(57)【要約】  本発明は、反応性色素とケラチン結合ポリペプチドとを含有するケラチン結合エフェクター分子、および毛髪着色調製物中におけるその使用に関する。本発明は、毛髪を染める方法にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)少なくとも1種の反応性色素(i)と、
(b)少なくとも1種のケラチン結合ポリペプチド(ii)と
を含むケラチン結合エフェクター分子。
【請求項２】
前記ケラチン結合ポリペプチド(ii)が、ヒト毛髪ケラチン、爪ケラチンまたは皮膚ケラチンに対して結合親和性を有する、請求項１に記載のケラチン結合エフェクター分子。
【請求項３】
使用される前記ケラチン結合ポリペプチド(ii)が、
(a)配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170により示される配列の少なくとも1つを含み、または
(b)配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170により示される配列の少なくとも1つと少なくとも40％同一でありかつケラチンに結合することができるポリペプチドに相当する、請求項１または２に記載のケラチン結合エフェクター分子。
【請求項４】
使用される前記ケラチン結合ポリペプチド(ii)が、
(a)配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170に示される配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子、
(b)配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、145、149、152、159、161、163、165、167または169に示される配列の少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む核酸分子、
(c)配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170の配列により示されるポリペプチドをコードする核酸分子、
(d)配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、145、149、152、159、161、163、165、167または169により示される配列の少なくとも1つに相当する核酸配列を有する核酸分子、またはこの核酸分子から置換、欠失または挿入によって誘導される、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170により示される配列の少なくとも1つと少なくとも40％同一でありかつケラチンに結合することができるポリペプチドをコードする核酸分子、
(e)(a)〜(c)に記載の核酸分子によりコードされるポリペプチドに対するモノクローナル抗体によって認識されるポリペプチドをコードする核酸分子、
(f)ストリンジェントな条件下で(a)〜(c)に記載の核酸分子とハイブリダイズする、ケラチン結合タンパク質をコードする核酸分子、および
(g)ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、少なくとも15ヌクレオチドを含む(a)〜(c)に記載の核酸分子またはその部分断片をプローブとして使用してDNAバンクから単離することができる、ケラチン結合タンパク質をコードする核酸分子、
(h)配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170に示されるアミノ酸配列の1つを逆翻訳することによって生成することができる核酸分子
からなる群から選択される少なくとも1つの核酸分子を含む核酸分子によりコードされる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のケラチン結合エフェクター分子。
【請求項５】
前記反応性色素(i)が、
(a)アルカリ性条件下で活性化可能な式1：
【化１】
2009523706.tif 000518
の基[式中、
【化２】
2009523706.tif 000519
は、色素分子(D)への結合を意味し、
Xは、電子求引基であり、またはアルキル、-O-アルキル、シアノ、ヒドロキシ、ハロゲン基もしくはHであり、
kは、1、2または3であり、
nは、0または1であり、
Bは、基CH=CH2または基CH2-CH2-Qまたは-NH-CH2-CH2-Qまたは-NH-CH=CH2(式中、Qは、アルカリ性条件下で切断可能な基である)である]、
(b)式2：
【化３】
2009523706.tif 000520
のアクリルアミドアンカー[式中、
【化４】
2009523706.tif 000521
は、色素分子Dへの結合を意味する]、
(c)式3、4または5：
【化５】
2009523706.tif 000522
により示される化合物の1つ[式中、
【化６】
2009523706.tif 000523
は、色素分子(D)への結合を意味し、
Vは、フッ素または塩素であり、
U1、U2は、互いに独立に、フルオロ、クロロまたは水素であり、
Q1、Q2は、互いに独立に、クロロ、フルオロ、シアナミド、ヒドロキシ、(C1〜C6)-アルコキシ、フェノキシ、スルホフェノキシ、メルカプト、(C1〜C6)-アルキルメルカプト、ピリジノ、カルボキシピリジノ、カルバモイルピリジノ、または一般式(6)もしくは(7)の基
【化７】
2009523706.tif 000524
(式中、R2は、水素、または(C1〜C6)-アルキル、スルホ-(C1〜C6)-アルキル;または非置換かもしくは(C1〜C4)-アルキル、(C1〜C4)-アルコキシ、スルホ、ハロゲン、カルボキシ、アセトアミド、ウレイドによって置換されたフェニルであり、
R3およびR4は、互いに独立に、R2の意味の1つを有するか、あるいは一般式(8)の基
【化８】
2009523706.tif 000525
であるか、または式-(CH2)j-(式中、jは4または5である)、または-(CH2)2-E-(CH2)2-(式中、Eは酸素、硫黄、スルホ、-NR5-(式中、R5'=(C1〜C6)-アルキルである)である)の環系を形成し、
Wは、非置換かもしくは(C1〜C4)-アルキル、(C1〜C4)-アルコキシ、カルボキシ、スルホ、クロロ、ブロモなどの1個または2個の置換基によって置換されたフェニレンであり;または酸素、硫黄、スルホ、アミノ、カルボニル、カルボンアミドによって中断されていてもよい(C1〜C4)-アルキレン-アリーレンまたは(C2〜C6)-アルキレンであり;または非置換かもしくは(C1〜C4)-アルキル、(C1〜C4)-アルコキシ、ヒドロキシ、スルホ、カルボキシ、アミド、ウレイドまたはハロゲンによって置換されたフェニレン-CONH-フェニレンであり;または非置換かもしくは1個または2個のスルホ基によって置換されたナフチレンであり、
Zは、基CH=CH2または基CH2-CH2-Qまたは-NH-CH2-CH2-Qまたは-NH-CH=CH2(式中、Qはアルカリ性条件下で切断可能な基である)であり、
R24、R25およびR26は、(C1〜C4)-アルキルまたは(C1〜C4)-ヒドロキシアルキルであり、
B-は、硫酸水素塩、硫酸塩、フッ化物、塩化物、臭化物、二水素リン酸塩、一水素リン酸塩、リン酸塩、水酸化物または酢酸塩などのアニオンの等価物である)である]
からなる群から選択される少なくとも1種の反応性アンカーを有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のケラチン結合エフェクター分子。
【請求項６】
式1中における基Xの少なくとも1つが基SO3Hである、請求項５に記載のケラチン結合エフェクター分子。
【請求項７】
式1におけるBが、-CH=CH2、基-CH2-CH2-O-SO3H、または-CH2-CH2Clである、請求項４〜６のいずれか１項に記載のケラチン結合エフェクター分子。
【請求項８】
式1の前記活性化可能な基が、基-NH-、-N=N-、-NH-C(O)-、-NH-SO2-または-N(R)-(式中、Rはアルキルである)を介して前記色素分子(D)に結合している、請求項４〜７のいずれか１項に記載のケラチン結合エフェクター分子。
【請求項９】
前記色素(D)が、フタロシアニン系色素、アントラキノン色素、アゾ色素、ホルマザン色素、ジオキサジン色素、アクチジン色素、キサンテン色素、ポリメチン色素、スチルベン色素、硫黄色素、トリアリールメタン色素、ベンゾピラン色素、ジベンゾアントロン色素、およびこれらの色素の金属錯体から選択される、請求項８に記載のケラチン結合エフェクター分子。
【請求項１０】
式1における「n」が0である、請求項４〜９のいずれか１項に記載のケラチン結合エフェクター分子。
【請求項１１】
式1〜5に記載の前記反応性アンカーが、下記の基(1-1)〜(1-43)：
【化９】
2009523706.tif 000526
2009523706.tif 000527
から選択される少なくとも1種の反応性色素を含む、請求項５〜１０のいずれか１項に記載のケラチン結合エフェクター分子。
【請求項１２】
前記反応性色素(i)が、前記ケラチン結合ポリペプチド(ii)に、リンカー分子を介して間接的にカップリングしている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のケラチン結合エフェクター分子。
【請求項１３】
式9または10：
【化１０】
2009523706.tif 000528
[式中、「n」は、0〜40の整数である]に記載のリンカー分子(iii)が使用されている、請求項１２に記載のケラチン結合エフェクター分子。
【請求項１４】
毛髪着色剤中での、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のケラチン結合エフェクター分子の使用。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のケラチン結合エフェクター分子を含む毛髪着色剤。
【請求項１６】
(a)少なくとも1種のケラチン結合ポリペプチド(ii)と、
(b)反応性色素(i)または色素と
を含む、少なくとも1種のケラチン結合エフェクター分子を使用する、毛髪または皮膚を着色する方法。
【請求項１７】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の前記ケラチン結合エフェクター分子の少なくとも1種を使用する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
染色が可逆的であり、
i. ケラチン結合ポリペプチド、または
ii. 皮膚ケラチンもしくは毛髪ケラチン、または
iii. 界面活性剤
を含む溶液での処理による置換反応において、前記ケラチン結合エフェクター分子が皮膚または毛髪から除去される、請求項１６または１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、反応性色素とケラチン結合ポリペプチドとを含むケラチン結合エフェクター分子、毛髪着色調製物中におけるそれらの使用、および毛髪着色調製物そのものに関する。本発明は、さらに毛髪を着色する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
毛髪着色用組成物(毛髪着色剤)は、色の耐性によって3種類のクラスに分けられる。それらは、1〜2回の洗髪の間のみ持続する一時的毛髪着色剤、8〜10回の洗髪の後に繰り返さなくてはならない半持続的毛髪着色剤、および洗い流すことができない持続的毛髪着色剤である。
【０００３】
一時的および半持続的毛髪着色剤は、非酸化性と称される。この場合、色素は毛髪のケラチンに付着するか、または毛髪繊維に浸透する。間違いなく最も一般に普及した毛髪着色剤である持続的毛髪着色剤の場合、酸化剤としての役割を果たす過酸化水素の存在下で、化学反応の結果として無色の前駆体から色が毛髪上または毛髪内に直接形成される。ここでは、毛髪は完全に着色され、色を洗い流すことができない。これらの毛髪着色剤は、酸化性毛髪着色剤と称される。
【０００４】
持続的毛髪着色は、毛髪洗浄、光の作用および他の毛髪処理方法に対し極めて耐性を示す。それらは、最も一般に普及しており、毛髪着色剤の中で約80％の市場占有率を有する。ただ毛髪の成長によってほぼ毎月追加する必要がある。この着色系では、未着色の中間体または前駆体が受ける化学反応の結果として、毛髪上および毛髪中に色素が直接形成される。アンモニアまたはモノエタノールアミンの存在下で過酸化水素によってもたらされる酸化反応、カップリング過程および凝縮がここで起こる。したがって、過酸化水素は色素形成を開始させるだけでなく、同時に毛髪中のメラニン色素を破棄し、それによって漂白がもたらされる(このためにこの着色手順は淡色化着色とも称される)ため、酸化剤として過酸化水素の使用が必要である。基本的には持続的毛髪着色剤には、空気中の酸素によってでさえも酸化されるいわゆる自己酸化色素も含まれる。
【０００５】
毛髪着色剤は通常、水溶液、好ましくは粘稠溶液、またはエマルジョンの形態であり、色素に加えて、例えば、脂肪アルコールおよび/または他の油性成分、乳化剤および界面活性剤、ならびに適切な場合はアルコールを含む。
【０００６】
酸化毛髪着色剤は一般に、2種の成分、すなわち
(A)色素を含む色素担体塊および
(B)酸化剤調製物
からなる。
【０００７】
これらの成分は、塗布の直前に混合し、次いで染める予定の繊維に塗布する。このような持続的または酸化毛髪着色剤の従来通りの塗布形態は、クリームヘアカラーおよび毛髪着色ゲルである。
【０００８】
研究によると、工業国の女性の35％および男性の10％は、定期的に毛髪を染める。しかし、健康上のリスクが払拭されないため、化学的ヘアカラーは長い間論争の的であった。
【０００９】
したがって、毛髪着色のたびに毛髪へのダメージも同時に起こる。着色顔料は、保護的な(predective)鱗状層を通して毛髪の表層に組み込まれなくてはならない。
【００１０】
上記ですでに説明したように、ヘアカラーは2種の成分、酸化剤および着色クリームを含む。ヘアカラー中にある芳香族アミンは、特に最近批判を受けてきた。着色の間、これらは頭部を通って身体に入り、肝臓内で分解される。次いで、膀胱において分解産物が発癌物質に変化する場合がある。
【００１１】
"International Journal of Cancer" (A. Andres: Int J Cancer 2004; 109: 581-586)におけるダートマス医科大学による最近の研究によって、毛髪着色と膀胱癌との関連の可能性が認識されている。持続的毛髪着色剤を定期的に使用する女性は、毛髪を染めていない女性より、膀胱癌となる危険性が平均して1.5〜2.3倍増加する。
【００１２】
その許容性に関してこれまで試験されていない持続的ヘアカラーは、将来EUにおいて禁止される予定である。現時点では、これによって全ての毛髪着色剤の半分が影響を受けるであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、皮膚または毛髪に塗布するための、特に皮膚、毛髪または爪を着色するための新しいタイプの皮膚化粧料活性成分化合物、およびそれらを生成する方法を提供することであった。好都合には、ケラチン結合特性を有し、さらに化粧用組成物および/または毛髪着色剤を製造するのに適切である活性成分化合物が明らかになるであろう。さらに、共有結合を介してケラチン結合特性を有するポリペプチドにカップリングすることができる適切な化合物を明らかにすることが本発明の1つの目的であった。特に、本発明の1つの目的は、毛髪の着色、好ましくは毛髪へのダメージができるだけ小さい可逆的着色をするための革新的な方法を提供することであった。
【００１４】
驚いたことに、これらの目的は下記で説明するように、化学的色素をケラチン結合ポリペプチドにカップリングすることによって達成することができた。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
第1の実施形態では、本発明は、(a)少なくとも1種の反応性色素(i)と、(b)少なくとも1種のケラチン結合ポリペプチド(ii)とを含むケラチン結合エフェクター分子に関する。
【００１６】
好ましい実施形態では、特定のケラチン結合エフェクター分子は、ヒトの皮膚ケラチン、毛髪ケラチンまたは爪ケラチンに対して結合親和性を有する少なくとも1種のケラチン結合ポリペプチド(ii)を含む。
【００１７】
好ましくは、(b)で特定したケラチン結合ポリペプチド(ii)は、
(a)配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170に示される配列の1つを有する少なくとも1つのポリペプチド、または
(b)配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170により示される配列の少なくとも1つと少なくとも40％同一でありかつケラチンに結合することができるポリペプチドを含む。
【００１８】
好ましくは、本発明により使用されるケラチン結合ポリペプチド(ii)は、
(a)配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170に示される配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子、
(b)b)配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、145、149、152、159、161、163、165、167または169に示される配列の少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む核酸分子、
(c)配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98 100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170により示されるポリペプチドをコードする核酸分子、
(d)配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、145、149、152、159、161、163、165、167または169により示される配列の少なくとも1つに相当する核酸配列を有する核酸分子、またはこの核酸分子から置換、欠失または挿入によって誘導される、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170により示される配列の少なくとも1つと少なくとも40％同一であり、ケラチンに結合することができるポリペプチドをコードする核酸分子、
(e)(a)〜(c)に記載の核酸分子によりコードされるポリペプチドに対するモノクローナル抗体によって認識されるポリペプチドをコードする核酸分子、
(f)ストリンジェントな条件下で(a)〜(c)に記載の核酸分子とハイブリダイズする、ケラチン結合タンパク質をコードする核酸分子、
(g)ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、少なくとも15nt(ヌクレオチド)、好ましくは20nt、30nt、50nt、100nt、200ntまたは500ntを含む(a)〜(c)に記載の核酸分子またはその部分断片をプローブとして使用してDNAバンクから単離することができる、ケラチン結合タンパク質をコードする核酸分子、
(h)配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170に示されるアミノ酸配列の1つを逆翻訳することによって生成することができる核酸分子、
からなる群から選択される少なくとも1つの核酸分子を含む核酸分子によってコードされることが好ましい。
【００１９】
本発明のさらに好ましい実施形態では、特定のケラチン結合エフェクター分子は、
(a)アルカリ性条件下で活性化可能な式1：
【化１】
2009523706.tif 000002
【００２０】
の基[式中、
【化２】
2009523706.tif 000003
【００２１】
は、色素分子(D)への結合を意味し、
Xは、電子求引基であり、またはアルキル、-O-アルキル、シアノ、ヒドロキシ、ハロゲン基もしくはHであり、
kは、1、2または3であり、
nは、0または1であり、
Bは、基-CH=CH2または基-CH2-CH2-Qまたは-NH-CH2-CH2-Qまたは-NH-CH=CH2(式中、Qは、アルカリ性条件下で切断可能な基である)である]、
(b)式2：
【化３】
2009523706.tif 000004
【００２２】
のアクリルアミドアンカー[式中、
【化４】
2009523706.tif 000005
【００２３】
は、色素分子(D)への結合を意味する]、
(c)式3、4または5：
【化５】
2009523706.tif 000006
2009523706.tif 000007
【００２４】
による化合物の1つ[式中、
【化６】
2009523706.tif 000008
【００２５】
は、色素分子(D)への結合を意味し、
Vは、フッ素または塩素であり、
U1、U2は、互いに独立に、フルオロ、クロロまたは水素であり、
Q1、Q2は、互いに独立に、クロロ、フルオロ、シアナミド、ヒドロキシ、(C1〜C6)-アルコキシ、フェノキシ、スルホフェノキシ、メルカプト、(C1〜C6)-アルキルメルカプト、ピリジノ、カルボキシピリジノ、カルバモイルピリジノ、または一般式(6)もしくは(7)の基：
【化７】
2009523706.tif 000009
【００２６】
(式中、R2は、水素、または(C1〜C6)-アルキル、スルホ-(C1〜C6)-アルキル;または非置換かもしくは(C1〜C4)-アルキル、(C1〜C4)-アルコキシ、スルホ、ハロゲン、カルボキシ、アセトアミド、ウレイドによって置換されたフェニルであり、
R3およびR4は、互いに独立に、R2の意味の1つを有するか、あるいは一般式(8)の基
【化８】
2009523706.tif 000010
【００２７】
であるか、または式-(CH2)j-(式中、jは4または5である)、または-(CH2)2-E-(CH2)2-(式中、Eは酸素、硫黄、スルホ、-NR5-(式中、R5'=(C1〜C6)-アルキル)である)の環系を形成し、
Wは、非置換かもしくは(C1〜C4)-アルキル、(C1〜C4)-アルコキシ、カルボキシ、スルホ、クロロ、ブロモなどの1個または2個の置換基によって置換されたフェニレンであり;または酸素、硫黄、スルホ、アミノ、カルボニル、カルボンアミドによって中断されていてもよい(C1〜C4)-アルキレン-アリーレンまたは(C2〜C6)-アルキレンであり;または非置換かもしくは(C1〜C4)-アルキル、(C1〜C4)-アルコキシ、ヒドロキシ、スルホ、カルボキシ、アミド、ウレイドまたはハロゲンによって置換されたフェニレン-CONH-フェニレンであり;または非置換かもしくは1個または2個のスルホ基によって置換されたナフチレンであり、
Zは、基-CH=CH2または基-CH2-CH2-Qまたは-NH-CH2-CH2-Qまたは-NH-CH=CH2(式中、Qはアルカリ性条件下で切断可能な基である)であり、
R24、R25およびR26は、(C1〜C4)-アルキルまたは(C1〜C4)-ヒドロキシアルキルであり、
B-は、硫酸水素塩、硫酸塩、フッ化物、塩化物、臭化物、二水素リン酸塩、一水素リン酸塩、リン酸塩、水酸化物または酢酸塩などのアニオンの等価物である)である]
からなる群から選択される少なくとも1種の反応性アンカーを有する少なくとも1種の反応性色素(ii)を含む。
【００２８】
本発明のさらに好ましい実施形態では、ケラチン結合エフェクター分子は、式1(そのなかにある基の少なくとも1つが基SO3Hである)による反応性アンカーを含む反応性色素を含む。
【００２９】
さらに、本発明は好ましくは、式1(式1のBは、CH=CH2、基CH2-CH2-O-SO3HまたはCH2-CH2CLである)による反応性アンカーを含む反応性色素を含むケラチン結合エフェクター分子に関する。
【００３０】
本発明によれば、アルカリ性条件下で活性化可能な式1の基が、基-NH-、-N=N-、-NH-C(O)-、-NH-SO2-または-N(R)-(式中、Rはアルキルである)を介して、色素分子(D)に結合している、上記のケラチン結合エフェクター分子が好ましい。特に好ましい実施形態では、それらは、フタロシアニン系色素、アントラキノン色素、アゾ色素、ホルマザン色素、ジオキサジン色素、アクチジン色素、キサンテン色素、ポリメチン色素、スチルベン色素、硫黄色素、トリアリールメタン色素、ベンゾピラン色素、ジベンゾアントロン色素およびこれらの色素の金属錯体の群から選択される色素を含むケラチン結合エフェクター分子である。
【００３１】
本発明によれば、下記の基(1-1)〜(1-43)から選択された反応性アンカーを含む少なくとも1種の反応性色素を含むケラチン結合エフェクター分子もまた好ましい：
【化９】
2009523706.tif 000011
2009523706.tif 000012
2009523706.tif 000013
【００３２】
本発明は、反応性色素(i)が、リンカー分子を介してケラチン結合ポリペプチド(ii)に間接的にカップリングしているケラチン結合エフェクター分子を提供することがまた好ましい。
【００３３】
本発明により好ましいケラチン結合エフェクター分子の場合、色素または反応性色素は、式9または10：
【化１０】
2009523706.tif 000014
【００３４】
[式中、「n」は、0〜40の整数である]により示されるリンカー分子(iii)を介してケラチン結合ポリペプチドにカップリングしている。
【００３５】
本発明は、皮膚着色剤、毛髪着色剤または装飾用化粧品における上記のケラチン結合エフェクター分子の使用をさらに提供する。
【００３６】
さらに、本発明は、上記の本発明によるケラチン結合エフェクター分子の少なくとも1種を含む皮膚着色剤、爪着色剤および/または毛髪着色剤、好ましくは毛髪着色剤に関する。
【００３７】
本発明は、(a)少なくとも1種のケラチン結合ポリペプチド(ii)と、(b)色素または反応性色素(i)とを含むケラチン結合エフェクター分子を使用した、毛髪、皮膚または爪を着色する方法をさらに提供する。
【００３８】
本発明の方法の特に好ましい実施形態では、本発明による上記で定義したケラチン結合エフェクター分子を使用する。
【００３９】
毛髪、皮膚または爪を着色するための上記の方法の特に好ましい実施形態では、(i)ケラチン結合ポリペプチドまたは(ii)ケラチン含有溶液による処理によって、ケラチン結合エフェクター分子が、置換反応において毛髪ケラチン、皮膚ケラチンまたは爪ケラチンから置換される、あるいは高い界面活性剤含量の溶液(例えば、SDS)によってケラチン結合エフェクター分子が皮膚、毛髪または爪から取り除かれる可逆的方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
定義
本明細書と関連して、「アミノ官能基担持エフェクター分子」、「アミノ官能基」とは、前記アミノ官能基担持分子がアミド結合を介して他の分子と共有結合することを可能にするアミノ基を意味する。本発明の目的での「アミノ官能基」は、アミノ官能基に化学変換することができるものでもある。ここで、本発明のエフェクター分子は少なくとも1つのアミノ官能基を有する。しかし、2つ、3つまたはそれを超えるアミノ官能基および/または第2級アミノ基を有するエフェクター分子を使用することも可能である。
【００４１】
本発明の目的での「抗体」とは、抗原(身体に対し異質である感染症病原体または生体物質)に対して保護するためにヒトおよび顎を有する脊椎動物が産生するタンパク質である。抗体はより高等な真核生物の免疫系において中心的な成分であり、白血球の一種であるB細胞により分泌される。抗体は血液中および組織の細胞外体液中にある。
【００４２】
「装飾用化粧品」は、主として手入れのためには使用されず、皮膚、毛髪、ならびに/または指の爪および足指の爪の外見の美化または改善のために使用される化粧用助剤を意味する。このタイプの助剤は、当業者であれば適切に知られており、例えば、コールペンシル、マスカラ、アイシャドウ、着色デイクリーム、パウダー、コンシーラースティック、ほお紅、リップスティック、リップライナースティック、メーキャップ、マニキュア液、グラマーゲルなどが含まれる。本発明の目的のために、それらは特に、皮膚、爪および/または毛髪を着色するのに適切な組成物である。
【００４３】
「毛髪着色剤」は、毛髪を着色する組成物または調製物(i)である。本発明の目的での「毛髪着色剤」は、直接染料および真のヘアカラーに分けられる。直接染料の場合、色を再び除くのに1回または複数回の洗髪で十分である(ティント)。色素は、毛髪物質の表面にのみ付着し、化学反応は起こらない。毛髪そのもののためには、この方法には危険性がない。真の(持続性)ヘアカラーは、酸化着色を使用する(「背景技術」もまた参照されたい)。毛髪着色剤は、化粧用として適合性のある媒体中に、当業者によく知られており、化粧品ハンドブック、例えば、Schrader, Grundlagen und Rezepturen der Kosmetika [Fundamentals and formulations of cosmetics], Huthig Verlag, Heidelberg, 1989, ISBN 3-7785-1491-1、またはUmbach, Kosmetik:Entwicklung, Herstellung und Anwendung kosmetischer Mittel [Cosmetics:development, manufacture and use of cosmetic compositions], 2nd extended edition, 1995, Georg Thieme Verlag, ISBN 3 13 712602 9に見出すことができる、適切な助剤および添加剤を含む。
【００４４】
本発明の目的での「エフェクター分子」とは、皮膚、毛髪または爪への特定の予見できる効果、好ましくは色の変化および/または手入れ効果または化粧用としての装飾効果を有する分子を意味する。好ましくは、エフェクター分子は、例えば、表3、表5および表6において示されているような色素である。
【００４５】
本発明の目的での「ケラチン」とは、ロープ様タンパク質複合体で構成される中間径フィラメントを意味する。中間径フィラメントは、平行に配置された同じタイプ(モノマー)の多くのタンパク質で構成され、チューブ様の構造をしている。中間径フィラメントは、結合し、比較的大きい束となる(張原繊維)。中間径フィラメントは、微小管およびアクチンフィラメントと共に細胞の細胞骨格を形成する。中間径フィラメントには5種類のタイプ区別がある。酸性ケラチンおよび塩基性ケラチン、デスミン、ニューロフィラメントならびにラミンである。本発明の目的のために特に好ましいのは、上皮(多細胞動物生物体の外側の体表全てを覆う単層または多層の細胞層)中にある酸性ケラチンおよび塩基性ケラチンである。1種または複数の「ケラチン」(あるいは、角質物質、硬タンパク質)は、細胞の安定性と形状に関与するタンパク質を意味する。このタンパク質は、哺乳動物の皮膚、毛髪および爪の成分である。ケラチンの強度は、繊維形成により強化される。個々のアミノ酸鎖は、右巻きのα-ヘリックスを形成し、これらのへリックスは3個毎に左巻きのスーパーヘリックス(=プロトフィブリル)を形成する。11個のプロトフィブリルが集まって、ミクロフィブリルとなり、これらの集まりがまた束となり、マクロフィブリルを形成し、これが、例えば毛髪細胞を囲んでいる。
【００４６】
「ケラチン結合ポリペプチド」は、あるケラチンに結合する特性を有するポリペプチドまたはタンパク質を意味する。したがって、ケラチン結合ポリペプチドもまた、中間径フィラメントに関連したタンパク質である。これらのケラチン結合ポリペプチドは、ケラチンに対して、あるいはプロトフィブリル、ミクロフィブリルまたはマクロフィブリルなどのケラチンからなるマクロ構造に対して結合親和性を有する。さらに、ケラチン結合ポリペプチドは、哺乳動物の皮膚、毛髪、および/または指の爪もしくは足指の爪への結合親和性を有するポリペプチドを意味すると理解される。
【００４７】
「ケラチン結合ポリペプチド」はまた、哺乳動物生物体において、ケラチン、ケラチン繊維、皮膚または毛髪の結合と関連する生物学的機能を有するポリペプチドでもある。ケラチン結合ポリペプチドはまた、ケラチン、ケラチン繊維、皮膚、毛髪または爪への実際の結合に必要な結合モチーフまたはタンパク質ドメインも意味する。ケラチン結合ポリペプチド(ii)のケラチンへの結合は、実施例8、9および10に記載された条件下で試験することができる。ケラチン結合ポリペプチドは、上記の定量的ケラチン結合試験において、デスモプラキン(配列番号2)のケラチン結合能、好ましくはデスモプラキン(配列番号4)のケラチン結合ドメインBのケラチン結合能の約10％、20％、30％、40％または50％、好ましくは50％、60％、70％、80％または90％、特に好ましくは100％、125％、150％、特に非常に好ましくは200％、300％または400％、最も好ましくは500％、600％、700％または1000％またはそれ以上を有するポリペプチドである。
【００４８】
リンカー分子のエフェクター分子またはケラチン結合タンパク質への結合に関連した「カップリング」は、前記分子の共有結合を意味する。
【００４９】
「化粧用として適合性のある媒体」は、広義に理解するべきであり、化粧用または皮膚化粧用調製物の製造に適切な物質とこれらの混合物を意味する。それらは、好ましくはタンパク質と適合する媒体である。
【００５０】
ヒトおよび/または動物の皮膚組織または毛髪と接触する場合、「化粧用として適合性のある物質」は、刺激作用またはダメージをもたらさず、他の物質との不適合性を有さない。さらにこれらの物質は、僅かなアレルギーの可能性を有し、国の登録認定機関に化粧用調製物における使用を承認されている。これらの物質は、当業者によく知られており、例えば、化粧品ハンドブック、例えばSchrader, Grundlagen und Rezepturen der Kosmetika [Fundamentals and formulations of cosmetics], Huthig Verlag, Heidelberg, 1989, ISBN 3-7785-1491-1に見出すことができる。
【００５１】
「核酸」または「核酸分子」は、一本鎖または二本鎖の形態のセンスまたはアンチセンス配向の、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはそれらのポリマーもしくはハイブリッドを意味する。核酸または核酸分子という用語は、遺伝子、DNA、cDNA、mRNA、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを説明するために使用することができる。
【００５２】
「核酸配列」は、上記の定義による核酸分子のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの連続的で結合した配列を意味し、利用可能なDNA/RNA配列決定法を使用して確認することができ、ヌクレオチドを表す略語、文字または単語のリストで表されまたは示される。
【００５３】
本発明の目的での「ポリペプチド」とは、アミノ酸が、共にペプチド結合を介して線状に結合している、アミノ酸分子から構成される巨大分子を意味する。ポリペプチドは、いくつかのアミノ酸(約10個〜100個)で構成することが可能であるが、タンパク質も含まれる。タンパク質は、概ね少なくとも100個のアミノ酸から構成される。しかし、数千個のアミノ酸を含むことも可能である。好ましくは、ポリペプチドは、少なくとも20個、30個、40個または50個、特に好ましくは少なくとも60個、70個、80個または90個、特に非常に好ましくは少なくとも100個、125個、150個、175個または200個、最も好ましくは少なくとも200個超のアミノ酸を含むが、上限が数千個のアミノ酸でも可能である。
【００５４】
2つの核酸配列の間の「相同性」または「同一性」は、対象となる全配列長に亘る、核酸配列の同一性を意味すると理解され、これはプログラムアルゴリズムGAP(Wisconsin Package Version 10.0、University of Wisconsin、Genetics Computer Group(GCG)社製、Madison、USA;Altschul et al. (1997)Nucleic Acids Res. 25:3389ff)の補助により、下記のパラメーター設定により比較によって計算される：
ギャップ加重:50
長さ加重:3
平均マッチ:10
平均ミスマッチ:0。
【００５５】
例えば、核酸をベースとして配列番号1と少なくとも80％の相同性を有する配列は、上記の一連のパラメーターによる上記のプログラムアルゴリズムによって、配列番号1と比較した場合、少なくとも80％の相同性を有する配列を意味すると理解される。
【００５６】
2つのポリペプチド間の相同性は、対象となる全配列長に亘るアミノ酸配列の同一性を意味すると理解され、これはプログラムアルゴリズムGAP(Wisconsin Package Version 10.0、University of Wisconsin、Genetics Computer Group(GCG)社製、Madison、USA)の補助により、下記のパラメーター設定により比較によって計算される：
ギャップ加重:8
長さ加重:2
平均マッチ:2.912
平均ミスマッチ:-2.003。
【００５７】
例えば、ポリペプチドをベースとして配列番号2と少なくとも80％の相同性を有する配列は、上記の一連のパラメーターによる上記のプログラムアルゴリズムによって、配列番号2と比較した場合、少なくとも80％の相同性を有する配列を意味すると理解される。
【００５８】
「ハイブリダイゼーション条件」は、広義に理解すべきであり、適用によってストリンジェントまたはよりストリンジェントでないハイブリダイゼーション条件を意味する。このようなハイブリダイゼーション条件は、とりわけSambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al., in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pages 9.31-9.57) またはCurrent Predocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に記載されている。当業者であれば、特異的ハイブリダイゼーションと非特異的ハイブリダイゼーションとを区別することができるハイブリダイゼーション条件を選択するであろう。例えば、洗浄ステップの間の条件は、低ストリンジェントな条件(約2×SSC、50℃)、および高ストリンジェントな条件(約0.2×SSC、50℃、好ましくは65℃)から選択することができる(20×SSC:0.3Mのクエン酸ナトリウム、3MのNaCl、pH7.0)。さらに、洗浄ステップの間の温度は、室温である約22℃の低ストリンジェントな条件から、約65℃のより高ストリンジェントな条件に高めることができる。塩濃度および温度の両方のパラメーターを、同時に、またはいずれの場合にも他のパラメーターを一定に保ちながら個々に変更することができる。ハイブリダイゼーションの間、例えば、ホルムアミドまたはSDSなどの変性剤を使用することもできる。ハイブリダイゼーションを、50％ホルムアミドの存在下で、42℃で行うことが好ましい。ハイブリダイゼーションおよび洗浄ステップのいくつかの例示的な条件を下記に示す。
【００５９】
1. ハイブリダイゼーション条件を、例えば下記の条件から選択することができる：
(a)4×SSC、65℃、
(b)6×SSC、45℃、
(c)6×SSC、100μg/mlの変性し断片化された魚精子DNA、68℃、
(d)6×SSC、0.5％SDS、100μg/mlの変性したサケ精子DNA、68℃、
(e)6×SSC、0.5％SDS、100μg/mlの変性し断片化されたサケ精子DNA、50％ホルムアミド、42℃、
(f)50％ホルムアミド、4×SSC、42℃、または
(g)50％(容量/容量)ホルムアミド、0.1％ウシ血清アルブミン、0.1％フィコール、0.1％ポリビニルピロリドン、50mM リン酸ナトリウムバッファー(pH6.5)、750mM NaCl、75mM クエン酸ナトリウム、42℃、または
(h)2×または4×SSC、50℃(低ストリンジェントな条件)、
(i)30〜40％ホルムアミド、2×または4×SSC、42℃(低ストリンジェントな条件)
500mN リン酸ナトリウムバッファー(pH7.2、7％SDS(g/V)、1mM EDTA、10μg/mlの一本鎖DNA、0.5％BSA(g/V)(Church and Gilbert, Genomic sequencing. Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A.81:1991. 1984)。
【００６０】
2. 洗浄ステップは、例えば、下記の条件から選択することができる：
(a)0.015M NaCl/0.0015Mクエン酸ナトリウム/0.1％SDS、50℃
(b)0.1×SSC、65℃
(c)0,1×SSC、0.5％SDS、68℃
(d)0.1×SSC、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃
(e)0.2×SSC、0.1％SDS、42℃
(f)2×SSC、65℃(低ストリンジェントな条件)。
【００６１】
一実施形態では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、下記の通りに選択される：
ハイブリダイゼーションバッファーは、ホルムアミド、NaClおよびPEG6000を含むものを選択する。ハイブリダイゼーションバッファー中にホルムアミドがあることによって、二本鎖核酸分子が不安定化し、その結果としてハイブリダイゼーション温度は、ストリンジェント度を低下させずに42℃に低下させることができる。ハイブリダイゼーションバッファー中の塩の使用は、二本鎖の再生率またはハイブリダイゼーション効率を増加させる。PEGは、溶液の粘度を増加させるが、これは再生率に悪影響を有し、溶液中にポリマーがあることによって、残りの培地中のプローブの濃度が増加し、それによってハイブリダイゼーション率が増加する。バッファーの組成は下記の通りである：
【表１】
2009523706.tif 000015
【００６２】
42℃で一晩ハイブリダイゼーションを行う。フィルターを翌朝3回、いずれの場合にも2×SSC+0.1％SDSで約10分間洗浄する。
【００６３】
明細書と関連して、「ヒドロキシ官能基担持エフェクター分子」、「ヒドロキシ官能基」は、これらのOH基を担持する分子がエステル化反応を介して他の分子と共有結合することを可能にする遊離OH基またはヒドロキシル基を意味する。本発明の目的での「ヒドロキシ官能基」はまた、OH官能基(例えば、メトキシ、エトキシなどの誘導体)に化学変換することができるものである。ここで本発明のエフェクター分子は、少なくとも1つのヒドロキシル基を有する。しかし、2つ、3またはそれ以上のヒドロキシ官能基を有するエフェクター分子を使用することも可能である。
【００６４】
「カップリング官能基」は、エフェクター分子またはケラチン結合タンパク質の官能基と共有結合できる、リンカー分子の官能基である。言及することのできる非限定的な例としては、ヒドロキシ基、カルボキシル基、チオ基およびアミノ基である。「(複数の)カップリング官能基」または「カップリング官能基」および「(複数の)アンカー基」または「アンカー基」は、同意語として使用する。
【００６５】
本発明の目的での「反応性色素」とは、共有結合を介してケラチン結合ポリペプチドとカップリングすることができる少なくとも1種の反応性アンカーを含む色素を意味する。
【００６６】
本発明の目的での「反応性アンカー」とは、化学的官能基または基を意味し、これによって、反応性色素分子の炭素原子もしくはリン原子と、他の分子のヒドロキシ基、アミノ基またはチオール基の酸素原子、窒素原子もしくは硫黄原子との共有結合が実現する。
【００６７】
「アルカリ性条件下で切断可能な基Q」とは、アルカリ性条件下、すなわち7またはそれを上回るpH、好ましくは7.5またはそれを上回るpHで切断され、脱離およびビニルスルホン基の形成を伴う基を意味すると理解される。このような基の例は、ハロゲン(例えば、クロロ、ブロモまたはヨード)、また-O-SO3H、-S-SO3H、ジアルキルアミノ、第四級アンモニウム基(例えば、トリ-C1〜C4-アルキルアンモニウム、ベンジルジ-C1〜C4-アルキルアンモニウムなど)またはN-結合ピリジニウム、および式R3S(O)2-、R4S(O)2-O-、R5C(O)-O-の基である。ここで、R3、R4およびR5は、互いに独立に、アルキル、ハロアルキルまたは場合により置換されたフェニルであり、R5は水素でもよい。好ましくは、Qは、基-O-(CO)CH3、特に-O-SO3Hである。
【００６８】
本発明の目的での「可逆的着色」とは、本発明の方法を使用して実現する、元に戻すことができる、皮膚ケラチン、毛髪ケラチンまたは爪ケラチンの色の変化を意味する。
【００６９】
本発明の目的での「逆翻訳」とは、タンパク質配列の、そのタンパク質をコードしている核酸配列への翻訳を意味する。したがって逆翻訳は、アミノ酸配列を、それに相当する核酸配列へと解読する方法である。従来の方法は、コンピュータを使った配列比較により得た、個々のタイプのコドン使用頻度表の作製に基づいている。コドン使用頻度表を使用して、特定のタイプの特定のアミノ酸に最も頻繁に使用されるコドンを決定することができる。タンパク質の逆翻訳は、当業者には公知であり、かつこの目的のために特に作製されたコンピュータアルゴリズムを使用して行うことができる(Andres Moreira and Alejandro Maass. TIP:protein backtranslation aided by genetic algorithms. Bioinformatics, Volume 20, Number 13 Pp. 2148-2149 (2004);G Pesole, M Attimonelli, and S Liuni. A backtranslation method based on codon usage strategy. Nucleic Acids Res. 1988 March 11;16(5 Pt A):1715〜1728.)。
【００７０】
本発明は、(a)少なくとも1種の反応性色素(i)と、(b)少なくとも1種のケラチン結合ポリペプチド(ii)とを含むケラチン結合エフェクター分子を提供する。
【００７１】
好ましい実施形態では、特定のケラチン結合エフェクター分子は、ヒトの皮膚ケラチン、毛髪ケラチンまたは爪ケラチンに対して結合親和性を有する少なくとも1種のケラチン結合ポリペプチド(ii)を含む。本発明によって適切なケラチン結合ポリペプチドドメインは、例えば、デスモプラキン、プラコフィリン、プラコグロビン、プレクチン、ペリプラキン、エンボプラキン、トリコヒアリン、エピプラキンまたは毛包のタンパク質のポリペプチド配列中に存在する。
【００７２】
好ましくは、(b)で特定したケラチン結合ポリペプチド(ii)は、
(c)配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170に示される配列の1つを有する少なくとも1つのポリペプチド、または
(d)配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170により示される配列の少なくとも1つと少なくとも40％同一でありかつケラチンに結合することができるポリペプチドを含む。
【００７３】
好ましくは、特定のケラチン結合エフェクター分子は、核酸分子によってコードされ、
(c)配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170に示される配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子、
(d)b)配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、145、149、152、159、161、163、165、167または169に示される配列の少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む核酸分子、
(c)配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170により示されるポリペプチドをコードする核酸分子、
(j)配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、145、149、152、159、161、163、165、167または169により示される配列の少なくとも1つに相当する核酸配列を有する核酸分子、またはこの核酸分子から置換、欠失または挿入によって誘導される、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170により示される配列の少なくとも1つと少なくとも40％同一でありかつケラチンに結合することができるポリペプチドをコードする核酸分子、
(k)(a)〜(c)に記載の核酸分子によりコードされるポリペプチドに対するモノクローナル抗体によって認識されるポリペプチドをコードする核酸分子、
(l)ストリンジェントな条件下で(a)〜(c)に記載の核酸分子とハイブリダイズする、ケラチン結合タンパク質をコードする核酸分子、
(m)ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、少なくとも15nt、好ましくは20nt、30nt、50nt、100nt、200ntまたは500ntを含む(a)〜(c)に記載の核酸分子またはその部分断片をプローブとして使用してDNAバンクから単離することができる、ケラチン結合タンパク質をコードする核酸分子、
(n)配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170に示されるアミノ酸配列の1つを逆翻訳することによって生成することができる核酸分子
からなる群から選択される少なくとも1つの核酸分子を含む、少なくとも1種のケラチン結合ポリペプチド(ii)を含む。
【００７４】
本発明の好ましい実施形態では、前記ケラチン結合エフェクター分子は、配列番号2、42、44、46、48、146、150、153、156、157、158、160、162、164もしくは166によるデスモプラキンまたはその部分断片、および/あるいは配列番号18、20、26、28、32、34、36、168、170によるプラコフィリンまたはその部分配列、および/あるいは配列番号50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70の配列によるプラコグロビンまたはその部分配列、および/あるいは配列番号86の配列によるペリプラキン、および/あるいは配列番号90、92、94、96、98、102、104、105の配列によるエンボプラキンまたはその部分配列、および/あるいは配列番号138および140による配列を、ケラチン結合ポリペプチドとして含む。好ましいケラチン結合ドメインは、配列番号4、6、8、10、12、14、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168もしくは170に示されるデスモプラキンポリペプチド、およびその機能的等価物である。特に非常に好ましい本発明の実施形態では、配列番号156、157、158、160、162、164、168および/または170に示されるケラチン結合ポリペプチドが、本発明の方法に使用される。一番好ましい本発明の実施形態では、配列番号168に示されるケラチン結合タンパク質が使用される。配列番号168中にあるヒスチジンアンカーの有無にかかわらず、このタンパク質を使用することができることはここでは言うまでもない。したがって、ヒスチジンアンカー(または同様に使用される精製/検出系)は、C末端にもある場合がある。前記ケラチン結合タンパク質の実用において(例えば、化粧用調製物中)、ヒスチジンアンカー(または同様に使用される精製/検出系)は必要ない。したがって、さらなるアミノ酸配列なしでの前記タンパク質を使用することが好ましい。
【００７５】
本発明に同様に含まれるものは、特に開示されているケラチン結合ポリペプチド(ii)の「機能的等価物」および本発明の方法におけるこれらの使用である。
【００７６】
本発明の目的での、特に開示されたケラチン結合ポリペプチド(ii)の「機能的等価物」または類似体とは、例えばケラチン結合などの所望の生物学的活性も有する、ケラチン結合ポリペプチドとは異なるポリペプチドである。したがって、例えば、ケラチン結合ポリペプチドの「機能的等価物」は、実施例に記載した定量的ケラチン結合試験において、他の点では同等の条件下で、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136 138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170、好ましくは配列番号2、4、6、8、10、12、14、40、42、44、46、48、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170、特に好ましくは166および168、最も好ましくは168に示されたポリペプチドのケラチン結合能の約10％、20％、30％、40％または50％、好ましくは60％、70％、80％または90％、特に好ましくは100％、125％、150％、特に非常に好ましくは200％、300％または400％、最も好ましくは500％、600％、700％または1000％またはそれ以上を有するポリペプチドを意味すると理解される。
【００７７】
本発明によれば、「機能的等価物」とは、上記のアミノ酸配列の少なくとも1つの配列位置において、具体的に記載されるアミノ酸以外のアミノ酸を有するが、それにもかかわらず上記の生物学的活性の1つを有する変異タンパク質も特に意味すると理解される。したがって、「機能的等価物」には、任意の配列位置において特定の変化が起こる可能性がある、突然変異によって得られる変異タンパク質が含まれる(ただし、その変化が本発明による特性のプロファイルを有する変異タンパク質をもたらす場合)。
【００７８】
本発明の目的での「突然変異」とは、プラスミド中または生物体のゲノム中の遺伝子変異体の核酸配列の変化を意味する。突然変異は、例えば複製する間の誤差の結果として起こる場合、または変異源による場合がある。多数の生物的、化学的または物理的変異源が、見識ある当業者には公知ではあるが、生物体の細胞ゲノムにおける自然変異の割合は非常に低い。
【００７９】
突然変異には、1つまたは複数の核酸基の置換、挿入、欠失が挙げられる。置換は、個々の核酸塩基の置き換えを意味すると理解され、ここでは、塩基転移(プリン塩基によるプリン塩基の置換またはピリミジン塩基によるピリミジン塩基の置換)と、塩基転換(プリン塩基によるピリミジン塩基の置換(またはその反対))とを区別する。
【００８０】
付加または挿入は、追加の核酸基のDNAへの組込みを意味するものと理解され、読み枠の移動をもたらす可能性がある。この種類の読み枠の移動においては、「インフレーム」の挿入/付加と、「アウトフレーム」挿入とを区別する。「インフレーム」の挿入/付加の場合、読み枠は維持され、挿入された核酸によってコードされたアミノ酸の数だけ増えたポリペプチドが生じる。「アウトフレーム」挿入/付加の場合、元来の読み枠は失われ、完全な機能性ポリペプチドの形成はもはや可能でない。
【００８１】
欠失は、1つまたは複数の塩基対の喪失を表し、これも同様に「インフレーム」または「アウトフレーム」読み枠の移動をもたらし、および完全なタンパク質の形成に関してそれと関連する結果をもたらす。
【００８２】
ランダム突然変異または部位特異的突然変異を生じさせるために使用することができる変異誘発物質(変異源)および適用できる方法および技術は当業者には公知である。このような方法および変異源は、例えば、A.M. van Harten [(1998)、「Mutation breeding: theory and practical applications」, Cambridge University Press, Cambridge, UK], E Friedberg,G Walker, W Siede [(1995)、「DNA Repair and Mutagenesis」, Blackwell Publishing],またはK. Sankaranarayanan, J. M. Gentile, L. R. Ferguson [(2000)「Predocols in Mutagenesis」, Elsevier Health Sciences]に記載されている。
【００８３】
部位特異的突然変異を導入するために、例えば、in vitro MutagenEse Kit、LA PCR in vitro Mutagenesis Kit(宝酒造社製、京都)、またはStratagene社製QuikChange(登録商標)Kit、または適切なプライマーを使用したPCR突然変異誘発などの従来通りの分子生物学的方法およびプロセスを使用することができる。
【００８４】
上記ですでに述べたように、数多くの化学的、物理的および生物的変異源がある。
【００８５】
一覧表示した変異源を下記に例として示すが、限定的なものではない。
【００８６】
化学的変異源は、それらの作用機序に従って細分することができる。すなわち、塩基類似体(例えば、5-ブロモウラシル、2-アミノプリン)、単官能性および二官能性アルキル化剤(例えば、エチルメチルスルホン酸、硫酸ジメチルなどの単官能性のもの、または亜硫酸ジクロロエチル、マイトマイシン、ニトロソグアニジン、ジアルキルニトロソアミン、N-ニトロソグアニジン誘導体などの二官能性のもの)、あるいは挿入物質(例えば、アクリジン、臭化エチジウム)がある。
【００８７】
したがって、例えば本発明のケラチン結合エフェクター分子において、本発明によるポリペプチドの変異の結果として得た、例えば配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168および/または170により示される存在するポリペプチドも可能である。
【００８８】
適切なアミノ酸置換の例を、下記の表に示す。
【表２】
2009523706.tif 000016
【００８９】
配列番号2において、天然で2849位にあるセリンは、この位置でのリン酸化を避けるために、例えばグリシンで置換することが可能であることが知られている(Fontao L, Favre B, Riou S, Geerts D, Jaunin F, Saurat JH, Green KJ, Sonnenberg A, Borradori L., Interaction of the bullous pemphigoid antigen 1 (BP230)and desmoplakin with intermediate filaments is mediated by distinct sequences within their COOH terminus., Mol Biol Cell. 2003 May;14(5):1978〜92. Epub 2003 Jan 26)。
【００９０】
上記の意味では、「機能的等価物」はまた、記載したポリペプチドの「前駆体」、ならびにポリペプチドの「機能的誘導体」および「塩」でもある。
【００９１】
ここで「前駆体」とは、所望の生物学的活性の有無にかかわらず、ポリペプチドの天然または合成の前駆体である。
【００９２】
「塩」という表現は、本発明のタンパク質分子の、カルボキシル基の塩、またはアミノ基の酸付加塩を意味すると理解される。カルボキシル基の塩は、それ自体が公知の方法によって調製することができ、例えば、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄および亜鉛塩などの無機塩;また例えば、アミン(トリエチルアミンなど)、アルギニン、リジン、ピペリジンなどの有機塩基を有する塩が挙げられる。酸付加塩、例えば、塩酸または硫酸などの鉱酸との塩、ならびに酢酸およびシュウ酸などの有機酸との塩なども同様に、本発明により提供される。
【００９３】
「機能的等価物」には当然、他の生物から取得可能なポリペプチド、および天然に存在する変異体(対立遺伝子)も含まれる。例えば、配列の比較によって、相同配列領域または保存領域の範囲を決定することができる。これらの配列を使用して、DNAデータベース(例えば、ゲノムまたはcDNAデータベース)を、生物情報学の比較プログラムを使用して同等の酵素があるかを調べることができる。公共で利用できる適切なコンピュータプログラムおよびデータベースは、十分に当業者には公知である。
【００９４】
公知のタンパク質配列のこれらのアラインメントは、例えば、InforMax社のベクターNTI8(2002年9月25日版)などのコンピュータプログラムを使用して行うことができる。
【００９５】
さらに、「機能的等価物」は、上記のポリペプチド配列またはそれに由来する機能的等価物の1つを有し、N末端またはC末端の機能的連結においてそれらと機能的に異なる(すなわち、融合タンパク質の部分の相互の本質的な機能障害がない)少なくとも1つのさらなる異種配列を有する融合タンパク質である。このような異種配列の非限定的な例は、例えば、シグナルペプチドまたは酵素である。
【００９６】
本発明により含まれる「機能的等価物」は、特に開示されたタンパク質の相同体である。定義において開示されているコンピュータプログラムおよびコンピュータアルゴリズムを使用して計算した場合、これらは、特に開示されたアミノ酸配列の1つに対して、少なくとも40％、45％または50％、好ましくは少なくとも55％、60％、65％または70％、特に好ましくは少なくとも75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％または94％、特に非常に好ましくは少なくとも95％または96％の相同性を有する。
【００９７】
タンパク質のグリコシル化が起こり得る場合は、本発明による「機能的等価物」には、脱グリコシル化型またはグリコシル化型、およびまたグリコシル化パターンの改変によって得ることができる修飾型の上記の種類のタンパク質が含まれる。
【００９８】
タンパク質のリン酸化が起こり得る場合は、本発明による「機能的等価物」には、脱リン酸化型またはリン酸化型、およびまたリン酸化パターンの改変によって得ることができる修飾型の上記の種類のタンパク質が含まれる。
【００９９】
本発明によるポリペプチドの相同体は、変異体のコンビナトリアルバンクをスクリーニングすることによって、例えば変異体の短縮によって同定することができる。例えば、タンパク質変異体のバンクは、核酸レベルでのコンビナトリアル突然変異誘発によって、例えば、合成オリゴヌクレオチド混合物を酵素的にライゲーションすることによって生成することができる。縮重オリゴヌクレオチド配列から相同体候補のバンクを得るために使用することができる多数の方法が存在する。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動DNA合成機において行うことができ、次いでその合成遺伝子を適切な発現ベクターにライゲーションすることが可能である。遺伝子の縮重セットの使用によって、1つの混合物中で所望のセットのタンパク質配列候補をコードする全ての配列を提供することが可能となる。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は、当業者に公知である(例えば、Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11:477)。
【０１００】
従来技術では、点突然変異または短縮によって生成されたコンビナトリアルバンク中の遺伝子産物をスクリーニングするための技術、および選択された特性を有する遺伝子産物に関してcDNAバンクをスクリーニングするためのいくつかの技術が公知である。ハイスループット分析の対象である大規模な遺伝子バンクをスクリーニングするために最も使用される技術には、複製可能発現ベクター中に遺伝子バンクをクローニングし、得られたベクターバンクで適切な細胞を形質転換し、所望の活性の検出が、産物が検出されてきた遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現させることが挙げられる。バンク中の機能的変異体の発生頻度を増大させる技術である再帰的アンサンブル突然変異誘発(REM)を、スクリーニング試験と組み合わせて使用して、相同体を同定することができる(Arkin and Yourvan (1992) PNAS 89:7811〜7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327〜331)。
【０１０１】
配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、145、149、152、159、161、163、165、167および/または169、特に好ましくは配列番号165および167、最も好ましくは配列番号167に示された核酸配列、またはその一部分をプローブとして示された核酸配列を使用する、物理的に利用可能な他の生物のcDNAまたはゲノムDNAライブラリーの検査は、他の方法で相同体を同定するための当業者には公知の方法である。ここで、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、145、149、152、159、161、165、167および/または169、特に好ましくは配列番号165および167、最も好ましくは配列番号167により示される核酸配列から誘導されたプローブは、少なくとも20bp、好ましくは少なくとも50bp、特に好ましくは少なくとも100bp、特に非常に好ましくは少なくとも200bp、最も好ましくは少なくとも400bpの長さを有する。プローブはまた、1キロベース以上の長さ、例えば、1Kb、1.5Kbまたは3Kbを有することも可能である。ライブラリーを検査するために、20bpから数キロベースの長さの、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、145、149、152、159、161、165、167および/または169、特に好ましくは配列番号165および167、最も好ましくは配列番号167に示された相補的DNA鎖の配列、またはその断片のうちの1つを使用することもまた可能である場合がある。使用するハイブリダイゼーション条件を上に記載する。
【０１０２】
本発明の方法では、標準状態において、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、145、149、152、159、161、165、167および/または169、特に好ましくは配列番号165および167、最も好ましくは配列番号167に示される核酸分子とハイブリダイズするDNA分子、ケラチン結合ポリペプチドをコードし、これらの相補的核酸分子または前記分子の部分とハイブリダイズするDNA分子、完全配列として配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170に示されたポリペプチドと同じ特性を有するポリペプチドをコードするDNA分子を使用することもまた可能である。
【０１０３】
特に好都合な本発明の実施形態において、ケラチン結合エフェクター分子は、ケラチン結合ポリペプチド(ii)として、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170に示されたポリペプチド配列の少なくとも1つを含むこれらのポリペプチドを含むが、ただし、実施例9または10による試験において測定して、前記ポリペプチドのケラチン結合が、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170に示された対応するポリペプチド配列が有する値の少なくとも10％、20％、30％、40％または50％、好ましくは60％、70％、80％または90％、特に好ましくは100％である。
【０１０４】
所望の生物に対する高度に特異的な親和性を有するケラチン結合ポリペプチド(ii)を使用することが好ましい。したがって、ヒト毛髪着色への使用には、ヒト毛髪ケラチンに対して特に高親和性を有するこれらのケラチン結合ポリペプチド(ii)を使用することが好ましい。
【０１０５】
しかし、本発明によるエフェクター分子(i)にカップリングしている複数のケラチン結合ポリペプチド(ii)を使用することもまた可能であり、例えば、ヒトの皮膚のケラチンに対して高い結合親和性を有するケラチン結合ポリペプチド(ii)は、ヒト毛髪のケラチンに対して高親和性を有する他のケラチン結合ポリペプチド(ii)と組み合わせて、エフェクター分子と結合することができる。同一の(また異なる)ケラチン結合ポリペプチド(ii)またはそのケラチン結合ドメインの2つ以上のコピーを含むキメラポリペプチドを使用することもまた可能である。そのようにして、例えば特に効果的なケラチン結合を実現することが可能であった。
【０１０６】
適切なケラチン結合ポリペプチド(ii)は公知である。例えば、デスモプラキンおよびプレクチンは、ケラチン結合ドメインを有する(Fontao L, Favre B, Riou S, Geerts D, Jaunin F, Saurat JH, Green KJ, Sonnenberg A, Borradori L., Interaction of the bullous pemphigoid antigen 1 (BP230) and desmoplakin with intermediate filaments is mediated by distinct sequences within their COOH terminus., Mol Biol Cell. 2003 May;14(5):1978〜92. Epub 2003 Jan 26;Hopkinson SB, Jones JC., The N-terminus of the transmembrane protein BP180 interacts with the N-terminal domain of BP230, thereby mediating keratin cytoskeleton anchorage to the cell surface at the site of the hemidesmosome, Mol Biol Cell. 2000 Jan;11(1):277〜86)。
【０１０７】
好ましくは、本発明のケラチン結合エフェクター分子は、毛髪用化粧品、好ましくは毛髪着色中に使用される。それらは、手入れ、保護的(predecting)または色を変化させるエフェクター分子の高濃度で長い作用時間を可能とする。
【０１０８】
特に好ましい本発明の実施形態では、ヒトの皮膚ケラチン、毛髪ケラチンまたは爪ケラチンに対して結合親和性を有するケラチン結合ポリペプチドが使用される。
【０１０９】
本発明のさらに好ましい実施形態では、特定のケラチン結合エフェクター分子は、
(a)アルカリ性条件下で活性化可能な式1：
【化１１】
2009523706.tif 000017
【０１１０】
の基[式中、
【化１２】
2009523706.tif 000018
【０１１１】
は、色素分子(D)への結合を意味し、
Xは、電子求引基であり、またはアルキル、-O-アルキル、シアノ、ヒドロキシ、ハロゲン基もしくはHであり、
kは、1、2または3であり、
nは、0または1であり、
Bは、基-CH=CH2または基-CH2-CH2-Qまたは-NH-CH2-CH2-Qまたは-NH-CH=CH2(式中、Qは、アルカリ性条件下で切断可能な基である)である]、
(b)式2：
【化１３】
2009523706.tif 000019
【０１１２】
のアクリルアミドアンカー[式中、
【化１４】
2009523706.tif 000020
【０１１３】
は、色素分子(D)への結合を意味する]、
(c)式3、4または5：
【化１５】
2009523706.tif 000021
【０１１４】
による化合物の1つ[式中、
【化１６】
2009523706.tif 000022
【０１１５】
は、色素分子(D)への結合を意味し、
Vは、フッ素または塩素であり、
U1、U2は、互いに独立に、フルオロ、クロロまたは水素であり、
Q1、Q2は、互いに独立に、クロロ、フルオロ、シアナミド、ヒドロキシ、(C1〜C6)-アルコキシ、フェノキシ、スルホフェノキシ、メルカプト、(C1〜C6)-アルキルメルカプト、ピリジノ、カルボキシピリジノ、カルバモイルピリジノ、または一般式(6)もしくは(7)の基：
【化１７】
2009523706.tif 000023
【０１１６】
(式中、R2は、水素、または(C1〜C6)-アルキル、スルホ-(C1〜C6)-アルキル;または非置換かもしくは(C1〜C4)-アルキル、(C1〜C4)-アルコキシ、スルホ、ハロゲン、カルボキシ、アセトアミド、ウレイドによって置換されたフェニルであり、
R3およびR4は、互いに独立に、R2の意味の1つを有するか、あるいは一般式(8)の基
【化１８】
2009523706.tif 000024
【０１１７】
であるか、または式-(CH2)j-(式中、jは4または5である)、または-(CH2)2-E-(CH2)2-(式中、Eは酸素、硫黄、スルホ、-NR5-(式中、R5'=(C1〜C6)-アルキル)である)の環系を形成し、
Wは、非置換かもしくは(C1〜C4)-アルキル、(C1〜C4)-アルコキシ、カルボキシ、スルホ、クロロ、ブロモなどの1個または2個の置換基によって置換されたフェニレンであり;または酸素、硫黄、スルホ、アミノ、カルボニル、カルボンアミドによって中断されていてもよい(C1〜C4)-アルキレン-アリーレンまたは(C2〜C6)-アルキレンであり;または非置換かもしくは(C1〜C4)-アルキル、(C1〜C4)-アルコキシ、ヒドロキシ、スルホ、カルボキシ、アミド、ウレイドまたはハロゲンによって置換されたフェニレン-CONH-フェニレンであり;または非置換かもしくは1個または2個のスルホ基によって置換されたナフチレンであり、
Zは、基CH=CH2または基CH2-CH2-Qまたは-NH-CH2-CH2-Qまたは-NH-CH=CH2(式中、Qはアルカリ性条件下で切断可能な基である)であり、
R24、R25およびR26は、(C1〜C4)-アルキルまたは(C1〜C4)-ヒドロキシアルキルであり、
B-は、硫酸水素塩、硫酸塩、フッ化物、塩化物、臭化物、二水素リン酸塩、一水素リン酸塩、リン酸塩、水酸化物または酢酸塩などのアニオンの等価物である)である]
からなる群から選択される少なくとも1種の反応性アンカーを有する少なくとも1種の反応性色素(ii)を含む。
【０１１８】
したがって好ましい実施形態では、本発明は、エフェクター分子として、アルカリ性条件下で活性化可能な式1：
【化１９】
2009523706.tif 000025
【０１１９】
[式中、
【化２０】
2009523706.tif 000026
【０１２０】
は、色素分子(D)の基への結合であり、
Xは、電子求引基であり、
kは、1、2または3であり、
nは、0または1であり、
Bは、基CH=CH2または基CH2-CH2-Qまたは-NH-CH2-CH2-Qまたは-NH-CH=CH2(式中、Qはアルカリ性条件下で切断可能な基である)である]
の少なくとも1つの基を有する、少なくとも1種の反応性色素(ii)を含む、ケラチン結合エフェクター分子に関する。
【０１２１】
ここでおよび以下において、発現アルキルは通常、メチル、エチル、プロピル、イソプロピルなどなどの、1〜6個、好ましくは1〜4個の炭素原子(C1〜C6-またはC1〜C4-アルキル)を有する直鎖状もしくは分枝状の炭化水素基である。ハロアルキルは、トリフルオロメチル、トリクロロメチル、ペンタフルオロエチルなどのような、水素原子がハロゲン原子によって、特にフッ素原子によって部分的もしくは完全に置換されている、上記で定義したアルキルである。上記で定義したように、アルコキシは、酸素原子を介して結合したアルキル基である。任意選択に置換されたフェニルとは、フェニル基が、例えば、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、ニトロ、シアノ、COOH、SO3Hなどから選択された1個または複数、例えば1個、2個、3個または4個の置換基を有することのできることを意味する。ハロゲンは、特にフッ素、塩素または臭素である。
【０１２２】
電子求引基Xは、それらが結合している芳香族基にM効果および/またはI効果を及ぼすものである。これらには、例えば、フッ素または塩素、CN、NO2、および式-C(O)-R1およびS(O)2R2(式中、R1およびR2は、互いに独立に、OH、アルキル、ハロアルキル、アルコキシまたは任意選択に置換されたフェニルである)の基が挙げられる。式1が複数の基を持つ場合(k>1)、基Xは同一でもまたは異なってもよい。
【０１２３】
好ましくは、基Xの少なくとも1つは、ヒドロキシスルホニル基(SO3H)である。
【０１２４】
変数kは、好ましくは1または2であり、すなわち式1は、1つまたは2つの電子求引基Xを有する。好ましくは式1における「n」は0であり、すなわち式1はベンゼンに由来する。「n」が1の場合、式1はナフタレンに由来する。これらの場合、基SO2-Bは、基Xと同じベンゼン環上に位置することができる
さらに、本発明は、式1(式1のBは、CH=CH2、基CH2-CH2-O-SO3HまたはCH2-CH2-Clである)による反応性アンカーを含む反応性色素を含むケラチン結合エフェクター分子に関する。
【０１２５】
本発明によれば、アルカリ性条件下で活性化可能な式1の基が、基-NH-、-N=N-、-NH-C(O)-、-NH-SO2-または-N(R)-(式中、Rは(上記で定義した)アルキルである)を介して色素分子に結合している、上記のケラチン結合エフェクター分子が好ましい。好都合には、本発明によるケラチン結合エフェクター分子は、1つ、2つまたは3つ、好ましくは1つまたは2つの上記の反応性色素を有する。アルカリ性条件下で活性化可能な式1による基は、色素発色団の成分となることができる(しかし、成分である必要はない)。
【０１２６】
一般に、反応性色素は、色素分子当たり1個または複数の、例えば、1〜10個、特に2〜8個の色素に水溶性を付与する官能基を有する。これらは一般に、弱酸性またはアルカリ性pH、一般に4を上回るpHで水性媒体中において解離してアニオン基を形成するアニオン性または酸性官能基である。このような基の例は、ヒドロキシスルホニル基(-SO3H)、カルボキシル基(COOH)およびヒドロキシスルホニルオキシ基(-O-SO3H)、ならびにこれらの基のアニオンである。これらのアニオン性/酸性基は、式1による基および/または色素分子の他の部分に結合することができる。これらの基がアニオン基として色素中にある場合は、色素には中和に必要な対イオンもまた含まれることはもちろんのことである。適切な対イオンは、特にアルカリ金属イオン、特にナトリウム、カリウムおよびリチウムイオン、およびアンモニウムイオン、例えば、モノ-、ジ-またはトリエタノールアミン由来のアンモニウムイオンである。
【０１２７】
本発明の特に好ましい対象は、フタロシアニン系色素、アントラキノン色素、アゾ色素、ホルマザン色素、ジオキサジン色素、アクチジン色素、キサンテン色素、ポリメチン色素、スチルベン色素、硫黄色素、トリアリールメタン色素、ベンゾピラン色素、ジベンゾアントロン色素およびこれらの色素の金属錯体の群から選択される色素(「D」)を含む、ケラチン結合エフェクター分子である。
【０１２８】
このような色素Dは、従来技術により部分的に知られており、例えば、特許出願WO94/18381、EP-A356931、EP-A559617、EP-A201868、DE-A19523245、DE-A19731166、EP745640、EP-A889098、EP-A1097971、EP-A880098に見出すことができ、あるいは例えば文献EP602562、EP-A597411、EP-A592105またはDE4319674から公知であるような、構造的に同様の色素の公知の調製方法と同様に調製される。
【０１２９】
式1による反応性アンカーを含む反応性色素を調製するために、式1bのアミノ化合物は一般に、それ自体公知の方法で求核置換が可能な基を有する色素前駆体と反応するであろう。求核置換が可能な基の例は、(ハロトリアジン基におけるような)芳香族に結合したハロゲン、あるいはハロスルホニル基またはハロカルボニル基の形態のハロゲン、特に塩素または臭素である。この方法はここで引用した従来技術から公知であり、色素Dの調製のために同様に使用することができる。あるいは、アミノ化合物1bをまずジアゾ化し、次いで対応する色素前駆体にカップリングすることもできる。アミノ化合物1bまたはそのジアゾニウム塩と色素前駆体との反応によって得られる反応生成物は、すでに色素Dである場合があり、またはそれが色素Dの前駆体を表わし、さらに公知の方法と同様に処理されて色素Dがそこから生じる場合がある。
【化２１】
2009523706.tif 000027
【０１３０】
式1bに示される基は、式1で示した定義と一致する。ここでは、色素には調製の結果として無機塩および増量剤を含むことができることを考慮するべきである。以下で無色成分とも称されるこのような成分の含量は一般に、色素中の着色および無色成分の全重量に基づいて、60重量％を超えず、10〜50重量％の範囲の場合が多いであろう。
【０１３１】
色素(D)の発色団系は、反応性色素でも非反応性色素でも関わりなく異なる構造を有することができる。下記に示す発色団(1〜7)は、いずれの場合にも特定の構造の部類の代表として特定される化合物である。この一覧は、限定的であると理解すべきではない。これらの部類の物質に属する基本的に全ての色素は、反応性色素として直接にまたはリンカー分子を介して、ケラチン結合ポリペプチドに結合することができることを、当業者であれば当然ながら認識している。色素は、金属非含有色素でもよいが、金属錯体、好ましくは遷移金属錯体、特に元素周期律表のVI〜X族の遷移金属錯体、特にCu、Cr、Fe、Ni、CoおよびMnの錯体でもよい。これらの金属錯体における遷移金属と色素分子とのモル比は、通常2:1〜1:2の範囲である。一般に、これらの色素における金属イオンの錯体化は、供与性(depredonated)ヒドロキシル基を介して、芳香族π-電子系に組み込まれているアミノ基、イミノ基、窒素原子を介して、またはアゾ基を介して起こる。
【０１３２】
1. アゾ色素
いくつのアゾ架橋(-N=N-)が色素に含まれるかによって、モノ-、ビス-、トリス-、テトラ-およびポリアゾ色素となる。1a、1bおよび1cにおける反応性アンカーへの結合もまた、当然ながらアゾ架橋である。
【０１３３】
a)モノアゾ
【化２２】
2009523706.tif 000028
【０１３４】
b)ビスアゾ
【化２３】
2009523706.tif 000029
【０１３５】
c)トリスアゾ
【化２４】
2009523706.tif 000030
【０１３６】
2. アントラキノン色素
【化２５】
2009523706.tif 000031
【０１３７】
3. トリフェンジオキサジン色素
【化２６】
2009523706.tif 000032
【０１３８】
4. フタロシアニン色素
【化２７】
2009523706.tif 000033
【０１３９】
5. ベンゾピラン色素
【化２８】
2009523706.tif 000034
【０１４０】
6. ジベンゾアントロン色素
【化２９】
2009523706.tif 000035
【０１４１】
7. ホルマザン色素
【化３０】
2009523706.tif 000036
【０１４２】
本発明によれば、下記の基(1-1)〜(1-43)から選択される反応性アンカーを含む反応性色素(i)を含むケラチン結合エフェクター分子もまた好ましい。
【化３１】
2009523706.tif 000037
2009523706.tif 000038
2009523706.tif 000039
【０１４３】
特に好ましい反応性色素は、式1による少なくとも1種の反応性アンカーを含み、この基は、式(1-1)〜(1-12)および(1-16)、(1-17)、好ましくは(1-1)、(1-3)、(1-4)、(1-6)、(1-7)、(1-9)、(1-10)、(1-12)、(1-16)、(1-17)、最も好ましくは(1-1)、(1-4)、(1-7)、(1-10)、(1-17)に示される基の少なくとも1つを有する。
【０１４４】
色素(D)とケラチン結合ポリペプチドとの反応において、ポリペプチドまたはタンパク質がそうでなければアンフォールディングし沈殿を生じるため、実質的な生理条件を維持するべきである。これは、純粋な有機溶媒を使用できず、中性に近いpHを選択しなくてはならないことを本質的に意味する。さらに、カップリングのための反応温度が45℃を超えないことが重要である。
【０１４５】
したがって、理論上では穏やかな条件下でケラチン結合ポリペプチドのSH基と反応することができる全ての反応性色素を使用することが可能である。穏やかな条件とは、ケラチン結合ポリペプチドがその物理的および化学的性質を保持しまたは不可逆的に失わない、温度、pHおよび濃度の範囲を意味すると理解される。
【０１４６】
適切な反応性色素は、少なくとも1種の反応性アンカーを含むが、2種以上の反応性アンカーを含むこともでき、これらは異なる反応性アンカーのタイプに相当する場合がある。
【０１４７】
ビニルスルホンアンカーを含む色素(式1を参照されたい)は通常、硫酸エステル化合物として調製される。硫酸エステル化合物の活性化(活性ビニルスルホン形態への脱離)は、布地および革への用途のために着色する間にその場で起こる、すなわち色素は、使用前にビニルスルホンに事前に脱離させる必要はない。適切な場合、色素はビニルスルホンとして単離することもでき、その後基質と反応することができる。
【０１４８】
本発明によるケラチン結合ポリペプチドまたはケラチン結合ドメイン(以下でKBDとも称する)について、pHに近い中性が選ばれ、さらに色素とのカップリングのための反応温度は45℃を超えるべきではないという事実の結果、色素は活性化ビニルスルホン形態に事前に脱離させなければならず、そのときのみ、例えばKBDとカップリングする。例えば、KBDとの反応は、(ビニルスルホン形態での色素の単離を伴わず)同じ溶液中で脱離後に直接起こることが可能であり、または色素を単離することも可能である。
【０１４９】
活性化のために、5〜14、特に7〜12のpH範囲、および0〜80℃、特に15〜50℃、好ましくは25〜45℃の温度範囲が必要である。活性化後に、pH5〜9、特に7〜8のpH範囲、および20〜50℃、特に25〜45℃の温度を確立し、色素は基質と(この場合は、ケラチン結合ポリペプチド/KBDと)迅速に反応する(数分以内の場合が多い)。硫酸エステルのビニルスルホンへの活性化(脱離)は、図1に示されたスキームに従って進む。
【０１５０】
活性化(脱離)の後に、図2において示される反応が起こる。アクリルアミドアンカーを有する色素(式2)は、事前に脱離(活性化)させずに、例えば、KBDと直接反応させることができる。反応条件は、ビニルスルホンアンカーの活性化のために選択された条件と一致する。その場合、付加および置換の両方が起こる場合がある(J.Soc.Dyers and Colourist, 1982, 98, 165-175)(図3を参照されたい)。
【０１５１】
ヘテロ芳香族アンカーを有する色素(式3、4、5)は、例えばKBDと直接、および事前の脱離(活性化)なしで反応することができる(図4)。反応条件は、ビニルスルホンアンカーのために選択される条件と一致する。ここで使用される反応性色素は、0〜20重量％、通常0〜10重量％、しばしば0〜5重量％の非反応性の二次的成分を含むことができる。反応性アンカーを有さない二次的成分は、当然ながらケラチン結合ポリペプチドと反応しない。これらは、合成または着色過程の間に除去することができる。1つの選択肢は、反応性色素と反応したケラチン結合ポリペプチドを毛髪に塗布し、結合していない色素画分を毛髪から洗い落とすことである。
【０１５２】
さらに、反応性色素と反応したケラチン結合ポリペプチドを、例えばカラムクロマトグラフィーによって精製する選択肢がある。1種の「カラムリアクター」内で、ケラチン結合ポリペプチドと反応性色素との反応を起こすこともまた可能である。ここでは、ケラチン結合ポリペプチドを、ニッケルアフィニティーカラムにカップリングさせ、色素をケラチン結合ポリペプチドに結合させ、固定されていない色素基を直接洗い落とすことが可能であった。次いで、ケラチン結合ポリペプチド色素(ケラチン結合エフェクター分子)を、カラムから溶出させることができた。
【０１５３】
特に好ましい本発明の実施形態では、ケラチン結合エフェクター分子は、化粧品用途に適切でありそれについて承認されている色素を含む。このような色素は、例えば、刊行物"Kosmetische Farbemittel" [Cosmetic Colorants] from the Farbstoffkommission der Deutschen Forschungsgemeinschaft [Dyes Commission of the German Research Society], published by Verlag Chemie, Weinheim, 1984, or in the third completely revised edition from 1991に一覧表示されている。
【０１５４】
毛髪の着色に通常使用され、本発明によるケラチン結合エフェクター分子中に存在し得るさらなる色素は、とりわけ、E. Sagarin, "Cosmetics, Science and Technology", Interscience Publishers Inc., New York (1957), pages 503 ff.、およびH. Janistyn, "Handbuch der Kosmetika und Riechstoffe" [Handbook of cosmetics and fragrances], volume 3 (1973), pages 388 ff. and K. Schrader, "Grundlagen und Rezepturen der Kosmetika" [Fundamentals and formulations of cosmetics], 2nd edition (1989), pages 782-815に記載されている。
【０１５５】
本発明によれば、反応性色素(i)が、間接的にリンカー分子を介してケラチン結合ポリペプチド(ii)にカップリングしているケラチン結合エフェクター分子もまた好ましい。
【０１５６】
このようなケラチン結合エフェクター分子の調製は、少なくとも2つのカップリング官能基を有するリンカー分子を使用して、(例えば、上記の反応性色素から選択された)少なくとも1つのヒドロキシ官能基、アミノ官能基またはカルボキシル官能基を担持するエフェクター分子(i)を、上記のケラチン結合ポリペプチド(ii)の1つにカップリングすることによって行うことができ、
(a)第1のカップリングステップにおいて、まずエフェクター分子(i)をリンカー分子(iii)に結合させ、
(b)さらなるカップリングステップにおいて、(a)からの反応生成物を、リンカー分子(iii)のまだ遊離のカップリング官能基を介して、ケラチン結合ポリペプチド(ii)とカップリングさせる。
【０１５７】
特に好ましい本発明の実施形態では、リンカー分子(iii)は、少なくとも2つの異なるカップリング官能基を有し、特に非常に好ましいのは、マレイミド基を有するリンカー分子(iii)である。
【０１５８】
使用されるリンカー分子(iii)は、特に好ましくは一般式9：
【化３２】
2009523706.tif 000040
【０１５９】
(式中、「n」は、0〜40または0〜20、好ましくは0〜15、特に好ましくは0〜10、特に非常に好ましくは1〜9、または2〜8、または3〜7、全ての中で最も好ましくは5の整数である)によるカルボン酸基担持マレイミドである。マレイミドカプロン酸の使用が全ての中で最も好ましい。さらに、マレイミドカプロン酸クロリドの使用が、特に非常に好ましい。
【０１６０】
さらに特に好ましい実施形態では、リンカー分子(iii)は、少なくとも2つの異なるカップリング官能基、さらに親水性を増加させるモジュールを有する。この好ましいリンカー分子を、式9bに示す：
【化３３】
2009523706.tif 000041
【０１６１】
式中、「n」は、0〜40または0〜20、好ましくは0〜15、特に好ましくは0〜10、特に非常に好ましくは1〜9、または2〜8、または3〜7の整数であり、Xは、基O、S、N、CH2、-O-C=O、O=C-O-、-NR、-NR-C=O、O=C-NR-であり、Rは、H;メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、tert-ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、またはシクロアルキルなどのC1〜C12の分岐状または枝分かれしていないアルキル基;ベンゾイル、ベンジル;フェニルおよびナフチル、ヘテロアリールなどのC6〜C10-アリール基、好ましくはH、メチルおよびエチルであり、「モジュール」は、エチレングリコールまたは2〜40個、好ましくは2〜20個、特に好ましくは2〜10個の繰り返し単位を有するポリエチレングリコール基;あるいはグリシン、アラニン、セリン、トレオニン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、アルギニンおよびシステインからなる群から好ましくは選択されるアミノ酸;あるいは2〜40個、好ましくは2〜20個、特に好ましくは2〜10個のアミノ酸を有するポリペプチド(アミノ酸は、好ましくは極性アミノ酸であり、特に好ましくはグリシン、アラニン、セリン、トレオニン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、アルギニンおよびシステインからなる群から選択される);あるいは2〜100個、好ましくは2〜80個、特に好ましくは2〜50個、最も好ましくは2〜20個のモノマー単位を有するポリアクリル酸基であり、あるいは親油性を高めるために、「モジュール」は、2〜40個の炭素を有するアルキル基;あるいは2〜40個、好ましくは2〜20個、特に好ましくは2〜10個の繰り返し単位を有するポリオレフィン基、あるいは好ましくはグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、メチオニンからなる群から選択されるアミノ酸、あるいは2〜40個、好ましくは2〜20個、特に好ましくは2〜10個、アミノ酸を有するポリペプチド(アミノ酸は、好ましくは非極性アミノ酸であり、特に好ましくは、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、メチオニンからなる群から選択される)、あるいは2〜100個、好ましくは2〜80個、特に好ましくは2〜50個、最も好ましくは2〜20個のモノマー単位を有するポリエステル、ポリアミドまたはポリウレタンである。
【０１６２】
さらに好ましい実施形態では、リンカー分子は、一般式9c：
【化３４】
2009523706.tif 000042
【０１６３】
(式中、o、mまたはp位のXは、COOHまたはR-COOHであり、Rは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、tert-ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシルなどのC1〜C12直鎖状アルキル基;または1つもしくは複数のC1〜C4-アルキル基で場合により置換されたC5〜C12-シクロアルキル基などの環状アルキル基;またはo-、m-またはp-配向性アリール、ベンジルまたはベンゾイル単位、好ましくはシクロヘキシル、フェニルおよびナフチルである)による分子である。
【０１６４】
さらなる好ましい実施形態では、Rは、式1bにおいて説明した「モジュール」でもよい。
【０１６５】
本発明のさらなる実施形態では、一般式10：
【化３５】
2009523706.tif 000043
【０１６６】
(式中、「n」は、0〜20、好ましくは0〜15、特に好ましくは1〜10、特に非常に好ましくは1〜8の整数であり、Yはヒドロキシ基またはアミノ基である)で示されるリンカー分子(ii)が使用される。アミノ基は、第一級または第二級でもよい。リンカー分子(iii)は、特に非常に好ましくはマレイミドアルカノールである。マレイミドアルカノールは、好ましくはマレイミドエタノール、全ての中で最も好ましくはマレイミドペンタノールである。
【０１６７】
さらに特に好ましい実施形態では、式10によるリンカー分子(iii)は、少なくとも2つの異なるカップリング官能基と、さらに、親水性または親油性を増加させるモジュールとを有する。この好ましいリンカー分子を式10bに示す：
【化３６】
2009523706.tif 000044
【０１６８】
式中、「n」は、0〜40または0〜20、好ましくは0〜15、特に好ましくは0〜10、特に非常に好ましくは1〜9、または2〜8、または3〜7の整数であり、Xは、基O、S、N、CH2、-O-C=O、O=C-O-、-NR、-NR-C=O、O=C-NR-であり、Rは、H、C1〜C12の分岐状または枝分かれしていないアルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、tert-ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、またはシクロアルキル、ベンゾイル、ベンジル、C6〜C10-アリール基、例えば、フェニルおよびナフチル、ヘテロアリール、好ましくはH、メチルおよびエチルであり、「モジュール」は、2〜40個、好ましくは2〜20個、特に好ましくは2〜10個の繰り返し単位を有するエチレングリコールまたはポリエチレングリコール基;あるいは好ましくはグリシン、アラニン、セリン、トレオニン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、アルギニンおよびシステインからなる群から選択されるアミノ酸;あるいは2〜40個、好ましくは2〜20個、特に好ましくは2〜10個のアミノ酸(アミノ酸は、好ましくは極性アミノ酸、特に好ましくはグリシン、アラニン、セリン、トレオニン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、アルギニンおよびシステインからなる群から選択される)を有するポリペプチド;あるいは2〜100個、好ましくは2〜80個、特に好ましくは2〜50個、最も好ましくは2〜20個のモノマー単位を有するポリアクリル酸基であり、あるいは親油性を増すために、「モジュール」は、2〜40個の炭素原子を有するアルキル基;あるいは2〜40個、好ましくは2〜20個、特に好ましくは2〜10個の繰り返し単位を有するポリオレフィン基;あるいは好ましくはグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、メチオニンからなる群から選択されるアミノ酸;あるいは2〜40個、好ましくは2〜20個、特に好ましくは2〜10個のアミノ酸(アミノ酸は、好ましくは非極性アミノ酸であり、特に好ましくはグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、メチオニンからなる群から選択される)を有するポリペプチド;あるいは2〜100個、好ましくは2〜80個、特に好ましくは2〜50個、最も好ましくは2〜20個のモノマー単位を有するポリエステル、ポリアミドまたはポリウレタンであり、Yは、ヒドロキシ基またはアミノ基の官能基である。
【０１６９】
さらなる好ましい実施形態では、リンカー分子(iii)とエフェクター分子(i)(例えば、上記の反応性色素)とのカップリングは、カルボジイミド、無水物または酸塩化物によって媒介されるエステル化反応またはアミド形成であり、リンカー分子(iii)の酸塩化物の使用が特に好ましい。カルボジイミド、無水物または酸塩化物によって媒介される反応とは、リンカー分子(iii)およびエフェクター分子(i)の間のエステルまたはアミド形成に必要なリンカー分子(iii)のカルボキシル基の活性化を意味する。
【０１７０】
言及するべきカルボジイミドは、好ましくはジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)、N'-(3-ジメチルアミノプロピル)-N-エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC)であり、ジイソプロピルカルボジイミドまたはEDCの使用が特に好ましい。さらに、カルボニルジイミダゾール(CDI)による活性化を行うことが可能である。これらのエステル化は、0.1〜100mol％、好ましくは0.5〜10％、特に好ましくは1〜6％のN,N-ジメチルアミノピリジン(DMAP)の存在下で行われる。アミド形成は、カルボジイミドにより活性化した化合物をアミンと反応させることによって行うことが可能である。任意選択で、アミド形成は、添加剤、例えば、N-ヒドロキシスクシンイミド、ペンタフルオロフェノールまたはN-ヒドロキシベンゾトリアゾールなどの存在下で行うことが可能である。このような添加剤は、当業者には公知である。これらの添加剤により単離可能な活性エステルが得られる場合は、これらの単離された活性エステルと、エフェクター分子との反応もまた、本発明によるカルボジイミドによって媒介されるエステル化と理解される。
【０１７１】
無水物を得るためのリンカー分子(iii)の反応は、当業者には公知の一般的な方法によって行われる。例えば、無水酢酸、無水ピバロイル、塩化アセチル、塩化ピバロイルまたはクロロギ酸エステルとの反応によって得られるような混合無水物の使用が好ましい。無水ピバロイルおよび炭酸無水物が特に好ましい。酸塩化物を使用する場合、例えば、ピリジン、トリエチルアミンなどの第3級塩基の存在下で無水物の形成を行うことが好都合である。
【０１７２】
(a)で説明したリンカー分子(iii)のエフェクター分子(i)とのカップリングは、上記のリンカー分子(iii)の活性化の後に行うことが好ましい場合があり、塩基の存在下で無水物が得られる。言及するべき好ましい塩基は、芳香族および第三級アルキルアミン、例えば、ピリジン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、トリオクチルアミン、エチルジイソプロピルアミンなどである。特に好ましい実施形態では、使用される塩基はトリエチルアミンである。
【０１７３】
リンカー分子(iii)の酸塩化物との反応のために、使用される塩素化剤は、当業者には公知の従来通りの塩素化剤、例えば塩化チオニル、三塩化リン、五塩化リン、塩化オキサリル、ホスゲン、またはオキシ塩化リンである。特に非常に好ましいのは、塩化チオニル(SOCl2)を使用することである。
【０１７４】
塩化チオニルを使用すると、例えば、マレイミドカプロン酸を酸塩化物に変換することが可能である。ここで適切な溶媒は、芳香族および脂肪族炭化水素(例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン、ヘキサン、ヘプタンなど)、ハロゲン化炭化水素(例えば、塩化メチレン)、エーテル(例えば、ジエチルエーテル、THFなど)、および過剰の塩素化剤それ自体である。好ましい実施形態では、トルエンが使用される。
【０１７５】
触媒ありでまたはなしで塩素化を行うことができる。塩素化のための触媒としてDMFが特に好ましい。
【０１７６】
任意選択で、ステップ(a)からの反応生成物(以下でリンカーエフェクター分子(iv)と称する)は、さらに精製され、反応生成物の可能性のある異性体を分離することができる。ここでは、化学物質を精製する全ての従来通りの方法、例えば、蒸留、精留、結晶化、抽出およびクロマトグラフィー精製方法を使用することができる。カラムクロマトグラフィーを行うことが好ましい。
【０１７７】
上記の反応性色素に加えて、他の色素もまた、リンカーによってケラチン結合ポリペプチドにカップリングされることができ、本発明の方法に使用することができる。
【０１７８】
ここで、特に有利な色素は、下記のリストに特定されているものである。カラーインデックス番号(CIN)は、Rowe Colour Index, 3rd edition, Society of Dyers and Colourists, Bradford, England, 1971から採用する。
【表３】
2009523706.tif 000045
2009523706.tif 000046
2009523706.tif 000047
【０１７９】
本発明のさらに好ましい実施形態では、皮膚、毛髪または爪を着色するための本発明の方法のために、上記のリンカーを介してカップリングされる表3に示す色素分子のうちの1つを含むケラチン結合エフェクター分子が使用される。
【０１８０】
上記の色素は、皮膚または爪を染める(例えば刺青)ために、皮膚または爪結合ポリペプチド配列(ii)に対するエフェクター分子(i)として使用することもできる。特に適切なのは、より健康的で輝いて見える皮膚の色合いを実現するため、および皮膚に塗布した後に光学的に皮膚の色を明るく(「美白」)するための、蛍光色素(例えば、表3に含まれる蛍光色素)を含むケラチン結合エフェクター分子の使用である。蛍光顔料の使用は、例えば、US6,753,002に記載されている。より健康的な皮膚の色合いを得るための蛍光色素は、"Filling the Fluorescent Palette, Cosmetics & Toiletries, 26-34, 121, No. 5, 2006"に記載されている。例えば、DayGlo社からの蛍光色素が好ましい。さらに、蛍光色素を含むこれらのケラチン結合エフェクター分子は、毛髪の色を明るくするため、および毛髪に特別な反射または輝きを与えるためにも使用することができる。これについては、例えば、"Hair lightening by fluorescent dyes, Cosmetics & Toiletries, 56-57, 120, No. 7, 2005"、およびその中で引用されている明細書US2004/0,258,641に記載されている。
【０１８１】
上記のステップ(a)から生じた反応生成物と、ケラチン結合ポリペプチド(ii)との結合は、リンカー分子の第2のまだ遊離のアンカー基を介して行われる。例えば、このようなアンカー基は、チオール官能基でもよく、これによってリンカーは、ケラチン結合ポリペプチド(ii)のシステイン基とジスルフィド結合することができる。
【０１８２】
目的に合わせて作られたリンカーの使用によって、リンカーエフェクター分子のケラチン結合ポリペプチドへの結合の正確なマッチングが可能となる。さらにその結果、2つ以上のエフェクター分子をケラチン結合ポリペプチド(ii)に結合することが可能である。
【０１８３】
使用されるリンカーは、カップリングする官能基によって左右される。適切なものは、例えば、スルフヒドリル反応性基(例えば、マレイミド、二硫化ピリジル、α-ハロアセチル、ビニルスルホン、スルファトアルキルスルホン(好ましくはスルファトエチルスルホン))によってポリペプチド(ii)をケラチン結合にカップリングする分子である。
【０１８４】
リンカー分子(iii)とケラチン結合ポリペプチド(ii)との共有結合が好ましい。例えば、ケラチン結合ポリペプチド(ii)の側鎖を介して、特にアミノ官能基、ヒドロキシ官能基、カルボン酸官能基またはチオール官能基を介して、これを行うことができる。1個もしくは複数のリジン基のアミノ官能基、システイン基の1個もしくは複数のチオール基、セリン、トレオニンまたはチロシン基の1個もしくは複数のヒドロキシル基、アスパラギン酸またはグルタミン酸基の1個もしくは複数のカルボキシル基を介する、あるいはケラチン結合ポリペプチド(ii)のN末端またはC末端官能基を介する結合が好ましい。ケラチン結合ポリペプチド(ii)の一次配列中のアミノ酸官能基とは別に、適切な官能基を有するアミノ酸(例えば、システイン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸)を配列に加えること、またはポリペプチド配列のアミノ酸をこのようなアミノ酸官能基によって置換することもまた可能である。突然変異誘発または核酸分子操作の方法は、当業者には十分に公知である。いくつかの選択した方法を下記に記載する。
【０１８５】
本発明の方法に好ましいとされているマレイミドカプロン酸を使用して調製したリンカーエフェクター分子(iv)を使用することが特に好ましい。このようなリンカーエフェクター分子(iv)の場合は、ケラチン結合ポリペプチド中にあるシステイン基がカップリングのために使用される。
【０１８６】
エフェクターカップリングの成功は、3種の異なる試験によってモニターすることができる：
(i)エフェクターカップリングの前および後のタンパク質中の遊離Cys-SH基の数を決定することができるエルマン試験。ここで、カップリング後の遊離SH基の相当の減少は、良好な反応が進行したことを示す(実施例11を参照されたい)。  
(ii)カップリングしたエフェクターがある場合およびない場合の、KBD-B(配列番号166)の毛髪への結合を測定することのできる活性試験。良好な反応制御は、カップリングしていないKBD-B(配列番号166)へのKBD-エフェクターの活性を減少させるべきではない(実施例12を参照されたい)。  
(iii)色素のKBD-B(配列番号166)へのカップリングの成功の結果として、毛髪または皮膚への目に見える着色(実施例14を参照されたい)。
【０１８７】
本発明による更なる実施形態では、エフェクター分子の結合は、内在性酵素(例えば、エステラーゼ、リパーゼまたはグルコシダーゼ)の作用によって、または経時による皮膚上の周囲条件(例えば、湿気、酸性pH)によって、ある意味での「持続放出」または「制御放出」で、ケラチン結合ポリペプチド(ii)から取り除かれ放出することができるような方法で行われる。したがって、ケラチン結合ポリペプチド(ii)は、塗布系として使用することが可能であり、一度または繰り返し塗布することによって、皮膚上に少量で遊離のエフェクター分子をもたらすことができる。基本的には、エフェクターは、皮膚上でその対応する誘導体から、例えば、酢酸トコフェロール、パルミチン酸アスコルビルまたはアスコルビルグルコシドから放出されることが可能であることは当業者には公知である(代表的文献: Redoules, D. et al. J. Invest. Dermatol. 125, 2005, 270, Beijersbegen van Henegouwen, G.M.J. et al., J. Photochem. Photobiol. 29, 1995, 45.)。
【０１８８】
本発明のさらに好ましい実施形態では、本発明の方法のために、カルボキシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基を担持している色素を使用する。ここで、使用されるエフェクター分子は、1個または複数のカルボキシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基を有することができる。
【０１８９】
本発明は、ケラチン繊維、好ましくは毛髪、皮膚または爪、特に好ましくはヒト毛髪を着色するのに適切な、化粧品組成物中での上記のケラチン結合エフェクター分子の使用をさらに提供する。
【０１９０】
他の好ましい実施形態では、上記の本発明のケラチン結合エフェクター分子の使用は、毛髪着色剤中に通常使用される化粧用として適切な助剤および添加剤と組み合わせて、毛髪を着色するのに適切な組成物である。
【０１９１】
ここで、上記の色素、好ましくは化粧品用途として承認された色素を使用することができる。これらの色素は通常、組成物の全重量に基づいて、0.001〜1重量％、好ましくは0.01〜0.9重量％、特に好ましくは0.01〜0.8重量％、または0.01〜0.7重量％、特に非常に好ましくは0.01〜0.6重量％、または0.01〜0.5重量％、最も好ましくは0.01〜0.4重量％、または0.01〜0.3重量％の濃度で通常加えることができる。さらなる実施形態では、組成物は、組成物の全重量に基づいて、1〜10重量％、好ましくは2〜8重量％、3〜7重量％、4〜6重量％の濃度の本発明のケラチン結合エフェクター分子を含むことができる。さらに、組成物は、組成物の全重量に基づいて、10〜20重量％、好ましくは11〜19重量％、12〜18重量％、13〜17重量％、14〜16重量％の濃度の本発明のケラチン結合エフェクター分子を含むことができる。
【０１９２】
毛髪着色組成物の活性成分が、塗布後毛髪上で特定の時間保持され、例えば顔などの望ましくない場所に移らないことを確実にするために、組成物は特定の最低減の粘度を有するべきである。この粘度は通常、増粘剤の使用によって達成され、それゆえ増粘剤は大部分の毛髪着色剤のさらなる成分である。
【０１９３】
使用される増粘剤は、通常架橋ポリアクリル酸(例えば、Carbopol(登録商標))、ヒドロキシエチルセルロース、ワックス、特に特定のHLB値(親水親油バランス)を有する非イオン性界面活性剤の混合物、アニオン性、カチオン性または非イオン性の会合ポリマーである。化粧品組成物のための増粘剤としての両性電解性コポリマーの使用は公知である。ポリマーは、アニオン生成基/アニオン基およびカチオン生成基/カチオン基の両方を有する場合は、両性電解性または両性と称される。適切な数の解離可能な基を有する両性ポリマーは、水溶性または水分散性であり、薬学および化粧品分野において様々な使用が見出されてきた。
【０１９４】
適切な増粘剤またはポリマーは、特許出願WO00/039176、WO04/058837、EP-A-0982021、WO01/62809、WO05/004821、DE20207896U1およびWO02/000181に記載されている。
【０１９５】
特定の特性を確立するために、調製物はさらにまたシリコーン化合物をベースとするコンディショニング物質を含むことができる。適切なシリコーン化合物は、例えば、ポリアルキルシロキサン、ポリアリールシロキサン、ポリアリールアルキルシロキサン、ポリエーテルシロキサン、シリコーン樹脂またはジメチコンコポリオール(CTFA)およびアモジメチコン(CTFA)などのアミノ官能性シリコーン化合物である。
【０１９６】
噴射剤は、ヘアスプレーまたはエアロゾルフォームに通例使用される噴射剤である。プロパン/ブタン混合物、ペンタン、ジメチルエーテル、1,1-ジフルオロエタン(HFC-152a)、二酸化炭素、窒素または圧縮空気が好ましい。
【０１９７】
使用することのできる乳化剤は、ヘアフォームにおいて通常使用される全ての乳化剤である。適切な乳化剤は、非イオン性、カチオン性またはアニオン性または両性でもよい。非イオン性乳化剤(INCI命名法)の例は、laureth、例えばlaureth-4、ceteth、例えばceteth-1、ポリエチレングリコールセチルエーテル、ceteareth、例えばceteareth-25、ポリグリコール脂肪酸グリセリド、水酸化レシチン、脂肪酸のラクチルエステル、アルキルポリグリコシドである。
【０１９８】
カチオン性乳化剤の例は、リン酸二水素セチルジメチル-2-ヒドロキシエチルアンモニウム、塩化セチルトリモニウム、臭化セチルトリモニウム、メチル硫酸ココトリモニウム(cocotrimonium methyl sulfate)、quaternium-1〜x(INCI)である。
【０１９９】
アニオン性乳化剤は、例えば、アルキル硫酸塩、アルキルエーテル硫酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルアリールスルホン酸塩、アルキルコハク酸塩、アルキルスルホコハク酸塩、N-アルコイルサルコシン酸塩、アシルタウリン酸塩、アシルイセチオン酸塩、アルキルリン酸塩、アルキルエーテルリン酸塩、アルキルエーテルカルボン酸塩、αオレフィンスルホン酸塩、特にアルカリ金属塩およびアルカリ土類金属塩、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、およびアンモニウム塩およびトリエタノールアミン塩の群から選択することができる。アルキルエーテル硫酸塩、アルキルエーテルリン酸塩およびアルキルエーテルカルボン酸塩は、分子中に1〜10個の酸化エチレンまたは酸化プロピレン単位、好ましくは1〜3個の酸化エチレン単位を有することが可能である。
【０２００】
使用することができるゲル形成剤は、化粧品において通例の全てのゲル形成剤である。これらには、僅かかに架橋されているポリアクリル酸、例えば、Carbomer(INCI)、セルロース誘導体、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カチオン変性セルロース、多糖類、例えば、キサンタンガム、カプリル酸/カプリン酸トリグリセリド、アクリル酸ナトリウムコポリマー、Polyquaternium-32(および)paraffinum liquidum(INCI)、アクリル酸ナトリウムコポリマー(および)paraffinum liquidum(および)PPG-1Trideceth-6、塩化アクリルアミドプロピルトリモニウム/アクリルアミドコポリマー、steareth-10アリルエーテル、アクリル酸コポリマー、Polyquaternium-37(および)paraffinum liquidum(および)PPG-1Trideceth-6、Polyquaternium-37(および)ジカプリン酸/ジカプリル酸プロピレングリコール(および)PPG-1Trideceth-6、Polyquaternium-7、Polyquaternium-44が挙げられる。
【０２０１】
シャンプー配合物中では、シャンプー中に通例使用される全てのアニオン性、中性、両性またはカチオン性界面活性剤を使用することができる。
【０２０２】
適切なアニオン性界面活性剤は、例えば、アルキル硫酸塩、アルキルエーテル硫酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルアリールスルホン酸塩、アルキルコハク酸塩、アルキルスルホコハク酸塩、N-アルコイルサルコシン酸塩、アシルタウリン酸塩、アシルイソチオン酸塩、アルキルリン酸塩、アルキルエーテルリン酸塩、アルキルエーテルカルボン酸塩、αオレフィンスルホン酸塩、特に、アルカリ金属塩およびアルカリ土類金属塩、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、およびアンモニウム塩およびトリエタノールアミン塩である。アルキルエーテル硫酸塩、アルキルエーテルリン酸塩およびアルキルエーテルカルボン酸塩は、分子中に1〜10個の酸化エチレンまたは酸化プロピレン単位、好ましくは1〜3個の酸化エチレン単位を有することが可能である。
【０２０３】
適切なものは、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、ラウリルエーテル硫酸アンモニウム、ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、オレイルコハク酸ナトリウム、ラウリルスルホコハク酸アンモニウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸トリエタノールアミンである。
【０２０４】
適切な両性界面活性剤は、例えば、アルキルベタイン、アルキルアミドプロピルベタイン、アルキルスルホベタイン、グリシン酸アルキル、カルボキシグリシン酸アルキル、アンホ酢酸アルキルまたはプロピオン酸アルキル、アンホ二酢酸アルキルまたは二プロピオン酸アルキルである。
【０２０５】
例えば、ココジメチルスルホプロピルベタイン、ラウリルベタイン、コカミドプロピルベタインまたはコカンホプロピオン酸ナトリウムを使用することができる。
【０２０６】
適切な非イオン性界面活性剤は、例えば、アルキル鎖中に直鎖状もしくは分枝状でもよい6〜20個の炭素原子を有する脂肪族アルコールまたはアルキルフェノールと、酸化エチレンおよび/または酸化プロピレンとの反応生成物である。アルキレンオキシドの量は、アルコール1モル当たり約6〜60molである。さらに、アルキルアミンオキシド、モノまたはジアルキルアルカノールアミド、ポリエチレングリコールの脂肪酸エステル、アルキルポリグリコシドまたはソルビタンエーテルエステルが適切である。
【０２０７】
さらに、シャンプー配合物は、従来通りのカチオン性界面活性剤、例えば、第四級アンモニウム化合物、例えば塩化セチルトリメチルアンモニウムなどを含むことができる。
【０２０８】
シャンプー配合物中に、特定の効果を実現するために、本発明のケラチン結合エフェクター分子と組み合わせて、従来通りのコンディショニング剤を使用することができる。
【０２０９】
これらには、例えば、INCI名Polyquaterniumの上記のカチオン性ポリマー、特にビニルピロリドン/N-ビニルイミダゾリウム塩のコポリマー(Luviquat FC、Luviquat & commat、HM、Luviquat MS、Luviquat Care)、硫酸ジエチルで四級化したN-ビニルピロリドン/メタクリル酸ジメチルアミノエチルのコポリマー(Luviquat D PQ11)、N-ビニルカプロラクタム/N-ビニルピロリドン/N-ビニルイミダゾリウム塩のコポリマー(Luviquat D Hold)、カチオン性セルロース誘導体(Polyquaternium-4および-10)、アクリルアミドコポリマー(Polyquaternium-7)が挙げられる。さらに、タンパク質水解物を使用することができ、またシリコーン化合物をベースとするコンディショニング物質、例えば、ポリアルキルシロキサン、ポリアリールシロキサン、ポリアリールアルキルシロキサン、ポリエーテルシロキサンまたはシリコーン樹脂も使用することができる。さらなる適切なシリコーン化合物は、ジメチコンコポリオール(CTFA)およびアミノ官能性シリコーン化合物(アモジメチコン(CTFA)など)である。さらに、Guar Hydroxypropyltrimonium Chloride(INCI)などのカチオン性グアー誘導体を使用することができる。
【０２１０】
一般に毛髪化粧用または皮膚化粧用調製物は、皮膚(局所用)または毛髪への塗布に使用される。局所用調製物はここでは、微細な分散状態で活性成分を皮膚または毛髪に塗布するのに適切である調製物を意味すると理解される。この目的に適切なものは、例えば、水性溶液および含水アルコール溶液、スプレー、フォーム、フォームエアロゾル、軟膏、水性ゲル、O/WまたはW/O型のエマルジョン、マイクロエマルジョンまたは化粧用スティック調製物である。
【０２１１】
本発明による化粧品組成物の好ましい一実施形態では、組成物は担体を含む。好ましい担体は、水、ガス、水ベースの液体、油、ゲル、エマルジョンまたはマイクロエマルジョン、分散液、あるいはこれらの混合物である。特定の担体は、良好な皮膚適合性を示す。局所用調製物に特に好都合なのは、水性ゲル、エマルジョンまたはマイクロエマルジョンである。
【０２１２】
使用することができる乳化剤は、非イオン性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤、両性界面活性剤またはアニオン性乳化剤である。乳化剤は、組成物に基づいて、0.1〜10重量％、好ましくは1〜5重量％の量で本発明による組成物中に存在し得る。
【０２１３】
使用される非イオン性界面活性剤は、例えば、下記の群の少なくとも1種からの界面活性剤でよい。
【０２１４】
8〜22個の炭素原子を有する直鎖状脂肪アルコール、12〜22個の炭素原子を有する脂肪酸、およびアルキル基中に8〜15個の炭素原子を有するアルキルフェノールと、2〜30molの酸化エチレンおよび/または0〜5molの酸化プロピレンとの付加物、
1〜30molの酸化エチレンとグリセロールとの付加物のC12/18-脂肪酸モノエステルおよびジエステル、
6〜22個の炭素原子を有する飽和および不飽和脂肪酸ならびにその酸化エチレン付加物のグリセロールモノエステルおよびジエステルならびにソルビタンモノエステルおよびジエステル、
アルキル基中に8〜22個の炭素原子を有するアルキルモノグリコシドおよびオリゴグリコシド、ならびにそのエトキシ化類似体、
ヒマシ油および/または硬化ヒマシ油と15〜60molの酸化エチレンとの付加物、
ポリオールエステル、特にポリグリセロールエステル、例えば、ポリリシノール酸ポリグリセロール、ポリ-12-ヒドロキシステアリン酸ポリグリセロールまたはダイマー酸ポリグリセロールなど(同様に、これらの物質クラス由来の2つ以上からの化合物の混合物も適している)、
ヒマシ油および/または硬化ヒマシ油と2〜15molの酸化エチレンとの付加物、
直鎖状、分枝状、不飽和または飽和のC6/22脂肪酸、リシノール酸、12-ヒドロキシステアリン酸およびグリセロール、ポリグリセロール、ペンタエリトリトール、ジペンタエリトリトール、糖アルコール(例えば、ソルビトール)、アルキルグルコシド(例えば、メチルグルコシド、ブチルグルコシド、ラウリルグルコシド)、およびポリグルコシド(例えば、セルロース)をベースとする部分エステル、
モノ-、ジ-およびトリアルキルホスファート、およびモノ-、ジ-および/またはトリ-PEGアルキルホスファートならびにその塩、
羊毛ワックスアルコール、
ポリシロキサン-ポリアルキルポリエーテルコポリマーおよび対応する誘導体、
独国特許第1165574号に開示されているペンタエリトリトール、脂肪酸、クエン酸および脂肪アルコールの混合エステル、ならびに/または6〜22個の炭素原子を有する脂肪酸、メチルグルコース、およびポリオール、好ましくはグリセロールまたはポリグリセロール、およびポリアルキレングリコールの混合エステル。
【０２１５】
さらに、双性イオン性界面活性剤を、乳化剤として使用することができる。双性イオン性界面活性剤は、分子中に少なくとも1個の第四級アンモニウム基、および少なくとも1個のカルボン酸基またはスルホン酸基を有する界面活性化合物を言及するために使用される用語である。特に適切な双性イオン性界面活性剤は、いわゆるベタインであり、N-アルキル-N,N-ジメチルアンモニウムグリシナート(例えば、ココアルキルジメチルアンモニウムグリシナート)、N-アシルアミノプロピル-N,N-ジメチルアンモニウムグリシナート(例えば、ココアシルアミノプロピルジメチルアンモニウムグリシナート)、および2-アルキル-3-カルボキシルメチル-3-ヒドロキシエチルイミダゾリン(いずれの場合にも、アルキル基またはアシル基中に8〜18個の炭素原子を有する)、ならびにココアシルアミノエチルヒドロキシエチルカルボキシメチルグリシナートなどである。CTFA名コカミドプロピルベタインで知られている脂肪酸アミド誘導体が特に好ましい。
【０２１６】
同様に適切な乳化剤は、両性界面活性剤である。両性界面活性剤は、C8/18-アルキル基または-アシル基以外に、分子中に少なくとも1個の遊離アミノ基および少なくとも1個の-COOH-基または-SO3H基を含み、内部塩を形成することができる界面活性化合物を意味すると理解される。適切な両性界面活性剤の例は、N-アルキルグリシン、N-アルキルプロピオン酸、N-アルキルアミノ酪酸、N-アルキルイミノジプロピオン酸、N-ヒドロキシエチル-N-アルキルアミドプロピルグリシン、N-アルキルタウリン、N-アルキルサルコシン、2-アルキルアミノプロピオン酸およびアルキルアミノ酢酸(いずれの場合にも、アルキル基中に約8〜18個の炭素原子を有する)である。
【０２１７】
特に好ましい両性界面活性剤は、N-ココアルキルアミノプロピオン酸塩、ココアシルアミノエチルアミノプロピオン酸塩およびC12/18-アシルサルコシンである。両性乳化剤以外に、第四級乳化剤もまた適切であり、エステルクアット型のもの、好ましくはメチル四級化ジ脂肪酸トリエタノールアミンエステル塩が特に好ましい。さらに、使用し得るアニオン性乳化剤は、アルキルエーテル硫酸塩、モノグリセリド硫酸塩、脂肪酸硫酸塩、スルホコハク酸塩および/またはエーテルカルボン酸である。
【０２１８】
適切な油体は、6〜18個、好ましくは8〜10個の炭素原子を有する脂肪アルコールをベースとするゲルベアルコール;直鎖状C6〜C22-脂肪酸と直鎖状C6〜C22-脂肪アルコールとのエステル;分枝状C6〜C13-カルボン酸と直鎖状C6〜C22-脂肪アルコールとのエステル;直鎖状C6〜C22-脂肪酸と分枝状アルコール、特に2-エチルヘキサノールとのエステル;直鎖状および/または分枝状脂肪酸と、多価アルコール(例えば、プロピレングリコール、ジメルジオールまたはトリメルトリオール(trimertriol)など)および/またはゲルベアルコールとのエステル;C6〜C10-脂肪酸をベースとするトリグリセリド;C6〜C18-脂肪酸をベースとする液体モノ/ジ、トリグリセリド混合物;C6〜C22-脂肪アルコールおよび/またはゲルベアルコールと、芳香族カルボン酸、特に安息香酸とのエステル;C2〜C12-ジカルボン酸と、1〜22個の炭素原子を有する直鎖状もしくは分枝状アルコール、または2〜10個の炭素原子および2〜6個ヒドロキシル基を有するポリオールとのエステル;植物油;分枝状第一級アルコール;置換シクロヘキサン;直鎖状C6〜C22脂肪アルコール炭酸エステル;ゲルベ炭酸エステル;安息香酸と直鎖状および/または分枝状C6〜C22-アルコールとのエステル(例えば、Finsolv(登録商標)TN);ジアルキルエーテル;エポキシ化脂肪酸エステルとポリオールとの開環生成物;シリコーン油および/または脂肪族またはナフテン系炭化水素である。使用し得る油体はまた、シリコーン化合物、例えば、ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、環状シリコーン、およびアミノ-、脂肪酸-、アルコール-、ポリエーテル-、エポキシ-、フッ素-、アルキル-および/またはグリコシド修飾型シリコーン化合物であり、これは室温で液体の形態または樹脂の形態でもよい。油体は、本発明による組成物中に、組成物に基づいて1〜90重量％、好ましくは5〜80重量％、および特に10〜50重量％の量で存在し得る。
【０２１９】
本発明によるケラチン結合エフェクター分子と共に使用することができる特定の成分の一覧は、当然ながら網羅的または限定的であると考えるべきではない。成分は、個々に、または互いに組み合わせて使用することができる。
【０２２０】
さらに、本発明は、皮膚、爪および/または毛髪を着色するのに適切な組成物、好ましくは本発明による上記のケラチン結合エフェクター分子の少なくとも1種を含む毛髪着色剤に関する。
【０２２１】
本発明は、本発明のケラチン結合エフェクター分子を使用した、毛髪、皮膚および/または爪を着色する方法をさらに提供する。この方法では、上記のケラチン結合ポリペプチド(ii)の少なくとも1種、および表3、5および6による少なくとも1種の色素または反応性色素を含むケラチン結合エフェクター分子を使用することが好ましい。
【０２２２】
当然、毛髪を着色するために適切な調製物を生成する場合は、特定の色のニュアンスを実現するために、ケラチン結合エフェクター分子を異なる色素と混合することもできる。特定の色のニュアンスを有する調製物は、例えば、
(a)ケラチン結合エフェクター分子の生成の間に、選択した反応性色素または色素を混合することによって、あるいは
(b)毛髪着色剤を生成するときに各々のケラチン結合エフェクター分子を混合することによって
生成することができる。
【０２２３】
本発明の方法の特に好ましい実施形態において、
(e) 配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170、好ましくは配列番号:2、4、6、8、10、12、14、40、42、44、46、48、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170、特に好ましくは166および168、最も好ましくは168により示されるる配列の1つを含み、あるいは配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170、好ましくは配列番号:2、4、6、8、10、12、14、40、42、44、46、48、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170、特に好ましくは配列番号166および168、最も好ましくは配列番号168により示されるる配列の少なくとも1つと少なくとも40％、45％または50％、好ましくは少なくとも55％、60％、65％または70％、特に好ましくは少なくとも75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％または94％、特に非常に好ましくは少なくとも95％または96％同一のポリペプチドに相当し、およびケラチンに結合することができるケラチン結合ポリペプチド、
(f)リンカー分子(iii)として、マレイミドカプロン酸またはマレイミドアルカノール、好ましくはマレイミドペンタノール、および
(g)表3に一覧表示されている色素から選択したエフェクター分子(i)、あるいは
(h)表6または7から選択した反応性色素
を含むケラチン結合エフェクター分子が使用される。
【０２２４】
好ましくは、本発明のケラチン結合エフェクター分子を含む調製物を、所望の色の変化を生じるのに十分な量および時間、着色予定の毛髪に塗布することによって毛髪は着色される。ここで、良好な着色は、非常に短時間(数分)後に、または少なくとも30分以内に適切なケラチン結合エフェクター分子で達成することができる(実施例20を参照されたい)。
【０２２５】
着色に必要な量および時間は着色予定の毛髪の長さおよび数によることを、当業者であれば認識している。
【０２２６】
上記の方法の特に好ましい実施形態では、それはケラチン結合エフェクター分子が置換反応で皮膚、毛髪または爪から除かれることができる可逆的着色方法である。このために、例えばケラチンを含有するリンスを使用することができ、その結果としてケラチン結合エフェクター分子は、ケラチンへの従前からの結合から置換され、リンスからのケラチンで飽和する。あるいは、洗い流すため高画分の洗剤(例えば、SDS)を有するリンスもまた可能である(実施例20を参照されたい)。
【０２２７】
配列表
2009523706.tif 000048
2009523706.tif 000049
2009523706.tif 000050
2009523706.tif 000051
2009523706.tif 000052
【実施例】
【０２２８】
実験的実施例
下記の実施例は、本発明の好ましい実施形態を例示するために開示する。これらの実施例は、網羅的なもの、または本発明の対象を限定するものとして考えるべきではない。
【０２２９】
実験の説明において、下記の略語を使用する：
(2-アミノ-2-メチルプロパノール)AMP、(摂氏温度)℃、(エチレンジアミン四酢酸)EDTA、 (1,1-ジフルオロエタン)HFC152、(国際化粧品成分命名法)INCI、(ミリリットル)ml、(分)min、(油/水)O/W、(ポリエチレングリコール)PEG-25、(パラアミノ安息香酸)PABA、(百万分率)ppm、(十分量)q.s.、(ビニルピロリドン)VP、(水/油)W/O、(活性成分)AI、(ポリビニルピロリドン)PVP、ケラチン結合ドメイン(KBD)、ヒトデスモプラキンのケラチン結合ドメインB(KBD-B)、ヒトデスモプラキンのケラチン結合ドメインC(KBD-C)。
【０２３０】
実施例1：発現ベクターおよび産生菌株
ケラチン結合ドメイン(KBD)の発現に関して様々な発現ベクターを試験した。この目的で、様々なプロモーター(例えば、IPTG誘導性、ラムノース誘導性、アラビノース誘導性、メタノール誘導性、構成的プロモーターなど)を使用した。同様に、KBDを融合タンパク質として(例えば、チオレドキシン、またはeGFP、またはYaaD[枯草菌(B.subtilis)、SWISS-PROT:P37527、PDX1]などとの融合物として)発現する構築物についても試験した。ここでは、様々な発現系を使用して、記載されたKBD-B(ケラチン結合ドメインB、配列番号4)、およびKBD-C(ケラチン結合ドメインC、配列番号10)の両方、ならびに2種類のドメインの組合せであるKBD-BCを発現させた。言及するベクター構築物は、特許請求の範囲を限定するものではない。
【０２３１】
代表例として、IPTG誘導性ベクターpQE30-KBD-B(図1)、メタノール誘導性ベクターpLib15(図2)およびpLib16(図3)、ならびに誘導性ベクターpLib19(図4)のベクターマップを挙げる。KBD-Cに関する手順もまた、記載するベクター構築および発現と同様とすることができる。
【０２３２】
KBDの発現のためには、様々な産生宿主、例えば、大腸菌株を使用した(実施例2を参照されたい。例えば、XL10-Gold[Stratagene社]、BL21-CodonPlus [Stratagene社]など)。しかし、他の細菌の産生宿主、例えば、巨大菌(Bacillus megaterium)または枯草菌などもまた使用した。巨大菌におけるKBD発現の場合、Barg, H., Malten, M. & Jahn, D. (2005). Protein and vitamin production in Bacillus megaterium. In Methods in Biotechnology-Microbial Products and Biotransformations (Barredo, J.-L., ed, 205-224)と同様の手順を行った。
【０２３３】
使用した真菌の産生菌株は、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)(実施例3を参照されたい。例えば、GS115およびKM71[両方ともInvitrogen社製]など)、ならびにアスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)(実施例4を参照されたい。例えば、RMS011 [Stringer, MA, Dean, RA, Sewall, TC, Timberlake, WE (1991) Rodletless, a new Aspergillus developmental mutant induced by direct gene activation. Genes Dev 5:1161-1171]およびSRF200 [Karos, M, Fischer, R (1999) Molecular characterization of HymA, an evolutionarily highly conserved and highly expressed protein of Aspergillus nidulans. Mol Genet Genomics 260:510-521]など)であった。しかし、他の真菌の産生宿主、例えば、クロカビ(Aspergillus niger)(EP0635574A1および/またはWO98/46772と同様のKBD発現)などをKBD発現に使用することも可能である。
【０２３４】
実施例2：大腸菌株におけるIPTG誘導性プロモーターを用いたKBD発現（例えば、発現プラスミドpQE30-KBD-Bによる）
発現には、様々な産生宿主、例えば、様々な大腸菌株(例えば、XL10-Gold [Stratagene社]、BL21-CodonPlus [Stratagene社]など)、巨大菌、枯草菌などを使用した。
【０２３５】
ここで、例示的な説明として、KBD-BのクローニングおよびpQE30-KBD-Bで形質転換された大腸菌によるKBD-Bの発現について記載する。
【０２３６】
pQE30-KBD-Bのクローニング
・Lambda-MaxiDNA(DNA-Lambda Maxi Kit、Qiagen社製)を、ヒトケラチン生成細胞(BD Bioscience、Clontech社製、ヒトケラチン生成細胞cDNA、包皮、対数期の初代培養、ベクター:λgt11)のcDNAバンクから調製した。
【０２３７】
下記のオリゴヌクレオチドを使用してPCRを行った：
Bag43(5'-GGTCAGTTACGTGCAGCTGAAGG-3')(配列番号141)、および
Bag44(5'-GCTGAGGCTGCCGGATCG-3')(配列番号142)。
【０２３８】
PCR混合物50μl：
10×PCRバッファーPfu Ultra High Fidelity:  5μl
Lambda DNA(744ng/μl)                 1μl(1:30希釈)
dNTPミックス(10mM)                    1μl
オリゴBag43(192ng/μl)                0.5μl
オリゴBag44(181ng/μl)                0.5μl
Pfu Ultra High Fidelityポリメラーゼ    1μl
H2O                                   41μl。
【０２３９】
温度プログラム：
【表４】
2009523706.tif 000053
【０２４０】
・サイズが約1102bpの得られたPCR産物を、アガロースゲルから切り出して精製した。  
・精製済PCR産物を鋳型として使用し、次いで2回目のPCRを行った。
【０２４１】
使用したオリゴヌクレオチド：
Bag53:(5'-CGCGCCTCGAGCCACATACTGGTCTGC-3')(配列番号143)、および
Bag51(5'-GCTTAGCTGAGGCTGCCGGATCG-3')(配列番号144)。
【０２４２】
PCR混合物50μl：
10×PCRバッファーTAQ:                  5μl
上記PCRからの鋳型                  3.5μl
dNTPミックス(10mM)                 1μl
Oligo Bag53(345ng/μl)             0.5μl
Oligo Bag51(157ng/μl)             0.5μl
TAQ ポリメラーゼ                   1μl
H2O                                39μl。
【０２４３】
温度プログラム:
【表５】
2009523706.tif 000054
【０２４４】
・サイズが約1073bpの得られたPCR産物をアガロースゲルから切り出して精製し、下記のベクターにクローニングした:pCR2.1-TOPO(Invitrogen社製)。  
・次いで、得られたベクターpCR2.1-TOPO+KBD-B(5027bp)を、形質転換させ、大腸菌中で増幅した後、XhoIおよびEcoRIで切断し、得られたKBD-B断片をpBAD/HisA(Invitrogen社製、XhoIおよびEcoRIで同様に切断)にクローニングした。  
・新たに形成したベクターpBAD/HisA+KBD-B(5171bp)を、SacIおよびStuIで再度切断し、得られたKBD-B断片をpQE30(Qiagen社製、SacIおよびSmaIで切断)にクローニングした。得られた発現ベクターpQE30-KBD-B(4321bp、図1も参照されたい)を、下記のKBD-B発現に使用した。
【０２４５】
ベクターpQE30-KBD-Bによって大腸菌で発現したKBD-B(配列番号4)は、N末端にアミノ酸MRGSHHHHHHGSACEL、およびC末端にアミノ酸GVDLQPSLIS(配列番号166)をさらに含むものとした。
【０２４６】
pQE30-KBD-Bによる大腸菌でのKBD-Bの発現
・pQE30-KBD-Bで形質転換された大腸菌株(例えば、XL10-Gold [Stratagene社])をプレートまたはグリセロール培養物から前培養に接種した。本培養の規模に応じて、培地(約1:100)による接種を、試験管または小型フラスコ中で行った。  
・使用する菌株に従って抗生物質を使用した(pQE30-KBD-Bでは、アンピシリン100μg/ml)。  
・250rpmおよび37℃でインキュベーションを行った。  
・本培養物に、前培養物を約1:100で接種した。本培養:対応する抗生物質を含むLB培地または適切な最小培地。250rpm、37℃でインキュベートする。  
・0.5を超える光学密度(600nm)で1mMのIPTGによる発現誘導を行った。  
・発現誘導の4時間後、細胞を遠心分離した。
【０２４７】
発酵槽中での手順は同様であったが、はるかに高いOD単位で発現誘導を行うことができ、したがって細胞およびタンパク質収率を大幅に上昇させることが可能であった。
【０２４８】
実施例3：メタノール誘導性プロモーターを使用する（例えば、発現プラスミドpLib15およびpLib16による）、ピキア・パストリス株によるKBDの細胞内および分泌発現(振とうフラスコ)
KBD発現では、様々なピキア・パストリス株、例えば、GS115およびKM71などを使用した(Pichia Expression Kit、Version M、Invitrogen Life Technologies社製)。
【０２４９】
以下、代表例として、pLib15(細胞内発現ベクター、図6を参照されたい)またはpLib16(分泌発現ベクター、図7を参照されたい)で形質転換されたピキア・パストリスによるKBD-Bの発現について記載する。
【０２５０】
・pLib15の作製のために、948bpのサイズのKBD-BをコードするDNA断片(配列番号145)を、オリゴヌクレオチドLib148-(5'-GCTAAGGAATTCACCATGCATCACCATCACCATCACGAGCCACATACTGGTCTGCT-3'(配列番号147))およびLib149-(5'-GCTGGAGAATTCTCAGCTAATTAAGCTTGGCTGCA-3'(配列番号148))、およびベクターpQE30-KBD-B(実施例2、図5)を鋳型として使用して、PCRによって増幅した。このときPCR産物の両端に、EcoRI制限部位を導入した。  
・pLib16の作製のために、942bpのサイズのKBD-BをコードするDNA断片(配列番号149)を、オリゴヌクレオチドLib149(5'-GCTGGAGAATTCTCAGCTAATTAAGCTTGGCTGCA-3'(配列番号148))およびLib150(5'-GCTAAGGAATTCCATCACCATCACCATCACGAGCCACATACTGGTCTGCT-3'(配列番号151))およびベクターpQE30-KBD-B(実施例2、図5)を鋳型として使用して、PCRによって増幅した。このときPCR産物の両端に、EcoRI制限部位を導入した。  
・下記の組成を有する50μlの反応混合物中でPCRを行った：
1μlのプラスミド-DNA pQE30-KBD-B
1μlのdNTP-Mix(各10mM、Eppendorf社製)
5μlの10×PCRバッファー+MgCl2(Roche社製)
1μlのLib148またはLib150の5'プライマー(50pmolに相当)
1μlのLib149の3'プライマー(50pmolに相当)
5U Pwoポリメラーゼ(Roche社製)。
【０２５１】
PCR反応を下記のサイクル条件下で行った：
ステップ1:5分、95℃(変性)
ステップ2:45秒、95℃
ステップ3:45秒、50℃(アニーリング)
ステップ4:2分、72℃(伸長)
30サイクルのステップ2〜4
ステップ5:10分、72℃(後伸長)
ステップ6:4℃(停止)。
【０２５２】
・オリゴヌクレオチドLib148/Lib149によって増幅したPCR産物(配列番号145)を、EcoRIで消化し、EcoRIで切断されたベクターpPIC3.5(Pichia Expression Kit、Version M、Invitrogen社製)中にライゲーションした。ライゲーションから得たベクターpLib15(図6)を配列決定することによって、正しいKBD-B増幅であるかどうか検査した。  
・オリゴヌクレオチドLib149/Lib150によって増幅したPCR産物(配列番号149)を、EcoRIで消化し、EcoRIで切断されたベクターpPIC9(Pichia Expression Kit、Version M、Invitrogen社製)中にライゲーションした。ライゲーションから得たベクターpLib16(図7)を配列決定することによって、正しいKBD-B増幅であるかどうか検査した。  
・ピキア・パストリス株のエレクトロコンピテントセルおよびスフェロプラストを、製造業者の指示に従って環状ベクターおよびStul線形ベクターpLib15およびpLib16で形質転換した(Pichia Expression Kit、Version M、Invitrogen社製)。  
・染色体DNAを使用したPCRおよびサザンブロットによって、形質転換体を分析した。  
・前培養のために、プレートまたはグリセロール培養物からKBD-Bを発現しているピキア・パストリス形質転換体を接種した。本培養物の規模に応じて、試験管または小型フラスコ中のMGY、BMGまたはBMGY培地(Pichia Expression Kit、Version M、Invitrogen社製)(約1:100)に接種した。  
・培養物を、250〜300rpm、30℃でOD600=2〜6までインキュベートした。  
・室温にて5分間1500〜3000×gで細胞を回収した。  
・本培養のために、回収した細胞ペレットを、メタノール含有mM、BMMまたはBMMY培地(Pichia Expression Kit、Version M、Invitrogen社製)中にOD600=1の濃度で加え、発現を誘導した。  
・本培養物を、250〜300rpm、30℃で、1〜96時間インキュベートした。  
・100％メタノールをメタノール最終濃度0.5％で加えることによって24時間毎に発現誘導を維持した。  
・細胞内発現の場合は、本培養の終了後に細胞の回収およびMenton-Gaulinを用いた破壊を行った。  
・分泌発現の場合は、培養上清を回収し、そこからKBD-Bを直接的に精製した。  
・ピキア・パストリスにおいて細胞内発現したKBD-B(pLib15)(配列番号145)には、ポリペプチド配列(配列番号4)に加えて、N末端にアミノ酸MHHHHHH、C末端にアミノ酸GVDLQPSLISをさらに含むものとした。  
・ピキア・パストリスにおいて分泌発現したKBD-B(pLib16)(配列番号149)には、プロセシング前に、ポリペプチド配列(配列番号4)に加えて、N末端にアミノ酸MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAYVEFHHHHHHが、C末端にアミノ酸GVDLQPSLISをさらに含むものとした。  
・ピキア・パストリスによってプロセシングおよび分泌されたKBD-B(pLib16)(配列番号149)には、ポリペプチド配列(配列番号4)に加えて、N末端にアミノ酸YVEFHHHHHH、C末端にアミノ酸GVDLQPSLISをさらに含むものとした。
【０２５３】
実施例4：誘導性alcAプロモーターを使用する（例えば、発現プラスミドpLib19を介する）、アスペルギルス・ニデュランス株によるKBDの発現(振とうフラスコ)
発現のために、例えばRMS011またはSRF200などのアスペルギルス・ニデュランス野生型株を使用した。以下、例示的な説明として、pLib19(図8)で形質転換されたアスペルギルス・ニデュランスによるKBD-Bの発現について記載する。
【０２５４】
・pLib19の構築のために、922bpのサイズのKBD-BをコードするDNA断片(配列番号152)を、オリゴヌクレオチドLib151(5'-CACCATGCATCACCATCACCATCACGAGCCACATACTGGTCTGCT-3'(配列番号154))およびLib152(5'-GCTAATTAAGCTTGGCTGCA-3'(配列番号155))、およびベクターpQE30-KBD-B(実施例2、図5)を鋳型として使用して、PCRによって増幅した(プライマーLib151およびLib152のTm値に適合させ、53℃のPCRプログラムのアニーリング温度を用いて上記のPCR条件を使用)。PCR産物を、ベクターpENTR/D(pENTR(商標)Directional TOPO(登録商標)Cloning Kit、Version E、Invitrogen社製)中にライゲーションした。配列決定によって正しいKBD-B増幅を検査した。  
・「Gateway(登録商標)LR clonase(商標)酵素ミックス」(Invitrogen社製)を使用して、KBD-BをコードするDNA断片の、ベクターpMT-OvEへの組換えを行った(Toews MW, Warmbold J, Konzack S, Rischitor P, Veith D, Vienken K, Vinuesa C, Wei H, Fischer R; Establishment of mRFP1 as a fluorescent marker in Aspergillus nidulans and construction of expression vectors for high-throughput protein tagging using recombination in vitro (GATEWAY). (2004) Curr Genet 45: 383-389)。これによってベクターpLib19が生成された(図8)。  
・アスペルギルス・ニデュランス野生型株のプロトプラストを、環状ベクターpLib19で形質転換した(Yelton MM, Hamer JE, Timberlake WE; Transformation of Aspergillus nidulans by using a trpC plasmid., (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81: 1479-1474)。染色体DNAを使用したPCRおよびサザンブロットによって、形質転換体を分析した。  
・KBD-Bを発現しているアスペルギルス・ニデュランス形質転換体の前培養のために、500mlフラスコ中の100mlの最小培地(0.6％NaNO3、0.152％KH2PO4、0.052％KCl[pH6.5]、0.8％グルコース、0.05％MgSO4、1ml微量元素溶液[1g/l FeSO4×7H2O、8.8g/l ZnSO4×7H2O、0.4g/l CuSO4×5H2O、0.15g/l MnSO4×4H2O、0.1g/l Na2B4O7×10H2O、0.05g/l (NH4)6Mo7O24×4H2O]、菌株特異的添加物)または100mlの完全培地(2％麦芽エキス、0.1％ペプトン、2％グルコース、菌株特異的添加物)に、106〜107個の胞子を接種し、200〜250rpm、37℃で16〜24時間インキュベートした。  
・前培養の後に、濾過によって真菌の菌糸体を回収し、蒸留水で洗浄し、100〜500mlの新鮮な最小培地と共にフラスコに移した。この本培養培地において、C供給源としてグルコースの代わりに0.1％フルクトースを使用した。KBD発現を誘導するために、エタノール(1％最終濃度)またはグリセロール(50mM)または酢酸ナトリウム(50mM)またはエチルアミンまたはトレオニンを、さらに培地に加えた。発現を誘導するために言及した添加剤は、特許請求の範囲を制限するものではない。本培養物を、200〜250rpmおよび37℃でさらに5〜48時間インキュベートした。  
・培養終了後に、室温で5分間、1500〜3000×gで真菌の菌糸体を回収し、Menton-Gaulinを用いて破壊した。  
・アスペルギルス・ニデュランス中で発現したKBD-B(pLib19)(配列番号152)には、ポリペプチド配列(配列番号4)に加えて、N末端にアミノ酸MHHHHHH、C末端にアミノ酸GVDLQPSLISKGGRADPAFLYKVVMIRLLTKPERKLLEGGPGTQLLFPLVRVNCALGVIMVIAVSCVKLLSAHNSTQHTSRKHKVをさらに含むものとした。
【０２５５】
実施例5：細胞破壊および細胞内封入体精製(pQE30-KBD-B)
可溶性発現したKBDを、(例えば、Menton-Gaulinによる)細胞破壊の後に直接使用し、またはクロマトグラフィーによって精製することができた(実施例6を参照されたい)。(例えば、封入体中で)不溶性発現したKBDを、下記のように精製した。
【０２５６】
・発酵槽内容物を遠心分離し、ペレットを20mMリン酸バッファー(pH=7.5)に懸濁し、Menton-Gaulinを用いて破壊した。  
・破壊した細胞を再び遠心分離(15000g)し、そのペレットを、20mMリン酸、500mM NaClおよび8M尿素で処理し、そして撹拌した(封入体の溶解)。  
・上清のpHを7.5に調節した。  
・次いで、遠心分離を再び行い、実施例6に記載のように、上清をNiキレートセファロースカラムに加え、精製した。
【０２５７】
実施例6：Niキレートセファロースでのケラチン結合ドメインBの精製
Niカラムによって結合したHisタグを介して、KBDをクロマトグラフィーによって精製することができた。
【０２５８】
カラム材料:Ni-セファロースHigh Performance
Amersham Biosciences社、品番17-5268-02。
【０２５９】
材料をカラム(例えば、直径2.6cm、高さ10cm)中に詰め、バッファーA+4％バッファーB(20mMイミダゾールに相当)で平衡化した。  
タンパク質抽出物(例えば、細胞破壊および細胞内封入体精製を参照されたい)を、Superloop(AKTA system)を使用してカラムに加えた(pH7.5)(流量、約5ml/分)。  
添加の後、バッファーA+20mMイミダゾールで洗浄を行った。  
バッファーB(バッファーA中、500mMイミダゾール)によって溶出を行った。  
フラクションコレクターを使用して溶出液を画分として回収した。  
次いで、溶出液を脱塩した(濃縮する試料には好都合である)。このために、例えばセファデックスG25中型カラム(Amersham社製)によって、溶出液を脱塩した。続いて、濃縮のためには、例えば、Amiconチャンバー(撹拌限外濾過セル、Millipore社製)が可能であった。
【０２６０】
バッファーA:20mMリン酸二水素ナトリウム
500mM NaCl(所望であれば、低濃度のNaClを有するバッファーを使用することも可能である。)
8M尿素(すでに可溶性発現した「活性」KBDが、クロマトグラフィーによって分離される場合は、尿素を使用する必要はない。尿素がない場合、タンパク質のそれに続く再生は必要ない。)
pH=7.50
バッファーB:20mMのリン酸二水素ナトリウム
500mM NaCl(所望であれば、低濃度のNaClを有するバッファーを使用することも可能である)
8M尿素
500mMイミダゾール
pH=7.50。
【０２６１】
実施例7：ケラチン結合ドメインBの再生
不溶性発現した(例えば、封入体由来の)ケラチン結合ドメインを、下記のように再生し、ゆえに活性化することができる。
【０２６２】
方法1:不連続透析
Cellytic IB(Sigma社製、品番C5236)6.5ml、5mM DTTを、8M尿素(Niキレート溶出液、HiTrap)中のKBD-B封入体6.5mlに加えた。次いで、再生対象の溶液を透析チューブに注ぎ入れた(Spectrum社製:Spectra Por MWCO:12〜14kD)。  
注意深く撹拌しながら、4℃で約12時間、6M尿素溶液1Lに対して透析を行った。  
25mM Tris/HCl(pH=7.50)500mlを加え、同様に4℃で9時間透析を行った。次いで、さらなるトリスバッファー(上記を参照されたい)250mlを加え、さらに12時間透析を行った。  
次いで、25mM Tris/HCl(pH=7.50)500mlを再度加え、4℃で9時間、同様に透析を行った。次いで、さらなるトリスバッファー(上記を参照されたい)250mlを加え、さらに12時間透析を行った。  
次いで、25mM Tris/HCl(pH=7.50)500mlを再度加え、4℃で9時間、同様に透析を行った。次いで、透析物を含有する透析チューブを、25mM Tris+150mM NaCl(pH=7.50)2L中に加えた。次いで、4℃で12時間、再度透析を行った。  
次いで、透析チューブの内容物を取り出した。
【０２６３】
方法2:連続透析
8M尿素(Niキレート溶出液、HiTrap)中のKBD-B封入体20mlを、Cellytic IB(Sigma社製、品番C5236)10ml、5mM DTTで処理した。次いで、その溶液を透析チャンバー(Slide-A-Lyzer Dialyses Cassette PIERCE、MWCO:10kD、品番66830)に注いだ。  
次いで、6M尿素溶液1Lに対して、4℃で約1時間透析を行った。  
次いで、48時間に亘り、下記のバッファー2Lを、蠕動ポンプによって計量しながら連続供給した(25mM Tris/HCl、pH=7.5)。  
次いで、透析物を含有する透析チューブを、最終バッファー2Lに加え(25mM Tris+150mM NaCl、pH=7.50)、4℃で約12時間、透析を行った。  
次いで、透析チューブの内容物を取り出した。
【０２６４】
実施例8：皮膚への結合1(定性的)
KBDが皮膚に結合するかどうかを調べるために視覚による定性試験を開発した。
【０２６５】
使用する溶液:
ブロッキング溶液:ウェスタンブロッキング試薬1921673Roche(10×溶液)をTBSで希釈したもの
TBS:20mM Tris、150mM NaCl(pH7.5)
TTBS:TBS+0.05％Tween20。
【０２６６】
第1のステップは、皮膚の外側角質層を安定的な支持材に移すことである。この目的で、透明な接着テープを、脱毛済みのヒト皮膚にしっかりと貼り、そして剥がした。試験は、透明な接着テープ上で直接行うことができ、または接着した角質層をスライドガラスに再度接着させて移すことができる。下記のように結合を実証した：
・様々な試薬とのインキュベーションのために、ファルコン容器に移す。  
・適切な場合、脱脂のためにエタノールを加え、エタノールを除去し、スライドを乾燥させる。  
・ブロッキングバッファーと室温で1時間インキュベートする。  
・TTBSで5分間、2回洗浄する。  
・TBSで5分間、1回洗浄する。  
・試験対象のKBD(タグ、例えば、His6、HAなどにカップリングされている)または対照タンパク質と共に、TBS/0.05％Tween20中、室温で2〜4時間インキュベートする。  
・上清を除去する。  
・TBSで3回洗浄する。  
・TBS+0.01％ブロッキング中で1:2000に希釈されたモノクローナル抗ポリヒスチジン(または特異的KBDウサギ)抗体と室温で1時間インキュベートする。  
・TTBSで5分間、2回洗浄する。  
・TBSで5分間、1回洗浄する。  
・TBS+0.01％ブロッキング中で1:5000に希釈された抗マウスIgGアルカリホスファターゼコンジュゲートと室温で1時間インキュベートする。  
・TTBSで2回、5分間洗浄する。  
・TBSで1回、5分間洗浄する。  
・ホスファターゼ基質を加える(NBT-BCIP;Boehringer MA1錠/水40ml、2.5分、水で停止)。  
・肉眼でまたは顕微鏡を使用して、有色沈殿物を光学的に検出する。青色沈殿物は、KBDが皮膚に結合したことを示す。
【０２６７】
実施例9：皮膚への結合2(定量的)
KBDの毛髪/皮膚結合強度を非特異的タンパク質と比較することのできる、定量試験を開発した。
【０２６８】
5mm穿孔器を使用して、毛髪のない解凍した乾燥片(ヒトまたはブタ)からの切片に孔をあけた(あるいは、表面試験の場合、皮膚の切片をファルコン蓋中に入れる)。次いで、皮膚試料を2〜3mmの厚さにし、存在する全ての組織を除去する。次いで、皮膚試料を、エッペンドルフ容器(タンパク質低結合性)に移し、結合の実証を行う(図9も参照されたい。あるいは、L'Oreal社製Episkin system[再構成したヒトの皮膚]も使用することができる)：
・PBS/0.05％Tween20により2回洗浄する。  
・PBS中の1％BSA 1mlを加え、穏やかに回旋運動(900rpm)させながら、室温で1時間インキュベートする。  
・上清を除去する。  
・PBS中のKBD100μgを0.05％Tween20に加え、穏やかに回旋運動(900rpm)させながら、室温で2時間インキュベートする。  
・上清を除去する。  
・PBS/0.05％Tween20により3回洗浄する。  
・穏やかに回旋運動(900rpm)させながら、1mlのモノクローナルマウス抗タグ(His6またはHAまたは特異的KBD)抗体(ペルオキシダーゼコンジュゲートを有する)(0.05％Tween20を含むPBS中、1:2000)[モノクローナル抗ポリヒスチジンペルオキシダーゼコンジュゲート、マウスで産生、凍結乾燥粉末、Sigma社製]と共に、室温で2〜4時間インキュベートする。  
・PBS/0.05％Tween20で3回洗浄する。  
・ペルオキシダーゼ基質(1ml/エッペンドルフ容器;組成は下記のこと)を加える。  
・青色に呈色するまで反応を進行させる(約90秒)。  
・2M H2SO4100μlで反応を停止させる。  
・405nmでの吸収を測定した。
【０２６９】
ペルオキシダーゼ基質(直前に調製)：
TMB溶液0.1ml(DMSO中42mMのTMB)
+基質バッファー10ml(0.1M酢酸ナトリウムpH4.9)
+14.7μlのH2O2(3％濃度)。
【０２７０】
実施例10：毛髪への結合(定量的)
他のタンパク質と比較してのKBDの毛髪への結合強度を示すことができるように、定量的アッセイを開発した(図9も参照されたい)。この試験において、まず毛髪をKBDと共にインキュベートし、過剰なKBDを洗い落とした。次いで、抗体-ペルオキシダーゼコンジュゲートを、KBDのHisタグを介してカップリングさせた。結合していない抗体-ペルオキシダーゼコンジュゲートを、再び洗い落とした。結合している抗体-ペルオキシダーゼコンジュゲート[モノクローナル抗ポリヒスチジンペルオキシダーゼコンジュゲート、マウスで産生、凍結乾燥粉末、Sigma社製]は、無色の基質(TMB)を有色生成物に変換することができ、これを405nmでの光度測定によって測定することができる。吸収強度は、結合しているKBDまたは比較タンパク質の量を示す。選択した比較タンパク質は、例えば、枯草菌由来のYaaDであり、本試験で必要であるので、それは検出用のHisタグを同様に有するものとした。Hisタグの代わりに、ペルオキシダーゼとコンジュゲートされている他の特異的抗体を使用することもできる。
【０２７１】
毛髪(ヒト)5mgを、長さ5mmに切断し、エッペンドルフ容器(タンパク質低結合性)に移して、結合の実証を行う：
・脱脂のためエタノール1mlを加える。  
・遠心分離し、エタノールを除去し、毛髪をH2Oで洗浄する。  
・PBS中の1％BSA1mlを加え、穏やかに回旋運動させながら、室温で1時間インキュベートする。  
・遠心分離し、上清を除去する。  
・1mlのPBS/0.05％Tween20中の試験対象のケラチン結合ドメイン(タグ(例えば、His6、HAなど)にカップリングされている)または対照タンパク質を加え、穏やかに回旋運動させながら、4℃で16時間(または室温で少なくとも2時間)インキュベートする。  
・遠心分離し、上清を除去する。  
・PBS/0.05％Tween20で3回洗浄する。  
・穏やかに回旋運動させながら、1mlのモノクローナルマウス抗タグ(His6またはHA)抗体(ペルオキシダーゼコンジュゲートを有する)(PBS/0.05％Tween20中、1:2000)[モノクローナル抗ポリヒスチジンペルオキシダーゼコンジュゲート、マウスで産生、凍結乾燥粉末、Sigma社製]と共に、室温で2〜4時間インキュベートする。  
・PBS/0.05％Tween20で3回洗浄する。  
・ペルオキシダーゼ基質(1ml/エッペンドルフ容器)を加える。  
・青色に呈色するまで反応を進行させる(約2分)。  
・2M H2SO4100μlで反応を停止させる。  
・405nmでの吸収を測定する。
【０２７２】
ペルオキシダーゼ基質(直前に調製)：
TMB溶液0.1ml(DMSO中の42mMのTMB)
+基質バッファー10ml(0.1Mの酢酸ナトリウム、pH4.9)
+14.7μlのH2O2(3％濃度)
BSA=ウシ血清アルブミン
PBS=リン酸緩衝食塩水
Tween20=モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、nは約20
TMB=3,5,3',5'-テトラメチルベンジジン。
【０２７３】
KBD-Bについて例示的に行った毛髪への結合試験では、比較タンパク質YaaDの有意に不十分な結合と比較して、KBD-B(配列番号166)の毛髪への結合性が大変優れていることが示された。
【表６】
2009523706.tif 000055
【０２７４】
実施例11：IPTG誘導性プロモーターを有する発現プラスミドpRee024(図8)を使用した大腸菌株によるKBD-D(配列番号167)の発現
発現のために、大腸菌株XL10 Gold[Stratagene社]を使用した。
【０２７５】
ここで、代表例として、KBD-D(配列番号167)のクローニング、その後のpRee024(図8)で形質転換された大腸菌でのKBD-Dタンパク質(配列番号168)の発現について記載する。
【０２７６】
pRee024のクローニング
・Lambda-MaxiDNA(DNA-Lambda Maxi Kit、Qiagen社製)を、ヒトケラチン生成細胞のcDNAバンク(BD Bioscience、Clontech社製、ヒトケラチン生成細胞cDNA、包皮、対数期の初代培養、ベクター:λgt11)から調製した。  
KBD-D遺伝子の増幅のためのPCRを、2つのステップで行った。まず5'末端および3'末端を別々に増幅させた。これらの断片は、全KBD-D遺伝子の増幅のためのマトリックスであった。
【０２７７】
5'末端の増幅のためのPCRを下記のように行った。  
プライマーは、下記の配列を有した：
HRe6:5'-ATGAACCACTCGCCGCTCAAGACCGCCTTG-3'(配列番号171)
HRe9:5'-CGTTCCCGGTTCTCCTCAGGAGGCTGACTG-3'(配列番号172)。
【０２７８】
100μlのPCR混合物：
10×PCRバッファーPfu Ultra High Fidelity:    10μl
Lambda DNA(744ng/μl)                    1μl(1:10希釈)
dNTPミックス(10mM)                       10μl
HRe6(196ng/μl)                          1μl
HRe9(201ng/μl)                          1μl
Pfu Ultra High Fidelityポリメラーゼ      1μl
再蒸留H2O                                 76μl。
【０２７９】
温度プログラム:
【表７】
2009523706.tif 000056
【０２８０】
・約1kbのサイズの断片を、アガロースゲル中で検出した。反応物を精製し、KBD-D遺伝子の増幅のために5'末端鋳型として下記で使用した。
【０２８１】
3'末端の増幅のためのPCRを下記のように行った。  
プライマーは、下記の配列を有した：
HRe7:5'-TTAGAATCGGGAGGTGAAGTTCCTGAGGCT-3'(配列番号173)
HRe8:5'-CACCACCAACAAGCTGGAGACCCGGAG-3'(配列番号174)。
【０２８２】
100μlのPCR混合物:
10×PCRバッファーPfu Ultra High Fidelity:       10μl
Lambda DNA(744ng/μl)                       1μl(1:10希釈)
dNTPミックス(10mM)                          10μl
HRe7(201ng/μl)                             1μl
HRe8(209ng/μl)                             1μl
Pfu Ultra High Fidelityポリメラーゼ         1μl
再蒸留H2O                                   76μl。
【０２８３】
温度プログラム:
【表８】
2009523706.tif 000057
【０２８４】
・約1.2kbのサイズの断片を、アガロースゲル中で検出した。反応物を精製し、下記でKBD-D遺伝子の増幅のための3'末端鋳型として使用した。  
・KBD-D遺伝子の増幅のために、5'末端鋳型および3'末端鋳型をマトリックスとして使用した。PCRを下記のように行った：
100μlのPCR混合物:
10×PCRバッファーPfu Ultra High Fidelity:     10μl
dNTP-mix(10mM)                            10μl
再蒸留H2O                                 75μl
5'末端鋳型                                1μl
3'末端鋳型                                1μl
Pfu Ultra High Fidelityポリメラーゼ       1μl
H2O                                       76μl。
【０２８５】
温度プログラム：
【表９】
2009523706.tif 000058
【０２８６】
10サイクル後に、1μlのプライマーHRe6(196μg/ml)およびHRe7(206μg/ml)および1μlのPfu Ultra High Fidelityポリメラーゼを加え、反応を伴う下記の温度プログラムを行った。  
温度プログラム：
【表１０】
2009523706.tif 000059
【０２８７】
次いで、Taqポリメラーゼ1μlを加え、混合物を72℃で10分間インキュベートした。  
・得られた約2150bpのサイズのPCR産物を、アガロースゲルから切り出して精製し、下記のベクターpCR2.1-TOPO(Invitrogen社製)にクローニングした。  
・次いで、得られたベクターpRee019(6112bp)を形質転換し、大腸菌中で増幅し、KBD-D遺伝子を配列決定によって検査した。  
・次いで、KBD-D遺伝子を発現ベクター中にクローニングした。このために、ベクターpRee019をさらなる鋳型としてPCRをさらに行った。
【０２８８】
使用するオリゴヌクレオチド：
HRe26:5'-CTCGGTACCAACCACTCGCCGCTCAAGACCGCCTTGGCG-3'(配列番号175)
HRe27:5'-ATTAAGCTTTTAGAATCGGGAGGTGAAGTTCCTGAGGCT-3'(配列番号176)。
【０２８９】
100μlのPCR混合物:
10×PCRバッファーPfu Ultra High Fidelity:       10μl
pRee019(25ng/μl)                           1μl
dNTPミックス(10mM)                         10μl
HRe26(287ng/μl)                            1μl
HRe27(354ng/μl)                            1μl
Pfu Ultra High Fidelityポリメラーゼ         1μl
再蒸留H2O                                   76μl。
【０２９０】
温度プログラム：
【表１１】
2009523706.tif 000060
【０２９１】
・約2.2kbのサイズの断片を、アガロースゲル中に検出した。反応物を精製し、次いで制限エンドヌクレアーゼKpnIおよびHindIIIで切断し、得られた断片を発現ベクター中にクローニングした。これによってベクターpRee024が得られ、これを次いでKBD-D発現のために使用した。
【０２９２】
大腸菌中のpRee024によるKBD-D(配列番号167)の発現
・pRee024で形質転換された大腸菌株(例えば、TG10)をプレートまたはグリセロール培養物から前培養物に接種した。本培養物の規模に応じて、LB培地(約1:100)による接種を、試験管または小型フラスコ中で行った。
【０２９３】
・使用する菌株に従って抗生物質を使用した(pRee024で形質転換された大腸菌TG10では、アンピシリン100μg/ml)。  
・250rpm、37℃でインキュベートした。  
・本培養物に前培養物を約1:100で接種した。本培養物:対応する抗生物質を含むLB培地または適切な最少培地。250rpm、37℃でインキュベーションを行った。  
・OD578nmが1を超えた時点で1mMのIPTGを用いて発現誘導した。次いで、インキュベーション温度を室温(約20℃)に下げた。発現誘導の2時間後に、細胞を遠心分離した(図9を参照されたい)。
【０２９４】
実施例12：細胞破壊および細胞内封入体精製(pRee024)
不溶性発現した(例えば封入体中の)KBD-D(配列番号168)を、下記のように精製した。
【０２９５】
実施例2からの細胞沈殿物を、100mM NaCl(pH=7.5)を含む20mMリン酸バッファー中に再懸濁し、超音波処理によって破壊した。  
破壊した細胞を、再び遠心分離した(4℃、12000g、20分)。上清を廃棄した。沈殿物をバッファーA(10mM NaH2PO4、2mM KH2PO4、100mM NaCl、8M尿素、5mM DTT)に再溶解した。次いで、混合物を再び遠心分離し、上清をNiキレートセファロースに加えた。添加の後に、バッファーA(20mMのイミダゾール)で洗浄を行った。バッファーB(10mM NaH2PO4、2mM KH2PO4、100mM NaCl、8M尿素、5mM DTT、500mMイミダゾール)で、カラムからの溶出を行った。溶出液を画分として回収し、SDS-PAGEにより分析した。精製したKBD-Dを含んだ画分を、実施例13に記載するように再生した。
【０２９６】
実施例13：ケラチン結合ドメインD(配列番号168)の再生
(例えば、封入体からの)不溶性発現したケラチン結合ドメインDは、透析によって再生でき、したがって活性化できた。手順は下記の通りであった：
精製したKBD-Dを含む実施例12からの画分を、透析チューブ(MWCO12〜14KD)中に注いだ。  
次いで、8M尿素溶液1Lに対して透析を約1時間行った。  
次いで、12時間に亘って、脱イオン水2Lを、蠕動ポンプによって計量しながら連続供給した。  
次いで、透析チューブの内容物を取り出した。このように活性化したKBD-Dを、下記の活性試験において使用した。
【０２９７】
実施例14：皮膚への定性的結合
KBD-D(配列番号168)が皮膚に結合したかどうかを試験するために視覚による定性試験を使用した。
【０２９８】
使用する溶液：
ブロッキング溶液:ウェスタンブロッキング試薬1921673Roche(10×溶液)をTBSで希釈したもの
TBS:20mM Tris、150mM NaCl、pH7.5
TTBS:TBS+0.05％Tween20。
【０２９９】
第1のステップは、皮膚の外側角質層を安定的な支持材に移すことである。この目的で、透明な接着テープを、脱毛済みのヒト皮膚にしっかりと貼り、そして剥がした。試験は、透明な接着テープ上で直接行うことができ、または接着した角質層をスライドガラスに再度接着させて移すことができる。下記のように結合を実証した：
・様々な試薬とのインキュベーションのために、ファルコン容器に移す。  
・適切な場合、脱脂のためにエタノールを加え、エタノールを除去し、スライドを乾燥させる。  
・ブロッキングバッファーと室温で1時間インキュベートする。  
・TTBSで5分間、2回洗浄する。  
・TBSで5分間、1回洗浄する。  
・試験対象のKBD(タグ、例えば、His6、HAなどにカップリングされている)と共に、TBS/0.05％Tween20中、室温で2〜4時間インキュベートする。  
・上清を除去する。  
・TBSで3回洗浄する。  
・モノクローナルマウス抗タグ(His6またはHA)抗体(ペルオキシダーゼコンジュゲートを有する)(TBS+0.01％ブロッキング中で、1:2000)[モノクローナル抗ポリヒスチジンペルオキシダーゼコンジュゲート、マウスで産生、凍結乾燥粉末、Sigma社製]と共に、室温で1時間インキュベートする。  
・TTBSで5分間、2回洗浄する。  
・TBSで5分間、1回洗浄する。  
・ホスファターゼ基質を添加する(NBT-BCIP;Boehringer MA1錠/水40ml、2.5分;水で停止)。  
・肉眼でまたは顕微鏡を使用して、有色沈殿物を光学的に検出する。
【０３００】
KBD-Dと相互作用する抗ポリヒスチジン-APコンジュゲートの反応である青色の沈殿物が、KBD-Dで処理した透明の接着テープ上に見えた。陰性対照として、透明の接着テープをバッファーのみで処理した。明らかな青色呈色はここでは見られなかった。これらの結果は、KBD-Dが透明の接着テープ上の皮膚ケラチンに結合したことを示す。
【０３０１】
実施例15：皮膚および毛髪への定量的結合
KBD-B(配列番号166)と比較しての皮膚および毛髪へのKBD-D(配列番号168)の結合強度を調査するために、定量試験を行った。この試験において、まず毛髪を、KBD-BまたはKBD-Dと共にインキュベートし、過剰なKBD-Bまたは-Dを洗い落とした。次いで、抗体-ペルオキシダーゼコンジュゲートを、KBD-Bまたは-DのHis/タグを介してカップリングした。結合していない抗体-ペルオキシダーゼコンジュゲートを再び洗い落とした。結合している抗体-ペルオキシダーゼコンジュゲートは、無色の基質(TMB)を有色生成物に変換することができ、これを405nmでの光度測定によって測定した。吸収強度は、結合しているKBD-Bまたは-Dの量を示す。
【０３０２】
皮膚への結合の試験を、下記のようにマイクロタイタープレート中においてヒトケラチン生成細胞で行った。  
・PBS/0.05％Tween20で2回洗浄する。  
・PBS中の1％BSA1mlを加え、穏やかに回旋運動(900rpm)させながら、室温で1時間インキュベートする。  
・上清を除去する。  
・PBS(0.05％Tween20)中のKBD100μgを加え、穏やかに回旋運動(900rpm)させながら、室温で2時間インキュベートする。  
・上清を除去する。  
・PBS/0.05％Tween20で3回洗浄する。  
・穏やかに回旋運動(900rpm)させながら、モノクローナルマウス抗タグHis6抗体1mlと室温で2〜4時間インキュベートする。  
・PBS/0.05％Tween20で3回洗浄する。  
・ペルオキシダーゼ基質を加える(1ml/エッペンドルフ容器、組成は下記を参照されたい)。  
・青色に呈色するまで反応させる(約90秒)。  
・2M H2SO4100μlで反応を停止した。  
・405nmでの吸収を測定した。
【０３０３】
ペルオキシダーゼ基質(直前に調製)：
TMB溶液0.1ml(DMSO中の42mMのTMB)
+基質バッファー10ml(0.1M酢酸ナトリウム、pH4.9)
+14.7μlのH2O2(3％濃度)。
【０３０４】
KBD-Bと比較したKBD-Dの毛髪結合を特徴付けるために、下記の結合アッセイを行った：
毛髪(ヒト)5mgを、5mmの長さの断片に切断し、エッペンドルフ容器(タンパク質低結合性)に移した。  
・脱脂のためにエタノール1mlを加える。  
・遠心分離し、エタノールを除去し、毛髪をH2Oで洗浄する。  
・遠心分離し、上清を除去する。  
・PBS/0.05％Tween201ml中に試験対象のケラチン結合ドメイン(タグ(例えば、His6、HAなど)にカップリング)を加え、室温にて2時間穏やかに回旋運動させながら、インキュベートする。  
・遠心分離し、上清を除去する。  
・PBS/0.05％Tween20で3回洗浄する。  
・モノクローナルマウス抗タグ(His6またはHA)抗体(ペルオキシダーゼコンジュゲートを有する)(PBS/0.05％Tween20中で1:2000)[モノクローナル抗ポリヒスチジンペルオキシダーゼコンジュゲート、マウスで産生、凍結乾燥粉末、Sigma社製]1mlと共に、穏やかに回旋運動させながら、室温で2〜4時間インキュベートする。  
・PBS/0.05％Tween20で3回洗浄する。  
・ペルオキシダーゼ基質を加える(1ml/エッペンドルフ容器)。  
・青色に呈色するまで反応を進める(90秒)。  
・2M H2SO4100μlで反応を停止させる。  
405nmでの吸収を測定した。
【０３０５】
ペルオキシダーゼ基質(直前に調製)：
TMB溶液0.1ml(DMSO中42mMのTMB)
+基質バッファー10ml(0.1Mの酢酸ナトリウム、pH4.9)
+14.7μlのH2O2(3％濃度)
BSA=ウシ血清アルブミン
PBS=リン酸緩衝食塩水
Tween20=モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、nは約20
TMB=3,5,3',5'-テトラメチルベンジジン。
【表１２】
2009523706.tif 000061
【表１３】
2009523706.tif 000062
【表１４】
2009523706.tif 000063
【０３０６】
これらの結果は、タンパク質KBD-Dが、毛髪に結合することができ、皮膚にさらに強く結合することができることを示す(表5を参照されたい)。KBD-B(配列番号166)と対照的に、KBD-D(配列番号168)の結合は、10％濃度までのSDS溶液による洗浄による影響はより弱い(表5aを参照されたい)。
【０３０７】
実施例16：カップリング成功の試験(エルマン試験)
エフェクターカップリングの成功を、3種の異なる試験によってモニターした：
(i)エフェクターカップリングの前および後の、タンパク質中の遊離Cys-SH基の数を決定することができるエルマン試験。ここで、カップリング後の遊離SH基の顕著な減少は、良好な反応進行を示す。  
(ii)カップリングしたエフェクターがある場合およびない場合の、KBD-B(配列番号166)の毛髪への結合を測定することのできる活性試験。良好な反応制御は、カップリングしていないKBD-B(配列番号166)と比較して、KBD-エフェクターの活性を減少させるべきではない(実施例17を参照されたい)。  
(iii)KBD-B(配列番号166)への色素のカップリングが成功した結果としての毛髪または皮膚の可視的着色(実施例20を参照されたい)。
【０３０８】
(iii)に関して、エフェクターカップリングの成功を、エルマン試験を用いて下記のように試験した：
必要な材料：
・エルマン試薬:5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)(DTNB)、0.1Mリン酸ナトリウムバッファー中に4mg/1ml
・0.1Mリン酸ナトリウムバッファー(pH8.0)
・システイン溶液(システイン塩酸塩一水和物26.3mg/リン酸ナトリウムバッファー100ml)。溶液は使用の直前にし、直前にのみ調製しなくてはいけない。
【０３０９】
1. いずれの場合にも、25μl、50μl、100μl、150μl、200μlおよび250μlのシステイン溶液を、較正曲線のために試験管(13×100mm)にピペットで移した。測定対象のタンパク質試料を、別々の試験管(容量<=250μl)に注いだ。試験対象のKBDのうち、反応混合物当たり少なくとも1mgの量を分注した。試験管の場合、次いで全容量をいずれの場合にもリン酸ナトリウムバッファーで250μlに調節した。(必要なKBD1mgのために)250μlの試料の容量を超えた場合は、2においてリン酸ナトリウムバッファー2.5mlを注ぎ足すときにこれを考慮した。  
2. いずれの場合にも、エルマン試薬50μlおよびリン酸ナトリウムバッファー2.5mlを添加する。短時間混合し、RTで15分間インキュベートする。  
3. 412nmでの吸収を測定する。  
4. 較正曲線を作成し、プロットし、測定するタンパク質試料の値を読み取る。
【０３１０】
様々なエフェクターとのカップリング反応後のエルマン試験の評価によって、KBD-B:色素の混合比が1:2である場合、遊離チオール基の2/3は、活性化された反応性色素(実施例19を参照されたい)またはマレイミドカプロン酸リンカーを有する色素にカップリングすることができることを示す。
【０３１１】
実施例17：KBD-B-色素の毛髪結合活性
KBD-B(配列番号166)がまた、カップリングしている色素と共に毛髪に結合するかどうかを試験するために、定量的結合アッセイを行った(図9を参照されたい)。この試験において、髪をまずKBD-B-色素と共にインキュベートし、結合していないKBD-B-色素を洗い落とした。次いでペルオキシダーゼを、KBD-BのHisタグを介して結合させた。結合していないペルオキシダーゼを、再び洗い落とした。結合しているペルオキシダーゼは、無色の基質(TMB)を着色した生成物に変換させることができ、これを測光法によって405nmで測定した。吸収強度は、結合しているKBD-B-パンテノールの量を示す。比較試料として、色素を伴わないKBD-Bを選択した。正確な手順は、実施例10を参照されたい。
【０３１２】
実施例18：反応性色素中にあるビニルスルホン反応性アンカーの活性化
色素(14_264、表6を参照されたい)0.075molを、水800mlで溶解し、25重量％濃度のNaOH溶液を加えることによってpHを10.5に調節した。反応溶液を室温で15分間撹拌し、安定するまでその間pHを10.5に保った。次いで、21重量％濃度のHCl溶液を加えることによってpHを4.5に調節し、反応混合物を減圧下で蒸発させた(図10を参照されたい)。
【０３１３】
実施例19：反応性色素のKBD-B(配列番号166)へのカップリング
色素とKBD-Bとの反応の間、タンパク質がそうでなければアンフォールディングし、沈殿を生じるため、実質的な生理条件を維持するべきである。これは、純粋な有機溶媒を使用できず、中性に近いpHを選択しなくてはならないことを本質的に意味する。さらに、カップリングのための反応温度が45℃を超えるべきではないことが重要である。
【０３１４】
反応性色素のカップリングのために、KBD(配列番号166)においてシステインを使用した。例えば、KBD-B(配列番号166)は、4個のシステインを有する。これらのうち、2個のシステインは構造の内側にあり、エフェクターのカップリングのために利用可能ではない(結晶構造から認識できる)。N末端(アミノ酸位置14および83、配列KBD-B(配列番号166)を参照されたい)に近い残りの2個のシステインは、エフェクターカップリングのために利用可能である。
【０３１５】
カップリングすることができる反応性色素は、システインの2個の遊離SH基の少なくとも1個を介してKBD-B(配列番号166)とカップリングした。理想的には、KBD-Bと活性化した色素との反応は、したがって1:2のモル比で行われる。
【０３１６】
実施例19a：反応性色素のKBD-D(配列番号168)へのカップリング
活性化した色素をカップリングするために、KBD-Bと同様に、システインをKBD-D(配列番号168)にも使用することができる。例えば、KBD-D(配列番号168)は、24個のシステインを有する。さらに、カップリングすることのできるシステイン基は、部位特異的突然変異誘発によって部位特異的な様式で導入することができる。
【０３１７】
したがって色素のKBD-D(配列番号168)へのカップリングは、実施例19に記載した方法と同様に行うことができ、KBD-Dを使用して、KBD-Bのために19b)で記載したように色素(14_1〜14_366)が用いられる(実施例65を参照されたい)。色素14_153、14_154、14_155、14_156、14_181、14_182、14_183、14_276および14_289は、すでにビニルスルホン形態である、すなわちこれらは活性化させる(事前に脱離させる)必要がなく、直接KBD-Dと反応することができる(図11に相当する)。このようにして得たKBD-D反応性色素は、実施例66〜108に記載の化粧用配合物中に、実施例65からのKBD-D反応性色素と同様に使用することができた。
【０３１８】
実施例19b：下記へのKBD-B(配列番号166)のカップリング
(a)ビニルスルホン色素(式1)
KBD-Bと活性化した色素との反応は、KBD-Bがエフェクターカップリングために2個の遊離システインを有しているため、1:2のモル比で行う。カップリングのために選択されたビニルスルホン色素は通常、硫酸エステル形態で合成され、色素はそのビニルスルホン形態においてのみ求核基と反応することができるため、したがってKBD-Bとの反応の前にビニルスルホン形態へ活性化しなくてはならない。活性化はアルカリ性条件下で行われ、水溶液中の色素は、室温で2分間pH11に調節される。次いで、タンパク質を加える前に、pHを塩酸で7〜8に調節する(実施例18も参照されたい)。
【０３１９】
反応溶液を、30℃で30分間穏やかに振盪させる(pH7〜8)。この間、活性化したビニルスルホン色素(例えば、14_264、表6を参照されたい)は、KBDの遊離システインのチオール基と反応する(図2を参照されたい)。
【０３２０】
下記の色素(14_1〜14_291)は、KBDと同様に反応することができる。色素14_153、14_154、14_155、14_156、14_181、14_182、14_183、14_276および14_289は、すでにビニルスルホン形態であり、すなわちこれらは活性化させる(事前に脱離させる)必要はなく、KBDと直接に反応することができる(図11に相当する)。各々の生成物の色を示す。
【表１５】
2009523706.tif 000064
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【０３２１】
(b)式3、4、5の色素
あるいは、それらの反応性アンカー中に置換可能なハロゲン原子を有する色素(例えば、色素14_354、図12)もまた使用することができる。これらの色素は、KBD-BのSH基と活性化を伴わずに反応させることができる。KBDと色素14_354との反応は、KBD-Bがエフェクターカップリングのための2個の遊離システインを有するため、1:2のモル比で行われる。反応溶液を30℃で30分間穏やかに振盪させる(pH8〜9)。
【０３２２】
下記の色素(14_292〜14_366)とKBD-B(配列番号166)またはKBD-D(配列番号168)とは、同様に反応させることができる。各々の生成物の色を示す。
【表１６】
2009523706.tif 000106
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【０３２３】
(a)および(b)で説明した反応の後に、未反応の色素を不活性化させる遊離SH基を有する分子(例えば、システイン)を、加えることができる。ここで使用される色素が合成後に精製されない場合は、それらは反応性および非反応性両方の二次的成分を含む。反応性アンカーを有さない二次的成分、またはその反応性アンカーに、実際のKBDカップリング反応後に例えば遊離システインが結合した二次的成分は、KBD-B分子と反応しない。
【０３２４】
このような二次的成分は、カップリング反応の後、または例えば、毛髪着色過程の間に除去することができる。1つの選択肢は、色素と反応したKBD-Bを、例えばカラムクロマトグラフィーによって精製することにある。1種の「カラムリアクター」内で、KBD-Bと反応性色素とを反応させることも可能である。これに関しては、KBD-Bを、ニッケルアフィニティーカラムにカップリングさせ、色素をKBD-Bに結合させ、固定されていない色素基を直接洗い落とすことが可能であった。次いでKBD-B-色素をカラムから溶出させることができる。他の選択肢は、色素と反応したKBD-Bを、非反応性二次的成分と共に毛髪に塗布し、結合していない色素画分を毛髪から洗い落とすことである。このために、例えば15％濃度のTween20水溶液が適切である。
【０３２５】
実施例20：KBD-B-色素カップリングによる毛髪着色
まず赤色の反応性色素14_264を、上記の方法に従ってKBD-B(配列番号166)にカップリングさせた。KBD-B-色素カップリングの毛髪への結合がタンパク質によって媒介され、遊離色素そのものによっては媒介されないことを示すために、同じ色素をいずれの場合にも、KBD-Bを含まずシステインでのみ処理した。次いで、KBD-B-14_264および14_264を、各々5mgの毛髪に塗布し、短時間インキュベートし、15％濃度のTween20溶液を使用して、結合していないKBD-B-色素または純粋な色素を洗い落とした。その結果は、毛髪への結合がKBD-Bにより媒介され毛髪の着色が起こったことを明らかに示す。
【０３２６】
他方、毛髪を再び脱色することが必要である場合、15％のSDS画分による洗浄、またはケラチン含有溶液による処理が適切である。
【０３２７】
実施例19に従って調製したケラチン結合エフェクター分子を含む、本発明による皮膚化粧用調製物を下記に説明する(色素14_264とカップリングしている配列番号166により示されるケラチン結合ドメイン)。前記ケラチン結合エフェクター分子は、下記の実施例においてケラチン結合ドメイン-反応性色素14_264を示す。当業者であれば、表6および表7に記載した全ての他の色素は、実施例19、19aまたは19bに従ってKBDとカップリングすることができ、下記の調製物中に使用できることを理解するであろう。
【０３２８】
実施例21：シャンプー(ケラチン結合ドメイン-反応性色素を含有しないベース配合物)
【表１７】
2009523706.tif 000117
【０３２９】
調製:相Aの成分を計量しながら加え、溶解する。pHを6〜7に調節する。相Bを加え、約50℃に加熱する。撹拌しながら室温まで冷却する。
【０３３０】
下記の実施例中のケラチン結合ドメイン-反応性色素14_264の内容物は、100％ケラチン結合ドメイン-反応性色素14_264を示す。本発明による活性成分は、純粋な形態または水溶液として使用することができる。水溶液の場合、各々の配合物中の脱塩水の含量を調節しなくてはならない。
【０３３１】
実施例22：毛髪着色シャンプー
【表１８】
2009523706.tif 000118
【表１９】
2009523706.tif 000119
【０３３２】
調製:相Aの成分を計量しながら加え、溶解する。pHを6〜7に調節する。相Bを加え、約40℃に加熱する。撹拌しながら室温に急速に冷却する。
【０３３３】
実施例23：カラースタイリングムース
【表２０】
2009523706.tif 000120
【表２１】
2009523706.tif 000121
【０３３４】
調製:相Aの成分を混合する。相Bを計量しながら加え、溶解して透明な溶液とし、次いで相A中に撹拌する。相Cと共にボトリングする。
【０３３５】
実施例24：カラースタイリングムース
【表２２】
2009523706.tif 000122
【表２３】
2009523706.tif 000123
【０３３６】
調製:相Aの成分を混合する。相Bを計量しながら加え、溶解して透明な溶液とし、次いで相A中に撹拌する。相Cと共にボトリングする。
【０３３７】
実施例25
未漂白のブロンドの毛髪2房:ヨーロッパ人天然毛髪、色9/0、ナチュラルブロンド(2g)を、実施例22/バリエーション1の毛髪着色シャンプー0.5gで処理し、毛髪着色シャンプーを毛髪上に15分間放置する。次いで毛髪の房を水で洗浄し、実施例21のシャンプーで洗い、乾燥させる。毛髪は完全に赤色である。ブロンドの毛髪はもはや検出されない。1房を比較として保存しておく。
【０３３８】
次いで第2の房を実施例21のシャンプーで5回洗浄し、乾燥させる。5回の洗浄の後、その房を保存している試料と比較する。5回洗浄した房は、まだ完全に赤色である。2房は同じ赤い色合いを有する。視覚的に、色の深みの違いは見出されない。
【０３３９】
実施例26
白い毛髪2房:選択された白色のヨーロッパ人天然毛髪(2g)を、実施例22/バリエーション1の毛髪着色シャンプー0.5gで処理し、毛髪着色シャンプーを毛髪上に15分間放置する。次いで毛髪の房を水で洗浄し、実施例21のシャンプーで洗い、乾燥させる。毛髪は完全に赤色である。白い毛髪はもはや検出されない。1房を比較として保存しておく。
【０３４０】
次いで第2の房を実施例21のシャンプーで5回洗浄し、乾燥させる。5回の洗浄の後、その房を保存している試料と比較する。5回洗浄した房は、まだ完全に赤色である。2房は同じ赤い色合いを有する。視覚的に、色の深みの違いは見出すことができない。
【０３４１】
実施例27
未漂白のブロンドの毛髪2房:ヨーロッパ人天然毛髪、色9/0、ナチュラルブロンド(2g)を、実施例23/バリエーション2のカラースタイリングムース0.5gで処理し、カラースタイリングムースを毛髪上に15分間放置する。次いで毛髪の房を水で洗浄し、実施例21のシャンプーで洗い、乾燥させる。毛髪は完全に赤色である。ブロンドの毛髪はもはや検出されない。1房を比較として保存しておく。
【０３４２】
次いで第2の房を実施例21のシャンプーで5回洗浄し、乾燥させる。5回の洗浄の後、その房を保存している試料と比較する。5回洗浄した房は、まだ完全に赤色である。2房は同じ赤い色合いを有する。視覚的に、色の深みの違いは見出されない。
【０３４３】
実施例28
白い毛髪2房:選択された白色のヨーロッパ人天然毛髪(2g)を、実施例23/バリエーション2のカラースタイリングムース0.5gで処理し、カラースタイリングムースを毛髪上に15分間放置する。次いで毛髪の房を水で洗浄し、実施例21のシャンプーで洗い、乾燥させる。毛髪は完全に赤色である。白い毛髪はもはや検出されない。1房を比較として保存しておく。
【０３４４】
次いで第2の房を実施例21のシャンプーで5回洗浄し、乾燥させる。5回の洗浄の後、その房を保存している試料と比較する。5回洗浄した房は、まだ完全に赤色である。2房は同じ赤い色合いを有する。視覚的に、色の深みの違いは見出されない。
【０３４５】
実施例29
未漂白のブロンドの毛髪2房:ヨーロッパ人天然毛髪、色9/0、ナチュラルブロンド(2g)を、実施例24/バリエーション1のカラースタイリングムース0.5gで処理し、カラースタイリングムースを毛髪上に15分間放置する。次いで毛髪の房を水で洗浄し、実施例21のシャンプーで洗い、乾燥させる。毛髪は完全に赤色である。ブロンドの毛髪はもはや検出されない。1房を比較として保存しておく。
【０３４６】
次いで第2の房を実施例21のシャンプーで5回洗浄し、乾燥させる。5回の洗浄の後、その房を保存している試料と比較する。5回洗浄した房は、まだ完全に赤色である。2房は同じ赤い色合いを有する。視覚的に、色の深みの違いは見出されない。
【０３４７】
実施例30
白い毛髪2房:選択された白色のヨーロッパ人天然毛髪(2g)を、実施例23/バリエーション1のカラースタイリングムース0.5gで処理し、カラースタイリングムースを毛髪上に15分間放置する。次いで毛髪の房を水で洗浄し、実施例21のシャンプーで洗い、乾燥させる。毛髪は完全に赤色である。白い毛髪はもはや検出されない。1房を比較として保存しておく。
【０３４８】
次いで第2の房を実施例21のシャンプーで5回洗浄し、乾燥させる。5回の洗浄の後、その房を保存している試料と比較する。5回洗浄した房は、まだ完全に赤色である。2房は同じ赤い色合いを有する。視覚的に、色の深みの違いは見出されない。
【０３４９】
実施例31：デイケア用エマルジョンにおけるKBDの使用-O/Wタイプ
【表２４】
2009523706.tif 000124
【表２５】
2009523706.tif 000125
【０３５０】
調製:相AおよびBを別々に約80℃まで加熱する。相Bを相A中に撹拌導入し、ホモジナイズする。相Cを混合した相AおよびB中に撹拌導入し、再びホモジナイズする。撹拌しながら約40℃まで冷却し、相Dを加え、相Eを使用してpHを約6.5に調節し、ホモジナイズし、撹拌しながら室温まで冷却する。  
注記:配合物は、保護ガスなしで調製する。ボトリングは、酸素不透過性の容器、例えば、アルミニウム管で行わなければならない。
【０３５１】
実施例32：保護用デイクリームにおけるKBDの使用-O/Wタイプ
【表２６】
2009523706.tif 000126
【表２７】
2009523706.tif 000127
【０３５２】
調製:相AおよびBを別々に約80℃まで加熱する。相Bを相A中に撹拌導入し、ホモジナイズする。相Cを混合した相AおよびBに組み込み、ホモジナイズする。撹拌しながら約40℃まで冷却する。相Dを加え、相Eを使用してpHを約6.5に調節し、ホモジナイズする。撹拌しながら室温まで冷却する。
【０３５３】
実施例33：顔用クレンジングローションにおけるKBDの使用-O/Wタイプ
【表２８】
2009523706.tif 000128
【表２９】
2009523706.tif 000129
【０３５４】
調製:相Aを溶解する。相Bを相A中に撹拌導入する。相Cを混合した相AおよびBに組み込む。相Dを溶解し、混合した相A、BおよびC中に撹拌導入し、ホモジナイズする。その後15分間撹拌する。
【０３５５】
実施例34：デイリーケアボディースプレーにおけるKBDの使用
【表３０】
2009523706.tif 000130
【表３１】
2009523706.tif 000131
【０３５６】
調製:相Aの成分を計量しながら加え、透明になるまで溶解する。
【０３５７】
実施例35：スキンケアゲルにおけるKBDの使用
【表３２】
2009523706.tif 000132
【表３３】
2009523706.tif 000133
【０３５８】
調製:透明となるまで相Aを溶解する。相Bを膨潤させ、相Cで中和する。相Aをホモジナイズした相B中に撹拌導入し、ホモジナイズする。
【０３５９】
実施例36：アフターシェーブローションにおけるKBDの使用
【表３４】
2009523706.tif 000134
【表３５】
2009523706.tif 000135
【０３６０】
調製:相Aの成分を混合する。相Bを溶解し、相A中に組み込み、ホモジナイズする。
【０３６１】
実施例37：アフターサンローションにおけるKBDの使用
【表３６】
2009523706.tif 000136
【表３７】
2009523706.tif 000137
【０３６２】
調製:相Aの成分を混合する。相Bを相A中にホモジナイズしながら撹拌導入する。相Cで中和し、再びホモジナイズする。
【０３６３】
実施例38：日焼け止めローションにおけるKBDの使用
【表３８】
2009523706.tif 000138
【表３９】
2009523706.tif 000139
【０３６４】
調製:相AおよびBの成分を約80℃に別々に加熱する。相Bを相A中に撹拌導入し、ホモジナイズする。相Cを約80℃に加熱し、混合した相AおよびB中にホモジナイズしながら撹拌導入する。撹拌しながら約40℃まで冷却し、相Dを加え、再びホモジナイズする。
【０３６５】
実施例39：日焼け止めローションにおけるKBDの使用-O/Wタイプ
【表４０】
2009523706.tif 000140
【表４１】
2009523706.tif 000141
【０３６６】
調製:相Aを約80℃に加熱し、相B中に撹拌導入し、3分間ホモジナイズする。同様に相Cを80℃に加熱し、混合した相AおよびB中にホモジナイズしながら撹拌導入する。約40℃まで冷却し、相D中に撹拌導入し、再びホモジナイズする。
【０３６７】
実施例40：日焼け止めローションにおけるKBDの使用-O/Wタイプ
【表４２】
2009523706.tif 000142
【表４３】
2009523706.tif 000143
【０３６８】
調製:相Aを約80℃に加熱し、相B中に撹拌導入し、3分間ホモジナイズする。同様に相Cを80℃に加熱し、混合した相AおよびB中にホモジナイズしながら撹拌導入する。約40℃まで冷却し、相D中に撹拌導入し、再びホモジナイズする。
【０３６９】
実施例41：フットバルサムにおけるKBDの使用
【表４４】
2009523706.tif 000144
【表４５】
2009523706.tif 000145
【０３７０】
調製:相AおよびBの成分を約80℃に別々に加熱する。相Bを相A中にホモジナイズしながら撹拌導入する。撹拌しながら約40℃まで冷却し、相CおよびDを加え、その後短時間ホモジナイズする。撹拌しながら室温まで冷却する。
【０３７１】
実施例42：ビサボロール含有W/OエマルジョンにおけるKBDの使用
【表４６】
2009523706.tif 000146
【表４７】
2009523706.tif 000147
【０３７２】
調製:相AおよびBを別々に約85℃まで加熱する。相Bを相A中に撹拌導入し、ホモジナイズする。撹拌しながら約40℃まで冷却し、相Cを加え、再び短時間ホモジナイズする。撹拌しながら室温まで冷却する。
【０３７３】
本発明のケラチン結合ドメインの配合物リスト-ヘアケア
実施例43：セッティング剤含有フォームコンディショナー
【表４８】
2009523706.tif 000148
【表４９】
2009523706.tif 000149
【０３７４】
調製:相Aの成分を共に計量しながら加え、全てが溶解するまで撹拌し、相Bと共にボトリングする。
【０３７５】
実施例44：毛髪着色フォームコンディショナー
【表５０】
2009523706.tif 000150
【表５１】
2009523706.tif 000151
【０３７６】
調製:相Aの成分を共に計量しながら加え、全てが溶解して透明な溶液が得られるまで撹拌し、相Bと共にボトリングする。
【０３７７】
実施例45：毛髪着色フォームコンディショナー
【表５２】
2009523706.tif 000152
【表５３】
2009523706.tif 000153
【０３７８】
調製:相Aの成分を共に計量しながら加え、全てが溶解して透明な溶液が得られるまで撹拌し、相Bと共にボトリングする。
【０３７９】
実施例46：毛髪着色スタイリングフォーム
【表５４】
2009523706.tif 000154
【表５５】
2009523706.tif 000155
【０３８０】
調製:相Aの成分を混合する。相Bの成分を1つずつ加え、溶解する。相Cと共にボトリングする。
【０３８１】
実施例47：毛髪着色スタイリングフォーム
【表５６】
2009523706.tif 000156
【表５７】
2009523706.tif 000157
【０３８２】
調製:相Aの成分を混合する。相Bの成分を1つずつ加え、溶解する。相Cと共にボトリングする。
【０３８３】
実施例48：毛髪着色スタイリングフォーム
【表５８】
2009523706.tif 000158
【表５９】
2009523706.tif 000159
【０３８４】
調製:相Aの成分を混合する。透明となるまで相Bの成分を溶解し、次いで相Bを相Aに撹拌導入する。pHを6〜7に調節し、相Cと共にボトリングする。
【０３８５】
実施例49：毛髪着色スタイリングフォーム
【表６０】
2009523706.tif 000160
【表６１】
2009523706.tif 000161
【０３８６】
調製:相Aの成分を混合する。相Bの成分を1つずつ加え、溶解する。相CをAおよびBの混合物中で膨潤させ、次いでpHを6〜7に調節する。相Dと共にボトリングする。
【０３８７】
実施例50：毛髪着色スタイリングフォーム
【表６２】
2009523706.tif 000162
【表６３】
2009523706.tif 000163
【０３８８】
調製:相Aの成分を混合する。相Bの成分を1つずつ加え、溶解する。相CをAおよびBの混合物中で膨潤させ、次いでpHを6〜7に調節する。相Dと共にボトリングする。
【０３８９】
実施例51：毛髪着色スタイリングフォーム
【表６４】
2009523706.tif 000164
【表６５】
2009523706.tif 000165
【０３９０】
調製:相Aを溶解させる。相Bを相Aに計量しながら加え、透明になるまで溶解する。pHを6〜7に調節し、相Cと共にボトリングする。
【０３９１】
実施例52：毛髪着色スタイリングフォーム
【表６６】
2009523706.tif 000166
【表６７】
2009523706.tif 000167
【０３９２】
調製:相Aを溶解させる。相Bを相Aに計量しながら加え、透明になるまで溶解する。pHを6〜7に調節し、相Cと共にボトリングする。
【０３９３】
実施例53：毛髪着色スタイリングフォーム
【表６８】
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【表６９】
2009523706.tif 000169
【０３９４】
調製:相Aを溶解させる。相Bを相Aに計量しながら加え、透明になるまで溶解する。pHを6〜7に調節し、相Cと共にボトリングする。
【０３９５】
実施例54：毛髪着色スタイリングフォーム
【表７０】
2009523706.tif 000170
【表７１】
2009523706.tif 000171
【０３９６】
調製:相Aの成分を混合する。相Bの成分を1つずつ加え、溶解する。相Cと共にボトリングする。
【０３９７】
実施例55：ケアシャンプー
【表７２】
2009523706.tif 000172
【表７３】
2009523706.tif 000173
【０３９８】
調製:相Aの成分を混合し、溶解する。クエン酸でpHを6〜7に調節する。
【０３９９】
実施例56：シャワー用ゲル
【表７４】
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【表７５】
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【０４００】
調製:相Aの成分を混合し、溶解する。クエン酸でpHを6〜7に調節する。
【０４０１】
実施例57：シャンプー
【表７６】
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【表７７】
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【０４０２】
調製:相Aの成分を混合し、溶解する。クエン酸でpHを6〜7に調節する。
【０４０３】
実施例58：毛髪着色シャンプー
【表７８】
2009523706.tif 000178
【表７９】
2009523706.tif 000179
【０４０４】
調製:相Aの成分を計量しながら加え、溶解する。pHを6〜7に調節する。相Bを加え、約40℃に加熱する。撹拌しながら室温まで冷却する。
【０４０５】
実施例59：保湿ボディーケアクリーム
【表８０】
2009523706.tif 000180
【表８１】
2009523706.tif 000181
【０４０６】
調製:相AおよびBを別々に約80℃に加熱する。相Bを短時間プレホモジナイズし、次いで相Bを相A中に撹拌導入し、再びホモジナイズする。約40℃まで冷却し、相Cを加え、再び完全にホモジナイズする。クエン酸でpHを6〜7に調節する。
【０４０７】
実施例60：保湿ボディーケアクリーム
【表８２】
2009523706.tif 000182
【表８３】
2009523706.tif 000183
【０４０８】
調製:相AおよびBを別々に約80℃に加熱する。相Bを相A中に撹拌導入し、ホモジナイズする。撹拌しながら約40℃まで冷却し、相Cを加え、再びホモジナイズする。撹拌しながら室温まで冷却させる。
【０４０９】
実施例61：液体メーキャップ-O/Wタイプ
【表８４】
2009523706.tif 000184
【表８５】
2009523706.tif 000185
【０４１０】
調製:相AおよびBを別々に約80℃に加熱する。相Bを相A中に撹拌導入し、ホモジナイズする。撹拌しながら約40℃まで冷却し、相CおよびDを加え、再び完全にホモジナイズする。撹拌しながら室温まで冷却させる。
【０４１１】
実施例62
特定したケラチン結合ドメイン-反応性色素14_264を、約5重量％濃度の水溶液として使用する。下記のデータは重量部である。
【表８６】
2009523706.tif 000186
【表８７】
2009523706.tif 000187
【表８８】
2009523706.tif 000188
【表８９】
2009523706.tif 000189
【表９０】
2009523706.tif 000190
【表９１】
2009523706.tif 000191
【表９２】
2009523706.tif 000192
【表９３】
2009523706.tif 000193
【表９４】
2009523706.tif 000194
2009523706.tif 000195
【表９５】
2009523706.tif 000196
2009523706.tif 000197
【表９６】
2009523706.tif 000198
2009523706.tif 000199
【表９７】
2009523706.tif 000200
【表９８】
2009523706.tif 000201
2009523706.tif 000202
【表９９】
2009523706.tif 000203
【表１００】
2009523706.tif 000204
2009523706.tif 000205
【表１０１】
2009523706.tif 000206
2009523706.tif 000207
【表１０２】
2009523706.tif 000208
【表１０３】
2009523706.tif 000209
【表１０４】
2009523706.tif 000210
【表１０５】
2009523706.tif 000211
【表１０６】
2009523706.tif 000212
【表１０７】
2009523706.tif 000213
【表１０８】
2009523706.tif 000214
【０４１２】
実施例63
下記の配合物において、少なくとも１種の無機顔料、好ましくは酸化亜鉛および/または酸化チタン、Univul A Plus、ならびにさらなる有機UV-AおよびUV-Bフィルターの組合せを含む化粧用日焼け止め調製物を説明する。
【０４１３】
ここで無機顔料は、コーティングされた形態で存在し得る、すなわちそれらは表面処理されている。この表面処理は、DE-A-3314742に記載されているようなそれ自体公知の方法によって、例えば顔料に疎水性薄層を与えることであってもよい。
【０４１４】
下記で示した配合物を、当業者には公知の従来通りの方法で調製する。
【０４１５】
実施例19に従って調製したケラチン結合エフェクター分子を含む本発明による皮膚化粧用調製物を下記に説明する(色素14_264とカップリングした配列番号166によるケラチン結合ドメイン)。前記ケラチン結合エフェクター分子は、下記の実施例においてケラチン結合ドメイン-反応性色素14_264と称される。表6および表7に記載した他の色素の全てもまた、実施例19、19aまたは19bに従ってKBDとカップリングすることができ、下記に示す調製物中で使用することができることは当業者であれば理解するであろう。
【０４１６】
ケラチン結合ドメイン-反応性色素14_264の含量は、100％の活性成分を示す。本発明による活性成分は、純粋な形態で、または水溶液として使用することができる。水溶液の場合は、特定の配合物中の脱塩水の含量を調節しなくてはならない。
【表１０９】
2009523706.tif 000215
【表１１０】
2009523706.tif 000216
【表１１１】
2009523706.tif 000217
【表１１２】
2009523706.tif 000218
【表１１３】
2009523706.tif 000219
【表１１４】
2009523706.tif 000220
【表１１５】
2009523706.tif 000221
【表１１６】
2009523706.tif 000222
【表１１７】
2009523706.tif 000223
【表１１８】
2009523706.tif 000224
【表１１９】
2009523706.tif 000225
【表１２０】
2009523706.tif 000226
2009523706.tif 000227
【表１２１】
2009523706.tif 000228
【表１２２】
2009523706.tif 000229
【表１２３】
2009523706.tif 000230
【表１２４】
2009523706.tif 000231
【表１２５】
2009523706.tif 000232
【表１２６】
2009523706.tif 000233
【表１２７】
2009523706.tif 000234
【表１２８】
2009523706.tif 000235
【表１２９】
2009523706.tif 000236
【表１３０】
2009523706.tif 000237
【表１３１】
2009523706.tif 000238
【表１３２】
2009523706.tif 000239
【表１３３】
2009523706.tif 000240
【表１３４】
2009523706.tif 000241
【表１３５】
2009523706.tif 000242
【表１３６】
2009523706.tif 000243
【表１３７】
2009523706.tif 000244
【表１３８】
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【表１３９】
2009523706.tif 000246
【表１４０】
2009523706.tif 000247
【表１４１】
2009523706.tif 000248
【表１４２】
2009523706.tif 000249
【表１４３】
2009523706.tif 000250
【表１４４】
2009523706.tif 000251
【表１４５】
2009523706.tif 000252
【表１４６】
2009523706.tif 000253
【表１４７】
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【表１４８】
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【表１４９】
2009523706.tif 000256
【表１５０】
2009523706.tif 000257
【表１５１】
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【表１５２】
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【表１５３】
2009523706.tif 000260
【表１５４】
2009523706.tif 000261
【表１５５】
2009523706.tif 000262
【表１５６】
2009523706.tif 000263
【表１５７】
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【表１５８】
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【表１５９】
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【表１６０】
2009523706.tif 000267
【表１６１】
2009523706.tif 000268
【表１６２】
2009523706.tif 000269
【表１６３】
2009523706.tif 000270
【表１６４】
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【表１６５】
2009523706.tif 000272
【表１６６】
2009523706.tif 000273
【表１６７】
2009523706.tif 000274
【表１６８】
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【表１６９】
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【表１７０】
2009523706.tif 000277
【表１７１】
2009523706.tif 000278
【表１７２】
2009523706.tif 000279
【表１７３】
2009523706.tif 000280
【表１７４】
2009523706.tif 000281
【表１７５】
2009523706.tif 000282
【表１７６】
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【表１７７】
2009523706.tif 000284
【表１７８】
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【表１７９】
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【表１８０】
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【表１８１】
2009523706.tif 000288
【表１８２】
2009523706.tif 000289
【表１８３】
2009523706.tif 000290
【表１８４】
2009523706.tif 000291
【表１８５】
2009523706.tif 000292
【表１８６】
2009523706.tif 000293
【表１８７】
2009523706.tif 000294
【表１８８】
2009523706.tif 000295
【表１８９】
2009523706.tif 000296
【表１９０】
2009523706.tif 000297
【表１９１】
2009523706.tif 000298
【表１９２】
2009523706.tif 000299
【表１９３】
2009523706.tif 000300
【表１９４】
2009523706.tif 000301
【表１９５】
2009523706.tif 000302
【表１９６】
2009523706.tif 000303
【表１９７】
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【表１９８】
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【表１９９】
2009523706.tif 000306
【表２００】
2009523706.tif 000307
【表２０１】
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【表２０２】
2009523706.tif 000309
【表２０３】
2009523706.tif 000310
【表２０４】
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【表２０５】
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【表２０６】
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【表２０７】
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【表２０８】
2009523706.tif 000315
【表２０９】
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【表２１０】
2009523706.tif 000317
【０４１７】
実施例65：KBD-B-色素カップリングによる毛髪着色
まず赤色の反応性色素14_264を、上記の方法に従ってKBD-D(配列番号168)にカップリングさせた(実施例19)。KBD-D-色素カップリングの毛髪への結合がタンパク質によって媒介され、遊離色素そのものによっては媒介されないことを示すために、同じ色素をいずれの場合にも、KBD-Dを含まずシステインでのみ処理した。次いで、KBD-D-14_264および14_264を、各々5mgの毛髪に塗布し、短時間インキュベートし、15％濃度のTween20溶液を使用して結合していないKBD-D-色素または純粋な色素を洗い落とした。その結果は、毛髪への結合がKBD-Dにより媒介され毛髪の着色が起こったことを明らかに示す。
【０４１８】
他方、毛髪を再び脱色することが所望である場合、15％のSDS画分による洗浄、またはケラチン含有溶液による処理が適切である。
【０４１９】
実施例20に従って調製したケラチン結合エフェクター分子(色素14_264とカップリングした配列番号168によち示されるケラチン結合ドメイン)を含む本発明による皮膚化粧用調製物を下記に記載する。前記ケラチン結合エフェクター分子は、下記の実施例においてケラチン結合ドメイン-反応性色素14_264と称される。表6および表7に記載されている全ての他の色素は、実施例21に従ってKBDとカップリング可能であり、下記の調製物中で使用できることを当業者であれば理解するであろう。
【０４２０】
実施例66：シャンプー(ケラチン結合ドメイン-反応性色素を含有しないベース配合物)
【表２１１】
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【０４２１】
調製:相Aの成分を計量しながら加え、溶解する。pHを6〜7に調節する。相Bを加え、約50℃に加熱する。撹拌しながら室温まで冷却する。
【０４２２】
下記の実施例におけるケラチン結合ドメイン-反応性色素14_264KBD-D(配列番号168)の内容物は、100％ケラチン結合ドメイン-反応性色素14_264を示す。本発明による活性成分は、純粋な形態としてまたは水溶液として使用することができる。水溶液の場合、各々の配合物中の脱塩水の含量を調節しなくてはならない。
【０４２３】
実施例67：毛髪着色シャンプー
【表２１２】
2009523706.tif 000319
【表２１３】
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【０４２４】
調製:相Aの成分を計量しながら加え、溶解する。pHを6〜7に調節する。相Bを加え、約40℃に加熱する。撹拌しながら室温に急速に冷却する。
【０４２５】
実施例68：カラースタイリングムース
【表２１４】
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【表２１５】
2009523706.tif 000322
【０４２６】
調製:相Aの成分を混合する。相Bを計量しながら加え、溶解して透明な溶液とし、次いで相A中に撹拌導入する。相Cと共にボトリングする。
【０４２７】
実施例69：カラースタイリングムース
【表２１６】
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【表２１７】
2009523706.tif 000324
【０４２８】
調製:相Aの成分を混合する。相Bを計量しながら加え、溶解して透明な溶液とし、次いで相A中に撹拌導入する。相Cと共にボトリングする。
【０４２９】
実施例70
未漂白のブロンドの毛髪2房:ヨーロッパ人天然毛髪、色9/0、ナチュラルブロンド(2g)を、実施例67/バリエーション1の毛髪着色シャンプー0.5gで処理し、毛髪着色シャンプーを毛髪上に15分間放置する。次いで毛髪の房を水で洗浄し、実施例66のシャンプーを使用して洗い、乾燥させる。毛髪は完全に赤色である。ブロンドの毛髪はもはや検出されない。1房を比較として保存しておく。
【０４３０】
次いで第2の房を実施例66のシャンプーで5回洗浄し、乾燥させる。5回の洗浄の後、その房を保存している試料と比較する。5回洗浄した房は、まだ完全に赤色である。2房は同じ赤い色合いを有する。視覚的に、色の深みの違いは見出されない。
【０４３１】
実施例71
白い毛髪2房:選択された白色のヨーロッパ人天然毛髪(2g)を、実施例67/バリエーション1の毛髪着色シャンプー0.5gで処理し、毛髪着色シャンプーを毛髪上に15分間放置する。次いで毛髪の房を水で洗浄し、実施例66のシャンプーを使用して洗い、乾燥させる。毛髪は完全に赤色である。白い毛髪はもはや検出されない。1房を比較として保存しておく。
【０４３２】
次いで第2の房を実施例66のシャンプーで5回洗浄し、乾燥させる。5回の洗浄の後、その房を保存している試料と比較する。5回洗浄した房は、まだ完全に赤色である。2房は同じ赤い色合いを有する。視覚的に、色の深みの違いは見出されない。
【０４３３】
実施例72
未漂白のブロンドの毛髪2房:ヨーロッパ人天然毛髪、色9/0、ナチュラルブロンド(2g)を、実施例68/バリエーション2のカラースタイリングムース0.5gで処理し、カラースタイリングムースを毛髪上に15分間放置する。次いで毛髪の房を水で洗浄し、実施例66のシャンプーを使用して洗い、乾燥させる。毛髪は完全に赤色である。ブロンドの毛髪はもはや検出されない。1房を比較として保存しておく。
【０４３４】
次いで第2の房を実施例66のシャンプーで5回洗浄し、乾燥させる。5回の洗浄の後、その房を保存している試料と比較する。5回洗浄した房は、まだ完全に赤色である。2房は同じ赤い色合いを有する。視覚的に、色の深みの違いは見出されない。
【０４３５】
実施例73
白い毛髪2房:選択された白色のヨーロッパ人天然毛髪(2g)を、実施例68/バリエーション2のカラースタイリングムース0.5gで処理し、カラースタイリングムースを毛髪上に15分間放置する。次いで毛髪の房を水で洗浄し、実施例66のシャンプーで洗い、乾燥させる。毛髪は完全に赤色である。白い毛髪はもはや検出されない。1房を比較として保存しておく。
【０４３６】
次いで第2の房を実施例66のシャンプーで5回洗浄し、乾燥させる。5回の洗浄の後、その房を保存している試料と比較する。5回洗浄した房は、まだ完全に赤色である。2房は同じ赤い色合いを有する。視覚的に、色の深みの違いは見出されない。
【０４３７】
実施例74
未漂白のブロンドの毛髪2房:ヨーロッパ人天然毛髪、色9/0、ナチュラルブロンド(2g)を、実施例69/バリエーション1のカラースタイリングムース0.5gで処理し、カラースタイリングムースを毛髪上に15分間放置する。次いで毛髪の房を水で洗浄し、実施例66のシャンプーで洗い、乾燥させる。毛髪は完全に赤色である。ブロンドの毛髪はもはや検出されない。1房を比較として保存しておく。
【０４３８】
次いで第2の房を実施例66のシャンプーで5回洗浄し、乾燥させる。5回の洗浄の後、その房を保存している試料と比較する。5回洗浄した房は、まだ完全に赤色である。2房は同じ赤い色合いを有する。視覚的に、色の深みの違いは見出されない。
【０４３９】
実施例75
白い毛髪2房:選択された白色のヨーロッパ人天然毛髪(2g)を、実施例69/バリエーション1のカラースタイリングムース0.5gで処理し、カラースタイリングムースを毛髪上に15分間放置する。次いで毛髪の房を水で洗浄し、実施例66のシャンプーで洗い、乾燥させる。毛髪は完全に赤色である。白い毛髪はもはや検出されない。1房を比較として保存しておく。
【０４４０】
次いで第2の房を実施例66のシャンプーで5回洗浄し、乾燥させる。5回の洗浄の後、その房を保存している試料と比較する。5回洗浄した房は、まだ完全に赤色である。2房は同じ赤い色合いを有する。視覚的に、色の深みの違いは見出されない。
【０４４１】
実施例76：デイケア用エマルジョンにおけるKBDの使用-O/Wタイプ
【表２１８】
2009523706.tif 000325
【表２１９】
2009523706.tif 000326
【０４４２】
調製:相AおよびBを別々に約80℃まで加熱する。相Bを相A中に撹拌導入し、ホモジナイズする。相Cを混合した相AおよびB中に撹拌導入し、再びホモジナイズする。撹拌しながら約40℃まで冷却し、相Dを加え、相Eを使用してpHを約6.5に調節し、ホモジナイズし、撹拌しながら室温まで冷却する。  
注記:配合物は、保護ガスなしで調製する。ボトリングは、酸素不透過性の容器、例えば、アルミニウム管で行わなければならない。
【０４４３】
実施例77：保護用デイクリームにおけるKBDの使用-O/Wタイプ
【表２２０】
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【表２２１】
2009523706.tif 000328
【０４４４】
調製:相AおよびBを別々に約80℃まで加熱する。相Bを相A中に撹拌導入し、ホモジナイズする。相Cを混合した相AおよびBに組み込み、ホモジナイズする。撹拌しながら約40℃まで冷却する。相Dを加え、相Eを使用してpHを約6.5に調節し、ホモジナイズする。撹拌しながら室温まで冷却する。
【０４４５】
実施例78：顔用クレンジングローションにおけるKBDの使用-O/Wタイプ
【表２２２】
2009523706.tif 000329
【表２２３】
2009523706.tif 000330
【０４４６】
調製:相Aを溶解する。相Bを相A中に撹拌導入する。相Cを混合した相AおよびBに組み込む。相Dを溶解し、混合した相A、BおよびC中に撹拌導入し、ホモジナイズする。その後15分間撹拌する。
【０４４７】
実施例79：デイリーケアボディースプレーにおけるKBDの使用
【表２２４】
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【表２２５】
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【０４４８】
調製:相Aの成分を計量しながら加え、透明になるまで溶解する。
【０４４９】
実施例80：スキンケアゲルにおけるKBDの使用
【表２２６】
2009523706.tif 000333
【表２２７】
2009523706.tif 000334
【０４５０】
調製:透明となるまで相Aを溶解する。相Bを膨潤させ、相Cで中和する。相Aをホモジナイズした相B中に撹拌導入し、ホモジナイズする。
【０４５１】
実施例81：アフターシェーブローションにおけるKBDの使用
【表２２８】
2009523706.tif 000335
【表２２９】
2009523706.tif 000336
【０４５２】
調製:相Aの成分を混合する。相Bを溶解し、相A中に組み込み、ホモジナイズする。
【０４５３】
実施例82：アフターサンローションにおけるKBDの使用
【表２３０】
2009523706.tif 000337
【表２３１】
2009523706.tif 000338
【０４５４】
調製:相Aの成分を混合する。相Bを相A中にホモジナイズしながら撹拌導入する。相Cで中和し、再びホモジナイズする。
【０４５５】
実施例83：日焼け止めローションにおけるKBDの使用
【表２３２】
2009523706.tif 000339
【表２３３】
2009523706.tif 000340
【０４５６】
調製:相AおよびBの成分を約80℃に別々に加熱する。相Bを相A中に撹拌導入し、ホモジナイズする。相Cを約80℃に加熱し、混合した相AおよびB中にホモジナイズしながら撹拌導入する。撹拌しながら約40℃まで冷却し、相Dを加え、再びホモジナイズする。
【０４５７】
実施例84：日焼け止めローションにおけるKBDの使用-O/Wタイプ
【表２３４】
2009523706.tif 000341
【表２３５】
2009523706.tif 000342
【０４５８】
調製:相Aを約80℃に加熱し、相B中に撹拌導入し、3分間ホモジナイズする。同様に相Cを80℃に加熱し、混合した相AおよびB中にホモジナイズしながら撹拌導入する。約40℃まで冷却し、相D中に撹拌導入し、再びホモジナイズする。
【０４５９】
実施例85：日焼け止めローションにおけるKBDの使用-O/Wタイプ
【表２３６】
2009523706.tif 000343
【表２３７】
2009523706.tif 000344
【０４６０】
調製:相Aを約80℃に加熱し、相B中に撹拌導入し、3分間ホモジナイズする。同様に相Cを80℃に加熱し、混合した相AおよびB中にホモジナイズしながら撹拌導入する。約40℃まで冷却し、相D中に撹拌導入し、再びホモジナイズする。
【０４６１】
実施例86：フットバルサムにおけるKBDの使用
【表２３８】
2009523706.tif 000345
【表２３９】
2009523706.tif 000346
【０４６２】
調製:相AおよびBの成分を約80℃に別々に加熱する。相Bを相A中にホモジナイズしながら撹拌導入する。撹拌しながら約40℃まで冷却し、相CおよびDを加え、その後短時間ホモジナイズする。撹拌しながら室温まで冷却する。
【０４６３】
実施例87：ビサボロール含有W/OエマルジョンにおけるKBDの使用
【表２４０】
2009523706.tif 000347
【表２４１】
2009523706.tif 000348
【０４６４】
調製:相AおよびBを別々に約85℃まで加熱する。相Bを相A中に撹拌導入し、ホモジナイズする。撹拌しながら約40℃まで冷却し、相Cを加え、再び短時間ホモジナイズする。撹拌しながら室温まで冷却する。
【０４６５】
本発明のケラチン結合ドメインの配合物リスト-ヘアケア
実施例88：セッティング剤を含有するフォームコンディショナー
【表２４２】
2009523706.tif 000349
【表２４３】
2009523706.tif 000350
【０４６６】
調製:相Aの成分を計量しながら併せ、全てが溶解するまで撹拌し、相Bと共にボトリングする。
【０４６７】
実施例89：毛髪着色フォームコンディショナー
【表２４４】
2009523706.tif 000351
【表２４５】
2009523706.tif 000352
【０４６８】
調製:相Aの成分を計量しながら併せ、全てが溶解して透明な溶液が得られるまで撹拌し、相Bと共にボトリングする。
【０４６９】
実施例90：毛髪着色フォームコンディショナー
【表２４６】
2009523706.tif 000353
【表２４７】
2009523706.tif 000354
【０４７０】
調製:相Aの成分を計量しながら併せ、全てが溶解して透明な溶液が得られるまで撹拌し、相Bと共にボトリングする。
【０４７１】
実施例91：毛髪着色スタイリングフォーム
【表２４８】
2009523706.tif 000355
【表２４９】
2009523706.tif 000356
【０４７２】
調製:相Aの成分を混合する。相Bの成分を1つずつ加え、溶解する。相Cと共にボトリングする。
【０４７３】
実施例92：毛髪着色スタイリングフォーム
【表２５０】
2009523706.tif 000357
【表２５１】
2009523706.tif 000358
【０４７４】
調製:相Aの成分を混合する。相Bの成分を1つずつ加え、溶解する。相Cと共にボトリングする。
【０４７５】
実施例93：毛髪着色スタイリングフォーム
【表２５２】
2009523706.tif 000359
【表２５３】
2009523706.tif 000360
【０４７６】
調製:相Aの成分を混合する。透明となるまで相Bの成分を溶解し、次いで相Bを相A中に撹拌導入する。pHを6〜7に調節し、相Cと共にボトリングする。
【０４７７】
実施例94：毛髪着色スタイリングフォーム
【表２５４】
2009523706.tif 000361
【表２５５】
2009523706.tif 000362
【０４７８】
調製:相Aの成分を混合する。相Bの成分を1つずつ加え、溶解する。相Cを、AとBとの混合物中で膨潤させ、次いでpHを6〜7に調節する。相Dと共にボトリングする。
【０４７９】
実施例95：毛髪着色スタイリングフォーム
【表２５６】
2009523706.tif 000363
【表２５７】
2009523706.tif 000364
【０４８０】
調製:相Aの成分を混合する。相Bの成分を1つずつ加え、溶解する。相Cを、AとBとの混合物中で膨潤させ、次いでpHを6〜7に調節する。相Dと共にボトリングする。
【０４８１】
実施例96：毛髪着色スタイリングフォーム
【表２５８】
2009523706.tif 000365
【表２５９】
2009523706.tif 000366
【０４８２】
調製:相Aを溶解させる。相Bを相Aに計量しながら加え、透明になるまで溶解する。pHを6〜7に調節し、相Cと共にボトリングする。
【０４８３】
実施例97：毛髪着色スタイリングフォーム
【表２６０】
2009523706.tif 000367
【表２６１】
2009523706.tif 000368
【０４８４】
調製:相Aを溶解させる。相Bを相Aに計量しながら加え、透明になるまで溶解する。pHを6〜7に調節し、相Cと共にボトリングする。
【０４８５】
実施例98：毛髪着色スタイリングフォーム
【表２６２】
2009523706.tif 000369
【表２６３】
2009523706.tif 000370
【０４８６】
調製:相Aを溶解させる。相Bを相Aに計量しながら加え、透明になるまで溶解する。pHを6〜7に調節し、相Cと共にボトリングする。
【０４８７】
実施例99：毛染めスタイリングフォーム
【表２６４】
2009523706.tif 000371
【表２６５】
2009523706.tif 000372
【０４８８】
調製:相Aの成分を混合する。相Bの成分を1つずつ加え、溶解する。相Cと共にボトリングする。
【０４８９】
実施例100：ケアシャンプー
【表２６６】
2009523706.tif 000373
【表２６７】
2009523706.tif 000374
【０４９０】
調製:相Aの成分を混合し、溶解する。クエン酸でpHを6〜7に調節する。
【０４９１】
実施例101：シャワー用ゲル
【表２６８】
2009523706.tif 000375
【表２６９】
2009523706.tif 000376
【０４９２】
調製:相Aの成分を混合し溶解する。クエン酸でpHを6〜7に調節する。
【０４９３】
実施例102：シャンプー
【表２７０】
2009523706.tif 000377
【表２７１】
2009523706.tif 000378
【０４９４】
調製:相Aの成分を混合し、溶解する。クエン酸でpHを6〜7に調節する。
【０４９５】
実施例103：毛髪着色シャンプー
【表２７２】
2009523706.tif 000379
【表２７３】
2009523706.tif 000380
【０４９６】
調製:相Aの成分を計量しながら加え、溶解する。pHを6〜7に調節する。相Bを加え、約40℃に加熱する。撹拌しながら室温まで冷却する。
【０４９７】
実施例104：保湿ボディーケアクリーム
【表２７４】
2009523706.tif 000381
【表２７５】
2009523706.tif 000382
【０４９８】
調製:相AおよびBを別々に約80℃に加熱する。相Bを短時間プレホモジナイズし、次いで相Bを相A中に撹拌導入し、再びホモジナイズする。約40℃まで冷却し、相Cを加え、再び完全にホモジナイズする。クエン酸でpHを6〜7に調節する。
【０４９９】
実施例105：保湿ボディーケアクリーム
【表２７６】
2009523706.tif 000383
【表２７７】
2009523706.tif 000384
【０５００】
調製:相AおよびBを別々に約80℃に加熱する。相Bを相A中に撹拌導入し、ホモジナイズする。撹拌しながら約40℃まで冷却し、相Cを加え、再びホモジナイズする。撹拌しながら室温まで冷却させる。
【０５０１】
実施例106：液体メーキャップ-O/Wタイプ
【表２７８】
2009523706.tif 000385
【表２７９】
2009523706.tif 000386
【０５０２】
調製:相AおよびBを別々に約80℃に加熱する。相Bを相A中に撹拌導入し、ホモジナイズする。撹拌しながら約40℃まで冷却し、相CおよびDを加え、再び完全にホモジナイズする。撹拌しながら室温まで冷却させる。
【０５０３】
実施例107
実施例19に従って調製したケラチン結合エフェクター分子を含む本発明による皮膚化粧用調製物を下記に説明する(色素14_264とカップリングした配列番号168によるケラチン結合ドメイン)。前記ケラチン結合エフェクター分子は、下記の実施例においてケラチン結合ドメイン-反応性色素14_264を示す。表6および表7に記載した他の色素の全てもまた、実施例19、19aまたは19bに従ってKBDとカップリングすることができ、下記に示す調製物中で使用することができることは当業者であれば理解するであろう。
【０５０４】
特定したケラチン結合ドメイン-反応性色素14_264KBD-D(配列番号168)を、約5重量％濃度の水溶液として使用する。下記のデータは重量部である。
【表２８０】
2009523706.tif 000387
【表２８１】
2009523706.tif 000388
【表２８２】
2009523706.tif 000389
【表２８３】
2009523706.tif 000390
【表２８４】
2009523706.tif 000391
【表２８５】
2009523706.tif 000392
【表２８６】
2009523706.tif 000393
【表２８７】
2009523706.tif 000394
【表２８８】
2009523706.tif 000395
2009523706.tif 000396
【表２８９】
2009523706.tif 000397
2009523706.tif 000398
【表２９０】
2009523706.tif 000399
2009523706.tif 000400
【表２９１】
2009523706.tif 000401
【表２９２】
2009523706.tif 000402
2009523706.tif 000403
【表２９３】
2009523706.tif 000404
【表２９４】
2009523706.tif 000405
2009523706.tif 000406
【表２９５】
2009523706.tif 000407
【表２９６】
2009523706.tif 000408
【表２９７】
2009523706.tif 000409
【表２９８】
2009523706.tif 000410
【表２９９】
2009523706.tif 000411
【表３００】
2009523706.tif 000412
【表３０１】
2009523706.tif 000413
【表３０２】
2009523706.tif 000414
【０５０５】
実施例108
下記の配合物において、少なくとも1種の無機顔料、好ましくは酸化亜鉛および/または酸化チタン、Uvinul A Plusおよびさらなる有機UV-AおよびUV-Bフィルターの組合せを含む化粧用日焼け止め調製物を説明する。
【０５０６】
ここで無機顔料は、コーティングされた形態で存在し得る、すなわちそれらは表面処理されている。この表面処理は、例えば、DE-A3314742に記載されているようなそれ自体公知の方法によって、顔料に疎水性薄層を与えることでありうる。
【０５０７】
下記に示す配合物は、当業者には公知の従来通りの方法で調製される。
【０５０８】
実施例19に従って調製したケラチン結合エフェクター分子を含む本発明による皮膚化粧用調製物を下記に説明する(色素14_264とカップリングした配列番号168によるケラチン結合ドメイン)。前記ケラチン結合エフェクター分子は、下記の実施例においてケラチン結合ドメイン-反応性色素14_264と称される。表6および表7に記載した他の色素の全てもまた、実施例19、19aまたは19bに従ってKBDとカップリングすることができ、下記に示す調製物中で使用することができることは当業者であれば理解するであろう。
【０５０９】
ケラチン結合ドメイン-反応性色素14_264KBD-D(配列番号168)の含量は、100％の活性成分を示す。本発明による活性成分は、純粋な形態で、または水溶液として使用することができる。水溶液の場合は、特定の配合物中の脱塩水の含量を調節しなくてはならない。
【表３０３】
2009523706.tif 000415
【表３０４】
2009523706.tif 000416
【表３０５】
2009523706.tif 000417
【表３０６】
2009523706.tif 000418
【表３０７】
2009523706.tif 000419
【表３０８】
2009523706.tif 000420
【表３０９】
2009523706.tif 000421
【表３１０】
2009523706.tif 000422
【表３１１】
2009523706.tif 000423
【表３１２】
2009523706.tif 000424
【表３１３】
2009523706.tif 000425
【表３１４】
2009523706.tif 000426
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【表３１５】
2009523706.tif 000428
【表３１６】
2009523706.tif 000429
【表３１７】
2009523706.tif 000430
【表３１８】
2009523706.tif 000431
【表３１９】
2009523706.tif 000432
【表３２０】
2009523706.tif 000433
【表３２１】
2009523706.tif 000434
【表３２２】
2009523706.tif 000435
【表３２３】
2009523706.tif 000436
【表３２４】
2009523706.tif 000437
【表３２５】
2009523706.tif 000438
【表３２６】
2009523706.tif 000439
【表３２７】
2009523706.tif 000440
【表３２８】
2009523706.tif 000441
【表３２９】
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【表３３０】
2009523706.tif 000443
【表３３１】
2009523706.tif 000444
【表３３２】
2009523706.tif 000445
【表３３３】
2009523706.tif 000446
【表３３４】
2009523706.tif 000447
【表３３５】
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【表３３６】
2009523706.tif 000449
【表３３７】
2009523706.tif 000450
【表３３８】
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【表３３９】
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【表３４０】
2009523706.tif 000453
【表３４１】
2009523706.tif 000454
【表３４２】
2009523706.tif 000455
【表３４３】
2009523706.tif 000456
【表３４４】
2009523706.tif 000457
【表３４５】
2009523706.tif 000458
【表３４６】
2009523706.tif 000459
【表３４７】
2009523706.tif 000460
【表３４８】
2009523706.tif 000461
【表３４９】
2009523706.tif 000462
【表３５０】
2009523706.tif 000463
【表３５１】
2009523706.tif 000464
【表３５２】
2009523706.tif 000465
【表３５３】
2009523706.tif 000466
【表３５４】
2009523706.tif 000467
【表３５５】
2009523706.tif 000468
【表３５６】
2009523706.tif 000469
【表３５７】
2009523706.tif 000470
【表３５８】
2009523706.tif 000471
【表３５９】
2009523706.tif 000472
【表３６０】
2009523706.tif 000473
【表３６１】
2009523706.tif 000474
【表３６２】
2009523706.tif 000475
【表３６３】
2009523706.tif 000476
【表３６４】
2009523706.tif 000477
【表３６５】
2009523706.tif 000478
【表３６６】
2009523706.tif 000479
【表３６７】
2009523706.tif 000480
【表３６８】
2009523706.tif 000481
【表３６９】
2009523706.tif 000482
【表３７０】
2009523706.tif 000483
【表３７１】
2009523706.tif 000484
【表３７２】
2009523706.tif 000485
【表３７３】
2009523706.tif 000486
【表３７４】
2009523706.tif 000487
【表３７５】
2009523706.tif 000488
【表３７６】
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【表３７７】
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【表３７８】
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【表３７９】
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【表３８０】
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【表３８１】
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【表３８２】
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【表３８３】
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【表３８４】
2009523706.tif 000497
【表３８５】
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【表３８６】
2009523706.tif 000499
【表３８７】
2009523706.tif 000500
【表３８８】
2009523706.tif 000501
【表３８９】
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【表３９０】
2009523706.tif 000503
【表３９１】
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【表３９２】
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【表３９３】
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【表３９４】
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【表３９５】
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【表３９６】
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【表３９７】
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【表３９８】
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【表３９９】
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【表４００】
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【表４０１】
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【表４０２】
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【表４０３】
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【表４０４】
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【図面の簡単な説明】
【０５１０】
【図１】式1による反応性アンカーの活性化を示す。
【図２】式1による活性化された反応性アンカーとKBDとの反応を示す。
【図３】式2による反応性アンカーとKBDとの反応を示す。
【図４】式3による反応性アンカーとKBDとの反応を示す。
【図５】ケラチン結合ドメインBを発現するためのpQE30-KBD-Bのベクターマップを示す。
【図６】ケラチン結合ドメインBを発現するためのpLib15のベクターマップを示す。
【図７】ケラチン結合ドメインBを発現するためのpLib16のベクターマップを示す。
【図８】ケラチン結合ドメインBを発現するためのpLib19のベクターマップを示す。
【図９】定量的KBD活性試験を示す模式図である。Hisタグ抗体-ペルオキシダーゼコンジュゲートを、Hisタグを介して、皮膚または毛髪に結合しているKBDにカップリングさせる。ペルオキシダーゼは、呈色反応を触媒し、その最終生成物は黄色であり、これは測光法で測定することができる。
【図１０】式1による反応性アンカーを含む反応性色素の活性化を示す。
【図１１】ケラチン結合ポリペプチドへの活性化された反応性色素14_264のカップリングを示す。
【図１２】ケラチン結合ポリペプチドへの反応性色素14_354のカップリングを示す。
【図１３】大腸菌におけるタンパク質生成のためのKBD-D発現ベクターを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年8月1日(2008.8.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７４】
実施例11：IPTG誘導性プロモーターを有する発現プラスミドpRee024(図13)を使用した大腸菌株によるKBD-D(配列番号167)の発現
発現のために、大腸菌株XL10 Gold[Stratagene社]を使用した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７５】
ここで、代表例として、KBD-D(配列番号167)のクローニング、その後のpRee024(図13)で形質転換された大腸菌でのKBD-Dタンパク質(配列番号168)の発現について記載する。
【国際調査報告】
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