば治療効果又は安定性（例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏでの有効期間、及びｉｎ  ｖｉｖｏでのタンパク質分解耐性）を高めるといった目的で行なわれる場合がある。Ｌｅｆｔｙ誘導体は又、例えばアミノ酸の置換、削除又は追加によっても生成することができる。例えば、ロイシンからイソロイシン又はバリンへの、アスパラギン酸からグルタミン酸への、スレオニンからセリンへの単独の代替、又は任意のアミノ酸から構造的に関連するアミノ酸（例えば、保存的突然変異）への同様の代替には、得られる分子の生物学的活性に大きな影響は及ぼさないことが合理的に予想される。保存的代替は、側鎖において関連するアミノ酸のファミリー内で行われる代替である。Ｌｅｆｔｙ誘導体のアミノ酸配列の変化によって機能性ホモログがもたらされるかどうかは、変異体プロペプチドが野生型Ｌｅｆｔｙと同様に細胞内で応答を生成する能力、又はリガンドに結合する能力を評価することにより容易に判定することができる。
【００６５】
特定の実施形態において、本発明は、Ｌｅｆｔｙ配列のタンパク質開裂部位に突然変異を行い、該部位がタンパク質開裂を受けにくくなるようにすることを考慮する。タンパク質開裂部位は、コンピュータ解析（市販のソフトウェア（例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ，  Ｏｍｅｇａ，  ＰＣＧｅｎｅ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ，  Ｉｎｃ．）を使用）を使用して同定することができる。当業者により認識されるように、記載した突然変異、変異体又は修飾の殆どは、核酸レベルで、又は場合により翻訳後修飾若しくは化学合成により生成される場合がある。このような技法は、当該技術分野で周知である。
【００６６】
特定の実施形態において、本発明は、ポリペプチドのグリコシル化を改変するためにＬｅｆｔｙ配列の特定の突然変異を考慮する。このような突然変異は、例えばＯ結合又はＮ結合グリコシル化部位といった、１つ以上のグリコシル化部位を導入又は排除するために選択される場合がある。アスパラギン結合グリコシル化認識部位は一般的に、適切な細胞内グリコシル化酵素により特異的に認識されるトリペプチド配列である、アスパラギン−Ｘ−スレオニン（この場合「Ｘ」は、任意のアミノ酸である）を含む。改変は、野生型Ｌｅｆｔｙの配列（Ｏ結合グリコシル化部位の場合）の１つ以上のセリン又はスレオニン残基の追加、又はこれによる置換によっても行われる場合がある。グリコシル化認識部位の第１又は第三のアミノ酸位置の一方又は両方における種々のアミノ酸置換又は削除（及び／又は第２の位置におけるアミノ酸削除）によって、修飾されたトリペプチド配列における非グリコシル化が行われる。Ｌｅｆｔｙポリペプチドの糖部分の数を増やす別の手段としては、グリコシドをＬｅｆｔｙポリペプチドに化学又は酵素結合させる方法がある。使用する結合様式によって、糖は、（ａ）アルギニン及びヒスチジン；（ｂ）遊離カルボキシル基；（ｃ）例えばシステイン等の遊離スルフヒドリル基；（ｄ）例えばセリン、スレオニン、若しくはヒドロキシプロリン等の遊離ヒドロキシル基；（ｅ）例えばフェニルアラニン、チロシン、若しくはトリプトファン等の芳香族残基；又は（ｆ）グルタミンのアミド基に結合する場合がある。Ｌｅｆｔｙポリペプチド上に存在する１つ以上の糖部分は、化学的に及び／又は酵素的に除去される場合がある。化学的な脱グリコシル化は、例えば、化合物トリフルオロメタンスルホン酸、又は等価化合物へのＬｅｆｔｙポリペプチの暴露を伴う場合がある。この処理により、結合糖（Ｎ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクトサミン）を除いた殆ど又は全ての糖が開裂される一方で、アミノ酸配列はそのままの状態が維持される。化学的な脱グリコシル化については、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ２５９：５２；及びＥｄｇｅ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８１）  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １１８：１３１に詳述されている。Ｌｅｆｔｙポリペプチド上の糖部分の酵素開裂は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １３８：３５０に記載されているような、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを使用することにより達成される場合がある。プロペプチドの核酸及び／又はアミノ酸配列は、哺乳動物、酵母、昆虫及び植物細胞が全て、ペプチドのアミノ酸配列による影響を受ける可能性がある異なるグリコシル化パターンを導入する場合があることから、使用する発現系の種類に応じて適宜調整される場合がある。
【００６７】
Ｌｅｆｔｙ−Ａで行うことができる配列修飾の例を、以下に示す。
【００６８】
【化１１】
2009502121.tif 000012
第１及び第２の開裂部位には、下線が引いてある。一緒に、個別に、又は組み合わせて使用される場合がある可能な改変は、改変するアミノ酸に続けて括弧内に示す。このバージョンにおいて、ポリペプチドは、第１の部位で開裂されて、太字フォントのフェニルアラニン（Ｆ）で開始する３４ｋＤａのＬｅｆｔｙ−Ａポリペプチドが生じる。第２のＲＸＸＲ開裂部位は、開裂を排除する（例えば、ＲからＧへの改変）又は開裂を排除してグリコシル化部位を導入する（図示したその他の変化）ために改変される場合がある。その他の突然変異は、領域１及び領域３のＣ−末端にグリコシル化部位を導入することが示されている。配列番号２〜４の何れかにも、類似の突然変異が生成される場合がある。
【００６９】
本開示内容は、Ｌｅｆｔｙポリペプチドのコンビナトリアル突然変異のセット、及び切断型突然変異を含む突然変異を生成する方法を考慮する。コンビナトリアル突然変異のプールは、機能性変異体配列の同定に特に有用である。このようなコンビナトリアルライブラリーのスクリーニングは、例えば、Ｎｏｄａｌ、ミオスタチン及び／又はＧＤＦ−１１の拮抗物質として作用し得るＬｅｆｔｙ誘導体を生成することを目的とする場合がある。例えば、Ｌｅｆｔｙポリペプチド変異体は、Ｎｏｄａｌ、ミオスタチン及び／若しくはＧＤＦ−１１ポリペプチドに結合する能力、或いは例えばＡｃｔＲＩＩＡ若しくはＢのような受容体を発現する細胞へのＮｏｄａｌ、ミオスタチン及び／若しくはＧＤＦ−１１の結合を防止する能力に関してスクリーニングされる場合がある。Ｌｅｆｔｙポリペプチド変異体の活性は、細胞ベースの試験又はｉｎ  ｖｉｖｏ試験で試験される場合もある。例えば、筋細胞増殖又はミオスタチン感受性プロモーターに関与する遺伝子の発現に対する、Ｌｅｆｔｙポリペプチド変異体の効果が評価される場合がある。同様に、Ｌｅｆｔｙポリペプチドがマウス又はその他の動物に投与されて、１つ以上の骨質、例えば密度又は容積等が評価される場合がある。骨折の治癒率も評価される場合がある。ミオスタチン、Ｎｏｄａｌ又はＧＤＦ−１１の何れかによる遺伝子発現変化に対するＬｅｆｔｙポリペプチドの効果が評価される場合がある。例えば、Ａ−２０４レポーター遺伝子試験は、ＧＤＦ−１１及びミオスタチン又はその他のＴＧＦ−βファミリーメンバーによるシグナル伝達に対するＬｅｆｔｙポリペプチドの効果を評価するために使用される場合がある。細胞系（例えば、ヒト横紋筋肉腫細胞系）は、ＴＧＦ−βシグナル伝達感受性調節要素（例えば、Ｄｅｎｎｌｅｒら、１９９８，  ＥＭＢＯ  １７：  ３０９１−３１００に記載のｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２）の誘導下で、レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）を配置するレポーターベクターでトランスフェクトされる場合がある。ＣＡＧＡ１２モチーフは、ＴＧＦ−β応答遺伝子（ＰＡＩ−１遺伝子）に存在し、この種のベクターは、Ｓｍａｄ２及び３を介してシグナル伝達する因子に一般的に使用されている。Ｌｅｆｔｙポリペプチドは、レポーター遺伝子活性に対する効果について試験される場合がある。
【００７０】
組み合わせにより誘導される変異体は、天然のＬｅｆｔｙポリペプチドに対して選択的効能を有するものを生成することができる。同様に、変異誘発によって、対応する野生型プロペプチドとは劇的に異なる細胞内半減期を有する変異体を生じさせることができる。例えば、改変したタンパク質は、タンパク質分解に対してより安定したものにすることもできれば、より不安定なものにすることもできる。
【００７１】
コンビナトリアルライブラリーは、それぞれ潜在的なＬｅｆｔｙポリペプチド配列の少なくとも一部を含むポリペプチドのライブラリーをコードする遺伝子の縮重ライブラリーによって生成される場合がある。例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物は、遺伝子配列内に酵素的に連結して、潜在的なＬｅｆｔｙポリペプチドヌクレオチド配列の縮重セットが、個々のポリペプチドとして、或いはより大きな融合タンパク質のセット（例えば、ファージディスプレイのため）として発現することができる。
【００７２】
縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的なホモログのライブラリーを生成することができる方法は数多く存在する。縮重遺伝子配列の化学合成は自動ＤＮＡ合成装置で行うことができ、次いで、発現に適切なベクターに合成遺伝子を連結することができる。縮重オリゴヌクレオチドの合成は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ，  ＳＡ  （１９８３）  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら、（１９８１）  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，  Ｐｒｏｃ．  ３ｒｄ  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｓｙｍｐｏｓ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，  ｅｄ．  ＡＧ  Ｗａｌｔｏｎ，  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  ｐｐ２７３−２８９；Ｉｔａｋｕｒａら、（１９８４）  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら、（１９８４）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：  １０５６；Ｉｋｅら、（１９８３）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １１：４７７を参照）。このような技法は、その他のタンパク質の定向進化法で使用されている（例えば、Ｓｃｏｔｔら、（１９９０）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０；Ｒｏｂｅｒｔｓら、（１９９２）  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８９：２４２９−２４３３；Ｄｅｖｌｉｎら、（１９９０）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：  ４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａら、（１９９０）  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８７：  ６３７８−６３８２；並びに米国特許第５，２２３，４０９号、米国特許第５，１９８，３４６号、及び米国特許第５，０９６，８１５号を参照）。
【００７３】
或いは、変異誘発のその他の形態を使用して、コンビナトリアルライブラリーを生成するも可能である。例えば、Ｌｅｆｔｙポリペプチド変異体は、例えばアラニン走査変異誘発等を使用したスクリーニングにより（Ｒｕｆら、（１９９４）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３  ：  １５６５−１５７２；Ｗａｎｇら、（１９９４）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９：３０９５−３０９９；Ｂａｌｉｎｔら、（１９９３）  Ｇｅｎｅ  １３７：１０９−１１８；Ｇｒｏｄｂｅｒｇら、（１９９３）  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２１８：５９７−６０１；Ｎａｇａｓｈｉｍａら、（１９９３）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６８：２８８８−２８９２；Ｌｏｗｍａｎら、（１９９１）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０８３２−１０８３８；及びＣｕｎｎｉｎｇｈａｍら、（１９８９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５）；リンカー走査変異誘発により（Ｇｕｓｔｉｎら、（１９９３）  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９３：６５３−６６０；Ｂｒｏｗｎら、（１９９２）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １２：２６４４−２６５２；ＭｃＫｎｉｇｈｔら、（１９８２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：３１６）；飽和変異誘発により（Ｍｅｙｅｒｓら、（１９８６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：６１３）；ＰＣＲ変異誘発により（Ｌｅｕｎｇら、（１９８９）  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １：１１−１９）；又は化学的変異誘発等を含めたランダム変異誘発により（Ｍｉｌｌｅｒら、（１９９２）  Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ；及びＧｒｅｅｎｅｒら、（１９９４）  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ７：３２−３４）、ライブラリーから生成及び単離することができる。特にコンビナトリアル設定におけるリンカー走査変異誘発は、Ｌｅｆｔｙポリペプチドの開裂（生理活性）形態を同定する魅力的な方法である。
【００７４】
点突然変異及び切断により形成されるコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングする技法、更には、特定の特性を有する遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする技法は、当該技術分野で幅広く知られている。このような技法は一般的に、Ｌｅｆｔｙポリペプチドのコンビナトリアル変異誘発により生成される遺伝子ライブラリーの高速スクリーニングに適合させることができる。多くの遺伝子ライブラリーのスクリーニングに最も広く使用されている技法は一般的に、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクター内にクローニングし、得られたベクターのライブラリーで適切な細胞を形質転換し、所望の活性を検出することによって、検出した産物の遺伝子をコードするベクターの比較的容易な単離が促進される条件下で、組み合わせ遺伝子を発現させることを含む。以下に記載する例示的な試験は何れも、コンビナトリアル変異誘発法により形成される膨大な縮重配列のスクリーニングで必要とされるような、高スループットの解析を適用することができる。
【００７５】
特定の実施形態において、本発明のＬｅｆｔｙポリペプチドは、ペプチド模倣薬を含む。本明細書で使用される「ペプチド模倣薬」という用語は、化学的に修飾されたペプチド、並びに非天然のアミノ酸、ペプトイド等を含むペプチド様分子を含む。ペプチド模倣薬は、被験体に投与された場合に安定性が向上することを含めて、ペプチドを超える種々の利点を提供する。ペプチド模倣薬を同定する方法は、当該技術分野で周知であり、潜在的なペプチド模倣薬のライブラリーを含むデータベースのスクリーニングを含む。例えば、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅは、既知の結晶構造を有する３００，０００を超える化合物のコレクションを含む（Ａｌｌｅｎら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｂ，  ３５：２３３１  （１９７９））。標的分子の結晶構造が得られない場合は、例えばＣＯＮＣＯＲＤプログラムを使用して構造を生成することができる（Ｒｕｓｉｎｋｏら、Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｆ．  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｓｃｉ．  ２９：２５１  （１９８９））。別のデータベースであるＡｖａｉｌａｂｌｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；米国カリフォルニア州サンロレンゾ）は、市販の約１００，０００の化合物を含んでおり、Ｌｅｆｔｙポリペプチドの潜在的なペプチド模倣薬を同定するために検索することができる。例えば、このような残基の非加水分解性ペプチド類似体は、ベンゾジアゼピン（例えば、Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇ．Ｒ．  Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｄ．，  ＥＳＣＯＭ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：  Ｌｅｉｄｅｎ，  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，  １９８８を参照）、アゼピン（例えば、Ｈｕｆｆｍａｎら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇ．Ｒ．  Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｄ．，  ＥＳＣＯＭ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：  Ｌｅｉｄｅｎ，  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，  １９８８を参照）、置換γラクタム環（Ｇａｒｖｅｙら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇ．Ｒ．  Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｄ．，  ＥＳＣＯＭ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：  Ｌｅｉｄｅｎ，  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，  １９８８）、ケト−メチレン擬ペプチド（Ｅｗｅｎｓｏｎら、（１９８６）  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ２９：２９５；及びＥｗｅｎｓｏｎら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  （Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ９ｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ）  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．  Ｒｏｃｋｌａｎｄ，  ＩＬ，  １９８５）、ｂ−ターン・ジペプチドコア（Ｎａｇａｉら、（１９８５）  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２６：６４７；及びＳａｔｏら、（１９８６）  Ｊ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ  １  ：１２３１）、及びｂ−アミノアルコール（Ｇｏｒｄｏｎら、（１９８５）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １２６：４１９；及びＤａｎｎら、（１９８６）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １３４：７１）を使用して生成することができる。
【００７６】
特定の実施形態において、本発明のＬｅｆｔｙポリペプチドは、プロペプチドに天然に存在するものに加えて、更に翻訳後修飾を含む場合がある。このような修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、及びアシル化が含まれるが、これらに限定されない。その結果、修飾されたＬｅｆｔｙポリペプチドは、非アミノ酸要素、例えばポリオキシアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール）、脂質、多糖又は単糖、及びリン酸を含む場合がある。このような非アミノ酸要素がＬｅｆｔｙポリペプチドの機能性に及ぼす効果は、本明細書に記載の通り試験される場合がある。Ｌｅｆｔｙポリペプチドの新生形態を開裂することにより細胞内でＬｅｆｔｙポリペプチドが生成される場合、翻訳後プロセシングは、タンパク質の適切な折り畳み及び／又は機能に重要な場合もある。異なる細胞（例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、ＮＩＨ−３Ｔ３又はＨＥＫ２９３）は、このような翻訳後活性の特定の細胞機構及び特徴的な機序を有し、Ｌｅｆｔｙポリペプチドの適切な修飾及びプロセシングを確実にするように選択される場合がある。
【００７７】
Ｌｅｆｔｙポリペプチドは、種々のものが融合タンパク質として調製される場合がある。融合タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける半減期、取込み／投与、組織の局在化若しくは分布、タンパク質複合体の形成、及び／又は精製の１つ以上を改善する、１つ以上の更なるポリペプチド部分を含む場合がある。例えば、融合タンパク質は、免疫グロブリンＦｃドメイン、並びに／又はエピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジン配列、及びＧＳＴ融合から選択される精製サブ配列を含む場合がある。Ｌｅｆｔｙポリペプチドは、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分にコンジュゲートしたアミノ酸、及び有機誘導体化剤にコンジュゲートしたアミノ酸から選択される１つ以上の修飾アミノ酸残基を含む場合がある。
【００７８】
融合タンパク質又は結合タンパク質系（例えば、架橋による非融合の共有結合）は、Ｎｏｄａｌ、ミオスタチン及び／又はＧＤＦ−１１に選択的に結合し、ＡＬＫ７又はＡＬＫ４受容体の結合と競合するポリペプチド親和性試薬である第２の拮抗物質ドメインも含む場合がある。親和性試薬は、抗体薬である場合がある。抗体薬は、例えば組換え抗体；モノクローナル抗体；ＶＨドメイン；ＶＬドメイン；ｓｃＦｖ；Ｆａｂ断片；Ｆａｂ’断片；Ｆ（ａｂ’）２；Ｆｖ；若しくはジスルフィド結合Ｆｖ、完全ヒト抗体若しくはヒト化キメラ抗体、又はそれらの抗原結合断片である場合がある。親和性試薬は、Ｎｏｄａｌ、ミオスタチン及び／又はＬｅｆｔｙに選択的に結合して、ＡＬＫ７又はＡＬＫ４受容体の結合と競合するペプチド又は骨格ペプチドである。親和性試薬は、ＡＬＫ７又はＡＬＫ４のＮｏｄａｌ、ミオスタチン及び／又はＧＤＦ−１１結合ドメインを含む場合がある。例えば、ＡＬＫ７又はＡＬＫ４（好ましくはヒトＡＬＫ７又はＡＬＫ４）の細胞外ドメインが使用される場合がある。親和性試薬は、Ｎｏｄａｌ、ミオスタチン及び／又はＧＤＦ−１１に選択的に結合して、ＡＬＫ７又はＡＬＫ４受容体の結合と競合する小有機分子である場合がある。
【００７９】
ヒトＡＬＫ７リガンド結合ドメインの例を、以下に示す。
【００８０】
【化１２】
2009502121.tif 000013
ヒトＡＬＫ４ミオスタチン結合ドメインの例を、以下に示す・
【００８１】
【化１３】
2009502121.tif 000014
融合タンパク質の種々の要素は、所望の機能性と矛盾しない任意の様式で配置される場合があることが理解される。例えば、Ｌｅｆｔｙポリペプチドが、異種ドメインのＣ−末端に配置される場合もあれば、或いは異種ドメインが、ＬｅｆｔｙポリペプチドのＣ−末端に配置される場合もある。プロペプチドドメインと異種ドメインは、融合タンパク質中で隣接する必要はなく、何れかのドメインのＣ−若しくはＮ−末端に、又はこれらのドメインの間に、更なるドメイン又はアミノ酸配列が含まれる場合がある。
【００８２】
特定の実施形態において、本発明のＬｅｆｔｙポリペプチドは、Ｌｅｆｔｙポリペプチドを安定化させることができる１つ以上の修飾を含む。例えば、このような修飾は、プロペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ半減期を延長するか、プロペプチドの循環半減期を延長するか、又はプロペプチドのタンパク質分解を低下させる場合がある。このような安定化修飾には、融合タンパク質（例えばＬｅｆｔｙポリペプチド及び安定化剤ドメインを含む融合タンパク質を含む）、グリコシル化部位の修飾（例えば、Ｌｅｆｔｙポリペプチドへのグリコシル化部位の付加を含む）、及び糖部分の修飾（例えばＬｅｆｔｙポリペプチドからの糖部分の除去を含む）が含まれるが、これらに限定されない。融合タンパク質の場合、Ｌｅｆｔｙポリペプチドは、ＩｇＧ分子（例えば、Ｆｃドメイン）等の安定化剤ドメインに融合される。本明細書で使用される「安定化剤ドメイン」という用語は、融合タンパク質の場合のように融合ドメイン（例えば、Ｆｃ）のみを指すだけでなく、糖部分等の非タンパク質性修飾、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非タンパク質性ポリマーも含む。ＰＥＧは、ポリマー分子量が１，０００Ｄ〜５０，０００Ｄ以上の、種々の大きさのＬｅｆｔｙポリペプチドに添加される場合がある。ＰＥＧポリマーは、特にＮ−末端アミン又は操作されたシステインに指向される場合、選択的且つ残基特異的にプロペプチドに添加される場合がある。ＰＥＧポリマーは又、第１級アミン及び／又はスルフヒドリル基が反応される場合がある比較的非制御の反応で添加される場合がある。化学量論は、１：１（ＰＥＧ：ペプチド）〜２：１以上の範囲にわたる場合がある。
【００８３】
特定の実施形態において、Ｌｅｆｔｙポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃドメインと融合される。好ましい実施形態において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃ断片である。ＩｇＧ１  Ｆｃ断片は、例えばＦｃγ受容体への結合を低下させる突然変異、及びＭＨＣクラスＩ関連のＦｃ受容体（ＦｃＲＮ）への結合を低下させる突然変異を含めた、種々の改変を含む場合がある。突然変異の例には、Ｆｃ部分内の位置２６５（ＡｓｐからＡｌａ）、３２２（ＬｙｓからＡｌａ）、及び４３４（ＡｓｎからＡｌａ）における突然変異が含まれる。
【００８４】
特定の実施形態において、本発明は、他のタンパク質から単離された、又はさもなくば他のタンパク質を実質的に含まない、Ｌｅｆｔｙポリペプチドの単離及び／又は精製形態を提供する。
【００８５】
特定の実施形態において、本発明のＬｅｆｔｙポリペプチド（非修飾又は修飾）は、当該技術分野で認識される種々の技法により生成することができる。例えば、このようなＬｅｆｔｙポリペプチドは、Ｂｏｄａｎｓｋｙ，  Ｍ．  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｈｅｓｉｓ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｂｅｒｌｉｎ  （１９９３）；及びＧｒａｎｔ  Ｇ．  Ａ．  （ｅｄ．），  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９２）に記載されているような標準的なタンパク質化学法を使用して合成することができる。更には、自動ペプチド合成装置も市販されている（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ  Ｍｏｄｅｌ  ３９６；  Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  ９６００）。或いは、Ｌｅｆｔｙポリペプチド、それらの断片又は変異体は、当該技術分野で周知の通り、種々の発現系（例えば、大腸菌、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＣＯＳ細胞、バキュロウイルス）を使用して組換えにより生成される場合もある（以下も参照）。更なる実施形態において、修飾又は非修飾Ｌｅｆｔｙポリペプチドは、例えば、プロテアーゼ（例えば、トリプシン、サーモリシン、キモトリプシン、ペプシン、又は対になった塩基性アミノ酸変換酵素（ＰＡＣＥ））を使用した、天然の又は組換えにより生成されたＬｅｆｔｙポリペプチドの消化により、生成される場合がある。タンパク質開裂部位は、コンピュータ解析（市販のソフトウェア（例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ，  Ｏｍｅｇａ，  ＰＣＧｅｎｅ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ，  Ｉｎｃ．）を使用）を使用して同定することができる。
【００８６】
３．Ｌｅｆｔｙポリペプチドをコードする核酸
特定の態様において、本発明は、本明細書に開示する誘導体を含めたＬｅｆｔｙポリペプチドの何れかをコードする単離及び／又は組換え核酸を提供する。本発明の核酸は、一本鎖である場合もあれば、二本鎖である場合もある。このような核酸は、ＤＮＡである場合もあれば、ＲＮＡ分子である場合もある。これらの核酸は、例えば、Ｌｅｆｔｙポリペプチドの製造方法で、又は（例えば、遺伝子療法における）直接の治療薬として使用される場合がある。
【００８７】
他の実施形態において、本発明の核酸は又、配列番号１３〜１６に指定したヌクレオチド、配列番号１３〜１６の相補性配列、又はそれらの断片と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む。上述の通り、ＤＮＡのハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件は変化させることができることを、当業者であれば容易に理解するであろう。例えば、約４５℃にて６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）でハイブリダイゼーションを行い、続いて５０℃にて２．０×ＳＳＣの洗浄を行うことができる。例えば、洗浄手順における塩濃度は、５０℃にて約２．０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから、５０℃にて約０．２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーの間で選択することができる。更に、洗浄手順における温度は、室温にてある約２２℃の低ストリンジェンシー条件から約６５℃の高ストリンジェンシー条件まで上昇させることができる。温度及び塩を何れも変化させる場合もあれば、温度又は塩濃度を一定に保ち、他方の変数を変化させる場合もある。一実施形態において、本発明は、室温にて６×ＳＳＣの低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズした後、室温にて２×ＳＳＣの洗浄を行う核酸を提供する。
【００８８】
遺伝暗号の縮重により、配列番号１３〜１６に示す核酸とは異なる単離された核酸も、本発明の適用範囲内に含まれる。例えば、幾つかのアミノ酸は、複数の三つ組により指定される。同一のアミノ酸を特定するコドン、即ち同義語（例えば、ＣＡＵ及びＣＡＣはヒスチジンの同義語である）は、タンパク質のアミノ酸配列に影響を及ぼさない「サイレント」突然変異を生じる場合がある。しかし、哺乳動物細胞には、本発明のタンパク質のアミノ酸配列における変化を生じるＤＮＡ配列多型が存在すると予想される。当業者であれば、所定の種の個体には、天然の対立遺伝子改変により、特定のタンパク質をコードする核酸の１つ以上のヌクレオチド（約３〜５％以下のヌクレオチド）における改変が存在する場合があることを理解するであろう。このようなヌクレオチド改変の何れか及び全て、並びに得られたアミノ酸多型は、本発明の適用範囲内に含まれる。
【００８９】
特定の実施形態において、本発明の組換え核酸は、発現コンストラクト内の１つ以上の調節ヌクレオチド配列に操作可能に結合する場合がある。調節ヌクレオチド配列は一般的に、発現に使用される宿主細胞に適切である。種々の宿主細胞の適切な発現ベクター及び好適な調節配列は、数多くの種類のものが当該技術分野で既知である。通常、前記の１つ以上の調節ヌクレオチド配列には、プロモーター配列、リーダー又はシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終結配列、翻訳開始及び終結配列、並びにエンハンサー又はアクチベーター配列が含まれる場合があるが、これらに限定されない。当該技術分野で既知の構成又は誘導プロモーターが本発明により考慮される。プロモーターは、天然のプロモーターである場合もあれば、複数のプロモーターの要素を組み合わせるハイブリッドプロモーターである場合もある。発現コンストラクトは、細胞内で、例えばプラスミド等のエピソーム上に存在する場合もあれば、染色体内に挿入される場合もある。好ましい実施形態において、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にする選択マーカー遺伝子を含む。選択マーカー遺伝子は、当該技術分野で周知であり、使用する宿主細胞により異なる。
【００９０】
本発明の特定の態様においては、Ｌｅｆｔｙポリペプチドをコードし、少なくとも１つの調節配列に操作可能に結合したヌクレオチド配列を含む本発明の核酸が、発現ベクター内に提供される。調節配列は当該技術分野で認知されており、Ｌｅｆｔｙポリペプチドの発現を誘導するように選択される。従って、調節配列という用語は、プロモーター、エンハンサー、及びその他の発現制御要素を含む。代表的な調節配列については、Ｇｏｅｄｄｅｌ；  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ  （１９９０）に記載されている。例えば、操作可能に結合されるとＤＮＡ配列の発現を制御する広範な発現制御配列の何れかが、これらベクターで使用され、ＬｅｆｔｙポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現させる場合がある。このように有用な発現制御配列は、例えばＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０のｅａｒｌｙ及びｌａｔｅプロモーター、ｔｅｔプロモーター、アデノウイルス又はサイトメガロウイルスｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ又はＴＲＣ系、発現がＴ７  ＲＮＡポリメラーゼにより誘導されるＴ７プロモーター、λファージの主オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又はその他の解糖酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼ（例えば、Ｐｈｏ５）のプロモーター、酵母α接合因子のプロモーター、バキュロウイルス系の多面体プロモーター、及び原核生物若しくは真核生物細胞又はそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが知られるその他の配列、並びにそれらの種々の組み合わせを含む。発現ベクターの設計は、形質転換する宿主細胞の選択、及び／又は発現が所望されるタンパク質の種類等の因子により異なる場合があることを理解しなければならない。更に、ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、及び例えば抗生物質マーカー等、ベクターによりコードされるその他何れかのタンパク質の発現も考慮する必要がある。
【００９１】
本発明の組換え核酸は、クローン遺伝子又はその一部を、原核生物細胞、真核生物細胞（酵母、鳥類、昆虫又は哺乳動物）の何れか、又はそれらの両方における発現に好適なベクターに連結することにより、生成することができる。組換えＬｅｆｔｙポリペプチドを生成する発現ビヒクルは、プラスミド及びその他のベクターを含む。例えば、好適なベクターは、大腸菌等の原核生物における発現のための、ｐＢＲ３２２誘導プラスミド、ｐＥＭＢＬ誘導プラスミド、ｐＥＸ誘導プラスミド、ｐＢＴａｃ誘導プラスミド、及びｐＵＣ誘導プラスミドといった種類のプラスミドを含む。
【００９２】
幾つかの哺乳動物発現ベクターは、細菌内でベクターの増殖を促進する原核生物配列と、真核生物細胞内で発現される１つ以上の真核生物転写単位との両方を含む。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ＰＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏ及びｐＨｙｇ由来のベクターは、真核生物細胞のトランスフェクションに好適な哺乳動物発現ベクターの例である。これらベクターの幾つかは、例えばｐＢＲ３２２等の細菌プラスミドからの配列で修飾されて、原核生物及び真核生物細胞の両方内で複製及び薬物耐性選択を促進する。或いは、ウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ−Ｉ）、又はＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ誘導及びｐ２０５）等のウイルス誘導体を、真核生物細胞内でのタンパク質の一過性発現に使用される場合がある。他のウイルス（レトロウイルスを含む）発現系の例は、以下の遺伝子療法送達系の記載に見出すことができる。プラスミドの調製、及び宿主有機体の形質転換に使用される種々の方法は、当該技術分野で周知である。原核生物及び真核生物細胞の両方に関するその他の好適な発現系、並びに一般的な組換え手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  ｅｄ．  ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）  Ｃｈａｐｔｅｒｓ  １６  ａｎｄ  １７を参照されたい。ある場合に、バキュロウイルス発現系を使用して組換えＳＬＣ５Ａ８ポリペプチドを発現させることが所望される場合がある。それらのバキュロウイルス発現系の例は、ｐＶＬ誘導ベクター（例えばｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３及びｐＶＬ９４１等）、ｐＡｃＵＷ誘導ベクター（例えばｐＡｃＵＷｌ等）、及びｐＢｌｕｅＢａｃ誘導ベクター（例えばβ−ｇａｌ含有ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ等）を含む。
【００９３】
特定の実施形態において、ベクターは、例えばＰｃｍｖ−Ｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  Ｃａｌｉｆ．）、ｐｃＤＮＡ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  Ｃａｌｉｆ．）及びｐＣＩ−ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓｅ）等のＣＨＯ細胞内での本発明のＬｅｆｔｙポリペプチドの生成のために設計されるであろう。明らかとなるように、本発明の遺伝子コンストラクトは、培地中で増殖した細胞内で本発明のＬｅｆｔｙポリペプチドを発現させて、例えば、精製のための融合タンパク質又は変異体タンパク質を含むタンパク質を生成するために使用される場合がある。
【００９４】
本発明は、本発明のＬｅｆｔｙポリペプチドの１つ以上のコード配列を含む、組換え遺伝子をトランスフェクトした宿主細胞にも関する。宿主細胞は、任意の原核生物又は真核生物細胞である場合がある。例えば、本発明のＬｅｆｔｙポリペプチドは、例えば大腸菌等の細菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を使用）、酵母、又は哺乳動物細胞内で発現される場合がある。その他の好適な宿主細胞は、当業者に既知である。
【００９５】
従って、本発明は、更に、本発明のＬｅｆｔｙポリペプチドの製造方法に関する。例えば、Ｌｅｆｔｙポリペプチドをコードする発現ベクターをトランスフェクトした宿主細胞を、適切な条件下で培養して、Ｌｅｆｔｙポリペプチドを発現させる。Ｌｅｆｔｙポリペプチドは、プロペプチドを含有する細胞と培地との混合物から分泌及び単離される場合がある。或いは、ポリペプチドは、細胞質内又は膜画分中に保持され、細胞を回収し、溶解し、タンパク質を単離してもよい。細胞培養物は、宿主細胞、培地、及び他の副生物を含有する。細胞培養のための好適な培地は、当該技術分野で周知である。ポリペプチドは、イオンクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、超濾過、電気泳動、及びＬｅｆｔｙポリペプチドの特定のエピトープに特異的な抗体による免疫親和精製を含む、好適なのタンパク質精製法を使用して、宿主細胞、細胞培地、又は両方から単離することができる。好ましい実施形態において、Ｌｅｆｔｙポリペプチドは、その精製を促進するドメイン（精製ドメイン）を含む融合タンパク質である。例えば、例えば組換えＬｅｆｔｙポリペプチドの所望の部分のＮ−末端におけるポリ−（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ開裂部位配列等、精製リーダー配列又はＣ−末端テールをコードする融合遺伝子は、Ｎｉ２＋金属樹脂を使用した親和性クロマトグラフィーによる、発現した融合タンパク質の精製を可能にする。次に、精製配列をエンテロキナーゼで処理して除去し、精製Ｌｅｆｔｙポリペプチドを提供する（例えば、Ｈｏｃｈｕｌｉら、（１９８７）  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ４１１：１７７；及びＪａｎｋｎｅｃｈｔら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８：８９７２を参照）。
【００９６】
融合遺伝子の製造法は周知である。基本的に、異なるポリペプチド配列をコードする種々のＤＮＡ断片は、連結のための平滑末端又はねじれ型末端、適切な末端を提供する制限酵素消化、付着末端の適宜の埋込み、望ましくない連結を避けるアルカリフォスファターゼ処理、及び酵素的連結を使用して、従来の技法に従って連結される。別の実施形態において、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置を含む従来の技法により合成してもよい。或いは、２つの連続した遺伝子断片間に相補的なオーバーハングを生じさせるアンカープライマーを使用して、次にこれらをアニールしてキメラ遺伝子配列を生成する、遺伝子断片のＰＣＲ増幅を実施してもよい（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｅｄｓ．  Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：  １９９２を参照）。
【００９７】
４．例示的な治療用途
例えば完全長及びＮ−末端開裂Ｌｅｆｔｙ誘導体等の本発明のＬｅｆｔｙポリペプチドは、ミオスタチン、Ｎｏｄａｌ又はＧＤＦ−１１の存在により生じる又は増悪する多数の疾患の多数の治療的設定にて使用される場合がある。
【００９８】
特定の実施形態において、本発明のＬｅｆｔｙポリペプチドは、筋ジストロフィー処置の一部として使用される。「筋ジストロフィー」という用語は、骨格筋、時には心筋及び呼吸筋の漸進的な衰弱及び悪化により特徴付けられる変性性筋肉疾患の群を指す。筋ジストロフィーは、進行性の筋肉消耗、及び筋肉の顕微鏡的変化で開始される衰弱により特徴付けられる遺伝性疾患である。ある時間にわたり筋肉が変性すると、患者の筋肉強度が減退する。本発明のミオスタチンを含む療法で処置可能な代表的な筋ジストロフィーは：デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベーカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、エメリ・ドレフュス筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨ又はＦＳＨＤ）（顔面肩甲上腕型（Ｌａｎｄｏｕｚｙ−Ｄｅｊｅｒｉｎｅ）としても知られる）、筋緊張性ジストロフィー（ＭＭＤ）（シュタイネルト病としても知られる）、眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）、遠位型筋ジストロフィー（ＤＤ）、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）を含む。
【００９９】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、最初に、１８６０年にフランスの神経学者Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ａｍａｎｄ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅにより説明された。ベーカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）は、１９５０年にこのＤＭＤの変異体を最初に記載したドイツ人医師Ｐｅｔｅｒ  Ｅｍｉｌ  Ｂｅｃｋｅｒにちなんで付けられた。ＤＭＤは、少年３，５００人の１人に発症する、男性で最も頻度の高い遺伝病である。ＤＭＤは、Ｘ染色体の短腕上に位置するジストロフィン遺伝子が破損した場合に発生する。男性は、Ｘ染色体のコピーを１つのみ保有するため、ジストロフィン遺伝子のコピーを１つのみ有する。ジストロフィンタンパク質なしでは、筋肉は、収縮と弛緩の周期中に容易に損傷される。疾患の早期において、筋肉は再生により補償し、その後、筋肉前駆細胞は、進行中の損傷に追いつけず、健康な筋肉が非機能性線維脂肪組織で代替される。
【０１００】
ＤＭＤにおいて、少年は、早くも３歳で筋肉衰弱の徴候が開始する。疾患は、徐々に腕、足及び体幹の骨格筋又は随意筋を衰弱させる。十代初期又はそれより早期までは、少年の心臓及び呼吸筋も罹患する場合がある。ＢＭＤは、ＤＭＤよりもかなり軽度である。これは通常、十代又は成人早期に発症し、経過はＤＭＤと比較すると遅く、かなり予想不可能である（ＤＭＤ及びＢＭＤは、殆ど少年に排他的に発症するが、まれに少女にも発症する）。
【０１０１】
１９８０年まで、何れの種類の筋ジストロフィーの原因も、殆ど知られていなかった。１９８６年に、ＤＭＤの原因として、ジストロフィン遺伝子欠損が同定された。ＢＭＤは、同一の遺伝子内の異なる突然変異から生じる。ＢＭＤ患者は、幾分かのジストロフィンを有するが、量が不十分であり、又は品質が乏しい。幾分かのジストロフィンを有することは、ＢＭＤの人の筋肉を、ＤＭＤの人と同様に酷く又は急速に変性することから保護する。
【０１０２】
最近の報告では、ＤＭＤ及びＢＭＤ患者において、ｉｎ  ｖｉｖｏでミオスタチン機能を遮断又は排除することにより、少なくとも特定の症状を効果的に処置できることが示されている（Ｂｏｇｄａｎｏｖｉｃｈら、ｓｕｐｒａ；Ｗａｇｎｅｒら、ｓｕｐｒａ）。従って、本発明のＬｅｆｔｙ誘導体、特にそのＮ−末端開裂バージョンは、ＤＭＤ及びＢＭＤ患者において、ｉｎ  ｖｉｖｏでミオスタチンの機能を遮断する代替手段を構成する。
【０１０３】
同様に、本発明のＬｅｆｔｙ誘導体、特にそのＮ−末端開裂バージョンは、筋肉増殖が必要な他の疾患状態に、筋肉量を増大させる有効な手段を提供する。例えば、Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃａｄａｖｉｄ，  ｅｔ  ａｌ．  （ｓｕｐｒａ）は、ヒトにてミオスタチン遺伝子の発現が除脂肪量と逆相関し、ミオスタチン遺伝子の発現の増大は、ＡＩＤＳ消耗症候群を有する人にて体重減少と関連することを報告した。ＡＩＤＳ患者のミオスタチンの機能を阻害することにより、完全に排除せずとも、少なくとも特定のＡＩＤＳの徴候が緩和されて、ＡＩＤＳ患者の生活の質が有意に改善される場合がある。
【０１０４】
ミオスタチン機能の損失は又、栄養摂取の低下なしでの脂肪消失と関連し（Ｚｉｍｍｅｒｓら、ｓｕｐｒａ；ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，  ｓｕｐｒａ）、本発明のＬｅｆｔｙ誘導体、特にそのＮ−末端開裂バージョンは、更に、肥満症及びＩＩ型糖尿病の発症を遅延又は予防する治療薬として使用される場合がある。Ｌｅｆｔｙ誘導体は、ミオスタチンと関連がない理由により、肥満症に影響を及ぼす場合があることも留意するべきである。
【０１０５】
癌食欲不振−悪液質症候群は、癌の最も衰弱性の、且つ生命を脅かす態様である。癌食欲不振−悪液質症候群における進行性の体重減少は、多種の癌にて共通する特徴であり、乏しい生活の質及び化学療法に対する乏しい応答だけでなく、体重減少を伴わない同様の腫瘍を有する患者に見出される生存期間と比較して短い生存期間の原因でもある。食欲不振、脂肪及び筋肉組織の萎縮、精神的苦痛、並びにより低い生活の質に関連して、悪液質は、癌と宿主との間の複雑な相互作用から発生する。これは癌患者の間で最も普遍的な死因の１つであり、死の８０％に存在する。悪液質は、タンパク質、炭水化物、及び脂肪代謝に作用する代謝カオスの複合例である。腫瘍は、間接異常及び直接異常の両方を生成し、食欲不振及び体重減少を引き起こす。現在、この過程を制御又は逆転する処置は、全く存在しない。
【０１０６】
癌食欲不振−悪液質症候群は、サイトカイン産生、脂質動員及びタンパク質分解誘導因子の放出、並びに中間代謝の変化に影響を与える。食欲不振は一般的であるが、摂食の減少単独では、癌患者に見られる身体組成物の変化の原因となり得ず、栄養摂取の増大は、消耗症候群を逆転し得ない。悪液質は、６ヶ月の期間内に、発病前の体重の５％を超える不随意の体重減少が起こる場合、癌の患者に疑う必要がある。
【０１０７】
成体マウスにおけるミオスタチンの全身の過剰発現が、ヒト悪液質症候群に見出されるものと類似する筋肉及び脂肪損失を誘導することが見出されたことから（Ｚｉｍｍｅｒｓら、ｓｕｐｒａ）、医薬組成物としての本発明のＬｅｆｔｙ誘導体、特にそのＮ−末端開裂バージョンは、筋肉増殖が所望される悪液質症候群の症状を予防、処置、又は緩和するための、ミオスタチン拮抗物質／遮断薬として有利に使用される場合がある。
【０１０８】
特定の実施形態において、本発明のＬｅｆｔｙポリペプチドは、神経変性に関与する疾患の宿主の症状の予防、処置、又は緩和に有利に使用される場合がある医薬組成物の製造に使用される場合がある。医薬組成物としての本発明のＬｅｆｔｙポリペプチドは、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病等を含む神経変性を伴う疾患の症状の予防、処置、又は緩和に有利に使用される場合がある。
【０１０９】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、徐々に発生して、記憶損失、異常行動、人格変化、及び思考能力の低下に至る、慢性且つ不治の、制止不可能な中枢神経系（ＣＮＳ）疾患である。これらの損失は、特定のタイプの脳細胞の死、及びそれら間の接続の崩壊に関連する。
【０１１０】
ＡＤは、幼児期の発達の逆として説明されている。ＡＤを有する殆どの患者にて、症状は６０歳以後に出現する。最も早期の症状は、近時記憶の損失、誤った判断、及び人格の変化を含む。疾患の後期になると、ＡＤ患者は、手を洗うというような単純な作業の方法を忘れる場合がある。最終的には、ＡＤ患者は、全ての推論能力を失い、毎日の世話に関して他人に依存するようになる。そして遂に、疾患は寝たきりになるほど患者を衰弱させ、通常は共存疾患を発症させる。ＡＤ患者の殆どは、通常、疾患発症から８〜２０年後に、肺炎で死亡する。
【０１１１】
パーキンソン病（ＰＤ）は、徐々に発生して、制御されない身体の動き、強剛性、振戦、及び歩行困難に至る慢性且つ不治の、制止不可能なＣＮＳ疾患である。これら運動ニューロン系の問題は、筋肉活性の制御を補助する化合物であるドーパミンを生成する脳の領域内の、脳細胞の死に関連する。
【０１１２】
ＰＤを有する殆どの人にて、症状は５０歳以後に出現する。ＰＤの最初の症状は、手又は唇で顕著な、四肢に発症する重度の振戦である。続くＰＤの特徴的症状は、硬直又は動きの遅さ、引きずり歩行、前屈姿勢、及び平衡障害である。例えば記憶損失、痴呆症、鬱、感情変化、嚥下困難、異常発語、性機能不全、並びに膀胱及び腸管障害等の種々の二次症状がある。これらの症状は、例えばフォークを掴む又は新聞を読む等の日常的活動を妨げ始める。最終的に、ＰＤの人は、寝たきりとなる程、重度の身体障害者となる。ＰＤの人は、通常、肺炎により死亡する。
【０１１３】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；ルー・ゲーリック病；運動ニューロン疾患）は、脳を骨格筋と接続するＣＮＳの構成要素である運動ニューロンを攻撃する、慢性且つ不治の、制止不可能なＣＮＳ疾患である。ＡＬＳにおいて、運動ニューロンは悪化して最終的に死に至り、患者の脳が完全な機能を維持し俊敏であっても、動佐の命令は、筋肉に決して到達しない。
【０１１４】
ＡＬＳ患者の殆どは、４０〜７０歳である。衰弱する最初の運動ニューロンは、腕又は足に至るニューロンである。ＡＬＳ患者は、歩行が困難になり、物を落とし、転倒し、発語が不明瞭になり、笑い又は涙が止まらなくなる場合がある。最終的には、四肢の筋肉が、不使用から萎縮を開始する。この筋肉弱化は衰弱となり、患者は車椅子が必要となり、又は床の外で働くことが不可能となる。殆どのＡＬＳ患者は、疾患発症から３〜５年後に、呼吸不全、又は肺炎のような心室補助装置の合併症から死亡する。ＡＬＳ徴候は、筋肉機能の損失に関連するため、例えば抗ミオスタチン処置等、筋肉線維増殖又は保持を高める処置が有効である場合がある。
【０１１５】
これら神経疾患の原因は、殆どが未知のままである。これらは従来より、異なる疾患として定義されているが、基本的過程において非常な類似性を明白に示し、通常、偶然のみで、予想されるよりも相当重複した症状を示す。現在の疾患の定義は、神経変性疾患の重複の問題に適切に対処しておらず、新しい分類が必要とされる。
【０１１６】
ハンチントン病（ＨＤ）は、脳の特定の領域内の神経の、遺伝的にプログラムされた変性から生じる他の神経変性疾患である。この変性は、制御されない動き、知的能力の損失、及び感情障害を引き起こす。ＨＤは、野生型遺伝子内のドミナントな突然変異を介して親から子へ受け渡される家族性疾患である。ＨＤの幾つかの初期症状は、気分変動、鬱、易刺激性、又は運転、新しい物事の学習、事実の記憶、若しくは決心における障害である。疾患が進行するにつれて、知的作業への集中が次第に困難になり、患者は自身で摂食及び嚥下できなくなる場合がある。疾患の進行速度及び発症年齢は、人により異なる。
【０１１７】
テイ・サックス病及びサンドホフ病は、リソソーム性β−ヘキソサミニダーゼの欠乏を原因とする糖脂質貯蔵疾患である（Ｇｒａｖｅｌら、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，  ｅｄｓ．  Ｓｃｒｉｖｅｒら、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ．２８３９−２８７９，  １９９５）。両疾患において、ＧＭ２ガングリオシドと、β−ヘキソサミニダーゼの関連する糖脂質基質が神経系内に蓄積し、急性神経変性を引き起こす。最も重篤な形態では、症状の発症は、幼児期の早期に開始する。次いで、罹患した幼児は、運動不全、てんかん、視力損失、及び聴覚損失を示し、急峻な神経変性過程が後続する。死は、通常２〜５歳までに起こる。アポトーシス機序を介したニューロンの消失が示されている（Ｈｕａｎｇら、Ｈｕｍ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ６：  １８７９−１８８５，  １９９７）。
【０１１８】
免疫系内のＡＩＤＳ発病にアポトーシスが役割を果たすことが周知である。しかし、ＨＩＶ−１は、神経疾患も誘導する。Ｓｈｉ等（Ｊ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９８：  １９７９−１９９０，  １９９６）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルで及びＡＩＤＳ患者からの脳組織内で、ＨＩＶ−１感染により誘導される中枢神経系（ＣＮＳ）のアポトーシスを試験し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで神経細胞及び星状細胞内で、一次脳培養物のＨＩＶ−１感染がアポトーシスを誘導することを見出した。神経細胞及び星状細胞のアポトーシスは、ＨＩＶ−１痴呆症の５／５患者、及び認知障害のない患者４／５を含む１０／１１  ＡＩＤＳ患者からの脳組織内でも検出された。
【０１１９】
ニューロン欠損は、例えばヒトのクロイツフェルト・ヤコブ病、牛のＢＳＥ（狂牛病）、羊の及び山羊のスクレイピー疾患、並びに猫海綿状脳症（ＦＳＥ）等のプリオン疾患の顕著な特徴でもある。
【０１２０】
本発明のＬｅｆｔｙポリペプチドは、例えば以下に記載する疾患等、種々のＰＮＳ疾患の徴候の予防、処置、及び緩和に有用である。ＰＮＳは、ＣＮＳに至り又はＣＮＳから分岐する神経から構成される。末梢神経は、感覚、運動、及び自律機能を含む、身体内での多様な機能を扱う。個体が末梢神経障害を有する場合、ＰＮＳの神経が損傷されている。神経損傷は、疾患、物理的傷害、中毒、又は栄養障害等の幾つかの原因から生じる可能性がある。これらの因子は、求心性又は遠心性神経に作用する場合がある。傷害の原因に応じて、神経細胞軸索、その保護ミエリン鞘、又は両方が傷害又は破壊される場合がある。
【０１２１】
末梢神経障害という用語は、脳及び脊髄外の神経−末梢神経−が損傷されている広範な疾患を包含する。末梢神経障害は、末梢神経炎と呼ばれる場合もあれば、多数の神経が関与する場合、多発神経障害又は多発神経炎という用語が使用される場合もある。
【０１２２】
末梢神経障害は、広範な疾患であり、多数の内在する原因が存在する。これら原因の幾つかは、例えば糖尿病等、一般的であり、他は、例えばアクリルアミド中毒及び特定の遺伝性疾患等、非常にまれである。末梢神経障害の世界中で最も一般的な原因は、ハンセン病である。ハンセン病は、罹患した人々の末梢神経を攻撃する細菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅを原因とする。世界保健機関が収集した統計によれば、世界中でおよそ１．１５百万人がハンセン病を有する。
【０１２３】
糖尿病が末梢神経障害の最も良く知られる原因となっている米国では、ハンセン病は非常にまれな疾患である。欧米では、１７百万人を超える人が、糖尿病関連の多発神経障害を有すると概算されている。多くの神経障害は突発性であり、その原因は不明である。米国で最も一般的な遺伝性末梢神経障害は、約１２５，０００人が罹患しているシャルコー・マリー・トゥース病である。
【０１２４】
より周知の他の末梢神経障害は、例えばサイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）等のウイルス疾患、又はカンピロバクター・ジェジュニ及びライム病を含む細菌感染に関連した合併症から生じるギラン・バレー症候群である。世界での発症率は、年間、１００，０００人中約１．７人である。末梢神経障害のその他の周知の原因には、慢性アルコール症、水痘退場疱疹ウイルス、ボツリヌス中毒、及び灰白隋炎の感染が含まれる。末梢神経障害は、一次症状として発生する場合もあれば、別の疾患が原因となる場合もある。例えば、末梢神経障害は、例えばアミロイド神経障害、特定の癌、又は遺伝性神経性疾患等の疾患の唯一の症状である。このような疾患は、末梢神経系（ＰＮＳ）及び中枢神経系（ＣＮＳ）、並びにその他の身体組織を冒す場合がある。
【０１２５】
本発明のＬｅｆｔｙ誘導体、特にＮ−末端開裂Ｌｅｆｔｙ誘導体で処置可能な他のＰＮＳ疾患には、腕神経叢障害（頸部及び第１胸根、神経幹、索、及び腕神経叢の末梢神経成分の疾患）が含まれる。臨床的症状には、局所疼痛、錯感覚；筋脱力、及び上肢の感覚低下が含まれる。これらの疾患は、出生時外傷を含む外傷；胸郭出口症候群；新生物、神経炎、放射線療法；及びその他の病態（Ａｄａｍｓら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，  ６ｔｈ  ｅｄ，  ｐｐｌ３５１−２を参照）；糖尿病性神経痛（糖尿病に関連する末梢、自律、及び脳神経疾患）に関連する場合がある。これらの病態は、通常、神経を供給する小血管（神経の脈管）に関与する糖尿病性微小血管障害から生じる。糖尿病性神経痛に関連する場合がある比較的一般的な病態には、第三脳神経麻痺；単神経障害；多神経障害；糖尿病性筋萎縮症；有痛性の多発神経障害；自律神経障害；及び胸腹部神経障害（Ａｄａｍｓら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，  ６ｔｈ  ｅｄ，  ｐｉ  ３２５を参照）；分離した単一末梢神経に関与する単神経障害（疾患若しくは外傷、又は末梢神経障害拡散の証拠の不釣り合いである。多発性単神経炎は、多数の分離した神経損傷により特徴付けられる病態を指す。単神経障害は、虚血；外傷性障害；圧迫；結合組織病；累積外傷性障害；及び他の病態）；神経痛（末梢神経又は脳神経の経路又は分布に沿って起こる激痛又はうずく痛み）；末梢神経系新生物（末梢神経組織から生じる新生物。これは、神経線維腫；シュワン腫；顆粒細胞腫瘍；及び悪性末梢神経鞘腫瘍を含む。ＤｅＶｉｔａ  Ｊｒ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，  ５ｔｈ  ｅｄ，  ｐｐｌ７５０−１を参照）；神経圧迫症候群（内因又は外因による神経又は神経根の機械的圧迫。これらは、例えばミエリン鞘障害、又は軸索消失による神経インパルスの伝導ブロックから生じ得る。神経及び神経鞘損傷は、虚血；炎症；又は直接的な機械的作用を原因とし得る）；神経炎（末梢又は脳神経の炎症を示す一般的な用語。臨床的症状は、疼痛；四肢知覚異常；感覚異常；又は感覚過敏（ｈｙｐｅｒｔｈｅｓｉａ）を含む場合がある）；多発神経障害（複数の末梢神経の疾患。種々の形態は、罹患した神経の種類（例えば、感覚、運動、又は自律）、神経損傷の分布により（例えば、近位対遠位）、主に罹患した神経成分により（例えば、脱髄対軸索）、病因により、又は遺伝パターンにより分類される）を含めた幅広い原因から生じる場合がある。
【０１２６】
ミオスタチン阻害剤は又、骨増殖、及び骨と筋肉強化の組み合わせを促進し、本明細書に開示するＬｅｆｔｙポリペプチドを、例えば骨粗鬆症、虚弱、低い骨密度、及び腫瘍による骨量の減少等の疾患の処置に有用にする場合もある。
【０１２７】
上記の説明は、それによりＬｅｆｔｙ誘導体を含むＬｅｆｔｙポリペプチドが、所望の治療効果を達成する場合があると思われる作用機序を提供する一方、これらの効果は、代替的な機序又は幾つかの異なる機序からも生じる場合がある。ＬｅｆｔｙポリペプチドがＴＧＦ−βファミリーの更なるメンバーを阻害しることから、このような活性が治療効果に寄与する可能性も高い。
【０１２８】
５．代表的な製剤
本発明の組成物は、単独で、又は他の化合物／医薬組成物との共同療法の一部として使用される場合がある。特定の実施形態において、Ｌｅｆｔｙポリペプチドを含有する薬学的製剤は、関連する規制機関（例えば、米国内の食品医薬品局）により確立されたガイドラインに順守するであろう。それらの製剤は、通常、実質的に発熱物質を含有しない（ｐｙｒｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ）であろう。
【０１２９】
本発明の方法に使用するためのＬｅｆｔｙポリペプチドは、例えば水、緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール及び同様物）又はそれらの好適な混合物等の生物学的に許容される媒体と共に投与するよう処方される場合がある。選択した媒体中の活性成分（一種又は複数種）の最適濃度は、医薬品化学者に周知の手順に従って経験的に決定することができる。本明細書で使用される「生物学的に許容される媒体」は、薬学的製剤の所望の投与経路に適切である場合がある任意の及び全ての溶媒、分散媒体、及び同様物を含む。薬学的に活性な物質のためのそれら媒体の使用は、当該技術分野で既知である。任意の従来の媒体又は薬剤は、ホスホペプチド治療薬の活性と適合しない場合を除き、本開示内容の薬学的製剤中でのその使用が想定される。好適なビヒクル及び他のタンパク質を含むそれらの製剤は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ  ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｛Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ  ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．，  ＵＳＡ  １９８５）に記載されている。これらのビヒクルは、注射用の「沈殿製剤（ｄｅｐｏｓｉｔ  ｆｏｒｕｌａｔｉｏｎｓ）」を含む。
【０１３０】
本開示内容の薬学的製剤は、獣医用組成物、例えば家畜（雌牛、羊、山羊、豚、及び馬等）又は家庭内動物、例えば猫及び犬の処置に好適なＬｅｆｔｙ治療薬の薬学的製剤も含む場合がある。
【０１３１】
本開示内容の方法は、再充填型又は生分解性デバイスによっても提供される場合がある。近年、タンパク性生物製剤を含む薬物の制御送達のための種々の遅延放出ポリマーデバイスが開発され、ｉｎ  ｖｉｖｏで試験されている。生分解性及び非分解性ポリマーの両方を含む多様な生体適合性ポリマー（ハイドロゲルを含む）を使用して、特定の標的部位で治療薬を持続放出する移植片を形成することができる。
【０１３２】
本開示内容に従った医薬組成物は、単一用量として又は多数回用量で投与される場合がある。本開示内容の医薬組成物は、個々の治療薬として、又はその他の治療薬との組み合わせで投与される場合がある。本開示内容の処置は、連続的に又は同時に投与される場合がある従来の治療薬と組み合わせてもよい。本開示内容の医薬組成物は、Ｌｅｆｔｙポリペプチドを標的細胞／組織／器官へ到達させる任意の手段により投与される場合がある。幾つかの実施形態において、投与経路は、経口、膀胱内、静脈内、動脈内、腹腔内、標的細胞が存在する器官の血液供給への局所投与、又は細胞への直接投与からなる群から選択される。好ましい投与モードは、静脈内投与である。静脈内投与は、輸液ポンプの補助により達成される場合がある。
【０１３３】
本明細書で使用される「非経口投与」及び「非経口的に投与」という用語は、腸内及び局所投与以外の、通常、注入による投与モードを意味し、静脈内、筋内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心腔内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、皮膜下、くも膜下、髄腔内及び胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｍａｌ）注入及び点滴を含むが、これらに限定されない。
【０１３４】
本明細書で使用される「全身投与」、「全身に投与」、「末梢投与」及び「末梢的に投与」という用語は、化合物、薬物又は他の物質が中枢神経系に直接ではなく投与され、患者の系に入って代謝及び他の同様の過程を受ける、例えば皮下投与を意味する。
【０１３５】
これらの化合物は、口腔及び舌下を含む、経口、膀胱内、例えば噴霧による経鼻的、直腸的、経膣的、非経口的、大槽内及び局所的、粉末として、軟膏又は液滴による投与を含めた何れかの好適な投与経路により、ヒト及び他の動物に治療のために投与される場合がある。
【０１３６】
選択される投与経路に係わらず、好適な水和形態で使用される場合がある本開示内容の化合物、及び／又は本開示内容の医薬組成物は、例えば以下に記載する薬学的に許容される剤形に、又は当業者に既知の他の従来の方法により調製される。
【０１３７】
本開示内容の医薬組成物中の活性成分の実際の用量レベルは、特定の患者において該患者に毒性を付与せずに、所望の治療応答、組成物、及び投与モードを達成するに有効な活性成分の量を得るように改変される場合がある。
【０１３８】
選択される用量レベルは、使用する本開示内容の特定の化合物、又はそのエステル、塩若しくはアミドの活性、使用する特定の化合物の投与経路、投与時間、排泄速度、処置の持続時間、使用する特定のホスホペプチド治療薬との組み合わせで使用される他の薬物、化合物及び／又は材料、処置する患者の年齢、性別、体重、病態、一般的健康及び以前の病歴、並びに医学分野で周知の同様の因子を含む種々の因子に依存するであろう。
【０１３９】
当該技術分野の医師又は獣医は、必要な医薬組成物の有効量を容易に決定及び処方することができる。例えば、医師又は獣医は、所望の治療効果を達成するために、医薬組成物中に使用される本開示内容の化合物の投与を、必要とするより低いレベルで開始して、所望の効果が達成されるまで、用量を徐々に増加させる。
【０１４０】
一般的に、本開示内容の化合物の好適な一日用量は、治療効果を生じるに有効な最低用量である化合物の量であろう。このような有効用量は、概して上述した因子に依存するであろう。一般的に、患者のための本開示内容の化合物の静脈内、脳室内及び皮下用量は、体重１キログラム当たり約０．０００１〜約１００ｍｇ／日の範囲であろう。
【０１４１】
所望であれば、活性化合物の一日有効用量を、２、３、４、５、６又はそれ以上のサブ用量として、場合により単位剤形で、一日を通して適切な間隔にて別々に投与してもよい。
【０１４２】
「処置」という用語は、予防、治療及び治癒も包含することを意図する。
【０１４３】
この処置を受ける患者は、一般的に霊長類、特にヒト、並びに例えば馬、牛、豚及び羊等の他の非ヒト哺乳動物；並びに家禽類及びペットを含む、処置を必要とする任意の動物である。
【０１４４】
本開示内容の化合物は、そのまま又は薬学的に許容される担体との混合物で投与してもよく、例えばペニシリン、セファロスポリン、アミノグリコシド及びグリコペプチド等の他の抗菌薬と併せて投与してもよい。従って、併用療法は、最初に投与した１つの治療薬の効果が、続く１つの投与時に完全に排除されていない、活性化合物の連続、同時及び個別投与を含む。
【０１４５】
一般的に、本明細書に使用した用語、及び本開示内容にて使用した研究室での手順は、分子、生化学、微生物学及び組換えＤＮＡ技法を含む。それらの技法は、文献に完全に説明されている。例えば、全て参照により本明細書に組み入れられる以下を参照されたい。“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”  Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｒ．  Ｍ．，  ｅｄ．  （１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｍｄ．  （１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，  “Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ”，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎら、（ｅｄｓ）  “Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ”，  Ｖｏｌｓ．  １−４，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号；米国特許第４，６８３，２０２号；米国特許第４，８０１，５３１号；米国特許第５，１９２，６５９号及び米国特許第５，２７２，０５７号；“Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｅｌｌｉｓ，  Ｊ．  Ｅ．，  ｅｄ．  （１９９４）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．  Ｅ．，  ｅｄ．  （１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら、（ｅｄｓ），  “Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”  （８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），  Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，  Ｎｏｒｗａｌｋ，  ＣＴ  （１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ  （ｅｄｓ），  “Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８０）に開示されている方法体系；利用可能なイムノ試験は、例えば米国特許第３，７９１，９３２号；米国特許第３，８３９，１５３号；米国特許第３，８５０，７５２号；米国特許第３，８５０，５７８号；米国特許第３，８５３，９８７号；米国特許第３，８６７，５１７号；米国特許第３，８７９，２６２号；米国特許第３，９０１，６５４号；米国特許第３，９３５，０７４号；米国特許第３，９８４，５３３号；米国特許第３，９９６，３４５号；米国特許第４，０３４，０７４号；米国特許第４，０９８，８７６号；米国特許第４，８７９，２１９号；米国特許第５，０１１，７７１号及び米国特許第５，２８１，５２１号；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”  Ｇａｉｔ，  Ｍ．  Ｊ．，  ｅｄ．  （１９８４）；“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”  Ｈａｍｅｓ，  Ｂ．  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．  Ｊ．，  ｅｄｓ．  （１９８５）；“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”  Ｈａｍｅｓ，  Ｂ．  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．  Ｊ．，  ｅｄｓ．  （１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｒ．  Ｌ，  ｅｄ．  （１９８６）；“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄＥｎｚｕｍｅｓ”  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  （１９８６）；“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”  Ｐｅｒｂａｌ，  Ｂ．，  （１９８４）  ａｎｄ  “ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”  Ｖｏｌ．  １−３１７，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；“ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ．  （１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ”  ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９６）の特許及び科学文献に広範に記載されている。本明細書を通して、他の一般的な参考文献が提供されている。それらに記載されている手順は、当該技術分野で周知と思われ、読者の利便性のために提供する。それらに含まれる全情報は、参照により本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１４６】
本発明を一般的に説明し、本発明は、特定の実施形態及び本発明の実施形態の例示のみを目的として含まれ、本発明を限定することを意図しない以下の実施例を参照することにより容易に理解されるであろう。
【０１４７】
（実施例１  Ｌｅｆｔｙポリペプチドの構築、発現及び精製）
図６に記載した種々のＬｅｆｔｙ−ＡコンストラクトをｐＡＩＤ４ベクター内にサブクローニングし、プラスミドｃＤＮＡを、リポフェクタミン法により、Ｃｏｓ細胞内に一過的にトランスフェクト（１０ｕｇ  ＤＮＡ）した。６時間後、増殖培地を加えた。２４時間後、培地を血清フリー培地と交換し、４８時間後に回収した。遠心分離後、上清を収集し、−２０℃に保持した。
【０１４８】
生成及び試験したコンストラトは、Ｌｅｆｔｙ−Ａシグナル配列を蜜蜂メラチン配列で置き換えている。以下のＬｅｆｔｙ−Ａ配列は、３４ｋＤａ（長い）形態の発現のためのメラチンに融合された：
【０１４９】
【化１４】
2009502121.tif 000015
太字の「Ｆ」は、成熟３４ｋＤａ形態の予想される第１のアミノ酸を指す。下線を引いた「Ｇ」は、第２のＲＸＸＲ開裂部位を排除するＲ→Ｇ改変部位を示す。
【０１５０】
以下の配列は、Ｌｅｆｔｙ−Ａの２８ｋＤａ（短い）形態の発現のためのメラチンリーダーに融合された：
【０１５１】
【化１５】
2009502121.tif 000016
図６に記載した種々のＦｃ融合は、上記の「Ｌｅｆｔｙ  ３４」及び「Ｌｅｆｔｙ  ２８」コンストラクトに基づき生成された。
【０１５２】
（実施例２  Ｌｅｆｔｙ−Ａポリペプチドは、ミオスタチンに結合する）
Ｌｅｆｔｙコンストラクトを使用して、ＢｉａＣｏｒｅチップ分析を行った。ＧＤＦ−１１は、神経過程を調節するミオスタチンの密接したホモログである。標準的なアミン結合手順を使用して、ＧＤＦ−１１をＢｉａＣｏｒｅ  ＣＭ５チップ上に固定化した。図７に示す通り、各Ｌｅｆｔｙコンストラクトは、ミオスタチンに結合する。
【０１５３】
本明細書に言及した全ての刊行物及び特許は、個々の各刊行物又は特許が特に及び個別に参照により組み入れられることを示すかように、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１５４】
主題の特定の実施形態を説明してきたが、上記の説明は例示であり、網羅的なものではない。当業者には、本明細書及び特許請求の範囲を検討することにより、多数の改変が明白となるであろう。本発明の完全な範囲は、特許請求の範囲をその等価物の完全な範囲と共に、明細書をそれらの改変と共に参照して決定するべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】ＢＭＰ−７の構造に基づいた、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーの保存システインノット構造の概略図である。構造のコアを形成するシステインは、Ｃ１〜Ｃ６として示す。このファミリーの従来の受容体リガンドメンバーでは、ループＡ及びループＢが、ＩＩ型受容体への結合を媒介するのに対し、Ｃ３とＣ４間の領域は、αヘリックス、並びに二量体化及びＩ型受容体への結合を媒介するその他のアミノ酸を含む。Ｃ３とＣ４間の領域は、単量体間のジスルフィド結合の形成に不可欠なシステインも含む。リガンド結合「トラップ」のＤａｎファミリーでは、ループＡ及びループＢが、標的ＢＭＰリガンドへの結合に関与するのに対して、Ｃ３とＣ４間の領域は、一般的に受容体リガンド内の領域よりも小さい。本明細書に記載の通り、Ｌｅｆｔｙタンパク質は、この構造上にマッピングされ、５つの機能的領域に分割される場合がある。領域１は、Ｃ１（システインノットドメインの第１システイン）のＮ−末端である成熟ポリペプチドの部分である。領域２及び領域４は、ループＡ及びループＢに対応し、リガンド結合（例えばＮｏｄａｌ、ミオスタチン及びＧＤＦ−１１等のリガンド）に関与する。Ｌｅｆｔｙタンパク質の領域３は、αヘリックス、及び分子間架橋に関与するシステインを有さない。領域５は、システインノットドメインの最終システインのＣ−末端である部分である。
【図２】ＴＧＦ−βファミリーの幾つかのメンバーのシステインノットドメインの配列を示す。ＰＤＲＣ、Ｇｒｅｍｌｉｎ、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ及びＮｏｇｇｉｎは、ＴＧＦ−βファミリーの種々の受容体リガンドメンバーに結合して、これらの活性を阻害するタンパク質である、リガンド「トラップ」グループのメンバーである。ＢＭＰ−２、ＧＤＦ−８及びＴＧＦ−βは、ジスルフィド架橋二量体を形成して、Ｉ型及びＩＩ型受容体媒介シグナル伝達を結合及び活性化する、従来の受容体リガンドであ。真ん中に示すＬｅｆｔｙは、Ｌｅｆｔｙポリペプチドである。ＢＭＰ受容体リガンド内におけるＩＩ型受容体の結合を媒介する、ループＡ及びループＢに対応する領域には、下線が引いてある。「二量体化ループ」に対応する領域には、上線が引いてあり、四角の囲みは、ＢＭＰ−２のＩ型受容体結合ヘリックスを示す。単量体−単量体ジスルフィド結合形成に関与するシステインは、赤色で示す。注目すべき点として、二量体化ループは、Ｌｅｆｔｙ又はトラップファミリーメンバーよりもＢＭＰ−２、ＧＤＦ−８及びＴＧＦ−βにおいて長い。保存システインは、緑色で示す。これら各配列の配列番号は、以下の通りである：ＰＤＲＣ（配列番号１７）；Ｇｒｅｍｌｉｎ（配列番号１８）；Ｃｅｒｂｅｒｕｓ（配列番号１９）；Ｄａｎ（配列番号２０）；Ｎｏｇｇｉｎ（配列番号２１）；ヒトＬｅｆｔｙ  Ａ（配列番号２２）；ＢＭＰ−２（配列番号２３）；ＧＤＦ−８（配列番号２４）；ＴＧＦ−β（配列番号２５）。
【図３】ヒトＬｅｆｔｙ−Ａ及びＬｅｆｔｙ−Ｂ並びにマウスｌｅｆｔｙ−１及びｌｅｆｔｙ−２からなるＬｅｆｔｙタンパク質の配列を示す。シグナルペプチド、ＲＸＸＲ開裂部位（プロペプチドＣ−末端の印となる部位）、システインノットの保存システイン（「Ｃ」）、及びヒトの障害（Ｒ３１４Ｋ５、Ｓ３４２Ｋ）に関連した配列改変の位置に対応する領域を示す。配列番号１〜４。
【図４】ヒトＬｅｆｔｙ  Ａ及びＬｅｆｔｙ  Ｂアミノ酸配列（それぞれ、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ  ＮＰ＿００３２３１及びＮＰ＿０６６２７７；それぞれ、配列番号１及び配列番号２）を示す。シグナル配列には、点線で下線が引いてある。ＲＸＸＲ開裂部位は、下線が引いてある。システインノットドメインには、二重下線が引いてある。
【図５】第１のＲＸＸＲ開裂部位における開裂により得られたヒトＬｅｆｔｙ  Ａ及びＬｅｆｔｙ  Ｂの３４ｋＤａ成熟形態のアミノ酸配列を示す（それぞれ、配列番号９及び配列番号１０）。図１に示したような領域１〜５を示す。領域１及び領域５には、破線で下線が引いてある。領域２及び領域４には、一重下線が引いてある。領域３には、二重下線が引いてある。網掛けを付けた領域は、Ｎｏｄａｌ、ミオスタチン及び／又はＧＤＦ−１１阻害活性を保持するＬｅｆｔｙ変異体を生成する際に修飾又は削除する場合がある領域に対応する。
【図６】調製後にミオスタチン結合に関して試験を行った種々のヒトＬｅｆｔｙ  Ａコンストラクトを示す概略図である。大きい方の形態（３４ｋＤａ、即ち「Ｌｅｆｔｙ  ３４」）は、第２のＲＸＸＲ開裂部位を不活性化する改変を含んでいた。天然のシグナル配列は、（そのＣ−末端の２つのアラニン残基と共に）蜜蜂メラチンリーダー配列で置き換えられた。短い方の形態（２８ｋＤａ、即ち「Ｌｅｆｔｙ  ２８」）は、第２のＲＸＸＲ開裂配列の直前のロイシンで開始される、アミノ末端にて切断したＬｅｆｔｙ配列に続くメラチンリーダー配列を含んでいた。Ｎ−及びＣ−末端のＦｃ融合は、図示の通り調製した。
【図７】ＢｉａｃｏｒｅＴＭ結合試験のデータを示す。ＧＤＦ−１１をＢｉａｃｏｒｅチップに固定化し、このチップにより種々のＬｅｆｔｙコンストラトを発現する細胞由来のならし培地を継代培養した。上昇する曲線は、タンパク質の結合を示しており、この曲線はその後の洗浄段階で下降している。対照試料は、結合を殆ど又は全く示していない。これらのデータは、Ｌｅｆｔｙ  ３４及びＬｅｆｔｙ  ２８が、ミオスタチンに直接結合することを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年2月27日(2008.2.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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