(57)【要約】  本発明は、キメラ抗体またはその抗原結合部分を提供する。前記抗原結合部分は、少なくとも2つの相補性決定領域(CDR)および少なくとも3つのフレームワーク領域を含有し、少なくとも1つのCDRが非新世界霊長類CDRである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原結合部分が少なくとも2つの相補性決定領域(CDR)配列および少なくとも3つのフレームワーク領域を含有し、少なくとも1つのCDRが新世界霊長類CDRであるキメラ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２】
前記抗原結合部分が3つのCDRおよび4つのフレームワーク領域を含有する、請求項1に記載のキメラ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３】
前記抗原結合部分がヒトCDRである少なくとも1つのCDRを含有する、請求項1または2に記載のキメラ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項４】
前記抗原結合部分がヒトCDRである2つのCDRを含有する、請求項1から3のいずれか一項に記載のキメラ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項５】
CDR2が新世界霊長類CDR2である、請求項1から4のいずれか一項に記載のキメラ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項６】
前記CDR2配列が、KVSNRAS、RVSNRAS、KVSTRGP、AASNRAS、TSSNLQA、DASSLQP、及びYASFLQGからなる群から選択される、請求項5に記載のキメラ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項７】
前記CDR2配列が、KVSNRAS、AASNRAS、TSSNLQA、及びKVSTRGPからなる群から選択される。請求項6に記載のキメラ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８】
前記フレームワーク領域がヒト配列である、請求項1から7のいずれか一項に記載のキメラ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項９】
少なくとも1つのフレームワーク領域を改変して結合を増大する、請求項1から8のいずれか一項に記載のキメラ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１０】
少なくとも1つのフレームワーク領域を改変してヒトにおける予測される免疫原性を減少する、請求項1から9のいずれか一項に記載のキメラ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１１】
少なくとも1つの新世界霊長類CDR配列を改変せずに、少なくとも1つのCDR配列を改変して結合を増大する、請求項1から10のいずれか一項に記載のキメラ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１２】
少なくとも1つの新世界霊長類CDR配列を改変せずに、少なくとも1つのCDR配列を改変してヒトにおける予測される免疫原性を減少する、請求項1から11のいずれか一項に記載のキメラ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１３】
改変する少なくとも1つのCDR配列が新世界霊長類CDRではない、請求項11または12に記載のキメラ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１４】
前記抗原結合部分がドメイン抗体である、請求項1から13のいずれか一項に記載のキメラ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１５】
さらにヒトまたは非ヒト霊長類定常領域配列を含有する、請求項1から14のいずれか一項に記載のキメラ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１６】
前記新世界霊長類が、マーモセット類、タマリン類、リスザル、ウアカリ、サキ属、ティティザル、クモザル、ウーリーモンキー、オマキザル、ヨザル、およびホエザルからなる群から選択される、請求項1から15のいずれか一項に記載のキメラ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１７】
前記新世界霊長類がマーモセットである、請求項16に記載のキメラ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１８】
癌胎児性抗原、EpCAM、Lewis-Y、Lewis-Y/b、PMSA、CD20、CD30、CD33、CD38、CD52、CD154、EGF-R、Her-2、TRAILおよびVEGFレセプターを含む腫瘍関連抗原;CD3、CD4、CD25、CD40、CD49d、MHCクラスI、MHCクラスII、GM-CSF、インターフェロン-γ、IL-I、IL-12、IL-13、IL-23、TNF-α、およびIgEを含む免疫もしくは炎症疾患または免疫もしくは炎症障害に関与する抗原;糖タンパク質IIb/IIIa、P-糖タンパク質、プリンレセプターおよびCD11a、CD1lb、CD11c、CDl8、CD56、CD58、CD62またはCD144を含む接着レセプターを含む宿主細胞上に発現される抗原;エオタキシン(eotaxin)、IL-6、IL-8、TGF-β、C3a、C5a、VEGF、NGFおよびそれらのレセプターを含む、サイトカイン、ケモカイン、成長因子もしくは他の可溶性生理学的調節物質またはそれらのレセプターを含む抗原;β-アミロイドおよびプリオンを含む中枢神経系疾患または障害に関与する抗原;呼吸器合胞体ウイルスタンパク質F、炭疽毒素、ガラガラヘビ毒、およびジゴキシンを含む、非ヒト由来抗原、例えば、微生物、ナノ微生物またはウイルスの抗原または毒素からなる抗原から選択される、天然の、ペプチド、タンパク質、炭水化物、糖タンパク質、脂質または糖脂質である抗原に結合する、請求項1から17のいずれか一項に記載のキメラ抗体または抗原結合部分。
【請求項１９】
TNFαに結合する、請求項18に記載のキメラ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２０】
少なくとも2つのCDRおよび少なくとも3つのフレームワーク領域を含有するヒト抗体可変領域から1つのCDRを除去し、それを低い免疫原性を有すると予測される新世界霊長類CDRで置換し、キメラ可変領域を生産することを含む、キメラ抗体またはその抗原結合部分の製造方法。
【請求項２１】
キメラ可変領域を回収する工程を更に含む、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
前記新世界霊長類CDRがCDR2である、請求項20または21に記載の方法。
【請求項２３】
前記新世界霊長類CDR配列を改変せずに、キメラ可変領域の配列を改変して結合を増大する工程を更に含む、請求項20から22のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記新世界霊長類CDR配列を改変せずに、キメラ可変領域の配列を改変してヒトにおける免疫原性を減少する工程を更に含む、請求項20から23のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記新世界霊長類が、マーモセット類、タマリン類、リスザル、ティティザル、クモザル、ウーリーモンキー、オマキザル、ウアカリ、サキ属、ヨザル、およびホエザルからなる群から選択される、請求項20から24のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記新世界霊長類がマーモセットである、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体が、癌胎児性抗原、EpCAM、Lewis-Y、Lewis-Y/b、PMSA、CD20、CD30、CD33、CD38、CD52、CD154、EGF-R、Her-2、TRAILおよびVEGFレセプターを含む腫瘍関連抗原;CD3、CD4、CD25、CD40、CD49d、MHCクラスI、MHCクラスII、GM-CSF、インターフェロン-γ、IL-I、IL-12、IL-13、IL-23、TNF-α、およびIgEを含む免疫もしくは炎症疾患または免疫もしくは炎症障害に関与する抗原;糖タンパク質IIb/IIIa、P-糖タンパク質、プリンレセプターおよびCD11a、CD1lb、CD11c、CDl8、CD56、CD58、CD62またはCD144を含む接着レセプターを含む宿主細胞上に発現される抗原;エオタキシン(eotaxin)、IL-6、IL-8、TGF-β、C3a、C5a、VEGF、NGFおよびそれらのレセプターを含む、サイトカイン、ケモカイン、成長因子もしくは他の可溶性生理学的調節物質またはそれらのレセプターを含む抗原;β-アミロイドおよびプリオンを含む中枢神経系疾患または障害に関与する抗原;呼吸器合胞体ウイルスタンパク質F、炭疽毒素、ガラガラヘビ毒、およびジゴキシンを含む、非ヒト由来抗原、例えば、微生物、ナノ微生物またはウイルスの抗原または毒素からなる抗原から選択される、天然の、ペプチド、タンパク質、炭水化物、糖タンパク質、脂質または糖脂質である抗原に結合する、請求項20から26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体がTNFαを結合する、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
請求項20から28のいずれか一項に記載の方法によって製造されたキメラ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３０】
請求項1から19のいずれか一項に記載のキメラ抗体もしくはその抗原結合部分、包装および使用説明書を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原結合部分が少なくとも2つの相補性決定領域(CDR)配列および少なくとも3つのフレームワーク領域を含有し、少なくとも1つのCDRが新世界霊長類CDRであるキメラ抗体またはその抗原結合部分に関し、並びに疾患または疾病の治療における前記抗体またはその抗原結合部分の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体(イムノグロブリン)は、哺乳動物の免疫システムにおいて重要な役割を果たす。それらは、前駆体B細胞から成熟した血漿細胞により産生される。抗体は、ジスルフィド架橋により結合した2つの同一の軽ポリペプチド鎖および2つの同一の重ポリペプチド鎖からなる。軽鎖はカッパまたはラムダ軽鎖と呼ばれ、重鎖はガンマ、ミュー、デルタ、アルファまたはイプシロンと呼ばれる。各鎖は定常および可変領域からなる。可変領域は抗体にその特異性を与える。各可変領域内には、超可変領域または相補性決定領域(CDR)があり、フレームワーク領域と呼ばれるより保存された領域が並んでいる。各可変領域内には、3つのCDRおよび4つのフレームワーク領域がある。
【０００３】
抗体は2機能性分子であり、重鎖および軽鎖からのN-末端可変断片は、抗原表面の特定のエピトープに対して親和性を示す3次元構造を生成するための特定の方法により互いに結合している。定常領域部分は、血清の半減期および抗体のエフェクター機能の延長に関与し、補体結合、食細胞の刺激、抗体依存性細胞毒、および顆粒球の顆粒放出のきっかけに関係する。
【０００４】
ハイブリドーマ技術の進歩は、特定の特異性を有するモノクローナル抗体の生産を促進した。典型的には、かかるハイブリドーマはネズミハイブリドーマである。
【０００５】
ヒト/マウスキメラ抗体が作製され、そのマウスゲノムからの抗体可変領域配列がヒトゲノムからの抗体定常領域配列と結合している。キメラ抗体は親のマウス抗体の結合特性およびヒト定常領域に関連するエフェクター機能を示す。抗体は、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、NSO骨髄腫細胞、COS細胞およびSP2細胞を含む宿主細胞における発現により生産される。
【０００６】
このようなキメラ抗体はヒトの治療において使用されてきたが、これらのキメラ抗体に対する抗体がヒトの被提供者により生産されてきた。かかる抗キメラ抗体は、キメラ抗体による継続的治療に悪影響を及ぼす。
【０００７】
ヒトモノクローナル抗体が、in vivoヒト治療のためのマウスモノクローナル抗体の改良となることが予測されるといわれてきた。旧世界霊長類(赤毛猿およびチンパンジー)からの抗体を用いてなされた研究から、これらの非ヒト霊長類抗体がヒト抗体と構造的に類似しているため、ヒトにおいて許容されると主張されてきた(Ehrlich PH et al., Human and primate monoclonal antibodies for in vivo therapy. Clin Chem, 1988, 34:9 1681〜1688)。さらに、ヒト抗体が赤毛猿において非免疫原性であるため(Ehrich PH et al. Rhesus monkey responses to multiple injections of human monoclonal amtibodies. Hybridoma, 1987, 6:151〜60)、逆もまた適用可能であり、霊長類抗体がヒトにおいて非免疫原性であると思われる。これらのモノクローナル抗体は、ヒト×マウスへテロ骨髄腫とのリンパ球の融合により構成されるハイブリドーマから分泌される。
【０００８】
EP 0605 442は、ヒト抗原と結合するキメラ抗体を開示する。これらの抗体は旧世界猿からの可変領域およびヒトまたはチンパンジー抗体の定常領域のすべてを含有する。これらの構成について、この参照文献において示唆される利点の1つは、マウス宿主において惹起される抗体と比較してヒトにおける免疫原性の小さい、ヒト抗原に対する旧世界猿の抗体を惹起する能力である。
【０００９】
新世界霊長類(広鼻下目(infraorder-Platyrrhini))は、一般に2つの科、CallithricidaeおよびCebidaeに分けられる少なくとも53の種を有する。Callithricidaeはマーモセット類およびタマリン類からなる。Cebidaeはリスザル、ティティザル、クモザル、ウーリーモンキー、オマキザル、ウアカリ、サキ属、ヨザル(night or owl monkey)、およびホエザルを含む。
【００１０】
進化的に離れた霊長類、例えば新世界霊長類は、ヒト抗原に対する抗体が生成されるのを許容する程度にヒトと十分に異なるだけでなく、かかる霊長類由来の抗体がヒトの体内に導入された場合に、宿主が抗抗体免疫反応を生じることのないように、ヒト抗体と類似の抗体を有する程度にヒトと十分に類似する。
【００１１】
これまでの研究は、Callithrix jacchusマーモセットの発現されたイムノグロブリン重鎖レパートリーを有することを特徴とする(von Budingen H-C et al. Characterization of the expressed immunoglobuilin IGHV repertoire in the New World marmoset Callihrix Jacchus. Immunogenetics, 2001, 53:557〜563)。それらの対応するヒトIGHVと高度の配列相同性を示す6つのIGHVサブグループが同定された。フレームワーク領域は、相補性決定領域(CDR)と比較した場合、より保全されている。コモンマーモセット(C. jacchus)とヒトとの間のIGHV配列の類似の程度は、非ヒト旧世界霊長類とヒトとの間に比べて小さい。
【００１２】
ドメイン抗体
ドメイン抗体(dAb)は、抗体フレームワークを用いて作製することのできる機能的結合単位であり、抗体の重鎖(VH)または軽鎖(VL)のいずれかの可変領域に対応する。ドメイン抗体は、約13kDaの分子量を有するか、または抗体の全サイズの10分の1より小さい。
【００１３】
イムノグロブリン軽鎖はカッパまたはラムダ軽鎖と呼ばれ、重鎖はガンマ、ミュー、デルタ、アルファまたはイプシロンと呼ばれる。可変領域は抗体に特異性を与える。各抗体の可変領域内には超可変領域、さもなければ、フレームワーク領域と呼ばれる、より保存された領域が並んで位置する相補性決定領域(CDR)として知られている領域が存在する。各軽鎖および重鎖可変領域内には、3つのCDRおよび4つのフレームワーク領域が存在する。
【００１４】
従来の抗体とは対照的に、ドメイン抗体は細菌、酵母、および哺乳動物系においてよく発現される。小サイズのそれらは、生成物1グラム当りのより多くのモル量を可能にし、したがって効力が顕著に増大する。加えてドメイン抗体は治療製品を製造するための構成要素、例えば、2つ以上の可変ドメインを含有する構成体が2つ以上の治療目標に結合する多重標的ドメイン抗体、または肺もしくは経口投与を目的としたドメイン抗体として用いることができる。
【特許文献１】EP 0605 442
【特許文献２】WO 2004/003019
【特許文献３】PCT/GB2003/002804
【特許文献４】米国特許第4816567号
【特許文献５】米国特許第5585089号
【特許文献６】米国特許出願公開第20030039649号
【特許文献７】国際公開第93/06213号
【特許文献８】国際公開第92/01047号
【非特許文献１】Ehrlich PH et al., Clin Chem., 1988, 34:9 1681〜1688
【非特許文献２】Ehrich PH et al. Hybridoma, 1987, 6:151〜60
【非特許文献３】von Budingen H-C et al. Inmmunogenetics, 2001, 53:557〜563
【非特許文献４】Schneider H et at, Mol Phylogenet Evol., 1993 Sep;2(3):225〜42
【非特許文献５】Stern, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6808〜6812 (1990)
【非特許文献６】Kong, Y-Y. et al. Nature 397:315〜323 (1990)
【非特許文献７】Matthews, N. and M. L. Neale in Lymphokines and Interferons, a Practical Approach, 1987
【非特許文献８】M.J. Clemens, A.C. Morris and A.J. H. Gearing, eds., IRL Press, p.221
【非特許文献９】van den Beuken T et al, 2001, J. Mol. Biol, 310, 591
【非特許文献１０】Ward et al, 1989, Nature 341 :544〜546
【非特許文献１１】Bird et al., 1988, Science 242:423〜426
【非特許文献１２】Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879〜5883
【非特許文献１３】Holliger, P., et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444〜6448
【非特許文献１４】Poljak, R.J., et al., 1994, Structure, 2:1121〜1123
【非特許文献１５】http://www.imtech.res.in/raghava/propred
【非特許文献１６】http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html
【非特許文献１７】Flower DR, Doytchinova IA. (2004) Immunoinformatics and the prediction of immunogenicity, Drug Discov Today, 9(2): 82〜90
【非特許文献１８】Hammer J et al., 1994, J. Exp. Med., 180:2353
【非特許文献１９】http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
【非特許文献２０】Jespers等の/TECHNOLOGY Vol 12 1994, 899〜903頁
【非特許文献２１】McCafferty等の1990, Nature, 348:552〜554
【非特許文献２２】Griffiths等の1993,EMBO J,12:725〜734
【非特許文献２３】Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Molecular Cloning; a laboratory manual, second edition, Cold Spring Harbor, N.Y (1989)
【非特許文献２４】R.A. Irving et al., 2001, Journal of Immunological Methods, 248, 31〜45
【非特許文献２５】Sambrook, Joseph; and David W. Russell (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor, N. Y.; Cold Spring Harbor Laboratory Press
【非特許文献２６】Kipriyanov, S. M., et al., 1995 Human Antibodies and Hybridomas, 6:93〜101
【非特許文献２７】Kipriyanov, S. M, et al, 1994 Mol. Immunol., 31: 1047〜1058
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明者等は、新世界霊長類がヒト抗原を含む広範囲の抗原に対する抗体のための結合ドメインの豊かな供給源を提供することを見出した。更に、ヒトと新世界霊長類の間の配列の相同性のため、これらの新世界霊長類配列は、ヒトにおける比較的低い免疫原性を有するようである。
【００１６】
第一の特徴点では、本発明は、抗原結合部分が少なくとも2つの相補性決定領域(CDR)および少なくとも3つのフレームワーク領域を含有し、少なくとも1つのCDRが新世界霊長類CDRであるキメラ抗体またはその抗原結合部分に関する。
【００１７】
少なくとも2つのCDRおよび少なくとも3つのフレームワーク領域を含有するヒト抗体可変領域から1つのCDRを除去し、それを低い免疫原性を有すると予測される新世界霊長類CDRで置換し、キメラ可変領域を生産することを含む、キメラ抗体またはその抗原結合部分の製造方法を提供する。
【００１８】
関連する特徴点では、前記方法は、キメラ可変領域を回収する工程を更に含む。
【００１９】
また別の特徴点では、本発明は、本発明の方法によって製造されたキメラ抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００２０】
更なる特徴点では、本発明は、製薬学的に許容可能な賦形剤または希釈剤とともに、本発明に係る有効量の抗体またはその抗原結合部分を含む製薬組成物を提供する。
【００２１】
また更なる特徴点では、本発明は、特定の疾患または疾病と関連する抗原を検出するための診断上の利用における、本発明の抗体またはその抗原結合部分の使用を提供する。
【００２２】
別の特徴点では、抗体またはその抗原結合部分がTNF-αを結合する、ここに記載された有効量のキメラ抗体またはその製薬組成部を、治療の必要のある患者に投与する工程を含む、ヒト患者におけるヒトTNF-α活性によって特徴づけされる疾患または疾病の治療方法を提供する。
【００２３】
第一の特徴点では、本発明は、抗原結合部分が少なくとも2つの相補性決定領域(CDR)および少なくとも3つのフレームワーク領域を含有し、少なくとも1つのCDRが新世界霊長類CDRであるキメラ抗体またはその抗原結合部分に関する。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
第一の特徴点では、本発明は、抗原結合部分が少なくとも2つの相補性決定領域(CDR)および少なくとも3つのフレームワーク領域を含有し、少なくとも1つのCDRが新世界霊長類CDRであるキメラ抗体またはその抗原結合部分に関する。
【００２５】
抗原結合部分は、3つのCDRと4つのフレームワーク領域を含むことが好ましい。
【００２６】
本発明のある実施態様では、キメラ抗体またはその抗原結合部分は、1つの新世界霊長類CDRを含む。他の実施態様では、キメラ抗体またはその抗原結合部分は、2つの新世界霊長類CDRを含む。別の実施態様では、抗体またはその抗原結合部分のCDR2が新世界霊長類CDRである。
【００２７】
本発明の他の実施態様では、少なくとも1つの新世界霊長類CDRは、標的抗原を結合する配列由来ではない。
【００２８】
本発明の他の実施態様では、フレームワーク領域はヒト配列である。ヒト配列であるフレームワーク領域は、ヒトフレームワーク領域、またはヒトフレームワーク領域に基づく合成配列から由来する配列を含む。
【００２９】
抗原結合または力価のような抗原結合特性を改良するため、抗原結合部分の配列が、親和性成熟に更に供されても良いことが、本発明の範囲内に存在する。
【００３０】
結合の増大は、抗体またはその抗原結合部分に対するKD(Koff/Kon)の減少により示される。有効性の増大は生物学的分析により示される。例えば、抗体またはその抗原結合部分の有効性を測定するのに用いることができる分析は、TNFα-誘導L929細胞毒中和分析、IL-12誘導ヒトPHA-活性化末梢血単核細胞(PBMC)増殖分析、およびマウス脾細胞の破骨細胞分化を媒介したRANKLを含む(Stern, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6808〜6812 (1990); Kong, Y-Y. et al. Nature 397:315〜323 (1990); Matthews, N. and M. L. Neale in Lymphokines and Interferons, a Practical Approach, 1987, M.J. Clemens, A.C. Morris and A.J. H. Gearing, eds., IRL Press, p.221)。
【００３１】
更に好ましい実施態様では、少なくとも1つのCDRは、結合または力価を増大するために、及びヒトにおける予測される免疫原せいを減少するために改変される。改変された少なくとも1つのCDR配列が新世界霊長類CDRではないことが好ましい。2つ以上の新世界霊長類CDRが存在する場合、少なくとも1つの新世界霊長類CDRが改変されていないことが好ましい。
【００３２】
本発明の他の実施態様では、少なくとも1つのCDR配列に加えて、結合を増大するために、及び/またはヒトにおける予測される免疫原性を減少するために、少なくとも1つのフレームワーク領域が改変される。改変された少なくとも1つのCDR配列は、新世界霊長類CDR配列でないことが好ましい。
【００３３】
好ましい実施態様では、抗原結合部分はドメイン抗体である。
【００３４】
本発明の更なる実施形態において、ドメイン抗体は、例えばヘテロ-またはホモ二量体(例えば、VH/VH、VL/VLまたはVH/VL)、ヘテロ-またはホモ三量体(例えば、VH/VH/VH、VL/VL/VL、VH/VH/VLまたはVH/VL/VL)、ヘテロ-またはホモ四量体(例えば、VH/VH/VH/VH、VL/VL/VL/VL、VH/VH/VH/VLまたはVH/VH/VL/VLまたはVH/VL/VL/VL)、あるいはより高次の他のヘテロ-またはホモ多量体として多量体化していてもよい。多量体化は抗原結合の強度を増大させることができ、ここで結合強度は多重結合部位の結合親和性またはその一部の総和に関係する。
【００３５】
かくして本発明は、少なくとも1つの更なるドメイン抗体に結合したドメイン抗体を提供する。各ドメイン抗体は、同じまたは異なる抗原に結合しても良い。
【００３６】
ドメイン抗体多量体は、さらに1つまたは複数の連結しているドメイン抗体を含有していてもよく、ここで、各ドメイン抗体は異なる抗原、いわゆる「二重特異的リガンド(dual-specific ligand)」を含む多重特異的リガンドに結合する。例えば、二重特異的リガンドは一対のVHドメインまたは一対のVLドメインを含有していてもよい。かかる二重特異的リガンドはDomantis Ltdの名でWO 2004/003019 (PCT/GB2003/002804)に記載されており、それらはすべて参照により本明細書に組み込まれる。
【００３７】
好ましくは、前記抗体またはその抗原結合部分は、ヒトまたは非ヒト霊長類定常領域配列を更に含む。非ヒト霊長類の例は、チンパンジー、オラウータン、及びゴリラを含むがこれらに制限されない。
【００３８】
本発明はまた、少なくとも2つのCDRおよび少なくとも3つのフレームワーク領域を含有するヒト抗体可変領域から1つのCDRを除去し、それを低い免疫原性を有すると予測される新世界霊長類CDRで置換し、キメラ可変領域を生産することを含む、キメラ抗体またはその抗原結合部分の製造方法を提供する。
【００３９】
関連する特徴点では、前記方法は、キメラ可変領域を回収する工程を更に含む。
【００４０】
選択される新世界霊長類CDRはCDR2であることが好ましい。CDR2配列は、KVSNRAS、RVSNRAS、KVSTRGP、AASNRAS、TSSNLQA、DASSLQP、及びYASFLQGから選択される。特に好ましい配列は、その予測されるより低い免疫原性のため、KVSNRAS、AASNRAS、TSSNLQA、及びKVSTRGPである。
【００４１】
更なる実施態様では、前記方法は、結合を増大するため、及び/またはヒトにおける免疫原性を減少するため、キメラ可変領域の配列を改変する工程を含む。新世界霊長類CDR配列は改変されないことが好ましい。二つ以上の新世界霊長類CDR配列が存在する場合、少なくとも1つの新世界霊長類CDRは改変されないことが好ましい。
する。
【００４２】
本発明の他の実施態様では、結合を増大するために、及び/またはヒトにおける予測される免疫原性を減少するために、少なくとも1つのCDR配列に加えて、少なくとも1つのフレームワーク領域が改変される。改変された少なくとも1つのCDR配列は、新世界霊長類CDR配列ではないことが好ましい。本発明はまた、本発明の方法によって製造されたキメラ抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００４３】
本明細書において用いる用語「抗体」は、4つのポリぺプチド鎖、ジスルフィド結合により相互連結された2つの重(H)鎖および2つの軽(L)鎖を含むイムノグロブリン分子を指すものとする。各重鎖は、重鎖可変領域(HCVRまたはVH)および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は3つのドメイン、CH1、CH2およびCH3を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域(LCVRまたはVL)および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は1つのドメイン、CLを含む。VHおよびVL領域は、さらに超可変領域に分割することができ、相補性決定領域(CDR)と呼ばれ、より保存されたフレームワーク領域(FR)と呼ばれる領域が組み込まれている。各VHおよびVL領域は、3つのCDRおよび4つのFRsから構成され、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端まで配列している:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
【００４４】
本明細書において用いる用語、抗体の「抗原結合部分」とは、抗原に結合する能力を示す、1つまたは複数の成分またはイムノグロブリンの誘導体をいう。抗体の抗原結合機能は、完全な長さの抗体のフラグメントにより達成できることが示されている。用語、抗体の「抗原結合部分」に包含される結合フラグメントの例は、(i)VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる一価のフラグメントである、Fabフラグメント;(ii)ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により連結された2つのFabフラグメントを含有する2価のフラグメントである、F(ab')2フラグメント;(iii)VHおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント;(iv)抗体の1つの腕のVLおよびVHドメインからなるFvフラグメント;(v)1つのVHドメインまたはVLドメイン(van den Beuken T et al, 2001, J. Mol. Biol, 310, 591)からなるdAbフラグメント (Ward et al, 1989, Nature 341 :544〜546);および(vi)単離された相補性決定領域(CDR)を含む。さらに、Fvフラグメントの2つのドメイン、VLおよびVHは分離した遺伝子によりコードされ、それらは組換え方法を用い、合成リンカーにより連結することができ、VLおよびVH域の対が、単一鎖Fv(scFv)として知られている一価の分子を形成する単一のタンパク質鎖をつくる(例えば、Bird et al., 1988, Science 242:423〜426およびHuston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879〜5883参照)。かかる単一鎖Fvsはまた、用語、抗体の「抗原結合部分」に包含されるものである。単一鎖Fvsの他の形態および関連する分子、例えば2量体または3量体も包含される。2量体は、VHおよびVLドメインが単一ポリぺプチド鎖上に発現されている二価抗体であるが、同じ鎖上の2つのドメイン間の対形成には短すぎるリンカーを使用するため、ドメインを他の鎖の相補性ドメインを用いて対にし、2つの抗原結合部分を形成している(例えば、Holliger, P., et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444〜6448; Poljak, R.J., et al., 1994, Structure, 2:1121〜1123参照)。
【００４５】
ここで使用される用語「キメラ」は、抗体またはその抗原結合部分が2つの異なる種由来の配列を含むことを意味する。  
【００４６】
一つの実施態様では、ドメイン抗体は、ヒトフレームワーク領域と、少なくとも1つの新世界霊長類CDR、より好ましくはマーモセットCDRを含む。
【００４７】
好ましくは、新世界霊長類は、マーモセット類、タマリン類、リスザル、ティティザル、クモザル、ウーリーモンキー、オマキザル、ウアカリ、サキ属、ヨザル、およびホエザルからなる群から選択される。より好ましくは、新世界霊長類は、マーモセットである。
【００４８】
本発明のキメラ抗体製造方法は、例えば、米国特許第4816567号、米国特許第5585089号および米国特許出願公開第20030039649号、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、を参照する当業者によく知られたものとなる。かかる方法は標準的な組換え技術の使用を必要とする。
【００４９】
本発明の抗体またはその抗原結合部分は、ヒト宿主において予測される低い免疫原性を有するのが好ましい。
【００５０】
「低免疫原性」は、治療効果を達成するのに十分な時間において、継続された抗体投与の効果を低下させるのに十分な量の抗体を受ける個体の少なくとも過半数において、抗体が抗体反応を惹起しないことを意味する。
【００５１】
ヒトにおける免疫原性のレベルは、MHCクラスII結合予測プログラムPropred(http://www.imtech.res.in/raghava/propred)を用い、すべての対立遺伝子の1%閾値解析を用いて予測することができる。使用可能な他のプログラムは:
Rankpep (http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html) 
Epibase (Algonomics proprietary software: algonomics.com)
を含む。
【００５２】
低い免疫原性の分子は、標的集団において高度に発現されるMHCクラスII対立遺伝子に結合すると予測される0または低数のペプチドを含むであろう(Flower DR, Doytchinoya 1A. (2004) immunoinformatics and the prediction of immunogenisity, Drug Discov Today, 9(2): 82-90)。
【００５３】
免疫原性の低減した分子は、初期のドナー分子と比較し、標的集団において高度に発現されるMHCクラスII対立遺伝子に結合すると予測されるぺプチドを含まないか、低減した数のぺプチドを含む。
【００５４】
MHCクラスII結合の機能分析は、当該タンパク質に対応する、重複するぺプチドを生成し、T細胞活性化を惹起するそれらの能力を試験するか(T細胞増殖分析)、またはレポーターぺプチドである、既知のMHCクラスII結合ぺプチドを置き換えることにより実施することができる(Hammer J et al., 1994, J. Exp. Med., 180:2353)。
【００５５】
本発明は、さらに新世界霊長類イムノグロブリン遺伝子増幅のための方法、例えば、重鎖および軽鎖可変領域遺伝子ファミリーに対し特異的なプライマーを用いる、新世界霊長類リンパ球から抽出された核酸からのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による方法に基づく。新世界霊長類キメラ組換え抗体を製造するため、増幅された可変領域を、ヒトまたは霊長類の定常領域遺伝子を含有する発現ベクター中にクローン化する。標準組換えDNA法を抗体重鎖および軽鎖遺伝子を得るために用い、これらの遺伝子を組換え発現ベクター中に組み込み、ベクターを宿主細胞、例えば、Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Molecular Cloning; a laboratory manual, second edition, Cold Spring Harbor, N.Y (1989)に記載の宿主細胞中に導入する。
【００５６】
好適な発現ベクターは、当業者によく知られている。イムノグロブリンを産生する新世界霊長類リンパ球は、典型的には骨髄腫細胞株との融合により不死化し、ハイブリドーマを生成する。
【００５７】
本発明の組換え抗体を発現するための好ましい哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣 (CHO)、NSO骨髄腫細胞、COS細胞およびSP2細胞を含む。
【００５８】
哺乳動物の発現システムに加え、本発明はまた非哺乳動物発現システム、例えば、誘導された植物または原核生物(細菌)の使用を検討する。かかる発現システムは当業者によく知られている。
【００５９】
VH、VLおよび定常領域ドメインのレパートリーは、自然に生成するイムノグロブリン配列のレパートリーまたは合成レパートリーであってよい。自然に生成するレパートリーは、例えば、1種または複数種の新世界霊長類から採取されたイムノグロブリン発現細胞から調製されるレパートリーである。かかるレパートリーは未熟であってよく、すなわち、新生児イムノグロブリン発現細胞から調製するか、または再配列することができ、例えば成体の霊長類B細胞から調製することができる。必要であれば、天然のレパートリー、または標的抗原に結合する任意のレパートリーから同定されたクローンを、向上した結合特性を有する変異株を生成し選択するため、突然変異生成に供し、さらにスクリーニングを行う。
【００６０】
イムノグロブリン可変ドメインの合成レパートリーは、クローン化された可変ドメイン中に多様性を人工的に導入することにより調製する。かかる親和性成熟技術は、当業者によく知られている(R.A. Irving et al., 2001, Ribosome display and affinity maturation: from antibodies to single V-domains and steps towards cancer therapoutics, Journal of Immunological Methods, 248: 31-45)。
【００６１】
新世界霊長類抗体遺伝子の可変領域またはそれらのCDRは、核酸、例えばcDNAを供給し、抗体遺伝子の5'リーダー配列をコードするcDNA配列に相補的なプライマーを供給し、cDNAとプライマーを接触させてハイブリッド複合体を形成し、およびcDNAを増幅して新世界霊長類抗体遺伝子の可変領域(またはCDR領域)をコードする核酸を製造することによりクローン化することができる。
【００６２】
本明細書の教示を考慮すれば、新世界霊長類可変領域配列が、非新世界霊長類配列の移植用のアクセプターとして使用できること、特に、CDR配列を標準的な組換え技術を用いて使用できることは、本発明の技術分野の熟練者により認識される。例えば、米国特許第5585089号は、非ヒト親抗体の高親和性を保持し、かつドナーイムノグロブリンからの1つまたは複数のCDRおよびヒトイムノグロブリンからのフレームワーク領域を含有する低免疫原性のキメラ抗体を作製するための方法を記載する。米国特許出願公開第20030039649号は、ヒト化抗体のための適切なヒトフレームワーク配列を選択する基準として、ヒト抗体の生殖細胞系列の標準的なCDR構造タイプと比較した非ヒト抗体の標準的なCDR構造タイプの使用に基づいて、非ヒト抗体およびヒト抗体のフレームワーク配列からのCDR配列を含有する低免疫原性のキメラ抗体を作製するためのヒト化方法を記載する。したがって、これらの原則は、新世界霊長類アクセプター可変領域中に、1つまたは複数の非新世界霊長類CDRを移植するのに適用することができる。
【００６３】
CDR配列は、抗体から単離されたゲノムDNAから、またはデータベース、例えば、The National Centre for Biotechnology Informationタンパク質および核酸データベース、The Kabat Database of Sequences of Proteins of Immunological Interest に存在する配列から得ることができる。CDR配列はゲノムDNAまたはcDNAであってもよい。
【００６４】
アクセプター可変配列中にCDR(s)を置き換える移植方法は、本発明の技術分野の熟練者によく知られている。典型的には、CDRはアクセプター可変領域配列中の、可変軽鎖および可変重鎖またはドメイン抗体の場合は単鎖のそれぞれに移植する。本発明の好ましい方法は、可変領域配列において、突然変異生成を目的としたプライマーを介するCDR1またはより好ましくはCDR2の置換を含む。該方法は、標的領域に対する望ましい突然変異をコードする合成オリゴヌクレオチドのアニーリングからなり、合成オリゴヌクレオチドはDNAのin vitro合成の開始用のプライマーとして供給し、DNAポリメラーゼによりオリゴヌクレオチドを延長し、望ましい突然変異を有する二重らせんDNAを生成し、該配列を適切な発現ベクター中に結紮し、クローン化する(Sambrook, Joseph; and David W. Russell (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor, N. Y.; Cold Spring Harbor Laboratory Press)。
【００６５】
さらに、抗体またはその抗原結合部分は、1つまたは複数の他のタンパク質またはぺプチドを有する抗体または抗体部分の共有または非共有の会合により形成される、より大きい免疫接着物分子の一部であってもよい。このような免疫接着物分子の例は、4量体のscFv分子を調製するためにストレプトアビジンのコア領域の使用(Kipriyanov, S. M., et al., 1995 Human Antibodies and Hybridomas, 6:93〜101)および二価およびビオチニル化したscFv分子を調製するためにシステイン残基、マーカーぺプチドおよびC末端ポリヒスチジンタグの使用を含む(Kipriyanov, S. M, et al, 1994 Mol. Immunol., 31: 1047〜1058)。Fab、F(ab')2フラグメント等の抗体部分は、全体の抗体をそれぞれパパイン消化またはペプシン消化する等の慣用の方法を用いて、全体の抗体から調製することができる。さらに、抗体、抗体部分および免疫接着分子は、本明細書に記載され、当業者に知られている、標準的な組換えDNA技術を用いて得ることができる。
【００６６】
定常領域配列(Fc部分)は、好ましくはヒトまたは非ヒト霊長類のイムノグロブリン配列から得る。霊長類配列は、新世界霊長類または旧世界霊長類の配列であってよい。好適な旧世界霊長類は、チンパンジー、または他のヒト科の動物、類人猿、例えばゴリラまたはオランウータンを含み、それらは系統発生学的にヒトに非常に近接しているため、ヒトの定常領域配列と高度の相同性を共有する。ヒトまたは霊長類の定常領域に対してコードする配列は、例えば、The National Centre for Biotechnology Information protein and nucleotide databases, The Kabat Database of Sequences of Proteins of Immunological Interestを含むデータベースから入手することができる。
【００６７】
本発明の抗体または抗原結合部分は、ヒトまたは非ヒト抗原に結合することができる。
【００６８】
好ましくは、キメラ抗体またはその抗原結合部分に結合する抗原は、癌胎児性抗原、EpCAM、Lewis-Y、Lewis-Y/b、PMSA、CD20、CD30、CD33、CD38、CD52、CD154、EGF-R、Her-2、TRAILおよびVEGFレセプターを含む腫瘍関連抗原;CD3、CD4、CD25、CD40、CD49d、MHCクラスI、MHCクラスII、GM-CSF、インターフェロン-γ、IL-I、IL-12、IL-13、IL-23、TNF-α、およびIgEを含む免疫もしくは炎症疾患または免疫もしくは炎症障害に含まれる抗原;糖タンパク質IIb/IIIa、P-糖タンパク質、プリンレセプターおよびCD11a、CD1lb、CD11c、CDl8、CD56、CD58、CD62またはCD144を含有する接着レセプターを含む宿主細胞上に発現される抗原;エオタキシン(eotaxin)、IL-6、IL-8、TGF-β、C3a、C5a、VEGF、NGFおよびそれらのレセプターを含有する、サイトカイン、ケモカイン、成長因子もしくは他の可溶性生理学的調節物質またはそれらのレセプターを含む抗原;β-アミロイドおよびプリオンを含む中枢神経系疾患または障害に含まれる抗原;呼吸器合胞体ウイルスタンパク質F、炭疽毒素、ガラガラヘビ毒、およびジゴキシンを含有する、非ヒト由来抗原、例えば、微生物、ナノ微生物またはウイルスの抗原または毒素からなる抗原から選択される、天然の、ペプチド、タンパク質、炭水化物、糖タンパク質、脂質または糖脂質である抗原に結合し;キメラ抗体は、アゴニストもしくはアンタゴニストとして作用するか、補体もしくはキラー細胞(例えば、NK細胞)の作用により望ましくない細胞(例えば、抗CD4)を減少させる(死滅させるか排除する)ことに対し活性であるか、または細胞毒性薬として活性であるか、または食細胞のFcレセプターと結合するか、もしくはその標的の生物学的活性を中和する。
【００６９】
より好ましくは、抗原はTNFαであり、最も好ましくはヒトTNFαである。
【００７０】
代わりに、抗体またはその抗原結合部分は非ヒト抗原に結合することができる。好ましくは非ヒト抗原は、呼吸器合胞体ウイルスFタンパク質、サイトメガロウイルス、ヘビ毒、およびジゴキシンからなる群から選択される。
【００７１】
本明細書において用いる用語「に結合する」は、例えば、BTAcore(商標)表面プラズモン共鳴システムおよびBTAcore(商標)速度評価ソフトウェア(例えば、version 2.1)を用いる表面プラズモン共鳴分析により測定したときに、1μMまたはそれより低い解離定数(Kd)を有する抗体のイムノグロブリン可変領域による抗原の結合をいうものとする。特定の結合相互作用に対する親和または解離定数(Kd)は、好ましくは約500nMから約50pMであり、より好ましくは約500nM以下、さらに好ましくは約300nM以下、および好ましくは少なくとも約300nMから約50pM、約200nMから約50pM、およびより好ましくは少なくとも約100nMから約50pM、約75nMから約50pM、約10nMから約50pMである。
【００７２】
本発明の抗体は、ヒト抗抗体反応を誘導する可能性が減少するため、ヒトの治療に有利である。
【００７３】
標的抗原に結合する、本発明に従って生産された組換え抗体は、望ましい結合特異性および機能的性質を示すライブラリーメンバーを単離するために、組合せのイムノグロブリンライブラリー(例えば、ファージ表示ライブラリー)をスクリーニングすることにより同定し、単離することができる。抗原結合部分または抗体の誘導体、例えばFabs、scFvおよびVドメインまたはドメイン抗体、を用いるすべての方法は、本発明の範囲内にあることが理解される。ファージ表示技術が当該技術分野において広範囲にわたって記載されており、かかるライブラリーおよびそれらの親和性成熟生成物を生成し、スクリーニングするための方法および化合物の例は、例えば、Barbas et al, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7978-7982; Clarkson et al., 1991, Nature, 352:624:628; Dower et al., PCT公開番号国際公開第91/17271号, 米国特許第5,427,908号, 米国特許第5,580,717号およびEP 527,839; Fuchs et al, 1991, Bio/Technology, 9:1370-1372; Garrad et al, 1991 Bio/Technology, 9:1373: 1377; Garrard el al, PCT公開番号国際公開第92/09690号; Gram et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:3576-3580; Griffiths et al., 1993 EMBO J, 12:725:734; Griffiths et al, 米国特許第5,885,793号およびEP 589,877; Hawkins et al, 1992, J Mol Biol, 226:889-896; Hay et al 1992, Hum Antibod Hybridomas, 3:81-85; Hoogenboom et al, 1991 Nuc Acid Res, 19:4133-4137; Huse et al., 1989, Science, 246:1275-1281; Knappik et al., 2000, J Mol Biol, 296:57-86; Knappik et al. PCT国際公開第97/08320号; Ladner et al., 米国特許第5,223,409号, 第5,403,484号, 第5,571,698号, 第5,837,500号およびEP 436,597; McCafferty et al., 1990, Nature. 348:552-554; McCafferty et al., PCT公開番号国際公開第92/01047号, 米国特許第5,969,108号およびEP 589,877; Salfeld et al, PCT国際公開第97/29131号, 米国仮出願第60/126,603号;およびWinter et al. PCT国際公開第92/20791号およびEP 368,684;において見出すことができる。
【００７４】
本発明の抗体を発現する組換えライブラリーは、微生物、例えば酵母または細菌の表面に発現することができる(PCT公開国際公開第99/36569号および国際公開第98/49286号参照)。
【００７５】
最新技術において参照されるように、選択されたリンパ球抗体法またはSLAMは、高親和性抗体を迅速に生成する別の手段である。ファージディスプレイの方法と異なり、すべての抗体は完全な2価である。新世界霊長類抗体を生成するために、新世界霊長類はヒト抗原、例えば、TNFαポリぺプチドにより免疫する。免疫した後、細胞を取り除き、個々のマイクロウェルにおいて選択的に増殖する。ウェルから上清を除き、結合および機能の両方を試験する。遺伝子配列は、後続の操作、例えばヒト化、Fabフラグメント、scFvまたはドメイン抗体生成のために回収することができる。したがって別の例は、SLAMおよびその誘導体による本発明のリガンドの誘導である(Babcook, J.S. et al 1996, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 93; 7843-7848, 米国特許第5,627,052号およびPCT公開国際公開第92/Q2551号)。SLAMの適用、例えば、panning等の上清を試験するための他の使用も本発明の範囲内である。
【００７６】
1つの発現システムにおいて、組換えぺプチド/タンパク質ライブラリーは、リボソーム上に表示される(例えば、Roberts, RW and Szostak, J.W.1997. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 94: 12297 - 123202およびPCT公開国際公開第98/31700号参照)。このような別の例は、好ましくは、特に制限されないが免疫細胞から調製される(例えば、抗体および誘導体の)DNAライブラリーの生成およびin vitro転写、タンパク質および「免疫された」mRNAsがリボソーム上にあるライブラリーの翻訳、親和性選択(例えば、RSPに結合することによる)、mRNAの単離、逆翻訳(reverse translation)およびそれに続く増幅(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応または関連する技術による)を含む。選択および増幅の追加のラウンドは、必要に応じて、このシステムにおいて体細胞変異の導入を介して親和性成熟に連結してもよいし、または最新技術において知られている親和性成熟の他の方法により親和性成熟に連結してもよい。
【００７７】
他の例は、本発明の抗体生成へのエマルジョン細分化(emulsion compartmentalisation)技術の適用を参照されたい。エマルジョン細分化において、in vitroおよび光学的スクリーニング法は、エマルジョン油滴中の水相内に存在する、翻訳されたタンパク質および配列をコードするそのヌクレオチドの共細分化(co-compartmentalisation)と組み合わされる(PCT公開国際公開第99026711号および国際公開第0040712号)。抗体の生成および選択のための主な要素は、リボソームディスプレイのin vitro方法に基本的に類似する。
【００７８】
本発明の抗体またはその抗原結合部分は、他の機能性分子に誘導体化するか、または結合することができる。例えば、抗体または抗原結合部分は、化学的結合、遺伝子融合、非共有会合により、さもなければ別の方法により、1つまたは複数の他の分子実体、例えば、他の抗体、検出可能薬、細胞毒薬、医薬品、および/または別の分子(例えば、ストレプトアビジンコア領域またはポリヒスチジンタグ)により抗体もしくはその抗原結合部分の会合を媒介できるタンパク質もしくはぺプチドに機能的に結合することができる。
【００７９】
抗体またはその抗原結合部分が誘導体化されていてもよい有用な検出可能薬は、蛍光化合物を含む。蛍光検出剤の例としては、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、5-ジメチルアミン-1-ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリトリン等を含む。抗体は、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ等の検出可能な酵素により誘導体化されていてもよい。抗体が検出可能な酵素によって誘導体化されている場合、抗体は、検出可能な反応生成物を生成するために酵素が使用する試薬をさらに加えることにより検出される。抗体はビオチンを用いて誘導体化することもでき、アビジンまたはストレプトアビジン結合の間接的な測定により検出される。
【００８０】
本発明は、非PEG化抗体ポリぺプチドに関して、活性を損失すること(例えば、結合親和性)なく半減期を延長し、分解に対する抵抗を増大させる、PEG化した抗体または抗体結合部位に及ぶ。
【００８１】
本明細書に記載したように、抗体またはその抗原結合部分は、当該技術分野において知られている方法を用いて、半減期を延長し、分解抑制特性を向上させるのに有用なポリマー分子(好ましくはPEG)に連結することができる。本発明において利用することのできるポリマー部分は、合成または天然に生成するものであってよく、特に限定されず、直鎖もしくは分岐鎖のポリアルキレン、ポリアルケニレンもしくはポリオキシアルキレンポリマー、または分岐もしくは非分岐のポリサッカライド、例えばホモもしくはヘテロポリサッカライドを含む。本発明に用いることのできる合成ポリマーの好ましい例は、直鎖もしくは分岐鎖のポリ(エチレングリコール)(PEG)、ポリ(プロピレングリコール)、またはポリ(ビニルアルコール)およびその誘導体もしくは置換体を含む。本明細書に記載の抗体に連結するための特に好ましい置換されたポリマーは、メトキシ(ポリエチレングリコール)を含む置換されたPEGを含む。PEGに加えて、またはPEGの代わりに使用することのできる、天然に生成するポリマー部分は、ラクトース、アミロース、デキストランもしくはグリコーゲン、または当業者が認識しているそれらの誘導体を含む。
【００８２】
ポリマー分子の誘導体化した形態は、例えば、追加部分または本明細書に記載の抗体ポリぺプチドのアミノ酸残基と相互作用することのできる反応性基を有する誘導体を含む。かかる誘導体は、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)活性エステル、スクシンイミジルプロピオナートポリマー、およびマレイミド、ビニルスルホン、チオール等のスルフヒドリル選択的反応性剤を含む。特に好ましい誘導体化ポリマーは、以下の式を有するPEGポリマー:PEG-O-CH2CH2CH2-CO2-NHS; PEG-O-CH2-NHS; PEG-O-CH2CH2-CO2-NHS; PEG-S-CH2CH2-CO-NHS; PEG-O2CNH-CH(R)-CO2-NHS; PEG-NHCO-CH2CH2-CO-NHS;およびPEG-O-CH2-CO2-NHS、ただし、Rは((CH2)4)NHCO2(mPEG)である、を含むが、これらの誘導体化ポリマーに限定されない。PEGポリマーは、直線状の分子または分岐であってよく、多重PEG部分は単一のポリマー中に存在する。
【００８３】
反応性基(例えば、MAL、NHS、SPA、VSまたはチオール)は、直接PEGポリマーに結合するか、またはリンカー分子を介してPEGに結合してもよい。
【００８４】
本発明において有用なポリマーのサイズは、500Daから60kDaの範囲とすることができ、例えば、1000Daから60kDaの間、10kDaから60kDaの間、20kDaから60kDaの間、30kDaから60kDaの間、40kDaから60kDaの間、および50kDaから60kDaの間までの範囲とすることができる。本発明に使用できるポリマー、特にPEGは、直鎖ポリマーとすることができ、または分岐構造を有していてもよい。
【００８５】
本発明に有用なポリマー(PEG)分子は、当該技術分野においてよく知られている方法を用いて抗体またはその抗原結合部分に結合することができる。本発明の抗体ポリぺプチドモノマーまたはマルチマーに対するPEGまたは他のポリマー部分の結合の最初の段階は、親電子含有官能基(electrophilc-containing functional groups)によるPEGポリマーのヒドロキシ末端基の置換である。特に、PEGポリマーは、抗体ポリぺプチドモノマーまたはマルチマー中に存在するシステインまたはリジン残基に結合する。システインまたはリジン残基は自然に生成することも、人工的に抗体ポリぺプチド分子中に導入することもできる。例えば、システイン残基は組換え技術によって抗体ポリぺプチドのC末端に導入することができ、または抗体ポリぺプチド中の特定の溶媒接近可能な位置における残基は、システインまたはリジンにより置換することができる。
【００８６】
抗体は、そのin vivoの半減期を延長することのできる1つまたは複数の分子に連結することができる。これらの分子は、抗原結合部分に干渉すること、または抗原結合部分の立体障害となることがないように、抗原結合部分以外の抗体上の部位において抗体に連結する。典型的には、かかる分子はin vivoにおいて自然に生成し、内因性の機構による分解または排除に抵抗するポリぺプチドである。かかる自然に生成する分子のフラグメントまたは誘導体を用いること、およびいくつかがポリぺプチドでないことは、当業者にとって自明である。半減期を延長する分子は、以下のものから選択することができる:
(a)細胞外マトリックスからのタンパク質、例えばコラーゲン、ラミニン、インテグリンおよびフィブロネクチン;
(b)血液中に見られるタンパク質、例えば、フィブリンα-2マクログロブリン、血清アルブミン、フィブリノーゲンA、フィブリノーゲンB、血清アミロイドタンパク質A、ヘプタグロビン(heptaglobin)、タンパク質、ユビキチン、ウテログロブリン、β-2ミクログロブリン、プラスミノーゲン、リゾチーム、シスタチンC、α-1-アンチトリプシンおよび膵臓kypsin阻害剤;
(c)免疫血清タンパク質、例えば、IgE、IgG、IgM;
(d)輸送タンパク質、例えば、レチノール結合タンパク質、α-1ミクログロブリン;
(e)デフェンシン、例えば、β-デフェンシン1、好中球デフェンシン1,2および3;
(f)血液脳関門または神経組織において見られるタンパク質、例えば、メラノコルチンレセプター、ミエリン、アスコルビン酸輸送体(ascorbate transporters);
(g)トランスフェリンレセプター特異的リガンド-神経医薬融合タンパク質(米国特許第5977307号参照);脳毛細血管内皮細胞レセプター、トランスフェリン、トランスフェリンレセプター、インスリン、インスリン様成長因子1(IGF1)レセプター、インスリン様成長因子2(IGF2)レセプター、インスリンレセプター;
(h)腎臓に局在するタンパク質、例えば、ポリシスチン(polycystin)、タイプIVコラーゲン、有機陰イオン輸送体K1、ハイマン抗原(Heymann's antigen);
(i)肝臓に局在するタンパク質、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ、G250;
(j)血液凝固因子X;
(k)α-1アンチトリプシン
(l)HNF1α;
(m)肺に局在するタンパク質、例えば、分泌成分(IgAに結合);
(n)心臓に局在するタンパク質、例えば、HSP27;
(o)皮膚に局在するタンパク質、例えば、ケラチン;
(p)骨特異的タンパク質、例えば、骨形態形成タンパク質(BMPs)例えば、BMP-2、-4、-5、-6、-7(骨形成タンパク質(OP-1)および-8(OP-2)ともいう);
(q)腫瘍特異的タンパク質、例えば、ヒトトロホブラスト抗原、ハーセプチンレセプター、エストロゲンレセプター、カテプシン、例えばカテプシンB(肝臓および脾臓において見られる);
(r)疾患特異的タンパク質、例えば、LAG-3(リンパ球活性化遺伝子)を含む活性化したT細胞上のみに発現された抗原;破骨細胞形成抑制因子(osteoprotegerin)リガンド(OPGL)Nature 402, 304-309, 1999参照;OX40(TNFレセプターファミリーの一員であり、活性化T細胞上に発現され、およびヒトT細胞白血病ウイルスタイプI(HTLV-I)産生細胞において特異的に上方制御されることが知られている共刺激(costimulatory)のみのT細胞分子-J. Immunol. 2000 Jul 1;16561);263-70;CG6512ショウジョウバ(Drosophila)、ヒトパラプレジン(paraplegin)、ヒトFtsH、ヒトAFG3L2、ネズミftsHを含むメタロプロテアーゼ(関節炎/癌に関連する);酸性線維芽細胞増殖因子(FGF- 1), 塩基性線維芽細胞増殖因子 (FGF-2)、血管内皮増殖因子/血管透過性因子(VEGF/VPF)、形質転換成長因子-α(TGF-α)、腫瘍壊死因子-α(TNF-α)、アンギオジェニン、インターロイキン-3(IL-3)、インターロイキン-8(IL-8)、血小板由来内皮増殖因子(PD- ECGF)、胎盤増殖因子(PlGF)、ミッドカイン血小板由来増殖因子-BB(PDGF)、フラクタルカインを含む血管新生因子;
(s)ストレスタンパク質(熱ショックタンパク質);
(t)Fc トランスポート中に含まれるタンパク質;および
(u)ビタミン、例えばB12、ビオチン。
【００８７】
別の態様において、本発明は、有効量の本発明のキメラ抗体またはその抗原結合部分、および1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤または希釈剤を含有する医薬組成物を提供する。
【００８８】
「薬学的に許容される賦形剤または希釈剤」は、任意のおよびすべての溶媒、分散媒体、被覆、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、ならびに生理学的に適合する同様のものを含む。薬学的に許容される担体の例は、1つまたは複数の水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、およびそれらの組合せを含む。多くの場合において、等張剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物中に含むのが好ましい。湿潤剤のような製薬学的に許容可能な物質、または湿潤剤または乳化剤、防腐剤または緩衝剤のような微量の助剤物質を含んでも良い。
【００８９】
用語「有効量」は、特定の疾患もしくは障害、または1つもしくは複数のその症状の処置もしくは改善、および/または疾患もしくは障害の発生の抑制もしくは低減に十分な抗体またはその抗原結合部分(抗体またはその抗原結合部分を含有する医薬組成物を含む)の量をいう。
【００９０】
用語「診断上有効な量」または「診断のための有効量」およびその同義語は、特定の疾患もしくは障害および/または1つもしくは複数のその発現を診断するのに十分な抗体またはその抗原結合部分(抗体またはその抗原結合部分を含有する医薬組成物を含む)の量をいい、診断は、疾患もしくは障害の存在を同定すること、および/または疾患もしくは障害の範囲もしくは重症度を検出することを含む。しばしば、診断は疾患もしくは障害を有しない個体に対して観察される、ベースラインまたはバックグラウンドの検出レベルに関連して実施される。上記バックグラウンドまたはベースラインレベルの検出レベル(上昇した検出レベル)は、存在の指標およびいくつかの場合において状態の重症度を示す。
【００９１】
処置方法および抗体またはその抗原結合部分の使用(抗体またはその抗原結合部分を含有する医薬組成物を含む)に関して用いられる場合、「それらを必要とする」個体は、処置すべき疾患もしくは障害と診断された個体、または疾患もしくは障害について以前に処置された個体であってもよい。診断方法に関して、「それらを必要とする」個体は疾患もしくは障害を有すると疑われるか、疾患もしくは障害の危険性があるか、または以前に疾患もしくは障害と診断された個体であってもよい(例えば、診断は、期間を通しておよび/または治療と連結した疾患もしくは障害の重症度のモニタリング(例えば、進行性/退行性)を含むことができる)。
【００９２】
好ましくはキメラ抗体またはその抗原結合部分は、レセプター機能をブロックもしくは刺激するか、または活性可溶性生成物、例えば、1種または複数種のインターロイキン、TNFまたはC5aを中和するのが好ましい。より好ましくは、活性可溶性生成物はヒトTNF-αである。
【００９３】
組成物は、液体、半固体または固体の投与形態、例えば液体溶液(例えば、注射可能な溶液および注入可能な溶液)、分散体または懸濁液、錠剤、ピル、粉末、リポソームまたは坐薬を含む種々の形態であってもよい。好ましくは、組成物は予防接種用の注射可能な溶液の形態である。投与は、静脈内、皮下、腹膜内、筋肉内、経皮、髄腔内、および動脈内に行うことができる。好ましくは、投与形態は約0.001mgから10mg/kg体重の範囲での、毎日、毎週、2週間もしくは3週間毎、または毎月の投与であり、より好ましくは約0.05から約5mg/kg体重での毎週の投与である。
【００９４】
組成物は、無菌注射溶液調製用の無菌粉末として製剤化されていてもよい。
【００９５】
ある実施形態においては、化合物を急速放出から保護する担体、例えば、移植、経皮パッチ、マイクロカプセル化送達システムを含む放出制御製剤を用いて活性化合物を調製することができる。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸等の相溶性ポリマーを用いることができる。
【００９６】
組成物はまた、経口投与用に製剤化することができる。この実施形態において、抗体は硬質または柔質の外殻ゼラチンカプセル中に封入するか、錠剤中に圧縮するか、または対象の食餌中に直接組み込むことができる。
【００９７】
組成物は直腸投与用に製剤化してもよい。
【００９８】
抗体は、in vitroまたはin vivoで、選択された細胞に結合し、かつ同定するため、またはin vivoで、選択された細胞に結合し、かつ破壊するため、in vivoで、選択された細胞に侵入し、かつ破壊するために投与することができる。代わりに、抗体を免疫性毒として用いることができ、細胞毒性剤、例えば毒性薬もしくは化学療法薬を特定の細胞タイプ、例えば腫瘍細胞に送達することができる。免疫性毒の調製は当業者によく知られている。
【００９９】
免疫毒性を生成するために一般的に使用される細胞毒製剤は、放射性同位元素、例えば111Inまたは90Y、セレン、リボヌクレアーゼ、結合ドメイン欠失切り詰め抗菌毒素、例えばシュードモナスエンドトキシン、またはジフテリア毒素、チューブリンインヒビター、例えばカリケアマイシン（オザガマイシン）、マイタンシノイド（DM-1を含む）、スリスタチン、及びタクソイド、リボソーム不活性化タンパク質、例えばリシン、エブリンI、サポリン、及びゲロニン、及びプロドラッグ、例えばメルファランを含む。
【０１００】
本発明はまた、特定の疾患または障害に関連する抗原を検出するための診断用途におけるキメラ抗体またはその抗原結合部分の使用を提供する。
【０１０１】
より好ましくは、第3の態様によれば、本明細書に記載するように、本発明は、特定の疾患または障害に関連する抗原を有する対象の診断方法において、前記対象に抗体、その抗原結合部分または医薬組成物の診断上の有効量を投与することを含む、キメラ抗体またはその抗原結合部分の使用を提供する。好ましくは対象はヒトである。
【０１０２】
例えば、標識されている抗体またはその抗原結合部分は、生物学的試料、例えば血清または血漿中の抗原の存在、または抗原(例えば、TNF-α)の上昇レベルを、慣用の免疫測定法、例えば酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)、放射免疫測定法(RIA)または組織免疫組織化学(tissue immunohistochemistry)用いて検出するために使用することができる。
【０１０３】
好ましくは、キメラ抗体またはその抗原結合部分に結合する抗原は、癌胎児性抗原、EpCAM、Lewis-Y、Lewis-Y/b、PMSA、CD20、CD30、CD33、CD38、CD52、CD154、EGF-R、Her-2、TRAILおよびVEGFレセプターを含む腫瘍関連抗原;CD3、CD4、CD25、CD40、CD49d、MHCクラスI、MHCクラスII、GM-CSF、インターフェロン-γ、IL-I、IL-12、IL-13、IL-23、TNF-α、およびIgEを含む免疫もしくは炎症疾患または免疫もしくは炎症障害に含まれる抗原;糖タンパク質IIb/IIIa、P-糖タンパク質、プリンレセプターおよびCD11a、CD11b、CD11c、CDl8、CD56、CD58、CD62またはCD144を含有する接着レセプターを含む宿主細胞上に発現される抗原;エオタキシン(eotaxin)、IL-6、IL-8、TGF-β、C3a、C5a、VEGF、NGFおよびそれらのレセプターを含有する、サイトカイン、ケモカイン、成長因子もしくは他の可溶性生理学的調節物質またはそれらのレセプターを含む抗原;β-アミロイドおよびプリオンを含む中枢神経系疾患または障害に含まれる抗原;呼吸器合胞体ウイルスタンパク質F、炭疽毒素、ガラガラヘビ毒、およびジゴキシンを含有する、非ヒト由来抗原、例えば、微生物、ナノ微生物またはウイルスの抗原または毒素からなる抗原から選択される、天然の、ペプチド、タンパク質、炭水化物、糖タンパク質、脂質または糖脂質である抗原に結合し;キメラ抗体は、アゴニストもしくはアンタゴニストとして作用するか、補体もしくはキラー細胞(例えば、NK細胞)の作用により望ましくない細胞(例えば、抗CD4)を減少させる(死滅させるか排除する)ことに対し活性であるか、または細胞毒性薬として活性であるか、または食細胞のFcレセプターと結合するか、もしくはその標的の生物学的活性を中和する。
【０１０４】
本発明による抗ヒトTNF-αキメラ抗体またはその抗原結合部分は、TNF-α活性の阻害が必要な細胞培養用途にも用いることができる。
【０１０５】
本発明はまた、それらを必要とする対象にキメラ抗体またはその抗原結合部分がTNF-αに結合する、本発明に係る医薬組成物を投与することを含む、ヒト対象におけるヒトTNF-α活性により特徴付けられる疾患または障害の処置方法を提供する。
【０１０６】
本明細書で用いる用語「ヒトTNF-α活性により特徴付けられる疾患または障害」は、疾患もしくは障害において、疾患もしくは障害に罹患している対象におけるTNF-αの存在が示されるか、または疾患もしくは障害に関与すると疑われるか、疾患もしくは障害の病態生理学に含まれるか、または疾患もしくは障害を悪化させる因子である、疾患もしくは障害を含むことを意味するものとする。したがって、TNF-α活性が有害な疾患もしくは障害は、TNF-α活性の阻害が疾患もしくは障害の症状および/または進行を緩和すると予測される疾患もしくは障害である。かかる疾患もしくは障害は、例えば、疾患もしくは障害に罹患している対象の生物学的液体中のTNF-αの濃度の上昇により証拠立てることができ(例えば、対象の血清、血漿、関節液等におけるTNF-α濃度の上昇)、例えば、TNF-αに対して特異的な本発明の抗体等を用いて検出することができる。
【０１０７】
ヒトTNF-α活性により特徴付けられる疾患もしくは障害は、疾患もしくは障害に罹患している対象中のTNF-αの存在が、疾患もしくは障害の病態生理に関与するか、または疾患もしくは障害を悪化させる因子であると示されるか、または疑われる疾患もしくは障害を含むことを意味する。好ましくは、ヒトTNF-α活性により特徴付けられる疾患もしくは障害は、敗血性ショック、内毒素性ショック、グラム陰性敗血症および毒素性ショック症候群を含む敗血症;関節リウマチ、リウマチ様脊椎炎、変形性関節症、乾癬および痛風性関節炎、アレルギー、多発性硬化症、自己免疫性糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎およびネフローゼ症候群を含む自己免疫疾患;感染による熱および筋痛症(myalgias)ならびに感染に伴う悪液質を含む感染性疾患;移植片対宿主拒絶反応;腫瘍の増殖または転移;成人呼吸窮迫症候群、ショック肺、慢性炎症性肺疾患、肺サルコイドーシス、肺線維症および珪肺症を含む肺疾患;クローン病および潰瘍性大腸炎を含む炎症性大腸炎;心疾患;炎症性骨疾患、肝炎、凝固障害、熱傷、再かん流傷害、ケロイド形成および瘢痕組織形成からなる群から選択される。
【０１０８】
補助活性化合物を該組成物中に組み込むこともできる。抗体または抗体結合フラグメントは、1種または複数種の追加の治療剤、例えば、サイトカインまたは細胞表面分子または代わりにヒトTNF-αの産生または活性を阻害する1種または複数種の化学剤等の他の標的に結合する抗体を用いて共製剤化されてもよいし、および/または同時に、分離して、連続して投与されてもよい。
【０１０９】
別の態様において、本発明は、治療上有効な量の本発明の抗体またはその抗原結合部分、または治療上有効な量のキメラ抗体またはその抗原結合部分を含有する医薬組成物と、包装および使用説明書とを含むキットを提供する。ある実施形態において、使用説明書は治療上有効な量の本発明のキメラ抗体またはその抗原結合部分を効果的に投与する方法についての説明を含む。
【０１１０】
本明細書を通して、語「含む(comprise)」またはその変形、例えば「含有する(comprises)」もしくは「含有している(comprising)」は、上記の要素、整数もしくは段階、または要素の群、複数の整数もしくは段階を含むが、他の要素、整数もしくは段階、または要素の群、複数の整数もしくは段階を除外しないことを示唆すると理解される。
【０１１１】
本明細書において述べたすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文献のいかなる検討、作用、材料、装置、製品等も専ら本発明についての状況を提供するものである。これらの事項のいかなるまたはすべてのものは、本願の各クレームの優先日より前にオーストラリアまたは他の地において存在する、先行技術の一部を形成し、または本発明に関連する分野における技術常識であることを認めるものではない。
【０１１２】
本発明の性質をより明確に理解するために、それらの好ましい形態を限定されることのない以下の実施例により説明する。
【実施例１】
【０１１３】
マーモセットの可変領域のヒト定常領域への融合
材料および方法
遺伝子合成およびクローニング
MOG特異的マーモセット誘導化抗体のVH鎖(アクセッション番号:AAM54057, 配列番号1)を、ヒト定常領域(ヒトIgGl 重鎖CH1, ヒンジ, CH2 & CH3 ドメイン(NCBIアクセッション番号P01857等)(配列番号2))を用いて発現した。これは、遺伝子最適化技術(Gene Optimizer technology)を用いて哺乳動物細胞の発現を最適化し、および合成オリゴヌクレオチド(GeneArt, ドイツ)の組合せにより新たに(de novo)合成されたDNA配列にアミノ酸配列を逆翻訳することにより達成した。DNA配列を最適化する際に、特定の制限酵素の部位Asc fおよびTth l 111を、VH領域のさらなる操作を可能にするために含有した。遺伝子合成の後に、Kozak配列を含むすべての配列をpEE6.4 GS付属ベクター(Lonza Biologies)の多重クローニング部位中にクローン化した。MOG特異的マーモセット誘導化抗体のVL鎖(アクセッション番号:AAM54058, 配列番号3)は、ヒトカッパ軽鎖定常領域(NCBI アクセッション番号AAA58989等)(配列番号4)により発現した。軽鎖(VLカッパ)アミノ酸配列をコードするDNAは、上記の重鎖と同様に調製した。DNA配列の最適化および合成の際に、特定の制限酵素の部位Bsi WI/Rsr IIを、VL領域のさらなる操作を可能にするために含有した。遺伝子合成の後に、Kozak配列を含むすべての配列をpEE12.4 GS発現ベクター(Lonza Biologies)の多重クローニング部位中にクローン化した。安定した発現のために、2つの単一の遺伝子ベクター(pEE6.4- VH-IgG1およびpEE12.4-VL-Kappa)を組み合わせて二重遺伝子ベクターとした。これは、Not IおよびBamH Iを用い、pEE6.4骨格からの重鎖発現カセット(hCMV-MIE プロモーター, Kozak配列, マーモセットVH, ヒト定常領域およびSV40 polyA部位)を消化することにより行った。得られたフラグメントをNot IおよびBamH I部位を用い、AB 138(配列番号5および6)の重鎖および軽鎖の両方を発現するベクターを作製する、軽鎖発現カセット(hCMV-MIEプロモーター、Kozak配列、マーモセットVL、ヒトカッパ定常領域およびSV40 polyA部位)のpEE12.4-VL-カッパベクター下流中にサブクローン化した。
【０１１４】
トランスフェクション
各トランスフェクションについて、175μlのリポフェクトアミン2000を6ウェルプレートのウェル中の5mLのOptimem I媒体に加えた(Invitrogen カタログ番号, 11668-027および31985-062)。2番目のウェル中の70μlの発現ベクター(70μg)を5mLのOptimem I媒体に加えた。室温で5分間のインキュベーション後、2つのウェル中の内容物を互いに混合し、さらに20分間のインキュベーションを行った。この2番目のインキュベーションの後、全体のトランスフェクション混合物をCHOK1SV細胞を含有するT175組織培養フラスコに加えた。細胞を72から96時間インキュベートし、上清を採取した。上清を4000×gで5分間遠心分離し、ペレット状の細胞残屑とし、0.22μmのカートリッジフィルターを通して無菌ろ過した。
【０１１５】
抗体精製
上清をHiTrapプロテインAカラム(Amersham Biosciences, カタログ番号: 17-0402-01)に流速1mL/分で3回通した。次に、カラムを20mMのリン酸ナトリウムにより1mL/分で40分間洗浄した。集めたフラクションを用いて抗体を0.1Mのクエン酸pH3.5で溶出させ、直ちに1Mのトリス-HCl pH9.0で中和した。次に、抗体試料をPD-10カラム(Amersham Biosciences, カタログ番号: 17-0851-01)で脱塩した。SDS-PAGEおよびサイズ排除HPLCによる抗体の分析により、正しい分子量、組み立てられた抗体の存在および抗体の濃度を確認した。
【０１１６】
ウェスタンブロット分析
M26抗原、ラットMOG(ミエリン-オリゴデンドロサイト糖タンパク質)への結合を保持するためのAB138の能力をウェスタンブロットにより試験した。130mgのラット脊髄(IMVS、オーストラリア)を1.8mlのCelLytic M 細胞溶解試薬(SIGMA, C2978)中でホモジナイズし、4℃で30分間インキュベートした。さらに、溶解物を27g 1/2針で数回引き、次いで4℃、13000gで30分間遠心分離することによりホモジナイズした。ペレットおよび上清をSDS-PAGE試料緩衝液(125mMトリス-HCl pH6.8,5%SDS,0.25%ブロモフェノールブルー,25%グリセロール)中に希釈した。これとともに、200μlのCHOKISV細胞を1ml当り1×106個の生細胞において、13000×g、4℃で1分間遠沈し、200μlのCelLytic M 細胞溶解試薬(SIGMA)中に再懸濁させた。4℃および13000×gで30分間遠心分離した後、上清を適当量のSDS-PAGE試料緩衝液と混合した。すべての試料を、試料の分子量マーカーの試料とともに4〜20%のNovex pre-castゲル(Invitrogen, オーストラリア)に120Vで2時間流した。次に、ウェスタンブロット装置を用い、20%のメタノールを含む1×トリス-グリシン緩衝液(BioRad, Cat 161+-0771)中、4℃、250mAで2時間、タンパク質をPVDF(BioRad, オーストラリア)に転写した。膜を5%のスキムミルク粉末を含有するPBSを用い、室温で1時間インキュベーションすることによりブロックした。次に、膜を1×PBSで3回洗浄し、AB138を10μg/mL含有するPBSを用い、4℃で一晩インキュベーションした。洗浄後1×PBSで1:5000に希釈された、ヤギ抗ヒトIgG(H+L)HRPコンジュゲート(conjugate)(Sigma, オーストラリア)を用いて膜を室温で1時間インキュベーションした。洗浄後、結合した抗体をECLウェスタンブロット分析システム(Amersham Biosciences Cat: RPN2109)を用いて検出した。非特異的結合事象を同定するため、AB138をアイソタイプが一致した、特異性のない陰性対照抗体(抗TNFαモノクローナル抗体)と置き換えて平行実験を行った。
【０１１７】
結果
タンパク質発現および精製を行った後、AB138についてウェスタンブロット分析を実施し、ラットMOGに対する結合親和性が保持されているか否かを測定した。AB138は、ラット脊髄の澄明な(cleared)溶解物中に存在する約25kDaのサイズのタンパク質に結合し、CHOKISVの澄明な溶解物中に存在しないタンパク質と結合した(図1)。陰性対照抗体は、いずれの溶解物の存在するタンパク質にも結合せず、AB138と25kDaのサイズを有するタンパク質との間の相互作用が、ヒト定常領域に関連する人工物または非特異的結合物に関係しないことを示した(図2)。このタンパク質は、単一の配列(24.9kDa)を差し引いたラットMOGの予測されたサイズと一致する。この結果は、ラットMOGに対する親和性を保持したAB138がラット脊髄溶解物中に存在し、マーモセットヒト融合抗体が抗原結合能を保持できることを示す。
【０１１８】
組換えDNA技術、およびELISA、Biacore分析等の結合分析において測定される、ラットMOGに結合するAB138の能力を用いてラットMOGが製造できることは、当業者により理解され得る。
【実施例２】
【０１１９】
ドメイン抗体のCDR2置換
標準的な組換えDNA法を使用して、アクセプター抗TNF-αドメイン抗体(Basran等, WO 2004/081026；配列番号7；図3)のCDR2を、ドナー新世界霊長類イムノグロブリン由来のCDR2で置換することにより、部分的に加工されたドメイン抗体を生産できる。
【０１２０】
Kabat(Sequences of Proteins of Immunological Intcrest, H. Kabat等, U.S. Department of Health and Human Services, 1983)の規則を適用し、CDR2は、アクセプター抗TNF-αドメイン抗体上で同定される(SASELQS)。次いで、ドメイン抗体アクセプター配列を、新世界霊長類イムノグロブリン配列のパネルに対して並べる。これらの配列は、Maヨザル(Aotus Nancymaac)（配列番号8-18）及び一般的なマーモセット(Callithrix jacchus)（配列番号19-24）から由来する（図4）。アクセプターCDR2配列のものとは異なる新世界霊長類イムノグロブリンのCDR2配列は、SASTLQT、DASSLQP、GASTRAT、KVSNRAS、RVSNRAS、KVSTRGP、AASNRAS、TSSNLQA、KASTLQS、AASTLQS、YASSLQS、YASFLQGとして同定できる（表1）。これらのドナー新世界霊長類CDR2配列のそれぞれについてのBLAST分析(http://www.neci.nlm.nih.gov/BLAST)を実施し、非とイムノグロブリン配列に正確にマッチする配列を除去する。新世界霊長類に独特の配列は、KVSNRAS、RVSNRAS、KVSTRGP、AASNRAS、TSSNLQA、DASSLQP、YASFLQGであった(表1)。
【０１２１】
【表１】
2009504686.tif 000002
【０１２２】
アクセプターCDR2と潜在的なドナーCDR2を、全ての対立遺伝子の１％閾値分析を使用して、MHCクラスII結合予測プログラムPropred(http://www.imtech.rcs.in/raghavu/propred)により、ヒトにおけるその予測される免疫原性について調べた。この分析から、アクセプターCDR2であるSASELQSは、１１の対立遺伝子(DRB1_0306、DRB1_0307、DRB1_0308、DRB1_0311、DRB1_0401、DRB1_0426、DRB1_0806、DRB1_0813、DRB1_1501、DRB1_1502、DRB1_1506)によってコードされるMHCクラスIIを結合すると予測されるペプチドLIYSASELQの一部を形成する。ドナーCRD2配列KVSNRASは、９の対立遺伝子(DRB1_0309、DRB1_0402、DRB1_0802、DRB1_0804、DRB1_0806、DRB1_0813、DRB1_1301、DRB1_1327、DRB1_1328)によってコードされるMHCクラスIIを結合すると予測される配列LIYKVSNRASの一部を形成する。ドナーCDR2配列AASNRASは、６の対立遺伝子(DRB1_0402、DRB1_0404、DRB1_0408、DRB1_0423、DRB1_0813、DRB1_1506)によってコードされるMHCクラスIIを結合すると予測される配列LIYAASNRAの一部を形成する。ドナーCDR2配列TSSNLQAは、１０の対立遺伝子(DRB1_0401、DRB1_0402、DRB1_0404、DRB1_0410、DRB1_0423、DRB1_0426、DRB1_0813、DRB1_1501、DRB1_1502、DRB1_1506)によってコードされるMHCクラスIIを結合すると予測される配列LIYTSSNLQAの一部を形成する。ドナーCDR2配列KVSTRGPは、８の対立遺伝子(DRB1_0309、DRB1_0802、DRB1_0804、DRB1_0806、DRB1_0813、DRB1_1301、DRB1_1327、DRB1_1328)によってコードされるMHCクラスIIを結合すると予測される配列LLIYKVSTRの一部を形成する。それ故アクセプターCDR2は、KVSNRAS、AASNRAS、TSSNLQA、及びKVSTRGPを含む、低いと予測される免疫原性のドナーCDR2で置換できる。
【０１２３】
組換えDNA法を使用して、アクセプターCDR2はドナーCDR2配列で置換され、部分的に操作されたドメイン抗体（配列番号25-31）を生成する。組換えDNA法の例としては、Winter等（米国特許第5,225,539号）によって記載されたものを含み、部位指向的ミュータジェネシス及びオリゴアニリングのような方法を含むがこれらに制限されない。ドメイン抗体のタンパク質発現は、pET21d(+)（Novagen,Germany）のような発現のための適切なベクターを使用して、大腸菌BL21(DE3)pLys（Novagen,Germany）で実施でき、またはBasran等(WO 2004/081026)に記載されたもののような当業者に既知の他の方法によって実施できる。細菌細胞溶解に引き続き、ドメイン抗体は、プロテインL（Pierce,USA）を使用して精製される。
【０１２４】
精製に引き続き、操作されたドメイン抗体を、L929中和アッセイ、またはTNFαレセプターI結合アッセイのような当業者に既知の方法によって、TNFα結合能力の維持について分析する。
【０１２５】
操作されたドメイン抗体の結合親和性の改良のために、親和性成熟を、CDR2を取り囲んで安定化するフレームワーク残基のアミノ酸置換によって、または当業者に既知の他の方法によって実施できる（Winter等, US 5,225,539；Griffiths等, US 5,885,793；Rajpal, A等, 2005 A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using comninatorial libraries, Proc Natl Acad Sci USA 102(24) 8466-71；Irving R.A.等, (2001) Ribosome display and affinity maturation: from antibodies to single V-domains and steps towards cancer therapeutics, Journal of Immunological Methods, 248: 31-45）。
【０１２６】
数多くの変形及び/または修正が、広く記載された本発明の精神または範囲から離れることなく、特定の実施態様で示された本発明に実施されて良いことは、当業者に予測されるであろう。それ故、本発明の実施態様は、全ての点で説明のためのものであり、制限的なものではないと考慮されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】AB138とラット脊髄溶解物(レーン2)中に存在するラットMOGとの結合およびCHOKlSV溶解物(レーン3)中に存在するラットMOGとの非結合を示す図である。レーン1は分子量マーカーを含有する。
【図２】同一の試料のラット脊髄溶解物(レーン2)およびCHOKlSV溶解物(レーン3)中に存在するラットMOGに対する抗TNFαモノクローナル抗体の非特異的結合の欠如を示す図である。レーン1は分子量マーカーを含有する。
【図３】アクセプタードメイン抗体アミノ酸及びヌクレオチド配列（両鎖）を示す図である。CDR2を含む領域を摘出するKpnI及びSanDIの制限切断部位が図に示されている。CDR2残基は下線で示されている。
【図４】AlignX(Vector NTJ, Invitrogen, Australia)を使用して実施された新世界霊長類イムノグロブリン配列のパネルを使用するドメイン抗体アクセプター配列のアライメントを示す図である。CDR2は太字で強調されている。
【図１】
2009504686.tif 000003
【図２】
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【図３】
2009504686.tif 000005
【図４】
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【配列表】
2009504686000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成20年4月17日(2008.4.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
選択される新世界霊長類CDRはCDR2であることが好ましい。CDR2配列は、KVSNRAS（配列番号32）、RVSNRAS（配列番号33）、KVSTRGP（配列番号34）、AASNRAS（配列番号35）、TSSNLQA（配列番号36）、DASSLQP（配列番号37）、及びYASFLQG（配列番号38）から選択される。特に好ましい配列は、その予測されるより低い免疫原性のため、KVSNRAS、AASNRAS、TSSNLQA、及びKVSTRGPである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２０】
Kabat(Sequences of Proteins of Immunological Intcrest, H. Kabat等, U.S. Department of Health and Human Services, 1983)の規則を適用し、CDR2は、アクセプター抗TNF-αドメイン抗体上で同定される(SASELQS（配列番号39）)。次いで、ドメイン抗体アクセプター配列を、新世界霊長類イムノグロブリン配列のパネルに対して並べる。これらの配列は、Maヨザル(Aotus Nancymaac)（配列番号8-18）及び一般的なマーモセット(Callithrix jacchus)（配列番号19-24）から由来する（図4）。アクセプターCDR2配列のものとは異なる新世界霊長類イムノグロブリンのCDR2配列は、SASTLQT（配列番号40）、DASSLQP、GASTRAT（配列番号41）、KVSNRAS、RVSNRAS、KVSTRGP、AASNRAS、TSSNLQA、KASTLQS（配列番号42）、AASTLQS（配列番号43）、YASSLQS（配列番号44）、YASFLQG（配列番号45）として同定できる（表1）。これらのドナー新世界霊長類CDR2配列のそれぞれについてのBLAST分析(http://www.neci.nlm.nih.gov/BLAST)を実施し、非とイムノグロブリン配列に正確にマッチする配列を除去する。新世界霊長類に独特の配列は、KVSNRAS、RVSNRAS、KVSTRGP、AASNRAS、TSSNLQA、DASSLQP、YASFLQGであった(表1)。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２２】
アクセプターCDR2と潜在的なドナーCDR2を、全ての対立遺伝子の１％閾値分析を使用して、MHCクラスII結合予測プログラムPropred(http://www.imtech.rcs.in/raghavu/propred)により、ヒトにおけるその予測される免疫原性について調べた。この分析から、アクセプターCDR2であるSASELQSは、１１の対立遺伝子(DRB1_0306、DRB1_0307、DRB1_0308、DRB1_0311、DRB1_0401、DRB1_0426、DRB1_0806、DRB1_0813、DRB1_1501、DRB1_1502、DRB1_1506)によってコードされるMHCクラスIIを結合すると予測されるペプチドLIYSASELQ（配列番号46）の一部を形成する。ドナーCRD2配列KVSNRASは、９の対立遺伝子(DRB1_0309、DRB1_0402、DRB1_0802、DRB1_0804、DRB1_0806、DRB1_0813、DRB1_1301、DRB1_1327、DRB1_1328)によってコードされるMHCクラスIIを結合すると予測される配列LIYKVSNRAS（配列番号47）の一部を形成する。ドナーCDR2配列AASNRASは、６の対立遺伝子(DRB1_0402、DRB1_0404、DRB1_0408、DRB1_0423、DRB1_0813、DRB1_1506)によってコードされるMHCクラスIIを結合すると予測される配列LIYAASNRA（配列番号48）の一部を形成する。ドナーCDR2配列TSSNLQAは、１０の対立遺伝子(DRB1_0401、DRB1_0402、DRB1_0404、DRB1_0410、DRB1_0423、DRB1_0426、DRB1_0813、DRB1_1501、DRB1_1502、DRB1_1506)によってコードされるMHCクラスIIを結合すると予測される配列LIYTSSNLQA（配列番号49）の一部を形成する。ドナーCDR2配列KVSTRGPは、８の対立遺伝子(DRB1_0309、DRB1_0802、DRB1_0804、DRB1_0806、DRB1_0813、DRB1_1301、DRB1_1327、DRB1_1328)によってコードされるMHCクラスIIを結合すると予測される配列LLIYKVSTR（配列番号50）の一部を形成する。それ故アクセプターCDR2は、KVSNRAS、AASNRAS、TSSNLQA、及びKVSTRGPを含む、低いと予測される免疫原性のドナーCDR2で置換できる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2009504686000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成20年5月8日(2008.5.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２０】  Kabat(Sequences of Proteins of Immunological Intcrest, H. Kabat等, U.S. Department of Health and Human Services, 1983)の規則を適用し、CDR2は、アクセプター抗TNF-αドメイン抗体上で同定される(SASELQS（配列番号39）)。次いで、ドメイン抗体アクセプター配列を、新世界霊長類イムノグロブリン配列のパネルに対して並べる。これらの配列は、Maヨザル(Aotus Nancymaac)（配列番号8-18）及び一般的なマーモセット(Callithrix jacchus)（配列番号19-24）から由来する（図4）。アクセプターCDR2配列のものとは異なる新世界霊長類イムノグロブリンのCDR2配列は、SASTLQT（配列番号40）、DASSLQP、GASTRAT（配列番号41）、KVSNRAS、RVSNRAS、KVSTRGP、AASNRAS、TSSNLQA、KASTLQS（配列番号42）、AASTLQS（配列番号43）、YASSLQS（配列番号44）、YASFLQGとして同定できる（表1）。これらのドナー新世界霊長類CDR2配列のそれぞれについてのBLAST分析(http://www.neci.nlm.nih.gov/BLAST)を実施し、非とイムノグロブリン配列に正確にマッチする配列を除去する。新世界霊長類に独特の配列は、KVSNRAS、RVSNRAS、KVSTRGP、AASNRAS、TSSNLQA、DASSLQP、YASFLQGであった(表1)。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２２】  アクセプターCDR2と潜在的なドナーCDR2を、全ての対立遺伝子の１％閾値分析を使用して、MHCクラスII結合予測プログラムPropred(http://www.imtech.rcs.in/raghavu/propred)により、ヒトにおけるその予測される免疫原性について調べた。この分析から、アクセプターCDR2であるSASELQSは、１１の対立遺伝子(DRB1_0306、DRB1_0307、DRB1_0308、DRB1_0311、DRB1_0401、DRB1_0426、DRB1_0806、DRB1_0813、DRB1_1501、DRB1_1502、DRB1_1506)によってコードされるMHCクラスIIを結合すると予測されるペプチドLIYSASELQ（配列番号45）の一部を形成する。ドナーCRD2配列KVSNRASは、９の対立遺伝子(DRB1_0309、DRB1_0402、DRB1_0802、DRB1_0804、DRB1_0806、DRB1_0813、DRB1_1301、DRB1_1327、DRB1_1328)によってコードされるMHCクラスIIを結合すると予測される配列LIYKVSNRAS（配列番号46）の一部を形成する。ドナーCDR2配列AASNRASは、６の対立遺伝子(DRB1_0402、DRB1_0404、DRB1_0408、DRB1_0423、DRB1_0813、DRB1_1506)によってコードされるMHCクラスIIを結合すると予測される配列LIYAASNRA（配列番号47）の一部を形成する。ドナーCDR2配列TSSNLQAは、１０の対立遺伝子(DRB1_0401、DRB1_0402、DRB1_0404、DRB1_0410、DRB1_0423、DRB1_0426、DRB1_0813、DRB1_1501、DRB1_1502、DRB1_1506)によってコードされるMHCクラスIIを結合すると予測される配列LIYTSSNLQA（配列番号48）の一部を形成する。ドナーCDR2配列KVSTRGPは、８の対立遺伝子(DRB1_0309、DRB1_0802、DRB1_0804、DRB1_0806、DRB1_0813、DRB1_1301、DRB1_1327、DRB1_1328)によってコードされるMHCクラスIIを結合すると予測される配列LLIYKVSTR（配列番号49）の一部を形成する。それ故アクセプターCDR2は、KVSNRAS、AASNRAS、TSSNLQA、及びKVSTRGPを含む、低いと予測される免疫原性のドナーCDR2で置換できる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２７】
【図１】AB138とラット脊髄溶解物(レーン2)中に存在するラットMOGとの結合およびCHOKlSV溶解物(レーン3)中に存在するラットMOGとの非結合を示す図である。レーン1は分子量マーカーを含有する。
【図２】同一の試料のラット脊髄溶解物(レーン2)およびCHOKlSV溶解物(レーン3)中に存在するラットMOGに対する抗TNFαモノクローナル抗体の非特異的結合の欠如を示す図である。レーン1は分子量マーカーを含有する。
【図３】アクセプタードメイン抗体アミノ酸（配列番号17）及びヌクレオチド配列（両鎖（配列番号50及び51））を示す図である。CDR2を含む領域を摘出するKpnI及びSanDIの制限切断部位が図に示されている。CDR2残基は下線で示されている。
【図４】AlignX(Vector NTJ, Invitrogen, Australia)を使用して実施された新世界霊長類イムノグロブリン配列のパネルを使用するドメイン抗体アクセプター配列のアライメントを示す図である。CDR2は太字で強調されている。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2009504686000001.app
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
2009504686.tif 000007
【国際調査報告】
2009504686.tif 000008