(57)【要約】  本発明は、安定なＭＭＬＶ逆転写酵素変異体の生成および特徴に関する。本発明はまた、ＭＭＬＶ逆転写酵素変異体を用いる方法を開示する。
2009504162.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｅ６９、Ｅ３０２、Ｗ３１３、Ｌ４３５、Ｎ４５４およびＭ６５１のうちの少なくとも１つのアミノ酸に変異を含む変異体ＭＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項２】
逆転写酵素が、Ｅ６９の位置でグルタミン酸からリジンへの変異、Ｅ３０２の位置でグルタミン酸からリジンへの変異、Ｅ３０２の位置でグルタミン酸からアルギニンへの変異、Ｗ３１３の位置でトリプトファンからフェニルアラニンへの変異、Ｌ４３５の位置でロイシンからグリシンへの変異、Ｌ４３５の位置でロイシンからメチオニンへの変異、Ｎ４５４の位置でアスパラギンからリジンへの変異、Ｎ４５４の位置でアスパラギンからアルギニンへの変異、およびＭ６５１の位置でメチオニンからロイシンへの変異のうちの少なくとも１つを含む変異体ＭＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項３】
変異体が、Ｅ３０２Ｒ、Ｅ６９Ｋ、Ｗ３１３Ｆ、Ｌ４３５Ｇ及びＮ４５４Ｋの変異と、Ｅ３０２Ｒ、Ｗ３１３Ｆ、Ｌ４３５Ｇ及びＮ４５４Ｋの変異と、Ｅ３０２Ｒ、Ｗ３１３Ｆ及びＬ４３５Ｇの変異と、Ｅ３０２Ｒ、Ｅ６９Ｋ及びＮ４５４Ｋの変異と、Ｅ３０２Ｒ及びＷ３１３Ｆの変異と、並びにＥ６９Ｋ、Ｅ３０２Ｒ、Ｗ３１３Ｆ、Ｌ４３５Ｇ、Ｎ４５４Ｋ及びＤ５２４Ｎの変異からなる群より選択される変異体ＭＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項４】
Ｃ末端伸長をさらに含む請求項１に記載の変異体ＭＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項５】
前記Ｃ末端伸長が、ＲＤＲＮＫＮＮＤＲＲＫＡＫＥＮＥである請求項４に記載の変異体ＭＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項６】
前記逆転写酵素がＲＮａｓｅ  Ｈ活性を欠く請求項１に記載の変異体ＭＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項７】
安定性の増大、正確性の増大、プロセッシビティーの増大および特異性の増大のうちの少なくとも１つをさらに含む請求項１に記載の変異体ＭＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項８】
Ｅ６９、Ｅ３０２、Ｗ３１３、Ｌ４３５、Ｎ４５４およびＭ６５１のうちの少なくとも１つのアミノ酸に変異を含む、変異体ＭＭＬＶ逆転写酵素をコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９】
変異体ＭＭＬＶ逆転写酵素をコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドであって、前記逆転写酵素が、Ｅ６９の位置でグルタミン酸からリジンへの変異、Ｅ３０２の位置でグルタミン酸からリジンへの変異、Ｅ３０２の位置でグルタミン酸からアルギニンへの変異、Ｗ３１３の位置でトリプトファンからフェニルアラニンへの変異、Ｌ４３５の位置でロイシンからグリシンへの変異、Ｌ４３５の位置でロイシンからメチオニンへの変異、Ｎ４５４の位置でアスパラギンからリジンへの変異、Ｎ４５４の位置でアスパラギンからアルギニンへの変異、およびＭ６５１の位置でメチオニンからロイシンへの変異のうち少なくとも１つを含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
変異体ＭＭＬＶ逆転写酵素をコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドであって、前記変異体が、Ｅ３０２Ｒ、Ｅ６９Ｋ、Ｗ３１３Ｆ、Ｌ４３５Ｇ、及びＮ４５４Ｋの変異と、Ｅ３０２Ｒ、Ｗ３１３Ｆ、Ｌ４３５Ｇ、及びＮ４５４Ｋの変異と、Ｅ３０２Ｒ、Ｗ３１３Ｆ、及びＬ４３５Ｇの変異と、Ｅ３０２Ｒ、Ｅ６９Ｋ、及びＮ４５４Ｋの変異と、Ｅ３０２Ｒ及びＷ３１３Ｆの変異と、並びにＥ６９Ｋ、Ｅ３０２Ｒ、Ｗ３１３Ｆ、Ｌ４３５Ｇ、Ｎ４５４Ｋ、及びＤ５２４Ｎの変異からなる群より選択される単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１】
Ｃ末端伸長をさらにコードする請求項８に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記Ｃ末端伸長が、ＲＤＲＮＫＮＮＤＲＲＫＡＫＥＮＥである請求項１１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１３】
Ｅ６９、Ｅ３０２、Ｗ３１３、Ｌ４３５、Ｎ４５４およびＭ６５１のうちの少なくとも１つのアミノ酸に変異を含む変異体ＭＭＬＶ逆転写酵素を含む組成物。
【請求項１４】
変異体ＭＭＬＶ逆転写酵素を含む組成物であって、前記逆転写酵素が、Ｅ６９の位置でグルタミン酸からリジンへの変異、Ｅ３０２の位置でグルタミン酸からリジンへの変異、Ｅ３０２の位置でグルタミン酸からアルギニンへの変異、Ｗ３１３の位置でトリプトファンからフェニルアラニンへの変異、Ｌ４３５の位置でロイシンからグリシンへの変異、Ｌ４３５の位置でロイシンからメチオニンへの変異、Ｎ４５４の位置でアスパラギンからリジンへの変異、Ｎ４５４の位置でアスパラギンからアルギニンへの変異、およびＭ６５１の位置でメチオニンからロイシンへの変異のうち少なくとも１つを含む組成物。
【請求項１５】
変異体ＭＭＬＶ逆転写酵素を含む組成物であって、前記変異体が、Ｅ３０２Ｒ、Ｅ６９Ｋ、Ｗ３１３Ｆ、Ｌ４３５Ｇ、及びＮ４５４Ｋの変異と、Ｅ３０２Ｒ、Ｗ３１３Ｆ、Ｌ４３５Ｇ、及びＮ４５４Ｋの変異と、Ｅ３０２Ｒ、Ｗ３１３Ｆ、及びＬ４３５Ｇの変異と、Ｅ３０２Ｒ、Ｅ６９Ｋ、及びＮ４５４Ｋの変異と、Ｅ３０２Ｒ及びＷ３１３Ｆの変異と、並びにＥ６９Ｋ、Ｅ３０２Ｒ、Ｗ３１３Ｆ、Ｌ４３５Ｇ、Ｎ４５４Ｋ、及びＤ５２４Ｎの変異からなる群より選択される、組成物。
【請求項１６】
Ｃ末端伸長をさらに含む請求項１３に記載の組成物。
【請求項１７】
前記Ｃ末端伸長が、ＲＤＲＮＫＮＮＤＲＲＫＡＫＥＮＥである請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
安定性の増大、正確性の増大、プロセッシビティーの増大および特異性の増大のうちの少なくとも１つをさらに含む、求項１３に記載の組成物。
【請求項１９】
前記逆転写酵素がＲＮａｓｅ  Ｈ活性を欠く請求項１３に記載の組成物。
【請求項２０】
真正細菌由来のεサブユニットをさらに含む請求項１３に記載の組成物。
【請求項２１】
前記εサブユニットが、大腸菌由来である請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記εサブユニットが、大腸菌由来のε１８６である請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
ホルムアミド、ベタインまたはＤＭＳＯをさらに含む請求項１３に記載の組成物。
【請求項２４】
Ｅ６９、Ｅ３０２、Ｗ３１３、Ｌ４３５、Ｎ４５４およびＭ６５１のうちの少なくとも１つのアミノ酸に変異を含む変異体ＭＭＬＶ逆転写酵素と、そのパッケージング材料とを含むキット。
【請求項２５】
変異体ＭＭＬＶ逆転写酵素と、そのパッケージング材料とを含むキットであって、前記逆転写酵素が、Ｅ６９の位置でグルタミン酸からリジンへの変異、Ｅ３０２の位置でグルタミン酸からリジンへの変異、Ｅ３０２の位置でグルタミン酸からアルギニンへの変異、Ｗ３１３の位置でトリプトファンからフェニルアラニンへの変異、Ｌ４３５の位置でロイシンからグリシンへの変異、Ｌ４３５の位置でロイシンからメチオニンへの変異、Ｎ４５４の位置でアスパラギンからリジンへの変異、Ｎ４５４の位置でアスパラギンからアルギニンへの変異、およびＭ６５１の位置でメチオニンからロイシンへの変異のうちの少なくとも１つを含むキット。
【請求項２６】
変異体ＭＭＬＶ逆転写酵素と、そのパッケージング材料とを含むキットであって、前記変異体が、Ｅ３０２Ｒ、Ｅ６９Ｋ、Ｗ３１３Ｆ、Ｌ４３５Ｇ、及びＮ４５４Ｋの変異と、Ｅ３０２Ｒ、Ｗ３１３Ｆ、Ｌ４３５Ｇ、及びＮ４５４Ｋの変異と、Ｅ３０２Ｒ、Ｗ３１３Ｆ、及びＬ４３５Ｇの変異と、Ｅ３０２Ｒ、Ｅ６９Ｋ、及びＮ４５４Ｋの変異と、Ｅ３０２Ｒ及びＷ３１３Ｆの変異と、並びにＥ６９Ｋ、Ｅ３０２Ｒ、Ｗ３１３Ｆ、Ｌ４３５Ｇ、Ｎ４５４Ｋ、及びＤ５２４Ｎからなる群より選択されるキット。
【請求項２７】
前記逆転写酵素がＲＮａｓｅ  Ｈ活性を欠く請求項２４に記載のキット。
【請求項２８】
前記変異体ＭＭＬＶ逆転写酵素がＣ末端伸長をさらに含む請求項２４に記載のキット。
【請求項２９】
前記Ｃ末端伸長が、ＲＤＲＮＫＮＮＤＲＲＫＡＫＥＮＥである請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
前記逆転写酵素が、安定性の増大、正確性の増大、プロセッシビティーの増大および特異性の増大のうちの少なくとも１つをさらに含む請求項２４に記載のキット。
【請求項３１】
真正細菌由来のεサブユニットをさらに含む請求項２４に記載のキット。
【請求項３２】
前記εサブユニットが、大腸菌由来である請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
前記εサブユニットが、大腸菌由来のε１８６である請求項３１に記載のキット。
【請求項３４】
ホルムアミド、ベタインまたはＤＭＳＯをさらに含む請求項２４に記載のキット。
【請求項３５】
（ａ）請求項１に記載の変異体逆転写酵素を準備する工程と；
（ｂ）前記変異体逆転写酵素と核酸テンプレートとを接触させてｃＤＮＡ合成をする工程と
を含むｃＤＮＡ合成のための方法。
【請求項３６】
（ａ）請求項１に記載の変異体逆転写酵素を準備する工程と；
（ｂ）前記変異体逆転写酵素と核酸テンプレートとを接触させて合成ｃＤＮＡ産物を生成する工程と、
（ｃ）前記合成されたｃＤＮＡ産物をクローニングベクターに挿入する工程と、
を含むクローニングのための方法。
【請求項３７】
（ａ）請求項１に記載の変異体逆転写酵素を準備する工程と；
（ｂ）前記変異体逆転写酵素と核酸テンプレートとを接触させて前記核酸テンプレートを複製および増幅する工程と、
を含むＲＴ−ＰＣＲのための方法。
【請求項３８】
前記ＲＴ−ＰＣＲが、エンドポイントＲＴ−ＰＣＲを含む請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＲＴ−ＰＣＲが、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲである請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
（ａ）請求項１に記載の変異体逆転写酵素を準備する工程と；
（ｂ）前記変異体逆転写酵素と核酸テンプレートとを接触させて合成ｃＤＮＡ産物を生成する工程と、
（ｃ）前記合成されたｃＤＮＡ産物をベクターに挿入する工程と、
を含むｃＤＮＡライブラリー構築のための方法。
【請求項４１】
（ａ）請求項１に記載の変異体逆転写酵素を準備する工程と；
（ｂ）前記変異体逆転写酵素と核酸テンプレートとを接触させて合成ｃＤＮＡ産物を生成する工程と、
（ｃ）前記ｃＤＮＡ産物を基板に結合させる工程と
を含むマイクロアレイを作成するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、２００５年８月１０日出願の米国特許仮出願第６０／７０７，０１９号の恩典を請求する。
【０００２】
本発明は、安定性が増大された変異体逆転写酵素に関する。
【背景技術】
【０００３】
レトロウイルス逆転写酵素の３つのプロトタイプ型が徹底的に研究されている。モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）（Ｍ−ＭＬＶ）の逆転写酵素は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する７８ｋＤａの単一のサブユニットを含有する。この酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて完全な活性型でクローニングされて発現されている（Ｐｒａｓａｄ，Ｖ．Ｒ．，Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ｐ．１３５（１９９３）に概説される）。ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ）（ＨＩＶ）の逆転写酵素は、ｐ６６およびｐ５１のサブユニットのヘテロ二量体であって、この小さい方のサブユニットは、タンパク質分解性の切断によって大きい方から誘導される。ｐ６６サブユニットは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮａｓｅ  Ｈドメインの両方を有するが、ｐ５１サブユニットは、ＤＮＡポリメラーゼドメインのみを有する。活性なＨＩＶのｐ６６／ｐ５１逆転写酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉを含む多数の発現宿主において首尾よくクローニングされかつ発現されている（Ｌｅ  Ｇｒｉｃｅ，Ｓ．Ｆ．Ｊ．，Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ，ｐ．１６３（１９９３）に概説される）。ＨＩＶのｐ６６／ｐ５１ヘテロ二量体では、５１−ｋＤのサブユニットは触媒的に不活性であり、そして６６−ｋＤのサブユニットがＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮａｓｅ  Ｈ活性の両方を有する（Ｌｅ  Ｇｒｉｃｅ，Ｓ．Ｆ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １０：３９０５（１９９１）；Ｈｏｓｔｏｍｓｋｙ，Ｚ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：３１７９（１９９２））。トリ肉腫白血病ウイルス（Ａｖｉａｎ  Ｓａｒｃｏｍａ−Ｌｅｕｋｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）（ＡＳＬＶ）逆転写酵素としては、限定はしないが、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ  Ｓａｒｃｏｍａ  Ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）の逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス（Ａｖｉａｎ  Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）（ＡＭＶ）の逆転写酵素、トリ（ニワトリ）赤芽球症ウイルス（Ａｖｉａｎ  Ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）（ＡＥＶ）ヘルパーウイルスＭＣＡＶの逆転写酵素、トリ骨髄球腫症ウイルス（Ａｖｉａｎ  Ｍｙｅｌｏｃｙｔｏｍａｔｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）ＭＣ２９ヘルパーウイルスＭＣＡＶの逆転写酵素、トリ細網内皮症ウイルス（Ａｖｉａｎ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）（ＲＥＶ−Ｔ）ヘルパーウイルスＲＥＶ−Ａの逆転写酵素、トリ肉腫ウイルス（Ａｖｉａｎ  Ｓａｒｃｏｍａ  Ｖｉｒｕｓ）ＵＲ２のヘルパーウイルスＵＲ２ＡＶの逆転写酵素、トリ肉腫ウイルスＹ７３のヘルパーウイルスＹＡＶの逆転写酵素、ラウス随伴ウイルス（Ｒｏｕｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ）（ＲＡＶ）の逆転写酵素、および骨髄芽球症随伴ウイルス（Ｍｙｅｌｏｂｌ��ｓｔｏｓｉｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ）（ＭＡＶ）の逆転写酵素が挙げられるが、この逆転写酵素はまた２つのサブユニットであるα（約６２ｋＤａ）およびβ（約９４ｋＤａ）のヘテロ二量体であり、ここでαは、タンパク分解性切断によってβから誘導される（Ｐｒａｓａｄ，Ｖ．Ｒ．，Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３），ｐ．１３５に概説される）。ＡＳＬＶ逆転写酵素は、２つのさらなる触媒的に活性な構造型であるββおよびαで存在し得る（Ｈｉｚｉ，Ａ．およびＪｏｋｌｉｋ，Ｗ．Ｋ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：２２８１（１９７７））。沈降分析によって、αβおよびββは、二量体であって、そのα型は、単量体型と二量体型との間で平衡に存在するということが示唆される（Ｇｒａｎｄｇｅｎｅｔｔ，Ｄ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７０：２３０（１９７３）；Ｈｉｚｉ，Ａ．およびＪｏｋｌｉｋ，Ｗ．Ｋ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：２２８１（１９７７）；ならびにＳｏｌｔｉｓ，Ｄ．Ａ．およびＳｋａｌｋａ，Ａ．Ｍ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：３３７２（１９８８））。ＡＳＬＶのαβおよびββ逆転写酵素は、同じタンパク質複合体において以下の３つの異なる活性を含むレトロウイルス逆転写酵素の唯一の公知の例である。ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性、およびＤＮＡエンドヌクレアーゼ（インテグラーゼ）活性（Ｓｋａｌｋａ，Ａ．Ｍ．，Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３），ｐ．１９３に概説される）。このα型は、インテグラーゼのドメインおよび活性を欠く。
【０００４】
逆転写酵素媒介性逆転写によるｍＲＮＡからｃＤＮＡへの変換は、多くの遺伝子発現研究における本質的な工程である。しかし、逆転写を触媒する未改変の逆転写酵素（ＲＴ）の使用は、多数の理由のために不十分である。第一に、逆転写酵素は時に、逆転写酵素に存在する内因性のＲＮａｓｅ  Ｈ活性に主に起因して、第一鎖反応が開始されるかまたは終了される前にＲＮＡテンプレートを分解する。さらに、ｍＲＮＡテンプレート分子のミスプライミングは、ｃＤＮＡ第一鎖における誤りの誘導をもたらし得る。ＲＴは、ｃＤＮＡ合成の間にＨＩＶのＲＴについては３０００〜６０００ヌクレオチドあたり１つ、そしてＡＭＶのＲＴについては１／１０，０００ヌクレオチドあたり１つの塩基エラーを組み込むことが実際に示されている（Ｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２：２３６５−２３７２（１９８３）；Ｋｒｕｇ，Ｍ．Ｓ．，およびＢｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３１６（１９８７）；Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７５：５２３（１９９６））。ｍＲＮＡ分子自体の二次構造が、第一鎖合成に対して抵抗性のいくつかのｍＲＮＡを作成し得る。逆転写酵素の有効性に影響する別の要因は、ＲＮＡが二次構造を形成する能力である。このような二次構造は、例えば、ＲＮＡ分子の領域がハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡを形成するのに十分な相補性を有する場合に、形成し得る。一般には、ＲＮＡ二次構造の形成は、ＲＮＡ分子を有する溶液の温度を上昇させることによって低減され得る。従って、多くの場合には、３７℃を超える温度でＲＮＡを逆転写させることが望ましい。しかし、当分野で公知の逆転写酵素は一般的に、３７℃よりかなり高い温度（例えば、５０℃）でインキュベートされると活性を失う。
【０００５】
熱安定性逆転写酵素を操作するための試みの種々の方法が当分野で公知である。これらの方法は、逆転写酵素活性を含有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いる工程（Ｓｈａｎｄｉｌｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ，２００４  ８：２４３）と、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを変異誘発させてそれらの逆転写酵素活性を増大させる工程（米国特許第２００２／００１２９７０号）と、熱不安定性の逆転写酵素を変異誘発させる工程（米国特許第２００４／０２０９２７６号）と、Ｔａｑ／Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼの存在下でＭｇ2+の代わりにＭｎ2+を用いる工程（Ｍｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９１  ３０：７６６１）と、熱不安定性逆転写酵素とともにトレハロースのような添加物を用いる工程（Ｃａｒｎｉｎｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：５２０）とを含む。
【０００６】
この分野における科学者はまた、ＤＮＡまたはＲＮＡテンプレート上での重合化の忠実度を増大するための種々の酵素組成物および方法を試みてきた。例えば、Ｓｈｅｖｅｌｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：３６４（２００２）は、３’−５’エキソヌクレアーゼに対する概説を提供している。Ｐｅｒｒｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，８６：３０８５（１９８９）は、仔ウシ胸腺ＤＮＡポリメラーゼαの忠実度を増大するためのＥ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのεサブユニットの使用を報告している。Ｂａｋｈａｎａｓｈｖｉｌｉ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８：２０４７（２００１）は、ｐ５３タンパク質のプルーフリーディング活性を記載しており、そしてＨｕａｎｇらのＯｎｃｏｇｅｎｅ，１７：２６１（１９９８）は、ｐ５３がＤＮＡ複製の忠実度を増強する能力を記載している。Ｂａｋｈａｎａｓｈｖｉｌｉ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２０：７６３５（２００１）はまた、ｐ５３が、Ｉ型ＨＩＶの逆転写酵素によるＤＮＡ合成の忠実度を強化することを報告する。Ｈａｗｋｉｎｓらは、長ｍＲＮＡ転写物からの全長ｃＤＮＡの合成を記載する（２００２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３４：７６８）。
【０００７】
米国特許出願第２００３／０１９８９４４Ａ１号および米国特許第６，５１８，０１９号は、２つ以上の逆転写酵素（例えば、各々の逆転写酵素は、異なる転写停止部位を有する）および必要に応じて１つ以上のＤＮＡポリメラーゼを含有する酵素混合物を提供する。米国特許出願第２００２／０１１９４６５Ａ１号は、変異体熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよび変異体逆転写酵素（例えば、変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび変異体ＭＭＬＶ−ＲＴ）を含む組成物を開示する。米国特許第６，４８５，９１７Ｂ１号および米国特許出願第２００３／００７７７６２号および欧州特許出願ＥＰ１  １３２４７０は、逆転写酵素活性を有する酵素および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するα型ＤＮＡポリメラーゼの存在下でｃＤＮＡを合成する方法を提供する。
【０００８】
逆転写酵素のＲＮａｓｅ  Ｈ活性の除去は、ＲＮＡテンプレートのＲＮＡ分解の問題を排除し、そして逆転写の有効性を改善し得る（Ｇｅｒａｒｄ，Ｇ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，ＦＯＣＵＳ  １１（４）：６０（１９８９）；Ｇｅｒａｒｄ，Ｇ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，ＦＯＣＵＳ  １４（３）：９１（１９９２））。しかし、このような逆転写酵素（「ＲＮａｓｅ  Ｈ−」型）は、ミスプライミングおよびｍＲＮＡ二次構造のさらなる問題には対応していない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
当分野には安定性の増大を示す逆転写酵素の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、熱安定性ＭＭＬＶ逆転写酵素の構築および特徴付けに関する。本発明はまた、本明細書において記載される熱安定性ＭＭＬＶ逆転写酵素を用いる方法、およびこの酵素を含むキットに関する。
【００１１】
本発明は、変異体ＭＭＬＶ逆転写酵素であって、以下のアミノ酸位置：Ｅ６９、Ｅ３０２、Ｗ３１３、Ｌ４３５、Ｎ４５４およびＭ６５１のうちの少なくとも１つにある変異を含む、変異体ＭＭＬＶ逆転写酵素に関する。
【００１２】
本発明はまた、変異体ＭＭＬＶ逆転写酵素であって、位置Ｅ６９でのグルタミン酸のリジンへの変異、位置Ｅ３０２でのグルタミン酸のリジンへの変異、位置Ｅ３０２でのグルタミン酸のアルギニンへの変異、位置Ｗ３１３でのトリプトファンのフェニルアラニンへの変異、位置Ｌ４３５でのロイシンのグリシンへの変異、位置Ｌ４３５でのロイシンのメチオニンへの変異、位置Ｎ４５４でのアスパラギンのリジンへの変異、位置Ｎ４５４でのアスパラギンのアルギニンへの変異、および位置Ｍ６５１でのメチオニンのロイシンへの変異のうちの少なくとも１つを含む、変異体ＭＭＬＶ逆転写酵素に関する。
【００１３】
本発明はまた、変異体ＭＭＬＶ逆転写酵素であって、Ｅ３０２Ｒ／Ｅ６９Ｋ／Ｗ３１３Ｆ／Ｌ４３５Ｇ／Ｎ４５４Ｋ；Ｅ３０２Ｒ／Ｗ３１３Ｆ／Ｌ４３５Ｇ／Ｎ４５４Ｋ；Ｅ３０２Ｒ／Ｗ３１３Ｆ／Ｌ４３５Ｇ；Ｅ３０２Ｒ／Ｅ６９Ｋ／Ｎ４５４Ｋ；Ｅ３０２Ｒ／Ｗ３１３Ｆ；およびＥ６９Ｋ／Ｅ３０２Ｒ／Ｗ３１３Ｆ／Ｌ４３５Ｇ／Ｎ４５４Ｋ／Ｄ５２４Ｎからなる群より選択される、変異体ＭＭＬＶ逆転写酵素に関する。
【００１４】
１実施形態では、変異体ＭＭＬＶ逆転写酵素はさらにＣ末端伸長を含む。
【００１５】
別の実施形態では、Ｃ末端伸長は、ＲＤＲＮＫＮＮＤＲＲＫＡＫＥＮＥ（配列番号１）である。
【００１６】
別の実施形態では、変異体ＭＭＬＶ逆転写酵素はＲＮａｓｅ  Ｈ活性を欠く。
【００１７】
別の実施形態では、この変異体ＭＭＬＶ逆転写酵素は、安定性の増大、正確性の増大、プロセッシビティー（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）の増大および特異性の増大のうちの少なくとも１つをさらに含む。
【００１８】
本発明はまた、変異体ＭＭＬＶ逆転写酵素をコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチドであって、この逆転写酵素が、以下のアミノ酸位置：Ｅ６９、Ｅ３０２、Ｗ３１３、Ｌ４３５、Ｎ４５４およびＭ６５１のうちの少なくとも１つが、ある変異を含む、単離されたポリヌクレオチドに関する。
【００１９】
本発明はまた、変異体ＭＭＬＶ逆転写酵素をコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドであって、この逆転写酵素が、位置Ｅ６９でのグルタミン酸のリジンへの変異、位置Ｅ３０２でのグルタミン酸のリジンへの変異、位置Ｅ３０２でのグルタミン酸のアルギニンへの変異、位置Ｗ３１３でのトリプトファンのフェニルアラニンへの変異、位置Ｌ４３５でのロイシンのグリシンへの変異、位置Ｌ４３５でのロイシンのメチオニンへの変異、位置Ｎ４５４でのアスパラギンのリジンへの変異、位置Ｎ４５４でのアスパラギンのアルギニンへの変異、および位置Ｍ６５１でのメチオニンのロイシンへの変異のうちの少なくとも１つを含む、単離されたポリヌクレオチドに関する。
【００２０】
本発明はまた、単離されたポリヌクレオチドであって、Ｅ３０２Ｒ／Ｅ６９Ｋ／Ｗ３１３Ｆ／Ｌ４３５Ｇ／Ｎ４５４Ｋ；Ｅ３０２Ｒ／Ｗ３１３Ｆ／Ｌ４３５Ｇ／Ｎ４５４Ｋ；Ｅ３０２Ｒ／Ｗ３１３Ｆ／Ｌ４３５Ｇ；Ｅ３０２Ｒ／Ｅ６９Ｋ／Ｎ４５４Ｋ；Ｅ３０２Ｒ／Ｗ３１３Ｆ；およびＥ６９Ｋ／Ｅ３０２Ｒ／Ｗ３１３Ｆ／Ｌ４３５Ｇ／Ｎ４５４Ｋ／Ｄ５２４Ｎからなる群より選択される、変異体ＭＭＬＶ逆転写酵素をコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチドに関する。
【００２１】
１実施形態では、この単離されたポリヌクレオチドは、Ｃ末端伸長をさらにコードする。
【００２２】
１実施形態では、上記Ｃ末端伸長は、ＲＤＲＮＫＮＮＤＲＲＫＡＫＥＮＥ（配列番号１）である。
【００２３】
本発明はまた、以下のアミノ酸位置：Ｅ６９、Ｅ３０２、Ｗ３１３、Ｌ４３５、Ｎ４５４およびＭ６５１のうちの少なくとも１つが、ある変異を含む、変異体ＭＭＬＶ逆転写酵素を含む組成物に関する。
【００２４】
本発明はまた、変異体ＭＭＬＶ逆転写酵素を含む組成物であって、この逆転写酵素が、位置Ｅ６９でのグルタミン酸のリジンへの変異、位置Ｅ３０２でのグルタミン酸のリジンへの変異、位置Ｅ３０２でのグルタミン酸のアルギニンへの変異、位置Ｗ３１３でのトリプトファンのフェニルアラニンへの変異、位置Ｌ４３５でのロイシンのグリシンへの変異、位置Ｌ４３５でのロイシンのメチオニンへの変異、位置Ｎ４５４でのアスパラギンのリジンへの変異、位置Ｎ４５４でのアスパラギンのアルギニンへの変異、および位置Ｍ６５１でのメチオニンのロイシンへの変異のうちの少なくとも１つを含む、組成物に関する。
【００２５】
本発明はまた、変異体ＭＭＬＶ逆転写酵素を含む組成物であって、この変異体が、Ｅ３０２Ｒ／Ｅ６９Ｋ／Ｗ３１３Ｆ／Ｌ４３５Ｇ／Ｎ４５４Ｋ；Ｅ３０２Ｒ／Ｗ３１３Ｆ／Ｌ４３５Ｇ／Ｎ４５４Ｋ；Ｅ３０２Ｒ／Ｗ３１３Ｆ／Ｌ４３５Ｇ；Ｅ３０２Ｒ／Ｅ６９Ｋ／Ｎ４５４Ｋ；Ｅ３０２Ｒ／Ｗ３１３Ｆ；およびＥ６９Ｋ／Ｅ３０２Ｒ／Ｗ３１３Ｆ／Ｌ４３５Ｇ／Ｎ４５４Ｋ／Ｄ５２４Ｎからなる群より選択される、組成物に関する。
【００２６】
１実施形態では、この組成物の変異体逆転写酵素はさらにＣ末端伸長を含む。
【００２７】
別の実施形態では、このＣ末端伸長は、ＲＤＲＮＫＮＮＤＲＲＫＡＫＥＮＥ（配列番号１）である。
【００２８】
別の実施形態では、この変異体逆転写酵素はさらに、安定性の増大、正確性の増大、プロセッシビティーの増大、および特異性の増大のうちの少なくとも１つをさらに含む。
【００２９】
別の実施形態では、この逆転写酵素はＲＮａｓｅ  Ｈ活性を欠く。
【００３０】
別の実施形態では、この組成物は、真正細菌由来のεサブユニットをさらに含む。
【００３１】
別の実施形態では、このεサブユニットは、大腸菌由来である。
【００３２】
別の実施形態では、このεサブユニットは、大腸菌由来のε１８６である。
【００３３】
別の実施形態では、この組成物は、ホルムアミド、ベタインまたはＤＭＳＯをさらに含む。
【００３４】
本発明はまた、以下のアミノ酸位置：Ｅ６９、Ｅ３０２、Ｗ３１３、Ｌ４３５、Ｎ４５４およびＭ６５１のうちの少なくとも１つが、ある変異を含む、変異体ＭＭＬＶ逆転写酵素と、そのパッケージング材料とを含む、キットを提供する。
【００３５】
本発明はまた、変異体ＭＭＬＶ逆転写酵素であって、この逆転写酵素が、位置Ｅ６９でのグルタミン酸のリジンへの変異、位置Ｅ３０２でのグルタミン酸のリジンへの変異、位置Ｅ３０２でのグルタミン酸のアルギニンへの変異、位置Ｗ３１３でのトリプトファンのフェニルアラニンへの変異、位置Ｌ４３５でのロイシンのグリシンへの変異、位置Ｌ４３５でのロイシンのメチオニンへの変異、位置Ｎ４５４でのアスパラギンのリジンへの変異、位置Ｎ４５４でのアスパラギンのアルギニンへの変異、および位置Ｍ６５１でのメチオニンのロイシンへの変異のうちの少なくとも１つを含む、変異体ＭＭＬＶ逆転写酵素と、そのパッケージング材料とを含む、キットを提供する。
【００３６】
本発明はまた、変異体ＭＭＬＶ逆転写酵素であって、この変異体が、Ｅ３０２Ｒ／Ｅ６９Ｋ／Ｗ３１３Ｆ／Ｌ４３５Ｇ／Ｎ４５４Ｋ；Ｅ３０２Ｒ／Ｗ３１３Ｆ／Ｌ４３５Ｇ／Ｎ４５４Ｋ；Ｅ３０２Ｒ／Ｗ３１３Ｆ／Ｌ４３５Ｇ；Ｅ３０２Ｒ／Ｅ６９Ｋ／Ｎ４５４Ｋ；Ｅ３０２Ｒ／Ｗ３１３Ｆ；およびＥ６９Ｋ／Ｅ３０２Ｒ／Ｗ３１３Ｆ／Ｌ４３５Ｇ／Ｎ４５４Ｋ／Ｄ５２４Ｎからなる群より選択される、変異体ＭＭＬＶ逆転写酵素と、そのパッケージング材料とを含む、キットを提供する。
【００３７】
１実施形態では、このキットの変異体逆転写酵素はＲＮａｓｅ  Ｈ活性を欠く。
【００３８】
別の実施形態では、このキットの変異体ＭＭＬＶ逆転写酵素は、Ｃ末端伸長をさらに含む。
【００３９】
別の実施形態では、このＣ末端伸長は、ＲＤＲＮＫＮＮＤＲＲＫＡＫＥＮＥ（配列番号１）である。
【００４０】
別の実施形態では、このキットの変異体逆転写酵素は、安定性の増大、正確性の増大、プロセッシビティーの増大、および特異性の増大のうちの少なくとも１つをさらに含む。
【００４１】
別の実施形態では、このキットは、真正細菌由来のεサブユニットをさらに含む。
【００４２】
別の実施形態では、このεサブユニットは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来である。
【００４３】
別の実施形態では、このεサブユニットは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来のε１８６である。
【００４４】
別の実施形態では、このキットは、ホルムアミド、ベタインまたはＤＭＳＯをさらに含む。
【００４５】
本発明はまた、ｃＤＮＡ合成のための方法であって、本発明の変異体逆転写酵素を準備する工程と；この変異体逆転写酵素と核酸テンプレートとを接触させてｃＤＮＡを合成する工程とを含む、方法を提供する。
【００４６】
本発明はまた、クローニングのための方法であって、本発明の変異体逆転写酵素を準備する工程と；この変異体逆転写酵素と核酸テンプレートとを接触させて合成ｃＤＮＡ産物を生成させる工程と、この合成されたｃＤＮＡ産物をクローニングベクターに挿入する工程とを含む、方法を提供する。
【００４７】
本発明はまた、ＲＴ−ＰＣＲのための方法であって、本発明の変異体逆転写酵素を準備する工程と；この変異体逆転写酵素と核酸テンプレートとを接触させてこの核酸テンプレートを複製および増幅する工程とを含む、方法を提供する。
【００４８】
１実施形態では、このＲＴ−ＰＣＲは、エンドポイントＲＴ−ＰＣＲを含む。
【００４９】
別の実施形態では、このＲＴ−ＰＣＲは、リアルタイムで行われる。
【００５０】
本発明はまた、ｃＤＮＡライブラリー構築のための方法であって、本発明の変異体逆転写酵素を準備する工程と；この変異体逆転写酵素と核酸テンプレートとを接触させて合成ｃＤＮＡ産物を生成させる工程と、この合成されたｃＤＮＡ産物をベクターに挿入する工程とを含む、方法を提供する。
【００５１】
本発明はまた、マイクロアレイを調製するための方法であって、本発明の変異体逆転写酵素を準備する工程と；この変異体逆転写酵素と核酸テンプレートとを接触させて合成ｃＤＮＡ産物を生成させる工程と、このｃＤＮＡ産物を基板に結合させる工程とを含む、方法を提供する。
【００５２】
（定義）
本明細書において用いる場合、「逆転写酵素活性（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）」および「逆転写（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）」とは、ある酵素が、ＲＮＡ鎖をテンプレートとして利用して、ＤＮＡ鎖（すなわち、相補的なＤＮＡまたはｃＤＮＡ）を合成する能力をいう。逆転写酵素活性は、例えば、実施例３に記載のように、適切な条件下、適切な緩衝液の存在下において、ＲＮＡテンプレートおよびデオキシヌクレオチドの存在下で、酵素をインキュベートすることによって測定され得る。
【００５３】
本明細書において用いる場合、「逆転写酵素（ＲＴ）」とは、その最も広い意味では、本明細書において開示されるかまたは当分野で公知の方法によって測定した場合、逆転写酵素活性を示す任意の酵素をいうために用いられる。従って、本発明の「逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）」とは、レトロウイルス、他のウイルス由来の逆転写酵素、ならびに、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｎｅ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼなどのような逆転写酵素活性を示すＤＮＡポリメラーゼを含む。レトロウイルス由来のＲＴとしては、限定はしないが、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）（Ｍ−ＭＬＶ）のＲＴ、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ）（ＨＩＶ）のＲＴ、トリ肉腫白血病ウイルス（Ａｖｉａｎ  Ｓａｒｃｏｍａ−Ｌｅｕｋｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）（ＡＳＬＶ）のＲＴ、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ  Ｓａｒｃｏｍａ  Ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）のＲＴ、トリ骨髄芽球症ウイルス（Ａｖｉａｎ  Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）（ＡＭＶ）のＲＴ、トリ（ニワトリ）赤芽球症ウイルス（Ａｖｉａｎ  Ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）（ＡＥＶ）ヘルパーウイルスＭＣＡＶのＲＴ、トリ骨髄球腫症ウイルス（Ａｖｉａｎ  Ｍｙｅｌｏｃｙｔｏｍａｔｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）ＭＣ２９ヘルパーウイルスＭＣＡＶのＲＴ、トリ細網内皮症ウイルス（Ａｖｉａｎ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）（ＲＥＶ−Ｔ）ヘルパーウイルスＲＥＶ−ＡのＲＴ、トリ肉腫ウイルス（Ａｖｉａｎ  Ｓａｒｃｏｍａ  Ｖｉｒｕｓ）ＵＲ２のヘルパーウイルスＵＲ２ＡＶのＲＴ、トリ肉腫ウイルスＹ７３のヘルパーウイルスＹＡＶのＲＴ、ラウス随伴ウイルス（Ｒｏｕｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ）（ＲＡＶ）のＲＴ、および骨髄芽球症随伴ウイルス（Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ）（ＭＡＶ）のＲＴが挙げられ、そして（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）米国特許出願第２００３／０１９８９４４号に記載されるとおりである。概説については、例えば、Ｌｅｖｉｎ，１９９７，Ｃｅｌｌ，８８：５−８；Ｂｒｏｓｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  １１：１６３−７９を参照のこと。ウイルス由来の公知の逆転写酵素は、ＲＮＡテンプレートからＤＮＡ転写物を合成するためにプライマーを必要とする。逆転写酵素は、主にＲＮＡをｃＤＮＡに転写するために用いられており、次いでこれがさらなる操作のためにベクターにクローニングされてもよいし、または種々の増幅方法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＮＡＳＢＡ法、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、または３ＳＲ法（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）において用いられてもよい。
【００５４】
本明細書において用いる場合、「逆転写活性（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）」および「逆転写酵素活性（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）」という用語は、交換可能に用いられ、ある酵素（例えば、逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼ）がＲＮＡ鎖をテンプレートとして利用してＤＮＡ鎖（すなわち、ｃＤＮＡ）を合成する能力をいう。ＲＴ活性を測定するための方法は、本明細書において以下に説明されており、そしてまた、当分野で周知である。例えば、Ｑｕａｎ−Ｔ−ＲＴアッセイシステムは、Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，Ｉ１１．）から市販されており、そしてＢｏｓｗｏｒｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９８９，３４１：１６７−１６８に記載されている。
【００５５】
本明細書において用いる場合、「増大した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」逆転写酵素活性という用語は、その野性型と比較した、変異体酵素（例えば、変異体逆転写酵素）の逆転写酵素活性のレベルをいう。変異体酵素は、その逆転写酵素活性のレベル（本明細書において記載されるかまたは当分野で公知の方法によって測定した場合）が、その野性型よりも少なくとも１０％以上大きい、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以上、または少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍もしくは１０倍以上大きい場合、「増大した」逆転写酵素活性を有するといわれる。
【００５６】
本発明の逆転写酵素とは、本明細書に記載の特性のうちの１つまたは組み合わせを有する任意の逆転写酵素を含む。このような特性としては、限定はしないが、安定性の増大、熱安定性の増強、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性の低下または除去、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性の低下、正確性の増大、プロセッシビティーの増大、特異性の増大および／または忠実度の増大が挙げられる。
【００５７】
「相補的な（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」とは、塩基対合を通じた、２つのポリヌクレオチド鎖の領域の間、または２つのヌクレオチドの間の配列相補性の広範な概念をいう。アデニンヌクレオチドが、チミンまたはウラシルであるヌクレオチドと特異的な水素結合（「塩基対合」）を形成し得ることが公知である。同様に、シトシンヌクレオチドは、グアニンヌクレオチドと塩基対合し得ることが公知である。
【００５８】
本明細書において用いる場合、「変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）」とは、ＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を変化させる、または親のまたは野性型のＤＮＡ配列へ導入される変化をいい、これには、限定はしないが、置換、挿入、欠失、ポイントミューテーション、複数のヌクレオチドまたはアミノ酸の変異、転位（ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）、逆位（ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ）、フレームシフト、ナンセンス変異、短縮、または、遺伝子もしくは遺伝子産物の野性型配列とはポリヌクレオチドもしくはタンパク質配列が異なる他の形態の異常が挙げられる。変異の結果としては、限定はしないが、親のＤＮＡによってコードされるタンパク質に見出されない新規な特徴、特性、機能または形質の作成が挙げられ、これには、限定はしないが、Ｎ末端短縮、Ｃ末端短縮または化学的修飾が挙げられる。「変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）」はまた、Ｎ末端またはＣ末端の伸長を含む。
【００５９】
本発明は、詳細には、変異体または修飾された逆転写酵素であって、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、１０、１２、１５、２０など）のアミノ酸が変異しており、これが、未変異または未修飾の逆転写酵素に比較して、酵素を核酸合成においてより安定にさせる逆転写酵素に関する。当業者によって理解されるとおり、特定されたアミノ酸のうちの１つ以上が、１つもしくは多数のアミノ酸残基を欠失しても、および／または１つもしくは多数のアミノ酸残基で置換されてもよい。好ましい態様では、アミノ酸のうち任意の１つ以上が、任意の１つ以上のアミノ酸残基、例えば、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、および／またはＶａｌで置換されてもよい。
【００６０】
本発明の逆転写酵素は、以下の特性のうちの２つ以上を有してもよい。（ａ）上昇した温度での安定性の増大または半減期の増大；（ｂ）減少した、実質的に減少した、または検出不能なＲＮａｓｅ  Ｈ活性、（ｃ）減少したまたは実質的に減少した末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性、（ｄ）正確性の増大、（ｅ）特異性の増大、（ｆ）プロセッシビティーの増大、および／または（ｄ）忠実度の増大。ある実施形態では、本発明の逆転写酵素は、上記で列挙される複数の特性を有してもよい（例えば、逆転写酵素は、熱安定性の増強、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性の減少、および正確性の増強を有し得る）。本発明の逆転写酵素は、以下の特性のうちの１つ以上を有してもよい。（ａ）上昇した温度での熱安定性の増大または半減期の増大；（ｂ）減少した、実質的に減少した、または検出不能なＲＮａｓｅ  Ｈ活性、（ｃ）減少したまたは実質的に減少した末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性、および／または（ｄ）忠実度の増大。
【００６１】
「野性型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）」という用語は、遺伝子または遺伝子産物であって、天然に存在する供給源から単離された場合、その遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する遺伝子または遺伝子産物をいう。対照的に、「改変された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）」または「変異体（ｍｕｔａｎｔ）」という用語は、野性型の遺伝子または遺伝子産物に比較した場合、変更された特徴を提示する遺伝子または遺伝子産物をいう。例えば、本発明における変異体ＤＮＡポリメラーゼは、減少したウラシル検出活性を示すＤＮＡポリメラーゼである。
【００６２】
本明細書において用いる場合、野性型酵素に比較した場合、「増大した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」とは、１０％より大きい（例えば、１１％、１２％、１３％、１４％  １５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％以上）ことをいう。「増大した」とはまた、野性型酵素に比較した場合、少なくとも２倍より大きい（例えば、３、４、５、１０、２０、５０、１００、１０００、１０，０００倍以上）ことをいう。
【００６３】
本明細書において用いる場合、「安定な（ｓｔａｂｌｅ）」とは、同一の変性条件に供された野性型酵素の活性に比較した場合、より高温（例えば、３７℃より大きい（例えば、３８、３９、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５℃以上）を含むがこれに限定されない変性条件のもとで、またはＤＭＳＯもしくはホルムアミドまたはベタインを含むがこれに限定されない、変性剤の存在下で、本明細書に規定されるような、増大した活性を示すことをいう。
【００６４】
本明細書において用いる場合、「安定な（ｓｔａｂｌｅ）」とは、本明細書に規定されるような「熱安定性な（の）（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ）」を含む。
【００６５】
本明細書において用いる場合、「熱安定性な、熱安定性の」とは、熱による不活性化に抵抗性である酵素をいう。「熱安定性な（の）」とはまた、例えば、同様の活性を有する酵素の熱安定性でない型と比較した場合、熱に対して、好ましくは約３８〜１００℃の間、例えば、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００℃およびより好ましくは、約４０〜８０℃（例えば、４０、４１、４２、４３、４４、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０℃）程度の大きさの温度で、安定でかつ活性である酵素をいう。熱安定性は以下にさらに定義される。
【００６６】
１実施形態では、本発明は、改変または変異した逆転写酵素であって、上昇した温度、すなわち３７℃よりより大きい温度で、対応する未修飾のまたは未変異の逆転写酵素よりも大きい半減期を有する逆転写酵素活性を有する、改変または変異した逆転写酵素を提供する。ある実施形態では、本発明の逆転写酵素の半減期は、５０℃で５分以上、そして好ましくは１０分以上であってもよい。ある実施形態では、本発明の逆転写酵素は、約２５分以上、好ましくは約５０分以上、さらに好ましくは、約１００分以上、そして最も好ましくは、約２００分以上の半減期（例えば、５０℃で）を有し得る。
【００６７】
ある実施形態では、本発明の逆転写酵素は、約１０分〜約２００分、約１０分〜約１５０分、約１０分〜約１００分、約１０分〜約７５分、約１０分〜約５０分、約１０分〜約４０分、約１０分〜約３０分、または約１０分〜約２０分という５０℃での半減期を有し得る。
【００６８】
本発明の変異または改変された逆転写酵素は、対応する未変異のまたは未修飾の逆転写酵素の逆転写酵素活性よりも５５℃でより長い半減期を有する逆転写酵素活性（例えば、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性）を有し得る。５５℃では、本発明の変異した、または修飾された逆転写酵素の逆転写酵素活性の半減期は、約２分より大きくても、約３分より大きくても、約４分より大きくても、約５分より大きくても、約６分より大きくても、約７分より大きくても、約８分より大きくても、約１０分より大きくても、約１５分より大きくても、約２０分より大きくても、または約３０分より大きくてもよい。５５℃では、本発明の逆転写酵素の逆転写酵素活性の半減期は、約２分〜約６０分、約２分〜約４５分、約２分〜約３０分、約２分〜約２０分、約２分〜約１５分、約２分〜約１０分、約２分〜約８分、約２分〜約７分、約２分〜約６分、約２分〜約５分、約２分〜約４分、または約２分〜約３分であってもよい。
【００６９】
本発明の逆転写酵素は、他の逆転写酵素よりも高い温度でより多くの生成物（例えば、全長生成物）を生成し得る。１態様では、全長生成物合成の比較は、異なる温度で行われる（例えば、１方の温度は低く、例えば、３７℃〜５０℃で、そして一方の温度は高く、例えば、５０℃〜７８℃で）が、全ての他の反応条件は類似または同じで維持する。生成される全長生成物の量は、当分野で周知の技術を用いて、例えば、第一の温度（例えば、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃など）での逆転写酵素反応を行うこと、および生成される全長転写物の量を決定すること、第一の温度よりも高い温度（例えば、４５℃、５０℃、５２．５℃、５５℃など）で第二の逆転写酵素反応を行うこと、および生成される全長生成物の量を決定すること、および２つの温度で生成された量を比較することによって決定され得る。好都合な比較の形態は、第二（すなわち、上昇した）温度で生成される第一の温度での全長生成物の量の割合を決定することである。２つの反応物に用いられる反応条件（例えば、塩濃度、緩衝液濃度、ｐＨ、二価金属イオン濃度、ヌクレオシド三リン酸濃度、テンプレート濃度、逆転写酵素濃度、プライマー濃度、行われる反応時間の長さなど）は好ましくは、両方の反応に同じである。適切な反応条件としては、限定はしないが、約１ｎＭ〜約ｌμＭ、約１００ｎＭ〜１μＭ、約３００ｎＭ〜約７５０ｎＭ、または約４００ｎＭ〜約６００ｎＭのテンプレート濃度、そして約１ｎＭ〜約１μＭ、約１０ｎＭ〜５００ｎＭ、約５０ｎＭ〜約２５０ｎＭ、または約７５ｎＭ〜約１２５ｎＭの逆転写酵素濃度が挙げられる。逆転写酵素の濃度に対するテンプレートの濃度の比は、約１００：１〜約１：１、約５０：１〜約１：１、約２５：１〜約１：１、約１０：１〜約１：１、約５：１〜約１：１、または約２．５：１〜１：１であり得る。反応は、約５分〜約５時間、約１０分〜約２．５時間、約３０分〜約２時間、約４５分〜約１．５時間、または約４５分〜約１時間行われ得る。適切な反応時間は約１時間である。他の適切な反応条件は、慣用的な技術を用いて当業者によって決定され得、そしてこのような条件の例は下に提供される。
【００７０】
上昇した温度で本発明の逆転写酵素によって生成した全長生成物の量を、低温で同じ逆転写酵素によって生成した全長生成物の量に比較した場合、高温では、本発明の逆転写酵素は、低温で生成された全長生成物の量の約２５％、３５％、４５％、５５％、６５％、７５％、８５％、９５％、１００％以上生成され得る。ある場合には、本発明の逆転写酵素は、より低温で逆転写酵素によって生成された全長生成物の量よりも大きい高温での全長生成物の量を生成し得る（例えば、１％〜約１００％以上）。１態様では、本発明の逆転写酵素は、より高温で作成される全長生成物の量に比較して、より低温で全長生成物のほぼ同じ量（例えば、２５％以下の相違）を生成する。
【００７１】
本発明の逆転写酵素は、ある量の全長生成物を合成する逆転写酵素であってもよく、５０℃で合成されたこの全長生成物の量は、４０℃で合成する全長生成物の量の１０％以上（例えば、約１０％〜約９５％、約１０％〜約８０％、約１０％〜約７０％、約１０％〜約６０％、約１０％〜約５０％、約１０％〜約４０％、約１０％〜約３０％、または約１０％〜約２０％）である。ある実施形態では、本発明の逆転写酵素は、５０℃で合成される全長生成物の量が、４０℃で合成する全長生成物の量の５０％以上（例えば、約５０％〜約９５％、約５０％〜約８０％、約５０％〜約７０％、または約５０％〜約６０％）である、逆転写酵素である。いくつかの実施形態では、本発明の逆転写酵素は、５０℃で合成される全長生成物の量が、４０℃で合成する全長生成物の量の７５％以上（例えば、約７５％〜約９５％、約７５％〜約９０％、約７５％〜約８５％、または約７５％〜約８０％）である、逆転写酵素である。他の実施形態では、本発明の逆転写酵素は、５０℃で合成される全長生成物の量が、４０℃で合成する全長生成物の量の８５％以上（例えば、約８５％〜約９５％、または約８５％〜約９０％）である、逆転写酵素である。
【００７２】
本発明の逆転写酵素は、ある量の全長生成物であって、５２．５℃で合成される全長生成物の量が、４０℃で合成する全長生成物の量の１０％以上（例えば、約１０〜約３０％、約１０％〜約２５％、約１０％〜約２０％、約１０％〜約１５％、約２０％〜約６０％、約２０％〜約４０％、約２０％〜約３０％、約３０％〜約８０％、約３０％〜約６０％、約３０％〜約４５％、約４０％〜約９０％、約４０％〜約８０％、約４０％〜約６０％、約４０％〜約５０％、約５０％〜約９０％、または約５０％〜約７０％）である量の全長生成物を合成する逆転写酵素であってもよい。ある実施形態では、５２．５℃で合成される全長生成物の量は、４０℃で合成する全長生成物の量の３０％以上（例えば、約３０％〜約７０％、約３０％〜約６０％、約３０％〜約５０％、または約３０％〜約４０％）である。ある実施形態では、５２．５℃で合成される全長生成物の量は、４０℃で合成される全長生成物の量の５０％以上（例えば、約５０％〜約７０％、約５０％〜約６５％、約５０％〜約６０％、または約５０％〜約５５％）である。
【００７３】
本発明の逆転写酵素は、ある量の全長生成物であって、５５℃で合成される全長生成物の量が、４０℃で合成する全長生成物の量の１％以上（例えば、約１％〜約３０％、約１０％〜約２５％、約１％〜約２０％、約１％〜約１５％、約１％〜約１０％、または約１％〜約５％）である量の全長生成物を合成する逆転写酵素であってもよい。ある実施形態では、５５℃で合成される全長生成物の量は、４０℃で合成する全長生成物の量の５％以上（例えば、約５％〜約３０％、約５％〜約２５％、約５％〜約２０％、約５％〜約１５％、または約５％〜約１０％）である。ある実施形態では、５５℃で合成される全長生成物の量は、４０℃で合成する全長生成物の量の１０％以上（例えば、約１０％〜約３０％、約１０％〜約〜約２５％、約１０％〜約２０％、約１０％〜約１５％、約２０％〜約６０％、約２０％〜約４０％、約２０％〜約３０％、約３０％〜約８０％、約３０％〜約６０％、約３０％〜約４５％、約４０％〜約９０％、約４０％〜約８０％、約４０％〜約６０％、約４０％〜約５０％、約５０％〜約９０％、または約５０％〜約７０％）である。
【００７４】
別の態様では、本発明の逆転写酵素は、対応する非変異または未改変の逆転写酵素（例えば、コントロールの逆転写酵素）と比較して、１つまたは多数の上昇した温度（代表的には４０℃〜７８℃）で、より多くの核酸生成物（例えば、ｃＤＮＡ）および好ましくはより多くの全長生成物を生成し得る。このような比較は代表的には、同様のまたは同じ反応条件下で行い、そしてコントロールの逆転写酵素によって合成される生成物の量を、本発明の逆転写酵素によって合成された生成物の量に比較する。好ましくは、本発明の逆転写酵素は、同じ反応条件および温度のもとで、対応するコントロールの逆転写酵素に比較して、少なくとも約５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、または少なくとも２００％多くの生成物または全長生成物を生成する。本発明の逆転写酵素は好ましくは、同じ反応条件およびインキュベーション温度のもとで、コントロールの逆転写酵素に比較して、約１０％〜約２００％、約２５％〜約２００％、約５０％〜約２００％、約７５％〜約２００％、または約１００％〜約２００％多くの生成物または全長生成物を生成する。本発明の逆転写酵素は好ましくは、同じ反応条件および温度のもとで、コントロールの逆転写酵素（例えば、対応する未変異または未修飾の逆転写酵素）に比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも７５倍、少なくとも１００倍、少なくとも１５０倍、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも５，０００倍、または少なくとも１０，０００倍多くの生成物または全長生成物を生成する。本発明の逆転写酵素は好ましくは、同じ反応条件および温度のもとで、コントロールの逆転写酵素よりも、２〜１０，０００倍、５〜１０，０００倍、１０〜５，０００倍、５０〜５，０００倍、５０〜５００倍、２〜５００倍、５〜５００倍、５〜２００倍、５〜１００倍、または５〜７５倍多くの生成物または全長生成物を生成する。
【００７５】
１態様では、本発明の逆転写酵素は、５０℃で、コントロールの逆転写酵素（これは好ましくは対応する野性型逆転写酵素である）よりも、少なくとも２５％以上、より好ましくは少なくとも５０％以上、そしてより好ましくは少なくとも１００％以上の核酸生成物または全長生成物を生成する。別の態様では、５２．５℃で、本発明の逆転写酵素は、コントロールの逆転写酵素に比較して少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍の量の核酸生成物または全長生成物を生成する。別の態様では、５５℃で、本発明の逆転写酵素は、コントロールの逆転写酵素に比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも７５倍、少なくとも１００倍の量の核酸生成物または全長生成物を生成する。このような比較は好ましくは、同じ反応条件および温度のもとで行われる。
【００７６】
本発明の改変または変異された逆転写酵素は、対応する未修飾または未変異の逆転写酵素に比較した場合、上昇した温度で熱安定性の増大を有し得る。それらは、ＲＮＡテンプレートの有無において、熱安定性の増大を示し得る。ある場合には、本発明の逆転写酵素は、ＲＮＡテンプレートの有無に関わらず、熱安定性の増大を示し得る。当業者は、逆転写酵素が代表的には、ＲＮＡテンプレートの存在下において、より熱安定性であるということを理解する。熱安定性の増大は、対応する未改変または未変異の逆転写酵素のパラメーターに対して、本発明における修飾されるかまたは変異された逆転写酵素の適切なパラメーターを比較することによって測定され得る。比較するための適切なパラメーターとしては、限定はしないが、同じ温度で対応する未修飾または未変異の逆転写酵素によって合成される生成物および／または全長生成物の量に比較した、上昇した温度で修飾または変異された逆転写酵素によって合成される生成物および／または全長生成物の量、ならびに／あるいは対応する未修飾または未変異の逆転写酵素の半減期に比較した、上昇した温度での修飾または変異された逆転写酵素の上昇した温度での逆転写酵素活性の半減期が挙げられる。
【００７７】
本発明の修飾されるかまたは変異された逆転写酵素は、例えば、対応する未変異のまたは未修飾の逆転写酵素に比較して、５０℃で少なくとも約１．５倍（例えば、約１．５倍〜約１００倍、約１．５倍〜約５０倍、約１．５倍〜約２５倍、約１．５倍〜約１０倍）という熱安定性の増大を有してもよい。本発明の逆転写酵素は、例えば、対応する未変異のまたは未改変の逆転写酵素に比較して、５０℃で少なくとも約１０倍（例えば、約１０倍〜約１００倍、約１０倍〜約５０倍、約１０倍〜約２５倍、または約１０倍〜約１５倍）という熱安定性の増大を有してもよい。本発明の逆転写酵素は、対応する未変異のまたは未改変の逆転写酵素に比較して、５０℃で少なくとも約２５倍（例えば、約２５倍〜約１００倍、約２５倍〜約７５倍、約２５倍〜約５０倍、または約２５倍〜約３５倍）という熱安定性の増大を有してもよい。
【００７８】
本発明はまた、改変されたまたは変異された熱安定性の逆転写酵素であって、例えば、対応する未変異のまたは未改変の逆転写酵素に比較して、５２．５℃で約１．５倍（例えば、約１．５倍〜約１００倍、約１．５倍〜約５０倍、約１．５倍〜約２５倍、または約１．５倍〜約１０倍）という熱安定性の増大を有する逆転写酵素を意図する。本発明の逆転写酵素は、例えば、対応する未変異のまたは未改変の逆転写酵素に比較して、５２．５℃で少なくとも約１０倍（例えば、約１０倍〜約１００倍、約１０倍〜約５０倍、約１０倍〜約２５倍、または約１０倍〜約１５倍）という熱安定性の増大を有してもよい。本発明の逆転写酵素は、例えば、対応する未変異のまたは未改変の逆転写酵素に比較して、５２．５℃で少なくとも約２５倍（例えば、約２５倍〜約１００倍、約２５倍〜約７５倍、約２５倍〜約５０倍、または約２５倍〜約３５倍）という熱安定性の増大を有してもよい。
【００７９】
他の実施形態では、本発明は、逆転写酵素であって、対応する未変異のまたは未改変の逆転写酵素に比較して、５５℃で約１．５倍より大きい（例えば、約１．５倍〜約１００倍、約１．５倍〜約５０倍、約１．５倍〜約２５倍、または約１．５倍〜約１０倍）という熱安定性の増大を有する逆転写酵素を提供する。ある実施形態では、本発明の逆転写酵素は、対応する未変異のまたは未改変の逆転写酵素に比較して、５５℃で少なくとも約１０倍（例えば、約１０倍〜約１００倍、約１０倍〜約５０倍、約１０倍〜約２５倍、または約１０倍〜約１５倍）という熱安定性の増大を有してもよい。ある実施形態では、本発明の逆転写酵素は、対応する未変異のまたは未改変の逆転写酵素に比較して、５５℃で少なくとも約２５倍（例えば、約２５倍〜約１００倍、約２５倍〜約７５倍、約２５倍〜約５０倍、または約２５倍〜約３５倍）という熱安定性の増大を有してもよい。
【００８０】
本発明のこの態様に従う逆転写酵素に適した核酸テンプレートとしては、任意の核酸分子または核酸分子の集団（好ましくは、ＲＮＡそして最も好ましくはｍＲＮＡ）、特に細胞または組織由来のものが挙げられる。特定の態様では、ｍＲＮＡ分子の集団（代表的には、特定の細胞または組織タイプから得られる、多数の異なるｍＲＮＡ分子）を用いて、本発明に従ってｃＤＮＡライブラリーを作製する。核酸テンプレートの細胞供給源の例としては、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞および動物細胞が挙げられる。
【００８１】
本明細書において用いる場合、「Ｃ末端伸長（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）」とは、ランダム配列のペプチドテール（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔａｉｌ）の付加をいう。Ｃ末端伸長は好ましくは、１〜５００個のアミノ酸、より好ましくは１〜１００個のアミノ酸、そして最も好ましくは２〜５０アミノ酸である。
【００８２】
本明細書において用いる場合、「ランダム（ｒａｎｄｏｍ）」とは、アミノ酸配列に関して、その配列の各々のアミノ酸が等しい出現確率を有するアミノ酸配列を意味する。
【００８３】
本明細書において用いる場合、「ＲＮａｓｅ  Ｈ活性（ＲＮａｓｅ  Ｈ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）」とは、２〜９塩基長である５’リン酸塩終止オリゴヌクレオチドを生成するためのＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡのエンドリボヌクレアーゼ分解をいう。ＲＮａｓｅ  Ｈ活性とは、一本鎖核酸、二重鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＲＮＡの分解は含まない。
【００８４】
本明細書において用いる場合、「ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を実質的に欠く（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｌａｃｋｓ  ＲＮａｓｅ  Ｈ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）」という句は、野性型酵素の活性の１０％、５％、１％、０．５％、または０．１％未満を有することを意味する。「ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を欠く（ｌａｃｋｉｎｇ  ＲＮａｓｅ  Ｈ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）」という句は、検出不能なＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有するか、または野性型酵素のＲＮａｓｅ  Ｈ活性の約１％、０．５％、または０．１％未満を有することを意味する。
【００８５】
ＲＮａｓｅ  Ｈ活性が「低下した（ｒｅｄｕｃｅｄ）」酵素とは、この酵素が、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を含有する対応する野性型酵素のＲＮａｓｅ  Ｈ活性の５０％未満、例えば、４０％未満、３０％、または２５％未満、２０％、より好ましくは１５％未満、１０％未満、または７．５％未満、そして最も好ましくは５％未満または２％未満を有することを意味する。酵素のＲＮａｓｅ  Ｈ活性は、種々のアッセイによって、例えば、その全ての開示が参照によって本明細書に全体に組み込まれる、米国特許第５，４０５，７７６号；同第６，０６３，６０８号；同第５，２４４，７９７号；および同第５，６６８，００５号において、Ｋｏｔｅｗｉｃｚ，Ｍ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：２６５（１９８８）およびＧｅｒａｒｄ，Ｇ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，ＦＯＣＵＳ  １４（５）：９１（１９９２）において記載されるアッセイによって決定され得る。
【００８６】
本明細書において用いる場合、「プロセッシビティー（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）」とは、核酸を修飾する酵素、例えば逆転写酵素核酸が、テンプレートまたは基板に結合したまま残り、そして複数の修飾反応を行う能力をいう。「修飾反応、改変反応（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）」とは、限定はしないが、合成を含む。「プロセッシビティー」とはまた、核酸を修飾する酵素、例えば逆転写酵素が、成長しているＤＮＡ鎖からの酵素の解離を中断することなく一連の工程を行う能力もいう。「プロセッシビティー」は、核酸を修飾する酵素の性質、核酸テンプレートの配列、および反応条件、例えば、塩濃度、温度または特定のタンパク質の存在に依存し得る。
【００８７】
本明細書において用いる場合、「プロセッシビティーの増大（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）」とは、野性型の逆転写酵素に比較した場合、５〜１０％の増大、好ましくは１０〜５０％、より好ましくは５０〜１００％以上の増大をいう。プロセッシビティーおよびプロセッシビティーの増大は、Ｍａｌｂｏｅｕｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３０：１０７４に記載されるように測定され得る。
【００８８】
本明細書において用いる場合、「正確性（ａｃｃｕｒａｃｙ）」とは、本明細書において下に規定される「忠実度（ｆｉｄｅｌｉｔｙ）」をいう。正確性または忠実度は、その全体が本明細書において参照によって組み込まれる、米国特許出願第６０／５５９，８１０号および同第１１，１００，１８３号に記載されるとおり測定され得る。
【００８９】
本明細書において用いる場合、「特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）」とは、同一の条件下で行う野性型逆転写酵素によるミスプライミングの量に比較して、より高温で反応が行われる場合の、逆転写酵素によるミスプライミングの量の減少をいう。特異性は、Ｍｉｚｕｎｏ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９９，２７：１３４５−１３４９に記載のとおり測定され得る。
【００９０】
本明細書において用いる場合、「減少する、低下する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」とは、同一の条件下で行う野性型酵素よりも、少なくとも１倍以上、例えば、１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０００倍以上小さいことをいう。「減少する、低下する」とはまた、同一の条件下で行う野性型酵素よりも少なくとも５％以上、（例えば、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９９、１００％）小さいことをいう。
【００９１】
「忠実度（ｆｉｄｅｌｉｔｙ）」という用語は、本明細書において用いる場合、逆転写酵素またはテンプレート依存性のＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性のＤＮＡポリメラーゼによるヌクレオチド合成の正確性をいう。逆転写酵素を含むＤＮＡポリメラーゼの忠実度は、誤りの率（ｅｒｒｏｒ  ｒａｔｅ）（不正確なヌクレオチド、すなわち、テンプレート依存性の方式で組み込まれないヌクレオチドを組み込む頻度）によって測定される。ＤＮＡ重合化の正確性または忠実度は、ポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の両方によって維持される。「高い忠実度（ｈｉｇｈ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ）」という用語は、１塩基対あたり３３×１０-6以下という誤り率をいう（全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｒｏｂｅｒｔｓ  Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８，２４２：１１７１−１１７３を参照のこと）。ＤＮＡポリメラーゼの忠実度または誤り率は、当分野で公知のアッセイを用いて測定され得る（例えば、Ｌｕｎｄｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１  Ｇｅｎｅ，１０８：１−６を参照のこと）。
【００９２】
「忠実度の増大（または増強または上昇）（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ（ｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｏｒ  ｈｉｇｈｅｒ）ｆｉｄｅｌｉｔｙ）」を有する逆転写酵素は、その野性型または未修飾型に比較して忠実度のなんらかの増大をともなう、すなわち、所与の長さの任意の所与の核酸分子の合成の間に誤って組み込まれるヌクレオチドの数が減少している、変異体または改変された逆転写酵素（逆転写酵素活性を示すＤＮＡポリメラーゼを含む）として規定される。好ましくは、所与の長さの任意の所与の核酸分子の合成の間に誤って組み込まれるヌクレオチドの数の１．５〜１，０００倍（より好ましくは２〜１００倍、より好ましくは３〜１０倍）の減少がある。例えば、変異した逆転写酵素は、１０００塩基のサイズのセグメントで１０ヌクレオチドを誤って組み込む未変異の逆転写酵素に比較して、同じサイズの１０００塩基の核酸分子セグメントの合成において１ヌクレオチドを誤って組み込み得る。このような変異体逆転写酵素は、忠実度において１０倍の増大を有するといわれる。
【００９３】
本明細書において用いる場合、「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）」、「ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」および「オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」という用語は、検出されるべきプライマー、プローブおよびオリゴマーのフラグメントをいい、そしてポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有する）に、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含有する）に、そして任意の他のタイプのポリヌクレオチドであって、プリンもしくはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるか、または修飾されたプリンもしくはピリミジン塩基（脱塩基部位を含む）であるポリヌクレオチドに一般的である。「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語の間で長さの区別は意図しておらず、これらの用語は交換可能に用いられる。これらの用語は、分子の一次構造のみをいう。従って、これらの用語は、二本鎖および一本鎖のＤＮＡ、ならびに二本鎖および一本鎖のＲＮＡを含む。
【００９４】
本明細書において用いる場合、「ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」とは、塩基−糖−リン酸塩の組み合わせをいう。ヌクレオチドは、核酸配列（ＤＮＡおよびＲＮＡ）の単量体単位であり、そしてデオキシリボヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡに「組み込まれる（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）」。ヌクレオチドという用語は、限定はしないが、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、またはその誘導体を含む。このような誘導体としては、例えば、［ａＳ］ｄＡＴＰ、７−デアザ（ｄｅａｚａ）−ｄＧＴＰ、７−デアザ−ｄＡＴＰ、アミノ−アリルｄＮＴＰ、蛍光標識ｄＮＴＰが挙げられ、これにはＣｙ３、Ｃｙ５標識ｄＮＴＰが挙げられる。本明細書において用いる場合、ヌクレオチドという用語はまた、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰおよび非環式ヌクレオチド）およびそれらの誘導体（例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：１２７１−１２７４に記載される）を指す。
【００９５】
本明細書において用いる場合、「プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）」とは、少なくとも３つのヌクレオチドを含むデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの配列をいう。一般には、このプライマーは、約３〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約５〜約５０ヌクレオチド、そしてさらにより好ましくは約５〜約２５ヌクレオチドを含む。５０ヌクレオチド未満を有するプライマーはまた本明細書において、「オリゴヌクレオチドプライマー（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｉｍｅｒ）」とも呼ばれる。本発明のプライマーは、例えば、ヌクレオチドの段階的な付加によって、合成的に生成されてもよいし、または、他のヌクレオチド酸分子のフラグメント、一部、部分または伸長生成物であってもよい。「プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）」という用語は、任意の長さのヌクレオチドであってその最も一般的な意味で用いられ、増幅目的で用いられた場合、ＲＮＡまたはＤＮＡテンプレートのいずれかを用いて、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成の開始のための遊離の３’ヒドロキシル基を提供し得る。ＤＮＡ合成は、プライマーの伸長を生じて、プライマーがハイブリダイズする核酸鎖に対して相補的であるプライマー伸長生成物を生成する。
【００９６】
本明細書において用いる場合、「相同性、ホモロジー（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」という用語は、アルゴリズムのコンピューター実行によって行われ得る、配列（ヌクレオチドまたはアミノ酸のいずれか）の最適のアラインメントをいう。例えば、ポリヌクレオチドに関して「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」とは、デフォールトパラメーターを用いるＢＬＡＳＴＮバージョン２．０での分析によって決定され得る。ポリペプチド（すなわち、アミノ酸）に関して「相同性」とは、デフォールトパラメーターを用いるＢＬＡＳＴＰバージョン２．２のようなプログラムを用いて決定され得、ここでは比較されるポリペプチドまたはフラグメントを整列して、それらの間のアミノ酸の同一性または類似性の程度を決定する。アミノ酸「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」とは、保存的置換、すなわち、同様の特徴の別のアミノ酸によってポリペプチド中の所与のアミノ酸を置換する置換を含むことが理解される。代表的には、保存的置換ととられるのは、以下の置換である。脂肪族アミノ酸、例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの別の脂肪族アミノ酸での置換；ＳｅｒのＴｈｒでの置換、または逆も同様；酸性残基、例えば、ＡｓｐまたはＧｌｕの別の酸性残基での置換；ＡｓｎまたはＧｌｎのようなアミド基を保有する残基の、アミド基を保有する別の残基での置換；塩基性残基、例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇの別の塩基性残基での置換；ならびに芳香族残基、例えばＰｈｅまたはＴｙｒの別の芳香族残基での置換。それぞれ、別のアミノ酸配列もしくは別の核酸配列に対して少なくとも５０％の相同性を含む、ポリペプチド配列（すなわち、アミノ酸配列）またはポリ核酸配列は、５０％、または５０％を超える、例えば、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％（すなわち同一）の相同性を含む。
【００９７】
「Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩＩ  ｈｏｌｏｅｎｚｙｍｅ）」という用語は、例えば、Ｋｅｌｍａｎ，Ｚ．＆Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ｍ．（１９９５）．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４，１７１２００（全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されるような、２つの触媒コア、２つのスライドクランプおよびクランプローダーでアセンブルされる１０個のサブユニットから構成されるＥ．ｃｏｌｉのポリメラーゼＩＩＩホロ酵素をいう。
【００９８】
本発明による「イプシロン（ε）サブユニット（ｅｐｓｉｌｏｎ（ε）ｓｕｂｕｎｉｔ）」という用語は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するεサブユニットをいう。εサブユニットは、任意の真正細菌由来、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来、または他の生物体由来であってもよい。Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素のイプシロン（ε）サブユニットは、ホロ酵素の３’−５’エキソヌクレアーゼであって、α（ポリメラーゼユニット）およびθ（機能は未知）サブユニットと相互作用する（例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｆｉｊａｌｋｏｗｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：２８５６−２８６１を参照のこと）。Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素のイプシロン（ε）サブユニット（図９を参照のこと）は、ｄｎａＱ遺伝子によってコードされる（図９を参照のこと）。本発明のεサブユニットはまた、図９に提示される配列に対して少なくとも５０％相同性（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、または同一）である野性型ポリペプチドを含み、そして３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を含有する。本発明によるイプシロン（ε）サブユニットはさらに、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を依然として含有する変異体イプシロン（ε）サブユニットを含む。このような変異体εは、野性型εサブユニットに対して、欠失（例えば、短縮）、置換、ポイントミューテーション、複数のアミノ酸の変異、または挿入を含んでもよい。例えば、本発明によって有用な短縮εは、例えば、全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｈａｍｄａｎ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００２，４１：５２６６−５２７５に開示されるとおりであり得る。
【００９９】
本明細書において用いる場合、「ε１８６（ｅｐｓｉｌｏｎ  １８６）」とは、前出のＨａｍｄａｎらに開示されるような、εサブユニット（ｄｎａＱのコドン２−１８６）のＮ末端ドメインをいう。
【０１００】
「θεサブユニット複合体（θε  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｃｏｍｐｌｅｘ）」または「θεｌ８６サブユニット複合体（θεｌ８６  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｃｏｍｐｌｅｘ）」という用語は、Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素のθサブユニットと組み合わせた、Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素のεサブユニットまたは変異体εサブユニット（例えば、ε１８６）の組み合わせをいう。
【０１０１】
本明細書において用いる場合、「真正細菌（ｅｕｂａｃｔｅｒｉａ）」という用語は、原核生物である単細胞性生物体をいう（例えば、Ｇａｒｒｉｔｙ，ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｏｕｔｌｉｎｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｃａｒｙｏｔｉｃ  ｇｅｎｅｒａ．Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ（登録商標）ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，第２版．Ｒｅｌｅａｓｅ  １．０，Ａｐｒｉｌ  ２００１において、そしてＷｅｒｒｅｎ，１９９７，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ  ４２：５８７−６０９において記載されるとおり）。真正細菌としては、以下の属が挙げられる。エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、ミクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、スタヒロコッカス（ブドウ球菌）属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、乳酸桿菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｃｉｌｕｓ）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、など（Ｋａｎｄｌｅｒ，Ｏ．，Ｚｂｌ．Ｂａｋｔ．Ｈｙｇ．，ＩＡｂｔ．Ｏｒｉｇ．Ｃ３，１４９  １６０（１９８２）を参照のこと）、ならびに真正細菌の主な小集団、例えば、Ａｑｕｉｆｅｘ（極めて好熱性の化学合成無機栄養生物）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ、（極めて好熱性の化学合成有機栄養生物）、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ（好熱性の光合成細菌）、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ（放射線耐性菌）、Ｔｈｅｒｍｕｓ（好熱性の化学合成従属栄養生物）、スピロヘータ（Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ）（鞭毛がある螺旋状の細菌）、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）（グラム陰性でかつ紫色の光合成細菌）、シアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）（青−緑色の光合成細菌）、グラム陽性（グラム陽性の細菌）、バクテロイデス属／フラボバクテリウム属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ／Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（滑走運動性のある偏性嫌気性生物／偏性好気性生物）、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ（光独立栄養のイオウ酸化生物）、プランクトミセス（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｓ）（ペプチドグリカンのない出芽細菌）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）（細胞内寄生生物）。真正細菌としては、全ての熱安定性の細菌が挙げられる。
【０１０２】
本明細書において用いる場合、「合成（ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」とは、テンプレートに依存した方式で、ポリヌクレオチドの新規な鎖を作製するか、または既存のポリヌクレオチド（すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を伸長させるための任意のインビトロの方法をいう。本発明による合成とは、ポリメラーゼの使用によってポリヌクレオチドテンプレート配列のコピーの数を増大する、増幅を含んでもよい。ポリヌクレオチド合成によって、ヌクレオチドのポリヌクレオチド（すなわちプライマー）への組み込みが生じ、これによって、ポリヌクレオチドテンプレートに相補的な新規なポリヌクレオチド分子が形成される。この形成されたポリヌクレオチド分子およびそのテンプレートは、さらなるポリヌクレオチド分子を合成するためのテンプレートとして用いられ得る。
【０１０３】
本明細書において用いる場合、「増幅産物、増幅生成物（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ）」とは、増幅反応の終わりの一本鎖または二本鎖のポリヌクレオチド集団をいう。この増幅生成物は、増幅反応の間にポリヌクレオチドテンプレートを用いてＤＮＡポリメラーゼによって合成された、もとのポリヌクレオチドテンプレートおよびポリヌクレオチドを含む。好ましくは増幅された生成物は、逆転写酵素および／またはＤＮＡポリメラーゼによって生成される。
【０１０４】
本明細書において用いる場合、「ポリヌクレオチドテンプレート（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｅｍｐｌａｔｅ）」または「標的ポリヌクレオチドテンプレート（ｔａｒｇｅｔ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｅｍｐｌａｔｅ）」とは、テンプレートに依存した方式でＤＮＡを合成するＤＮＡポリメラーゼのためのテンプレートとして働く、ポリヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ）をいう。本明細書において用いる場合、この「増幅領域（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）」とは、逆転写酵素によって合成されるか、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅されるかのいずれかによって合成されるべきポリヌクレオチドの領域である。例えば、ポリヌクレオチドテンプレートの増幅領域は、２つのＰＣＲプライマーが相補的である２つの配列の間に存在し得る。
【０１０５】
本明細書において用いる場合、「テンプレート依存性の方式（ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍａｎｎｅｒ）」という用語は、プライマー分子（例えば、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成）のテンプレート依存性の伸長を含むプロセスをいう。「テンプレート依存性の方式（ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍａｎｎｅｒ）」とは、ＲＮＡまたはＤＮＡのポリヌクレオチド合成をいい、このポリヌクレオチドの新規に合成された鎖の配列は、相補的な塩基対合の周知の規則によって決定される（例えば、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，第４版，Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ（１９８７）を参照のこと）。
【０１０６】
本明細書において用いる場合、「ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）」（「ＰＣＲ」）という用語は、Ｋ．Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓの方法，例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，９６５，１８８号（各々が参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるような、そして当分野で公知の任意の他の改善方法をいう。ＰＣＲとは、クローニングまたは精製なしに、ゲノムＤＮＡの混合物中において標的配列のセグメントの濃度を増大するための方法である。標的配列を増幅するためのこのプロセスは代表的には、所望の標的配列を含むＤＮＡ混合物への大過剰の２つのオリゴヌクレオチドプライマーの導入、その後のＤＮＡポリメラーゼの存在下でのサーマルサイクリングの正確な配列から構成される。この２つのプライマーは二本鎖標的配列のそれぞれの鎖に対して相補的である。増幅を達成するために、この混合物を変性し、次いでそのプライマーを標的分子内のそれらの相補的な配列にアニーリングする。アニーリング後、このプライマーをポリメラーゼで伸長させて、相補的な鎖の新規な対を形成する。変性、プライマーアニーリングおよびポリメラーゼ伸長の工程を、多数回繰り返して（すなわち、変性、アニーリングおよび伸長は、１つの「サイクル」を構成し；多数の「サイクル」であってもよい）、所望の標的配列の高濃度の増幅されたセグメントを得てもよい。所望の標的配列の増幅されたセグメントの長さは、お互いに対するプライマーの相対的な位置によって決定され、従って、この長さは、制御可能なパラメーターである。このプロセスの繰り返し態様のために、この方法は、「ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）」（本明細書において以降では「ＰＣＲ」）と呼ばれる。標的配列の所望の増幅セグメントは、混合物中で優勢な（濃度に関して）配列となるので、それらは、「ＰＣＲ増幅された（ＰＣＲ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ）」といわれる。
【０１０７】
本明細書において用いる場合、「ＲＴ−ＰＣＲ」という用語は、ＲＮＡ配列の複製および増幅をいう。この方法では、逆転写は、例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，３２２，７７０号に記載されるように、ＰＣＲに組み合わされる。ＲＴ−ＰＣＲでは、ＲＮＡテンプレートを酵素の逆転写酵素活性に起因してｃＤＮＡに変換し、次いで、同じまたは異なる酵素の重合化活性を用いて増幅する。安定な熱安定性または熱不安定性の逆転写酵素およびポリメラーゼが用いられ得る。
【０１０８】
本明細書で同定されるアミノ酸残基は、天然のＬ立体配置が好ましい。標準的なポリペプチド命名法、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３：３５５７−３５５９，１９６９を順守して、アミノ酸残基についての略号は以下の表１に示すとおりである。
【０１０９】
【表１】
2009504162.tif 000003
【０１１０】
「ダブル・チューブＲＴ−ＰＣＲ（ｄｏｕｂｌｅ  ｔｕｂｅ  ＲＴ−ＰＣＲ）」または「２ステップＲＴ−ＰＣＲ（ｔｗｏ  ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ）」とは、ＲＴ工程を第一のチューブ中で行い、次いで、ｃＤＮＡを増幅のために第二のチューブに移す反応をいう。従って、ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲは、２つの別のチューブ中で起こる。「シングル・チューブＲＴ−ＰＣＲ（ｓｉｎｇｌｅ  ｔｕｂｅ  ＲＴ−ＰＣＲ）」または「１ステップＲＴ−ＰＣＲ（ｏｎｅ  ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ）」とは、ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲの両方とも同じチューブで行う反応をいう。
【０１１１】
本明細書において用いる場合、「エンドポイントＲＴ−ＰＣＲ（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ  ＲＴ−ＰＣＲ）」とは、ＰＣＲ反応の開始時点でテンプレートが添加され、そしてその反応が多数のサイクルで、通常は２０〜５０サイクルで行われる、ＲＴ−ＰＣＲをいう。これが、検出されるか、および／または定量される増幅反応の最終生成物である。
【０１１２】
本明細書において用いる場合、「リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ）」または「定量的（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ）」または「ＱＲＴ−ＰＣＲ」とは、ＲＴ−ＰＣＲ増幅の進行が、起こっているとおりに測定または検出されるＲＴ−ＰＣＲプロセスをいう。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ技術では、シグナル（通常は蛍光）は生じたとおりにモニターされ、それらがバックグラウンドよりも大きくなり、反応がプラトーに達する前に記録される。
【０１１３】
本明細書において用いる場合、「リアルタイム（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ）」という用語は、モニターされるか、測定されるかまたは観察される事象と同時に行われるものであって、かつそれを、モニターされるか、測定されるかまたは観察される事象の出現と、同時に、または効率的に、実施者に対して、モニタリング、測定または観察の結果を提供することをいう。従って、「リアルタイム」のアッセイまたは測定は、測定されたそして定量された結果、例えば、生成されたシグナルを含むだけでなく、これをリアルタイムで、すなわち、数時間、数分、数秒、数ミリ秒、数ナノ秒、数ピコ秒などで表現する。
【０１１４】
本明細書において用いる場合、「マイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒａｙ）」とは、基板と安定に会合される複数の核酸のメンバーをいう。「アレイ（ａｒｒａｙ）」という用語は、「マイクロアレイ」という用語と交換可能に用いられるが、「マイクロアレイ」という用語を用いて、顕微鏡で可視であるというさらなる特性を有するアレイを規定する。
【０１１５】
本明細書において用いる場合、「顕微鏡で可視（ｖｉｅｗａｂｌｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃａｌｌｙ）」とは、解剖用または複合顕微鏡のステージにおくことが可能であって、顕微鏡の接眼レンズを用いて見ることができる少なくとも一部を有する対象物をいう。
【０１１６】
本明細書において用いる場合、「安定に会合した（ｓｔａｂｌｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）」とは、核酸ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件の下で変化しない基板上の位置との会合をいう。
【０１１７】
本発明は以下の配列を含む。
Ａ．ＷＴ−ＭＭＬＶ−ＲＴ核酸配列（配列番号２）
Ｂ．ＭＭＬＶ−ＲＴ  Ｅ６９Ｋ核酸配列（配列番号３）
Ｃ．ＭＭＬＶ−ＲＴ  Ｅ３０２Ｋ核酸配列（配列番号４）
Ｄ．ＭＭＬＶ−ＲＴ  Ｅ３０２Ｒ核酸配列（配列番号５）
Ｅ．ＭＭＬＶ−ＲＴ  Ｗ３１３Ｆ核酸配列（配列番号６）
Ｆ．ＭＭＬＶ−ＲＴ  Ｌ４３５Ｇ核酸配列（配列番号７）
Ｇ．ＭＭＬＶ−ＲＴ  Ｌ４３５Ｍ核酸配列（配列番号８）
Ｈ．ＭＭＬＶ−ＲＴ  Ｎ４５４Ｋ核酸配列（配列番号９）
Ｉ．ＭＭＬＶ−ＲＴ  Ｎ４５４Ｒ核酸配列（配列番号１０）
Ｊ．ＭＭＬＶ−ＲＴ  Ｄ５２４Ｎ核酸配列（配列番号１１）
Ｋ．ＭＭＬＶ−ＲＴ  Ｍ６５１Ｌ核酸配列（配列番号１２）
Ｌ．ＭＭＬＶ−ＲＴ  Ｅ３０２Ｒ／Ｅ６９Ｋ／Ｗ３１３Ｆ／Ｌ４３５Ｇ／Ｎ４５４Ｋ核酸配列（配列番号１３）
Ｍ．ＭＭＬＶ−ＲＴ  Ｅ３０２Ｒ／Ｗ３１３Ｆ／Ｌ４３５Ｇ／Ｎ４５４Ｋ核酸配列（配列番号１４）
Ｎ．ＭＭＬＶ−ＲＴ  Ｅ３０２Ｒ／Ｗ３１３Ｆ／Ｌ４３５Ｇ核酸配列（配列番号１５）
Ｏ．ＭＭＬＶ−ＲＴ  Ｅ３０２Ｒ／Ｅ６９Ｋ／Ｎ４５４Ｋ核酸配列（配列番号１６）
Ｐ．ＭＭＬＶ−ＲＴ  Ｅ３０２Ｒ／Ｗ３１３Ｆ核酸配列（配列番号１７）
Ｑ．ＭＭＬＶ−ＲＴ  Ｅ３０２Ｒ／Ｅ６９Ｋ／Ｗ３１３Ｆ／Ｌ４３５Ｇ／Ｎ４５４Ｋ／Ｄ５２４Ｎ核酸配列（配列番号１８）
Ｒ．ＷＴ−ＭＭＬＶ−ＲＴタンパク質配列（配列番号１９）
Ｓ．ＭＭＬＶ−ＲＴ  Ｅ６９Ｋタンパク質配列（配列番号２０）
Ｔ．ＭＭＬＶ−ＲＴ  Ｅ３０２Ｋタンパク質配列（配列番号２１）
Ｕ．ＭＭＬＶ−ＲＴ  Ｅ３０２Ｒタンパク質配列（配列番号２２）
Ｖ．ＭＭＬＶ−ＲＴ  Ｗ３１３Ｆタンパク質配列（配列番号２３）
Ｗ．ＭＭＬＶ−ＲＴ  Ｌ４３５Ｇタンパク質配列（配列番号２４）
Ｘ．ＭＭＬＶ−ＲＴ  Ｌ４３５Ｍタンパク質配列（配列番号２５）
Ｙ．ＭＭＬＶ−ＲＴ  Ｎ４５４Ｋタンパク質配列（配列番号２６）
Ｚ．ＭＭＬＶ−ＲＴ  Ｎ４５４Ｒタンパク質配列（配列番号２７）
ＡＡ．ＭＭＬＶ−ＲＴ  Ｄ５２４Ｎタンパク質配列（配列番号２８）
ＢＢ．ＭＭＬＶ−ＲＴ  Ｍ６５１Ｌタンパク質配列（配列番号２９）
ＣＣ．ＭＭＬＶ−ＲＴ  Ｅ３０２Ｒ／Ｅ６９Ｋ／Ｗ３１３Ｆ／Ｌ４３５Ｇ／Ｎ４５４Ｋタンパク質配列（配列番号３０）
ＤＤ．ＭＭＬＶ−ＲＴ  Ｅ３０２Ｒ／Ｗ３１３Ｆ／Ｌ４３５Ｇ／Ｎ４５４Ｋタンパク質配列（配列番号３１）
ＥＥ．ＭＭＬＶ−ＲＴ  Ｅ３０２Ｒ／Ｗ３１３Ｆ／Ｌ４３５Ｇタンパク質配列（配列番号３２）
ＦＦ．ＭＭＬＶ−ＲＴ  Ｅ３０２Ｒ／Ｅ６９Ｋ／Ｎ４５４Ｋタンパク質配列（配列番号３３）
ＧＧ．ＭＭＬＶ−ＲＴ  Ｅ３０２Ｒ／Ｗ３１３Ｆタンパク質配列（配列番号３４）
ＨＨ．ＭＭＬＶ−ＲＴ  Ｅ３０２Ｒ／Ｅ６９Ｋ／Ｗ３１３Ｆ／Ｌ４３５Ｇ／Ｎ４５４Ｋ／Ｄ５２４Ｎタンパク質配列（配列番号３５）
図９は、Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素（Ａ）およびｄｎａＱ遺伝子（Ｂ）のイプシロンサブユニット（ε）の配列を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１１８】
本発明は、変異体逆転写酵素（ＲＴ）に関する。１実施形態では、この変異体ＲＴは、野性型酵素に比較した場合、安定性、例えば、熱安定性の増大を示す。本発明の変異体ＲＴは、ｃＤＮＡ合成、クローニング、ｃＤＮＡライブラリーまたはマイクロアレイの生成およびＲＴ−ＰＣＲに有用である。
【０１１９】
（Ｉ．逆転写酵素）
遺伝子発現の研究への１つの一般的なアプローチは、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の生成である。レトロウイルスからのＲＮＡ依存性のＤＮＡポリメラーゼ、いわゆる逆転写酵素（ＲＴ）の発見によって、逆転写反応が可能になり、ここではｃＤＮＡがＲＮＡをテンプレートとして用いて合成される。ＲＴの同定の結果として、ｍＲＮＡ分子を分析するための方法は、急速に進行した。逆転写酵素を用いるｍＲＮＡ分子を分析するための方法はいまや、遺伝子発現および機能を研究するための必須の実験方法となっている。結果として、クローニングおよびＰＣＲ技術にあてはめられているこれらの方法はまた、生物学、医薬および農業を含む広範な種々の分野で不可欠の技術となっている。
【０１２０】
本発明は、以下からなる群より選択される逆転写酵素（ＲＴ）に関する。モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）（Ｍ−ＭＬＶ）のＲＴ、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ）（ＨＩＶ）のＲＴ、トリ肉腫白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）のＲＴ、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ  Ｓａｒｃｏｍａ  Ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）のＲＴ、トリ骨髄芽球症ウイルス（Ａｖｉａｎ  Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）（ＡＭＶ）のＲＴ、トリ（ニワトリ）赤芽球症ウイルス（Ａｖｉａｎ  Ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）（ＡＥＶ）ヘルパーウイルスＭＣＡＶのＲＴ、トリ骨髄球腫症ウイルス（Ａｖｉａｎ  Ｍｙｅｌｏｃｙｔｏｍａｔｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）ＭＣ２９ヘルパーウイルスＭＣＡＶのＲＴ、トリ細網内皮症ウイルス（Ａｖｉａｎ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）（ＲＥＶ−Ｔ）ヘルパーウイルスＲＥＶ−ＡのＲＴ、トリ肉腫ウイルス（Ａｖｉａｎ  Ｓａｒｃｏｍａ  Ｖｉｒｕｓ）ＵＲ２のヘルパーウイルスＵＲ２ＡＶのＲＴ、トリ肉腫ウイルスＹ７３のヘルパーウイルスＹＡＶのＲＴ、ラウス随伴ウイルス（Ｒｏｕｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ）（ＲＡＶ）のＲＴ、および骨髄芽球症随伴ウイルス（Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ）（ＭＡＶ）のＲＴ。
【０１２１】
本発明の組成物、方法およびキットにおける使用のための酵素としては、逆転写酵素活性を有する任意の酵素が挙げられる。このような酵素としては、限定はしないが、レトロウイルスの逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、Ｂ型肝炎逆転写酵素、カリフラワーモザイクウイルス逆転写酵素、Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼおよびクレノウフラグメント、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：４８７−４９１（１９８８）；米国特許第４，８８９，８１８号および同第４，９６５，１８８号）、Ｔｎｅ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ９６／１０６４０）、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第５，３７４，５５３号）、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ由来のＣ．Ｔｈｅｒｍ  ＤＮＡポリメラーゼ（欧州特許第０９２１１９６Ａ１号，Ｒｏｃｈｅ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ，カタログ番号２０１６３３８）、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｓｂａｄ，ＣＡ、カタログ番号１１７３１−０１５）およびそれらの変異体、フラグメント、改変体または誘導体が挙げられる。当業者によって理解されるとおり、改変された逆転写酵素は、当分野で慣用的であってかつ周知である組み換えまたは遺伝子操作の技術によって得ることができる。変異体逆転写酵素は、例えば、部位特異的突然変異誘発またはランダム突然変異誘発によって目的の逆転写酵素をコードする遺伝子（単数または複数）を変異することによって得ることができる。このような変異は、ポイントミューテーション、欠失変異および挿入変異を含んでもよい。好ましくは、１つ以上のポイントミューテーション（例えば、１つ以上のアミノ酸の１つ以上の異なるアミノ酸での置換）を用いて、本発明の変異体逆転写酵素を構築する。逆転写酵素のフラグメントは、当分野で慣用的であってかつ周知である組み換え技術による欠失変異によって、または任意の多数の周知のタンパク質分解性酵素を用いる目的の逆転写酵素の酵素的な消化によって得ることができる。例えば、その全体が参照によって組み込まれる、米国特許出願第１０／４３５，７６６号に記載されるような逆転写酵素活性を含有する変異体ＤＮＡポリメラーゼもやはり本発明に従って有用である。
【０１２２】
本発明の方法において有利に用いられ得る逆転写酵素活性を有するポリペプチドとしては限定はしないが、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）（Ｍ−ＭＬＶ）の逆転写酵素、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ  Ｓａｒｃｏｍａ  Ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）の逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス（Ａｖｉａｎ  Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）（ＡＭＶ）の逆転写酵素、ラウス随伴ウイルス（Ｒｏｕｓ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ）（ＲＡＶ）の逆転写酵素、骨髄芽球症随伴ウイルス（Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ）（ＭＡＶ）の逆転写酵素、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ）（ＨＩＶ）の逆転写酵素、トリ肉腫白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）の逆転写酵素、レトロウイルスの逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、Ｂ型肝炎ウイルスの逆転写酵素、カリフラワーモザイクウイルスの逆転写酵素、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａ（Ｔｎｅ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（ＴｌｉまたはＶＥＮＴRTM）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶＥＮＴ（商標）、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）種ＧＢ−Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｅｓｉ（Ｐｗｏ）のＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）のＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｃａ）のＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ（Ｓａｃ）のＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ（Ｔａｃ）のＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ（Ｔｆｌ／Ｔｕｂ）のＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ（Ｔｒｕ）のＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ（ＤＹＮＡＺＹＭＥ（商標））のＤＮＡポリメラーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（Ｍｔｈ）のＤＮＡポリメラーゼ、およびそれらの変異体、改変体および誘導体が挙げられる。本発明はまた、残留逆転写酵素活性を有する細菌のＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含む（説明については、例えば、Ｓｈａｄｉｌｙａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４  Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ，８：２４３を参照のこと）。
【０１２３】
本発明における使用に特に好ましいのは、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性が減少しているこれらの酵素の改変体である（すなわち、ＲＮａｓｅ  Ｈ−酵素）。好ましくは、この酵素は、野性型または「ＲＮａｓｅ  Ｈ+」酵素、例えば、野性型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のＲＮａｓｅ  Ｈ活性の２０％未満、より好ましくは１５％、１０％または５％未満、そして最も好ましくは２％未満を有する。任意の酵素のＲＮａｓｅ  Ｈ活性は、その全ての開示が参照によって本発明に詳細に組み込まれる、例えば、米国特許第５，２４４，７９７号；同第５，４０５，７７６号；同第５，６６８，００５号；および同第６，０６３，６０８号に；Ｋｏｔｅｗｉｃｚ，Ｍ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：２６５（１９８８）に、そしてＧｅｒａｒｄ，Ｇ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，ＦＯＣＵＳ  １４（５）：９１（１９９２）に記載されるアッセイのような種々のアッセイによって決定され得る。
【０１２４】
本発明における使用のために特に好ましいＲＮａｓｅ  Ｈ−逆転写酵素としては、限定はしないが、例えば、前に記載されたような、Ｍ−ＭＬＶ  Ｈ−逆転写酵素、ＲＳＶ  Ｈ−逆転写酵素、ＡＭＶ  Ｈ−逆転写酵素、ＲＡＶ  Ｈ−逆転写酵素、ＭＡＶ  Ｈ−逆転写酵素、およびＨＩＶ  Ｈ−逆転写酵素が挙げられる（参照によって各々の全体が組み込まれる、米国特許第５，２４４，７９７号；同第５，４０５，７７６号；同第５，６６８，００５号および同第６，０６３，６０８号；およびＷＯ９８／４７９１２を参照のこと）。任意の酵素のＲＮａｓｅ  Ｈ活性は、種々のアッセイ、例えば、参照によってその全体の開示が本明細書に詳細に組み込まれる、米国特許第５，２４４，７９７号；同第５，４０５，７７６号；同第５，６６８，００５号および同第６，０６３，６０８号に；Ｋｏｔｅｗｉｃｚ，Ｍ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：２６５（１９８８）に；そしてＧｅｒａｒｄ，Ｇ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，ＦＯＣＵＳ  １４（５）：９１（１９９２）に記載されるアッセイなどによって決定され得る。しかし、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性が実質的に減少しているリボ核酸分子からＤＮＡ分子を生成し得る（すなわち、逆転写酵素活性を有する）任意の酵素が、本発明の組成物、方法およびキットにおいて等しく用いられ得るということが当業者に理解される。
【０１２５】
本発明における使用のための逆転写酵素活性を有するポリペプチドは、商業的に、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ  Ｊ．）、Ｓｉｇｍａ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）またはＲｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ）から入手してもよい。あるいは、逆転写酵素活性を有するポリペプチドは、当業者に周知である天然のタンパク質を単離および精製するための標準的な手順に従って、それらの天然のウイルス供給源または細菌供給源から単離され得る（例えば、Ｈｏｕｔｓ，Ｇ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２９：５１７（１９７９）を参照のこと）。さらに、逆転写酵素活性を有するポリペプチドは、当業者に周知である組み換えＤＮＡ技術によって調製され得る（例えば、Ｋｏｔｅｗｉｃｚ，Ｍ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：２６５（１９８８）；Ｓｏｌｔｉｓ，Ｄ．Ａ．，およびＳｋａｌｋａ，Ａ．Ｍ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：３３７２−３３７６（１９８８）を参照のこと）。上記の引用文献の全体的な教示は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１２６】
ＲＮａｓｅ  Ｈ活性が減少している酵素は、当分野で公知の方法によって、例えば、目的の逆転写酵素内のＲＮａｓｅ  Ｈドメインを変異することによって、好ましくは、上記されるような、例えば、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，０６３，６０８号に記載されるような、１つ以上のポイントミューテーション、１つ以上の欠失変異、および／または１つ以上の挿入変異によって、得てもよい。
【０１２７】
逆転写酵素活性を有する２つ以上の酵素を、単一の組成物、例えば同じ反応混合物中で用いてもよい。この方式で用いられる酵素は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２００３／０１９８９４４Ａ１号に記載されるとおり、テンプレート核酸に関して、別個の逆転写停止部位を有し得る。
【０１２８】
本発明の逆転写酵素活性を含む酵素はまた、変異体または改変された逆転写酵素を含んでもよく、この逆転写酵素では、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、例えば、国特許出願２００３／０００３４５２Ａ１号に記載されるように、１つ以上のアミノ酸変化が、この酵素を核酸合成においてより正確に（高度に忠実に）させる。
【０１２９】
（εサブユニット）
本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのθサブユニットおよびＥ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのεサブユニットとを含む複合体と組み合わせて本発明の逆転写酵素を提供する（例えば、Ｈａｍｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１：５２６６−５２７５を参照のこと）。このθサブユニットをまた、εサブユニットの任意の他の変異型、例えば、εサブユニットのε１８６短縮バージョンとともに用いて、この酵素の安定性を増大するか、ならびに／または逆転写酵素の正確性、特異性および／もしくはプロセッシビティーを改善してもよい。
【０１３０】
本発明の１実施形態では、変異体逆転写酵素は、θεサブユニット複合体と組み合わせて提供される。あるいは、変異体逆転写酵素は、θおよびεサブユニットの変異型、例えばε１８６を含む複合体と組み合わせて提供される。
【０１３１】
（変性剤および有機溶媒）
本発明はまた、限定はしないがホルムアミドおよびＤＭＳＯを含む変性剤または有機溶媒と組み合わせて逆転写酵素を提供する。
【０１３２】
本発明はまた、ＰＣＲ増強因子、例えば、ベタインと組み合わせて逆転写酵素を提供する。
【０１３３】
（ＩＩ．遺伝子組み換え−突然変異誘発）
変異体逆転写酵素を調製する好ましい方法は、遺伝子改変による（例えば、野性型逆転写酵素のＤＮＡ配列を改変することによる）。ＤＮＡ配列のランダムな変異および標的化変異を可能にする多数の方法が当分野で公知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ．ａｌ．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５）第３版．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照のこと）。さらに、従来の方法およびＰＣＲに基づく方法の両方を含む、部位特異的な突然変異誘発のための多数の市販のキットがある。例としては、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  Ｒａｎｄｏｍ突然変異誘発キット（ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号６００５５０または２００５５０）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なＥＸＳＩＴＥ（商標）ＰＣＲ−Ｂａｓｅｄ  Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（カタログ番号２００５０２）およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅから入手のＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（商標）Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（カタログ番号２００５１８）、およびこれもＳｔｒａｔａｇｅｎｅから入手のＣＨＡＭＥＬＥＯＮ（登録商標）二本鎖部位特異的突然変異誘発キット（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ）（カタログ番号２００５０９）が挙げられる。
【０１３４】
さらに、変異体逆転写酵素は、当業者に公知の方法論に従って、挿入変異または短縮（Ｎ末端、内部、またはＣ末端）によって生成され得る。
【０１３５】
当分野で公知の部位特異的な突然変異誘発の古い方法は、一本鎖ＤＮＡテンプレートの単離を可能にする、Ｍ１３バクテリオファージベクターのようなベクターへの変異されるべき配列のサブクローニングに依拠する。これらの方法では、当業者は、突然変異誘発プライマー（すなわち、突然変異されるべき部位にアニーリングし得るが、突然変異されるべき部位で１つ以上のミスマッチしたヌクレオチドを保有し得るプライマー）を一本鎖テンプレートに対してアニーリングし、次いで、変異原性プライマーの３’末端から出発するテンプレートの相補体を重合する。次いで、得られた二重鎖を宿主細菌に形質転換して、所望の変異についてプラークをスクリーニングする。
【０１３６】
より近年では、部位特異的突然変異誘発は、一本鎖テンプレートを必要としないという利点を有するＰＣＲ方法を使用している。さらに、サブクローニングを必要としない方法が開発されている。ＰＣＲに基づく部位特異的な突然変異誘発が行われる場合、いくつかの問題が考慮されなければならない。第一に、これらの方法では、ポリメラーゼによって誘導される望ましくない変異の拡大を防ぐためにＰＣＲサイクルの回数を減らすことが所望される。第二に、反応中に残存する変異されていない親の分子の数を減らすために選択を行わなければならない。第三に、単一のＰＣＲプライマーセットの使用を可能にするためには、伸長した長ＰＣＲ法（ｅｘｔｅｎｄｅｄ−ｌｅｎｇｔｈ  ＰＣＲ）が好ましい。第四に、いくつかの熱安定性ポリメラーゼの非テンプレート依存性末端伸長活性のせいで、ＰＣＲ生成された変異体生成物のブラント・エンド（平滑端）ライゲーション（ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）の前にエンドポリッシング工程（ｅｎｄ−ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）を組み込むことがしばしば必要である。
【０１３７】
本発明の有用な変異体逆転写酵素の単離のための非限定的な例は、実施例１および２に詳細に記載される。
【０１３８】
１つ以上の無作為に位置する変異を保有する変異体のパネルを生じるランダム突然変異誘発の方法が当分野には存在する。次いで、このようなパネルの変異体を、所望の特性、例えば、野性型逆転写酵素に対する安定性の増大を示すものについてスクリーニングしてもよい。ランダム突然変異誘発のための方法の例は、いわゆる「エラー・プローン（誤りがちな）ＰＣＲ法（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ  ｍｅｔｈｏｄ）」である。この名称が意味するとおり、この方法は、ＤＮＡポリメラーゼが高い忠実度の組み込みを支持しない条件下で所定の配列を増幅する。異なるＤＮＡポリメラーゼについてエラー・プローン組み込みを促進する条件は変化するが、当業者は、所定の酵素についてこのような条件を決定し得る。増幅の忠実度における多くのＤＮＡポリメラーゼについての重要な変数は、例えば、緩衝液中の二価金属イオンのタイプおよび濃度である。従って、マンガンイオンの使用および／またはマグネシウムもしくはマンガンイオン濃度の変動は、ポリメラーゼの誤り率に影響するように適用され得る。
【０１３９】
突然変異誘発によって生成される所望の変異体逆転写酵素のための遺伝子を配列決定して、変異の部位および数を特定してもよい。１つ以上の変異を含むそれらの変異体について、所定の変異の影響は、特定の変異体に担われる他の変異からの単離において、部位特異的な突然変異誘発による野性型遺伝子への特定された変異の導入によって評価され得る。次いで、このように生成した単一の変異体のスクリーニングアッセイによって、その変異単独の効果の決定が可能になる。
【０１４０】
野性型ＭＭＬＶ逆転写酵素のアミノ酸およびＤＮＡコード配列は図８に示す。本発明に従って有用な変異体ＭＭＬＶ逆転写酵素を調製するための非限定的な詳細な手順は、実施例１および２に示す。
【０１４１】
本開示の恩典を有する当分野の当業者は、他の逆転写酵素由来の変異体逆転写酵素ポリメラーゼであって、限定はしないが、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）（Ｍ−ＭＬＶ）；ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ）（ＨＩＶ）の逆転写酵素、ならびにトリ肉腫白血病ウイルス（ａｖｉａｎ−Ｓａｒｃｏｍａ−Ｌｅｕｋｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）（ＡＳＬＶ）の逆転写酵素であって、限定はしないがラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ  Ｓａｒｃｏｍａ  Ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）の逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス（Ａｖｉａｎ  Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）（ＡＭＶ）の逆転写酵素、トリ（ニワトリ）赤芽球症ウイルス（Ａｖｉａｎ  Ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）（ＡＥＶ）ヘルパーウイルスＭＣＡＶの逆転写酵素、トリ骨髄球腫症ウイルス（Ａｖｉａｎ  Ｍｙｅｌｏｃｙｔｏｍａｔｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）ＭＣ２９ヘルパーウイルスＭＣＡＶの逆転写酵素、トリ細網内皮症ウイルス（Ａｖｉａｎ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）（ＲＥＶ−Ｔ）ヘルパーウイルスＲＥＶ−Ａの逆転写酵素、トリ肉腫ウイルス（Ａｖｉａｎ  Ｓａｒｃｏｍａ  Ｖｉｒｕｓ）ＵＲ２のヘルパーウイルスＵＲ２ＡＶの逆転写酵素、トリ肉腫ウイルスＹ７３のヘルパーウイルスＹＡＶの逆転写酵素、ラウス随伴ウイルス（Ｒｏｕｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ）（ＲＡＶ）の逆転写酵素、および骨髄芽球症随伴ウイルス（Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ）（ＭＡＶ）の逆転写酵素を含む逆転写酵素を含む、変異体逆転写酵素ポリメラーゼが、本発明の組成物において適切に用いられ得るということを認識する。
【０１４２】
本発明の組成物の酵素は、まだ単離されていない逆転写酵素を含んでもよい。
【０１４３】
酵素の熱安定性を増大しようと企図して、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのカタラーゼＩのＣ末端に対してランダム配列を有するペプチドテールの付加を使用する方法が記載されている（Ｍａｔｓｕｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：５８）。本発明は、Ｃ末端伸長を含む変異体逆転写酵素を意図する。
【０１４４】
本明細書において用いる場合、「Ｃ末端伸長（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）」とは、ランダムな配列のペプチドテールをいう。Ｃ末端伸長は好ましくは１〜５００個のアミノ酸，より好ましくは１〜１００個のアミノ酸，そして最も好ましくは２〜５０個のアミノ酸である。
【０１４５】
（ＩＩＩ．熱安定性の増大について変異体を評価する方法）
当分野で公知のとおり、または本明細書において記載されたとおり生成され、そして細菌で発現されたランダムなまたは部位特異的な変異体は、いくつかの異なるアッセイによってＲＴ活性およびＲＴ活性の安定性の増大についてスクリーニングしてもよい。好ましくは、ＲＴ酵素は、本明細書において下の実施例３に記載されるようなＲＴ熱安定性のスクリーニングにおいてスクリーニングされる。
【０１４６】
（ＩＶ．本発明による野性型または変異体酵素の発現）
当分野で公知の方法は、本発明による変異型の逆転写酵素を発現して単離するために適用され得る。本明細書に記載される方法はまた、本発明において有用な野性型酵素の発現にも適用され得る。多くの細菌発現ベクターは、外来の配列によってコードされるタンパク質の高レベルの誘導性発現を可能にする配列エレメントまたは配列エレメントの組み合わせを含む。例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の組み込まれた誘導性型を発現する細菌を、Ｔ７プロモーターに連結された変異型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を保有する発現ベクターで形質転換してもよい。適切な誘導因子、例えば、ｌａｃ誘導性プロモーターについてのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの誘導によって、Ｔ７プロモーターからの変異された遺伝子の高レベル発現が誘導される。
【０１４７】
細菌の適切な宿主株は、当業者によって当分野で入手可能な宿主株から選択され得る。非限定的な例として、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ−２１が外来性のタンパク質の発現のために通常用いられる。なぜならこの株は、Ｅ．ｃｏｌｉの他の株に比べてプロテアーゼ欠損であるからである。誘導性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を保有するＢＬ−２１株としては、ＷＪ５６およびＥＲ２５６６が挙げられる（Ｇａｒｄｎｅｒ  ＆  Ｊａｃｋ，１９９９，前出）。特定の逆転写酵素遺伝子についてのコドン用法がＥ．ｃｏｌｉ遺伝子で通常みられるものと異なる状況については、ｔＲＮＡをコードするｔＲＮＡ遺伝子をまれなアンチコドン（例えば、ａｒｇＵ、ｉｌｅＹ、ｌｅｕＷおよびｐｒｏＬ  ｔＲＮＡ遺伝子）とともに担持するように改変されているＢＬ−２１の株があり、これによってクローニングされたタンパク質遺伝子、例えば、クローニングされた古細菌酵素遺伝子の高度に効率的な発現が可能になる（まれなコドンｔＲＮＡを担持しているいくつかのＢＬ２１−ＣＯＤＯＮ  ＰＬＵＳＴＭ細胞株は、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能である）。
【０１４８】
（Ｖ．本発明の適用）
（ｃＤＮＡ合成）
本発明によれば、ｃＤＮＡ分子（一本鎖または二本鎖）は、種々の核酸テンプレート分子から調製され得る。本発明における使用のための好ましい核酸分子としては、一本鎖または二本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡ分子、ならびに二本鎖のＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドが挙げられる。より好ましい核酸分子としては、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）分子が挙げられるが、ｍＲＮＡ分子が、本発明による好ましいテンプレートである。
【０１４９】
本発明は、特異性および正確性が増大しているｃＤＮＡ合成のための組成物および方法を提供する。本発明は、高い忠実度のｃＤＮＡ合成のための組成物および方法を提供する。本発明の組成物および方法はまた、逆転写の効率および合成されるｃＤＮＡの長さを増大し得る。結果として、合成されたｃＤＮＡの忠実度、効率および引き続く操作（例えば、増幅、配列決定、クローニングなど）の収率も増大する。本発明の方法に従ってｃＤＮＡ分子を調製するために用いられる核酸分子は、当業者に周知である標準的な有機化学合成方法に従って合成的に調製されてもよい。より好ましくは、この核酸分子は、種々の細胞、組織、器官または生物体のような天然の供給源から得ることができる。核酸分子の供給源として用いられ得る細胞は、原核生物（限定はしないが、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、スタヒロコッカス（ブドウ球菌）属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、エルビニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、根粒菌属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）およびストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の種を含む細菌細胞）、または真核生物（真菌（特に酵母）を含む）、植物、原生動物および他の寄生生物、ならびに昆虫（特にＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｓｐｐ．細胞）、線虫（特に、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ細胞）および哺乳動物（特にヒト細胞）を含む動物であってもよい。
【０１５０】
核酸の供給源として用いられ得る哺乳動物の体細胞としては、血球（網状赤血球および白血球）、内皮細胞、上皮細胞、神経細胞（中枢神経系または末梢神経系由来）、筋細胞（骨格筋、平滑筋または心筋由来の筋細胞および筋芽細胞を含む）、結合組織細胞（線維芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、骨細胞および骨芽細胞を含む）および他の間質細胞（例えば、マクロファージ、樹状細胞、シュワン細胞）が挙げられる。哺乳動物の生殖細胞（精母細胞および卵母細胞）はまた、本発明における使用のための核酸の供給源として用いられ得、上記の体細胞および生殖細胞を生じさせる前駆体（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）、前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）および幹細胞も同様であり得る。また、核酸供給源としての使用に適切なのは、哺乳動物の組織または器官、例えば、脳、腎臓、肝臓、膵臓、血液、骨髄、筋、神経、皮膚、尿生殖器、循環器、リンパ系、胃腸、および結合組織源由来の組織または器官、ならびに哺乳動物（ヒトを含む）の胚または胎児由来の組織または器官である。
【０１５１】
任意の上記の原核生物または真核生物の細胞、組織および器官は、正常でも、疾患でも、形質転換されても、樹立されても、前駆体（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）でも、前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ）でも、胎児性でもまたは胚性であってもよい。疾患の細胞としては、例えば、感染性疾患（細菌、真菌または酵母、ウイルス（ＡＩＤＳ、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、ヘルペス、肝炎などを含む）または寄生生物によって起こる）に、遺伝的なまたは生化学的な病理（例えば、嚢胞性線維症、血友病、アルツハイマー病、筋ジストロフィーまたは多発性硬化症）に、またはガンの過程に関与する細胞を挙げることができる。形質転換されたまたは樹立された動物細胞株としては、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｋ５６２細胞、２９３細胞、Ｌ９２９細胞、Ｆ９細胞などを挙げることができる。本発明における使用のための核酸の供給源として適切な他の細胞、細胞株、組織、器官および生物体は、当業者に明らかである。
【０１５２】
一旦、出発する細胞、組織、器官または他のサンプルを得れば、それから核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ）を、当分野で周知である方法によって単離してもよい（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １５：６８７−７０１（１９７８）；Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．，およびＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：１６１−１７０（１９８２）；Ｇｕｂｌｅｒ，Ｕ．，ａｎｄ  Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｂ．Ｊ．，Ｇｅｎｅ  ２５：２６３−２６９（１９８３）を参照のこと）。次いで、このように単離した核酸分子を用いてｃＤＮＡ分子およびｃＤＮＡライブラリーを本発明に従って調製してもよい。
【０１５３】
本発明の実施において、ｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡライブラリーは、上記のように得られた１つ以上の核酸であって、好ましくは１つ以上のｍＲＮＡ分子、例えば、ｍＲＮＡ分子の集団である核酸分子と、本発明の組成物とを、ｃＤＮＡ分子（一本鎖または二本鎖）を形成するための組成物の酵素の作用による核酸分子の逆転写に好都合な条件下で混合することによって生成され得る。従って、本発明の方法は、（ａ）１つ以上の核酸テンプレート（好ましくは、１つ以上のＲＮＡまたはｍＲＮＡテンプレート、例えば、ｍＲＮＡ分子の集団）と本発明の変異体ＲＴとを混合する工程と、（ｂ）ｃＤＮＡ合成を例えば、１つ以上のテンプレートの全てまたは一部に対して可能にするのに十分な条件下でこの混合物をインキュベートする工程とを含む。
【０１５４】
本発明の組成物を、ｃＤＮＡ合成の方法、例えば、下の実施例に記載される方法、または当分野で周知の他の方法（例えば、Ｇｕｂｌｅｒ，Ｕ．，およびＨｏｆｆｍａｎ，Ｂ．Ｊ．，Ｇｅｎｅ  ２５：２６３−２６９（１９８３）；Ｋｒｕｇ，Ｍ．Ｓ．，およびＢｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３１６−３２５（１９８７）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．８．６０−８．６３（１９８９）を参照のこと）と組み合わせて用いて、ｃＤＮＡ分子またはライブラリーを生成してもよい。
【０１５５】
本発明は、当分野で公知であるような第一鎖および第二鎖のｃＤＮＡをさらに生成するこのような方法に関する。本発明によれば、この方法によって生成される第一および第二の鎖のｃＤＮＡは、二本鎖のＤＮＡ分子を形成し得、このＤＮＡ分子は全長ｃＤＮＡ分子であってもよい。
【０１５６】
本発明に有利であり得るｃＤＮＡ合成の他の方法は、当業者に容易に明らかである。
【０１５７】
（合成ｃＤＮＡの引き続く操作）
本発明によってｃＤＮＡ分子またはライブラリーを得れば、これらのｃＤＮＡは、単離してもよいし、またはこのｃＤＮＡを含む反応混合物をさらなる分析または操作のために直接用いてもよい。ｃＤＮＡの精製のための詳細な方法論は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるＧＥＮＥＴＲＡＰＰＥＲ（商標）マニュアル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に教示されるが、ｃＤＮＡ単離の別の標準的な技術、例えば、下の実施例に記載される技術または当分野で公知である他の技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．８．６０−８．６３（１９８９）を参照のこと）を用いてもよい。
【０１５８】
本発明の別の態様では、本発明は、核酸分子を増幅するための方法に用いられ得る。本発明の態様による核酸増幅方法は、１工程（例えば、１工程ＲＴ−ＰＣＲ）反応であっても、または２工程（例えば、２工程ＲＴ−ＰＣＲ）反応であってもよい。本発明によれば、１工程ＲＴ−ＰＣＲタイプの反応は、１チューブで達成して、それによって混入の可能性を低くしてもよい。このような１工程反応は、（ａ）核酸テンプレート（例えば、ｍＲＮＡ）と本発明の酵素とを混合する工程と、（ｂ）この混合物を増幅させるのに十分な条件下でインキュベートさせる工程とを含む。２工程ＲＴ−ＰＣＲ反応は、２つの別の工程で達成され得る。このような方法は、（ａ）核酸テンプレート（例えば、ｍＲＮＡ）と本発明の酵素とを混合する工程と、（ｂ）この混合物をｃＤＮＡ合成を可能にするのに十分な条件下でインキュベートさせる工程と、（ｃ）１つ以上のＤＮＡポリメラーゼを（ｂ）における反応混合物と混合させる工程と、（ｄ）増幅を可能にするのに十分な条件下で工程（ｃ）の混合物をインキュベートする工程とを含む。長い核酸分子（すなわち、長さが約３−５Ｋｂより大きい）の増幅のためには、ＤＮＡポリメラーゼの組み合わせ、例えば、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する１つのＤＮＡポリメラーゼと、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が減少している別のＤＮＡポリメラーゼとの組み合わせを用いてもよい。
【０１５９】
本発明に従って用いられ得る増幅方法としては、ＰＣＲ（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号）、鎖置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ；例えば、米国特許第５，４５５，１６６号；欧州特許第０６８４３１５号）、および核酸配列ベースの増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＮＡＳＢＡ；例えば、米国特許第５，４０９，８１８号；欧州特許０３２９８２２号）が挙げられる。特に好ましい態様では、本発明は、１つ以上のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、例えば、任意の上記のＰＣＲベースの方法を含む核酸分子を増幅する方法で用いられ得る。全ての引用文献は参照によって全体として組み込まれる。
【０１６０】
種々の特異的なＰＣＲ増幅適用が当分野で利用可能である（概説としては、例えば、Ｅｒｌｉｃｈ，１９９９，Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．，１：１２７−３４；Ｐｒｅｄｉｇｅｒ  ２００１，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６０：４９−６３；Ｊｕｒｅｃｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：３１６−２１；Ｔｒｉｇｌｉａ，２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３０：７９−８３；ＭａＣｌｅｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．４：Ｓ６６−８１；Ａｂｒａｍｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍｙｅｒｓ，１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：４１−４７を参照のこと；その各々は参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０１６１】
本発明は、限定はしないが以下を含む、ＰＣＲ適用において用いられ得る、ｉ）非特異的な増幅を減少させるホット−スタート（ｈｏｔ−ｓｔａｒｔ）ＰＣＲ；ｉｉ）高アニーリング温度で開始して、次いで段階的にアニーリング温度を下げて非特異的なＰＣＲ産物を減らす、タッチダウン（ｔｏｕｃｈ−ｄｏｗｎ）ＰＣＲ；ｉｉｉ）プライマーの外部セットおよびプライマーの内部セットを用いてより信頼できる生成物を合成するネスト化ＰＣＲ；ｉｖ）公知の配列に隣接する領域の増幅のためのインバース（ｉｎｖｅｒｓｅ）ＰＣＲ。この方法では、ＤＮＡを消化して所望のフラグメントをライゲーションによって環化して、次いで外向きに伸長する公知の配列に相補的なプライマーを用いるＰＣＲをする；ｖ）ＡＰ−ＰＣＲ（恣意的プライマー（ａｒｂｉｔｒａｒｙ  ｐｒｉｍｅｄ））／ＲＡＰＤ（ランダム増幅ポリマーＤＮＡ（ｒａｎｄｏｍ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ＤＮＡ））。これらの方法は、恣意的なオリゴヌクレオチドを用いて増幅することによってほとんど未知の標的配列を有する種からゲノムフィンガープリントを行う；ｖｉ）次にＰＣＲに用いられるｃＤＮＡを合成するためのＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）を用いるＲＴ−ＰＣＲ。この方法は、組織または細胞中で特定の配列の発現を検出するために極めて鋭敏である。これはまたｍＲＮＡ転写物を定量するためにも用いられ得る；ｖｉｉ）ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ））。これは、ＤＮＡ／タンパク質配列についての情報が限られている場合に用いられる。この方法は、各々１つの特異的なプライマーのみ（加えて１つのアダプタープライマー）を用いてｃＤＮＡのフラグメントを生成するｃＤＮＡの３’または５’末端を増幅する。次いで、重複するＲＡＣＥ生成物を組み合わせて全長ｃＤＮＡを生成してもよい；ｖｉｉｉ）異なる組織で示差的に発現される遺伝子を特定するために用いられるＤＤ−ＰＣＲ（示差的ディスプレイＰＣＲ（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｄｉｓｐｌａｙ  ＰＣＲ））。ＤＤ−ＰＣＲにおける第一の工程は、ＲＴ−ＰＣＲに関与し、次いで増幅は、短い意図的に非特異的なプライマーを用いて行われる；ｉｘ）同じ標本中のＤＮＡ配列の２つ以上の固有の標的が同時に増幅されるＭｕｌｔｉｐｌｅｘ−ＰＣＲ。１つのＤＮＡ配列が、ＰＣＲの質を検証するためのコントロールとして用いられ得る；ｘ）同じセットのプライマーについて標的ＤＮＡ（競合的ＰＣＲ）と競合する内部コントロールＤＮＡ配列（ただしサイズは異なる）を用いる、Ｑ／Ｃ−ＰＣＲ（定量的比較的（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ））；ｘｉ）遺伝子を合成するために用いられる再帰的（Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ）ＰＣＲ。この方法で用いられるオリゴヌクレオチドは、遺伝子のストレッチ（＞８０塩基）に対して、あるいは、末端重複（約２０塩基）を有するセンス鎖に対しておよびアンチセンス鎖に対して相補的である；ｘｉｉ）非対称性のＰＣＲ；ｘｉｉｉ）インサイチュＰＣＲ；ｘｉｖ）部位特異的なＰＣＲ突然変異誘発。
【０１６２】
本発明は、任意の特定の増幅システムに限定されないことが理解されるべきである。他のシステムが開発される場合、それらのシステムは、本発明の実施によって利益があり得る。
【０１６３】
本発明におけるテンプレートとしてＲＮＡからｃＤＮＡを合成するために用いられるプライマーは、そのプライマーが、テンプレートＲＮＡのものに相補的な核酸配列を有し、かつ用いられる反応条件下でテンプレートＲＮＡにアニーリングし得るオリゴヌクレオチドである限りは、特定のプライマーには限定されない。このプライマーは、ランダム配列（ランダムプライマー）または遺伝子特異的なプライマーを有するオリゴ（ｄＴ）またはオリゴヌクレオチドのようなオリゴヌクレオチドであってもよい。
【０１６４】
本発明の方法によって調製された核酸分子（例えば、合成されたｃＤＮＡまたは増幅された生成物）またはｃＤＮＡライブラリーは、例えば、クローニングおよび配列決定（すなわち、核酸分子の核酸配列を決定すること）によって、本発明の配列決定方法によって、またはその他当分野で標準であるものによって（例えば、ＤＮＡ配列決定の方法に関する、米国特許第４，９６２，０２２号および同第５，４９８，５２３号を参照のこと）さらに特徴付けられ得る。あるいは、これらの核酸分子は、当分野で周知である方法によるハイブリダイゼーションプローブのような、産業的プロセスにおける種々の物質の製造のために用いられ得る。ｃＤＮＡ由来のハイブリダイゼーションプローブの生成によって、例えば、医学の分野における、例えば、特定の遺伝子マーカー、例えば、ガンのマーカー、感染性もしくは遺伝性の疾患のマーカー、または胚発達のマーカーの存在について患者の細胞または組織を試験する、その能力が得られる。さらに、このようなハイブリダイゼーションプローブは、さらなる特徴づけのための異なる細胞、組織または生物体から調製されるゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーからＤＮＡフラグメントを単離するために用いられ得る。
【０１６５】
被験体酵素を用いて生成される増幅産物が、当分野で公知の任意の方法によってクローニングされ得るということが理解される。１実施形態では、本発明は、ＰＣＲ増幅産物の直接クローニングを可能にする組成物を提供する。
【０１６６】
ＰＣＲ産物をクローニングするための最も一般的な方法は、プライマー分子の末端上に隣接する制限部位の組み込みを含む。ＰＣＲサイクリングを行って、次いで増幅ＤＮＡを精製して、適切なエンドヌクレアーゼで制限して、適切なベクター調製物に連結する。
【０１６７】
ＰＣＲ産物を直接クローニングするための方法は、制限認識配列を有するプライマーを調製する必要性を省いて、クローニングのためのＰＣＲ産物を調製するための制限工程の必要性を省く。さらに、このような方法で好ましくは、精製工程を介在させることなしにＰＣＲ産物を直接クローニングすることが可能になる。
【０１６８】
米国特許第５，８２７，６５７号および同第５，４８７，９９３号（全体が本明細書に組み込まれる）は、ＰＣＲ生成された核酸の３’末端に結合された単一の３’−デオキシ−アデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）残基を利用するＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲ産物の直接クローニングのための方法を開示する。ベクターは、適切な制限酵素との反応の際に３’末端デオキシ−チミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）残基を与える認識配列で調製される。従って、遺伝子のＰＣＲ生成されたコピーは、ベクター中に、そこで適切な制限部位を有するプライマーを調製する必要性なしに直接クローニングされ得る。
【０１６９】
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、末端トランスフェラーゼ活性を示し、この活性は、テンプレートの非存在下でＰＣＲ産物の３’末端に対して単一のｄＡＴＰを付加する。この活性は、ＴＡクローニング方法の基礎であって、ここではＴａｑで増幅されたＰＣＲ産物が直接、単一の３’ｄＴオーバーハングを含むベクターに連結される。Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼは他方では、末端トランスフェラーゼ活性を欠き、従って、ブラント・エンドの（ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄｅｄ）ベクターに効率的にクローニングされる、ブラント・エンドのＰＣＲ産物を生成する。
【０１７０】
１実施形態では、本発明は、ウラシル検出活性が減少した変異体ＤＮＡポリメラーゼの存在下で生成された、ＰＣＲ産物を提供し、これを引き続いて、７２℃で１５〜３０分間、ｄＡＴＰの存在下でＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼとともにインキュベートする。次いで、増幅したＤＮＡ産物の末端への３’−ｄＡＭＰの付加によって、当業者に周知である方法に従うＴＡクローニングベクターへのクローニングが可能になる。
【０１７１】
本発明の核酸分子（例えば、合成されたｃＤＮＡまたは増幅された産物）はまた、組み換えＤＮＡ方法における使用のための組成物を調製するために用いられてもよい。従って本発明は、本発明のｃＤＮＡまたは増幅された核酸分子を含む組み換えベクターに、この組み換えベクターで遺伝子操作される宿主細胞に、これらのベクターおよび宿主細胞を用いる組み換えポリペプチドの生成のための方法に、そしてこれらの方法を用いて生成された組み換えポリペプチドに関する。
【０１７２】
組み換えベクターは、当分野で周知である方法を用いて、本発明の方法に従って調製された１つ以上のｃＤＮＡ分子または増幅された核酸分子をベクターに挿入することによって、本発明のこの態様に従って生成され得る。本発明のこの態様で用いられるベクターは、例えば、ファージまたはプラスミドであってもよく、そして好ましくはプラスミドである。好ましいのは、目的のポリペプチドをコードする核酸に対するシス作用性コントロール領域を含むベクターである。適切なトランス作用因子は、宿主によって供給されてもよく、補完性のベクターによって供給されてもよく、または宿主への導入の際にベクター自体によって供給されてもよい。
【０１７３】
これに関する特に好ましい実施形態では、このベクターは、誘導性であっても、および／または細胞タイプ特異的であってもよい、特異的な発現を提供する（従って、「発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ）」と呼ばれる）。このようなベクターのなかで特に好ましいのは、温度および栄養素添加物のような、操作の容易である環境要因によって誘導性であるベクターである。
【０１７４】
本発明において有用な発現ベクターとしては、染色体由来、エピソーム由来およびウイルス由来のベクター、例えば、細菌プラスミドまたはバクテリオファージ由来のベクター、ならびにその組み合わせ由来のベクター、例えば、コスミドおよびファージミドが挙げられ、そして好ましくは、細菌宿主細胞における培養のためのテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝子のような少なくとも１つの選択マーカーが挙げられる。このような発現ベクターへの挿入の前に、本発明のｃＤＮＡまたは増幅された核酸分子は、適切なプロモーター、例えば、ファージλＰLプロモーター、Ｅ  ｃｏｌｉのｌａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロモーターに作動可能に連結されるべきである。他の適切なプロモーターが当業者に公知である。
【０１７５】
なかでも本発明における使用に好ましいベクターとしては、Ｑｉａｇｅｎから入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐｃＤＮＡ３；Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＧＥＸ、ｐＴｒｘｆｕｓ、ｐＴｒｃ９９ａ、ｐＥＴ−５、ｐＥＴ−９、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５；ならびにＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能なｐＳＰＯＲＴｌ、ｐＳＰＯＲＴ２およびｐＳＶ．ｍｕｌｔｉｄｏｔ．ＳＰＯＲＴ１が挙げられる。他の適切なベクターは、当業者に容易に明白である。
【０１７６】
本発明はまた、本発明のｃＤＮＡ分子、増幅された核酸分子または組み換えベクターを含む組み換え宿主細胞を生成する方法、ならびにこのような方法によって生成される宿主細胞を提供する。本発明によって生成され得る代表的な宿主細胞（原核生物または真核生物）としては、限定はしないが、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞および動物細胞が挙げられる。好ましい細菌宿主細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの細胞（最も好ましくは、市販されているＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０ＢおよびＳｔｂ１２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．））、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．細胞、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐｐ．細胞、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．細胞およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞が挙げられる。好ましい動物宿主細胞としては、昆虫細胞（最も好ましくはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのＳＪ９およびＳｆ２１細胞ならびにＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓａ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｖｅ細胞）および哺乳動物細胞（最も好ましくはＣＨＯ、ＣＯＳ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫおよびヒト細胞）が挙げられる。このような宿主細胞は、当業者に周知である、周知の形質転換、エレクトロポレーションまたはトランスフェクションの技術によって調製されてもよい。
【０１７７】
さらに、本発明は、組み換えポリペプチドおよびこれらの方法によって生成されたポリペプチドを生成するための方法を提供する。本発明のこの態様によれば、組み換えポリペプチドは、それからのポリペプチドの生成およびポリペプチドの単離に有利である条件下で任意の上記の組み換え宿主細胞を培養することによって生成され得る。組み換え宿主細胞を培養するため、そしてそれからのポリペプチドの生成および単離のための方法は、当業者に周知である。
【０１７８】
本明細書に記載される方法および適用に対する他の適切な改変および適合は、明白であって、本発明の範囲またはその任意の実施形態から逸脱することなくなされ得るということは当業者には容易に明白である。本発明をここで詳細に記載しているが、同じことが以下の実施例を参照してより明白に理解され、以下の実施例は、例示の目的でのみ本明細書に含まれるものであり、本発明を限定するものではない。
【０１７９】
（ＶＩ．キット）
本発明の組成物は、核酸分子の逆転写、クローニングまたは増幅における使用のためにキットにアセンブルされ得る。本発明のこの態様によるキットは、キャリア手段、例えば、ボックス、カートン、チューブなどを備え、これは、その中の閉じた区画に１つ以上の容器手段、例えば、バイアル、チューブ、アンプル、ボトルなどを有する。本発明のキットはまた、（同じまたは別の容器中に）１つ以上の逆転写酵素、適切な緩衝液、１つ以上のヌクレオチド、および／または１つ以上のプライマー、または本発明の組成物に記載される任意の他の試薬を含んでもよい。
【０１８０】
本発明のキットは、当分野で公知のとおり合成されたｃＤＮＡの引き続く操作を容易にする試薬を含んでもよい。
【実施例】
【０１８１】
（ＶＩＩ．実施例）
（実施例１．熱安定性スクリーニングのためにＲＮａｓｅ  ＨマイナスＭＭＬＶ−ＲＴポイントミューテーションライブラリーを生成する）
ＲＮａｓｅ  ＨマイナスＭＭＬＶ−ＲＴ（Ｄ５２４Ｎ）遺伝子（２ｋｂ）に、製造業者の推奨に従って、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号２００５５０または６００５５０）およびプライマーｐＳＴＲＡＴ−ＦおよびｐＳＴＲＡＴ−Ｒ（表２）を用いて突然変異誘発した。変異したＰＣＲ産物「メガプライマー（Ｍｅｇａ  ｐｒｉｍｅｒｓ）」を用いて、製造業他の推奨に従って、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号２００５１８）を用いて野性型ＲＮａｓｅ  ＨマイナスＭＭＬＶ−ＲＴ遺伝子を置き換えた。得られたプラスミドをＸＬ−１０  Ｇｏｌｄコンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号２００３１７）中にクローニングした。ライブラリーのサイズは５×１０4（１ｋｂあたり１〜６個の変異を含む）であった。ＤＮＡは、ＳｔｒａｔａＰｒｅｐ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号４００７６１）を用いて全体的なライブラリーから抽出した。次いで、このＤＮＡの一部をＢＬ２１−ＤＥ３−ＲＩＬ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号２３０２４０）中に形質転換して、５×１０4のサイズを有するライブラリーを生成した。
【０１８２】
（結果）
このライブラリー中のクローンは、１ｋｂあたり１〜６個の変異を含んだ。
【０１８３】
（実施例２．熱安定性スクリーニングのためにＲＮａｓｅ  ＨマイナスＭＭＬＶ−ＲＴランダムＣ末端伸長ライブラリーを生成する）
プライマーＲＴＳＳＣ１２ＡＸｈｏＩおよびＲＴＳＳＥＩ−ｖｅｃＦ（表２）を用いて、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号６００２６０）を用いて、ＲＮａｓｅ  ＨマイナスＭＭＬＶ−ＲＴ遺伝子を増幅した。次いで、ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化して、Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ結合単位およびＦＬＡＧ配列を失っているｐＣａｌ−ｎ−ＦＬＡＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号２１４３１１）中にクローニングした。得られたＣ末端伸長ライブラリーを、ＸＬ−１０  Ｇｏｌｄコンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号２００３１７）中にクローニングした。ＳｔｒａｔａＰｒｅｐ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号４００７６１）を用いてライブラリー全体からＤＮＡを抽出して、ＢＬ２１−ＤＥ３−ＲＩＬ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号２３０２４０）中に形質転換した。
【０１８４】
（結果）
ライブラリーのサイズは１０4であった。配列決定した１７個のクローンから、１２は７〜１４個のアミノ酸付加を有し、２つは、１〜２個のアミノ酸付加を有し、１つは１８個のアミノ酸付加を有し、１つは３０個のアミノ酸付加を有し、そして１つは付加を有さなかった。
【０１８５】
（実施例３．ＲＴ熱安定性スクリーニングアッセイ）
ＢＬ２１−ＤＥ３−ＲＩＬライブラリー由来の変異体コロニー（ポイントミューテーションでかつＣ末端伸長ライブラリー）を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび３５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（Ｃｏｓｔａｒ９６ウェルプレート（２９４４４−１０２））を含有する１２０μｌのＬＢ培地に接種して、３７℃で一晩増殖させた。これらの培養物の１０μｌを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、３５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール、および１ｍＭのＩＰＴＧを含有する１１０μｌのＬＢ培地中に接種して（Ｃｏｓｔａｒ  ９６ウェルプレート（２９４４４−１０２））、一晩増殖させた。細胞を、３０μｌの溶解緩衝液（１２５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）、４．５％グルコース、５０ｍＭのＥＤＴＡ、２．５％のＴｒｉｔｏｎ、５ｍｇ／ｍｌのリゾチームおよび５０ｍＭのＤＴＴ）を用いて溶解した。１０μｌの溶解物を、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭのＫＣｌ、８ｍＭのＭｇＣｌ2、２μｇのポリ（ｒＣ）、０．５μｇのオリゴ（ｄＧ）、１０ｍＭのＤＴＴ、５０ｍＭのｄＧＴＰ、および０．５μＣｉのα33ｐｄＧＴＰを含有する５０μｌのアッセイ中で用いた。反応は、４２℃または５５℃で６０分間インキュベートした（図１）。これらの反応物の４μｌをＤＥ−８１フィルターにスポットして、乾燥させた。次いで、このフィルターを２×ＳＳＣで５回洗浄して乾燥した。次いで、このフィルターをＫｏｄａｋ  ＢｉｏＭａｘ  ＭＲ−１フィルム（ＶＷＲ  ＩＢ８９４１１１４））に一晩露光させた。
【０１８６】
（結果）
ポイントミューテーションライブラリー由来の３４００個のクローンを、上記の熱安定性アッセイを用いてスクリーニングした。ＷＴの酵素に比較して５５℃でより高い活性を示す変異体（図１）を選択して、同じＲＴ活性アッセイを３回以上用いて再スクリーニングした。最も活性の高い変異体を選択して、配列決定して、Ｈｉｓ−ｔａｇ精製した（実施例６のとおり）。変異Ｅ６９Ｋ、Ｌ４３５Ｍ、Ｎ４５４ＫおよびＭ６５１Ｌを発見して、それらの５２℃／４２℃でのＲＴ活性（実施例４のとおり）をＷＴの酵素と比較した（図２）。全てのＨｉｓタグ化精製変異体が、ＷＴの酵素に比較して５２℃／４２℃でより高い活性を示した。
【０１８７】
Ｃ末端伸長ライブラリー由来の４０００個のクローンをまた、上記の熱安定性アッセイを用いてスクリーニングした。ＷＴ酵素に比較して５５℃で高い活性を示す変異体を選択して、同じＲＴ活性アッセイをさらに３回用いて再スクリーニングした。最高の変異体を選択して、配列決定して、Ｈｉｓ−ｔａｇ精製した（実施例６のとおり）。マルチペプチドテール（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔａｉｌｓ）は、ＷＴの酵素に比較して５２℃／４２℃でＲＴの活性（実施例４にアッセイされるとおり）を増大した（図３）。
【０１８８】
（実施例４．ＲＴ活性アッセイ：）
Ｈｉｓ−ｔａｇ精製したＷＴおよび変異体についてのＲＮＡ依存性ＤＮＡ重合化アッセイを以下のとおり行なった。各々の酵素の約５単位（ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のタンパク質の等価量）を、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭのＫＣｌ、８ｍＭのＭｇＣｌ2、２μｇのポリ（ｒＣ）、０．５μｇのオリゴ（ｄＧ）、１０ｍＭのＤＴＴ、５０ｍＭのｄＧＴＰ、および０．５μＣｉのα33ｐｄＧＴＰを含有する５０μｌのアッセイ中で用いた。反応物は、４２℃または５２℃で３０分間インキュベートした。これらの反応物の５μｌをＤＥ−８１フィルターにスポットして、乾燥させた。次いで、このフィルターを２×ＳＳＣで５回洗浄し、続いて１００％エタノールで短時間洗浄した。次いで、このフィルターを乾燥させた。取り込まれた放射能をシンチレーションカウンティングによって測定した。酵素を欠く反応物を、サンプルインキュベーションとともに設定して、「総ｃｐｍ（ｔｏｔａｌ  ｃｐｍｓ）」（フィルター洗浄工程省略）および「最小ｃｐｍ（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｃｐｍｓ）」（上記のとおりフィルターを洗浄する）を決定した。最小ｃｐｍをサンプルｃｐｍから差引きして、「補正したｃｐｍ（ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ  ｃｐｍｓ）」を決定した。
【０１８９】
（実施例５．各々の部位で独立して最高の変異を特定する推定の「熱安定性（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ）」残基での飽和突然変異誘発）
飽和突然変異誘発は、製造業者の推奨に従って、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号２００５１８）、およびＥ６９、Ｅ３０２、Ｆ３０３、Ｇ３０５、Ｗ３１３、Ｌ４３５、Ｎ４５４、Ｍ６５１（表２）に縮重部位を含むプライマーを用いて行った。あらゆるライブラリーからの２００個のクローンをスクリーニングした（実施例３のとおり）。５５℃で最高の活性を有する変異体を選択して、配列決定した。
【０１９０】
（結果）
以下の変異は、５５℃で最高の活性を示す：
Ｅ６９Ｋ、Ｅ３０２Ｋ、Ｅ３０２Ｒ、Ｗ３１３Ｆ、Ｌ４３５Ｍ、Ｌ４３５Ｇ、Ｎ４５４Ｋ、Ｎ４５４Ｒ、Ｍ６５１Ｌ。
【０１９１】
（実施例６．熱安定性変異の組み合わせ）
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号２００５１４）を４つのプライマー（表２）とともに用いて、変異Ｅ６９Ｋ、Ｗ３１３Ｆ、Ｌ４３５Ｇ、およびＮ４５４Ｋを、既にＥ３０２Ｒ変異体を含んだＲＮａｓｅ  ＨマイナスＭＭＬＶ−ＲＴ遺伝子に導入した。１０個のクローンを配列決定した。
（結果）
以下の組み合わせを得た。
クローン１：Ｅ３０２Ｒ／Ｅ６９Ｋ／Ｗ３１３Ｆ／Ｌ４３５Ｇ／Ｎ４５４Ｋ
ＲＫＦＧＫ（配列番号３６）
クローン２：Ｅ３０２Ｒ／Ｗ３１３Ｆ／Ｌ４３５Ｇ／Ｎ４５４Ｋ
ＲＦＧＫ（配列番号３７）
クローン３：Ｅ３０２Ｒ／Ｗ３１３Ｆ／Ｌ４３５Ｇ
ＲＦＧ
クローン４：Ｅ３０２Ｒ／Ｅ６９Ｋ／Ｎ４５４Ｋ
ＲＫＫ
クローン５：Ｅ３０２Ｒ／Ｗ３１３Ｆ
ＲＦ
【０１９２】
活性アッセイ（実施例３と同様−ＤＥ−８１フィルターおよびポリ（ｒＣ）：オリゴ（ｄＧ）18を用いる）を４２℃および５７℃で行って、その結果（図４）、野性型酵素に比較して単一または複数の変異を含むクローンについて５７℃でより高い活性が示される。
【０１９３】
（実施例７．ポリ（Ａ）ＲＮＡラダーを用いる活性アッセイ：）
全長ｃＤＮＡプロファイリングは、ポリ（Ａ）テールのＲＮＡラダー（Ａｍｂｉｏｎ＃７１５０）を用いて、ＷＴ  ＲＴ対ＲＫＦＧＫ変異体ＲＴ（Ｈｉｓ−ｔａｇ化タンパク質）について行った。反応物は、２μｇのＲＮＡラダー、０．５μｇのオリゴ（ｄＴ）18、３．２ｍＭのｄＮＴＰおよび約１００単位の酵素（ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で等価なタンパク質量）を、３または６ｍＭのＭｇ2+を含有する１×ＳｔｒａｔａＳｃｒｉｐｔ緩衝液中に含んだ。反応物は、４２℃、５０℃、および５２℃で６０分間インキュベートして、１％のアルカリアガロースゲル上で泳動して、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄで染色した。
【０１９４】
（結果）
ＲＫＦＧＫ（配列番号３６）変異体ＲＴは、ＷＴ酵素に比較してより高温（５２℃）でより長いｃＤＮＡラダーを生成する（図５）。
【０１９５】
（実施例８．最終構築物の精製および熱安定性の比較：）
３つのＨｉｓタグ化構築物であって、ＲＮａｓｅ  ＨマイナスＭＭＬＶ−ＲＴ（Ｄ５２４Ｎ）、ＲＮａｓｅ  ＨマイナスＭＭＬＶ−ＲＴ（Ｄ５２４Ｎ、Ｅ３０２Ｒ、Ｅ６９Ｋ、Ｗ３１３Ｆ、Ｌ４３５Ｇ、Ｎ４５４Ｋ）、およびＲＮａｓｅ  ＨマイナスＭＭＬＶ−ＲＴ（Ｄ５２４Ｎ、Ｅ３０２Ｒ、Ｅ６９Ｋ、Ｗ３１３Ｆ、Ｌ４３５Ｇ、Ｎ４５４Ｋ）プラスＣ末端伸長（ＲＤＲＮＫＮＮＤＲＲＫＡＫＥＮＥ）（配列番号１）を含む構築物を、ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ（Ｑｉａｇｅｎ）に従って発現および精製した。ポリ（ｒＣ）：ポリ（ｄＧ）を用いるＲＴ活性アッセイは、実施例４と同様に行った。
【０１９６】
（結果）
Ｃ末端伸長（ＲＤＲＮＫＮＮＤＲＲＫＡＫＥＮＥ）（配列番号１）を有するＲＮａｓｅ  ＨマイナスＭＭＬＶ−ＲＴ（Ｄ５２４Ｎ、Ｅ３０２Ｒ、Ｅ６９Ｋ、Ｗ３１３Ｆ、Ｌ４３５Ｇ、Ｎ４５４Ｋ）が、５５℃および６０℃で最高の活性を示す（図６）。
【０１９７】
（実施例９．半減期決定：）
本発明の変異体逆転写酵素の半減期は以下のとおり決定した。
【０１９８】
３つの非Ｈｉｓタグ化構築物であって、ＲＮａｓｅ  ＨマイナスＭＭＬＶ−ＲＴ（Ｄ５２４Ｎ）（図７Ａ、プロット１）、ＲＮａｓｅ  ＨマイナスＭＭＬＶ−ＲＴ（Ｄ５２４Ｎ、Ｅ３０２Ｒ、Ｅ６９Ｋ、Ｗ３１３Ｆ、Ｌ４３５Ｇ、Ｎ４５４Ｋ）（図７Ｂ、プロット２）、およびＲＮａｓｅ  ＨマイナスＭＭＬＶ−ＲＴ（Ｄ５２４Ｎ、Ｅ３０２Ｒ、Ｅ６９Ｋ、Ｗ３１３Ｆ、Ｌ４３５Ｇ、Ｎ４５４Ｋ）プラスＣ末端伸長（ＲＤＲＮＫＮＮＤＲＲＫＡＫＥＮＥ）（配列番号１）（図７Ｃ、プロット３）を含む構築物を以下のとおりアッセイした。２μｇのｐｏｌｙ（ｒＣ）、０．５μｇのオリゴ（ｄＧ）18の存在下で各々の酵素の０．５ｐｍｏｌを含む混合物を、プロットに示されるとおり種々の時間５５℃でインキュベートした。インキュベーションは、氷上にチューブを置くことによって停止させた。５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのＤＴＴ、５０ｍＭのｄＧＴＰ、および０．５μＣｉのα33ｐｄＧＴＰ中で残留活性についてアリコートをアッセイした。反応物を４２℃で３０分間インキュベートした。これらの反応物の５μｌを、ＤＥ−８１フィルター上にスポットして、乾燥させた。次いで、このフィルターを２×ＳＳＣを用いて５回洗浄し、続いて１００％のエタノールで短時間洗浄した。次いで、このフィルターを乾燥させた。取り込まれた放射能を、シンチレーションカウンティングによって測定した。酵素を欠く反応物を、サンプルインキュベーションとともに設定して、「総ｃｐｍ（ｔｏｔａｌ  ｃｐｍｓ）」（フィルター洗浄工程省略）および「最小ｃｐｍ（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｃｐｍｓ）」（上記のとおりフィルターを洗浄する）を決定した。最小ｃｐｍをサンプルｃｐｍから差引きして、「補正したｃｐｍ（ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ  ｃｐｍｓ）」を決定した。
【０１９９】
（結果）
ＲＮａｓｅ  ＨマイナスＭＭＬＶ−ＲＴ（Ｄ５２４Ｎ）の半減期（図７Ａ、プロット１）は、５分未満であるが、ＲＮａｓｅ  ＨマイナスＭＭＬＶ−ＲＴ（Ｄ５２４Ｎ、Ｅ３０２Ｒ、Ｅ６９Ｋ、Ｗ３１３Ｆ、Ｌ４３５Ｇ、Ｎ４５４Ｋ）の半減期（図７Ｂ、プロット２）は、３０分より大きく、ＲＮａｓｅ  ＨマイナスＭＭＬＶ−ＲＴ（Ｄ５２４Ｎ、Ｅ３０２Ｒ、Ｅ６９Ｋ、Ｗ３１３Ｆ、Ｌ４３５Ｇ、Ｎ４５４Ｋ）プラスＣ末端伸長（ＲＤＲＮＫＮＮＤＲＲＫＡＫＥＮＥ）（配列番号１）の半減期（図７Ｃ、プロット３）は、５５℃で約３０分である。
【０２００】
【表２】
2009504162.tif 000004
【０２０１】
本明細書に組み込まれる全ての特許、特許出願および公表された引用文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。本発明は、その好ましい実施形態を参照して詳細に示されかつ記載されているが、形態および詳細における種々の変化が、添付の特許請求の範囲によって含まれる本発明の範囲から逸脱することなく本発明においてなされ得るということが当業者によって理解される。
【図面の簡単な説明】
【０２０２】
【図１】ＭＭＬＶ−ＲＴ熱安定性スクリーニングの結果を示す。
【図２】Ｈｉｓタグ化精製されたＭＭＬＶ−ＲＴポイントミューテーションの熱安定性を示す。
【図３】Ｃ末端伸長した変異体の熱安定性を示す。
【図４】複数の変異を有するＲＴについての活性アッセイの結果を示す。
【図５】Ｈｉｓタグ化変異体ＲＴによるｃＤＮＡラダー合成を示す。
【図６】本発明の変異体ＲＴの熱安定性を示す。
【図７】本発明による変異体ＲＴの半減期を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
2009504162.tif 000007
【図４】
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【図５】
2009504162.tif 000009
【図６】
2009504162.tif 000010
【図７】
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【配列表】
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