(57)【要約】  Ｒｈｏ、Ａｒｆ、Ｒａｂ、Ｒａｎ又はＲａｐファミリータンパク質の活性化を調節する方法であって、前記試料にＵＳＰ−１７調節因子、例えばＤＵＢ−３の発現又は活性化阻害剤を投与するステップを含む方法が記載される。本発明は、転移癌及び他の状態の治療におけるＵＳＰ−１７調節因子の使用を可能にする。【選択図】  図１１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料におけるＲａｓスーパーファミリータンパク質の活性化を調節する方法であって、前記試料にＵＳＰ−１７調節因子を投与するステップを含み、前記Ｒａｓスーパーファミリータンパク質がＲｈｏ、Ａｒｆ、Ｒａｂ、Ｒａｎ又はＲａｐファミリータンパク質である方法。
【請求項２】
Ｒａｓスーパーファミリータンパク質が、Ｒｈｏ、Ａｒｆ、Ｒａｂ又はＲａｎファミリータンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｒａｓスーパーファミリータンパク質が、Ｒｈｏファミリータンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｒｈｏファミリータンパク質が、ＲｈｏＡ、Ｒａｃ又はＣｄｃ４２である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Ｒａｓスーパーファミリータンパク質が、Ｒａｐタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
スーパーファミリータンパク質の活性化が、ケモカイン刺激性活性化である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ケモカイン誘導性細胞浸潤を調節する方法であって、ＵＳＰ−１７調節因子を投与するステップを含む方法。
【請求項８】
ケモカイン誘導性細胞接着を調節する方法であって、ＵＳＰ−１７調節因子を投与するステップを含む方法。
【請求項９】
ケモカイン誘導性細胞遊走を調節する方法であって、ＵＳＰ−１７調節因子を投与するステップを含む方法。
【請求項１０】
走化性細胞におけるＲｈｏ、Ａｒｆ、Ｒａｂ、Ｒａｎ及び／又はＲａｐタンパク質のケモカイン誘導性移行を阻害する方法であって、前記細胞にＵＳＰ−１７調節因子を投与するステップを含む方法。
【請求項１１】
タンパク質がＲｈｏタンパク質である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ケモカインがＣＸＣＬ１２である、請求項５〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
動物における腫瘍転移数を減少させる方法であって、前記動物にＵＳＰ−１７調節因子を投与するステップを含む方法。
【請求項１４】
動物が少なくとも１個の原発腫瘍を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
転移発生率が低下する、請求項１３又は請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
１つ又は複数の転移が根絶される、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記動物がステージ３又はステージ４の腫瘍を有する、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＵＳＰ−１７調節因子が、ＤＵＢ−３発現及び／又はＤＵＢ−３活性を阻害する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
細胞におけるＵＳＰ−１７タンパク質の活性又は発現を調節する方法であって、前記細胞にケモカインを投与するステップを含む方法。
【請求項２０】
ＵＳＰ−１７タンパク質がＤＵＢ−３である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
炎症性疾患の治療を必要とする動物における炎症性疾患を治療する方法であって、前記動物にＵＳＰ−１７調節因子を投与するステップを含む方法。
【請求項２２】
炎症性疾患が細胞遊走を伴う炎症性疾患である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
炎症性疾患が、関節リウマチ、同種移植拒絶反応、糖尿病、多発性硬化症（ＭＳ）／実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、皮膚炎又は喘息である、請求項２１又は請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
炎症性疾患が炎症を伴う感染性疾患である、請求項２１又は請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
感染性疾患がインフルエンザ、肝炎又は重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
細胞遊走を伴う感染症の治療を必要とする動物における細胞遊走を伴う感染症を治療する方法であって、前記動物にＵＳＰ−１７調節因子を投与するステップを含む方法。
【請求項２７】
感染症が呼吸器感染症、皮膚感染症又は腸感染症である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
感染症がインフルエンザ、肝炎又はＳＡＲＳである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記調節因子がＤＵＢ−３発現及び／又はＤＵＢ−３活性を阻害する、請求項２１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
Ｒｈｏ、Ａｒｆ、Ｒａｂ又はＲａｎタンパク質活性化の調節因子を同定するためのアッセイ方法であって、
ａ）ＵＳＰ−１７タンパク質を発現することができる試験細胞に候補薬剤を接触させるステップと、
ｂ）前記試験細胞における候補薬剤の存在下でのＵＳＰ−１７タンパク質発現を判定するステップと、
ｃ）候補薬剤の存在下でのＵＳＰ−１７タンパク質発現を、前記候補薬剤に曝露されない対照細胞と比較するステップと
を含み、対照細胞と試験細胞とのＵＳＰ−１７タンパク質発現の差が、候補薬剤がＲｈｏ、Ａｒｆ、Ｒａｂ又はＲａｎタンパク質活性化を調節し得ることを示す方法。
【請求項３１】
腫瘍転移の調節因子を同定するためのアッセイ方法であって、
ａ）ＵＳＰ−１７タンパク質を発現することができる試験細胞に候補調節因子を接触させるステップと、
ｂ）前記試験細胞における候補調節因子の存在下でのＵＳＰ−１７タンパク質発現を判定するステップと、
ｃ）候補調節因子の存在下でのＵＳＰ−１７タンパク質発現を、前記候補調節因子に曝露されない対照細胞と比較するステップと
を含み、対照細胞と試験細胞とのＵＳＰ−１７タンパク質発現の差が、候補調節因子が腫瘍転移の調節因子であり得ることを示す方法。
【請求項３２】
走化性細胞における腫瘍ＧＴＰアーゼ移行の調節因子を同定するためのアッセイ方法であって、
ａ）ＵＳＰ−１７タンパク質を発現することができる試験細胞に候補調節因子を接触させるステップと、
ｂ）前記試験細胞における候補調節因子の存在下でのＵＳＰ−１７タンパク質発現を判定するステップと、
ｃ）候補調節因子の存在下でのＵＳＰ−１７タンパク質発現を、前記候補調節因子に曝露されない対照細胞と比較するステップと
を含み、対照細胞と試験細胞とのＵＳＰ−１７タンパク質発現の差が、候補調節因子がＧＴＰアーゼ移行の調節因子であり得ることを示す方法。
【請求項３３】
ＧＴＰアーゼがＲｈｏタンパク質である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ＧＴＰアーゼがＲａｐ１タンパク質である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
転移の治療剤の調製におけるＵＳＰ−１７調節因子の使用。
【請求項３６】
炎症性疾患の治療剤の調製におけるＵＳＰ−１７調節因子の使用。
【請求項３７】
炎症性疾患が細胞遊走を伴う炎症性疾患である、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
炎症性疾患が、関節リウマチ、同種移植拒絶反応、糖尿病、多発性硬化症（ＭＳ）／実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、皮膚炎又は喘息である、請求項３６又は請求項３７に記載の使用。
【請求項３９】
炎症性疾患が炎症を伴う感染性疾患である、請求項３６又は請求項３７に記載の使用。
【請求項４０】
感染性疾患がインフルエンザ、肝炎又は重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）である、請求項３８９に記載の使用。
【請求項４１】
転移が、前骨髄球性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ芽球性白血病、バーキットリンパ腫、膵臓癌、肺癌、脾臓癌、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、卵巣癌、脳癌、骨癌又は頭頸部腫瘍である原発腫瘍の転移である、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法又は請求項３５に記載の使用。
【請求項４２】
ＵＳＰ−１７タンパク質がＤＵＢ−３である、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の方法又は請求項３５〜４０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４３】
対照細胞と試験細胞とのＵＳＰ−１７タンパク質発現の差が、試験細胞における発現の低下である、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
ＵＳＰ−１７タンパク質がＤＵＢ−３である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ＵＳＰ−１７調節因子がＤｕｂ−３調節因子である、請求項３５〜４０のいずれか一項に記載の使用又は請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
調節因子がＤＵＢ−３発現又は活性の阻害剤である、請求項４５に記載の使用又は方法。
【請求項４７】
細胞における接着依存性増殖を阻害する方法であって、前記細胞にＵＳＰ−１７調節因子を投与するステップを含む方法。
【請求項４８】
前記ＵＳＰ−１７調節因子の投与が、アノイキスを促進する、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
接着依存性細胞増殖を遮断及び／又はアノイキスを促進するためのＵＳＰ−１７調節因子の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本出願は、炎症性疾患、感染性疾患及び腫瘍性疾患の治療方法並びにこうした治療で使用するための組成物に関する。詳細には、本出願は、原発腫瘍を有する動物における転移発生など、細胞浸潤を伴う又は細胞浸潤の結果生じる疾患を阻害又は治療する方法、急性慢性炎症を低減する方法、及び感染症の全身への拡散を低減する方法に関する。
【０００２】
［発明の背景］
疾患の転移拡散は、癌治療における予後不良因子である。多数の既存の化学療法戦略は、原発腫瘍での治療においてはある程度成功しているものの、こうした戦略は、転移形成の予防及びこうした転移が生じた場合のこの治療においては成功しないことが多い。したがって、原発腫瘍からの転移発生を防ぎ、転移が生じた時と場所においてこれを根絶する新たな戦略を開発する差し迫った必要がある。
【０００３】
脱ユビキチン化（結合したタンパク質からのユビキチンモノマー又はユビキチン鎖の除去）は、２つの主なサブファミリー、すなわち、ユビキチナチン（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｎ）−プロセシングプロテアーゼ（ＵＢＰ）及びユビキチンカルボキシル末端加水分解酵素（ＵＣＨ）に分けられるシステインプロテアーゼにより行われる（Ｗｉｎｇ  ２００３年による概説）。脱ユビキチン化酵素のファミリーであるＤＵＢ（脱ユビキチン化酵素）は、ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ（ＵＳＰ）サブファミリーＵＳＰ−１７に属し、造血細胞で特異的に発現される最初のメンバーが同定された（Ｚｈｕら、１９９６ａ）。以来、２００４年のＢｕｒｒｏｗｓ及び同僚によるヒトメンバーＤｕｂ−３を含むさらに４種類のＤＵＢファミリーメンバーが同定されている（Ｚｈｕら、１９９７年；Ｂａｅｋら、２００４年；Ｂａｅｋら、２００１年；Ｂｕｒｒｏｗｓら、２００４年；Ｓａｉｔｏｎら、２０００年）。Ｄｕｂ−３は、様々な悪性細胞株で発現されており、癌の病因におけるＤｕｂ−３の潜在的役割を示唆する（Ｂｕｒｒｏｗｓら、２００４年）。これまでに、他の脱ユビキチン化酵素が発癌経路で役割を果たすことが示されている。脱ユビキチン化酵素Ｕｎｐ（偏在核タンパク質）、ＶＤＵ２（ｐＶＨＬ相互作用脱ユビキチン化酵素２）及びＨＡＵＳＰ（ヘルペスウイルス関連ユビキチン特異的プロテアーゼ）は、腫瘍抑制因子Ｒｂ（網膜芽細胞腫タンパク質）、ｐＶＨＬ（ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ）及びｐ５３とそれぞれ相互作用することが示されている（ＤｅＳａｌｌｅ  ＬＭら、２００１年；Ｌｉ  Ｚら、２００２年；Ｌｉ  Ｍら、２００２年）。
【０００４】
最近、Ｒａｓスーパーファミリーメンバーの活性は、翻訳後プロセシングにより制御され得、ＧＴＰ−ＧＤＰサイクリングにだけ制御され得るわけではないことが見出された。Ｒａｓスーパーファミリーメンバーは、Ｃ末端ＣＡＡＸモチーフ（Ａは脂肪族アミノ酸、Ｘは任意のアミノ酸）を有し、このＣ末端ＣＡＡＸモチーフに対する翻訳後修飾は、もう１つのＧＴＰアーゼ活性化様式に関与する。翻訳後修飾は、一連の酵素作用、すなわち、細胞質プレニルトランスフェラーゼ、小胞体（ＥＲ）プロテアーゼＲＣＥ１（Ｒａｓ変換酵素）、及びＥＲ酵素ＩＣＭＴ（イソプレニルシステイン特異的（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）カルボキシルメチルトランスフェラーゼ）により実現される。（Ｃｌａｒｋ  １９９２年；Ｃａｓｅｙ  Ｓｅａｂｒａ  １９９６年；Ｂｏｙａｒｔｃｈｕｋら、１９９７年；Ｄｉａら、１９９８年）。これらの翻訳後修飾の産物は、最終的に完全なＧＴＰアーゼ活性をもたらす、親水性ＧＴＰアーゼ分子のＣ末端における疎水性ドメインである。
【０００５】
２０〜３０ｋＤａの単量体グアニンヌクレオチド結合タンパク質のＲａｓスーパーファミリーは、１５０を超える既知のヒトメンバーを有し、５つのファミリー、すなわち、Ｒａｓ、Ｒｈｏ、Ａｒｆ、Ｒａｂ、及びＲａｎに分けられ（Ｗｅｎｎｅｒｂｅｒｇら、２００５年）、メンバーのそれぞれが細胞に対する異なる効果を有し、異なる制御作用を受ける。例えば、Ｒａｓは、増殖因子を介して増殖を制御するが、Ｒｈｏファミリーは増殖因子を介して増殖を制御しない。さらに、Ｒａｓは、ファルネシル化により制御されるが、Ｒａｓファミリーのメンバー全てがファルネシル化により制御されるわけではない。例えばＲａｐ−１は、ゲラニルゲラニル化により制御される。さらに、Ｒｈｏファミリーのタンパク質は、ゲラニルゲラニル化により制御される。また、Ｒｈｏファミリーはアクチン細胞骨格を制御し、Ｒａｐ−１は接着を制御するが、Ｒａｓは制御しない。
【０００６】
Ｒｈｏファミリーは、細胞運動及び腫瘍転移に最も関連がある。Ｒｈｏファミリーのうち、ＲｈｏＡ、Ｒａｃ−１及びＣｄｃ４２は、癌の浸潤に最も関連したＧＴＰアーゼである。癌細胞の浸潤及び転移は、３つの細胞プロセス、すなわち、細胞接着、細胞遊走及び細胞外マトリックス分解酵素の産生により制御され、これら３つのプロセスは、全てＲａｓスーパーファミリーＧＴＰアーゼにより誘導される（それぞれ、Ｋａｔａｇｉｒｉら、２０００年；Ｅｄｅｎら、２００２年；Ｚｈｕｇｅら、２００１年）。
【０００７】
国際公開第２００５／０４９８１８号パンフレットに記載の通り、本発明者らは、恐らくＲｃｅｌ制御を介したＲａｓプロセシング及び活性化の制御因子としてＤＵＢ−３を同定した。特に、本文献は、ＤＵＢ−３を増大する薬剤が、Ｒａｓ活性化の低下に有利となり得、こうした薬剤は癌治療に使用され得ることを開示する。
【０００８】
上述の通り、Ｒａｓスーパーファミリーの異なるファミリーは、この制御及び効果を含め、多くの側面で互いに大きく異なる。したがって、Ｒａｓスーパーファミリーの１つのファミリーの制御経路の同定は、こうした制御経路が該スーパーファミリーの他のファミリーに当てはまることを示すものではない。
【０００９】
［発明の概要］
本明細書では、Ｒａｓスーパーファミリーのファミリーの制御に多くの違いがあるにもかかわらず、本発明者らは、ＵＳＰ−１７酵素ＤＵＢ−３がＲｈｏタンパク質制御に役割を果たすことを予想外に見出した。さらに驚いたことは、ＤＵＢの上方及び下方制御とも、Ｒｈｏタンパク質の活性化を高める効果を有することの実証であった。
【００１０】
さらに、本発明者らは、ＤＵＢ−３が、Ｒｈｏタンパク質の修飾を介して悪性細胞のケモカイン刺激性細胞接着、遊走及び化学浸潤（ｃｈｅｍｏｉｎｖａｓｉｏｎ）に役割を果たすこと、並びに、この結果、ＤＵＢ−３などのＵＳＰ−１７酵素が、癌の転移及び浸潤治療のための治療標的として使用できることをさらに示した。
【００１１】
したがって、本発明の第１の態様では、生体試料におけるＲｈｏタンパク質の活性化を調節する方法であって、前記試料にＵＳＰ−１７調節因子を投与するステップを含む方法が提供される。
【００１２】
本発明の方法は、任意のＲｈｏタンパク質、例えばＲｈｏＡ、ＲｈｏＢ、ＲｈｏＣ、Ｒａｃ１、Ｒａｃ２、Ｒａｃ３、ＲｈｏＧ、Ｃｄｃ４２、ＴＣ１０、ＴＣＬ、Ｗｒｃｈ−１、Ｒｎｄ１、Ｒｎｄ２、ＲｈｏＥ／Ｒｎｄ３、ＲｈｏＤ、Ｒｉｆ、及び／又はＲｈｏＨ／ＴＩＦの活性化を調節するのに使用され得る。
【００１３】
１つの実施形態では、Ｒｈｏタンパク質はＲａｃ１である。
【００１４】
さらに、予想に反して、ＤＵＢ−３がＲｈｏタンパク質の制御に影響するという実証は、ＵＳＰ−１７酵素、例えばＤＵＢ−３が、Ｒａｓファミリー以外のＲａｓスーパーファミリーの他のファミリーに対し制御的役割を果たすことを示唆するものである。
【００１５】
故に、本発明の第２の態様では、生体試料におけるＲａｓスーパーファミリータンパク質の活性化を調節する方法であって、前記試料にＵＳＰ−１７酵素を調節する薬剤を投与するステップを含み、前記Ｒａｓスーパーファミリータンパク質が、Ｒｈｏ、Ａｒｆ、Ｒａｂ、又はＲａｎタンパク質である方法が提供される。
【００１６】
本発明の別の態様では、生体試料におけるＲａｓスーパーファミリータンパク質の活性化を調節する方法であって、前記試料にＵＳＰ−１７酵素を調節する薬剤を投与するステップを含み、前記Ｒａｓスーパーファミリータンパク質が、Ｒａｌ、Ｒａｐ又はＲｈｅｂタンパク質である方法が提供される。１つの実施形態では、Ｒａｓスーパーファミリータンパク質は、ＲａｌＡ、ＲａｌＢ、Ｒａｐ１ａ、Ｒａｐ１ｂ、Ｒａｐ２ａ、Ｒａｐ２ｂ、及びＲｈｅｂから成る群から選択される。
【００１７】
本発明者らは、インビボでのＤＵＢ−３の役割を解明するため、ＤＵＢ−３の制御（ｃｏｎｔｒｏｌ）を調べた。実施例に記載の通り、本発明者らは、ＤＵＢ−３がケモカイン、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦによりメッセージレベルで制御されることを見出した。故に本発明の第１又は第２の態様の１つの実施形態では、Ｒａｓスーパーファミリータンパク質、例えばＲｈｏファミリータンパク質の活性化はケモカイン刺激性活性化である。
【００１８】
さらに、本発明の第３の態様では、細胞におけるＵＳＰ−１７酵素、例えばＤＵＢ−３の発現を刺激する方法であって、ケモカインを前記細胞に投与するステップを含む方法が提供される。
【００１９】
任意の適切なケモカインが使用されてよい。適切なケモカインには、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−１ｂ、ＭＣＰ−１、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１又はＧタンパク質共役受容体化学誘引性リガンドが含まれるが、これらに限定されない。
【００２０】
１つの実施形態では、ケモカインはＣＸＣＬ１２／ＳＤＦである。
【００２１】
ケモカイン刺激は、細胞接着、細胞遊走及び細胞浸潤（化学浸潤）を誘導することが知られている。ケモカイン刺激は、ＤＵＢ−３メッセージ発現を制御することが見出されたため、本発明者らは、ＤＵＢ−３の脱制御がケモカイン誘導性機能に影響し得るかどうかを調べた。
【００２２】
実施例に記載の通り、ＤＵＢ−３の調節が、人工基底膜を介したＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ刺激性走化性、並びにＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ刺激性遊走及び浸潤を阻害することが意外にも示された。
【００２３】
したがって、本発明者らは、ＤＵＢ−３などのＵＳＰ  １７酵素はケモカインが促進する細胞事象の重要な調節因子であり、細胞浸潤を伴う炎症性疾患及び感染性疾患や腫瘍転移など、細胞浸潤に媒介される疾患及び状態の潜在的治療標的となることを確証した。
【００２４】
故に、本発明の第４の態様によれば、ケモカイン誘導性細胞浸潤を調節する方法であって、ＵＳＰ−１７調節因子を投与するステップを含む方法が提供される。
【００２５】
第５の態様では、ケモカイン誘導性細胞接着を調節する方法であって、ＵＳＰ−１７調節因子を投与するステップを含む方法が提供される。
【００２６】
本発明の第６の態様では、ケモカイン誘導性細胞遊走を調節する方法であって、ＵＳＰ−１７調節因子を投与するステップを含む方法が提供される。
【００２７】
本発明の第４、第５又は第６の態様の１つの実施形態では、ケモカインはＣＸＣＬ１２である。
【００２８】
本発明者らは、Ｒａｃ、ＲｈｏＡ及びＣｄｃ４２など幾つかのＲｈｏタンパク質、並びにＲａｐ１に対するＤＵＢ−３の影響を調べ、実施例に記載の通り、ＤＵＢ−３調節が、Ｒａｃ及びＲａｐ１活性化を脱制御すること、両タンパク質のＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２刺激性形質膜輸送を阻害し、さらに、細胞増殖を阻害することを実証した。
【００２９】
したがって、本発明の第７の態様では、走化性細胞におけるＲｈｏタンパク質及び／又はＲａｐタンパク質のケモカイン誘導性移行を阻害する方法であって、前記細胞にＵＳＰ−１７調節因子を投与するステップを含む方法が提供される。
【００３０】
１つの実施形態では、Ｒｈｏタンパク質はＲａｃである。
【００３１】
１つの実施形態では、ケモカインはＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２である。
【００３２】
細胞遊走及び浸潤を調節可能にすることで、本発明は、転移の治療及び予防での使用を見出す。
【００３３】
故に、本発明の第８の態様では、原発腫瘍を有する動物における腫瘍転移数を減少させる方法であって、前記動物にＵＳＰ−１７調節因子を投与するステップを含む方法が提供される。
【００３４】
本発明の第８の態様では、転移発生率が低下し得る、すなわち転移発生が阻害され得る、及び／又は既存の転移数を減少し得るように１つ又は複数の転移が根絶され得る。
【００３５】
故に本発明は、ステージ３又はステージ４の腫瘍を治療するのに使用され得る。
【００３６】
腫瘍転移の治療に関連するほか、ＵＳＰ−１７脱制御が、細胞浸潤及び移動挙動を減少し得るという発見は、細胞遊走を特徴とする炎症性疾患に関与する細胞にも関連する。
【００３７】
したがって、本発明の第９の態様では、細胞浸潤を伴う炎症性疾患又は感染性疾患の治療を必要とする動物における細胞浸潤を伴う炎症性疾患又は感染性疾患を治療する方法であって、前記動物にＵＳＰ−１７調節因子を投与するステップを含む方法が提供される。
【００３８】
本発明が使用され得る炎症性疾患又は状態には、関節リウマチ、同種移植拒絶反応、糖尿病、多発性硬化症（ＭＳ）／実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、皮膚炎、及び喘息が含まれる。
【００３９】
本発明が使用され得る炎症性疾患又は状態の他の例には、肝炎、変形性関節症、結核、呼吸器感染症、乾癬、ＨＩＶ、インフルエンザ、ＳＡＲＳ、結膜炎（ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｔｉｓ）、帯状疱疹、髄膜炎、接触性皮膚炎、歯肉炎、蜂巣炎、肺炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、皮膚潰瘍形成、真菌感染症、鵞口瘡、脳炎、及び尿管感染症を含む、ウイルス感染症及び細菌感染症が含まれる。
【００４０】
本発明の１つの実施形態では、ＵＳＰ−１７酵素はＤＵＢ−３である。その調節が本発明での使用を見出し得る他のＵＳＰ−１７酵素には、ＵＳＰ−１７ホモログ、ＤＵＢ−３、ＤＵＢ−４、ＤＵＢ−５、ＤＵＢ−６、ＤＵＢ−７、ＤＵＢ−８、ＤＵＢ−９、ＤＵＢ−１０、ＤＵＢ−１１、ＤＵＢ−１２、ＤＵＢ−１３、及びＤＵＢ−１４、並びにこれらの変異体又は断片が含まれる。ＤＵＢ−３〜ＤＵＢ−１２の各々のアミノ酸配列が、図１２に示される。ＤＵＢ−３〜ＤＵＢ−１２、並びにこれらの変異体及び断片に関するさらなる詳細は、国際公開第２００５／０４９８１８号パンフレットに記載されており、この内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００４１】
任意の適切なＵＳＰ−１７調節因子が、本発明で使用されてよい。ＵＳＰ−１７調節因子は、ＵＳＰ−１７酵素の発現及び／又は活性を調節し得る。ＵＳＰ−１７調節因子は、通常の状態と比較して１つ又は複数のＵＳＰ−１７酵素の増減をもたらし得る。１つの実施形態では、ＵＳＰ−１７調節因子は、投与される細胞における特定のＵＳＰ−１７酵素、例えばＤＵＢ−３タンパク質の濃度を低下させる。別の実施形態では、ＵＳＰ−１７調節因子は、投与される細胞における１つ又は複数のＵＳＰ−１７タンパク質の濃度を上昇させる。
【００４２】
本発明で使用され得るＵＳＰ−１７調節因子には、例えば、小分子薬剤、ペプチド又は抗体、前記ペプチド又は抗体をコードする核酸分子、アプタマー、アンチセンス分子又は例えばＤＵＢ３に対するｐＳｕｐｅｒ標的構築物などのｓｉＲＮＡ分子が含まれる。
【００４３】
上述及び実施例に記載の通り、ＤＵＢ−３を増大する薬剤は、Ｒａｓ活性化の低下に有利であること、及びこうした薬剤は癌治療に使用され得ることが開示された国際公開第２００５／０４９８１８号パンフレットに記載された結果とは特に異なり、本発明者らは、ＤＵＢ−３の下方制御がＲｈｏ及びＲａｐタンパク質の活性化を高める結果となり、さらに転移癌などの病因と関係がある走化性などの細胞プロセスを阻害することを示した。したがって、１つの実施形態では、ＵＳＰ−１７調節因子は１つ又は複数のＵＳＰ−１７酵素、例えばＤＵＢ−３の活性化又は発現を阻害する。
【００４４】
故にＵＳＰ−１７調節因子は、例えばＤＵＢ３  ｓｉＲＮＡなどのＵＳＰ１７  ｓｉＲＮＡ、又は例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓら、２００４年に開示されている抗体（Ｂｕｒｒｏｗｓ  ＪＦら、ＪＢＣ  ２００４年  ２７９（１４）：１３９９３〜４０００頁）など、抗体又は抗体断片などの抗体分子といった小分子阻害剤などのＵＳＰ−１７阻害剤であってよい。
【００４５】
ＤＵＢ−３を阻害するのに使用され得るヘアピンｓｉＲＮＡ配列例は、ＧＣＡＧＧＡＡＧＡＴＧＣＣＣＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＧＣＡＴＣＴＴＣＣＴＧＣである。任意の適切なベクターが使用され得る。例えば、１つの実施形態では、ｐＳＵｐｅｒ標的構築物が使用され得る。
【００４６】
ＵＳＰ−１７酵素とＲｈｏ、Ａｒｆ、Ｒａｂ、及びＲａｎタンパク質活性化との関連、並びにケモカイン誘導性細胞浸潤及び移動挙動に対するＵＳＰ−１７酵素の影響の発見は、さらに、Ｒｈｏ、Ａｒｆ、Ｒａｂ、又はＲａｎタンパク質活性化のさらなる調節因子、並びに故に細胞浸潤及び移動挙動の調節因子の同定を可能にする。
【００４７】
したがって、本発明の第１０の態様では、Ｒｈｏ、Ａｒｆ、Ｒａｂ、又はＲａｎタンパク質活性化の調節因子を同定するためのアッセイ方法であって、
ａ）ＵＳＰ−１７タンパク質を発現することができる試験細胞に候補薬剤を接触させるステップと、
ｂ）前記試験細胞における候補薬剤の存在下でのＵＳＰ−１７タンパク質発現を判定するステップと、
ｃ）候補薬剤の存在下でのＵＳＰ−１７タンパク質発現を前記候補薬剤に曝露されない対照細胞と比較するステップと
を含み、対照細胞と試験細胞とのＵＳＰ−１７タンパク質発現の差が、候補薬剤がＲｈｏ、Ａｒｆ、Ｒａｂ、又はＲａｎタンパク質活性化を調節し得ることを示す方法が提供される。
【００４８】
また、本発明の第１１の態様では、腫瘍転移の調節因子を同定するためのアッセイ方法であって、
ａ）ＵＳＰ−１７タンパク質を発現することができる試験細胞に候補調節因子を接触させるステップと、
ｂ）前記試験細胞における候補調節因子の存在下での前記ＵＳＰ−１７タンパク質発現を判定するステップと、
ｃ）候補調節因子の存在下でのＵＳＰ−１７タンパク質発現を前記候補調節因子に曝露されない対照細胞と比較するステップと
を含み、対照細胞と試験細胞とのＵＳＰ−１７タンパク質発現の差が、候補調節因子が腫瘍転移の調節因子であり得ることを示す方法も提供される。
【００４９】
本発明の第１０又は第１１の態様のアッセイ方法は、確認ステップ、すなわち
（ｄ）Ｒｈｏ、Ａｒｆ、Ｒａｂ、又はＲａｎファミリータンパク質、例えばＲａｃの活性化を判定するためのアッセイを提供するステップと、
（ｅ）候補調節因子の存在下及び非存在下でのファミリータンパク質の活性化を判定するステップであって、候補調節因子の非存在下でのファミリータンパク質発現と比べた候補調節因子の存在下でのファミリータンパク質発現の低下が、候補薬剤がＲｈｏ、Ａｒｆ、Ｒａｂ、又はＲａｎタンパク質発現の阻害剤であることを裏付けるステップと
を含み得る。
【００５０】
さらに、第１１の態様のアッセイは、上述の通りステップ（ｄ）及び（ｅ）を場合により含むほか、或いは又はさらに、１つ又は複数のさらなる確認ステップを含み得る。
【００５１】
１つの実施形態では、さらなる確認アッセイステップは、
（ｉ）細胞遊走アッセイを提供するステップと、
（ｉｉ）候補調節因子の存在下での細胞遊走を判定するステップと、
（ｉｉｉ）候補調節因子の非存在下での細胞遊走を判定するステップと
を含む。前記候補調節因子の存在下での細胞遊走の減少は、調節因子が腫瘍転移阻害剤であることを裏付ける。
【００５２】
使用され得る別のさらなる確認アッセイステップは、
（ｉ）細胞接着アッセイを提供するステップと、
（ｉｉ）候補調節因子の存在下での細胞の細胞接着を判定するステップと、
（ｉｉｉ）候補調節因子の非存在下での細胞の細胞接着を判定するステップと
を含む。前記候補調節因子の存在下での細胞接着の減少は、調節因子が腫瘍転移阻害剤であることを裏付ける。
【００５３】
使用され得る別のさらなる確認アッセイステップは、
（ｉ）細胞化学浸潤アッセイを提供するステップと、
（ｉｉ）候補調節因子の存在下での細胞化学浸潤を判定するステップと、
（ｉｉｉ）候補調節因子の非存在下での細胞化学浸潤を判定するステップと
を含む。前記候補調節因子の存在下での化学浸潤の減少は、調節因子が腫瘍転移阻害剤であることを裏付ける。
【００５４】
本発明の第１２の態様は、走化性細胞における腫瘍ＧＴＰアーゼ移行の調節因子を同定するためのアッセイ方法であって、
ａ）ＵＳＰ−１７タンパク質を発現することができる試験細胞に候補調節因子を接触させるステップと、
ｂ）前記試験細胞における候補調節因子の存在下での前記ＵＳＰ−１７タンパク質発現を判定するステップと、
ｃ）候補調節因子の存在下でのＵＳＰ−１７タンパク質発現を前記候補調節因子に曝露されない対照細胞と比較するステップと
を含み、対照細胞と試験細胞とのＵＳＰ−１７タンパク質発現の差が、候補調節因子がＧＴＰアーゼ移行の調節因子であり得ることを示す方法を提供する。
【００５５】
本発明の第１０〜第１２の態様の１つの実施形態では、ＵＳＰ−１７タンパク質はＤＵＢ−３である。
【００５６】
本発明のこの態様の１つの実施形態では、ＧＴＰアーゼはＲｈｏタンパク質、例えばＲａｃである。別の実施形態では、ＧＴＰアーゼはＲａｐ１である。
【００５７】
１つの実施形態では、移行は、ケモカイン、サイトカイン又は増殖因子誘導性移行である。１つの実施形態では、ケモカインはＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２である。
【００５８】
また、細胞遊走を伴う炎症性疾患の治療剤の調製におけるＵＳＰ−１７調節因子の使用も、本発明の第１３の態様として提供される。
【００５９】
本発明の第１４の態様は、腫瘍転移及び浸潤の治療剤の調製におけるＵＳＰ−１７調節因子の使用を提供する。
【００６０】
本発明の第１３又は第１４の態様の１つの実施形態では、ＵＳＰ−１７調節因子はＵＳＰ−１７タンパク質の発現又は活性を低下させる。
【００６１】
本発明は、任意の腫瘍タイプの転移の予防又は治療に使用され得る。例えば、本発明がその転移の治療に使用され得る原発腫瘍には、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、卵巣癌、リンパ腫、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、脳癌、骨癌、膀胱癌、脾臓癌及び頭頸部腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
【００６２】
本発明の第１５の態様は、炎症性疾患の治療剤の調製におけるＤＵＢ−３調節因子の使用を提供する。
【００６３】
実施例に記載の通り、本発明者らは、ＤＵＢ−３がＲａｐ−１のサイトカイン誘導性活性化を調節することも見出した。
【００６４】
したがって、本発明のさらなる態様では、生体試料におけるＲａｐタンパク質の活性化を調節する方法であって、前記試料にＵＳＰ−１７調節因子、例えばＤＵＢ−３を投与するステップを含む方法が提供される。この態様の１つの実施形態では、Ｒａｐ活性化は、ケモカイン、サイトカイン又は増殖因子誘導性活性化である。
【００６５】
本発明のこの態様の１つの実施形態では、調節因子は、ＵＳＰ−１７タンパク質、例えばＤＵＢ−３の発現又は活性化を増大する。
【００６６】
本発明の各態様の好ましい特徴は、他の態様の各々に関しては準用する。
【００６７】
［詳細な説明］
ＵＳＰ−１７調節因子
任意の適切なＵＳＰ−１７調節因子が、本発明では使用され得る。ＵＳＰ−１７調節因子は、ＵＳＰ−１７の活性又は発現を増減し得る。
【００６８】
上述の通り、調節因子は、核酸分子又は抗体分子であってよい。別の実施形態では、ＵＳＰ−１７調節因子は、ＤＵＢ−３のペプチド又は非ペプチド小分子調節因子であってよい。さらなる実施形態では、ＵＳＰ−１７調節因子はアプタマーであってよい。例えば、調節因子は、ｓｉＲＮＡ、例えばｐＳＵＰＥＲ  ＲＮＡｉシステム（Ｏｌｉｇｏｅｎｇｉｎｅ社、シアトル、ＵＳＡ）を使用するｓｉＲＮＡであってよい。ｐＳＵＰＥＲ  ＲＮＡｉシステムは、ｓｉＲＮＡ様転写物の細胞内合成を導く哺乳類発現ベクターである。ベクターは、ポリメラーゼ−ＩＩＩ  Ｈ１−ＲＮＡ遺伝子プロモーターを使用する。
【００６９】
１つの実施形態では、ＵＳＰ−１７調節因子は、ＤＵＢ−３調節因子である。特定の実施形態では、本発明で使用するためのＤＵＢ−３調節因子はＤＵＢ−３阻害剤である。
【００７０】
核酸
本発明で使用するための核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡを含み得る。核酸は、標準的方法を用いるクローニングを含め、組換え的に、合成的に、又は当業者に利用可能な任意の手段により作製され得る。
【００７１】
核酸は、任意の適切なベクター、例えばウイルス（例えばワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）、バキュロウイルス；酵母ベクター、ファージ、染色体、人工染色体、プラスミド、又はコスミドＤＮＡに挿入され得る。ベクターは、原核又は真核細胞であり得る宿主細胞に核酸を導入するのに使用され得る。
【００７２】
例えば、核酸構築物の調製、突然変異誘発、配列決定、細胞へのＤＮＡ導入及び遺伝子発現における核酸操作、並びにタンパク質分析のための既知の方法及びプロトコルに関するさらなる詳細については、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第５版、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、２００５年及び、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｏｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：第３版  Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２００１年を参照されたい。
【００７３】
アンチセンス／ｓｉＲＮＡ
本発明で使用するためのＵＳＰ−１７調節因子は、遺伝子発現を調節することができる、例えばＤＵＢ−３タンパク質コード配列の発現を下方制御することができる核酸分子を含み得る。こうした核酸分子には、アンチセンス分子、例えば低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などの低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、核酸センサー分子、アロザイム、酵素の核酸分子、及び三重鎖オリゴヌクレオチド並びに配列特異的にＲＮＡ干渉「ＲＮＡｉ」又は遺伝子サイレンシングを媒介するのに使用することができる任意の他の核酸分子が含まれるが、これらに限定されない（例えばＢａｓｓ、２００１年、Ｎａｔｕｒｅ、４１１、４２８〜４２９頁；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１年、Ｎａｔｕｒｅ、４１１、４９４〜４９８頁；国際公開第００／４４８９５号パンフレット；国際公開第０１／３６６４６号パンフレット；国際公開第９９／３２６１９号パンフレット；国際公開第００／０１８４６号パンフレット；国際公開第０１／２９０５８号パンフレット；国際公開第９９／０７４０９号パンフレット；及び国際公開第００／４４９１４号パンフレット；Ａｌｌｓｈｉｒｅ、２００２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９７、１８１８〜１８１９；Ｖｏｌｐｅら、２００２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９７、１８３３〜１８３７頁；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ、２００２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９７、２２１５〜２２１８頁；Ｈａｌｌら、２００２年、Ｓｉｅｎｃｅ、２９７、２２３２〜２２３７；Ｈｕｔｖａｎｇｅｒ及びＺａｍｏｒｅ、２００２年、Ｓｉｅｎｃｅ、２９７、２０５６〜６０頁；ＭｃＭａｎｕｓら、２００２年、ＲＮＡ、８、８４２〜８５０頁；Ｒｅｉｎｈａｒｔら、２００２年、Ｇｅｎｅ  ＆  Ｄｅｖ．、１６、１６１６〜１６２６；Ｒｅｉｎｈａｒｔ  ＆  Ｂａｒｔｅｌ、２００２年、Ｓｉｅｎｃｅ、２９７、１８３１頁参照）。
【００７４】
「アンチセンス核酸」は、ＲＮＡ−ＲＮＡ又はＲＮＡ−ＤＮＡ又はＲＮＡ−ＰＮＡ（タンパク質核酸；Ｅｇｈｏｌｍら、１９９３年  Ｎａｔｕｒｅ  ３６５、５６６頁）相互作用を用いて標的ＲＮＡに結合する非酵素的核酸分子であり、標的ＲＮＡの活性を変化させる（概説として、Ｓｔｅｉｎ及びＣｈｅｎｇ、１９９３年  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１、１００４頁並びにＷｏｏｌｆら、米国特許第５，８４９，９０２号明細書参照）。アンチセンス分子は、アンチセンス分子の単一の連続配列に沿った標的配列に相補的であり得、又は特定の実施形態では、アンチセンス分子が２つ以上の不連続基質配列に相補的であり得る、若しくはアンチセンス分子の２つ以上の不連続配列部分が標的配列に相補的であり得る、若しくはこの両方であり得るように、アンチセンス分子がループを形成するように、基質、アンチセンス分子若しくはこの両方が結合できるように、アンチセンス分子は基質に結合し得る。アンチセンス法の詳細は、当技術分野では周知であり、例えばＳｃｈｍａｊｕｋら、１９９９年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４、２１７８３〜２１７８９頁、Ｄｅｌｉｈａｓら、１９９７年、Ｎａｔｕｒｅ、１５、７５１〜７５３頁、Ｓｔｅｉｎら、１９９７年、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎ．Ａ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．、７、１５１、Ｃｒｏｏｋｅ、２０００年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、３１３、３〜４５；Ｃｒｏｏｋｅ、１９９８年、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ．、１５、１２１〜１５７頁、Ｃｒｏｏｋｅ、１９９７年、Ａｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、４０、１〜４９頁を参照されたい。
【００７５】
「三重鎖核酸」又は「三重鎖オリゴヌクレオチド」は、配列特異的に二本鎖ＤＮＡに結合して三重らせんを形成することができるポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドである。こうした三重らせん構造の形成は、標的遺伝子の転写を調節することが示されている（Ｄｕｖａｌ−Ｖａｌｅｎｔｉｎら、１９９２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９、５０４頁）。
【００７６】
アプタマー
アプタマーは、特定の分子標的と密接に結合する核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）マクロ分子である。アプタマーは、例えばＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化）によりインビトロでの選択を繰り返すことで迅速に作製することができ、小分子、タンパク質、核酸などの様々な分子標的に結合する（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ及びＳｚｏｓｔａｋ、Ｎａｔｕｒｅ  ３４６（６２８７）：８１８〜８２２頁（１９９０年）、Ｔｕｅｒｋ及びＧｏｌｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９（４９６８）：５０５〜５１０頁（１９９０年）米国特許第６，８６７，２８９号明細書；米国特許第５，５６７，５８８号明細書、米国特許第６，６９９，８４３号明細書参照）。
【００７７】
顕著な特異性を示すことに加え、アプタマーは一般に、きわめて高い親和性で標的に結合する。大半の抗タンパク質アプタマーは、ピコモル（ｐＭ）〜低ナノモル（ｎＭ）範囲の平衡解離定数（Ｋｄｓ）を有する。
【００７８】
アプタマーは、化学合成により迅速に作製され、望ましい保存特性を有し、治療適用での免疫原性をほとんど誘発しないか又は誘発しない。
【００７９】
非修飾アプタマーは、アプタマーの本質的に低い分子量のために、主にヌクレアーゼ分解及び腎クリアランスにより、数分〜数時間の半減期で血流から急速に除去される。しかし、当技術分野で周知の通り、２’−フッ素置換ピリミジン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）結合などの修飾は、該分子の半減期を必要に応じて数日〜数週間に調整するのに使用することができる。
【００８０】
ペプチドアプタマーは、細胞内の他のタンパク質相互作用を干渉するように設計されたタンパク質である。これは、タンパク質スカフォールドに両末端で付加された可変ペプチドループから成る。この二重構造的拘束は、抗体に匹敵するレベル（ナノモル範囲）までペプチドアプタマーの結合親和性を大幅に高める。可変ループの長さは、典型的には１０〜２０アミノ酸から成り、スカフォールドは、良好な可溶性及び緻密性（ｃｏｍｐａｃｉｔｙ）特性を有する任意のタンパク質であってよい。アプタマーは、任意のデオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド、又はリンに結合した非架橋リガンドの１つとして酸素の代わりに硫黄を有するデオキシチオホスホスフェート（又はホスホロチオエート）など、これらの塩基の修飾物を含み得る。モノチオホスフェートαＳは、１個の硫黄原子を有する故にリン中心の周囲がキラルとなる。
【００８１】
ジチオホスフェートは、両方の酸素の位置で置換される故にアキラルとなる。ホスホロチオエートヌクレオチドは、市販されているか又は当技術分野で周知の幾つかの異なる方法で合成することができる。
【００８２】
抗体分子
本発明の文脈では、「抗体分子」は、免疫グロブリン若しくはこの一部、又は抗体結合ドメインである、若しくは抗体結合ドメインに相同な結合ドメインを含む任意のポリペプチドを指すと理解すべきである。抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多特異性抗体及びこれらの断片、並びに別のポリペプチドに融合した免疫グロブリン結合ドメインを含むキメラ抗体が含まれるがこれらに限定されない。
【００８３】
インタクトな（完全な）抗体は、重鎖及び軽鎖から成る免疫グロブリン分子を含む。重鎖及び軽鎖の各々は、それぞれＶＨ及びＶＬと名付けられた可変領域を有する。可変領域は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ、超可変領域としても知られる）及び４つのフレームワーク領域（ＦＲ）又はスカフォールドから成る。ＣＤＲは、抗原分子と相補的な立体構造を形成し、抗体の特異性を決定する。
【００８４】
抗体断片は、インタクトな抗体の結合能を保持し得、インタクトな抗体の代わりに使用され得る。したがって、本発明の目的のため、特に文脈が求めない限り、「抗体」という用語は、抗体断片を包含すると理解すべきである。抗体断片例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｄＡｂ、及びＦｖ断片、ｓｃＦｖ、二重特異性ｓｃＦｖ、ダイアボディ、直鎖抗体が含まれる（米国特許第５，６４１，８７０号明細書、実施例２；Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  ８（１０）：１０５７〜１０６２頁［１９９５］参照）、一本鎖抗体分子、及び抗体断片から形成される多特異性抗体が含まれる。
【００８５】
Ｆａｂ断片は、ＶＨ及びＣＨ１と共にＬ鎖全体（ＶＬ及びＣＬ）から成る。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ又は複数のシステインを含む別の数個の残基を、ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に有することでＦａｂ断片とは異なる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、２つのジスルフィド結合Ｆａｂ断片を含む。
【００８６】
Ｆｄ断片は、ＶＨ及びＣＨ１ドメインから成る。
【００８７】
Ｆｖ断片は、単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインから成る。
【００８８】
一本鎖Ｆｖ断片は、ｓｃＦｖが抗原結合部位を形成できるようにするリンカーで結合されたＶＨ及びＶＬドメインを含む抗体断片である。（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ｖｏｌ．１１３、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｉｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、２６９〜３１５頁（１９９４年）参照）。
【００８９】
ダイアボディは、Ｖドメインの鎖内ペアリングではなく鎖間ペアリングを実現し、結果として多価断片、すなわち２つの抗原結合部位を有する断片が得られるように、ＶＨとＶＬドメインとの間に短いリンカー（約５〜１０残基）でｓｃＦｖ断片（前節参照）を構築して調製される小さな抗体断片である（例えば、ＥＰ  ４０４  ０９７；国際公開第９３／１１１６１号パンフレット；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４〜６４４８頁（１９９３年）参照）。
【００９０】
断片にさらに包含されるのは、個々のＣＤＲである。
【００９１】
本発明の１つの実施形態では、ＵＳＰ−１７調節因子は、ＤＵＢ−３のタンパク質分解活性又は脱ユビキチン化活性を阻害する抗体分子である。こうした適切な抗体例は、Ｂｕｒｒｏｗｓ  ＪＦら、ＪＢＣ  ２００４年  ２７９（１４）：１３９９３〜４０００頁に開示されている。
【００９２】
上述の通り、本発明で使用するための抗体分子は、例えば、脱ユビキチン化活性を阻害する任意の他の抗体にまで及ぶ。例えば脱ユビキチン化活性を阻害する能力を保持する、既知の抗ＤＵＢ−３抗体変異体が使用され得る。故に、既知のＵＳＰ−１７のＣＤＲアミノ酸配列、例えば１つ又は複数のアミノ酸残基が修飾されるＤＵＢ−３抗体分子も、ＣＤＲ配列として使用され得る。こうした変異体は、当技術分野で周知の方法を用いて提供され得る。ＣＤＲは、抗体重鎖若しくは軽鎖配列又はこの部分を含むフレームワーク構造に運ばれ得る。好ましくはこうしたＣＤＲは、自然発生的ＶＨ及びＶＬドメインのＣＤＲの位置に相当する場所に位置する。このようなＣＤＲの位置は、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、米国保健福祉省、公衆衛生局、Ｎａｔ’ｌ  Ｉｎｓｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２、１９９１年及びオンラインｗｗｗ．ｋａｂａｔｄａｔａｂａｓｅ．ｃｏｍ
ｈｔｔｐ：／／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ
に記載の通りに決定され得る。
【００９３】
さらに、修飾は、或いは又はさらに可変領域のフレームワーク領域に対し行われ得る。フレームワーク領域のこうした変更は、安定性を向上させ得、抗体の免疫原性を低下させ得る。
【００９４】
本明細書では本発明で使用するための抗体は、「キメラ」抗体を含む。キメラ抗体では、重鎖及び／又は軽鎖部分が、特定の種由来の抗体、又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一又は相同である一方、鎖の残りは、これが所望の生物活性を示す限り、別の種由来の抗体、又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体、及びこうした抗体の断片における対応する配列と同一又は相同である（米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１〜６８５５頁（１９８４年）参照）。本明細書では目的とするキメラ抗体は、ヒト以外の霊長類（例えば旧世界ザル、類人猿など）由来の可変領域抗原結合配列、及びヒト定常領域配列を含む「霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）」抗体を含む。
【００９５】
本発明で使用するための抗体分子は、任意の適切な方法で自然に又は合成的に作製され得る。このような方法には、例えば、従来のハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５年）Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９９頁）、組換えＤＮＡ法（例えば米国特許第４，８１６，５６７号明細書参照）、又は抗体ライブラリーを用いるファージディスプレイ法（例えばＣｌａｃｋｓｏｎら（１９９１年）Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４〜６２８頁及びＭａｒｋｓら（１９９２年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９〜７８３頁参照）。他の抗体作製法は、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、編Ｈａｒｌｏｗら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８年に記載されている。
【００９６】
従来のハイブリドーマ法は、典型的には、抗原に結合可能なリンパ球の産生を誘発するための、抗原でのマウス又は他の動物の免疫感作を含む。リンパ球は単離され、ミエローマ細胞系と融合されてハイブリドーマ細胞を形成する。ハイブリドーマ細胞は次いで、親ミエローマ細胞の増殖は阻害するが抗体産生細胞の増殖を可能にする条件で培養される。ハイブリドーマは、産生抗体の結合特異性を変え得る又は変え得ない遺伝子変異を受け得る。
【００９７】
合成抗体は、当技術分野で周知の方法を用いて作製することができる（例えば、Ｋｎａｐｐｉｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０００年）２９６、５７〜８６頁及びｋｒｅｂｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．（２００１年）２１５４  ６７〜８４頁参照）。
【００９８】
修飾は、当技術分野で周知の任意の適切な方法により、抗体分子のＶＨ、ＶＬ若しくはＣＤＲで、又は実際にＦＲで行われ得る。例えば、可変ＶＨ及び／又はＶＬドメインは、こうしたＣＤＲを欠くＶＨ又はＶＬドメインにＣＤＲ、例えばＣＤＲ３を導入して作製され得る。Ｍａｒｋｓら（１９９２年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９〜７８３頁は、ＣＤＲ３を欠くＶＨ可変領域のレパートリーが作製され、次いで特定の抗体のＣＤＲ３と結合されて新規なＶＨ領域を生成するシャッフリング法を記載する。類似の方法により、本発明のＣＤＲ由来配列を含む新規なＶＨ及びＶＬドメインが生成され得る。
【００９９】
本発明で使用するための抗体の代替作製方法は、例えば、エラープローンＰＣＲによるＶＨ又はＶＬドメインコード遺伝子のランダム突然変異誘発を含み得る（Ｇｒａｍら、１９９２年、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．８９  ３５７６〜３５８０頁参照）。さらに又は或いは、ＣＤＲは、例えばＢａｒｂａｓら  １９９１年  ＰＮＡＳ  ３８０９〜３８１３頁及びＳｃｉｅｒ  １９９６  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２６３  ５５１〜５６７頁に記載の分子進化アプローチにより突然変異誘発の標的にされ得る。
【０１００】
こうした変異体、抗体及び断片を作製することで、ＵＳＰ−１７調節因子、例えばＤＵＢ−３への結合及び分子の脱ユビキチン化活性の阻害が試験され得る。
【０１０１】
免疫複合体
本発明の別の実施形態では、本発明で使用するための抗体分子は、「活性治療剤」に結合した抗体断片を含む、免疫複合体の形態であってよい。治療剤は、化学療法剤又は別の分子であってよい。
【０１０２】
免疫複合体の生成方法は、当技術分野でよく知られている。例えば、米国特許第５，０５７，３１３号明細書、Ｓｈｉｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４１：８３２〜８３９頁（１９８８年）；Ｓｈｉｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４６：１１０１〜１１０６頁（１９９０年）、Ｗｏｎｇ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１年）；Ｕｐｅｓｌａｃｉｓら、「Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｂｉｒｃｈら編、１８７〜２３０頁（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５年）；Ｐｒｉｃｅ、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｒｉｔｔｅｒら編、６０〜８４頁（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５年）参照。
【０１０３】
本発明で使用するための抗体分子はさらなる修飾を含み得る。例えば抗体は、グリコシル化、ペグ化、又はアルブミン若しくは非タンパク質性ポリマー結合することができる。抗体分子は、免疫複合体の形態であってよい。
【０１０４】
アッセイ
薬剤、例えば小分子又は抗体の、ＤＵＢ−３の脱ユビキチン化活性を調節する、例えば阻害する能力は、任意の適切な方法により試験され得る。例えば阻害剤は、ＤＵＢ触媒ドメインへの結合及びＤＵＢ３活性遮断が試験され得る。アッセイは、標的に結合したユビキチンの使用、及び組換えＤＵＢ３プローブによる切断に対する薬剤効果の試験を含み得る。
【０１０５】
細胞浸潤を阻害する薬剤の能力は、当技術分野で周知の任意の適切な浸潤アッセイにより試験され得る。例えば、化学誘引物質勾配への人工細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を介した細胞移動を測定する浸潤アッセイが使用されてよい。浸潤活性の同定は、細胞がＥＣＭを分解する能力のほかＥＣＭを介して遊走する能力を必要とするであろう。このような能力は、実施例に記載の通り及び当技術分野で周知の通り、改変ボイデンチャンバーにより試験され得る。薬剤は、任意の適切な細胞系、例えばＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を用いて試験され得る。薬剤は、これが統計的に有意な量で浸潤を阻害する能力を有するならば、細胞浸潤を阻害すると考えられ得る。例えば、１つの実施形態では、ＤＵＢ−３調節因子として使用するための薬剤は、適切な対照抗体と比較した場合、浸潤を少なくとも１０％、例えば少なくとも２５％、５０％、７０％、８０％又は９０％阻害することができる。
【０１０６】
細胞遊走を阻害する薬剤の能力は、当技術分野で周知の任意の適切な遊走アッセイにより試験され得る。例えば、化学誘引物質勾配への細胞移動を測定する遊走アッセイが使用され得る。こうした能力は、実施例に記載の通り及び当技術分野で周知の通り、改変ボイデンチャンバーにより試験され得る。
【０１０７】
細胞接着を阻害する薬剤の能力は、当技術分野で周知の任意の適切な接着アッセイにより試験され得る。例えば、該能力は、実施例に記載の通り及び当技術分野で周知の通り、フィブリノーゲン被覆プレートに接着する細胞の能力を判定して試験され得る。
【０１０８】
治療
「治療」は、ヒト又はヒト以外の動物に便益をもたらすことができる任意のレジメンを含む。治療は、現状に関してであり得、又は予防（予防的治療）であり得る。治療には、治癒、緩和又は予防効果が含まれ得る。
【０１０９】
「癌治療」は、癌の増殖及び／又は血管新生を原因とする状態の治療を含み、並びに腫瘍増殖又は腫瘍の治療を含む。本発明を用いて治療することができる腫瘍例は、例えば、骨肉腫及び軟部組織肉腫を含む肉腫、癌腫、例えば、乳−、肺−、膀胱−、甲状腺−、前立腺−、結腸−、直腸−、膵臓−、胃−、肝臓−、子宮−、前立腺、子宮頸及び卵巣癌、非小細胞肺癌、肝細胞癌、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、神経芽細胞腫、メラノーマ、ミエローマ、ウィルムス腫瘍、並びに急性リンパ芽球性白血病及び急性骨髄芽球性白血病を含む白血病、星状細胞腫、グリオーマ並びに網膜芽細胞腫である。
【０１１０】
本明細書では、本発明は、腫瘍が転移した、ステージ３及びステージ４の腫瘍の治療において特に有用である。多くの腫瘍治療は、局所腫瘍治療では成功しているものの、転移治療の治療又は予防では治療効果がほとんどないか又はない。
【０１１１】
上述の通り本発明は、原発腫瘍を有する動物における腫瘍転移数を減少させる方法であって、前記動物にＵＳＰ−１７酵素の調節因子、例えばＤＵＢ−３を投与するステップを含む方法が提供される。
【０１１２】
転移の減少は、転移発生率の低下を含み得（すなわち転移発生が阻害され得る）、及び／又は既存の転移数を減少し得るような１つ又は複数の転移の根絶を含み得る。
【０１１３】
本発明の方法は、ＤＵＢ３などのＵＳＰ１７タンパク質が高度に発現される、例えば星状細胞腫、乳腺腫瘍及び他の腫瘍の転移治療において特に有用であり得る。
【０１１４】
炎症性疾患／感染性疾患
本発明はさらに、炎症性疾患、例えば細胞浸潤を伴う炎症性疾患での使用を見出す。本発明が使用され得る炎症性疾患には、炎症性筋疾患、関節リウマチ、同種移植拒絶反応、糖尿病、多発性硬化症（ＭＳ）／実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、皮膚炎、及び喘息が含まれる。
【０１１５】
全身に感染が拡散する間、炎症細胞は、正常又は病変組織に侵入又は循環系から浸出する。これは、慢性炎症又は感染の全身拡散をもたらし得る。したがって本発明は、呼吸器感染症、皮膚、腸若しくは他の組織の感染症の治療、又はインフルエンザ、肝炎、ＳＡＲＳなどの感染性疾患などの状態の治療にも使用され得る。
【０１１６】
医薬組成物
本発明で使用するための抗体及び核酸分子を含むＵＳＰ−１７調節因子、例えばＤＵＢ−３調節因子は、医薬組成物として提供され得る。本発明による使用のための医薬組成物は、活性成分に加え、薬学的に許容可能な賦形剤、キャリア、緩衝剤、安定剤又は当業者によく知られた他の材料を含み得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ｇｅｎｎａｒｏ  ＡＲら、編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００５年参照。）。こうした材料は、酢酸、トリス、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝剤；抗酸化物質；保存剤；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシンなどのアミノ酸；炭水化物；キレート剤；等張化剤（ｔｏｎｉｃｉｆｉｅｒ）；並びに界面活性剤を含み得る。
【０１１７】
医薬組成物は、本発明の組成物活性に悪影響を与えない補足的活性を好ましくは有する、治療中の特定の適応のため必要に応じて選択される１つ又は複数のさらなる活性化合物も含有し得る。例えば、癌治療では、ＵＳＰ−１７調節因子に加えて製剤は、追加成分、例えば第２の又はさらなるＵＳＰ−１７調節因子、化学療法剤、又はＵＳＰ−１７タンパク質以外の標的に対する、例えば特定の癌の増殖に影響する増殖因子に対する抗体を含み得る。
【０１１８】
活性成分（例えば抗体分子及び／又は化学療法剤）は、ミクロスフェア、マイクロカプセル、リポソーム、他の微粒子送達系を介して投与されてよい。例えば、活性成分は、コロイド剤送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）若しくはマクロエマルジョンにおいて、例えば、コアセルベーション法又は界面重合（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）により調製され得るマイクロカプセル内に封入され得る。さらなる詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ｇｅｎｎａｒｏ  ＡＲら、編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００５年を参照されたい。
【０１１９】
徐放性製剤は活性剤の送達に使用され得る。徐放性製剤の適切な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含む。マトリックスは、例えばフィルム、座薬又はマイクロカプセルなどの成形物の形態である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号明細書）、Ｌ−グルタミン酸及びエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、並びにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。
【０１２０】
上述の通り、核酸は治療方法でも使用され得る。本発明で使用するための核酸は、当技術分野で周知の任意の適切な方法により目的とする細胞に送達され得る。核酸（場合によりベクター中に含有される）は、インビボ又はエクスビボ法により患者の細胞に送達され得る。インビボ法では、ウイルスベクター（アデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ関連ウイルスなど）によるトランスフェクション及び脂質ベースの系（脂質媒介遺伝子導入に有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ及びＤＣ−Ｃｈｏｌである）が使用され得る（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：８０８〜８１３頁（１９９２年）参照。国際公開第９３／２５６７３号パンフレットも参照）。
【０１２１】
エクスビボ法では、核酸は、患者の単離細胞へ導入され、修飾細胞は、患者に直接投与され、又は、例えば、患者に移植される多孔質膜内に封入されて投与される（例えば米国特許第４，８９２，５３８号明細書及び第５，２８３，１８７号明細書参照）。生存細胞への核酸導入に利用可能な方法には、レトロウイルスベクター、リポソーム、電気穿孔、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などが含まれ得る。
【０１２２】
ＵＳＰ−１７調節因子、例えば抗体、薬剤、製品又は組成物は、腫瘍部位若しくは他の所望の部位に局所的に投与され得、又は腫瘍又は他の細胞を標的にする方法で送達され得る。標的療法は、抗体又は細胞特異的リガンドなどの標的系を使用して、特定の種類の細胞に活性剤をより特異的に送達するのに使用され得る。標的は、様々な理由、例えば薬剤が許容できないほど有毒である場合、又はそうしなければあまりに高い用量が必要となる場合、又はそうしなければ標的細胞に侵入できない場合に望ましい場合がある。
【０１２３】
用量
ＵＳＰ−１７調節因子は、個体に対する便益を示すのに十分な「治療有効量」で個体に適切に投与される。実際の用量レジメンは、治療中の状態、この重症度、治療患者、使用薬剤を含む幾つかの要因に依存する、及び医師の裁量によるであろう。
【０１２４】
投与
ＵＳＰ−１７調節因子は、化学療法剤と同時に、別々に又は連続して投与され得る。別々に又は連続して投与される場合、ＵＳＰ−１７調節因子は、任意の適切な時間内、例えば互いに１、２、３、６、１２、２４、４８又は７２時間以内に投与され得る。１つの実施形態では、それらは、２時間以内、１時間以内、例えば互いに２０分以内など、６時間以内に投与される。
【０１２５】
本発明の１つの実施形態では、ＵＳＰ−１７調節因子及び化学療法剤は、個々の成分が相乗的に作用する増強比（ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｎｇ  ｒａｔｉｏ）で投与される。
【０１２６】
相乗作用は、Ｒｏｍａｎｅｌｉにより改変された（Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、４１：３８５〜３９０頁、１９９８年）Ｋｅｒｎの方法（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、４８：１１７〜１２１頁、１９８８年）による１（ｕｎｉｔｙ）を超えるＲＩとして定義され得る。
【０１２７】
本発明は、これより以下の非限定例においてさらに記載される。添付図が参照される。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１ａ】ＤＵＢ−３メッセージがケモカインＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２で下方制御される、８０ｎｇ／ｍｌのＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２で刺激したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞から抽出したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【図１ｂ】ＤＵＢ−３メッセージがケモカインＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２で上方制御される、１００ｎｇ／ｍｌのＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２で刺激した、Ｊｕｒｋａｔ細胞から抽出したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲの結果（ｉ）及びＰＢＭＣから抽出したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲの結果（ｉｉ）及びＰＢＭＣから抽出したタンパク質（ｉｉｉ）を示す図である。
【図２ａ】ＧＴＰアーゼタンパク質レベルがＤＵＢ−３で制御されることを示す図である。図２ａは、ＲｈｏファミリーＧＴＰアーゼをトランスフェクトし、Ｄｕｂ−３（Ｄ３）、Ｄｕｂ−３ＣＳ（ＣＳ）、Ｄｕｂ−３ｓｉＲＮＡ、及び空ベクター（ＥＶ）を共トランスフェクトした２９３Ｔ細胞を示す。
【図２ｂ】２３９Ｔ細胞におけるＤｕｂ−３ｓｉＲＮＡによるＤｕｂ−３ノックダウンを示す。
【図３】Ｄｕｂ−３の脱制御が細胞接着を阻害することを示す図である。図３ａは、１０ｎｇ／ｍｌのＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２によりフィブリノーゲン被覆プレートで刺激したトランスフェクトＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、及び判定したパーセント細胞接着を示し、図３ｂは、ＥＶ及びＤＵＢ−３ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＤｕｂ−３  ＲＴ−ＰＣＲを示す。
【図４】１０ｎｇ／ｍｌ  ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦへのＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のパーセント遊走を示す図である。Ｄｕｂ−３ノックダウンは、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２刺激性走化性を阻害する。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に、ＥＶ、ＤＵＢ３、ＤＵＢ３ＣＳ又はＤＵＢ３ｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、細胞を１０ｎｇ／ｍｌ  ＳＤＦ／ＣＸＣＬ１２で１０時間刺激し、改変ボイデンチャンバーによる走化性アッセイにかけた。
【図５】１０ｎｇ／ｍｌ  ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦで刺激したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のパーセント化学浸潤を示す図である。Ｄｕｂ−３の脱制御は、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２誘導性細胞浸潤を阻害する。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に、ＥＶ、Ｄｕｂ−３、Ｄｕｂ−３Ｃ／Ｓ、Ｄｕｂ−３ｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、１０ｎｇ／ｍｌ  ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２で刺激した。Ｄｕｂ−３及びＤｕｂ−３ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞は、マトリゲルを介した浸潤を障害した。
【図６】Ｄｕｂ−３ノックダウンが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＲａｐ活性化を増大させることを示す図である。ＥＶ、Ｄ３  ｓｉＲＮＡ及びＤ３をトランスフェクトしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、１００ｎｇ／ｍｌ  ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２で刺激した。Ｄ３  ｓｉＲＮＡ細胞は、ＲａｌＧＤＳ−ＧＳＴ融合タンパク質プルダウンからのＧＴＰ結合Ｒａｐを増大させた。
【図７−１】ａ〜ｇは、Ｄｕｂ−３ノックダウンが、ＨｅＬａ細胞でのＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２刺激性Ｒａｐ形質膜移行を阻害することを示す図である。
【図７−２】ａ〜ｇは、Ｄｕｂ−３ノックダウンが、ＨｅＬａ細胞でのＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２刺激性Ｒａｐ形質膜移行を阻害することを示す図である。
【図８】Ｄｕｂ−３ノックダウンが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞でのＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２刺激性Ｒａｃ活性化を低下させることを示す図である。ＥＶ及びＤ３  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、１００ｎｇ／ｍｌ  ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２で刺激した。Ｄ３  ｓｉＲＮＡ細胞は、Ｐａｋ−ＧＳＴ融合タンパク質プルダウンからのＧＴＰ結合Ｒａｃを低下させた。
【図９】ａ〜ｆは、ＤＵＢ−３ノックダウンが、ＨｅＬａ細胞でのＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２刺激性Ｒａｃ形質膜移行を阻害することを示す図である。
【図１０】ＨｅＬａ細胞から行ったＰＡＫＧＳＴ融合タンパク質を用いるＣｄｃ４２  ＧＴＰプルダウンの結果を示す図である。ＤＵＢ−３のノックダウンは、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２に誘導された異常なＣｄｃ４２−ＧＴＰ結合の増大をもたらす。細胞にＥＶ又はＤＵＢ３ｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２で０、０．５、２、５及び１０分間刺激した。
【図１１】Ｄｕｂ−３ノックダウンが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ａ）及びＨｅＬａ細胞（ｂ）における細胞増殖を阻害することを示す図である。細胞にＤｕｂ−３ｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、生細胞を２４時間ごとに計数した。ＤＵＢ−３ノックダウン細胞数は、空ベクタートランスフェクト細胞よりも一貫して少なかった。
【図１２−１】ＤＵＢ−３、ＤＵＢ−４、ＤＵＢ−５、ＤＵＢ−６、ＤＵＢ−７、ＤＵＢ−８、ＤＵＢ−９、ＤＵＢ−１０、ＤＵＢ−１１又はＤＵＢ−１２のアミノ酸配列を示す図である。
【図１２−２】ＤＵＢ−３、ＤＵＢ−４、ＤＵＢ−５、ＤＵＢ−６、ＤＵＢ−７、ＤＵＢ−８、ＤＵＢ−９、ＤＵＢ−１０、ＤＵＢ−１１又はＤＵＢ−１２のアミノ酸配列を示す図である。
【図１２−３】ＤＵＢ−３、ＤＵＢ−４、ＤＵＢ−５、ＤＵＢ−６、ＤＵＢ−７、ＤＵＢ−８、ＤＵＢ−９、ＤＵＢ−１０、ＤＵＢ−１１又はＤＵＢ−１２のアミノ酸配列を示す図である。
【図１２−４】ＤＵＢ−３、ＤＵＢ−４、ＤＵＢ−５、ＤＵＢ−６、ＤＵＢ−７、ＤＵＢ−８、ＤＵＢ−９、ＤＵＢ−１０、ＤＵＢ−１１又はＤＵＢ−１２のアミノ酸配列を示す図である。
【図１２−５】ＤＵＢ−３、ＤＵＢ−４、ＤＵＢ−５、ＤＵＢ−６、ＤＵＢ−７、ＤＵＢ−８、ＤＵＢ−９、ＤＵＢ−１０、ＤＵＢ−１１又はＤＵＢ−１２のアミノ酸配列を示す図である。
【実施例】
【０１２９】
試薬及び抗体
ウサギポリクローナルＤＵＢ−３抗体は、前述の通り（Ｂｕｒｒｏｗｓ  Ｊ．Ｆ．、２００４年、上述）Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社（ベルファスト、ＵＫ）により作製された。使用した他の抗体には、抗Ｒａｃ、及び抗Ｒａｐ抗体が含まれた。
【０１３０】
細胞培養及びトランスフェクション
Ｄａｖｉｄ  Ｗａｕｇｈ博士の好意により提供されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、１０％ウシ胎仔血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％Ｌ−グルタミン及び１％ピルビン酸ナトリウムを添加したＤＭＥＭ（ＰＡ）で３７℃、５％ＣＯ２で増殖させた。Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞を、１０％ウシ胎仔血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び１％Ｌ−グルタミンを添加したＲＰＭＩ（ＰＡ）で３７℃、５％ＣＯ２で増殖させた。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に、メーカーの指示に従いＦｕｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ社）との比１：３で３ｕｇのプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。
【０１３１】
プラスミド
以下のプラスミド、Ｄｕｂ−３ＰＤＱ、ＣＳ−ＰＤＱ、Ｄ３ｐＳｕｐｅｒ、ＲａｐＧＦＰ、ＲａｃＧＦＰ、Ｃｄｃ４２ＧＦＰ、ＲｈｏＧＦＰ及びＥＶｐｓｕｐｅｒを使用した。
【０１３２】
ケモカイン刺激及びＲＴ−ＰＣＲ
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、１０ｃｍ組織培養皿（Ｎｕｎｃ社）に１．５×１０６細胞で播種し、０％ＦＣＳ  ＤＭＥＭで１２時間静置した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、２％ＲＰＭＩで１×１０６細胞／ｍｌで静置した。予め播種したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞及び９×１０６Ｊｕｒｋａｔ細胞を、１００ｎｇ／ｍｌ  ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社）により指定時間刺激した。細胞を次いで氷冷ＰＢＳで洗浄し、ＲＮＡをＳｔａｔ−６０試薬（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ  Ｉｎｃ社、フレンドウッド、ＵＳＡ）により抽出した。ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を、メーカーの指示に従い、ＲＴ−ＰＣＲ用のプライマーセットＤ１、
５’−ＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＧＴＧＧＧＡＡＴＧＧＡＧＧＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＣＴＡＣ−３’
及びＤ２、５’−ＡＧＴＣＡＴＣＧＡＴＣＴＧＧＣＡＣＡＣＡＡＧＣＡＴＡＧＣＣＣＴＣ−３’、
及びＧＡＰＤＨ  Ｆ  ５’−ＴＧＡＴＧＡＣＡＴＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧ−３’
及びＧＡＰＤＨ  Ｒ  ５’−ＴＴＡＣＴＣＣＴＴＧＧＡＧＧＣＣＡＴＧＴ−３’
と共に使用した。
【０１３３】
細胞接着アッセイ
９６ウェルプレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ社）を、アッセイする前夜にＰＢＳ中の５μｇ／ｍｌフィブリノーゲンにより被覆し、４℃でインキュベートした。細胞をプレートから除去し、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加したハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）（ＰＡＡ）で数回洗浄し、ｐＨを７．５に調整し、計数した。細胞を次いで同じＨＢＳＳ溶液で再懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートして１０μｍのカルセインＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、ペイズリー、ＵＫ）で標識した。標識後、細胞を３回洗浄し、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１％ＢＳＡ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２及び１ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ＨＢＳＳで再懸濁した。細胞を被覆ウェルプレートに１ウェル（２００μｌ）あたり５０，０００細胞で添加した。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、次いで蛍光光度計Ｇｅｎｉｏｓ  Ｐｒｏ（Ｔｅｃａｎ社、メンドルフ／チューリッヒ、スイス）（励起：４８５、蛍光（ｅｍｉｓｓｉｏｎ）：５３０）で判定した。ウェルを次いでＰＢＳで３回洗浄し、プレートを再び判定した。２回目の判定からのパーセンテージを１回目の判定から出した。
【０１３４】
細胞遊走アッセイ
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を前述の通りトランスフェクトした。細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、１トップチャンバーあたり５００μｌ無血清培地中０．５×１０６細胞で無血清ＤＭＥＭに播種し、７５０μｌの無血清培地又は１０ｎｇ／ｍｌ  ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２含有無血清培地をボトムチャンバーに添加した。プレートを次いで３７℃で５％ＣＯ２で２０時間インキュベートした。インキュベーション後、遊走しなかった細胞を綿を用いてトップチャンバーから除去した。トップチャンバーの底の遊走細胞を、メタノールで１０分間固定し、次いでクリスタルバイオレットで２０分間染色した。染色後、トップチャンバーを流水で洗浄し、１時間風乾した。フィルターを次いで３００μｌの脱染溶液（エタノール１：クエン酸ナトリウム１）で２０分間脱染し、２００μｌの脱染を分光測定により５７０ｎｍ（６５０ｎｍ参照）で測定した。
【０１３５】
化学浸潤アッセイ
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を前述の通りトランスフェクトした。マトリゲル（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、オックスフォード、ＵＫ）を被覆し、化学浸潤アッセイが始まる１２時間前に直径１２ｍｍのトランスウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ  Ｃｏｒｐ．社、ケンブリッジ、ＵＳＡ）インサートで乾燥させた。細胞を次いでトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、１トップチャンバーあたり５００μｌ無血清培地中０．５×１０６細胞で無血清ＤＭＥＭに播種し、１０ｎｇ／ｍｌ  ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２含有無血清培地７５０μｌをボトムチャンバーに添加した。プレートを次いで３７℃で５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。２４時間後、インサートを除去し、培地を捨てた。非浸潤細胞を綿を用いてインサートの上部から除去した。インサートをカルノア固定液（メタノール３：氷酢酸１）で１０分間固定した。インサートを乾燥後、これをヘキスト３３２５８染色（５０ｎｇ／ｍｌ）で３０分間染色した。染色後、インサートをＰＢＳで２回洗浄し、次いで膜をインサートから除去し、顕微鏡スライドにマウントし、カバースリップで封入した。次いで、スライドを調べられるまで暗所に保存した。浸潤した細胞を、ニコンＤＸＭ１２００デジタルカメラを備えたニコンＥｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ３００蛍光顕微鏡により×２０で調べた。結果をＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＩｍａｇｉｎｇによるＬｕｃａ  ＧＦ  ４．６０を用いて分析した。
【０１３６】
ＧＳＴプルダウンアッセイ
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を前述の通りトランスフェクトし、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２刺激の前に０％ＦＣＳ  ＤＭＥＭで１２時間静置した。細胞を次いで１００ｎｇ／ｍｌのＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２により様々な時間で刺激した。刺激後、細胞を氷冷ＰＢＳで直ちに洗浄し、０．５Ｍトリス  ｐＨ７．５、０．１Ｍ  ＭｇＣ１２、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１％トリトン及び５％グリセロール含有溶解緩衝液で、１０μｇ／ｍｌ  ロイペプチン、１０μｇ／ｍｌ  アプロチニン、１ｍＭ  ＰＭＳＦ及び２ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４により溶解した。溶解物を氷上で１０分間静置し、１２，０００ＲＰＭで１０分間遠沈して膜を沈殿させた。溶解物を除去し、ＧＳＴビーズを予め結合させたＰａｋ−又はＲａｌＧＤＳ−ＧＳＴ融合タンパク質のいずれかに添加した。ビーズ、溶解物、及び融合タンパク質を、４℃で１時間回転させた。ビーズを次いで阻害剤無しの溶解緩衝液で洗浄し、次いでβＭＥを加えたレムリ（ｌｅａｍｅｌｌｉ）緩衝液中で煮沸し、１２％ポリアクリルアミドゲルに添加した。
【０１３７】
共焦点顕微鏡
ＨｅＬａ細胞を、ＬａｂＴｅｋ  ＩＩ  ＣＣ２処理チャンバースライド（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ社）の１．７ｃｍ２ウェルあたり１．５×１０４細胞で播種した。細胞を、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて、各プラスミド０．２５μｇで前述の通りトランスフェクトした。トランスフェクション２４時間後、細胞を室温で２０分間、ＣＢＳ中４％パラホルムアルデヒドにより固定した。細胞を次いで、ＰＢＳ中０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００により５分間透過処理し、ＰＢＳで洗浄し、室温で１時間ＰＢＳ中１％ＢＳＡ、１０％ロバ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社、ケンブリッジ、ＵＫ）のブロッキング溶液でブロッキングした。チューブリンを、抗α−チューブリン抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）により可視化し、１：２００の希釈で使用した。１：１００希釈の抗カルネキシン（Ａｂｃａｍ社、ケンブリッジ、ＵＫ）を、小胞体の検出に使用した。ロバ抗マウスＣｙ５又はＴＲＩＴＣ複合体（Ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  Ｃｙ５  ｏｒ  ＴＲＩＴＣ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）を、２次標識抗体として１：２００希釈で使用した。各抗体をブロッキング溶液で希釈し、室温で１時間インキュベートした。Ｆ−アクチンの可視化のためメーカーの指示に従い、Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ５５５又はＲｈｏｄａｍｉｎｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を使用した。スライドを、ライカＤＢＭＲＥ共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ社、ミルトンキーンズ、ＵＫ）により４０×で調べ、ライカＬＡＳ  ＡＦソフトウェア（Ｌｅｉｃａ社）を用いて分析した。
【０１３８】
増殖アッセイ
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞及びＨｅＬａ細胞を前述の通りトランスフェクトした。２４時間後、トランスフェクション細胞を６ウェルプレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ社）で１ウェルあたり４．２×１０４細胞で播種した。細胞を２４時間ごとにウェルから除去し、トリパンブルーで希釈し、生細胞を計数した。
【０１３９】
結果
本発明者らは、ケモカインが特異的にＵＳＰ−１７、例えばＤｕｂ−３レベルを調節することができるかどうか調べた。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２のケモカイン受容体であるＣＸＣＲ４を内因的に発現することから、本発明者らは先ず、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を１００ｎｇ／ｍｌのＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２で刺激した（図１ａ）。Ｄｕｂ−３メッセージは、Ｔ０で構成的に発現され、刺激後１０、１５、及び３０分目において、Ｄｕｂ−３メッセージレベルは有意に低下した。この結果は、刺激するとＤｕｂ−３メッセージレベルを増大させるサイトカイン増殖因子刺激（Ｂｕｒｒｏｗｓら、２００４年）とは逆であった。
【０１４０】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は接着細胞系であり、ケモカイン刺激は接着及び懸濁細胞に異なる形で（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ）影響することから、本発明者らは、懸濁細胞のケモカイン刺激がＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞で見られるよりも異なる効果を有する可能性があると仮定した。Ｊｕｒｋａｔ懸濁細胞はＣＸＣＲ４を内因的に発現し、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２に反応することから、これを使用した。Ｊｕｒｋａｔ懸濁細胞を、２％  ＦＣＳ培地で一晩静置し、わずかに内因的に発現されたＤｕｂ−３メッセージレベルを無効にした（図１ｂ）。静置した細胞を次いで、１００ｎｇ／ｍｌのＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２で刺激した。Ｄｕｂ−３メッセージは、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２刺激により早くも５分目で誘導され、１５分目でピークに達した。同様に、ＤＵＢ−３メッセージは、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２刺激によりＰＢＭＣで誘導された（図１ｂ（ｉｉ）（ｉｉｉ））。これらの結果は、Ｄｕｂ−３メッセージがケモカインＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２により制御されること、様々な細胞種で特異的に制御されることを示唆する。
【０１４１】
本発明者らは、Ｒａｐ及び様々なＲｈｏタンパク質に対するＤｕｂ−３過剰発現及びＤｕｂ−３ノックダウンの効果を調べた。図２ａは、ＧＴＰａｓｅ  Ｒａｐ、ＲｈｏＡ、Ｒａｃ、及びＣｄｃ４２をトランスフェクトし、及びＤＵＢ３、ＤＵＢ３ＣＳ、ＤＵＢ３ｓｉＲＮＡ又は空ベクター（ＥＶ）を共トランスフェクトした２９３Ｔ細胞を示す。全てのＧＴＰａｓｅで、Ｄｕｂ−３の上方及び下方調節は、非トランスフェクト、ＥＶ及びＤＵＢ３触媒不活性共トランスフェクションに比べ、ＧＴＰａｓｅタンパク質レベルの増大をもたらした。これらの結果は、Ｄｕｂ−３調節因子の有無が、Ｒｈｏファミリー及びＲａｐの幾つかのメンバーのタンパク質レベルに影響することができることを示す。Ｄｕｂ３ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞におけるＤｕｂ−３の著しいノックダウンは、図２ｂに示したＲＴ−ＰＣＲにより実証した。
【０１４２】
ケモカイン刺激は、細胞接着、細胞遊走及び細胞浸潤（化学浸潤）を誘導することが知られている。ケモカイン刺激がＤｕｂ−３メッセージ発現を制御したことから、本発明者らは、Ｄｕｂ−３の脱制御はケモカイン誘発性機能に影響し得るのではないかと考えた。本発明者らは、先ず、ｓｉＲＮＡによるＤｕｂ−３の過剰発現及び／又はノックダウンが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞刺激性接着に影響し得るかどうかを判定した。過去に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２刺激が、フィブロネクチン被覆プレートへの細胞接着を増大することが示されている（Ｆｅｒｎａｎｄｉｓら、２００４年）。
【０１４３】
図３ａでは、ＤＵＢ３、触媒不活性ＤＵＢ３Ｃ／Ｓ、ＥＶ及びＤＵＢ３ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２で刺激し、フィブリノーゲン被覆プレートに接着させた。ＥＶ及びＤＵＢ３Ｃ／Ｓはいずれも、１００％に近い接着を示したが、過剰発現及びノックダウンによるＤＵＢ３の上方及び下方調節は、細胞接着を約５０％減少させた。ＤＵＢ３  ｍＲＮＡは、ＥＶトランスフェクションでは影響されなかったが、図３ｂに示した通りＤＵＢ３  ｓｉＲＮＡでは有意に減少した。
【０１４４】
ケモカインに誘発される細胞接着、細胞遊走及び細胞浸潤は、全てＲａｓ様小ＧＴＰアーゼのＲｈｏファミリーに媒介されることが知られている（Ｅｄｅｎら、２００２年；Ｍａｃｈｅｓｋｙら、１９９８年；Ｚｈｕｇｅら、２００１年）。本発明者らは、Ｄｕｂ−３がＧＴＰアーゼのＲｈｏファミリーを調節することで、細胞接着、細胞遊走及び細胞浸潤に影響し得るかどうか試験した。
【０１４５】
細胞遊走は、ケモカイン刺激の最も関連する機能である。Ｄｕｂ−３の脱制御が細胞接着に影響したことから、本発明者らは、これが走化性にも影響すると仮定した。図４は、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２がＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の遊走を刺激したことを示す。この場合も、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に、ＥＶ、Ｄｕｂ−３、Ｄｕｂ−３Ｃ／Ｓ、及びＤｕｂ−３  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。細胞を１０ｎｇ／ｍｌのＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２で刺激し、改変ボイデンチャンバーを介して遊走させた。ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞のみが、５％未満という非刺激値にほぼ等しい走化性の阻害を示したのに対し、トランスフェクトしない刺激細胞は約１２％の遊走率であった。
【０１４６】
化学浸潤は、細胞骨格再構成、細胞接着、及び細胞外マトリックスを介した細胞遊走のためのマトリックス分解に依存する。さらに、浸潤細胞の先導端（ｌｅａｄｉｎｇ  ｅｄｇｅ）である浸潤突起（ｉｎｖａｄｏｐｏｄｉａ）の形成は、細胞外マトリックスへの強力な接着に依存する。Ｄｕｂ−３脱制御が、細胞遊走及び細胞接着の両方に影響したことから、Ｄｕｂ−３脱制御細胞を、異常な化学浸潤について試験した。トランスフェクトＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２で刺激し、ＢＤマトリゲルを被覆した改変ボイデンチャンバーを介して浸潤させた（図５）。非刺激細胞が約１０％のランダムな浸潤率であったのに対し、刺激したトランスフェクト及びＥＶトランスフェクト細胞は、約４０％の浸潤率であった。Ｄｕｂ−３過剰発現細胞及びＤｕｂ−３ｓｉＲＮＡ細胞はどちらも、約１０％と化学浸潤を障害した。これらの値は、非トランスフェクト及びＥＶトランスフェクト刺激細胞の約２５％であった。
【０１４７】
最近、ＲａｓファミリーメンバーＲａｐ１が、細胞接着に関与する重要なＧＴＰアーゼであることが示された（Ｋａｔａｇｉｒｉら  ２０００年；Ｒｅｅｄｑｕｉｓｔら  ２０００年）。ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２で刺激されたＲａｐ１は、細胞接着に続いて起こるＲａｐ１リガンドＲａｐＬの活性化により細胞接着を増大することが知られる（Ｋａｔａｇｉｒｉら  ２００３年）。さらに、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２刺激は、刺激後早くも３０秒でＲａｐ１を活性化することが以前に示されている（２４  Ｓｈｉｍｏｎａｋａ，Ｍ．２００３年）。図３が、ＤＵＢ−３の上方及び下方調節がケモカイン刺激性細胞接着の減少をもたらしたことを示したことから、本発明者らはノックダウン又は過剰発現がＲａｐ１の活性化に影響し得るかどうかを試験した（図６）。Ｔ０でのＥＶ細胞におけるごくわずかなＲａｐ１−ＧＴＰに比べ、対照ＥＶトランスフェクト細胞においてＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２処理後２分目のＲａｐ１活性化が著しく増大した。ＤＵＢ−３ノックダウン細胞は、図６に示した通りＲａｐ１の基礎活性化を増大させた。さらに、Ｒａｐ１−ＧＴＰレベルが、Ｄｕｂ−３ノックダウン細胞でのケモカイン刺激後１０分目では維持されたのに対し、ＥＶトランスフェクト細胞では、Ｒａｐ１−ＧＴＰは１０分目で検出されなかった。逆に、Ｄｕｂ−３過剰発現細胞は、全ての時点でＲａｐ１活性化を鈍らせた。したがって、これらの結果は、Ｄｕｂ−３の上方及び下方調節がＲａｐＧＴＰアーゼの異常活性化をもたらすことから、Ｄｕｂ−３がＲａｐＧＴＰアーゼの活性化を制御することを示唆する。
【０１４８】
さらに、Ｒａｐ１は、増殖因子に刺激された細胞において膜に移行することが示された（Ｂｉｖｏｎａら、２００４年）。細胞は、ケモカイン勾配による刺激後に極性化するようになり、高濃度の化学誘引物質を検出する表面は先導端となる。これは、強いアクチン及びチューブリン極性化領域である。
【０１４９】
ＧＴＰアーゼのＲｈｏファミリー及びＲａｐ  ＧＴＰアーゼは、細胞極性に寄与する細胞骨格極性化を制御する。細胞極性は、ＲａｓＧＴＰアーゼ  Ｒａｐ１によっても制御される。Ｒａｐ１ノックアウト細胞が細胞極性及び細胞接着及びＲａｐ１のリガンドであるＲａｐＬを阻害した場合、欠損細胞は細胞極性及び遊走を阻害した（Ｄｕｎｃｈｎｉｅｗｉｃｚら  ２００６年；Ｋａｔａｇｉｒｉら  ２００４）。したがって、本発明者らは、Ｒａｐ１−ＧＦＰ及びＤＵＢ３ｓｉＲＮＡ又はＥＶを発現するＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２刺激ＨｅＬａ細胞におけるＲａｐ１の細胞局在を調べた。無血清培地で１２時間インキュベートした後、細胞を５０ｎｇ／ｍｌのＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２で０、２、５、及び１０分間刺激した（図７）。共焦点顕微鏡により、Ｒａｐ１局在のほかＦ−アクチン形成及びα−チューブリン重合について細胞を分析した。Ｆ−アクチン及びα−チューブリンは、先導端形成及び細胞極性化を可視化するための対比染色として選択した。ＥＶトランスフェクト細胞は、Ｒａｐ１−ＧＦＰの拡散した細胞質局在又は核周囲局在のどちらか、並びに図７ａに示した通りチューブリン及びＦ−アクチンの均一な分布を示した。Ｄｕｂ−３ノックダウン細胞では、Ｒａｐ１ＧＦＰは核周囲への集中が観察され、強力な核周囲のチューブリン分布があったが、周辺のＦ−アクチン重合はごくわずかであった（図７ｂ）。
【０１５０】
Ｂｉｖｏｎａら（２００４年）は、強い核周囲分布を有するＲａｐ１を記載している。ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２刺激の２分後、ＥＶトランスフェクト細胞は、Ｒａｐ１形質膜局在の著しい増大のほか、周辺のチューブリン及びＦ−アクチン重合の形成増大を示した（図７ｃ）。これらの構造の形成及びＲａｐ１−ＧＦＰ膜局在が、２分目でのＤｕｂ−３ノックダウン細胞では観察されなかったのに対し、Ｒａｐ−１は、核周囲分布により依然として観察された（図７ｄ）。５分目でのＥＶトランスフェクト細胞では、Ｒａｐ−１は形質膜にあったが、２分目と比べると強度は低かった（図７ｅ）。Ｒａｐ−１は、依然としてＤｕｂ−３ノックダウン細胞の核周囲で細胞内に集中していたほか、細胞極性化に関連した構造及び先導端形成は見えなかった（図７ｆ）。ＤＵＢ３ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞におけるＤＵＢ３の著しいノックダウンは、ＲＴ−ＰＣＲにより実証した。（図７ｇ）。
【０１５１】
こうしたデータは、Ｄｕｂ−３が細胞極性及び標準的細胞接着、走化性及び化学浸潤に不可欠な細胞骨格の再構成に影響することを示唆する。
【０１５２】
細胞遊走及び浸潤に最も一般に関連するＧＴＰアーゼは、ＲｈｏファミリーメンバーのＲａｃである。Ｒａｃ  ＧＴＰアーゼは、ケモカインにより活性化され、遊走細胞の先導端でのラメリポディア形成を介して細胞極性化及び遊走を促進することが知られる。ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２刺激は、Ｒａｃを活性化することが以前に示されている（Ｇａｒｃｉａ−Ｂｅｒｎａｌら、２００５年）。本発明者らは、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２により誘導されたＲａｃ−ＧＴＰ結合が、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＤｕｂ−３のｓｉＲＮＡノックダウン又はＤｕｂ−３過剰発現により影響されたかどうかを試験した。
【０１５３】
ＤＵＢ−３ノックダウンは、静置時のＲａｃ−ＧＴＰ結合をもたらした。これは、ＥＶトランスフェクト細胞では検出できなかった（図８）。ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２刺激後、ＥＶ細胞はＲａｃ−ＧＴＰ結合が有意に増大した。この活性化は、対照細胞では１０分目にバックグラウンドまで低下したが、Ｄｕｂ−３ノックダウン細胞では１０分目で維持された。Ｄｕｂ−３過剰発現細胞は、調べた全ての時点でＲａｃ活性化を鈍らせた。Ｄｕｂ−３過剰発現細胞も、Ｒａｃ−ＧＴＰ結合が増大した。これらの結果は、Ｄｕｂ−３の上方及び下方調節がＲａｃＧＴＰアーゼの異常活性化をもたらすことから、Ｄｕｂ−３がＲａｐＧＴＰアーゼの活性化を制御することを示唆する。
【０１５４】
Ｒａｃは、走化性細胞における先導端形成及び細胞極性化をもたらすアクチン重合の重要な調節因子であることが示されている（Ｐｏｚｏら、１９９９年）。ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２刺激ＤＵＢ−３ノックダウン細胞におけるＲａｃ１の細胞局在も調べた。
【０１５５】
ＨｅＬａ細胞にＲａｃ−ＧＦＰ及びＤＵＢ３ｓｉＲＮＡ又はＥＶをトランスフェクトした。静置後、細胞を１００ｎｇ／ｍｌのＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２で０、２、５、及び１０分間刺激した（図９）。共焦点顕微鏡により、Ｒａｃ局在について細胞を分析した。Ｆ−アクチン形成及び小胞体（ＥＲ）局在を共染色して、先導端形成及び細胞極性化をそれぞれ可視化した。ＥＶトランスフェクト細胞は、Ｒａｃ−ＧＦＰの拡散した細胞質局在、Ｆ−アクチンの均一な分布、及び拡散した核周囲のＥＲを示した（図９ａ）。Ｄｕｂ−３ノックダウン細胞では、ＲａｃＧＦＰは核周囲に集中し、細胞は周辺のＦ−アクチン形成が減少した（図９ｂ）。刺激後５分目で、ＥＶトランスフェクト細胞は著しく増大したＦ−アクチン重合を示し、付随して増大した細胞周囲へのＲａｃ−ＧＦＰ局在により細胞突起及び膜ラッフル（ｒｕｆｆｌｅ）を形成した（図９ｃ）。さらに、ＥＲはより集中したように見え、移動の方向に集中した。これは細胞極性化を示すものである。
【０１５６】
これらの構造の形成及びＲａｃ−ＧＦＰ膜局在は、２分目のＤＵＢ３ノックダウン細胞では観察されず、Ｒａｃはサイトゾルに拡散して局在していた（図９ｄ）。１０分目のＥＶトランスフェクト細胞では、図９ｅに示した通り、増大した周囲のＦ−アクチンと共局在する、形質膜へのＲａｃ局在が劇的に増大した。Ｄｕｂ−３細胞では１０分目にＲａｃは拡散して局在し、細胞局在及び先導端形成に関連した構造は、見えなかった（図９ｆ）。したがって、結果は、細胞骨格再構成、細胞極性及びこれに続く走化性及び浸潤のための重要な事象である、Ｒａｃの活性化及び細胞局在の制御におけるＤｕｂ−３の関与を示唆する。
【０１５７】
ＰＡＫＧＳＴ融合タンパク質を用いるＣｄｃ４２  ＧＴＰプルダウンは、ＨｅＬａ細胞から行った。細胞にＥＶ又はＤＵＢ３ｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、０、０．５、２、５、及び１０分間ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ２で刺激した。図１０に示した通り、ＤＵＢ−３のノックダウンは、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２により誘導された異常なＣｄｃ４２−ＧＴＰ結合の増加をもたらす。
【０１５８】
Ｄｕｂ−３ノックダウンがＧＴＰアーゼ  Ｒａｃ、Ｒａｐ及びＣｄｃ４２の異常な活性をもたらしたことから、本発明者らは、Ｄｕｂ−３のノックダウンが細胞増殖に影響するかどうかを調べた。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図１１ａ）及びＨｅＬａ（図１１ｂ）細胞に、Ｄｕｂ−３ｓｉＲＮＡ及びＥＶをトランスフェクトし、材料及び方法に記載の通り増殖アッセイを行った。Ｄｕｂ−３ノックダウンは、ＥＶ対照に比べＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞数の有意な減少をもたらした。ＨｅＬａ細胞でのＤｕｂ−３ノックダウンは、ＥＶ対照が通常通り増殖した細胞増殖を劇的に阻害した。こうした結果は、Ｄｕｂ−３が細胞増殖の阻害をもたらすことを示唆する。
【０１５９】
考察
上記に示され、考察されたデータは、治療標的としてのＵＳＰ−１７タンパク質、例えばＤＵＢ−３を裏付ける。Ｄｕｂ−３が、悪性細胞の転移をもたらす動的なＧＴＰアーゼ依存性事象を制御することが明確に示された。さらに、Ｄｕｂ−３遮断により、重大な転移事象、細胞接着、細胞遊走及び細胞浸潤が阻害されることが実証された。Ｄｕｂ−３は、関連する重要なＧＴＰアーゼの翻訳後プロセシング、これに続く活性化及び細胞局在を制御することでこれらの事象に影響を与えることが示された。重要なことは、本発明者らは、Ｄｕｂ−３阻害が悪性細胞増殖を有意に低下させたことも示した点であり、これにより治療剤としてのＤｕｂ−３の可能性が加わった。
【０１６０】
本明細書で本発明者らは、ＵＳＰ１７タンパク質発現が、ケモカイン依存的に制御され得ること、及びＤｕｂ−３の脱制御が、細胞接着、細胞遊走、化学浸潤及びＧＴＰアーゼ活性化などのケモカイン刺激の下流事象に影響することを示した。データは、Ｄｕｂ−３活性はケモカイン誘導性機能に対する時期特異的影響が厳重に制御されることを示唆する。同様に、ケモカイン刺激性Ｄｕｂ−３遺伝子制御は、阻害的であれ活性的であれ、刺激された細胞の形態によって異なる可能性がある。これは、Ｄｕｂ−３誤制御が、多くの考えられる病理学的表現型につながる、様々な結果をもたらす可能性があることを示唆する。
【０１６１】
癌の表現型は、誤制御されたＧＴＰアーゼの結果である場合が多い。同様に、浸潤癌細胞及び癌転移は、誤制御されたケモカイン経路が原因であり、悪性細胞の不適切な可動化が原因であることが示された（Ｃｈａｎら、２００５年）。細胞接着、細胞遊走及び化学浸潤を誘導することが知られるＲａｃ、Ｒｈｏ、及びＣｄｃ４２などのＲｈｏ  ＧＴＰアーゼは、転移表現型の発生に重要な役割を果たすと意味づけられている。これらのＧＴＰアーゼの誤制御が、悪性腫瘍を促進する決定因子であり、Ｄｕｂ−３発現及び活性が、発病をもたらす決定因子であり得る可能性がある。
【０１６２】
さらに、細胞浸潤の主要なプロモーターである細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分解は、ＥＣＭ成分を分解する酵素に制御されており、マトリックスメタロプロテイナーゼ、すなわちＭＭＰＳは、浸潤癌細胞表現型をもたらすＥＣＭ分解にほとんどの場合に関連する酵素である。最近、小ＧＴＰアーゼのＲａｓスーパーファミリーは、浸潤をもたらす細胞プログラムに重要な役割を果たすと意味づけられた（Ｃｈａｎら、２００５年）。さらに、Ｒａｓスーパーファミリーメンバーの誤制御がＭＭＰの過活性化をもたらすことで細胞浸潤を促進することが示された（Ｂａｒｔｏｌｏｍｅら、２００４年；Ｄｅｒｏａｎｎｅら、２００５年；Ｚｈｕｇｅら、２００１年）。したがって、Ｄｕｂ−３などのＵＳＰ−１７タンパク質は、病理学的表現型をもたらすＲａｓスーパーファミリーメンバーを調節してマトリックス分解の制御に役割を果たし得る可能性がある。
【０１６３】
本明細書で本発明者らは、ＤＵＢ３などのＵＳＰ−１７タンパク質は、Ｒｈｏタンパク質の適正な活性化及び制御に重要であることを示した。誤制御されたＤｕｂ−３は、ＧＴＰアーゼを不適切に活性化し、浸潤及び転移のＧＴＰアーゼ促進をもたらすと考えられる。本明細書に記載された結果は、Ｄｕｂ−３が、悪性細胞のケモカイン刺激性細胞接着、遊走及び化学浸潤に不可欠な役割を果たすこと、故にＤｕｂ−３を標的にすることが、浸潤癌の治療及び炎症疾患の制御に様々な治療的利点を有することを示唆する。
【０１６４】
この明細書で言及された文献は全て、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の記載された実施形態に対する様々な改変及び変更が可能であることは、本発明の範囲及び趣旨を逸脱することなく当業者には明らかであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連して記載されたが、請求された本発明は、こうした特定の実施形態に不当に限定されるべきはでないことを理解すべきである。実際に、当業者には明らかな本発明を実施する記載された様式の様々な改変は、本発明により網羅されることが意図される。
【０１６５】
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１．  Ａｐｐｅｌｓ，  Ｎ．  Ｍ．，  Ｂｅｉｊｎｅｎ，  Ｊ．  Ｈ．  ＆  Ｓｃｈｅｌｌｅｎｓ，  Ｊ．  Ｈ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｆａｒｎｅｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：  ａ  ｒｅｖｉｅｗ．  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  １０，  ５６５−５７８  （２００５）．
２．  Ｂａｅｋ，  Ｋ．，  Ｋｉｍ，  Ｍ．，  Ｋｉｍ，  Ｙ．，  Ｓｈｉｎ，  Ｊ．  ＆  Ｃｈｏｉ，  Ｈ．  ＤＵＢ−１Ａ，  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｄｅｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ，  ｉｓ  ｐｏｌｙｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｅｄ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｉｎ  Ｂ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７９，  ２３６８−７６  （２００４）．
３．  Ｂａｅｋ，  Ｋ．，  Ｍｏｎｄｏｕｘ，  Ｍ．，  Ｊａｓｔｅｒ，  Ｒ．，  Ｆｉｒｅ−Ｌｅｖｉｎ，  Ｅ．  ＆  Ｄ'Ａｎｄｒｅａ，  Ａ．  ＤＵＢ−２Ａ，  ａ  ｎｅｗ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＤＵＢ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｄｅｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ．  Ｂｌｏｏｄ  ９８，  ６３６−４２  （２００１）．
４．  Ｂａｒｔｏｌｏｍｅ，  Ｒ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒ−１ａｌｐｈａ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｃｒｏｓｓ  ｂａｓｅｍｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｔｙｐｅ  １  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ａｎｄ  Ｒｈｏ  ＧＴＰａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６４，  ２５３４−２５４３  （２００４）．
５．  Ｂｉｖｏｎａ，  Ｔ．  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｒａｐ１  ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ．  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １６４，  ４６１−４７０  （２００４）．
６．  Ｂｏｙａｒｔｃｈｕｋ，  Ｖ．  Ｌ．，  Ａｓｈｂｙ，  Ｍ．  Ｎ．  ＆  Ｒｉｎｅ，  Ｊ．  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒａｓ  ａｎｄ  ａ−ｆａｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃａｒｂｏｘｙｌ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５，  １７９６−１８００  （１９９７）．
７．  Ｂｕｒｒｏｗｓ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  ＤＵＢ−３，  ａ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｄｅｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｔｈａｔ  ｂｌｏｃｋｓ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７９，  １３９９３−４０００  （２００４）．
８．  Ｃａｓｅｙ，  Ｐ．  Ｊ．  ＆  Ｓｅａｂｒａ，  Ｍ．  Ｃ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｅｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１，  ５２８９−５２９２  （１９９６）．
９．  Ｃｈａｎ，  Ａ．  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒａｃ１  ａｎｄ  Ｒａｃ３  ＧＴＰａｓｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｉｎｖａｓｉｏｎ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２４，  ７８２１−７８２９  （２００５）．
１０．  Ｃｏｘ，  Ａ．  Ｄ．  Ｆａｒｎｅｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｄｒｕｇｓ  ６１，  ７２３−７３２  （２００１）．
１１．  ｄｅｌ  Ｐｏｚｏ，  Ｍ．  Ａ．，  Ｖｉｃｅｎｔｅ−Ｍａｎｚａｎａｒｅｓ，  Ｍ．，  Ｔｅｊｅｄｏｒ，  Ｒ．，  Ｓｅｒｒａｄｏｒ，  Ｊ．  Ｍ．  ＆  Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｍａｄｒｉｄ，  Ｆ．  Ｒｈｏ  ＧＴＰａｓｅｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ  ＥＲＭ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２９，  ３６０９−３６２０  （１９９９）．
１２．  Ｄｅｒｏａｎｎｅ；  Ｃ．  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｄｃ４２  ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ＭＭＰ−１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ＥＲＫ１／２  ｐａｔｈｗａｙ．  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｓｃｉ．  １１８，  １１７３−１１８３  （２００５）．
１３．  ＤｅＳａｌｌｅ，  Ｌ．  ｅｔ  ａ１．  Ｔｈｅ  ｄｅ−ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  Ｕｎｐ  ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０，  ５５３８−４２  （２００１）．
１４．  Ｄｕｃｈｎｉｅｗｉｃｚ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｒａｐ１Ａ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｔ  ａｎｄ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ｓｈｏｗ  ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２６，  ６４３−６５３  （２００６）．
１５．  Ｅｄｅｎ，  Ｓ．，  Ｒｏｈａｔｇｉ，  Ｒ．，  Ｐｏｄｔｅｌｅｊｎｉｋｏｖ，  Ａ．  Ｖ．，  Ｍａｎｎ，  Ｍ．  ＆  Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒ，  Ｍ．  Ｗ．  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＷＡＶＥ１−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｃｔｉｎ  ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｒａｃ１  ａｎｄ  Ｎｃｋ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４１８，  ７９０−７９３  （２００２）．
１６．  Ｆｅｒｎａｎｄｉｓ，  Ａ．  Ｚ．，  Ｐｒａｓａｄ，  Ａ．，  Ｂａｎｄ，  Ｈ．，  Ｋｌｏｓｅｌ，  Ｒ．  ＆  Ｇａｎｊｕ，  Ｒ．  Ｋ．  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＸＣＲ４−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｉｎｖａｓｉｏｎ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３，  １５７−１６７  （２００４）．
１７．  Ｇａｒｃｉａ−Ｂｅｒｎａｌ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｖａｖ１  ａｎｄ  Ｒａｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ−ｐｒｏｍｏｔｅｄ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｌｐｈａ４ｂｅｔａ１．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｅｌｌ  １６，  ３２２３−３２３５  （２００５）．
１８．  Ｋａｔａｇｉｒｉ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｒａｐ１  ｉｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｆｏｒ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  １  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−３−ＯＨ  ｋｉｎａｓｅ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２０，  １９５６−１９６９  （２０００）．
１９．  Ｋａｔａｇｉｒｉ，  Ｋ．，  Ｍａｅｄａ，  Ａ．，  Ｓｈｉｍｏｎａｋａ，  Ｍ．  ＆  Ｋｉｎａｓｈｉ，  Ｔ．  ＲＡＰＬ，  ａ  Ｒａｐ１−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｔｈａｔ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  Ｒａｐ１−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｐａｔｉａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＬＦＡ−１．  Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４，  ７４１−７４８  （２００３）．
２０．  Ｋａｔａｇｉｒｉ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｒｕｃｉａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒａｐ１  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ＲＡＰＬ  ｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｎｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ．  Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ５，  １０４５−１０５１  （２００４）．
２１．  Ｌｉ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｅｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ５３  ｂｙ  ＨＡＵＳＰ  ｉｓ  ａｎ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ  ｆｏｒ  ｐ５３  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４１６，  ６４８−５３  （２００２）．
２２．  Ｌｉ，  Ｚ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｄｅｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｄｉｒｅｃｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７，  ４６５６−６２  （２００２）．
２３．  Ｍａｃｈｅｓｋｙ，  Ｌ．  Ｍ．  ＆  Ｉｎｓａｌｌ，  Ｒ．  Ｈ．  Ｓｃａｒｌ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  Ｗｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  ＷＡＳＰ，  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｎ  ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  Ａｒｐ２／３  ｃｏｍｐｌｅｘ．  Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．  ８，  １３４７−１３５６  （１９９８）．
２４．  Ｍａｌｌｉｒｉ，  Ａ．  ＆  Ｃｏｌｌａｒｄ，  Ｊ．  Ｇ．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｒｈｏ−ｆａｍｉｌｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １５，  ５８３−５８９  （２００３）．
２５．  Ｒｅｅｄｑｕｉｓｔ，  Ｋ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｓｍａｌｌ  ＧＴＰａｓｅ，  Ｒａｐ１，  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ＣＤ３１−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｄｈｅｓｉｏｎ．  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １４８，  １１５１−１１５８  （２０００）．
２６．  Ｓｅｂｔｉ，  Ｓ．  Ｍ．  ＆  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  Ａ．  Ｄ．  Ｆａｒｎｅｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ａｎｄ  ｇｅｒａｎｙｌｇｅｒａｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｉ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：  ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｎｄ  ｂｅｎｃｈ−ｔｏ−ｂｅｄｓｉｄｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９，  ６５８４−６５９３  （２０００）．
２７．  Ｓｅｂｔｉ，  Ｓ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆａｒｎｅｓｙｌａｔｉｏｎ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｎｏｒｍａｌ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ７，  ２９７−３００  （２００５）．
２８．  Ｓｈｉｍｏｎａｋａ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｒａｐ１  ｔｒａｎｓｌａｔｅｓ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｔｏ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，  ｃｅｌｌ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ａｃｒｏｓｓ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ  ｕｎｄｅｒ  ｆｌｏｗ．  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １６１，  ４１７−４２７  （２００３）．
２９．  Ｗｅｎｎｅｒｂｅｒｇ，  Ｋ．，  Ｒｏｓｓｍａｎ，  Ｋ．  Ｌ．  ＆  Ｄｅｒ，  Ｃ．  Ｊ．  Ｔｈｅ  Ｒａｓ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ａｔ  ａ  ｇｌａｎｃｅ．  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｓｃｉ．  １１８，  ８４３−８４６  （２００５）．
３０．  Ｗｉｎｇ，  Ｓ．  Ｄｅｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ−−ｔｈｅ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｄｒｉｖｉｎｇ  ｉｎ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ａｌｏｎｇ  ｔｈｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｐａｔｈｗａｙ．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ３５，  ５９０−６０５  （２００３）．
３１．  Ｗｉｎｔｅｒ−Ｖａｎｎ，  Ａ．  Ｍ．  ＆  Ｃａｓｅｙ，  Ｐ．  Ｊ．  Ｐｏｓｔ−ｐｒｅｎｙｌａｔｉｏｎ−ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｓ  ｎｅｗ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｉｎ  ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃａｎｃｅｒ．  ５，  ４０５−４１２  （２００５）．
３２．  Ｚｈｕ，  Ｙ．，  Ｃａｒｒｏｌｌ，  Ｍ．，  Ｐａｐａ，  Ｆ．，  Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ，  Ｍ．  ＆  Ｄ'Ａｎｄｒｅａ，  Ａ．  ＤＵＢ−１，  ａ  ｄｅｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｗｉｔｈ  ｇｒｏｗｔｈ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ．  ９３，  ３２７５−９  （１９９６）．
３３．  Ｚｈｕ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  ＤＵＢ−２  ｉｓ  ａ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｄｅｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２，  ５１−７  （１９９７）．
３４．  Ｚｈｕ，  Ｙ．，  Ｐｌｅｓｓ，  Ｍ．，  Ｉｎｈｏｒｎ，  Ｒ．，  Ｍａｔｈｅｙ−Ｐｒｅｖｏｔ，  Ｂ．  ＆  Ｄ'Ａｎｄｒｅａ，  Ａ．  Ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ＤＵＢ−１  ｇｅｎｅ  ｉｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｂｅｔａｃ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １６，  ４８０８−１７  （１９９６）．
３５．  Ｚｈｕｇｅ，  Ｙ．  ＆  Ｘｕ，  Ｊ．  Ｒａｃ１  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＭＭＰ−２  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｃｒｏｓｓ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｂａｒｒｉｅｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６，  １６２４８−１６２５６  （２００１）．
【図１ａ】
2009538600.tif 000003
【図２ｂ】
2009538600.tif 000004
【図４】
2009538600.tif 000005
【図５】
2009538600.tif 000006
【図１１】
2009538600.tif 000007
【図１２−１】
2009538600.tif 000008
【図１２−２】
2009538600.tif 000009
【図１２−３】
2009538600.tif 000010
【図１２−４】
2009538600.tif 000011
【図１２−５】
2009538600.tif 000012
【図１ｂ】
2009538600.tif 000013
【図２ａ】
2009538600.tif 000014
【図３】
2009538600.tif 000015
【図６】
2009538600.tif 000016
【図７−１】
2009538600.tif 000017
【図７−２】
2009538600.tif 000018
【図８】
2009538600.tif 000019
【図９】
2009538600.tif 000020
【図１０】
2009538600.tif 000021
【配列表】
2009538600000001.app
【国際調査報告】
2009538600.tif 000022
2009538600.tif 000023
2009538600.tif 000024
2009538600.tif 000025
2009538600.tif 000026
2009538600.tif 000027