(57)【要約】  二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子及び約５乃至約４０アミノ酸のペプチドを含む組成物を提供し、ここでｄｓＲＮＡ分子がペプチドと抱合している。ｄｓＲＮＡの鎖は約２５乃至約３０塩基対の長さを有することができ、同じでも異なっていてもよい。代替的に、ｓｉＲＮＡは少なくとも３つの鎖（すなわち、少なくとも２つのセンス鎖及び１つのアンチセンス鎖、又は少なくとも２つのアンチセンス鎖及び１つのセンス鎖）を含むことができ、ここで少なくとも２つのセンス鎖又は少なくとも２つのアンチセンス鎖は少なくとも１ヌクレオチドのニック又はギャップによって分けられている。【選択図】図３
2009514877.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物において：
（ａ）二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子であって、当該鎖が約２５乃至約３０ヌクレオチドの同一又は異なる長さを有する分子と；
（ｂ）約５乃至約４０個のアミノ酸を具えるペプチドであって、アミノ酸配列ＫＶＬＫＱ（配列番号５１）を含むペプチドと；
を具える組成物において、前記ｄｓＲＮＡ分子が前記ペプチドと抱合していることを特徴とする組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物において、前記ｄｓＲＮＡ分子がｓｉＲＮＡであることを特徴とする組成物。
【請求項３】
請求項２に記載の組成物において、前記ｓｉＲＮＡが、ヒトＴＮＦ−α遺伝子の核酸配列の一部と相同的な核酸配列を含むことを特徴とする組成物。
【請求項４】
請求項２に記載の組成物において、前記ｓｉＲＮＡが、ウィルス遺伝子の核酸配列の一部と相同的な核酸配列を含むことを特徴とする組成物。
【請求項５】
請求項４に記載の組成物において、前記ウィルス遺伝子の供給源がインフルエンザウィルスであることを特徴とする組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の組成物が更に担体を具えることを特徴とする組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の組成物において、前記ｄｓＲＮＡ分子が、２個のヌクレオチドを含む一本鎖３’アンチセンス鎖オーバハングを更に具えることを特徴とする組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の組成物において、前記ｄｓＲＮＡ分子が、２個のヌクレオチドを含む一本鎖３’センス鎖オーバハングを更に具えることを特徴とする組成物。
【請求項９】
請求項１に記載の組成物において、前記ｄｓＲＮＡ分子がオーバハングを有しないことを特徴とする組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の組成物において、前記鎖が、約２５乃至約２９ヌクレオチドの同一又は異なる長さを有することを特徴とする組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載の組成物において、前記ｄｓＲＮＡ分子がセンスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖からなり、前記ペプチドが前記アンチセンスＲＮＡ鎖の５’末端に抱合されることを特徴とする組成物。
【請求項１２】
請求項１に記載の組成物において、前記ペプチドの前記アミノ酸配列が：
ＫＧＳＫＫＡＶＴＫＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（配列番号３３）；
ＫＫＡＶＴＫＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（配列番号４２）；
ＶＴＫＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（配列番号４３）；
ＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（配列番号４４）；
ＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（配列番号４５）；
ＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（配列番号４６）；
ＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（配列番号４７）；
ＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（配列番号４１）；
ＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（配列番号４８）；
ＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（配列番号４９）；
ＹＫＶＬＫＱ（配列番号５０）；
ＫＶＬＫＱ（配列番号５１）；
からなる群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項１３】
請求項１に記載の組成物において、前記ペプチドが動物の細胞と結合する分子と抱合していることを特徴とする組成物。
【請求項１４】
ＴＮＦ−αに関連する炎症を回復させるための請求項１乃至３又は請求項６乃至１３のいずれか１項に記載の組成物の使用において、回復する量の前記組成物を動物へ投与するステップを具えることを特徴とする使用。
【請求項１５】
動物のＴＮＦ−αに関連する炎症を回復させる薬物の製造における請求項１乃至３又は請求項６乃至１３のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項１６】
請求項１４又は１５に記載の使用において、前記炎症が関節炎に生じていることを特徴とする使用。
【請求項１７】
請求項１４又は１５に記載の使用において、前記炎症が乾癬に生じていることを特徴とする使用。
【請求項１８】
炎症回復のために動物の遺伝子発現を阻害する医薬組成物の使用において、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を前記動物へ投与するステップを具え、前記医薬組成物が前記ｄｓＲＮＡ分子とペプチドを具え、前記ｄｓＲＮＡ分子が約２５乃至約３０の塩基対を具え、前記ペプチドが約５乃至約４０個のアミノ酸を具え、かつ、アミノ酸配列ＫＶＬＫＱ（配列番号５１）を具え、前記ｄｓＲＮＡ分子が前記ペプチドと抱合していることを特徴とする使用。
【請求項１９】
炎症回復のために動物の遺伝子発現を阻害する薬物の製造における二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子及びペプチドを具える医薬組成物の使用において、前記ｄｓＲＮＡ分子が約２５乃至約３０の塩基対を具え、前記ペプチドが約５乃至約４０個のアミノ酸を具え、かつアミノ酸配列ＫＶＬＫＱ（配列番号５１）を具え、前記ｄｓＲＮＡ分子が前記ペプチドと抱合していることを特徴とする使用。
【請求項２０】
請求項１８又は１９に記載の使用において、前記炎症が関節炎に生じていることを特徴とする使用。
【請求項２１】
請求項１８又は１９に記載の使用において、前記炎症が乾癬に生じていることを特徴とする使用。
【請求項２２】
インフルエンザウィルスに関連する感染症を回復させるための請求項１に記載の組成物の使用において、回復する量の前記組成物を動物へ投与するステップを具えることを特徴とする使用。
【請求項２３】
動物のインフルエンザウィルスに関連する感染症を回復させる薬物の製造における請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項２４】
組成物において：
（ａ）約１５乃至約５０個のヌクレオチドを具える第１のＲＮＡ鎖（Ａ鎖）と、約１乃至約２５個のヌクレオチドを具える第２のＲＮＡ鎖（Ｂ１鎖）と、約１乃至約２５個のヌクレオチドを具える第３のＲＮＡ鎖（Ｂ２鎖）とを具える低分子抑制核酸（ｓｉＲＮＡ）分子であって：
前記ｓｉＲＮＡ分子がペプチドと抱合し；
前記Ｂ１鎖及び前記Ｂ２鎖が、前記Ａ鎖の非オーバラップ領域と各々相補的であり；
第１の二重鎖領域（Ａ：Ｂ１）が、前記Ｂ１鎖と前記Ａ鎖とをアニーリングすることによって形成され；
第２の二重鎖領域（Ａ：Ｂ２）が、前記Ｂ２鎖と前記Ａ鎖とをアニーリングすることによって形成された；
低分子抑制核酸（ｓｉＲＮＡ）分子と；
（ｂ）約５乃至約４０個のアミノ酸を具えるペプチドであって、前記ｓｉＲＮＡ分子が前記ペプチドと抱合するペプチドと；
を具えることを特徴とする組成物。
【請求項２５】
前記Ａ：Ｂ１二重鎖が、ニック又はギャップによって前記Ａ：Ｂ２二重鎖から分離されており、前記ギャップが前記Ａ：Ｂ１二重鎖と前記Ａ：Ｂ２二重鎖との間に位置するＡ鎖内の少なくとも一つの不対ヌクレオチドから生ずることを特徴とする請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記Ａ鎖、前記Ｂ１鎖、及び／若しくは前記Ｂ２鎖のいずれか又は両方の３’末端に１又はそれ以上の不対ヌクレオチドを更に具えることを特徴とする請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記Ａ鎖が約１８ヌクレオチド乃至約４０ヌクレオチドであることを特徴とする請求項２５乃至２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記Ａ鎖が約２０ヌクレオチド乃至約３２ヌクレオチドであることを特徴とする請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記Ａ鎖が２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、又は３１ヌクレオチドであることを特徴とする請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記Ａ：Ｂ１二重鎖及び前記Ａ：Ｂ２二重鎖が、合計で約１５の塩基対乃至約４０の塩基対を具えることを特徴とする請求項２５乃至２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３１】
前記Ａ：Ｂ１二重鎖及び前記Ａ：Ｂ２二重鎖が、合計で約１８の塩基対乃至約３５の塩基対を具えることを特徴とする請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記Ａ：Ｂ１二重鎖及び前記Ａ：Ｂ２二重鎖が、合計で約２０の塩基対乃至約３０の塩基対を具えることを特徴とする請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記Ａ：Ｂ１二重鎖及び前記Ａ：Ｂ２二重鎖が、合計で２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、又は２９の塩基対を具えることを特徴とする請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記ｓｉＲＮＡ分子が、１ヌクレオチド乃至５ヌクレオチドである１又は２個の一本鎖３’オーバハングを具えることを特徴とする請求項２６に記載の組成物。
【請求項３５】
前記Ａ鎖がヌクレオチド配列３’ＴＴＣＣＵＡＧＡＡＵＡＡＡＧＡＡＧＣＣＵＣＵＧＵＵＡＣ５’（配列番号７６）を具えることを特徴とする請求項２５乃至２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３６】
前記Ｂ１鎖がヌクレオチド配列５’ＧＧＡＵＣＵ３’（配列番号７７）を具えることを特徴とする請求項２２に記載の組成物。
【請求項３７】
前記Ｂ２鎖がヌクレオチド配列５’ＡＣＡＡＵＧ３’（配列番号９０）を具えることを特徴とする請求項２５に記載の組成物。
【請求項３８】
前記Ａ：Ｂ１二重鎖が、ニックによって前記Ａ：Ｂ２二重鎖から分離されていることを特徴とする請求項２５に記載の組成物。
【請求項３９】
前記Ｂ２鎖が５’ヒドロキシル末端を有することを特徴とする請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記Ｂ１鎖がヌクレオチド配列５’ＧＧＡＵＣＵＵＡＵＵＵ３’（配列番号１３５）を具え、前記Ｂ２鎖がヌクレオチド配列５’ＣＵＵＣＧＧＡＧＴＴ３’（配列番号１３６）を具え、前記Ａ鎖がヌクレオチド配列５’ＣＵＣＣＧＡＡＧＡＡＡＵＡＡＧＡＵＣＣＴＴ３’（配列番号１３７）を具えることを特徴とする請求項３８に記載の組成物。
【請求項４１】
前記Ｂ１鎖がヌクレオチド配列５’ＧＧＡＴＣＴＴＡＴＴＴ３’（配列番号１４４）を具え、前記Ｂ２鎖がヌクレオチド配列５’ＣＴＴＣＧＧＡＧＴＴ３’（配列番号１４５）を具え、前記Ａ鎖がヌクレオチド配列５’ＣＴＣＣＧＡＡＧＡＡＡＴＡＡＧＡＴＣＣＴＴ３’（配列番号１４６）を具えることを特徴とする請求項３８に記載の組成物。
【請求項４２】
前記Ｂ１鎖がヌクレオチド配列５’ＣＴＣＣＧＡＡＧＡＡ３’（配列番号１４８）を具え、前記Ｂ２鎖がヌクレオチド配列５’ＡＴＡＡＧＡＴＣＣＴＴ３’（配列番号１４９）を具え、前記Ａ鎖がヌクレオチド配列５’ＧＧＡＴＣＴＴＡＴＴＴＣＴＴＣＧＧＡＧＴＴ３’（配列番号１４７）を具えることを特徴とする請求項３８に記載の組成物。
【請求項４３】
前記Ｂ１鎖がヌクレオチド配列５’ＧＧＡＵＣＵＵＡＵＵＵ３’（配列番号１５３）を具え、前記Ｂ２鎖がヌクレオチド配列５’ＣＵＵＣＧＧＡＧＴＴ３’（配列番号１５４）を具え、前記Ａ鎖がヌクレオチド配列５’ＣＵＣＣＧＡＡＧＡＡＡＵＡＡＧＡＵＣＣＴＴ３’（配列番号１５５）を具えることを特徴とする請求項３８に記載の組成物。
【請求項４４】
前記Ｂ１鎖がヌクレオチド配列５’ＧＧＡＴＣＴＴＡＴＴＴ３’（配列番号１５９）を具え、前記Ｂ２鎖がヌクレオチド配列５’ＣＴＴＣＧＧＡＧＴＴ３’（配列番号１６０）を具え、前記Ａ鎖がヌクレオチド配列５’ＣＴＣＣＧＡＡＧＡＡＡＴＡＡＧＡＴＣＣＴＴ３’（配列番号１６１）を具えることを特徴とする請求項３８に記載の組成物。
【請求項４５】
前記Ｂ１鎖がヌクレオチド配列５’ＣＴＣＣＧＡＡＧＡＡ３’（配列番号１６６）を具え、前記Ｂ２鎖がヌクレオチド配列５’ＡＴＡＡＧＡＴＣＣＴＴ３’（配列番号３４）を具え、前記Ａ鎖がヌクレオチド配列５’ＧＧＡＴＣＴＴＡＴＴＴＣＴＴＣＧＧＡＧＴＴ３’（配列番号１６５）を具えることを特徴とする請求項３８に記載の組成物。
【請求項４６】
前記Ｂ１鎖が５’リン酸末端であることを特徴とする請求項３８に記載の組成物。
【請求項４７】
前記Ｂ１鎖がヌクレオチド配列５’ＧＧＡＵＣＵＵＡＵＵＵ３’（配列番号１３８）を具え、前記Ｂ２鎖がヌクレオチド配列５’ＣＵＵＣＧＧＡＧＴＴ３’（配列番号１３９）を具え、前記Ａ鎖がヌクレオチド配列５’ＣＵＣＣＧＡＡＧＡＡＡＵＡＡＧＡＵＣＣＴＴ３’（配列番号１４０）を具えることを特徴とする請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
前記Ｂ１鎖がヌクレオチド配列５’ＧＧＡＴＣＴＴＡＴＴＴ３’（配列番号１４１）を具え、前記Ｂ２鎖がヌクレオチド配列５’ＣＴＴＣＧＧＡＧＴＴ３’（配列番号１４２）を具え、前記Ａ鎖がヌクレオチド配列５’ＣＴＣＣＧＡＡＧＡＡＡＴＡＡＧＡＴＣＣＴＴ３’（配列番号１４３）を具えることを特徴とする請求項４６に記載の組成物。
【請求項４９】
前記Ｂ１鎖がヌクレオチド配列５’ＣＴＣＣＧＡＡＧＡＡ３’（配列番号１５１）を具え、前記Ｂ２鎖がヌクレオチド配列５’ＡＴＡＡＧＡＴＣＣＴＴ３’（配列番号１５２）を具え、前記Ａ鎖がヌクレオチド配列５’ＧＧＡＴＣＴＴＡＴＴＴＣＴＴＣＧＧＡＧＴＴ３’（配列番号１５０）を具えることを特徴とする請求項４６に記載の組成物。
【請求項５０】
前記Ｂ１鎖がヌクレオチド配列５’ＧＧＡＵＣＵＵＡＵＵＵ３’（配列番号１５６）を具え、前記Ｂ２鎖がヌクレオチド配列５’ＣＵＵＣＧＧＡＧＴＴ３’（配列番号１５７）を具え、前記Ａ鎖がヌクレオチド配列５’ＣＵＣＣＧＡＡＧＡＡＡＵＡＡＧＡＵＣＣＴＴ３’（配列番号１５８）を具えることを特徴とする請求項４６に記載の組成物。
【請求項５１】
前記Ｂ１鎖がヌクレオチド配列５’ＧＧＡＴＣＴＴＡＴＴＴ３’（配列番号１６２）を具え、前記Ｂ２鎖がヌクレオチド配列５’ＣＴＴＣＧＧＡＧＴＴ３’（配列番号１６３）を具え、前記Ａ鎖がヌクレオチド配列５’ＣＴＣＣＧＡＡＧＡＡＡＴＡＡＧＡＴＣＣＴＴ３’（配列番号１６４）を具えることを特徴とする請求項４６に記載の組成物。
【請求項５２】
前記Ｂ１鎖がヌクレオチド配列５’ＣＴＣＣＧＡＡＧＡＡ３’（配列番号３９）を具え、前記Ｂ２鎖がヌクレオチド配列５’ＡＴＡＡＧＡＴＣＣＴＴ３’（配列番号４０）を具え、前記Ａ鎖がヌクレオチド配列５’ＧＧＡＴＣＴＴＡＴＴＴＣＴＴＣＧＧＡＧＴＴ３’（配列番号３８）を具えることを特徴とする請求項４６に記載の組成物。
【請求項５３】
組成物において：
（ａ）低分子抑制核酸（ｓｉＲＮＡ）分子であって、当該ｓｉＲＮＡがＡ、Ｂ１、及びＢ２（Ａ：Ｂ１Ｂ２）の３つの鎖を具え；
Ａ：Ｂ１Ｂ２が合計で約１４の塩基対乃至約２４の塩基対を具え；
Ａがセンス鎖を表し、Ｂ１Ｂ２がアンチセンス鎖を表し；
Ａが約１９ヌクレオチド乃至約２５ヌクレオチドであり；
Ｂ１及びＢ２が各々個別に約１ヌクレオチド乃至約１５ヌクレオチドであり；
Ｂ１及びＢ２を合わせた長さが約１３ヌクレオチド乃至約２３ヌクレオチドである；
ｓｉＲＮＡ分子と；
（ｂ）約５乃至約４０個のアミノ酸を具えるペプチドと；
を具え、前記ｓｉＲＮＡ分子が前記ペプチドと抱合していることを特徴とする組成物。
【請求項５４】
組成物において：
（ａ）低分子抑制核酸（ｓｉＲＮＡ）分子であって、当該ｓｉＲＮＡがＡ、Ｂ１、及びＢ２（Ａ：Ｂ１Ｂ２）の３つの鎖を具え；
Ａ：Ｂ１Ｂ２が合計で約１６の塩基対乃至約２２の塩基対を具え；
Ａがセンス鎖を表し、Ｂ１Ｂ２がアンチセンス鎖を表し；
Ａが約１９ヌクレオチド乃至約２３ヌクレオチドであり；
Ｂ１及びＢ２が各々個別に約１ヌクレオチド乃至約１５ヌクレオチドであり；
Ｂ１及びＢ２を合わせた長さが約１３ヌクレオチド乃至約２３ヌクレオチドである；
ｓｉＲＮＡ分子と；
（ｂ）約５乃至約４０個のアミノ酸を具えるペプチドと；
を具え、前記ｓｉＲＮＡ分子が前記ペプチドと抱合していることを特徴とする組成物。
【請求項５５】
組成物において：
（ａ）低分子抑制核酸（ｓｉＲＮＡ）分子であって、当該ｓｉＲＮＡがＡ、Ｂ１、及びＢ２（Ａ：Ｂ１Ｂ２）の３本の鎖を具え；
Ａ：Ｂ１Ｂ２が合計で約１４の塩基対乃至約２４の塩基対を具え；
Ａがアンチセンス鎖を表し、Ｂ１Ｂ２がセンス鎖を表し；
Ａが約１４ヌクレオチド乃至約２４ヌクレオチドであり；
Ｂ１及びＢ２が各々個別に約１ヌクレオチド乃至約１５ヌクレオチドであり；
Ｂ１及びＢ２を合わせた長さが約１８ヌクレオチド乃至約２４ヌクレオチドである；
ｓｉＲＮＡ分子と、
（ｂ）約５乃至約４０個のアミノ酸を具えるペプチドと；
を具え、前記ｓｉＲＮＡ分子が前記ペプチドと抱合していることを特徴とする組成物。
【請求項５６】
組成物において：
（ａ）低分子抑制核酸（ｓｉＲＮＡ）分子であって、当該ｓｉＲＮＡがＡ、Ｂ１、及びＢ２（Ａ：Ｂ１Ｂ２）の３本の鎖を具え；
Ａ：Ｂ１Ｂ２が合計で約１４の塩基対乃至約２２の塩基対を具え；
Ａがアンチセンス鎖を表し、Ｂ１Ｂ２がセンス鎖を表し；
Ａが約１６ヌクレオチド乃至約２２ヌクレオチドであり；
Ｂ１及びＢ２が各々個別に約１ヌクレオチド乃至約１５ヌクレオチドであり；
Ｂ１及びＢ２を合わせた長さが約１８ヌクレオチド乃至約２２ヌクレオチドである；
ｓｉＲＮＡ分子と、
（ｂ）約５乃至約４０個のアミノ酸を具えるペプチドと；
を具え、前記ｓｉＲＮＡ分子が前記ペプチドと抱合していることを特徴とする組成物。
【請求項５７】
組成物において：
（ａ）請求項２４及び請求項５３乃至５６のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ分子であって、当該ｓｉＲＮＡ分子が、レトロウィルス、呼吸器系ウィルス、ヒトメタニューモウィルス、ヒトパラインフルエンザウィルス、及びインフルエンザウィルスからなる群から選択される標的ウィルスの力価を低下させるのに有効であるｓｉＲＮＡ分子と；
（ｂ）約５乃至約４０個のアミノ酸を具えるペプチドと；
を具え、前記ｓｉＲＮＡ分子が前記ペプチドと抱合していることを特徴とする組成物。
【請求項５８】
前記ペプチドが、ＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号２）、ＤＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＴＥＲＰＲＡＰＡＲＳＡＳＲＰＲＲＰＶＤ（配列番号３）、ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号４）、ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号５）、ＶＴＶＬＡＬＧＡＬＡＧＶＧＶＧ（配列番号６）、ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡ（配列番号７）、ＭＧＬＧＬＨＬＬＶＬＡＡＡＬＱＧＡ（配列番号８）、ＬＧＴＹＴＱＤＦＮＫＦＨＴＦＰＱＴＡＩＧＶＧＡＰ（配列番号９）、ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号１０）、ＴＰＰＫＫＫＲＫＶＥＤＰＫＫＫＫ（配列番号１１）、ＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号１２）、ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ（配列番号１３）、ＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＮＧＷＥＧ（配列番号１４）、ＦＦＧＡＶＩＧＴＩＡＬＧＶＡＴＡ（配列番号１５）、ＦＬＧＦＬＬＧＶＧＳＡＩＡＳＧＶ（配列番号１６）、ＧＶＦＶＬＧＦＬＧＦＬＡＴＡＧＳ（配列番号１７）、ＧＡＡＩＧＬＡＷＩＰＹＦＧＰＡＡ（配列番号１８）、ＡＣＴＣＰＹＣＫＤＳＥＧＲＧＳＧＤＰＧＫＫＫＱＨＩＣＨＩＱＧＣＧＫＶＹＧＫＴＳＨＬＲＡＨＬＲＷＨＴＧＥＲＰＦＭＣ（配列番号１９）、ＡＣＴＣＰＮＣＫＤＧＥＫＲＳＧＥＱＧＫＫＫＨＶＣＨＩＰＤＣＧＫＴＦＲＫＴＳＬＬＲＡＨＶＲＬＨＴＧＥＲＰＦＶＣ（配列番号２０）、ＡＣＴＣＰＮＣＫＥＧＧＧＲＧＴＮＬＧＫＫＫＱＨＩＣＨＩＰＧＣＧＫＶＹＧＫＴＳＨＬＲＡＨＬＲＷＨＳＧＥＲＰＦＶＣ（配列番号２１）、ＡＣＳＣＰＮＣＲＥＧＥＧＲＧＳＮＥＰＧＫＫＫＱＨＩＣＨＩＥＧＣＧＫＶＹＧＫＴＳＨＬＲＡＨＬＲＷＨＴＧＥＲＰＦＩＣ（配列番号２２）、ＲＣＴＣＰＮＣＴＮＥＭＳＧＬＰＰＩＶＧＰＤＥＲＧＲＫＱＨＩＣＨＩＰＧＣＥＲＬＹＧＫＡＳＨＬＫＴＨＬＲＷＨＴＧＥＲＰＦＬＣ（配列番号２３）、ＴＣＤＣＰＮＣＱＥＡＥＲＬＧＰＡＧＶＨＬＲＫＫＮＩＨＳＣＨＩＰＧＣＧＫＶＹＧＫＴＳＨＬＫＡＨＬＲＷＨＴＧＥＲＰＦＶＣ（配列番号２４）、ＲＣＴＣＰＮＣＫＡＩＫＨＧＤＲＧＳＱＨＴＨＬＣＳＶＰＧＣＧＫＴＹＫＫＴＳＨＬＲＡＨＬＲＫＨＴＧＤＲＰＦＶＣ（配列番号２５）、ＰＱＩＳＬＫＫＫＩＦＦＦＩＦＳＮＦＲＧＤＧＫＳＲＩＨＩＣＨＬＣＮＫＴＹＧＫＴＳＨＬＲＡＨＬＲＧＨＡＧＮＫＰＦＡＣ（配列番号２６）、ＷＷＥＴＷＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＴＲＱＡＲＲＮＨＲＲＲＨＲ（配列番号２７）、ＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号２８）、ＲＶＩＲＶＷＦＱＮＫＲＣＫＤＫＫ（配列番号２９）、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号３０）、ＧＥＱＩＡＱＬＩＡＧＹＩＤＩＩＬＫＫＫＫＳＫ（配列番号３１）、ＫＧＳＫＫＡＶＴＫＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（配列番号３３）、ＫＧＳＫＫＡＶＴＫＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（配列番号３７）、ＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（配列番号４１）、ＫＫＡＶＴＫＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（配列番号４２）、ＶＴＫＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（配列番号４３）、ＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（配列番号４４）、ＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（配列番号４５）、ＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（配列番号４６）、ＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（配列番号４７）、ＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（配列番号４８）、ＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（配列番号４９）、ＹＫＶＬＫＱ（配列番号５０）、ＫＶＬＫＱ（配列番号５１）、及びＫＧＳＫＫＡＶＴＫＡＱＫＫＥＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（配列番号５２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を具えることを特徴とする、請求項２４及び請求項５３乃至５６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５９】
標的ウィルスの力価を低下させるためのｓｉＲＮＡ分子の使用において：
（ａ）標的遺伝子が標的ウィルス遺伝子であるｓｉＲＮＡ媒介性ジーンサイレンシング用の標的遺伝子を選択するステップと；
（ｂ）前記標的ウィルス遺伝子のｓｉＲＮＡ媒介性ジーンサイレンシング用に適切なｓｉＲＮＡ分子を設計及び／又は合成するステップであって、前記ｓｉＲＮＡ分子の各々がギャップ又はニックを有する二重鎖を具え、前記ギャップ又はニックが前記ｓｉＲＮＡ二重鎖のセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかに発現するステップと、
（ｃ）前記ｓｉＲＮＡを、約５乃至約４０個のアミノ酸を具えるペプチドに抱合するステップと、
（ｄ）前記ｓｉＲＮＡ分子を前記標的ウィルス遺伝子を発現する細胞へ投与するステップと；
を具え、前記ｓｉＲＮＡ分子とペプチドとの抱合体が前記対応する標的ウィルスのｍＲＮＡと特異的に結合可能であり、これによって前記細胞内の発現レベルを低下させることを特徴とする使用。
【請求項６０】
標的ウィルス遺伝子のｓｉＲＮＡ媒介性ジーンサイレンシングによって標的ウィルスの力価を低下させる薬物を製造するためのｓｉＲＮＡ分子の使用において、前記ｓｉＲＮＡ分子の各々がギャップ又はニックを有する二重鎖を具え、前記ギャップ又はニックが前記ｓｉＲＮＡ二重鎖のセンス鎖又はアンチセンス鎖の一方に発現し；前記ｓｉＲＮＡが約５乃至約４０個のアミノ酸を含むペプチドと抱合し；前記ｓｉＲＮＡ分子とペプチドとの抱合体が前記対応する標的ウィルスのｍＲＮＡと特異的に結合可能であり、これによって前記細胞内の発現レベルを低下させることを特徴とする使用。
【請求項６１】
内在性遺伝子の発現を低下させるためのｓｉＲＮＡ分子の使用において：
（ａ）ｓｉＲＮＡ媒介性ジーンサイレンシングのための標的遺伝子を選択するステップであって、当該標的遺伝子が内在性遺伝子であるステップと；
（ｂ）前記内在性標的遺伝子のｓｉＲＮＡ媒介性ジーンサイレンシングのための適切なギャップ又はニックを有する二重鎖ｓｉＲＮＡ分子を設計及び／又は合成するステップであって、前記ｓｉＲＮＡ分子がギャップ又はニックを有する二重鎖を具え、前記ギャップ若しくはニックが前記ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかに発現するステップと；
（ｃ）前記ｓｉＲＮＡを約５乃至約４０個のアミノ酸を具えるペプチドと抱合するステップと；
（ｄ）前記ｓｉＲＮＡ分子を前記内在性標的遺伝子を発現する細胞へ投与するステップと；
を具え、前記ｓｉＲＮＡ分子とペプチドとの抱合体が前記対応する内在性標的ｍＲＮＡと特異的に結合可能であり、これによって前記細胞内の発現レベルを低下させることを特徴とする方法。
【請求項６２】
内在性標的遺伝子のｓｉＲＮＡ媒介性ジーンサイレンシングによって内在性遺伝子の発現を低下させる薬物を製造するためのｓｉＲＮＡ分子の使用において、前記ｓｉＲＮＡ分子がギャップ又はニックを有する二重鎖を具え、前記ギャップ又はニックが前記ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかに発現し；前記ｓｉＲＮＡが約５乃至約４０個のアミノ酸を含むペプチドと抱合し；前記ｓｉＲＮＡ分子とペプチドとの抱合体が前記対応する内在性標的ｍＲＮＡと特異的に結合可能であり、これによって前記細胞内の発現レベルを低下させることを特徴とする使用。
【請求項６３】
医療に使用する、請求項１乃至１３又は請求項２４乃至５８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６４】
ＴＮＦ−αに関連する炎症を回復させる薬物として使用する、請求項１乃至３又は請求項６乃至１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６５】
前記炎症が関節炎に生じていることを特徴とする請求項６４に記載の組成物。
【請求項６６】
前記炎症が乾癬に生じていることを特徴とする請求項６４に記載の組成物。
【請求項６７】
インフルエンザウィルスに関連する感染症を回復させる薬物として使用する、請求項１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）による疾患の治療全般に関する。さらに詳細には、本開示は、遺伝子発現に対するＲＮＡｉを媒介することができる低分子抑制核酸分子（ｓｉＲＮＡ）及びその変異体の標的送達に関する。本明細書で述べるｓｉＲＮＡは、１又は２個以上のペプチドと抱合することができ、ここで抱合されたペプチドはｓｉＲＮＡの送達を促進し、安定性を向上し、及び／又は毒性を低下させる。
【背景技術】
【０００２】
動物及びヒト（植物）の内部へ核酸を送達することは、分子生物学及び臨床研究における重要な課題である。具体的には、遺伝子治療、アンチセンス治療、及びＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）治療の分野における最近の発展により、核酸を細胞内へ導入するためのより効率的な方法の開発が必要となってきた。
【０００３】
現在までの人工的に核酸を細胞へ送達する最も一般的な方法では、カチオン性脂質、エレクトロポレーション、及びウィルス形質導入、並びに機械的又は生化学的膜破壊及び／又は膜貫通（例：界面活性剤、マイクロインジェクション、若しくはパーティクルガンを使用）を用いる数多くの方法を使用している。これらの方法には種々の欠点がある。例えば、カチオン性脂質は、インビトロでのＤＮＡ及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の送達に最も頻繁に使用されるが、一般に毒性が強いため疾患の治療などのインビボでの用途には不適当である。ウィルス形質導入では、送達媒体として用いた複製欠損ウィルスが野生型に戻って病原性となる可能性がある。エレクトロポレーションは、遺伝子導入効率が低いこと、及び細胞を損傷するという欠点があるため臨床応用は限られる。
【０００４】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、植物及び動物の細胞内において特定の遺伝子の発現を調整するための有望な技術として浮上してきており、従って、内在性遺伝子発現の調整による治療を受け入れることができる広範囲にわたる疾患及び障害を治療するための有用な治療法（ツール）を提供することが期待される。ＲＮＡ干渉とは、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、通常は標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の一部分と相同的な配列であるｄｓＲＮＡ、が媒介する、動物内部での配列特異的な転写後ジーンサイレンシングのプロセスのことである。Ｆｉｒｅら，Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：  ８０６，  １９９８及びＨａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：  ９５０−９５１，  １９９９を参照のこと。植物内部でのこれに相当するプロセスは、一般に転写後ジーンサイレンシング又はＲＮＡサイレンシングと呼ばれ、真菌類では「ｑｕｅｌｌｉｎｇ」とも呼ばれる。転写後ジーンサイレンシングのプロセスは、進化の過程で保存されてきた異質遺伝子の発現を防ぐために用いられる細胞の防御メカニズムであると考えられており、一般に様々な動植物に共有されている（Ｆｉｒｅら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  １５：  ３５８，  １９９９）。
【０００５】
適切なｄｓＲＮＡを細胞内へ導入することにより、内在性の同族ｍＲＮＡ（すなわち、導入されたｄｓＲＮＡと実質的な配列同一性を共有するｍＲＮＡ）が誘起される。ｄｓＲＮＡ二重鎖が標的ジーンサイレンシングを媒介するメカニズムは、二段階プロセスであると考えられる。まず、ダイザと呼ばれるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素によってｄｓＲＮＡが低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に断片化（分解）される（Ｈａｍｉｌｔｏｎら，上掲；Ｂｅｒｓｔｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：  ３６３，  ２００１）。ダイザ活性から誘導された低分子干渉ＲＮＡは、通常約２１乃至約２３ヌクレオチドの長さで２塩基分の３’オーバハングを有する（Ｋｉｍら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２３（２）：  ２２２，  ２００５）。最近の研究から、より長いｄｓＲＮＡ（２５乃至３０ヌクレオチドの長さ）が同じ標的部位に対して、短いもの（２１−ｍｅｒ）よりも高いジーンサイレンシング活性を持ち得ることが示唆されている（Ｋｉｍら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２３（２）：  ２２２，  ２００５）。さらに、２１−ｍｅｒのＲＮＡによるｓｉＲＮＡ媒介性ジーンサイレンシングに対して耐性を持つ特定の標的部位は、より長い２７−ｍｅｒのｓｉＲＮＡ二重鎖によって効果的にジーンサイレンシングすることができる。このようなより長いｓｉＲＮＡ二重鎖の効力が高いのは、これらがダイザエンドヌクレアーゼの基質であるという事実に起因する（Ｋｉｍら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２３（２）：  ２２２，  ２００５）。従って治療薬という意味では、これらのより長いｄｓＲＮＡは前駆体として働き、ダイザで処理されるとＲＩＳＣ複合体へ進入して標的ジーンサイレンシングのメディエータとして機能する。
【０００６】
二番目の段階では、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体又は「ＲＩＳＣ」と呼ばれる多成分ヌクレアーゼ複合体へｓｉＲＮＡを取り込むことを含む。ＲＩＳＣは、そのｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖への相補性によってｍＲＮＡ基質を識別し、標的ｍＲＮＡに結合してその破壊（開裂）を誘起することによって遺伝子発現のサイレンシングを引き起こす。標的ＲＮＡの開裂はｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央部で発生する（Ｅｌｂａｓｈｉｒら，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １５：  １８８，  ２００１）。
【０００７】
本技術分野では、特に既存の細胞送達技術が、効率の悪さ及び／又は送達試薬の高い毒性によって限界があるという事実に鑑みて、核酸、ペプチド、及びその他の薬理剤を細胞へ送達するためのより良いツール並びに方法が長年にわたって求められている。これに関連して、標的細胞の表現型又は疾患状態を変化させる方法で遺伝子発現の制御を媒介するために、細胞、組織、又は区画へ選択的に、無毒性送達媒体を用いて、活性状態及び持続的状態で効果量を送達するための改善された方法並びに製剤が必要とされている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本開示は、とりわけ疾患の治療のための治療用プロドラッグ送達システムとしてのポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド／ダイザ基質ｄｓＲＮＡ抱合体を提供することにより、これらの及びその他の関連する要求に応えるものである。前駆体ｓｉＲＮＡは、ポリペプチドによって細胞内へ送達されるとダイザによって開裂されて送達ペプチドから遊離され、そしてそれによってｓｉＲＮＡはＲＩＳＣ複合体へ進入して特定の遺伝子を転写後ジーンサイレンシングの標的とすることができる。本明細書で述べるペプチド−ｄｓＲＮＡ抱合体は、内在性遺伝子発現の調整による治療を受け入れることができる広範囲にわたる疾患及び障害を治療するためのｄｓＲＮＡ治療前駆体の細胞内への送達を向上させる有望な新規の方法を提供する。本明細書で開示するポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド／ダイザ基質ｄｓＲＮＡ抱合体は、ｄｓＲＮＡの防御能力及び／又は予防能力をそのインビボでの寿命を延ばすことによって有利に向上する。
【０００９】
一つの態様において、本開示は、動物に対して１又は２種類以上の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を投与するのに適した医薬組成物を含む組成物を提供し、この場合組成物は１又は２種類以上のｄｓＲＮＡ分子及び１又は２種類以上のペプチドを含み、各ｄｓＲＮＡ分子は約２５乃至約３０の塩基対を具え、各ペプチドは約５乃至約４０個のアミノ酸とアミノ酸配列ＫＶＬＫＱ（配列番号５１）を具え、前記ｄｓＲＮＡ分子は前記ペプチドと抱合している。ある様態の範囲内では、ペプチドのアミノ酸配列は、ＫＧＳＫＫＡＶＴＫＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（配列番号３３）、ＫＫＡＶＴＫＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（配列番号４２）、ＶＴＫＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（配列番号４３）、ＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（配列番号４４）、ＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（配列番号４５）、ＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（配列番号４６）、ＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（配列番号４７）、ＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（配列番号４１）、ＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（配列番号４８）、ＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（配列番号４９）、ＹＫＶＬＫＱ（配列番号５０）、及びＫＶＬＫＱ（配列番号５１）からなる群より選択することができる。
【００１０】
他の様態では、ｄｓＲＮＡは２若しくは３個以上の塩基対を有する５’オーバハング又は２若しくは３個以上の塩基対を有する３’オーバハングを持ち、この場合オーバハングはセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖の一方又は両方に存在することができる。さらなる様態では、ｄｓＲＮＡはオーバハングを持たない。さらなる様態では、ｄｓＲＮＡは約２５塩基対乃至２９塩基対の長さの鎖を持つ。さらなる様態では、ｄｓＲＮＡ分子はセンスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を含み、ペプチドはアンチセンス鎖の５’末端で抱合されている。
【００１１】
他の態様では、本開示は、動物に対して１又は２種類以上のｓｉＲＮＡ分子を投与するのに適した、医薬組成物を含む組成物を提供し、この場合組成物は１又は２種類以上のｓｉＲＮＡ分子及び１又は２種類以上のペプチドを具え、各ｓｉＲＮＡ分子は約２５乃至約３０の塩基対の二本鎖リボ核酸を具え、各ペプチドは約５乃至約４０個のアミノ酸を具えてアミノ酸配列ＫＶＬＫＱ（配列番号５１）を含み、ペプチドはｄｓＲＮＡ分子と抱合している。一つの様態では、ペプチドは動物の細胞と結合する分子と抱合している。別の様態では、ｓｉＲＮＡ分子は、ＴＮＦ−α遺伝子の一部分の配列と相同的である配列を含む。
【００１２】
さらに他の様態では、本開示は、ｓｉＲＮＡ分子及びこれらのｓｉＲＮＡとポリペプチドとの抱合体を提供し、この場合、ｓｉＲＮＡは本明細書においてＡ、Ｂ１、及びＢ２（Ａ：Ｂ１Ｂ２）と称する三本鎖を具え、Ｂ１及びＢ２は、Ａの非オーバーラップ領域と相補的で塩基対（ｂｐ）を形成する。従って、これらの様態の範囲内におけるｓｉＲＮＡ分子において、Ｂ１とＡのアニーリングによって形成された二本鎖領域は、Ｂ２とＡのアニーリングによって形成された二本鎖領域とは異なる。Ａ：Ｂ１二重鎖とＡ：Ｂ２二重鎖は、Ａ：Ｂ１二重鎖とＡ：Ｂ２二重鎖の間に位置し、Ａ、Ｂ１、及び／又はＢ２鎖の一方又は両方の３’末端における１又は２個以上のいずれの不対ヌクレオチドとも異なる少なくとも一つのＡ鎖中の不対ヌクレオチドによる「ギャップ」によって分けることができる。代替的に、Ａ：Ｂ１二重鎖とＡ：Ｂ２二重鎖は「ニック」によって分けることができ、その場合Ａ：Ｂ１二重鎖とＡ：Ｂ２二重鎖の間に位置するＡ鎖の不対ヌクレオチドが存在せず、唯一の不対ヌクレオチドが、もし存在する場合には、Ａ、Ｂ１、及び／又はＢ２鎖の一方又は両方の３’末端に存在する。
【００１３】
典型的には、本開示のこれらの態様によるｓｉＲＮＡは、合計で約１５塩基対乃至約４０塩基対を具え、より典型的には約１８乃至約３５塩基対であり、さらにより典型的には約２０乃至３０塩基対であり、最も典型的には２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、又は２９塩基対のいずれかである。ｓｉＲＮＡは任意に、１ヌクレオチド乃至５ヌクレオチドの一本鎖３’オーバハングを具えていてもよい。最も典型的には、そのような一本鎖３’オーバハングは１、２、３、又は４ヌクレオチドである。
【００１４】
従って、このような本開示の三本鎖ｓｉＲＮＡはＡセンス鎖又はＡアンチセンス鎖のどちらかを具え、この場合Ａ鎖の長さは約１５ヌクレオチド乃至約５０ヌクレオチドであり、より典型的にはＡ鎖の長さは約１８ヌクレオチド乃至約４０ヌクレオチドであり、さらにより典型的にはＡ鎖の長さは約２０ヌクレオチド乃至約３２ヌクレオチドであり、最も典型的にはＡ鎖の長さは２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、又は３１ヌクレオチドである。
【００１５】
本開示の三本鎖ｓｉＲＮＡはさらに、本明細書において例えばＢ１及びＢ２と称する２又は３本以上のＢ鎖を具え、この場合各Ｂ鎖は、同族であるＡ鎖の非オーバーラップ領域と相補的であり、第一のＢ鎖（Ｂ１）と第二のＢ鎖（Ｂ２）は、ニック又は１若しくは２個以上のヌクレオチドギャップで分けられる。同族Ａ鎖がセンス鎖であるか又はアンチセンス鎖であるかに依存して、各Ｂ鎖はそれぞれアンチセンス鎖又はセンス鎖となる。本明細書で述べるＢ鎖（Ｂ１、Ｂ２等）は各々独立して、約１ヌクレオチド乃至約２５ヌクレオチドの長さであり、より典型的には約４ヌクレオチド乃至約２０ヌクレオチドの長さであり、さらにより典型的には約５ヌクレオチド乃至約１６ヌクレオチドの長さであり、最も典型的には６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５ヌクレオチドの長さである。
【００１６】
厳密にどのような用途を意図しているかによって、第一のＢ鎖（Ｂ１）と第二のＢ鎖（Ｂ２）はニック又はギャップで分けることができる。Ｂ１とＢ２がギャップによって分けられる様態では、典型的にはギャップは約１ヌクレオチド乃至約２５ヌクレオチドであり、より典型的にはギャップは約１ヌクレオチド乃至約１５ヌクレオチドであり、さらにより典型的にはギャップは約１ヌクレオチド乃至約１０ヌクレオチドであり、最も典型的にはギャップは１、２、３、４、５、６、７、８、又は９ヌクレオチドである。Ｂ鎖は各々独立して、５’−ヒドロキシル（すなわち５’−ＯＨ）末端か、又は５’−リン酸（すなわち５’−ＰＯ４）末端を有していてもよい。
【００１７】
本開示の他の態様の範囲内において、ギャップ又はニックを有する１又は２種類以上の二重鎖ｓｉＲＮＡ分子を用いる方法、及びギャップ又はニックを有する１又は２種類以上の二重鎖ｓｉＲＮＡ分子を具える組成物が提供される。
【００１８】
ある様態の範囲内において、本明細書で開示される方法は、（ａ）ｓｉＲＮＡ媒介性ジーンサイレンシングのための標的遺伝子を選択するステップであって、ここで標的遺伝子が標的ウィルス遺伝子であるステップと、（ｂ）標的ウィルス遺伝子のｓｉＲＮＡ媒介性ジーンサイレンシングのための適切なｓｉＲＮＡ分子を設計及び／又は合成するステップであって、ここでｓｉＲＮＡ分子がギャップ又はニックを有する二重鎖を含み、そのギャップ又はニックがセンス鎖又はアンチセンス鎖のどちらかに見られるステップと、（ｃ）標的ウィルス遺伝子を発現する細胞へｓｉＲＮＡ分子を投与するステップであって、ここでｓｉＲＮＡが対応する標的ウィルスのｍＲＮＡと特異的に結合することができ、それによって細胞中におけるその発現レベルを低下させるステップとを具える。
【００１９】
代替的な様態の範囲内において、本明細書で開示される方法は、（ａ）ｓｉＲＮＡ媒介性ジーンサイレンシングのための標的遺伝子を選択するステップであって、ここで標的遺伝子が内在性遺伝子であり、内在性遺伝子が任意に、対応する野生型内在性遺伝子からの１又は２個以上の配列変異を含むステップと、（ｂ）内在性標的遺伝子のｓｉＲＮＡ媒介性ジーンサイレンシングのためのギャップ又はニックを有する適切なｓｉＲＮＡ分子を設計及び／又は合成するステップであって、ここでｓｉＲＮＡ分子がギャップ又はニックを有する二重鎖を具え、そのギャップ又はニックがセンス鎖又はアンチセンス鎖のどちらかに見られるステップと、（ｃ）内在性標的遺伝子を発現する細胞へｓｉＲＮＡ分子を投与するステップであって、ここでｓｉＲＮＡが対応する内在性標的ｍＲＮＡと特異的に結合することができ、それによって細胞中におけるその発現レベルを低下させるステップとを具える。
【００２０】
本発明の方法が、ギャップ又はニックを有する二重鎖ｓｉＲＮＡが標的とする可能なあらゆる遺伝子変異体のヌクレオチド配列に関する経験的知識を必要としているわけではないことは理解されるであろう。最初は、ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を標的遺伝子の保存領域から選択してもよい。
【００２１】
本明細書で開示される組成物及び方法は、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）等のレトロウィルス、並びにヒト呼吸器多核体ウィルス、ヒトメタニューモウィルス、ヒトパラインフルエンザウィルス１型、ヒトパラインフルエンザウィルス２型、ヒトパラインフルエンザウィルス３型、ヒトパラインフルエンザウィルス４ａ型、ヒトパラインフルエンザウィルス４ｂ型、Ａ型インフルエンザウィルス、Ｂ型インフルエンザウィルス、ライノウィルス、及びＣ型インフルエンザウィルス等の呼吸器系ウィルスを含むがこれらに限定されない広範囲にわたる種類の標的ウィルスの力価を低下させるのに有用である。
【００２２】
本開示の別の態様の範囲内において、動物の遺伝子の発現を阻害する方法が提供され、その方法は、医薬組成物を含む１又は２種類以上の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子の組成物を動物に投与するステップを具え、この場合医薬組成物はｄｓＲＮＡ及びペプチドを具え、各ｄｓＲＮＡ分子は約２５乃至約３０塩基対であり、各ペプチドは約５乃至約４０アミノ酸であって典型的にはアミノ酸配列ＫＶＬＫＱ（配列番号５１）を含み、各ｄｓＲＮＡ分子はペプチドと抱合している。
【００２３】
配列番号１は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＫＲＲＱＲＲＲである。
配列番号２は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫである。
配列番号３は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＤＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＴＥＲＰＲＡＰＡＲＳＡＳＲＰＲＲＰＶＤである。
配列番号４は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰである。
配列番号５は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰである。
配列番号６は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＶＴＶＬＡＬＧＡＬＡＧＶＧＶＧである。
配列番号７は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡである。
配列番号８は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＭＧＬＧＬＨＬＬＶＬＡＡＡＬＱＧＡである。
配列番号９は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＬＧＴＹＴＱＤＦＮＫＦＨＴＦＰＱＴＡＩＧＶＧＡＰである。
配列番号１０は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬである。
配列番号１１は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＴＰＰＫＫＫＲＫＶＥＤＰＫＫＫＫである。
配列番号１２は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＲＲＲＲＲＲＲである。
配列番号１３は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡである。
配列番号１４は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＮＧＷＥＧである。
配列番号１５は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＦＦＧＡＶＩＧＴＩＡＬＧＶＡＴＡである。
配列番号１６は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＦＬＧＦＬＬＧＶＧＳＡＩＡＳＧＶである。
配列番号１７は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＧＶＦＶＬＧＦＬＧＦＬＡＴＡＧＳである。
配列番号１８は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＧＡＡＩＧＬＡＷＩＰＹＦＧＰＡＡである。
配列番号１９は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＡＣＴＣＰＹＣＫＤＳＥＧＲＧＳＧＤＰＧＫＫＫＱＨＩＣＨＩＱＧＣＧＫＶＹＧＫＴＳＨＬＲＡＨＬＲＷＨＴＧＥＲＰＦＭＣである。
配列番号２０は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＡＣＴＣＰＮＣＫＤＧＥＫＲＳＧＥＱＧＫＫＫＨＶＣＨＩＰＤＣＧＫＴＦＲＫＴＳＬＬＲＡＨＶＲＬＨＴＧＥＲＰＦＶＣである。
配列番号２１は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＡＣＴＣＰＮＣＫＥＧＧＧＲＧＴＮＬＧＫＫＫＱＨＩＣＨＩＰＧＣＧＫＶＹＧＫＴＳＨＬＲＡＨＬＲＷＨＳＧＥＲＰＦＶＣである。
配列番号２２は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＡＣＳＣＰＮＣＲＥＧＥＧＲＧＳＮＥＰＧＫＫＫＱＨＩＣＨＩＥＧＣＧＫＶＹＧＫＴＳＨＬＲＡＨＬＲＷＨＴＧＥＲＰＦＩＣである。
配列番号２３は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＲＣＴＣＰＮＣＴＮＥＭＳＧＬＰＰＩＶＧＰＤＥＲＧＲＫＱＨＩＣＨＩＰＧＣＥＲＬＹＧＫＡＳＨＬＫＴＨＬＲＷＨＴＧＥＲＰＦＬＣである。
配列番号２４は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＴＣＤＣＰＮＣＱＥＡＥＲＬＧＰＡＧＶＨＬＲＫＫＮＩＨＳＣＨＩＰＧＣＧＫＶＹＧＫＴＳＨＬＫＡＨＬＲＷＨＴＧＥＲＰＦＶＣである。
配列番号２５は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＲＣＴＣＰＮＣＫＡＩＫＨＧＤＲＧＳＱＨＴＨＬＣＳＶＰＧＣＧＫＴＹＫＫＴＳＨＬＲＡＨＬＲＫＨＴＧＤＲＰＦＶＣである。
配列番号２６は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＰＱＩＳＬＫＫＫＩＦＦＦＩＦＳＮＦＲＧＤＧＫＳＲＩＨＩＣＨＬＣＮＫＴＹＧＫＴＳＨＬＲＡＨＬＲＧＨＡＧＮＫＰＦＡＣである。
配列番号２７は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＷＷＥＴＷＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＴＲＱＡＲＲＮＨＲＲＲＨＲである。
配列番号２８は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬである。
配列番号２９は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＲＶＩＲＶＷＦＱＮＫＲＣＫＤＫＫである。
配列番号３０は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱである。
配列番号３１は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＧＥＱＩＡＱＬＩＡＧＹＩＤＩＩＬＫＫＫＫＳＫである。
配列番号３３は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＫＧＳＫＫＡＶＴＫＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱである。
配列番号３５は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列５’−ＡＵＧＧＵＧＵＧＧＧＵＧＡＧＧＡＧＣＡＣＡＵＧＧＧＵＧ−３’である。
配列番号３６は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列５’−ＣＣＣＡＵＧＵＧＣＵＣＣＵＣＡＣＣＣＡＣＡＣＣｄＡＴ−３’である。
配列番号３７は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＫＧＳＫＫＡＶＴＫＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱである。
配列番号４１は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱである。
配列番号４２は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＫＫＡＶＴＫＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱである。
配列番号４３は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＶＴＫＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱである。
配列番号４４は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱである。
配列番号４５は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱである。
配列番号４６は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱである。
配列番号４７は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱである。
配列番号４８は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱである。
配列番号４９は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＶＹＶＹＫＶＬＫＱである。
配列番号５０は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＹＫＶＬＫＱである。
配列番号５１は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＫＶＬＫＱである。
配列番号５２は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ＫＧＳＫＫＡＶＴＫＡＱＫＫＥＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱである。
配列番号５３は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列５’−ＧＣＣＵＧＵＡＣＣＵＣＡＵＣＵＡＣＵＣＵＵ−３’である。
配列番号５４は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列３’−ＵＵＣＧＧＡＣＡＵＧＧＡＧＵＡＧＡＵＧＡＧ−５’である。
配列番号５５は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列５’−ＧＣＣＵＣＵＵＣＵＣＣＵＵＣＣＵＧＡＵＣＧＵＧｄＧｄＣ−３’である。
配列番号５６は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列３’−ＧＵＣＧＧＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＧＡＣＵＡＧＣＡＣＣＧ−５’である。
配列番号５７は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列５’−ＧＣＣＵＧＣＵＧＣＡＣＵＵＵＧＧＡＧＵＧＡＵＣｄＧｄＧ−３’である。
配列番号５８は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列３’−ＧＡＣＧＧＡＣＧＡＣＧＵＧＡＡＡＣＣＵＣＡＣＵＡＧＣＣ−５’である。
配列番号５９は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列５’−ＣＣＣＡＵＧＵＧＣＵＣＣＵＣＡＣＣＣＡＣＡＣＣｄＡＴ−３’である。
配列番号６０は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列３’−ＧＵＧＧＧＵＡＣＡＣＧＡＧＧＡＧＵＧＧＧＵＧＵＧＧＵＡ−５’である。
配列番号６１は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列５’−ＡＣＣＵＣＡＵＣＵＡＣＵＣＣＣＡＧＧＵＣＣＵＣｄＴｄＴ−３’である。
配列番号６２は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列３’−ＣＡＵＧＧＡＧＵＡＧＡＵＧＡＧＧＧＵＣＣＡＧＧＡＧＡＡ−５’である。
配列番号６３は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列５’−ＧＣＣＵＧＵＡＣＣＵＣＡＵＣＵＡＣＵＣＣＣＡＧＧＵＣＣ−３’である。
配列番号６４は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列５’−ＧＧＵＣＣＵＧＧＧＡＧＵＡＧＡＵＧＡＧＧＵＡＣＡＧＧＣＵＵ−３’である。
配列番号６５は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列５’−ＡＧＡＣＡＧＣＧＡＣＣＡＡＡＡＧＡＡＵＵＣＧＧｄＡｄＵ−３’である。
配列番号６６は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列５’−ＡＵＣＣＧＡＡＵＵＣＵＵＵＵＧＧＵＣＧＣＵＧＵＣＵｄＴｄＴ−３’である。
配列番号６７は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列５’−ＡＵＧＡＡＧＡＵＣＵＧＵＵＣＣＡＣＣＡＵＵＧＡｄＡｄＧ−３’である。
配列番号６８は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列５’−ＣＵＵＣＡＡＵＧＧＵＧＧＡＡＣＡＧＡＵＣＵＵＣＡＵｄＴｄＴ−３’である。
配列番号６９は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列５’−ＧＡＵＣＵＧＵＵＣＣＡＣＣＡＵＵＧＡＡＧＡＡＣｄＵｄＣ−３’である。
配列番号７０は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列５’−ＧＡＧＵＵＣＵＵＣＡＡＵＧＧＵＧＧＡＡＣＡＧＡＵＣｄＴｄＴ−３’である。
配列番号７１は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列５’−ＵＵＧＡＧＧＡＧＵＧＣＣＵＧＡＵＵＡＡＵＧＡＵｄＣｄＣ−３’である。
配列番号７２は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列５’−ＧＧＡＵＣＡＵＵＡＡＵＣＡＧＧＣＡＣＵＣＣＵＣＡＡｄＴｄＴ−３’である。
配列番号７３は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列５’−ＧＧＡＵＣＵＵＡＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＧＡＣＡＡｄＴｄＧ−３’である。
配列番号７４は、本明細書で述べるｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列５’−ＣＡＵＵＧＵＣＵＣＣＧＡＡＧＡＡＡＵＡＡＧＡＵＣＣｄＴｄＴ−３’である。
配列番号７５は、本明細書の表２に示すｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的な２５塩基長のＢ鎖配列のヌクレオチド配列５’−ＧＧＡＵＣＵＵＡＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＧＡＣＡＡＵＧ−３’である。
配列番号７６は、本明細書の表２に示すｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的な２７塩基長のＡ鎖配列のヌクレオチド配列３’−ＴＴＣＣＵＡＧＡＡＵＡＡＡＧＡＡＧＣＣＵＣＵＧＵＵＡＣ−５’である。
配列番号７７乃至１３２は、本明細書の表２に示すギャップ付きｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するための典型的なポリヌクレオチドのＡ鎖、Ｂ１鎖、及びＢ２鎖のヌクレオチド配列である。
配列番号３４、３８乃至４０、１３３、及び１６６は、本明細書で述べるニック付きｓｉＲＮＡ−ペプチド抱合体を生成するための典型的なポリヌクレオチドのＡ鎖、Ｂ１鎖、及びＢ２鎖のヌクレオチド配列である。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本開示は、短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）又はその前駆体がポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと組み合わせて用いられると、ヒトなどの哺乳類にインビボで投与された時に送達を促進し、安定性を向上し、及び／又は毒性を低下させるという観察に基づいている。従って、本明細書で開示されるポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、とりわけｓｉＮＡを含むポリヌクレオチド及びその前駆体の細胞内送達又は取り込みを促進させる能力によって選択された天然の又は人工のポリペプチドあってよい。
【００２５】
本発明のｓｉＮＡ及び組成物は、１又は２種類以上のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと混合、複合体化、又は抱合されて、標的細胞とｓｉＮＡ単独（すなわち送達促進ポリペプチドなしのｓｉＮＡ）との接触による送達と比べてｓｉＮＡの細胞内送達を促進する組成物を形成することができる。
【００２６】
ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドの選択及び設計
本発明の特定の様態では、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、ヒストンタンパク質、又はそのポリペプチド若しくはペプチド断片、誘導体、類似体、若しくは抱合体である。これらの様態の範囲内において、ｓｉＮＡは、例えばヒストンＨ１、ヒストンＨ２Ａ、ヒストンＨ２Ｂ、ヒストンＨ３、若しくはヒストンＨ４などの１種類以上のヒストン、又は典型的にはもとのヒストンタンパク質の少なくとも５乃至１０個若しくは１０乃至２０個の連続する残基であるヒストンタンパク質の部分配列を少なくとも含む、それらの１種類以上のポリペプチド断片若しくは誘導体などといった１種類以上の完全長型ヒストンタンパク質、又はヒストンタンパク質の部分配列に少なくとも一部対応するポリペプチドと混合、複合体化、又は抱合している。
【００２７】
より詳細な様態では、ｓｉＲＮＡ／ヒストン混合物、複合体、又は抱合体は実質的に両親媒性化合物を含まない。他の詳細な様態では、ヒストンタンパク質又はポリペプチドと混合、複合体化、または抱合されたｓｉＮＡは、例えば３０又は２９個以下のヌクレオチドを有する二本鎖ＲＮＡなどの二本鎖ＲＮＡを具え、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。典型的な様態では、ヒストンポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、本明細書において以下で述べるＰＮ７３と称するポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドによって例示されるように、ヒストンＨ２Ｂの断片を具える。さらに追加的な詳細な様態では、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドはペグ化することにより、特にインビボ投与という面において安定性及び／又は有効性を向上させることができる。
【００２８】
本発明の追加的な様態の範囲内において、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、両親媒性アミノ酸配列を具えるように選択又は合理的に設計される。例えば、有用なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドとしては、帯電した配列ドメイン若しくはモチーフを形成する複数の帯電したアミノ酸残基と連結して両親媒性ペプチドを生成する、疎水性配列ドメイン若しくはモチーフを形成する複数の非極性又は疎水性アミノ酸残基を具えるものを選択することができる。
【００２９】
他の様態では、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、タンパク質導入ドメイン又はモチーフ、及び膜融合ペプチドドメイン又はモチーフを含むように選択される。タンパク質導入ドメインは、細胞膜内へ挿入することができ、好ましくは細胞膜を通過することができるペプチド配列である。膜融合ペプチドは、例えば細胞膜又はエンドソームを取り囲む膜などの脂質膜を不安定化するペプチドであり、この働きは低ｐＨにおいて促進される。典型的な膜融合ドメイン又はモチーフは、例えば線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ−４）などの広範囲にわたる種々のウィルス融合タンパク質及びその他のタンパク質に見られる。
【００３０】
本発明のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを合理的に設計するために、核酸の細胞膜を通しての細胞内への進入を促進するモチーフとして、タンパク質導入ドメインが用いられる。ある様態では、輸送された核酸はエンドソーム内に封入されることになる。エンドソーム内部はｐＨが低いため、膜融合ペプチドモチーフがエンドソームの膜を不安定化させる結果となる。エンドソームの膜の不安定化及び分解により、ｓｉＮＡが細胞質内へ放出され、ｓｉＮＡはそこでＲＩＳＣ複合体と会合して標的ｍＲＮＡへ向かうことができる。
【００３１】
本発明のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドへ任意に取り込まれるタンパク質導入ドメインの例としては、
１．ＴＡＴタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）（配列番号１）ＫＲＲＱＲＲＲ；
２．ペネトラチン（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）ＰＴＤ（配列番号２）ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ；
３．ＶＰ２２  ＰＴＤ（配列番号３）ＤＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＴＥＲＰＲＡＰＡＲＳＡＳＲＰＲＲＰＶＤ；
４．カポジＦＧＦシグナル配列（配列番号４）ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ；及び（配列番号５）ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ；
５．ヒトβ３インテグリンシグナル配列（配列番号６）ＶＴＶＬＡＬＧＡＬＡＧＶＧＶＧ；
６．ｇｐ４１融合配列（配列番号７）ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡ；
７．カイマンクロコディルス（ｃａｉｍａｎ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｕｓ）のＩｇ（ｖ）軽鎖（配列番号８）ＭＧＬＧＬＨＬＬＶＬＡＡＡＬＱＧＡ；
８．ｈＣＴ−誘導性ペプチド（配列番号９）ＬＧＴＹＴＱＤＦＮＫＦＨＴＦＰＱＴＡＩＧＶＧＡＰ；
９．トランスポータン（配列番号１０）ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ；
１０．ロリゴマ（ｌｏｌｉｇｏｍｅｒ）（配列番号１１）ＴＰＰＫＫＫＲＫＶＥＤＰＫＫＫＫ；
１１．アルギニンペプチド（配列番号１２）ＲＲＲＲＲＲＲ；並びに
１２．両親媒性モデルペプチド（配列番号１３）ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ；
が挙げられる。
【００３２】
本発明のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドへ任意に取り込まれるウィルス融合ペプチド膜融合ドメインの例としては、
１．インフルエンザＨＡ２（配列番号１４）ＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＮＧＷＥＧ；
２．センダイＦ１（配列番号１５）ＦＦＧＡＶＩＧＴＩＡＬＧＶＡＴＡ；
３．呼吸器系シンチウムウィルスＦ１（配列番号１６）ＦＬＧＦＬＬＧＶＧＳＡＩＡＳＧＶ；
４．ＨＩＶ  ｇｐ４１（配列番号１７）ＧＶＦＶＬＧＦＬＧＦＬＡＴＡＧＳ；及び
５．エボラＧＰ２（配列番号１８）ＧＡＡＩＧＬＡＷＩＰＹＦＧＰＡＡ；
が挙げられる。本発明のさらに追加的な様態の範囲内では、本発明の方法及び組成物の範囲内において、ポリペプチド−ｓｉＮＡ複合体形成を促進、及び／若しくはｓｉＮＡの送達を促進するＤＮＡ結合ドメイン又はモチーフが取り込まれたポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドが提供される。ここで言うＤＮＡ結合ドメインの典型例としては、以下の表１に示すＤＮＡ結合性制御タンパク質及びその他のタンパク質で述べるように、様々な「ジンクフィンガー」ドメインが挙げられる（例えば、Ｓｉｍｐｓｏｎら，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７８：  ２８０１１-２８０１８，  ２００３を参照）。
【００３３】
【表１】
2009514877.tif 000003
＊この表は、Ｃ−ｘ（２，４）−Ｃ−ｘ（１２）−Ｈ−ｘ（３）−Ｈ（配列番号３２）のモチーフパターンで表される二本鎖ＤＮＡ結合性の保存ジンクフィンガーモチーフを示しており、それ自体を用いて本発明にかかる追加的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを選択して設計することができる。
＊＊表１に示す配列、Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３、Ｓｐ４、ＤｒｏｓＢｔｄ、ＤｒｏｓＳｐ、ＣｅＴ２２Ｃ８．５、及びＹ４ｐＢ１Ａ．４は、本明細書ではそれぞれ配列番号１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、及び２６と定める。
【００３４】
本発明のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを構築するのに有用なＤＮＡ結合ドメインの他の選択肢としては、例えばＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質配列の一部分が挙げられる（以下の実施例参照）。
【００３５】
本明細書において以下に述べる本発明の典型的な様態の範囲内において、前述の構造要素、ドメイン、又はモチーフのいずれかをｓｉＮＡの対象細胞への送達の促進を媒介するのに効果的な単一のポリペプチドと組み合わせることによって、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを合理的に設計し構築することができる。例えば、ＴＡＴポリペプチドのタンパク質導入ドメインを、ＨＡ２と呼ばれるインフルエンザウィルスの赤血球凝集素タンパク質のＮ末端側の２０個のアミノ酸と融合することにより、本発明の典型的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド構成が得られた。様々なその他のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドが本開示で提供され、このことは本発明の発想が、ｓｉＮＡの送達を促進するのに効果的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドの様々な集団の作製及び使用に広く適用されることを明らかに示している。
【００３６】
本発明の範囲内のさらに追加的な典型的ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、以下に示すペプチド、ＷＷＥＴＷＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＴＲＱＡＲＲＮＨＲＲＲＨＲ（配列番号２７）；ＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号２８）；ＲＶＩＲＶＷＦＱＮＫＲＣＫＤＫＫ（配列番号２９）；ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号３０）；ＧＥＱＩＡＱＬＩＡＧＹＩＤＩＩＬＫＫＫＫＳＫ（配列番号３１）；Ｐｏｌｙ  Ｌｙｓ−Ｔｒｐ，４：１，分子量  ２０，０００−５０，０００；及びＰｏｌｙ  Ｏｒｎ−Ｔｒｐ，４：１，分子量  ２０，０００−５０，０００より選択することができる。本発明の組成物及び方法の範囲内で有用な追加的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、メリチンタンパク質配列のすべて又は一部を含む。
【００３７】
さらに他の典型的ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは以下の例で示される。これらのペプチドのいずれか一つ若しくは組み合わせを選択又は組み合わせて、本発明の方法及び組成物の範囲内でｓｉＮＡの細胞内送達を誘起又は促進するのに効果的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド試薬を得ることができる。
【００３８】
ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド、ｓｉＲＮＡ、及び脂質を含む組成物
より詳細な態様では、１又は２種類以上のｓｉＲＮＡ及びポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを具える混合物、複合体、及び／又は抱合体を、任意にＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）などのカチオン性脂質と組み合わせてもよい（例：混合又は複合体化）。この点で、ｓｉＲＮＡ単独と複合体化又は抱合されたポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、ＲＮＡｉによるジーンサイレンシングを媒介するのに十分なｓｉＮＡの送達をもたらすということが、予想外なことに本発明において開示される。本発明ではさらに、ｓｉＲＮＡ／ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド複合体又は抱合体は、リポフェクティンなどのカチオン性脂質と混合又は複合体化されると、ｓｉＮＡ送達及びジーンサイレンシングを媒介する活性がより高くなることも開示される。
【００３９】
ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド、ｓｉＲＮＡ、及び脂質を具えたこれらの組成物を作製するためには、まずｓｉＲＮＡ及びペプチドを細胞培地などの適切な媒体中で互いに混合し、その後カチオン性脂質を混合物へ添加してｓｉＲＮＡ／送達ペプチド／カチオン性脂質組成物を形成することができる。任意に、ペプチドとカチオン性脂質をまず細胞培地などの適切な媒体中で互いに混合し、その後ｓｉＲＮＡを添加してｓｉＲＮＡ／送達ペプチド／カチオン性脂質組成物を形成することもできる。
【００４０】
本発明のこれらの態様の範囲内において有用なカチオン性脂質の例としては、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−３−（トリメチルアンモニウム）プロパン、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリフルオロアセテート、１，３−ジオレオイルオキシ−２−（６−カルボキシスペルミル）−プロピルアミド、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド、テトラメチルテトラパルミトイルスペルミン、テトラメチルテトラオレイルスペルミン、テトラメチルテトララウリルスペルミン、テトラメチルテトラミリスチルスペルミン、及びテトラメチルジオレイルスペルミンが挙げられる。ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３，３−（トリメチルアンモニウム）プロパン）、ＤＭＲＩＥ（１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド）、又はＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド）。多価カチオン性脂質としては、リポスペルミンが含まれ、具体的にはＤＯＳＰＡ（２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリフルオロアセテート）及びＤＯＳＰＥＲ（１，３−ジオレオイルオキシ−２−（６−カルボキシスペルミル）−プロピルアミド）、並びにＴＭＴＰＳ（テトラメチルテトラパルミトイルスペルミン）、ＴＭＴＯＳ（テトラメチルテトラオレイルスペルミン）、ＴＭＴＬＳ（テトラメチルテトララウリルスペルミン）、ＴＭＴＭＳ（テトラメチルテトラミリスチルスペルミン）、ＴＭＤＯＳ（テトラメチルジオレイルスペルミン）、及びＤＯＧＳ（ジオクタデシル−アミドグリシルスペルミン）（ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ）（登録商標）を含むがこれらに限定されないジ及びテトラアルキルテトラメチルスペルミンを含む。その他の有用なカチオン性脂質は、例えば米国特許公報第６，７３３，７７７号、米国特許公報第６，３７６，２４８号、米国特許公報第５，７３６，３９２号、米国特許公報第５，６８６，９５８号、米国特許公報第５，３３４，７６１号、及び米国特許公報第５，４５９，１２７号に記載されている。
【００４１】
カチオン性脂質は、任意に非カチオン性脂質、特に、例えばＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＰｈＰＥ（ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン）、又はコレステロールなどの中性脂質と組み合わされる。ＤＯＳＰＡとＤＯＰＥの３：１（ｗ／ｗ）混合物又はＤＯＴＭＡとＤＯＰＥの１：１（ｗ／ｗ）混合物（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）よりなるカチオン性脂質組成物は、一般に本発明の組成物をトランスフェクトするのに有用である。高等真核細胞系の十分なトランスフェクションを誘起する組成物がトランスフェクション組成物として好ましい。
【００４２】
短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）の選択、設計、及び合成
典型的な様態では、本開示は、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと混合し、複合体化し、又は抱合した短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）などの低分子核酸分子を具える組成物を特徴とする。
【００４３】
本明細書で用いる「短鎖干渉核酸」、「ｓｉＮＡ」、「短鎖干渉ＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」、「短鎖干渉核酸分子」、「短鎖干渉オリゴヌクレオチド分子」、又は「化学修飾短鎖干渉核酸分子」の各用語は、例えば配列特異的にＲＮＡ干渉「ＲＮＡｉ」又はジーンサイレンシングを媒介することによって、遺伝子発現又はウィルス複製を阻害又は下方制御可能な核酸分子を意味する。典型的な様態の範囲内において、ｓｉＮＡは自己相補的なセンス鎖及びアンチセンス鎖を具える二本鎖ポリヌクレオチド分子であって、この場合、アンチセンス領域が、発現を下方制御する標的核酸分子内のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列又はその一部を具え、センス領域が、標的核酸の配列又はその一部に対応する（すなわち実質的に同一の配列である）ヌクレオチド配列を具える。
【００４４】
「ｓｉＮＡ」は、例えば短鎖二本鎖核酸であるｓｉＲＮＡ（又は任意に、長鎖のその前駆体）などの低分子干渉核酸を意味し、標的細胞内において容認できないような毒性はない。本発明の範囲内で有用なｓｉＮＡの長さは、ある様態においては約２１乃至２３ｂｐの長さで最適化される。しかし、ｓｉＲＮＡを含む有用なｓｉＮＡの長さには特に制限はない。例えばｓｉＮＡはまず、標的細胞内に生存して、標的細胞への送達と同時に又はその後にジーンサイレンシングを引き起こす最終的な形又はプロセッシングを受けた形のｓｉＮＡとは十分に異なる前駆体の形で細胞へ導入することができる。ｓｉＮＡの前駆体は、例えば送達と同時に又はその後にプロセッシング、分解、変性、又は開裂に付される前駆体配列要素を含むことで、細胞内でジーンサイレンシングを媒介する活性を有するｓｉＮＡを生成することができる。従って、ある様態において、本発明の範囲内の有用なｓｉＮＡの前駆体の長さは例えば約１００乃至２００塩基対、５０乃至１００塩基対、又は約５０塩基対未満であって、これによって標的細胞内において活性なプロセッシングを受けたｓｉＮＡが生成される。他の様態においては、有用なｓｉＮＡ又はｓｉＮＡ前駆体の長さは、約１０乃至４９ｂｐ、１５乃至３５ｂｐ、又は約２１乃至３０ｂｐである。
【００４５】
本開示の典型的なｓｉＮＡ分子は化学的に合成される。オリゴヌクレオチドは、例えばＣａｒｕｔｈｅｒｓら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２１１：  ３−１９，  １９９２；  Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、国際公開公報ＷＯ９９／５４４５９、Ｗｉｎｃｏｔｔら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２３：  ２６７７−２６８４，  １９９５；  Ｗｉｎｃｏｔｔら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏ．  ７４：  ５９，  １９９７；  Ｂｒｅｎｎａｎら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ６１：  ３３−４５，  １９９８；  及びＢｒｅｎｎａｎ、米国特許公報第６００１３１１号に記載の本技術分野で公知のプロトコルを用いて合成される。化学的修飾が可能な本発明のｓｉＮＡ分子の合成は、（ａ）ｓｉＮＡ分子の二つの相補鎖を合成するステップ、及び（ｂ）二本鎖ｓｉＮＡ分子を得るのに適した条件下でこの二つの相補鎖をアニーリングするステップを具える。別の様態では、ｓｉＮＡ分子の二つの相補鎖は、固相オリゴヌクレオチド合成によって合成される。さらに別の様態では、ｓｉＮＡ分子の二つの相補鎖は、固相タンデムオリゴヌクレオチド合成によって合成される。
【００４６】
オリゴヌクレオチド（例：特定の修飾オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドのリボヌクレオチドを含まない部分）は、例えばＣａｒｕｔｈｅｒｓら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２１１：  ３−１９，  １９９２；  Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、国際公開公報ＷＯ９９／５４４５９、Ｗｉｎｃｏｔｔら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２３：  ２６７７−２６８４，  １９９５；  Ｗｉｎｃｏｔｔら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏ．  ７４：  ５９，  １９９７；  Ｂｒｅｎｎａｎら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ６１：  ３３−４５，  １９９８；  及びＢｒｅｎｎａｎ、米国特許公報第６００１３１１号に記載の本技術分野で公知のプロトコルを用いて合成される。本発明の特定のｓｉＮＡ分子を含むＲＮＡの合成は、例えばＵｓｍａｎら，Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １０９：  ７８４５，  １９８７；  Ｓｃａｒｉｎｇｅら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １８：  ５４３３，  １９９０；  Ｗｉｎｃｏｔｔら, Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２３  ２６７７−２６８４：  １９９５；  及びＷｉｎｃｏｔｔら, Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏ．  ７４：  ５９，  １９９７、に記載の一般的手順に従う。
【００４７】
本発明のある様態において、上述のように、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを用いて、大きなｓｉＮＡの核酸前駆体を含む従来のｓｉＮＡよりも大きな核酸分子の送達を促進する。例えば、本発明の方法及び組成物を、所望のｓｉＮＡの「前駆体」である大きな核酸の送達を促進するために用いることができ、この場合前駆体のアミノ酸が標的細胞への送達の前、間、若しくは後に開裂又はプロセッシングされて標的細胞内での遺伝子発現を調節する活性ｓｉＮＡを形成することができる。例えば、ｓｉＮＡ前駆体ポリヌクレオチドとしては、自己相補的なセンス領域及びアンチセンス領域を具える２又は３個以上のループ構造並びにステムを有する環状一本鎖ポリヌクレオチドを選択することができ、この場合アンチセンス領域は、標的核酸分子内のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列又はその一部を具え、センス領域は、標的核酸の配列又はその一部に対応するヌクレオチド配列を有し、そしてこの環状ポリヌクレオチドがインビボ又はインビトロでプロセッシングを受けることでＲＮＡｉを媒介可能な活性ｓｉＮＡ分子を生成することができる。
【００４８】
哺乳類細胞内では、３０塩基対を超える長さのｄｓＲＮＡが、通常はインターフェロンによって誘起されるｄｓＲＮＡ依存性キナーゼＰＫＲ及び２’−５’−オリゴアデニレートシンテターゼの活性化を行うことができる。活性化されたＰＫＲは、翻訳因子である真核生物翻訳開始因子２α（ｅＩＦ２α）をリン酸化することで一般翻訳を阻害し、一方２’−５’−オリゴアデニレートシンテターゼは、ＲＮａｓｅＬの活性化による非特異的なｍＲＮＡの分解を引き起こす。本発明のｓｉＮＡは、通常３０塩基対未満、最も一般的には約１７乃至１９塩基対、１９乃至２１塩基対、又は２１乃至２３塩基対というその小さいサイズ（特に前駆体でない形において）のため、インターフェロン応答の活性化を起こさない。
【００４９】
長鎖ｄｓＲＮＡの非特異的効果とは対照的に、ｓｉＲＮＡは哺乳類系で選択的なジーンサイレンシングを媒介することができる。短鎖ループ及び１９乃至２７塩基対のステムを有するヘアピンＲＮＡも、その二本鎖ステムの配列と相同的な遺伝子の発現を選択的にサイレンシングする。哺乳類細胞は短鎖ヘアピンＲＮＡをｓｉＲＮＡへ変換して、選択的ジーンサイレンシングを媒介することができる。
【００５０】
ＲＩＳＣは、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に対して相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡの開裂を媒介する。標的ＲＮＡの開裂は、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に対して相補的な領域の中央部で発生する。２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ二重鎖は、２ヌクレオチドの３’末端オーバハングを含む場合に最も活性が高いことが研究によって示されている。さらに、ｓｉＲＮＡの一方又は両方の鎖を２’−デオキシ（２’−Ｈ）ヌクレオチド又は２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで完全に置換するとＲＮＡｉ活性が著しく低下するが、ｓｉＲＮＡの３’末端オーバハングのヌクレオチドをデオキシヌクレオチド（２’−Ｈ）で置換することは許容されることが報告されている。
【００５１】
２ヌクレオチドの３’末端オーバハングを有する２１−ｍｅｒのｓｉＲＮＡ二重鎖の３’末端オーバハングセグメントをデオキシリボヌクレオチドで置換しても、ＲＮＡｉ活性への悪影響が生じないことが研究によって示されている。ｓｉＲＮＡの各末端では４ヌクレオチドまではデオキシリボヌクレオチドによる置換が十分に許容されることが報告されているが、完全にデオキシリボヌクレオチドで置換してしまうとＲＮＡｉ活性を喪失する。
【００５２】
本発明のある様態では、ｄｓＲＮＡは２若しくは３ｂｐ以上の５’末端オーバハング又は２若しくは３ｂｐ以上の３’末端オーバハングを持ち、オーバハングはセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかに存在していてもよい。ある様態では、ｄｓＲＮＡは、オーバハングを有しない。ある様態では、ｄｓＲＮＡは２７ｂｐ乃至２９ｂｐの長さを有する。ある様態では、ｄｓＲＮＡ分子はセンスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を含み、ペプチドはアンチセンス鎖の５’末端で抱合される。
【００５３】
代替的に、ｓｉＮＡは、単一の又は複数のｓｉＮＡをコードし、標的細胞内でそれらを発現させるポリヌクレオチドベクタによって発現された単一の又は複数の転写産物として送達することができる。このような様態においては、標的細胞内で発現されるｓｉＲＮＡの最終転写産物の二本鎖部分の長さは、例えば１５乃至４９ｂｐ、１５乃至３５ｂｐ、又は約２１乃至３０ｂｐであってよい。典型的な様態の範囲内において、２つの鎖が対合しているｓｉＮＡの二本鎖部分は、完全に対合したヌクレオチドセグメントに限定されず、ミスマッチ（対応するヌクレオチドが相補的でない）、バルジ（一方の鎖上の対応する相補的ヌクレオチドが欠失）、又はオーバハングなどによって対合していない部分を含んでよい。非対合部分は、ｓｉＮＡ形成に干渉しない程度含まれていてよい。より詳細な様態において、「バルジ」は１乃至２個の非対合ヌクレオチドを具えることができ、２つの鎖が対合しているｓｉＮＡの二本鎖領域は、約１乃至７個又は約１乃至５個のバルジを含むことができる。さらに、ｓｉＮＡの二本鎖領域に含まれる「ミスマッチ」部分は、約１乃至７個又は約１乃至５個存在することができる。ミスマッチで最も多いのは、ヌクレオチドの一つがグアニンで他方がウラシルの場合である。このようなミスマッチは、例えばセンスＲＮＡをコードする対応するＤＮＡ内のＣからＴ、ＧからＡ、又はそれらの組み合わせという変異に起因するであろうが、他の要因も考えられる。さらに、本発明において、２つの鎖が対合しているｓｉＮＡの二本鎖領域は、定められたおおよその数の範囲内で、バルジ部分とミスマッチ部分の両方を含むことができる。
【００５４】
本発明のｓｉＮＡの末端構造は、ｓｉＮＡが標的遺伝子の発現を阻害する活性を保持する限りにおいて、平滑末端又は粘着末端（オーバハング）であってよい。粘着末端（オーバハング）構造は、他の研究者による報告のように、３’末端オーバハングのみに限定されない。それどころか、ＲＮＡｉによるなど、ジーンサイレンシング効果を誘起する能力がある限りにおいて、５’末端オーバハング構造も含まれる場合がある。さらに、オーバハング部のヌクレオチド数は報告されている限界である２個又は３個に限定されず、ｓｉＮＡのジーンサイレンシング活性を損なわない限りにおいて、ヌクレオチド数はいくつであってもよい。例えば、オーバハング部は約１乃至約８個のヌクレオチドを具え、より多くの場合において約２乃至４個のヌクレオチドを具えてよい。
【００５５】
粘着末端（オーバハング）構造を有するｓｉＮＡの長さは、対合する二重鎖部分及び各末端のオーバハング部の長さとして表すことができる。例えば、２ｂｐの３’末端アンチセンスオーバハングを有する２５／２７−ｍｅｒのｓｉＮＡ二重鎖は、２５−ｍｅｒのセンス鎖及び２７−ｍｅｒのアンチセンス鎖を持ち、ここで対合部の長さは２５ｂｐである。
【００５６】
さらに、オーバハング配列は標的遺伝子に対する特異性は低くてよいため、標的遺伝子配列に対して相補的（アンチセンス鎖）でなくても同一（センス鎖）でなくてもよい。さらに、ｓｉＮＡは、標的遺伝子に対してジーンサイレンシング効果を保持することができる限りにおいて、例えば一方の末端のオーバハング部中に低分子量構造（例えばｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、若しくはウィルスＲＮＡなどの自然ＲＮＡ分子又は人工ＲＮＡ分子）を含んでよい。
【００５７】
ｓｉＮＡの末端構造は、二本鎖核酸の一方の末端部が、例えばリンカＲＮＡなどのリンカ核酸によって繋がっているステム−ループ構造であってよい。二本鎖領域（ステム−ループ部分）の長さは、例えば１５乃至４９ｂｐ、多くの場合１５乃至３５ｂｐ、そしてより一般的には約２１乃至３０ｂｐであってよい。代替的に、標的細胞内で発現されるｓｉＮＡの最終転写産物である二本鎖領域の長さは、例えば約１５乃至４９ｂｐ、１５乃至３５ｐ、又は約２１乃至３０ｂｐであってよい。リンカセグメントを用いる場合、ステム部の対合を妨げない限りにおいてリンカの長さに特に制限はない。例えば、ステム部の安定な対合とこのステム部をコードするＤＮＡ間の組換えの抑制のために、リンカ部はクローバー型のｔＲＮＡ構造を取ってもよい。たとえリンカがステム部の対合を妨げるような長さであったとしても、例えば前駆体ＲＮＡが成熟ＲＮＡへプロセッシングされる間にイントロンが除去され、それによってステム部の対合が可能となるようにイントロンを含むリンカ部を構築することは可能である。ステム−ループｓｉＲＮＡの場合、ループ構造を持たない側のＲＮＡ端部（ヘッド又はテール）が低分子量ＲＮＡを有してよい。上述のように、こういった低分子量ＲＮＡは、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、若しくはウィルスＲＮＡなどの自然ＲＮＡ分子、又は人工ＲＮＡ分子を含んでよい
【００５８】
ｓｉＮＡは、標的核酸分子内のヌクレオチド配列又はその一部分と相補的なヌクレオチド配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドを具えることもでき（例えば、そのようなｓｉＮＡ分子が、標的核酸配列又はその一部分に対応するヌクレオチド配列のｓｉＮＡ分子内での存在を必要としない場合）、この場合一本鎖ポリヌクレオチドは、５’リン酸エステル（例えば、Ｍａｒｔｉｎｅｚら，Ｃｅｌｌ．  １１０：  ５６３−５７４，  ２００２； Ｓｃｈｗａｒｚら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ  １０：  ５３７−５６８，  ２００２、を参照）又は５’，３’リン酸ジエステルなどの末端リン酸基をさらに具えることもできる。
【００５９】
本明細書で用いるｓｉＮＡ分子という用語は、天然のＲＮＡ又はＤＮＡのみを含む分子に限定されず、化学修飾されたヌクレオチド及び非ヌクレオチドも包含する。
【００６０】
ある様態において、本発明の短鎖干渉核酸分子は２’−ヒドロキシ（２’−ＯＨ）を含むヌクレオチドが欠失している。ある様態において、短鎖干渉核酸はＲＮＡｉを媒介するのに２’−ヒドロキシ基を有するヌクレオチドは存在する必要がなく、従って本発明の短鎖干渉核酸分子は、任意にリボヌクレオチド（例：２’−ＯＨ基を持つヌクレオチド）をまったく含まなくてもよい。しかし、ＲＮＡｉを媒介するためにｓｉＮＡ分子内にリボヌクレオチドが存在する必要がないそのようなｓｉＮＡ分子は、２’−ＯＨ基を有する１又は２個以上のヌクレオチドを含む、抱合した一個若しくは複数個のリンカ、又はその他の抱合若しくは会合した基、部位、若しくは鎖を有してよい。任意にｓｉＮＡ分子は、ヌクレオチド部位の約５、１０、２０、３０、４０、又は５０％にリボヌクレオチドを具えていてもよい。
【００６１】
本明細書で用いるｓｉＮＡという用語は、例えば、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短鎖干渉オリゴヌクレオチド、短鎖干渉核酸、短鎖干渉修飾オリゴヌクレオチド、化学修飾ｓｉＲＮＡ、及び転写後ジーンサイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）など、配列特異的ＲＮＡｉを媒介することができる核酸分子を示すのに用いられるその他の用語と同義であることを意図している。
【００６２】
他の様態では、本発明の範囲内で用いるｓｉＮＡ分子は個別のセンス及びアンチセンス配列若しくは領域を含むことができ、この場合センス領域とアンチセンス領域はヌクレオチド若しくは非ヌクレオチドリンカ分子によって共有結合されているか、又は代替的にイオン性相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、及び／若しくはスタッキング相互作用により非共有結合されている。
【００６３】
「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的遺伝子ｍＲＮＡと相補的な配列を有するＲＮＡ鎖であって、標的遺伝子ｍＲＮＡと結合することによってＲＮＡｉを誘起すると考えられるＲＮＡ鎖をいう。「センスＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡと相補的な配列を有し、その相補的アンチセンスＲＮＡとアニーリングすることでｓｉＲＮＡを形成する。このようなアンチセンスＲＮＡ及びセンスＲＮＡは、従来からＲＮＡ合成装置によって合成されている。
【００６４】
本明細書で用いる「ＲＮＡｉ構築物（ＲＮＡｉ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）」という用語は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ヘアピンＲＮＡ、及びインビボで開裂してｓｉＲＮＡを形成することができるその他のＲＮＡ種を含む、本明細書を通して用いられる一般名称である。本明細書におけるＲＮＡｉ構築物は、細胞中でｄｓＲＮＡ若しくはヘアピンＲＮＡを形成する転写物、及び／又はｓｉＲＮＡをインビボで生成することができる転写物を生じさせることが可能な発現ベクタ（ＲＮＡｉ発現ベクタとも言う）も含む。任意に、ｓｉＲＮＡはｓｉＲＮＡの一本鎖又は二本鎖を含む。
【００６５】
ｓｉＨｙｂｒｉｄ分子は、ｓｉＲＮＡと同様の機能を有する二本鎖核酸である。二本鎖ＲＮＡ分子と違い、ｓｉＨｙｂｒｉｄはＲＮＡ鎖及びＤＮＡ鎖から構成される。アンチセンス鎖が標的ｍＲＮＡと結合する鎖であることから、ＲＮＡ鎖がアンチセンス鎖であることが好ましい。ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖のハイブリダイゼーションによって生じたｓｉＨｙｂｒｉｄは、ハイブリダイズされた相補的部分、及び好ましくは少なくとも一つの３’末端オーバハングを有する。
【００６６】
本発明の範囲内で使用するｓｉＮＡは、二つの別々のオリゴヌクレオチドから構築することができ、ここでこのうち一方はセンス鎖でもう一方はアンチセンス鎖であって、この場合アンチセンス鎖とセンス鎖は自己相補的（すなわち、各鎖が他方の鎖のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を具える；アンチセンス鎖及びセンス鎖が二重鎖又は二本鎖構造を形成し、ここで、例えばその二本鎖領域が約１９塩基対である場合など）である。アンチセンス鎖は標的核酸分子のヌクレオチド配列又はその一部分と相補的なヌクレオチド配列を具えることができ、センス鎖は標的核酸配列又はその一部分に対応するヌクレオチド配列を具えることができる。代替的に、ｓｉＮＡは単一のオリゴヌクレオチドから構築することもでき、この場合、ｓｉＮＡの自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域は核酸系又は非核酸系リンカによって結合される。
【００６７】
追加的な様態の範囲内において、本発明の方法及び組成物にかかる細胞内送達のためのｓｉＮＡは、自己相補的センス及びアンチセンス領域を有し、二重鎖、非対称二重鎖、ヘアピン、又は非対称ヘアピン二次構造を有するポリヌクレオチドであってよく、この場合アンチセンス領域は個々の標的核酸分子内のヌクレオチド配列又はその一部分と相補的なヌクレオチド配列を具え、センス領域は標的核酸配列又はその一部分に対応するヌクレオチド配列を具える。
【００６８】
さらなる様態の範囲内において、本開示は、１又は２種類以上のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと混合、複合体化、又は抱合された三本鎖ｓｉＮＡ及びその組成物を提供する。ここで述べるｓｉＮＡ分子はＡ、Ｂ１、及びＢ２（Ａ：Ｂ１Ｂ２）の３つの鎖を具え、この場合Ｂ１鎖及びＢ２鎖は同族のＡ鎖の非オーバーラップ領域と相補的でありこの非オーバーラップ領域と塩基対（ｂｐ）を形成し、Ｂ１鎖は対応するＢ２鎖とニック又はギャップで分けられる。ここで述べるｓｉＲＮＡ分子は、結果的に標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現を調整するＲＮＡ干渉の連続過程を誘起することができる。
【００６９】
本明細書で述べるｓｉＮＡ分子は、例えばＡ、Ｂ１、及びＢ２（Ａ：Ｂ１Ｂ２）等の３又は４個以上の鎖を具え、この場合Ｂ１及びＢ２は、Ａの非オーバーラップ領域と相補的でありこの非オーバーラップ領域と塩基対（ｂｐ）を形成し、Ｂ１とＡのアニーリングによって形成された二本鎖領域は、Ｂ２とＡのアニーリングによって形成された二本鎖領域と異なっており、互いにオーバーラップもしておらず、そしてＡ：Ｂ１二重鎖とＡ：Ｂ２二重鎖は、Ａ：Ｂ１二重鎖とＡ：Ｂ２二重鎖の間に位置し、Ａ、Ｂ１、及び／若しくはＢ２鎖の一方又は両方の３’末端にある１若しくは２個以上のいずれの不対合ヌクレオチドとも異なる少なくとも一つのＡ鎖の不対合ヌクレオチドによる「ギャップ」で分けられる。
【００７０】
代替的に、本開示で述べるｓｉＮＡ分子は、例えばＡ、Ｂ１、及びＢ２（Ａ：Ｂ１Ｂ２）等の３又は４個以上の鎖を含み、この場合Ｂ１及びＢ２は、Ａの非オーバーラップ領域と相補的でありこの非オーバーラップ領域と塩基対（ｂｐ）を形成し、Ｂ１とＡのアニーリングによって形成された二本鎖領域は、Ｂ２とＡのアニーリングによって形成された二本鎖領域と異なっており、互いにオーバーラップもしておらず、そしてＡ：Ｂ１二重鎖とＡ：Ｂ２二重鎖は、Ａ：Ｂ１二重鎖とＡ：Ｂ２二重鎖の間の「ニック」で分けられる。
【００７１】
一つの様態では、Ａ：Ｂ１Ｂ２は、合計で約１４塩基対乃至約４０塩基対を含む。この様態では、Ａがセンス鎖であり、Ｂ１Ｂ２がアンチセンス鎖である。Ａは１５乃至５０ヌクレオチドの長さであり、Ｂ１及びＢ２はそれぞれ独立して１乃至２０ヌクレオチドの長さであり、Ｂ１とＢ２を合わせた長さは約８ヌクレオチド乃至約４０ヌクレオチドである。
【００７２】
別の様態では、Ａ：Ｂ１Ｂ２は、合計で約１６塩基対乃至約４０塩基対を含む。この様態では、Ａがセンス鎖であり、Ｂ１Ｂ２がアンチセンス鎖である。Ａは２０乃至４０ヌクレオチドの長さであり、Ｂ１及びＢ２はそれぞれ独立して１乃至１５ヌクレオチドの長さであり、Ｂ１とＢ２を合わせた長さは約１０ヌクレオチド乃至約３０ヌクレオチドである。
【００７３】
別の様態では、Ａ：Ｂ１Ｂ２は、合計で約１４塩基対乃至約４０塩基対を含む。この様態では、Ａがアンチセンス鎖であり、Ｂ１Ｂ２がセンス鎖である。Ａは１５乃至５０ヌクレオチドの長さであり、Ｂ１及びＢ２はそれぞれ独立して１乃至２０ヌクレオチドの長さであり、Ｂ１とＢ２を合わせた長さは約８ヌクレオチド乃至約４０ヌクレオチドである。
【００７４】
別の様態では、Ａ：Ｂ１Ｂ２は、合計で約１６塩基対乃至約４０塩基対を含む。この様態では、Ａがアンチセンス鎖であり、Ｂ１Ｂ２がセンス鎖である。Ａは２０乃至４０ヌクレオチドの長さであり、Ｂ１及びＢ２はそれぞれ独立して１乃至１５ヌクレオチドの長さであり、Ｂ１とＢ２を合わせた長さは約１０ヌクレオチド乃至約３０ヌクレオチドである。
【００７５】
上述のように、本明細書で開示する三本鎖ｓｉＲＮＡは、典型的には合計で約１５塩基対乃至約４０塩基対を具え、より典型的には約１８乃至約３５塩基対であり、さらにより典型的には約２０乃至３０塩基対であり、最も典型的には２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、又は２９塩基対のいずれかである。特定の様態の範囲内では、ｓｉＲＮＡは任意に、１ヌクレオチド乃至５ヌクレオチドの一本鎖３’末端オーバハングを含んでもよい。最も典型的には、そのような一本鎖３’ 末端オーバハングは１、２、３、又は４ヌクレオチドである。
【００７６】
そのようなｓｉＲＮＡはＡセンス鎖又はＡアンチセンス鎖のどちらかを含み、この場合Ａ鎖の長さは約１５ヌクレオチド乃至約５０ヌクレオチドであり、より典型的にはＡ鎖の長さは約１８ヌクレオチド乃至約４０ヌクレオチドであり、さらにより典型的にはＡ鎖の長さは約２０ヌクレオチド乃至約３２ヌクレオチドであり、最も典型的にはＡ鎖の長さは２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、又は３１ヌクレオチドである。
【００７７】
本開示のｓｉＲＮＡはさらに、本明細書において例えばＢ１及びＢ２と称する２又は３個以上のＢ鎖を含み、この場合各Ｂ鎖は、同族のＡ鎖の非オーバーラップ領域と相補的であり、第一のＢ鎖（Ｂ１）と第二のＢ鎖（Ｂ２）はニック又は１若しくは２個以上のヌクレオチドギャップによって分けられる。同族Ａ鎖がセンス鎖であるか又はアンチセンス鎖であるかによって、各Ｂ鎖はそれぞれアンチセンス鎖又はセンス鎖となる。本明細書で述べるＢ鎖（Ｂ１、Ｂ２など）は各々独立して、約１ヌクレオチド乃至約２５ヌクレオチドの長さであり、より典型的には約４ヌクレオチド乃至約２０ヌクレオチドの長さであり、さらにより典型的には約５ヌクレオチド乃至約１６ヌクレオチドの長さであり、最も典型的には６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５ヌクレオチドの長さである。
【００７８】
合成された後、Ａ鎖、Ｂ１鎖、及びＢ２鎖はアニーリングによってｓｉＲＮＡ分子を形成する。アニーリング反応を決定するのは相補性である。第一のＢ鎖（Ｂ１）と第二のＢ鎖（Ｂ２）はニック又はギャップで分けることができる。従って、Ｂ鎖上に同族のヌクレオチドが存在しないＡ鎖上のヌクレオチドは不対合状態を維持し、ｓｉＲＮＡ分子のギャップとなる。ギャップのサイズは、Ｂ１鎖とＢ２鎖の間に位置するＡ鎖内の不対合ヌクレオチドの数に依存することになる。Ｂ１鎖とＢ２鎖の間の領域内にあるＡ鎖上に不対合であるヌクレオチドが存在しない形でＡ鎖がＢ１鎖及びＢ２鎖と塩基対を形成した場合にニックが形成される。
【００７９】
Ｂ１とＢ２がギャップで分けられる様態では、ギャップは典型的には約１乃至約２５ヌクレオチドであり、より典型的にはギャップは約１乃至約１５ヌクレオチドであり、さらにより典型的にはギャップは約１乃至約１０ヌクレオチドであり、最も典型的にはギャップは１、２、３、４、５、６、７、８、又は９ヌクレオチドである。
【００８０】
Ｂ鎖は各々独立して、５’−ヒドロキシル（すなわち５’−ＯＨ）末端か、又は５’−リン酸（すなわち５’−ＰＯ４）末端であってよい。通常、合成ＲＮＡ分子は３’−ヒドロキシル末端及び５’−ヒドロキシル末端を含む。従って、第一のＢ鎖の３’−ＯＨは、第二のＢ鎖の５’−ＯＨに直接隣接して並置される場合がある。ある様態では、第一のＢ鎖の３’−ＯＨが第二のＢ鎖の５’−ＰＯ４に直接隣接して並置されるように、５’末端が５’−ＰＯ４を有する第二のＢ鎖を用いることが好ましい。そのような場合、本技術分野でよく知られておりすぐに利用可能な方法でＲＮＡキナーゼの触媒活性を利用して一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡ分子へＰＯ４基を付加することにより、Ｂ鎖の５’末端にリン酸を付加することができる。キナーゼ反応を行った後、Ｂ鎖が５’Ｂ１ｐＢ２３’と配向されるようにＡ鎖、Ｂ１鎖、及びＢ２鎖は互いにアニーリングされる。
【００８１】
以下のｓｉＲＮＡ分子は、本明細書において上述の１若しくは２種類以上のポリペプチドと適切に抱合することができる、ギャップ又はニックを有するｓｉＲＮＡ分子の特定の制限されない典型的な様態を表す。
【００８２】
ｉ  ギャップ付き二重鎖ｓｉＲＮＡ分子
本明細書で述べる特定の典型的なギャップ付き二重鎖ｓｉＲＮＡ分子は、２５−ｍｅｒのセンスＢ鎖配列５’−ＧＧＡＵＣＵＵＡＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＧＡＣＡＡＵＧ−３’（配列番号７５）及び２７−ｍｅｒのアンチセンスＡ鎖配列３’−ＴＴＣＣＵＡＧＡＡＵＡＡＡＧＡＡＧＣＣＵＣＵＧＵＵＡＣ−５’（配列番号７６）に基づいている。代替的な典型的なギャップ付き二重鎖ｓｉＲＮＡ分子は、２５−ｍｅｒのアンチセンスＢ鎖配列５’−ＧＧＡＵＣＵＵＡＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＧＡＣＡＡＵＧ−３’（配列番号７５）及び２７−ｍｅｒのセンスＡ鎖配列３’−ＴＴＣＣＵＡＧＡＡＵＡＡＡＧＡＡＧＣＣＵＣＵＧＵＵＡＣ−５’（配列番号７６）に基づいている。
【００８３】
このような典型的なｓｉＮＡ分子は、Ａ、Ｂ１、及びＢ２（Ａ：Ｂ１Ｂ２）の３つの鎖を持ち、この場合Ｂ１及びＢ２は、Ａの非オーバーラップ領域と相補的でありこの非オーバーラップ領域と塩基対（ｂｐ）を形成し、Ｂ１とＡのアニーリングによって形成された二本鎖領域は、Ｂ２とＡのアニーリングによって形成された二本鎖領域と異なっており、そしてＡ：Ｂ１二重鎖とＡ：Ｂ２二重鎖は、Ａ：Ｂ１二重鎖とＡ：Ｂ２二重鎖の間に位置し、Ａ、Ｂ１、及び／又はＢ２鎖の一方又は両方の３’末端にある１又は２個以上のいずれの不対合ヌクレオチドとも異なる１又は２個以上のＡ鎖の不対ヌクレオチドによる「ギャップ」で分けられる。
【００８４】
これらの様態の特定の態様の範囲内では、Ａ：Ｂ１Ｂ２は合計で約１４乃至約２４の塩基対からなり、この場合Ａ鎖（センス）は約１９ヌクレオチド乃至約２７ヌクレオチドであり、Ｂ１（アンチセンス）鎖及びＢ２（アンチセンス）鎖は各々独立して約１ヌクレオチド乃至約１８ヌクレオチドであり、Ｂ１とＢ２を合わせた長さは約１３ヌクレオチド乃至約２３ヌクレオチドである。
【００８５】
これらの様態の他の態様の範囲内では、Ａ：Ｂ１Ｂ２は合計で約１６乃至約２２の塩基対からなり、この場合Ａ鎖（センス）は約１９ヌクレオチド乃至約２３ヌクレオチドであり、Ｂ１（アンチセンス）鎖及びＢ２（アンチセンス）鎖は各々独立して約１ヌクレオチド乃至約１５ヌクレオチドであり、Ｂ１とＢ２を合わせた長さは約１３ヌクレオチド乃至約２３ヌクレオチドである。
【００８６】
これらの様態のさらなる態様の範囲内では、Ａ：Ｂ１Ｂ２は合計で約１４乃至約２４の塩基対からなり、この場合Ａ鎖（アンチセンス）は約１４ヌクレオチド乃至約２７ヌクレオチドであり、Ｂ１（センス）鎖及びＢ２（センス）鎖は各々独立して約１ヌクレオチド乃至約１８ヌクレオチドであり、Ｂ１とＢ２を合わせた長さは約１８ヌクレオチド乃至約２４ヌクレオチドである。
【００８７】
これらの様態のさらなる他の態様の範囲内では、Ａ：Ｂ１Ｂ２は合計で約１４乃至約２２の塩基対からなり、この場合Ａ鎖（アンチセンス）は約１６ヌクレオチド乃至約２２ヌクレオチドであり、Ｂ１（センス）鎖及びＢ２（センス）鎖は各々独立して約１ヌクレオチド乃至約１５ヌクレオチドであり、Ｂ１とＢ２を合わせた長さは約１８ヌクレオチド乃至約２２ヌクレオチドである。
【００８８】
これらの様態による代表的なｓｉＲＮＡを表２に示す。
【００８９】
【表２】
2009514877.tif 000004
2009514877.tif 000005
2009514877.tif 000006
【００９０】
Ａ鎖、Ｂ１鎖、及びＢ２鎖の厳密なヌクレオチド配列は様々であり得るが、ただし、ｓｉＲＮＡ分子は連続する塩基対の二つのストレッチを含み、各々の連続する塩基対のストレッチは、単一のアンチセンスＡ鎖又は単一のセンスＡ鎖内の１若しくは２個以上の不対合塩基に対応する少なくともヌクレオチド１個分のギャップで分けられている、ということは認識されるであろう。
【００９１】
ｉｉ  ニック付き二重鎖ｓｉＲＮＡ分子
以下に示す配列中の「ｐ」は、５’リン酸がＢ２鎖に結合したＲＮＡ鎖内のニックを表す。以下に示す配列中の「＊」は、Ｂ２鎖に結合した５’リン酸のないＲＮＡ鎖内のニックを表す。「ｐ」及び「＊」はニックの位置も示す。すべての場合において、Ａ鎖は無処置（ニックなし）であり、Ａ鎖上に見られる隙間はｓｉＲＮＡ分子の正しい配列アラインメント（配列相同性による）を保持するためのものである。以下に示す配列中の「Ｔ（太字イタリック体）」は、その位置にリボチミジン（ｒＴ）分子が存在することを示す。以下に示す配列中の「Ｔ（太字体）」は、その位置にデオキシリボチミジン（ｄＴ）分子が存在することを示す。連続鎖、つまりギャップもニックもない鎖には下線を付してある。
１．コントロールｄｓＲＮＡ
2009514877.tif 000007
２．５’リン酸を持たないニック付きセンス鎖
2009514877.tif 000008
３．５’リン酸を持つニック付きセンス鎖
2009514877.tif 000009
４．二本鎖ともにｒＴ分子で完全修飾した、５’リン酸を持つニック付きセンス鎖
2009514877.tif 000010
５．二本鎖ともにｒＴ分子で完全修飾した、５’リン酸を持たないニック付きセンス鎖
2009514877.tif 000011
６．アンチセンス鎖をｒＴ分子で完全修飾し、センス鎖は未修飾（コントロール）の、５’リン酸を持たないニック付きアンチセンス鎖
2009514877.tif 000012
７．アンチセンス鎖をｒＴ分子で完全修飾し、センス鎖は未修飾（コントロール）の、５’リン酸を持つニック付きアンチセンス鎖
2009514877.tif 000013
８．ＩＤ：ＮｉｃｋｅｄＳ−ＷＴ：ニック付きセンス鎖を持つ二重鎖
2009514877.tif 000014
９．ＩＤ：ＮｉｃｋｅｄＳ−ＷＴ：ニック付きセンス鎖を持つ二重鎖；Ｂ２は５’末端をリン酸エステル化
2009514877.tif 000015
１０．ＩＤ：ＮｉｃｋｅｄＳ−ＲＴ：ニック付きセンス鎖を持つ二重鎖；ｒＴにより完全修飾
2009514877.tif 000016
１１．ＩＤ：ＮｉｃｋｅｄＳ−ＲＴ：ニック付きセンス鎖を持つ二重鎖；Ｂ２は５’末端をリン酸エステル化；ｒＴにより完全修飾
2009514877.tif 000017
１２．ＩＤ：ＮｉｃｋｅｄＡ−ＲＴ：ニック付きアンチセンス鎖を持つ二重鎖；ｒＴにより完全修飾
2009514877.tif 000018
１３．ＩＤ：ＮｉｃｋｅｄＡ−ＲＴ：ニック付きアンチセンス鎖を持つ二重鎖；Ｂ２は５’末端をリン酸エステル化；ｒＴにより完全修飾
2009514877.tif 000019
【００９２】
ｉｉｉ  リンカによって閉じられたギャップ又はニックを有する二重鎖ｓｉＲＮＡ分子
別の様態では、本開示にかかるギャップ又はニックを有する二重鎖ｓｉＲＮＡ分子は、リンカ分子を用いて「閉じる」ことができる。得られた分子は非常により安定となる、すなわちより高いＴｍを有して宿主細胞内での分解に対する耐性が高まるはずである。
【００９３】
本開示にかかるそのようなリンカの例としては、例えば脱塩基ヌクレオチド、脱塩基プロパンジオール等の脱塩基リンカ、及び多くの低分子Ｃ６型リンカが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９４】
非ヌクレオチドリンカは、脱塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリ炭化水素、又はその他のポリマ化合物（例：２乃至１００個のエチレングリコール単位を有するポリエチレングリコール等）から構成されていてよい。具体例としては、Ｓｅｅｌａ及びＫａｉｓｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １８：  ６３５３，  １９９０、及びＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １５：  ３１１３，  １９８７；  Ｃｌｏａｄ及びＳｃｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１３：  ６３２４，  １９９１；  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ及びＳｃｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１３：  ５１０９，  １９９１；  Ｍａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２１：  ２５８５，  １９９３、及びＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３２：  １７５１，  １９９３；  Ｄｕｒａｎｄら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １８：  ６３５３，  １９９０；  ＭｃＣｕｒｄｙら，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，  １０：  ２８７，  １９９１；  Ｊｓｃｈｋｅら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ３４：  ３０１，  １９９３；  Ｏｎｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３０：  ９９１４，  １９９１；  Ａｒｎｏｌｄら、国際公開公報ＷＯ８９／０２４３９、Ｕｓｍａｎら、国際公開公報ＷＯ９５／０６７３１、Ｄｕｄｙｃｚら、国際公開公報ＷＯ９５／１１９１０、並びにＦｅｒｅｎｔｚ及びＶｅｒｄｉｎｅ，Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１３：  ４０００，  １９９１、に記載のものが挙げられる。「非ヌクレオチドリンカ」はさらに、糖及び／又はリン酸エステル置換基を含む１又は２個以上のヌクレオチド単位の代わりに核酸鎖に取り込まれることができ、残った塩基に酵素活性を示させる基又は化合物を意味する。この基又は化合物は、例えば糖のＣ１の位置にアデノシン、グアニン、シトシン、ウラシル、又はチミン等の一般的に認知されたヌクレオチド塩基を含まない点において、脱塩基型となり得る。
【００９５】
このリンカの存在が、ＲＩＳＣ活性を著しく阻害することがあってはならない。本開示のリンカを含むギャップ又はニックを有する二重鎖ｓｉＲＮＡ分子の投与の結果、対応するリンカを含まないギャップ又はニックを有する二重鎖ｓｉＲＮＡ分子を用いた場合に見られるＲＮＡ干渉と実質的に同じＲＮＡ干渉のレベルとなることが好ましい。本開示のリンカを含むギャップ又はニックを有する二重鎖ｓｉＲＮＡ分子の投与の結果、対応するリンカを含まないギャップ又はニックを有する二重鎖ｓｉＲＮＡ分子を用いた場合に見られるＲＮＡ干渉よりも高いＲＮＡ干渉レベルとなることが最も好ましい。
【００９６】
低分子抑制核酸（ｓｉＮＡ）の化学修飾
限定されない例において、核酸分子中に化学修飾ヌクレオチドを導入することは、外部から送達された天然ＲＮＡ分子に固有のインビボでの安定性及び生体利用度の潜在的な限界を克服する強力なツールとなる。例えば、化学修飾核酸分子は血清中の半減期が長くなる傾向にあるため、化学修飾核酸分子を用いることで、ある治療効果のための特定の核酸分子の投与量を抑えることが可能となる。さらに、特定の化学修飾によって、特定の細胞若しくは組織を標的にすること、及び／又は核酸分子の細胞取り込みを高めることにより核酸分子の生体利用度を向上させることができる。従って、化学修飾核酸分子の活性が、例えば全ＲＮＡ核酸分子等の天然の核酸分子と比較して低下したとしても、分子の安定性及び／又は送達が向上したことにより、修飾核酸分子全体としての活性は天然の核酸分子よりも高めることができる。天然の未修飾ｓｉＮＡとは異なり、化学修飾ｓｉＮＡはヒトのインターフェロン活性を活性化する可能性を最小限に抑えることもできる。
【００９７】
本明細書で述べるｓｉＮＡ分子については、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は、該アンチセンス領域の３’末端にヌクレオチド間ホスホロチオエート結合を有することができる。本明細書で述べるｓｉＮＡ分子のいずれの様態においても、アンチセンス領域は、該アンチセンス領域の５’末端に約１乃至約５個のヌクレオチド間ホスホロチオエート結合を具えることができる。本明細書で述べるｓｉＮＡ分子のいずれの様態においても、本発明のｓｉＮＡ分子の３’末端ヌクレオチドオーバハングは、核酸の糖、塩基、若しくはバックボーンが化学修飾されたリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを具えることができる。本明細書で述べるｓｉＮＡ分子のいずれの様態においても、３’末端ヌクレオチドオーバハングは、１又は２個以上のユニバーサル塩基リボヌクレオチドを具えることができる。本明細書で述べるｓｉＮＡ分子のいずれの様態においても、３’末端ヌクレオチドオーバハングは、１又は２個以上の非環式ヌクレオチドを具えることができる。
【００９８】
例えば、限定されない例において、本発明は、約１、２、３、４、５、６、７、８個又は９個以上のヌクレオチド間ホスホロチオエート結合を一方のｓｉＮＡ鎖に有する化学修飾短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）を特徴とする。さらに別の様態では、本発明は、約１、２、３、４、５、６、７、８個又は９個以上のヌクレオチド間ホスホロチオエート結合を、独立して両方のｓｉＮＡ鎖に有する化学修飾短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）を特徴とする。ヌクレオチド間ホスホロチオエート結合は、例えばセンス鎖、アンチセンス鎖、又はその両方のようにｓｉＮＡ二重鎖の一方又は両方のオリゴヌクレオチド鎖に存在することができる。本発明のｓｉＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、又はその両方の３’末端、５’末端、又は３’末端と５’末端の両方に、１又は２個以上のヌクレオチド間ホスホロチオエート結合を具えることができる。例えば、本発明の典型的なｓｉＮＡ分子は、約１乃至約５個又は６個以上（例：約１、２、３、４、５個、又は６個以上）の連続するヌクレオチド間ホスホロチオエート結合を、センス鎖、アンチセンス鎖、又はその両方の５’末端に具えることができる。別の限定されない例では、本発明の典型的なｓｉＮＡ分子は１又は２個以上（例：約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又は１１個以上）のヌクレオチド間ピリミジンホスホロチオエート結合を、センス鎖、アンチセンス鎖、又はその両方に有することができる。さらに別の限定されない例では、本発明の典型的なｓｉＮＡ分子は１又は２個以上（例：約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又１１個以上）のヌクレオチド間プリンホスホロチオエート結合を、センス鎖、アンチセンス鎖、又はその両方に具えることができる。
【００９９】
ｓｉＮＡ分子は環状核酸分子から構成することができ、この場合、ｓｉＮＡの長さは約３８乃至約７０（例：約３８、４０、４５、５０、５５、６０、６５、又は７０）ヌクレオチドであって、約１８乃至約２３（例：約１８、１９、２０、２１、２２、又は２３）塩基対を有し、この場合、環状オリゴヌクレオチドは約１９塩基対及び２つのループを有するダンベル型構造を形成する。
【０１００】
環状ｓｉＮＡ分子は二つのループモチーフを含み、この場合、ｓｉＮＡ分子の一方又は両方のループ部は生分解性である。例えば、本発明の環状ｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ分子のループ部のインビボでの分解によって、約２個のヌクレオチドを含む３’末端ヌクレオチドオーバハング等の３’末端オーバハングを有する二本鎖ｓｉＮＡ分子を生成することができるように設計される。
【０１０１】
ｓｉＮＡ分子内に存在し、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖にあることが好ましいが、任意にセンス鎖、及び／又はアンチセンス鎖とセンス鎖の両方にあってもよい修飾ヌクレオチドは、天然のリボヌクレオチドに類似の性質又は特性を有する修飾ヌクレオチドを具える。例えば、本発明はノーザンコンフォメーション（例：ノーザン擬回転周期（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｐｓｅｕｄｏｒｏｔａｔｉｏｎ  ｃｙｃｌｅ）、例えばＳａｅｎｇｅｒ著、「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ− Ｖｅｒｌａｇ編集、１９８４年を参照）を持つ修飾ヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。従って、本発明のｓｉＮＡ分子内に存在し、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖にあることが好ましいが、任意にセンス鎖、及び／又はアンチセンス鎖とセンス鎖の両方にあってもよい化学修飾ヌクレオチドは、ヌクレアーゼ分解に対する耐性を有し、同時にＲＮＡｉを媒介する能力も保持する。ノーザン立体配置を持つヌクレオチドの限定されない例としては、架橋型核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ；ＬＮＡ）ヌクレオチド（例：２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−（Ｄ−リボフラノシル）ヌクレオチド）、２’−メトキシエトキシ（ＭＯＥ）ヌクレオチド、２’−メチルチオエチル、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−クロロヌクレオチド、２’−アジドヌクレオチド、及び２’−Ｏ−メチルヌクレオチドが挙げられる。
【０１０２】
二本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖は、逆位デオキシ塩基部位（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄｅｏｘｙｂａｓｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）などの末端キャップ部位をセンス鎖の３’末端、５’末端、又は３’末端と５’末端の両方に有してもよい。
【０１０３】
限定されない抱合体の例としては、２００３年４月３０日に出願されたＶａｒｇｅｅｓｅら、米国特許出願番号１０／４２７１６０に記載の抱合体及びリガンドが挙げられ、図面を含むこの出願の全文は参照することで本明細書に組み入れられる。別の様態では、抱合体は、生分解性リンカによって化学修飾ｓｉＮＡ分子と共有結合している。一つの様態では、抱合体分子は化学修飾ｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖のいずれか、又はその両方の３’末端に結合している。別の様態では、抱合体分子は化学修飾ｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖のいずれか、又はその両方の５’末端に結合している。さらに別の様態では、抱合体分子は、化学修飾ｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖のいずれか、若しくはその両方の３’末端及び５’末端の両方、又はこれらのいずれかの組み合わせに結合している。一つの様態では、本発明の抱合体分子は、細胞等の生体系への化学修飾ｓｉＮＡ分子の送達を促進する分子を具える。別の様態では、化学修飾ｓｉＮＡ分子と結合する抱合体分子は、ポリエチレングリコール、ヒト血清アルブミン、又は細胞取り込みを媒介できる細胞受容体のリガンドである。本発明で意図する、化学修飾ｓｉＮＡ分子と結合可能な抱合体分子の具体例は、Ｖａｒｇｅｅｓｅら、２００３年７月１０日公開の米国特許公開公報ＵＳ２００３／０１３０１８６及び２００４年６月１０日公開の米国特許公開公報ＵＳ２００４／０１１０２９６に記載されている。用いられる抱合体の種類及び本発明のｓｉＮＡ分子の抱合の度合いを評価することによって、ｓｉＮＡがＲＮＡｉ活性を媒介する能力を同時に保持した状態でのｓｉＮＡ構築物の薬物動態特性、生体利用度、及び／又は安定性の向上を調べることができる。従って、当業者は、種々の抱合体で修飾されたｓｉＮＡ構築物をスクリーニングすることにより、例えば本技術分野で一般的に知られる動物モデルにおいて、ｓｉＮＡ抱合複合体の性質がＲＮＡｉを媒介する能力を保持した状態で向上されたかどうかを調べることができる。
【０１０４】
ｓｉＮＡはさらに、ｓｉＮＡのセンス領域とｓｉＮＡのアンチセンス領域を連結する、ヌクレオチドリンカ、非ヌクレオチドリンカ、又はヌクレオチド／非ヌクレオチド混在リンカを具えることができる。一つの様態では、ヌクレオチドリンカの長さは＞２ヌクレオチドであり、例えば３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチドであってよい。別の様態では、ヌクレオチドリンカは核酸アプタマであってよい。本明細書で用いる「アプタマ」又は「核酸アプタマ」とは、標的分子に特異的に結合する核酸分子を意味し、この場合、核酸分子は、自然環境下で標的分子によって認識される配列を含む配列を具える。代替的に、アプタマは、標的分子が核酸と自然には結合しない場合に標的分子と結合する核酸分子であってよい。標的分子は対象であるいかなる分子であってもよい。例えば、アプタマを用いてタンパク質のリガンド結合性ドメインと結合させ、それによって天然のリガンドとタンパク質との相互作用を防ぐことができる。これは限定されない例であり、当業者であれば、本技術分野で一般的に知られる技術を用いて他の様態を容易に作り出せることが認識されるであろう（例えば、Ｇｏｌｄら，Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６４：  ７６３，  １９９５；  Ｂｒｏｄｙ及びＧｏｌｄ，Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ７４：  ５，  ２０００；  Ｓｕｎ，Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ２：  １００，  ２０００；  Ｋｕｓｓｅｒ，Ｊ.  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ７４：  ２７，  ２０００；  Ｈｅｒｍａｎｎ及びＰａｔｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：  ８２０，  ２０００；  及びＪａｙａｓｅｎａ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４５：  １６２８，  １９９９、を参照）。
【０１０５】
非ヌクレオチドリンカは、脱塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリ炭化水素、又はその他のポリマ化合物（例：２乃至１００個のエチレングリコール単位を有するポリエチレングリコール等）から構成されていてよい。具体例としては、Ｓｅｅｌａ及びＫａｉｓｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １８：  ６３５３，  １９９０、及びＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １５：  ３１１３，  １９８７；  Ｃｌｏａｄ及びＳｃｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１３：  ６３２４，  １９９１；  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ及びＳｃｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１３：  ５１０９，  １９９１；  Ｍａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２１：  ２５８５，  １９９３、及びＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３２：  １７５１，  １９９３；  Ｄｕｒａｎｄら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １８：  ６３５３，  １９９０；  ＭｃＣｕｒｄｙら，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，  １０：  ２８７，  １９９１；  Ｊｓｃｈｋｅら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ３４：  ３０１，  １９９３；  Ｏｎｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３０：  ９９１４，  １９９１；  Ａｒｎｏｌｄら、国際公開公報ＷＯ８９／０２４３９、Ｕｓｍａｎら、国際公開公報ＷＯ９５／０６７３１、Ｄｕｄｙｃｚら、国際公開公報ＷＯ９５／１１９１０、並びにＦｅｒｅｎｔｚ及びＶｅｒｄｉｎｅ，Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１３：  ４０００，  １９９１、に記載のものが挙げられる。「非ヌクレオチドリンカ」はさらに、糖及び／又はリン酸エステル置換基を含む１又は２個以上のヌクレオチド単位の代わりに核酸鎖に取り込まれることができ、残った塩基に酵素活性を示させる基又は化合物を意味する。この基又は化合物は、例えば糖のＣ１の位置にアデノシン、グアニン、シトシン、ウラシル、又はチミン等の一般的に認知されたヌクレオチド塩基を含まない点において、脱塩基型となり得る。
【０１０６】
ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド／ｓｉＮＡ抱合体を具える組成物の投与
本開示の送達促進ポリペプチド／ｓｉＮＡ抱合体を用いて、本明細書で述べる若しくは本技術分野で知られる疾患又は状態を治療することができる。特定の疾患又は状態を治療するために、本発明の送達促進ポリペプチド／ｓｉＮＡ抱合体を、個別に若しくは一つ以上の化合物と組み合わせて、治療に適した条件下で患者に投与するか又は当業者にとって明らかな他の適切な細胞へ投与するかができる。
【０１０７】
例えば、本明細書で述べる送達促進ポリペプチド／ｓｉＮＡ抱合体は、他の公知の治療法及び／又は治療薬と組み合わせて用いることにより、広範囲にわたる種々の状態、特にウィルス感染を治療することができる。本発明の送達促進ポリペプチド／ｓｉＮＡ抱合体と容易に組み合わせることのできる他の治療薬の限定されない例としては、例えば、酵素核酸分子、アロステリック核酸分子、アンチセンス、デコイ、又はアプタマ核酸分子、モノクローナル抗体等の抗体、低分子、並びに金属、塩、及びイオンを含む他の有機及び／又は無機化合物が挙げられる。
【０１０８】
従って、本開示は、１又は２種類以上の送達促進ポリペプチド／ｓｉＮＡ抱合体を、安定剤やバッファ等の許容される担体中に含む組成物について述べる。送達促進ポリペプチド／ｓｉＮＡ抱合体は、治療に適した組成物を形成する安定剤やバッファ等を含んだ又は含まない状態で、いかなる標準的な方法によって患者に投与してもよい。リポソーム送達メカニズムの使用を所望する場合は、リポソームを形成する標準的なプロトコルに従うことができる。本発明の組成物は、経口投与のために錠剤、カプセル、若しくはエリキシール剤として、直腸内投与のために坐薬として、及び注射投与のために無菌溶液若しくは懸濁液として、本技術分野で公知の他の化合物を含んで、又は含まないで製剤し、使用することもできる。送達促進ポリペプチド／ｓｉＮＡ抱合体製剤は、例えば塩酸、臭素酸、酢酸、及びベンゼンスルホン酸の塩といった酸付加塩等の上述の化合物の塩を含む。
【０１０９】
医薬組成物又は製剤とは、例えば全身投与等、細胞又はヒト等の患者に対する投与に適した形の組成物又は製剤のことである。適切な形は、用途、又は例えば経口、経皮、若しくは注射等の進入経路に一部依存する。そのような形は、組成物又は製剤が標的細胞（すなわち、負に帯電した核酸を送達させたい細胞）へ到達することを妨げてはならない。例えば、血流中に注入される医薬組成物は溶解性であるべきである。他の要因は本技術分野で公知であり、毒性及び組成物又は製剤がその効果を発揮することを妨げる形等の考慮が含まれる。
【０１１０】
個々のレポータ遺伝子発現構築物は、１又は２種類以上の送達促進ポリペプチド／ｓｉＮＡ抱合体と共トランスフェクトすることができる。特定の送達促進ポリペプチド／ｓｉＮＡ抱合体が、意図する各遺伝子変異体の発現レベルを低下させる能力は、修飾ｓｉＮＡをトランスフェクトした細胞としない細胞のレポータ遺伝子活性を測定して比較することによって測定することができる。
【０１１１】
核酸分子を送達する方法は、例えばＡｋｈｔａｒら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．  ２：  １３９，  １９９２；  Ａｋｈｔａｒ編、「Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、１９９５年；  Ｍａｕｒｅｒら，Ｍｏｌ．  Ｍｅｍｂｒ．  Ｂｉｏｌ．  １６：  １２９−１４０，  １９９９；  Ｈｏｆｌａｎｄ及びＨｕａｎｇ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｅｘｐ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １３７：  １６５−１９２，  １９９９；  及びＬｅｅら，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐ．  Ｓｅｒ．  ７５２：  １８４−１９２，  ２０００、に記載されている。Ｓｕｌｌｉｖａｎら、国際公開公報ＷＯ９４／０２５９５には、酵素核酸分子の送達の一般的方法がさらに記載されている。これらのプロトコルは、実質的にいかなる核酸分子の送達に対しても利用することができる。
【０１１２】
本明細書で述べる「全身投与」という用語は、インビボでの血流中の薬物の全身吸収又は全身蓄積、及びそれに続く全身への分配を含むことを意図したものである。全身吸収をもたらす投与経路としては、静脈内、皮下、腹腔内、吸入、経口、肺内、及び筋肉内が挙げられるがこれらに限定されない。これらの各投与経路により、例えば核酸等の所望の負に帯電したポリマが、到達可能な患部組織へ曝露される。薬物の循環中への進入速度は、分子量又はサイズに依存することが示されている。
【０１１３】
核酸分子は、当業者に公知の様々な方法によって細胞へ投与することができ、その方法にはリポソーム内への封入、イオントフォレーシス、又はハイドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、及び生体接着性マイクロスフェア等の他の媒体への取り込み、又はタンパク質性ベクタによる取り込み（Ｏ’Ｈａｒｅ及びＮｏｒｍａｎｄ、国際公開公報ＷＯ００／５３７２２参照）が含まれるがこれらに限定されない。代替的に、核酸／媒体の組み合わせを、直接注射又は輸液ポンプの使用によって局所的に送達することもできる。本発明の核酸分子の直接注射は、皮下注射、筋肉内注射、若しくは皮内注射を問わず、標準的な針とシリンジによる方法、又は、Ｃｏｎｒｙら，Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５：  ２３３０−２３３７，  １９９９、及びＢａｒｒｙら、国際公開公報ＷＯ９９／３１２６２に記載のような無針技術を用いて行うことができる。
【０１１４】
本明細書で開示する送達促進ポリペプチド／ｓｉＮＡ抱合体は、医薬品として用いることができる。医薬品は、患者の疾患状態の発生を予防若しくは調節し、又はそれを治療（症状を、好ましくはすべての症状を、ある程度軽減）する。
【０１１５】
本明細書で用いる「薬理学的に許容される製剤」とは、本発明の核酸分子をその所望する活性にとって最適な体内の場所へ効果的に送達させる組成物又は製剤を含むことを意図したものである。本発明の核酸分子と製剤するのに適した剤の限定されない例としては、ＣＮＳへの薬物の進入を促進可能なＰ−糖タンパク質阻害剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ８５等）（Ｊｏｌｌｉｅｔ−Ｒｉａｎｔ及びＴｉｌｌｅｍｅｎｔ，Ｆｕｎｄａｍ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １３：  １６−２６，  １９９９）、脳内移植後の持続的放出送達のためのＤＬ−ラクチド−グリコリド共重合ポリママイクロスフェア（Ｅｍｅｒｉｃｈら，Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ８：  ４７−５８，  １９９９）（Ａｌｋｅｒｍｅｓ，  Ｉｎｃ．社、マサチューセッツ州、ケンブリッジ）等の生分解性ポリマ、及び血液脳関門を通して薬物を送達可能で神経細胞の取り込みメカニズムを変性可能なポリブチルシアノアクリレートから作られたもの（Ｐｒｏｇ  Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ２３：  ９４１−９４９，  １９９９）等の充填されたナノ粒子が含まれる。
【０１１６】
本発明の化合物を含むリポソーム又はその他の薬物担体を使用することにより、例えば網状内皮系（ＲＥＳ）の組織等特定の種類の組織内で薬物を局在化することが潜在的に可能である。薬物とリンパ球やマクロファージ等の細胞の表面との会合を促進することができるリポソーム製剤も有用である。この方法によると、マクロファージ及びリンパ球によるガン細胞等の異常細胞に対する免疫認識特異性を利用して、標的細胞への薬物の送達を促進することができる。
【０１１７】
本発明の核酸分子を送達する方法の他の限定されない例としては、Ｂｏａｄｏら，Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ８７：  １３０８−１３１５，  １９９８；  Ｔｙｌｅｒら，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ４２１：  ２８０−２８４，  １９９９；  Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９２：  ５５９２−５５９６，  １９９５；  Ｂｏａｄｏ，Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．  １５：  ７３−１０７，  １９９５；  Ａｌｄｒｉａｎ−Ｈｅｒｒａｄａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２６：  ４９１０−４９１６，  １９９８；及びＴｙｌｅｒら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ．  ９６：  ７０５３−７０５８，  １９９９、に記載の内容が挙げられる。
【０１１８】
本開示はさらに、ポリ（エチレングリコール）脂質を含む表面改質リポソーム（ＰＥＧ改質、又は長期循環リポソーム若しくはステルスリポソーム（ｓｔｅａｌｔｈ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ））を含有する組成物の使用も特徴とする。これらの製剤は、標的組織内での薬物の蓄積を増加させる方法を提供する。この種の薬物担体は、単核食細胞系（ＭＰＳ又はＲＥＳ）によるオプソニン化及び排出に対する耐性を有し、そのため血液内の循環時間が長くなり、封入された薬物の組織への曝露が促進される。Ｌａｓｉｃら，Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．  ９５：  ２６０１−２６２７，  １９９５；  Ｉｓｈｉｗａｔａら，Ｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ．  ４３：  １００５−１０１１，  １９９５。このようなリポソームは、恐らくは新血管新生された標的組織内での血管外遊走及び捕獲により、腫瘍内で選択的に蓄積されることが分かっている。Ｌａｓｉｃら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：  １２７５−１２７６，  １９９５；  Ｏｋｕら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １２３８：  ８６−９０，  １９９５。長期循環リポソームは、特にＭＰＳの組織内に蓄積されることが知られている従来のカチオン性リポソームと比較して、ＤＮＡ及びＲＮＡの薬物動態及び薬効を高める。Ｌｉｕら，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ４２：  ２４８６４−２４８７０，  １９９５；  Ｃｈｏｉら、国際公開公報ＷＯ９６／１０３９１；  Ａｎｓｅｌｌら、国際公開公報ＷＯ９６／１０３９０；  Ｈｏｌｌａｎｄら、国際公開公報ＷＯ９６／１０３９２。長期循環リポソームは、肝臓や膵臓等の代謝が活発なＭＰＳ組織内への蓄積を避けることができることから、カチオン性リポソームよりも強く薬物をヌクレアーゼ分解から保護する傾向もある。
【０１１９】
本開示はさらに、薬理学的に許容される担体又は希釈剤中に薬理学的に効果的な量の所望の化合物を含む、保存又は投与のために調製された組成物を含む。治療用途に許容可能な担体又は希釈剤は薬理分野で周知であり、例えば、Ａ．Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ編集、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．社、１９８５年、に記載されている。例えば、保存剤、安定剤、染料、及び香味料を挙げることができる。これらには、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。さらに、抗酸化剤及び懸濁剤を用いることもできる。
【０１２０】
薬理学的に効果的な投与量は、疾患状態を予防し、その発生を抑制し、又はそれを治療する（症状を、好ましくはすべての症状を、ある程度軽減する）のに必要な投与量である。薬理学的に効果的な投与量は、疾患の種類、用いた組成物、投与経路、治療される哺乳類の種類、想定する特定の哺乳類の身体的特性、同時に行われている薬物療法、及び医療分野の当業者が認識するその他の要因に依存する。一般的に、負に帯電したポリマの効力に応じて、一日あたり、体重に対して０．１ｍｇ／ｋｇ乃至１００ｍｇ／ｋｇの量の活性成分が投与される。
【０１２１】
本開示はさらに、薬理学的に許容される担体又は希釈剤中に薬理学的に効果的な量の所望の化合物を含む、保存又は投与のために調製された組成物を含む。核酸分子の送達のための補助的な又は補完的な方法は、例えばＡｋｈｔａｒら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．  ２：  １３９，  １９９２；  Ａｋｈｔａｒ編集、「Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、１９９５年；  Ｍａｕｒｅｒら，Ｍｏｌ．  Ｍｅｍｂｒ．  Ｂｉｏｌ．  １６：  １２９−１４０，  １９９９；  Ｈｏｆｌａｎｄ及びＨｕａｎｇ，Ｈａｎｄｂ．  Ｅｘｐ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １３７：  １６５−１９２，  １９９９；及びＬｅｅら，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐ．  Ｓｅｒ．  ７５２：  １８４−１９２，  ２０００、に記載されている。Ｓｕｌｌｉｖａｎら、国際公開公報ＷＯ９４／０２５９５には、酵素核酸分子の送達の一般的方法がさらに記載されている。これらのプロトコルは、本発明の範囲内で意図される実質的にいかなる核酸分子の補助的な又は補完的な送達に対しても利用することができる。
【０１２２】
核酸分子及びポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、当業者に公知の様々な方法によって細胞へ投与することができ、その方法にはｓｉＮＡ及びポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドのみを含む製剤、又は薬理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、アジュバント、乳化剤、バッファ、安定剤、保存剤等の１若しくは２種類以上の追加成分をさらに含む製剤の範囲内での投与が含まれるが、これらに限定されない。ある様態において、ｓｉＮＡ及び／又はポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、リポソーム内に封入されたり、イオントフォレーシスで投与されたり、又はハイドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、生体接着性マイクロスフェア、若しくはタンパク質性ベクタ等の他の媒体へ取り込まれたりすることができる（Ｏ’Ｈａｒｅ及びＮｏｒｍａｎｄ、国際公開公報ＷＯ００／５３７２２参照）。代替的に、核酸／ペプチド／媒体の組み合わせを、直接注射又は輸液ポンプの使用によって局所的に送達することもできる。本発明の核酸分子の直接注射は、皮下注射、筋肉内注射、若しくは皮内注射を問わず、標準的な針とシリンジによる方法、又は、Ｃｏｎｒｙら，Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５：  ２３３０−２３３７，  １９９９、及びＢａｒｒｙら、国際公開公報ＷＯ９９／３１２６２に記載されるような無針技術を用いて行うことができる。
【０１２３】
本発明の組成物は、実質的に医薬品として使用することができる。医薬品は、患者の疾患状態若しくはその他の有害な状態の発生又は重症度化を予防若しくは調節し、又はこれらを治療（１若しくは２種類以上の症状を、検出若しくは測定可能な程度で軽減）する。
【０１２４】
従って、追加的様態の範囲内において、本発明は、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドペプチドと組み合わされた、複合体化した、若しくは抱合した形であって、任意に希釈剤、安定剤、バッファ等の薬理学的に許容される担体と共に製剤されていてよい通常は１若しくは２種類以上のｓｉＮＡである、１若しくは２種類以上のポリ核酸の存在又は投与を特徴とする医薬組成物及び方法を提供する。
【０１２５】
本発明は、対象の特定の疾患状態又はその他の有害な状態と関連する遺伝子の発現を調節する短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を提供することにより、更なる課題及び利点を満足するものである。通常ｓｉＮＡは、対象の疾患状態又は有害な状態と関連する原因因子又は寄与因子として、高レベルに発現された遺伝子を標的とすることになる。この点で、ｓｉＮＡは、１又は２種類以上の関連する疾患症状の再発が予防される、又はその重症度が軽減若しくは減少するレベルまで遺伝子の発現を効果的に下方制御するであろう。代替的に、疾患又は他の有害な状態の結果又は続きとして標的遺伝子の発現が必ずしも高まらない様々な個別の疾患モデルに対しても、それでも標的遺伝子の下方制御は遺伝子の発現を低下させる（すなわち、標的遺伝子の選択されたｍＲＮＡ及び／又はタンパク質産物のレベルを下げる）ことによって治療効果を示すであろう。代替的に、本発明のｓｉＮＡは、一つの遺伝子の発現の低下を目的とすることによって、その標的遺伝子の産物又は活性によって発現が負の制御を受ける「下流」の遺伝子の上方制御を行うことができる。
【０１２６】
典型的な様態の範囲内において、本発明の組成物及び方法は、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）の発現を制御して関節リウマチ（ＲＡ）の症状を治療又は予防するための治療用ツールとして有用である。この点で、本発明はさらに、低分子核酸を用いたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によるＴＮＦ−αの発現及び活性の調節に有用な化合物、組成物、及び方法を提供する。より詳細な様態では、本発明は、哺乳類の対象中でＲＡの症状を予防若しくは低減するためのＴＮＦ−α及び／又はＴＮＦ−α遺伝子の発現を調節するのに有効な、短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、及び短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子等の低分子核酸、並びに関連する方法を提供する。これらの及び関連する治療用組成物並びに治療方法の範囲内において、化学修飾ｓｉＮＡの使用により、例えばインビボでのヌクレアーゼ分解に対する耐性が高まる、及び／又は細胞取り込みが改善する等によって、天然ｓｉＮＡ分子の性質と比較して修飾ｓｉＮＡの性質が向上することが多い。本発明の開示により容易に判断できるように、複数の化学修飾部位を持つ有用なｓｉＮＡはそのＲＮＡｉ活性を保持するであろう。本発明のｓｉＮＡ分子は、従って、種々の治療、診断、標的の確認、ゲノムの発見、遺伝子工学、及び薬理ゲノミクスへの応用に有用な試薬並びに方法を提供する。
【０１２７】
本発明のｓｉＮＡは、例えば経皮投与又は局所注射（例：乾癬治療のための乾癬性プラーク患部における局所注射、又は乾癬性関節炎若しくはＲＡを患う患者の関節への局所注射）等、いかなる形でも投与することができる。より詳細な様態では、本発明は、ＴＮＦ-αのｍＲＮＡを標的とし、効果的にＴＮＦ-αのＲＮＡを下方制御することでＴＮＦ-αと関連する１若しくは２種類以上の炎症状態を低減又は予防するｓｉＮＡを治療効果量投与するための製剤及び方法を提供する。選択された疾患状態と関連する原因因子又は寄与因子として発現が異常に増加することが知られている大多数の遺伝子のいずれをも含む、対象動物の選択された疾患状態に関連する１又は２種類以上の異なる遺伝子の発現を標的とする類似の方法及び組成物が提供される。
【０１２８】
本発明のｓｉＮＡ／ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド混合物は、例えばＲＡ又は乾癬等の炎症疾患に有効な治療薬等、疾患状態を標的とするその他の標準的な治療と組み合わせて投与することができる。この点で、組み合わせとして有用で効果的な薬剤の例としては、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、メトトレキサート、金化合物、Ｄ−ペニシラミン、抗マラリア薬、スルファサラジン、グルココルチコイド、並びにインフリキシマブ及びエントラセプト（ｅｎｔｒａｃｅｐｔ）等その他のＴＮＦ-α中和剤が挙げられる。
【０１２９】
本発明の負に帯電したポリヌクレオチド（例：ＲＮＡ又はＤＮＡ）は、医薬組成物を形成する安定剤やバッファ等を含んだ又は含まない状態で、いかなる標準的な方法によっても患者に投与することができる。リポソームによる送達メカニズムの使用を所望する場合は、リポソームを形成する標準的なプロトコルに従うことができる。本発明の組成物は、経口投与のために錠剤、カプセル、又はエリキシール剤として、直腸内投与のために坐薬として、注射投与のために無菌溶液又は懸濁液として、及び本技術分野で公知のその他の組成物として製剤し、使用することもできる。
【０１３０】
本発明はさらに、本明細書で述べる組成物の薬理学的に許容される製剤も含む。このような製剤は、例えば塩酸、臭素酸、酢酸、及びベンゼンスルホン酸の塩といった酸付加塩等の上述の化合物の塩を含む。
【０１３１】
薬理組成物又は製剤とは、例えば全身投与等、細胞又は例えばヒト等を含む患者に対する投与に適した形の組成物又は製剤のことである。適切な形は、用途、又は例えば経口、経皮、若しくは注射等の進入経路に一部依存する。そのような形は、組成物又は製剤が標的細胞（すなわち、負に帯電した核酸を送達させたい細胞）へ到達することを妨げてはならない。例えば、血流中に注入される薬理組成物は溶解性であるべきである。他の要因は本技術分野で公知であり、毒性等の考慮が含まれる。
【０１３２】
「全身投与」とは、インビボでの血流中の薬物の全身吸収又は全身蓄積、及びそれに続く全身への分配を意味する。全身吸収をもたらす投与経路としては、静脈内、皮下、腹腔内、吸入、経口、肺内、及び筋肉内が挙げられるがこれらに限定されない。これらの各投与経路により、例えば核酸等の所望の負に帯電したポリマが、到達可能な患部組織へ曝露される。薬物の循環中への進入速度は、分子量又はサイズに依存することが示されている。本発明の化合物を含むリポソーム又はその他の薬物担体を使用することにより、例えば網状内皮系（ＲＥＳ）の組織等特定の種類の組織内で薬物を局在化することが潜在的に可能である。薬物とリンパ球やマクロファージ等の細胞の表面との会合を促進することができるリポソーム製剤も有用である。この方法によると、マクロファージ及びリンパ球によるガン細胞等の異常細胞に対する免疫認識特異性を利用して、標的細胞への薬物の送達を促進することができる。
【０１３３】
「薬理学的に許容される製剤」とは、本発明の核酸分子をその所望する活性にとって最適な体内の場所へ効果的に送達させる組成物又は製剤を意味する。本発明の核酸分子と製剤するのに適した薬剤の限定されない例としては、ＣＮＳへの薬物の進入を促進可能なＰ−糖タンパク質阻害剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ８５等）（Ｊｏｌｌｉｅｔ−Ｒｉａｎｔ及びＴｉｌｌｅｍｅｎｔ，Ｆｕｎｄａｍ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １３：  １６−２６，  １９９９）、脳内移植後の持続的放出送達のためのＤＬ−ラクチド−グリコリド共重合ポリマのマイクロスフェア（Ｅｍｅｒｉｃｈ，Ｄ．Ｆ．ら，Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ８：  ４７−５８，  １９９９）（Ａｌｋｅｒｍｅｓ，  Ｉｎｃ．社、マサチューセッツ州、ケンブリッジ）等の生分解性ポリマ、及び血液脳関門を通して薬物を送達可能で神経細胞の取り込みメカニズムを変性可能なポリブチルシアノアクリレートから作られたもの（Ｐｒｏｇ．  Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｂｉｏｌ．  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ２３：  ９４１−９４９，  １９９９）等の充填されたナノ粒子が含まれる。本発明の核酸分子を送達する方法の他の限定されない例としては、Ｂｏａｄｏら，Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ８７：  １３０８−１３１５，  １９９８；  Ｔｙｌｅｒら，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ４２１：  ２８０−２８４，  １９９９；  Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９２：  ５５９２−５５９６，  １９９５；  Ｂｏａｄｏ，Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．  １５：  ７３−１０７，  １９９５；  Ａｌｄｒｉａｎ−Ｈｅｒｒａｄａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２６：  ４９１０−４９１６，  １９９８；及びＴｙｌｅｒら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ．  ９６：  ７０５３−７０５８，  １９９９、に記載される材料が挙げられる。
【０１３４】
本開示はさらに、薬理学的に許容される担体又は希釈剤中に薬理学的に効果的な量の所望の化合物を含む、保存又は投与のために調製された組成物を含む。治療用途に許容可能な担体又は希釈剤は薬理分野で公知であり、例えば、Ａ．Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ編集、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．社、１９８５年、に記載されており、これは参照することで本明細書に組み入れられる。例えば、保存剤、安定剤、染料、及び香味料を挙げることができる。これらには、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。さらに、抗酸化剤及び懸濁剤を用いることもできる。
【０１３５】
薬理学的に効果的な投与量は、疾患状態を予防し、その発生を抑制し、又はそれを治療する（症状を、好ましくはすべての症状を、ある程度軽減する）のに必要な投与量である。薬理学的に効果的な投与量は、疾患の種類、用いた組成物、投与経路、治療される哺乳類の種類、想定する特定の哺乳類の身体的特性、同時に行われている薬物療法、及び医療分野の当業者が認識するその他の要因に依存する。一般的に、負に帯電したポリマの効力に応じて、一日あたり、体重に対して０．１ｍｇ／ｋｇ乃至１００ｍｇ／ｋｇの量の活性成分が投与される。
【０１３６】
本開示の送達促進ポリペプチド／ｓｉＮＡ抱合体及びその製剤は、従来の無害な薬理学的に許容可能な担体、アジュバント、及び／又は媒体を含む投与単位の製剤で、経口的に、局所的に、非経口的に、呼吸若しくはスプレーにより、又は経直腸的に投与することができる。本明細書で用いる非経口的とは、経皮、皮下、血管（例：静脈）内、筋肉内、若しくはくも膜下腔内注射、又は注入技術等を含む。さらに、本発明の核酸分子及び薬理学的に許容される担体を含む医薬組成物も提供される。１若しくは２種類以上の本発明の核酸分子は、１若しくは２種類以上無害の薬理学的に許容される担体及び／又は希釈剤及び／又はアジュバント、並びに必要に応じてその他の活性成分と共存することができる。本発明の核酸分子を含む医薬組成物は、例えば錠剤、トローチ、ロゼンジ、水性若しくは油性懸濁液、分散性粉末若しくは顆粒、エマルジョン、硬カプセル若しくは軟カプセル、又はシロップ若しくはエリキシール剤等の経口投与に適した形とすることができる。
【０１３７】
経口投与を意図した組成物は、医薬組成物製造の技術分野で公知のいかなる方法によっても調製することができ、そのような組成物は、１若しくは２種類以上の甘味料、香味料、着色料、又は保存料を含有することで薬理学的に上品で飲みやすい製剤を提供することができる。錠剤は、錠剤の製造に適した無害で薬理学的に許容される賦形剤との混合物の形で活性物質を含む。このような賦形剤は、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、又はリン酸ナトリウム等の不活性希釈剤、例えばコーンスターチ又はアルギン酸等の造粒剤及び崩壊剤、例えばデンプン、ゼラチン、又はアカシア等の結合剤、並びに例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、又はタルク等の潤滑剤であってよい。錠剤は被覆されていなくても、公知の技術によって被覆されていてもよい。公知の技術によってそのような被覆を施し、胃腸管内での崩壊と吸収を遅延させることでより長い期間にわたって活性を持続させる場合もある。例えばモノステアリン酸グリセリン又はジステアリン酸グリセリン等の遅延剤を用いることができる。
【０１３８】
経口投与のための製剤は、硬ゼラチンカプセルとして提供することもでき、この場合活性成分は、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、若しくはカオリン等の不活性固体希釈剤と混合され、又は軟ゼラチンカプセルとして提供することもでき、この場合活性成分は、水又は例えばピーナッツ油、液体パラフィン、若しくはオリーブ油等の油性媒体と混合される。
【０１３９】
水性懸濁液は、水性懸濁液を製造するのに適した賦形剤との混合物として活性物質を含有する。そのような賦形剤としては、例えばカルボキシメチルセルロースのナトリウム塩、メチルセルロース、ヒドロプロピル−メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガントガム、及びアカシアガム等の懸濁剤であり、分散剤又は湿潤剤は例えばレシチン等の天然のホスファチド、例えばポリオキシエチレンステアレート等のアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール等のエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート等のエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトールから誘導される部分エステルとの縮合生成物、又は例えばポリエチレンソルビタンモノオレエート等のエチレンオキシドと脂肪酸及び無水ヘキシトールから誘導される部分エステルとの縮合生成物であってよい。水性懸濁液は、例えばｐ−ヒドロキシ安息香酸のエチル若しくはｎ−プロピルエステル等の１又は２種類以上の保存剤、１又は２種類以上の着色剤、１又は２種類以上の香味料、及びスクロース若しくはサッカリン等の１又は２種類以上の甘味料をさらに含んでよい。
【０１４０】
油性懸濁液は、例えば落花生油、オリーブ油、ゴマ油、若しくはココナッツ油等の植物性油、又は液状パラフィン等の鉱油中に活性成分を懸濁させることで調製することができる。油性懸濁液は、例えば蜜蝋、固形パラフィン、又はセチルアルコール等の増粘剤を含んでもよい。飲みやすい経口製剤を提供するために甘味料及び香味料を加えてもよい。このような組成物は、アスコルビン酸等の抗酸化剤を加えることで保存することができる。
【０１４１】
水の添加によって水性懸濁液を調製するのに適した分散性粉末及び顆粒により、活性成分は、分散剤又は湿潤剤と、懸濁剤と、１又は２種類以上の保存料との混合物として提供される。適切な分散剤若しくは湿潤剤又は懸濁剤の例としては上述のものが挙げられる。例えば甘味料、香味料、及び着色料等の追加的な賦形剤も存在してよい。
【０１４２】
本発明の医薬組成物は、水中油型エマルジョンの形をとることもできる。油相は、植物油、鉱油、又はこれらの混合物であってよい。適切な乳化剤としては、例えばアカシアガム又はトラガントガム等の天然ガム、例えば大豆、レシチン等の天然ホスファチド、並びに、例えばソルビタンモノオレエート等の脂肪酸と無水ヘキシトールとから誘導されるエステル又は部分エステル、及び例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート等の前述の部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物であってよい。また、エマルジョンは甘味料及び香味料を含んでいてもよい。
【０１４３】
シロップ及びエリキシール剤は、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、グルコース、又はスクロース等の甘味料を用いて製剤することができる。そのような製剤は、さらに粘滑剤、保存料、香味料、及び着色料を含むことができる。医薬組成物は、無菌注射用水性又は油性懸濁液の形をとることができる。この懸濁液は、上述の適切な分散剤又は湿潤剤、及び懸濁剤を用いて既知の技術に従って調製することができる。無菌注射用製剤は、例えば１，３−ブタノール溶液等非経口的に許容される無害な希釈剤若しくは溶媒中の無菌注射用溶液又は懸濁液であってもよい。使用することができる許容可能な媒体及び溶媒としては、水、リンゲル液、及び等張性の塩化ナトリウム溶液が挙げられる。さらに、無菌固定油は、溶媒又は懸濁媒体として従来から使用されている。上記目的のためには、合成モノグリセリド又はジグリセリドを含むいかなる無刺激の固定油も使用することができる。さらに、オレイン酸等の脂肪酸も注射液の調製に有用である。
【０１４４】
本開示で述べる送達促進ポリペプチド／ｓｉＮＡ抱合体は、例えば薬物の直腸内投与等のために坐薬の形で投与することもできる。このような組成物は、薬物を、常温で固体だが直腸内温度では液体となるため直腸内で融解して薬物を放出する適切な非刺激性賦形剤と混合することによって調製することができる。そのような物質としては、ココアバター及びポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１４５】
本開示で述べる送達促進ポリペプチド／ｓｉＮＡ抱合体は、無菌媒体中で、非経口的に投与することができる。用いる媒体及び濃度によるが、薬物は媒体中に懸濁又は溶解することができる。有益なことに、局部麻酔薬、保存料、及びバッファ等のアジュバントを媒体中に溶解することができる。
【０１４６】
体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇ乃至約１４０ｍｇのオーダーの１日あたりの投与レベルが上述の状態の治療に有用である（患者一人に対して一日あたり約０．５ｍｇ乃至約７ｇ）。単一投与分を作製するのに担体物質と混合することができる活性成分の量は、治療されるホスト及び個々の投与方法によって様々である。単位投与分は、一般に約１ｍｇ乃至約５００ｍｇの活性成分を含有する。
【０１４７】
個々の患者に対する具体的な投与レベルは、用いた具体的化合物の活性、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食事習慣、投与時間、投与経路及び排泄速度、薬物の組み合わせ、並びに特定の治療中の疾患の重症度を含む様々な要因に依存することが理解される。
【０１４８】
ヒト以外の動物への投与に関しては、組成物を飼料や飲料水に添加することもできる。動物が飼料と共に治療上適切な量の組成物を摂取するので、動物飼料組成物及び飲料水組成物を製剤することは有用であろう。組成物を試料や飲料水に添加するための混合剤の形にすることも有用であろう。
【０１４９】
送達促進ポリペプチド／ｓｉＮＡ抱合体は、他の治療化合物と組み合わせて患者に投与することによって、全体の治療効果を向上させることができる。適応症の治療に複数の化合物を使用することにより、副作用を低減すると同時に有益な効果を高めることができる。
【０１５０】
一つの様態では、本発明の組成物は、送達促進ポリペプチド／ｓｉＮＡ抱合体を肝細胞等の特定の細胞へ投与するのに適している。例えば、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰｒ）は肝細胞に特有のもので、アシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）等の分岐鎖ガラクトース末端糖タンパク質に結合する。ｓｉＮＡは、例えば２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｈ等のヌクレアーゼ耐性を持つ基によって様々に修飾することによって安定性を向上することができる（レビューは、Ｕｓｍａｎ及びＣｅｄｅｒｇｒｅｎ，ＴＩＢＳ  １７  ：３４，  １９９２；  Ｕｓｍａｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．  Ｓｅｒ．  ３１：  １６３，  １９９４を参照）。ｓｉＮＡ構築物は、一般的な方法を用いたゲル電気泳動又は高圧液体クロマトグラフィーによって精製し、水中に再懸濁することができる。
【０１５１】
修飾（塩基、糖、及び／又はリン酸）された核酸分子を化学合成することにより、血清リボヌクレアーゼによる分解を防ぎ、その効力を高めることができる。例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎら、国際公開公報ＷＯ９２／０７０６５； Ｐｅｒｒａｕｌｔら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：  ５６５，  １９９０；  Ｐｉｅｋｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：  ３１４，  １９９１；  Ｕｓｍａｎ及びＣｅｄｅｒｇｒｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．  １７：  ３３４，  １９９２；  Ｕｓｍａｎら、国際公開公報ＷＯ９３／１５１８７；及びＲｏｓｓｉら、国際公開公報ＷＯ９１／０３１６２；  Ｓｐｒｏａｔ、米国特許公報第５３３４７１１号；  Ｇｏｌｄら、米国特許公報第６３０００７４号を参照のこと。上述の文献にはすべて、本明細書で述べる核酸分子の塩基、リン酸、及び／又は糖部分に施すことが可能な種々の化学修飾が記載されている。
【０１５２】
本技術分野では、核酸分子に導入してそのヌクレアーゼに対する安定性及び有効性を著しく高める、糖、塩基、及びリン酸の修飾に関する例がいくつか存在する。例えば、オリゴヌクレオチドは、例えば２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｈ等のヌクレアーゼ耐性を持つ基によるヌクレオチド塩基修飾によって、安定性及び／又は生物活性が高められる。総説については、Ｕｓｍａｎ及びＣｅｄｅｒｇｒｅｎ，ＴＩＢＳ  １７  ：３４，  １９９２；  Ｕｓｍａｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．  Ｓｅｒ．  ３１：  １６３，  １９９４；  Ｂｕｒｇｉｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：  １４０９０，  １９９６を参照のこと。核酸分子の糖修飾は、本技術分野において幅広く記述されたものがある。Ｅｃｋｓｔｅｉｎら、国際公開公報ＷＯ９２／０７０６５； Ｐｅｒｒａｕｌｔら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：  ５６５−５６８，  １９９０；  Ｐｉｅｋｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：  ３１４−３１７，  １９９１；  Ｕｓｍａｎ及びＣｅｄｅｒｇｒｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．  １７：  ３３４−３３９，  １９９２；  Ｕｓｍａｎら、国際公開公報ＷＯ９３／１５１８７；  Ｓｐｒｏａｔ、米国特許公報第５３３４７１１号；  Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０：  ２５７０２：  １９９５；  Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら、国際公開公報ＷＯ９７／２６２７０；  Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら、米国特許公報第５７１６８２４号；  Ｕｓｍａｎら、米国特許公報第５６２７０５３号；  Ｗｏｏｌｆら、国際公開公報ＷＯ９８／１３５２６；  Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，Ｋａｒｐｅｉｓｋｙら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ３９：  １１３１，  １９９８；  Ｅａｒｎｓｈａｗ及びＧａｉｔ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）  ４８：  ３９−５５，  １９９８；  Ｖｅｒｍａ及びＥｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６７：  ９９−１３４，  １９９８；及びＢｕｒｌｉｎａら，Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ５：  １９９９−２０１０，  １９９７を参照のこと。このような刊行物には、触媒作用を変えることなく核酸分子へ挿入された糖、塩基、及び／又はリン酸修飾等の部位を特定するための一般的な方法及び方策が記載されている。このような教示を参考にして、ｓｉＮＡの細胞内でＲＮＡｉを促進する能力が著しく阻害されない限りにおいて、本明細書に述べるように類似の修飾を本発明のｓｉＮＡ核酸分子に施すことができる。
【０１５３】
ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、及び／又は５’−メチルホスホネート結合によるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合の化学修飾は安定性を向上させるが、過剰な修飾は幾分かの毒性の付与又は活性の低下を引き起こす場合がある。従って、核酸分子を設計する場合は、これらのヌクレオチド間の結合の量は最低限に抑えるべきである。これらの結合の濃度を低下させることによって毒性が下がり、有効性が向上する結果となるはずである。Ｗｕ，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６２：  ４４２９−４４３２，  １９８７。このような糖タンパク質又は合成複合糖質と受容体との結合は、オリゴ糖鎖の分岐度に大きく依存する親和性に従って発生し、例えば三分岐構造（ｔｒｉａｔｅｎｎａｒｙ）は、二分岐（ｂｉａｔｅｎａｒｒｙ）又は一分岐鎖（ｍｏｎｏａｔｅｎｎａｒｙ  ｃｈａｉｎ）と比べてより高い親和性をもって結合する。Ｂａｅｎｚｉｇｅｒ及びＦｉｅｔｅ，Ｃｅｌｌ  ２２：  ６１１−６２０，  １９８０、及びＣｏｎｎｏｌｌｙら，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５７：  ９３９−９４５，  １９８２。Ｌｅｅ及びＬｅｅは、炭水化物部位として、ガラクトースに比べて受容体への親和性が高いＮ−アシル−Ｄ−ガラクトサミンを用いて、このような高い特異性を得た。Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊ．  ４：  ３１７−３２８，  １９８７。この「クラスター効果（ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔ）」は、マンノシル末端糖タンパク質又は複合糖質の結合及び取り込みに対しても記載されている。Ｐｏｎｐｉｐｏｍら，Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ２４：  １３８８−１３９５，  １９８１。ガラクトース及びガラクトサミンとヌクレオチドの抱合体（ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｄ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を使用して外来性の化合物を細胞膜を超えて輸送することにより、ＨＢＶ感染又は肝細胞ガン等の肝臓疾患を治療するための標的送達法を提供することができる。生体抱合体（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を使用することにより、治療に必要な治療用化合物の必要投与量を減らすこともできる。さらに、治療的生体利用度、薬物動態、及び薬物速度パラメータを、本発明の核酸生体抱合体を用いることで調節することができる。これらの分子のより高い特異性。
【０１５４】
一つの様態では、本発明はリン酸エステルバックボーンが修飾されたｓｉＮＡ分子を特徴とし、その修飾には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、モルホリノ、アミデートカルバメート、カルボキシメチル、アセトアミデート、ポリアミド、スルホネート、スルホンアミド、スルファメート、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、及び／又はアルキルシリルによる１若しくは２種類以上の置換が含まれる。オリゴヌクレオチドバックボーンの修飾に関するレビューは、Ｈｕｎｚｉｋｅｒ及びＬｅｕｍａｎｎ著、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ:  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ,  ｉｎ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」、ＶＣＨ、ｐ．３３１−４１７、１９９５年、及びＭｅｓｍａｅｋｅｒら著、「Ｎｏｖｅｌ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，  ｉｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、ＡＣＳ、ｐ．２４−３９、１９９４年を参照のこと。
【０１５５】
核酸分子を送達する方法は、核酸分子を送達する方法は、例えばＡｋｈｔａｒら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．  ２：  １３９，  １９９２；  Ａｋｈｔａｒ編、「Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、１９９５年；  Ｍａｕｒｅｒら，Ｍｏｌ．  Ｍｅｍｂｒ．  Ｂｉｏｌ．  １６：  １２９−１４０，  １９９９；  Ｈｏｆｌａｎｄ及びＨｕａｎｇ，Ｈａｎｄｂ．  Ｅｘｐ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １３７：  １６５−１９２，  １９９９；  及びＬｅｅら，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐ．  Ｓｅｒ．  ７５２：  １８４−１９２，  ２０００に記載されている。Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら、米国特許公報第６３９５７１３号及びＳｕｌｌｉｖａｎら、国際公開公報ＷＯ９４／０２５９５にはさらに、核酸分子の送達の一般的方法が記載されている。これらのプロトコルは、実質的にいかなる核酸分子の送達に対しても利用することができる。核酸分子は、当業者に公知の様々な方法によって細胞へ投与することができ、その方法にはリポソーム内への封入、イオントフォレーシス、生分解性ポリマ、ハイドロゲル、シクロデキストリン（例えば、Ｇｏｎｚａｌｅｚら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  １０：  １０６８−１０７４，  １９９９；  Ｗａｎｇら、国際公開公報ＷＯ０３／４７５１８及び同ＷＯ０３／４６１８５参照）、乳酸−グリコール酸共重合ポリマ（ＰＬＧＡ）及びＰＬＣＡマイクロスフェア（米国特許公報第６４４７７９６号及び米国特許公開公報ＵＳ２００２／１３０４３０参照）、生分解性ナノカプセル、並びに生体接着性マイクロスフェア等のその他の媒体への取り込み、又はタンパク質性ベクタによる取り込み（Ｏ’Ｈａｒｅ及びＮｏｒｍａｎｄ、国際公開公報ＷＯ００／５３７２２参照）が含まれるがこれらに限定されない。代替的に、核酸／媒体の組み合わせは、直接注射又は輸液ポンプの使用によって局所的に送達される。本発明の核酸分子の直接注射は、皮下注射、筋肉内注射、若しくは皮内注射を問わず、標準的な針とシリンジによる方法、又は、Ｃｏｎｒｙら，Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５：  ２３３０−２３３７，  １９９９、及びＢａｒｒｙら、国際公開公報ＷＯ９９／３１２６２に記載のような無針技術を用いて行うことができる。本発明の分子は医薬品として使用することができる。医薬品は、対象の疾患状態について、その発生を予防若しくは調節したり、又はこれを治療（症状を、好ましくはすべての症状を、ある程度軽減）したりする。
【０１５６】
「リガンド」という用語は、受容体等の別の化合物と直接的に若しくは間接的に相互作用を起こすことができる、薬物、ペプチド、ホルモン、若しくは神経伝達物質等のいかなる化合物又は分子も意味する。リガンドと相互作用を起こす受容体は、細胞表面に存在してもよく、又は細胞内受容体でもよい。リガンドの受容体との相互作用は、生化学的反応であってよく、又は単に物理的相互作用若しくは会合であってもよい。
【０１５７】
本明細書で用いる「非対称ヘアピン」とは、アンチセンス領域と、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを含むことができるループ部と、アンチセンス領域と塩基対を作ってループ付き二重鎖を形成するのに十分な相補的ヌクレオチドを有する限りにおいてアンチセンス領域よりも少ないヌクレオチドを含むセンス領域と、を含む直鎖ｓｉＮＡ分子を意味する。例えば、本発明の非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子は、Ｔ−細胞内でＲＮＡｉを媒介するのに十分な長さ（例：約１９乃至約２２（例：約１９、２０、２１、又は２２）ヌクレオチド）を有するアンチセンス領域と、約４乃至約８（例：約４、５、６、７、又は８）ヌクレオチドを有するループ部と、約３乃至約１８（例：約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８）ヌクレオチドを有しアンチセンス領域と相補的なセンス領域と、を含むことができる。非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子はさらに、化学修飾が可能な５’末端リン酸基を含むこともできる。非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子のループ部は、本明細書で述べるように、ヌクレオチド、非ヌクレオチド、リンカ分子、又は抱合体分子を含むことができる。
【０１５８】
本明細書で用いる「非対称二重鎖」とは、センス領域及びアンチセンス領域を含む別々の２つの鎖を有するｓｉＮＡ分子を意味し、この場合センス領域は、アンチセンス領域と塩基対を作って二重鎖を形成するのに十分な相補的ヌクレオチドを有する限りにおいてアンチセンス領域よりも少ないヌクレオチドを具える。例えば、本発明の非対称二重鎖ｓｉＮＡ分子は、Ｔ−細胞内でＲＮＡｉを媒介するのに十分な長さ（例：約１９乃至約２２（例：約１９、２０、２１、又は２２）ヌクレオチド）を有するアンチセンス領域と、約３乃至約１８（例：約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８）ヌクレオチドを有しアンチセンス領域と相補的なセンス領域とを具えることができる。
【０１５９】
「遺伝子発現を調節する」とは、標的遺伝子の発現を上方制御又は下方制御することであり、細胞内に存在するｍＲＮＡのレベル、ｍＲＮＡの翻訳、又は標的遺伝子によってコードされるタンパク質若しくはタンパク質サブユニットの合成の上方制御又は下方制御を含む場合がある。遺伝子発現の調節は、上方制御若しくは下方制御された標的遺伝子によってコードされた１又は２種類以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットの存在、量、又は活性により、対象とするタンパク質若しくはサブユニットの発現、レベル、又は活性が調節因子（例：ｓｉＲＮＡ）の非存在下で観察されるより高いか低いかに基づいて決定することもできる。例えば、「調節」という用語は「阻害」を意味する場合もあるが、「調節」という言葉の使用はこの定義に限定されない。
【０１６０】
「阻害する」、「下方制御する」、又は「発現を低下させる」とは、遺伝子の発現、ＲＮＡ分子又は１又は２種類以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットをコードする同等のＲＮＡ分子のレベル、又は標的遺伝子によってコードされる１又は２種類以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットのレベル若しくは活性が、本発明の核酸分子（例：ｓｉＮＡ）の非存在下で観察されるよりも低下することを意味する。一つの様態では、ｓｉＮＡ分子による阻害、下方制御、又は低下とは、不活性又は効果の弱い分子の存在下で観察されたレベルよりも低いことである。別の様態では、ｓｉＮＡ分子による阻害、下方制御、又は低下とは、例えばスクランブル配列又はミスマッチを有するｓｉＮＡの存在下で観察されたレベルよりも低いことである。別の様態では、本発明の核酸分子による遺伝子発現の阻害、下方制御、又は低下は、その核酸分子が存在する場合の方が存在しない場合よりも大きい。
【０１６１】
ジーン「サイレンシング」とは、細胞内の遺伝子発現の標的阻害による部分的な又は完全な機能喪失のことであり、「ノックダウン」と言うこともある。状況及び扱うべき生物学的問題によっては、遺伝子発現を部分的に低下させることが好ましい場合もある。代替的に、可能な限り遺伝子発現を低下させることが好ましい場合もある。ジーンサイレンシングの程度は本技術分野で公知の方法によって定量することができ、方法のうちのいくつかは国際公開公報ＷＯ９９／３２６１９にまとめられている。アッセイによっては、遺伝子発現の定量により、ｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベル若しくは活性という点で標的遺伝子の発現を、例えばベースライン（すなわち通常状態）又は、治療の対象である特定の疾患状態若しくはその他の状態と関連するであろう上昇した発現レベルを含む他のコントロールレベルの１０％以上、３０％以上、５０％以上、７５％以上、９０％以上、９５％以上、又は９９％以上ノックダウンすることが可能である予防及び治療方法を含む、本発明の特定の様態において所望されるであろう種々の阻害量の検出が可能となる。
【０１６２】
「標的遺伝子の発現を阻害する」とは、本発明のｓｉＮＡが標的遺伝子のジーンサイレンシングを誘起する能力を意味する。ジーンサイレンシングの程度を調べるために、特定の構築物を発現する対象生物又は培養中の細胞のサンプル又はアッセイを、構築物を発現しないコントロールサンプルと比較する。コントロールサンプル（構築物の発現なし）の相対値を１００％とする。標的遺伝子の阻害は、コントロールに対する相対値としての試験値が約９０％、多くの場合は５０％、そしてある様態においては２５乃至０％の時に達成される。適切なアッセイとしては、例えばドットブロット、ノーザンブロット、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、酵素機能、並びに当業者に公知の表現型アッセイ等、当業者に公知の技術を用いたタンパク質又はｍＲＮＡレベルの検査が含まれる。
【０１６３】
「対象」とは、生物、組織、又は細胞を意味し、対象若しくはドナーとしての生物、又は外植細胞若しくはそれ自体がｓｉＮＡ送達の対象である細胞のレシピエントを含むことができる。従って「対象」とは、本発明の核酸分子が投与され本明細書で述べるポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドによって促進され得る、インビトロ若しくはエキソビボでの対象器官、組織、又は細胞を含む生物、器官、組織、又は細胞のことである。典型的な対象としては、例えばヒトである患者若しくは細胞等、哺乳類の個体又は細胞が挙げられる。
【０１６４】
本明細書で用いる「細胞」は、その通常の生物学的意味で用いられており、例えば特にヒト等の多細胞生物全体を意味するものではない。細胞は、例えばトリ、植物、並びにヒト、ウシ、ヒツジ、類人猿、サル、ブタ、イヌ、及びネコ等の哺乳類等の生物中に存在することができる。細胞は原核細胞（例：バクテリア細胞）、又は真核細胞（例：哺乳類、若しくは植物細胞）であってよい。細胞は、体細胞又は生殖系細胞であってよく、全能性細胞又は多能性細胞であってよく、分裂細胞又は非分裂細胞であってよい。細胞は、配偶子若しくは胚、幹細胞、又は完全に分化した細胞から誘導することもでき、又はこれらを具えることもできる。
【０１６５】
「ベクタ」とは、所望の核酸を送達するために用いる核酸及び／又はウィルスに基づいた技術を意味する。
【０１６６】
「具える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、「具える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」に続くあらゆる言葉を含むが、それに限定されないという意味である。従って、「具える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語を用いた場合は、列挙された要素が必要又は必須であることを示すが、他の要素は任意であり存在しても存在しなくてもよいということを示す。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」とは、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」というフレーズに続く言葉を含み、それに限定されるという意味である。従って、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」というフレーズは、列挙された要素が必要又は必須であり、他の要素は存在できないということを示す。「実質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」とは、このフレーズの後に列挙されたいかなる要素も含み、他の要素は列挙された要素に対する開示で特定された活性若しくは作用を妨げない又はこれらに寄与しないものに限られるという意味である。従って、「実質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」というフレーズは、列挙された要素が必要又は必須であり、しかし他の要素は任意で、列挙された要素の活性若しくは作用に影響するかしないかに依存して存在してもしなくてもよいということを示す。
【０１６７】
「ＲＮＡ」とは、少なくとも一つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。「リボヌクレオチド」とは、ベータ−Ｄ−リボフラノース部位の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドである。「ＲＮＡ」という用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的に精製されたＲＮＡなどの単離されたＲＮＡ、実質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組み換えによって作製したＲＮＡ、並びに１若しくは２個以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換、及び／又は変性によって天然のＲＮＡとは異なる変性されたＲＮＡを含む。このような変性は、例えばＲＮＡの１又は２個以上のヌクレオチドのようなｓｉＮＡの末端部又は内部への非ヌクレオチド材料の付加を含む場合がある。本発明のＲＮＡ分子中のヌクレオチドには、天然ではないヌクレオチド又は化学合成されたヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチド等の非標準的なヌクレオチドが含まれる場合もある。このような変性されたＲＮＡは類似体又は天然ＲＮＡの類似体と呼ばれる場合がある。
【０１６８】
「高度保存配列領域」とは、標的遺伝子の１又２種類以上の領域のヌクレオチド配列が、一つの世代から別の世代へ、又は一つの生体系から別の生体系へかけて実質的に変化しないことを意味する。
【０１６９】
「センス領域」とは、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域に対して相補性を有するそのｓｉＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。さらに、ｓｉＮＡ分子のセンス領域は、標的核酸配列と相同性を有する核酸配列を具えることができる。
【０１７０】
「アンチセンス領域」とは、標的核酸配列に対して相補性を有するｓｉＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。さらに、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は、任意にそのｓｉＮＡ分子のセンス領域に対して相補性を有する核酸配列を具えることができる。
【０１７１】
「標的核酸」とは、発現又は活性が調節されるいずれの核酸配列も意味する。標的核酸はＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。
【０１７２】
「相補性」とは、核酸が別の核酸配列と、従来から知られるワトソン−クリック型によるか又はその他の従来のものとは異なる種類の型により水素結合を形成できることを意味する。本発明の核酸分子に関連しては、核酸分子のその相補性配列との結合自由エネルギーは十分に大きく、例えばＲＮＡｉ活性等の核酸の関連する機能を発することができる。核酸分子の結合自由エネルギーの定量は、本技術分野でよく知られている（例えば、Ｔｕｒｎｅｒら，ＣＳＨ  Ｓｙｍｐ．  Ｑｕａｎｔ．  Ｂｉｏｌ．  ＬＩＩ，  １９８７，  ｐｐ．１２３−１３３；  Ｆｒｉｅｒら，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３：  ９３７３−９３７７，  １９８６；  Ｔｕｒｎｅｒら，Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １０９：  ３７８３−３７８５，  １９８７参照）。相補性のパーセントは、第二の核酸配列と水素結合（例：ワトソン−クリック塩基対）を形成することができる、核酸分子の連続する残基のパーセントを示す（例：第一のオリゴヌクレオチドにある全１０ヌクレオチドのうち、１０ヌクレオチドを有する第二の核酸配列と５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチドが塩基対を形成する場合が、それぞれ５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び１００％の相補性を表す）。「完全に相補的」とは、核酸配列の連続するすべての残基が、第二の核酸配列の同数の連続する残基と水素結合を形成することを意味する。
【０１７３】
本明細書で用いる「ユニバーサル塩基」という用語は、天然のＤＮＡ／ＲＮＡ塩基の各々とほとんど区別なく塩基対を形成するヌクレオチド塩基類似体を意味する。ユニバーサル塩基の限定されない例としては、本技術分野で公知のように、Ｃ−フェニル、Ｃ−ナフチル、及び他の芳香族誘導体、イノシン、アゾール、カルボキシアミド、並びに３−ニトロピロール、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、及び６−ニトロインドール等のニトロアゾール誘導体が挙げられる（例えばＬｏａｋｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２９：  ２４３７−２４４７，  ２００１参照）。
【０１７４】
本明細書で用いる「非環式ヌクレオチド」という用語は、例えばリボースの炭素（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、若しくはＣ５）のいずれかが独立に又は組み合わせてヌクレオチドから欠失する場合等の非環式リボース糖を有するヌクレオチドを意味する。
【０１７５】
本明細書で用いる「生分解性」という用語は、例えば酵素分解又は化学分解等の生体系内での分解を意味する。
【０１７６】
本明細書で用いる「生物学的に活性な分子」という用語は、系内での生物学的応答を誘起若しくは調節することができる化合物又は分子を意味する。単独の又は本発明で意図する他の分子と組み合わせる生物学的に活性なｓｉＮＡ分子の限定されない例としては、抗体、コレステロール、ホルモン、抗ウィルス剤、ペプチド、タンパク質、化学療法剤、低分子、ビタミン、補助因子、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、酵素核酸、アンチセンス核酸、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、２，５−Ａキメラ、ｓｉＮＡ、ｄｓＲＮＡ、アロザイム、アプタマ、デコイ、及びこれらの類似体等の治療活性分子が挙げられる。本発明の生物学的に活性な分子は、例えば脂質並びにポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、及びその他のポリエーテル等のポリマ等の他の生物学的に活性な分子の薬物動態及び／又は薬効を調節することが可能な分子も含む。
【０１７７】
本明細書で用いる「リン脂質」という用語は、少なくとも一つのリン含有基を含む疎水性分子を意味する。例えば、リン脂質は、リン含有基、及び任意にＯＨ、ＣＯＯＨ、オキソ、アミン、又は置換若しくは非置換アリール基で置換されていてもよい飽和又は不飽和のアルキル基を含むことができる。
【０１７８】
「キャップ構造」とは、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端に取り込まれた化学修飾を意味する（例えば、本明細書に組み入れられるＡｄａｍｉｃら、米国特許公報第５９９８２０３号を参照）。このような末端修飾は、核酸分子をエキソヌクレアーゼ分解から保護し、細胞内での送達及び／又は局在化を促進することができる。キャップは５’末端（５’キャップ）に存在してもよく、３’末端（３’キャップ）に存在してもよく、又は両末端に存在してもよい。限定されない例において、５’キャップはグリセリル、逆位デオキシ脱塩基残基（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄｅｏｘｙ  ａｂａｓｉｃ  ｒｅｓｉｄｕｅ）（部位）、４’，５’−メチレンヌクレオチド、１−（β−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、１，５−無水ヘキシトールヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチド、α−ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、ホスホロジチオエート結合、スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド、非環式３’，４’−セコヌクレオチド、非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環式３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’−３’−逆位ヌクレオチド部位（３’−３’−ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｏｉｅｔｙ）、３’−３’−逆位脱塩基部位（３’−３’−ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ａｂａｓｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）、３’−２’−逆位ヌクレオチド部位（３’−２’−ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｏｉｅｔｙ）、３’−２’− 逆位脱塩基部位（３’−２’−ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ａｂａｓｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）、１，４−ブタンジオールリン酸、３’−ホスホルアミデート、ヘキシルリン酸、アミノヘキシルリン酸、３’−リン酸、３’−ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、又は架橋若しくは非架橋のメチルホスホネート部位を含むがこれらに限定されない。
【０１７９】
３’キャップの限定されない例としては、グリセリル、逆位デオキシ脱塩基残基（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄｅｏｘｙ  ａｂａｓｉｃ  ｒｅｓｉｄｕｅ）（部位）、４’，５’−メチレンヌクレオチド、１−（β−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、５’−アミノ−アルキルリン酸、１，３−ジアミノ−２−プロピルリン酸、３−アミノプロピルリン酸、６−アミノヘキシルリン酸、１，２−アミノドデシルリン酸、ヒドロキシプロピルリン酸、１，５−無水ヘキシトールヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチド、α−ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、ホスホロジチオエート、スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド、非環式３’，４’−セコヌクレオチド、３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド、３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−反転ヌクレオチド部位（５’−５’−ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｏｉｅｔｙ）、５’−５’−逆位脱塩基部位（５’−５’−ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ａｂａｓｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）、５’−ホスホルアミデート、５’−ホスホロチオエート、１，４−ブタンジオールリン酸、５’−アミノ、架橋及び／若しくは非架橋の５’−ホスホルアミデート、ホスホロチオエート及び／又はホスホロジチオエート、架橋若しくは非架橋のメチルホスホネート、並びに５’−メルカプト部位を含むがこれらに限定されない（より詳細には、参照することで本明細書に組み入れられるＢｅａｕｃａｇｅ及びＬｙｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９：  １９２５，１９９３、を参照）。
【０１８０】
「非ヌクレオチド」という用語は、糖及び／又はリン酸置換基を含む１又は２個以上のヌクレオチド単位の代わりに核酸鎖に取り込まれることができ、残った塩基に酵素活性を示させる基又は化合物を意味する。この基又は化合物は、アデノシン、グアニン、シトシン、ウラシル、又はチミン等の一般的に認知されたヌクレオチド塩基を含まず、従って１’位に塩基が存在しないという点において脱塩基型である。
【０１８１】
本明細書で用いる「ヌクレオチド」とは、本技術分野で認知されているように、本技術分野で公知の天然塩基（標準的）及び修飾塩基を含むものである。そのような塩基は、一般的にヌクレオチドの糖部位の１’位に位置している。ヌクレオチドは一般的に、塩基、糖及びリン酸基を含む。ヌクレオチドは、糖、リン酸及び／又は塩基部位において修飾されていなくても修飾されていてもよい（互換的に，ヌクレオチド類似体、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、非標準的ヌクレオチド等とも称される；  例えば、Ｕｓｍａｎ及びＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，上掲；  Ｅｃｋｓｔｅｉｎら、国際公開公報ＷＯ９２／０７０６５；  Ｕｓｍａｎら、国際公開公報ＷＯ９３／１５１８７；  Ｕｈｌｍａｎ及びＰｅｙｍａｎ，上掲、を参照；  これらはすべて参照することで本明細書に組み入れられる）。本技術分野で知られる修飾核酸塩基のいくつかの例が、Ｌｉｍｂａｃｈら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．  ２２：  ２１８３，１９９４、にまとめられている。核酸分子中に導入することができる塩基修飾の限定されないいくつかの例としては、イノシン、プリン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、シュードウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（例：５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例：リボチミジン）、５−ハロウリジン（例：５−ブロモウリジン）、又は６−アザピリミジン若しくは６−アルキルピリミジン（例：６−メチルウリジン）、プロピン等が挙げられる（Ｂｕｒｇｉｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：  １４０９０，１９９６；  Ｕｈｌｍａｎ及びＰｅｙｍａｎ，上掲）。この観点において、「修飾塩基」とは、１’位におけるアデニン、グアニン、シトシン及びウラシル以外のヌクレオチド塩基又はそれらに相当するものを意味する。
【０１８２】
「標的部位」とは、アンチセンス領域内に標的配列と相補的な配列を含むｓｉＮＡ構築物によって媒介される開裂の「標的」となる標的ＲＮＡ内の配列を意味する。
【０１８３】
「検出可能な開裂レベル」とは、標的ＲＮＡのランダム分解によって生成するＲＮＡのバックグラウンドを超える、開裂産物を識別するのに十分な程度の標的ＲＮＡの開裂（及び開裂産物ＲＮＡの形成）を意味する。ほとんどの検出方法において、標的ＲＮＡの１乃至５％の開裂産物が生成すれば、バックグランドを超えて検出するのに十分である。
【０１８４】
「生体系」とは、純粋な又は非純粋な形での、ヒト、動物、植物、昆虫、バクテリア、ウィルス、又はその他の供給源を含むがこれらに限定されない生物的供給源に由来の物質を意味し、この場合生体系はＲＮＡｉ活性に必要な成分を含有する。「生体系」という用語は、例えば細胞、組織、若しくは生命体、又はこれらの抽出物を含む。生体系という用語は、インビトロ環境下で用いることができる再構築されたＲＮＡｉ系も含む。
【０１８５】
本明細書で用いる「生分解性リンカ」とは、例えば生物的に活性な分子と本発明のｓｉＮＡ分子とを、又は本発明のｓｉＮＡ分子のセンス鎖とアンチセンス鎖とを連結させるような、一つの分子をもう一つの分子と連結させるための生分解性リンカとして設計された核酸又は非核酸リンカ分子を意味する。生分解性リンカは、特定の組織又は細胞種への送達等の特定の目的のためにその安定性を調節することができるように設計されている。核酸に基づいた生分解性リンカ分子の安定性は、例えばリボヌクレオチドと、デオキシリボヌクレオチドと、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−アミノ、２’−Ｏ−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−Ｏ−アリル、及びその他の２’位修飾ヌクレオチド又は塩基修飾ヌクレオチド等の化学修飾ヌクレオチドとの組み合わせ等の様々な化学的作用を用いて調節することができる。生分解性核酸リンカ分子は、例えば長さが約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０ヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドのような二量体、三量体、四量体、若しくはさらに長い核酸分子であってよく、又は例えばホスホロアミデート若しくはホスホジエステル結合等のリン含有結合を有する一つのヌクレオチドを含んでもよい。生分解性核酸リンカ分子は、核酸のバックボーン、核酸の糖、又は核酸の塩基の修飾を具えていてもよい。
【０１８６】
「脱塩基」とは、糖部位の塩基が欠失した、又は糖部位の１’位に塩基の代わりに他の化学基を有することを意味し、例えばＡｄａｍｉｃら、米国特許公報第５９９８２０３号を参照のこと。
【０１８７】
「非修飾ヌクレオシド」とは、ベータ−Ｄ−リボフラノースの１’位の炭素にアデニン、シトシン、グアニン、チミン、又はウラシルの塩基のうちの一つが結合していることを意味する。
【０１８８】
「修飾ヌクレオシド」とは、非修飾ヌクレオチドの塩基、糖、及び／又はリン酸の化学構造中に修飾部を有するヌクレオチド塩基を意味する。修飾ヌクレオチドの限定されない例は、本明細書に記載の構造式Ｉ乃至ＶＩＩ及び／又はその他の修飾によって示される。
【０１８９】
本発明に関して述べる２’位修飾ヌクレオチドに関連して、「アミノ」とは、２’−ＮＨ２又は２’−Ｏ−−ＮＨ２を意味し、修飾されていてもされていなくてもよい。このような修飾された基は、例えばＥｃｋｓｔｅｉｎら、米国特許公報第５６７２６９５号及びＭａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃら、米国特許公報第６２４８８７８号に記載されている。
【０１９０】
ｓｉＮＡ分子は、カチオン性脂質と複合体化したり、リポソーム内に封入したり、又は標的細胞若しくは組織へ送達したりすることができる。核酸又は核酸複合体は、注射、輸液ポンプ、若しくはステントにより、生体高分子に取り込まれた形若しくは取り込まれない形で、局所的に投与することができる。別の様態では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が、本発明のｓｉＮＡ化合物、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド、又はその両方と共有結合することができる。結合したＰＥＧはいかなる分子量でもよく、好ましくは約２０００乃至約５０，０００ダルトン（Ｄａ）である。
【０１９１】
センス領域は、ポリヌクレオチドリンカ又は非ヌクレオチドリンカ等のリンカ分子によってアンチセンス領域と結合することができる。
【０１９２】
「逆位リピート（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ）」とは、リピートが転写された時に二本鎖ｓｉＲＮＡを形成することができるように位置するセンス要素及びアンチセンス要素を含む核酸配列を意味する。逆位リピートは、任意にリピートの二つの要素間に、リンカ又は自己開裂リボザイム等の異種配列を有していてもよい。逆位リピートの要素は二本鎖ＲＮＡを形成するのに十分な長さを有する。通常、逆位リピートの各要素の長さは、約１５乃至約１００ヌクレオチドであり、好ましくは約２０乃至３０塩基のヌクレオチド長であり、好ましくは約２０乃至２５ヌクレオチドであり、例えば２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチドである。
【０１９３】
「核酸」とは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、及び一本鎖又は二本鎖の形のこれらのポリマを意味する。この用語は、合成、天然、及び非天然であって、基準となる核酸と同様の結合性質を有し、基準となる核酸と同様な代謝作用を受ける、既知のヌクレオチド類似体又は修飾バックボーン残基若しくは結合を含む核酸を包含する。このような類似体の例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１９４】
「高分子二本鎖ＲＮＡ」とは、約４０塩基対（ｂｐ）を超えるサイズを有する二本鎖ＲＮＡを意味し、例えば１００ｂｐ超、又はより詳細には３００ｂｐ超のサイズである。高分子ｄｓＲＮＡの配列は、ｍＲＮＡのセグメントに相当するものであっても、又はｍＲＮＡ全体に相当するものであってもよい。本発明では、高分子ｄｓＲＮＡの最大サイズに制限はない。二本鎖ＲＮＡは、リン酸糖バックボーン又はヌクレオチドが修飾されていてもよい修飾塩基を含んでも良い。そのような修飾は、ヘテロ原子である窒素若しくは硫黄による修飾、又は本技術分野で公知のその他の修飾であってよい。
【０１９５】
二本鎖構造は、ヘアピンＲＮＡ若しくはマイクロＲＮＡ等で発生するような自己相補的ＲＮＡ鎖によって、又は二つの別々のＲＮＡ鎖のアニーリングによって形成することができる。
【０１９６】
「重複（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）」とは、二つのＲＮＡ断片が、一つの鎖上で複数のヌクレオチド分重複する配列を有する状態を意味し、例えば複数のヌクレオチド（ｎｔ）の数がわずか２乃至５ヌクレオチド、又は５乃至１０ヌクレオチド若しくは１１ヌクレオチド以上である等の場合がある。
【０１９７】
「１又は２種類以上のｄｓＲＮＡ」とは、配列に基づいて互いに異なるｄｓＲＮＡを意味する。
【０１９８】
「標的遺伝子又はｍＲＮＡ」とは、対象である遺伝子又はｍＲＮＡを意味する。実際には、過去に遺伝学又はシークエンシングによって同定されたいずれの遺伝子も標的となり得る。標的遺伝子又はｍＲＮＡには、発生遺伝子、制御遺伝子、並びに代謝遺伝子若しくは構造遺伝子、又は酵素をコードする遺伝子を含むことができる。標的遺伝子は、表現型の研究中である細胞内、又は生命体内で、表現型特性に直接的に若しくは間接的に影響を与える方法で発現される場合がある。標的遺伝子は内在性であっても外来性であってもよい。そのような細胞は、生殖細胞を含む成体若しくは胎仔動物の体内細胞又は植物の細胞、又は不死化セルライン若しくは初代細胞培養のような単離された細胞を含む。
【０１９９】
本明細書及び添付の請求項において、単数形の「１の（ａ）」「１の（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈から明確に示される場合以外は、複数の事柄を含む。
【０２００】
本明細書で示された例は、単に例示目的のためのものであって、請求項に記載の本発明の範囲を制限することを意図したものではない。本明細書では具体的な用語及び数値が用いられてはいるが、そのような用語及び数値は典型的なものであって、本発明の範囲を制限するものではないことが理解されるであろう。
【０２０１】
本開示で引用するすべての刊行物及び参考文献の全文献は、あらゆる点で参照することで本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０２０２】
上記の開示によって本発明を全体的に説明し、さらに以下の実施例によって本発明を例証する。これらの実施例は、単に例示目的のために記載されており、本発明の範囲を制限することを意図したものではない。ここで具体的な用語及び数値が用いられてはいるが、同様にそのような用語及び数値は典型的なものであって、本発明の範囲を制限するものではないことが理解されるであろう。
【０２０３】
実施例１
使用したプロトコル及び方法
ｓｉＲＮＡ／ポリペプチド抱合体の合成
ポリペプチド及びＲＮＡは両方とも、標準的固相合成法によって調製される。ポリペプチド及びＲＮＡ分子は、特定の部位で官能化してお互いが共有結合できるようにしなければならない。ポリペプチドについては、Ｎ−末端が３−マレイミドプロピオン酸で官能化される。しかし、ブロモ部位又はヨードアセチル部位等の他の官能基も機能することが認知されている。ＲＮＡ分子については、センス鎖の５’末端又はアンチセンス鎖の５’末端が１−Ｏ−ジメトキシトリチル−へキシル−ジスルフィドリンカで官能化される。
【０２０４】
ＲＮＡオリゴを、２ｍＬのバッファＡ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、５０％ホルムアミド）を添加した水０．５ｍＬに溶解した。続いてポリペプチドＰＮ２７７を添加して析出物を形成させ、さらに２ＭのＴＥＡＡバッファ１ｍＬを加えて析出物を溶解した。反応が完了した時点で溶媒を減圧留去し、得られた固体をバッファＡ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、５０％ホルムアミド）中に溶解した。その物質をＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｒｅｒｓｏｕｒｃｅ  Ｑカラムへローディングし、５カラム分の体積のバッファＡを用いて６ｍＬ／分で洗浄した。分離は、１５カラム分の体積のバッファＢ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ）を用い、６ｍＬ／分で１５から６０％の直線勾配を流すことで完了した。精製した抱合体を、ｓｌｉｄａｌｙｚｅｒ透析カセット（３．５Ｋ  ＭＷＣＯ）を用いてＰＢＳに対して脱塩した。抱合体の量は、λ＝２６０ｎｍでのモル吸光度係数の算出値に基づいて分光測定により定量した。ＲＰ−ＨＰＣＬによるこの抱合体の純度の分析を以下に示す。
【０２０５】
ポリペプチドと抱合したアンチセンスＲＮＡ鎖と、それと相補的なセンスＲＮＡ鎖とを、５０ｍＭ酢酸カリウム、１ｍＭ酢酸マグネシウム、及び１５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）でアニーリングさせ、９０℃で２分間加熱し、続いて３７℃で１時間インキュベートした。二本鎖ＲＮＡ抱合体の形成を、非変性（１５％）ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び臭化エチジウム染色により確認した。
【０２０６】
本発明のｓｉＲＮＡ／ポリペプチド抱合体の例を実施例３に示す。
【０２０７】
抱合体調製例１：以下の構造を有するペプチドＰＮ２７７（Ｈ２Ｂ１３−４８）（配列番号３７）とアンチセンス鎖ＣＮ９５０ａｓｅｎ（Ｎ１６３ａｓｅｎ）（配列番号６０）の５’末端との抱合体
2009514877.tif 000020
オリゴＣＮ９５０ａｓｅｎを、２ｍＬのバッファＡ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、５０％ホルムアミド）を添加した水０．５ｍＬに溶解した。続いてペプチド（ＰＮ０２７７）を添加して析出物を形成させ、さらに２ＭのＴＥＡＡバッファ１ｍＬを加えて析出物を溶解した。反応が完了した時点で溶媒を減圧留去し、得られた固体をバッファＡ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、５０％ホルムアミド）中に溶解した。その物質をＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑカラムへローディングし、５カラム分の体積のバッファＡを用いて６ｍＬ／分で洗浄した。分離は、１５カラム分の体積のバッファＢ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ）を用い、６ｍＬ／分で１５から６０％の直線勾配を流すことで完了した。精製した抱合体を、ｓｌｉｄａｌｙｚｅｒ透析カセット（３．５Ｋ  ＭＷＣＯ）を用いてＰＢＳに対して脱塩した。抱合体の量は、λ＝２６０ｎｍでのモル吸光度係数の算出値に基づいて分光測定により定量した。抱合体の純度はＲＰ−ＨＰＣＬによって確認した。ペプチド抱合体のアンチセンス鎖と、相補的なアンチセンス鎖とを、５０ｍＭ酢酸カリウム、１ｍＭ酢酸マグネシウム、及び１５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中でアニーリングさせ、９０℃で２分間加熱し、続いて３７℃で１時間インキュベートした。二本鎖ＲＮＡ抱合体の形成を、非変性（１５％）ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び臭化エチジウム染色により確認した。
【０２０８】
抱合体調製例２：上述の抱合体調製例１の方法及び手順を用いて以下の抱合体を合成した。
【０２０９】
以下の構造を有するペプチドＰＮ２７７（配列番号３７）とオリゴＣＮ９５２ｓｅｎ（Ｎ１６３ｓｅｎ）（配列番号５９）との抱合体
2009514877.tif 000021
【０２１０】
以下の構造を有するペプチドＰＮ２７７とオリゴＣＮ７４０ｓｅｎ（配列番号６３）との、ダイザの基質である２７−ｍｅｒの抱合体
2009514877.tif 000022
【０２１１】
以下の構造を有するペプチドＰＮ２７７とオリゴＣＮ７４１ａｓｅｎ（配列番号６４）との、ダイザの基質である２９−ｍｅｒの抱合体
2009514877.tif 000023
【０２１２】
細胞及び細胞培養
マウス尾線維芽細胞はＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス又はｔｇ１９７ｈＴＮＦ−αトランスジェニックマウスの尾から得た。尾を切り離し、剃刀の刃で切って小片とした。この小片をＰＢＳで３回洗浄した後、０．５ｍｇ/ｍｌのコラゲナーゼ、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、及び１００μｇ/ｍｌのストレプトマイシンと共に３７℃で振とう器中でインキュベートして組織を破壊した。次に尾の小片を補助剤（上記の通り）含有ＤＭＥＭ培地中で培養した。９Ｌ／ｌａｃＺ細胞は恒常的にＬａｃＺを発現するラット膠肉腫維芽細胞であり、ＡＴＣＣ（＃ＣＲＬ−２２００）より入手してこれも補助剤（上記の通り）含有ＤＭＥＭ培地中で培養した。
【０２１３】
単離したヒト単球は、４ｍＭのＬ−グルタミン、非必須アミノ酸、及び１０％ウシ胎児血清含有イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）中で保持した。マウス尾線維芽細胞（ＭＴＦ）は、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、及び２０％ウシ胎児血清の補助剤含有ダルベッコ改変必須培地（ＤＭＥＭ）中で保持した。細胞はすべて、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、及び０．２５ｍｇ／ｍｌのＦｕｎｇｉｚｏｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州、カールズバッド）を含む抗生物質混合物を補充し、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。
【０２１４】
ヒト単球の単離および精製
健康な提供者からのヒトの新鮮血サンプルをＧｏｌｄｅｎ  Ｗｅｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社（カリフォルニア州、テメキュラ）より購入した。単球の単離のために、血液サンプルは入手後直ちにＰＢＳにより１：１の比率で希釈した。まず全血から末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、ニュージャージー州、ピスカタウェイ）勾配法により単離した。さらにＭｉｌｔｅｎｙｉＣＤ１４ポジティブ選別キット（ＭＩＬＴＥＮＹＩ  ＢＩＯＴＥＣ  ＧｍｂＨ社、ドイツ）を用い、製造元の説明書に従って単球をＰＢＭＣから分離した。単球試料の純度は、細胞を抗ＣＤ１４抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カリフォルニア州、サンノゼ）で染色後、フローサイトメトリで評価したところ９５％超であった。精製したヒト単球は導入及びノックダウンアッセイの前に、完全培地（上述）中で一晩保持した。
【０２１５】
ヒト単球の活性化
０．１乃至１．０ｎｇ／ｍｌのリポ多糖、ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州、セントルイス）を細胞培養液に添加して腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）の生成を刺激することにより、ヒト単球の活性化を行った。細胞はＬＰＳと共に３時間インキュベートした後に回収し、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅアッセイ（Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ社、カリフォルニア州、フリーモント）を用いて製造元の説明書に従ってｍＲＮＡレベルを測定した。導入後のＴＮＦ−αレベルの変化は、ＥＬＩＳＡ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カリフォルニア州、サンノゼ）を用いて製造元のプロトコルに従って測定した。
【０２１６】
ｍＲＮＡ（ｂＤＮＡ）及びタンパク質（ＥＬＩＳＡ）のためのヒトＴＮＦ−αノックダウンアッセイ
ＴＮＦ−αノックダウン実験のために、単球を、ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国、カールズバッド）を用いた９６ウェルプレート中へ、１００Ｋ細胞／１００μｌ／ウェルで播種した。ペプチドとｓｉＲＮＡをＯｐｔｉＭＥＭ中で５分間複合体化させ、次にウシ胎児血清（ＦＢＳ）を複合体に添加してＦＢＳ最終濃度を３％とした。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州、カールズバッド）による細胞のトランスフェクションについては、製造元のプロトコルに従った。トランスフェクションはすべて、細胞を３７℃、５％ＣＯ２下で３時間インキュベートし、続いてトランスフェクション試薬を除去し、完全培地を補充して一晩培養することで行った。ｂＤＮＡアッセイ（Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ  ａｓｓａｙ、Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ社、カリフォルニア州、フリーモント）は、製造元の説明書に従って行った。ＥＬＩＳＡアッセイについては、細胞培地から採取したサンプルをそのまま使用した。トランスジェニックマウスを用いた実験の分析に関しては、血漿サンプルを眼窩採血で採取した全血から分離した。ｈＴＮＦ−αの血漿中レベルを、ＥＬＩＳＡにより、１：２の希釈で製造元の説明書（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネソタ州、ミネアポリス）に従って定量した。
【０２１７】
フローサイトメトリ
フローサイトメトリ分析は、Ｂｅｃｋｍａｎ社のＣｏｕｌｔｅｒ  ＦＣ５００セルアナライザー（カリフォルニア州、フラートン）を用いて行った。装置は、用いた蛍光プローブ（ｓｉＲＮＡにはＦＡＭ又はＣｙ５、ＣＤ１４にはＦＩＴＣ又はＰＥ）に合わせて調節した。細胞生存率及び細胞毒性の指標として、ヨウ化プロピジウム（Ｆｌｕｋａ社、ミズーリ州、セントルイス）及びアネキシンＶ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カリフォルニア州、サンノゼ）を用いた。
【０２１８】
ダイザ媒介ｓｉＲＮＡ分解アッセイ
ｓｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ／ポリペプチド抱合体をダイザエンドヌクレアーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、カタログ番号２４０１００）と共にインキュベートし、これらが分解されやすいかどうかを調べた。製造元のプロトコルに従った。簡潔に述べると、分解反応は全体積１０μＬで行い、３７℃で一晩インキュベートした。一晩のインキュベーション後、分解混合物のサンプル２μＬを２×ローディング色素（ｌｏａｄｉｎｇ  ｄｙｅ）と混合し、尿素含有１５％ＴＢＥ及び１５％ＴＢＥによる非変性ポリアクリルアミドゲルでのゲル電気泳動で分析した。
【０２１９】
ＬＣ−ＭＳによるＲＮＡのダイザ分解のモニタリング
ＬＣ−ＭＳは、２．５μｍ、２．１×５０ｍｍのＸＴｅｒｒａ  Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．社）を用いて６５℃で行った。移動相は、１００ｍＭヘキサフルオオロイソプロパノール及び７ｍＭトリエチルアミンであり、溶出は１００％メタノールで行った。勾配は、４０分間で５から１６％とした。溶出液はＰＤＡ中へ分割し、Ｗａｔｅｒｓ社のシングル四重極型質量分析器Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＺＱ  ＥＳＩを負イオンモードで作動させた。キャピラリー電圧は３．０ｋＶ、コーン電圧は４５Ｖであった。脱溶媒は６００Ｌ／ｈの窒素中、３００℃で行った。イオン源は９０℃に維持した。測定用のスキャン速度は１秒あたり１０００乃至２０００ｍ／ｚであった。
【０２２０】
実施例２
ｈＴＮＦ−αノックダウン活性のためのスクリーニングされたダイザエンドヌクレアーゼ基質ｓｉＲＮＡ
本実施例では、ｈＴＮＦ−α遺伝子発現レベルを効果的に低下させるためにスクリーニングされた本発明の典型的ｓｉＲＮＡを例示する。ｈＴＮＦ−α遺伝子は、ヒトやその他の哺乳類の対象中で過剰発現すると関節リウマチ（ＲＡ）の発症と進行を媒介することが示唆されているため、これを標的とすることは重要である。従って、ｈＴＮＦ−α遺伝子を標的にしてその発現を低下させることは、ＲＡの治療に役立てることができる。
【０２２１】
最近の研究結果により、２５乃至３０ヌクレオチドの長さのＲＮＡ二重鎖が、標的遺伝子の発現レベルの低下に関して、対応するより短いＲＮＡ二重鎖と比べて最大１００倍の効果を有することが示唆されている。このようにノックダウン活性が向上するのは、これらの長鎖ｓｉＲＮＡ二重鎖がダイザエンドヌクレアーゼ（ＲＮＡｓｅＩＩＩ）の基質であるという事実に起因する。以下の表３に、長さが２１乃至２７ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ二重鎖を示す。ＹＣ１２及びＮ１６１からＮ１６４は、ｈＴＮＦ−α遺伝子の配列特異的な転写後ジーンサイレンシングのためにスクリーニングしたものである。この最初のスクリーニングプロセスには、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州、カールズバッド）を用いて表３に挙げた個々のｓｉＲＮＡをＬＰＳで刺激したヒト単球中へトランスフェクトすることも含まれていた。
【０２２２】
【表３】
2009514877.tif 000024
【０２２３】
表３に挙げたＹＣ１２及びＮ１６１からＮ１６４の配列は、５’−３’のセンス鎖（上）及び３’−５’のアンチセンス鎖（下）である。
【０２２４】
ＹＣ１２及びＮ１６１からＮ１６４の各配列は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州、カールズバッド）を用いて、０．１６ｎＭ、０．８ｎＭ、４ｎＭ、及び２０ｎＭの各濃度でトランスフェクトした。各ｓｉＲＮＡのＴＮＦ−αノックダウン活性をパーセント表示で表４にまとめた。Ｑｎｅｇは、ランダムｓｉＲＮＡ配列であり、ネガティブコントロールとした。観察されたＱｎｅｇによるノックダウン活性を１００％（遺伝子発現レベル１００％）の基準とし、各ｓｉＲＮＡのノックダウン活性をこのネガティブコントロールに対する相対パーセントで表した。表４のデータは、Ｎ１６１、Ｎ１６２及びＮ１６４のｓｉＲＮＡが、ＱｎｅｇのｓｉＲＮＡネガティブコントロールと比較してＴＮＦ−α  ｍＲＮＡレベルに対して有意の影響を与えなかったことを示している。対照的に、Ｙ１２のｓｉＲＮＡは、ＴＮＦ−α  ｍＲＮＡレベルをネガティブコントロールＱｎｅｇの６６％まで低下させ、Ｎ１６３のｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡレベルをネガティブコントロールＱｎｅｇの５７％まで低下させた。
【０２２５】
表４のデータは、ダイザ基質ｓｉＲＮＡであるＮ１６３とＹＣ１２が、ヒト単球中のｈＴＮＦ−α  ｍＲＮＡレベルを効果的に低下させたことを示している。Ｎ１６３のｓｉＲＮＡを選択してさらなる特性分析を行った。
【０２２６】
【表４】
2009514877.tif 000025
【０２２７】
実施例３
ｓｉＲＮＡ／ポリペプチド抱合体によるヒト単球中ｈＴＮＦ−α  ｍＲＮＡレベルの効果的な低下
本例は、本発明の典型的なダイザ基質ｓｉＲＮＡが、本発明の典型的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと抱合した場合に、ｈＴＮＦ−α  ｍＲＮＡの発現レベルを効果的に低下させたことを示すものである。ｓｉＲＮＡ／ポリペプチド抱合体のノックダウン活性を以下の表５にまとめた。
【０２２８】
実施例２の表４に示したデータによると、Ｌｉｐｏｆｅｃａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州、カールズバッド）でトランスフェクトされた場合に、Ｎ１６３のｓｉＲＮＡがｈＴＮＦ−α  ｍＲＮＡレベルを効果的に低下させたことを示しており、従ってこれは、ＴＮＦ−αと関連する１若しくは２種類以上の炎症状態を治療及び／又は予防するのに優れた候補物質である。しかし、カチオン性脂質は細胞毒性を示す場合があり、従って疾患治療におけるインビボでの送達用途には適さない。従って、このカチオン性脂質媒介による送達の欠点を克服するため、本発明の典型的ｓｉＲＮＡであるＮ１６３を、送達媒体として用いた時に細胞毒性効果が最小限乃至ゼロであるポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと抱合させた。送達ポリペプチドをダイザ基質型（２７−ｍｅｒ）であるｓｉＲＮＡ配列と抱合させることにより、ＲＩＳＣへのローディングの前にｓｉＲＮＡからポリペプチドを除去することができ、従ってポリペプチドがＲＩＳＣ活性を阻害する可能性を低減できる。実際、これらの抱合体は、プロセッシングを受けると所望の標的遺伝子の効果的なノックダウンを媒介するｓｉＲＮＡ前駆体を効率的に細胞質内へ送達する。
【０２２９】
本発明の典型的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド（ＰＮ２７７）は、ヒトのヒストン２Ｂ（Ｈ２Ｂ）タンパク質のアミノ酸配列から誘導し、その一次構造は以下の通りである。
ＰＮ２７７
ＮＨ２−ＫＧＳＫＫＡＶＴＫＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ−アミド（配列番号３７）
【０２３０】
抱合体は、本発明の典型的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ２７７を、本発明の典型的ｓｉＲＮＡであるＮ１６３のセンス鎖の５’末端又はアンチセンス鎖の５’末端へ共有結合させることで作製した。ｓｉＲＮＡ／ポリペプチド抱合体の例は以下の通りである。
【０２３１】
ｓｉＲＮＡであるＮ１６３のアンチセンス鎖の５’末端へポリペプチドＰＮ２７７を抱合させた（ｄｓＣｏＰ２７７ｎｆＲ９５０；配列番号３７及び３５）。ｓｉＲＮＡであるＮ１６３のセンス鎖は図示していない。
2009514877.tif 000026
【０２３２】
ｓｉＲＮＡであるＮ１６３のセンス鎖の５’末端へポリペプチドＰＮ２７７を抱合させた（ｄｓＣｏＰ２７７ｎｆＲ９５２；配列番号３７及び３６）。ｓｉＲＮＡであるＮ１６３のアンチセンス鎖は図示していない。
2009514877.tif 000027
【０２３３】
本発明でネガティブコントロールとして用いるＱｎｅｇのｓｉＲＮＡのセンス鎖の５’末端へポリペプチドＰＮ２７７を抱合させたものは図示していない。
【０２３４】
この実施例では、Ｑｎｅｇ  ｓｉＲＮＡ／ポリペプチド抱合体を含む上述の各ｓｉＲＮＡ／ポリペプチド抱合体は、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、及び２００ｎＭの濃度で、ヒト単球と共にインキュベートした。各ｓｉＲＮＡ／ポリペプチド抱合体のＴＮＦ−αノックダウン活性をパーセント表示で表５にまとめた。観察されたＱｎｅｇによるノックダウン活性を１００％（遺伝子発現レベル１００％）の基準とし、各ｓｉＲＮＡのノックダウン活性をこのネガティブコントロールに対する相対パーセントで表した。
【０２３５】
表５のデータは、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと抱合したｓｉＲＮＡ二重鎖Ｎ１６３が、ｓｉＲＮＡ分子Ｎ１６３のセンス鎖の５’末端への共有結合又はアンチセンス鎖の５’末端への共有結合に関係なく、ｈＴＮＦ−α  ｍＲＮＡ発現レベルを効果的に低下させたことを示している。より具体的には、ｓｉＲＮＡ／ポリペプチド抱合体であるｄｓＣｏＰ２７７ｎｆＲ９５２は、ｈＴＮＦ−α  ｍＲＮＡレベルをＱｎｅｇ／ポリペプチド抱合体ネガティブコントロールのｍＲＮＡレベルの６２％まで低下させ、ｄｓＣｏＰ２７７ｎｆＲ９５０は、ｈＴＮＦ−α  ｍＲＮＡレベルをＱｎｅｇ／ポリペプチド抱合体ネガティブコントロールのｍＲＮＡレベルの３８％まで低下させた。
【０２３６】
【表５】
2009514877.tif 000028
【０２３７】
表５に示すデータは驚くべき予期せぬ発見であり、本発明の典型的なダイザ基質ｓｉＲＮＡが、本発明の典型的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと抱合されると、ｈＴＮＦ−α  ｍＲＮＡの発現レベルを効果的に低下させたことを示している。さらに、抱合体のノックダウン活性は、リポフェクタミンによって送達された同じｓｉＲＮＡが示したノックダウン活性を上回った。
【０２３８】
実施例４
ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと抱合したｓｉＲＮＡのダイザエンドヌクレアーゼによるプロセッシング
この実施例は、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと抱合したｓｉＲＮＡが、ダイザエンドヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅＩＩＩ）によって分解されることを示すものである。本例では、実施例３で示した３種類のｓｉＲＮＡ／ポリペプチド抱合体（Ｑｎｅｇ、ｄｓＣｏＰ２７７ｎｆＲ９５０、及びｄｓＣｏＰ２７７ｎｆＲ９５２）を、ダイザエンドヌクレアーゼの存在下又は非存在下でインキュベートした。さらに、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドのないｓｉＲＮＡ二重鎖Ｎ１６３も、ダイザエンドヌクレアーゼの存在下又は非存在下でインキュベートした。目的は、ｓｉＲＮＡがダイザによる分解の標的であるかどうか、及びポリペプチドによるｓｉＲＮＡ  ＲＩＳＣのローディング阻害を防ぐために不可欠である、共有結合しているｓｉＲＮＡ二重鎖からのポリペプチドの除去が行われるかどうか、を調べることであった。ＲＩＳＣ複合体を阻害すると、標的遺伝子の転写後ジーンサイレンシングを妨げることになる。
【０２３９】
ポリアクリルアミドゲルの電気泳動による比較を図１に示す。図１では、ダイザなしのインキュベーション及びダイザありのインキュベーションの両方で、Ｑｎｅｇ  ｓｉＲＮＡ／ポリペプチド抱合体が分子量の等しい「シャープな」バンドで移動しており、これは予想通り、Ｑｎｅｇ  ｓｉＲＮＡ／ポリペプチド抱合体がダイザエンドヌクレアーゼの存在下でも非存在下でも分解しなかったことを示している。本発明の典型的なＮ１６３  ｓｉＲＮＡ（ポリペプチドなし）は、ダイザエンドヌクレアーゼの非存在下ではポリアクリルアミドゲル上を「シャープな」バンドで移動した。しかし、ダイザでインキュベートした場合、ダイザでインキュベートしていないＮ１６３  ｓｉＲＮＡと比べてわずかに分子量の小さいバンドで示されるように、わずかに短いＮ１６３  ｓｉＲＮＡ二重鎖が観察された。アンチセンス鎖の５’末端でポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド共有結合した典型的なｓｉＲＮＡ  Ｎ１６３（ｄｓＣｏＰ２７７ｎｆＲ９５０）とセンス鎖の５’末端でポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド共有結合した典型的なｓｉＲＮＡ  Ｎ１６３（ｄｓＣｏＰ２７７ｎｆＲ９５２）との間で分解に違いが見られた。ダイザの非存在下では、予想通りこのｓｉＲＮＡ／ポリペプチド抱合体は両方とも分子量に相当するはっきりしたバンドとして移動しており、分解されなかったことを示している。しかし、ダイザエンドヌクレアーゼの存在下では、ｄｓＣｏＰ２７７ｎｆＲ９５２（センス鎖結合）は二本の異なる分子量のバンドを示した。一方のバンドの分子量は分解されていないｄｓＣｏＰ２７７ｎｆＲ９５２に相当し、二本目のバンドはダイザで分解されたＮ１６３  ｓｉＲＮＡ（ポリペプチドなし）の分子量に相当し、このことは共有結合したＮ１６３  ｓｉＲＮＡがポリペプチドから分離されたことを示している。高分子量側のバンド（すなわち非分解Ｎ１６３  ｓｉＲＮＡ／ポリペプチド）は低分子側のバンド（すなわち分解Ｎ１６３  ｓｉＲＮＡ／ポリペプチド）の約２倍の濃さであり、このことはｄｓＣｏＰ２７７ｎｆＲ９５２（センス鎖結合）の大部分が分解されなかったことを示している。対照的に、非分解ｄｓＣｏＰ２７７ｎｆＲ９５０のサイズに相当するバンドが比較的薄く、ダイザで分解されたＮ１６３  ｓｉＲＮＡ（ポリペプチドなし）のサイズに相当する分子量のバンドの方が濃いことから分かるように、ｄｓＣｏＰ２７７ｎｆＲ９５０（アンチセンス鎖結合）はダイザによってより分解されやすいことを示した。ｓｉＲＮＡ／ポリペプチドｄｓＣｏＰ２７７ｎｆＲ９５０（アンチセンス鎖結合）がｄｓＣｏＰ２７７ｎｆＲ９５２（センス鎖結合）と比較して相対的にダイザによる分解をより受けやすいということは、ｄｓＣｏＰ２７７ｎｆＲ９５０（アンチセンス鎖結合；実施例２参照）で見られたより高いノックダウン活性と強い相関を示している。ｓｉＲＮＡ／ポリペプチドがダイザによる分解を受けやすいということは、ポリペプチドによるＲＩＳＣ複合体の干渉の可能性が低減され、従って標的遺伝子のより高いサイレンシングを意味する。
【０２４０】
このようなデータは、本発明のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと抱合した典型的なｓｉＲＮＡがダイザによる分解を受けやすく、標的ジーンサイレンシングのために細胞へ治療用ｓｉＲＮＡ前駆体を効果的に送達する理想的な候補であることを示している。
【０２４１】
ｓｉＲＮＡ  Ｎ１６３はダイザエンドヌクレアーゼで分解されると２１−ｍｅｒのＲＮＡとなる。図２は、非抱合ｓｉＲＮＡ  Ｎ１６３二重鎖に対するＲＰ−ＨＰＬＣによるダイザエンドヌクレアーゼによるプロセッシングの動態解析を示す。図２（Ａ）はプロセッシングなしのＮ１６３二重鎖に対するＲＰ−ＨＰＬＣを示す。図２（Ｂ）から（Ｅ）は、ダイザエンドヌクレアーゼとそれぞれ（Ｂ）１時間、（Ｃ）２．５時間、（Ｄ）５時間、及び（Ｅ）７時間インキュベートしたＮ１６３二重鎖のＲＰ−ＨＰＬＣを示す。これらのデータを図３にグラフで示す。
【０２４２】
図２（Ｅ）に示すダイザエンドヌクレアーゼによりｓｉＲＮＡ  Ｎ１６３を７時間分解した後のＲＮＡの同一性を、図４に示すようにＥＳＩ−ＭＳ分析で確認した。図４は、Ｎ１６３のダイザによる開裂産物である２１−ｍｅｒのセンス鎖に相当する質量６６０６．６、及びＮ１６３のダイザによる開裂産物である２１−ｍｅｒのアンチセンス鎖に相当する質量６９６５．７にピークを示している。
【０２４３】
抱合したｓｉＲＮＡ  Ｎ１６３のダイザエンドヌクレアーゼによる分解後のＲＮＡの同一性を、図５に示すようにＥＳＩ−ＭＳ分析で確認した。図５は、ｓｉＲＮＡ  Ｎ１６３と抱合したポリペプチドＰＮ８５７を有する抱合体化ｓｉＲＮＡのダイザエンドヌクレアーゼによるプロセッシングのＥＳＩ−ＭＳを示す。本発明の典型的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ８５７は、ヒトのヒストン２Ｂ（Ｈ２Ｂ）タンパク質のアミノ酸配列から誘導し、その一次構造は以下の通りである。
ＰＮ８５７
Ｍａｌ−ＫＧＳＫＫＡＶＴＫＡＱＫＫＥＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ−アミド（配列番号５２）
【０２４４】
ポリペプチドＰＮ８５７は、Ｎ１６３  ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５’末端で抱合させた。
【０２４５】
図５（Ａ）には、ダイザエンドヌクレアーゼ非存在下における抱合体二重鎖のコントロールインキュベーションを示した。図５（Ａ）は、Ｎ１６３の２７-ntのアンチセンス鎖とポリペプチドＰＮ８５７との抱合体に相当する質量１３４３６．２、及びＮ１６３の２５-ntのセンス鎖に相当する質量７８３５．３にピークを示している。
【０２４６】
図５（Ｂ）には、ダイザエンドヌクレアーゼ存在下における抱合体二重鎖の８時間のインキュベーションを示した。図５（Ｂ）は、Ｎ１６３の２７-ntのアンチセンス鎖とポリペプチドＰＮ８５７との抱合体に相当する質量１３４３６．１、Ｎ１６３の２５-ntのセンス鎖に相当する質量７８３５．６、２７−ｍｅｒのＮ１６３抱合体のダイザによる開裂産物である２１−ｍｅｒのアンチセンス鎖に相当する質量６９６６．３、及び２５−ｍｅｒのＮ１６３のダイザによる開裂産物である２１−ｍｅｒのセンス鎖に相当する質量６６０７．６にピークを示している。
【０２４７】
実施例５
インターフェロン応答を誘起しないダイザ基質ｓｉＲＮＡ／ポリペプチド抱合体
本実施例は、本発明の典型的なｓｉＲＮＡ／ポリペプチド抱合体が、ヒト単球とインキュベートされた場合にインターフェロン反応を誘起しないことを示すものである。インターフェロン反応性は、ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞に起こり得る副作用である。従って、ｓｉＲＮＡ／ポリペプチドｄｓＣｏＰ２７７ｎｆＲ９５０（アンチセンス鎖結合）及びｄｓＣｏＰ２７７ｎｆＲ９５２（センス鎖結合）がインターフェロン反応を誘起するかどうかを評価するためにインビトロでの実験を行った。Ｑｎｅｇ  ｓｉＲＮＡ／ポリペプチド抱合体（ＣｏＰ８４０）をネガティブコントロールとし、インターフェロン−１（ＩＦＮ−１）をポジティブコントロールとした。各抱合体は１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、及び２００ｎＭの濃度で実験を行った。インターフェロン反応性のアッセイは分子マーカーＭＩＰ１αを用いて行った。予想通り、Ｑｎｅｇ  ｓｉＲＮＡ／ポリペプチド抱合体はＭＩＰ１αの発現を誘起せず、ポジティブコントロールであるＩＦＮ−１は大量のＭＩＰ１αの発現を誘起した。抱合体ｄｓＣｏＰ２７７ｎｆＲ９５０及びｄｓＣｏＰ２７７ｎｆＲ９５２は、Ｑｎｅｇ  ｓｉＲＮＡ／ポリペプチドのネガティブコントロールが誘起したＭＩＰ１αのレベルと同等であり、このことはこれらの抱合体が、有効なＴＮＦ−αのノックダウン活性を示す濃度（実施例３の表５参照）においてインターフェロン反応を誘起しないことを示している。
【０２４８】
実施例６
２４ウェルプレートを用いたベロ細胞トランスフェクション
この実施例は、ｓｉＲＮＡを標的細胞へ導入する方法を開示するものである。
【０２４９】
ベロ細胞は、１０％ＦＢＳ、２ｍＬのＬ−グルタミン、１０ｎＭのＨｅｐｅｓ、及び１００ユニット／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培地で培養する。トランスフェクションの一日前に、対数期にある培養ベロ細胞を２４ウェルプレート中に５０，０００細胞／ウェルで播種する。トランスフェクションの前に、すべてのｓｉＲＮＡ投与分に対してＬ２Ｋ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の適切なストック溶液を調製する。Ｌ２ＫをＯｐｔｉＭＥＭ（登録商標）細胞培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中へゆっくり混合し、希釈したｓｉＲＮＡに添加する。この混合物を室温で１５乃至３０分間インキュベートし、トランスフェクション複合体を形成させる。インキュベーションの最後に培養液の上清を吸引し、各ウェル中に１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培養液１５０μｌを添加する。次に、各トランスフェクション複合体１５０μｌを各ウェルへ三つの系に重複して添加する。プレートをゆっくり前後に振とうして混合させる。３７℃で３時間インキュベートした後、上清を除去し、１ｍｌの完全培地を各ウェルに添加する。Ｃｙ５−ｓｉＲＮＡの検出には、細胞を一晩インキュベートし、顕微鏡下で蛍光を測定する。翌日、ＨｏｅｃｈｓｔＤＮＡ染料を用い、１．５μｌのＨｏｅｃｈｓｔストックを各ウェルへ添加することによって細胞を染色して毒性の検出を行う。ウェルをゆっくり回転させ、３７℃で１５分間インキュベートする。細胞の測定は、Ｃｙ５及びＵＶフィルターを用いて、蛍光顕微鏡により直ちに行うことができる。トランスフェクション化合物の毒性については、位相差顕微鏡を用いて細胞の測定を行う。
【０２５０】
実施例７
血球凝集アッセイ（ＨＡアッセイ）
この例は、ウィルス感染細胞から産生されたウィルスの力価を算出するために用いることができる血球凝集アッセイを開示するものである。
【０２５１】
血球凝集アッセイ（ＨＡアッセイ）を用いて細胞培養液の上清中のウィルスの定量を行う。例えばインフルエンザウィルス等、ウィルスの科の中には、ヒト又は動物の赤血球（ＲＢＣ）を凝集（に付着）し、ＲＢＣ表面上のＮ−アセチルノイラミン酸と結合することができる表面又はエンベロープタンパク質を有するものがある。各ウィルスは多くの表面タンパク質を有しているため、一つのウィルスは一つ以上のＲＢＣに付着することができる。この結果、ウィルスと結合したＲＢＣがウィルスによって架橋されることになり、一種のＲＢＣ「格子」を形成する。この格子が形成されると、凝集されたＲＢＣをカウントすることができ、ウィルスの力価を算出することができる。ｓｉＲＮＡがトランスフェクトされた細胞のウィルス力価がｓｉＲＮＡがトランスフェクトされていない細胞の力価と比べて低下したということは、ｓｉＲＮＡ分子が標的ウィルス遺伝子又は標的遺伝子の発現を阻害したことを示す。
【０２５２】
ＰＢＳ中０．５％のニワトリ赤血球を、４枚のプレートに対して２０ｍｌずつ調製する。各サンプルの培養液の上清１００μｌを、９６ウェルＶ底プレートの第一列目にある各ウェルへ移す。サンプル間でチップは交換する。無菌状態が必要である場合は細胞培養室フード内で行う。ウィルス培養液の上清を移した第一列目を除くプレートの残りの部分は、マルチチャネルピペットを用いて各ウェルに５０μｌずつのＰＢＳを添加する。マルチチャネルピペットを用いて第一列目から培養液の上清５０μｌを吸い上げ、第二列目のＰＢＳ５０μｌと混合する。ピペットによる吸い上げと押し出しを３回繰り返す。マルチチャネルピペットを用いて第二列目の希釈サンプル５０μｌを吸い上げ、第三列目のＰＢＳ５０μｌと混合する。ピペットによる吸い上げと押し出しを３回繰り返す。これらの操作を最後の列まで繰り返す。希釈サンプル５０μｌを捨てる。０．５％のニワトリ赤血球５０μｌを各ウェルに添加する。プレートを氷上で１時間インキュベートする。ＨＡの結果を読み取り、ウィルス力価を算出する。
【０２５３】
実施例８
２４ウェルプレートによるベロ細胞トランスフェクション／インフェクション力価ノックダウンスクリーンニングアッセイ
本例は、本発明のギャップ又はニックを有する二重鎖ｓｉＲＮＡが１又は２種類以上のウィルス標的遺伝子の発現を下方制御することができるかどうかを調べるために用いることができるアッセイを開示するものである。
【０２５４】
本実施例では、哺乳類の細胞を、ウィルスＲＮＡと相同的なギャップ又はニックを有する二重鎖ｓｉＲＮＡでトランスフェクトする。トランスフェクションの後、トランスフェクトされた細胞は、トランスフェクトした本発明にかかるｓｉＲＮＡ分子と相同的な配列を有する１又は２個の遺伝子を含むウィルスに感染させる。
【０２５５】
ベロ細胞を、実施例６の方法に従ってギャップ又はニックを有する二重鎖ｓｉＲＮＡでトランスフェクトする。ｓｉＲＮＡ及びベロ細胞のインキュベーションの終了にかけて、感染ステップのためのウィルスの希釈を行う。ウィルスサンプルは、所望の感染効率（ＭＯＩ）が達成されるように希釈する。ウィルスサンプルをＰＢＳ／ＢＳＡ／ＰＳ中に希釈し、適量のウィルス溶液を各ウェルに添加する。３７℃で１時間インキュベートした後、一定量の感染媒体（０．３％ＢＳＡ、２ｍＬのＬ−グルタミン、１０ｎＭのＨｅｐｅｓ、１００ユニット／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、及びトリプシンを添加したＤＭＥＭ培養液）を各ウェルに添加する。３７℃で４８時間インキュベートする。インキュベーションの最後に上清を回収し、４℃で保存する。ｓｉＲＮＡによるウィルスＲＮＡ干渉は、実施例７に記載するＨＡアッセイを行って測定する。
【０２５６】
実施例９
ノックダウン活性でスクリーニングしたインフルエンザ特異的ダイザエンドヌクレアーゼ基質ｓｉＲＮＡ
この実施例は、感染したベロ細胞中のインフルエンザウィルス力価の効果的な低下に基づいてスクリーニングした、本明細書で示す典型的なインフルエンザ特異的ｓｉＲＮＡを例示するものである。非標的コントロールｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞のウィルス力価と比較して、インフルエンザ特異的ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞のウィルス力価が低下したということの意味は、それが、インフルエンザ特異的ｓｉＲＮＡ分子が標的ウィルス遺伝子又は標的遺伝子の発現を阻害したことを示すということである。
【０２５７】
以下の表６には、インフルエンザ特異的ｓｉＲＮＡ二重鎖の５’−３’センス鎖（上）及び５’−３’アンチセンス鎖（下）を示す。
【０２５８】
【表６】
2009514877.tif 000029
【０２５９】
ベロ細胞を、１００μｌの１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地中へ９６ウェルプレートの各ウェルに１．５×１０４個、トランスフェクションの前日に播種した。１００、２０、若しくは５ｎＭの各インフルエンザ特異的ｓｉＲＮＡ又は非標的コントロールｓｉＲＮＡであるＱｎｅｇ、をｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）０．３μｌ（１ｍｇ／Ｌのストック）と複合体化し、ＯｐｔｉＭＥＭ２５μｌ中（全体積）（Ｇｉｂｃｏ社）室温で２０分間インキュベートした。播種されたベロ細胞の各ウェル中の上清を除去し、１０％ＤＭＥＭ完全培養液７５μＬを添加した。それから、ＯｐｔｉＭＥＭ中のｓｉＲＮＡ／ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ複合体２５μｌを各ウェルへ添加した。各条件について、三つのウェルで重複して実験を行った。トランスフェクションの条件ではない追加的なコントロールウェルを調製した。トランスフェクションから３時間後、培養液を除去した。各ウェルを０．３％ＢＳＡ／１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＰＳを含有する１×ＰＢＳ１００μｌで１回洗浄した。ＭＯＩ＝０．１のＰＲ８インフルエンザウィルス３０μｌを各ウェルに添加して感染を行った。プレートを室温で１時間振とうした。感染後、細胞は脱着し始めるので、０．３％ＢＳＡ／１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＰＳ及び４μｇ／ｍｌのトリプシンを含有するＤＭＥＭ１００μｌを各ウェルへゆっくり側壁上へ添加した。プレートを３７℃で、５％のＣＯ２下、４８時間インキュベートした。各ウェルの上清５０μｌを、二つの系に重複してＨＡアッセイで分析した。
【０２６０】
濃度が５ｎＭ、２０ｎＭ、及び１００ｎＭのＤＸ２８５２、ＤＸ２８５５、ＤＸ２８５８、ＤＸ２８６１、ＤＸ２９５６、及びＧ１４９８の各インフルエンザ特異的ダイザ基質ｓｉＲＮＡ、並びに非標的コントロールｓｉＲＮＡであるＱｎｅｇをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州、カールズバッド）と複合体化させ、それを用いて播種したベロ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞をＭＯＩ（感染効率）が０．１であるＰＲ８インフルエンザウィルスで感染させた。産生されたウィスルを定量するために、感染細胞を含むウェルの上清を、実施例７に示すように血球凝集（ＨＡ）アッセイで分析した。表７には、各ｓｉＲＮＡのインフルエンザ遺伝子発現活性のノックダウンを、ウィルス力価の低下をパーセントで表してまとめた（１−（インフルエンザｓｉＲＮＡ処理のＨＡユニット）／（コントロールｓｉＲＮＡ処理のＨＡユニット））。
【０２６１】
【表７】
2009514877.tif 000030
【０２６２】
表７のデータは、インフルエンザ特異的ダイザ基質ｓｉＲＮＡのＤＸ２９５６が、インフルエンザウィルスに感染したベロ細胞中のインフルエンザ力価を効果的に低下させたことを示している。ＤＸ２９５６はＧ１４９８と同様の活性を示したが、他の４種類のダイザ基質ｓｉＲＮＡはＤＸ２９５６よりも低い活性を示した。これらのデータより、ｓｉＲＮＡ  ＤＸ２９５６は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州、カールズバッド）でトランスフェクトされた場合にインフルエンザのｍＲＮＡレベルを効果的に低下させており、従ってこれがインフルエンザ感染の治療及び／又は予防のための優れた候補であることが示された。
【０２６３】
上述の本発明を、明確な理解を目的として例を挙げる方法で詳細に説明してきたが、限定されるのではなく、例示の形で示された添付の請求項の範囲内において特定の変形及び変更を行うことが可能であることは、熟練者には明らかであろう。この意味で、説明を省略するために、上述の本開示の範囲内において様々な刊行物及びその他の文献を引用した。これらの全文献は各々、あらゆる点で参照することで本明細書に組み入れられる。しかし、留意点として、本明細書で取り上げた種々の刊行物は、本出願の出願日以前の開示事項を組み入れただけであって、発明者は先行発明の理由により、そのような開示に先行する権利を保持する。
【図面の簡単な説明】
【０２６４】
【図１】ｓｉＲＮＡ  Ｎ１６３と抱合したポリペプチドＰＮ２７７を有する抱合体ｄｓＣｏＰ２７７ｎｆＲ９５２及びｄｓＣｏＰ２７７ｎｆＲ９５０のインビトロでのダイザ分解生成物のゲル電気泳動を示す図である。
【図２】非抱合ｓｉＲＮＡであるＮ１６３二重鎖の、ダイザエンドヌクレアーゼプロセッシング反応速度のＲＰ−ＨＰＣＬ分析を示す図である。（Ａ）未処理Ｎ１６３二本鎖、（Ｂ）ダイザエンドヌクレアーゼと共に１時間インキュベート、（Ｃ）ダイザエンドヌクレアーゼと共に２．５時間インキュベート、（Ｄ）ダイザエンドヌクレアーゼと共に５時間インキュベート、（Ｅ）ダイザエンドヌクレアーゼと共に７時間インキュベート。
【図３】図２に示した非抱合ｓｉＲＮＡ  Ｎ１６３二本鎖の、ダイザエンドヌクレアーゼプロセッシング反応速度のＲＰ−ＨＰＣＬ分析のチャートである。
【図４】非抱合Ｎ１６３を７時間ダイザ分解したもののＥＳＩ−ＭＳ分析を示す図である。
【図５】ｓｉＲＮＡ  Ｎ１６３と抱合したポリペプチドＰＮ８５７を有する抱合体化ｓｉＲＮＡの、ダイザエンドヌクレアーゼプロセッシングのＥＳＩ−ＭＳ分析を示す図である。（Ａ）ダイザエンドヌクレアーゼの非存在下での８時間のコントロール、（Ｂ）ダイザエンドヌクレアーゼにより抱合体を８時間分解。
【図１】
2009514877.tif 000031
【図２】
2009514877.tif 000032
【図３】
2009514877.tif 000033
【図４】
2009514877.tif 000034
【図５】
2009514877.tif 000035
【配列表】
2009514877000001.xml
【国際調査報告】
2009514877.tif 000080
2009514877.tif 000081
2009514877.tif 000082
2009514877.tif 000083
2009514877.tif 000084