(57)【要約】  本発明は、プレキシンＤ１の発現を伴う疾患の治療又は診断において標的可能なタンパク質として使用するためのプレキシンＤ１に関する。診断は、身体又は体組織若しくは体液中でプレキシンＤ１の存在を検出することによって適切に実施されるのに対し、治療は、治療を要する部位へ治療薬を送達するためにプレキシンＤ１を標的化することによって実施される。本発明は、更に、プレキシンＤ１の発現を伴う疾患の治療又は診断のための治療用組成物の調製のために、プレキシンＤ１、プレキシンＤ１をコードする核酸又はプレキシンＤ１のリガンドを結合する分子の使用に関する。疾患は、プレキシンＤ１が、腫瘍細胞、腫瘍血管又は活性化されたマクロファージで発現する疾患を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プレキシンＤ１の発現を伴う疾患の治療又は診断における標的可能なタンパク質として使用するためのプレキシンＤ１。
【請求項２】
診断が、身体又は体組織若しくは体液中のプレキシンＤ１の存在を検出することによって実施される、請求項１に記載のプレキシンＤ１。
【請求項３】
治療が必要とされる部位への治療薬の送達のためにプレキシンＤ１を標的化することによって治療が実施される、請求項１に記載のプレキシンＤ１。
【請求項４】
プレキシンＤ１とそのリガンドとの相互作用を妨害することによって治療が実施される、請求項１に記載のプレキシンＤ１。
【請求項５】
プレキシンＤ１の機能を妨害することによって治療が実施される、請求項１に記載のプレキシンＤ１。
【請求項６】
プレキシンＤ１をコードする遺伝子の発現を妨害することによって治療が実施される、請求項１に記載のプレキシンＤ１。
【請求項７】
プレキシンＤ１の発現を伴う疾患の治療又は診断のための治療用組成物の調製のための、プレキシンＤ１、プレキシンＤ１をコードする核酸又はプレキシンＤ１のリガンドを結合する分子の使用。
【請求項８】
疾患が、腫瘍細胞、腫瘍血管又は活性化されたマクロファージ上にプレキシンＤ１が発現されている疾患を含む、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
疾患が、脳腫瘍、特に、星状細胞腫、乏突起膠腫及び血管芽腫、大腸癌、特に大腸の管癌、前立腺癌、腎臓細胞癌、特に腎臓明細胞癌、乳癌、特に乳管癌、卵巣癌、扁平上皮細胞癌、黒色腫、肺癌、特に小細胞肺癌及び非小細胞肺癌、軟部組織肉腫から選択される、請求項７又は８に記載の使用。
【請求項１０】
疾患が、炎症性疾患である、請求項７又は８に記載の使用。
【請求項１１】
炎症性疾患が、自己免疫疾患である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
自己免疫疾患が、関節リウマチである、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
炎症性疾患が、アテローム性動脈硬化症又は多発性硬化症である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１４】
プレキシンＤ１を結合する分子が、抗体、抗体断片、タンパク質ドメイン、ペプチド、小分子、ＤＮＡ又はＲＮＡアプタマーから選択される、請求項７に記載の使用。
【請求項１５】
プレキシンＤ１をコードする核酸を結合する分子が、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスホスホチオオリゴヌクレオチドから選択される、請求項７に記載の使用。
【請求項１６】
プレキシンＤ１リガンドを結合する分子が、リガンドに対する抗体、プレキシンＤ１の可溶性外部ドメイン、プレキシンＤ１結合部位に対して親和性を有するペプチドから選択される、請求項７に記載の使用。
【請求項１７】
結合分子が、検出可能なマーカーで標識される、請求項７ないし１６の何れか一項に記載の使用。
【請求項１８】
検出可能なマーカーが、放射性標識、常磁性標識、蛍光標識、化学発光標識から選択される、請求項１２に記載の使用。
【請求項１９】
結合分子に、エフェクター化合物又はエフェクター化合物を含むナノデバイスが付与される、請求項７ないし１８の何れか一項に記載の使用。
【請求項２０】
エフェクター化合物が、毒素、血栓症誘発化合物、化学療法剤、放射性部分、アポトーシス誘発ペプチド、特に（ＫＬＡＫＬＡＫ）２である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
毒素が、血栓症を誘発するために上皮細胞を損傷又は死滅させ、及び特にリシンである、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
血栓症誘発化合物が、末端切断型組織因子である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２３】
化学療法剤が、ドキソルビシン、シスプラチン、硫酸ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル及びシクロホスファミドヒドロキシ尿素から選択される、請求項２０に記載の使用。
【請求項２４】
放射性実体が、テクネチウム９９ｍ、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、レニウム−１８６又は−１８８、ガリウム−６７、イットリウム−９０、ルテチウム−１７７から選択される、請求項２０に記載の使用。
【請求項２５】
ナノデバイスが、リポソーム、ポリマーソーム（ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅ）、特にブロック共重合体から構成されるポリマーソムである、請求項１９に記載の使用。
【請求項２６】
プレキシンＤ１結合分子。
【請求項２７】
Ａ１２（配列番号１）、Ｆ８（配列番号２）、１１Ｆ５Ｈ６（配列番号３）又は１７Ｅ９Ｃ１２（配列番号４）のプレキシンＤ１結合部分を含む、請求項２６に記載のプレキシンＤ１結合分子。
【請求項２９】
請求項１８に記載の検出可能なマーカーに連結結合された、請求項２６又は２７に記載のプレキシン結合分子。
【請求項３０】
エフェクター分子又は、エフェクター化合物を含むナノデバイスへ結合されており、前記エフェクター化合物が請求項２０ないし２４の何れか一項に定義されているとおりである、請求項２６又は２７に記載のプレキシン結合分子。
【請求項３１】
ナノデバイスが、請求項２５に定義されるとおりである、請求項２６又は２７に記載のプレキシン結合分子。
【請求項３２】
請求項２９に記載のプレキシン結合分子を含む、診断用組成物。
【請求項３３】
請求項３０ないし３２の何れか一項に記載のプレキシン結合分子を含む、治療用組成物。
【請求項３４】
一本鎖抗体Ａ１２（配列番号１）。
【請求項３５】
一本鎖抗体Ｆ８（配列番号２）。
【請求項３６】
一本鎖抗体１１Ｆ５Ｈ６（配列番号３）。
【請求項３７】
一本鎖抗体１７Ｅ９Ｃ１２（配列番号４）。
【請求項３８】
方法が、分子の群をプレキシンＤ１と接触させること、及びプレキシンＤ１結合分子としてプレキシンＤ１への結合を示す分子を、プレキシンＤ１結合分子として、前記群から選択することを含む、プレキシンＤ１に結合できる前記分子を同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍、特に固形腫瘍、及び炎症、特に関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症及び多発性硬化症を伴う疾患の治療及び診断において使用できる新規の標的可能なタンパク質の同定に関する。
【背景技術】
【０００２】
２ないし３ｍｍ３の大きさを超えて発達するために、腫瘍は、血管新生を介して新生血管を動員する必要がある。腫瘍中心での低酸素症によって誘発され、又は腫瘍抑制因子遺伝子産物若しくは活性化された癌原遺伝子の機能が異常化する結果として誘導された血管内皮増殖因子−Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）の発現を介して、腫瘍はこれを達成する。血管新生を阻害し、その結果、腫瘍の増殖を阻害する目的で、ＶＥＧＦ−Ａシグナル伝達経路を標的とする多くの化合物が開発されてきた。このような抗血管新生治療は、動物腫瘍モデルにおいて有効であったが、臨床レベルへの移行は、これまでのところ、それほど成功していないことが判明している（Ｅｉｃｈｈｏｒｎ，ＭＥ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔ  Ｕｐｄａｔｅ  ７：１２５−１３８（２００４））。
【０００３】
これに対しては、可能な説明が多数存在する。臨床的に妥当な状況において、腫瘍は、診断の時点ですでに何ヶ月間も、あるいは何年間も増殖し続けてきた可能性があり、脈管構造の著しい割合は、多かれ少なかれ成熟しており、このため、血管新生阻害に対して非感受性である可能性がある。この状況は、概して、迅速に増殖する浸潤性腫瘍が研究されている多くの動物モデルにおけるものと好対照を成す。更に、抗血管新生治療の候補である患者は、典型的には、転移した調節不可能な癌を有する患者であり、転移の発達は、必ずしも血管新生に厳密に依存するとは限らない。多くの転移は、血液により運搬されるため、既存の血管による吸収によって、転移が血管新生非依存的様式で増殖することができる肝臓、肺及び脳のように、本質的に高い血管密度を有する臓器中で増殖する。
【０００４】
実際、数多くの皮下腫瘍モデルで腫瘍の増殖を極めて効果的に阻害する血管新生阻害剤（Ｗｅｄｇｅ，ＳＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６２：４６４５−４６５５（２００２））は、マウスの脳において浸潤性腫瘍の増殖を阻害しない。更に、著しい血管新生が生じた脳腫瘍を有するマウスの治療に際して、血管新生阻害は、更なる腫瘍の進行の停止をもたらさず、むしろ吸収及び浸潤に向けた表現型のシフト後に進行をもたらす（Ｌｅｅｎｄｅｒｓ，ＷＰ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：６２２２−６２３０（２００４））。これらの結果は、既存の腫瘍血管床が攻撃され、腫瘍の血液供給の崩壊による二次性腫瘍細胞死をもたらす血管標的療法によって、抗血管新生療法が補充されるべきであることを示唆する。
【０００５】
効果的な血管標的療法を達成するためには、腫瘍血管に対して特異性を有するマーカーが同定されなければならない。これに対して、多大なる努力がすでに為されてきたが、成功の程度は異なっている。効果的な血管腫瘍標的化は、血管新生腫瘍中に新たに形成された血管の細胞外マトリクス内に選択的に発現及び沈着されるフィブロネクチンＥＤ−Ｂドメインに対して誘導された一本鎖抗体を使用して達成されている（Ｓａｎｔｉｍａｒｉａ，Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ９：５７１−５７９（２００３））。ＲＧＤペプチド又はビタキシンを用いたαｖβ３−インテグリンの標的化（その発現は、未熟な血管に限定される。）は、不本意な結果に至ったのに対し、エンドグリン発現は、腫瘍血管に特異的ではなかった（Ｐｏｓｅｙ，ＪＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ  １６：１２５−１３２（２００１）、Ｂａｌｚａ，Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ９４：５７９−５８５（２００１））。
【０００６】
関節リウマチ（ＲＡ）又はアテローム性動脈硬化症等の炎症性疾患では、血管新生及び血管の活性化も、しばしば病変の一部である。ここでは、血管は、炎症細胞が血管外に滲出し、その破壊的作用を発揮する道を築く。従って、このような疾病には、血管への標的化が有益であり得る。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
それゆえ、癌及び炎症性疾患又は炎症を伴う疾病の治療及び診断において使用できる新たな標的可能なタンパク質を提供することが、本発明の目的である。
【０００８】
本発明に至る研究において、腫瘍血管中の内皮細胞の管腔側に、腫瘍細胞自体の上に、並びに、腫瘍、炎症及び動脈硬化性プラークで見られる活性化されたマクロファージ上に、プレキシンＤ１が発現されていることが明らかとなった。
【０００９】
従って、本発明は、プレキシンＤ１の発現を伴う疾患の治療又は診断における標的可能なタンパク質としての使用のためのプレキシンＤ１に関する。
【００１０】
受容体のプレキシンファミリーは、哺乳動物において、４つのクラス（ＰＬＸＮＡ−Ｄ）及び９つのメンバーからなる。プレキシンは、ＭＥＴ遺伝子ファミリーによってコードされる散乱因子受容体に対して相同性を有する大きな単回膜通過タンパク質のファミリーを含む。プレキシンファミリーのメンバーは、Ｓｅｍａドメイン、Ｍｅｔ関連配列（ＭＲＳ）、膜通過領域及びＲａｃ／Ｒｈｏ−ＧＴＰａｓｅシグナル伝達を予測する細胞内モチーフを共有する（図１）。
【００１１】
ＧＴＰａｓｅを介するシグナル伝達は、糸状仮足及び葉状仮足の形成及び細胞遊走に強く関与する事象である細胞骨格再編成を生じるので、プレキシンは、遊走の制御因子と考え得る。
【００１２】
プレキシンは、７つのサブクラスに細分される分泌型、ＧＰＩ−アンカー型又は膜貫通タンパク質のファミリーであるセマフォリンに対する受容体である。各プレキシンは、それ自体のセマフォリン結合対（のセット）を有し、各プレキシン−セマフォリンの組み合わせは、特異的な応答を生じる。クラス３のセマフォリンは、有力な軸索忌避剤であり、従って、神経系の形態形成に関与する（総説に関しては、Ｐａｓｔｅｒｋａｍｐ，ＲＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  １３：７９−８９（２００３）、Ｆｕｊｉｓａｗａ，Ｈ，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  ５９：２４−３３（２００４）参照）。セマフォリンによるプレキシンの活性化のためには、更なるプレキシン結合対が必要とされ得る。これらの結合対であるニューロピリン−１及び−２（ＮＰ−１及びＮＰ−２）は、細胞内ドメインにシグナル伝達モチーフを有さず、受動的な共受容体と考えられており、セマフォリンとプレキシンの間での相互作用を可能にする。
【００１３】
幾つかのプレキシンは、更に大きな膜複合体を形成し、オフトラック（Ｏｔｋ）としてシグナル伝達受容体及び散乱因子受容体Ｍｅｔ及びＲｏｎを活性化する。プレキシンＡ１と血管新生血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）との直接的な相互作用も示されている（Ｔｏｙｏｆｕｋｕ，Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅ−ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １８：４３５−４４７（２００４））。ＮＰ−１は、プレキシンファミリーメンバーに結合するが、ＶＥＧＦＲ２にも結合するので、ＶＥＧＦＲ２、ＮＰ−１及びプレキシンを包含する多成分膜タンパク質複合体が存在すると考えられており、プレキシンと血管新生との関連を確立する（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，ＢＭ，Ｃｅｌｌ，１２０：２９９−３０２（２００５）も参照）。
【００１４】
ニューロピリンも、有力な血管新生因子である血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ１６５）に対する共受容体であり、ＶＥＧＦＲ２に対するその親和性を増強させる。興味深いことに、ＮＰ−１上のＶＥＧＦ−Ａ１６５結合部位は、セマフォリン３Ａに対するものと重複する（Ｍｉａｏ，Ｈ  Ｑ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４６：２３３−２４２（１９９９））。ＮＰ−１へのＶＥＧＦ−Ａの結合は、クラス３セマフォリンの結合と競合することによって内皮細胞の遊走を促進し、その後、一般的には、Ｆ−アクチンの脱重合及び細胞伸長の反発が生じると推測されている（Ｂａｃｈｅｌｄｅｒ，ＲＥ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６３：５２３０−５２３３（２００３））。ＶＥＧＦ−Ａ及びクラス３セマフォリンの同様の拮抗性挙動が、ニューロン前駆細胞系（Ｂａｇｎａｒｄ，Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２１：３３３２−３３４１（２００１））及び腫瘍細胞（Ｂａｃｈｅｌｄｅｒ（２００３）、上述）において記述されてきた。ＶＥＧＦ受容体を欠失する腫瘍細胞において、拮抗性効果が観察されたので、基礎をなす機序には、プレキシンファミリーのメンバーが関与していると考えられており、プレキシンとＶＥＧＦ−Ａシグナル伝達の間の更なる関連を確立する。
【００１５】
本発明者らは、ファミリーメンバーであるプレキシンＤ１（ｐｌｘｎＤ１）が、発達の初期段階中に、ニューロン細胞においてのみならず、血管内皮細胞においても発現されていることをすでに発見しており（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｚｗａａｇ，Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｄｙｎ  ２２５：３３６−３４３（２００２））、２つの他のグループによってこの見解は確認された（Ｇｉｔｌｅｒ，ＡＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ  ７：１０７−１１６（２００４）、Ｔｏｒｒｅｓ−Ｖａｚｑｕｅｚ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ  ７：１１７−１２３（２００４））。成人の血管では、ｐｌｘｎＤ１は欠失している。ｐｌｘｎｄ１遺伝子に突然変異を有するｐｌｘｎｄ１ノックアウトマウス及びゼブラフィッシュは、心臓血管系の発達不全を特徴とする（Ｇｉｔｌｅｒ，ＡＤ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）、上述、Ｔｏｒｒｅｓ−Ｖａｚｑｕｅｚ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）、上述）。ニューロピリン１（ＮＰ−１）及びＮＰ−１／ニューロピリン２（ＮＰ−２）二重ノックアウトマウスも、胚発生中に、血管新生の致死的な欠陥を及び大動脈弓の形成異常を示す（Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２６：４８９５−４９０２（１９９９）、Ｔａｋａｓｈｉｍａ，Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：３６５７−３６６２（２００２）、Ｇｕ，Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ  ５：４５−５７（２００３））。
【００１６】
更に、ゼブラフィッシュでのＮＰ−１のモルフォリノ仲介性ノックダウンは、セグメント間の血管の発達不全を引き起こし、このモデル系において、ＮＰ−１とＶＥＧＦ−Ａ１６５の間の明確な関連が確立されてきた（Ｌｅｅ，Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：１０４７０−１０４７５（２００２））。ｐｌｘｎｄ１、ニューロピリン１及びセマフォリン３Ｃノックアウトマウスの表現型の類似性（Ｆｅｉｎｅｒ，Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２８：３０６１−３０７０（２００１））は、プレキシンＤ１がセマフォリン３Ｃに対するニューロピリン１依存性受容体であるという知見（Ｇｉｔｌｅｒ，ＡＤ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）、上述）と一致する。しかしながら、ｐｌｘｎＤ１は、セマフォリン３Ｅに対する受容体でもあり、この相互作用は、セマフォリン３Ｅ仲介性シグナル伝達のためにニューロピリンを必要としない（Ｇｕ，Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０７：２６５−２６８（２００５））。
【００１７】
本発明により、プレキシンＤ１が、腫瘍の増殖中の血管新生にも関与していること、及び腫瘍血管中の内皮細胞の管腔側に発現されていることがここに明らかとなった。プレキシンＤ１は、更に、活性化されたマクロファージによって発現されることが見出された。プレキシンＤ１は、様々な腫瘍の種類の腫瘍細胞で発現することも見出された。
【００１８】
従って、本発明は、プレキシンＤ１の発現を伴う疾患の治療又は診断における標的可能なタンパク質としての使用のためのプレキシンＤ１に関する。
【００１９】
診断は、身体又は体組織若しくは体液中のプレキシンＤ１又はプレキシンＤ１コード核酸の存在を検出することによって実施される。
【００２０】
治療は、治療が必要な部位への治療薬の送達のためにプレキシンＤ１を標的化することによって、プレキシンＤ１とそのリガンドとの相互作用を妨害することによって、プレキシンＤ１遺伝子の発現を妨害することによって、又はプレキシンＤ１リガンドを捕捉してプレキシンＤ１との相互作用を阻害することによって実施される。
【００２１】
従って、本発明は、プレキシンＤ１の発現を伴う疾患の治療又は診断のための治療用組成物の調製のために、プレキシンＤ１、プレキシンＤ１をコードする核酸又はプレキシンＤ１のリガンドを結合する分子の使用に関する。これらの分子は全て本明細書において、「結合分子」又は「結合実体」として同定される。
【００２２】
疾患は、特に、プレキシンＤ１が、腫瘍細胞、腫瘍血管又は活性化されたマクロファージ上に発現される疾患を含む。
【００２３】
プレキシンＤ１が発現されている腫瘍細胞は、脳腫瘍、特に、星状細胞腫、乏突起膠腫及び血管芽腫、結腸癌、特に結腸管癌、前立腺癌、腎臓細胞癌、特に腎臓明細胞癌、乳癌、特に乳管癌、卵巣癌、扁平上皮細胞癌、黒色腫、肺癌、特に小細胞肺癌及び非小細胞肺癌、軟部組織肉腫等を含む。
【００２４】
本発明に従って治療される疾患が炎症性疾患である場合には、前記疾患は特に自己免疫疾患であり、より具体的には関節リウマチであるか、又は前記疾患はアテローム性動脈硬化症若しくは多発性硬化症である。
【００２５】
プレキシンＤ１を結合する分子は、例えば、抗体、抗体断片、タンパク質、タンパク質ドメイン、ペプチド、小分子から選択される。これらの分子は、プレキシンを標的化するために使用できる。
【００２６】
プレキシンＤ１をコードする核酸を結合する分子は、例えば、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスホスホチオ−オリゴヌクレオチドから選択される、ＲＮＡ又はＤＮＡアプタマー等のオリゴヌクレオチドである。これらの分子は、プレキシンＤ１の発現を妨害するために使用できる。
【００２７】
プレキシンＤ１リガンドを結合する分子は、例えば、リガンドに対する抗体、プレキシンＤ１又は、プレキシンＤ１リガンドを結合する、ペプチド等の小分子の可溶性外部ドメインから選択される。これらの分子は、循環しているプレキシンＤ１リガンドを捕捉し、腫瘍血管、腫瘍細胞又は活性化されたマクロファージ上でプレキシンＤ１に対するリガンドの結合を抑制し、これらの細胞上でプレキシンＤ１の機能を妨害するのに使用できる。
【００２８】
診断においては、結合分子は、検出可能なマーカーで適切に標識される。このような検出可能なマーカーは、例えば、放射性標識、常磁性標識、蛍光標識、化学発光標識から選択される。診断は、生体内、原位置又は生体外の体液又は体組織の試料中で実施できる。診断技術の例は、例えば、生検又は腫瘍細胞上でのプレキシンＤ１ｍＲＮＡのインサイチュハイブリダイゼーション又は免疫組織化学である。
【００２９】
治療においては、例えば、腫瘍細胞及び／又は腫瘍内皮細胞を損傷又は死滅させる実体、特に放射性核種、毒素、ホウ素中性子捕捉療法（ＢＮＣＴ）のためのホウ素、又は開裂可能なリンカーの開裂に反応して活性化される前記リンカーを介して結合実体へ連結されたプロドラッグ、又は一例が（ＫＬＡＫＬＡＫ）２配列であるアポトーシス誘発ペプチドが結合分子に提供される。このようなペプチドは、分子の遺伝子工学技術によって結合実体へ付加される。上述の実体は、結合実体へ直接結合され得るか、又は上述の実体は結合実体へ結合されたリポソーム又はポリマーソーム等のナノデバイス中に存在し得る。
【００３０】
ホウ素中性子捕捉療法（ＢＮＣＴ）は、腫瘍又は炎症等の罹患した領域の照射を含み、ここで、ホウ素は、中性子とともに、リポソーム結合体の静脈内注射後に蓄積し、その後、ホウ素原子は破壊性アルファ粒子の放出下でリチウムへ壊変する。
【００３１】
あるいは、療法は、腫瘍血管中に局所的な血栓症を誘発して、腫瘍への血液供給を遮断し、細胞死を誘発することによって行われ得る。このような分子の一例は、組織因子（ＴＦ）である。
【００３２】
有利なことに、プレキシンＤ１は、腫瘍血管中の内皮細胞の管腔側で発現するので、プレキシンＤ１は、静脈内投与に際し、特異的結合分子で標的化できる。結合分子へ連結された腫瘍細胞を損傷又は死滅させるための治療用化合物は、内部から腫瘍に到達でき、血栓症を誘発する化合物は、それらの作用部位へ簡単に送達される。
【００３３】
プレキシンＤ１機能の妨害は、血管新生を阻害し、腫瘍細胞遊走を阻害し、マクロファージ遊走を阻害する方法となる。従って、本発明は、プレキシンＤ１の特異的存在を使用することによって、罹患した組織へ局所的に治療薬を送達することによって、及び／又はプレキシンＤ１の機能若しくはプレキシンＤ１とそのリガンド間の相互作用の妨害によってプレキシンＤ１が関与する疾患を治療又は抑制する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
本発明は、従って、腫瘍血管上の標的可能なマーカーとして、腫瘍血管新生に関与する標的可能なタンパク質として、腫瘍細胞上の標的可能なマーカーとして、細胞遊走に関与する標的可能なタンパク質として、プレキシンＤ１を使用できるという事実に基づいている。
【００３５】
従って、本発明は、診断及び治療においてプレキシンＤ１、その遺伝子若しくはｍＲＮＡ又はそのリガンドへ結合する分子の使用にも関する。特定の結合分子の全ての種類及びそれらの誘導体を本発明において使用することが可能であり、特に、以下に限定されるわけではないが、抗体、抗体断片、単一ドメイン抗体断片等のタンパク質性化合物、以下に限定されるわけではないが、リポカリン等のタンパク質性結合ドメイン、及びプレキシンＤ１又はそのリガンドと特異的に結合する小分子を使用することができる。プレキシンＤ１遺伝子又はプレキシンＤ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡに対する結合のため、ＤＮＡ又はＲＮＡアプタマー等の核酸分子が使用できる。
【００３６】
本発明の第一の実施形態において、プレキシンＤ１又はプレキシンＤ１リガンド結合分子は、抗体、特にモノクローナル抗体、より特別には元の抗体の定常部が、ヒト抗体の定常部と置換されたヒト若しくはヒト化抗体、又はプレキシンＤ１若しくはそのリガンドへなお結合するヒト若しくはヒト化抗体である。
【００３７】
抗体は、好ましくはヒトＩｇＧ１抗体である。しかしながら、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ及びＩｇＥを含む他のヒト抗体分子種も本発明によって包含される。また、多様な分子種の動物由来の抗体は全て、本発明において使用できる。
【００３８】
抗体は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖Ｆｖ断片、又は単一ドメインＶＨＨ、ＶＨ又はＶＬ単一ドメインを含むフルサイズの抗体又は抗体の抗原結合断片であり得る。
【００３９】
好ましくは、プレキシンＤ１に対する抗体は、不死化された細胞へ融合された、ヒト重鎖導入遺伝子及びヒト軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する免疫化されたトランスジェニック動物から得られるＢ細胞を含むハイブリドーマ細胞によって産生されるヒトモノクローナル抗体であり、又は不死化された細胞へ融合された、免疫化動物から得られるＢ細胞を含むハイブリドーマ細胞によって産生される動物由来の抗体若しくは抗体断片、又は該抗体若しくは抗体断片をコードするｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡがで形質移入された真核細胞によって産生されるヒト及び動物抗体である。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態において、プレキシンＤ１に対する親和性を有する単一ドメイン（ＶＨＨ）ラマ抗体が提供され、より具体的には、Ｍ１３バクテリオファージ上にディスプレイされた又はされていないラマ単一ドメイン抗体Ａ１２（配列番号１）及びＦ８（配列番号２）（ファージディスプレイＶＨＨ抗体としても当業者に知られている。）が提供される。
【００４１】
好ましい一本鎖抗体は、抗体１１Ｆ５Ｈ６及び１７Ｅ９Ｃ１２から得られる。一本鎖抗体の配列は、配列番号３及び配列番号４に示されている。
【００４２】
本発明に従って使用するための抗体は、非トランスジェニックの実験動物において、又は内在性グロブリン座が、ヒトグロブリン座と置換されており、従って、このような動物中でヒト抗体を産生できるトランスジェニック動物において惹起される高親和性抗体であり得る（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６：５６１−５６６（１９９５））。
【００４３】
本発明は、更に、プレキシンＤ１、又はプレキシンＤ１若しくはプレキシンＤ１をコードする核酸、若しくはプレキシンＤ１の細胞外ドメインの一部を発現する細胞で動物を免疫化し、これによりプレキシンＤ１に対する抗体が、動物のＢ細胞によって産生されること、前記Ｂ細胞を動物から単離し、前記Ｂ細胞をミエローマ細胞系へ融合して、抗体を分泌する不死化細胞を得ることを含む、本発明の抗体を産生する方法に関する。前記動物は、好ましくは、ヒト重鎖導入遺伝子及びヒト軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック動物であり、これにより得られた抗体がヒト化される。
【００４４】
ある実施形態において、前記方法は、プレキシンＤ１細胞外ドメインから選択される合成ペプチド、例えば成熟プレキシンＤ１アミノ酸配列のアミノ末端に対応するペプチド４７ないし６３で実験動物を免疫化することを含む。しかしながら、免疫化は、好ましくは、組換え細胞外ドメイン、好ましくはプレキシンの他のファミリーメンバーと類似性の低い領域、例えばＭｅｔ関連配列を欠失するアミノ酸４７ないし５４６を含む領域において実施される。該組換えプレキシンＤ１細胞外ドメインは、例えばβ−ガラクトシダーゼプロモーターの調節下での、適切な原核生物発現ベクター中へのコード核酸の挿入、該ベクターによるＥ．コリ細胞の形質転換、及び精製された封入体からの組換えタンパク質の単離によってＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞中で生成できる。しかしながら、抗体は、真核細胞、例えばベクターによる形質移入後のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞によって産生される該組換えプレキシンＤ１細胞外ドメインで免疫化すること、それゆえ、未変性のプレキシンＤ１中に存在するものと最も同様な翻訳後修飾を含有し、サイトメガロウィルスプロモーターの調節下で該細胞外ドメインのコード核酸を含有することが好ましい。組換え細胞外プレキシンＤ１断片は、精製を容易にするタグ、例えばＶＳＶタグ又は免疫グロブリンの重鎖の定常部へ融合されてもよいし又はされなくてもよい。
【００４５】
前記抗体を産生する方法は、該プレキシンＤ１特異的Ｂ細胞から発現ベクター中に抗体コード領域をクローニングすること、及びコード配列を発現させることも含み得る。好ましい実施形態において、発現ベクターはＥ．コリ宿主細胞による抗体の発現を可能とし、水疱性口内炎ウィルス（ＶＳＶタグ）及びＨｉｓ＊８タグがカルボキシ末端に隣接するｐＨＥＮＩＸＨＩＳＶＳＶである。ＶＳＶタグは、特異的抗体を使用して、免疫組織化学的検出を容易にすることを目的としている。Ｈｉｓ＊８タグは、ニッケルアフィニティクロマトグラフィーに基づいた精製を容易にすることを目的としている。他の発現ベクターは、同様に使用できる。
【００４６】
より具体的には、本発明は、２×１０−８Ｍ未満の解離定数を有し、プレキシンＤ１のアミノ末端へ結合し、免疫組織化学的染色においてプレキシンＤ１を検出し、プレキシンＤ１発現腫瘍血管に向かう、単離された単一ドメイン抗体Ａ１２を提供し、３×１０−８Ｍ未満の解離定数を有し、プレキシンＤ１のアミノ末端へ結合し、免疫組織化学的染色においてプレキシンＤ１を検出し、プレキシンＤ１発現腫瘍血管に向かう、単離された単一ドメイン抗体F8もまた提供する。単離された単一ドメイン抗体はいずれも、ヒトＩｇＧ１重鎖の定常部又はマウスＩｇＧ１重鎖の定常部へ融合され得る。
【００４７】
好ましくは、完全にヒトの抗体は、本発明の範囲内で使用される。別の実施形態において、ヒト化又は実験動物由来の抗体が使用され得る。
【００４８】
本発明は、更に、プレキシンＤ１に対する結合特異性、及びヒト抗原呈示細胞に対するか又はＦｃ受容体に対する結合特異性を有する二重特異性抗体を提供し、その中で、前記Ｆｃ受容体は、Ｆｃ（ガンマ）Ｒ１又はヒトＦｃ（アルファ）受容体である。
【００４９】
本発明は、好ましい抗体又は抗原結合部分をコードする核酸分子も提供する。本発明の抗体をコードする核酸を含む組換え発現ベクター及び前記ベクターで形質移入された宿主細胞も、本発明に包含される。
【００５０】
本発明において使用するための他の結合分子は、プレキシンＤ１に特異的に結合する小分子である。「小分子」という用語は、しばしば、５００以下の分子量を有する分子を指す。前記用語は近年、普遍的に使用されており、従って、当業者に明確である。
【００５１】
更に、小分子ライブラリはすでに入手可能であるか又は開発中である。このようなライブラリの一例は、ＮＩＨ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（ＭＬＳＭＲ）である。このようなライブラリは、高処理量スクリーニング（ＨＴＳ）へ供され、プレキシンＤ１に結合する分子を同定する。本発明は、このようなライブラリのスクリーンから得られる小分子にも関する。
【００５２】
本発明に従って使用できる他の化合物は、プレキシンＤ１の細胞外ドメインに結合することにより、それによりプレキシンＤ１に対するプレキシンＤ１リガンドの結合を妨害するペプチド又はアプタマー（Ｕｌｒｉｃｈ，Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１（２）：１９９−２０８（２００５））を含む。逆に、このようなペプチド又はアプタマーは、プレキシンＤ１リガンドのプレキシンＤ１結合部位へも結合し得、これによりプレキシンＤ１へのリガンド結合を妨害する。
【００５３】
プレキシンＤ１遺伝子の発現を妨害するために、結合分子の別の種類、特にｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ又はアンチセンスホスホチオヌクレオチドが使用される。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、メッセンジャーＲＮＡの翻訳を妨害するＲＮＡの小さな鎖を含む。ｓｉＲＮＡは、標的メッセンジャーＲＮＡの相補的な部分に結合し、分解のために前記部分にタグを付し、これにより遺伝子発現を阻害する。これは、遺伝子「サイレンシング」として普遍的に公知である。ｓｉＲＮＡは、通常、２１ないし２３個のヌクレオチド長である。アンチセンスＲＮＡは、テンプレートよりもむしろコードＤＮＡ鎖から転写されるＲＮＡ分子であり、従って、センスｍＲＮＡと相補的である。センスとアンチセンスＲＮＡ分子の間の二本鎖の形成は、翻訳を遮断し、従って遺伝子の発現を阻害する二本鎖特異的ヌクレアーゼへ両分子を供することもできる。遺伝子発現の阻害は、血管新生並びに腫瘍細胞及びマクロファージの遊走を遮断するのに使用できる。
【００５４】
好ましくは、上述の結合分子は、真核細胞において、プレキシンＤ１、その遺伝子又はそのリガンドへ結合する。該分子は、静脈内注射の際、腫瘍中に特異的に蓄積するか又は、静脈内注射の際、腫瘍血管中に特異的に蓄積する。
【００５５】
抗体、その断片、全てプレキシンＤ１を結合する小分子及び他のタンパク質性化合物は、多様な方法で使用できる。
【００５６】
ある実施形態において、本発明は、プレキシンＤ１の細胞外部分に結合し、プレキシンＤ１の機能を妨害する化合物に関する。あるいは、本発明は、プレキシンＤ１の細胞内ドメインに結合し、プレキシンＤ１機能を妨害する化合物に関する。
【００５７】
特異的な実施形態において、このような結合分子は、プレキシンＤ１に結合し、プレキシンＤ１リガンド、特にニューロピリン−１、ニューロピリン−２、セマフォリン３Ｃ、セマフォリン３Ｅ、ＶＥＧＦ受容体１、ＶＥＧＦ受容体２又はＶＥＧＦ−ＡのプレキシンＤ１への結合を阻害することによって、多重成分膜複合体の形成を妨害する。このような結合分子は、プレキシンＤ１によるリガンド誘発性ＧＴＰａｓｅシグナル伝達の阻害又はプレキシンＤ１を発現させる細胞、特に腫瘍関連内皮細胞、腫瘍細胞又はマクロファージの遊走の阻害をもたらす。
【００５８】
前記実施形態の別の態様によると、本発明は、プレキシンＤ１を発現させる細胞の溶解が生じるように、ヒト効果器細胞の存在下で、プレキシンＤ１を発現させる細胞を、本発明の結合分子、特に抗体と接触させることを含む、プレキシンＤ１を発現させる細胞の溶解を誘導する方法に関する。
【００５９】
更なる実施形態において、結合分子は、診断目的のためにプレキシンＤ１の存在を検出することができ、又はプレキシンＤ１を発現させる細胞に及ぼす効果を実施することができるエフェクター化合物と組み合わせられ、又は連結される。診断用又は治療用エフェクター化合物は、結合分子に直接連結することが可能であり、又は、結合分子へ連結されるナノデバイス、特にリポソーム又はポリマーソーム等の輸送媒体中に存在することが可能である。あるいは、結合分子は、プレキシンＤ１と前記エフェクター化合物の両者を結合して、エフェクター化合物を、プレキシンＤ１の発現する部位又は細胞へ向けることができる二重特異性抗体であり得る。
【００６０】
従って、本発明は、その特定の実施形態において、結合分子のインビトロ検出を可能とするエフェクター化合物へ抱合されたタンパク質性の、アプタマーの又は小分子のプレキシンＤ１結合分子の静脈内送達を含むプレキシンＤ１の発現によって媒介される疾病の診断方法におけるこのような結合分子の使用を提供する。
【００６１】
診断用エフェクター化合物は、例えば、ガドリニウム−ＤＴＰＡ等の磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）のための放射性同位体若しくは造影剤、又は蛍光染色剤である。
【００６２】
放射性物質の例は、以下に限定されるわけではないが、テクネチウム９９ｍ（９９ｍＴｃ）、ヨウ素−１２３（１２３Ｉ）、ヨウ素−１３１（１３１Ｉ）、レニウム−１８６又は−１８８（１８６／１８８Ｒｅ）、ガリウム−６７（６７Ｇａ）、ベータ放射線放射物質イットリウム−９０（９０Ｙ）又はルテチウム−１７７（１７７Ｌｕ）、陽子放射同位体フッ素−１８（１８Ｆ）及び炭素−１１（１１Ｃ）を含む。このような放射性同位体は、プレキシンＤ１を発現させる細胞を検出し、又は損傷若しくは死滅させるために使用できる。通常、異なる放射性同位体が、診断及び治療に使用される。当業者は、どの放射性同位体をどの組織に対して使用するか、及びどの種類を使用するかを知悉している。
【００６３】
別の実施形態において、本発明において使用するためのタンパク質性の、アプタマーの及び小分子の結合分子は、直接的に又は媒体、特にリポソーム又はポリマーソーム等のナノデバイス中に入れて、化学療法剤等の毒性因子と組み合わせ、又は連結できる。
【００６４】
別の実施形態において、本発明のプレキシンＤ１結合実体は、窒素マスタード（例えば、シクロフォスファミド及びイフォスファミド）、アジリジン（例えば、チオテパ）、スルホン酸アルキル（例えば、ブスルファン）、ニトロソ尿素（例えば、カルムスチン及びストレプトゾシン）、白金複合体（例えば、カルボプラチン及びシスプラチン）、非古典的アルキル化剤（例えば、デカルバジン及びテモゾールアミド）、葉酸塩アナログ（例えば、メトトレキサート）、プリンアナログ（例えば、フルダラビン及びメルカプトプリン）、アデノシンアナログ（例えば、クラドリビン及びペントスタチン）、ピリミジンアナログ（例えば、フルオロウラシル（単独又はロイコボリンとの組み合わせで）及びゲムシタビン）、置換型尿素（例えば、ヒドロキシ尿素）、抗腫瘍抗生物質（例えば、ブレオマイシン及びドキソルビシン）、エピポドフィロトキシン（例えば、エトポシド及びテニポシド）、微小管剤（例えば、イリノテカン及びトポテカン）、酵素（例えば、アスパラギナーゼ）、サイトカイン（例えば、インターロイキン２及びインターフェロン［アルファ］）、モノクローナル抗体（例えば、トラスツズマブ及びベバシズマブ）、組換え毒素及び免疫毒素（例えば、組換えコレラ毒素Ｂ及びＴＰ−３８）、癌遺伝子療法、及び癌ワクチン（例えば、テロメラーゼに対するワクチン）からなる群から選択される１つ又はそれ以上の化学療法剤へ連結される。
【００６５】
化学療法剤は、好ましくは、ドキソルビシン、シスプラチン、硫酸ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル及びシクロホスファミドヒドロキシ尿素からなる群から選択される。他の化合物は、当業者に公知である。
【００６６】
腫瘍は、腫瘍血管中に局所的な血栓症を誘発させることによって、その血液供給を遮断することによっても治療できる。本発明の結合分子は、本実施形態において、血液凝固共因子ＴＦ（組織因子）等の血栓症誘発分子、放射性実体又はリシン等の毒素を、腫瘍の部位へ向かわせるために使用できる。エフェクター化合物は、結合分子、特にプレキシンＤ１結合分子へ連結することが可能であり、又はプレキシンＤ１結合分子へ連結されたリポソーム又はポリマーソーム等のナノデバイス中に存在することが可能である。
【００６７】
本発明に係る癌又は炎症性疾患を治療する別の方法は、ホウ素によるものである。本発明の結合分子は、治療用組成物を得るためにホウ素が充填された輸送ビヒクル、特にリポソーム又はポリマーソーム等のナノデバイスに抱合することが可能である。罹患した領域中への本組成物の送達及び蓄積の後、この領域を中性子で照射して、腫瘍内皮細胞、腫瘍細胞及び／又は活性化されたマクロファージを損傷又は死滅させる放射性及び細胞毒性アルファ粒子の放射をもたらす
腫瘍血管のため、標的化抗体は、プレキシンＤ１に対して高い親和性を有し、例えば１０−８Ｍより高く、好ましくは１０−９より高く、より好ましくは１０−１０Ｍより高いことが望ましい。しかしながら、抗体の高い親和性及び高分子量によって、腫瘍組織中への貫通が制限される。それゆえ、ＲＴ−ＰＣＲクローニングを介して得られる、該モノクローナル抗体をコードする核酸は、抗体誘導体、例えば定常部を欠失し一価である抗体、又は変異原性手法による血管標的化又は腫瘍貫通に対する最適な親和性に適した抗体断片を生じるのに使用できる。前記抗体誘導体は、より低い親和性及びより低分子量を有し、腫瘍細胞標的化特性が改善される。
【００６８】
本発明の異別の結合分子は、混合物中で組み合わされることができる。特異的な実施形態において、混合物のメンバーの親和性は変動する。このような組み合わせの一例は、モノクローナル抗体及び／又は抗体断片の混合物、又は抗体と小分子の混合物である。高い親和性のモノクローナル抗体は、血管を標的化するために使用できるのに対し、親和性のより低いより小さな断片は、腫瘍細胞を貫通して到達することができる。あるいは、プレキシンＤ１結合分子の混合物は、プレキシンＤ１リガンド結合分子及び／又はプレキシンＤ１をコードする核酸を結合する分子とともに使用できる。又は、プレキシンＤ１リガンド結合分子は、プレキシンＤ１をコードする核酸を結合する分子と組み合わせることができる。
【００６９】
本発明のプレキシンＤ１結合分子は、プレキシンＤ１の発現によって媒介される疾病を治療するのに有効な用量で、本発明の結合分子を静脈内送達することを含む、前記疾病を治療する方法において使用できる。
【００７０】
前記結合分子は、プレキシンＤ１結合分子と常磁性、蛍光性又は放射性トレーサーとの結合体の静脈内送達後の磁気共鳴画像法、光学的画像法、ＳＰＥＣＴ又はＰＥＴを含む、プレキシンＤ１の発現によって仲介される疾病を診断する方法においても使用できる。
【００７１】
結合分子は、更に、本発明のタンパク質性の小分子結合分子又はタンパク質性の小分子結合分子の組成物の静脈内送達を含む、プレキシンＤ１の発現によって媒介される疾病を治療又は抑制する方法において使用できる。
【００７２】
治療又は診断される疾病は、癌、炎症性疾患、特に関節リウマチ等の自己免疫疾患、又はアテローム性動脈硬化症若しくは多発性硬化症であり得る。
【００７３】
診断は、インビボ及びインビトロで実施できる。インビボでの方法は、上述されており、罹患した組織中の放射性標識した結合分子の蓄積の後に、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）又はＳＰＥＣＴ若しくはＰＥＴカメラを使用して実施できる。
【００７４】
別の診断方法は、インビトロ又はインビボで試料中のプレキシンＤ１の存在を検出することを含む。このような方法は、プレキシンＤ１の結合分子、又はプレキシンＤ１遺伝子若しくはそのｍＲＮＡ又は前記ｍＲＮＡから派生したコピーＤＮＡを結合する核酸と試料を接触させること、及び複合体の形成を検出することを含む。複合体は、検出可能なマーカーを可視化することによって検出できる。試料は、血液、血清、血漿、唾液、尿、精液等の体液、糞便又は腫瘍細胞の生検等の組織であり得る。
【００７５】
本発明は、更に、ラマ抗体Ｆ８又はＡ１２に関する、又は１１Ｆ５Ｈ６抗体及び適切な制御配列から派生した単鎖抗体に関するコード配列を含む発現ベクターに関する。本発明は、該発現ベクターで形質移入された細胞にも関する。本発明は、更に、発現ベクターを発現することによって得ることができる組換えタンパク質に関する。
【００７６】
本発明の別の態様は、必要に応じてヒト重鎖の定常部及び適切な制御配列へ融合したプレキシンＤ１の細胞外ドメインに関するコード配列を含む発現ベクターに関する。本発明は、該発現ベクターで形質移入された細胞にも関する。本発明は更に、発現ベクターを発現することによって得ることができる組換えタンパク質に関する。
【００７７】
組換えタンパク質は、プレキシンＤ１リガンドへ結合して、プレキシンＤ１を伴う細胞に対するリガンドの結合を抑制する、プレキシンＤ１の細胞外ドメインを含む。好ましくは、コード配列は、プレキシンＤ１リガンドに結合して、細胞に付随するプレキシンＤ１へのリガンドの結合を抑制する、プレキシンＤ１の細胞外ドメインのアミノ酸４７ないし５０６を含む組換えタンパク質をコードし、又はプレキシンＤ１リガンドに結合して、細胞に付随するプレキシンＤ１へのリガンドの結合を抑制する、プレキシンＤ１の細胞外ドメインのアミノ酸５０７ないし１２４７を含む組み換えタンパク質をコードする。このような組換えタンパク質は、プレキシンＤ１リガンドに対する親和性を増大させる変異を有し得、それにより囮受容体としての作用強度を増大させる。このような変異は、通常、組換えタンパク質を産生するために使用されるコード配列に変化を加えることによって誘導される。
【００７８】
本発明は更に、上述の囮プレキシンＤ１細胞外ドメインの静脈内又は腫瘍内送達を含む、プレキシンＤ１によって仲介される疾病を治療又は抑制する方法において、又は上述のプレキシンＤ１の組換え細胞外ドメイン又はその一部に対するコードヌクレオチドを含有するアデノウィルス又はレンチウィルスの静脈内送達を含む、プレキシンＤ１によって仲介される疾病を治療又は抑制する方法において、本発明の結合分子を使用することに関する。
【００７９】
これらの拮抗性囮プレキシンＤ１受容体は、プレキシンＤ１とそのリガンド、特にニューロピリン１、セマフォリン３Ｃ及びセマフォリン３Ｅとの相互作用を妨害することにより、プレキシンＤ１機能を妨害する。
【００８０】
好ましくは、囮プレキシンＤ１受容体は、プレキシンＤ１と比較して、プレキシンＤ１リガンドに対する親和性を増大させる。このような親和性の増大は、プレキシンＤ１細胞外ドメインのライブラリーを作製し、無作為に導入される変異を有し、細胞遊走アッセイにおいて最も強力な拮抗性挙動を有する囮受容体を選択することによって得られ得る。
【００８１】
（ペプチド、ポリペプチド及びグリコシル化されたポリペプチド又は他の翻訳後又は翻訳周囲（ｐｅｒｉｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ）修飾を有するポリペプチドなどの）前記タンパク質性分子を作製するために、セマフォリン３Ｃ、セマフォリン３Ｅ及びＮＰ−１に対する結合部位を含むプレキシンＤ１の細胞外ドメインの断片をコードする組換え核酸を、発現ベクター中へ挿入することが望ましい。本発明のアンタゴニストは、好ましくは宿主細胞中で、本発明の核酸又は発現ベクターから好ましく産生される。
【００８２】
本発明の分子は、上述の治療方法及び／又は従来療法若しくは腫瘍血管新生の形成を更に予防するための抗血管新生療法との組み合わせ、又は放射線療法及び／又はアジュバント化学療法においても使用され得る。
【００８３】
本発明は、更に、分子の回収物をプレキシンＤ１と接触させること、プレキシンＤ１結合分子としてプレキシンＤ１への結合を示す回収物から分子を選択することを含む、プレキシンＤ１に対して結合できる分子を同定する方法に関する。分子の回収物は、例えば、タンパク質アレイ等上の小分子ライブラリ中に存在し得る。分子の回収物をスクリーニングするための技術は、それ自体公知である。本発明は、プレキシンＤ１である、結合されるべき標的の同定に存する。
【００８４】
本願において、「結合分子」という用語は、結合分子の全ての種類、すなわちプレキシンＤ１を結合するもの、プレキシンＤ１遺伝子をコードする核酸を結合するもの、プレキシンＤ１リガンドを結合するものに対して使用される。分子のこれらの種類は全て、上述のエフェクター化合物へ連結できる。
【００８５】
本発明は、以下の実施例においてさらに説明されているが、以下の実施例は、決して、本発明を限定することを意図したものではない。実施例において、以下の図面が参照される。
【００８６】
表は、次のものを示す。
【００８７】
表１：プレキシンＤ１発現に関する異別の病態の分析。
【００８８】
表２：メラニン細胞病変中のプレキシンＤ１発現は、両性から悪性の病変まで増大する。
【実施例１】
【００８９】
腫瘍関連血管におけるプレキシンＤ１の特異的発現
プレキシンＤ１は、ニューロン上に発現されるが、胚発生時に新生血管中の内皮細胞上にも発現する。本発明は、プレキシンＤ１が、腫瘍関連血管で発現されるが、正常な血管では発現されないことを示す。これは、ヒトの血管新生の黒色腫病変を含有するマウス脳のインサイチュハイブリダイゼーションによって示されてきた（図２）。動物腫瘍モデルは、Ｋｕｓｔｅｒｔｓ，Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６３：５４０８−５４１３（２００３）に記載されている。簡潔にいえば、右頸動脈中に顕微手術法を介して、腫瘍細胞を注入し、右脳半球実質中で腫瘍を発達させる。３週間後、神経学的症状の開始時に、マウスを屠殺し、脳を摘出し、ホルマリン固定する。
【００９０】
ジゴキシゲニン標識したセンス及びアンチセンスＲＮＡ断片を使用するインサイチュハイブリダイゼーションへ、４μｍの切片を供した。Ｔ７及びＴ３プロモーターによって隣接される３’非翻訳領域中に６００塩基を包含するＰＣＲ産物から、Ｔ３及びＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをそれぞれ使用する転写によって、ＲＮＡプローブを得た（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｚｗａａｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）、上述）。
【００９１】
標準的なプロトコールを使用して、アンチセンスＲＮＡプローブ及び陰性対照としてのセンスＲＮＡプローブを使用するインサイチュハイブリダイゼーションを実施した。６０℃でパラフィンを融解することによって切片を脱パラフィン処理し、キシレン及びエタノールでその後の処理をした。リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）中で再水和の後、プロテアーゼＫ消化を３７℃で１５分間実施した（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．４／５ｍＭ  ＥＤＴＡ中の１０μｇ／ｍＬ  ＰＢＳ）。４％緩衝ホルムアルデヒド中で切片を１０分間後固定し、０．１Ｍ無水酢酸中でアセチル化した。その後、スライドを２×ＳＳＣ（クエン酸ナトリウム／塩化ナトリウム）及びミリＱ水中で洗浄した。乾燥後、ジゴキシゲニン標識したＲＮＡプローブでスライドを、６５℃で一晩、５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ中でハイブリダイズした。
【００９２】
マウス特異的プレキシンＤ１  ＲＮＡプローブを使用して、血管新生Ｍｅ１５７腫瘍の血管（図２）中で、プレキシンＤ１  ＲＮＡの高レベルを観察した。腫瘍細胞も、転写産物に対して陽性であった。プレキシンＤ１のマウスとヒトとの間の不完全な相同性の結果、マウスプローブを使用するヒト腫瘍細胞中でより弱いシグナルが生じる。
【実施例２】
【００９３】
腫瘍中でのプレキシンＤ１の発現
ヒト腫瘍試料中でプレキシンＤ１  ＲＮＡ発現を研究するために、本発明者らは、ヒト特異的プレキシンＤ１  ＲＮＡプローブによるインサイチュハイブリダイゼーションを実施した。高いプレキシンＤ１  ＲＮＡ発現レベルは、腫瘍血管及び腫瘍細胞の両者において、多数ヒト腫瘍中で見出されており、その中には多形神経膠芽腫、肉腫の脳転移、腎臓細胞癌、結腸腺癌及び乳腺癌があった。プレキシンＤ１発現腫瘍の種類の要約を表１に付与する。図３は、インサイチュハイブリダイゼーションの幾つかの例、例えば、神経膠芽腫、黒色腫の脳転移及び結腸癌の脳転移を示す。プレキシンＤ１  ＲＮＡは、腫瘍血管でだけでなく、腫瘍細胞自体でも過剰に見出された。重要なことに、図４Ａにあるように、プレキシンＤ１  ＲＮＡ発現は、正常な脳の血管で観察されていない。図４Ｂにおいて、ＣＤ３１染色を示し、豊富な血管がこれらの切片に存在することを示す。
【実施例３】
【００９４】
プレキシンＤ１に対する抗体の調製
プレキシンＤ１タンパク質を検出するために、プレキシンＤ１に対する親和性で抗体を選択した。この目的のため、ｖａｎ  Ｋｏｎｉｎｇｓｂｒｕｇｇｅｎ，Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２７９：１４９−１６１（２００３）に記載のラマＢリンパ球からのＲＴ−ＰＣＲによって構築されるラマ単一ドメインＶ−Ｈ抗体を発現するＭ１３  ｐＨＥＮＩＸファージライブラリを構築した。Ｖ−Ｈ単一ドメイン抗体（ｓｄａｂ）断片をコードする得られたｃＤＮＡの集団を、ファージベクターｐＨＥＮＩＸＨｉｓ８ＶＳＶ中に連結した（結果非表示）結果、Ｃ末端に８＊Ｈｉｓタグ及びＶＳＶ−Ｇタグとの融合産物を生じた。イーコリＴＧ１細胞中での電気穿孔後、アンピシリン耐性コロニーを回収し、プールした。
【００９５】
得られたライブラリは、８×１０８クローンの複雑性を有した。ＰＣＲ分析及びｓｄａｂｓ中のＶＳＶ−Ｇタグの免疫学的ドットブロット検出によって測定されたところによれば、プラスミドの８０％は、全長のｓｄａｂインサートを含有した（以下参照）。イーコリＴＧ１細菌中のファージミドとして、ファージライブラリを伝播した。トリプシン感受性ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７による感染によって、ファージ粒子を救出した（５０）。ファージを精製し、標準的な方法論を介した２０％ポリエチレングリコール／２．５Ｍ  ＮａＣｌによる沈殿によって、培養上清からファージを濃縮した。
【００９６】
プレキシンＤ１に対する親和性を有する抗体を示すファージに関して選択するため、５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．６）中の５μｇ／ｍＬのＫＬＨ結合ペプチド（成ヒトＰＬＸＮＤ１タンパク質（受入番号ＡＹ１１６６６１）のアミノ酸１ないし１６に対応するＨ２Ｎ−ＡＬＥＩＱＲＲＦＰＳＰＴＰＴＮＣ−ＣＯＮＨ２）で、イムノチューブ（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を４℃で一晩コーティングした。注目すべきことに、このペプチドにおける位置３のグルタミン酸は、マウス配列中のリジンであり、残余アミノ酸は、マウスｐｌｘｎｄ１と相同である。
【００９７】
ＰＢＳ／０．０５％トゥイーン２０（ＰＢＳＴ）による厳密な洗浄の後、ＰＢＳＴ中の５％マーベル（ＭＰＢＳＴ、室温（ＲＴ）で１時間）で非特異的結合部位をブロックし、ライブラリストックからの１０１３個のファージ粒子を固定したペプチドとともに、室温で９０分間温置した。ＰＢＳＴ及びＰＢＳによる厳密な洗浄の後、結合したファージをトリプシン処理（１０ｍｇ／ｍＬ、室温で３０分間）で溶出した。
【００９８】
１％新生児ウシ血清によるトリプシン不活性化の後、溶出液を使用して、対数相のＴＧ１細胞を感染させ、ＰＬＸＮＤ１結合ファージを増幅し、結合体の数を算出した。
【００９９】
結合ファージを濃縮するため、選択を４回実施した。第２回の実施から、ＤＮＡ結合プレート（Ｃｏｓｔａｒ）に固定した結合していないペプチドに対して選択を実施し、ＫＬＨ−結合体の選択を予防した。
【０１００】
ＰＣＲで確認した全長のｓｄａｂインサートによる個々のＰＬＸＮＤ１結合ファージを、プレキシンＤ１に対する特異性に関して検査した。ＰＬＸＮＤ１−ペプチド又は無関連ペプチド（ＰＢＳ／０．５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ９．０中の１μｇ／ウェル）、ウシ血清アルブミン（５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３  ｐＨ９．６中の１μｇ／ウェル）又はヒト免疫グロブリン（５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３  ｐＨ９．６中の１μｇ／ウェル）で、ＤＮＡ結合プレート又はイムノプレート（Ｎｕｎｃ）のウェルを４℃で一晩コーティングした。ＭＰＢＳＴによる非特異的結合部位をブロックした後、ＭＰＢＳＴ中のファージでウェルを室温で１時間インキュベートし、厳密な洗浄によって結合していないファージを除去した。ＨＲＰにより結合した抗Ｍ１３（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）及びテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ；ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  Ｂ．Ｖ．，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して、結合したファージを検出した。２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で反応を終止させ、ＥＬＩＳＡリーダーを使用して、４５０ｎｍでの吸光度を測定することによって酵素活性を定量化した。
【０１０１】
この選択手法を使用して、表面上にＶ−Ｈ単一ドメイン抗体Ａ１２及びＦ８を呈するファージを、特異的結合体として同定した。図５Ａは、Ｍ１３ファージ関連抗体Ａ１２及びＦ８が、プレキシンＤ１ペプチドに対して特異的に結合するが、ウシ血清アルブミン、免疫グロブリン又は無関連ペプチドとは結合しないことを示す。
【０１０２】
２×ＴＹＡ培地／１ｍＭ  ＩＰＴＧ中、３０℃で培養することによって、対数相のイーコリＴＧ１細胞中で、可溶性単一ドメイン抗体の発現を導入した。プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含有する氷冷ＴＥＳ緩衝液（２００ｍＭトリスＨＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５００ｍＭショ糖）を使用する浸透圧溶解によって、ｓｄａｂｓを回収した。マウスモノクローナル抗ＶＳＶ−Ｇ  Ｐ５Ｄ４、アルカリホスファターゼ結合ウサギ抗マウス免疫グロブリン（Ｄａｋｏ，Ｄｅｎｍａｒｋ）及びＮＢＴ／ＢＣＩＰ染色を使用するドットブロット分析を介して、ｓｄａｂ濃度を概算した。ＰＬＸＮＤ１−ペプチド特異性に関して、ＥＬＩＳＡでｓｄａｂｓを検査した。単一ドメイン抗体Ａ１２及びＦ８は、無関連ペプチドにも、ウシ血清アルブミンにも、ヒト免疫グロブリンＧにも結合しなかった（図５Ｂ）。Ｂｉａｃｏｒｅ２０００（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）バイオセンサーを使用して、単一ドメイン抗体Ａ１２とＦ８との間の結合の解離定数（ｋｄ’ｓ）を測定した。Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢからセンサーチップ及びタンパク質カップリング化学物質を購入した。製造元の推奨する条件の下で、Ｎ−エチル−Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを使用して、ＰＬＸＮＤ１−ペプチド−ＫＬＨ結合体（酢酸Ｎａ、ｐＨ４．０中の２７μｇ／ｍＬ）又はＢＳＡ（酢酸Ｎａ、ｐＨ５．０中の１μｇ／ｍＬ）を、活性型ＣＭ５表面へ連結した。
【０１０３】
ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）中で、２５℃、１０ｍＬ／分の流速で、動態学的測定を実施した。
【０１０４】
（１ｍＭないし５０μＭの範囲の）Ｎｉアフィニティ精製したｓｄａｂｓの６個の濃度を使用して、ＰＬＸＮＤ１−ペプチドとの相互作用に関する解離定数（Ｋｄｓ）を測定した。各実験後、１０ｍＭ  ＮａＯＨを使用して、センサー表面の再生を実施した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１ソフトウェア及び１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを使用して、ＰＬＸＮＤ１−表面に対する結合から対照ＢＳＡ−表面に対する結合を減じたものによって定義される特異的結合を分析した。
【０１０５】
単一ドメイン抗体Ａ１２及びＦ８の親和性はそれぞれ、２．１×１０−８Ｍ及び３．５×１０−８Ｍであった（図６）。
【実施例４】
【０１０６】
単一ドメイン抗体Ａ１２及びＦ８による免疫組織化学的染色
カルボキシ末端において、単一ドメイン抗体にＶＳＶ−Ｈｉｓタグを付し、抗ＶＳＶ抗体を使用する免疫組織化学的染色を可能にした。単一ドメイン抗体Ａ１２及びＦ８による免疫組織化学的染色のため、次のプロトコールに従った。脱パラフィン処理の後、０．０３％Ｈ２Ｏ２による温置によって、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。標準的なプロトコールに従って、プロナーゼによる処理によって抗原検索を実施した。その後、（ヒト及びマウスそれぞれの組織切片中の非特異的結合部位をブロックするために）標準的なウマ又はヤギ血清によってスライドを予め温置した後、ｓｄａｂｓで１時間温置した。マウス又はウサギ抗ＶＳＶ−Ｇ抗血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂ．Ｖ．，Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、適切なビオチン化抗マウス又は抗ウサギ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）、及びアビジン−ビオチンペルオキシダーゼ複合体（Ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）による連続した１時間の温置によって、Ｓｄａｂｓを検出した。最後に、対比染色としてのヘマトキシリンによる３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＳｃｙＴｅｋ，Ｕｔａｈ，ＵＳＡ）ペルオキシダーゼ反応によって、ペルオキシダーゼを可視化した。全ての工程を室温で実施した。
【０１０７】
ＲＮＡレベルに関するプレキシンＤ１の発現パターンが十分に特徴付けられているマウス胚（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｚｗａａｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）、上述）を染色し、特性を抗内皮抗体である抗ＣＤ３１（ＤＡＫＯ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）による免疫染色と比較することによって、免疫組織化学的染色におけるプレキシンＤ１に対する抗体Ａ１２及びＦ８の特異性をまず検討した。Ｅ１６．５でのマウス胚の海面骨の成長板において、ＣＤ３１陽性血管で免疫染色を観察した。染色特性は、プレキシンＤ１転写産物に関するインサイチュハイブリダイゼーションと十分に相関した（図７Ａ）。ｓｄａｂｓ及び抗ヒト抗ＣＤ３１抗体（抗ヒトＣＤ３１）による連続切片上での染色を実施することによって、ＰＬＸＮＤ１発現の血管由来を更に確認した。
【実施例５】
【０１０８】
Ｆ８による腫瘍細胞の染色
実施例４に例証したプロトコールに従って、ヒト黒色腫細胞系Ｍｅ１５７−ＶＥＧＦ−Ａのマウス大脳異種移植片（Ｋｕｓｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）、上述）の４μｍ切片を単一ドメイン抗体Ｆ８で染色した。抗体は、腫瘍血管上のプレキシンＤ１を明確に認識した（図７Ｂ）。腫瘍上でのプレキシンＤ１タンパク質発現を更に研究するため、異別の源（多形神経膠芽腫（図８Ａ）、黒色腫の脳転移（図８Ｂ）、結腸癌（図８Ｃ）及び腎臓細胞癌（図８Ｄ））の保存記録用にパラフィン包埋したか又は腫瘍の組織を抗ＰＬＸＮＤ１ｓｄａｂｓで免疫染色した。連続切片上で抗体Ａ１２を使用する免疫組織化学及び抗ヒトＣＤ３１染色による比較によって、検討した全ての腫瘍での発現が示され、腫瘍細胞及び腫瘍血管中におけるタンパク質レベルでのプレキシンＤ１発現が確認された。
【実施例６】
【０１０９】
悪性細胞におけるプレキシン発現のタイミング
プレキシンＤ１の発現が悪性細胞で生じるかどうかを研究するため、本発明者は、良性母斑、形成異常母斑、放射状発達相の黒色腫、侵襲性黒色腫、播種性黒色腫からなる黒色腫の一連の進行を染色した。良性母斑及び形成異常母斑におけるメラニン形成細胞は、タンパク質を発現しないのに対し、悪性に形質転換した細胞は、放射状発達相においても垂直発達相においても腫瘍はタンパク質に対して陽性である（図９及び表２）。
【実施例７】
【０１１０】
プレキシンＤ１発現細胞の活性化状態
プレキシンＤ１発現は、腫瘍血管における内皮細胞の活性化状態と関連する。ＶＥＧＦＲ２及びＥＧＦＲの阻害剤であるＺＤ６４７４による処理は、マウス脳腫瘍モデルにおいて血管新生をブロックし、その結果、血管新生から非血管新生への血管吸収発現型の発現型移行を生じることがすでに示された（４３）。ＺＤ６４７４による処理は結果的に、用量依存的な様式で腫瘍関連血管におけるプレキシンＤ１発現を低下させた（図１０）。従って、プレキシンＤ１発現は、活性化された内皮細胞の特徴である。
【実施例８】
【０１１１】
正常組織でのＡ１２による免疫組織化学
抗体Ａ１２を使用する免疫組織化学によって、正常な脳、心臓、皮膚、腎臓、脾臓、腸、子宮内膜におけるプレキシンＤ１の発現を検討した。増殖性子宮筋における血管は、プレキシンＤ１を発現し、プレキシンＤ１が病理学的血管新生とだけでなく、生理学的血管新生（非表示）とも関連することを示した。
【０１１２】
幾つかの場合において、ＣＤ６８マクロファージマーカーを使用して、同時免疫染色を実施した。これらの染色によって、マクロファージの亜集団がタンパク質を発現することが明らかになった（図１１）。皮膚中の線維芽細胞及び幾分増殖している腸の上皮細胞も、プレキシンＤ１を発現させることがわかった（非表示）。
【実施例９】
【０１１３】
炎症性疾患におけるマクロファージの染色
マクロファージが顕著に関与する疾病におけるプレキシンＤ１の関与を更に検討するため、アテローム性動脈硬化症プラーク、多発性硬化症、関節リウマチにおいて、免疫組織化学的染色を実施した。マクロファージは、プレキシンＤ１を発現させる。
【実施例１０】
【０１１４】
静脈内注射を介する腫瘍血管におけるプレキシンＤ１へのアクセス
腫瘍血管におけるプレキシンＤ１タンパク質の発現は、プレキシンＤ１が、静脈内注射を介してアクセス可能であることを示唆する。このことを検査するため、ＶＥＧＦ−Ａ１６５分子種を発現する安定して形質移入された２×１０５個のＭｅ１５７細胞を、ＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスの右内頸動脈中に顕微手術で注入した。１８日後、動物が神経学的症状を示したとき（Ｋｕｓｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）、上述）、確立されたＭｅ１５７−ＶＥＧＦ−Ａ１６５脳転移を有するヌードマウスの尾静脈中に、クローンＡ１２、Ｆ８の１０１２個のＰＬＸＮＤ結合ファージ又は無関連ファージを注射した（Ａ１２はｎ＝２、Ｆ８はｎ＝４、対照ファージはｎ＝３）。
【０１１５】
マウスの他の２群において、本発明者は、３０μｇのｓｄａｂ  Ｆ８又は対照ｓｄａｂを静脈注射した（各群ｎ＝２）。５分後、イソフルランを使用してマウスを麻酔し、胸部切開し、リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）１５ｍＬによる心臓灌流によって、非結合型ファージを系から洗浄した。次に、頸部脱臼によってマウスを屠殺し、脳の一部、心臓、肺、肝臓、脾臓及び腎臓を液体窒素中で瞬時凍結した。
【０１１６】
パラフィン包埋されるため、他の部分をホルマリン固定した。短いヘマトキシリン染色の後、レーザー捕捉切開顕微鏡（Ｌｅｉｃａレーザー切開顕微鏡）を使用して、１０μｍの脳切片から腫瘍を摘出した。腫瘍とは反対側の罹患していない脳から、等価の領域を摘出した。
【０１１７】
その後、トリプシン処理を使用して、摘出した組織からファージを溶出し、ＴＧ１細胞を感染させるために使用した。コロニー形成ファージの数を計数し、腫瘍ホーミングの測定結果として使用した。ファージ又はｓｄａｂｓによって腫瘍ホーミングを定量的に査定するため、レーザー切開に使用される切片と連続した４μｍの切片を抗Ｍ１３ｐ８抗体（Ａｂｃａｍ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）で染色し、結合したファージを検出するか又は、抗ＶＳＶ−Ｇ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色し、単一ドメイン抗体を検出した。
【０１１８】
血管新生性黒色腫病変を有するマウスにおける、無関連の単一ドメイン抗体を有するファージではなく、抗ＰＬＸＮＤ１単一ドメイン抗体Ｆ８をディスプレイするＭ１３ファージの静脈内注射の結果、腫瘍血管においてファージが蓄積したが、正常な脳血管ではファージの特異的な存在を検出できず、肝臓、脾臓、腎臓（図１２Ａ，Ｄ及び非表示）でも検出できなかった。このことは、プレキシンＤ１が、腫瘍血管において特異的に内皮細胞の管腔側で発現し、従って標的可能なマーカーとして使用できることを示す。
【０１１９】
従って、部分的に精製される単一ドメイン抗体の注射によって、腫瘍を優先的に局在化させる（図１２Ｃ）。後者の状況において、単一ドメイン抗体の２０ｋＤａの低分子量のため、非常に透過可能な腫瘍血管から血管外遊走でき、腫瘍の間質中に蓄積できることは考慮されなければならない。この後者の効果は、非特異的であり、無関連の単一ドメイン抗体を使用しても観察される。低分子量の抗体及び比較的低い親和性によって、腫瘍を通じての浸透性がより高くなり、腫瘍細胞区画を標的化するのにより適していることが想像される。
【実施例１１】
【０１２０】
腫瘍血管におけるＦ８の蓄積
神経膠腫異種移植系であるＥ９８をマウスに経頭蓋的に注射した。Ｅ９８腫瘍は、皮下腫瘍として維持される。皮下Ｅ９８腫瘍を有するＢａｌｂｃ／ｃ  ｎｕ／ｎｕ胸腺欠損マウスを屠殺し、腫瘍を摘出した。滅菌済みメスで腫瘍を細片化し、滅菌済み７０μｍメッシュナイロンフィルターに、ホモジネートを通過させた。１５，０００個の細胞を含有する得られた細胞懸濁液２０μＬをヌードマウスの脳中に経頭蓋的に注射した。３週間後、単一ドメイン抗体Ｆ８を呈するＭ１３ファージを静脈内注射し、５分後、リン酸緩衝塩類溶液１５ｍＬを使用する心臓灌流へマウスを供した。
【０１２１】
マウスを屠殺し、脳を摘出し、ホルマリン中で固定した。抗Ｍ１３抗体による免疫組織化学へ４μｍの切片を供し、ＣＤ３４（内皮マーカー）及びＧＬＵＴ１（既存の脳内皮細胞のためのマーカー（Ｋｕｓｔｅｒｓ，Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６２：３４１−３４５（２００２）））に対する抗体で、連続切片を免疫組織化学的に染色した。
【０１２２】
抗プレキシンＤ１単一ドメイン抗体を有するファージは、腫瘍関連血管において特異的に蓄積したが、正常血管では蓄積しなかった（図１３）。重要なことに、ファージは、新たに形成される血管よりもむしろ、ＧＬＵＴ１に対して陽性であり、それゆえ既存の血管として考えられる、腫瘍血管においても蓄積した。このことは、血管新生性血管だけでなく、非血管新生性の、腫瘍中でなおも活性化された血管も、抗プレキシンＤ１抗体による標的化へ供されることを示す。
【実施例１２】
【０１２３】
組換えプレキシンＤ１外部ドメインは血管新生を阻害する
ベクターｐＩＲＥＳｈｙｇにおけるＶＥＧＦ−Ａ１６５コード配列でヒト黒色腫Ｍｅ１５７細胞を形質移入した。１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）及びペニシリン／ストレプトマイシンで補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で２００μｇ／ｍＬハイグロマイシン中で培養することによって、安定して形質移入した細胞を選択した。ハイグロマイシン耐性遺伝子の発現が、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を介してＶＥＧＦ−Ａ  ｃＤＮＡの発現と連結するため、ハイグロマイシン耐性細胞は全て、ＶＥＧＦ−Ａタンパク質も生じる。安定して形質移入されたＭｅ１５７−ＶＥＧＦ細胞をその後、ｐＩＲＥＳｎｅｏ−プレキシンＤ１  ＥＤで形質移入した。ベクターは、ＩＲＥＳを介してネオマイシン耐性遺伝子の発現へ連結されるヌクレオチド１ないし２７４５から細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡを含有する。
【０１２４】
ヌードマウスの右頸動脈中に二重形質移入体を注射し、腫瘍を発達させた。神経学的症状の開始時（約１８日）に、ガドリニウム−ＤＴＰＡで増強した磁気共鳴画像法へマウスを供した。その後、マウスを屠殺し、脳をホルマリン固定し、免疫組織化学的染色へ供して、腫瘍の血管を検討した。
【０１２５】
ＶＥＧＦ−Ａのみを発現する腫瘍からなる対照と比較すると、Ｔ１強調磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）におけるＧｄ−ＤＴＰＡ増強はより低かった（Ｍｅ１５７−ＶＥＧＦ−Ａ１６５腫瘍の２例を表す図１４Ａを、Ｍｅ１５７−ＶＥＧＦ−Ａ１６５／プレキシンＤ１−ＥＤ腫瘍の２例を表す図１４Ｂと比較する。）。ＶＥＧＦ−Ａ１６５及びプレキシンＤ１外部ドメインを発現する腫瘍において、血管は、内皮マーカーＣＤ３４（ＶＥＧＦ−Ａ１６５による内皮活性化の特徴）の上方制御を示す。ＶＥＧＦ−Ａ１６５のみを発現する腫瘍中の血管は、脳内皮細胞マーカーＧＬＵＴ１に対して陰性であり、これらの血管が新たに形成され、それゆえ脳−内皮細胞特異的マーカーを欠失するという事実と一致する。図１２Ｂにおいて見られるように、プレキシンＤ１外部ドメインも発現する腫瘍と関連した血管は、ＧＬＵＴ１を発現する。このことは、これらの血管が実際に既存のものであることを強く示す。従って、プレキシンＤ１外部ドメインは、ＶＥＧＦ−Ａ１６５による内皮細胞の活性化を予防しないが、新生血管の形成を予防する。
【実施例１３】
【０１２６】
プレキシンＤ１に対する高親和性抗体
発現ベクターｐＱＥ１６（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、イーコリＭ１５ｐＲＥＰ４細胞において、アミノ酸４０ないし５０６に対応するタンパク質配列（成熟タンパク質の４５９の最大末端アミノ酸）を発現した。封入体として細菌細胞中で生成される組換えタンパク質は、４Ｍ尿素及び１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含有する変性緩衝液中で溶解し、その後、ＰＢＳに対して徐々に透析した。タンパク質を使用して、標準的な手法に従って、ＢＡＬＢｃ／ｃマウス２５を免疫化した。
【０１２７】
図１５は、マウス血清の特徴を示す。図１５Ｂに示されるように、マウス免疫血清は、イーコリ組換えタンパク質４７ないし５０６（５２ｋＤａ、レーン１）、及びアミノ酸２２５ないし３８８を含む（従って、免疫化に使用される配列内で完全にある）１８ｋＤａの第二組換えプレキシンＤ１配列（レーン２）を特異的に認識した。免疫前血清は、このような反応性を示さなかった（パネルＡ）。
【０１２８】
胞状軟部肉腫の脳転移に関する免疫組織化学的染色において検査されるとき、免疫前血清（パネルＣ）ではなく、マウス免疫血清（パネルＤ）は、血管及び腫瘍細胞に対して陽性を示し、染色パターンは、単一ドメイン抗体Ａ１２のものと同様であった。従って、このマウスのＢリンパ球は、脾臓Ｂリンパ球と骨髄腫細胞系ＳＰ２／０とのハイブリドーマを生じるのに適していると考えられた。
【０１２９】
これらのハイブリドーマから、ＥＬＩＳＡにおけるタンパク質４７ないし５０６に対する反応性に基づいて、幾多の抗体産生細胞系を選択し、前記細胞系の可能性に関して分析し、ヒト腫瘍の凍結切片中でプレキシンＤ１を検出した。これらのうち、両者ともＩｇＭサブタイプの抗体である１１Ｆ５Ｈ６及び１７Ｅ９Ｃ１２は、図１６に示されるように、肉腫及び黒色腫の脳転移において強い陽性を示した。パネルＣないしＦ中の挿入図は、一次抗体を省略した対照染色を表す。パネルＡ及びＢは、これらの抗体が、正常な脳組織中で血管構造を顕著には認識しないことを示す。
【実施例１４】
【０１３０】
モノクローナル抗体１１Ｆ５Ｈ６は、腫瘍血管を認識できる
モノクローナル抗体１１Ｆ５Ｈ６が、腫瘍血管を認識できるかどうかを更に評価するため、本質的に実施例１０に記載のとおり、血管新生Ｍｅ１５７−ＶＥＧＦ−Ａ腫瘍をヌードマウスの脳中で発達させた。この時間後、１．３％イソフルランでマウスを麻酔し、胸部切開し、２０ｍＬのリン酸緩衝塩類溶液で心臓灌流を実施した。
【０１３１】
この手法の後、マウスを断頭し、脳を摘出し、瞬時凍結又はホルマリン固定した。４μｍの凍結切片を抗ＩｇＭ抗体で染色した。図１７Ａにおいて、抗体１１Ｆ５Ｈ６が、正常血管ではなく腫瘍血管にホーミングし、蓄積することが示されている（図１７Ａの抗ＩｇＭ染色を、図１７Ｂの抗内皮ＣＤ３１染色と比較する。）。このような染色は、注射していないマウスで抗ＩｇＭ染色を実施するときには観察されない。従って、１１Ｆ５Ｈ６は、腫瘍標的化を可能とする有望な抗体である。
【実施例１５】
【０１３２】
関節リウマチにおけるプレキシンＤ１発現
関節リウマチのマウスモデルにおけるマクロファージ中で、プレキシンＤ１を発現させる（図１８）。ヒトアテローム性動脈硬化症プラーク中のマクロファージのサブセットも、プレキシンＤ１を発現させる（図１９）。単一ドメイン抗体Ａ１２による染色を実施した。図１９で、プレキシンＤ１を赤で、マクロファージマーカーＣＤ６８を青で表示する二重染色を実施した。紫色は、同時発現を示す。
【０１３３】
【化１】
2009506985.tif 000002
2009506985.tif 000003
【０１３４】
【化２】
2009506985.tif 000004
【０１３５】
【化３】
2009506985.tif 000005
【０１３６】
【化４】
2009506985.tif 000006
【０１３７】
【表１】
2009506985.tif 000007
2009506985.tif 000008
【０１３８】
【表２】
2009506985.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】図１：プレキシンファミリーメンバーの構造ドメイン：プレキシンＡないしＤと命名された４つのサブファミリーが同定されている。水平に線の入ったボックスは、Ｓｅｍａドメインを示し、斜方向に線の入ったボックスは、Ｍｅｔ関連配列（ＭＲＳ）モチーフを示し、空のボックスは、ＰＬＸＮＤ１の非定型のＭＲＳモチーフを示す。プレキシンＢサブファミリーメンバーは、灰色のリボンによって記された、フリン様タンパク質分解性候補部位を有する。膜貫通領域は、陰影のついたボックスによって記されており、２つの楕円によって記されたＳＰドメインを互いに含む２つの保存性細胞内ドメインが後続する。
【図２】図２：Ａ）ジゴキシゲニン標識したマウス特異的ｐｌｘｎｄ１ＲＮＡプローブを使用する大脳Ｍｅ１５７−ＶＥＧＦ−Ａ１６５病変のインサイチュハイブリダイゼーション分析。腫瘍血管は、強力に陽性（矢印）であるのに対し、病変から離れた脳血管は陰性である（図２ＢにおいてＣＤ３４染色でＩＳＨ特性を比較する。）。
【図３】図３：多形神経膠芽腫（Ａ）肉腫の脳転移（Ｂ）、黒色腫（Ｃ）及び乳癌（Ｄ）のヒトＰＬＸＮＤ１特異的ＩＳＨ分析。挿入図は、連続切片のＣＤ３１染色を示す。センスプローブを使用する対照ＩＳＨは、陰性であった（非表示）。これらの腫瘍において、ＰＬＸＮＤ１発現は血管に制限されないことに留意されたい。又、腫瘍細胞においてＰＬＸＮＤ１転写産物の高いレベルが見られる。ｔ＝腫瘍、Ｖ＝血管。
【図４】図４：正常脳のヒト特異的ジゴキシゲニン標識したＲＮＡプローブを使用するＩＳＨ分析（Ａ）及びＣＤ３１による免疫組織化学的染色（Ｂ）。血管は豊富に存在するが、これらはプレキシンＤ１転写産物を発現しないことに留意されたい。
【図５】図５：ペプチドＨ２Ｎ−ＡＬＥＩＱＲＲＦＰＳＰＴＰＴＮＣ−ＣＯＮＨ２に対するファージ（Ａ）及び対応する単一ドメイン抗体（ｓｄａｂｓ）（Ｂ）Ａ１２及びＦ８の特異性。Ａにおいて、１０１０個のファージが、ＰＬＸＮＤ−１ペプチド、ＢＳＡ、ヒトＩｇＧ又は本文に記載の関連性のないペプチドへ結合できた。厳密な洗浄の後、抗Ｍ１３抗体を使用して、結合したファージを検出した。Ｂにおいて、しかし今では可溶性ｓｄａｂｓで同様の温置を実施した。洗浄後、結合したｓｄａｂｓを検出し、ＶＳＶ−Ｇタグを介して半定量化した。
【図６】図６：Ｂｉａｃｏｒｅ２０００（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）バイオセンサーを使用して、単一ドメイン抗体Ａ１２とＦ８との間の結合の解離定数（ｋｄ’ｓ）を測定した。Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢからセンサーチップ及びタンパク質カップリング化学物質を購入した。製造元の推奨する条件の下で、Ｎ−エチル−Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを使用して、ＰＬＸＮＤ１−ペプチド−ＫＬＨ結合体（酢酸Ｎａ、ｐＨ４．０中の２７μｇ／ｍＬ）又はＢＳＡ（酢酸Ｎａ、ｐＨ５．０中の１μｇ／ｍＬ）を、活性型ＣＭ５表面へ連結した。１Ｍエタノールアミン、ｐＨ８．５によって、未反応基を不活性化した。  ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）中で、２５℃、１０ｍＬ／分の流速で、動態学的測定を実施した。（１ｍＭないし５０μＭの範囲の）Ｎｉアフィニティ精製したｓｄａｂｓの６個の濃度を使用して、ＰＬＸＮＤ１−ペプチドとの相互作用に関する解離定数（Ｋｄｓ）を測定した。各実験後、１０ｍＭ  ＮａＯＨを使用して、センサー表面の再生を実施した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１ソフトウェア及び１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを使用して、ＰＬＸＮＤ１−表面に対する結合から対照ＢＳＡ−表面に対する結合を減じたものによって定義される特異的結合を分析した。単一ドメイン抗体Ａ１２及びＦ８の親和性は、２．１×１０−８Ｍ及び３．５×１０−８Ｍであった。
【図７】図７：単一ドメイン抗体のプレキシンＤ１特異性の評価。図Ａは、抗体の検出にＶＳＶ−Ｇタグを利用する、マウス胚の海面骨の成長板の、単一ドメイン抗体Ａ１２による免疫組織化学的染色を示す。挿入図は、マウス特異的ジゴキシゲニン標識したプレキシンＤ１プローブを使用する同様の胚の構造のインサイチュハイブリダイゼーションを示す。プレキシンＤ１のインサイチュハイブリダイゼーションと免疫染色の重複に留意されたい。図７Ｂは、ヌードマウスの脳におけるＭｅ１５７−ＶＥＧＦ−Ａ１６５病変の代表例である。プレキシンＤ１  ＩＳＨ（図２も参照）でも陽性である血管は、単一ドメイン抗体Ｆ８で免疫陽性である。
【図８】図８：ヒト脳腫瘍の選択に関する単一ドメイン抗体Ａ１２による免疫染色。示される腫瘍は、Ａ）多形神経膠芽腫、Ｂ）黒色腫の転移、Ｃ）乳癌、Ｄ）腎臓細胞癌である。Ａ及びＢにおける挿入図は、抗ＶＳＶ抗体のみによる対照染色からなり、腫瘍染色が特異的であることを示す。血管及び腫瘍細胞が、抗体に非常に反応していることに留意されたい。
【図９】図９：黒色腫の進行連続での単一ドメイン抗体Ａ１２による免疫染色。母斑、異形性母斑並びに黒色腫の水平方向及び垂直方向の発達相に関して、免疫染色を実施した。腫瘍性細胞のみがプレキシンＤ１を発現させることに留意されたい。
【図１０】図１０：ＺＤ６４７４で処理したマウスにおけるＭｅ１５７−ＶＥＧＦ−Ａ脳腫瘍の切片上での単一ドメイン抗体Ａ１２による免疫染色。未処理の又はプラセボ処理したマウスにおいて、腫瘍血管は、この抗体で陽性染色する。しかしながら、ＺＤ６４７４で処理されたマウスにおいて、プレキシンＤ１発現は用量依存的に低下する。経口的に、１日１回、示される容量で、ＺＤ６４７４を付与した。
【図１１】図１１：乳癌に関するマクロファージマーカーＣＤ６８（青に染色）及び単一ドメイン抗体Ａ１２（赤に染色）による二重免疫染色。マクロファージの亜集団は、プレキシンＤ１を紫色に染色するタンパク質によって評価されるように発現する。
【図１２】図１２：Ｍｅ１５７−ＶＥＧＦ１６５脳病変に対するファージＡ１２、Ｆ８又は無関連のファージの生体内ホーミング。腫瘍を有するマウスに、尾静脈で１０１２個のファージを注射し、５分後、マウスを麻酔し、リン酸緩衝塩類溶液１５ｍＬによる心臓灌流へ供した。マウスを屠殺し、脳を摘出し、ファージ含有量及び分布に関して凍結切片を分析した。Ａ）脳Ｍｅ１５７−ＶＥＧＦ１６５病変の凍結切片のＭ１３染色。ファージは、Ｂ）に示される連続切片上での抗ＣＤ３４免疫染色によって明白なように、明らかに血管と結合している。矢印は、抗Ｍ１３染色によって強調されていない、病変から離れたＣＤ３４陽性血管を示す。（Ａ）の挿入図は、無関連ファージが注射された対照実験を示す。Ｃ）腫瘍負荷マウスにおける静脈内注射後のｓｄａｂＦ８の分布。抗ＶＳＶ抗体を使用する免疫組織化学によって、Ｓｄａｂｓを可視化する。ｓｄａｂは、腫瘍血管中で検出されるが、正常な脳の毛細血管では検出されないことに留意されたい。挿入図は、無関連のｓｄａｂが注射された対照実験を示す。間質性局在化が観察され、これらの腫瘍における血管の漏出性と一致した。Ｄ）ファージホーミングの定量化。レーザー捕捉切開顕微鏡を使用して、１０μｍの凍結切片から腫瘍組織を摘出した。ＴＧ１細胞の感染後、コロニー形成ファージ（ｃｆｐ）の数を計数した。未感染の脳組織の比較可能な領域からよりも、腫瘍から２０倍多くのＦ８ファージを溶出した。
【図１３】図１３：単一ドメイン抗体は、それ自体新たに形成されない腫瘍血管に対してホーミングする。皮下Ｅ９８腫瘍から得られたヒト神経膠腫Ｅ９８の１．５×１０５個の細胞の細胞懸濁液をヌードマウスに接種した。３週間後、単一ドメイン抗体Ｆ８を有するファージを尾静脈中に注射し、５分後、マウスを麻酔し、リン酸塩類溶液１５ｍＬを使用する心臓灌流へ供した。次に、マウスを屠殺し、脳を摘出し、ホルマリン中で固定した。Ｍ１３ｐ８タンパク質（Ａ）、内皮マーカーＣＤ３４（Ｂ）及びＧＬＵＴ１（既存の脳毛細血管に対するマーカー）（Ｃ）に対する抗体で染色した。Ａ、Ｂ及びＣの比較によって、新たに形成された腫瘍血管のみがファージＦ８を蓄積するだけでなく、ｇｌｕｔ−１を発現、従って、腫瘍中に取り込まれた既存の脳血管と考えられる拡張していない脳血管も蓄積することが明らかとなる。
【図１４】図１４：腫瘍血管の発達に及ぼすプレキシンＤ１の細胞外ドメインの効果。ＶＥＧＦ−Ａ１６５及び、アミノ酸１ないし８５０を含むプレキシンＤ１の細胞外ドメインを発現する、ヒト黒色腫細胞系Ｍｅ１５７の二重形質移入を、ヌードマウスの右内頸動脈中に注射した。３週間後、ガドリニウム−ＤＴＰＡで増強した磁気共鳴画像法へ、前記マウスを供した。図１４Ａは、ＶＥＧＦ−Ａ１６５のみを発現するＭｅ１５７脳腫瘍を有する２匹の対照マウスのＭＲ画像を示し、図１４Ｂは、二重形質移入を有する２匹のマウスの脳のＭＲ画像を示す。Ｇｄ−ＤＴＰＡ血管外遊走によってアッセイされる血管の漏出は、二重形質移入においてほとんどない傾向にあり、ＶＥＧＦ−Ａ誘発性血管漏出が、プレキシンＤ１外部ドメインによって相殺されることを示唆する。より重要なことに、二重形質移入した腫瘍中の血管は、ＣＤ３４の上方制御によって示されるように活性化されるが、前記血管はＧＬＵＴ１を発現し、これらの血管が吸収の現象によって腫瘍中に組み込まれる既存の血管であることを強く示唆する。ＶＥＧＦ−Ａ１６５のみを発現する腫瘍中の血管が、ＧＬＵＴ１に対して陰性であり、それゆえ、新たに形成されると考えられることに留意されたい。
【図１５】図１５：イーコリ中で発現し、アミノ酸４７ないし５０６（レーン１）又はアミノ酸２２５ないし３８８（レーン２）を包含する、組換えプレキシンＤ１外部ドメインによるウェスタンブロットを生じた。プレキシンＤ１領域４７ないし５０６による免疫化の前（パネルＡ）及び後（パネルＢ）で、マウス２５の血清を検査した。図１５Ｂに示されるように、マウス免疫血清は、イーコリ組換えタンパク質４７ないし５０６（５２ｋＤａ、レーン１）及びプレキシンＤ１残基２２５ないし３８８を包含するタンパク質（免疫化に使用された配列内に完全に存在する１８ｋＤａタンパク質、レーン２）。免疫前血清は、このような反応性を示さなかった（パネルＡ）。胞状軟部肉腫の脳転移に関する免疫組織化学的染色において検査される場合には、マウス免疫血清（パネルＤ）は、血管及び腫瘍細胞に対して陽性を示したが、免疫前血清（パネルＣ）は陽性を示さず、染色パターンは、単一ドメイン抗体Ａ１２のものと同様であった。
【図１６】図１６：マウス２５由来のＢリンパ球から得られたモノクローナルＩｇＭ抗体による免疫組織化学。ＥＬＩＳＡにおいてタンパク質４７ないし５０６に対する反応性に基づいて、抗体１１Ｆ５Ｈ６及び１７Ｅ９Ｃ１２を選択し、ヒト腫瘍の凍結切片中でプレキシンＤ１を検出する可能性に関して分析した。これらの抗体は、図に示されるように、肉腫及び黒色腫の脳転移において強力な陽性を示した。注目すべきことに、パネルＣないしＦの挿入図は、一次抗体が省略された対照染色を表す。パネルＡ及びＢは、これらの抗体が、正常な脳組織中で血管構造を顕著には認識しないことを示す。
【図１７】図１７：抗体１１Ｆ５Ｈ６の腫瘍ホーミング。モノクローナル抗体１１Ｆ５Ｈ６が、腫瘍血管を認識できるかどうかを更に評価するため、実施例１０に本質的に記載されるように、血管新生Ｍｅ１５７−ＶＥＧＦ−Ａ腫瘍をヌードマウスの脳中で発育させた。抗体１１Ｆ５Ｈ６（１ｍｇ）を外側尾静脈中に注射し、１５分間循環させた。この時間後、１．３％イソフルランでマウスを麻酔し、胸部切開し、２０ｍＬのリン酸緩衝塩類溶液で心臓灌流を実施した。この手法の後、マウスを断頭し、脳を摘出し、瞬時凍結又はホルマリン固定した。４μｍの凍結切片を抗ＩｇＭ抗体で染色した。図１７Ａにおいて、抗体１１Ｆ５Ｈ６が、正常血管ではなく腫瘍血管にホーミングし、蓄積することが示されている（図１７Ａの抗ＩｇＭ染色を、図１７Ｂの抗内皮ＣＤ３１染色と比較する。）。このような染色は、注射していないマウスで抗ＩｇＭ染色を実施するときには観察されない。従って、１１Ｆ５Ｈ６は、腫瘍標的化の可能な、有望な抗体である。
【図１８】図１８：関節リウマチのマウスモデルにおけるマクロファージ中のプレキシンＤ１の発現。単一ドメイン抗体Ａ１２による染色を実施した。
【図１９】図１９：アテローム性動脈硬化症におけるプレキシンＤ１の発現。ヒトアテローム性動脈硬化症プラーク中のマクロファージのサブセットは、プレキシンＤ１を発現させる。単一ドメイン抗体Ａ１２による染色を実施した。プレキシンＤ１を赤で、マクロファージマーカーＣＤ６８を青で表示する二重染色を実施した。紫色は、同時発現を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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