(57)【要約】不安などの神経精神障害を治療するための方法が開示される。この方法は、アンジオテンシンＩＶ受容体の発現を調節する工程、または受容体に対するアンタゴニストを利用することによってアンジオテンシンＩＶ受容体の生物活性を調節する工程を含む。対象において不安を軽減するのに効果的であるアンジオテンシンＩＶ受容体のアンタゴニストを同定するための方法もまた、開示される。
2009506049.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
製薬上許容される担体およびアンジオテンシンＩＶ受容体（ＡＴ４Ｒ）の生物活性を低下させるのに有効な量のＡＴ４Ｒアンタゴニストを含む組成物を対象に投与する工程を含む、神経精神障害の治療を必要とする対象においてかかる障害を治療するための方法。
【請求項２】
ＡＴ４Ｒアンタゴニストが、ＡＴ４Ｒに立体構造の変化を引き起こす、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＡＴ４ＲアンタゴニストがＡＴ４Ｒの活性部位を阻害する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ＡＴ４Ｒアンタゴニストが、アンジオテンシンＩＶ、ジバリナール−アンジオテンシンＩＶ、ＬＶＶ−ヘモルフィン７、Ｎｌｅ−ＡｎｇＩＶ、またはノルロイシナールＡｎｇＩＶである、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
対象におけるＡＴ４Ｒの発現を調節する工程を含む、神経精神障害の治療を必要とする対象においてかかる障害を治療するための方法。
【請求項６】
ＡＴ４Ｒの発現が、ＡＴ４Ｒをコードする核酸に対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチド分子を利用することによって減弱される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ＡＴ４Ｒをコードする核酸に対してアンチセンスである分子がｓｉＲＮＡである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
神経精神障害が不安である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
細胞膜へのＡＴ４Ｒの局在化を調節する工程を含む、不安の治療を必要とする対象において該不安を治療するための方法。
【請求項１０】
対象中の抗不安性神経ペプチドまたは不安惹起性神経ペプチドの濃度を調節する工程を含む、不安の治療を必要とする対象において該不安を治療するための方法。
【請求項１１】
抗不安性神経ペプチドの濃度を上昇させる、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
抗不安性神経ペプチドがオキシトシンである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
不安惹起性神経ペプチドの濃度を低下させる、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
不安惹起性神経ペプチドがバソプレシンである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
抗不安性神経ペプチドまたは不安惹起性神経ペプチドの濃度がシナプス中の濃度である、請求項１０から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
試験化合物を対象に投与する工程と、試験化合物の不在下での対象の不安レベルと比較した、対象の不安レベルの低下を測定する工程とを含む、対象の不安を軽減する化合物を同定するための方法。
【請求項１７】
試験化合物をＡＴ４Ｒと接触させ、かつ、試験化合物の不在下でのＡＴ４Ｒの生物活性と比較した、試験化合物の存在下でのＡＴ４Ｒの生物活性の低下を測定する工程と、試験化合物を対象に投与し、かつ、試験化合物の不在下での対象の不安レベルと比較した、対象の不安レベルの低下を測定する工程とを含む、対象の不安を軽減する化合物を同定するための方法。
【請求項１８】
対象が哺乳動物である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
哺乳動物がヒトである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
試験化合物をＡＴ４Ｒと接触させる工程と、試験化合物の不在下でのＡＴ４Ｒの生物活性に比べた、試験化合物の存在下でのＡＴ４Ｒの生物活性の低下を測定する工程とを含む、ＡＴ４Ｒのアンタゴニストを同定するための方法。
【請求項２１】
ＡＴＲ４が、細胞膜または細胞膜断片に結合している、請求項１７または２０に記載の方法。
【請求項２２】
細胞膜または細胞膜断片が哺乳動物細胞に由来する、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
哺乳動物細胞が、腎臓細胞、心臓細胞、副腎細胞、または脳細胞である、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
哺乳動物細胞が、ＡＴ４Ｒを発現する安定な細胞または安定な細胞株である、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
請求項１６、１７、または２０から２４のいずれか一項に記載の方法によって同定された化合物。
【請求項２６】
請求項２５に記載の化合物および製薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、その全体を出典明示により本明細書の一部とする、２００５年８月２３日に出願された米国特許仮出願第６０／７１０３８５号の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般に、神経薬理学の分野に関する。本発明は、不安などの神経精神障害を治療するための方法を特徴とする。また、対象において不安を軽減する化合物を同定するための方法も特徴とする。
【背景技術】
【０００３】
特許、公開出願、技術論文、および学術論文を含む様々な刊行物が、本明細書の全体を通して引用される。これらの引用刊行物は、各々、その出典を明示することにより全体を本明細書の一部とする。
【０００４】
インスリン調節膜アミノペプチダーゼ（ＩＲＡＰ）としても公知であるアンジオテンシンＩＶ受容体（ＡＴ４Ｒ）は、ヘキサペプチドアンジオテンシンＩＶ（ＡＴ４）に対する高親和性結合部位として１９９２年に最初に説明された。（Ｓｗａｎｓｏｎ，ＧＮら、Ｒｅｇｕｌ．Ｐｅｐｔ．（１９９２年）第４０巻、４０９〜１９頁）。ＡＴ４Ｒは、亜鉛メタロペプチダーゼのＭ１ファミリーのメンバーであり、かつ、ＩＩ型の膜貫通タンパク質である。すなわち、その活性部位は細胞外にある。（Ｋｅｌｌｅｒ，ＳＲら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９５年）２７０巻、２３６１２〜１８頁）。位置確認調査により、ＡＴ４Ｒが、腎臓、心臓、および副腎組織中に存在することが実証された。（Ｂａｋｅｒ，ＫＭら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９０年）２５９巻、Ｈ３２４〜３２頁；Ｓｌｉｎｋｅｒ，ＢＫら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．（１９９９年）４２巻、６６０〜９頁；Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＴＡら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（２００１年）２２巻、９３５〜４４頁；およびＡｂｒａｈａｍｓｅｎ，ＣＴら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．（２００２年）３０１巻、２１〜８頁）。ウェスタンブロット実験およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション実験により、中枢神経系内部で、ＡＴ４Ｒが、海馬、ならびに嗅内皮質、前前頭皮質、および島皮質において高いレベルで存在することが示された。黒質、視床下部、および扁桃体などの辺縁系領域におけるレベルもまた、中程度に高い。（Ｔｈｏｍａｓ，ＷＧら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（２００３年）３５巻、７７４〜９頁）。脳中にＡＴ４Ｒが差次的に分布することから、かなりの調査が、中枢神経系機能における受容体の生物学的役割の同定へと駆り立てられた。
【０００５】
いくつかの文献報告書において、ＡＴ４Ｒが認知機能の様々な面に影響することが示されている。例えば、１つのＡＴ４Ｒリガンド、すなわちＡＴ４を中枢内注入すると、げっ歯動物の受動的回避様式における記憶の保持および読み出しが促進される。（Ｗｒｉｇｈｔ，ＪＷら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．（１９９３年）３２巻、４９７〜５０２頁、およびＢｒａｓｚｋｏ，ＪＪら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．（１９９８年）３８巻、４６１〜８頁）。同様に、長期的なＡＴ４注入は、モリス水迷路における行動を改善することが判明した。（Ｐｅｄｅｒｓｏｎ，ＥＳら、Ｒｅｇｕｌ，Ｐｅｐｔ．（１９９８年）７４巻、９７〜１０３頁）。さらに、ＡＴ４の合成類似物は、スコポラミンまたは両側性の貫通線維病変のいずれかによって誘導される記憶欠損を回復させることも判明した。（Ｐｅｒｄｅｒｓｏｎ，ＥＳ（１９９８年）、およびＷｒｉｇｈｔ，ＪＷら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（１９９９年）１９巻、３９５２〜６１頁）。ＡＴ４Ｒの認知増強役割と一致して、ＡＴ４Ｒが、海馬切片において、長期の増強作用およびカリウムによって誘発されるアセチルコリン放出の双方を向上させることが報告されている。（Ｗａｙｎｅｒ，ＭＪら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（２００１年）２２巻、１４０３〜１４頁）。
【０００６】
ＡＴ４が認知プロセスに影響を及ぼす際の機序は、ＡＴ４Ｒの構成的に活性なペプチダーゼ活性を停止させることによると考えられている。ＡＴ４Ｒ活性を阻害すると、認知プロセスに関与しているいくつかの神経ペプチドのシナプスレベルが上昇する。（Ｋｏｖａｃｓ，ＧＬおよびＤｅ  Ｗｉｅｄ、Ｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．（１９９４年）４６巻、２６９〜２９１頁）。これらの神経ペプチドには、オキシトシン、ソマトスタチン、コレシストキニン８、バソプレシン、およびサブスタンスＰが含まれる。（Ｈｅｒｂｓｔ，Ｊ．Ｊ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９７年）２７２巻、Ｅ６００〜Ｅ６０６頁、およびＭａｔｓｕｍｏｔｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２０００年）２６７巻、４６〜５２頁）。ペプチダーゼ活性に対する正確な認識配列は、これから解明されなければならないが、ＡＴ４Ｒペプチダーゼ活性を妨害しても、ＧｎＲＨ、神経ペプチドＹ、ＴＲＨ、メラノコルチン、α−ＭＳＨ、ガラニン、またはカルシトニンなど他の神経ペプチドに影響は及ぼされないようである。さらに、ＡＴ４は、酵素の活性部位に結合することによってはＡＴ４Ｒを阻害しないようである。もっと正確に言えば、ＡＴ４は、膜近傍領域に結合して、ＡＴ４Ｒに立体構造の変化を引き起こす。ＡＴ４ＲにＡＴ４が結合した結果、ＡＴ４Ｒのペプチダーゼ活性が阻害される。（Ａｌｂｉｓｔｏｎ，ＡＬら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｄｏ．Ｍｅｔａｂｏｌ．（２００３年）４３巻、７２〜７７頁）。
【０００７】
いくつかの報告書は、オキシトシン、すなわちＡＴ４Ｒ抑制の結果として増大する神経ペプチドの１種は、抗不安効果を発揮し得ることを示唆している。オキシトシンノックアウトマウスは、不安を調べる高架式十字迷路試験（ＥＰＭ）において試験された場合に、野生型マウスに比べて、より高いレベルの不安に関連した挙動を示した。（Ａｍｉｃｏ，ＪＡら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．（２００４年）１６：３１９〜２４頁）。さらに、オキシトシンノックアウトマウスに合成オキシトシンを中枢内投与すると、ＥＰＭによって測定される不安レベルが低下し、また、オキシトシンに加えてオキシトシン受容体アンタゴニストをノックアウトマウスモデルに投与すると、オキシトシンの抗不安効果が抑制された。（Ｍａｎｔｅｌｌａ，ＲＣ（２００３年））。同様に、ラットへのオキシトシンの中枢内投与は、脳においてストレスによって誘発される神経内分泌および分子応答を減弱させることが判明した。（Ｗｉｎｄｌｅ，ＲＪら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００４年）２４巻、２９７４〜８２頁）。
【０００８】
一方、ＡＴ４Ｒが阻害された場合に同様に増加するバソプレシンは、不安惹起性の神経ペプチドである。（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ，ＳＫら、Ｂｉｏｇｅｎｉｃ  Ａｍｉｎｅｓ（１９９８年）１４巻、３６７〜８６頁）。ＡＴ４Ｒが、オキシトシンを切断するよりも効率的にバソプレシンを切断すると仮定すると（Ｌｅｗ，ＲＡら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．（２００３年）８６巻、３４４〜５０頁）、中枢神経系におけるＡＴ４Ｒの阻害は、抗不安効果よりむしろ、不安惹起効果を及ぼす可能性がより高いであろうと思われる。しかし、これまで報告されている研究は、ＡＴ４Ｒ活性と不安などの神経精神医学的状態とのいかなる関係も検討していない。
【０００９】
大半の個体は、人生において、特に、新しい出来事または重要な出来事の前後には、不安の感情を経験するが、不安障害は、個体の毎日の生活の活動および経験を一般に妨げる、恐怖および神経質の慢性かつ絶え間ないエピソードを特徴とする。不安障害は、米国において最も一般的な精神疾患の１つであり、１９００万人超、または、１８歳〜５４歳の成人のおよそ１３％が罹患している。（情報源：米国国立精神衛生研究所（Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｈｅａｌｔｈ））。不安障害は、以下のいくつかのクラスに分類される。毎日のごく普通の生活活動に関する恒常的かつ過度の心配性な思考、ならびに、振せん、疲労、不眠症、頭痛、および悪心などの身体的症状を特徴とする全般性不安障害；強く大きな恐怖のエピソードの反復、ならびに、心悸亢進（ｐｏｕｎｄｉｎｇ  ｈｅａｒｔ）、胸痛、頭部ふらふら感、振せん、発汗、および、のぼせ、または悪寒などの身体的症状を特徴とするパニック障害；不能状態、および特定の物体または状況に対する不合理な恐怖（そのような物体または状況を不必要に敬遠する個体をもたらし得る）を特徴とする恐怖症；停止することも制御することも不可能に思われる、望ましくない思考または強迫性の挙動の繰り返しを特徴とする強迫性障害；ならびに、強姦、虐待、戦争、災害、または深刻な事故などの恐ろしい事象を目撃するか、またはそれらに関与した後に一般に起こり、不眠症、悪夢、フラッシュバック、うつ、および過敏性などの身体的症状を伴う心的外傷後ストレス障害。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
不安障害は、典型的には、認知行動療法および様々な医薬品を用いて治療される。しかし、不安障害を治療するために現在使用されている多くの薬物の副作用を考慮すれば、副作用がより少ないか、または副作用の程度がより軽い、より新しい薬物および治療方法が望ましい。さらに、既存の療法と相乗的に作用してそれらの有効性を向上させることができる薬物、または、問題の不安障害の根底にある分子的原理、生化学的原理、もしくは生理学的原理を標的とすることができる薬物を得ることも望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、不安などの神経精神障害を治療するための方法、および不安などの神経精神障害を治療するための化合物を同定するための方法を記載する。
【００１２】
本発明のいくつかの態様は、製薬上許容される担体およびアンジオテンシンＩＶ受容体の生物活性を低下させるのに有効な量のＡＴ４Ｒアンタゴニストを含む組成物を対象に投与することによって、そのような治療を必要とする対象において神経精神障害を治療するための方法を特徴とする。詳細な実施形態では、神経精神障害は、不安である。さらに詳細な実施形態では、アンタゴニストは、アンジオテンシンＩＶ、ジバリナール−アンジオテンシンＩＶ、ＬＶＶ−ヘモルフィン７、Ｎｌｅ−アンジオテンシンＩＶ、ノルロイシナール−アンジオテンシンＩＶ、またはそれらの任意の誘導体である。
【００１３】
本発明はまた、対象におけるＡＴ４Ｒの発現を調節することによって、そのような治療を必要とする対象において神経精神障害を治療するための方法も特徴とする。詳細な実施形態では、神経精神障害は、不安である。さらに詳細な実施形態では、ＡＴ４Ｒの発現が低減される。いくつかの実施形態では、細胞膜上のＡＴ４Ｒの発現が減弱される。いくつかの態様では、ＡＴ４Ｒの発現は、ＡＴ４Ｒをコードする核酸に対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドによって調節される。いくつかの実施形態では、ＡＴ４Ｒの発現は、膜移行シグナルペプチドを除去もしくは改変することにより、または、発現されたＡＴ４Ｒをプロテアソーム分解に導くことにより、細胞表面へのＡＴ４Ｒの局在化を防止することによって、減弱される。
【００１４】
本発明はまた、ＡＴ４Ｒに対する抗体を用いてＡＴ４Ｒの活性部位を妨害し、その結果、ＡＴ４Ｒ基質など他の分子がＡＴ４Ｒの活性部位に接近できないようにすることによって、そのような治療を必要とする対象において神経精神障害を治療するための方法も提供する。いくつかの実施形態では、神経精神障害は、不安である。
【００１５】
本発明の別の態様は、ＡＴ４Ｒのアンタゴニストを同定するための方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、これらの方法は、試験化合物をＡＴ４Ｒと接触させる工程と、試験化合物の不在下でのＡＴ４Ｒの生物活性に比べた、試験化合物の存在下でのＡＴ４Ｒの生物活性の低下を決定する工程とを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、精製されたＡＴ４Ｒを使用する。他の実施形態では、この方法は、ＡＴ４Ｒを含む細胞膜上で実施される。他の実施形態では、この方法は、ＡＴ４Ｒを発現する全細胞上で実施される。本発明の方法によって同定される化合物、ならびに、製薬上許容される担体と混合された、本発明の方法によって同定される化合物を含む医薬組成物もまた、本発明の範囲内にあると企図される。
【００１６】
また、試験化合物を対象に投与し、かつ、試験化合物の不在下での対象の不安レベルに比べた、対象の不安レベルの低下を決定することによって、対象の不安を軽減する化合物を同定するための方法も提供される。対象の不安は、４プレートモデルのようなモデル、高架式ゼロ迷路、高架式十字迷路、明暗選択テスト、ゲラー型抗コンフリクト試験、フォーゲル型抗コンフリクト試験、ホールボード試験、モリス水迷路試験、スケジュール誘導性多渇症モデル、ストレス誘発性高体温症モデル、恐怖驚愕増強（ｆｅａｒ−ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｄ  ｓｔａｒｔｌｅ）モデル、母子分離試験、水泳−絶望試験、または微量透析を用いて決定することができる。本発明の方法によって同定される化合物、ならびに、製薬上許容される担体と混合された、本発明の方法によって同定される化合物を含む医薬組成物もまた、本発明の範囲内にあると企図される。
【００１７】
本発明は、試験化合物をＡＴ４Ｒと接触させ、かつ、試験化合物の不在下でのＡＴ４Ｒの生物活性に比べた、試験化合物の存在下でのＡＴ４Ｒの生物活性の低下を決定し、次いで、その試験化合物を対象に投与し、かつ、試験化合物の不在下での対象の不安レベルに比べた、対象の不安レベルの低下を決定することによって、対象の不安を軽減する化合物を同定するための方法を特徴とする。本発明の方法によって同定される化合物、ならびに、製薬上許容される担体と混合された、本発明の方法によって同定される化合物を含む医薬組成物もまた、本発明の範囲内にあると企図される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本明細書において説明するように、本発明者らは、ＡＴ４Ｒを阻害すると、霊長類およびヒトにおける効果の予測に役立つ、広く使用されているげっ歯動物不安モデルにおいて抗不安効果が生じることを実証した。ＡＴ４Ｒ活性を妨害することによって観察される抗不安効果は、抗不安薬ジアゼパムを投与することによって観察される効果に匹敵する。さらに、抗不安効果は、オキシトシンアンタゴニストを動物に同時投与した場合にはそれらの効果が逆転されるため、神経ペプチドオキシトシンによって媒介されていることを本発明者らは示した。
【００１９】
以前のｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究により、ＡＴ４Ｒを阻害すると、オキシトシンおよびバソプレシンの双方の切断が阻害されることが実証された。（Ｈｅｒｂｓｔ（１９９７年）およびＭａｔｓｕｍｏｔｏ（２０００年））。オキシトシンは、抗不安性であると考えられているが、バソプレシンは、不安惹起性である。（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ，ＳＫら、Ｂｉｏｇｅｎｉｃ  Ａｍｉｎｅｓ（１９９８年）１４巻、３６７〜８６頁）。ＡＴ４Ｒは、オキシトシンを切断するよりも、バソプレシンをより効率的に切断するため（Ｌｅｗ，ＲＡら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．（２００３年）８６巻、３４４〜５０頁）、ＡＴ４Ｒプロテアーゼ活性を阻害すると、バソプレシンのシナプスレベルが上昇し、それによって、不安惹起効果が誘導されるか、または、最低でも、オキシトシンレベルの上昇に起因し得る任意の潜在的な抗不安効果を相殺するであろうことが、本発明の前に予想されていたはずである。本発明者らによって観察された効果は、これらの予想とは異なっている。
【００２０】
ＡＴ４Ｒの阻害により抗不安効果が発揮されるという本発明者らの発見により、本発明に従ういくつかの方法を実施することが可能になる。これらには、個体の不安を治療する方法、ならびに、下記により詳細に説明するように、ＡＴ４Ｒ経路を介して作用する抗不安化合物を同定する方法が含まれる。
【００２１】
定義
本発明の方法および他の態様に関する様々な用語が、明細書および特許請求の範囲の全体を通して使用される。このような用語には、別段の定めが無い限り、当技術分野において通常の意味が与えられるものとする。他の具体的に定義される用語は、本明細書において提供される定義と一致するように、解釈されるものとする。
【００２２】
「治療すること」または「治療」という用語は、症状の緩和、寛解、または軽減；病変または病態に対する対象の耐性の増大；および対象の身体的または精神的な幸福の改善など任意の客観的または主観的なパラメーターを含めて、病変または病態の減弱または回復における成功の任意の徴候を意味する。病変または病態の減弱回復における成功の徴候は、身体検査、神経学的検査、および／または心理学的評価もしくは精神医学的評価の結果を含めて、任意の客観的または主観的なパラメーターに基づいてよい。
【００２３】
「不安を軽減する」または「不安を軽減すること」または「不安の軽減」という用語は、不安の症状、または不安の根底にある心理学的根拠、分子的根拠、生化学的根拠、細胞的根拠、もしくは生理学的根拠の測定可能な任意の減少、減弱、または回復（消失を含む）を意味する。
【００２４】
「有効量」とは、特定の生物学的結果を実現するのに効果的な、本明細書において説明する化合物、材料、または組成物の量を意味する。このような結果には、それだけには限らないが、対象の不安など神経精神障害の治療が含まれ得る。
【００２５】
「ｉｎ  ｖｉｖｏ」とは、生体内であることを意味する。
【００２６】
「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」とは、人工環境内であることを意味する。
【００２７】
「不安」とは、非現実的または想像上の危険の懸念または恐怖に対する心理学的応答、分子的応答、生化学的応答、細胞的応答、および生理学的応答を含む感情の状態を意味する。不安には、それだけには限らないが、全般性不安障害、パニック不安、強迫性障害、社会恐怖、パフォーマンス不安、心的外傷後ストレス障害、急性ストレス反応、適応障害、心気性障害、分離不安障害、広場恐怖症、および特定の恐怖症が含まれる。本発明の方法を用いて治療できる特定の不安に関係した恐怖症は、臨床実践において一般に経験されるものであり、それだけには限らないが、動物、昆虫、嵐、運転、飛行、高所もしくは橋の横断、閉鎖空間もしくは狭い空間、水、血液もしくは傷害に対する恐怖、ならびに、接種または他の侵襲性の医学的処置もしくは歯科処置に対する極端な恐怖が含まれる。
【００２８】
「抗不安性」とは、不安を軽減する任意の傾向を意味する。
【００２９】
「不安惹起性」とは、不安を誘導する任意の傾向を意味する。
【００３０】
「神経ペプチド」とは、少なくとも２つのアミノ酸から構成される、末梢神経系または中枢神経系に由来する組織中に存在する任意の分子を意味する。
【００３１】
「シナプス」とは、インパルスが１つのニューロンから別のニューロンへと伝達される、ニューロン間の機能的付着部位を意味する。
【００３２】
「製薬上許容される」とは、薬理学的／毒物学的観点から患者に許容され、かつ、組成、処方、安定性、患者の許容性、および生物学的利用能に関する物理的／化学的観点から製薬薬剤師に許容されるような特性および／または物質を意味する。「製薬上許容される担体」とは、有効成分の生物活性の有効性を妨げず、かつ、投与される宿主に対して毒性ではない媒体を意味する。
【００３３】
「ＡＴ４Ｒアンタゴニスト」という用語は、最も広範な意味で使用され、アンジオテンシンＩＶ受容体の生物活性を部分的または完全に、妨害、阻害、低減、または中和する任意の分子を含む。
【００３４】
「生物活性」とは、ある分子の任意の機能もしくは作用、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏで効果をもたらす能力を意味する。ＡＴ４Ｒに関して、このような活性には、プロテアーゼ／ペプチダーゼ活性、およびそれらの下流の効果すべてが含まれ、それだけには限らないが、抗不安効果または不安惹起効果、シグナル伝達、グルコース輸送、記憶の増強、健忘症の回復などが含まれる。
【００３５】
本明細書において使用される場合、「試験化合物」とは、本発明の方法を用いて分析され得る、任意の精製された分子、実質的に精製された分子、化合物混合物の１種もしくは複数種の構成要素である分子、またはある化合物と他の任意の物質との混合物を意味する。試験化合物は、有機または無機の化学物質または生体分子、およびそれらのすべての断片、類似体、ホモログ、複合体、および誘導体でよい。生体分子には、タンパク質、ポリペプチド、核酸、脂質、多糖類、およびそれらのすべての断片、類似体、ホモログ、複合体、および誘導体が含まれる。試験化合物は、天然由来でも合成由来でもよく、また、それらの天然供給源から単離もしくは精製してもよく、または新規に合成してもよい。試験化合物は、構造もしくは組成の面から定義することができるか、または定義されていなくてもよい。化合物は、構造が不明な単離された生成物、いくつかの公知の生成物の混合物、または１種もしくは複数種の化合物を含む未定義の組成物でよい。未定義の組成物の例には、細胞抽出物および組織抽出物、原核細胞、真核細胞、および古細菌細胞が培養された増殖培地、発酵培養液、タンパク質発現ライブラリーなどが含まれる。
【００３６】
本明細書において使用される場合、「測定する」または「決定する」とは、任意の定性的測定または定量的測定を意味する。
【００３７】
「安定な細胞」または「安定な細胞株」とは、ＡＴ４Ｒ全体を含めて、ＡＴ４Ｒの任意のサブユニットまたはその組合せをその中で発現させることができ、その結果、ＡＴ４Ｒのアンタゴニストを同定および試験することができ、かつ、不安などの神経精神障害におけるＡＴ４Ｒの役割を検査することができる任意の細胞を意味する。
【００３８】
本明細書において使用される「抗体」には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、およびヒト化抗体、ならびに、Ｆａｂまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの生成物を含めて、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ）が含まれる。抗体に関して、「免疫学的に特異的な」または「特異的な」という用語は、対象のタンパク質の１つまたは複数のエピトープに結合するが、抗原性の生物学的分子の混合集団を含む試料中の他の分子を実質的に認識せず、かつ結合しない抗体を意味する。ある抗体の結合特異性を決定するスクリーニングアッセイ法は、当技術分野において周知であり、かつごく普通に実施される。このようなアッセイ法の包括的な考察については、Ｈａｒｌｏｗら（編）、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク（１９８８年）、第６章を参照されたい。
【００３９】
治療方法
本発明の一態様は、そのような治療を必要とする対象において神経精神障害を治療するための方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、この方法は、製薬上許容される担体およびアンジオテンシンＩＶ受容体の生物活性を低下させるのに有効な量のアンジオテンシンＩＶ受容体アンタゴニストを含む組成物を対象に投与する工程を含む。好ましい一実施形態では、神経精神障害は、不安である。
【００４０】
ＡＴ４Ｒアンタゴニストは、ＡＴ４Ｒの活性部位を阻害することによって、または、ＡＴ４Ｒに立体構造の変化を引き起こすことによって、ＡＴ４Ｒの活性を調節することができる。アンタゴニストは、任意の有機もしくは無機の化学物質もしくは生体分子、またはそれらの任意の断片、類似体、ホモログ、複合体、および誘導体でよい。ＡＴ４Ｒアンタゴニストの好ましい例には、それだけには限らないが、アンジオテンシンＩＶ（Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ）（配列番号１）、ジバリナール−アンジオテンシンＩＶ、Ｎｌｅ−アンジオテンシンＩＶ、ノルロイシナールアンジオテンシンＩＶ、ＬＶＶ−ヘモルフィン−７（Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ）（配列番号２）、以下を含む、ＬＶＶ−ヘモルフィン−７のペプチド類似体が含まれる。
Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｒｙ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ（配列番号３）、Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ（配列番号４）、Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ（配列番号５）、Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ（配列番号６）、Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ、Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ（配列番号７）、Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ（配列番号８）、Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ（配列番号９）、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ（配列番号１０）、Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ（配列番号１１）、Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ（配列番号１２）、Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ  （配列番号１３）、Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ（配列番号１４）、Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ（配列番号１５）、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ（配列番号１６）、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ（配列番号１７）、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ（配列番号１８）、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ（配列番号１９）、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ（配列番号２０）、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ（配列番号２１）、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ（配列番号２２）、またはＬｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ（配列番号２３）。
（Ｌｅｅ，Ｊら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（２００３年）３０５巻、２０５〜１１頁およびＬｅｗ，ＲＡ．（２００３年））。ＡＴ４Ｒに対する抗体は、アンタゴニストとして使用することもできる。このような抗体はモノクローナルでもポリクローナルでもよく、または、抗血清の形態であってもよい。
【００４１】
対象は、任意の動物でよく、好ましくは、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、雌ウシ、ウマ、ブタなどの哺乳動物である。最も好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００４２】
好ましいアンタゴニストは、指定濃度のアンタゴニストで、少なくとも約５％のＡＴ４Ｒのペプチダーゼ活性の低下、より好ましくは少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または９５％を上回る、ＡＴ４Ｒのペプチダーゼ活性の低下を提供するものである。好ましい一実施形態では、ＡＴ４Ｒのペプチダーゼ活性の低下は、シナプス中の抗不安性神経ペプチドまたは不安惹起性神経ペプチドの濃度を調節する。詳細な実施形態では、抗不安性神経ペプチドのシナプス濃度を、対象において上昇させる。別の詳細な実施形態では、不安惹起性神経ペプチドのシナプス濃度を、対象において低下させる。より好ましい実施形態では、対象において、抗不安性神経ペプチドのシナプス濃度を上昇させ、かつ、不安惹起性神経ペプチドのシナプス濃度を低下させる。抗不安性神経ペプチドの非限定的な例には、オキシトシン、ガラニン、および神経ペプチドＹが含まれる。不安惹起性神経ペプチドの非限定的な例には、バソプレシン、ソマトスタチン、コルチコトロピン放出因子（ＣＲＦ）、およびサブスタンスＰが含まれる。
【００４３】
ＡＴ４Ｒのペプチダーゼ活性を減少させるのに必要とされるアンタゴニスト濃度は、対象の種類、血統、サイズ、身長、体重、年齢、全般的健康、使用されるアンタゴニストのタイプ、または神経精神障害の重症度と共に変動し得る。個々の状況に必要とされる適切なアンタゴニスト濃度の決定は、当業者の技能の範囲内である。本発明の方法において、組成物は、組成物の乾燥重量の約０．００１％〜約９０％、または約１ｐＭ〜約１Ｍの範囲の濃度のアンタゴニストを含む。投薬量範囲は、例えば、対象の体重１ｋｇ当たり約１ｐｇ〜約１ｇまで変動してよい。対象の体重１ｋｇ当たり約１μｇ〜約１００ｍｇの１日量範囲がいくつかの実施形態において使用されるのに対し、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇの１日投薬量範囲が他の実施形態において使用される。治療は、アンタゴニストの最適用量を下回る、より少量の投薬量で開始し、続いて、その環境下での最適効果に達するまで、治療期間を通じて投薬量を増加させることができる。必要とされる場合には、１日の総投薬量を分割し、かつ、１日を通して、一部分ずつ投与してよい。
【００４４】
組成物は、所与の剤形を調製するのに適切な当技術分野の任意の手段に従って、多種多様の剤形で調製することができる。製薬上許容される担体は、固体でも液体でもよい。固形製剤の非限定的な例には、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、ロゼンジ、カシェ剤、坐剤、分散性顆粒剤などが含まれる。固形担体は、希釈剤、矯味剤、緩衝剤、結合剤、保存剤、錠剤崩壊剤、またはカプセル化材としても作用し得る１種または複数種の物質を含んでよい。適切な担体は、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、ココアバターなどである。液体製剤の非限定的な例には、液剤、懸濁剤、および乳剤、例えば、水溶液、アルコール溶液、プロピレングリコール水溶液などが含まれる。
【００４５】
組成物の投与は、輸注によって、注射（静脈内、筋肉内、皮内、皮下、十二指腸内、腹腔内など）によって、鼻腔内、直腸経由、経口的、または経皮的でよい。好ましくは、組成物は経口投与される。
【００４６】
不安を効果的に治療するために、当業者は、治療される対象に適切な投与計画および投薬量を推奨することができる。投薬は、必要とされる間、毎日１回〜４回実施することが好ましい場合がある。投薬は、組成物が持続性デリバリービヒクル中に調剤されている場合には、より低い頻度で実施してよい。また、投与計画は、対象の必要に依存し得る活性薬物濃度に応じて変動し得る。
【００４７】
本発明の別の態様は、対象におけるＡＴ４Ｒの発現を調節することによって、そのような治療を必要とする対象において神経精神障害を治療するための方法を特徴とする。好ましい一実施形態では、神経精神障害は、不安である。いくつかの実施形態では、ＡＴ４Ｒの発現は、例えば、ＡＴ４Ｒタンパク質の発現を減少させることによって、分子レベルで調節される。
【００４８】
ＡＴ４Ｒの発現は、アンチセンス核酸またはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用することによって、分子レベルで特異的に抑制することができる。ＲＮＡｉの総説は、Ｍａｒｘ，Ｊ．（２０００年）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８８巻、１３７０〜１３７２頁において見い出される。手短に言えば、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡを使用する遺伝子抑制の従来の方法は、対象の遺伝子の逆配列に結合し、その結果、結合により、後続の細胞プロセスが妨げられ、かつ、対応するタンパク質の合成が妨害されることによって、機能する。遺伝子発現を制御または変更するための例示的な方法は、ＷＯ  ９９／４９０２９、ＷＯ  ９９／５３０５０、およびＷＯ  ０１／７５１６４において提供されており、それらの開示内容は、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。これらの方法において、転写後の遺伝子サイレンシングは、配列に関連した遺伝子の転写物の急速な分解をもたらす、配列特異的なＲＮＡ分解プロセスによって引き起こされる。研究により、二本鎖ＲＮＡが、配列特異的遺伝子サイレンシングの媒介物として作用し得ることが示された（例えば、ＭｏｎｔｇｏｍｅｒｙおよびＦｉｒｅ、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１４巻、２５５〜２５８頁、１９９８年を参照されたい）。自己相補的な領域を有する転写物を生成する遺伝子構築物は、遺伝子サイレンシングにおいて特に効率的である。
【００４９】
１種または複数種のリボヌクレアーゼが二本鎖ＲＮＡに特異的に結合し、かつそれらを切断してより短い断片にすることが実証されている。リボヌクレアーゼは、これらの断片と結合したままであり、これらは、次に、相補的ｍＲＮＡに特異的に結合する、すなわち、対象の遺伝子の転写ｍＲＮＡ鎖に特異的に結合する。この遺伝子のｍＲＮＡもまた、リボヌクレアーゼによって、より短い断片に分解され、それによって、遺伝子の翻訳および発現が回避される。さらに、ＲＮＡポリメラーゼは、短断片の多数のコピーの合成を促進するように作用することもでき、それによって、系の効率が指数関数的に上昇する。遺伝子サイレンシングは、開始される場である細胞を超えて及ぶことができ、その結果、その阻害により、他の細胞およびその生物の全体にわたる系において、生化学的変化、分子的変化、生理学的変化、または表現型的変化が生じ得る。
【００５０】
したがって、ＡＴ４Ｒのヌクレオチド配列など入手可能な遺伝情報を用いて、当技術分野で公知の従来法によってデリバリーすることができる、遺伝子サイレンシング構築物および／または遺伝子特異的な自己相補的二本鎖ＲＮＡ配列を作製することができる。遺伝子構築物を使用して、自己相補的なＲＮＡ配列を発現させることができる。あるいは、ＲＮＡ分子が細胞の細胞質中に内部移行して遺伝子サイレンシング効果を発揮するように、細胞を遺伝子特異的な二本鎖ＲＮＡ分子と接触させる。二本鎖ＲＮＡは、非標識遺伝子の発現に影響を及ぼさずにＲＮＡｉを実現するのに十分な、標的遺伝子に対する相同性を有していなければならない。二本鎖ＤＮＡは、少なくとも２０ヌクレオチド長、好ましくは２１〜２３ヌクレオチド長である。好ましくは、二本鎖ＲＮＡは、本発明のポリヌクレオチドに特異的に対応する。哺乳動物細胞における遺伝子発現を抑制するための、２１〜２３ヌクレオチド長の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子の使用は、ＷＯ  ０１／７５１６４に記載されている。最適な阻害性ｓｉＲＮＡを設計するための道具には、ＤＮＡｅｎｇｉｎｅ  Ｉｎｃ．社（シアトル、ワシントン州）から入手可能なものが含まれる。ＷＯ  ０１／６８８３６を参照されたい。Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、ＲＮＡ（２００１年）７巻、１５０９〜１５２１頁、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ（２００１年）４０９巻、３６３〜３６６頁、Ｂｉｌｌｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ（２００１年）９８巻、１４４２８〜３３頁、Ｃａｐｌａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ（２００１年）９８巻、９７４２〜７頁、Ｃａｒｔｈｅｗら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（２００１年）１３巻、２４４〜８頁、Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ（２００１年）４１１巻、４９４〜４９８頁、Ｈａｍｍｏｎｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００１年）２９３巻、１１４６〜５０頁、Ｈａｍｍｏｎｄら、Ｎａｔ．Ｒｅｆ．Ｇｅｎｅｔ．（２００１年）２巻、１１０〜１１９頁、Ｈａｍｍｏｎｄら、Ｎａｔｕｒｅ（２０００年）４０４巻、２９３〜２９６頁、ＭｃＣａｆｆｒｒｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ（２００２年）、４１８巻、３８〜３９頁、およびＭｃＣａｆｆｒｅｙら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００２年）５巻、６７６〜６８４頁、Ｐａｄｄｉｓｏｎら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．（２００２年）１６巻、９４８〜９５８頁、Ｐａｄｄｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ（２００２年）９９巻、１４４３〜４８頁、Ｓｕｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ（２００２年）９９巻、５５１５〜２０頁も参照されたい。注目に値する米国特許には、米国特許第５９８５８４７号および第５９２２６８７号が含まれる。同様に、ＷＯ／１１０９２も注目に値する。注目に値するその他の参考文献には、Ａｃｓａｄｉら、Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌ．（１９９１年１月）３巻、７１〜８１頁、Ｃｈａｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２００１年）７５巻、３４６９〜３４７３頁、Ｈｉｃｋｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．（１９９４年）５巻、１４７７〜１４８３頁、Ｌｉｕら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（１９９９年）６巻、１２５８〜１２６６頁、Ｗｏｌｆｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０年）２４７巻、１４６５〜１４６８頁、およびＺｈａｎｇら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（１９９９年）１０巻、１７３５〜１７３７頁、およびＺｈａｎｇら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（１９９９年）７巻、１３４４〜１３４９頁が含まれる。これらの開示は、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００５１】
遺伝子療法の適用では、治療的に有効な遺伝子産物のｉｎ  ｖｉｖｏ合成を実現するために、例えば欠陥遺伝子を置換するために、遺伝子が細胞中に導入される。「遺伝子療法」は、１回の治療によって持続的な効果が実現される従来の遺伝子療法、および治療的に有効なＤＮＡまたはｍＲＮＡの１回の投与または反復投与を伴う、遺伝子治療物質の投与の両方を含む。アンチセンスＲＮＡおよびアンチセンスＤＮＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏで特定の遺伝子の発現を妨害するための治療物質として使用することができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞膜による取込みの制限が原因で細胞内濃度は低いものの、阻害物質として作用する場となる細胞中に移入され得ることが既に示されている。（Ｚａｍｅｃｎｉｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３巻、４１４３〜４１４６頁（１９８６年））。オリゴヌクレオチドは、例えば、負電荷を持ったリン酸ジエステル基を非荷電基で置換することによって、改変して、それらの取込みを向上させることができる。
【００５２】
生細胞中に核酸を導入するために利用可能な様々な技術がある。これらの技術は、対象とする宿主の細胞においてｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏで核酸を培養細胞中に導入するかどうかによって異なる。細胞中にｉｎ  ｖｉｔｒｏで核酸を導入するのに適した技術には、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストランの使用、リン酸カルシウム沈殿法などが含まれる。一般に好ましいｉｎ  ｖｉｖｏの遺伝子導入技術には、ウイルスベクターを用いたトランスフェクション、およびウイルスコートタンパク質−リポソームを介したトランスフェクションが含まれる（Ｄｚａｕら、１９９３年、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１巻、２０５〜２１０頁）。ウイルスベクターを介した技術は、対象の遺伝子をデリバリーするための構築物の構築にあたって、様々なウイルスを使用してよい。使用されるウイルスベクターのタイプは、免疫原性および組織向性を含むいくつかの因子に依存している。遺伝子療法において有用なウイルスベクターのいくつかの非限定的な例には、レトロウイルスベクター（例えば、米国特許第６３１２６８２号、同第６２３５５２２号、同第５６７２５１０号、および同第５９５２２２５号を参照されたい）、アデノウイルス（Ａｄ）ベクター（例えば、米国特許第６４８２６１６号、同第５８４６９４５号を参照されたい）、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、米国特許第６５６６１１９号、同第６３９２８５８号、同第６４６８５２４号、およびＷＯ  ９９／６１６０１を参照されたい）が含まれる。いくつかの状況では、細胞表面膜タンパク質または標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上の受容体に対するリガンドなど、標的細胞を標的とする作用物質を、核酸供給源に提供することが望ましい。リポソームが使用される場合、エンドサイトーシスに関連している細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の細胞型に対して向性であるキャプシドタンパク質またはその断片、循環中に内部移行されるタンパク質に対する抗体、および細胞内局在を導き、かつ、細胞内半減期を延長させるタンパク質を、ターゲティングのために、かつ／または取込みを促進するために、使用することができる。受容体を介したエンドサイトーシスの技術は、例えば、Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２巻、４４２９〜４４３２頁（１９８７年）、およびＷａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７巻、３４１０〜３４１４頁（１９９０年）によって説明されている。一般に公知の遺伝子作製プロトコールおよび遺伝子療法プロトコールに関する総説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６巻、８０８〜８１３頁（１９９２年）を参照されたい。
【００５３】
本発明の別の態様は、細胞表面へのＡＴ４Ｒの局在化を調節することによって、そのような治療を必要とする対象において神経精神障害を治療するための方法を特徴とする。好ましい一実施形態では、神経精神障害は、不安である。いくつかの実施形態では、細胞表面へのＡＴ４Ｒの局在化は、発現されたＡＴ４Ｒをプロテアーゼ分解に導くことによって調節される。例えば、ＡＴ４Ｒのユビキチン化を利用して、発現されたＡＴ４Ｒをプロテアソームに導くことができる。いくつかの実施形態では、細胞表面へのＡＴ４Ｒの局在化は、細胞表面移行シグナルペプチドを除去することによって調節される。このようなシグナルペプチドは、転写前または翻訳後に除去することができる。
【００５４】
本発明の別の態様は、ＡＴ４Ｒの活性部位を妨害することによって、そのような治療を必要とする対象において神経精神障害を治療するための方法を特徴とする。ＡＴ４Ｒの「活性部位を妨害する」とは、化学物質または生体分子を利用してＡＴ４Ｒの活性部位を遮り、その結果、ＡＴ４Ｒの基質がＡＴ４Ｒの活性部位に到達できず、したがって、ＡＴ４Ｒによって切断されないようにすることを意味する。好ましい一実施形態では、神経精神障害は、不安である。いくつかの実施形態では、ＡＴ４Ｒの活性部位は、ＡＴ４Ｒに対する抗体によって妨害される。
【００５５】
化合物をスクリーニングするための方法
本発明の別の態様は、試験化合物をＡＴ４Ｒと接触させる工程と、試験化合物の不在下でのＡＴ４Ｒの生物活性に比べた、試験化合物の存在下でのＡＴ４Ｒの生物活性の低下を決定する工程とを含む、ＡＴ４Ｒのアンタゴニストを同定するための方法を特徴とする。
【００５６】
スクリーニングアッセイのために、当技術分野において適切な任意の供給源からＡＴ４Ｒを得てよい。ＡＴ４Ｒは、精製されても、または、細胞膜もしくは膜断片に結合されていてもよい。精製されたＡＴ４Ｒ、またはそのサブユニットは、新規に合成してよく、または、腎臓組織、心臓組織、副腎組織、もしくは脳組織などＡＴ４Ｒを天然に発現する任意の哺乳動物細胞から得てもよい。膜結合型タンパク質を精製するための方法は、当技術分野において十分に確立されており、かつ、ＰｒｏｔｅｏＰｒｅｐ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ社、セントルイス、ミズーリ州）およびＱｐｒｏｔｏｍｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、カリフォルニア州）など市販のキットも入手可能である。精製されたＡＴ４Ｒはまた、トランスフェクトされたＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞などＡＴ４Ｒを発現する安定な細胞または細胞株の膜から得ることもできる。（Ｌｅｗ，ＲＡ（２００３年））。精製されたＡＴ４Ｒはまた、細菌系、酵母系、昆虫細胞系などの組換え発現系から得ることもできる。スクリーニングアッセイは、細胞膜に結合されたままのＡＴ４Ｒ上で実施することもできる。組換えクローニングならびにタンパク質の発現および精製の技術は、当技術分野において十分に確立されている。
【００５７】
膜結合型ＡＴ４Ｒまたはそのサブユニットは、ＡＴ４Ｒまたはそのサブユニットを発現する任意の細胞から得ることができる。哺乳動物の腎臓細胞、心臓細胞、副腎細胞、または脳細胞などの細胞は、天然にＡＴ４Ｒを発現することができる。これらの細胞は、トランスフェクトされたＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞などＡＴ４Ｒを発現するように誘導された安定な細胞または安定な細胞株でよい。（Ｌｅｗ，ＲＡ（２００３年））。安定な細胞は、クローニングおよび組換え遺伝子発現のための当技術分野において適切な任意の手段によって作製することができる。ＡＴ４Ｒを含む細胞膜または膜断片の単離は、Ｍｕｓｔａｆａらによって説明されている膜抽出法（Ｍｕｓｔａｆａ，Ｔら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．（２００１年）７６巻、１６７９〜８７頁）を含めて、当技術分野において適切な任意の手段に従って実施することができる。代替法として、膜がＡＴ４Ｒを含む細胞全体を使用することもできる。
【００５８】
一実施形態では、試験化合物とＡＴ４Ｒの相互作用は、当技術分野において公知である任意の定性的技術または定量的技術によって決定される。試験化合物がＡＴ４Ｒと相互作用するかどうかの決定は、試験化合物を標識する結合アッセイを用いて実施することができる。標識は、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、３３Ｐ、３２Ｐ、１７７Ｌｕ、９０Ｙなどを含む、放射性同位体；ＦＩＴＣ、フィコエリトリン、ローダミン、Ｃｙ１、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ４、Ｃｙ５、アロフィコシアニン、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバッド、カリフォルニア州）、蛍光性タンパク質などを含む、蛍光体；または、ホスファターゼ、ルシフェラーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどを含む酵素標識など、当技術分野において適切な任意の標識でよい。結合アッセイでは、平衡定数、解離定数、結合定数を決定することができる。結合測定は、それだけには限らないが、顕微鏡観察、平衡透析、限外ろ過、分光学的解析、クロマトグラフィー、および等温滴定熱量計などの熱量測定を含めて、当技術分野において適切な任意の手段によって実施することができる。Ｍｕｓｔａｆａら（Ｍｕｓｔａｆａ，Ｔ．（２００１年））、Ｌｅｅら（Ｌｅｅ，Ｊ（２００３年））、およびＬｅｗら（Ｌｅｗ，ＲＡ（２００３年））によって説明されているものなどの競合アッセイもまた、試験化合物とＡＴ４Ｒの相互作用を決定するために使用することができる。
【００５９】
ＡＴ４Ｒの生物活性に対する試験化合物の効果は、当技術分野において適切な任意の手段によって決定することができる。試験化合物は、複数の濃度で評価することができる。ＡＴ４Ｒの生物活性の低下は、試験化合物の不在下、またはＡＴ４Ｒを陰性対照化合物と接触させた際に観察される蛍光レベルと比較した、Ｌｅｕ−β−ＮＡ、すなわちＡＴ４Ｒの基質の切断に起因する蛍光の減少に関して測定することができる。（Ｌｅｗ，ＲＡ（２００３年））。あるいは、ＡＴ４Ｒの生物活性の低下は、ＡＴ４Ｒの他の任意の基質の切断の減少に関して測定することができる。このような測定は、クロマトグラフィー／ＨＰＬＣ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、または質量分析など当技術分野において適切な任意の手段によって実施することができる。（Ｚｈｕ，Ｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００３年）２７８巻、２２４１８〜２３頁）。ＡＴ４Ｒの生物活性の調節は、公知のＡＴ４Ｒ基質である神経ペプチドの濃度調節を測定することによって決定することもできる。このような神経ペプチドの濃度調節は、シナプスにおいて測定することができる。
【００６０】
本発明の別の態様は、試験化合物を対象に投与し、かつ、試験化合物の不在下での対象の不安レベルに比べた、対象の不安レベルの低下を決定することによって、対象の不安を軽減する化合物を同定するための方法を特徴とする。
【００６１】
不安のベースラインレベル、および対象への試験化合物の投与に起因する、不安の任意の軽減は、当技術分野において許容される任意の手段を用いて測定することができる。このような手段は、対象に対する罰を併用しても併用しなくてもよい。不安を測定するために当技術分野において使用されるアッセイの非限定的な例には、４プレートモデル、高架式ゼロ迷路、高架式十字迷路、明暗選択テスト、ゲラー型抗コンフリクト試験、フォーゲル型抗コンフリクト試験、ホールボード試験、モリス水迷路試験、スケジュール誘導性多渇症モデル、ストレス誘発性高体温症モデル、恐怖驚愕増強モデル、母子分離試験、水泳−絶望試験、微量透析などが含まれる。
【００６２】
本発明のさらなる態様は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのスクリーニングアッセイの組合せによって、対象の不安を軽減する化合物を同定するための方法を特徴とする。一実施形態では、試験化合物を最初にｉｎ  ｖｉｔｒｏでスクリーニングして、その生理的効果、細胞的効果、生化学的効果、または分子的効果を決定し、次いで、さらにｉｎ  ｖｉｖｏ  でスクリーニングして、その化合物が不安を軽減できるかを決定する。別の実施形態では、試験化合物を最初にｉｎ  ｖｉｖｏでスクリーニングして、その化合物が不安を軽減できるかを決定し、次いで、さらにｉｎ  ｖｉｔｒｏでスクリーニングして、その生理的効果、細胞的効果、生化学的効果、または分子的効果を決定する。
【００６３】
詳細な実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのスクリーニングアッセイは、試験化合物をＡＴ４Ｒと接触させる工程と、試験化合物の不在下でのＡＴ４Ｒの生物活性に比べた、試験化合物の存在下でのＡＴ４Ｒの生物活性の低下を決定する工程とを含む、ＡＴ４Ｒのアンタゴニストを同定する工程を含む。この実施形態は、本明細書において説明する詳細に従って実施することができる。さらに詳細な実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏのスクリーニングアッセイは、試験化合物を対象に投与する工程と、試験化合物の不在下での対象の不安レベルに比べた、対象の不安レベルの低下を決定する工程とを含む、対象の不安を軽減する化合物を同定する工程を含む。この実施形態は、本明細書において説明する詳細に従って実施することができる。
【００６４】
前述の本発明のスクリーニング法のいずれかによって同定される化合物は、本発明の範囲内にあると企図される。このような化合物は、好ましくは、抗不安性である。このような化合物は、本明細書において説明するように、投与される対象の不安を軽減するのに有効な量のこのような化合物を製薬上許容される担体と混合することによって、医薬組成物として調剤することができる。このような医薬組成物は、対象の不安を治療するために、本発明の方法に従って対象に投与することができる。
【００６５】
以下の実施例は、本発明をより詳細に例示するために提供される。これらの実施例は、本発明を例示することを意図し、限定することを意図しない。
【実施例１】
【００６６】
マウス４プレートモデルにおける不安挙動に対するＡＴ４受容体遮断の効果
ＡＴ４によるＡＴ４受容体遮断の効果を、マウス４プレート不安モデルにおいて調査した。
【００６７】
体重１８ｇ〜２４ｇの雄のスイスウェブスターマウスを４プレート研究において使用した。動物は、１５匹ずつのグループで、食物および水を自由に摂取可能な状態で、ＡＡＡＬＡＣ認定施設（Ｗｙｅｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、プリンストン、ニュージャージ州）において飼育した。動物を１２時間の明暗サイクル（６時００分に点灯）で維持し、すべての研究は、明期の間に実施した。実験の日、研究開始の３０分前に、マウスにＡＴ４（０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、および１０ｍｇ／ｋｇ）を注射した。最初に、ショックジェネレーター（Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社）にワイヤーで接続された、４つの長方形金属プレート（８×１１ｃｍ）からなる床を有するプレキシガラスケージ（１８×２５×１６ｃｍ）中にマウスを個別に入れた。各実験において、マウスを試験室中に入れ、かつ１８秒の馴化期間を与え、続いて、１分間の試験セッションを実施した。馴化期間後、マウスが１つのプレートから別のプレートに横断する際に、電撃ショック（０．８ｍＡ）を３．０秒間与えた。１つのプレートから次のプレートへの横断は、「罰刺激横断（ｐｕｎｉｓｈｅｄ  ｃｒｏｓｓｉｎｇ）」と呼ばれる。１分間の試験期間中の罰刺激横断の回数をコンピューターによって記録した。各グループの罰刺激横断の平均回数を、対照動物において観察される値に対するパーセンテージとして表した。データを全般的な一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に供し、かつ、最小２乗を用いた対比によって、事後比較を実施した。ビヒクルと比較してｐ＜０．０５の場合に、処置の有意な差異が存在した。
【００６８】
結果を図１に示す。確認することができるように、３ｍｇ／ｋｇのＡＴ４および１０ｍｇ／ｋｇのＡＴ４で急性処置すると、ビヒクルのみで処置した動物と比べて、罰刺激横断の回数は有意に（ｐ＜０．０５）増加した。これらの結果は、このモデルにおいてＶａｌｉｕｍ（ジアゼパム）など公知の抗不安薬を用いて観察される結果と同様である。
【実施例２】
【００６９】
オキシトシンのアンタゴニストによるＡＴ４の抗不安様効果の逆転
ＡＴ４受容体遮断の抗不安様効果が、オキシトシンによって少なくとも部分的に媒介されるかどうかを決定するために、実施例１で説明した手順を、公知のオキシトシン受容体アンタゴニストであるＷＡＹ−１６２７２０の存在下で繰り返した。
【００７０】
これらの研究のために、上記の実施例１で説明したのと同じ４プレート手順を使用した。唯一の違いは、オキシトシン受容体アンタゴニストであるＷＡＹ−１６２７２０  １０ｍｇ／ｋｇを動物に注射したということであった。この注射は、４プレートケージ中にマウスを入れる３０分前に投与されるＡＴ４（３ｍｇ／ｋｇ）と同時に実施した。１８秒間の馴化期間後、マウスが１つのプレートから別のプレートに横断する際に、電撃ショック（０．８ｍＡ）を３．０秒間与えた。各ショックデリバリーから３秒間おいて、コンピューターで、１分間の試験期間中の罰刺激横断の回数を記録した。各グループの罰刺激横断の平均回数を、対照動物において観察される値に対するパーセンテージとして表した。データを全般的な一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に供し、かつ、最小２乗を用いた対比によって、事後比較を実施した。ビヒクルと比較してｐ＜０．０５の場合に、処置の有意な差異が存在した。
【００７１】
結果を図２に示す。確認することができるように、ＷＡＹ−１６２７２０で急性処置しても、単独で試験した場合には、挙動にいかなる効果ももたらさず、また、ＡＴ４で急性処置すると、ビヒクル対照を投与された動物と比べて、罰刺激横断の数は増加した。ＷＡＹ−１６２７２０およびＡＴ４による急性処置は、このオキシトシン受容体アンタゴニストが４プレートモデルにおいてＡＴ４の抗不安効果を完全に妨害することを示した。
【実施例３】
【００７２】
ラット扁桃体中のオキシトシンレベルに対するＡＴ４受容体遮断の効果
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＡＴ４は、ＡＴ４受容体のペプチダーゼ活性を阻害して、オキシトシンを含むいくつかのペプチドのレベルの上昇をもたらす。この観察結果をｉｎ  ｖｉｖｏで確認するために、イムノアッセイ技術と組み合わせた微量透析を用いて、ラット扁桃体中のオキシトシンの細胞外レベルの基本的変化およびＡＴ４に誘導される変化をモニターした。
【００７３】
微量透析プロトコールのために、体重２８０ｇ〜３５０ｇの雄のスプラーグドーリーラットを、ＡＡＡＬＡＣ認定施設においてグループに分けて飼育し、かつ、１２時間の明暗サイクルで維持した。手順はすべて、明期（６時００分に点灯）の間に実施した。２〜３％ハロタン（フローセン（Ｆｌｕｏｔｈａｎｅ）；Ｚｅｎｅｃａ社、チェシャー州、イギリス）による麻酔を用いて、耳棒および切歯棒付きの定位固定フレーム（Ｄａｖｉｄ  Ｋｏｐｆ社、タハンガ（Ｔｕｊｕｎｇａ）、カリフォルニア州）中に動物を固定した。微量透析ガイドカニューレ（ＣＭＡ／１２；ＣＭＡ  Ｍｉｃｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ社、ストックホルム、スウェーデン）を、以下の座標、すなわちＡ／Ｐ−２．７ｍｍ、Ｍ／Ｌ−４．６ｍｍ、およびＤ／Ｖ−７．２ｍｍを用いて、ラット扁桃体の方向に誘導した（Ｐａｘｉｎｏｓ，ＧおよびＷａｔｓｏｎ，Ｃ．Ｔｈｅ  Ｒａｔ  Ｂｒａｉｎ  ｉｎ  Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ、１９８６年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）。ガイドカニューレを、ステンレス鋼ネジ２つ（Ｓｍａｌｌ  Ｐａｒｔｓ社、ロアノーク（Ｒｏａｎｏｋｅ）、バージニア州）および歯科用アクリル（Ｐｌａｓｔｉｃｓ  Ｏｎｅ社、ロアノーク、バージニア州）を用いて頭蓋に固定した。手術後、動物をプレキシガラスケージ（４５ｃｍ平方）中に個別に約２４時間収容し、かつ、食物および水は自由に摂取できるようにした。手術後に２４時間回復させた後、予め洗浄した微量透析プローブ（ＣＭＡ／１２；ＯＤ０．５ｍｍ、膜の長さ２ｍｍ、カットオフ値２０ｋＤ）に、人工ＣＳＦ（ＣＳＦ；１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、０．７５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、および１．２ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）を流速０．２ｍｌ／分で少なくとも１８時間灌流させた後、実験を実施した。処置当日に、ガイドカニューレを介して微量透析プローブを扁桃体中に挿入し、かつ、ＣＳＦを流速１μｌ／分で灌流させた。プローブ挿入後、３時間の安定化期間を与えた後、任意の神経化学物質を測定した。試料を３０分毎に２時間採取して、安定なベースラインを確立させた。これらの試料を直ちにドライアイス上に置いた。次に、プローブを通してＡＴ４を扁桃体中に６０分間、直接注入した。注入が完了した後、注入後３時間、試料を採取して、ＡＴ４効果の経時変化を評価した。採取後、すべての試料をドライアイス上で保存した。透析試料のオキシトシンレベルを、製造業者によって指定された条件に従って、オキシトシンイムノアッセイ（カタログ番号；ＤＥ１９００、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ社）により定量した。
【００７４】
１ｕＭおよび１０ｕＭのＮｌｅ−ＡＴ４を扁桃体内に注入（６０分）すると、扁桃体中のオキシトシンレベルが濃度依存的に上昇した（それぞれ、ベースラインから８３％および１２８％上昇）。さらに、Ｎｌｅ−ＡＴ４を全身注射（０．５ｍｇ／ｋｇ、皮下）すると、ビヒクルで処置した動物と比べて、扁桃体中のオキシトシンレベルが著しく上昇（５倍）し、これにより、このペプチドが中枢神経系に容易に移行することが示唆された。
【実施例４】
【００７５】
ＡＴ４受容体アンタゴニストであるジバリナールは、アンジオテンシンＩＶの抗不安特性を妨害する
ＡＴ４受容体がＡＴ４の抗不安様特性を媒介するかどうかを決定するために、実施例２で説明した手順を、公知のＡＴ４受容体アンタゴニストであるジバリナールの存在下で繰り返した。
【００７６】
これらの研究のために、上記の実施例１で説明したのと同じ４プレート手順を使用した。唯一の違いは、ＡＴ４受容体アンタゴニストであるジバリナール５ｎｍｏｌを動物に脳室内（ｉｃｖ）注射したということであった。ＡＴ４（３ｍｇ／ｋｇ）およびジバリナールを、それぞれ、４プレートケージに入れて馴化させる３０分前および２０分前に投与した。１８秒間の馴化期間後、マウスが１つのプレートから別のプレートに横断する際に、電撃ショック（０．８ｍＡ）を３．０秒間与えた。１分間の試験期間中の罰刺激横断の回数をコンピューターによって記録した。各グループの罰刺激横断の平均回数を、対照動物において観察される値に対するパーセンテージとして表した。データを全般的な一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に供し、かつ、最小２乗を用いた対比によって、事後比較を実施した。ビヒクルと比較してｐ＜０．０５の場合に、処置の有意な差異が存在した。
【００７７】
結果を図３に示す。ＡＴ４受容体アンタゴニストのジバリナール５ｎｍｏｌによる急性処置（脳室内）は、単独で試験した場合には挙動に対していかなる効果も持たなかった。しかし、ジバリナールは、４プレートモデルにおいて、アンジオテンシンＩＶの抗不安様効果を完全に妨害した。これらのデータは、ＡＴ４受容体が、Ａｎｇ  ＩＶの抗不安様特性を部分的に媒介することを示す。
【００７８】
本発明は、上記に説明および例示した実施形態に限定されないが、添付の特許請求の範囲内で変形および修正することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】マウス４プレート不安モデルにおける、ＡＴ４によるＡＴ４Ｒ遮断の抗不安様効果を示す棒グラフである。ＡＴ４を急性投与すると、用量依存的に、マウスにおいて抗不安様効果が生じる。マウスに、ビヒクル、または１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、および１０ｍｇ／ｋｇ体重のＡＴ４を全身皮下注射投与し（Ｘ軸）、かつ、罰刺激横断の回数（Ｙ軸）を測定することによって、マウス４プレートモデルにおいて不安を評価した。（＊  ビヒクルと比較してＰ＜０．０５）。
【図２】オキシトシン受容体アンタゴニストによる、ＡＴ４投与の抗不安様効果の逆転を示す棒グラフである。マウスに、ビヒクル、３ｍｇ／ｋｇのＡＴ４、１０ｍｇ／ｋｇのＷＡＹ−１６２７２０、オキシトシン受容体アンタゴニスト、または３ｍｇ／ｋｇのＡＴ４および１０ｍｇ／ｋｇのＷＡＹ−１６２７２０のいずれかを投与し（Ｘ軸）、かつ、罰刺激横断の回数（Ｙ軸）を測定することによって、マウス４プレートモデルにおいて不安を評価した。（＊  ビヒクルと比較してＰ＜０．０５）。
【図３】ＡＴ４受容体アンタゴニストによるＡＴ４投与の抗不安様効果の逆転を示す棒グラフである。マウスに、ビヒクル、３ｍｇ／ｋｇのＡＴ４、５ｎｍｏｌ（脳室内）のジバリナール、ＡＴ４受容体アンタゴニスト、または３ｍｇ／ｋｇのＡＴ４および５ｎｍｏｌ（脳室内）のジバリナールのいずれかを投与し（Ｘ軸）、かつ、罰刺激横断の回数（Ｙ軸）を測定することによって、マウス４プレートモデルにおいて不安を評価した。（＊  ビヒクルと比較してＰ＜０．０５）。
【図１】
2009506049.tif 000003
【図２】
2009506049.tif 000004
【図３】
2009506049.tif 000005
【配列表】
2009506049000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成20年4月22日(2008.4.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2009506049000001.app
【国際調査報告】
2009506049.tif 000011
2009506049.tif 000012
2009506049.tif 000013
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