(57)【要約】  本発明は炭素ナノチューブ（carbon nanotube）を含む細胞無毒性幹細胞移植用構造支持体及び、(i)幹細胞及び(ii)幹細胞の細胞無毒性構造支持体としての炭素ナノチューブを有効成分として含む幹細胞治療剤組成物に関するものである。炭素ナノチューブを含む本発明の幹細胞移植用構造支持体は、生体内に移植された幹細胞被移植組織で分化して周囲の細胞等とネットワーキングをなすにおいて、極めて優れた支持体特性を表し、結局このような支持体を含む本発明の治療剤組成物は実際的に疾患動物において改善された幹細胞治療効能を表す。
2009502308.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素ナノチューブを含む細胞無毒性幹細胞移植用構造支持体。
【請求項２】
(a)幹細胞；及び(b)幹細胞の細胞無毒性構造支持体としての炭素ナノチューブを有効成分として含む幹細胞治療剤組成物。
【請求項３】
前記幹細胞は胚芽幹細胞又は成体幹細胞であることを特徴とする第２項記載の組成物。
【請求項４】
前記幹細胞は神経幹細胞であり、前記治療剤組成物は神経疾患治療用組成物であることを特徴とする第３項記載の組成物。
【請求項５】
前記神経疾患は神経退行性疾患、及び虚血又は再灌流による疾患で構成された群より選ばれることを特徴とする第４項記載の組成物。
【請求項６】
前記神経退行性疾患は、アルツハイマー病、ハンチントン疾病、パーキンソン疾病及び筋萎縮性側索硬化症で構成された群より選ばれる神経疾患であることを特徴とする第５項記載の組成物。
【請求項７】
前記虚血又は再灌流による疾患は虚血性脳卒中であることを特徴とする第５項記載の組成物。
【請求項８】
前記炭素ナノチューブは炭素ナノ粒子の懸濁液形態で存在することを特徴とする第２項記載の組成物。
【請求項９】
(a)幹細胞；及び(b)幹細胞の細胞無毒性構造支持体としての炭素ナノチューブを有効成分として含む幹細胞治療剤組成物を動物に投与する段階を含む幹細胞を利用した細胞治療方法。
【請求項１０】
前記幹細胞は胚芽幹細胞又は成体幹細胞であることを特徴とする第９項記載の細胞治療方法。
【請求項１１】
前記幹細胞は神経幹細胞であって、前記治療剤組成物は神経疾患治療用組成物であることを特徴とする第１０項記載の細胞治療方法。
【請求項１２】
前記神経疾患は神経退行性疾患、及び虚血又は再灌流による疾患で構成された群より選ばれることを特徴とする第１１項記載の細胞治療方法。
【請求項１３】
前記神経退行性疾患は、アルツハイマー病、ハンチントン疾病、パーキンソン疾病及び筋萎縮性側索硬化症で構成された群より選ばれる神経疾患であることを特徴とする第１２項記載の細胞治療方法。
【請求項１４】
前記虚血又は再灌流による疾患は虚血性脳卒中であることを特徴とする第１２項記載の細胞治療方法。
【請求項１５】
前記炭素ナノチューブは炭素ナノ粒子の懸濁液形態で存在することを特徴とする第９項記載の細胞治療方法。
【請求項１６】
細胞治療剤薬物を製造する為の(a)幹細胞；及び(b)幹細胞の細胞無毒性構造支持体としての炭素ナノチューブを有効成分として含む組成物の用途。
【請求項１７】
前記幹細胞は胚芽幹細胞又は成体幹細胞であることを特徴とする第１６項記載の用途。
【請求項１８】
前記幹細胞は神経幹細胞であり、前記治療剤組成物は神経疾患治療用組成物であることを特徴とする第１７項記載の用途。
【請求項１９】
前記神経疾患は神経退行性疾患、及び虚血又は再灌流による疾患で構成された群より選ばれることを特徴とする第１８項記載の用途。
【請求項２０】
前記神経退行性疾患は、アルツハイマー病、ハンチントン疾病、パーキンソン疾病及び筋萎縮性側索硬化症で構成された群より選ばれる神経疾患であることを特徴とする第１９項記載の用途。
【請求項２１】
前記虚血又は再灌流による疾患は虚血性脳卒中であることを特徴とする第１９項記載の用途。
【請求項２２】
前記炭素ナノチューブは炭素ナノ粒子の懸濁液形態で存在することを特徴とする第１６項記載の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は幹細胞移植用構造支持体及び幹細胞治療剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳虚血、パーキンソン、アルツハイマー、心筋梗塞、冠状動脈及び肝臓疾患を含む各種疾患の治療において、最近最も多くの関心を浴びているのが多分化能幹細胞治療剤である。
一方、移植された幹細胞が疾患の治療に有効性を有する為には、少なくとも２つの要件を満たさなければならない。１番目の要件は移植された幹細胞が所望の細胞に分化されることである。２番目の要件は治療の為に正常に分化された幹細胞が損傷を受けた部位において、その機能を十分に発揮できるように被移植組織とネットワークをなすことである。
【０００３】
しかしながら、事実上損傷を受けた部位への直接的な幹細胞移植は種々の要因によりその場でネットワーク（例えば、神経ネットワーク）を成し得ず洗い去られる。さらに、所望しない部位に移動して異種細胞に分化されることもあり得る。
【０００４】
従って、現在多くの研究陣により生体内毒性を有しない幹細胞治療剤の構造的支持体開発に対する研究が多くなされている。しかしながら、全く毒性を有しない構造物の開発自体も難しいばかりでなく、支持構造物を各疾患部位に挿入するにおいて、各種の副作用が多く報告されている。従って、幹細胞の治療効果を高める為に臨床的な適用が容易で、生体毒性を全く有しない新たな支持体開発の要求が台頭されている。
【０００５】
本明細書全体に亙り多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体が本明細書に参照として挿入され、本発明が属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者等は上述した当業界の要求を解決する為に、鋭意研究努力した結果、幹細胞の構造支持体として炭素ナノチューブが細胞毒性が無く、移植された幹細胞の被移植組織におけるネットワーキングに卓越な効果を発揮し、in-vivoにおいて実際的に改善された幹細胞治療効果を発揮するということを確認することにより、本発明を完成するようになった。
【０００７】
従って、本発明の目的は細胞無毒性幹細胞移植用構造支持体を提供することにある。
本発明の他の目的は改善された治療効能を発揮する幹細胞治療剤組成物を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は幹細胞を利用した細胞治療方法を提供することにある。
本発明の他の目的は細胞治療剤薬物（medicament）を製造する為の炭素ナノチューブの用途を提供することにある。
本発明の他の目的及び利点は下記の発明の詳細な説明、請求範囲及び図面によりさらに明確になる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様によれば、本発明は炭素ナノチューブ（carbon nanotube）を含む細胞無毒性幹細胞移植用構造支持体（scaffold）を提供する。
本発明の他の態様によれば、本発明は(a)幹細胞；及び(b)細胞無毒性幹細胞の構造支持体としての炭素ナノチューブを有効成分として含む幹細胞治療剤組成物を提供する。
【０００９】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は(a)幹細胞；及び(b)幹細胞の細胞無毒性構造支持体としての炭素ナノチューブを有効成分として含む幹細胞治療剤組成物を動物に投与する段階を含む幹細胞を利用した細胞治療方法を提供する。
【００１０】
本発明の他の態様によれば、本発明は細胞治療剤薬物（medicament）を製造する為の(a)幹細胞；及び(b)幹細胞の細胞無毒性構造支持体としての炭素ナノチューブを有効成分として含む組成物の用途(use)を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
以上詳細に説明した通り、本発明は新規の細胞無毒性幹細胞移植用構造支持体を提供する。さらに、本発明は改善された治療効能を発揮する幹細胞治療剤組成物を提供する。CNTを含む本発明の幹細胞移植用構造支持体は、生体内に移植された幹細胞被移植組織から分化して周囲の細胞等とネットワーキングをなすにおいて、極めて優れた支持体特性を呈し、結局このような支持体を含む本発明の治療剤組成物は実際的に疾患動物から改善された幹細胞治療効能を表わす。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明者等は、幹細胞治療技術(stem cell therapy)の大きな障害物である被移植組織と分化された幹細胞のネットワーク形成問題を克服する為に、幹細胞の構造支持体を開発しようと努力した結果、炭素ナノチューブが細胞に毒性が無く、移植された幹細胞の被移植組織におけるネットワーキングに卓越な効果を発揮し、in-vivoで実際的に改善された細胞治療効果を発揮することを確認した。
【００１３】
本発明で幹細胞支持体として利用される炭素ナノチューブはフラーレン(fullerenes)の一つの形態として、フラーレンは炭素-ケージ(carbon cage)分子集団を意味する。このフラーレンは円形（ブッキボール）又はチューブ（ナノチューブ）のような形態を有し得る。
【００１４】
本明細書で用語“炭素ナノチューブ(carbon nanotube:CNT)”は炭素-ケージ分子集団を意味する為に使われたものにして、フラーレン、炭素ブッキボール及び炭素ナノチューブを包括する意味を有するものの、好ましくは、チューブの形態を有するフラーレンつまり炭素ナノチューブを指示する。さらに、炭素ナノチューブは凝集(aggregation)程度により、炭素ナノファイバー(carbon  nanofiber)と炭素ナノ粒子(carbon  nanoparticles)とも表現できる。一方、炭素ナノチューブは密閉された円形多重層殻、多重壁ナノチューブ(multi-wall  nanotube)又は単一壁ナノチューブ(single-wall  nanotube)として存在し得る。好ましくは、本発明で利用される炭素ナノチューブは単一壁ナノチューブである。本発明の好ましい具現例によれば、本発明で利用される炭素ナノチューブは官能基化(functionalized)CNTである。CNTに結合される官能基は例えば、チオール基及びカルボキシル基を含む。官能基化CNTはCNT分子間の凝集(aggregation)を減少させる。本発明で利用される炭素ナノチューブの炭素数は特に制限されず、好ましくは、C20-C150である。本発明で利用される炭素ナノチューブは当業界に公知された多様な方法を通じて製造できる（参照：米国特許第5,753,088号、第5,641,466号、第5,292,813号及び第5,558,903号）。
【００１５】
CNTは1991年に発見されて以降、継続的にその用途と特徴機能に対する研究が全世界的に継続されており、その利用度が漸次高まりつつある未来のナノ技術の最先端素材と言える。CNTは一般的に、極めて強く流動的で電気伝導体として作用し得るのみならず、水溶性、脂溶性の特徴を共に有していて(Mattson MP, et al.,J Mol Neurosci 14(3):175-82,2000)、他の多くの分子的物質等の移動通路となり得ると知られている（Nadine  Wong  Shi  Kam  et  al.,  JACS  126:6850-6851,  2004;  Nadine  Wong  Shi  Kam  et  al.,  JACS  127:6021-6026, 2005）。さらに、生体で薬物送達システムとしてのCNTに対する研究もある（Zhu  Yinghuai,  et  al.,  JACS  127:9875-9880, 2005）。このような特徴等によりCNTが関心を浴びているものの、生体に適用しようとする努力は事実上多くの研究がなされていない。
本発明は従来のCNT物質を幹細胞に対する構造的支持体としての用途を初めて究明したものである。
【００１６】
CNTを含む本発明の幹細胞移植用構造支持体は、生体内に移植された幹細胞被移植組織において、分化して周囲の細胞等とネットワーキングをなすにおいて、極めて優れた支持体特性を呈する。下記の実施例で立証した通り、本発明のCNT幹細胞支持体は細胞に対する接着性が優れて細胞密度を向上させ、細胞等間の凝集性(adhesion)も向上させる作用をし、しかも細胞に毒性がない。このようなCNTの特性は移植された幹細胞が移植部位でその機能を十分に発揮できるように、被移植組織とのネットワーク形成に寄与し、移植部位で洗い去られる現象を抑制する。
【００１７】
特に、CNTを含む本発明の幹細胞構造支持体は従来の種々の構造的支持体とは別に、炭素ナノ粒子として注射で幹細胞と共に容易に移植が可能であり、細胞の電気生理学的作用をシリコンのように妨げず、かえってその作用を助ける作用をなし得る点でも極めて有利な効果を発揮する。さらに、本発明に利用されるCNTは炎症反応をかなり減らし得る利点も有している（Shvedova  AA,  et al.,  Am.  J  Physiol  Lung  Cell  Mol  Physiol,  in  print,  2005）。
【００１８】
一方、CNTは容易に幹細胞治療剤と混合物を形成して、注射で所望する部位に注入することから、その分手術による他の副作用を最小化できる長所を有している。さらに、注入されたCNTはそれ自体で時間が経ちながら構造体を形成し、さらに、このような構造体は細胞間ネットワークを形成する為に適切であり、CNTの電気伝導性の為電気的誘導を通じて適宜所望する個所に移動が可能で、組織が壊れた個所で流動的に細胞と共に支持体の役割を十分に果たし得る。
【００１９】
本発明が適用される幹細胞は制限がなく、幹細胞の特性、つまり未分化、無限定増殖及び特定細胞への分化能を有する細胞は本発明が適用できる細胞である。本発明が適用される幹細胞は２種類に大別される：胚芽幹細胞(ES)及び胚芽生殖細胞(EG)を含む全能性幹細胞（pluripotent stem cell）と多能性幹細胞（multipotent  stem  cell）。胚芽幹細胞は胚盤胞の内部細胞塊(ICM)から由来され、胚芽生殖細胞は5-10週齢の生殖隆起(gonadalridge)の原始生殖細胞から由来される。一方、多能性幹細胞は胚芽組織、胎児組織及び成体組織で発見され、これは成体幹細胞を含む。全能性幹細胞はin-vitroで無限定増殖され、３種類の全胚芽層（外胚葉、中胚葉と内胚葉）から由来される多様な細胞に分化できる能力を有する。一方、多能性幹細胞はそれが由来された特定組織に分化できる能力を有し、自己再生産能力を典型的に有機体のライフタイムで制限される。多能性幹細胞のソースは全ての組織種類であり、特に骨髄、血液、肝臓、皮膚、腸、膵臓、脳、骨格筋及び歯髄から主に分離される。
【００２０】
本発明が適用される幹細胞は胚芽幹細胞、成体幹細胞、胚芽生殖細胞及び胚芽腫瘍細胞を含み、好ましくは、胚芽幹細胞及び成体幹細胞である。
【００２１】
本発明の治療剤組成物において、好ましくは、幹細胞分化誘導剤を追加的に含む。幹細胞分化誘導剤の好ましい例は、レチノ酸(retinoic acid)、アスコルビン酸(ascorbic acid)、メラトニン(melatonine)、又は種々の成長因子［例えば、GDNF(glial  cell  line-derived  neurotrophic  factor)、EGF(epidermal  growth  factor)、NGF  (nerve  growth  factor)］を含む。
【００２２】
本発明の治療剤組成物により治療できる疾病又は疾患は、幹細胞治療技術により治療することができるものとして知られた全ての疾病又は疾患を含む。好ましくは、本発明の治療剤組成物は神経疾患(neuronal disease)、心筋梗塞、脊椎損傷及び退行性関節炎治療に利用される。
【００２３】
本発明の好ましい具現例において、本発明の組成物に含まれる幹細胞は神経幹細胞（neural  stem  cell）であり、この場合治療剤組成物は神経疾患(neuronal  disease)治療用組成物となる。
【００２４】
本発明の組成物が神経疾患治療用組成物として製造される場合、この組成物により治療できる疾患は神経細胞の損傷により誘発される全ての神経疾患を含む。好ましくは、前記神経疾患は神経退行性疾患、及び虚血又は再灌流による疾患で構成された群より選ばれる。より好ましくは、前記神経退行性疾患はアルツハイマー病、ハンチントン疾病、パーキンソン疾病及び筋萎縮性側索硬化症で構成された群より選ばれ、最も好ましくは、パーキンソン疾病である。本発明の好ましい具現例によれば、前記虚血又は再灌流による疾患は虚血性脳卒中である。
【００２５】
CNTを含む本発明の幹細胞構造支持体は、従来の種々の構造的支持体とは別に炭素ナノ粒子として注射で幹細胞と共に容易に移植が可能である。従って、本発明の治療剤組成物の好ましい具現例によれば、炭素ナノチューブは炭素ナノ粒子の懸濁液形態で存在する。
【００２６】
本発明の組成物におけるCNTの含量は0.002-10mg/ml、好ましくは、0.01-1mg/ml、より好ましくは、0.01-0.5mg/ml、最も好ましくは、0.01-0.3mg/mlである。
【００２７】
本発明の治療剤組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に利用されるものにして、ラクトース、テキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルキネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイル等を含むものの、これに限定されるものではない。本発明の治療剤組成物は前記成分等の他に潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤等を追加して含み得る。薬剤学的に許容される担体及び製剤はRemington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)に詳細に記載されている。
【００２８】
本発明の治療剤組成物は非経口で投与することができ、局所注入(local injection)が最も好ましい投与方法である。
【００２９】
本発明の組成物の適合した投与量は製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因等により、多様に処方できる。一方、本発明の組成物の投与量は好ましくは、１回２×１０５−２×１０６細胞であり、通常的に１回又は２回投与される。
【００３０】
本発明の組成物は当該発明が属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施し得る方法により、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を利用して製剤化することにより、単位容量形態で製造されるか又は多容量容器内に入れて製造できる。この際、剤形はオイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液形態の場合もあって、分散剤又は安定化剤を追加的に含め得る。
【００３１】
本発明の治療剤組成物は、幹細胞の機能を十分に発揮できるように細胞間ネットワーキングを卓越に形成させ、実際的に疾患動物から改善された治療効能を呈する。
【００３２】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例はただ本発明をより具体的に説明する為のものであって、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例により制限されないということは、当業界で通常の知識を有する者において明らかなことである。
【実施例】
【００３３】
実験材料及び実験方法
細胞培養
本研究では神経細胞としてSK-NSH(ATCC)を利用し、DMEM(GIBCO)に10%牛胎児血清(FBS, GIBCO)を添加して製造された培地を含む細胞培養皿に培養した。又幹細胞はP19 EC(embryonal carcinoma)細胞(Cell  Bank,  Korea)を利用し、α-MEM(GIBCO)に7.5%牛血清(CS,GIBCO)と2.5%FBS(GIBCO)を添加して、製造された培地を含む細胞培養皿で培養した。さらに、星状膠細胞(astrocyte) A172(ATCC)を利用して研究を進めた。培地はSKN-SHと同一である。前記細胞等を利用して、CNTの細胞毒性と細胞付着性及び構造体形成可能性に対する研究を進めた。
【００３４】
炭素ナノチューブ
３種の炭素ナノチューブ、functionalized Single-Walled CNT(f-SWCNT)、functionalized  Multi-Walled  CNT(f-MWCNT)及びCNT炭素ナノファイバーを実験に利用した。これらの炭素ナノチューブの特性は下記表１の通りである。f-SWCNT及びf-MWCNTはカルボキシル酸であって、官能化(functionalization)されたものである。
【００３５】
【表１】
2009502308.tif 000003
【００３６】
ＣＮＴの細胞付着性と構造体形成可能性研究
培養されたそれぞれの細胞に単一壁ナノチューブ形態のCNT(IL JIN, Korea)を0.05mg/mlで処理し、37℃で5%恒温器で48時間培養した後、それぞれ細胞付着性と構造体形成を確認した。細胞の付着性は48時間後に電子顕微鏡(JEM 200CS, JEOL,Japan)を利用して付着程度を写真で確認した。直接付着性と構造体形成にCNTの効果を数値化する為に、本研究ではCNT処理後時間別に形態変化をそれぞれ観察し、このように観察された細胞の比率を同一にした後、遠心分離して細胞のCNT付着性と構造体形成による比重の差を数値化した。この数値は遠心分離後上層部位の培養液に1ml当り細胞の個数を表に示した。
【００３７】
細胞生存率測定
培養されたそれぞれの細胞にCNTを0.05mg/mlで処理して、37℃で5%CO2恒温器で培養した。CNTの処理後12時間乃至72時間後に各時間別に10μlのalarmablue溶液(Serotec,  UK)を各ウェルに添加した後、さらに３時間培養した。糸粒体の活性を測定する為に、還元されたalarmablueをELISAリーダ(Molecular  Devices,  Sunnyvale,CA)を利用して570nmで吸光度を測定した。吸光度の背景は600nmで測定して570nmの測定値から差し引いた。細胞の生存率は次のように求める：
細胞の生存率＝［（試料カウント）-（ブランクカウント）／（非処理対照群カウント）-（ブランクカウント）］×100(Shimoke  and  Chiba,2001)。
【００３８】
Mac-1免疫細胞化学染色
50%トリプシンを利用して細胞を引離して収集した後PBSで洗滌し、引き続きPoly-L-lysinで１時間コーティングしたスライドで７日間培養した。以降、細胞をPBSで洗滌した後、アセトン／メタノール(50%/50%)混合液で２分間固定して５分間乾燥させた。細胞をPBSで３回水洗後、細胞内に存在するパーオキシダーゼの効果を遮断し、細胞透過性を高める為に、エタノール内3%H2O2に10分間処理した。その後、細胞を10%非-免疫血清(Zymed Co.,  USA)で30分間処理後、Mac-1の１次抗体(Santacurz,  USA)を1:100の比率で希釈した後、37℃培養器で２時間反応させた。以降、細胞をPBSで水洗後２次抗体(biotinylated  anti-IgG,  VECTA)を37℃培養器で１時間反応させた。細胞をPBSで水洗した後、３次抗体（streptavidin  peroxidase  conjugated,  VECTA）で37℃培養器で１時間反応させた後、DAB溶液で発色した後、蒸留水を流してカバーガラスの背面を洗い、ヘマトキシリンで10秒程染色後、再度背面を水洗後マウント過程を経て光学顕微鏡で観察した。
【００３９】
DCF-DA染色
HCSS緩衝液(20mM HEPES, 2.3mM CaCl2,  120mM  NaCl,  10mM  NaOH,  5mM  KCl,  1.6mM  MgCl2及び15mM  グルコース)に溶解させた10μMのDCFDA(6-carboxy-2',7'-dichloro-dihydrofluoresceine  diacetate,  dicarboxymethylester,  Invitrogen)と懸濁補助剤である2%Pluronic F-127を培養した細胞に37℃で30分間処理した。細胞内自由ラジカルによるDCF蛍光は室温で水銀ランプ蛍光付属を備えたOlympus IX70倒立顕微鏡上で観察し、（Excitation=488nm, Emission=510nm）CCDカメラで画像を捕捉した後、NIH Image 1.65プログラムを利用して映像分析するか又は、Flow  cytometry(GENios,  Tecan,  NC,  USA)を利用してExcitation波長485nmとEmission波長510nmで測定した。
【００４０】
動物実験
種々の退行性疾患動物モデル
５週齢の雄マウスとラット(SAMTACO, Korea)を利用した。４週齢のラットを１週間適応させて脳虚血動物モデルを作った。脳に血液を供給する右腕の手首動脈にナイロン糸を挿入して30分後にナイロン糸を除去し、血液の循環を再開させ、傷口を縫合した。１週間このように手術した動物を飼育し、１週間目から多様な行動結合と関連した実験を行い、幹細胞治療剤或いはCNTと幹細胞の混合物を18-ケージ針を利用して注入し、効果の研究を行った。この場合、幹細胞のみを注入する場合には、細胞懸濁液 (40000細胞／μl) 5μlを注入し、CNTと幹細胞の混合物を注入する場合には、細胞懸濁液２×１０５細胞及びCNT 0.02mg/mlの混合物5μlを注入した。
【００４１】
アルツハイマー性動物モデルは、５週齢マウスを利用して作った。本実験ではstereotaxicシステムを利用して所望する部位にアミロイドβ 1-42蛋白質(Biosource CA USA)を注入してアルツハイマーモデルを作った。本研究ではアミロイドβ蛋白質を脳室(intraventricular zone)に注入した。ここは左右連結されている脳室にして、左右半球全てからアミロイドβ蛋白質の影響を受けるようになる。本モデルの場合、十分に影響を持たせる為に、１週間後に再度同じ方法でアミロイドβ蛋白質を注入して、再び２週間後から行動実験を行い、幹細胞治療剤或いはCNTと幹細胞治療剤を注入した。治療剤注入量は前記の通りである。
【００４２】
パーキンソン疾患動物モデルは、５週齢マウスの黒質(substantial nigra)部位にstereotaxicシステムを利用して6-OHDA(6-hydroxydopamine)を注入して適切に線条体(striatum)のドーパミン性神経細胞を選択的な死滅を誘導して作った。本モデルの場合は２週間後に動物行動実験を行い、再度３日後から幹細胞治療剤或いはCNTと幹細胞の混合物をそれぞれ注入する方法で効果を確認した。治療剤の注入量は前記の通りである。
【００４３】
炭素ナノチューブの注入
炭素ナノチューブの動物への注入は、動物にCNT(f-SWCNT又はf-MWCNT)を単独で注入する時、0.2mg/2mlの濃度で注入し、細胞と共に移植する時は移植の直前に0.2mg/1mlと200000個/1mlの濃度に混合してこれを行った。この際、注入１時間前にCNTを十分にultrasonicationを通じて一つ一つのCNTに落して利用した。
【００４４】
行動実験
８-方迷路実験
８個の迷路を有する透明なアクリル材質の放射状迷路（radial arm maze）を使用した。放射状迷路は径が40cm、高さ30cm、一辺の長さが15cmの８角形の中央プラットホーム（central platform）を有しており、これを中心に長さが70cm、幅9cm、高さ8cmの空間を有する８個の迷路が放射状に延びている形態に製作した。中央プラットホームと迷路間には開閉自在な扉があり、この迷路の終着地点には、補償を提供する飲食皿(5cm×5cm×2.5cm)が動かないように固定させた。飲食皿は不透明で深さがあって中央プラットホームでは補償として提供される水の有無が見えないようにした。放射迷路の周囲には視覚端緒なるような実験台、窓、ゴミ箱、冷房器等の位置を固定的に維持した。実験者も亦視覚端緒となるので、常に一定した位置で実験を実施した。
幹細胞を全く注射しない動物と、幹細胞治療剤のみを注射した個体、さらに、幹細胞治療剤とCNT混合物を注射した個体で放射迷路学習を実施した。作業記憶による学習は放射迷路の全ての迷路（８個）にある水を探当てて飲む時間と、施行毎の誤謬回数で測定し、参照記憶の学習は４個の迷路にだけ水を備えて置き、学習をさせて迷路の水を全部探して飲む時間と施行毎の誤謬回数で測定した。
【００４５】
最初の実験対象の鼠の場合、実験開始30時間前から水を剥奪して渇症を誘発させ、実験初日には８個の迷路に通ずる通路を遮断したまま、動物を中央のプラットホームに５分間入れて置いて実験状況に適応するようにした。翌日から学習を開始し、実験開始15分前に飼育室で行動観察室に移して急迫な移動に伴う鼠の諸般変化を防止した。毎日１回施行の学習後には鼠を飼育室に戻して30分間水を与えた後、翌日の施行まで水を剥奪した。
【００４６】
作業記憶の学習手順：作業記憶を利用した学習は各迷路の終着地点にある８個の飲食皿全てに0.1mlの水を備えておき、迷路の扉が閉じられた状態で白鼠を中央プラットホームに位置させ、約１分間放射状迷路に適応させた後、８個の迷路の扉を同時に開けて、白鼠が自在に歩き回れるようにした。鼠が８個の迷路を１回ずつ訪問して迷路で水を全て摂取したか、若しくは制限時間５分を超えると１つの施行を終了した。毎施行毎に水は１回に限定して供給した。水がある迷路に入ってからも水を摂取しなかったり、鼠が１度訪問して水を摂取した迷路を２回以上訪問すれば、誤謬を犯したものと見做してその回数を記録し、８個の迷路全部を訪問して水を全て摂取するまでの時間も共に記録した。この際、誤謬率は既に訪問した迷路に再び訪問した数と水がある迷路に入ってからも水を摂取できなかった回数を、総訪問した迷路の数で割って百分率で表示した。
【００４７】
この課題では制限時間５分内に各迷路を１回ずつ訪問して、総８回目の訪問時に水を全て摂取するのが最も効率的な遂行となる。誤謬率が5%以下に落ちると学習が終了したものと見做して実験を終了した。
【００４８】
参照記憶の学習手順：参照記憶を利用した学習は各迷路の終着地点がある８個の飲食皿の内，特定４個の飲食皿にのみ0.1mlの水を備えて置いて、迷路の扉が閉まった状態で白鼠を中央プラットホームに位置させ、約１分間放射状迷路に適応させた後、８個の迷路の扉を同時に開けて白鼠が自在に歩き回れるようにした。鼠が水がある特定４個の迷路を訪問して水を全て摂取したか、若しくは、制限時間５分を超えると１つの施行を終了した。毎施行毎に水は１回に限定して供給し、水がある迷路に入ってからも水を摂取しなかったり、水がない迷路を訪問すれば、誤謬を犯したものと見做してその回数を記録し、水がある４個の迷路を全て訪問して水を全部摂取するまでの時間も共に記録した。誤謬率は水がある迷路に入ってからも水が摂取できなかったり、水がない迷路を訪問した数を総訪問した迷路の数で割って百分率で表示した。
【００４９】
この課題では制限時間５分内に水がある４個の迷路のみを１回ずつ訪問して、総４回目の訪問時に水を全て摂取するのが最も効率的な遂行となる。誤謬率が5%以下に落ちると学習が終了したものと見做して実験を終了した。
【００５０】
水迷路(water  maze)実験
本研究では、空間知覚能力及び記憶能力を確認する為に、Morris water maze実験方法（Morris,  R.,  Developments  of  a  water-maze  procedure  for  studying  spatial  learning  in  the  rat.  J.  Neurosci.  Methods  11:47-60(1984)）を利用して学習及び記憶力能力を測定した。各実験群の動物を５日間水迷路でプラットホームを探して行けるように１日にそれぞれ４方向で４回ずつ学習をさせた。各学習間の間隔は少なくとも25分を基準とした。５日間学習をさせた動物は６日目になった時、プラットホームを取り除いて、どれ程プラットホームのある所を探して行けるのかを測定して数値化した。
【００５１】
受動回避実験（passive  avoidance）
刺戟による受動回避実験を通じて学習と記憶がどれ程早く進行され、かつ持続されるかを調べた。本研究では各動物を利用して４日間騒音と光から、暗くて静かな所に移動できるように学習を進行した。本学習では20秒以下に各刺戟を避けて暗空間に移動すると、学習が進行されたものと判断した。さらに、刺戟が発生する空間で180秒間適応を経て以後に刺戟が始まり、刺戟のない暗空間に移動できるように扉が開くようになる。この際、刺戟は高出力の騒音と明るい光で定義し、最大90秒間持続するようにした。さらに、刺戟のない暗空間に移動する場合には、直ぐに扉が降りて全ての刺戟は除去され、ここでも60秒間本学習状況を認知させる過程を経るようになる。このように４日間持続的に学習をさせ、５日目に暗空間に動物が移動する場合、0.1mAの刺戟を３秒間動物に加えて、以降暗空間に移動する場合、電気的刺戟が存在することを認知させる。さらに、このようなshock学習以降２日後に再度学習させるのと同一な状況で暗空間への移動時間を測定した。この際、無刺戟暗空間に移動しても電気的刺戟はなく、移動時間が短い程学習及び記憶に損傷があると判断した。
【００５２】
実験結果
in-vitroでCNTの細胞との結合性と細胞の凝集性に及ぼす影響
先ず、本研究ではCNTが神経細胞を含む多様な細胞等と結合できるか否かを確認する為に、時間別に各細胞にCNTを処理し、12時間から72時間まで変化を観察した。実際、幹細胞の構造的支持体としてその役割を果たす為には、多様な細胞等と自在に接合できなければならず、移植された幹細胞の結集が誘導されなければならない。従って、各時間帯で細胞の凝集にどのような影響を及ぼすかを調べる為に、細胞の凝集力と細胞の重さの変化等を確認した。
【００５３】
電子顕微鏡写真の図１で確認できるように、CNTは幹細胞であるP19 EC細胞に付着性を有することが分かった。さらに、神経細胞であるSK-NSH及び星状膠細胞にもCNTが結合することを確認した。
【００５４】
図１で確認したCNTの細胞に対する結合性が細胞の凝集性(adhesion)にどのような影響を及ぼすかを確認した。CNTが処理された状況で多様な細胞等の凝集性を確認する為に、細胞培養皿で細胞密度(density)を確認した。図２に示された通り、CNTを処理した時、全ての細胞から凝集性が向上したことを発見し、特に、幹細胞と神経細胞において極めて大きく向上することを確認することができた。しかしながら、星状膠細胞の場合、他の細胞等に比べて凝集性程度が大きく向上されなかった。
【００５５】
結論的に、CNTは神経細胞及び幹細胞に結合するばかりでなく各細胞の凝集性を向上させ得ることが分かる。
【００５６】
炭素ナノチューブによる微細膠細胞腫の細胞生存率に及ぼす影響分析
鼠の脳細胞の内、微細膠細胞腫であるBV-2細胞(ATCC, USA)で多様なCarbon Nanotube(CNT)による毒性及び細胞生存率に及ぼす影響を調べる為に、CNTを処理する２時間前に1% FBSを含むDMEM培地で細胞を培養し、CNTにより誘発された細胞生存率測定は、alamarBlue assayで測定した。本実験に使用したCNTはfunctionalized  Single-Walled  CNT(f-SWCNT)、functionalized  Multi-Walled  CNT(f-MWCNT)及びCNT  fiber等の３種を利用し、濃度は10、100、1000及び10000ug/mlで処理して12時間間隔で48時間まで観察した。この際、時間及び濃度依存的に細胞生存率にどのような変化を誘発するかを確認した。
【００５７】
図３（ａ）に示した通り、f-SWCNTをそれぞれ10、100、1000及び10000ug/mlで処理して48時間まで観察した結果、濃度と時間全ての要因において大きな差がなく、細胞生存率には殆ど影響を及ぼさないものとして表れた。さらに、図３（ａ）及び図３（ｂ）に示された通り、f-MWCNT及びCNT fiberをそれぞれ使用して、前記の濃度と時間に沿って測定した結果からも別段の細胞生存率変化が表れなかった。さらに、細胞の外形的変化と生きている細胞と死んだ細胞とを直接的に表わした実験にして、PIとFDA染色を行い、細胞死滅有無程度を確認した。赤色蛍光を示すPI染色は死んだ細胞を、緑色蛍光を示すFDA染色は生きている細胞を表わす。図３（ｄ）は、最も高い濃度の10000ug/mlのf-SWCNT、f-MWCNT、CNT  fiberをそれぞれ処理した後、48時間以降の写真を示す。図３（ｄ）に示した通り、赤色の蛍光を帯びる細胞が殆ど表れないことが確認できた。CNTそれぞれの３種より全て同じ様相を示し、これは３種のCNTを低濃度から高濃度まで処理した場合、細胞の死滅誘発、つまり、細胞生存に殆ど影響を及ぼさないことを示す結果と言える。
【００５８】
以上の結果を綜合してみれば、f-SWCNT、f-MWCNT及びCNT  fiber等は10000ug/ml濃度以下の場合、細胞死滅や生存に影響を及ぼさないので、微細膠細胞に毒性がないものと判断される。従って、炭素ナノチューブの細胞治療剤のスカフォルドとしての安定性は優れている。
【００５９】
微細膠細胞における炭素ナノチューブによる炎症誘発有無確認
鼠の微細膠細胞腫であるBV-2細胞において、functionalized  Single-Walled  CNT(f-SWCNT)、functionalized  Multi-Walled  CNT(f-MWCNT)及びCNT  fiver等の３種のCNTを利用して100ug/mlで処理して24時間後の炎症反応を示す微細膠細胞の活性化をMac-1免疫細胞化学染色を施行して観察した。図４に示した通り、f-SWCNT、f-MWCNT及びCNT  fiber  100ug/mlを処理した結果、対照群に比べて有意な変化を観察することができなかった。従って、CNTによって炎症反応は表れないものと判断できる。一番右側の写真は1ug/mlのLPSを処理したものであって、positive  controlとして使用したものである。下記のグラフは本Mac-1免疫細胞化学染色を定量化して表したグラフにして、同一な結果を表す。
【００６０】
微細膠細胞における炭素ナノチューブによる活性期酸素発生有無確認
酸化的ストレスの主要因である活性期酸素は細胞の死滅、生存、分化及び炎症反応等の多様な細胞信号伝達に影響を及ぼす。その中で刺戟や環境によって発生した酸化的ストレスは炎症反応においても重要な信号伝達メカニズムを活性化させ、下位信号伝達体系を伝達するものと知られている。従って、炭素ナノチューブにより炎症反応と関連して活性期酸素の発生を確認する為、鼠の微細膠細胞腫であるBV-2細胞からfunctionalized  Single-Walled  CNT(f-SWCNT)、functionalized  Multi-Walled  CNT(f-MWCNT)及びCNT  fiver等の３種のCNTを利用して、10、100、1000及び10000ug/mlで処理して1、2及び６時間まで活性期酸素腫がどれ程発生したかをDCF-DA染色を行って観察した。図５（ａ）に示した通り、f-SWCNT、f-MWCNT及びCNT  fiberを濃度別に時間別に処理した結果、有意な活性期酸素の発生は観察されなかった。この結果は、Fluoremeterを利用した定量化した結果(図5（b）)からも同一な結果を表した。従って、CNT自体によっては自己毒性及び細胞生存に影響を与えず、炎症反応においても或る誘発刺戟となり得ないのみならず、活性期酸素発生にも大きな影響を与えないものとして確認された。
従って、CNTは幹細胞移植用スカフォルドとして極めて安定性の優れた素材であることが分かる。
【００６１】
CNT注入によるマウスの脳におけるin-vivo毒性有無
前記実験結果を通じて、本研究陣はCNTのみのin-vitro細胞毒性はないものと確認し、CNTを臨床適用する前に追加的にin-vivo毒性を調査した。CNTのin-vivo毒性を確認する為に、５週齢鼠の脳の縁側脳室部位にCNT(f-SWCNT又はf-MWCNT)を直接注入して、５週間の間手術した鼠の生存率を確認した。
【００６２】
図６に示した通り、CNT注入は鼠に何等の影響も及ぼさなかった。さらに、CNT注入が神経細胞死滅や、細胞流失(cell loss)のような悪影響を表わさないということを組織染色を通じて確認した。
従って、本研究結果を基にCNTはin-vivo毒性を全く有せず、脳機能異常を誘発しないことが分かる。このような非毒性結果を基にしてCNTを幹細胞と共に移植して治療効果を確認した。
【００６３】
幹細胞及びCNTの混合物によるパーキンソン疾患治療効果
本実験は、6-OHDAにより作られたパーキンソンマウスモデルを利用してCNT(f-SWCNT又はf-MWCNT)と幹細胞混合物のパーキンソン疾患治療効果を確認した。
図７に示した通り、幹細胞単独移植治療効果よりもCNTと幹細胞を共に移植した疾患動物から、その改善効果がさらに優れたことが分かる。このような改善された治療効果はCNTが幹細胞の効果的な神経ネットワーク形成に大きく一助した為と判断される。
【００６４】
脳虚血動物モデルにおいて幹細胞とCNTの相互作用による行動異常治療効果
脳虚血動物モデルから幹細胞の治療効果を向上させる為にCNTが全臨床的に効果の有無を確認した。
図８（ａ）に示した通り、脳虚血動物モデルからCNTを幹細胞と共に脳損傷部位に注入した時、幹細胞のみを注入したものより行動病症治療効果が優れ、空間知覚力と学習及び記憶力回復治療に優れた効果があった。図８（ａ）で潜伏時間(latency)が長引く程記憶力が上昇したことを意味する。
【００６５】
一方、図８（ｂ）は受動回避行動実験を移植後１週毎に別の個体群を以て行い、統計処理した結果である。本結果から確認できるように脳虚血動物モデルから幹細胞のみを移植した場合よりも、CNTを利用した幹細胞移植の場合、その治療効果がより速やかで有意に増加することが分かる。幹細胞のみを移植した場合、少なくとも４週以上経って初めて認知及び学習力低下の改善効果が表われたものの、CNTを利用した移植の場合、２週目にその効果が表れた。のみならず、CNTは幹細胞の長期生存を助けることにより、持続的な治療効果を呈することを確認した。
【００６６】
アルツハイマー疾患における幹細胞とCNTを利用した行動及び認知機能改善効果
アルツハイマー動物モデルを利用して、８方迷路テストを通じてSAT(spatial alteration task)を確認した。図９に示した通り、幹細胞のみを注入した時よりCNTを利用した幹細胞移植が記憶力改善にさらに大きい効果があった。特に、移植１週間後から８日間記憶力テストを行った結果、CNTと幹細胞を共に移植した場合、安定的で持続的に記憶力が向上することを確認することができ、この結果は幹細胞のみを移植したものとは著しい差を表すものである。
【００６７】
以上で本発明の特定した部分を詳細に記述したところ、当業界の通常の知識を有する者においてこのような具体的な技術は単に好ましい具現例であるのみ、これに本発明の範囲が制限されるものではない点は明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は添付された請求項とその等価物により定義されると言える。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】炭素ナノチューブ(CNT)のP19 EC幹細胞に対する付着性を示す電子顕微鏡写真。
【図２】細胞凝集性に対するCNTの影響を示すグラフ。
【図３（ａ）】-
【図３（ｃ）】はCNTのin-vitro細胞毒性有無を確認した実験結果を示すグラフ。図３（ａ）-図３（ｃ）はそれぞれfunctionalized  Single-Walled  CNT(f-SWCNT)、functionalized  Multi-Walled  CNT(f-MWCNT)、及びCNT  fiberに対する実験結果。
【図３（ｄ）】CNTのin-vitro細胞毒性有無をPIとFDAを利用した細胞染色で分析した結果写真。
【図４】CNTによる炎症反応誘発可否を分析した実験結果を示す。
【図５（ａ）】CNTによる活性期酸素発生可否を分析したDCF-DA染色結果の写真。
【図５（ｂ）】CNTによる活性期酸素発生可否を分析したFluoremeter測定結果。
【図６】CNTin-vivo毒性有無を確認した実験結果を示すグラフ。
【図７】CNTと幹細胞混合治療剤のパーキンソン疾患動物モデルにおける治療効能を示すグラフ。
【図８（ａ）】CNTと幹細胞混合治療剤の脳虚血動物モデルにおける記憶力回復能を示すグラフ。
【図８（ｂ）】CNTと幹細胞混合治療剤の脳虚血動物モデルにおける受動回避行動実験結果を示すグラフ。
【図９】CNTと幹細胞混合治療剤のアルツハイマー動物モデルにおける認知機能改善効能を示すグラフ。
【図１】
2009502308.tif 000004
【図２】
2009502308.tif 000005
【図３（ａ）】
2009502308.tif 000006
【図３（ｂ）】
2009502308.tif 000007
【図３（ｃ）】
2009502308.tif 000008
【図３（ｄ）】
2009502308.tif 000009
【図４】
2009502308.tif 000010
【図５（ａ）】
2009502308.tif 000011
【図５（ｂ）】
2009502308.tif 000012
【図６】
2009502308.tif 000013
【図７】
2009502308.tif 000014
【図８（ａ）】
2009502308.tif 000015
【図８（ｂ）】
2009502308.tif 000016
【図９】
2009502308.tif 000017
【手続補正書】
【提出日】平成20年2月19日(2008.2.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
図３（ａ）に示した通り、f-SWCNTをそれぞれ10、100、1000及び10000ug/mlで処理して48時間まで観察した結果、濃度と時間全ての要因において大きな差がなく、細胞生存率には殆ど影響を及ぼさないものとして表れた。さらに、図３（ｂ）及び図３（ｃ）に示された通り、f-MWCNT及びCNT fiberをそれぞれ使用して、前記の濃度と時間に沿って測定した結果からも別段の細胞生存率変化が表れなかった。さらに、細胞の外形的変化と生きている細胞と死んだ細胞とを直接的に表わした実験にして、PIとFDA染色を行い、細胞死滅有無程度を確認した。赤色蛍光を示すPI染色は死んだ細胞を、緑色蛍光を示すFDA染色は生きている細胞を表わす。図３（ｄ）は、最も高い濃度の10000ug/mlのf-SWCNT、f-MWCNT、CNT  fiberをそれぞれ処理した後、48時間以降の写真を示す。図３（ｄ）に示した通り、赤色の蛍光を帯びる細胞が殆ど表れないことが確認できた。CNTそれぞれの３種より全て同じ様相を示し、これは３種のCNTを低濃度から高濃度まで処理した場合、細胞の死滅誘発、つまり、細胞生存に殆ど影響を及ぼさないことを示す結果と言える。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３（ａ）
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３（ａ）】
2009502308.tif 000018
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３（ｂ）
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３（ｂ）】
2009502308.tif 000019
【国際調査報告】
2009502308.tif 000020
2009502308.tif 000021
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