(57)【要約】【解決手段】  本明細書では、脂質に共有結合することができるペプチド、およびそのようなペプチド並びにリポペプチドを用いて疾患を予防または治療する方法が開示される。【選択図】      図１
2009506986.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫反応を必要とする被験対象における免疫反応を刺激する方法であって、
脂質に共有結合した約５〜約２５アミノ酸を有するペプチドを含有する有効量の薬剤を前記被験対象に投与する工程と、
前記被験対象における免疫反応を刺激する工程と
を有する方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、前記薬剤は、以下の化学式（Ｉ）のグリセリドを有するものであって、
【化１】
2009506986.tif 000013
式中、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３は、水素、Ｃ２〜Ｃ２５脂肪酸、および前記約５〜約２５アミノ酸のペプチドから選択されるものであり、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３の少なくとも１つは、前記ペプチドである。
【請求項３】
請求項１記載の方法において、免疫反応を刺激する工程は、さらに、
先天性免疫反応を刺激する工程を有するものである。
【請求項４】
請求項１記載の方法において、免疫反応を刺激する工程は、さらに、
組織常在性免疫細胞を刺激する工程を有するものである。
【請求項５】
請求項４記載の方法において、前記組織常在性免疫細胞は、γδＴ細胞、単球、ＮＫ細胞、好中球、ＣＤ５＋Ｂ細胞、およびそれらの組み合わせから選択されるものである。
【請求項６】
請求項４記載の方法において、前記組織常在性免疫細胞は、前記ペプチドが接触するときに刺激されるものである。
【請求項７】
請求項１記載の方法において、免疫反応を刺激する工程は、投与後少なくとも約３日間、免疫反応を刺激する工程を有するものである。
【請求項８】
請求項１記載の方法において、前記化合物は、前記被験対象の脂肪組織に実質的に沈着されるものである。
【請求項９】
請求項１記載の方法において、前記薬剤を投与する工程は、腸内、非経口、局所、乳腺注射、およびそれらの組み合わせから選択される方法により前記薬剤を投与する工程を有するものである。
【請求項１０】
請求項１記載の方法において、前記薬剤は、疾患形成因子曝露前に投与されるものである。
【請求項１１】
請求項７記載の方法において、感染は実質的に予防されるものである。
【請求項１２】
請求項１記載の方法において、前記薬剤は、感染前に投与されるものである。
【請求項１３】
請求項１記載の方法において、前記薬剤は、疾患形成因子曝露後に投与されるものである。
【請求項１４】
請求項１記載の方法において、前記薬剤は、感染後に投与されるものである。
【請求項１５】
アミノ酸配列ＹＴＳＨＮＬＣＸまたはその逆配列のペプチドを有する化合物。
【請求項１６】
請求項１５記載の化合物において、前記ペプチドは、脂質に共有結合されるものである。
【請求項１７】
アミノ酸配列ＲＳＨＮＬＣＸまたはその逆配列のペプチドを有する化合物。
【請求項１８】
請求項１７記載の化合物において、前記ペプチドは、脂質に共有結合されるものである。
【請求項１９】
アミノ酸配列ＹＴＳＨＮＬＣＸＣＬＮＨＳＲまたはその逆配列のペプチドを有する化合物。
【請求項２０】
請求項１９記載の化合物において、前記ペプチドは、脂質に共有結合されるものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００５年７月２５日付けで出願された表題「新規リポペプチド類およびその生物活性」の米国仮出願第６０／７０２，１１１号、２００６年２月２８日付けで出願された表題「新規免疫調整ペプチド及びリポペプチド、並びにそれらの生物活性」の米国仮出願第６０／７７７，３１９号、及び２００６年３月２９日付けで出願された表題「新規免疫調節ペプチド及びリポペプチド」の米国仮出願第６０／７８７，３８５号に対して優先権を主張するものであり、この参照によりその全開示内容が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
現在のパラダイム下において、脊椎動物の免疫機能は、適応性免疫反応および先天性免疫反応の主に２種類の反応から成るものとして描かれている。前記適応性免疫反応は脊椎動物のみに存在し、以前に感染したことのある病原体による再感染からの選択的、長期的保護を提供する。前記先天性免疫反応は感染または外傷に対する即時型反応を提供し、エフェクター細胞の局所的な食作用、細胞溶解作用、および細胞毒性作用を促す。
【０００３】
前記先天性免疫反応は進化的には動物最古の（２億５０００万年以上遡る）免疫系であり、事実上すべての脊椎動物および無脊椎動物に存在する。前記脊椎動物の先天性免疫反応は、侵入した病原体に対する防御の第一線であり、組織コンパートメント、特に皮膚および呼吸、消化管など、細菌およびウイルス性病原体の主な侵入経路である組織に多く見られる免疫細胞から成る。生殖細胞系にコードされた一連の受容体が介在する前記先天性免疫反応の免疫細胞は、前記適応性免疫反応の作用に介在する免疫細胞とは表現型および遺伝子型で区別できる。
【０００４】
前記先天性免疫反応と炎症とは深く関連している。局所的な感染または外傷に対する炎症反応は一般に有益であると考えられ、組織常在性エフェクター細胞の細胞毒性作用および食作用により、病原体を封じ込め、除去する。局所炎症は有益であるが、全身炎症は有害であり、外傷または敗血症といった致命的な結果となることも多い。そのため、外傷または敗血症に対する炎症反応を制限することは現在の医学研究の主題であり、外傷または敗血症時の先天性免疫反応を制限することは、炎症の抑制に効果的な方法と考えられる。
【０００５】
組織因子つまり外因系血液凝固カスケードは、最近、全身炎症または敗血症時の凝固活性化因子として同定された。伝統的に、凝固は炎症とは別のプロセスであり、特に循環系の物理的破損の結果、血液容積および血液成分が失われないようにするために進化したものと考えられてきた。この伝統的な見方では、トロンビンが前記カスケードに介在し、これが血液凝固の唯一のメカニズムである。しかし、最近の証拠によって、炎症誘発性（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカイン、特にＩＬ−６も組織因子（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒ：ＴＦ）の発現を増加させることで凝固を促すことが確立され、現在、この組織因子が全身炎症または敗血症時の主な凝固活性化因子であると考えられている。
【０００６】
逆に、トロンビンは白血球付着、炎症誘発性サイトカインの産生（特にＩＬ−６およびＩＬ−８）、血小板からの可溶性ＣＤ４０Ｌの放出、肥満細胞からのヒスタミンの放出を含む、様々な炎症誘発作用を有する。血小板もこれまでのところ、炎症と前記先天性免疫反応とを結び付ける分子シグナル伝達能を持つ炎症メディエーターとして認識されていない。そのため、凝固、炎症、及び前記先天性免疫反応は相互に関連するプロセスであることは今や明らかである。宿主免疫反応における炎症の役割はあまり理解されていないが、前記先天性免疫反応の調節、制御、および相互関係における重要な態様である。統一見解によれば、哺乳類の先天性免疫反応は、炎症に始まり、先天性免疫エフェクター細胞のアップレギュレーション、前記先天性免疫反応の細胞毒性作用および細胞溶解作用のダウンレギュレーションを経て、ホメオスタシスに戻る、という連続する４段階である。さらに理解された炎症カスケードは、最も重要なヒト疾患の多く、及び安全で効果的な治療戦略の合理的設計の基礎となる免疫病理学の理解の中核となっている。
【０００７】
Ｔ細胞は哺乳類の免疫反応で中心的役割を果たし、Ｔ細胞受容体（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ＴＣＲ）の発現の違いにより、αβまたはγδヘテロ二量体のいずれかに分類されている。ヒト循環血液中のＴ細胞の大部分はαβサブセット（αβＴ細胞）である。歴史的には前記αβＴ細胞に研究の焦点が当てられ、適応性免疫におけるその役割は、抗原提示細胞による抗原認識および主要組織適合複合体（ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ：ＭＨＣ）とＴＣＲとの結合により明確に確立された。
【０００８】
Ｔ細胞のγδサブセットは十分には研究されていない組織常在性細胞の細胞系譜であり、組織常在性Ｔ細胞集団の最高５０％を占める。しかし、循環血液中では、γδＴ細胞はαβＴ細胞よりもはるかに少なく、循環血液中Ｔ細胞集団の約１〜５％を構成するのみである。マクロファージおよびナチュラルキラー細胞（ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ：ＮＫ細胞）活性に対するγδＴ細胞のサイトカイン放出の影響が、最近、マウスモデルにおいて報告された。簡単には、γδＴ細胞欠損マウスは細菌感染抵抗力が低いことが示され、マクロファージのホメオスタシス崩壊、ＮＫ細胞によるＩＮＦ−γ産生低下、及び細菌増殖の亢進で特徴付けられる。γδＴ細胞による抗原認識はＭＨＣと独立しており、これらの細胞は多様なＴＣＲレパートリーを有する。従って、γδＴ細胞は広範な感染で活性化される可能性がある。これらの細胞が活性化されるとクローン増殖され、インビトロ適応性免疫反応と同様と思われるクローン増殖メカニズムにより、総Ｔ細胞集団の最高９７％を構成することができる。
【０００９】
ナイーブマウスおよび仮性結核菌感染マウスにおけるγδＴ細胞の転写プロフィールの特徴が決定され、マウスγδＴ細胞は、グランザイムＡ、Ｂ、およびＲＡＮＴＥＳ、並びにリンホトキシンｂ、Ｆａｓリガンド、ＮＫＲ−ＰＬＡ、ＮＫＲ−ＰＬＣ、ＬＡＧ−３、および２Ｂ４などの他の細胞毒性メディエーター、さらに、対応する抑制性受容体の転写を高レベルで構成的に発現することを示していた。しかし、我々の知る限り、霊長類γδＴ細胞を用いた同様の研究は行われていない。
【００１０】
先天性免疫細胞による病原体認識は、一般に、組織常在性単球のパターン認識受容体（ｐａｔｔｅｒｎ−ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ＰＲＲｓ）と呼ばれる、一連の生殖細胞系列でコードされた受容体を介すると考えられている。最も良く研究されているＰＲＲは、Ｔｏｌｌ様受容体（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ＴＬＲ）である。Ｔｏｌｌ受容体はショウジョウバエで初めて同定された膜貫通型受容体であるが、その後、ヒトでＴＬＲの相同ファミリーが同定された。ＴＬＲの細胞内ドメインはＩＬ−１受容体と構造的に密接に関連しており、Ｔｏｌｌ／インターロイキン−１（Ｔｏｌｌ／ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１：ＴＩＲ）ドメインと呼ばれる。ショウジョウバエのＴｏｌｌとヒトＴＬＲは、（１）アダプタータンパク質ＭｙＤ８８、（２）ＴＯＬＬＩＰ（Ｔｏｌｌ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、（３）プロテインキナーゼＩＲＡＫ（ＩＬ−１Ｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ）、および（４）ＴＲＡＦ６（ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  ６）の主に４成分から成る相同細胞内シグナル伝達成分を共有している。
【００１１】
ＴＬＲｓは、細菌細胞壁のリポ多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ：ＬＰＳ）、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  Ｂ：ＳＥＢ）、破傷風毒素抗原（ｔｅｔａｎｕｓ  ｔｏｘｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎ：ＴＴＡ）、二本鎖ウイルスＲＮＡ断片、細菌ＤＮＡ、およびフラジェリンなど、一般的には病原体関連分子パターン、つまりＰＡＭＰｓ（ｐａｔｈｏｇｅｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｔｅｒｎｓ）と呼ばれる病原体由来分子の保存領域を認識する。ＴＬＲが活性化すると、最終的にはＮＦκＢが活性化し、ＩＬ−８、ＩＰ−１０、ＭＩＰ−１αおよびβ、並びにＲＡＮＴＥＳを含むマクロファージおよび樹状細胞の下流ケモカインの産生、および感染部位のＮＫ細胞およびＴ細胞流入が活性化する。フィブロネクチン断片を除き、ヒトＴＬＲｓがショウジョウバエのＳｐａｔｚｌｅプロセシングと類似の方法で病原体感染に反応して内因性リガンドを認識することは示されていない。
【００１２】
熱ショックタンパク質（Ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＨＳＰｓ）は、哺乳類細胞および微生物病原体で同様に産生される、非常に保存されたストレス誘導タンパク質ファミリーであり、ＨＳＰｓは関節リウマチおよびアテローム性動脈硬化の免疫病理に関与している。ＨＳＰｓの免疫原性は、ＨＳＰｓがシャペロン結合した抗原ペプチドに由来するようにみえる。ＨＳＰ−ペプチド複合体は、前記シャペロン結合したペプチドの抗原性を、アルブミンなどの非ＨＳＰペプチド結合抗原と比べ、桁違いに増強する。前記ＨＳＰ−ペプチド複合体の一般的な受容体は、単球のα２マクログロブリン受容体であるＣＤ９１と同定された。そのため、前記ＨＳＰｓは病原体感染に対する先天性免疫反応の中で重要な炎症制御タンパク質である。
【００１３】
ディフェンシンおよびカテリシジンは、最近発見された免疫調節性を持つ陽イオン性抗菌小ペプチドである。ヒトのディフェンシンおよびカテリシジンは、好中球、単球、特定のリンパ球集団、ケラチノサイト、および気管支上皮細胞を含む細胞に由来する。ディフェンシンは３．５〜４ｋＤａのシステインに富む陽イオン性ペプチドであり、ケモカインの構造に似た複雑な三次構造を有する。カテリシジンは直鎖ペプチドであり、ＬＬ−３７に典型的に見られるように、ヒトＣＡＰ−１８のＣ−末端配列に由来する。
【００１４】
細菌細胞膜由来の様々なリポタンパク質がマクロファージ、線維芽細胞、およびリンパ球を活性化し炎症反応を誘導することが示されており、広く炎症誘発性があると考えられている。例えば、大腸菌のリポタンパク質は単球の活性化因子であると特徴付けられ、そうであることが示されている。最近、マイコプラズマのリポペプチドファミリーの特徴が決定された。２ｋＤａの親リポペプチドは、マクロファージの強力な活性化因子としての特徴が決定され、マクロファージ活性化リポペプチド、つまりＭＡＬＰ−２として知られている。これらの単球活性化リポペプチドは、一般にある種の重要な構造的特徴を有している。前記マイコプラズマリポペプチドは様々な長さ及び配列のペプチドを含むが、すべてがＮ末端にシステインを有する。この脂質部分は前記Ｎ末端システインの２，３−ジアコイルオキシプロピルチオエーテル（２，３−ｄｉａｃｏｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌ  ｔｈｉｏｅｔｈｅｒ）としてエステル化されている。そのため、Ｎ−末端窒素は保護されていない。さらに、Ｓ鏡像異性体は生物学的に活性であるが、Ｒ鏡像異性体は活性ではない。一方、大腸菌由来の活性リポペプチドは３脂質変異体であり、３番目の脂質がＮ末端アミドとして結合される。
【００１５】
ジアシルグリセロールの生物学的役割については文献に十分報告されている。例えば、ジアシルグリセロールはトリグリセリドとして脂質輸送に関与し、アポリポタンパク質などの可溶性タンパク質と共同でコレステロールのトランスポーターとなることは周知である。ジアシルグリセロールは細胞内シグナル伝達機能を有することも知られている。細胞内膜結合型ホスファチジルイノシトール−４，５−重リン酸塩は酵素ホスホリパーゼＣの作用により開裂し、２つの細胞内メッセンジャー分子、イノシトール三リン酸と膜結合型ジアシルグリセロール（特に、１−ステアロイル−２−アラキドノイルグリセロール）とを放出する。ジアシルグリセロールはプロテインキナーゼＣを活性化し、これが転写因子ＮＦκＢを活性化し、様々なサイトカインおよびケモカインの遺伝子発現をアップレギュレートする。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本明細書に記載する本発明の実施形態には、脂質に共有結合した約５〜約２５アミノ酸の免疫反応性ペプチドを含む、免疫反応を刺激することができる化合物が含まれる。一部の実施形態において、前記脂質は、以下の一般式（Ｉ）のグリセリドであり、
【化２】
2009506986.tif 000003
【００１７】
式中、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３は水素、Ｃ２〜Ｃ２５脂肪酸、およびペプチドから選択されるものであり、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３の少なくとも１つはペプチドである。実施形態の前記脂肪酸は飽和、不飽和、または多価不飽和脂肪酸とすることができ、前記ペプチドは前記ペプチドのＣ末端で、エステル結合により前記脂質と共有結合することができる。
【００１８】
特定の実施形態において、前記免疫反応性ペプチドのアミノ酸配列はＸＳＨＮＬＣＸまたはその逆配列であり、一部の実施形態において、ＲＳＨＮＬＣＸまたはＹＴＳＨＮＬＣＸまたはその逆配列とすることができる。さらに他の実施形態において、前記アミノ酸配列はＹＴＳＨＮＬＣＸＣＬＮＨＳＲまたはその逆配列とすることができ、特定の他の実施形態において、前記アミノ酸配列はＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥとすることができる。
【００１９】
本発明の実施形態の化合物は、さらに、薬学的に許容可能な賦形剤を含んでも良く、前記化合物の有効量に一致する単位用量の形態で提供されても良く、これらの実施形態は薬学的組成物とみなされても良い。
【００２０】
本発明のさらなる実施形態は方法を含み、この方法は、脂質に共有結合した約５〜約２５アミノ酸を有するペプチドで作られた薬物の有効量を、それを必要とする被験対象に投与する工程と、免疫反応を刺激する工程とを含んでも良い。本発明の実施形態の前記ペプチドは、アミノ酸配列ＲＳＨＮＬＣＸまたはＹＴＳＨＮＬＣＸまたはその逆配列のペプチドまたはペプチド断片を含んでも良く、一部の実施形態において、ＹＴＳＨＮＬＣＸＣＬＮＨＳＲまたはその逆配列のペプチドまたはペプチド断片を含んでも良い。
【００２１】
本発明の実施形態の薬物は、以下の一般式（Ｉ）のグリセリドを含んでも良く、
【化３】
2009506986.tif 000004
【００２２】
式中、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３は水素、Ｃ２〜Ｃ２５脂肪酸、およびペプチドから選択されるものであり、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３の少なくとも１つはペプチドである。実施形態の前記脂肪酸は、飽和、不飽和、または多価不飽和脂肪酸とすることができる。前記ペプチドは、前記ペプチドのＣ末端で、エステル結合により前記脂質に共有結合することができる。前記薬物は、投与されて先天性免疫反応を刺激することができ、γδＴ細胞、単球、ＮＫ細胞、好中球、ＣＤ５＋Ｂ細胞、およびその組み合わせを含む（これに限定されるものではないが）組織常在性免疫細胞が刺激されても良い。一部の実施形態において、前記組織常在性免疫細胞は前記ペプチドと接触したときに刺激される。
【００２３】
本発明の特定の実施形態において、刺激された免疫反応には、前記薬物投与後、少なくとも３日間免疫反応を刺激する場合が含まれても良く、特定の他の実施形態において、前記免疫反応は１週間若しくはそれ以上刺激されることもある。
【００２４】
本発明のさらに他の実施形態において、前記薬物は前記被験対象の脂肪組織に沈着することがあり、前記薬物は経腸、非経口、および局所投与、乳房注射、およびこれらの組み合わせを含むいかなる方法でも投与することができる。非経口投与には、（これに限定されるものではないが）関節内、滑液嚢内、髄腔内、静脈内、筋肉内、皮下、およびその組み合わせが含まれても良い。経腸投与には（これに限定されるものではないが）経口（ｏｒａｌおよびｐｅｒｏｒａｌ）、直腸、およびその組み合わせが含まれても良く、局所投与には（これに限定されるものではないが）鼻腔内、呼吸器内、経皮（ｅｐｉｃｕｔａｎｅｏｕｓおよびｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）投与、およびその組み合わせが含まれても良い。
【００２５】
本発明の一部の実施形態において、疾患形成因子に曝露する前に前記薬物を投与することができ、これらの実施形態では、実質的に疾患を予防することができる。他の実施形態において、前記薬物を疾患前に投与することができる。前記薬物は疾患形成因子に曝露した後に投与することもでき、これらの実施形態では、実質的に疾患を予防することができる。更に他の実施形態において、前記薬物は、疾患後に前記被験対象に投与されても良い。
【００２６】
本発明の実施形態のさらなる方法には、感染を治療する方法、免疫反応を刺激する方法、疾患を予防する方法、感染を予防する方法、並びに上述の本発明の薬物および組成物を用いて疾患を治療し、二次感染を予防する方法などのこれらを組み合わせた方法が含まれる。
【００２７】
本発明の実施形態には、さらに、本発明の化合物に結合する抗体と、（これに限定されるものではないが）全身炎症、慢性炎症性疾患などの炎症、および敗血症、敗血症以外の損傷、外傷、手術、またはその組み合わせによる炎症を、本発明の実施形態の抗体を投与することによって治療する方法とが含まれる。本発明の実施形態の抗体は、（これに限定されるものではないが）経腸、非経口、および局所投与を含む当該分野で既知のいかなる方法でも、被験対象に投与されても良い。
【００２８】
本発明の実施形態の抗体は、（これに限定されるものではないが）タンパク質などの蛍光マーカー、または量子ドットなどの選択的マーカーに結合してプローブを形成することもでき、このようなプローブを用いて生物、細胞、または組織サンプルなどのサンプル中のペプチド、およびそのようなペプチドと相互作用する細胞またはタンパク質を検出および同定する方法と関連付けることもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
文脈において他の意味を明らかに指示していない限り、本明細書および添付の請求項に用いるように、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は複数形についての言及も含むことに留意すべきである。従って、例えば、「細胞」について言及する場合、１若しくはそれ以上の細胞および当業者に周知なその等価物に言及している。他に定義しない限り、本明細書で用いたすべての技術および科学用語は、当業者の１人に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で説明されたものと同一または同等のいかなる方法および材料も、本発明の実施形態の実施または検証に用いることができるが、今回は好ましい方法、装置、および材料を説明する。本明細書に言及したすべての出版物は、参照によって組み込まれるものである。本明細書では、先行する発明に基づいて、本発明がそのような開示に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されることはない。
【００３０】
「アジュバント」とは、抗原の免疫刺激作用または薬物の薬理作用を向上させる任意の物質を指す。
【００３１】
本明細書に用いるように、「約」という用語は、一緒に使用される数値のプラスまたはマイナス１０％を意味する。従って、約５０％は４５〜５５％の範囲を意味する。
【００３２】
本明細書では、「模倣体」、「ペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃ）」、および「ペプチドミメティック（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）」という用語は同義的に用いられ、一般に、特定の天然型ペプチド、またはタンパク質の機能ドメイン（例えば、結合モチーフまたは活性部位）の三次結合構造または活性を模倣した、ペプチド、部分ペプチド、または非ペプチド分子を指す。以下にさらに説明するように、これらのペプチド模倣体には、遺伝子組換えまたは化学的に修飾されたペプチド、および小分子薬物模倣体などの非ペプチド物質を含む。
【００３３】
本明細書に用いるように、「薬学的に許容可能な塩、エステル、アミド、およびプロドラッグ」という用語は、適切な医学的判断の範囲内で、妥当な利益／リスク比と釣り合い、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などを生じずに、患者の組織と接触させて使用するのに適し、その使用目的において効果的である、本発明の化合物のカルボン酸塩、アミノ酸付加塩、エステル、アミド、およびプロドラッグ、および可能な場合は本発明の化合物の双性イオン形を指す。
【００３４】
本明細書に用いるように、「生理学的に許容される」という用語およびその文法的変化形は、組成物、担体、希釈剤、および試薬を指す場合は同義的に用いられ、吐き気、眩暈、皮疹、または急性胃ぜん動などの望ましくない生理的影響を発生させないか、又は最小限として、前記物質を哺乳類に投与可能であることを意味する。好ましい実施形態において、治療目的でヒト患者または他の動物に投与する場合、前記治療組成物には抗原性がない。
【００３５】
治療薬と関連して用いる場合、「提供する」とは、標的組織内または組織表面に直接治療薬を投与すること、または患者に治療薬を投与し、それによって前記治療薬が標的とする組織に好ましい影響を与えることを意味する。
【００３６】
本明細書に用いるように、「被験対象」または「患者」は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、サル、ウサギ、ラット、マウスを含む（これに限定されるものではないが）動物または哺乳類を指す。
【００３７】
本発明の目的において、「疾患」は、例えばウイルス粒子、病原菌などの任意の感染因子であっても良い。「罹患した被験対象」に関して用いられる「罹患した」は、感染因子に感染したヒトまたは動物の被験対象を指しても良い。前記「罹患した被験対象」は、例えば既知の症状など、感染の徴候を示すこともあれば、示さないこともある。
【００３８】
本明細書に用いるように、「試料」には本発明の方法で検証することができる生物学的試料が含まれ、（これに限定されるものではないが）血清、血漿、全血、脳脊髄液、リンパ液、様々な外分泌物（尿、呼吸器、腸、または尿生殖路分泌物、涙など）などの体液が含まれる。
【００３９】
本明細書に用いるように、「治療薬」という用語は、患者の望まない状態または疾患を治療、対処、回復、予防、または改善するために利用される物質を意味する。本発明の実施形態は、先天性免疫反応を刺激し、炎症反応を調節することに向けられている。本発明の方法を利用する場合は、予防的利用、および既存の状態の治療における治療的利用を意図している。
【００４０】
本明細書に用いるように、「治療的に有効な」または「有効な」という用語は同義的に用いることができ、本発明の実施形態の治療的組成物、例えば、１若しくはそれ以上のペプチジルジアシルグリセリドまたはその模倣体などの量を指す。例えば、１−ペプチジル−２，３−ジアシルグリセリド、またはその模倣体を有する組成物の治療的有効量は、望みの効果を達成する、つまり前記組成物が投与される動物の先天性免疫反応を効果的に刺激するように計算された所定の量である。
【００４１】
本発明の治療用組成物に関して用いた場合の「単位用量」という用語は、前記被験対象に用いる単位用量に適した物理的に不連続な単位を指し、各単位は必要な希釈剤、つまり、賦形剤、担体、または媒体と関連して望みの治療効果を生じるように計算された活性物質の所定量を含む。
【００４２】
本発明の１の実施形態は、１−ペプチジル−２，３−ジアシルグリセリド、つまりＰＤＡＧに関するものとすることができる。本発明の他の実施形態には、ＰＤＡＧｓを含む組成物、ＰＤＡＧｓの一部を含む組成物、ＰＤＡＧペプチドの類似体を含む組成物、およびＰＤＡＧｓのペプチド模倣体を含む組成物が含まれても良い。
【００４３】
本発明の実施形態において、ＰＤＡＧｓ、ＰＤＡＧｓの一部、ＰＤＡＧｓの類似体、およびＰＤＡＧｓの模倣体は、被験対象に提供されても良く、また（これに限定されるものではないが）免疫反応などの治療的効果を刺激しても良く、特定の実施形態において、前記免疫反応は、提供される被験対象の先天性免疫反応であることもある。本発明の他の実施形態において、ＰＤＡＧｓ、ＰＤＡＧｓの一部、ＰＤＡＧの類似体、およびＰＤＡＧの模倣体を、疾患の治療を受けている被験対象、健康な被験対象、または健康であり、且つ疾患、疾患形成粒子、または罹患したヒトおよび／または動物に感染する可能性がある被験対象に投与することができる。ＰＤＡＧｓ、ＰＤＡＧｓの一部、ＰＤＡＧｓの類似体、およびＰＤＡＧｓの模倣体、およびＰＤＡＧｓ、ＰＤＡＧｓの一部、ＰＤＡＧｓの類似体、並びにＰＤＡＧｓの模倣体を含む治療薬が健常な被験対象に提供される本発明の実施形態において、前記ＰＤＡＧｓ、ＰＤＡＧｓの一部、ＰＤＡＧｓの類似体、およびＰＤＡＧの模倣体は、前記被験対象の免疫系の予防的活性化を促し、特定の実施形態において、先天性免疫の予防的活性化を促すことができる。
【００４４】
理論に縛られることは望まないが、本発明の実施形態において、被験対象に提供される場合、前記ＰＤＡＧｓ、ＰＤＡＧｓの一部、ＰＤＡＧｓの類似体、およびＰＤＡＧｓの模倣体は、前記被験対象の組織常在性免疫細胞を活性化しても良い。いくつかの実施形態において、前記ＰＤＡＧｓ、ＰＤＡＧｓの一部、ＰＤＡＧｓの類似体、およびＰＤＡＧｓの模倣体は、免疫反応を開始しても良く、他の実施形態において、前記免疫反応は先天性免疫反応であっても良い。
【００４５】
本発明の実施形態には、（これに限定されるものではないが）非経口、経腸、または局所投与など、ＰＤＡＧｓ、ＰＤＡＧｓの一部、ＰＤＡＧｓの類似体、およびＰＤＡＧの模倣体、並びにＰＤＡＧｓ、ＰＤＡＧｓの一部、ＰＤＡＧｓの類似体、およびＰＤＡＧｓの模倣体を含む治療薬を投与する方法が含まれても良い。
【００４６】
本発明の他の実施形態には、ＰＤＡＧｓに特異性を持つ抗体、および被験対象の全身または局所ＰＤＡＧｓ濃度が減少している場合にそのような抗体を使用する方法が含まれる。特定の実施形態において、ＰＤＡＧｓに特異的な抗体が提供される被験対象は、（これに限定されるものではないが）全身炎症、慢性炎症性疾患、アテローム硬化性疾患、リウマチ様疾患、自己免疫疾患などの免疫疾患の症状を示していることがある。
【００４７】
本発明のさらに他の実施形態には、蛍光標識されたＰＤＡＧｓ、ＰＤＡＧｓの類似体、およびＰＤＡＧｓに特異性を持つ蛍光標識された抗体または抗体断片、並びにそのような蛍光標識されたＰＤＡＧｓ、ＰＤＡＧｓの類似体、および抗体を作成する方法が含まれる。本発明の実施形態において、蛍光標識されたＰＤＡＧｓ、ＰＤＡＧｓの類似体、および抗体は、インビトロおよびインビボの両方で免疫系および免疫病理の態様を評価する診断ツールとして使用されても良く、いくつかの実施形態では、被験対象に（これに限定されるものではないが）慢性炎症性疾患、自己免疫疾患、アテローム硬化性疾患、糖尿病などと一致した症状を示す被験対象が含まれても良い。
【００４８】
本発明の様々な実施形態において記載されるＰＤＡＧｓには、脂質分子に共有結合した少なくとも１つのペプチド部分を有するペプチジルジアシルグリセリドが含まれても良く、その一般式は１−ペプチジル−２，３−ジアシルグリセリドである。特定の実施形態において、前記脂質分子は１−ステアロイル−２−アラキドニルグリセロールである。
【００４９】
本発明の実施形態において記載されるＰＤＡＧｓは、以下の一般式（Ｉ）であっても良く、
【化４】
2009506986.tif 000005
式中、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３は、水素、ペプチド、ペプチド模倣体、またはペプチド類似体、または約１〜約２０炭素原子を有する飽和、不飽和、または多価不飽和脂肪酸であっても良い。本発明の一部の実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３の少なくとも１つは、ペプチド、ペプチド模倣体、またはペプチド類似体であっても良く、他の実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３の１つ以上は、ペプチド、ペプチド模倣体、ペプチド類似体であっても良い。
【００５０】
本発明の実施形態のペプチド部分は、約５〜約２５アミノ酸からできていても良く、１若しくはそれ以上の天然型、非天然型、および化学修飾されたアミノ酸を含んでも良い。これらのペプチド部分の分子量は約１０００〜約３０００ａｍｕであっても良い。本発明に含まれるペプチドまたはその模倣体には、望みの免疫活性化作用を与えるアミノ酸配列が含まれても良い。ペプチド部分は脂質部分に結合する前に作成および／または単離されても良く、例えば、ヒト、動物、細菌試料などの天然試料から合成および単離することができ、または当該分野で既知の方法により合成することができる。このように合成および単離されたペプチド、ペプチド模倣体、ペプチド類似体は、例えばろ過、クロマトグラフィーなどの当業者に周知の方法で精製または濃縮されても良い。前記ペプチド部分は、前記ペプチドのカルボキシ末端のカルボン酸でエステル化することにより、前記脂質部分に共有結合されることができ、一部の実施形態において、前記ペプチドのカルボキシ末端のカルボン酸のリン酸エステルを介して、前記ペプチド部分は前記脂質部分に結合されることができる。
【００５１】
脂質部分に共有結合し、ＰＤＡＧｓを形成するペプチド、ペプチド模倣体、またはペプチド類似体は、「ＰＤＡＧリポペプチド」と考えることができ、以下そのように呼ぶ。
【００５２】
例えば、ＰＤＡＧｓは以下の通り合成することができる。ＰＤＡＧペプチドまたはＰＤＡＧペプチド模倣体を、例えば、ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔカップリングサイクルを延長し、Ｗａｎｇ樹脂を事前充填するＦＭＯＣ合成プロトコールなどの固相合成法により作成しても良い。合成後、ペプチド側鎖の保護基を開裂し、前記ペプチドを、Ｒｅａｇｅｎｔ−Ｋを用いて樹脂から放出させても良い。次に前記ペプチドを、例えばジエチルエーテル抽出および凍結乾燥により、合成緩衝液から抽出しても良い。逆相Ｃ−１８精製を利用し、得られた粗ペプチドをさらに精製しても良く、その後ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる特徴決定を行い、アミノ酸配列を確認しても良い。
【００５３】
ペプチド模倣体のＰＤＡＧペプチドを、２段階の工程により前記ＰＤＡＧの脂質部分に共有結合させることができ、この工程では、まず、脱保護工程を除き、前記ＰＤＡＧペプチドを上述の通り合成する。次に、Ｃ末端カルボン酸を、例えばジシクロヘキシルカルビミド（ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｉｍｉｄｅ）を用いて活性化することができ、前記ペプチドをジアシルグリセロールまたはリン酸ジアシルグリセロール存在下で数時間保温することができる。この保温段階中にエステル化が起こることもあり、ペプチジルジアシルグリセミドが形成される。次に、前記ペプチド側鎖の保護基をＲｅａｇｅｎｔ  Ｋにより開裂することができ、前記ペプチジルジアシルグリセミド生成物をクロマトグラフィーにより単離、精製することができる。その後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる特徴決定により、精製した生成物の構造を確認することができる。
【００５４】
本発明の実施形態のＰＤＡＧｓのペプチド部分は、例えば、遺伝的にコードされた２０アミノ酸（またはＤアミノ酸）の１若しくはそれ以上の天然型側鎖を、（これに限定されるものではないが）例えばアルキル、低級アルキル、４−、５−、６−から７員環アルカリル、アミド、アミド低級アルキル、アミドジ（低級アルキル）、低級アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシ、およびその低級エステル誘導体を含む非天然型側鎖などの非天然型側鎖、および４−、５−、６−から７員環複素環と置換することにより修飾し、ペプチド模倣体を作成することができる。例えば、プロリン残基の環サイズを５員環から４、６、または７員環に変更したプロリン類似体を作成することができる。環状基は飽和または不飽和とすることができ、不飽和の場合は芳香族または非芳香族とすることができる。複素環基には、例えば窒素、酸素、および／または硫黄などの１若しくはそれ以上のヘテロ原子が含まれても良く、（これに限定されるものではないが）フラザニル、フリル、イミダゾリジニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、モルホリニル（例えば、モルホリノ）、オキサゾリル、ピペラジニル（例えば、１−ピペラジニル）、ピペリジル（例えば、１−ピペリジリル、ピペリジノ）、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリジニル（例えば、１−ピロリジニル）、ピロリニル、ピロリル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、チオモルホリニル（例えば、チオモルホリノ）、およびトリアゾリルを含む基を形成することができる。これらの複素環基は置換または非置換とすることができる。置換された複素環基には、（これに限定されるものではないが）アルキル、アルコキシ、ハロゲン、酸素、または置換または非置換フェニルなどの置換基を含むことができる。ＰＤＡＧペプチドのペプチド模倣体は、例えばリン酸化、スルホン化、ビオチン化などで化学的に修飾されたアミノ酸残基を有することもできる。
【００５５】
対応する天然型ペプチドと同一または同様の望ましい生物活性を持つが、溶解性、安定性、および／または加水分解またはタンパク分解感受性が向上したペプチド模倣体を作成するには、様々な技術が利用できる。従って、これらのペプチド模倣体化合物の特徴により、細胞透過性が向上し、細胞受容体への親和性および／または結合活性が高くなり、生物学的半減期が長くなるため、治療への応用が促進される。特定のペプチド模倣体化合物は、本発明のペプチドのアミノ酸配列に基づいている。ペプチド模倣体化合物は、特定ペプチドの３次元構造を基本とした３次元構造（つまり、「ペプチドモチーフ」）を有する合成化合物であることも多い。前記ペプチドモチーフは、前記望ましい生物活性、つまり、免疫反応を向上または刺激する活性を持つペプチド模倣体化合物を提供し、前記模倣体化合物の結合活性は実質的に低下しておらず、前記模倣体をモデルとした天然型ペプチドの活性と同一か、それよりも高いことが多い。
【００５６】
ペプチド模倣体の設計戦略については、当該分野で容易に利用できる。ペプチド模倣体の一の種類は、部分的または完全に非ペプチドであるが、ペプチド骨格の原子間結合を模倣し、天然型アミノ酸残基の側鎖の機能性を同様に模倣した側鎖を有する骨格を含む。エステル、チオエステル、チオアミド、レトロアミド、還元カルボニル、ジメチレン、およびケトメチレン結合などの数種類の化学結合が、一般的にプロテアーゼ耐性ペプチド模倣体作成時のペプチド結合に有用な置換基として、当該分野で知られている。他の種類のペプチド模倣体は、別のペプチドまたはタンパク質に結合するが、必ずしも天然型ペプチドの構造模倣体ではない、小分子の非ペプチドである。さらに他のの種類のペプチド模倣体は、コンビナトリアルケミストリーおよび大量の化学物質ライブラリを作成することによって生じる。これらは一般に新規の鋳型であり、天然型ペプチドと構造上の関連性はないが、非ペプチド骨格に必要な官能基が位置し、元のペプチドの「局所的」模倣体として機能する。
【００５７】
理論に縛られることは望まないが、ＰＤＡＧｓ、ＰＤＡＧｓの一部、ＰＤＡＧｓ類似体、またはＰＤＡＧｓ模倣体は、リポタンパク質リパーゼが前記ＰＤＡＧの脂質骨格を開裂し、前記ジアシルグリセロールからペプチジル部分を放出する時に、標的組織内で活性化されても良い。次に、前記ペプチジル部分は（これに限定されるものではないが）γδＴ細胞などの組織常在性免疫細胞に結合し、（これに限定されるものではないが）ＩＮＦ−γ、ＴＮＦ−α、グランザイム、およびＲＡＮＴＥＳなどのサイトカイン放出を開始し、組織常在性マクロファージ、食作用を示すＮＫ細胞、または好中球を活性化し、他の刺激性サイトカインおよびペプチドの放出を刺激することができる。サイトカイン放出によってＣＤ５＋Ｂ細胞（組織常在性Ｂ１細胞としても知られている）が刺激され、免疫グロブリン（強力なオプソニン化作用のある免疫グロブリンＩｇＭ）および他のＢ細胞由来サイトカインおよびケモカインを産生することができる。従って、本発明の実施形態にはＰＤＡＧペプチド、ＰＤＡＧペプチドの一部、ＰＤＡＧペプチド類似体、またはＰＤＡＧペプチドのペプチド模倣体が含まれ、これらは被験対象に投与したときに不活性型（つまり、前記脂質部分に共有結合している状態）で標的組織に存在し、経時的にリポタンパク質リパーゼの作用により活性化される可能性があり、それによって、被験対象の標的組織中で上昇したＰＤＡＧペプチド濃度および免疫活性を経時的に維持することができる。活性ＰＤＡＧペプチドが持続的に放出されることにより、先天性免疫系を持続的に活性化することができ、これにより、予防的に投与された被験対象において、免疫学的に障害のある場合に長期にわたって疾患と闘う能力が向上し、または治療的に投与された被験対象において、前記ＰＤＡＧが長期的に形成されるようになる。
【００５８】
本発明のさらなる実施形態において、１若しくはそれ以上のＰＤＡＧペプチドは、前記脂質部分と共有結合することができる。理論に縛られることは望まないが、ＰＤＡＧペプチド、またはペプチド模倣体の効果的な放出時間は、前記脂質部分に結合したＰＤＡＧペプチド、またはペプチド模倣体の数と直接関連している可能性がある。従って、３つのＰＤＡＧペプチド部分が１つの脂質部分に結合したＰＤＡＧｓ、ＰＤＡＧｓの一部、ＰＤＡＧｓ類似体、またはＰＤＡＧｓ模倣体を投与すると、ＰＤＡＧ部分が脂質部分に１つだけ結合したＰＤＡＧｓ、ＰＤＡＧｓの一部、ＰＤＡＧｓ類似体、またはＰＤＡＧｓ模倣体を同様に投与した場合よりも、長時間ＰＤＡＧペプチドを放出することができる。
【００５９】
一部の実施形態において、ＰＤＡＧｓ、ＰＤＡＧｓの一部、ＰＤＡＧｓ類似体、およびＰＤＡＧｓ模倣体を直接被験対象に投与することができ、他の実施形態において、ＰＤＡＧｓ、ＰＤＡＧｓの一部、ＰＤＡＧｓ類似体、およびＰＤＡＧｓ模倣体を薬学的に許容可能な担体と併用し、被験対象に投与または提供することができる薬学的組成物を形成することができる。
【００６０】
本発明の実施形態において、様々な投与経路を利用できる。選択される特定の方法は、選択される特定の化学療法薬、治療される状態の重症度、および治療効果を発揮するために必要な用量によって決まる。本発明の方法は、概して医学的に許容可能な投与方法により実行することができ、これは、臨床的に許容されない副作用を生じずに、有効レベルの前記活性化合物を産生するすべての方法を意味する。そのような投与方法には、（これに限定されるものではないが）経口、直腸、局所、経鼻、皮内、吸入、腹腔内、または非経口経路が含まれる。前記「非経口」という用語には、皮下、静脈内、筋肉内、または注入が含まれる。静脈内、皮下、または筋肉内経路は、特に本発明の目的に適している。
【００６１】
本発明の実施形態の薬学的組成物には、例えば酢酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、リン酸塩などの緩衝剤、および選択的に、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベン、チメロサールなどの保存料が含まれても良い。
【００６２】
薬学的組成物は、単位用量の形態で都合良く提示されても良く、また薬学分野で周知のいかなる方法によっても調整されても良い。すべての方法に、１若しくはそれ以上の副成分を構成する担体と前記活性薬物とを組み合わせる工程が含まれても良い。一般に、前記活性化合物を、液体担体、微粉化した固体担体、またはその両方と均一かつしっかりと組み合わせ、必要であれば、その後に生成物を成形することによって前記薬学的組成物を調整することができる。
【００６３】
他の様々な担体物質は、適当量の鼻腔用スプレーとして有利に存在することもできる。水媒体に少量の塩化ナトリウムを溶解することで、溶液を低濃度の食塩水とすることができる。塩濃度は約０．１〜２．０％の範囲とすることができ、好ましくは約０．６５％である。界面活性剤、ビタミンおよびビタミン誘導体、抗ヒスタミン薬、湿潤薬、保存料、保湿剤、乳化剤、着臭剤などの他の物質も慣習的な濃度で存在させることができる。適切な物質に関する開示が、水性媒体中で効果的な濃度に関する記述とともに、多くの文献に見ることができる。当業者は、既知の機能を生じる適切な物質と濃度とを困難なく決定することができるだろう。鼻腔へのスプレー噴霧は、従来の噴霧法または装置により行うことができる。
【００６４】
本発明の実施形態は、非経口投与に適した組成物も提供し、ＰＤＡＧｓ、ＰＤＡＧｓの一部、ＰＤＡＧｓ類似体、およびＰＤＡＧｓ模倣体の滅菌水性製剤は、好ましくは被験対象の血液と等張である。この水性製剤は、適切な分散剤または湿潤剤と懸濁化剤とを用い、既知の方法により製剤化することができる。滅菌注射製剤は、非毒性で非経口投与可能な希釈剤または溶媒の滅菌注射溶液または懸濁液、例えば１，３−ブタンジオール溶液とすることもできる。許容可能な媒体および溶媒には、水、リンガー溶液、および等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、滅菌不揮発性油は、溶媒または懸濁媒体として従来から利用されている。この目的において、合成モノまたはジグリセリドを含むいかなる無刺激性不揮発性油も利用することができる。さらに、注入液の調整に、オレイン酸などの脂肪酸を使用することができる。経口、皮下、静脈内、筋肉内などの投与に適した担体製剤は、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（ペンシルバニア州Ｅａｓｔｏｎ）のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに見ることができ、この参照により全開示内容が本明細書に組み込まれるものである。
【００６５】
本発明の実施形態のデリバリーシステムは、持続放出（ｔｉｍｅ−ｒｅｌｅａｓｅｄ）、遅延放出（ｄｅｌａｙｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）、または持続放出（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）デリバリーシステムを含むように設計されても良い。ＰＤＡＧｓ、ＰＤＡＧｓの一部、ＰＤＡＧｓ類似体、およびＰＤＡＧｓ模倣体をさらなる免疫刺激薬または免疫増強薬と併用することもできる。このようなシステムを利用し、ＰＤＡＧｓ、ＰＤＡＧｓの一部、ＰＤＡＧｓ類似体、およびＰＤＡＧｓ模倣体を繰り返し投与することを避け、被験対象の便益を高めることができ、このようなシステムは、本発明の特定の組成物に特に適している可能性がある。
【００６６】
ＰＤＡＧｓ、ＰＤＡＧｓの一部、ＰＤＡＧｓ類似体、ＰＤＡＧｓ模倣体、並びにＰＤＡＧｓ、ＰＤＡＧｓの一部、ＰＤＡＧｓ類似体、およびＰＤＡＧｓ模倣体を含む薬学的組成物を、免疫反応を向上または刺激するのに効果的な量で、また特定の実施形態において、先天性免疫反応を刺激するのに効果的な量で投与することができる。
【００６７】
一般に、臨床試験のルーティンな実験により、各薬物または薬学的組成物と投与プロトコールとに対する最適な効果の特定の範囲を決定することができる。特定の被験対象に対するＰＤＡＧｓ、ＰＤＡＧｓの一部、ＰＤＡＧｓ類似体、ＰＤＡＧｓ模倣体、並びにＰＤＡＧｓ、ＰＤＡＧｓの一部、ＰＤＡＧｓ類似体、およびＰＤＡＧｓ模倣体を含む薬学的組成物の投与を、最初の投与に対する前記被験対象の状態および反応によって、有効かつ安全な範囲に調節することができる。ただし、最終的な投与プロトコールは、前記被験対象の年齢、疾患およびサイズ、ＰＤＡＧｓ、ＰＤＡＧｓの一部、ＰＤＡＧｓ類似体、ＰＤＡＧｓ模倣体、並びにＰＤＡＧｓ、ＰＤＡＧｓの一部、ＰＤＡＧｓ類似体、およびＰＤＡＧｓ模倣体を含む薬学的組成物の効能、投与期間、および治療される疾患の重症度などの因子を考慮し、担当の臨床医の判断によって調節することができる。
【００６８】
本発明の実施形態において、ＰＤＡＧｓ、ＰＤＡＧｓの一部、ＰＤＡＧｓ類似体、ＰＤＡＧｓ模倣体、並びにＰＤＡＧｓ、ＰＤＡＧｓの一部、ＰＤＡＧｓ類似体、およびＰＤＡＧｓ模倣体を含む薬学的組成物の投与方法を、鼻腔用スプレーまたは吸入器による投与とすることができる。鼻腔用スプレーまたは吸入器用製剤では、ＰＤＡＧｓ、ＰＤＡＧｓの一部、ＰＤＡＧｓ類似体、ＰＤＡＧｓ模倣体、並びにＰＤＡＧｓ、ＰＤＡＧｓの一部、ＰＤＡＧｓ類似体、およびＰＤＡＧｓ模倣体を含む薬学的組成物を効果的に溶解または分散するための粒子粉砕サイズを約０．１〜約２０ミクロン、約０．２〜約１０ミクロン、および特定の実施形態において約０．２〜約５ミクロンとすることができる。例えば濃度４％のラクトン溶液などの溶液中にＰＤＡＧｓ、ＰＤＡＧｓの一部、ＰＤＡＧｓ類似体、またはＰＤＡＧｓ模倣体がまず分散されることで、ＰＤＡＧｓ、ＰＤＡＧｓの一部、ＰＤＡＧｓ類似体、またはＰＤＡＧｓ模倣体の水性担体への取り込みが促される可能性がある。一度完全に混合、分散、および／または溶解されると、ＰＤＡＧｓ、ＰＤＡＧｓの一部、ＰＤＡＧｓ類似体、またはＰＤＡＧｓ模倣体は、約０．００１％〜約２．０％、約０．０１％〜約０．３５％、および特定の実施形態において約０．１０％の濃度で存在することができる（他に記載のない限り、本明細書中のパーセンテージはすべて重量換算である）。
【００６９】
他の実施形態において、ＰＤＡＧｓ、ＰＤＡＧｓの一部、ＰＤＡＧｓ類似体、またはＰＤＡＧｓ模倣体は、経口投与されても良く、２〜４回の分割量で、約２５μｇ〜約２０００μｇ／日、約２５μｇ〜５００μｇ／日、または他の実施形態において、約５０μｇ〜約２５０μｇ／日の範囲の総血中濃度を達成することができる。一部の実施形態において、間欠療法（例えば、３週間中１週間または４週間中３週間など）を利用することもできる。
【００７０】
最初の投与で被験対象の反応が不十分な場合は、当該患者が許容できる程度まで、より高い用量（または異なるより限局性のデリバリー経路によって効果のあるより高い用量）を利用することができる。化合物の適切な全身濃度を達成するため、１日当たり複数回投与することもできる。一般に、最大量を使用することができる。最大量は、適切な医学的判断により、安全な最高用量と考えることができる。ただし、当業者は、医学的理由、心理的理由、または事実上いかなる他の理由からも、被験対象がより低い用量または耐容量を主張することもあることは理解するだろう。
【００７１】
本発明の他の実施形態において、少なくとも１つのＰＤＡＧ、ＰＤＡＧの一部、ＰＤＡＧ類似体、ＰＤＡＧ模倣体、またはＰＤＡＧペプチドは、抗原ペプチドに共有結合されるか、前記抗原ペプチドまたはワクチンを被験対象に投与する前に、単純に前記抗原ペプチドまたはワクチンと混合されることができる。理論に縛られることは望まないが、ＰＤＡＧまたはＰＤＡＧペプチドを追加することで、前記抗原ペプチドまたはワクチンの投与時に前記先天性免疫系が刺激されることにより、前記抗原ペプチドまたはワクチンの免疫原性が向上する可能性がある。１若しくはそれ以上のＰＤＡＧまたはＰＤＡＧペプチドが共有結合した合成抗原、またはＰＤＡＧまたはＰＤＡＧペプチド抗原またはワクチン混合物を被験対象に投与して、前記被験対象の長期的な適応性、より具体的にはＴＨ１型「細胞性」免疫反応を誘導することができる。
【００７２】
本発明のさらなる実施形態において、天然型ＰＤＡＧｓまたはＰＤＡＧペプチドに対して抗体を産生させることができ、またさらなる実施形態において、そのように産生された抗体を被験対象に投与し、前記抗体が産生されたＰＤＡＧの濃度を減少させることができる。理論に縛られることは望まないが、ＰＤＡＧおよび／またはＰＤＡＧペプチドを減少させた抗体を投与することは、例えば、敗血症、アテローム硬化性疾患、リウマチ様疾患、自己免疫疾患、炎症性腸疾患、ＩＩ型糖尿病などの全身炎症がコントロールされていない被験対象に対する有益な治療戦略となる可能性がある。同様の実施形態において、ＰＤＡＧおよびＰＤＡＧペプチドを減少させた抗体を用い、例えば、外傷、広範な手術による炎症などの敗血症以外の損傷を治療することができる。
【００７３】
本発明の実施形態のＰＤＡＧおよびＰＤＡＧペプチド抗体は、当業者に周知の方法により、ウサギ、マウス、ヤギ、ウマ、または他種で産生させることができる。例えば、ＰＤＡＧまたはＰＤＡＧペプチドモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ融合法により作成することができ、特定のハイブリドーマは、細胞培養またはバイオリアクターで管理し、モノクローナル抗体を連続的に作成することができる。一部の実施形態において、抗体全体を特異的に化学開裂するか、当該分野で既知の組み換え法により、モノクローナル抗体のＰＤＡＦペプチド特異的結合領域を選択的に作成することができる。他の実施形態において、前記特異的ＰＤＡＦ結合領域をヒト抗体のＦｃ領域に結合させ、ＰＤＡＧが減少した抗体をヒト被験対象に投与するため、ヒト化キメラを作成することができる。キメラ抗体は当該分野で周知であり、合成、半合成、または組み換え法により作成することができる。ヒト被験対象では実質的に二次抗体反応が引き起こされないため、ヒト化ＰＤＡＧキメラ抗体はヒト被験対象に使用する上で好都合と考えられる。
【００７４】
本発明のさらに他の実施形態において、蛍光標識したＰＤＡＧｓ、ＰＤＡＧペプチド、またはＰＤＡＧ抗体を作成することができる。そのような実施形態において、（これに限定されるものではないが）フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ：ＰＥ）、赤色蛍光色素、フルオロセインイソチオシネート（ｆｌｕｏｒｏｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙｎａｔｅ：ＦＩＴＣ）、緑色蛍光色素などの蛍光色素をＰＤＡＧ、ＰＤＡＧペプチド、またはＰＤＡＧ抗体の保護されていないアミノ基のペプチジル部分のＮ末端に結合させ、活性化することができる。
【００７５】
そのような結合体を作成する方法は当該分野で周知であり、例えば、スクシンイミジルトランス−４−（マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＬＣ−ＳＭＣＣ）のチオール反応性延長鎖類似体に結合させることによってＰＤＡＧまたはＰＤＡＦペプチドを活性化し、更にサイズ排除クロマトグラフィーにより誘導体化した前記ＰＤＡＧペプチドから未反応のＬＣ−ＳＭＣＣを分離させることによって、そのＮ末端を介して当該ＰＤＡＧまたはＰＤＡＦペプチドを蛍光色素に結合させることができる。Ｒ−ＰＥまたはＦＩＴＣの保護されていないチオールのピリジルジスルフィド誘導体を、トリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）中で１０〜１５分間、前記Ｒ−ＰＥまたはＦＩＴＣを保温することで活性化することができる。次に、精製したＬＣ−ＳＭＣＣ−ＰＤＡＧペプチド誘導体を活性化Ｒ−ＰＥまたはＦＩＴＣと合わせ、４℃で一晩混合することができる。残りのチオール基をすべてキャップするＮ−エチルマレイミド（Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ：ＮＥＭ）を追加し、反応を停止することができる。Ｒ−ＰＥまたはＦＩＴＣ結合体をサイズ排除クロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥させると、最終生成物を得ることができる。
【００７６】
本発明の他の実施形態において、蛍光標識したＰＤＡＧｓまたはＰＤＡＧペプチドを用い、組織サンプルを分析することができる。例えば、蛍光標識したＰＤＡＧｓまたはＰＤＡＧペプチドをエクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で被験対象サンプルと混合し、前記蛍光標識したＰＤＡＧｓまたはＰＤＡＧペプチドが結合した免疫細胞を検出および定量することができる。さらに他の実施形態において、前記ＰＤＡＧｓまたはＰＤＡＧペプチドに対する蛍光標識した抗体を用い、蛍光顕微鏡法、ＥＬＩＳＡなどの方法により、エクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で被験対象サンプル中のＰＤＡＧまたはＰＤＡＧペプチドを検出し、その濃度を定量することができる。そのような分析方法は当業者に周知である。
【実施例１】
【００７７】
この実施例では、ヒト、ヒト以外の霊長類、および霊長類以外の種からのＰＤＡＧｓの単離と構造分析について説明する。ＰＤＡＧｓは、蒸留水に対して分子量のカットオフ値１０ｋＤａの透析カセット（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）から透析し、減圧留去により濃縮し、その透析液を凍結乾燥することで、研究規模の量で凝固血液の血清分画から日常的に単離することができる。
【００７８】
粗血清分画を、サイズ排除樹脂またはろ過器を通過させるサイズ排除クロマトグラフィーまたはろ過によりさらに精製し、塩および他の低分子量混入物質を取り除く。最終精製を逆相ＨＰＬＣにより行う。この手順は、精製後、生物活性研究を実施し、生理活性成分の化学的特徴決定に着手するのに十分な物質を提供する。ＬＣ／ＭＳ分析では、前記ＰＤＡＦ成分を２〜３ｋＤａのリポペプチドとして特徴付けている。総重量に基づく定量分析によって、ＰＤＡＧの純度がＨＰＬＣ後に９８％を超えることが示される。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を用い、前記ペプチドのアミノ酸配列を確認し、前記ＰＤＡＧｓの脂質部分を同定することができる。霊長類以外の精製ＰＤＡＧの代表的なＨＰＬＣプロフィールを図１に示している。Ｐｈｅｍｏｍｅｎｅｘ  Ｃ−１８カラム（２５０×４．６ｍｍ）と、移動相として０．１％ＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）および０．１％ＴＦＡ水溶液にアセトニトリルを溶解したもの（溶媒Ｂ）を用い、分析用ＨＰＬＣを行った。１０分間でＡ９５％およびＢ５％からＡ７０％およびＢ３０％（毎分２．５％）に始まり、次の３０分間でＡ４０％およびＢ６０％（毎分１％）となる直線的勾配が形成された。これらの条件下、ヒト、サル、および非霊長類の血清ＰＤＡＧｓは、それぞれ２４．２分、２２．７分、および２３．６分に溶出する。
【００７９】
ＨＰＬＣで精製した非霊長類ＰＤＡＧ約１００ｍｇの酸（６Ｎ  ＨＣＬ）または塩基（１Ｎ  ＮａＯＨ）加水分解を行い、ＨＰＬＣ−ＭＳで分析した。観察されたイオンフラグメントは、ステアロイル−アラキドノイルグリセロールが存在することを裏付けるものであり、以下の表に示している。
【００８０】
【表１】
2009506986.tif 000006
【００８１】
約２０ｍｇの精製ＰＤＡＧをｄ６−ＤＭＳＯに溶解し、ＮＩＴＹ  Ｐｌｕｓ−４００核磁気共鳴分光計（３９９．９５ＭＨｚの１Ｈ）でスペクトルを得た。高周波帯域幅は６０００Ｈｚであり、パルス角４５度、緩和時間１．０秒、捕捉時間２．６０１秒／スキャンであった。総分析時間は１１時間４３分２２秒であった。いくつかの主要な構造特性が明らかとなっている。前記スペクトルの低磁場領域から、酸性プロトンの吸収が９．２ｐｐｍで観察される。芳香族領域には、ペプチジルアミドの水素に特徴的な約８．０ｐｐｍを中心とする大きなマルチプレットが明らかとなっている。７．４ｐｐｍ（Ｊ＝２００Ｈｚ）を中心にもう１つのスプリットマルチプレットが観察され、これはフェニルアラニンおよび／またはチロシンの存在を示している可能性がある。６．６〜７．０ｐｐｍの領域にビニル水素が観察され、これは不飽和脂肪酸によって説明できる。０．８ｐｐｍにメチル水素の吸収が観察され、１．５ｐｐｍ付近の領域に顕著なメチレン水素の吸収が認められる。また、ペプチドと脂肪酸とが広範に結合していることは、メチルおよびメチレン水素の異方性遮へい効果によるものと考えられる芳香族シグナルの広がりを説明している可能性がある。４．０〜５．０ｐｐｍ領域の広域シグナルは、ペプチド結合のαメチレン水素の吸収と一致している。図２は、ＨＰＬＣで精製したＰＤＡＧのＮＭＲスペクトル（図２Ａ）と、モデルとして１−ペプチジル−２，３−ジアシルグリセリドの理論的に予想したＮＭＲ（図２Ｂ）とを比較して示しているものである。挿入部分は、１−ステアロイル−２−アラキドノイルグリセロールの実際のＮＭＲスペクトルを示している。仮説に基づく１−ペプチジル−２，３−ジアシルグリセリドのトリメチルシランの予想１Ｈ化学シフト（図２Ｂ）は、半経験的ＭＮＤＯ計算（ＭＯＰＡＣおよびＭＭ２）を繰り返すことにより、生成熱および立体エネルギーのエネルギーを最小化した理論計算値に由来する最小エネルギー配座に基づいている。モデルである１−ペプチジル−２−アラキドノイル−３−ステアロイルの理論的に予想したＮＭＲと天然型ＰＤＡＧとがよく一致していたことが、この構造特徴解析を裏付けている。
【００８２】
霊長類以外のＰＤＡＧのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を図３に示している。表２は、主要イオンフラグメントの関係性と同定とを示すものであり、ＰＤＡＧのペプチジル部分のアミノ酸組成を証明している。
【００８３】
【表２】
2009506986.tif 000007
【００８４】
上記の化合物は、配列ＲＳＨＮＬＣＸ（１６２５ａｍｕ）およびＹＴＳＨＮＬＣＸ（１７３４ａｍｕ）であって、Ｘがそれぞれ８７９および８８０ａｍｕのイオン質量を有するペプチド断片と一致している。
【００８５】
７２７および８９５ａｍｕのＭＡＬＤＩイオンは、１−ステアロイル−２−アラキドノイル−３−ホスホグリセロール（７２７ａｍｕ）と一致したジアシルグリセロールリン酸部分を含み、８９５のイオンは１−アルギニンホスホチジル−２−アラキドノイル−３−ステアロイルグリセロール（１−ａｒｇｉｎｉｎｅｐｈｏｓｐｏｔｉｄｙｌ−２−ａｒａｃｈｉｄｏｎｏｙｌ−３−ｓｔｅａｒｏｙｌ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）と一致する。従って、非霊長類血清の生物活性ＰＤＡＧの部分構造は、配列ＹＴＳＨＮＬＣＸＣＬＮＨＳＲ−ＯＰＯ３−ＤＡＧと一致している。または、前記ペプチジル部分をＣＸＣ型のサイトカインとして分類することもできる。
【実施例２】
【００８６】
この実施例では、ＰＤＡＧｓのペプチド部分を放出させるリポタンパク質リパーゼ存在下での、ＰＤＡＧｓの開裂について説明する。イリノイ大学シカゴ医学校（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  ａｔ  Ｃｈｉｃａｇｏ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）のＰｒｉｍａｔｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒにおいて、別にプールした静脈血試料２つ（それぞれ３０ｍｌ）をカニクイザル（マカク属）７匹から収集した。プールしたヒト静脈血試料（５００ｍｌ）をＬａｍｐｉｒｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手した。リポタンパク質リパーゼ（牛乳から精製、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を前記サル血液試料の１つに加え、両方のサンプルを凝固、遠心分離させ、血清分画を回収、凍結、および保存（−８０℃）してから、ピッツバーグ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ）のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに発送した。実施例１に記載の方法でＰＤＡＧｓを単離および分析した。正常なサル血清のＰＤＡＧ分画は、特定の条件下、わずか２１分で溶出し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳでは１−ペプチジル−２，３−ジアシルグリセリドおよび対応するペプチドと、１−ステアロイル−２−アラキドノイルグリセロールフラグメントとがあることを確認した。対照的に、リポタンパク質リパーゼ存在下で調整した血清分画には、ＰＤＡＧのみが認められた。プールしたヒト血清でも同様の結果が得られた。リポタンパク質リパーゼ処理前後のヒト血清のＨＰＬＣプロフィールを図４に示している。Ｐｈｅｍｏｍｅｎｅｘ  Ｃ−１８カラム（２５０×４．６ｍｍ）と移動相として０．１％ＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）およびアセトニトリルを０．１％ＴＦＡに溶解したもの（溶媒Ｂ）とを用い、分析用ＨＰＬＣを行った。１５分間でＡ９５％およびＢ５％からＡ２０％およびＢ８０％（毎分５％）となる直線的勾配が形成された。これらの条件下、ヒト、サル、および非霊長類の血清ＰＤＡＧｓはクロマトグラフィーでは区別できず、１０〜１１分に溶出する。
【実施例３】
【００８７】
この実施例では、全血の凝固プロセス中に血小板からＰＤＡＧｓが誘導されることを証明している。イリノイ大学シカゴ医学校（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  ａｔ  Ｃｈｉｃａｇｏ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）のＰｒｉｍａｔｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒにおいて、抗凝固剤としてヘパリンナトリウムを追加した場合と追加しない場合で、プールした静脈血試料（それぞれ３０ｍｌ）をカニクイザル（マカク属）７匹から収集した。遠心分離、凍結、および保存（−８０℃）後に血漿および血清分画を回収してから、ピッツバーグ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ）のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに発送した。前記血漿および血清を実施例１に記載の方法で分析した。血漿中ＰＤＡＧは血清中ＰＤＡＧの２％のみであった。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳでは、１−ペプチジル−２，３−ジアシルグリセリドおよび対応するペプチドと、１−ステアロイル−２−アラキドノイルグリセロールフラグメントとがあることが確認された。サル血清および血漿から単離したＰＤＡＧのＨＰＬＣプロフィールの比較を図５に示している。Ｐｈｅｍｏｍｅｎｅｘ  Ｃ−１８カラム（２５０×４．６ｍｍ）と、移動相として０．１％ＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）およびアセトニトリルを０．１％ＴＦＡ水溶液に溶解したもの（溶媒Ｂ）とを用い、分析用ＨＰＬＣを行った。１０分間でＡ９５％およびＢ５％からＡ７０％およびＢ３０％（毎分２．５％）に始まり、次の３０分間でＡ４０％およびＢ６０％（毎分１％）となる直線的勾配が形成された。これらの条件下では、サル血清ＰＤＡＧは２２．７分に溶出する。
【実施例４】
【００８８】
この実施例では、前記ＰＤＡＧｓのペプチジル部分の固相合成法と、蛍光標識したＰＤＡＧｓまたはＰＤＡＧペプチドの調整とについて説明する。ＰＤＡＧペプチドおよび変異体は、ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔカップリングサイクルを延長し、Ｗａｎｇ樹脂を事前充填するＦＭＯＣ合成プロトコールにより、４３３Ａペプチド合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）で固相合成される。合成後にペプチド側鎖の保護基を開裂し、Ｒｅａｇｅｎｔ−Ｋにより樹脂から放出させた後、ジエチルエーテルで抽出し、凍結乾燥する。Ｗａｔｅｒｓ  ＤｅｌｔａＰｒｅｐ  ４０００クロマトグラフィーシステムで得られた粗ペプチドの逆相Ｃ−１８精製を行った後、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  ＢｉｏｓｐｅｃｔｏｍｅｔｒｙワークステーションにてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ特徴分析を行い、アミノ酸配列を確認する。
【００８９】
フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ：ＰＥ）は赤色蛍光色素、フルオロセインイソチオシネート（ＦＩＴＣ）は緑色蛍光色素であり、これらは１級アミンおよびスルフヒドリルに結合する活性型として市販されている。ＰＥ（またはＦＩＴＣ）は、スペーサーアームを介してＰＤＡＧペプチジル部分のＮ末端に結合する。Ｎ末端での結合を促すため、スクシンイミジルトランス−４−（マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＬＣ−ＳＭＣＣ）のチオール反応性延長鎖類似体を結合することでＰＤＡＧペプチドを活性化する。リン酸緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）によりＧ−１０カラムから溶出し、誘導体化したＰＤＡＧペプチドから未反応のＬＣ−ＳＭＣＣを分離する。トリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を用いて１０〜１５分間保温すると、Ｒ−フィコエリトリン（またはＦＩＴＣ）のピリジルジスルフィド誘導体は遊離チオール型に活性化される。直ちに精製したＬＣ−ＳＭＣＣ  ＰＤＡＧペプチド誘導体を活性化Ｒ−フィコエリトリン（またはＦＩＴＣ）と合わせ、一晩４℃で混合する。保温時間終了後、残りのチオール基をキャップするＮ−エチルマレイミド（Ｎ−ｅｔｈｙｌ  ｍａｌｅｉｍｉｄｅ：ＮＥＭ）を追加することで反応を停止する。ＰＢＳにより溶出することで、Ｒ−フィコエリトリン（またはＦＩＴＣ）−ＰＤＡＧ結合体をＧ−１０カラムで精製し、一晩凍結乾燥すると、最終生成物が得られる。
【実施例５】
【００９０】
この実施例では、合成ペプチドの標準品（ＦＮＮ−２１）を用い、霊長類および霊長類以外の種から単離したＰＤＡＧｓの生物学的同等性を証明している。ＦＮＮ−２１は破傷風毒素の２１アミノ酸ペプチドであり、普遍的なＴ細胞エピトープ（破傷風毒素ａａの９４７〜９６７）と推定されている。ウサギ３匹ずつの７群に、（ｉ）通常の生理食塩水としたプラセボ、（ｉｉ）フロイント完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ'ｓ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔ：ＦＣＡ）、（ｉｉｉ）サルＰＤＡＧ血清因子（ＨＰＬＣの純度９５＋％）、（ｉｖ）ヤギＰＤＡＧ血清因子（ＨＰＬＣの純度９５＋％）、または４種類の合成ＦＮＮ−２１投与量（２５μｇ、５０μｇ、または１００μｇ）の１つ、のいずれかを投与した。動脈血試料を各動物から採血、凝固し、血清のＩｇＭ力価をＥＬＩＳＡで分析した。
【００９１】
血清ＰＤＡＧ（純度９５＋％）を実施例１に記載の通り調整した。ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔカップリングサイクルを延長し、Ｗａｎｇ樹脂を事前充填する標準的なＦＭＯＣ固相ペプチド合成プロトコールにより合成ＦＮＮ−２１を調整した。すべての被験物質はフロイント完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ'ｓ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔ：ＦＣＡ）の注入液として製剤化した。
【００９２】
合成ＦＮＮ−２１を通常の生理食塩水に溶解し、最終濃度を１ｍｇ／ｍｌとした。このストック用注入液はＦＣＡで１：２．５、１：５、または１：１０倍希釈し、それぞれ４００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、および１００μｇ／ｍｌの注入液にした。
【００９３】
精製した血清由来ＰＤＡＧを通常の生理食塩水に溶解し、１ｍｇ／ｍｌのストック用注入液にした。このストック用注入液をＦＣＡで１：５倍希釈し、最終注入液濃度を２００μｇ／ｍｌとした。
【００９４】
試験０日目、すべてのウサギの胸郭外側に適当な注入液または通常の生理食塩水であるプラセボ０．２５ｍｌを皮下注入した。１日目（ベースライン）および３、５、７、１０、および１４日目にすべての動物から動脈血試料を採血し、凝固させた。ＥＬＩＳＡ法により血清の結核菌特異的な免疫グロブリン力価（ＩｇＧおよびＩｇＭ）を分析し、各分析日の吸光度単位（ＡＵ  ４０５ｎｍ）において、各被験群（ｎ＝６）のウサギ３匹それぞれを２回ずつ測定し、平均吸光度として報告した。これらの結果を以下の表に示している。ＦＮＮ−２１の検査結果は、最高用量の検査群（１００μｇ）である。
【００９５】
【表３】
2009506986.tif 000008
【実施例６】
【００９６】
この実施例では、ＰＤＡＧが本質的に抗菌性ではないことを証明している。ＨａｒｔおよびＣｈａｍｐｌｉｎ（１９８８）が報告したディスク寒天拡散法を行うことで、グラム陽性菌とグラム陰性菌の両方に対するＰＤＡＧ（２００μｇ／ｍｌ）の抗菌活性を評価した。すでに報告されている培養液希釈法により（Ｄａｒｎｅｌｌら、１９８７）、Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ培養液中の抗生物質の最小発育阻止濃度（ＭＩＣｓ）を決定した。ＰＤＡＧを染み込ませた滅菌ろ紙ディスクを、播種プレート表面に無菌的に貼り付けた。前記プレートを３７℃で２４時間保温し、この間、４時間および２４時間の時点で、前記ディスク周辺領域の成長抑制を視覚的に評価した。ＰＤＡＧは、すべての検査細菌種の成長を抑制することができなかった。
【００９７】
ＰＤＡＧは、グラム陰性菌およびグラム陽性菌の成長を抑制することができなかった。典型的なディフェンシンの最小発育阻止濃度（ｔｈｅ  ｍｉｎｉｍｕｍ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ：ＭＩＣ）は、通常、１〜８μｇ／ｍｌの範囲である。ＰＤＡＧを、ディフェンシンで認められたＭＩＣ範囲の上限の２５倍、観察された治療用量の４倍である２００μｇ／ｍｌで検査し、グラム陽性菌またはグラム陰性菌の成長は抑制されなかった。
【実施例７】
【００９８】
この実施例では、ＰＤＡＧの予防的利益を証明し、無作用量（ＮＯＥＬ）に対するＰＤＡＧのクリアランス速度を証明している。様々な時間に治療レベルのＰＤＡＧの単回量（５０μｇ、皮下）をマウスに投与してから、致死的細菌負荷量を投与し、１０日間各群の罹患率／死亡率を追跡した。負荷１、２、および４日前（−１、−２、および−４日目）、または０日目の負荷と同時にＰＤＡＧを投与した。ネズミチフス菌（〜５×１０３ｃｆｕ／マウス、腹腔内投与）を負荷した雌Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウスの対照集団において、４日目まで罹患状態の発症を観察した。結果として死亡が急激に増加し、負荷後７〜８日目までに累積死亡率は約８０％、１０日目までの死亡率は１００％となった。負荷４日前にＰＤＡＧを投与したマウスは、死亡率において、非投与の対照マウスとは有意な差を示さなかった。ただし、−２、−１、または０日目にＰＤＡＧを投与した場合、予防的利益が観察された。８日目までに非投与の対照集団では死亡率が８０％に昇ったが、−２、−１、または０日目のいずれかにＰＤＡＧを投与した群では、累積死亡率がそれぞれ６０％、３０％、および５０％であった。（この対照集団で死亡率が確立された）負荷後４日目から、対照群とＰＤＡＧ投与群との間で統計的に有意な死亡の遅れがあった。また−１日目投与群では、０日目および−２日目投与群よりも８日目までの累積死亡率が有意に低かった（それぞれｐ＝０．０１８９およびｐ＝０．００１２）。従って、ＮＯＥＬに対するＰＤＡＧのクリアランス速度は９６時間、ＰＤＡＧの５０％クリアランス速度は約４８時間である。
【実施例８】
【００９９】
この実施例では、ナイーブＳｐｒａｇｕｅ  ＤａｗｌｅｙラットのＰＤＡＧ炎症誘発作用の指標として、急性期タンパク質の産生について検討している。ラット５匹ずつの２群に対し、ＰＤＡＧを、治療用量（５０μｇ、静注）または治療用量の２倍（１００μｇ、静注）のいずれかで投与した。ラット５匹のプラセボ群には通常の生理食塩水を投与した。３日後にラットを屠殺し、心臓からの吸引によって採血した血液の循環血液中急性期タンパク質（血清アミロイドＡおよびハプトグロブリン）を測定した。急性期タンパク質濃度の平均値を以下の表４に示している。
【０１００】
【表４】
2009506986.tif 000009
【０１０１】
これらの結果は、急性期に誘導されたタンパク質産生で測定する限り、ＰＤＡＧに炎症誘発作用があり、急性期タンパク質の産生はＰＤＡＧの用量に依存するようにみえることを明らかに証明している。
【０１０２】
実施例９
この実施例では、有症状および無症状の細菌性乳腺炎と診断された泌乳期乳牛の治療におけるＰＤＡＧの有効性を証明している。ウシ乳腺炎のＰＤＡＧ治療の有効性を、２５０頭の商業的酪農場で検討した。このウシ群のバルクタンクの体細胞数（ＢＴＳＣＣ）の平均は検査期間中７６３，０００であり、前記ウシ群の約４０％が正常な体細胞数を上回っていた。体細胞数が増加し、且つ治療を受けていない４９頭（ｎ＝４９）を無作為に選択し、ＰＤＡＧ（６００μｇ、筋注）を投与してから、初回投与の３日後に２回目のブースター注射を行った。治療を受けたウシを除く前記ウシ群の残り（ｎ＝１００）は対照群として治療しないまま残した。次にＤＨＩＡ体細胞数を測定してから３日後に治療群のウシと対照ウシの体細胞数（ＳＣＣ）を比較した。被験群と対照群は投与前後で統計的な差がないと判断された（ｔ＝０．１７０３、Ｐ＝０．８６５０）。投与後、ＰＤＡＧ投与群のウシの５６％で１頭あたり平均２５％ＳＣＣが減少することが示されたが、非治療の対照ウシでは、試験期間中平均ＳＣＣが１頭あたり１１％増加した。この差は統計的に有意であると判断された（Ｐ<０．０５）。
【０１０３】
１９頭が有症状の乳腺炎の徴候、つまり乳汁状態の異常を示していた。これらのウシを被験群または対照群に無作為に割り付けた。乳腺炎の有症状症例を治療する場合の前記酪農場の通常の業務、つまり、商標Ｐｏｌｙｆｌｅｘ（Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）のアンピシリンの筋注により、対照群のウシ（ｎ＝１０）を治療した。被験群（ｎ＝９）のウシにはＰＤＡＧ（６００μｇ、筋注）を投与し、３日後にブースター注射を行った。次のＤＨＩＡの体細胞数測定後、被験および対照ウシのＳＣＣを比較した。投与前の被験群と対照群との平均値は統計的に差がなく（Ｐ＝０．３９６５、ｔ＝０．８６９８）、２群の標準偏差も統計的に差がないと判断された（Ｆ＝１．８８９、Ｐ＝０．１９１４）。サンプリングしたデータは、ガウス分布に従う集団をコルモゴロフ・スミルノフの方法で検定し、正規分布であると判断された集団に由来する（ＫＳ〜０．２、Ｐ>０．０１）。前記被験群のウシ７頭が改善を示し、前記被験群の平均ＳＣＣは１９％低下した。前記被験群の２頭が治療に無反応であった。前記対照群では１頭のみが改善を示し、前記対照群の平均体細胞数は試験期間中７％上昇した。これらの結果を表５に一覧にしている。
【０１０４】
【表５】
2009506986.tif 000010
【０１０５】
前記ウシ群の９頭はこれまで抗生物質治療に難治性であるか、又は搾乳中に有症状の乳腺炎が複数回発生していたものである。ＰＤＡＧ被験群のこれらの９頭と難治性の２頭（動物番号１１および１１６）とをまとめ（ｎ＝１１）、アジュバント療法として抗生物質（Ｐｏｌｙｆｌｅｘ）＋ＰＤＡＧを投与した。次に予定されたＤＨＩＡ  ＳＣＣ測定後、治療効果を評価した。１１頭中８頭は改善し（８０％）、この群の平均ＳＣＣは４２％低下した。２頭（２０％）はまだ治療に反応しなかった。これらの結果を表６に一覧にしている。
【０１０６】
【表６】
2009506986.tif 000011
【０１０７】
前記ウシ群中、５例の無症状乳腺炎を同定した。これら５頭の乳汁の細菌培養では、原因菌として非溶血性連鎖球菌および大腸菌の混合菌が示された。これらの無症状の５頭にＰＤＡＧを投与し、投与後、次のＤＨＩＡサンプリング期間にＳＣＣを測定した。５頭中４頭では投与後にＳＣＣが正常であり、５頭すべてで改善が示された。投与前のこの群の平均ＳＣＣは７１５，０００であり、投与後は２０５，０００に低下した。不均等な標準偏差を補正するためにウェルチの近似を行い、有意性について両側ｔ検定を行ったところ、投与前および投与後の群の平均値の差は非常に有意であることが示された（Ｐ＝０．００５、ｔ＝４．７５９）。これらの結果を表７に示している。
【０１０８】
【表７】
2009506986.tif 000012
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】図１は、精製した１−ペプチジル−２，３−ジアシルグリセリドの代表的なＨＰＣＬクロマトグラムを示すものである。
【図２】図２は、ＨＰＬＣで精製したＰＤＡＧの１Ｈ核磁気共鳴スペクトル（図２Ａ）と、仮説に基づく１−ペプチジル−２，３−ジアシルグリセリドの予想ＮＭＲ（図２Ｂ）とを比較して示したものである。挿入部分は、１−ステアロイル−２−アラキドノイルグリセロールの実際のＮＭＲスペクトルを示している。
【図３】図３は、霊長類以外の１−ペプチジル−２，３−ジアシルグリセリドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示すものである。
【図４】図４は、リポタンパク質リパーゼ処理前（図４Ａ）および処理後（図４Ｂ）の１−ペプチジル−２，３−ジアシルグリセリドを含むヒト血清分画のＨＰＬＣクロマトグラムを示すものである。
【図５】図５は、１−ペプチジル−２，３−ジアシルグリセリドを含む精製したサル血清（図５Ａ）とサル血漿の対応する分画（図５Ｂ）とのＨＰＬＣクロマトグラムを示すものである。
【図１】
2009506986.tif 000014
【図２】
2009506986.tif 000015
【図３】
2009506986.tif 000016
【図４】
2009506986.tif 000017
【図５】
2009506986.tif 000018