(57)【要約】本発明において、エキソン内部ＡＯＮを用いてエキソンスキッピングを最適化するための手段及び方法が提供される。我々は、スキッピング効率が、エキソン内の推定上のスプライシング調節配列（ＥＳＥ）を標的とすることにより改善されることを示す。そのような二重標的化は特に、本発明の前には効率的なスキッピングを得ることが困難であったエキソンについて特に有用でありうる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
成熟ｍＲＮＡのエキソン含有前駆体を産生する細胞において、該ｍＲＮＡからエキソンが排除される効率が増加されうるかどうかを決定する方法であって、
該細胞に、該エキソンのエキソン内部部分とハイブリダイズすることができる第１のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を与えること、及び、該エキソンの他のエキソン内部部分とハイブリダイズすることができる第２のＡＯＮを該細胞に与えたときに、該効率が増加されるかどうかを決定することを含む上記方法。
【請求項２】
該第１のＡＯＮのハイブリダイゼーション部位と該第２のＡＯＮのハイブリダイゼーション部位とが、５未満のヌクレオチドの重複を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該エキソンのＲＮＡ上の、該第１のＡＯＮのハイブリダイゼーション部位が、該エキソンＲＮＡ上の予測されたエキソンのスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）部位と重複する、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該エキソンのＲＮＡ上の、該第２のＡＯＮのハイブリダイゼーション部位が、該エキソンＲＮＡ上の予測されたＥＳＥ部位と重複する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
該エキソンが、少なくとも２の独立性ＥＳＥ部位を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
さらに、該ｍＲＮＡの前駆体を産生する細胞において該成熟ｍＲＮＡから該エキソンが排除される効率を、該細胞への該第２のＡＯＮの提供が増加するときに、該第１及び該第２のＡＯＮをＡＯＮの１セット中に含めることをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
さらに、該セットをヒト細胞に与えることを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項６又は請求項７に記載の方法により得られるＡＯＮのセット。
【請求項９】
表１又は表２の少なくとも１のＡＯＮを含む、請求項８に記載のＡＯＮのセット。
【請求項１０】
表２のＡＯＮ。
【請求項１１】
ｍＲＮＡのエキソン含有前駆体を産生する細胞であって、該エキソンのエキソン内部部分とハイブリダイズすることができる第１のＡＯＮ及び該エキソンの他のエキソン内部部分とハイブリダイズすることができる第２のＡＯＮを含む上記細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴヌクレオチド及びその等価物、並びにｍＲＮＡからのエキソンの排除を誘発するためにそれらを使用する方法に関係する。
【背景技術】
【０００２】
アンチセンス技術が近年、相当に開発された。アンチセンス技術の一般的な分野は、いくつかの領域に分けられうる。これらの領域の一つは、エキソンスキッピングの分野である。
【０００３】
この分野において、１つのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のスプライシングを特異的に干渉する為に、より特には成熟ｍＲＮＡ中の特定のエキソンの組み込み又は組み込みの欠如を干渉する為に、小さな分子が細胞に加えられる。
【０００４】
エキソンスキッピングの分野において、２つの一般的なアプローチが区別されうる。１つのアプローチは、スプライシングの酵素的過程、すなわちエキソン配列の物理的な連結を干渉することに焦点を当てる。他のアプローチは、スプライシング過程の「ロジスティクス」、すなわちスプライシング機構によるエキソンの認識を干渉することに依存する。両方のアプローチは、所望の効果を得るために、小さな分子を使用する。該小さな分子は全て、相補的配列と「ハイブリダイズ」することができるための、核酸の特徴を共有する。そのような小さな分子の例は、もちろん、ＲＮＡ及びＤＮＡであり、並びに、ＬＮＡ及びモルフォリノのような修飾されたＲＮＡ及びＤＮＡでもあり、並びに、ＰＮＡなどの核酸模倣体である。これらの分子はさらに、一般的な語「小分子」と呼ばれ、又は、よりしばしば用いられる語「アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）」と呼ばれる。
【０００５】
該小分子は、前駆ｍＲＮＡ上の特定の位置へとハイブリダイズすることによって作用すると考えられる。該ハイブリダイゼーションは、スプライシングの酵素的過程又はエキソンの認識を干渉すると考えられる。
【０００６】
現在は、エキソンスキッピングは、成熟ｍＲＮＡからの１以上のエキソンの特異的排除に焦点を当てる。しかしながら、他のエキソンがｍＲＮＡに含まれるようなスプライシング機構に向け直すことも可能である。例えば、このアプローチは、選択的スプライシングに向けられる遺伝子において使用することである。これらの状況において、特定の選択物がより効率的に作られるようにスプライシング機構を向け直す小分子が設計されうる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明において、エキソンスキッピングプロセスがより効率的になされうることが発見された。エキソンスキッピングについてのより早期の研究の多くは、ジストロフィン遺伝子におけるエキソンスキッピングに対して向けられるＡＯＮを用いてなされた。現在までに、我々は、培養された筋細胞内の、３５のエキソンのスキッピングを誘発する為の、１１４のエキソン内部ＡＯＮの一連を同定した（１４）。我々のデータは、エキソンのスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）部位への、セリン／アルギニンに富む（ＳＲ）タンパク質ファミリーのメンバーが結合することの立体障害によって、有効なエキソン内部ＡＯＮが作用する傾向にあることを示す（１５）。ＳＲタンパク質は、エキソン配列モチーフに結合し、そして、他のスプライシング因子を募って、スプライシングを媒介する（１９）。我々が研究した多くのエキソンについて、単独のＥＳＥのＡＯＮ標的化が、有意な水準のエキソンスキッピングを誘発する為に十分であった（１４）。しかしながら、いくつかのエキソンについては、スキッピング効率は、低い〜ゼロであった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明において、我々は、スキッピング水準が、２以上のエキソン内部ＡＯＮによってエキソンを標的とすることにより改善されることを実証した。この目的の為に、本発明は、成熟ｍＲＮＡのエキソン含有前駆体を産生する細胞内で、該ｍＲＮＡからエキソンが排除される該効率が増加されうるかどうかを決定する方法であって、
該細胞に、該エキソンのエキソン内部部分とハイブリダイズすることができる第１のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を与えること、及び、該エキソンの他のエキソン内部部分とハイブリダイズすることができる第２のＡＯＮを該細胞に与えたときに該効率が増加されるかどうかを決定することを含む上記方法を提供する。該効率増加は好ましくは、いずれかのＡＯＮ単独の効率と、水準を比較することにより決定される。語「増加した効率」は、本明細書において用いられるときに、（ｉ）標的エキソンが排除されるｍＲＮＡの量がいずれかのＡＯＮ単独によるよりも高い状況、又は（ｉｉ）標的エキソンの排除が該細胞において検出されることができる期間が増加される状況、又は（ｉｉｉ）両方の組合せの状況をいう。本発明の方法は、単独のＡＯＮを用いるエキソンスキッピングの方法と比較したときに、付加的な頑強さも提供する。それ故に、本発明はさらに、細胞により産生される前駆ｍＲＮＡにおけるエキソンスキッピングを誘発する方法であって、該前駆ｍＲＮＡ上のエキソンの異なるエキソン内部部分とハイブリダイズすることができる少なくとも２のＡＯＮを該細胞に与えること及び該細胞を培養して該前駆ｍＲＮＡのスプライシングを許すことを含む上記方法を提供する。
【０００９】
配列は通常、該配列が最後には成熟ｍＲＮＡとなる前駆ｍＲＮＡの一部である故に、エキソンといわれる。前駆ｍＲＮＡは、少なくとも１のイントロンを含む。最初のエキソンはキャップ部位を含む一方で、最後のエキソンは典型的にポリＡシグナルを含む。本発明において、エキソンスキッピングは選択的に内部エキソンに向けられる。内部エキソンは、エキソン２〜エキソンｎ−１のいずれか１つであり、ここでｎは該前駆ｍＲＮＡ内のエキソンの総数である。エキソンがスキップされるとき、それはもはや成熟ｍＲＮＡへと含まれない。この特徴は、該配列がもはやエキソンでなくむしろイントロン（の一部）であることを意味するとしてもみなされうる。それ故に、エキソンは、本明細書において、前駆ｍＲＮＡ中に存在する配列であって、該エキソンのスキッピングを誘発するＡＯＮを、該前駆ｍＲＮＡを発現する細胞が与えられないときに、該細胞のスプライシング機構により、成熟ｍＲＮＡへと組み込まれる上記配列として定義される。それ故に、本発明におけるエキソンスキッピングの方法は、エキソン配列をイントロン配列へと変える方法としても言われ、代わりに、本発明の方法は、該エキソン配列が、隠されたときに、細胞のスプライシング機構によりエキソンとしてもはや認識されないようにエキソン配列を隠す方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ−１】エキソンとＡＯＮの配置を示す図である。
【図１Ａ−２】エキソンとＡＯＮの配置を示す図である。
【図１Ｂ】エキソン４７についてのＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【図１Ｃ】エキソン５７についてのＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【図１Ｄ】エキソン４５についてのＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【図１Ｅ】エキソン２についてのＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
細胞は、多くのさまざまな方法において、ＡＯＮを与えられうる。好ましい実施態様において、該ＡＯＮは、遺伝子デリバリー媒体、好ましくはリポソームへと、該ＡＯＮを組み込むことにより該細胞へ与えられる。他の好ましい実施態様において、該ＡＯＮは、該ＡＯＮ又はその前駆体を発現するベクターにより該細胞へ与えられる。好ましい実施態様において、該ベクターは、ウィルス性ベクター、好ましくはアデノ随伴ウィルスベクターを含む。すなわち、本発明はさらに、同じエキソンに特異的な少なくとも２のエキソン内部ＡＯＮを含む遺伝子デリバリー媒体を提供する。
【００１２】
該エキソンをスキップする為に同じエキソンに特異的な少なくとも２のエキソン内部ＡＯＮを用いることは、本発明の方法をより頑強にする。さらに、それは、ただ１つのＡＯＮを用いたときに効率的にスキップしないエキソンの効率的なスキッピングを許す。理論にとらわれることなく、エキソン内部ＡＯＮは、エキソンのスプライスエンハンサー（ＥＳＥ）部位に結合するいわゆるＳＲ（Ｓｅｒ−Ａｒｇ）タンパク質が結合することを邪魔することによりエキソンのスキッピングを誘発することが考えられる。本発明において、とりわけ、エキソンは、いわゆる独立性ＥＳＥ部位を含みうることが発見された。これは、１のＥＳＥ部位の活性が、例えば該エキソン上のＡＯＮの存在により、ブロックされ又は邪魔されたときに、該エキソン上の他の独立性ＥＳＥは機能的なままであることを意味する。このＥＳＥが機能的なままであるので、該エキソンはｍＲＮＡへとなお効率的に組み込まれる。この効果は、該エキソン上の独立性ＥＳＥ部位の全てを標的とすることにより、相殺されうる。この場合、ＥＳＥ部位の本質的に全てが、ＡＯＮにより標的とされ、それにより該ＥＳＥ部位へＳＲタンパク質が結合することをブロックし又は邪魔し、これは結果として、このように標的とされたエキソンの効率的なスキッピングをもたらす。ＥＳＥ部位をブロックすること又は邪魔することは、種々の方法において達成されうる。例えば、該ＡＯＮのハイブリダイゼーションは、ＳＲタンパク質がもはや該ＥＳＥ部位に結合することができないように、エキソンの二次構造を変えうる。好ましい実施態様において、該ＡＯＮは、標的エキソン上の予測されたＥＳＥ部位の少なくとも一部と重複する。このようにして、該部位へＳＲタンパク質が結合することが、そこへの該ＡＯＮのハイブリダイゼーションにより立体的にブロックされる。該ＡＯＮが、少なくとも１の予測されたＥＳＥ部位に重複することが好ましい。予測されたＥＳＥ部位は、クラスター形成する傾向を有するので、該ＡＯＮが、該エキソン上の少なくとも２及び好ましくは少なくとも３つの予測されたＥＳＥ部位と重複することが好ましい。すなわち、好ましい実施態様において、該エキソンのＲＮＡ上の該第１のＡＯＮのハイブリダイゼーション部位は、該エキソンＲＮＡ上の少なくとも１の予測されたＥＳＥ部位と重複する。好ましくは、該エキソンＲＮＡ上の該第２のＡＯＮのハイブリダイゼーション部位は、該エキソンＲＮＡ上の少なくとも１の予測されたＥＳＥ部位と重複する。該第１及び該第２のＡＯＮを、該エキソンＲＮＡ上のただ一つの予測されたＥＳＥ部位に向けることは好ましくない。これが事実であることもあり得るが、該第１のＡＯＮは、該第２のＡＯＮと異なるＥＳＥを標的とすることが好ましい。これは、種々の方法で達成されうる。同じＥＳＥを標的とすることは好ましくは、該エキソンＲＮＡ上の該ＡＯＮのハイブリダイゼーション部位におけるかなりの重複を回避することにより回避される。すなわち、好ましくは、該第１のＡＯＮのハイブリダイゼーション部位と該第２のＡＯＮのハイブリダイゼーション部位とは、５未満の連続するヌクレオチドの重複を示す。より好ましくは、該部位は、３未満及びより好ましくは１未満の重複を有し又は重複を有さない。そのような重複は、ＡＯＮの選択により容易に回避されうる。本発明のＡＯＮは好ましくは、該エキソンＲＮＡに対する線状且つ連続的なハイブリダイゼーション部位を有するので、重複は好ましくは、用いられるＡＯＮにおけるかなりの配列同一性を回避することにより回避される。この点において、該第１の及び該第２のＡＯＮが、５未満の連続するヌクレオチド配列同一性を有することが好ましい。好ましくは該エキソンＲＮＡ上の該第１及び該第２のハイブリダイゼーション部位は、３未満の連続するヌクレオチドの重複、より好ましくは２未満、及び好ましくは１未満のヌクレオチドの重複を有し又は重複を有さない。同様に、該第１の及び該第２のＡＯＮは好ましくは、３未満の連続するヌクレオチド配列同一性、より好ましくは２未満、及び好ましくは１未満のヌクレオチド配列同一性を有する。好ましい実施態様において、該エキソンは、少なくとも２の独立性ＥＳＥ部位を含む。該第１のＡＯＮは好ましくは、少なくとも２の独立性ＥＳＥ部位を標的とし、及び該第２のＡＯＮは、その第２を標的とする。
【００１３】
本明細書において用いられるときの条件「配列同一性」は好ましくは、ヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ又はＴを用いる同定をいい、ここでＴはＵにより置き換えられうる。近年、多くの様々なヌクレオチド類似体が作られた。これらのいくつかは、言及された古典的又は天然のヌクレオチドと質及び量において同じ結合特性を有する。しかしながら、それらの多くは質において結合特性を模倣するが、量においては模倣しない。多くの場合、相補的ヌクレオチドへの類似体の結合強度は、対応する古典的ヌクレオチドのそれよりも低い。２以上の古典的なヌクレオチドの結合特性を模倣する類似体もあり、そして、核酸に効率的に組み込まれるが、対立する鎖の特定の古典的ヌクレオチドとの、有意な選択性又は結合性を示さないヌクレオチド類似体もある。当技術分野の当業者は、これら及び同様の類似体の詳細に詳しく、そして、本発明のＡＯＮにおいて、該ＡＯＮが該エキソンＲＮＡ上のハイブリダイゼーション部位へとハイブリダイズすることができる限りにおいてそれらを使用することができる。
【００１４】
本発明のＡＯＮは好ましくは、１４〜４０のヌクレオチド又はその類似体を含む。好ましくは該ＡＯＮは、１４〜２５のヌクレオチド又はその類似体を含む。本発明のＡＯＮは好ましくは、１０％未満のヌクレオチド類似体を含む。ＡＯＮは好ましくは、４未満、好ましくは３未満、より好ましくは２未満のヌクレオチド類似体を含む。
【００１５】
本発明のＡＯＮは好ましくは、修飾オリゴヌクレオチドである。特に好ましい実施態様において、該ＡＯＮは、１以上の２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチドを含み、これはＲＮａｓｅ  Ｈにより誘発される、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの分解に対して、該ＡＯＮを耐性にする。加えて、ホスホロチオエート骨格が、ヌクレアーゼに対するＡＯＮの安定性を増加する為に及び細胞の取り込み増強する為に、用いられうる。本発明のＡＯＮは、好ましい実施態様において、完全長ホスホロチオエート骨格を有し、且つ、全塩基（ヌクレオチド）は、２’−Ｏ−メチル修飾を有する。代わりに、モルホリノホスホロジアミデートＤＮＡ（モルホリノ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、及びエチレン架橋核酸（ＥＮＡ）オリゴが、スプライシングを調節するために用いられている。それ故に、本発明のＡＯＮは、これらの修飾も有することができる。これらの修飾は、該オリゴにＲＮａｓｅ  Ｈ耐性及びヌクレアーゼ耐性を与え、そして、標的ＲＮＡについての親和性を増加する。ＥＮＡ及びＬＮＡ修飾に関して、この増加は、減少された配列特異性を伴う。
【００１６】
エキソンのエキソン内部部分は、該エキソンの５’−又は３’−末端との重複を示さない部分である。エキソンの５’−及び３’−末端は、該エキソンの連結領域と関連のある配列情報を含む。該エキソンのエキソン内部部分は、該エキソン境界への内側の少なくとも１、及び少なくとも２、及びより好ましくは少なくとも５のヌクレオチドである。エキソン内部ＡＯＮは、本明細書上記で定義されたとおりのエキソン内部部分に加えて、該エキソンの境界へ延びる又は該エキソンの境界を越えて延びるヌクレオチドも有しうる。しかしながら、これは好ましくは当てはまらない。
【００１７】
本発明の方法は好ましくは、該第２のＡＯＮを該細胞に提供することが、該成熟ｍＲＮＡの前駆体を産生する細胞内で該ｍＲＮＡから該エキソンが排除される該効率を増加するときに、ＡＯＮの１セット中に該第１及び該第２のＡＯＮを含めることを、さらに含む。該セットは、その後好ましくは、該前駆ｍＲＮＡを発現する標的細胞においてエキソンスキッピングを得るために用いられる。本発明は、少なくとも２のＡＯＮを含む１セットも提供し、ここで少なくとも該ＡＯＮの第１は、エキソンのエキソン内部部分とハイブリダイズすることができ、且つ、該ＡＯＮの第２は、該エキソンの他のエキソン内部部分へとハイブリダイズすることができる。本発明の好ましい実施態様において、該セットは、本発明の方法により得られる。特に好ましい実施態様において、該ＡＯＮの該第１及び該第２は、該エキソンＲＮＡ上のＥＳＥ部位に向けられる。より好ましくは、該ＡＯＮの該第１及び該第２は、該エキソンＲＮＡ上の独立性ＥＳＥ部位に向けられる。
【００１８】
本発明の１セットは、多くの方法において用いられることができる。１つの実施態様において、該セットは、細胞内の異常タンパク質の産生を少なくとも部分的に減少する為に用いられる。そのようなタンパク質は、例えば、がんタンパク質又はウィルスタンパク質でありうる。多くの腫瘍において、がんタンパク質の存在だけでなく、その相対的発現水準も、腫瘍細胞の表現型に関連している。同様に、ウィルスタンパク質の存在だけでなく、細胞内のウィルスタンパク質の量も、特定のウィルスの病原性を決定する。さらに、ウィルスの効率的な複製及び伝播について、細胞内の或るウィルスタンパク質の、ライフサイクルにおける発現の時期及び量におけるバランスが、ウィルスが効率的に又は非効率的に産生されるかどうかを決定する。本発明の１セットを用いて、例えば腫瘍細胞がより腫瘍原性（転移性）でなくなるように及び／又はウィルスに感染した細胞がより少ないウィルスを産生するように、細胞内の異常タンパク質の量を低めることが可能である。
【００１９】
好ましい実施態様において、本発明の１セットは、該異常タンパク質を、機能的タンパク質へと変える為に用いられる。１つの実施態様において、該機能的タンパク質は、通常は、細胞内に存在するが、処理されるべき細胞内において不在であるタンパク質の機能を実行することができる。非常にしばしば、機能の部分的な回復が、このように処理された細胞の有意に改善された性能を結果する。該より良い性能に起因して、そのような細胞は、修正されていない細胞を超える選択的な利点も有することができ、すなわち該処理の有効性の助けとなる。本発明のこの局面は特に、欠陥遺伝子の発現の回復に適する。これは、標的エキソンの特異的なスキッピングを引き起こすことにより、すなわち有害な変異（典型的にはストップ変異又はフレームシフト点変異、翻訳終結をもたらす単独エキソン又は複数エキソンの欠失又は挿入）を迂回すること又は修正することにより達成される。
【００２０】
遺伝子導入戦略と比較して、エキソンスキッピング遺伝子治療は、はるかに小さい治療的試薬（典型的には、約１４〜４０ヌクレオチドを含む又は模倣するＡＯＮだが、これらに限定されない）の投与を必要とする。好ましい実施態様において、１４〜２５のヌクレオチドのＡＯＮが用いられる。なぜなら、これらの分子は製造することがより容易であり、且つ、より効率的に細胞に入るからである。本発明のセットは、有効且つ安全なエキソンスキッピング戦略及び／又は投与系の続く設計において、より多くの柔軟性を許す。ＡＯＮの遺伝子機能回復セットの重要な追加の利点は、それが、内因性遺伝子の活性（の少なくとも一部）を回復することであり、これはその遺伝子制御回路のほとんど又は全てをなお有し、すなわち適切な発現水準及び組織特異的アイソフォームの合成を確保する。
【００２１】
本発明のこの局面は原理的には、任意の遺伝子疾患又は遺伝子疾病素因に適用されることができ、ここで標的とされた特定のエキソンのスキッピングが、翻訳読み枠が最初の変異により破壊されているときに翻訳読み枠を回復する。この適用は特に、内部的にわずかに短い又は変化されたタンパク質の翻訳が完全に又は部分的に機能的であるときに有用である。この適用が治療的価値を有しうるための好ましい実施態様は：がん抑制遺伝子における第２のヒット変異（second  hit  mutation）への素因、例えば乳がん、大腸がん、結節硬化、神経線維腫症などに関係する癌抑制遺伝子における第２のヒット変異への素因であり、ここで活性の（部分的な）回復が第２のヒット変異による零染色体性の出現を妨げ、そしてすなわち腫瘍発生から保護するだろう。他の好ましい実施態様は、疾患を引き起こす直接的な効果を有する欠陥遺伝子産物の（部分的な）回復に関し、例えば血友病Ａ（凝固因子ＶＩＩＩ欠乏）、（サイログロブリン合成欠損に起因する）先天性甲状腺機能低下病のいくつかの形態、及びデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）（Ｘ連鎖性ジストロフィン遺伝子におけるフレームシフトする欠失、重複及びストップ変異が重度の進行性筋肉分解を引き起こす）である。ＤＭＤは典型的には、後期青年期又は早期成人期において致死であるが、他方で、同じ遺伝子におけるフレームシフトしない欠失又は重複は、はるかにより穏やかなベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）を引き起こし、３５〜４０年から正常までの平均余命に対応する。ＤＭＤに適用されるときの実施態様において、本発明は、読み枠を回復する為に及び内部的にわずかに短いがなお機能的なタンパク質を産生する為に必要とされる数の隣接エキソンによって、存在する欠失をエキソンスキッピングが延長できるようにする（又は存在する重複のｍＲＮＡ産物をエキソンスキッピングが変えることができるようにする）。この誘発された欠失と同等のものを有するＢＭＤ患者におけるはるかにより穏やかな臨床症状に基づき、ＤＭＤ患者における疾患は、ＡＯＮ治療後にはるかに穏やかな経過を有するだろう。本発明のセットの多くの臨床的用途を考慮すると、本発明の方法は好ましくはさらに、ヒト細胞に該セットを与えることを含む。一つの実施態様において、本発明は、本発明の方法により得られるＡＯＮの１セットを提供する。好ましい実施態様において、該セットは、表１または表２の少なくとも１のＡＯＮを含む。好ましい実施態様において、本発明は少なくとも表１及び／又は表２のＡＯＮを含む１セットを提供する。
【００２２】
2009537129.tif 000002
2009537129.tif 000003
2009537129.tif 000004
2009537129.tif 000005
【００２３】
１の局面において、本発明はさらに、腫瘍、ウィルス感染及び／又は遺伝性疾患及び／又は遺伝性素因を患う個体の処置の為の方法であって、該個体に本発明のＡＯＮの１セットを投与することを含む上記方法を提供する。本発明はさらに、本発明に従うＡＯＮの１セットを含む医薬組成物を提供する。好ましくは、該セットは、腫瘍、ウィルス感染及び／又は遺伝性疾患及び／又は遺伝性素因を患う個体の処置の為に用いられる。好ましくは、該セットは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の処置の為に用いられる。
【００２４】
本発明は、ｍＲＮＡのエキソン含有前駆体を産生する細胞も提供し、ここで該細胞は、該エキソンのエキソン内部部分にハイブリダイズすることができる第１のＡＯＮ及び該エキソンの他のエキソン内部部分にハイブリダイズすることができる第２のＡＯＮを含む。
【実施例１】
【００２５】
結果と考察
【００２６】
１つのエキソン内の二重標的化
我々は、１つのエキソン内の複数のＥＳＥを標的とすることにより、単独のＡＯＮを用いて高い水準でスキップされることができないエキソンについて、スキッピング効率が増加されうると仮定した。（ＥＳＥファインダー（ＥＳＥ  ｆｉｎｄｅｒ）により予測されたとおりの）推定上のＥＳＥへのＡＯＮの相対的な位置は、表１Ａにおいて、これらのエキソンの夫々について描かれる。
【００２７】
我々は最初に、２のスキップできないエキソン（エキソン４７及び５７）について二重標的化を試験した。これらのＡＯＮの種々の組み合わせにより、ヒトの対照筋管培養物が処理されたときに、エキソン４７及び５７のスキッピングの有意な水準が、ＲＴ−ＰＣＲ分析により測定されたとおりに達成されることができた（図１ＢＣ、補足表１）。興味深いことに、エキソン４７については、重複がないＡＯＮの組み合わせだけが、エキソンスキッピングを誘発した一方で、重複するそれらは、無効であった（補足表１）。同様に、エキソン５７について、もう少しで重複するＡＯＮの組み合わせ（ｈ５７ＡＯＮ１及び２）は、エキソンスキッピングを誘発しなかった。これは、２つの相互に排他的なＥＳＥ部位がこれらのエキソン内に存在するという我々の仮説に合う。
【００２８】
エキソン２及びエキソン４５について、単独のＡＯＮが再現性よく、低い水準のエキソンスキッピングを誘発した（夫々、ｈ２ＡＯＮ１及びｈ４５ＡＯＮ５）。エキソン４５スキッピングの相当に高い水準が、有効なｈ４５ＡＯＮ５と無効なＡＯＮとを組み合わせることにより、並びに個々には無効な２のＡＯＮ（例えばｈ４５ＡＯＮ３及びｈ４５ＡＯＮ９）を組み合わせることにより、誘発されることができた（図１Ｄ）。すなわち、このエキソンについて、２の有効なＥＳＥが、同様に存在しそうである。対照的に、エキソン２について、ＡＯＮの組み合わせは、スキッピング効率を増加しなかった。実際には、有効なｈ２ＡＯＮ１と無効なｈ２ＡＯＮ２との組み合わせが、エキソン２スキッピングを無効にした（図１Ｅ）。この干渉は、ｈ２ＡＯＮ１と（ｈ２ＡＯＮ２より少なく重複する）ｈ２ＡＯＮ３との組み合わせに関して観察されなかった。エキソン４３及び４８について、有効なＡＯＮは、スキッピングの中程度の水準だけを誘発した。これらのエキソンについて、スキッピング水準は、ＡＯＮの組み合わせを用いることにより増加されることはできなかった（補足表１）。これらのエキソンにおいて、３又はさらにより多いＥＳＥが存在しうる。それ故に、我々は、３の異なるＡＯＮの組み合わせによりエキソン４８を標的とし、これはなおスキッピング水準を改善しなかった。すなわち、このエキソンのスプライシングは主として、ＥＳＥ部位に依存しない。これは、該予測されたスプライス部位が、完全である（３’スプライス部位）又はほぼ完全である（５’スプライス部位）こと及び少数のＥＳＥだけがエキソン４８について予測されることにより支持される。
【００２９】
最後に、我々はエキソン４６特異的ＡＯＮの組み合わせを用いた。このいくつかは、個々にすでに非常に効率的であった。我々は、（ほぼ）１００％へスキッピング水準を増加することを目標とした。しかしながら、用いられた組み合わせのいずれもが、単独の標的化と比較して、スキッピング水準をさらに改善しなかった（補足表１）。これは、１のＥＳＥ部位のブロッキングが、このエキソンの正確なスプライシングを撹乱するのに十分であることを示唆する。このエキソンのＥＳＥ部位が互いに依存し、その結果、１をブロッキングすることにより、より多く又は全てのＥＳＥが、不活性化されることも可能である。代わりに、他のＥＳＥ部位がもはやＳＲタンパク質結合の為に利用できないように、前駆ｍＲＮＡの二次構造が、ＡＯＮが結合するときに変化されうる。
【００３０】
興味深いことに、いったん、より多くが（部分的に）重複すると、組み合わせは、単独のＡＯＮが有効であるか又は無効であるかに関係なく、個々のエキソンスキッピング能力を負に干渉すると見えた。２の無効な、重複するＡＯＮの組み合わせもまた無効であることが予測された。なぜなら、それらは、両方ともが機能的でないＥＳＥ部位を標的とするか、又は、両方ともが２（又はそれ以上）の相互に排他的なＥＳＥ部位の同じものを標的とするからである。重複する、有効なＡＯＮの組み合わせについて、この発見は予測されなかった。しかしながら、これらのＡＯＮが、互いに競合し、そして、互いを、動的過程において標的転写物から引き離させ、それにより、標的部位をＳＲタンパク質にとって再度利用できるようにすることも可能である。結合すると、ＳＲタンパク質は、他のスプライシング因子を該標的部位へと募るであろうし、すなわち、エキソンスキッピングよりもむしろエキソン包含を増強する。
【００３１】
材料と方法
【００３２】
ＡＯＮ及びプライマー
二重標的化実験の為に用いられた全てのＡＯＮは、前に記載された（補足表１を参照されたい）（１１、１４、１５）。全てのＡＯＮは、２−Ｏ−メチルＲＮＡ，ホスホロチオエート骨格及び５’蛍光標識を含み、そして、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ（ベルギー）により製造された。（ＲＴ−）ＰＣＲプライマーは、スキップされるエキソンに隣接するエキソン内において選ばれた（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ、ベルギー；配列は要求に応じて利用できる）。
【００３３】
組織培養、形質移入、及びＲＴ−ＰＣＲ分析
対照及びＤＭＤ患者由来の筋管培養物は前に記載されたとおりに得られた（９、２２）。エキソンスキッピング実験の為に、形質移入が、２００ｎＭの夫々のＡＯＮにより少なくとも２回実施された。全ての実験において、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｅｘｇｅｎ  ５００、ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）が、製造者の指示に従い、１μｇのＡＯＮ当たり２〜３．５μｌのＰＥＩで、用いられた。夫々の標的エキソンについて利用できる有効なＡＯＮの数に基づき、ＡＯＮの種々の組み合わせが試験された（補足表１）。夫々のＡＯＮについて、ＡＯＮ−ＰＥＩ複合物の個々の溶液が調製された。形質移入効率は、核蛍光シグナルの存在に基づき、概して８０％超であった。ＲＮＡは、形質移入の２４〜４８時間後に単離され、そして、ＲＴ−ＰＣＲ分析が、前に記載されたとおりに実施された（１４）。夫々のＡＯＮの成功した形質移入は、標的エキソンに隣接するエキソン内のプライマーによるＲＴ−ＰＣＲ分析によって確認された。ＰＣＲ断片がアガロースゲルから単離され、そして、配列分析が、前に記載されたとおりに実施された（１０）。
【００３４】
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１  ＋＋  正常対照筋管培養物における転写物の２５％超で観察されたエキソンスキッピング；＋  転写物の２５％までで観察されたエキソンスキッピング；−  エキソンスキッピングは検出されなかった
２  夫々のＡＯＮについて、最高の値が、ＳＲタンパク質の夫々について与えられる
３  ヌクレオチド内のＡＯＮと５’及び３’スプライス部位（ＳＳ）との間のヌクレオチド数。３’及び５’スプライス部位への距離は、標的配列内の最初（３’スプライス部位）又は最後（５’スプライス部位）のヌクレオチドから測定される。
４  ＡＯＮの、全長に対する、予測された二次ＲＮＡ構造内の、ＡＯＮにより標的とされる利用可能なヌクレオチドの割合
５  このＡＯＮは、欠損Ｋｏｂｅ（Ｍａｔｕｓｏら、１９９０；Ｍａｔｕｓｏら、１９９１）において欠損したＥＳＥの一部を標的とする
６  前に発行された（ｖａｎ  Ｄｅｕｔｅｋｏｍら、２００１）
７  前に発行された（Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓら、２００２）
８  前に発行された（ｖａｎ  Ｄｅｕｔｅｋｏｍら、２００１；Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓら、２００３；Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓら、２００４）
【００３５】
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【００３６】
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１  “＋”  この個々のＡＯＮについて観察されたエキソンスキッピング、“−”  この個々のＡＯＮについて（再現性よく）観察されなかったエキソンスキッピング
２  単独の標的化と比較した二重標的化の結果；“＋”  単独のＡＯＮによる標的化のいずれよりも効率的である二重標的化、“＝”  最も効率的な単独のＡＯＮに匹敵する二重標的化の効率、“−”  効率的でない、又は、最も効率的な単独のＡＯＮよりも効率的でない二重標的化。
効率的なＡＯＮは明るい灰色で影を付けられる、最も効率的な単独のＡＯＮよりも顕著によく働く組み合わせは、より暗い灰色で影を付けられる、重複する組み合わせは下線付加された。
【００３７】
図面の簡単な説明
図１、二重標的化。（Ａ）。エキソン２、４３、４５〜４８及び５７内のＡＯＮ及び推定上のＥＳＥ部位の相対的な位置。エキソン及びＡＯＮは、夫々のエキソンについての線として、一定の縮尺で描かれる。ＥＳＥファインダーにより予測されたとおりの、ＳＦ２／ＡＳＦ、ＳＣ３５、ＳＲｐ４０及びＳＲｐ５５の推定上の結合部位は、それらのぞれぞれの位置で、四角として描かれる。（Ｂ〜Ｅ）。二重標的化実験後のＲＴ−ＰＣＲ分析のいくつかの例。（ＢＣ）。エキソン４７及び５７について、再現性よくエキソンスキッピングを誘発する利用可能なＡＯＮはなかった。しかしながら、これらのＡＯＮの組み合わせを用いて、エキソン４７及び５７スキッピングは、再現性よく、有意な水準で誘発された。エキソン５７について、ｈ５７ＡＯＮ３を含む組み合わせが最も効率的であった一方で、エキソン４７について、重複しない全ての組み合わせが、エキソン４７スキッピングの匹敵する水準を誘発した。いくつかの場合で、（野生型の産物よりも若干短かった）追加のバンドが、エキソン４７ＰＣＲにおいて観察されることができた。このバンドは、再現性が無く、処理された試料及び処理されていない試料の両方で観察され、そして、ＤＭＤエキソン７２〜７４を含むａ−特異的ＰＣＲ産物であると分かった。（Ｄ）。エキソン４５について、利用できるＡＯＮのただ１つが、再現性よく、スキッピングを誘発したが、低水準であった（ｈ４５ＡＯＮ５）。とても低い水準のエキソンスキッピングが、ｈ４５ＡＯＮ１及びｈ４５ＡＯＮ４について時々観察されたが、これは再現性が無かった。エキソン４５スキッピングは、ＡＯＮの組合せを用いて、はるかにより高い水準で達成されることができた。エキソン４５スキッピングの最高の水準が、ｈ４５ＡＯＮ５と、ｈ４５ＡＯＮ１又はｈ４５ＡＯＮ３との組み合わせ、及び、ｈ４５ＡＯＮ１とｈ４５ＡＯＮ９との組み合わせについて観察された。対照的に、重複するｈ４５ＡＯＮ２とｈ４５ＡＯＮ９との混合物は無効であった。（Ｅ）。エキソン２について、重複するＡＯＮだけが利用可能であった。有効なｈ２ＡＯＮ１が、無効で、重複するｈ２ＡＯＮ２と組み合わされたときに、スキッピングは誘発されることができなかった。この効果は、ｈ２ＡＯＮ１が、無効で、より重ならないｈ２ＡＯＮ３と組み合わされたときには、見られなかった。言及されたＡＯＮの配列は、文献Aartsma-Rus A, et al. (2005). Functional analysis of 114 exon-internal AONs for targeted DMD exon skipping: indication for steric hindrance of SR protein binding sites. Oligonucleotides 15: 284-297において与えられる。
ＮＴは、形質移入されていない、−ＲＴは、負の対照、Ｍは、１００ｂｐサイズマーカー。
【００３８】
引用文献
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【図１Ａ−１】
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【図１Ａ−２】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【国際調査報告】
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