(57)【要約】  本発明は重金属吸着タンパク質を用いた重金属ナノ粒子の製造方法に係り、さらに詳しくは、重金属吸着タンパク質をコードする遺伝子で形質転換された微生物を重金属入り培地中において培養して微生物内に重金属構造体を生成するステップと、前記生成された重金属構造体を回収するステップと、を含む重金属構造体の製造方法及び該方法により製造される重金属構造体のナノ粒子に関する。本発明によるナノ粒子である生体内量子点は、既存の金属物質を物理的に結合して製造する方法とは異なり、重金属吸着タンパク質を細胞内に発現させて量子点を生体内において効率よく生産することができ、前記ナノ粒子は有機蛍光色素分子の短所である光学的な安定性の問題を解消可能なメリットを有しており、有用である。
2009538127.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
重金属吸着タンパク質をコードする遺伝子で形質転換された微生物を重金属入りの培地で培養して微生物内に重金属構造体を生成するステップと、前記生成された重金属構造体を回収するステップと、を含む重金属構造体のナノ粒子の製造方法。
【請求項２】
前記重金属吸着タンパク質は、フィトケラチン合成酵素またはメタロチオネインであることを特徴とする請求項１に記載の重金属構造体のナノ粒子の製造方法。
【請求項３】
前記重金属吸着タンパク質は、ヒト(Homosapiens)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、観賞用たばこ(Ornamental tobacco)、ハツカネズミ(Musmusculus)、清酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)、蛍光菌(Pseudomonas putida)及び大腸菌(Escherichia coli)よりなる群から選ばれるいずれか１種に由来のものであることを特徴とする請求項１に記載の重金属構造体のナノ粒子の製造方法。
【請求項４】
前記微生物はグラム陰性菌、グラム陽性菌、放線菌、酵母及びカビよりなる群から選ばれることを特徴とする請求項１に記載の重金属構造体のナノ粒子の製造方法。
【請求項５】
前記微生物は重金属吸着タンパク質の細胞内発現に有利になるように発現されたタンパク質を分解することに関与する細胞内外のタンパク質分解酵素を生産できないように修飾されたことを特徴とする請求項１に記載の重金属構造体のナノ粒子の製造方法。
【請求項６】
前記微生物は大腸菌（E.coli）であることを特徴とする請求項１に記載の重金属構造体のナノ粒子の製造方法。
【請求項７】
前記重金属は、カドミウム（Ｃｄ）、亜鉛（Ｚｎ）、セレニウム（Ｓｅ）、テルル（Ｔｅ）、セシウム（Ｃｓ）、銅（Ｃｕ）、塩素（Ｃｌ）、鉛（Ｐｂ）、ニッケル（Ｎｉ）、マンガン（Ｍｎ）、水銀（Ｈｇ）、コバルト（Ｃｏ）及びクロム（Ｃｒ）よりなる群から選ばれるいずれか１種であることを特徴とする請求項１に記載の重金属構造体のナノ粒子の製造方法。
【請求項８】
前記重金属構造体はナノ粒子であることを特徴とする請求項１に記載の重金属構造体のナノ粒子の製造方法。
【請求項９】
前記ナノ粒子は量子点であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項８の方法により製造され、５〜１２０ｎｍの直径を有し、球状の重金属構造体のナノ粒子。
【請求項１１】
重金属吸着タンパク質をコードする遺伝子またはその一部を含有する発現ベクターにより形質転換された重金属構造体の生成能力を有する組換え微生物。
【請求項１２】
前記重金属は、カドミウム（Ｃｄ）、亜鉛（Ｚｎ）、セレニウム（Ｓｅ）、テルル（Ｔｅ）、セシウム（Ｃｓ）、銅（Ｃｕ）、塩素（Ｃｌ）、鉛（Ｐｂ）、ニッケル（Ｎｉ）、マンガン（Ｍｎ）、水銀（Ｈｇ）、コバルト（Ｃｏ）及びクロム（Ｃｒ）よりなる群から選ばれるいずれか１種であることを特徴とする請求項１１に記載の組換え微生物。
【請求項１３】
前記重金属吸着タンパク質は、フィトケラチン合成酵素またはメタロチオネインであることを特徴とする請求項１１に記載の組換え微生物。
【請求項１４】
前記フィトケラチン合成酵素をコードする遺伝子の一部は配列番号５の塩基配列に表すことを特徴とする請求項１３に記載の組換え微生物。
【請求項１５】
前記重金属吸着タンパク質は、ヒト(Homosapiens)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、観賞用たばこ(Ornamental tobacco)、ハツカネズミ(Musmusculus)、清酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)、蛍光菌(Pseudomonas putida)及び大腸菌(Escherichia coli)よりなる群から選ばれるいずれか１種に由来のものであることを特徴とする請求項１１に記載の組換え微生物。
【請求項１６】
前記微生物はグラム陰性菌、グラム陽性菌、放線菌、酵母及びカビよりなる群から選ばれることを特徴とする請求項１１に記載の組換え微生物。
【請求項１７】
前記微生物は大腸菌（E.coli）であることを特徴とする請求項１１に記載の組換え微生物。
【請求項１８】
前記微生物は重金属吸着タンパク質の細胞内発現に有利になるように発現されたタンパク質を分解することに関与する細胞内外のタンパク質分解酵素を生産できないように修飾されたことを特徴とする請求項１１に記載の組換え微生物。
【請求項１９】
前記重金属吸着タンパク質をコードする遺伝子またはその一部を含有する発現ベクターは、前記重金属吸着タンパク質が重金属吸着に有利になるようにタンパク質のアミノ酸配列の一部が除去されているか、あるいは、位置特異的に突然変異されたことを特徴とする請求項１１に記載の組換え微生物。
【請求項２０】
前記重金属吸着タンパク質をコードする遺伝子またはその一部を含有する発現ベクターは、図２の切断地図を有するｐＴＪ１−ＡｔＰＣＳであることを特徴とする請求項１１に記載の組換え微生物。
【請求項２１】
前記重金属吸着タンパク質をコードする遺伝子またはその一部を含有する発現ベクターは、図３の切断地図を有するｐＴＪ１−ＰｐＭＴであることを特徴とする請求項１１に記載の組換え微生物。
【請求項２２】
請求項１０に記載のナノ粒子を化学物質、リガンド、金属、ＤＮＡ及びタンパク質よりなる群から選ばれるいずれか１種と結合することを特徴とするナノ粒子の改良方法。
【請求項２３】
請求項１０に記載のナノ粒子にタンパク質を結合し、前記結合されたタンパク質に標識された物質を認識するタンパク質、目的タンパク質に結合する標識されたリガンドまたは目的タンパク質に特異的に結合する抗体を用いてナノ粒子を改良することを特徴とするナノ粒子の改良方法。
【請求項２４】
以下のステップを含む請求項１０に記載のナノ粒子を改良する方法：
（ａ）請求項１０に記載のナノ粒子の表面にビオチンをコーティングするステップと、
（ｂ）前記ビオチンがコーティングされた表面にストレプタビジンをコーティングするステップと、
（ｃ）前記ストレプタビジンがコーティングされた表面にアミン、アルデヒド及びカルボキシル基よりなる群から選ばれるいずれか１種以上の化学的な残基を修飾するステップと、
（ｄ）前記表面に金または銀をコーティングして改良されたナノ粒子を製造するステップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は重金属吸着タンパク質を用いた重金属ナノ粒子の製造方法に係り、さらに詳しくは、重金属吸着タンパク質をコードする遺伝子で形質転換された微生物を重金属入り培地中において培養して微生物内に重金属構造体を生成するステップと、前記生成された重金属構造体を回収するステップと、を含む重金属構造体の製造方法及び該方法により製造される重金属構造体のナノ粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
量子点は、光などのエネルギーで刺激すると光を発するナノサイズの半導体粒子であって、粒子のサイズに応じて放出する光の色合いが異なってくる物質である。すなわち、物質が小さくなって、物質の次元が低くなると、電子状態密度とエネルギーが異なるため、物質の特性も次元によってそれぞれ異なってくる。例えば、２次元系においては、３次元物質においては発現されない量子ホール効果が見られる。ここで、次元を減らすとは、厳密な意味からすると、電子をドブロイ波長よりも小さな領域において閉じ込めるということをいう。０次元的な量子点は面積が全くない点ではなく、実際には３次元的にサイズがドブロイ波長よりも小さな試料のことを言う。量子力学において運動量を有するあらゆる物質粒子に伴われる波動、すなわち、ドブロイ波長は物質によって異なるが、半導体の場合には約１０ｎｍのレベルである。
【０００３】
一般に、量子点は、図１に示すように、コア及びシェルからなり、球状を帯びており、図１に例示する構造のＺｎ、Ｓ、Ｃｄなどの重金属を含有するが、これに限定されるものではなく、その他の種々の重金属が含まれる。
【０００４】
量子点は、大きく２種類の方法により製作可能である。一つは、レーザーなどの光源を利用するリソグラフィによる方法であり、もう一つは、化学合成による方法である。これらのうち、化学合成法による量子点の合成は、リソグラフィによる方法よりも比較的に単純な装置により量子点を生産することができるというメリットはあるが、この方法もまた、未だ大量の量子点を安価に生産するには技術的に解決すべき問題が多い。また、既存のバルク方法と比較して、分子化学的な技法により形成された量子点は、光学的な安定性に優れており、ナノ物質のサイズ、形状及び成分によって様々な波長の光を発するように光学的な属性を調節することができる。これにより、量子点系のナノ物質を中心として急速に生物学的な応用を行うことが可能になった。これは、バイオセンサーの分野だけではなく、生体内光学映像の造影剤としても使用可能な幅広い応用可能性を示唆し、近年、様々な研究を通じてその可能性が立証されている(Jovin, Nat. Biotechnol., 21:32, 2003; Wu et al., Nat. Biotechnol., 21:41, 2003; Alivisatos, Nat. Biotechnol., 22:47, 2004; Gao et al., Nat. Biotechnol., 22:969, 2004; Lidke et al., Nat. Biotechnol., 22:198, 2004)。
【０００５】
その代表例として、生体外において生存細胞の信号伝達を追跡可能な技法が開発されているが、ＨＥＲ２／ｎｅｕ経路へのアプローチがその一例である。これは、既存の有機蛍光色素分子（organic fluorophore）の欠点として指摘されていた、光学的な安定性を失い易いため持続的な細胞変化を確認できないという問題を克服した方法である (Wu et al., Nat. Biotechnol., 21:41, 2003; Lidke et al., Nat. Biotechnol., 22:198, 2004)。また、生存細胞にｅｒｂＢ／ＨＥＲ受容体仲裁された信号伝達の追跡のために、量子点に上皮細胞成長因子（epidermal growth factor、ＥＧＦ）を接合し、上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合して活性化させた後、細胞内に取り込まれる過程を追跡した(Lidke et al., Nat. Biotechnol., 22:198, 2004)。この方法により生存細胞における生物学的な過程をリアルタイムにて観察することが可能になった。
【０００６】
さらに、生体内透過度が不足するという欠点を克服するために、近赤外範囲の波長が利用可能な半導体ナノ結晶を開発することにより、生体内映像を取得することが可能になった(Gao et al., Nat. Biotechnol., 22:969, 2004)。この方法においては、量子点に有効に受容性を帯びさせ、これと同時に有効に生体内に伝達するために、トリブロック共重合体を用いて量子点（ＺｎＳで覆われたＣｄＳｅ）をコーティングし、このコーティングされたポリマーの反応基部分に単クローン抗体を接合する方法を選択した。
【０００７】
さらに、光学的な映像の弱点である生体透過度が低いことを克服するために、波長を近赤外に合わせられる量子点が開発されている。その例として、近赤外の波長を有する量子点をマウスの腋窩リンパ節を光学映像で映像化した(Kim et al., Nat. Biotechnol., 22:93, 2004)。このようなナノ物質の特性は、量子点などから見られるように、バルク方法とは対比する物性を示すことにより、磁気共鳴映像に応用可能な潜在能力を有している。
【０００８】
一方、環境において金属イオンを処理する方法には、一般に、化学的、物理的及び生物学的な処理方法などがある。生物学的な処理方法は、微生物そのものの生体機序を利用するものであり、微生物の生体蓄積、酸化還元反応、金属有機物質複合反応と非溶解性複合体の形成などの機序は重金属により汚染された環境を復元するのに重要な技術基盤を提供する (Valls and de Lorenzo, FEMS. Microbiol. Rev., 26:327, 2002)。さらに、分子生物学の発展に伴い、最近、重金属吸着能を向上させた菌株を開発しようとする試みがあるが、これは、既存の生物学的な処理方法を改良・発展させることのできる可能性を提示している。微生物は生体蓄積を通じて細胞内外において重金属結合タンパク質を合成するが、これらは、重金属を除去するだけではなく、細胞内金属イオンの貯蔵や濃度の調節とも関連する。
【０００９】
近年、鉛、水銀及びカドミウムなどの有害元素と自然的に結合して無毒化させる、フィトケラチン（phytochelatin）と呼ばれるペプチドが重金属に露出されたカビと植物により生産されるということが判明されている。フィトケラチンは、（γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ）ｎ−Ｇｌｙ（ｎ＝２−７）の構造を有しており、且つ、ペプチド−金属混合体の形成を通じて有害金属イオンを蓄積する(Cobbett, Curr. Opin. Plant Biol., 3:211, 2000)。また、他の種類の重金属結合タンパク質として、メタロチオネイン（metallothionein）と呼ばれる低分子タンパク質についての研究も盛んに行われており、前記タンパク質はシステインの含量が多く、カドミウム、亜鉛、ニッケル、銅などと結合する(Hamer, Annu. Rev. Biochem., 55:913, 1986; Wu and Lin, Biosens. Bioelectron., 20:864, 2004)。
【００１０】
一方、量子点の製造と関連する従来の技術として、金属粉末を用いた量子点の製造方法（大韓民国登録特許第１０−０５４０８０１号）、磁性体膜または半導体膜にレーザーを照射して均一な分布を有する量子点を製造する方法（大韓民国登録特許第１０−０５２６８２８号）、半導体物質の量子点形成方法（大韓民国登録特許第１０−０５４１５１６号）、ナノメートルサイズのシリコン量子点形成方法（大韓民国登録特許第１０−０２７９７３９号）などがあるが、これらの方法は、金属物質を物理的に結合して製造する方法である。
【００１１】
そこで、本発明者らは、量子点の構成成分がカドミウム（Ｃｄ）、セレニウム（Ｓｅ）、亜鉛（Ｚｎ）、テルル（Ｔｅ）の規則的な配列により合成されるという点に着目し、重金属吸着タンパク質を遺伝工学的に発現させた結果、経済性の高い量子点を生体内において合成することが可能であるということを見出すと共に、前記生物学的なシステムを用いて光学的な安定性を有する量子点を製造し、本発明を完成するに至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】大韓民国登録特許第１０−０５４０８０１号公報
【特許文献２】大韓民国登録特許第１０−０５２６８２８号公報
【特許文献３】大韓民国登録特許第１０−０５４１５１６号公報
【特許文献４】大韓民国登録特許第１０−０２７９７３９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、重金属構造体の生成能を有する組換え微生物及び前記組換え微生物を重金属入り培地中において培養する重金属構造体のナノ粒子を製造する方法を提供することにある。
【００１４】
本発明の他の目的は、前記ナノ粒子を化学物質、リガンド、金属、ＤＮＡ、及びタンパク質よりなる群から選ばれるいずれか１種と結合するナノ粒子の改良方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
前記目的を達成するために、本発明は、重金属吸着タンパク質をコードする遺伝子で形質転換された微生物を重金属入りの培地中において培養して微生物内に重金属構造体を生成するステップと、前記生成された重金属構造体を回収するステップと、を含む重金属構造体の製造方法を提供する。
【００１６】
また、本発明は、前記方法により製造され、５〜１２０ｎｍの直径を有し、球状の重金属構造体のナノ粒子を提供する。
【００１７】
さらに、本発明は、重金属吸着タンパク質をコードする遺伝子またはその一部を含有する発現ベクターにより形質転換された重金属構造体の生成能を有する組換え微生物を提供する。
【００１８】
さらに、本発明は、前記ナノ粒子を化学物質、リガンド、金属、ＤＮＡ及びタンパク質よりなる群から選ばれるいずれか１種と結合することを特徴とするナノ粒子の改良方法を提供する。
【００１９】
さらに、本発明は、前記ナノ粒子にタンパク質を結合し、前記結合されたタンパク質に標識された物質を認識するタンパク質、目的タンパク質に結合する標識されたリガンドまたは目的タンパク質に特異的に結合する抗体を用いてナノ粒子を改良することを特徴とするナノ粒子の改良方法を提供する。
【００２０】
さらに、本発明は、（ａ）前記ナノ粒子の表面にビオチンをコーティングするステップと、（ｂ）前記ビオチンがコーティングされた表面にストレプタビジンをコーティングするステップと、（ｃ）前記ストレプタビジンがコーティングされた表面にアミン、アルデヒド及びカルボキシル基よりなる群から選ばれるいずれか１種以上の化学的な残基を修飾するステップと、（ｄ）前記表面に金または銀をコーティングして改良されたナノ粒子を製造するステップと、を含む前記ナノ粒子を改良する方法を提供する。
【００２１】
本発明の他の特徴及び具現例は、下記の詳細な説明及び特許請求の範囲からなお一層明らかになる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明は、重金属吸着タンパク質を用いて重金属構造体を製造する方法、該方法により製造されたナノ粒子である量子点及び重金属吸着タンパク質をコードする遺伝子またはその一部を含有する発現ベクターで形質転換された重金属構造体の生成能を有する組換え微生物を提供する効果がある。
本発明において提供されるナノ粒子である生体内量子点は、既存の金属物質を物理的に結合させて製造する方法とは異なり、生体内において発現される酵素の活性により合成されることから、重金属吸着タンパク質を細胞内に発現させて量子点を生体内において効率よく生産することが可能であり、製造工程が単純なので高い生産性と経済性を有する他、前記量子点は有機蛍光色素分子の短所である光学的な安定性の問題を解決可能なメリットがあり、有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、通常の量子点の構造を示す例示図である。
【図２】図２は、本発明による発現ベクターｐＴＪ１−ＡｔＰＣＳの遺伝子地図である。
【図３】図３は、本発明による発現ベクターｐＴＪ１−ＰｐＭＴの遺伝子地図である。
【図４】図４は、本発明において、カドミウム、セシウムなどの重金属を含む培養培地にフィトケラチン合成酵素を発現させた大腸菌の蛍光スキャン模式図である。
【図５】図５は、本発明において、フィトケラチン合成酵素を発現させた大腸菌の細胞内に蓄積された重金属構造体の共焦点顕微鏡写真である（ａ：４２０ｎｍの発光スペクトルを有するものと一致する青色蛍光の大腸菌細胞、ｂ：７００ｎｍ発光スペクトルを有する黄色蛍光の大腸菌細胞、ｃ：実像、ｄ：ａ及びｂの結合イメージ、スケールバーはそれぞれ５μｍのサイズを示す）。
【図６】図６は、本発明において、フィトケラチン合成酵素を発現させた大腸菌の細胞内に蓄積された重金属構造体の透過電子顕微鏡写真である（ａ：フィトケラチン合成酵素が発現されていない対照群、ｂ〜ｄ：フィトケラチン合成酵素を発現させた大腸菌の細胞内に蓄積された重金属構造体の様々な倍率における電子顕微鏡写真）。
【図７】図７は、本発明において、フィトケラチン合成酵素を発現させた大腸菌を、カドミウム（Ｃｄ）、亜鉛（Ｚｎ）及びセシウム（Ｃｓ）を含む培地中において培養したときの細胞内に蓄積された重金属構造体のＸ線分光分析（ＥＤＳ、Energy Dispersive X-Ray Spectrometry）模式図及び透過電子顕微鏡写真である。
【図８】図８は、本発明において、フィトケラチン合成酵素を発現させた大腸菌を、カドミウム（Ｃｄ）、亜鉛（Ｚｎ）及びセレニウム（Ｓｅ）を含む培地中において培養したときの細胞内に蓄積された重金属構造体のＸ線分光分析模式図及び透過電子顕微鏡写真である。
【図９】図９は、本発明において、フィトケラチン合成酵素を発現させた大腸菌を、カドミウム（Ｃｄ）、亜鉛（Ｚｎ）、セレニウム（Ｓｅ）及びテルル（Ｔｅ）を含む培地中において培養したときの細胞内に蓄積された重金属構造体のＸ線分光分析模式図及び透過電子顕微鏡写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明においては、重金属吸着タンパク質遺伝子を大腸菌に取り込んで発現させた後、前記吸着タンパク質を発現させて細胞内において重金属を吸着・蓄積する度合いに応じて量子点を合成するために、重金属吸着タンパク質遺伝子であるフィトケラチン合成酵素若しくはメタロチオネインをコードする遺伝子が単独または融合した形で発現されるようにプラスミドを製作し、前記プラスミドにより大腸菌を形質転換して培養することにより重金属吸着タンパク質を細胞内に生成し、これを重金属の各成分が含まれている培地を用いて培養し、細胞内において合成された重金属吸着構造体を成分分析及び蛍光分析することにより細胞内合成された量子点であるかどうかを確認した。
【００２５】
一観点において、本発明は、重金属吸着タンパク質をコードする遺伝子で形質転換された微生物を重金属入り培地中において培養して微生物内に重金属構造体を生成するステップと、前記生成された重金属構造体を回収するステップと、を含む重金属構造体の製造方法及び該方法により製造され、５〜１２０ｎｍの直径を有し、球状の重金属構造体のナノ粒子に関する。
【００２６】
本発明において、前記重金属構造体はナノ粒子であることを特徴とし、前記ナノ粒子は量子点であることを特徴とする。
【００２７】
本発明において、前記重金属吸着タンパク質は、ヒト(Homosapiens)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、観賞用たばこ(Ornamental tobacco)、ハツカネズミ(Musmusculus)、清酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)、蛍光菌(Pseudomonas putida)及び大腸菌(Escherichia coli)よりなる群から選ばれるいずれか１種に由来のものであるが、これに限定されるものではない。
【００２８】
本発明の重金属吸着タンパク質としては、フィトケラチン合成酵素とメタロチオネインを例示したが、同じ特性を有する他のタンパク質やペプチドもまた本発明に適用可能であるということは当業者にとって自明である。                                        
【００２９】
他の観点において、本発明は、重金属吸着タンパク質をコードする遺伝子またはその一部を含有する発現ベクターにより形質転換された重金属構造体の生成能を有する組換え微生物に関する。
【００３０】
本発明において、前記重金属吸着タンパク質はフィトケラチン合成酵素またはメタロチオネインであることを特徴とし、前記フィトケラチン合成酵素をコードする遺伝子の一部は配列番号５の塩基配列で表わされることを特徴とする。
【００３１】
本発明は、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)のフィトケラチン合成酵素と蛍光菌(Pseudomonas putida)のメタロチオネインを単独または融合された形で発現させる組換えベクターにより形質転換された大腸菌を培養して重金属吸着タンパク質を発現させるステップを含む。本発明において、重金属吸着タンパク質は、前記タンパク質のＣ−末端、またはＮ−末端に融合されていることが好ましい。
【００３２】
本発明において使用可能な重金属の具体例としては、カドミウム（Ｃｄ）、亜鉛（Ｚｎ）、セレニウム（Ｓｅ）、テルル（Ｔｅ）、セシウム（Ｃｓ）、銅（Ｃｕ）、塩素（Ｃｌ）、鉛（Ｐｂ）、ニッケル（Ｎｉ）、マンガン（Ｍｎ）、水銀（Ｈｇ）、コバルト（Ｃｏ）、クロム（Ｃｒ）などが挙げられる。
【００３３】
本発明の一態様において用いられるフィトケラチン合成酵素が発現されるように形質転換された大腸菌を製造するための組換えプラスミドであるｐＴＪ１−ＡｔＰＣＳは、フィトケラチン合成酵素を暗号化する遺伝子及びアンピシリン抵抗遺伝子、並びに発現誘導のためのプロモーターであるｔｒｃプロモーターを含む。このとき、大腸菌において、フィトケラチン合成酵素を発現させるためにシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)染色体ＤＮＡの相補的な塩基配列（ｃＤＮＡ）から２つのプライマーを合成してＰＣＲを通じて製作し、蛍光菌(Pseudomonas putida)の染色体ＤＮＡからGenBankに登録された塩基配列を用いてＰＣＲによりメタロチオネインの重金属吸着領域遺伝子を得て重複ＰＣＲを通じてフィトケラチン合成酵素とメタロチオネインが融合された形の遺伝子を得て、菌株の選別のためにアンピシリン抵抗遺伝子を利用することができる。
【００３４】
前記菌株から得られたフィトケラチン合成酵素とメタロチオネインを単独または融合された形で発現させて重金属イオン入り培地中において培養して成長ステップ別、重金属濃度別に観察した結果、細胞内に重金属が吸着・蓄積されて規則的な配列を有する量子点を形成することを確認することができ、前記生体内量子点を簡単な細胞破砕工程を経てこれらを数百ナノメートルの孔径を有する膜にろ過して容易に量子点を得ることができる。
【００３５】
また、前記重金属吸着タンパク質だけではなく、下記の実施例に制限されることなく、重金属が吸着可能なタンパク質、ＤＮＡ、中間物質及び代謝物質など全ての細胞内の構成成分は、当業者にとって容易に本発明に適用することができる。様々な重金属吸着タンパク質を合成可能な生物としては、高等生物から微生物に至るまで広範に亘っており、馬の腎臓細胞において最初に発見されている(Margoshe and Vallee, J. Am. Chem. Soc., 79:4813, 1957)。現在、文献上に代表的に開示されている種としては、ヒト(Homosapiens)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、観賞用たばこ(Ornamental tobacco)、ハツカネズミ(Musmusculus)、清酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)、蛍光菌(Pseudomonas putida)及び大腸菌(Escherichia coli)などの多様な種から表すことが知られている。これより、様々な重金属吸着領域を本発明に適用することは本発明が属する技術分野における通常の者にとって自明である。
【００３６】
本発明において、前記微生物は、グラム陰性菌、グラム陽性菌、放線菌、酵母及びカビよりなる群から選ばれることを特徴とし、本発明において、前記組換え微生物は大腸菌（E.coli）であることを特徴とする。
【００３７】
本発明において、前記微生物は、重金属吸着タンパク質の細胞内発現に有利になるように発現されたタンパク質を分解することに関与する細胞内外のタンパク質分解酵素を生産できないように修飾されたことを特徴とする。
【００３８】
本発明において、前記重金属吸着タンパク質をコードする遺伝子またはその一部を含有する発現ベクターは、前記重金属吸着タンパク質が重金属吸着に有利になるようにタンパク質のアミノ酸配列の一部が除去されているか、あるいは、位置特異的に突然変異されたことを特徴とする。
【００３９】
本発明において、前記重金属吸着タンパク質をコードする遺伝子またはその一部を含有する発現ベクターは、図２の切断地図を有するｐＴＪ１−ＡｔＰＣＳであることを特徴とし、前記重金属吸着タンパク質をコードする遺伝子またはその一部を含有する発現ベクターは、図３の切断地図を有するｐＴＪ１−ＰｐＭＴであることを特徴とする。
【００４０】
本発明による重金属構造体のナノ粒子は、様々な化学物質やバイオ物質と容易に結合するため、様々な目的に改良することが可能である。このため、本発明は、さらに他の観点において、前記ナノ粒子を化学物質、リガンド、金属、ＤＮＡ及びタンパク質よりなる群から選ばれるいずれか１種以上と結合することを特徴とするナノ粒子の改良方法に関する。
【００４１】
一具現例として、本発明によるナノ粒子にタンパク質を結合させ、前記結合されたタンパク質に標識された物質を認識するタンパク質、目的タンパク質に結合する標識されたリガンドまたは目的タンパク質に特異的に結合する抗体を用いてナノ粒子を改良することが可能である。
【００４２】
他の具現例として、本発明によるナノ粒子は、下記のステップを経て改良することも可能である：（ａ）前記ナノ粒子の表面にビオチンをコーティングするステップと、（ｂ）前記ビオチンがコーティングされた表面にストレプタビジンをコーティングするステップと、（ｃ）前記ストレプタビジンがコーティングされた表面をアミン、アルデヒド及びカルボキシル基よりなる群から選ばれるいずれか１種以上の化学的な残基で修飾するステップと、（ｄ）前記表面に金または銀をコーティングして改良されたナノ粒子を製造するステップ。
【００４３】
実施例
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。但し、これらの実施例は単に本発明を一層詳しく説明するためのものであり、本発明の要旨により本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではないということは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかである。
【実施例１】
【００４４】
実施例１：重金属を吸着するタンパク質の発現ベクターの製造
（１）フィトケラチン合成酵素の発現ベクターの製造
フィトケラチン合成酵素を合成するＡｔＰＣＳの遺伝子(ＮＣＢＩ accession No. ＡＦ４６１１８０）を確保するために、配列番号５(Arabidopsis thaliana phytochelatin synthase)の塩基配列で表わされるシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)の相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を標的ＤＮＡとして使用し、下記の配列番号１及び配列番号２のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、下記の通りである：最初の変性：９４℃の温度条件下で７分、２回目の変性：９４℃の温度条件下で１分、アニール：５５℃の温度条件下で１分、延長：７２℃の温度条件下で１分３０秒、３０回繰り返し、最後の延長：７２℃の温度条件下で７分。
配列番号１：５’−ＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＴＡＴＧＧＣＧＡＧＴＴＴＡＴ−３’
配列番号２：５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＧＣＡＧＧＡＧＣＡＧＣＧＡＧ−３’
【００４５】
アガロースゲル電気泳動法により、前記ＰＣＲにより得られた約１．５ｋｂサイズのＤＮＡ切片を分離し、これを２種類の制限酵素のEcoRIとHindIIIで切断した。これと同時に、誘導可能で且つ強力なｔａｃプロモーターがあるプラスミドｐＴａｃ９９Ａ(Park and Lee, Biotechnol. Techn., 12:815, 1998)を２種類の制限酵素EcoRIとHindIIIで切断した後、これを前記ＤＮＡ切片と混合して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結させ、これをエレクトロポレーション方法を用いて大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。前記形質転換菌株は、抗生剤アンピシリン（１００μｇ／Ｌ）入りＬＢ平板培地中において選別し、これからｐＴＪ１−ＡｔＰＣＳ組換えプラスミドを得た（図２）。このようにして製造したｐＴＪ１−ＡｔＰＣＳ組換えプラスミドは、重金属吸着タンパク質として使われるＡｔＰＣＳ遺伝子が強力で且つ誘導可能なｔａｃプロモーターにより発現可能である。
【００４６】
（２）メタロチオネインの発現ベクターの製造
メタロチオネインを合成するＰｐＭＴの遺伝子(ＮＣＢＩ accession No. ＮＣ＿００２９４７  ＲＥＧＩＯＮ：  ３６９６７５３．．３６９６９７７)を確保するために、配列番号６(Pseudomonas putida ＫＴ２４４０ metallothionein)の塩基配列で表わされる蛍光菌(Pseudomonas putida)ＫＴ２４４０の染色体ＤＮＡを標的ＤＮＡとして使用し、配列番号３及び配列番号４のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、下記の通りである：最初の変性：９４℃の温度条件下で７分、２回目の変性：９４℃の温度条件下で１分、アニール：５５℃の温度条件下で１分、延長：７２℃の温度条件下で１分、３０回繰り返し、最後の延長：７２℃の温度条件下で７分。
配列番号３：５’−ＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＣＧＡＴＣＡＡＣＧＣＴＧＣＧＣ−３’
配列番号４：５’−ＡＡＣＴＧＣＡＧＴＴＡＧＧＧＣＧＡＧＡＴＣＧＧＡＴＣＡＣＴ−３’
【００４７】
アガロースゲル電気泳動法で、前記重合酵素連鎖反応により得られた約２３０ｂｐサイズのＤＮＡ切片を分離し、これを２種類の制限酵素EcoRIとｐｓｔIで切断した。これと同時に、誘導可能で且つ強力なｔａｃプロモーターがあるプラスミドｐＴａｃ９９Ａ(Park and Lee, Biotechnol. Techn., 12:815, 1998)を２種類の制限酵素EcoRIとｐｓｔIで切断した後、これを前記ＤＮＡ切片と混合して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結させ、これをエレクトロポレーション方法を用いて大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。前記形質転換菌株は、抗生剤アンピシリン（１００μｇ／Ｌ）入りＬＢ平板培地中において選別し、これからｐＴＪ１−ＰｐＭＴ組換えプラスミドを得た（図３）。このようにして製造したｐＴＪ１−ＰｐＭＴ組換えプラスミドは、重金属吸着タンパク質として使われるＰｐＭＴ遺伝子が強力で且つ誘導可能なｔａｃプロモーターにより発現可能である。
【００４８】
組換えタンパク質を発現させるための宿主細胞としては、短時間内に高濃度の菌体培養が可能であり、遺伝子操作が容易である他、遺伝学的、生理的な特徴がよく判明されている大腸菌 (Escherichia coli)、枯草菌 (Bacillus subtillis)などの原核細胞が汎用されてきている。しかしながら、タンパク質の翻訳後修飾、分泌過程及び活性型の３次元構造、タンパク質の活性状態の問題点を解決するために、最近、単細胞真核細胞である酵母系(Pichia pastoris、Saccharomyces cerevisiae、Hansenula polymorphaなど)をはじめとして、糸状性真菌類、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞などの高等生物に至るまでの細胞が組換えタンパク質生産の宿主細胞として活用されているため、実施例において例示された大腸菌だけではなく、他の宿主細胞を利用することは当業界における通常の知識を有する者にとって容易に適用可能である。
【実施例２】
【００４９】
実施例２：組換えプラスミドｐＴＪ１−ＡｔＰＣＳが発現された大腸菌の蛍光分析
強力で且つ誘導可能なｔａｃプロモーターを有している組換えプラスミドｐＴＪ１−ＡｔＰＣＳで形質転換された大腸菌ＤＨ５αを培養してフィトケラチン合成酵素を製造した。形質転換された組換え大腸菌を重金属イオンがそれぞれ含有 （５ｍＭ  ＣｄＣｌ2・２．５Ｈ2Ｏ、ＺｎＣｌ2、ＳｅＯ2、ＴｅＣｌ4、ＣｓＣｌ2）されたＬＢ液体培地１００ｍＬが入れられている５００ｍＬフラスコに接種して３７℃の温度条件下で培養した。ｐＴＪ１−ＡｔＰＣＳ組換えプラスミドはｔａｃプロモーターを有しているため、ＩＰＴＧを添加して遺伝子発現を誘導したが、分光光度計により６００ｎｍの波長において測定した光学密度が（ＯＤ）が０.６であるとき、１ｍＭのＩＰＴＧを添加して行った。誘導発現してから４時間後に全体の培養液を４℃の温度条件下で６０００ｒｐｍにて５分間遠心分離した後、上澄み液を除去した。次いで、１０ｍＬＰＢＳバッファ（ｐＨ７．４）で１回洗浄し、さらに４℃の温度条件下で６０００ｒｐｍにて５分間遠心分離した後、ＰＢＳバッファ１０ｍＬ溶液に懸濁した。懸濁したサンプルを９６−ウェル黒色プレートに１００μＬずつ分注して蛍光分光光度計（Molecular Devices、アメリカ）を用いて３６０〜７００ｎｍにおける発光スペクトルを分析した（図４）。図４に示すように、３２０ｎｍの紫外線領域励起において約４２０ｎｍの発光スペクトルピークを有する蛍光シグナルが強力に現れることを確認することができた。これにより、量子点固有の蛍光シグナルを有する物質が大腸菌内に含まれていることが分かる。
【００５０】
さらに、これらのフィトケラチン合成酵素が発現された組換え大腸菌を蒸留水により洗浄してポリ−Ｌ−リジンがコーティングされたスライドガラスにおいて固定した後、カバーガラスを覆い、その後、共焦点顕微鏡（Confocal laser scanning microscopy、ＬＳＭ  ５１０、Carl Zeiss、ドイツ）を用いて、細胞内に蓄積された重金属の蛍光イメージを分析した（図５）。その結果、図５に示すように、図４に示す約４２０ｎｍの発光スペクトルを有するものと一致する青色蛍光（ａ）と約７００ｎｍ発光スペクトルを有する黄色蛍光（ｂ）の大腸菌細胞を観察することができた。これにより、量子点のようなナノ粒子でしか見られない蛍光発光特性を本発明における細胞内重金属構造体において確認することができた。（ｃ）は実像であり、（ｄ）は（ａ）及び（ｂ）の結合イメージである。なお、図示のスケールバーはそれぞれ５μｍのサイズを示す。
【実施例３】
【００５１】
実施例３：組換えプラスミドｐＴＪ１−ＡｔＰＣＳが発現された大腸菌から生体内に合成された重金属の特性調査
誘導可能なｔａｃプロモーターを有している組換えプラスミドｐＴＪ１−ＡｔＰＣＳで形質転換された大腸菌ＤＨ５αにおいてＩＰＴＧにより発現されたフィトケラチン合成酵素が組換え大腸菌内において重金属構造体を形成しているかどうかを確認するために、前記実施例２の組換え大腸菌を蒸留水により洗浄して凍結乾燥機において真空状態で１日中乾燥させた後、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ、Technai Ｇ２、ＦＥＩ、オランダ）を用いて細胞内に蓄積された重金属を分析した結果、重金属構造体のサイズ及び形状が均一であることを確認することができた（図６）。フィトケラチン合成酵素が発現されていない対照群（ａ）においては見られない重金属構造体がフィトケラチン合成酵素が発現された組換え大腸菌の内部に存在することを確認することができた（図６におけるｂ、ｃ及びｄ）。
【００５２】
前記細胞内に合成された重金属パーチクルのサイズは、図示のスケールバーと比較して確認できるように、約５〜１２０ｎｍであったが、このサイズに制限されることなく、種々のサイズの重金属パーチクルを製造することが可能である。また、本発明において、細胞内に蓄積された重金属パーチクル固有の構造形態である格子状の構造を形成することを確認することができた（図６におけるｃ及びｄ）。
【００５３】
さらに、フィトケラチン合成酵素を発現させた大腸菌の細胞内に吸着された重金属構造体のＸ線分光（ＥＤＳ、Energy Dispersive X-Ray Spectrometry）を透過電子顕微鏡（ＦＥ−ＴＥＭ／ＥＤＳ、Technai Ｇ２、ＦＥＩ、オランダ）を用いて分析した。このとき、電子顕微鏡写真に表示された個所の重金属構造体を分析した結果、培養液に添加した成分のうちカドミウム（Ｃｄ）、亜鉛（Ｚｎ）、セシウム（Ｃｓ）などが検出されていた（図７）。
【００５４】
図７は、本発明において、フィトケラチン合成酵素を発現させた大腸菌を、カドミウム（Ｃｄ）、亜鉛（Ｚｎ）及びセシウム（Ｃｓ）を各５ｍＭずつ含む培地中において培養したときの細胞内に蓄積された重金属構造体のＸ線分光分析（ＥＤＳ、Energy Dispersive X-Ray Spectrometry）模式図及び透過電子顕微鏡写真である。有機物である大腸菌において発現可能な炭素（Ｃ）、酸素（Ｏ）があり、これらの他に細胞内に常に存在するナトリウム（Ｎａ）及び塩素（Ｃｌ）を除くと、亜鉛（Ｚｎ）、カドミウム（Ｃｄ）及びセシウム（Ｃｓ）が細胞内重金属ナノ粒子を構成する成分であることを確認することができた。
【００５５】
図８は、本発明において、フィトケラチン合成酵素を発現させた大腸菌を、カドミウム（Ｃｄ）、亜鉛（Ｚｎ）及びセレニウム（Ｓｅ）を各５ｍＭずつ含む培地中において培養したときの細胞内に蓄積された重金属構造体のＸ線分光分析模式図及び透過電子顕微鏡写真である。特に、電子顕微鏡写真に表示された個所の重金属構造体を分析した結果、亜鉛（Ｚｎ）とセレニウム（Ｓｅ）の構成成分を含有し、セレニウム（Ｓｅ）の含量が高い重金属構造体を形成していることを確認することができた。
【００５６】
図９は、本発明において、フィトケラチン合成酵素を発現させた大腸菌を、カドミウム（Ｃｄ）、亜鉛（Ｚｎ）、セレニウム（Ｓｅ）及びテルル（Ｔｅ）を各５ｍＭずつ含む培地中において培養したときの細胞内に蓄積された重金属構造体のＸ線分光分析模式図及び透過電子顕微鏡写真である。電子顕微鏡写真に表示された個所の重金属構造体を分析した結果、亜鉛（Ｚｎ）、セレニウム（Ｓｅ）及びカドミウム（Ｃｄ）を少量含有し、特に、テルル（Ｔｅ）の含量が高い重金属構造体を形成していることを確認することができた。
【００５７】
図７から図９のＸ線分光分析に用いられた細胞内重金属ナノ粒子のサイズは、略３０〜５０ｎｍであって、これに加えて、前記重金属ナノ粒子が約５ｎｍから約１２０ｎｍまで様々な形で細胞内に存在することを透過電子顕微鏡により確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
以上詳述及び立証したように、本発明は、重金属吸着タンパク質を用いて重金属構造体を製造する方法、該方法により製造されたナノ粒子である量子点及び重金属吸着タンパク質をコードする遺伝子またはその一部を含有する発現ベクターで形質転換された重金属構造体の生成能を有する組換え微生物を提供する効果がある。本発明において提供されるナノ粒子である生体内量子点は、既存の金属物質を物理的に結合させて製造する方法とは異なり、生体内において発現される酵素の活性により合成されることから、重金属吸着タンパク質を細胞内に発現させて量子点を生体内において効率よく生産することが可能であり、製造工程が単純なので高い生産性と経済性を有する他、前記量子点は有機蛍光色素分子の短所である光学的な安定性の問題を解決可能なメリットがあり、有用である。
【００５９】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかであろう。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定まると言えるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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