(57)【要約】  本発明は、副甲状腺関連障害、例えば、ＨＰＴ−ＪＴ、家族性孤発性原発性副甲状腺機能亢進症（ＦＩＰＨ）、および副甲状腺機能亢進症−顎腫瘍（ＨＰＴ−ＪＴ）症候群、さらにはまた、その付随合併症の処置、改善、および診断のための、ＴＧＦ−βアンタゴニストの使用に関する。本発明はまた、ＴＧＦβ関連障害、例えば、肺高血圧症、癌、高血圧症、線維症、創傷治癒の処置、改善、および診断のための、ＨＲＰＴ２およびその関連ＰＡＦ１複合体のモジュレーターの使用にも関する。ＨＲＰＴ２／ＰＡＦ１およびＳＭＡＤ／ＴＧＦβのモジュレーターの同定アッセイもまた提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における副甲状腺関連障害を処置するまたは予防する方法であって、その患者にＴＧＦβアンタゴニストを投与することを含んでなる方法。
【請求項２】
ＴＧＦβアンタゴニストがポリクローナル中和抗体（ＮＡb）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＴＧＦβアンタゴニストが可溶性ＴＧＦ−β受容体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＴＧＦβアンタゴニストが小分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＴＧＦβアンタゴニストがＴＧＦβ受容体キナーゼ阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
副甲状腺関連障害がＨＰＴ−ＪＴである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
副甲状腺関連障害が原発性副甲状腺機能亢進症（例えば、副甲状腺過形成）である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
副甲状腺関連障害が家族性孤発性原発性副甲状腺機能亢進症（ＦＩＰＨ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
副甲状腺関連障害がＨＰＴ−ＪＴである、請求項２−５のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
患者におけるＴＧＦβ関連障害を処置するまたは予防する方法であって、その患者に、ＰＡＦ１複合体とＳＭＡＤタンパク質との間の結合事象を正常化することができる薬剤を投与することを含んでなる方法。
【請求項１１】
患者にＨＲＰＴ２発現レベルまたはパラフィブロミンタンパク質レベルを正常化することができる薬剤を投与することをさらに含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
本発明には、ＰＡＦ１複合体メンバーとＳＭＡＤとの間に形成される複合体を調整する試験薬剤を同定する方法であって、
ａ）ＳＭＡＤタンパク質に結合することができるＰＡＦ１複合体タンパク質または相同体、該ＰＡＦ１複合体タンパク質または相同体と相互作用することが知られているＳＭＡＤタンパク質または相同体、およびスクリーニングするための試験薬剤を得て；
ｂ）該ＰＡＦ１複合体タンパク質または相同体、該ＳＭＡＤタンパク質または相同体、並びにＰＡＦ１複合体タンパク質または相同体、該ＳＭＡＤタンパク質または相同体、および試験すべき薬剤をスクリーニングするための試験薬剤をいずれかの順序で混合し；そして
ｃ）試験化合物の存在下における該ＰＡＦ１複合体タンパク質または相同体と該ＳＭＡＤタンパク質または相同体との間の結合の変化を、該化合物の不存在下における結合と比較して測定する；
ことを含んでなる方法が含まれる。
【請求項１３】
ＰＡＦ１複合体タンパク質がパラフィブロミンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＳＭＡＤタンパク質が、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ６、およびＳＭＡＤ７のいずれか１つである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
副甲状腺関連障害の処置に有用な化合物をスクリーニングするための方法であって、パラフィブロミンを発現する細胞およびＳＭＡＤタンパク質を化合物と接触させて、ＳＭＡＤタンパク質活性および／またはＴＧＦβ経路活性における変化を検出することを含んでなる方法。
【請求項１６】
ＴＧＦβ関連障害の処置に有用な化合物をスクリーニングするための方法であって、パラフィブロミンを発現する細胞およびＳＭＡＤタンパク質を化合物と接触させて、ＳＭＡＤタンパク質活性および／またはＴＧＦβ経路活性における変化を検出することを含んでなる方法。
【請求項１７】
患者が副甲状腺関連障害に罹患しているかまたはそれに対する危険性があるかどうかを判定する方法であって、
患者；
ｂ）試験試料をＳＭＡＤタンパク質と接触させ；そして
ｃ）該試料内のパラフィブロミンタンパク質が、正常組織から得た比較生体試料内に含まれるパラフィブロミンと同じ方法で、該ＳＭＡＤに結合することができるかどうかを判定する（相違は、パラフィブロミン突然変異および副甲状腺障害の結果的な存在またはそれに対する危険性を示す）；
ことを含んでなる方法。
【請求項１８】
ＳＭＡＤが、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ６、およびＳＭＡＤ７のいずれか１つである、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
副甲状腺機能亢進症−顎腫瘍（ＨＰＴ−ＪＴ）症候群は、副甲状腺、顔面骨、腎臓、子宮、またことによると、甲状腺、膵臓および精巣に関与する異常腫瘍の発生により特徴付けられる常染色体優性障害である。特徴的病変には、副甲状腺腺腫または癌腫、下顎および上顎の線維骨性病変、腎嚢胞および腫瘍、並びに子宮腫瘍が含まれる（Chen et al. (2003) J. Intern. Med. 253: 634）。その症候群は、染色体１ｑ３１.２に位置する腫瘍抑制ＨＲＰＴ２遺伝子の突然変異により引き起こされ得る。ＨＲＰＴ２（副甲状腺機能亢進症−顎腫瘍症候群２）は、パラフィブロミンと呼ばれる（その副甲状腺腫瘍および骨化性線維腫における関与から名付けられた）、偏在的に発現した５３１のアミノ酸タンパク質をコードする１７のエクソンから成る。ＨＲＰＴ２は、ＲＮＡポリメラーゼIIと相互作用する酵母ＰＡＦ１複合体で存在する、Ｓ.セレビシエ（酵母）タンパク質Ｃdc７３のヒト相同分子種である。
【０００２】
生殖細胞系列ＨＲＰＴ２突然変異は、ＨＰＴ−ＪＴ患者の２４症例のうち１４症例において見い出され、そして体細胞突然変異もまた、検査した散発性副甲状腺癌の４つの腫瘍全てにおいて検出されることが報告されている（Carptenら（2002）Nat. Genetics 32: 676；Howellら（2003）J. Med. Genetics 40: 657）。加えて、ＨＲＰＴ２突然変異は、明らかに散発性の副甲状腺癌を患う１５人の患者のうち１０人の患者において見い出された（Rubinら（2005）J. Clin. Endocrin. Metab. 90(9): 5505）。ほとんどのＨＲＰＴ２突然変異は、タンパク質の無発現またはより小さなタンパク質の発現のいずれかをもたらす早期切断である。実際、パラフィブロミン免疫反応性の喪失は、副甲状腺癌の際立った特徴である（Tanら（2004）Clin Cancer Res. 10(19): 6629）。
【０００３】
ＴＧＦ−β（形質転換増殖因子−β）シグナル伝達経路は、その標的遺伝子の調節によって、細胞増殖および分化、増殖停止、アポトーシス、並びに上皮間充織分化転換（ＥＭＴ）といったような、多くの細胞活性を調節することができる。ＴＧＦ−β自体（例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３）、アクチビンおよび骨形成タンパク質（ＢＭＰ）が含まれる、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーは、細胞増殖、分化、移動およびアポトーシスの強力な調節剤である。それらは、細胞表面上のセリン／スレオニンキナーゼ受容体へ結合して活性化すること、そして下流エフェクターＳＭＡＤ（ＭＡＤの脊椎動物相同体、または“Ｍothers against ＤＰＰ”タンパク質）タンパク質が重要な役割を担う細胞内シグナル伝達経路を誘発することによって作用する（Hataら，Mol Med Today (1998) 6: 257）。ＳＭＡＤタンパク質は、細胞内ＴＧＦ−βシグナル伝達において重要な役割を果たし、そして活性化すると、それらが転写を活性化し得るところから核へと直接転位置させる（Liuら（1996）Nature 381:622）。
【０００４】
ＨＲＰＴ２またはその相互作用物質(interactors)を調整する方法の発見は、ＨＰＴ−ＪＴ、家族性孤発性原発性副甲状腺機能亢進症（ＦＩＰＨ）、散発性副甲状腺腫瘍、および他の関連悪性腫瘍を診断する、それらの症状を改善する、それらから保護する、そしてそれらを処置するのに有用であろう。同様に、ＴＧＦ−βおよびその相互作用物質を調整する方法の発見は、ＴＧＦ−β関連障害および他の関連悪性腫瘍を診断する、それらの症状を改善する、それらから保護する、そしてそれらを処置するのに有用であろう。
【発明の概要】
【０００５】
発明の要約
本発明は、例えば、ＴＧＦ−βアンタゴニストの使用によって、副甲状腺関連障害（例えば、ＨＰＴ−ＪＴ、ＦＩＰＨ、散発性副甲状腺腫瘍、および他の関連悪性腫瘍等）を診断する、それらの症状を改善する、それらから保護する、そしてそれらを処置する方法を提供する。
【０００６】
本発明はまた、例えば、ＨＲＰＴ２および／またはＰＡＦ１複合体のモジュレーターの使用によって、ＴＧＦ−β関連障害（例えば、肺高血圧症、癌、高血圧症、線維症、創傷治癒）を診断する、それらの症状を改善する、それらから保護する、そしてそれらを処置する方法を提供する。
【０００７】
本発明はまた、例えば、ＨＲＰＴ２（またはパラフィブロミン）および／またはＰＡＦ１複合体のモジュレーターの使用によって、シグナル伝達ＴＧＦβ経路を調整する方法を提供する。好ましい態様において、その方法は、ＨＲＰＴ２遺伝子またはそのタンパク質産物であるパラフィブロミンを拮抗することによっての、ＴＧＦβ経路の活性化である。
【０００８】
本発明はまた、ＴＧＦ−βおよびその関連タンパク質のアゴニストおよびアンタゴニストを同定して試験する方法、並びにＨＲＰＴ２（またはパラフィブロミン）、ＰＡＦ１、およびそれらの関連タンパク質のアゴニストおよびアンタゴニストを同定して試験する方法も提供する。本発明のタンパク質に関する発見：パラフィブロミンとＳＭＡＤとの間のタンパク質相互作用は、インビトロまたはインビボにおいて、この結合事象（または結果的な複合体形成）を高めるまたは妨げるであろう薬剤を同定するのに、そしてこの結合事象（または結果的な複合体形成）の不存在または存在と関連のある障害を処置するのに使用され得る薬剤を発見するのに有用である。
【０００９】
本発明には、ＰＡＦ１複合体メンバーとＳＭＡＤとの間に形成される複合体を調整する（例えば、妨害する）試験薬剤を同定する方法であって、ａ）ｉ）ＳＭＡＤタンパク質（例えば、ＳＭＡＤ３）に結合することができるＰＡＦ１複合体メンバータンパク質または相同体（例えば、パラフィブロミン）；ii）該ＰＡＦ１複合体メンバーと相互作用することが知られているＳＭＡＤタンパク質または相同体；およびiii）スクリーニングするための１つまたはそれ以上の試験薬剤を与え；ｂ）該ＰＡＦ１複合体メンバータンパク質または相同体、該ＳＭＡＤタンパク質または相同体、および試験すべき１つまたはそれ以上の該薬剤をいずれかの順序で混合し；そしてｃ）試験薬剤の存在下におけるＰＡＦ１複合体メンバータンパク質（または類似体）：ＳＭＡＤ（または類似体）結合の変化を、該薬剤の不存在下における結合と比較して測定する：ことを含んでなる方法が含まれる。その変化は、ＰＡＦ１複合体メンバーとＳＭＡＤとの間に形成される複合体を調整する（例えば、妨害する）試験薬剤の能力を示し、また従って、その試験薬剤は、その複合体に関連した障害における治療的有用性を有し得る。
【００１０】
好ましい態様において、ＰＡＦ１複合体メンバーはパラフィブロミンであって、薬剤を、パラフィブロミンおよびＳＭＡＤタンパク質の結合を特異的に妨害するその能力に関して試験する。
【００１１】
別の好ましい態様において、ＳＭＡＤタンパク質は、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ６、またはＳＭＡＤ７である。
【００１２】
本発明には、副甲状腺関連障害の処置に有用な化合物をスクリーニングするための方法であって、パラフィブロミンを発現する細胞およびＳＭＡＤタンパク質を化合物と接触させて、ＳＭＡＤタンパク質活性および／またはＴＧＦβ経路活性における変化を検出することを含んでなる方法が含まれる。
【００１３】
本発明には、ＴＧＦβ関連障害の処置に有用な化合物をスクリーニングするための方法であって、パラフィブロミンを発現する細胞およびＳＭＡＤタンパク質を化合物と接触させて、ＳＭＡＤタンパク質活性および／またはＴＧＦβ経路活性における変化を検出することを含んでなる方法が含まれる。
【００１４】
ＳＭＡＤタンパク質活性および／またはＴＧＦβ経路活性におけるこの変化は、ＰＣＲ、タックマン(Taqman) ＰＣＲ、ファージディスプレイシステム(phage display systems)、ゲル電気泳動、酵母ツーハイブリッドアッセイ(yeast-two hybrid assay)、ノーザンまたはウエスタン分析、免疫組織化学的検査、従来のシンチレーションカメラ、ガンマカメラ、直線スキャナー、ＰＥＴスキャナー、ＳＰＥＣＴスキャナー、ＭＲＩスキャナー、ＮＭＲスキャナー、またはＸ線装置により測定され得る。ＳＭＡＤタンパク質活性および／またはＴＧＦβ経路活性タンパク質における変化は、パラフィブロミン（またはＰＡＦ１複合体におけるタンパク質）とＳＭＡＤタンパク質との間の相互作用における変化を検出することにより、パラフィブロミンレベルにおける変化を検出することにより、またはＴＧＦβ経路における１つもしくはそれ以上のタンパク質レベルにおける変化を検出することにより検出され得る。そのような細胞は、骨格筋由来のものであるのがよく、培養細胞であるのがよく、またはトランスジェニック生物から得るのがよいか、もしくはトランスジェニック生物内であるのがよい。そのようなトランスジェニック生物には、限定されるものではないが、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシまたは霊長類が含まれる。
【００１５】
本発明は、パラフィブロミン、ＰＡＦ１、ＴＧＦβ、もしくはＳＭＡＤポリペプチドの天然配列、または記載したいずれかのポリペプチドの天然配列に限定されるものではない。部分またはフラグメントを使用する場合でも、これらの部分またはフラグメントは、アミノ酸配列の変化を有し得る。例えば、ＨＰＴ−ＪＴがパラフィブロミン遺伝子の突然変異により引き起こされるなら、本発明の方法は、ＨＰＴ−ＪＴに罹患している患者で使用する場合、突然変異型のパラフィブロミン（例えば、タンパク質パラフィブロミンの切断型を結果的に生ずる）、およびその結合複合体に関するであろう。本発明はまた、タンパク質：パラフィブロミンまたはＳＭＡＤ類似体を含んでなるタンパク質複合体も意図する。
【００１６】
上記方法の一態様において、パラフィブロミンポリペプチドまたは類似体を標識化する。別の態様において、ＳＭＡＤポリペプチドまたは類似体を標識化する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１Ａは、パラフィブロミン（ＨＲＰＴ２のタンパク質産物）とＳＭＡＤ６との間の特異的相互作用を実証する、免疫共沈降実験の結果を示す。図１Ｂは、ＳＭＡＤ６と、ヒトＨＰＴ−ＪＴ患者から同定されたＨＲＰＴ２突然変異体との間の同一相互作用の欠如を示す。
【００１８】
【図２】図２は、レポーター遺伝子のＴＧＦβおよびＢＭＰ媒介活性化に対する、ＨＲＰＴ２またはＨＲＰＴ２突然変異体過剰発現効果のグラフ表示を示す。
【００１９】
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子のＴＧＦβおよびＢＭＰ媒介活性化に対する、siＲＮＡを使用してのＨＲＰＴ２ノックダウン効果のグラフ表示を示す。
【００２０】
【図４】図４Ａ−Ｃは、ＰＡＦ１：ＳＭＡＤ相互作用の特異性および有意性のグラフ表示である。哺乳類ＰＡＦ１複合体の成分は、着色された四角により同定される。Ｙ軸は、一定のタンパク質と同時精製するエントリーポイント数を示す。ＳＭＡＤ３、６および７は、ＰＡＦ１複合体と相互作用するエントリーポイントのみ（３３５のエントリーポイントの中で）である（Ｙ軸上の低いところ）。Ｘ軸は、有意性スコアを表す。右の一番端にくるそれらの相互作用物質がより有意である。ＳＭＡＤ３およびＳＭＡＤ７は両方とも、同時精製するほとんどのタンパク質に比べて高度の有意性を実証する。
【００２１】
【図５】図５は、ＨＲＰＴ２ノックダウンがＴＧＦb刺激ＥＭＴに対して細胞を感作することを示す。それは、ＨＲＰＴ２ノックダウンがＴＧＦ−β誘発浸潤および移動に対して細胞を感作することを示す位相差像である。
【００２２】
【図６】図６は、ＨＲＰＴ２ノックダウンにさらした細胞が非常に低用量のＴＧＦβに反応して表現型の変化を示したことを示す。この図は、作用染色を使用する。
【００２３】
【図７】図７は、ＨＲＰＴ２ノックダウンにさらした細胞が非常に低用量のＴＧＦβに反応して表現型の変化を示したことを示す。この図は、Ｅ−カドヘリン染色を使用する。
【００２４】
【図８】図８は、これらの細胞における２４時間および４２時間でのＥ−カドヘリンの発現レベルを示す。
【００２５】
【図９】図９は、ＴＧＦ−βにより誘発された浸潤を示し、これは、ＨＲＰＴ２を２つの独立したsiＲＮＡ二本鎖によりノックダウンした細胞において約３−６倍まで増大した。
【００２６】
【図１０】図１０Ａは、図９における試料の蛍光顕微鏡写真を示す。図１０Ｂは、ノックダウンＨＲＰＴ２がＴＧＦβに反応してＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞の移動を増大させることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
本明細書中、“処置”という用語には、病気に（例えば、副甲状腺関連障害に）かかりやすい患者、さらにはまた、病気の患者の処置を含め、予防的(prophylactic)または予防的(preventive)処置の両方、さらにはまた、治療的または疾患抑制的処置が含まれる。この用語にはさらに、疾患の進行遅延のための処置が含まれる。
【００２８】
例えば、副甲状腺関連障害（例えば、ＨＲＰＴ２またはパラフィブロミン突然変異と関連のある障害）を“抑制するおよび／または回復させる”という語により、出願人は、該状態を抑止すること、または該状態を処置前もしくは無処置の場合より重篤ではない状態にすることを意味する。
【００２９】
“ＴＧＦ−βアンタゴニスト”は、本明細書中でさらに定義する場合、当業界で知られているＴＧＦ−βアンタゴニストを含め、ＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する薬剤である。非限定的な例には、ヒトＴＧＦ−βに特異的な遮断（中和）抗体（ＮＡbs）、可溶性ＴＧＦ−β受容体、膜結合性ＴＧＦ−β受容体、前駆体ＴＧＦ−βを成熟ＴＧＦ−βへと活性化することを担うプロテアーゼを不活性化するプロテアーゼ阻害剤、ＴＧＦ−β受容体（Ｉ型、II型またはIII型）に特異的であって、その受容体へのＴＧＦ−β結合を予防する抗体、およびそれらの組み合わせが含まれる。
【００３０】
本明細書中で使用する場合の“治療”は、処置によって、障害、例えば、副甲状腺関連障害、またはその継続的な症状発現の寛解をもたらすことを意味する。
【００３１】
“予防(prophylaxis)”または“予防(prevention)”という用語は、副甲状腺関連障害、例えば、ＨＰＴ−ＪＴの発症または再発を妨げることを意味する。
【００３２】
本明細書中で使用する場合の“進行遅延”は、患者における副甲状腺関連障害（例えば、ＨＰＴ−ＪＴ）の前段階または初期段階での、患者へのモジュレーター（例えば、ＴＧＦβアンタゴニスト）の投与が、その疾患をさらに進行せぬようにするか、またはそのモジュレーターの投与無しでの疾患の進行に比べて疾患の進行を遅らせることを意味する。
【００３３】
本明細書中で使用する場合の“副甲状腺関連障害”には、原発性副甲状腺機能亢進症（例えば、副甲状腺過形成）、家族性孤発性原発性副甲状腺機能亢進症（ＦＩＰＨ）、および副甲状腺機能亢進症−顎腫瘍（ＨＰＴ−ＪＴ）症候群、さらにはまた、その付随合併症が含まれ、これには、限定されるものではないが、副甲状腺腺腫および癌腫、下顎および上顎の線維骨性病変、並びに子宮腫瘍が含まれる。合併症にはまた、生殖細胞系列ＨＲＰＴ２突然変異と関連のある、腎嚢胞および腫瘍も含まれ得る（Zhaoら（2006）Oncogene, 1.）。非限定的な例には、ウィルムス腫瘍および乳頭腫瘍、明細胞癌、好酸性顆粒細胞腫、並びに腎細胞癌（例えば、嫌色素性細胞ＲＣＣ）が含まれる。“副甲状腺関連障害”にはまた、骨化性線維腫、並びに副甲状腺（良性および悪性型両方の、散発性および遺伝性副甲状腺腫瘍の両方を含む）、顔面骨、腎臓、子宮、甲状腺、膵臓、および精巣に関与する腫瘍も含まれる。“副甲状腺関連障害”にはまた、ＨＲＰＴ２遺伝子またはパラフィブロミンタンパク質の突然変異と関連のある状態も含まれる。
【００３４】
本明細書中で使用する場合の“ＴＧＦβ関連障害”には、異常に高いレベルのＴＧＦβシグナル伝達に関連した障害（例えば、高血圧症および癌）、および異常に低いレベルのＴＧＦβシグナル伝達に関連した障害（例えば、軟骨および／または腱の再生が治療法であるそれらの障害）の両方が含まれる。“ＴＧＦβ関連障害”の定義内に含まれる障害の非限定リストは、高血圧症（肺高血圧症（例えば、家族性原発性肺高血圧症、または“ＦＰＰＨ”）を含む）、癌、高血圧症、線維症、創傷治癒、マルファン症候群、腫瘍転移、先天性心疾患、骨および筋肉変性疾患、並びに動脈ねじれ症候群（ＡＴＳ）（動脈壁の内側層における弾性繊維の崩壊を原因とする、主要動脈でのねじれ、伸長、狭窄および動脈瘤形成により特徴付けられる常染色体劣性障害）である。
【００３５】
本明細書中で使用する場合、“調整する”は、直接的または間接的に制御するまたは影響を与える能力を示し、そして非限定的な例として、あるいはまた、阻害することまたは刺激すること、作用することまたは拮抗すること、妨害することまたは促進すること、および強めることまたは弱めることを意味し得る。
【００３６】
本明細書中で使用する場合、“有機小分子”または“小分子”は、３キロダルトン未満、また好ましくは１.５キロダルトン未満の分子量を有する有機化合物（または無機化合物（例えば、金属）と複合体を形成した有機化合物）である。
【００３７】
本明細書中で使用する場合、“レポーター”遺伝子は、“マーカー遺伝子”という用語と互換的に使用され、そしてルシフェラーゼといったような、容易に検出可能である遺伝子産物を容易に検出できるおよび／またはコードする核酸である。
【００３８】
転写および翻訳制御配列は、宿主細胞においてコード配列の発現を与える、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター等といったようなＤＮＡ調節配列である。真核細胞において、ポリアデニル化シグナルは制御配列である。
【００３９】
“プロモーター配列”は、細胞においてＲＮＡポリメラーゼを結合して、下流（３’方向）コード配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。本発明を定義する目的で、プロモーター配列を転写開始部位によりその３’末端で結合させて、バックグラウンドより上の検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最少数の塩基または要素が含まれるよう、上流（５’方向）へと拡張する。プロモーター配列内には、転写開始部位（便宜上、例えば、ヌクレアーゼＳ１でマッピングすることにより定義される）、さらにはまた、ＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（共通配列）が見い出されるであろう。
【００４０】
ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をmＲＮＡへと転写した後、これがトランスＲＮＡスプライスされて、そのコード配列によりコードされるタンパク質へと翻訳される場合、コード配列は、細胞における転写および翻訳制御配列の“制御下”である。
【００４１】
“薬学的に許容され得る”という語句は、ヒトに投与した場合、生理学的に容認されて、典型的には、胃の不快感、目まい等といったような、アレルギーまたは同様の有害反応をもたらさない分子実体および組成物を示す。好ましくは、本明細書中で使用する場合、“薬学的に許容され得る”という用語は、動物での、そしてより具体的には、ヒトでの使用に関して、連邦規制機関もしくは州政府により認可されたこと、または米国薬局方もしくは他の一般的に承認された薬局方に収載されたことを意味する。
【００４２】
“担体”という用語は、化合物と共に投与する、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを示す。そのような医薬担体は、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油等といったような、石油、動物、植物または合成起源のものを含め、水および油といったような滅菌液であり得る。水または水溶液である食塩溶液並びに水性デキストロースおよびグリセロール溶液を、特に注射溶液のための担体として使用するのが好ましい。適当な医薬担体は、E. W. Martinによる“Remington’s Pharmaceutical Sciences”に記載されている。
【００４３】
“治療上有効な量”および“有効量”という語句は、宿主の活性、機能および反応における臨床的に有意な不足を、少なくとも約１５パーセントまで、好ましくは少なくとも５０パーセントまで、より好ましくは少なくとも９０パーセントまで減少させるのに、そして最も好ましくは防ぐのに十分な量を意味するものとして本明細書中で使用する。あるいはまた、治療上有効な量は、宿主における臨床的に有意な状態／症状での改善を引き起こすのに十分である。
【００４４】
“薬剤”は、全て本発明に従って、医薬および診断用組成物を調製するために使用され得る物質、または化合物、核酸、ポリペプチド、フラグメント、イソ型、変異体であり得る物質、またはそのような目的のために独立して使用され得る他の物質を全て示す。
【００４５】
本明細書中で使用する場合の“類似体”は、化合物、ヌクレオチド、タンパク質、もしくはポリペプチド、または本発明の所望の活性および治療効果（例えば、腫瘍増殖の阻害）を有する化合物と同様または同一の活性または機能を持つが、好ましい態様の配列または構造と同様または同一である配列または構造を必ずしも含んでなる必要のない、小さな有機化合物、ヌクレオチド、タンパク質、またはポリペプチドを示す。
【００４６】
“誘導体”は、化合物、アミノ酸残基置換、欠失もしくは付加の導入により変更されている親タンパク質もしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含んでなるタンパク質もしくはポリペプチド、またはヌクレオチド置換もしくは欠失、付加もしくは突然変異のいずれかの導入により修飾されている核酸もしくはヌクレオチドのいずれかを示す。誘導核酸、ヌクレオチド、タンパク質またはポリペプチドは、親ポリペプチドと同様または同一の機能を有する。
【００４７】
“阻害剤”または“アンタゴニスト”は、ＨＲＰＴ２活性の、ＴＧＦβシグナル伝達の、または関連タンパク質（例えば、ＳＭＡＤ、ＰＡＦ１複合体のタンパク質等）の活性の、ＴＧＦβ経路機能に関するインビトロおよびインビボにおけるアッセイを使用して同定されたものを含め、阻害分子を示す。阻害剤およびアンタゴニストは、経路（例えば、ＴＧＦβ経路）によってシグナル伝達を減少させる、遮断する、もしくは防ぐ薬剤、および／またはＰＡＦ１複合体もしくはヒストンメチルトランスフェラーゼ複合体といったようなタンパク質複合体の形成を防ぐ薬剤であり得る。
【００４８】
本明細書中で使用する場合、“癌”という用語には、哺乳類固形腫瘍、さらにはまた、血液悪性腫瘍が含まれる。“哺乳類固形腫瘍”には、頭頸部、肺、中皮腫、縦隔、食道、胃、膵臓、肝胆道系、小腸、結腸、結腸直腸、直腸、肛門、腎臓、尿道、膀胱、前立腺、尿道、陰茎、精巣、婦人科器官、卵巣、胸部、内分泌系、皮膚、脳を含む中枢神経系の癌；軟組織および骨の肉腫；並びに皮膚および眼内発生の黒色腫が含まれる。“血液悪性腫瘍”という用語には、小児白血病およびリンパ腫、ホジキン病、リンパ球および皮膚発生のリンパ腫、急性および慢性白血病、形質細胞新生物、並びにＡＩＤＳと関連のある癌が含まれる。加えて、原発性、転移性、および再発性癌といったような、いずれの進行期での癌も処置することができる。多数の癌の種類に関しての情報は、例えば、American Cancer Societyから、または例えば、Wilsonら（1991）Harrison’s Principles of Internal Medicine, 12th Edition, McGraw-Hill, Inc.から見い出され得る。
【００４９】
ＨＲＰＴ２
【００５０】
ＨＲＰＴ２は、遺伝子発現の調節において、特に副甲状腺腫瘍において重要な役割を果たす、染色体１ｑ３１.２に位置する腫瘍抑制遺伝子である（Wangら（2005）Horm. Metab. Res. 37:380）。その遺伝子は、パラフィブロミンと呼ばれる（その副甲状腺腫瘍および骨化性線維腫における関与から名付けられた）、偏在的に発現した５３１のアミノ酸タンパク質をコードする１７のエクソンから成る。野性型パラフィブロミンは、抗増殖特性を実証し、これは、重要な細胞周期関連遺伝子の調節と密接に関連するらしい。例えば、野性型パラフィブロミンは、副甲状腺腫瘍形成に関係する、そのサイクリンＤ１阻害によって、腫瘍抑制遺伝子として作用することが示されている（Shattuckら（2002）J. Bone. Miner. Res. 17(2): N30）。ＨＲＰＴ２（およびパラフィブロミン）突然変異体は、腫瘍形成および細胞増殖因子を阻害する能力を失い、また従って、癌（特に副甲状腺種の）を生み出すと考えられる。
【００５１】
比較研究は、ＨＲＰＴ２が、ＰＡＦ１、Ｃdc７３、Ｌeo１、ctr９、およびＲtf１から成る酵母ＰＡＦ１複合体で存在する、Ｓ.セレビシエ（酵母）タンパク質Ｃdc７３（ＧenＢankのアクセス番号ＮＰ＿０１３５２２）のヒト相同分子種であること示している。その酵母ＰＡＦ１複合体は、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、例えば、set１複合体をＲＮＡポリメラーゼIIに補充することにより、ヒストンメチル化を調節し、それによって、転写活性化または抑制のいずれかを結果的に生ずることを含め、多面的機能を有する（Rozenblatt-Rosenら（2005）Mol. Cell. Biol. 25: 612）。
【００５２】
ＰＡＦ１複合体は、ヒストン修飾および転写後事象（例えば、ヒストンＨ３メチル化事象）への関連に重要であって、脂質および核酸代謝、タンパク質合成、並びに細胞周期における産物機能を制御する遺伝子の調節に関係する（Betzら（2002）Mol. Genet. Genomics 268: 272）。哺乳類ＰＡＦ１複合体は、ＰＤ２、パラフィブロミン、ＬＯＣ１２３１６９、およびＳＨ２ＢＰ１という４つのタンパク質を含み、これらは各々、酵母ＰＡＦ１、Ｃdc７３、Ｌeo１、およびctr９の哺乳類相同体である（Rozenblatt-Rosenら）。
【００５３】
副甲状腺機能亢進症−顎腫瘍（ＨＰＴ−ＪＴ）症候群は、副甲状腺、顔面骨、腎臓、子宮、またことによると、甲状腺、膵臓および精巣に関与する異常腫瘍の発生により特徴付けられる常染色体優性障害であって（Chenら）、ＨＲＰＴ２の突然変異により引き起こされると考えられる。パラフィブロミン免疫反応性の喪失は、副甲状腺癌の際立った特徴である（Tanら）。ＨＲＰＴ２突然変異の大部分は、フレームシフト、ナンセンス、およびスプライスであり、これらは、タンパク質の無発現またはより小さなタンパク質の発現のいずれかと関連のある早期切断をもたらす。パラフィブロミンの幾つかの突然変異型は、ＰＡＦ１複合体およびヒストンメチルトランスフェラーゼ複合体とは関連せず、癌における突然変異にさらに関係する。
【００５４】
症候性型の家族性原発性副甲状腺機能亢進症（例えば、ＨＰＴ−ＪＴ）の不完全発現はまた、家族性孤発性原発性副甲状腺機能亢進症（ＦＩＰＨ）も起こし得る（Cetaniら（2006）Clin Endocrinol 64(2):146）。さらにまた、ＨＲＰＴ２突然変異はまた、散発性副甲状腺腫瘍を含め、副甲状腺悪性腫瘍にも関連付けられている。今日まで、ＨＲＰＴ２の突然変異がどのようにして副甲状腺腫瘍の発生をもたらすかを提唱する報告はまだない。
【００５５】
ＴＧＦ−β
【００５６】
ＴＧＦ−β（形質転換増殖因子−β）シグナル伝達経路は、その標的遺伝子の調節によって、細胞増殖および分化、増殖停止、アポトーシス、並びに上皮間充織分化転換（ＥＭＴ）といったような、多くの細胞活性を調節することができる。ＴＧＦ−β自体（例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３）、アクチビンおよび骨形成タンパク質（ＢＭＰ）が含まれる、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーは、細胞増殖、分化、移動およびアポトーシスの強力な調節剤である。
【００５７】
ＴＧＦ−βは、ＢおよびＴリンパ球および活性化マクロファージを含め、多くの細胞により、さらにはまた、多くの他の細胞型により産生される、２４Ｋdのタンパク質である。免疫系に対するＴＧＦ−βの効果の中には、ＩＬ−２受容体誘導、ＩＬ−１誘発性胸腺細胞増殖の阻害、およびガンマインターフェロン誘発性マクロファージ活性化の遮断がある。ＴＧＦ−βは、様々な病的状態に関与すると考えられており（Borderら（1992）J. Clin. Invest. 90:1）、そして腫瘍抑制物質または腫瘍プロモーターのいずれかとして機能することが十分裏付けられている。
【００５８】
ＴＧＦβは、２つのセリン／スレオニンキナーゼ細胞表面受容体であるＴＧＦβＲIIおよびＡＬＫ５によって、そのシグナル伝達を媒介する。ＴＧＦβシグナル伝達は、ＴＧＦβＲIIがＡＬＫ５受容体をリン酸化するのを可能とする、リガンド誘発性受容体二量体化で開始される。そのリン酸化は、ＡＬＫ５キナーゼ活性を活性化して、活性化ＡＬＫ５は次に、下流エフェクターＳＭＡＤタンパク質（ＭＡＤの脊椎動物相同体、または“Ｍothers against ＤＰＰ（デカペンタプレジック）”タンパク質）、ＳＭＡＤ２または３をリン酸化する。ＳＭＡＤ４とのp−ＳＭＡＤ２／３複合体は、核に入って、標的遺伝子の転写を活性化する。
【００５９】
ＳＭＡＤ３は、ＳＭＡＤのＲ−ＳＭＡＤ（受容体−活性化ＳＭＡＤ）サブグループのメンバーであって、ＴＧＦβ受容体による転写活性化の直接メディエーターである。ＴＧＦβ刺激は、ＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３のリン酸化および活性化をもたらし、これらは、ＳＭＡＤ４（脊椎動物における“共通(common)ＳＭＡＤ”または“co−ＳＭＡＤ”）と複合体を形成し、これが核と共に蓄積して、標的遺伝子の転写を調節する。Ｒ−ＳＭＡＤは、細胞質に局在し、そしてＴＧＦβ受容体によるリガンド誘発性リン酸化で、co−ＳＭＡＤと複合体を形成して、核へと移動し、ここで、それらは、クロマチンおよび協同転写因子と関連のある遺伝子発現を調節する。ＳＭＡＤ６およびＳＭＡＤ７は阻害性ＳＭＡＤ（“Ｉ−ＳＭＡＤ”）であり、すなわち、ＴＧＦβにより転写的に誘発されて、ＴＧＦβシグナル伝達の阻害剤として機能する（(Fengら（2005）Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 21: 659)。ＳＭＡＤ６／７は、Ｒ−ＳＭＡＤの受容体媒介活性化を妨げることにより、それらの阻害効果を発揮する；それらは、Ｒ−ＳＭＡＤの動員およびリン酸化を競合的に妨げる、Ｉ型受容体と関連する。ＳＭＡＤ６およびＳＭＡＤ７は、ＳＭＡＤ６／７相互作用タンパク質のユビキチン化および分解をもたらす、Ｅ３ユビキチンリガーゼを補充することが知られている。
【００６０】
ＴＧＦ−βは、癌において少なくとも２つの重要な役割を担う。それは、多くの細胞の増殖を阻害するので、ＴＧＦ−βに対する反応性の喪失（例えば、受容体またはＳＭＡＤタンパク質の突然変異によって）は、無制御増殖を結果的に生ずる。第二に、それは、非常に免疫抑制性であるので、ＴＧＦ−β自体にもはや反応しない腫瘍細胞は、ＴＧＦ−βの発現を上方調節して、それら自体を免疫系から保護する。ＴＧＦ−βの発現増大はまた、転移の間に新たな部位へと移動する腫瘍細胞の能力も高め得る。
【００６１】
ＴＧＦβおよびＨＲＰＴ２
【００６２】
本出願の実験の項においてさらに記載するように、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）実験は、ＰＡＦ１複合体のタンパク質と、ＳＭＡＤ３、６、および７との間で検出された結合事象に基づき、ＨＲＰＴ２とＴＧＦβシグナル伝達経路との間の関係を実証する。以下にもまた記載する（また図において見られる）ように、その関係は、ＨＲＰＴ２の過剰発現により、そして阻害性ＲＮＡ（siＲＮＡ）でのＨＲＰＴ２のノックダウンにより、ＴＧＦβ経路の活性化における増大を示すことによってさらに立証される。ＨＲＰＴ２突然変異によってはＴＧＦβ活性化に対して何ら効果は見られず、これらは、副甲状腺関連障害（例えば、ＨＰＴ−ＪＴ、ＦＩＰＨ、散発性副甲状腺腫瘍、および他の関連悪性腫瘍）といったような障害に関係する。
【００６３】
正常な生理学的事象の経過において、パラフィブロミンおよびその複合体ＰＡＦ１は、ＳＭＡＤ６および７といったような阻害性ＳＭＡＤと結合して、複合体を形成し、それによって、ＴＧＦβ活性化およびシグナル伝達を抑制すると考えられる。この複合体の崩壊は、無傷複合体の阻害効果の喪失が原因でＴＧＦβ活性化を結果的に生ずる。この複合体の崩壊、また従って、ＴＧＦβシグナル伝達阻害の喪失は、（ｉ）ＨＲＰＴ２突然変異（例えば、ＨＰＴ−ＪＴ患者において見られるものといったような機能喪失突然変異）の存在；（ii）それら本来の形成とは別に複合体形成を担う他のタンパク質を封鎖する効果を有する、ＨＲＰＴ２の過剰発現；および（iii）ＨＲＰＴ２不足から複合体形成を防ぐ効果を有する、ノックダウンＨＲＰＴ２（例えば、siＲＮＡによる）を含め、幾つかの事象が原因で発生し得る。
【００６４】
パラフィブロミンとＳＭＡＤとの間の結合、およびその結果生ずるＴＧＦβ活性化に対する効果のために、ＨＲＰＴ２（またはパラフィブロミン）のモジユレーターは、ＴＧＦβ関連障害に関係し得る。そのようなモジユレーターの目的の１つは、パラフィブロミンレベルを正常化して、ＴＧＦβシグナル伝達抑制のために、とりわけ、ＰＡＦ１複合体のタンパク質とＳＭＡＤとの間の複合体形成を可能とすることである。そのような抑制は、ＴＧＦβシグナル伝達レベルの病理学的上昇と関連のある障害（例えば、高血圧症および癌）の処置に有用である。
【００６５】
異常に高いＴＧＦβ活性化により特徴付けられる障害においてＴＧＦβ活性化レベルを低下させることによるといったような、ＴＧＦβシグナル伝達の正常化もまた、本明細書中で説明する理由から、副甲状腺関連障害に望ましい。副甲状腺関連障害は、ＨＲＰＴ２の過剰発現またはノックダウンＨＲＰＴ２の結果としてのＴＧＦβの活性化が原因であると考えられるので、異常に高いＴＧＦβ活性化を軽減することにより、例えば、ＴＧＦβアンタゴニストを投与することにより、該障害を治療することができる。
【００６６】
逆に、ＨＲＰＴ２調整の代替目的は、正常なパラフィブロミンタンパク質、ＰＡＦ１複合体のタンパク質、およびＳＭＡＤの間で形成された複合体を崩壊することであり、該崩壊は、ＴＧＦβシグナル伝達活性化をもたらす。そのようなＴＧＦβ活性化は、低いまたは存在しないＴＧＦβシグナル伝達と関連のある障害において有用である。自己免疫障害の場合、例えば、免疫抑制は、ＴＧＦβ経路活性化を増大させることによって（例えば、パラフィブロミンが一部である複合体の崩壊によって）達成されまたは高められ得る。
【００６７】
そしてまた、パラフィブロミンとＳＭＡＤとの間で観察される結合、およびその結果生ずるＴＧＦβ活性化に対する効果のために、ＴＧＦβのモジユレーターは、ＨＲＰＴ２関連障害（例えば、ＨＰＴ−ＪＴ、肺高血圧症、およびＡＴＳ）に関係し得る。マルファン症候群、ＴＧＦβシグナル伝達を活性化する突然変異により特徴付けられる障害（またその効果は、ＴＧＦβアンタゴニストの投与により治療される）の処置に類似した方法で、本発明は、ＨＲＰＴ２突然変異とＴＧＦβシグナル伝達との間の関係を利用する（Habashiら（2006）Science 312: 117）。Habashiは、ＦＢＮ１遺伝子（フィブリン−１をコードする）において突然変異を持つマウスがどのようにしてＴＧＦβシグナル伝達の増大と関連のある肺胞中隔形成の損傷を経験するかを記載しており、これは、ＴＧＦβ中和抗体（ＮＡb）といったようなＴＧＦβアンタゴニストにより改善され得る。ＦＢＮ１に似ているＨＲＰＴ２は、ＴＧＦβの調節剤であり（その効果がＦＢＮ１よりもっとエピジェネティックな性質のものである調節剤ではあるが）；従って、マルファン症候群でのように、ＴＧＦβアンタゴニストの投与により、ＨＲＰＴ２突然変異と関連のある障害（例えば、肺高血圧症および動脈ねじれ症候群（ＡＴＳ））を処置することができ、またそれらの効果を緩和することができる。
【００６８】
ＴＧＦ−βアンタゴニスト
【００６９】
ＴＧＦ−βの効果は、細胞上に存在する特異的受容体への活性ＴＧＦ−βの結合、続いて、それらの細胞へのシグナル伝達により媒介される。ＴＧＦ−βアンタゴニストは、当業界で知られているＴＧＦ−βアンタゴニストを含め、ＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する薬剤として定義される。例えば、ＴＧＦ−βを結合して、ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β受容体に結合するのを防ぐ薬剤は、ＴＧＦ−βアンタゴニストとして作用するであろう。
【００７０】
他の非限定的な例には、Daschら（J. Immunol.(1989) 142:1536）およびLucasら（J. Immunol. (1990) 145:1415）により記載されたものといったような、ヒトＴＧＦ−βに特異的な遮断（中和）抗体（ＮＡb）、可溶性ＴＧＦ−β受容体、膜結合性ＴＧＦ−β受容体、前駆体ＴＧＦ−βを成熟ＴＧＦ−βへと活性化することを担うプロテアーゼを不活性化するプロテアーゼ阻害剤、ＴＧＦ−β受容体（Ｉ型、II型またはIII型）に特異的であって、その受容体へのＴＧＦ−β結合を予防する抗体、およびそれらの組み合わせが含まれる。
【００７１】
当業者は、１つの種、例えば、マウスから得た抗体を操作して、もう１つの種、例えば、ヒトにおいて治療上有用であるようにすることができる種々の方法を認識する。これらの技術の幾つかは、HarrisおよびEmery, TIBTECH 11:42-44, 1993において簡単に再考される。
【００７２】
ＴＧＦ−βは、一般的には、潜伏関連タンパク質と呼ばれるタンパク質と非共有結合したＴＧＦ−βから成る潜伏前駆体として分泌される（ＬＡＰ；Harpelら（1992）Prog. Growth Factor Res. 4: 321において再考）。この潜伏複合体は、活性サイトカインを放出するために、炭水化物基の酵素的切断および一時的酸性化を必要とする。精製ＬＡＰはそれ自体で、活性ＴＧＦ−βを高親和性で結合して、潜伏複合体を形成する。プレ−プロ−ＴＧＦ−βに対応し、成熟型のＴＧＦ−βの直前で終わって、Ｓer３３置換のためのＣys３３を含む、２７８のアミノ酸ペプチドをコードするＤＮＡが述べられており（Derynckら（1985）Nature 316: 701）、またＴＧＦ−βを結合して、それを潜伏した状態にすることが見い出されている。
【００７３】
可溶型のＴＧＦ−β受容体もまたＴＧＦ−βを結合して、膜結合性ＴＧＦ−β受容体への結合を防ぐであろう。ＴＧＦ−β受容体は、Wangら（Cell (1991) 67: 797）およびLinら（Cell (1992) 68: 775）により記載されている。可溶型のＴＧＦ−β受容体は、当業界で知られている方法により調製され得る。例えば、ＴＧＦ−β受容体の膜貫通ドメインを欠く欠失突然変異体を調製することができ、これは、可溶性ＴＧＦ−β結合タンパク質を発現するであろう。Miyazonoら（Adv. Immunol. (1994) 55: 181）は、ＴＧＦ−β受容体を再考している。
【００７４】
他の型のＴＧＦ−βアンタゴニストもまた当業界で知られている。例えば、Yamaguchiら（Nature (1990) 346: 281）は、ＴＧＦ−βを結合して、この増殖因子の活性を調整する、小さなコンドロイチン−デルマタン硫酸プロテオグリカンであるデコリンを論じている。OhtsukiおよびMassague（Mol. Cell. Biol. 12:261-265, 1992）は、ＴＧＦ−βの幾つかの生物活性を遮断するプロテインキナーゼ阻害剤を開示している。T. cruziは、不活性ＴＧＦ−β前駆体を活性の成熟ＴＧＦ−βへと転換する、システインプロテアーゼを産生する（クルザイン(cruzain)またはクルジペイン(cruzipain)；Eakinら（1992）J. Biol. Chem. 267: 7411）。プロテアーゼ阻害剤の薬物としての設計および使用は、当業界で十分知られている（Design of Enzyme Inhibitors as Drugs; SandlerおよびSmith編; 1989, Oxford University Press; Proteinase Inhibitors Medical and Biological Aspects; Katunuma, UmezawaおよびHolzer編, 1983, Springer-Verlag）；このように、クルザインヴァン(cruzain van)の阻害剤を製造すると、ＴＧＦ−βアンタゴニストとして有用であろう。
【００７５】
またさらなる他のＴＧＦ−βアンタゴニストおよびそれらの製造方法は、現在開発中のより多くのものと共に、当業界で十分知られている。有効なＴＧＦ−βアンタゴニストはいずれも、本発明の方法において有用であり得ることから、使用する特異的ＴＧＦ−βアンタゴニストは、限定的な特徴のものではない。そのようなアンタゴニストの例には、１つまたはそれ以上のイソ型のＴＧＦ−βに対するモノクローナルおよびポリクローナル抗体（米国特許第５,５７１,７１４号およびＰＣＴ特許出願ＷＯ ９７／１３８４４）、ＴＧＦ−β受容体、そのフラグメント、その誘導体、およびＴＧＦ−β受容体に対する抗体（米国特許第５,６９３,６０７号、同第６,００８,０１１号、同第６,００１,９６９号および同第６,０１０,８７２号、並びにＰＣＴ特許出願ＷＯ ９２／００３３０、ＷＯ ９３／０９２２８、ＷＯ ９５／１０６１０およびＷＯ ９８／４８０２４）；潜伏関連ペプチド（ＷＯ ９１／０８２９１）、大きな潜伏ＴＧＦ−β（ＷＯ ９４／０９８１２）、フェチュイン（米国特許第５,８２１,２２７号）、デコリン、並びにバイグリカン、フィブロモジュリン、ルミカンおよびエンドグリンといったような他のプロテオグリカン（米国特許第５,５８３,１０３号、同第５,６５４,２７０号、同第５,７０５,６０９号、同第５,７２６,１４９号、同第５,８２４,６５５号、同第５,８３０,８４７号、同第６,０１５,６９３号、並びにＰＣＴ特許出願ＷＯ ９１／０４７４８、ＷＯ ９１／１０７２７、ＷＯ ９３／０９８００およびＷＯ ９４／１０１８７）が含まれる。
【００７６】
そのようなアンタゴニストのさらなる例には、ソマトスタチン（ＰＣＴ特許出願ＷＯ ９８／０８５２９）、マンノース−６−リン酸またはマンノース−１−リン酸（米国特許第５,５２０,９２６号）、プロラクチン（ＰＣＴ特許出願ＷＯ ９７／４０８４８）、インスリン様増殖因子II（ＰＣＴ特許出願ＷＯ ９８／１７３０４）、ＩＰ−１０（ＰＣＴ特許出願ＷＯ ９７／００６９１）、アルギニン(arg)-グリシン(gly)-アスパラギン酸(asp)含有ペプチド（米国特許第５,９５８,４１１号およびＰＣＴ特許出願ＷＯ ９３／１０８０８）、植物、真菌類および細菌類の抽出物（欧州特許出願第８１３８７５号、日本特許出願第８１１９９８４号および米国特許第５,６９３,６１０号）、アンチセンスオレゴヌクレオチド（米国特許第５,６８３,９８８号、同第５,７７２,９９５号、同第５,８２１,２３４号および同第５,８６９,４６２号、並びにＰＣＴ特許出願ＷＯ ９４／２５５８８）、並びにＳＭＡＤおよびＭＡＤ（欧州特許出願ＥＰ ８７４０４６、ＰＣＴ特許出願ＷＯ ９７／３１０２０、ＷＯ ９７／３８７２９、ＷＯ ９８／０３６６３、ＷＯ ９８／０７７３５、ＷＯ ９８／０７８４９、ＷＯ ９８／４５４６７、ＷＯ ９８／５３０６８、ＷＯ ９８／５５５１２、ＷＯ ９８／５６９１３、ＷＯ ９８／５３８３０およびＷＯ ９９／５０２９６、並びに米国特許第５,８３４,２４８号、同第５,８０７,７０８号および同第５,９４８,６３９号）、並びにＳkiおよびＳno（G. Vogel, Science, 286:665 (1999)およびStroscheinら, Science, 286:771-74 (1999)）、並びにＴＧＦ−βの活性を阻害する能力を保持する上記分子のいずれかのフラグメントおよび誘導体を含め、ＴＧＦ−βシグナル伝達に関与する他のタンパク質の宿主が含まれる。
【００７７】
ＴＧＦ−β受容体およびＴＧＦ−β受容体のＴＧＦ−β結合フラグメント、とりわけ、可溶性フラグメントは、本発明の方法において有用なＴＧＦ−βアンタゴニストである。ＴＧＦ−β受容体およびそれらをコードする核酸は、当業界で十分知られている。ＴＧＦ−β１型受容体をコードする核酸配列は、ＧenＢankのアクセス番号Ｌ１５４３６およびDonahoeらの米国特許第５,５３８,８９２号に開示されている。ＴＧＦ−β２型受容体の核酸配列は、ＧenＢankのアクセス番号ＡＷ２３６００１；ＡＩ３５７９０；ＡＩ２７９８７２；ＡＩ０７４７０６；およびＡＡ８０８２５５の下、公的に入手可能である。ＴＧＦ−β３型受容体の核酸配列もまた、ＧenＢankのアクセス番号ＮＭ００３２４３；ＡＩ８８７８５２；ＡＩ８１７２９５；およびＡＩ６８１５９９の下、公的に入手可能である。好ましい態様において、ＴＧＦ−βアンタゴニストは、その受容体、またはＦ(ab)２フラグメント、Ｆvフラグメント、一本鎖抗体、およびＴＧＦ−βに結合する能力を保持する他の“抗体”型といったようなそのフラグメントへのＴＧＦ−β結合を遮断する抗体である。その抗体は、キメラ化またはヒト化され得る。本明細書中、キメラ化抗体は、ヒト抗体の定常領域、およびマウス抗体といったような非ヒト抗体の可変領域を含んでなる。ヒト化抗体は、ヒト抗体の定常領域およびフレームワーク可変領域（すなわち、超可変領域以外の可変領域）、並びにマウス抗体といったような非ヒト抗体の超可変領域を含んでなる。勿論、その抗体は、ファージ提示システムから選択されるもしくは選抜されるか、またはゼノマウスから産生されるヒト抗体といったような、いずれかの他の種類の抗体誘導体であり得る。
【００７８】
より好ましい態様において、モノクローナル抗体は、ヒト化型のマウスモノクローナル抗体１Ｄ１１である。
【００７９】
関連態様において、ＴＧＦ−βアンタゴニストは遺伝子治療によって送達され、ここでは、そのアンタゴニストをコードする核酸配列をインビボにおいて患者へ投与するか、またはインビトロにおいて細胞へ投与した後、これを患者へと導入して、その核酸配列によってコードされる産物の発現により、そのアンタゴニストが産生される。ＴＧＦ−βアンタゴニストを送達するための遺伝子治療方法は、当業者に十分知られている。例えば、ＰＣＴ特許出願ＷＯ ９６／２５１７８を参照されたい。
【００８０】
ＴＧＦ−βアンタゴニストの投与
【００８１】
本発明は、有効量のＴＧＦ−βアンタゴニスト並びに適当な希釈剤および担体を含んでなる治療組成物を使用する方法、そして例えば、副甲状腺関連障害を処置するための方法を提供する。可溶性サイトカイン受容体もしくはサイトカイン、または他の免疫調節性分子と併せての、ＴＧＦ−βアンタゴニストの使用もまた意図する。
【００８２】
治療上の使用に関して、精製ＴＧＦ−βアンタゴニストは、適応症に適当な方法での処置のために、患者、好ましくはヒトに投与される。従って、例えば、マクロファージの免疫および／または炎症機能を増強させるために投与するＴＧＦ−βアンタゴニスト組成物は、ボーラス注射、連続注入、植込錠からの持続放出、または他の適当な技術により与えられ得る。典型的には、治療剤は、生理学的に許容され得る担体、賦形剤または希釈剤と併せて、精製ＴＧＦ−βアンタゴニストを含んでなる組成物の形態で投与されるであろう。そのような担体は、使用する投薬量および濃度で、レシピエントに対して無毒であろう。
【００８３】
通常、そのようなＴＧＦ−βアンタゴニスト組成物の調製は、ＴＧＦ−βアンタゴニストを、緩衝剤、アスコルビン酸といったような抗酸化剤、低分子量の（約１０残基未満の）ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、グルコース、スクロースまたはデキストリンが含まれる糖質、ＥＤＴＡといったようなキレート剤、グルタチオン、並びに安定剤および賦形剤と混ぜ合わせることを必要とする。中性緩衝生理食塩水または同種血清アルブミンと混合した生理食塩水が適当な希釈剤の例示である。好ましくは、適当な賦形剤溶液（例えば、スクロース）を希釈剤として使用して、生成物を凍結乾燥物として製剤化する。
【００８４】
適当な投薬量は、最初に適当な動物モデルでの、また続いて処置すべき種での治験において測定され得る。投与の量および頻度は、勿論、処置する適応症の性質および重篤度、所望の反応、処置する個体の状態等といったような因子に左右されるであろう。適当な投薬量は、各々または組み合わせで、約１０ng／kg／日〜約１００μg／kg／日の範囲内である。好ましくは、１−２０日間１００ng／kg／日〜約１０００ng／kg／日の用量が適当な生物学的効果を誘発すると期待され得る。あるいはまた、約１μg／kg／日から約１００μg／kg／日までのボーラス注射は、マクロファージ／単球により媒介される免疫および／または炎症反応の増強によって抗菌効果を発揮するよう、約４日間隔で与えられ得る。
【００８５】
本発明は、例えば、ＴＧＦ−βアンタゴニストの使用によって、副甲状腺関連障害（例えば、ＨＰＴ−ＪＴ、ＦＩＰＨ、散発性副甲状腺腫瘍、および他の関連悪性腫瘍等）を診断する、それらの症状を改善する、それらから保護する、そしてそれらを処置する方法を提供する。
【００８６】
本明細書中に記載するように、異常なＨＲＰＴ２および／またはパラフィブロミンレベル（例えば、過剰発現およびノックダウン状況の両方において見られる）は、ＴＧＦβ標的遺伝子発現を高めること、ＴＧＦβ刺激上皮間充織分化転換（ＥＭＴ）および生育増殖を高めること、そしてＴＧＦβ ＲＧＡ反応を感作することを含め、ＴＧＦβ経路を活性化することが示されている。従って、ＴＧＦβ経路の活性化により一部特徴付けられる、副甲状腺関連障害といったような障害は、ＴＧＦβ経路を拮抗することにより、治療され、診断され、そして改善され得る。
【００８７】
本発明はまた、例えば、パラフィブロミンおよび／またはＰＡＦ１複合体のモジュレーターの使用によって、ＴＧＦ−β関連障害（例えば、肺高血圧症、癌、高血圧症、線維症、創傷治癒）を診断する、それらの症状を改善する、それらから保護する、そしてそれらを処置する方法も提供する。
【００８８】
パラフィブロミンおよび／またはＰＡＦ１とＳＭＡＤタンパク質との間に形成される複合体を正常化することは、すなわち、ＴＧＦβシグナル伝達経路を安定化することができる。従って、パラフィブロミンおよび／またはＰＡＦ１複合体を調整することは、ＴＧＦβ関連障害（すなわち、異常なＴＧＦβシグナル伝達と関連のあるもの）の処置を生み出すことができる。
【００８９】
本発明はまた、例えば、ＨＲＰＴ２および／またはＰＡＦ１複合体のモジュレーターの使用によって、シグナル伝達ＴＧＦβ経路を調整する方法も提供する。好ましい態様において、その方法は、ＨＲＰＴ２遺伝子またはそのタンパク質産物であるパラフィブロミンを拮抗することによっての、ＴＧＦβ経路の活性化である。
【００９０】
本発明はまた、ＴＧＦ−βおよびその関連タンパク質のアゴニストおよびアンタゴニストを同定して試験する方法、並びにＨＲＰＴ２（またはパラフィブロミン）、ＰＡＦ１、およびそれらの関連タンパク質のアゴニストおよびアンタゴニストを同定して試験する方法も提供する。本発明のタンパク質に関する発見：パラフィブロミンとＳＭＡＤとの間のタンパク質相互作用は、インビトロまたはインビボにおいて、この結合事象（または結果的な複合体形成）を高めるまたは妨げるであろう薬剤を同定するのに、そしてこの結合事象（または結果的な複合体形成）の不存在または存在と関連のある障害を処置するのに使用され得る薬剤を発見するのに有用である。
【００９１】
本発明には、ＰＡＦ１複合体メンバーとＳＭＡＤとの間に形成される複合体を調整する（例えば、妨害する）試験薬剤を同定する方法であって、ａ）ｉ）ＳＭＡＤタンパク質（例えば、ＳＭＡＤ３）に結合することができるＰＡＦ１複合体メンバータンパク質または相同体（例えば、パラフィブロミン）；ii）該ＰＡＦ１複合体メンバーと相互作用することが知られているＳＭＡＤタンパク質または相同体；およびiii）スクリーニングするための１つまたはそれ以上の試験薬剤を与え；ｂ）該ＰＡＦ１複合体メンバータンパク質または相同体、該ＳＭＡＤタンパク質または相同体、および試験すべき１つまたはそれ以上の該薬剤をいずれかの順序で混合し；そしてｃ）試験薬剤の存在下におけるＰＡＦ１複合体メンバータンパク質（または類似体）：ＳＭＡＤ（または類似体）結合の変化を、該薬剤の不存在下における結合と比較して測定する：ことを含んでなる方法が含まれる。その変化は、ＰＡＦ１複合体メンバーとＳＭＡＤとの間に形成される複合体を調整する（例えば、妨害する）試験薬剤の能力を示し、また従って、その試験薬剤は、その複合体に関連した障害における治療的有用性を有し得る。
【００９２】
好ましい態様において、ＰＡＦ１複合体メンバーはパラフィブロミンであって、薬剤を、パラフィブロミンおよびＳＭＡＤタンパク質の結合を特異的に妨害するその能力に関して試験する。
【００９３】
別の好ましい態様において、ＳＭＡＤタンパク質は、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ６、またはＳＭＡＤ７である。
【００９４】
本発明の好ましい態様において、パラフィブロミン、ＳＭＡＤタンパク質、およびＴＧＦβ経路活性化を測定することができるＴＧＦβ基質／レポーター構築物を含んでなる細胞を作成する。ＰＡＦ１複合体メンバーとＳＭＡＤとの間に形成される複合体を調整するのに利用することができる試験薬剤は、ＴＧＦβ経路活性化を引き起こすものとして同定される。
【００９５】
パラフィブロミンおよびＳＭＡＤタンパク質並びにそれらの関連基質／レポーター構築物を発現させるのに有用な細胞には、培養で維持することができ、そして異種核酸を発現するよう操作することができる細胞のいずれかおよび全てが含まれる。その細胞は、初代培養物または樹立細胞株であるのがよい。
【００９６】
適当な転写および翻訳調節配列の制御下での、パラフィブロミン、ＳＭＡＤタンパク質、およびＴＧＦβ基質／レポーター構築核酸は、例えば、形質転換、形質移入、感染、形質導入および注射を含め、当業界で知られている方法により、細胞へと導入され得る。適当なプロモーターの制御下での、パラフィブロミン、ＳＭＡＤタンパク質、およびＴＧＦβ基質／レポーター構築核酸を含む発現ベクターは、既知の方法、例えば、リポソーム媒介形質移入、リン酸カルシウム媒介形質移入、ＤＥＡＥ−デキストラン形質移入、裸のＤＮＡ形質移入、微量注射、電気穿孔法、レトロウイルス媒介感染、アデノウイルス媒介感染、またはアデノ随伴ウイルス媒介感染により細胞へと導入される。レポーター構築核酸は、安定にまたは一時的に細胞へと導入され得る。異種核酸を真核細胞へと導入するための方法は、例えば、ＤＮＡクローニング：A Practical Approach, vols. I-III (1985) Glover編, IRL Press Limited, Oxford、およびSambrookら（1989）分子クローニング：A Laboratory. Manual, 2.sup.nd edition, Cold Spring Harbor, N.Y.を含め、多数の実験マニュアルに記載されている。
【００９７】
好ましい態様において、例えば、Pearら（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8392（参照により本明細書中に組み込まれる）により記載されているように、核酸をレトロウイルスベクターへと挿入する。この態様において、ウイルスＬＴＲプロモーターは、核酸の転写を制御する。Pearら（同上）により記載されているように、そのベクターをレトロウイルスパッケージング株へと一過性に形質移入して、その結果生ずる、核酸を含む組み換えウイルスを回収する。次いで、Hoffmanら（1996）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5185（参照により本明細書中に組み込まれる）に記載されているように、その組み換えウイルスを使用して、細胞を感染させる。それらを、少なくとも１０％のウシ胎仔血清を含む組織培養培地で培養することにより、細胞を未分化状態で維持することができ、またはそれらを、２％ ウマ血清を含む培地で培養することにより、それらを分化させることができる。必要な組織培養方法は、当業者に知られている。
【００９８】
ＰＡＦ１複合体メンバーとＳＭＡＤとの間に形成される複合体を調整する（例えば、妨害する）薬剤の同定方法において、その薬剤は、当業界で知られている方法により、パラフィブロミン、ＳＭＡＤタンパク質、およびＴＧＦβ基質／レポーター構築物を含んでなる細胞と接触させるのがよい。培養中の細胞またはトランスジェニック生物から得られた細胞に関して、その細胞は、例えば、直接適用により、薬剤と接触させるのがよい。その薬剤は、細胞への侵入を促進するよう、修飾されるか、または送達ビヒクルに含まれ得る。その薬剤は、単離されて精製され得るか、または本発明の方法における陽性結果の後でさらなる単離および精製にかけるべき試料もしくは組成物中に存在し得る。例えば、その薬剤は、細胞溶解物、条件細胞培養培地、または合成もしくは天然由来化合物のライブラリーに含まれ得る。トランスジェニック生物に存在する細胞に関して、その細胞は、当業界で知られている方法によって、例えば、摂取、非経口投与、または組織表面への直接適用によって薬剤を送達することにより、薬剤と接触させるのがよく、そして担体または希釈剤を含んでなる組成物中に存在し得る。本発明の方法で試験することができる薬剤には、例えば、タンパク質、ペプチド、脂質、炭水化物、アンチセンスが含まれる核酸、金属、塩等といったような、有機および無機分子が含まれる。
【００９９】
さらに別の好ましい態様において、ＴＧＦβ経路の成分は、インビトロにおけるアッセイで発現されることから、薬剤を検査して、インビトロにおいてＴＧＦβを活性化するそれらの能力を測定することができる。これらのタンパク質に特異的な抗体を使用して、活性化ＴＧＦβ基質の存在もまた評価することができる。
【０１００】
本発明には、副甲状腺関連障害の処置に有用な化合物をスクリーニングするための方法であって、パラフィブロミンを発現する細胞およびＳＭＡＤタンパク質を化合物と接触させて、ＳＭＡＤタンパク質活性および／またはＴＧＦβ経路活性における変化を検出することを含んでなる方法が含まれる。
【０１０１】
本発明には、ＴＧＦβ関連障害の処置に有用な化合物をスクリーニングするための方法であって、パラフィブロミンを発現する細胞およびＳＭＡＤタンパク質を化合物と接触させて、ＳＭＡＤタンパク質活性および／またはＴＧＦβ経路活性における変化を検出することを含んでなる方法が含まれる。
【０１０２】
ＳＭＡＤタンパク質活性および／またはＴＧＦβ経路活性におけるこの変化は、ＰＣＲ、タックマンＰＣＲ、ファージディスプレイシステム、ゲル電気泳動、酵母ツーハイブリッドシステム、ノーザンまたはウエスタン分析、免疫組織化学的検査、従来のシンチレーションカメラ、ガンマカメラ、直線スキャナー、ＰＥＴスキャナー、ＳＰＥＣＴスキャナー、ＭＲＩスキャナー、ＮＭＲスキャナー、またはＸ線装置により測定され得る。ＳＭＡＤタンパク質活性および／またはＴＧＦβ経路活性タンパク質における変化は、パラフィブロミン（またはＰＡＦ１複合体におけるタンパク質）とＳＭＡＤタンパク質との間の相互作用における変化を検出することにより、パラフィブロミンレベルにおける変化を検出することにより、またはＴＧＦβ経路における１つもしくはそれ以上のタンパク質レベルにおける変化を検出することにより検出され得る。そのような細胞は、骨格筋由来のものであるのがよく、培養細胞であるのがよく、またはトランスジェニック生物から得るのがよいか、もしくはトランスジェニック生物内であるのがよい。そのようなトランスジェニック生物には、限定されるものではないが、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシまたは霊長類が含まれる。
【０１０３】
本発明は、パラフィブロミン、ＰＡＦ１、ＴＧＦβ、もしくはＳＭＡＤポリペプチドの天然配列、または記載したいずれかのポリペプチドの天然配列に限定されるものではない。部分またはフラグメントを使用する場合でも、これらの部分またはフラグメントは、アミノ酸配列の変化を有し得る。例えば、ＨＰＴ−ＪＴがＨＲＰＴ２遺伝子の突然変異により引き起こされるなら、本発明の方法は、ＨＰＴ−ＪＴに罹患している患者で使用する場合、突然変異型のＨＲＰＴ２（例えば、タンパク質パラフィブロミンの切断型を結果的に生ずる）、およびその結合複合体に関するであろう。本発明はまた、タンパク質：ＨＲＰＴ２またはＳＭＡＤ類似体を含んでなるタンパク質複合体も意図する。
【０１０４】
上記方法の一態様において、ＨＲＰＴ２ポリペプチドまたは類似体を標識化する。別の態様において、ＳＭＡＤポリペプチドまたは類似体を標識化する。
【０１０５】
スクリーニングアッセイ
【０１０６】
本発明は、パラフィブロミンもしくはＳＭＡＤタンパク質に、または関連複合体（例えば、ＰＡＦ１複合体）のタンパク質メンバーに結合して、例えば、ＨＲＰＴ２（またはパラフィブロミン）発現もしくは活性、またはＴＧＦβシグナル伝達に対して刺激または阻害効果を有する、モジュレーター、すなわち、候補もしくは試験化合物または薬剤（例えば、ペプチド、ペプチド模倣薬、小分子または他の薬物）を同定するための方法（本明細書中ではまた“スクリーニングアッセイ”とも呼ぶ）を提供する。
【０１０７】
本発明には、化合物をスクリーニングするための方法であって、ａ）ｉ）ＳＭＡＤタンパク質（例えば、ＳＭＡＤ３）に結合することができるＰＡＦ１複合体メンバータンパク質または相同体（例えば、パラフィブロミン）；ii）該ＰＡＦ１複合体メンバーと相互作用することが知られているＳＭＡＤタンパク質または相同体；およびiii）スクリーニングするための１つまたはそれ以上の試験化合物を与え；ｂ）該ＰＡＦ１複合体メンバータンパク質または相同体、該ＳＭＡＤタンパク質または相同体、および試験すべき１つまたはそれ以上の該化合物をいずれかの順序で混合し；そしてｃ）試験化合物の存在下におけるＰＡＦ１複合体メンバータンパク質（または類似体）：ＳＭＡＤ（または類似体）結合の変化を、該化合物の不存在下における結合と比較して測定する：ことを含んでなる方法が含まれる。
【０１０８】
一態様において、本発明は、パラフィブロミンタンパク質もしくはポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分を結合する、候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。別の態様において、本発明は、パラフィブロミンタンパク質もしくはポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分に結合する、またはその活性を調整する、例えば、通常、複合体において見い出される他のタンパク質（例えば、ＰＤ２、パラフィブロミン、ＬＯＣ１２３１６９、およびＳＨ２ＢＰ１）とのＰＡＦ１複合体を形成するパラフィブロミンの能力を調整する；および／またはパラフィブロミンの腫瘍抑制活性を調整する、候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。
【０１０９】
別の態様において、本発明は、ＳＭＡＤ（例えば、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ６、またはＳＭＡＤ７）タンパク質もしくはポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分を結合する、候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。別の態様において、本発明は、ＳＭＡＤタンパク質もしくはポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分に結合する、またはその活性を調整する、例えば、ＴＧＦβを阻害する、および／またはＲ−ＳＭＡＤと結合するＳＭＡＤ６の能力を調整する、候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。
【０１１０】
本発明の試験化合物は、生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な平行固相または溶液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法；“１ビーズ・１化合物(one-bead one-compound)”ライブラリー法；および親和性クロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法を含め、当業界で知られている組み合わせライブラリー法における多数の方法のいずれかを使用して得ることができる。生物学的ライブラリー法は、ペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つの方法は、ペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の小分子ライブラリーに適用可能である（Lamら（1997）Anticancer Drug Des. 12: 145）。
【０１１１】
分子ライブラリーの合成方法の例は、当業界において、例えば、DeWittら（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909；Erbら（1994）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422；Zuckermannら（1994）J. Med. Chem. 37: 2678；Choら（1993）Science 261: 1303；Carrellら（1994）Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059；Carellら（1994）Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061；において、またGallopら（1994）J. Med. Chem. 37: 1233において見い出され得る。
【０１１２】
化合物のライブラリーは、溶液（例えば、Houghten (1992) Biotechniques 13: 412）中に、またはビーズ（Lam (1991) Nature 354: 82）、チップ（Fodor (1993) Nature 364: 555）、細菌（Ladner，米国特許第５,２２３,４０９号）、胞子（Ladner ‘409）、プラスミド（Cullら（1992）Proc Natl Acad Sci USA 89: 1865）上に、またはファージ（ScottおよびSmith（1990）Science 249: 386）；（Devlin (1990) Science 249: 404）；（Cwirlaら（1990）Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 6378）；（Felici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301）；（Ladner, 上記）上に存在し得る。
【０１１３】
一態様において、アッセイは、細胞発現ＨＲＰＴ２（またはパラフィブロミン）を、試験化合物、例えば、試験ＴＧＦ−βアンタゴニストと接触させて、ＨＲＰＴ２の活性を調整する（例えば、刺激するまたは阻害する）試験化合物の能力を測定することを含んでなる、細胞ベースのアッセイである。ＨＲＰＴ２の活性を調整する試験化合物の能力を測定することは、例えば、ＨＲＰＴ２に結合するＴＧＦ−βアンタゴニストの能力を測定することにより、またはＰＡＦ１複合体形成を妨害するＴＧＦ−βアンタゴニストの能力を測定することにより達成され得る。
【０１１４】
別の態様において、アッセイは、ＳＭＡＤタンパク質を発現する細胞を試験化合物と接触させて、ＳＭＡＤタンパク質の活性を調整する（例えば、刺激するまたは阻害する）試験化合物の能力を測定することを含んでなる、細胞ベースのアッセイである。ＳＭＡＤタンパク質の活性を調整する試験化合物の能力を測定することは、例えば、パラフィブロミンに結合するＳＭＡＤタンパク質（例えば、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ６、またはＳＭＡＤ７）の能力を測定することにより、またはＳＭＡＤ複合体形成を妨害する試験化合物の能力を測定することにより達成され得る。
【０１１５】
ＨＲＰＴ２タンパク質を調整する試験ＴＧＦ−βアンタゴニストの能力、またはＳＭＡＤタンパク質を調整する試験化合物の能力を測定することは、直接結合を測定することにより達成され得る。これらの測定は、例えば、試験化合物（例えば、ＴＧＦβアンタゴニスト）へのタンパク質の結合が、複合体における標識化タンパク質を検出することにより測定され得るよう、ＨＲＰＴ２またはＳＭＡＤタンパク質を放射性同位体または酵素標識と結合させることにより達成され得る。例えば、分子、例えば、タンパク質は、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈで、直接的または間接的のいずれかに標識化することができ、またその放射性同位体は、電波放射の直接計数により、またはシンチレーション計数により検出され得る。あるいはまた、分子は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的に標識化することができ、またその酵素標識は、適当な基質の産物への転換の測定により検出され得る。
【０１１６】
反応体のいずれかの標識化なしに、パラフィブロミンタンパク質（またはＰＡＦ１複合体のタンパク質メンバー）を調整する試験ＴＧＦ−βアンタゴニストの能力を測定すること、またはＳＭＡＤタンパク質を調整する試験化合物の能力を測定することもまた、本発明の範囲内である。例えば、マイクロフィジオメーター(microphysiometer)を使用して、パラフィブロミンまたは試験ＴＧＦ−βアンタゴニストの標識化なしに、試験ＴＧＦ−βアンタゴニストのパラフィブロミンとの（またはＰＡＦ１複合体のタンパク質メンバーとの）相互作用を検出することができる（McConnellら（1992）Science 257: 1906）。同様に、同じ装置を使用して、ＳＭＡＤまたは試験化合物の標識化なしに、試験化合物のＳＭＡＤタンパク質との相互作用を検出することができる。本明細書中で使用する場合、“マイクロフィジオメーター”（例えば、サイトセンサー(Cytosensor)）は、光アドレス可能な電位差測定センサー(light-addressable potentiometric sensor)（ＬＡＰＳ）を使用して、細胞がその環境を酸性化する速度を測定する分析機器である。この酸性化速度における変化は、化合物と受容体との間の相互作用の指標として使用され得る。
【０１１７】
さらに別の態様において、本発明のアッセイは、タンパク質またはその生物学的に活性な部分を、試験化合物（例えば、試験ＴＧＦβアンタゴニスト）、またはＳＭＡＤタンパク質（また従って、ＴＧＦβシグナル伝達）を調整するその能力に関して試験する化合物と接触させる、無細胞アッセイであって、パラフィブロミンタンパク質、もしくはＳＭＡＤタンパク質、またはその生物学的に活性な部分に結合する試験化合物の能力を測定する。上記のように、パラフィブロミンタンパク質またはＳＭＡＤタンパク質への試験化合物の結合は、直接的または間接的のいずれかに測定され得る。好ましい態様において、そのアッセイには、パラフィブロミンタンパク質またはその生物学的に活性な部分を、パラフィブロミンを結合することが知られている化合物と接触させて、アッセイ混合物を形成すること、そのアッセイ混合物を試験化合物と接触させること、そしてパラフィブロミンタンパク質と相互作用する試験化合物の能力を測定することが含まれ、ここで、パラフィブロミンタンパク質と相互作用する試験化合物の能力を測定することは、既知の化合物と比較して、パラフィブロミンまたはその生物学的に活性な部分へ優先的に結合する試験化合物の能力を測定することを含んでなる。
【０１１８】
別の好ましい態様において、そのアッセイには、ＳＭＡＤタンパク質（例えば、ＳＭＡＤ６）またはその生物学的に活性な部分を、ＳＭＡＤを結合することが知られている化合物と接触させて、アッセイ混合物を形成すること、そのアッセイ混合物を試験化合物と接触させること、そしてＳＭＡＤタンパク質と相互作用する試験化合物の能力を測定することが含まれ、ここで、ＳＭＡＤタンパク質と相互作用する試験化合物の能力を測定することは、既知の化合物と比較して、ＳＭＡＤまたはその生物学的に活性な部分へ優先的に結合する試験化合物の能力を測定することを含んでなる。
【０１１９】
そのような測定は、実時間生体分子相互作用分析（ＢＩＡ）といったような技術を使用して達成され得る。Sjolanderら，1991 Anal. Chem. 63:2338-2345およびSzaboら，1995 Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705。本明細書中で使用する場合、“ＢＩＡ”は、反応体のいずれか（例えば、ＢＩＡコア）を標識化することなく、実時間での生体特異的相互作用を研究するための技術である。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象における変化は、生体分子間の実時間反応の指標として使用され得る。
【０１２０】
本発明の上記アッセイ方法の１つ以上の態様において、パラフィブロミンまたはＳＭＡＤを固定化して、非複合型のタンパク質からの複合型の分離を促進し、さらにはまた、そのアッセイの自動化を提供するのが望ましいであろう。パラフィブロミンまたはＳＭＡＤへの試験化合物の結合は、反応物を含むのに適当ないずれかの容器中で達成され得る。そのような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、および微小遠心管が含まれる。一態様において、タンパク質をマトリックスへ結合させるのを可能とするドメインを加える融合タンパク質が提供され得る。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／キナーゼ融合タンパク質またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ（Sigma Chemical, St. Louis, Mo.）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着させ得た後、これを試験化合物または試験化合物および非吸着パラフィブロミンまたはＳＭＡＤタンパク質と合わせて、その混合物を複合体形成を促す条件下に（例えば、塩およびpＨに関する生理学的条件で）インキュベートすることができる。インキュベーション後、例えば、上記のように、そのビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、非結合成分、ビーズの場合には固定化されたマトリックス、直接的または間接的のいずれかに測定される複合体をいずれも除去する。あるいはまた、その複合体をマトリックスから解離して、標準的な技術を使用して、結合レベルを測定することができる。
【０１２１】
タンパク質をマトリックス上に固定化するための他の技術はまた、本発明のスクリーニングアッセイにおいても使用され得る。例えば、ビオチンおよびストレプトアビジンの結合を利用して、パラフィブロミンまたはＳＭＡＤを固定化することができる。当業界で十分知られている技術（例えば、ビオチン化キット，Pierce Chemicals, Rockford, Ill.）を使用して、ビオチン化パラフィブロミンもしくはＳＭＡＤタンパク質または標的分子をビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から製造して、ストレプトアビジンで被覆した９６ウェルのプレート（Pierce Chemical）のウェルに固定化することができる。あるいはまた、そのプレートのウェルにパラフィブロミンもしくはＳＭＡＤタンパク質または標的分子と反応する抗体を誘導体化して、非結合パラフィブロミンまたはＳＭＡＤタンパク質を抗体結合によりウェルの中に閉じ込めることができる。そのような複合体を検出するための方法には、ＧＳＴ固定化複合体に関して上記したものに加えて、パラフィブロミンもしくはＳＭＡＤタンパク質または標的分子と反応する抗体を使用しての複合体の免疫検出が含まれる。
【０１２２】
本発明のさらに別の態様において、パラフィブロミンまたはＳＭＡＤタンパク質をツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイにおける“ベイトタンパク質”として使用して（例えば、米国特許第５,２８３,３１７号；Zervosら，1993 Cell 72:223-232; Maduraら，1993 J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartelら，1993 Biotechniques 14:920-924; Iwabuchiら，1993 Oncogene 8:1693-1696;およびBrent ＷＯ９４／１０３００を参照されたい）、パラフィブロミンまたはＳＭＡＤに結合する他のタンパク質を同定することができる。そのようなパラフィブロミンまたはＳＭＡＤ結合タンパク質はまた、パラフィブロミンまたはＳＭＡＤタンパク質によるシグナル伝搬にも関与するらしい。
【０１２３】
ツーハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合および活性化ドメインからなるほとんどの転写因子のモジュール性質に基づく。簡単に言えば、そのアッセイは、２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。ある構築物において、パラフィブロミンまたはＳＭＡＤタンパク質をコードする遺伝子は、既知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子と融合する。他の構築物において、未同定タンパク質（“プレイ”または“試料”）をコードするＤＮＡ配列のライブラリー由来のＤＮＡ配列は、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子と融合する。もし“ベイト”および“プレイ”タンパク質がインビボにおいて相互作用して、キナーゼ依存複合体を形成することができるのなら、転写因子のＤＮＡ結合および活性化ドメインを密接させる。この近接は、転写因子に反応して転写調節部位へ操作的に結合するレポーター遺伝子（例えば、ＬacＺ）の転写を可能とする。レポーター遺伝子の発現を検出することができ、また機能転写因子を含む細胞コロニーを単離して、パラフィブロミンまたはＳＭＡＤタンパク質をコードするクローン化遺伝子を得るために使用することができ、これがタンパク質と相互作用する。
【０１２４】
本発明はさらに、上記スクリーニングアッセイにより同定される新規薬剤に関する。従って、本明細書中に記載するようにして同定した薬剤を適当な動物モデルにおいてさらに使用することは本発明の範囲内である。例えば、本明細書中に記載するようにして同定した薬剤（例えば、ＨＲＰＴ２またはＳＭＡＤ調整剤）を動物モデルにおいて使用して、そのような薬剤での処置の有効性、毒性、または副作用を判定することができる。あるいはまた、本明細書中に記載するようにして同定した薬剤を動物モデルにおいて使用して、そのような薬剤の作用機序を決定することができる。さらにまた、本発明は、本明細書中に記載するような処置のための、上記スクリーニングアッセイにより同定した新規薬剤の使用に関する。
【０１２５】
次の実施例は、単に説明するものであって、本発明の請求の範囲を何ら限定しようと意図するものではない。
【実施例１】
【０１２６】
実施例
実施例１：ＴＧＦβとパラフィブロミン／ＰＡＦ１との間の関連性
【０１２７】
ＴＧＦβ経路の新規モジュレーターを同定するために、我々は、系統的タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）法をＴＧＦβ経路の幾つかの既知のシグナル伝達分子（ベイトタンパク質として、ＳＭＡＤ１、２、３、４、５、６、７、および８；ＡＬＫ３、５、および６；ＴＧＦβＲII；ＢＭＰＲII；Ｓmurf１、２；並びにＴＡＫ１を使用することが含まれる）に適用した。Rigautら（Nat Biotechnol. (1999) 17(10): 1030）（この内容は、参照により本明細書中に組み込まれる）に記載されているように、ＴＡＰ精製法は、興味深い標的タンパク質とのＴＡＰタグの融合、および同族宿主細胞または生物への構築物の導入を伴う。
【０１２８】
ＴＡＰタグは、（ｉ）黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡのＩgＧ結合単位（ＰrotＡ）；および（ii）ＴＥＶプロテアーゼ切断部位により分離されるカルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）のタンデム融合である。それは、複合体組成物、活性、または機能の予備知識なしに、比較的少数の細胞からの複合体の急速精製を可能とする。質量分析と組み合わせて、ＴＡＰ法は、与えられた標的タンパク質と相互作用するタンパク質の同定を可能とする。
【０１２９】
タンデムアフィニティー精製および質量分析
【０１３０】
レトロウイルス形質導入ベクターは、オープンリーディングフレームをクローン化することにより作成され、Gatewayの部位特異的組み換えシステム（Life Technologies）を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応により、モロニーをベースとするベクターへと増幅させた。ウイルスストックは、ＨＥＫ２９３ Ｇag−Ｐolパッケージング細胞系列において作成された。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を感染させて、修正ＴＡＰプロトコル１を使用することにより、複合体を精製し、これを一過性に形質移入した。ＴＡＰタグを付けたタンパク質全ての適正な局在化を間接免疫蛍光法によりモニターした。細胞を、１０％ ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地において培養した。刺激のために、その培地を、２ng／ml ＴＧＦβ１もしくは５０ng／ml ＢＭＰ２を含む新鮮培地、または新鮮培地単独のいずれかと交換した。細胞を、ＳＭＡＤ３に関しては２時間、ＳＭＡＤ６およびＳＭＡＤ７に関しては４時間刺激した。細胞を機械的分離により回収し、氷上にて過剰のＰＢＳで洗浄して、免疫沈降緩衝液中に溶解させた。Shevchenko（Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O. & Mann， M． Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal． Chem． 68， 850‐858 (1996)）に記載されているように、タンパク質試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、完全ゲルレーンを系統的にスライスして、タンパク質を、トリプシンを含むゲル中で消化させた。タンパク質同定をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより行って、ＭＳデータを社内監督版の国際タンパク質インデックス（ＩＰＩ）に対して検索し、ＥＢＩ（Hinxton, UK）で保持した。さらなる生物情報学分析のために、データベース検索の結果をデータベースシステムに読み込んだ。
【０１３１】
データ分析
【０１３２】
ある一定の実験セットにおける発見の統計的有意性を反映するデータベースにより、有意性スコアが各々の候補同定に与えられる。その有意性スコアは、特異性、再現性および同定（例えば、質量分析計による同定）の質に重みを加える。有意な候補は、リストから選択され、またネットワークグラフにおいて別々に表される。
【０１３３】
ＰＡＦ１複合体の４つのメンバー、ＨＲＰＴ２、ＰＤ２、ＬＯＣ１２３１６９およびＳＨ２ＢＰ１は全て、ＳＭＡＤ３およびＳＭＡＤ６またはＳＭＡＤ７と独占的に結合することが見い出された。図１Ａおよび１Ｂにおいて見られるように、免疫−共沈（Ｃo−ＩＰ）による確認は、ＨＲＰＴ２がＳＭＡＤ６と特異的に相互作用する一方で、ヒトＨＰＴ−ＪＴ患者において見い出される３つのＨＲＰＴ２突然変異体は相互作用しないことを示し、この特異的なＨＲＰＴ２とＳＭＡＤ６との相互作用は、ＨＰＴ−ＪＴの病因において重要であり得ることを提唱する。
【０１３４】
図４は、ＰＡＦ１：ＳＭＡＤ相互作用の特異性および有意性を実証する。哺乳類ＰＡＦ１複合体の成分は、着色された四角により同定される。Ｙ軸は、一定のタンパク質と同時精製するエントリーポイント数を示す。ＳＭＡＤ３、６および７は、ＰＡＦ１複合体と相互作用するエントリーポイントのみ（３３５のエントリーポイントの中で）である（Ｙ軸上の低いところ）。１つの他のエントリーポイントのみが、ＰＡＦ１複合体の１つの成分と再現可能な方法で相互作用することを示している。Ｘ軸は、有意性スコアを表す。右の一番端にくるそれらの相互作用物質がより有意である。ＳＭＡＤ３およびＳＭＡＤ７は両方とも、同時精製するほとんどのタンパク質に比べて高度の有意性を実証する。
【実施例２】
【０１３５】
実施例２：ＨＲＰＴ２発現とＴＧＦβ活性化との間の相互関係
【０１３６】
図２において見られるように、ＨＲＰＴ２ cＤＮＡの過剰発現は、ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいてＴＧＦβ経路の活性化をもたらし、また一方で、ＨＲＰＴ２突然変異体の過剰発現は、何の効果も有していない。加えて、siＲＮＡでのＨＲＰＴ２発現のノックダウンもまた、ＴＧＦβシグナル伝達の増大をもたらす（図３Ａおよび３Ｂ）。ＨＲＰＴ２ヘテロ接合性の喪失は、ノックダウンＨＲＰＴ２発現と同じ効果、すなわち、ＴＧＦβシグナル伝達活性化の向上を有することが期待される。ＴＧＦβシグナル伝達活性化の向上は、上皮間充織分化転換（ＥＭＴ）、細胞増殖、そして最終的には、腫瘍形成をもたらす。
【０１３７】
全長のＨＲＰＴ２またはＨＲＰＴ２突然変異体をコードするcＤＮＡを発現ベクターpcＤＮＡ３.１へとクローン化した。その結果得られる発現構築物をＴＧＦb反応性ホタルルシフェラーゼレポーターおよびＳＶ４０プロモーター駆動ウミシイタケ(renella)ルシフェラーゼプラスミドpＣＡＧＡ−Ｌucと共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞へ同時形質移入した。形質移入から３６時間後、細胞をＴＧＦb（２ng／ml）で１８−２４時間刺激した。製造業者のプロトコルに従い、プロメガ(Promega) Dual-Glo Kitを使用して、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。形質移入効率対照としてウミシイタケルシフェラーゼ活性を使用して、ホタルルシフェラーゼ活性を正規化した。
【０１３８】
１０％ ＦＢＳ中のミルス(Mirus) TransIT-LT1 TKO試薬（カタログ番号 ＭＩＲ ２３００）を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞を市販の５０nＭ siＲＮＡ二本鎖（Dharmacon HRPT2 SMARTpool試薬（カタログ番号 ０１５１８４）で形質移入した。形質移入から２４時間後、次いで、ロシュ(Roche) FuGENE 6 形質移入試薬（カタログ番号 １ ８１５ ０９１）を使用して、細胞をＣＡＧＡ１２−Ｌuc.プロモーターレポーターおよびＳＶ４０−Ｌuc.ウミシイタケ対照で形質移入した。プラスミド形質移入から２４時間後、細胞をＴＧＦbで刺激した。プロメガ Dual-Glo Kit（カタログ番号 Ｅ２９８０）を使用して、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【実施例３】
【０１３９】
実施例３：ＴＧＦβ調節細胞活性におけるＨＲＰＴ２の特性決定
【０１４０】
次のアッセイを使用して、ＴＧＦβ活性を調節するＨＲＰＴ２／ＰＡＦ１複合体の能力をさらに確認する。
【０１４１】
次のように、内因性標的遺伝子発現は、ＰＡＩ−１、ＳnoＮ、Ｐ２１、ＳＭＡＤ６およびＳＭＡＤ７といったような、ＴＧＦ−β経路メンバーに対する定量的ＰＣＲの使用によって行われ得る：ＴＧＦbを十分裏付けして、上記のものが含まれる多くの標的遺伝子の転写を刺激する。ＨＲＰＴ２遺伝子発現は、ＨaＣaＴ細胞におけるsiＲＮＡによりノックダウンされ得て、これらの遺伝子のＴＧＦb刺激転写に対するノックダウン効果は、定量的ＰＣＲにより測定され得る。
【０１４２】
ホスホ−ＳＭＡＤ２／３アッセイの実行によって、ＴＧＦβ刺激は、ＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３の急速なリン酸化を１０−６０分でもたらすべきである。このアッセイは、ＴＧＦβ刺激p−ＳＭＡＤ２／３動態を高めるＨＲＰＴ２の能力を実証し、また上記のように、蛍光体−ＳＭＡＤアッセイを使用して、ＨＲＰＴ２ siＲＮＡノックダウン効果を評価することができる。
【０１４３】
これらのアッセイの表現型反応は、癌の阻害と直接関連がある。ＴＧＦβ誘発性増殖停止、アポトーシス、およびＥＭＴに対する、ＨaＣaＴ細胞におけるＨＲＰＴ２のsiＲＮＡノックダウン効果は、上記と同じアッセイシステムで測定され得る。
【実施例４】
【０１４４】
実施例４：ＰＡＦ１複合体とＳＭＡＤとの間の相互作用の細胞確認
【０１４５】
ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）アッセイ：ＰＡＦ１複合体は、ヒストンメチルトランスフェラーゼ複合体と関連することが示されている。抗ＳＭＡＤ６またはＳＭＡＤ７抗体を使用して、各々、ＳＭＡＤ６またはＳＭＡＤ７を免疫沈降させ、またアップステート(Upstate)製のキット（カタログ番号 １７−３３０）を使用して、その免疫沈降物をＨＭＴ活性に関してアッセイすることができる。
【０１４６】
クロマチン免疫沈降（ＣhＩＰ）アッセイ：Strahl-Bolsingerら（Genes Dev. (1997) 11: 83-93）（この内容は、参照により本明細書中に組み込まれる）においてより詳しく記載されているように、抗ＨＲＰＴ２抗体をＣhＩＰに使用して、ＣＡＧＡ−Ｌucレポーターおよび／またはＰＡＩ、ＳＭＡＤ７、およびＳnoＮプロモーターがＨＲＰＴ２／ＰＡＦ１複合体により占拠されるかどうかを調べることができる。
【実施例５】
【０１４７】
実施例５：ＴＧＦβシグナル伝達および副甲状腺癌の病理学的分析
【０１４８】
ＳＭＡＤ２またはＳＭＡＤ３リン酸化レベルに関して、またＴＧＦβ標的遺伝子（例えば、ＰＡＩ−１、ＳＭＡＤ７およびＳnoＮ）発現レベルに関して、健常者および副甲状腺腫瘍を患う被験者の両方から得た組織試料を試験することができる。
【０１４９】
その組織試料に対して移植片培養を行った後、正常と罹患との間での比較のために、すなわち、（蛍光体−ＳＭＡＤ２アッセイ、ＰＡＩ−１、ＳnoＮおよびＳＭＡＤ７でのqＰＣＲアッセイ、並びに増殖／アポトーシスアッセイを使用して）正常試料と比較して副甲状腺腫瘍試料におけるＴＧＦβ反応の上昇が起こるかどうかを確かめるために、これをＴＧＦβで刺激する。ＴＧＦβ反応の上昇効果を逆転させるＴＧＦβ受容体Ｉキナーゼ阻害剤の能力は、副甲状腺腫瘍の処置におけるＴＧＦβアンタゴニストの有用性の特許請求を支持する。
【実施例６】
【０１５０】
実施例６：ＨＲＰＴ２ノックダウンがＴＧＦβ誘発性上皮間充織分化転換（ＥＭＴ）に対してＮＭuＭＧ細胞を感作する
【０１５１】
上皮間充織分化転換（ＥＭＴ）は、発達段階の間に現存する基本的機構である。成人健常者において、ＥＭＴは、組織／細胞傷害に対する適当な再生のための生理学的反応であり；調節し損ねた場合、それは、線維症および腫瘍形成といったような疾患をもたらし得る。この細胞形質転換は、細胞接着および頂底極性の喪失、続いて、間葉表現型に対する細胞骨格動態での変化を伴う。その表現型の変化はまた、アクチンストレス線維の形成、並びに細胞間結合でのＥ−カドヘリンの非局在化および下方調節も伴う。乳腺上皮由来細胞株であるＮＭuＭＧ細胞は、ＴＧＦβに反応してＥＭＴを反映する、典型的で明らかな表現型の変化を示す。
【０１５２】
ＮＭuＭＧ細胞を、２つの個々のＨＲＰＴ２ siＲＮＡ二本鎖、さらにはまた、対照として非特異的なsiＲＮＡで処理した。形質移入から２日後、細胞を種々の用量のＴＧＦβで２４時間処理した後、固定して、アクチンおよびＥ−カドヘリンを染色した。図５は、ＨＲＰＴ２ノックダウンがＴＧＦ−β誘発性浸潤および移動に対して細胞を感作することを示す位相差像である。
【０１５３】
ＴＧＦ−βの不存在下、ＮＭuＭＧ細胞は、典型的な上皮細胞表現型を示した。ＴＧＦβ処置から２４時間後、この規則的な敷石様パターンは、紡錘状線維芽細胞様パターンとなった。非特異的なsiＲＮＡで処理した対照細胞株において、細胞は２ng／mlのＴＧＦβで表現型的(phonotypical)変化を受けたが、ＨＲＰＴ２をノックダウンした細胞において、その細胞は、非常に低用量の約０.７５ng／mlのＴＧＦβで表現型の変化を実証した。
【０１５４】
図６および７は、各々、アクチンおよびＥ−カドヘリン染色を示す。ＴＧＦβで処理した細胞において、アクチンストレス線維の形成、並びに細胞間結合でのＥ−カドヘリンの非局在化および下方調節が観察された。図５と同様に、ＨＲＰＴ２ノックダウンにさらした細胞は、非常に低用量のＴＧＦβに反応して表現型の変化を示した。
【０１５５】
これらの細胞におけるＥ−カドヘリンの発現レベルは、ウエスタンブロットにより検出された。図８は、これらの細胞における２４時間および４２時間でのＥ−カドヘリンの発現レベルを示す。期待されるように、ＨＲＰＴ２をノックダウンした細胞におけるＥ−カドヘリン発現は、対照細胞と両方の時点で比較して、より低いＴＧＦβ刺激に反応して減少し、本明細書中に記載する表現型の変化と一致した。これらのデータは、ノックダウンＨＲＰＴ２がＴＧＦβ誘発性ＥＭＴに対してＮＭuＭＧ細胞を感作したことを示す。ＥＭＴが主要な腫瘍形成機構の１つであるとすれば、ＨＲＰＴ２は、Ｓmad３と相互作用することにより、その腫瘍抑制機能を発揮して、ＴＧＦβ誘発性ＥＭＴを阻害すると考えられる。
【実施例７】
【０１５６】
実施例７：ＨＲＰＴ２ノックダウンがＴＧＦβ誘発性浸潤および移動に対してＮＭuＭＧ細胞を感作する
【０１５７】
細胞がＥＭＴを受けた後の１つの重要な段階は、細胞を発達させて新たな位置へと移動させて分化させるための、または腫瘍細胞がより栄養のある環境へ移転するためのいずれかの、移動および浸潤の増大である。上記のように、ノックダウンＨＲＰＴ２は、ＴＧＦβ誘発性ＥＭＴに対してＮＭuＭＧ細胞を感作する。多くの上皮癌において浸潤性の表現型を誘発するというＴＧＦβの推定される役割から考えて、ノックダウンＨＲＰＴ２を、ＴＧＦβにより誘発されるような細胞浸潤に対するその効果に関して研究した。
【０１５８】
先に記載したように、ＮＭuＭＧ細胞をＨＲＰＴ２ siＲＮＡおよび対照siＲＮＡで形質移入した後、その細胞を三次元マトリゲルチャンバーウェルへと分配して、ＴＧＦβの存在下または不存在下に培養した。処置から１日後、ゲルによって成長した細胞を染色して、計数した；各々の試料に関して複数のウェルを計数して、平均数を計算した。
【０１５９】
図９が示すように、ＴＧＦβにより誘発される浸潤は、ＨＲＰＴ２を２つの独立したsiＲＮＡ二本鎖によりノックダウンした細胞において約３−６倍まで増大した。図１０Ａは、試料の蛍光顕微鏡写真を示す。このデータは、ノックダウンＨＲＰＴ２がまたＴＧＦβ誘発性浸潤に対してもＮＭuＭＧ細胞を感作することを示す。
【０１６０】
悪性および高度移動性ヒト乳癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞での移動に対するＨＲＰＴ２ノックダウン効果もまた試験した。図５において同様に示すように、ノックダウンＨＲＰＴ２は、ＴＧＦβに反応してＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞の移動を増大させる（図１０Ｂを参照されたい）。まとめると、ＴＧＦβ誘発性浸潤および移動に対するＮＭuＭＧ細胞およびＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞の両方の感作は、ノックダウンＨＲＰＴ２により生ずる場合、ＨＲＰＴ２機能の喪失が、腫瘍形成（例えば、細胞を移動させて、細胞間マトリックスを通して浸潤することによる）、また従って、生存に寄与することを示す。
【０１６１】
これらの実験は、ＴＧＦβの発癌促進効果を一部阻害することによる腫瘍抑制物質としてのＨＲＰＴの機能を支持する。ＨＲＰＴ２の突然変異は、ＴＧＦβ誘発性ＥＭＴ、移動、浸潤に対して細胞を感作し、そして最終的には、癌をもたらし得る。
【０１６２】
本発明は、本明細書中に記載する具体的な態様による範囲に限定されるものではない。実際、前述の説明および添付図から、本明細書中に記載するものに加えて、本発明の種々の変更が当業者に明らかとなるであろう。そのような変更は、付記する特許請求の範囲内であることを意図する。
【０１６３】
種々の出版物を本明細書中に引用し、これらの開示は、参照によりその全体を本明細書の一部とする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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