(57)【要約】本発明は、抗ＨＥＲ２抗体およびＮＫ細胞活性化因子ＭｉｃＢを含む融合ポリペプチド、ならびに、それらの生成および治療用途のための方法に関する。本発明は、部分的には、抗ＨＥＲ２抗体およびＭｉｃＢの融合ポリペプチドがＨＥＲ２発現細胞の細胞殺傷の増強を示すという発見に基づく。従って、これらの分子は、ガン治療のための抗ＨＥＲ２抗体の有効性を増強するために用いられ得る。１局面では、本発明は、抗ＨＥＲ２抗体または抗原結合フラグメントおよびＭＩＣＢまたはＮＫＧ２Ｄレセプターを結合するフラグメントを含む融合ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、この融合ポリペプチドは、抗体または抗原結合フラグメントとＭＩＣＢまたはフラグメントとの間にリンカーをさらに含む。ある実施形態では、このリンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号５）を含む。
2009514537.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合ポリペプチドであって：
（ａ）ＨＥＲ２に結合する抗体または該抗体の抗原結合フラグメント；および
（ｂ）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性化ポリペプチドであって、ＭＩＣＢまたはＮＫＧ２Ｄレセプターに結合するそのフラグメントである、ＮＫ細胞活性化ポリペプチド、
を含む、融合ポリペプチド。
【請求項２】
前記抗体または抗原結合フラグメントと前記ＮＫ細胞活性化ポリペプチドとの間にリンカーをさらに含む、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３】
前記リンカーがアミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号５）を含む、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
前記融合ポリペプチドがＭＩＣＢの細胞外ドメインを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
前記融合ポリペプチドが、少なくとも２つのコピーのＭＩＣＢまたはそのフラグメントを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
前記抗体または抗原結合フラグメントが２つの重鎖を含み、かつ該重鎖の各々が少なくとも１つのコピーのＭＩＣＢまたはそのフラグメントを含む、請求項５に記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
前記活性化ポリペプチドが前記抗体のカルボキシ末端に融合される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項９】
前記抗体がヒト化される、請求項８に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１０】
前記モノクローナル抗体が：ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−７、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８およびトラスツマブからなる群より選択される、請求項９に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１】
前記モノクローナル抗体が、ＨＥＲ２に対するトラスツマブの結合をブロックする、請求項８に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドを含む薬学的組成物。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１５】
請求項１３に記載の核酸分子を含むか、または該核酸分子を含むベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１５に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドを生成するための方法。
【請求項１７】
ＨＥＲ２を発現する細胞を殺傷する方法であって、ナチュラルキラー細胞の存在下で請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドに対してＨＥＲ２を発現する該細胞を暴露させる工程を包含する、方法。
【請求項１８】
ＨＥＲ２を発現する細胞を含む腫瘍を有する患者を処置する方法であって、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドの有効量を該患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１９】
ＨＥＲ２を発現する細胞を含む腫瘍を有する患者を処置する方法であって、請求項１２に記載の薬学的組成物を該患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２０】
請求項１８または１９に記載の方法であって、前記患者に対して：増殖阻害因子、化学療法剤、ＥＧＦＲインヒビター、チロシンキナーゼインヒビター、または血管新生阻害剤を投与する工程をさらに包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、抗ＨＥＲ２抗体およびＮＫＧ２ＤリガンドＭｉｃＢを含む融合ポリペプチドであって、標的された腫瘍細胞の殺傷に有効である、融合ポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
従来のガン化学療法は、特異性を欠いており、全身的な毒性および標的細胞の薬物耐性を生じる。対照的に、標的された腫瘍特異的な免疫療法、例えば、受動的な抗体媒介性の免疫療法によって、腫瘍特異的な抗原に対する抗体の送達を介した腫瘍細胞の標的化殺傷が得られる。
【０００３】
標的化免疫療法の例は、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）腫瘍抗原に対する抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体での処置である。ＨＥＲ２の増幅／過剰発現は、侵攻性の疾患および不良な予後を伴う乳がんの初期の事象である。ＨＥＲ２の遺伝子増幅は、原発性乳癌の２０〜２５％で見いだされる（Ｓｌａｍｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：７０７−１２（１９８９）；Ｏｗｅｎｓら、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ  ７６：Ｓ６８  ａｂｓｔｒａｃｔ  ２３６（２００２））。ＨＥＲ２陽性の疾患は、低下した無再発性および全生存と相関する（Ｓｌａｍｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：１７７〜８２（１９８７）；Ｐａｕｌｅｔｔｉら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １８：３６５１〜６４（２０００））。ＨＥＲ２遺伝子の増幅は、リンパ節陽性疾患における再発までの時間の有意な減少および低い生存率（Ｓｌａｍｏｎら、（１９８７）；Ｐａｕｌｅｔｔｉら、（２０００））ならびにリンパ節陰性疾患における不良な転帰（Ｐｒｅｓｓら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １９９７；１５：２８９４〜９０４（１９９７）；Ｐａｕｌｅｔｔｉら、（２０００））を伴っている。マウスＨＥＲ２抗体４Ｄ５の組み換えヒト化バージョン（ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８、ｒｈｕＭＡｂ  ＨＥＲ２、トラスツマブまたはＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）；特許文献１）は、広範な事前の抗癌療法を受けているＨＥＲ２を過剰発現する転移性乳癌を有する患者で臨床的に活性である（非特許文献１）。
【特許文献１】米国特許第５，８２１，３３７号明細書
【非特許文献１】Ｂａｓｅｌｇａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１４：７３７〜７４４（１９９６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ガン治療のための抗ＨＥＲ２抗体の有効性を増強するためには、新規であって、かつより有効な治療が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の要旨
本発明は、抗ＨＥＲ２抗体およびＮＫ細胞活性化因子ＭｉｃＢを含む融合ポリペプチド、ならびに、それらの生成および治療用途のための方法に関する。本発明は、部分的には、抗ＨＥＲ２抗体およびＭｉｃＢの融合ポリペプチドがＨＥＲ２発現細胞の細胞殺傷の増強を示すという発見に基づく。従って、これらの分子は、ガン治療のための抗ＨＥＲ２抗体の有効性を増強するために用いられ得る。
【０００６】
１局面では、本発明は、抗ＨＥＲ２抗体または抗原結合フラグメントおよびＭＩＣＢまたはＮＫＧ２Ｄレセプターを結合するフラグメントを含む融合ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、この融合ポリペプチドは、抗体または抗原結合フラグメントとＭＩＣＢまたはフラグメントとの間にリンカーをさらに含む。ある実施形態では、このリンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号５）を含む。
【０００７】
ある実施形態では、この融合ポリペプチドは、ＭＩＣＢの細胞外ドメインを含む。ある実施形態では、この融合ポリペプチドは、少なくとも２つのコピーのＭＩＣＢまたはフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、この融合ポリペプチドは、この抗体または抗原結合フラグメントの各々の重鎖の上に１コピーのＭＩＣＢまたはフラグメントを含む。ある実施形態では、この活性化ポリペプチドは、抗体のカルボキシ末端に融合される。
【０００８】
ある実施形態では、この抗体は、モノクローナル抗体である。ある実施形態では、この抗体はヒト化される。ある実施形態では、このモノクローナル抗体は、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−７、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８およびトラスツマブからなる群より選択される。ある実施形態では、このモノクローナル抗体は、ＨＥＲ２に対するトラスツマブの結合をブロックする。
【０００９】
ある実施形態では、本発明は、本発明の融合ポリペプチドを含む薬学的組成物を提供する。
【００１０】
ある実施形態では、本発明は、本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。ある実施形態では、本発明は、このような核酸分子を含むベクターを提供する。ある実施形態では、本発明は、このような核酸分子またはベクターを含む宿主細胞を提供する。ある実施形態では、本発明は、本発明の融合ポリペプチドを生成するための方法であって、このような核酸分子またはベクターを含む、宿主細胞を培養するための工程を包含する方法を提供する。
【００１１】
ある実施形態では、本発明は、ＨＥＲ２を発現する細胞を殺傷する方法であって、ナチュラルキラー細胞の存在下でこの細胞を本発明の融合ポリペプチドに対して暴露させる工程を包含する方法を提供する。ある実施形態では、本発明は、ＨＥＲ２を発現する細胞を含む腫瘍を有する患者を処置する方法であって、本発明の融合ポリペプチドまたは薬学的組成物の有効量をこの患者に投与する工程を包含する、方法を提供する。ある実施形態では、これらの方法は、この患者に対して、増殖阻害因子、化学療法剤、ＥＧＦＲインヒビター、チロシンキナーゼインヒビター、または血管新生阻害剤を投与する工程をさらに包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
「乳癌（ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）」とは本明細書において、乳房の細胞または組織に関与するガンをいう。
【００１３】
「転移性（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ）」乳癌とは、乳房および所属リンパ節以外の身体の部分へ伝播されたガンをいう。
【００１４】
「非転移性（ｎｏｎｍｅｔａｓｔａｔｉｃ）」乳癌とは、乳房および／または所属リンパ節に限局されるガンである。
【００１５】
「有効な量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」という用語は、患者においてガンを処置するのに有効な薬物または薬物併用の量をいう。この薬物の有効量は、ガン細胞の数を減じ；腫瘍のサイズを減じ；末梢器官へのガン細胞浸潤を阻害し（すなわち、ある程度まで遅らせ、そして好ましくは停止する）；腫瘍転移を阻害し（すなわち、ある程度まで遅らせ、そして好ましくは停止する）；腫瘍増殖をある程度まで阻害し；ガンに関連する１つ以上の症状をある程度まで和らげ得る。この程度までこの薬物は既存のガン細胞の増殖を妨げるか、および／またはガン細胞を殺傷し得、これは、細胞増殖抑制性、および／または細胞傷害性であってもよい。有効量は、無病生存（ｄｉｓｅａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）（ＤＦＳ）を改善し、全生存（ｏｖｅｒａｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）（ＯＳ）を改善し、再発の確率を低下させ、再発までの時間を延ばし、遠隔再発（すなわち、乳房の外側の再発）までの時間を延ばし、ガンを治癒させ、乳癌の症状を改善し（例えば、乳癌特異的な調査を用いて計測される場合）、対側乳癌を軽減し、第二の原発性ガンの出現を軽減し得るなどである。
【００１６】
本明細書における「被験体（ｓｕｂｊｅｃｔ）」または「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」とは、ヒト被験体または患者である。
【００１７】
「トラスツマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））によって結合されるＨＥＲ２ドメインＩＶに結合する」抗体は、ＨＥＲ２ＥＣＤのおよそ４８９〜６３０（配列番号４）の残基を含むエピトープに結合する。好ましいこのような抗体は、トラスツマブ、またはそのそのアフィニティー成熟改変体であり、そして／または改変Ｆｃ領域（例えば、改良されたエフェクター機能を有する）を含む。
【００１８】
「ＨＥＲ２に対するトラスツマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））の結合をブロックする」抗体とは、ＨＥＲ２に対するトラスツマブの結合をブロックするか、またはＨＥＲ２に対する結合についてトラスツマブと競合することが実証され得る抗体である。このような抗体は、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ  Ｌａｎｅ編（１９８８）；またはＦｅｎｄｌｙら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５０：１５５０−１５５８（１９９０）に記載されるアッセイのような交差ブロックアッセイ（ｃｒｏｓｓ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ）を用いて特定され得る。
【００１９】
本明細書における「トラスツマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））エピトープ」とは、ＨＥＲ２の細胞外ドメインにおける領域であって、それに対して抗体４Ｄ５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０４６３）またはトラスツマブが結合する領域である。このエピトープは、ＨＥＲ２の膜貫通ドメインに近く、かつＨＥＲ２のドメインＩＶ内である。このエピトープに結合する抗体についてスクリーニングするために、交差ブロッキングアッセイ、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ  Ｌａｎｅ編（１９８８）、またはＦｅｎｄｌｙら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５０：１５５０〜１５５８（１９９０）に記載されるアッセイが行われてもよい。あるいは、抗体がＨＥＲ２のトラスツマブエピトープに結合するか否かを評価するためにエピトープマッピングが行われてもよい（例えば、シグナルペプチドを含んで番号付けする残基で、ＨＥＲ２  ＥＣＤを含めて、ほぼ５２９残基〜ほぼ６２５残基の領域での任意の１つ以上の残基）。当業者はまた、抗体ＨＥＲ２構造を研究して（Ｆｒａｎｋｌｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ５：３１７〜３２８（２００４））、ＨＥＲ２のどのエピトープが抗体に結合されるかを理解し得る。
【００２０】
本明細書における目的については、「トラスツマブ（ｔｒａｓｔｕｍａｂ）」、「ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）」および「ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８」とは、それぞれ図１および２に示される軽鎖および重鎖のアミノ酸配列を含む抗体をいう。
【００２１】
本明細書における目的のためには、「ＨＥＲ２陽性（ＨＥＲ２  ｐｏｓｉｔｉｖｅ）」なガンまたは腫瘍とは、正常な乳房の細胞または組織で見いだされるレベルを超えるレベルでＨＥＲ２を発現するガンまたは腫瘍である。このようなＨＥＲ２陽性は、ＨＥＲ２遺伝子増幅、および/または増大した転写、および／または翻訳によって生じ得る。ＨＥＲ２陽性腫瘍は、種々の方法で、例えば、タンパク質発現／過剰発現（例えば、ＤＡＫＯ  ＨＥＲＣＥＰＴＥＳＴ（登録商標））免疫組織化学アッセイを評価することによって、細胞中のＨＥＲ２核酸を評価することによって（例えば、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を介して、Ｖｙｓｉｓ  ＰＡＴＨＶＩＳＩＯＮ（登録商標）ＦＩＳＨアッセイとして含む１９９８年１０月公開、ＷＯ９８／４５４７９を参照のこと；サザンブロッティング；またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を含む）、血清のような生物学的な液体中でシェッド抗原（ｓｈｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ）（例えば、ＨＥＲ細胞外ドメイン）を測定することによって（例えば、１９９０年６月１２日発行の米国特許第４，９３３，２９４号；１９９１年４月１８日公開ＷＯ９１／０５２６４；１９９５年３月２８日発行米国特許第５，４０１，６３８号；ならびにＳｉａｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３２：７３〜８０（１９９０）を参照のこと）、または検出可能な標識、例えば、放射性同位体で必要に応じて標識される抗体に対して患者の身体内で細胞を暴露することによって特定され得、そして患者における細胞に対する抗体の結合は、例えば、放射能について外部スキャンニングによって、または抗体に対して前に暴露された患者から採取された生検を分析することによって評価され得る。さらに、ＨＥＲ２陽性のガンまたは腫瘍サンプルは、間接的に、例えば、ＨＥＲ２レセプターを通じて媒介される下流シグナル伝達、遺伝子発現プロファイリングなどを評価することによって特定され得る。
【００２２】
ＨＥＲ２の「ヘテロ二量体結合部位に結合する（ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  ａ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ）」ＨＥＲ２抗体は、ドメインＩＩにおける残基に結合し（そして必要に応じて、ドメインＩおよびＩＩＩのようなＨＥＲ２細胞外ドメインのドメインの他の残基にも結合し）、そしてＨＥＲ２−ＥＧＦＲ、ｈＥＲ２−ＨＥＲ３、またはＨＥＲ２−ＨＥＲ４ヘテロ二量体の形成を、少なくともある程度まで立体障害し得る。Ｆｒａｎｋｌｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ５：３１７〜３２８（２００４）は、ＨＥＲ２のヘテロ二量体結合部位に結合する例示的な抗体を図示しているＲＣＳＢ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＩＤ  Ｃｏｄｅ  ＩＳ７８）に寄託されたＨＥＲ２−ペルツズマブの結晶構造を特徴づける。
【００２３】
タンパク質「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」とは、遺伝子中にコードされた情報のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への、次いでタンパク質への変換をいう。
【００２４】
本明細書においては、目的のタンパク質（例えば、ＨＥＲ２）を「発現する（ｅｘｐｒｅｓｓ）」サンプルまたは細胞とは、タンパク質をコードするｍＲＮＡ、またはタンパク質であってそのフラグメントを含むタンパク質が、そのサンプルまたは細胞に存在することが確認されている、サンプルまたは細胞である。
【００２５】
「ネイティブな配列、天然の配列（ｎａｔｉｖｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」のポリペプチドとは、天然に存在するかまたは対立遺伝子の改変体を含む、天然に由来するあるポリペプチド（例えば、ＨＥＲレセプターまたはＨＥＲリガンド）と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドである。このような天然の配列ポリペプチドは、自然から単離されてもよいし、または組み換え手段もしくは合成方法によって生成されてもよい。従って、天然の配列ポリペプチドは、天然に存在するヒトポリペプチド、マウスポリペプチド、または任意の他の哺乳動物種由来のポリペプチドのアミノ酸配列を有してもよい。
【００２６】
本明細書における「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、広範な意味で用いられ、そして詳細には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多価特異的抗体（例えば、二価特異的抗体）および抗体フラグメントを、それらが所望の生物学的活性を示す限り、包含する。
【００２７】
「モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は本明細書において用いる場合、実質的に相同な抗体の集団由来の抗体をいう。すなわち、この集団を含む個々の抗体は、モノクローナル抗体の産生の間に生じ得る可能な改変体であって、一般には少量で存在する改変体を除いて、同一であり、そして／または同じエピトープに結合する。このようなモノクローナル抗体は代表的には、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を包含し、この標的結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列からの単一の標的結合ポリペプチド配列の選択を含むプロセスによって得られた。例えば、この選択プロセスは、複数のクローン、例えば、ハイブリドーマクローン、ファージクローンまたは組み換えＤＮＡクローンのプールからの固有のクローンの選択であってもよい。選択された標的結合配列は、例えば、標的についての親和性を改善するように、標的結合配列をヒト化するように、細胞培養中でのその産生を改善するように、そのインビボでの免疫原性を低下するように、多価特異的な抗体を生じるようになどのためにさらに変更されてもよいこと、そして変更された標的結合配列を含む抗体も本発明のモノクローナル抗体であることが理解されるべきである。代表的には、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各々のモノクローナル抗体は、ある抗原に対する単一の決定基に対する。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、それらが代表的には他の免疫グロブリンによって汚染されないという点で有利である。修飾子「モノクローナル（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）」とは、実質的に相同な集団の抗体から得られる抗体の特徴を示しており、任意の特定の方法による抗体の産生を要すると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って用いられるべきモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）；Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，第２版．１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−ＣｅＩｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３〜６８１，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１））、組み換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）、ファージディスプレイ技術（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４〜６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２２：５８１〜５９７（１９９１）；Ｓｉｄｈｕら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９〜３１０（２００４）；Ｌｅｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３〜１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７〜１２４７２（２００４）；およびＬｅｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９〜１３２（２００４）を参照のこと）、ならびにヒト免疫グロブリン遺伝子��またはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部または全てを有する動物におけるヒトまたはヒト様抗体を産生するための技術（例えば、ＷＯ１９９８／２４８９３；ＷＯ１９９６／３４０９６；ＷＯ１９９６／３３７３５；ＷＯ１９９１／１０７４１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５〜２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）；米国特許第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，５９１，６６９号（全てＧｅｎＰｈａｒｍ）；米国特許第５，５４５，８０７号；ＷＯ１９９７／１７８５２；米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；および同第５，６６１，０１６号；Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９〜７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ，３６８：８５６〜８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３６８：８１２〜８１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：８４５〜８５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：８２６（１９９６）；ならびにＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３：６５−９３（１９９５）を参照のこと）を含む種々の技術によって作成され得る。
【００２８】
本明細書におけるモノクローナル抗体は詳細には、「キメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）」抗体を包含し、ここでは、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列に対して同一であるかまたは相同であるが、この鎖の残りは、別の種に由来するかまたは別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体、ならびにこのような抗体のフラグメントにおける対応する配列に対して、それらが所望の生物学的活性を示す限り、同一であるかまたは相同である（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１〜６８５５（１９８４））。本明細書における目的のキメラ抗体としては、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿など）由来の可変ドメイン抗原結合配列およびヒト定常領域配列を含む「霊長類化された（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）」抗体、ならびに「ヒト化された（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）」抗体が挙げられる。
【００２９】
非ヒト（例えば、げっ歯類）の「ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）」型抗体は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であって、ここではこのレシピエントの超可変領域由来の残基は、所望の特異性、親和性および能力を有する、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類のような非ヒト種の超可変領域由来の残基で置換される（ドナー抗体）。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ｆｒｅｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ）（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基で置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでもよい。これらの改変は、抗体の能力をさらに洗練するために作成される。一般には、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、そして代表的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここでは全てまたは実質的に全ての超可変ループが非ヒト免疫グロブリンのループに相当し、そして全てまたは実質的に全てのＦＲは、ヒト免疫グロブリン配列のものである。このヒト化抗体は必要に応じてまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、代表的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３〜５９６（１９９２）を参照のこと。
【００３０】
ヒト化ＨＥＲ２抗体としては、参照によって本明細書に明確に援用される米国特許第５，８２１，３３７号の表３に記載されるような、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−７およびｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８またはトラスツマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））；ヒト化５２０Ｃ９（ＷＯ９３／２１３１９）；ならびにヒト化２Ｃ４抗体、例えば、本明細書に記載されるようなペルツズマブが挙げられる。
【００３１】
本明細書においては、「ペルツズマブ」および「ＯＭＮＩＴＡＲＧＴＭ」とは、それぞれ、図３および４に示される軽鎖および重鎖のアミノ酸配列を含む抗体をいう。
【００３２】
本明細書の「インタクトな抗体（ｉｎｔａｃｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」とは、２つの抗原結合領域およびＦｃ領域を含む抗体である。好ましくは、このインタクトな抗体は機能的なＦｃ領域を有する。
【００３３】
「抗体フラグメント（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）」は、インタクトな抗体の一部を含み、好ましくはその抗原結合領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ，Ｆａｂ’，Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；二重特異性抗体（ダイアボディ）（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）；直鎖状抗体（ｌｉｎｅａｒ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）；単鎖抗体分子（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）；および抗体フラグメントから形成される多価特異的抗体が挙げられる。
【００３４】
「天然の抗体（ｎａｔｉｖｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」とは、２つの同一の軽鎖（Ｌ）および２つの同一の重鎖（Ｈ）から構成される、約１５０，０００ダルトンの通常ヘテロ四量体の糖タンパク質である。各々の軽鎖は、１つの共有結合のジスルフィド結合によって重鎖に連結されるが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で変化する。各々の重鎖および軽鎖はまた、一定間隔の鎖内のジスルフィド結合を有する。各々の重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）、続いて多数の定常ドメインを有する。各々の軽鎖は、一端に可変ドメインを（ＶＬ）、そしてその他方の末端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第一の定常ドメインと整列され、そして軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列される。特定のアミノ酸残基が、軽鎖と重鎖の可変ドメインの間で境界を形成すると考えられる。
【００３５】
「可変（ｖａｒｉａｂｌｅ）」という用語は、可変ドメインの特定の部分が、抗体の間で配列が極めて異なるという事実を指しており、そして各々の特定の抗体の、その特定の抗原についての結合および特異性に用いられる。しかし、この変動は、抗体の可変ドメイン全体にわたって均一に分布するのではない。これは、軽鎖および重鎖の可変ドメインの両方において、超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのさらに高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは各々４つのＦＲを含み、ループ接続を形成してある場合にはβシート構造の一部を形成する、３つの超可変領域によって接続される、βシート構成を主として採用している。各々の鎖における超可変領域は、ＦＲと近接して一緒に、他の鎖由来の超可変領域とともに保持されて、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）を参照のこと）。定常ドメインは、抗原に対する抗体の結合には直接関与しないが、種々のエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）における抗体の関与を示す。
【００３６】
「超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）」という用語は、本明細書において用いる場合、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基をいう。超可変領域は一般には、「相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメインでは残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）、そして重鎖可変ドメインでは、３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））および／または「超可変領域ループ（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｏｏｐ）」由来の残基｛例えば、軽鎖可変ドメインでは残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）、そして重鎖可変ドメインでは２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７（１９８７））を含む。「フレームワーク領域（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  Ｒｅｇｉｏｎ）」または「ＦＲ」の残基は、本明細書において規定されるような超可変領域の残基以外の可変ドメイン残基である。
【００３７】
抗体のパパイン消化は、各々が単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメント、およびその名称はそれが容易に結晶化する能力を反映している、残りの「Ｆｃ」フラグメントを生じる。ペプシン処理によって、２つの抗原結合部位を有しており、かつ依然として抗原を架橋し得るＦ（ａｂ’）２フラグメントが得られる。
【００３８】
「Ｆｖ」は、最少抗体フラグメントであり、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含む。この領域は、１つの重鎖の二量体および１つの軽鎖可変ドメインの緊密な、非供給結合から構成される。この構成では、各々の可変ドメインの３つの超可変領域が相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を規定する。集合的に、６つの超可変領域が、抗体に対する抗原結合特異性を付与する。しかし、単独の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのみの超可変領域を含むＦｖの半分）でさえ、全体的な結合部位よりも低い親和性だが、抗原を認識して結合する能力を有する。
【００３９】
このＦａｂフラグメントはまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端における２〜３の残基の付加によってＦａｂフラグメントと異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が少なくとも１つの遊離のチオール基を保有するＦａｂ’についての本明細書における命名である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントはもともと、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメントの対として生成される。抗体フラグメントの他の化学的カップリングも公知である。
【００４０】
任意の脊椎動物種由来の抗体の「軽鎖（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎｓ）」は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に別個のタイプのうちの１つに割り当てられ得る。
【００４１】
本明細書における「Ｆｃ領域（Ｆｃ  ｒｅｇｉｏｎ）」という用語は、天然の配列Ｆｃ領域および改変体Ｆｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を規定するために用いられる。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化するが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常は、Ｃｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０の位置のアミノ酸残基から、そのカルボキシル末端へ延びると規定される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵ番号付けシステムに従えば残基４４７）は、例えば、抗体の産生もしくは精製の間に、または抗体の重鎖をコードする核酸の組み換え遺伝子操作によって除去され得る。従って、インタクトな抗体の組成は、全てのＫ４４７残基が除去されている抗体集団、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体集団、およびＫ４４７残基の有無がある抗体の混合物を有する抗体集団を含み得る。
【００４２】
他に示さない限り、免疫グロブリン重鎖における残基の番号付けは、参照によって本明細書に明白に援用される、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）におけるとおりのＥＵインデックスの番号付けである。「ＫａｂａｔにおけるとおりのＥＵインデックス（ＥＵ  ｉｎｄｅｘ  ａｓ  ｉｎ  Ｋａｂａｔ）」とは、ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の残基番号付けをいう。
「機能的なＦｃ領域（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｆｃ  ｒｅｇｉｏｎ）」は、天然の配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能（ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）」を保有する。例示的な「エフェクター機能」としては、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害作用；Ｆｃレセプター結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面レセプターの下方制御（例えば、Ｂ細胞レセプター；ＢＣＲ）などが挙げられる。このようなエフェクターは一般には、Ｆｃ領域が結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わされることを必要とし、そして例えば、本明細書に開示されるような種々のアッセイを用いて評価され得る。
【００４３】
「天然の配列のＦｃ領域（ｎａｔｉｖｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｆｃ  ｒｅｇｉｏｎ）」は、天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む。天然の配列のヒトＦｃ領域としては、天然の配列のヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域（非ＡおよびＡアロタイプ）；天然の配列のヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域；天然の配列のヒトＩｇＧ３ＦＣ領域および天然の配列のヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域、ならびにそれらの天然に存在する改変体が挙げられる。
【００４４】
「改変体Ｆｃ領域（ｖａｒｉａｎｔ  Ｆｃ  ｒｅｇｉｏｎ）」は、少なくとも１つのアミノ酸の改変、好ましくは１つ以上のアミノ酸の置換のせいで天然のＦｃ領域のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、この改変体Ｆｃ領域は、天然の配列Ｆｃ領域に対して、または親のポリペプチドのＦｃ領域に対して比較して少なくとも１つのアミノ酸置換、例えばほぼ１つ〜約１０個のアミノ酸置換、そして好ましくは、ほぼ１つ〜約５個のアミノ酸置換を天然の配列のＦｃ領域にまたは親ポリペプチドのＦｃ領域に有する。本明細書におけるこの改変体Ｆｃ領域は好ましくは、天然の配列のＦｃ領域と、および／または親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の相同性、そして最も好ましくは、それと少なくとも約９０％の相同性、より好ましくはそれと少なくとも約９５％の相同性を保有する。
【００４５】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、インタクトな抗体は、種々の「クラス（ｃｌａｓｓｅｓ）」に割り当てられ得る。インタクトな抗体の５つの主要なクラスがある：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ、そしてこれらのうちいくつかは、さらに「サブクラス（ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ）」（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２に分けられ得る。異なるクラスの抗体に相当する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置は周知である。
【００４６】
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）」および「ＡＤＣＣ」とは、細胞媒介性反応であって、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）を発現する非特異的な細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球およびマクロファージ）が、標的細胞上の結合した抗体を認識し、引き続いてその標的細胞の溶解を生じる反応をいう。ＡＤＣＣを媒介するための主な細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおｙびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現は、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７〜９２（１９９１）の４６４頁の表３にまとめられる。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためには、米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号に記載されるようなインビトロのＡＤＣＣアッセイを行ってもよい。このようなアッセイのために有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、またはさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されるような動物モデルで評価されてもよい。
【００４７】
「ヒトエフェクター細胞（ｈｕｍａｎ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ）」とは、１つ以上のＦｃＲを発現して、エフェクター機能を行う白血球である。好ましくは、この細胞は少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、そしてＡＤＣＣエフェクター機能を行う。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例としては、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞および好中球が挙げられ；ここでＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。このエフェクター細胞は、その天然の供給源から、例えば、本明細書に記載されるような血液またはＰＢＭＣから単離され得る。
【００４８】
「Ｆｃレセプター（Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」すなわち「ＦｃＲ」という用語は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記載するために用いられる。好ましいＦｃＲは、天然の配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合するもの（γレセプター）であって、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγ  ＲＩＩＩのサブクラスのレセプターを含み、これにはこれらのレセプターの対立遺伝子改変体および選択的スプライシング型が挙げられる。ＦｃγＲＩＩレセプターとしては、ＦｃγＲＩＩＡ（ａｎ「活性化レセプター（ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害レセプター（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」が挙げられ、これは、その細胞質ドメインにおいて主に異なる同様のアミノ酸配列を有する。活性化レセプターＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ）（ＩＴＡＭ）を含む。阻害レセプターＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ）（ＩＴＩＭ）を含む（概説Ｍ．Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４（１９９７）を参照のこと）。ＦｃＲは、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７〜９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌら、ｌｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５〜３４（１９９４）；ならびにｄｅ  Ｈａａｓら、Ｊ．Ｌａｂ．ＣＨｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０〜４１（１９９５）に概説される。将来特定されるものを含む他のＦｃＲは、本明細書において「ＦｃＲ」という用語で包含される。この用語はまた、胎児への母性ＩｇＧの移行を担い（Ｇｕｙｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））、そして免疫グロブリンの恒常性を調節する新生児受容体（ｎｅｏｎａｔａｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）ＦｃＲｎを包含する。
【００４９】
「補体依存性細胞傷害作用（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）」すなわち「ＣＤＣ」とは、補体の存在下で標的を溶解する分子の能力をいう。補体活性化経路は、同種の抗原と複合された分子（例えば、抗体）に対する補体系の第一の成分（Ｃ１ｑ）の結合によって開始される。補体活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）に記載されるようなＣＤＣアッセイを行ってもよい。
【００５０】
「アフィニティー成熟された、親和性成熟された（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒｅｄ）」抗体とは、その１つ以上の超可変領域において１つ以上の変更を有する抗体であって、その変更を保有しない親抗体に比較して、抗原についての抗体のアフィニティーの改善を生じる変更を有する抗体である。好ましくは、アフィニティー成熟された抗体は、標的抗原についてナノモルまたはさらにはピコモルの親和性を有する。アフィニティー成熟された抗体は、当該分野で公知の手順によって生成される。Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）は、ＶＨおよびＶＬドメインのシャッフリングによるアフィニティー成熟を記載する。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発は、Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ  ９１：３８０９〜３８１３（１９９４）；Ｓｃｈｉｅｒら、Ｇｅｎｅ  １６９：１４７〜１５５（１９９５）；Ｙｅｌｔｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４〜２００４（１９９５）；Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０〜９（１９９５）；およびＨａｗｋｉｎｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９〜８９６（１９９２）によって記載される。
【００５１】
本明細書における「主要種抗体（ｍａｉｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、組成物における抗体構造であって、この組成物における量的に主要な抗体分子の抗体構造をいう。１実施形態では、この主要種抗体は、ＨＥＲ２抗体、例えば、トラスツマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））によって結合されるＨＥＲ２  ＥＣＤのドメインＩＶに結合する抗体である。主要種抗体の本明細書の好ましい実施形態は、配列番号５および配列番号６（トラスツマブ）における軽鎖および重鎖のアミノ酸配列を比較するものである。
【００５２】
本明細書における「グリコシル化改変体（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｖａｒｉａｎｔ）」抗体とは、そこに結合される１つ以上の炭水化物部分を有する抗体であって、主要種抗体に結合された１つ以上の炭水化物部分と異なる炭水化物部分を有する抗体である。本明細書におけるグリコシル化改変体の例としては、そのＦｃ領域に結合される、Ｇ０オリゴサッカライド構造の代わりにＧ１またはＧ２オリゴサッカライド構造を有する抗体、その１つまたは２つの軽鎖に結合される１つまたは２つの炭水化物部分を有する抗体、抗体の１つまたは２つの重鎖に炭水化物が結合されていない抗体など、およびグリコシル化変更の組み合わせが挙げられる。
【００５３】
抗体がＦｃ領域を有する場合、オリゴサッカライド構造は、抗体の１つまたは２つの重鎖に対して、例えば、２９９残基（残基のＥｕ番号付けでは２９８）で結合され得る。
【００５４】
「脱アミノ化（ｄｅａｍｉｎａｔｅｄ）」抗体とは、その１つ以上のアスパラギン残基が、例えば、アスパラギン酸、スクシンイミドまたはイソ−アスパラギン酸に誘導体化されている抗体である。
【００５５】
本明細書における「腫瘍サンプル（ｔｕｍｏｒ  ｓａｍｐｌｅ）」とは、患者の腫瘍に由来するサンプル、または患者の腫瘍由来の腫瘍細胞を含むサンプルである。本明細書における腫瘍サンプルの例としては、限定はしないが、腫瘍生検、循環している腫瘍細胞、循環している血漿タンパク質、腹水、腫瘍または既存の腫瘍様の特性に由来する初代細胞培養物または細胞株、ならびに保存された腫瘍サンプル、例えば、ホルマリン固定された、パラフィン包埋腫瘍サンプルまたは凍結された腫瘍サンプルが挙げられる。
【００５６】
「固定された（ｆｉｘｅｄ）」腫瘍サンプルとは、固定液を用いて組織学的に保存されているサンプルである。
【００５７】
「ホルマリン固定された（ｆｏｒｍａｌｉｎ−ｆｉｘｅｄ）」腫瘍サンプルとは、固定液としてホルムアルデヒドを用いて保存されているサンプルである。
【００５８】
「包埋された（ｅｍｂｅｄｄｅｄ）」腫瘍サンプルとは、フィルム、そして一般には、硬性の媒体、例えば、パラフィン、ワックス、セロイジンまたは樹脂によって囲まれるサンプルである。包埋によって、顕微鏡検査のため、または組織マイクロアレイ（ｔｉｓｓｕｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ）（ＴＭＡｓ）の生成のための薄い切片の切断が可能になる。
【００５９】
「パラフィン包埋された（ｐａｒａｆｆｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ）」腫瘍サンプルとは、石油由来の固体炭化水素の精製された混合物によって囲まれるサンプルである。
【００６０】
本明細書において、「凍結された（ｆｒｏｚｅｎ）」腫瘍サンプルとは、凍結されるか、凍結されている腫瘍サンプルをいう。
【００６１】
本明細書においては、「遺伝子発現プロファイリング（ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）」とは、ＨＥＲ２レセプター発現を直接決定するための代用としての１つ以上の遺伝子の発現の評価をいう。
【００６２】
「ホスホ−ＥＬＩＳＡアッセイ（ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＬＩＳＡ  ａｓｓａｙ）」とは本明細書において、１つ以上のＨＥＲレセプター、特にＨＥＲ２のリン酸化が、試薬、通常は抗体を用いて酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で評価され、リン酸化されたＨＥＲレセプター、基質または下流シグナル伝達分子が検出されるアッセイである。好ましくは、リン酸化されたＨＥＲ２を検出する抗体が用いられる。このアッセイは、細胞溶解液、好ましくは新鮮または凍結された生物学的なサンプルで行われ得る。
【００６３】
「増殖阻害因子（ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）」とは本明細書において用いる場合、細胞、特にインビトロまたはインビトロにおいてＨＥＲ発現ガン細胞の増殖を阻害する化合物または組成物をいう。従って、この増殖阻害因子は、Ｓ期のＨＥＲ発現細胞の割合を有意に減少する因子であり得る。増殖阻害性因子の例としては、細胞周期進行を（Ｓ期以外の位置で）ブロックする因子、例えば、Ｇ１停止およびＭ期停止を誘導する因子が挙げられる。古典的なＭ期の拮抗剤（ブロッカー）（ｂｌｏｃｋｅｒ）としては、ビンカ（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、トキソイド、およびトポＩＩインヒビター、例えば、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、およびブレオマイシンが挙げられる。Ｇ１を停止させる因子、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５−フルオロウラシルおよびａｒａ−Ｃはまた、Ｓ期停止に波及する。さらなる情報は、Ｍｕｒａｋａｍｉら（ＷＢ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ；Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９５）による、Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，ＭｅｎｄｅｌｓｏｈｎおよびＩｓｒａｅｌ編，第１章「Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ，ａｎｄ  ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ」というタイトル、特に１３頁に見出され得る。
【００６４】
「増殖阻害性（ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ）」抗体の例は、ＨＥＲ２に結合して、ＨＥＲ２を過剰発現するガン細胞の増殖を阻害する抗体である。好ましい増殖阻害性ＨＥＲ２抗体は、細胞培養物中でＳＫ−ＢＲ−３乳房腫瘍細胞の増殖を２０％より大きくまで、そして好ましくは５０％より大きく（例えば、約５０％〜約１００％）まで、約０．５〜３０μｇ／ｍｌの抗体濃度で阻害し、この増殖阻害は、この抗体に対するＳＫ−ＢＲ−３細胞の暴露６日後に決定される（１９９７年１０月１４日発行、米国特許第５，６７７，１７１号を参照のこと）。ＳＫ−ＢＲ−３細胞増殖阻害アッセイは、その特許および本明細書の以降においてさらに詳細に記載される。好ましい増殖阻害性抗体は、マウスモノクローナル抗体のヒト化改変体、例えば、トラスツマブである。
【００６５】
「アポトーシスを誘導する（ｉｎｄｕｃｅ  ａｐｏｔｏｓｉｓ）」抗体とは、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の拡大、細胞の断片化、および／または膜小胞（アポトーシス小体と呼ばれる）の形成によって決定される、プログラムされた細胞死を誘導する抗体である。この細胞とは通常、ＨＥＲ２レセプターを過剰発現する細胞である。好ましくは、この細胞は腫瘍細胞、例えば、乳房、卵巣、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸、甲状腺、膵臓または膀胱の細胞である。インビトロでは、この細胞は、ＳＫ−ＢＲ−３、ＢＴ４７４、Ｃａｌｕ  ３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１またはＳＫＯＶ３細胞であってもよい。アポトーシスに関連する細胞事象を評価するためには種々の方法が利用可能である。例えば、ホスファチジルセリン（ＰＳ）転移は、アネキシン結合によって測定され得る；ＤＮＡ断片化は、ＤＮＡラダーリング（ｌａｄｄｅｒｉｎｇ）を通じて評価され得；そしてＤＮＡ断片化を伴う核／クロマチンの凝縮は、ハイポディプロイド（低二倍体）（ｈｙｐｏｄｉｐｌｏｉｄ）細胞の増大によって評価され得る。好ましくは、アポトーシスを誘導する抗体は、ＢＴ４７４細胞を用いてアネキシン結合アッセイにおいて未処理の細胞に対してアネキシン結合の誘導を、約２〜５０倍、好ましくは５〜５０倍、そして最も好ましくは、約１０〜５０倍生じる抗体である。アポトーシスを誘導するＨＥＲ２抗体の例は、７Ｃ２および７Ｆ３である。詳細には、ＷＯ９８／１７７９７を参照のこと。
【００６６】
「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、治療処置および予防または保存的な方法の両方をいう。処置の必要なものとしては、既にガンを有するもの、およびガンが防止されるべきであるものが挙げられる。従って、本明細書において処置されるべき患者は、ガンを有すると診断されていてもよいし、またはガンの素因があるかもしくはガンが疑われてもよい。
【００６７】
「細胞傷害性因子（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ａｇｅｎｔ）」という用語は本明細書において用いる場合、細胞の機能を阻害もしくは妨げるか、そして／または細胞の破壊を生じる物質をいう。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２およびＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、および毒素、例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物由来の低分子毒素、または酵素的に活性な毒素であって、そのフラグメントおよび／または改変体を含むものを包含するものとする。
【００６８】
「化学療法剤（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ）」とは、ガンの処置において有用な化合物である。化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））；スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン、イムプロスルファン（ｉｍｐｒｏｓｕｌｆａｎ）およびピポスルファン（ｐｉｐｏｓｕｌｆａｎ）；アジリジン、例えば、ベンゾドパ、カルボキオン（ｃａｒｂｏｑｕｏｎｅ）、メツレドパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）およびウレドパ（ｕｒｅｄｏｐａ）；エチレンイミンおよびメチルアメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）であって、アルトレタミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチルオロメラミンを含む；アセトゲニン（特に、ブルタシンおよびブルタシノン）；δ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；β−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成アナログトポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチンおよび９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成アナログを含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；テニポシド；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成アナログ、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エレウテロビン（ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｂｉｎ）；パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコジクチイン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンギスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）；ナイトロジェン・マスタード（ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｍｕｓｔａｒｄｓ）、例えば、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、クロルナファジン（ｃｈｌｏｒｎａｐｈａｚｉｎｅ）、クロロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、酸化メクロレタミン塩酸塩（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ  ｏｘｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、メルファラン、ノベンビシン、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシル・マスタード；ニトロソウレア、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチンおよびラニムヌスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ）；抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンγ１ＩおよびカリケアマイシンωＩ１（例えば、Ａｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３〜１８６（１９９４）を参照のこと）；ダイネミシンＡを含むダイネミシン；エスペラマイシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連の色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎｓ）、アクチノマイシン、オースラマイシン���ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射剤（ＤＯＸＩＬ（登録商標）を含む）、リポソームドキソルビシンＴＬＣ  Ｄ−９９（ＭＹＯＣＥＴ（登録商標））、ペグ化リポソームドキソルビシン（ＣＡＥＬＹＸ（登録商標））、およびデオキシドキソルビシン）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、メルセロマイシン、マイトマイシン、例えば、マイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、プロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗物質、例えば、メトトレキサート、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、テガフール（ＵＦＴＯＲＡＬ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、エポチロン、および５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸アナログ、例えば、デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート；プリンアナログ、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；抗副腎剤（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補給物（ｆｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）、例えば、フロリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；エルフォルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン；マイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ）、例えば、マイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）およびアンサマイトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎｓ）；ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）；ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン（ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ）；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）ポリサッカライド複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）（特に、Ｔ−２毒素、ベラクリンＡ（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ  Ａ）、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポビロマン（ｐｉｐｏｂｒｏｍａｎ）；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド（ｔａｘｏｉｄ）、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子処方物（ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭ）、およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））；クロラムブシル；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金剤（ｐｌａｔｉｎｕｍ  ａｇｅｎｔｓ）、例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、およびカルボプラチン；チューブリン重合化を微小管を形成しないように妨げるビンカ（ｖｉｎｃａｓ）であって、これには、ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））、ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））、ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））、およびビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））を含む；エトポシド（ＶＰ−１６）；イフォスファミド；ミトキサントロン；ロイコボリン（ｌｅｕｃｏｖｏｖｉｎ）；ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）；エダトレキセート（ｅｄａｔｒｅｘａｔｅ）；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えば、レチノイン酸であって、ベキサロテン（ｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ）（ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（登録商標））を含む；ビスフォスフォネート、例えば、クロドロネート（ｃｌｏｄｒｏｎａｔｅ）（例えば、ＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）またはＯＳＴＡＣ（登録商標））、エチドロネート（ｅｔｉｄｒｏｎａｔｅ）（ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標））、ＮＥ−５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロン酸塩（ＺＯＭＥＴＡ（登録商標））、アレンドロネート（ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標））、パミドロネート（ＡＲＥＤＩＡ（登録商標））、チルドロネート（ｔｉｌｕｄｒｏｎａｔｅ）（ＳＫＥＬＩＤ（登録商標））、またはリセドロネート（ｒｉｓｅｄｒｏｎａｔｅ）（ＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標））；トロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、異常な細胞増殖に関与するシグナル伝達経路で遺伝子の発現を阻害するオリゴヌクレオチド、例えば、ＰＫＣ−α、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓおよび上皮増殖因子受容体（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＥＧＦ−Ｒ）など；ワクチン、例えば、ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチンおよび遺伝子治療ワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、およびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン；トポイソメラーゼ１インヒビター（例えば、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標））；ｒｍＲＨ（例えば、ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標））；ＢＡＹ４３９００６（ソラフェニブ；Ｂａｙｅｒ）；ＳＵ−１���２４８（Ｐｆｉｚｅｒ）；ペリフォシン（ｐｅｒｉｆｏｓｉｎｅ）、ＣＯＸ−２インヒビター（例えば、セレコキシブまたはエトリコキシブ）、プロテオソームインヒビター（例えば、ＰＳ３４１）；ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標））；ＣＣＩ−７７９；ティピファルニブ（ｔｉｐｉｆａｒｎｉｂ）（Ｒ１１５７７）；オラフェニブ、ＡＢＴ５１０；Ｂｃｌ−２インヒビター、例えば、オブリマーセン・ナトリウム（ｏｂｌｉｍｅｒｓｅｎ  ｓｏｄｉｕｍ）（ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標））；ピクサントロン（ｐｉｘａｎｔｒｏｎｅ）；ＥＧＦＲインヒビター（下の定義を参照のこと）；チロシンキナーゼインヒビター（下の定義を参照のこと）；ならびに任意の上記の薬学的に受容可能な塩、酸または誘導体；ならびに上記の２つ以上の組合せ、例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾロンの併用療法についての略号であるＣＨＯＰ、そしてオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮＴＭ）と５−ＦＵおよびロイコボリン（ｌｅｕｃｏｖｏｖｉｎ）とを併用した処置レジメンの略号であるＦＯＬＦＯＸが挙げられる。
【００６９】
本明細書においては、化学療法剤としては、ガンの増殖を促進し得るホルモンの影響を調節、軽減、ブロックまたは阻害するように作用する「抗ホルモン剤（ａｎｔｉ−ｈｏｒｍｏｎａｌ  ａｇｅｎｔｓ）」または「内分泌療法剤（ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」が挙げられる。それらはホルモン自体であってもよく、これには限定はしないが以下が挙げられる：混合されたアゴニスト／アンタゴニストプロフィールを有する抗エストロゲンであって、これにはタモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標））、４−ヒドロキシタモキシフェン、トレミフェン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標））、イドキシフェン、ドロロキシフェン、ラロキシフェン（ＥＶＩＳＴＡ（登録商標））、トリオキシフェン、ケオキシフェンおよび選択的エストロゲンレセプター調節因子（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）（ＳＥＲＭ）、例えば、ＳＥＲＭ３が挙げられる；アゴニスト特性のない純粋な抗エストロゲン、例えば、フルベストラント（ｆｕｌｖｅｓｔｒａｎｔ）（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標））、およびＥＭ８００（このような因子は、エストロゲンレセプター（ＥＲ）二量体化をブロックし、ＤＮＡ結合を阻害し、ＥＲ代謝回転を増大し、そして／またはＥＲレベルを抑制し得る）；アロマターゼインヒビターであって、これには、ステロイド性のアロマターゼインヒビター、例えば、フォルメスタンおよびエキセメスタン（ｅｘｅｍｅｓｔａｎｅ）（ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標））、および非ステロイド性アロマターゼインヒビター、例えば、アナストラゾール（ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標））、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標））およびアミノグルテチミドが挙げられ、ならびに他のアロマターゼインヒビターであって、これにはボロゾール（ｖｏｒｏｚｏｌｅ）（ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標））、酢酸メゲステロール（ＭＥＧＡＳＥ（登録商標））、ファドロゾールおよび４（５）−イミダゾールを含む；黄体形成ホルモン放出ホルモンアゴニストであって、ロイプロリド（ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）およびＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標））、ゴセレリン、ブセレリンおよびトリプテレリンを含む；性ステロイドであって、プロゲスチン、例えば、酢酸メゲストロールおよび酢酸メドロキシプロゲステロン、エストロゲン、例えば、ジエチルスチルベストロールおよびプレマリン、ならびにアンドロゲン／レチノイド、例えば、フルオキシメステロン、オールトランスレチノイン酸（ａｌｌ  ｔｒａｎｓｒｅｔｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）およびフェンレチニド（ｆｅｎｒｅｔｉｎｉｄｅ）を含む；オナプリストン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）；抗プロゲステロン；エストロゲンレセプター下方調節因子（ＥＲＤ）；抗アンドロゲン、例えば、フルタミド、ニルタミドおよびビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）；ならびに上記のいずれかの薬学的に受容可能な塩、酸または誘導体；ならびに上記の２つ以上の組合せ。
【００７０】
本明細書においては、「タキソイド（ｔａｘｏｉｄ）」とは、微小管の脱重合を阻害するように機能する化学療法剤である。例としては、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、パクリタキセルのアルブミン操作されたナノ粒子処方物（ａｌｂｕｍｉｎ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）（ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭ）、およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））が挙げられる。好ましいタキソイドはパクリタキセルである。
【００７１】
本明細書において用いる場合、「ＥＧＦＲインヒビター（ＥＧＦＲ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」という用語は、ＥＧＦＲに結合するか、そうでなければ直接相互作用して、そのシグナル伝達活性を妨げるかもしくは軽減する化合物をいい、別に「ＥＧＦＲアンタゴニスト（ＥＧＦＲ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）」とも呼ばれる。このような因子の例としては、ＥＧＦＲに結合する抗体および低分子が挙げられる。ＥＧＦＲに結合する抗体の例としては、ＭＡｂ  ５７９（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ＨＢ  ８５０６）、ＭＡｂ  ４５５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ＨＢ  ８５０７）、ＭＡｂ  ２２５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ８５０８）、ＭＡｂ  ５２８（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ８５０９）（Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎら、米国特許第４，９４３，５３３号を参照のこと）およびその改変体、例えば、キメラ化された２２５（ｃｈｉｍｅｒｉｚｅｄ  ２２５）（Ｃ２２５またはＣｅｔｕｘｉｍａｂ；ＥＲＢＵＴＩＸ（登録商標））および再形成されたヒト２２５（ｈｕｍａｎ  ２２５）（Ｈ２２５）（ＷＯ９６／４０２１０，Ｉｍｃｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．を参照のこと）；ＩＭＣ−１１Ｆ８、完全ヒト、ＥＧＦＲ−標的化抗体（Ｉｍｃｌｏｎｅ）；ＩＩ型変異体ＥＧＦＲに結合する抗体（米国特許第５，２１２，２９０号）；米国特許第５，８９１，９９６号に記載されるようなＥＧＦＲに結合するヒト化抗体およびキメラ抗体；ならびにＥＧＦＲに結合するヒト抗体、例えば、ＡＢＸ−ＥＧＦまたはパニツムマブ（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）（ＷＯ９８／５０４３３，Ａｂｇｅｎｉｘ／Ａｍｇｅｎを参照のこと）；ＥＭＤ  ５５９００（Ｓｔｒａｇｌｉｏｔｔｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３２Ａ：６３６〜６４０（１９９６））；ＥＭＤ７２００（マツズマブ（ｍａｔｕｚｕｍａｂ））ＥＧＦＲ結合についてＥＧＦおよびＴＧＦ−αの両方と競合するＥＧＦＲに対するヒト化ＥＧＦＲ抗体（ＥＭＤ／Ｍｅｒｃｋ）；ヒトＥＧＦＲ抗体、ＨｕＭａｘ−ＥＧＦＲ（ＧｅｎＭａｂ）；米国特許第６，２３５，８８３号に記載される、Ｅ１．１、Ｅ２．４、Ｅ２．５、Ｅ６．２、Ｅ６．４、Ｅ２．１１、Ｅ６．３およびＥ７．６．３として公知の完全ヒト抗体；ＭＤＸ−４４７（Ｍｅｄａｒｅｘ  Ｉｎｃ）；ならびにｍＡｂ  ８０６またはヒト化ｍＡｂ  ８０６（Ｊｏｈｎｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（２９）：３０３７５〜３０３８４（２００４））が挙げられる。この抗−ＥＧＦＲ抗体は、細胞傷害剤と結合体化されて、これによって免疫結合体を生成し得る（例えば、欧州特許６５９，４３９Ａ２，Ｍｅｒｃｋ  Ｐａｔｅｎｔ  ＧｍｂＨを参照のこと）。ＥＧＦＲアンタゴニストとしては、低分子、例えば：米国特許第５，６１６，５８２号、同第５，４５７，１０５号、同第５，４７５，００１号、同第５，６５４，３０７号、同第５，６７９，６８３号、同第６，０８４，０９５号、同第６，２６５，４１０号、同第６，４５５，５３４号、同第６，５２１，６２０号、同第６，５９６，７２６号、同第６，７１３，４８４号、同第５，７７０，５９９号、同第６，１４０，３３２号、同第５，８６６，５７２号、同第６，３９９，６０２号、同第６，３４４，４５９号、同第６，６０２，８６３号、同第６，３９１，８７４号、同第６，３４４，���５５号、同第５，７６０，０４１号、同第６，００２，００８号、および同第５，７４７，４９８号、ならびに以下のＰＣＴ公開：ＷＯ９８／１４４５１、ＷＯ９８／５００３８、ＷＯ９９／０９０１６、およびＷＯ９９／２４０３７に記載される化合物が挙げられる。特定の低分子ＥＧＦＲアンタゴニストとしては、ＯＳＩ−７７４（ＣＰ−３５８７７４、エルロチニブ、ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＰＤ  １８３８０５（ＣＩ  １０３３，２−プロペナミド、Ｎ−［４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−７−［３−（４−モルホリニル）プロポキシ］−６−キナゾリニル］−、二塩酸塩、Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．）；ＺＤ１８３９、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡＴＭ）４−（３’−クロロ−４’−フルオロアニリノ）−７−メトキシ−６−（３−モルホリノプロポキシ）キナゾリン，ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；ＺＭ  １０５１８０（（６−アミノ−４−（３−メチルフェニル−アミノ）−キナゾリン，Ｚｅｎｅｃａ）；ＢＩＢＸ−１３８２（Ｎ８−（３−クロロ−４−フルオロ−フェニル）−Ｎ２−（１−メチル−ピペリジン−４−イル）−ピリミド［５，４−ｄ］ピリミジン−２，８−ジアミン，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）；ＰＫＩ−１６６（（登録商標）−４−［４−［（１−フェニルエチル）アミノ］−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル］−フェノール）；（登録商標）−６−（４−ヒドロキシフェニル）−４−［（１−フェニルエチル）アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン）；ＣＬ−３８７７８５（Ｎ−［４−［（３−ブロモフェニル）アミノ］−６−キナゾリニル］−２−ブチナミド）；ＥＫＢ−５６９（Ｎ−［４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−３−シアノ−７−エトキシ−６−キノリニル］−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテンアミド）（Ｗｙｅｔｈ）；ＡＧ１４７８（Ｓｕｇｅｎ）；ＡＧ１５７１（ＳＵ  ５２７１；Ｓｕｇｅｎ）；二重ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２チロシンキナーゼインヒビター、例えば、ラパチニブ（ＧＷ  ５７２０１６またはＮ−［３−クロロ−４−［（３  フルオロフェニル）メトキシ］フェニル］６［５［［［２メチルスルホニル）エチル］アミノ］メチル］−２−フラニル］−４−キナゾリンアミン；Ｇｌａｘｏ−ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）が挙げられる。
【００７２】
「チロシンキナーゼインヒビター（ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」とは、ＨＥＲレセプターのようなチロシンキナーゼのチロシンキナーゼ活性を阻害する分子である。このようなインヒビターの例としては、前の段落に注記されるＥＧＦＲ−標的化薬物；低分子ＨＥＲ２チロシンキナーゼインヒビター、例えば、武田から入手可能なＴＡＫ１６５；ＥｒｂＢ２レセプターチロシンキナーゼの経口選択的インヒビターＣＰ−７２４、７１４（ＰｆｉｚｅｒおよびＯＳＩ）；ＥＧＦＲに優先的に結合するが、ＨＥＲ２およびＥＧＦＲ−過剰発現細胞の両方を阻害する、二重−ＨＥＲインヒビター、例えば、ＥＫＢ−５６９（Ｗｙｅｔｈから入手可能）；ラパチニブ（ＧＷ５７２０１６；Ｇｌａｘｏ−ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅから入手可能）経口ＨＥＲ２およびＥＧＦＲチロシンキナーゼインヒビター；ＰＫＩ−１６６（Ｎｏｖａｒｔｉｓから入手可能）；汎（ｐａｎ）−ＨＥＲインヒビター、例えば、カネルチニブ（ｃａｎｅｒｔｉｎｉｂ）（ＣＩ−１０３３；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；Ｒａｆ−１インヒビター、例えば、Ｒａｆ−１シグナル伝達を阻害する、ＩＳＩＳ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓから入手可能なアンチセンス因子ＩＳＩＳ−５１３２；非−ＨＥＲ標的化ＴＫインヒビター、例えば、Ｇｌａｘｏから入手可能なイマチニブ・メシレート（Ｉｍａｔｉｎｉｂ  ｍｅｓｙｌａｔｅ）（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標））；ＭＡＰＫ細胞外調節キナーゼＩインヒビターＣＩ−１０４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）；キナゾリン、例えば、ＰＤ  １５３０３５、４−（３−クロロアニリノ）キナゾリン；ピリドピリミジン；ピリミドピリミジン；ピロロピリミジン、例えば、ＣＧＰ  ５９３２６、ＣＧＰ６０２６１およびＣＧＰ６２７０６；ピラゾロピリミジン、４−（フェニルアミノ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン；クルクミン（ジフェルロイルメタン（ｄｉｆｅｒｕｌｏｙｌ  ｍｅｔｈａｎｅ）、４，５−ビス（４−フルオロアニリノ）フタルイミド）；ニトロチオフェン部分を含むチルホスチン（ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎｅｓ）；ＰＤ−０１８３８０５（Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒ）；アンチセンス分子（例えば、ＨＥＲ−コード核酸に結合するもの）；キノキサリン（米国特許第５，８０４，３９６号）；トリホスチン（ｔｒｙｐｈｏｓｔｉｎｓ）（米国特許第５，８０４，３９６号）；ＺＤ６４７４（Ａｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ）；ＰＴＫ−７８７（Ｎｏｖａｒｔｉｓ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  ＡＧ）；汎ＨＥＲインヒビター（ｐａｎ−ＨＥＲ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）、例えば、ＣＩ−１０３３（Ｐｆｉｚｅｒ）；Ａｆｆｉｎｉｔａｃ（ＩＳＩＳ  ３５２１；Ｉｓｉｓ／Ｌｉｌｌｙ）；イマチニブ・メシレート（Ｉｍａｔｉｎｉｂ  ｍｅｓｙｌａｔｅ）（Ｇｌｅｅｖａｃ；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＰＫＩ  １６６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＧＷ２０１６（Ｇｌａｘｏ  ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）；ＣＩ−１０３３（Ｐｆｉｚｅｒ）；ＥＫＢ−５６９（Ｗｙｅｔｈ）；Ｓｅｍａｘｉｎｉｂ（Ｓｕｇｅｎ）；ＺＤ６４７４（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；ＰＴＫ−７８７（Ｎｏｖａｒｔｉｓ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  ＡＧ）；ＩＮＣ−１Ｃ１１（Ｉｍｃｌｏｎｅ）；または以下の特許公開：米国特許第５，８０４，３９６；ＷＯ９９／０９０１６（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎａｍｉｄ）；ＷＯ９８／４３９６０（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎａｍｉｄ）；ＷＯ９７／３８９８３（Ｗａｒｎｅｒ  Ｌａｍｂｅｒｔ）；ＷＯ９９／０６３７８（Ｗａｒｎｅｒ  Ｌａｍｂｅｒｔ）；ＷＯ９９／０６３９６（Ｗａｒｎｅｒ  Ｌａｍｂｅｒｔ）；ＷＯ９６／３０３４７（Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ）；ＷＯ９６／３３９７８（Ｚｅｎｅｃａ）；ＷＯ９６／３３９７（Ｚｅｎｅｃａ）；およびＷＯ９６／３３９８０（Ｚｅｎｅｃａ）のいずれかに記載されるものが挙げられる。
【００７３】
本明細書においては、「標準的ケア（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｏｆ  ｃａｒｅ）」化学療法とは、特定のガンを処置するために慣用的に用いられる化学療法剤をいう。例えば、リンパ節陽性乳癌を含む取扱可能な乳癌については、標準的ケアのアジュバント療法は、アントラサイクリン／シクロホスファミド（ＡＣ）化学療法、シクロホスファミド、メトトレキセート、フルオロウラシル（ＣＭＦ）化学療法、フルオロウラシル、アントラサイクリンおよびシクロホスファミド（ＦＡＣ）化学療法またはＡＣに続くパクリタキセル（Ｔ）（ＡＣ→Ｔ）であり得る。本明細書における実施例に記載される患者については、「標準的ケア」はＡＣ→Ｔ処置であった。
【００７４】
抗癌剤、例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）が、「単独の薬剤（ｓｉｎｇｌｅ  ａｇｅｎｔ）」として投与される場合、これは、処置レジメンの間、ガンを処置するために被験体に投与される唯一の薬剤であり、すなわち、この薬剤は、他の抗ガン剤と組み合わせて提供されるのではない。しかし、このような処置は、抗ガン剤の投与の実質的に前、または後に他の抗ガン剤の投与を包含する。
【００７５】
「血管新生阻害剤（ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）」とは、血管の発達をある程度までブロックまたは妨害する化合物をいう。この血管新生阻害因子は、例えば、血管新生を促進するのに関与する増殖因子または増殖因子レセプターに結合する低分子または抗体であってもよい。本明細書における好ましい抗ガン因子は、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））のような血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体である。
【００７６】
「サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）」という用語は、細胞内メディエーターとして別の細胞に作用する、１つの細胞集団によって放出されるタンパク質についての一般名称である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカインおよび伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインのなかに包含されるのは、成長ホルモン、例えば、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プロレラキシン；糖タンパク質ホルモン、例えば、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ））、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）；肝成長因子（ｈｅｐａｔｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）；線維芽成長因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子−αおよび−β；ミュラー管抑制物質；マウスゴナドドロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；神経成長因子、例えば、ＮＧＦ−β；血小板増殖因子；トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、例えば、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β；インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン、例えば、インターフェロン−α、−βおよび−γ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２；腫瘍壊死因子、例えば、ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−β；ならびにＬＩＦおよびキットリガンド（ｋｉｔ  ｌｉｇａｎｄ）（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子である。本明細書において用いる場合、サイトカインという用語は、天然の供給源由来または組み換え細胞培養物由来のタンパク質、および天然のサイトカイン配列の生物学的に活性な等価物を包含する。
【００７７】
「細胞傷害性造血性細胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ）」とは、本明細書において、他の細胞に対して毒性である、例えば、他の細胞の機能を妨げるかまたは他の細胞の破壊を生じる造血系由来の細胞をいう。造血系の細胞傷害性細胞の例としては、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋リンパ球のサブセット）および活性化されたマクロファージが挙げられる。
【００７８】
「融合タンパク質（ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」という用語は、第二の異種タンパク質にカップリングされた第一のタンパク質をいう。この第一および第二のタンパク質は、第一および第二のタンパク質がフレーム中で発現されるような、遺伝子操作技術を介して融合され得る。ポリペプチドリンカーは、第一と第二のタンパク質の間で遺伝子操作され得る。例えば、ポリペプチドリンカー、例えば、ＧＧＧＧＳは、抗体の重鎖のＦｃとＭＩＣＢのＮ末端との間に位置され得る。
【００７９】
「非相同性、異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）」という用語は、例えば、細胞または組織由来、種由来などの起源が異なる、ポリアクリルアミドおよびポリペプチドのような分子をいう。異種とはまた、構造および／または機能が異なる分子であって、異なるリガンドを各々が認識するリガンド結合分子をいう。
【００８０】
本明細書において用いる場合、「宿主細胞（ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ）」という用語は、異種ポリヌクレオチド分子を発現する細胞をいう。本発明において有用な宿主細胞の例としては限定はしないが、細菌、昆虫および哺乳動物の細胞が挙げられる。このような細胞の特異的な例としては、ＳＦ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７１１）、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５８）、ヒト胚性腎細胞（２９３細胞）、チャイニーズハムスター卵巣（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）（ＣＨＯ）細胞（Ｐｕｃｋら、１９５８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６０：１２７５−８１）、ヒト乳癌細胞（ＭＣＦ−７）（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ２２）、ダウディ（Ｄａｕｄｉ）細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２１３）、ＨＥＫ２９３などが挙げられる。
【００８１】
本明細書において用いる場合、「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」とは、少なくとも１つの混入物（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）から分離されているポリヌクレオチドまたはポリペプチドであって、それが、例えば、天然に見出される形態とは異なる形態で、通常会合されている混入物から分離されているポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。
【００８２】
「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）」、「ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」、「ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」および「オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」という用語は、交換可能に用いられ、そして任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはそのアナログをいう。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有してもよく、そして公知または未知の１つ以上の機能を果たし得る。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子フラグメントのコード領域または非コード領域、連鎖解析から規定される遺伝子座（単数または複数）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログを含んでもよい。存在するならば、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーのアセンブリの前に与えられても、または後に与えられてもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、標識成分との結合体化などによって、重合化後にさらに修飾されてもよい。
【００８３】
核酸は、別の核酸配列との機能的な関係におかれる場合、「作動可能に連結（
ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」される。例えば、プレ配列または分泌リーダーのためのＤＮＡは、それがあるポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、そのポリペプチドについてのＤＮＡに作動可能に連結されている；プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響する場合、コード配列に対して作動可能に連結される；またはリボソーム結合部位は、コード配列に対して、それが翻訳を容易にするように位置される場合、作動可能に連結される。一般には、「作動可能に連結される（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」とは、連結されているＤＮＡ配列が連続しており、そして分泌リーダーの場合には、連続しておりかつリーディングフレームにあるということを意味する。しかし、エンハンサーは、連続している必要はない。連鎖は、都合のよい制限部位での連結によって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーは、従来の習慣に従って用いられる。例えば、Ｌｏｗｍａｎ，米国特許第５，９９４，５１１号；米国特許第６，１７２，２１３号を参照のこと。
【００８４】
「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」、「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」および「ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）」という用語は、本明細書において交換可能に用いられて、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。このポリマーは、直線であっても分枝していてもよく、これは、修飾されたアミノ酸を含んでもよく、そして非アミノ酸で中断されてもよい。この用語はまた、修飾されているアミノ酸ポリマーを包含する；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作、例えば、標識成分との結合体化。
【００８５】
本明細書において用いる場合、「精製する（ｐｕｒｉｆｙ）」または「精製された（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」という用語は、少なくとも５~１０％の混入するタンパク質がない標的タンパク質をいう。混入しているタンパク質からのタンパク質の精製は、公知の技術、例えば、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを用いて達成され得る。例えば、Ｍａｇｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，第７９〜９７頁（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編（Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８、および季刊最新版）を参照のこと。
【００８６】
ポリペプチド「改変体（ｖａｒｉａｎｔ）」（例えば、「ＭＩＣＢ改変体」）とは本明細書において用いる場合、親の配列ポリペプチドと、例えば、全長ＭＩＣＢ参照配列と、または可溶型ｓＭＩＣＢ参照配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する生物学的に活性なポリペプチドを意味する。このような改変体としては、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端で付加または欠失された１つ以上のアミノ酸残基を有するポリペプチドが挙げられる。
【００８７】
本明細書における「ローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）」用量は一般には、患者に投与される治療剤の最初の用量を含み、その後にその１つ以上の維持用量が続けられる。一般には、単一ローディング用量が投与されるが、複数のローディング用量が本明細書において考慮される。一般には、投与されるローディング用量の量は、投与される維持用量の量を超えるか、そして／またはローディング用量は、維持用量よりも頻繁に投与され、そのためにこの治療剤の所望の定常状態濃度は、維持用量よりも早期に達成できる。
【００８８】
本明細書における「維持（ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ）」用量とは、処置期間にわたって患者に投与される治療剤の１つ以上の用量をいう。一般には、維持用量は、間の空いた処置間隔、例えば、ほぼ毎週、ほぼ２週ごと、ほぼ３週ごと、またはほぼ４週ごとに投与される。
【００８９】
ＩＩ．抗ＨＥＲ２−ＭｉｃＢ融合タンパク質の生成
抗ＨＥＲ抗体とＭｉｃＢとの間の融合タンパク質を生成するための技術は、当業者に周知である。本発明において用いられ得る例示的な抗ＨＥＲ２抗体およびＭｉｃＢ配列およびフラグメントは下記されている。
【００９０】
ＨＥＲレセプターおよびそれに対する抗体
レセプターチロシンキナーゼのＨＥＲファミリーは、細胞増殖、分化および生存の重要なメディエーターである。レセプターのファミリーは、４つの異なるメンバーを含み、これには、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１、またはＨＥＲ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２またはｐｌ８５ｎｅｕ）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）およびＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４またはｔｙｒｏ２）が挙げられる。
【００９１】
ｅｒｂＢ１遺伝によってコードされるＥＧＦＲは、ヒト悪性腫瘍に原因として関連している。詳細には、ＥＧＦＲの発現増大は、乳房、膀胱、肺、頭部、頸部および胃の癌、ならびにグリア芽細胞腫において観察されている。ＥＧＦＲレセプター発現の増大はしばしば、ＥＧＦＲリガンド、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦ−α）の生成の増大に関連しており、同じ腫瘍細胞により、自己分泌刺激性経路によってレセプター活性化を生じる。Ｂａｓｅｌｇａ  ａｎｄ  Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．６４：１２７〜１５４（１９９４）。ＥＧＦＲまたはそのリガンドＴＧＦ−αおよびＥＧＦに対するモノクローナル抗体は、このような悪性腫瘍の処置において治療剤として評価されている。例えば、ＢａｓｅｌｇａおよびＭｅｎｄｅｌｓｏｈｎ．，前出；Ｍａｓｕｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４４：１００２〜１００７（１９８４）；ならびにＷｕら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：１８９７〜１９０５（１９９５）を参照のこと。
【００９２】
ＨＥＲファミリーの第二のメンバーであるｐ１８５ｎｅｕは、化学的に処理されたラットの神経芽細胞腫由来のトランスフォーミング遺伝子の産物としてもともと特定された。ｎｅｕプロトオンコジーンの活性化型は、コードされたタンパク質の膜貫通領域におけるポイントミューテーション（バリンからグルタミン酸）から生じる。ｎｅｕのヒトホモログの増幅は、乳房および卵巣の癌で観察され、そして不良な予後と相関している（Ｓｌａｍｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５：１７７〜１８２（１９８７）；Ｓｌａｍｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：７０７〜７１２（１９８９）；ならびに米国特許第４，９６８，６０３号）。今日まで、ｎｅｕのプロトオンコジーンにおけるものと類似のポイントミューテーションはヒト腫瘍では報告されていない。ＨＥＲ２の過剰発現（遺伝子増幅に起因して頻繁だが均一ではない）はまた、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸、甲状腺、膵臓および膀胱の癌を含む他の癌腫でも観察されている。とりわけ、Ｋｉｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：９７４（１９８５）；Ｙｏｋｏｔａら、Ｌａｎｃｅｔ：１：７６５〜７６７（１９８６）；Ｆｕｋｕｓｈｉｇｅら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，６：９５５〜９５８（１９８６）；Ｇｕｅｒｉｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓ．，３：２１〜３１（１９８８）；Ｃｏｈｅｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，４：８１〜８８（１９８９）；Ｙｏｎｅｍｕｒａら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５１：１０３４（１９９１）；Ｂｏｒｓｔら、Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ，３８：３６４（１９９０）；Ｗｅｉｎｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５０：４２１〜４２５（１９９０）；Ｋｅｒｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５０：５１８４（１９９０）；Ｐａｒｋら、，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４９：６６０５（１９８９）；Ｚｈａｕら、，Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇ．，３：２５４〜２５７（１９９０）；Ａａｓｌａｎｄら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５７：３５８〜３６３（１９８８）；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５９：４６〜５２（１９９１）；およびＭｃＣａｎｎら、Ｃａｎｃｅｒ，６５：８８〜９２（１９９０）を参照のこと。ＨＥＲ２は、前立腺癌で過剰発現され得る（Ｇｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．９９：１８５〜９（１９９６）；Ｒｏｓｓら、Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．２８：８２７〜３３（１９９７）；Ｒｏｓｓら、Ｃａｎｃｅｒ  ７９：２１６２〜７０（１９９７）；ならびにＳａｄａｓｉｖａｎら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５０：１２６−３１（１９９３））。
【００９３】
ＨＥＲ２の増幅／過剰発現は、侵攻性の疾患または不要な予後と関連する乳癌の初期事象である。ＨＥＲ２遺伝子増幅は、２０〜２５％の原発性乳癌で見られる（Ｓｌａｍｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：７０７〜１２（１９８９）；Ｏｗｅｎｓら、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ  ７６：Ｓ６８  ａｂｓｔｒａｃｔ  ２３６（２００２））。ＨＥＲ２陽性の疾患は、無再発および全生存の低下と相関している（Ｓｌａｍｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：１７７〜８２（１９８７）；Ｐａｕｌｅｔｔｉら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １８：３６５１〜６４（２０００））。ＨＥＲ２遺伝子の増幅は、リンパ節陽性疾患における再発までの時間の有意な短縮および不良な生存（Ｓｌａｍｏｎら、（１９８７）；Ｐａｕｌｅｔｔｉら、（２０００））ならびにリンパ節陰性疾患の不良な転帰（Ｐｒｅｓｓら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １９９７；１５：２８９４−９０４（１９９７）；Ｐａｕｌｅｔｔｉら、（２０００））と関連している。
【００９４】
ラットｐｌ８５ｎｅｕおよびヒトＨＥＲ２タンパク質生成物に対する抗体が記載されている。
【００９５】
Ｄｒｅｂｉｎおよび同僚らは、ラットのｎｅｕ遺伝子産物ｐｌ８５ｎｅｕに対する抗体を惹起している。例えば、Ｄｒｅｂｉｎら、Ｃｅｌｌ  ４１：６９５〜７０６（１９８５）；Ｍｙｅｒｓら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１９８：２７７〜２９０（１９９１）；およびＷＯ９４／２２４７８を参照のこと。Ｄｒｅｂｉｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２：２７３〜２７７（１９８８）は、ｐ１８５ｎｅｕの２つの別個の領域と反応性である抗体の混合物が、ヌードマウスに移植されたｎｅｕ−形質転換されたＮＩＨ−３Ｔ３細胞に対して相乗的な抗腫瘍効果を生じるということを報告している。また１９９８年１０月２０日発行米国特許第５，８２４，３１１号も参照のこと。
【００９６】
Ｈｕｄｚｉａｋら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９（３）：１１６５〜１１７２（１９８９）は、ヒト乳房腫瘍細胞株ＳＫ−ＢＲ−３を用いて特徴づけされたＨＥＲ２抗体のパネルの生成を記載している。抗体に対する暴露後、ＳＫ−ＢＲ−３細胞の相対的な細胞増殖は、７２時間後、単層のクリスタル・バイオレット・染色によって決定した。このアッセイを用いて、最大阻害は、４Ｄ５と呼ばれる抗体で得られ、この抗体は細胞増殖を５６％まで阻害した。このパネルにおける他の抗体は、このアッセイでより低い程度まで細胞増殖を軽減した。この抗体４Ｄ５はさらに、ＴＮＦ−αの細胞傷害性効果に対して、ＨＥＲ２過剰発現乳房腫瘍細胞株を感作することが見出された。また、１９９７年１０月１４日発行の米国特許第５，６７７，１７１号も参照のこと。Ｈｕｄｚｉａｋらに考察されるＨＥＲ２抗体はさらに、Ｆｅｎｄｌｙら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５０：１５５０〜１５５８（１９９０）；Ｋｏｔｔｓら、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ２６（３）：５９Ａ（１９９０）；Ｓａｒｕｐら、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  １：７２〜８２（１９９１）；Ｓｈｅｐａｒｄら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１（３）：１１７〜１２７（１９９１）；Ｋｕｍａｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１（２）：９７９〜９８６（１９９１）；Ｌｅｗｉｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３７：２５５〜２６３（１９９３）；Ｐｉｅｔｒａｓら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ９：１８２９〜１８３８（１９９４）；Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５４：５３０１〜５３０９（１９９４）；Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（２０）：１４６６１〜１４６６５（１９９４）；Ｓｃｏｔｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１４３００〜５（１９９１）；Ｄ’ｓｏｕｚａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：７２０２〜７２０６（１９９４）；Ｌｅｗｉｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５６：１４５７〜１４６５（１９９６）；およびＳｃｈａｅｆｅｒら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １５：１３８５〜１３９４（１９９７）において特徴づけられる。
【００９７】
マウスＨＥＲ２抗体４Ｄ５の組み換えヒト化バージョン（ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８、ｒｈｕＭＡｂ  ＨＥＲ２、トラスツマブまたはＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）；米国特許第５，８２１，３３７号）は、大がかりな事前の抗癌療法を受けている、ＨＥＲ２過剰発現転移性乳癌を有する患者で臨床的に活性である（Ｂａｓｅｌｇａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１４：７３７〜７４４（１９９６））。
【００９８】
種々の特性を有する他のＨＥＲ２抗体は、Ｔａｇｌｉａｂｕｅら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４７：９３３〜９３７（１９９１）；ＭｃＫｅｎｚｉｅら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ４：５４３〜５４８（１９８９）；Ｍａｉｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：５３６１〜５３６９（１９９１）；Ｂａｃｕｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ３：３５０〜３６２（１９９０）；Ｓｔａｎｃｏｖｓｋｉら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８８：８６９１〜８６９５（１９９１）；Ｂａｃｕｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：２５８０〜２５８９（１９９２）；Ｘｕら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５３：４０１〜４０８（１９９３）；ＷＯ９４／００１３６；Ｋａｓｐｒｚｙｋら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：２７７１〜２７７６（１９９２）；Ｈａｎｃｏｃｋら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：４５７５〜４５８０（１９９１）；Ｓｈａｗｖｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：１３６７〜１３７３（１９９４）；Ａｒｔｅａｇａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：３７５８〜３７６５（１９９４）；Ｈａｒｗｅｒｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６７：１５１６０〜１５１６７（１９９２）；米国特許第５，７８３，１８６；ならびにＫｌａｐｐｅｒら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １４：２０９９〜２１０９（１９９７）に記載されている。
【００９９】
相同性スクリーニングによって、２つの他のＨＥＲレセプターファミリーのメンバーの特定が得られている；ＨＥＲ３（米国特許第５，１８３，８８４号および同第５，４８０，９６８号、ならびにＫｒａｕｓら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８６：９１９３〜９１９７（１９８９））およびＨＥＲ４（欧州特許出願第５９９，２７４号；Ｐｌｏｗｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：１７４６〜１７５０（１９９３）；およびＰｌｏｗｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３６６：４７３〜４７５（１９９３））。これらのレセプターの両方が、少なくともいくつかの乳癌細胞株で発現の増大を示す。
【０１００】
ＨＥＲレセプターは一般には、種々の組合せで細胞に見出され、そしてヘテロ二量体化は、種々のＨＥＲリガンドに対する細胞応答の多様性を増大すると考えられる（Ｅａｒｐら、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ３５：１１５〜１３２（１９９５））。ＥＧＦＲは、６つの異なるリガンドによって結合される；上皮増殖因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子α（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  α）（ＴＧＦ−α）、アンフィレグリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）、ヘパリン結合上皮増殖因子（ｈｅｐａｒｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）（ＨＢ−ＥＧＦ）、ベタセルリン（ｂｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎ）およびエピレグリン（ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ）（Ｇｒｏｅｎｅｎら、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  １１：２３５〜２５７（１９９４））。単一遺伝子の選択的スプライシングから得られるヘレグリン（ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ）タンパク質のファミリーは、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４についてのリガンドである。ヘレグリンファミリーは、α、βおよびγヘレグリンを包含する（Ｈｏｌｍｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：１２０５〜１２１０（１９９２）；米国特許第５，６４１，８６９；およびＳｃｈａｅｆｅｒら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １５：１３８５〜１３９４（１９９７））；ｎｅｕ分化因子（ｎｅｕ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ）（ＮＤＦ）、グリア増殖因子（ＧＧＦ）；アセチルコリンレセプター誘導性活性（ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）（ＡＲＩＡ）；ならびに感覚および運動ニューロン由来因子（ｓｅｎｓｏｒｙ  ａｎｄ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒ）（ＳＭＤＦ）。概説については、Ｇｒｏｅｎｅｎら、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  １１：２３５〜２５７（１９９４）；Ｌｅｍｋｅ，Ｇ．Ｍｏｌｅｃ．＆Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：２４７〜２６２（１９９６）およびＬｅｅら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｖ．４７：５１〜８５（１９９５）を参照のこと。近年、３つのさらなるＨＥＲリガンドが特定された；ＨＥＲ３またはＨＥＲ４のいずれかに結合することが報告されるニューレグリン−２（ＮＲＧ−２）（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８７  ５０９〜５１２（１９９７）；およびＣａｒｒａｗａｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：５１２〜５１６（１９９７））；ＨＥＲ４に結合するニューレグリン−３（Ｚｈａｎｇら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９４（１８）：９５６２〜７（１９９７））；ならびにＨＥＲ４に結合するニューレグリン−４（Ｈａｒａｒｉら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８：２６８１〜８９（１９９９））ＨＢ−ＥＧＦ、ベタセルリン（ｂｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎ）そしてエピレグリンもまたＨＥＲ４に結合する。
【０１０１】
ＥＧＦおよびＴＧＦαは、ＨＥＲ２に結合するが、ＥＧＦはＥＧＦＲおよびＨＥＲ２を刺激して、ヘテロ二量体を形成し、これがＥＧＦＲを活性化して、ＨＥＲ２のリン酸転移反応をヘテロ二量体で生じる。二量体化および／またはリン酸化転移反応は、ＨＥＲ２チロシンキナーゼを活性化すると考えられる。Ｅａｒｐら、前出を参照のこと。同様に、ＨＥＲ３がＨＥＲ２と同時発現される場合、活性なシグナル伝達複合体が形成されて、ＨＥＲ２に対する抗体はこの複合体を破壊し得る（Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９（２０）：１４６６１〜１４６６５（１９９４））。さらに、ヘレグリン（ＨＲＧ）についてのＨＥＲの親和性は、ＨＥＲ２と同時発現される場合高い親和性状態まで増大される。また、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３タンパク質複合体に関しては、Ｌｅｖｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １５：１３２９〜１３４０（１９９５）；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：１４３１〜１４３５（１９９５）；ならびにＬｅｗｉｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６：１４５７〜１４６５（１９９６）を参照のこと。ＨＥＲ４は、ＨＥＲ３と同様に、ＨＥＲ２との活性なシグナル伝達複合体を形成する（ＣａｒｒａｗａｙおよびＣａｎｔｌｅｙ，Ｃｅｌｌ７８：５〜８（１９９４））。
【０１０２】
ＨＥＲ抗体に関する特許刊行物としては以下が挙げられる：米国特許第５，６７７，１７１号、米国特許第５，７２０，９３７号、米国特許第５，７２０，９５４号、米国特許第５，７２５，８５６号、米国特許第５，７７０，１９５号、米国特許第５，７７２，９９７号、米国特許第６，１６５，４６４号、米国特許第６，３８７，３７１号、米国特許第６，３９９，０６３号、米国特許出願公開第２００２／０１９２２１１Ａ１号、米国特許第６，０１５，５６７号、米国特許第６，３３３，１６９号、米国特許第４，９６８，６０３号、米国特許第５，８２１，３３７号、米国特許第６，０５４，２９７号、米国特許第６，４０７，２１３号、米国特許第６，７１９，９７１号、米国特許第６，８００，７３８、米国特許出願公開第２００４／０２３６０７８Ａ１号、米国特許第５，６４８，２３７号、米国特許第６，２６７，９５８号、米国特許第６，６８５，９４０号、米国特許第６，８２１，５１５、ＷＯ９８／１７７９７、米国特許第６，１２７，５２６号、米国特許第６，３３３，３９８号、米国特許第６，７９７，８１４号、米国特許第６，３３９，１４２号、米国特許第６，４１７，３３５号、米国特許第６，４８９，４４７、ＷＯ９９／３１１４０、米国特許出願公開第２００３／０１４７８８４Ａ１号、米国特許出願公開第２００３／０１７０２３４Ａ１号、米国特許出願公開第２００５／０００２９２８Ａ１号、米国特許第６，５７３，０４３、米国特許出願公開第２００３／０１５２９８７Ａ１号、ＷＯ９９／４８５２７、米国特許出願公開第２００２／０１４１９９３Ａ１号、ＷＯ０１／００２４５、米国特許出願第２００３／００８６９２４号、米国特許出願公開第２００４／００１３６６７Ａ１号、ＷＯ００／６９４６０、ＷＯ０１／００２３８、ＷＯ０１／１５７３０号、米国特許第６，６２７，１９６Ｂ１号、米国特許第６，６３２，９７９Ｂ１号、ＷＯ０１／００２４４、米国特許出願公開第号２００２／００９０６６２Ａ１号、ＷＯ０１／８９５６６、米国特許出願第２００２／００６４７８５号、米国特許出願第２００３／０１３４３４４号、ＷＯ０４／２４８６６、米国特許出願第２００４／００８２０４７号、米国特許出願公開第２００３／０１７５８４５Ａ１号、ＷＯ０３／０８７１３１、米国特許出願第２００３／０２２８６６３号、ＷＯ２００４／００８０９９Ａ２、米国特許出願第２００４／０１０６１６１号、ＷＯ２００４／０４８５２５、米国特許出願公開第２００４／０２５８６８５Ａ１号、米国特許第５，９８５，５５３号、米国特許第５，７４７，２６１号、米国特許第４，９３５，３４１号、米国特許第５，４０１，６３８号、米国特許第５，６０４，１０７号、ＷＯ８７／０７６４６、ＷＯ８９／１０４１２、ＷＯ９１／０５２６４、欧州特許第４１２，１１６Ｂ１号、欧州特許第４９４，１３５Ｂ１号、米国特許第５，８２４，３１１、欧州特許第４４４，１８１Ｂ１号、欧州特許出願公開第１，００６，１９４Ａ２号、米国特許出願公開第２００２／０１５５５２７Ａ１号、ＷＯ９１／０２０６２、米国特許第５，５７１，８９４号、米国特許第５，９３９，５３１号、欧州特許第５０２，８１２Ｂ１号、ＷＯ９３／０３７４１、欧州特許第５５４，４４１Ｂ１号、欧州特許出願第６５６，３６７Ａ１号、米国特許第５，２８８，４７７号、米国特許第５，５１４，５５４号、米国特許第５，５８７，４５８号、ＷＯ９３／１２２２０、ＷＯ９３／１６１８５、米国特許第５，８７７，３０５、ＷＯ９３／２１３１９、ＷＯ９３／２１２３２、米国特許第５，８５６，０８９号、ＷＯ９４／２２４７８、米国特許第５，９１０，４８６号、米国特許第６，０２８，０５９、ＷＯ９６／０７３２１、米国特許第５，８０４，３９６号、米国特許第５，８４６，７４９、欧州特許第７１１，５６５号、ＷＯ９６／１６６７３号、米国特許第５，７８３，４０４号、米国特許第５，９７７，３２２号、米国特許第６，５１２，０９７号、ＷＯ９７／００２７１号、米国特許第６，２７０，７６５号、米国特許第６，３９５，２７２号、米国特許第５，８３７，２４３号、ＷＯ９６／４０７８９、米国特許第５，７８３，１８６号、米国特許第６，４５８，３５６号、ＷＯ９７／２０８５８、ＷＯ９７／３８７３１号、米国特許第６，２１４，３８８号、米国特許第５，９２５，５１９号、ＷＯ９８／０２４６３号、米国特許第５，９２２，８４５号、ＷＯ９８／１８４８９、ＷＯ９８／３３９１４号、米国特許第５，９９４，０７１号、ＷＯ９８／４５４７９号、米国特許第６，３５８，６８２Ｂ１号、米国特許出願第２００３／００５９７９０号、ＷＯ９９／５５３６７、ＷＯ０１／２００３３、米国特許出願公開第２００２／００７６６９５Ａ１号、ＷＯ００／７８３４７、ＷＯ０１／０９１８７、ＷＯ０１／２１１９２、ＷＯ０１／３２１５５、ＷＯ０１／５３３５４、ＷＯ０１／５６６０４、ＷＯ０１／７６６３０、ＷＯ０２／０５７９１、ＷＯ０２／１１６７７号、米国特許第６，５８２，９１９号、米国特許出願公開第２００２／０１９２６５２Ａ１号、米国特許出願公開第２００３／０２１１５３０Ａ１号、ＷＯ０２／４４４１３、米国特許出願第２００２／０１４２３２８号、米国特許第６，６０２，６７０Ｂ２号、ＷＯ０２／４５６５３、ＷＯ０２／０５５１０６号、米国特許第２００３／０１５２５７２、米国特許出願第２００３／０１６５８４０号、ＷＯ０２／０８７６１９、ＷＯ０３／００６５０９、ＷＯ０３／０１２０７２、ＷＯ０３／０２８６３８、米国特許出願第２００３／００６８３１８号、ＷＯ０３／０４１７３６、欧州特許第１，３５７，１３２号、米国特許出願第２００３／０２０２９７３号、米国特許出願第２００４／０１３８１６０号、米国特許第５，７０５，１５７号、米国特許第６，１２３，９３９号、欧州特許第６１６，８１２Ｂ１号、米国特許出願第２００３／０１０３９７３号、米国特許出願第２００３／０１０８５４５号、米国特許第６，４０３，６３０Ｂ１号、ＷＯ００／６１１４５、ＷＯ００／６１１８５、米国特許第６，３３３，３４８Ｂ１号、ＷＯ０１／０５４２５、ＷＯ０１／６４２４６、米国特許出願第２００３／００２２９１８、米国特許出願公開第２００２／００５１７８５Ａ１号、米国特許第６，７６７，５４１号、ＷＯ０１／７６５８６、米国特許出願第２００３／０１４４２５２号、ＷＯ０１／８７３３６、米国特許出願公開第２００２／００３１５１５Ａ１号、ＷＯ０１／８７３３４、ＷＯ０２／０５７９１、ＷＯ０２／０９７５４、米国特許出願第２００３／０１５７０９７号、米国特許出願第２００２／００７６４０８号、ＷＯ０２／０５５１０６、ＷＯ０２／０７０００８、ＷＯ０２／０８９８４２およびＷＯ０３／８６４６７。
【０１０３】
本発明の融合ポリペプチドで処置される患者は、ＨＥＲ２過剰発現／増幅に基づく治療のために選択され得る。例えば、ＷＯ９９／３１１４０（Ｐａｔｏｎら）、米国特許出願公開第２００３／０１７０２３４Ａ１号（Ｈｅｌｌｍａｎｎ，Ｓ．）、および米国特許出願第２００３／０１４７８８４号（Ｐａｔｏｎら、）；ならびにＷＯ０１／８９５６６、米国特許出願第２００２／００６４７８５号、および米国特許出願第２００３／０１３４３４４号（Ｍａｓｓら、）を参照のこと。また、米国特許出願第２００３／０１５２９８７号，Ｃｏｈｅｎら、も参照のこと。これは、ＨＥＲ２の過剰発現および増幅を検出するための免疫組織化学（ＩＨＣ）および蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）（ＦＩＳＨ）に関する。
【０１０４】
ＷＯ２００４／０５３４９７および米国特許出願公開第ＵＳ２００４／０２４８１５Ａ１号（Ｂａｃｕｓら）、ならびに米国特許出願第２００３／０１９０６８９号（ＣｒｏｓｂｙおよびＳｍｉｔｈ）は、トラスツマブ治療に対する応答を決定または予測することを言及している。米国特許出願公開第２００４／０１３２９７Ａ１号（Ｂａｃｕｓら）は、ＡＢＸ０３０３  ＥＧＦＲ抗体療法に対する応答を決定または予測することに関する。ＷＯ２００４／００００９４（Ｂａｃｕｓら）は、低分子、ＥＧＦＲ−ＨＥＲ２チロシンキナーゼインヒビターであるＧＷ５７２０１６に対する応答を決定することに関する。ＷＯ２００４／０６３７０９，Ａｍｌｅｒらは、ＥＧＦＲインヒビター、エルロチニブＨＣｌに対する感度を決定するためのバイオマーカーおよび方法を言及する。Ｃｏｂｌｅｉｇｈらの米国特許出願第２００４／０２０９２９０号は、乳癌予後診断のための遺伝子発現マーカーに関する。
【０１０５】
ペルツズマブで処置された患者は、ＨＥＲ活性または二量体化に基づく治療について選択され得る。ペルツズマブおよびそれでの治療のための患者の選択に関する特許刊行物としては以下が挙げられる：ＷＯ０１／００２４５（Ａｄａｍｓら）；米国特許出願第２００３／００８６９２４号（Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．）；米国特許出願公開第２００４／００１３６６７Ａ１号（Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．）；ならびにＷＯ２００４／００８０９９Ａ２、および米国特許出願第２００４／０１０６１６１号（Ｂｏｓｓｅｎｍａｉｅｒら）。
【０１０６】
Ｃｒｏｎｉｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１６４（１）：３５〜４２（２００４）は、記録保管用パラフィン包埋組織での遺伝子発現の測定を記載する。Ｍａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ５：６０７〜６１６（２００４）は、記録保管された最初の生検から採取した腫瘍組織切片から単離したＲＮＡを用いる、遺伝子オリゴヌクレオチドマイクロアレイによる遺伝子プロファイリングを記載する。
【０１０７】
説明は、本発明に従って用いられるさらなるＨＥＲ２抗体の産生のための例示的な技術に従う。抗体の産生のために用いられるべきＨＥＲ２抗原は、例えば、所望のエピトープを含む、ＨＥＲ２レセプターの細胞外ドメインまたはその一部の可溶型であってもよい。あるいは、ＨＥＲ２をその細胞表面で発現する細胞（例えば、ＨＥＲを過剰発現するように形質転換されたＮＩＨ−３Ｔ３細胞；またはＳＫ−ＢＲ−３細胞のようなガン細胞株、Ｓｔａｎｃｏｖｓｋｉら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８８：８６９１〜８６９５（１９９１）を参照のこと）が、抗体を生成するために用いられ得る。抗体を生成するために有用な他の形態のＨＥＲ２は当業者に明らかである。
【０１０８】
（ｉ）ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は好ましくは、関連の抗原およびアジュバントの複数回の皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射によって動物において上昇される。これは、免疫される種で免疫原性であるタンパク質に対して関連の抗原を結合体化するために有用であり得る。例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、または二機能性または誘導体化因子を用いるダイズトリプシンインヒビター、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を通じた結合体化）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を通じる）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、またはＲおよびＲ１が異なるアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ。
【０１０９】
動物を、例えば、１００μｇまたは５μｇのタンパク質または結合体（それぞれ、ウサギまたはマウスについて）と、３容積のフロイントの完全アジュバントとを組み合わせること、およびこの溶液を皮内に複数の部位で注射することによって、この抗原、免疫結合体または誘導体に対して免疫する。１ヶ月後、その動物を、複数部位での皮下注射によって、フロイント完全アジュバント中に含まれる、もとの量のペプチドまたは結合体の１／５〜１／１０を用いてブースト（追加免疫）する。７〜１４日後、その動物を採血して、その血清を抗体力価についてアッセイする。動物を力価がプラトーになるまでブーストする。好ましくは、この動物は同じ抗原の結合体であって、ただし異なるタンパク質に対して、および／または異なる架橋試薬を通じて結合体化された結合体を用いてブーストする。結合体はまた、タンパク質融合物として組み換え細胞培養物中で作成されてもよい。また、ミョウバンのような凝集因子を適切に用いて、免疫応答を増強する。
【０１１０】
（ｉｉ）モノクローナル抗体
本明細書においてモノクローナル抗体を作成するための種々の方法は当該分野で利用可能である。例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって初めて記載されたハイブリドーマ方法を用いて、組み換えＤＮＡ方法によって（米国特許第４，８１６，５６７号）作成されてもよい。
【０１１１】
ハイブリドーマ方法では、マウスまたは他の適切な宿主動物、例えば、ハムスターを、本明細書において上記されるように免疫して、リンパ球を誘導し、このリンパ球が免疫に用いられるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するかまたは抗体を産生し得る。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫されてもよい。次いで、リンパ球を、適切な融合因子、例えば、ポリエチレングリコールを用いて、骨髄腫細胞と融合して、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９〜１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。
【０１１２】
このように調製されたハイブリドーマ細胞を播種して、融合されていない親の骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質を好ましくは含む、適切な培養培地中で播種して増殖する。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は代表的には、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（ＨＡＴ培地）を含み、この物質がＨＧＰＲＴ−欠乏細胞の増殖を妨げる。
【０１１３】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞によって抗体の安定な高レベルの産生を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に感受性である細胞である。これらのなかでも、好ましい骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫株、例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍由来の細胞株、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  ＵＳＡから入手可能なＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞である。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒト異種骨髄腫細胞株はまた、ヒトモノクローナル抗体の産生のために記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；およびＢｒｏｄｅｕｒら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，第５１〜６３頁（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７））。
【０１１４】
ハイブリドーマ細胞が増殖されている培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、またはインビトロ結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定される。
【０１１５】
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のＳｃａｔｃｈａｒｄ分析によって決定され得る。
【０１１６】
所望の特異性、親和性および／または活性の抗体を生じるハイブリドーマ細胞が特定された後、そのクローンを限界希釈手順によってサブクローニングして、標準的な方法によって増殖してもよい（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，第５９〜１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。この目的のための適切な培養培地としては、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。さらに、このハイブリドーマ細胞は、動物の腹水腫瘍としてインビボで増殖され得る。
【０１１７】
このサブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、培養培地、腹水、または血清から、従来の抗体精製手順、例えば、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィーなどによって適切に分離される。
【０１１８】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは従来の手順を用いて容易に単離かつ配列決定される（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）。このハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として機能する。一旦単離されれば、ＤＮＡは、発現ベクターに入れられてもよく、次いで、ここでこれらは、トランスフェクトされなければ抗体タンパク質を生じない宿主細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵母細胞（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ）（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞にトランスフェクトされて、組み換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成が得られる。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組み換え発現に対する概説記事としては、Ｓｋｅｒｒａら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，５：２５６〜２６２（１９９３）およびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．，１３０：１５１〜１８８（１９９２）が挙げられる。
【０１１９】
さらなる実施形態では、モノクローナル抗体または抗体フラグメントは、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２〜５５４（１９９０）に記載の技術を用いて生成された抗体ファージライブラリーから単離され得る。Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４〜６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１〜５９７（１９９１）は、ファージライブラリーを用いる、それぞれマウスおよびヒトの抗体の単離を記載している。その後の刊行物は、チェーンシャッフリングによる高い親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の産生（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９〜７８３（１９９２））、ならびにコンビナトリアルインフェクションおよびインビボ組換えを、極めて大きいファージライブラリーを構築するためのストラテジーとして記載する（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２１：２２６５〜２２６６（１９９３））。従って、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に対する実現可能な代替である。
【０１２０】
このＤＮＡはまた、例えば、相同なマウス配列の位置にヒトの重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列を置き換えることによって（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１（１９８４））、または免疫グロブリンコード配列を非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てまたは一部に共有結合することによって改変され得る。
【０１２１】
代表的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドを、抗体の定常ドメインについて置換するか、またはそれらを、抗体の抗原結合部位の可変ドメインについて置換して、抗原についての特異性を有する１つの抗原結合部位、および異なる抗原について特異性を有する別の抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を作成する。
【０１２２】
（ｉｉｉ）ヒト化抗体
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野で記載されている。好ましくは、ヒト化抗体は、非ヒト供給源からそこに導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば、「インポート（ｉｍｐｏｒｔ）」残基と呼ばれ、代表的には、「インポート」可変ドメインからとられる。ヒト化は本質的に、Ｗｉｎｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３〜３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４〜１５３６（１９８８））に従って、ヒト抗体の対応する配列で超可変領域を置換することによって行われる。従って、このような「ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）」抗体は、キメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）であって、インタクトなヒト可変ドメイン実質的に未満が、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されているキメラ抗体である。実際には、ヒト化抗体とは代表的には、ヒト抗体であって、いくつかの超可変領域残基および可能性としてはいくつかのＦＲ残基がげっ歯類抗体における類似の部位由来の残基で置換されているヒト抗体である。
【０１２３】
ヒト可変ドメインの選択であって、軽鎖および重鎖の両方であって、ヒト化抗体を作成するのにおいて用いられるべきヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低下させるのに極めて重要である。いわゆる「ベスト−フィット（ｂｅｓｔ−ｆｉｔ）」方法によれば、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列は、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングされる。次いで、げっ歯類の配列に最も近いヒト配列が、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク領域（ＦＲ）として受容される（Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９６：９０１（１９８７））。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列由来の特定のフレームワーク領域を用いる。同じフレームワークがいくつかの異なるヒト化抗体のために用いられてもよい（Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５１：２６２３（１９９３））。
【０１２４】
抗原について高い親和性および他の好適な生物学的特性を保持したままで抗体をヒト化することはさらに重要である。この目的を達成するために、好ましい方法に従って、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを用いて、親の配列および種々の概念的なヒト化生成物の分析のプロセスによって、ヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般に、利用可能であって、かつ当業者には周知である。選択された候補免疫グロブリン配列の有望な三次元立体配置構造を図示および提示するコンピュータープログラムが利用可能である。これらのディスプレイの検討によって、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響する残基の分析が可能になる。この方法では、ＦＲ残基は、レシピエントおよび重要な配列から選択されかつ組み合わされて、その結果所望の抗体特徴、例えば、標的抗原についての親和性の増大が達成される。一般には、この超可変領域の残基は直接かつもっとも実質的に抗原結合に対する影響に関与する。
【０１２５】
種々の形態のヒト化抗体またはアフィニティー成熟抗体が考慮される。例えば、ヒト化抗体または親和性（アフィニティー）成熟された抗体は、抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂであってもよく、これは免疫結合体を生成するために１つ以上の細胞傷害性因子と必要に応じて結合体化される。あるいは、このヒト化抗体または親和性成熟抗体は、インタクトな抗体、例えば、インタクトなＩｇＧ１抗体であってもよい。
【０１２６】
マウス４Ｄ５抗体のヒト化であって、そのヒト化改変体を生成するためのヒト化は、トラスツマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）を含み、米国特許第５，８２１，３３７号、同第６，０５４，２９７号、同第６，４０７，２１３号、同第６，６３９，０５５号、同第６，７１９，９７１号、および同第６，８００，７３８号、ならびにＣａｒｔｅｒら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８９：４２８５〜４２８９（１９９２）に記載される。ＨｕＭＡｂ４Ｄ５−８（トラスツマブ）は、ＨＥＲ２抗原に対して、マウス４Ｄ５抗体よりも３倍緊密に結合し、そしてヒトエフェクター細胞の存在下でヒト化抗体の直接の細胞傷害性活性を可能にする二次的な免疫機能（ＡＤＣＣ）を有した。ＨｕＭＡｂ４Ｄ５−８は、ＶＬκサブグループＩコンセンサスフレームワークに組み込まれた可変軽鎖（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ）（ＶＬ）ＣＤＲ残基、およびＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークに組み込まれた可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ残基を含んだ。この抗体はさらに、ＶＨの７１、７３、７８および９３の位置で（ＦＲ残基のＫａｂａｔ番号付け）フレームワーク領域（ＦＲ）置換を；そしてＶＬの６６位置（ＦＲ残基のＫａｂａｔ番号付け）でＦＲ置換を含んだ。トラスツマブは、非Ａアロタイプヒトγ１Ｆｃ領域を含む。
【０１２７】
（ｉｖ）ヒト抗体
ヒト化とは別に、ヒト抗体が生成されてもよい。例えば、今や、内因性の免疫グロブリン生成なしにヒト抗体のフルレパートリーを免疫の際に産生し得るトランスジェニック動物（すなわち、マウス）を作成できる。例えば、キメラおよび生殖系列変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性欠失は内因性抗体産生の完全な阻害を生じるということが記載されている。このような生殖系列変異マウスにおけるヒト生殖系列の免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、抗原チャレンジの際にヒト抗体の産生を生じる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５〜２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）；ならびに米国特許第５，５９１，６６９号、同第５，５８９，３６９号、および同第５，５４５，８０７号を参照のこと。あるいは、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２〜５５３（１９９０））を用いて、ヒト抗体および抗体フラグメントを、インビトロにおいて、免疫されていないドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから生成してもよい。この技術によれば、抗体のＶドメイン遺伝子は、糸状バクテリオファージ、例えば、Ｍ１３またはｆｄの大きいまたは小さいコートタンパク質遺伝子のいずれかにインフレームでクローニングされ、そしてファージ粒子の表面上の機能的な抗体フラグメントとして提示される。糸状粒子は、ファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能的な特性に基づく選択によってまた、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択が得られる。従って、このファージはＢ細胞のいくつかの特性を模倣する。ファージディスプレイは、種々の形式で行われてもよい；例えばそれらの概説については、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ  Ｓ．およびＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ  Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５６４〜５７１（１９９３）を参照のこと。Ｖ−遺伝子セグメントのいくつかの供給源が、ファージディスプレイのために用いられ得る。Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４〜６２８（１９９１）は、免疫されたマウスの脾臓から誘導されたＶ遺伝子の小型のランダムなコンビナトリアルライブラリーから、抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。免疫されていないヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーが、構築されてもよく、そして抗原（自己抗原を含む）の多様なアレイに対する抗体は、本質的に、Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１〜５９７（１９９１）、またはＧｒｉｆｆｉｔｈら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５〜７３４（１９９３）に記載される技術に従って単離されてもよい。米国特許第５，５６５，３３２号および同第５，５７３，９０５号も参照のこと。
【０１２８】
上記で考察されるとおり、ヒト抗体は、インビトロで活性化されたＢ細胞によって生成されてもよい（米国特許第５，５６７，６１０号および同第５，２２９，２７５号を参照のこと）。
【０１２９】
ヒトＨＥＲ２抗体は、１９９８年６月３０日発行の米国特許第５，７７２，９９７号、および１９９７年１月３日発行のＷＯ９７／００２７１に記載される。
【０１３０】
（ｖ）抗体フラグメント
種々の技術が、１つ以上の抗原結合領域を含む抗体フラグメントの生成について開発されている。伝統的には、これらのフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質分解性の消化を介して誘導される（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７〜１１７（１９９２）；およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照のこと）。しかし、これらのフラグメントはいまや、組み換え宿主細胞によって直接生成され得る。例えば、抗体フラグメントは、上記で考察される抗体ファージライブラリーから単離されてもよい。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収されて、そして化学的にカップリングされてＦ（ａｂ’）２フラグメントが形成される（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３〜１６７（１９９２））。別のアプローチによれば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、組み換え宿主細胞培養物から直接単離され得る。抗体フラグメントの産生のための他の技術は、当業者に明白である。抗体フラグメントはまた、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に例えば、記載されるような「直鎖状抗体（ｌｉｎｅａｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」であってもよい。このような直鎖状抗体フラグメントは、一価特異的または二価特異的であり得る。一般には、それらは、本発明の融合タンパク質に用いられる場合二価特異的である。
【０１３１】
（ｖｉ）二価特異的抗体
二価特異的抗体とは、少なくとも２つの異なるエピトープについて結合特異性を有する抗体である。例示的な二価特異的抗体は、ＨＥＲ２タンパク質の２つの異なるエピトープに結合し得る。他のこのような抗体は、ＨＥＲ２結合部位とＥＧＦＲ、ｈＥＲ３および／またはＨＥＲ４についての結合部位とを組み合わせ得る。あるいは、ＨＥＲ２アームは、ＨＥＲ２発現細胞に対する細胞防御機構に集中するように、白血球上のトリガー分子、例えば、Ｔ細胞レセプター分子（例えば、ＣＤ２またはＣＤ３）、またはＩｇＧについてのＦｃレセプター（ＦｃγＲ）、例えば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）に結合するアームと組み合わされてもよい。二価特異的な抗体はまた、ＨＥＲ２を発現する細胞に対して細胞傷害性因子を局在させるために用いられ得る。これらの抗体は、ＨＥＲ２結合アームおよび細胞傷害性剤（例えば、サポリン、抗インターフェロンα、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセートまたは放射性同位体ハプテン）に結合するアームを保有する。二価特異的な抗体は、全長抗体として調製されても、または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二価特異的抗体）として調製されてもよい。
【０１３２】
ＷＯ９６／１６６７３は、二価特異的なＨＥＲ２／ＦｃγＲＩＩＩ抗体を記載しており、そして米国特許第５，８３７，２３４号は、二価特異的なＨＥＲ２／ＦｃγＲＩ抗体ＩＤＭ１（Ｏｓｉｄｅｍ）を開示する。二価特異的なＨＥＲ２／Ｆｃα抗体は、ＷＯ９８／０２４６３に示される。米国特許第５，８２１，３３７号は、二価特異的なＨＥＲ２／ＣＤ３抗体を教示する。ＭＤＸ−２１０は、二価特異的なＨＥＲ２−ＦｃγＲＩＩＩ  Ａｂである。
【０１３３】
二価特異的な抗体を作成するための方法は当該分野で公知である。全長の二価特異的な抗体の伝統的な産生は、２つの鎖が異なる特異性を有する、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖の対の過剰発現に基づく（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７〜５３９（１９８３））。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな組み合わせのおかげで、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０の異なる抗体分子の可能性のある混合物を生成し、そのうち１つだけが正確な二価特異性の構造を有する。アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常行われる正確な分子の精製はむしろ厄介であって、その生成収率は低い。同様の手順がＷＯ９３／０８８２９に、そしてＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：３６５５〜３６５９（１９９１）に開示される。
【０１３４】
異なるアプローチによれば、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原組み合わせ部位）は、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。この融合は好ましくは、少なくとも一部のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む、免疫グロブリン重鎖定常ドメインとである。少なくとも１つの融合物に存在する、軽鎖結合のために必要な部位を含む第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物、および所望の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを、別の発現ベクターに挿入して、適切な宿主生物体に同時トランスフェクトする。これによって、この構築物で用いられる３つのポリペプチド鎖の等しくない比が最適の収率を生じる場合の実施形態で、３つのポリペプチドフラグメントの変異割合を調節するのにおいて大きな可塑性が得られる。しかし、少なくとも２つのポリペプチド鎖の等しい比での発現が高い収率を生じるか、またはこの比が特に有意ではない場合、１つの発現ベクターにおいて２つまたは３つ全てのポリペプチド鎖をコード配列に挿入することが可能である。
【０１３５】
このアプローチの好ましい実施形態では、この二価特異的な抗体は、１つのアームにおける第一の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他のアームにおけるハイブリッドの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第二の結合特異性を提供する）から構成される。この非対称性構造によって、望ましくない免疫グロブリン鎖の組合せ由来の所望の二価特異的な化合物の分離を促進することが見出されている。なぜなら二価特異的な分子の半分だけの免疫グロブリン軽鎖の存在によって手軽な分離方法が得られるからである。このアプローチは、ＷＯ９４／０４６９０に開示される。二価特異的な抗体を生成するためのさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照のこと。
【０１３６】
米国特許第５，７３１，１６８号に記載される別のアプローチによれば、抗体分子の対の間の境界は、組み換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の割合を最大化するために操作されてもよい。好ましい境界は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第一の抗体分子の境界からの１つ以上の小さいアミノ酸側鎖が、それより大きい側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えられる。大きい側鎖に対する同一または同様のサイズの代償性「キャビティ（ｃａｖｉｔｉｅｓ）」が、第二の抗体分子の境界上で、大きいアミノ酸側鎖を小さいもの（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置き換えることによって作成される。これによって、ホモ二量体のような他の望ましくない最終生成物を超えてヘテロ二量体の収率を増大するための機構が得られる。
【０１３７】
二価特異的な抗体としては、架橋された抗体または「ヘテロ結合体（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」抗体が挙げられる。例えば、ヘテロ結合体における抗体の１つは、アビジンに、その他はビオチンに結合されてもよい。このような抗体は、例えば、望ましくない細胞へ免疫系細胞を標的するために（米国特許第４，６７６，９８０）、そしてＨＩＶ感染の処置のために（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３、および欧州特許第０３０８９号）提唱されている。異種結合体抗体は、任意の従来の架橋方法を用いて作成され得る。適切な架橋剤は、当該分野で周知であって、多数の架橋技術とともに、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
【０１３８】
抗体フラグメントからの二価特異的な抗体の生成のための技術も文献に記載されている。例えば、二価特異的抗体は、化学結合を用いて調製され得る。Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）は、インタクトな抗体がタンパク質分解的に切断されてＦ（ａｂ’）２フラグメントが生成される手順を記載している。これらのフラグメントを、ジチオール錯化剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して、近接するジオールを安定化して、分子内のジスルフィド形成を妨げる。次いで、生成されたＦａｂ’フラグメントを、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つが、メルカプトエチルアミンでの還元によってＦａｂ’−チオールに再変換されて、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合され、二価特異的な抗体が形成される。生成された二価特異的な抗体は、酵素の選択的な免疫のための因子として用いられ得る。
【０１３９】
近年の進歩によって、二価特異的抗体を形成するように化学的にカップリングされ得る、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＦａｂ’−ＳＨフラグメントの直接の回収が容易になっている。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５：２１７〜２２５（１９９２）は、完全にヒト化された二価特異的な抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生を記載している。各々のＦａｂ’フラグメントはＥ．ｃｏｌｉから別々に分泌されて、インビトロで直接の化学的カップリングに供されて、二価特異的な抗体が形成される。このように形成された二価特異的な抗体は、ＨＥＲ２レセプターを過剰発現する細胞、および正常なヒトＴ細胞に結合し得、そしてヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解性活性を誘発する。
【０１４０】
組み換え細胞培養物から直接、二価特異的抗体フラグメントを作成および単離するための種々の技術も記載されている。例えば、二価特異的抗体は、ロイシンジッパーを用いて生成されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７〜１５５３（１９９２）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドが、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に結合された。この抗体ホモ二量体はヒンジ領域で還元されて、単量体が形成され、次いで再酸化されて、抗体のヘテロ二量体が形成される。この方法はまた、抗体のホモ二量体の生成についても利用され得る。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４〜６４４８（１９９３）に記載される「二重特異性抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）」技術によって、二価特異的な抗体フラグメントを作成するための代替的な機構が提供されている。このフラグメントは、同じ鎖の上の２つのドメインの間の対合を可能にするためには短すぎるリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。従って、１つのフラグメントのＶＨおよびＶＬドメインは、別のフラグメントの相補的なＶＬおよびＶＨドメインと対合するように強制され、これによって２つの抗原結合部位が形成される。一本鎖Ｆｖ（ｓＦＶ）二量体の使用によって二価特異的抗体フラグメントを作成するための別のストラテジーも報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５２：５３６８（１９９４）を参照のこと。
【０１４１】
３つ以上の価数を有する抗体が考慮される、例えば、三価特異的抗体が調製される。Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【０１４２】
（ｖｉｉ）他のアミノ酸配列改変
本明細書に記載される抗体のアミノ酸配列改変が考慮される。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが所望され得る。抗体のアミノ酸配列改変体は、適切なヌクレオチド変化を抗体核酸へ導入することによって、またはペプチド合成によって調製される。このような改変としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／またはそこへの挿入、および／またはその置換が挙げられる。欠失、挿入および置換の任意の組合せを行って、最終構築物に達するが、これはこの最終構築物が所望の特徴を有するという条件下である。このアミノ酸変化はまた、グリコシル化部位の数または位置を変化させるような、抗体の翻訳後プロセシングを変化し得る。
【０１４３】
突然変異誘発のための好ましい位置である抗体の特定の残基または領域の特定のための有用な方法は、ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓによってＳｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１〜１０８５（１９８９）に記載されるように、「アラニンスキャニング突然変異誘発（ａｌａｎｉｎｅ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）」と呼ばれる。ここでは、残基または標的残基の群が特定され（例えば、家電された残基、例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕ）、そしてアミノ酸と抗原との相互作用に影響するように中性または負に荷電されたアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）で置換される。次いで、この置換基に対する機能的な感度を実証するアミノ酸位置は、置換の部位でまたは置換の部位をさらにまたは他の改変体を導入することによって精錬される。このようにアミノ酸配列改変を導入するための部位は予め決定されるが、変異の性質自体は、予め決定される必要はない。例えば、所定の部位で変異の能力を分析するために、ａｌａ（アラニン）スキャニングまたはランダム変異導入法（ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を標的コドンまたは領域で行い、そして発現された抗体改変体を所望の活性についてスクリーニングする。
【０１４４】
アミノ酸配列挿入としては、１残基から百以上の残基を含むポリペプチドまでの長さにおよぶアミノ末端および／またはカルボキシル末端融合物、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列間挿入物が挙げられる。末端挿入物の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体、または細胞傷害性ポリペプチドに融合された抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入改変体としては、抗体の血清半減期を延長する酵素（例えば、ＡＤＥＰＴについて）またはポリペプチドに対する抗体のＮ末端またはＣ末端に対する融合が挙げられる。
【０１４５】
別のタイプの改変体は、アミノ酸置換改変体である。これらの改変体は、異なる残基で置換される抗体分子中に少なくとも１つのアミノ酸残基を有する。置換突然変異誘発のための最も望ましい部位としては、超可変領域が挙げられるが、ＦＲ変更も意図される。保存的置換は表１に「好ましい置換（ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）」という見出しで示される。このような置換が、生物学的活性に変化を生じるならば、表１において「例示的な置換（ｅｘｅｍｐｌａｒｙ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）」と命名されるか、またはアミノ酸のクラスに関して下にさらに記載される、より実質的な変化が導入されて、生成物がスクリーニングされてもよい。
【０１４６】
【表１−１】
2009514537.tif 000003
【０１４７】
【表１−２】
2009514537.tif 000004
抗体の生物学的な特性における実質的な改変は、（ａ）置換の領域でポリペプチド骨格の構造を、例えば、シートまたはらせん高次構造として、（ｂ）標的部位でその分子の荷電もしくは疎水性を、または（ｃ）側鎖のバルクを、維持することに対してその影響を有意に変える置換を選択することによって達成される。アミノ酸は、それらの側鎖の特性における類似性に従って分類され得る（Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２版、第７３〜７５頁，Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７５））：
（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、ＶａＩ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）
（２）非荷電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（登録商標）、Ｈｉｓ（Ｈ）
あるいは、天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて群に分けられてもよい。
【０１４８】
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の方向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１４９】
非保存的な置換基は、別のクラスをこれらのクラスの１つのメンバーで交換するこを包含する。
【０１５０】
抗体の適切な高次構造を維持するのに関与しない任意のシステイン残基は、その分子の酸化的安定性を改善して異常な架橋を妨げるために、一般にはセリンで置換されてもよい。逆に、システイン結合が、抗体に対してその安定性を改善するために付加されてもよい（特にこの抗体がＦｖフラグメントのような抗体フラグメントである場合）。
【０１５１】
特に好ましいタイプの置換改変体は、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換する工程を包含する。一般には、さらなる開発のために選択された、得られた改変体は、それらが生成される親抗体に対して改善された生物学的特性を有する。このような置換改変体を生成するための従来の方法は、ファージディスプレイを用いるアフィニティー成熟に関与する。要するに、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７部位）が変異されて、各々の部位で全ての可能なアミノ置換が生成される。このように生成された抗体改変体は、各々の粒子内のＭ１３パッケージの遺伝子ＩＩＩ産物に対する融合物として糸状ファージ粒子から１価の方式で提示される。次いで、このファージディスプレイ改変体は、本明細書に開示されるような、それらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。改変のための候補超可変領域を特定するためには、アラニンスキャンニング変異誘発を行って、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を特定してもよい。あるいはまたはさらに、抗体とヒトＨＥＲ２との間の接触ポイントを特定するための抗原−抗体複合体の結晶構造を分析することが有益であり得る。このような接触残基および隣接する残基は、本明細書に詳細に述べられた技術によれば置換のための候補である。一旦このような改変体が生成されれば、改変体のパネルは、本明細書に記載されるようなスクリーニングに供されて、優れた特性を有する抗体が１つ以上の関連のアッセイでさらなる開発のためにスクリーニングされ得る。
【０１５２】
本明細書における例示的なトラスツマブ改変体としては、米国特許出願公開第２００３／０２２８６６３Ａ１号（Ｌｏｗｍａｎら、）に記載のものが挙げられ、これは以下のＶＬ位置の１つ以上の置換：Ｑ２７、Ｄ２８、Ｎ３０、Ｔ３１、Ａ３２、Ｙ４９、Ｆ５３、Ｙ５５、Ｒ６６、Ｈ９１、Ｙ９２、および／もしくはＴ９４；ならびに／あるいは１つ以上のＶＨ位置：Ｗ９５、Ｄ９８、Ｆ１００、Ｙ１００ａ、および／またはＹ１０２の置換を包含する。
【０１５３】
抗体の別のタイプのアミノ酸改変体は、この抗体のもとのグリコシル化パターンを変更する。変更するとは、抗体で見いだされる１つ以上の炭水化物部分を欠失すること、および／またはこの抗体に存在しない１つ以上のグリコシル化部位を付加することを意味する。
【０１５４】
抗体のグリコシル化は代表的には、Ｎ連結またはＯ連結のいずれかである。Ｎ連結とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付加をいう。このトリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニンは、Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸であって、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的付加のための認識配列である。従って、ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を作成する。Ｏ結合グリコシル化部位（Ｏ−ｌｉｎｋｅｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）とは、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはトレオニンに対する糖Ｎ−アシルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースのうちの１つの付加をいうが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンも用いられてもよい。
【０１５５】
抗体に対するグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を変更することによって都合よく達成され、その結果この抗体は、１つ以上の上記のトリペプチド配列（Ｎ連結グリコシル化部位について）を含む。この変更はまた、もとの抗体の配列への１つ以上ののセリンまたはトレオニン残基の付加、またはそれによる置換によって作成され得る（Ｏ−連結グリコシル化部位について）。
【０１５６】
この抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合される炭水化物が変更されてもよい。例えば、抗体のＦｃ領域に結合されたフコースを欠く成熟炭水化物構造を有する抗体は、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌの米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８Ａ１号に記載される。また、米国特許出願公開第２００４／００９３６２１Ａ１号（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）も参照のこと。抗体のＦｃ領域に結合された炭水化物におけるＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）が分断されている抗体は、ＷＯ０３／０１１８７８，Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔら、および米国特許第６，６０２，６８４号、Ｕｍａｎａらに言及される。抗体のＦｃ領域に結合されたオリゴサッカライドに少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体は、ＰａｔｅｌらのＷＯ９７／３００８７に報告される。また、そのＦｃ領域に結合された変更された炭水化物を有する抗体に関与するＷＯ９８／５８９６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）およびＷＯ９９／２２７６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）も参照のこと。
【０１５７】
例えば、抗体の抗原依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を増強するために、エフェクター機能に関して本発明の抗体を改変することが所望され得る。これは、抗体のＦｃ領域において１つ以上のアミノ酸置換を導入することによって達成され得る。あるいは、またはさらに、システイン残基がＦｃ領域に導入されてもよく、これによってこの領域における鎖間ジスルフィド結合形成が可能になる。このように生成されたホモ二量体抗体は、改善された内部移行能力および／または増大した補体依存性細胞傷害性および抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有し得る。Ｃａｒｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１７６：１１９１〜１１９５（１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ，Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８〜２９２２（１９９２）を参照のこと。増強された抗腫瘍活性を有するホモ二量性抗体はまた、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：２５６０〜２５６５（１９９３）に記載されるようなヘテロ二官能性の架橋剤を用いて調製されてもよい。あるいは、二重のＦｃ領域を有し、それによって増強された補体溶解およびＡＤＣＣ能力を有し得る抗体が操作されてもよい。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３：２１９〜２３０（１９８９）を参照のこと。
【０１５８】
ＷＯ００／４２０７２（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）はヒトエフェクター細胞の存在下で改善されたＡＤＣＣ機能を有する抗体を記載しており、ここではこの抗体は、そのＦｃ領域にアミノ酸置換を含む。好ましくは、改善されたＡＤＣＣを有する抗体は、Ｆｃ領域の２９８、３３３および／または３３４の位置（残基のＥｕ番号付け）に置換を含む。好ましくは、この変更されたＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域であって、これらの位置の１、２または３つで置換基を含むかまたは置換基から構成される。このような置換基は必要に応じて、Ｃ１ｑ結合および／またはＣＤＣを増大する置換基と組み合わされる。
【０１５９】
変更されたＣ１ｑ結合および／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を有する抗体は、ＷＯ９９／５１６４２，米国特許第６，１９４，５５１Ｂ１号、米国特許第６，２４２，１９５Ｂ１号、米国特許第６，５２８，６２４Ｂ１号および米国特許第６，５３８，１２４号（Ｉｄｕｓｏｇｉｅら）に記載される。この抗体は、そのＦｃ領域の１つ以上のアミノ酸位置２７０、３２２、３２６、３２７、３２９、３１３、３３３  および／または３３４（残基のＥｕ番号付け）でアミノ酸置換を含む。
【０１６０】
抗体の血清半減期を増大するために、当業者は、例えば、米国特許第５，７３９，２７７号に記載されるように、抗体（特に抗体フラグメント）中にサルベージ（ｓａｌｖａｇｅ）レセプター結合エピトープを組み込み得る。本明細書に用いられる場合、「サルベージレセプター結合エピトープ（ｓａｌｖａｇｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｐｉｔｏｐｅ）」という用語は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期を増大することを担うＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを指す。
【０１６１】
新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）に対する結合が改善され、半減期が増大された抗体は、ＷＯ００／４２０７２（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）および米国特許出願公開第２００５／００１４９３４Ａ１号（Ｈｉｎｔｏｎら）に記載される。これらの抗体は、ＦｃＲｎに対するＦｃ領域の結合を改善する、１つ以上の置換を有するＦｃ領域をその中に含む。例えば、Ｆｃ領域は、１つ以上の位置２３８、２５０、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１４、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、４２８または４３４（残基のＥｕ番号付け）で置換を有し得る。ＦｃＲｎ結合が改善されている好ましいＦｃ領域含有抗体は、そのＦｃ領域の位置３０７、３８０および４３４（残基のＥｕ番号付け）のうちの１つ、２つまたは３つでアミノ酸置換を含む。
【０１６２】
３つ以上（好ましくは４つ）の機能的な抗原結合部位を有する操作された抗体もまた考慮される（米国特許出願公開第２００２／０００４５８７Ａ１号、Ｍｉｌｌｅｒら、）。
【０１６３】
抗体のアミノ酸配列改変体をコードする核酸分子は当該分野で公知の種々の方法によって調製される。これらの方法としては、限定はしないが、天然の供給源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列改変体の場合）、またはオリゴヌクレオチド媒介性（または部位特異的）の突然変異誘発による調製、ＰＣＲ突然変異誘発、および抗体の早期調製改変体または非改変体バージョンのカセット突然変異誘発が挙げられる。
【０１６４】
（ｖｉｉｉ）所望の特製を有する抗体についてのスクリーニング
抗体を生成するための技術は、上記されている。当業者は、所望の場合、特定の生物学的特徴を有する抗体をさらに選択し得る。
【０１６５】
トラスツマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））によって結合されるＨＥＲ２ドメインＩＶに対して結合するＨＥＲ２抗体を特定するため、当業者は、ＨＥＲ２  ＥＣＤに存在するか；または、インタクトなＨＥＲ２レセプター（ここでＥＣＤもしくはレセプターは、単離されてもよいし、または細胞の表面に存在してもよい）に存在するような単離されたドメインＩＶペプチド、ドメインＩＶ（ＤｏｍａｉｎＩＶ）に対して結合する能力を評価してもよい。必要に応じて、当業者は、目的のＨＥＲ２抗体がトラスツマブもしくは４Ｄ５エピトープに対して結合するか、またはＨＥＲ２に対するトラスツマブもしくは４Ｄ５の結合をブロックもしくは競合するかを評価し得る；このような抗体は必然的に、トラスツマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））によって結合されるＨＥＲ２ドメインＩＶに対して結合すると考えられる。目的の抗体によって結合されるＨＥＲ２上のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，編集ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されるような慣用的な交差ブロック（ｃｒｏｓｓ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ）アッセイを行って、この抗体が、ＨＥＲ２に対するトラスツマブまたは４Ｄ５のような、抗体の結合をブロックするか否かを評価してもよい。Ｆｅｎｄｌｙら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５０：１５５０〜１５５８（１９９０）も参照のこと、ここでは、インタクトなＨＥＲ２陽性細胞上での直接蛍光によってＨＥＲ２抗体で交差ブロック研究を行った。ＨＥＲ２モノクローナル抗体は、関連しないモノクローナル抗体のコントロールと比較して５０％以上まで各々が他の結合をブロックする場合、エピトープを共有するとみなした。Ｆｅｎｄｌｙらの研究では、３Ｈ４および４Ｄ５は同じエピトープに結合した。あるいは、またはさらに、エピトープマッピングは、当該分野で公知の方法によって行われてもよく、そして／または当業者は抗体−ＨＥＲ２構造を研究して（Ｆｒａｎｋｌｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ５：３１７〜３２８（２００４））、どのＨＥＲ２のドメインまたはエピトープが抗体によって結合されるかを理解し得る。
【０１６６】
トラスツマブは、インビボアッセイおよび動物の両方において、ＨＥＲ２を過剰発現するヒト腫瘍細胞の増殖を阻害することが示されている。Ｈｕｄｚｉａｋら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９：１１６５〜１１７２（１９８９）；米国特許第５，６７７，１７１号；Ｌｅｗｉｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，ｌｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ３７：２５５〜２６３（１９９３）；Ｐｉｅｔｒａｓら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９９８；１７：２２３５〜４９（１９９８）；およびＢａｓｅｌｇａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：２８２５〜２８３１（１９９８）。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）は、ＨＥＲ２陽性の腫瘍細胞株で細胞増殖抑制性および細胞傷害性の両方の効果を有する（Ｌｅｗｉｓら、（１９９３））。
【０１６７】
この特性を有する別の増殖阻害性ＨＥＲ２抗体を選択するために、インビトロまたはインビボのアッセイを用いて、増殖阻害性生物学的活性についてＨＥＲ２抗体をスクリーニングしてもよい。詳細には、増殖阻害性ＨＥＲ２抗体を特定するために、当業者は、インビトロでＨＥＲ２を過剰発現するガン細胞の増殖を阻害する抗体をスクリーニングしてもよい。１実施形態では、選り抜きの増殖阻害性抗体は、細胞培養物におけるＳＫ−ＢＲ−３細胞の増殖を約０．５〜３０μｇ／ｍｌの抗体濃度で約２０〜１００％まで、そして好ましくは約５０〜１００％まで阻害し得る。このような抗体を特定するために、米国特許第５，６７７，１７１号に記載されるＳＫ−ＢＲ−３アッセイを行ってもよい。このアッセイによれば、ＳＫ−ＢＲ−３細胞は、Ｆ１２、および１０％ウシ胎仔血清、グルタミン、およびペニシリンストレプトマイシンを補充されたＤＭＥＭ培地の１：１混合物で増殖される。ＳＫ−ＢＲ−３細胞を、３５ｍｍの細胞培養ディッシュ（２ｍｌ／３５ｍｍディッシュ）中で２０，０００細胞までプレートする。０．５〜３０μｇ／ｍｌのＨＥＲ２抗体を１つのディッシュに添加する。６日後、未処理の細胞に比較した細胞の数を、電気的なＣＯＵＬＴＥＲＴＭ細胞カウンターを用いてカウントする。ＳＫ−ＢＲ−３細胞の増殖を約２０〜１００％までまたは約５０〜１００％まで阻害する抗体は、増殖阻害性抗体として選択され得る。４Ｄ５および３Ｅ８のような増殖阻害性抗体についてのスクリーニングのためのアッセイについては米国特許第５，６７７，１７１号を参照のこと。
【０１６８】
ＨＥＲ２陽性腫瘍の増殖をインビボで阻害するＨＥＲ２抗体を選択するために、Ｐｉｅｔｒａｓら、（１９９８）およびＢａｓｅｌｇａら（１９９８）における研究のような異種移植片研究を行って、この特性についてＨＥＲ２抗体をスクリーニングしてもよい。
【０１６９】
トラスツマブは、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）のメディエーターである。Ｈｏｔａｌｉｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３７：４７１（１９９６），抄録３２１５；Ｐｅｇｒａｍら、Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ３８：６０２（１９９７），抄録４０４４；米国特許第５，８２１，３３７号、同第６，０５４，２９７号、同第６，４０７，２１３号、同第６，６３９，０５５号、同第６，７１９，９７１号、および同第６，８００，７３８号；ならびにＣａｒｔｅｒら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８９：４２８５〜４２８９（１９９２）；Ｃｌｙｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６：４４３〜６（２０００））。ＡＤＣＣを媒介する他のＨＥＲ２抗体は、これらの引用文献に記載されるアッセイを含む種々のアッセイを用いて特定され得る。
【０１７０】
トラスツマブはまた、ＨＥＲ２エクトドメイン切断を阻害することが報告されており（Ｍｏｌｉｎａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：４７４４〜４７４９（２００１））、そしてこの機能を有する他のＨＥＲ２抗体は、例えば、Ｍｏｌｉｎａら、によって用いられる方法論を用いて特定され得る。
【０１７１】
ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）はまた、血管新生因子の効果を調節することによってＨＥＲ２陽性ヒト乳房腫瘍で腫瘍脈管構造の正常化および退行を誘導することが報告されている（Ｉｚｕｍｉら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１６：２７９〜８０（２００２））。この特性を有する他のＨＥＲ２抗体は、Ｉｚｕｍｉらに記載される実験を用いて特定され得る。
【０１７２】
（ｉｘ）ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）組成物
本発明のＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）−由来組成物は、主要種抗体の混合物、およびその改変型、詳細には酸性改変体（脱アミド化改変体を含む）を含んでもよい。好ましくは、このような酸性改変体の組成物中における量は、約２５％未満である。米国特許第６，３３９，１４２号を参照のこと。また、陽イオン交換クロマトグラフィーによって分解可能なトラスツマブの形態に関与する、Ｈａｒｒｉｓら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ  ７５２：２３３〜２４５（２００１）も参照のこと、このクロマトグラフィーは、ピークＡ（両方の軽鎖においてＡｓｎ３０がＡｓｐに脱アミド化）：ピークＢ（１つの重鎖でＡｓｎ５５がｉｓｏＡｓｐに脱アミド化）；ピーク１（１つの軽鎖でＡｓｎ３０がＡｓｐに脱アミド化）；ピーク２（１つの軽鎖でＡｓｎ３０がＡｓｐに脱アミド化、そして１つの重鎖でＡｓｐ１０２がｉｓｏＡｓｐに異性化）；ピーク３（主要ピーク型、または主要種抗体）；ピーク４（１つの重鎖でＡｓｐ１０２がｉｓｏＡｓｐに異性化）；そしてピークＣ（１つの重鎖でＡｓｐ１０２スクシンイミド（Ａｓｕ））。このような改変型および組成物は本明細書において本発明に含まれる。
【０１７３】
ＮＫ細胞、ＭｉｃＢリガンドおよびレセプター
古典的なナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、最初の免疫学的チャレンジに対して先天性の免疫応答で重要な役割を果たすことが見出されている、ＣＤ３−、ｓｉｇ−、ＣＤ１６＋およびＣＤ５６＋として表現型が規定された、大型の顆粒リンパ球である。それらは抗原特異的な活性化の必要なしに種々の標的細胞タイプに対して急速な自発的な殺傷を示すので、ナチュラルキラー細胞と呼ばれる。ＮＫ細胞の細胞傷害性およびＩＦＮ−γ産生のピークは、初回感染の後最初の数時間から数日内に生じる。しかし、Ｔ細胞およびＢ細胞由来の適応免疫応答は発達するのに２週間以上要する（Ｂｉｒｏｎ，Ｃ．Ａ．ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１８９〜２２０（１９９９））。ＮＫ細胞は生得的とみなされる。なぜなら、それらは適応的免疫応答の遅い特徴である抗原についてクローンとして分布されたレセプターを発現しないからである。これらの先天性の機構のおかげで、それらは、極めて危険な細胞を急速に検出して、効率的に排除し得る。これらの機構によって、チンパンジーとヒトとの間の発現の実質的な相違によって実証されるとおり、ヒト免疫学的順応が近年発展された。（Ｄｅ  Ｍａｒｉａ，Ａ．ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：３５４６〜３５５６（２００１））。
【０１７４】
ＮＫ細胞は、末梢血、脾臓および骨髄に主に限局されるが、化学誘引物質に応答して炎症組織に遊走し得る。活性化の際、それらは標的細胞を溶解するだけでなく、サイトカインおよびケモカインも発現し、これが炎症性応答を誘導し、造血を調節し、単球および顆粒球の増殖および機能を制御し、これが次に引き続く免疫応答に影響する。詳細には、ＮＫは、サイトカイン、例えば、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、およびＩＬ−８を分泌する（Ｓｃｏｔｔ，Ｆ．，ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７：３４〜４０，（１９９５））。さらに、サイトカイン、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、およびＩ１−１は、ＮＫ細胞がサイトカインを産生するように誘導する。
【０１７５】
ＮＫ細胞のその表面分子による他の細胞との直接相互作用はまた、その細胞傷害性活性においてある役割を果たす。これらとしては、ＮＫ細胞によるＡｂ依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介することを担う分子であるヒトＩｇＧの低親和性レセプターであるＦγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）（Ｌａｎｉｅｒ，ＬＬ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：３４７８〜８５（１９８８））、ＣＤ６９（Ｍｏｒｅｔｔａ，Ａ．，ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７４：１３９３〜９８（１９９１）），ＣＤ４４（Ｇａｌａｎｄｒｉｎｉ，Ｒ．，ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：４３９９〜４４０７（１９９４））、ＣＤ５６（Ｇｅｉｔｅｎｂｅｅｋ，ＴＢら，Ｐｌａｃｅｎｔａ  ２２（補遺Ａ）：Ｓ１９〜２３（２００１））、ＭＨＣ分子を認識し得、そして係合された場合に阻害性または刺激性のシグナルを送達し得るキラー活性化レセプター（ｋｉｌｌｅｒ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）（ＫＩＲ）のファミリー、ならびに接着分子、例えば、ＣＤ２またはＣＤ１８（Ｃｏｌｏｎｎａ，Ｍ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１５５：１２７〜１３３（１９９７））が挙げられる。
【０１７６】
ＮＫ細胞は、プロテアーゼ、ヌクレアーゼおよびパーフォリンを含有する細胞質顆粒の作用を通じて細胞を溶解する（Ｄ．，ら，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４６：２１７〜２２４，１９９７を参照のこと）。さらに、ＮＫ細胞はまた、抗体依存性細胞傷害性を通じて細胞を溶解し得る（Ｄ，ら，１９９７を参照のこと）。
【０１７７】
ＮＫ細胞は抗原特異的な活性化を欠くにもかかわらず、ＮＫ細胞は、標的を認識する能力において驚くべき特異性を実証している。ＮＫ細胞はもともと、それが、正常な細胞は見逃しながら、特定の腫瘍およびウイルス感染した細胞を殺傷するという識別的な能力によって特定された。ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞表面上で活性化および阻害性レセプターの複雑な組み合わせを通じてその特異性を達成する。ＮＫ細胞活性化および活性化の程度は、活性化および阻害のシグナルの両方のバランスによって決定される。
【０１７８】
ＮＫ細胞が正常な細胞を見逃す分子機構は、ほとんど全ての正常な核形成細胞で発現される主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子を認識する専門的な阻害性レセプターに起因する。Ｋａｒｒｅらは、「ミッシング−セルフ（ｍｉｓｓｉｎｇ  ｓｅｌｆ）」仮説を提唱しており、ここではＮＫ細胞は、正常な自己ＭＨＣ分子を十分に発現しない標的細胞を検出しかつ排除する。（Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ  Ｈ−Ｇ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６２：１７４５〜５９（１９８５），Ｐｉｏｎｔｅｃｋ  ＧＥ，ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：４２８１〜８８（１９８５），Ｋａｒｒｅ  Ｋ．，ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１９：６７５〜７８（１９８６））。逆相関が、標的細胞上の表面ＭＨＣクラスＩ分子の発現と、ＮＫ細胞媒介性溶解に対するそれらの感受性との間で確立された。ウイルス感染細胞または腫瘍細胞は代表的に、特定のクラスＩ対立遺伝子を下方制御するか、またはＭＨＣクラスＩ分子によって提示される変更されたペプチドパターンを発現する。（Ｃｈａｄｗｉｃｋ  ＢＳ，ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３１５０〜５６（１９９２））。従ってＮＫ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞を補完し、これは、外来ペプチドを提示するクラスＩタンパク質によって誘発される。感染された細胞または腫瘍細胞であって、細胞傷害性Ｔ細胞による検出を逃避するようにそれらのＭＨＣクラスＩ分子を下方制御する細胞は、ＮＫ細胞によるのではない殺傷について検出および標的される。
【０１７９】
しかし、この「ミッシング・セルフ」仮説では、ＭＨＣクラスＩ分子の十分な量を発現する細胞の標的化殺傷が説明されなかった。さらに、ＮＫ細胞活性化の感度は、ＭＨＣクラスＩ発現は常には相関しなかった。（Ｃｏｒｒｅａ  Ｉ，ら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２４：１３２３〜１３３１，（１９９４））。引き続き、ＭＩＣＡ（Ｍａｊｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｉ  Ｃｈａｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  Ａ）のような関連のＭＨＣクラスＩ分子が発見され、これは、ＮＫ細胞活性化レセプターに対する活性化リガンドとして機能することが見出された。（Ｄｉｅｆｅｎｂａｃｈ，Ａ．ａｔ．ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，９：Ｒ８５１〜Ｒ８５３．（１９９９））。引き続く研究によって、ホストのＮＫ細胞活性化および阻害レセプターが特定されている。ＮＫ細胞活性化は、ある程度は活性化し、そしてある程度は阻害する反対の機能を有する多数のレセプターの相互作用およびバランスを要することが現在公知である。この活性化およびＮＫ細胞活性化の程度は、競合するシグナルのバランスによって決定される（Ｍｏｒｅｔｔａ，Ａ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：１（２００２））。
【０１８０】
ＮＫ細胞は長らく、ガンの予防および制御に関与することが公知であった。ＮＫ細胞はもともと、その腫瘍細胞の選択性の認識および溶解のおかげで特定された。（Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ，Ｇ．，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４７：１８７（１９８９））。ＮＫ細胞は、耐性および転移の制御の両方に関与することが示されている（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅ，Ｔ．，ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７：７０４〜７１０，（１９９５））。
【０１８１】
ＮＫ細胞活性は、広範なウイルス感染の状況で研究されている。上昇したＮＫ細胞活性は、以下のウイルスの感染の間に観察されている：アレナウイルス、例えば、リンパ球性脈絡髄膜炎（ＬＣＭＶ）（Ｂｉｒｏｎ，ＣＡ，ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：１７０４〜１７１０，（１９８７），Ｗｅｌｓｈ，ＲＭ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１４８：１６３〜１８１，（１９７８））、ヘルペスウイルス、例えば、マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）（Ｗｅｌｓｈ，ＲＭ，（１９７８），Ｏｒａｎｇｅ，ＪＳ，ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：４７４６〜４７５６（１９９６））、単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ）（ＨＳＶ）（Ｃｈｉｎｇ，Ｃ，ら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．２６：４９〜５６（１９７９））、オルトミクソウイルス、例えば、インフルエンザウイルス（Ｓａｎｔｏｌｉ，Ｄ．，ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２１：５３２〜３８（１９７８））、ピコルナウイルス、例えば、コクサッキーウイルス（Ｇｏｄｅｎｙ，ＥＫ，ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：１６９５〜７０２（１９８６））。
【０１８２】
ウイルス感染に対する防御におけるＮＫ細胞の関与のさらなる証拠は、ヒト感染に関与する臨床データに由来する。低いＮＫ細胞活性は、重篤な汎発性ヘルペスグループウイルス感染（Ｃｈｉｎｇ，Ｃ，（１９７９），Ｂｉｒｏｎ，Ｃ，ら，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２０：１７３１〜３５（１９８９））、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）（Ｍｅｒｉｎｏ，Ｒ．，ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２９９〜３０５（１９８６）、Ｊｏｎｃａｓ，Ｊ．ら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．２８：１１０〜１７（１９８９））、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）（Ｂｉｒｏｎ，ＣＡ，（１９８９），Ｑｕｉｎｎａｎ，ＧＶ．，ら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０７：７〜１３，（１９８２））に対する感度の増大、およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染の後期段階（Ｂｏｎａｖｉｄａ，Ｂ．，ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：１１５７〜６３（１９８６），Ｋａｔｚ，ＪＤ．，ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：５５〜６０（１９８７））と相関している。
【０１８３】
古典的なＮＫ細胞と特徴を共有するＴ細胞の集団は、ＮＫ細胞マーカーの発現に基づいて特定されている（「ＮＫＴ細胞」；Ｂｅｎｅｄｅｌａｃ，Ａ．，ら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：５３５〜６２（１９９７），Ｏｈｔｅｋｉ，Ｔ．，ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：６９９〜７０４（１９９４））。これらの細胞は、限られた範囲のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）を発現し、そしてマウスで主にＴＣＲα／βを発現する（Ｌａｎｚ，Ｏ．，ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０：１０９７〜１０６（１９９４），Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．，ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９３：１１０２５〜２８（１９９６））。いくつかの活性化されたＮＫＴ細胞は、古典的な細胞媒介性の細胞傷害性に対して感受性の細胞を溶解し得（Ｋｏｙａｓｕ，Ｓ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７９：１９５７〜７２，（１９９４）、ＮＫＴ細胞は、ＩＬ−２に応答して増殖し、そしてそれらは、ＣＤ３複合体を介してＩＬ−４刺激の際にＩＬ−４を放出する。（Ａｒａｓｅ、Ｈ．，ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：２３９１〜９６（１９９６）．Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．，ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１２８６〜９５（１９９４），Ｃｈｅｎ、ｈ．，ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：２２４０〜４４（１９９７））。ＮＫＴ細胞は、それらが、初回チャレンジの間にＩＬ−４を分泌するという点で生得的な免疫応答に関与する（Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．，（１９９４），Ｃｈｅｎ、ｈ．，（１９９７））。従って、ＮＫＴ細胞は、古典的なＮＫ細胞と密接に関連するが、別個のものであり、混同されるべきではない。
【０１８４】
重要な役割に照らして、ＮＫ細胞はインビボで、免疫監視において、ガン、ウイルス感染および自己免疫疾患における宿主防御で機能し、ＮＫ細胞の細胞傷害性活性は、強力であるが、未使用の免疫学的治療能力として存在する。本発明は、治療を増強するために、標的化された融合ポリペプチドにおけるＮＫ細胞の細胞傷害性機構を利用する。
【０１８５】
ＭＩＣＢは、細胞表面タンパク質およびＮＫ細胞レセプターに対する活性化リガンドである。ＭＩＣＢは、細胞傷害性造血細胞に存在するレセプター、例えば、ＮＫ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、および活性化マクロファージの表面上のＮＫＧ２Ｄレセプターによって認識される。ＭＩＣは、肺、乳房、腎臓、卵巣、前立腺および腸由来の上皮細胞腫瘍を含む、ストレス誘発性腸上皮腫瘍細胞で発現される（Ｇｒｏｈら、１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：６８７９〜８４；Ｇｒｏｈら、１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１２４４５〜５０）。
【０１８６】
ＭＩＣＢのタンパク質ドメインは規定されており、そしてこれには、表２に示されておりそして下に示される適切なアミノ酸残基を有するシグナルペプチド、α−１ドメイン、α−２ドメイン、α−３ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質テールが挙げられる。各々のドメインについての正確なアミノ酸境界は、例えば、約５〜１０アミノ酸ずつ変化し得る（Ｂａｒｈａｍ，１９９４，前出；Ｓｔｅｉｎｌｅ，１９９８，前出）。
【０１８７】
ＭＩＣＢドメイン
【０１８８】
【表２】
2009514537.tif 000005
ＧｅｎＢａｎｋは、ＭＩＣＢのいくつかの参照配列を列挙する。これらとしては、以下のアクセッション番号：ＭＩＣＢのｃＤＮＡについてのＸ９１６２５およびＭＩＣＢタンパク質のＣＡＡ６２８２３が挙げられる。これらの参照配列は、「参照ＭＩＣＢ（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＭＩＣＢ）」に相当するが、多くの改変体配列が、例えば、下に考察されるように公知であることが理解される。
【０１８９】
ＭＩＣＢをコードする核酸配列は、極めて多形性であって、対応して異常な分布の多数の改変体アミノ酸をそれらの細胞外α−１、α−２およびα−３ドメインで示す（エキソン２〜４）。ＭＩＣＢ遺伝子をコードする多数の対立遺伝子改変体が記載される。（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，２００１，前出；Ｚｈａｎｇら、２００１，前出；Ｆｉｓｃｈｅｒら、２０００，前出；およびＰｅｔｅｒｓｄｏｒｆら、１９９９，前出）。現在まで、少なくとも１３のＭＩＣＢ配列デポジション（ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）が作成されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）。Ｆｉｓｃｈｅｒら、（２０００，前出）は、いくつかのＭＩＣＢ対立遺伝子（すなわち、３つの新規な対立遺伝子）を記載しており、これによってＭＩＣＢ遺伝子におけるほとんどの多形性がコード領域に存在するという以前の知見が確認され、そして２つの遺伝子における多形性の程度が匹敵し得るということが示唆される。
【０１９０】
本明細書において用いる場合、ＭＩＣＢはさらに、例えば、シグナルペプチド／リーダー配列、膜貫通ドメイン、および細胞質テールのうちの１つ以上の全てまたは一部の欠失によって短縮される改変体を包含する。このようなＭＩＣ改変体であって、少なくともα１、α２およびα３ドメインを含む改変体は、可溶性ＭＩＣＢとして有用である。
【０１９１】
本発明のいくつかの実施形態では、融合タンパク質のＭｉｃＢ部分は、リンカーを介して抗ＨＥＲ２抗体に連結される。本発明のハイブリッド分子のリンカー成分は、分子の結合に関与する必要はない。従って、本発明によれば、リンカードメインとは、分子の活性なドメインとペプチドリガンドドメインとの間の空間的な架橋をもたらす任意の群の分子である。
【０１９２】
リンカードメインは、可変性の長さであっても作成されてもよい、しかし、本発明に従えば、これはリンカードメインの長さであって、そしてその構造は重要ではない。このリンカードメインによって好ましくは、ＭｉｃＢ部分がＮＫ細胞に結合すること、そして抗ＨＥＲ２抗体部分が標的細胞に対して、立体的および／または立体配置的な制限が実質的になしで、結合することが可能になる。従って、リンカードメインの長さは、ハイブリッド分子の２つの「機能的な（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）」ドメインの特徴に依存する。
【０１９３】
当業者は、原子の種々の組合せによって、種々の結合の間の既知の距離に基づいて可変長の分子が得られることを認識する（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，およびＢｏｙｄ，Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３版、Ａｌｌｙｎ  ａｎｄ  Ｂａｃｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ（１９７７））。例えば、リンカードメインは、可変超のポリペプチドであってもよい。ポリペプチドのアミノ酸組成によって、リンカーの特徴および長さが決定される。好ましい実施形態では、このリンカー分子は、可塑性の親水性ポリペプチド鎖を含む。例示的なリンカードメインは、１つ以上の［（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ］単位（配列番号５）、例えば、本明細書の実施例のセクションで記載されるものを含む。
【０１９４】
別の実施形態では、この融合ポリペプチドは、腫瘍の事前標的化における利用のための「レセプター（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」（例えば、ストレプトアビジン）に結合体化されてもよく、ここでこの融合ポリペプチドが患者に投与され、その後に、除去剤（ｃｌｅａｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を用いる循環から未結合の結合体の除去、続いて細胞傷害性因子（例えば、放射性核種）に結合体化される「リガンド（ｌｉｇａｎｄ）」（例えば、ビオチンまたはアビジン）の投与が続く。
【０１９５】
本発明はまた、本明細書に開示されるような抗体およびＭｉｃＢを含む融合ポリペプチドをコードする単離された核酸、この核酸を含むベクターおよび宿主細胞、ならびにこの融合ポリペプチドの生成のための組み換え技術を提供する。
【０１９６】
融合ポリペプチドの組み換え産生のために、融合ポリペプチドをコードする核酸を単離して、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）のために、または発現のために、複製可能なベクターに挿入する。融合ポリペプチドをコードするＤＮＡは容易に単離されて、従来の手順を用いて配列決定される（例えば、ポリペプチド改変体をコードする遺伝子に対して特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）。多くのベクターが利用可能である。このベクター成分は一般に、限定はしないが、以下のうち１つ以上を含む：シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終結配列。
【０１９７】
（ｉ）シグナル配列成分
本発明の融合ポリペプチドは、直接組み換え的に生成されるだけでなく、異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとして生成されてもよく、この融合ポリペプチドは好ましくは、シグナル配列または成熟タンパク質もしくはポリペプチドのＮ末端で特異的な切断を有する、他のポリペプチドである。選択されるこの異種シグナル配列は好ましくは、宿主細胞によって認識されてプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）シグナル配列である。天然のポリペプチド改変体シグナル配列を認識してプロセシングしない原核生物宿主細胞については、このシグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列によって置換される。酵素分泌のためには天然のシグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓのα−因子リーダーを含む）、または酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのグルコアミラーゼリーダー、またはＷＯ９０／１３６４６に記載されるシグナルによって置換されてもよい。哺乳動物細胞発現では、哺乳動物シグナル配列およびウイルスの分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。
【０１９８】
このような前駆体領域のためのＤＮＡは、融合ポリペプチドをコードするＤＮＡに対してリーディングフレーム中で連結される。
【０１９９】
（ｉｉ）複製起点成分
発現ベクターおよびクローニングベクターの両方とも、１つ以上の選択された宿主細胞中でベクターを複製可能にする核酸配列を含む。一般には、クローニングベクターでは、この配列は、宿主の染色体ＤＮＡとは独立してベクターを複製可能にさせる配列であって、複製起点または自律複製配列を含む。このような配列は種々の細菌、酵母およびウイルスについて周知である。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点は、ほとんどのグラム陰性最近に適切であり、２μのプラスミド起源が、酵母に適切であり、そして種々のウイルス起源（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）が、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターのために有用である。一般には、複製起点の成分は、哺乳動物発現ベクターには必要ではない（ＳＶ４０起点は、代表的には、それが初期プロモーターを含むという理由だけで用いられ得る）。
【０２００】
（ｉｉｉ）選択遺伝子成分
発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含んでもよい。代表的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートもしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与するか、（ｂ）栄養要求性の欠損を補完するか、または（ｃ）複合培地から利用できない重要な栄養素を供給する（例えば、ＢａｃｉｌｌｉについてのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）、タンパク質をコードする。
【０２０１】
選択スキームの一例は、宿主細胞の増殖を停止させる薬物を利用する。異種遺伝子で首尾よく形質転換される細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生じ、これによって選択レジメンを生き残る。このようなドメイン選択の例は、薬物ネオマイシン、ミコフェノール酸およびハイグロマイシンを用いる。
【０２０２】
哺乳動物細胞のための適切な選択マーカーの別の例は、ポリペプチド改変核酸を拾い上げるためにコンピテントな細胞の特定を可能にする選択マーカー、例えば、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉおよび−ＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどである。
【０２０３】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞は、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトレキセート（Ｍｔｘ）を含む培養培地中で全ての形質転換体を培養することによって最初に特定される。野性型ＤＨＦＲが使用される場合の適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性を欠くチャイニーズハムスター卵巣（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ（ＣＨＯ））細胞株である。
【０２０４】
あるいは、ポリペプチド改変体、野性型ＤＨＦＲＲタンパク質および別の選択マーカー、例えば、アミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）をコードするＤＮＡ配列で形質転換されるかまたは同時形質転換された宿主細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含む野性型宿主）は、アミノグリコシド系抗生物質、例えば、カナマイシン、ナオマイシンまたはＧ４１８のような選択マーカーのための選択因子を含む培地中での細胞増殖によって選択され得る。米国特許第４，９６５，１９９号を参照のこと。
【０２０５】
酵母における使用のための適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９（１９７９））に存在するｔｒｐ１遺伝子である。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母の変異株、例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１についての選択マーカーを提供する。Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２（１９７７）。次いで、酵母宿主細胞ゲノムにおけるｔｒｐ１領域の存在によって、トリプトファンの非存在下での増殖によって形質転換を検出するための有効な環境が得られる。同様に、Ｌｅｕ−２欠損酵母株（ＡＴＣＣ  ２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を保有する公知のプラスミドによって補完される。
【０２０６】
さらに、１．６μｍの環状プラスミドｐＫＤ１由来のベクターが、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ酵母の形質転換のために用いられ得る。あるいは、組み換えウシキモシンの大規模産生のための発現系が、Ｋ．ｌａｃｔｉｓについて報告された。Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：１３５（１９９０）。Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓの工業的な株による成熟組み換えヒト血清アルブミンの分泌のための適切なマルチコピー発現ベクターも開示されている。Ｆｌｅｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９６８〜９７５（１９９１）。
【０２０７】
（ｉｖ）プロモーター成分
発現ベクターおよびクローニングベクターは通常、宿主生物体によって認識され、かつ本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されるプロモーターを含む。原核生物宿主との使用に適切なプロモーターとしては、ｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、およびハイブリッドプロモーター、例えば、ｔａｃプロモーターが挙げられる。しかし、他の公知の細菌プロモーターが適切である。細菌の系での使用のためのプロモーターはまた、ポリペプチド改変体をコードするＤＮＡに対して作動可能に連結されたシャイン・ダルガーノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）（Ｓ．Ｄ．）配列を含む。
【０２０８】
プロモーター配列は原核生物について公知である。実質的に全ての原核生物遺伝子が、転写が開始される部位からほぼ２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始から７０〜８０塩基上流で見いだされる別の配列はＣＮＣＡＡＴ領域であり、ここでＮは任意のヌクレオチドであってもよい（配列番号６）。ほとんどの原核生物遺伝子の３’末端は、ＡＡＴＡＡＡ配列（配列番号７）であって、これは、コード配列の３’末端に対するポリＡテールの付加のためのシグナルであり得る。これらの配列の全てが原核生物発現ベクターに適切に挿入される。
【０２０９】
酵母宿主との使用のための適切なプロモーター配列の例としては、３−ホスホグリセレートキナーゼまたは他の解糖酵素、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスファターゼデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼのためのプロモーターが挙げられる。
【０２１０】
他の酵母プロモーターであって、増殖状態によって制御される転写のさらなる利点を有する誘導性プロモーターであるプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用を担う酵素についてのプロモーター領域である。酵母発現における使用のための適切なベクターおよびプロモーターは、さらに、欧州特許７３，６５７に記載される。酵母エンハンサーはまた、酵母プロモーターとともに有利に用いられる。
【０２１１】
哺乳動物宿主細胞におけるベクター由来の融合ポリペプチド転写物は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはサルウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、熱ショックプロモーターから得られたプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系と適合性であるという条件下であれば、制御される。
【０２１２】
ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターおよび後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点も含むＳＶ４０制限フラグメントとして都合よく得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限フラグメントとして都合よく得られる。ベクターとしてウシパピローマウイルスを用いて哺乳動物宿主でＤＮＡを発現するための系は、米国特許第４，４１９，４４６号に開示される。この系の改変は、米国特許第４，６０１，９７８号に記載される。また、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの制御下のマウス細胞におけるヒトβインターフェロンｃＤＮＡの発現に対する、Ｒｅｙｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：５９８〜６０１（１９８２）も参照のこと。あるいは、ラウス肉腫ウイルス長末端反復が、プロモーターとして用いられてもよい。
【０２１３】
（ｖ）エンハンサーエレメント成分
高等な真核生物による本発明の融合ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写はしばしば、ベクターへのエンハンサー配列の挿入によって増大される。多くのエンハンサー配列が現在、哺乳動物遺伝子から公知である（グロブリン、エラスターゼ、アルブミン、αフェトプロテインおよびインスリン）。しかし、代表的には、当業者は、原核生物細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。また、原核生物プロモーターの活性化についてのエレメントのエンハンサーに対しては、Ｙａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：１７〜１８（１９８２）を参照のこと。このエンハンサーは、融合ポリペプチドコード配列に対して５’位置または３’位置でベクター中にスプライシングされてもよいが、好ましくはプロモーターから５’部位に位置する。
【０２１４】
（ｖｉ）転写物末端成分
原核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物体由来の核形成細胞）において用いられる発現ベクターはまた、転写の終結のため、およびｍＲＮＡの安定化のために必要な配列を含む。このような配列は、真核生物またはウイルスのＤＮＡもしくはｃＤＮＡの５’および時には３’非翻訳領域から商業的に入手可能である。これらの領域は、ポリペプチド改変体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分におけるポリアデニル化フラグメントとして転写されたヌクレオチドセグメントを含む。１つの有用な転写終止成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６およびそこに記載される発現ベクターを参照のこと。
【０２１５】
（ｖｉｉ）宿主細胞の選択および形質転換
本明細書におけるベクターでＤＮＡをクローニングまたは発現するための適切な宿主細胞は、上記される原核生物、酵母または高等な真核生物の細胞である。この目的のために適切な原核生物としては、真正細菌、例えば、グラム陰性またはグラム陽性の生物体、例えば、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ，例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、およびＳｈｉｇｅｌｌａ、ならびにＢａｃｉｌｌｉ、例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（例えば、１９８９年４月１２日公開、ＤＤ２６６，７１０に開示されるＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ４１Ｐ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが挙げられる。１つの好ましいＥ．ｃｏｌｉクローニング宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）であるが、他の株、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）が適切である。これらの例は限定ではなく例示である。
【０２１６】
原核生物に加えて、真核生物の微生物、例えば、糸状菌または酵母は、ポリペプチド改変体コードベクターのための適切なクローニング宿主または発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、または一般的なパン酵母は、下等な真核生物宿主生物体のなかで最も一般的に用いられる。しかし、多数の他の属、種、および株が一般に利用可能であって、本明細書において有用である。例えば、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主、例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ  １２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ３６，９０６）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、およびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓなど；ｙａｒｒｏｗｉａ（欧州特許第４０２，２２６号）；Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（欧州特許第１８３，０７０号）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ（欧州特許第２４４，２３４号）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ、例えば、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ；ならびに糸状菌、例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主など、例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓおよびＡ．ｎｉｇｅｒ。
【０２１７】
グリコシル化ポリペプチド改変体の発現のために適切な宿主細胞は、多細胞生物体由来である。無脊椎動物細胞の例としては植物および昆虫の細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株および改変体、ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（キャタピラー（イモムシ）（ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ））、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）、およびＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉのような宿主由来の対応する許容される昆虫宿主細胞が特定されている。トランスフェクションのための種々のウイルス株は、公的に入手可能である。例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ＮＰＶのＬ−１改変体、およびＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＮＰＶのＢｍ−５株、そしてこのようなウイルスは、本発明によって本明細書のウイルスとして、特に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために用いられ得る。
【０２１８】
綿、コーン、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマトおよびタバコの植物細胞培養物も宿主として利用され得る。
【０２１９】
しかし、脊椎動物細胞が最も有益であり、培養物（組織培養）中の脊椎動物細胞の増殖は、慣用的な手順となっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚性腎臓株（２９３細胞または懸濁培養物中での増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ）腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌｓ）／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））；マウス・セルトリ（ｍｏｕｓｅ  Ｓｅｒｔｏｌｉ）細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３〜２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファロー・ラット（ｂｕｆｆａｌｏ  ｒａｔ）肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；ヒト乳腺細胞（ＨＥＫ２９３）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  ＮＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４〜６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞腫株（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０２２０】
宿主細胞は、融合ポリペプチド産生のための上記の発現またはクローニングのベクターで形質転換されて、プロモーター誘導に、形質転換体選択にまたは所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切であるように改変された従来の栄養培地中で培養される。
【０２２１】
（ｖｉｉｉ）宿主細胞を培養する工程
本発明の融合ポリペプチドを生成するために用いられる宿主細胞は、種々の培地中で培養され得る。市販の培地、例えば、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最少基本培地（Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）（（ＤＭＥＭ），Ｓｉｇｍａ）が宿主細胞を培養するのに適切である。さらに、Ｈａｍら、Ｍｅｔｈ．Ｅｍ．５８：４４（１９７９），Ｂａｒｎｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  １０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；同第４，５６０，６５５号；または同第５，１２２，４６９号；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；または米国再発行特許第３０，９８５号に記載される任意の培地が、宿主細胞のための培養培地として用いられ得る。任意のこれらの培地には、ホルモンおよび／または他の増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩）、緩衝液（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮＴＭ薬物）、微量元素（最終濃度でマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として規定される）、およびグルコースまたは等価なエネルギー供給源が必要に応じて補充されてもよい。任意の他の必要な補充物も、当業者に公知である適切な濃度で含まれてもよい。培養条件、例えば、温度、ｐＨなどは、発現のために選択された宿主細胞とともに以前に用いられているものであって、当業者には明白である。
【０２２２】
（ｉｘ）融合ポリペプチド精製
組み換え技術を用いる場合、この融合ポリペプチドは、細胞内で、細胞膜周辺腔で生成され得、または培地に直接分泌され得る。融合ポリペプチドが細胞内で生成される場合、第一工程として、微粒子細片が、宿主細胞または溶解されたセグメントから、例えば、超遠心または限外濾過によって除去される。Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３〜１６７（１９９２）は、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離するための手順を記載している。要するに、細胞ペーストを酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡおよびフェニルメチルスルホニルフッ化物（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分以上にわたって解凍する。細胞細片は、遠心分離によって除去され得る。融合ポリペプチドが培地に分泌される場合、このような発現系からの上清は一般に、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ超遠心ユニットを用いて最初に濃縮される。プロテアーゼインヒビター、例えば。ＰＭＳＦが、タンパク質分解を阻害するための任意の前述の工程に含まれてもよく、そして抗生物質が、アデノウイルス混入物の増殖を妨げるために含まれてもよい。
【０２２３】
細胞から調製される融合ポリペプチド組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析およびアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製されてもよく、ここでアフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニテイーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、ポリペプチド改変体に存在する任意の免疫グロブリンＦｃ領域の種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２またはγ４重鎖に基づくポリペプチド改変体を精製するために用いられ得る（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１〜１３（１９８３））。プロテインＧが、全てのマウスアイソタイプについて、そしてヒトγ３について推奨される（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。アフィニティーリガンドが結合されるマトリックスは、ほとんどの場合アガロースであるが、他のマトリクックスも利用可能である。機械的に安定なマトリックス、例えば、制御細孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）またはポリ（シチレンジビニル）ベンゼンによって、アガロースで達成され得るよりも速い流速および短い処理時間が可能になる。ポリペプチド改変体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸＴＭ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）が精製に有用である。タンパク質精製のための他の技術、例えば、イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｈａｓｅ）ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）上でのヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭクロマトグラフィー上でのクロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿も、回収されるポリペプチド改変体に依存して利用可能である。
【０２２４】
任意の予備的精製工程後、目的のポリペプチド改変体および混入物を含む混合物を、約２．５〜４．５のｐＨの溶出緩衝液を用い、好ましくは、低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍの塩）で行われる、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供してもよい。
【０２２５】
ＩＩＩ．薬学的処方物
融合ポリペプチドの治療処方物は、所望の程度の純度を有する融合ポリペプチドと任意の生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ編．（１９８０））とを、水溶液、凍結乾燥または他の乾燥処方物の形態で混合することによって保管のために調製される。受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、使用される投薬量および濃度でレシピエントに毒性でなく、そしてこれには、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン；マンノサッカライド、ジサッカライド、およびグルコース、マンノースまたはデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／または非イオン性サーファクタント、例えば、ＴＷＥＥＮＴＭ，ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。
【０２２６】
本明細書における処方物はまた、処置されている特定の適応に必要な２つ以上の活性化合物、好ましくはお互いに有害に影響しない相補的な活性を有する活性化合物を含んでもよい。このような分子は適切には、意図される目的に有効である量で組み合わせて存在する。
【０２２７】
活性成分はまた、調製されるマイクロカプセルに、例えば、コアセルベーション技術によって、または界面重合によって、捕捉され得る、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル、コロイド薬物送達系で（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）、またはマクロエマルジョンで。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）に開示される。
【０２２８】
インビボ投与のために用いられる処方物は、無菌でなければならない。これは、滅菌濾過メンブレンを通じた濾過によって容易に達成される。
【０２２９】
徐放性調製物が調製されてもよい。徐放性調製物の適切な例としては、融合ポリペプチドを含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスであって、成形物の形態、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルであるマトリックスが挙げられる。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタミン酸塩のコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射用微粒子）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。ポリマー、例えば、エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸は１００日を超える分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲルは、それより短期間タンパク質を放出する。カプセル化された抗体は、長期間体内で保持され、それらは、３７℃で水分に曝された結果として変性するかまたは凝集し得、そして免疫原性における生物学的な活性および可能な変化の損失が生じる。合理的なストラテジーによって、関与する機構次第で安定化が工夫され得る。例えば、凝集機構が、チオ−ジスルフィド交換を通じて分子間Ｓ−Ｓ結合形成されることが発見される場合、安定化は、スルフヒドリル残基を改変すること、酸性溶液を凍結乾燥すること、水分を制御すること、適切な添加物を用いること、および特定のポリマーマトリックス成分を開発することによって達成されてもよい。
【０２３０】
ＩＶ．製品
本発明の別の実施形態では、上記の障害の処置のために有用な物質を含む製品が提供される。この製品は、容器および表示または添付文書を、容器上に、または容器に付随して備える。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどが挙げられる。この容器は、ガラスまたはプラスチックのような種々の物質から形成され得る。この容器は、この状態を処置するために有効である組成物を保持し、そして無菌のアクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、静脈内溶液バッグであっても、または皮下注射針によって穿刺可能な栓を有するバイアルであってもよい）。この組成物における少なくとも１つの活性因子は、本明細書に記載される融合ポリペプチドである。この表示または添付文書は、この組成物が、選ばれた状態、例えば、ガンを処置するために用いられることを示す。本発明のこの実施形態における製品はさらに、この第一および第二の組成物がガンを処置するために用いられ得ることを示す添付文書を備えてもよい。あるいは、またはさらに、この製品は、薬学的に受容可能な緩衝液、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液を含む第二（または第三）の容器を備えてもよい。これは、商業的見地および使用者の観点から所望される他の物質をさらに含んでもよく、これには他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針およびシリンジが挙げられる。
【０２３１】
Ｖ．融合ポリペプチドに関するインビボの使用。
【０２３２】
本発明の融合ポリペプチドは、哺乳動物、例えば、この融合ポリペプチドの投与から利益があり得る疾患または障害に罹患しているかまたはその素因がある患者を処置するために用いられ得ると考えられる。融合ポリペプチドで処置され得る状態としては、例えば、ＨＥＲ２発現ガン、例えば、ＨＥＲ２レセプターの過剰発現によって特徴づけられる良性または悪性の腫瘍が挙げられる。このようなガンとしては、限定はしないが、乳癌、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、消化管癌、膵臓癌、グリア芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、膀胱癌、肝細胞腫、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌および種々のタイプの頭頸部癌が挙げられる。本明細書の教示に従って、当業者は、改善されたＡＤＣＣ活性を有する改変Ｆｃ領域を有するポリペプチドを調製し得る。このような分子は、種々の障害の処置において適用を見出す。
【０２３３】
融合ポリペプチドは、非経口、皮下、腹腔内、肺内および鼻腔内を含む任意の適切な手段によって、そして局所的な免疫抑制処置のために所望される場合、病変内投与によって投与される。非経口インフュージョン（注入）としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内または皮下の投与が挙げられる。好ましくは、投薬量は注射によって、最も好ましくは静脈内または皮下注射によって、部分的には、投与が短時間か慢性的であるかに依存して与えられる。
【０２３４】
疾患の予防または処置のために、融合ポリペプチドの適切な投薬量は、処置される疾患のタイプ、疾患の重篤度および経過、融合ポリペプチドが予防目的で投与されるか治療目的で投与されるか、事前の治療、患者の臨床的病歴およびこの融合ポリペプチドに対する応答、ならびに担当医の判断に依存する。この融合ポリペプチドは患者に対して、１回または一連の処理にわたって、適切に投与される。
【０２３５】
疾患のタイプおよび重篤度に依存して、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）の融合ポリペプチドが、例えば、１回以上の別々の投与によって、または連続的なインフュージョンによってのいずれかによる、この患者への投与のための初回の候補投薬量である。代表的な１日用量は、上述の要因に依存して、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲に及んでもよい。数日間またはそれ以上におよぶ反復投与については、条件次第で、この処置は疾患症状の所望の抑制が生じるまで維持される。しかし、他の投薬レジメンも有用であり得る。この治療の進行は従来の技術およびアッセイによって容易にモニターされる。
【０２３６】
融合ポリペプチド組成物は、適正医療行為（ｇｏｏｄ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）に一致する方式で処方、投薬および投与される。この状況での考慮のための要因としては、処置されている特定の障害、処置されている特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、因子の送達部位、投与方法、投与のスケジュール、および医療従事者に公知の他の要因が挙げられる。投与されるポリペプチド改変体の「治療上有効な量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」とは、このような考慮によって支配され、そして、疾患または障害を予防、寛解または処置するのに必要な最少量である。ポリペプチド改変体は、該当の障害を予防または処置するために現在用いられている１つ以上の因子で、必須ではないが必要に応じて処方される。このような他の因子の有効な量は、処方物に存在するポリペプチド改変体の量、障害または処置のタイプ、ならびに上記で考察される他の要因に依存する。これらは、一般には、本明細書において前に用いられたのと同じ投薬量で、そして投与経路で用いられるか、または本明細書において前に使用される投薬量の１〜９９％である。
【０２３７】
ＶＩ．治療のための患者選択
本明細書の患者は一般に、ＨＥＲ２陽性被験体を特定するために、治療前の診断試験に供される。例えば、診断試験は、ＨＥＲ２発現（過剰発現を含む）、増幅、および／または活性化（リン酸化または二量体化を含む）を評価し得る。
【０２３８】
一般には、診断試験が行われる場合、サンプルは治療の必要な患者から得られてもよい。被験体がガンを有する場合、サンプルは一般には腫瘍サンプルである。好ましい実施形態では、腫瘍サンプルは、乳癌生検由来である。本明細書における生物学的サンプルは、固定されたサンプル、例えば、ホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）サンプル、または凍結サンプルであってもよい。
【０２３９】
ガンでのＨＥＲ２発現または増幅を決定するために、種々の診断／予後予測アッセイが利用可能である。１実施形態では、ＨＥＲ２過剰発現は、ＩＨＣによって、例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＥＳＴ（登録商標）（Ｄａｋｏ）を用いて分析され得る。腫瘍生検由来のパラフィン包埋された組織切片を、ＩＨＣアッセイに供してもよく、これは、以下のようなＨＥＲ２タンパク質染色強度基準に一致する：
スコア０、染色が観察されないか、または膜染色が腫瘍細胞の１０％未満で観察される。
スコア１＋、かすかな／かろうじて感知できる膜染色が腫瘍細胞の１０％より多くで検出される。細胞は、その膜の一部でのみ染色される。
スコア２＋、弱〜中の完全な膜染色が腫瘍細胞の１０％より多くで観察される。
スコア３＋、中〜強い完全な膜染色が腫瘍細胞の１０％より多くで観察される。
【０２４０】
ＨＥＲ２過剰発現評価について０または１＋スコアの腫瘍は、ＨＥＲ２を過剰発現しないと特徴づけられ得るが、２＋または３＋スコアを有する腫瘍は、ＨＥＲ２を過剰発現すると特徴づけられ得る。
【０２４１】
ＨＥＲ２を過剰発現する腫瘍は、１細胞あたり発現されるＨＥＲ２分子のコピー数に相当する免疫組織化学スコアによって処置され得、そして生化学的に決定され得る：
０＝０〜１０，０００コピー／細胞
１＋＝少なくとも約２００，０００コピー／細胞
２＋＝少なくとも約５００，０００コピー／細胞
３＋＝少なくとも約２，０００，０００コピー／細胞
チロシンキナーゼのリガンド依存性の活性化をもたらす３＋レベルでのＨＥＲ２の過剰発現（Ｈｕｄｚｉａｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：７１５９〜７１６３（１９８７））は、約３０％の乳癌で存在し、そしてこれらの患者では、無再発生存率および全生存が低下される（Ｓｌａｍｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：７０７〜７１２（１９８９）；Ｓｌａｍｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５：１７７〜１８２（１９８７））。
【０２４２】
あるいは、またはさらに、ＦＩＳＨアッセイ、例えば、ＩＮＦＯＲＭＴＭ（Ｖｅｎｔａｎａ，Ａｒｉｚｏｎａが販売）またはＰＡＴＨＶＩＳＩＯＮＴＭ（Ｖｙｓｉｓ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）を、ホルマリン固定された、パラフィン包埋された腫瘍組織で行って、腫瘍でのＨＥＲ２増幅の程度（もしあれば）を決定してもよい。
【０２４３】
ＨＥＲ２の陽性はまた、インビボの診断アッセイを用いて、例えば、検出されるべき分子に結合して、検出可能な標識（例えば、放射性同位体）でタグ化される分子（例えば、抗体）を投与すること、およびこの標識の局剤化についてこの患者を外部からスキャニングすることによって、評価され得る。
【０２４４】
ＨＥＲ２陽性腫瘍を特定するための他の方法は、本明細書に考慮されており、これには、限定はしないが、シエッド（ｓｈｅｄ）抗原を測定すること、およびＨＥＲ２陽性腫瘍を間接的に検出すること、例えば、ＨＥＲ２レセプターを通じて媒介される下流シグナル伝達、遺伝子発現プロファイリングを評価することなどが挙げられる。
【０２４５】
好ましくは、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって評価される場合ＨＥＲ２を過剰発現するか、および／またはＦＩＳＨによって評価する場合増幅されたＨＥＲ２遺伝子を有する、ＨＥＲ２陽性の腫瘍またはサンプルを有する被験体が選択される。
【０２４６】
本発明の融合ポリペプチドは単一の因子として投与されるが、患者は好ましくは、１つ以上の化学療法剤と組み合わせて処置される。好ましくは、少なくとも１つの化学療法剤はタキソイドである。併用投与としては、別々の処方物または単一の薬学的処方物を用いる同時投与または併用投与、ならびにいずれかの順序での連続投与であって、好ましくはある期間が空くが、両方（または全ての）活性因子が同時にその生物学的活性を発揮する連続投与が挙げられる。従って、化学療法剤は、この融合ポリペプチドの投与の前に、または後に投与されてもよい。この実施形態では、化学療法剤の少なくとも１つの投与と、融合ポリペプチドの少なくとも１つの投与との間のタイミングは、好ましくは約１か月未満、そして最も好ましくは約２か月未満である。あるいは、この化学療法剤および融合ポリペプチドは、患者に、単一処方物で、または別々の処方物で同時投与される。化学療法剤（例えば、タキソイド）および融合ポリペプチドの併用による処置によって、相乗的または相加的より大きい、治療的な利益がこの患者に生じ得る。
【０２４７】
化学療法剤は、投与される場合、それにとって公知の投薬量で通常投与されるか、または薬物の併用作用もしくは代謝拮抗化学療法剤の投与に起因し得る負の副作用に起因して必要に応じて低下される。このような化学療法剤のための調製および投薬スケジュールは、製造業者の指示に従って、当業者によって経験的に決定されるとおり用いられ得る。化学療法剤がパクリタキセルである場合、好ましくは、これは毎週（例えば、８０ｍｇ／ｍ２）または３週毎（例えば、１７５ｍｇ／ｍ２または１３５ｍｇ／ｍ２で）投与される。適切なドセタキセル投薬量としては、６０ｍｇ／ｍ２、７０ｍｇ／ｍ２、７５ｍｇ／ｍ２、１００ｍｇ／ｍ２、（３週ごと）；または３５ｍｇ／ｍ２、または４０ｍｇ／ｍ２（毎週）が挙げられる。
【０２４８】
組み合され得る種々の化学療法剤は上記で開示される。融合ポリペプチドと組み合わされる好ましい化学療法剤は、タキソイド（ドセタキセルおよびパクリタキセルを含む）、ビンカ（例えば、ビノレルビンまたはビンブラスチン）、白金化合物（例えば、カルボプラチンまたはシスプラチン）、アロマターゼインヒビター（例えば、レトロゾール、アナストラゾールまたはエキセメスタン）、抗エストロゲン（例えば、フルベストラントまたはタモキシフェン）、エトポシド、チオテパ、シクロホスファミド、メトトレキセート、リポソームのドキソルビシン、ペグ化リポソームドキソルビシン、カペシタビン、ゲムシタビン、ＣＯＸ−２インヒビター（例えば、セレコキシブ）、またはプロテオソームインヒビター（例えば、ＰＳ３４２）からなる群より選択される。
【０２４９】
最も好ましくは、この融合ポリペプチドは、タキソイド、例えば、パクリタキセルまたはドセタキセルと組み合わされ、必要に応じて、少なくとも１つの他の化学療法剤、例えば、白金化合物（例えば、カルボプラチンまたはシスプラチン）と組み合わされる。
【０２５０】
アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシンまたはエピルビシン）が、被験体に投与される場合、好ましくは、これは、融合ポリペプチドの投与の前および／または後に、例えば、アントラサイクリン／シクロホスファミド併用物が手術後に被験体に投与される以下の実施例に開示されるプロトコールで、ただし融合ポリペプチドおよびタキソイドの投与の前に与えられる。しかし、修飾されたアントラサイクリン、例えば、リポソームのドキソルビシン（ＴＬＣ  Ｄ−９９（ＭＹＯＣＥＴ（登録商標））、ペグ化リポソームのドキソルビシン（ＣＡＥＬ  ＹＸ（登録商標））、またはエピルビシンであって、心臓毒性が低下したものを、融合ポリペプチドと組み合わせてもよい。
【０２５１】
融合ポリペプチドおよび化学療法剤は別として、他の治療レジメンを組み合わせてもよい。例えば、第二（三番目、四番目など）の化学療法剤を投与してもよく、この第二の化学療法剤は、別であるか、異なるタキソイド化学療法剤であるか、またはタキソイドでない化学療法剤である。例えば、第二の化学療法剤は、タキソイド（例えば、パクリタキセルまたはドセタキセル）、ビンカ（例えば、ビノレルビン）、白金化合物（例えば、シスプラチンまたはカルボプラチン）、抗ホルモン剤（例えば、アロマターゼインヒビターまたは抗エストロゲン）、ゲムシタビン、カペシタビンなどであってもよい。例示的な組み合わせとしては、タキソイド／白金化合物、ゲムシタビン／タキソイド、ゲムシタビン／ビノレルビン、ビノレルビン／タキソイド、カペシタビン／タキソイドなどが挙げられる。種々の化学療法剤の「カクテル（ｃｏｃｋｔａｉｌ）」が投与され得る。
【０２５２】
融合ポリペプチドと併用され得る他の治療剤としては、以下の任意の１つ以上が挙げられる：第二の、異なるＨＥＲ２抗体、または融合ポリペプチド（例えば、ＨＥＲ２ヘテロ二量体化インヒビター、例えば、ペルツズマブ、またはＨＥＲ２過剰発現剤某のアポトーシスを誘発するＨＥＲ２抗体、例えば、７Ｃ２、７Ｆ３またはそのヒト化抗体）；異なる腫瘍関連抗原に対する抗体、例えば、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４；抗ホルモン化合物または内分泌療法、例えば、抗エストロゲン化合物、例えば、タモキシフェン、またはアロマターゼインヒビター；心保護剤（治療に関する心筋機能不全を防止または軽減するため）；サイトカイン；ＥＧＦＲインヒビター（例えば、ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）、ＩＲＥＳＳＡ（登録商標）またはセツキシマブ）；血管新生阻害剤（特に、ＡＶＡＳＴＩＮＴＭの商標でＧｅｎｅｎｔｅｃｈから販売されるうベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ））；チロシンキナーゼインヒビター；ＣＯＸインヒビター（例えば、ＣＯＸ−ＩまたはＣＯＸ−２インヒビター）；非ステロイド性抗炎症性薬物、セレコキシブ（ＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標））；ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎから入手可能なティピファルニブ（Ｔｉｐｉｆａｒｎｉｂ）／ＺＡＲＮＥＳＴＲＡ（登録商標）Ｒ１１５７７７、またはＳｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈから入手可能なＬｏｎａｆａｒｎｉｂ  ＳＣＨ６６３３６）；ＨＥＲ２ワクチン（例えば、ＰｈａｒｍｅｘｉａのＨＥＲ２  Ａｕｔｏ  Ｖａｃワクチン、またはＤｅｎｄｒｅｏｎのＡＰＣ８０２４タンパク質ワクチン、またはＧＳＫ／ＣｏｒｉｘａのＨＥＲ２ペプチドワクチン）；別のＨＥＲ標的化療法（例えば、トラスツマブ、セツキシマブ、ＡＢＸ−ＥＧＦ、ＥＭＤ７２００、ゲフィニチブ、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、ＣＰ７２４７１４、ＣＩ１０３３、ＧＷ５７２０１６、ＩＭＣ−１１Ｆ８、ＴＡＫ１６５など）；Ｒａｆおよび／またはｒａｓインヒビター（例えば、ＷＯ２００３／８６４６７を参照のこと）；ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射剤（ＤＯＸＩＬ（登録商標））；トポイソメラーゼＩインヒビター、例えば、トポテカン；タキソイド；ＨＥＲ２およびＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼインヒビター、例えば、ラパチニブ／ＧＷ５７２０１６；ＴＬＫ２８６（ＴＥＬＣＹＴＡ（登録商標））；ＥＭＤ−７２００；ＡＢ１００７（第ＸＩＩ重鎖抗体、Ｂ７Ｃ９）；エベロリムス（ｅｖｅｒｏｌｉｍｉｓ）（ＣＥＲＴＩＣＡＮ（登録商標））；シロリムス（ラパマイシン、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標））；体温低下医薬、例えば、アセトアミノフェン、ジフェニルドラミン、またはメペリジン；造血性増殖因子、など。
【０２５３】
任意の上記の同時投与される因子の適切な投薬量は、現在用いられているものであって、この因子および融合ポリペプチドの併用作用（相乗作用）に起因して低下され得る。
【０２５４】
上記の治療レジメンに加えて、患者は、放射線療法に供されてもよい。
【０２５５】
ＶＩ．物質の沈着
以下のハイブリドーマ細胞株が、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９，ＵＳＡ（ＡＴＣＣ）に寄託されている：
抗体の命名          ＡＴＣＣ番号                  寄託日
７Ｃ２          ＡＴＣＣＨＢ−１２２１５        １９９６年１０月１７日
７Ｆ３          ＡＴＣＣＨＢ−１２２１６        １９９６年１０月１７日
４Ｄ５          ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０４６３    １９９０年５月２４日
２Ｃ４          ＡＴＣＣ  ＨＢ−１２６９７      １９９９年４月８日
本発明のさらなる詳細は、以下の非限定的な例によって例示される。本明細書の全ての引用物の開示は参照によって本明細書に明らかに援用される。
【実施例】
【０２５６】
実施例１：融合タンパク質の分子クローニングおよび発現
抗−ＨＥＲ２−Ｈ６０および抗−ＨＥＲ２−ＭｉｃＢ融合タンパク質を、ＰＣＲを用いてアセンブルした。Ｈ６０は、Ｂａｌｂ／Ｃマウス脾臓ｃＤＮＡライブラリーから増幅され、そしてＭｉｃＢは、Ｈ６０（またはＭｉｃＢ）の細胞外ドメインをコードするＤＮＡ配列を増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーの対を用いてヒト肺ｃＤＮＡライブラリーから増幅された。クローニングを容易にするために、このプライマーにはまたそれぞれ、５’および３’末端にＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ部位を導入した。得られたＰＣＲ生成物は、成熟Ｈ６０のＮ末端塩基またはＭｉｃＢタンパク質をコードする配列を含み、そしてＣ末端に伸長した（Ｈ６０についてアミノ酸残基３０〜２１３、またはＭｉｃＢについてアミノ酸残基１６〜２９７）。Ｎ末端オリゴヌクレオチドはまた、ＧＧＧＧＳリンカーをコードしており、このリンカーは、成熟Ｈ６０（またはＭｉｃＢ）タンパク質の第一の残基を有する抗ＨＥＲ２の重鎖のＣ末端残基を連結する。オリゴヌクレオチドの別の対を用いて、４Ｄ５ｍＩｇ２ａをコードする哺乳動物発現プラスミド由来の抗ＨＥＲ２の重鎖をコードするＤＮＡを増幅した。これらのオリゴヌクレオチドは、それぞれ５’末端および３’末端にＸｂａＩおよびＢａｍＨＩを導入した。２つのＰＣＲ反応を別々に行い、ゲル精製し、次いで、ＸｂａＩおよびＳａｌＩ部位で切断される抗ＨＥＲ２重鎖哺乳動物細胞発現ベクターにクローニングし戻す。
【０２５７】
抗ＨＥＲ２−Ｈ６０および抗ＨＥＲ２−ＭｉｃＢ融合構築物プラスミドを、４Ｄ５ｍＩｇＧ２ａの抗ＨＥＲ２免疫グロブリン軽鎖をコードする別の哺乳動物発現ベクターとともにＣＨＯ細胞へ同時トランスフェクトした。この融合タンパク質および軽鎖をアセンブルして、Ｈ６０またはＭｉｃＢのいずれかの２つのコピーを有する抗体を形成する。この上清をＰｒｏｔｅｉｎＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）で精製した。このタンパク質を２ｍＭのグリシンｐＨ３で溶出して、Ｔｒｉｓ生理食塩水に緩衝液交換した。
【０２５８】
残基Ｄ２６５およびＮ２９７で２つの置換を有するさらなる抗−ＨＥＲ２−ＭｉｃＢプラスミドを、Ｄ２６５ＡおよびＮ２９７Ａ変異を含む重鎖ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩインサートをスワッピングすることによって上記のように構築した（抗−ＨＥＲ２＊−ＭｉｃＢと命名される）。これらの２つの置換基は、マウスＦｃγＲＩおよびマウスＦｃγＲＩＩＩに対する結合を破壊する。連結および引き続くトランスフェクションも、前に記載のとおり行った。
【０２５９】
全ての融合抗体を４〜１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離した。非還元条件では、抗−ＨＥＲ２−Ｈ６０、抗−ＨＥＲ２−ＭｉｃＢおよび抗−ＨＥＲ２＊−ＭｉｃＢ融合抗体は２５０，０００ダルトンに泳動し、このことは、この融合タンパク質が二量体であって、正確に折りたたまれることを示唆している。１ｍＭのジチオスレイトールを添加して、ジスルフィド結合を還元した場合、単一の２５０，０００ダルトンの二量体分子が２つのバンドに分離し、予想される１００Ｋの抗ＨＥＲ２重鎖Ｈ６０（またはＭｉｃＢ）融合タンパク質および２５Ｋの分子量の抗ＨＥＲ２の軽鎖に相当する１００，０００および２５，０００の相対分子量に泳動する。従って、抗ＨＥＲ２に対するＨ６０（またはＭｉｃＢ）融合分子および対応するＦｃドメインＤ２６５Ａ＋Ｎ２９７Ａ変異体は、二量体分子として発現可能であって、２つのＨ６０（またはＭｉｃＢ）分子に融合されたインタクトな抗ＨＥＲ２抗体を形成すると考えられた。
【０２６０】
実施例２：この融合タンパク質は、ＨＥＲ２およびＮＫＧ２Ｄレセプターに結合する。
【０２６１】
全長マウスＮＫＧ２ＤおよびＤＡＰ１０をクローニングして、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。安定な単一のクローンをＧ４１８を用いて選択し、そして細胞表面発現を、ｍＮＫＧ２Ｄ抗原に対するポリクローナルハムスター血清を用いてフローサイトメトリーによって確認した。ＣＨＯ細胞上のマウスＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩの安定細胞株はＰｒｅｓｔａおよびＳｈｉｅｌｄｓから贈呈された。細胞株の詳細は、それぞれ、マウスＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩに対するモノクローナル抗体（１Ｆ３．４．３および２５Ｈ１．１．３）によって確認した。
【０２６２】
ＥＬＩＳＡを展開させて、ｍＮＫＧ２Ｄに対する抗−ＨＥＲ２、抗−ＨＥＲ２−Ｈ６０、抗−ＨＥＲ２−ＭｉｃＢおよび抗−ＨＥＲ２＊−ＭｉｃＢの結合を確認した。残基８８−２３２を示すマウスＮＫＧ２Ｄの可溶型を哺乳動物Ｎ’−ＦＬＡＧタグ化プラスミドにクローニングして、ＣＨＯ細胞中で発現した。これは、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でグリコシル化二量体として発現された。リン酸緩衝化生理食塩水中のマウスＮＫＧ２Ｄの１ミリリットルあたり１マイクログラムを、Ｎｕｎｃ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｐプレート上に４℃で一晩固定した。未結合のタンパク質を除去して、遊離の結合部位を、０．５％のウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝化生理食塩水でブロックした。抗ＨＥＲ２、抗−ＨＥＲ２−Ｈ６０、抗−ＨＥＲ２−ＭｉｃＢ、抗−ＨＥＲ２＊−ＭｉｃＢおよびマウスＩｇＧ２ａコントロール抗体の滴定量を添加して、室温で１時間インキュベートした。未結合のタンパク質を、ＰＢＳ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０での数回の洗浄によって除去し、次いでヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）２西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化抗体を添加した。６０分後、このプレートを上記のとおり洗浄して、ＴＭＢ基質を添加した（ＫＰＬ）。
【０２６３】
抗−ＨＥＲ２および抗−ＨＥＲ２−Ｈ６０改変体の滴定量を、結合についてアッセイした。期待どおり、マウスＮＫＧ２Ｄに対する結合は、抗−ＨＥＲ２でもｍＩｇＧ２ａでも観察されなかった。対照的に、抗−ＨＥＲ２−Ｈ６０は、ＥＣ５０＝０．２ｎＭで固定されたＮＫＧ２Ｄに特異的に結合した。抗−ＨＥＲ２−ＭｉｃＢおよび抗−ＨＥＲ２＊−ＭｉｃＢは、捕獲されたｍＮＫＧ２Ｄに対してＥＣ５０＝０．３ｎＭで結合した。競合ＥＬＩＳＡはまた、増大した濃度の可溶性ｍＮＫＧ２Ｄタンパク質を添加することによって行った。予想どおり、可溶性ｍＮＫＧ２Ｄは、特異的に、捕獲されたＮＫＧ２Ｄに対するＨ６０およびＭｉｃＢリガンド結合を阻害した。
【０２６４】
抗ＨＥＲ２および抗ＨＥＲ２−Ｈ６０の全ての操作された改変体が、Ｈｅｒ２抗原に対する結合を維持するか否かを決定するために、フローサイトメトリーを全ての改変体で行って、ＢＴ４７４細胞に対するそれらの結合を確認した。フローサイトメトリーアッセイを設定して、種々の構築物が、Ｈｅｒ２＋細胞、ｍＮＫＧ２Ｄ形質移入体、ｍＦｃγＲＩおよびｍＦｃγＲＩＩＩ  ＣＨＯ集合物およびＣ５７Ｂ１６マウス由来の脾臓細胞を染色するか否かを確認した。ＢＴ４７４細胞（細胞表面で高レベルのＨＥＲ２を発現するヒト上皮乳癌細胞）のＨｅｒ２＋単層を、トリプシンで除去して、２％のウシ胎仔血清を含有するリン酸緩衝化生理食塩水中で洗浄した。１×１０６個の細胞に、滴定量の抗−ＨＥＲ２、抗−ＨＥＲ２−Ｈ６０、抗−ＨＥＲ２−ＭｉｃＢおよび抗−ＨＥＲ２＊−ＭｉｃＢタンパク質を添加して、氷上で３０分間インキュベートし、次いで冷緩衝液で２回洗浄した。発蛍光団結合体化ヤギ−抗マウスＦ（ａｂ’）２を３０分間添加し、再度洗浄して、ＦＡＣＳ  ｃａｎまたはＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒＴＭ（ＢＤ）によって分析した。バックグランド結合を決定するために、コントロール抗体マウスＩｇＧ２ａを含んだ。
【０２６５】
マウスＩｇＧ２ａコントロール抗体でインキュベートしたＢＴ４７４細胞はバックグラウンドレベルの染色のみを示したが、滴定量の抗ＨＥＲ２は、ＢＴ４７４細胞の陽性染色を示した（図５）。抗−ＨＥＲ２−Ｈ６０、抗−ＨＥＲ２−ＭｉｃＢおよび抗ＨＥＲ２＊−ＭｉｃＢを含む融合抗体は、抗ＨＥＲ２抗体に比較してわずかに（２〜３倍）低いＢＴ４７４細胞の染色を示した。
【０２６６】
ＮＫＧ２Ｄに対する融合タンパク質の結合を確認するために、ＨＥＫ２９３細胞におけいて安定なｍＫＧ２Ｄ形質移入体を作成した。予想どおり抗−ＨＥＲ２−Ｈ６０は、フローサイトメトリー（ＭＦＩ＝１００）によればｍＮＫＧ２Ｄ形質移入体に対して極めてよく結合した。一方、抗−ＨＥＲ２−ＭｉｃＢおよび抗−ＨＥＲ２＊−ＭｉｃＢは、ｍＮＫＧ２Ｄ形質移入体に対してＭＦＩ＝１１で結合した（アイソタイプＭＦＩ＝４）。しかし、抗−ＨＥＲ２−ＭｉｃＢおよび抗−ＨＥＲ２＊−ＭｉｃＢは、ヒトＮＫＧ２Ｄ−ＣＨＯ形質移入体細胞に対してＭＦＩ＝６１．７で結合した。
【０２６７】
本発明者らはまた、Ｈ６０が抗−ＨＥＲ２に融合される場合、脾臓細胞由来のＮＫ細胞上のｍＮＫＧ２Ｄに結合し得ることを確認した。融合抗体をビオチン化して、ＦＡＣによって発蛍光団結合体化ストレプトアビジン二次抗体で検出した。予想どおり、バックグラウンドレベルを超える染色は、抗−ＨＥＲ２でも、またはマウスＩｇＧ２ａコントロール抗体でも観察されなかった。対照的に、抗−ＨＥＲ２−Ｈ６０は、陽性染色を示し、ＭＦＩ＝４８．９であった。さらに、この染色は、ｍＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインタンパク質によって、または抗−ｍＮＫＧ２Ｄ抗体でブロックされ得る。抗−ＨＥＲ２−ＭｉｃＢおよび抗−ＨＥＲ２＊−ＭｉｃＢは、好ましくは、マウスＮＫＧ２Ｄレセプターに対する低親和性結合に起因して、コントロールに対して等価な結合を示した。
【０２６８】
実施例３：抗−ＨＥＲ２融合タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄを通じたＮＫ細胞媒介性殺傷を誘導する。
【０２６９】
細胞標的のＮＫ細胞媒介性殺傷は、ＣＤ１６およびＮＫＧ２Ｄを通じて生じ得る。本発明者らは、融合構築物がＮＫＧ２Ｄを通じて作用するということを確認するために実験を設計した。本発明者らは、マウスＤＸ５＋ＮＫ細胞を活性化して、ＨＥＲ２＋ＢＴ４７４細胞を殺傷する能力についてアッセイした。
【０２７０】
抗−ＨＥＲ２−Ｈ６０（またはＭｉｃＢ）が、ＮＫＧ２Ｄを通じるかまたはＣＤ１６を通じたＮＫ細胞殺傷を活性化するか否かを決定するために、本発明者らは、Ｆｃ変異（Ｄ２６５Ａ＋Ｎ２９７Ａ）がそのレセプターに対するＦｃ結合を破壊することを試験した。本発明者らは、抗ＨＥＲ２−Ｈ６０および抗−ＨＥＲ２−ＭｉｃＢ抗体が、ｍＦｃγＲＩに結合することを最初に確認した。フローサイトメトリーによって、本発明者らは、抗−ＨＥＲ２−Ｈ６０がｍＦｃγＲＩおよびｍＦｃγＲＩＩＩのＣＨＯ細胞に結合するが、その結合は予期せぬことに減弱されたことを見出した。この減弱はおそらく、Ｈ６０がＦｃ結合を邪魔することに起因する。しかし、本発明者らは、ｍＦｃγＲＩおよびｍＦｃγＲＩＩＩのＣＨＯ細胞に対する抗−ＨＥＲ２−ＭｉｃＢ結合が、抗−ＨＥＲ２の裸の抗体に匹敵したことを観察した。予想どおり、抗−ＨＥＲ２＊−ＭｉｃＢのｍＦｃγＲＩおよびｍＦｃγＲＩＩＩのＣＨＯ細胞にの結合は、無視できた。
【０２７１】
次いで、本発明者らは、ｍＩｇＧ２ａ、抗−ＨＥＲ２、抗−ＨＥＲ２−Ｈ６０、抗−ＨＥＲ２−ＭｉｃＢまたは抗−ＨＥＲ２＊−ＭｉｃＢの６．７ｎＭ溶液を、約１０，０００個のＨｅｒ２発現細胞株ＢＴ４７４細胞に対して、９６ウェルマイクロタイタープレート中で添加して、室温で２０分間インキュベートした。同時に、脾臓をＣ５７ＢＬ６マウスまたはマウスＦｃγＲＩＩＩノックアウトマウスから取り出して、カバーガラスでミンチにして、単一細胞懸濁物を作成した。細胞を、０．５％ウシ血清アルブミンを含有する冷ＰＢＳ中で洗浄した。ＮＫ細胞を単離するために、ＤＸ５磁気ビーズを加えて（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）、ＤＸ５陽性のＮＫ細胞を、磁気分離によって単離した。この細胞をカウントして、調節し、ＢＴ４７４細胞比を標的するためのＮＫエフェクター細胞の範囲を得た。ＮＫ細胞を、マイクロタイターウェル中で標的細胞に添加して、さらに４時間インキュベートした。培養上清を回収して、市販の診断キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて乳酸デヒドロゲナーゼについてアッセイした。
【０２７２】
抗−ＨＥＲ２単独では、本発明者らは、１５％でＢＴ４７４細胞の殺傷を観察し、これは５０：１のＥ：Ｔ比であった。抗ＨＥＲ２−ＭｉｃＢはこの殺傷を３０％まで２倍にした。対照的に、抗−ＨＥＲ２＊−ＭｉｃＢをアッセイした場合、殺傷は、５０：１のＥ：Ｔ比で１５％に低下した。
【０２７３】
殺傷がｍＮＫＧ２Ｄを介して媒介されることをさらに実証するために、抗マウスＣＤ１６抗体（ＢＤからの２．４Ｇ２）または抗ｍＮＫＧ２Ｄ抗体のＦ（ａｂ’）２（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓのクローン１９１００４）を殺傷アッセイに添加した。抗マウスＣＤ１６の添加は、抗−ＨＥＲ２殺傷を完全に阻害したが、抗ＨＥＲ２＊−ＭｉｃＢ誘発性の殺傷は阻害せず、一方、抗−ｍＮＫＧ２Ｄ抗体のＦ（ａｂ’）２は、抗−ＨＥＲ２＊−ＭｉｃＢ媒介性の殺傷を完全に阻害したが、裸の抗−ＨＥＲ２抗体は阻害しなかった（図６ａ）。これらのデータによって、抗−ＨＥＲ２＊−ＭｉｃＢは、ＮＫＧ２Ｄ経路に関与するＣＤ１６−依存性の経路を通じた殺傷を誘発したことが確認された。あるいは、本発明者らは、エフェクター細胞としてマウスＦｃγＲＩＩＩノックアウトマウス脾臓ＮＫ細胞を用いて、ＣＤ１６媒介性殺傷を排した。予想どおり、抗−ＨＥＲ２は、ｍＩｇＧ２ａに比較して殺傷を誘発しなかったが、抗−ＨＥＲ２−Ｈ６０および抗−ＨＥＲ２−ＭｉｃＢは、殺傷を約１０％で、Ｅ：Ｔ比が２０：１でやはり誘発し得る。さらに、これらの２つの融合抗体媒介性の殺傷は、抗−ｍＮＫＧ２Ｄ抗体によって完全にブロックされ得ない（図６ｂ）。
【０２７４】
実施例４：結合体のインビボ治療用途
Ｈ６０（ＭｉｃＢ）およびｍＮＫＧ２Ｄの相互作用が、インビボの腫瘍殺傷を開始し得るか否かを決定するために、本発明者らは、ＢＴ４７４異種移植片モデルで本発明者らの融合抗体を試験した。五百万個のＢＴ４７４細胞を、０．１ｍｌのＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）と混合された０．１ｍｌのＰＢＳ中で１日目に皮下注射した。２〜４か月齢の雌性無胸腺ヌードマウスに、１７βエストラジオール６０日放出ペレット（１７β−ｅｓｔｒａｄｉｏｌ  ６０−ｄａｙ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｐｅｌｌｅｔｓ）（０．７５ｍｇ／ペレット；Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｓａｒａｓｏｔａ，Ｆｌｏｒｉｄａ）を、腫瘍細胞注射の２４時間前に皮下注射した。腫瘍容積が１００ｍｍ３に達した後で（約１０〜１４日）、マウスをランダムに分類した。５ｍｇ／ｋｇのｍＩｇＧ２ａ、抗−ＨＥＲ２および６ｍｇ／ｋｇの抗−ＨＥＲ２−Ｈ６０、抗−ＨＥＲ２−ＭｉｃＢおよび抗−ＨＥＲ２＊−ＭｉｃＢを腹腔内に注射した。腫瘍容積は、以下の式を用いて毎週測定した：幅×長さ×０．５２高さ。
【０２７５】
単一用量の５ｍｇ／ｋｇの４Ｄ５ｍＩｇＧ２ａでは、２０日で腫瘍増殖のほぼ完全な増殖が生じた。Ｆｃ機能を保持する４Ｄ５ｍＩｇＧ２ａ−ＭｉｃＢは、４Ｄ５でみられたものと匹敵するほぼ完全な阻害を生じた。Ｆｃ機能をノックアウトされた４Ｄ５＊−ＭｉｃＢは、腫瘍増殖を阻害する能力を失った。結局、インビトロでＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩに対する結合が減少している４Ｄ５−Ｈ６０は、４Ｄ５よりも抗腫瘍活性が少なかった（図７）。血清サンプルを抗体の投与後２、７、２０日で採取して、それらのＰＫについて測定した。全ての抗体の匹敵するＰＫレベルが見出された。
【０２７６】
本明細書および特許請求の範囲を通じて、「含む、包含する、備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、またはバリエーション、例えば、「含む、包含する、備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、または「含む、包含する、備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、任意の言及される整数または整数の群の包含を示しており、ただし任意の他の整数または整数の群の排除は示さない。
【０２７７】
上記の明細書、実施例およびデータは、本発明の組成物の製造および使用の完全な説明を提供している。本発明の多くの実施形態は、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなくなされ得るので、本発明は全てのこのような実施形態を包含する。
【０２７８】
本明細書は、文献および特許に対する多くの引用を含む。各々が本明細書において、あたかも詳細に説明されるかのように、全ての目的のために参照によって援用される。
【図面の簡単な説明】
【０２７９】
【図１】図１はトラスツマブの軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１）を図示する。
【図２】図２はトラスツマブの重鎖のアミノ酸配列（配列番号２）を図示する。
【図３】図３はペルツズマブの軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３）を図示する。
【図４】図４はペルツズマブの重鎖のアミノ酸配列（配列番号４）を図示する。
【図５】図５はＨｅｒ２陽性細胞に対する抗ＨＥＲ２−Ｈ６０融合抗体の結合を図示する。
【図６】図６ａおよび図６ｂはＢＴ４７４細胞に対する抗ＨＥＲ２−Ｈ６０融合抗体の細胞傷害性活性を図示する。
【図７】図７は、ＢＴ４７４異種移植片モデルにおける抗ＨＥＲ２融合タンパク質の活性を図示する。
【図１】
2009514537.tif 000006
【図２】
2009514537.tif 000007
【図３】
2009514537.tif 000008
【図４】
2009514537.tif 000009
【図５】
2009514537.tif 000010
【図６】
2009514537.tif 000011
【図７】
2009514537.tif 000012
【配列表】
2009514537000001.app
【国際調査報告】
2009514537.tif 000013
2009514537.tif 000014
2009514537.tif 000015