(57)【要約】  ペプチド鎖をコードする遺伝子に作動可能に連結される場合にペプチド鎖発現を増大させるＤＮＡ配列、および前述を使用するペプチド鎖発現宿主細胞の生成方法が開示される。ペプチド鎖発現宿主細胞もまた開示される。
2009504160.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１および配列番号２に示される配列を有する核酸を含んでなる単離されたＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号１、２、３、４、５、６、７若しくは８に示される配列を有する核酸より本質的になる単離されたＤＮＡ。
【請求項３】
ペプチド鎖をコードする組換えＤＮＡに作動可能に連結される、配列番号１、２、３、４、５、６、７若しくは８に示される配列を有する核酸を含んでなる単離されたＤＮＡ。
【請求項４】
組換えＤＮＡがｃＤＮＡである、請求項３に記載のＤＮＡ。
【請求項５】
配列番号１に示される配列を有する核酸が、ペプチド鎖をコードする組換えＤＮＡの３’側に作動可能に連結される、請求項３に記載のＤＮＡ。
【請求項６】
グルタミン合成酵素をコードするＤＮＡをさらに含んでなる、請求項５に記載のＤＮＡ。
【請求項７】
ペプチド鎖が抗体フラグメントである、請求項３に記載のＤＮＡ。
【請求項８】
配列番号２、３、４、５、６、７若しくは８に示される配列を有する核酸が、ペプチド鎖をコードする組換えＤＮＡの５’側に作動可能に連結される、請求項３に記載のＤＮＡ。
【請求項９】
グルタミン合成酵素をコードするＤＮＡをさらに含んでなる、請求項８に記載のＤＮＡ。
【請求項１０】
ペプチド鎖が抗体フラグメントである、請求項８に記載のＤＮＡ。
【請求項１１】
ペプチド鎖をコードする組換えＤＮＡに作動可能に連結される、配列番号１および配列番号２に示される配列を有する核酸を含んでなる単離されたＤＮＡ。
【請求項１２】
組換えＤＮＡがｃＤＮＡである、請求項１１に記載のＤＮＡ。
【請求項１３】
配列番号１に示される配列を有する核酸が、組換えＤＮＡの３’側に作動可能に連結され、かつ、配列番号２に示される配列を有する核酸が、組換えＤＮＡの５’側に作動可能に連結される、請求項１１に記載のＤＮＡ。
【請求項１４】
グルタミン合成酵素をコードするＤＮＡをさらに含んでなる、請求項１３に記載のＤＮＡ。
【請求項１５】
ペプチド鎖が抗体フラグメントである、請求項１４に記載のＤＮＡ。
【請求項１６】
ａ）真核生物細胞を提供する工程；
ｂ）配列番号１、２、３、４、５、６、７若しくは８または配列番号１および配列番号２双方に示される配列を有する核酸を含んでなるＤＮＡを細胞に導入する工程；ならびに
ｃ）導入されたＤＮＡがペプチド鎖をコードするＤＮＡに作動可能に連結されている細胞を同定する工程
を含んでなる、ペプチド鎖発現宿主細胞の製造方法。
【請求項１７】
ａ）真核生物細胞を提供する工程；ならびに
ｂ）ペプチド鎖をコードするＤＮＡに作動可能に連結される、配列番号１、２、３、４、５、６、７若しくは８または配列番号１および２に示される配列を有する核酸を含んでなるＤＮＡを細胞に導入する工程
を含んでなる、ペプチド鎖発現宿主細胞の製造方法。
【請求項１８】
ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、７若しくは８または配列番号１および配列番号２に示される配列を有する核酸を含有する真核生物細胞を提供する工程；
ｂ）ペプチド鎖をコードするＤＮＡを細胞に導入する工程；ならびに
ｃ）導入されたＤＮＡが配列番号１、２、３、４、５、６、７若しくは８または配列番号１および２に作動可能に連結されている細胞を同定する工程
を含んでなる、ペプチド鎖発現宿主細胞の製造方法。
【請求項１９】
請求項１６、１７若しくは１８に記載の方法により製造される細胞。
【請求項２０】
請求項１９に記載の細胞を培養することを含んでなる、ペプチド鎖の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド鎖をコードする遺伝子に作動可能に連結される場合にペプチド鎖発現を増大させるＤＮＡ配列、および前述を使用するペプチド鎖発現宿主細胞の生成方法に関する。本発明はペプチド鎖発現宿主細胞にもまた関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体のような組換えタンパク質の大スケール生産は、典型的には培養産生細胞株からのタンパク質の発現に頼る。培養細胞により発現されるタンパク質は、標準的ベンチ若しくは工業スケールの精製技術を使用して容易に回収かつ精製し得る。
【０００３】
抗体産生細胞株は、Ｈ鎖およびＬ鎖抗体発現構築物の宿主細胞のゲノムＤＮＡ中への無作為組込みにより創製し得る。この無作為組込みは比較的低レベルの抗体発現を有する安定クローンの高い比率を生じる。この現象は、多くの組込みが、高レベルの発現に対し伝導性でない凝縮クロマチンの領域に導入遺伝子を挿入するという事実によりうる（非特許文献１）。
【０００４】
タンパク質発現レベルは、バイオリアクター若しくは他の系からのこうしたタンパク質の製造および精製に影響を及ぼす重要なパラメータである。一般に、より高い精製タンパク質収量は、発現レベルが相対的に高い場合に達成され得る。逆に、発現レベルが低い場合、収量は低いことがあり、そしてタンパク質精製は経済的に実行可能でないことがある。
【０００５】
低タンパク質発現を伴う細胞の問題を回避することへの１アプローチは、低発現細胞の一集団から高発現細胞をサブクローニングしかつ単離することであった。典型的に、これは、高発現細胞株の制限連続希釈、スクリーニングおよび選択の数回のかつ労働集約的な繰り返しを必要とする。あるいは、タンパク質を産生する全く新たな細胞株を、該新たな細胞株が高発現株であることができるという意図をもって生成する。
【０００６】
しかしながら、これらのアプローチのいずれも、成功のいかなる保証も提供せず、かつ、双方は重大な制限を有する。例えば、低発現細胞の一集団からサブクローニングすることにより高発現細胞株を同定することは、該集団中の高発現細胞の相対的希少性、ならびにいずれかの高発現細胞の同定に必要とされる大量の時間および労働により制限される。さらに、抗体若しくは目的のタンパク質を産生する新たな細胞株は、該細胞株の増殖および成長の間の導入遺伝子発現のサイレンシング、または他の形態の遺伝的若しくは後成的不安定性により、高発現であることを継続しないかも知れない。（インスレーターは役立たないとみられる）
【０００７】
従って、ペプチド鎖発現を効果的に増大させる組成物、方法および細胞に対する必要性が存在する。
【非特許文献１】Ｆｕｒｔｈら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、１９、６２０５−６２０８（１９９１）
【発明の開示】
【０００８】
［発明の要約］
本発明の一局面は、配列番号１および配列番号２に示される配列を有する核酸を含んでなる単離されたＤＮＡである。
【０００９】
本発明の別の局面は、配列番号１、２、３、４、５、６、７若しくは８に示される配列を有する核酸より本質的になる単離されたＤＮＡである。
【００１０】
本発明の別の局面は、ペプチド鎖をコードする組換えＤＮＡに作動可能に連結される、配列番号１、２、３、４、５、６、７若しくは８に示される配列を有する核酸を含んでなる単離されたＤＮＡである。
【００１１】
本発明の別の局面は、ペプチド鎖をコードする組換えＤＮＡに作動可能に連結される、配列番号１および配列番号２に示される配列を有する核酸を含んでなる単離されたＤＮＡである。
【００１２】
本発明のなお別の局面は、真核生物細胞を提供する工程；配列番号１、２、３、４、５、６、７若しくは８または配列番号１および配列番号２双方に示される配列を有する核酸を含んでなるＤＮＡを細胞に導入する工程；ならびに、導入されたＤＮＡがペプチド鎖をコードするＤＮＡに作動可能に連結されている細胞を同定する工程を含んでなる、ペプチド鎖発現宿主細胞の製造方法である。
【００１３】
本発明の別の局面は、真核生物細胞を提供する工程；ならびに、ペプチド鎖をコードするＤＮＡに作動可能に連結される、配列番号１、２、３、４、５、６、７若しくは８または配列番号１および２に示される配列を有する核酸を含んでなるＤＮＡを細胞に導入する工程を含んでなる、ペプチド鎖発現宿主細胞の製造方法である。
【００１４】
本発明の別の局面は、配列番号１、２、３、４、５、６、７若しくは８または配列番号１および配列番号２に示される配列を有する核酸を含有する真核生物細胞を提供する工程；ペプチド鎖をコードするＤＮＡを細胞に導入する工程；ならびに、導入されたＤＮＡが配列番号１、２、３、４、５、６、７若しくは８または配列番号１および２に作動可能に連結されている細胞を同定する工程を含んでなる、ペプチド鎖発現宿主細胞の製造方法である。
【００１５】
［発明の詳細な記述］
本明細で引用される、限定されるものでないが特許および特許出願を挙げることができる全部の刊行物は、完全に示されるかのように引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００１６】
本明細書および請求の範囲で使用されるところの、単数形の形態「ある（ａ）」、「および（ａｎｄ，）」、および「該（ｔｈｅ）」は、文脈が別の方法で明瞭に指図しない限り、複数の参照を包含する。従って、例えば「ある細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」への言及は１個若しくはそれ以上の細胞への言及であり、そして当業者に既知のそれらの同等物を包含する。
【００１７】
別の方法で定義されない限り、本明細書で使用される全部の技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されると同一の意味を有する。本明細書に記述されるものに類似若しくは同等のいかなる方法、装置および物質も本発明の実務若しくは試験で使用し得るとは言え、例示的方法、装置および物質を今や記述する。
【００１８】
「作動可能に連結される」という用語は、第一の配列若しくは配列の組に、第二の配列によりコードされるペプチド鎖の発現を増大させるように連結が機能する、向き若しくは距離に関係しない、核酸配列間のいかなる連結も意味しているが、但し、該第二の配列はマウス系統Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの染色体６若しくは１２からのゲノムＤＮＡでない。こうした連結は物理的連結を包含し得る。
【００１９】
「組換えＤＮＡ」という用語は、その天然の情況から取り出されているか若しくは天然に存在しないＤＮＡであるＤＮＡを意味している。組換えＤＮＡは、下で定義されるところの組換えペプチド鎖を発現するのに使用し得る。
【００２０】
「ペプチド鎖」という用語は、ペプチド結合により連結されて鎖を形成する最低２個のアミノ酸残基を含んでなる分子を意味している。５０アミノ酸以上の大型ペプチド鎖は「ポリペプチド」若しくは「タンパク質」と称されうる。５０アミノ酸未満の小型ペプチド鎖は「ペプチド」と称されうる。
【００２１】
本明細書で使用されるところの「抗体」という用語は、広範な意味で意味しており、そして、ポリクローナル抗体、マウス、ヒト、ヒト化およびキメラモノクローナル抗体を包含するモノクローナル抗体、組換え工作されたモノクローナル抗体を包含する免疫グロブリンすなわち抗体分子、ならびに抗体フラグメントを包含する。
【００２２】
一般に、抗体は、特異的抗原に対する結合特異性を表すタンパク質若しくはポリペプチドである。無傷の抗体は、２本の同一のＬ鎖（ＬＣ）および２本の同一のＨ鎖（ＨＣ）から構成されるヘテロ四量体の糖タンパク質である。典型的には、各Ｌ鎖は１個の共有ジスルフィド結合によりＨ鎖に連結される一方、ジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプのＨ鎖間で変動する。各ＨおよびＬ鎖は規則的に空間を空けられた鎖間ジスルフィド架橋もまた有する。各Ｈ鎖は一端に１個の可変ドメイン（ＶＨ）次いで多数の定常ドメインを有する。各Ｌ鎖は、一端の１個の可変ドメイン（ＶＬ）および他端に１個の定常ドメインを有し；Ｌ鎖の定常ドメインはＨ鎖の第一の定常ドメインと整列され、また、Ｌ鎖可変ドメインはＨ鎖の可変ドメインと整列される。いかなる脊椎動物種の抗体Ｌ鎖も、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、２種の明瞭に異なるタイプすなわちκおよびλの一方に割り当てられ得る。免疫グロブリンは、Ｈ鎖定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、５種の主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭに割り当てられ得る。ＩｇＡおよびＩｇＧはアイソタイプＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４としてさらに下位分類される。
【００２３】
「抗体フラグメント」という用語は無傷の抗体の一部分を意味している。この部分は、無傷の抗体のＨ鎖配列、Ｌ鎖配列、抗原結合すなわち可変領域でありうる。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント、二重特異性抗体、一本鎖抗体分子、ならびに最低２種の無傷の抗体から形成される多特異性抗体を包含する。
【００２４】
「発現宿主細胞」という用語は特定のペプチド鎖を発現する細胞を意味している。
【００２５】
本発明は、ペプチド鎖をコードする遺伝子に作動可能に連結される場合にペプチド鎖発現を増大させるＤＮＡに関する。該ＤＮＡは単独で若しくは相互と組合せで使用し得る。本発明は、前述を使用するペプチド鎖発現宿主細胞の生成方法および該方法により生成した宿主細胞にもまた関する。
【００２６】
本発明の一局面は、配列番号１、および配列番号２、３、４、５、６、７若しくは８に示される核酸配列を含んでなる単離されたＤＮＡである。本発明の別の局面は、配列番号１、２、３、４、５、６、７若しくは８に示される核酸配列よりなる若しくはより本質的になる単離されたＤＮＡである。これらのＤＮＡは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を増大させるのに使用しうる。それぞれ図６および９に示されるプラスミドｐ２１０６−ＤＶ６／１２Ｈｙｂ−ＺｓＧｒｅｅｎおよびｐＤＧ−ＧＳ−６Ｒ／１２ＲはこうしたＤＮＡの例である。
【００２７】
本発明の別の局面は、ペプチド鎖をコードする組換えＤＮＡに作動可能に連結される、配列番号１、２、３、４、５、６、７若しくは８に示される核酸配列を含んでなる単離されたＤＮＡである。こうしたＤＮＡは、該組換えＤＮＡによりコードされるペプチド鎖の発現を増大させるのに使用しうる。組換えＤＮＡの例は、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡのような人工ＤＮＡである。ゲノムＤＮＡはいずれかの種若しくは細胞型のＤＮＡから単離しうる。ゲノムＤＮＡは染色体およびオルガネラＤＮＡを包含する。人工ＤＮＡは、例えば、イントロンエンハンサー要素のようなイントロンにスプライシングされたｃＤＮＡ配列、合理的設計の結果であるＤＮＡ、若しくは異なる生物体から発する配列を含んでなる人工ＤＮＡを含有しうる。こうした配列の部分は、例えばヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）（ヒト）若しくはハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（マウス）起源のような異なる生物体から発しうる。当業者は、本発明の範囲内の他の組換えＤＮＡもまた認識するであろう。
【００２８】
本発明の一態様において、配列番号１、２、３、４、５、６、７若しくは８に示される配列を有する核酸に作動可能に連結される組換えＤＮＡはｃＤＮＡである。こうしたｃＤＮＡはペプチド鎖をコードすることができかつイントロンを含有しないことができる。しかしながら、いくつかの例においては、イントロン要素をコードするＤＮＡを伴うｃＤＮＡの部分に隣接することが望ましいことができる。プラスミドｐ２１０６−ＤＶ６−ＺｓＧｒｅｅｎ（図６に示される）は、ｃＤＮＡがイントロン要素により隣接されている組換えＤＮＡの一例である。ｃＤＮＡはいかなる種の核酸にも由来しうる。例えばｃＤＮＡはヒト起源若しくはマウス起源のものでありうる。
【００２９】
別の態様において、配列番号１、２、３、４、５、６、７若しくは８に示される配列を有する核酸配列に作動可能に連結される組換えＤＮＡは、ＢＡＬＢ／ｃ若しくはＮＡＫＥＤ系統のようなハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）系統のゲノムから得られるゲノムＤＮＡでありうる。これらの組換えＤＮＡは、イエハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）およびインドハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｂｏｏｄｕｇａ）のようなハツカネズミ属（Ｍｕｓ）の他の緊密に関係するメンバーからのゲノムＤＮＡ、若しくはヒトのような他の種のゲノムでもまたありうる。あるいは、こうしたＤＮＡはｃＤＮＡ若しくは他の人工ＤＮＡを包含する組換えＤＮＡでありうる。当業者は、本発明の本態様の範囲内の他の組換えＤＮＡを認識するであろう。
【００３０】
本発明の別の態様において、配列番号１に示される配列を有する核酸は、ペプチド鎖をコードする組換えＤＮＡの３’側に作動可能に連結される。該核酸は、それが同一ＤＮＡ鎖上かつ組換えＤＮＡのセンスコーディング配列の３’側に配置される場合に、該組換えＤＮＡの３’側に連結されているとみなしうるか；あるいは、それは、それが組換えＤＮＡを含有する鎖の３’部分に相補的なＤＮＡ鎖上に配置される場合に、該組換えＤＮＡの３’側に連結されているともまたみなしうる。こうした連結は、介在配列を伴わず直接、若しくは存在するいずれかの型の介在配列を伴う間接的でありうる。
【００３１】
本発明の別の態様において、ペプチド鎖をコードする組換えＤＮＡに作動可能に連結される、配列番号１、２、３、４、５、６、７若しくは８に示される配列を有する核酸を含んでなる単離されたＤＮＡは、グルタミン合成酵素をコードする単離されたＤＮＡをさらに含んでなる。グルタミン合成酵素をコードするこうしたＤＮＡはいかなる生物体由来でもありうるが、但し、それらは宿主細胞のグルタミン代謝欠損を是正することが可能である。こうした代謝欠損を、本発明のＤＮＡを含有する細胞の選択の基礎として使用し得る。当業者が認識するであろうとおり、Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ｐｌｃ（英国スラウ）により供給される「ＧＳ発現系」が１種のこうしたグルタミン代謝欠損の選択および発現系である。本発明の一実施様式において、グルタミン合成酵素遺伝子はこの「ＧＳ発現系」由来である。
【００３２】
本発明の別の態様において、配列番号１、２、３、４、５、６、７若しくは８に示される配列を有する核酸に作動可能に連結される組換えＤＮＡは、抗体フラグメントであるペプチド鎖をコードする。こうした抗体フラグメントは、ＩｇＧアイソタイプ治療抗体からのＨＣ若しくはＬＣフラグメント、またはＦａｂのような他の治療抗体フラグメントでありうる。当業者は、本発明の範囲内にまたある診断抗体のような他の抗体からの他の抗体フラグメントを認識するであろう。
【００３３】
本発明の別の態様において、配列番号１、２、３、４、５、６、７若しくは８に示される配列を有する核酸は、ペプチド鎖をコードする組換えＤＮＡの５’側に作動可能に連結される。配列番号２に示される配列を有する核酸は、それが同一ＤＮＡ鎖上かつ組換えＤＮＡの５’側に配置される場合に、該組換えＤＮＡの５’側に連結されているとみなしうるか；あるいは、該核酸は、それが組換えＤＮＡを含有する鎖の５’部分に相補的なＤＮＡ鎖上に配置される場合に、該組換えＤＮＡの５’側に連結されているともまたみなしうる。こうした連結は、介在配列を伴わず直接、若しくは存在するいずれかの型の介在配列を伴い間接的でありうる。
【００３４】
本発明の別の局面は、ペプチド鎖をコードする組換えＤＮＡに作動可能に連結される、配列番号１および配列番号２に示される配列を有する核酸を含んでなる単離されたＤＮＡである。こうしたＤＮＡは、該組換えＤＮＡによりコードされるペプチド鎖の発現を増大させるのに使用しうる。組換えＤＮＡ、および本発明の範囲内の組換えＤＮＡの特定の例は上に論考されている。
【００３５】
本発明の一態様において、配列番号１および配列番号２に示される配列を有する核酸に作動可能に連結される組換えＤＮＡはｃＤＮＡである。本発明の範囲内のｃＤＮＡは上述されている。
【００３６】
本発明の別の態様において、配列番号１に示される配列を有する核酸は、該組換えＤＮＡの３’側に作動可能に連結され、また、配列番号２、３、４、５、６、７若しくは８に示される配列を有する核酸は、ペプチド鎖をコードする組換えＤＮＡの５’側に作動可能に連結される。組換えＤＮＡの３’側の配列番号１に示される配列を有する核酸の作動可能な連結は上述されている。組換えＤＮＡの５’側の配列番号２、３、４、５、６、７若しくは８に示される配列を有する核酸の作動可能な連結もまた上述されている。
【００３７】
本発明の別の態様において、ペプチド鎖をコードする組換えＤＮＡに作動可能に連結される、配列番号１および配列番号２に示される配列を有する核酸を含んでなる単離されたＤＮＡは、グルタミン合成酵素をコードする単離されたＤＮＡをさらに含んでなる。グルタミン合成酵素をコードするこうしたＤＮＡは上で記述かつ論考されている。上述されたとおり、本発明の一実施様式において、グルタミン合成酵素遺伝子は「ＧＳ発現系」由来である。
【００３８】
本発明の別の態様において、配列番号１および配列番号２に示される配列を有する核酸に作動可能に連結される組換えＤＮＡは、抗体フラグメントであるペプチド鎖をコードする。こうした抗体フラグメントおよびそれらの例は上述されている。
【００３９】
本発明の別の局面は、真核生物細胞を提供する工程；配列番号１、２、３、４、５、６、７若しくは８または配列番号１および配列番号２双方に示される配列を有する核酸を含んでなるＤＮＡを細胞に導入する工程；ならびに、導入されたＤＮＡがペプチド鎖をコードするＤＮＡに作動可能に連結されている細胞を同定する工程を含んでなる、ペプチド鎖発現宿主細胞の製造方法である。
【００４０】
本発明の方法で有用な真核生物細胞はいかなる起源のものでもありうる。例示的真核生物細胞は、ヒト、ならびにハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（ハツカネズミ）およびモンゴルキヌゲネズミ（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）（チャイニーズハムスター）のようなげっ歯類起源のもの、または昆虫のような他の真核生物種の細胞でありうる。ＨＥＫ−２９３細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３ＴＭ）はヒト由来細胞の一例である。ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−９６１８ＴＭ）細胞はチャイニーズハムスター由来細胞の一例である。Ｓｐ２／０細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１８５１ＴＭ）はマウス系統ＢＡＬＢ／ｃ由来細胞の一例である。当業者は、本発明の方法で有用な他の真核生物細胞を認識するであろう。
【００４１】
本発明の方法での使用のため提供される真核生物細胞は、単離された細胞若しくは細胞の一集団の一部でありうる。真核生物細胞のこうした集団はクローン性（均質）若しくは不均質でありうる。均質若しくは不均質な細胞の一集団の一部である真核生物細胞は、組織若しくは器官の一部でありうる。
【００４２】
真核生物細胞は、既知組成培地若しくは血清含有培地のようないずれの適する培地中でも維持しうる。細胞は、フラスコ、バイオリアクター、ウェーブバッグ（ｗａｖｅ  ｂａｇ）および他の容器のようないずれの適する培養系容器中でも培養しうる。当業者は、本発明の方法で有用な他の培地、培養系容器および関係する方法を認識するであろう。
【００４３】
配列番号１、２、３、４、５、６、７若しくは８または配列番号１および配列番号２双方に示される配列を有する核酸を含んでなるＤＮＡは、トランスフェクション、または、プラスミド、トランスポゾン、ＤＮＡウイルス若しくは別の融合パートナー細胞のような当業者に公知のベクターを使用するウイルス感染のような多数の多様な方法により細胞中に導入しうる。これらのＤＮＡは、ベクターの使用を伴わない裸のＤＮＡとしてもまた細胞に導入しうる。こうしたＤＮＡは、ウイルス宿主細胞の内側で、配列番号１、２、３、４、５、６、７若しくは８または配列番号１および２に示される配列を有する核酸に逆転写され得る核酸配列を含有するＲＮＡウイルスによってもまた細胞に導入しうる。トランスフェクション方法は例えばリポフェクションおよび電気穿孔法を包含する。ウイルス感染方法は、例えば第二のウイルスによる感染を可能にするためのヘルパーウイルスの使用を包含する。ウイルスに基づくＤＮＡ導入方法は、単離された細胞または細胞の均質若しくは不均質な集団にＤＮＡを導入するのに使用しうる。当業者は、細胞中にＤＮＡを導入するための多くの他の方法およびベクターを認識するであろう。
【００４４】
配列番号１、２、３、４、５、６、７若しくは８または配列番号１および２に示される配列を有する核酸に連結されるか、あるいはこれらのＤＮＡとともに細胞に共導入されるマーカーを、これらのＤＮＡが導入された細胞についてスクリーニングするのに使用し得る。こうしたマーカーは、特定のマーカー配列が導入された細胞を同定するのに使用し得るいずれの核酸配列でもあり得る。マーカーは、例えば、特定の遺伝子と関連する表現型を有する細胞を同定するのに使用し得る遺伝子でありうる。こうしたマーカーを、マーカー関連の表現型に基づく細胞のスクリーニング若しくは選択に使用しうる。薬剤耐性遺伝子は当該技術分野で公知であるマーカーの一分類である。代謝、温度感受性若しくは他の欠損を伴う細胞が生存することを可能にするレスキュー遺伝子は、別の分類のマーカーの一例である。マーカーは、特定の表現型の発現を転写レベルで制御する遺伝子でもまたあることができ；誘導可能なプロモーターはこの分類のマーカーの一例である。容易に検出可能なポリペプチド、若しくはレクチンのような他の生体分子を発現する遺伝子は別の分類のマーカーである。ルシフェラーゼ若しくは蛍光タンパク質のような光を発射することが可能な抗体若しくはタンパク質をコードする遺伝子は、この分類のマーカーの例である。マーカーは、該核酸配列と関連する特定の表現型の非存在下でさえ、特定の配列が導入された細胞を同定するために使用し得る核酸配列でもまたありうる。当業者が認識するであろうとおり、こうしたマーカー配列に特異的なプライマーを用いるＰＣＲを、この型のマーカーが導入された細胞を同定するのに使用し得る。当業者は、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）のような細胞分取に基づく技術を使用して、マーカーを持つ細胞の同定を容易にしうることを認識するであろう。当業者は、他のマーカーおよび関係技術もまた認識するであろう。
【００４５】
配列番号１、２、３、４、５、６、７若しくは８または配列番号１および配列番号２双方に示される配列を有する導入されたＤＮＡがペプチド鎖をコードするＤＮＡに作動可能に連結されている細胞の同定は、容易に達成し得る。これは、対照細胞によるペプチド鎖の発現を、配列番号１、２、３、４、５、６、７若しくは８または配列番号１および配列番号２に示される配列を有する核酸を含んでなるＤＮＡの細胞への導入後の細胞中でのペプチド鎖発現レベルと比較することによりなし得る。配列番号１、２、３、４、５、６、７若しくは８または配列番号１および配列番号２に示される配列を有する核酸を含んでなるＤＮＡは、こうしたＤＮＡを受領する細胞中でのペプチド鎖発現が対照細胞に関して増大される場合に、ペプチド鎖をコードするＤＮＡに作動可能に連結されている。この表現型は作動可能な連結を診断する。
【００４６】
配列番号１、２、３、４、５、６、７若しくは８または配列番号１および配列番号２に示される配列を有する核酸を含んでなるＤＮＡは、最低２種の異なる方法で、ペプチド鎖をコードするＤＮＡに作動可能に連結されたようになることができる。作動可能な連結は、細胞への導入前に、配列番号１、２、３、４、５、６、７若しくは８または配列番号１および配列番号２に示される配列を有する核酸を含んでなるＤＮＡを、作動可能な連結を生じることが既知の若しくは合理的にありそうなコンホメーションのペプチド鎖をコードするＤＮＡに物理的に連結することにより遂げ得る。あるいは、作動可能な連結は、配列番号１、２、３、４、５、６、７若しくは８または配列番号１および配列番号２に示される配列を有する核酸を含んでなるＤＮＡの細胞への導入後に遂げ得る。これは、これらのＤＮＡ間で作動可能な連結を生じるｉｎ  ｖｉｖｏ組換え事象を介して達成し得る。
【００４７】
こうした組換え事象は、特定のＤＮＡ配列で起こるように標的を定め得るか、若しくは無作為なＤＮＡ配列で起こることを可能にし得る。組換え事象は、染色体若しくはオルガネラＤＮＡのようなゲノムＤＮＡ、または染色体外で維持されるプラスミドＤＮＡ若しくは人工染色体のようなゲノム以外ＤＮＡを必要とし得る。組換え事象は、配列番号１、２、３、４、５、６、７若しくは８または配列番号１および配列番号２に示される配列を有する核酸を含んでなるＤＮＡに加えて、標的ＤＮＡに同一の数キロ塩基の配列を含有する直鎖状ＤＮＡを使用することにより、特定のＤＮＡ配列で起こるように標的を定め得る。異種ＤＮＡ配列を導入するために特定のＤＮＡ配列に組換え事象の標的を定めるための戦略および関連方法は当該技術分野で公知であり（例えばＨａｒｒｉｓら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２５３、５２３−５３２（１９９９）を参照されたい）、そして、トランスジェニック動物、細胞および細胞株の生成で慣例に使用される。無作為組換え事象は、標的ＤＮＡ配列を欠く直鎖状ＤＮＡを導入すること、若しくは非直鎖状の環状プラスミドＤＮＡを細胞に単純に導入することにより発生し得る。当業者は、ＤＮＡ間で作動可能な連結を生じるｉｎ  ｖｉｖｏ組換え事象を達成するための他の方法および戦略を認識するであろう。
【００４８】
本発明の別の局面は、真核生物細胞を提供する工程；ならびに、ペプチド鎖をコードするＤＮＡに作動可能に連結される配列番号１、２、３、４、５、６、７若しくは８または配列番号１および配列番号２双方に示される配列を有する核酸を含んでなるＤＮＡを細胞に導入する工程を含んでなる、ペプチド鎖発現宿主細胞の製造方法である。真核生物細胞は上述されたとおりでありうる。本発明の本局面において、作動可能な連結は、細胞への導入前に、配列番号１、２、３、４、５、６、７若しくは８または配列番号１および配列番号２に示される配列を有する核酸を含んでなるＤＮＡを、作動可能な連結を生じることが既知若しくは合理的にありそうなコンホメーションのペプチド鎖をコードするＤＮＡに物理的に連結することにより遂げられる。
【００４９】
本発明の別の局面は、配列番号１、２、３、４、５、６、７若しくは８または配列番号１および配列番号２に示される配列を有する核酸を含んでなる真核生物細胞を提供する工程；ペプチド鎖をコードするＤＮＡを該細胞に導入する工程；ならびに、導入されたＤＮＡが配列番号１、２、３、４、５、６、７若しくは８または配列番号１および配列番号２に示される配列を有する核酸に作動可能に連結されている細胞を同定する工程を含んでなる、ペプチド鎖発現宿主細胞の製造方法である。配列番号１、２、３、４、５、６、７若しくは８または配列番号１および２に示される配列を有する核酸を含有する細胞は、ＰＣＲに基づく技術、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、若しくはサザンブロッティングのような当該技術分野で公知の他のハイブリダイゼーションに基づく技術により容易に同定し得る。核酸配列決定とともにの分子クローニング技術もまた、これらの配列を含有する細胞を同定するのに使用し得る。
【００５０】
本発明の本局面において、ペプチド鎖をコードするＤＮＡは、上で論考された方法若しくは当該技術分野で公知の他の方法のいずれかにより細胞に導入しうる。こうした導入されたＤＮＡは、これらのＤＮＡ間で作動可能な連結を生じるｉｎ  ｖｉｖｏ組換え事象を介して、配列番号１、２、３、４、５、６、７若しくは８または配列番号１および配列番号２に示される配列を有する核酸に作動可能に連結されたようになり得る。こうした組換え事象は特定のＤＮＡ配列で発生するよう標的を定め得るか、若しくは無作為のＤＮＡ配列で発生することを可能にし得る。
【００５１】
本発明の別の態様は、本発明の方法により製造される細胞である、本発明のなお別の態様は、本発明の方法により製造される細胞を培養することを含んでなるペプチド鎖の製造方法である。
【００５２】
本発明は今や、以下の特定の制限しない実施例を参照して記述されることができる。
【実施例１】
【００５３】
Ｃ１２８Ｄ細胞で高度に発現される２種の組換え遺伝子に隣接する染色体ＤＮＡ配列の単離
Ｃ１２８Ｄ細胞株は、ヒト／マウスキメラ抗体全体の発現を可能にするように２種の組換えＤＮＡ構築物で安定にトランスフェクトされているＳｐ２／０ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）系統ＢＡＬＢ／ｃ骨髄腫由来細胞株である。第一の構築物はヒトＧ１定常領域とともにマウス抗ＣＤ４  ＨＣ可変領域をコードした。第二の構築物はヒトκ定常領域とともにマウス抗ＣＤ４  ＬＣ可変領域をコードした。Ｃ１２８Ｄ細胞中で、ＨおよびＬ鎖ポリペプチドは極めて高レベル（消費済み（ｓｐｅｎｔ）振とうフラスコ中１５８ｍｇ／Ｌ；灌流バイオリアクター中１ｇ／Ｌ／日）で発現された。加えて、最低１コピーのＬＣ遺伝子および最低１コピーのＨＣ遺伝子構築物が、Ｃ１２８Ｄ細胞株のゲノムＤＮＡ中に相互にすぐ隣接して組込んでいる。図１を参照されたい。
【００５４】
Ｃ１２８Ｄ細胞株で組換えＨＣおよびＬＣ遺伝子に隣接するゲノム領域を、標準的ライゲーション媒介性ＰＣＲ技術によりクローン化した。２５７ｂｐのＬＣ遺伝子組込み部位の３’側に隣接するマウスゲノム配列をクローン化した。２２６ｂｐのＨＣ遺伝子組込み部位の５’側に隣接するマウスゲノム配列もまたクローン化した。図１および２を参照されたい。
【００５５】
ＢＬＡＳＴＮ分析は、該２５７ｂｐのフラグメントが、受託番号ＣＡＡＡ０１１２２２２０．１を有するハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）系統Ｃ５７ＢＬ／６Ｊゲノムの染色体６の一部分に一致したことを示した。ＢＬＡＳＴＮ分析は、２２６ｂｐのフラグメントが、受託番号ＣＡＡＡ０１０６０９０７を有するハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）系統Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの染色体１２の一部分に一致したこともまた示した。全ＢＬＡＳＴＮ分析は、フィルタリングをオフにしてデフォルトの設定を使用して実施した。蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析は、染色体トランスロケーションが、高発現Ｃ１２８Ｄ細胞株でＨＣおよびＬＣ組込みの部位で相互に隣接するマウス染色体６およびマウス染色体１２の一片をもたらしたことを示した。
【００５６】
標準的ＰＣＲ技術をその後使用して、組換え遺伝子組込み部位に隣接する４１５２ｂｐの染色体６ＤＮＡ（６Ｒ；配列番号１）、およびトランスロケーションの非存在下で該組込み部位に隣接していたとみられるおよそ４９００ｂｐのＤＮＡ（６Ｌ）を別個にクローン化した。６Ｒおよび６Ｌ双方のＰＣＲクローニングのためのプライマーを設計するのに、受託番号ＣＡＡＡ０１１２２２２０．１を部分的に使用した。
【００５７】
クローン化した６Ｒ配列（配列番号１）は、受託番号ＣＡＡＡ０１１２２２２０．１の４１５２ｂｐの部分に対する９９％の同一性を有した。受託番号ＣＡＡＡ０１１２２２２０．１は、染色体６の１２５３８ｂｐを含有するハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統のゲノムショットガン集成コンティグ全体である。クローン化した６Ｒおよび６Ｌフラグメントに対応する受託番号ＣＡＡＡ０１１２２２２０．１の部分は、遺伝子発現を増大させることが可能なＤＮＡ配列を含有することは報告されていない。
【００５８】
標準的ＰＣＲ技術を、組換え遺伝子組込み部位に隣接する２３０４ｂｐの染色体１２ＤＮＡ（１２Ｒ；配列番号１）、およびトランスロケーションの非存在下で該組換え遺伝子組込み部位に隣接していたとみられるおよそ１５００ｂｐのＤＮＡ（１２Ｌ）をクローン化するのにもまた使用した。１２Ｒおよび１２Ｌ双方のＰＣＲクローニングのためのプライマーを設計するために、受託番号ＣＡＡＡ０１０６０９０７を部分的に使用した。
【００５９】
クローン化した１２Ｒ配列（配列番号２）は、受託番号ＣＡＡＡ０１０６０９０７の４１５２ｂｐの部分に対する９９％の同一性を有した。受託番号ＣＡＡＡ０１０６０９０７は、染色体６の１８２９６ｂｐを含有するハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統のゲノムショットガン集成コンティグ全体である。クローン化した６Ｒおよび６Ｌフラグメントに対応する受託番号ＣＡＡＡ０１１２２２２０．１の部分は、遺伝子発現を増大させることが可能なＤＮＡ配列を含有することは報告されていない。
【００６０】
６Ｌおよび１２ＬのＰＣＲクローニング、ならびにＦＩＳＨデータは、Ｃ１２８Ｄ細胞が組換え遺伝子組込みの部位に６Ｌおよび１２Ｌ  ＤＮＡを含有しないことを示したが、しかしこれらの要素はＣ１２８Ｄ細胞のＤＮＡの別の場所に存在した。重要なことに、ＦＩＳＨおよびＰＣＲ分析により生成されるデータは、Ｃ１２８Ｄ細胞中での組換え遺伝子組込みの部位のＤＮＡ要素の順序が５’−１２Ｒ−ＨＣ−ＬＣ−６Ｒ−３’であったことを示した（図１を参照されたい）。これらのデータは、６Ｌおよび１２Ｌ  ＤＮＡがＣ１２８Ｄ細胞中の増大された組換え遺伝子発現に寄与しないことを示す。
【実施例２】
【００６１】
６Ｒおよび１２Ｒ  ＤＮＡは、安定にトランスフェクトした真核生物細胞中の組換えレポーター遺伝子発現を増大する
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター遺伝子に連結された６Ｒ、６Ｌ、１２Ｒおよび１２Ｌ  ＤＮＡを含有するベクター構築物を、組換え遺伝子発現を増大させる要素の同定を容易にするために作成した。全ベクターは標準的分子生物学的技術を使用して構築し、そしてプラスミド地図を全部図６に示す。
【００６２】
ｐ２１０６−ＤＶＢａｓｅ−ＺｓＧｒｅｅｎ（ＤＶ−ＢＡＳＥ）ベクターは、スナギンチャク（Ｚｏａｎｔｈｕｓ  ｓｐ．）のサンゴ由来のＺｓＧｒｅｅｎ  ＧＦＰレポーター遺伝子（Ｍａｔｚら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１７、９６９−９７３（１９９９）をコードするｃＤＮＡを含有する。ＤＶ−ＢＡＳＥ中のレポーター遺伝子は、６Ｒ、６Ｌ、１２Ｒ若しくは１２Ｌ  ＤＮＡに連結されていない。ｐ２１０６−ＤＶ６−ＺｓＧｒｅｅｎ（ＤＶ−６）ベクター中では、６Ｌ  ＤＮＡがＧＦＰレポーター遺伝子の５’側に連結され、また、６Ｒ  ＤＮＡがＧＦＰ遺伝子の３’側に連結されている。ｐ２１０６−ＤＶ１２−ＺｓＧｒｅｅｎ（ＤＶ−１２）ベクター中では、１２Ｒ  ＤＮＡがＧＦＰレポーター遺伝子の３’側に連結され、また、１２Ｌ  ＤＮＡがＧＦＰ遺伝子の５’側に連結されている。ｐ２１０６−ＤＶ６／１２Ｈｙｂ−ＺｓＧｒｅｅｎ（ＤＶ−６／１２）ベクターでは、１２Ｒ  ＤＮＡがＧＦＰレポーター遺伝子の５’側に連結され、また、６Ｒ  ＤＮＡがＧＦＰ遺伝子の３’側に連結されている。ＤＶ−６／１２は、Ｃ１２８Ｄ細胞に見出される６Ｒおよび１２ＲのＤＮＡ要素の５’−１２Ｒ−組換え遺伝子−６Ｒ−３’型の配置を表す。Ｃ１２８Ｄ細胞は組換え遺伝子組込みの部位に６Ｌおよび１２Ｌ  ＤＮＡを含有しない。ＤＶ−６、ＤＶ−１２およびＤＶ−６／１２ベクターは、それ以外はＤＶ−ＢＡＳＥベクターに同一である。
【００６３】
ＣＨＯＫ１−ＳＶ若しくはＨＥＫ−２９３細胞を、ＤＶ−ＢＡＳＥ、ＤＶ−６、ＤＶ−１２若しくはＤＶ−６／１２ベクターで安定にトランスフェクトした。６Ｒ、６Ｌ、１２Ｒおよび１２Ｌ隣接ＤＮＡがＧＦＰ発現を増大させたかどうかを決定するために、その後ＧＦＰ発現を評価した。ＣＨＯＫ１−ＳＶ細胞はチャイニーズハムスター卵巣細胞由来である。ＨＥＫ−２９３細胞はヒト腎細胞由来である。安定なトランスフェクタントを、バルク培養物（ｂｕｌｋ  ｃｕｌｔｕｒｅ）中で４００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含有する培地中での増殖について選択し、そして限界希釈により９６ウェルプレートにサブクローニングした。ＨＥＫ−２９３細胞はＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３発現培地（カタログ番号１２３３８−０１８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃｏｒｐ．カリフォルニア州カールズバッド）中で培養した。ＣＨＯＫ１−ＳＶ細胞は、標準的細胞培養技術を使用し、５％ＣＯ２雰囲気中３７℃でＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋６ｍＭグルタミン中で培養した。
【００６４】
図３および４に示されるデータは、６Ｒおよび１２Ｒ  ＤＮＡがＧＦＰレポーター遺伝子に連結されているベクターで安定にトランスフェクトしたＣＨＯＫ１−ＳＶ細胞中で、ＧＦＰ発現が対照に関して増大されることを示す。ＧＦＰ発現を評価するため、ＤＶ−ＢＡＳＥ、ＤＶ−６、ＤＶ−１２若しくはＤＶ−６／１２で安定にトランスフェクトしたＣＨＯＫ１−ＳＶ細胞のバルク集団で、標準的方法および器具類を使用するフローサイトメトリー分析を実施した。このフローサイトメトリー分析は、ＤＶ−ＢＡＳＥでトランスフェクトした細胞に関して、６Ｒおよび１２Ｒ  ＤＮＡをＧＦＰレポーター遺伝子に連結することにより、ＤＶ−６、ＤＶ−１２若しくはＤＶ−６／１２でトランスフェクトしたＣＨＯＫ１−ＳＶ細胞中でＧＦＰ発現の中央値がおよそ２ないし３倍増大したことを示した。
【００６５】
個々の安定にトランスフェクトしたＣＨＯＫ１−ＳＶ由来細胞をその後、標準的方法を使用して単離し、そして生じるクローン集団を９６ウェルプレートで培養した。安定にトランスフェクトした細胞のそれぞれ独立に派生したクローン集団で蛍光画像化分析を実施し、そして集団をＧＦＰ発現の順序で等級付けした（図４）。この分析は、再度、６Ｒおよび１２Ｒ  ＤＮＡをＧＦＰレポーター遺伝子に連結することにより、ＤＶ−６、ＤＶ−１２若しくはＤＶ−６／１２でトランスフェクトしたＣＨＯＫ１−ＳＶ細胞中でＧＦＰ発現がおよそ２ないし３倍増大したことを示した。蛍光画像化分析は標準的方法および器具類を使用して実施した。
【００６６】
図５のデータは、ＧＦＰ発現が、６Ｒおよび１２Ｒ  ＤＮＡがＧＦＰレポーター遺伝子に連結されているベクターで安定にトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞中で対照に関してまた増大されることを示す。フローサイトメトリー分析は、ＤＶ−ＢＡＳＥでトランスフェクトした細胞に関して、６Ｒおよび１２Ｒ  ＤＮＡをＧＦＰレポーター遺伝子に連結することにより、ＤＶ−６、ＤＶ−１２若しくはＤＶ−６／１２でトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞中でＧＦＰ発現の中央値がおよそ２ないし４倍増大したことを示した。細胞のバルク集団でのフローサイトメトリー分析は上述されたとおり実施した。
【００６７】
一緒に、これらの結果は、６Ｒおよび１２Ｒ  ＤＮＡが、多様な種および組織由来の真核生物細胞での組換え遺伝子発現を増大させ得ることを示す。
【実施例３】
【００６８】
６Ｒおよび１２Ｒ  ＤＮＡは、安定にトランスフェクトしたヒト細胞中の組換え抗体遺伝子発現を増大させる
ＩＬ−６に対するヒトＩｇＧ１Ｋ抗体をコードするＨＣおよびＬＣ遺伝子に連結した６Ｒおよび１２Ｒ  ＤＮＡを含有するベクター構築物を作成した。１構築物はｐ２１０６−ＤＶＢａｓｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＤＶ−ＢＡＳＥ−Ａｂ）であった。ＤＶ−ＢＡＳＥ−Ａｂは、ＧＦＰレポーター遺伝子が抗体ＨＣ遺伝子で置換されかつＬＣ遺伝子が該ベクターに存在するウサギβ−グロビンイントロンＩＩ要素に対し５’に挿入されたことを除き、ｐ２１０６−ＤＶＢＡＳＥ−ＺｓＧｒｅｅｎ（図６に示される）に本質的に同一である。第二の構築物はｐ２１０６−ＤＶ６／１２Ｈｙｂ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＤＶ６／１２−Ａｂ）であった。ＤＶ６／１２−Ａｂは、ＧＦＰレポーター遺伝子がＨＣ遺伝子で置換されかつＬＣ遺伝子が該ベクターに存在するウサギβグロビンイントロンＩＩ要素に対し５’に挿入されたことを除き、ｐ２１０６−ＤＶ６／１２Ｈｙｂ−ＺｓＧｒｅｅｎ（図６に示される）に本質的に同一である。ＤＶ６／１２−Ａｂ中で、１２Ｒ  ＤＮＡはＨＣ遺伝子の５’側に連結され、また、６Ｒ  ＤＮＡはＬＣ遺伝子の３’側に連結される。ＤＶ６／１２は、Ｃ１２８Ｄ細胞中に見出される６Ｒおよび１２Ｒ  ＤＮＡ要素の配置を表す。全ベクターは標準的分子生物学技術を使用して構築した。
【００６９】
ＨＥＫ−２９３細胞をＤＶ−ＢＡＳＥ−ＡｂおよびＤＶ−６／１２−Ａｂで安定にトランスフェクトした。安定なトランスフェクタントのバルク集団および生じるクローン集団での抗体発現を、６Ｒおよび１２Ｒ隣接ＤＮＡが組換え抗体遺伝子発現を増大させたかどうかを決定するために評価した。安定なトランスフェクタントを、上の実施例２に記述されるとおり選択し、培養しかつサブクローニングした。培地中の抗体力価は標準的方法を使用して測定した。比生産性（細胞あたりに基づく抗体分泌の速度の尺度）もまた、標準的方法を使用して決定した。
【００７０】
組換え抗体遺伝子発現は、ＤＶ−６／１２−Ａｂで安定にトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞中で対照に関して増大される（図７および表１）。ＤＶ−６／１２−Ａｂでトランスフェクトした細胞のバルク細胞集団で、培養２２日後の抗体濃度は、ＤＶ−ＢＡＳＥ−Ａｂでトランスフェクトした細胞に関して数倍増大した（図７）。抗体発現の速度もまた、ＤＶ−６／１２−Ａｂでトランスフェクトした細胞のバルク集団で、ＤＶ−ＢＡＳＥ−Ａｂでトランスフェクト細胞に関しておよそ２．６倍増大した（表１）。
【００７１】
【表１】
2009504160.tif 000003
【００７２】
個々のＤＶ−６／１２−ＡｂおよびＤＶ−ＢＡＳＥ−Ａｂで安定にトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３由来細胞をその後、標準的方法を使用して単離し、そして生じるクローン集団を９６ウェルプレートで培養した。各ウェル中の抗体力価を、安定にトランスフェクトした細胞の各独立に派生したクローン集団について決定し、そして集団をＡｂ発現の順序で等級付けした（図７）。この分析は、再度、６Ｒおよび１２Ｒ  ＤＮＡをＧＦＰレポーター遺伝子に連結することにより、ＤＶ６／１２−ＡｂでトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞中でＡｂ発現が数倍増大したことを示した（図７）。
【００７３】
上の実施例のデータと一緒にすれば、これらの結果は、６Ｒおよび１２Ｒ  ＤＮＡが、本質的に異なる型のタンパク質をコードする組換え遺伝子の発現を増大し得ることを示す。さらに、これらの結果は、組換え遺伝子発現を増大させる６Ｒおよび１２Ｒ  ＤＮＡの能力が、特定のレポーター、抗体若しくは他の組換え遺伝子に制限されないようであることを示す。
【実施例４】
【００７４】
１２Ｒ  ＤＮＡは、安定にトランスフェクトした真核生物細胞中の組換え抗体遺伝子発現を増大させ得る
組織因子に対するヒト抗体をコードするＨおよびＬ鎖遺伝子に連結された６Ｒおよび１２Ｒ  ＤＮＡを含有するベクター構築物を、示されるとおり作成した（プラスミド地図を図９に示す）。全ベクターは標準的分子生物学技術を使用して構築した。
【００７５】
ｐＤＧ−ＧＳ構築物中で、治療抗体ＬＣをコードする遺伝子は同一抗体のＨＣをコードする遺伝子に対し５’に配置した。第二の構築物ｐＤＧ−ＧＳ−１２Ｒは、１２Ｒ  ＤＮＡがＬＣ遺伝子の５’側に配置されることを除きｐＤＧ−ＧＳに本質的に同一である（図９）。第三の構築物ｐＤＧ−ＧＳ−６Ｒ／１２Ｒは、６Ｒ  ＤＮＡがＨＣ遺伝子の３’側に配置されることを除きｐＤＧ−ＧＳ−１２Ｒに同一である（図９）。全ベクターはグルタミン合成酵素（ＧＳ）選択マーカーを含有する。
【００７６】
ＣＨＯＫ１−ＳＶ細胞を各構築物でトランスフェクトし、そして、安定なトランスフェクタントを、５０μＭメチオニンスルホキシイミン（ＭＳＸ）を含有するＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋６ｍＭグルタミン中での増殖および抗体産生について選択した。安定なトランスフェクタントを、上の実施例２に記述されたとおりサブクローニングした。培地中の抗体力価は、標準的方法を使用して測定した。
【００７７】
個々のｐＤＧ−ＧＳ、ｐＤＧ−ＧＳ−１２Ｒ若しくはｐＤＧ−ＧＳ−６Ｒ／１２Ｒで安定にトランスフェクトしたＣＨＯＫ１−ＳＶ由来細胞を、標準的方法を使用して単離し、そして生じるクローン集団を９６ウェルプレートで培養した。各ウェル中の抗体力価を、安定にトランスフェクトした細胞の各独立に派生したクローン集団について決定し、そして、最高のＡｂレベルを産生する１５個のクローン集団を抗体発現の順序で等級付けした。
【００７８】
図８に示すデータは、ｐＤＧ−ＧＳ−１２ＲおよびｐＤＧ−ＧＳ−６Ｒ／１２Ｒでトランスフェクトした細胞中の組換え抗体遺伝子発現および分泌速度が、対照のｐＤＧ−ＧＳでトランスフェクトした細胞に関して増大されたことを示す。この分析は、１２Ｒ  ＤＮＡ単独が対照に関して抗体発現を増大し得ることを示す。
【実施例５】
【００７９】
６Ｒ  ＤＮＡは、安定にトランスフェクトした真核生物細胞中の組換え抗体遺伝子発現を増大し得る
ＩＬ−６に対するマウス可変／ヒト定常キメラ抗体をコードするＨＣおよびＬＣ遺伝子に連結した６Ｒ  ＤＮＡを含有するベクター構築物を、示されるとおり作成した（プラスミド地図を図１１に示す）。全ベクターは標準的分子生物学技術を使用して構築した。
【００８０】
ｐ２２９９−ＨＣ−Ａｂ構築物はＨＣをコードするｃＤＮＡを含有する。第二の構築物ｐ２２９９−ＬＣ−ＡｂはＬＣをコードするｃＤＮＡを含有する。第三の構築物ｐ２２９９−ＨＣ−Ａｂ−６Ｒは、単一の６Ｒ  ＤＮＡ要素がＨＣ遺伝子の３’側に配置されることを除き、ｐ２２９９−ＨＣ−Ａｂに本質的に同一である（図１１）。第四の構築物ｐ２２９９−ＬＣ−Ａｂ−６Ｒは、単一の６Ｒ  ＤＮＡ要素がＬＣ遺伝子の３’側に配置されることを除き、ｐ２２９９−ＬＣ−Ａｂに本質的に同一である（図１１）。追加の６Ｒ要素がトランスフェクションの間にトランスで提供される。全ベクターは、グアニン−ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ）選択マーカーを含有する。
【００８１】
Ｃ８８４Ｃ細胞を、ｐ２２９９−ＨＣ−Ａｂおよびｐ２２９９−ＬＣ−Ａｂ若しくはｐ２２９９−ＨＣ−Ａｂ−６Ｒ、ｐ２２９９−ＬＣ−Ａｂ−６Ｒ、ならびにいずれかの他のＤＮＡに連結されない直鎖状６Ｒ  ＤＮＡいずれかでコトランスフェクトした。Ｃ８８４Ｃ細胞は、既知組成培地中での増殖について適合されたＮＳ／０由来細胞株である。該ＮＳ／０細胞株はハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（マウス）骨髄腫細胞株である。安定なトランスフェクタントを、１×ＭＨＸ（１ｍｌあたり１０μｇのミコフェノール酸、１５μｇのヒポキサンチンおよび２５μｇのキサンチン）、８ｍＭのＬ−グルタミンならびに１ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムを含有するＣＤ−ハイブリドーマタンパク質を含まない既知組成培地（カタログ番号１１２７９−０２３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）、若しくはＧＰＴ選択培地中での増殖、ならびに抗体産生について選択した。安定なトランスフェクタントは上の実施例２で記述されたとおりサブクローニングした。培地中の抗体力価は標準的方法を使用して測定した。
【００８２】
個々のｐ２２９９−ＨＣ−Ａｂ／ｐ２２９９−ＬＣ−Ａｂ若しくはｐ２２９９−ＨＣ−Ａｂ−６Ｒ／ｐ２２９９−ＬＣ−Ａｂ−６Ｒ／６Ｒで安定にトランスフェクトした細胞を、標準的方法を使用して単離し、そして生じる初代クローン集団を２４ウェルプレートで培養した。二次クローンをその後、さらなるＧＰＴ選択後に初代クローンから単離し、そして２４ウェルプレートで培養した。初代（データは表２に示される）若しくは二次クローン（データは表３に示される）の独立に派生した集団を含有する各ウェル中の抗体力価を測定し、そして最高のＡｂレベルを産生するクローンからの力価を表にした。
【００８３】
【表２】
2009504160.tif 000004
【００８４】
【表３】
2009504160.tif 000005
【００８５】
表２および３に示されるデータは、ｐ２２９９−Ｈｃ−Ａｂ−６Ｒ／ｐ２２９９−ＬＣ−Ａｂ−６Ｒ／６Ｒで安定にコトランスフェクトした細胞中の組換え抗体遺伝子発現が、対照のｐ２２９９−ＨＣ−Ａｂ／ｐ２２９９−ＬＣ−Ａｂでトランスフェクトした細胞に関しておよそ２ないし３倍増大されたことを示す。これらの結果は、抗体をコードする組換え遺伝子に６Ｒ  ＤＮＡ単独を連結することが、１２Ｒ  ＤＮＡからのいかなる寄与も伴わずに対照に関して抗体発現および分泌速度を増大し得ることを示す。
【実施例６】
【００８６】
１２Ｒ  ＤＮＡおよびそのフラグメントの核マトリックス結合活性
図１０に示されるデータは、１２Ｒ  ＤＮＡおよびそのフラグメントが核マトリックス結合活性を有することを示す。核マトリックス結合活性は、マトリックス付着領域（ＭＡＲ）を含んでなるＤＮＡと一般に関連する。ＭＡＲは、転写エンハンサーおよび障壁型インスレーターＤＮＡ要素としばしば緊密に関連しかつ頻繁にそれらに隣接する。「障壁型インスレーター」は、隣接する凝縮クロマチンがそれ以外は転写的に活性の遺伝子の遺伝子座に侵食しかつ抑制することを予防する障壁として作用することにより、遺伝子発現を増大させ得る。
【００８７】
核マトリックスは、真核生物細胞の核から調製される染色体外の生化学的画分である。顕微鏡技術を使用して見る場合、核マトリックスは、核膜およびゲノムＤＮＡのループと会合した線維顆粒状（ｆｉｂｒｏｇｒａｎｕｌａｒ）構造の広範囲に分枝した網として見える。ＤＮＡのこれらのループは凝縮し、クロマチンと会合し、そしておそらくは転写的に抑制若しくは拡大されかつおそらくは転写的に活性でありうる。
【００８８】
Ｃ４６３Ａ  Ｓｐ２／０マウス骨髄腫細胞からの核マトリックスを調製し、そして、核マトリックス結合アッセイを、ＭＡＲ要素を含有するＤＮＡを同定するためのＹｕｓｕｆｚａｉとＦｅｌｓｅｎｆｅｌｄの方法（ＹｕｓｕｆｚａｉとＦｅｌｓｅｎｆｅｌｄ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．、１０１：８６２０−８６２４（２００４））を使用して実施した。６Ｒおよび１２Ｒ  ＤＮＡをこれらの実験のため蛍光標識した。Ａ（配列番号３）、Ｂ（配列番号４）、Ｃ（配列番号５）、Ｄ（配列番号６）、Ｅ（配列番号７）およびＦ（配列番号８）と称される１２Ｒの制限フラグメントもまた調製し、そして標準的方法を使用して蛍光標識した。ＭＡＲを含有することが既知のＩｇＨイントロンエンハンサー要素を含有する真核生物ＤＮＡもまた放射標識し、そして陽性対照として使用した。
【００８９】
蛍光標識したＤＮＡをその後核マトリックスとインキュベートした。核マトリックス、およびいかなる会合したＤＮＡも高速遠心分離によりペレットにした。マトリックス会合領域を含有する共沈殿したＤＮＡをその後、プロテイナーゼＫ消化、次いで標準的フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により核マトリックスタンパク質から分離した。沈殿したＤＮＡペレットをその後緩衝液に再懸濁し、そして１．２％アガロースゲル上で分離しかつ蛍光バンドを定量した。
【００９０】
図１１に示される核マトリックス結合アッセイのデータは、１２Ｒ  ＤＮＡ、ならびに１２ＲのＡおよびＣフラグメントが、転写エンハンサーおよび障壁型インスレーターＤＮＡ要素に典型的に隣接するＭＡＲ  ＤＮＡ要素を含有することをはっきりと示す。この結果は、ＭＡＲに隣接する配列はしばしば転写的に活性でありかつ遺伝子発現で重要な役割を演じているため、ＡおよびＣフラグメントに隣接するＢおよびＤフラグメントもまた遺伝子発現に重要でありうることもまた示唆する。加えて、これらのデータは、ＡおよびＣフラグメントを含有するＭＡＲを包含するより大きなＥおよびＦフラグメントが遺伝子発現で重要な役割を演じているかもしれないことを示唆する。一緒に、これらの結果は、１２Ｒ、制限フラグメントＡ、制限フラグメントＢ、制限フラグメントＣ、制限フラグメントＤ、制限フラグメントＥおよび制限フラグメントＦが、遺伝子発現で重要な中核ＤＮＡ要素を含有することを示す。これらの中核ＤＮＡ要素は、これらの要素が連結されている遺伝子の転写および究極的には発現を増大させるためのエンハンサー若しくは障壁型インスレーターとして機能するか、または他の方法で遺伝子発現を調節するよう機能することが可能でありうる。
【実施例７】
【００９１】
組換え遺伝子発現を増大させる中核６Ｒおよび１２Ｒ  ＤＮＡ要素の同定
組換え遺伝子発現を増大させかつ６Ｒおよび１２Ｒ  ＤＮＡ中に存在する中核ＤＮＡ要素は容易に同定し得る。最初に、６Ｒおよび１２Ｒ  ＤＮＡのフラグメントを生成しかつサブクローニングすることができる。６Ｒおよび１２Ｒ  ＤＮＡフラグメントは制限酵素消化若しくはＰＣＲのような技術を使用して生成し得る。こうしたフラグメントは、いずれかの大きさの５’、３’若しくは内部に配置された欠失をもつ６Ｒおよび１２Ｒ  ＤＮＡを包含しうる。フラグメントは、５’、３’若しくは内的に配置された挿入若しくは置換をもつ６Ｒおよび１２Ｒ  ＤＮＡもまた包含しうる。必要な場合は、当業者に公知の技術を使用して、制限フラグメントのようなフラグメントから５’若しくは３’ＤＮＡオーバーハングを排除し得る。
【００９２】
個々のサブクローニングした６Ｒおよび１２Ｒ  ＤＮＡフラグメントをその後、核酸構築物中でレポーター遺伝子に連結することができる。上述されたｐ２１０６−ＤＶＢａｓｅ−ＺｓＧｒｅｅｎ（ＤＶ−ＢＡＳＥ）は、６Ｒおよび１２Ｒ  ＤＮＡフラグメントをレポーター遺伝子に連結し得る核酸構築物の一例である。フラグメントは、単独若しくは組合せで、いずれの方向でもレポーター遺伝子に対し５’若しくは３’で連結することができ、また、位置の効果を取り扱うためにレポーター遺伝子から変動する距離に挿入しうる。レポーター遺伝子はタンパク質を発現するいかなる遺伝子でもありうる。
【００９３】
６Ｒ若しくは１２Ｒ  ＤＮＡフラグメントを含有するレポーター核酸構築物、およびこれらのフラグメントを欠く親構築物からのレポーター遺伝子発現をその後測定することができる。レポーター核酸構築物からの遺伝子発現は、例えば適切な細胞を該構築物でトランスフェクトすることによりｉｎ  ｖｉｖｏで達成し得る。ｐ２１０６−ＤＶＢａｓｅ−ＺｓＧｒｅｅｎ（ＤＶ−ＢＡＳＥ）型構築物を使用する場合、ＣＨＯＫ１−ＳＶ細胞をトランスフェクトし得る。安定なトランスフェクタントが、組換え遺伝子発現を増大する中核６Ｒおよび１２Ｒ  ＤＮＡ要素の同定に最も適することができるが、しかし一過性トランスフェクションもまた適切でありうる。
【００９４】
レポーター遺伝子の発現をその後、レポーター遺伝子にコードされるタンパク質の発現若しくは活性をアッセイすることによりモニターしうる。ｐ２１０６−ＤＶＢａｓｅ−ＺｓＧｒｅｅｎ（ＤＶ−ＢＡＳＥ）型構築物については、標準的な蛍光に基づくアッセイを使用してＧＦＰ発現をモニターし得る。いくつかの例では、レポーター遺伝子転写物レベルをアッセイすることができ、そして、レポーター遺伝子タンパク質発現の代用品として使用しうる。
【００９５】
レポーター遺伝子発現を増大させることが可能な中核要素を含有する６Ｒおよび１２Ｒ  ＤＮＡフラグメントは、これらのフラグメントを欠く親レポーター核酸構築物より高レベルの発現を生じることができる。こうした中核ＤＮＡ要素を、本明細書に記述される組成物、方法および細胞で配列番号１若しくは配列番号２と互換性に使用しうる。こうした中核要素は、多様な異なる機構により発現を増大させることができ、そして、例えば転写エンハンサー要素若しくは障壁型インスレーター要素でありうる。
【００９６】
本発明は今や完全に記述されたので、付随する請求の範囲の技術思想若しくは範囲から離れることなくそれに対し多くの変更および改変がなされ得ることが当業者に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】Ｃ１２８Ｄ細胞中のＨ鎖およびＬ鎖組換え部位に隣接する２５７ｂｐおよび２２６ｂｐのＤＮＡを単離するのに使用したＰＣＲに基づくクローニング戦略を示す。
【図２】Ｃ１２８Ｄ細胞からポリヌクレオチド６Ｒ（配列番号１）、６Ｌ、１２Ｒ（配列番号２）および１２Ｌを単離するのに使用したＰＣＲに基づくクローニング戦略を示す。
【図３】プラスミドｐ２１０６−ＤＶＢａｓｅ−ＺｓＧｒｅｅｎ、ｐ２１０６−ＤＶ６−ＺｓＧｒｅｅｎ、ｐ２１０６−ＤＶ１２−ＺｓＧｒｅｅｎ若しくはｐ２１０６−ＤＶ６／１２Ｈｙｂ−ＺｓＧｒｅｅｎで安定にトランスフェクトしたＣＨＯＫ１−ＳＶ細胞の集団による緑色蛍光タンパク質発現のフローサイトメトリー分析を示す。
【図４】プラスミドｐ２１０６−ＤＶＢａｓｅ−ＺｓＧｒｅｅｎ、ｐ２１０６−ＤＶ６−ＺｓＧｒｅｅｎ、ｐ２１０６−ＤＶ１２−ＺｓＧｒｅｅｎ若しくはｐ２１０６−ＤＶ６／１２Ｈｙｂ−ＺｓＧｒｅｅｎで安定にトランスフェクトした個々のＣＨＯＫ１−ＳＶ細胞による緑色蛍光タンパク質発現の蛍光画像化分析を示す。
【図５】プラスミドｐ２１０６−ＤＶＢａｓｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｐ２１０６−ＤＶ６−Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｐ２１０６−ＤＶ１２−Ａｎｔｉｂｏｄｙ若しくはｐ２１０６−ＤＶ６／１２Ｈｙｂ−Ａｎｔｉｂｏｄｙで安定にトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞の集団による治療抗体発現のフローサイトメトリー分析を示す。
【図６】プラスミドｐ２１０６−ＤＶＢａｓｅ−ＺｓＧｒｅｅｎ、ｐ２１０６−ＤＶ６−ＺｓＧｒｅｅｎ、ｐ２１０６−ＤＶ１２−ＺｓＧｒｅｅｎおよびｐ２１０６−ＤＶ６／１２Ｈｙｂ−ＺｓＧｒｅｅｎのベクター地図を示す。
【図７】プラスミドｐ２１０６−ＤＶＢａｓｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ若しくはｐ２１０６−ＤＶ６−Ａｎｔｉｂｏｄｙで安定にトランスフェクトした個々のＨＥＫ−２９３細胞による治療抗体発現の抗体力価分析を示す。
【図８】プラスミドｐＤＧ−ＧＳ、ｐＤＧ−ＧＳ−１２Ｒ若しくはｐＤＧ−ＧＳ−６Ｒ／１２Ｒで安定にトランスフェクトした個々のＨＥＫ−２９３細胞の抗体力価分析を示す。
【図９】プラスミドｐＤＧ−ＧＳ、ｐＤＧ−ＧＳ−１２ＲおよびｐＤＧ−ＧＳ−６Ｒ／１２Ｒのベクター地図を示す。
【図１０】１２Ｒ  ＤＮＡ、ならびにＡ（配列番号３）、Ｂ（配列番号４）、Ｃ（配列番号５）、Ｄ（配列番号６）、Ｅ（配列番号７）およびＦ（配列番号８）と称されるそのフラグメントの核マトリックス結合活性を示す。
【図１１】プラスミドｐ２２９９−ＨＣ−Ａｂ−６Ｒおよびｐ２２９９−ＬＣ−Ａｂ−６Ｒのベクター地図を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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