(57)【要約】本発明は、ＧＣＰＩＩ(Ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ−ＩＩ)を有効成分として含むベータアミロイドの脳内蓄積予防及び治療用薬学的組成物及びそれを利用したスクリーニング方法に関するものである。本発明のＧＣＰＩＩは、Ａβモノマー（ｍｏｎｏｍｅｒ）及びオリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒ）を分解すると同時に、水溶性Ａβ及び不溶性Ａβ、特異的に凝集されたＡβを分解して、脳でのＡβ凝集を予防または減少させることができるので、アルツハイマー病またはダウン症候群のための治療剤としてすぐれた候補物質である。2009506026.tif 000003
2009506026.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＣＰ−ＩＩタンパク質を有効成分として含む、Ａβの脳内蓄積予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項２】
ＧＣＰ−ＩＩタンパク質が、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１に記載のＡβの脳内蓄積予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項３】
ＧＣＰ−ＩＩタンパク質が、配列番号１で表される塩基配列を有する遺伝子によってコードされることを特徴とする、請求項２に記載のＡβの脳内蓄積予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項４】
Ａβが、溶解性または不溶性Ａβであることを特徴とする、請求項１に記載のＡβの脳内蓄積予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項５】
ヒトＧＣＰ−ＩＩ遺伝子を含むＡβの脳内蓄積予防及び治療剤スクリーニング用組成物。
【請求項６】
ヒトＧＣＰ−ＩＩ遺伝子が、配列番号１で表される塩基配列、配列番号１の多型現象を含む塩基配列及び配列番号１またはその多型現象を含む遺伝子断片塩基配列の中から選択される１種以上である、請求項５に記載のＡβの脳内蓄積予防及び治療剤スクリーニング用組成物。
【請求項７】
ヒトＧＣＰ−ＩＩタンパク質を含むＡβの脳内蓄積予防及び治療剤スクリーニング用組成物。
【請求項８】
ヒトＧＣＰ−ＩＩタンパク質が、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、配列番号１の塩基配列または配列番号１の多型現象を含む塩基配列の中から選択された一つから発現されたタンパク質及びＧＣＰ−ＩＩと同等な生理的活性を示すＧＣＰ−ＩＩポリペプチド断片の中から選択される１種以上である、請求項７に記載のＡβ脳内蓄積予防及び／または治療剤スクリーニング用組成物。
【請求項９】
ｉ）請求項５または請求項６の組成物を試験対象物質と接触させる工程；及び
ｉｉ）工程ｉ）の反応を確認して前記遺伝子の発現を増進させる活性または抑制する活性を示すかどうかを決定する工程を含む、Ａβ脳内蓄積予防及び治療剤スクリーニング方法。
【請求項１０】
ｉ）請求項７または請求項８の組成物を試験対象物質と接触させる工程；及び
ｉｉ）工程ｉ）の反応を確認して前記遺伝子の発現を増進させる活性または抑制する活性を示すかどうかを決定する工程を含む、Ａβ脳内蓄積予防及び治療剤スクリーニング方法。
【請求項１１】
ＧＣＰ−ＩＩが発現される発現ベクターを有効成分として含む、Ａβ脳内蓄積予防及び治療剤。
【請求項１２】
発現ベクターが、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、アデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）及びワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ）からなる群から選択される１種以上のウイルス性発現ベクターであることを特徴とする、請求項１１に記載のＡβ脳内蓄積予防及び治療剤。
【請求項１３】
ＧＣＰ−ＩＩタンパク質または前記タンパク質をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターを治療的有効量で対象に投与する工程を含む、Ａβ脳内蓄積予防及び治療方法。
【請求項１４】
ＧＣＰ−ＩＩタンパク質が、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１３に記載のＡβ脳内蓄積予防及び治療方法。
【請求項１５】
ＧＣＰ−ＩＩタンパク質が、配列番号１で表される塩基配列を有する遺伝子によってコードされることを特徴とする、請求項１３に記載のＡβ脳内蓄積予防及び治療方法。
【請求項１６】
治療的有効量が、０．１μｇ／ｋｇないし０．１ｇ／ｋｇであることを特徴とする、請求項１３に記載のＡβ脳内蓄積予防及び治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＧＣＰ−ＩＩ（ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ−ＩＩ）を有効成分として含むβ−アミロイド（β−Ａｍｙｌｏｉｄ，以下「Ａβ」と略称する）の脳内蓄積予防及び治療用薬学的組成物と治療剤スクリーニング用組成物、及びそれを使用したスクリーニング方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
急速な経済的成長を成した我が国の場合、老人人口の増加とともにアルツハイマー病に代表される老人性痴呆症が社会的問題化している。現在、アルツハイマー病による社会経済的負担は非常に大きく、益々増加する傾向にある。
【０００３】
アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ，以下「ＡＤ」と略称する）は、病理学的に脳のＡβ蓄積によって現れる最も優勢な神経退行性疾患である。Ａβ合成と除去の不均衡は、Ａβ蓄積または老人性プラークを示すようになる（Ｇｅｕｌａ  Ｃ．等，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，４，８２７−８３１（１９９８）（非特許文献1））。アルツハイマー性痴呆症は、漠然と一般人等が考えているのとは異なり、遺伝的な変異によって発病する家族性アルツハイマー病（ｆａｍｉｌｉａｌＡＤ，ＦＡＤ）と、その原因がまだ把握されていない散発性アルツハイマー病（ｓｐｏｒａｄｉｃＡＤ，ＳＡＤ）とに分けることができる。家族性ＡＤの場合は、全体ＡＤ患者の５〜１０％程度を占めていて、大部分の場合が散発性ＡＤ患者である。家族性ＡＤの原因遺伝因子としては、染色体１４番に位置したプレセニリン１（ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ  １，以下「ＰＳ１」と略称する）遺伝因子、染色体２１番に位置したアミロイド前駆体タンパク質（ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ，以下「ＡＰＰ」と略称する）遺伝因子、染色体１番に位置したプレセニリン２（ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ  ２，以下「ＰＳ２」と略称する）遺伝因子が知られている。
【０００４】
家族性ＡＤ患者にみられるＡＰＰ突然変異遺伝因子を過発現するＡＰＰ過発現形質転換マウス（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ）の場合、ＡＤ患者に見られる老人斑点が見られ、ＡＤ患者の特異的症状である空間知覚学習能力が低下する結果を示した。また、正常ＰＳ１タンパク質が過発現した場合、Ａβの生成には大きな変化がなかったが、ＰＳ１遺伝因子に突然変異が発生したタンパク質を過発現した形質転換マウスの場合、ＡＤ患者でたくさん発見される形態のＡβが過量生成されることが分かった。このような様々な報告を総合してみる時、家族性ＡＤ患者で見られるＡＰＰ遺伝因子の変異は、Ａβの過量生成と密接に係わっており、かつＡＤの発病に重要な役割をすると認識される。
【０００５】
家族性ＡＤでＡβの過量生成と係わる遺伝子であるＡＰＰ、ＰＳ１及びＰＳ２に関する研究は活発に進行されている一方、老化によるＡβの分解低下と係わる研究は進められずにきた。最近、細胞あるいは動物実験でネプリライシン（ｎｅｐｒｉｌｙｓｉｎ，以下「ＮＥＰ」と略称する）やインシュリン分解酵素（ｉｎｓｕｌｉｎ  ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ，以下「ＩＤＥ」と略称する）の活性を阻害すると、Ａβが過量蓄積されることがみられることから、Ａβを分解する遺伝子の発現及び機能低下が老化した脳でのＡβ蓄積の主な原因であると考えられる。また、ＮＥＰまたはＩＤＥを過発現させた形質転換マウスをＡβを過量生産するマウスと交配すると、ＮＥＰあるいはＩＤＥによってＡβが分解されることが観察された。
【０００６】
このようなＡβを分解することができる酵素の活性化は、家族性ＡＤだけでなく老化によって増加するＡβを分解させることにより、ＡＤ治療に重要なターゲットになり得るが、実際にこれらタンパク質分解酵素が、凝集したＡβも分解することができるかどうかに関してはさまざまな意見がお互いに対立しており、これらタンパク質分解酵素が過発現された形質転換マウスでもＡβが多量に残っていることから、Ａβを分解することができる他のタンパク質分解酵素が存在するものと考えられている。
【０００７】
今までアルツハイマー病などを予防及び治療するために多くの努力が試みられたが、その例として、Ａβの凝集または蓄積を抑制するためにＡβペプチドを使用した非−自己抗原ワクチン（ＷＯ２００１／３９７９６（特許文献1））、ＶＥＧＦのＡβとの結合を抑制するためにＶＥＧＦポリペプチドを使用したＡβ隔離化合物（ＷＯ２００３／０５５９１０（特許文献2））、ダウン症候群及びアルツハイマー類型の老人性痴呆症治療に使用される化合物を基盤にしたＡβコア（ｃｏｒｅ）タンパク質の生成及びプラーク（ｐｌａｑｕｅ）形成を抑制させる化合物（ＷＯ１９９５／０９８３８（特許文献3））などを使用してアルツハイマー病を治療しようとする多くの試みがなされてきた。
【０００８】
本発明者等は、Ａβを分解する酵素を探し出すためにたゆまぬ努力を重ねて、バクテリアから分離したＡβの凝集を抑制するタンパク質に対して、すでに特許出願を行った（大韓民国特許公開番号第１０−２００５−００７１０２号（特許文献4））。
【０００９】
本発明では、ヒトタンパク質の中からＡβを分解する酵素を探し出すための努力として、前記特許のＡβ分解タンパク質であるＡＡＢＡ（ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）と遺伝子配列が類似の多くのヒト発現タンパク質の中からＧＣＰ−ＩＩを候補遺伝子としてクローニングすることにより、生物学的及び生化学的特性を明らかにして、それをさらに有用に使用しようとした。その結果、本発明のＧＣＰ−ＩＩは、Ａβのモノマー及びオリゴマー形態だけではなく、溶解性及び不溶性形態、そして凝集した形態に変換されたＡβも分解する効果を有するという事実を確認することによって本発明を完成させた。
【００１０】
【特許文献１】ＷＯ２００１／３９７９６
【特許文献２】ＷＯ２００３／０５５９１０
【特許文献３】ＷＯ１９９５／０９８３８
【特許文献４】大韓民国特許公開番号第１０−２００５−００７１０２号
【非特許文献１】Ｇｅｕｌａ  Ｃ．等，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，４，８２７−８３１（１９９８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、ＧＣＰ−ＩＩを有効成分として含むＡβの脳内蓄積予防及び治療用薬学的組成物と治療剤スクリーニング用組成物及びそれを使用したスクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記目的を達成するために、本発明は、ＧＣＰ−ＩＩタンパク質を有効成分として含むＡβの脳内蓄積予防及び治療用薬学的組成物を提供する。
【００１３】
また、本発明は、ＧＣＰ−ＩＩ遺伝子を含む、Ａβの脳内蓄積予防及び治療剤スクリーニング用組成物を提供する。
【００１４】
また、本発明は、ＧＣＰ−ＩＩタンパク質を含む、Ａβの脳内蓄積予防及び治療剤スクリーニング用組成物を提供する。
【００１５】
また、本発明は、
ｉ）前記ＧＣＰ−ＩＩ遺伝子を含む組成物を試験対象物質と接触させる工程；及び
ｉｉ）工程ｉ）の反応を確認して前記遺伝子の発現を増進させる活性または抑制する活性を示すかどうかを決定する工程を含む、Ａβ脳内蓄積予防及び治療剤スクリーニング方法を提供する。
【００１６】
また、本発明は、
ｉ）前記ＧＣＰ−ＩＩタンパク質を含む組成物を試験対象物質と接触させる工程；及び
ｉｉ）工程ｉ）の反応を確認して前記遺伝子の発現を増進させる活性または抑制する活性を示すかどうかを決定する工程を含む、Ａβ脳内蓄積予防及び治療剤スクリーニング方法を提供する。
【００１７】
同時に、本発明は、ＧＣＰ−ＩＩ遺伝子が発現される発現ベクターを有効成分として含むＡβ脳内蓄積予防及び治療剤を提供する。
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１９】
本発明は、ＧＣＰ−ＩＩタンパク質を有効成分として含む、Ａβの脳内蓄積予防及び治療用薬学的組成物を提供する。
【００２０】
本発明者等は、コンゴレッド分析（Ｃｏｎｇｏ  ｒｅｄ  ａｓｓａｙ）によってアミロイドペプチドの凝集を減少させる活性を有するストレプトマイセス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）からバクテリア性アミノペブチダーゼ（ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）を見いだした。その結果、獲得されたタンパク質をＡＢＢＡ（Ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）と命名し、前記発明は大韓民国特許出願公開番号第１０−２００５−００７１０２号に詳細に記載されている。
【００２１】
ヒトゲノムデータベースを検索して、ストレプトマイセス種から分離したＡＢＢＡと高い相同性を有する多くの哺乳類アミノペブチダーゼ（ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）を捜した。その中の一つが、カルボキシペブチダーゼ（ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ）活性を有するヒトＧＣＰ−ＩＩである。
【００２２】
ＧＣＰ−ＩＩは、人体の多くの臓器で発現される膜貫通メタロプロチナーゼ（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）で、食餌から摂取された葉酸塩（ｆｏｌａｔｅ）を腸で吸収することができる形態にする役割を遂行することが知られている（Ｈａｌｓｔｅｄ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８年，第２７３巻，２０４１７−２４頁；Ｇｈｏｓｈ等， Ｐｒｏｓｔａｔｅ，２００３年，第５７巻，１４０−１５１頁）。脳でのＧＣＰ−ＩＩの役割は、虚血性疾患でＮＡＡＧ（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ  ａｓｐａｒｔｙｌ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ）というグルタミン酸神経伝達物質（ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ）前駆体からグルタミン酸（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）を形成するのに関与することが知られているが、外国のお互いに違う二つの実験室で製作したＧＣＰ−ＩＩを除去したマウス（ＧＣＰ−ＩＩ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｉｃｅ）では、胎児が死亡したり（Ｔｓａｉ等，Ｓｙｎａｐｓｅ，２００３年，２８５−９２頁）または、全く形質変化を示さず（Ｂａｃｉｃｈ等，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，２００２年，第８３巻，２０−９頁）、今までＧＣＰ−ＩＩの脳での生理的機能は正確に確認することができなかった。しかし、ＧＣＰ−ＩＩの発現阻害剤を脳卒中モデル（ｓｔｒｏｋｅ  ｍｏｄｅｌ）マウスに投与すると、脳の細胞死を減らすことが報告され（Ｓｌｕｓｈｅｒ等，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９９年，第５巻，１３９６−４０２頁；及びＴｏｒｔｅｌｌａ等，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２０００年，第４０２巻，３１−７頁）、ＧＣＰ−ＩＩによる過量のグルタミン酸生成が神経細胞に有害な作用をするものと示唆される。
【００２３】
本発明者等は、ＧＣＰ−ＩＩのＡβ分解程度を測定するために合成されたＡβ４０（図１Ａ参照）またはＡβ４２（図１Ｂ参照）をＧＣＰ−ＩＩを過発現させたＨＥＫ２９３細胞及び、既存のＡβを分解する酵素として知られたＮＥＰとＩＤＥが過発現されたＨＥＫ２９３の細胞培養液に入れて反応させて、エライザ（ＥＬＩＳＡ）分析で培地に残っているＡβの量を測定した結果、ＧＣＰ−ＩＩを過発現させた細胞の細胞培養液に残っているＡβ４０及びＡβ４２の量は空ベクター（ｍｏｃｋ  ｖｅｃｔｏｒ）を形質導入させた細胞の培養液に残っている量より、３０％減少することを示し、ＧＣＰ−ＩＩの効果はＮＥＰまたはＩＤＥのＡβを分解する程度と類似であることを示した。
【００２４】
また、ＧＣＰ−ＩＩのＡβ分解効果が大脳細胞でも起きるのかどうかを調べるための実験で、レンチウイルス（Ｌｅｎｔｉ−ｖｉｒｕｓ）を使用して一次大脳細胞（ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｃｅｌｌｓ）にＧＣＰ−ＩＩを過発現させた後、Ａβが分解される程度を調べた結果、ＧＣＰ−ＩＩは一次大脳細胞でＡβを９０％以上分解することが示され、実際にＡβが蓄積される大脳細胞でＧＣＰ−ＩＩが効率的にＡβを分解することを示した（図２参照）。
【００２５】
実験的にＧＣＰ−ＩＩを過発現させた細胞でだけではなく、生理的水準でＧＣＰ−ＩＩが実際に合成Ａβを分解することができるのかどうかを確認するために、ｓｉＲＮＡ方法でＧＣＰ−ＩＩの発現を遮断した細胞株に合成されたＡβを添加して、ＥＬＩＳＡ分析で培地内に残っているＡβの量を測定し、培養後に残った空ベクター（ｅｍｐｔｙ  ｖｅｃｔｏｒ）を含むＧＣＰ−ＩＩを発現する細胞株でのＡβ水準と比較した時、前記ｓｉＲＮＡ細胞株によるＡβの分解が対照群に比較して減少することが示されて、ＧＣＰ−ＩＩが生理的に生成されたＡβを減少し得ることが示された（図３参照）。
【００２６】
続いて、ＧＣＰ−ＩＩが実質的に生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で過発現されるＡβを分解することができるのかどうかを確認するために、前記Ａβを過発現させた形質転換マウスでＧＣＰ−ＩＩ抑制剤によるＡβの分解能を調査した結果、図１２Ｂのように野生型マウス（ＷＴ）では約５０％程度、形質転換マウスでは約３０％程度有意性を持ってＧＣＰ−ＩＩ活性を減少させることを観察することができた。これは、ＧＣＰ−ＩＩが脳でのＡβ分解に直接的に関与することを示す重要な結果である。
【００２７】
併せて、ＡβにおいてＧＣＰ−ＩＩによって分解されるアミノ酸位置を調べるために、組換えＧＣＰ−ＩＩタンパク質（以下「ｒＧＣＰ−ＩＩ」と略称する）を製作（図４Ａ参照）して、酵素活性程度を測定した後（図４Ｂ参照）、Ａβ及びｒＧＣＰ−ＩＩタンパク質と反応させたＡβをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ方法で分解されたペプチドを確認した（図５Ａ−５Ｄ参照）。加熱してタンパク質の活性を無くしたＧＣＰ−ＩＩとＡβを反応させて、Ａβが分解されないことを確認することで、ＧＣＰ−ＩＩのＡβ分解作用は、ＧＣＰ−ＩＩの酵素活性に影響を与えるという事実を立証した（図５Ｅ参照）。また、前記ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析によって獲得したＡβ１８、Ａβ１９、Ａβ２０、Ａβ２１、Ａβ２２、Ａβ２５、Ａβ２９及びＡβ３５断片で、Ａβの分解位置を確認し、特にＡβ１８がｒｈＧＣＰ−ＩＩによる主要分解断片であることが判明した（図６参照）。
【００２８】
ＧＣＰ−ＩＩがＡβを特異的に分解するということを示す実験として、アミルリン及びＡＣＴＨ（ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｃ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、インシュリンβ−チェーン（ｃｈａｉｎ）とＧＣＰ−ＩＩを反応させた後、分子量分析装置で各試料の分子量を測定した結果、インシュリンβ−チェーン（図７Ａ及び７Ｂ参照）とＡＣＴＨ（図７Ｃ及び７Ｄ参照）は、ＧＣＰ−ＩＩによって分解されない基質特異性を有しているということが分かる一方、アミルリンの場合、ＧＣＰ−ＩＩと反応させると、１５００及び２０００で二つのピーク（ｐｅａｋ）が現れることがみられるが（図７Ｅ及び７Ｆ参照）、このような結果から本発明者等は、ＧＣＰ−ＩＩがＡβあるいはアミルリンのようなアミロイド生成（ａｍｙｌｏｄｏｉｇｅｎｉｃ）タンパク質に対して特異性があることを確認した。ＩＤＥもアミルリンを分解するという報告（Ｂｅｎｅｔｔｅ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０００年，第２７５巻，３６６２１−５頁）があり、ＧＣＰ−ＩＩによるアミルリン分解は、凝集毒性を帯びた基質を分解する重要酵素であることを示唆する結果である。
【００２９】
合成Ａβだけではなく実際に細胞で形成されたＡβに対するＧＣＰ−ＩＩの分解効果を調べるために、Ａβが過量に形成されるｓｗＡＰＰ（Ｓｗｅｄｉｓｈ  ｍｕｔａｎｔ  ＡＰＰ）遺伝子を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞株を製作した後、培地を集めてｒＧＣＰ−ＩＩタンパク質と反応させて培地に残っているＡβの量をＥＬＩＳＡで測定した結果、前記ｓｗＡＰＰ安定細胞の培地と様々な濃度のｒＧＣＰ−ＩＩを添加して培養した時、生理的に生成されたＡβ４２の濃度が減少することが分かった。これは、ｒＧＣＰ−ＩＩが生理的に生成されたＡβも分解するということを意味する（図８参照）。
【００３０】
また、Ａβのモノマー（ｍｏｎｏｍｅｒ）及びマルチマー（ｍｕｌｔｉｍｅｒ）に対するＧＣＰ−ＩＩの分解効果を調べるために、７日間成熟したＡβをｒＧＣＰ−ＩＩと反応させてウエスタンブロットを実施した後、イメージプログラムで定量した。その結果、ＧＣＰ−ＩＩの濃度を増加させながらＡβと反応させると、モノマー形態よりオリゴマー（またはマルチマー）形態のＡβがより早く減少することを観察した。このような結果からＧＣＰ−ＩＩは、神経細胞に有害なオリゴマー形態のＡβを効率的に分解することが分かった（図９参照）。
【００３１】
Ａβ４０の多様な形態が、ヒトＧＣＰ−ＩＩによってさらに容易に分解されるのかどうかを確認するために、Ａβを溶解性または不溶性に分画した後、ｒＧＣＰ−ＩＩとともに培養した結果、ｒＧＣＰ−ＩＩは、不溶性Ａβ４０を３５％減少させ、溶解性Ａβ４０を２０％減少させた（図１０Ａ参照）。それで、本発明のＧＣＰ−ＩＩは、不溶性Ａβにも活性を示すことにより蓄積されたＡβをより効率的に分解することができることが分かる（図１０Ｂ参照）。
【００３２】
凝集したＡβに対するｒＧＣＰ−ＩＩの分解効果を確認するために、２１日間凝集したＡβをｒＧＣＰ−ＩＩタンパク質と反応させた後、変化した凝集Ａβの量をコンゴレッド方法で測定した結果、ＡβがｒＧＣＰ−ＩＩによって分解されることで、その凝集核配列（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｃｏｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を失ったＡβ断片が生成されることを確認することができた。したがって、本発明のＧＣＰ−ＩＩは、投与濃度に比例してＣｂ値が減少することを示し、ＧＣＰ−ＩＩが多様な形態のＡβを分解することができ、特に、ＧＣＰ−ＩＩは凝集したＡβをより効率的に分解することができることが分かった（図１１参照）。
【００３３】
本発明のＧＣＰ−ＩＩタンパク質を有効成分として含む組成物は、前記有効成分以外に薬学的に適合し、生理学的に許容される補助剤を使用して製造することができ、前記補助剤としては、賦形剤、崩解剤、甘味料、結合剤、被覆剤、膨張剤、潤滑剤、滑沢剤または香味剤などの可溶化剤を使用することができる。
【００３４】
本発明のＧＣＰ−ＩＩタンパク質を有効成分として含む組成物は、投与のために前記記載した有効成分以外に追加で薬学的に許容可能な担体を１種以上含んで、薬学的組成物として好ましく製剤化することができる。
【００３５】
液状溶液に製剤化される組成物において、薬学的に許容される担体としては、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エチルアルコール及びこれら成分の中から１成分以上を混合して使用することができる。必要によって、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。さらに、当該技術分野の適切な方法でＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）に開示されている方法を使用して、各疾患によってまたは成分によって好ましく製剤化することができる。
【００３６】
本発明のＧＣＰ−ＩＩタンパク質を有効成分として含む組成物の薬剤製剤形態は、顆粒剤、散剤、被覆錠、錠剤、カプセル剤、座薬、シロップ、汁、懸濁液、乳剤、点滴剤または注射可能な液剤及び活性化合物の徐放出型製剤などが挙げられる。
【００３７】
本発明のＧＣＰ−ＩＩタンパク質を有効成分として含む組成物の投与方法は、特別にこれに制限されるものではないが、投与目的によって非経口投与、例えば静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、胸骨内、経皮、鼻側内、吸入、局所、直腸または経口投与を通じて通常的な方式で投与することができる。
【００３８】
本発明のＧＣＰ−ＩＩタンパク質を有効成分として含む組成物の投与量は、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含有された有効成分、他の成分の種類及び含量、剤形の種類及び患者の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路及び組成物の分泌率、治療期間、同時使用される薬物を含めた多様な因子によって調節することができる。成人の場合、ＧＣＰ−ＩＩタンパク質を１日１回ないし数回にわけて投与することができ、投与時に０．１μｇ／ｋｇ〜０．１ｇ／ｋｇの用量で投与することが好ましい。
【００３９】
本発明の治療用組成物は、ＡＤ治療のために単独またはホルモン治療、薬物治療及び生物学的反応調節剤を使用する方法等と並行して使用することができる。
【００４０】
また、本発明は、ヒトＧＣＰ−ＩＩ遺伝子を含むＡβの脳内蓄積予防及び治療剤スクリーニング用組成物を提供する。
【００４１】
前記ヒトＧＣＰ−ＩＩ遺伝子は、配列番号１で表される塩基配列、配列番号１の多型現象を含む塩基配列及び配列番号１またはその多型現象を含む遺伝子断片塩基配列の中から１種以上を選択することができる。
【００４２】
また、本発明は、ＧＣＰ−ＩＩタンパク質を含むＡβの脳内蓄積予防及び治療剤スクリーニング用組成物を提供する。
【００４３】
前記ＧＣＰ−ＩＩタンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、配列番号１の塩基配列または配列番号１の多型現象を含む塩基配列の中から選択された一つから発現したタンパク質、及びＧＣＰ−ＩＩと同等な生理的活性を示すＧＣＰ−ＩＩポリペプチド断片の中から１種以上を選択することができる。
【００４４】
また、本発明は、
ｉ）前記ＧＣＰ−ＩＩ遺伝子を含む組成物を試験対象物質と接触させる工程；及び
ｉｉ）工程ｉ）の反応を確認して前記遺伝子の発現を増進させる活性または抑制する活性を示すかどうかを決定する工程を含む、Ａβ脳内蓄積予防及び治療剤スクリーニング方法を提供する。
【００４５】
また、本発明は、
ｉ）前記ＧＣＰ−ＩＩタンパク質を含む組成物を試験対象物質と接触させる工程；及び
ｉｉ）工程ｉ）の反応を確認して前記遺伝子の発現を増進させる活性または抑制する活性を示すかどうかを決定する工程を含む、Ａβ脳内蓄積予防及び治療剤スクリーニング方法を提供する。
【００４６】
本発明のスクリーニング方法で、ＧＣＰ−ＩＩ遺伝子を含む組成物と試験対象物質間の反応確認は、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、ＤＮＡ−タンパク質及びＤＮＡ−化合物間の反応有無を確認するのに使用される通常的な方法等を使用することができる。
【００４７】
例えば、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で前記遺伝子と試験対象物質との結合有無を確認するための混成化試験、哺乳類細胞と試験対象物質を反応させた後、実施するノーザンブロット分析（ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ａｓｓａｙ）、定量的ＰＣＲ及び定量的リアルタイム（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ）ＰＣＲなどを通じた前記遺伝子の発現率測定方法、または前記遺伝子にレポーター（Ｒｅｐｏｒｔｅｒ）遺伝子を連結させて細胞内に導入した後、試験対象物質と反応させてレポータータンパク質の発現率を測定する方法などを使用することができる。
【００４８】
このような場合、本発明の組成物は、ＧＣＰ−ＩＩ遺伝子以外にも核酸の構造を安定に維持させる蒸留水または緩衝液を含むことができる。
【００４９】
本発明のスクリーニング方法でＧＣＰ−ＩＩタンパク質を含む組成物と試験対象物質間の反応確認は、タンパク質−タンパク質及びタンパク質−化合物間の反応有無を確認するのに使用される通常的な方法等を使用することができる。例えば、ＧＣＰ−ＩＩ遺伝子またはＧＣＰ−ＩＩタンパク質と試験対象物質を反応させた後、活性を測定する方法、酵母ツーハイブリッド法（ｙｅａｓｔ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ）、ＧＣＰ−ＩＩタンパク質に結合するファージ−ディスプレイペプチドクローン（ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｌｏｎｅ）の検索、天産物及び化学物質ライブラリー（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｉｂｒａｒｙ）などを使用した高処理スクリーニング（ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ＨＴＳ）、薬物処理ＨＴＳ（ｄｒｕｇ  ｈｉｔ  ＨＴＳ）、細胞基盤スクリーニング（ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）または、ＤＮＡマイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）を使用するスクリーニング方法などを使用することができる。
【００５０】
このような場合、本発明の組成物は、ＧＣＰ−ＩＩから発現されるタンパク質の外にも、タンパク質の構造または生理活性を安定に維持させる緩衝液または反応液を含むことができる。また、本発明の組成物は、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）実験をするために、前記タンパク質を発現する細胞または転写率を調節することができるプロモーター下で前記タンパク質を発現する発現ベクターを含む細胞などを含むことができる。
【００５１】
本発明のスクリーニング方法で試験対象物質は、通常的な選定方式によってＡβの脳内蓄積予防及び治療剤としての可能性を有することが推定されたり、または無作為的に選定された個別的な核酸、タンパク質、その他の抽出物または天産物などを挙げられ得る。
【００５２】
本発明のスクリーニング方法を通じて得た遺伝子発現を増進させたりタンパク質の機能を増進させる活性を示す試験対象物質、及び遺伝子発現を抑制させたりタンパク質の機能を抑制させる活性を示す試験対象物質は、前者の場合、Ａβの脳内蓄積予防及び治療剤候補物質になり得る。後者の場合は、試験対象物質に対する抑制剤として開発することで、Ａβの脳内蓄積予防及び治療剤候補物質になり得る。このようなＡβの脳内蓄積予防及び治療剤候補物質は、以後のＡβの脳内蓄積予防及び治療剤開発過程で先導物質（ｌｅａｄｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）として作用するようになり、前記先導物質がＧＣＰ−ＩＩ遺伝子またはそれから発現されるタンパク質の機能増進効果を示すようにその構造を変形させて最適化することで、新しいＡβの脳内蓄積予防及び治療剤を開発することができる。
【００５３】
前記から修得した物質は、哺乳類のＧＣＰ−ＩＩ遺伝子またはそれから発現されるタンパク質に対して部分的または完全な活性増進効果を示すので、ＧＣＰ−ＩＩ遺伝子発現抑剤またはそれから発現されるタンパク質の機能低下によるＡβの脳内蓄積及びそれによって誘発される疾患等を抑制することができる。
【００５４】
また、本発明は、ＧＣＰ−ＩＩ遺伝子が発現される発現ベクターを有効成分として含むＡβ脳内蓄積予防及び治療剤を提供する。
【００５５】
本発明では、ＧＣＰ−ＩＩを大脳細胞内に伝達するために、レンチウイルスを遺伝子伝達体に使用したが、これに限定されるものではない。例えば、ＧＣＰ−ＩＩの細胞内発現を誘導するためにアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルスを含むレトロウイルス及びワクシニアウイルスなどを使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５６】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。
【００５７】
但し、下記実施例は本発明をより易しく例示するだけのものであって、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
【００５８】
＜実施例１＞ＧＣＰ−ＩＩのＡβ分解能測定
＜１−１＞ＧＣＰ−ＩＩの発掘
ヒトＧＣＰ−ＩＩｃＤＮＡを獲得するために、ＲＴ−ＰＣＲを遂行した。ｐＥＦ１／Ｍｙｃ（Ｃ−末端にＭｙｃ−ｔａｇを含み、ＢａｍＨ  ＩとＮｏｔ  Ｉ制限酵素サイト使用，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国）ベクター内に挿入するためのプライマーは、ＢａｍＨ  Ｉ制限酵素を含む配列番号３で表されるフォワードプライマー及びＮｏｔ  Ｉ制限酵素を含む配列番号４で表されるリバースプライマーを使用し、下記のようなＰＣＲ条件で反応を遂行した。
【００５９】
フォワードプライマー：cgcggatccaccatgtggaatctccttcacgaaa（ＧＣＰ−ＩＩ−１Ｆと称する）
リバースプライマー：atttgcggccgctggctacttcactcaaagtctc（ＧＣＰ−ＩＩ−ＩＲと称する）
フォワードプライマー：cgcagatctaccatgtggaatctccttcacgaaa（ＧＣＰ−ＩＩ−２Ｆと称する）
リバースプライマー：atttagatctttaggctacttcactcaaagtctc（ＧＣＰ−ＩＩ−２Ｒと称する）
９４℃５分
９４℃３０秒、６２℃１分、７２℃２分：３０回
７２℃７分
４℃
【００６０】
また、ＧＣＰ−ＩＩｃＤＮＡをｐＳＧ５（Ｎ−末端にＨＡ  ｔａｇを含み、Ｂｇｌ  ＩＩ制限酵素サイト使用，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，米国）に挿入するためのプライマーは、Ｂｇｌ  ＩＩ制限酵素を含む配列番号５で表されるフォワードプライマー及び配列番号６で表されるリバースプライマーを使用し、前記のような条件のＰＣＲ反応によってＵ８７  ＭＧ（ＡＴＣＣ，米国）ヒト星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）からヒトＧＣＰ−ＩＩｃＤＮＡを増幅した後、各ベクター内に挿入し、それを各々ｐＭｙｃ−ＧＣＰＩＩ及びｐＨＡ−ＧＣＰＩＩと命名した。
【００６１】
本発明に使用されたすべてのクローンは、ＤＮＡ配列分析（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によって確認した。
【００６２】
＜１−２＞ＧＣＰ−ＩＩのＡβ分解能測定
ＧＣＰ−ＩＩのＡβ分解程度を測定するために、２ｎｇ／ｕｌの合成Ａβ４０またはＡβ４２（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩＮＣ．）を、各々ＧＣＰ−ＩＩが過発現されるＨＥＫ２９３細胞の培養液に入れて２０時間後、ＥＬＩＳＡ分析キット（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩＮＣ．）を使用して培地に残っているＡβの量を測定した。
【００６３】
ＧＣＰ−ＩＩを過発現するＨＥＫ２９３細胞株（ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌ）に、前記実施例＜１−１＞で製造したＧＣＰ−ＩＩ発現ベクターであるｐＨＡ−ＧＣＰＩＩまたはｐｍｙｃ−ＧＣＰＩＩを、トランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ（商標），Ｒｅａｇｅｎｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国）を使用して一時的に導入した。前記ＧＣＰ−ＩＩが一時的に導入されたＨＥＫ２９３細胞を１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）が添加されたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）培地で培養した。前記ＨＥＫ２９３細胞株から、タンパク質分解酵素抑制剤（ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：アプロチニン、ロイペプチン、またはフェニルメチルスルホニルフルオリド）を含んだＲＩＰＡバッファーで細胞溶解物を獲得し、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥでＧＣＰ−ＩＩタンパク質を分離してＧＣＰ−ＩＩの発現を確認した後に使用した。
【００６４】
ｐｃＤＮＡベクターに挿入されているＮＥＰとＩＤＥ遺伝子は、各々日本のＳａｉｔｏ（Ｓｈｉｐｐ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８８年，第８５巻，４８１９−２３頁）とアメリカのＳｅｌｋｏｅ教授（Ｋｕｏ等，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１９９１年，第５巻，１４６７−７６頁）から譲り受け、ＨＥＫ２９３細胞株に一時的な形質導入して発現を確認した後に使用した。
【００６５】
前記ＮＥＰとＩＤＥのプラスミドを形質導入させたＨＥＫ２９３細胞を陽性対照群に使用し、空ベクターは陰性対照群に使用した。形質導入されたＨＥＫ２９３細胞におけるヒトＧＣＰ−ＩＩまたはＮＥＰの発現水準は、各々抗−ＧＣＰ−ＩＩ抗体（ＭＡＢ５４４Ｂ，Ｍａｉｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）または抗−ＮＥＰ抗体（Ｌ−ＣＤ１０−２７０，Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ）を使用したウエスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ）分析によって確認した（図１Ｃ）。
【００６６】
ＧＣＰ−ＩＩを発現するＨＥＫ２９３細胞培地に残っている外因性Ａβの水準は、Ａβ添加２０時間後に空ベクターで形質導入させた細胞と比較した時、６０±５％水準で減少することが示され、ＧＣＰ−ＩＩの効果が既存のＡβを分解する酵素として知られたＮＥＰやＩＤＥがＡβを分解する程度と類似であることを示した。
【００６７】
＜実施例２＞レンチウイルスを使用したＧＣＰ−ＩＩを過発現させた大脳皮質細胞でのＡβ分解能
ＧＣＰ−ＩＩのＡβ分解効果が大脳皮質細胞でも起きるのかどうかを調べるための実験として、レンチウイルスを使用して一次大脳皮質細胞にＧＣＰ−ＩＩを過発現させた後、Ａβが分解される程度を調べた（図２）。皮質細胞は、Ｅ１６ラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ  ｒａｔ）から分離培養し、培養の１０％以下を構成する非神経細胞の拡散を防止するために培養後３〜６日からは、５−フルオロ−２−デオキシウリジン（５−ｆｌｕｏｒｏ−２−ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）が入った２４ウェルプレート（ウェル当り１×１０５細胞）で培養した。ＧＣＰ−ＩＩを発現するレンチウイルスを製造するために、ｐＬｅｎｔｉＨ１．２ベクターにＧＣＰ−ＩＩを挿入した後（以下、ｐＬｅｎｔｉＨ１．２−ＧＣＰＩＩと命名）２９３Ｔ細胞株にｐＬｅｎｔｉＨ１．２−ＧＣＰ−ＩＩ及びパッケージング構成物（ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）と外皮構成物（ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を一緒に導入して、４８時間後に培地に放出されたウイルスの濃度を計算した。
【００６８】
前記方法にしたがって、ＧＣＰ−ＩＩが導入されたレンチウイルス遺伝子伝達体を製造して、これをＬｅｎｔｉ−ＧＣＰ−ＩＩと命名した。
【００６９】
３日間Ｌｅｎｔｉ−ＧＣＰ−ＩＩを感染させた大脳皮質細胞を、２０時間Ａβ４０を添加して培養した後、培地に残っているＡβを前記実施例１のＥＬＩＳＡ分析を使用して測定した。
【００７０】
形質導入された細胞でのＧＣＰ−ＩＩの発現水準は、各々抗−ＧＣＰ−ＩＩ抗体（ＭＡＢ５４４Ｂ，Ｍａｉｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用したウエスタンブロット分析によって確認した。
【００７１】
１０、２０、５０ＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）のＬｅｎｔｉ−ＧＣＰ−ＩＩで感染した大脳皮質細胞で、各々Ａβの量が約９０％程度減少することが示され（図２）、ＡＤ患者でＡβが蓄積される部位である大脳皮質細胞で、ＧＣＰ−ＩＩが効率的にＡβを分解することを示した。
【００７２】
＜実施例３＞生理的水準でのＲＮＡｉ方法によるＧＣＰ−ＩＩのＡβ分解能検証
実験的にＧＣＰ−ＩＩを過発現させた細胞だけではなく、生理的水準でＧＣＰ−ＩＩが実際に合成Ａβを分解することができるのかどうかを確認するために、本発明者等は、ＨＥＫ２９３細胞株でｓｉＲＮＡ方法でＧＣＰ−ＩＩの発現を遮断した細胞株、ＧＣＰ−ＩＩを除去した安定的な細胞（ｋｎｏｃｋ−ｄｏｗｎ  ｓｔａｂｌｅ  ｃｅｌｌ）を製作して、合成されたＡβを添加して１６時間後にＥＬＩＳＡ分析を通じて培地内に残っているＡβの量を測定した（図３）。２６個の塩基配列からなるＧＣＰ−ＩＩ  ｓｉＲＮＡが入っているネオマイシン抵抗性の構成物をＯｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入してＨＥＫ２９３細胞株に形質導入した後、６００μｇ／ｍＬのＧ４１８で選別してＧＣＰ−ＩＩを除去した安定的な細胞を製作し、ＲＴ−ＰＣＲ方法でｓｉＧＣＰ−ＩＩ効果を確認した。空ベクターを含むＧＣＰ−ＩＩを発現する対照群に比較して、ｓｉＧＣＰ−ＩＩによるＧＣＰ−ＩＩを除去した安定的な細胞（ｋｎｏｃｋ−ｄｏｗｎ  ｓｔａｂｌｅ  ｃｅｌｌ）でｓｉＧＣＰ−ＩＩによるＧＣＰ−ＩＩ発現減少を確認し（図３Ａ）、特に、ＨＥＫ２９３細胞コロニー中の＃４−５と＃４−７で顕著に減少した。
【００７３】
また、前記各々の細胞培地にＡβを添加して２０時間培養した後、残ったＡβ量を比較した結果、空ベクターを含むＧＣＰ−ＩＩを発現する安定細胞株群のＡβ水準に比べて、ＧＣＰ−ＩＩを除去した安定的な細胞（ｋｎｏｃｋ−ｄｏｗｎ  ｓｔａｂｌｅ  ｃｅｌｌ）で、約１．７〜２倍高かった（図３Ｂ）。
【００７４】
これは、前記ｓｉＲＮＡ細胞株によって培養液に添加したＡβの分解が対照群と比較して減少することを示し、ＧＣＰ−ＩＩが生理的にＡβを減少させることができることを示唆する。
【００７５】
＜実施例４＞ｒｈＧＣＰ−ＩＩを使用したＧＣＰ−ＩＩのＡβ分解能分析
＜４−１＞ｒＧＣＰ−ＩＩの製造
ＧＣＰ−ＩＩが過発現された細胞でＡβの量が減少されることがＧＣＰ−ＩＩによる分解作用なのかを確認し、またＡβがＧＣＰ−ＩＩによって分解されるアミノ酸位置を確認するために、ｒＧＣＰ−ＩＩタンパク質を製作した。
【００７６】
前記実施例１で製造されたｐＥＦ−ＧＣＰ−ＩＩを鋳型にしてＰＣＲ方法で得られた産物を制限酵素Ｂａｍ  ＨＩとＸｈｏ  Ｉで切断した後、バキュロウイルス（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）ベクターであるｐＥｎｔｒＢＨＲＮＸベクターのＢａｍ  ＨＩとＸｈｏ  Ｉの制限酵素部位にサブクローニングした（Ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｘ  Ｃｏ．，韓国）。前記方法によって製造されたベクターをｐＢＨＲＮＸ−ＧＣＰ−ＩＩと命名した。
【００７７】
昆虫細胞株であるＳＦ２１（Ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｘ  Ｃｏ．，韓国）を宿主細胞に使用し、ｐＢＨＲＮＸ−ＧＣＰ−ＩＩで感染させた昆虫細胞に０．１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加してタンパク質発現を誘導した。
【００７８】
前記細胞は、粉砕溶液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，ｐＨ８．０，３００ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，１ｍｇ／ｍｌ  ｌｙｓｏｚｙｍｅ，ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ）に再浮遊させた後、氷中で超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）した後、これを遠心分離した。タンパク質精製カラム（Ｈｉｓ−Ｓｔｒｅｐ  Ｎｉ−ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ｃｏｌｕｍｎ，Ｑｉａｇｅｎ，米国）を使用して遠心分離で得られたペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を１ｍｌの５０％Ｎｉ−ＮＴＡスラリーと反応させてカラムに注入した後、洗浄溶液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，ｐＨ８．０，３００ｍＭ  ＮａＣｌ，２０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）で３回洗浄した。最後に、ｒＧＣＰ−ＩＩは溶出溶液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，ｐＨ８．０，３００ｍＭ  ＮａＣｌ）を使用して溶出し、クーマシー染色（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）またはウエスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ）を使用してタンパク質発現様相を確認した（図４Ａ）。
【００７９】
＜４−２＞ｒＧＣＰ−ＩＩによるＡβ分解位置確認
Ａβ分解に対するｒＧＣＰ−ＩＩの効能を確認するのに先立って、３７℃、５０ｎｇ／μｌのｒＧＣＰ−ＩＩによる０．００２ないし２μＭのＮ−アセチル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−［３，４−３Ｈ］−グルタメート（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）から遊離された［３Ｈ］グルタメートを測定することで、ｒＧＣＰ−ＩＩの酵素活性を示すＫｍ値を分析した。ｒＧＣＰ−ＩＩの酵素作用は、１．０μＭのＮ−アセチル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−［３，４−３Ｈ］から飽和された。その結果、ｒＧＣＰ−ＩＩのＫｍ値は、０．５μＭと示された。
【００８０】
前記酵素活性程度を測定した後（Ｋｍ＝０．５μＭ、図４Ｂ）、Ａβ４０（１００ｎｇ／ｌ）及びＧＣＰ−ＩＩタンパク質とＡβ４０を２０時間反応させた後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍａｔｒｉｘ  ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ）を使用して分解されたペプチドを確認した（図５Ａ−Ｄ）。ｒＧＣＰ−ＩＩとともに培養したＡβは、試料プローブにローディングして、常温で乾燥させた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分子量分析装置（Ｖａｙａｇｅｒ−ＤＥ  Ｐｒｏ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，米国）に前記プローブを入れて、試料の分子量を分析してＡβの分子量を測定した。また、加熱して不活性化させたＧＣＰ−ＩＩとＡβを反応させてＡβが分解されないことを確認した（図５Ｅ）。
【００８１】
ＧＣＰ−ＩＩと反応しないＡβの分子量が、４３３１で主ピーク（ｐｅａｋ）を見せる一方、０．５ｎｇ／μｌのＧＣＰ−ＩＩと反応させたＡβでは、３９１５と２６６２で新しいピークを示した。このピークにあたる分子量は、Ａβ３５とＡβ２１ペプチドに一致する大きさであり、これは、ＧＣＰ−ＩＩがＡβを分解した産物を意味する。万一、ＧＣＰ−ＩＩの濃度を２５ｎｇ／μｌに増加させると、２，３００〜３，５００で６〜７個の新しいピークが生成されるが、２５ｎｇ／μｌ以上のＧＣＰ−ＩＩと反応させると、Ａβ１８に該当する分子量２，１６７で一つの主要ピークを示して、ＧＣＰ−ＩＩの量を増加させてもこれ以上分解されるペプチド断片は示されなかった。前記、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析でＡβの分解位置を確認し（図６Ａ）、これを通じてＧＣＰ−ＩＩによって分解される主要Ａβの断片は、Ａβ１８であることが分かった（図６Ｂ）。
【００８２】
＜４−３＞ＧＣＰ−ＩＩのＡβに対する特異性確認
ＧＣＰ−ＩＩがＡβを特異的に分解するということを示す実験として、アミルリン、ＡＣＴＨ（ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｃ  ｈｏｒｍｏｎｅ）またはインシュリンβ−チェーン（ｃｈａｉｎ）とＧＣＰ−ＩＩを３７℃で１５時間反応させた後、分子量分析装置で各試料の分子量を測定した（図７）。インシュリンβ−チェーン（図７Ａ及び７Ｂ）及びＡＣＴＨ（図７Ｃ及び７Ｄ）は、ＧＣＰ−ＩＩによって分解されない基質特異性を持っている一方、アミルリンの場合には、ＧＣＰ−ＩＩと反応させると１５００及び２０００で二つのピークが生成された（図７Ｅ及び７Ｆ）。
【００８３】
アミルリンは、腎臓で凝集されてアミロイド生成（ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｅｓｉｓ）を起こすタンパク質で、前記結果から、ＧＣＰ−ＩＩはＡβあるいはアミルリンのようなアミロイド生成（ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｉｃ）タンパク質に対して特異性があることが分かる。ＩＤＥもアミルリンを分解するという報告（Ｂｅｎｅｔｔ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０００年，第２７５巻，３６６２１−５頁）があり、これはＧＣＰ−ＩＩのアミルリン分解は、凝集毒性を帯びた基質を分解する重要酵素であることを示す結果でもある。
【００８４】
＜実施例５＞細胞内で形成されたＡβのＧＣＰ−ＩＩによる分解効果確認
本発明では、ヒトＧＣＰ−ＩＩが実質的に細胞内で形成されたＡβに対して分解効果があるのかどうかを確認するために、Ａβが過量に形成されるｓｗＡＰＰ（Ｓｗｅｄｉｓｈ  ｍｕｔａｎｔ  ＡＰＰ）遺伝子を安定に発現する細胞株を製作した。このためにＨＥＫ２９３細胞株にｓｗＡＰＰを形質導入させてＧ４１８で選別した後、培地を集めてｒＧＣＰ−ＩＩタンパク質と反応させて、培地に残っているＡβの量をＥＬＩＳＡで測定した（図８）。
【００８５】
Ａβ４２濃度及びＡＰＰ発現水準を、ｓｗＡＰＰ安定細胞コロニーを選別するための基準に使用した。多くの安定細胞コロニー中で＃２コロニーは、ＡＰＰ発現水準が一番高く（図８Ａ）、Ａβ４２濃度は生理的に生成されたＡβ水準に比較して１４倍以上増加した。前記ｓｗＡＰＰ安定細胞の＃２コロニー培地と各０、０．５、２．５及び１０μｇ／μｌ濃度のｒＧＣＰ−ＩＩを一緒に培養した時、生理的に生成されたＡβ４２の濃度が減少した。これは、ｒＧＣＰ−ＩＩが生理的に生成されたＡβも分解するということを意味する（図８Ｂ）。
【００８６】
＜実施例６＞Ａβのモノマー（ｍｏｎｏｍｅｒ）及びマルチマー（ｍｕｌｔｉｍｅｒ）に対するＧＣＰ−ＩＩの分解効果確認
Ａβのモノマー及びマルチマーに対するＧＣＰ−ＩＩの分解効果を調べるために、７日間成熟させたＡβをｒＧＣＰ−ＩＩと２０時間反応させて、１６％トリス−トリシンゲル（ｔｒｉｓ−ｔｒｉｃｉｎｅ  ｇｅｌ）で電気泳動した後、抗−Ａβ抗体（６Ｅ１０）でウエスタンブロットを実施した（図９Ａ）。５回以上実施されたブロットティング結果をイメージプログラム（Ｉｍａｇｅ  Ｊ  ｐｒｏｇｒａｍ，ＮＩＨ，米国）を使用して定量した（図９Ｂ）。その結果、ＧＣＰ−ＩＩの濃度を増加させてＡβと反応させると、モノマー形態よりはオリゴマー（またはマルチマー）形態のＡβがより早く減少することを観察することができた。このような結果は、ＧＣＰ−ＩＩが神経細胞に有害なオリゴマー形態のＡβをより効率的に分解するということを意味する。
【００８７】
＜実施例７＞溶解性（ｓｏｌｕｂｌｅ）及び不溶性（ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ）形態のＡβに対するＧＣＰ−ＩＩの分解効果確認
反応溶液内に多様な形態のＡβ４０が存在するので、本発明者等は前記Ａβ４０に対するｒＧＣＰ−ＩＩの親和性を確認した（図１０）。
【００８８】
大脳皮質をタンパク質分解酵素抑制剤（ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ）を含むｐＨ７．６、５０ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ溶液（ＴＢＳ）で均質化（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅ）し、４℃、１００，０００ｇで４０分間遠心分離した。上澄み液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）は、溶解性断片と定義し、ペレットは、タンパク質分解酵素抑制剤（ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ）を含む６Ｍのグアニジン−ＨＣｌ（ｇｕａｎｉｄｉｎｅ−ＨＣｌ）溶液で超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）して不溶性断片と定義し、溶解性Ａβ及び不溶性Ａβの濃度を測定した。
【００８９】
溶解性Ａβまたは不溶性ＡβとｒＧＣＰ−ＩＩを一緒に培養した結果、ｒＧＣＰ−ＩＩは不溶性Ａβ４０を３５％減少させ、溶解性Ａβ４０を２０％減少させた（図１０Ａ）。これによって、本発明のＧＣＰ−ＩＩは、溶解性Ａβだけではなく不溶性Ａβにも活性を示すことにより、蓄積されたＡβをさらに効率的に分解することができることが分かった（図１０Ｂ）。
【００９０】
＜実施例８＞凝集されたＡβに対するｒＧＣＰ−ＩＩの分解効果確認
２１日間凝集したＡβを１６時間ｒＧＣＰ−ＩＩタンパク質と反応させた後、変化された凝集Ａβの量をコンゴレッド方法を使用して測定することで、ｒＧＣＰ−ＩＩの分解能をもう一度確認した。
【００９１】
５．０ｍＭのコンゴレッド濃縮溶液（ｓｔｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を用いて５．０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭの  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４のコンゴレッド（Ｃｏｎｇｏ  ｒｅｄ）溶液（５μＭ）を準備した後、ｒＧＣＰ−ＩＩの存在下または非存在下でＡβとともに混合して吸収率を測定する前に３０分間常温で培養してスペクトルを獲得した。コンゴレッド分析方法で、タンパク質の凝集された形態は、コンゴレッドと結合することで吸収分光分析（ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）値を増加させる。
【００９２】
ＧＣＰ−ＩＩは、溶解性を失った凝集Ａβ４０を分解するにおいて、２１日間成熟されたＡβ４０凝集体（ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）のコンゴレッド値（ｃｏｎｇｏ−ｒｅｄ  ｖａｌｕｅ，Ｃｂ）が３±０．４５μＭと比較する時、ＧＣＰ−ＩＩと反応させるとＣｂ値が各々のＧＣＰ−ＩＩ濃度増加にしたがって２．３５、１．８２、０．７２に減少することが示された。
【００９３】
さらに、ｒＧＣＰ−ＩＩ作用によるＡβの主要断片であるＡβ１８のＣｂ値は、２１日間成熟後にも変化がほとんどなかった（ｂｌａｎｋ）。これは、Ａβ４０だけがｒＧＣＰ−ＩＩによって切断されることで、その凝集核配列（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｃｏｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を失ったＡβ断片を生成したことを示す。
【００９４】
したがって、本発明のＧＣＰ−ＩＩは、投与濃度にしたがってＣｂ値が減少することを確認することで、多様な形態のＡβを分解することができ、特に凝集されたＡβにおいてさらに効率的に分解することができることを確認することができた（図１１）。
【００９５】
＜実施例９＞生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でのＧＣＰ−ＩＩによるＡβの分解能測定
本発明のＧＣＰ−ＩＩが実質的に生体内で過発現されるＡβを分解することができるのかどうかを確認するために、本発明者等は、前記Ａβを過発現させた形質転換マウスでＧＣＰ−ＩＩ抑制剤によってＡβの分解能が抑制されるのかどうか調査した。具体的には、Ａβを遺伝的に過発現させた痴呆症モデルマウス（ＡＰＰ  Ｓｗｅｄｉｓｈ／ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ  ｄｅｌｔａ９  ｄｅｌｔｉｏｎ，１２週齢、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，米国）を準備した後、ＧＣＰ−ＩＩ抑制剤である２−ＰＭＰＡ（２−ｐｈｏｓｐｈｏｎｏｍｅｔｈｙｌ−ｐｅｎｔａｎｅｄｉｏｉｃ  ａｃｉｄ）を１週間に２回程度、１０ｍｇ／ｋｇの用量で３０日間腹腔内に注入した。ここで、対照群にはリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）を使用した。前記ＧＣＰ−ＩＩ抑制剤を最後に注入した後、マウスの脳組織の中で大脳皮質、海馬及び小脳部分を切除した後、微細秤で各々重さを測定した。続いて、前記組職を室温で６Ｍグアニジン−ハイドロクロライド（ｇｕａｎｉｄｉｎｅ−ｈｙｄｒｏｃｈｒｏｌｉｄｅ）溶液で４時間程度インキュベートした後、冷たいＰＢＳを１／１０の割合で添加して遠心分離させた後、上澄み液を収集した。このように得られた試料は、ＥＬＩＳＡ測定のために適正な濃度に希釈し、またＡβの標準溶液と適正な比率で混合してＡβ抗体がコーティングされたプレートに添加した後、３時間反応させた。以後、ホースラディシュペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＨＲＰ）が標識された２次抗体で１時間処理した後、ＴＭＢ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｓｉｄｉｎｅ）で発色させて、前記反応物の吸光度を４５０ｎｍ波長で測定した。また、ＧＣＰ−ＩＩ抑制剤が正しく処理されたのかどうか確認するために、前記マウス脳組織の一部分を切開してＧＣＰ−ＩＩ活性を測定した。具体的に、マウス脳組織からＧＣＰ−ＩＩが存在する細胞膜層を分離した後、それを５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液で粉砕した後、超遠心分離器（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）を使用して１，０００，０００ｇで遠心分離した後、その上澄み液を収集した。このように得た細胞膜層で１０ｕｇのタンパク質を同位元素（３Ｈ）が標識されたＮＡＡＧ（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ａｓｐａｒｔｙｄｙｌ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ）と混合して３７℃で培養し、これをＡＧ−１Ｘ８陰イオン交換樹脂（ａｎｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｒｅｓｉｎ）が満たされた９６−ウェルスピンカラムを通じて１，０００ｇで遠心分離した後、０．５Ｍギ酸塩でＧＣＰ−ＩＩによって切られたグルタミン酸塩を分離した。このように、分離した試料は、同位元素定量計を使用してＧＣＰ−ＩＩの活性度を測定した。
【００９６】
図１２Ａのように、実験群及び対照群マウスの大脳皮質に存在するＡβ４０及びＡβ４２の量を各々ＥＬＩＳＡで測定した結果、形質転換マウスの大脳皮質組職に存在するＡβ４０の量は、ＧＣＰ−ＩＩ抑制剤である２−ＰＭＰＡを処理した実験群と処理しない対照群のすべてで統計的に有意な差を示さない一方、Ａβ４２の量は対照群に比較して実験群で約３０％増加した。ここで、野生型マウス（ＷＴ）では、Ａβ４０及びＡβ４２がほとんど検出されなかった。また、痴呆症モデルマウスに処理された２−ＰＭＰＡが、ＧＣＰ−ＩＩ活性を抑制するのかどうかを調査した結果、図１２Ｂのように野生型マウス（ＷＴ）では約５０％、形質転換マウスでは約３０％有意性をもってＧＣＰ−ＩＩ活性を減少させた。これは、ＧＣＰ−ＩＩ抑制剤が脳でのＧＣＰ−ＩＩ活性を抑制させるということを意味する。
【００９７】
したがって、ＧＣＰ−ＩＩ抑制剤である２−ＰＭＰＡによってＧＣＰ−ＩＩ活性が抑制される場合、それによりＧＣＰ−ＩＩによるＡβ切断が抑制されることでＡβ４２の量が増加することが分かる。すなわち、ＧＣＰ−ＩＩが脳でのＡβ分解に関与することを示した重要な結果である。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
前記で詳しくみたように、本発明のＡβを分解する新しいタンパク質分解酵素であるＧＣＰ−ＩＩは、Ａβのモノマー及びオリゴマー形態だけではなく、溶解性及び不溶性形態、そして凝集された形態に変換されたＡβも分解するということを確認することにより、アルツハイマー病治療、ダウン症候群、アミロイド症のための薬物開発及び遺伝子治療に応用することができる。
【００９９】
当業界の当業者は、前記記載の概念及び特別な実施態様を認識することができ、本発明と同一な目的を遂行するために、それを基に変形または設計による実施態様のために利用することができる。また、当業界の当業者は、同一な実施態様が請求項に明確に記載された本願発明の精神および領域から逸脱しないことを認識できる。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
本発明の優先的な実施態様の適用は、添付の図を基準に良く理解される。
【０１０１】
【図１】ＧＣＰ−ＩＩが過発現された細胞でＡβの分解程度をＮＥＰ（ｎｅｐｒｉｌｙｓｉｎ）またはＩＤＥ（ｉｎｓｕｌｉｎ  ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）が過発現された細胞を通じて比較した結果で、図１のＡはＧＣＰ−ＩＩ及びＮＥＰとＩＤＥを過発現させたＨＥＫ２９３細胞に合成されたＡβ４０を反応させた後、ＥＬＩＳＡ分析キット（ＩＢＬ）を使用して培地に残っているＡβの量を測定した結果を示したものであり、図１のＢは前記と同一な細胞に合成されたＡβ４２を反応させた後、培地に残っているＡβ４２の量を測定した結果を示したものであり、図１のＣはＨＥＫ２９３細胞で抗−ＧＣＰ−ＩＩまたは抗−ＮＥＰ抗体でウエスタンブロットを遂行してＧＣＰ−ＩＩ及びＮＥＰの発現程度を示した図である。
【図２】レンチウイルス（Ｌｅｎｔｉ−ｖｉｒｕｓ）を使用して、ＧＣＰ−ＩＩを過発現させた大脳皮質細胞からＡβが分解される程度のＥＬＩＳＡ分析結果を示したグラフである。
【図３】細胞内で生理的に発現されるＧＣＰ−ＩＩが除去された細胞培養液で蓄積されたＡβ量をＲＮＡｉ方法で測定した結果で、図３のＡはＧＣＰ−ＩＩを除去した安定的な細胞（ｋｎｏｃｋ−ｄｏｗｎ  ｓｔａｂｌｅ  ｃｅｌｌ）からｓｉＧＣＰ−ＩＩ遺伝子配列を使用してＧＣＰ−ＩＩの発現減少有無をＲＴ−ＰＣＲを使用して確認した結果を示したものであり、図３のＢは前記ｓｉＧＣＰ−ＩＩを除去した安定的な細胞と合成されたＡβを反応させた後、ＥＬＩＳＡ分析で培地内に残っているＡβの量を測定した結果を示した図である。
【図４】組換えＧＣＰ−ＩＩ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＧＣＰ−ＩＩ，以下「ｒＧＣＰ−ＩＩ」と略称する）に関するもので、図４のＡは昆虫細胞（Ｓｆ２１）を使用してＧＣＰ−ＩＩを精製してクマシー染色及びウエスタンブロットで示した図であり、図４のＢは精製したｒＧＣＰ−ＩＩの酵素活性を示すＫｍ値を測定した結果を示したグラフである。
【図５】ｒＧＣＰ−ＩＩがＡβを分解するアミノ酸配列をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを使用して解明した結果で、図５のＡはＡβだけをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで分析した結果を示したグラフであり、図５のＢないし５ＤはｒＧＣＰ−ＩＩ濃度によってＡβ４０（１００ｕｇ／ｌ）と反応させたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析結果を示したグラフであり、図５のＥはｒＧＣＰ−ＩＩを煮沸後、Ａβ４０と反応させることでＡβ４０の分解がｒＧＣＰ−ＩＩの酵素活性に起因することを示した結果である。
【図６】ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析結果ｒＧＣＰ−ＩＩによって形成されるＡβ分解産物に関するもので、図６のＡはｒＧＣＰ−ＩＩによるＡβの分解位置を示すものであり、図６のＢはＡβがＧＣＰ−ＩＩによって分解されて生産されるさまざまな分解産物を図式化したものである。
【図７】ｒＧＣＰ−ＩＩの基質特異性を明らかにするためにインシュリンβ−チェーン、アミルリン及びＡＣＴＨ（Ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｃ  Ｈｏｒｍｏｎｅ）と反応させた結果で、図７のＡはインシュリンβ−チェーンのみをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで分析した結果を示したグラフで、図７のＢはｒＧＣＰ−ＩＩとインシュリンβ−チェーンを反応させた後のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析結果を示したグラフで、図７のＣはＡＣＴＨのみをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで分析した結果を示したグラフで、図７のＤはｒＧＣＰ−ＩＩとＡＣＴＨを反応させた後にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで分析した結果を示したグラフで、図７のＥはアミルリンのみをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで分析した結果を示したグラフで、図７のＦはｒＧＣＰ−ＩＩとアミルリンを反応させた後にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで分析した結果を示したグラフである。
【図８】ｒＧＣＰ−ＩＩが細胞から分泌したＡβを分解するのかどうかを解明した結果で、図８のＡはＡβを過量で形成するｓｗＡＰＰ（Ｓｗｅｄｉｓｈ  ｍｕｔａｎｔ  ＡＰＰ）過発現安定細胞株でＡＰＰの発現程度を示した結果であり、図８のＢは前記細胞の培養液を集めた後、ｒＧＣＰ−ＩＩと反応させてＥＬＩＳＡ分析で残ったＡβの量を示したグラフである。
【図９】多様な形態のＡβがｒＧＣＰ−ＩＩによって分解されることを示した結果で、図９のＡはｒＧＣＰ−ＩＩの濃度によるオリゴマーＡβ及びモノマーＡβの分解を示すウエスタンブロット結果であり、図９のＢはオリゴマーＡβ及びモノマーＡβの分解実験を５回以上実施してそのウエスタンブロット結果をイメージ分析プログラムを使用して定量した結果を示したグラフである。
【図１０】溶解性Ａβ及び不溶性ＡβがＧＣＰ−ＩＩによって分解されることを示した結果で、図１０のＡは溶解性Ａβ及び不溶性Ａβの分解を示す結果であり、図１０のＢはＧＣＰ−ＩＩによって溶解性Ａβ及び不溶性Ａβが分解されることを図式化したものである。
【図１１】ｒＧＣＰ−ＩＩと凝集されたＡβを反応させた後、変化した凝集Ａβの量をコンゴレッド（ｃｏｎｇｏ−ｒｅｄ）方法を使用して示したグラフである。
【図１２】Ａβを過発現させた形質転換動物及び対照群でＧＣＰ−ＩＩ抑制剤である２−ＰＭＰＡ処理後、Ａβの分解能を示した結果で、図１２のＡはＡβを過発現させた実験群及び対照群の大脳皮質に存在するＡβ４０及びＡβ４２の量をＥＬＩＳＡで測定した結果であり、図１２のＢはＡβを過発現させた実験群及び対照群でのＧＣＰ−ＩＩ抑制剤（２−ＰＭＰＡ）によるＧＣＰ−ＩＩ活性変化を示したグラフである。
【配列表フリーテキスト】
【０１０２】
配列番号１は、ヒトＧＣＰ−ＩＩをコードする塩基配列である。
配列番号２は、ヒトＧＣＰ−ＩＩをコードするアミノ酸配列である。
配列番号３は、ヒトＧＣＰ−ＩＩｃＤＮＡをｐＥＦ１／ＭｙｃベクターにクローニングするためにＰＣＲ反応に使用したフォワードプライマー配列である。
配列番号４は、ヒトＧＣＰ−ＩＩｃＤＮＡをｐＥＦ１／ＭｙｃベクターにクローニングするためにＰＣＲ反応に使用したリバースプライマー配列である。
配列番号５は、ヒトＧＣＰ−ＩＩｃＤＮＡをｐＳＧ５ベクターにクローニングするためにＰＣＲ反応に使用したフォワードプライマー配列である。
配列番号６は、ヒトＧＣＰ−ＩＩｃＤＮＡをｐＳＧ５ベクターにクローニングするためにＰＣＲ反応に使用したリバースプライマー配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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