(57)【要約】  ウィルス負荷を、パンクレアチン試料から分離するための方法及びパンクレアチン試料中のウィルス負荷を定量的に決定する方法が本願中に開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）パンクレアチン試験体からの遠心分離に適した液体のパンクレアチン試験試料を、この間にこのウィルス負荷を変更させること無く製造する方法工程、
ｂ）方法工程ａ）からの前記パンクレアチン試験試料の定義された少なくとも一部を、少なくとも１回の低速遠心分離に、沈降定数≧１２０Ｓを有するウィルスがペレットをまだ生じない条件下に課す方法工程、
ｃ）方法工程ｂ）において低速遠心分離の間に場合により生じる固形の堆積物を捨て、かつ、パンクレアチン試験試料上清を維持する方法工程、
ｄ）方法工程ｃ）において得られる定義された少なくとも一部のパンクレアチン試験試料上清を、不連続的な勾配媒体中で超遠心に課す方法工程、その際、超遠心分離の期間及び超遠心分離のための相対的遠心分離力を、このウィルス負荷が、パンクレアチン試験試料上清から目標画分中に定量的に輸送されるように選択し、その際目標画分は、この上にある、最低濃度勾配成分と、この下にある、次により高い濃度勾配成分との間の境界層の上または中にある、及び
ｅ）パンクレアチン試験試料上清からウィルス負荷を含有する目標画分を定量的に分離する方法工程
を含有する、パンクレアチン試験体からウィルス負荷を分離するための方法。
【請求項２】
方法工程ｅ）の後の方法工程ｆ）において、付加的に、パンクレアチン試験体のウィルス負荷の定量的な決定が、このウィルス負荷を含有する目標画分中のウィルス感染力価の決定により実施される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
希釈したか又は希釈していない目標画分を、このウィルス負荷の定量的な決定が実施される前に、マイクロフィルターを通じて濾過する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
方法工程ａ）において、パンクレアチン試験試料を、パンクレアチン試験試料懸濁体として、このパンクレアチン試験体と、検査されるべきウィルスタイプを培養するために使用される細胞系列に適した細胞培養培地と、及び、１種以上の抗生物質とを組み合わせることにより製造する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
パンクレアチン試験試料懸濁体の製造が、０〜１５℃の温度への冷却と共に進行する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
方法工程ｂ）における低速遠心分離が、それぞれの場合において、１００００×ｇ未満の相対的遠心分離力でもって実施される、請求項１記載の方法。
【請求項７】
方法工程ｂ）における低速遠心分離が、それぞれの場合において、1５００〜５０００×ｇの相対的遠心分離力でもって実施される、請求項１記載の方法。
【請求項８】
方法工程ｂ）における低速遠心分離が、少なくとも５分間実施される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
方法工程ｄ）における超遠心分離が、少なくとも１時間実施され、かつ、この相対的遠心分離力が少なくとも１０００００×ｇである、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
方法工程ｄ）における超遠心分離が、２〜８時間実施され、かつ、この相対的遠心分離力が２０００００〜３５００００×ｇである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
方法工程ｂ）における低速遠心分離及び方法工程ｄ）における超遠心分離が、それぞれの場合において、０〜１５℃の温度への冷却とともに実施される、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
方法工程ｄ）において導入される不連続的勾配媒体が、不連続的な２相のスクロース勾配である、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
不連続的勾配媒体が、５０％（ｗｔ．／ｖｏｌ．）の緩衝化されたスクロース溶液及び２０％（ｗｔ．／ｖｏｌ．）の緩衝化されたスクロース溶液から調製される勾配である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
パンクレアチン試験体が、ブタパンクレアチン試験体である、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
パンクレアチン試験試料のウィルス負荷が、ブタロタウィルスＡ、脳心筋炎ウィルス、ブタサーコウィルス、ブタパラボウィルス、ブタロタウィルスＡ、ブタテシオウィルス及び／又はブタ小胞性疾病ウィルスを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
パンクレアチン試験試料を、パンクレアチン試験体と、検査されるべきウィルスタイプを培養するために使用される細胞系列に適した細胞培養培地と、及び、１種以上の抗生物質とを組み合わせることによりパンクレアチン試験試料懸濁体として産生する、請求項４記載の方法の方法工程ａ）により得られるパンクレアチン試験試料懸濁体。
【請求項１７】
方法工程ａ）において、パンクレアチン試験試料を、パンクレアチン試験体と、検査されるべきウィルスタイプを培養するために使用される細胞系列に適した細胞培養培地と、及び、１種以上の抗生物質とを組み合わせることによりパンクレアチン試験試料懸濁体として産生する、請求項１記載の方法の方法工程ａ）〜ｃ）により得られるパンクレアチン試験試料上清。
【請求項１８】
請求項１記載の方法により得られる、単離された目標画分。
【請求項１９】
請求項１記載の方法工程ａ）において、パンクレアチン試験試料を、このパンクレアチン試験体と、検査されるべきウィルスタイプを培養するために使用される細胞系列に適した細胞培養培地と、及び、１種以上の抗生物質とを組み合わせることによりパンクレアチン試験試料懸濁体として産生する、請求項１８記載の単離された目標画分。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パンクレアチン試験体からウィルス負荷を実質的に定量的に分離するための方法、及び、パンクレアチン試験体のウィルス負荷を定量的に決定するための方法に関する。
【０００２】
パンクレアチンは、哺乳類の膵腺から得られる、様々な生理学的に活性のある構成要素の長い間公知の混合物である。パンクレアチンの主たる構成要素は、消化酵素、特にパンクレアチン性リパーゼであり、またアミラーゼ及びプロテアーゼでもある。その有効な治療的特性及び使用の際の高レベルな安全性のために、パンクレアチンは、酵素代替療法において、医薬組成物として十分に成功してこれまで使用されている。パンクレアチン性リパーゼは、ここで最も重要であり、しかしながら、アミラーゼ及びプロテアーゼもまた、パンクレアチンの治療的な有益性にかなり寄与している。治療目的のためのパンクレアチンは、通常は、ウシ（"bovine pancreatin"）又はブタ（"porcine pancreatin"）から得られ、ブタパンクレアチンは、量の観点において最も重要である。治療目的のためのパンクレアチンの製造方法は、自体公知であり、例えば、刊行物EP 0 1 15 023 Aから公知である。
【０００３】
動物由来のパンクレアチンの性質のために、この出発材料は、典型的には、不所望な生物学的成分を随伴する可能性があり、これは例えば、細菌又はウィルス汚染物質である。しかしながら、１００年間以上の、パンクレアチンを含有する医薬製品の市販の間に、患者が、ウィルス汚染されたパンクレアチンにより苦しめられる症例が報告されたことはなかった。それにもかかわらず、生物学的な組織及び／又は体液に由来する医薬製品を製造する会社は、懸念される汚染物質が、ヒト病原性と考慮されようとそうでなかろうとにかかわらず、全ての汚染物質を可能な最低レベルに減少させることにより、製品の安全性のレベルを高めるように取締機関からの増加する圧力を経験している。医薬製品におけるパンクレアチンの適用のためには、従って、このような生物学的な汚染物質を検出及び定量化するための、信頼できる分析方法を有することが望まれる。
【０００４】
現在では、パンクレアチン試料中のウィルス汚染物質を定量的に検出又は分離するための信頼できる方法は開発されていない。これは、パンクレアチンの酵素活性構成要素が、当業者に公知の技術を用いるウィルスの増殖のために典型的に使用される細胞系列と非相容性であり、このため、パンクレアチン試料中のウィルス力価を決定することが一層困難であるか、更には不可能であるとの事実によるものであるようである、
従って、本発明の課題は、パンクレアチン試験体からウィルス負荷を実質的に定量的に分離するための方法、及び、パンクレアチン試験体のウィルス負荷を定量的に決定するための方法を提供することであった。特に、本発明の課題は、パンクレアチン試験体から感染性ウィルス負荷を実質的に定量的に分離するための方法、及び、パンクレアチン試験体の感染性ウィルス負荷を定量的に決定するための方法を提供することであった。
【０００５】
意外にも、パンクレアチン試験体のウィルス負荷、特に感染性ウィルス負荷は、ウィルス負荷が最初にパンクレアチン試験体から多工程の遠心分離方法において分離され、かつ、この分離されたウィルス負荷が次いで自体公知のウィルス学的な方法を用いて定量的に決定される場合に、実質的に定量的に決定されてよいことが見出された。
【０００６】
刊行物JP 12856990は、既に、低速遠心分離と超遠心分離の非特異的な組み合わせによって、肝炎ウィルスを濃縮又は単離するための方法を開示している。
【０００７】
第１の実施態様において、本発明は、ウィルス負荷をパンクレアチン試験体から分離するための方法であって、
ａ）パンクレアチン試験体から、遠心分離に適した液体のパンクレアチン試験試料を、この間にこのウィルス負荷を変更させること無く製造する方法工程、
ｂ）方法工程ａ）からの前記パンクレアチン試験試料の定義された少なくとも一部を、沈降定数≧１２０Ｓを有するウィルスがまだペレットを生じない条件下に、少なくとも１回の低速遠心分離に課す方法工程、
ｃ）方法工程ｂ）において低速遠心分離の間に場合により生じる固形の堆積物を捨て、かつ、パンクレアチン試験試料上清を維持する方法工程、
ｄ）方法工程ｃ）において得られる定義された少なくとも一部のパンクレアチン試験試料上清を、不連続的な勾配媒体中で超遠心に課す方法工程、その際、超遠心分離の期間及び超遠心分離のための相対的遠心分離力を、このウィルス負荷が、パンクレアチン試験試料上清から目標画分中に定量的に輸送されるように選択し、その際目標画分は、この上にある、最低濃度勾配成分と、この下にある、次により高い濃度勾配成分との間の境界層の上または中にある、及び
ｅ）パンクレアチン試験試料上清からウィルス負荷を含有する目標画分を定量的に分離する方法工程
を含有する、パンクレアチン試験体からウィルス負荷を分離するための方法に関する。
【０００８】
第２の実施態様において、本発明は、パンクレアチン試験体のウィルス負荷、特にパンクレアチン試験体の感染性ウィルス負荷を定量的に決定するための方法に関する。この第２の実施態様において、第１の実施態様による方法に加えて、方法工程ｅ）の後の更なる方法工程ｆ）において、パンクレアチン試験体のウィルス負荷の定量的な決定が、このウィルス負荷を含有する目標画分中のウィルス感染力価の決定により実施される。
【０００９】
本願明細書中に他に記載がなければ、以下に示される任意の技術的及び化学的用語は、それぞれの場合において、この技術の特定の分野において当業者により慣用的に理解されるのと同じ意味合いを有する。この中で、例えば「０〜１５℃」との形式において言及される温度範囲は、それぞれの場合においてこの範囲の限度を含めて、０℃〜１５℃の温度範囲を指す。例えば「３０〜１２０分間」の形式においてこの中で言及される時間範囲は、それぞれの場合においてこの範囲の限度を含めて、３０分間から１２０分間の時間範囲を指す。例えば「２〜８時間」の形式においてこの中で言及される時間範囲は、それぞれの場合においてこの範囲の限度を含めて、２時間から８時間の時間範囲を指す。この中で例えば「１５００〜５０００×ｇ」との形式において示される相対的な遠心分離力の範囲は、それぞれの場合においてこの範囲の限度を含めて、１５００×ｇから５０００×ｇの範囲内の相対的な遠心分離力を指す。例えば「１０〜１５ｍｌ」の形式においてこの中で言及される容積範囲は、それぞれの場合においてこの範囲の限度を含めて、１０ｍｌから１５ｍｌの容積範囲を指す。例えば「８０〜１００ｍｍ」の形式においてこの中で言及される長さ範囲の尺度は、それぞれの場合においてこの範囲の限度を含めて、８０ｍｍから１００ｍｍの長さ範囲の尺度を指す。
【００１０】
本発明による方法は、動物起源の全ての種類のパンクレアチンに適し、かつ、特に、慣用の市販のブタパンクレアチン及びウシパンクレアチンに対して実施されてよい。この方法は、有利には、ブタパンクレアチン試験体に対して実施される。
【００１１】
本発明による方法は、一般的には、パンクレアチン試験体からウィルス負荷を分離するため、そして、引き続き、パンクレアチン試験体のウィルス負荷を実質的に定量的に決定するために適している。特に、この方法は、パンクレアチン試験体のウィルス負荷の分離のため及び定量的な決定のために適し、このパンクレアチン試験体中では、ウィルス負荷が、ウシロタウィルスＡ、脳心筋炎ウィルス（＝ＥＭＣＶ）、ブタサーコウィルス（＝ＰＣＶ）、ブタパラボウィルス（＝ＰＰＶ）、ブタロタウィルスＡ、ブタテシオウィルス及び／又はブタ小胞性疾患ウィルス（＝ＳＶＤＶ）を含む。極めて類似の特性のために、ヒトコクサッキーウィルスＢ５／１は、ＳＶＤＶを分離及び／又は定量的に決定するための本発明による方法の適性を確認するためのモデルとして使用されてよい。極めて類似の特性のために、ウシロタウィルスＡ（例えばＢ２２３株）は、ブタロタウィルスＡを分離及び／又は定量的に決定するための本発明による方法の適性を確認するためのモデルとして使用されてよい。
【００１２】
本発明による方法の方法工程ａ）において、遠心分離に適した液体のパンクレアチン試験試料が、パンクレアチン試験体から分離され、このようにする間にこのウィルス負荷の、特にこの感染性ウィルス負荷の変化又は変更はない。これは例えば、パンクレアチン試験体からパンクレアチン試験試料懸濁液を産生することにより進行してよい。パンクレアチン試験試料懸濁体は、パンクレアチン試験体を、検査されるべきウィルス種を培養するために使用される細胞系列に適した細胞培養培地と、及び、この目的に適した１種以上の抗生物質とを組み合わせることにより、産生される。一般的に、全ての抗生物質は、方法工程ａ）において場合により使用される抗生物質溶液を産生するために適している。通例は、広範囲のスペクトルの抗生物質又はこのような広範囲のスペクトルの抗生物質の混合物が使用される。適した抗生物質は、例えば、β−ラクタム抗生物質、例えばペニシリン、セファロスポリン（オキサセフェム及びカルバセファムを含む）、カルバペネム及びモノバクタム；ストレプトマイシン（硫酸ストレプトマイシンを含む）；ネオマイシン（ネオマイシンＡ、ネオマイシンＢ及びパロモマイシンを含む）；カナマイシン（カナマイシン、ゲンタマイシン、アミカシン及びトブラマイシンを含む）；スペクチノマイシン；テトラサイクリン（テトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、ドキシサイクリン及びミノサイクリンを含む）；マクロライド抗生物質（エリスロマイシン、クラリスロマイシン、ロキシスロマイシン、アジスロマイシン、ジョサマイシン及びスピラマイシンを含む）；ジャイレース阻害剤（ナリジクス酸、シノキサシン、ピペミジン酸、ノルフロキサシン、ペフロキサシン、シプロフロキサシン、オフロキサシン及びフレロキサシンを含む）；葉酸アンタゴニスト（スルホンアミド抗生物質、ジアミノベンジルピリミジン及びその組み合わせを含む）；クロラムフェニコール；リコサミド；グリコペプチド抗生物質（バンコマイシン及びタイコプラニンを含む）；ホスホマイシン；ポリペプチド抗生物質（ポリミキシンＢ、コリスチン、バシトラシン及びチロチシンを含む）及びムピロシンを含む群から選択されてよい。有利な抗生物質は、硫酸ストレプトマイシン及びペニシリン及び硫酸ストレプトマイシン及びペニシリンの混合物、例えば抗生物質「カクテル」としての混合物である。１種以上の抗生物質が、例えば、溶媒の溶液中で使用されてよく、これは１種以上の抗生物質のために、それぞれの場合において、即ち抗生物質溶液として適している。
【００１３】
パンクレアチン試験試料懸濁体は、慣用的には、０〜１５℃の温度、例えば４〜１０℃の温度への冷却とともに産生される。パンクレアチン試験試料懸濁体を産生するための構成成分は、慣用的には、氷冷と共に、少なくとも３０分間、例えば３０〜１２０分間、有利には４５〜９０分間、特に５０分間又は６０分間撹拌される。パンクレアチン試験試料懸濁体の及び全ての更なる方法工程における冷却の目的は、それぞれの場合において、パンクレアチン試験体の酵素活性のある構成要素による、ウィルス負荷のいかなる不所望な不活性化を回避するか又は少なくとも実質的に減少させることにある、一実施態様において、本発明は、方法工程ａ）により産生されてよいパンクレアチン試験試料懸濁体をも提供する。
【００１４】
方法工程ａ）におけるパンクレアチン試験試料懸濁体の産生においてそれぞれの場合においてどの細胞培養媒体が使用されるかは、本発明による方法により分離及び／又は定量的に決定されるべきウィルス種により決定される。検査されるウィルス試験体が、可能な場合には、細胞変性効果（＝ＣＰＥ）を開始させる許容可能な細胞培養液は、特定のウィルス種を培養及び検出するために使用される。ＣＰＥは、光学顕微鏡により認識可能なウィルス感染した細胞の変更である。培養細胞中でＣＰＥ無しでウィルス種が増殖する場合には、このような増殖は、それでも一般的には、自体公知の非直接的な検出方法により同定されてよい。
【００１５】
例えば、ウシロタウィルスＡが、分離及び／又は定量的に決定されるべきである場合には、胎児サル腎臓細胞（＝ＭＡ−１０４細胞）が、例えば、この培養のために使用されてよい。この場合には、自体公知のダルベッコ改質イーグル培地（＝ダルベッコ培地）が、例えば、細胞培養媒体として適している。ＥＭＣＶが分離及び／又は定量的に決定されるべき場合には、ブタ腎臓細胞（＝ＰＫ−１５細胞）又は胚性のブタ腎臓細胞（＝ＳＰＥＶ細胞）が、この培養のために使用されてよい。ＰＫ−１５細胞の場合には、自体公知の最小必須培地（＝ＭＥＭ）が、例えば、細胞培養培地として適している。ＳＰＥＶ細胞の場合には、ダルベッコ培地が、例えば、細胞培養媒体として適している。例えば、ＰＣＶが、分離及び／又は定量的に決定されるべき場合には、ＰＫ−１５細胞）が、例えば、この培養のために使用されてよい。例えば、ＰＰＶが、分離及び／又は定量的に決定されるべきである場合には、ウシ腎臓細胞（ＳＫ−１６細胞）が、例えば、この培養のために使用されてよい。この場合に、ダルベッコ培地が、例えば、細胞培養媒体として適している。例えば、ブタロタウィルスＡが、分離及び／又は定量的に決定されるべき場合には、ＭＡ−１０４細胞が、例えば、この培養のために使用されてよい。例えば、ブタテシオウィスルが、分離及び／又は定量的に決定されるべき場合には、ＰＫ−１５細胞が、例えば、この培養のために使用されてよい。例えば、ＳＶＤＶが、分離及び／又は定量的に決定されるべき場合には、ＳＰＥＶ細胞が、例えば、この培養のために使用されてよい。この分野の当業者は、特定のウィルス種を培養するために適した細胞系及び相応する適した細胞培養媒体を知っている。本発明による豊富に使用可能なウィルス種及び相応する細胞系列は、適した供給源、例えば「American Type Culture Collection」（Manassas, USA）（＝ＡＴＣＣ）、「Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH」（Braunschweig, Germany）（＝ＤＳＭＺ）、「Friedrich-Loffler-lnstitut」（Federal Research Institute for Animal Health, lnsel Riems, Germany）（＝ＦＬＩ）、又は「Department of Agriculture and Rural Development」の「Veterinary Service Division」（Belfast, United Kingdom）（＝ＤＡＲＤ）、から得られてよい。
【００１６】
方法工程ｂ）において、方法工程ａ）において得られるパンクレアチン試験試料は、この全体において使用されてよいか、又は、パンクレアチン試験試料の定義された部分において使用されてよく、特にパンクレアチン試験試料の定義された容積が使用されてよい。方法工程ａ）において得られるパンクレアチン試験試料は、有利にはこの全体において有利には使用される。
【００１７】
方法工程ｂ）において、低速遠心分離の場合には、条件は、沈降定数≧１２０Ｓ、特に１２０Ｓ〜５０００Ｓを有するウィルスがまだペレットを形成しない条件下が確立されてよい。通常は、沈降定数≧１２０Ｓを有するウィルス、特に沈降定数≧１２０Ｓ〜５０００Ｓを有するウィルスは、それぞれの場合において１００００×ｇ未満、有利にはそれぞれの場合において１５００〜５０００×ｇ、特に有利にはそれぞれの場合において２０００〜３５００×ｇ、例えばそれぞれの場合において２７００×ｇの相対遠心力でもって低速遠心分離が実施される場合にペレットを形成しない。低速遠心分離工程の期間は、慣用的には、少なくとも５分間、通常は５〜６０分間、特に１０〜４５分間、有利には１０〜３０分間、特に１５分間となる。方法工程ｂ）の有利な一実施態様において、低速遠心分離工程は、温度０〜１５℃、例えば温度４〜１０℃への冷却とともに、有利には冷却遠心機中で実施される。
【００１８】
方法工程ｂ）における低速遠心分離工程の目的は、原則的には、このパンクレアチン懸濁体から、パンクレアチン構成要素、例えば非溶解性粒子その他を除去することであり、これらはパンクレアチン試験体のウィルス負荷の分離及び／又は定量的決定において、更なる処理に適したパンクレアチン試験試料上清を得るために、邪魔となる。低速遠心分離工程において場合により得られるこの固形の堆積物は、従って、一般的には方法工程ｃ）において廃棄され、この一方で、上清は、次の方法工程ｄ）のために使用される。場合により得られる固形の堆積物の引き続く廃棄を有する低速遠心分離工程は、慣用的には、固形の堆積物が形成されることがもはや観察されないまで、繰り返される。通常は、場合により得られる固形の堆積物の引き続く廃棄を有する、低速遠心分離工程の、更なる繰り返しは、１〜３回の繰り返し後には、特に１回の繰り返し後には、必要でない。本発明の一実施態様において、方法工程ｂ）において得られるものとしての固形の堆積物は、沈殿であることができる。
【００１９】
本発明の一実施態様において、低速遠心分離工程において得られる堆積物は、１回以上、例えば１〜３回、廃棄前に、適した洗浄液体で洗浄される。適した洗浄液体は、例えば、低速遠心分離自体の後に得られるパンクレアチン試験試料上清であり、これは、次いで方法工程ｄ）において使用されてよい。パンクレアチン試験試料上清自体以外の洗浄液体が使用される場合には、この洗浄液体は、この堆積物の洗浄が完了したら、パンクレアチン試験試料上清と組み合わされ、かつ、次いで方法工程ｄ）において使用される。パンクレアチン試験体のウィルス負荷が、ＥＭＣＶを含有する場合には、方法工程ｄ）においての使用前に、前述の様式において、この堆積物を洗浄することが特に有利である。
【００２０】
特定の一実施態様において、本発明は、また、上述した方法工程ａ）〜ｃ）により産生されてよいパンクレアチン試験試料上清をも含む。
【００２１】
不連続的な２相のスクロース勾配が、慣用的には、方法工程ｄ）における不連続的な勾配媒体として使用される。不連続的勾配媒体は、有利には、５０％（ｗｔ．／ｖｏｌ．）の緩衝化されたスクロース溶液及び２０％（ｗｔ．／ｖｏｌ．）の緩衝化されたスクロース溶液から調製された勾配を含有する。天然の緩衝液（即ち、これは、ｐＨ値７付近で緩衝する）は、例えば、スクロース溶液のための緩衝液として使用されてよい。ＰＢＳ緩衝液（＝「リン酸緩衝化生理食塩水」緩衝液、ｐＨ７．２）は、有利に使用される。滅菌した勾配媒体は通常使用される。前述の種類の２相の不連続スクロース勾配は、特に適した沈殿及び従って見出されて良いウィルスのための分離条件を提供する。不連続スクロース勾配は、特に、前述したとおりに、５０％（ｗｔ．／ｖｏｌ．）の場合により緩衝化されたスクロース溶液及び２０％（ｗｔ．／ｖｏｌ．）の緩衝化されたスクロース溶液から調製されたとおりの勾配は、更に、場合により存在するいかなるウィルス負荷を不活性化しないための、適した浸透圧条件を示す。方法工程ｄ）による超遠心分離は、例えば、パンクレアチン試験体から生じるウィルス負荷が、不連続的な勾配媒体中へのパンクレアチン試験試料上清から実質的に定量に輸送されることを確実にする。実質的に定量とは、ここでは、前もって試験試料に添加されたウィルス負荷が完全に回収されるので、添加されたウィルス負荷中と超遠心が実施された後に回収されるウィルス負荷中との力価の差異が、ウィルス力価の常用対数の１／２ステップ（＝０．５ｌｏｇステップ）以下であることを意味する。方法工程ｄ）による超遠心分離は更に、ウィルス負荷が、目標画分中に輸送され、この画分は、パンクレアチン試験試料からは十分に離れていて、この結果、パンクレアチン試験試料からのこの機械的な分離を、分離が生じるために邪魔な相のいかなる再混合をも可能にすることがなく確かなものにする。
【００２２】
方法工程ｄ）は、慣用的には、最高濃度の勾配媒体の容積を、超遠心分離管中に導入することにより実施され、この超遠心管の上方では、次に低い濃度の勾配媒体の容積が積層されている。この方法は、多相の勾配媒体を得るために所望される限り複数回繰り替えされ、この最終的な（トップの）層は、ウィルス負荷が分離されるべき遠心に適した液体のパンクレアチン試験試料の容積である。２相の勾配媒体の場合には、次に低い濃度勾配媒体の容積は、次いで、遠心分離に適した液体パンクレアチン試験試料の容積又はパンクレアチン試験試料懸濁体の容積（パンクレアチン試験試料容積）でもってすぐさま覆われる。２相の勾配媒体の場合には、これは、超遠心分離管中でパンクレアチン試験試料容積を含有する第１層（トップ）、次いで、最低濃度の勾配媒体の容積（ミドル、例えば２０％（ｗｔ．／ｖｏｌ．）の緩衝化されたスクロース溶液）、そして最後に、最高濃度の勾配媒体の容積（ボトム、超遠心分離管の底をカバーする、例えば５０％（ｗｔ．／ｖｏｌ．）の緩衝化されたスクロース溶液）のトップダウンからの、相の順列を生じる。個々の容積にかぶせる場合には、それぞれの境界で乱れ又は混ぜ合わせが生じないことを保証するために気をつけなくてはならない。
【００２３】
方法工程ｄ）中での目標画分は、典型的には、（ｉ）パンクレアチン試験試料容積からは十分に離れかつ遠い、最低濃度勾配媒体の一部、及び、（ｉｉ）次により高い濃度勾配媒体の完全な容積を含有する。２相勾配媒体の場合には、この目標画分は、例えば、パンクレアチン試験試料容積からは十分に離れかつ遠い、最低濃度勾配媒体の一部、及び、超遠心分離管の底部へと下方に広がる最高濃度勾配媒体の完全な容積を含有する。
【００２４】
パンクレアチン試験試料容積から十分に除去され、これにより、引き続く分離を可能にする目標画分の場所を計算する場合には、この粒子の位置のための計算された値（即ち、パンクレアチン試料から隔たったこのウィルス粒子の位置）は、通常は、ガウス分布の頂点を指すことを心に留めるべきである。従って、粒子は、この計算された位置の上方及び下方の両者に分布されるものである。従って、パンクレアチン試験試料容積からの目標画分の所望される位置を決定する場合には、この粒子の場所のガウス分布を考慮にいれるための付加的なゆとりを含めることが必要である。超遠心分離のために、沈降定数≧１２０Ｓ、特に≧１２０Ｓ〜５０００Ｓを有する粒子がパンクレアチン試験試料容積から、少なくとも１０ｍｍ、例えば少なくとも１５ｍｍ、少なくとも２０ｍｍ、少なくとも２５ｍｍ又は少なくとも３０ｍｍ、この最低濃度勾配媒体中に拡散している場合には、このウィルス負荷は、慣用的には、引き続く分離のためにパンクレアチン試験試料容積からは十分に遠位にある目標画分中に輸送される。前に説明した、２相勾配媒体の場合には、この最低濃度勾配媒体は、２０％（ｗｔ．／ｖｏｌ．）の緩衝化したスクロース溶液である。超遠心分離工程の一変形において、沈降定数≧１２０Ｓ、特に≧１２０Ｓ〜５０００Ｓを有する実質的に全ての粒子が、完全に、この最低濃度勾配媒体を介して通過し、かつ、この次により高い濃度の勾配媒体に対する境界層で濃縮化される（即ち、「スクロースクッション」で）。当業者は、超遠心分離のための相応する条件の計算及び実施の適した方法を知っている。適した超遠心分離条件は、パンクレアチン試料から分離されるべきウィルスの特性（例えば、密度及び沈降定数）に基づき決定されてよく、ここで、自体公知の簡略化を当然のことと考慮することが適用可能である（参照、例えば、Lebowitz et al., "Modern analytical ultracentrifugation in protein science: A tutorial review"; Protein Science 11 (2002) 2067-2079）。
【００２５】
超遠心分離が、慣用の容積比を用いて、かつ、不連続的な勾配媒体、有利には２相の不連続的スクロース勾配において実施される場合には、超遠心分離が、少なくとも１時間、通常は少なくとも２時間、例えば、２〜８時間、特に３〜６時間実施される場合には、ウィルス負荷は、慣用的には、引き続く分離のために適した目標画分中への輸送される。本発明による超遠心分離のための適した相対的遠心分離力は、少なくとも１０００００×ｇ、例えば２０００００〜３５００００×ｇである。超遠心分離工程の一実施態様において、前記工程は、３〜６時間の間、超遠心分離を実施するために慣用の容積比で、相対的な遠心分離力２０００００〜３５００００×ｇで、５０％（ｗｔ．／ｖｏｌ．）の緩衝化されたスクロース溶液及び２０％（ｗｔ．／ｖｏｌ．）の緩衝化されたスクロース溶液から調製された勾配中で、実施される。超遠心分離工程の他の実施態様において、前記工程は、３．５〜４．５時間の間、相対的な遠心分離力２５００００〜３５００００×ｇでもって、超遠心分離を実施するために慣用の容積比で、かつ、５０％（ｗｔ．／ｖｏｌ．）の緩衝化されたスクロース溶液及び２０％（ｗｔ．／ｖｏｌ．）の緩衝化されたスクロース溶液から調製された勾配中で実施される。超遠心分離を実施するために慣用の容積比は、例えば、慣用の遠心分離管が使用される場合に得られる。慣用の遠心分離管は、ここでは、例えば、容積１０〜１５ｍｌ、特に１２〜１３ｍｌ、内径６〜８mm、特に７mm、そして高さ８０〜１００mm、特に８５〜９５ｍｍを有するものであると理解される。慣用の遠心分離管が、方法工程ｄ）において使用される場合には、この最高濃度の勾配媒体（例えば、５０％（ｗｔ．／ｖｏｌ．）の緩衝化されたスクロース溶液）の容積は、例えば、０．５ｍｌであると考慮されてよく、この次により低い濃度の勾配媒体（例えば、２０％（ｗｔ．／ｖｏｌ．）の緩衝化されたスクロース溶液）の容積は、例えば、４．５ｍｌであると考慮されてよく、かつ、このパンクレアチン試験試料容積は、例えば５ｍｌであると考慮されてよい。
【００２６】
方法工程ｄ）の実施態様の有利な一変形において、別な様式で選択された条件にもかかわらず、超遠心分離は、０〜１５℃の温度、有利には４〜１０℃の温度への冷却とともに実施される。
【００２７】
この方法工程において使用されてよい慣用の冷却遠心機は、この分野の当業者に自体公知である。慣用的な市販の超遠心分離機は、方法工程ｄ）において慣用的に使用され、例えば、スウィングバケットローターを有する冷却可能な超遠心分離機、例えば、Sorvall(R)からの「TH641モデル」、スウィングバケットローターを有する超遠心分離機が使用される。
【００２８】
本発明による低速遠心分離工程及び超遠心分離工程の上述の説明は、当業者により、任意の所望の程度にまで、特に、本発明の、発明の詳細な説明中に示した更なる技術情報の助力を得て、スケールアップ又はダウンされてよい。
【００２９】
方法工程ｅ）において、ウィルス負荷を含有する目標画分は、パンクレアチン試験試料上清から定量的に分離される。分離は、通常は、目標画分の前もって決定された境界の高さでの超遠心分離管でのマークを配置することにより、進行する。この境界上方の全ての容積を次いで、例えば、吸引により、残りの容積から分離する。吸引は、例えば、慣用の蠕動ポンプを用いて進行してよく、この管及び細管は慣用的には前もって滅菌されている。適したポンプ速度は、例えば２ｍｌ／分の速度である。吸引の間に、この蠕動性ポンプ細管が、常に、この液体の上方の境界線に存在することを保証すべく、注意しなくてはならない。この超遠心分離管中に残存する目標画分は、次いで、慣用の単一チャネルピペット、有利には滅菌チップを用いて、自体公知の様式で、超遠心分離管から除去されてよい。この超遠心分離管中中にまだなお残存する可能性のある任意の沈殿は、同時に除去されてよく、例えば、単一チャネルピペットを用いた繰り返した吸い上げ及び再懸濁により、除去されてよい。
【００３０】
一実施態様において、本発明は、方法工程ａ）〜ｅ）により産生されてよい単離された目標画分をも提供する。
【００３１】
パンクレアチン試験体のウィルス負荷を定量的に決定するための方法が実施されるべき場合には、方法工程ｆ）が、方法工程ｅ）の後に引き続く。方法工程ｆ）において、このパンクレアチン試験体のウィルス負荷は、このウィルス負荷を含有する目標画分中のウィルス感染力価を決定することにより、定量的に決定される。目標画分中のウィルス感染力価の定量的な決定は、ここでは、ウィルス学において自体公知の処理方法に一致して、例えば、ウィルス力価決定（＝ＶＩＴＤ）の自体公知の原則に一致して進行して良い。
【００３２】
この目標画分は、例えば、適した細胞培養培地を用いて、ウィルス決定試験試料を得るために適した比に希釈されてよい。適した細胞培養媒体は、それぞれの場合において、この試験されるウィルス種の機能として、使用可能であるべき上述のものである。ウィルス感染のための、誤った陽性ヒットを除外するために、本発明の実施態様において、この希釈されたか又は希釈されていない目標画分は、マイクロフィルターを通じて、このウィルス負荷の定量的な決定が方法工程ｆ）中で実施される前に、濾過されてよい。
【００３３】
適した希釈は、例えば、方法工程ｄ）において使用されるパンクレアチン試験試料上清の当初の容積に、この目標画分を細胞培養媒体でもって希釈することにより達成されてよい。次いで、最初の工程において、このウィルス決定試験試料の希釈系列は、最初に、自体公知の様式において産生され、例えば１：２、１：５、１：１０の希釈工程において、又は、これらの希釈工程の組み合わせにおいて、定量的なＶＩＴＤを実施するために、産生されてよい。次いで、第２工程において、適した細胞懸濁体は、自体公知の様式で、希釈系列からの異なる濃度のウィルス決定試験試料でもって、接種されてよく、これにより、細胞層は、異なる濃度のウィルス決定試験試料に対して形成されることが可能になる。ウィルス感染についての誤った陽性のヒット（これは、微生物、例えば不活性な細菌又はマイコプラズマの存在により引き起こされてよい）を除外するために、検出器セルに対してこれらを接種する前に、このウィルス決定試験試料を濾過することが通常は適切である。この最後に、ウィルス決定試験試料又は希釈したウィルス決定試験試料は、適した孔径のフィルターを通じて、例えばマイクロフィルター、例えば、孔径０．１〜１０μｍ（範囲の限界は含められる＝マイクロ濾過）のマイクロフィルターを通じて、通常は孔径１μｍのマイクロフィルターを通じて、濾過されてよい。この濾過物は、次いで、更なる検査のために試験試料として使用されてよい。次いで、第３の工程において、この接種された試験試料は、感染が示された様式に依存して、その感染の程度について、読み取りされる。ここで、ＣＰＥが、細胞層の感染の指示体として使用されてよく、ＣＰＥは、約４〜７日間の後に、自体公知の様式で、読み取りされる。ウィルス決定試験試料の滴定（終点希釈）は、ここでは、本来存在する感染用量の定量的な決定を可能にする。滴定は、慣用的には、１０倍の希釈により、即ち、１０を定数とする対数に基づき進行する。実際には、５０％の感染用量（＝ＩＤ50）が通常は計算される。
【００３４】
並行した複数のバッチの場合には、この同定されたＩＤ50は次いで、最高の（逆数の）、ウィルス決定試験試料の希釈のものに相応し、ここで、ＣＰＥは、このバッチの半分中で正確に検出可能である。この結果は、場合により、更に、自体公知の様式で、コンピューターにより補正又は修正されてよい。ウィルス力価の計算のために最も一般的に使用される方法は、Spearman and Kaerber (参照 C. Spearman, Br. J. Psychol. 2 (1908) 227-242 及び G. Kaerber, Arch. Exp. Path. Pharmak. 162 (1931 ) 480-483;また、Bundesanzeiger [Federal gazette] no. 84, May 4 1994) による方法又は Reed and Muench (Reed, L. J., Muench, H. Am. J. Hyg. 27 (1938) 493-497参照)による方法である。
【００３５】
細胞層の感染の他の指示体例えば、ウィルス抗原誘導又はプラーク誘導が使用されてもよい。当業者は、これらの方法及び本件ケースの場合においてのその適用について知っていて、例えば、ウィルス学の教科書、例えば "Medizinische Virologie" H. W. Doerr 及びW. H. Gerlich, Georg Thieme Verlag Stuttgart, New York, 第1版、2002年度又はそれぞれの場合において、この最も最近の版から、知っている。
【００３６】
実施例
以下の実施例において述べられた全ての処理は、滅菌したワークベンチで滅菌条件下で実施された。ウィルス学的研究室において慣用の手順、例えば安全手順が遵守されなくてはならない。以下の材料を特に使用した：
１．抗生物質溶液、１．０ｇの硫酸ストレプトマイシン及び１．２ｇのペニシリンを、２０ｍｌの２回蒸留した水中に溶解させ、かつ、０．２μｍのフィルターを通じて濾過した。この濾過物を、次に１ｍｌのアリコートに分け、かつ、場合により−２０℃で使用まで貯蔵した；
２．ダルベッコ培地、ＳＫ６細胞、ＳＰＥＶ細胞及びＭＡ１０４細胞のための細胞培養媒体；
３．単一チャネルピペット、滅菌チップ付き；
４．ＦＣＳ、胎児ウシ血清、Bio Whittakerから（＝血清）；
５．組織培養フラスコ、滅菌、このフラスコ底部の領域はそれぞれ、２５、７５又は１７５ｃｍ2；
６．ＭＥＭ、ＰＫ−１５細胞のための細胞培養培地、１．５ｇ／ｌの重炭酸ナトリウム及び１ｍＭのピルビン酸を有する；
７．マイクロタイタープレート、滅菌、９６ウェル及びフタを有する；
８．ＰＡＮ懸濁体、１０％のパンクレアチン懸濁体；１．０ｇのブタパンクレアチン（他に言及がなければ）を、滅菌条件下で、ビーカー中に秤量し、かつ、１ｍの抗生物質溶液及び（他に言及がなければ）８．０ｍｌの特定の相応する細胞培養培地と組み合わせ、かつ、（他に言及がなければ）６０分間のうちに、氷浴上で、撹拌しながら懸濁した；
９．パーディー緩衝液（Pardee）、パーディーの二酸化炭素緩衝液；
１０．ＰＢＳ、滅菌、「リン酸緩衝化した食塩水」溶液（ｐＨ７．２）；
１１．ピペット、滅菌；
１２．ピペットチップ、滅菌して、滅菌トレイ中に；
１３．プラスチックパウチ、ＣＯ2不透過性、栓あり（Merckからの"Anaerocult(R)）"；
１４．ポリクローナル抗ＰＰＶ抗体、フルオレセインイソシアナート（＝ＦＩＴＣ）コンジュゲート、NatuTec GmbHから；
１５．管、滅菌、１５及び５０ｍｌ；
１６．スクロース溶液、２０％、ＰＢＳ緩衝化、滅菌；濃度を自体公知の様式で、慣用の屈折計を用いて適合する；
１７．スクロース溶液、５０％、ＰＢＳ緩衝化、滅菌；濃度を自体公知の様式で、慣用の屈折計を用いて適合する；
１８．スクリュートップ管、滅菌；
１９．トリプシン溶液、「TrypL Express(R)」、からINVITROGEN；
２０．蠕動ポンプ、「ismaTec」から、５．８ｍｌ／分までのポンプ速度；
２１．冷却超遠心分離機、「Sorvall(R) Pro 80」、「TH-641」ローターを有する；
２２．超遠心分離管、滅菌、容量１１ｍｌ；直径９×９０ｍｍ；
２３．希釈ブロック、９６ウェル、それぞれ１．０ｍｌ；
２４．ＭＡ−１０４細胞、ＦＬＩにより供給；
２５．ＰＫ−１５細胞、ＤＡＲＤにより供給；
２６．ＳＫ−６細胞、ＦＬＩにより供給；
２７．ＳＰＥＶ細胞、ＦＬＩにより供給；
２８．試験すべきＳＫ６、ＳＰＥＶ及びＰＫ−１５細胞の細胞懸濁体、１０％のＦＣＳを有する細胞培養媒体中で２０００００細胞／ｍｌを有する；
２９．滅菌Falconマイクロ管、容量１５ｍｌ。
【００３７】
実施例１：様々な細胞系列におけるパンクレアチンの有害な効果の検査
細胞培地を用いた材料試験試料中でのウィルスの検出の目的のために、細胞に対する検査すべきパンクレアチン試験体の有害な効果が、ＣＰＥｓを評価する際に誤った陰性の結果を除外することができるように、確かめられなければならない。後述するとおり、パンクレアチン試験試料懸濁体の有害な効果を確かめるための検査を従って、様々な細胞系列で実施した。
【００３８】
上述したとおり産生されたＰＡＮ懸濁体０．５ｍｌを有害な効果を試験するために取り出し、「パンクレアチン懸濁体試験試料」と名付けた。
【００３９】
低速遠心分離：残存するＰＡＮ懸濁体を、１５分間４０００ｒｐｍ（２７００×ｇ）及び４℃で、慣用の冷却遠心分離器（Megafuge(R) 1.0R Heraeus SEPATECH(R)、スウィングバケットローターを有する、Ｎｏ，２７０４）中で、遠心分離した。低速遠心分離後のこの上清を、次いで、更なる１５分間４０００ｒｐｍ及び４℃で遠心分離し、かつ、「低速遠心分離後の上清（supernatant after low-speed centrifugation）」と名付け、ウィルス滴定及び超遠心分離のために使用した。低速遠心分離後にそれぞれの場合において得られるこの２つの沈殿物を、組み合わせ（一緒で１ｍｌ）、それぞれの適した細胞培養培地９ｍｌ中に再懸濁し、かつ、「沈殿」と名付けた。
【００４０】
超遠心分離：試験試料「低速遠心分離後の上清」から５．０ｍｌを取り出し、超遠心分離機中で超遠心分離に課した。この終わりに、５０％のスクロース溶液０．５ｍｌをピペットを用いて、試験の実施のために必要な数の超遠心分離管中に導入した。傾斜角でもってこの超遠心分離官を維持し、この層に注意深く、４．５ｍｌの２０％スクロース溶液を積層し、この２つの溶液の間の区別する層が認識可能であった。上述したとおり取り出した「低速遠心分離後の上清」の試験試料の層５．０ｍｌを次いで、再度注意深く、かつ、乱れ及び２混合無しに、０％スクロース溶液上に配置した。この超遠心分離管を次いで、超遠心分離機ローター中に懸垂した。この終わりに、このローターの反対側の２つの超遠心分離管をそれぞれの場合に、ＰＢＳで平衡をとり、これを相応するホルダー中に挿入し、かつ、付属のフタでもってしっかりと封止した。このホルダーをローター中に挿入し、この試験試料を、４時間１０℃及び４００００ｒｐｍで遠心分離した（２７３７９９×ｇ）。超遠心分離後に、この超遠心分離管を、このホルダーから滅菌したワークベンチ上に取り除き、かつ、１．５ｃｍの高さでマークを付け、これは遠心分離管の底部から測定したものである。前もって滅菌されている蠕動ポンプ、チューブ及び細管を用いて、このマーク上の液体を、超遠心分離管から、ポンプ速度２ｍｌ／分で吸引し、この細管は常に、この液体の上方の境界に存在する。この様式で得られる最初の画分を、「超遠心分離後の上方画分」と名付けた。この遠心分離管中に残存する「超遠心分離後の下方画分」（１．５ｍｌ）をそれぞれの場合において、超遠心分離管から、単一チャネルピペットを用いて除去した。この超遠心分離管の底部に残存する可能性のある任意の沈殿を、単一チャネルピペットで繰り返し吸い上げることにより再懸濁し、かつ、同様に除去した。「超遠心分離後の下方画分」は、５．０ｍｌからなり、これは、当初使用されたウィルス含有試験試料容積に相当し、滅菌した勾配を付けられた管中で、それぞれ適した細胞培養培地と一緒に存在する。更なる処理まで、この２つの生じる画分を４℃で、又は延長した貯蔵の場合には、−２０℃で貯蔵した。
【００４１】
試験試料、「パンクレアチン懸濁試験試料」、「低速遠心分離後の上清」、「沈殿」（低速遠心分離後）、「超遠心分離後の上方画分」及び「超遠心分離後の下方画分」（５．０ｍｌに構成された後に）を、次いで、様々な細胞系列に関して、その有害作用について試験した。この終わりに、試験すべき試験試料の希釈系列を、それぞれの場合に産生した。試験すべき全ての試験試料を、それぞれ適した細胞培養培地での１：５の希釈から２倍に希釈した。マイクロタイタープレート中には、８つのパラレルで、ウェルにつきＰＫ−１５、ＳＰＥＶ又はＳＫ６細胞を含有する細胞懸濁体の１００μｌまで添加され、産生された試験試料希釈１００μｌが、それぞれの場合に、新規に産生された細胞懸濁体の１００μｌに対する。ＭＡ１０４細胞が試験され、２４時間の細胞層を有するマイクロタイタープレートを使用した。この終わりに、細胞培養培地をそれぞれの場合に、このウェルから除去し、かつ、血清無しの新規の細胞培養培地１００μｌで置換し、この結果、１：１０、１：２０、１；４０、１：８０、１：１６０その他の最終的な試験試料希釈を生じた。対照として、細胞培養培地１００μｌを、希釈系列１００μｌの代わりに、それぞれのマイクロタイタープレートの８つのウェル中に導入した。４ｍｌのパラディ緩衝液を含有する管及び濾紙と一緒にプレートの対を、気密なパウチ中に配置し、封止クリップでしっかりと封止した。このプレートを次いで、３６±１℃で、７日間の間インキュベーションした。インキュベーションの時間にあたり、このプレートを毎日、ＣＰＥの程度について、即ち、細胞溶解及び／又は細胞の分解、及び、パンクレアチンの有害な作用の結果としての細胞層の形成の不存在について、顕微鏡により検査した。この最終的な評価を、７日後に実施した。細胞分解が、この最終的な読み取り時に対照中で既に生じている場合には、滴定を繰り返した。
【００４２】
以下の第１表は、様々な細胞系列に関するその有害な作用についての様々な試験試料の試験結果を示す。試験試料が、最終的な希釈、例えば１：６４０で有害であり、希釈１：１２８０ではそうではない場合には、表中でこの試料について述べられる結果は、「≧１：６４０で有害、しかし、＜１：１２８０でそうでない試験試料」である。
【００４３】
第１表：パンクレアチン懸濁体及びこのサブトラクションの、様々な細胞系列に対する有害性についての試験結果
【表１】
2009537163.tif 000002
【００４４】
第１表中に示した結果からは、「超遠心分離後の下方画分」（これは、本発明による超遠心分離工程に曝され、かつ、この中で、ウィルス負荷が濃縮されている）中には、検査した全ての他の試験試料と比較して、検査した細胞系列に対する有害な作用においての、顕著な減少が存在する。
【００４５】
未処理のパンクレアチン懸濁体試験試料の有害な作用が、超遠心分離後の下方画分のものと比較した場合には、ＭＡ１０４細胞について上述した試験において、それぞれの場合には３つの更なる試験細胞について、８倍、そして、１６倍、有害な作用を減少することが可能であった。パンクレアチン懸濁体試験試料が低速遠心分離に２回かけられた後に、この上清はまだなお、僅かに濁っている。超遠心分離の間に、不溶性の粒子が、超遠心分離管の底部に薄い堆積物として沈殿する。この堆積物をまた再懸濁し、かつ、これは「超遠心分離後の下方画分」の一構成要素であった。従って、この堆積物が、「超遠心分離後の下方画分」の残留する有害な作用に寄与することが仮定されることができ、かつ、その残留する有害な作用がまだなお、この上述の堆積物の分離により減少されてよく、そしてもはや再懸濁にはよらない。
【００４６】
実施例２：増加したウィルス力価の添加での、パンクレアチン試験体の検査
増加したウィルス力価の添加でのパンクレアチン試験体の検査（＝「高スパイク試験」）の目的は、とりわけ、本発明による方法が、パンクレアチン試験体及び生細胞に有害であってよいその構成要素からウィルス負荷を定量的に分離するために適していることを示すことである。この終わりに、検査すべきこの各ウィルスの高力価の「スパイク（spiked）ウィルス調製物」を、公知の様式において調製した。
【００４７】
「高力価」とは、ここでは特に、（使用されるウィルス種の機能として）、それぞれの場合には、検査した試験試料のｍｌ当たりのおよそ最大の「組織培養感染用量（Tissue Culture Infectious Dose）」の少なくとも４ステップの１０を底とする対数（＝ｌｏｇ）のスパイクしたウィルス調製物の力価を意味すると理解されるべきである（＝ＴＣＩＤ50／ｍｌ）。ＰＣＶの高力価のスパイクしたウィルス調製物は、例えば、I. Tischer et al., Arch. Virol. 96 (1987) 39-57の方法に一致して、Ｄ−（＋）−グルコサミン溶液で培養するために使用したＰＫ−１５細胞を調製することにより得られてよい。
【００４８】
ａ．ＥＭＣＶ（ＬＣ  ７５株）での高スパイク試験
高力価（７．７０±０．１０  ｌｏｇ  ＴＣＩＤ50／ｍｌ）の、ＥＭＣＶ（ＬＣ  ７５株）のスパイクしたウィルス調製物０．７５ｍｌ及び抗生物質溶液０．７５ｍｌを、ＰＡＮ懸濁液（０．７５ｇのパンクレアチンに対する４．５ｍｌのダルベッコ培地の添加及び５０分間の氷冷しながらの撹拌により産生）に添加し、かつ、この生じる懸濁体を、更に１０分間撹拌した。０．５ｍｌのこの懸濁液を、ウィルス滴定のために取り出し、かつ、滴定まで４℃で貯蔵した（＝「ＥＭＣＶ高画分１」）。この残りの懸濁体を、１５分間４０００ｒｐｍ（＝２７００×ｇ）及び４℃で遠心分離した。遠心分離後のこの上清を、新規の遠心分離管中で、１５分間、４℃及び４０００ｒｐｍで再度遠心分離した。この第２の遠心分離後の上清を、滅菌した管中に定量的に移した（＝「ＥＭＣＶ高画分２」）。低速遠心分離後のこの２つの沈殿を、合計で６．５ｍｌのダルベッコ培地で再懸濁し、一緒にし、１５分間の、４０００ｒｐｍ及び４℃で再遠心分離した。この生じる上清を、滅菌した管中に移した。この沈殿の洗浄を２回更に繰り返し、それぞれ、６．５ｍｌの新規のダルベッコ媒体で繰り返した。この３回の洗浄溶液を組み合わせ、かつ、ウィルス滴定のために使用した（＝「ＥＭＣＶ高画分３」）。３回の洗浄後に、沈殿を、６．５ｍｌのダルベッコ培地中に再懸濁し、次いで滴定した（＝「ＥＭＣＶ高画分４」）。
【００４９】
５．０ｍのＥＭＣＶ高画分２を、実施例１で説明したとおりの、不連続的なスクロース勾配中で超遠心分離した。超遠心分離後に、この上方の（＝「ＥＭＣＶ高画分５」）及び下方の（＝「ＥＭＣＶ高画分６」）の画分を、別個に得、かつ、滴定した。
【００５０】
３倍のウィルス希釈系列を産生し、かつ、それぞれを、ＳＰＥＶ細胞懸濁体を有するマイクロプレート上に、１２個のパラレルで１２個の希釈工程を用いて移した。スパイクウィルス−希釈１０-3からの滴定；ＥＭＣＶ高画分−希釈１０-2からの滴定；ＥＭＣＶ高画分２−希釈１０-2からの滴定：ＥＭＣＶ高画分４−希釈１０-1からの滴定：ＥＭＣＶ高画分３−希釈１０-2からの滴定；ＥＭＣＶ高画分５−未希釈の試験試料からの滴定：ＥＭＣＶ高画分６−希釈１０-3からのトリプリケートの滴定。
【００５１】
マイクロタイタープレートを３６±１℃で、約５％のＣＯ2雰囲気で、かつ、６〜７日間にわたりインキュベーションし、顕微鏡により、ウェル中でＣＰＥの展開について評価した。力価を試験試料中で、Spearman-Kaerber方法に一致して計算した。ＥＭＣＶでの高スパイク試験の結果を、以下の表２中に示す。
【００５２】
第２表：パンクレアチン懸濁体中でのＥＭＣＶを用いた高スパイク試験の結果
【表２】
2009537163.tif 000003
【００５３】
１）値は、個々の滴定の標準偏差である；２）値は、９５％信頼区間である；３）値は、３回の決定の標準偏差である。
【００５４】
第２表からは、本発明による処理が実施される場合には、この未処理のスパイク試験試料（ＥＭＣＶ高画分１及び２）のウィルス負荷は、０．５ｌｏｇステップの偏差の一般的に許容される範囲を考慮して、少なくともおよそ定量的に、超遠心分離後の下方画分中で回収されたことが明らかである（ＥＭＣＶ高画分６）。更に、試験結果からは、ＥＭＣＶに対して、パンクレアチン試験体自体が、阻害性の又は不活性化する作用を有しないことが結論付けられる。
【００５５】
ｂ．ブタパルボウィルスを用いた高スパイク試験
ブタパルボウィルス（ＰＰＶ）は、成長するＳＫ６細胞中で培養されることができる。このウィルス収量が低すぎる場合には、このウィルスは、培養後に濃縮される。
【００５６】
高力価（４．７５±０．０６  ｌｏｇ  ＴＣＩＤ50／ｍｌ）の、ＰＰＶのスパイクしたウィルス調製物１．０ｍｌを、ＰＡＮ懸濁液（７．０ｍｌのダルベッコ培地の添加及び５０分間の氷冷しながらの撹拌により産生）に添加し、かつ、この生じる懸濁体を、更に１０分間撹拌した。０．５ｍｌのこの懸濁液を、ウィルス滴定のために取り出し、かつ、滴定まで４℃で貯蔵した（＝「ＰＰＶ高画分１」）。この残りの懸濁体を、１５分間４０００ｒｐｍ（＝２７００×ｇ）及び４℃で遠心分離した。遠心分離後のこの上清を、新規の遠心分離管中で、１５分間、４℃及び４０００ｒｐｍで再度遠心分離した。この第２の遠心分離後の上清を、滅菌した管中に定量的に移した（＝「ＰＰＶ高画分２」）。低速遠心分離後のこの２つの沈殿を、合計で９ｍｌのダルベッコ培地で再懸濁し、一緒にし、１５分間の、４０００ｒｐｍ及び４℃で再遠心分離した。この生じる上清を、滅菌した管中に移した。この沈殿の洗浄を２回更に繰り返し、それぞれ、９ｍｌの新規のダルベッコ媒体で繰り返した。この３回の洗浄溶液を組み合わせ、かつ、ウィルス滴定のために使用した（＝「ＰＰＶ高画分３」）。３回の洗浄後に、沈殿を、９ｍｌのダルベッコ培地中に再懸濁し、次いで滴定した（＝「ＰＰＶ高画分４」）。
【００５７】
５．０ｍｌのＰＰＶ高画分２を、実施例１で説明したとおりの、不連続的なスクロース勾配中で超遠心分離した。超遠心分離後に、この上方の（＝「ＰＰＶ高画分５」）及び下方の（＝「ＰＰＶ高画分６」）の画分を、別個に得、かつ、滴定した。
【００５８】
３倍のウィルス希釈系列を産生し、かつ、それぞれを、ＳＫ６細胞懸濁体を有するマイクロプレート上に、１２個のパラレルで１２個の希釈工程を用いて移した。マイクロタイタープレートを３６±１℃で、約５％のＣＯ2雰囲気で、かつ、６〜７日間にわたりインキュベーションし、顕微鏡により、ウェル中でＣＰＥの展開について評価した。このインキュベーション時間後に、プレートを、氷冷したアセトン／メタノール混合物の添加により固定し、不確定のＣＰＥを有するこのウェルを最終的な力価決定について、更に、ＦＩＴＣラベル化した抗ＰＰＶ抗体でインキュベーションし、次いでＵＶ光学顕微鏡のもとで評価した。力価を試験試料中で、Spearman-Kaerber方法に一致して計算した。
第３表：パンクレアチン懸濁体中でのＰＰＶを用いた高スパイク試験の結果
【表３】
2009537163.tif 000004
【００５９】
１）値は、個々の滴定の標準偏差である；２）値は、９５％信頼区間である；３）値は、３回の決定の標準偏差である。
【００６０】
第３表からは、ＥＭＣＶ高スパイク実験中で示されたとおり、本発明による処理が成功して進行する場合には、この未処理のスパイク試験試料（ＰＰＶ高画分１及び２）のウィルス負荷は、０．５ｌｏｇステップの偏差の一般的に許容される範囲を考慮して、少なくともおよそ定量的に、超遠心分離後の下方画分中で回収されたことが明らかである（ＰＰＶ高画分６）。ＰＰＶ高画分１中には、即ち、不溶性粒子の存在においては、１ｌｏｇステップより低い力価が、ＰＰＶ高画分２中で決定される。不溶性構成要素の存在は従って、明らかに滴定を邪魔する。更に、試験結果からは、パンクレアチン試験体自体は、ＰＰＶに対して阻害性の又は不活性化する作用を有しないことが結論付けられてよい。
【００６１】
実施例２：低いウィルス力価の添加での、パンクレアチン試験体の検査
減少するウィルス力価の添加でのパンクレアチン試験体の検査（＝「低スパイク試験」）の目的は、特に、それぞれの場合に使用されるウィルスについての本発明による方法の検出限度を確かめることであった。減少するウィルス力価を有する個々の試験試料中でのウィルス負荷の定量的な検出は、当初添加されるスパイクしたウィルス調製物のウィルス力価が、０．５ログステップの偏差の一般的に許容可能な範囲を考慮して、少なくともおおよそ、超遠心分離後の下方画分中で定量的に回収されている場合に、成功したとみなされる。
【００６２】
ａ．ＥＭＣＶを用いた低スパイク試験
ＰＡＮ懸濁体を産生した（２．５ｇのブタパンクレアチン、２．５ｍｌの抗生物質溶液、２０ｍｌのダルベッコ培地）。低スパイク試験を次いで、デュプリケイトで、相互に独立した試験において実施した。
【００６３】
第１の試験において、以下に述べるバッチを、ＰＡＮ懸濁体＋ＥＭＣＶスパイクウィルス溶液から産生した：
１）４．５ｍｌのパンクレアチン懸濁体＋０．５ｍｌの１０-3の希釈のスパイクウィルス；生じる希釈、１０-4；
２）４．５ｍｌのパンクレアチン懸濁体＋０．５ｍｌの１０-4の希釈のスパイクウィルス；生じる希釈、１０-5；
３）４．５ｍｌのパンクレアチン懸濁体＋０．５ｍｌの１０-5の希釈のスパイクウィルス；その他；
４）４．５ｍｌのパンクレアチン懸濁体＋０．５ｍｌの１０-6の希釈のスパイクウィルス；
５）４．５ｍｌのパンクレアチン懸濁体＋０．５ｍｌの１０-7の希釈のスパイクウィルス；
６）４．５ｍｌのパンクレアチン懸濁体＋０．５ｍｌの１０-8の希釈のスパイクウィルス。
【００６４】
全てのバッチを１時間室温でインキュベーションし、次いで、１５分間４℃で及び４０００ｒｐｍ（２７００×ｇ）で低速遠心分離した。低速遠心分離後の上清をそれぞれの場合に、新規の遠心分離管に移し、かつ、同じ条件下での別の低速遠心分離にかけた。低速遠心分離後の上清は、必要な場合には、細胞培養培地で５．０ｍｌの容積に構成され、かつ、それぞれの場合に、低速遠心分離後の上清５．０ｍｌを、実施例１に上記したとおりの不連続的なスクロース勾配において超遠心分離した。超遠心分離後に、この上方画分（＝「ＥＭＣＶ低画分２」；超遠心分離管の１．５ｃｍ下方）をそれぞれの場合に、蠕動ポンプを用いて取り出し、かつ、このそれぞれの下方画分（＝「ＥＭＣＶ下方画分３」）を、超遠心分離管からピペットを用いて除去した。超遠心分離後の下方画分はそれぞれの場合にＭＥＭで５．０ｍｌに構成され、次いで組織培養フラスコ中で滴定又は培養のために使用した。
【００６５】
３倍のウィルス希釈系列を次いで、前述のバッチ１）〜３）のそれぞれから産生し、かつ、それぞれを、１２個のパラレルで１２回の希釈ステップを用いて、ＳＰＥＶ細胞懸濁液を有するマイクロタイタープレート上に移した（ウェルにつき１００μｌの、２０００００細胞／ｍｌを有する、ＳＰＥＶ細胞の新規に調製された細胞懸濁液）。全てのバッチのＥＭＣＶ低画分３の試験試料を更に、ベース範囲２５ｃｍ2及び新規に調製された、２０００００細胞／ｍｌのＳＰＥＶ細胞の細胞懸濁液１０ｍｌの部分を有する細胞培養フラスコ中に移した。この終わりに、それぞれの試験試料のための６個の細胞培養フラスコを、０．２ｍｌの部分の試験試料ＥＭＣＶ低画分３で感染させた。並行して、対照を、いかなる添加のない１つの組織培養フラスコにより供給した。全ての滴定プレート及び組織培養フラスコを、３６℃±１℃でインキュベーションし、かつ、６〜７日間にわたり、ウェル又は組織培養フラスコ中のＣＰＥの展開について顕微鏡により評価した。力価を滴定した試験試料中で、Spearman-Kaerber方法に一致して計算した。
【００６６】
ＣＰＥが、７日後にバッチの６個の組織培養フラスコのいずれにも観察されない場合には、このフラスコを３回−７０℃で凍結し、かつ、再度解凍した。全ての組織培養フラスコの内容物を組み合わせ、かつ、０．１μｍ（孔径）のフィルターを通じて濾過した。この生じる濾過物を、ＳＰＥＶ細胞懸濁体に対する第２のパス（pass）を調製するために使用した。それぞれ１０ｍｌの新規のＳＰＥＶ細胞懸濁体を含有する２個の組織培養フラスコを、第１のパスから得られた懸濁体２ｍｌで感染させ、かつ、同様に、７日間３６±１℃でインキュベーションし、かつ、ＣＰＥの展開について観察した。ＣＰＥが第２のパスにおいても観察されない場合には、第３のパスが更に実施された。ネガティブな結果が第３のパスでも見出される場合には、当初の試験試料は、ＥＭＣＶ不含であると見なされてよい。
【００６７】
使用した０．１ｇのパンクレアチン試験体につきＥＭＣＶの１つの感染性単位の本発明による方法の検出限度を、ＥＭＣＶの勾配付けられた希釈での前述の低スパイク試験において確かめた。
【００６８】
ｂ．ＰＰＶを用いた低スパイク試験
ＰＡＮ懸濁体を産生した（２．５ｇのブタパンクレアチン、２．５ｍｌの抗生物質溶液、２０ｍｌのダルベッコ培地）。低スパイク試験を次いで、デュプリケイトで、相互に独立した試験において実施した。
【００６９】
この終わりにおいて、以下に述べるバッチを、ＰＡＮ懸濁体＋ＰＰＶスパイクウィルス溶液から産生した：
１）４．５ｍｌのパンクレアチン懸濁体＋０．５ｍｌの１０-1の希釈のスパイクウィルス；
２）４．５ｍｌのパンクレアチン懸濁体＋０．５ｍｌの１０-2の希釈のスパイクウィルス；
３）４．５ｍｌのパンクレアチン懸濁体＋０．５ｍｌの１０-3の希釈のスパイクウィルス；
４）４．５ｍｌのパンクレアチン懸濁体＋０．５ｍｌの１０-4の希釈のスパイクウィルス。
【００７０】
全てのバッチを１時間室温でインキュベーションし、次いで、１５分間４℃で及び４０００ｒｐｍ（２７００×ｇ）で低速遠心分離した。低速遠心分離後の上清をそれぞれの場合に、新規の遠心分離管に移し、かつ、同じ条件下での別の低速遠心分離にかけた。低速遠心分離後の上清は、必要な場合には、細胞培養培地で５．０ｍｌの容積に構成され、かつ、それぞれの場合に、低速遠心分離後の上清５．０ｍｌを、実施例１に上記したとおりの不連続的なスクロース勾配において超遠心分離した。超遠心分離後に、この上方画分（＝「ＰＰＶ低画分２」；超遠心分離管の１．５ｃｍ下方）をそれぞれの場合に、蠕動ポンプを用いて取り出し、かつ、このそれぞれの下方画分（＝「ＰＰＶ下方画分３」）を、超遠心分離管からピペットを用いて除去した。超遠心分離後の下方画分はそれぞれの場合にダルベッコ培地で５．０ｍｌに構成され、次いで組織培養フラスコ中で滴定又は培養のために使用した。
【００７１】
３倍のウィルス希釈系列を次いで、前述のバッチ１）〜３）のそれぞれから産生し、かつ、それぞれを、８個のパラレルで１２回の希釈ステップを用いて、ＳＫ６細胞懸濁液を有するマイクロタイタープレート上に移した（ウェルにつき１００μｌの２０００００細胞／ｍｌを有する、ＳＫ６細胞の新規に調製された細胞懸濁液）。
【００７２】
それぞれのバッチのための６個の細胞培養フラスコを、０．２ｍｌの部分のＰＰＶ低画分３で感染させた。並行して、対照を、いかなる添加のない１つの組織培養フラスコにより供給した。全ての滴定プレート及び組織培養フラスコを、３６℃±１℃でインキュベーションし、かつ、６〜７日間にわたり、ウェル又は組織培養フラスコ中のＣＰＥの展開について顕微鏡により評価した。力価を滴定した試験試料中で、Spearman-Kaerber方法に一致して計算した。
【００７３】
ＣＰＥが、７日後にバッチの６個の組織培養フラスコのいずれにも観察されない場合には、このフラスコを３回−７０℃で凍結し、かつ、再度解凍した。全ての組織培養フラスコの内容物を組み合わせ、かつ、０．１μｍ（孔径）のフィルターを通じて濾過した。この生じる濾過物を、ＳＫ−６細胞懸濁体に対する第２のパスを調製するために使用した。それぞれ１０ｍｌの新規のＳＫ−６細胞懸濁体を含有する２個の組織培養フラスコを、第１のパスから得られた懸濁体２ｍｌで感染させ、かつ、同様に、７日間３６±１℃でインキュベーションし、かつ、ＣＰＥの展開について観察した。ＣＰＥが第２のパスにおいても観察されない場合には、第３のパスが更に実施された。第３のパス中でもＣＰＥが見出されない場合には、細胞培養培地を、第３のパスのフラスコから７日間後に取り除き、かつ、細胞層を、氷冷したアセトン／メタノール（８０：２０ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）で固定した。感染した細胞を次いで、組織培養フラスコ中で、ＦＩＴＣラベル化抗ＰＰＶ抗体を用いて検出した（フラスコにつき１ｍｌの抗体溶液；３７℃での６０分間のインキュベーション、洗浄緩衝液での洗浄及びＵＶ光での顕微鏡による引き続く評価）。第３のパスのフラスコが感染した細胞不含である場合には、この当初の試験試料はＰＰＶ不含であると見なされた。
【００７４】
使用した０．１ｇのパンクレアチン試験体につきＰＰＶの１つの感染性単位の本発明による方法の検出限度を、ＰＰＶの勾配付けられた希釈での前述の低スパイク試験において確かめた。
【国際調査報告】
2009537163.tif 000005
2009537163.tif 000006