(57)【要約】【課題】【解決手段】有効量のヒートショックプロテインＨｓｐ２０またはＨｓｐ２０のレベル及び／または活性を増大する薬剤を個体に投与することを特徴とする心機能を改善する方法、及び／または個体の心臓における心臓リモデリングを軽減及び／または防止する方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のヒートショックプロテインＨｓｐ２０またはＨｓｐ２０のレベル及び／または活性を増大する薬剤を個体に投与して、心臓での心機能を改善することを特徴とする個体の心臓における心機能を改善する方法。
【請求項２】
心機能が、個体の心臓における肥大を軽減及び／または減少することによって改善される請求項１記載の方法。
【請求項３】
心機能が、個体の心臓における心筋収縮性を高めることによって改善される請求項１記載の方法。
【請求項４】
心機能が、個体における心不全の発症または経時的変化を軽減及び／または防止することによって改善される請求項１記載の方法。
【請求項５】
心機能が、個体の心臓における虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）障害を減少及び／または防止することによって改善される請求項１記載の方法。
【請求項６】
心機能が、Ｈｓｐ２０またはＨｓｐ２０のレベル及び／または活性を増大する薬剤を投与しない個体と比べてＩ／Ｒ障害後に改善される請求項５記載の方法。
【請求項７】
梗塞の大きさが、Ｈｓｐ２０またはＨｓｐ２０のレベル及び／または活性を増大する薬剤を投与しない個体と比べてＩ／Ｒ障害後に減少される請求項５記載の方法。
【請求項８】
Ｈｓｐ２０またはＨｓｐ２０のレベル及び／または活性を増大する薬剤を投与しない個体と比べて心臓の構造的要素に対する損傷が少ない請求項５記載の方法。
【請求項９】
アポトーシス関連蛋白質が、Ｉ／Ｒ障害後に安定化される請求項５記載の方法。
【請求項１０】
カルパーゼ−３活性が、Ｉ／Ｒ障害後に減少される請求項５記載の方法。
【請求項１１】
個体の生存率が改善される請求項１記載の方法。
【請求項１２】
個体が、心臓障害を有する、または心臓障害を発症する恐れがある請求項１記載の方法。
【請求項１３】
心臓障害が、心不全、虚血、心筋梗塞、うっ血性心不全またはこれらの組合せからなる請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
個体の心臓が、Ｈｓｐ２０またはＨｓｐ２０のレベル及び／または活性を増大する薬剤の投与後に完全な機能回復をする請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
心臓の筋肉の完全性が、Ｈｓｐ２０またはＨｓｐ２０のレベル及び／または活性を増大する薬剤の投与後に維持される請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
Ｈｓｐ２０が、リン酸化されている請求項１記載の方法。
【請求項１７】
投与が、静脈内、皮内、皮下、経口、経皮、経粘膜、またはこれらの組合せからなる請求項１記載の方法。
【請求項１８】
Ｈｓｐ２０が、全長Ｈｓｐ２０、Ｈｓｐ２０断片またはこれらの組合せからなる請求項１記載の方法。
【請求項１９】
投与が、ウイルスベクター、リポソーム、非ウイルス輸送系またはこれらの組合せからなる請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
個体に有効量のＨｓｐ２０またはＨｓｐ２０のレベル及び／または活性を増大する薬剤を投与して、個体における心臓リモデリングを軽減及び／または防止することを特徴とする個体の心臓における心臓リモデリングを軽減及び／または防止する方法。
【請求項２１】
心臓リモデリングが、肥大、心不全進行またはこれらの組合せからなる請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
Ｈｓｐ２０で幹細胞を修飾することからなる幹細胞の生存を高める方法であって、幹細胞の生存が高められることを特徴とする方法。
【請求項２３】
幹細胞が、成体幹細胞、胚幹細胞、骨髄由来幹細胞またはこれらの組合せからなる請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
Ｈｓｐ２０で修飾された幹細胞が、心臓リモデリングを軽減及び／または防止する、及び／または個体の心臓での心機能を改善する請求項２２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００５年８月１２日に出願した米国出願番号６０／７０７，７０４号の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９による優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、少なくとも一部は、助成番号ＨＬ−２６０５７、ＨＬ−６４０１８及びＨＬ−５２３１８によって授与された米国連邦政府からの基金でなされた。従って、米国政府は、本発明に対し一定の承認された権利を有する。
【０００３】
本発明は、心機能（cardiac function）を改善する方法、及び／または個体における心臓での心臓リモデリング（cardiac remodeling）を軽減（attenuating）及び／または防止（prevention）する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
心臓病は、死亡及び身体障害の主な原因である。例えば、虚血性心臓病（ischemic heart disease）は、男性の全死亡の約３分の１及び女性の全死亡の約４分の１の原因となっている。この不利益は、病気及び／または虚血性の心筋細胞（cardiomyocytes）内の基礎をなす生物学的過程を目標とする効果的な治療法の不足を反映している。心臓において、続いて再灌流が起こる一時的虚血（虚血／再灌流、ishemia/reperfusion；Ｉ／Ｒ）は、壊死（necrosis）及びアポトーシス（apoptosis）を誘発し、心筋機能不全に至る。心機能の保存、心臓リモデリングの軽減及び／または防止、及びＩ／Ｒ後の梗塞領域の減少は、重要な適応反応（critical adaptive responses）に依存する。従って、心臓において、心機能を改善し、心臓リモデリングを軽減及び／または防止し、及び／またはＩ／Ｒ障害を減少または防止するための治療法を開発することが、有利であろう。
【０００５】
最近の実験結果は、成体骨髄由来（adult bone-marrow-derived）の間葉幹細胞（mesenchymal stem cells；ＭＳＣｓ）等の幹細胞を用いて損傷した心筋（myocardium）を再生する可能性を提案している。しかしながら、幹細胞を用いた治療法の有効性に対する主な限界は、移植された細胞の劣った生存能力である。実際、幹細胞を用いた治療法による機能の改善は、極めて少なかった。高レベルの移植された細胞の死が、損傷した心臓への移植後４日以内に生じる。さらにまた、幹細胞から再生した組織は、虚血の繰り返される発作（bouts）に耐えられない。従って、１週間の細胞保護（cytoprotection）が、細胞療法の有効性を改善するために重要であり、そして幹細胞または前駆細胞（progenitor cells）の遺伝子修飾（genetic modificaton）が、再生医療（regenerative medicine）における重要な戦略的進歩を意味する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、個体における心臓での心機能を改善する方法に関する。この方法は、有効量のヒートショックプロテイン（Heat-Shock Protein）Ｈｓｐ２０またはＨｓｐ２０のレベル及び／または活性を増大する薬剤を個体に投与して、心臓の機能を改善することを含む。
【０００７】
また、本発明は、個体における心臓での心臓リモデリングを軽減及び／または防止する方法に関する。この方法は、有効量のヒートショックプロテインＨｓｐ２０またはＨｓｐ２０のレベル及び／または活性を増大する薬剤を個体に投与して、心臓リモデリングを軽減及び／または防止することを含む。
【０００８】
さらに、本発明は、幹細胞の生存を高める方法に関する。この方法は、Ｈｓｐ２０で幹細胞を修飾して、幹細胞の生存を高めることを含む。
【０００９】
以下の本発明の詳細な説明は、図面を考慮してより完全に理解されるだろう。
【００１０】
図１は、心臓特異（cardiac-specific）Ｈｓｐ２０ＴＧマウスの生産及び特徴付けを説明するものである。ａは、Ｈｓｐ２０ＴＧの構成概念の図である。ＴＧマウスは、α−ミオシン重鎖プロモータ（αＭＨＣｐ）の制御下にマウス心臓のＨｓｐ２０ｃＤＮＡ（ｍｃＨｓｐ２０）を使用することによって生産される。６００ｂｐのＤＮＡ断片は、５００ｂｐのｍｃＨｓｐ２０ｃＤＮＡオープン・リーディング・フレームに３’で連結されたヒト成長ホルモンポリアデニル化配列（ｈＧＨｐＡ）を含む。次に、ｍｃＨｓｐ２０／ｈＧＨｐＡを含む断片は、５．５ｋｂのマウス心臓特異αＭＨＣプロモータから下流に連結される。ジェノタイピング（genotyping）に使用されるＰＣＲプライマーの位置は、矢印によって示す。ｂは、ＷＴ（−）及びＴＧ（＋）マウスからのゲノムＤＮＡの遺伝子型分析（Genotypic analysis）を示す。対照ＰＣＲを行い、ＴＳＨ−βの３５０ｂｐ断片を増幅する。ｃは、ヘマトキシリン及びエオシンで染色された３ヶ月齢のマウスからの心室の切片であり（倍率：４００倍）、ＴＧ心臓に明白な心臓の形態学的／病理学的異常を示していない。ｄは、抗Ｈｓｐ２０抗体を用いてウエスタンブロッティングに供したＷＴ及びＴＧマウスからの異なる組織ホモジネートのアリコート（aliquot）（２０μｇ）である。ｅは、ＴＧ心臓でのＨｓｐ２０プロテインレベルの増加が、ＷＴ心臓（１．０）に対して１０倍であることを示している定量免疫ブロッティング分析である。ｆは、増大したＨｓｐ２０発現が、Ｈｓｐ２５及びαβ−クリスタリンプロテインレベルを変えないことを示す。
【００１１】
図２は、Ｈｓｐ２０の過剰発現が、分離灌流（isolated perfused）心臓における虚血後の心機能を改善することを示す。ＫＨ緩衝液で３０分間安定化させた後に、心臓を４５分間の完全虚血（global ischemia）及び２時間の再灌流を行う。ａは、再灌流中の左心室発生圧力（left ventricular developed pressure；LVDP）が、ＷＴ心臓におけるよりＴＧにおいて高いことを示している。ｂ及びｃは、虚血後の収縮機能（postischemic contractile function）（±ｄＰ／ｄｔ）の回復が、ＴＧ心臓において有意に改善されることを示している（ｎ＝１５、ＷＴ；ｎ＝１２、Ｈｓｐ２０ＴＧ；＊ＷＴに対しＰ＜０．０５）。
【００１２】
図３は、Ｈｓｐ２０の過剰発現が、Ｉ／Ｒ誘導壊死及びアポトーシスを軽減することを示す。４５分間の非流動虚血、引き続き２時間の再灌流を行ったＨｓｐ２０ＴＧ心臓が、ＷＴ心臓（ｎ＝６）と比べて有意に減少された（ａ）再灌流の最初の１時間中に採集される冠状動脈溶出液（coronary effluent）における全ＬＤＨ放出（total LDH efflux）（Ｕ／ｇ、湿潤心臓重量）；（ｂ）ＤＮＡ断片化；及び（ｃ）矢印によって示すＴＵＮＥＬ染色細胞（暗褐色）の陽性数（ｎ＝８）を示す。＊ＷＴに対しＰ＜０．０５。
【００１３】
図４は、Ｈｓｐ２０の過剰発現が、Ｉ／Ｒ障害を緩和することを示す。ａ〜ｄは、生体外の虚血後の心臓からの代表的なトリクローム染色心筋切片を示している。収縮帯（長矢印）及び小胞（短矢印）（全て細胞損傷の印である）が、ＷＴにおいて存在する（ａ及びｃ）が、ＴＧ心臓には存在しない（ｂ及びｄ）。ｅは、Ｈｓｐ２０の心臓特異過剰発現が、４５分間の非流動虚血及び１２０分間の再灌流後の危険領域に対するパーセンテージとして示される生体外での心筋梗塞の大きさを有意に低減することを示している（１心臓当り５つから６つの薄片；ｎ＝６、ＴＧ；ｎ＝８、ＷＴ；＊虚血後ＷＴ心臓に対しＰ＜０．０１）。ｆは、Ｈｓｐ２０の過剰発現が、ＬＡＤ閉塞（上左）を経由し、３０分間の心筋虚血、引き続き２４時間の再灌流を行った後、生体内心筋梗塞の大きさを大いに減少することを示している。心臓に大動脈を介して１％ＴＴＣを注入し、引き続き５％フタロブルーを注入し、次に、心臓を２ｍｍから３ｍｍの厚さの薄片に横に切断する。壊死の領域及び危険領域を先に述べたように（２８）定量化する（ｎ＝７、ＴＧ；ｎ＝１１、ＷＴ；＊虚血後ＷＴ心臓に対しＰ＜０．００１）。危険領域は、群間で有意に異ならない（ＴＧ、５２．９±１．５；ＷＴ，４５±３．２；Ｐ＜０．０５）。正規化前の梗塞の大きさは、ＴＧ、４．３±０．５；ＷＴ、８．８±１．２；Ｐ＜０．０５である。
【００１４】
図５は、アポトーシス関連蛋白質に及ぼすＨｓｐ２０の過剰発現の効果を示す。生体外のＷＴ心臓において、４５分間の非流動虚血後、引き続いて１２０分間の再灌流を行った後に、Ｂｃｌ−２のプロテインレベル（ａ）が、有意に減少しているが、Ｂａｘレベル（ｂ）は、有意に増大している。これらの蛋白質は、ＴＧ細胞においては何の変化も示さない。ｃは、虚血／再灌流後のＴＧ心臓におけるＢｃｌ−２／Ｂａｘプロテインレベル比が、ＷＴ心臓におけるより有意に高いことを示している。ｄ及びｅは、Ｈｓｐ２０が、Ｂｃｌ−２とではなくＢａｘと共免疫沈降することを示している。マウス心臓のホモジネートを、抗Ｈｓｐ２０抗体（ｄ）または抗Ｂａｘ抗体（ｅ）と免疫沈降させる。蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、抗Ｂａｘ抗体（ｄ１）または抗Ｈｓｐ２０抗体（ｅ１）で調べる（probed）。次に、膜（ｄ１）をストリッピングし、抗Ｂｃｌ−２抗体（ｄ２）で再度調べる。次に、この膜（ｄ２）を再度ストリッピングし、抗Ｈｓｐ２０抗体（ｄ３）で再度調べる。同様に、膜（ｅ１）をストリッピングし、抗Ｂａｘ抗体（ｅ２）で再度調べる。予め免疫沈降した心臓ホモジネートを陽性対照（＋）として使用し、そしてＨｓｐ２０またはＢａｘ抗体のない免疫沈降物を陰性対照（−）として使用する。ｆは、カスパーゼ（caspase）−３活性が、Ｉ／Ｒ後にＷＴ心臓におけるよりＴＧ心臓において有意に低いことを示している。＊虚血／再灌流後のＷＴ心臓に対しＰ＜０．０５；各群においてｎ＝６。ｇ〜ｊは、２Ｄゲル電気泳動を用いてＨｓｐ２０のリン酸化反応を分析したことを示している。ホモジネートを、虚血／再灌流前（ｇ及びｉ）及び虚血／再灌流後（ｈ及びｊ）の、３０分間のＬＡＤ動脈の閉塞及び２４時間の再灌流を行ったＷＴ心臓及びＴＧ心臓から得る。尿素７ｍｏｌ／Ｌ、チオ尿素２ｍｏｌ／Ｌ、ＣＨＡＰＳ４％、ＤＴＴ２０ｍｍｏｌ／Ｌ、スペルミン２０ｍｍｏｌ／Ｌ及びＰＭＳＦ１ｍｍｏｌ／Ｌの可溶化溶液を用いることによってホモジネートを抽出する。抽出物を遠心分離（１００，０００ｇ、１０℃で１時間）し、等電点電気泳動細片（isoelectric focusing strips）〔インモビリンドライストリップ（Immobiline Drystrips）、１８ｃｍ、ｐＨ４から７〕を用いる２Ｄ電気泳動によって、各試料から５００μｇを分離する。２Ｄゲルは、サイプロルビー（Sypro Ruby）で染色し、そしてリン酸化（ｐＩの５．５）及び非リン酸化（ｐＩの５．７）Ｈｓｐ２０に対応する蛋白質スポットを、ウエスタンブロッティング及びＬＣＭＳ／ＭＳ分析によってさらに確認する（データは示していない）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
ヒートショックプロテイン（Ｈｓｐ）の合成は、熱、及び広範囲のストレスの多い潜在的に有害な刺激に曝されると、細胞のホメオスタシスを保護する道具として一時的に発生する。Ｈｓｐは、特に虚血再灌流傷害の実験的モデルにおいて、心筋保護のメディエータ（mediators）として関与している。また、Ｈｓｐは、ストレス誘発障害から心臓保護することも示されている。Ｈｓｐ７０の心臓保護作用が、分離成体ネコ心筋細胞、アデノウイルスにより媒介された遺伝子転移後のウサギ心臓、及び完全（global）虚血または部分（regional）虚血後のトランスジェニック（ＴＧ）マウス心臓において示されている。最近、心筋虚血中の保護も、低分子量（small）ヒートショックプロテインＨｓｐ２７及びαβ−クリスタリンに対して示されたが、虚血障害に対する心臓保護において、Ｈｓｐ２７及びαβ−クリスタリンとかなりの配列相同性を共有している他の低分子量Ｈｓｐ、Ｈｓｐ２０の役割については、ほとんど知られていない。
【００１６】
低分子量Ｈｓｐ、Ｈｓｐ２０は、初め、骨格筋肉からクリスタリンＨｓｐファミリーの一員として同定された。それは、チャイニーズハムスター卵巣細胞において熱処理に対する耐性を与え、その発現レベルが、ブタ頸動脈の熱予備処理、骨格筋肉のインスリン暴露、及び心筋細胞のβ−作用薬（agonist）刺激において高められる。興味深いことに、Ｈｓｐ２０は、血管拡張（vasodilation）を調節し、また血小板凝集を抑制することが示されている。さらに、本発明者等の最近の研究は、分離心筋細胞におけるＨｓｐ２０のアデノウイルス遺伝子転移が、収縮機能を改善し、また、β−作用薬により媒介されるアポトーシス（β-agonist-mediated apoptosis）に対し保護したことを示している。
【００１７】
増加する証拠は、幾つかのＨｓｐが、抗アポトーシスの役割を有し、心臓におけるＨｓｐ２７、αβ−クリスタリン、Ｈｓｐ３２（ＨＯ−１）及びＨｓｐ７０の過剰発現がＩ／Ｒ傷害を軽減し、心機能を改善することを示しているが、ここで研究したＨｓｐ２０は、独特なプロテインキナーゼＡ／プロテインキナーゼＧリン酸化部位ＲＲＡＳ（Ｓｅｒ−１６部位のリン酸化が心筋細胞における収縮性を有意に増大する；未公開データ）、血管緊張低下（vasorelaxation）の調節活性（regulatory activities）、及び血小板凝集において他のＨｓｐとは異なる。さらにまた、これまでの研究により、Ｈｓｐ２０が、ストレスでアクチンフィラメントに移行される（translocated）ことが示されている。これは、心筋細胞におけるその細胞骨格安定化機能を示唆している。総合すると、Ｈｓｐ２０のこれらの特性は、複数のレベルで虚血性心臓のために有益であることを示唆している。
【００１８】
生体内でのＨｓｐ２０の機能的有意性及びその潜在的な保護メカニズムをさらに明確にするために、本発明者らは、Ｈｓｐ２０の心臓特異的過剰発現を有するＴＧマウスモデルを生産した。この知見は、心臓での増加したＨｓｐ２０の発現が、心機能を改善することを証明している。従って、本発明者らは、個体における心臓での心機能を改善する方法を確定した。これらの方法は、有効量のＨｓｐ２０またはＨｓｐ２０のレベル及び／または活性を増大する薬剤を個体に投与して、心臓での心機能を改善することを特徴とする。本発明者らは、これらの方法を用いて、個体の生存率だけでなく、組織及び／または細胞の生存率をも改善することもできることをさらに確定した。ここで用いる「個体」とは、ヒトに限定されない哺乳類及びげっし動物を含む動物を意味する。
【００１９】
当業者は、個体の心臓における心機能が、本発明の方法を用いて改善することができる種々の手段を認めるであろう。一実施態様において、心機能は、個体の心臓における肥大（hypertrophy）を軽減及び／または減少することによって改善される。他の実施態様において、心機能は、個体の心臓における心筋収縮性（cardiac contractility）を高めることによって改善される。さらに他の実施態様において、心機能は、個体における心不全の発症または経時的変化（time course）を軽減及び／または防止することによって改善される。
【００２０】
当業者は、個体に投与されたＨｓｐ２０が、全長（full-length）Ｈｓｐ２０、Ｈｓｐ２０断片またはこれらの組合せから成り得ることを理解するであろう。ここで用いる「Ｈｓｐ２０断片」とは、全長Ｈｓｐ２０と同じ活性を有する全長Ｈｓｐ２０のいかなる断片について言うものであり、また全長Ｈｓｐ２０の化学的または構造的類似体（atructural analogue）である。本発明においては、Ｈｓｐ２０のレベル及び／または活性を増大する薬剤を用いて、心機能を改善することもできる。当業者は、そのいずれもがここで使用することができる、Ｈｓｐ２０のレベル及び／または活性を増大する種々の薬剤を理解するだろう。当業者は、心臓での心機能を改善するために、及び／または心臓リモデリングを軽減及び／または防止するために個体に投与することができる、そのいずれもがここで使用することができる、Ｈｓｐ２０またはＨｓｐ２０のレベル及び／または活性を増大する薬剤の種々の有効量も理解するだろう。
【００２１】
Ｈｓｐ２０及び／またはＨｓｐ２０のレベル及び／または活性を増大する薬剤は、当業者に知られたいかなる方法によっても投与することができる。一実施態様において、Ｈｓｐ２０及び／またはＨｓｐ２０のレベル及び／または活性を増大する薬剤の投与は、静脈内、皮内、皮下、経口、経皮、経粘膜、またはこれらの組合せからなる。他の実施態様において、Ｈｓｐ２０及び／またはＨｓｐ２０のレベル及び／または活性を増大する薬剤の核酸輸送（nucleic acid delivery）のために、投与は、ウイルスベクター、リポソーム、非ウイルス輸送系（non-viral delivery system）またはこれらの組合せからなる。
【００２２】
実施例で説明するように、心機能は、Ｈｓｐ２０またはＨｓｐ２０のレベル及び／または活性を増大する薬剤を投与することによって個体の心臓における虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）障害を減少及び／または防止することによって改善することもできる。一実施態様において、個体の心機能が、Ｈｓｐ２０またはＨｓｐ２０のレベル及び／または活性を増大する薬剤を投与しない個体と比べて、Ｉ／Ｒ障害後に改善される。他の実施態様において、梗塞の大きさが、Ｈｓｐ２０またはＨｓｐ２０のレベル及び／または活性を増大する薬剤を投与しない個体と比べて、Ｉ／Ｒ障害後に減少される。さらに他の実施態様において、Ｈｓｐ２０またはＨｓｐ２０のレベル及び／または活性を増大する薬剤を投与しない個体と比べて、Ｉ／Ｒ障害後に心臓の構造的要素（structural components）に対する損傷が少ない。
【００２３】
最近、Ｈｓｐ６０及びαβ−クリスタリンも、プロアポトーシスプロテインＢａｘと複合体を形成することが示された。ストレス条件下に、これらのＨｓｐとＢａｘとは解離（dissociate）し、その後Ｂａｘは、ミトコンドリアに移行（translocate）して、アポトーシスに関与する。これは、カスパーゼ活性化（caspase activation）の上流でのＨｓｐのための役割を示唆している。しかしながら、Ｈｓｐ７０は、カスパーゼ−３の強いられた発現によって誘導される死から細胞を保護することがわかっている。このことは、Ｈｓｐ７０による保護が、カスパーゼ活性化の下流で生じ得ることを示唆している。さらに、Ｈｓｐ７０は、Ａｐａｆ−１との直接相互作用（direct interaction）によってアポトーシスを干渉することが報告されている。さらに、Ｈｓｐ２７は、細胞質のチトクロームｃに直接結合し、それをＡｐａｆ−１から分離することが報告されている。従って、異なるＨｓｐは、異なるメカニズムによって作用して、細胞死を防止することができる。実施例に示したデータは、Ｈｓｐ２０が、恐らくＢａｘ−カスパーゼ経路を通って、Ｉ／Ｒ誘導アポトーシスを防止することを証明している。理論によって縛られることを望まないが、Ｂｃｌ−２及びＢａｘ等のアポトーシス関連蛋白質が、Ｉ／Ｒ障害後に安定化され、そしてカルパーゼ−３活性が、Ｉ／Ｒ障害後に減少されると思われる。
【００２４】
心機能を改善することに加えて、本発明者等は、個体の心臓での心臓リモデリングを軽減及び／または防止する方法を確定した。これらの方法は、有効量のＨｓｐ２０またはＨｓｐ２０のレベル及び／または活性を増大する薬剤を個体に投与して、個体の心臓での心臓リモデリングを軽減及び／または防止することを特徴とする。心臓リモデリングの例には、それらに限定されないが、肥大（hypertrophy）、心不全進行（heart failure progression）、またはこれらの組合せがある。一実施態様において、Ｉ／Ｒ障害後のＴＧ心臓におけるより損傷が少ない筋原線維の存在によって実施例において証明されたように、Ｈｓｐ２０またはＨｓｐ２０のレベル及び／または活性を増大する薬剤の投与は、例えばＩ／Ｒ障害中に、筋肉の完全性の維持（the maintenance of muscle integrity）を改善する。理論によって縛られることを望まないが、細胞骨格障害が、心筋虚血障害の病原における重要な役割を演じるという強い証拠があるので、Ｈｓｐ２０が、Ｉ／Ｒ後に心筋細胞の可溶分画から不溶分画に移行して、崩壊中間径フィラメント網（collapsed intermediate filament network）または細胞骨格蛋白質損傷（cytoskeletal protein damage）を保護するに至るものと考えられる。
【００２５】
これらの心臓保護作用は、また、マイクロフィラメント（microfilaments）をさらに安定化する、リン酸化Ｈｓｐ２０のアクチン及びアクチニンとの相互作用の強化に関する先の報告と一致して、増大したＨｓｐ２０リン酸化と関連があるかもしれない。さらに、理論によって縛られることを望まないが、本発明者らは、他のメカニズムが、ＡＳＫ１、Ｐ１３Ｋ−Ａｋｔ及びプロテインホスファターゼ１を含み得ると考える。従って、発明者の知見は、Ｈｓｐ２０の高められた発現及びその付随するリン酸化が、心臓を保護して、心機能の回復及び梗塞形成の低減に至ることを証明している。
【００２６】
心臓障害を有する、または心臓障害（heart disorder）を発現する恐れがある個体において、心機能を改善することができ、さらに／または、心臓リモデリングを軽減及び／または防止することができる。ここで使用する「心臓障害（heart disorder）」とは、その正常な機能を損なう心臓の構造的または機能的異常について言う。当業者は、種々のタイプの心臓障害を理解するだろう。例えば、心臓障害には、それらに限定されないが、心不全、虚血、心筋梗塞、うっ血性心不全（congestive heart failure）、または心臓障害のいかなる組合せがある。一実施態様において、心臓障害を有する、または心臓障害を発症する恐れがある個体の心臓は、Ｈｓｐ２０またはＨｓｐ２０のレベル及び／または活性を増大する薬剤の投与後に完全な機能回復をする。他の実施態様において、心臓障害を有する、または心臓障害を発症する恐れがある個体の心臓の筋肉の完全性（integrity）が、Ｈｓｐ２０またはＨｓｐ２０のレベル及び／または活性を増大する薬剤の投与後に維持される。
【００２７】
理論によって縛られることを望まないが、本発明者らは、Ｈｓｐ２０で修飾（modified）された、それらに限定されないが、成体幹細胞（adult stem cells）、胚幹細胞（embryonic stem cells）、間葉幹細胞（ＭＳＣｓ）等の骨髄由来幹細胞（bone-marrow-derived stem cells）、またはこれらの組合せを含む幹細胞が、生体外及び生体内でアポトーシスにより耐えるようになると考える。梗塞細胞に注射した場合、Ｈｓｐ２０で修飾された幹細胞は、心室リモデリングを制限し、また、心機能を改善して、対照幹細胞と比べてより効率的な治療に至る。これは、心筋の修復及び再生に対する細胞・遺伝子療法の理想的な組み合わせを示唆している。Ｈｓｐ２０を投与することの臨床的有益性は、また、生体内でのアデノウイルスまたはアデノウイルス関連ウイルス遺伝子導入を用いることに使用することができ、または、心筋梗塞後の移植Ｈｓｐ２０により修飾された幹細胞は、Ｈｓｐ２０の潜在的な臨床的有益性をさらに明瞭にすることができる。
【実施例】
【００２８】
方法
Ｈｓｐ２０の過剰発現が、生体外及び生体内の両方において虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）障害に保護効果を及ぼすかどうかを検討するために、本発明者らは、Ｈｓｐ２０の心臓特異的過剰発現（１０倍）を有するトランスジェニック（ＴＧ）マウスモデルを生産した。
【００２９】
ＴＧマウスモデルの生産
α−ミオシン重鎖プロモータ（αＭＨＣｐ）（図１ａ）の制御下にマウス心臓のＨｓｐ２０ｃＤＮＡを使用することによって、ＴＧマウスを生産する。この研究で使用したＴＧ系は、Ｈｓｐ２０の１０倍の過剰発現を有している。αＭＨＣプロモータ（５’−ＣＡＣＡＴＡＧＡＡＧＣＣＴＡＧＣＣＣＡＣＡＣ−３’）（配列ＩＤ番号：１）から上部プライマー及びｍｃＨｓｐ２０ｃＤＮＡ（５’−ＧＣＴＴＧＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＧＡＣ−３’）（配列ＩＤ番号：２）から下部プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、通常のジェノタイピング（routine genotyping）を実施して、αＭＨＣプロモータとｍｃＨｓｐ２０ｃＤＮＡとの連結にかかる６００ｂｐ断片を増幅する。対照ＰＣＲを行い、上流プライマー：５’−ＴＣＣＴＣＡＡＡＧＡＴＧＣＴＣＡＴＴＡＧ−３’（配列ＩＤ番号：３）及び下流プライマー：５’−ＧＴＡＡＣＴＣＡＣＴＣＡＴＧＣＡＡＡＧＴ−３’）（配列ＩＤ番号：４）を用いてＴＳＨ−βの３５０ｂｐ断片を増幅する（図１ｂ）。
【００３０】
免疫ブロッティング
心臓ホモジネートを標準ウエスタンブロッティングによって解析して、Ｈｓｐ２０、Ｈｓｐ２５、αβ−クリスタリン、Ｂｃｌ−２、Ｂａｘ、アクチン及びα−アクチンレベルを比較する。プライマリー抗体の結合は、ペルオキシダーゼ接合二次抗体（peroxidaseconjugated secondary antibodies）及び高められたケミルミネセンス（chemiluminescence）（アマシャム社；Amersham）によって検出し、そしてバンドをデンシトメトリーで定量化する。抗体Ｈｓｐ２０（リサーチダイアゴノスチックス社；Reserch Diagnostics Inc）、Ｈｓｐ２５（アフィニティーバイオリエージェンツ社；Affinity BioReagents Inc）、αβ−クリスタリン（カルビオケム社；Calbiochem）、Ｂｃｌ−２（Ｃ−２）、Ｂａｘ（Ｂ−９）、アクチン及びα−アクチン（サンタクルズバイオテクノロジー社；Santa Cruz Biotechnology Inc）。
【００３１】
免疫沈降
Ｈｓｐ２０とＢａｘ及びＢｃｌ−２との会合を、製造業者の指示に従って、ダイナビーズプロテインＧ（Dynabeads Protein G）（ダイナルバイオテク社；Dynal Biotech）を用いて研究する。簡潔には、野生型（ＷＴ）心臓からの心臓ホモジネートを、４℃で１時間ビーズを用いてインキュベートすることによってプレクリア（preclear）して、非特異的結合を最小にする。新鮮なビーズを０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄し、次に抗Ｈｓｐ２０または抗Ｂａｘ抗体で被覆する。結合抗体を、０．２ｍｏｌ／Ｌトリエタノールアミン溶液中のピメリン酸ジメチル２０ｍｍｏｌ／Ｌを用いてビーズに架橋する。次に、プレクリアしたホモジネートを架橋したビーズに加え、結合を４℃で１時間媒介させる。最後に、蛋白質を溶出し（０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸塩を用いる）、そしてそれらの固有性（identity）を免疫ブロッティングによって調べる。
【００３２】
生体外完全虚血
Ｉ／Ｒに対する細胞性及び機能的反応を、先に述べたように分離灌流（isolated perfused）心臓モデルを使用することによってマウスで評価する。雄成体マウス（１２週から１４週齢）を、ペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ）を用いて腹腔内（ＩＰ）麻酔する。心臓を迅速に取り出し、ランゲンドルフ装置（Langendorff apparatus）に載置し、クレブス−ヘンゼライト（Krebs-Henseleit）緩衝液（非循環；noncirculating）で灌流し、そして３０分間安定化し、次にこれらの心臓を、４５分間の非流動完全虚血及び２時間の再灌流に供する。プラスチックフィルム製の流体充填バルーンを、僧帽弁（mitral valve）を介して左心室に挿入し、膨らませて、１０ｍｍＨｇの左心室拡張末期圧（left ventricular end-diastolic pressure）を得る。バルーンを、ポリエチレンチューブ（ＰＥ５０）を介して心臓性能分析装置（Heart Performing Analyzer）（マイクロメド社；MicroMed）に接続した圧力変換器に付け、そして連続左心室圧力を測定する。双極電極（ヌーメド社；NuMed）を右房に挿入して、そして心房ペーシングをガラスＳ−５刺激装置（Grass S-5 stimulator）を用いて４００ｂｐｍで実施する。
【００３３】
ぺーシングを虚血中に停止し、再灌流で再開する。再灌流後、心臓を計量し、凍結し、そして房室溝に平行に２ｍｍ厚の薄片に切断する。薄片を解凍し、先に述べたように、３７℃の１％塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）のリン酸緩衝液（Ｎａ２ＨＰＯ４８８ｍｍｏｌ／Ｌ、ＮａＨ２ＰＯ４１．８ｍｍｏｌ／Ｌ）溶液中、１０分から２０分間インキュベートして染色する。梗塞、危険帯及び非危険心筋の領域を、各薄片の面積測定により決定する。
【００３４】
乳酸脱水素酵素放出及びＴＵＮＥＬアッセイ
心機能に加えて、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出（release）を測定することによって心臓障害を検定する。灌流溶出液（perfusion effluent）を虚血前及び再灌流中の１５分毎に採集する。心臓から放出された全ＬＤＨをCytoTox96アッセイ（プロメガ社；Promega）を用いて定量し、湿潤心臓重量の１グラム当りの単位として表す。末端ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ；terminal dUTP nick end-labeling）アッセイ用に、心臓をＩ／Ｒ後に装置から取り出し、心房組織を切り離す。心室を１０％緩衝ホルマリン中で固定し、その後、標準の手順に従ってパラフィン中に埋め込み、３μｍ厚さの切片を得て、製造業者の指示に従ってApopTag Plus Peroxidase In situ アポトーシス検出キット（ケミコン社；Chimicon）を用いてＴＵＮＥＬアッセイを実施する。ＴＵＮＥＬ陽性の心筋細胞を中央心室切片の１０領域を任意に計数することによって決定し、全心筋細胞数に対するパーセンテージとして表す。
【００３５】
ＤＮＡ断片化
心臓サンプルを、２．５容量の細胞溶解緩衝液（cell lysis buffer）（ＲＩＰＡ、μｍｏｌ／Ｌで：１ＤＴＴ及び５０ＰＭＳＦ）中でダウンス均質化（Dounce-homogenized）し、１３，０００ｇで１０分間遠心分離し、さらに各心臓からの上澄み（１００μｇ）を、測光酵素免疫測定（photometric enzyme immunoassay）に使用して、市販の分析キットCell Death Detection ELISAPLUS（ロシュ社；Roche）を用いてプログラム細胞死の細胞質ヒストン結合ＤＮＡ断片（cytoplasmic histone-associated DNA fragments）〔モノヌクレオソーム及びオリゴヌクレオソーム（mononucleosomes and oligonucleosomes）〕を定量する。結果を、キットに備わった規格に標準化して、対照に対する増加倍数として表す。
【００３６】
カスパーゼ−３活性
カスパーゼ−３活性を検出するために、各心臓からの２００μｇの溶解物（lysate）を、フルオロジェニックカスパーゼ−３基質と結合して、カスパーゼアッセイ緩衝液（２５０ｍｍｏｌ／ＬのＰＩＰＥＳ、５０ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ、２．５％のＣＨＡＰＳ、及び１２５ｍｍｏｌ／ＬのＤＴＴ）で３００ｍｇ／Ｌに希釈し、蛍光光度計で即座に測定する。測定は、１時間の間に１０分毎に繰り返し、１時間当りの蛍光単位の傾きを計算し、そして値を公知標準と比較して、酵素活性を決定する。
【００３７】
生体内部分虚血
２５ｇから３０ｇの重量のマウスをペントバルビタールナトリウム（９０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）を用いて麻酔し、ＰＥ９０チューブを挿入し、そして酸素を補充した室内空気をマウス用小送風器（ハーバードアパレイタス社；Harvard Apparatus）を用いて通気する。呼吸数は、１分当り１００から１０５呼吸である。ＰＯ２、ＰＣＯ２、血液ｐＨ及び体温を、先に述べたように手順全般にわたって正常範囲内に維持する。ＥＣＧ電極を皮下に設置し、データをDigi-Med Sinus Rhythm分析装置（マイクロメド社；MicroMed）で記録する。側方開胸術（lateral thoracotomy）（第二及び第三肋骨間で１．５ｃｍ切開）を実施して、肋骨及び胸骨の切除、収縮及び心臓の回転を避けながら、左冠動脈前下行枝（ＬＡＤ）を露出させる。近傍の血管束をマイクロコアグレータ（microcoagulator）（メディカルインダストリーズ社；Medical Industries）を用いて凝固する。８−０ナイロン縫合糸（8-0 nylon suture）を、左心耳（lefr auricle）の頂点から２ｍｍから３ｍｍの所でＬＡＤの回りに置き、一片の軟質シリコンチューブ（内径０．６４ｍｍ、外径１．１９ｍｍ）を動脈上に置く。全てのマウスにおいて、縫合糸をきつく締めて結ぶことにより３０分間の冠状動脈閉塞（coronary occlusion）を行う。虚血を目視観測（チアノーゼ）及び連続ＥＣＧ監視によって確認する。再灌流の２４時間後、大動脈にカニューレを挿入（cannulated）し、心臓を、先に述べたように１％ＴＴＣ（３７℃、６０ｍｍＨｇ）で灌流する。適所に残されていた閉塞物（occluder）を結び直し（retied）、そして心臓を５％フタロブルーで灌流する。心臓を、結さつ部位に作られた１切片を含む５切片から６切片に横に（transversely）切断する。梗塞の大きさを測定して、危険領域に対するパーセンテージとして表す。
【００３８】
統計学的分析
データを平均±ＳＥＭ（mean±SEM）として表す。統計学的分析は、対応のない記録の両側スチューデントのｔ検定（2-tailed Student t test for unpaired observations）及び多数比較用のＡＮＯＶＡ（ANOVA for multiple comarisons）を用いて実施する。Ｐ＜０．０５の値は、統計学的に有意であると考える。
【００３９】
結果
Ｈｓｐ２０ＴＧマウスの生産
αＭＨＣマウスプロモータの制御下にマウスの心臓のＨｓｐ２０ｃＤＮＡを有する（carry）ＴＧマウスを生産する（図１、ａ及びｂ）。全てのＨｓｐ２０ＴＧマウスは、健康であり、明白な心臓の形態学的または病理学的な異常を示さない（図１ｃ）。組織ホモジネートのウエスタンブロット分析（図１ｄ）により、Ｈｓｐ２０が、ＷＴマウスの心臓で発現しており、骨格筋及び平滑筋ではそれよりかなり少ない量で発現することが分かる。ＴＧ心臓でのＨｓｐ２０プロテインレベルに関して、トランスジェネシス（transgenesis）は、Ｈｓｐ２０プロテインレベルが１０倍に増加する結果となる（図１ｅ）。Ｈｓｐ２０の心臓での過剰発現により、心臓においてＨｓｐ２５及びαＢａｒ−クリスタリン等の他の低分子量Ｈｓｐの発現は、変わらない（図１ｆ）。
【００４０】
虚血後の機能回復の改善
【００４１】
【表１】
2009504683.tif 000003
【００４２】
HR：心拍数、BW：体重、HW：心臓重量、LVDP：左心室発生圧力、+dP/dt：収縮率、及び-dP/dt：弛緩率。
＊：対応するＷＴ群に対しＰ＜０．０５
【００４３】
ラットの心筋細胞におけるＨｓｐ２０の急性発現が、アポトーシスに対し保護するため、生体内でのＨｓｐ２０の増加した発現が、虚血後の障害に対し保護するかどうかを試験する。再灌流に際し炎症性成分の係わり合いを排除するために、分離灌流心臓試料（isolated perfused heart preparation）を使用する。これらの研究に使用したマウスの体重及び心臓重量は、ＴＧ及びＷＴ群間で同様である（表１）。心臓を３０分間安定化し、基線関数（baseline function）を測定する。Ｈｓｐ２０の過剰発現により、基本条件下で収縮機能が増大する結果となる（表１）。これは、心筋細胞におけるアデノウイルス媒介Ｈｓｐ２０遺伝子転移を使用した発明者の先の報告と一致する。次に、２０個の心臓を４５分間の完全虚血及び２時間の再灌流に供する。再灌流中、ＴＧ心臓は、ＷＴ心臓より有意に良好な機能回復を示す（図２）。左心室発生圧力が回復し、収縮率（＋ｄＰ／ｄｔ）及び弛緩率（−ｄＰ／ｄｔ）が、再灌流の１０分後に、ＴＧ心臓において、それぞれ５４±５％及び５９±４％であり、ＷＴ心臓において、それぞれ２０±３％及び２１±３％であることは、注目すべきことである。最も重要なことには、これらのパラメータは、ＴＧ心臓において再灌流の１時間後に完全に回復するが、ＷＴ心臓では、虚血前の値のそれぞれ６９±６％及び７１±４％に回復する。
【００４４】
Ｉ／Ｒ誘導壊死及びアポトーシスの軽減
これらのＩ／Ｒ心臓における壊死の程度を調べるために、完全虚血後の再灌流の最初の１時間中に放出されるＬＤＨのレベルを評価する。全ＬＤＨは、ＷＴ心臓において、ＴＧ心臓と比べて２倍であり（図３ａ）、これは、Ｈｓｐ２０を過剰に発現する心臓において壊死が低減することを示している。そのため、Ｈｓｐ２０ＴＧ心臓の機能保護が、低分子量Ｈｓｐの抗アポトーシス特性に関連するかどうかを試験する。実験用のＷＴ及びＴＧ動物の部分集合（subset）からの心臓溶解物（heart lysates）について、定量ヌクレオソームアッセイによってＤＮＡ断片化の測定を行う。ＷＴ心臓は、Ｈｓｐ２０ＴＧ心臓より３倍の増加を示す（図３ｂ）。その抗アポトーシス作用によるＨｓｐ２０の保護効果を実証するために、心臓のＴＵＮＥＬアッセイを実施する。ＷＴ動物の左心室からのＴＵＮＥＬ陽性の心筋細胞は、ＴＧ動物におけるものより４倍高い（図３ｃ）。かくして、アポトーシスを検出する両方法（ＤＮＡ断片化及びＴＵＮＥＬアッセイ）により、ＴＧ心臓において有意の軽減が実証される。
【００４５】
生体外及び生体内での減少した心筋梗塞サイズ
非流動完全虚血の４５分後、生体外で１２０分の再灌流を行い、組織化学的及びＴＴＣ染色法によって心筋梗塞の大きさを調べる。虚血／再灌流後のＷＴ心臓の組織学的実験により、収縮帯（contraction band）〔過収縮筋原線維（hypercontracted myofibers）〕及び空胞変性（vacuolizations）が現れる（図４、ａ及びｃ）。これらは共に、心筋細胞の損傷を示すものであるが、筋原線維は、Ｈｓｐ２０ＴＧ心臓において十分に保存されている（図４、ｂ及びｄ）。このことは、心臓にＨｓｐ２０を与えると、Ｉ／Ｒ障害中に、筋肉の完全性が維持されることを示唆している。危険領域のパーセンテージとして表す心筋梗塞の大きさは、ＷＴ心臓と比べて、ＴＧ心臓では６分の１に縮小する（図４ｅ）。これらの研究は、冠状動脈閉塞による３０分の心筋虚血後、引き続き２４時間の再灌流を行う生体内モデルにも拡大される。重要なことには、危険領域に対する梗塞領域の比率は、生体内条件下で、ＷＴ心臓における１９．５±２．１％（ｎ＝１１、Ｐ＜０．００１）に比べて、ＴＧ心臓において８．１±１．１％（ｎ＝７）である（図４ｆ）。
【００４６】
Ｉ／ＲにおけるＨｓｐ２０の心臓保護効果のメカニズム
低酸素／再酸素化（hypoxia/reoxygenation）後の分離心筋細胞（isolated cardiomyocytes）及びＩ／Ｒ中の心臓においてＢｃｌ−２及びＢａｘプロテインレベルの変化が証明されているため、Ｈｓｐ２０の心臓保護の潜在的なメカニズムを解明するために、まず、Ｉ／Ｒ前後の心臓におけるＢｃｌ−２及びＢａｘプロテイン発現レベルを評価する。Ｈｓｐ２０の過剰発現は、Ｂｃｌ−２及びＢａｘのいずれの発現レベルも変えないが（図５、ａ及びｂ）、ＷＴ心臓においては、それらの虚血前の試料と比べて、Ｉ／Ｒ時に、Ｂｃｌ−２のレベルは有意に低減するが、Ｂａｘのレベルは、非常に増大する（図５、ａ及びｂ）。従って、ＴＧ心臓におけるＢａｘ発現に対するＢｃｌ−２発現の相対比率は、Ｉ／Ｒ後のＷＴ心臓と比べて２倍より高い（図５ｃ）。さらに、Ｈｓｐ２０抗体を用いるＷＴ心臓からのホモジネートの免疫沈降は、Ｈｓｐ２０がＢｃｌ−２とではなく、Ｂａｘと相互作用したことを表している（図５ｄ）。Ｂａｘ抗体を用いる相互免疫沈降法（reciprocal immunoprecipitation approach）も、Ｈｓｐ２０とＢａｘの会合（association）を証明している（図５ｅ）。さらにまた、カスパーゼ−３の活性が、Ｉ／Ｒ時にＷＴ心臓と比べてＴＧ心臓において有意に低減される（図５ｆ）。
【００４７】
Ｈｓｐ２０は、分離心筋細胞のβ−アドレナリン刺激下にリン酸化されることがこれまでに証明されている。生体内でのＩ／Ｒ障害に対するＨｓｐ２０の保護効果が、そのリン酸化レベルの増加と関連するかどうかを調べるために、２Ｄゲル電気泳動を適応する。この研究により、全Ｈｓｐ２０の１６±１％が、ＴＧ心臓においてリン酸化されることが示される（図５ｉ）。このリン酸化は、再灌流の２４時間後に３７±２％に有意に増加される（図５ｊ）。このことは、Ｈｓｐ２０のリン酸化が、Ｉ／Ｒ障害に対する心臓保護において重要な役割を演じることを示唆している。ＷＴ心臓における変更したＨｓｐ２０のリン酸化の同様な評価は、内因性（endogenous）Ｈｓｐ２０の発現レベルが低いため、不可能である。（図５、ｇ及びｆ）。
【００４８】
本研究において、発明者らは、心筋虚血中の心臓保護に関するＨｓｐ２０の役割を見出した。興味深いことに、Ｈｓｐ２０の心臓選択的な過剰発現（cardiac-selective overexpression）が、Ｉ／Ｒ障害時に生体外及び生体内の両方において、全機能の回復及び梗塞の大きさの縮小に関連する。Ｉ／Ｒ障害からＨｓｐ２０ＴＧマウスの心臓を保護する基礎となる少なくとも２つのメカニズムが存在する。第一は、Ｈｓｐ２０過剰発現によるアポトーシス関連蛋白質Ｂｃｌ−２及びＢａｘの安定化に関係するが（図５、ａ〜ｃ）、生体内における最近の発見と同様に、ＷＴ心臓は、Ｂｃｌ−２レベルの減少及びＢａｘレベルの増加を示した。Ｂｃｌ−２２４の過剰発現またはＢａｘ２５の減少（ablation）が、Ｉ／Ｒ後、心機能の改善と関連し、これが心筋細胞のアポトーシスの低減と相関関係のあることがこれまでに示されている。さらに、ウサギ心臓のフェニレフリン処理（phenylephrine treatment）時に、遅発性虚血プレコンディショニングにより、Ｂｃｌ−２／Ｂａｘ比が増大し、アポトーシスが低減した。従って、保存された（preserved）Ｂｃｌ−２及びＢａｘプロテインレベルは、Ｈｓｐ２０によりＩ／Ｒ誘導アポトーシス（I/R-induced apoptosis）を阻害する重要なメカニズムであり得る。
【００４９】
重要なことに、Ｉ／Ｒ中に細胞質ゾル（cytosol）からミトコンドリアへのＢａｘの移行を防止した可能性がある蛋白質Ｂａｘと複合（complexed）したＨｓｐ２０（図５、ｄ及びｅ）が実証される。その結果、Ｈｓｐ２０は、ミトコンドリアの完全性を保存し、チトクロームｃの放出を制限し、カスパーゼ−３の活性化を抑制することができる。実際に、データは、虚血／再灌流後のＴＧ心臓においてカスパーゼ−３活性の低減を証明した（図５ｆ）。このことは、Ｂａｘの移行の阻害（データは示していない）のため、Ｉ／Ｒ誘導アポトーシスからの心臓保護は、プロカスパーゼ−３（ｐ２４）の活性カスパーゼ−３への転換の阻害に関係することを示唆している。カスパーゼ−３発現が、実験動物において心不全及びアポトーシスと関連して増大することが示されている。ペプチド阻害剤でのカスパーゼ活性化の直接遮断が、致命的な再灌流障害から心筋を保護する。これに反し、マウスにおけるカスパーゼ−３の心臓を標的とした過剰発現（heart targeted overexpression of caspase-3）により、梗塞の大きさが増大し、また心機能が低下することが示された。理論によって縛られることを望まないが、カスパーゼ−３の活性化が減少することも、Ｉ／Ｒにより誘導される障害に対する心臓保護のメカニズムの１つであると考えられる。
【００５０】
従って、本発明者らは、Ｈｓｐ２０が、心臓病に対する新規の潜在的な治療標的を提供することができることを見出した。具体的に、これらの知見は、心臓における増大したＨｓｐ２０の発現が、心機能を改善し、及び／または心臓リモデリングを軽減及び／または防止することを証明するものである。
【００５１】
ここに記載した具体的説明及び実施態様は、事実上例示するだけのものであり、請求の範囲によって規定される本発明を限定する意図はない。さらなる実施態様及び実施例は、本明細書を考慮して当業者に明らかになり、また請求された発明の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、心臓特異Ｈｓｐ２０ＴＧマウスの生産及び特徴付けを説明するものである。
【図２】図２は、Ｈｓｐ２０の過剰発現が、分離灌流心臓における虚血後の心機能を改善することを示す。
【図３】図３は、Ｈｓｐ２０の過剰発現が、Ｉ／Ｒ誘導壊死及びアポトーシスを軽減することを示す。
【図４】図４は、Ｈｓｐ２０の過剰発現が、Ｉ／Ｒ障害を緩和することを示す。
【図５】図５は、アポトーシス関連蛋白質に及ぼすＨｓｐ２０の過剰発現の効果を示す。
【図１】
2009504683.tif 000004
【図２】
2009504683.tif 000005
【図３】
2009504683.tif 000006
【図４】
2009504683.tif 000007
【図５】
2009504683.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成20年4月9日(2008.4.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体の心臓における心機能を改善する医薬を製造するためのヒートショックプロテインＨｓｐ２０またはＨｓｐ２０のレベル及び／または活性を増大する薬剤の使用。
【請求項２】
個体の心臓における肥大を軽減及び／または減少することによって心機能を改善する医薬を製造するための請求項１記載の使用。
【請求項３】
個体の心臓における心筋収縮性を高めることによって心機能を改善する医薬を製造するための請求項１記載の使用。
【請求項４】
個体における心不全の発症または経時的変化を軽減及び／または防止することによって心機能を改善する医薬を製造するための請求項１記載の使用。
【請求項５】
個体の心臓における虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）障害を減少及び／または防止することによって心機能を改善する医薬を製造するための請求項１記載の使用。
【請求項６】
Ｈｓｐ２０またはＨｓｐ２０のレベル及び／または活性を増大する薬剤を投与しない個体と比べてＩ／Ｒ障害後に心機能を改善する医薬を製造するための請求項５記載の使用。
【請求項７】
Ｈｓｐ２０またはＨｓｐ２０のレベル及び／または活性を増大する薬剤を投与しない個体と比べてＩ／Ｒ障害後に梗塞の大きさを減少する医薬を製造するための請求項５記載の使用。
【請求項８】
Ｈｓｐ２０またはＨｓｐ２０のレベル及び／または活性を増大する薬剤を投与しない個体と比べて心臓の構造的要素に対する損傷を減少する医薬を製造するための請求項５記載の使用。
【請求項９】
Ｉ／Ｒ障害後にアポトーシス関連蛋白質を安定化する医薬を製造するための請求項５記載の使用。
【請求項１０】
Ｉ／Ｒ障害後にカスパーゼ−３活性を減少する医薬を製造するための請求項５記載の使用。
【請求項１１】
個体の生存率を改善する医薬を製造するための請求項１記載の使用。
【請求項１２】
心臓障害を有する、または心臓障害を発症する恐れがある個体のための医薬を製造するための請求項１記載の使用。
【請求項１３】
心臓障害が、心不全、虚血、心筋梗塞、うっ血性心不全またはこれらの組合せからなる請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
医薬の投与後に個体の心臓の完全な機能回復を提供する医薬を製造するための請求項１２記載の使用。
【請求項１５】
医薬の投与後に心臓の筋肉の完全性を維持する医薬を製造するための請求項１２記載の使用。
【請求項１６】
Ｈｓｐ２０が、リン酸化されている請求項１記載の使用。
【請求項１７】
医薬が、静脈内、皮内、皮下、経口、経皮または経粘膜による投与、またはこれらの組合せに適している請求項１記載の使用。
【請求項１８】
Ｈｓｐ２０が、全長Ｈｓｐ２０、Ｈｓｐ２０断片またはこれらの組合せからなる請求項１記載の使用。
【請求項１９】
該医薬が、ウイルスベクター、リポソーム、非ウイルス輸送系またはこれらの組合せからなる請求項１８記載の使用。
【請求項２０】
個体の心臓における心臓リモデリングを軽減及び／または防止する医薬を製造するためのヒートショックプロテインＨｓｐ２０またはＨｓｐ２０のレベル及び／または活性を増大する薬剤の使用。
【請求項２１】
心臓リモデリングが、肥大、心不全進行またはこれらの組合せからなる請求項２０記載の使用。
【請求項２２】
幹細胞を修飾して、幹細胞の生存を高める医薬を製造するためのヒートショックプロテインＨｓｐ２０またはＨｓｐ２０のレベル及び／または活性を増大する薬剤の使用。
【請求項２３】
成体幹細胞、胚幹細胞、骨髄由来幹細胞またはこれらの組合せを修飾する医薬を製造するための請求項２２記載の使用。
【請求項２４】
心臓リモデリングを軽減及び／または防止する、及び／または個体の心臓での心機能を改善する、修飾された幹細胞を提供する医薬を製造するための請求項２２記載の使用。
【請求項２５】
請求項１ないし２４のいずれか１項に従って製造した医薬。
【国際調査報告】
2009504683.tif 000009