(57)【要約】  本発明は、概日リズムの伸長におけるアデニリルシクラーゼ阻害剤を含む組成物の使用、対象において概日リズム周期を拡張する方法であって、対象にアデニリルシクラーゼ阻害剤を投与するステップを含む方法、及び概日リズム障害の治療において使用するためのアデニリルシクラーゼ阻害剤に関する。阻害剤はＰサイト阻害剤、好ましくは９−（テトラヒドロフリル）アデニンであることが好ましい。組成物はＪＮＫ阻害剤を更に含んでもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
概日リズムの延長におけるアデニリルシクラーゼ阻害剤を含む組成物の使用であって、前記アデニリルシクラーゼ阻害剤がプリン部位（Ｐサイト）阻害剤である使用。
【請求項２】
対象において概日リズム周期を延張する方法であって、前記対象にアデニリルシクラーゼ阻害剤を含む組成物を投与するステップを含み、前記アデニリルシクラーゼ阻害剤がプリン部位（Ｐサイト）阻害剤である方法。
【請求項３】
概日リズム障害用の医薬を製造するためのアデニリルシクラーゼ阻害剤を含む組成物の使用であって、前記アデニリルシクラーゼ阻害剤がプリン部位（Ｐサイト）阻害剤である使用。
【請求項４】
時差症候群用の医薬を製造するためのアデニリルシクラーゼ阻害剤を含む組成物の使用であって、前記アデニリルシクラーゼ阻害剤がプリン部位（Ｐサイト）阻害剤である使用。
【請求項５】
家族性睡眠相前進症候群用の医薬を製造するためのアデニリルシクラーゼ阻害剤を含む組成物の使用であって、前記アデニリルシクラーゼ阻害剤がプリン部位（Ｐサイト）阻害剤である使用。
【請求項６】
交代勤務症候群用の医薬を製造するためのアデニリルシクラーゼ阻害剤を含む組成物の使用であって、前記アデニリルシクラーゼ阻害剤がプリン部位（Ｐサイト）阻害剤である使用。
【請求項７】
アデニリルシクラーゼ阻害剤がプリン部位リガンドである、請求項１、３、４、５若しくは６のいずれかに記載の使用、又は請求項２に記載の方法。
【請求項８】
アデニリルシクラーゼ阻害剤がアデニリルシクラーゼに対して特異的である、請求項１、３、４、５若しくは６のいずれかに記載の使用、又は請求項２に記載の方法。
【請求項９】
アデニリルシクラーゼ阻害剤がアデニリルシクラーゼのＰサイトに作用する、請求項１、３、４、５若しくは６のいずれかに記載の使用、又は請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
アデニリルシクラーゼ阻害剤が、９−（テトラヒドロフリル）−アデニン、９−（シクロペンチル）アデニン及び２’，５’−ジデオキシアデノシンからなる群より選択される、請求項１、３、４、５若しくは６のいずれかに記載の使用、又は請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
アデニリルシクラーゼ阻害剤が９−（テトラヒドロフリル）−アデニンである、請求項１、３、４、５若しくは６のいずれかに記載の使用、又は請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
組成物がｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）阻害剤を更に含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の使用又は方法。
【請求項１３】
ＪＮＫ阻害剤がＳＰ６００１２５（アントラ［１，９−ｃｄ］ピラゾール−６（２Ｈ）−オン；１，９−ピラゾロアントロン；ＳＡＰＫ阻害剤II）である、請求項１２に記載の使用又は方法。
【請求項１４】
概日リズム障害の治療において使用するためのアデニリルシクラーゼ阻害剤。
【請求項１５】
障害が時差症候群である、請求項１４に記載のアデニリルシクラーゼ阻害剤。
【請求項１６】
障害が交代勤務症候群である、請求項１４に記載のアデニリルシクラーゼ阻害剤。
【請求項１７】
障害が家族性睡眠相前進症候群である、請求項１４に記載のアデニリルシクラーゼ阻害剤。
【請求項１８】
プリン部位リガンドである、請求項１４に記載のアデニリルシクラーゼ阻害剤。
【請求項１９】
アデニリルシクラーゼに対して特異的である、請求項１４に記載のアデニリルシクラーゼ阻害剤。
【請求項２０】
アデニリルシクラーゼのＰサイトに作用する、請求項１４に記載のアデニリルシクラーゼ阻害剤。
【請求項２１】
９−（テトラヒドロフリル）−アデニン、９−（シクロペンチル）アデニン及び２’，５’−ジデオキシアデノシンからなる群より選択される、請求項１４に記載のアデニリルシクラーゼ阻害剤。
【請求項２２】
９−（テトラヒドロフリル）−アデニンである、請求項１４に記載のアデニリルシクラーゼ阻害剤。
【請求項２３】
請求項１〜１１のいずれかに記載のアデニリルシクラーゼ阻害剤及び、ＪＮＫ阻害剤を含む組成物。
【請求項２４】
医薬品における使用のための請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
（ｉ）アデニリルシクラーゼ阻害剤、及び
（ii）ＪＮＫ阻害剤
を含む医薬パック又はキット。
【請求項２６】
アデニリルシクラーゼ阻害剤が、請求項１〜１１のいずれかに記載のアデニリルシクラーゼ阻害剤である、請求項２５に記載の医薬パック又はキット。
【請求項２７】
ＪＮＫ阻害剤がＳＰ６００１２５（アントラ［１，９−ｃｄ］ピラゾール−６（２Ｈ）−オン；１，９−ピラゾロアントロン；ＳＡＰＫ阻害剤II）である、請求項２５又は２６に記載の医薬パック又はキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は体内時計の調整に関する。特に、本発明は体内時計異常の治療における体内時計周期の遅延又は引延ばしに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学的体内時計は、約２４時間周期で振動する。こうした体内時計は、多くの細菌だけでなく真核生物の大部分において見られる。体内時計は行動及び生理機能の多くの面に影響を及ぼし、２４時間周期にわたる活動において、規則的かつ測定可能な変動をもたらす。睡眠、メラトニン分泌及び核心温の概日リズムは、哺乳類の体内時計の解剖学的所在である視床下部の視交叉上核により引き起こされる。概日リズムの異常は様々な臨床的障害のもとになる。
【０００３】
先進国において２０％近くの被雇用者が交代勤務で雇用されており、週替わりで、又は更には日替わりで睡眠習慣の激変を余議なくされている。従来にない勤務時間に働く必要のある被雇用者の数が増加している。日中の睡眠が困難なシフトワーカーは、勤務中に起きていることも困難である。こうしたシフトワーカーは疲労するほど、「微小睡眠（microsleep）」という、睡眠不足によって起こる、数秒間続く無意識の睡眠発作を経験しやすくなる。およそ２０％のシフトワーカーが勤務中の入眠を報告しており、これにより労働災害の危険性が増加し、生産性が低下する。
【０００４】
２つの主な種類の交代勤務がある。被雇用者は、従来にない非変動型の勤務時間、例えば午後１１時〜午前７時に勤務するか、又は２４時間全体をカバーする３交代勤務を持ち回る場合がある。どちらのパターンも、睡眠障害、及び概日リズムに影響を及ぼす関連問題を引き起こす可能性がある。交代勤務の変化（ＳＷＣ, shift work change、「交代勤務症候群」又は「交代勤務睡眠障害」とも呼ばれる）は、交代勤務で要求される、非従来型の及び／又は変動型の睡眠／覚醒行動パターンに概日リズムを順応できないことにより引き起こされる。
【０００５】
この状態の治療は限定されている。当技術分野で知られている行動及び／又は薬理学的療法は、症状の軽減に寄与することしかできない。当技術分野における１つの見解によると、特に週末に通常の睡眠スケジュールに切り替える人は、体が交代勤務に完全に順応することはないだろう。
【０００６】
睡眠相遅延症候群とも呼ばれる睡眠相後退症候群（ＤＳＰＳ, delayed sleep phase syndrome）は、概日リズム睡眠障害である。しかしながら、時差症候群又は交代勤務症候群とは異なり、睡眠相後退症候群は持続性の状態である。臨床環境において、睡眠相後退症候群は最もよく見られる睡眠覚醒パターンの障害の１つである。
【０００７】
睡眠相後退症候群は、患者の内因性生物時計と外的環境の脱同調によって起こる。時差症候群とは対照的に、この脱同調は旅行又は外的環境の変化によって活性化されるわけではなく、患者の入眠傾向は、健常者の入眠傾向に対して遅延される。
【０００８】
ＤＳＰＳ患者は、典型的には午前２時前に入眠できず、早く（例えば午前７時までに）起床することが極めて困難である。ＤＳＰＳ患者にとって主な困難なことは、朝早くに活動することである。ＤＳＰＳ患者は、学業で失敗すること及び／又は仕事を続けるのに苦労することが多く、このことは社会的に損害を与える可能性があり、しばしばＤＳＰＳ患者の健康を危険にさらす。５０００人の参加者を対象とした最近の研究においてＤＳＰＳは、睡眠覚醒スケジュールに関与する障害の約４０％を占めていた。
【０００９】
家族性睡眠相前進症候群（ＦＡＳＰＳ, Familial Advanced Sleep Phase Syndrome）は、極端に早い睡眠の開始及び終了を特徴とする。この障害は特に、若年成人に多い。睡眠覚醒、メラトニン及び体温リズムの位相の著しい前進は、この障害の特徴である。この形質は、浸透度の高い常染色体優性として分離する。当技術分野において、この障害の有効な治療はない。
【００１０】
時差症候群は、個人の健康及び能力に悪影響を及ぼす。職場における非効率性及び／又は低い生産性などの、時差症候群と関連した経済的な問題が存在する。機械操作時、運転時又は同様の活動時に、疲労により事故の可能性が増加するなどの深刻なリスクを与える危険もある。現在のところ、時差症候群の唯一の治療はメラトニン療法である。メラトニン療法は、晩に投与された場合、１日当たり約３０分、体内時計の位相をわずかにリセットする効果をもたらすことができる。メラトニン療法は、時間的な治療域が狭い、ヒトにおいて有効性がほとんどない、などの問題がある。更に、メラトニンは睡眠を促進するため、覚醒度又は注意力がしばらく必要な場合、例えば到着してすぐに空港から車で遠くへ行く場合には不適である。従って、時差症候群及び関連障害に対する改善した又は代替の治療法が必要である。
【００１１】
体内時計は非常に強力であるため、温度摂動にさえ影響を受けないことに留意すべきである。通常の生物物理学的予測によると、５℃の温度低下は３４時間の時計周期をもたらすと推測されるはずである。しかしながら、わずかに抑制するにも関わらず、処理前、処理中及び処理後に視交叉上核は２４時間に極めて近いリズムを維持する。前記時計の外的因子に対する極度の安定性及び抵抗性は、それを調整する際に問題になる。
【００１２】
ｃＡＭＰ濃度の変動は１日サイクルの全体にわたって観察されてきた。ｃＡＭＰは、体内時計によって濃度が制御され得る下流エフェクターであると見なされてきた。ｃＡＭＰが先行技術において研究されてきた際、それは急激な調整によるものであった。典型的には、系のアゴニスト又はアンタゴニストを適用し、急性効果を最大２４又は４８時間にわたってモニターした。これにより、ｃＡＭＰアナログは概日リズムに位相シフト効果を引き起こすことができることが示唆された。リズムの発振周期に対する何らかの効果が得られると示唆するものは全くなかった。当技術分野の見解によると、ｃＡＭＰの作用の程度は、体内時計機構の作用の程度よりもかなり低い。
【００１３】
Marks and Birabil (2000 Neuroscience Volume 98 pages 311-315)は、アデニリルシクラーゼ阻害剤をラット中枢神経系中に注入することによりレム睡眠を強化できることを開示している。特に、この化合物をラット脳の特定部へ導入することによりレム睡眠にかかる時間を長く持続して増加させることができる。この文献中に、概日リズム調整に関する言及はない。レム睡眠パターンの誘導及び決定は、概日リズムとは別の機構によってなされることに留意すべきである。睡眠中のレムの回数及び周期は、睡眠サイクル中の局所的な脳波及び電気パルスによって決定される。このように、Marks and Birabilにおいて、周期性又は生物時計に関する教示はない。
【非特許文献１】Marks and Birabil (2000 Neuroscience Volume 98 pages 311-315)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、先行技術に伴う問題を克服しようと試みる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
ｃＡＭＰは、全ての細胞において重要なセカンドメッセンジャーである。ｃＡＭＰ濃度の１日サイクルは観察することができる。こうしたｃＡＭＰ濃度の周期的変動は、体内時計のアウトプットであると考えられていた。しかしながら、驚くべきことに、ｃＡＭＰは実際には体内時計の内因性の又は構造的な部分であることが、本発明者らによって初めて示された。本発明はこの注目すべき発見に基づく。
【００１６】
体内時計の構造的特徴と単なるアウトプットの違いは大きい。多数の概日リズムエフェクターが存在し、１日２４時間にわたって非常に多くの生物学的事象が変動する、又は規則的に変化するのを見ることができる。しかしながら、様々なアウトプット又はエフェクターの研究も、根底にある基本的な時計機構の調整又は適合を可能にするものではない。実際の生物時計機構の調整が、本発明によって初めて可能になる。この成果の重要性は、機械時計との比較によって容易に理解できる。作業者が機械時計の針を調整すると、時計の針はアウトプットを変化させたように見えるはずである。しかしながら、時計の針は決して時計の機構に影響を及ぼしたわけではなく、時計の時間管理特性は変化していないことが明らかなはずである。このことは当該技術分野の状態を表しており、つまり、せいぜい時計の不十分な位相変化又は時計エフェクターの大まかな変更が可能なだけである。対照的に本発明によると、実際の時間管理機構、すなわち体内時計周期は今や調整することができる。このことが可能になったのは、これが最初である。
【００１７】
本発明者らは、ｃＡＭＰが体内時計の核心であることを開示する。ｃＡＭＰ濃度を調整することによって、この時計が時間を管理する速度を変えることが可能であり、すなわち時計周期を調整することができる。
【００１８】
従って、一態様において本発明は、概日リズムの延長におけるアデニリルシクラーゼ阻害剤を含む組成物の使用を提供する。
【００１９】
アデニリルシクラーゼ阻害剤がプリン部位（Ｐサイト）阻害剤であることが好ましい。
【００２０】
別の態様において本発明は、対象において概日リズム周期を延長する方法であって、前記対象にアデニリルシクラーゼ阻害剤を含む組成物を投与するステップを含む方法を提供する。阻害剤は、選択した量によってリズム周期を延長するのに有効な量で投与される。例示的な用量に関する手引きは下記に示す。
【００２１】
延長（elongation）は、当技術分野における標準的な意味を有し、延張（extension）又は延長（prolongation）とも称する。延長は、時間の増加、すなわち長くすることを意味することが好ましい。本発明の文脈において、延長は概日リズム周期を増大させることを意味する。
【００２２】
別の態様において本発明は、概日リズム障害用の医薬を製造するためのアデニリルシクラーゼ阻害剤を含む組成物の使用を提供する。
【００２３】
別の態様において本発明は、時差症候群用の医薬を製造するためのアデニリルシクラーゼ阻害剤を含む組成物の使用を提供する。
【００２４】
別の態様において本発明は、家族性睡眠相前進症候群用の医薬を製造するためのアデニリルシクラーゼ阻害剤を含む組成物の使用を提供する。
【００２５】
別の態様において本発明は、交代勤務症候群用の医薬を製造するためのアデニリルシクラーゼ阻害剤を含む組成物の使用を提供する。
【００２６】
阻害剤は、プリン部位リガンドであることが好ましい。
阻害剤は、アデニリルシクラーゼに対して特異的であることが好ましい。
阻害剤は、アデニリルシクラーゼのＧｓα結合部位に作用しないことが好ましい。
阻害剤は、アデニリルシクラーゼのＰサイトに作用することが好ましい。
阻害剤は、９−（テトラヒドロフリル）−アデニン、９−（シクロペンチル）アデニン及び２’，５’−ジデオキシアデノシンからなる群より選択されることが好ましい。
阻害剤は、９−（テトラヒドロフリル）−アデニン（SQ22536又はＴＨＦＡ, 9-(tetrahydrofuryl)-adenine）又は２’，５’−ジデオキシアデノシンであることが好ましい。
阻害剤は、９−（テトラヒドロフリル）−アデニンであることが好ましい。
【００２７】
組成物は、アデニリルシクラーゼ阻害剤からなってもよい。
【００２８】
別の態様において本発明は、概日リズム障害の治療において使用するためのアデニリルシクラーゼ阻害剤を提供する。
【００２９】
障害は、時差症候群であることが好ましい。
障害は、交代勤務症候群であることが好ましい。
障害は、家族性睡眠相前進症候群であることが好ましい。
阻害剤は、プリン部位リガンドであることが好ましい。
阻害剤は、アデニリルシクラーゼに対して特異的であることが好ましい。
阻害剤は、アデニリルシクラーゼのＰサイトに作用することが好ましい。
阻害剤は、９−（テトラヒドロフリル）−アデニン、９−（シクロペンチル）アデニン及び２’，５’−ジデオキシアデノシンからなる群より選択されることが好ましい。
阻害剤は、９−（テトラヒドロフリル）−アデニンであることが好ましい。
【００３０】
別の態様において本発明は、組成物がｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）阻害剤を更に含む、前述の使用又は方法を提供する。
【００３１】
ＪＮＫ阻害剤が、ＳＰ６００１２５（アントラ［１，９−ｃｄ］ピラゾール−６（２Ｈ）−オン；１，９−ピラゾロアントロン；ＳＡＰＫ阻害剤II）であることが好適である。
【００３２】
別の態様において本発明は、上記で定義されたアデニリルシクラーゼ阻害剤及びＪＮＫ阻害剤を含む組成物を提供する。
【００３３】
別の態様において本発明は、医薬品における使用のための前述の組成物を提供する。
【００３４】
別の態様において本発明は、
（ｉ）アデニリルシクラーゼ阻害剤、及び
（ｉｉ）ＪＮＫ阻害剤
を含む医薬パック又はキットを提供する。
【００３５】
アデニリルシクラーゼ阻害剤は、上記で定義されたアデニリルシクラーゼ阻害剤であることが好適である。
【００３６】
ＪＮＫ阻害剤は、ＳＰ６００１２５（アントラ［１，９−ｃｄ］ピラゾール−６（２Ｈ）−オン；１，９−ピラゾロアントロン；ＳＡＰＫ阻害剤II）であることが好適である。
【００３７】
アデニリルシクラーゼ阻害剤
アデニリルシクラーゼ（アデニル酸シクラーゼと称することもある）は、タンパク質ファミリーである。数多くの異なるイソ型が存在する。これらのイソ型は、異なる組織発現パターンを有し得る。
【００３８】
当技術分野で知られている数多くのアデニリルシクラーゼ阻害剤がある。異なるクラスの阻害剤は、異なる作用点を有し得る。Ｇｓα作用阻害剤は、ｃＡＭＰをゼロ又は検出不能な濃度まで減少させる傾向があることが開示されている。この大幅な減少の効果は、概日リズムの消散である。これは、不規則な行動及び時計機能の欠損をもたらす。阻害剤の除去後、時計機能は回復可能である。
【００３９】
対照的に、プリン部位（Ｐサイト）阻害剤はｃＡＭＰ濃度を減少させるが、完全に除去するわけではない。Ｐ（プリン）部位リガンドは、以下の特徴：非競合的；行き止まり（dead-end）；ポスト遷移状態機構；アデニリルシクラーゼに対して特異的；の少なくとも１つを好ましくは有する機構によって阻害し、前記阻害剤は前記特徴の全てを有する機構によって作用することが好ましい。本発明によると、Ｐサイトアデニリルシクラーゼ阻害剤は、時計周期を延長する、すなわち時計機構を遅延させるために使用できる。有利には、Ｐサイト阻害剤は時計機能を完全に除去するのではなく、制御しながら時計機能を遅延させる。阻害剤はＰサイト阻害剤であることが好ましい。阻害剤はＧｓα結合部位阻害剤ではないことが好ましく、阻害剤はＧａＳ部位阻害剤（例えば、ＭＤＬ―ＭＤＬはフォルスコリン（forskolin）（これはＧｓアルファ部位に作用する）の作用に拮抗する）ではないことが好ましい。阻害剤は、Ｇｉ部位阻害剤（例えば、百日咳毒素―百日咳毒素（ＰＴＸ, Pertussis taxin）はＧｉ及びＧｏタンパク質を不可逆的にＡＤＰリボシル化し、それらを不活性化し、アデニリルシクラーゼ（ＡＣ, adenylyl cyclase）阻害が起こらないようにする。ＰＴＸ処理は振幅に影響を及ぼすが周期には影響を及ぼさない。）ではないことが好ましい。
【００４０】
Ｐサイト阻害剤及びその特性は、Dessauer et al (1999 TIPS vol 20 p 205)に概説されている。「Ｐサイトリガンド」は、ＡＣ触媒（プリン作動性）部位に結合する部分のことを指す。「Ｐサイト阻害剤」はこの結合特性を有し、酵素活性を阻害する。
【００４１】
Ｐサイト阻害剤の重要な特性は、ＡＴＰ（酵素基質）に対して競合的でないことである。非競合的／不競合的阻害剤は、酵素−基質又は酵素−生成物複合体の安定性を変えることによって反応速度に影響を及ぼす。ＡＣの場合、反応速度は２つの因子：１）環化反応速度及び２）ＰＰｉ（生成物の１つ―無機リン酸）の放出速度によって決定される。Ｐサイト阻害剤は、プリン作動性の疎水ポケットに結合し（環状ＡＭＰの解離後）、ポスト遷移状態酵素−生成物複合体の立体構造を安定化し、そのためにＰＰｉの放出を遅らせ（参照により本明細書中に組み込まれるDessauer et al同頁参照）、酵素−ＰＰｉ複合体の蓄積をもたらす。このように、Ｐサイト阻害剤は、ピロリン酸の存在下でアデニリルシクラーゼの活性部位に結合することにより行き止まり複合体（dead-end complex）を形成する。
【００４２】
Ｐサイト結合の測定は、簡単な酵素反応速度論であり、例えばDessauer and Gilman (1997 JBC vol 272 pp27787-95)にあるように、当技術分野の数多くのＰサイト阻害剤について行われている。
【００４３】
当業者であれば、このアッセイを実施することができ、成分がＡＣのＰサイトに結合するかどうかを推定できる。何らかの更なる手引きが必要な場合、１００μＭ未満の解離定数（Ｋｄ）が特異性を意味するはずである。しかしながら、阻害剤の場合明らかに、作業者の選択によってＫｉ、又はＩＣ５０又はＥＣ５０を評価することがより適切であり得る。いかなる場合でも、Ｐサイト阻害剤がＡＣと結合するという機構のために、Ｐｉ（無機リン酸）存在下でのみ結合の観察が予想されることに留意すべきである。
【００４４】
ＡＣ活性アッセイ及び従って阻害測定に関して、これは標準的な生化学的アッセイであり、当技術分野で周知の様々な方法で実施できる。何らかの手引きが必要な場合、Onda et al (参照により本明細書に組み込まれる、2001 JBC vol 276 pp47785-47793、特に第１節 R-col page 47786)に記載の通りにＡＣアッセイを実施することが好ましい。活性／阻害は、アデニリルシクラーゼ全体、又は精製した触媒ドメインなどの任意の適した部分に関して測定できる。阻害の測定は従って、当業者が行うことができる。何らかの更なる手引きが必要な場合、インビトロアッセイに関して、弱い阻害剤でも５ｍＭ未満のＩＣ５０を有するはずであると予想される。
【００４５】
リチウムは概日周期の増大を誘発することができる。しかしながら、リチウムのＡＣ阻害への関連は立証されておらず、疑わしい。実際は、リチウムは、グリコーゲンシンターゼキナーゼ、イノシトールモノホスファターゼ、イノシトールポリリン酸１−ホスファターゼ、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３、フルクトース１,６−ビスホスファターゼ、ビスリン酸ヌクレオチダーゼ及びホスホグルコムターゼ（全てＥＣ５０は２ｍＭ未満）に対して選択的な活性を有することが当技術分野で知られている。一方、リチウムのアデニリルシクラーゼに対する生理学的なＥＣ５０は約２０ｍＭであると報告されており（Goldberg et al, 1988, Am 3 Renal Physiol）、これはヒトにおいて有毒といってもいい濃度である。リチウムの生理学的意義のある役割に関する研究は、インビボ及びインビトロ両方において、ＡＣ／ｃＡＭＰに対するリチウムのいかなる作用も間接的であるようだという当技術分野の一般的な考えを支持する。更に、ＡＣに対して起こり得るリチウムの生理学的作用（インビトロ）は、触媒部位でＭｇ２＋イオンと競合することによって仲介されると主に考えられており、これは、（本発明の好ましい阻害剤ＴＨＦＡの場合、ＡＴＰと非競合的であるのとは対照的に）リチウムの阻害機構の一般的特徴である。結論として、リチウムは当分野においてＰサイト阻害剤として見なされず、又は実際にＡＣに特異的であるとは全く見なされず、そのためリチウムの作用機序はＭｇ２＋との競合によるものと考えられている。加えて、１０ｍＭのリチウムはインビトロでＳＣＮ周期の２〜３時間の増大を誘発するが、３Ｔ３線維芽細胞において概日周期に影響を及ぼさない。一方、ＴＨＦＡなどを用いる本発明による処理は、試験した全ての組織において周期を増大させる。更に、当技術分野において、リチウムの周期効果はＧＳＫ３ベータ（ＥＣ５０＝０．８ｍＭ）によって仲介されると広く考えられている。このように、リチウムはアデニリルシクラーゼのＰサイト阻害剤ではない。本発明のアデニリルシクラーゼ阻害剤は、リチウムではないことが好ましい。
【００４６】
本明細書に開示しているように、特定の種類のアデニリルシクラーゼ阻害剤はｃＡＭＰレベルの「完全な」ノックダウンをもたらす。これは、時計機能を消散させ得る、又は時計の完全なリセットをもたらし得るため、本発明の大部分の態様にとって望ましくない。本発明は、アデニリルシクラーゼ活性を完全に除去することなく、低減させることが好ましい。このように本発明は、有利には（時計機能の除去よりも）周期の延長に関する。「完全な」ノックダウンアデニリルシクラーゼ阻害剤の一例は、MDL-12330Aである。アデニリルシクラーゼの有益な減少をもたらす（が「完全な」ノックダウンはもたらさない）好ましい阻害剤の一例は、ＴＨＦＡである。言い換えれば本発明は、（ＭＤＬにより生じるような）「完全な」ノックダウンよりも、（ＴＨＦＡにより生じるような）低く安定した状態のアデニリルシクラーゼ活性をもたらすことが好ましい。
【００４７】
従って、広範な態様において、本発明は体内時計の調整におけるアデニリルシクラーゼ阻害剤の使用に関する。好ましくは、本発明は体内時計周期の延長におけるアデニリルシクラーゼ阻害剤の使用に関する。
【００４８】
アデニリルシクラーゼ阻害剤は、Ｇｓα部位阻害剤ではないことが好ましい。
【００４９】
アデニリルシクラーゼ阻害剤は、Ｐサイト阻害剤であることが好ましい。
【００５０】
アデニリルシクラーゼ阻害剤は、９−テトラヒドロフリルアデニン（「ＴＨＦＡ」又は「ＳＱ２２５３６」とも称する）、２’，５’−ジデオキシアデノシン、又は９−（シクロペンチル）アデニンであることが好ましい。
【００５１】
Ｐサイト阻害剤などのこのような阻害剤は、例えば、Sigma-Aldrich（２’，５’−ｄｄ−Ａｄｏ（２’，５’−ジデオキシアデノシン、カタログ番号Ｄ７４０８）；９−ＴＨＦ−Ａｄｅ（９−（テトラヒドロフリル）−アデニン、ＳＱ２２５３６、カタログ番号Ｓ−１５３）；９−ＣＰ−Ａｄｅ（９−（シクロペンチル）アデニン、カタログ番号Ｃ４４７９）から市販されている。
【００５２】
阻害剤は、膜透過性であることが好ましい。好ましい膜透過性のＰサイト阻害剤は、９−（テトラヒドロフリル）−アデニン（ＳＱ２２５３６又はＴＨＦＡ）、２’，５’−ジデオキシアデノシン、及び９−（シクロペンチル）−アデニンである。３種類全てが、少なくとも１２５ｍＭまで水に溶けるという利点を有する。阻害剤は、９−（テトラヒドロフリル）−アデニン（ＳＱ２２５３６又はＴＨＦＡ）又は２’，５’−ジデオキシアデノシンであることが好ましい。阻害剤は、９−（テトラヒドロフリル）−アデニン（ＳＱ２２５３６又はＴＨＦＡ）であることが好ましい。
【００５３】
Ｐサイト阻害剤のうち、ＴＨＦＡが最も好ましい。ＴＨＦＡは、非常に水に溶けやすいという利点を有する。残りの阻害剤は溶解性が低い（２’，５’−ジデオキシアデノシンに関するいくつかの実施形態では、希釈前にＤＭＳＯストックを調製することが好ましい）。
【００５４】
９−（シクロペンチル）アデニンは、ＴＨＦＡよりも代謝及び化学安定性が高く、水溶性でもあるという利点を有する。しかしながら、ＴＨＦＡよりも効力が弱い可能性があり、従って投薬は、本明細書中で教示されるように対応して適合させる必要があり得る。
【００５５】
アデニリルシクラーゼに関して、これは多くのファミリーメンバーを有する酵素である。異なるイソ型アデニリルシクラーゼは、異なる発現パターンを有する。理論に束縛されるつもりはないが、提案されている機構は、ＡＣの回転率が全ての組織において減少し、時計の、すなわち処理されている生体全体にわたって、全体的な遅延をもたらすというものである。異なる組織発現パターンを有する異なるイソ型の存在を考慮すると、より広範に発現されるイソ型ＡＣは、組織発現が制限されているものと比較して優れた標的である可能性がある。特定のイソ型アデニルシクラーゼは、より顕著な概日機能を有する場合さえあり得る。それにも関わらず、有利には、イソ型アデニリルシクラーゼ全てに活性を有するアデニリルシクラーゼ阻害剤が使用され、それによりイソ型特異的阻害剤カクテルを使用する必要性を軽減する。阻害剤は、Ｐサイト阻害剤、好ましくはＴＨＦＡであることが好ましい。
【００５６】
ＪＮＫ阻害剤
ｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）は、重要なマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰキナーゼ）ファミリーメンバーである。ＪＮＫはときに、ストレス活性化プロテインキナーゼ（ＳＡＰＫ, stress-activated protein kinase）と称される。
【００５７】
特筆すべきことに、本明細書で開示したｃＡＭＰの概日活動はプロテインキナーゼＡ非依存的であるが、グアニンヌクレオチド交換因子のＥｐａｃファミリーに依存的であり、ＪｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）を介してシグナル伝達して概日遺伝子発現を活性化する。ＡＣ及びＪＮＫ活性の同時阻害などの組合せ阻害は、ＳＣＮスライス及び線維芽細胞の両方において概日周期のこれまでにない延長を引き起こす。
【００５８】
従って本発明は、本明細書に開示した治療と、ＪＮＫ阻害剤の投与などによるＪＮＫ阻害との組み合わせに関する。
【００５９】
有利な相乗効果（すなわち時計周期の延長強化）は、ＪＮＫ阻害剤とアデニリルシクラーゼ阻害剤との組合せによって得られる。
【００６０】
適したＪＮＫ阻害剤は、ＪＩＰ−１；ジクマロール；ＪＮＫ阻害剤Ｉ（Ｌ型）（例えば１μＭ）；ＪＮＫ阻害剤II（ＳＰ６００１２５）（例えば４０〜９０ｎＭ）；ＪＮＫ阻害剤III；ＪＮＫ阻害剤Ｖ（例えば７０〜２２０ｎＭ）；ＮＰＰＢ（５−ニトロ−２−（３−フェニルプロピルアミノ）安息香酸）；ＤＭＡＰ（Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン；６−ジメチルアデノプリン）を含む。これらは、別途指示のない限り製造業者の使用説明書に従って使用することが好ましく、例えばCalbiochem／Merck biosciencesから市販されている。
【００６１】
好ましいＪｎｋキナーゼ阻害剤は、ＳＰ６００１２５（アントラ［１，９−ｃｄ］ピラゾール−６（２Ｈ）−オン；１，９−ピラゾールアントロン；ＳＡＰＫ阻害剤II）である。好ましい濃度は３０〜５０μＭである。
【００６２】
更なるＪＮＫ阻害剤は以下を含む。
AEgeraのＡＥＧ−３３７８３。ＡＥＧ−３３７８３は、小分子のニューロトロフィン模倣薬である。適した用量は１０ｍｇ／ｋｇ／日である。ＡＥＧ−３３７８３は、経口で又は静脈内に適切に投与される。
CelgeneのＪＮＫ４０１。ＪＮＫ−４０１は５０ｍｇ／ｋｇで適切に投与される。
CephalonのＣＥＰ−１１００４。適した用量は１〜１０ｍｇ／ｋｇである。
CephalonのＣＥＰ−１３４７。適した用量は１ｍｇ／ｋｇの２４時間皮下治療である。
Cytokine PharmaSciencesのセマピモド（Semapimod）。適した用量は、消化管経由で８又は２５ｍｇ／ｍ（２）である。
XigenのＡＭ−１１１。適した用量は、２５０μｌのゲル処方中に０．４ｍｇ／ｍｌ又は２ｍｇ／ｍｌのＡＭ−１１１である。これは、他の用途では、聴力欠損した耳への経鼓室注入によって投与されている。
XigenのＸＧ−１０２。適した投与は、Vehicle（ＰＢＳ、２μｌ）又はＤ−ＪＮＫＩ−１溶液（Alexisから市販されているＤ−ＪＮＫＩ−１；ＪＮＫＩ−１ペプチド１５．７ｎｇ含有）の注入である。
EisaiのＥＲ−１８１３０４。適した用量は１００ｍｇ／ｋｇを経口で１日２回である。
Merck KGaAのＡＳ−６０２８０１。適した用量は３０ｍｇ／ｋｇを１日１回である。１２日間繰り返すことができる。
【００６３】
他に考えられるＪＮＫ阻害剤は、Merck KGaAのＪＮＫ阻害剤；PhytomedicsのＰＭＩ−００２；CeptyrのＪＳＰ１阻害剤；Incyte CorpのＭＸ６；XigenのＸＧ−１０１；CelgeneのＣＣ−９３０；CelgeneのＪＮＫ９３０；CelgeneのＪＮＫ９３５９；又は（任意の適した供給源の）Ｄｚ−１３若しくはAEterna Zentaris／Keryx Biopharmaceuticalsのペリホシン（Perifosine（Ｄ−２１２６６）は、アルキルホスホコリンのリン脂質誘導体である）を含んでもよく、適した用量は経口で１日に１００ｍｇである。
【００６４】
適用
本発明は家族性睡眠相前進症候群（ＦＡＳＰＳ）に適用される。ＦＡＳＰＳに罹患している対象は、典型的に２１〜２２時間のリズムを示す。本発明によると、この状態は、対象の生物時計を２４時間リズムに遅延させるためにアデニリルシクラーゼ阻害剤を投与することによって治療される。対象の通常の概日周期に約２時間の後退をもたらすための最低用量を提供するために、与えられる投薬量は漸増させることが好ましい。
【００６５】
本発明は時差症候群の治療に適用される。通常は、体は１サイクルにつき約１時間を適合させることができる。そのため、対象が約５時間の時差により時差ボケになると、その概日リズムが、対象が置かれた新しい時間帯に正しく適合するのに約５日間かかるであろうと予想される。本発明によると、時差症候群に罹患している対象は、アデニリルシクラーゼ阻害剤の投与によって治療できる。阻害剤の用量は、概日リズムに必要な後退の長さに応じて、作業者によって適合されるはずである。例えば、ロンドンからニューヨークまでの飛行の後に時差症候群に罹患した対象は、通常、サイクルを約５時間適合させる必要があるはずである。従って、用量は、約２９時間サイクルを提供するように適合させるべきである。この２９時間サイクルに好ましい用量は、最終血清濃度で０．５〜１ｍＭのＴＨＦＡである（ＴＨＦＡの停留に応じて、成人に対して１００ｍｇ／ｋｇの摂取が必要な場合がある）。飛行している概日サイクル中に治療を提供することが好ましい。より大きな調整をする場合、用量は２つの連続したサイクル中に提供してもよい。例えば、ロンドンからロサンゼルスまで飛行する対象の場合、時差は６．５時間（単回用量によりもたらされるおよそ最大の調整）を超え、そのためこのような対象は２つの連続したサイクルにおける用量を必要とするはずである。最初の用量は飛行しているサイクル中に与えることが好ましい。
【００６６】
本発明は、西向きの飛行に適用することが好ましい。これは、本発明は、概日リズムの後退又は延長、すなわち西向きの時差症候群で見られる効果である１日の延長において使用されることが好ましいためである。
【００６７】
本発明は、東向きの時差症候群に適用できる。本実施形態において、時計を前進させる必要性を考慮して用量を適合させるべきである。本発明によると、このような前進は、正味の効果をサイクルの前進と等しくできるように、概日サイクルの複数の遅延（複数の延長）として治療されるべきである。例えば、対象が東向きに飛行して昼／夜サイクルの１２時間のずれを経験する場合には、好ましくは、２回分の用量のアデニリルシクラーゼ阻害剤を２つの連続したサイクル中に与えるはずであり、２サイクルのうちのそれぞれにおいて約６時間のずれをもたらし、合計で１２時間のずれとなり、それにより対象の概日リズムを現地時間に同調させる。この例において理解されるように、対象の体内時計を前進させるのではなく、同じ効果をもたらす、すなわち時計を新しい現地時間に同調させるために遅らせている。この原理は、対象の時計を「前進させる」ために本発明を行う場合に適用されるべきである。特に、ＪＮＫ阻害剤とともに投与されるアデニリルシクラーゼ阻害剤などの組み合わせ治療は、東向きの時差症候群への適用に特に適している。これは、このような組み合わせを使用して周期を相乗的に更に延長することにより、上記で説明した時計の前進と同等とみなせる効果をもたらすことができるためである。例えば、アデニリルシクラーゼ阻害剤とＪＮＫ阻害剤の二重治療を行うことにより周期を約３６時間まで延長することができ、これは１２時間の前進に匹敵する効果を有するはずであり、従って有利なことに、そうでなければ同じ適合度をもたらすために必要であろう（例えば複数の小さい遅延による）単回治療（及びサイクル）の回数を減少させる。
【００６８】
本発明は、シフトワーカーの治療に適用できる。例えば、勤務者が連続夜勤を始める場合、最初の夜勤前のアデニリルシクラーゼ阻害剤の投与によって勤務者の時計を適合させることができる。これは、勤務時間の終了間際まで勤務者の代謝、睡眠、及び他のサイクルを後退させられるように勤務者の概日サイクルを延長するはずである。こうしたシフトが約６．５時間（単一サイクル中で可能なおよそ最大の変化）を超える場合には、リズムに必要な変化をもたらすのに適切なように、用量を２つ以上の連続したサイクルに配分することができる。或いは、シフトワーカーは勤務時間パターンが変わる前に、時計を適合させるために必要に応じて用量を摂取してもよい。
【００６９】
組合せ
リチウム治療は概日周期を延長することが示されている。リチウム治療は通常、周期を器官型スライスにおいて約２６時間まで、及び丸ごとの動物において約２５時間まで延長する。理論に束縛されるつもりはないが、リチウムを使用する時計の適合は、アデニリルシクラーゼ阻害剤を使用する時計の適合とは異なる機構を介して働くと考えられている。従って一実施形態において、リチウム治療は、有利には、アデニリルシクラーゼ阻害剤を使用する治療と組み合わせて付加的な効果をもたらすことができ、この効果は有利には、特定の調整を達成するために必要な投与回数を減少させることができる。
【００７０】
リチウムは、１０ｍＭで、好ましくは３ｍＭで、好ましくは０．８〜１．２ｍＭの最終血清濃度などのヒトにおけるリチウムの臨床用途のために確立された用量で使用することが好ましい。
【００７１】
メラトニンは、概日リズムの適合のために先行技術において使用されてきた。メラトニンは通常、概日リズムに急激な位相シフトをもたらす。従って一実施形態において、本発明はアデニリルシクラーゼ阻害剤と一緒にメラトニンを投与することに関する。この方法において有利には、所望の適合を達成するために、リズムの位相シフト及び後退が組み合わされてもよい。
【００７２】
メラトニンは、好ましくは製造業者の推奨用量で使用する。メラトニンは、平均的成人に対して約０．５〜５ｍｇ／日（すなわちサイクル毎）の用量で使用することが好ましい。
【００７３】
ＪｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）阻害剤は、概日リズム周期を延長するために使用できる。実際に、ＪＮＫ阻害剤が本発明によるアデニリルシクラーゼ阻害剤と相乗的に作用することができ、概日リズム周期の更なる延長強化をもたらすことが本明細書において初めて開示されている。これは、東向きの時差症候群などの適用において特に有用である。
【００７４】
別の実施形態において本発明は、任意の１回の概日リズムにおいて可能な調整度を有利に最大化する、リチウム、メラトニン及びアデニリルシクラーゼ阻害剤の３つの組み合わせに関する。
【００７５】
投与
原則として、概日サイクルに対する複数の小さい調整は１回の大きい調整より好ましい。複数の小さい調整を行う利点は、特定の所定サイクルにおいて１回の大きい調整を行うことによる患者への影響を軽減することである。従って、６時間の調整が必要な場合には、好ましくは、２つの連続したサイクル中に３時間の治療が２回提供されるはずである。
【００７６】
１回のサイクルは、２〜１２時間、好ましくは２〜１０時間、好ましくは２〜８時間、好ましくは２〜６時間、好ましくは２〜４時間、好ましくは１サイクルにつき３時間、好ましくは１サイクルにつき２時間調整されることが好ましい。
【００７７】
一般に、小さい周期変化に対しては少ない用量を使用し、逆もまた同様である。
【００７８】
最大のシフトはＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞において観察される。ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞は約２１時間の概日周期を有する。１．２ｍＭのＴＨＦＡによって約３０時間までシフトする。従って、この状態において推定される最大の周期増大は約９時間である。視交叉上核（親時計として）は、より長い２４時間の内因性の周期を有するので、同様の条件下で約６時間シフトする。
【００７９】
投与は経口投与であることが好ましい。
【００８０】
投与量
通常、医師は、個々の対象に最も適する実際の投薬量を決定するはずである。任意の特定の患者に対する具体的な投与量及び頻度は異なる場合があり、採用された特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性及び作用期間、年齢、体重、全身状態、性別、食事、投与方法及び時間、排出速度、薬剤の組み合わせ、特定の状態の重症度、並びに個々の受けている療法を含む、様々な要因によって決まるはずである。
【００８１】
ＴＨＦＡは、経口で、好ましくは水溶液で投与することが好ましい。マウスに対して、投与濃度は４ｍＭ水溶液である。
【００８２】
或いは、ＴＨＦＡは錠剤形態で投与してもよく、好ましくは錠剤形態はヒトに対して使用する。
【００８３】
いかなる投薬計画もそうであるように、処置する人は、代謝／排出される速度のバランスを維持しながら、ＴＨＦＡの慢性摂取のための適切な用量の選択に注意を払わなければならない。更に、薬剤に対する応答／薬剤の有効性への任意の効果を考慮する（概日に関しては、必要に応じて位相反応曲線に注意を払うべきである）にあたって、（例えば、急性治療の場合もそうであるように）どの時刻に薬剤を投与するかに注意を払わなければならない。
【００８４】
必要に応じて、作用物質は、０．０１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１〜１ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与することができる。
【００８５】
ＳＱ２２５３６（ＴＨＦＡ）に関して、通常用量は成人に対して５０ｍｇ／ｋｇである。
【００８６】
２’，５’−ジデオキシアデノシンに関して、通常用量は成人に対して６０ｍｇ／ｋｇである。
【００８７】
９−（シクロペンチル）アデニンに関して、通常用量は成人に対して７５ｍｇ／ｋｇである。
【００８８】
用量は、有利には１回のサイクル中に生じるリズムの大きな変化の影響を低減するために、２回以上の別個のサイクルにおいて投与するために２つ以上の投与に好ましくは分割してもよい。
【００８９】
所定のサイクル範囲内の場合、用量は単回投与で投与することが好ましい。
【００９０】
用量は、経口で又は注入によって、好ましくは経口で投与することが好ましい。
【００９１】
所定のサイクルに所望される時間後退に応じて、アデニリルシクラーゼ阻害剤の用量は相応に異なる。例えば、（約６．５〜９時間、好ましくは丸ごとの動物に関して６．５時間の）最大の後退を達成するために、約１００ｍｇ／ｋｇのＴＨＦＡの用量が平均的成人男性に投与されるはずである。約３時間の後退を達成するために、用量は約３０ｍｇ／ｋｇとなるはずである。
【００９２】
０．３％リチウムによる治療は、周期を約２％延長する。
【００９３】
２５％Ｄ２Ｏによる治療は、周期を約５％増大させる。
【００９４】
医薬組成物
本発明は、アデニリルシクラーゼ阻害剤を含む組成物及びこれらの組成物の使用に関する。いくつかの実施形態において、本発明はアデニリルシクラーゼ阻害剤自体の使用に関する。
【００９５】
本発明はまた、治療的に有効な量の本発明のアデニリルシクラーゼ阻害剤及び薬学的に許容される基剤、希釈剤又は賦形剤（これらの組み合わせを含む）を含む医薬組成物も提供する。
【００９６】
医薬組成物は、人間医学及び獣医学におけるヒト又は動物の使用目的であってよく、通常、任意の１種又は複数種の薬学的に許容される希釈剤、基剤、又は賦形剤を含むはずである。治療目的の使用に許容される基剤又は希釈剤は医薬分野において周知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985) に記載されている。医薬基剤、賦形剤又は希釈剤の選択は、予定された投与経路及び標準的な医薬の実務に関して選択することができる。医薬組成物は、基剤、賦形剤又は希釈剤として、又はそれに加えて、任意の適した結合剤、滑剤、懸濁化剤、コーティング剤、可溶化剤を含むことができる。
【００９７】
防腐剤、安定剤、色素及び更には香味剤も、医薬組成物中に提供されてよい。防腐剤の例は、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸及びｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルを含む。抗酸化剤及び懸濁化剤もまた使用してもよい。
【００９８】
異なる送達系に応じて異なる配合／処方が必要な可能性がある。一例として、本発明の医薬組成物はミニポンプを使用して又は粘膜経路によって、例えば、吸入用の鼻腔スプレー若しくはエアゾール又は摂取可能な溶液として、或いは、例えば静脈内、筋肉内又は皮下経路による送達用に、組成物を注入可能な形態で処方して非経口的に投与するために処方できる。或いは、処方を多数の経路によって投与するために設計できる。
【００９９】
作用物質が胃腸粘膜を通して経粘膜投与される場合、胃腸管を通過する間、安定なままで存在できるべきであり、例えば、タンパク質分解に耐性であり、酸性ｐＨにおいて安定であり、胆汁の洗浄作用に耐性であるべきである。
【０１００】
適切な場合、医薬組成物は吸入によって、坐剤又は膣坐剤の形態で、ローション、溶液、クリーム、軟膏又は散布剤の形態で経皮パッチの使用によって局所的に、デンプン又はラクトースなどの賦形剤を含有する錠剤の形態で、又は単独の又は賦形剤と混合したカプセル又はオブレ（ovule）で、又は香味剤又は着色剤を含有するエリキシル剤、溶液又は懸濁液の形態で経口的に投与でき、或いは非経口的に、例えば静脈内に、筋肉内に、又は皮下に注入できる。非経口投与では、組成物は、例えば溶液を血液と等張にするために十分な塩又は単糖などの他の物質を含有できる無菌水溶液の形態で使用されるのが最適である。口腔内又は舌下投与では、組成物は、従来の方式で処方可能な錠剤又はトローチ剤の形態で投与できる。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、本発明の作用物質及び／又は増殖因子はまた、シクロデキストリンと組み合わせて使用してもよい。シクロデキストリンは、薬剤分子と包接及び非包接複合体を形成することが知られている。薬剤−シクロデキストリン複合体の形成は、薬剤分子の溶解度、溶解速度、バイオアベイラビリティ及び／又は安定性特性を変更し得る。薬剤−シクロデキストリン複合体は一般に、大部分の剤形及び投与経路に有用である。薬剤との直接的な複合体形成の代替として、シクロデキストリンは、例えば基剤、希釈剤又は可溶化剤などの補助的な添加剤として使用してもよい。アルファ−、ベータ−及びガンマ−シクロデキストリンは最も一般に使用され、適した例は、国際公開第９1／１１１７２号パンフレット、国際公開第９４／０２５１８号パンフレット及び国際公開第９８／５５１４８号パンフレットに記載されている。
【０１０２】
アデニリルシクラーゼ阻害剤がタンパク質である場合には、前記タンパク質は治療を受けている対象においてインサイチュで調製できる。因みに、前記タンパク質をコードする塩基配列は、非ウイルス技術（例えばリポソームの使用によって）及び／又はウイルス技術（例えばレトロウイルスベクターの使用によって）の使用によって、前記タンパク質が前記塩基配列から発現されるように送達できる。
【０１０３】
好ましい実施形態において、本発明の薬剤は経口投与することができる。従って、前記薬剤は経口送達に適した形態であることが好ましい。
【０１０４】
投与技術
「投与された」という用語は、ウイルス又は非ウイルス技術による送達を含む。ウイルス送達機構は、限定するものではないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、及びバキュロウイルスベクターを含む。非ウイルス送達機構は、脂質を使用したトランスフェクション、リポソーム、免疫リポソーム、リポフェクチン、カチオン表面両親媒性物質（ＣＦＡ）及びこれらの組み合わせを含む。
【０１０５】
本発明の成分は単独で投与してもよいが、一般には、例えば、成分が、予定された投与経路及び標準的な医薬の実務に関して選択される適切な医薬賦形剤、希釈剤又は基剤との混合物である場合、医薬組成物として投与されるはずである。
【０１０６】
例えば、成分は、即時放出、遅延放出、放出調節、持続放出、パルス放出又は放出制御の適用のために香味剤又は着色剤を含有してもよい錠剤、カプセル、オブレ、エリキシル剤、溶液又は懸濁液の形態で、（例えば経口的又は局所的に）投与できる。
【０１０７】
製薬が錠剤である場合には、錠剤は、微結晶セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウム、及びグリシンなどの賦形剤、デンプン（好ましくはトウモロコシ、ジャガイモ又はタピオカデンプン）、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム及び特定の複合ケイ酸塩などの崩壊剤、及びポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ, hydroxypropylmethylcellulose）、ヒドロキシプロピルセルロール（ＨＰＣ, hydroxypropylcellulose）、ショ糖、ゼラチン及びアラビアゴムなどの造粒結合剤を含有してもよい。加えて、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル及びタルクなどの滑剤を含んでもよい。
【０１０８】
同様の種類の固体組成物もまた、ゼラチンカプセルの充填剤として採用できる。これに関して好ましい賦形剤は、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖、又は高分子量ポリエチレングリコールを含む。水性懸濁液及び／又はエリキシル剤では、作用物質は、様々な甘味剤若しくは香味剤、着色物質又は色素と、乳化剤及び／又は懸濁化剤と、並びに水、エタノール、プロピレングリコール及びグリシンなどの希釈剤及びこれらの組み合わせと混合してもよい。
【０１０９】
投与（送達）経路は、限定するつもりはないが、経口（例えば、錠剤、カプセルとして、又は摂取可能な溶液として）、局所、粘膜（例えば、吸入用の鼻腔スプレー又はエアゾールとして）、鼻、非経口（例えば注入可能な形態によって）、胃腸、髄腔内、腹腔内、筋肉内、静脈内、子宮内、眼内、皮内、頭蓋内、気管内、膣内、脳室内、大脳内、皮下、眼（硝子体内又は眼房内を含む）、経皮、直腸、口腔、膣、硬膜外、舌下のうちの１つ又は複数を含む。
【０１１０】
薬剤の全成分を同じ経路によって投与する必要があるわけではないことを理解されたい。同様に、組成物が２種類以上の活性成分を含む場合には、それらの成分は異なる経路によって投与してもよい。
【０１１１】
本発明の成分が非経口投与される場合、そのような投与の例は、成分の静脈内、動脈内、腹腔内、莢膜内、心室内、尿道内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内又は皮下投与、及び／又は点滴技術による投与のうちの１つ又は複数を含む。
【０１１２】
非経口投与のために、成分は、例えば溶液を血液と等張にするために十分な塩又はグルコースなどの他の物質を含有できる無菌水溶液の形態で使用するのが最適である。必要であれば、水溶液は適当に緩衝化するべきである（好ましくはｐＨ３〜９に）。無菌条件下において適した非経口処方の調製は、当業者に周知の標準的な医薬技術によって容易に達成できる。
【０１１３】
示したように、本発明の成分は、鼻腔内に又は吸入によって投与でき、好都合には、乾燥粉末吸入器又は加圧容器、ポンプ、スプレー又は噴霧器からのエアゾールスプレー形の形態で、適した噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、ヒドロフルオロアルカン、例えば１，１，１,２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ  １３４Ａ（商標））若しくは１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ  ２２７ＥＡ（商標））など、二酸化炭素又は他の適したガスを使用して、送達される。加圧エアゾールの場合、投薬単位は計量された量を送達するためのバルブを備えることにより決定できる。加圧容器、ポンプ、スプレー又は噴霧器は、例えば、更に例えばソルビタントリオレエートなどの滑剤を含んでもよい、エタノールと溶媒としての噴射剤との混合物を使用して、活性化合物の溶液又は懸濁液を含有してもよい。吸入器又は散布器で使用するカプセル及びカートリッジ（例えばゼラチン製）は、作用物質とラクトース又はデンプンなどの適した粉末基剤との粉末混合物を含有するように処方してもよい。
【０１１４】
或いは、本発明の成分は、坐剤又は膣坐剤の形態で投与でき、又はゲル、ヒドロゲル、ローション、溶液、クリーム、軟膏又は散布剤の形態で局所的に適用してもよい。本発明の成分はまた、例えば経皮パッチを使用して、皮膚投与又は経皮投与してもよい。また、肺又は直腸経路によって投与してもよい。また、眼経路により投与してもよい。眼への使用では、化合物は、等張の、ｐＨ調整された無菌生理食塩水中の微粉化懸濁液として、又は好ましくは、等張の、ｐＨ調整された無菌生理食塩水中の溶液として、塩化ベンジルアルコニウムなどの防腐剤と任意選択で組み合わせて処方できる。或いは、ワセリンなどの軟膏として処方してもよい。
【０１１５】
皮膚への局所適用のために、本発明の成分は、例えば、鉱油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ろう及び水のうちの１つ又は複数との混合物中に懸濁又は溶解した活性化合物を含有する、適切な軟膏として処方できる。或いは、例えば、鉱油、ソルビタンモノステアレート、ポリエチレングリコール、流動パラフィン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール及び水のうちの１つ又は複数との混合物中に懸濁又は溶解した、適切なローション又はクリームとして処方できる。
【０１１６】
医薬の組合せ
本発明の作用物質は、１種又は複数種の他の薬学的に活性な物質と一緒に投与してもよい。一例として、本発明は、本発明のアデニリルシクラーゼ阻害剤及び１種又は複数種のステロイド、鎮痛剤、抗ウイルス剤又はリチウム及び／若しくはメラトニンなどの他の薬学的に活性な物質を用いる同時又は逐次治療を包含する。
【０１１７】
特に、本発明は、本発明によるアデニリルシクラーゼ阻害剤及び１種又は複数種のＪＮＫ阻害剤を用いる同時又は逐次治療に関する。
【０１１８】
こうした投薬計画は、物質を逐次的に、同時に、又は一緒に投与することを含むと理解されるはずである。
【０１１９】
療法は、本明細書中に記載された障害、又は関連する病状の１つ又は複数の治療を含むことができる。
【０１２０】
体内時計
概日リズムは追跡可能であり、強固である。概日リズムは、血中コルチゾル濃度、体温、睡眠パターン、及び他の生物学的に重要な特性などの、行動、生理機能及び代謝を制御することが知られている。概日リズムは、典型的に２３．５〜２４．５時間の範囲内であること観察されている。リズムは、全ての生物レベル、組織レベルで、及び細胞レベルにおいても明白である。
【０１２１】
体内時計（「生物時計」と称することもある）の振動は、２つの基本特性を有する。１つめは周期である。これは、サイクル毎に測定したピークとピーク（又は谷と谷）の間の時間である。言い換えると、これは時計の１回の完全な「回転」にかかる時間である。健常者において、周期は通常２４時間である。振動の２つめの特徴は、振幅である。振幅は、時計サイクルのピーク及び谷の最大範囲又は最大値のことを指す。振幅及び周期は、時計振動の別個の特徴である。本発明は主に、概日リズム／時計の調整に、すなわちリズム／時計の周期の調整に関係している。リズム／時計の周期の延長は、便宜上、単にリズム／時計の拡張と称することがある。
【０１２２】
体内時計は、当初は、視交叉上核（ＳＣＮ, suprachiasmatic nucleus）に全て存在すると考えられていた。ＳＣＮの除去によって、動物は不規則になった。しかしながら最近になって、末梢組織は、通常あまり強固でなく、振幅が小さく、ＳＣＮの統括的な制御下にあるが、それ自体の内因性振動子を示すことが観察された。更に、遺伝子発現の概日リズムは、ほとんどの種類の細胞においてゲノムの最大で１０％までが影響を受けていることが認められた。これらの現象はまた、同調性を獲得するためにＳＣＮの直接的又は間接的制御下にあるとも考えられている。
【０１２３】
一般に認められた概日リズム作用の遺伝モデルを以下に概説する。簡潔に言えば、転写複合体（clock及びbmal1などの因子を含む）の活性化により、概日リズムの昼の早い時間帯にPer1／2／3、Cry1／2などの阻害タンパク質の転写を促進する。これらの阻害タンパク質はその後、数時間を要した後に核内に安定して移行し得る。これは、（ＧＳＫ−３などのキナーゼによる）これらのタンパク質の細胞質内でのリン酸化は、ユビキチンに仲介される負のフィードバックループ時計因子の分解を促進するという観察結果により一部説明される。しかしながら、阻害タンパク質はまた、最終的に阻害複合体を核移行させる他のキナーゼとの複合体形成／該キナーゼによるリン酸化によって安定化され、自身の転写を抑制できる可能性もあるようでもある。これらの複合体が分解されてしまい、サイクルが再び開始できるまでに、ほぼ正確に２４時間が経過している。この転写／翻訳フィードバックループは、更なる標的、いわゆる「output clock遺伝子」を有し、実際、多数の遺伝子が転写又は翻訳プロファイルに概日パターンを有する。全ての生物は、内部時計を外部刺激によって毎日リセットする必要がある。位相変化を伝えるためのシグナル伝達機構の１つは、ｃＡＭＰなどのセカンドメッセンジャー及び／又はカルシウムによる場合がある。１つの推定エフェクターは、いくつかの概日遺伝子プロモーター中に活性化可能なＣＲＥが存在することである。興味深いことには、時計遺伝子のうち、周期性を完全に欠損した変異体のみがＰＥＲ２及びＢＭＡＬ１の変異である。そのため、ＰＥＲ２及びＢＭＡＬ１は現在、このモデルにおいて時計の必須成分であると見なされている。
【０１２４】
更に、シアノバクテリアの研究により、組換え概日タンパク質は、転写の起こらないインビトロにおいて自己リン酸化の概日サイクルを安定に維持できることが示されており、先行技術の見解に更なる複雑さと混乱を与えている。
【０１２５】
セカンドメッセンジャー
ＳＣＮにおけるＣＡ２＋濃度は、発火率の増加より先に上昇する。ＣＲＥ結合タンパク質（ＣＲＥＢ, CRE binding-protein）のリン酸化は、光パルスの後に起こる。活性な環状ＡＭＰ／Ｃａ２＋レスポンスエレメント（ＣＲＥ, Ca2+Response Elements）は、いくつかの「時計遺伝子」プロモーター（例えば、Per1／Per2／Dec1）において見られる。ＣＡ２＋のキレート化は、リズムを急速に抑制する。ニューロン間の情報伝達はＳＣＮの機能に必須である。ｃＡＭＰ濃度において二相性の日内変動が観察されることがある。いくつかのイソ型アデニリルシクラーゼの概日発現が認められることもある。
【０１２６】
ｃＡＭＰ
ｃＡＭＰシグナル伝達は新たな段階の概日制御を構成することを、本明細書において初めて開示する。
【０１２７】
環状ヌクレオチドは、多種類のホルモン及び神経伝達物質受容体の活性化により開始される細胞内事象のセカンドメッセンジャーとして広く研究されてきた。ＡＴＰの環状３’,５’−アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ, cyclic 3', 5'-adenosine monophosphate）への変換を刺激する受容体は、Ｇタンパク質と会合している。ホルモン又は神経伝達物質の膜結合受容体への結合は、受容体の立体構造変化を引き起こし、これがＧタンパク質のα−サブユニットを活性化させる。活性化されたＧｓサブユニットは、アデニリルシクラーゼ（ＡＣ）、更に、細胞内カルシウム及び／又はプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ, protein kinase C）によって更に制御されることが知られているいくつかのイソ型ＡＣを刺激する一方、Ｇｉサブユニットは阻害する。ＡＣの刺激は、細胞質のＡＴＰのｃＡＭＰへの変換を触媒する。ｃＡＭＰは、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ、及びプロテインキナーゼＡ（ＰＫ, protein kinase A）を含む他のエフェクターを活性化する。細胞内酵素のリン酸化（活性化又は非活性化）を触媒することによって、ｃＡＭＰ依存性キナーゼは多様な代謝及び機能プロセスを誘発する。ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ, phosphodiesterase）がｃＡＭＰのアデノシン−５’−一リン酸（５’−ＡＭＰ, adenosine-5'-monophosphate）への加水分解を触媒する経路において、負の制御が起こることがある。ホスホジエステラーゼのいくつかのファミリー（ＰＤＥ  Ｉ〜VI）は、ｃＡＭＰのアデノシン−５’−一リン酸（５’−ＡＭＰ）への分解を触媒することによって、制御スイッチとして作用する。ＰＤＥ  IIは、ｃＡＭＰとｃＧＭＰの両方を切断できる低親和性のＰＤＥである。ＰＤＥ  IIの活性は、ｃＧＭＰによって刺激される。ＰＤＥ  IIIは、ｃＧＭＰによって阻害され、平滑筋及び心収縮の制御に関与する低親和性のＰＤＥである。ＰＤＥ  IVは、ｃＡＭＰに対して高度に選択的であり、ほとんどの細胞種に存在する高親和性のＰＤＥである。
【０１２８】
我々は、ｃＡＭＰシグナル伝達経路が哺乳類の体内時計機構の核心を構成することを初めて開示する。第一に、ｃＡＭＰシグナル伝達経路は視交叉上核（ＳＣＮ）の概日ペースメーカーにおいて組織及び細胞の周期性を維持する。第二に、ｃＡＭＰシグナル伝達経路はＳＣＮニューロン間で細胞間の同調を仲介する。第三に、ｃＡＭＰシグナル伝達経路はインビトロとインビボの両方において概日ペースメーキングの内因性周期を決定する。我々は、アデニリルシクラーゼ（ＡＣ）の薬理学的阻害によってＳＣＮにおける周期を劇的に延長することを実証する。概日時間管理におけるこうしたｃＡＭＰシグナル伝達の役割は幅広く、また哺乳類の末梢組織及び細胞系において明らかである。本発明によると、ｃＡＭＰシグナル伝達を毎日活性化することにより、転写サイクルの進行を持続すると考えられる。これらの発見は、先に発表された転写フィードバックモデルとは質的に異なる、哺乳類における概日制御の新たな思いがけない点を明らかにする。我々は、概日機能障害のための新たな治療標的を開示する。
【０１２９】
概日性のアデニリルシクラーゼ活性化は、２４時間周期をセットするために必須であることが初めて開示される。アデニリルシクラーゼ阻害は、３０又は３１時間もの、又は更にそれ以上のこれまでにない周期延長をもたらす。
【０１３０】
当技術分野での概日リズム作用に関する見解では、ｃＡＭＰなどのセカンドメッセンジャーによる遺伝子発現／タンパク質フィードバック系は、単なるエフェクターにすぎない。しかしながら、驚くべきことに、実際はｃＡＭＰは体内時計の必須要素であり、周期を支配していることが本明細書で開示される。この驚くべき発見によって、本発明は、時計周期を調整するためのｃＡＭＰ量の調整に基づいて可能となった。
【０１３１】
候補となる実体が時計機構の構造部であるかどうかの確定試験は、異なる条件下で前記実体の周期（すなわち時計サイクルの長さ）を評価することである。アウトプット又はエフェクター機能を評価するだけでは厳密でなく、従ってあまり好ましくない。周期に対する特定の介入効果を、実際の体内時計機構に対する効果の指標として測定することが好ましい。
【０１３２】
カルシウム量などのセカンドメッセンジャーが発火の前に上昇するという事実は、単なるアウトプット以上の制御されたプロセスを示唆し、これが、ＥＤＴＡ／ＢＡＰＴＡ分析によって支持される必須の特徴であるという推論に導かれる。従って、ｃＡＭＰは概日リズム制御に関与するということが開示される。これは、（必須ではない）リセット機構としての先行技術の見解とは対照的であり、ｃＡＭＰが概日リズムを発生させるのに中心的役割を果たしているとは、本発明以前は考えられたことがなかった。
【０１３３】
更なる適用
本発明は、他の薬剤の効果を調節するために適用してもよい。例えば、肝臓は概日リズムに制御された生理サイクルに従う。昼の肝臓の活動は夜と異なる。結果として、特定の治療薬は、概日サイクル中の異なった時間に投与された後、より急速に又はゆっくりと肝臓により分解される場合がある。このため本発明は、概日周期の調整とその後の薬剤投与に適用される。これは有利なことに、投与される概日サイクルの時点によって所定の薬剤の有効性を最大にする。従って本発明は、概日リズムの調節によって特定の薬剤に対する応答を調節するために使用できる。
【０１３４】
当技術分野において、一日の初めに血圧のピークがあることは周知である。この血圧のピークは、脳卒中、脳梗塞又は心筋梗塞の発生率の高さと関連付けられてきた。これらの状態の発生率は、血圧の１日のピークの時間前後に最大で３０％まで高くなることがある。従って、この効果に対処するために、早朝の血圧ピークに対する血圧管理を目標とすることが望ましい。このため本発明は、早朝の血圧ピークを調節し、それにより前述したものなどの血圧に誘発される障害のリスクを低減させるための、概日リズムの調整に適用される。
【０１３５】
本発明は宇宙旅行に適用される。地球の日長は２３時間５６分である。火星の日長は２４時間３７分である。従って、火星に旅行する宇宙飛行士は、地球の日長に比べて増大した火星の日長に合わせるために自分の概日リズムを適合させる必要がある。従って、一態様において本発明は、適切な用量のアデニリルシクラーゼ阻害剤をそれを必要とする対象に投与することにより、約２４時間３７分まで日長を延長することに関する。従って本発明によると、火星旅行者は、現地環境の周期と一致させるために自分の概日周期を増大させることができ、従って地球以外の惑星で地球の日長の生活をしようとすることの悪影響を防止する。
【０１３６】
本発明はまた、概日周期の長さを増大させることにも関する。用量依存的な周期長の増大は、好ましくは全ての組織において、家族性睡眠相前進症候群患者の治療を可能にし、患者の周期を２４時間にする（長期治療）。シフトワーカーは、概日周期長の急激な調整によって必要な勤務時間と一致するように概日相を適合させることにより、異常な生活時間を続けることの不快な副作用及び長期にわたる健康上の悪影響を低減できる。「ジェットラグ」患者は、概日周期長の急激な調整によって目的地の時間帯と一致するように概日相を適合させることにより、時間帯を変化させることの不快な副作用及び長期にわたる健康上の悪影響を低減できる。
【０１３７】
本発明はまた、季節性情動障害（ＳＡＤ, Seasonal Affective Disorder）治療にも関する。用量依存的な周期長の増大は、好ましくは全ての組織において、ＳＡＤ（又は冬季うつ病）患者が生理的に認識される日長時間を増大させることを可能にし、従って高緯度での日長短縮に伴うＳＡＤ症状を軽減する。
【０１３８】
本発明はまた、睡眠障害の治療にも関する。用量依存的な周期長の増大により、好ましくは全ての組織において、不眠症及び／又はナルコレプシー患者は、生理的に認識される昼及び／又は夜の開始の調整によって状態に対処する手段を有することができる。
【０１３９】
本発明はまた、うつ病の治療にも関する。リチウムは、うつ病の治療において特徴的な役割を有する。その主な薬理作用は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β阻害により仲介され、これにより概日周期は軽度に（マウス行動リズムにおいて約３０分、器官型組織抽出物において約２時間）増大する。ＳＣＮ（視交叉上核―哺乳類の親時計）は正中縫線核の５−ＨＴまで相互連絡が伸びており、ＳＣＮスライスの５−ＨＴ処理（インビトロ）は位相シフトを引き起こし、ＳＣＮの概日周期も増大させる処理は、有利には抗うつ作用を有し得る。
【０１４０】
本発明はまた、食欲制御の治療にも関する。ｃＡＭＰは、細胞間での空腹状態のシグナル伝達において、このシグナル伝達経路への薬理的介入において重要なセカンドメッセンジャーであり、特にＳＣＮは視床下部のオレキシンニューロンまで連絡が伸びているので、有利には食欲抑制において作用を有し得る。
【０１４１】
本発明はまた、他の薬剤／治療の作用の調節にも関する。多くの薬剤及び健康管理の治療は、投与される２４時間周期の昼／夜の時間によって有効性が変化することが示されてきた。患者の生理的な昼／夜の長さの調整により、有利には、最大有効性のための治療域を拡張させ、及び／又は他の薬剤の有毒な副作用を低減させ得る。
【０１４２】
本発明はまた、神経変性疾患における睡眠パターン障害の治療にも関する。進行性のパーキンソン病、アルツハイマー病などの患者は、２４時間監視なしには介護することが困難な睡眠パターン障害を有する。生理的に認識される昼／夜の長さの調整により、これらの症状を低減できる。
【０１４３】
本発明はまた、生活様式／効率強化の用途にも関する。例えば、急性治療による生理的な夜の継続時間の増大は、睡眠不足などの状態の軽減に寄与することができる。急性治療による生理的な昼の継続時間の増大は、覚醒時間、運動能力又は生産性を増加させることができる。
【０１４４】
アデニリルシクラーゼ阻害剤がＴＨＦＡである好ましい実施形態において、本発明はまた、高血圧などの血圧疾患の治療も包含する。ｃＡＭＰは心臓の興奮収縮連関の重要な調節因子であり、この役割は主にＰＫＡによって仲介され、従って非競合的Ｐサイト阻害剤の使用により、有利には、高い心拍を低減できる。
【０１４５】
アデニリルシクラーゼ阻害剤がＴＨＦＡである好ましい実施形態において、本発明はまた、特定組織の治療も包含する。ＴＨＦＡは膜透過性阻害剤であり、それ自体で多様な組織中に、好ましくは組織の種類に関わらず同じ程度に十分拡散できる。ＴＨＦＡ分子に特定の成分を付加することにより、特定組織を標的とすることができる。例えば、非血液系の脳透過性成分は、末梢組織にのみ影響を及ぼすはずである。
【０１４６】
アデニリルシクラーゼ阻害剤がＴＨＦＡである好ましい実施形態において、本発明はまた、ＴＨＦＡが腫瘍抑制作用を有し得る癌治療を包含する。
【０１４７】
アデニリルシクラーゼ阻害剤がＴＨＦＡである好ましい実施形態において、本発明はまた、脳卒中治療を包含する。ＴＨＦＡは抗アポトーシス機能を有することができ、従って脳卒中発生後の投与により脳の損傷を低減できる。
【０１４８】
本発明によると、Ｇｓα部位アデニリルシクラーゼ阻害剤は概日リズム周期の延長に有用ではないが、有利には、本明細書に記載された他の態様において適用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１４９】
限定する意図は全くなく、説明を目的とする例として、本発明を以下に記載する。実施例において、以下の図を参照する。
【０１５０】
［実施例］
一般法
研究は、英国動物（科学的処置）法１９８６（UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986）の下で、医学研究審議会及びケンブリッジ大学による地方倫理審査の認可を受けた。Per1::luciferase及びPer2-lucトランスジェニックマウスを使用した。器官型スライス培養のために、５〜１０日齢の子犬から脳を取り出し、McIlwain「Tissue Chopper」を用いて３００μｍの厚さで薄片を切り出した。スライスは、主にＳＣＮ組織を含有するように選別及びトリミングし、以前記載されているように（Gainer et al, 1998）３７℃、５％ＣＯ２中で培養するためにMilliporeメンブレンインサート（ＰＩＣＭＯＲＧ）上に置いた。長期記録のために、カバースリップと真空グリースで密封したガラス底ペトリ皿中の、１００μＭの甲虫ルシフェリンを含む１．１ｍｌのHEPES緩衝培地にスライスを移した。光不透過性（light-tight）の３７℃のインキュベーター内に収容されたHamamatsu光電子増倍管アセンブリを用いて、全生物発光を記録した。光電子倍増管の記録は、６分間のサンプル瓶をまとめた、秒当たりのカウントとして表した。周期は、各データ点について少なくとも３回反復した、少なくとも３サイクルのピークとピークの間の平均である。ｃＡＭＰアッセイは、R&D systems社の第３世代のｃＡＭＰ  ＥＬＩＳＡキットによって測定した。全ての薬剤はSigma Aldrichから購入し、溶媒又はＤＭＳＯ中にストック溶液として作製した後、組織培地に加えた。
【実施例１】
【０１５１】
環状ＡＭＰ依存性シグナルは哺乳類の分子の時間管理を持続させ、概日周期を決定する
序論
哺乳類細胞の概日時間調整は、自己調節による転写／翻訳後のフィードバックループに基づいており、Period遺伝子及びCryptochrome遺伝子の周期的な発現を軸に回っている。様々なセカンドメッセンジャーシグナル伝達カスケード（環状ヌクレオチド、ＭＡＰＫ及びカルシウムを含む）の概日性活性化は広範に観察されているが、時計機構内での役割は主に、最も明瞭にはPer発現の誘導による、エントレインメントについて見られる。しかしながらＶＩＰ２受容体ノックアウトマウス（Ｖｉｐ２ｒ−／−）において、分子時計機構は大部分の視交叉上核（ＳＣＮ）ニューロンにおいて一時停止する。この受容体は、アデニリルシクラーゼ（ＡＣ）を介してシグナル伝達する。そのため本発明者らは、概日遺伝子発現の生物発光リアルタイムレコーディングを使用して、哺乳類の概日時間管理の維持におけるＡＣシグナル伝達の役割を試験しようと努めた。
【０１５２】
実験
ＡＣのＧｓα結合部位の阻害は、光電子倍増管によってモニターしたPer1::luciferase器官型ＳＣＮスライス培養から、概日遺伝子発現の用量依存的で可逆的な抑制を引き起こした。この効果の普遍性を確認するために、本発明者らは３Ｔ３線維芽細胞を調べた。Bmal1:: luciferaseレポーター構築体で報告されたように、ｃＡＭＰ濃度の内因性振動の阻害により概日遺伝子発現は停止した。ＰサイトＡＣ阻害は、線維芽細胞の周期を約２１時間〜約３０時間まで延長した。Per1::luciferaseＳＣＮスライスの同等な処理は、概日周期を３０時間まで延長した。
【０１５３】
ｃＡＭＰシグナル伝達の欠損は、Ｖｉｐ２ｒ−／−変異マウスのＳＣＮにおける分子の時間管理の欠損の主な原因となり得る。より一般的に言えば、ｃＡＭＰシグナル伝達経路は、ＳＣＮ及び末梢細胞の両方において、哺乳類の体内時計機構周期を維持及び制御するために必須である。従って本発明により、Ｐサイトアデニリルシクラーゼ阻害剤は概日周期を延長することが実証される。
【実施例２】
【０１５４】
アデニリルシクラーゼ阻害剤を使用した概日リズム延長の実証
本発明者らは、哺乳類の概日リズム調整の新しい様式として環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）経路を開示する。本発明者らは、１日に２回観察されるｃＡＭＰ濃度の細胞内変化は、アウトプットではなくむしろ時計の本質的特徴であることを示す。本発明者らのｃＡＭＰ合成の調整は、この役割を裏付ける。更に本発明は、この適用のために以前特徴付けられた細胞内標的を同定する。
【０１５５】
初めに本発明者らは、一般的な市販のアデニリルシクラーゼ酵素阻害剤を用いた様々なマウス組織（例えば器官型脳及び腎臓スライス、線維芽細胞など）の処理が、概日周期（様々な生物発光レポーターにより検出した）を抑制することなく約２４〜３０時間超まで延長することを見出した。この効果は概日生理学／薬理学においてこれまでにないものである。
【０１５６】
本発明による好ましい阻害剤は、Ｐ（プリン）サイトリガンドと歴史上呼ばれるクラスに属し、非競合的で行き止まりの、アデニリルシクラーゼ特異性をもたらす転移後状態機構を介して阻害する。これらの阻害剤のうち最も有効なのはＴＨＦＡ［９−（テトラヒドロフリル）−アデニン、又はＳＱ２２５３６］である。
【０１５７】
ＴＨＦＡは膜透過性、水溶性であり、以前に、生きたげっ歯類において頭蓋内注射により安全に使用されている（例えば、Marks et al, Neuroscience, 2000  同頁）。更に、インビトロで最大７日間の、２ｍＭもの高濃度のＴＨＦＡとの長期インキュベーション中に、いかなる毒性効果も観察されなかった。周期は、薬剤の除去から約２４時間後に正常値に戻る。
【０１５８】
本発明者らは、ＴＨＦＡのマウス線維芽細胞への適用は、その基底状態に影響を及ぼすことなく、検出可能な二相性の内因性ｃＡＭＰ上昇を低減させることを見出した。この薬剤のマウスへの経口送達は従って、有利には、ｃＡＭＰの基礎的機能を弱めることなく概日周期を変更し、ヒトの乱れた概日リズムの治療としての有用性を実証する。
【０１５９】
本発明は、特に睡眠障害（不眠症及び睡眠相）、交代勤務障害及び時差症候群などの概日機能障害において、これらの経路を標的とすることに適用される。
【実施例３】
【０１６０】
概日リズム
図１は、ＶＰＡＣ２に関して異なる状態の遺伝子を有するPer1::luc動物の活性をトレースしたものを示す。受容体に対して陰性の動物の行動は無秩序である。
【０１６１】
図２は、ＶＰＡＣ２−／−スライスが細胞外刺激の後により一貫したリズムを持続できることを示す。
【０１６２】
図３は、定説となっているｃＡＭＰシグナル伝達経路の図を示す。
【０１６３】
ＶＰＡＣマウスは行動が周期的でない。これはＳＣＮリズムの不完全な周期性及び小さな振幅に反映されている。電気生理学的測定によって、ＶＰＡＣ  ＳＣＮの更なる表現型は過分極されていることであると示されている。従って、ＶＰＡＣ  ＳＣＮはＫ＋、又はＡＰ−４（ナトリウムチャネル遮断薬）によって「始動（kick-start）」することができる。これは、スライスの同調性及びいくらかの振幅を時間的に回復させる。
【０１６４】
この効果は、１．６μＭのＥＧＴＡによるスライスの全処理によって阻害され得るので、余剰の細胞内カルシウムフラックスによって少なくとも一部仲介されるようである。
【０１６５】
しかしながら、ＶＰＡＣ受容体はイオンチャネルではなく、実際はＧｓによってシグナル伝達すると考えられているＧＰＣＲである。従って本発明者らは、ｃＡＭＰを研究することによって問題を更に調べた。
【０１６６】
環状ヌクレオチドの代謝―ｃＡＭＰ
環状ヌクレオチドは、多くの種類のホルモン及び神経伝達物質受容体の活性によって開始される細胞内事象のセカンドメッセンジャーとして、広く研究されてきた。ＡＴＰの環状３’,５’−アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）への変換を刺激する受容体は、Ｇタンパク質と関連している。ホルモン又は神経伝達物質の膜結合受容体への結合は、Ｇタンパク質のａ−サブユニットの活性化をもたらす受容体の立体構造変化を引き起こす。活性化されたＧｓサブユニットはアデニリルシクラーゼ（ＡＣ）を刺激し、一方Ｇｉサブユニットは阻害する。ＡＣ刺激は細胞質ＡＴＰのｃＡＭＰへの変換を触媒する。
【０１６７】
Cummings et alは１９７５年にｃＡＭＰの（体内時計の生化学モデルにおける）重要な役割を提唱したが、この考えはその後アカパンカビ（Neurospora）において反証された。当技術分野における現在の見解では、ｃＡＭＰの関与は位相リセットにおける役割に限定される。
【実施例４】
【０１６８】
概日リズムにおけるアデニリルシクラーゼの役割
アデニリルシクラーゼアゴニスト
フォルスコリンは、よく特徴付けられた作用を有するアデニリルシクラーゼアゴニストである。図４は、ＡＣアゴニストの効果を示すグラフ及び棒グラフである。フォルスコリンの適用は、ＶＰＡＣスライスの活性をいくらか回復させた。外観上は高カリウムの効果によく似ており、ニューロン間の同調性が高いことを示唆する。しかしながら、カリウム処理と同様に強いリズムは徐々に衰退する。これは恐らく、この処理は提案された概日性のｃＡＭＰ増加を回復したのではなく、ｃＡＭＰを本質的に上昇させたので、細胞内ＰＤＥの正の制御を反映している。
【０１６９】
しかしながら、適用後の最初の数サイクルは野生型リズムに明らかに近く、本明細書に開示しているモデルを支持する。
【０１７０】
アデニリルシクラーゼ阻害剤
哺乳類において、少なくとも１０種類の異なるイソ型アデニリルシクラーゼがあり、１種類を除く全てが膜結合性であり、最も重要な膜貫通シグナル伝達経路のうちの１つに対する中心となる。可溶型は重炭酸により制御されるが、膜結合型は非常に多くの神経伝達物質及びホルモンによって、ヘテロ三量体（αβγ）の刺激性（Ｇｓ）及び阻害性（Ｇｉ）グアニンヌクレオチド依存性制御タンパク質（Ｇタンパク質）を介して連結した細胞表面受容体を通して制御される。大部分のアイソザイムはＧαｓによって活性化されるが、Ｇαｉによる制御、及びＧβγの作用は更に著しく異なる。これらのアデニリルシクラーゼアイソザイムは、１２個の膜貫通領域及び、６個の膜貫通領域の後にそれぞれ１個ずつ、２個の約４０ｋＤａの細胞質ドメイン（Ｃ１及びＣ２）を有する推定トポロジーを示す。Ｃ１及びＣ２は、相互作用して、触媒活性部位を形成する裂け目を形成する、大きな保存領域を共有している。Ｎ末端ドメインは極めて多様であり、制御的な役割を果たす。アデニルシクラーゼのＣ２ドメインとの相互作用によってＧαｓの活性化が起こり、活性酵素であるＧＴＰαｓＣを生じる。アデニリルシクラーゼのＣ１ドメイン域を有するＧαｉの直接的作用によって、又はβγとＧαｓの組換えによって、Ｇタンパク質による阻害が起こることもある。
【０１７１】
図５は、ｃＡＭＰ経時変化のグラフを示す。この実験は３Ｔ３細胞におけるものである。図中に効果を見ることができる。
【０１７２】
ＭＤＬ１２３３０Ａは、膜透過性であり、２５０μｍのＩＣ５０でＧｓα部位に不可逆的に結合する、強力な特異的アデニリルシクラーゼ阻害剤である。
【０１７３】
図６は、ＡＣ阻害がPer2-lucレポーターを抑制することを示す。
【０１７４】
図７は、代替の概日レポーターがＡＣ阻害作用を裏付けることを実証するグラフを示す。
【０１７５】
この作用は毒性により生じるわけではない。
【０１７６】
次いでこの作用を、per1::luc、bma1::lucなどの他のレポーターを使用して試験した。図８は、ＡＣ阻害の作用を裏付ける更に代替の概日レポーターのグラフ及び棒グラフを示す。
【０１７７】
異なるプロモーターを使用してＭＤＬが３Ｔ３を抑制するという事実を踏まえて、本発明者らは、ｃＡＭＰシグナル伝達が哺乳類組織の概日リズムに普遍的に要求されるのかどうかを調べた。
【０１７８】
理論に束縛されるものではないが、末梢組織において、周期的なセカンドメッセンジャーシグナル伝達の内因的な発生は周期性を維持するために必須である可能性があり、ＳＣＮにおいて、周期的なセカンドメッセンジャーシグナル伝達の内因的な発生は、振幅の大きいリズムを維持するために周期的な細胞外刺激によって強化しなければならない。
【０１７９】
従って本発明者らは、以下のように要約できる修正された見解に達した。
ＶＰＡＣ２−／−マウスは、Ｇｓ刺激によるｃＡＭＰ上昇がないので、概日リズム障害を有する。
ｃＡＭＰリズムはＳＣＮの周期性に必須である。
ｃＡＭＰリズムは末梢組織の周期性に必須である。
ＡＣアゴニストは周期効果を有さない。
【０１８０】
結論
野生型ＳＣＮ外殖片におけるＡＣ阻害はＶＰＡＣ２−／−を表現型模写する。
ｃＡＭＰシグナル伝達の変化は、哺乳類の概日リズムを維持するための普遍的な中心的機構を構成する可能性がある。
理論に束縛されるつもりはないが、本発明者らは、細胞質時計がアウトプットとしての転写リズムに関係している可能性がある（例えば、シアノバクテリア）ことを提唱する。
【０１８１】
概日リズムを説明する先行技術モデルは、位相リセットにおいてそれほど重要でない役割とされていたｃＡＭＰシグナル伝達による遺伝子発現／タンパク質フィードバックシステムを含む。本発明者らは、ｃＡＭＰが遥かに中心的な役割を果たすという、概日リズムの根本的に異なる新たな見解を発表する。
【実施例５】
【０１８２】
概日リズムの調整
本発明者らは、概日性のアデニリルシクラーゼ活性化が２４時間周期を設定するために必須であることを示す。本発明者らは、阻害が振幅に影響せず、振動周期にのみ影響することを示す。本発明者らは、３１時間までの、３０％の周期増大を実証する。これは、哺乳類の概日生物学においてこれまでに観察された最も長いものである。
【０１８３】
本発明者らは、アデニリルシクラーゼが臨床的に有意義な細胞内標的であることを実証する。
【０１８４】
図９は、本発明のアデニリルシクラーゼ阻害が周期を延長することを例示するグラフを示す。
【０１８５】
用量を増加しても、やはり大きな振幅効果はない。
【０１８６】
これは、観察された最も長い哺乳類概日サイクルである。比較のために、１０ｍＭリチウムにおいてスライスを調べたところ、これは２６時間周期を示す。
【０１８７】
阻害剤のウォッシュアウトは以前の周期を回復させることに更に留意すべきである。このことは、有利には単回治療後の有害な永続性の又は長期の周期延長を避けながら、短期間で概日リズムを適合させることにおける本発明の有用性を実証する。換言すれば、対象が本発明に従う活性化合物を摂取するのを一旦中止すれば、対象のリズムは正常周期に戻る。従って、時差症候群、交代勤務症候群又は関連する適用には、治療の短期コースが、その後約２４時間周期に戻るリズムの調整のために適切である。同時に、ＦＡＳＰＳ患者には、各サイクルを少しずつ延長して約２４時間にするように、長期低用量の毎日（１サイクルに１回）の治療計画が指示される。
【実施例６】
【０１８８】
用量反応
図１０は、ＳＣＮスライスに対する用量反応曲線を示す。データは一部位阻害モデルと合致する。データは、本発明者らがこの阻害剤を使用して可能な最大の後退を達成している可能性があることを示唆する。
【０１８９】
図１１は、３Ｔ３細胞に対する用量反応を示す。データは一部位阻害モデルと合致する。データは、本発明者らがこの阻害剤を使用して可能な最大の後退を達成している可能性があることを示唆する。
【０１９０】
Forskolin（ＡＣアゴニスト）は振幅効果を有したのに対して、ＴＨＦＡ（ＡＣ阻害剤）は周期効果を有することに留意すべきである。これは極めて驚くべき目覚ましい結果である。
【実施例７】
【０１９１】
本発明によるＰサイト阻害剤の使用
図１２は、Ｐサイト阻害対Ｇｓ部位阻害のグラフを示す。ＴＨＦＡはＰサイト阻害剤であり、ＭＤＬはＧｓ部位阻害剤である。本発明によればＰサイト阻害剤が好ましい。
【０１９２】
図１３は、ＳＣＮ周期が細胞レベルであることを実証するグラフを示す。これは単一ニューロンレベルでも当てはまる。
【０１９３】
次いで本発明者らは、ＳＣＮ発光波形への変化により、何らかの機構の詳細が示唆されるかどうかを調べた。
【０１９４】
概要
従って本発明者らは、重要な時計機構を実証し、どれほどこの系が信頼できるのか、かつてないほどの更なる時計周期の延長により再現性が混乱し得るのかを示す。これは時差症候群、交代勤務症候群及び関連する概日性の障害並びにＦＡＳＰＳなどの遺伝性疾患の治療において有用である。
【０１９５】
ｃＡＭＰシグナル伝達が新たな段階の概日制御を構成することを示す。
【０１９６】
概日性のアデニリルシクラーゼの活性化が２４時間周期をセットするために必須であることを示す。
【０１９７】
アデニリルシクラーゼ阻害が、少なくとも３０〜３１時間周期のこれまでにない周期延長をもたらすことを示す。阻害は、振幅には影響せず、周期にのみ影響する。
【０１９８】
概日リズムに関連する疾患の治療における、アデニリルシクラーゼ阻害剤、好ましくはＰサイトアデニリルシクラーゼ阻害剤の有用性を実証する。
【０１９９】
従って、概日リズムの変更における細胞内標的としてｃＡＭＰの重要性を実証する。
【実施例８】
【０２００】
哺乳類における概日リズム調整
マウスにおいてＰサイトアデニリルシクラーゼ阻害剤投与によるＰサイトアデニリルシクラーゼ阻害効果を実証する。本実施例において、Ｐサイトアデニリルシクラーゼ阻害剤はＴＨＦＡである。図１４は、２０５．２のＭｗを有するＳＱ２２５３６（９−（テトラヒドロ−２’−フリル）アデニン（ＴＨＦＡ））の構造を示す。本実施例において、哺乳類はマウスである。
【０２０１】
背景
Iwahana et al(Eur J Neurosci. 2004)は、マウスに０．３％ＬｉＣＯ３＝４１ミリモルリチウム／ｇ食品を含有する食物ペレットを投与した。（ヒト血清において１ｍＭリチウム最終濃度は非毒性である。）
【０２０２】
Matsumoto et al(Learning and memory, 2005)は、マウスに３μｌ生理食塩水０．１％ＤＭＳＯ中の１ｍＭのＴＨＦＡ（＝ＳＱ２２５３６）を注入した。顕著な毒性は報告されなかった。
【０２０３】
Simchowitz et al(J Cyclic Nucleotide Protein Phosphor Res. 1983)はインタクトなヒト好中球において、ＳＱ２２５３６（＝ＴＨＦＡ）が非毒性のアデニリルシクラーゼ阻害剤であると報告している。
【０２０４】
実験
比較用として、１０ｍＭのＬｉＣｌ２中のスライスは完全に健常のようであり、２６時間周期を示した。
【０２０５】
２ｍＭのＴＨＦＡ中の本発明によるスライス／３Ｔ３細胞／他の組織は、完全に健常のようであり、３０〜３１時間周期を示した。
【０２０６】
本発明中で使用されるマウスは、典型的には成体体重：２０〜４０ｇ、食物消費：１５ｇ／１００ｇ／日及び水分消費：１５ｍｌ／１００ｇ／日を示す。
【０２０７】
水分摂取は約５ｍｌ／日と推定する。
【０２０８】
食物摂取は約５ｇ／日と推定する。
【０２０９】
従って、以下のいずれかに準じてマウスを扱う：
２０マイクロモルＴＨＦＡ／日＝３０ｇ食物中２５ｍｇの食物摂取、又は
２０マイクロモルＴＨＦＡ／日＝４ｍＭ溶液（２５ｍｇに対して３０ｍｌの水を加える）の水分摂取。
【０２１０】
入るのと同じ速度でＴＨＦＡが翌日に体から出るという前提に基づく計算により、血清濃度は１〜２日以内に約０．６〜０．９ｍＭに達すると推測される。
【０２１１】
概日リズム周期に対する効果をモニターする。
【実施例９】
【０２１２】
アデニリルシクラーゼの関与
細胞内シグナル伝達が哺乳類の時計を維持するかもしれないという可能性を調べた。血管作動性腸管ペプチドのＶＰＡＣ２受容体（Ｖｉｐ２ｒ−／−）を欠損したマウスのＳＣＮにおいて、［Ｃａ２＋］の緩衝化はＳＣＮ概日遺伝子発現を弱め、細胞リズムは弱まるのみならず脱同調する。この受容体はＡＣに確実に結合し、mPer1::luciferaseレポーターを有する器官型Ｖｉｐ２ｒ−／−ＳＣＮスライスにおいて、フォルスコリンが直接ＡＣを活性化することにより概日転写活性を強化する（図１５ａ、ｂ）。ＡＣ依存性シグナル伝達が正常な時計機能に必要であれば、その場合は野生型ＳＣＮにおけるＡＣシグナル伝達の抑制によって概日遺伝子発現が弱まり、細胞の脱同調をもたらすはずである。更に重要なことには、ＡＣが細胞の時計の一部であれば、その場合はＡＣの適切な調整が概日周期、つまり振動子の基本特性に影響を及ぼすはずである。
【０２１３】
野生型ＳＣＮスライスにおける転写サイクルに対する内因性ＡＣの寄与を、使用される最大用量でｃＡＭＰ量を検出感度より低く抑制する、強力で不可逆的なＡＣのＧｓα部位阻害剤であるＭＤＬ−１２３３０Ａ（ＭＤＬ）の添加によって試験した（図２０ａ）。ＭＤＬは概日サイクルの急激な用量依存的抑制を引き起こしたことが、mPERIOD2-LUCIFERASE（mPER2-LUC）融合タンパク質及びmPer1::luc転写レポーターの両方において観察された（図１５ｃ、図２０ｂ）。概日周期は影響されなかった。おそらく新たなＡＣが合成されたため、高用量から回復するのに時間は要したが、ウォッシュアウトによって抑制は可逆的であった（図１５ｄ、図２０ｂ）。ＳＣＮスライスの転写抑制は、個々の細胞の振幅の欠損及び／又は細胞の脱同調により生じた可能性があった。
【０２１４】
ＣＣＤカメラを使用した細胞の概日mPER2-LUC発現のビデオイメージングにより、ＳＣＮ全体での２．５μＭのＭＤＬの極めて迅速な作用が明らかになった（図１５ｅ）。中用量のＭＤＬ（１．０μＭ）による長期（７日間超）の処理の間、ＳＣＮ細胞はＶｉｐ２ｒ−／−ＳＣＮを表現型模写して、概日振幅を失うだけでなく脱同調したことが明らかになった（図１５ｆ）。時計機構に対するＡＣ−Ｇｓα阻害作用は全体的で、ＳＣＮに限定されたものではなかった。ＭＤＬの可逆的で用量依存的な概日アウトプット抑制は、mPER2-LUCマウス及びBmal1::lucレポーターをトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞の器官型腎臓スライスにおいても明らかであった（Ueda et al 2005 Nat Genet Vol 37 pp 187-92、図２０ｃ、ｄ参照）。非概日プロモーターをＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトした対照のルシフェラーゼ発現に対して、ＭＤＬは作用を及ぼさなかった。
【０２１５】
材料及び方法
ＳＣＮ又は末梢組織の器官型スライスのルシフェラーゼ活性を、５〜７日齢の子犬、PER2::LUC及びPer1::LUCマウスにおいて、全組織の発光には光電子増倍管アセンブリ、又は単一ＳＣＶ細胞イメージングにはＣＣＤカメラ（Hamamatsu Photonics社製、英国）のいずれかを使用して、May Wood et al 2006 Curr. Biol. Vol. 16 pp 599-605に記載のように記録した。ｃＡＭＰ  ＥＬＩＳＡキットはR&D systems社（Wiesbaden、ドイツ）より購入した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞は記載（Kume et al 1999 Cell Vol 98 pp 193-205）のように培養し、Genejuice（Novagen社製、San Diego、カリフォルニア州）を使用してトランスフェクトした。ＰＫＡ／Ｅｐａc活性ｃＡＭＰアナログ（Axxora社製、Grunberg、ドイツ）及びＫＴ５７２０（Calbiochem社製、Nottingham、英国）を除く全ての薬剤はSigma-Aldrich社（Poole、英国）から購入した。薬剤は溶媒又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ, dimethylsulfoxide）中に可溶化し、ストック溶液を５０〜１０００×使用溶液にした。［ＤＭＳＯ］は０．４％を決して超えないようにした。使用したＥｐａｃ１及びＥｐａｃ２に対するＲＮＡ干渉は、指示通りに（Validated Stealth RNAi、Invitrogen、カリフォルニア州）予め配列を確認した。ウェスタンブロットはReddy et al（2006 Curr. Biol. Vol 16 oo 1107-15）の通りに行った。回し車及び受動型赤外線運動検出器によって記録した行動リズムは、Clocklab（Actimetrics、Evanston III）において分析した。ＳＣＮで定方的に向けられた中枢カニューレ及び薬剤点滴のための皮下ミニポンプ（Alzet（登録商標）model 1002 ポンプ及びブレインインフュージョンキットII）は、指示通りに備え付けた（Durect社製、Cupertino、カリフォルニア州）。Prism GraphPad（商標）及びStatview（商標）を使用して統計分析を行った。周期は、３日間以上の記録について計算した。比較目的のために、ＰＭＴ記録による転写振幅を１００×として計算した（処理後発光ピーク−谷／処理前ピーク−谷）。全ての場合において、エラーバーはｎが３以上の平均についてのＳＥＭを示す。
【実施例１０】
【０２１６】
Ｐサイト阻害
機能できるＡＣがない場合のＳＣＮ概日振幅及び細胞同調性の欠損は、不完全な時計アウトプットからも生じることがあるため、核となる振動子におけるＡＣ／ｃＡＭＰのシグナル伝達の役割を必ずしも立証するわけではない。そのため、プリン作動性部位（Ｐサイト）の非競合的ＡＣ阻害剤である９−（テトラヒドロ−２−フリル）−アデニン（ＴＨＦＡ）を使用することによって、ＡＣ阻害の代替形態の作用を試験した。ＭＤＬとは対照的に、ＴＨＦＡは線維芽細胞のｃＡＭＰの基底レベルを変化させなかったが、ｃＡＭＰ合成速度を遅延させ、それにより線維芽細胞におけるピークレベルを抑制した（図２０ｅ）。mPer1::luc及びmPER2-LUC  ＳＣＮスライスにおいて、ＴＨＦＡは、高用量で転写振幅をいくらか抑制したが、約２４〜３１時間まで、強固で用量依存的な概日周期増大を引き起こした（図１６ａ、ｂ、ｃ）。用量反応は一部位阻害モデルと一致して、２ｍＭ付近で飽和し、薬剤ウォッシュアウトにより迅速に反転した。更に、ＣＣＤイメージングによりＴＨＦＡがＳＣＮ全体の個々のニューロンにおける周期を増大させることが明らかとなった（図１６ｃ）。
【０２１７】
Ｐサイト阻害の概日効果を、更に非競合的阻害剤である２’，５’−ジデオキシアデノシン及び９−シクロペンチルアデニンを用いて確認した（図１６ｄ）。mPer1::luc及びPER2-LUC  ＳＣＮスライスの両方において周期は延長された。ＳＣＮ周期に対するＴＨＦＡの作用はClock変異の作用に相加的であり（図１６ｅ）、Ｅ−ｂｏｘを介するＣＬＯＣＫの転写促進に加えて、且つ独立してＴＨＦＡが作用することを示唆した。重要なことには、２ｍＭのＴＨＦＡはまた、試験した全てのmPER2-LUCマウス由来末梢組織における概日周期の劇的な増大も引き起こしたが（図１６ｆ）、mBmal::lucレポーターをトランスフェクトした線維芽細胞において概日周期を約２１〜３１時間に延長するという更に顕著な作用を示した（図１６ｇ、ｈ）。ＡＣ阻害は中枢カニューレ挿入されたマウスのＳＣＮに送達された場合、車回し運動の概日周期も延長した。手術からの回復後、媒体で処理されたマウスの活動／休止サイクルは明暗サイクルにはっきりと同調しており、活動開始は消灯と同時であり、連続暗赤色灯の中へ放つと２４時間に非常に近い周期でフリーランした（図１７ａ、ｂ）。対照的に、慢性的な中枢ＴＨＦＡを受けた９匹のマウス全てにおいて、連続暗赤色灯へ移すとフリーラン概日周期は著しく（ｐ＜０．０１、ｔ−検定）延長した。
【実施例１１】
【０２１８】
ＪＮＫ阻害
プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）はｃＡＭＰの概日効果を仲介する候補物質であるため、mPer1::luc及びmPER2-LUC  ＳＣＮスライスを、調節又は触媒サブユニットのいずれかを標的とした、よく特徴付けられた一連のＰＫＡ阻害剤と一緒にインキュベートした。驚くべきことに、概日振幅又は周期のどちらに対しても大きな影響はなかった（図２１）。
【０２１９】
Ｅｐａｃ１／２は、ＡＣシグナル伝達の代替となる仲介物質であると報告されている。推定される役割を試験するために、mPer1::luc  ＳＣＮスライスを特異的ＥｐａｃアゴニストであるＳｐ−８−ＣＰＴ−２’−Ｏ−Ｍｅ−ｃＡＭＰＳと一緒にインキュベートした。これは、周期的な転写振幅又は周期に対して大きな影響を与えなかった。しかしながら、mPER2-LUC  ＳＣＮスライスを２．５μＭ  ＭＤＬで処理して抑制を誘導した場合、Ｅｐａｃ特異的アゴニストは劇的に概日アウトプットを回復し、高振幅のリズムが数日間持続し（図１８ａ、図２２ａ）、これにより下流Ｅｐａc活性の活性化が概日遺伝子発現に対するＡＣ阻害作用を相殺できることが示された。ＣＣＤレコーディングにより、Ｅｐａｃアゴニストが、ＭＤＬ処理されたＳＣＮニューロンにおける概日遺伝子発現を一時的に活性化し、再同調させたことを明らかにした（図１８ｂ）。更に、Bmal1::lucレポーターを有する線維芽細胞に既知のＥｐａc阻害剤、ＨＡ−Ｒａｐ１（Ｓ１７Ｎ）をトランスフェクトした場合、概日遺伝子発現は顕著に抑制された（図１８ｃ、図２２ｂ）。Ｅｐａｃに作用しない野生型Ｒａｐ１の影響はなかった。更に、線維芽細胞における内因性Ｅｐａｃ１及びＥｐａｃ２のＲＮＡｉノックダウンも同様に概日遺伝子発現を抑制した（図１８ｄ、図２２ｃ）。Ｅｐａｃはｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）ｐ４６を活性化し、ｐＪＮＫは次にＡＰ−１ファミリーの転写因子を介して概日遺伝子発現を活性化することが報告されている。Period遺伝子がＡＰ−１調節配列を含有すると仮定して、本発明者らは、ｃＡＭＰ／Ｅｐａｃ／ＪＮＫ／ＡＰ−１の周期的な活性化が概日ペースメーキングを促進するモデルを考えた。このモデルと一致して、Ｅｐａｃアゴニストは５μＭを与えたｐＪＮＫ（ｐＣＲＥＢではない）線維芽細胞の概日遺伝子発現を増大させ（図２２ｄ、ｅ）、ＪＮＫ阻害はＡＣ阻害作用と同等にＳＣＮスライス及び線維芽細胞において概日周期を延長した（図１８ｅ、ｆ、図２２ｆ、ｇ）。重要なことに、ＪＮＫ阻害作用はＴＨＦＡの作用に相加的であり、約３６時間まで、ＳＣＮ及び線維芽細胞時計機構のこれまでにない延長をもたらした。対照的に、線維芽細胞において周期を延長したＩＢＭＸはＴＨＦＡの作用を強化しなかったが、これはおそらくどちらもｃＡＭＰレベルを乱すことにより作用するために過剰な作用を有するからである（図２２ｇ）。
【０２２０】
概要
本発明者らの結果は、ＡＣ活性が、おそらくＥｐａｃ／ＪＮＫを介して概日転写ループの振幅及び周期を決定すること、及び、おそらく概日振幅の欠損が、核となる振動子からのアウトプットを構成するＶＩＰ放出などのニューロン間シグナル伝達を弱めるために、ＡＣシグナル伝達の阻害によってＳＣＮ時計細胞を脱同調させることを実証する。従って本発明者らは、哺乳類の概日時間調整は、転写／翻訳後フィードバックループ及び神経活動がＡＣシグナル伝達の細胞内リズムを促進するという相互作用によって維持され、またその周期が決定されていると提案する。この細胞質リズムは次に転写サイクルを増強し、すなわち時計アウトプットが進行中の及び／又は次のサイクルへのインプットを構成する（図１９）。ｃＡＭＰシグナル伝達に対する転写サイクルの依存は、概日遺伝子発現の低下及びＶｉｐ２ｒ−／−マウスの行動を説明し、またＶＩＰ以外の求心性シグナルがＡＣ活性を調節する主要器官における局所的時計機構におそらく当てはまる。この依存はまた、ＡＣを活性化するＰＤＦ受容体（ＶＰＡＣ２受容体ホモログ）により維持されるショウジョウバエ（Drosophila）時計にも及ぶ。ＡＣ阻害剤の異なる作用（Ｇｓα対Ｐサイト）はおそらくＡＣ反応速度論に対する特定の作用を反映し、ＴＨＦＡなどの非競合的Ｐサイト阻害剤は、全ての生体組織において急性（時差症候群、交代勤務症候群）又は持続性（家族性睡眠相前進症候群）の概日周期延長が指示される広範な治療に適用される。
【０２２１】
上記明細書中に記載された全ての出版物は、参照により本明細書中に組み込まれる。記載された本発明の方法及び系の様々な変形形態及び変更形態が、本発明の範囲から逸脱することなく、当業者には明らかなはずである。本発明を特定の好ましい実施形態に関連して記載したが、請求された本発明はこのような特定の実施形態に必要以上に限定されるべきではないことが理解されるべきである。更に、生化学及び生物工学又は関連分野における当業者に明らかな、本発明を実施するために記載された方式の様々な変更形態が、特許請求の範囲内であると意図される。
【図面の簡単な説明】
【０２２２】
【図１】Per1::luc動物における行動トレースを示す図である。
【図２】ＶＰＡＣ２−／−スライスにおけるリズムを示すグラフである。
【図３】略図を示す図である。
【図４】グラフ及び棒グラフを示す図である。
【図５】グラフを示す図である。
【図６】グラフ、棒グラフ、及び略図を示す図である。
【図７】グラフを示す図である。
【図８】グラフ及び棒グラフを示す図である。
【図９】グラフを示す図である。
【図１０】用量反応曲線を示すグラフである。
【図１１】用量反応曲線を示すグラフである。
【図１２】グラフを示す図である。
【図１３】グラフを示す図である。
【図１４】ＳＱ２２５３６（９−（テトラヒドロ−２’−フリル）−アデニン（ＴＨＦＡ））の構造を示す図である。
【図１５】ＡＣのＧｓα部位の阻害が概日遺伝子発現を抑制し、ＳＣＮニューロンを脱同調させることを示す図である。（ａ）mPer1::luc、Ｖｉｐ２ｒ−／−マウス由来の器官型ＳＣＮスライスにおいて、１０μＭフォルスコリン（赤色）は概日転写振幅を増大させるが媒体（黒色）は増大させないことを示す代表的なトレースである。（ｂ）１０μＭフォルスコリン（治療効果、ｐ＜０．０１、2-way ANOVA）処理後の、mPer1::luc、Ｖｉｐ２ｒ−／−マウスにおいて強化された概日遺伝子発現を示す集団データ（平均＋ＳＥＭ、ｎ＝３）である。（ｃ）代表的なトレースにより、ＭＤＬ−１２３３０ＡをPER2-LUC  ＳＣＮスライスに添加後の概日タンパク質発現の可逆的な抑制を示す。（ｄ）集団データ（平均＋ＳＥＭ、ｎ＞３）により、PER2-LUC  ＳＣＮスライスにおけるＭＤＬ−１２３３０Ａによる概日遺伝子発現（初期振幅に比べて発現した）の、可逆的で用量依存的な抑制を示す図である（０＝黒色、０．５μＭ＝緑色、１．０μＭ＝赤色、２．５μＭ＝橙色、５μＭ＝青色）。最高用量のＭＤＬ添加後の回復のために２回目のウォッシュが必要であった。（ｅ）ＣＣＤイメージングにより、２．５μＭのＭＤＬ−１２３３０Ａで処理したPER2-LUCスライス由来ＳＣＮニューロンにおける概日振幅の欠損が示される。顕微鏡写真により、処理前（左）及び処理中（右）のＳＣＮスライス全体における細胞概日PER2-LUC発現の分布を説明する。Ｖ＝第３脳室、バー  ５００μｍ。グラフは、ＭＤＬ添加前及び添加中の２０個の典型的な細胞のトレースを示す。差し込み図は縦座標を拡大した同じデータを示す。ＭＤＬによる細胞プロファイルの秩序の破壊に留意する。データは３スライスを代表するものである。（ｆ）ＣＣＤイメージングにより、１．０μＭのＭＤＬ−１２３３０Ａで７日間以上にわたって処理したPER2-LUCスライス由来ＳＣＮニューロンにおける概日時間調整の脱同調が示される。顕微鏡写真により、処理前（左）及び処理中（右）のＳＣＮスライス全体における細胞概日PER2-LUC発現の分布を説明する。ラスタープロットは、ＭＤＬ処理の前（−６〜０日）及び１週間後（＋７〜１２）のＳＣＮ細胞におけるPER2::LUC発現を示す。
【図１６】ＡＣ触媒Ｐサイト阻害がＳＣＮ、末梢組織及び３Ｔ３線維芽細胞において概日周期を延長することを示す図である。（ａ）代表的なトレースにより、ＴＨＦＡのmPer1::luc器官型ＳＣＮスライスへの添加が概日周期の可逆的な増大を引き起こすことを示す。媒体＝黒色、０．５ｍＭ  ＴＨＦＡ＝赤色、２．０ｍＭ＝青色。（ｂ）mPer1::luc  ＳＣＮにおける用量依存的で飽和可能な周期延長（実線は平均データに一致するＳ字曲線、点線は９５％信頼限界、ｎ＞３）。赤色のデータ点はウォッシュアウト後の周期を示す（平均＋ＳＥＭ）。（ｃ）ＣＣＤによりイメージングし、１．０ｍＭのＴＨＦＡにより処理したPER2::LUCスライス由来の２０個の代表的なＳＣＮニューロンにおける概日周期の延長。データは３スライスを代表するものである。（ｄ）２’，５’−ジデオキシアデノシン（赤色）、０．５ｍＭのＴＨＦＡ（青色）、及び９−（シクロペンチル）アデニン（緑色）で処理したＳＣＮ  mPer1::lucスライスにおける可逆的な周期延長（平均＋ＳＥＭ、ｎ＞３、ｐ＜０．０１、2-way ANOVA）。（ｅ）ＴＨＦＡは、Clockヘテロ接合及びホモ接合変異体ＳＣＮにおいて概日周期を著しく（＊ｐ＜０．０５対処理前）延長する。（ｆ）PER2::LUCマウス由来の末梢組織器官型培養において、ＴＨＦＡ（２ｍＭ）は周期を延長する（全ての組織について：ｎ≧４、薬剤効果  ｐ≦０．０２）。（ｇ）mBmal1::lucレポーターをトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞の代表的なトレースは、ＴＨＦＡに対して周期延長を示す。黒色＝媒体、赤色＝０．３ｍＭ及び青色＝１．２ｍＭ  ＴＨＦＡ）。（ｈ）ＴＨＦＡによる３Ｔ３細胞の用量依存的で飽和可能な周期延長（実線は平均データに一致するＳ字曲線、点線は９５％信頼限界、ｎ＞３）。
【図１７】ＴＨＦＡの脳内注入はインビボでマウスの概日周期を延長することを示す図である。（ａ）１２時間の明（影付き）及び１２時間の暗の光スケジュールに同調させ、浸透圧ミニポンプ及びＳＣＮに中枢カニューレ（アスタリスク）を取り付けた、媒体（左）及びＴＨＦＡ（右）に処理されたマウスの代表的なダブルプロットアクトグラム。次いでマウスを連続暗赤色灯の中へ放ち、フリーラン周期を測定した。ＴＨＦＡ処理マウスにおいて周期がより長かったことに留意する。（ｂ）集団データ（平均＋ＳＥＭ）により、媒体と比較してＴＨＦＡによるインビボでのフリーラン周期の著しい（ｐ＜０．０１、ｔ−検定）延長が示される。
【図１８】ｃＡＭＰがＥＰＡＣシグナル伝達を介して概日遺伝子発現を調節することを示す図である。（ａ）代表的なトレースにより、ＭＤＬ−１２３３０Ａ存在下で抑制された概日遺伝子発現が、Ｅｐａｃアゴニスト（矢印、１００μＭ）で処理したPER2-LUC  ＳＣＮスライスにおいて回復可能であることが示される。（ｂ）ＣＣＤイメージングにより、ＭＤＬで、及びその後所定のＥｐａｃアゴニストで前処理されたＳＣＮスライスにおいて、細胞概日遺伝子発現の急激な活性化及び同調が示される。上のパネルは２０個の代表的な細胞のラスタープロットを示し、グラフプロットとして下のパネルで示される。データは３スライスを代表するものである。（ｃ）代表的なトレースにより、Ｅｐａｃ阻害剤Ｒａｐ１Ｓ１７Ｎ（赤色の曲線）の過剰発現が、mBmal1::lucをトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞において概日遺伝子発現リズムを培地交換（矢印）の前後ともに抑制することが示される。野生型Ｒａｐ（青色）又は空のベクター（黒色）の過剰発現は影響を及ぼさなかった。（ｄ）代表的なトレースにより、空のベクター（黒色）と比較して、mBmal1::lucレポーターをトランスフェクトし、Ｅｐａｃ１（青色）又はＥｐａｃ２（赤色）に対する干渉ＲＮＡにより処理した３Ｔ３細胞における概日遺伝子発現の抑制が示される。（ｅ）ＡＣ（ＴＨＦＡ  １ｍＭ、赤色）活性及びＪＮＫ（ＳＰ６００１２５  ２０μＭ、緑色）活性の共同阻害（青色）は、PER2::LUC  ＳＣＮスライス（代表的スライス）において概日周期を劇的に延長する。（ｆ）集団データ（平均＋ＳＥＭ、ｎ＞３）により、PER2::LUC  ＳＣＮスライスにおいてＡＣ（ＴＨＦＡ  １ｍＭ、ＴＨ）及びＪＮＫ（ＳＰ６００１２５  ２０μＭ、ＳＰ）の共同阻害による概日周期の著しい相加的な延長が示される（＊＊ｐ＜０．０１  one-way ANOVA；ｎ．ｓ．＝有意でない）。
【図１９】連結したＡＣ依存的シグナル伝達経路及び転写フィードバックループから概日時計機構がどのように生じるかという図解モデルである。時計の特徴的なフィードバック振動子は、周期的な、交互の活性化並びにＥ−ｂｏｘ及びＲＯＲＥなどのＤＮＡ制御配列の阻害により促進される自己調節フィードバックループ（緑色）を含む。ループの転写アウトプットは、概日生物学を維持する種々の細胞外シグナルに翻訳される。概日転写ループは、時計遺伝子のＡＰ−１ＤＮＡ制御配列によっておそらく作用するＥｐａｃ及びＪＮＫ（赤色）を介して、アデニリルシクラーゼ（ＡＣ）シグナル伝達により維持される。ＡＣ活性の概日サイクルは、細胞内転写ループ（例えば、ＡＣの周期的発現）並びにＧｓα及びＧｓｉ（青色）に作用する求心性刺激のアウトプット産物である。転写フィードバックループ又はＡＣシグナル伝達の阻害は、時計機構を一時停止させるか、その周期を変えることができる。ＳＣＮ回路内で、２つの更に特別な状態が当てはまる。第一に、ＶＩＰ神経分泌の形態の１個の細胞の細胞外アウトプットは、シナプス後細胞への刺激を同調及び持続させるはずである。第二に、グルタミン酸作動性刺激に仲介される網膜神経支配は、［Ｃａ＋＋］ｉ依存性ＣＲＥ  ＤＮＡ制御配列を介する転写フィードバックループをリセットすることにより、時計細胞を同調させることができる。ＳＣＮ以外の組織において、ＡＣ及び［Ｃａ＋＋］ｉ依存性経路は代替の、組織特異的同調因子により対処されるはずであり、シグナル伝達カスケード間に広範な相互作用をおそらく含むと考えられる。
【図２０】概日遺伝子発現及びｃＡＭＰレベルに対するＡＣ阻害剤ＭＤＬ及びＴＨＦＡの異なる作用を示す図である。（ａ）対照のＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞の同調培養におけるｃＡＭＰレベルのＥＬＩＳＡにより、ＭＤＬ−１２３３０Ａ存在下で測定可能なｃＡＭＰの喪失が示される（平均＋ＳＥＭ、全てについてｎ＝３）。（ｂ）野生型mPer1::lucスライスに５μＭのＭＤＬ―１２３３０Ａを添加すると、転写振幅を抑制する。繰り返されるウォッシュアウト（矢印）後に能力のある概日転写を回復するまでの遅延が延長されることに留意する。（ｃ）代表的なトレースにより、mBmal1::lucレポーターをトランスフェクトした３Ｔ３細胞において概日遺伝子発現の急速な減少が示される。周期性を回復するために、ウォッシュアウト（矢印）の長期の繰り返しが再度必要であった。（ｄ）集団データにより、mBmal1::lucレポーターをトランスフェクトした３Ｔ３細胞においてＭＤＬ−１２３３０Ａによる概日遺伝子発現の用量依存的な抑制、及びウォッシュアウトによる反転が示される（平均＋ＳＥＭ、ｎ≧３、薬剤効果ｐ＜０．０００１、2-way ANOVA）。（ｅ）ＮＩＨ３Ｔ３細胞へのＴＨＦＡの添加は、ｃＡＭＰのピークレベルを抑制するが、基底レベルを維持する（平均＋ＳＥＭ、全てについてｎ＝３、対照データは（ａ）に記載の通り）。（ｆ）（ｅ）に記載のものと同様であるがmBmal1::lucをトランスフェクトした線維芽細胞培養における概日遺伝子発現パターンは、ｃＡＭＰピーク力価の低下が概日周期の延長にともなうことを示す。
【図２１】ＰＫＡ阻害がＳＣＮの概日遺伝子発現に影響を及ぼさないことを示す図である。（ａ）mPER2-LUC  ＳＣＮスライスの代表的なトレースにより、ＰＫＡ調節サブユニットに対する阻害剤による処理（赤のトレース、３００μＭのＲｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰＳに加えて１００μＭのＲｐ−８−ＣＰＴ−ｃＡＭＰＳ）は、媒体（黒のトレース）と比較して、概日周期にも転写振幅にも大きな影響を及ぼさなかった。（ｂ）、（ｃ）２種類のＰＫＡＲが転写振幅（ｎ＝４、ｐ＝０．８９、両側ｔ−検定）、及び概日周期（ｎ＝４、ｐ＝０．１５、両側ｔ−検定）のどちらに対しても大きな影響を及ぼさないことを示す集団データ。（ｄ）ＰＫＡ触媒サブユニットに対する阻害剤（１μＭ  ＫＴ５７２０）を用いたmPer1::luc  ＳＣＮスライスの代表的なトレースにより、周期及び転写振幅のどちらに対してもＰＫＡＣ阻害は大きな大きな影響を及ぼさないことが示される。（ｅ）、（ｆ）集団データにより、転写振幅（ｎ＝３、ｐ＝０．３４、2-way ANOVA相互作用）、及び概日周期（ｎ＝３、ｐ＝０．７５、2-way ANOVA相互作用）のどちらに対してもＰＫＡＣ阻害は大きな影響を及ぼさないことが示される。
【図２２】Ｅｐａｃ／ＪｕｎＫ経路がｃＡＭＰ／ＡＣシグナル伝達の概日効果を仲介することを示す図である。（ａ）集団データにより、ＭＤＬ存在下においてＥｐａｃアゴニストによる概日遺伝子発現の急激な誘導が示される。処理前、集団間に大きな差異はなかった（ｐ＝０．８）が、１００μＭのＥｐａｃアゴニストはルシフェラーゼ活性を著しく増大させた（ｐ＝０．０１６、薬剤効果  2-way ANOVA）（平均＋ＳＥＭ、ｎ＝５）。（ｂ）集団データ（平均＋ＳＥＭ、処理毎のｎ＝４）により、Ｒａｐ１Ｓ１７ＮによるＥｐａｃ阻害後の３Ｔ３細胞において概日振幅の顕著な（ｐ＜０．０１）抑制が確認される。（ｃ）集団データ（平均＋ＳＥＭ、処理毎のｎ＝５）により、空のベクター（黒色）と比較して、mBmal1::lucレポーターをトランスフェクトし、Ｅｐａｃ１（青色）又はＥｐａｃ２（赤色）に対する干渉ＲＮＡにより処理した３Ｔ３細胞において、概日遺伝子発現の減少が示される（薬剤効果ｐ＜０．０１、2-way ANOVAによる）。（ｄ）３Ｔ３細胞抽出物の代表的なウェスタンブロット（各２レーン）により、Ｅｐａｃアゴニスト（１００μＭ、２時間）の添加がＭＤＬ（５０μＭ）と４０時間インキュベーション後にＪＮＫリン酸化の低下を反転させることが示される。Ｅｐａｃは、ＣＲＥＢリン酸化に対して影響を及ぼさなかった。（ｅ）集団データ（平均＋ＳＥＭ、ｎ＝４  独立した実験）により、ＭＤＬで処理した３Ｔ３細胞におけるＥｐａｃによるＪＮＫ活性化の顕著な増大が示される（＊ｐ＜０．０５  one-way ANOVA）。（ｆ）代表的なトレースにより、ＡＣ（ＴＨＦＡ  １ｍＭ）活性とＪＮＫ（ＳＰ６００１２５  ２０μＭ）活性の同時阻害は、媒体処理（黒のトレース）と比較して、３Ｔ３細胞における概日周期を劇的に延長する（赤のトレース）ことが示される。（ｇ）集団データ（平均＋ＳＥＭ、ｎ＜３）により、ＡＣ（ＴＨＦＡ  １ｍＭ、ＴＨ）及びＪＮＫ（ＳＰ６００１２５  ２０μＭ、ＳＰ）の共同阻害による、Bmal1;;lucレポーターをトランスフェクトした３Ｔ３細胞における概日周期の顕著な相加的延長、並びにＴＨＦＡ及びＩＢＭＸ（３００μＭ、ＩＢ）の非相加的な作用が示される（＊＊ｐ＜０．０１、one-way ANOVAによる、ｎ．ｓ．＝有意でない）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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