(57)【要約】  本発明は、一般的には多糖シンターゼに関する。より詳細には、本発明は（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼに関する。本発明は、とりわけ、細胞により生成される（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルを制御する方法ならびに（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸およびアミノ酸配列を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞により生成される（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルを制御する方法であって、該細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を変化させるステップを含む、上記方法。
【請求項２】
細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を変化させる方法であって、該細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸の発現を変化させるステップを含む、上記方法。
【請求項３】
細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を変化させる方法であって、該細胞中のＣｓｌＦ遺伝子またはその機能的ホモログの発現を変化させるステップを含む、上記方法。
【請求項４】
（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの生成方法であって、単離された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸で細胞を形質転換するステップ、および該細胞に該単離された核酸を発現させるステップを含む、上記方法。
【請求項５】
前記細胞が植物細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が単子葉植物細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が禾穀類植物細胞である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
請求項４に記載の方法により生成された、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン。
【請求項９】
以下のもの：
（ｉ）同じ分類群の野生型細胞と比較して変化した（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンレベル；
（ｉｉ）同じ分類群の野生型細胞と比較して変化した（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性；
（ｉｉｉ）同じ分類群の野生型細胞と比較して変化した（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸の発現
のうち、いずれか１以上を示す細胞。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法により作製された、請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
植物細胞である、請求項９または１０に記載の細胞。
【請求項１２】
単子葉植物細胞である、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
禾穀類植物細胞である、請求項１０または１１に記載の細胞。
【請求項１４】
請求項９〜１３のいずれか１項に記載の１以上の細胞を含んでなる、多細胞構造物。
【請求項１５】
植物全体、植物組織、植物器官、植物断片、植物繁殖材料、または培養植物組織からなるリストから選択される、請求項１４に記載の多細胞構造物。
【請求項１６】
禾穀類植物、またはその組織、器官もしくは断片である、請求項１４または１５に記載の多細胞構造物。
【請求項１７】
穀粒を含んでなる、請求項１６に記載の多細胞構造物。
【請求項１８】
変化した（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンレベルを示す穀粒であって、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの変化したレベルおよび／もしくは活性、および／または（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸分子の変化した発現を示す１以上の細胞を含んでなる、上記穀粒。
【請求項１９】
以下のもの：
（ｉ）請求項１７または１８に記載の穀粒を製粉することにより製造される穀粉；および
（ｉｉ）任意により、１以上の他の穀粒を製粉することにより製造される穀粉
を含んでなる穀粉。
【請求項２０】
（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする、単離された核酸分子。
【請求項２１】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９および配列番号１１のいずれかにより表されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項２２】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９および配列番号１１のいずれかにより表されるヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％同一なヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項２３】
低ストリンジェンシー条件下で請求項２１に記載の核酸分子にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項２４】
中程度のストリンジェンシー条件下で請求項２１に記載の核酸分子にハイブリダイズする、請求項２３に記載の単離された核酸分子。
【請求項２５】
高ストリンジェンシー条件下で請求項２１に記載の核酸分子にハイブリダイズする、請求項２３または２４に記載の単離された核酸分子。
【請求項２６】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２のいずれかにより表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項２７】
請求項２０〜２６のいずれか１項に記載の単離された核酸分子のヌクレオチド配列の相補体であるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項２８】
請求項２０〜２６のいずれか１項に記載の単離された核酸分子のヌクレオチド配列の逆相補体であるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項２９】
請求項２０〜２８のいずれか１項に記載の単離された核酸分子のうちのいずれか１つの断片。
【請求項３０】
請求項２０〜２９のいずれか１項に記載の単離された核酸分子を含む遺伝子構築物またはベクター。
【請求項３１】
請求項２０〜２９のいずれか１項に記載の単離された核酸分子または請求項３０に記載の遺伝子構築物を含んでなる細胞。
【請求項３２】
植物細胞である、請求項３１に記載の細胞。
【請求項３３】
単子葉植物細胞である、請求項３２に記載の細胞。
【請求項３４】
禾穀類植物細胞である、請求項３２または３３に記載の細胞。
【請求項３５】
請求項３１〜３４のいずれか１項に記載の細胞のうち１以上を含んでなる、多細胞構造物。
【請求項３６】
植物全体、植物組織、植物器官、植物断片、植物繁殖材料、または培養植物組織からなるリストから選択される、請求項３５に記載の多細胞構造物。
【請求項３７】
禾穀類植物、またはその組織、器官もしくは断片である、請求項３５または３６に記載の多細胞構造物。
【請求項３８】
穀粒を含んでなる、請求項３７に記載の多細胞構造物。
【請求項３９】
（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼタンパク質をコードするアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項４０】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２のいずれかにより表されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項４１】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２のいずれかにより表されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性を示すアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項４２】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９および配列番号１１のいずれかにより表されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項４３】
請求項３９〜４２のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチドの断片。
【請求項４４】
請求項４０〜４３のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチドまたはその断片であって、そのアミノ酸配列が（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする、上記ポリペプチドまたはその断片。
【請求項４５】
１以上の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼエピトープを含む、単離されたポリペプチド。
【請求項４６】
請求項３９〜４５のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチドまたはその断片に対して生起された、抗体またはそのエプトープ結合性フラグメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には多糖シンターゼに関する。より詳細には、本発明は（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
禾穀類の各種組織は、穀粒発育中、休眠中および発芽後において、多様な機能を有する。
【０００３】
例えば、果皮膜および種皮は、発育中および休眠中に種を保護することに係わる。しかし、穀粒が成熟し、穀粒のこれらの外側組織が死んだ後、組織内残留物は、ほぼ全体が細胞壁残留物から構成される。種皮とアリューロン表面との間にある核組織は、穀粒成長のために栄養素の伝達に関与するが、成熟と同時にこの組織もまた、細胞壁断片を残すのみで崩壊する。成熟した穀粒のデンプン質の胚乳の薄い有壁細胞は死ぬが、デンプンと貯蔵タンパク質が充満する。対照的に、厚い有壁かつ有核のアリューロン細胞は、穀粒の成熟時点でも生きており、タンパク体および脂肪滴が充満している。デンプン質胚乳の接触面には胚盤があり、胚乳を発育させるための栄養素を運ぶ役割をすると共に、発芽中に消化産物を運び、発育する胚芽に対して沈着する。
【０００４】
穀粒中の各組織の異なる構造と機能は、少なくとも１つには、これらの細胞種それぞれの細胞壁組成によって決まる。
【０００５】
非セルロース多糖類は、禾穀類組織の細胞壁における主要な成分であり、例えば（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン、ヘテロキシラン（主にアラビノキシラン）、グルコマンナン、キシログルカン、ペクチン多糖類およびカロースなどを含んでなる。これら非セルロース多糖類は、通常、穀粒全重量の１０％未満を構成するにすぎないが、穀粒品質の主要な決定因子である。
【０００６】
個々の非セルロース多糖類とその他の壁構成成分との正確な物理的関係は述べられてこなかったが、壁中で、セルロースの微小線維は非セルロース多糖類およびタンパク質のマトリックス相に組み込まれいる。壁の完全性は、主にマトリックス相と微小線維構成素との間の広範な非共有結合相互作用、特に水素結合によって維持される。ヘテロキシランの間にあるいくつかの穀粒組織の壁中に、共有結合性会合、リグニン、およびタンパク質が存在する。各成分間の共有結合性会合の範囲は、壁の種類および遺伝子型によっても異なる。
【０００７】
非セルロース多糖類、特にヘテロキシランおよび（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、アリューロンおよびデンプン質胚乳の壁、また恐らくは、胚盤においても、比較的高い割合を占める。これらの組織において、セルロースの割合はそれに反比例して低くなる。該してセルロース含有量が低い壁は、リグニンを全く含まないという事実の他、穀粒の中央部の壁の構造的な硬さに関する限定的な要件、および穀粒の発芽後に壁成分を急速に脱重合するための要件に関係すると考えられている。
【０００８】
対照的に、果皮膜の細胞壁は、胚芽および胚乳のための保護膜を提供し、発芽中に発動しないものであるが、同細胞壁中のセルロースおよびリグニンの含有量は非常に高く、非セルロース多糖類の濃度は、それに応じて低い。
【０００９】
（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、混合結合もしくは穀類β−グルカンとも呼ばれる、非セルロース多糖類であるが、穀類および牧草が属する単子葉植物族イネ科の植物、および同類のイネ目に自然発生する。
【００１０】
これらの非セルロース多糖類は、ほとんどの禾穀類のデンプン質胚乳およびアリューロン細胞壁において重要な構成物質であり、該壁重量のうち、最高で７０％から９０％までを占めることがよくある。
【００１１】
オオムギ、オートムギおよびライムギは（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの宝庫であるが、これらに比べ、コムギ、イネおよびトウモロコシは、この多糖類濃度が低い。（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンはまた、穀類および牧草の栄養組織にある細胞壁の比較的微量な構成要素である。栄養組織において比較的微量な構成要素として現れるが、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、例えば、動物による栄養組織の消化率の観点から、またバイオエタノール生産用に作物残滓を使用する観点からもなお重要である。
【００１２】
（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、酒造および飼料製造業者を含む大規模食品加工活動において重要である。さらには、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンなど、穀類の非デンプン質多糖類は、ヒトの栄養素として潜在的に有効な効果があることから、近年新たな関心を引き寄せている。
【００１３】
しかしながら、このような関心の高さにもかかわらず、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン生合成をはじめとして、禾穀類中の非セルロース多糖類生合成を制御する遺伝子および酵素の知識には大きな隔たりがある。
【００１４】
穀粒中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン濃度は、遺伝子型および環境の両者により影響されると考えられている。例えば、禾穀類中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの濃度は、遺伝子型、穂の穀粒の位置、植え付け場所、成長中の植え付け場所、気候条件および土壌窒素などの環境条件に左右される。
【００１５】
しかしながら、穀粒中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン含有量に寄与する遺伝子は、まだ特定されていない。
【００１６】
典型的な生化学的アプローチを通じた（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする遺伝子の特定は、この酵素を均一にまで精製することができないため、著しく阻まれてきた。（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼは、膜結合型であるので、活性な形態で可溶化するのが困難である。さらに（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼは、細胞の破壊後に急速に活性を失うため、細胞内に極めて少量で存在している可能性が高い。数多くの試みにもかかわらず、均一なまでの（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの精製は達成されておらず、したがって酵素自体から得られたアミノ酸配列についての報告は一切ない。精製された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ酵素から部分的なアミノ酸配列でさえも得られないので、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする遺伝子を特定し、単離することも阻まれてきた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
しかし、細胞により生成される（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルの変化を促し、これによって穀粒または栄養組織の品質を変えられるので、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする遺伝子の特定は望ましいと言える。そこで、細胞内の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルの変化を可能にし、それに伴う穀類または栄養組織品質の変化を可能にするため、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする遺伝子の特定は、是非とも必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本明細書における従来技術の参照は、従来技術がいかなる国においても共通する一般知識の一部を形成することの同意と、またはいかなる形態の示唆と解釈されるべきではない。
【００１９】
本発明は、１つには、本明細書において「（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ」と称される、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンに関する生合成酵素をコードする遺伝子の特定に基づく。
【００２０】
本発明により、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼはＣｓｌＦ遺伝子ファミリーのメンバーによってコードされることが明らかにされた。
【００２１】
（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードするヌクレオチド配列、および対応するアミノ酸配列の特定の結果として、本発明はとりわけ、細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を制御し、それによって細胞により生成される（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルを制御する方法および組成物を提供する。
【００２２】
したがって、第１の態様において、本発明は、細胞により生成される（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルを制御する方法であって、該細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を変化させるステップを含む方法を提供する。
【００２３】
特に好ましい実施形態の１つとして、細胞は植物細胞、さらに好ましくは単子葉植物細胞および最も好ましくは禾穀類植物細胞である。
【００２４】
第２の態様において、本発明は細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を変化させる方法であって、該細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸の発現を変化させるステップを含む方法を提供する。
【００２５】
第３の態様において、本発明は細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を変化させる方法であって、該細胞中のＣｓｌＦ遺伝子またはその機能的ホモログの発現を変化させるステップを含む方法を提供する。
【００２６】
第４の態様において、本発明は（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの生成方法であって、該細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸を発現させるステップを含む方法を提供する。
【００２７】
第５の態様において、本発明は、本発明の第４の態様の方法により生成された、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンも提供する。
【００２８】
第６の態様において、本発明は以下のもの：
（ｉ）同じ分類群の野生型細胞と比較して変化した（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンレベル；
（ｉｉ）同じ分類群の野生型細胞と比較して変化した（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性；
（ｉｉｉ）同じ分類群の野生型細胞と比較して変化した（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸の発現
のうち、いずれか１以上を示す細胞を提供する。
【００２９】
さらに、第７の態様において、本発明は、本発明の第６の態様による１以上の細胞を含んでなる、多細胞構造物を提供する。
【００３０】
上記の通り、１つの好ましい実施形態において、細胞は植物細胞であり、したがって本発明は、本発明の第６の態様による１以上の植物細胞を含んでなる植物全体、植物組織、植物器官、植物断片、植物繁殖材料または培養植物組織を含む。さらに好ましい実施形態において、本発明は、本発明の第６の態様による１以上の細胞を含んでなる穀類植物を提供する。特に好ましい実施形態において、本発明は、本発明の第６の態様による１以上の植物細胞を含んでなる穀粒を提供する。
【００３１】
したがって、第８の態様において、本発明は変化した（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンレベルを示す穀粒であって、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの変化したレベルおよび／もしくは活性、および／または（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸分子の変化した発現を示す１以上の細胞を含んでなる、上記穀粒を提供する。
【００３２】
第９の態様において、本発明は以下のもの：
（ｉ）本発明の第８の態様に記載の穀粒を製粉することにより製造される穀粉；および
（ｉｉ）任意により、１以上の他の穀粒を製粉することにより製造されたる穀粉
を含んでなる穀粉も提供する。
【００３３】
上記の通り、本発明は、１つには、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードするヌクレオチドおよびアミノ酸配列の特定および単離に基づく。
【００３４】
したがって、第１０の態様において、本発明は（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする、単離された核酸分子を提供する。
【００３５】
第１１の態様において、本発明は以下のもの：
（ｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９および配列番号１１のいずれかにより表されるヌクレオチド配列；
（ｉｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９および配列番号１１のいずれかにより表されるヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％同一なヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）低ストリンジェンシー、より好ましくは中程度のストリンジェンシーおよび最も好ましくは高ストリンジェンシー条件下で、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９および配列番号１１のいずれかにより表されるヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子にハイブリダイズするヌクレオチド配列；
（ｉｖ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２のいずれかにより表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれか１つに記載のものの相補体であるヌクレオチド配列；
（ｖｉ）（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれか１つに記載のものの逆相補体であるヌクレオチド配列；
（ｖｉｉ）（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれか１つの断片
のうち、いずれか１以上を含む、単離された核酸分子も提供する。
【００３６】
第１２の態様において、本発明は、本発明の第１１の態様に記載の単離された核酸分子を含む遺伝子構築物またはベクターを提供する。
【００３７】
第１３の態様において、本発明は、本発明の第１０または第１１の態様に記載の単離された核酸分子または本発明の第１２の態様に記載の遺伝子構築物を含んでなる細胞にまで及ぶ。
【００３８】
第１４の態様において、本発明は、本発明の第１３の態様に記載の細胞のうち１以上を含んでなる、多細胞構造物を提供する。
【００３９】
上記の通り、本発明は同様に、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのアミノ酸配列を提供する。
【００４０】
したがって、第１５の態様において、本発明は、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼタンパク質をコードするアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドを提供する。
【００４１】
第１６の態様において、本発明は以下のもの：
（ｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２のいずれかにより表されるアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２のいずれかにより表されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性を示すアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９および配列番号１１のいずれかにより表されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列；ならびに／または
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）のいずれか１つの断片
のうち１以上を含む、単離されたポリペプチドを提供する。
【００４２】
好ましい実施形態において、本発明の単離されたポリペプチドは、上記に定義の「（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ」を規定するアミノ酸配列を含む。
【００４３】
上記の通り、本発明の第１６の態様では、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼエピトープを含む、単離されたポリペプチドの断片も提供する。
【００４４】
本発明の第１６の態様に記載の単離されたポリペプチドおよび（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼエピトープを持ったポリペプチドは、例えば、単離された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼタンパク質に結合する抗体の生成に有用である。
【００４５】
したがって、第１７の態様において、本発明は、上記に定義の単離された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼタンパク質またはそのエピトープに対して生起された、抗体またはそのエピトープ結合性フラグメントを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
本明細書を通じて、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単語「含む（comprise）」または「含む（comprises）」もしくは「含む（comprising）」などの、その変化形は、記述された要素もしくは整数または要素もしくは整数の群の包含を示唆するが、 その他任意の要素もしくは整数または要素もしくは整数の群の排除を示唆するものではないと理解されよう。
【００４７】
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、本明細書において配列識別子番号（配列番号）により示される。配列番号は、配列識別子＜４００＞１（配列番号：１）、＜４００＞２（配列番号２）などに数値的に対応する。配列識別子の概要を表１に示す。配列のリストは、本明細書の巻末に示されている。
【表１】
2009502180.tif 000002
2009502180.tif 000003
2009502180.tif 000004
【００４８】
好ましい実施形態の説明
以下の説明は、特定の実施形態のみを説明することを目的とするが、上記の説明に関する限定であることを意図しないと理解されるべきである。
【００４９】
本発明は、１つには、本明細書において「（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ」と称される（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの生合成酵素をコードする遺伝子の特定に基づく。
【００５０】
「（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン」は、β−Ｄ−グルコピラノシル単量体が（１→４）結合および（１→３）結合の両者によって重合された直鎖、非分枝状の多糖類を含むと理解されるべきである。
【００５１】
（１→４）結合および（１→３）結合の比率は、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンが自然的に発生する際に、一般に２．２〜２．６：１の範囲である。ただし、比率はこの範囲以外のこともある。たとえば、ソルガム胚乳の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン中、同比率は、１．１５：１である。２種類の結合は、規則的な繰り返し配列にはならない。（１→３）結合単位は、２以上の（１→４）結合により分離される。２ないし３つの隣り合う（１→４）結合の領域が優勢であるが、これら単位の配置には規則性がないことを重ねて述べる。結合配列は、２つのグルコース単位より、さらに前記結合への依存が薄く、二次マルコフ連鎖分布に従っている。さらに、１０％以下の連鎖は、５から２０の隣り合う（１→４）結合が拡張した領域からなる場合がある。したがって、穀類の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、セロトリオシル（cellotriosyl）（Ｇ４Ｇ４ＧRed）、セロテトラオシル（cellotetraosyl）（Ｇ４Ｇ４Ｇ４ＧRed）単位の（１→３）−β−結合した共重合体とみなすことができる。
【００５２】
内在性（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン中、三糖単位：四糖単位の比率は、穀物種によって異なる。例えば、コムギではその比率は３．０−４．５：１であるが、オオムギでは２．９−３．４：１、ライムギでは２．７：１およびオートムギでは１．８−２．３：１である。さらに、実際の比率は、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン抽出物の温度および条件によっても異なる可能性がある。
【００５３】
穀類の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンについて報告されている平均分子量は、穀物種、細胞壁の種類、抽出手順および分子量判定に用いた手順によるが、４８，０００（ＤＰ〜３００）から３，０００，０００（ＤＰ〜１８５０）に及ぶ。これらは、分子量に関して常に多分散であって、これはオオムギ（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンに関し、数平均分子量（Ｍｗ／Ｍｎ）１．１８に対する加重平均により説明される。ある種のオオムギ （１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンはまた、少量のタンパク質と共有結合しており、推定分子量４０，０００，０００を有している。
【００５４】
穀粒壁からの（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン抽出率は、自己会合および他の細胞壁多糖類およびタンパク質との会合の関数である。特に抽出率は、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン連鎖における分子量および結合分布に依存する。 他のポリマーおよび高分子量との広範な会合が、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンを穀粒から抽出することをさらに困難にしている。
【００５５】
例えば、オオムギ、オートムギおよびライムギの（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの一部は、ｐＨ７．０、４０℃の水で抽出することができる。さらなるフラクションは、より高温で溶解度を高めることができる。４０℃の水で溶解できる総（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの割合は、植物種によって異なる。例えば、ロウ質の多い（アミロース分が高い）オオムギは、通常のオオムギよりも水溶性の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの割合がより高い。４０℃でオオムギから抽出された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、６５℃で抽出されたもの（２．０：１）より、三糖：四糖の比率がわずかに低い（１．７：１）。穀粒からの穀物（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンを完全に抽出するためには、還元末端によるアルカリ性誘導の劣化を防ぐために、ＮａＢＨ４を含む４Ｍ  ＮａＯＨまたは含水Ｂａ（ＯＨ）２などのアルカリ性抽出物を使用する必要がある。アルカリで抽出されたオオムギ（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのフラクションは、分子量が高く、（１→４）:（１→３）結合の比率が高く、より多くの、接触してリンクした（１→４）結合したセグメントを有し、水による抽出物よりも三糖：四糖の比率が高い。ジメチルスルホキシド、高温の過塩素酸、トリクロロ酢酸、Ｎ−メチルモルフォリノ−Ｎ−酸化物およびジメチルアセトアミド−ＬｉＣｌなどの他の抽出剤も、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの溶解度を高めるために使用してもよい。しかしこれら抽出剤は、脱重合、またはポリマーの劣化を招く恐れがある。温水またはアルカリで一旦得られると、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、中性ｐＨおよび室温でよく溶解するようになる。しかし、冷却すると同時に、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは会合し、沈着する可能性がある。
【００５６】
上記の通り、本発明は、１つには（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの合成を触媒する生合成酵素の特定およびコード遺伝子に基づく。本明細書において用いられる場合、この酵素は本明細書において「（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ」と称される。
【００５７】
本発明は、発現配列標識ライブラリーおよびセルロースシンターゼ（ＣｅｓＡ）遺伝子を含む他の配列データベースの分析に、一部起因する。さらに具体的には、ＣｅｓＡ遺伝子は、これにはＣｅｓＡ遺伝子およびセルロースシンターゼ様（Ｃｓｌ）遺伝子ファミリーの両者を含む、事実上、非常に大きな遺伝子スーパーファミリーの一員であることが、これら研究において確認された。
【００５８】
しかし、著しい研究努力にもかかわらず、個々のＣｓｌ遺伝子は大部分が未知である。Ｃｓｌ遺伝子は、さらにＣｓｌＡ〜ＣｓｌＨまでの８グループに区分される。しかし、具体的な生化学的機能が決定されているＣｓｌ遺伝子は、グアルおよびシロイヌナズナから得られたＣｓｌＡ遺伝子のみである。
【００５９】
セルロースおよび（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの構造の類似性を前提とし、本発明者らは、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする遺伝子が、Ｃｓｌ遺伝子ファミリーのメンバーであると仮定した。
【００６０】
しかし、ほとんどの線維束植物のＣｓｌ遺伝子ファミリーは非常に大きく、ＣｓｌＡからＣｓｌＨまでのいくつかのグループに分類されている。シロイヌナズナでは、２９のＣｓｌ遺伝子が知られており、イネにおいては３７の同遺伝子が知られている。シロイヌナズナのゲノムは、細胞壁代謝に係わる７００超の遺伝子を含むと概ね考えられている。しかし、基本的に、これら遺伝子の具体的な機能は定かではない。例えば、ペクチン生合成に係わる１７０超の遺伝子のうち、２つの具体的な機能が特定されているのみである。さらに、ＣｅｓＡ遺伝子とは対照的に、Ｃｓｌ遺伝子の機能を特定することは困難であることが分かっている。事実、高等植物の複数のＣｓｌ遺伝子のうち、ＣｓｌＡグループのみに、一定の機能が割り当てられている。
【００６１】
本発明では、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする、ヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を特定するため遺伝的アプローチを用いた。本発明によって、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼが、ＣｓｌＦ遺伝子ファミリーのメンバーによりコードされることが明らかにされた。
【００６２】
（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする、ヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列の特定の結果、本発明はとりわけ、細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を制御し、それによって細胞により生成される（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルを制御する方法および組成物を提供する。
【００６３】
したがって、第１の態様において、本発明は、細胞により生成される（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルを制御する方法であって、該細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を変化させるステップを含む方法を提供する。
【００６４】
「細胞」は、任意の適当な真核細胞または原核細胞とすることができる。したがって、本明細書において言及される「細胞」とは、酵母細胞もしくは菌糸真菌細胞などの真菌細胞；哺乳動物細胞などの動物細胞もしくは昆虫細胞；または植物細胞をはじめとする真核細胞とすることができる。あるいは、細胞は、大腸菌（E. coli）細胞を含む細菌細胞または古細菌細胞などの原核細胞とすることもできる。
【００６５】
好ましくは、細胞は植物細胞、さらに好ましくは、単子葉植物もしくは双子葉被子植物細胞または裸子植物細胞を含む線維束植物細胞である。さらに好ましい実施形態において、植物は単子葉植物細胞である。
【００６６】
１つの特に好ましい実施形態において、単子葉植物細胞は、禾穀類植物細胞である。
【００６７】
本明細書において用いられる「禾穀類植物」という用語は、ヒトまたは動物の食料用の食用穀類を作出するイネ目（イネ科植物属）のメンバーを含む。イネ目禾穀類植物の例としては、決して本発明を限定するものではないが、コムギ、イネ、トウモロコシ、キビ、ソルガム、ライムギ、トリチカレ、オートムギ、オオムギ、テフ、野生米、スペルトコムギなどが挙げられる。しかしながら、禾穀類植物という用語は同様に、アマランス、ソバ、キノアなどの、食用穀類を作出しかつ偽穀類（pseudocereal）としても公知の非イネ目種の植物を含むと理解されるべきである。
【００６８】
禾穀類植物は、特に好ましくは単子葉植物であるものの、特にロリウム種(Lolium spp)などの牧草を含むイネ目の他の非穀類植物などの、他の単子葉植物も好ましい。
【００６９】
上記の通り、本発明は、１つには、細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を変化させることに基づく。
【００７０】
「（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ」は、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの合成を触媒し、任意により、グルコピラノシル単量体の重合を触媒することができる任意のタンパク質と見なされるべきである。
【００７１】
好ましくは、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２および配列番号３４のいずれかにより表されるアミノ酸配列、またはそれらに対して少なくとも４０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００７２】
さらに好ましくは、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２および配列番号３４のいずれかに対して少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性、なおいっそう好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性および最も好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を含む。特に好ましい実施形態においては、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２および配列番号３４のいずれかに表されているアミノ酸配列を含む。
【００７３】
アミノ酸配列を比較する場合に、比較される配列は、少なくとも１００個のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも２００個のアミノ酸残基、さらに好ましくは少なくとも４００個のアミノ酸残基、さらにより好ましくは少なくとも８００個のアミノ酸残基、最も好ましくは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２および配列番号３４のいずれかの全長を超える比較ウィンドウと比較されることが望ましい。比較ウィンドウは、二個の最適アライメントの配列の基準配列（付加または欠失を含まない）と比較して、約２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含む場合がある。比較ウィンドウをアラインするための最適アライメントの配列は、Altschul、他が開示したプログラムのＢＬＡＳＴファミリーのようなアルゴリズムをコンピュータに実装して実施される場合もある（Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402, 1997）。配列分析の詳細な検討は、Ausubel、他のUnit 19.3に記載されている（"Current Protocols in Molecular Biology" John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15,1998）。
【００７４】
さらに好ましい実施形態において、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼは、ＣｓｌＦ遺伝子またはその機能的ホモログ（後に定義される）によりコードされる。
【００７５】
本明細書に記載の通り、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの「レベル」の変化は、細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ転写産物および／またはポリペプチドのレベルの変化を含むと理解されるべきである。（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの「活性」の変化は、細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの総体的活性、特異的活性、半減期および／または安定性の変化を含むと理解されるべきである。
【００７６】
（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性に関する「変化」によって、細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を減少させることまたは増加させることを意図する。「減少させる」とは、例えば、細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルまたは活性の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の低下を意図する。「増加させる」とは、例えば、細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルまたは活性の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍の増加を意図する。「変化」とは同様に、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼを、この導入される酵素を通常は発現していない細胞に導入すること、またはそのような活性を通常有する細胞における（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの実質的に完全な阻害を含む。
【００７７】
１つの好ましい実施形態において、細胞により生成される（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルは、細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を増加させることにより増加される。別の好ましい実施形態において、細胞により生成される（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルは、細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を減少させることにより減少される。
【００７８】
本発明の方法は、細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を変化させることができる、当技術分野において公知の任意の手段を包含する。これには、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼアゴニストもしくはアンタゴニストの適用のような、細胞中での（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの活性を変化させる薬剤の適用、細胞中での（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ活性を擬態する薬剤の適用、細胞中での（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸の発現の変化、または特異的活性、半減期および／もしくは安定性の増加したもしくは減少した（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼが細胞によって発現されるような、細胞中での改変型または変異型（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸の発現の達成などが含まれる。
【００７９】
好ましい実施形態において、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性は、細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸の発現を変化させることにより変化される。
【００８０】
したがって、第２の態様において、本発明は細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を変化させる方法であって、該細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸の発現を変化させるステップを含む方法を提供する。
【００８１】
本明細書に記述のように、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼがＣｓｌＦ遺伝子ファミリーのメンバーによりコードされることが特定された。したがって、好ましい実施形態において、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸は、ＣｓｌＦ遺伝子またはその機能的ホモログである。
【００８２】
したがって、第３の態様において、本発明は細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を変化させる方法であって、該細胞中のＣｓｌＦ遺伝子またはその機能的ホモログの発現を変化させるステップを含む方法を提供する。
【００８３】
本明細書において用いられる「ＣｓｌＦ遺伝子またはその機能的ホモログ」という用語は、以下：
（ｉ）本明細書において定義される（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸分子；ならびに
（ｉｉ）好ましくは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１および配列番号３３のいずれかにより表されるヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％同一なヌクレオチド配列を含む、核酸分子；ならびに／または
（ｉｉｉ）好ましくは、ストリンジェントな条件下で、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１および配列番号３３のいずれかにより表されるヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子にハイブリダイズする、核酸分子
を含むと理解されるべきである。
【００８４】
より好ましくは、ＣｓｌＦ遺伝子またはその機能的ホモログは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１および配列番号３３のいずれかに対して少なくとも５４％同一であるヌクレオチド配列を含み、さらに好ましくは、ＣｓｌＦ遺伝子またはその機能的ホモログは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１および配列番号３３のいずれかに対して少なくとも７０％同一であるヌクレオチド配列を含み、ならびに最も好ましくは、ＣｓｌＦ遺伝子またはその機能的ホモログは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１および配列番号３３のいずれかに対して少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【００８５】
特に好ましい実施形態において、ＣｓｌＦ遺伝子またはその機能的ホモログは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１および配列番号３３のいずれかに表されているヌクレオチド配列を含む。
【００８６】
同一性の割合を計算するために、ヌクレオチド配列を配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１および配列番号３３のいずれかと比較する際に、比較されるヌクレオチド配列は、少なくとも３００個のヌクレオチド残基、より好ましくは少なくとも６００個のヌクレオチド残基、さらに好ましくは１２００個のヌクレオチド残基、さらにより好ましくは２４００個のヌクレオチド残基、最も好ましくは、配列番号１の全長を超える比較ウィンドウに対して比較されるべきである。比較ウィンドウは、二個の最適アライメントの配列のための基準配列（付加または欠失を含まない）に対して比較したときに、約２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含む場合がある。比較ウィンドウをアラインするための最適アライメントの配列は、Altschul、他が開示したプログラムのＢＬＡＳＴファミリーのようなアルゴリズムをコンピュータに実装して実施する場合がある（Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402, 1997）。配列分析の詳細な検討は、Ausubel、他のユニット１９．３に記載されている（"Current Protocols in Molecular Biology" John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15,1998）。
【００８７】
上記に示したように、ＣｓｌＦ遺伝子またはその機能的ホモログは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１および配列番号３３のいずれかに記載されるヌクレオチド配列からなる核酸分子に対してハイブリダイズする核酸を含みうる。本明細書において用いられる「ストリンジェントな」ハイブリダイズ条件とは、塩濃度が約１．５ Ｍ  Ｎａイオン未満であり、通常は約０．０１から１．０Ｍ  Ｎａイオン濃度（または 他の塩）、ｐＨ７．０〜８．３であって、温度は少なくとも３０℃を条件とする。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によっても達成できる。ストリンジェントなハイブリダイズ条件は、低ストリンジェンシー条件、より好ましくは、中程度のストリンジェンシー条件、および最も好ましくは、高ストリンジェンシー条件であってもよい。典型的な低ストリンジェンシー条件には、３７℃の３０％〜３５％のホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液、および５０〜５５℃の１×〜２×ＳＳＣ中での洗浄（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ  ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）を使用するハイブリダイゼーションを含む。典型的な中程度のストリンジェンシー条件には、３７℃の４０％〜４５％のホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝溶液、および５５℃〜６０℃の０．５×〜１×ＳＳＣ中での洗浄でのハイブリダイゼーションを含む。典型的な高ストリンジェンシー条件には、３７℃の５０％のホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝溶液、および６０℃〜６５℃での０．１×ＳＳＣの洗浄中でのハイブリダイズを含む。任意に、洗浄緩衝溶液は、約０．１％から約１％のＳＤＳからなる場合もある。ハイブリダイゼーションの時間は、一般に約２４時間未満であり、通常は約４時間〜１２時間である。
【００８８】
ハイブリダイゼーションの特異性は、通常、ハイブリダイゼーション後の洗浄の働きに依存し、重要な要因は最終洗浄液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの場合、ＴｍはMeinkothおよびWahlの式（Anal. Biochem. 138: 267-284, 1984）から概算される。すなわち、Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ Ｍ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌである。ここでＭは、一価の陽イオンのモル濃度、％ＧＣは、ＤＮＡ中の グアノシンおよびシトシンヌクレオチドの割合、％ｆｏｒｍは、ハイブリダイズ溶液中のホルムアミドの割合であり、Ｌは、塩基対中のハイブリッド長さである。Ｔｍは、相補的なターゲット配列の５０％が完全にマッチするプローブに対してハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度およびｐＨに基づく）である。Ｔｍは、１％のミスマッチごとに約１℃下がる。したがって、Ｔｍ、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件は、異なる度合いの相補性を持つ配列に対してハイブリダイズするために調整することができる。例えば、＞９０％の同一性を有する配列は、Ｔｍを約１０℃下げることによりハイブリダイズできる。一般に、ストリンジェントな条件は、特定の配列および定義されたイオン強度およびｐＨにおけるその相補体の熱融解点（Ｔｍ）よりも５℃低くなるよう選択される。しかし、高ストリンジェンシー条件では、熱融解点（Ｔｍ）よりも、例えば１、２、３または４℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができる。中程度のストリンジェンシー条件では、熱融解点（Ｔｍ）よりも、例えば６、７、８、９または１０℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができる。低ストリンジェンシー条件では、熱融解点（Ｔｍ）よりも、例えば１２、１３、１４、１５または２０℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができる。該式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成および望ましいＴｍを使用することにより、一般的なスキルであるこれらにより、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液のストリンジェンシーにおけるバリエーションが、基本的に説明されることが分かる。望ましい程度のミスマッチは、４５℃未満（水溶性溶液）または３２℃未満（ホルムアミド溶液）のＴｍの結果になるとすれば、より高温を利用できるようにＳＳＣ濃度を高めることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範なガイドは、Tijssen（Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Pt I, Chapter 2, Elsevier, New York, 1993）、Ausubel、他、編者（Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1995）およびSambrook、他（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY, 1989）に述べられている。
【００８９】
ＣｓｌＦ遺伝子またはその機能的ホモログは、１以上の非タンパク質領域または１以上のイントロン領域を含むことがある、生物由来のゲノムヌクレオチド配列からなってもよい。典型的なゲノムヌクレオチド配列は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８のいずれかに記載されるHordeum vulgare（野生オオムギ）ゲノムヌクレオチド配列をはじめとするＣｓｌＦ遺伝子を含む。
【００９０】
上記の通り、本発明は細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸の発現を変化させる方法を提供する。本発明は、細胞中の核酸分子をコードする（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの発現を変化させることができる任意の方法を包含する。
【００９１】
好ましくは、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸の発現に関して「変化させる」という用語は、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸の転写および／または翻訳を増加または減少させることを包含する。「減少させる」とは、例えば、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸の転写および／または翻訳の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、 ９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の低下を包含している。「増加させる」とは、例えば、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸の転写および／または翻訳の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍以上の増加を包含している。変化させることはまた、通常特定の細胞中では発見されない（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸の発現を導入すること、もしくは通常当該活性を有する細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸の発現の事実上、完全な阻害（例、ノックアウト）を含む。
【００９２】
細胞中の特定の核酸分子の発現を変化させる方法は、当技術分野において公知であり、本発明ではそのような任意の方法を包含する。（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸の発現を変化させる典型的な方法は、内在性（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの発現をアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションさせるような細胞の遺伝的改変、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸での形質転換による遺伝的改変、細胞中での内在性（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸の発現を変化させる細胞への核酸分子の投与などを含む。
【００９３】
１つの好ましい実施形態において、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸の発現を、細胞の遺伝子的改変により変化させる。本明細書において用いられる「遺伝的に改変された」という用語は、細胞の遺伝的に改変されていない形態に比べて、遺伝的に改変された細胞中での（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸の発現の変化に影響を及ぼす任意の遺伝的改変を含むと理解されるべきである。本明細書において包含される遺伝的改変の典型的なタイプとしては、内在性（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸を過剰発現または過小発現する変異体の選別と共に、トランスポゾン、化学物質、紫外線およびファージ突然変異生成などのランダム突然変異生成；細胞中での（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸の発現および／または過剰発現を指令する１以上の核酸分子の、細胞への一過的または安定的導入；内在性（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸の部位特異的突然変異誘発による内在性（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの阻害；細胞中での内在性（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸の発現を阻害する１以上の核酸分子、例えば、コサプレッション構築物またはＲＮＡｉ構築物の導入などが挙げられる。
【００９４】
特に好ましい実施形態において、遺伝的改変は対象となる細胞への核酸の導入を含む。
【００９５】
核酸は、例えば、SambrookおよびRussell（Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000）に述べられたものなど、使用される細胞種に適した、当技術分野において公知の任意の方法を用いて導入されてもよい。
【００９６】
本発明の好ましい実施形態において、前記した通り、細胞は植物細胞であり、核酸分子の導入のための適切な方法には、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性の形質転換、マイクロプロジェクタイル法に基づく形質転換方法および直接的ＤＮＡ取り込みに基づく方法を含んでよい。Roa-Rodriguez、他（Agrobacterium-mediated transformation of plants, 3rd Ed. CAMBIA Intellectual Property Resource, Canberra, Australia, 2003）は、広範な植物種について、適切なアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性の植物形質転換方法を総説している。マイクロプロジェクタイル法は、植物組織を形質転換したり、植物、特に穀類植物の形質転換方法に用いられたりするために使用されてもよい。また、当該方法は、Casas、他（Plant Breeding Rev. 13: 235-264, 1995）により総説されている。プロトプラスト形質転換およびエレクトロポレーションなどの直接的なＤＮＡ取り込みによる形質転換プロトコルは、Galbraith、他（編）（Methods in Cell Biology Vol. 50, Academic Press, San Diego, 1995）に詳しく述べられている。上記方法に加えて、さまざまな 他の形質転換プロトコルが用いられてもよい。これらは、浸潤、細胞および組織のエレクトロポレーション、胚芽のエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、花粉管経路、炭化ケイ素およびリポソーム媒介による形質転換を含む。これらのような方法は、Rakoczy-Trojanowska（Cell. Mol. Biol. Lett. 7: 849-858, 2002）により総説されている。他のさまざまな植物形質転換方法もまた、当業者にとって明らかなものであってよい。
【００９７】
導入される核酸は、一本鎖または二本鎖でもよい。核酸は、ｍＲＮＡに転写され、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼまたは別のタンパク質に翻訳されてもよい。また、ＲＮＡｉ構築物、コサプレッション構築物、アンチセンスＲＮＡ，ｔＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ，ｎｔＲＮＡなどのような非翻訳ＲＮＡをコードしてもよく、あるいは、直接細胞中で作用してもよい。導入された核酸は、ヌクレオチド塩基、糖、リン酸骨格に対する改変を含むが、核酸に対する機能的等価性を保持する、未改変のＤＮＡまたはＲＮＡ、もしくは改変されたＤＮＡまたはＲＮＡの場合がある。導入された核酸は、細胞中に任意に複製されてもよい。細胞の染色体または染色体外エレメントに組み込まれてもよい。および／または、細胞により転写されてもよい。導入された核酸はまた、宿主細胞に関して同種または異種のいずれかでよい。すなわち、導入された核酸は、遺伝的に改変された細胞と同じ生物種の細胞から得られるか（すなわち同種）、もしくは導入された核酸は、異なる生物種から得られる（すなわち異種）。トランスジーンは、合成トランスジーンでもよい。
【００９８】
１つの好ましい実施形態において、本発明は、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸を細胞に導入することにより、細胞により生成される（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルを増加させることを包含する。より好ましくは、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸は、ＣｓｌＦ遺伝子またはその機能的ホモログを含む。
【００９９】
（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードするヌクレオチド配列を特定することにより、さらなる実施形態において、本発明は細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸の発現をダウンレギュレーションする方法も提供する。
【０１００】
例えば、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸配列の特定は、本発明によれば、以下：
（ｉ）ノックアウト構築物との相同組み換えによる細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸のノックアウトまたはノックダウンを含む、細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸の挿入突然変異（植物での標的遺伝子破壊の例としては、Terada他、Nat. Biotechnol. 20: 1030-1034, 2002を参照）；
（ｉｉ）細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸の転写後遺伝子抑制（ＰＴＧＳ）またはＲＮＡｉ（ＰＴＳＧおよびＲＮＡｉの総説については、Sharp, Genes Dev. 15(5): 485-490, 2001、およびHannon, Nature 418: 244-51, 2002を参照）；
（ｉｉｉ）細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸を標的とするアンチセンス構築物を有する細胞の形質転換（植物のアンチセンス抑制の例については、v van der Krol、他、Nature 333: 866-869、van der Krol、他、BioTechniques 6: 958-967、 およびvan der Krol、他、Gen. Genet. 220: 204-212を参照）；
（ｉｖ）細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸に方向付けられたコサプレッション構築物を有する細胞の形質転換（植物のコサプレッションの例については、van der Krol、他、Plant Cell 2(4): 291-299を参照）；
（ｖ）細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸を標的とする二本鎖ＲＮＡをコードする構築物を有する細胞の形質転換（ｄｓＲＮＡ介在遺伝子抑制の例については、Waterhouse、他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13959-13964, 1998を参照）；および
（ｖｉ）細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸を標的とするｓｉＲＮＡまたはヘアピンＲＮＡをコードする構築物を有する細胞の形質転換（ｓｉＲＮＡまたはヘアピンＲＮＡ介在遺伝子の例については、Lu、他、Nucl. Acids Res. 32(21): e171、doi:10.1093/nar/gnh170, 2004を参照）
などの方法による細胞中での内在性（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸のノックアウトまたはノックダウンなどの方法を容易にする。
【０１０１】
本発明は、細胞に投与される細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸を標的とするｓｉＲＮＡまたはマイクロＲＮＡなどの合成オリゴヌクレオチドの利用を介して、細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸のダウンレギュレーションも促進するものである（合成ｓｉＲＮＡ介在抑制の例については、Caplen、他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 9742-9747, 2001、Elbashir、他、Genes Dev. 15: 188-200, 2001、Elbashir、他、Nature 411: 494-498, 2001、Elbashir、他、EMBO J. 20: 6877-6888, 2001、およびElbashir、他、Methods 26: 199-213, 2002を参照）。
【０１０２】
上記例の他に、導入された核酸は、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ配列に直接関係しないヌクレオチド配列を含むこともあるが、それでも、細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸の発現を直接的または間接的に変化させることがある。例としては、細胞中の核酸分子をコードする（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの発現を促進する、または抑制する転写因子または他のタンパク質をコードする核酸分子、直接的または間接的に内在性（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼを促進または抑制するほかの非翻訳型ＲＮＡなどがある。
【０１０３】
遺伝的に改変された細胞中での導入核酸の発現を達成するため、必要に応じ、導入核酸は１以上の制御配列に機能的に連結されてもよい。「制御配列」とは、機能的に連結された核酸またはそれによりコードされる転写産物またはタンパク質の転写、翻訳およびまたは翻訳後修飾に必要なまたは有利な、当技術分野において公知の全ての構成要素を含むと理解されるべきである。各制御配列は、機能的に連結された核酸に対し生来的でもまたは外来性でもよい。制御配列は、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、エンハンサーまたは上流の活性化配列、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターを含むが、これらに限定されない。典型的には、制御配列はプロモーターを少なくとも含む。
【０１０４】
本明細書において用いられる「プロモーター」という用語は、細胞中の核酸分子の発現を実現する、活性する、または促進する任意の核酸をいう。プロモーターは、一般的に、プロモーターが制御する遺伝子の５'（上流）に位置させる。異種プロモーター／構造遺伝子の組み合わせである構築物において、プロモーターと遺伝子（該プロモーターが自然環境において制御する遺伝子、すなわち該プロモーターが由来する遺伝子）との間の距離にほぼ等しい遺伝子転写開始部位からの距離に、プロモーターを配置することが、一般的に好ましい。当技術分野において周知の通り、この距離の変更は、プロモーター機能を失うことなく収めることができる。同様に、異種遺伝子に関する調節塩基配列エレメントの好ましい配置は、自然環境における配置、すなわち抽出を行う遺伝子中のエレメントの配置により決定される。繰り返し述べるが、当技術分野において周知の通り、この距離も変更することができる。
【０１０５】
プロモーターは、物理応力、病原体または特に金属イオンなどの外部刺激に反応して、もしくは１以上の転写活性化因子に反応して発現が発生する細胞、組織、器官または発生段階に関し、構成的に、または特異的に、機能的に連結したヌクレオチドの発現を制御してもよい。つまり、本発明の方法に従って使用されるプロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的のプロモーターまたは活性化プロモーターを含んでもよい。
【０１０６】
本発明は、対象となる細胞で活性な任意のプロモーターを使用することを包含している。つまり、細菌、菌類、動物細胞または植物細胞のいずれかで活性な多様なプロモーターは、当業者がすぐに分かるであろう。しかし、特に好ましい本発明の実施形態においては、植物細胞を使用する。したがって、植物で活性な構成的、誘導可能な、組織特異的または活性可能なプロモーターが、特に望ましい。
【０１０７】
植物の構成的プロモーターは、通常植物のほぼ全ての組織での発現を指令し、環境および発生的要因からは、概ね独立している。本発明に従い使用することができる構成的プロモーターの例には、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓおよび１９Ｓ（ＣａＭＶ３５ＳおよびＣａＭＶ１９Ｓ）プロモーターなどの植物ウイルス由来のプロモーター、例えばアグロバクテリウム（Agrobacterium）から得られるノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）プロモーターなど、アグロバクテリウム種（Agrobacterium spp.）より得られるオパインプロモータなどの細菌性植物病原体由来のプロモーター、およびルビスコ小サブユニット遺伝子（ｒｂｃＳ）プロモーター、植物ユビキチンプロモーター（Ｐｕｂｉ）およびイネアクチンプロモーター（Ｐａｃｔ）などの植物由来のプロモーターが含まれる。
【０１０８】
「誘導可能な」プロモーターには、化学的に誘導可能なプロモーターおよび物理的に誘導可能なプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。化学的に誘導可能なプロモーターは、アルコール、抗生物質、ステロイド、金属イオンまたは他の化合物などの化学化合物により制御される活性を有するプロモーターを含む。化学的に誘導可能なプロモーターの例には、アルコール制御プロモーター（例、欧州特許第６３７３３９号参照）、テトラサイクリン制御プロモーター（例、米国特許第５，８５１，７９６号および米国特許第５，４６４，７５８号参照）、グルココルチコイド受容体プロモーター（例、米国特許第５，５１２，４８３号参照）などのステロイド反応プロモーター、エストロゲン受容体プロモーター（例、欧州特許出願第１ ２３２ ２７３号参照）、エクジソン受容体プロモーター（例、米国特許第６，３７９，９４５号参照）など、メタロチオネインプロモーター（例、米国特許４，９４０，６６１、米国特許第４，５７９，８２１号および米国特許第４，６０１，９７８号参照）などの金属応答プロモーター、およびキチナーゼプロモーターおよびリゾチームプロモーター（例、米国特許第５，６５４，４１４号参照）またはＰＲタンパク質プロモーター（例、米国特許第５，６８９，０４４号、米国特許第５，７８９，２１４号、豪州特許第７０８８５０号、米国特許第６，４２９，３６２号参照）などの病因関連プロモーターを含む。
【０１０９】
誘導性プロモーターは、温度（高温、低温とも）、光などの非化学的環境要因により制御される物理的に制御されるプロモーターである場合もある。物理的に制御されるプロモーターの例には、ヒートショックプロモーター（例、米国特許第５,４４７８５８号、豪州特許第７３２８７２号、カナダ国特許出願第１３２４０９７号参照）、低温誘導性プロモーター（例、米国特許第６，４７９，２６０号、米国特許第６，０８４、０８号、米国特許第６，１８４，４４３号および米国特許第５，８４７，１０２号）、光誘導性プロモーター（例、米国特許第５，７５０，３８５号およびカナダ国特許第１３２１５６３号参照）を含む。
【０１１０】
「組織特異的プロモーター」には、優勢にまたは特異的に、生物中の１以上の特定の細胞、組織または器官で発現するプロモーターが含まれる。組織特異的プロモーターは、構成的または誘導性のいずれかでもよい。
【０１１１】
植物の組織特異的プロモーターの例には、米国特許出願第２００１０４７５２５号に記載された通りの根特異的プロモーター、欧州特許第３１６４４１号、米国特許第５，７５３，４７５号および欧州特許出願第９７３９２２号に記載の通りの子房および花托組織特異的プロモーターをはじめとする果実特異的プロモーター、および豪州特許第６１２３２６号および欧州特許出願第０７８１８４９号および豪州特許第７４６０３２号に記載の通りの種子特異的プロモーターが含まれる。
【０１１２】
１つの好ましい実施形態において、組織特異的プロモーターは、種子および／または穀類特異的プロモーターである。種子または穀類特異的プロモーターの例には、ｐｕｒｏｉｎｄｏｌｉｎｅ−ｂ遺伝子プロモーター（例えば、Digeon、他、Plant Mol. Biol. 39: 1101-1112, 1999を参照）、Ｐｂｆ 遺伝子プロモーター（例えば、Mena、他、Plant J. 16:53-62, 1998）、ＧＳ１−２ 遺伝子プロモーター（例えば、Muhitch、他、Plant Sci. 163:865-872, 2002）、グルテリンＧｔ１遺伝子プロモーター （例えば、Okita et al., J. Biol. Chem. 264: 12573-12581, 1989、heng、他、Plant J. 4: 357-366, 1993、Sindhu、他、Plant Sci. 130: 189-196, 1997、 Nandi、他、Plant Sci. 163: 713-722, 2002を参照） 、 Ｈｏｒ２−４遺伝子プロモーター （例えば、KnudsenおよびMuller, Planta 195: 330-336, 1991、Patel、他、Mol. Breeding 6: 113-123, 2000、Wong、他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 16325-16330, 2002を参照）、 リポキシゲナーゼ１遺伝子プロモーター （例えば、Rouster、他、Plant J. 15: 435-440, 1998を参照）、Ｃｈｉ２６遺伝子プロモーター（例えば、Leah、他、Plant J. 6: 579-589, 1994を参照）、Ｇｌｕ−Ｄ１−１遺伝子プロモーター （例えば、Lamacchia、他、J. Exp. Bot. 52: 243-250, 2001、 Zhang、他、Theor. Appl. Genet. 106: 1139-1146, 2003を参照）、Ｈｏｒ３−１遺伝子プロモーター（例えば、Sorensen、他、Mol. Gen. Genet. 250: 750-760, 1996、Horvath、他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 1914-1919, 2000を参照）およびロウ質（Ｗｘ）遺伝子プロモーター（例えば、Yao、他、Acta Phytophysiol. Sin. 22: 431-436, 1996、Terada、他、Plant Cell Physiol. 41: 881-888, 2000、Liu、他、Transgenic Res. 12: 71-82, 2003を参照）を含む。特に好ましい実施形態において、種子特異的プロモーターは胚乳特異的プロモーターである。
【０１１３】
プロモーターは、本明細書において「活性化可能プロモーター」と呼ばれる、１以上の転写活性化因子により活性化可能であるプロモーターでもよい。例えば、活性化可能プロモーターは、上流活性化配列（ＵＡＳ）に機能的に連結された最小プロモーターを含む場合がある。これはとりわけ、１以上の転写活性化因子のＤＮＡ結合部位を含む。
【０１１４】
本明細書に記載の通り、「最小プロモーター」という用語は、少なくともＲＮＡポリメラーゼ結合部位ならびに、好ましくはＴＡＴＡボックスおよび転写開始部位および／または１以上のＣＡＡＴボックスを組み入れた任意のプロモーターを含むと理解されるべきである。さらに好ましくは、細胞が植物細胞である場合、最小プロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ（ＣａＭＶ ３５Ｓ）に由来することができる。好ましくは、ＣａＭＶ ３５Ｓ由来の最小プロモーターは、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの（転写開始部位の）−９０位から＋１位（−９０ ＣａＭＶ ３５Ｓ最小プロモーターとも称される）、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの−６０位から＋１位（−６０ ＣａＭＶ ３５Ｓ最小プロモーターとも称される）またはＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの−４５位から＋１位（−４５ ＣａＭＶ ３５Ｓ最小プロモーターとも称される）に相当する配列を含むことができる。
【０１１５】
上記に示した通り、活性化可能プロモーターは、上流活性化配列（ＵＡＳ）に融合される最小プロモーターを含むことがある。ＵＡＳは、最小プロモーターを活性化するために転写活性因子を結合することが可能な任意の配列でありうる。転写活性因子の例として、例えば、Ｇａｌ４、Ｐｄｒ１、Ｇｃｎ４およびＡｃｅ１などの酵母由来の転写活性因子、ＶＰ１６、Ｈａｐ１ （Hach 、他、J Biol Chem 278: 248-254, 2000）、Ｇａｆ１（Hoe、他、Gene 215(2): 319-328, 1998）、Ｅ２Ｆ（Albani、他、J Biol Chem 275: 19258-19267, 2000）、ＨＡＮＤ２（Dai and Cserjesi, J Biol Chem 277: 12604-12612, 2002）、ＮＲＦ−１およびＥＷＧ（Herzig、他、J Cell Sci 113: 4263-4273, 2000）、Ｐ／ＣＡＦ （Itoh、他、Nucl Acids Res 28: 4291 - 4298, 2000）、ＭａｆＡ（Kataoka、他、J Biol Chem 277: 49903-49910, 2002）、ヒト活性転写因子４（LiangおよびHai、J Biol Chem 272: 24088 - 24095, 1997）、Ｂｃｌ１０（Liu、他、Biochem Biophys Res Comm 320(1): 1-6, 2004）、ＣＲＥＢ−Ｈ（Omori、他、Nucl Acids Res 29: 2154 - 2162, 2001）、ＡＲＲ１およびＡＲＲ２（Sakai、他、Plant J 24(6): 703-711, 2000）、Ｆｏｓ（Szuts and Bienz, Proc Natl Acad Sci USA 97: 5351-5356, 2000）、ＨＳＦ４（Tanabe、他、J Biol Chem 274: 27845 - 27856, 1999）、ＭＡＭＬ１（Wu、他、Nat Genet 26: 484-489, 2000）などのウイルス由来の転写活性因子を含む。
【０１１６】
１つの好ましい実施形態において、ＵＡＳは、少なくともＧＡＬ４転写活性因子のＤＮＡ結合ドメインと結合可能なヌクレオチド配列を含む。ＵＡＳ配列は、少なくともＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインを含む転写活性因子を結合する配列であり、本明細書において、ＵＡＳGと呼ぶ。特に好ましい実施形態において、ＵＡＳGは、配列５’−ＣＧＧＡＧＴＡＣＴＧＴＣＣＴＣＣＧＡＧ−３’またはその機能的ホモログを含む。
【０１１７】
本明細書に記載の通り、ＵＡＳG配列の「機能的ホモログ」は、少なくともＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインを結合でき、かつ好ましくはＵＡＳGヌクレオチド配列と好ましくは５０％の同一性、より好ましくは少なくとも６５％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも８０％の同一性および最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む任意のヌクレオチド配列をいうと理解されるべきである。
【０１１８】
活性化可能プロモーター中のＵＡＳ配列は、ＤＮＡ結合ドメイン標的配列の多数のタンデムリピートを含んでもよい。例えば、ＵＡＳGはその天然の状態においては、ＤＮＡ結合ドメイン標的配列の４つのタンデムリピートを含む。したがって、ＤＮＡ結合ドメイン標的配列のタンデムリピートの数に関して本明細書において用いられる「多数」という用語は、少なくとも２つのタンデムリピート、より好ましくは少なくとも３つのタンデムリピート、およびさらにより好ましくは少なくとも４つのタンデムリピートを含むと理解されるべきである。
【０１１９】
上記の通り、制御配列は、ターミネーターも含むことがある。「ターミネーター」とは、転写終了を示す転写ユニットの終端にあるＤＮＡ配列をいう。ターミネーターは、一般にポリアデニル化シグナルを含む３’非翻訳ＤＮＡ配列であって、一次転写産物の３’末端に対してポリアデニル配列の追加を促進する。プロモーター配列と同様に、ターミネーターは、使用しようとする細胞、組織または器官で機能的な任意のターミネーター配列であってもよい。植物細胞中で有用でありうる適切なターミネーター配列の例には、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）ターミネーター、ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター、オクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）ターミネーター、ｐｉｎＩＩおよびｐｉｎＩＩＩターミネーターなどのジャガイモのプロテイナーゼ阻害遺伝子（ｐｉｎ）ターミネーターが含まれる。
【０１２０】
当業者によって理解されるように、細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を変化させることにより、細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルを変化させる本発明の方法には、いくつかの産業上の用途がある。
【０１２１】
例えば、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、粘性溶液を形成することで知られている。水溶性穀類（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのの粘性を生じる物性は穀類加工の多くの局面において重要な決定因子である。例えば、オオムギ麦芽および穀類添加物由来の不完全に分解された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、麦汁およびビールの粘性に寄与できるが、麦汁分離およびビールのろ過における問題を伴う（例、Bamforth、Brew. Dig. 69 (5): 12-16, 1994を参照）。したがって、例えば１つの実施形態において、本発明は、ビール製造への適性を高めるため、オオムギ粒の１以上の細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼレベルおよび／または活性を減じることにより、オオムギ粒中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンレベルを減じるために適用することもできる。
【０１２２】
水溶性穀類の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、ブタや家禽などの単胃動物に対してアンチニュートリティブな効果をもたらすとも考えられている。「アンチニュートリティブ」な効果は、胃内容物の粘度を高め、消化酵素の放散および酵素作用の分解産物の吸収を遅らせることである。言い換えれば、これは成長率を遅らせることにつながる。
【０１２３】
さらに、家禽の飼料配合において、高い（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン濃度は、「粘性の」糞に関係しており、これは（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの消化性が低いことを示し、かつ生産者にとって主要な取扱いおよび衛生上の問題になりうる。したがって、別の実施形態において、本発明は、動物飼料としての植物の適合性を改善するため、動物飼料に使用される植物の１以上の細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルを低下させるのに適用することができる。
【０１２４】
しかしながら、穀類の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、ヒトおよび動物の食事における食物繊維の重要な構成要素である。本明細書において用いられる「食物繊維」という用語は、大腸における完全なもしくは部分的な発酵とともにヒト小腸での消化および吸収に抵抗性を示す植物の可食部または類似の炭水化物を含むと理解されるべきである。「食物繊維」は、多糖類（特に（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンを含む）、オリゴ糖、リグニンおよび関連する植物物質を含む。少なくともヒトの食事において、食物繊維は、全般的な腸の調子、便通、血中コレステロールの低減、および／または血中グルコールの低減を含めた有益な生理的効果を促進する。
【０１２５】
ヒトおよび単胃動物は、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンを分解する酵素を作らないが、いくぶんかの脱重合が胃および小腸で発生していることが示されている。これは、片利共生微生物によるものと推測される。水溶性（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンと 他の非デンプン質の多糖類を比較すると、腸内細菌により容易に発酵し、可消化エネルギーにわずかながら寄与する。単胃動物におけるアンチニュートリティブ効果とは対照的に、ヒトの食物中の高濃度のオートムギおよびオオムギの（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、特に食事後の血糖値およびインスリン反応を抑えることにより、非インスリン依存の糖尿病にとって有益な効果をもたらす。食物中高濃度の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン（２０％ｗ／ｖ）は、食物から食物コレステロールまたは胆汁酸の吸収を抑えることにより、血中コレステロール濃度を下げることにも関連付けられている。
【０１２６】
したがって、別の実施形態において、本発明は植物またはその断片中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンレベルを高めることにより、食用植物または食用植物断片の食物繊維含有量を増加させることに適用することもできる。特に好ましい実施形態において、食用植物または植物の可食部断片は、禾穀類植物またはその一部である。
【０１２７】
（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、特に（１→３）−β−Ｄ−グルカンにおいて、他のいくつかの多糖類と同じく、細網内系統の細胞の受容体との結合により媒介されるプロセスにより、ヒトの免疫反応を変化させるとも考えられている。さらに、血中の抗体が産生される前に、最初の防衛線として発動するシステムである、ヒトの補体経路のタンパク質を活性する能力を有することがある。
【０１２８】
本発明の第１の態様である方法は、組み換え発現系中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン形成も促進する。例えば、プロモーター制御下にあって、本明細書に記載のトリヌクレオチド配列をコードする（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼを細胞に導入することにより、組み換え技術によって形成されてもよい。前記した通り、細胞が引き続き（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼを発現させるとともに、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンを形成する。
【０１２９】
（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸を発現させるために使用することができる多様な組み換え発現系は当技術分野において周知である。組み換え発現系の例は、大腸菌発現系などの細菌発現系（Baneyx, Curr. Opin. Biotechnol. 10: 411-421, 1999 おいて総説されている。例：Gene expression in recombinant microorganisms, Smith (Ed.), Marcel Dekker, Inc. New York, 1994、およびProtein Expression Technologies: Current Status and Future Trends, Baneyx (Ed.), Chapters 2 and 3, Horizon Bioscience, Norwich, UK, 2004も参照）、バシラス属ｓｐｐ．発現系 （例：Protein Expression Technologies: Current Status and Future Trends, 前記, chapter 4を参照）、およびストレプトミセスｓｐｐ．（例：Practical Streptomyces Genetics, Kieser 、他、(Eds.), Chapter 17, John Innes Foundation, Norwich, UK, 2000を参照）、サッカロミセスｓｐｐ．、シゾサッカロミセスポンベ、Hansenula polymorphaおよび ピチア属ｓｐｐ．および糸状菌発現系などの酵母発現系を含む菌性発現系（例：Protein Expression Technologies: Current Status and Future Trends, 前記, chapters 5, 6および7、Buckholz and Gleeson, Bio/Technology 9(11): 1067-1072, 1991、Cregg、他Mol. Biotechnol. 16(1): 23-52, 2000、CereghinoおよびCregg, FEMS Microbiology Reviews 24: 45-66, 2000、Cregg 、他、Bio/Technology 11: 905 - 910, 1993を参照）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞発現系（例：Protein Expression Technologies: Current Status and Future Trends, 前記, chapter 9を参照）、バキュロウイルス発現系を含む昆虫細胞培養（例：Protein Expression Technologies: Current Status and Future Trends, 前記, chapter 8、KostおよびCondreay, Curr. Opin. Biotechnol. 10: 428-433, 1999、Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual WH Freeman & Co., New York, 1992、およびThe Baculovirus Expression System: A Laboratory Manual, Chapman & Hall, London, 1992を参照）、タバコ、ダイズ、イネおよびトマト細胞発現系などの植物細胞発現系（例：Hellwig、他、Nat Biotechnol 22: 1415-1422, 2004を参照）などを含む。
【０１３０】
したがって、第４の態様において、本発明は（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの生成方法であって、該細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸を発現させるステップを含む方法を提供する。
【０１３１】
１つの好ましい実施形態において、細胞は、先に定義された通りの組み換え発現系から得られる細胞である。
【０１３２】
別の好ましい実施形態において、細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸は、ＣｓｌＦ遺伝子またはその機能的ホモログである。
【０１３３】
第５の態様において、本発明は、本発明の第４の態様の方法により生成された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンも提供する。
【０１３４】
第６の態様において、本発明は以下のもの：
（ｉ）同じ分類群の野生型細胞と比較して変化した（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンレベル；
（ｉｉ）同じ分類群の野生型細胞と比較して変化した（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性；
（ｉｉｉ）同じ分類群の野生型細胞と比較して変化した（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸の発現
のうち、いずれか１以上を示す細胞を提供する。
【０１３５】
好ましい実施形態において、本発明の第６の態様である細胞は、本明細書に記載された第１、第２または第３の態様の方法で作製されている。別の好ましい実施形態において、細胞は植物細胞であり、より好ましくは単子葉植物細胞であり、最も好ましくは禾穀類植物細胞である。
【０１３６】
さらに、第７の態様において、本発明は、本発明の第６の態様による１以上の細胞を含んでなる、多細胞構造物を提供する。
【０１３７】
本明細書では、「多細胞構造物」は、１以上の細胞の任意の凝集物を含む。したがって、多細胞構造物は特に組織、器官、生物全体およびその一部を包含する。さらに、多細胞構造物は同様に、コロニー、植物カリ(plant calli)、浮遊培養物などの培養細胞の多細胞凝集物を包含すると理解されるべきである。
【０１３８】
上記の通り、１つの好ましい実施形態において、細胞は植物細胞であり、したがって本発明は、本発明の第６の態様による１以上の植物細胞を含んでなる植物全体、植物組織、植物器官、植物断片、植物繁殖材料または培養植物組織を含む。
【０１３９】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、本発明の第６の態様による１以上の細胞からなる穀粒を提供する。
【０１４０】
特に好ましい実施形態において、本発明は、本発明の第６の態様による１以上の細胞からなる穀類植物を提供する。
【０１４１】
したがって、第８の態様において、本発明は変化した（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンレベルを示す穀粒であって、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの変化したレベルおよび／もしくは活性、および／または（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸分子の変化した発現を示す１以上の細胞を含んでなる穀粒を提供する。
【０１４２】
１つの実施形態において、本発明の第８の態様である穀粒は、同種と野生型穀粒を比較した場合に、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルが高くてもよい。代替の実施形態において、穀粒は、同種と野生型穀粒を比較した場合に、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルが低くてもよい。
【０１４３】
第９の態様において、本発明は以下のもの：
（ｉ）本発明の第８の態様に記載の穀粒を製粉することにより製造される穀粉；および
（ｉｉ）任意により、１以上の他の穀粒を製粉することにより製造される穀粉
を含んでなる穀粉も提供する。
【０１４４】
したがって、本発明の第８の態様である穀粒を製粉して生産される穀粉は、例えば、本発明の第９の態様の穀粉重量の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％から構成されてもよい。
【０１４５】
本明細書に述べられた通り、「製粉」は、Brennan、他（Manual of Flour and Husk Milling, Brennan、他（編）、 AgriMedia, ISBN: 3-86037-277-7）に述べられた製粉などの、穀粒を製粉する当技術分野において周知の任意の方法を包含する。
【０１４６】
好ましくは、本発明の第９の態様である穀粉に使用される本発明の第８の態様である穀粒を製粉して製造される穀粉は、野生型と比較した場合により高いレベルの（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンを含む。
【０１４７】
「１以上の別の穀粒を製粉して製造される穀粉」は、先に定義されたいずれの穀類植物から得られる穀粒を製粉して製造される穀粉でもよい。本発明の第８の態様である穀粉の構成要素は、例えば重量の０％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％を構成してもよい。
【０１４８】
好ましい実施形態において、１以上の他の穀粒を製粉して製造される穀粉は、小麦粉である。また、これにより本発明の第９の態様である穀粉は、パン、ケーキ、ビスケットなどを調理するのに適しているものでもよい。
【０１４９】
上記に示した通り、本発明は、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードするヌクレオチドおよびアミノ酸配列の特定と単離に基づいている。
【０１５０】
したがって、第１０の態様において、本発明は（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする、単離された核酸分子を提供する。
【０１５１】
本発明において、「単離された」とは、元の環境（例えば、それが天然に存在するならば天然の環境）から取り出された物質をいい、したがって、「人の手によって」その天然の状態から改変されている。例えば、単離されたポリヌクレオチドは、ベクターもしくは物質の組成物の一部とすることができ、細胞内に含まれることができ、そのベクター、物質の組成物、または特定の細胞は該ポリヌクレオチドの元の環境ではないので、依然として「単離され」ている。「単離された」核酸分子は同様に、当技術分野において公知の方法を用いた化学合成によりまたはインビトロでの増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応などの）により作出されるものを含めて、合成核酸分子を含むと理解されるべきである。
【０１５２】
本発明の単離された核酸分子は、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドから構成されてもよい。これは、未修飾のＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡでもよい。例えば、発明の単離された核酸分子は、一本鎖および二本鎖のＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、および一本鎖および二本鎖領域の混合であるＲＮＡ、ＤＮＡからなる混成分子および一本鎖、またはより通常では二本鎖、もしくは一本鎖および二本鎖領域の混合でよいＲＮＡにより構成されてもよい。さらに、単離された核酸分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡ，もしくはＲＮＡおよびＤＮＡの両者からなる三本鎖領域から構成されてもよい。単離された核酸分子は、安定性または他の理由により修飾された１以上の塩基、もしくはＤＮＡまたはＲＮＡ骨格を含んでよい。「修飾」塩基は、例えば、イノシンなどのトリチル塩基および通常のものでない塩基を含む。さまざまな修飾は、ＤＮＡおよびＲＮＡに対して実施することができることから、「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態を含む。
【０１５３】
第１１の態様において、本発明は以下のもの：
（ｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９および配列番号１１のいずれかにより表されるヌクレオチド配列；
（ｉｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９および配列番号１１のいずれかにより表されるヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％同一なヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）低ストリンジェンシー、より好ましくは中程度のストリンジェンシーおよび最も好ましくは高ストリンジェンシー条件下で、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９および配列番号１１のいずれかにより表されるヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子にハイブリダイズするヌクレオチド配列；
（ｉｖ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２のいずれかにより表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれか１つに記載のものの相補体であるヌクレオチド配列；
（ｖｉ）（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれか１つに記載のものの逆相補体であるヌクレオチド配列；
（ｖｉｉ）（ｉ）〜（ｖｉ）のいずれか１つの断片
のうち、いずれか１以上を含む、単離された核酸分子も提供する。
【０１５４】
本発明の第１１の態様に記載の通り、「少なくとも５０％同一な」という用語は、５０％を超えるヌクレオチド配列の同一性の割合も含むと理解されるべきである。例えば、「少なくとも５０％同一な」という用語は、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性および少なくとも９５％の同一性を包含することが好ましい。
【０１５５】
好ましい実施形態において、単離された核酸分子またはその断片は、本明細書において先に定義されるように、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む。より好ましい実施形態において、本明細書において先に定義されるように、単離された核酸分子は、ＣｓｌＦ遺伝子を規定するヌクレオチド配列、またはその機能的ホモログを含む。
【０１５６】
上記の通り、本発明の第１１の態様は、ヌクレオチド配列の断片を提供する。ヌクレオチド配列の「断片」とは、長さが少なくとも１５ヌクレオチド（ｎｔ）、およびより好ましくは少なくとも２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも３０ｎｔ、なおいっそう好ましくは、少なくとも４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４５０、５００、５５０または６００ｎｔとすべきである。これらの断片には、以下に限定されないが、診断用プローブおよびプライマーを含む多数の用途がある。もちろん、長さが６０１〜３０００ｎｔのものなどの、より大きな断片も、全てではないが、ヌクレオチド配列の配列番号１の大部分に対応する断片と同様、本発明によって有用である。例えば、長さが少なくとも２０ｎｔの断片とは、例えば、配列番号１のヌクレオチド配列由来の２０以上の隣接する塩基を含んだ断片を意図する。
【０１５７】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチド断片は、本明細書に定義される通りの（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの機能的活性を有するポリペプチドをコードする。
【０１５８】
これらポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドまたはタンパク質もまた、本発明に含まれる。
【０１５９】
第１２の態様において、本発明は、本発明の第１１の態様に記載の単離された核酸分子を含む遺伝子構築物またはベクターを提供する。
【０１６０】
本発明の第１１の態様である核酸の他、本発明の第１２の態様であるベクターまたは構築物は、好ましくは、さらに１以上の宿主の複製起点、１以上の宿主中で活性である選択可能なマーカー遺伝子、または細胞中で単離された核酸分子の転写を可能にする１以上の制御配列のうちの複数を含む。
【０１６１】
本明細書において用いられる「選択可能なマーカー遺伝子」という用語には、発明の遺伝子構築物で感染させたかもしくは形質転換した細胞の特定および／または選択を促進するために、それが発現される細胞に表現型を与える任意の遺伝子が含まれる。
【０１６２】
「選択可能なマーカー遺伝子」は、細胞により発現される場合に、これら形質転換された細胞の特定および／または選択を促進する表現型を細胞に与える任意のヌクレオチド配列を含む。適切な選択的標識をコードするヌクレオチド配列の範囲は、当技術分野において周知である。選択的標識をコードするヌクレオチド配列の例は、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、抗真菌性抗生物質オーレオバシジンＡに耐性を与えるＡＵＲＩ−Ｃ遺伝子、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（例：ｎｐｔｌおよびｎｐｔｌｌ）およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（例：ｈｐｔ）、グルホシネート（glufosinate）、ホスフィノトリシンまたはビアラホス耐性遺伝子をコードするホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼなどのグルホシネート（glufosinate）、ホスフィノトリシンまたはビアラホス耐性遺伝子を含む除草剤耐性遺伝子（例：ｂａｒ）、３−エノイルピルビルシキミ酸（shikimate）５−リン酸塩シンターゼをコードする遺伝子をはじめとするグリホサート耐性遺伝子（例：ａｒｏＡ）、ブロミキシニル（bromyxnil）ニトリラーゼをコードする遺伝子をはじめとするブロミキシニル（bromyxnil）耐性遺伝子、ジヒドロプテレート（dihydropterate）シンターゼをコードする遺伝子をはじめとするスルホンアミド（salfonamide）耐性遺伝子（例：ｓｕｌ）およびアセトラクテートシンターゼをコードする遺伝子をはじめとするスルホニル尿素耐性遺伝子、ＧＵＳおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードする遺伝子などの酵素コードレポーター遺伝子、緑色蛍光タンパクコード遺伝子などの蛍光レポーター遺伝子、および、とりわけルシフェラーゼ遺伝子などの発光に基づくレポーター遺伝子を含む。
【０１６３】
さらに、選択可能なマーカー遺伝子は、構築物中の独立したオープンリーディングフレームであるか、あるいは（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼタンパク質との融合タンパク質として発現する場合もあることに注目すべきである。
【０１６４】
本発明の第１２の態様は、本明細書に記載の通り、原核生物または真核生物中の遺伝子構築物の維持および／または複製、および／または遺伝子構築物もしくはその一部分を原核生物または真核生物細胞のゲノムに組み込ませるために包含されたヌクレオチド配列をはじめとする、本質的に全ての遺伝子構築物に及ぶ。
【０１６５】
１つの好ましい実施形態において、本発明の第１２の態様である構築物は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介により植物細胞に少なくとも一部移入されるようにつくられる。したがって、特に好ましい実施形態において、本発明の第１２の態様による構築物は、左および／または右Ｔ−ＤＮＡ境界配列を含む。
【０１６６】
適切なＴ−ＤＮＡ境界配列は、当業者によって容易に確認されよう。しかしながら、「Ｔ−ＤＮＡ境界配列」という用語は、アグロバクテリウム属の種（Agrobacterium sp）の細胞からアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性の形質転換を受けやすい植物細胞に移入される核酸分子の範囲を定める、実質的に相同のおよび実質的に直接反復性のヌクレオチド配列を包含すると理解されるべきである。例証としては、PeraltaおよびReamによる論文（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82(15): 5112-5116, 1985）およびGelvinの概説（Microbiology and Molecular Biology Reviews, 67(1): 16-37, 2003）を参照されたい。
【０１６７】
１つの好ましい実施形態において、本発明の第１２の態様である構築物は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換を介して植物に移入するためにつくられているにせよ、本発明は、Broothaerts、他（Nature 433: 629-633, 2005）に述べられた通り、アグロバクテリウム属の種（Agrobacterium sp.）以外の細菌を介して、細菌媒介による植物細胞への導入を促進する遺伝子構築物に対する任意の適切な改変も包含している。
【０１６８】
当業者は、望むならば、本明細書に記載された構築物をどのように作製するか、また、所望の条件下で特定の細胞または細胞タイプでその発現を得るための必要条件を知るであろう。特に、本発明を実施するために必要な遺伝子操作は、大腸菌細胞などの原核細胞または植物細胞または動物細胞での、本明細書に記載の遺伝子構築物またはその誘導体の増殖を必要とすることが、当業者にとって知られるであろう。核酸分子をクローニングするための方法例は、Sambrook 、他（2000, 前記）に述べられている。
【０１６９】
第１３の態様において、本発明は、本発明の第１０または第１１の態様に記載の単離された核酸分子または本発明の第１２の態様に記載の遺伝子構築物を含んでなる細胞を提供する。
【０１７０】
本発明の第１０または第１１の態様の単離された核酸分子、または本発明の第１２の態様の遺伝子構築物は、当技術分野において周知の任意の手段を介して細胞中に導入されてもよい。
【０１７１】
上記に言及される単離核酸分子または構築物は、エピソーム（例：プラスミド、コスミド、人工染色体または同様のもの）の一部分として、ＤＮＡ分子として細胞中に維持されてもよいし、または細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれてもよい。
【０１７２】
本明細書において用いられる「ゲノムＤＮＡ」という用語は、その最も広義な背景において、細胞の遺伝子相補体を構成するあらゆるＤＮＡを含むと理解されるべきである。したがって、細胞のゲノムＤＮＡは、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、色素体ＤＮＡ 、葉緑体ＤＮＡ、内在性プラスミドＤＮＡなどを含むと理解されるべきである。したがって、「ゲノムに組み込まれた」という用語は、染色体への組み込み、ミトコンドリアＤＮＡへの組み込み、プラスチドＤＮＡへの組み込み、葉緑体ＤＮＡへの組み込み、内在性プラスミドへの組み込みなどを包含する。
【０１７３】
好ましくは、単離された核酸分子は、とりわけ、細胞が単離された核酸分子を発現するように、プロモーターに機能的に連結される。
【０１７４】
本発明の第１３の態様である細胞は、原核細胞または真核細胞でありうる。したがって、細胞は大腸菌細胞またはアグロバクテリウム属の種（Agrobacterium spp.）の細胞、または古細菌細胞を含む細菌細胞などの原核細胞でもよい。該細胞は、酵母細胞または真菌細胞、菌糸真菌細胞、哺乳類細胞または昆虫細胞などの動物細胞、または植物細胞を含む真核細胞であってもよい。好ましい実施形態において、細胞は植物細胞である。より好ましい実施形態において、植物細胞は単子葉植物細胞である。もっとも好ましい実施形態において、植物細胞は穀物植物細胞である。
【０１７５】
第１４の態様において、本発明は、本明細書に定義される通り、本発明の第１３の態様に記載の細胞のうち１以上を含んでなる、多細胞構造物を提供する。
【０１７６】
上記の通り、１つの好ましい実施形態において、細胞は植物細胞であり、したがって本発明は、本発明の第１３の態様の１以上の細胞を含んでなる植物全体、植物組織、植物器官、植物断片、植物繁殖材料または培養植物組織を特に含むと理解されるべきである。
【０１７７】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、本発明の第１３の態様の１以上の細胞からなる穀類植物またはその断片を提供する。
【０１７８】
特に好ましい実施形態において、本発明の第１４の態様は、本発明の第１３の態様の１以上の細胞から構成される穀粒を提供する。
【０１７９】
上記の通り、本発明は、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのためのアミノ酸配列も提供する。
【０１８０】
したがって、第１５の態様において、本発明は、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼタンパク質をコードするアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドを提供する。したがって、本発明は、単離された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼタンパク質を提供する。
【０１８１】
本明細書において用いられる「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸の任意の長さの多量体を含むと理解されるべきである。したがって、「ポリペプチド」という用語はペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を包含すると理解されるべきである。
【０１８２】
第１６の態様において、本発明は以下のもの：
（ｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２のいずれかにより表されるアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２のいずれかにより表されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性を示すアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９および配列番号１１のいずれかにより表されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列；ならびに／または
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）のいずれか１つの断片
のうち１以上を含む、単離されたポリペプチドを提供する。
【０１８３】
本発明の第１６の態様に記載の通り、「少なくとも５０％同一な」という用語は、５０％を超えるアミノ酸配列の同一性の割合も含むと理解されるべきである。例えば、「少なくとも５０％同一な」という用語は、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性および少なくとも９５％の同一性を包含することが好ましい。
【０１８４】
好ましい実施形態において、本発明の単離されたポリペプチドは、本明細書に定義される通りの「（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ」を含む。
【０１８５】
第１６の態様の単離されたポリペプチドは、ペプチド結合または修飾ペプチド結合、すなわちペプチドイソスター（isostere）によって互いに連結されたアミノ酸から構成されてもよく、２０種の遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。本発明の単離されたポリペプチドは、翻訳後プロセシングなどの天然のプロセス、または当技術分野において周知である化学的修飾技術により修飾されてもよい。そのような修飾は、基礎的なテキストにおよびさらに詳細な研究論文に、ならびに文献に十分に記述されている。
【０１８６】
修飾はペプチド骨格、アミノ酸側鎖および／または末端を含めて、単離されたポリペプチドのどこで行われてもよい。同じ種類の修飾は、与えられた単離されたポリペプチドの複数部位で同程度または種々の程度で存在してもよいことは、高く評価されるだろう。また、本発明の単離されたポリペプチドは、多数の種類の修飾を含んでもよい。
【０１８７】
該タンパク質は、例えばユビキチン化の結果として分岐しても、および／または、分岐の有無にかかわらず環状でもよい。環状の、分岐した、および分岐した環状ポリペプチドは、翻訳後自然プロセスの結果であっても、あるいは合成方法により作成されてもよい。
【０１８８】
修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトール共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合、脱メチル反応、共有結合性架橋結合、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グルコシル化、ＧＰＩアンカーの形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）付加、タンパク質分解プロセシング、プレニル化、ラセミ化、セレノイレーション、硫酸化、アルギニル化およびユビキンチン化などのトランスファーＲＮＡ媒介によるタンパク質へのアミノ酸添加物を含む（例としては、Proteins--Structure And Molecular Properties 2nd Ed., Creighton (ed.), W. H. Freeman and Company, New York, 1993、Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, Johnson (Ed.), Academic Press, New York, 1983、Seifter et al., Meth Enzymol 182: 626-646, 1990、Rattan et al., Ann NY Acad Sci 663: 48-62,1992を参照）。
【０１８９】
上記の通り、本発明の第１６の態様では、単離されたポリペプチドの断片も提供する。ポリペプチド断片は、該断片が「自立」または一部または領域を形成する大きなポリペプチド内に含まれてもよい。
【０１９０】
タンパク質断片は、長さが少なくとも３、４、５、６、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０アミノ酸でありうる。１つの好ましい実施形態において、断片は配列番号２に記載の配列の一部であるアミノ酸配列を含む。
【０１９１】
１つの好ましい実施形態において、断片は、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの機能的活性を含む。しかしながら、該断片は、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼタンパク質の１以上の生物学的機能を保有しないにもかかわらず、 他の機能的活性は依然として保有されてもよい。例えば、該断片は（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの機能的活性を欠くが、単離された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼタンパク質の完全型または成熟形態に結合する抗体に対して導入する、および／または、結合する能力を保有する。単離された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼタンパク質の完型または成熟形態を結合させる抗体を誘導するか、かつ／またはそれに結合する能力を有するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質断片は、本明細書において「（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼエピトープ」と呼ぶ。
【０１９２】
（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼエピトープは、３〜４個の少ないアミノ酸残基を含み、好ましくは５個のアミノ酸およびより好ましくは１０個のアミノ酸残基を含んでもよい。単離された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼタンパク質の特定のエピトープが当該免疫学的活性を保有しているかどうかは、当技術分野で周知の方法により容易に判定することができる。したがって、１つの好ましい（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼタンパク質断片は、１以上の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼエピトープを含むポリペプチドである。
【０１９３】
１以上の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼエピトープからなるポリペプチドは、当技術分野で周知の合成および組み換え方法を含むポリペプチドを作成する従来の手段により作製してもよい。１つの実施形態において、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼエピトープを持つポリペプチドは、化学合成の周知の方法を用いて合成されてもよい。例えば、Houghtenは、多数のペプチドを合成する単純な方法を述べている（Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5131-5135, 1985）。
【０１９４】
単離されたポリペプチド、および本発明の第１６の態様である（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼエピトープを持つポリペプチドは、例えば、発明の単離された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼタンパク質を結合する抗体の生成において有用である。
【０１９５】
当該抗体は、とりわけ（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼタンパク質の検出および局在決定において、また、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼタンパク質のアフィニティ精製において有用である。抗体は、当技術分野において周知の方法を用いて、多様な定性的または定量的イムノアッセイにおいて、日常的に使用することができる。例えば、Harlow、他、Antibodies:A Laboratory Manual,（Cold Spring Harbor Laboratory Press 2nd Ed., 1988）を参照されたい。
【０１９６】
したがって、第１７の態様において、本発明は、上記に定義の単離された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼタンパク質またはそのエピトープに対して生起された、抗体またはそのエピトープ結合性フラグメントを提供する。
【０１９７】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生される断片および上記のいずれかのエピトープ結合性フラグメントを含むが、これらに限定されない。
【０１９８】
本明細書において用いられる「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、すなわち、抗原に対して免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子をいう。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意の種類（例、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例、ＩｇＧ１、ＩｇＥ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４，ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）およびサブクラスでありうる。
【０１９９】
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性またはより多特異性でもよい。多特異性抗体は、本発明のポリペプチドの異なるエピトープに対して特異的であるか、または異種ポリペプチドまたは固相担体材料などの異種エピトープと、本発明のポリペプチドとの両者に対して特異的であってよい。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９３／１７７１５、ＷＯ９２／０８８０２、ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／０５７９３、Tutt、他、J. Immunol. 147: 60-69, 1991、米国特許第４，４７４，８９３号、同第４，７１４，６８１号、同第４，９２５，６４８号、同第５，５７３，９２０号、同第５，６０１，８１９号、およびKostelny 、他、J. Immunol. 148: 1547-1553, 1992を参照されたい。
【０２００】
１つの実施形態において、本発明の抗体は（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用してもよい。別の実施形態において、本発明の抗体は、例えばインビトロおよびインビボ診断および治療方法の両者をはじめとする本発明のポリペプチドの精製、検出および標的化のために使用されてもよい。例えば、抗体は、生体サンプル中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルを定性的にかつ定量的に測定するためのイムノアッセイにおいて使用されている。例として、Harlow、他、Antibodies: A Laboratory Manual （Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988）を参照されたい。
【０２０１】
本明細書において用いられる「抗体」という用語は、例えば、共有結合によって抗体が（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼまたはそのエピトープに結合するのを妨げないような任意のタイプの分子の共有結合により、修飾されている誘導体を包含すると理解されるべきである。例えば、抗体の誘導体は、例えばグルコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、リン酸化、アミド化、公知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質との結合などにより修飾されている抗体を含む。さらに、多くの化学的修飾のいずれを公知の技術によって行ってもよい。これらは特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含む。さらに、該誘導体は１以上の非古典的アミノ酸を含んでもよい。
【０２０２】
抗体は、体外免疫法、体内免疫法およびファージディスプレイ法など、当技術分野で周知の方法を用いて生成してもよい。例えば、Bittle、他（J. Gen. Virol. 66: 2347-2354, 1985）を参照されたい。
【０２０３】
インビボ免疫法を使用する場合、動物を遊離ペプチドで免疫してもよいが、抗ペプチド抗体力価は、キーホールリンペットヘモシアニンまたは破傷風トキソイドなどの、高分子キャリアにペプチドを結合することにより、増加させることができる。例えば、システイン残基を含むペプチドは、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide）エステル（ＭＢＳ）法などのリンカーを用いてキャリアに結合させてもよく、一方他のペプチドは、グルタールアルデヒドなどのより一般的な架橋剤を用いてキャリアに結合させてもよい。
【０２０４】
ウサギ、ラット、マウスなどの動物は、例えば遊離またはキャリアを結合したペプチドを用いて、約１００マイクログラムのペプチドまたはキャリアタンパク質およびフロイントアジュバントを含むエマルジョンを腹腔内および／または皮内注射することにより、免疫される。例えば固体表面に吸着する遊離ペプチドを用いるＥＬＩＳＡ分析により、約２週間毎に、検出可能な抗ペプチド抗体の有用な力価を提供するために、何回かの追加免疫注射が必要とされてもよい。免疫された動物の結成中の抗ペプチドの力価は、抗ペプチド抗体の選別により、例えば、当技術分野で周知の方法により選択された抗体の固相担体および溶出のペプチドに吸着することにより、増加させてもよい。
【０２０５】
例えば、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼタンパク質または１以上の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼエピトープからなるポリペプチドに対するポリクローナル抗体は、当技術分野で周知の様々な手順により生成することができる。例えば、本発明のポリペプチドは、抗原固有のポリクローナル抗体を含む血清の生産を誘発するため、限定するものではないが、ウサギ、マウス、ラット等を含む様々な宿主動物に投与することができる。例えばフロイントアジュバント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびＢＣＧ（カルメットゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・パルバムなど潜在的に有用なヒトのアジュバントなど、様々なアジュバントは、宿主動物種によるが、免疫反応を高めるために使用されてもよい。当該アジュバントもまた、当技術分野において周知である。
【０２０６】
別の例として、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、遺伝子組み換えおよびファージディスプレイ技術、またはその組み合わせの利用をはじめとする当技術分野で周知の多様な技術を使用して準備することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野で周知であって、例えば、Harlow、他、 Antibodies: A Laboratory Manual、（Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed., 1988）およびHammerling、他、Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas （Elsecier, NY, 1981）などに教示されているものを含むハイブリドーマ技術を用いて生産することができる。本明細書において用いられる「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術により生産される抗体に限定されるものではない。「モノクローナル抗体」は、真核生物、原核生物およびファージクローンを含む任意の単一クローンから誘導され、また抗体が生成される方法以外に由来する抗体をいう。
【０２０７】
ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を生成し、選別する方法は、日常的に行われ、当技術分野で周知である。例えば、マウスは、本発明のポリペプチドまたは当該ペプチドを発現する細胞により免疫することができる。免疫応答が検出されると、例えば、抗原に固有の抗体がマウスの血清中で検出されるとすぐに、マウスの脾臓が摘出され、脾細胞が単離される。脾細胞は、周知の技術により、例えばＡＴＣＣから入手可能な細胞株ＳＰ２０由来の細胞など、適切な骨髄腫細胞に融合させる。ハイブリドーマを選択し、限界希釈によりクローン化する。ハイブリドーマクローンは、本発明のポリペプチドを結合することのできる抗体を分泌する細胞のための、当技術分野で周知の方法によりアッセイされる。一般に高レベルの抗体を含む腹水は、陽性ハイブリドーマクローンを有するマウスを免疫することにより生成することができる。
【０２０８】
１以上の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼエピトープを認識する抗体断片は、公知の技術によって作出されてもよい。例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、（Ｆａｂ断片を生産するため）パパインなどの酵素、またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を作出するため）を用いて、免疫グロブリン切断により作出されてもよい。Ｆ（ａｂ’）２断片は、多様な領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。
【０２０９】
本発明の抗体は、当技術分野において周知のファージディスプレイ法を用いて生成することもできる。ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保持するファージ粒子の表面に提示（ディスプレイ）される。特定の実施形態において、当該ファージはレパートリーまたは組み合わせ抗体ライブラリー（例：ヒトまたはマウス）から発現する抗原結合ドメインを提示するために使用することができる。対象とする抗原を結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、例えば標識化された抗原、または固体表面かビーズに結合された、あるいは捕捉された抗原などを使い、選択または特定することができる。これら方法に使用されるファージは、典型的には、該ファージにより発現されるｆｄおよびＭ１３結合性ドメインを、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組み換え技術によって融合されたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインととこに含む、線状ファージである。
【０２１０】
本発明の抗体を作製するために使用することのできるファージディスプレイ法の例としては、Brinkman、他（J. Immunol. Methods 182: 41-50, 1995）、Ames、他（J. Immunol. Methods 184: 177-186, 1995）、Kettleborough、他（Eur. J. Immunol. 24: 952-958, 1994）、Persic、他（Gene 187: 9-18, 1997）、Burton、他（Advances in Immunology 57: 191-280, 1994）、ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０２８０９、ＷＯ９１／１０７３７、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９３／１１２３６、ＷＯ９５／１５９８２、ＷＯ９５／２０４０１および米国特許第５，６９８，４２６号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５８０，７１７号、同第５，４２７，９０８号、同第５，７５０，７５３号、同第５，８２１，０４７号、同第５，５７１，６９８号、同第５，４２７，９０８号、同第５，５１６，６３７号、同第５，７８０，２２５号、同第５，６５８，７２７号、同第５，７３３，７４３号および同第５，９６９，１０８号により開示された方法が挙げられる。
【０２１１】
ファージ選択後、ファージ由来の領域をコードする抗体は、全抗体または断片を結合する任意の望ましい他の抗原を精製するために単離され、使用することができ、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌および細菌を含む、任意の望ましい宿主で発現させることができる。例えば、組み換え技術によりＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片を生産するための技術はまた、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／２２３２４、Mullinax、他BioTechniques 12(6): 864-869, 1992）およびSawai、他（AJRI 34:26-34, 1995）およびBetter、他（Science 240: 1041-1043, 1988）に開示された方法など当技術分野で周知の方法を用いて、使用することも可能である。
【０２１２】
一本鎖Ｆｖを生産するために使用可能な技術の例は、米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号、Huston、他（Methods in Enzymology 203: 46-88, 1991）、Shu、他（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7995-7999, 1993）およびSkerra、他（Science 240: 1038-1040, 1988）に記載されている。
【実施例】
【０２１３】
本発明をさらに、以下の非限定的な例により説明する。
【０２１４】
実施例１
オオムギ穀粒の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン含有量の自然変動による候補遺伝子の特定
比較マッピングの研究により、イネ科の種の染色体に沿う遺伝子順序の高レベルの保存があることが明らかにされてきたが、このレベルでのマクロな直線性から、遺伝子の存在または順序を必ずしも予測できるわけではない。それにもかかわらず、メガ塩基対レベルでの共直線性は、遺伝子のポジショナルクローニングのために、分子マーカーの開発のために、モデル生物種のシンテニー領域を基準とすることにより、１つの種における当該形質に影響を及ぼす候補遺伝子を特定するために不可欠である。したがって、このアプローチを、穀類の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの候補遺伝子を特定するために採用した。
【０２１５】
量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）マッピングおよび比較ゲノミクスは、トウモロコシ（Zea mays）での細胞壁生合成に係わる遺伝子を特定するために使用されてきた。麦芽処理および醸造特性において（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンが果たす中心的な役割のため、穀粒の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン含有量のＱＴＬ分析が利用可能である。図１に示された通り、穀粒の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン含有量に最大の影響を有するＱＴＬは、Ａｄｈ８およびＡＢＧ０１９マーカーの間にあるオオムギ染色体２Ｈ上に位置することが分かった。
【０２１６】
第２Ｈ染色体のオオムギＱＴＬに隣接する２つのＤＮＡマーカーの配列を用いて、シンテニー領域は、イネの第７染色体に位置することが分かった。ここで、６個のセルロースシンターゼ様（Ｃｓｌ）遺伝子のクラスターは、染色体の２１．５９−２１．７２  Ｍｂ領域に相当する１１９Ｋｂの区画内で検出された（図１）。
【０２１７】
それぞれの遺伝子は、イネのＣｓｌＦグループに分類され、これらはＯｓＣｓｌＦ１（配列番号１９）、ＯｓＣｓｌＦ２ （配列番号２１）、ＯｓＣｓｌＦ３（配列番号２３）、ＯｓＣｓｌＦ４（配列番号２５）、ＯｓＣｓｌＦ８（配列番号３１）およびＯｓＣｓｌＦ９（配列番号３３）と命名された。イネ第７染色体のこの区画における他の周知の遺伝子は、偽遺伝子を表すと思われる切断型ＯｓＣｓｌＦ遺伝子を含む。
【０２１８】
ＯｓＣＳｓｌＦ５（配列番号２７）およびＯｓＣｓｌＦ７（配列番号２９）遺伝子は、イネゲノムの他の場所に位置する（データは示さない）。
【０２１９】
これに基づき、比較ゲノミクスアプローチは、穀類の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの潜在的な候補遺伝子として、ＣｓｌＦグループの遺伝子の特定を可能にした。Ｃｓｌ遺伝子のＣｓｌＦグループは、イネ目の細胞壁中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの排他的発生に一致して、単子葉植物にのみ見出されているのは注目に値する。
【０２２０】
材料および方法
（ｉ）植物組織
組織は、高湿度、光強度３００ｕｍｏｌ／ｍ／ｓおよび１１／１３時間の昼夜レジームのもと、日中２８℃および夜間２２℃の温度で成長させた、成熟させたイネ（Oryzae sativa cv Nippon Bare）から収集された。材料は、シャーレのなかで湿ったろ過紙上で２８℃にて発芽させた成長５日目の苗からも収集された。
【０２２１】
（ｉｉ）シンテニー分析
オオムギ （１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのＱＴＬに基づくマーカーのＤＮＡ配列は、ＧｒａｉｎＧｅｎｅｓデータベース（ｈｔｔｐ:／／ｗｈｅａｔ.ｐｗ.ｕｓｄａ.ｇｏｖ）から得た。Ｂａｒｌｅｙ−Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ２（Qi、他、Genome 39: 379-394, 1996）およびＢａｒｌｅｙ−Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ２００３（Karakousis、他、Australian Journal of Agricultural Research 54: 1173-1185, 2003）マップも調査に含まれた。イネゲノム上のマーカーのシンテニーの染色体位置は、ＧＲＡＭＥＮＥウェブサイト（ｈｔｔｐ:／／ｗｗｗ.ｇｒａｍｅｎｅ.ｏｒｇ）ＢＬＡＳＴＮ分析により判定された。シンテニー領域は、細胞壁多糖類の合成をコードする酵素の遺伝子注釈について調べられた。オオムギ第２Ｈ染色体上の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのＱＴＬピークに相当するイネ第７染色体上の領域について徹底的な分析を行い、さらに分析した結果、６個の同一箇所に位置するＣｓｌＦ遺伝子が同定された。
【０２２２】
実施例２
イネＣｓｌＦ遺伝子でのシロイヌナズナの形質転換
（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン合成におけるイネＯｓＣｓｌＦ遺伝子の考えられる役割は、トランスジェニックシロイヌナズナ植物体でのゲイン・オブ・ファンクションにより試験された。シロイヌナズナ細胞壁は、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンを含んでおらず、シロイヌナズナゲノムは、既知のＣｓｌＦ遺伝子を含んでいない。したがって、イネＯｓＣｓｌＦ遺伝子を有するトランスジェニックシロイヌナズナの細胞壁での（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの沈着は、導入された遺伝子が（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードすることを示唆する。このアプローチは、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン合成に必要な任意の前駆体、中間体、補因子または補助酵素のシロイヌナズナ中の利用可能性を前提とし、これに依存している。
【０２２３】
よって、イネＣｓｌＦ１、２、３、４、８遺伝子を、ＰＣＲによりｃＤＮＡからうまく増幅し、図２に示された通り、３５Ｓプロモーターの下流に、ｐＡＪ２２バイナリーベクターにクローニングした。
【０２２４】
次に、プラスミドベクターを、標準的な花浸漬法（CloughおよびBent, Plant J. 16: 735, 1998）によりシロイヌナズナの形質転換を行うために使用される、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）に挿入した。複数のＯｓＣｓｌＦ遺伝子が（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン合成に必要とされる場合、形質転換は、単一遺伝子構築物ばかりではなく、ＯｓＣｓｌＦ遺伝子を様々に組み合わせて実施した。
【０２２５】
除草剤ＢＡＳＴＡによる選択後、ＤＮＡおよびＲＮＡを選択されたトランスジェニック植物から単離し、トランスジーンの有無を確認し、リアルタイム定量的ＰＣＲ（Burton、他（2005, 前記）に記載されたＱ−ＰＣＲ）によりトランスジーンの転写をモニタリングした。
【０２２６】
サザンハイブリダイゼーション分析により、トランスジーンの存在を確認した（図３）。図４に示した通り、少なくともいくつかの株は、様々なＯｓＣｓｌＦ遺伝子の単一コピーを含むことが発見された。シロイヌナズナを複数のＯｓＣｓｌＦ遺伝子で形質転換した場合には、これら全ての遺伝子を検出することができた（図３）。
【０２２７】
トランスジェニック株の１４日齢の葉でのＯｓＣｓｌＦ遺伝子の転写も確認された。標準化したｍＲＮＡレベルを、選択されたトランスジェニック植物について図５に示した。ここで、トランスジーンの転写活性における大きな相違は、植物株間で明らかであり、また、同様に大きな相違が、複数のトランスジーンを有する株の個々のＯｓＣｓｌＦ遺伝子の間に観察される。例えば、ＯｓＣｓｌＦ２、ＯｓＣｓｌＦ４およびＯｓＣｓｌＦ８遺伝子により形質転換された株において、ＯｓＣｓｌＦ４の転写産物は、通常最も量が多い。この結果は、３５Ｓプロモーターは、多くの株で明らかに高レベルの転写を促進したことを示している。
【０２２８】
材料および方法
（ｉ）植物
シロイヌナズナは、長い１２／１２時間の昼夜条件か、または短い８時間／１６時間の昼夜条件で、栽培チャンバーで２３℃にてシロイヌナズナ土壌ミックスで生育させた。トランスジェニック植物から収集した種を乾かし、清浄化し、２日間４℃で春化処理し、選択のための２５ｍｇ／ｌのＢｉａｌｏｐｈｏｓを含む固体ＭＳ培地に播種した。その中で残ったものを、第５葉期の時点で土壌に移植し、上記条件の下で、栽培室で栽培した。
【０２２９】
（ｉｉ）バイナリーベクター構築
バイナリーベクターｐＡＪ２２（図２）は、Ａｎｄｒｅｗ  Ｊａｃｏｂｓ博士（アデレード大学）より頂戴したものであり、ｐＡＭＰＡＴ−ＭＣＳバックボーン（登録番号ＡＹ４３６７６５）に基づいている。これは、ｐＮＯＳターミネーター領域を有する二重３５Ｓプロモーターを含むが、該プロモーターは本実施例では使用されないトリプルＨＡエピトープを組み込んでいる改変されたマルチクローニング部位により、分離されている。上記の通り増幅されたイネＯｓＣｓｌＦ ｃＤＮＡに対応する完全長ＰＣＲ産物は、ＴＥＡＳＹベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。正しいサイズのインサートを担持するクローンを、適切な制限酵素（表２）およびＴＥＡＳＹバックボーンを二分割するための酵素で消化した。反応物を、アガロースゲル電気泳動法により分離し、ＣｓｌＦ断片を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（ＱＩＡＧＥＮ）ゲル抽出キットを製造元の説明書に従って使用して精製した。バイナリーベクターｐＡＪ２２は、対応する一対の制限酵素により消化され、ＣｓｌＦ断片は、ｐＡＪ２２ベクターにライゲーションした。プラスミドＤＮＡを、ＱＩＡｑｕｉｃｋミニプレップキットを用いて陽性クローンから抽出し、インサートを、アプライドバイオシステムズ社製ＡＢＩ３７００キャピラリーシーケンサーでＢｉｇＤｙｅ３．１化学（ＡＢＩ）を用いて、配列決定した。確認済みインサートを含むプラスミドＤＮＡ調製物は、Mersereau、他 （Gene 90: 149, 1990）の方法を用いて、エレクトロポレーションを介してアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ｃｖＧＶ３１０１に形質転換され、陽性コロニーを、２５ｍｇ／ｌのリファンピシン、４８ｍｇ／ｌのカルベリシニン、５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む培地で選択した。
【０２３０】
（ｉｉｉ）シロイヌナズナ形質転換
シロイヌナズナ形質転換体は、CloughおよびBent（Plant J. 16: 735, 1998）の花浸漬法により作製した。
【０２３１】
（ｉｖ）ＤＮＡ抽出およびサザンハイブリダイゼーション分析
ゲノムＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎミニプレッププラントキットを用いて若葉および花芽から抽出した。植物体ごとに約５μｇのゲノムＤＮＡを該当する制限酵素により消化し、１％のアガロースＴＡＥゲルで分離した。ＤＮＡを、Ｈｉｇｈｂｏｎｄ＋メンブレンにトランスファーした。メンブレンにプレハイブリダイズおよびハイブリダイズを施し、プローブ断片を、Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅラベリングキット（Amersham, High Wycome, UK）を製造元の説明書に従って用いて標識化した。
【０２３２】
（ｖ）ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成およびＲＴ−ＰＣＲ
全てのＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成は、Burton、他（Plant Physiol. 134: 224-236, 2004）に記載された通りに行った。適切な組織から得たｃＤＮＡのサンプルは、Ｅｌｏｎｇａｓｅ Ｔａｑポリメラーゼ（インビトロジェン社製）を用いて、ＰＣＲにより完全長ＣｓｌＦ配列を増幅するために、鋳型として用いた。表２に挙げられたプライマーペアは、製造元が提案する標準的レシピに従い、ＰＣＲ中で使用した。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ，５％ ｖ／ｖ、Sigma, St Louis, MO, USA）を添加し、ＰＣＲを、９４℃で３０秒間、５０℃〜５８℃（個々のプライマーのＴｍによる）で３０秒間、６８℃で３分間を４０サイクルとして実施した。プライマーは、表２に示した通り、増幅された断片をバイナリーベクターに対するクローニングを促進するための各末端の制限酵素部位を含んでいた。
【表２】
2009502180.tif 000005
【０２３３】
（ｖｉ）定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）分析
対照遺伝子および特異的ＣｓｌＦ遺伝子のプライマーペアを表３に示した通り使用した。希釈系列調製物用のＰＣＲ産物の原液は、イネまたはシロイヌナズナ組織のｃＤＮＡの成分のいずれかに由来するｃＤＮＡからＰＣＲにより調製し、精製し、次にBurton、他（2004, 前記）に記載された通り、ＨＰＬＣにより定量化した。７桁にわたる希釈系列は、以下の通り１０9コピー／μｌ原液から調製した。原液１マイクロリットルを９９μｌの水に加え、６つの１：１０の段階希釈物を調製し、１０7コピー／μｌから１０1コピー／μｌにわたる合計７種類の溶液を作製した。７つの標準溶液のそれぞれについて３つずつの複製を、最低３つの鋳型を含まない対照とともに、各Ｑ−ＰＣＲ実験ごとに含めた。全ての遺伝子について、ｃＤＮＡの１：２０希釈液は、許容範囲の標準偏差を有する発現データを作成するには十分であった。各ｃＤＮＡの３つの複製ＰＣＲを、各実験に含めた。全てのＱ−ＰＣＲ反応混合物は、ＣＡＳ−１２００ロボット（Corbett Robotics, Brisbane, Australia）で調製した。
【０２３４】
２マイクロリットルの希釈ｃＤＮＡ溶液を、５μｌのＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ試薬、４μＭにて各１μｌのフォワードおよびリバースプライマー、水に０．３μｌの１０×ＳＹＢＲ（BioWhittaker Molecular Applications, Rockland, USA、ＤＭＳＯ中１０，０００×を５００μｌの水に０．５μｌ加えて毎日調製する）および０．７μｌの水を含む反応液中で用いた。各Ｑ−ＰＣＲ反応系列の総量は１０μｌである。反応は、ＲＧ３０００  Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅリアルタイムサーマルサイクラー（Corbett Research, Sydney, Australia）において、９５℃にて１５分間保持後、９５℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃３０秒間、表３に記載の通りの最適アクイジション温度（ＡＴ）１５秒間を４５サイクルとして実施した。融解曲線は、７０℃〜９９℃で加熱することにより、増幅終了時の産物から得た。実験後、最適なサイクル閾値（ＣＴ）は、希釈系列から判定され、生の発現データが得られた。各ｃＤＮＡの３つの複製の各セットについて、平均発現レベルおよび標準偏差を求めた。
【０２３５】
外来性ＣｓｌＦ遺伝子の生の発現データは、Vandesompele、他（Genome Biol. 3: 1-11, 2002）のアプローチを用いてスケール化された。４種類のシロイズナズナ対照遺伝子のうち最良の３種類に由来する標準化係数を、Ｇｅｎｏｒｍソフトウェア（Vandesompele、他、前記, 2002）を用いて導いた。各ｃＤＮＡ中の外来性ＣｓｌＦ遺伝子の生の発現データを、特定のｃＤＮＡに関する標準化係数で生の発現値を除算することによりスケール化した。
【表３】
2009502180.tif 000006
【０２３６】
実施例３
トランスジェニックシロイヌナズナ株の免疫学的特徴
ＯｓＣｓｌＦ転写産物レベルが最も高いトランスジェニックシロイヌナズナ株を、特に細胞壁中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン沈着に関してさらに詳細な分析を行うために選択した。第１の例において、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンに特異的なモノクローナル抗体および電子顕微鏡法を含む免疫細胞化学的方法を、シロイヌナズナ株における多糖類の存在について、トランスジェニック株を選別するために使用した。使用した抗体は、セロオリゴ糖または（１→３）−β−Ｄ−グルカン、カロースとは結合しない。阻害研究により、（１，３；１，４）−β−Ｄ−オリゴグルコシドに対して比較的弱く結合することが示された。
【０２３７】
１４日齢および２８日齢の葉の小片を、モノクローナル抗体でのプローブ付けのために切断し、抗体は、市販のオオムギ（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンを用いて、プレインキュベーションにより組織の切片ごとにルーチンでチェックした。多糖類とのプレインキュベーションは、金標識二次抗体の結合をブロックする。（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、図７に示された通り、特異的なモノクローナル抗体によりいくつかのトランスジェニックシロイヌナズナ植物（シロイヌナズナ株Ａ２８、Ａ２９およびＡ１８など）の細胞壁において、検出された。図７、パネルＢにおいて、トランスジェニックシロイヌナズナ株Ａ１８からの葉の表皮層から得た細胞壁は、約１４日をかけて（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンが沈着したことを示している。多糖類は、この株のほかの組織では検出されなかった。最後に、パネルＣは、バックグラウンドの標識が通常は最小限であるか全く観察されないＷＴシロイヌナズナ葉表皮細胞壁の切片の代表的な対照パネルを示している。
【０２３８】
材料および方法
（ｉ）電子顕微鏡法のための形質転換したシロイヌナズナ葉の調製
シロイヌナズナ葉を、ｐＨ７．２のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の４％（ｖ／ｖ）のグルタールアルデヒド（ＥＭグレード）で固定し、４℃で保存した。サンプルはＰＢＳ中で３回洗浄し、ＰＢＳ中で２％の四酸化オスミウム中で室温にて１時間、後固定した。ＭｉｌｌｉＱ水中で３回すすいだ後、サンプルをエタノール系列で脱水し、数日間をかけて徐々にＬＲ  Ｗｈｉｔｅ樹脂を浸潤させた。個々の葉を、未使用の樹脂が満たされたゼラチンカプセル中に入れ、６５℃で一晩、重合させた。
【０２３９】
（ｉｉ）透過電子顕微鏡法の免疫学的標識
シロイヌナズナ葉の切片（８０ｎｍ）は、Ｌｅｉｃａ  ＵｌｔｒａｃｕｔＲミクロトームで、ダイアモンドナイフを用いて作製し、１００および２００メッシュ、Ｆｏｒｍｖａｒコーティング済ゴールドグリッドに回収した。超薄切片は、ＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン中で３０分間ブロッキングし、その後、オオムギ（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンに対して生起されたマウスのモノクローナル抗体（１：５００に希釈；Biosupplies Australia, Parkville, VIC 3052, Australia）中、室温で１時間および４℃で一晩インキュベートした。グリッドを、ＰＢＳ中で２回洗浄し、ブロッキングバッファー中で３回洗浄し、１８ｎｍのコロイド金−ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）（Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., PA, USA）中で１時間インキュベートした。全てのグリッドを、ＰＢＳ中で２回洗浄し、ＭｉｌｌｉＱ中で数回洗浄した後、２％の含水酢酸ウラニル中で染色し、続いてクエン酸鉛三重染色を施した。切片を、Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＢｉｏＴｗｉｎ透過電子顕微鏡で観察し、Ｇａｔａｎ  Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ ＣＣＤカメラで撮像した。
【０２４０】
一部の実験では、一次抗体をはぶいて、非特異的な二次抗体の結合の対照とした。他の対照実験では、抗体の特異性を確認するために一次抗体をそれぞれの多糖類に予め吸収させた。オオムギ（Biosupplies Australia）から得た（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を、同量のそれぞれの希釈した一次抗体と混合した。これらの陰性対照実験のいずれにおいても、標識は観察されなかった。
【０２４１】
本実験に関する補助データは、Burton、他、Science 311: 1940-1942, 2006に述べられている。
【０２４２】
実施例４
オオムギのＣｓｌＦ配列の特定
入手できる場合、部分ＥＳＴオオムギ配列を、ガイドとしてイネのＣｓｌＦ配列を用いて、完全ＣｓｌＦ配列に組み立てた。
【０２４３】
オオムギＥＳＴ配列が入手できなかった場合、推定コムギＣｓｌＦ配列を特定した。これは、対応するオオムギ配列に高い相同性があると思われる。コムギＥＳＴ配列に基づきプライマーを設計し、対応するオオムギ配列を増幅するために、オオムギｃＤＮＡ集団に対して使用した。３’および ５’ＲＡＣＥアプローチを用いてオオムギ配列を伸長させた。
【０２４４】
少数のケースで、対応するコムギＥＳＴのない密接に関連したオオムギ遺伝子の追加的な一部分が増幅され、ＲＡＣＥを使用して、これらも伸長させた。合計で、６つの異なるオオムギＣｓｌＦ配列が特定され、これらは、ＨｖＣｓｌＦ１、ＨｖＣｓｌＦ２、ＨｖＣｓｌＦ３、ＨｖＣｓｌＦ４、ＨｖＣｓｌＦ５およびＨｖＣｓｌＦ６と命名された。
【０２４５】
実施例５
イネおよびオオムギのＣｓｌＦ ＤＮＡ配列およびアミノ酸配列のアライメント
イネおよびオオムギ両者のＣｓｌＦ配列のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列のアライメントを行った。結果を図８に示す。
【０２４６】
タンパク質配列はＮＣＢＩのｂｌ２ｓｅｑペアワイズアライメントプログラム（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi）のデフォルトパラメーターを用いて、アライメントし、比較した。ＤＮＡアライメントに関し、ＥＭＢＯＳＳペアワイズアライメントアルゴリズム（http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/）をｗａｔｅｒ（ｌｏｃａｌ）法とともに用いた。
【０２４７】
Thompson、他（Nucl Acids Res 25: 4876-4882, 1997）に記載されたＣｌｕｓｔａｌＸプログラムを用いてマルチプル配列アライメントおよび系統樹作成を行った。得られた系統樹を図９に示す。
【０２４８】
実施例６
オオムギＣｓｌＦ遺伝子のマッピング
穀粒（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン含有量に最大の影響を及ぼすＱＴＬは、Ａｄｈ８およびＡＢＧ０１９マーカーの間のオオムギ第２Ｈ染色体上に位置し、マーカーは、Han、他（Theor. Appl. Genet. 91: 921, 1995）によるＳｔｅｐｔｏｅ×Ｍｏｒｅｘ倍加半数体（ＤＨ）においてマッピングされた通りである。
【０２４９】
ＰＣＲにより生成した６つのオオムギＣｓｌＦ ｃＤＮＡの特異的遺伝子断片を放射性標識し、コムギ・オオムギ付加株のセットから得られたＤＮＡに対してプローブとして使用した（それぞれの染色体位置を最初に確立し、遺伝子の精細マッピングを行うためのIslamおよびCliper×SaharaオオムギＤＨ集団）。
【０２５０】
コムギ・オオムギ付加株の使用により、ＨｖＣｓｌＦ２、４、５および６が、第２Ｈ染色体上に発見され、ＨｖＣｓｌＦ１は、第７Ｈに、ＨｖＣｓｌＦ３は第１ＨＳにそれぞれ発見された。ＨｖＣｓｌ２、４、５および６のためのＣｌｉｐｅｒおよびＳａｈａｒａオオムギ栽培品種（親株）の間での多型の特定、および、続くこれら親株から作出したＤＨマッピング集団のスクリーニングにより、定義される遺伝子の正確なマップ位置決定が可能になった（図１０）。したがって、これら４つのオオムギＣｓｌＦ遺伝子は、オオムギ第２Ｈ染色体上の穀粒（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン含有量のメジャーなＱＴＬに一致することが分かった。これは、１以上のこれらの遺伝子が、オオムギ粒（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン含有量に直接影響を及ぼす可能性があることを示唆している。
【０２５１】
材料および方法
コムギ・オオムギ付加株（Islam、他、Heredity 46: 161-174 1981）の消化済みゲノムＤＮＡのフィルターを、染色体レベルで遺伝子をマッピングするために使用した。オオムギＤＨマッピング集団Clipper×Saharaを、ＨｖＣｓｌＦ遺伝子を精細にマッピングするために使用した（Karakousis、他、Aust. J. Ag. Res. 54: 1137-1140, 2003）。標準的方法を使うサザンハイブリダイゼーション分析のための、消化済みゲノムＤＮＡフィルターの両方のセットは、Peter Langridge教授（Australian Centre for Plant Functional Genomics, University of Adelaide）から提供して頂いた。遺伝子座は、Ｍａｐ  Ｍａｎａｇｅｒ  ＱＴＸソフトウェア（Manly  et al., Mammalian Genome 12: 930-932, 2001）を用いて位置決定した。
【０２５２】
実施例７
トランスジェニックオオムギ植物でのオオムギＣｓｌＦ遺伝子の過剰発現
（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン合成でのオオムギＣｓｌＦ遺伝子ファミリーの個々のメンバーの役割を、強力な構成的プロモーターであるＣａＭＶ ３５Ｓの制御下に遺伝子をGolden Promiseオオムギ植物のゲノムに挿入することにより調べた。オオムギ遺伝子ＣｓｌＦ１、ＣｓｌＦ４およびＣｓｌＦ６の完全ｃＤＮＡは、表４に示したプライマーおよび高フィデリティーポリメラーゼを用いてＰＣＲにより増幅し、配列決定して、ＰＣＲ導入エラーを含まないことを確認した。ＰＣＲ断片は、図１１に示したバイナリーベクターｐＭＤＣ３２にクローニングした。
【０２５３】
プラスミドベクターは、次にアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）に挿入し、これを標準的な形質転換手法（Tingay、他、Plant J. 11: 1369-1376, 1997、 Matthews、他、Mol. Breeding 7: 195-202, 2001）によりオオムギ栽培品種であるGolden Promiseを形質転換するために使用した。
【０２５４】
ハイグロマイシンでの選択に続き、トータルＲＮＡをトランスジェニック苗から抽出し、Ｑ−ＰＣＲにより内在性および組み込まれたトランスジーンの転写をモニタリングした（Burton 、他、Plant Phys. 134: 224-236, 2004）。表５に示されたプライマーを使用した選択可能なマーカー遺伝子ハイグロマイシンの転写についてのＱＰＣＲの結果を、図１２に示す。野生型、非形質転換対照植物（株ＷＴ１−３）のｃＤＮＡ中にはハイグロマイシンに関するＰＣＲ産物は見られないが、ＣｓｌＦファミリーと無関係の遺伝子を含む形質転換された対照（Ｇ８９株）を含む、ハイグロマイシントランスジーンについてのトランスジェニックである全ての植物は、陽性レベルのハイグロマイシンＱＰＣＲ産物（図２）を示している。
【０２５５】
３つのＨｖＣｓｌＦ遺伝子の転写についても、表５に記載のプライマーを使用して、これらの植物について試験した。標準化ｍＲＮＡレベルを、トランスジェニック集団全体および対照植物にわたってＨｖＣｓｌＦ１、ＨｖＣｓｌＦ４およびＨｖＣｓｌＦ６について示す。３５Ｓ：ＨｖＣｓｌＦ１により形質転換した植物はＧ９８と記され、これらの株のＨｖＣｓｌＦ１遺伝子の過剰発現は、ＷＴＣ、Ｇ８９、Ｇ９９およびＧ１０３群（図１３）中の内在性遺伝子の過剰発現を超える有意なレベルで顕著である。特に高いレベルの転写産物は、植物９８−１０、９８−１１および９８−２４に見られる（図１３）。３５Ｓ：ＨｖＣｓｌＦ４により形質転換した植物は、Ｇ１０３と記され、これらの株のＨｖＣｓｌＦ４遺伝子の過剰発現は、ＷＴＣ、Ｇ８９、Ｇ９９およびＧ９９群（図１４）中の内在性遺伝子の過剰発現を超える有意なレベルで顕著である。最も高いレベルの転写産物は、植物１０３−５に見られる（図１４）。最後に、３５Ｓ：ＨｖＣｓｌＦ６により形質転換した植物は、Ｇ９９と記され、これらの株のＨｖＣｓｌＦ６遺伝子の過剰発現は、ＷＴＣ、Ｇ８９、Ｇ９８およびＧ１０３群（図１５）中の内在性遺伝子の過剰発現を超える有意なレベルで顕著であり、株９９−６および９９−１１に見られる最も高いレベルの転写産物を伴う（図１５）。
【０２５６】
材料および方法
（ｉ）バイナリーベクター構築
バイナリーベクターｐＭＤＣ３２は、マーク・カーティス博士、チューリッヒ大学（http://www.unizh.ch/botinst/Devo_Website/curtisvector/index_2.html）から頂戴したものであるが、ハイグロマイシン耐性遺伝子、および遺伝子過剰発現が望まれるオオムギ形質転換実験における使用に適したＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを有する、Ｇａｔｅｗａｙ可能な（Invitrogen社）バイナリーベクターである（Curtis and Gossniklaus, Plant Phys 133: 462-469, 2003）。表４に示されたプライマーで増幅されたオオムギＨｖＣｓｌＦ ｃＤＮＡに相当する完全長ＰＣＲ生成物は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＡＢＩ３７００キャピラリーシーケンサーでＢｉｇＤｙｅ ３．１化学（ＡＢＩ）を用いて配列決定された。正しいｃＤＮＡは、ＧａｔｅｗａｙエントリーベクターｐＤＥＮＴＲ−Ｔｏｐｏ（Invitrogen社製）に再結合された。ｃＤＮＡの向きは、制限酵素消化により確認し、次にエントリークローンを、デスティネーションベクターとしてｐＭＤＣ３２とのＬＲ再結合反応（Invitrogen社）中で使用した。ｐＭＤＣ３２への挿入の成功は、制限酵素消化により確認され、確認されたインサートを含むプラスミドＤＮＡ調製物で、Mersereau、他（Gene 90: 149, 1990）の方法を用いるエレクトロポレーションを介してアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ｃｖＡＧＬ０を形質転換し、陽性コロニーを、２５ｍｇ／ｌのリファンピシンおよび２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む培地上で選択した。
【０２５７】
（ｉｉ）オオムギ形質転換
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）媒介形質転換実験は、Tingay、他（1997, 前記）により開発され、Matthews、他（2001, 前記）により改変された手法を用いて実施した。発育中の穂を、未成熟の胚芽が直径約１〜２ｍｍになった時点で、温室で育てたドナー植物（cv. Golden Promise）から採取した。未成熟の胚芽を、表面消毒した穀粒から無菌的に切除し、胚盤は胚軸を取り除いて単離した。WanおよびLemauxのレシピに基づき（Plant Phys. 104: 37-48, 1994）、単離されたばかりの２５個の胚盤を、切断面を上にして、カルス誘導培地の入った９０ｍｍ×１０ｍｍのペトリ皿の中央において培養した。この培地は、ＭＳマクロ栄養素（MurashigeおよびSkoog, Physiologia Plant. 15: 473-497, 1962）、３０ｇ／Ｌのマルトースを添加したＦＨＧミクロ栄養素、１ｍｇ／Ｌのチアミン−ＨＣＩ、０．２５ｇ／Ｌのミオイノシトール、１ｇ／Ｌのカゼイン加水分解物、０．６９ｇ／ＬのＬ−プロリン、１０μＭのＣｕＳＯ４、２．５ｍｇ／Ｌのジカンバ（３，６−ジクロロ−ｏ−アニス酸）から構成され、３．５ｇ／ＬのＰｈｙｔａｇｅｌ(商標)（Sigma Chemicals, St. Louis, MO, USA）により固形化した。アグロバクテリウム（Agrobacterium）懸濁液（５０μｌ）を、胚盤上に分配し、ペトリ皿を４５度の角度に傾けて、余分な細菌懸濁液を除いた。外植片を裏返し、ペトリ皿の端に培地の表面を片寄せた。胚盤は、カルス導入培地の新しいプレートに移動し、切断面を上にして２２℃〜２４℃の暗所で３日間培養した。共培養後、胚盤を９５μＭハイグロマイシンＢ（Becton Dickinson Biosciences, Palo Alto, CA, USA）を含む新しいカルス導入培地に移し、暗所で培養した。個々の胚盤の全カルスは、さらに６週間、二晩ごとに新しい選択培地へ移し換えた。カルス選択期間終了と同時に、各処理された胚盤から得られたカルスをシュート再生培地に移し換えた。この培地は、WanおよびLemaux（1994, 前記）のＦＨＧレシピに基づいている。これは、ＦＨＧマクロ栄養素およびミクロ栄養素、１ｍｇ／Ｌチアミン−ＨＣＩ、１ｍｇ／Ｌのベンジルアミノプリン、０．２５ｇ／Ｌのミオイノシトール、０．７３ｇ／ＬのＬ−グルタミン、６２ｇ／Ｌのマルトース、１０μＭのＣｕＳＯ４、３８μＭハイグロマイシンＢを含み、３．５ｇ／ＬのＰｈｙｔａｇｅｌ(商標)により固形化した。培養物は、２２〜２４℃で３週間から４週間光曝露（昼１６時間／夜８時間の光周期）した。再生シュートを、カルスから切り離し、９５μＭハイグロマイシンＢを添加したホルモン不含のカルス誘導培地が入った培養ボックス（Magenta Corporation, Chicago, IL, USA）に移し換えて、根形成を誘導した。活発に育っている組織培養で得た植物を土壌に定着させ、成熟させた（Singh、他、Plant Cell, Tissue and Organ Culture 49:121-127 1997）。全ての培地は、共培養後にアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の成長を阻害するために、１５０ｍｇ／ＬのＴｉｍｅｎｔｉｎ(登録商標)（SmithKline Beecham, Pty. Ltd., Melbourne, Australia）を含んでいた。
【０２５８】
（ｉｉｉ）ＲＮＡ抽出物およびｃＤＮＡ合成
トータルＲＮＡは、ＴＲＩＺＯＬを用いて、上記の通りＭａｇｅｎｔａボックスで成長している苗の葉から抽出し、ｃＤＮＡを、Burton、他（Plant Phys 134: 224-236, 2004）に記載のように逆転写酵素Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Invitrogen社）を用いて合成した。
【０２５９】
（ｉｖ）定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）解析
対照遺伝子のプライマーペア（Burton、他、2004, 前記）および特異的ＣｓｌＦ遺伝子のプライマーペアは、表５に示した通り使用した。希釈系列の調製物用のＰＣＲ産物の原液は、オオムギ組織ｃＤＮＡのいずれかの成分に由来するｃＤＮＡからＰＣＲにより調製し、次にBurton、他（2004, 前記）により記載された通り、ＨＰＬＣにより精製および定量化を行った。７桁にわたる希釈系列を、 以下の通り１０９コピー／μｌ原液から調製した：１μｌの原液を９９μｌの水に加え、６つの１：１０系列希釈液を調製して、１０７コピー／μｌから１０１コピー／μｌにわたる合計７つの溶液を作製した。各Ｑ−ＰＣＲ実験ごとに７つの標準溶液のそれぞれについて３つの複製を、最低３つの鋳型を含まない対照と共に含めた。すべての遺伝子について、ｃＤＮＡの１：２０の希釈物は、許容範囲の標準偏差を有する発現データを得るのに十分であった。各ｃＤＮＡの３つの複製ＰＣＲを、各実験に含めた。全てのＱ−ＰＣＲ反応混合物は、ＣＡＳ−１２００ロボット（Corbett Robotics, Brisbane, Australia）で調製した。
【０２６０】
２μｌの希釈されたｃＤＮＡ溶液を、５μｌのＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ試薬、４μＭにて１μｌのフォワードおよびリバースプライマー、０．３μｌの１０×ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（水中；10,000x in DMSO, BioWhittaker Molecular Applications, Rockland, USA；５００μｌの水に０．５μｌを添加して毎日調製）、および０．７μｌの水を含む反応液中で使用した。各Ｑ−ＰＣＲ反応混合物の総量は、１０μｌである。反応は、以下の通りＲＧ ３０００ Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ リアルタイムサーマルサイクラー（Corbett Research, Sydney, Australia）で実施した：９５℃にて１５分間保持後、９５℃で２０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間および最適アクイジション温度（ＡＴ）で１５秒間を４５サイクル行った。融解曲線は、７０℃〜９９℃に加熱することにより、増幅後に産物から得た。実験後、最適サイクル閾値（ＣＴ）を、希釈系列から判定し、生の発現データを得た。各ｃＤＮＡの３つの複製セットについて、平均発現レベルおよび標準偏差を算出した。
【０２６１】
ＨｖＣｓｌＦ遺伝子の生の発現データは、Vandesompele、他（Genome Biol. 3: 1-11, 2002）のアプローチを用いてスケール化した。４種類のオオムギ対照遺伝子のうち最良の３種類からの標準化係数を、Ｇｅｎｏｒｍソフトウェア（Vandesompele et al., 前記, 2002）を用いて導いた。各ｃＤＮＡ中の外来性ＣｓｌＦ遺伝子の生の発現データは、特定のｃＤＮＡについての標準化係数で生の発現値を除算することによりスケール化した。
【表４】
2009502180.tif 000007
【表５】
2009502180.tif 000008
【０２６２】
実施例８
光学顕微鏡のレベルでのトランスジェニックオオムギ株中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの免疫学的検出
３５Ｓプロモーターにより制御されるＨｖＣｓｌＦ１、ＨｖＣｓｌＦ４またはＨｖＣｓｌＦ６転写産物レベルが最も高い、実施例７に記載のトランスジェニックオオムギ株は、細胞壁中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの沈着に関してさらに分析するために、選択された。葉の切片は、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンに特異的なモノクローナル抗体を蛍光団コンジュゲート二次抗体により検出し、それを光学顕微鏡により観察する免疫学的方法を用いて、オオムギ株における多糖類の存在についてスクリーニングされた。内在性ＣｓｌＦ遺伝子の発現により、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、葉などの栄養組織の細胞壁に通常沈着する。また、オオムギ苗の新生組織中でのその存在と分布は、TretheweyおよびHarris（New Phytologist 154: 347-358, 2002）によりＴＥＭレベルで報告されている。対照葉切片における内在性（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの分布パターンを、オオムギＣｓｌＦ遺伝子を過剰発現するトランスジェニック葉のサンプルにより示されたパターンと対比させる。
【０２６３】
実施例７に記載の植物群を代表する葉小片を、固定し、パラフィンに包埋した。スライドにマウントした切片は、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンに結合する特異的モノクローナル抗体（一次抗体）で処理し、洗浄後、蛍光団コンジュゲートＡｌｅｘａ４８８（二次抗体）を添加した。切片をバッファーですすぎ、封入剤を添加し、適切な蛍光フィルターにより顕微鏡を使用して撮像した。全ての画像は、７秒の標準曝露時間で撮像した。全体的な形態および様々な細胞タイプの位置は、全ての細胞壁材料に非特異的に蛍光を生じさせる、ＵＶフィルターを使って特定された（図１６）。特異的抗体シグナルは、Ｉ３フィルターを用いて観察された（図１７および１８）。
【０２６４】
一次抗体、二次抗体または両方の抗体なしで処理したサンプルから採集した全ての対照切片は、４００×倍率で非常に低いレベルの蛍光を示した（図１７）。一次抗体および二次抗体による標識は、Ｉ３フィルターを用いると緑色のシグナルとして現れる（図１８）。両方の抗体を用いて予想される通り、内在性（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、野生型（ＷＴ、図１８Ｅ）およびトランスジェニック対照（Ｇ８９、図１８Ｆ）から得られた組織切片上で明らかであり、シグナルは、主に葉肉細胞および切片の中間領域の維管束に集中していた。ＵＶの下で、全切片中の全細胞が存在し、無傷であることは確かであった。一方で、トランスジェニックＧ９８およびＧ１０３植物は、Ｇ９８−１０（図１８Ａ）、Ｇ９８−２４（図１８Ｂ）およびＧ１０３−５（図１８Ｃ）などのように、シグナル強度の増加傾向を示し、表皮細胞および厚壁線維細胞は、非常に強く標識化されている。圧壁細胞は、肥厚した二次細胞壁を有し、TretheweyおよびHarris（2002, 前記）は、野生型苗から採取したこれら細胞ではＴＥＭレベルで希薄な標識化しか検出しなかった。Ｇ９９−１２など、Ｇ９９植物により示された標識化パターン（図１８Ｄ）は、野生型およびトランスジェニック対照により示されたパターン、およびＧ９８およびＧ１０３植物とも異なる。この場合、蛍光は、気孔細胞および維束管の一部分にのみ見られる。
【０２６５】
これらの結果は、個々のオオムギＣｓｌＦ遺伝子の過剰発現が、上昇したタンパク質レベルのグルカンシンターゼ酵素を導く可能性があり、したがって、これらトランスジェニック植物の細胞壁中、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの沈着増加を導くことを示している。
【０２６６】
材料および方法
（ｉ）光学顕微鏡法のための形質転換したオオムギ葉の調製
オオムギ葉小片を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．２中の、０．２５％（ｖ／ｖ）のグルタールアルデヒド、４％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒド（ＥＭグレード）および４％のスクロースで固定し、４℃で一晩保存した。サンプルは、ＰＢＳ中で３回洗浄し、エタノール系列中で脱水し、ゆっくり数日間をかけてパラフィンを浸潤させた。ブロックをトリミングし、６μｍに切片化した。
【０２６７】
（ｉｉ）蛍光団コンジュゲート抗体による光学顕微鏡のための免疫標識化
切片は、キシレン中で脱パラフィンし、１００％、９０％、７０％のエタノール溶液により徐々に再水和させた。１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）により２回すすいだ後、残留アルデヒド基を不活性化するために、切片を２０分間０．０５Ｍグリシンとインキュベートした。切片を、非特異的結合を防ぐために、インキュベーションバッファー（１×ＰＢＳ中、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））で２×１０分間ブロッキングした。スライドの水気を切り、特異的一次抗体ＢＧ１（BioSupplies, Melbourne, Australia）を、１：５０の希釈比率で添加し、湿チャンバーで１時間インキュベートした。未結合一次抗体を、インキュベーションバッファーで３×１０分間すすいで除去し、二次抗体Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ(登録商標)４８８ヤギ抗体マウスＩｇＧ（Molecular Probes, Eugene, USA）を添加した。スライドを、光を除くために、アルミホイルで包み、室温で２時間インキュベートした。未結合二次抗体は、インキュベーションバッファーで３×１０分間すすぐことにより除去し、封入剤（９０％グリセロール：１０％水）を数滴載せ、切片にカバーガラスをかけた。対照では、一次抗体、二次抗体または両方の抗体のいずれかを除いた。ＤＦＣ４８０ＣＣＤカメラを使い、フィルターＤ（ＵＶ、励起３５５〜４２５ｎｍ）またはフィルターＩ３（青、励起４５０〜４９０ｎｍ）の下で、Ｌｅｉｃａ  ＡＳ  ＬＭＤ顕微鏡で撮像した。示した全てのイメージは、蛍光強度を標準化するために、７秒の曝露時間で４００×倍率で撮影した。
【０２６８】
実施例９
透過電子顕微鏡を用いたトランスジェニックオオムギ中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの免疫学的検出
３５Ｓプロモーターにより制御されるＨｖＣｓｌＦ１、４または６の転写産物レベルが最も高い、実施例７および８に記載のトランスジェニックオオムギ株は、細胞壁中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの沈着に関し、さらに分析を行うために選択された。実施例３に記載の、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンに特異的なモノクローナル抗体および電子顕微鏡法を使用する免疫細胞化学的な方法を用いて、オオムギ株中の多糖の存在について葉の切片をスクリーニングした。内在性ＣｓｌＦ遺伝子の発現により、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは葉などの栄養組織の細胞壁に通常沈着する。また、オオムギ苗の新生組織中での存在と分布は、TretheweyおよびHarris（New Phytologist 154: 347-358, 2002）によって、ＴＥＭレベルで報告されている。光学顕微鏡レベルで対照材料中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの分布を、実施例７でのオオムギＣｓｌＦ遺伝子を過剰発現する苗の葉切片に示されるものと比較した。特異的なモノクローナル抗体およびＴＥＭを用いる同じ株のサブセットの繰り返し分析は、個々の細胞壁をより精密に試験することができるものであり、ここで説明する。
【０２６９】
実施例７で述べた植物群を代表する葉小片を採取し、固定し、ＬＲ  Ｗｈｉｔｅ樹脂中に包埋した。封入した切片を、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンに結合する特異的モノクローナル抗体およびコロイド金を用いて処理した。
【０２７０】
内在性（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの存在は、野生型（ＷＴ）およびトランスジェニック対照（Ｇ８９）葉から得た切片で、予想通り明らかに顕著であった。対照的に、Ｇ９８−１０およびＧ１０３−５などのトランスジェニックＧ９８およびＧ１０３植物から得た切片は、非常に強い標識化を示す。対照Ｇ８９の標識化した表皮細胞壁を図１９Ａに示した。トランスジェニックＧ９８−１０およびＧ１０３−５の同等の表皮細胞壁を図１９Ｂ（Ｇ９８−１０）および図１９Ｃ（Ｇ１０３−５）に示した。図中標識量が増えているのが明らかである。図２０Ａは、軽度に標識化されたＧ８９対照中の厚壁線維細胞壁を示している。かかる細胞は、厚みを増した二次細胞壁を有しているが、TretheweyおよびHarris（2002, 前記）もまた野生型苗から採取したこれら線維中でＴＥＭレベルでわずかながら標識化を検出した。それに比べて、図２０Ｂおよび２０Ｃにそれぞれ示された、Ｇ９８−１０およびＧ１０３−５から得た線維細胞壁は、より強く標識化されている。これらの結果は、個々のＣｓｌＦ遺伝子の過剰発現が、トランスジェニック植物の細胞壁中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの沈着を増加させている可能性があることを示している。これは、光学顕微鏡レベル（実施例７）でのグルカン検出のために蛍光団を用いること、および本実施例で実証された通り、ＴＥＭレベルで免疫金標識化を採用することの両者により実証された。
【０２７１】
材料および方法
（ｉ）電子顕微鏡法のための形質転換したオオムギ葉の調製
オオムギ苗葉の小片は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．２中の、０．２５％（ｖ／ｖ）のグルタールアルデヒド、４％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒド（ＥＭグレード）および４％のスクロースで固定し、４℃で一晩保存した。ＭｉｌｌｉＱ水中で３回洗浄した後、サンプルをエタノール系列中で脱水し、ゆっくり数日間をかけてＬＲ  Ｗｈｉｔｅ樹脂を浸潤させた。個々の葉の小片を、新しい樹脂を満たしたゼラチンカプセルに入れ、６５℃で一晩重合させた。
【０２７２】
（ｉｉ）透過電子顕微鏡法のための免疫標識化
オオムギ葉の切片（８０ｎｍ）は、ダイヤモンドナイフを用いてＬｅｉｃａ  Ｕｌｔｒａｃｕｔ Ｒミクロトームで作製し、１００および２００のメッシュ、Ｆｏｒｍｖａｒコーティングしたゴールドグリッドに回収した。超薄断片は、ＰＢＳ中１％ウシ血清アルブミンにて３０分間ブロッキングし、続いてオオムギ（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンに対して生起したマウスのモノクローナル抗体中（希釈率１：５０００、Biosupplies Australia, Parkville, VIC 3052, Australia）で１時間室温および一晩４℃でインキュベートした。グリッドを、ＰＢＳ中で２回洗浄し、３回ブロッキングバッファーで洗浄した後、１８ｎｍのコロイド金ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）（Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., PA, USA）中で１時間インキュベートした。全てのグリッドを、ＰＢＳで２回、ＭｉｌｌｉＱ水で数回洗浄した後、Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＢｉｏＴｗｉｎ透過電子顕微鏡で観察し、Ｇａｔａｎ  Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ  ＣＣＤカメラで撮像した。
【０２７３】
当業者であれば、本明細書に記述されている本発明が、具体的に記述されているもの以外の変形および変更を許容することを理解するであろう。本発明はそのような全ての変形および変更を含むと理解されるべきである。本発明は同様に、個別的にまたは集合的に、本明細書において述べられ、または示されているステップ、特徴、組成物および化合物の全て、ならびに該ステップまたは特徴のいずれか２つ以上の任意のおよび全ての組合せを含む。
【０２７４】
同様に、本明細書において用いられる単数形の「１つの（a）」、「１つの（an）」および「その（the）」は、文脈上既に特段の指示がないかぎり、複数の態様を含むことに留意しなければならない。すなわち、例えば、「トランスジーン（a transgene）」への言及は、単一のトランスジーンだけでなく２つ以上のトランスジーンを含む；「植物細胞(a plant cell)」は単一の細胞だけでなく２つ以上の細胞を含む、など。
【図面の簡単な説明】
【０２７５】
【図１】オオムギ第２Ｈ染色体の一定領域にシンテニーであるイネの第７染色体上の領域を示す。６つのセルロースシンターゼ様（Ｃｓｌ）遺伝子のクラスターが、染色体の２１．５９−２１．７２  Ｍｂに対応する１１９Ｋｂの区画で検出された。
【図２】シロイヌナズナでＣｓｌＦ遺伝子を発現させるために使用されるｐＡＪ２２ベクターのベクターマップを示す。
【図３】ＯｓＣｓｌＦ２、ＯｓＣｓｌＦ４およびＯｓＣｓｌＦ８からの断片を用いてプローブされた形質転換シロイヌナズナ植物由来のＸｂａＩおよびＳｃａＩ消化ＤＮＡを示すサザンブロットである。これらについてハイブリダイズした断片は、図面上でＦ２、Ｆ４およびＦ８と、記号が付されている。レーン番号１〜１４は、それぞれ植物株Ａ２、Ａ３、Ａ７、Ａ１２、Ａ１６、Ａ１８、Ａ２１、Ａ２３、Ａ２８、Ａ２９、Ａ３１、Ａ３３、Ａ４１およびＡ４２であり、レーン１５は、野生型Columbia植物由来のＤＮＡを示す。
【図４】ＢＡＲ遺伝子の断片でプローブされた、形質転換シロイヌナズナ植物由来のＸｂａｌ消化ＤＮＡを示すサザンブロット法ある。トラック番号１〜１４は、それぞれ植物株Ａ２、 Ａ３、Ａ７、Ａ１２、Ａ１６、Ａ１８、Ａ２１、Ａ２３、Ａ２８、Ａ２９、Ａ３１、Ａ３３、Ａ４１およびＡ４２であり、トラック１５は、野生型Columbia植物由来のＤＮＡを示す。
【図５】ＯｓＣｓｌＦ２、ＯｓＣｓｌＦ４またはＯｓＣｓｌＦ８の１以上を発現する１４日齢のトランスジェニックシロイヌナズナ植物の葉での、Ｑ−ＰＣＲにより判定された、標準化ｍＲＮＡレベルを示す。
【図６−１】オオムギ（Hordeum vulgare）およびイネ（Oryza sativa）由来のＣｓｌＦアミノ酸配列のＣｌｕｓｔａｌＷマルチプル配列アライメントを示す。
【図６−２】オオムギ（Hordeum vulgare）およびイネ（Oryza sativa）由来のＣｓｌＦアミノ酸配列のＣｌｕｓｔａｌＷマルチプル配列アライメントを示す。
【図６−３】オオムギ（Hordeum vulgare）およびイネ（Oryza sativa）由来のＣｓｌＦアミノ酸配列のＣｌｕｓｔａｌＷマルチプル配列アライメントを示す。
【図６−４】オオムギ（Hordeum vulgare）およびイネ（Oryza sativa）由来のＣｓｌＦアミノ酸配列のＣｌｕｓｔａｌＷマルチプル配列アライメントを示す。
【図６−５】オオムギ（Hordeum vulgare）およびイネ（Oryza sativa）由来のＣｓｌＦアミノ酸配列のＣｌｕｓｔａｌＷマルチプル配列アライメントを示す。
【図６−６】オオムギ（Hordeum vulgare）およびイネ（Oryza sativa）由来のＣｓｌＦアミノ酸配列のＣｌｕｓｔａｌＷマルチプル配列アライメントを示す。
【図７】特異的モノクローナル抗体を使ったいくつかのトランスジェニックシロイヌナズナ植物の細胞壁中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの検出を図示する透過電子顕微鏡写真である。パネルＡは、形質転換シロイズナズナ株Ａ２８およびＡ２９中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの検出を示す。パネルＢでは、トランスジェニックシロイヌナズナ株Ａ１８の葉の表皮層からの細胞壁を示し、約１４日間で（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンが沈着していることを示している。最後に、パネルＣは、通常、バックグラウンド標識化が最小限しかないか、または全く見られないＷＴシロイヌナズナ葉表皮細胞壁の代表的な切片を示している。
【図８】イネ（Oryza sativa）およびオオムギ（Hordeum vulgare）由来のＣｓｌＦ配列間のヌクレオチド配列同一性、タンパク質配列同一性および、タンパク質配列の類似性を示している。
【図９】オオムギ（Hordeum vulgare）およびイネ（Oryza sativa）由来の完全および部分ＣｓｌＦアミノ酸配列の関係を示す系統樹である。
【図１０】Ｓｔｅｐｔｏｅ × Ｍｏｒｅｘの第２Ｈ染色体（ＳｘＭ ２Ｈ）ＢＩＮマップ上のＨｖＣｓｌＦ２、４、５および６遺伝子の位置を示している。主要マーカー（図１の通り）は、右側に示されており、センチモルガンでの染色体頂部からの距離は、左側に表されている。
【図１１】ｐＭＤＣ３２ベクターのマップを示す。
【図１２】対照およびトランスジェニックオオムギ植物におけるハイグロマイシン転写産物レベルのＱＰＣＲ分析結果を示す。
【図１３】対照およびトランスジェニックオオムギ植物におけるＨｖＣｓｌＦ１転写産物レベルのＱＰＣＲ分析結果を示す。
【図１４】対照およびトランスジェニックオオムギ植物におけるＨｖＣｓｌＦ４転写産物レベルのＱＰＣＲ分析結果を示す。
【図１５】対照およびトランスジェニックオオムギ植物におけるＨｖＣｓｌＦ６転写産物レベルのＱＰＣＲ分析結果を示す。
【図１６】細胞形態を実証するためにＵＶ下の葉の自己蛍光を示す。ａｂ＝背軸面、ａｄ＝向軸面、ｂｓ＝線維束鞘細胞、ｂｕｌ＝機動細胞（bulliform cell）、ｅ＝表皮細胞、ｍ＝葉肉細胞、ｐ＝師部、ｓｃｌ＝圧膜組織線維、ｓｔ＝気孔、ｘ＝木質部。
【図１７】一次抗体と二次抗体の両方を標識化手順から除外した、Ｉ３フィルターでの７秒間の曝露で撮影されたＧ９８−１０を示す。
【図１８−１】対照植物（ＥおよびＦ）と比較したトランスジェニック植物（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）を示す。全てＩ３フィルターに７秒間曝露して撮影したものである。（Ａ）Ｇ９８−１０および（Ｂ）Ｇ９８−２４の両者は、対照切片と比較すると、葉先端の表皮細胞および厚膜組織線維の増加した蛍光を示している。
【図１８−２】対照植物（ＥおよびＦ）と比較したトランスジェニック植物（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）を示す。全てＩ３フィルターに７秒間曝露して撮影したものである。（Ｃ）Ｇ１０３−５：対照切片と比較して、全ての細胞タイプにおいて増加した蛍光を示す。（Ｄ）Ｇ９９−１２：対照切片と比較して、気孔および線維束組織中の増加した蛍光を示す。
【図１８−３】対照植物（ＥおよびＦ）と比較したトランスジェニック植物（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）を示す。全てＩ３フィルターに７秒間曝露して撮影したものである。（Ｅ）ＷＴ対照：内在性（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンからの蛍光シグナルを示す。（Ｆ）トランスジェニック対照Ｇ８９−１：内在性（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンからの蛍光シグナルを示す。
【図１９−１】透過電子顕微鏡写真を示す。パネルＡは、内在性レベルの（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの標識化を表す、トランスジェニック対照Ｇ８９−１の代表的な表皮細胞壁を示す。パネルＢは、これら植物の細胞壁中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの有意に強い標識化を表すトランスジェニック対照Ｇ８９−１の代表的な表皮細胞壁を示す。
【図１９−２】透過電子顕微鏡写真を示す。パネルＡは、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの内在性レベルの標識化を示す、トランスジーン対照Ｇ８９−１の代表的な表皮細胞壁を示す。パネルＣは、これら植物の細胞壁中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの有意に強い標識化を示すトランスジェニック対照Ｇ１０３−５の代表的な表皮細胞壁を示す。
【図２０−１】透過電子顕微鏡写真を示す。パネルＡは、内在性レベルの（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの標識化を表すトランスジェニック対照Ｇ８９−１からの代表的な厚膜組織線維細胞壁である。パネルＢは、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの比較的強い標識化を示すトランスジェニックＧ９８−１０からの代表的な厚膜組織線維細胞壁を示す。
【図２０−２】透過電子顕微鏡写真を示す。パネルＣは（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの比較的強い標識化を示す、トランスジェニックＧ１０３−５からの厚膜組織線維細胞壁を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2009502180.tif 000038
2009502180.tif 000039
2009502180.tif 000040
2009502180.tif 000041
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