(57)【要約】本発明は、血管発生を調節するためにＤＬＬ４モジュレーターを使用する方法を提供する。更に、ＤＬＬ４アンタゴニストのようなＤＬＬ４モジュレーターを使用する治療法が提供される。本発明は、ノッチ受容体経路のデルタ様４（同じ意味で「ＤＬＬ４」と呼ばれる）活性化を調節する薬剤による処理によって血管発生が阻害されるという発見に部分的に基づく。ＤＬＬ４アンタゴニストによる処理は、腫瘍血管を含む血管において、内皮細胞（ＥＣ）増殖の増加、不適切な内皮細胞分化および不適切な動脈発生をもたらした。驚くべきことに、抗ＤＬＬ４抗体による処理はいくつかの異なる癌において腫瘍増殖の阻害をもたらした。したがって本発明は、血管形成に関与する過程の調節（例えば、促進または阻害）のための、および血管形成に関連する病理学的症状を標的とする使用のための方法、組成物、キットおよび製品を提供する。
2009539870.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍、癌または細胞増殖障害を治療する方法であって、そのような治療を必要とする被験体への有効量のＤＬＬ４アンタゴニストの投与を含み、それによって該腫瘍、癌または細胞増殖障害が治療される、方法。
【請求項２】
前記腫瘍、癌または細胞増殖障害が、結腸癌、肺癌、メラノーマまたはリンパ腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
血管形成に関連する病理学的状態を治療する方法であって、そのような治療を必要とする被験体への有効量のＤＬＬ４アンタゴニストの投与を含み、それによって血管形成に関連する病理学的状態が治療され、該ＤＬＬ４アンタゴニストが、内皮細胞増殖を刺激、内皮細胞分化を阻害、動脈発生を阻害、または血管灌流を阻害することができる、方法。
【請求項４】
前記血管形成に関連する病理学的状態が、腫瘍、癌、および／または細胞増殖障害である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記血管形成に関連した病理学的状態が眼内血管新生疾患である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
そのような治療を必要とする被験体における内皮細胞増殖を刺激する方法であって、該被験体への有効量のＤＬＬ４アゴニストの投与を含み、それによって内皮細胞増殖が刺激される、方法。
【請求項７】
そのような治療を必要とする被験体の内皮細胞分化を減少または阻害する方法であって、該被験体への有効量のＤＬＬ４アンタゴニストの投与を含み、それによって内皮細胞増殖が阻害される、方法。
【請求項８】
そのような治療を必要とする被験体の動脈発生を減少または阻害する方法であって、該被験体への有効量のＤＬＬ４アンタゴニストの投与を含み、それによって動脈発生が阻害される、方法。
【請求項９】
そのような治療を必要とする被験体の腫瘍の血管灌流を減少または阻害する方法であって、該被験体への有効量のＤＬＬ４アンタゴニストの投与を含み、腫瘍の血流灌流が阻害される、方法。
【請求項１０】
前記被験体への有効量の抗血管形成剤の投与をさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗血管形成剤が、前記ＤＬＬ４アンタゴニストの投与の前にまたは続いて投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗血管形成剤が前記ＤＬＬ４アンタゴニストと同時に投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗血管形成剤が血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）のアンタゴニストである、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＶＥＧＦアンタゴニストが抗ＶＥＧＦ抗体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗ＶＥＧＦの抗体がベバシズマブである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
有効量の化学療法剤の投与をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
血管形成に関連する病理学的状態を有する被験体における抗血管形成剤の有効性を促進する方法であって、該抗血管形成剤との組合せで有効量のＤＬＬ４アンタゴニストを該被験体へ投与し、それによって該抗血管形成剤の阻害活性を促進することを含む、方法。
【請求項１８】
前記血管形成に関連する病理学的状態が、腫瘍、癌、および／または細胞増殖障害である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記血管形成に関連する病理学的状態が眼内血管新生疾患である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＤＬＬ４アンタゴニストが抗ＤＬＬ４の抗体である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＤＬＬ４アンタゴニストがＤＬＬ４イムノアドヘジンである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＤＬＬ４抗体がモノクローナル抗体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＤＬＬ４抗体がヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＤＬＬ４抗体が抗体フラグメントである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
抗体フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２またはｓｃＦｖである、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に血管発生の調節のために有用な組成物および方法に関する。部分的に、本発明は、血管形成に関連した障害の診断および治療のためのデルタ様４（ＤＬＬ４）アンタゴニストの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
血管供給の発生は多くの生理学的および病理学的過程のための基本的な必要条件である。胚および腫瘍のような活発に増殖する組織は適切な血液供給を必要とする。これらの組織は、血管形成と呼ばれる過程を介して新しい血管の形成を促進する血管形成支持因子の産生によって、この必要性を満たす。血管の管形成は、下記工程のすべてまたは多くを含む、複雑であるが秩序正しい生物学的事象である：ａ）内皮細胞（ＥＣ）は既存のＥＣから増殖するか、または前駆細胞から分化する；ｂ）ＥＣは索状組織様構造を形成するために移動および合体する；ｃ）次に、血管索状組織は、中心部内腔を備えた血管を形成するために管形成を行う；ｄ）既存の索状組織または血管は、二次血管を形成するために出芽する；ｅ）原始血管網はさらなる再構築および再形成を行う；およびｆ）内皮周辺の細胞は内皮の管を囲むために動員され、血管に維持および調節機能を提供し；そのような細胞は、微小毛細血管については周皮細胞、より大きな血管については平滑筋細胞および心臓における心筋細胞を含む。Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：４８−５０（１９９７）；Ｈｏｇａｎ，Ｂ．Ｌ．＆  Ｋｏｌｏｄｚｉｅｊ，Ｐ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．３：５１３−２３（２００２）；Ｌｕｂａｒｓｋｙ，Ｂ．＆  Ｋｒａｓｎｏｗ，Ｍ．Ａ．Ｃｅｌｌ．１１２：１９−２８（２００３）。
【０００３】
血管形成が様々な障害の病因に関係することは、今や十分に確立されている。これらは、固形腫瘍および転移、アテローム性動脈硬化、後水晶体線維形成症、血管腫、慢性炎症、増殖性網膜症（例えば糖尿病性網膜症）のような眼内血管新生疾患、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、血管新生緑内障、移植された角膜組織および他の組織の免疫拒絶、関節リウマチならびに乾癬を含む。Ｆｏｌｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６７：１０９３１−  １０９３４  （１９９２）；  Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ５３：２１７−２３９  （１９９１）；  ａｎｄ  Ｇａｒｎｅｒ  Ａ．，  “Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ”，  Ｉｎ：  Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｏｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ．  Ａ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｇａｒｎｅｒ  Ａ．，  Ｋｌｉｎｔｗｏｒｔｈ  ＧＫ編、  第２版（マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ）、ニューヨーク、１９９４）、１６２５〜１７１０ページ。
【０００４】
腫瘍増殖の場合において、血管形成は、過形成から新生物形成への転換のために、および腫瘍の増殖および転移のための栄養の提供のために、重要であると思われる。Ｆｏｌｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：５８  （１９８９）。血管新生は、腫瘍細胞が、正常細胞に比べて、成長優位性および増殖自律性を獲得することを可能にする。腫瘍は、通常利用可能な毛細血管床からの距離のために、たった数立方ミリメートルのサイズに増殖できる一つの異常な細胞として始まり、それは、長期間の間さらに増殖および播種することなく「休止状態」でとどまる。次にいくつかの腫瘍細胞は、内皮細胞を活性化するために血管形成的な表現型に切り替わり、内皮細胞は増殖し新しい毛細血管へと成熟する。新しく形成された血管は、一次腫瘍の継続的な増殖だけでなく、転移性腫瘍細胞の播種および再コロニー形成もまた可能にする。したがって、腫瘍切片における微小血管の密度と、他のいくつかの腫瘍に加えて乳癌における患者の生存との間で、相関性が観察された。Ｗｅｉｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ  ３２４：  １−６  （１９９１）；  Ｈｏｒａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ  ３４０：  １１２０−１１２４  （１９９２）；  Ｍａｃｃｈｉａｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｌａｎｃｅｔ  ３４０：  １４５−１４６  （１９９２）。血管形成スイッチを制御する正確なメカニズムは十分に理解されていないが、腫瘍塊の血管新生は多くの血管形成の促進因子および阻害因子のネットバランスに起因すると考えられている（Ｆｏｌｋｍａｎ，  １９９５，  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １（１）：２７−３１）。
【０００５】
血管発生の過程は厳密に調節される。現在まで、かなりの数の分子（多くは、周囲の細胞により産生される分泌因子）は、ＥＣの分化、増殖、移動および索状組織様構造への合体を調節することが示された。例えば、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は、血管形成刺激および血管透過性誘導に関与する鍵となる因子として同定された。Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｄｏｃｒ．  Ｒｅｖ．  １８：４−２５  （１９９７）。単一のＶＥＧＦ対立遺伝子の欠損でさえ胚致死性をもたらすという発見から、この因子が、血管系の発生および分化において欠くことのできない役割を果たすことが示される。更に、ＶＥＧＦは、腫瘍および眼内障害に関連する血管新生の鍵となる仲介因子であることが示された。Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｅｎｄｏｃｒ．  Ｒｅｖ．上記。ＶＥＧＦのｍＲＮＡは、調べられた大多数のヒト腫瘍により過剰表現される。Ｂｅｒｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９１  ：１５３−１５９  （１９９３）；  Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈｏｌ．  ２６：８６−９１  （１９９５）；  Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５３：４７２７−４７３５  （１９９３）；  Ｍａｔｔｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｒｉｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ７３：９３１−９３４  （１９９６）；  Ｄｖｏｒａｋ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  １４６：１０２９−１０３９  （１９９５）。
【０００６】
さらに、眼球の液体中のＶＥＧＦの濃度レベルは、糖尿病性網膜症および他の虚血関連性網膜症に罹患する患者における血管の活発な増殖の存在に、高く関連している。Ａｉｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３３１  ：  １４８０−１４８７  （１９９４）。更に、ＡＭＤに罹患した患者において脈絡膜新生血管膜中にＶＥＧＦが局在することが、研究から実証されている。Ｌｏｐｅｚ  ｅｔ  ａｌ，  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．  Ｖｉｓ．  Ｓｃｉ．  ３７：８５５−８６８  （１９９６）。
【０００７】
抗ＶＥＧＦの中和抗体は、ヌードマウスにおける様々なヒト腫瘍細胞株の増殖を抑制し（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：８４１−８４４  （１９９３）；  Ｗａｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９５：１７８９−１７９７  （１９９５）；  Ｂｏｒｇｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５６：４０３２−４０３９  （１９９６）；  Ｍｅｌｎｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５６：９２１−９２４  （１９９６））、虚血性網膜障害のモデルにおける眼内血管形成もまた阻害する。Ａｄａｍｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｃｈ．  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．  １１４：６６−７１  （１９９６）。したがって、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体、またはＶＥＧＦ作用の他の阻害剤は、腫瘍および様々な眼内血管新生障害の治療のための有望な候補である。そのような抗体は、例えば１９９８年１月１４日に公表されたＥＰ  ８１７，６４８中に；および両方とも１９９８年１０月１５日に公表されたＷＯ９８／４５３３１およびＷＯ９８／４５３３２中に記載されている。抗ＶＥＧＦ抗体の１つであるベバシズマブは、転移性結腸直腸癌（ＣＲＣ）を治療するために化学療法レジメンとの組合せにおける使用についてＦＤＡによって承認された。さらにベバシズマブは、様々な癌徴候の治療のために多くの進行中の臨床試験において研究されている。
【０００８】
多くの疾患および障害での血管形成の役割の概観において、これらの過程を引き起こす１つまたは複数の生物学的効果を調節する手段を有することは望ましい。治療剤としての開発のために最適な臨床的特質を有する薬剤に対する必要性が引き続き存在することは明らかである。本明細書において記載される本発明はこの必要性を満たし、他の利点を提供している。
【０００９】
特許出願および公開を含む本明細書において引用された参照はすべて、それら全体を参照することによって組み入れられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の要旨
本発明は、ノッチ受容体経路のデルタ様４（同じ意味で「ＤＬＬ４」と呼ばれる）活性化を調節する薬剤による処理によって血管発生が阻害されるという発見に部分的に基づく。ＤＬＬ４アンタゴニストによる処理は、腫瘍血管を含む血管において、内皮細胞（ＥＣ）増殖の増加、不適切な内皮細胞分化および不適切な動脈発生をもたらした。驚くべきことに、抗ＤＬＬ４抗体による処理はいくつかの異なる癌において腫瘍増殖の阻害をもたらした。したがって本発明は、血管形成に関与する過程の調節（例えば、促進または阻害）のための、および血管形成に関連する病理学的症状を標的とする使用のための方法、組成物、キットおよび製品を提供する。
【００１１】
１つの態様において、本発明は、そのような治療を必要とする被験体への有効量のＤＬＬ４アンタゴニストの投与を含む、腫瘍、癌および／または細胞増殖障害を治療する方法を提供する。
【００１２】
１つの態様において、本発明は、腫瘍または癌の増殖を低下、阻害、遮断または予防する方法であって、そのような治療を必要とする被験体への有効量の抗ＤＬＬ４アンタゴニストの投与を含む方法を提供する。
【００１３】
１つの態様において、本発明は、そのような治療を必要とする被験体への有効量のＤＬＬ４アンタゴニスト（抗ＤＬＬ４抗体のような）の投与を含む、血管形成阻害のための方法を提供する。
【００１４】
１つの態様において、本発明は、そのような治療を必要とする被験体への有効量のＤＬＬ４アンタゴニスト（抗ＤＬＬ４抗体のような）の投与を含む、血管形成に関連する病理学的症状の治療のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、血管形成に関連した病理学的症状は、腫瘍、癌および／または細胞増殖障害である。いくつかの実施形態において、血管形成に関連した病理学的症状は、眼内血管新生疾患である。
【００１５】
１つの態様において、本発明は、そのような治療を必要とする被験体への有効量のＤＬＬ４アンタゴニストの投与を含む、内皮細胞増殖刺激のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、被験体は、血管形成に関連する病理学的症状（腫瘍、癌および／または細胞増殖障害のような）を有している。
【００１６】
１つの態様において、本発明は、そのような治療を必要とする被験体への有効量のＤＬＬ４アンタゴニストの投与を含む、内皮細胞分化阻害のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、被験体は、血管形成に関連する病理学的症状（腫瘍、癌および／または細胞増殖障害のような）を有する。
【００１７】
１つの態様において、本発明は、そのような治療を必要とする被験体への有効量のＤＬＬ４アンタゴニストの投与を含む、動脈発生阻害のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、被験体は、血管形成に関連する病理学的症状（腫瘍、癌および／または細胞増殖障害のような）を有する。
【００１８】
１つの態様において、本発明は、そのような治療を必要とする被験体への有効量のＤＬＬ４アンタゴニストの投与を含む、血管灌流の阻害のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、被験体は、血管形成に関連する病理学的症状（腫瘍、癌および／または細胞増殖障害のような）を有する。
【００１９】
別の態様において、本発明は、抗血管形成剤との組合せで有効量のＤＬＬ４アンタゴニストの被験体への投与を含む、血管新生に関連する病理学的症状を有する被験体において抗血管形成剤治療の有効性を促進する方法を提供する。そのような方法は、障害（例えば癌、眼内血管新生疾患、特に抗血管新生剤単独による治療へ低反応である障害の疾患またはそのような段階）の治療において有用である。抗血管形成剤は、抗ＶＥＧＦ抗体のようなＶＥＧＦアンタゴニストを含む、血管形成を低下または阻害する任意の薬剤でありえる。
【００２０】
１つの態様において、本発明は、有効量のＤＬＬ４アンタゴニスト（抗ＤＬＬ４抗体のような）の、他の治療剤（抗血管形成剤のような）との有効量の組合せでの投与を含む方法を提供する。例えば、様々な新生物性症状または非新生物性症状を治療するために、ＤＬＬ４アンタゴニストは。抗癌剤または抗血管形成剤との組合せにおいて使用される。１つの実施形態において、新生物性症状または非新生物性症状は、血管形成に関連する病理学的症状である。いくつかの実施形態において、他の治療剤は、抗血管形成剤、抗新生物剤および／または化学療法剤である。
【００２１】
ＤＬＬ４アンタゴニストは、それらの目的のために有効な他の治療剤と共に、同一の組成物中でまたは分離した組成物として、連続的にまたは組合せで投与することができる。ＤＬＬ４アンタゴニストおよび他の治療剤（例えば抗癌剤、抗血管形成剤）の投与は、同時に（例えば、単一組成物、または同一の投与経路もしくは異なる投与経路を使用する２つまたは複数の異なる組成物として）行うことができる。あるいはまたは加えて、投与は任意の順序で連続して行うことができる。あるいはまたは加えて、工程は、任意の順序で連続および同時の両方で、組合せとして行なうことができる。特定の実施形態において、分〜日から週〜月にわたる間隔が、２つまたは複数の組成物の投与の間に存在できる。例えば、抗癌剤を最初に投与し、ＤＬＬ４アンタゴニストが後続してもよい。しかしながら、同時投与またはＤＬＬ４アンタゴニストの最初の投与もまた検討される。したがって１つの態様で、本発明は、抗血管形成剤（ベバシズマブのような抗ＶＥＧＦの抗体のような）の投与が後続する、ＤＬＬ４アンタゴニスト（抗ＤＬＬ４抗体のような）の投与を含む方法を提供する。特定の実施形態において、分〜日から週〜月にわたる間隔が、２つまたは複数の組成物の投与の間に存在できる。
【００２２】
特定の態様において、本発明は、有効量のＤＬＬ４アンタゴニストおよび／または血管形成阻害剤および１つまたは複数の化学療法剤の投与によって障害（腫瘍、癌および／または細胞の増殖障害のような）を治療する方法を提供する。様々な化学療法剤は、本発明の組合わせ治療法において使用されてもよい。検討される化学療法剤の例示的および非限定的リストは、「定義」の下で本明細書において提供される。ＤＬＬ４アンタゴニストおよび化学療法剤の投与は、同時に（例えば、単一の組成物、または同一の投与経路もしくは異なる投与経路を使用する２つまたは複数の異なる組成物として）行うことができる。あるいはまたは加えて、投与は任意の順序で連続して行うことができる。あるいはまたは加えて、工程は任意の順序で連続および同時の両方で、組合せとして行なうことができる。特定の実施形態において、分〜日から週〜月にわたる間隔は、２つまたは複数の組成物の投与の間に存在できる。例えば、化学療法剤を最初に投与し、ＤＬＬ４アンタゴニストが後続してもよい。しかしながら、同時投与またはＤＬＬ４アンタゴニストを最初に投与することもまた検討される。したがって１つの態様において、本発明は、化学療法剤の投与が後続する、ＤＬＬ４アンタゴニスト（抗ＤＬＬ４抗体のような）の投与を含む方法を提供する。特定の実施形態において、分〜日から週〜月にわたる間隔は、２つまたは複数の組成物の投与の間に存在できる。
【００２３】
１つの態様において、本発明は、血管形成に関連した病理学的症状のような障害の療法的治療および／または予防的治療のための薬剤の調製におけるＤＬＬ４アンタゴニストの使用を提供する。いくつかの実施形態において、障害は、腫瘍、癌、および／または細胞増殖障害である。
【００２４】
１つの態様において、本発明は、そのような治療を必要とする被験体への有効量のＤＬＬ４アゴニストの投与を含む、障害の治療のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、障害は、ＤＬＬ４−ノッチ受容体経路の発現および／または活性と関連している（ＤＬＬ４−ノッチ受容体経路の活性増加のような）。いくつかの実施形態において、障害は、血管形成、血管新生および／または肥大が所望される障害（例えば、血管外傷である、創傷、裂傷、切開、熱傷、潰瘍（例えば糖尿病性潰瘍、圧迫潰瘍、血友病潰瘍、静脈瘤性潰瘍）、組織増殖、体重増加、末梢動脈障害、分娩誘導、毛髪増殖、水疱性表皮剥離症、網膜萎縮、骨折、骨脊椎固定術、半月板披裂など）である。いくつかの実施形態において、障害は血管形成の阻害が所望される障害である。いくつかの実施形態において、ＤＬＬ４アゴニストはＤＢＺである。
【００２５】
ＤＬＬ４のアンタゴニストおよびアゴニストは当技術分野において公知であり、いくつかは本明細書において記述および例示される。いくつかの実施形態において、ＤＬＬ４アンタゴニストは、ＤＬＬ４に結合し、ＤＬＬ４に関連する効果の１つまたは複数の態様を中和、遮断、阻害、停止、低下または妨害する分子である。いくつかの実施形態において、ＤＬＬ４アンタゴニストは、ノッチ受容体（ノッチ１、ノッチ２、ノッチ３および／またはノッチ４のような）に結合し、ＤＬＬ４に関連する効果の１つまたは複数の態様を中和、遮断、阻害、停止、低下または妨害する分子である。いくつかの実施形態において、ＤＬＬ４アンタゴニストは、内皮細胞増殖の促進、内皮細胞分化の阻害、動脈発生の阻害および／または血管灌流の低下を可能にする。当技術分野において確立しているように、内皮細胞増殖、内皮細胞分化、動脈発生および血管機能（血管灌流のような）は、任意の様々な分析（それらのいくつかは本明細書において記述および例示される）を使用して、評価することができ、様々な定量値に換算して表現することができる。いくつかの実施形態において、ＤＬＬ４アンタゴニストの、内皮細胞増殖促進、内皮細胞分化阻害、動脈発生阻害および／または血管機能低下（血管灌流低下のような）の能力は、ＤＬＬ４アンタゴニストによる治療の非存在下における内皮細胞増殖、内皮細胞分化、動脈発生および／または血管機能（血管灌流のような）のレベルと比較して評価される。いくつかの実施形態において、内皮細胞増殖促進、内皮細胞分化阻害、動脈発生阻害および／または血管機能低下（血管灌流低下のような）の能力は、インビトロの分析（本明細書において記載されるＨＵＶＥＣ分析のような）において決定される。いくつかの実施形態において、内皮細胞増殖促進、内皮細胞分化阻害、動脈発生阻害および／または血管機能低下（血管灌流低下のような）の能力は、インビボの分析（本明細書において記載されるマウス網膜発生分析のような）において決定される。
【００２６】
ＤＬＬ４アンタゴニストは抗ＤＬＬ４抗体であってもよい。いくつかの実施形態において、抗ＤＬＬ４抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、抗体はポリクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、キメラ抗体、親和性成熟抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、抗体は抗体フラグメントである。いくつかの実施形態において、抗体はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２またはｓｃＦｖである。いくつかの実施形態において、抗体は、表１中に示される重鎖および軽鎖可変領域を含む。
【００２７】
【表１−１】
2009539870.tif 000003
１つの実施形態において、抗体は、キメラ抗体、例えば異種の非ヒト配列、ヒト配列またはヒト化配列に移植された非ヒトドナーからの抗原結合配列を含む抗体である（例えばフレームワークおよび／または定常ドメイン配列）。１つの実施形態において、非ヒトドナーはマウスである。１つの実施形態において、例えば抗原結合配列は、変異誘発（例えばファージディスプレースクリーニングなど）により得られた合成物である。１つの実施形態において、本発明のキメラ抗体にはマウスＶ領域およびヒトＣ領域を有する。１つの実施形態において、マウス軽鎖Ｖ領域はヒトκ軽鎖へ融合される。１つの実施形態において、マウス重鎖Ｖ領域はヒトＩｇＧ１のＣ領域へ融合される。
【００２８】
ヒト化抗体は、ＦＲ中のアミノ酸置換、および移植されたＣＤＲ中の変化をともなう親和性成熟変異型を有するものを含んでいる。ＣＤＲまたはＦＲ中の置換されたアミノ酸は、ドナーまたはレシピエント抗体中に存在するものに限定されない。他の実施形態において、さらなる本発明の抗体は、促進されたＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ機能およびＢ細胞死滅を含む改良されたエフェクター機能をもたらす、Ｆｃ領域中のアミノ酸残基における変化を含む。本発明の他の抗体は、安定性を改善する特異的変化を有するものを含む。他の実施形態において、本発明の抗体は、エフェクター機能低下（例えばＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ機能低下、および／またはＢ細胞死滅低下）をもたらすＦｃ領域中のアミノ酸残基における変化を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態において、ＤＬＬ４アンタゴニストはＤＬＬ４イムノアドヘジンである。
【００３０】
１つの態様において、本発明は、１つまたは複数のＤＬＬ４アンタゴニストおよび担体を含む組成物を提供する。１つの実施形態において、担体は薬学的に許容される。いくつかの実施形態において、ＤＬＬ４アンタゴニストは抗ＤＬＬ４抗体である。
【００３１】
１つの態様において、本発明は、有効量のＤＬＬ４アンタゴニストおよび薬学的に許容される担体を含む、腫瘍、癌および／または細胞増殖障害の治療における使用（該使用は抗血管形成剤の同時投与または連続投与を含む）のための組成物を提供する。いくつかの実施形態において、ＤＬＬ４アンタゴニストは抗ＤＬＬ４抗体である。いくつかの実施形態において、抗血管形成剤は抗ＶＥＧＦ抗体（ベバシズマブのような）である。
【００３２】
１つの態様において、本発明は、有効量のＤＬＬ４アンタゴニストおよび薬学的に許容される担体を含む、腫瘍、癌および／または細胞増殖障害の治療における使用（該使用は抗癌剤の同時投与または連続投与を含む）のための組成物を提供する。いくつかの実施形態において、ＤＬＬ４アンタゴニストは抗ＤＬＬ４抗体である。いくつかの実施形態において、抗癌剤は化学療法剤である。いくつかの実施形態において、使用は、抗血管形成剤の同時投与または連続投与をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＤＬＬ４アンタゴニストは抗ＤＬＬ４抗体である。いくつかの実施形態において、抗血管形成剤は抗ＶＥＧＦ抗体（ベバシズマブのような）である。
【００３３】
１つの態様において、本発明は、容器；および容器内に含まれる組成物（組成物は１つまたは複数のＤＬＬ４アンタゴニストまたはＤＬＬ４アゴニストを含む）を含む製品を提供する。
【００３４】
１つの態様において、本発明は、１つまたは複数のＤＬＬ４アンタゴニストまたはＤＬＬ４アゴニストを含む組成物を含む第１の容器；および緩衝液を含む第２の容器を含むキットを提供する。１つの実施形態において、緩衝液は薬学的に許容される。１つの実施形態において、ＤＬＬ４アンタゴニストは抗ＤＬＬ４抗体である。
【００３５】
別の態様において、本発明は、治療的有効量のＤＬＬ４アンタゴニストまたは薬学的に許容される担体とＤＬＬ４アゴニストの混合を含む、組成物調製のための方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１ａ】図１：ＤＬＬ４に仲介されるノッチシグナリングはＥＣ増殖を調節する、ａ−ｃ、ｆ、三次元フィブリンゲル中のＨＵＶＥＣ出芽分析。抗ＤＬＬ４抗体（ＹＷ２６．８２）またはＤＢＺは、ＨＵＶＥＣの出芽を促進した（ａ）。抗ＤＬＬ４抗体またはＤＢＺによるＨＵＶＥＣの三次元フィブリンゲル培養（７日間）におけるノッチ遮断（左）、または固定化ＤＬＬ４によるＨＵＶＥＣの二次元培養（３６時間）におけるノッチ活性化（右）に反応したＶＥＧＦＲ２発現の定量的ＰＣＲ分析。抗ＤＬＬ４抗体およびＤＢＺを、それぞれ５μｇ／ｍｌおよび０．０８μＭで使用した（ａ−ｃ、ｅ−ｇ）。
【図１ｂ】Ｋｉ６７染色は、抗ＤＬＬ４抗体またはＤＢＺがＨＵＶＥＣの過剰増殖を引き起こすことを示した（ｂ）。
【図１ｃ】抗ＤＬＬ４抗体またはＤＢＺは、ＳＦ馴化培地の存在下におけるＨＵＶＥＣの出芽を増加させた（ｃ）。
【図１ｄ】ｄ、ｈ、抗ＤＬＬ４抗体の全身送達は、新生仔網膜においてＥＣの大量蓄積を引き起こした。網膜血管（イソレクチン染色）の低倍率（上部）および高倍率（下部）の共焦点画像（ｄ）。Ｋｉ６７染色から、抗ＤＬＬ４抗体により処理された新生仔網膜におけるＥＣ増殖の増加が示される（ｈ）。
【図１ｅ】ｅ、固定化ＤＬＬ４によるノッチ活性化はＨＵＶＥＣ増殖を阻害し、ｆ、抗ＶＥＧＦ抗体はＤＢＺの存在下または非存在下でＨＵＶＥＣ出芽を阻害した。
【図１ｆ】ｅ、固定化ＤＬＬ４によるノッチ活性化はＨＵＶＥＣ増殖を阻害し、ｆ、抗ＶＥＧＦ抗体はＤＢＺの存在下または非存在下でＨＵＶＥＣ出芽を阻害した。
【図１ｇ】ｇ、ノッチによるＶＥＧＦＲ２の調節。
【図１ｈ】ｄ、ｈ、抗ＤＬＬ４抗体の全身送達は、新生仔網膜においてＥＣの大量蓄積を引き起こした。網膜血管（イソレクチン染色）の低倍率（上部）および高倍率（下部）の共焦点画像（ｄ）。Ｋｉ６７染色から、抗ＤＬＬ４抗体により処理された新生仔網膜におけるＥＣ増殖の増加が示される（ｈ）。
【図２ａ】図２：ＤＬＬ４に仲介されるノッチシグナリングはＥＣ分化を調節する、ａ、フィブリンゲル中で増殖するＨＵＶＥＣにより形成された内腔様構造（白矢印）は、抗ＤＬＬ４抗体またはＤＢＺの存在下において失われた。代わりに、筒先には細胞が非常に詰め込まれた（黒矢印）。
【図２ｂ】ｂ、ノッチによるＴＧＦβ２の調節。抗ＤＬＬ４抗体またはＤＢＺによるＨＵＶＥＣの三次元フィブリンゲル培養（７日間）におけるノッチ遮断（左）、または固定化ＤＬＬ４によるＨＵＶＥＣの二次元培養（３６時間）におけるノッチ活性化（右）に反応したＴＧＦβ２発現の定量的ＰＣＲ分析。
【図２ｃ】ｃ、抗ＤＬＬ４抗体は動脈発生を遮断する。アルファ平滑筋アクチン（ＡＳＭＡ）およびイソレクチンにより染色された新生仔マウス網膜の共焦点画像。図１ｄにおいて記載されるように、新生仔マウスを処理した。
【図２ｄ】ｄ、ＡＳＭＡおよびイソレクチンにより染色された成体マウス網膜の共焦点画像。８週齢マウスを、ＰＢＳまたは抗ＤＬＬ４抗体（１０ｍｇ／ｋｇ、１週間に２回）により２週間処理した。
【図３ａ】図３：ＤＬＬ４および／またはＶＥＧＦの選択的な遮断は腫瘍血管形成を中断し、腫瘍増殖を阻害する、ａ−ｆ、腫瘍モデルの結果：ＨＭ７（ａ）、Ｃｏｌｏ２０５（ｂ）、Ｃａｌｕ６（ｃ）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５（ｄ）、ＭＶ−５２２（ｅ）およびＷＥＨＩ３（ｆ）。標準誤差をともなう平均の腫瘍容積が提供される。
【図３ｂ】腫瘍モデルの結果：ＨＭ７（ａ）、Ｃｏｌｏ２０５（ｂ）、Ｃａｌｕ６（ｃ）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５（ｄ）、ＭＶ−５２２（ｅ）およびＷＥＨＩ３（ｆ）。標準誤差をともなう平均の腫瘍容積が提供される。
【図３ｃ】腫瘍モデルの結果：ＨＭ７（ａ）、Ｃｏｌｏ２０５（ｂ）、Ｃａｌｕ６（ｃ）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５（ｄ）、ＭＶ−５２２（ｅ）およびＷＥＨＩ３（ｆ）。標準誤差をともなう平均の腫瘍容積が提供される。
【図３ｄ】腫瘍モデルの結果：ＨＭ７（ａ）、Ｃｏｌｏ２０５（ｂ）、Ｃａｌｕ６（ｃ）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５（ｄ）、ＭＶ−５２２（ｅ）およびＷＥＨＩ３（ｆ）。標準誤差をともなう平均の腫瘍容積が提供される。
【図３ｅ】腫瘍モデルの結果：ＨＭ７（ａ）、Ｃｏｌｏ２０５（ｂ）、Ｃａｌｕ６（ｃ）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５（ｄ）、ＭＶ−５２２（ｅ）およびＷＥＨＩ３（ｆ）。標準誤差をともなう平均の腫瘍容積が提供される。
【図３ｆ】腫瘍モデルの結果：ＨＭ７（ａ）、Ｃｏｌｏ２０５（ｂ）、Ｃａｌｕ６（ｃ）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５（ｄ）、ＭＶ−５２２（ｅ）およびＷＥＨＩ３（ｆ）。標準誤差をともなう平均の腫瘍容積が提供される。
【図３ｇ】ｇ−ｈ、腫瘍血管の組織学的研究。対照、抗ＤＬＬ４抗体および抗ＶＥＧＦにより処理されたマウスからのＥＬ４腫瘍切片における、抗ＣＤ３１の免疫組織化学（ｇ）。
【図３ｈ】ＥＬ４腫瘍切片における、レクチン灌流および抗ＣＤ３１の染色（ｈ）。
【図３ｉ】ｉ−ｐ。腫瘍モデルＳＫ−ＯＶ−３Ｘ１（ｉ）、ＬＬ２（ｊ）、ＥＬ４（ｋ）、Ｈ１２９９（ｌ）、ＳＫＭＥＳ−１（ｍ）、ＭＸ−１（ｎ）、ＳＷ６２０（ｏ）およびＬＳ１７４Ｔ（ｐ）の結果。
【図３ｊ】ｉ−ｐ。腫瘍モデルＳＫ−ＯＶ−３Ｘ１（ｉ）、ＬＬ２（ｊ）、ＥＬ４（ｋ）、Ｈ１２９９（ｌ）、ＳＫＭＥＳ−１（ｍ）、ＭＸ−１（ｎ）、ＳＷ６２０（ｏ）およびＬＳ１７４Ｔ（ｐ）の結果。
【図３ｋ】ｉ−ｐ。腫瘍モデルＳＫ−ＯＶ−３Ｘ１（ｉ）、ＬＬ２（ｊ）、ＥＬ４（ｋ）、Ｈ１２９９（ｌ）、ＳＫＭＥＳ−１（ｍ）、ＭＸ−１（ｎ）、ＳＷ６２０（ｏ）およびＬＳ１７４Ｔ（ｐ）の結果。
【図３ｌ】ｉ−ｐ。腫瘍モデルＳＫ−ＯＶ−３Ｘ１（ｉ）、ＬＬ２（ｊ）、ＥＬ４（ｋ）、Ｈ１２９９（ｌ）、ＳＫＭＥＳ−１（ｍ）、ＭＸ−１（ｎ）、ＳＷ６２０（ｏ）およびＬＳ１７４Ｔ（ｐ）の結果。
【図３ｍ】ｉ−ｐ。腫瘍モデルＳＫ−ＯＶ−３Ｘ１（ｉ）、ＬＬ２（ｊ）、ＥＬ４（ｋ）、Ｈ１２９９（ｌ）、ＳＫＭＥＳ−１（ｍ）、ＭＸ−１（ｎ）、ＳＷ６２０（ｏ）およびＬＳ１７４Ｔ（ｐ）の結果。
【図３ｎ】ｉ−ｐ。腫瘍モデルＳＫ−ＯＶ−３Ｘ１（ｉ）、ＬＬ２（ｊ）、ＥＬ４（ｋ）、Ｈ１２９９（ｌ）、ＳＫＭＥＳ−１（ｍ）、ＭＸ−１（ｎ）、ＳＷ６２０（ｏ）およびＬＳ１７４Ｔ（ｐ）の結果。
【図３ｏ】ｉ−ｐ。腫瘍モデルＳＫ−ＯＶ−３Ｘ１（ｉ）、ＬＬ２（ｊ）、ＥＬ４（ｋ）、Ｈ１２９９（ｌ）、ＳＫＭＥＳ−１（ｍ）、ＭＸ−１（ｎ）、ＳＷ６２０（ｏ）およびＬＳ１７４Ｔ（ｐ）の結果。
【図３ｐ】ｉ−ｐ。腫瘍モデルＳＫ−ＯＶ−３Ｘ１（ｉ）、ＬＬ２（ｊ）、ＥＬ４（ｋ）、Ｈ１２９９（ｌ）、ＳＫＭＥＳ−１（ｍ）、ＭＸ−１（ｎ）、ＳＷ６２０（ｏ）およびＬＳ１７４Ｔ（ｐ）の結果。
【図４−１】図４：ＤＬＬ４／ノッチはマウス腸のホメオスタシスにおいて重要でない。対照（ａ、ｄ、ｇ、ｊ）、抗ＤＬＬ４抗体（１０ｍｇ／ｋｇ、６週間毎週２回）（ｂ、ｅ、ｈ、ｋ）およびＤＢＺ処理（３０μｍｏｌ／ｋｇ、５日間毎日）（ｃ、ｆ、ｉ、１）マウスからの小腸の免疫組織化学的研究。ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）（ａ、ｂ、ｃ）およびアルシアンブルー染色（ｄ、ｅ、ｆ）により示されるように、ＤＢＺは杯細胞によるＴＡ集団の置換を引き起こした。この変化は、抗ＤＬＬ４抗体処理には完全に存在しなかった。Ｋｉ６７（ｇ、ｈ、ｉ）およびＨＥＳ−１（ｊ、ｋ、１）染色から、抗ＤＬＬ４抗体が、ＤＢＺの効果を繰り返さないことがさらに確認された。
【図４−２】図４：ＤＬＬ４／ノッチはマウス腸のホメオスタシスにおいて重要でない。対照（ａ、ｄ、ｇ、ｊ）、抗ＤＬＬ４抗体（１０ｍｇ／ｋｇ、６週間毎週２回）（ｂ、ｅ、ｈ、ｋ）およびＤＢＺ処理（３０μｍｏｌ／ｋｇ、５日間毎日）（ｃ、ｆ、ｉ、１）マウスからの小腸の免疫組織化学的研究。ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）（ａ、ｂ、ｃ）およびアルシアンブルー染色（ｄ、ｅ、ｆ）により示されるように、ＤＢＺは杯細胞によるＴＡ集団の置換を引き起こした。この変化は、抗ＤＬＬ４抗体処理には完全に存在しなかった。Ｋｉ６７（ｇ、ｈ、ｉ）およびＨＥＳ−１（ｊ、ｋ、１）染色から、抗ＤＬＬ４抗体が、ＤＢＺの効果を繰り返さないことがさらに確認された。
【図５ａ】図５：抗ＤＬＬ４抗体の特性評価、ａ、抗ＤＬＬ４抗体（ＹＷ２６．８２）のエピトープマッピング。Ｃ末端ヒト胎盤アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）融合タンパク質として発現される、１セットのＤＬＬ４変異体の図式的な表示。融合タンパク質を含む２９３Ｔ細胞馴化培地を、精製抗ＤＬＬ４抗体（ＹＷ２６．８２、０．５μｇ／ｍｌ）によりコーティングされた９６ウェルマイクロタイタープレート上で検査した。結合されたＤＬＬ４．ＡＰを、基質としてワンステップＰＮＰＰ（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）社）、およびＯＤ４０５ｎｍ吸光度測定を使用して検出した。
【図５ｂ】ｂ−ｄ、ＤＬＬ４へのＹＷ２６．８２の選択的結合。９６ウェルのヌンク・マキシソープ（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ）プレートを、示されるような精製組換えタンパク質でコーティングした（１μｇ／ｍｌ）。示された濃度でのＹＷ２６．８２の結合をＥＬＩＳＡ分析により測定した。結合された抗体を、基質としてＴＭＢを使用する抗ヒト抗体ＨＲＰコンジュゲートおよびＯＤ４５０ｎｍの吸光度測定により検出した。抗ＨＥＲ２および組換えＥｒｂＢ２−ＥＣＤを、分析対照として使用した（ｂ）。
【図５ｃ】ベクター、全長ＤＬＬ４、Ｊａｇ１またはＤＬＬ１により一過性にトランスフェクションした２９３細胞のＦＡＣＳ分析。ＹＷ２６．８２の有意な結合は、ＤＬＬ４にトランスフェクションされた細胞でのみ検出された（上部パネル）。Ｊａｇ１およびＤＬＬ１の発現は、組換えラットノッチ１−Ｆｃ（ｒｒノッチ１−Ｆｃ、中央パネル）および組換えラットノッチ２−Ｆｃ（ｒｒノッチ２−Ｆｃ、下部パネル）の結合により、それぞれ確認された。ＹＷ２６．８２、ｒｒノッチ１−Ｆｃまたはｒｒノッチ２−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄシステム社）は２μｇ／ｍｌで使用され、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＰＥ（１：５００、ジャクソン・イムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）社）が後続した（ｃ）。
【図５ｄ】抗ＤＬＬ４抗体は、〜１２ｎＭの計算されたＩＣ５０で、コートされたｒノッチ１へのＤＬＬ４−ＡＰの結合を阻害したが、ＤＬＬ１−ＡＰの結合を阻害しなかった（左パネル）。抗ＤＬＬ４の抗体は、〜８ｎＭの計算されたＩＣ５０で、コートされたｒノッチ１へのＤＬＬ４−Ｈｉｓの結合を阻害したが、Ｊａｇ１−Ｈｉｓの結合を阻害しなかった。（右パネル）（ｄ）。
【図５ｅ】ｅ、内在的に発現するＤＬＬ４へのＹＷ２６．８２の特異的結合。対照、またはＤＬＬ４特異的ｓｉＲＮＡによりトランスフェクションされたＨＵＶＥＣのＦＡＣＳ分析。ＹＷ２６．８２は２μｇ／ｍｌで使用され、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＰＥ（１：５００、ジャクソン・イムノリサーチ社）が後続した（ｅ）。
【図６】図６：ノッチ活性化によるＤＬＬ４のアップレギュレーション。ＨＵＶＥＣを、ＤＢＺの非存在下または存在下（０．０８μＭ）において、固定化Ｃ末端Ｈｉｓ−タグ付加ヒトＤＬＬ４（アミノ酸１〜４０４）によって刺激した。刺激の３６時間後に、内在性のＤＬＬ４発現を抗ＤＬＬ４の抗体によるＦＡＣＳ分析によって検討した。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
（発明の詳細な説明）
一般的な技術
本明細書において記載または参照される技術および手順は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ．  ｅｄｉｔｉｏｎ  （２００１）  コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、  コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  （Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．  編、  （２００３））；  ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  （アカデミック出版社（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．））：  ＰＣＲ  ２：  Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ  （Ｍ．  Ｊ．  ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，  Ｂ．  Ｄ．  Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｇ．  Ｒ．  Ｔａｙｌｏｒ  編  （１９９５））、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ編  （１９８８）  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，  ａｎｄ  ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ  （Ｒ．  Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編  （１９８７））において記載される広く利用される方法のような、当業者により通常の方法を用いて、一般に十分に理解され、通常は利用される。
【００３８】
定義
本明細書において使用されるように、用語「ＤＬＬ４」（同じ意味で「デルタ様４」と呼ばれる）は、特にまたは文脈上で他の方法で示されない場合には、任意の天然ＤＬＬ４ポリペプチドまたは変異型（天然または合成にかかわらず）ＤＬＬ４ポリペプチドを指す。用語「天然配列」は、具体的には、天然に存在する短縮型または分泌型（例えば細胞外ドメイン配列）、天然に存在する変異型形態（例えばオルタナティブスプライス型）および天然に存在する対立遺伝子変異型を包含する。用語「野生型ＤＬＬ４」は、一般に天然に存在するＤＬＬ４タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。用語「野生型ＤＬＬ４配列」は、一般に天然に存在するＤＬＬ４において見出されるアミノ酸配列を指す。
【００３９】
本明細書において使用されるように、用語「ノッチ受容体」（同じ意味で「ノッチ」と呼ばれる）は、特にまたは文脈上で他の方法で示されない場合には、任意の天然ノッチ受容体ポリペプチドまたは変異型（天然または合成にかかわらず）ノッチ受容体ポリペプチドを指す。ヒトは、４つのノッチ受容体（ノッチ１、ノッチ２、ノッチ３およびノッチ４）を有する。本明細書において使用されるように、用語ノッチ受容体は、ヒトノッチ受容体の任意の１つまたは４つすべてを含む。用語「天然配列」は、具体的には、天然に存在する短縮型または分泌型（例えば細胞外ドメイン配列）、天然に存在する変異型形態（例えばオルタナティブスプライス型）および天然に存在する対立遺伝子変異型を包含する。用語「野生型ノッチ受容体」は、一般に天然に存在するノッチ受容体タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。用語「野生型ノッチ受容体配列」は、一般に天然に存在するノッチ受容体において見出されるアミノ酸配列を指す。
【００４０】
上で定義されるように、「ＤＬＬ４核酸」は、ＤＬＬ４ポリペプチドをコードするＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはそのようなＤＮＡもしくはＲＮＡへハイブリダイズし、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で安定的に結合したままであり、長さで約１０ヌクレオチド以上のものである。ストリンジェントな条件は、（１）洗浄のために低イオン強度および高温を利用するもの（例えば５０℃で０．１５Ｍ  ＮａＣｌ／０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウム）、または（２）ハイブリダイゼーション間にホルムアミドのような変性剤を使用するもの（例えば４２℃で５０％（体積／体積）ホルムアミドと共に、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ２、７５ｍＭクエン酸ナトリウム）である。
【００４１】
「キメラＤＬＬ４」分子は、異種のポリペプチドへ融合または結合された、全長ＤＬＬ４またはその１つもしくは複数のドメインを含むポリペプチドである。キメラＤＬＬ４分子は、一般に、天然に存在するＤＬＬ４と共通の少なくとも１つ生物学的特性を共有するだろう。キメラＤＬＬ４分子の一例は、精製目的のためにエピトープタグを付加されたものである。別のキメラＤＬＬ４分子は、ＤＬＬ４イムノアドヘジンである。
【００４２】
用語「ＤＬＬ４イムノアドヘジン」は、用語「ＤＬＬ４−イムノグロブリンキメラ」と共に同じ意味で使用され、イムノグロブリン配列とＤＬＬ４分子（天然または変異型）の少なくとも一部を組み合わせるキメラ分子を指す。イムノグロブリン配列は、好ましくはイムノグロブリン定常ドメイン（Ｆｃ領域）であるが、必ずしもそうではなくてもよい。イムノアドヘジンは、ヒト抗体の有益な化学的特性および生物学的特性の多くを有することができる。適切なヒト免疫グロブリンヒンジおよび定常ドメイン（Ｆｃ）配列へ結合された、所望される特異性を有するヒトタンパク質配列からイムノアドヘジンを構築することができるので、対象となる結合特異性は完全にヒトの成分を使用して達成することができる。そのようなイムノアドヘジンは、患者に対して最小限の免疫原性であり、連用または反復使用に対して安全である。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は天然配列のＦｃ領域である。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は変異型Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は機能的なＦｃ領域である。
【００４３】
治療的使用のために記載されるホモ多量体のイムノアドヘジンの具体例は、細胞表面ＣＤ４へのＨＩＶの結合阻害のためのＣＤ４−ＩｇＧイムノアドヘジンを含む。ＣＤ４−ＩｇＧが分娩直前に妊婦に対して投与された第Ｉ相臨床試験から得られたデーターは、このイムノアドヘジンがＨＩＶの母体−胎児間の移行の予防において有用かもしれないことを示唆する（Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ｅｔ  ａｈ，  Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １０：２１９−２２７  （１９９３））。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を結合するイムノアドヘジンも開発されている。ＴＮＦは、敗血症性ショックの主な仲介因子であることが示される炎症誘発性サイトカインである。敗血症性ショックのマウスモデルに基づいて、ＴＮＦ受容体イムノアドヘジンは、敗血症性ショックの治療における臨床用途のための候補としての将来性を示した（Ａｓｈｋｅｎａｚｉ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８：１０５３５−１０５３９  （１９９１））。エンブレル（ＥＮＢＲＥＬ）（登録商標）（エタネルセプト）（ＩｇＧのＦｃ領域に融合させたＴＮＦ受容体配列を含むイムノアドヘジン）は、１９９８年１１月２日に関節リウマチの治療のためにアメリカ食品薬品局（ＦＤＡ）により承認された。関節リウマチの治療におけるエンブレル（登録商標）の新しい発展した使用は、２０００年６月６日にＦＤＡにより承認された。エンブレル（登録商標）を含むＴＮＦ遮断薬についての最近の情報については、Ｌｏｖｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４２：７６３−１６９  （２０００）および８１０〜８１１ページの付随の論説；ならびに  Ｗｅｉｎｂｌａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４０：２５３−２５９  （１９９９）；Ｍａｉｎｉ  ａｎｄ  Ｔａｙｌｏｒ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｍｅｄ．  ５１  ：２０７−２２９  （２０００）の総説を参照。
【００４４】
イムノアドヘジン構造の２つのアームが異なる特異性を有するならば、イムノアドヘジンは二重特異性抗体に対する類似により「二重特異性イムノアドヘジン」と呼ばれる。Ｄｉｅｔｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １６２：１２３  （１９９３）は、接着分子のＥ−セレクチンおよびＰ−セレクチン（各々のセレクチンは天然では異なる細胞タイプにおいて発現される）の細胞外ドメインを組み合わせるような二重特異性イムノアドヘジンを記載する。結合試験から、そのように形成された二重特異性免疫グロブリン融合タンパク質は、それが由来した単一特異性イムノアドヘジンに比べて、骨髄細胞系への促進された結合能力を有することが示された。
【００４５】
用語「ヘテロアドヘジン」は、表現「キメラヘテロ多量体アドへジン」と同じ意味で使用され、各キメラ分子が、多量体化ドメインにより、各々のヘテロ多量体の受容体単量体の細胞外ドメインのような生物学的に活性のある部分を組み合わせる、キメラ分子（アミノ酸配列）の複合体を指す。「多量体化ドメイン」は、ヘテロ多量体複合体内でキメラ分子の安定した相互作用を促進する。多量体化ドメインは、免疫グロブリン配列、ロイシンジッパー、疎水性領域、親水性領域、またはキメラヘテロ多量体のキメラ分子間の分子間ジスルフィド結合を形成する遊離チオールを介して相互作用してもよい。多量体化ドメインは免疫グロブリン定常領域を含んでもよい。加えて、立体相互作用が安定した相互作用を促進するように、多量体化領域は操作されてもよいだけでなく、単量体の混合物からホモ二量体よりもヘテロ二量体の形成をさらに促進する。「突起」は、第１のポリペプチドの接触面からの小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えばチロシンまたはトリプトファン）に置換することによって構築される。突起に対して同一または類似したサイズの代償的な「くぼみ」は、大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えばアラニンまたはスレオニン）に置換することによって、第２のポリペプチドの接触面上に任意に生成される。免疫グロブリン配列は、好ましくは免疫グロブリン定常ドメインであるが、必ずしもそうでなくてもよい。本発明のキメラにおける免疫グロブリン部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくは、ＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭから得られてもよいが、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ３である。
【００４６】
用語「Ｆｃ領域」は、天然配列のＦｃ領域および変異型Ｆｃ領域を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するように本明細書において使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化するかもしれないが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、位置Ｃｙｓ２２６でのアミノ酸残基から、またはＰｒｏ２３０から、そのカルボキシル末端へのストレッチに定義される。Ｆｃ領域のＣ末端のリジン（ＥＵのナンバリングシステムに従って残基４４７）は、例えば抗体の産生または精製の間に、または抗体重鎖をコードする核酸を組換えにより操作することによって除去されてもよい。したがって、そのままの抗体の組成物は、すべてのＫ４４７残基が除去された抗体集団、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体集団、およびＫ４４７残基を持つおよび持たない抗体の混合物を有する抗体集団、を含んでもよい。
【００４７】
特別の指示のない限り、本明細書において、免疫グロブリン重鎖中残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ  （１９９１）中のようなＥＵインデックスの番号付けであり、特に参照することにより本明細書に組み入れられる。「ＫａｂａｔのＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１のＥＵ抗体残基ナンバリングを指す。
【００４８】
「機能的なＦｃ領域」は、天然配列のＦｃ領域の「エフェクター機能」を有する。例示的な「エフェクター機能」はＣ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；ファゴサイトーシス；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体；ＢＣＲ）のダウンレギュレーション、などを含む。そのようなエフェクター機能は、一般に結合ドメイン（例えば抗体可変ドメイン）とＦｃ領域が組み合わされることを必要とし、例えば、本明細書において開示されるような様々な分析を使用して評価することができる。
【００４９】
「天然配列のＦｃ領域」は天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列に同一のアミノ酸配列を含む。天然配列のヒトＦｃ領域は、天然配列のヒトＩｇＧ１のＦｃ領域（非ＡアロタイプおよびＡアロタイプ）；天然配列のヒトＩｇＧ２のＦｃ領域；天然配列のヒトＩｇＧ３のＦｃ領域；および天然配列のヒトＩｇＧ４のＦｃ領域に加えて、その天然に存在する変異型を含む。
【００５０】
「変異型Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾、好ましくは１つまたは複数のアミノ酸置換によって、天然配列のＦｃ領域のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、天然配列のＦｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して、変異型Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域中にまたは親ポリペプチドのＦｃ領域中に、少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば約１〜約１０のアミノ酸置換、および好ましくは約１〜約５のアミノ酸置換を有する。本明細書において変異型Ｆｃ領域は、好ましくは天然配列のＦｃ領域とおよび／または親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の相同性、最も好ましくはそれと少なくとも約９０％の相同性、より好ましくはそれと少なくとも約９５％の相同性を有するだろう。
【００５１】
「単離された」抗体は、その天然環境の成分から同定および分離および／または回収されるものである。その天然環境の混入物成分は、抗体の診断的使用または治療的使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモンおよび他のタンパク性溶質または非タンパク性溶質を含んでもよい。好ましい実施形態において、抗体は、（１）ローリー法により決定されるような抗体の重量で９５％以上まで、および最も好ましくは重量で９９％以上、（２）スピニングカップシークエネーターの使用によりＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または（３）クマシーブルーまたは好ましくは銀染色を使用する還元条件または非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで均質であるまで精製されるだろう。抗体の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないので、単離された抗体は組み換え細胞内のそのままの状態の抗体を含む。しかしながら、通常は単離された抗体は、少なくとも１つの精製工程により調製されるだろう。
【００５２】
用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、最も広い意味において同じ意味で使用され、モノクローナル抗体（例えば全長または完全な形のモノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、多価抗体、多重特異性抗体（例えば所望される生物学的活性を示す限りは、二重特異性抗体）を含み、特定の抗体フラグメントもまた含んでもよい（より詳しく本明細書において記載されるように）。抗体は、ヒト、ヒト化および／または親和性成熟されうる。
【００５３】
用語「可変」は、可変ドメインの特定の部分が抗体の中の配列において広範囲に異なり、各々の特定の抗体の結合および特異性で特定の抗原に対して使用されるという事実を指す。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインの全体にわたって均一に分布しない。それは、軽鎖および重鎖可変ドメインの両方において、相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中する。可変ドメインのうちの保存性の高い部分はフレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは各々、主としてβ−シート立体配置を取り入れ、β−シート構造を接続、およびいくつかの場合においてβ−シート構造の一部を形成する、ループを形成する３つのＣＤＲによって接続される４つのＦＲ領域を含む。各鎖中のＣＤＲは、他の鎖からのＣＤＲと共にＦＲ領域により隣接して保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ  （１９９１）を参照）。定常ドメインは抗体を抗原への結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与のような様々なエフェクター機能を示す。
【００５４】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれ、各々は単一の抗原結合部位を備えた２つの同一の抗原結合フラグメント、および残りの１つの「Ｆｃ」フラグメント（この名称は容易に結晶化する能力を反映する）を産生する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有しており、抗原をなお架橋することができるＦ（ａｂ’）２フラグメントを産出する。
【００５５】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。二本鎖Ｆｖ種において、この領域は、緊密な非共有結合性会合で１つの重鎖および１つの軽鎖の可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ種において、軽鎖および重鎖が二本鎖Ｆｖ種のものと類似した「二量体」構造で結合させることができるように、１つの重鎖および１つの軽鎖の可変ドメインは、柔軟なペプチドリンカーにより共有結合する。ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を定義するように、各可変ドメインの３つのＣＤＲは、この立体配置で相互作用する。まとめると、６つのＣＤＲは、抗体に対して抗原結合特異性を付与する。しかしながら、完全な結合部位よりも低い親和性でだが、単一の可変ドメイン（すなわち抗原に対して特異的な３つのＣＤＲのみしか含まない、Ｆｖの半分）でさえ、抗原を認識し結合する能力を有している。
【００５６】
Ｆａｂフラグメントは、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）もまた含む。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの１つまたは複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での数残基の追加により、Ｆａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’についての本明細書における名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、それらの間にヒンジシステインを有するペアのＦａｂ’フラグメントとしてもともと産生された。抗体フラグメントの他の化学的カップリングもまた公知である。
【００５７】
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる、２つの明らかに異なるタイプのものへ割り当てることができる。
【００５８】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは異なるクラスへ割り当てることができる。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭの５つの主要なクラスの免疫グロブリンがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２（アイソタイプ）へとさらに分けることができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する、重鎖定常ドメインは、α、δ、ε、γおよびμとそれぞれ呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置は周知である。
【００５９】
「抗体フラグメント」は、完全な形の抗体の一部のみを含み、その一部は、完全な形の抗体中に存在する場合にその一部に通常は関連する少なくとも１つの、好ましくは大部分またはすべての機能を好ましくは保持する。抗体フラグメントの具体例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント；ダイアボディ；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子；および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体を含む。１つの実施形態において、抗体フラグメントは、完全な形の抗体の抗原結合部位を含み、したがって抗原を結合する能力を保持する。別の実施形態において、抗体フラグメント（例えばＦｃ領域を含むもの）は、ＦｃＲｎ結合、抗体半減期調節、ＡＤＣＣ機能および補体結合のような、完全な形の抗体中にある場合にＦｃ領域に通常は関連する生物学的機能の少なくとも１つを保持する。１つの実施形態において、抗体フラグメントは、完全な形の抗体に実質的に類似するインビボ半減期を有する一価抗体である。例えば、そのような抗体フラグメントは、フラグメントに対してインビボの安定性を付与することができるＦｃ配列に連結された抗原結合アームを含んでもよい。
【００６０】
用語「超可変領域」、「ＨＶＲ」または「ＨＶ」は、本明細書において使用される場合、配列において超可変であり、および／または構造的に定義されるループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般に、抗体は６つの超可変領域の、３つのＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、および３つのＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。多数の超可変領域の概要説明が使用されており、本明細書において包含される。Ｋａｂａｔの相補性決定領域（ＣＤＲ）は配列可変性に基づき、最も一般に使用されるものである（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ．  （１９９１））。Ｃｈｏｔｈｉａは、代わりに構造的ループの位置に言及する（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  Ｊ．  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１−９１７  （１９８７））。ＡｂＭ超可変領域は、ＫａｂａｔのＣＤＲおよびＣｈｏｔｈｉａの構造的ループの間の折衷案を表わし、オックスフォード・モレキュラー（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）社のＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用される。「接触」超可変領域は利用可能な複合体結晶構造の分析に基づく。これらの超可変領域の各々からの残基は以下に示される。
【００６１】
【表１−２】
2009539870.tif 000004
超可変領域は「拡張された超可変領域」を以下のとおり含んでもよい：ＶＬにおいて２４−３６または２４−３４（Ｌｌ）、４６−５６または５０−５６（Ｌ２）および８９−９７（Ｌ３）、ならびにＶＨにおいて２６−３５（Ｈｌ）、５０−６５または、４９−６５（Ｈ２）および９３−１０２、９４−１０２または９５−１０２（Ｈ３）。可変ドメイン残基は、これらの定義の各々に対して、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（前出）に従ってナンバリングされる。
【００６２】
「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書において定義されるような超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００６３】
本明細書において使用されるような用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団からの抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、モノクローナル抗体の産生の間に生じる可能性のある一般に少量で存在するそのような変異型を除いて、同一であり、および／または同種類のエピトープを結合する。そのようなモノクローナル抗体は、典型的には標的を結合するポリペプチド配列を構成する抗体を含み、標的結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列の選択を含む過程により得られた。例えば、選択過程は、ハイブリドーマクローン、ファージクローンまたは組換ＤＮＡクローンのプールのような複数のクローンからの特有のクローンの選択でありえる。例えば、標的に対する親和性を改善するために、標的結合配列をヒト化するために、細胞培養でその産生を改善するために、インビボでその免疫原性を低下させるために、多重特異性抗体を生成するなどのために、選択された標的結合配列をさらに改変することができること、および改変された標的結合配列を含む抗体もまた本発明のモノクローナル抗体であることが理解されるに違いない。異なる決定基（エピトープ）に対して作製された異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製とは対照的に、モノクローナル抗体調製物のうちの各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対して作製される。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、他の免疫グロブリンが典型的には混入していないことで有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に抗体の均質集団から得られるような抗体の性質を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすることとして解釈しない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ方法を含む様々な技術により作製されてもよい（例えばＫｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６：４９５  （１９７５）；  Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  （コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版、第２版、１９８８年）；  Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ｉｎ：  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１，  （エルゼビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、ニューヨーク１９８１年））、組換ＤＮＡ法（例えば米国特許第４，８１６，５６７号を参照）、ファージディスプレー技術（例えばＣｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３５２：６２４−６２８  （１９９１）；  Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ，  ２２２：５８１−５９７  （１９９１）；  Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．  ３３８（２）：２９９−３１０  （２００４）；  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：  １０７３−１０９３  （２００４）；  Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０１（３４）：  １２４６７−１２４７２  （２００４）；  ａｎｄ  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９−１３２  （２００４）を参照）、およびヒト免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子座または遺伝子の一部またはすべてを有する動物におけるヒトまたはヒト様抗体の産生のための技術（例えばＷＯ  １９９８／２４８９３；  ＷＯ  １９９６／３４０９６；  ＷＯ  １９９６／３３７３５；  ＷＯ  １９９１／１０７４１；  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９０：２５５１  （１９９３）；  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３６２：２５５−２５８  （１９９３）；  Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，  ７：３３  （１９９３）；米国特許番号５，５４５，８０６；５，５６９，８２５；５，５９１，６６９（すべてジェンファーム（ＧｅｎＰｈａｒｍ）社）；５，５４５，８０７；ＷＯ  １９９７／１７８５２；米国特許番号５，５４５，８０７；５，５４５，８０６；５，５６９，８２５；５，６２５，１２６；５，６３３，４２５；および５，６６１，０１６；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １０：  ７７９−７８３  （１９９２）；  Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３６８：  ８５６−８５９  （１９９４）；  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３６８：  ８１２−８１３  （１９９４）；  Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １４：  ８４５−８５１  （１９９６）；  Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １４：  ８２６  （１９９６）；  ａｎｄ  Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，  Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １３：  ６５−９３  （１９９５）を参照）。
【００６４】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含むキメラ抗体である。大部分については、ヒト化抗体は、所望される特異性、親和性および受容能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒトの霊長類のような非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域からの残基によりレシピエントの超可変領域からの残基が置換される、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの実例において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は対応する非ヒト残基により置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体において見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾はさらに抗体性能を改良するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、超可変ループはすべてまたは実質的にすべて非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、ＦＲがすべてまたは実質的にすべてヒト免疫グロブリン配列のＦＲである、少なくとも１つの、および典型的には２つの可変ドメインを実質的にすべて含むだろう。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（典型的にはヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域）の少なくとも一部もまた任意に含むだろう。より詳細には、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１  ：５２２−５２５  （１９８６）；  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９  （１９８８）；および  Ｐｒｅｓｔａ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ２：５９３−５９６  （１９９２）を参照。以下の総説論文、およびその中に引用される参照もまた参照：Ｖａｓｗａｎｉ  ａｎｄ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  Ａｎｎ．  Ａｌｌｅｒｇｙ，  Ａｓｔｈｍａ  ＆  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １  ：１０５−１１５  （１９９８）；  Ｈａｒｒｉｓ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ２３：１０３５−１０３８  （１９９５）；  Ｈｕｒｌｅ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ５：４２８−４３３  （１９９４）。
【００６５】
「キメラ」抗体（免疫グロブリン）は、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同の重鎖および／または軽鎖の一部を有し、一方それらが所望される生物学的活性を示す限りそのような抗体のフラグメントに加えて、鎖の残りは、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同である（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１  ：６８５１−６８５５  （１９８４））。本明細書において使用されるようなヒト化抗体はキメラ抗体のサブセットである。
【００６６】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一ポリペプチド鎖で存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、抗原結合の所望される構造をｓｃＦｖが形成することを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの総説については、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  ｖｏｌ．  １１３，  Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ．  ２６９−３１５  （１９９４）中のＰｌｕｃｋｔｈｕｎを参照。
【００６７】
「抗原」は抗体が選択的に結合できる所定の抗原である。標的抗原は、ポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ハプテンまたは他の天然に存在する化合物もしくは合成物化合物であってもよい。好ましくは、標的抗原はポリペプチドである。
【００６８】
用語「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を備えた小抗体フラグメントを指し、そのフラグメントは、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）中で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同一鎖上の２つのドメイン間の対合が可能でないほど短いリンカーの使用により、ドメインは、別の鎖の相補ドメインとの対合を強いられ、２つの抗原結合部位を生成する。例えば、ダイアボディはより完全にＥＰ  ４０４，０９７；、ＷＯ  ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９０：６４４４−６４４８  （１９９３）中に記載される。
【００６９】
「ヒト抗体」は、ヒトにより生産されるおよび／または本明細書において開示されるようなヒト抗体の作製のための技術のいずれかを使用して作製される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原を結合する残基を含むヒト化抗体を特異的に除外する。
【００７０】
「親和性成熟」抗体は、それらの変化を持たない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性の改善を結果的にもたらす、１つまたは複数のそのＣＤＲ中の１つまたは複数の変化を備えたものである。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対してナノモルまたはピコモルの親和性を有するだろう。親和性成熟抗体は当技術分野において公知の手順により産生される。Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０  ：７７９−７８３  （１９９２）は、ＶＨおよびＶＬのドメインシャッフリングによる親和性成熟を記載する。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダム変異誘発は以下により記載される：Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ，  ＵＳＡ  ９１  ：３８０９−３８１３  （１９９４）；  Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅ  １６９：１４７−１５５  （１９９５）；  Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５５：１９９４−２００４  （１９９５）；  Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５４（７）：３３１０−９  （１９９５）；  およびＨａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  ＭｏｌＩ．  Ｂｉｏｌ．  ２２６：８８９−８９６  （１９９２）。
【００７１】
抗体「エフェクター機能」は抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列変異型Ｆｃ領域）に起因するそれらの生物学的活性を指し、抗体アイソタイプに応じて変化する。抗体エフェクター機能の具体例は、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；ファゴサイトーシス；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）のダウンレギュレーション；およびＢ細胞活性化を含む。
【００７２】
「抗体依存性細胞性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」は、特定の細胞傷害性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球およびマクロファージ）に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）上に結合される分泌Ｉｇが、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原保有標的細胞へ特異的に結合することを可能にし、続いて細胞毒素により標的細胞を殺す、細胞傷害形態を指す。抗体は細胞傷害性細胞を「武装」させ、そのような死滅のために完全に必要とされる。ＡＤＣＣの仲介のための一次細胞（ＮＫ細胞）はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞に関するＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２  （１９９１）の４６４ページの表３に要約される。対象となる分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号またはＰｒｅｓｔａ米国特許６，７３７，０５６番に記載されるもののようなインビトロのＡＤＣＣ分析は行なわれてもよい。そのような分析のための有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含んでいる。あるいはまたは加えて、対象となる分子のＡＤＣＣ活性は、例えばＣｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＮＡＳ  （ＵＳＡ）  ９５：６５２−６５６  （１９９８）中に開示されるもののような動物モデルにおいてインビボで評価されてもよい。
【００７３】
「ヒトエフェクター細胞」は、１つまたは複数のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を実行する白血球である。好ましくは、細胞は少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを仲介するヒト白血球の具体例は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞障害性Ｔ細胞および好中球を含み；ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は天然ソースから、例えば血液から単離されてもよい。
【００７４】
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を説明する。好ましいＦｃＲは天然配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）を結合し、これらの受容体の対立遺伝子変異型およびオルタナティブスプライス型を含む、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含むものである。ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性受容体」）を含み、それらは、主としてその細胞質ドメインで異なる、類似したアミノ酸配列を有する。受容体ＦｃγＲＩＩＡの活性化は、その細胞質ドメイン中に免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢはその細胞質ドメイン中に免疫受容体チロシン阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（総説Ｍ．  ｉｎ  Ｄａｅｒｏｎ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５：２０３−２３４  （１９９７）を参照）。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２  （１９９１）；  Ｃａｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４  （１９９４）；  およびｄｅ  Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｌａｂ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｅｄ．  １２６：３３０−４１  （１９９５）中で概説される。今後同定されるそれらを含む他のＦｃＲは、用語「ＦｃＲ」により本明細書において包含される。この用語は、新生仔受容体（胎児への母体ＩｇＧの移行に関与するＦｃＲｎ）もまた含み（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１７：５８７  （１９７６）  ａｎｄ  Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４：２４９  （１９９４））免疫グロブリンのホメオスタシスを調節する。
【００７５】
ＷＯ００／４２０７２（Ｐｒｅｓｔａ）は、改良または減少したＦｃＲへの結合を備えた抗体変異型を説明する。特許公報の内容は、参照することにより特に本明細書に組み入れられる。Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ９（２）：  ６５９１−６６０４  （２００１）も参照。
【００７６】
ＦｃＲｎへの結合を測定する方法は公知である（例えばＧｈｅｔｉｅ  １９９７，  Ｈｉｎｔｏｎ  ２００４を参照）。ヒトＦｃＲｎへのインビボでの結合およびヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えばヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウスもしくはトランスフェクションされたヒト細胞株、またはＦｃ変異型ポリペプチドを投与された霊長類において分析できる。
【００７７】
「補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」は、補体の存在下における標的細胞の溶解を指す。古典的補体経路の活性化は、それらの同種抗原へ結合される抗体（適切なサブクラスの）へ補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）の結合により開始される。補体活性化を評価するために、ＣＤＣ分析を、例えばＧａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３  （１９９６）中に記載されるように、実行してもよい。
【００７８】
改変されたＦｃ領域アミノ酸配列および増加または低下したＣ１ｑ結合能を有するポリペプチド変異型は、米国特許第６，１９４，５５１Ｂｌ号およびＷＯ９９／５１６４２中に記載される。それらの特許公報の内容は、参照することにより特に本明細書に組み入れられる。Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６４：  ４１７８−４１８４  （２０００）もまた参照。
【００７９】
用語「Ｆｃ領域含有ポリペプチド」は、Ｆｃ領域を含む、抗体またはイムノアドヘジン（下記の定義を参照）のようなポリペプチドを指す。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵナンバリングシステムに従う残基４４７）は、例えば、ポリペプチドの精製の間に、またはポリペプチドをコードする核酸の組換え操作によって除去されてもよい。したがって、本発明に従うＦｃ領域を有するポリペプチドを含む組成物は、Ｋ４４７を持つポリペプチド、すべてのＫ４４７が除去されたポリペプチド、またはＫ４４７残基を持つおよび持たないポリペプチドの混合物を含むことができる。
【００８０】
「遮断」抗体または「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物学的活性を阻害または低下させる抗体である。好ましい遮断抗体またはアンタゴニスト抗体は、実質的にまたは完全に抗原の生物学的活性を阻害する。
【００８１】
「長期」投与は、長期間最初の治療的効果（活性）を維持するように、短期様式とは対照的な継続的様式の薬剤の投与を指す。「間欠」投与は、中断なしで引き続いて行われないが、本来むしろ周期的な治療である。
【００８２】
「障害」または「疾患」は、物質／分子による治療または本発明の方法から利益を得る任意の状態である。これは、問題となる障害へ哺乳類を罹患しやすくする病理学的状態を含む長期および短期の障害または疾患を含んでいる。本明細書において治療される障害の非限定的具体例は悪性腫瘍および良性腫瘍；癌腫、芽細胞腫ならびに肉腫を含む。
【００８３】
用語「細胞増殖障害」および、「増殖障害」は、ある程度の異常な細胞増殖に関連する障害を指す。１つの実施形態において、細胞増殖障害は癌である。
【００８４】
「腫瘍」は、本明細書において使用されるように、悪性または良性にかかわらず、すべての新生細胞の成長および増殖、ならびにすべての前癌性および癌性の細胞および組織を指す。本明細書において言及されるような、用語「癌」、「癌性」、「細胞増殖障害」「増殖障害」および「腫瘍」は相互に排他的ではない。
【００８５】
用語「癌」および「癌性」は、無秩序な細胞成長／増殖によって典型的には特徴づけられる、哺乳類における生理学的状態を指すかまたは説明する。癌の具体例は、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病を含むが、これらに限定されない。
【００８６】
そのような癌のより詳細な具体例は、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、消化管癌、膵臓癌、グリア芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝臓癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、胃癌、メラノーマおよび様々なタイプの頭頸部癌を含む。血管形成の調節異常は、本発明の組成物および方法によって治療できる多くの障害をもたらしうる。これらの障害は、非新生物性症状および新生物性症状の両方を含んでいる。新生物は、上で説明されたものを含むが、これらに限定されない。非新生物性障害は、所望されないまたは異常な肥大、関節炎、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、乾癬性局面、類肉腫症、アテローム性動脈硬化、アテローム斑、糖尿病性網膜症および末熟児網膜症を含む他の増殖性網膜症、後水晶体線維形成症、血管新生緑内障、加齢黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、角膜血管新生、角膜移植片血管新生、角膜移植後拒絶反応、網膜／脈絡膜血管新生、隅角の血管新生（ルベオーシス）、眼血管新生疾患、血管再狭窄、動静脈奇形（ＡＶＭ）、髄膜腫、血管腫、線維性血管腫、甲状腺過形成（グレーヴス病を含む）、角膜および他の組織移植、慢性炎症、肺炎症、急性肺損傷／ＡＲＤＳ、敗血症、原発性肺高血圧症、悪性肺水、脳水腫（例えば、急性脳卒中／閉鎖性頭部外傷／外傷と関連する）、滑膜炎、ＲＡにおけるパンヌス形成、骨化性筋炎、肥大性骨形成、骨関節炎（ＯＡ）、難治性腹水症、多嚢胞卵巣、子宮内膜症、体液のサードスペースへの移行に関する疾患（３ｒｄ  ｓｐａｃｉｎｇ  ｏｆ  ｆｌｕｉｄ  ｄｉｓｅａｓｅ）（膵炎、隔壁腔症候群、熱傷、腸疾患）、子宮筋腫、早産、ＩＢＤのような慢性炎症（クローン病および潰瘍性大腸炎）、腎臓同種移植拒絶、炎症性腸疾患、ネフローゼ症候群、所望されないまたは異常な組織量の増殖（非癌）、血友病性関節、肥厚性瘢痕、髪の成長の阻害、オジェ・ウェーバー（Ｏｓｉｅｒ−Ｗｅｂｅｒ）症候群、化膿性肉芽腫後水晶体線維形成症、硬皮症、トラホーム、血管の癒着、関節滑膜炎、皮膚炎、子癇前症、腹水、心膜液貯留（心膜炎に関連するもののような）、ならびに胸水を含むが、これらに限定されない。
【００８７】
本明細書において使用されるように、「治療」は、治療されている個体または細胞の自然経過を改変しようとする、臨床的介入を指し、予防のために、または臨床病理学の過程の間のいずれかで実行することができる。治療の望ましい効果は、疾患の発生または再発の予防、病徴の緩和、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的帰結の減少、転移の予防、疾患進行率の低下、病状の改良または緩和、および寛解または予後の改善を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、疾患または障害の発生を遅延させるために使用される。
【００８８】
「個体」は脊椎動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトである。哺乳類は、酪農動物（ウシのような）、競技動物、ペット（ネコ、イヌおよびウマのような）、霊長類、マウスおよびラットを含むが、これらに限定されない。
【００８９】
治療目的の「哺乳類」は、ヒト、家畜および酪農動物、ならびにイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどのような、動物園動物、競技動物またはペット動物を含む、哺乳類として分類される任意の動物を指す。好ましくは、哺乳類はヒトである。
【００９０】
「有効量」は、所望される治療的または予防的な結果を達成する、投与量でのおよび必要な期間での、有効な量を指す。
【００９１】
物質／分子の「治療的有効量」は、病状、個体の年齢、性別および体重のような因子、ならびに物質／分子、アゴニストまたはアンタゴニストが個体において所望される反応を誘発する能力に従って変化してもよい。治療的有効量は、治療上有益な効果が、物質／分子、アゴニストまたはアンタゴニストの任意の毒性効果または損傷効果を上回るものでもある。「予防的有効量」は、所望される予防的な結果を達成する、投与量でのおよび必要な期間での、有効な量を指す。典型的には、予防的用量が疾患の初期段階の前にまたは初期段階で、被験体において使用されるので、予防的有効量は治療的有効量よりも少ないが、必ずしもそうでなくてもよい。
【００９２】
本明細書において使用されるような用語「細胞傷害剤」は、細胞の機能を阻害または防止する、および／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えばＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２およびＬｕの放射性同位体）、化学療法剤（例えばメトトレキサート、アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｉｃｉｎ）、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブチル、ダウノルビシンまたは他のインターカレーター、核酸分解酵素のような酵素およびそのフラグメント、抗生物質、ならびにそのフラグメントおよび／または変異型を含む、細菌、真菌、植物もしくは動物起源の低分子毒素または酵素により活性のある毒素のような毒素）、および以下に開示される様々な抗腫瘍剤または抗癌剤を含むように意図される。他の細胞傷害剤は以下に記載される。殺腫瘍剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
【００９３】
「化学療法剤」は癌の治療において有用な化学化合物である。化学療法剤の具体例は、チオテパおよびサイトキサン（ＣＹＴＯＸＡＮ）（登録商標）シクロスフォスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンのようなアルキルスルホネート；ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）およびウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）のようなアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド（ｔｒｉｅｔｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリエチレンチオホスホルアミド（ｔｒｉｅｔｈｉｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）およびトリメチローロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含むエチレンイミンおよびメチラメルアミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；アセトゲニン（特にブラタシンおよびブラタシノン（ｂｕｌｌａｔａｃｉｎｏｎｅ））；δ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、マリノール（ＭＡＲＩＮＯＬ）（登録商標））；β−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン  （合成アナログのトポテカン（ハイカムチン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ）（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、カンプトサール（ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ）（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン（ｓｃｏｐｏｌｅｃｔｉｎ）、および９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシンの合成アナログを含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスチン；デュオカルマイシン（合成アナログ、ｋＷ−２１８９およびＣＢｌ−ＴＭｌを含む）；エルーテロビン（ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｂｉｎ）；パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコジクチン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンジスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）；クロラムブチル、クロルナファジン、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベムビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロホスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタードのようなナイトロジェンマスタード；カルマスティン、クロロゾトシン、ホテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン、ニムスチンおよびラニムヌスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ）のようなニトロスウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）；エンジイン抗生物質（例えばカリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマール（ｇａｍｍａｌｌ）およびカリケアマイシンオメガール（ｏｍｅｇａｌｌ）のような抗生物質（例えばＡｇｎｅｗ，  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．，  ３３：  １８３−１８６  （１９９４）を参照）；ダイネミシンＡを含むダイネミシン；エスペラミシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）；に加えてネオカ���チノスタチン発色団および関連した色素タンパク質エンジインアンティオビオティック（ａｎｔｉｏｂｉｏｔｉｃ）発色団）、アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎ）、アクチノマイシン、アスラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジオリピン、クロモマイシニス（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、アドリアマイシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ）（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ−アドリアマイシン、シアノモルホリノ−アドリアマイシンおよび２−ピロリノ（ｐｙｒｒｏｌｉｎｏ）−アドリアマイシンおよびデオキシアドリアマイシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）のような抗代謝物質；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートのような葉酸アナログ；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）、チオグアニンのようなプリンアナログ；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンのようなピリミジンアナログ；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンのようなアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎物質（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）；フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）のような葉酸リプレニッシャー；アセグラトン；アルドホスファミド配糖体；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビスアントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デホファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジコン；エルフォルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ）；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；メイタンシンのようなメイタンシノイドおよびアンサマイトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド  ；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）ポリサッカライド複合体（ＪＨＳナチュラル・プロダクツ（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄ���ｃｔｓ）社、ユージーン、オレゴン）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラクリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎ）Ａおよびアングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ））；ウレタン；ビンデシン（エルディシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ）（登録商標）、フィルデシン  （ＦＩＬＤＥＳＩＮ）（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシッド（「アラＣ」）；チオテパ；タキソイド、例えばタキソール（ＴＡＸＯＬ）（登録商標）パクリタキセル（ブリストル・マイヤーズ・スクイブ・オンコロジー（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）社、プリンストン、ニュージャージー）、アブラキサン（ＡＢＲＡＸＡＮＥ）（商標）クレモフォール不含、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子処方（アメリカン・ファーマシューティカル・パートナーズ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ）社、シャンバーグ、イリノイ）、およびタキソテール（ＴＡＸＯＴＥＲＥ）（登録商標）ｄｏｘｅｔａｘｅｌ（ローヌ・プーラン・ローラー（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ）社、アントニー、フランス）；クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｎｂｕｃｉｌ）；ゲムシタビン（ジェムザール（ＧＥＭＺＡＲ）（登録商標））；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンおよびカルボプラチンのような白金アナログ；ビンブラスチン（ベルバンＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（オンコビン（ＯＮＣＯＶＩＮ）（登録商標））；オキサリプラチン；ロイコボビン（ｌｅｕｃｏｖｏｖｉｎ）；ビノレルビン（ナベルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ）（登録商標））；ノバントロン；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸のようなレチノイド；カペシタビン（ゼローダ（ＸＥＬＯＤＡ）（登録商標））；上述ののいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体；加えてＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾロンの組合せ療法の略語）およびＦＯＬＦＯＸ（５−ＦＵおよびロイコボビンと組合せるオキサリプラチン（エロキサチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ）（商標））による治療計画の略語）のような上述のの２つまたは複数の組合せ、を含む。
【００９４】
さらにこの定義に含まれるものは、癌の増殖を促進できるホルモンの効果を調節、低下、遮断、または阻害するように作用する抗ホルモン剤であり、しばしば全身投与形態、または全身的治療である。それらはホルモン自体であってもよい。具体例は、（例えば）タモキシフェン（ノルバデックス（ＮＯＬＶＡＤＥＸ）（登録商標）タモキシフェンを含む）、エビスタ（ＥＶＩＳＴＡ）（登録商標）ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン（ｔｒｉｏｘｉｆｅｎｅ）、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹｌ  １７０１８、オナプリストン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）、およびフェアストン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ）（登録商標）トレミフェンを含む抗エストロゲンおよび選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）；抗プロゲステロン；エストロゲン受容体のダウンレギュレーター（ＥＲＤ）；卵巣を抑制または停止するように機能する薬剤、例えばリュプロン（ＬＵＰＲＯＮ）（登録商標）およびエリガード（ＥＬＩＧＡＲＤ）（登録商標）酢酸ロイプロリド、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリンおよびトリプトレリンのような黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト；フルタミド、ニルタミドおよびビカルタミドのような他の抗アンドロゲン；および酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤（例えば４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、メゲース（ＭＥＧＡＳＥ）（登録商標）酢酸メゲストロール、アロマシン（ＡＲＯＭＡＳＩＮ）（登録商標）エキセメスタン、フォルメスタニー（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｉｅ）、ファドロゾール、リビソール（ＲＩＶＩＳＯＲ）（登録商標）ボロゾール、フェマーラ（ＦＥＭＡＲＡ）（登録商標）レトロゾールおよびアリミデックス（ＡＲＩＭＩＤＥＸ）（登録商標）アナストロゾールのような、副腎におけるエストロゲン産生を調節するもの）を含む。さらに化学療法剤のそのような定義は、クロドロネート（例えばボネフォス（ＢＯＮＥＦＯＳ）（登録商標）またはオスタック（ＯＳＴＡＣ）（登録商標））、ジドロカル（ＤＩＤＲＯＣＡＬ）（登録商標）エチドロネート、ＮＥ−５８０９５、ゾメタ（ＺＯＭＥＴＡ）（登録商標）ゾレドロン酸／ゾレドロナート、フォサマックス（ＦＯＳＡＭＡＸ）（登録商標）アレンドロネート、アレディア（ＡＲＥＤＩＡ）（登録商標）パミドロネート、スケリッド（ＳＫＥＬＩＤ）（登録商標）チルドロネートまたはアクトネル（ＡＣＴＯＮＥＬ）（登録商標）リセドロネートのようなビスホスホネート；トロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ）に加えて；アンチセンスオリゴヌクレオチド（特に例えばＰＫＣα、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓおよび表皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）のような異常な細胞増殖に関係するシグナル経路中の遺伝子の発現を阻害するもの）；セラトープ（ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ）（登録商標）ワクチンおよび遺伝子療法ワクチンのようなワクチン（例えばアロベクチン（ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ）（登録商標）ワクチン、リューベクチン（ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ）（登録商標）ワクチン、バキシド（ＶＡＸＩＤ）（登録商標）ワクチン）；ルルトテカン（ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ）（登録商標）トポイ��メラーゼ１阻害剤；アバレリクス（ＡＢＡＲＥＬＩＸ）（登録商標）ｒｍＲＨ；ラパチニブトシル酸（ＧＷ５７２０１６としてもまた公知のＥｒｂＢ−２およびＥＧＦＲのデュアルチロシンキナーゼ低分子阻害剤）；および上述の任意のものの薬学的に許容される塩、酸または誘導体を含む。
【００９５】
「増殖阻害剤」は、本明細書において使用された場合、インビトロまたはインビボのいずれかで細胞（ＤＬＬ４を発現する細胞のような）の増殖を阻害する化合物または組成物を指す。したがって、増殖阻害剤は、Ｓ期にある細胞（ＤＬＬ４を発現する細胞のような）のパーセンテージを著しく低下させるものでありえる。増殖阻害剤の具体例は、Ｇ１期停止およびＭ期停止を誘導する薬剤のような、細胞周期進行（Ｓ期以外の場所での）を遮断する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカ（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、タキサン、ならびにドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシドおよびブレオマイシンのようなトポイソメラーゼＩＩ阻害剤を含んでいる。Ｇ１期を停止する薬剤は、さらにＳ期停止へと波及し、例えばタモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシルおよびアラＣのようなＤＮＡアルキル化剤である。さらに詳しい情報は、Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，  Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  ａｎｄ  Ｉｓｒａｅｌ，  編、（ＷＢサンダース（Ｓａｕｎｄｅｒｓ）：フィラデルフィア、１９９５年）チャプター１、Ｍｕｒａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．  による表題「Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，  ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ，  ａｎｄ  ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ」、特にページ１３において見出すことができる。タキサン（パクリタキセルおよびドセタセル）は両者ともセイヨウイチイに由来する抗癌剤である。ヨーロッパのイチイに由来するドセタセル（タキソテール（ＴＡＸＯＴＥＲＥ）（登録商標）、ローヌ・プーラン・ローラー社）は、パクリタキセル（タキソール（ＴＡＸＯＬ）（登録商標）、ブリストル・マイヤーズ・スクイブ社）の半合成アナログである。パクリタキセルおよびドセタセルは、チューブリン二量体からの微小管の集合を促進および解重合の防止によって微小管を安定化し、それは細胞中の有糸分裂の阻害をもたらす。
【００９６】
「ドキソルビシン」はアントラサイクリン系抗生物質である。ドキソルビシンの完全な化学名は、（８Ｓ−シス）−１０−［（３−アミノ−２，３，６−トリデオキシ−α−Ｌ−リキソ−ヘキサピラノシル）オキシ］−７，８，９，１０−テトラヒドロ−６，８，１１−トリヒドロキシ−８−（ヒドロキシアセチル）−１−メトキシ−５，１２−ナフタセンジオンである。
【００９７】
「眼内血管新生疾患」は、眼の血管新生により特徴づけられる疾患である。眼内血管新生疾患の具体例は、増殖性網膜症、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性および他の虚血関連の網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォンヒッペル−リンダウ病、眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）を含む網膜静脈閉塞、角膜血管新生、網膜血管新生などを含むが、これらに限定されない。
【００９８】
疾患の「病理」は、患者の健康を損なう現象をすべて含む。癌については、これは異常または制御できない細胞増殖および転移、隣接の細胞の正常な機能の妨害、異常レベルでのサイトカインまたは他の分泌物の放出、炎症反応または免疫反応の抑制または増悪などを含むが、これらに限定されない。
【００９９】
１つまたは複数のさらなる治療剤との「組合せ」での投与は、同時（併用）投与および任意の順番での連続投与を含む。
【０１００】
本明細書において使用されるような「担体」は、用いられる投与量および濃度でそれらに暴露されている細胞または哺乳類に対して無毒である、薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤を含む。生理学的に許容される担体は、しばしば水溶性のｐＨ緩衝液である。生理学的に許容される担体の具体例は、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸のような緩衝剤；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基以下の）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンのようなアミノ酸；単糖、二糖類、およびグルコース、マンノースまたはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような塩形成カウンターイオン；および／またはツイーン（ＴＷＥＥＮ）（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびプルロニクス（ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ）（商標）のような非イオン性界面活性剤を含む。
【０１０１】
「リポソーム」は、哺乳類へ薬物（ＤＬＬ４ポリペプチドまたはそれに対する抗体のような）の送達に有用である、様々なタイプの脂質、リン脂質および／または界面活性剤からなる小さな小胞である。リポソームの成分は一般に、二重層形成（生体膜の脂質配置に類似する）で配置される。
【０１０２】
用語「ＶＥＧＦ」および「ＶＥＧＦ−Ａ」は、Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４６：１３０６  （１９８９），  Ｈｏｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．，  ５：１８０６  （１９９１），  ａｎｄ，  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＆  Ｓｔｒｉｎｇｅｒ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １４４（５）：８５３−８６５  （２００１）により説明されるように、天然に存在する対立遺伝子およびそのプロセシングされた型と共に、１６５アミノ酸の血管内皮細胞増殖因子および関連する１２１、１４５、１８３、１８９および２０６アミノ酸の血管内皮細胞増殖因子を指すように同じ意味で使用される
「ＶＥＧＦアンタゴニスト」は、１つまたは複数のＶＥＧＦ受容体へのその結合を含むＶＥＧＦ活性を、中和、遮断、阻害、停止、減少または妨害してできる分子を指す。ＶＥＧＦアンタゴニストは、抗ＶＥＧＦ抗体およびその抗原結合フラグメント、ＶＥＧＦに特異的に結合することによって１つまたは複数の受容体へのその結合を隔離する受容体分子および誘導体、抗ＶＥＧＦ受容体抗体およびＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの低分子阻害剤のようなＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト、ならびに融合タンパク質（例えばＶＥＧＦトラップ（リジェネロン（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）社）、ＶＥＧＦ１２１ゲロニン（ペレグリン（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｅ）社））を含む。ＶＥＧＦアンタゴニストは、ＶＥＧＦのアンタゴニスト変異型、ＶＥＧＦに向けられたアンチセンス分子、ＲＮＡアプタマー、およびＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体に対するリボザイムもまた含む。
【０１０３】
「抗ＶＥＧＦ抗体」は十分な親和性および特異性によりＶＥＧＦに結合する抗体である。抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦ活性が関与する疾患または症状を標的および妨害することで治療剤として使用することができる。例えば、米国特許６，５８２，９５９および６，７０３，０２０；ＷＯ９８／４５３３２；ＷＯ９６／３００４６；ＷＯ９４／１０２０２、ＷＯ２００５／０４４８５３；；ＥＰ  ０６６６８６８Ｂ１；米国特許出願２００３０２０６８９９、２００３０１９０３１７、２００３０２０３４０９、２００５０１１２１２６、２００５０１８６２０８および２００５０１１２１２６；Ｐｏｐｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８８：  １４９−１６４  （２００４）；およびＷＯ２００５０１２３５９を参照。抗ＶＥＧＦ抗体は、通常ＶＥＧＦ−ＢまたはＶＥＧＦ−Ｃのような他のＶＥＧＦホモログにも、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦまたはｂＦＧＦのような他の増殖因子にも結合しない。「ｒｈｕＭＡｂ  ＶＥＧＦ」または「アバスチン（登録商標）」としてもまた公知の抗ＶＥＧＦの抗体「ベバシズマブ（ＢＶ）」は、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５７：４５９３−４５９９  （１９９７）に従って産生される組換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体である。それは、受容体へのヒトＶＥＧＦの結合を遮断するマウス抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体Ａ．４．６．１から変異させた、ヒトＩｇＧ１フレームワーク領域および抗原結合相補性決定領域を含む。大部分のフレームワーク領域を含むベバシズマブのアミノ酸配列のおよそ９３％はヒトＩｇＧ１に由来し、配列の約７％はマウス抗体Ａ４．６．１に由来する。ベバシズマブは、約１４９，０００のダルトンの分子量を有しており糖鎖が付加する。抗ＶＥＧＦ抗体フラグメント「ラニビズマブ」（「ルセンティス（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）（登録商標）」としてもまた公知）を含む、ベバシズマブおよび他のヒト化抗ＶＥＧＦ抗体は、２００５年２月２６日に発行された米国特許第６，８８４，８７９号にさらに記載されている。
【０１０４】
ＤＬＬ４ポリペプチドに関する、用語「生物学的活性」および「生物学的に活性のある」は、ＤＬＬ４に関連した物理的／化学的性質および生物学的機能を指す。いくつかの実施形態において、ＤＬＬ４の「生物学的活性」は、以下の１つ以上を含んでいる：ノッチ受容体（例えばノッチ１、ノッチ２、ノッチ３、ノッチ４）の結合、ノッチ受容体の活性化、およびノッチ受容体下流の分子シグナリングの活性化。この文脈において、用語「調節する」は、促進および阻害の両方を含む。
【０１０５】
「ＤＬＬ４アンタゴニスト」は、例えば、ノッチ受容体活性化の減少または遮断、ノッチ受容体下流の分子シグナリングの減少または遮断、ＤＬＬ４へのノッチ受容体の結合の破壊または遮断、および／または内皮細胞増殖の促進、および／または内皮細胞分化の阻害、および／または動脈分化の阻害を含む、ＤＬＬ４の活性を中和、遮断、阻害、停止、減少または妨害できる分子を指す。ＤＬＬ４アンタゴニストは、抗体およびその抗原結合フラグメント、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、ポリサッカライド、オリゴサッカライド、核酸、生体有機分子、ペプチド模倣薬、薬物およびその代謝物質、転写制御配列および翻訳制御配列、ならびに同種のものを含む。アンタゴニストは、タンパク質の低分子阻害剤、および融合タンパク質、タンパク質に特異的に結合することによってその標的へのその結合を隔離する受容体分子および誘導体、タンパク質のアンタゴニスト変異型、ｓｉＲＮＡ分子、タンパク質に向けられたアンチセンス分子、タンパク質に向けられたＲＮＡアプタマー、ならびにタンパク質に対するリボザイムもまた含む。いくつかの実施形態において、ＤＬＬ４アンタゴニストは、ＤＬＬ４と結合し、ＤＬＬ４の生物学的活性を中和、遮、阻害、停止、減少または妨害する分子である。いくつかの実施形態において、ＤＬＬ４アンタゴニストは、ノッチ受容体（ノッチ１、ノッチ２、ノッチ３および／またはノッチ４のような）と結合し、ＤＬＬ４の生物学的活性を中和、遮断、阻害、停止、減少または妨害する分子である。いくつかの実施形態において、ＤＬＬ４アンタゴニストは、ノッチ受容体活性化の減少または遮断、ノッチ受容体下流の分子シグナリングの減少または遮断、ＤＬＬ４へのノッチ受容体の結合の破壊または遮断、および／または内皮細胞増殖の促進、および／または内皮細胞分化の阻害、および／または動脈分化の阻害、および／または腫瘍の血管灌流の阻害、および／または腫瘍、細胞増殖障害または癌の治療および／または予防；および／またはＤＬＬ４発現および／または活性および／または治療に関連した障害の治療または予防、またはノッチ受容体発現および／または活性に関連した障害の予防の１つまたは複数のいずれかを含むが、これらに限定されない、ＤＬＬ４に関連する効果の１つまたは複数の態様を調節する。
【０１０６】
用語「抗新生物組成物」は、少なくとも１つの活性のある治療剤（例えば「抗癌剤」）を含む、癌の治療において有用な組成物を指す。治療剤（本明細書において「抗新生物剤」と呼ばれる抗癌剤）の具体例は、例えば化学療法剤、増殖阻害剤、細胞傷害剤、放射線療法において使用される薬剤、抗血管形成剤、アポトーシス剤、抗チューブリン剤、毒素、ならびに癌を治療する他の薬剤、例えば、抗ＶＥＧＦ中和抗体、ＶＥＧＦアンタゴニスト、抗−ＨＥＲ−２、抗ＣＤ２０、表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）アンタゴニスト（例えばチロシンキナーゼインヒビター）、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ阻害剤、エルロチニブ、ＣＯＸ−２阻害剤（例えばセレコキシブ）、インターフェロン、サイトカイン、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４またはＶＥＧＦ受容体の１つまたは複数に結合するアンタゴニスト（例えば中和抗体）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）および／または幹細胞因子（ＳＣＦ）に対する受容体チロシンキナーゼ阻害剤（例えばメシル酸イマチニブ（グリーベック（Ｇｌｅｅｖｅｃ）（登録商標）ノバルティス（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）社））、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌ、ならびに他の生物活性薬剤および有機化学薬剤などを含むが、これらに限定される。
【０１０７】
本願において使用されるような用語「プロドラッグ」は、親薬物と比較して腫瘍細胞に対してそれほど細胞傷害性ではなく、より活性のある親形態へと酵素的に活性化または変換することができる、薬学的に活性のある物質の前駆体または誘導体の形態を指す。例えばＷｉｌｍａｎ、“Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ”  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，  １４，  ｐｐ．  ３７５−３８２，  ６１５ｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｂｅｌｆａｓｔ  （１９８６）、Ｓｔｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ，  “Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：  Ａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，  Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．編、ページ２４７−２６７、ヒューマナ出版（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）１９８５年を参照。本発明のプロドラッグは、リン酸塩含有プロドラッグ、チオリン酸塩含有プロドラッグ、硫酸塩含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸修飾プロドラッグ、糖鎖付加プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグまたは任意に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロサイトシンおよびより活性のある細胞傷害性不含薬物に変換可能な他の５−フルオロウリジンプロドラッグを含むが、これらに限定されない。本発明で使用されるプロドラッグ形態へと誘導体化することができる細胞毒性薬の具体例は、上で説明される化学療法剤を含むが、これらに限定されない。
【０１０８】
「血管形成因子または血管形成剤」は、血管の発生を刺激する（例えば、血管形成、血管内皮細胞の増殖、血管の安定性、および／または脈管形成などを促進する）増殖因子である。例えば血管形成因子は、例えばＶＥＧＦおよびＶＥＧＦファミリーの一員、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦファミリー、線維芽細胞増殖因子ファミリー（ＦＧＦ）、ＴＩＥリガンド（アンジオポイエチン）、エフリン、ＡＮＧＰＴＬ３、ＤＬＬ４などを含むが、これらに限定されない。それは、創傷治癒を促進する因子（成長ホルモン、インスリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、ＶＩＧＦ、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＣＴＧＦおよびそのファミリーの一員、ならびにＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βのような）もまた含むだろう。例えばＫｌａｇｓｂｒｕｎ  ａｎｄ  Ｄ’Ａｍｏｒｅ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  ５３：２１７−３９  （１９９１）；  Ｓｔｒｅｉｔ  ａｎｄ  Ｄｅｔｍａｒ，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  ２２：３１７２−３１７９  （２００３）；  Ｆｅｒｒａｒａ  ＆  Ａｌｉｔａｌｏ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５（１２）：  １３５９−１３６４  （１９９９）；  Ｔｏｎｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  ２２：６５４９−６５５６  （２００３）（例えば、表１にリストしてある血管形成因子）；およびＳａｔｏ  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．，  ８：２００−２０６  （２００３）を参照。
【０１０９】
「抗血管形成剤」または「血管形成阻害剤」は、血管形成、脈管形成または不適当な血管透過性を直接的または間接的のいずれかで阻害する、低分子量物質、ポリヌクレオチド（例えば抑制性ＲＮＡ（ＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡ）を含む）、ポリペプチド、単離タンパク質、組換えタンパク質、抗体、またはそのコンジュゲートもしくは融合タンパク質を指す。例えば抗血管形成剤は、上で定義されるような血管形成剤に対する抗体または他のアンタゴニスト、例えばＶＥＧＦに対する抗体、ＶＥＧＦ受容体に対する抗体、ＶＥＧＦ受容体シグナリングを遮断する低分子（例えばＰＴＫ７８７／ＺＫ２２８４、ＳＵ６６６８、スーテント（ＳＵＴＥＮＴ）（登録商標）／ＳＵ  １１２４８（スニチニブリンゴ酸塩）、ＡＭＧ７０６、または例えば国際特許出願ＷＯ  ２００４／１１３３０４に記載されるもの）である。抗血管形成剤は、天然の血管形成阻害剤（例えばアンジオスタチン、エンドスタチンなど）もまた含む。例えば、Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ  ａｎｄ  Ｄ’Ａｍｏｒｅ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ，  ５３：２１７−３９  （１９９１）；  Ｓｔｒｅｉｔ  ａｎｄ  Ｄｅｔｍａｒ，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  ２２：３１７２−３１７９  （２００３）（例えば、表３に悪性メラノーマにおける抗血管形成療法をリストする）；Ｆｅｒｒａｒａ  ＆  Ａｌｉｔａｌｏ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５（１２）：  １３５９−１３６４  （１９９９）；  Ｔｏｎｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  ２２：６５４９−６５５６  （２００３）（例えば表２に抗血管形成因子をリストする）；およびＳａｔｏ  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．，  ８：２００−２０６  （２００３）（例えば、表１に臨床試験において使用される抗血管形成剤をリストする）を参照。
【０１１０】
本発明の方法および組成物
本発明は、ノッチ受容体経路のデルタ様４（同じ意味で「ＤＬＬ４」と呼ばれる）活性化を調節する薬剤による処理によって血管発生が阻害されるという発見に部分的に基づく。ＤＬＬ４アンタゴニストによる処理は、腫瘍血管を含む血管において、内皮細胞（ＥＣ）増殖の増加、不適切な内皮細胞分化および不適切な動脈発生をもたらした。驚くべきことに、抗ＤＬＬ４抗体による処理はいくつかの異なる癌において腫瘍増殖の阻害をもたらした。理論により束縛されるものではないが、ＥＣ増殖の増加およびＥＣ分化の低下は、不適切な腫瘍血管機能をもたらし、腫瘍増殖の阻害を引き起こすと考えられている。したがって、ＤＬＬ４アンタゴニストは、癌の治療のために広く有効なアプローチを示すと考えられる。
【０１１１】
したがって、本発明は血管形成に関与する過程の調節（例えば、促進または阻害）のための、および癌のような血管形成に関連する病理学的症状を標的とする使用のための方法、組成物、キットおよび製品を提供する。
【０１１２】
本発明に従って、ＤＬＬ４モジュレーターおよび／またはＤＬＬ４モジュレーターと他の治療剤の組合せは、様々な障害の治療のために使用できることが検討される。
【０１１３】
したがって本発明は、ノッチ受容体（ノッチ１、ノッチ２、ノッチ３および／またはノッチ４のような）のＤＬＬ４による活性化を阻害するために、有効量のＤＬＬ４アンタゴニスト（抗ＤＬＬ４抗体またはＤＬＬ４イムノアドヘジンのような）を使用する、血管形成阻害のための方法を包含する。別の態様において、本発明は、そのような治療を必要とする被験体への有効量のＤＬＬ４アンタゴニスト投与を含む、血管形成阻害のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＤＬＬ４アンタゴニストは、内皮細胞増殖の促進、内皮細胞分化の阻害、動脈発生の阻害および／または血管灌流の低下を可能にする。別の態様において、本発明は、そのような治療を必要とする被験体への有効量のＤＬＬ４アンタゴニストの投与を含む、内皮細胞増殖刺激、内皮細胞分化阻害、動脈発生阻害および／または腫瘍血管灌流阻害のための方法を提供する。
【０１１４】
ＤＬＬ４アンタゴニスト（抗ＤＬＬ４の抗体のような）により治療される腫瘍性疾患の具体例は、用語「癌」および「癌性」の下で本明細書において説明されたものを含むが、これらに限定されない。本発明において有用なアンタゴニストによる治療を適用可能な非新生物性症状は、例えば、所望されないまたは異常な肥大、関節炎、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、乾癬性局面、類肉腫症、アテローム性動脈硬化、アテローム斑、心筋梗塞からの浮腫、糖尿病性網膜症および末熟児網膜症を含む他の増殖性網膜症、後水晶体線維形成症、血管新生緑内障、加齢黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、角膜血管新生、角膜移植片血管新生、角膜移植後拒絶反応、網膜／脈絡膜血管新生、隅角の血管新生（ルベオーシス）、眼血管新生疾患、血管再狭窄、動静脈奇形（ＡＶＭ）、髄膜腫、血管腫、線維性血管腫、甲状腺過形成（グレーヴス病を含む）、角膜および他の組織移植、慢性炎症、肺炎症、急性肺損傷／ＡＲＤＳ、敗血症、原発性肺高血圧症、悪性肺水、脳水腫（例えば、急性脳卒中／閉鎖性頭部外傷／外傷に関連する）、滑膜炎、ＲＡにおけるパンヌス形成、骨化性筋炎、肥大性骨形成、骨関節炎（ＯＡ）、難治性腹水症、多嚢胞卵巣、子宮内膜症、体液のサードスペースへの移行に関する疾患（膵炎、隔壁腔症候群、熱傷、腸疾患）、子宮筋腫、早産、ＩＢＤのような慢性炎症（クローン病および潰瘍性大腸炎）、腎臓同種移植拒絶、炎症性腸疾患、ネフローゼ症候群、所望されないまたは異常な組織量の増殖（非癌）、肥満、脂肪組織量増殖、血友病性関節、肥厚性瘢痕、髪の成長の阻害、オジェ・ウェーバー症候群、化膿性肉芽腫後水晶体線維形成症、硬皮症、トラホーム、血管の癒着、関節滑膜炎、皮膚炎、子癇前症、腹水、心膜液貯留（心膜炎に関連するもののような）、ならびに胸水であるが、これらに限定されない。ＤＬＬ４アンタゴニスト（抗ＤＬＬ４の抗体のような）により治療される障害のさらなる具体例は、上皮障害または心臓障害を含む。
【０１１５】
ＤＬＬ４のモジュレーター（例えばＤＬＬ４のアゴニストまたは活性化因子）は、病理学的障害の治療のために利用することができる。いくつかの実施形態において、血管形成の阻害が所望される場合には、ＤＬＬ４のモジュレーター（例えばＤＬＬ４のアゴニスト）は、病理学的障害の治療において利用することができる。血管形成または血管新生および／または肥大が所望される場合には、ＤＬＬ４のモジュレーター（例えばＤＬＬアゴニスト）は、例えば、血管外傷、創傷、裂傷、切開、熱傷、潰瘍（例えば糖尿病性潰瘍、圧迫潰瘍、血友病患者潰瘍、静脈瘤性潰瘍）、組織増殖、体重増加、末梢動脈障害、分娩誘導、髪の増殖、水疱性表皮剥離症、網膜萎縮、骨折、骨脊椎固定術、半月板披裂などを含むが、これらに限定されない病理学的障害の治療のためにもまた使用することができる。
【０１１６】
組合せ療法
上で示されるように、本発明は、ＤＬＬ４アンタゴニスト（抗ＤＬＬ４の抗体のような）またはＤＬＬ４アゴニストが別療法と共に投与される、組合せ療法を提供する。例えば、様々な新生物性症状または非新生物性症状を治療するために、ＤＬＬ４アンタゴニストは抗癌薬剤または抗血管形成剤との組合せにおいて使用される。１つの実施形態において、新生物性症状または非新生物性症状は、異常または所望されない血管形成に関連する病理学的障害によって特徴づけられる。ＤＬＬ４アンタゴニストは、それらの目的のために有効な他の薬剤と共に連続的にまたは組合せで、同じ組成物中にまたは個別の組成物のいずれかとして投与することができる。あるいはまたは加えて、ＤＬＬ４の複数の阻害剤を投与することができる。
【０１１７】
ＤＬＬ４アンタゴニスト（またはＤＬＬ４アゴニスト）および他の治療剤（例えば抗癌薬剤、抗血管形成剤）の投与は、同時に（例えば、単一の組成物、または同じ投与経路またもしくは異なる投与経路を使用する２つまたは複数の異なる組成物として）行うことができる。あるいはまたは加えて、投与は、任意の順序で連続して行うことができる。あるいはまたは加えて、工程は、任意の順序で連続および同時の両方で、組合せとして実行することができる。
【０１１８】
特定の実施形態において、分〜日から週〜月にわたる間隔は、２つまたは複数の組成物の投与の間に存在できる。例えば、抗癌薬剤を最初に投与し、ＤＬＬ４アンタゴニストが後続してもよい。しかしながら、同時投与またはＤＬＬ４アンタゴニストを最初に投与することもまた検討される。したがって１つの態様において、本発明は、抗血管形成剤（抗ＶＥＧＦのような）の投与が後続する、ＤＬＬ４アンタゴニスト（抗ＤＬＬ４の抗体のような）の投与を含む方法を提供する。特定の実施形態において、分〜日から週〜月にわたる間隔は、２つまたは複数の組成物の投与の間に存在できる。
【０１１９】
ＤＬＬ４アンタゴニスト（またはＤＬＬ４アゴニスト）と共に一緒に投与される治療剤の有効量は、医師または獣医の裁量によるものであるだろう。投与量および調整は治療される症状の最高の処置を達成するために行う。用量は使用される治療剤のタイプおよび治療されている特異的な患者のような因子にさらに依存するだろう。抗癌剤のために適切な投与量は、現時点で使用されるものであり、抗癌剤とＤＬＬ４アンタゴニストを組み合わせた作用（相乗作用）のために低下させることができる。特定の実施形態において、阻害剤の組合せは、単一の阻害剤の有効性を強化する。用語「強化する」は、その一般的用量または承認された用量での治療剤の有効性の改善を指す。本明細書において医薬組成物と題するセクションも参照。
【０１２０】
典型的には、ＤＬＬ４アンタゴニストおよび抗癌剤は、腫瘍、癌または細胞の増殖障害のような病理学的障害を遮断または低下させるために、同一の疾患または類似した疾患のために適切である。１つの実施形態において、抗癌剤は抗血管形成剤である。
【０１２１】
癌に関連する抗血管形成療法は、腫瘍増殖を維持する栄養物質の供給のために必要とされる腫瘍血管の発生の阻害を目指した癌治療戦略である。血管形成が原発腫瘍の増殖および転移の両方に関与するので、本発明によって提供される抗血管形成治療は、二次的部位での腫瘍の転移の予防と同様に、原発部位での腫瘍の新生物的増殖を阻害することができ、したがって他の治療による腫瘍の攻撃を可能にする。
【０１２２】
多くの抗血管形成剤が同定され、本明細書においてリストされた（例えば定義の下でリストされた）もの、および例えばＣａｒｍｅｌｉｅｔ  ａｎｄ  Ｊａｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：２４９−２５７  （２０００）；  Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ：Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，  ３：３９１−４００  （２００４）；  ａｎｄ  Ｓａｔｏ  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ，  ８：２００−２０６  （２００３）によるものを含んで、当技術分野で公知である。米国特許出願ＵＳ２００３００５５００６もまた参照。１つの実施形態において、ＤＬＬ４アンタゴニストは、例えば、可溶性ＶＥＧＦ受容体（例えばＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ニューロピリン（例えばＮＲＰ１、ＮＲＰ２））フラグメント、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲを遮断できるアプタマー、中和抗ＶＥＧＦＲ抗体、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の低分子量の阻害剤、ＶＥＧＦのためのアンチセンス戦略、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体に対するリボザイム、ＶＥＧＦのアンタゴニスト変異型；およびその任意の組合せを含むが、これらに限定されない、抗ＶＥＧＦ中和抗体（またはフラグメント）および／または他のＶＥＧＦアンタゴニストまたはＶＥＧＦ受容体アンタゴニストとの組合せで使用される。あるいはまたはさらに、２つまたは複数の血管形成阻害剤は、任意で、ＶＥＧＦアンタゴニストおよび他の薬剤に加えて患者に同時投与されてもよい。特定の実施形態において、１つまたは複数の追加治療剤（例えば抗癌剤）は、ＤＬＬ４アンタゴニスト、ＶＥＧＦアンタゴニストおよび抗血管形成剤と共に一緒に投与することができる。
【０１２３】
本発明の特定の態様において、ＤＬＬ４アンタゴニスト（またはＤＬＬ４アゴニスト）との組合せ腫瘍治療法のために有用な他の治療剤は、他の癌治療法、例えば手術、放射線治療（例えば放射性物質の照射または投与を含む）、化学療法、本明細書においてリストされるおよび当技術分野において公知の抗癌剤による治療、またはその組合せを含む。あるいはまたはさらに、本明細書において開示される同一の抗原または２つまたは複数の異なる抗原を結合する２つまたは複数の抗体は、患者に同時投与することができる。時には、患者に対して１つまたは複数のサイトカインを投与することもまた有用かもしれない。
【０１２４】
化学療法剤
１つの態様において、本発明は、ＤＬＬ４アンタゴニスト（またはＤＬＬ４アゴニスト）および／または血管形成阻害剤ならびに１つまたは複数の有効量の化学療法剤の投与によって、障害（腫瘍、癌または細胞増殖障害のような）を治療する方法を提供する。様々な化学療法剤は本発明の組合わせ治療法において使用されてもよい。検討される化学療法剤の例示的および非限定的リストは、「定義」の下で本明細書において提供される。ＤＬＬ４アンタゴニストおよび化学療法剤の投与は、同一または異なる投与経路を使用して、例えば、単一の組成物または２つまたは複数の異なる組成物として同時に行うことができる。あるいはまたはさらに、投与は、任意の順序において、連続して行うことができる。あるいはまたはさらに、工程は、任意の順序において、連続および同時の療法で、組合せとして実行することができる。特定の実施形態において、分〜日から週〜月にわたる間隔は、２つまたは複数の組成物の投与の間に存在できる。例えば、化学療法剤を最初に投与し、ＤＬＬ４アンタゴニストが後続してもよい。しかしながら、同時投与またはＤＬＬ４アンタゴニストを最初に投与することもまた検討される。したがって１つの態様において、本発明は、化学療法剤の投与が後続する、ＤＬＬ４アンタゴニスト（抗ＤＬＬ４の抗体のような）の投与を含む方法を提供する。特定の実施形態において、分〜日から週〜月にわたる間隔は、２つまたは複数の組成物の投与の間に存在できる。
【０１２５】
当業者により理解されるように、化学療法剤の適切な用量は一般に、化学療法薬が単独または他の化学療法との組合せで投与される、臨床治療法において既に用いられる用量の付近であるだろう。治療される条件に依存して、投与量の変動が恐らく生じるだろう。治療を行う医師は、個別の被験体のために適切な用量を決定することができるだろう。
【０１２６】
再発腫瘍増殖
本発明は、再発腫瘍増殖または再発癌細胞増殖の阻害または予防のための方法および組成物もまた提供する。再発腫瘍増殖または再発癌細胞増殖は、１つまたは複数の現在利用可能な治療法（例えば化学療法のような癌治療法、放射線療法、手術、ホルモン療法および／または生物学的療法／免疫療法、抗ＶＥＧＦ抗体療法、特に特定の癌のための標準治療レジメン）を受けているかまたはそれらにより治療された患者が、治療には臨床的に適切ではないか、またはこれらの患者が追加の有効な治療法を必要とするように、患者はもはや療法からいかなる有益な効果を受けない、症状を説明するために使用される。本明細書において使用されるように、この語句は「反応しない／抵抗性のある」患者の症状もまた指すことができ、例えば、それは治療法に反応しさらに副作用のある、抵抗性を発達させる、治療法に反応しない、治療法に十分に反応しない、などの患者を説明する。様々な実施形態において、癌細胞の数が有意に低下しない、または増加した、または腫瘍サイズが有意に低下しない、または増加した、またはさらなる癌細胞のサイズもしくは数の減少が達成されない場合、癌は再発腫瘍増殖または再発癌細胞増殖である。癌細胞が再発腫瘍増殖または再発癌細胞増殖かどうかの決定は、そのような文脈において「再発」または「抵抗性がある」または「反応しない」の当技術分野で許容される意味を使用して、癌細胞での治療の実効性の分析のための当技術分野において公知の任意の方法により、インビボまたはインビトロのいずれかで行うことができる。抗ＶＥＧＦ治療に耐性の腫瘍は再発腫瘍増殖の具体例である。
【０１２７】
本発明は、被験体中の再発腫瘍増殖または再発癌細胞増殖を遮断または低下させるために１つまたは複数のＤＬＬ４アンタゴニスト（またはＤＬＬ４アゴニスト）を投与することによって、被験体において再発腫瘍増殖または再発癌細胞増殖を遮断または低下させる方法を提供する。特定の実施形態において、アンタゴニストは癌治療に後続して投与することができる。特定の実施形態において、ＤＬＬ４アンタゴニストは癌治療法と同時に投与される。あるいはまたはさらに、ＤＬＬ４アンタゴニスト療法は、別の癌治療法と任意の順序で交互に実行することができる。本発明は、さらに癌に罹患しやすい患者における癌の発症または再発を予防するために１つまたは複数の阻害性抗体を投与する方法を包含する。一般に、被験体は、同時に癌治療を受けていたか、または受けている。１つの実施形態において、癌治療法は抗血管形成剤（例えばＶＥＧＦアンタゴニスト）による治療である。抗血管形成剤は当技術分野において公知のもの、および本明細書における定義の下で見出されるものを含む。１つの実施形態において、抗血管形成剤は、抗ＶＥＧＦ中和抗体またはフラグメント（例えばヒト化Ａ４．６．１、アバスチン（ＡＶＡＳＴＩＮ）（登録商標）（ジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニア）、Ｙ０３１７、Ｍ４、Ｇ６、Ｂ２０、２Ｃ３など）である。例えば米国特許第６，５８２，９５９号、第６，８８４，８７９号、第６，７０３，０２０号；ＷＯ９８／４５３３２；ＷＯ９６／３００４６；ＷＯ９４／１０２０２；ＥＰ０６６６８６８Ｂ１；米国特許出願第２００３０２０６８９９号、第２００３０１９０３１７号、第２００３０２０３４０９号、および第２００５０１１２１２６号；Ｐｏｐｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８８：１４９−１６４  （２００４）；ならびにＷＯ２００５０１２３５９を参照。追加剤は、再発腫瘍増殖または再発癌細胞増殖を遮断または低下させるためにＶＥＧＦアンタゴニストおよびＤＬＬ４アンタゴニストを一緒に投与することができ、例えば、本明細書における組合せ療法と題されたセクションを参照。
【０１２８】
ＤＬＬ４
ＤＬＬ４は膜貫通型タンパク質である。細胞外領域は、すべてのノッチリガンドの間で保存され受容体結合のために必要なＤＳＬドメインに加えて、８つのＥＧＦ様リピートを含んでいる。予測されるタンパク質は、膜貫通領域、およびいかなる触媒モチーフを欠く細胞質尾部もまた含んでいる。ヒトＤＬＬ４タンパク質は６８５アミノ酸タンパク質であり、以下の領域を含む：シグナルペプチド（アミノ酸１〜２５）；ＭＮＮＬ（アミノ酸２６〜９２）；ＤＳＬ（アミノ酸１５５〜２１７）；ＥＧＦ様（アミノ酸２２１〜２５１）；ＥＧＦ様（アミノ酸２５２〜２８２）；ＥＧＦ様（アミノ酸２８４〜３２２）；ＥＧＦ様（アミノ酸３２４〜３６０）；ＥＧＦ様（アミノ酸３６６〜４００）；ＥＧＦ様（アミノ酸４０２〜４３８）；ＥＧＦ様（アミノ酸４４０〜４７６）；ＥＧＦ様（アミノ酸４８０〜５１８）；膜貫通（アミノ酸５２９〜５５１）；細胞質ドメイン（アミノ酸５５２〜６８５）。ＤＬＬ４の核酸およびアミノ酸配列は当技術分野において公知であり、本明細書においてさらに議論される。ＤＬＬ４をコードする核酸配列は、ＤＬＬ４の所望される領域のアミノ酸配列を使用してデザインすることができる。あるいは、ＤＬＬ４のｃＤＮＡ配列（またはそのフラグメント）を使用することができる。ヒトＤＬＬ４のアクセッション番号はＮＭ＿０１９０７４であり、マウスＤＬＬ４のアクセッション番号はＮＭ＿０１９４５４である。
【０１２９】
ＤＬＬ４はノッチ受容体を結合する。進化的に保存されたノッチ経路は、出生後の自己複製器官系と同様に、多くの発生過程の重要な調節因子である。無脊椎動物から哺乳動物まで、ノッチシグナリングは、無数の細胞運命決定を介して細胞を導き、増殖、分化およびアポトーシスに影響を及ぼす（Ｍｉｅｌｅ  ａｎｄ  Ｏｓｂｏｒｎｅ，  １９９９）。ノッチファミリーは、ＤＳＬ遺伝子ファミリー（ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）からのデルタおよびセレート、ならびにシー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）からのＬａｇ−２に対して命名される）の膜結合型リガンドにより活性化される、構造的に保存された細胞表面受容体からなる。哺乳類は、４つの受容体（ノッチ１、ノッチ２、ノッチ３、ノッチ４）および５つのリガンド（Ｊａｇ１、Ｊａｇ２、ＤＬＬ１、Ｄｌｌ３およびＤＬＬ４）を有する。隣接細胞上に提示されたリガンドによる活性化に際して、ノッチ受容体は連続したタンパク質分解による切断を受ける。これはノッチ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）の放出を引き起こし、それは核の中へ移動し、ＤＮＡ結合タンパク質（ＣＳＬ［ＣＢＦ１／Ｓｕ（Ｈ）／Ｌａｇ−１に対して］としてもまた公知のＲＢＰ−Ｊｋ）および他の転写コファクターとの転写複合体を形成する。ノッチ活性化の一次標的遺伝子はＨＥＳ（ヘアリー／エンハンサーオブスプリット）遺伝子ファミリーおよびＨＥＳ関連遺伝子（Ｈｅｙ、ＣＨＦ、ＨＲＴ、ＨＥＳＲ）を含み、次にそれは組織および細胞のタイプに特異的な様式で下流の転写エフェクターを調節する（Ｉｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３；  Ｌｉ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ，  ２００５）。
【０１３０】
ＤＬＬ４モジュレーター
ＤＬＬ４のモジュレーターは、ＤＬＬ４の、例えば、アゴニストおよびアンタゴニストの活性を調節する分子である。用語「ＤＬＬ４アゴニスト」は、ＤＬＬ４のペプチドおよび非ペプチドアナログ（本明細書において説明される多量体化ＤＬＬ４のような）を指し、およびもし他の薬剤が天然のノッチ受容体（例えばノッチ１、ノッチ２、ノッチ３、ノッチ４）を介するシグナリング能力を有していれば、それらを指すように使用される。用語「アゴニスト」は、ノッチ受容体の生物学的役割の文脈において定義されている。特定の実施形態で、アゴニストは、上で定義されるように、ノッチ受容体（例えばノッチ１、ノッチ２、ノッチ３、ノッチ４）の結合、ノッチ受容体の活性化、およびノッチ受容体下流の分子シグナリングの活性化のようなＤＬＬ４の生物学的活性を持つ。いくつかの実施形態において、ＤＬＬ４アゴニストは、内皮細胞増殖を阻害、上皮細胞分化を促進、および／または動脈発生を促進する。いくつかの実施形態において、ＤＬＬ４アゴニストは血管発生を阻害する。
【０１３１】
ＤＬＬ４モジュレーターは当技術分野において公知であり、いくつかは本明細書において記述および例示される。検討されるＤＬＬ４アンタゴニスト（抗ＤＬＬ４抗体およびＤＬＬ４イムノアドヘジンのような）の例示的および非限定的リストは、「定義」の下で本明細書において提供される。
【０１３２】
本発明において有用なモジュレーターは、当技術分野で公知の様々な分析により、それらの物理的／化学的性質および生物学的機能について特性を評価することができる。いくつかの実施形態において、ＤＬＬ４アンタゴニストは任意の１つまたは複数の以下のものについて特性を評価される：ＤＬＬ４への結合、ノッチ受容体への結合、ノッチ受容体活性化の減少または遮断、ノッチ受容体下流の分子シグナリングの減少または遮断、ＤＬＬ４へのノッチ受容体結合の破壊または遮断、および／または内皮細胞増殖の促進、および／または内皮細胞分化の阻害、および／または動脈分化の阻害、および／または腫瘍血管灌流の阻害、および／または腫瘍、細胞増殖障害または癌の治療および／または予防；およびに／またはＤＬＬ４の発現および／または活性に関連した障害の治療または予防、および／またはノッチ受容体の発現および／または活性に関連した障害の治療または予防。いくつかの実施形態において、ＤＬＬ４アゴニストは任意の１つまたは複数の以下のものについて特性を評価される：ノッチ受容体（例えばノッチ１、ノッチ２、ノッチ３、ノッチ４）の結合、ノッチ受容体の活性化、ノッチ受容体下流の分子シグナリングの活性化、内皮細胞増殖の阻害、上皮細胞分化の促進、および／または動脈発生の促進。ＤＬＬ４のアンタゴニストおよびアゴニストを特性を評価する方法は、当技術分野において公知であり、いくつかは本明細書において記述および例示される。
【０１３３】
抗体
ＤＬＬ４抗体は当技術分野において公知であり、いくつかは本明細書において記述および例示される。抗ＤＬＬ４抗体は、好ましくはモノクローナルである。本明細書において提供される抗ＤＬＬ４抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントもまた、本発明の範囲内に包含される。これらの抗体フラグメントは、酵素による消化のような従来の手段により生成することができるか、または組換え技術により産生されてもよい。そのような抗体フラグメントはキメラまたはヒト化されたものであってもよい。これらのフラグメントは以下に示される診断および治療目的に対し有用である。
【０１３４】
モノクローナル抗体は実質的に均質の抗体の集団から得られ、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在してもよい天然に存在する可能性のある変異を除いて同一である。したがって、修飾語「モノクローナル」は、個別の抗体の混合物ではないような抗体の性質を示す。
【０１３５】
抗ＤＬＬ４モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６：４９５  （１９７５）により最初に記述されたハイブリドーマ方法を使用して作製することができるか、または組換ＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）により作製されてもよい。
【０１３６】
ハイブリドーマ法では、マウスまたはハムスターのような他の適切な宿主動物は、免疫のために使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生可能なリンパ球を誘導するために免疫される。ＤＬＬ４に対する抗体は、一般にＤＬＬ４およびアジュバントの皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）の複数の注射により動物中で作製される。ＤＬＬ４は当技術分野において周知の方法を使用して調製されてもよく、それらのうちのいくつかは本明細書においてさらに記述される。例えば、ＤＬＬ４の組換えによる産生が記載される。１つの実施形態において、動物は、免疫グロブリン重鎖のＦｃ部分に融合させたＤＬＬ４の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含むＤＬＬ４の誘導体により免疫される。好ましい実施形態において、動物はＤＬＬ４−ＩｇＧ１融合タンパク質により免疫される。動物は、モノフォスフォリルリピドＡ（ＭＰＬ）／トレハロースジクリノミコレート（ｄｉｃｒｙｎｏｍｙｃｏｌａｔｅ）（ＴＤＭ）（リビ・イムノケム・リサーチ（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）社、ハミルトン、モンタナ）と共にＤＬＬ４の免疫原性コンジュゲートまたは誘導体に対して通常免疫され、溶液は複数の部位で皮内注射される。２週間後に、動物はブーストされる。７〜１４日後に動物は採血され、血清は抗ＤＬＬ４の力価について分析される。力価がプラトーに達するまで、動物をブーストする。
【０１３７】
あるいは、リンパ球はインビトロで免疫されてもよい。次にリンパ球は、ハイブリドーマ細胞を形成するために、ポリエチレングリコールのような適切な融合する薬剤を使用して、ミエローマ細胞と融合される。（Ｇｏｄｉｎｇ，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５９〜１０３ページ（アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８６年））。
【０１３８】
したがって調製されたハイブリドーマ細胞を播種し、未融合の親ミエローマ細胞の増殖または生存を阻害する、１つまたは複数の物質を好ましくは含む適切な培養液中で増殖させる。例えば、親ミエローマ細胞が酵素ヒポキサンチングアニンフォスフォリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠損していれば、ハイブリドーマのための培養液は典型的には、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（ＨＡＴ培地）を含むだろう。
【０１３９】
好ましいミエローマ細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定した高レベルの産生を維持し、ＨＡＴ培地のような培地に感受性のあるものである。これらの中で、好ましいミエローマ細胞株は、ソーク研究所細胞分配センター（Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ）、サンディエゴ、カリフォルニア、アメリカから入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍に由来するもののようなマウスミエローマ株、ならびに米国培養菌保存施設（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ロックヴィル、メリーランド、アメリカから入手可能なＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞である。ヒトミエローマおよびマウス−ヒトのヘテロミエローマ細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記述された。（Ｋｏｚｂｏｒ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３３：３００１  （１９８４）；  Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１〜６３ページ（マルセル・デッカー、ニューヨーク、１９８７年）。
【０１４０】
ハイブリドーマ細胞が増殖する培養液は、ＤＬＬ４に対して作製されたモノクローナル抗体の産生について分析される。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降、または放射免疫分析（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）のようなインビトロの結合分析により決定される。
【０１４１】
モノクローナル抗体の結合能は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １０７：２２０  （１９８０）のスキャチャード解析により決定することができる。
【０１４２】
所望される特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈手順によりサブクローン化し、標準方法により増殖してもよい。（Ｇｏｄｉｎｇ，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５９〜１０３ページ（アカデミックプレス、１９８６年））。この目的のために適切な培養培地は、例えばＤ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地を含む。さらに、ハイブリドーマ細胞を、動物中で腹水癌としてインビボで増殖してもよい。
【０１４３】
サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析または親和性クロマトグラフィーのような通常の免疫グロブリン精製法により、培養液、腹水または血清から適切に分離される。
【０１４４】
抗ＤＬＬ４抗体は、所望される活性を備えた合成抗体クローンについてスクリーニングするために組合わせライブラリーを使用することによって、作製することができる。原理上、合成抗体クローンは、ファージコートタンパク質に融合された抗体可変領域（Ｆｖ）の様々なフラグメントを提示するファージを含む、ファージライブラリーのスクリーニングによって選択される。そのようなファージライブラリーは、所望される抗原に対する親和性クロマトグラフィーにより選別される。所望される抗原に結合できるＦｖフラグメントを発現するクローンは、抗原に吸着され、したがってライブラリー中の非結合クローンから分離される。次に結合クローンは抗原から溶出され、抗原吸着／溶出の追加のサイクルによりさらに濃縮できる。任意の抗ＤＬＬ４抗体は、対象となるファージクローンからのＦｖ配列、およびＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、ＮＩＨ出版（ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）、ベテスダ、メリーランド（１９９１）、１−３巻、９１−３２４２中に記載される適切な定常領域（Ｆｃ）配列を使用して、対象となるファージクローンについて選択するために適切な抗原スクリーニング手順のデザイン、続いて全長の抗ＤＬＬ４抗体クローンの構築によって得ることができる。
【０１４５】
抗体の抗原結合ドメインは、約１１０アミノ酸の２つの可変（Ｖ）領域から（各々１つの軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）から）形成され、両方は３つの超可変ループまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）を示す。可変ドメインは、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １２：  ４３３−４５５  （１９９４）中に記載されるように、ＶＨおよびＶＬが短く柔軟なペプチドを介する共有結合で結合される一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントとして、または各々が定常ドメインに融合されて非共有結合で相互作用するＦａｂフラグメントとしてのいずれかで、ファージ上で機能的に提示することができる。本明細書において使用されるように、ファージクローンをコードするｓｃＦｖ、およびファージクローンをコードするＦａｂは、「Ｆｖファージクローン」または「Ｆｖクローン」とまとめて呼ばれる。
【０１４６】
ＶＨおよびＶＬの遺伝子のレパートリーは、個別にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりクローニングしファージライブラリーにおいて無作為に再結合することができ、次にＷｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １２：  ４３３−４５５  （１９９４）中に記載されるように、抗原結合クローンを探索できる。免疫ソースからのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なしに、免疫原に対して高親和性抗体を提供する。あるいは、ナイーブレパートリーは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ，  １２：  ７２５−７３４  （１９９３）により記述されるように、いかなる免疫なしに、広範囲の非自己抗原およびさらに自己抗原に対するヒト抗体の単一ソースを提供するためにクローニングすることができる。最終的に、ナイーブライブラリーは、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２７：  ３８１−３８８  （１９９２）により記述されるように、再構成されていないＶ遺伝子セグメントのクローニングによって、ならびに高度に可変的なＣＤＲ３領域をコードするためおよびインビトロの再構成を遂行するためにランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用することによって、幹細胞から合成的に作製することもできる。
【０１４７】
線状ファージを、マイナーなコートタンパク質ｐＩＩＩへの融合によって抗体フラグメントを提示するために使用する。抗体フラグメントは、例えばＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ，  ２２２：  ５８１−５９７  （１９９１）によって記述されるように、ＶＨおよびＶＬのドメインが柔軟なポリペプチドスペーサーによって同一のポリペプチド鎖上に結合される一本鎖Ｆｖフラグメントとして提示することができるか、または、例えばＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １９：  ４１３３−４１３７  （１９９１）中に記載されるように、野生型コートタンパク質のうちのいくつかを置き換えることによってファージ表面上に提示されるようになるＦａｂ−コートタンパク質構造の集合で、１つの鎖がｐＩＩＩに融合され、他方が細菌の宿主細胞ペリプラスムの中へ分泌されるＦａｂフラグメントとして提示することができる。
【０１４８】
一般に、抗体遺伝子フラグメントをコードする核酸は、ヒトまたは動物から採取される免疫細胞から得られる。抗ＤＬＬ４のクローンに偏ったライブラリーが所望されるならば、被験体を抗体反応を生成するためにＤＬＬ４により免疫し、脾臓細胞および／または循環Ｂ細胞、他の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）をライブラリー構築のために回収する。好ましい実施形態において、抗ＤＬＬ４のクローンに偏ったヒト抗体遺伝子フラグメントのライブラリーは、ＤＬＬ４免疫がＤＬＬ４に対するヒト抗体を産生するＢ細胞を生じさせるように、機能的なヒト免疫グロブリン遺伝子アレイを保有する（および機能的な内在性の抗体産生システムを欠損する）トランスジェニックマウスにおいて、抗ＤＬＬ４抗体反応の生成によって得られる。以下にヒト抗体を産生するトランスジェニックマウスの生成を記載する。
【０１４９】
抗ＤＬＬ４の反応細胞集団についてのさらなる濃縮は、ＤＬＬ４に特異的な膜結合型抗体を発現するＢ細胞を単離するために適切なスクリーニング法を使用することによって（例えばＤＬＬ４親和性クロマトグラフィーによる細胞分離またはフロー活性化細胞分取（ｆｌｏｗ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＦＡＣＳ）が後続する蛍光色素標識ＤＬＬ４への細胞の吸着によって）得ることができる。
【０１５０】
あるいは、免疫されていないドナーからの脾臓細胞および／またはＢ細胞または他のＰＢＬの使用は、可能な抗体レパートリーのよりよい表示を提供し、ＤＬＬ４が抗原性でない任意の動物（ヒトまたは非ヒト）種を使用して、抗体ライブラリーの構築をさらに可能にする。インビトロの抗体遺伝子構築を組み入れるライブラリーについては、再構成されていない抗体遺伝子セグメントをコードする核酸を提供するために、幹細胞を被験体から採取する。対象となる免疫細胞は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、オオカミ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、およびトリ種などのような様々な動物種から得ることができる。
【０１５１】
核酸をコードする抗体可変遺伝子セグメント（ＶＨおよびＶＬのセグメントを含む）は、対象となる細胞から回収され増幅される。再構成されたＶＨおよびＶＬ遺伝子ライブラリーの場合では、所望されるＤＮＡは、Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （ＵＳＡ），  ８６：  ３８３３−３８３７  （１９８９）中に記載されるように、リンパ球からのゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡの単離、続いて再構成されたＶＨおよびＶＬ遺伝子の５’端および３’端に一致するプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって得ることができ、その結果として発現について多様なＶ遺伝子レパートリーが作製される。Ｖ遺伝子は、Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）およびＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３４１  ：  ５４４−５４６  （１９８９）中に記載されるように、成熟Ｖドメインをコードするエクソンの５’末端でのバックプライマー、およびＪ部位内にあるフォワードプライマーにより、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡから増幅できる。しかしながらｃＤＮＡからの増幅については、バックプライマーはＪｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ９：  ８８−８９  （１９９１）中に記載されるようにリーダーエクソン中に、およびフォワードプライマーはＳａｓｔｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （ＵＳＡ），  ８６：  ５７２８−５７３２  （１９８９）中に記載されるように定常領域内にあってもよい。相補性を最大にするために、Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）またはＳａｓｔｒｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）中に記載されるように、プライマー中に縮重を取り込むことができる。好ましくは、ライブラリー多様性は、例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２２：  ５８１−５９７  （１９９１）の方法において記載されるように、またはＯｒｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２１  ：  ４４９１−４４９８  （１９９３）の方法において記載されるように、免疫細胞核酸サンプル中に提示されるすべての利用可能なＶＨおよびＶＬの構成を増幅するために、各Ｖ遺伝子ファミリーに標的化されたＰＣＲプライマーを使用することによって最大にされる。増幅されたＤＮＡの発現ベクターへのクローニングのために、Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）において記載されるように、まれな制限部位を１つの末端でタグとして、またはＣｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３５２：  ６２４−６２８  （１９９１）において記載されるように、タグ付加プライマーによるさらなるＰＣＲ増幅によって、ＰＣＲプライマー内に導入できる。
【０１５２】
合成的に再配列されたＶ遺伝子のレパートリーはＶ遺伝子セグメントからインビトロで得ることができる。大部分のヒトＶＨ遺伝子セグメントはクローニングおよび配列決定されており（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ，  ２２７：  ７７６−７９８  （１９９２）中で報告される）、マッピングされており（Ｍａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，  ３：  ８８−９４  （１９９３）中で報告される）；クローニングされたセグメント（Ｈ１およびＨ２ループの主要なコンフォーメーションをすべて含む）は、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ，  ２２７：  ３８１−３８８  （１９９２）中で記載されるように、多様な配列および長さのＨ３ループをコードするＰＣＲプライマーにより多様なＶＨ遺伝子レパートリーを生成するために使用することができる。ＶＨレパートリーは、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８９：  ４４５７−４４６１  （１９９２）中で記載されるように、単一長の長いＨ３ループ中に集中するすべての配列多様性をともなって作製することもできる。ヒトＶκおよびＶλセグメントはクローニングおよび配列決定され（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２３：  １４５６−１４６１  （１９９３）中で報告される）、合成軽鎖レパートリーを作製するために使用することができる。合成Ｖ遺伝子レパートリー（ＶＨおよびＶＬのフォールド、ならびにＬ３およびＨ３の長さの範囲に基づく）は、かなりの構造多様性の抗体をコードするだろう。Ｖ遺伝子をコードするＤＮＡの増幅に続いて、生殖細胞系Ｖ遺伝子セグメントは、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２７：  ３８１−３８８  （１９９２）の方法に従って、インビトロで再構成することができる。
【０１５３】
抗体フラグメントのレパートリーは、いくつかの手段でＶＨおよびＶＬの遺伝子レパートリーをともに組み合わせることによって構築できる。各レパートリーは異なるベクターにおいて生成することができ、ベクターは、Ｈｏｇｒｅｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  １２８：  １１９−１２６  （１９９３）中で記載されるように例えばインビトロで、またはインビボで組合わせ感染（例えばＷａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２１  ：  ２２６５−２２６６  （１９９３）中で記載されるｌｏｘＰシステム）によって、再結合される。インビボの組換えアプローチは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換率により課されたライブラリーサイズに対する制限を克服するために、Ｆａｂフラグメントの二本鎖の性質を利用する。ナイーブＶＨおよびＶＬレパートリーは、個別に、１つはファージミドの中におよび他方はファージベクターの中にクローニングされる。次に、各細胞が異なる組合せを含み、ライブラリーサイズが存在する細胞（約１０１２クローン）の数のみにより限定されるように、２つのライブラリーはファージミド含有細菌のファージ感染により組み合わせられる。ＶＨおよびＶＬの遺伝子が単一レプリコン上に再結合され、ファージビリオンの中に共にパッケージにされるように、両方のベクターはインビボ組換えシグナルを含む。これらの巨大なライブラリーは、多数の十分な親和性の多様な抗体を提供する（約１０−８ＭのＫｄ−１）。
【０１５４】
あるいは、レパートリーは、例えばＢａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８８：  ７９７８−７９８２  （１９９１）中で記載されるように、同一のベクターの中に連続してクローニングされてもよいか、または例えばＣｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３５２：  ６２４−６２８  （１９９１）中で記載されるように、ＰＣＲによりともにアセンブルされ次にクローニングされてもよい。ＰＣＲアセンブリーは、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）レパートリーを形成するように柔軟なペプチドスペーサーをコードするＤＮＡにＶＨおよびＶＬのＤＮＡを結合するために使用することもできる。さらに別の技術において、「細胞中ＰＣＲアセンブリー」は、Ｅｍｂｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２０：  ３８３１−３８３７  （１９９２）中で記載されるように、ＰＣＲによってリンパ球内でＶＨおよびＶＬの遺伝子を組み合わせ、次に連鎖遺伝子のレパートリーをクローニングするために使用される。
【０１５５】
ナイーブライブラリー（天然または合成）によって産生される抗体は、中程度の親和性（約１０６〜１０７Ｍ−１のＫｄ−１）でありえるが、親和性成熟もまた、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）、前出中で記載されるように、二次的なライブラリーの構築およびそれからの再選択によってインビトロで模倣できる。例えば、変異は、Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ，  ２２６：  ８８９−８９６  （１９９２）の方法またはＧｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ８９：  ３５７６−３５８０  （１９９２）の方法中のエラープローンポリメラーゼ（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，  １：１１−１５  （１９８９）中に報告される）を使用することによって任意にインビトロで導入することができる。さらに、親和性成熟は、選択された個々のＦｖクローンおよびより高い親和性クローンのためのスクリーニングにおいて、例えば対象となるＣＤＲにまたがるランダム配列を保有するプライマーによるＰＣＲを使用して、１つまたは複数のＣＤＲをランダムに変異させることによって実行することができる。ＷＯ９６０７７５４（１９９６年３月１４日に公開された）は、軽鎖遺伝子のライブラリーを生成するために、免疫グロブリン軽鎖の相補性決定領域中の変異誘発を誘導する方法について記述した。別の有効なアプローチは、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １０：  ７７９−７８３  （１９９２）中で記載されるように、免疫されていないドナーから得られる天然に存在するＶドメイン変異型のレパートリーを備えたファージディスプレーによって選択されたＶＨまたはＶＬのドメインを再結合し、数ラウンドの鎖の再シャフリングにおいてより高い親和性をスクリーニングすることである。この技術は、１０−９Ｍの範囲の親和性を持つ抗体および抗体フラグメントの産生を可能にする。
【０１５６】
ＤＬＬ４の核酸およびアミノ酸配列は当技術分野において公知であり、本明細書においてさらに議論される。ＤＬＬ４をコードするＤＮＡは、当技術分野において公知の様々な方法によって調製することができる。これらの方法は、トリエステル法、フォスファイト法、フォスフォアミダイト法およびＨ−ホスホン酸法のような、Ｅｎｇｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｇｎｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ，  ２８：  ７１６−７３４  （１９８９）中で記載されていた方法のうちのいずれかによる化学合成を含むが、これらに限定されない。１つの実施形態において、発現宿主細胞に好ましいコドンが、ＤＬＬ４をコードするＤＮＡのデザインにおいて使用される。あるいは、ＤＬＬ４をコードするＤＮＡは、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーから単離できる。
【０１５７】
ＤＬＬ４をコードするＤＮＡ分子の構築に続いて、ＤＮＡ分子はプラスミドのような発現ベクターの発現制御配列に操作可能に結合され、制御配列はベクターにより形質転換された宿主細胞に認識される。一般に、プラスミドベクターは、宿主細胞と適合する種に由来する複製配列および制御配列を含む。ベクターは、通常、形質転換細胞中で表現型による選択を提供できるタンパク質をコードする配列に加えて、複製部位を保有する。原核生物および真核生物の宿主細胞の発現のために適切なベクターは当技術分野において公知であり、いくつかは本明細書においてさらに記述される。酵母のような真核生物または哺乳類のような多細胞生物に由来する細胞が使用されてもよい。
【０１５８】
任意で、ＤＬＬ４をコードするＤＮＡは、宿主細胞による発現産物の培養液の中への分泌をもたらす、分泌リーダー配列に操作可能に結合される。分泌リーダー配列の具体例は、ｓｔＩＩ、エコチン（ｅｃｏｔｉｎ）、ｌａｍＢ、ヘルペスＧＤ、ｌｐｐ、アルカリフォスファターゼ、インベルターゼ、およびアルファ因子を含む。さらに、本明細書における使用のために適切なものはプロテインＡの３６アミノ酸リーダー配列である（Ａｂｒａｈｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ４：  ３９０１  （１９８５））。
【０１５９】
宿主細胞は、トランスフェクションされ、本発明の上記の発現ベクターまたはクローニングベクターにより好ましくは形質転換され、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望される配列をコードする遺伝子の増幅のために適切なように調節される通常の培養液中で培養される。
【０１６０】
トランスフェクションは、任意のコード配列が実際に発現されてもされなくても、宿主細胞による発現ベクターの獲得を指す。トランスフェクションの多数の方法が当業者に公知である（例えばリン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション）。このベクターの操作の任意の徴候が宿主細胞内に生じる場合、トランスフェクションの成功は一般に認識される。トランスフェクションのための方法は当技術分野において周知であり、いくつかは本明細書においてさらに記述される。
【０１６１】
形質転換は、ＤＮＡが染色体外のエレメントとして、または染色体の成分によって複製可能なように、生物の中にＤＮＡを導入することを意味する。使用される宿主細胞に依存して、形質転換はそのような細胞に適切な標準技術を使用して行われる。形質転換のための方法は当技術分野において周知であり、いくつかは本明細書においてさらに記述される。
【０１６２】
Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、前出中で一般に記載されるように、ＤＬＬ４を産生するために使用される原核生物の宿主細胞は培養できる。
【０１６３】
ＤＬＬ４を産生するために使用される哺乳類宿主細胞は、様々な培地において培養でき、当技術分野において周知であり、それらのうちのいくつかは本明細書において記述される。
【０１６４】
この開示において言及された宿主細胞は、宿主動物内にある細胞に加えて、インビトロの培養の細胞も包含する。
【０１６５】
ＤＬＬ４の精製は当技術分野で認められている方法を使用して、遂行されてもよく、それらのうちのいくつかは本明細書において記述される。
【０１６６】
精製されたＤＬＬ４は、ファージディスプレークローンの親和性クロマトグラフ分離における使用のために、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、ガラスビーズ、セルロース、様々なアクリル共重合体、ヒドロキシルメタクリレートゲル、ポリアクリル酸およびポリメタクリル酸共重合体、ナイロン、中性担体およびイオン担体ならびに同種のもののような適切なマトリックスに結合することができる。マトリックスへのＤＬＬ４タンパク質の結合はＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌ．  ４４  （１９７６）中で記載される方法によって遂行することができる。ポリサッカライドマトリックス（例えばアガロース、デキストラン、セルロース）にタンパク質リガンドを結合するために一般に用いられる技術は、ハロゲン化シアンによる担体の活性化、および続いて行なわれるペプチドリガンドの脂肪族第一アミンまたは芳香族第一アミンの活性化されたマトリックスへのカップリングを含んでいる。
【０１６７】
あるいは、ＤＬＬ４は吸着プレートのウェルをコーティングするために使用されるか、吸着プレートに固定された宿主細胞上で発現されるか、または細胞選別において使用されるか、またはストレプトアビジンコートビーズによる捕捉のためのビオチンにコンジュゲートされるか、またはファージディスプレーライブラリーをパニングする他の当技術分野において公知の方法での使用が可能である。
【０１６８】
ファージライブラリーサンプルは、吸着剤によるファージ粒子の少なくとも一部の結合のために適切な条件下で固定化ＤＬＬ４と接触させられる。通常は、ｐＨ、イオン強度、温度および同種のものを含む条件は生理学的条件を模倣するように選択される。固相に結合されたファージは洗浄され、例えばＢａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ８８：  ７９７８−  ７９８２  （１９９１）中で記載されるように酸によって、または例えばＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ，  ２２２：  ５８１−５９７  （１９９１）中で記載されるようにアルカリによって、または例えばＣｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３５２：  ６２４−６２８  （１９９１）の抗原競合方法に類似する手順でのＤＬＬ４抗原競合によって次に溶出される。ファージは、単一ラウンドの選択で２０〜１，０００倍濃縮される。さらに、濃縮されたファージは、細菌培養いおいて増殖可能であり、さらなる選択ラウンドにかけることができる。
【０１６９】
選択効率は、洗浄の間の解離速度を含む多くの因子、および単一ファージ上の複数の抗体フラグメントが抗原と同時に接触できるかに依存する。速い解離速度（および弱い結合能）を備えた抗体は、短い洗浄、多価性のファージディスプレー、および固相における抗原の高いコーティング密度を使用することによって保持することができる。高密度は、多価性の相互作用を介するファージを安定化するだけでなく、解離したファージの再結合を促進する。遅い解離速度（および十分な結合能）を備えた抗体の選択は、Ｂａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  ８：  ３０９−３１４  （１９９０）およびＷＯ  ９２／０９６９０中で記載されるように、長い洗浄および１価のファージディスプレーの使用、ならびにＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢｉｏｔｅｃｈｎｏＬ，  １０：  ７７９−７８３  （１９９２）中で記載されるように、抗原の低コーティング密度によって促進することができる。
【０１７０】
ＤＬＬ４について異なる親和性のファージ抗体（わずかに異なる親和性のものでさえ）の間で選択することは可能である。しかしながら、選択された抗体のランダム変異（例えば上で記述された親和性成熟技術のうちのいくつかにおいて実行されるように）は、多くの変異体（大部分は抗原へ結合し、少数はより高い親和性で結合する）を生じさせるだろう。ＤＬＬ４を限定することにより、まれな高い親和性ファージを競合により選び出せる。より高い親和性変異体をすべて保持するために、ファージを過剰のビオチン化ＤＬＬ４と共に（しかしＤＬＬ４についての標的モル結合定数よりも低いモル濃度の濃度でのビオチン化ＤＬＬ４と共に）インキュベートすることができる。次に高親和性結合ファージを、ストレプトアビジンをコートした常磁性粒子によって捕捉することができる。そのような「平衡捕捉」は、抗体が、２倍以上高い親和性ほどの変異体クローンの単離を可能にする感度により、より低い親和性のファージの大過剰量から抗体の結合親和性に従って選択されることを可能にする。固相に結合されたファージの洗浄において使用される条件もまた、解離速度に基づいて識別するように操作できる。
【０１７１】
抗ＤＬＬ４クローンは活性選択されてもよい。１つの実施形態において、本発明は、ノッチ受容体（ノッチ１、ノッチ２、ノッチ３および／またはノッチ４のような）とＤＬＬ４との間の結合を遮断するが、ノッチ受容体と第２のタンパク質との間の結合を遮断しない、抗ＤＬＬ４抗体を提供する。そのような抗ＤＬＬ４抗体に対応するＦｖクローンは、（１）上で記述されるようなファージライブラリーから抗ＤＬＬ４クローンを分離すること、および任意で適切な細菌宿主における集団の増殖によりファージクローンの単離集団を増幅することと；（２）遮断活性および非遮断活性がそれぞれ所望されるＤＬＬ４および第２のタンパク質を選択することと；（３）固定化ＤＬＬ４へ抗ＤＬＬ４ファージクローンを吸着させることと；（４）第２のタンパク質の結合決定基と重複または共有されるＤＬＬ４結合決定基を認識する、任意の所望されないクローンを溶出するために第２のタンパク質の過剰量を使用することと；（５）工程（４）後に吸着されたままであるクローンを溶出することと、によって選択することができる。任意で、所望される遮断／非遮断特性のクローンは、本明細書において記述される選択手順の１回または複数回の繰り返しによりさらに濃縮することができる。
【０１７２】
ハイブリドーマ由来モノクローナル抗体またはファージディスプレーＦｖクローンをコードするＤＮＡは、通常の手順を使用して（例えばハイブリドーマまたはファージのＤＮＡ鋳型から対象となる重鎖および軽鎖のコード領域を特異的に増幅するようにデザインされたオリゴヌクレオチドプライマーの使用によって）、容易に単離および配列決定される。一旦単離されたならば、ＤＮＡは発現ベクターの中へ入れることができ、次に組換え宿主細胞中で所望されるモノクローナル抗体の合成を得るために、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはその他に免疫グロブリンタンパク質を産生しないミエローマ細胞のような宿主細胞の中にトランスフェクションされる。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組み換え発現に対して総説記事は、Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ５：  ２５６  （１９９３）およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖｓ，  １３０：  １５１  （１９９２）を含む。
【０１７３】
ＦｖクローンをコードするＤＮＡは、完全または部分的な長さの重鎖および／または軽鎖をコードするクローンを形成するために、重鎖および／または軽鎖の定常領域をコードする、公知のＤＮＡ配列（例えば、適切なＤＮＡ配列はＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．、前出から得ることができる）と組み合わせることができる。任意のアイソタイプの定常領域（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥの定常領域を含む）をこの目的のために使用することができ、そのような定常領域は任意のヒトまたは動物種から得ることができることが認識されるだろう。１つの動物（ヒトのような）種の可変ドメインＤＮＡに由来し、次に「ハイブリッド」の全長重鎖および／または軽鎖についてのコード配列を形成するために別の動物種の定常領域ＤＮＡに融合したＦｖクローンは、本明細書において使用されるような「キメラ」抗体および「ハイブリッド」抗体の定義に含まれている。好ましい実施形態において、すべてヒトの、完全または部分的な長さの重鎖および／または軽鎖についてのコード配列を形成するために、ヒト可変ＤＮＡに由来するＦｖクローンは、ヒト定常領域ＤＮＡに融合される。
【０１７４】
ハイブリドーマに由来する抗ＤＬＬ４抗体をコードするＤＮＡは、例えばハイブリドーマクローンに由来する相同なマウス配列の代わりのヒト重鎖および軽鎖の定常ドメインについてのコード配列を置換することによってもまた修飾することができる（例えばＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８１  ：  ６８５１−６８５５  （１９８４）の方法におけるように）。ハイブリドーマもしくはＦｖのクローンに由来する抗体またはフラグメントをコードするＤＮＡは、免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列のすべてまたは一部を共有結合で結合することによってさらに修飾することができる。この様式において、Ｆｖクローンまたはハイブリドーマクローンに由来する抗体の結合特異性を有する、「キメラ」抗体または「ハイブリッド」抗体が調製されている。
【０１７５】
抗体フラグメント
本発明は抗体フラグメントを包含する。特定の状況において、抗体全体ではなく、抗体フラグメントを使用するという優位性がある。フラグメントのより小さなサイズは迅速な除去を可能にし、固形腫瘍への接近の改良を引き起こしてもよい。
【０１７６】
様々な技術は抗体フラグメントの産生のために開発されている。伝統的には、これらのフラグメントは完全な形の抗体のタンパク分解を介して得られた。（例えばＭｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７  （１９９２）；、Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２２９：８１  （１９８５）を参照）。しかしながら、これらのフラグメントは、今や、組換え宿主細胞によって直接産生することができる。Ｆａｂ、ＦｖおよびＳｃＦｖ抗体フラグメントはすべて大腸菌中で発現させてそれから分泌させることができ、それによりこれらのフラグメントの容易な大量産生を可能にする。抗体フラグメントは上で議論された抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントは、直接大腸菌から回収され、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを形成するために化学的に結合することができる。（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７  （１９９２））。別のアプローチに従って、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。サルベージ受容体結合のエピトープ残基を含む、増加したインビボ半減期を備えたＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２のフラグメントは、米国特許第５，８６９，０４６号に記載されている。抗体フラグメントの産生のための他の技術は当業者に明らかである。他の実施形態において、選択の抗体は一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ  ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；および第５，５８７，４５８号を参照。ＦｖおよびｓＦｖは、定常領域を欠いており、完全な形の結合部位を備えた唯一の種であり；したがってそれらはインビボ使用中の非特異的結合の低下に適切である。ｓＦｖ融合タンパク質は、ｓＦｖのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかでエフェクタータンパク質の融合をもたらすように構築されてもよい。Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編、前出を参照。抗体フラグメントは、例えば米国特許第５，６４１，８７０号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもまたよい。そのような直鎖状抗体フラグメントは単一特異性または二重特異性であってもよい。
【０１７７】
ヒト化抗体
本発明はヒト化抗体を包含する。非ヒト抗体をヒト化する様々な方法は、当技術分野において公知である。例えばヒト化抗体は、その中に非ヒトソースから１つまたは複数のアミノ酸残基を導入することができる。これらの非ヒトアミノ酸残基は多くの場合「インポート」残基と呼ばれ、典型的には「インポート」可変ドメインから採用される。ヒト化は、ヒト抗体の対応する配列の超可変領域配列で置換することによって、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１  ：５２２−５２５；  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；  Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：  １５３４−１５３６）に従って、本質的には実行することができる。したがって、そのような「ヒト化」抗体は、非ヒト種からの対応する配列によって置換された、完全な形のヒト可変ドメインよりも実質的に少ないキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはいくつかの超可変領域残基および恐らくいくつかのＦＲ残基がげっ歯類抗体中の類似した部位からの残基によって置換されるヒト抗体である。
【０１７８】
ヒト化抗体の作製において使用されるヒト可変ドメイン（軽鎖および重鎖の両方）の選択は抗原性を低下させるのに非常に重要である。いわゆる「最良適合」法に従って、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列は、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体からスクリーニングされる。次にげっ歯類の配列に最も近いヒト配列は、ヒト化抗体のためのヒトフレームワークとして認められる。（Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５１  ：２２９６；  Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１）。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同一のフレームワークはいくつかの異なるヒト化された抗体に使用されてもよい（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８９：４２８５；  Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １５１  ：２６２３）。
【０１７９】
抗体が、抗原に対する高い親和性および他の好ましい生物学的特性の保持と共にヒト化されることはさらに重要である。この目標を達成するために、１つの方法に従って、ヒト化抗体は、親配列およびヒト化配列の三次元模型を使用して、親配列および様々な予想されるヒト化製品の分析の過程により調製される。三次元の免疫グロブリンモデルは一般に利用可能で、当業者によく知られている。候補の免疫グロブリン配列の推定三次元コンフォーメーション構造を例証および提示するコンピュータープログラムは、利用可能である。これらのディスプレイの検査は、候補免疫グロブリン配列の機能と関連した残基の可能性の高い役割の分析（すなわち候補免疫グロブリンがその抗原を結合する能力に影響を及ぼす残基の分析）を可能にする。このように、標的抗原に対する親和性の増加のような所望される抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基はレシピエント配列およびインポート配列から選択し組み合わせることができる。一般に、超可変領域残基は、抗原結合に影響を及ぼすことに直接そして最も実質的に関与する。
【０１８０】
ヒト抗体
ヒト抗ＤＬＬ４抗体は、上で記述されるような公知のヒト定常ドメイン配列に、ヒト由来ファージディスプレーライブラリーから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を組み合わせることによって構築することができる。あるいは、ヒトモノクローナル抗ＤＬＬ４抗体はハイブリドーマ方法により作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒトミエローマおよびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株は、例えばＫｏｚｂｏｒ  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １３３：  ３００１  （１９８４）；  Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ｐｐ．  ５１−６３  （マルセル・デッカー、ニューヨーク、１９８７年）；およびＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １４７：  ８６  （１９９１）により記述されている。
【０１８１】
内在性の免疫グロブリン産生の非存在下において、ヒト抗体の全レパートリーを、免疫に際して、産生可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）を今や産生することができる。例えば、キメラおよび生殖細胞系変異マウスにおける抗体重鎖Ｊ領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合体欠失が、内在性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。そのような生殖細胞系変異マウスにおけるヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、抗原チャレンジに際してヒト抗体の産生をもたらすだろう。例えばＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ９０：  ２５５１  （１９９３）；  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３６２：  ２５５  （１９９３）；  Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ７：  ３３  （１９９３）を参照。
【０１８２】
遺伝子シャフリングもまた非ヒト（例えばげっ歯類）抗体からヒト抗体を得るために使用することができ、ヒト抗体は出発の非ヒト抗体に類似する親和性および特異性を有する。この方法（それは「エピトープインプリンティング」とも呼ばれる）に従って、上で記述されるようなファージディスプレー技術により得られる非ヒト抗体フラグメントの重鎖または軽鎖の可変領域のいずれかは、ヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーと置換され、非ヒト鎖／ヒト鎖のｓｃＦｖまたはＦａｂキメラの集団を生成する。抗原による選択は非ヒト鎖／ヒト鎖のキメラｓｃＦｖまたはＦａｂの単離をもたらし、そこではヒト鎖は、一次ファージディスプレークローン中の対応する非ヒト鎖の除去に際して破壊された抗原結合部位を回復し、すなわちエピトープは、ヒト鎖パートナーの選択を支配する（インプリントする）。この過程を残存する非ヒト鎖を置き換えるために繰り返する場合、ヒト抗体が得られる。（１９９３年４月１日に公開されたＰＣＴ  ＷＯ  ９３／０６２１３を参照）。従来のＣＤＲ移植による非ヒト抗体のヒト化と異なり、この技術は、非ヒト起源のＦＲ残基またはＣＤＲ残基を持たない完全ヒト抗体を提供する。
【０１８３】
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性があるモノクローナル、好ましくはヒトまたはヒト化抗体である。本事例において、結合特異性のうちの１つはＤＬＬ４についてであり、他方は他の抗原についてである。例示的な二重特異性抗体は、ＤＬＬ４タンパク質の２つの異なるエピトープに結合してもよい。二重特異性抗体は、ＤＬＬ４を発現する細胞へ細胞傷害剤を局在させるためにもまた使用されてよい。これらの抗体は、ＤＬＬ４を結合するアーム、および細胞傷害剤（例えばサポリン、抗インターフェロン−α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサートまたは放射性同位体ハプテン）を結合するアームを持つ。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体フラグメント（例えばＦ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製することができる。
【０１８４】
二重特異性抗体を作製する方法は、当技術分野において公知である。伝統的には、２つの重鎖が異なる特異性を有する場合には、二重特異性抗体の組換え産生は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペアの共発現に基づく（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３０５：  ５３７  （１９８３））。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな組合せのために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０の異なる抗体分子の可能な混合物を産生し、このうちの１つのみが適正な二重特異性構造を有する。正しい分子の精製（それは親和性クロマトグラフィー工程により通常行われる）はかなり煩わしく、産物収率は低い。類似した手順は、１９９３年５月１３日に公表されたＷＯ  ９３／０８８２９、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １０：  ３６５５  （１９９１）中で開示される。
【０１８５】
異なるより好ましいアプローチに従って、所望される結合特異性（抗体−抗原結合部位）を備えた抗体可変ドメインは、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。融合は、好ましくは、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖の定常ドメインによるものである。少なくとも１つの融合に存在する第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）（軽鎖結合に必要な部位を含む）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合および（所望されるならば）免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、個別の発現ベクターの中へ挿入され、適切な宿主生物の中に共トランスフェクションされる。これは、構築において使用される３つのポリペプチド鎖の不均等な比率により最適収率が提供される場合に、実施形態における３つのポリペプチドフラグメントの相互の比率の調整において高い融通性を提供する。しかしながら、少なくとも２つのポリペプチド鎖の等比率での発現が高収率をもたらす場合、または比率が特に重要でない場合、１つの発現ベクター中に２つまたは３つのポリペプチド鎖についてのコード配列をすべて挿入することができる。
【０１８６】
このアプローチの好ましい実施形態において、二重特異性抗体は、１つのアーム中の第１の結合特異性を備えたハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他のアーム中のハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペア（第２の結合特異性を提供する）からなる。二重特異性分子の２分の１のみでの免疫グロブリン軽鎖の存在により分離の容易な手段が提供されるので、この非対称構造が、不要な免疫グロブリン鎖の組合せからの、所望される二重特異性化合物の分離を促進することが見出された。このアプローチはＷＯ９４／０４６９０中で開示される。二重特異性抗体を生成するさらなる詳細については、例えばＳｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １２１  ：２１０  （１９８６）を参照。
【０１８７】
別のアプローチに従って、ペアの抗体分子の間の接触面は、組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体のパーセンテージを最大にするように操作できる。好ましい接触面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法において、第１の抗体分子の接触面からの１つまたは複数の小さなアミノ酸側鎖は、より大きな側鎖（例えばチロシンまたはトリプトファン）と置換される。大きな側鎖と同一または類似したサイズの代償的な「くぼみ」は、大きなアミノ酸側鎖をより小さなアミノ酸（例えばアラニンまたはスレオニン）に置換することによって、第二の抗体分子の接触面上に生成される。これは、ホモ二量体のような他の不要な最終生成物を超えてヘテロ二量体の収率を増加させるためのメカニズムを提供する。
【０１８８】
二重特異性抗体は、架橋抗体または「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲート抗体のうちの１つはアビジンに、他方はビオチンに結合できる。そのような抗体は、例えば不要な細胞に対して免疫細胞を標的とするために（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染の治療のために（ＷＯ  ９１／００３６０、ＷＯ  ９２／００３７３およびＥＰ  ０３０８９）提案された。ヘテロコンジュゲート抗体は任意の都合のよい架橋方法を使用して作製されてもよい。適切な架橋剤は当技術分野において周知であり、多数の架橋技術に加えて米国特許第４，６７６，９８０号中で開示される。
【０１８９】
抗体フラグメントからの二重特異性抗体の生成ために技術もまた文献中で記載されている。例えば、二重特異性抗体は化学結合を使用して調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２２９：  ８１  （１９８５）は、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生成するために完全な形の抗体をタンパク質分解的に切断する手順について記述する。近傍のジチオールを安定化しおよび分子間ジスルフィド形成を防止するために、これらのフラグメントは、ジチオール錯化剤の亜ヒ酸ナトリウムの存在下において還元される。次に、生成されたＦａｂ’フラグメントはチオニトロベンゾアート（ＴＮＢ）誘導体に変換される。次にＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体のうちの１つはメルカプトエチルアミンによる還元によってＦａｂ’−チオールに再変換され、二重特異性抗体を形成するために等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と共に混合される。産生される二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のために薬剤として使用できる。
【０１９０】
最近の進歩により、二重特異性抗体を形成するために化学的に結合できるＦａｂ’−ＳＨフラグメントの大腸菌からの直接的な回収が容易にされた。Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １７５：  ２１７−２２５  （１９９２）により、完全ヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生が記述される。各Ｆａｂ’フラグメントは、大腸菌から別々に分泌され、二重特異性抗体を形成するためにインビトロの指向性化学カップリングを行なった。このように形成された二重特異性抗体は、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の溶解作用を引き起こすことに加えて、ＨＥＲ２受容体を過剰発現する細胞および正常なヒトＴ細胞に対して結合することができた。
【０１９１】
組換え細胞培養から二重特異性抗体フラグメントを直接作製し単離するために様々な技術もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して産生される。Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １４８（５）：  １５４７−１５５３  （１９９２）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドは、２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に遺伝子融合によって結合された。抗体ホモ二量体を単量体の形成のためにヒンジ領域で還元し、次に抗体ヘテロ二量体を形成するために再酸化した。この方法は、抗体ホモ二量体の産生のためにもまた利用できる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９０：６４４４−６４４８  （１９９３）によって記述された「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体フラグメントの作製ための代替メカニズムを提供する。このフラグメントは、同一鎖上の２つのドメイン間の対合が可能でないほど短いリンカーによって、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、１つのフラグメントのＶＨおよびＶＬのドメインは、別のフラグメントの相補的なＶＬおよびＶＨドメインと共に対合するように強いられ、その結果として、２つの抗原結合部位を形成する。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用によって二重特異性抗体フラグメントを作製するための別の戦略も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １５２：５３６８  （１９９４）を参照。
【０１９２】
２以上の価数を備えた抗体が検討される。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４７：  ６０  （１９９１）。
【０１９３】
多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞によって二価抗体よりも速く細胞内に取り込まれ（および／または異化され）てもよい。本発明の抗体は、３つ以上の抗原結合部位（例えば四価抗体）を備えた多価抗体（それらはＩｇＭクラス以外である）になりえ、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現によって容易に産生することができる。多価抗体は二量体化ドメインおよび３つ以上の抗原結合部位を含みうる。好ましい二量体化ドメインは、Ｆｃ領域またはヒンジ領域を含む（またはそれらからなる）。この場合において、抗体はＦｃ領域およびＦｅ領域に対して３つ以上の抗原結合部位アミノ末端を含むだろう。本明細書において好ましい多価抗体は、３〜約８、好ましくは４つの抗原結合部位を含む（またはそれらからなる）多価抗体は少なくとも１つのポリペプチド鎖（および好ましくは２つのポリペプチド鎖）を含み、ポリペプチド鎖は２つまたは複数の可変ドメインを含む。例えば、ポリペプチド鎖はＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−（Ｘ２）ｎ−Ｆｃを含んでもよく、ここで、ＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域の１つのポリペプチド鎖であり、Ｘ１およびＸ２はアミノ酸またはポリペプチドを表わし、ｎは０または１である。例えば、ポリペプチド鎖は、ＶＨ−ＣＨ１−柔軟なリンカー−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖；またはＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖を含んでもよい。本明細書における多価抗体は、好ましくはさらに少なくとも２（好ましくは４）つの軽鎖可変ドメインポリペプチドを含む。本明細書における多価抗体は、例えば約２〜約８つの軽鎖可変ドメインポリペプチドを含んでもよい。本明細書で検討される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを含み、任意でさらにＣＬドメインを含む。
【０１９４】
抗体変異型
いくつかの実施形態において、本明細書において記述される抗体のアミノ酸配列修飾が検討される。例えば、抗体の結合能および／または他の生物学的特性を改善することは望ましいかもしれない。抗体のアミノ酸配列変異型は、抗体核酸の中に適切なヌクレオチド変化を導入することによって、またはペプチド合成によって調製される。そのような修飾は、例えば抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／またはその中への挿入、および／またはその置換を含む。もし最終的なコンストラクトが所望される特性を持つならば、欠失、挿入および置換の任意の組合せは最終コンストラクトに達するように作製される。配列作製時に、被験体抗体アミノ酸配列中にアミノ酸変化を導入してもよい。
【０１９５】
変異誘発のために好ましい位置にある抗体の特定の残基または領域の有用な同定法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ  （１９８９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４４：１０８１−１０８５によって記述されるような「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれるものである。ここで、残基または標的残基のグループは同定され（例えばａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓおよびｇｌｕのような荷電残基）、抗原とのアミノ酸の相互作用に影響するように中性アミノ酸または負に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）により置換される。次に置換に対して機能的感受性を示すアミノ酸位置を、置換の部位でまたはそれに対して、さらなるまたは他の変異を導入することによって改良する。したがって、アミノ酸配列変異の導入ための部位は前もって定義されるが、変異の性質それ自体は前もって定義される必要がない。例えば与えられた部位での変異の遂行を解析するために、アラニンスキャニング変異誘発またはランダム変異誘発は標的のコドンまたは領域で行われ、発現された免疫グロブリンは所望される活性についてスクリーニングされる。
【０１９６】
アミノ酸配列挿入は、単一のアミノ酸残基または複数のアミノ酸残基の配列内挿入だけでなく、１残基〜１００以上の残基を含むポリペプチド長にわたるアミノ末端および／またはカルボキシル末端融合を含んでいる。末端挿入の具体例は、Ｎ末端メチオニル残基を備えた抗体または細胞傷害性ポリペプチドに融合した抗体を含む。抗体分子の他の挿入の変異型は、抗体の血清半減期を増加させる酵素（例えばＡＤＥＰＴについて）またはポリペプチドの抗体のＮ末端またはＣ末端への融合を含んでいる。
【０１９７】
ポリペプチドの糖鎖付加は典型的にはＮ結合型またはＯ結合型である。Ｎ結合型は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（ここでＸはプロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素による結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、可能な糖鎖付加部位を生成する。Ｏ結合型糖鎖付加は、ヒドロキシアミノ酸（５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンが使用されてもよいが、最も一般的にはセリンまたはスレオニン）への糖（Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースのうちの１つ）の結合を指す。
【０１９８】
抗体への糖鎖付加部位の追加は、それが上記のトリペプチド配列の１つ以上を含むように、アミノ酸配列を改変することによって都合よく遂行される（Ｎ結合型糖鎖付加部位のため）。その変化は、もとの抗体の配列への１つまたは複数のセリンまたはスレオニン残基の追加によってまたは置換によってもまた行われてよい（Ｏ結合型糖鎖付加部位のため）。
【０１９９】
抗体がＦｃ領域を含む場合には、それに結合された炭水化物が改変されてもよい。例えば、抗体のＦｃ領域に結合されたフコースを欠損する成熟糖鎖構造を有する抗体は、米国特許出願第ＵＳ  ２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，  Ｌ．）中に記載されている。ＵＳ２００４／００９３６２１（協和醗酵工業（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ）株式会社）もまた参照。抗体Ｆｃ領域に結合された炭水化物中の分岐型Ｎ‐アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を備えた抗体は、ＷＯ  ２００３／０１１８７８、Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．および米国特許第６，６０２，６８４号、Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．  中で参照される。抗体Ｆｃ領域に結合されるオリゴサッカライド中の少なくとも１つのガラクトース残基を備えた抗体は、ＷＯ  １９９７／３００８７、Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．中で報告される。そのＦｃ領域に結合された改変炭水化物の抗体に関する、ＷＯ  １９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ，  Ｓ．）およびＷＯ  １９９９／２２７６４（Ｒａｊｕ，  Ｓ．）もまた参照。修飾された糖鎖付加をともなう抗原結合分子に関するＵＳ２００５／０１２３５４６（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．）もまた参照。
【０２００】
本明細書における好ましい糖鎖付加変異型はＦｃ領域を含み、Ｆｃ領域に結合する糖鎖構造はフコースを欠損する。そのような変異型はＡＤＣＣ機能を改善した。任意で、さらにＦｃ領域は、ＡＤＣＣをさらに改善する１つまたは複数のその中のアミノ酸置換、例えばＦｃ領域の位置２９８、３３３、および／または３３４（残基のＥｕナンバリング）での置換を含む。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体に関連した公報の具体例は、ＵＳ  ２００３／０１５７１０８；ＷＯ  ２０００／６１７３９；ＷＯ  ２００１／２９２４６；ＵＳ  ２００３／０１１５６１４；ＵＳ  ２００２／０１６４３２８；ＵＳ  ２００４／００９３６２１；ＵＳ  ２００４／０１３２１４０；ＵＳ  ２００４／０１１０７０４；ＵＳ  ２００４／０１１０２８２；ＵＳ  ２００４／０１０９８６５；ＷＯ  ２００３／０８５１１９；ＷＯ  ２００３／０８４５７０；ＷＯ  ２００５／０３５５８６；ＷＯ  ２００５／０３５７７８；ＷＯ２００５／０５３７４２；Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３３６：１２３９−１２４９  （２００４）；  Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ８７：  ６１４  （２００４）を含む。脱フコシル化抗体を産生する細胞株の具体例は、タンパク質フコシル化が欠損したＬｅｃｌ３  ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ２４９：５３３−５４５  （１９８６）；  米国特許出願第ＵＳ  ２００３／０１５７１０８  Ａ１号、Ｐｒｅｓｔａ，  Ｌ；  およびＷＯ  ２００４／０５６３１２  Ａ１，  Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，  特に実施例１１で）、およびα−１、６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞のようなノックアウト細胞株（Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ８７：  ６１４  （２００４））を含んでいる。
【０２０１】
別のタイプの変異型はアミノ酸置換変異型である。これらの変異型は、抗体分子中に異なる残基により置換された少なくとも１つのアミノ酸残基を有している。置換変異誘発のために最も興味のある部位は超可変領域を含むが、ＦＲ変化も検討される。保存的置換は「好ましい置換」の標題の下に表２において示される。そのような置換が生物学的活性における変化をもたらすならば、次に、より本質的な変化、表２中で示される「例示的な置換」、またはアミノ酸クラスに関してさらに以下で記載されるようなものを導入してもよく、産物はスクリーニングされる。
【０２０２】
【表２】
2009539870.tif 000005
抗体の生物学的特性の本質的な調節は、（ａ）例えばシートまたはヘリカルコンフォーメーションとしての置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の荷電または疎水性、または（ｃ）側鎖の容積、の維持に対するそれらの効果が有意に異なる置換の選択によって遂行される。天然に存在する残基は一般的な側鎖特性に基づいたグループへと分けられる：（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；（４）塩基性：ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【０２０３】
非保存的な置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーの別のクラスとの交換を要する。
【０２０４】
１つのタイプの置換変異型は、親抗体（例えばヒト化またはヒト抗体）の１つまたは複数の超可変領域残基の置換を含む。一般に、さらなる開発のために選択された結果として生じる変異型は、それらが生成された親抗体と比較して生物学的特性は改善されているだろう。そのような置換変異型の生成ための都合のよい手段はファージディスプレーを使用する親和性成熟を含んでいる。簡潔には、いくつかの超可変領域部位（例えば６〜７部位）は、各部位ですべての可能なアミノ酸置換を生成するように変異させられる。このように生成された抗体は、各粒子内にパッケージにされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合として、線状ファージ粒子から提示される。次にファージで提示された変異型は、本明細書において開示されるようなそれらの生物学的活性（例えば結合能）についてスクリーニングされる。調節のための候補の超可変領域部位を同定するために、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基の同定に、アラニンスキャニング変異誘発を実行できる。あるいはまたはさらに、抗体および抗原との間の接触点を同定する抗原抗体複合体の結晶構造を解析することは有用かもしれない。そのような接触残基および隣接残基は本明細書において詳述される技術に従う置換のための候補である。一旦そのような変異型が生成されれば、変異型のパネルは、本明細書において記述されるようなスクリーニングにかけられ、抗体はさらなる開発のために、１つまたは複数の関連する分析における優れた特性により選択されてもよい。
【０２０５】
抗体のアミノ酸配列変異型をコードする核酸分子は、当技術分野において公知の様々な方法によって調製される。これらの方法は、天然源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列変異型の場合において）、またはオリゴヌクレオチドを仲介した（または部位特異的）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、および以前に調製された変異型または抗体の非変異型バージョンのカセット式変異誘発による調製を含むが、これらに限定されない。
【０２０６】
免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域中に１つまたは複数のアミノ酸修飾を導入し、その結果としてＦｃ領域変異型を生成することは望ましい。Ｆｃ領域変異型は、ヒンジのシステインを含む１つまたは複数のアミノ酸位置でのアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のＦｃ領域）を含んでもよい。
【０２０７】
この記述および当技術分野の教示に従って、いくつかの実施形態において、野生型の対応する抗体と比較して（例えばＦｃ領域において）、方法で使用される抗体が１つまたは複数の変化を含むことができるように検討される。これらの抗体は、それらの野生型相当物と比較して、治療的有用性のために必要とされる同一の特性を、それにもかかわらず実質的に保持するだろう。例えば、ＷＯ９９／５１６４２において例えば記載されるように、改変された（すなわち改良または減少された、のいずれか）Ｃ１ｑ結合および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をもたらすＦｃ領域中の特定の変化を作製できると考えられる。Ｆｃ領域変異型の他の具体例に関する、Ｄｕｎｃａｎ  ＆  Ｗｉｎｔｅｒ  Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：７３８−４０  （１９８８）；  米国特許第５，６４８，２６０号；  米国特許第５，６２４，８２１号；  およびＷＯ９４／２９３５１もまた参照。ＷＯ００／４２０７２（Ｐｒｅｓｔａ）およびＷＯ  ２００４／０５６３１２（Ｌｏｗｍａｎ）は、ＦｃＲに対して改良された結合または減少した結合を有する抗体変異型について記述する。これらの特許公報の内容は、参照することにより本明細書に特に組み入れられる。Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ９（２）：  ６５９１−６６０４  （２００１）もまた参照。増加した半減期および新生仔Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）（胎児に対する母体ＩｇＧの移行に関与する）に対する改良された結合を備えた抗体（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１７：５８７  （１９７６）およびＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４：２４９  （１９９４））は、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）中で記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎに対するＦｃ領域の結合を改善する１つまたは複数のその中の置換を備えたＦｃ領域を含む。改変されたＦｃ領域アミノ酸配列および増加または低下したＣ１ｑ結合能を備えたポリペプチド変異型は、米国特許第６，１９４，５５１Ｂ１号、ＷＯ９９／５１６４２中で記載される。それらの特許公報の内容は、参照することにより特に本明細書に組み入れられる。Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６４：  ４１７８−４１８４  （２０００）もまた参照。
【０２０８】
抗体誘導体
抗体は、当技術分野において公知であり容易に利用可能な追加の非タンパク性部分を含むようにさらに修飾することができる。好ましくは、抗体の誘導体化のために適切な部分は水溶性重合体である。水溶性重合体の非限定的具体例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（ホモ重合体またはランダム共重合体のいずれか）、およびデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレン（ｐｒｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）グリコールホモ重合体、プロリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキサイド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにその混合物を含むが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のために製造における長所を有するだろう。重合体は任意の分子量であってもよく、分岐または直鎖状であってもよい。抗体に対して結合された重合体の数は変化してもよく、１つ以上の重合体が結合されるならば、それらは同一分子または異なる分子でありえる。一般に、誘導体化のために使用される重合体の数および／またはタイプは、抗体誘導体が定義された条件下の治療法において使用されるかどうかなどにかかわらず、特定の特性または改良されるべき抗体の機能を含むが、これらに限定されない考慮に基づいて決定することができる、
所望される特性を備えた抗体のためのスクリーニング
抗体は、当技術分野において公知の様々な分析により、それらの物理的／化学的特性および生物学的機能について特性を評価することができる。いくつかの実施形態において、抗体は、任意の１つまたは複数の、ＤＬＬ４への結合、ノッチ受容体活性化の減少または遮断、ノッチ受容体下流の分子シグナリングの減少または遮断、ＤＬＬ４へのノッチ受容体結合の破壊または遮断、および／または内皮細胞増殖の促進、および／または内皮細胞分化の阻害、および／または動脈分化の阻害、および／または腫瘍血管灌流の阻害、および／または腫瘍、細胞増殖障害または癌の治療および／または予防；および／またはＤＬＬ４の発現および／または活性に関連した障害の治療または予防、および／またはノッチ受容体の発現および／または活性に関連した障害の治療または予防について特性を評価される。
【０２０９】
精製された抗体は、Ｎ末端配列決定、アミノ酸分析、非変性サイズ排除高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析、イオン交換クロマトグラフィーおよびパパイン消化を含むが、これらに限定されなかい、一連の分析によりさらに特性を評価することができる。
【０２１０】
本発明の特定の実施形態において、本明細書において産生された抗体は、それらの生物学的活性について解析される。いくつかの実施形態において、本発明の抗体はそれらの抗原結合活性について検査される。当技術分野において公知であり、本明細書において使用することができる抗原結合分析は、ウエスタンブロット、放射免疫分析、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着分析）、「サンドイッチ」免疫分析、免疫沈降分析、蛍光性免疫分析およびプロテインＡ免疫分析のような技術を使用する、任意の直接的または競合的結合分析を含むが、これらに限定されない。例示的な抗原結合分析は、以下の実施例セクションにおいて提供される。
【０２１１】
本明細書において記述される特有の特性を持つ抗ＤＬＬ４抗体は、任意の都合のよい方法により所望される特性について抗ＤＬＬ４のハイブリドーマクローンをスクリーニングすることによって得ることができ、それらのうちのいくつかは本明細書において記述され例示される。例えば、ＤＬＬ４へのノッチ受容体の結合を遮断するかまたは遮断しない抗ＤＬＬ４モノクローナル抗体が所望されるならば、候補抗体は、競合的結合ＥＬＩＳＡのような結合競合分析において検査することができ、その場合プレートウェルはＤＬＬ４によりコートされ、対象となるノッチ受容体の過剰量中で、抗体の溶液はコートされたプレート上に重ねられ、結合した抗体は酵素により検出される（例えば結合した抗体のＨＲＰコンジュゲート抗Ｉｇ抗体またはビオチン化抗Ｉｇ抗体との接触および例えばストレプトアビジンＨＲＰおよび／または過酸化水素によるプレートの現像によるＨＲＰ発色反応の現像およびＥＬＩＳＡプレートリーダーによる４９０ｎｍでの分光測光によるＨＲＰ発色反応の検出）。
【０２１２】
１つの実施形態において、抗体はすべてのエフェクター機能ではなくいくつかを持つ改変された抗体であり、インビボ抗体の半減期は重要であるが、特定のエフェクター機能（補体およびＡＤＣＣのような）は不必要または有害であるという点で、この抗体を多数の適用のための望ましい候補にする。特定の実施形態において、生産された免疫グロブリンのＦｃ活性は望ましい特性のみが維持されていることを保証するために測定される。インビトロのおよび／またはインビボ細胞毒性分析は、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認するために行なうことができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合分析は抗体がＦｃγＲ結合を欠損している（従ってＡＤＣＣ活性が欠損している可能性の高い）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持することを保証するために行なうことができる。ＡＤＣＣの仲介ための主要な細胞（ＮＫ細胞）はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２  （１９９１）の４６４ページの表３に要約される。対象となる分子のＡＤＣＣ活性を評価するインビトロの分析の一例は、米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号に記載されている。そのような分析のために有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含んでいる。あるいはまたはさらに、対象となる分子のＡＤＣＣ活性は、例えばＣｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＮＡＳ  （ＵＳＡ）  ９５：６５２−６５６  （１９９８）中で開示されるもののような動物モデルにおいてインビボで評価されてもよい。Ｃ１ｑ結合分析もまた、抗体がＣ１ｑを結合することができず従ってＣＤＣの活性を欠損することを確認するために行なわれてもよい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣの分析は、例えばＧａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３  （１９９６）に記載されるように実行されてもよい。ＦｃＲｎ結合およびインビボクリアランス／半減期の定量もまた、当技術分野において公知の方法（例えば実施例セクションに記載されるもの）を使用して実行することができる。
【０２１３】
ベクター、宿主細胞および組換え法
抗体の組換え産生のために、それをコードする核酸は単離され、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のための複製可能ベクターへと挿入される。抗体をコードするＤＮＡは、通常の手順（例えば抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に対して特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブの使用によって）を使用して、容易に単離および配列決定される。多数のベクターが利用可能である。ベクターの選択は、使用される宿主細胞に部分的に依存する。一般に、好ましい宿主細胞は、原核生物または真核生物（一般に哺乳類）起源である。任意のアイソタイプの定常領域（ＩｇＧおよびＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ定常領域を含む）をこの目的のために使用することができ、そのような定常領域は任意のヒトまたは動物種から得ることができることが認識される。
【０２１４】
ａ．原核生物の宿主細胞を使用する抗体の生成：
ｉ．ベクター構築抗体のポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチド配列は標準の組換え技術を使用して得ることができる。望ましいポリヌクレオチド配列は、ハイブリドーマ細胞のような抗体産生細胞から単離および配列決定されてもよい。あるいはポリヌクレオチドは、ヌクレオチドシンセサイザーまたはＰＣＲ技術を使用して合成することができる。一旦得られたならば、ポリペプチドをコードする配列は、原核生物宿主中で異種ポリヌクレオチドを複製および発現できる組換えベクターへと挿入される。当技術分野において利用可能であり、公知の多数のベクターは本発明のために使用できる。適切なベクターの選択は、ベクターへと挿入される核酸のサイズおよびベクターにより形質転換される特定の宿主細胞に主に依存するだろう。各ベクターは、その機能（異種ポリヌクレオチドの増幅もしくは発現、またはその両方）、およびそれが存在する特定の宿主細胞との適合性に依存して、様々な成分を含む。ベクター成分は一般に、複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種核酸挿入物および転写終結配列を含むが、これらに限定されない。
【０２１５】
一般に、宿主細胞に適合する種に由来するレプリコンおよび制御配列を含むプラスミドベクターは、これらの宿主に関連して使用される。ベクターは、通常、形質転換細胞における表現型による選択を提供することができるマーキング配列に加えて、複製部位を保有する。例えば、典型的には、大腸菌はｐＢＲ３２２（大腸菌種に由来するプラスミド）を使用して形質転換される。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン（Ａｍｐ）およびテトラサイクリン（Ｔｅｔ）抵抗性をコードする遺伝子を含んでおり、したがって形質転換細胞の同定ための容易な手段を提供する。ｐＢＲ３２２、その誘導体または他の微生物のプラスミドまたはバクテリオファージは、微生物による内在性タンパク質の発現のために使用することができるプロモーターもまた含むかまたは含むように修飾されてもよい。特定の抗体の発現のために使用されるｐＢＲ３２２誘導体の具体例は、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ、米国特許第５，６４８，２３７号に詳細に記載される。
【０２１６】
さらに、宿主微生物に適合するレプリコンおよび制御配列を含むファージベクターは、形質転換ベクターとしてこれらの宿主に関連して使用することができる。例えば、λＧＥＭ（商標）−１１のようなバクテリオファージは、大腸菌ＬＥ３９２のような感受性宿主細胞の形質転換に使用できる組換えベクターの作製において利用されてもよい。
【０２１７】
発現ベクターはポリペプチド成分の各々をコードする、２つまたは複数のプロモーター−シストロンペアを含んでもよい。プロモーターは、その発現を調節するシストロンに対して上流に（５’）置かれる翻訳されない調節配列である。原核生物のプロモーターは典型的には誘導可能で構成的である２つのクラスに分類される。誘導可能プロモーターは、培養条件の変化（例えば栄養物質の存在もしくは非存在、または温度の変化）に反応して、その制御下でシストロンの転写を増加したレベルで開始するプロモーターである。
【０２１８】
様々な可能な宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが周知である。選択されたプロモーターは、制限酵素の消化を介してソースＤＮＡからプロモーターを取り出し、単離されたプロモーター配列をベクターに挿入することによって、軽鎖または重鎖をコードするシストロンＤＮＡへ操作可能に結合することができる。天然のプロモーター配列および多数の異種プロモーターの両方が、標的遺伝子の直接的な増幅および／または発現に対して使用されてもよい。いくつかの実施形態において、天然の標的ポリペプチドプロモーターと比較して、異種プロモーターは一般に、発現させる標的遺伝子のより多量の転写およびより高い収率を可能にするので、異種プロモーターが利用される。
【０２１９】
原核生物宿主との使用のために適切なプロモーターは、ＰｈｏＡプロモーター、β−ガラクタマーゼ（ｇａｌａｃｔａｍａｓｅ）およびラクトースプロモーターシステム、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム、およびｔａｃまたはｔｒｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーターを含む。しかしながら、細菌において機能的な他のプロモーター（他の公知の細菌またはファージのプロモーターのような）は、同様に適切である。それらのヌクレオチド配列が公表されており、その結果として、当業者が、任意の必要な制限部位を供給するためにリンカーまたはアダプターを使用して、標的の軽鎖および重鎖（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８０）  Ｃｅｌｌ  ２０：  ２６９）をコードするシストロンへ、それらを操作可能にライゲーションすることを可能にする。
【０２２０】
本発明の１つの態様において、組換えベクター内の各シストロンは、膜を横切って発現されるポリペプチドの移行を導く分泌シグナル配列成分を含む。一般に、シグナル配列はベクターの成分であってもよいか、またはそれはベクターへと挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部であってもよい。本発明のために選択されるシグナル配列は、宿主細胞によって認識およびプロセッシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）配列であるべきである。異種ポリペプチドに固有のシグナル配列を認識およびプロセッシングしない原核生物の宿主細胞のために、シグナル配列は、例えばアルカリフォスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐまたは耐熱性毒素ＩＩ（ＳＴＩＩ）リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡおよびＭＢＰからなる群から選択される原核生物のシグナル配列によって置換される。本発明の１つの実施形態において、発現系の両方のシストロンにおいて使用されるシグナル配列は、ＳＴＩＩシグナル配列またはその変異型である。
【０２２１】
別の態様において、本発明に記載の免疫グロブリンの産生が宿主細胞の細胞質中で生じる場合があり、したがって各シストロン内に分泌シグナル配列の存在を必要としない。その点で、免疫グロブリン軽鎖および重鎖は、細胞質内で機能的な免疫グロブリンを形成するように発現され、折畳まれ、集合させられる。特定の宿主株（例えば大腸菌ｔｒｘＢ−株）は、ジスルフィド結合形成のために好ましい細胞質条件を提供し、その結果として、発現されたサブユニットタンパク質の適切な折畳みおよび集合を可能にする。Ｐｒｏｂａ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ｇｅｎｅ，  １５９：２０３  （１９９５）。
【０２２２】
抗体の発現のために適切な原核生物の宿主細胞は、グラム陰性またはグラム陽性菌のような、古代細菌および真性細菌を含んでいる。有用な菌の具体例は、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属（例えば大腸菌）、杆菌（例えば枯草菌（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、腸内細菌またはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種（例えば緑膿菌（Ｐ．  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）またはセラチア・マルセッサンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、プローテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａ）属、ビトレオシラ（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ）属またはパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属を含んでいる。１つの実施形態において、グラム陰性細胞が使用される。１つの実施形態において、大腸菌細胞は宿主として本発明のために使用される。大腸菌株の具体例は、遺伝子型Ｗ３１１０  ΔｆｈｕＡ  （ΔｔｏｎＡ）  ｐｔｒ３  ｌａｃ  Ｉｑ  ｌａｃＬ８  ΔｏｍｐＴΔ（ｎｍｐｃ−ｆｅｐＥ）  ｄｅｇＰ４１  ｋａｎＲ（米国特許第５，６３９，６３５号）を有する株３３Ｄ３を含む、株Ｗ３１１０（Ｂａｃｈｍａｎｎ，  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌ．  ２  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．  Ｃ：  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  １９８７）ページ１１９０〜１２１９；ＡＴＣＣ登録番号２７，３２５）およびその誘導体を含む。大腸菌２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）、大腸菌Ｂ、大腸菌λ１７７６（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）および大腸菌ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ  ３１，６０８）のような、他の株およびその誘導体もまた適切である。これらの実施例は、限定するものではなく例示的である。定義された遺伝子型を有する上述の細菌のいずれかの誘導体を構築する方法は、当技術分野において公知であり、例えばＢａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  ８：３０９−３１４  （１９９０）中で記載される。細菌細胞中のレプリコンの複製可能性を考慮に入れて、適切な細菌を選択することが一般に必要である。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７またはｐＫＮ４１０のような周知のプラスミドがレプリコンを供給するために使用される場合、大腸菌、セラチア菌またはサルモネラ菌種は、宿主として適切に使用できる。典型的には、宿主細胞は最小限の量のタンパク質分解酵素を分泌すべきであり、望ましくは追加のプロテアーゼ阻害剤を細胞培養中に取り入れてもよい。
【０２２３】
ｉｉ．抗体産生
宿主細胞は上記の発現ベクターにより形質転換され、形質転換体を選択するプロモーターの誘導または望ましい配列をコードする遺伝子の増幅のために適切なように調節した通常の培養液中で培養される。
【０２２４】
形質転換は、ＤＮＡが染色体外のエレメントとして、または染色体の成分によって複製可能なように、原核生物の宿主の中にＤＮＡを導入することを意味する。使用される宿主細胞に依存して、形質転換はそのような細胞に適切な標準技術を使用して行われる。塩化カルシウムを用いるカルシウム処理は、堅牢な細胞壁バリアを含む細菌細胞のために一般に使用される。形質転換のための別の方法は、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。さらに使用される別の技術は、エレクトロポレーションである。
【０２２５】
ポリペプチドを産生するために使用される原核細胞は、当技術分野において公知であり、選択された宿主細胞の培養のために適切な培地中で増殖される。適切な培地の具体例は、必要な栄養サプリメントを加えたルリア培養液（ＬＢ）を含む。いくつかの実施形態において、培地は、発現ベクターを含む原核細胞の増殖を選択的に可能にする、発現ベクターの構築に基づいて選ばれた選択薬剤もまた含む。例えば、アンピシリンは、アンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の増殖のための培地に加えられる。
【０２２６】
炭素、窒素および無機リン酸塩源に加えて、任意の必要なサプリメントもまた、単独、または複合窒素源のような別のサプリメントまたは培地との混合物として導入され、適切な濃度で含まれてもよい。任意で、培養液は、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオエリトリトールおよびジチオトレイトールからなる群から選択される１つまたは複数の還元剤を含んでもよい。
【０２２７】
原核生物の宿主細胞は適温で培養される。大腸菌増殖のために、選択温度は例えば約２０℃〜約３９℃にわたり、より好ましくは約２５℃〜約３７℃、さらにより好ましくは約３０℃である。培地のｐＨは、主に宿主生物に依存して、約５〜約９にわたる任意のｐＨであってもよい。大腸菌については、ｐＨは好ましくは約６．８〜約７．４、およびより好ましくは約７．０である。
【０２２８】
誘導可能プロモーターが発現ベクター中で使用されるならば、タンパク質発現はプロモーターの活性化のために適切な条件下で誘導される。本発明の１つの態様において、ＰｈｏＡプロモーターはポリペプチドの転写制御のために使用される。したがって、形質転換された宿主細胞は誘導のためにリン酸塩制限培地中で培養する。好ましくは、リン酸塩制限培地は、Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地である（例えばＳｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  （２００２），  ２６３：１３３−１４７を参照）。当技術分野において公知であるように、様々な他の誘導因子は、用いられるベクターコンストラクトに従って使用されてもよい。
【０２２９】
１つの実施形態において、発現された本発明のポリペプチドは、宿主細胞のペリプラスムの中に分泌され、ペリプラスムから回収される。タンパク質回収は、一般に浸透圧ショック、超音波処理または溶解のような手段によって微生物を破壊することを典型的には必要とする。一旦細胞が破壊されれば、細胞残屑または完全な細胞を遠心分離または濾過によって除去してもよい。タンパク質は、例えば親和性樹脂クロマトグラフィーによってさらに精製されてもよい。あるいは、タンパク質は培養培地の中に輸送され、その中に単離できる。細胞は培養から撤去されてもよく、培養上清は産生タンパク質のさらなる精製のために濾過および濃縮される。発現ポリペプチドは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）およびウエスタンブロット分析のような一般に公知の方法を使用して、さらに単離および同定できる。
【０２３０】
本発明の１つの態様において、抗体産生は発酵プロセスによって大量に行われる。様々な大規模流加発酵手順が組換えタンパク質の産生のために利用可能である。大規模発酵は少なくとも１０００リットルの収容能力、好ましくは約１，０００〜１００，０００リットルの収容能力を有する。これらの発酵槽は、酸素および栄養物質、特にグルコース（好ましい炭素／エネルギー源）を分散するために撹拌羽根を使用する。小規模発酵は、容積収容能力で最高およそ１００リットルであり、約１リットル〜約１００リットルにわたる発酵槽中の発酵を一般に指す。
【０２３１】
発酵過程において、細胞が望ましい密度（例えば約１８０〜２２０のＯＤ５５０、この段階では細胞は初期定常期である）まで適切な条件下で増殖した後に、タンパク質発現の誘導は典型的には開始される。当技術分野において公知であり上で記載されるような様々な誘導因子は、用いられるベクターコンストラクトに従って使用されてもよい。細胞は誘導の前に、短い期間増殖されてもよい。さらに長いまたは短い誘導時間を使用してもよいが、通常細胞は約１２〜５０時間誘導される。
【０２３２】
ポリペプチド産生の収率および質を改善するために、様々な発酵条件は調節することができる。例えば分泌された抗体ポリペプチドの適切な集合および折畳みを改善するために、Ｄｓｂタンパク質（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ、またはＤｓｂＧ）またはＦｋｐＡ（シャペロン活性をともなうペプチジルプロリルシス、トランス−イソメラーゼ）のようなシャペロンタンパク質を過剰発現する追加のベクターは、宿主原核細胞を共形質転換するために使用できる。シャペロンタンパク質は、細菌宿主細胞に産生された異種タンパク質の適切な折畳みおよび溶解を促進することが実証されている。Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｊ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ  ２７４：１９６０１−１９６０５；  Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ、米国特許第６，０８３，７１５号；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許６，０２７，８８８番；Ｂｏｔｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  （２０００）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５：１７１００−１７１０５；  Ｒａｍｍ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  （２０００）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５：１７１０６−１７１１３；  Ａｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３９：  １９９−２１０。
【０２３３】
発現された異種タンパク質のタンパク質分解を最小限にするために（特にタンパク質分解感受性のもの）、タンパク質分解酵素を欠損した特定の宿主株を本発明のために使用できる。例えば宿主細胞株は、プロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩおよびその組合せのような公知の細菌プロテアーゼをコードする遺伝子中の遺伝子変異をもたらすように調節されてもよい。いくつかの大腸菌のプロテアーゼ欠損株は利用可能であり、例えばＪｏｌｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）、前出；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，２６４，３６５号；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，５０８，１９２号；Ｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，  ２：６３−７２  （１９９６）中で記載されている。
【０２３４】
１つの実施形態において、タンパク質分解酵素を欠損して、１つまたは複数のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドにより形質転換された大腸菌株は、発現系における宿主細胞として使用される。
【０２３５】
ｉｉｉ．抗体精製
当技術分野において公知の標準タンパク質精製方法を用いることができる。以下の手順は適切な精製法の例示である：免疫親和性またはイオン交換カラムによる分画、エタノール沈澱、逆相ＨＰＬＣ、シリカまたはＤＥＡＥのような陽イオン交換樹脂によるクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫安沈澱、および例えばセファデックスＧ−７５を使用するゲル濾過。
【０２３６】
１つの態様において、固相上の固定化プロテインＡは全長抗体産物の免疫親和性精製のために使用される。プロテインＡは、抗体のＦｃ領域に対する高親和性により結合するスタフィロコッカス・アウレアス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅａｓ）からの４１ｋＤ細胞壁タンパク質である。Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ  （１９８３）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．  ６２：１−１３。プロテインＡが固定化される固相は、好ましくはガラスまたはシリカの表面を含むカラム、より好ましくは、細孔性ガラスカラムまたはケイ酸カラムである。いくつかの適用において、カラムは混入物の非特異性の接着を防止しようとして、グリセロールのような試薬によりコートされた。
【０２３７】
精製の第１の工程として、プロテインＡに対する対象となる抗体の特異的結合を可能にするために、上で記述されるような細胞培養に由来する調製品は、プロテインＡ固定化固相上に適用される。次に非特異的に固相に結合された混入物を除去するために、固相を洗浄する。最終的に対象となる抗体を溶出によって固相から回収する。
【０２３８】
ｂ．真核生物宿主細胞を使用する抗体の生成：
ベクター成分は、一般に以下の１つまたは複数を含むが、これらに限定されない：シグナル配列、複製起点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終結配列。
【０２３９】
（ｉ）シグナル配列成分
真核生物宿主細胞で使用されるベクターは、シグナル配列、または対象となる成熟タンパク質もしくはポリペプチドのＮ末端で特異的な切断部位を有する他のポリペプチドもまた含んでもよい。好ましくは選択された異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識およびプロセッシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）配列である。哺乳類細胞発現では、ウイルス性分泌リーダー（例えば単純ヘルペスｇＤシグナル）と同様に、哺乳類シグナル配列も利用可能である。
【０２４０】
そのような前駆体領域のためのＤＮＡは、抗体をコードするＤＮＡに対するリーディングフレーム中でライゲーションされる。
【０２４１】
（ｉｉ）複製起点
一般に、複製起点成分は哺乳類発現ベクターのために必要ではない。例えば、初期プロモーターを含んでいるという理由で、ＳＶ４０起点は典型的には使用されてもよい。
【０２４２】
（ｉｉｉ）選択遺伝子成分
発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択可能なマーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含んでもよい。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートまたはテトラサイクリン、に対する耐性を付与するか、（ｂ）場合により、栄養要求性の欠損を相補するか、または（ｃ）複合培地から利用可能でない重要な栄養物質を供給する、タンパク質をコードする。
【０２４３】
選択スキームの１つの具体例は、宿主細胞の増殖を停止するために薬物を利用する。異種遺伝子により結果よく形質転換される細胞は、薬剤抵抗性を付与するタンパク質を産生し、したがって選択レジメンから生存する。そのような優性選択の具体例は、薬剤のネオマイシン、ミコフェノール酸およびヒグロマイシンを使用する。
【０２４４】
哺乳類細胞のために適切な選択マーカーの別の具体例は、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉおよび−ＩＩ、好ましくは霊長類のメタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどのような抗体核酸を取り込むのに有能な細胞の識別を可能にするものである。
【０２４５】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子により形質転換された細胞は、ＤＨＦＲの競合的なアンタゴニストであるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含む培養液中ですべての形質転換体を培養することによって最初に同定される。野生型ＤＨＦＲが用いられる場合の適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性欠損チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（例えばＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０９６）である。
【０２４６】
あるいは、抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、およびアミノグリコシド３’−フォスフォトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）のような別の選択可能なマーカーにより形質転換または共形質転換された宿主細胞（特に内在性のＤＨＦＲを含む野生型宿主）は、アミノグリコシド系抗生物質（例えばカナマイシン、ネオマイシン、Ｇ４１８）のような選択可能マーカーのための選択薬剤を含む培地中での細胞増殖によって選択することができる。米国特許第４，９６５，１９９号を参照。
【０２４７】
（ｉｖ）プロモーター成分
発現ベクターおよびクローニングベクターは通常、宿主生物によって認識され操作可能に抗体ポリペプチド核酸に結合されるプロモーターを含む。プロモーター配列は真核生物については公知である。実質的には、すべての真核細胞遺伝子は、転写が開始される部位からおよそ２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多数の遺伝子の転写開始から７０〜８０塩基上流に見出される別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域（ここでＮは任意のヌクレオチド）である（配列番号：３）。大部分の真核細胞遺伝子の３’末端は、コード配列の３’末端へのポリＡテイルの追加のためのシグナルのＡＡＴＡＡＡ配列である（配列番号：４）。これらの配列はすべて、真核細胞発現ベクターの中へ適切に挿入される。
【０２４８】
哺乳類宿主細胞中のベクターからの抗体ポリペプチド転写は、もしかかるプロモーターが宿主細胞システムに適合すれば、例えばポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２のような）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスゲノムから、異種の哺乳類のプロモーター（例えばアクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター）から、熱ショックプロモーターから、得られたプロモーターによって制御される。
【０２４９】
ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点もまた含むＳＶ４０制限断片として都合よく得られる。ヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限断片として都合よく得られる。ベクターとしてウシパピローマウイルスを使用して、哺乳類宿主中でＤＮＡを発現するためのシステムは、米国特許第４，４１９，４４６号中で開示される。このシステムの修飾は米国特許４，６０１，９７８番中で記載されている。あるいは、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復はプロモーターとして使用できる。
【０２５０】
（ｖ）エンハンサーエレメント成分
本発明の抗体ポリペプチドをコードするＤＮＡのより高等な真核生物による転写は、ベクターの中へエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増加される。多数のエンハンサー配列が、哺乳類遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインスリン）から今や公知である。しかしながら典型的には、真核生物細胞ウイルスからのエンハンサーを使用するだろう。具体例は、複製起点（ｂｐ１００〜２７０）の後期側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマウイルスエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーを含む。真核生物プロモーターの活性化のためのエレメントの増強に関するＹａｎｉｖ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：１７−１８  （１９８２）もまた参照。エンハンサーは抗体ポリペプチドをコードする配列に対して５’または３’の位置でベクターの中につながれてもよいが、好ましくはプロモーターから５’部位に位置する。
【０２５１】
（ｖｉ）転写終結成分
真核生物宿主細胞中で使用される発現ベクターは、典型的には転写の終了のために、およびｍＲＮＡの安定化のために必要な配列もまた含むだろう。そのような配列は、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’および時々３’の非翻訳領域から一般に利用可能である。これらの領域は、抗体をコードするｍＲＮＡのうちの非翻訳部分中でポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含んでいる。１つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６およびその中に開示される発現ベクターを参照。
【０２５２】
（ｖｉｉ）宿主細胞の選択および形質転換
本明細書のベクターにおけるＤＮＡのクローニングまたは発現のために適切な宿主細胞は、脊椎動物宿主細胞を含む、本明細書において記述されるより高等な真核細胞を含んでいる。培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖はルーチンの手順となっている。有用な哺乳類宿主細胞株の具体例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、  ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚腎臓株（浮遊培養中の増殖のためにサブクローン化された２９３細胞または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．  ３６：５９  （１９７７））；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：４２１６  （１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．  ２３：２４３−２５１  （１９８０））；サル腎細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ３８３：４４−６８  （１９８２））；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞癌株（Ｈｅｐ  Ｇ２）。である。
【０２５３】
宿主細胞は、抗体産生のための上記の発現ベクターまたはクローニングベクターにより形質転換され、プロモーターの誘導形質転換体の選択、または望ましい配列をコードする遺伝子の増幅のために適切なように調節した通常の培養液中で培養される。
【０２５４】
（ｖｉｉｉ）宿主細胞の培養
本発明の抗体を産生するために使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養されてもよい。ハムＦ１０（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、シグマ社）、ＲＰＭＩ−１６４０（シグマ社）およびダルベッコ変法イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、シグマ）のような市販で入手可能な培地は、宿主細胞の培養のために適切である。さらに、Ｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚ．  ５８：４４  （１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５  （１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；第４，６５７，８６６号；第４，９２７，７６２号；第４，５６０，６５５号；もしくは第５，１２２，４６９号；  ＷＯ  ９０／０３４３０；  ＷＯ  ８７／００１９５；または米国特許Ｒｅ．３０，９８５中で記載される培地のいずれかは、培養培地として宿主細胞のために使用されてもよい。これらの培地のいずれかは、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の増殖因子（インスリン、トランスフェリンまたは表皮増殖因子のような）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩のような）、緩衝剤（ヘペスのような）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンのような）、抗生物質（ゲンタマイシン（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ）（商標）薬物のような）、微量エレメント（通常マイクロモル範囲の最終的な濃度で存在する無機化合物として定義される）およびグルコースまたは実効エネルギー源を追加されてもよい。他の必要なサプリメントもまた、当業者に公知の適切な濃度で含まれてもよい。温度、ｐＨおよび同種のもののような培養条件は、発現のために選択された宿主細胞により以前に使用されたものであり、当業者には明らかである。
【０２５５】
（ｉｘ）抗体の精製
組換え技術を使用する場合、抗体は細胞内で産生されるか、または直接培地の中に分泌されうる。第１の工程として、抗体が細胞内で産生されるならば、微粒子残屑（宿主細胞または溶解されたフラグメントのいずれか）は、例えば遠心分離または限外濾過によって除去される。抗体が培地の中に分泌される場合には、一般にそのような発現系から上清は、市販で入手可能なタンパク質濃縮フィルター（例えばアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）社またはミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）社ペリコン（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ）限外濾過ユニット）を使用して、最初に濃縮される。ＰＭＳＦのようなプロテアーゼ阻害剤はタンパク質分解を阻害する前述の工程のいずれかの中に含まれてもよく、抗生物質は外因性汚染菌の増殖を防止するために含まれてもよい。
【０２５６】
細胞から調製される抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、および親和性クロマトグラフィー（好ましい精製法は親和性クロマトグラフィーである）を使用して精製することができる。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡはヒトγ１、γ２またはγ４重鎖に基づいて、抗体を精製するために使用することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．  ６２：１−１３  （１９８３））。プロテインＧはすべてのマウスアイソタイプおよびヒトγ３に対して推奨される（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ５  ：  １５６７１５７５  （１９８６））。親和性リガンドが結合されるマトリックスは、多くの場合アガロースであるが、他のマトリックスは利用可能である。細孔性ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンのような機械的に安定したマトリックスは、アガロースで達成できるよりも速い流速およびより短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合には、ベイカーボンド（Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ）ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．ベイカー（Ｂａｋｅｒ）社（フィリップスバーグ、ニュージャージー））が、精製のために有用である。イオン交換カラム上の分画、エタノール沈澱、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のクロマトグラフィー、ヘパリンセファロース（ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ）（商標）上のクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂上のクロマトグラフィー（ポリアスパラギン酸カラムのような）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび硫安沈澱のようなタンパク質精製のための他の技術もまた、回収される抗体に依存して利用可能である。
【０２５７】
任意の予備的な精製工程に続いて、対象となる抗体および混入物を含む混合物は、約２．５〜４．５間のｐＨの溶出緩衝液を使用して、好ましくは低い塩濃度（例えば約０〜０．２５Ｍの塩から）で実行される低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけられてもよい。
【０２５８】
免疫コンジュゲート
本発明は、化学療法剤、薬物、増殖阻害剤、毒素（例えば細菌、真菌、植物、動物起源の酵素により活性のある毒素、またはそのフラグメント）または放射性同位体（すなわち放射性コンジュゲート）のような細胞傷害剤にコンジュゲートされた抗ＤＬＬ４の抗体を含む、免疫コンジュゲート（同じ意味で「抗体−薬物コンジュゲート」または「ＡＤＣ」と呼ばれる）を検討する。
【０２５９】
コンジュゲートしていない薬物剤の全身投与が除去されようとする腫瘍細胞だけでなく正常細胞に対する許容できないレベルの毒性をもたらす場合、細胞傷害剤または細胞静止剤（すなわち癌の治療において腫瘍細胞を殺すかまたは阻害する薬剤（Ｓｙｒｉｇｏｓ  ａｎｄ  Ｅｐｅｎｅｔｏｓ  （１９９９）  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９：６０５−６１４；  Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ−Ｄｕｖａｚ  ａｎｄ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  （１９９７）  Ａｄｖ．  Ｄｒｇ  Ｄｅｌ．  Ｒｅｖ．  ２６：１５１−１７２；  米国特許第４，９７５，２７８号）の局所送達のための抗体薬物コンジュゲートの使用は、腫瘍に対する薬物部分の標的化された送達およびその中での細胞内蓄積を可能にする（Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８６）  Ｌａｎｃｅｔ  ｐｐ．（Ｍａｒ．  １５，  １９８６）：６０３−０５；  Ｔｈｏｒｐｅ，  （１９８５）  “Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：  Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ，”  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ａ．  Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （編），  ページ４７５−５０６）。それによって最小の毒性で最高の有効性が求められる。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方は、これらの戦略において有用なものとして報告された。（Ｒｏｗｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８６）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，  ２１  ：１８３−  ８７）。これらの方法において使用される薬剤はダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサートおよびビンデシンを含む（Ｒｏｗｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８６）前出）。抗体毒素コンジュゲートにおいて使用される毒素は、ジフテリア毒素のような細菌毒素、リシンのような植物毒素、ゲルダナマイシンのような低分子毒素（Ｍａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ  （２０００）  Ｊｏｕｒ，  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ９２（１９）：  １５７３−  １５８１；  Ｍａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ  （２０００）  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １０：１０２５−１０２８；  Ｍａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ  （２００２）  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  １３：７８６−７９１）、メイタンシノイド（ＥＰ  １３９１２１３；  Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：８６１８−８６２３）、およびカリケアマイシン（Ｌｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ  （１９９８）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５８：２９２８；  Ｈｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ  （１９９３）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５３：３３３６−３３４２）を含む。毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合またはトポイソメラーゼ阻害を含むメカニズムによって、それらの細胞傷害性効果および細胞静止効果をもたらす。いくつかの細胞毒性薬は、高分子の抗体またはタンパク質受容体リガンドにコンジュゲートした場合に不活性またはそれほど活性がない傾向がある。
【０２６０】
ゼバリン（ＺＥＶＡＬＩＮ）（登録商標）（イブリツモマブ・チウクセタン、バイオジェン／アイデック（Ｂｉｏｇｅｎ／Ｉｄｅｃ）社）は、チオ尿素リンカーキレーターによって結合された正常なＢリンパ球および悪性Ｂリンパ球の表面上に見出されるＣＤ２０抗原に対して作製されたマウスＩｇＧ１カッパモノクローナル抗体ならびに放射性同位元素の１１１Ｉｎまたは９０Ｙからなる抗体−放射性同位元素コンジュゲートである（Ｗｉｓｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ  （２０００）  Ｅｕｒ．  Ｊｏｕｒ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  ２７（７）：７６６−７７；  Ｗｉｓｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ  （２００２）  Ｂｌｏｏｄ  ９９（１２）：４３３６−４２；  Ｗｉｔｚｉｇ  ｅｔ  ａｌ  （２００２）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ２０（１０）：２４５３−６３；  Ｗｉｔｚｉｇ  ｅｔ  ａｌ  （２００２）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ２０（１５）：３２６２−６９）。ゼバリンはＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）に対する活性を有するが、投与は大部分の患者において重篤かつ持続的血球減少をもたらす。マイロターグ（ＭＹＬＯＴＡＲＧ）（商標）（ゲムツズマブ・オゾガミシン、ワイス・ファーマシューティカルズ（Ｗｙｅｔｈ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）社）（カリケアマイシンに結合されたｈｕ  ＣＤ３３抗体からなる抗体薬物コンジュゲート）は、注入による急性骨髄白血病の治療のために２０００年に承認された（Ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ  （２０００）  ２５（７）：６８６；米国特許第４９７０１９８号；第５０７９２３３号；第５５８５０８９号；第５６０６０４０号；第５６９３７６２号；第５７３９１１６号；第５７６７２８５号；第５７７３００１号）。カンツズマブ・メルタンシン（ｃａｎｔｕｚｕｍａｂ  ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）（イミュノジェン（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）社）（ジスルフィドリンカーＳＰＰを介してメイタンシノイド薬物部分（ＤＭ１）に結合されたｈｕＣ２４２抗体からなる抗体薬物コンジュゲート）は、結腸癌、膵臓癌、胃癌および他のもののようなＣａｎＡｇを発現する癌の治療のための第ＩＩ相試験へ進んでいる。ＭＬＮ−２７０４（ミレニアム・ファルマ（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍ．）社、ＢＺＬバイオロジーズ（Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ）社、イミュノジェン社）（メイタンシノイド薬物部分（ＤＭ１）に結合された抗前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）モノクローナル抗体からなる抗体薬物コンジュゲート）は、前立腺腫瘍の可能な治療のために開発中である。オーリスタチンペプチド、オーリスタチンＥ（ＡＥ）およびモノメチルオーリスタチン（ＭＭＡＥ）（ドラスチンの合成アナログ）は、キメラモノクローナル抗体ｃＢＲ９６（癌表面のルイスＹに特異的）およびｃＡＣ１０（血液悪性腫瘍表面のＣＤ３０に特異的）にコンジュゲートされ（Ｄｏｒｏｎｉｎａ  ｅｔ  ａｌ  （２００３）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１（７）：７７８−７８４）、治療のために開発中である。
【０２６１】
免疫コンジュゲートの生成に有用な化学療法剤は本明細書において記述される（例えば上記）。使用することができる、酵素により活性のある毒素およびそのフラグメントは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、エキソトキシンＡ鎖（緑膿菌から）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンシン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、フィトラカ・アメリカナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、ゴーヤ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン  （ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）およびトリコテセンを含む。例えば１９９３年１０月２８日に公開されたＷＯ  ９３／２１２３２を参照。様々な放射性核種は、放射性コンジュゲート抗体の産生のために利用可能である。具体例は、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙおよび１８６Ｒｅを含む。抗体と細胞傷害剤のコンジュゲートは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオールプロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣｌのような）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルのような）、アルデヒド（グルタルアルデヒドのような）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンのような）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンのような）、ジイソシアナート（トルエン２，６−ジイソシアナートのような）およびビス活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンのような）のような様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作製される。例えばＶｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３８：  １０９８  （１９８７）に記載されるようにリシン免疫毒素を調製できる。炭素１４で標識された１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性ヌクレオチドの結合のための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照。
【０２６２】
抗体と、カリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスチン、オーロスタチン（ａｕｒｏｓｔａｔｉｎ）、トリコテセンおよびＣＣ  １０６５、ならびに毒素活性がある毒素の誘導体のような１つまたは複数の低分子毒素のコンジュゲートもまた本明細書において検討される。
【０２６３】
ｉ．メイタンシンおよびメイタンシノイド
いくつかの実施形態では、免疫コンジュゲートは、１つまたは複数のメイタンシノイド分子にコンジュゲートされる抗体（全長またはフラグメント）を含む。
【０２６４】
メイタンシノイドはチューブリン重合の阻害により作用する有糸分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初に東アフリカの低木メイテナス・セラタ（Ｍａｙｔｅｎｕｓ  ｓｅｒｒａｔａ）から単離された。（米国特許第３，８９６，１１１号）。続いて、特定の微生物がメイタンシノイド（メイタンシノールおよびＣ−３メイタンシノールエステルのような）を産生することもまた見い出された（米国特許第４，１５１，０４２号）。合成メイタンシノールならびにその誘導体およびアナログは、例えば米国特許第４，１３７，２３０号；第４，２４８，８７０号；第４，２５６，７４６号；第４，２６０，６０８号；第４，２６５，８１４号；第４，２９４，７５７号；第４，３０７，０１６号；第４，３０８，２６８号；第４，３０８，２６９号；第４，３０９，４２８号；第４，３１３，９４６号；第４，３１５，９２９号；第４，３１７，８２１号；第４，３２２，３４８号；第４，３３１，５９８号；第４，３６１，６５０号；第４，３６４，８６６号；第４，４２４，２１９号；第４，４５０，２５４号；第４，３６２，６６３号；および第４，３７１，５３３号中で開示される。
【０２６５】
以下の理由から、メイタンシノイド薬物部分は抗体薬物コンジュゲートの好ましい薬物部分である：（ｉ）発酵または化学的修飾（発酵産物の誘導体化）による調製が比較的容易、（ｉｉ）非ジスルフィドリンカーを介する抗体への結合のために適切な官能基での誘導体化に適用可能、（ｉｉｉ）血漿中で安定、および（ｉｖ）様々な腫瘍細胞株に対して有効である。
【０２６６】
メイタンシノイドを含む免疫コンジュゲートを同様に作製する方法およびそれらの治療上の使用は、例えば米国特許第５，２０８，０２０号、第５，４１６，０６４号およびヨーロッパ特許ＥＰ  ０  ４２５  ２３５  Ｂ１中で開示され、これらの開示は特に参照することにより本明細書に組み入れられる。Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：８６１８−８６２３  （１９９６）は、ヒト結腸直腸癌に対して作製されたモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合されたＤＭ１と呼ばれるメイタンシノイドを含む免疫コンジュゲートについて記述した。コンジュゲートは培養結腸癌細胞に対して細胞傷害性が高いことが見出され、インビボの腫瘍増殖分析において抗腫瘍活性を示した。Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：  １２７−１３１  （１９９２）は、ジスルフィドリンカーを介して、ヒト結腸癌細胞株表面の抗原に結合するマウス抗体Ａ７に、またはＨＥＲ−２／ｎｅｕ癌遺伝子を結合する別のマウスモノクローナル抗体ＴＡ．１に、メイタンシノイドがコンジュゲートされる免疫コンジュゲートについて記述する。ＴＡ．１−メイタンシノイドコンジュゲートの細胞傷害性は、１つの細胞あたり３×１０５のＨＥＲ−２表面抗原を発現するヒト乳癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３でインビトロで検査された。薬物コンジュゲートは、遊離メイタンシノイド薬物に類似する細胞傷害性度を達成し、１つの抗体分子あたりメイタンシノイド分子の数を増加させることにより、細胞傷害性度を増加できるかもしれない。Ａ７−メイタンシノイドコンジュゲートは、マウスにおいて全身的な低細胞傷害性を示した。
【０２６７】
抗体−メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体またはメイタンシノイド分子のいずれかの生物学的活性を有意に減少せずに、抗体をメイタンシノイド分子に化学的に結合することにより調製されている。例えば米国特許第５，２０８，０２０号を参照（その開示は参照することにより本明細書に特に組み入れられる）。毒素１分子／抗体でさえ、そのままの抗体の使用以上に細胞傷害性を促進すると予想されるが、１抗体分子あたりコンジュゲートされる平均３〜４のメイタンシノイド分子は、抗体の機能または溶解度に悪影響を与えずに、標的細胞の細胞傷害性の増強に有効性を示した。メイタンシノイドは当技術分野において周知であり、公知の技術により合成または天然源から単離することができる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第５，２０８，０２０号、ならびに上記で言及された他の特許および非特許公報中で開示される。好ましいメイタンシノイドは、様々なメイタンシノールエステルのようなメイタンシノール分子の芳香環でまたは他の位置で修飾されるメイタンシノールおよびメイタンシノールアナログである。
【０２６８】
例えば、米国特許第５，２０８，０２０号またはヨーロッパ特許０  ４２５  ２３５  Ｂ１、Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：  １２７−１３１  （１９９２）、および２００４年１０月８日に出願された米国特許出願第１０／９６０，６０２号中で開示されたものを含む、抗体−メイタンシノイドコンジュゲートの作製ための当技術分野において公知の多数の連結基があり、この開示は参照することにより特に本明細書に組み入れられる。２００４年１０月８日に出願された米国特許出願第１０／９６０，６０２号中で開示されるように、リンカー成分ＳＭＣＣを含む抗体−メイタンシノイドコンジュゲートが調製されてもよい。連結基はジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定基、光不安定基、ペプチダーゼ不安定基またはエステラーゼ不安定基を含み、上で記載された特許中で開示されたように、ジスルフィド基およびチオエーテル基が好ましい。追加の連結基は、本明細書において記述および例示される。
【０２６９】
抗体とメイタンシノイドのコンジュゲートは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣｌのような）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルのような）、アルデヒド（グルタルアルデヒドのような）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンのような）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンのような）、ジイソシアナート（トルエン２，６−ジイソシアナートのような）およびビス活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンのような）のような様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作製されてもよい。特に好ましいカップリング剤はＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（Ｃａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  １７３：７２３−７３７  （１９７８））、およびジスルフィド結合を提供するＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルチオ）ペンタノアート（ＳＰＰ）を含む。
【０２７０】
リンカーは、結合のタイプに依存して、様々な位置でメイタンシノイド分子に結合されてもよい。例えば、エステル結合は通常のカップリング技術を使用して、ヒドロキシル基との反応により形成されてもよい。反応は、ヒドロキシル基を有するＣ−３位、ヒドロキシメチルで修飾されるＣ−１４位、ヒドロキシル基で修飾されるＣ−１５位、およびヒドロキシル基を有するＣ−２０位で生じてもよい。好ましい実施形態において、結合は、メイタンシノールまたはメイタンシノールアナログのＣ−３位で形成される。
【０２７１】
ｉｉ．オーリスタチンおよびドラスチン
いくつかの実施形態において、免疫コンジュゲートは、ドラスチンまたはドロスチン（ｄｏｌｏｓｔａｔｉｎ）ペプチドのアナログおよび誘導体（オーリスタチン）にコンジュゲートされる抗体を含む（米国特許第５６３５４８３号；第５７８０５８８号）。ドラスチンおよびオーリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解、および核および細胞分裂（Ｗｏｙｋｅ  ｅｔ  ａｌ  （２００１）  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ４５（１２）：  ３５８０−３５８４）を妨害し、抗癌活性（ＵＳ  ５６６３１４９）および抗真菌活性（Ｐｅｔｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ  （１９９８）  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ４２：２９６１−２９６５）を有することが示された。ドラスチンまたはオーリスタチンの薬物部分は、ペプチドの薬物部分のＮ（アミノ）末端またはＣ（カルボキシル）末端を介して抗体に結合されてもよい（ＷＯ  ０２／０８８１７２）。
【０２７２】
例示的なオーリスタチン実施形態は、２００４年１１月５日に出願された「Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌｖａｌｉｎｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  Ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｌｉｇａｎｄｓ」、米国特許出願第１０／９８３，３４０号中で開示された、Ｎ末端結合モノメチルオーリスタチン薬物部分ＤＥおよびＤＦを含み、この開示は全体を参照するにより特に組み入れられる。
【０２７３】
典型的には、ペプチドベースの薬物部分は、２つまたは複数のアミノ酸および／またはペプチドフラグメントとの間のペプチド結合の形成により調製することができる。そのようなペプチド結合は、例えばペプチド化学の分野において周知の液相合成方法（Ｅ．  Ｓｃｈｒｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｋ．  Ｌｕｂｋｅ、「Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」（１巻）、ページ７６〜１３６、アカデミックプレス、１９６５年を参照）に従って調製することができる。オーリスタチン／ドラスチン薬物部分は以下の方法に従って調製されてもよい：ＵＳ  ５６３５４８３；ＵＳ  ５７８０５８８；  Ｐｅｔｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ  （１９８９）  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１１  ：５４６３−５４６５；  Ｐｅｔｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ  （１９９８）  Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  １３：２４３−２７７；  Ｐｅｔｔｉｔ，  Ｇ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  １９９６，  ７１９−７２５；  ａｎｄ  Ｐｅｔｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ  （１９９６）  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．  １  ５：８５９−８６３。Ｄｏｒｏｎｉｎａ  （２００３）  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２１（７）：７７８−７８４；「Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌｖａｌｉｎｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  Ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｌｉｇａｎｄｓ」、２００４年１１月５日に出願された米国特許出願第１０／９８３，３４０号もまた参照、その全体を参照することにより本明細書に組み入れられる（例えば、リンカー、およびリンカーにコンジュゲートするＭＭＡＥおよびＭＭＡＦのようなモノメチルバリン化合物を調製する方法を開示する）。
【０２７４】
ｉｉｉ．カリケアマイシン
他の実施形態において、免疫コンジュゲートは、１つまたは複数のカリケアマイシン分子にコンジュゲートされる抗体を含む。抗生物質のカリケアマイシンファミリーは、サブピコモル濃度で二本鎖ＤＮＡの切断を生ずることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲート調製品については、米国特許５，７１２，３７４、５，７１４，５８６、５，７３９，１１６、５，７６７，２８５、５，７７０，７０１、５，７７０，７１０、５，７７３，００１、５，８７７，２９６を参照（すべてアメリカン・サイアナミッド（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎａｍｉｄ）社）。使用されてもよいカリケアマイシンの構造的なアナログは、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧおよびθＩ１を含むが、これらに限定されない（Ｈｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：３３３６−３３４２  （１９９３），  Ｌｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：２９２５−２９２８  （１９９８）およびアメリカン・サイアナミッド社の前述の米国特許）。抗体をコンジュゲートできる別の抗腫瘍薬物は、抗葉酸剤のＱＦＡである。カリケアマイシンおよびＱＦＡの両方は細胞内作用部位を有しており、容易に細胞膜を通過しない。したがって、抗体を介した内部移行によるこれらの薬剤の細胞の取り込みは、それらの細胞傷害効果を非常に促進する。
【０２７５】
ｉｖ．他の細胞傷害剤
抗体にコンジュゲートすることができる他の抗腫瘍剤は、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｉｃｉｎ）、ビンクリスチンおよび５−フルオロウラシル、米国特許５，０５３，３９４、５，７７０，７１０中で記載されるまとめてＬＬ−Ｅ３３２８８複合体として公知の薬剤ファミリー、エスペラマイシン（米国特許５，８７７，２９６）も同様に含む。
【０２７６】
使用することができる、酵素により活性のある毒素およびそのフラグメントは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、エキソトキシンＡ鎖（緑膿菌から）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンシンタンパク質、フィトラカ・アメリカナタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、ゴーヤ阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンを含む。例えば１９９３年１０月２８日に公開されたＷＯ  ９３／２１２３２を参照。
【０２７７】
さらに本発明は、抗体と、核酸分解活性（例えばデオキシリボヌクレアーゼ；  ＤＮａｓｅのような、リボヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ）を備えた化合物との間で形成される免疫コンジュゲートを検討する。
【０２７８】
腫瘍の選択的破壊のために、抗体は高放射能原子を含んでもよい。様々な放射性同位体は、放射性コンジュゲートされた抗体の産生のために利用可能である。具体例は、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２およびＬｕの放射性同位体を含んでいる。コンジュゲートが検出のために使用される場合、それはシンチグラフ検査のための放射性原子（例えばｔｃ９９ｍまたはＩ１２３）、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像（磁気共鳴画像、ｍｒｉとしてもまた公知）のためのスピン標識（再びヨウ素１２３、ヨウ素１３１、インジウム１１１、フッ素１９、炭素１３、窒素１５、酸素１７、ガドリニウム、マンガンまたは鉄のような）を含んでもよい。
【０２７９】
放射性標識または他の標識は、公知の手段でコンジュゲートに取り込まれてもよい。例えば、ペプチドは生合成されてもよいし、または例えば水素の代わりにフッ素−１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用して、化学的アミノ酸合成により合成されてもよい。ｔｃ９９ｍまたはＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８およびＩｎ１１１のような標識は、ペプチドのシステイン残基を介して結合することができる。イットリウム９０はリジン残基を介して結合することができる。イオドゲン（ＩＯＤＯＧＥＮ）法（Ｆｒａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ  （１９７８）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ８０：  ４９−５７）は、ヨウ素１２３を組み入れるために使用することができる。「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ」（Ｃｈａｔａｌ、ＣＲＣ出版社１９８９）は、他の方法について詳細に記述する。
【０２８０】
抗体と細胞傷害剤のコンジュゲートは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオプロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣｌのような）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルのような）、アルデヒド（グルタルアルデヒドのような）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンのような）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンのような）、ジイソシアナート（トルエン２，６−ジイソシアナートのような）およびビス活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンのような）のような様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作製されてもよい。例えば、Ｖｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８  （１９８７）中で記載されるように、リシン免疫毒素は調製することができる。炭素１４で標識された１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体に放射性ヌクレオチドの結合のための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照。リンカーは、細胞中の細胞毒性薬の放出を促進する「切断可能なリンカー」であってもよい。例えば、酸不安定リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１  （１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号）を使用してもよい。
【０２８１】
化合物は、以下の架橋剤試薬により調製されたＡＤＣを特に検討するが、これらに限定されない：市販で入手可能である（例えば、ピアース・バイオテクノロジー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社、ロックフォード、イリノイ、米国から）、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルフォ−ＥＭＣＳ、スルフォ−ＧＭＢＳ、スルフォ−ＫＭＵＳ、スルフォ−ＭＢＳ、スルフォ−ＳＩＡＢ、スルフォ−ＳＭＣＣ、およびスルフォ−ＳＭＰＢ、ならびにＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾアート。２００３−２００４  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ａｎｄ  Ｃａｔａｌｏｇ、４６７−４９８ページを参照。
【０２８２】
ｖ．抗体薬物コンジュゲートの調製
抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）において、抗体（Ａｂ）は、リンカー（Ｌ）を介して１つまたは複数の薬物部分（Ｄ）（例えば１つの抗体あたり約１〜約２０の薬物部分）にコンジュゲートされる。式ＩのＡＤＣは、以下のものを含む当業者に公知の有機化学反応、条件および試薬を用いて、いくつかの経路により調製されてもよい：（１）共有結合を介してＡｂ−Ｌを形成するための二価リンカー試薬との抗体の求核基の反応、続いて薬物部分Ｄとの反応；および（２）共有結合を介してＤ−Ｌを形成するための二価リンカー試薬との薬物部分の求核基の反応、続いて抗体の求核基との反応。ＡＤＣを調製する追加の方法は本明細書において記述される。
【０２８３】
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ            Ｉ
リンカーは１つまたは複数のリンカー成分からなってもよい。例示的なリンカー成分は６−マレイミドカプロイル（「ＭＣ」）、マレイミドプロパノイル（「ＭＰ」）、バリン−シトルリン（「ｖａｌ−ｃｉｔ」）、アラニン−フェニルアラニン（「ａｌａ−ｐｈｅ」）、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（「ＰＡＢ」）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタノアート  （「ＳＰＰ」）、Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１カルボキシラート（「ＳＭＣＣ」）、およびＮ−スクシンイミジル（４−ヨード−アセチル）アミノベンゾアート（「ＳＩＡＢ」）を含んでいる。追加のリンカー成分は当技術分野において公知であり、いくつかは本明細書において記述される。２００４年１１月５日に出願された「Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌｖａｌｉｎｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  Ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｌｉｇａｎｄｓ」、米国特許出願第１０／９８３，３４０号もまた参照、それらの内容はその全体の参照により本明細書に組み入れられる。
【０２８４】
いくつかの実施形態において、リンカーはアミノ酸残基を含んでもよい。例示的なアミノ酸リンカー成分はジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドまたはペンタペプチドを含んでいる。例示的なジペプチドは、バリン−シトルリン（ｖｃまたはｖａｌ−ｃｉｔ）、アラニン−フェニルアラニン（ａｆまたはａｌａ−ｐｈｅ）を含む。例示的なトリペプチドは、グリシン−バリン−シトルリン（ｇｌｙ−  ｖａｌ−ｃｉｔ）およびグリシン−グリシン−グリシン（ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ）を含む。アミノ酸リンカー成分を含むアミノ酸残基は、シトルリンのようなマイナーなアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸類似体に加えて、天然に存在するアミノ酸を含む。アミノ酸リンカー成分は、特定の酵素（例えば腫瘍関連のプロテアーゼ、カテプシンＢ、ＣおよびＤ、またはプラスミンプロテアーゼ）による酵素的切断のためのそれらの選択性においてデザインおよび最適化することができる。
【０２８５】
抗体上の求核基は以下のものを含むが、これらに限定されない：（ｉ）  Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基（例えばリジン）、（ｉｉｉ）側鎖チオール基（例えばシステイン）、および（ｉｖ）抗体に糖鎖が付加する場合、糖ヒドロキシル基またはアミノ基。アミン基、チオール基およびヒドロキシル基は求核性であり、リンカー部分上の求電子基およびリンカー試薬と共有結合を形成するための反応が可能であり、以下のものを含む：（ｉ）ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメートおよび酸ハロゲン化物のような活性エステル；（ｉｉ）アルキル、およびハロアセトアミドのようなハロゲン化ベンジル；（ｉｉｉ）アルデヒド基、ケトン基、カルボキシル基およびマレイミド基。特定の抗体は還元可能な鎖間ジスルフィド（すなわちシステイン架橋）を有する。抗体は、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）のような還元剤の処理によって、リンカー試薬による結合に対して反応性となる。各システイン架橋はしたがって理論上、２つの反応性チオール求核分子を形成するだろう。追加の求核基は、２つのイミノチオランとリジンの反応を介して抗体へ導入することができ（Ｔｒａｕｔの試薬）、アミンのチオールへの変換を結果として生じる。反応性チオール基は、１、２、３、４またはそれ以上のシステイン残基の導入により、抗体（またはそのフラグメント）へ導入されてもよい（例えば１つまたは複数の非天然のシステインアミノ酸残基を含む変異抗体を調製する）。
【０２８６】
抗体薬物コンジュゲートも、求電子部分（リンカー試薬または薬物上の求核性置換基と反応することができる）を導入する抗体の修飾によって産生されてもよい。糖鎖が付加した抗体の糖は、リンカー試薬または薬物部分のアミン基と反応するアルデヒド基またはケトン基を形成するために、例えば過ヨウ素酸塩酸化剤により酸化されてもよい。結果として生じるイミンシッフ塩基は安定した結合を形成してもよいし、または安定したアミン結合を形成するために、例えばホウ化水素試薬によって還元されてもよい。１つの実施形態において、ガラクトース酸化酵素またはメタ過ヨウ素酸ナトリウムのいずれかとの糖鎖付加抗体の炭水化物部分の反応は、薬物上の適切な基と反応できるタンパク質のカルボニル（アルデヒドおよびケトン）基をもたらしてもよい（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）。別の実施形態において、Ｎ末端のセリン残基またはスレオニン残基を含むタンパク質は、メタ過ヨウ素酸ナトリウム（第１のアミノ酸の代わりにアルデヒドの産生を結果として生じる）と反応することができる（Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ  ＆  Ｓｔｒｏｈ，  （１９９２）  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ３：１３８−１４６；  ＵＳ  ５３６２８５２）。薬物部分またはリンカー求核分子とそのようなアルデヒドを反応させることができる。
【０２８７】
同様に、薬物部分上の求核基は以下のものを含むが、これらに限定されない：アミン基、チオール基、ヒドロキシル基、ヒドラジド基、オキシム基、ヒドラジン基、チオセミカルバゾン基、ヒドラジンカルボキシラート基およびアリールヒドラジド基であり、これらはリンカー部分上の求電子基およびリンカー試薬と共有結合を形成するための反応が可能であり、以下のもの含む：（ｉ）ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメートおよび酸ハロゲン化物のような活性エステル；（ｉｉ）アルキル、およびハロアセトアミドのようなハロゲン化ベンジル；（ｉｉｉ）アルデヒド基、ケトン基、カルボキシル基およびマレイミド基。
【０２８８】
あるいは、抗体および細胞傷害剤を含む融合タンパク質は、例えば組換え技術またはペプチド合成によって作製されてもよい。ＤＮＡの長さは、互いに隣接する、またはコンジュゲートの望ましい特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域によって分離された、コンジュゲートの２つの部分をコードするそれぞれの領域を含んでもよい。
【０２８９】
さらに別の実施形態において、抗体は、腫瘍前標的化の利用のために「受容体」にコンジュゲート（ストレプトアビジンのような）されてもよく、抗体受容体コンジュゲートは患者に投与され、クリアリング剤を使用する循環からの未結合コンジュゲートの除去および次に細胞傷害剤（例えば放射性ヌクレオチド）にコンジュゲートされた「リガンド」（例えばアビジン）の投与が続く。
【０２９０】
ＤＬＬ４ポリペプチドに対する共有結合修飾
ポリペプチドのアンタゴニストまたはアゴニスト（例えばポリペプチドアンタゴニストフラグメント、ＤＬＬ４融合分子（例えばＤＬＬ４イムノアドヘジン）、抗ＤＬＬ４抗体）の共有結合修飾は、本発明の範囲内に含まれている。適用可能なならば、それらは、化学合成、またはポリペプチドの酵素切断もしくは化学切断によって作製されてもよい。ポリペプチドの他のタイプの共有結合修飾は、選択された側鎖またはＮもしくはＣ末端残基と反応できる有機誘導体化剤とポリペプチドの標的化されたアミノ酸残基を反応させることによって、または増大するポリペプチド鎖へ修飾されたアミノ酸または天然に存在しないアミノ酸を組み入れること例えば、Ｅｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍ．  ２０２：３０１−３３６  （１９９１）；  Ｎｏｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：  １８２  （１９８９）；ならびに米国特許出願公報２００３０１０８８８５および２００３００８２５７５によって、分子へ導入される。
【０２９１】
システイニル残基は、最も一般的には、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチルの誘導体を生ずるために、クロロ酢酸またはクロロアセトアミドのようなα−ハロアセタート（および対応するアミン）と反応させる。システイニル残基は、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、リン酸クロロアセチル、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロマーキュリーベンゾアート、２−クロロマーキュリー−４−ニトロフェノールまたはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によってもまた誘導体化される。
【０２９２】
この薬剤がヒスチジル側鎖について比較的特異的であるので、ヒスチジル残基はｐＨ  ５．５〜７．０でジエチルピロ炭酸塩との反応によって誘導体化される。ｐ‐臭化ブロモフェナシル  もまた有用であり；反応は典型的にはｐＨ  ６．０で０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム中で実行される。
【０２９３】
リシニル残基およびアミノ末端残基はコハク酸または他のカルボン酸無水物と反応させられる。これらの薬剤による誘導体化は、リシニル残基の荷電を逆転する効果を有する。α−アミノ含有残基の誘導体化のために適切な他の試薬は、ピコリンイミド酸メチル、ピリドキサールリン酸、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオンのようなイミドエステル、およびグリオキシラートとのトランスアミナーゼによる触媒反応を含む。
【０２９４】
アルギニル残基は、１つまたは複数の従来の試薬、とりわけフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンとの反応によって修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基のｐＫａが高いために、アルカリ性条件下での反応の実行を必要とする。更に、これらの試薬は、アルギニンε−アミノ基だけでなくリジン基と反応してもよい。
【０２９５】
チロシル残基の特異的な修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によってチロシル残基へスペクトル標識を導入することに特に利益があれば行われてもよい。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾール（ｉｍｉｄｉｚｏｌｅ）およびテトラニトロメタンを、それぞれＯ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体を形成するために使用する。チロシル残基は、放射免疫分析における使用のための標識タンパク質を調製するために１２５Ｉまたは１３１Ｉを使用してヨウ化される。
【０２９６】
カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）（式中ＲおよびＲ’は１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドのような異なるアルキル基である）との反応によって選択的に修飾される。更に、アスパルチル残基およびグルタミル残基はアンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル残基およびグルタミニル残基に変換される。
【０２９７】
グルタミニルおよびアスパラギニルの残基は、しばしば対応するグルタミルおよびアスパルチル残基へそれぞれ脱アミド化される。これらの残基は中性または塩基性条件下で脱アミド化される。これらの残基の脱アミド化形態は、本発明の範囲以内にある。
【０２９８】
他の修飾は、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリル残基またはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジンの側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．  Ｅ．  Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  ｐｐ．  ７９−８６  （１９８３））、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびに任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【０２９９】
別のタイプの共有結合修飾は本発明のポリペプチドへ化学的にまたは酵素により配糖体を結合することを含む。これらの手順は、それらがＮまたはＯ結合型糖鎖付加のための糖鎖付加能力を有する宿主細胞のポリペプチドの産生を必要としないという点で有利である。使用される結合する様式に依存して、糖は（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインの遊離スルフヒドリル基のような遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、スレオニンまたはヒドロキシプロリンの遊離ヒドロキシル基のような遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンの芳香族残基のような芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基、へ結合されてもよい。これらの方法は、１９８７年９月１１日に公表されたＷＯ  ８７／０５３３０およびＡｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｒｉｓｔｏｎ，  ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ｐｐ．  ２５９−３０６  （１９８１）中で記載されている。
【０３００】
本発明のポリペプチド上に存在する任意の炭水化物部分の除去は、化学的にまたは酵素により遂行されてもよい。化学的脱グリコシル化は、化合物トリフルオロメタンスルホン酸、または同等の化合物に対するポリペプチドの暴露を必要とする。この処理は、ポリペプチドは完全な形のままであるが、結合糖（Ｎ‐アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）以外の大部分またはすべての糖の切断をもたらす。化学的脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ２５９：５２  （１９８７）  ａｎｄ  ｂｙ  Ｅｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １１８：１３１  （１９８１）によって記述される。炭水化物部分の（例えば抗体上の）酵素的な切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １３８：３５０  （１９８７）によって記述されるような様々なエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用によって達成することができる。
【０３０１】
本発明のポリペプチドの別のタイプの共有結合修飾は、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号または第４，１７９，３３７号中で示される様式で、ポリペプチドを様々な非タンパク性重合体（例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン）のうちの１つへの結合を含む。
【０３０２】
医薬製剤
抗体を含む治療製剤は、水溶液、凍結乾燥製剤または他の乾燥製剤の形態で、望ましい程度の純度を有する抗体を、任意の生理学的に許容される担体、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ第２０版、２０００年）と混合することによって、保存のために調製される。許容される担体、賦形剤または安定剤は用いられる投与量および濃度でレシピエントに対して無毒であり、リン酸塩およびクエン酸塩およびヒスチジンおよび他の有機酸のような緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノールアルコール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；メチルパラベンまたはプロピルパラベンのようなアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールのような）；低分子量（約１０残基以下の）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジンのようなアミノ酸；単糖、二糖類、およびグルコース、マンノースまたはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールのような糖；ナトリウムのような塩を形成する対イオン；金属複合体（例えばＺｎタンパク質複合体）；および／またはツイーン（商標）、プルロニクス（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン性界面活性剤。を含む。
【０３０３】
治療されている特定の徴候のために必要なように、本明細書における製剤は、好ましくは互いに影響しない相補的な活性を備えた１つ以上の活性化合物もまた含んでよい。そのような分子は、意図した目的のために有効な量の組合せで適切に存在する。
【０３０４】
活性成分は、例えばコアセルベーション技術によって、または界面重合法によって調製されたマイクロカプセル（例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース、またはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル）中に、コロイド状薬物送達システム（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル剤）、またはマクロエマルジョンで、トラップされてもまたよい。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ第２０版、２０００年中で開示される。
【０３０５】
インビボの投与のために使用される製剤は滅菌されてなくてはならない。これは、滅菌された濾過膜による濾過によって容易に遂行される。
【０３０６】
徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性製剤の適切な具体例は、免疫グロブリンを含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含んでおり、このマトリックスは、造形品（例えばフィルムまたはマイクロカプセル）の形態である。徐放性マトリックスの具体例は、ポリエステル、ハイドロゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタメートの共重合体、非分解性のエチレン酢酸ビニール、リュプロンデポー（ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ）（商標）（乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフェア）のような分解性の乳酸−グリコール酸共重合体、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。エチレン酢酸ビニールおよび乳酸−グリコール酸のような重合体は１００日以上にわたって分子の放出を可能にするが、特定のハイドロゲルはより短い期間にわたりタンパク質を放出する。封入された免疫グロブリンが生体中で長い間残存する場合、それらは３７℃での水分への暴露の結果として変性または凝集し、生物学的活性の欠損および免疫原性の可能な変化を結果として生じる。関係するメカニズムに依存して、安定化のために合理的な戦略を考案できる。例えば、凝集メカニズムがチオ−ジスルフィド交換を介する分子間Ｓ‐Ｓ結合形成であると分かったならば、安定化は、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含量の制御、適切な添加剤の使用、および特異的なポリマーマトリックス組成物の開発によって達成されてもよい。
【０３０７】
本発明において有用な薬剤は遺伝子療法によって被験体に導入できることをさらに検討した。遺伝子療法は、被験体への核酸の投与によって実行される治療法を指す。遺伝子療法適用において、遺伝子は、例えば欠陥遺伝子の置換のために、治療上有効な遺伝子産物のインビボの合成を達成するために細胞へ導入される。「遺伝子療法」は、永続効果が単一の処理によって達成される従来の遺伝子療法、および治療上有効なＤＮＡまたはｍＲＮＡの１回または連続投与を伴う遺伝子治療剤の投与、の両方を含む。アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡは、インビボで特定の遺伝子の発現を遮断するための治療剤として使用することができる。例えば実施例中で記載されるＤＬＬ４−ＳｉＲＮＡを参照。細胞膜による取り込みの限定によって低細胞内濃度がもたらされるにもかかわらず、短いアンチセンスオリゴヌクレオチドは、それらが阻害剤として作用する細胞へ取り込めることは既に示されている（Ｚａｍｅｃｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３：４１４３−４１４６  （１９８６））。オリゴヌクレオチドは、例えばそれらの負に荷電したホスホジエステル基を非荷電基で置換することによって、それらの取り込みを促進するように修飾できる。遺伝子療法の方法の一般的な総説については、例えばＧｏｌｄｓｐｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５  （１９９３）；  Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５  （１９９１）；  Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  ３２：５７３−５９６  （１９９３）；  Ｍｕｌｌｉｇａｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２  （１９９３）；  Ｍｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６２：１９１−２１７  （１９９３）；  および  Ｍａｙ  ＴＩＢＴＥＣＨ  １１  ：１５５−２１５  （１９９３）を参照。当技術分野において一般に公知の使用できる組換えＤＮＡ技術の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．  （１９９３）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ  （１９９０）  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ストックトン・プレス（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク中に記載されている。
【０３０８】
投与量および投与
分子は、ボーラス投与としてまたは長期間にわたる連続的な点滴による静脈内投与のような公知の方法に沿って、腹腔内経路、筋肉内経路、脳脊髄内経路、皮下経路、関節内経路、滑液内経路、鞘内経路、経口経路、局所経路、吸入経路、および／または皮下投与によって、ヒト患者に対して投与される。
【０３０９】
特定の実施形態において、本発明の治療は、ＤＬＬ４アンタゴニストと１つまたは複数の抗癌薬剤（例えば抗血管形成剤）の組合わせ投与を含む。１つの実施形態において、追加の抗癌薬剤（例えば１つまたは複数の異なる抗血管形成剤および１つまたは複数の化学療法剤など）は存在する。本発明は、さらに複数の阻害剤（例えば同一の抗原に対する複数の抗体または異なる癌で活性のある分子に対する複数の抗体）の投与を検討する。１つの実施形態において、異なる化学療法剤のカクテルは、ＤＬＬ４アンタゴニストおよび／または１つまたは複数の抗血管形成剤と共に投与される。組合わせ投与は、個別の製剤または単一の医薬製剤を使用する、共投与、および／またはいずれか順番における連続投与を含む。例えば、ＤＬＬ４アンタゴニストは、先行するか、後続するか、抗癌剤の投与と交互であるか、またはそれと同時に与えられてもよい。１つの実施形態において、両方の（またはすべての）活性薬剤が同時にそれらの生物学的活性を発揮する期間が存在する。
【０３１０】
疾患の予防または治療のために、ＤＬＬ４アンタゴニストの適切な投与量は、治療される疾患のタイプ（上で定義されたように）、疾患の重症度および過程、阻害剤が予防または治療目的のために投与されるか、以前の治療法、患者の病歴および阻害剤に対する反応、ならびに主治医の裁量、に依存するだろう。阻害剤は、患者に対して一度にまたは一連の治療にわたって適切に投与される。組合せ療法レジメンにおいて、本発明の組成物は治療的有効量または治療上相乗的な量で投与される。本明細書において使用されるように、治療的有効量は、本発明の組成物の投与、および／またはＤＬＬ４アンタゴニストと１つまたは複数の他の治療剤の共投与が、標的とする疾患または症状の減少または阻害をもたらすようなものである。薬剤の組合せ投与の効果は相加的でありえる。１つの実施形態において、投与の結果は相乗的効果である。治療上相乗的な量は、特定の疾患に関連する状態または病徴を相乗的にまたは有意に減少または除去するのに必要な、ＤＬＬ４アンタゴニストおよび１つまたは複数の他の治療剤（例えば血管形成阻害剤）の量である。
【０３１１】
疾患のタイプおよび重症度に依存して、例えば１つまたは複数の個別投与によっても、または連続的な点滴によってでも、約１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）のＤＬＬ４アンタゴニストまたは血管形成阻害剤は、患者に対する投与のための最初の候補投与量である。典型的な毎日投与量は、上で言及された因子に依存して、約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上にわたる。数日またはそれ以上にわたる連続投与については、状態に依存して、病徴の望ましい抑制が生じるまで治療を継続する。しかしながら、他の投与量レジメンが有用かもしれない。典型的には、臨床医は投与量が必要な生物学的作用を提供するまで分子を投与するだろう。本発明の治療法の進行は、従来の技術および分析で容易にモニタリングされる。
【０３１２】
例えば、血管形成阻害剤（例えばアバスチン（登録商標）（ジェネンテック社）のような抗ＶＥＧＦの抗体）のための調製および投薬のスケジュールは、製造者の指示に従って使用されてもよいか、または当業者により経験的に決定されてもよい。別の具体例において、そのような化学療法剤のための調製および投薬のスケジュールは、製造者の指示に従って使用されてもよい、または当業者により経験的に決定されてもよい。化学療法のための調製および投薬のスケジュールは、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｍ．Ｃ．  Ｐｅｒｒｙ編、ウィリアムズ・アンド・ウィルキンズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ）、ボルティモア、メリーランド（１９９２）中にも記載される。
【０３１３】
治療の有効性
本発明の治療の有効性は、新生物または非新生物の障害の評価において一般に使用される様々な評価項目により測定することができる。例えば癌治療は、例えば腫瘍退縮、腫瘍の重量またはサイズの縮小、進行に対する時間、生存の期間、無増悪生存率、全奏功率、反応の期間、および生活の質によって評価できるが、これらに限定されない。本明細書において記述される抗血管形成剤が腫瘍血管を標的とし、必ずしも新生細胞自体を標的とするのではないので、それらは特有のクラスの抗癌剤を表わし、したがって薬剤に対する臨床反応の特有の測定および定義を必要とする。例えば、５０％以上の腫瘍縮小は、２次元解析における反応を示すための標準カットオフである。しかしながら、阻害剤は、原発腫瘍の縮小を伴わないで、転移拡散の阻害をもたらしてもよいし、または単に腫瘍静止効果を発揮してもよい。したがって、治療法の有効性の決定に対するアプローチ（例えば血管形成の血漿または尿マーカーの測定、および放射性画像診断による反応の測定を含む）を用いることができる。
【０３１４】
以下の具体例は例示的な目的のみのために提供され、本発明の範囲を任意の手段で限定するようには意図されない。
【０３１５】
本明細書中に引用されたすべての特許および文献参照の開示は、それら全体を参照することによって本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０３１６】
実施例において言及される市販で入手可能な試薬は、特別の指示の無い限り、製造者の指示に従って使用された。以下の実施例においておよび明細書の全体にわたってＡＴＣＣアクセッション番号によって同定される細胞のソースは、米国培養菌保存施設、マナッサス、バージニア２０１０８である。実施例において引用された参照は、実施例の後にリストされる。本明細書において引用された参照はすべて、参照することによって本明細書に組み入れられる。
【０３１７】
実施例１：材料および方法
以下の材料および方法が実施例において使用された。
【０３１８】
ＨＵＶＥＣフィブリンゲルビーズ分析。ＨＵＶＥＣフィブリンゲルビーズ分析の詳細が記述されている（Ｎａｋａｔｓｕ，  Ｍ．  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ６６，  １０２−１２  （２００３））。簡潔には、サイトデックス（Ｃｙｔｏｄｅｘ）３ビーズ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）社）は、１ビーズあたり３５０〜４００ＨＵＶＥＣでコートされた。ＨＵＶＥＣをコートされたビーズ約２００個を、１２ウェル組織培養プレートの１ウェルの中のフィブリンクロット中に埋め込んだ。８×１０４ＳＦ細胞をクロットの上にプレートした。免疫染色および画像診断のために、分析を７日目〜９日目の間で終了した。いくつかの実験において、ＨＵＶＥＣの出芽を、ビオチン−抗−ＣＤ３１（クローンＷＭ５９、イーバイオサイエンス（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）社）およびストレプアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）−Ｃｙ３による染色によって可視化された。ＨＵＶＥＣ核染色のために、フィブリンゲルを２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で一晩固定し、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、シグマ社）で染色した。Ｋｉ６７染色については、最上層ＳＦを除去するためにフィブリンゲルを５分間１０×トリプシン−ＥＤＴＡで処理し、ＰＢＳ中１０％ＦＢＳで中和し、４％ＰＦＡ中で一晩固定した。次にフィブリンゲルをＰＢＳＴ中１０％ヤギ血清で４時間ブロッキングし、ウサギ抗マウスＫｉ６７（即時使用可能、クローンＳｐ６、ラブ・ビジョン（Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ）社）で一晩インキュベートし、続いて抗ウサギＩｇＧ−Ｃｙ３（ジャクソン・イムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）社）により二次検出した。一晩のインキュベーションはすべて４℃で行われた。
【０３１９】
マウス新生仔網膜研究。同腹子からの新生仔ＣＤ１マウスは、Ｐ１およびＰ３にＰＢＳまたはＹＷ２６．８２（１０ｍｇ／ｋｇ）により腹腔内注射された。眼をＰ５に回収し、ＰＢＳ中４％ＰＦＡで一晩固定した。解剖した網膜を、ＰＢＳＴ中１０％ヤギ血清で３時間ブロッキングし、次に一次抗体で一晩でインキュベートした。一次カクテルは、ビオチン化イソレクチンＢ４（２５μｇ／ｍｌ、バンデイラエア・  シンプリシフォリア（Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ）；シグマ社）および以下の１つを含んだ：ＰＢＬＥＣ中１０％血清と共に（ＰＢＳ  ｐＨ６．８中で、１％トリトンＸ−１００、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＭｎＣｌ２）、ウサギ抗マウスＫｉ６７（１：１、即時使用可能、クローンＳｐ６、ラブ・ビジョン社）、またはマウスのＣｙ３コンジュゲート抗α−ＳＭＡ（１：２０００、シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）社）。次に網膜をＰＢＳＴ中で洗浄し、アレクサ（Ａｌｅｘａ）４８８ストレプトアビジン（１：２００；モレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）社）およびＣｙ３−抗ウサギＩｇＧ（１：２００；ジャクソン・イムノリサーチ社）の二次抗体の組合せと共に一晩インキュベートした。染色が完了した後、網膜をＰＢＳ中４％ＰＦＡにより後固定した。一晩のインキュベーションはすべて４℃で行った。平らにマウントされた網膜の画像を共焦点蛍光顕微鏡によって捕捉した。
【０３２０】
腫瘍モデル。メスのベージュヌードマウス（８〜１０週齢）を使用した。皮下腫瘍を得るために、マウスに、５０％マトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）（ＢＤバイオサイエンス）を含む０．１ｍｌの細胞懸濁物を右後部横腹の中へ注射した。５×１０６ヒト結腸癌ＨＭ７細胞、１０×１０６ヒト結腸癌Ｃｏｌｏ２０５細胞、１０×１０６ヒト肺癌Ｃａｌｕ６細胞、１０×１０６ヒト肺癌ＭＶ−５２２細胞、１０×１０６マウス白血病ＷＥＨＩ−３細胞、１０×１０６マウスリンパ腫ＥＬ４細胞、１０×１０６ヒト卵巣癌ＳＫ−ＯＶ−３  Ｘ１細胞、１０×１０６マウス肺癌ＬＬ２細胞、１０×１０６白血病／リンパ腫ＥＬ４細胞または１０×１０６非小細胞肺癌Ｈ１２９９細胞を、各マウスの中へ注射した。ヒト黒色腫ＭＤＡ−ＭＢ−４３５モデルのために、５０％マトリゲルを含む０．１ｍｌの細胞（５×１０６）懸濁物をマウス乳腺脂肪体の中へ注射した。抗ＤＬＬ４の抗体ＹＷ２６．８２を腹腔内経由で投与した（１０ｍｇ／ｋｇ体重、毎週２回）。以下の腫瘍モデルについては、各試験マウスの右横腹に皮下腫瘍フラグメント（１ｍｍ）を移植した：非小細胞肺癌ＳＫＭＥＳ−１、ヒト乳癌ＭＸ−１、ヒト結腸直腸癌ＳＷ６２０およびヒト腺癌ＬＳ１７４Ｔ。腫瘍増殖を測径器測定によって定量した。腫瘍容積（ｍｍ３）は、長さ（ｌ）および幅（ｗ）の測定および体積（Ｖ＝ｌｗ２／２）の計算によって決定された。１０〜１５匹の動物が各群に含まれていた。治療群の統計比較は両側スチューデントのｔ検定を使用して実行された。
【０３２１】
腫瘍血管の標識および免疫組織化学。マウスをイソフルランにより麻酔をかけた。ＦＩＴＣに標識されたトマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  Ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）レクチン（１５０μｌの０．９％ＮａＣｌ中１５０μｇ；ベクター・ラボラトリーズ）は、静脈注射され、全身的な灌流の前に５分間循環させた。血管をＰＢＳ中１％ＰＦＡで経心臓的に３分間潅流した。腫瘍を除去し、同一の固定液中の浸漬によって２時間後固定し、続いて凍結保護のために３０％ショ糖中で一晩のインキュベーションし、次にＯＣＴ中に包埋した。切片（厚さ４μｍ）を抗マウスのＣＤ３１（１：５０、ＢＤファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）社）、続いてアレクサ５９４ヤギ抗ラットＩｇＧ（１：８００、モレキュラー・プローブ社）で染色した。
【０３２２】
マウス腸の組織学および免疫組織化学。ホルマリン固定しパラフィン包埋したマウス小腸組織を、３μｍ厚さで切片にした。腸細胞タイプの組織化学的識別を、製造者（ポリサイエンティフィック（ＰｏｌｙＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社）によって推奨されるようにアルシアンブルーにより実行した。抗Ｋｉ６７の染色のために、切片をターゲットレトリーバルソルーション（Ｔａｒｇｅｔ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｓ  １７００、ダコ（ＤＡＫＯ）社）により前処理し、ウサギ抗Ｋｉ６７（１：２００、クローンＳＰ６、ネオマーカーズ（Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ）社）とインキュベートした。７．５ｇ／ｍｌ（ベクター・ラブ（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｓ）社）の二次ヤギ抗ウサギを、ベクタステイン（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ）のＡＢＣのエリート・キット（ベクター・ラブ）により検出した。Ｋｉ６７染色した切片のすべてを、マイヤーのヘマトキシリンで対比染色した。ＨＥＳ−１染色のために、抗ラットのＨＥＳ−１（クローンＮＭ１、ＭＢＬ、インターナショナル（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）社）、続いてＴＳＡ−ＨＲＰを使用さした。
【０３２３】
ＲＮＡ干渉。ヒトＤＬＬ４を標的とするＳＭＡＲＴｐｏｏｌ小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二重鎖、およびＳｉコントロール非標的ｓｉＲＮＡ＃２を、ダーマコン（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）社から購入した。ｓｉＲＮＲ二重鎖（５０ｎＭ）のトランスフェクションを、オプティｍｅｍ（Ｏｐｔｉｍｅｍ）−１およびリポフェクタミン（Ｌｉｐｆｅｃｔａｍｉｎｅ）  ２０００（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社）を使用して、４０％の密集度のＨＵＶＥＣで行った。ＦＡＣＳ分析を、ｓｉＲＮＡトランスフェクション４８時間後に行った。４つの抗ＤＬＬ４のＳＭＡＲＴプールｓｉＲＮＡの配列は以下のとおりだった：
ＣＡＡＣＴＧＣＣＣＴＴＡＴＧＧＣＴＴＴＴＴ（配列番号：５）（オリゴ１、センス）、
ＡＡＡＧＣＣＡＴＡＡＧＧＧＣＡＧＴＴＧＴＴ（配列番号：６）（オリゴ１、アンチセンス）、
ＣＡＡＣＴＧＣＣＣＴＴＣＡＡＴＴＴＣＡＴＴ（配列番号：７）（オリゴ２、センス）、
ＴＧＡＡＡＴＴＧＡＡＧＧＧＣＡＧＴＴＧＴＴ（配列番号：８）（オリゴ２、アンチセンス）、
ＴＧＡＣＣＡＡＧＡＴＣＴＣＡＡＣＴＡＣＴＴ（配列番号：９）（オリゴ３、センス）、
ＧＴＡＧＴＴＧＡＧＡＴＣＴＴＧＧＴＣＡＴＴ（配列番号：１０）（オリゴ３、アンチセンス）、
ＧＧＣＣＡＡＣＴＡＴＧＣＴＴＧＴＧＡＡＴＴ（配列番号：１１）（オリゴ４、センス）、
ＴＴＣＡＣＡＡＧＣＡＴＡＧＴＴＧＧＣＣＴＴ（配列番号：１２）（オリゴ４、アンチセンス）。
【０３２４】
ノッチリガンド：ノッチブロッキングＥＬＩＳＡ。９６ウェルマイクロタイタープレートを、０．５μｇ／ｍｌの組換えラットノッチ１−Ｆｃ（ｒｒノッチｌ−Ｆｃ、Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｓｙｓｔｅｍｓ）社）でコートした。ＤＬＬ４−ＡＰ（ヒト胎盤アルカリフォスファターゼに融合したＤＬＬ４のアミノ酸１〜４０４）を含む馴化培地を、分析において使用した。馴化培地を調製するために、２９３細胞を、フューゲン（Ｆｕｇｅｎ）β試薬（ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）社）によりＤＬＬ４−ＡＰを発現するプラスミドで一過性にトランスフェクションした。トランスフェクションの５日後、馴化培地を採取し、濾過し、４℃で保存した。０．１５〜２５μｇ／ｍｌに量を変更した精製抗体を、最大限に達成可能なコートされたｒｒノッチ１−Ｆｃへの結合の５０％を付与する希釈で、ＤＬＬ４−ＡＰ馴化培地と共に室温で１時間プレインキュベーションした。次に抗体／ＤＬＬ４−ＡＰ混合物を、室温で１時間ｒｒノッチ１−Ｆｃコートプレートに加え、その後プレートをＰＢＳ中で数回洗浄した。結合されたＤＬＬ４−ＡＰを、基質としてワンステップＰＮＰＰ（ピアース社）およびＯＤ４０５ｎｍ吸光度測定を使用して検出した。同一の分析をＤＬＬ１−ＡＰ（ヒトＤＬＬ１、アミノ酸１〜４４５）で実行した。類似した分析を、精製されたＤＬＬ４−Ｈｉｓ（Ｃ末端Ｈｉｓ−タグ付加ヒトＤＬＬ４、アミノ酸１〜４０４）およびＪａｇ  １−Ｈｉｓ（Ｒ＆  Ｄシステム社）で実行した。結合されたＨｉｓ−タグ付加リガンドを、マウス抗Ｈｉｓモノクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ、ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ社）、ビオチン化ヤギ抗マウス（ジャクソン・イムノリサーチ社）およびストレプトアビジンＡＰ（ジャクソン・イムノリサーチ社）により検出した。
【０３２５】
ＲＮＡ抽出およびリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ。二次元培養におけるＨＵＶＥＣからの全ＲＮＡ抽出を、製造者の指示の通りにＲＮイージー（ＲＮｅａｓｙ）ミニキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）社）を使用して行った。フィブリンゲル中で増殖するＨＵＶＥＣから全ＲＮＡを抽出するために、フィブリンゲルを、最上層線維芽細胞の除去のため１０×トリプシン−ＥＤＴＡ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）社）で５分間処理し、続いてＰＢＳ中１０％のＦＢＳにより中和した。次にゲルクロットを組織培養ウェルから取り出し、余分な体液を除去するためにマイクロチューブ中で遠心分離（５分間１０Ｋ）にかけた。結果として生じるゲル「沈殿」は溶解緩衝剤（ＲＮイージーミニキット）で溶解し、二次元培養中のＨＵＶＥＣでのようにさらに処理された。ＲＮＡの質は、ＲＮＡ  ６０００ナノチップスおよびアジレント２１００バイオアナライザー（アジレント・テクノロジー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社）を使用して評価された。リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ反応は、７５００リアルタイムＰＣＲシステム（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社）を使用して、３回繰り返して行った。ヒトＧＡＰＤＨを参照遺伝子として正規化のために使用した。発現レベルは、３つの別個の定量から、対照と比較して平均（±ＳＥＭ）倍ｍＲＮＡの変化として表現される。フォワードプライマーおよびリバースプライマー、ならびにＶＥＧＦＲ２、ＴＧＦβ２およびＧＡＰＤＨについてのプローブ配列は、以下のとおりであった。
【０３２６】
ＴＧＦｂ２
フォワード：ＧＴＡ  ＡＡＧ  ＴＣＴ  ＴＧＣ  ＡＡＡ  ＴＧＣ  ＡＧＣ  ＴＡ（配列番号：１３）
リバース：ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＴＡＴ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＴＧＴ  Ｃ（配列番号：１４）
プローブ：ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＴＧＧ  ＡＡＡ  ＡＧＴ  ＧＧＣ  ＡＡＧ  ＡＣＣ  ＡＡＡ  ＡＴ（配列番号：１５）
ＶＥＧＦＲ２
フォワード：ＣＴＴ  ＴＣＣ  ＡＣＣ  ＡＧＣ  ＡＧＧ  ＡＡＧ  ＴＡＧ（配列番号：１６）
リバース：ＴＧＣ  ＡＧＴ  ＣＣＧ  ＡＧＧ  ＴＣＣ  ＴＴＴ（配列番号：１７）
プローブ：ＣＧＣ  ＡＴＴ  ＴＧＡ  ＴＴＴ  ＴＣＡ  ＴＴＴ  ＣＧＡ  ＣＡＡ  ＣＡＧ  Ａ（配列番号：１８）
ＧＡＰＤＨ
フォワード：ＧＡＡ  ＧＡＴ  ＧＧＴ  ＧＡＴ  ＧＧＧ  ＡＴＴ  ＴＣ（配列番号：１９）
リバース：ＧＡＡ  ＧＧＴ  ＧＡＡ  ＧＧＴ  ＣＧＧ  ＡＧＴ  Ｃ（配列番号：２０）
プローブ：ＣＡＡ  ＧＣＴ  ＴＣＣ  ＣＧＴ  ＴＣＴ  ＣＡＧ  ＣＣ（配列番号：２１）
実施例２：ファージ抗ＤＬＬ４抗体の生成合成ファージ抗体ライブラリーは、重鎖および軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）内の多様性の導入によって、単一フレームワーク（ヒト化抗ＥｒｂＢ２抗体、４Ｄ５）上に構築された（Ｌｅｅ，  Ｃ  Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３４０，  １０７３−９３  （２００４）；  Ｌｉａｎｇ，  Ｗ．  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１，  ９５１−６１  （２００６））。ナイーブライブラリーによるプレートパニングは、マキシソープイムノプレートに固定化されたＨｉｓ−タグ付加ヒトＤＬＬ４（アミノ酸１〜４０４）に対して実行された。４ラウンド濃縮した後に、ランダムにクローンを採集し、特異的結合物をファージＥＬＩＳＡを使用して同定した。結果として生じるｈＤＬＬ４結合クローンを、種交差クローンを同定するためにＨｉｓ−タグ付加マウスＤＬＬ４タンパク質でさらにスクリーニングした。各々の陽性のファージクローンについては、重鎖および軽鎖の可変領域を、全長ＩｇＧ鎖を発現するように操作されたｐＲＫ発現ベクターへサブクローン化した。重鎖および軽鎖のコンストラクトを２９３細胞またはＣＨＯ細胞へと共トランスフェクションし、発現された抗体はプロテインＡ親和性カラムを使用して、無血清培地から精製された。精製された抗体は、ＤＬＬ４とラットノッチ１−Ｆｃとの間の相互作用の遮断についてＥＬＩＳＡにより検査され、全長ヒトＤＬＬ４またはマウスＤＬＬ４のいずれかを発現する安定細胞株への結合についてＦＡＣＳにより検査された。親和性成熟については、対象となる最初のクローンに由来するＣＤＲループ（ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１およびＣＤＲ−Ｈ２）の３つの異なる組合せを備えたファージライブラリーを、各選択位置を非野生型残基に変異させるか、または約５０：５０頻度で野生型として維持されるように、ソフトランダム化戦略によって構築した（Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６、上記）。次に高親和性クローンは、次第にストリンジェンシーを増加させて、ヒトおよびマウスのＨｉｓ−タグ付加ＤＬＬ４タンパク質の両方に対する液相パニングを４ラウンド行なって同定された。
【０３２７】
実施例３：抗ＤＬＬ４抗体の特性評価
抗ＤＬＬ４モノクローナル抗体ＹＷ２６．８２のエピトープマッピング：抗ＤＬＬ４のモノクローナル抗体２６．８２は、ヒトＤＬＬ４細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のＥＧＦ様リピート番号２（ＥＧＬ２）に存在する結合決定基を認識した。ＥＧＬ２は、ヒトＤＬＬ４のＥＣＤのアミノ酸２５２〜２８２を含む。簡潔には、ＤＬＬ４のＥＣＤ変異はアルカリフォスファターゼ融合タンパク質として発現され、抗体への結合が評価された。図５ａは、Ｃ末端ヒト胎盤アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）融合タンパク質として発現された、１セットのＤＬＬ４変異の図式的表示を示す。カッコ内は、融合タンパク質中に含まれるＤＬＬ４配列を示す。融合タンパク質を含む２９３Ｔ細胞馴化培地を、精製抗ＤＬＬ４モノクローナル抗体（ＹＷ２６．８２、０．５μｇ／ｍｌ）でコートした９６ウェルマイクロタイタープレート上で検査した。結合されたＤＬＬ４．ＡＰを、基質としてワンステップＰＮＰＰ（ピアース社）およびＯＤ４０５ｎｍの吸光度測定を使用して検出した。モノクローナル抗体ＹＷ２６．８２は、ＤＬＬ４のＥＧＬ２ドメインを含むコンストラクトを結合し、ＤＬＬ４のＥＧＬ２ドメインを欠くコンストラクトを結合しなかった。これは、抗ＤＬＬ４のモノクローナル抗体ＹＷ  ２６．８２がヒトＤＬＬ４  ＥＣＤのＥＧＬ２ドメインのエピトープを認識することを実証した。
【０３２８】
モノクローナル抗体ＹＷ２６．８２は、選択的にマウスおよびヒトのＤＬＬ４に結合する。９６ウェルのヌンク・マキシソーププレートを、指示されるように（１μｇ／ｍｌ）精製組換えタンパク質でコートした。指示された濃度のＹＷ２６．８２の結合をＥＬＩＳＡ分析によって測定した。結合された抗体を、基質としてＴＭＢおよびＯＤ４５０ｎｍの吸光度測定を使用して、抗ヒト抗体ＨＲＰコンジュゲートにより検出した。抗ＨＥＲ２および組換えＥｒｂＢ２−ＥＣＤを分析対照として使用した（図５ｂ）。この実験の結果を図５ｂ中で示す。モノクローナル抗体ＹＷ２６．８２は、ヒトおよびマウスのＤＬＬ４を結合し、ヒトＤＬＬ１およびヒトＪＡＧ１に検出可能な量で結合しなかった。これらの結果は、モノクローナル抗体ＹＷ２６．８２がＤＬＬ４に選択的に結合することを実証した。
【０３２９】
ベクター、全長ＤＬＬ４、ＪａｇｌまたはＤＬＬ１により一過性にトランスフェクションされた２９３細胞のＦＡＣＳ分析により、モノクローナル抗体ＹＷ２６．８２がＤＬＬ４に選択的に結合することもまた実証された。図５ｃ中で示されるように、ＹＷ２６．８２の有意な結合はＤＬＬ４でトランスフェクションされた細胞でのみ検出された（上部のパネル）。有意な結合はＤＬＬ１またはＪａｇ１でトランスフェクションされた細胞で検出されなかった。Ｊａｇ１およびＤＬＬ１の発現は、組換えラットノッチ１−Ｆｃ（ｒｒノッチ１−Ｆｃ、中央パネル）および組換えラットノッチ２−Ｆｃ（ｒｒノッチ２−Ｆｃ、下部パネル）の結合によってそれぞれ確認された。ＹＷ２６．８２、ｒｒノッチ１−Ｆｃまたはｒｒノッチ２−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄシステム）は２μｇ／ｍｌで使用され、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＰＥ（１：５００、ジャクソン・イムノリサーチ社）が後続した。
【０３３０】
競合実験は、モノクローナル抗体ＹＷ２６．８２が、他のノッチリガンドではなく、ＤＬＬ４とノッチの相互作用を効果的に選択的に遮断することを実証した。図５ｄ中で示されるように、抗ＤＬＬ４モノクローナル抗体は、計算されたＩＣ５０（〜１２ｎＭ）で、ＤＬＬ４−ＡＰ（ＤＬＬ１−ＡＰではなく）のコートされたｒノッチ１への結合を遮断した（左側パネル）。抗ＤＬＬ４のモノクローナル抗体は、計算されたＩＣ５０（〜８ｎＭ）で、ＤＬＬ４−Ｈｉｓ（Ｊａｇ１−Ｈｉｓではなく）のコートされたｒノッチ１への結合を遮断した（右側パネル）。
【０３３１】
抗ＤＬＬ４モノクローナル抗体ＹＷ２６．８２は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）において内在的に発現されるＤＬＬ４へ特異的に結合した。対照またはＤＬＬ４に特異的なｓｉＲＮＡによりトランスフェクションされたＨＵＶＥＣのＦＡＣＳ分析が実行された。ＹＷ２６．８２は２μｇ／ｍｌで使用され、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＰＥ（１：５００、ジャクソン・イムノリサーチ）が後続した。この実験の結果は図５ｅ中で示される。結合は、トランスフェクションされていないＨＵＶＥＣ（対照）、および対照ｓｉＲＮＡによりトランスフェクションされたＨＵＶＥＣで観察された。これとは対照的に、ＤＬＬ４  ｓｉＲＮＡによりトランスフェクションされたＨＵＶＥＣにおいて、結合は有意に減少した。これらの実験は、抗ＤＬＬ４のモノクローナル抗体ＹＷ２６．８２がＨＵＶＥＣ中で内在的に発現されたＤＬＬ４に特異的に結合することを実証した。
【０３３２】
実施例４：抗ＤＬＬ４抗体による治療によりインビトロの内皮細胞増殖は増加した。共培養されたヒト皮膚線維芽細胞（ＳＦ）細胞の存在下においてフィブリンゲル中で増殖するヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、明瞭な内腔様構造を備えた出芽を生成する（Ｎａｋａｔｓｕ，  Ｍ．  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ６６，  １０２−１２  （２００３））。抗ＤＬＬ４抗体ＹＷ２６．８２の追加は、出芽の長さおよび数を著しく増加させた（図１ａ）。タンパク質複合体のγ−セクレターゼ活性によって触媒されるノッチのタンパク質分解によるプロセッシングは、ノッチ活性化の間の必須工程である（Ｂａｒｏｎ，  Ｍ．  Ｓｅｍｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １４，  １１３−９  （２００３））。興味深いことには、γ−セクレターゼ阻害剤ジベンザゼピン（ＤＢＺ）（ｖａｎ  Ｅｓ，  Ｊ．  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４３５，  ９５９−６３  （２００５）；  Ｍｉｌａｎｏ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｓｃｉ  ８２，  ３４１−５８  （２００４））は、ＨＵＶＥＣ出芽に同一の効果を有していた。これらの２つの処理の別個のメカニズムを考慮すると、出芽の促進は、ノッチシグナリングの減衰に明らかに起因した。Ｋｉ６７染色により、ＥＣ出芽促進は細胞増殖の増加のためであることが明らかにされた（図１ｂ）。もとのフィブリンゲル分析において、ＨＵＶＥＣ出芽および続いて起こる内腔形成は共培養されたＳＦ細胞によって維持される。ＳＦ細胞を馴化培地に置換することによって、抗ＤＬＬ４のモノクローナル抗体およびＤＢＺの両方はＨＵＶＥＣ出芽をなお促進でき（図１ｃ）、ＤＬＬ４／ノッチシグナリングのＥＣ自律性の役割を支持する。逆の実験では、固定化ＤＬＬ４タンパク質によるノッチの活性化は、有意な増殖阻害をもたらした（図１ｅ）。これらの結果は、ＤＬＬ４／ノッチシグナリングの活性化状態がＥＣ増殖に密接に関連していることを示唆する。
【０３３３】
実施例５：抗ＤＬＬ４抗体による処理はインビボの内皮細胞増殖を増加させた。
【０３３４】
マウス出生後早期の網膜は、十分に定義された事象の順序で型通りの血管パターンを発達させる。（Ｓｔｏｎｅ，  Ｊ．  ＆  Ｄｒｅｈｅｒ，  Ｚ．  Ｊ  Ｃｏｍｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２５５，  ３５−４９  （１９８７）；  Ｇｅｒｈａｒｄｔ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １６１，  １１６３−７７  （２００３）；  Ｆｒｕｔｔｉｇｅｒ，  Ｍ．  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ４３，  ５２２−７  （２００２））。新生仔網膜でのＥＣの増殖と関連したＤＬＬ４の顕著で動的な発現は、ＤＬＬ４の網膜血管発生の調節における可能な役割を示唆する（Ｃｌａｘｔｏｎ，  Ｓ．  ＆  Ｆｒｕｔｔｉｇｅｒ，  Ｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ  ５，  １２３−７  （２００４））。ＹＷ２６．８２の全身的な送達は、網膜血管の重大な変化をもたらした。ＥＣの大量の蓄積が網膜で生じ、原始血管の形態を持ったシート様構造を生成した（図１ｄ）。ＥＣにおけるＫｉ６７標識の著しい増加が観察され、ＥＣ増殖の増加が示された（図１ｈ）。したがって、新生仔マウスでのＤＬＬ４遮断に際しての網膜ＥＣのこの過剰増殖性表現型は、インビトロの結果に確証を与えた。
【０３３５】
実施例６：上皮細胞増殖の調節におけるＤＬＬ４／ノッチの本質的な役割
ＶＥＧＦは、ＥＣのいくつかの基本的態様を制御する（Ｆｅｒｒａｒａ，  Ｎ．  Ｅｘｓ，  ２０９−３１  （２００５）；  Ｃｏｕｌｔａｓ，  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４３８，  ９３７−４５  （２００５））。しかしながら、動静脈（ＡＶ）分化および階層的血管構成のような複雑な血管過程（明らかに追加の高度に統合されたシグナリング経路を要求する事象）へとＶＥＧＦシグナリングがどのように組込まれるかはそれほど理解されない。ゼブラフィッシュにおける遺伝学的研究は、ＶＥＧＦが動脈内皮分化の間のノッチ経路の上流で作用することを示唆する（Ｌａｗｓｏｎ，  Ｎ．  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２８，  ３６７５−８３  （２００１））。我々は、ＨＵＶＥＣのＶＥＧＦ刺激がＤＬＬ４の表面発現の増加をもたらすことを見出し（データー不掲載）、ＶＥＧＦ刺激によるＤＬＬ４  ｍＲＮＡのアップレギュレーションに対する最近の報告と一致している（Ｐａｔｅｌ，  Ｎ．  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５，  ８６９０−７  （２００５））。興味深いことに、ＤＬＬ４それ自体はノッチ活性化に続いてアップレギュレートされ（図６）、ＤＬＬ４がノッチ経路に対してＶＥＧＦシグナリングを効果的に中継する正のフィードバックメカニズムが示唆される。簡潔には、ＨＵＶＥＣは、ＤＢＺ（０．０８μＭ）の非存在下または存在下において、固定化Ｃ末端Ｈｉｓ−タグ付加ヒトＤＬＬ４（アミノ酸１〜４０４）によって刺激された。刺激の３６時間後に、内在性のＤＬＬ４発現は抗ＤＬＬ４抗体によるＦＡＣＳ分析によって検討された。
【０３３６】
特に、ノッチシグナリングの遮断から結果として生じるＥＣの過剰増殖は、なおＶＥＧＦに依存した。三次元フィブリンゲル培養において、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体による処理は、ＤＢＺの存在下または非存在下のいずれかで大部分のＥＣ出芽を消失させ（図１ｆ）、過剰増殖性の挙動が、部分的には、促進されたＶＥＧＦシグナリングのためである可能性が出てきた。実際は、ＹＷ２６．８２またはＤＢＺによるノッチの遮断はＶＥＧＦＲ２のアップレギュレーションをもたらした（図１ｇ）。反対に、固定化ＤＬＬ４によるノッチの活性化はＶＥＧＦＲ２の発現を抑制した（図１ｇ）。したがって、ＶＥＧＦはＤＬＬ４／ノッチ経路の上流に作用することができるが、ＤＬＬ４／ノッチはＶＥＧＦＲ２発現を負に調節することを介して反応を微調整できる。
【０３３７】
実施例７：抗ＤＬＬ４の抗体による処理は内皮細胞分化を遮断し、動脈発生を遮断する。ＤＬＬ４／ノッチの拮抗は、ＥＣ増殖の増加に加えて、フィブリンゲル中のＥＣ出芽の劇的な形態学的変化をもたらした。多細胞内腔様構造はほとんど存在せず（図２ａ）、不完全なＥＣ分化が示唆された。モノクローナル抗体ＹＷ２６．８２に処理された網膜において、動脈および静脈が放射状に交差にする特徴的パターンは著しく破壊された。抗−α平滑筋アクチン（ＡＳＭＡ）染色（網膜動脈に関連する）は、全く存在しなかった（図２ｃ）。この観察は、ＤＬＬ４＋／−胚における不完全な動脈発生に著しく類似した。異なる角度からのこれらの結果は、ＥＣ分化の調節におけるＤＬＬ４／ノッチの本質的な役割を強調した。
【０３３８】
実施例８：ＴＦＧβ発現はノッチの活性化状態に関連づけられた。
【０３３９】
ノッチ経路に類似して、ＴＧＦβシグナリングは背景依存であり、細胞分化、増殖および増殖阻害に対して多様で、しばしば反対の効果を有する。さらにＴＧＦβ経路は血管過程に関係する（Ｕｒｎｅｓｓ，  Ｌ．  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２６，  ３２８−３１  （２０００）；  Ｏｓｈｉｍａ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １７９，  ２９７−３０２  （１９９６）；  Ｌａｒｓｓｏｎ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｍｂｏ  Ｊ  ２０，  １６６３−７３  （２００１））。例えば、アクチビン受容体様キナーゼ１（ＡＬＫ１）（ＥＣ特異的なタイプＩ  ＴＧＦβ受容体）の欠損は、卵黄嚢中の原始的なＥＣ網、および動静脈機能不全（ＡＶＭ）（欠陥ノッチシグナリングを持ったマウスに共有される表現型）をもたらした（Ｕｒｎｅｓｓ，  Ｌ．  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２６，  ３２８−３１  （２０００）；  Ｉｓｏ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ，  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｅ  Ｂｉｏｌ  ２３，  ５４３−５３  （２００３））。このことは、我々にこれらの２つの経路の間の可能な関係を調査させた。ＴＧＦβ２の発現（図２ｂ）はノッチの活性化状態に厳密に関連づけられることが見出され、ＴＧＦβ経路はノッチ経路の下流に作用することが示唆された。これらまとめると、我々の結果は、「シグナリングルーター」として貢献するＤＬＬ４／ノッチ軸が、ＤＬＬ４発現の調節を介してＶＥＧＦシグナリングを統合し、ＥＣ分化を促進するためにＴＧＦβ経路を取るというモデルを支持する。
【０３４０】
実施例９：抗ＤＬＬ４抗体による処理はインビボの腫瘍増殖を阻害した。
【０３４１】
腫瘍血管形成の間のＤＬＬ４／ノッチシグナリングの可能な役割を直接検討するために、前臨床腫瘍モデルにおける腫瘍増殖に対するＤＬＬ４の遮断の効果を研究した（図３ａ〜ｄ）。ＨＭ７、Ｃｏｌｏ２０５およびＣａｌｕ６の異種移植腫瘍モデル（図３ａ〜ｃ）において、ＹＷ２６．８２処理は、腫瘍確立後（腫瘍サイズで≧２５０ｍｍ３）に開始された。３つのモデルすべてにおいて、対照群と処理群との間の増殖率の分離は、投与３日後に明らかになった。処理群の腫瘍容積は２週間の処理にわたって静止したままだった。抗ＤＬＬ４のモノクローナル抗体は、皮下腫瘍に加えて、マウス乳腺脂肪体中で増殖する腫瘍もまた阻害した。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍モデルにおいて、腫瘍細胞注入１４日後に処理を開始した。対照群と処理群との間の腫瘍成長曲線の差は、投薬後に６日以内に明らかであり、処理の継続にしたがってますます有意になった（図３ｄ）。
【０３４２】
前臨床腫瘍モデルにおける多数の腫瘍増殖に対するＤＬＬ４および／またはＶＥＧＦの遮断の効果もまた研究した。（図３ｅ〜ｆ；ｉｐ）。ＭＶ−５２２およびＷＥＨＩ３の異種移植腫瘍モデルにおいて、ＹＷ２６．８２処理および／または抗ＶＥＧＦ処理は腫瘍確立後（腫瘍サイズで≧２５０ｍｍ３）に開始された。ＭＶ−５２２モデルにおいて、ＹＷ２６．８２および抗ＶＥＧＦの処理の両方は腫瘍増殖を個別に阻害したが、２つの処理の組合せが最も有効だった。ＷＥＨＩ３モデルにおいて、抗ＶＥＧＦの処理は腫瘍増殖に対する効果を示さなかったが、ＹＷ２６．８２による処理は腫瘍増殖に有意な阻害を示した。ＳＫ−ＯＶ−３Ｘ１、ＬＬ２、ＥＬ４、Ｈ  １２９９、ＳＫＭＥＳ−１、ＭＸ−１、ＳＷ６２０およびＬＳ１７４Ｔモデルにおいて、ＹＷ２６．８２処理（５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、毎週２回）および／または抗ＶＥＧＦ処理（５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、毎週２回）は、腫瘍の確立後に投与された。これらのモデルの各々において、ＹＷ２６．８２処理は単独で腫瘍増殖を阻害した。更に、これらモデルのすべてにおいて組合せが検査された場合、ＹＷ２６．８２は抗ＶＥＧＦとの組合せで有効性の促進を示した。
【０３４３】
実施例１０：抗ＤＬＬ４抗体による処理は腫瘍内皮細胞増殖を増加させた。
【０３４４】
腫瘍増殖阻害の観点から、ＥＬ４マウスのリンパ腫腫瘍モデルを血管の組織学研究のために使用した。抗ＤＬＬ４モノクローナル抗体処理が内皮細胞密度の劇的な増加をもたらすことが見出された（図３ｇ）。これとは対照的に、抗ＶＥＧＦは全く逆の効果を有していたが（図３ｇ）、両方の処理はこのモデルにおいて類似した有効性を示した。
【０３４５】
実施例１１：抗ＤＬＬ４の抗体による処理は腫瘍血管灌流を阻害した。
【０３４６】
ＤＬＬ４／ノッチ経路のインビトロでの遮断によりＥＣの内腔様構造の形成が低下したので（図２ａ）、抗ＤＬＬ４モノクローナル抗体による処理が、腫瘍血管の類似した障害をもたらし、効率的な血管灌流に影響したかどうかが調べられた。ＦＩＴＣ−レチン（ｌｅｔｉｎ）による全身的な灌流により、抗ＤＬＬ４モノクローナル抗体の処理が腫瘍血管のレクチン標識の著しい減少をもたらすことが明らかにされた（図３ｈ）。特に、ＡＬＫ１欠損マウスにおける動静脈の機能不全が異常な血液循環をもたらすことが示された（Ｕｒｎｅｓｓ，  Ｌ．  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２６，  ３２８−３１  （２０００））。ＡＶ分化におけるＤＬＬ４／ノッチシグナリングの重大な役割を考慮すると、胚および出生後早期の網膜の両方において、抗ＤＬＬ４モノクローナル抗体は、腫瘍ＥＣの細胞運命の特殊化に影響を与えて、不完全な方向性の血管灌流をもたらす。実際、抗ＤＬＬ４モノクローナル抗体で処理されたＣｏｌｏ２０５腫瘍において、高ＥＣ密度が生存可能な腫瘍細胞の低含量に関連する領域があり、低血管機能に関わっていた。血管イメージング技術を利用するさらなる研究が、正確な血管障害に対する洞察を得るために必要である。
【０３４７】
実施例１２：ＤＬＬ４／ノッチはマウス腸のホメオスタシスにおいて重要でない。
【０３４８】
ノッチの全体的な阻害に関する主な関心事は、出生後の自己再生システムのホメオスタシスの調節におけるノッチシグナリングの多面的な役割を考慮すると、それが有害かもしれないということである。例えば、ノッチシグナリングは腸において未分化の腺窩前駆細胞を維持するために必要とされる（ｖａｎ  Ｅｓ，  Ｊ．  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４３５，  ９５９−６３  （２００５）；  Ｆｒｅ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４３５，  ９６４−８  （２００５））。実際は、γ−セクレターゼ阻害剤（それらは無差別にノッチ活性をすべて遮断する）は、腺窩コンパートメント内の杯細胞の大量の増加のためにげっ歯類中で不要な副作用をもたらす（Ｍｉｌａｎｏ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｓｃｉ  ８２，  ３４１−５８  （２００４）；  Ｗｏｎｇ，  Ｇ．  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９，  １２８７６−８２  （２００４））。免疫組織化学分析によって抗ＤＬＬ４モノクローナル抗体により処理されたマウスの小腸を調べた。ＤＢＺ処理とは対照的に、６週間の処理後に、上皮腺窩細胞分化または増殖曲線の差は抗ＤＬＬ４モノクローナル抗体群および対照群との間で同定されなかった（図４）。更に、抗ＤＬＬ４モノクローナル抗体は、迅速に分裂する一時的な増幅（ＴＡ）集団におけるノッチ標的遺伝子ＨＥＳ−１の発現を変化させなかった（図４）。これらの結果は、ＤＬＬ４／ノッチシグナリングが血管系に主として限定されるという考えを支持する。
【０３４９】
実施例１３：抗ＤＬＬ４抗体による処理は成体の網膜血管を影響を与えない。
【０３５０】
ＤＬＬ４の遮断は新生仔マウスにおいて網膜血管発生に対して重大な影響を及ぼしたが、抗ＤＬＬ４抗体の投与は成体の網膜血管に対して目に見える影響を及ぼさない（図２ｄ）。したがって、ＤＬＬ４／ノッチシグナリングは活発な血管形成の間の重大であるが、正常な血管維持においてそれほど重要でない役割を果たす。この考えに一致して、抗ＤＬＬ４モノクローナル抗体の処理の過程の間に、最大８週間の１０ｍｇ／ｋｇで１週あたり２回投与された場合、明らかな体重減少または動物死は癌を持ったマウスにおいて観察されなかった。腫瘍モデルにおいて、抗ＤＬＬ４モノクローナル抗体および抗ＶＥＧＦは、腫瘍血管に対して逆効果を示し、重複しない作用機序を示唆する。
【０３５１】
前述の明文化された明細書は、当業者が本発明の実行を可能にするのに十分であると考えられる。しかしながら、本明細書において示され記述されたものに加えて、本発明の様々な修飾は、前述の記述に当業者に明らかになり、添付された請求項の範囲以内にあるだろう。
【図１ａ】
2009539870.tif 000006
【図１ｂ】
2009539870.tif 000007
【図１ｃ】
2009539870.tif 000008
【図１ｄ】
2009539870.tif 000009
【図１ｅ】
2009539870.tif 000010
【図１ｆ】
2009539870.tif 000011
【図１ｇ】
2009539870.tif 000012
【図１ｈ】
2009539870.tif 000013
【図２ａ】
2009539870.tif 000014
【図２ｂ】
2009539870.tif 000015
【図２ｃ】
2009539870.tif 000016
【図２ｄ】
2009539870.tif 000017
【図３ａ】
2009539870.tif 000018
【図３ｂ】
2009539870.tif 000019
【図３ｃ】
2009539870.tif 000020
【図３ｄ】
2009539870.tif 000021
【図３ｅ】
2009539870.tif 000022
【図３ｆ】
2009539870.tif 000023
【図３ｇ】
2009539870.tif 000024
【図３ｈ】
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【図３ｉ】
2009539870.tif 000026
【図３ｊ】
2009539870.tif 000027
【図３ｋ】
2009539870.tif 000028
【図３ｌ】
2009539870.tif 000029
【図３ｍ】
2009539870.tif 000030
【図３ｎ】
2009539870.tif 000031
【図３ｏ】
2009539870.tif 000032
【図３ｐ】
2009539870.tif 000033
【図４−１】
2009539870.tif 000034
【図４−２】
2009539870.tif 000035
【図５ａ】
2009539870.tif 000036
【図５ｂ】
2009539870.tif 000037
【図５ｃ】
2009539870.tif 000038
【図５ｄ】
2009539870.tif 000039
【図５ｅ】
2009539870.tif 000040
【図６】
2009539870.tif 000041
【配列表】
2009539870000001.app
【国際調査報告】
2009539870.tif 000042
2009539870.tif 000043
2009539870.tif 000044
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2009539870.tif 000046
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