(57)【要約】  本発明は、凝固経路の第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の構造および機能の特性化、ＦＶＩＩＩインヒビターの根絶の治療ストラテジーの設計、および医薬としての使用に特に適した新規な抗体ならびにその断片および誘導体に関する。本発明はまた、該特異的抗体を産生する細胞株に関する。さらにまた、本発明は、本発明の抗体、断片および／または誘導体を含む医薬組成物、ならびに該抗体もしくはその断片および誘導体またはその医薬組成物を用いることによる心血管障害の予防および処置方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＶＩＩＩのＡ２ドメインに特異的に結合する、ＩｇＧアイソタイプのヒトモノクローナル抗体。
【請求項２】
ＦＶＩＩＩの凝固促進活性を阻害する、請求項１に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項３】
抗体の可変領域の重鎖がそのＣＤＲ内に配列番号５〜７に対応する配列を含み、軽鎖可変領域がそのＣＤＲ内に配列番号８〜１０の配列を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項４】
抗体の可変領域の重鎖が配列番号２の配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号４の配列を含むことを特徴とする、請求項１〜３いずれか１項に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項５】
ＢＣＣＭに受託番号ＬＭＢＰ  ６４２２ＣＢで寄託された細胞株によって産生されるＢＯＩＩＢ２である、請求項１〜４いずれか１項に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項６】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、少なくとも２つの相補性決定領域（ＣＤＲ）の組合せ、可溶性もしくは膜固定単鎖可変部分、または単一の可変ドメインの群から選択される、請求項１〜５いずれか１項に記載の抗体の抗原結合断片。
【請求項７】
ＦＶＩＩＩへの結合に関して、ＢＣＣＭに受託番号ＬＭＢＰ  ６４２２ＣＢで寄託された細胞株によって産生される抗体ＢＯＩＩＢ２と競合する抗体。
【請求項８】
配列番号１１の配列に特異的に結合する、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
ヒト抗体、ラクダ抗体、サメ抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項７または８に記載の抗体。
【請求項１０】
モノクローナル抗体である、請求項７〜９いずれか１項に記載の抗体。
【請求項１１】
抗体の可変領域の重鎖が配列番号５〜７に対応する配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号８〜１０の配列を含むことを特徴とする、請求項７〜９いずれか１項に記載の抗体。
【請求項１２】
抗体の可変領域の重鎖が配列番号２の配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号４の配列を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
ＢＣＣＭに受託番号ＬＭＢＰ  ６４２２ＣＢで寄託された細胞株によって産生されるヒトモノクローナル抗体ＢＯＩＩＢ２である、請求項７〜１２いずれか１項に記載の抗体。
【請求項１４】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、少なくとも２つの相補性決定領域（ＣＤＲ）の組合せ、可溶性もしくは膜固定単鎖可変部分、または単一の可変ドメインの群から選択される、請求項７〜１３いずれか１項に記載の抗体の抗原結合断片。
【請求項１５】
配列番号６および配列番号７の配列または配列番号９および配列番号１０の配列を含む、請求項１４に記載の抗原結合断片。
【請求項１６】
請求項１〜１５いずれか１項に記載の抗体を産生する細胞株。
【請求項１７】
ＢＣＣＭに受託番号ＬＭＢＰ  ６４２２ＣＢで寄託されたＢＯＩＩＢ２という名称の抗体を産生する、請求項１６に記載の細胞株。
【請求項１８】
抗Ａ２インヒビター抗体の産生または活性を阻止および／または抑制する化合物の同定における、請求項１〜５もしくは請求項７〜１３いずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片の使用。
【請求項１９】
診断用ツールとしての請求項１〜５もしくは請求項７〜１３いずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片の使用。
【請求項２０】
ヒト試料におけるＦＩＩＩの免疫学的検出のための請求項１〜５もしくは請求項７〜１３いずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片の使用。
【請求項２１】
ＦＶＩＩＩ活性を阻害する化合物のスクリーニングのための請求項１〜５もしくは請求項７〜１３いずれか１項に記載の抗体または／およびその抗原結合断片の使用。
【請求項２２】
哺乳動物における凝固障害の予防または処置の医薬の製造のための、請求項１〜５もしくは請求項７〜１３いずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片の使用。
【請求項２３】
活性成分として請求項１〜５もしくは請求項７〜１３いずれか１項に記載のＦＶＩＩＩに対する抗体、または請求項６、１４もしくは１５いずれか１項に記載の抗原結合断片を、薬学的に許容され得る担体との混合状態で含む、哺乳動物における凝固障害の予防または処置のための医薬組成物。
【請求項２４】
前記抗原結合断片が配列番号５〜１０の群から選択される少なくとも２つのＣＤＲを含む、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
配列番号５〜配列番号１０で表されるＣＤＲから選択される少なくとも２つのＣＤＲを含む抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２６】
配列番号２に示されるアミノ酸重鎖可変領域をコードする配列を含む、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２７】
配列番号４に示されるアミノ酸軽鎖可変領域をコードする配列を含む、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２８】
哺乳動物における凝固障害の処置および／または予防方法であって、かかる処置または予防を必要とする哺乳動物に、請求項１〜５もしくは請求項７〜１３いずれか１項に記載の抗体、または請求項６、１４もしくは１５いずれか１項に記載の抗原結合断片から選択される活性成分の治療有効量を投与することを含む、方法。
【請求項２９】
凝固障害が、深部静脈血栓症、肺塞栓症、脳卒中、心筋梗塞およびＳＩＲＳと呼ばれる障害を含む群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
・まず、記憶ＩｇＧ担持Ｂ細胞を血友病患者のＰＢＭＣから調製する工程
・続いて、例えばトランスフェクト細胞株における場合のように、固定化ＣＤ４０リガンドを用いてＣＤ４０受容体による記憶Ｂ細胞の活性化を行ない、ＣＤ４０と交差反応させる工程
・ＥＢＶを添加して該細胞株を不死化させる工程
・このようにして得られる該細胞株によって産生されるモノクローナル抗体を得る工程を含む、ＩｇＧアイソタイプのヒトモノクローナル抗体の調製方法。
【請求項３１】
ＦＶＩＩＩ阻害能力を有する第ＶＩＩＩ因子のリガンドのスクリーニングのための配列番号１１の配列を含むペプチドの使用。
【請求項３２】
配列番号１、３および５〜１０からなる群より選択される、ペプチドをコードする組換え発現ベクター。
【請求項３３】
細菌、酵母、植物、哺乳動物またはウイルス系の発現ベクターである、請求項３２に記載の組換え発現ベクター。
【請求項３４】
請求項３２または３３に記載のベクターを含む組換え細胞。
【請求項３５】
ヒト細胞である請求項３４に記載の組換え細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、新規な抗体ならびにその断片および誘導体に関する。該抗体ならびにその断片および誘導体は、凝固経路の第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の構造および機能の特性化、ＦＶＩＩＩインヒビターの根絶の治療ストラテジーの設計、および医薬としての使用に特に適している。本発明はまた、該特異的抗体を産生する細胞株に関する。さらにまた、本発明は、本発明の抗体、断片および／または誘導体を含む医薬組成物、ならびに抗体もしくは断片およびその誘導体またはその医薬組成物を用いることによる心血管障害の予防および処置方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
哺乳動物における凝固系は、カスケード型の活性化において相互作用するプロ酵素および補因子を含む一連のタンパク質で構成されている。活性化されると、プロ酵素は、特定の補因子の存在下で、カスケード内の次の成分を切断する酵素に変換される。
【０００３】
かかる系は、通常、３つの時期：開始期、増幅期および伝播期に分けられる。開始期は、ＦＶＩＩａおよびカルシウムの存在下、組織因子によるＦＸおよびＦＩＸの酵素的切断によって誘発される。活性化ＦＸは、プロトロンビンをトロンビンに切断する。増幅期では、トロンビンが、ＦＶ、ＦＶＩＩＩおよびＦＸＩなど多数の因子を活性化し、これにより、今度はＦＩＸが活性化される。次いで、伝播期は、多数の正のフィードバック機構で構成され、活性化ＦＩＸとその補因子ＦＶＩＩＩａとの組合せによって、ＦＸがさらに切断される。ＦＸａおよびＦＶａは会合し、プロトロンビンをトロンビンに切断する。
【０００４】
ヒトＦＶＩＩＩは、２種類の内部相同性を含む３つのドメインで構成された３３０ｋｄの糖タンパク質である。第１のドメインは、互いに（Ａ１、Ａ２、Ａ３）＋／−３０％相同性を示し、かつ残基１〜３２９、３８０〜７１１、１，６４９〜２，０９１を含むＡセグメントの３重化にある。領域Ａ１およびＡ２は、重鎖を構成し、一方、グリコシル化部位（Ｂドメイン）高含有の９４８アミノ酸の領域で分離されたＡ３は、軽鎖のアミノ末端に位置する。第２の内部相同性は、該分子のカルボキシ末端に見られ、この部分には、４０％相同性を有するほぼ１５０アミノ酸を含む第３の型のドメインの２つのコピー（Ｃ１およびＣ２）が見られる。特定の酸性の領域（Ａ１−ａ１−Ａ２−ａ２−Ｂ−ａ３−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２）で分離された異なるセグメントで構成される天然のＦＶＩＩＩ分子は、酵素によって速やかに切断された後、血漿中に、２価のカチオンによって８０ｋＤの軽鎖（ａ３−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２）に会合される重鎖（Ａ１およびＡ２ドメインとＢドメインまたはその切断型部分と一緒に）からなるヘテロダイマーとして侵入する。活性となり、テナーゼ複合体形成においてその機能を果たすためには、循環ＦＶＩＩＩは、トロンビンによって切断されなければならない。
【０００５】
血友病Ａは、ＦＶＩＩＩの欠如または不充分な機能を特徴とする。重度の血友病Ａ（すなわち、１％未満の機能的ＦＶＩＩＩ）患者は、補充療法として、組換えまたは血漿由来ＦＶＩＩＩの投与によって処置される。ＦＶＩＩＩ輸液による補充療法中の血友病Ａ患者の約２５％は、ＦＶＩＩＩに対して免疫応答を発現する。これは、重度の血友病Ａ患者が、妊娠期間中、その患者の免疫系に対するＦＶＩＩＩの曝露が欠如するため、ＦＶＩＩＩに対して耐性になる機会がなかったという事実によるものである。また、抗ＦＶＩＩＩ抗体も、一部の自己免疫疾患の状況において、または時として、妊娠または手術後に見られ得る。かかる抗体は、インヒビターと呼ばれ、テナーゼ複合体によってトロンビン生成速
度を低下させ、それにより、凝固カスケードの増幅ループを阻害する。
【０００６】
インヒビター抗体は、ＦＶＩＩＩ分子上の多数の異なるエピトープを認識する。特に最も高頻度に認識されるエピトープは、Ｃ２およびＡ２ドメイン内に位置する。Ｃ２ドメイン内のエピトープの詳細な特性化は、Ｃ２の結晶構造の解析およびヒトモノクローナル抗Ｃ２抗体の利用可能性のおかげでなされ、これにより、Ｃ２ドメインの構造モデルの充分な確認ならびに単一のアミノ酸レベルでのエピトープの正確なマッピングが可能となった（Ｊａｃｑｕｅｍｉｎ  ＭＧら，１９９８  Ｂｌｏｏｄ．ＪｕＩ  １５：９２（２）：４９６−５０６）。この知見により、２つの系統の研究、すなわち、インヒビター抗体との相互作用が低減された新規なＦＶＩＩＩ分子の設計、および抗Ｃ２インヒビター抗体の産生の阻止または抑制を目的とする新規な治療ストラテジーの開発の道が開かれた。
【０００７】
Ａ２ドメインとの抗体相互作用を解明するための同様のアプローチは、これまで、適当な試薬がないことにより妨げられていた。先行技術では、ＦＶＩＩＩに対して低親和性を有するヒトモノクローナルＩｇＭ抗体が報告されたが、強いＦＶＩＩＩ阻害能力を有するヒトモノクローナルＩｇＧ抗体は、報告されていない。
【０００８】
インヒビターを有する患者のレパートリーに由来する抗体は、ＦＶＩＩＩに対して実際に生成される抗体であるため、特殊な試薬である。対照的に、マウスなどの動物モデルにおいて生成される抗体は、マウス免疫系の特性はヒトのものと同等でないため、ヒトでの状況を代表するものではない。
【０００９】
ＦＶＩＩＩの特性化またはインヒビターの産生の阻止もしくは抑制を目的とする治療法の確立のための潜在的使用の他、ＦＶＩＩＩのＡ２ドメインに対する抗体は、血友病Ａ患者由来のものもそうでないものも、治療目的、例えば、血餅の形成の阻害に有用であり得る。抗凝固および抗血栓性の処置は、危険な結末、例えば、心筋梗塞、脳卒中、末梢動脈疾患による四肢の損失または肺塞栓症を予防するための血餅の形成の阻害を目的とする。今日まで数年来、抗血栓療法は、数種類の薬物、すなわち、アスピリン、ヘパリンおよび経口ワルファリンに依存している。血栓症に関与するプロセスの理解が深まるとともに、開発された凝固因子の特異的インヒビター（例えば、組換え組織プラスミノゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）またはストレプトキナーゼなど）の数は増大している。しかしながら、これまで、より良好な有効性／安全性比は、これらでは得られていなかった。
【００１０】
モノクローナル抗体は、既に、抗血栓剤として治療価値があることが示されている。この分野で最初に認可された薬物は、血小板ＧＰ  ＩＩｂＩＩＩａ受容体に対するマウスモノクローナル抗体（７Ｅ３）のヒト化Ｆａｂ断片であるアブシキシマブ（ＲｅｏＰｒｏ  ＴＭ）である。マウス抗体は、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）を称される抗免疫グロブリン応答を惹起し、その治療有効性を低減もしくは破壊し得る、および／または患者においてアレルギー性もしくは過敏反応を誘発し得るため、ヒトの治療での使用がかなり制限され得る特性を有する。ヒトモノクローナル抗体の使用は、この制限に対処し得るが、従来のハイブリドーマ手法によって、かかる抗体を大量に生成させることは困難であることが示されている。
【００１１】
したがって、組換え手法を用い、マウスモノクローナル抗体の高結合親和性を維持しているが、ヒトにおいて免疫原性の低減を示す「ヒト化」抗体が構築されている。結合親和性および出血などの副作用の問題が、いくつかの「ヒト化」抗体療法に関して報告されている。
【００１２】
したがって、新規な抗凝固および抗血栓性／血栓溶解性の処置または、一般的に、凝固障害の処置のための化合物が必要とされている。抗体に基づく治療用薬剤では、理想的な
化合物は、充分な抗凝血有効性を有し、免疫原性を誘発しないヒト抗体である。
【００１３】
先行技術では、第ＶＩＩＩ因子のＡ２ドメインに対する単離されたヒト抗体が報告されており、これは、ＥＢＶ−不死化によって血友病Ａ患者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）由来の抗ＦＶＩＩＩ抗体を産生するリンパ芽球系細胞株から得られたものである（Ｇｈａｒａｇｏｚｌｏｕら  ２００３，ヒト抗体１２：６７−７６）。しかしながら、報告された抗体はすべて、もっぱらＩｇＭアイソタイプのものであり、したがって、治療目的に使用するのは困難である。さらにまた、この著者は、血友病患者には第ＶＩＩＩ因子特異的ＩｇＭ＋Ｂ細胞の優先的増殖の系が存在し、これは、血友病患者においてＦＶＩＩＩ分子の特質およびＦＶＩＩＩに対する感作の条件に特異的に関連している可能性があることを示唆しており、その結果、この様式でＩｇＧ抗体を得ることは可能でないか、または極めて困難であることを示唆している。
【００１４】
したがって、第ＶＩＩＩ因子のＡ２ドメインに結合し、ＦＶＩＩＩ活性を阻害するモノクローナル抗体および抗体断片の必要性が残る。理想的には、治療用薬剤のためには、かかる抗体は、ＨＡＭＡを惹起し得ない（またはその傾向が低い）ため、非免疫原性である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
発明の概要
本発明は、ＦＶＩＩＩのＡ２ドメインに指向される最初のヒトモノクローナルＩｇＧ抗体、その産生および完全な特性化、ならびにＦＶＩＩＩの構造的および機能的特性化のためのその使用、および医薬としての使用を提供する。さらにまた、本発明は、ＦＶＩＩＩのＡ２ドメインに特異的に結合し、研究、診断および治療に有用である抗体およびその抗原結合断片を提供する。本発明者らはまた、抗Ａ２阻害性抗体の産生の抑制を図るを治療の設計のためのストラテジーを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の第１の態様は、第ＶＩＩＩ因子のＡ２ドメインに指向される新規なモノクローナル抗体、より詳しくは、ＩｇＧアイソタイプならびにその断片および誘導体に関する。本発明のモノクローナル抗体の特別な一実施形態は、第ＶＩＩＩ因子の活性を阻害する。
【００１７】
本発明のこの態様の特別な実施形態は、より詳しくは、抗体の可変領域の重鎖がそのＣＤＲ内に配列番号５〜７に対応する配列もしくは少なくとも８０％または少なくとも９０％または９５％配列同一性を有する配列を含み、軽鎖可変領域がそのＣＤＲ内に配列番号８〜１０の配列、もしくはそれと少なくとも８０％または少なくとも９０％または９５％配列同一性を有する配列を含むことを特徴とするＩｇＧ型のヒトモノクローナル抗体を提供する。
【００１８】
さらなる特別な一実施形態は、その重鎖可変領域が配列番号２の配列もしくはそれと少なくとも８０％または少なくとも９０％または９５％配列同一性を有する配列をＣＤＲ領域内に含む、および／またはその軽鎖可変領域が配列番号４の配列もしくはそれと少なくとも８０％または少なくとも９０％または９５％配列同一性を有する配列をＣＤＲ領域内に含むことを特徴とするＩｇＧ型のヒトモノクローナル抗体を提供する。
【００１９】
さらなる特別な一実施形態は、ＢＣＣＭに受託番号ＬＭＢＰ  ６４２２ＣＢで寄託された細胞株によって産生される抗体ＢＯＩＩＢ２であるＩｇＧ型のヒトモノクローナル抗体を提供する。
【００２０】
本発明のこの態様のさらなる特別な一実施形態は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、少なくとも２つの相補性決定領域（ＣＤＲ）の組合せ、可溶性もしくは膜固定単鎖可変部分、または単一の可変ドメインの群から選択される、上記のヒトモノクローナルＩｇＧ抗体の抗原結合断片を提供する。
【００２１】
本発明の別の態様は、ＦＶＩＩＩのＡ２ドメインに特異的に結合し得る、ＢＣＣＭに受託番号ＬＭＢＰ  ６４２２ＣＢで寄託された細胞株によって産生される抗体ＢＯＩＩＢ２、およびＦＶＩＩＩへの結合に関して抗体ＢＯＩＩＢ２と競合する任意の抗体を提供する。
【００２２】
具体的な一実施形態によれば、ＦＶＩＩＩへの結合に関して抗体ＢＯＩＩＢ２と競合する抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、配列番号１１の配列に特異的に結合する。
【００２３】
さらなる具体的な一実施形態によれば、ＦＶＩＩＩへの結合に関して抗体ＢＯＩＩＢ２と競合する抗体は、ヒト抗体、ラクダ抗体、サメ抗体またはヒト化抗体またはキメラ抗体である。より特別には、該抗体はモノクローナル抗体である。
【００２４】
本発明のこの態様の特別な実施形態において、ＦＶＩＩＩへの結合に関して抗体ＢＯＩＩＢ２と競合する抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、該抗体の可変領域の重鎖がそのＣＤＲ内に配列番号５〜７に対応する配列もしくは少なくとも８０％または少なくとも９０％または９５％配列同一性を有する配列を含み、軽鎖可変領域がそのＣＤＲ内に配列番号８〜１０の配列、もしくはそれと少なくとも８０％または少なくとも９０％または９５％配列同一性を有する配列を含むことを特徴とする。
【００２５】
本発明のこの態様のさらなる特別な実施形態において、ＦＶＩＩＩへの結合に関して抗体ＢＯＩＩＢ２と競合する抗体は、その重鎖可変領域が配列番号２の配列もしくはそれと少なくとも８０％または少なくとも９０％または９５％配列同一性を有する配列をＣＤＲ領域内に含む、および／またはその軽鎖可変領域が配列番号４の配列もしくはそれと少なくとも８０％または少なくとも９０％または９５％配列同一性を有する配列をＣＤＲ領域内に含むことを特徴とする。
【００２６】
さらなる特別な実施形態において、本発明は、抗体断片、より特別にはＦＶＩＩＩへの結合に関して抗体ＢＯＩＩＢ２と競合する抗体の抗原結合断片、より特別にはＦＶＩＩＩへの結合に関して抗体ＢＯＩＩＢ２と競合する抗体断片を提供する。より詳しくは、これらの抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、少なくとも２つの相補性決定領域（ＣＤＲ）の組合せ、可溶性もしくは膜固定単鎖可変部分、または単一の可変ドメインからなる群より選択される。
【００２７】
かかる抗原結合断片の特別な実施形態としては、ＢＯＩＩＢ２の少なくとも２つのＣＤＲを含む断片もしくはその誘導体、またはより特別には、配列番号５〜１０の群から選択される少なくとも２つのＣＤＲ断片、または少なくとも２つのそれと少なくとも８０％または少なくとも９０％または９５％配列同一性を有する配列を含む断片が挙げられる。本発明の抗体断片の具体的な実施形態は、配列番号６および配列番号７の配列もしくはそれと少なくとも８０％または少なくとも９０％または９５％配列同一性を有する配列または配列番号９および配列番号１０の配列もしくはそれと少なくとも８０％または少なくとも９０％または９５％配列同一性を有する配列を含む断片である。
【００２８】
本発明の特別な一実施形態は、ヒトＢＯＩＩＢ２抗体の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）およびＦＶＩＩＩ活性を阻害し得るｓｃＦｖを提供することに関する。本発明の別の実施形態は、該抗体と標識または目的のペプチドもしくは他の分子、または１つ以上のＣＤＲを含むポリペプチドなどとの複合物を含む、本発明の抗体の抗原結合誘導体に関する。本発明の特別な一実施形態によれば、該抗体は、ハイブリッド抗体、最も特別には２つの異なる抗原またはエピトープに対する特異性を兼ね備える二価抗体である。
【００２９】
本発明のまたさらなる目的は、本発明の抗体を産生する細胞株を提供することである。これには、モノクローナルヒトＩｇＧ抗体を産生する細胞株、およびＦＶＩＩＩへの結合に関して抗体ＢＯＩＩＢ２と競合する本発明の抗体を産生する細胞株が含まれる。また、これには、例えば、組換え手法の結果としてＢＯＩＩＢ２またはその断片に由来する抗体を産生し得る細胞株が含まれる。本発明のこの態様の特別な一実施形態は、本発明によるモノクローナル抗体を産生するＢＯＩＩＢ２という名称の細胞株であり、これは、ＢＣＣＭ／ＬＭＢＰに受託番号ＬＭＢＰ  ６４２２ＣＢで寄託されている（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｃｏ−ｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ／Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕｍ  ｖｏｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｈｅｎｔ  Ｋ．Ｌ．Ｌｅｄｅｇａｎｃｋｓｔｒａａｔ  ３５，Ｂ−９０００  Ｇｈｅｎｔ，ＢＥ）。
【００３０】
本発明の別の態様は、本発明の抗体および抗原結合断片および誘導体の使用、すなわち、ヒト試料におけるＦＩＩＩの免疫学的検出のため、すなわち、診断用ツールとして、診断方法における標識化された標的成分として、ＦＶＩＩＩ活性を阻害する化合物のスクリーニングため、ＦＶＩＩＩの構造および機能の特性化のため、ならびにＦＶＩＩＩインヒビターの根絶のための治療ストラテジーの設計のため（とりわけ、抗Ａ２インヒビター抗体の産生または活性を阻止および／または抑制する化合物の同定における）の使用に関する。
【００３１】
本発明の別の態様は、哺乳動物における心血管障害の処置および／または予防方法を提供し、該方法は、かかる処置または予防を必要とする哺乳動物、より特別にはヒトに、ＦＶＩＩＩのＡ２ドメインに特異的に結合する本発明による抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体である活性成分の治療有効量を投与することを含む。本発明の方法の特別な一実施形態は、心血管障害、例えば限定されないが、ヒトにおける止血障害、特に凝固カスケードの障害および結果として起こる血栓性病態、例えば、深部静脈血栓症、肺塞栓症、脳卒中、心筋梗塞、ＳＩＲＳと呼ばれる障害、例えば限定されないが、膵炎における全身性炎症、虚血、多発外傷および組織損傷、出血性ショック、免疫媒介型臓器損傷および感染、セプシス、敗血症性ショック、微小血管系における血栓形成、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、敗血症などの処置および／または予防に関する。
【００３２】
本発明の別の態様は、凝固障害、例えば限定されないが心血管障害などの予防および／または処置のための医薬として、および医薬の製造のための該抗体ならびにその断片および誘導体の使用に関する。本発明の方法の具体的な実施形態において、凝固障害は、深部静脈血栓症、肺塞栓症、脳卒中、心筋梗塞およびＳＩＲＳと呼ばれる障害（全身性炎症反応症候群）からなる群より選択される、ヒトにおける血栓性病態である。
【００３３】
本発明はまた、凝固の内因性経路ならびに外因性経路によるトロンビン生成を抑制または低減するための本発明の抗体ならびに抗原結合断片および誘導体の使用に関する。
【００３４】
本発明の別の態様は、本発明の抗体またはその断片もしくは誘導体の医薬組成物、および本発明の抗体またはその断片もしくは誘導体を用いることによる凝固障害の処置方法に関する。
【００３５】
哺乳動物における凝固障害の予防または処置のための医薬組成物の特別な実施形態は、ＢＯＩＩＢ２であるＦＶＩＩＩに対する抗体または断片もしくは誘導体、より特別には、薬学的に許容され得る担体との混合物におけるその抗原結合断片を含む。本発明の具体的な実施形態は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２、可溶性もしくは膜固定単鎖可変部分または単一の可変ドメインからなる群より選択される、ＢＯＩＩＢ２またはその誘導体の抗原結合断片を含む医薬組成物である。本発明の最も特別な実施形態は、配列番号５〜１０の群から選択される少なくとも２つのＣＤＲまたは、配列番号５〜１０の群から選択される２つの異なる配列と少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％もしくは９５％配列同一性を有する少なくとも２つの配列を含む抗原結合断片を含む医薬組成物に関する。その特別な一実施形態は、本発明のＢＯＩＩＢ２抗体のｓｃＦｖを含む医薬組成物、より特別には、配列番号５〜１０の群から選択される少なくとも２つのＣＤＲまたは配列番号５〜１０の群から選択される２つの異なる配列と少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％もしくは９５％配列同一性を有する少なくとも２つの配列を含むｓｃＦｖを含む医薬組成物に関する。
【００３６】
本発明による医薬組成物のまた別の特別な一実施形態では、本発明の抗ＦＶＩＩＩ抗体または抗体断片に加えて、凝固障害の処置または予防に有用な別の薬剤の治療有効量を含む。この点において最も特別には、他の抗ＦＶＩＩＩ抗体またはその断片もしくは誘導体、例えば、Ｋｒｉｘ−Ｉなどが想定される。
【００３７】
本発明の別の目的は、まず、記憶ＩｇＧ担持Ｂ細胞を血友病患者のＰＢＭＣから調製する工程、続いて、ＣＤ４０受容体による記憶Ｂ細胞の活性化を行なう工程、およびＥＢＶを添加して該細胞株を不死化させる工程を含む、ＩｇＧアイソタイプの、より特別にはＦＶＩＩＩのＡ２ドメインに指向される、より特別にはＢＯＩＩＢ２のエピトープに結合するヒトモノクローナル抗ＦＶＩＩＩ抗体の作製方法に関する。別の実施形態は、（少なくとも）配列番号１１の配列を含むペプチドでの哺乳動物の例えばマウスの免疫処置により、ＩｇＧアイソタイプの、より特別にはＦＶＩＩＩのＡ２ドメインに指向される、より特別には、ＢＯＩＩＢ２のエピトープに結合するモノクローナル抗ＦＶＩＩＩ抗体の調製方法に関する。かかる抗体は、次いでヒト化され得るか、または断片および誘導体が、次いで、これらの哺乳動物抗体から調製され得る。
【００３８】
本発明の別の態様は、本明細書に開示されたＦＶＩＩＩに結合する抗体の抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド、より特別には、細胞株ＢＯＩＩＢ２によって産生されるＢＯＩＩＢ２の重鎖および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を提供する。最も詳しくは、配列番号２および配列番号４の可変領域をコードするヌクレオチド配列が想定される。さらに、ＢＯＩＩＢ２の少なくとも２つのＣＤＲを含む抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド配列、より詳しくは、配列番号５〜配列番号１０からなる群より選択される少なくとも２つのＣＤＲをコードするポリヌクレオチド、または配列番号５〜１０を少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％もしくは９５％配列同一性を有する少なくとも２つのＣＤＲを含む配列をコードするポリヌクレオチド。本発明のヌクレオチドの具体的な実施形態を、配列番号１および３に示す。さらなる具体的な実施形態としては、ＢＯＩＩＢ２のｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列、およびこれと少なくとも８０％または少なくとも９０％配列同一性を有する配列、最も特別には、ｓｃＦｖのＣＤＲ領域をコードする領域内の配列が挙げられる。しかしながら、遺伝暗号における重複の結果、本発明の範囲に含まれる多数のヌクレオチド配列が存在することは認識されよう。
【００３９】
さらに、本発明は、配列番号１、３および５〜１０からなる群より選択されるペプチドをコードする組換え発現ベクター、より詳しくは、細菌、酵母、植物、哺乳動物またはウイルス系の発現ベクターを提供する。さらに、本発明は、記載のベクターを含む組換え細
胞、より特別にはヒト細胞を提供する。
【００４０】
本発明の別の特別な一実施形態は、第ＶＩＩＩ因子のＡ２ドメインに指向されるＦＶＩＩＩ阻害抗体の作製のための本発明のＢＯＩＩＢ２のエピトープ（エピトープ配列配列番号１１）の使用、またはＦＶＩＩＩを阻害する化合物のスクリーニングのためのアッセイにおける使用に関する。
【００４１】
実施例を含む以下の記載は、本発明を、記載の具体的な実施形態に限定することを意図せず、添付の図面（参照により本明細書に組み込まれる）と関連させて理解され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
発明の詳細な説明
定義
用語「抗体断片」は、本明細書で用いる場合、抗体分子の下位区分または抗体の１つ以上の領域を含む分子であって、単独または他の断片との組合せで、これが生成された抗原に結合し得るものをいう。典型的な抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単一の可変ドメイン（Ｆｖ）または単鎖可変部分（もしくは領域）（ｓｃＦｖ）である。より小さな断片としては、相補性決定領域すなわちＣＤＲ、例えば、重鎖もしくは軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３など、および／またはその２つ以上の組合せが挙げられる。したがって、用語「抗体断片」は、インタクトな抗体の断片化によって得られ得る断片、および抗体の１つ以上の部分（すなわち、アミノ酸配列）を含む組換え手法によって得られる分子、例えば、限定されないが、ナノボディ、ビスｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディなど（ＨｏｌｌｉｇｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００５，２３（９）：１  １２６−１１３６に記載のような）の両方を包含する。
【００４３】
抗体または抗体断片の「誘導体」という用語は、本明細書において、（例えば、ヒト化して抗原に対する親和性または標識などの他の分子への結合を増大させるため）、例えばアミノ酸配列に関して元の抗体の修飾である（例えば、ハイブリドーマ細胞株によって産生される）が、抗原に対する抗体または断片に有意に影響しない抗体または抗体断片をいうために用いる。誘導体には、合成ポリペプチドなどの抗原結合分子をもたらす１つ以上のＣＤＲの代替構造が含まれる。誘導体としては、非ヒト抗体のヒト化型、ハイブリッド抗体および１種類以上の抗体の１つ以上の可変領域および／またはＣＤＲをグラフトまたは導入することにより得られた抗体または他の抗原結合分子が挙げられる。したがって、ヒト抗体の誘導体としては、ヒト抗体の１つ以上の可変領域および／またはＣＤＲを含む非ヒト種由来の抗体、例えば、限定されないが、ハイブリッドラクダ科動物もしくはテンジクザメの抗体またはこれらから得られるナノボディなどが挙げられる。さらに、用語「誘導体」は、グリコシル化に関して修飾された抗体および抗体断片を包含する。
【００４４】
「ヒト化抗体またはヒト化抗体断片」は、本明細書で用いる場合、ヒト抗体とより類似させるためにアミノ酸が置き換えられた、非ヒト抗体分子またはその断片をいう。典型的には、このような置換の大部分は、抗原結合に寄与しない領域内に存在する。多くの場合、該置換は、ＣＤＲ間のフレームワーク領域内に存在する。しかしながら、ＣＤＲ内で、抗原への結合に全くまたはほとんど関与しないアミノ酸もまた、ヒト抗体とより類似するように置換され得ることが想定される。
【００４５】
「新形態の」抗体もしくは抗体断片または「ハイブリッド抗体」は、本明細書で用いる場合、少なくとも２つの異なる抗体、より特別には異なる種の２つの抗体の一部分を含む抗体をいう。典型的には、ヒトハイブリッド抗体は、目的の抗原に対して指向される別の抗体の非ヒト（任意選択でヒト化された）可変領域に連結されたヒト定常領域、または抗
原結合領域内のアミノ酸配列が例えば目的のヒト抗原に対して指向される別の抗体由来の配列で置き換えられたヒト抗体の主鎖であり得る。より特別には、目的の抗原に対して親和性を有する抗体の抗原結合領域、例えば、１つ以上のＣＤＲもしくは可変領域またはその一部分が、ヒト抗体の主鎖内に導入される（例えば、ＣＤＲグラフト抗体）。異なるエピトープに対して指向される抗体のＣＤＲが導入される場合（例えば、抗体のアーム（ａｒｍ）の各々において）、新形態またはハイブリッドの抗体は、１つの抗原の２つの異なるエピトープに対して親和性を有するものであり得るか、または異なる抗原に対応する異なるエピトープに対して親和性を有するものでさえあり得る。
【００４６】
用語「相同性」または「相同な」は、本明細書で用いる場合、本発明の抗原結合分子に関して、該抗原結合分子のその抗原への結合と競合する、または該結合を阻害する分子をいう。該結合は特異的であるのがよい、すなわち、抗原に対する相同な分子の結合は、該抗原に対する該抗原結合分子の結合と同程度に特異的であるのがよい。
【００４７】
２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の「配列同一性」という用語は、本明細書で用いる場合、２つの配列をアラインメントしたとき、短い方の配列内のヌクレオチドまたはアミノ酸の数で除算される同一のヌクレオチドまたはアミノ酸を有する位置の数に関する。２つの配列の配列同一性は、７０％〜８０％、８１〜８５％、８６〜９０％、９１〜９５％または９６〜１００％であり得る。抗原との結合に対して可変領域の主鎖の寄与は一般的に限定的であることに鑑みると、配列同一性は、最も一般的に本明細書において、相補性決定領域もしくはＣＤＲ内のアミノ酸配列に関して、またはＣＤＲを構成するアミノ酸配列をコードする（ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａｎｄ）ヌクレオチド配列に関して特定される。
【００４８】
２つのアミノ酸は、これらがともに、以下の群ＧＡＳＴＣＰ；ＶＩＬＭ；ＹＷＦ；ＤＥＱＮ；ＫＨＲのうちの１つの同じ群に属する場合、「類似」とみなされる。したがって、本明細書でいう２つのタンパク質配列間の配列類似性の割合は、２つのタンパク質配列をアラインメントし、短い方の配列内のアミノ酸の総数で除算される同一または類似のアミノ酸を有する位置の数を決定することにより決定され得る。
【００４９】
用語「阻害性の」は、ＦＶＩＩＩに対する抗体またはその断片もしくは誘導体についていう場合、該抗体、断片または誘導体が、ＦＶＩＩＩの機能、より特別には凝固カスケードにおけるＦＶＩＩＩの機能を阻害し得ることを示すために使用される。第ＶＩＩＩ因子の機能は、以下のとおりである。ＦＶＩＩＩは、凝固の補因子としての機能を果たす。初期に大量のトロンビンが生成されると、ＦＶＩＩＩは、その活性形態（ＦＶＩＩＩａ）において切断され、そのシャペロン分子であるフォン・ビルブラント因子から解離する。次いで、ＦＶＩＩＩａは、活性化された第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）との複合体の形成の関与に充分利用可能となり、該複合体は、第Ｘ因子を切断してＦＸａを形成する。該複合体は、その活性に基づいて「テナーゼ（ｔｅｎａｓｅ）複合体」と呼ばれる。ＦＩＸａへのＦＶＩＩＩａの結合により、ＦＩＸの酵素活性は±１００，０００倍増大する。ＦＸａの形成は、活性化された第Ｖ因子との組合せで、プロトロンビンのトロンビンへの変換、続いて、凝固をもたらすフィブリンの形成をもたらす。したがって、ＦＶＩＩＩ活性の阻害により、一般的には、トロンビン、フィブリンの形成の低減および凝固の低減がもたらされ、これらは、本明細書に記載の方法によって測定され得る。ＦＶＩＩＩの阻害は、以下の効果：ＦＶＩＩＩａへの活性化の阻害、ｖＷＦからのＶＩＩＩの解離の阻害、ＦＩＸａとの複合体形成の阻害の１つ以上の結果であり得る。
【００５０】
用語「凝固障害」は、本明細書で用いる場合、ヒトにおける止血障害、特に、凝固カスケードの障害および結果として起こる血栓性病態、例えば、深部静脈血栓症、肺塞栓症、脳卒中、心筋梗塞、ＳＩＲＳと呼ばれる障害（全身性炎症反応症候群）などをいう。全身
性炎症は、いくつかの臨床症状、例えば、膵炎、虚血、多発外傷および組織損傷、出血性ショック、免疫媒介型臓器損傷および感染の考えられ得る終点である。最初の原因とは無関係に、全身性炎症では、かなり類似した病理学的変化が観察されるため、用語「全身性炎症反応症候群」（以下、本明細書においてＳＩＲＳという）は、かかる変化を説明するために一般的に引用し、したがって、本出願書類では、Ｃｈｅｓｔ（１９９２）１０１：１６４４−５５においてＲ．Ｃ．Ｂｏｎｅらによって明確化（ｆｏｒｍｕｌａｔｅ）されたＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃｈｅｓｔ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓの推奨に従って用いる。用語「全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）」には、セプシス、敗血症性ショック、微小血管系における血栓形成、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、敗血症などが含まれる。
【００５１】
本明細書において「組換え」と称する核酸は、組換えＤＮＡ方法論によって作製された核酸であり、人為的組換え、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および／または制限酵素を用いるベクター内へのクローニングなどの方法に依存する手順によって作製される核酸が挙げられる。「組換え」核酸はまた、細胞の天然の機構により起こる組換え事象に起因するものであるが、所望の組換え事象を許容し、起こり得ることを可能にするように設計された核酸が細胞内に導入された後、選択される。
【００５２】
詳細説明
本発明を、特定の実施形態および特定の図面を参照して説明するが、本発明は、これらに限定されるのではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。本発明は、驚くべきことに、新規なリガンド、すなわち、新規なモノクローナル抗体ならびにその断片、誘導体およびホモログ、より特別には、ＩｇＧアイソタイプであって、Ａ２ドメインへの結合によりＦＶＩＩＩを阻害するものが測定されたことに基づく。
【００５３】
本発明は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に指向される抗体およびその抗原結合断片に関する。ヒト第ＶＩＩＩ因子は、２種類の内部相同性を含有する３つのドメインで構成された３３０ｋｄの糖タンパク質である。第１のドメインは、互いに（Ａ１、Ａ２、Ａ３）＋／−３０％相同性を示し、それぞれ、残基１〜３２９、３８０〜７１１、１，６４９〜２，０９１を含むＡセグメントの３重化にある。領域Ａ１およびＡ２は、重鎖を構成し、一方、グリコシル化部位（Ｂドメイン）高含有の９４８アミノ酸の領域で分離されたＡ３は、軽鎖のアミノ末端に位置する。第２の内部相同性は、該分子のカルボキシ末端に見られ、この部分には、４０％相同性を有するほぼ１５０アミノ酸を含む第３の型のドメインの２つのコピー（Ｃ１およびＣ２）が見られる。特定の酸性の領域（Ａ１−ａ１−Ａ２−ａ２−Ｂ−ａ３−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２）で分離された異なるセグメントで構成される天然のＦＶＩＩＩ分子は、酵素によって速やかに切断された後、血漿中に、２価のカチオンによって８０ｋＤの軽鎖（ａ３−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２）に会合される重鎖（Ａ１およびＡ２ドメインとＢドメインまたはその切断型部分と一緒に）からなるヘテロダイマーとして侵入する。活性となり、テナーゼ複合体形成においてその機能を果たすためには、循環ＦＶＩＩＩは、トロンビンによって切断されなければならない。
【００５４】
本発明では、ＦＶＩＩＩのＡ２ドメインに特異的であり、ＦＶＩＩＩ機能を阻害する精製／単離された抗体の作製、特性化および使用を記載および提供する。
【００５５】
第ＶＩＩＩ因子、特に第ＶＩＩＩ因子のＡ２ドメインに対するかかる阻害性抗体、その断片および誘導体は、種々の目的に使用され得る。これらは、ＦＶＩＩＩの構造および機能の特性化のため、ＦＶＩＩＩインヒビターの根絶のための治療ストラテジーの設計のため、ヒト試料におけるＦＩＩＩの免疫学的検出のため、診断方法における標的化部分（すなわち、標識抗体）として、ＦＶＩＩＩを阻害する化合物のスクリーニングのため、または一般的に研究試薬として使用され得る。このように、これらは、ＦＶＩＩＩに対して実
際に生成される抗体であるため、特殊な試薬である。
【００５６】
ＦＶＩＩＩインヒビターの根絶のための治療ストラテジーの設計の一例として、抗Ａ２インヒビター抗体に結合し、その阻害特性を中和する能力を有するペプチドが作製され得る。かかる目的のためのペプチドは、ファージディスプレイランダムペプチド（例えば、Ｖｉｌｌａｒｄ  Ｓら  Ｂｌｏｏｄ（２００３）１０２：９４９−９５２に記載のものなど）を用いたスクリーニングにより得られ得る。Ａ２ドメインとの相互作用により第ＶＩＩＩ因子の機能を阻害する抗体を中和し得る化合物（すなわち、小分子、ペプチドなど）のスクリーニングは、本発明の抗体を用いて行なわれ得る。あるいはまたさらに、抗第ＶＩＩＩ因子抗体を阻害し得るペプチドは、ＢＯＩＩＢ２のエピトープを鋳型として用いて作製され得る。これは、当業者に知られた工程、すなわち、エピトープ配列に相同な配列を有するペプチドの作製後、阻害能力の試験を含み得る。
【００５７】
さらにまた、本発明の抗体は、ヒト試料の精製用カラム内で該抗体を用いることによる、ヒト試料からの第ＶＩＩＩ因子の精製に使用され得る。
【００５８】
さらにまた、本発明の抗体は、凝固障害の予防および／または処置のための医薬として、および医薬の製造のためにも使用され得る。医薬としてのこの使用では、哺乳動物の出血を誘発せず、第ＶＩＩＩ因子が１００％阻害されないことが確保される抗体用量が最適に確立されるのがよい。
【００５９】
本発明の第１の態様は、ＦＶＩＩＩに対する抗体、より特別には、第ＶＩＩＩ因子のＡ２ドメインに指向されるヒトＩｇＧ抗体およびその抗原結合断片に関する。
【００６０】
一例として、インヒビターを有する血友病Ａ患者の天然の記憶Ｂ細胞のレパートリーから得られたモノクローナルＩｇＧ抗体であるヒト抗体ＢＯＩＩＢ２を記載する。抗体ＢＯＩＩＢ２は、ＦＶＩＩＩのＡ２ドメイン、より特別には、その内部のアミノ酸３７９〜５４６に対応するエピトープに特異的に結合し、ＦＶＩＩＩ活性を阻害、より特別にはＦＶＩＩＩ凝固促進活性を阻害し、これは、外因性または内因性凝固経路の活性化の際に血小板高含有血漿（ＰＲＰ）中でのトロンビン生成によって測定される。
【００６１】
したがって、本発明のこの態様の特別な一実施形態は、第ＶＩＩＩ因子のＡ２ドメインに指向されるインタクトなＩｇＧ抗体、より特別にはＩｇＧ４抗体である抗体を提供する。ヒトＩｇＧを得るための方法によって、抗体が本明細書において記載され、本発明のさらなる態様を構成することがわかった。
【００６２】
したがって、本発明の第２の態様は、ＦＶＩＩＩへの結合において抗体ＢＯＩＩＢ２と競合し得る、第ＶＩＩＩ因子のＡ２ドメインに指向されるＦＶＩＩＩに対する抗体およびその抗原結合断片を提供する。本発明のこの態様の特別な実施形態は、ＦＶＩＩＩへの結合において抗体ＢＯＩＩＢ２と競合し得、ＦＶＩＩＩ活性を阻害する抗体および抗原結合断片に関する。
【００６３】
抗体ＢＯＩＩＢ２と競合し得る抗体は、種々の様式で、当業者に周知の方法によって同定され得る。例えば、抗体がＦＶＩＩＩへの結合に関してＢＯＩＩＢ２と競合する能力は、ＥＬＩＳＡにおいて試験され得、この場合、抗体に対するＦＶＩＩＩ結合が、ＦＶＩＩＩとＢＯＩＩＢ２または本明細書の実施例のセクションに記載のような抗体とのプレインキュベーションにより、またはなしで試験される。したがって、古典的な免疫処置方法とモノクローナル抗体手法のいずれかによって得られる抗体、またはインヒビターを有する血友病Ａ患者から得られる抗体であってＦＶＩＩＩに結合する抗体を試験し、抗体ＢＯＩＩＢ２との競合が測定され得る。
【００６４】
特別な一実施形態によれば、本発明は、抗体、特にモノクローナル抗体またはその断片もしくは誘導体、例えば、本明細書においてＢＯＩＩＢ２と称する抗体と同じＦＶＩＩＩのエピトープに結合するヒト化抗体および抗体断片を提供する。より特別には、該抗体が結合するエピトープは、立体的エピトープ、最も特別には、第ＶＩＩＩ因子の４８４〜５０８位の間のアミノ酸残基ならびにグルタミン酸残基３８９、３９０および３９１を含むエピトープである。特別な一実施形態において、本発明の抗体および断片は、配列番号１１を含むタンパク質またはペプチドに結合する。
【００６５】
本発明の具体的な実施形態としては、ＢＣＣＭに受託番号ＬＭＢＰ  ６４２２ＣＢで寄託された細胞株によって産生されるヒトモノクローナル抗体ＢＯＩＩＢ２、およびその断片または誘導体、例えば、組換え手法によって作製され得る断片および誘導体などが挙げられる。抗体ＢＯＩＩＢ２は、ヒト起源のＦＶＩＩＩに対して指向され、ヒトＦＶＩＩＩに結合し、ヒトＦＶＩＩＩの機能を阻害し、したがって、治療の状況および試験またはスクリーニング目的の両方においてＦＶＩＩＩの阻害に使用され得る。
【００６６】
本発明のさらなる実施形態は、抗体ＢＯＩＩＢ２と実質的に同じ特性を有するモノクローナル抗体に関し、より詳しくは、動物、好ましくはマウスにおいて、例えばマウスにＦＶＩＩＩに注射することによる意図的な免疫処置を行ない、次いで、脾臓のリンパ球をマウス骨髄腫細胞株と融合させた後、抗ＦＶＩＩＩ抗体を産生する細胞培養物を同定およびクローニングすることによって生成されるモノクローナル抗体に関する。任意選択で、抗体のさらなる選択を、ＢＯＩＩＢ２エピトープとの反応性に基づいて行なう。あるいはまた、動物をＢＯＩＩＢ２エピトープで、例えば、該エピトープの配列を有するペプチドを注射することにより免疫処置し、次いでかかる抗体をさらにヒト化し得る。
【００６７】
本発明の別の実施形態は、抗体ＢＯＩＩＢ２と実質的に同じ特性を有し、本明細書に記載の方法を用いること、すなわち、以下の工程
・まず、記憶ＩｇＧ担持Ｂ細胞を血友病患者のＰＢＭＣから調製する工程
・続いて、例えばトランスフェクト細胞株における場合のように、固定化ＣＤ４０リガンドを用いてＣＤ４０受容体による記憶Ｂ細胞の活性化を行ない、ＣＤ４０と交差反応させる工程、および
・ＥＢＶを添加して該細胞株を不死化させる工程
を行なうことによって血友病患者から得られるモノクローナル抗体に関する。
【００６８】
本発明のさらなる一態様は、ＢＣＣＭに受託番号ＬＭＢＰ  ６４２２ＣＢで寄託された細胞株によって産生され、ＦＶＩＩＩに結合してＦＶＩＩＩ活性を阻害し得るモノクローナル抗体ＢＯＩＩＢ２に由来する抗体およびその抗原結合断片に関する。抗体ＢＯＩＩＢ２に由来する抗体は、典型的には、ＢＯＩＩＢ２の少なくとも２つのＣＤＲを含む。典型的には、抗原結合は、主に、重鎖および軽鎖可変領域のＣＤＲ２およびＣＤＲ３によって決定される。さらなる特別な実施形態において、抗体ＢＯＩＩＢ２の誘導体は、抗体ＢＯＩＩＢ２の重鎖および／または可変軽鎖領域を含む。抗体ＢＯＩＩＢ２の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号２および配列番号４に開示する。
【００６９】
本発明のさらなる実施形態は、それぞれ、配列番号２および／または配列番号４と、少なくとも８０％、特に少なくとも８５％、より特別には少なくとも９０％、最も特別には少なくとも９５％配列同一性を有する可変重鎖領域およびまたは可変軽鎖領域を含む、抗体ＢＯＩＩＢ２に由来する抗体に関する。
【００７０】
種々の型の抗体ＢＯＩＩＢ２の誘導体が、本発明の状況において想定される。したがって、本発明はまた、ハイブリッド抗体またはキメラ抗体または二価抗体（すなわち、２つ
の異なる特異性を兼ね備えるもの）に関する。本発明の特別な実施形態は、図３の可変重鎖領域および／または軽鎖領域あるいはその一部分を含むハイブリッド抗体、ならびに配列番号５〜配列番号１０のＣＤＲの少なくとも２つ、より特別には３〜５つ、最も特別には６つすべてを含む抗体に関する。あるいはまた、本発明は、配列番号５〜１０とそれぞれ、少なくとも８０％、特に少なくとも８５％、より特別には少なくとも９０％、最も特別には少なくとも９５％の配列同一性を有する少なくとも２つ、より特別には３〜５つ、最も特別には６つのＣＤＲを含むハイブリッド抗体を提供する。
【００７１】
異なる抗体由来の結合相補性決定領域（「ＣＤＲ」）を関連させる方法は、当業者に知られている［例えば、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ＩｇＧ−ｌｉｋｅ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｍａｒｖｉｎ  ＪＳおよびＺｈｕ  Ｚ  ｉｎ  Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ  Ｓｉｎｉｃａ，２００５，２６：６４９−６５８を参照のこと］。あるいはまた、本発明の非ヒト抗ＦＶＩＩＩ抗体のアミノ酸をより限定的な数で置き換えることも想定される。
【００７２】
また別の態様は、本発明の抗体の機能性断片、例えば、本発明の抗体の誘導体の断片、例えば、キメラ抗体またはヒト化抗体の断片を提供する。本明細書に記載の抗体の機能性断片は、該断片が誘導される完全長抗体の少なくとも１つの結合機能および／またはモジュレーション機能を保持している。特別な機能性断片は、対応する完全長抗体（例えば、ＦＶＩＩＩのＡ２ドメインに対する特異性）の抗原結合機能を保持している。特別な機能性断片は、ＦＶＩＩＩに特徴的な１つ以上の機能を阻害する能力、例えば、その凝固促進活性を保持している。具体的な一実施形態によれば、本発明は、抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、２つ以上のＣＤＲ組合せ、該抗体のＣＤＲの２つ以上を含むペプチド、またはＢＯＩＩＢ２などの本発明のＦＶＩＩＩ結合抗体の単一の可変ドメインに関する。かかる断片は、酵素的切断または組換え手法によって作製され得る。Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片は、当該技術分野でよく知られた方法、例えば、Ｓｔａｎｗｏｒｔｈら，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８），第１巻  第８章（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）に記載のものを用いてモノクローナル抗体のタンパク質分解的消化によって生成され得る。かかる断片は、抗原に結合する能力を保持しており、親抗体の多数の特質、例えば、補体活性化またはＦｃγ受容体に結合する能力などを失ったものである。より詳しくは、本発明は、それぞれ配列番号２および配列番号４に対応するＢＯＩＩＢ２およびその誘導体の重鎖および軽鎖の可変領域を提供する。さらなる本発明の特別な一実施形態は、ＢＯＩＩＢ２およびその誘導体の相補性決定領域（ＣＤＲ）に関する。ＣＤＲの同定のために用いられる（ｆｏｌｌｏｗ）最も一般的な２つの方法は、ＩＭＧＴおよびＫＡＢＡＴであり、ＢＯＩＩＢ２のＣＤＲのいずれかの型の１つより多くを含む断片、ならびにこれらの断片またはＣＤＲを含むＢＯＩＩＢ２の誘導体が、本発明の状況において想定される。ＣＤＲのＥＭＧＴ同定によれば、ＢＯＩＩＢ２の可変領域内のＣＤＲ領域は、配列番号５〜１０に対応する。
【００７３】
本発明のさらなる実施形態は、それぞれ配列番号２および配列番号４と少なくとも８０％、特に少なくとも８５％、より特別には少なくとも９０％、最も特別には少なくとも９５％配列同一性を有する重鎖可変領域および／または軽鎖領域をＣＤＲ領域内に含む抗体断片に関する。フレームワーク領域内の配列同一性は、限定されないが、８０％未満であり得る。また、それぞれ配列番号５〜１０の配列と少なくとも８０％、特に少なくとも８５％、より特別には少なくとも９０％、最も特別には少なくとも９５％配列同一性を有する少なくとも２つのＣＤＲを含む抗体断片が想定される。
【００７４】
本発明のさらなる具体的な一実施形態は、ＦＶＩＩＩに対するモノクローナル抗体、より詳しくはＢＯＩＩＢ２の可溶性または膜固定単鎖可変部分を提供する。単鎖可変断片（
ｓｃＦｖ）は、遺伝子操作された抗体断片であり、通常、可動型ペプチドリンカーによって互いに連結された免疫グロブリンの可変重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）、またはその一部分からなる。任意選択で、ｓｃＦｖは、目的の抗体のＣＤＲ領域と別の抗体のフレームワーク領域とを含む。抗体の単鎖可変部分を得る方法は、当業者に知られている。例えば、該方法は、別々の反応でのヒト重鎖および軽鎖の可変部分ＤＮＡ配列の増幅ならびにクローニングの後、２工程ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＶＨとＶＬ間への１５アミノ酸リンカー配列、例えば（Ｇｌｙ４  Ｓｅｒ）３の挿入を含むものであり得る（例えば、ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ，「ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ」（１９９５），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ，ＵＳＡを参照のこと）。次いで、得られた断片は、単鎖断片可変断片（ｓｃＦｖ）の発現用の適当なベクター内に、可溶性またはファージディスプレイポリペプチドとして挿入され得る。これは、当業者によく知られた方法（例えば、Ｇｉｌｌｉｌａｎｄら，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ（１９９６）４７：１−２０に記載のものなど）によってなされ得る。
【００７５】
本発明はまた、ＦＶＩＩＩに結合し得るモノクローナル抗体の超可変領域に代表的なペプチドまたはその組合せを提供する。かかるペプチドは、アプライドバイオシステムズ合成装置、例えば、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ（ＵＳＡ）から入手可能な９０５０型などのポリペプチド合成装置または関連手法のモデルを用いた合成によって得られ得る。
【００７６】
また、本発明のさらなる一態様は、ＩｇＧアイソタイプの、より特別にはＦＶＩＩＩのＡ２ドメインに指向されるヒトモノクローナル抗ＦＶＩＩＩ抗体、例えば、ＢＯＩＩＢ２のエピトープに結合してＦＶＩＩＩの機能を阻害する抗体の調製方法に関し、該方法は、まず、記憶ＩｇＧ担持Ｂ細胞を、ＩｇＧ抗体を有する血友病患者のＰＢＭＣから調製する工程、続いて、ＣＤ４０受容体による記憶Ｂ細胞の活性化を行なう工程、およびＥＢＶを添加して該細胞株を不死化させる工程を含む。
【００７７】
ＩｇＧアイソタイプのヒトモノクローナル抗ＦＶＩＩＩ抗体の作製に使用される方法は、Ｇｈａｒａｇｏｚｌｏｕら（Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．２００３：１２（３）：６７−７６）に記載のものと、以下のように異なる：
（１）第１の工程は、ＩｇＧ担持Ｂ細胞を、患者から採取したＰＢＭＣからＦＶＩＩＩに対するインヒビターを用いて分取することからなる。したがって、ＩｇＭ担持Ｂ細胞は、抗ヒトＩｇＭ  抗体を担持している磁気ビーズ上への吸着によって枯渇される。Ｇｈａｒａｇｏｚｌｏｕらによって調製された抗体は、ＰＢＭＣから直接作製されたものであり、ＥＢＶによって形質転換され易い唯一の末梢血Ｂ細胞であるＩｇＭ担持Ｂ細胞を特異的に標的化する；
（２）ＩｇＧ担持Ｂ細胞（記憶Ｂ細胞）は、次いで、ヒトＣＤ４０のリガンド（ＣＤ４０Ｌ）でトランスフェクトされた細胞株（通常、線維芽細胞細胞株）に曝露される。これにより、Ｂ細胞表面でのＣＤ４０の活性化によって生存シグナルが伝達されるため、培養中、Ｂ細胞の初期のアポトーシスの回避（ｏｖｅｒｃｏｍｅ）が可能になる。この工程は、Ｇｈａｒａｇｏｚｌｏｕらの記載にはない。
【００７８】
本発明の方法の別の実施形態は、ＩｇＧアイソタイプの、より特別にはＦＶＩＩＩのＡ２ドメインに指向されるモノクローナル抗ＦＶＩＩＩ抗体、例えば、完全エピトープ配列または配列番号１１の配列を含むペプチドでの哺乳動物、例えばマウスの免疫処置によって、ＢＯＩＩＢ２のエピトープに結合する抗体などの調製方法に関する。この目的に使用されるペプチドは、他のアミノ酸をさらにまた含むものであってもよい。
【００７９】
したがって、本発明のまた別の態様は、本発明の抗ヒトＦＶＩＩＩ抗体を産生する細胞株、より特別には、モノクローナル抗体ＢＯＩＩＢ２またはその断片もしくは誘導体を産
生する細胞株に関する。本発明のこの態様の特別な一実施形態は、本発明によるＩｇＧアイソタイプのヒトモノクローナル抗体を産生するＢＯＩＩＢ２という名称のハイブリドーマ細胞株である。細胞株ＢＯＩＩＢ２は、ＢＣＣＭ／ＬＭＢＰに受託番号ＬＭＢＰ  ６４２２ＣＢで（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｃｏ−ｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ／Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕｍ  ｖｏｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｈｅｎｔ  Ｋ．Ｌ．Ｌｅｄｅｇａｎｃｋｓｔｒａａｔ  ３５，Ｂ−９０００  Ｇｈｅｎｔ，ＢＥ）、２００５年８月４日に発明者Ｍａｒｃ  Ｊａｃｑｕｅｍｉｎによって寄託された。さらに、本発明は、ＦＶＩＩＩとの結合に関して、本明細書に記載の上記の細胞株ＢＯＩＩＢ２から得られるヒトモノクローナル抗体ＢＯＩＩＢ２と競合し得るヒトモノクローナル抗体を産生する細胞株を提供する。
【００８０】
本発明のまた別の態様は、抗体ＢＯＩＩＢ２またはその断片もしくは誘導体（例えば、細胞株ＢＯＩＩＢ２から得られ得るものなど）の可変重鎖または可変軽鎖領域をコードするヌクレオチドを提供することに関する。本発明の特別な一実施形態は、それぞれ配列番号２および配列番号４によって規定される可変重鎖領域および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列、例えば限定されないが、配列番号１および配列番号３のヌクレオチド配列などに関する。また、本発明の状況において、配列番号５〜１０にて特定されるモノクローナル抗体ＢＯＩＩＢ２の１つ以上のＣＤＲ領域をコードするヌクレオチド配列が提供される。本発明の特別な実施形態としては、ＢＯＩＩＢ２のｓｃＦｖをコードする配列ならびにこれと少なくとも８０％配列同一性を有する配列（最も特別には、ＣＤＲをコードする領域内に）。本発明はまた、本明細書に記載のモノクローナル抗体またはその断片に対応する相補配列を含む。特に、本発明は、本明細書に記載のモノクローナル抗体もしくはその断片から構築されるプローブ、または本明細書に記載のポリヌクレオチドもしくは相補配列に由来するプローブを含む。
【００８１】
上記の本発明のヌクレオチドならびに細胞株ＢＯＩＩＢ２から得られ得るＢＯＩＩＢ２をコードするヌクレオチド配列は、例えば組換え法による抗体および他の抗原結合断片の作製に有用である。組換え抗体および抗体断片の作製のための方法、例えば、クローニングならびに抗体遺伝子の操作、ｓｃＦｖおよび他の抗原結合断片の作製が、当該技術分野において利用可能である。したがって、さらなる一態様は、ＦＶＩＩＩ結合の作製方法、および好ましくは、組換え手法により本発明のヌクレオチド配列の１つ以上を含むＦＶＩＩＩ−阻害性の分子に関する。
【００８２】
さらに、本発明のまた別の態様は、凝固がその病態に寄与する疾患の予防または処置のための医薬組成物を提供する。かかる凝固障害の例としては、深部静脈血栓症、肺塞栓症、脳卒中、心筋梗塞、ＳＩＲＳと呼ばれる障害（全身性炎症反応症候群）が挙げられる。
【００８３】
具体的な一実施形態によれば、本明細書に記載の抗体ならびにその抗原結合断片および誘導体は、凝固障害の処置および／または予防に特に適している。さらなる本発明の特別な一実施形態は、ＳＩＲＳ、より特別には、急性膵炎、虚血、多発外傷および組織損傷、出血性ショック、免疫媒介型臓器損傷および感染後のＳＩＲＳの予防および／または処置のための本発明の抗体および抗体断片の使用に関する。
【００８４】
本発明の重要な態様は、抗体、その断片および誘導体によって上記の疾患の処置および／または予防が、凝固障害の他の処置に起因する、または該処置では予測される副作用なく、可能になることである。
【００８５】
本発明の特別な一実施形態は、活性成分としてモノクローナル抗体ＢＯＩＩＢ２またはその抗原結合断片もしくは誘導体を、薬学的に許容され得る担体との混合状態で含む医薬
組成物に関する。本発明の医薬組成物は、前記モノクローナル抗体、断片または誘導体の治療有効量（例えば、処置または予防方法に関して以下に示すものなど）を含むものであるのがよい。
【００８６】
また本発明の別の態様によれば、本発明によるＦＶＩＩＩのＡ２ドメインに対する２つの異なる抗体または抗原結合その断片もしくは誘導体の組合せを含む医薬組成物が提供される。より特別には、該２つの異なる抗体はともに、ＦＶＩＩＩの結合に関して互いに競合する。具体的な実施形態において、該２つの抗体は、同じエピトープ、より特別には、抗体ＢＯＩＩＢ２のエピトープに結合するが、阻害活性（例えば、親和性の結果として）が異なる。同じ抗原に関して競合し得るが異なる阻害活性を有する２つの抗体を異なる比率で混合することにより、抗体または抗原結合断片の各々の阻害活性の範囲内の阻害活性を有する抗体混合物の作製が可能になる。具体的な一実施形態によれば、該２つの抗体の一方は、抗体ＢＯＩＩＢ２またはその抗原結合断片である。
【００８７】
また本発明の別の態様によれば、本発明の抗体または抗体断片もしくは誘導体および別の抗凝固剤を含む医薬組成物が提供される。好適な他の抗凝固製剤ならびにその通常の投薬量は、該製剤が属する類型に依存し、当業者によく知られている。
【００８８】
本発明の医薬組成物は、処置対象の疾患に対して活性な他の化合物／薬物の治療有効量をさらに含むものであり得る。
【００８９】
本発明の医薬組成物における使用に好適な医薬用担体は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１６版（１９８０）に記載されており、その製剤は当業者によく知られている。これらとしては、任意のあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤（例えば、フェノール、ソルビン酸、クロロブタノール）、等張剤（例えば、糖類または塩化ナトリウム）などが挙げられる。組成物中のモノクローナル抗体活性成分の作用持続時間を制御するため、さらなる成分を含めてもよい。したがって、制御放出組成物は、適切なポリマー担体、例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロリドン、エチレン−酢酸ビニルコポリマー、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、硫酸プロタミンなどを選択することにより得られ得る。薬物放出速度および作用持続時間はまた、モノクローナル抗体活性成分を、高分子物質、例えば、ヒドロゲル、ポリ乳酸、ヒドロキシメチルセルロース、ポリメタクリル酸メチルなどおよびその他の上記のポリマーの粒子、例えばマイクロカプセル内に組み込むことによっても制御され得る。かかる方法としては、リポソーム、ミクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、ナノカプセルなどのコロイド薬物送達系が挙げられる。投与経路に応じて、活性成分を含む医薬組成物には、保護コーティング剤が必要とされ得る。注射用途に適した医薬形態としては、滅菌水性の液剤または分散剤および即時調製のための滅菌粉剤が挙げられる。したがって、典型的な担体としては、生体適合性水性バッファー、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよびその混合物が挙げられる。
【００９０】
本発明はまた、医薬としてのリガンド、すなわち本発明のモノクローナル抗体の使用を提供する。より好ましくは、本発明において使用される医薬は、凝固障害の予防および／または処置するための一手段である。前記リガンドは、患者に対して当該技術分野でよく知られた任意の手段、すなわち、経口、鼻腔内、皮下、筋肉内、皮内、静脈内、動脈内、非経口またはカテーテル法によって提供され得る。
【００９１】
したがって、本発明は、凝固障害の処置および／または予防方法であって、かかる処置または予防を必要とする哺乳動物に、本明細書において上記に開示したものなどのリガンドの治療有効量を投与することを含む方法を提供する。好ましくは、前記リガンドは、細
胞株ＢＯＩＩＢ２から得られ得るＩｇＧアイソタイプのヒトモノクローナル抗体または抗原結合断片Ｆａｂ、Ｆａｂ’もしくはＦ（ａｂ’）２、相補性決定領域（ＣＤＲ）、可溶性もしくは膜固定単鎖可変断片もしくは一部分（ｓｃＦｖ）、単一の可変ドメイン、あるいはこれらの要素の任意の誘導体または組合せである。
【００９２】
本発明のまた別の態様は、ヒト試料におけるＦＶＩＩＩの免疫学的検出のための本発明のモノクローナル抗体および抗原結合断片の使用、ならびにかかる検出に適したキットの構成要素としての使用に関する。抗原の免疫学的検出方法は、当該技術分野で知られており、限定されないが、ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡおよび免疫組織化学的方法が挙げられる。ＦＶＩＩＩ抗原に対する本発明の抗体の結合は、例えば、標識された抗ヒト抗体によって間接的に検出され得る。あるいはまた、抗体またはその断片を直接標識してもよい。
【００９３】
本発明のまた別の態様は、診断用ツールとしての本発明の抗ＦＶＩＩＩ抗体およびその抗原結合断片の使用に関する。本発明の抗体または抗体断片は、病理学的状態の診断において、または正常状態では第ＶＩＩＩ因子がどのようなレベルであるかを、例えば、本発明の抗体または抗原結合断片がインビボで標識され、可視化される画像形成手法により確立することにおいて使用され得る。本発明の抗体の結合をインビボで画像化するためのさまざまな標識が当該技術分野で知られており、限定されないが、光学的（例えば、蛍光）、金属および磁性標識が挙げられ、これらは、各々、特定の（放射線および）検出装置を必要とする。本発明のこの態様の特別な一実施形態は、疾患の予後の予測および処置レジメンの決定における本発明の抗体の使用に関する。
【００９４】
本発明のまた別の態様は、ＦＶＩＩＩを阻害する化合物のスクリーニングのため、または好都合な特性を有する化合物を同定するための本発明の抗体の使用に関する。試験対象の化合物と本発明の抗体または断片との併用投与により、該化合物が、本発明の抗体または断片単独の投与時に観察される効果に対して付加的な効果を有するか否かを確認することが可能になる。他の態様、例えば、抗ＦＶＩＩＩ抗体との組合せでの化合物の反対効果または毒性などもまたこのようにして測定され得る。
【００９５】
ＢＯＩＩＢ２が結合するエピトープまたは対応する核酸配列は、種々の目的、例えば、モノクローナルＩｇＧ抗体を産生させるために哺乳動物の免疫処置のために使用され得るか、またはＦＶＩＩＩのＡ２ドメイン上のＢＯＩＩＢ２のエピトープに特異的に結合する阻害性ＦＶＩＩＩ分子の検出のためのアッセイにおいて使用され得る。
【００９６】
本発明を、以下の実施例によってさらに記載する。実施例は、例示の目的のために示すにすぎない。
【実施例】
【００９７】
以下の実施例により、ヒト抗Ａ２モノクローナル抗体の作製、特性化および使用の説明を提供する。
【００９８】
実施例１：ヒト抗Ａ２モノクローナル抗体の作製
インヒビターを有する血友病Ａ患者からインフォームドコンセントを得た後、末梢静脈血を採取した。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度遠心分離によって標準的な方法を用いて調製した。すべての細胞培養は、１０％ＩｇＧ無含有ウマ血清、１．５ｇ／ｌグルコース、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１％のＣａｒｙｏｓｅｒおよび８０ｍｇ／ｌのＧｅｏｍｙｃｉｎを補給したダルベッコＭＥＭ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘ  Ｆ１２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で行なった。
【００９９】
ＰＢＭＣを、以下のようにして不死化した。１０７個のＰＢＭＣを２ｍｌの培養培地中
に再懸濁し、２００μｌのエプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）上清み（Ｂ９５−８菌株）（１４）とともに２時間３７℃でインキュベートした。次いで、細胞を３００〜２４，０００細胞／ウェルで、マイトマイシンＣ（５０μｇ／ｍｌ）で１時間３７℃にて処理した３Ｔ６−ＴＲＡＰ細胞を入れた９６ウェルマウクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）内に播種し、培養ウェル内に、ＰＢＭＣのＥＢＶ感染前の日に播種した。３Ｔ６細胞株は、ヒトＣＤ４０リガンド用の発現ベクター（３Ｔ６−ＴＲＡＰ）で安定的にトランスフェクトされたものであった。１５０μｌの培養上清みを、１週間ごとに新鮮培養培地と交換した。個々のウェル内の成長速度に応じて４〜８週間後、培養上清みをＥＬＩＳＡにおいて、抗ｆＶＩＩＩ抗体の存在について試験した。陽性細胞株を２４ウェルプレートに移し、直ちに、６０細胞／９６ウェルプレートでフィーダー細胞なしでクローニングした。
【０１００】
したがって、ＦＶＩＩＩに対する抗体は、上清みを、ＦＶＩＩＩまたはフォン・ビルブラント因子（ｖＷＦ）との複合体のＦＶＩＩＩでコートしたポリスチレンプレートと反応させることにより同定される。特異的抗体の結合は、酵素に連結させた抗ヒトＩｇＧ試薬の添加によって検出される。該酵素の存在下で着色化合物に変換される酵素基質の添加により、特異的抗体の検出が可能になる。かかる方法は、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）と呼ばれ、当業者によく知られている。詳細な記載は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第２章，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ，１９９４（１５）を参照にするとよい。
【０１０１】
次いで、抗ＦＶＩＩＩ抗体を産生するＢ細胞を拡大培養し、限定希釈によってクローニングする。クローニングを行なうための方法は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第２章，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ，１９９４（１５）に記載されている。
【０１０２】
所望の特性、すなわち、ＦＶＩＩＩの凝固促進活性を阻害する能力を有する抗ＦＶＩＩＩ抗体は、市販の発色アッセイキットを製造業者の推奨に従って用いて同定される。充分な親和性を有するＦＶＩＩＩ機能を阻害する抗体を選択する。図１は、ＦＶＩＩＩのＡ２ドメインに特異的なＢＯＩＩＢ２と呼ばれる抗体の生成を示す。
【０１０３】
ＦＶＩＩＩに対して充分な結合アビディティを有し、ＦＶＩＩＩ機能を阻害する抗体を、次いで、バルク培養にて産生させ、アフィニティクロマトグラフィーによって当業者によく知られた方法を用いて精製する。
【０１０４】
あるいはまた、必要とされる特性を有する抗体は、動物の意図的な免疫処置によって生成させ得る。したがって、マウスにヒトＦＶＩＩＩをアジュバントと注射する。次いで、モノクローナル抗ヒトＦＶＩＩＩ抗体は、脾臓リンパ球とマウス骨髄腫細胞株との融合によって得られる。抗ＦＶＩＩＩ抗体を生成する細胞培養上清みを同定し、限定希釈によってクローン化する。かかる方法の一般的な記載は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第２章，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ，１９９４（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９４）第２章，編集Ｃｏｌｉｇａｎ  ＪＥ，Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ  ＡＭ，Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ  ＤＨ，Ｓｈｅｖａｃｈ  ＥＭ，Ｓｔｒｏｂｅｒ  Ｗ，Ｃｏｉｃｏ  Ｒ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ）を見るとよい。所望の特性を有するインヒビターのさらなる選択を、上記のようにして行なう。
【０１０５】
マウスにおいて生成された抗体を、次いでヒト化する。したがって、マウスの重鎖および軽鎖の可変部分の配列を、ヒト免疫グロブリン可変領域とアラインメントし、フレーム
ワーク領域内で最大の相同性を有するヒト抗体を同定する。ヒト化可変領域をコードするＤＮＡ断片を、次いで、ＰＣＲに基づくＣＤＲグラフティング方法によって、例えば、Ｓａｔｏら（Ｓａｔｏ  Ｋ，ら，１９９３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：８５１−８５６１６）に記載のようにして合成する。ヒト化抗体の重鎖可変部分をコードする最終ＰＣＲ産物を消化し、第１の発現プラスミド内のヒトＣγ−１遺伝子の上流にサブクローニングする。最終構築物のヒト化軽鎖可変領域を、第２の発現プラスミド内のヒトＣκ遺伝子の上流内に挿入する。該２つの構築物を、ＣＯＳ細胞発現系内にコトランスフェクトする。これらの方法の一般的な記載は、Ｓａｔｏら（上記）を見るとよい。
【０１０６】
実施例２：抗Ａ２抗体の特異性および親和性の特性化
Ａ２ドメインに対する抗体の特異性を、特異性に関して、既報（Ｂｅｎｈｉｄａら，調製の原稿）のような転写−翻訳系の組合せをウサギ網状赤血球とともに用いることにより、さらにキャラクタライズする。簡単には、Ａ２ドメインの種々の断片を含有するプラスミドのライブラリーを構築する。
【０１０７】
７．２Ｋｂの完全長ＦＶＩＩＩ  ｃＤＮＡを含有するプラスミド構築物ｐＳＰ６４−ＦＶＩＩＩ（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を鋳型として使用し、ＰＣＲによってあらゆる断片を作製した。変異または欠失を有するｃＤＮＡ断片を、Ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｏｖｅｒｌａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−ＰＣＲ（ＳＯＥ−ＰＣＲ）（Ｈｏｒｔｏｎ
ＲＭおよびＰｅａｓｅ  ＬＲ．，１９９１，Ｉｎ：ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  ＭＪ編，Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｏｘｆｏｒｄ：ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ：２１７−２２８：Ｊａｃｑｕｅｍｉｎ  Ｍ，ら  ２０００，Ｂｌｏｏｄ．Ａｕｇ  ｌ：９６（３）：９５８−６５）によって作製した。１５アミノ酸未満のＦＶＩＩＩの断片には、特異的抗タグ抗体による認識のためのユビキチンおよび／またはＴ７を含むタグ配列を、Ｓ標識のためのシステインの相補配列とともに付加した。ポリペプチドコードＦＶＩＩＩ断片を、ＴＮＴカップリングＲｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）において製造業者の使用説明書に従って作製した。
【０１０８】
転写された遺伝子の免疫沈降を、以下のようにして行なった。特異的抗体を含有する試料の希釈物を、４０μｌのプロテインＡセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に５００μｌの適切なバッファーにて混合し、混合物を１時間４℃で静かに振とうした。未結合抗体を、一連の遠心分離および洗浄によって除去した。抗体−プロテインＡセファロースの複合体を、３μｌのインビトロＬ−（３５Ｓ）メチオニン標識ＦＶＩＩＩポリペプチドを補給した３００μｌのバッファー中に再懸濁し、４℃で２時間インキュベーションする。結合抗原／抗体複合体をビーズから、３分間３０μｌの変性試料バッファー中で煮沸することによって溶出し、放射能をカウントする。第２のアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析し、オートラジオグラフィーによって可視化する。
【０１０９】
より詳細には、ＢＯＩＩＢ２のエピトープの決定のため、ＦＶＩＩＩのＡ２ドメインの一部分の野生型配列に対応するアミノ酸残基３７９〜５４６をコードするポリペプチドを、ＴｎＴカップリングＲｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）において製造業者の使用説明書に従って作製する。この系は、ウサギ網状赤血球によってもたらされる転写−翻訳の組合せを含む。さらに、変異Ｒ４８４Ａ；Ｙ４８７Ａ；Ｒ４８９ＡおよびＰ４９２Ａを含む３７９〜５４６をコードするポリペプチド、ならびに４６１〜５３１をコードするポリペプチドもまた作製した。反応混合物中への３５Ｓ−メチオニンの添加によって、ポリペプチドを放射性標識する。ＢＯＩＩＢ２抗体をプロテイン−Ａセファロースとともにインキュベートし、洗浄し、再懸濁した後、放射性標識したポリペプチドの１つを添加する。この懸濁液を９０分間室温でインキュベートし、洗浄し、標識ポリペプチドをセファロース
ビーズから、ドデシル硫酸ナトリウム含有バッファーの添加によって溶出する。標識ポリペプチドの存在（シンチレーションカウンティングによって評価）は、ＢＯＩＩＢ２が、かかるペプチド上への結合部位を有することを示す。
【０１１０】
図２は、抗体ＢＯＩＩＢ２のかかる実験の結果を示す。残基３８９〜５１０を含む領域内の結合部位は、Ａ２ドメイン内に同定されている。しかしながら、エピトープのさらなる詳細な表示（ｄｅｌｉｎｅａｔｉｏｎ）は、かかる断片のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかのトリミング（ｔｒｉｍｍｉｎｇ  ｏｆｆ）によって、抗体結合が急速に破壊されるため、困難であった。したがって、本発明者らは、単一の変異を主な推定結合部位、すなわち４８４〜５０９内に導入する段階的なアプローチで進めた。図２は、かかる部位内の単一の変異によって抗体結合が破壊されることを示す。さらに、単一の変異を、３８９〜３９１（Ｌｕｂｉｎ  ＩＭら  １９９７，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８：２７２（４８）：３０１９１−５１９）内に位置する３グルタミン酸の配列内に導入すると、これによっても、結合の低下がもたらされた（データ示さず）。したがって、結合部位は４８４〜５０９アミノ酸配列内に位置するが、効率的な抗体結合には、少し離れて３グルタミン酸が必要とされる結論付けられた。
【０１１１】
抗体親和性は、表面プラズモン共鳴系（Ｏ’Ｓｈａｎｅｓｓｙ  ＤＪ，ら  １９９３，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２１２：４５７−４６２）を用いて計算される。したがって、ＦＶＩＩＩとｈｕ−ｍＡｂ間のリアルタイムの動的相互作用を、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ機器（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ）を用いて解析した。精製ＢＯＩＩＢ２（１０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）中２０μｇ／ｍｌ）を、ＣＭ５センサーチップの活性化表面上に、製造業者の使用説明書に従って固定化した。すべての結合実験は、ＨＢＳ中、１０μｌ／分の一定流速で行なった。ＦＶＩＩＩ含有ＨＢＳをＥＣＲ固定化センサーチップの表面上に種々の濃度で注入した。各サイクルの最後に、表面をＨＣｌ（ｐＨ２）で３６秒間洗い流すことにより再生させた。会合および解離の速度定数を、ＢＩＡ評価ソフトウェアパッケージを用い、１つまたは２つの固定化しリガンドに対する１つの被検物質の結合を想定したモデルに従って決定した。
【０１１２】
ＢＯＩＩＢ２は、ｋｄｉｓｓが１×１０−８ｓ−１であり、ｋａｓｓが１×１０３Ｍ−１ｓ−１であると評価された。
【０１１３】
実施例３：ＢＯＩＩＢ２抗体の配列決定
ＥＢＶ不死化ヒトＢ細胞株からのＲＮＡの単離を、ＴＲＩｚｏｌ試薬を製造業者の使用説明書に従って用いて行なった（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。第１鎖ｃＤＮＡ合成用のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ予備増幅系を用いてｃＤＮＡを合成した。重鎖可変領域遺伝子（ＶＨ）をコードするｃＤＮＡを、ＶＨファミリーのリーダー配列およびＣγ領域の第１エキソンに特異的なプライマーを用いたＰＣＲによって既報（Ｊａｃｑｕｅｍｉｎ  Ｍ，ら  ２０００，Ｂｌｏｏｄ  １：９５（１）：１５６−６３）のとおりに増幅した。アニーリングは、６０℃で４０ＰＣＲサイクル行なった。適切な大きさ（４６０ｂｐ）のＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲルから単離し、ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＢＶ，Ｌｅｅｋ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いてクローニングした。目的のＶＨ遺伝子ファミリーに対応するプライマーの組を用いたＰＣＲスクリーニングを、無作為に選択したコロニーの培養物において行なった。陽性コロニー由来のプラスミドＤＮＡを、Ｗｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）を用いて単離し、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を製造業者の使用説明書に従って用いて両方向で配列決定した。可変遺伝子配列の解析を、「Ｖ  ＢＡＳＥ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ」（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら，ＭＲＣ  Ｃｅ
ｎｔｒｅ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を用いて行なった。
【０１１４】
ＢＯＩＩＢ２  ＶＨ遺伝子は、ＶＨ４グループに属し、ＤＰ−７１に最も相同である。Ｊセグメントは、ＪＨ６ｃに最も相同であった。クローニングされた軽鎖遺伝子の配列決定により、ＶＬはＶκＭであり、ＪセグメントはＪκ５であると同定された（図３）。図３は、リーダーペプチド配列を有する抗体の完全な配列を示す。本発明はまた、リーダー配列をもたない抗体に関する。得られた配列は以下の通りであった。
【０１１５】
実施例４：モノクローナル抗体の断片または誘導体の作製
モノクローナル抗体または誘導体の断片は、本発明の目的に使用され得る。充分報告された方法（Ｓｔａｎｗｏｒｔｈ  ＤおよびＴｕｒｎｅｒ  ＭＷ，１９７８，第６章，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙの第１巻，編集Ｗｅｉｒ  ＤＭ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）を用いた抗体のタンパク質分解的消化により、Ｆ（ａｂ’）２またはＦａｂ断片のいずれかが生成する。かかる断片は、抗体結合部位を含み、親抗体のいくつかの特性、例えば、補体活性化またはＦｃγ受容体への結合能力などが失われている。
【０１１６】
抗体の可溶性または膜固定単鎖可変部分が得られ得る。ヒト重鎖および軽鎖の可変部分のＤＮＡ配列を、別々の反応で増幅し、ＴＡクローニングベクター内に挿入する。１５−アミノ酸リンカー配列（例えば、（Ｇｌｙ４  Ｓｅｒ）３など）をＶＨとＶＬの間に、２工程ＰＣＲによって挿入する。得られた断片を、ｓｃＦｖ発現用の適当なベクター内に、可溶性またはファージディスプレイポリペプチドとして挿入する。かかる方法の記載は、Ｇｉｌｌｉｌａｎｄら（１９９６，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ４７：１−２０）を見るとよい。
【０１１７】
抗体の超可変領域の全部または一部の代表的なペプチドは、ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ合成装置または関連手法を用いた合成によって得られ得る。かかるペプチドは、単独または組合せで、親抗体のものと類似した特性を発揮する。
【０１１８】
あるいはまた、抗体のＣＤＲ領域の１以上、より特別には２つ以上を含むペプチドが、組換え法によって作製され得る。
【０１１９】
ＢＯＩＩＢ２に相同な抗体、例えば、８０％相同性を有する抗体、およびＦＶＩＩＩに対して同じかより高い親和性を有する抗体は、当該技術分野で知られた方法によって得られ得る。アミノ酸配列内、より特別には可変領域内またはさらにより特別にはＣＤＲ内の変異が、標準的な方法によって作製され得る。この後、親和性アッセイにおける得られた変異型の親和性の試験、阻害能力の試験、および本明細書に記載の方法により、エピトープが同じ状態で維持されているかか否かの試験が行なわれ得る。このようにして、修飾アミノ酸配列を有し、ＢＯＩＩＢ２に相同な抗体が得られ得る。あるいはまた、ＣＤＲ間のフレームワーク領域内の変異が、標準的な方法によって作製され得る。この後、得られ変異型の親和性および阻害能力が影響されたか否かの確認が行なわれ得る。
【０１２０】
実施例５：本発明の抗体の使用
・ＦＶＩＩＩ重鎖の３Ｄコンホメーションの確立
Ｃ２ドメインは、これまでに結晶化されたＦＶＩＩＩの唯一のドメインである。しかしながら、モデル構造の確認には、Ｃ２ドメインと特異的抗体との共結晶が必要とされた。したがって、Ｃ２ドメイン構造上に位置する推定リン脂質結合部位を、これらの部位を認識し、リン脂質への完全体ＦＶＩＩＩ分子の結合を阻害する抗体の結合により確認した。
かかる部位内の単一のアミノ酸置換によって、その機能的役割がさらに確認された。
【０１２１】
抗体との結晶を形成するための実験条件は、充分確立されている（例えば、Ｓｐｉｅｇｅｌ  ＰＣら  ２００１，Ｂｌｏｏｄ．ＪｕＩ  ｌ：９８（ｌ）：１３−９を参照のこと）。充分な親和性の抗体とのＡ２の共沈殿により、適切な開始条件の決定が大きく助長される。
・ＦＶＩＩＩ不活化の機構
ＦＶＩＩＩが不活化される主な機構の１つは、Ａ１およびＡ３−Ｃ１−Ｃ２で構成されたヘテロダイマーに非共有結合しているＡ２ドメインの解離によるものである（２６）。Ａ２ドメインを認識する抗体は、Ａ２の解離を加速することによりＦＶＩＩＩ機能を阻害し得る。Ａ２の生理学的解離をもたらす生化学的事象は充分確立されている（Ｊｅｎｋｉｎｓ  ＰＶら  ２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｍａｙ  ４：４３（１７）：５０９４−１０１）。
【０１２２】
ＦＶＩＩＩのＡ２ドメインの４８０〜５０９領域に対する抗体によって機能的活性が阻害され得る別の機構は、ＦＩＸａの結合の干渉によるものである。後者は、ＦＶＩＩＩ上の同じ領域に正確にマッピングされる低親和性結合部位を有する。したがって、ＢＯＩＩＢ２などの抗体の結合により、充分なＦＩＸａ酵素活性に必要とされるコンホメーションの変化が抑制され得る。
【０１２３】
図１は、機能的アッセイにおける、ＢＯＩＩＢ２がＦＶＩＩＩを阻害する能力の評価の結果を示す。
【０１２４】
機能的アッセイとして、本発明者らは、トロンビン（ｔｒｏｍｂｉｎ）活性化ＦＶＩＩＩが、第Ｘ因子の第Ｘａ因子への変換において第ＩＸａ因子の補因子としての機能を果たす発色アッセイを使用した。簡単には、ｒｅｃＦＶＩＩＩをＰＢＳ−ＢＳＡ溶液中に希釈した（１ＩＵ／ｍｌ）溶液２０μｌを、等容量のＢＯＩＩＢ２の連続希釈物（同じＰＢＳ−ＢＳＡ溶液中）と混合し（Ｘ軸（ａｘｅ））、１時間３７℃でインキュベートした。次いで、２０μｌの混合物を３分間室温にて、マイクロタイターウェル内で、２０μｌの化学反応物（ｒｅａｃｔｉｆ）１（第Ｘ因子）および２０μｌの化学反応物２（第ＩＸａ因子）とともにインキュベートした後、１００μｌの化学反応物３（発色基質および停止バッファー）を添加した。対照実験には、特異的抗体なしで、または同じ濃度の無関連抗体とともにインキュベートしたｒｅｃＦＶＩＩＩを含めた。基質着色の密度を４０５ｎｍで直接測定し、４５０ｎｍを参照とする。阻害割合（Ｙ軸）を、陽性対照ｒｅｃＦＶＩＩＩ
１ＩＵ／ｍｌに関して計算する。曲線は、ＢＯＩＩＢ２が、０．１μｇ／ｍｌの濃度でＦＶＩＩＩ機能を９９％まで阻害することを示した。
【０１２５】
・ＦＶＩＩＩクリアランス機構
ＦＶＩＩＩが循環系から排出される機構の１つは、低密度リポタンパク質受容体ファミリー（ＬＰＲ）への結合によるものである。ＬＰＲ受容体に対して少なくとも２つの結合部位が、ＦＶＩＩＩ分子のＡ２およびＣ２ドメインにおいてマッピングされた。Ａ２ドメインにマッピングされた部位は、単一のアミノ酸置換を特徴とし、本発明における抗体ＢＯＩＩＢ２で同定された抗体結合部位と重複する配列４８４〜５１０に対応することがわかった。したがって、ＢＯＩＩＢ２を用い、ＦＶＩＩＩの全クリアランスにおけるこのクリアランス機構の重要性が確立され得る。
【０１２６】
したがって、血友病Ａマウスに、２ＩＵの組換えＦＶＩＩＩまたは２ＩＵの組換えＦＶＩＩＩをＢＯＩＩＢ２とともにプレインキュベートすることにより作製された混合物のいずれかをＩＶ注射する。循環系からのＦＶＩＩＩのクリアランス率を、マウスから一定の時間間隔で採血し、残留ＦＶＩＩＩ活性を抗原特異的ＥＬＩＳＡによって測定することに
より確立する。
【０１２７】
実施例６：ＢＯＩＩＢ２抗体の存在下での血小板高含有血漿（ＰＲＰ）におけるトロンビン生成の評価
クエン酸バッファー（１容量の１２９ｍＭクエン酸ナトリウムに対して９容量の血液）を入れたチューブ内に血液を採取する。チューブを１５分間９００ｒｐｍで遠心機にかける。遠心分離後、ＰＲＰをピペッティングにより取り出し、収集する。血小板計数をＣｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒにて測定する。血小板をあまり含まない血漿を用い、ＰＲＰを３０００００血小板／μｌに調整する。８０μｌのＰＲＰを５分間、ＢＯＩＩＢ２抗体（３μｇ／ｍｌ）＋ＳｙｎｔｈＡｓｉｌビーズ（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）１／２００またはＩｎｎｏｖｉｎ（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）１／７５００を含有する２０μｌのＨｅｐｅｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｈｅｐｅｓ  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  １４０ｍＭ、ＢＳＡ  ５ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．３５）とともにインキュベートする。負の電荷を有するＳｙｎｔｈＡｓｉｌビーズにより凝固の内因性経路の活性化が可能になり、一方、組織因子のみを含有するＩｎｎｏｖｉｎにより、外因性経路の活性化が可能になる。純粋なＤＭＳＯ中に可溶化させ、発色（ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ）溶液（Ｈｅｐｅｓ  ２０ｍＭ、ＢＳＡ  ６０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．３５、ＣａＣ１２  １ｍ）中に希釈した２０μｌの基質（Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ）（Ｂａｃｈｅｍ；Ｂｕｂｂｅｎｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を、種々の試料に添加する。トロンビンにより分割されると、これは、蛍光ＡＭＣ（７−アミノ−４−メチルクマリン）を放出する。３分後、ＴｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅＴＭにおいて３９０ｎｍ励起／４６０ｍｍ発光フィルターセットで吸光度を読む。
【０１２８】
図５および６は、ＢＯＩＩＢ２が、凝固の内因性経路ならびに外因性経路によってトロンビン生成を充分に阻害することを示す。
【０１２９】
実施例７：抗体ＢＯＩＩＢ２と競合する抗体としての抗体の同定
ＦＶＩＩＩに対して指向される抗体は、従来のモノクローナル抗体手法によって作製されるか、またはインヒビターを有する血友病Ａ患者から得られるかのいずれかである。
【０１３０】
第ＶＩＩＩ因子結合抗体が抗体ＢＩＩＩＢ２と競合するか否かを確認するため、以下の方法を使用する。ポリスチレンマイクロタイター（ｍｉｃｒｏｔｉｔｒａｔｉｏｎ）プレートを、一晩４℃で、２μｇ／ｍｌの５０μＬの抗体とともにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中でインキュベートする。次いで、プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで４回洗浄する。ビオチン化組換えＦＶＩＩＩ（０．５マイクログラム／ｍｌ）を含有するＴｒｉｓ−ＢＳＡ−Ｔｗｅｅｎを、該抗体または種々の濃度のＢＯＩＩＢ２と混合した後、抗体コートプレートに添加する。４℃で２時間のインキュベーション期間後、プレートを４回洗浄し、１マイクログラム／ｍｌのアビジンペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）の添加によって、結合ビオチン化ＦＶＩＩＩを検出する。室温で３０分後、プレートを再度洗浄し、１００μＬのＯＰＤを補給する。得られたＯＤを、Ｅｍａｘ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａ）にて４９０ｎｍで読み取る。
【０１３１】
上記の実験における使用のためのビオチン化ＦＶＩＩＩは、Ｈｅｐｅｓバッファー（Ｈｅｐｅｓ  １０ｍＭ、ＮａＣｌ  ０．１５Ｍ、ＣａＣ１２  １０ｍＭ、ｐＨ  ８．５）中で透析した組換えＦＶＩＩＩ（１００マイクログラム／ｍｌ）を、１マイクログラム／ｍｌのスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）とともに２時間室温でインキュベートすることにより調製する。次いで、調製物をＨｅｐｅｓ  バッファーに対して透析し、−８０℃で保存する。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】図１は、機能的アッセイにおいてＢＯＩＩＢ２がＦＶＩＩＩを阻害する能力の評価である。阻害の割合（Ｙ軸）は、陽性対照ｒｅｃＦＶＩＩＩ  １ＩＵ／ｍｌに関して計算したものである。曲線は、ＢＯＩＩＢ２が、０．１μｇ／ｍｌの濃度でＦＶＩＩＩ機能を９９％まで阻害することを示す。
【図２】図２は、ＢＯＩＩＢ２エピトープマッピングである。Ａ２ドメイン残基３７９〜５４６（「３７９〜５４６」）、単一の変異を含むＡ２ドメイン残基３７９〜５４６（「３７９〜５４６Ｍｕｔ」）およびＡ２ドメイン残基４６１〜５３１（「４６１〜５３１」）ならびに対照Ｉｇ断片（「ｐＩｇタグ）（各々、ｃｍｙｃ９Ｅ１０でタグ化）に対する抗体ＢｏＩＩＢ２（「ＢｏＩＩＢ２）、抗ｃｍｙｃ９Ｅ１０抗体（「９Ｅ１０」）およびヒト血漿（健常ドナーから採取：「ヒト血漿」）の結合。結果は２連の平均であり、ＳＤを示す。
【図３】図３は、可変領域および定常領域ならびにＣＤＲの部位の一般同定を伴うヒト抗体（ＢＯＩＩＢ２）配列（ヌクレオチドおよびアミノ酸配列）である。
【図４】図４は、第ＶＩＩＩ因子のＡ２ドメインにおけるＢＯＩＩＢ２のエピトープの同定である。
【図５】図５は、本明細書において実施例６に記載の、ＢＯＩＩＢ２抗体の存在下での凝固の内因性経路の活性化の際の血小板高含有血漿（ＰＲＰ）におけるトロンビン生成の評価である。トロンビン基質ペプチドからの蛍光ＡＭＣの放出の検出に基づくＰＲＰにおけるトロンビン活性を、ＳｙｎｔｈＡｓｉｌ  １／２００単独およびＳｙｎｔｈＡｓｉｌ  １／２００＋３μｇ／ｍｌおよび抗体ＢＯＩＩＢ２の存在下で測定した。
【図６】図６は、さらに、ＢＯＩＩＢ２抗体の存在下での凝固の外因性経路の活性化の際の血小板高含有血漿（ＰＲＰ）におけるトロンビン生成の評価である。トロンビン基質ペプチドからの蛍光ＡＭＣの放出の検出に基づくＰＲＰにおけるトロンビン活性を、Ｉｎｎｏｖｉｎ  １／７５００単独およびＩｎｎｏｖｉｎ  １／７５００＋３μｇ／ｍｌの抗体ＢＯＩＩＢ２の存在下で測定した。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年4月3日(2008.4.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＶＩＩＩのＡ２ドメインに特異的に結合しＦＶＩＩＩの凝固促進活性を阻害する、ＩｇＧアイソタイプのヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
エピトープが、ＦＶＩＩＩの４８４〜５０８位の間のアミノ酸残基ならびにグルタミン酸残基３８９、３９０および３９１を含む、請求項１に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項３】
可変領域の重鎖がそのＣＤＲ内に配列番号５〜７の配列を含み、軽鎖可変領域がそのＣＤＲ内に配列番号８〜１０の配列を含むことを特徴とする、請求項２に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項４】
ＢＣＣＭに受託番号ＬＭＢＰ  ６４２２ＣＢで寄託された細胞株によって産生されるＢＯＩＩＢ２である、請求項１〜３いずれか１項に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項５】
請求項１〜４いずれか１項に記載の抗体を産生する細胞株。
【請求項６】
配列番号６と配列番号７および／または配列番号９と配列番号１０の配列あるいはそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲの組合せを含むことを特徴とする、ＦＶＩＩＩのＡ２ドメインに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、および可溶性もしくは膜固定単鎖可変部分の群から選択される、請求項１または６に記載の抗原結合断片。
【請求項８】
ヒト抗体、ラクダ抗体、サメ抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体またはその抗原結合断片である、請求項１、６または７に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
請求項１〜８いずれか１項に記載の抗体を産生する細胞株。
【請求項１０】
ＢＣＣＭに受託番号ＬＭＢＰ  ６４２２ＣＢで寄託されたＢＯＩＩＢ２という名称の抗体を産生する、請求項９に記載の細胞株。
【請求項１１】
試料を、請求項１〜８いずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片と接触させる工程を含む、ヒト試料におけるＦＶＩＩＩの検出方法。
【請求項１２】
ＦＶＩＩＩのＡ２ドメインに特異的に結合しＦＶＩＩＩの凝固促進活性を阻害する、ＩｇＧアイソタイプのヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含む、哺乳動物における心血管障害の処置および予防のための薬物。
【請求項１３】
前記抗体または抗原結合断片が配列番号５〜１０の群から選択される少なくとも２つのＣＤＲを含む、請求項１２に記載の薬物。
【請求項１４】
配列番号６と配列番号７および／または配列番号９と配列番号１０の配列あるいはそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲの組合せを含むことを特徴とする、ＦＶＩＩＩのＡ２ドメインに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む、哺乳動物における心血管障害の処置および予防のための薬物。
【請求項１５】
配列番号６と配列番号７および／または配列番号９と配列番号１０の配列を含む、ＦＶＩＩＩのＡ２ドメインに特異的に結合する抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１５に記載のヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクター。
【請求項１７】
・まず、記憶ＩｇＧ担持Ｂ細胞を血友病患者のＰＢＭＣから調製する工程
・続いて、例えばトランスフェクト細胞株における場合のように、固定化ＣＤ４０リガンドを用いてＣＤ４０受容体による記憶Ｂ細胞の活性化を行ない、ＣＤ４０と交差反応させる工程
・ＥＢＶを添加して該細胞株を不死化させる工程
・このようにして得られる該細胞株によって産生されるモノクローナル抗体を得る工程を含む、ＩｇＧアイソタイプのヒトモノクローナル抗体の調製方法。
【国際調査報告】
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2009502149.tif 000013
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