(57)【要約】  本発明は、タンパク質性薬剤を産生するための植物細胞培養物であって、タンパク質性薬剤をコードする導入遺伝子を発現するように安定的に形質転換された植物細胞系統および前記植物細胞培養物の増殖を支持するが、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ）の増殖を支持せず、そして動物起源の材料を含有しない増殖培地を含む植物細胞培養物を提供する。植物細胞系統は、継代中に一過性導入遺伝子発現が維持されるように連続的に継代されることが可能である。植物細胞系統はまた、凍結保存からの回収時に一過性導入遺伝子発現が回復されるように凍結保存されることが可能である。
2009514547.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質性薬剤を産生するための植物細胞培養物であって、
ａ）タンパク質性薬剤をコードする導入遺伝子を発現するように安定的に形質転換された植物細胞系統と、
ｂ）前記植物細胞培養物の増殖を支持するが、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ）の増殖を支持せず、そして動物起源の材料を含有しない増殖培地と、
を含み、
ここで、前記植物細胞系統は、継代中に一過性導入遺伝子発現が維持されるように連続的に継代されることが可能であり、前記植物細胞系統は、凍結保存からの回収時に一過性導入遺伝子発現が回復されるように凍結保存されることが可能である植物細胞培養物。
【請求項２】
前記形質転換植物細胞系統は、下等植物細胞系統、双子葉細胞系統または単子葉細胞系統である、請求項１に記載の植物細胞培養物。
【請求項３】
前記形質転換植物細胞系統は双子葉である、請求項２に記載の植物細胞培養物。
【請求項４】
前記形質転換植物細胞系統はタバコ細胞系統である、請求項３に記載の植物細胞培養物。
【請求項５】
前記タバコ細胞系統はＮＴ−１またはＢＹ−２から選択される、請求項４に記載の植物細胞培養物。
【請求項６】
前記双子葉形質転換細胞系統は、トマト、ジャガイモ、サツマイモ、キャッサバ、アルファルファおよびダイズを含むマメ科植物、ニンジン、イチゴ、レタス、オーク、カエデ、クルミ、バラ、ハッカ、ヒマワリ、ベニバナ、ワタ、タバコ、カボチャ、ヒナギク、カノーラまたはサボテンから選択される植物から誘導される、請求項３に記載の植物細胞培養物。
【請求項７】
前記単子葉形質転換細胞系統は、コムギ、芝、芝草、穀類、メイズまたはトウモロコシ、イネ、エンバク、コムギ、オオムギ、モロコシ、ラン、アヤメ、ユリ、タマネギ、バナナ、サトウキビ、モロコシ、およびヤシから選択される植物から誘導される、請求項２に記載の植物細胞培養物。
【請求項８】
前記形質転換下等植物細胞系統は、シダ、裸子植物、針葉植物、スギナ、ヒカゲノカズラ、苔類、ツノゴケ、コケ、紅藻、褐藻、配偶体、シダ植物の胞子体、または緑藻から誘導される、請求項２に記載の植物細胞培養物。
【請求項９】
前記タンパク質性薬剤はトリウイルス由来のタンパク質である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の植物細胞培養物。
【請求項１０】
前記タンパク質は、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）由来のヘマグルチニン／ノイラミニダーゼタンパク質、トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）由来のヘマグルチニンタンパク質、または伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス由来のＶＰ２タンパク質である、請求項９に記載の植物細胞培養物。
【請求項１１】
前記タンパク質は、配列番号２、配列番号４または配列番号１２を含む、請求項９に記載の植物細胞培養物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００５年１１月４日に出願されたU.S.provisional application Serial No.60/733,702の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、一般に、植物細胞培養物における植物細胞培養物およびタンパク質産生の分野に関する。特に、本発明は、治療用薬剤およびワクチンとしての使用のための広範な単純および複合タンパク質を産生することが可能な万能の産生システムならびに植物細胞系統に関する。
【背景技術】
【０００３】
組換えＤＮＡ技術は、ワクチンを含む薬学的ならびに獣医学的医薬品の安全性、品質、効力およびコストにおける実質的な改善を提供してきた。植物産生経粘膜ワクチンは、ＣｕｒｔｉｓｓおよびＣａｒｄｉｎｅａｕによって発明された。特許文献１；特許文献２および特許文献３（参照により本明細書に援用される）を参照のこと。Ａｒｎｔｚｅｎ、ＭａｓｏｎおよびＬａｍを含む他のものは、免疫防御抗原を発現するトランスジェニック植物および産生のための方法について記載している。特許文献４；特許文献５；特許文献６；特許文献７；特許文献８；および特許文献９（それらの全体が参照により本明細書に援用される）を参照のこと。
【０００４】
規定培地において細胞培養を使用する植物細胞産生は、増殖培地における動物を供給源とする成分の必要性を回避し、産生プロセスから病原性混入物を伝達する危険性を本質的になくす。植物細胞は翻訳後グリコシル化が可能であり、植物細胞増殖培地は、一般に、ワクチンの製造において現在使用されている従来の増殖培地と比較して、それほど高価ではなく、取り扱いおよび調製が容易である。
【０００５】
植物系において産生される薬理学的または関連の生物学的活性のワクチン抗原およびタンパク質は、従来の産生系より多くの利点を付与する。植物由来のサブユニットタンパク質は、毒性を再発し得ない（生の従来的にまたは組み換え的に産生される生のベクトル化されたワクチンの特徴）。従来の製造方法から産生されるサブユニットタンパク質は、タンパク質の不安定性および生化学的な抽出の問題により産生および精製することが困難であり得、原核細胞において産生される場合、グリコシル化を必要とするサブユニットワクチン成分がグリコシル化されない。
【０００６】
植物は、任意の単一な従来のまたは哺乳動物由来の組換えＤＮＡ系から誘導することが困難である独特な利益を提供する。従来、サブユニットワクチンまたはタンパク質性薬剤は次のようなものである：１）それらの産生を抑制する低い収率のため、組み換えまたは従来の供給源から精製することが困難である；２）タンパク質分解、ｐＨ、または精製中に使用される溶媒により不安定である；３）それらは生来ではないか、または精製プロセスは重要なエピトープを変性するため、より効力が低い；および４）哺乳動物系において産生される場合、生物学的起源の外来の材料により阻害される（上に記載）。
【０００７】
生物製薬学的産生のための「マスター細胞系統」の原理は、製造手順の部分として生体生物体を利用し、いくつかの基本的な教義に頼る：１）規定された起源および継代経歴の単一培養は、細胞表現型の規定された特徴および所望される製造特徴を伴って保存される；２）保存、典型的に、凍結保存は、長い間持続する（数年以上に及ぶ）；３）細胞は、回収され、拡大され、「ワーキングシード」に無期限に継代され、別の期間の凍結保存に供され得る（細胞の堅牢性を必要とする原理）；および４）細胞は、規定された数の継代後の初期のクリオスタット（ｃｒｙｏｓｔａｔｅ）の前に見出される細胞表現型の規定された特徴および所望される製造特徴を消失しない。
【特許文献１】U.S.Patent No.5,654,184
【特許文献２】U.S.Patent No.5,679,880
【特許文献３】U.S.Patent No.5,686,079
【特許文献４】U.S.Patent No.5,484,717
【特許文献５】U.S.Patent No.5,914,123
【特許文献６】U.S.Patent No.6,034,298
【特許文献７】U.S.Patent No.6,136,320
【特許文献８】U.S.Patent No.6,194,560
【特許文献９】U.S.Patent No.6,395,964
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
それ故、当該技術分野では、マスターシード原理下で標的成分を生物学的に製造する際の長期間増殖、再凍結保存、および安定性を提供する植物細胞ならびに植物細胞培養物が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、規制コンプライアンスおよびＧＭＰ（医薬品の製造管理および品質管理に関する基準）製造規範に適するタンパク質性薬剤の産生のための植物細胞培養物ならびに植物細胞を培養および貯蔵する方法を提供する。本発明の所定の態様では、トランスジェニック細胞培養物は、ワクチン、産業的、薬学的および薬理学的調製において有用な単純または複合的な生物薬理学的タンパク質ならびにペプチド薬剤を発現させるために使用される。本発明の他の態様は、植物細胞産生ワクチン産生系を提供する。さらに加えて、本明細書に記載の植物マスター細胞系統は、規制要件を満たすのに十分な安定性および堅牢性を提示する。
【００１０】
配列の概要
図１Ａおよび１Ｂに示される配列番号１および２は、ＮＤＶ株「ラソタ（Ｌａｓｏｔａ）」のＨＮ遺伝子の植物最適化コーディング配列およびタンパク質配列である。
【００１１】
図１０に示される配列番号３および４は、ＡＩＶ  Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６８（Ｈ５Ｎ９）のＨＡ遺伝子のＤＮＡおよびタンパク質配列である。
【００１２】
配列番号５は、ｐＣＰ！Ｈ上のＣｓＶＭＶプロモーターを末端加工（ｅｎｄ−ｔａｉｌｏｒ）するために使用されるＰＣＲプライマーである。
【００１３】
配列番号６は、ｐＣＰ！Ｈ上のＣｓＶＭＶプロモーターを末端加工するために使用されるＰＣＲプライマーである。
【００１４】
配列番号７は、ＮｃｏＩ部位を作製するために使用される変異誘発プライマーである。
【００１５】
配列番号８は、５’領域に相補的な順方向プライマーである。
【００１６】
配列番号９は、ＸｈｏＩＩ部位を作製するために使用される変異誘発プライマーである。
【００１７】
図１４に示される配列番号１０は、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのＶＰ２遺伝子のＤＮＡ配列である。
【００１８】
配列番号１１は、Ｅ／９１  ＶＰ２の変種をコードする植物最適化ＤＮＡ配列（１４２５塩基）である。Ｅ／９１植物最適化ＶＰ２のコーディング領域は、塩基１６〜１３８３（１３７１塩基）を含む。６つのフレーム終止が塩基１３８４〜１４２５において認められる。
【００１９】
配列番号１２は、Ｅ／９１  ＶＰ２コーディング領域の植物最適化バージョン（配列番号１１）によってコードされるＥ／９１  ＶＰ２タンパク質の配列を含む。
【００２０】
配列番号１３は、６つのリーディングフレームにおいて翻訳終結（「ストップ」）コドンをコードするＤＮＡ配列である。配列は、形質転換中のＤＮＡ組み込み後の偶発的オープンリーディングフレームの翻訳を終結させるために使用されたが、これはＳａｃＩ  ＢｓｔＥＩＩ、およびＢｇｌＩＩ制限酵素認識部位を含む（Tsukamoto K.,Kojima,C.,Komori,Y.,Tanimura,N.,Mase,M.,and Yamaguchi.,S.(1999)Protection of chickens against very virulent infectious bursal disease virus(IBDV)and Marek's disease virus(MDV)with a recombinant MDV expressing IBDV VP2.Virol.257:352-362）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本出願の特定の態様は、タンパク質性薬剤を産生するための植物細胞培養物であって、タンパク質性薬剤をコードする導入遺伝子を発現するように安定的に形質転換された植物細胞系統および前記植物細胞培養物の増殖を支持するが、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ）の増殖を支持せず、そして動物起源の材料を含有しない増殖培地を含む植物細胞培養物を提供する。植物細胞系統は、継代中に一過性導入遺伝子発現が維持されるように連続的に継代されることが可能であり、そして凍結保存からの回収時に一過性導入遺伝子発現が回復されるように凍結保存されることが可能である。
【００２２】
本出願の他の態様は、１つ以上の次の特徴を有するタンパク質性ワクチンまたは治療用薬剤を産生する植物細胞培養物を提供する：ａ）培養／増殖培地における動物生成物が欠如していること；ｂ）検出可能なレベルの植物二次代謝物（例えば、ニコチン代謝物）が認められないこと；またはｃ）検出可能なレベルのマイコプラズマ、ウイルス、細菌もしくは真菌が認められないこと。それ故、本発明によって提供される植物細胞培養物は、本段落に記載の特徴のうちのいずれか１つ、２つ、もしくは３つすべて（例えば、特徴ａ）；または特徴ｂ）；または特徴ｃ）；または特徴ａ）およびｂ）；または特徴ａ）およびｃ）；または特徴ｂ）およびｃ）；または特徴ａ）およびｂ）およびｃ））を有することができる。
【００２３】
本発明はまた、１つ以上の次の特徴を含む安定的に形質転換された植物に基づくワクチン産生系を提供する：ａ）タンパク質性薬剤を発現し、恒久的に貯蔵することができ、他のすべてのシードおよび継代物が誘導される他のすべての継代物の供給源としての役割を果たすことができる組み換え植物細胞培養マスター細胞系統の選択および樹立；ｂ）ワーキングシード（マスター細胞系統から誘導され、プロダクションシードを調製するために使用される貯蔵された供給源）およびプロダクションシード（植物から作製されるタンパク質性薬剤の産生を開始するためのさらなる増殖を伴わずに使用される指定された範囲の継代レベルにおける組み換え細胞）を作製する能力；ｃ）タンパク質性薬剤は、動物起源の産物（例えば、ウマ、ウシ胎児などのような哺乳動物起源の血清）の非存在下で（の使用を伴わずに）バイオリアクターにおいて、安定的に形質転換された植物細胞を増殖させることによって、産生させることができる；ｄ）皮膚、筋肉内、鼻腔内、または経口送達を介する動物への投与に安全であること；ｅ）検出可能なレベルの植物二次代謝物（例えば、多環芳香族炭化水素ならびにニトロソアミンであって、アナタビン、アナバシン、ベンゾ（ａ）ピレン、ニコチンおよびノルニコチンを含む）が認められないこと；ｆ）マイコプラズマ、ウイルス、真菌、または細菌が認められないこと；ｇ）数年間まで、好ましくは、１〜１０年間、より好ましくは、１〜５年間の長期間、周囲、冷蔵もしくは凍結条件下で凍結乾燥された粉末として安定であるタンパク質性薬剤またはワクチンを産生すること；ｈ）集成されたタンパク質性薬剤（ワクチン）（例えば、アジュバントと組み合わせられたワクチン抗原またはタンパク質性薬剤）は冷蔵条件下で数箇月間安定である；ｉ）系は、含有される条件においてかつ稔性植物体を再生する必要性を伴わずに実施することができるプロセスにおいて使用することができる；ｊ）系は、高い比率の回収率（例えば、１００％までの回収率、あるいは少なくともまたは９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％回収率を超える回収率）で融解することができるマスター細胞系統を提供する；ｋ）凍結保存されたマスター細胞系統から高い回収率（例えば、１００％までの回収率あるいは少なくともまたは９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％を超える回収率）を伴う凍結保存されたワーキングシードの調製および回収を提供すること；ｌ）生じるタンパク質性薬剤あるいはワクチンを、従来のワクチン集成体（既知のアジュバントと組み合わせられたタンパク質性薬剤／ワクチン）または新規のワクチン集成体（例えば、細胞ペースト）に処方し、そして、ワクチン接種された個体において血清変換（ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）および／もしくは疾患予防を提供するために投与することができる；ｍ）家畜もしくは家禽の確立された忍容レベル未満の２，４−Ｄレベルを有する従来または新規のワクチン集成体を提供すること；ｎ）商業的製造プロセスにまで規模を変更することができる（ｓｃａｌａｂｌｅ）こと（例えば、系または細胞は、１０リットル〜１００，０００リットル；���ましくは、１００リットル〜１，０００もしくは５，０００もしくは１０，０００の範囲の振盪フラスコからバイオリアクターの範囲に及ぶ容器において培養することができる）；ｏ）安定的に形質転換された植物細胞系統を産生すること；ならびに／あるいはｐ）マスターおよびワーキング対照（その有効性が、宿主動物において直接または間接的に相関する対照材料（例えば、サイトカインの生物学的活性またはワクチン抗原の抗原性／免疫原性）の調製のために使用することができること。本発明の所定の態様は、上記で同定される特徴のすべてを有する植物から作製されるワクチン産生系を提供する。
【００２４】
本明細書において使用するように、二次代謝物の「検出可能なレベルが認められない」という語句は、アッセイされる物質が、ＧＣ／ＭＳおよびＬＣ／ＭＳ技術のような標準的な技術を使用しても検出することができないことを意味するものと理解すべきである。これらの技術の検出限界は１００ｎｇ／ｍｌである。「マイコプラズマ、ウイルス、真菌および細菌が認められない」という用語は、本明細書の実施例５に記載の生物学的試験によって決定されるような生物体が存在しないことを意味する。
【００２５】
家禽についての２，４−Ｄ忍容レベル：トリ疾患ウイルスの予防のためのワクチン接種から生じる２，４−Ｄ残留物は、控えめに見積もっても、卵における２，４−Ｄに対する現在のＥＰＡの確立された忍容性の僅か０．００７％に過ぎない。家禽における２，４−Ｄについて確立された現在のＥＰＡ忍容性は、０．０５ｍｇ／ｋｇまたは５０μｇ／ｋｇである。トリウイルスの予防のためのワクチン接種から生じる２，４−Ｄ残留物は、控えめに見積もっても、家禽組織における２，４−Ｄに対する現在のＥＰＡの確立された忍容性の僅か０．０００７９％に過ぎない。
【００２６】
「安定的に形質転換された」、「安定的に形質転換された植物細胞系統」もしくは「安定的に形質転換された植物に基づくワクチン産生系」または「一過性導入遺伝子発現」という語句は、活発に増殖し、百（１００）を超える継代にわたって生物学的かつ免疫学的に活性な抗原を産生し、そして場合により、表現型増殖速度、もしくは導入遺伝子発現レベルにおいて有意な変化を生じないサザンブロット、ＰＣＲ、またはＡＦＬＰのような遺伝子解析に基づいて実証される経時的かつ継代数にわたって不変を保持する組み換え挿入物（遺伝事象）を含有する植物細胞系統あるいは植物に基づくワクチン産生系を提供する。
【００２７】
本出願に記載の植物細胞培養物は、下等植物、双子葉植物または単子葉植物から誘導される形質転換植物細胞系統を含有することができる。形質転換細胞系統を誘導することができる双子葉植物の非限定的例は、トマト、ジャガイモ、サツマイモ、キャッサバ、アルファルファおよびダイズを含むマメ科植物、ニンジン、イチゴ、レタス、オーク、カエデ、クルミ、バラ、ハッカ、ヒマワリ、ベニバナ、ワタ、タバコ、カボチャ、ヒナギク、カノーラまたはサボテンである。本発明の所定の態様は、ＮＴ−１またはＢＹ−２のようなタバコ細胞系統を利用する。形質転換植物細胞系統が単子葉植物から誘導される場合、コムギ、芝、芝草（ｔｕｒｆ  ｇｒａｓｓ）、穀類、メイズ（ｍａｉｚｅ）もしくはトウモロコシ、イネ、エンバク、コムギ、オオムギ、モロコシ、ラン、アヤメ、ユリ、タマネギ、バナナ、サトウキビ、モロコシ、またはヤシの植物を使用して、植物細胞系統を樹立することができる。さらに、細胞系統は、シダ、裸子植物、針葉植物、スギナ、ヒカゲノカズラ、苔類、ツノゴケ、コケ、紅藻、褐藻、配偶体、シダ植物の胞子体、または緑藻のような下等植物から樹立することができる。本発明において有用な植物細胞培養物の好適なグループは、トウモロコシ、イネまたはタバコ植物から誘導される植物細胞培養物である。
【００２８】
タンパク質性薬学的またはワクチン剤として、酵素、毒素、細胞受容体、リガンド、ウイルスまたは細菌性タンパク質もしくは抗原、シグナル伝達剤、サイトカイン、あるいはトランスジェニック植物細胞培養物において発現される他の治療用タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。そのようなタンパク質性薬学的またはワクチン剤をコードするポリヌクレオチド配列は、ＥＭＢＬ、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ、もしくはＮＣＢＩデータベースのような商業的データベースから得ることができる。タンパク質性薬剤はまた、特定の病原性ウイルス由来の１つ以上のタンパク質（抗原）であって、次のものを含むがこれらに限定されない：ＡＩＶ（トリインフルエンザウイルス）のＨＡ（ヘマグルチニン）タンパク質、１型糖タンパク質；トリＮＤＶ（ニューカッスル病ウイルス）のＨＮ（ヘマグルチニン／ノイラミニダーゼ）タンパク質、２型糖タンパク質（U.S.Patent No.5,310,678（参照により本明細書に援用される）を参照のこと）；伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）の構造タンパク質、ＶＰ２；酵素ＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の易熱性毒素のＬＴ−Ａサブユニット）；２つのサブユニットからなる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細菌毒素ＬＴ、ヒトウイルスであって、次のものを含むがこれらに限定されない：ポリオウイルス、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）のようなピコルナウイルス、デングおよびウエストナイルウイルスのようなフラビウイルスならびに呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）。典型的に、トランスジェニック植物細胞培養物において産生されるタンパク質性薬剤は、機能的または構造的活性において、天然の供給源から単離される同じタンパク質と等価である。ウイルス抗原の非限定的例はまた、配列番号１、２、３、４、１１、および１２にも記載されている。
【００２９】
ワクチン接種およびワクチン接種することは、宿主の免疫系が刺激され、そして病原体の以後の暴露に対する宿主の反応に関連する以後の所望されない病状を予防もしくは減弱するように、タンパク質性薬剤を含有する免疫原性製剤（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）を宿主に接種することによって、病原体に対して予防を提供するかまたは血清変換（例えば、抗体の産生）を誘導するための手段として規定される。
【００３０】
ワクチンは、ヒトを含む動物にワクチン接種するために使用される組成物であって、宿主の免疫系の刺激を誘導し、そして病原体免疫防御抗原物質の以後の暴露に対する宿主の反応に関連する以後の所望されない病状を予防または減弱する少なくとも１つのタンパク質性薬剤を含有する。
【００３１】
病原性生物体は、それが感染した動物または宿主において疾患または誘導された／制御された生理学的状態を引き起こす細菌、ウイルス、真菌、あるいは原生動物である。
【００３２】
本明細書の目的のために、アジュバントは、免疫原もしくは抗原に対する免疫応答を強化するか、増加するか、緩和するかまたは増強する物質である。アジュバントは、典型的に、体液性および細胞性免疫応答の両方を増強するが、しかし、他方の非存在下でいずれか一方に対して増加した応答も、アジュバントを規定する見込みがある。さらに、アジュバントおよびそれらの使用は免疫学者に周知であり、そして典型的に、免疫原の用量が制限される場合、免疫原が乏しい免疫原性である場合、または投与経路が最適な状態ではない場合、免疫応答を増強するために用いられる。それ故、「アジュバント量」という用語は、所定の免疫原または抗原に対する免疫応答を増強することが可能なアジュバントの量である。「アジュバント量」に等しい質量は変動し、免疫原の特徴、投与される免疫原の量、宿主の種、投与経路、および免疫原を投与するためのプロトコルを含むがそれらに限定されない様々な因子に依存する。「アジュバント量」は、特定の組の環境を所与として、日常的な実験によって容易に定量することができる。これは、当業者の裁量範囲内に十分に当てはまり、そして典型的に、投与される免疫原およびアジュバントの変動する用量に対して日常的な用量応答決定の使用を用いる。応答は、酵素免疫測定法（ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂａｎｔ  ａｓｓａｙ）、ラジオイムノアッセイ、赤血球凝集アッセイなどを使用して、血清抗体力価または免疫原に対して惹起される細胞性応答を決定することによって測定される。
【００３３】
有効量は、ヒトもしくは動物が病原因子によって展開される攻撃に効果的に抵抗するのに十分な免疫応答をヒトもしくは動物において誘導するかまたは糖尿病に対する自己免疫抗原のような動物の生理学的要件に応答するのに必要な量である。そのようなヒトまたは動物に投与される用量は、特定の免疫防御粒子（ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）もしくは粒子の組み合わせ、ヒトもしくは動物の病態、および選択された投与経路を含む関連の環境に照らし合わせて、医師、獣医師、または訓練された科学者によって決定される。一般に、有効量は、約１ｎｇ〜約０．５ｍｇ、好ましくは、約１μｇ〜約５０μｇの範囲である。家禽のニューカッスル病ウイルス（ＨＮ抗原）では、有効量は、約０．５μｇ〜約５０μｇ、好ましくは、ＳＱ経路を介して約２．５μｇ〜約５μｇの範囲である。ＩＮ／眼粘膜経路を介する家禽におけるＨＮに対する有効量は、約０．５μｇ〜約５０μｇ、好ましくは、約５μｇ〜約２５μｇ、より好ましくは、約１０μｇ〜約１２μｇの範囲である。トリインフルエンザウイルス（ＨＡ抗原）では、有効量は、約０．５μｇ〜約５０μｇ、好ましくは、約１μｇ〜約３０μｇ、より好ましくは、ＩＮ／眼経路を介して約２４μｇ〜約２６μｇであり、そして好ましくは、ＳＱ経路を介して約１μｇ〜約５μｇの範囲である。家禽の伝染性ファブリキウス嚢病（ＶＰ２抗原）では、有効量は、０．５μｇ〜約５０μｇ、好ましくは、約５μｇ〜約２５μｇ、より好ましくは、ＳＱ経路を介して約５μｇ〜約２０μｇの範囲である。ＬＴ抗原では、有効経口量は、約５０ｎｇ〜約２５０ｎｇ、好ましくは、約１００ｎｇ〜約２００ｎｇの範囲である。ＬＴ抗原では、有効ＳＱまたはＩＮ／眼適用量は、約５０ｎｇ〜約１００μｇ；好ましくは、約１μｇ〜約５０μｇ、より好ましくは、約２μｇ〜約１０μｇの範囲である。本明細書において示される用量範囲は、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、熟練した実践者のための一般的指針として示される。
【００３４】
トランスジェニック植物は、植物細胞培養物、植物細胞系統、植物組織培養物、下等植物、単子葉植物細胞培養物、双子葉植物細胞培養物、または形質転換植物細胞もしくはプロトプラストから誘導されるそれらの子孫として本明細書において規定され、ここで、形質転換植物のゲノムは、実験室技術によって誘導される外来ＤＮＡを含有し、同じ種の生来の非トランスジェニック植物細胞には本来存在しない。「トランスジェニック植物」および「形質転換植物」という用語は、ＤＮＡが外因性ＤＮＡ分子を含有する植物を規定するための同義語として当該技術分野において使用されている。
【００３５】
形質転換用植物または形質転換植物細胞培養物のための遺伝子カセットの構築は、Sambrook et al.(1989);and Ausubel et al.,(1987)Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,New York,NYにおいて開示されているような周知の方法を利用して、容易に達成することができる。本発明はまた、それらが発現に対して開示された効果を有することが可能であるように、免疫防御抗原またはタンパク質性薬剤をコードする開示された配列に実質的な配列相同性を有するＤＮＡ配列を含む。本出願において使用されるように、「実質的な配列相同性」という用語は、ヌクレオチド配列（ＤＮＡもしくはＲＮＡの場合）またはアミノ酸配列（タンパク質もしくはポリペプチドの場合）が別のヌクレオチドまたはアミノ酸配列との実質的、機能的または構造的等価物を呈することを示すために使用される。実質的な配列相同性を有する配列間の任意の機能的または構造的差異は、僅少であり；即ち、それらは、本出願に示されるように機能する配列の能力に影響を及ぼさない。本明細書において開示される配列と実質的な配列相同性を有する配列は、通常、変異体のような開示された配列の変種であるが、また、合成配列であってもよい。
【００３６】
ほとんどの場合、本明細書において具体的に開示した配列に対して９５％相同性を有する配列は、等価物として機能し、そして多くの場合、それよりかなり少ない相同性、例えば７５％または８０％が許容可能である。それほど重要ではないこれらの配列の部分を局在化することは、時間がかかりえるが、しかし、日常的であり、当該技術分野の技術の範囲内に良好に当てはまる。オリゴヌクレオチド配列を改変するための例示的技術は、ポリヌクレオチド仲介部位特異的変異誘発を使用することを含む。Zoller et al.(1984)；Higuchi et al.(1988);Ho et al.(1989)；Horton et al.(1989);and PCR Technology :Principles and Applications for DNA Amplification,(ed.)Erlich(1989)を参照のこと。
【００３７】
本発明に有用な構築物を調製する際に、多様なＤＮＡフラグメントは、適した配向において、必要に応じて、適したリーディングフレームにおいてＤＮＡ配列を提供するように、操作され得る。アダプターまたはリンカーは、ＤＮＡフラグメントを接続するために用いてもよく、または他の操作は、好都合な制限部位を提供すること、過分のＤＮＡの取り出し、制限部位の取り出しなどに関与し得る。
【００３８】
多様な工程を行う際に、所望される宿主細胞への以後の導入のためにプロモーター／目的の遺伝子を含有するベクターを増幅するように、クローニングが用いられる。広範なクローニングベクターが利用可能であり、ここで、クローニングベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において機能的である複製系および形質転換細胞の選択を可能にするマーカーを含む。例示的ベクターとして、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ系列、ｐＡＣＹＣ１８４、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系列（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などが挙げられる。それ故、配列は、適切な制限部位でベクターに挿入され得、生じるプラスミドを使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＨＢ１０１、ＪＭ１０１およびＤＨ５α）を形質転換し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は適切な栄養培地において増殖され、そして細胞は回収および溶解され、そしてプラスミドが回収される。解析は、配列解析、制限酵素解析（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）、電気泳動などに関与し得る。それぞれの操作後、最終的構築物におい使用すべきＤＮＡ配列は、制限酵素処理（ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）され、そして次の配列に接続され得、ここで、部分的構築物のそれぞれは、同じまたは異なるプラスミドにクローニングされ得る。
【００３９】
ベクターは利用可能であるか、または植物細胞の形質転換のために容易に調製することができる。一般に、プラスミドまたはウイルスベクターは、所定の宿主において異種のＤＮＡ配列の維持および発現に必要なすべてのＤＮＡ制御配列を含有すべきである。そのような制御配列として、一般に、リーダー配列、および翻訳開始シグナルコドンをコードするＤＮＡ配列、翻訳ターミネーターコドン、ならびにメッセンジャーＲＮＡプロセシングを制御する３’ＵＴＲシグナルをコードするＤＮＡ配列が挙げられる。任意の特定の種において発現を最適化するための適切なエレメントの選択は、本開示内容の教示を利用する当業者の問題である。最後に、ベクターは、望ましくは、ベクターを含有する宿主細胞の同定を可能にする表現型特性を提供することが可能であるマーカー遺伝子を有するべきである。
【００４０】
植物細胞に挿入される外来コーディング配列（例えば、免疫防御剤またはタンパク質性薬剤）の活性は、挿入物に隣接する内因性植物ＤＮＡの影響に依存する。一般に、異種遺伝子の挿入は、任意の形質転換技術を使用して無作為であるようであるが；しかし、植物細胞へのＤＮＡの部位特異的組み換えを伴う植物を産生させるための技術が現在存在する（WO91/09957を参照のこと）。プロモーターの制御下で所望される１つ以上の配列の発現を生じる任意の方法または方法の組み合わせが許容可能である。
【００４１】
本明細書において提供される植物細胞培養物として、植物細胞を形質転換するための特定の任意の方法があるが、これに限定されるわけではない。ＤＮＡを植物細胞に導入するための技術は、当業者に周知である。外来ＤＮＡを植物細胞に送達するための４つの基本的な方法が記載されている。化学的方法（Graham and van der Eb,Virology,54(02):536-539,1973;Zatloukal,Wagner,Cotten,Phillips,Plank,Steinlein,Curiel,Birnstiel,Ann.N.Y.Acad.Sci.,660:136-153,1992)；マイクロインジェクションを含む物理的方法（Capecchi,Cell,22(2):479-488,1980）、エレクトロポレーション（Wong and Neumann,Biochim.Biophys.Res.Commun.107(2):584-587,1982;Fromm,Taylor,Walbot,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82(17):5824-5828,1985;U.S.Pat.No.5,384,253）および遺伝子銃（Johnston and Tang,Methods Cell.Biol., 43(A):353-365, 1994;Fynan,Webster,Fuller, Haynes,Santoro,Robinson,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(24):11478-11482,1993）；ウイルス方法（Clapp,Clin.Perinatol.,20(1): 155-168,1993; Lu,Xiao,Clapp, Li,Broxmeyer, J.Exp.Med.178(6): 2089-2096,1993;Eglitis and Anderson, Biotechniques,6(7): 608-614,1988; Eglitis,Kantoff, Kohn, Karson, Moen, Lothrop, Blaese, Anderson, Avd.Exp.Med.Biol.,241:19-27,1988）；および受容体仲介方法（Curiel, Agarwal, Wagner, Cotten, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 88(19):8850-8854, 1991;Curiel, Wagner, Cotten, Birnstiel, Agarwal, Li,Loechel, Hu,Hum.Gen.Ther., 3(2):147-154, 1992;Wagner et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 89(13):6099-6103, 1992）。
【００４２】
エレクトロポレーションによるＤＮＡの植物細胞への導入は、当業者に周知である。ペクチン分解酵素のような植物細胞壁分解酵素は、非処置細胞よりエレクトロポレーションによる形質転換をより受け易いレシピエント細胞にするために使用される。エレクトロポレーションによって形質転換を行うために、細胞の懸濁培養物のような脆い組織、または胚状カルス（ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ  ｃａｌｌｕｓ）、または未熟な胚または他に由来する組織のいずれかを直接用いてもよい。一般に、ペクチン分解性酵素に対して標的植物材料の細胞壁を部分的に分解するかまたは制御された様式で機械的に損傷することが必要である。そのような処置された植物材料は、エレクトロポレーションによって容易に外来ＤＮＡを収容する。
【００４３】
外来形質転換用ＤＮＡを植物細胞に送達するための別の方法は、マイクロプロジェクタイルボンバードメントによる。この方法では、微小粒子が外来ＤＮＡで被覆され、そして推進力によって細胞に送達される。そのような微粒子は、典型的に、タングステン、金、白金、および類似の金属からなる。マイクロプロジェクタイルボンバードメントの利点は、プロトプラストの単離（Cristou et al.,1988,Plant Physiol.,87:671-674）も、またアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）感染に対する感受性のいずれも必要としないことである。加速によりＤＮＡをトウモロコシ細胞に送達するための方法の例示的実施形態がＢｉｏｌｉｓｔｉｃｓ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍであり、懸濁液において培養したトウモロコシ細胞で被覆されたフィルター表面上のスクリーンを介してＤＮＡまたは細胞で被覆された粒子を推進するために使用することができる。スクリーンは、粒子が大きな凝集体としてレシピエント細胞に送達されないように、粒子を分散する。ボンバードメントでは、懸濁液中の細胞を、フィルターまたは固体培養培地に集中させることが好ましい。あるいは、未熟な胚または他の標的細胞を、固体培養培地上に配置してもよい。衝撃しようとする細胞を、マクロプロジェクタイル停止プレートの下方の適切な距離に置く。ボンバードメント形質転換では、最大数の安定した形質転換体を得るために、プレボンバードメント培養条件およびボンバードメントパラメータを最適化することができる。ボンバードメントのための物理および生物学的パラメータは、この技術において重要である。物理的要因としては、ＤＮＡ／マイクロプロジェクタイル沈降の操作に関与するものまたはマイクロプロジェクタイルのいずれかの飛行および速度に影響を及ぼすものがある。生物学的因子としては、衝撃前および衝撃直後の細胞の操作に関与する総ての工程、衝撃に関連する損傷の軽減に役立つ標的細胞の浸透圧調整、ならびにまた、線状化ＤＮＡまたは無傷（ｉｎｔａｃｔ）なスーパーコイル状プラスミドのような形質転換用ＤＮＡの性質が挙げられる。
【００４４】
アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）仲介トランスファーは、ＤＮＡをあらゆる植物組織に導入することができ、プロトプラストからの無傷（ｉｎｔａｃｔ）な植物体を再生せる必要性がなくなるため、外来ＤＮＡを植物細胞に導入するための応用範囲の広い系である。ＤＮＡを植物細胞に導入するためにアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を仲介して植物体に組み込むベクターを使用することは、当該技術分野において周知である。例えば、Fraley et al.,1985,Biotechnology,3:629;Rogers et al.,1987,Meth.in Enzymol.,153:253-277に記載の方法を参照のこと。さらに、Ｔｉ−ＤＮＡの組み込みは、比較的正確なプロセスであり、再配列はほとんど起こらない。トランスファーしようとするＤＮＡの領域は、境界配列によって規定され、Spielmann et al., 1986, Mol.Gen.Genet.,205:34;Jorgensen et al.,1987,Mol.Gen.Genet.,207:471に記載されているように、通常、介在するＤＮＡが植物ゲノムに挿入される。
【００４５】
最新のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）形質転換ベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ならびにアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）での複製が可能であり、好都合な操作を可能にする。さらに、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）仲介遺伝子トランスファー用ベクターにおける最近の技術的進歩により、ベクターにおける遺伝子および制限部位の配列（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）が改善され、多様なタンパク質またはポリペプチドを発現することが可能なベクターの構築を容易にしている。挿入されたポリペプチドコーディング遺伝子の直接発現のための、プロモーターにフランキングする好都合なマルチリンカー領域およびポリアデニル化部位は、本目的に適している。さらに、形質転換には、武装されたおよび非武装Ｔｉ遺伝子の両方を含有するアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を使用することができる。
【００４６】
植物プロトプラストの形質転換は、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレングリコール処置、エレクトロポレーション、およびこれらの処置の組み合わせに基づく方法を使用して達成することができる（例えば、Potrykus et al., 1985,Mol.Gen.Genet., 199:183; Marcotte et al., Nature, 335:454,1988を参照のこと）。これらの系の異なる植物種への応用は、プロトプラストから特定の種を再生する能力に依存する。
【００４７】
本発明の実施のために、培養し、そして迅速に大規模化することができる植物細胞系統を形質転換することが好適である。植物細胞培養物の使用は、オープンフィールドでの産生を回避し、遺伝子逃避および食品汚染の可能性を顕著に減少する。ＮＴ−１およびＢＹ−２のようなタバコ懸濁細胞培養物（Kato et al.1972,Proc.IV IFS: Ferment.Technol.Today 689-695;An,G., 1985Plant Physiol.79, 568-570; Nagata et al.1992, International Review of Cytology 132,1-30）は、これらの系統が培養において得に取り扱いし易く、容易に形質転換され、安定的に組み込まれた事象を産生し、そして凍結保存に適用可能であるため、好適である。
【００４８】
タバコ懸濁細胞系統、ＮＴ−１は、本発明の実施に適する。ＮＴ−１細胞は、本来、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）Ｌ．ｃｖ．ｂｒｉｇｈｔ  ｙｅｌｌｏｗ２から開発された。ＮＴ−１細胞系統は広範に使用され、容易に利用可能である；尤も、いずれのタバコ懸濁細胞系統も本発明の実施と矛盾しない。さらに、細胞系統は変動可能であり、培養条件に応じて変化する。以下の実施例における使用に適するＮＴ−１細胞は、受託番号ＡＴＣＣ番号７４８４０下でＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから利用可能である。また、U.S.Patent No.6,140,075（その全体が参照により本明細書に援用される）を参照のこと。
【００４９】
多くの植物細胞培養技術および実験室規模の振盪フラスコから数千リットルのバイオリアクター容器の範囲に及ぶ系が記載されており、植物細胞培養の分野において周知である。例えば、Fischer, R.et al, 1999Biotechnol.Appl.Biochem.30,109-112 and Doran,P., 2000Current Opinions in Biotechnology11, 199-204を参照のこと。形質転換植物細胞を所望される嵩（ｍａｓｓ）まで培養した後、それらを回収し、穏やかに洗浄し、そして破砕に適する緩衝液に入れる。異なる多くの緩衝液が本発明に適合可能である。一般に、緩衝液は、膜を可溶化するために使用することができる刺激性の強い界面活性剤を含有しない中性またはその付近のｐＨ値の水性の等張性緩衝生理食塩水である。好適な緩衝液として、ダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）のリン酸緩衝食塩水および１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳが挙げられる。
【００５０】
安定的に形質転換された植物細胞系統を調製した後、全遺伝子挿入物のＰＣＲ増幅、それに続く制限酵素消化を使用して遺伝子挿入物（遺伝事象）を確認することによって、本発明の培養物を終了し得る。次いで、マスター細胞系統およびワーキング細胞系統は、９ＣＦＲ１１３．２６に記載の手順に従って、細菌および真菌の混入について評価すべきである。
【００５１】
マスターまたはワーキング細胞の最初の回収は、寒天プレート上で、カルスの形態であってもよい。これに続いて、液体懸濁培養への導入が行われ得る。ワーキング細胞および産生培養のための継代の範囲は、１〜５０または１００回の範囲であり得る。
【００５２】
本発明の植物細胞培養物を増殖させるために、動物起源の成分は使用しない。寒天プレートおよび懸濁培養のための培地は、一般的な植物培養培地（ムラシゲ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ）およびスクーグ（Ｓｋｏｏｇ）；ＭＳ）に基づき、本明細書において詳細に記載する。マスター細胞系統は、液体窒素の蒸気相において貯蔵される。この様式で維持される培養物は、無期限に貯蔵され得、寒天培地上でカルス培養物を調製するために使用され得る。ワーキング細胞系統は、液体窒素の蒸気相において貯蔵され、無期限に貯蔵され、カルス培養物を調製するために使用され得る。
【００５３】
ワーキング細胞またはワクチン産生のための接種物として使用されるマスター細胞およびワーキング細胞培養物は、寒天プレート上または懸濁培養物として増殖されるカルスの周期的循環によって維持され得る。凍結されたマスター細胞またはワーキング細胞は、融解し、そして寒天プレートに移し、そして１回以上、２５℃で約１〜２週間、培養し得る。次いで、カルスを細かく裂き、ワーキング細胞または産生培養物を産生するための液体懸濁培地のフラスコに接種するために使用する。室温で連続撹拌を伴って増殖され、そして液体懸濁培地に移される産生培養物のための接種物として使用されるワーキング細胞培養。培養物は、観察される増殖の程度に依存して約３〜１４日間ごとに移され、それぞれ移すごとに１：３または１：１０で分割され得る。
【００５４】
マスター細胞寒天プレートからワーキング細胞系統を産生させるために、健康なカルスを選択し、無菌的に裂き、そして部分を、液体懸濁培地を含有するフラスコに入れる。ワーキング細胞系統はまた、振盪フラスコにおいて１リットル容積が達成されるまで培養物の容積を増加しながら、１：３または１：１０分割を使用して、液体培養物から液体培養物へ移してもよい。１〜３リットルの振盪フラスコ培養物を、接種物としての１０リットルの撹拌型タンクに移し得る。産生培養物は、１００リットルの有効容積を伴う撹拌型タンクにおいて産生される。１００リットル発酵槽は、撹拌型タンクまたは複数の振盪フラスコ培養物から１：１０培養物比で接種され得る。１０リットルを超える撹拌型タンクにおける培養物は、選択因子を伴わない液体懸濁培地において増殖される。
【００５５】
培養物を、周囲温度で、連続撹拌を伴って、３〜１４日間の期間、ワーキング細胞培養のために増殖させる。ほとんどの場合、ワーキング細胞培養物は、１：１０の分割を伴って、７日間ごとに移す。ワーキング細胞の大規模化の間、培養物を、１：１０の分割で移し、そして少なくとも７日間、増殖させる。回収の前に、産生培養物を７〜１５日間、増殖させる。培養物を毎日、特徴的増殖について観察し、そして顕微鏡的調査およびパック細胞容積の決定のために、産生培養物のサンプルを無菌的に、周期的に取り出す。細胞は、密度において、約３５％のパック細胞容積（ＰＣＶ）まで増加すべきであり、回収時の視覚的見積もりに基づいて、少なくとも５０％の健康な生細胞を含有すべきである。細胞の顕微鏡的調査では、細胞内において視覚的に認められる核が示されるべきであり、他の細胞構造に注目すべきではない。
【００５６】
通気は、培養物の酸素需要に依存して変動してもよい。溶存酸素は、約１００％〜２０％の間で制御されるべきである。撹拌速度は酸素需要に依存して変動してもよいが、しかし、５００ｒｐｍを超えるべきではない。典型的に、ｐＨを制御する必要はない。産生培養物は、接種の７〜１５日後の間に、重力または従来のろ過媒体を使用する減圧ろ過によって回収し得る。次いで、日常的タンパク質精製手順を用いて、薬学的タンパク質性物質を単離し得る。
【００５７】
本明細書において言及し、または引用したすべての特許、特許出願、仮特許出願、および刊行物は、それらが本明細書の明白な教示と矛盾しない程度で、すべての図および表を含むそれらの全体が参照により援用される。
【００５８】
以下の実施例では、本発明を実施するための手順について例示する。これらの実施例は、限定的であるものとして解釈されるべきではない。他に示さない限り、すべての百分率は重量によるものであり、すべての溶媒混合割合は容積によるものである。
【実施例】
【００５９】
実施例１：ベクター
遺伝子構築：ＮＤＶ株「ラソタ（Ｌａｓｏｔａ）」（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＡＦ０７７７６１）のＨＮ遺伝子、ＡＩＶ株Ａ  Ｔｕｒｋｅｙ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６８のＨＡ遺伝子、ＩＢＤＶ株Ｅ１９（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ００４９３）のＶＰ２遺伝子、ならびに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＬＴ遺伝子のコーディング配列を、コドン使用ならびに不純なｍＲＮＡプロセシングおよび不安定性を仲介し得る所望されない配列モチーフ、またはゲノムＤＮＡのメチル化について解析した。Adang MJ,Brody MS, Cardineau G, Eagan N, Roush RT, Shewmaker CK, Jones A,Oakes JV, McBride KE(1993)The construction and expression of Bacillus thuringiensis cryIIIA gene in protoplasts and potato plants.Plant Mol Biol21:1131-1145を参照のこと。植物最適化コーディング配列を、トマトおよびジャガイモコドン使用頻度を反映するハイブリッドコドン選択により設計した（Ausubel F.,et al.,eds.(1994)Current Protocols in Molecular Biology,vol.3,p.A.1C.3Haq TA,Mason HS,Clements JD,Arntzen CJ(1995)Oral immunization with a recombinant bacterial antigen produced in transgenic plants.Science268:714-716）。ＨＮについて設計した配列を図１に示す。合成ＨＮ遺伝子を商業的供給者（Ｒｅｔｒｏｇｅｎ）によって集成し、５’（ｐ４１８７−４２０３−１）または３’（ｐ４２１１１−４２３５−１ｃ−１）のいずれか一方を含有する２つの個別のプラスミド（遺伝子の半分がｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔにクローニングされている）に収容させた。
【００６０】
プラスミド構築：アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）仲介植物形質転換のためのバイナリーベクターを、図２に示すベクターｐＢＢＶ−ＰＨＡＳ−ｉａａＨに基づいて構築したが、これは、U.S.Patent Number:5,879,903;5,637,489；5,276,268；および5,273,894（参照により本明細書に援用される）に記載の植物選択マーカーホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）を使用し、WO97/48819に記載の構成性キャッサバ葉脈モザイクウイルス（ｃａｓｓａｖａ  ｖｅｉｎ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）プロモーター（ＣｓＶＭＶ）によって駆動される。本発明者らは、はじめに、ＰａｃＩによるｐＢＢＶ−ＰＨＡＳ−ｉａａＨの消化およびｐＣＶＭＶ−ＰＡＴを形成させるための再連結によって、ｉａａＨ遺伝子およびファセオリンプロモーター配列を欠失させた；次いで、本発明者らは、それにＫｌｅｎｏｗ酵素を充填し、そしてｐＣＰ！Ｈを形成させるために再連結することによって、単一のＨｉｎｄＩＩＩ部位を欠失させた。本発明者らは、テンプレートｐＣＰ！Ｈ上でプライマーＣＶＭ−Ａｓｃ（５’−ＡＴＧＧＣＧＣＧＣＣＡＧＡＡＧＧＴＡＡＴＴＡＴＣＣＡＡＧ配列番号５）およびＣＶＭ−Ｘｈｏ（５’−ＡＴＣＴＣＧＡＧＣＣＡＴＧＧＴＴＴＧＧＡＴＣＣＡ配列番号６）を使用するＰＣＲによってＣｓＶＭＶプロモーターを末端加工し、そしてＥｃｏＲＶ消化Ｔテイル化ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳに産物をクローニングし、ｐＫＳ−ＣＶＭ７を作製した。ｐＣＰ！Ｈのマップを図３に示す。本発明者らは、ベクターｐＫＳ−ＣＶＭ７／ＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩと、３つの挿入フラグメント：ＮｃｏＩ／ＰｓｔＩ上のＨＮ  ５’側半分、ＰｓｔＩ／ＫｐｎＩ上のＨＮ３’側半分、およびＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ上のダイズｖｓｐＢ３’エレメントとを連結することによって、ＨＮ発現カセットｐＫＳ−ＣＨＮを構築した（Ｈａｑ１９９５）。次いで、バイナリーＴ−ＤＮＡベクターｐＣＨＮを、ベクターｐＣＰ！Ｈ／ＡｓｃＩ−ＥｃｏＲＩおよびｐＫＳ−ＣＨＮのＡｓｃＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントの連結によって集成した。ｐＣＨＮのマップを図４に示す。
【００６１】
U.S.Patent No.5,824,798（参照により本明細書に援用される）に記載の顆粒結合デンプンシンターゼ（ＧＢＳＳ）プロモーターを使用して、他のベクターを作製した。これらの構築物は、中国のジャガイモ品種「トンノン（Ｄｏｎｇｎｏｎｇ）」についてのＧｅｎｂａｎｋ受託Ｘ８３２２０における配列から設計したプライマーを使用して、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）Ｌ．ｃｖ．「デシレ（Ｄｅｓｉｒｅｅ）」のゲノムＤＮＡから増幅したプロモーターフラグメントを使用して、作製した。変異誘発プライマー「ＧＳＳ−Ｎｃｏ」（５’−［ＴＧＣＣＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＴＣＴＡＣＡＡ］配列番号７）を使用して、−１８００ｂｐの５’領域に相補的な順方向プライマー「ＧＳＳ−１．８Ｆ」（５’−［ＧＡＴＣＴＧＡＣＡＡＧＴＣＡＡＧＡＡＡＡＴＴＧ］配列番号８）と共に、翻訳開始コドンに重複するＮｃｏＩ部位を作製した；１８２５ｂｐのＰＣＲ産物を、Ｔテイル化ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳにクローニングしてｐＫＳ−ＧＢＮを作製し、そして配列決定した。変異誘発プライマー「ＧＳＳ−Ｘｈｏ」（５’−［ＡＧＣＴＣＧＡＧＣＴＧＴＧＴＧＡＧＴＧＡＧＴＧ］配列番号９）を使用して、プライマー「ＧＳＳ−１．８Ｆ」と共に、転写開始部位の直ぐ３’側にＸｈｏＩ部位を作製した；１５５０ｂｐのＰＣＲ産物をＴテイル化ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳにクローニングしてｐＫＳ−ＧＢＸを作製し、そして配列決定した。
【００６２】
ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩで消化したベクターｐＴＨ２１０と、ｐＫＳ−ＧＢＸのＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩフラグメントとの連結によってU.S.Patent No.5,891,665（参照により本明細書に援用される）に記載のＴＥＶ  ５’ＵＴＲ（非翻訳領域）を含有するＧＢＳＳプロモーター発現カセットを集成し、８１１ｂｐのＧＢＳＳプロモーターによるＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの置換を生じさせて、ｐＴＨ２５２Ａを作製した。Haq TA,Mason HS,Clements JD,Arntzen CJ(1995)Oral immunization with a recombinant bacterial antigen produced in transgenic plants.Science268:714-716を参照のこと。ＮｃｏＩ／ＰｓｔＩ上のＨＮ５’側半分およびＰｓｔＩ／ＫｐｎＩ上のＨＮ３’側半分との連結によって、ＨＮ遺伝子をｐＴＨ２５２Ａ／ＮｃｏＩ−ＫｐｎＩに挿入して、ｐＨＮ２５２Ａを作製した。バイナリーＴ−ＤＮＡベクターｐｇＨＮを、ＮｓｉＩおよびＥｃｏＲＩで消化したベクターｐＧＬＴＢ（図１１に示す）と、フラグメントｐＨＮ２５２Ａ／ＮｓｉＩ−ＫｐｎＩおよびｐＴＨ２１０／ＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩとの連結によって作製した。ｐｇＨＮのマップを図５に示す。
【００６３】
ＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｃｏＩで消化したベクターｐＴＨ２１０（Ｈａｑ１９９５）と、ｐＫＳ−ＧＢＮのＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｃｏＩフラグメントとの連結によってU.S.Patent No.5,824,798（参照により本明細書に援用される）に記載のＧＢＳＳ  ５’ＵＴＲを含有するＧＢＳＳプロモーター発現カセットを集成し、１０８４ｂｐのＧＢＳＳプロモーター／５’−ＵＴＲによる（カリフラワーモザイクウイルス）ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター／ＴＥＶ  ５’ＵＴＲの置換を生じさせて、ｐＴＨ２５１Ａを作製した。バイナリーＴ−ＤＮＡベクターｐｇＨＮ１５１を、ベクターｐＣＬＴ１０５（図１２に示す）とフラグメントｐＴＨ２５１Ａ／ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｃｏＩおよびｐＨＮ２５２Ａ／ＮｃｏＩ−ＫｐｎＩとの連結によって作製した。ｐｇＨＮ１５１のマップを図６に示す。
【００６４】
そのイントロンを伴うＧＢＳＳ  ５’ＵＴＲおよびマメファセオリン３’エレメントを含有するＧＢＳＳプロモーター発現カセット（U.S.Patent No.5,270,200；6,184,437；6,320,101（参照により本明細書に援用される）に記載されている）を構築した。第１に、ｐＣＰ！Ｈを、独特なＫｐｎＩ部位で消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、再連結して、ＫｐｎＩ部位が取り出されたｐＣＰ！ＨＫを作製した。ｐＣＰ！ＨＫをＮｓｉＩで消化し、続いて、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、次いで、ＰａｃＩで消化した。生じるベクターを、ＳａｃＩで消化したｐｇＨＮ１５１由来の２８４８ｂｐフラグメントと連結させ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、次いで、ＰａｃＩで消化して、ｐｇＨＮ１５３を作製した。ｇＨＮ１５３のマップを図７に示す。
【００６５】
キメラ構成性プロモーター（４ＯＣＳΔＭＡＳ  U.S.Patent No:5,001,060；5,573,932および5,290,924（参照により本明細書に援用される））を使用して、ＨＮのための別の発現ベクターを構築した。プラスミドｐＡＧＭ１４９を、ＥｃｏＲＶで消化およびＢａｍＨＩで部分消化した。このフラグメントを、ＰｍｅＩ／ＰｓｔＩで消化したｐＣＨＮおよびＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩによるｐＫＳ−ＣＨＮの消化によって得られる合成ＨＮ遺伝子の５’側半分と連結させた。生じるｐＭＨＮを図８に示す。
【００６６】
ＡＩＶ  Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６８（Ｈ５Ｎ９）のＨＡ遺伝子を含有するプラスミドを、Ｄａｖｉｄ  Ｓｕａｒｅｚ（ＳＥＰＲＬ、ジョージア州Ａｔｈｅｎｓ）から入手した（図１０）。それを、ＰＣＲにより末端処理（ｅｎｄ−ｔａｉｌｏｒｅｄ）して、５’末端に制限部位ＮｃｏＩおよび３’末端に制限部位ＫｐｎＩを付加し、そして３５Ｓプロモーター、ＴＥＶ  ５’−ＵＴＲ、およびｖｓｐＢ３’末端を含有するベクターｐＩＢＴ２１０．１（Haq et al.,1995）に挿入した。発現カセットを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ（部分的）による消化によってバイナリーベクターｐＧＰＴＶ−Ｋａｎ（Becker et al.,Plant Mol Biol1992;20:1195-7）にトランスファーし、ｐＩＢＴ−ＨＡＯを作製した。ｐＩＢＴ−ＨＡＯ由来のＨＡ遺伝子／ｖｓｐＢ３’末端フラグメントを、ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ（部分的）による消化によって入手し、そして、ｐＫＳ−ＣＶＭ７に挿入して、ｐＫＳ−ＣＨＡを作製した。ＣｓＶＭＶプロモーター、ＨＡ遺伝子、およびｖｓｐＢ３’末端を含有するカセットを、ＡｓｃＩおよびＥｃｏＲＩ（部分的）による消化によってｐＫＳ−ＣＨＡから入手し、そしてｐＣＰ！Ｈと連結させて、図９に示すｐＣＨＡを作製した。
【００６７】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｈ１０４０７のＬＴ−Ｂ遺伝子をコードする植物最適化配列は、当該技術分野において公知である（Mason HS,Haq TA, Clements JD,Arntzen CJ, 1998, Vaccine16:1336-1343）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｈ１０４０７のＬＴ−Ａ遺伝子をコードする植物最適化配列については、本来U.S.Provisional Application Number60/113,507として出願されたWO/00/37609に記載されている（それらの教示全体は、参照により本明細書に援用される）。WO/00/37609には、実施例２においてタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）ＮＴ−１細胞のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）仲介植物細胞形質転換に使用した３つのバイナリーＴ−ＤＮＡベクター（ｐＳＬＴ１０２、ｐＳＬＴ１０５、ｐＳＬＴ１０７）の構築が記載されている。生じる形質転換ＮＴ−１細胞系統（ＳＬＴ１０２、ＳＬＴ１０５およびＳＬＴ１０７）は、ＬＴ−Ｂおよび改変された形態のＬＴ−Ａサブユニットからなる十分に集成されたＬＴおよびＬＴアナログを発現および蓄積した。図１２は、Ａｌａ７２をＡｒｇ７２で置き換える改変されたＬＴ−Ａ遺伝子を含有するｐＳＬＴ１０７を例示する。ＳＬＴ１０２およびＳＬＴ１０５発現産物は、それらが、ＬＴ−Ａ遺伝子において異なる変更（ｐＳＬＴ１０２ではＳｅｒ６３からＬｙｓ６３へ；ｐＳＬＴ１０５ではＡｒｇ１９２からＧｌｙ１９２へ）を含有したことを除いて、同一であった。これらの系統は、核染色体ＤＮＡに安定に組み込まれたプラスミドの未知数のＴ−ＤＮＡ領域の複製を含有する。トランスジェニックＮＴ１細胞は、ガングリオシド依存性ＥＬＩＳＡによって決定されるように、全可溶性タンパク質の０．４％までのレベルでガングリオシド結合性ペンタマーに集成するＬＴ−Ｂサブユニットを蓄積する。トランスジェニックＮＴ１細胞はまた、改変されたＬＴ−Ａサブユニットを蓄積し、それらのいくつかは、ＬＴ−Ａ特異的抗体を使用するガングリオシド依存性ＥＬＩＳＡによって決定されるようなＬＴ−Ｂペンタマーを伴って集成した。
【００６８】
アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）仲介植物細胞形質転換のためのバイナリーベクターを、独特なＢａｍＨＩ部位で改変され、ＶＰ２および選択マーカー発現カセットの付加のためのＡｇｅＩリンカーを伴う基本バイナリーベクター（ｐＢＢＶ）から構築した。ＶＰ２は、ＲＢ７ＭＡＲエレメント（U.S.Patent No.5,773,689； U.S.Patent No.5,773,695； U.S.Patent No.6,239,328、WO94/07902、およびWO97/27207）ならびにアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｉｆａｃｉｅｎｓ）（Ａｔｕ）ＯＲＦ２４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ００４９３）３’ＵＴＲを伴うＣｓＶＭＶプロモーターにフランキングする。選択マーカーＰＡＴは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（Ａｔ）ユビキチン１０プロモーター（Plant J.1997.11(5): 1017;Plant Mol.Biol.1993.21(5): 895;Genetics,1995, 139(2):921)およびＡｔｕ  ＯＲＦ１(U.S.Patent No.5428147; Plant Molecular Biology.1983.2:335；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ００４９３）３’ＵＴＲによってレギュレートされる；生じるプラスミドｐＤＡＢ２４２３を図１３に示す。
【００６９】
伝染性ファブリキウス嚢病（ＩＢＤ）ウイルス、超強毒株Ｅｈｉｍｅ９１（J Vet Med Sci.1992.54(1): 153;JVI.2002.76(11): 5637）を使用し、株ＵＫ６６１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００４１７８）由来のアミノ酸番号４５４〜４５６を伴う報告されたＶＰ２アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０２４０７６）に基づいて、ＶＰ２植物最適化ヌクレオチド配列を産生させた。（ＶＰ２配列についての図１４を参照のこと）。
【００７０】
実施例２：トランスジェニックタバコ（ＮＩＣＯＴＩＡＮＡ  ＴＡＢＡＣＵＭ）の調製
形質転換の３〜４日前に、２ｍｌのＮＴ−１培養物を４０ｍｌＮＴ−１培地に添加することによって、１週齢のＮＴ−１培養物を新鮮培地にサブ培養した。サブ培養したものは、暗所、２５±１℃、振盪機上１００ｒｐｍで維持した。
【００７１】
【表１】
2009514547.tif 000003
B1イノシトールストック(100倍)(１リットル)
チアミンHCl(ビタミンB1)−0.1g
MES (20倍) (１リットル)
MES (2−N−モルホリノエタンスルホン酸)−10g
ミオイノシトール−10g
ミラー（Miller）I(１リットル)
KH2PO4−60g
【００７２】
【表２】
2009514547.tif 000004
【００７３】
【表３】
2009514547.tif 000005
【００７４】
目的の発現ベクターを含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を、グリセロールストックから５０ｍｇ／ｌスペクチノマイシンを含有するＬＢ培地のプレート上に画線した。細菌培養物を、暗所において、３０℃で２４〜４８時間、インキュベートした。１つの良好に形成されたコロニーを選択し、そして５０ｍｇ／Ｌスペクチノマイシンを含有する３ｍｌのＹＭ培地に移した。液体培養物を、暗所、３０℃、インキュベーター振盪機中２５０ｒｐｍで、ＯＤ６００が０．５〜０．６となるまで、インキュベートした。これは、約２４時間を要した。
【００７５】
【表４】
2009514547.tif 000006
【００７６】
【表５】
2009514547.tif 000007
（あるいは、粉末形態のＹＭを購入することができる（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ；カタログ番号１００９０−０１１）。液体培養培地を作製するために、１１．１ｇを１リットルの水に添加する。）
【００７７】
形質転換の日において、ＮＴ−１培養物のｍｌあたり１μｌの２０ｍＭアセトシリンゴンを添加した。形質転換の日にエタノール中アセトシリンゴンストックを作製した。ＮＴ−１細胞を損傷させて、形質転換効率を増加させた。損傷のために、懸濁培養物を、５ｍｌワイドボア滅菌ピペットを介して抜き取り、反復的（２０回）に上下させた。４ミリリットルの懸濁液を１０枚の６０×１５ｍｍペトリプレートのそれぞれに移した。１枚のプレートを別に取っておき、非形質転換コントロールとして使用した。約５０〜１００μｌのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）懸濁液を、残りの９枚のプレートのそれぞれに添加した。プレートをパラフィルムで巻き付け、次いで、暗所、振盪機上、１００ｒｐｍ、２５±１℃で３日間、インキュベートした。
【００７８】
細胞を、滅菌５０ｍｌ円錐型遠心管に移し、そしてＮＴＣ培地（オートクレーブ後に添加した５００ｍｇ／Ｌカルベニシリンを含有するＮＴ−１培地）で４５ｍｌの最終容積にした。それらを混合し、次いで、スイングバケットローターを備えた遠心分離機において、１０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した。上清を取り出し、そして得られるペレットを４５ｍｌのＮＴＣに再懸濁した。洗浄を反復した。懸濁液を遠心分離し、上清を捨て、そしてペレットを４０ｍｌＮＴＣに再懸濁した。５ｍｌのアリコートを、（８ｇ／ｌ寒天／寒天で固化し；オートクレーブ後に添加した１０ｍｇ／ｌビアラフォスで補充したＮＴＣ培地）を含有する各ペトリプレート（１５０×１５ｍｍ）ＮＴＣＢ１０培地上にプレート化した。プレートをパラフィルムで巻き付け、次いで、暗所において２５±１℃で維持した。培養室に移す前に、プレートを、層流フード中に開放した状態で放置し、過度の液体を蒸発させた。６〜８週間後、推定形質転換体が出現した。それらを選択し、そして新鮮ＮＴＣＢ５（８ｇ／ｌ寒天／寒天で固化し；オートクレーブ後に添加した５ｍｇ／ｌビアラフォスで補充したＮＴＣ培地）に移した。プレートをパラフィルムで巻き付け、そして暗所において２５±１℃で培養した。
【００７９】
推定形質転換体は、死滅した非形質転換細胞のバックグランドに対して、カルスの小さなクラスターとして出現した。これらのカルスをＮＴＣＢ５培地に移し、そして数週間増殖させた。各推定形質転換体の部分を、ＥＬＩＳＡ解析のために選択した。ＥＬＩＳＡを介する少なくとも２回の稼動後、最も高い抗原レベルを伴う系統を選択した。次いで、選ばれた系統のそれぞれについてのカルス材料の量を、プレート培養物において、および時折、液体培養物において増大させた。
【００８０】
実施例３：植物により作製されるタンパク質の安定性
組み換えまたは生来の供給源から抽出したタンパク質は、しばしば、プロテアーゼ、グリコシラーゼ、リパーゼもしくはタンパク質および細胞成分と共に同時精製する他の酵素により不安定である。ＮＴ−１細胞から単離されるタンパク質および免疫防御粒子は、本来的に安定であり、異なる多くのタイプの下流のプロセシング活動に対して堅牢である。図１４では、ＣＨＮ−１８細胞を、定常期において１０リットル発酵槽から回収し、そしてろ過し、遠心分離によって澄明にし、そしてマイクロ流動化した。次いで、上清を、０．２もしくは０．４５ミクロンフィルターを介してろ過して、ろ過またはマイクロ流動化を介する操作中に導入され得た任意の細菌因子を取り出し、安定剤をこれらの懸濁液に添加しなかったが、安定性は、これらのトランスジェニック細胞から誘導されるタンパク質に固有である。次いで、材料を、２〜７℃、２５℃で貯蔵するかまたは−８０℃で凍結させた；材料は、すべての温度で安定であることが見出されたが、しかし、最も興味深い結果は、２５℃（周囲温度）で保持した場合、単離されたタンパク質が安定であること（図１４に示す）が見出されたことである。シグナルの変動が１箇月ごとに認められたが、単離されたタンパク質の量は数箇月後も顕著な安定性を示したが、これらのデータから算出することができる半減期は、８箇月（０．４５ミクロンのサンプル）および０．２ミクロンろ過されたサンプルでは１〜数年を超える外挿された半減期を示す。
【００８１】
本明細書に記載の実施例および実施形態は、あくまで例示のためのものであり、それに照らして行われる多様な変形および変更が当業者に示唆され、本出願の趣旨および範囲ならびに添付の特許請求の範囲に含まれることが理解されるべきである。さらに、本明細書において開示した任意の発明またはその実施形態の任意の要素もしくは限定は、本明細書において開示した任意のおよび／または他のすべての要素または限定（個々にもしくは任意の組み合わせで）あるいは他の任意の発明またはその実施形態と組み合わせることができ、そのようなすべての組み合わせは、それに限定を伴うことなく、本発明の範囲にあるとみなされる。
【００８２】
実施例４：培地の処方
以下は、寒天上および液体懸濁液において生来のＮＴ−１細胞および組み換えＮＴ−１細胞を培養するために使用される培地の処方である。さらに、ＮＴ−１組み換えＮＴ−１を凍結保存するための培地の処方を規定する。
【００８３】
培地の処方
Ａ．成分
他で示さない限り、化学薬品を入手するための信頼できる納入業者を使用する
【００８４】
【表６】
2009514547.tif 000008
【００８５】
Ｂ．処方
１．１０倍バッチ塩
【００８６】
【表７】
2009514547.tif 000009
【００８７】
ｂ．調製
ｉ．７５０ｍＬのＲＯ／ＤＩ水を適切な容器に添加する。
ｉｉ．容器を加熱型撹拌プレート上に配置し、撹拌子で混合する。水を加熱して、すべての成分を溶解する必要があり得る。
ｉｉｉ．すべての成分を水に添加する。
ｉｖ．最後の成分を溶解した後、容積を１０００ｍＬにする。
ｖ．０．２μフィルターを介して溶液を滅菌する。
ｖｉ．室温で貯蔵し、１年間の使用期限を割り当てる。
【００８８】
Ｂ．２．ビアラホス（５ｍｇ／ｍＬ）
【００８９】
【表８】
2009514547.tif 000010
【００９０】
ｂ．調製
ｉ．５０ｍＬのＲＯ／ＤＩ水を適切な容器に添加する。
ｉｉ．容器を撹拌プレート上に配置し、撹拌子で混合する。
ｉｉｉ．ビアラホスを水に添加し、溶解するまで混合する。
ｉｖ．０．２μフィルターを介して滅菌する。
ｖ．凍結し、１年間の使用期限を割り当てる。
【００９１】
Ｂ．  ３．  １００倍改変ＭＳビタミン
【００９２】
【表９】
2009514547.tif 000011
【００９３】
ｂ．調製
ｉ．５００ｍＬのＲＯ／ＤＩ水を適切な容器に添加する。
ｉｉ．容器を撹拌プレート上に配置し、撹拌子で混合する。
ｉｉｉ．すべての成分を水に添加する。
ｉｖ．最後の成分を溶解した後、容積を１０００ｍＬにする。
ｖ．０．２μフィルターを介して滅菌する。
ｖｉ．２℃〜１０℃で貯蔵し、１年間の使用期限を割り当てる。
【００９４】
Ｂ．４．Ｌ−プロリン（２．５Ｍ）
【００９５】
【表１０】
2009514547.tif 000012
【００９６】
ｂ．調製
ｉ．５０ｍＬのＲＯ／ＤＩ水を適切な容器に添加する。
ｉｉ．容器を撹拌プレート上に配置し、撹拌子で混合する。
ｉｉｉ．Ｌ−プロリンを水に添加する。
ｉｖ．Ｌ−プロリンを溶解した後、容積を１００ｍＬにする。
ｖ．２℃〜１０℃で貯蔵し、３箇月の使用期限を割り当てる。
【００９７】
Ｂ．５．ＮＴ−１寒天プレート
【００９８】
【表１１】
2009514547.tif 000013
【００９９】
ｂ．調製
ｉ．５００ｍＬのＲＯ／ＤＩ水を適切な容器に添加する。
ｉｉ．容器を加熱型撹拌プレート上に配置し、撹拌子で混合する。
ｉｉｉ．寒天以外のすべての成分を水に添加する。
ｉｖ．最後の成分を溶解した後、容積を１０００ｍＬにする。
ｖ．寒天を溶液に添加し、寒天が十分に溶解するまで加熱する。
ｖｉ．溶液がまだ熱いうちに、溶液を、０．２μフィルターを介して滅菌する。
ｖｉｉ．培地が室温付近になるまで培地を冷却する。
ｖｉｉｉ．約２５ｍＬの寒天を１５ｃｍ２滅菌ペトリ皿のそれぞれにピペッティングし、それぞれのプレートを完全に冷却する。
ｉｘ．２℃〜１０℃で倒置したプレートを貯蔵し、３箇月の使用期限を割り当てる。
【０１００】
Ｂ．６．ＮＴ−１液体培地
【０１０１】
【表１２】
2009514547.tif 000014
【０１０２】
ｂ．調製
ｉ．５００ｍＬのＲＯ／ＤＩ水を適切な容器に添加する。
ｉｉ．容器を撹拌プレート上に配置し、撹拌子で混合する。
ｉｉｉ．すべての成分を水に添加する。
ｉｖ．最後の成分を溶解した後、容積を１０００ｍＬにする。
ｖ．７５０ｍｌアリコートに分配し、≧１２１℃で３０分間オートクレーブする。
ｖｉ．２℃〜１０℃で貯蔵し、１年間の使用期限を割り当てる。
【０１０３】
Ｂ．７．ＮＴ１ＶＰ培地
【０１０４】
【表１３】
2009514547.tif 000015
【０１０５】
ｂ．調製
ｉ．５００ｍＬのＲＯ／ＤＩ水を適切な容器に添加する。
ｉｉ．容器を撹拌プレート上に配置し、撹拌子で混合する。
ｉｉｉ．すべての成分を水に添加する。
ｉｖ．最後の成分を溶解した後、容積を１０００ｍＬにする。
ｖ．５００ｍｌアリコートに分配し、≧１２１℃で３０分間オートクレーブする。
ｖｉ．２℃〜１０℃で貯蔵し、１年間の使用期限を割り当てる。
【０１０６】
Ｂ．８．凍結保存培地
【０１０７】
【表１４】
2009514547.tif 000016
【０１０８】
ｂ．調製
ｉ．グリセロールを適切な容器に添加する。
ｉｉ．容器を加熱型撹拌プレート上に配置し、撹拌子で混合する。
ｉｉｉ．ＮＴ１ＶＰ培地を容器に添加する。
ｉｖ．低熱で混合し、溶解するまでスクロースを緩徐に添加する。
ｖ．ＤＭＳＯを添加する。
ｖｉ．０．２μフィルターを介して滅菌する。
ｖｉｉ．２℃〜１０℃で培地を貯蔵し、１年間の使用期限を割り当てる。
【０１０９】
実施例５
マイコプラズマ増殖を支持するための植物細胞増殖培地および懸濁培養物の評価
本明細書において開示した組み換えタバコ由来植物細胞系統、ＣＨＮ−１８ＮＴ−１、および増殖培地は、マイコプラズマの増殖を支持しない。本研究の目的は、ＮＴ−１増殖培地またはＮＴ−１およびＣＨＮ−１８ＮＴ−１の懸濁培養物が２つの種のマイコプラズマ、マイコプラズマ・ハイオライニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）およびマイコプラズマ・ライドラウィ（Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉ）の増殖を支持することができるかどうかを決定することであった。
【０１１０】
方法は、９ＣＦＲ１１３．２８に従った。試験の０日目、マイコプラズマによる接種の前に、試験材料をマイコプラズマ寒天上に配置して、試験材料中にマイコプラズマがないことを実証した。マイコプラズマポジティブコントロールを接種した試験材料は、試験の０日目に、マイコプラズマ寒天上に配置しなかった。マイコプラズマ接種試験材料のマイコプラズマ寒天へのサブ培養を、３、７、１０および１４日目に実施した。試験の第１日目に、マイコプラズマブロスおよび寒天にマイコプラズマポジティブコントロールを接種することによって、ポジティブコントロールを調製した。マイコプラズマブロスおよび寒天にマイコプラズマブロスを接種することによって、ネガティブコントロールを調製した。３、７、１０および１４日目に、ポジティブならびにネガティブコントロールをマイコプラズマ寒天上でサブ培養した。すべてのマイコプラズマ寒天プレートを、典型的なマイコプラズマのコロニーについて、接種の１０〜１４日後に調べた。
【０１１１】
試験材料は、ＮＴ−１植物細胞増殖培地およびＣＨＮ−１８植物細胞増殖培地ならびにＮＴ−１およびＣＨＮ−１８植物懸濁細胞培養物であった。それらが活動的に増殖していた（３〜４日齢の培養物）場合、植物懸濁培養物にマイコプラズマを接種した。
【０１１２】
ＮＴ−１増殖培地は、マイコプラズマの増殖を支持しなかった（表１）。マイコプラズマポジティブコントロール生物体を接種したＮＴ−１増殖培地からサブ培養したいずれのマイコプラズマ寒天プレートにおいても、マイコプラズマのコロニーは観察されなかった。マイコプラズマポジティブコントロールを添加する前に寒天プレート上に配置したＮＴ−１培地もまた、マイコプラズマの増殖を示さなかった。ポジティブコントロールでは、マイコプラズマブロスにおいて混濁増殖が認められ、すべてのマイコプラズマ寒天プレートにおいてマイコプラズマのコロニーが観察された。ネガティブコントロールでは、マイコプラズマブロスにおいて増殖が認められず、いずれのマイコプラズマ寒天プレートにおいてもマイコプラズマのコロニーは存在しなかった。
【０１１３】
【表１５】
2009514547.tif 000017
ＴＮＴＣ：大過剰のため計数不能、プレートあたり＞１００コロニー
ＮＤ：実施せず、マイコプラズマポジティブコントロール生物体を伴わないＮＴ−１培地を０日目に試験したところ、マイコプラズマのコロニーは認められなかった。
【０１１４】
ＮＴ−１細胞懸濁培養物は、マイコプラズマの増殖を支持しなかった（表２）。マイコプラズマポジティブコントロール生物体を接種したＮＴ−１細胞懸濁培養物からサブ培養したいずれのマイコプラズマ寒天プレートにおいても、マイコプラズマのコロニーは観察されなかった。マイコプラズマポジティブコントロールを添加する前に寒天プレート上に配置したＮＴ−１細胞懸濁培養物もまた、マイコプラズマの増殖を示さなかった。ポジティブコントロールでは、マイコプラズマブロスにおいて混濁増殖が認められ、すべてのマイコプラズマ寒天プレートにおいてマイコプラズマのコロニーが観察された。ネガティブコントロールでは、マイコプラズマブロスにおいて増殖が認められず、いずれのマイコプラズマ寒天プレートにおいてもマイコプラズマのコロニーは認められなかった。
【０１１５】
【表１６】
2009514547.tif 000018
ＴＮＴＣ：大過剰のため計数不能、プレートあたり＞１００コロニー
ＮＤ：実施せず、マイコプラズマポジティブコントロール生物体を伴わないＮＴ−１細胞懸濁培養物を０日目に試験したところ、マイコプラズマのコロニーは認められなかった。
【０１１６】
ＣＨＮ−１８増殖培地および細胞懸濁培養物は、マイコプラズマの増殖を支持しなかった（表３）。マイコプラズマポジティブコントロール生物体を接種したＣＨＮ−１８増殖培地または細胞懸濁培養物からサブ培養したいずれのマイコプラズマ寒天プレートにおいても、観察されたマイコプラズマのコロニーは存在しなかった。マイコプラズマポジティブコントロールを添加する前に寒天プレートに配置したＣＨＮ−１８培地またはＣＨＮ−１８細胞懸濁培養物では、マイコプラズマの増殖は観察されなかった。ポジティブコントロールでは、マイコプラズマブロスにおいて混濁増殖が認められ、すべてのマイコプラズマ寒天プレートにおいてマイコプラズマのコロニーが観察された。ネガティブコントロールでは、マイコプラズマブロスにおいて増殖が認められず、いずれのマイコプラズマ寒天プレートにおいてもマイコプラズのマコロニーは認められなかった。
【０１１７】
【表１７】
2009514547.tif 000019
ＴＮＴＣ：大過剰のため計数不能、プレートあたり＞１００コロニー
ＮＤ：実施せず、マイコプラズマポジティブコントロール生物体を伴わないＣＨＮ−１８増殖培地を０日目に試験したところ、マイコプラズマのコロニーは認められなかった。
【０１１８】
マイコプラズマは、ＮＴ−１細胞の産生において使用されたＮＴ−１増殖培地またはＣＨＮ−１８増殖培地のいずれにおいても増殖しなかった。さらに、ＮＴ−１の懸濁培養物またはＣＨＮ−１８細胞の懸濁培養物のいずれも、マイコプラズマの増殖を支持することができなかった。これらのデータは、ＮＴ−１およびＣＨＮ−１８増殖培地、ならびにＮＴ−１およびＣＨＮ−１８の培養物が、マイコプラズマの増殖を支持することができないことを実証する。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１Ａ】（配列番号１）。ＮＤＶ株「ラソタ（Ｌａｓｏｔａ）」のＨＮ遺伝子の植物最適化コーディング配列およびタンパク質配列。
【図１Ｂ】（配列番号２）。ＮＤＶ株「ラソタ（Ｌａｓｏｔａ）」のＨＮ遺伝子の植物最適化コーディング配列およびタンパク質配列。
【図２】構成性ＣｓＶＭＶ（キャッサバ葉脈モザイクウイルス（ｃａｓｓａｖａ  ｖｅｉｎ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ））プロモーターによって駆動され、ＭＡＳ３’（マンノピンシンターゼ）エレメントによって末端化される植物選択マーカーＰＡＴ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）を含有するｐＢＢＶ−ＰＨＡＳ−ｉａａＨのマップ。植物ゲノムに組み込まれるＤＮＡの境界を表すアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来のＬＢおよびＲＢ（左および右のＴ−ＤＮＡ境界）エレメント。
【図３】免疫防御抗原を発現するための様々な植物発現ベクターの開始プラスミドとして使用される「テンプレートベクター」であるｐＣ！Ｈのマップ。
【図４】ＮＤＶ  ＨＮタンパク質のｐＣＨＮ発現ベクターのマップ。ＨＮ発現ベクターまたはカセットは、構成性ＣｓＶＭＶプロモーターによって駆動され、ダイズｖｓｐＢ３’エレメントによって末端化される。
【図５】ＮＤＶ  ＨＮタンパク質のｐｇＨＮ発現ベクターのマップ。ＨＮ発現カセットは、ＴＥＶ  ５’ＵＴＲを伴う塊茎特異的ＧＢＳＳプロモーターによって駆動され、ダイズｖｓｐＢ３’エレメントによって末端化される。
【図６】ＮＤＶ  ＨＮタンパク質のｐｇＨＮ１５１発現ベクターのマップ。ＨＮ発現カセットは、その生来の５’ＵＴＲおよびイントロンを伴う塊茎特異的ＧＢＳＳプロモーターによって駆動され、ダイズｖｓｐＢ３’エレメントによって末端化される。ベクターは、ＣｓＶＭＶプロモーターによって駆動され、ＭＡＳ３’エレメントによって末端化される植物選択マーカーＰＡＴを含有するｐＢＢＶ−ＰＨＡＳ−ｉａａＨから誘導される。植物ゲノムに組み込まれるＤＮＡの境界を表すＬＢおよびＲＢ、左および右のＴ−ＤＮＡ境界エレメント。
【図７】ＮＤＶ  ＨＮタンパク質のｐｇＨＮ１５３発現ベクターのマップ。ＨＮ発現カセットは、その生来の５’ＵＴＲおよびイントロンを伴う塊茎特異的ＧＢＳＳプロモーターによって駆動され、マメファセオリン３’エレメントによって末端化される。ベクターは、ＣｓＶＭＶプロモーターによって駆動され、ＭＡＳ３’エレメントによって末端化される植物選択マーカーＰＡＴを含有するｐＢＢＶ−ＰＨＡＳ−ｉａａＨから誘導される。植物ゲノムに組み込まれるＤＮＡの境界を表すＬＢおよびＲＢ、左および右のＴ−ＤＮＡ境界エレメント。
【図８】ＮＤＶ  ＨＮタンパク質のｐＭＨＮ発現ベクターのマップ。ＨＮ発現カセットは、構成性４ＯＣＳΔＭＡＳプロモーター（Ｐ２方向）によって駆動され、ダイズｖｓｐＢ３’エレメントによって末端化される。ベクターは、ＣｓＶＭＶプロモーターによって駆動され、ＭＡＳ３’エレメントによって末端化される植物選択マーカーＰＡＴを含有するｐＢＢＶ−ＰＨＡＳ−ｉａａＨから誘導される。植物ゲノムに組み込まれるＤＮＡの境界を表すＬＢおよびＲＢ、左および右のＴ−ＤＮＡ境界エレメント。
【図９】ＡＩＶ  Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６８（Ｈ５Ｎ９）のＨＡ遺伝子のｐＣＨＡ発現ベクターのマップ。
【図１０】（配列番号３および４）。ＡＩＶ  Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６８（Ｈ５Ｎ９）のＨＡ遺伝子のＤＮＡおよびタンパク質配列。
【図１１】ｐＧＬＴＢ中間ベクターのマップ。
【図１２】ｐＣＬＴ１０５中間ベクターのマップ。
【図１３】ｐＤＡＢ２４２３。ＶＰ２をコードするバイナリーベクター。
【図１４】（配列番号１０）。ＩＢＤＶ伝染性ファブリキウス嚢病（ＩＢＤ）ウイルス、超強毒株Ｅｈｉｍｅ９１のＶＰ２遺伝子のＤＮＡ配列。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年8月7日(2008.8.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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