(57)【要約】式Ｉで表される（６Ｓ）−５，６，７，８−テトラヒドロプテロイン酸およびその誘導体を位置選択的にＮ（５）−ホルミル化する本発明の方法は、６．５〜７．５のｐＨを有する水性緩衝液を、反応容器に入れた式Ｉで表される化合物、酸化防止剤およびホルミル供与体の混合物に添加し、得られた懸濁液に不活性ガスを吹き込み、塩基水溶液を連続的に撹拌しながら滴下または数回に分けて添加して、６．５〜８．３のｐＨを有する透明溶液を得、酵素である組換型単機能性グルタミン酸ホルミルトランスフェラーゼ（ｒＧＦＴ）を前記水性緩衝液に添加し、温度を３０℃〜４５℃に上昇させて反応混合物を反応させることにより、ホルミル供与体から式Ｉで表される化合物へのホルミルの移動の少なくとも９５％を生じさせ、得られた反応混合物を０℃〜５℃に冷却し、無機酸水溶液を滴下してｐＨを２．７〜３．１とすることにより、式ＩＩで表される未精製化合物を沈殿させ、沈殿を完了させるために少なくとも１時間撹拌を続け、式ＩＩで表される未精製化合物を得ることを特徴とする。
2009523740.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉで表される（６Ｓ）−５，６，７，８−テトラヒドロプテロイン酸およびその誘導体を位置選択的にＮ（５）−ホルミル化する方法であって、
６．５〜７．５のｐＨを有する水性緩衝液を、反応容器に入れた式Ｉで表される化合物、酸化防止剤およびホルミル供与体の混合物に添加し、
得られた懸濁液に不活性ガスを吹き込み、
塩基水溶液を連続的に撹拌しながら滴下または数回に分けて添加して、６．５〜８．３のｐＨを有する透明溶液を得、
酵素である組換型単機能性グルタミン酸ホルミルトランスフェラーゼ（ｒＧＦＴ）を前記水性緩衝液に添加し、
温度を３０℃〜４５℃に上昇させて前記反応混合物を反応させることにより、前記ホルミル供与体から前記式Ｉで表される化合物へのホルミルの移動の少なくとも９５％を生じさせ、
得られた反応混合物を０℃〜５℃に冷却し、無機酸水溶液を滴下してｐＨを２．７〜３．１とすることにより、前記式ＩＩで表される未精製化合物を沈殿させ、
前記沈殿を完了させるために少なくとも１時間撹拌を続け、
前記式ＩＩで表される未精製化合物を得ることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１において、
前記式Ｉで表される化合物が（６Ｓ）−５，６，７，８−テトラヒドロプテロイン酸（（６Ｓ）−ＴＨＦ）であることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１または２において、
前記反応容器に、
まず、固体である前記式Ｉで表される化合物を添加し、
次に、好ましくは、アスコルビン酸、メルカプトエタノールおよびジチオトレイトールからなる群から選択される前記酸化防止剤を添加し、
次に、好ましくは、Ｎ−ホルミル−（Ｌ）−グルタミン酸、Ｎ−ホルミル−（Ｌ）−グルタミン、Ｎ−ホルミル−（Ｌ）−イソグルタミンおよびＮ−ホルミル−（Ｌ）−アスパラギン酸、あるいはそれらの水溶性塩（好ましくはナトリウム塩またはカリウム塩）からなる群から選択される前記ホルミル供与体を添加し、
不活性ガス下において前記混合物を室温で調製することを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項において、
６．５〜７．５のｐＨを有する前記水性緩衝液が、リン酸緩衝液（好ましくは１０ｍＭ〜１Ｍ（特に１００ｍＭ）のリン酸ナトリウムまたはリン酸カリウム緩衝液）であることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項において、
前記塩基水溶液が２０％ＮａＯＨ溶液または２０％ＫＯＨ溶液であることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項において、
前記塩基を添加した後に得られる前記透明溶液が６．５〜６．８のｐＨを有することを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項において、
前記酵素を添加した後に前記温度を３７℃〜４２℃に上昇させることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項において、
前記酵素を添加した後に、前記成分を少なくとも８時間（好ましくは１〜５日間）反応させることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項において、
前記無機酸がＨＣｌ（好ましくは１８％ＨＣｌまたはＨ２ＳＯ４）であることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項において、
前記式ＩＩで表される未精製化合物の沈殿を完了させるために少なくとも２時間撹拌を行うことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項において、
前記式ＩＩで表される未精製化合物を濾過または遠心分離によって得ることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項において、
前記ホルミル化反応時の前記ホルミル供与体と前記式Ｉで表される化合物とのモル比が２：１〜１０：１（特に５：１〜３：１）であることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項において、
前記酸化防止剤と前記式Ｉで表される化合物とのモル比が１：１〜５：１（特に２：１〜３：１）であることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項において、
６．５〜６．８のｐＨにおいて３７℃〜４２℃の温度で２４〜４８時間にわたって、０．０１〜０．１Ｕ／ｍｌ（特に０．０３〜０．０４Ｕ／ｍｌ）の酵素によって１ｍＭ〜２００ｍＭの（６Ｓ）−ＴＨＦをホルミル化することを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項において、
式ＩＩで表される前記未精製化合物の精製が、冷水中での前記未精製混合物の再懸濁、および濾過を含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項において、
前記組換型単機能性酵素をコードするＤＮＡ配列が、微生物（特にレンサ球菌科、好ましくは化膿性レンサ球菌種（例えば菌株ＡＴＣＣ  １９６１５））または同一の機能を有する変異株から単離された配列、あるいは化学合成した配列であることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項において、
前記組換型単機能性酵素が担体（例えばエポキシ活性樹脂）に固定化されていることを特徴とする方法。
【請求項１８】
式Ｉで表される（６Ｓ）−５，６，７，８−テトラヒドロプテロイン酸およびその誘導体を位置選択的にＮ（５）−ホルミル化するための組換型単機能性グルタミン酸ホルミルトランスフェラーゼの使用。
【請求項１９】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法によって得られ、
式Ｉで表される（６Ｓ）−Ｎ（５）−ホルミル−５，６，７，８−テトラヒドロプテロイン酸およびその誘導体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、式Ｉで表される（６Ｓ）−５，６，７，８−テトラヒドロプテロイン酸およびその誘導体の位置選択的なＮ（５）−ホルミル化のための方法に関する。
【０００２】
５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）のホルミル化は重要な工業プロセスであり、Ｎ（５）−ホルミル−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸（フォリン酸またはロイコボリン（Ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ）ともいう）を得ることができる。Ｎ（５）−ホルミル−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸は、腫瘍学分野およびビタミン分野で広く使用されている医薬活性成分である（例えば、「葉酸塩およびプテリン（Ｆｏｌａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｐｔｅｒｉｎｓ）」、Ｒ．Ｌ．Ｂｌａｋｌｅｙ，Ｖ．Ｍ．Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ編，第１〜３巻、（１９８６年），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓを参照）。
【０００３】
ホルミル化を行うために使用される試薬はホルムアミドおよび／またはギ酸を含有する（例えば、ノルウェー特許第１７２  ４９２号および米国特許第５，１９８，５４７号を参照）。
【０００４】
環境汚染および毒性試薬の使用を避ける現代の傾向に合わせて、ＴＨＦおよびプテロイン酸のその他の誘導体のホルミル化のためのより安全な代替手段を見い出す必要がある。
【０００５】
上記ホルミル化のためにホルムアミドおよび／またはギ酸の代替物を探すことが必要である別の理由は、これらの「強力な」試薬を使用することによって望ましくない副生成物が生成するためである。そのため、医薬活性物質に現在求められている高い純度基準を満たすために、単離された未精製生成物（例えばフォリン酸）を長く複雑な工程によって精製しなければならない（上記ノルウェー特許第１７２  ４９２号を参照）。
【０００６】
酵素委員会（ＥＣ）による一般的な分類（例えばＥＣ番号および名称）によれば、式Ｉで表される化合物のＮ（５）−位へのホルミル基の付加を触媒する酵素はトランスフェラーゼに属し、コード番号ＥＣ２．１．２．５に対応する。現在の命名法ではこの酵素に対して以下のような複数の定義がある。
グルタミン酸ホルムイミドイルトランスフェラーゼ（ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｆｏｒｍｉｍｉｄｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）
グルタミン酸ホルミルトランスフェラーゼ（ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｆｏｒｍｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）
ホルムイミノグルタミン酸トランスフェラーゼ（ｆｏｒｍｉｍｉｎｏｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）
ホルムイミノグルタミン酸ホルムイミノトランスフェラーゼ（ｆｏｒｍｉｍｉｎｏｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｏｒｍｉｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）
グルタミン酸ホルムイミノトランスフェラーゼ（ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｆｏｒｍｉｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）
５−ホルムイミドイルテトラヒドロ葉酸：Ｌ−グルタミン酸  Ｎ−ホルムイミドイルトランスフェラーゼ（５−ｆｏｒｍｉｍｉｄｏｙｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ：Ｌ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ  Ｎ−ｆｏｒｍｉｍｉｄｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）
重要なのはコード番号ＥＣ２．１．２．５である。
【０００７】
グルタミン酸ホルミルトランスフェラーゼ（ＧＦＴ）は、ヒスチジンの生化学的分解経路で作用する成分としてだけではなく、葉酸塩によるＣ１代謝において活性を示す。
【０００８】
ＧＦＴは、ホルミルトランスフェラーゼ活性を示すだけではなく、Ｎ（５）−ホルムイミノ−ＴＨＦをＮ（５），Ｎ（１０）−メテニル−ＴＨＦに転換する環化脱アミノ化（ｃｙｃｌｏｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ）を触媒する二機能性（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）酵素として哺乳類の体内に存在する。
【０００９】
文献に記載されている酵素ＥＣ２．１．２．５に関する全ての生化学研究は、哺乳類の肝臓由来の二機能性酵素を対象にして行ったものである。これらの研究は、ホルムイミノトランスフェラーゼとしての主要活性およびホルミルトランスフェラーゼとしての副次活性に関するものである（Ｍｉｌｌｅｒ  Ａ．およびＷａｅｌｓｃｈ  Ｈ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９５７年，第２２８巻，３９７〜４１７頁；Ｔａｂｏｒ  Ｈ．およびＷｙｎｇａｒｄｅｎ，Ｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９５９年，第２３４巻，１８３０〜１８４９頁；Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９５７年，第２２６巻，８３〜８４頁；ＢｏｒｔｏｌｕｚｚｉおよびＭｃＫｅｎｚｉｅ  Ｊ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８３年、第６１巻，２４８〜２５３頁）。
【００１０】
ブタの肝臓由来のＧＦＴ酵素のクローニングおよび配列決定後に（Ｍｕｒｌｅｙ  Ｌ．Ｌ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９３年，第２６８巻，２２８２０〜２２８２４頁）、推定ホルムイミノトランスフェラーゼをコードし得る別のＤＮＡ配列が発見された。また、これらのＤＮＡ配列は哺乳類以外の生物の体内からも発見された。近年の自動配列決定法の進歩によって、実際には非常に多くの原核生物および真核生物に関する非常に多くのゲノムデータを作成することができる。
【００１１】
また、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、コムギ（Ｔｒｙｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）およびダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）に関する研究に関連して、グルタミン酸ホルムイミノトランスフェラーゼ活性を有する植物酵素に関する報告が発表されている（米国特許出願公開第２００２／０１０２６８９号を参照）。
【００１２】
ブタの肝臓由来のＧＦＴ酵素の機能性を示す上記文献データに基づいて、ＧＦＴをコードする対応するＤＮＡ配列をクローニングし、高い機能蓋然性を有する酵素を得ようとすることは明らかだろう。しかし、二機能性酵素（例えば肝臓由来の酵素）は、特に酵素反応による最終生成物がＮ（５）−ホルミル型ではなくＮ（５），Ｎ（１０）−メテニル型であるため、式Ｉで表される（６Ｓ）−Ｎ（５）−ホルミル化化合物を工業的に製造するには適していない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、上記副生成物の大部分の生成を抑制する、より穏やかで環境に優しいホルミル化方法を提供することにある。
【００１４】
本発明の方法は、精製工程がずっと短くてすみ、純粋な生成物（特に（６Ｓ）−Ｎ（５）−ホルミル−ＴＨＦ）のトータル収率を向上させることができる未精製生成物（特にフォリン酸）を提供する。
【００１５】
本発明の方法は、上記精製化学プロセスの酵素的な代替手段を含む。
【００１６】
本発明の方法は、式ＩＩで表される（６Ｓ）−Ｎ（５）−ホルミル化化合物の工業的な製造に適している。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明では、ホルムイミノ（ホルミル）トランスフェラーゼの機能のみを示し、式Ｉで表されるＮ（５）−ホルミル化化合物の工業的な製造に適した原核細菌由来の組換型単機能性酵素を使用する。
【００１８】
上記目的は本発明によって達成される。
【００１９】
式Ｉで表される（６Ｓ）−５，６，７，８−テトラヒドロプテロイン酸およびその誘導体を位置選択的にＮ（５）−ホルミル化する本発明の方法は、
６．５〜７．５のｐＨを有する水性緩衝液を、反応容器に入れた式Ｉで表される化合物、酸化防止剤およびホルミル供与体の混合物に添加し、
得られた懸濁液に不活性ガスを吹き込み、
塩基水溶液を連続的に撹拌しながら滴下または数回に分けて添加して、６．５〜８．３のｐＨを有する透明溶液を得、
酵素である組換型単機能性グルタミン酸ホルミルトランスフェラーゼ（ｒＧＦＴ）を前記水性緩衝液に添加し、
温度を３０℃〜４５℃に上昇させて反応混合物を反応させることにより、ホルミル供与体から式Ｉで表される化合物へのホルミルの移動の少なくとも９５％を生じさせ、
得られた反応混合物を０℃〜５℃に冷却し、無機酸水溶液を滴下してｐＨを２．７〜３．１とすることにより、式ＩＩで表される未精製化合物を沈殿させ、
沈殿を完了させるために少なくとも１時間撹拌を続け、
式ＩＩで表される未精製化合物を得ることを特徴とする。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態は、従属請求項に記載されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の好ましい実施形態を、図面を参照しながら以下に説明する。
【００２２】
本発明では、ホルムイミノ（ホルミル）トランスフェラーゼの機能のみを示す原核細菌由来の組換型単機能性（ｍｏｎｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）酵素を使用する。
【００２３】
この酵素は上述した二機能性肝臓酵素とは異なるが、一部（特にホルムイミノトランスフェラーゼ領域に対応する部分）が類似している。
【００２４】
微生物から得られた原核細菌由来酵素、具体的には化膿性レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）によってコードされた酵素を使用する利点は、その単機能性グルタミン酸ホルムイミノ（ホルミル）トランスフェラーゼ活性にある。
【００２５】
生化学的反応を行う前にはこの酵素の有効活性について予見することはできなかったが、この酵素の単機能性は、ゲノムデータベースにおけるアミノ酸配列の比較分析によって推測された。
【００２６】
本発明で使用するＧＦＴのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は、米国特許出願公開第２００２／０１０２６８９号で報告されている植物の配列とは異なる。
【００２７】
酵素の本質的な立体選択性に起因して、（６ＲＳ）−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸を基質として使用することにより、（６Ｓ）−異性体のホルミル化のみが生じた。
【００２８】
以下の実施例によって本発明を説明する。
【実施例】
【００２９】
［実施例１］
（化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のグルタミン酸ホルミルトランスフェラーゼ（ＧＦＴ）遺伝子の起源）
化膿性レンサ球菌（ＡＴＣＣ  １９６１５）のＧＦＴ遺伝子をクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１（ＤＥ）中に過剰発現させた。
【００３０】
この方法により、十分な組換型単機能性酵素が製造された。
【００３１】
（ゲノムＤＮＡの抽出）
化膿性レンサ球菌（ＡＴＣＣ  １９６１５）の培養液２５ｍｌをＭＲＳ培地（Ｏｘｏｉｄ社製）にて一晩にわたって３７℃で培養した。
【００３２】
遠心分離後に得られたペレットを、ゲノムＤＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）の手順を変更した手順によってさらに処理した。
【００３３】
ペレットを５００μｌのＳＴＥＴ緩衝液（８％スクロース、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％トリトンＸ−１００）に溶解し、リゾチーム溶液（５０ｍｇ／ｍｌ）４００μｌを添加した。細胞が完全に溶解するまで混合物を３７℃で１５０分間培養した。
【００３４】
次に、推奨量の半分のみを使用したこと以外は、キットの製造業者（Ｑｉａｇｅｎ社）の指示に従って、溶解混合物を処理した。
【００３５】
イソプロパノールによる沈殿後、得られたＤＮＡを最初にフェノール／クロロホルム（１：１）、次にクロロホルムを使用した処理、次いでエタノールによる沈殿によって精製した。
【００３６】
（ＧＦＴ  ＤＮＡの単離および増幅）
化膿性レンサ球菌（ＡＴＣＣ  １９６１５）から抽出したゲノムＤＮＡを使用し、以下のオリゴヌクレオチド対を用いることにより、４５℃のハイブリダイゼーション温度でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってＧＦＴのＤＮＡ配列を増幅した。
オリゴ１：
５’ＡＧＧＡＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡＡＴＧＧＣＧＡＡＡＡＴＴＧＴＴＧＡＡＴＧＴＡＴＴＣＣＣ３’
オリゴ２：
５’ＴＡＡＧＡＡＴＴＣＣＴＡＣＴＡＡＣＣＴＡＧＣＡＡＡＴＧＧＴＴＴＴＣＡＡＧＡＡＴＣ３’
コード領域のクローニングおよびその後の配列決定によって、以下の配列が得られた。
ＡＴＧＧＣＧＡＡＡＡＴＴＧＴＴＧＡＡＴＧＴＡＴＴＣＣＣＡＡＣＴＴＣＴＣＡＧＡＡＧＧＣＣＡＡＡＡＴＣＡＧＧＣＴＧＴＴＡＴＣＧＡＴＧＧＴＴＴＧＧＴＡＧＣＧＡＣＧＧＣＣＡＡＡＡＧＴＡＴＴＣＣＴＧＧＡＧＴＧＡＣＣＣＴＴＣＴＣＧＡＣＴＡＣＴＣＴＴＣＴＧＡＴＧＣＧＡＧＣＣＡＣＡＡＣＣＧＧＡＧＣＧＴＧＴＴＴＡＣＣＴＴＧＧＴＴＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＧＴＣＴＡＴＴＣＡＡＧＡＡＧＣＡＧＣＴＴＴＣＣＡＡＣＴＧＧＴＧＡＡＡＴＡＣＧＣＴＴＣＴＧＡＡＡＡＣＡＴＴＧＡＴＡＴＧＡＣＣＡＡＡＣＡＴＣＡＴＧＧＣＧＡＡＣＡＣＣＣＴＣＧＴＡＴＧＧＧＡＧＣＡＡＣＴＧＡＴＧＴＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣＧＴＴＣＣＧＡＴＣＡＡＡＧＡＣＡＴＣＡＣＴＡＣＡＣＡＡＧＡＡＴＧＴＧＴＴＧＡＧＡＴＴＴＣＣＡＡＡＣＡＡＧＴＣＧＣＡＧＡＡＣＧＧＡＴＴＡＡＣＣＧＴＧＡＡＣＴＴＧＡＣＡＴＴＣＣＡＡＴＣＴＴＣＣＴＴＴＡＴＧＡＡＧＡＴＴＣＴＧＣＣＡＣＡＣＧＴＣＣＡＧＡＡＣＧＴＣＡＡＡＡＣＣＴＴＧＣＴＡＡＡＡＴＣＣＧＴＡＡＡＧＧＴＣＡＧＴＴＴＧＡＡＧＧＣＡＴＧＣＣＡＧＡＡＡＡＡＣＴＧＴＴＧＧＡＡＧＡＧＧＡＣＴＧＧＧＣＡＣＣＴＧＡＣＴＡＣＧＧＡＧＡＴＣＧＴＡＡＧＡＴＴＣＡＣＣＣＡＡＣＴＧＣＴＧＧＧＧＴＡＡＣＴＧＣＣＧＴＴＧＧＴＧＣＴＣＧＣＡＴＧＣＣＡＴＴＧＧＴＴＧＣＣＴＴＣＡＡＴＧＴＴＡＡＴＴＴＧＧＡＴＡＣＴＧＡＣＡＡＴＡＴＣＧＡＣＡＴＴＧＣＴＣＡＴＡＡＡＡＴＴＧＣＴＡＡＡＡＴＴＡＴＣＣＧＣＧＧＴＴＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＴＡＣＡＡＡＴＡＴＴＧＴＡＡＧＧＣＴＡＴＣＧＧＴＧＴＣＡＴＧＴＴＡＧＡＡＧＡＣＣＧＴＣＡＴＡＴＴＧＣＣＣＡＡＧＴＣＴＣＣＡＴＧＡＡＣＡＴＧＧＴＴＡＡＣＴＴＴＧＡＡＡＡＡＴＧＴＴＣＴＣＴＴＴＡＣＣＧＴＡＣＴＴＴＴＧＡＡＡＣＣＡＴＣＡＡＡＴＴＴＧＡＡＧＣＧＣＧＴＣＧＣＴＡＣＧＧＴＧＴＧＡＡＴＧＴＴＡＴＴＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＴＣＡＴＣＧＧＣＴＴＡＧＣＧＣＣＡＧＣＣＡＡＧＧＣＣＴＴＡＡＴＣＧＡＴＧＴＧＧＣＴＧＡＡＴＡＣＴＡＣＴＴＡＣＡＡＧＴＴＧＡＧＧＡＣＴＴＴＧＡＣＴＡＣＣＣＴＡＡＡＣＡＧＧＴＴＣＴＴＧＡＡＡＡＣＣＡＴＴＴＧＣＴＡＧＧＴＴＡＧ
（発現ベクターｐＥＴ２２ｂへのクローニング）
組換型単機能性ｒＧＦＴの発現および精製において高い収率を得るために、６つのヒスチジンをコードする配列（Ｈｉｓ−ｔａｇ）をｒＧＦＴのカルボキシル末端に付加した。
【００３７】
市販の発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）のＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ制限部位に、ｒＧＦＴ  ＤＮＡ断片をクローニングすることによって、上記操作を行った。
【００３８】
発現ベクター中に存在するＨｉｓ−Ｔａｇを用いて同一の配列を融合させることができるように、最初に、ＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ制限部位をｒＧＦＴ  ＤＮＡ断片に組み込んだ。以下のオリゴヌクレオチド対を使用して、５０℃のハイブリダイゼーション温度でｒＧＦＴ  ＤＮＡを増幅することによって、上記操作を行った。
オリゴ３：
５’ＣＣＣＴＣＴＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡＡＴＧＧＣＧ３’
オリゴ４：
５’ＧＴＣＣＣＡＧＧＡＴＣＣＡＡＡＣＣＴＡＧＣＡＡＡＴＧＧＴＴＴＴＣＡＡＧＡＡＴＣＴＧ３’
次に、新たに増幅されたｒＧＦＴ  ＤＮＡ断片を、ｐＥＴ２２ｂのＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ制限部位にクローニングし、クローニングした構造をＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ）に形質転換した。
【００３９】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ）でのクローニング後に得られたプラスミドによって、Ｔ７プロモーターの制御により、（Ｃ−末端にＨｉｓ−ｔａｇを有する）ｒＧＦＴ遺伝子を発現させることができる。
【００４０】
このようにして組み替えられた酵素の発現を、抗Ｈｉｓ抗体（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を使用したウェスタンブロット法によって確認した。
【００４１】
（ｒＧＦＴ酵素を発現するＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ）の培養）
ｒＧＦＴ酵素を発現する組換型Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ）の培養物を一晩にわたって成長させた後、３００ｍｌの新鮮なＬ培地（ＬＢ）中で１：５０に希釈し、ＯＤ６００が０．７となるまでアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）存在下で振盪機（１８０ｒｐｍ）内において３７℃で成長させた。
【００４２】
０．１Ｍ  ＩＰＴＧ（イソプロピル−チオ−ガラクトシド）１．４ｍｌを用いて誘導した後、約３時間培養した。
【００４３】
（ｒＧＦＴの精製）
得られた細胞培養物を遠心分離し、上澄み液を捨てた。
【００４４】
細胞ペレットを−７０℃で保存した。
【００４５】
次に、細胞ペレットを３０ｍｌの緩衝液Ａ（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフルオライド、ｐＨ７．４）に添加した。
【００４６】
次に、再懸濁させた細胞ペレットを、０．５ｇ／ｌのリゾチームの存在下で４℃にて３０分間インキュベートした。
【００４７】
得られた懸濁液をマイクロ流動化装置（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）によって１０，０００ｐｓｉの圧力で処理した。
【００４８】
次に、懸濁液をＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ（各１０μｇ／ｍｌ）を用いて４℃で４５分間インキュベートした。
【００４９】
次に、懸濁液を１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ペレットを捨てた。
【００５０】
上澄み液を５ｍｌのＮｉ２＋−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ＦＦカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に充填した。
【００５１】
緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）を用いて未結合のサンプル材料を結合させ、洗浄した。
【００５２】
緩衝液Ｃ（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ７．５）を用いて、結合したｒＧＦＴを溶離した。
【００５３】
次に、最終的な調製および保存のために、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５−Ｆカラム（５ｍｌ）を使用して緩衝液を交換した（緩衝液Ｄ：１００ｍＭ  リン酸カリウム、ｐＨ７．０）。
【００５４】
組換型単機能性ｒＧＦＴ酵素を含有する溶液は−７０℃で保存した。
【００５５】
このようにして得られたｒＧＦＴの対照サンプルの活性（ユニット／ｍｌおよびユニット／ｍｇ）を、ホルムイミノ−（Ｌ）−グルタミン酸の代わりにホルミル−（Ｌ）−グルタミン酸を使用し、２５℃の代わりに３７℃で培養することによって、ＥＣ２．１．２．５酵素用Ｓｉｇｍａアッセイに準拠して確認した。
【００５６】
Ｓｉｇｍａアッセイは、Ｔａｂｏｒ  Ｈ．およびＷｙｎｇａｒｄｅｎ  Ｌ．，「臨床試験（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）」１９５８年，第３７巻，８２４〜８２８頁に記載されているアッセイを変更したものである。
【００５７】
［実施例２］
欧州特許第０  ６００  ４６０  Ｂ１号に準拠して調製された（６Ｓ）−ＴＨＦ  ４４５ｍｇ（１ｍｍｏｌ）、アスコルビン酸８８０ｍｇ（５ｍｍｏｌ）、およびＮ−ホルミル−（Ｌ）−グルタミン酸８７５ｍｇ（５ｍｍｏｌ）を、マグネチックスターラー、窒素注入口および温度計を備えた２５ｍｌの３つ口反応容器に投入した。
【００５８】
Ｎ−ホルミル−（Ｌ）−グルタミン酸は、Ｈ．Ｔａｂｏｒ，Ａ．Ｈ．Ｍｅｈｌｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２１０、５５９（１９５４年）に準拠してを調製された。
【００５９】
ｐＨが６．７の１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液５ｍｌを、窒素雰囲気下で上記混合物に撹拌下で添加した。
【００６０】
ｐＨが６．７の均一な溶液が得られるまで、得られた懸濁液に２０％ＮａＯＨを滴下した。
【００６１】
次に、酸素を除去するために反応容器を排気し、窒素を導入した。この操作をさらに２回繰り返した。
【００６２】
次に、組換型単機能性グルタミン酸ホルミルトランスフェラーゼ０．３５Ｕを添加し、ｐＨ６．７の１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液０．３２ｍｌに溶解した。この酵素は、上記実施例１にしたがって調製された。
【００６３】
次に、排気および窒素導入をさらに３回行った。
【００６４】
反応混合物の温度を４０℃に昇温させ、混合物を合計で７２時間撹拌した。
【００６５】
ホルミル化反応の進行は、逆相カラムを用いたＨＰＬＣによって確認された。
【００６６】
７２時間の反応時間中に、Ｎ−ホルミル−（Ｌ）−グルタミン酸（０．５７ｍｍｏｌ）１００ｍｇを４回に分けてさらに添加した。
【００６７】
反応終了時に得られたＨＰＬＣクロマトグラムによれば、得られた（６Ｓ）−Ｎ（５）−ホルミル−ＴＨＦの純度は９５．０７％であった（図３Ａを参照）。
【００６８】
次に、反応混合物を５℃に冷却した。
【００６９】
ｐＨが３．０になるまで撹拌下で１８％ＨＣｌを滴下した。
【００７０】
この酸性化時に、白色固体が生成した。
【００７１】
沈殿を完了させるために、得られた懸濁液を５℃でさらに１時間撹拌した。
【００７２】
得られた固体を濾過により単離した後、約２ｍｌの冷水中で再懸濁させ、再度濾過した。
【００７３】
このようにして得られた固体（６Ｓ）−Ｎ（５）−ホルミル−ＴＨＦのＨＰＬＣクロマトグラムによれば、純度は９６．８８％であった（図３Ｂを参照）。
【００７４】
ノルウェー特許第１７２  ４９２号に記載されているように、例えば対応するＣａ２＋塩を調製することによって、生成物をさらに精製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】残基Ｒの定義を含む反応スキームを示す。
【図２】ノルウェー特許第１７２  ４９２号に準拠して調製された未精製（６Ｓ）−Ｎ（５）−ホルミル−ＴＨＦの逆相カラムによるＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図３Ａ】本発明の実施例２に準拠して調製された未精製（６Ｓ）−Ｎ（５）−ホルミル−ＴＨＦの逆相カラムによるＨＰＬＣクロマトグラムを示す。なお、保持時間１分間における大きなピークはアスコルビン酸に対応する。
【図３Ｂ】冷水中で再懸濁させ、濾過した後に、本発明の実施例２に準拠して調製された精製（６Ｓ）−Ｎ（５）−ホルミル−ＴＨＦの逆相カラムによるＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図１】
2009523740.tif 000003
【図２】
2009523740.tif 000004
【図３Ａ】
2009523740.tif 000005
【図３Ｂ】
2009523740.tif 000006
【配列表】
2009523740000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年10月30日(2007.10.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉで表される（６Ｓ）−５，６，７，８−テトラヒドロプテロイン酸およびその誘導体を位置選択的にＮ（５）−ホルミル化する方法であって、
【化１】
2009523740.tif 000007
６．５〜７．５のｐＨを有する水性緩衝液を、反応容器に入れた式Ｉで表される化合物、酸化防止剤およびホルミル供与体の混合物に添加し、
得られた懸濁液に不活性ガスを吹き込み、
連続的に撹拌しながら塩基水溶液を滴下または数回に分けて添加して、６．５〜８．３のｐＨを有する透明溶液を得、
ホルムイミノ（ホルミル）トランスフェラーゼの機能のみを示す酵素ＥＣ２．１．２．５である組換型単機能性グルタミン酸ホルミルトランスフェラーゼ（ｒＧＦＴ）を前記水性緩衝液に添加し、
温度を３０℃〜４５℃に上昇させて前記反応混合物を反応させることにより、前記ホルミル供与体から前記式Ｉで表される化合物へのホルミルの移動の少なくとも９５％を生じさせ、
得られた反応混合物を０℃〜５℃に冷却し、無機酸水溶液を滴下してｐＨを２．７〜３．１とすることにより、前記式ＩＩで表される未精製化合物を沈殿させ、
【化２】
2009523740.tif 000008
（式中、Ｒは前記式Ｉにおける基と同一の基である。）
前記沈殿を完了させるために少なくとも１時間撹拌を続け、
前記式ＩＩで表される未精製化合物を得ることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１において、
前記式Ｉで表される化合物が（６Ｓ）−５，６，７，８−テトラヒドロプテロイン酸（（６Ｓ）−ＴＨＦ）であることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１または２において、
前記反応容器に、
まず、固体である前記式Ｉで表される化合物を添加し、
次に、好ましくは、アスコルビン酸、メルカプトエタノールおよびジチオトレイトールからなる群から選択される前記酸化防止剤を添加し、
次に、好ましくは、Ｎ−ホルミル−（Ｌ）−グルタミン酸、Ｎ−ホルミル−（Ｌ）−グルタミン、Ｎ−ホルミル−（Ｌ）−イソグルタミンおよびＮ−ホルミル−（Ｌ）−アスパラギン酸、あるいはそれらの水溶性塩（好ましくはナトリウム塩またはカリウム塩）からなる群から選択される前記ホルミル供与体を添加し、
不活性ガス下において前記混合物を室温で調製することを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項において、
６．５〜７．５のｐＨを有する前記水性緩衝液が、リン酸緩衝液（好ましくは１０ｍＭ〜１Ｍ（特に１００ｍＭ）のリン酸ナトリウムまたはリン酸カリウム緩衝液）であることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項において、
前記塩基水溶液が２０％ＮａＯＨ溶液または２０％ＫＯＨ溶液であることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項において、
前記塩基を添加した後に得られる前記透明溶液が６．５〜６．８のｐＨを有することを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項において、
前記酵素を添加した後に前記温度を３７℃〜４２℃に上昇させることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項において、
前記酵素を添加した後に、前記成分を少なくとも８時間（好ましくは１〜５日間）反応させることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項において、
前記無機酸がＨＣｌ（好ましくは１８％ＨＣｌまたはＨ２ＳＯ４）であることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項において、
前記式ＩＩで表される未精製化合物の沈殿を完了させるために少なくとも２時間撹拌を行うことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項において、
前記式ＩＩで表される未精製化合物を濾過または遠心分離によって得ることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項において、
前記ホルミル化反応時の前記ホルミル供与体と前記式Ｉで表される化合物とのモル比が２：１〜１０：１（特に５：１〜３：１）であることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項において、
前記酸化防止剤と前記式Ｉで表される化合物とのモル比が１：１〜５：１（特に２：１〜３：１）であることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項において、
６．５〜６．８のｐＨにおいて３７℃〜４２℃の温度で２４〜４８時間にわたって、０．０１〜０．１Ｕ／ｍｌ（特に０．０３〜０．０４Ｕ／ｍｌ）の酵素によって１ｍＭ〜２００ｍＭの（６Ｓ）−ＴＨＦをホルミル化することを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項において、
式ＩＩで表される前記未精製化合物の精製が、冷水中での前記未精製混合物の再懸濁、および濾過を含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項において、
前記組換型単機能性酵素をコードするゲノムＤＮＡが、微生物（特にレンサ球菌科、好ましくは化膿性レンサ球菌種（例えば菌株ＡＴＣＣ  １９６１５））または同一の機能を有する変異株から単離された配列、あるいは化学合成した配列であることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項において、
前記組換型単機能性酵素が担体（例えばエポキシ活性樹脂）に固定化されていることを特徴とする方法。
【請求項１８】
式Ｉで表される（６Ｓ）−５，６，７，８−テトラヒドロプテロイン酸およびその誘導体を位置選択的にＮ（５）−ホルミル化するための組換型単機能性グルタミン酸ホルミルトランスフェラーゼの使用。
【化３】
2009523740.tif 000009
【請求項１９】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法によって得られ、
式ＩＩで表される（６Ｓ）−Ｎ（５）−ホルミル−５，６，７，８−テトラヒドロプテロイン酸およびその誘導体。
【化４】
2009523740.tif 000010
【国際調査報告】
2009523740.tif 000011
2009523740.tif 000012
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