(57)【要約】  ブタノールに対して増強された耐性を有する乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）が単離されている。この細菌はブタノールの発酵生成にとって有用である。ブタノール耐性乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）を単離するための新規な方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタノール耐性微生物を単離するための方法であって、
ａ）微生物コンソーシアムを含有する微生物試料を提供すること、
ｂ）上記微生物コンソーシアムを、発酵性炭素源を含有する成長培地と、微生物コンソーシアムのメンバーが成長するまで接触させること、
ｃ）ステップ（ｂ）の成長している微生物コンソーシアムをブタノールと接触させること、および
ｄ）ステップ（ｃ）の生存可能なメンバーを単離すること（ここでブタノール耐性微生物が単離される）、
を含む、方法。
【請求項２】
ステップ（ｂ）の成長しているコンソーシアムが対数増殖期に成長している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｃ）後、コンソーシアムを固形培地上でプレーティングする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
固体培地がブタノールを含有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｃ）の接触ステップを１回以上繰り返す、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
接触ステップ（ｃ）のブタノール濃度が約０．８％ｗ／ｖ〜約３．０％ｗ／ｖである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｄ）の単離が、
ｉ）ブタノールの非存在下液体培地でステップ（ｄ）の生存可能なメンバーを成長させること（これにより生存可能なメンバーが増殖する）、
ｉｉ）ブタノールの存在下でステップ（ｉ）の細胞を成長させること、および
ｉｉｉ）ブタノールの存在下で成長するステップ（ｉｉ）の細胞を回収すること（ここでブタノール耐性微生物が単離される）、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
発酵性炭素源が、スクロース、フルクトース、グルコース、酪酸、吉草酸およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ブタノールが主に１−ブタノールである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ブタノールが主に２−ブタノールである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ブタノールが主にイソブタノールである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
コンソーシアムを嫌気性条件下で成長させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
コンソーシアムを微好気性条件下で成長させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
コンソーシアムを好気性条件下で成長させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ｄ）の生存可能なメンバーが、固形培地上、３７℃で成長させる場合、少なくとも２．５％ｗ／ｖの１−ブタノールに耐性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ｄ）の生存可能なメンバーが、固形培地上、３７℃で成長させる場合、少なくとも３．９％ｗ／ｖの２−ブタノールに耐性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ｄ）の生存可能なメンバーが、固形培地上、３７℃で成長させる場合、少なくとも２．７％ｗ／ｖのイソブタノールに耐性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ｄ）の生存可能なメンバーが、固形培地上、３７℃で成長させる場合、少なくとも５．０％ｗ／ｖの２−ブタノンに耐性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ｄ）の生存可能なメンバーが、固形培地上、３７℃で成長させる場合、少なくとも９．０％ｗ／ｖのエタノールに耐性である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
微生物試料が環境試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ブタノール耐性微生物が乳酸桿菌属の種である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１に記載の方法により単離されるブタノール耐性微生物。
【請求項２３】
微生物が乳酸桿菌属の細菌である、請求項２２に記載のブタノール耐性微生物。
【請求項２４】
ブタノール耐性乳酸桿菌属を単離するための方法であって、
ａ）微生物コンソーシアムを含む微生物試料を提供すること、
ｂ）発酵性炭素源を含有する培地で乳酸桿菌属が存在する微生物コンソーシアムを増菌し、乳酸桿菌の増菌培養物を生成させること（この中で乳酸桿菌属の増菌培養物のメンバーが成長している）、
ｃ）ステップ（ｂ）の成長している乳酸桿菌属の増菌培養物をブタノールと接触させること、および
ｄ）ステップ（ｃ）の生存可能なメンバーを単離すること（ここでブタノール耐性乳酸桿菌属が単離される）、
を含む、方法。
【請求項２５】
ステップ（ｃ）の成長している乳酸桿菌属が対数増殖期に成長している、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
微生物試料が環境試料である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
ステップ（ｃ）後、コンソーシアムのメンバーを固形培地上でプレーティングする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
固形培地がブタノールを含有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
固形培地がブタノールを含有する乳酸菌培地である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ステップ（ｃ）の接触ステップを１回以上繰り返す、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
ステップ（ｃ）の接触ステップが約０．８％ｗ／ｖ〜約３．０％ｗ／ｖの濃度のブタノールを用いて行われる、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
ステップ（ｄ）の単離ステップが、
ｉ）ブタノールの非存在下液体培地でステップ（ｄ）の生存可能なメンバーを成長させること（これにより生存可能なメンバーが増殖する）、
ｉｉ）ブタノールの存在下でステップ（ｉ）の細胞を成長させること、および
ｉｉｉ）ブタノールの存在下で成長するステップ（ｉｉ）の細胞を回収すること（ここでブタノール耐性微生物が単離される）、
を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
発酵性炭素源がスクロース、フルクトース、グルコース、酪酸、吉草酸およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３４】
ブタノールが主に１−ブタノールである、請求項２４に記載の方法。
【請求項３５】
ブタノールが主に２−ブタノールである、請求項２４に記載の方法。
【請求項３６】
ブタノールが主にイソブタノールである、請求項２４に記載の方法。
【請求項３７】
ステップ（ｄ）の生存可能なメンバーが、固形培地上、３７℃で成長させる場合、少なくとも２．５％ｗ／ｖの１−ブタノールに耐性である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３８】
ステップ（ｄ）の生存可能なメンバーが、固形培地上、３７℃で成長させる場合、少なくとも３．９％ｗ／ｖの２−ブタノールに耐性である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３９】
ステップ（ｄ）の生存可能なメンバーが、固形培地上、３７℃で成長させる場合、少なくとも２．７％ｗ／ｖのイソブタノールに耐性である、請求項２４に記載の方法。
【請求項４０】
ステップ（ｄ）の生存可能なメンバーが、固形培地上、３７℃で成長させる場合、少なくとも５．０％ｗ／ｖの２−ブタノンに耐性である、請求項２４に記載の方法。
【請求項４１】
ステップ（ｄ）の生存可能なメンバーが、固形培地上、３７℃で成長させる場合、少なくとも９．０％ｗ／ｖのエタノールに耐性である、請求項２４に記載の方法。
【請求項４２】
請求項２４に記載の方法により単離されるブタノール耐性乳酸桿菌属。
【請求項４３】
固形培地上で成長させる場合、少なくとも２．５％ｗ／ｖのブタノールに耐性である、請求項４２に記載のブタノール耐性乳酸桿菌属。
【請求項４４】
乳酸桿菌属が、
ｉ）無芽胞通性嫌気性菌であり、かつ
ｉｉ）グラム陽性であり、かつ
ｉｉｉ）非運動性であり、かつ
ｉｖ）桿状の細胞形態を有し、かつ
ｖ）配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、および配列番号４４からなる群から選択される１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を含む、
特性を有する、請求項４２に記載のブタノール耐性乳酸桿菌属。
【請求項４５】
ｉ）無芽胞通性嫌気性菌であり、かつ
ｉｉ）グラム陽性であり、かつ
ｉｉｉ）非運動性であり、かつ
ｉｖ）桿状の細胞形態を有し、かつ
ｖ）固形培地上で成長させる場合、少なくとも２．５％ｗ／ｖのブタノールに耐性である、
特性を有する、ブタノール耐性乳酸桿菌属。
【請求項４６】
配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、および配列番号４４からなる群から選択される１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を含む、請求項４５に記載のブタノール耐性乳酸桿菌属。
【請求項４７】
ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３１８（ラクトバチルス・プランタラムＰＮ０５１０）、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３２０（ラクトバチルス・プランタラムＰＮ０５１１）、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−７７２７（ラクトバチルス・プランタラムＰＮ０５１２）およびＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３１９（ラクトバチルス・アリゾネンシスＰＮ０５１４）からなる群から選択されるブタノール耐性乳酸桿菌属。
【請求項４８】
ブタノールを生産するための方法であって、
ａ）ｉ）無芽胞通性嫌気性菌であり、かつ
ｉｉ）グラム陽性であり、かつ
ｉｉｉ）非運動性であり、かつ
ｉｖ）桿状の細胞形態を有し、かつ
ｖ）固形培地上、３７℃で成長させる場合、少なくとも２．５％ｗ／ｖのブタノールに耐性である、
特性を有する、ブタノール生合成経路をコードする遺伝子コンストラクトを含む乳酸桿菌属を提供すること、および
ｂ）ブタノールが生産される条件下でステップ（ａ）の乳酸桿菌属を成長させること、を含む、方法。
【請求項４９】
ブタノールを生産するための方法であって、
ａ）ブタノール生合成経路をコードする遺伝子コンストラクトを含む、請求項２４に記載の方法により単離される乳酸桿菌属を提供すること、および
ｂ）ブタノールが生産される条件下でステップ（ａ）の乳酸桿菌属を成長させること、を含む、方法。
【請求項５０】
ブタノールが主に１−ブタノールである、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５１】
ブタノールが主に２−ブタノールである、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５２】
ブタノールが主にイソブタノールである、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５３】
乳酸桿菌属が、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３１８（ラクトバチルス・プランタラムＰＮ０５１０）、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３２０（ラクトバチルス・プランタラムＰＮ０５１１）、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−７７２７（ラクトバチルス・プランタラムＰＮ０５１２）およびＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３１９（ラクトバチルス・アリゾネンシスＰＮ０５１４）からなる群から選択される、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５４】
ブタノールの生産において使用するためのブタノール耐性乳酸桿菌属。
【請求項５５】
２−ブタノンの生産において使用するための２−ブタノン耐性乳酸桿菌属。
【請求項５６】
２−ブタノンを生産するための方法であって、
ａ）ｉ）無芽胞通性嫌気性菌であり、かつ
ｉｉ）グラム陽性であり、かつ
ｉｉｉ）非運動性であり、かつ
ｉｖ）桿状の細胞形態を有し、かつ
ｖ）固形培地上で成長させる場合、少なくとも５．０％ｗ／ｖの２−ブタノンに耐性である、
特性を有する、２−ブタノン生合成経路をコードする遺伝子コンストラクトを含む乳酸桿菌属を提供すること、
ｂ）２−ブタノンが生産される条件下でステップ（ａ）の乳酸桿菌属を成長させること、
を含む、方法。
【請求項５７】
２−ブタノンを生産するための方法であって、
ａ）２−ブタノン生合成経路をコードする遺伝子コンストラクトを含む、請求項２４に記載の方法により単離される乳酸桿菌属を提供すること、および
ｂ）２−ブタノンが生産される条件下でステップ（ａ）の乳酸桿菌属を成長させること、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は２００６年６月１５日出願の米国仮特許出願第６０／８１３７７９号明細書の優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は工業微生物学の分野に関する。具体的には、アルコール、特にブタノールに高い耐性を示す微生物が単離されている。
【背景技術】
【０００３】
ブタノールは、燃料添加剤として、プラスチック産業における化学物質原料として、さらに食品および香料産業における食品等級の抽出剤として有用な重要な工業化学物質である。毎年、１００〜１２０億ポンドのブタノールが石油化学的手段により生産され、この汎用化学製品に対する需要は高まる可能性が高い。
【０００４】
ブタノールの化学合成方法は既知である。例えば１−ブタノールが、オキソプロセス、レッペ（Ｒｅｐｐｅ）プロセス、またはクロトンアルデヒドの水素化を用いて生成可能である（「Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第６版、２００３年、ワイリーＶＣＨフェアラーク（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨＶｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ  ａｎｄ  Ｃｏ．）、ドイツ国バインハイム（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）、第５巻、７１６−７１９頁）。２−ブタノールがｎ−ブテン水和を用いて生成可能である（「Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第６版、２００３年、ワイリーＶＣＨフェアラーク（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨＶｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ  ａｎｄ  Ｃｏ．）、ドイツ国バインハイム（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）、第５巻、７１６−７１９頁）。さらに、イソブタノールが、オキソ合成、一酸化炭素の触媒水素化（「Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第６版、２００３年、ワイリーＶＣＨフェアラーク（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨＶｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ  ａｎｄ  Ｃｏ．）、ドイツ国バインハイム（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）、第５巻、７１６−７１９頁）またはｎ−プロパノールによるメタノールのゲルベ（Ｇｕｅｒｂｅｔ）縮合（カーリニ（Ｃａｒｌｉｎｉ）ら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｃａｔａｌ．Ａ：Ｃｈｅｍ．２２０：２１５−２２０頁（２００４年））を用いて生成可能である。石油化学製品から誘導される出発原料を用いるこれらのプロセスは一般に高価であり、環境に優しいものではない。
【０００５】
発酵によりブタノールを生成する方法も既知であり、ここでは最も知られたプロセスによりアセトン、１−ブタノールおよびエタノールの混合物が生成され、それはＡＢＥプロセスと称される（ブラスチェック（Ｂｌａｓｃｈｅｋ）ら、米国特許第６，３５８，７１７号明細書）。クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）によるアセトン−ブタノール−エタノール（ＡＢＥ）発酵は最も古くから知られた工業用発酵の１つであり、これらの溶媒の生成を担う経路および遺伝子についての報告がされている（ガーバル（Ｇｉｒｂａｌ）ら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：１１−１６頁（１９９８年））。さらに、１−ブタノール生合成経路（ドナルドソン（Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ）ら、同時係属および共同所有の米国特許出願第１１／５２７９９５号明細書）、２−ブタノール生合成経路（ドナルドソン（Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ）ら、同時係属および共同所有の米国仮特許出願第６０／７９６，８１６号明細書、およびイソブタノール生合成経路（マッジオ−ホール（Ｍａｇｇｉｏ−Ｈａｌｌ）ら、同時係属および共同所有の米国特許出願第１１／５８６３１５号明細書）を発現する組換え微生物生成宿主についての記載がなされている。しかし、ブタノールの生物学的生成は、発酵において用いられる宿主微生物に対するブタノールの毒性により制限を受けると考えられる。
【０００６】
１−ブタノールに耐性があるクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）の株が化学的突然変異誘発（ジェイン（Ｊａｉｎ）ら、米国特許第５，１９２，６７３号明細書；およびブラスチェック（Ｂｌａｓｃｈｅｋ）ら、米国特許第６，３５８，７１７号明細書）、例えばストレス応答タンパク質を発現する遺伝子の特定のクラスの過剰発現（パポウトサキス（Ｐａｐｏｕｔｓａｋｉｓ）ら、米国特許第６，９６０，４６５号明細書；およびトーマス（Ｔｏｍａｓ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９（８）：４９５１−４９６５頁（２００３年））、ならびに連続濃縮（ｓｅｒｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）（クラチュレイン（Ｑｕｒａｔｕｌａｉｎ）ら、Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ（Ｐｒａｇｕｅ）  ４０（５）：４６７−４７１頁（１９９５年）；およびソウカイリェ（Ｓｏｕｃａｉｌｌｅ）ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４（５）：２９５−２９９頁（１９８７年））により単離されている。デズモンド（Ｄｅｓｍｏｎｄ）ら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０（１０）：５９２９−５９３６頁（２００４年））は、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）およびラクトバチルス・パラカセイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）内でのストレス応答タンパク質ＧｒｏＥＳＬの過剰発現により０．５％容量／容量（ｖ／ｖ）［０．４％重量／容量（ｗ／ｖ）］の１−ブタノールの存在下で成長可能な株が生成されたことを報告している。さらに、河口堆積物（サルデッサイ（Ｓａｒｄｅｓｓａｉ）ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ８２（６）：６２２−６２３頁（２００２年））および活性汚泥（ビーズキエヴィッツ（Ｂｉｅｓｚｋｉｅｗｉｃｚ）ら、Ａｃｔａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ  Ｐｏｌｏｎｉｃａ  ３６（３）：２５９−２６５頁（１９８７年））からの１−ブタノール耐性株の単離についての記載がなされている。さらに、一部の乳酸桿菌種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）がエタノールに耐性があることが知られている（例えば、コウト（Ｃｏｕｔｏ）、ピナ（Ｐｉｎａ）およびホッグ（Ｈｏｇｇ）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｌｅｔｔｅｒ  １９：４８７−４９０頁を参照）。イングラム（Ｉｎｇｒａｍ）およびブルケ（Ｂｕｒｋｅ）（１９８４年）  Ａｄｖ．Ｍｉｃｒｉｂｉａｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２５：２５３−３００頁。しかし、当該技術分野で記載がなされている大部分の微生物においては、液体培地内、３７℃で成長される場合、２．０％ｗ／ｖ未満の１−ブタノール濃度で成長が全面的に阻害される。さらに、２−ブタノールおよびイソブタノールに対する耐性を有する微生物株については当該技術分野で既知ではない。したがって、１−ブタノール、２−ブタノール、およびイソブタノールに対して高い耐性を有する微生物の同定が当該技術分野における先進性を示すことになると思われる。
【０００７】
さらに、２−ブタノンおよびエタノールは、微生物を用いる発酵により生成可能である貴重な化合物である。メチルエチルケトン（ＭＥＫ）とも称される２−ブタノンは、汎用の溶媒であり、アセトンに次いで最も重要な商業生産されるケトンである。それは塗料、樹脂、および接着剤における溶媒とともに選択的抽出剤および酸化反応の活性化物質として使用される。２−ブタノンは、２−ブタノール生合成経路の最終ステップを省くことにより作製可能である（ドナルドソン（Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ）ら、同時係属および共同所有の米国仮特許出願第６０／７９６８１６号明細書）。エタノールは代替燃料としての需要が高い。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の遺伝子組換え株がエタノール生成用の生体触媒として用いられている（アンダーウッド（Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ）ら、（２００２年）  Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：６２６３−６２７２頁）。エタノールの改善された生成を有する、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）の遺伝子組換え株が米国特許出願公開第２００３／０１６２２７１Ａ１号明細書に記載されている。２−ブタノンおよびエタノールに対する改善された耐性を有する微生物の同定がこれらの化合物の生成を促進することになると思われる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、ブタノールにより耐性がありかつブタノールの高力価に至る生物学的生成のために使用可能である微生物宿主株に対する需要がある。本発明は、ブタノール耐性微生物の発見およびそれを単離するための方法の開発を通じてのこの需要に対応する。さらに、発見された微生物は、２−ブタノンおよびエタノールに対して増強された耐性を有する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ブタノール耐性微生物、特に乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属のメンバー、およびそれを単離するための方法に関する。微生物コンソーシアムは濃縮され、ブタノールに対する耐性について選択された。固体培地上、３７℃で成長される場合、少なくとも２．５％ｗ／ｖの１−ブタノールのブタノールの濃度に対する耐性を示す乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の数種が単離された。
【００１０】
したがって、本発明は、ブタノール耐性微生物を単離するための方法であって、
ａ）微生物コンソーシアムを含有する微生物試料を提供するステップと、
ｂ）前記微生物コンソーシアムを、発酵性炭素源を含有する成長培地と、前記微生物コンソーシアムのメンバーが成長するようになるまで接触させるステップと、
ｃ）ステップ（ｂ）の成長中の微生物コンソーシアムをブタノールと接触させるステップと、
ｄ）ステップ（ｃ）の生存可能なメンバーを単離するステップであって、ブタノール耐性微生物が単離されるステップと、
を含む、方法を提供する。
【００１１】
別の実施形態では、本発明は、本発明の方法により単離されるブタノール耐性微生物を提供し、ここで好ましい微生物は乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属である。
【００１２】
他の実施形態では、本発明は、ブタノール耐性乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）を単離するための方法であって、
ａ）微生物コンソーシアムを含む微生物試料を提供するステップと、
ｂ）発酵性炭素源を含有する培地内で乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の存在のために前記微生物コンソーシアムを濃縮し、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の濃縮された培養物を生成するステップであって、前記乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の濃縮された培養物のメンバーが成長しているステップと、
ｃ）ステップ（ｂ）の成長中の乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の濃縮された培養物をブタノールと接触させるステップと、
ｄ）ステップ（ｃ）の生存可能なメンバーを単離するステップであって、ブタノール耐性乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）が単離されるステップと、
を含む、方法を提供する。
【００１３】
好ましい実施形態では、本発明は、本発明の方法により単離されるブタノール耐性乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）を提供し、ここではＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３１８（プランタラム菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１０）、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３２０（プランタラム菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１１）、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−７７２７（プランタラム菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２）およびＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３１９（ラクトバチルス・アリゾネンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｉｚｏｎｅｎｓｉｓ）ＰＮ０５１４）として同定された特定のブタノール耐性乳酸桿菌種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）が好ましい。
【００１４】
別の実施形態では、本発明は、ブタノールを生成するための方法であって、
ａ）ブタノール生合成経路をコードする遺伝子コンストラクトを含む、本発明の方法により単離される乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）を提供するステップと、
ｂ）ブタノールが生成される条件下でステップ（ａ）の前記乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）を成長させるステップと、
を含む、方法を提供する。
【００１５】
さらに別の実施形態では、本発明は、２−ブタノンを生成するための方法であって、
ｃ）２−ブタノン生合成経路をコードする遺伝子コンストラクトを含む、本発明の方法により単離される乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）を提供するステップと、
ｄ）２−ブタノンが生成される条件下でステップ（ａ）の前記乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）を成長させるステップと、
を含む、方法を提供する。
【００１６】
生物寄託および配列記述の簡単な説明
本発明の様々な実施形態は、本願の一部を形成する、以下の詳細な説明、生物学的寄託、および添付の配列記述からより十分に理解されうる。
【００１７】
本出願人は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｐｏｓｉｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｕｒｐｏｓｅｓ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）に関するブダペスト条約の条件下で以下の生物学的寄託を行った。
【００１８】
【表１】
2009539407.tif 000002
【００１９】
以下の配列は、米国特許施行規則第１．８２１〜１．８２５条（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を有する特許出願における要件−配列の規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ）」）に従い、かつ、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）基準ＳＴ．２５（１９９８年）ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表における要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、ならびに実施細則の第２０８節および付録Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データにおいて用いられる記号および形式は、米国特許施行規則第１．８２２条に示される規則に従う。
【００２０】
【表２】
2009539407.tif 000003
【００２１】
【表３】
2009539407.tif 000004
【００２２】
【表４】
2009539407.tif 000005
【００２３】
配列番号３９および４０は、実施例１に記載のようにブタノール耐性株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅するのに用いられるプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２４】
配列番号４１〜４４は、実施例１に記載のように単離されたブタノール耐性乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、アルコール、特にブタノール、ならびに２−ブタノンおよびエタノールに対して高い耐性を示す微生物を提供する。本発明の微生物は、固体培地上で２．５％ｗ／ｖ以上の１−ブタノールの存在下で成長可能である。さらに、本発明はブタノール耐性微生物を単離するための方法を提供する。これらのブタノール耐性微生物は、ブタノール生合成経路または２−ブタノン生合成経路を含むように遺伝子操作され、かつ高力価に至る１−ブタノール、２−ブタノール、イソブタノールまたは２−ブタノンの生物学的生成において使用可能である。
【００２６】
以下の定義および略語は、特許請求の範囲および本明細書の解釈のために用いられるものとする。
【００２７】
本明細書で用いられる「ブタノール」という用語は、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブタノール、またはそれらの混合物を示す。
【００２８】
「ブタノール耐性微生物」および「耐性がある」という用語は、本発明の微生物を説明するのに用いられる場合、固体培地上、３７℃で成長される場合での２．５％ｗ／ｖ以上の１−ブタノール、２−ブタノール、またはイソブタノールの存在下あるいは液体培地内、３７℃で成長される場合での２．０％ｗ／ｖ以上の１−ブタノール、２−ブタノール、またはイソブタノールの存在下で成長を示す細菌または酵母を示す。
【００２９】
「微生物コンソーシアム」という用語は、異なる遺伝子型を有する微生物の異種グループを示す。例として、微生物コンソーシアムは、排水汚泥または土壌またはたい肥または汚染水試料などの環境試料、純粋な細菌株の化学的に突然変異が誘発された微生物集団、マルチコピー（ｍｕｌｔｉｃｏｐｙ）のプラスミドライブラリーを有する微生物株、または特定の株のトランスポゾンでタグ化された突然変異体の集団でありうる。
【００３０】
「環境試料」という用語は、環境から得られる試料を示す。特に環境試料は、排水汚泥またはブタノールおよび／または他の溶媒に暴露されている場合に環境から得られる他の試料でありうる。環境試料は微生物コンソーシアムを含有する。
【００３１】
微生物の培養および特に微生物コンソーシアムの培養に適用される「濃縮する」という用語は、コンソーシアムまたは微生物培養物の細胞に過剰な成長栄養素を供給し、細胞の成長を増強または促進することを示す。
【００３２】
「発酵性炭素源」、「炭素基質」または「発酵性炭素基質」という用語は、同義的に用いられ、かつ微生物コンソーシアムにより容易に利用される炭素の供給源を示す。発酵性炭素源は、限定はされないが、単糖、オリゴ糖、多糖、および１炭素基質またはそれらの混合物を含む。好ましい発酵性炭素源の非限定的リストは、単糖、例えばグルコース、フルクトース、およびスクロース、ならびに脂肪酸、酪酸、および吉草酸などのカルボン酸を含む。
【００３３】
「好気性条件」という用語は酸素の存在下での成長条件を意味する。
【００３４】
「嫌気性条件」という用語は酸素の不在下での成長条件を意味する。
【００３５】
「微好気性条件」という用語は、低い酸素のレベル（すなわち標準の大気中の酸素レベル未満）での成長条件を意味する。
【００３６】
「ブタノール生合成経路」という用語は、１−ブタノール、２−ブタノール、またはイソブタノールを生成するための酵素経路を意味する。
【００３７】
「１−ブタノール生合成経路」という用語は、アセチル−補酵素Ａ（アセチル−ＣｏＡ）から１−ブタノールを生成するための酵素経路を示す。
【００３８】
「２−ブタノール生合成経路」という用語は、ピルビン酸塩から２−ブタノールを生成するための酵素経路を示す。
【００３９】
「イソブタノール生合成経路」という用語は、ピルビン酸塩からイソブタノールを生成するための酵素経路を示す。
【００４０】
「２−ブタノン生合成経路」という用語は、ピルビン酸塩から２−ブタノンを生成するための酵素経路を示す。
【００４１】
「アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ」という用語は、アセチル−ＣｏＡ２分子からアセトアセチル−ＣｏＡおよび補酵素Ａ（ＣｏＡ）への変換を触媒する酵素を示す。好ましいアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼは、好ましくは短鎖アシル−ＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡといった基質を有する（順方向での反応）アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼであり、Ｅ．Ｃ．２．３．１．９として分類されるが［「Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ」  １９９２年、サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）のアカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）］、より広範な基質範囲を有する酵素（Ｅ．Ｃ．２．３．１．１６）も同様に機能を果たすことになる。アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼは、多数の供給源、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿４１６７２８、ＮＣ＿０００９１３；ＮＣＢＩ（国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ））アミノ酸配列、ＮＣＢＩヌクレオチド配列）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿３４９４７６．１（配列番号２）、ＮＣ＿００３０３０；ＮＰ＿１４９２４２（配列番号４）、ＮＣ＿００１９８８）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿３９０２９７、ＮＣ＿０００９６４）、およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿０１５２９７、ＮＣ＿００１１４８）から入手可能である。
【００４２】
「３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素」という用語は、アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへの変換を触媒する酵素を示す。３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素は、好ましくは（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡまたは（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡといった基質の場合に還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）に依存する場合があり、各々、Ｅ．Ｃ．１．１．１．３５およびＥ．Ｃ．１．１．１．３０として分類される。さらに、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素は、好ましくは（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡまたは（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡといった基質の場合に還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）に依存する場合があり、各々、Ｅ．Ｃ．１．１．１．１５７およびＥ．Ｃ．１．１．１．３６として分類される。３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素は、多数の供給源、例えばクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿３４９３１４（配列番号６）、ＮＣ＿００３０３０）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＡＡＢ０９６１４、Ｕ２９０８４）、ラルストニア・ユウトロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＺＰ＿００１７１４４、ＮＺ＿ＡＡＤＹ０１０００００１、アルカリゲネス・ユウトロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＹＰ＿２９４４８１、ＮＣ＿００７３４７）、およびアルカリゲネス・ユウトロファス（Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：Ｐ１４６９７、Ｊ０４９８７）から入手可能である。
【００４３】
「クロトナーゼ（ｃｒｏｔｏｎａｓｅ）」という用語は、３ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからクロトニル−ＣｏＡおよびＨ2Ｏへの変換を触媒する酵素を示す。クロトナーゼは、好ましくは（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡまたは（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡといった基質を有する場合があり、各々、Ｅ．Ｃ．４．２．１．１７およびＥ．Ｃ．４．２．１．５５として分類される。クロトナーゼは、多数の供給源、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿４１５９１１（配列番号８）、ＮＣ＿０００９１３）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿３４９３１８、ＮＣ＿００３０３０）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＣＡＢ１３７０５、Ｚ９９１１３）、およびアエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＢＡＡ２１８１６、Ｄ８８８２５）から入手可能である。
【００４４】
トランス−エノイルＣｏＡレダクターゼとも称される「ブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素」という用語は、クロトニル−ＣｏＡからブチリル−ＣｏＡへの変換を触媒する酵素を示す。ブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素はＮＡＤＨ依存性またはＮＡＤＰＨ依存性である場合があり、各々、Ｅ．Ｃ．１．３．１．４４およびＥ．Ｃ．１．３．１．３８として分類される。ブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素は、多数の供給源、例えばクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿３４７１０２（配列番号１０）、ＮＣ＿００３０３０）、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：Ｑ５ＥＵ９０、ＡＹ７４１５８２）、ストレプトマイセス・コリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｌｌｉｎｕｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＡＡＡ９２８９０、Ｕ３７１３５）、およびストレプトマイセス・コエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＣＡＡ２２７２１、ＡＬ９３９１２７）から入手可能である。
【００４５】
「ブチルアルデヒド脱水素酵素」という用語は、共同因子としてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを用い、ブチリル−ＣｏＡからブチルアルデヒドへの変換を触媒する酵素を示す。ＮＡＤＨが好ましい場合のブチルアルデヒド脱水素酵素は、Ｅ．Ｃ．１．２．１．５７として知られ、例えばクロストリジウム・ベイジェリンキー（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＡＡＤ３１８４１（配列番号１２）、ＡＦ１５７３０６）およびクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿１４９３２５、ＮＣ＿００１９８８）から入手可能である。
【００４６】
「１−ブタノール脱水素酵素」という用語は、ブチルアルデヒドから１ブタノールへの変換を触媒する酵素を示す。１−ブタノール脱水素酵素はアルコール脱水素酵素の広範なファミリーのサブセットである。１−ブタノール脱水素酵素はＮＡＤＨ−またはＮＡＤＰＨ依存性でありうる。１−ブタノール脱水素酵素は、例えばクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿１４９３２５、ＮＣ＿００１９８８；ＮＰ＿３４９８９１（配列番号１４）、ＮＣ＿００３０３０；およびＮＰ＿３４９８９２（配列番号１６）、ＮＣ＿００３０３０）ならびに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿４１７４８４、ＮＣ＿０００９１３）から入手可能である。
【００４７】
「アセトヒドロキシ酸シンターゼ」とも称される「アセト乳酸シンターゼ」という用語は、ピルビン酸２分子からα−アセト乳酸１分子への変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを示す。アセト乳酸シンターゼ（ＥＣ２．２．１．６［従来は４．１．３．１８］として知られる）（「Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ」  １９９２年、サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）のアカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ））は、その活性については共同因子のチアミンピロリン酸に依存しうる。適切なアセト乳酸シンターゼ酵素は、多数の供給源、例えば枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＡＡＡ２２２２２  ＮＣＢＩ（国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ））アミノ酸配列、Ｌ０４４７０  ＮＣＢＩヌクレオチド配列）、クレブシエラ・テリゲナ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｔｅｒｒｉｇｅｎａ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＡＡＡ２５０５５、Ｌ０４５０７）、およびクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＡＡＡ２５０７９（配列番号２０）、Ｍ７３８４２（配列番号１９））から入手可能である。
【００４８】
「アセト乳酸デカルボキシラーゼ」という用語は、α−アセト乳酸からアセトインへの変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを示す。アセト乳酸デカルボキシラーゼは、ＥＣ４．１．１．５として知られ、例えば枯草菌（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＡＡＡ２２２２３、Ｌ０４４７０）、クレブシエラ・テリゲナ（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＡＡＡ２５０５４、Ｌ０４５０７）およびクレブシエラ・ニューモニエ（配列番号１８（アミノ酸）、配列番号１７（ヌクレオチド）から入手可能である。
【００４９】
「アセトインレダクターゼ」としても知られる「ブタンジオール脱水素酵素」という用語は、アセトインから２，３−ブタンジオールへの変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを示す。ブタンジオール脱水素酵素はアルコール脱水素酵素の広範なファミリーのサブセットである。ブタンジオール脱水素酵素は、アルコール生成物中でＲ−またはＳ−立体化学の生成に対して特異性を有しうる。Ｓに特異的なブタンジオール脱水素酵素は、ＥＣ１．１．１．７６として知られ、例えばクレブシエラ・ニューモニエ（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＢＢＡ１３０８５（配列番号２２）、Ｄ８６４１２）から入手可能である。Ｒに特異的なブタンジオール脱水素酵素は、ＥＣ１．１．１．４として知られ、例えばセレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿８３０４８１、ＮＣ＿００４７２２；ＡＡＰ０７６８２、ＡＥ０１７０００）、およびラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＡＡＫ０４９９５、ＡＥ００６３２３）から入手可能である。
【００５０】
「ジオールデヒドラターゼ」または「プロパンジオールデヒドラターゼ」としても知られる「ブタンジオールデヒドラターゼ」という用語は、２，３−ブタンジオールからメチルエチルケトン（ＭＥＫ）としても知られる２−ブタノンへの変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを示す。ブタンジオールデヒドラターゼでは共同因子のアデノシルコバラミンが用いられうる。アデノシルコバラミン依存性酵素は、ＥＣ４．２．１．２８として知られ、例えばクレブシエラ・オキシトカ（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＢＡＡ０８０９９（αサブユニット）（配列番号２４）、ＢＡＡ０８１００（βサブユニット）（配列番号２６）、およびＢＢＡ０８１０１（γサブユニット）（配列番号２８）（３つの全サブユニットは活性に必要とされることに注意のこと）、Ｄ４５０７１）から入手可能である。
【００５１】
「２−ブタノール脱水素酵素」という用語は、２ブタノンから２−ブタノールへの変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを示す。２−ブタノール脱水素酵素は、アルコール脱水素酵素の広範なファミリーのサブセットである。２−ブタノール脱水素酵素は、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ依存性でありうる。ＮＡＤＨ依存性酵素は、ＥＣ１．１．１．１として知られ、例えばロドコッカス・ルバー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｕｂｅｒ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＣＡＤ３６４７５（配列番号３０）、ＡＪ４９１３０７（配列番号２９））から入手可能である。ＮＡＤＰＨ依存性酵素は、ＥＣ１．１．１．２として知られ、例えばパイロコッカス・フリオシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＡＡＣ２５５５６、ＡＦ０１３１６９）から入手可能である。
【００５２】
「アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ」または「アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ」という用語は、電子供与体としてＮＡＤＰＨ（還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）を用いるアセト乳酸の２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への変換を触媒する酵素を示す。好ましいアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼは、ＥＣ番号１．１．１．８６として知られ、配列が、限定はされないが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿４１８２２２（配列番号３２）、ＮＣ＿０００９１３（配列番号３１））、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿０１３４５９、ＮＣ＿００１１４４）、メタノコッカス・マリパルディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＣＡＦ３０２１０、ＢＸ９５７２２０）、および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＣＡＢ１４７８９、Ｚ９９１１８）を含む、極めて多数の微生物から入手可能である。
【００５３】
「アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ」という用語は、２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸のα−ケトイソ吉草酸への変換を触媒する酵素を示す。好ましいアセトヒドロキシ酸脱水酵素はＥＣ番号４．２．１．９として既知である。これらの酵素は、限定はされないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＹＰ＿０２６２４８（配列番号３４）、ＮＣ＿０００９１３（配列番号３３））、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿０１２５５０、ＮＣ＿００１１４２）、メタノコッカス・マリパルディス（Ｍ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＣＡＦ２９８７４、ＢＸ９５７２１９）、および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＣＡＢ１４１０５、Ｚ９９１１５）を含む、極めて多数の微生物から入手可能である。
【００５４】
「分岐鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ」という用語は、α−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒドおよびＣＯ2への変換を触媒する酵素を示す。好ましい分岐鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼは、ＥＣ番号４．１．１．７２として知られ、限定はされないが、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＡＡＳ４９１６６、ＡＹ５４８７６０；ＣＡＧ３４２２６（配列番号３６）、ＡＪ７４６３６４）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿４６１３４６、ＮＣ＿００３１９７）、およびクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿１４９１８９、ＮＣ＿００１９８８）を含む多数の供給源から入手可能である。
【００５５】
「分岐鎖アルコール脱水素酵素」という用語は、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒する酵素を示す。好ましい分岐鎖アルコール脱水素酵素は、ＥＣ番号１．１．１．２６５として知られるが、他のアルコール脱水素酵素（具体的にはＥＣ１．１．１．１または１．１．１．２）下でも分類可能である。これらの酵素では、電子供与体としてＮＡＤＨ（還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）および／またはＮＡＤＰＨが用いられ、限定はされないが、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿０１０６５６、ＮＣ＿００１１３６；ＮＰ＿０１４０５１、ＮＣ＿００１１４５）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿４１７４８４（配列番号３８）、ＮＣ＿０００９１３（配列番号３７））、およびクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿３４９８９２、ＮＣ＿００３０３０）を含む多数の供給源から入手可能である。
【００５６】
「遺伝子」という用語は、場合によりコード配列の上流（５’非コード配列）および下流（３’非コード配列）の調節配列を含む、特定のタンパク質として発現可能な核酸断片を示す。「天然遺伝子」は、それ自体の調節配列を有する天然に見出される遺伝子を示す。「キメラ遺伝子」は、天然遺伝子でない任意の遺伝子を示し、天然に同時に見出されることのない調節およびコード配列を含む。したがって、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列または同じ供給源に由来する調節配列およびコード配列を含みうるが、天然に見出されるものとは異なる様式で配列されている。「内因性遺伝子」は、生物のゲノム内のその天然の位置における天然遺伝子を示す。「外来」遺伝子は、通常は宿主生物内に見出されることはないが宿主生物に遺伝子導入によって導入される遺伝子を示す。外来遺伝子は、非天然の生物に導入される天然遺伝子またはキメラ遺伝子を含みうる。「トランス遺伝子」は、形質転換手順によりゲノムに導入されている遺伝子である。
【００５７】
本明細書で用いられる「コード配列」という用語は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を示す。「適切な調節配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、コード配列内、またはその下流（３’非コード配列）に位置するヌクレオチド配列を示し、関連のコード配列の転写、ＲＮＡのプロセシングまたは安定性あるいは翻訳に作用する。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステムループ構造を含みうる。
【００５８】
「プロモーター」という用語は、コード配列または機能ＲＮＡの発現を制御可能なＤＮＡ配列を示す。一般に、コード配列はプロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは、その全体として天然遺伝子に由来するか、または天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なる要素から構成されるか、またはさらに合成ＤＮＡセグメントを含む場合がある。異なるプロモーターが異なる組織または細胞種における、あるいは発生の異なる段階で、あるいは異なる環境または生理的状態に応答して遺伝子の発現を誘導可能であることが当業者により理解されている。大部分の細胞種内でほぼ常に遺伝子の発現を誘導するプロモーターが一般に「構成プロモーター」と称される。さらに、ほとんどの場合、調節配列の正確な境界が完全に限定されていないことから、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有しうることと理解されている。
【００５９】
「作動可能に連結される」という用語は、一方の機能が他方により影響を受けるような核酸配列の単一の核酸断片上への結合を示す。例えば、プロモーターが、そのコード配列の発現に効果を及ぼすことが可能である（すなわちコード配列がプロモーターの転写調節下にある）場合、コード配列に作動可能に連結されている。コード配列は調節配列にセンスまたはアンチセンス方向に作動可能に連結されうる。
【００６０】
本明細書で用いられる「発現」という用語は、本発明の核酸断片に由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を示す。発現はｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳も示しうる。
【００６１】
本明細書で用いられる「形質転換」という用語は、核酸断片の宿主生物への転移を示し、遺伝的に安定な遺伝的形質をもたらす。形質転換された核酸断片を有する宿主生物は、「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換された」生物と称される。
【００６２】
「プラスミド」および「ベクター」という用語は、細胞の中央代謝の一部でない、遺伝子を保有することが多く、通常は環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態である特別な染色体要素を示す。かかる要素は、任意の供給源に由来する直鎖状または環状の一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡにおける自己複製配列、ゲノム結合（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ）配列、ファージまたはヌクレオチド配列である場合があり、ここでは多数のヌクレオチド配列が適切な３’未翻訳配列を有する選択された遺伝子産物におけるプロモーター断片およびＤＮＡ配列を細胞に導入可能な固有の作成物に連結されるかまたは組換えられている。「形質転換ベクター」は、外来遺伝子を有し、かつ特定の宿主細胞の形質転換を促進する、外来遺伝子に加わる要素を有する特定のベクターを示す。
【００６３】
本明細書で用いられる「コドン縮重」という用語は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に作用することなくヌクレオチド配列の変異を可能にする遺伝子コードにおける性質を示す。当業者は、所定のアミノ酸を特定するためのヌクレオチドコドンの使用における特定の宿主細胞により示される「コドンバイアス」について十分理解している。したがって、宿主細胞内での改善された発現を意図して遺伝子を合成する場合、遺伝子をそのコドン使用の頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用の頻度に近づくように設計することが望ましい。
【００６４】
「コドンが最適化された」という用語は、様々な宿主の形質転換における核酸分子の遺伝子またはコード領域を示すとき、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを改変することなく宿主生物の典型的なコドンの使用を反映するための核酸分子の遺伝子またはコード領域におけるコドンの改変を示す。
【００６５】
ここで用いられる標準の組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野で周知であり、サムブルック  Ｊ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．）、フリッツ  Ｅ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ  Ｅ．Ｆ．）およびマニアティス  Ｔ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）のコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）（１９８９年）（以後「マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）」）；シルハヴィ  Ｔ．Ｊ．（Ｓｉｌｈａｖｙ  Ｔ．Ｊ．）、ベナン  Ｍ．Ｌ．（Ｂｅｎｎａｎ  Ｍ．Ｌ．）、およびエンキスト  Ｌ．Ｗ．（Ｅｎｑｕｉｓｔ  Ｌ．Ｗ．）、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ」、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）のコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）（１９８４年）；ならびにアウスベル  Ｆ．Ｍ．（Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．）ら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、グリーン・パブリッシング・アソシエーション・アンド・ウィレイ・インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）発行（１９８７年）に記載されている。
【００６６】
本明細書で用いられる「発明（ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）」または「本発明（ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）」という用語は、提示されるまたは後に補正および補足がなされる特許請求の範囲あるいは本明細書において記載の本発明のすべての実施形態に一般に適用することを意味する。
【００６７】
一実施形態では、本発明はブタノール耐性微生物を単離するための方法を提供する。方法は、下記に詳述されるように、微生物コンソーシアムを成長条件下で濃縮するステップと、濃縮されたコンソーシアムをブタノールと接触させるステップと、を含む。アルコール、特にブタノールに対して高い耐性を示す、本発明の方法により同定された微生物も提供される。これらの同定された微生物はまた、２−ブタノンおよびエタノールに対しても高い耐性を有する。これらのブタノール耐性微生物は、ブタノール生合成経路または２−ブタノン生合成経路を含むように遺伝子操作可能であり、かつ高力価に至る１−ブタノール、２−ブタノール、イソブタノール、または２−ブタノンの生物学的生成において使用可能である。
【００６８】
ブタノール耐性微生物の単離
ブタノール耐性微生物は、排水汚泥などの環境試料ならびにブタノールおよび／または他の溶媒に暴露される場合の他の環境から得られる試料から単離されうる。例えば、環境試料は化学プラントでの排水処理施設から入手可能である。産業排水用バイオリアクターは、様々な有機溶媒の存在下での長期間の成長が理由で、望ましい耐性の表現型を有する微生物の環境試料における特に適した供給源である（ブラムッチ（Ｂｒａｍｕｃｃｉ）ら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：５０１−５０５頁（２０００年））。ブタノール耐性微生物は、同様に他の微生物試料から単離されうる。例えば、微生物試料は、純粋な細菌株の化学的に突然変異が誘発された微生物集団、マルチコピープラスミドライブラリーを有する微生物株、または特定の株のトランスポゾンでタグ化された突然変異体の集団でありうる。混合集団を含むこれらの微生物試料のいずれかが微生物コンソーシアムを含むといわれている。
【００６９】
本発明の一実施形態では、微生物試料は過剰な成長栄養素を有する成長培地内で培養されることにより、その中に含有される微生物コンソーシアムがコンソーシアムのメンバーが成長するようになるまで濃縮される。一実施形態では、培養物は対数期に成長している。成長培地は発酵性炭素源を含有し、適切なレベルの窒素、リン、硫黄、および塩を含有しうる。微生物コンソーシアムの成長にとって必要なこれらの栄養素の適切なレベルは当業者には周知であり、非限定的例が下記に提供される。発酵性炭素源は、限定はされないが、スクロース、フルクトース、グルコース、およびそれらの混合物を含む、微生物コンソーシアムのメンバーにより容易に代謝される任意の炭素源でありうる。発酵性炭素源はまた、脂肪酸、酪酸または吉草酸などのカルボン酸でありうる。炭素源は、典型的には約０．１％ｗ／ｖ（重量／容量）〜約１．５％ｗ／ｖの濃度で存在する。窒素源は、限定はされないが、アンモニウム塩または酵母抽出物を含む任意の適切な窒素源でありうる。窒素源は、典型的には約１０ｍＭの濃度で成長培地内に存在する。リンはリン酸塩、例えばリン酸ナトリウムおよびリン酸カリウムの形態で培地内に存在する場合があり、典型的には約５０ｍＭの濃度で成長培地内に存在する。硫黄は硫酸塩、例えば硫酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウムの形態で培地内に存在する場合があり、典型的には約１０ｍＭの濃度で成長培地内に存在する。さらなる塩が、限定はされないが、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化マンガン、塩化第二鉄、塩化第一鉄、塩化亜鉛、塩化第二銅、塩化コバルト、およびモリブデン酸ナトリウムを含む。これらの塩は、典型的には約１μＭ〜約２ｍＭの濃度で成長培地内に存在する。成長培地は塩酸チアミンなどのビタミンも含有しうる。
【００７０】
濃縮培養物が、約２５℃〜約６０℃の温度で、試料中の微生物コンソーシアムのメンバーが成長を示すのに十分な時間、典型的には約１２時間〜約２４時間成長される。培養物は、撹拌の有無にかかわらず、嫌気性、微好気性、または好気性条件の下で成長可能である。当業者により容易に理解されるように、嫌気性条件は酸素を含まない条件であり、好気性条件は酸素を含む条件であり、かつ微好気性条件は酸素が空気中に見出されるレベル未満、すなわち２１％未満で存在する場合の条件である。培養物の成長が、光学密度を典型的には６００ｎｍの波長で測定することにより監視可能である。
【００７１】
次いで、成長中の濃縮培養物はブタノールと接触される。この接触するステップは、濃縮培養物を、ブタノールを含有する新鮮成長培地で希釈することにより行われうる。それは濃縮培養物がこの時点で対数期に成長している場合に特に適切である。用いられるブタノール濃度は約０．８％ｗ／ｖ〜約３．０％ｗ／ｖ、好ましくは約０．８％ｗ／ｖ〜約２．０％ｗ／ｖである。一実施形態では、ブタノールは主に１−ブタノールである。別の実施形態では、ブタノールは主に２−ブタノールである。別の実施形態では、ブタノールは主にイソブタノールである。本明細書で用いられるように、主にとはブタノール全体の少なくとも約９０重量％を意味する。さらに、１−ブタノール、２−ブタノール、およびイソブタノールのうちの２つ以上の様々な組み合わせを含む混合物が使用可能である。培養物は、有意な成長が観察されるまでの時間にわたり成長される。場合により、有意な成長を示す培養物をブタノールと再び１回以上接触させることで、ブタノールに対する増強された耐性について選択することが可能である。各接触は、ブタノール濃度を漸増させなが
ら実施されうる。
【００７２】
次いで、ブタノールと接触された微生物コンソーシアムは分離され、個々の株が単離される。細胞単離の複数の手段については当業者に既知であり、液体または固体培地のいずれかを含む。例えば、ブタノールと接触された微生物コンソーシアムは、ブタノールを含有する場合も含有しない場合もある固体培地、例えば栄養寒天培地、ルリア・ベルターニ（Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）寒天、修飾されたＬＢ寒天（すなわち発酵性炭素源および塩が補充されたＬＢ寒天）、または寒天を有する最小濃縮培地の上にプレーティング可能である。ブタノールが固体培地内に存在する場合、その濃度は典型的には約１．２％ｗ／ｖ〜約３％ｗ／ｖである。培養物はコロニーが形成されるまで成長される。次いで、コロニーは当該技術分野で既知の方法を用いて単離され、ブタノール耐性微生物がもたらされる。例えば、下記に記載のように、固体培地由来のコロニーは回収され、当該技術分野で既知の方法を用いて同定されうる。あるいは、固体培地由来のコロニーは、ブタノールを含有しない液体または固体のいずれかの成長培地（例えば最小濃縮培地）に接種可能である。細胞は、成長後に回収され、同定されうる。場合により、コロニー由来の細胞は、ブタノールの存在下、液体または固体成長培地（例えば最小濃縮培地）内のいずれかで成長されうる。典型的には、培地内のブタノール濃度は約１．２％ｗ／ｖ〜約３％ｗ／ｖである。ブタノールの存在下で成長中の細胞は回収される。単離された微生物は、当該技術分野で既知の方法、例えば１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子の配列決定、脂肪酸の特性分析、またはリボタイピングを用いて同定可能である。
【００７３】
本発明の方法により単離されたブタノール耐性微生物は、固体培地上、３７℃で成長される場合には少なくとも２．５％のブタノール（すなわち、１−ブタノール、２−ブタノール、またはイソブタノール）、または液体培地内、３７℃で成長される場合には少なくとも２．０％ｗ／ｖのブタノールに耐性がある。微生物のブタノール耐性が典型的には液体培地上で成長される場合よりも固体培地上で成長される場合の方が高いことは注目されるべきである。さらに、微生物のブタノール耐性は成長温度に依存し、典型的にはより低い成長温度でより高い。濃縮された微生物コンソーシアムを１−ブタノールと接触させて単離された微生物は、一般に他のブタノールならびに２−ブタノンおよびエタノールにも耐性がある。例えば、１−ブタノールを用いて単離された微生物は２−ブタノールおよびイソブタノールにも耐性がある。
【００７４】
本方法を用いて単離された株の耐性は、添加される試験化学物質を含有する液体培地内での成長についてＩＣ50値を判定することにより評価可能である。ＩＣ50値は５０％の成長阻害を誘発する化学物質の濃度である。本明細書中の実施例１および２に示されるように、１−ブタノールにおける１．８％ｗ／ｖ、イソブタノールにおける２．４％ｗ／ｖ、２−ブタノールにおける３．１％ｗ／ｖ、２−ブタノンにおける４．５％ｗ／ｖおよびエタノールにおける５．９％ｗ／ｖというＩＣ50値が選択された株内で判定された。同定された耐性株は、１−ブタノールを含有する固体培地上での株の成長、これらのＩＣ50値および１−ブタノールに対する耐性と他の各試験化合物に対する耐性の間に見られる相関に基づくと、２．７％ｗ／ｖのイソブタノール、３．９％ｗ／ｖの２−ブタノール、５．０％ｗ／ｖの２−ブタノン、または９．０％ｗ／ｖのエタノールを含有する固体培地上で成長することが予想される。
【００７５】
濃縮培養物はまた、ケモスタットバイオリアクター内の連続培養物中で成長され、ブタノールと接触されうる。ケモスタットバイオリアクター内の細胞は、希釈率の適切な調節により様々な成長速度で成長可能である。ケモスタットの培養物における通気およびｐＨが正確に制御可能であることから、より高い細胞密度がもたらされる。さらに、ブタノールは供給組成物の調節により濃度増加において徐々に添加可能である。バイオリアクター内での濃縮培養物とブタノールとの接触後、ブタノール耐性微生物は上記のように単離され、同定される。
【００７６】
意外なことに、本明細書中の実施例において本発明の方法を用いて同定された多数のブタノール耐性微生物が乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌であった。乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）は通性嫌気性、グラム陽性、非運動性、棒状体細胞である（「Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」、第２巻、スニース（Ｓｎｅａｔｈ）ら編；メリーランド州ボルチモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）のウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）、１９８６年、１０６３−１０６５頁）。ブタノール耐性乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列（配列番号４１、４２、４３、および４４）を決定することにより本明細書中でさらに特徴づけられ、それによりプランタラム菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）およびラクトバチルス・アリゾネンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｉｚｏｎｅｎｓｉｓ）株であることが同定された。
【００７７】
ブタノール耐性微生物を単離するための本方法を改良することで、ブタノール耐性乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の選択的単離が可能である。例えば、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）は、Ｂａｃｔｏ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ  ＭＲＳ寒天などの乳酸菌培地を用いる、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）を培養するための標準的方法を用いて種々の環境から濃縮され、次いで１−ブタノールへの耐性についてスクリーニングされうる。
【００７８】
単離されたブタノール耐性乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株は、遺伝子操作によりブタノール生合成経路またはブタノン生合成経路をコードする遺伝子コンストラクトを含みうるとともに、適切な条件下で成長されることでブタノールまたはブタノンの生成が可能である。ブタノール生合成経路は、１−ブタノール、２−ブタノール、またはイソブタノール生合成経路でありうる。
【００７９】
１−ブタノール生合成経路
１−ブタノールを生成するための生合成経路は、ドナルドソン（Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ）らによる同時係属および共同所有の米国特許出願第１１／５２７９９５号明細書（参照により本明細書中に援用される）中に記載されている。この生合成経路は、
ａ）アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡへ（例えば配列番号１または３として示される遺伝子によりコードされるアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼにより触媒される）、
ｂ）アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへ（例えば配列番号５として示される遺伝子によりコードされる３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素により触媒される）、
ｃ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからクロトニル−ＣｏＡへ（例えば配列番号７として示される遺伝子によりコードされるクロトナーゼにより触媒される）、
ｄ）クロトニル−ＣｏＡからブチリル−ＣｏＡへ（例えば配列番号９として示される遺伝子によりコードされるブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素により触媒される）、
ｅ）ブチリル−ＣｏＡからブチルアルデヒドへ（例えば配列番号１１として示される遺伝子によりコードされるブチルアルデヒド脱水素酵素により触媒される）、および
ｆ）ブチルアルデヒドから１−ブタノールへ（例えば配列番号１３または１５として示される遺伝子によりコードされる１−ブタノール脱水素酵素により触媒される）、
といった基質から生成物への変換を含む。
【００８０】
経路はＡＴＰを全く必要とせず、ＮＡＤ+および／またはＮＡＤＰ+を生成することから、アセチル−ＣｏＡを生成する中央代謝経路と均衡する。
【００８１】
２−ブタノールおよび２−ブタノン生合成経路
２−ブタノールおよび２−ブタノンを生成するための生合成経路は、ドナルドソン（Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ）らによる同時係属および共同所有の米国特許出願第１１／７４１８９２号明細書および米国特許出願第１１／７４１９１６号明細書（参照により本明細書中に援用される）の中に記載されている。１つの２−ブタノール生合成経路が、
ａ）ピルビン酸塩からα−アセト乳酸へ（例えば配列番号１９として示される遺伝子によりコードされるアセト乳酸シンターゼにより触媒される）、
ｂ）α−アセト乳酸からアセトインへ（例えば配列番号１７として示される遺伝子によりコードされるアセト乳酸デカルボキシラーゼにより触媒される）、
ｃ）アセトインから２，３−ブタンジオールへ（例えば配列番号２１として示される遺伝子によりコードされるブタンジオール脱水素酵素により触媒される）、
ｄ）２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへ（例えば配列番号２３、２５、および２７として示される遺伝子によりコードされるブタンジオールデヒドラターゼにより触媒される）、および
ｅ）２−ブタノンから２−ブタノールへ（例えば配列番号２９として示される遺伝子によりコードされる２−ブタノール脱水素酵素により触媒される）、
といった基質から生成物への変換を含む。
【００８２】
上記経路の最後のステップ（ｅ）を省略することにより、メチルエチルケトン（ＭＥＫ）としても知られる２−ブタノンを生成するための生合成経路が提供される。
【００８３】
イソブタノール生合成経路
イソブタノールを生成するための生合成経路は、マッジオ−ホール（Ｍａｇｇｉｏ−Ｈａｌｌ）らによる同時係属および共同所有の米国特許出願第１１／５８６３１５号明細書（参照により本明細書中に援用される）中に記載されている。１つのイソブタノール生合成経路が、
ａ）ピルビン酸塩からアセト乳酸塩へ（例えば配列番号１９として示される遺伝子によりコードされるアセト乳酸シンターゼにより触媒される）、
ｂ）アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸へ（例えば配列番号３１として示される遺伝子によりコードされるアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼにより触媒される）、
ｃ）２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸へ（例えば配列番号３３として示される遺伝子によりコードされるアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼにより触媒される）、
ｄ）α−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒドへ（例えば配列番号３５として示される遺伝子によりコードされる分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼにより触媒される）、および
ｅ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへ（例えば配列番号３７として示される遺伝子によりコードされる分岐鎖アルコール脱水素酵素により触媒される）、
といった基質から生成物への変換を含む。
【００８４】
ブタノールまたはブタノンを生成するための乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主の作成
発酵性炭素基質をブタノールまたはブタノンに変換するための酵素経路の１つとして酵素をコードする必要な遺伝子を有する組換えブタノール耐性乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株は、当該技術分野で周知の技術を用いて作成されうる。プランタラム菌（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、サリバリウス菌（Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・サケイ（Ｌ．ｓａｋｅｉ）、ラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、アシドフィルス菌（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）およびブルガリア乳酸菌（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）のゲノム配列は、既知であり（国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）データベース）、
・プランタラム菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＷＣＦＳ１、完全ゲノム
ｇｉ｜２８３７６９７４｜ｒｅｆ｜ＮＣ＿００４５６７．１｜［２８３７６９７４］
・ラクトバチルス・サリバリウス・サブエスピー・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）ＵＣＣ１１８、完全ゲノム
ｇｉ｜９０９６０９９０｜ｒｅｆ｜ＮＣ＿００７９２９．１｜［９０９６０９９０］
・ラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ）株２３Ｋ、完全ゲノム
ｇｉ｜７８６０９２５５｜ｅｍｂ｜ＣＲ９３６５０３．１｜［７８６０９２５５］
・ラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＮＣＣ５３３、完全ゲノム
ｇｉ｜４２５１８０８４｜ｒｅｆ｜ＮＣ＿００５３６２．１｜［４２５１８０８４］
・アシドフィルス菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＮＣＦＭ、完全ゲノム
ｇｉ｜５８３３６３５４｜ｒｅｆ｜ＮＣ＿００６８１４．１｜［５８３３６３５４］
・ラクトバチルス・デルブレッキー・サブエスピー・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ１１８４２、完全ゲノム
ｇｉ｜１０４７７３２５７｜ｒｅｆ｜ＮＣ＿００８０５４．１｜［１０４７７３２５７］といったジェンバンク（ｇｅｎｂａｎｋ）（商標）の識別番号である。
【００８５】
これらの細菌は３２％〜４９％の範囲のＧ＋Ｃ含量を有する。
【００８６】
本発明では、上記のブタノールまたはブタノン生合成経路の一方の酵素をコードする遺伝子が様々な供給源から単離されうる（上記参照）。細菌ゲノムから所望の遺伝子を得る方法については一般的であり、かつ分子生物学分野で周知である。例えば、遺伝子の配列が既知である場合、プライマーを設計し、所望の配列をポリメラーゼ連鎖反応などの標準のプライマー特異的増幅方法（米国特許第４，６８３，２０２号明細書）を用いて増幅することで、形質転換ベクターへのクローニングに対して適量のＤＮＡを得ることが可能である。既知の配列に対して異種の遺伝子が単離されることになる場合、適切なゲノムライブラリーが制限エンドヌクレアーゼ消化により生成され、所望の遺伝子配列に対して相補配列を有するプローブを用いてスクリーニングされうる。一旦配列が単離されると、ＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応などの標準のプライマー特異的増幅方法（米国特許第４，６８３，２０２号明細書）を用いて増幅することで発現ベクターへのクローニングに対して適量のＤＮＡが得ることが可能であり、それは次いで適切な宿主細胞に形質転換される。
【００８７】
さらに、所望の酵素活性を有するタンパク質のアミノ酸配列を仮定すると、コード配列はタンパク質配列の逆翻訳により確認されうる。コード配列を有するＤＮＡ断片が、合成的に調製され、発現ベクターにクローニングされ、次いで所望の宿主細胞に形質転換されうる。
【００８８】
コード配列を有する合成ＤＮＡ断片の調製においては、この配列は標的宿主細胞内での発現に最適化されうる。異種宿主内での発現におけるコドン最適化のためのツールは容易に用いられうる。
【００８９】
一旦、関連の経路の遺伝子が同定されかつ単離されると、それらは当該技術分野で周知の手段により、ベクターに挿入され、ブタノール耐性乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主に形質転換されうる。乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の形質転換にとって有用なベクターについては既知である（下記参照）。典型的には、ベクターまたはカセットは、挿入されたＤＮＡ断片の転写および翻訳を誘導する配列、選択可能なマーカー、および自己複製または染色体組込みを可能にする配列を有する。適切なベクターは、転写開始制御を内在する挿入されたＤＮＡ断片の５’領域および転写終結を制御するＤＮＡ断片の３’領域を含む。両方の制御領域は形質転換宿主細胞に相同な遺伝子から誘導可能であるが、かかる制御領域が特定の生成宿主に対して天然でない遺伝子からも誘導可能であることが理解されるべきである。
【００９０】
開始制御領域またはプロモーターは、所望の乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞内での関連の経路をコードする領域の発現を駆動するのに有用であり、他の乳酸菌または他のグラム陽性生物から得ることが可能である。非限定例としてラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来のｎｉｓＡプロモーターが挙げられる。終結制御領域は、好ましい宿主または関連の細菌に対して天然の様々な遺伝子からも得ることが可能である。場合により終結部位が不要である場合があるが、含まれる場合が最も好ましい。
【００９１】
乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属はラクトバチルス目（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）ファミリーに属し、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）および連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の形質転換において用いられる多数のプラスミドおよびベクターが乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に用いられうる。適切なベクターの非限定例として、ｐＡＭβ１およびその誘導体（ルノー（Ｒｅｎａｕｌｔ）ら、Ｇｅｎｅ  １８３：１７５−１８２頁（１９９６年）；およびオサリバン（Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ）ら、Ｇｅｎｅ  １３７：２２７−２３１頁（１９９３年））、ｐＭＢＢ１およびｐＨＷ８００、ｐＭＢＢ１の誘導体（ウィコッフ（Ｗｙｃｋｏｆｆ）ら  Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２：１４８１−１４８６頁（１９９６年））；ｐＭＧ１、複合プラスミド（タニモト（Ｔａｎｉｍｏｔｏ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：５８００−５８０４頁（２００２年））；ｐＮＺ９５２０（クレールベゼム（Ｋｌｅｅｒｅｂｅｚｅｍ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：４５８１−４５８４頁（１９９７年））；ｐＡＭ４０１（フジモト（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：１２６２−１２６７頁（２００１年））；ならびにｐＡＴ３９２（アーサー（Ａｒｔｈｕｒ）ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３８：１８９９−１９０３頁（１９９４年））が挙げられる。プランタラム菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来の数種のプラスミドも報告されており（ヴァン・クラネンバーグ  Ｒ．（ｖａｎ  Ｋｒａｎｅｎｂｕｒｇ  Ｒ．）、ゴリック  Ｎ．（Ｇｏｌｉｃ  Ｎ．）、ボンジャース  Ｒ．（Ｂｏｎｇｅｒｓ  Ｒ．）、レア  Ｒ．Ｊ．（Ｌｅｅｒ  Ｒ．Ｊ．）、デ・ボス  Ｗ．Ｍ．（ｄｅ  Ｖｏｓ  Ｗ．Ｍ．）、ジーゼン  Ｒ．Ｊ．（Ｓｉｅｚｅｎ  Ｒ．Ｊ．）、クリーレベゼム  Ｍ．（Ｋｌｅｅｒｅｂｅｚｅｍ  Ｍ．）  Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００５年３月；７１（３）：１２２３−１２３０頁）、それらは形質転換において用いられうる。
【００９２】
ブタノールまたはブタノン生合成経路用の様々な遺伝子は、例えば上記の任意の適切なベクターに構築可能である。コドンは、例えばプランタラム菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）またはラクトバチルス・アリゾネンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｉｚｏｎｅｎｓｉｓ）における宿主株のゲノム配列から推定されるコドンインデックス（ｃｏｄｏｎ  ｉｎｄｅｘ）に基づいて発現のために最適化されうる。プラスミドは、クルス−ロッズ（Ｃｒｕｚ−Ｒｏｄｚ）ら、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２２４：１２５２−１５４頁（１９９０年））、ブリンゲル（Ｂｒｉｎｇｅｌ）およびユベール（Ｈｕｂｅｒｔ）（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３：６６４−６７０頁（１９９０年））、ならびにテレサ・アレグレ（Ｔｅｒｅｓａ  Ａｌｅｇｒｅ）、ロドリゲス（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ）およびメサス（Ｍｅｓａｓ）（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｌｅｔｔｅｒｓ
２４１：７３−７７頁（２００４年））といった参考文献のいずれかに記載の当該技術分野で既知の方法、例えばエレクトロポレーションを用いて宿主細胞に導入可能である。プラスミドは複合によりプランタラム菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）にも導入可能である（シュラゴ（Ｓｈｒａｇｏ）、シャッシー（Ｃｈａｓｓｙ）およびドブロゴス（Ｄｏｂｒｏｇｏｓｚ）  Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏ．５２：５７４−５７６頁（１９８６年））。ブタノールまたはブタノン生合成経路遺伝子は、組込みベクターを用いて乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の染色体に組込み可能である（ホルス（Ｈｏｌｓ）ら  Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏ．６０：１４０１−１４０３頁（１９９０年）；ジャン（Ｊａｎｇ）ら、Ｍｉｃｒｏ．Ｌｅｔｔ．２４：１９１−１９５頁（２００３年））。
【００９３】
発酵培地
ブタノールまたはブタノンを生成するための発酵培地は、適切な炭素基質を含有する必要がある。適切な基質は、限定はされないが、グルコースおよびフルクトースなどの単糖、乳糖またはスクロースなどのオリゴ糖、デンプンまたはセルロースなどの多糖、あるいはそれらの混合物、ならびに乳清透過液、コーンスティープリカー（ｃｏｒｎｓｔｅｅｐ  ｌｉｑｕｏｒ）、砂糖液（ｓｕｇａｒ  ｂｅｅｔ  ｍｏｌａｓｓｅｓ）、および大麦モルト（ｂａｒｌｅｙ  ｍａｌｔ）などの再生可能な原料由来の未精製混合物を含みうる。スクロースは、サトウキビ、甜菜、キャッサバ、およびさとうもろこし（Ｓｗｅｅｔ  ｓｏｒｇｈｕｍ）などの原料から入手可能である。グルコースおよびデキストロースは、とうもろこし、小麦、ライ麦、大麦、およびオート麦などの穀物を含むデンプンベースの原料の糖化を通じて得ることが可能である。
【００９４】
さらに、発酵性糖が、セルロース系およびリグノセルロース系のバイオマスから、例えば共同所有および同時係属の米国特許出願公開第２００７００３１９１８Ａ１号明細書（参照により本明細書中に援用される）中に記載の前処理および糖化のプロセスを通じて得ることが可能である。バイオマスは、任意のセルロース系またはリグノセルロース系の原料を示し、セルロースを含有し、かつ場合により、ヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖および／または単糖をさらに含有する原料を含む。バイオマスは、追加成分、例えばタンパク質および／または脂質も含有しうる。バイオマスは単一の供給源から誘導されうるか、またはバイオマスは２つ以上の供給源から誘導される混合物を含有する可能性があり、バイオマスは、例えばとうもろこし穂軸（ｃｏｒｎ  ｃｏｂ）およびコーンストーバーの混合物または草および葉の混合物を含有しうる。バイオマスは、限定はされないが、バイオエネルギー作物、農業残渣、地方自治体の固体廃棄物、産業固体廃棄物、製紙から排出される汚泥、庭ごみ、廃材および林業廃棄物を含む。バイオマスの例として、限定はされないが、とうもろこし粒、とうもろこし穂軸、とうもろこしの皮などのとうもろこし残渣、コーンストーバー、草、小麦、麦かん（ｗｈｅａｔ  ｓｔｒａｗ）、大麦、麦かん（ｂａｒｌｅｙ  ｓｔｒａｗ）、干し草、稲わら、スイッチグラス、紙くず、トウキビバガス、さとうもろこし、大豆、穀物、木、枝、根、葉、木片、おがくず、シュラブおよびブッシュのミリングから得られる成分、野菜、果物、花ならびに家畜糞尿が挙げられる。
【００９５】
上記の炭素基質およびそれらの混合物のすべてが本発明において適すると考えられるが、好ましい炭素基質はグルコース、フルクトース、およびスクロースである。
【００９６】
発酵培地は、適切な炭素源に加え、ブタノールまたはブタノンの生成に必要な培養物の成長および酵素経路の促進に適する、当業者に既知の、適切なミネラル、塩、共同因子、
緩衝液および他の成分を含有する必要がある。
【００９７】
培養条件
典型的には、適切な培地内、約２５℃〜約４０℃の範囲内の温度で細胞が成長される。本発明における適切な成長培地は、Ｂａｃｔｏ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ  ＭＲＳ培養液またはＡｇａｒ（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ））、ルリア・ベルターニ（ＬＢ）培養液、サブロー・デキストロース（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ）（ＳＤ）培養液または酵母培地（ＹＭ）培養液などの一般的な商業的に調製された培地である。他の限定または合成された成長培地も用いられる場合があり、かつ特定の微生物の成長に適する培地について微生物学または発酵科学に関する当業者は知っているであろう。異化代謝産物抑制を直接的または間接的に調節することで知られる作用物質、例えば環状アデノシン２’：３’−一リン酸の使用についても発酵培地に取り込まれうる。
【００９８】
発酵に適するｐＨ範囲はｐＨ５．０〜ｐＨ９．０であり、初期条件としてはｐＨ６．０〜ｐＨ８．０が好ましい。
【００９９】
発酵は好気性または嫌気性条件下で実施可能であり、嫌気性または微好気性条件が好ましい。
【０１００】
工業用バッチおよび連続発酵
発酵のバッチ方法を用い、ブタノールまたはブタノンが生成可能である。従来のバッチ発酵は、培地の組成物が発酵開始時に設定され、発酵の間に人工的な改変が施されることがない閉鎖系である。標準のバッチシステムに対する変形がフェドバッチシステムである。フェドバッチ発酵プロセスは本発明においても適切であり、発酵の進行につれて基質が発酵プロセスごとに添加されること以外では典型的なバッチシステムを含む。フェドバッチシステムは、異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向がある場合や培地内に限られた量の基質を有することが望ましい場合に有用である。バッチおよびフェドバッチ発酵は一般的で、当該技術分野で周知であり、例がトーマス  Ｄ．（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．）「Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、第２版（１９８９年）  マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ）のシナウアー・アソシエーツ（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）またはデシュパンデ・ムクンド  Ｖ．（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．）、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３６：２２７頁（１９９２年）（参照により本明細書中に援用される）において見出されうる。
【０１０１】
ブタノールまたはブタノンは、連続発酵方法を用いても生成可能である。連続発酵は、限定された発酵培地がバイオリアクターに連続的に添加されかつ等量の条件培地が処理と同時に除去される開放系である。連続発酵では、細胞が主に対数期での成長の最中である場合、一般に一定の高密度で培養物が維持される。連続発酵では、細胞成長または最終生成物濃度に作用する１つの要素またはいくつかの要素の調節が可能になる。連続発酵プロセス用の栄養素および成長因子を調節する方法ならびに生成物形成の速度を最大化するための技術については産業微生物学分野で周知であり、かつ種々の方法がＢｒｏｃｋ、上記で詳述されている。
【０１０２】
ブタノールまたはブタノンの生成がバッチ、フェドバッチまたは連続プロセスのいずれかを用いて実施可能であり、かつ発酵における既知のモードであればいずれであっても適することが考えられる。さらに、細胞が細胞触媒全体として基質上に固定化され、かつブタノールまたはブタノンの生成用の発酵条件に従いうることが考えられる。
【０１０３】
ブタノールおよび２−ブタノンを発酵培地から単離するための方法
生物学的に生成されたブタノールは、ＡＢＥ発酵分野で既知の方法を用いて発酵培地から単離されうる（例えば、デュレ（Ｄｕｒｒｅ）、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４９：６３９−６４８頁（１９９８年）、グルート（Ｇｒｏｏｔ）ら、Ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７：６１−７５頁（１９９２年）、およびその中の参考文献を参照）。例えば、固体が遠心分離、濾過、デカンテーションなどにより発酵培地から除去されうる。次いで、ブタノールは、蒸留、共沸蒸留、液体−液体抽出、吸着、ガスストリッピング、膜蒸発、または浸透気化法などの方法を用いて発酵培地から単離されうる。これらの同じ方法は、生物学的に生成された２−ブタノンの発酵培地からの単離に適合しうる。
【実施例】
【０１０４】
本発明はさらに以下の実施例にて定義される。これらの実施例が本発明の好ましい実施形態を示す一方であくまで例示目的で示されることは理解されるべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認でき、その趣旨および範囲から逸脱することなく本発明に対して様々な変更および改良を行うことで、本発明の様々な利用および条件への適合が可能である。
【０１０５】
略語の意味は以下の通りである。「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｓ」は秒を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍｍ」はミリメートルを意味し、「ｃｍ」はセンチメートルを意味し、「μｍ」はマイクロメートルを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「ｒｐｍ」は１分当たりの回転数を意味し、「ｗ／ｖ」は重量／容量を意味し、「ＯＤ」は光学密度を意味し、「ＯＤ600」は６００ｎｍの波長で測定された光学密度を意味し、「ＯＤ595」は５９５ｎｍの波長で測定された光学密度を意味し、「ＩＣ50」は成長の５０％の阻害を誘発するブタノールの濃度を意味し、「ＧＣＭＳ」はガスクロマトグラフィー−質量分析を意味し、かつ「ＨＰＬＣ」は高性能液体クロマトグラフィーを意味する。
【０１０６】
一般的方法
本実施例で用いられる標準の組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野で周知であり、サムブルック  Ｊ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッツ  Ｅ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）およびマニアティス  Ｔ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）のコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）（１９８９年）、Ｔ．Ｊ．シルハヴィ（Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ）、Ｍ．Ｌ．ベナン（Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ）、およびＬ．Ｗ．エンキスト（Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ）、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ」、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）のコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）（１９８４年）、ならびにアウスベル  Ｆ．Ｍ．（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）ら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、ニューヨーク州のグリーン・パブリッシング・アソシエーション・アンド・ウィレイ−インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）（１９８７年）により記載されている。
【０１０７】
細菌培養物の維持および成長に適する材料および方法についても当該技術分野で周知である。以下の実施例における使用に適する技術が、「Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」、フィリップ・ゲアハート（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マレイ（Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフ  Ｎ．コスチロウ（Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージン  Ｗ．ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリス  Ａ．ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエル  Ｒ．クリーグ（Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）およびＧ．ブリッグス・フィリップス（Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編、ワシントンＤＣ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．）のアメリカ微生物学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、１９９４年、またはトーマス  Ｄ．（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．）による「Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、第２版、マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ）のシナウアー・アソシエーツ（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）、１９８９年に見出されうる。細菌細胞の成長および維持に使用されるすべての試薬、制限酵素および材料は、他に特に規定がなければ、アルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ウィスコンシン州ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ））、ＢＤダイアグノスティック・システムズ（ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（メリーランド州スパークス（Ｓｐａｒｋｓ））、ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（メリーランド州ロックヴィル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ））、またはシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ））から入手した。
【０１０８】
実施例１
連続培養を用いるブタノール耐性菌株の単離
これらの実施例の目的は、ブタノール耐性菌株を単離することであった。環境試料をいくつかの排水処理場から得て、ケモスタットバイオリアクター内での連続培養で１−ブタノールの存在下で成長させた。数種の１−ブタノール耐性菌株を単離し、プランタラム菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）またはラクトバチルス・アリゾネンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｉｚｏｎｅｎｓｉｓ）として同定した。
【０１０９】
Ａｐｐｌｉｋｏｎ  Ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ（ニュージャージー州クリントン（Ｃｌｉｎｔｏｎ）のアプリコン（Ａｐｐｌｉｋｏｎ  Ｉｎｃ．））を嫌気性ケモスタットとして運転した。バイオリアクターシステムは、１Ｌの凹形底リアクター、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ  ＡＤＩ  １０３２  Ｐ１００、ならびにマリンおよびタービンインペラーを有する撹拌器ユニットからなるものであった。適切なセンサを備えるＢｉｏ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ  ＡＤＩ  １０３０  Ｚ５１０３０００２０でｐＨ、溶解酸素、および温度を監視した。Ｃｏｌｅ  Ｐａｒｍｅｒポンプおよびポンプヘッド（イリノイ州バーノンヒルズ（Ｖｅｒｎｏｎ  Ｈｉｌｌｓ）のコールパーマー・インスツルメント（Ｃｏｌｅ  Ｐａｒｍｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．））を酸および塩基の添加用に用い、ｐＨ７．０を維持した。循環式水槽を用い、温度を３７℃で維持した。培地（Ｓ２０培地）は、５ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０、１０ｍＭ硫酸アンモニウム、０．１％酵母抽出物、０．１％カゼアミノ酸（ｃａｓｅａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）、１００ｍＭ  ＭＯＰＳ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．７ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．０５ｍＭ  ＭｎＣｌ2、０．００１ｍＭ  ＺｎＣｌ2、０．００２ｍＭ塩酸チアミン、１．７２μＭ  ＣｕＣｌ2、２．５３μＭ  ＣｏＣｌ2、２．４２μＭ  Ｎａ2ＭｏＯ4、２５ｍＭグルコース、１２．５ｍＭスクロース、および１２．５ｍＭフルクトースからなるものであった。バイオリアクター内では容量５００ｍＬのこの培地を用いた。バイオリアクターを０．１〜１．０ｍＬ／分の範囲内の供給速度でかつ撹拌器を５０ｒｐｍの速度で運転した。
【０１１０】
バイオリアクターにイー・アイ・デュポン・ドゥ・ヌムール・アンド・カンパニー（Ｅ．Ｉ．ｄｕ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）の数か所の敷地での異なる排水処理設備から得られた数種の排水汚泥試料の混合物を接種した。バイオリアクターを、バッチモードで短時間運転後、１−ブタノールを培地に濃度増加において徐々に添加する連続供給モードで運転した。培地の流速は０．１〜１．０ｍＬ／分の範囲内であった。
【０１１１】
バイオリアクター内の細胞密度を６００ｎｍでの光学密度の測定により監視した。供給液内の１−ブタノールおよび廃液を、５９７３  Ｍａｓｓ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒを備えるＨＰ６８９０  Ｇａｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ（デラウェア州ウィルミントン（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ）のアジレント・テクノロジー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ））を用い、ＧＣＭＳにより測定した。ＧＣカラムはＤＢ−ＷＡＸ、３０ｍ×内径０．３２ｍｍ×０．２５μｍのカラム（カリフォルニア州フォルソム（Ｆｏｌｓｏｍ）の（ジェイアンドダブリュー・サイエンティフィック（Ｊ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．））であった。あるいは、試料を濾過し（Ａｃｒｏｄｉｓｃ  ＣＲ  ＰＴＦＥ、０．２μｍのフィルタ）、Ｓｈｏｄｅｘ（登録商標）ＳＨ−ＧガードカラムとともにＳｈｏｄｅｘ（登録商標）ＳＨ１０１１カラム（内径８ｍｍ×長３００ｍｍ；コロラド州コロラド・スプリングス（Ｃｏｌｏｒａｄｏ  Ｓｐｒｉｎｇｓ）のショーコー・アメリカ（Ｓｈｏｋｏ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｉｎｃ．））を用い、ＨＰＬＣにより分析した。移動相は０．０１Ｎの硫酸であった。カラム温度は５０℃であり、０．５ｍＬ／分の流速を用いた。検出においては、２１０ｎｍでの光度検出器および屈折率検出器を用いた。試料注入容量は１０μＬであった。
【０１１２】
初期調節期間後、供給液を通してバイオリアクターに入る１−ブタノールの量を２．５％ｗ／ｖまで漸増させた。これと同じ期間内に、バイオリアクターの廃液中のグルコースの量を監視した。供給液内の１−ブタノールの量を増加させた結果、細胞密度が低下し、それに伴いグルコースの利用が低下した。それに続くインキュベーションの結果、細胞密度およびグルコースの利用がより高レベルの１−ブタノールへの適応後に再び増大した。例えば、１−ブタノールを１．６％に増加させた結果、グルコース利用の低下に対応し、細胞密度が１．５未満のＯＤ600に低下した。しかし、それに続くインキュベーションの結果、グルコース消費の増大に対応し、細胞密度が２．３ＯＤ600に増加した。
【０１１３】
このバイオリアクターからの１−ブタノール耐性菌の純粋株の単離を以下のように行った。バイオリアクターのウェイスト・ジャグ（ｗａｓｔｅ  ｊｕｇ）に由来する細胞の試料を連続希釈し、連続希釈物を、１−ブタノールを含有しないトリプチカーゼ大豆寒天（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）；ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー（Ｂｅｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）；カリフォルニア州サンノゼ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ））上にプレーティングした。次いで、コロニーを、寒天培地から角形ウェルのマイクロタイタープレート（カリフォルニア州フラートン（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ）のベックマン・コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．）；カタログ番号０６９６８１）のウェル内の１−ブタノールを含有しないＳ２０培地１．２ｍＬに接種した。角形ウェルのマイクロタイタープレートを粘着性カバー（ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｃｏｖｅｒ）（ベックマン・コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．）；カタログ番号５３８６１９）で密封し、振とう下、３７℃で最大で７２時間インキュベートした。角形ウェルのマイクロタイタープレートを用い、マスタープレートを、培養物２００μＬを各角形ウェルから「Ｕ底」マイクロタイタープレート（ペンシルバニア州ウエスト・チェスター（Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ）のＶＷＲサイエンティフィック・プロダクツ（ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）；カタログ番号６２４０９−０５２）内の対応するウェルに分注することにより作製した。マスタープレートからの単離物を、Ｎｕｎｃ−ＴＳＰ移動性固相スクリーニング系（イリノイ州ネーパーヴィル（Ｎａｐｅｒｓｖｉｌｌｅ）のナルジーン・ヌンク・インターナショナル（Ｎａｌｇｅｎｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）；カタログ番号４４５４９７）を用い、１．２％〜３．４％の１−ブタノールを含有するＳ２０寒天またはＴＳＡ寒天プレート上に複製プレーティングした。耐性単離物を３７℃で成長させて２４〜７２時間後に同定した。３％の１−ブタノールを含有する寒天培地上で成長させた数種の単離物をさらに特徴づけた。
【０１１４】
以下のように、単離株のＩＣ50値を３７℃で判定した。単離物を、様々な量の１−ブタノールの不在下（対照）および存在下、Ｓ３０Ｌ培地（すなわち、１０ｍＭ硫酸アンモニウム、５ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０、５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、ｐＨ７．０、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．７ｍＭ  ＣａＣｌ2、５０μＭ  ＭｎＣｌ2、１μＭ  ＦｅＣｌ3、１μＭ  ＺｎＣｌ2、１．７２μＭ  ＣｕＣｌ2、２．５３μＭ  ＣｏＣｌ2、２．４２μＭ  Ｎａ2ＭｏＯ4、２μＭ塩酸チアミン、０．０１Ｍグルコース、および０．２％酵母抽出物）内、３７℃で培養し、各培養に対する倍加時間を成長曲線の対数部分から計算した（倍加時間＝０．６９３／成長速度）。試料フラスコ内で１−ブタノールによりもたらされる成長阻害パーセントを、１００％から成長パーセント（［対照フラスコの倍加時間／試料フラスコの倍加時間］×１００）を差し引くことにより判定した。ＩＣ50は５０％の成長阻害をもたらすブタノールの濃度であり、それをブタノール濃度対阻害パーセントのプロットにより判定した。結果を表４にまとめる。
【０１１５】
単離物を、各単離物から抽出したＤＮＡ内の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅から得られた産物の配列決定により同定した。ＤＮＡを１−ブタノール耐性株の各々から抽出した。各単離物を市販キット（カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）のモー・バイオ・ラボラトリーズ（Ｍｏ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）から入手されるＵｌｔｒａｃｌｅａｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、部品番号１２２２４−５０）を用いて処理した。単離物の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を、配列番号３９として示されるＪＣＲ１４（ＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ）および配列番号４０として示されるＪＣＲ１５（ＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡ）といったプライマーを用い、ＨｏｔＳｔａｒ  Ｔａｑ（カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ）のキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）；カタログ番号２０３４４６）を用い、ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ条件は、９５℃で１５分間、次いで９４℃で４５秒間、５５℃で１分間、および７２℃で１分間での３０サイクル、次いで７２℃で１０分間というものであった。ＰＣＲ産物を精製し、配列決定した。各配列をジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）のＢＬＡＳＴ探索におけるクエリー配列として用い、最も類似性が高い、予め同定された１６Ｓ  ｒＲＮＡの遺伝子配列を決定した。ブタノール耐性があるものとして選択した３種の株をプランタラム菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）として、かつ１種の株をラクトバチルス・アリゾネンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｉｚｏｎｅｎｓｉｓ）として同定した（表４参照）。
【０１１６】
【表５】
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【０１１７】
実施例２
１−ブタノール耐性乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の他の化合物に対する耐性
この実施例の目的は、１−ブタノールや、追加の化合物の２−ブタノール、イソブタノール、２−ブタノンおよびエタノールに対する耐性に基づいて単離した乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の耐性を試験することであった。これら化合物のＩＣ50値を、１−ブタノールについて実施例１に記載したように、選択された１−ブタノール耐性プランタラム菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２株について判定した。結果を表５にまとめる。
【０１１８】
同定された耐性株は、各化合物について判定したＩＣ50値および１−ブタノールに対する耐性と他の各試験化合物に対する耐性の間に見られる相関に基づき、３．９％ｗ／ｖの２−ブタノール、２．７％ｗ／ｖのイソブタノール、５．０％ｗ／ｖの２−ブタノン、または９．０％ｗ／ｖのエタノールを含有する固体培地上で成長することが予想される。
【０１１９】
【表６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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