(57)【要約】  メラノサイト刺激ホルモン活性を持っているペプチドが、提供されている。これらのペプチドをコード化しているベクター、および、これら上のベクターを含んでいる遺伝子導入（トランスジェニック）細胞も、提供されている。加えて、哺乳類細胞からの炎症サイトカインの放出を抑制もしくは予防する方法が、提供されており、同様に、炎症サイトカインカスケードにより媒介された病状を患っているかもしくはリスクのある哺乳類を処置する方法が、提供されている。更に、哺乳類における炎症サイトカインレベルを抑制する方法、体重オーバー（オーバーウェイト）の哺乳類を処置する方法、哺乳類における食物摂取を減らす方法、ならびに、哺乳類消化器系における先天免疫を阻害する方法が、提供されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
６８０未満のアミノ酸もしくは模倣体の単離精製ペプチドであって、該ペプチドが、Ｅ．ｃｏｌｉの配列ＩＤ番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１４を持っているＥＦ−Ｇのアミノ酸６７１〜７０３に対応している、天然起源延長因子−Ｇ（ＥＦ−Ｇ）の３３アミノ酸もしくは模倣体を含んでいる、ペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドが、哺乳類メラノコルチン受容体を活性化させる、請求項１のペプチド。
【請求項３】
前記哺乳類メラノコルチン受容体が、メラノコルチン−１受容体である、請求項２のペプチド。
【請求項４】
前記哺乳類メラノコルチン受容体が、メラノコルチン−４受容体である、請求項２のペプチド。
【請求項５】
前記哺乳類メラノコルチン受容体が、メラノコルチン−３受容体である、請求項２のペプチド。
【請求項６】
前記ペプチドが、原核生物ＥＦ−Ｇ由来である、請求項１のペプチド。
【請求項７】
前記ペプチドが、真核生物ＥＦ−Ｇ由来である、請求項１のペプチド。
【請求項８】
前記ペプチドが、１００未満のアミノ酸もしくは模倣体からなる、請求項１のペプチド。
【請求項９】
前記ペプチドが、３３アミノ酸もしくは模倣体からなる、請求項１のペプチド。
【請求項１０】
前記ペプチドが、配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：４、配列ＩＤ番号：５、配列ＩＤ番号：６、配列ＩＤ番号：７、配列ＩＤ番号：８、配列ＩＤ番号：９、配列ＩＤ番号：１０、配列ＩＤ番号：１１、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１５、配列ＩＤ番号：１６、もしくは配列ＩＤ番号：１７を含む、請求項１のペプチド。
【請求項１１】
前記ペプチドが、配列ＩＤ番号：１を含む、請求項１のペプチド。
【請求項１２】
前記ペプチドが、配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：４、配列ＩＤ番号：５、配列ＩＤ番号：６、配列ＩＤ番号：７、配列ＩＤ番号：８、配列ＩＤ番号：９、配列ＩＤ番号：１０、配列ＩＤ番号：１１、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１５、配列ＩＤ番号：１６、もしくは配列ＩＤ番号：１７からなる、請求項１のペプチド。
【請求項１３】
配列ＩＤ番号：１からなる、請求項１のペプチド。
【請求項１４】
６８０未満のアミノ酸もしくは模倣体の単離精製ペプチドであって、該ペプチドが、配列ＩＤ番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２を持っている３３アミノ酸もしくは模倣体を含んでいる、ペプチド。
【請求項１５】
配列ＩＤ番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１８を持っている３３アミノ酸もしくは模倣体を含んでいる、請求項１４のペプチド。
【請求項１６】
前記ペプチドが、哺乳類メラノコルチン受容体を活性化させる、請求項１４のペプチド。
【請求項１７】
前記哺乳類メラノコルチン受容体が、メラノコルチン−１受容体である、請求項１４のペプチド。
【請求項１８】
前記哺乳類メラノコルチン受容体が、メラノコルチン−４受容体である、請求項１４のペプチド。
【請求項１９】
前記哺乳類メラノコルチン受容体が、メラノコルチン−３受容体である、請求項１４のペプチド。
【請求項２０】
前記ペプチドが、１００未満のアミノ酸もしくは模倣体からなる、請求項１４のペプチド。
【請求項２１】
前記ペプチドが、３３アミノ酸もしくは模倣体からなる、請求項１４のペプチド。
【請求項２２】
前記ペプチドが、配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：４、配列ＩＤ番号：５、配列ＩＤ番号：６、配列ＩＤ番号：７、配列ＩＤ番号：８、配列ＩＤ番号：９、配列ＩＤ番号：１０、配列ＩＤ番号：１１、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１５、配列ＩＤ番号：１６、もしくは配列ＩＤ番号：１７を含む、請求項１４のペプチド。
【請求項２３】
前記ペプチドが、配列ＩＤ番号：１を含む、請求項１４のペプチド。
【請求項２４】
前記ペプチドが、配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：４、配列ＩＤ番号：５、配列ＩＤ番号：６、配列ＩＤ番号：７、配列ＩＤ番号：８、配列ＩＤ番号：９、配列ＩＤ番号：１０、配列ＩＤ番号：１１、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１５、配列ＩＤ番号：１６、もしくは配列ＩＤ番号：１７からなる、請求項１４のペプチド。
【請求項２５】
配列ＩＤ番号：１からなる、請求項１４のペプチド。
【請求項２６】
請求項２もしくは１６のペプチドをコード化している、ベクター。
【請求項２７】
哺乳類細胞を感染させられる、請求項２６のベクター。
【請求項２８】
前記ベクターが、ウィルスベクターである、請求項２６のベクター。
【請求項２９】
請求項２６のベクターを含んでいる、遺伝子導入（トランスジェニック）細胞。
【請求項３０】
原核生物である、請求項２９の細胞。
【請求項３１】
前記原核細胞が、哺乳類の腸において居住するよう適合されている、請求項３０の原核細胞。
【請求項３２】
前記原核細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項３１の原核細胞。
【請求項３３】
哺乳類細胞からの炎症サイトカインの放出を抑制もしくは予防していく方法であって、該方法が、該細胞を、請求項２もしくは１６のペプチドと、該炎症サイトカイン放出を抑制もしくは予防するに充分な様式で、接触させていくことを含んでいる、方法。
【請求項３４】
前記炎症サイトカインが、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン（ＩＬ）−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１８、もしくはＨＭＧＢ１である、請求項３３の方法。
【請求項３５】
前記炎症サイトカインが、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、もしくはＨＭＧＢ−１である、請求項３４の方法。
【請求項３６】
前記細胞が、マクロファージである、請求項３３の方法。
【請求項３７】
前記ペプチドが、前記細胞を、請求項２６のベクターと接触させていくことにより投与されている、請求項３３の方法。
【請求項３８】
前記細胞が、生存哺乳類中においてある、請求項３３の方法。
【請求項３９】
前記哺乳類が、炎症サイトカインカスケードにより媒介された病状を持つ、請求項３８の方法。
【請求項４０】
前記病状が、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、もしくは十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性、偽膜性、急性、もしくは虚血性大腸炎、腸閉塞、憩室炎、喉頭蓋炎、無弛緩症、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、クローン病、腸管炎、ホウィップル病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合疾患、臓器虚血、再灌流障害、臓器壊死、枯草熱、敗血症、敗血、内毒素ショック、悪液質、超高熱、好酸球肉芽腫、肉芽腫症、類肉腫症、敗血症流産、副睾丸炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、気腫、鼻炎、膵嚢胞性繊維症、肺炎、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、インフルエンザ、気道多核ウィルス感染、ヘルペス感染、ＨＩＶ感染、Ｂ型肝炎ウィルス感染、Ｃ型肝炎ウィルス感染、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、糸状虫症、アメーバ症、包虫嚢胞、火傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日焼け、蕁麻疹、疣、蕁麻疹、血管炎、脈管炎、心内膜炎、動脈炎、粥状（アテローム）硬化症、血栓性静脈炎、心膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リューマチ熱、アルツハイマー病、腹腔病、鬱血性心不全、成人呼吸困難症候群、髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、脳梗塞、脳塞栓症、ギラン・バレー症候群、神経炎、神経痛、脊髄障害、麻痺、葡萄膜炎、関節炎、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、リューマチ関節炎、滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎、全身エリテマトーデス狼瘡、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、移植拒絶、移植対宿主病、Ｉ型糖尿病、強直性脊椎炎、ＩＩ型糖尿病、強直性脊椎炎、バージャー病、ルティエ症候群、およびホジキン病である、請求項３９の方法。
【請求項４１】
前記病状が、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、もしくは十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性、偽膜性、急性、および虚血性大腸炎、肝炎、クローン病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、臓器虚血、再灌流障害、臓器壊死、枯草熱、敗血症、敗血、内毒素ショック、悪液質、敗血症流産、播種性菌血症、火傷、アルツハイマー病、腹腔病、鬱血性心不全、成人呼吸困難症候群、脳梗塞、脳塞栓症、脊髄障害、麻痺、移植拒絶、あるいは移植対宿主病である、請求項３９の方法。
【請求項４２】
前記病状が、敗血症、敗血、もしくは内毒素ショックである、請求項３９の方法。
【請求項４３】
前記病状が、敗血症、敗血、もしくは内毒素ショック、消化性潰瘍、胃潰瘍、もしくは十二指腸潰瘍、潰瘍性、偽膜性、急性、もしくは虚血性大腸炎、腸閉塞、憩室炎、喉頭蓋炎、無弛緩症、胆管炎、胆嚢炎、クローン病、腸管炎、あるいはホウィップル病である、請求項３９の方法。
【請求項４４】
前記哺乳類が、ヒトである、請求項３８の方法。
【請求項４５】
炎症サイトカインカスケードにより媒介された病状を患っている哺乳類を処置していく方法であって、該方法が、請求項２もしくは１６のペプチドを、該哺乳類に、該炎症サイトカインカスケードを抑制するに充分な様式で、投与していくことを含んでいる、方法。
【請求項４６】
ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１８、もしくはＨＭＧＢ１レベルが、前記哺乳類において抑制されている、請求項４５の方法。
【請求項４７】
ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、もしくはＨＭＧＢ１レベルが、前記哺乳類において抑制されている、請求項４５の方法。
【請求項４８】
前記病状が、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、もしくは十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性、偽膜性、急性、もしくは虚血性大腸炎、腸閉塞、憩室炎、喉頭蓋炎、無弛緩症、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、クローン病、腸管炎、ホウィップル病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合疾患、臓器虚血、再灌流障害、臓器壊死、枯草熱、敗血症、敗血、内毒素ショック、悪液質、超高熱、好酸球肉芽腫、肉芽腫症、類肉腫症、敗血症流産、副睾丸炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、気腫、鼻炎、膵嚢胞性繊維症、肺炎、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、インフルエンザ、気道多核ウィルス感染、ヘルペス感染、ＨＩＶ感染、Ｂ型肝炎ウィルス感染、Ｃ型肝炎ウィルス感染、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、糸状虫症、アメーバ症、包虫嚢胞、火傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日焼け、蕁麻疹、疣、蕁麻疹、血管炎、脈管炎、心内膜炎、動脈炎、粥状（アテローム）硬化症、血栓性静脈炎、心膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リューマチ熱、アルツハイマー病、腹腔病、鬱血性心不全、成人呼吸困難症候群、髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、脳梗塞、脳塞栓症、ギラン・バレー症候群、神経炎、神経痛、脊髄障害、麻痺、葡萄膜炎、関節炎、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、リューマチ関節炎、滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎、全身エリテマトーデス狼瘡、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、移植拒絶、移植対宿主病、Ｉ型糖尿病、強直性脊椎炎、ＩＩ型糖尿病、強直性脊椎炎、バージャー病、ルティエ症候群、およびホジキン病である、請求項４５の方法。
【請求項４９】
前記病状が、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、もしくは十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性、偽膜性、急性、および虚血性大腸炎、肝炎、クローン病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、臓器虚血、再灌流障害、臓器壊死、枯草熱、敗血症、敗血、内毒素ショック、悪液質、敗血症流産、播種性菌血症、火傷、アルツハイマー病、腹腔病、鬱血性心不全、成人呼吸困難症候群、脳梗塞、脳塞栓症、脊髄障害、麻痺、移植拒絶、あるいは移植対宿主病である、請求項４５の方法。
【請求項５０】
前記病状が、敗血症、敗血、もしくは内毒素ショックである、請求項４５の方法。
【請求項５１】
前記病状が、敗血症、敗血、もしくは内毒素ショック、消化性潰瘍、胃潰瘍、もしくは十二指腸潰瘍、潰瘍性、偽膜性、急性、もしくは虚血性大腸炎、腸閉塞、憩室炎、喉頭蓋炎、無弛緩症、胆管炎、胆嚢炎、クローン病、腸管炎、あるいはホウィップル病である、請求項４５の方法。
【請求項５２】
前記哺乳類が、ヒトである、請求項４５の方法。
【請求項５３】
炎症サイトカインカスケードにより媒介された病状に関するリスクにある哺乳類を処置していく方法であって、該方法が、請求項２もしくは１６のペプチドを、該哺乳類に、該炎症サイトカインカスケードを抑制するに充分な様式で、投与していくことを含んでいる、方法。
【請求項５４】
ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１８、もしくはＨＭＧＢ１が、前記哺乳類において抑制されている、請求項５３の方法。
【請求項５５】
ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、もしくはＨＭＧＢ１が、前記哺乳類において抑制されている、請求項５３の方法。
【請求項５６】
前記病状が、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、もしくは十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性、偽膜性、急性、もしくは虚血性大腸炎、腸閉塞、憩室炎、喉頭蓋炎、無弛緩症、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、クローン病、腸管炎、ホウィップル病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合疾患、臓器虚血、再灌流障害、臓器壊死、枯草熱、敗血症、敗血、内毒素ショック、悪液質、超高熱、好酸球肉芽腫、肉芽腫症、類肉腫症、敗血症流産、副睾丸炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、気腫、鼻炎、膵嚢胞性繊維症、肺炎、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、インフルエンザ、気道多核ウィルス感染、ヘルペス感染、ＨＩＶ感染、Ｂ型肝炎ウィルス感染、Ｃ型肝炎ウィルス感染、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、糸状虫症、アメーバ症、包虫嚢胞、火傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日焼け、蕁麻疹、疣、蕁麻疹、血管炎、脈管炎、心内膜炎、動脈炎、粥状（アテローム）硬化症、血栓性静脈炎、心膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リューマチ熱、アルツハイマー病、腹腔病、鬱血性心不全、成人呼吸困難症候群、髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、脳梗塞、脳塞栓症、ギラン・バレー症候群、神経炎、神経痛、脊髄障害、麻痺、葡萄膜炎、関節炎、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、リューマチ関節炎、滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎、全身エリテマトーデス狼瘡、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、移植拒絶、移植対宿主病、Ｉ型糖尿病、強直性脊椎炎、ＩＩ型糖尿病、強直性脊椎炎、バージャー病、ルティエ症候群、およびホジキン病である、請求項５３の方法。
【請求項５７】
前記病状が、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、もしくは十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性、偽膜性、急性、および虚血性大腸炎、肝炎、クローン病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、臓器虚血、再灌流障害、臓器壊死、枯草熱、敗血症、敗血、内毒素ショック、悪液質、敗血症流産、播種性菌血症、火傷、アルツハイマー病、腹腔病、鬱血性心不全、成人呼吸困難症候群、脳梗塞、脳塞栓症、脊髄障害、麻痺、移植拒絶、あるいは移植対宿主病である、請求項５３の方法。
【請求項５８】
前記病状が、敗血症、敗血、もしくは内毒素ショックである、請求項５３の方法。
【請求項５９】
前記病状が、敗血症、敗血、もしくは内毒素ショック、消化性潰瘍、胃潰瘍、もしくは十二指腸潰瘍、潰瘍性、偽膜性、急性、もしくは虚血性大腸炎、腸閉塞、憩室炎、喉頭蓋炎、無弛緩症、胆管炎、胆嚢炎、クローン病、腸管炎、あるいはホウィップル病である、請求項５３の方法。
【請求項６０】
前記哺乳類が、ヒトである、請求項５３の方法。
【請求項６１】
炎症サイトカインレベルを哺乳類において抑制していく方法であって、該方法が、請求項２もしくは１６のペプチドを、該哺乳類に、該炎症サイトカインレベルを抑制するに充分な様式で、投与していくことを含んでいる、方法。
【請求項６２】
前記炎症サイトカインが、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１８、もしくはＨＭＧＢ１である、請求項６１の方法。
【請求項６３】
前記炎症サイトカインが、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、もしくはＨＭＧＢ１である、請求項６１の方法。
【請求項６４】
前記哺乳類が、炎症サイトカインカスケードにより媒介された病状を患っているか、もしくは、リスクにある、請求項６１の方法。
【請求項６５】
前記病状が、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、もしくは十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性、偽膜性、急性、もしくは虚血性大腸炎、腸閉塞、憩室炎、喉頭蓋炎、無弛緩症、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、クローン病、腸管炎、ホウィップル病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合疾患、臓器虚血、再灌流障害、臓器壊死、枯草熱、敗血症、敗血、内毒素ショック、悪液質、超高熱、好酸球肉芽腫、肉芽腫症、類肉腫症、敗血症流産、副睾丸炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、気腫、鼻炎、膵嚢胞性繊維症、肺炎、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、インフルエンザ、気道多核ウィルス感染、ヘルペス感染、ＨＩＶ感染、Ｂ型肝炎ウィルス感染、Ｃ型肝炎ウィルス感染、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、糸状虫症、アメーバ症、包虫嚢胞、火傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日焼け、蕁麻疹、疣、蕁麻疹、血管炎、脈管炎、心内膜炎、動脈炎、粥状（アテローム）硬化症、血栓性静脈炎、心膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リューマチ熱、アルツハイマー病、腹腔病、鬱血性心不全、成人呼吸困難症候群、髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、脳梗塞、脳塞栓症、ギラン・バレー症候群、神経炎、神経痛、脊髄障害、麻痺、葡萄膜炎、関節炎、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、リューマチ関節炎、滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎、全身エリテマトーデス狼瘡、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、移植拒絶、移植対宿主病、Ｉ型糖尿病、強直性脊椎炎、ＩＩ型糖尿病、強直性脊椎炎、バージャー病、ルティエ症候群、およびホジキン病である、請求項６４の方法。
【請求項６６】
前記病状が、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、もしくは十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性、偽膜性、急性、および虚血性大腸炎、肝炎、クローン病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、臓器虚血、再灌流障害、臓器壊死、枯草熱、敗血症、敗血、内毒素ショック、悪液質、敗血症流産、播種性菌血症、火傷、アルツハイマー病、腹腔病、鬱血性心不全、成人呼吸困難症候群、脳梗塞、脳塞栓症、脊髄障害、麻痺、移植拒絶、あるいは移植対宿主病である、請求項６４の方法。
【請求項６７】
前記病状が、敗血症、敗血、もしくは内毒素ショックである、請求項６４の方法。
【請求項６８】
前記病状が、敗血症、敗血、もしくは内毒素ショック、消化性潰瘍、胃潰瘍、もしくは十二指腸潰瘍、潰瘍性、偽膜性、急性、もしくは虚血性大腸炎、腸閉塞、憩室炎、喉頭蓋炎、無弛緩症、胆管炎、胆嚢炎、クローン病、腸管炎、あるいはホウィップル病である、請求項６４の方法。
【請求項６９】
前記哺乳類が、ヒトである、請求項６１の方法。
【請求項７０】
体重オーバーの哺乳類を処置していく方法であって、該方法が、請求項２もしくは１６のペプチドを、該哺乳類に投与していくことを含んでいる、方法。
【請求項７１】
前記投与が、前記哺乳類における体重減少を引き起こす、請求項７０の方法。
【請求項７２】
前記哺乳類が、ヒトである、請求項７０の方法。
【請求項７３】
前記哺乳類が、メラノコルチン不全を持つ、請求項７０の方法。
【請求項７４】
前記メラノコルチン不全が、プロオピオメラノコルチン遺伝子欠陥による、請求項７３の方法。
【請求項７５】
前記ペプチドが、前記哺乳類に、請求項３０の原核生物の投与により投与されている、請求項７０の方法。
【請求項７６】
前記ペプチドが、前記哺乳類に、請求項２６のベクターの投与により投与されている、請求項７０の方法。
【請求項７７】
哺乳類において、食欲を減退させ、食物摂取を減少させ、体重を減少させ、および／または、エネルギー変換を減少させる方法であって、該方法が、請求項２もしくは１６のペプチドを、前記哺乳類に、前記哺乳類における、食欲を減退させ、食物摂取を減少させ、体重を減少させ、および／または、エネルギー変換を減少させるに充分な様式で、投与していくことを含んでいる、方法。
【請求項７８】
前記哺乳類が、体重オーバーである、請求項７７の方法。
【請求項７９】
前記哺乳類が、ヒトである、請求項７７の方法。
【請求項８０】
前記ペプチドが、前記哺乳類に、請求項３０の原核生物の投与により投与されている、請求項７７の方法。
【請求項８１】
前記ペプチドが、前記哺乳類に、請求項２２のベクターの投与により投与されている、請求項７３の方法。
【請求項８２】
哺乳類の消化器系における先天免疫を阻害していく方法であって、該方法が、請求項２もしくは１６のペプチドを、該哺乳類に、該哺乳類における先天免疫を阻害するに充分な様式で、投与していくことを含んでいる、方法。
【請求項８３】
前記哺乳類が、ヒトである、請求項８２の方法。
【請求項８４】
前記ペプチドが、前記哺乳類に、請求項２５の原核生物の投与により投与されている、請求項８２の方法。
【請求項８５】
前記ペプチドが、前記哺乳類に、請求項２７のベクターの投与により投与されている、請求項８２の方法。
【請求項８６】
哺乳類の皮膚を暗くさせる方法であって、該方法が、請求項２もしくは１６のペプチドを、該哺乳類の該皮膚に、該皮膚を暗くさせるに充分な様式で、投与していくことを含んでいる、方法。
【請求項８７】
前記哺乳類が、ヒトである、請求項８６の方法。
【請求項８８】
請求項１もしくは１４のペプチドのメラノコルチン受容体刺激能力を評価していく方法であって、該方法が、該ペプチドの、盲腸結紮および穿刺を受けた動物における敗血症を阻害できる能力を求めていくことを含んでいる、方法。
【請求項８９】
請求項１もしくは１４のペプチドのメラノコルチン受容体刺激能力を評価していく方法であって、該方法が、該ペプチドの、メラノコルチン受容体阻害剤存在下にもしくは非存在下に細胞からの炎症サイトカイン放出を阻害できる能力を求めていくことを含んでいる、方法。
【請求項９０】
前記細胞が、ＬＰＳを用いて処理されている、請求項８９の方法。
【請求項９１】
メラノコルチン受容体の前記阻害剤が、ａｇｏｕｔｉである、請求項８９の方法。
【請求項９２】
前記ペプチドのメラノコルチン受容体刺激能力が、もう１種別のメラノコルチン受容体刺激剤に相対して定量化されている、請求項８９の方法。
【請求項９３】
請求項１もしくは１４のペプチドを産生している原核生物のメラノコルチン受容体刺激能力を評価していく方法であって、該方法が、該原核生物を、哺乳類の腸管に投与していき、次いで、投与された該原核生物の、盲腸結紮および穿刺を受けた動物における敗血症の効果を阻害できる能力を求めていくことを含んでいる、方法。
【請求項９４】
請求項１もしくは１４のペプチドを産生している原核生物のメラノコルチン受容体刺激能力を評価していく方法であって、該方法が、該原核生物を、炎症サイトカインを産生していくことができる細胞と組み合わせていき、次いで、該原核生物の、メラノコルチン受容体阻害剤存在下にもしくは非存在下に細胞からの炎症サイトカイン放出を阻害できる能力を求めていくことを含んでいる、方法。
【請求項９５】
前記細胞が、ＬＰＳを用いて処理されている、請求項９４の方法。
【請求項９６】
前記阻害剤が、ａｇｏｕｔｉである、請求項９４の方法。
【請求項９７】
前記原核生物が、天然起源である、請求項９３もしくは９４の方法。
【請求項９８】
前記原核生物が遺伝子導入的に、前記ペプチドを産生する、請求項９３もしくは９４の方法。
【請求項９９】
哺乳類における食物摂取を増加させていく方法であって、該方法が、ＭＥＣＯ−１活性を、当該哺乳類において抑圧していくことを含んでいる、方法。
【請求項１００】
ＭＥＣＯ−１活性が、ＭＥＣＯ−１アンタゴニストを、前記哺乳類に投与していくことにより抑圧されている、請求項９９の方法。
【請求項１０１】
。
【請求項１０２】
前記ＭＥＣＯ−１アンタゴニストが、抗体であり、特異的にＭＥＣＯ−１に結合する、請求項１００の方法。
【請求項１０３】
ＭＥＣＯ−１活性が、前記哺乳類をＭＥＣＯ−１に対して免疫していくことにより抑圧されている、請求項９９の方法。
【請求項１０４】
前記哺乳類が、食事に関して増やされている酪農動物である、請求項９９の方法。
【請求項１０５】
前記哺乳類が、ヒトである、請求項９９の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本願は、米国仮出願第６０／７１３，９２７号、２００５年９月１日出願の利益を請求する。
【０００２】
（１）本発明の分野
本発明は一般的に、生物活性ペプチドに関する。より具体的には、本発明は、メラノサイト刺激ホルモンを、哺乳類メラノコルチン受容体を活性化させて模倣するペプチドに関している。
【背景技術】
【０００３】
（２）関連技術の記述
参考文献
Abreu MT, Fukata M, Arditi M. TLR signaling in the gut in health and disease. J Immunol. 2005 Apr 15; 174(8): 4453-60.
Backhed F, Ley RE, Sonnenburg JL, Peterson DA, Gordon JI. Host-bacterial mutualism in the human intestine. Science. 2005 Mar 25; 307(5717): 1915-20.
Badman MK, Flier JS. The gut and energy balance: visceral allies in the obesity wars. Science. 2005 Mar 25; 307(5717): 1909-14.
Bardwell L. A walk-through of the yeast mating pheromone response pathway. Peptides. 2004 Sep; 25(9): 1465-76. Review. Erratum in: Peptides. 2005 Feb; 26(2): 337. Corrected and republished in: Peptides. 2005 Feb; 26(2): 339-50.
Bhargava K, Templeton P, Spremulli LL. Expression and characterization of isoform 1 of human mitochondrial elongation factor G. Protein Expr Purif. 2004 Oct; 37(2): 368-76.
Catania A, Delgado R, Airaghi L, Cutuli M, Garofalo L, Carlin A, Demitri MT, Lipton JM. [alpha]-MSH in systemic inflammation. Central and peripheral actions. Ann NY Acad Sci. 1999 Oct 20; 885: 183-7.
Catania A, Gatti S, Colombo G, Lipton JM. Targeting melanocortin receptors as a novel strategy to control inflammation. Pharmacol Rev. 2004 Mar; 56(l): 1-29.
Chai BX, Neubig RR, Millhauser GL, Thompson DA, Jackson PJ, Barsh GS, Dickinson CJ, Li JY, Lai YM, Gantz I. Inverse agonist activity of agouti and agouti-related protein. Peptides. 2003 Apr; 24(4): 603-9.
Chandran P, Satthaporn S, Robins A, Eremin O. Inflammatory bowel disease: dysfunction of GALT and gut bacterial flora (I). Surgeon. 2003 Apr; l(2): 63-75.
Chhajlani V, Wikberg JE. Molecular cloning and expression of the human melanocyte stimulating hormone receptor cDNA (FEBS 11553). FEBS Lett. 1996 Jul 22; 390(2): 238.
Cone, RD. (Ed) (2000). The Melanocortin Receptors. Humana Press Totowa, NJ, USA 551pp.
Damcott CM, Sack P, Shuldiner AR. The genetics of obesity. Endocrinol Metab Clin North Am. 2003 Dec; 32(4): 761-86.
Delgado R, Carlin A, Airaghi L, Demitri MT, Meda L, Galimberti D, Baron P, Lipton JM, Catania A. Melanocortin peptides inhibit production of proinflammatory cytokines and nitric oxide by activated microglia. J Leukoc Biol. 1998 Jun; 63(6): 740-5.
Dumitriu IE, Baruah P, Manfredi AA, Bianchi ME, Rovere-Querini P. HMGBl: guiding immunity from within. Trends Immunol. 2005 Jul; 26(7): 381-7.
Eberle, AN. 2000 Propiomelanocortin and the Melanocortin Peptides. In The Melanocortin Receptors. R.D. Cone, editor. Humana Press, Totowa, N.J., USA. 3-67.    Eckburg PB, Bik EM, Bernstein CN, Purdom E, Dethlefsen L, Sargent M, Gill SR, Nelson KE, Relman DA. Diversity of the human intestinal microbial flora. Science. 2005 Jun 10; 308(5728): 1635-8.
Eckmann L. Innate immunity and mucosal bacterial interactions in the intestine. Curr Opin Gastroenterol. 2004 Mar; 20(2): 82-8.
Farooqi IS, O'Rahilly S. Monogenic obesity in humans. Annu Rev Med. 2005; 56: 443-58.
Federle MJ, Bassler BL. Interspecies communication in bacteria. J Clin Invest. 2003 Nov; 112(9): 1291-9.
Gallio M, Sturgill G, Rather P, Kylsten P. A conserved mechanism for extracellular signaling in eukaryotes and prokaryotes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Sep 17; 99(19): 12208-13.
Gao J, Yu L, Zhang P, Jiang J, Chen J, Peng J, Wei Y, Zhao S. Cloning and characterization of human and mouse mitochondrial elongation factor G, GFM and Gfm, and mapping of GFM to human chromosome 3q25.1-q26.2. Genomics. 2001 May 15; 74(l): 109-14.
Garside P, Millington O, Smith KM. The anatomy of mucosal immune responses. Ann NY Acad Sci. 2004 Dec; 1029: 9-15.
Gebbers JO, Laissue JA. Bacterial translocation in the normal human appendix parallels the development of the local immune system. Ann NY Acad Sci. 2004 Dec; 1029: 337-43.
Gerst JE, Sole J, Hazum E, Salomon Y. Identification and characterization of melanotropin binding proteins from M2R melanoma cells by covalent photoaffinity labeling. Endocrinology. 1988 Oct; 123(4): 1792-7.
Getz GS. Thematic review series: the immune system and atherogenesis. Immune function in atherogenesis. J Lipid Res. 2005 Jan; 46(l): 1-10.
Greenberg EP. Bacterial communication and group behavior. J Clin Invest. 2003 Nov; 112(9): 1288-90.
Hammarsund M, Wilson W, Corcoran M, Merup M, Einhorn S, Grander D, Sangfelt O. Identification and characterization of two novel human mitochondrial elongation factor genes, hEFG2 and hEFGl, phylogenetically conserved through evolution. Hum Genet. 2001 Nov; 109(5): 542-50.
Hansson GK. Inflammation, atherosclerosis, and coronary artery disease. N Engl J Med. 2005 Apr 21; 352(16): 1685-95.
Haynes RC Jr, Sutherland EW, Rail TW. The role of cyclic adenylic acid in hormone action. Recent Prog Horm Res. 1960; 16: 121-38.
Henke JM, Bassler BL. Bacterial social engagements. Trends Cell Biol. 2004 Nov; 14(11): 648-56.
Hoebe K, Janssen E, Beutler B. The interface between innate and adaptive immunity. Nat Immunol. 2004: 5(10): 971-4.
Hruby, VJ. and Han G. 2000 The Molecular Pharmacology of A-Melanocyte Stimulating Hormone: Structure-Activity Relationships for Melanotropins at Melanocortin Receptors. In The Melanocortin Receptors. R.D. Cone, editor. Humana Press, Totowa, N.J., USA. 239-261.
Janeway CA Jr, Medzhitov R. Innate immune recognition. Annu Rev Immunol. 2002; 20: 197-216.
Kieber-Emmons et al., Curr. Opin. Biotechnol. 1997; 8: 435-441.
Kita T, Inoue A, Nakanishi S, Numa S. Purification and characterization of the messenger RNA coding for bovine corticotropin/beta-lipotropin precursor. Eur J Biochem. 1979 Jan 15; 93(2): 213-20.
Korner J, Leibel RL. To eat or not to eat-how the gut talks to the brain. N Engl J Med. 2003 Sep 4; 349(10): 926-8.
Krude H, Biebermann H, Luck W, Horn R, Brabant G, Gruters A. Severe early-onset obesity, adrenal insufficiency and red hair pigmentation caused by POMC mutations in humans. Nat Genet. 1998 Jun; 19(2): 155-7.
Lefkowitz RJ, Roth J, Pricer W, Pastan I. ACTH receptors in the adrenal: specific binding of ACTH-125I and its relation to adenyl cyclase. Proc Natl Acad Sci U S A. 1970 Mar; 65(3): 745-52.
Lenard J. Mammalian hormones in microbial cells. Trends Biochem Sci. 1992 Apr; 17(4): 147-50.
Lerner AB. The discovery of the melanotropins. A history of pituitary endocrinology. Ann NY Acad Sci. 1993 May 31; 680: l-12.
LeRoith D, Delahunty G, Wilson GL, Roberts CT Jr, Shemer J, Hart C, Lesniak MA, Shiloach J, Roth J. Evolutionary aspects of the endocrine and nervous systems. Recent Prog Horm Res. 1986; 42: 549-87.
Li J, Kokkola R, Tabibzadeh S, Yang R, Ochani M, Qiang X, Harris HE, Czura CJ, Wang H, Ulloa L, Wang H, Warren HS, Moldawer LL, Fink MP, Andersson U, Tracey KJ, Yang H. Structural basis for the proinflammatory cytokine activity of high mobility group box 1. Mol Med. 2003 Jan-Feb; 9(l-2): 37-45.
Li J, Wang H, Mason JM, Levine J, Yu M, Ulloa L, Czura CJ, Tracey KJ, Yang H. Recombinant HMGBl with cytokine-stimulating activity. J Immunol Methods. 2004 Jun; 289(l-2): 211-23.
Lipton JM, Macaluso A, Hiltz ME, Catania A. Central administration of the peptide [alpha]-MSH inhibits inflammation in the skin. Peptides. 1991 Jul-Aug; 12(4): 795-8.
Lotze MT, Tracey KJ. High-mobility group box 1 protein (HMGBl): nuclear weapon in the immune arsenal. Nat Rev Immunol. 2005 Apr; 5(4): 331-42.
Maaser C, Kannengiesser K, Specht C, Luegering A, Brzoska T, Luger TA, Domschke W, Kucharzik T. Crucial role of the melanocortin receptor MClR in experimental colitis. Gut. 2006 Mar 16; 16543288.
Macchia V, Bates RW, Pastan I. The purification and properties of a thyroid-stimulating factor isolated from Clostridium perfringens. J Biol Chem. 1967 Aug 25; 242(16): 3726-30.
Macdonald TT, Monteleone G. Immunity, inflammation, and allergy in the gut. Science. 2005 Mar 25; 307(5717): 1920-5.
Mains RE, Eipper BA, Ling N. Common precursor to corticotropins and endorphins. Proc Natl Acad Sci U S A. 1977 Jul; 74(7): 3014-8.
Merritt, HH. 1955 A textbook of neurology. Lea & Febiger. Philadelphia, U.S.A. 746pp (see p.47)
Mathesius U, Mulders S, Gao M, Teplitski M, Caetano-Anolles G, Rolfe BG, Bauer WD. Extensive and specific responses of a eukaryote to bacterial quorum-sensing signals. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Feb 4; 100(3): 1444-9.
McGeer PL, McGeer EG. Inflammation and the degenerative diseases of aging. Ann NY Acad Sci. 2004 Dec; 1035: 104-16.
Mountjoy KG, Robbins LS, Mortrud MT, Cone RD. The cloning of a family of genes that encode the melanocortin receptors. Science. 1992 Aug 28; 257(5074): 1248-51.
Pasare C, Medzhitov R. Toll-like receptors: linking innate and adaptive immunity. Microbes Infect. 2004 Dec; 6(15): 1382-7.
Rendon-Mitchell B, Ochani M, Li J, Han J, Wang H, Yang H, Susarla S, Czura C, Mitchell RA, Chen G, Sama AE, Tracey KJ, Wang H. IFN-gamma induces high mobility group box 1 protein release partly through a TNF-dependent mechanism. J Immunol. 2003 Apr 1; 170(7): 3890-7.
Riehl RM, Toft DO. Analysis of the steroid receptor of Achlya ambisexualis. J Biol Chem. 1984 Dec 25; 259(24): 15324-30.
Ripka et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 1998; 2: 441-452.
Roberts JL, Herbert E. Characterization of a common precursor to corticotropin and beta-lipotropin: cell-free synthesis of the precursor and identification of corticotropin peptides in the molecule. Proc Natl Acad Sci U S A. 1977 Nov; 74(ll): 4826-30.
Roth J, Leroith D, Collier ES, Watkinson A, Lesniak MA. The evolutionary origins of intercellular communication and the Maginot Lines of the mind. Ann NY Acad Sci. 1986; 463: 1-11.
Saez JM, Evain D, Gallet D. Role of cyclic AMP and protein kinase on the steroidogenic action of ACTH, prostaglandin El and dibutyryl cyclic AMP in normal adrenal cells and adrenal tumor cells from humans. J Cyclic Nucleotide Res. 1978 Aug; 4(4): 311-21.
Sanchez-Mas J, Hahmann C, Gerritsen I, Garcia-Borron JC, Jimenez-Cervantes C. Agonist-independent, high constitutive activity of the human melanocortin 1 receptor. Pigment Cell Res. 2004 Aug; 17(4): 386-95.
Sanderson, Med. Res. Rev. 1999; 19: 179-197.
Sartor RB. Review article: Role of the enteric microflora in the pathogenesis of intestinal inflammation and arthritis. Aliment Pharmacol Ther. 1997 Dec; l 1 Suppl 3: 17-22; discussion 22-3.
Sartor RB. Targeting enteric bacteria in treatment of inflammatory bowel diseases: why, how, and when. Curr Opin Gastroenterol. 2003 Jul; 19(4): 358-65.
Schimmer BP, Ueda K, Sato GH. Site of action of adrenocorticotropic hormone (ACTH) in adrenal cell cultures. Biochem Biophys Res Commun. 1968 Sep 6; 32(5): 806-10.
Smith DW, Nagler-Anderson C. Preventing intolerance: the induction of nonresponsiveness to dietary and microbial antigens in the intestinal mucosa. J Immunol. 2005 Apr l; 174(7): 3851-7.
Smythies LE, Sellers M, Clements R, Mosteller-Barnum M, Meng G, Benjamin W, Orenstein JM, Smith P. Human intestinal macrophages display profound inflammatory anergy despite avid phagocytic and bacteriocidal activity. J Clin Invest. 2005 Jan; l 15(l): 66-75.
Steinhoff U. Who controls the crowd ? New findings and old questions about the intestinal microflora. Immunol Lett. 2005 Jun 15; 99(l): 12-6. Epub 2005 Jan 21.
Taherzadeh S, Sharma S, Chhajlani V, Gantz I, Rajora N, Demitri MT, Kelly L, Zhao H, Ichiyama T, Catania A, Lipton JM. A-MSH and its receptors in regulation of tumor necrosis factor-[alpha] production by human monocyte/macrophages. Am J Physiol. 1999 May; 276(5 Pt 2): R1289-94.
Taunton OD, Roth J, Pastan I. The first step in ACTH action: binding to tissue. J Clin Invest. 1967 June; 46(6): 1122-1129.
Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 1994 Nov 11; 22(22): 4673-80.
Schuiling GA. Deceive, and be deceived ! J Psychosom Obstet Gynaecol. 2004 Jun; 25(2): 170-4. Urban S, Freeman M. Intramembrane proteolysis controls diverse signalling pathways throughout evolution. Curr Opin Genet Dev. 2002 Oct; 12(5): 512-8.
Vaisse C, Clement K, Guy-Grand B, Froguel P. A frameshift mutation in human MC4R is associated with a dominant form of obesity. Nat Genet. 1998 Oct; 20(2): l13-4.
Wang H, Bloom O, Zhang M, Vishnubhakat JM, Ombrellino M, Che J, Frazier A, Yang H, Ivanova S, Borovikova L, Manogue KR, Faist E, Abraham E, Andersson J, Andersson U, Molina PE, Abumrad NN, Sama A, Tracey KJ. HMG-I as a late mediator of endotoxin lethality in mice. Science. 1999 Jul 9; 285(5425): 248-51.
Wang H, Yang H, Tracey KJ. Extracellular role of HMGBl in inflammation and sepsis. J Intern Med. 2004 Mar; 255(3): 320-31.
Wichmann MW, Haisken JM, Ayala A, Chaudry IH. Melatonin administration following hemorrhagic shock decreases mortality from subsequent septic challenge. J Surg Res. 1996 Oct; 65(2): 109-14.
Wilson CJ, Finch CE, Cohen HJ. Cytokines and cognition-the case for a head-to-toe inflammatory paradigm. J Am Geriatr Soc. 2002 Dec; 50(12): 2041-56.
Yaffe K, Kanaya A, Lindquist K, Simonsick EM, Harris T, Shorr RI, Tylavsky FA, Newman AB. The metabolic syndrome, inflammation, and risk of cognitive decline. JAMA. 2004 Nov 10; 292(18): 2237-42.
Yang H, Ochani M, Li J, Qiang X, Tanovic M, Harris HE, Susarla SM, Ulloa L, Wang H, DiRaimo R, Czura CJ, Wang H, Roth J, Warren HS, Fink MP, Fenton MJ, Andersson U, Tracey KJ. Reversing established sepsis with antagonists of endogenous high-mobility group box 1. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Jan 6; 101(l): 296-301.
Yang H, Wang H, Czura CJ, Tracey KJ. The cytokine activity of HMGBl. J Leukoc Biol. 2005 Jul; 78(l): l-8. Epub 2005 Feb 25.
Yeo GS, Farooqi IS, Aminian S, Halsall DJ, Stanhope RG, O'Rahilly S. A frameshift mutation in MC4R associated with dominantly inherited human obesity. Nat Genet. 1998 Oct; 20(2): lll-2.
【０００４】
如何にして、先天免疫系が、通常その宿主の腸管中において居住するバクテリア存在下に沈黙を保つのか？（ＪａｎｅｗａｙおよびＭｅｄｚｈｉｔｏｖ、２００２年；Ｓｔｅｉｎｈｏｆｆ、２００５年；ＳｍｉｔｈおよびＮａｇｌｅｒ−Ａｎｄｅｒｓｏｎ、２００５年）。細胞の天然の最も密な集まりの間で、これらの微生物が、継続して代謝し、増殖している（Ｅｃｋｂｕｒｇら、２００５年；Ｂａｃｋｈｅｄら、２００５年；Ｃｈａｎｄｒａｎら、２００３年）。これらは、その体の最大のリンパ器官たる腸関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）にも非常に近い（Ｃｈａｎｄｒａｎら、２００３年）。先天免疫系が、揃いの特異的受容体を有し、継続してその警戒にあり、生きていても死んでいても、バクテリアに対してならびにバクテリア分子成分に対して、即刻および激しく、認識ならびに応答する（ＰａｓａｒｅおよびＢｅｄｚｈｉｔｏｖ、２００４年；Ｈｏｅｂｅら、２００５年；ＭａｃｄｏｎａｌｄおよびＭｏｎｔｅｌｅｏｎｅ、２００５年；Ａｂｒｅｕら、２００５年）。少量のバクテリア産物が典型的に、バクテリアと格闘するよう設計（デザイン）された先天免疫系の細胞および体液性応答を活性化させる。時々、これらの応答がとても激しいことがあり、これらが防御されているその宿主を殺す。
【０００５】
我々は、Ｅ．ｃｏｌｉ、および、腸管叢における他の微生物が、ホルモンおよびホルモン様物質の宿主細胞受容体を介して作用する物質を放出し、通常の休止状態を維持し、ここで、腸管中の微生物膨大なバイオマス（全ての既知のエコシステムにおいて細胞最高密度において存在している）が、消化（ＧＩ）管において生物学的な平和において生存すると仮定する（我々により、腸管の平和（パックス・インテスティナリス）と名付けられた）。対照的に、血中もしくは他の体腔中のこのような微生物の少数が典型的に、急速に先天免疫系の多重の経路を活性化させ、広範な化学的および体液性応答を発生させる（ＪａｎｅｗａｙおよびＭｅｄｚｈｉｔｏｖ、２００２年；Ｓｔｅｉｎｈｏｆｆ、２００５年；ＳｍｉｔｈおよびＮａｇｌｅｒ−Ａｎｄｅｒｓｏｎ、２００５年；Ｅｃｋｂｕｒｇら、２００５年；Ｂａｃｋｈｅｄら、２００５年；Ｃｈａｎｄｒａｎら、２００３年；ＰａｓａｒｅおよびＢｅｄｚｈｉｔｏｖ、２００４年；Ｈｏｅｂｅら、２００５年；ＭａｃｄｏｎａｌｄおよびＭｏｎｔｅｌｅｏｎｅ、２００５年；Ａｂｒｅｕら、２００５年）。これらの仮定された物質の同定および特徴化が望ましく、哺乳類の免疫を逃れるバクテリアのメカニズムを特徴付け、炎症サイトカインカスケードのような過剰反応により特徴化された病気の処置を開発する。本発明は、こんな必要性に関する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明者らは、メラノサイト刺激ホルモンを、哺乳類メラノコルチン受容体を活性化させ、原炎症サイトカイン放出を阻害して模倣するペプチドを、同定した。これらペプチドは、炎症サイトカインカスケード活性化の尾を引く敗血症ショックおよび他の病状に有効な処置剤である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
これゆえ、ある幾つかの実施形態において、本発明は、６８０未満のアミノ酸もしくは模倣体の単離精製されたペプチドに関している。これらペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉの延長因子−Ｇ（ＥＦ−Ｇ）のアミノ酸６７１−７０３に対応している天然起源延長因子−Ｇの３３アミノ酸もしくは模倣体を含み、配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１４を持っている。
【０００８】
他の実施形態において、本発明は、６８０未満のアミノ酸もしくは模倣体の単離精製されたペプチドに関している。これらペプチドは、配列番号：２を持っている３３アミノ酸もしくは模倣体を含む。
【０００９】
本発明は加えて、上記ペプチドをコード化しているベクターに関している。
【００１０】
更なる実施形態において、本発明は、上記ベクターを含んでいる遺伝子導入（トランスジェニック）細胞に関している。
【００１１】
本発明は、哺乳類細胞からの、炎症サイトカイン放出を抑制もしくは予防する方法にも関する。これら方法は、該細胞を、哺乳類メラノコルチン受容体を活性化させる上記ペプチドのいずれかと接触させることを含み、該炎症サイトカイン放出を抑制もしくは予防するに充分な様式においてである。
【００１２】
更なる実施形態において、本発明は、炎症サイトカインカスケードにより媒介された病状に苦しんでいる哺乳類を処置する方法に関している。これら方法は、該哺乳類に、哺乳類メラノコルチン受容体を活性化させる上記ペプチドのいずれかを投与することを含み、該炎症サイトカインカスケードを抑制するに充分な様式においてである。
【００１３】
本発明は更に、炎症サイトカインカスケードにより媒介された病状に関するリスクにある哺乳類を処置する方法に関している。これら方法は、該哺乳類に、哺乳類メラノコルチン受容体を活性化させる上記ペプチドのいずれかを投与することを含み、該炎症サイトカインカスケードを抑制するに充分な様式においてである。
【００１４】
他の実施形態において、本発明は、炎症サイトカインレベルを、哺乳類において、抑制する方法に関している。これら方法は、該哺乳類に、哺乳類メラノコルチン受容体を活性化させる上記ペプチドのいずれかを投与することを含み、該炎症サイトカインレベルを抑制するに充分な様式においてである。
【００１５】
加えて、本発明は、体重オーバーの哺乳類を処置する方法に関している。これら方法は、該哺乳類に、哺乳類メラノコルチン受容体を活性化させる上記ペプチドのいずれかを投与することを含む。
【００１６】
更なる実施形態において、本発明は、食物摂取を、哺乳類において減らしていく方法に関している。これら方法は、該哺乳類に、哺乳類メラノコルチン受容体を活性化させる上記ペプチドのいずれかを投与することを含み、食物摂取を、該哺乳類において減らすに充分な様式においてである。
【００１７】
本発明は、先天免疫を、哺乳類の消化器系において阻害する方法にも関している。これら方法は、該哺乳類に、哺乳類メラノコルチン受容体を活性化させる上記ペプチドのいずれかを投与することを含み、先天免疫を、該哺乳類において阻害するに充分な様式においてである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明者らは、哺乳類メラノコルチン受容体を活性化させることによりメラノサイト刺激ホルモンを模倣し、原炎症サイトカイン放出を阻害するペプチドを、同定した。これらペプチドは、炎症サイトカイン放出を阻害し、炎症サイトカインの過剰な放出により特徴付けられた疾患に、有効な処置剤である。実施例参照。
【００１９】
略号：
ＡＣＴＨ、副腎皮質ホルモン；
ＭＳＨ、メラノサイト刺激ホルモン；
ＣＬＰ、盲腸結紮および穿刺；
ＥＦ−Ｇ、延長因子−Ｇ
ＨＭＧＢ１、高移動グループボックス１蛋白
ＬＰＳ、リポ多糖
ＭＣ１Ｒ、メラノコルチン−１受容体（ＭＣ２Ｒ−ＭＣ５Ｒに関してと同一の記号法）；
ＭＥＣＯ−１、メラノコルチン−Ｅ．ｃｏｌｉ−１；
ＰＯＭＣ、プロオピオメラノコルチン；
ＴＮＦ、腫瘍壊死因子。
【００２０】
下の実施例において確立されたとおり、ペプチドＭＥＣＯ−１（配列ＩＤ番号、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）が、炎症サイトカイン放出を減弱させ、敗血症に対して保護し、明らかに、哺乳類メラノコルチンにより標的とされたＭＣ１Ｒそして恐らく他の受容体の活性化に属している。こうして、ＭＥＣＯ−１が、α−メラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）を模倣する。ＭＥＣＯ−１は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）延長因子−ＧのＣ末端の３３アミノ酸であり、大腸菌により放出されている。如何なる特定の機序（メカニズム）もしくは生理学的役割によっても結び付けられずに、ＭＥＣＯ−１および似たペプチドが、哺乳類先天免疫系を、炎症サイトカインを放出していくことにより、定住腸バクテリア（および他の炎症刺激）に対して反応してしまうことから阻害すると思われている。
【００２１】
これら実施例が、ＭＥＣＯ−１が食物摂取を抑圧することも確立させ、明らかに、ＭＣ４Ｒの活性化に属している。
【００２２】
４種の哺乳類メラノコルチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、ならびに、α−、β−、およびγ−メラノサイト刺激ホルモン（ＭＳＨ）が、プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）遺伝子（図１）において、コード化されている（Ｃｏｎｅ、２０００年；Ｌｅｒｎｅｒ、１９９３年；Ｅｂｅｒｌｅ、２０００年；ＨｒｕｂｙおよびＨａｎ、２０００年；Ｍａｉｎｓら、１９７７年；ＲｏｂｅｒｔｓおよびＨｅｒｂｅｒｔ、１９７７年；Ｋｉｔａら、１９７９年）。これらのペプチドが、アデニル酸環化酵素経路を、５種の区別されるＧ−蛋白結合（７回膜貫通）メラノコルチン受容体（ＭＣ１Ｒ〜ＭＣ５Ｒ）を通して、活性化させる。生物学的に関連している末端地点が、副腎ステロイド合成（ＭＣ２Ｒ上でのＡＣＴＨ作用経由）刺激および皮膚暗色化（大きく、ＭＣ１Ｒ上でのα−ＭＳＨ作用経由）ならびに炎症阻害（殆ど、マクロファージおよび他の免疫細胞上のＭＣ１Ｒ経由のα−ＭＳＨ作用）および食物摂取抑圧（殆ど、下垂体神経上のＭＣ４Ｒ上でのα−ＭＳＨ作用経由）を包含する（Ｃｏｎｅ、２０００年；Ｔａｕｎｔｏｎら、１９６７年；Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚら、１９７０年；Ｓｃｈｉｍｍｅｒら、１９６８年；Ｇｅｒｓｔら、１９８８年；Ｍｏｕｎｔｊｏｙら、１９９２年；Ｓａｅｚら、１９７８年；ＣｈｈａｊｌａｎｉおよびＷｉｋｂｅｒｇ、１９９６年；Ｈａｙｎｅｓら、１９６０年）。プロオピオメラノコルチン遺伝子において遺伝子欠陥を有する非常に稀な患者が、早い発症の、肥満、副腎不全、および赤毛を確約させる。メラノコルチン−４受容体（ＭＣ４Ｒ）に関する遺伝子が、肥満における単一遺伝子欠陥の最もよくある部位（サイト）であり、肥満の深刻なヒトの５％において検出されており、ここで、若齢における発症および過食により、特徴付けられている（ＦａｒｏｏｑｉおよびＯ’Ｒａｈｉｌｌｙ、２００５年；Ｄａｍｃｏｔｔら、２００３年；Ｋｒｕｄｅら、１９９８年；Ｙｅｏら、１９９８年；Ｖａｉｓｓｅら、１９９８年）。
【００２３】
本発明者らは、配列ＩＤ番号：３および４をそれぞれ持っている、ヒトからの延長因子−Ｇ１（ＥＦ−Ｇ１）および延長因子−Ｇ２（ＥＦ−Ｇ２）の類似領域、ならびに、Ｂａｃｔｅｒｉｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓおよびＢａｃｔｅｒｉｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎからのもの（ぞれぞれ、配列ＩＤ番号：１６および１７）も、上記ＭＳＨ活性を持つことも、実証している（実施例参照）。これらの知見に基づけば、当業者であれば、如何なる延長因子−ＧのＣ−末端３３アミノ酸を含んでいる如何なるペプチドも、上記ＭＳＨ活性を持つと予期すると考えられる。
【００２４】
これゆえ、ある幾つかの実施形態において、本発明は、６８０未満のアミノ酸もしくは模倣体の単離精製ペプチドに関している。これらペプチドが、Ｅ．ｃｏｌｉの、配列ＩＤ番号：１４を持っている延長因子−Ｇ（ＥＦ−Ｇ）のアミノ酸６７１〜７０３に対応している天然起源原核生物もしくはミトコンドリアの延長因子−Ｇの３３アミノ酸もしくは模倣体を含む。好ましい実施形態において、該ペプチドが、哺乳類メラノコルチン受容体を活性化させる。より好ましい実施形態において、該メラノコルチン受容体が、メラノコルチン−４受容体、メラノコルチン−３受容体、もしくはメラノコルチン−１受容体である。これらの実施形態の如何なる特定のペプチドも、過度の実験なく、メラノコルチン受容体を活性化させることができる能力に関してテストされ得、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ盲腸結紮および穿刺（ＣＬＰ）テストを使用して、または、メラノコルチン受容体抗体、もしくは、ａｇｏｕｔｉもしくはａｇｏｕｔｉ関連ペプチドのようなメラノコルチン受容体アンタゴニストが加えられる。これらのテストの両方が更に、下の実施例において実施されている。
【００２５】
本明細書において使用された場合、模倣体もしくはペプチド模倣体は化合物であり、蛋白における天然親アミノ酸を模倣でき、ここで、当該ペプチド模倣体が、該蛋白の活性に影響しない。ペプチド模倣体を含んでいる蛋白は一般的に、プロテアーゼの基質ではなく、その天然蛋白に比較した場合、より長い期間の時間ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて活性であることが多い。加えて、より抗原性でなく、全般により高いバイオアベイラビリティーを示し得る。当業者であれば、ペプチド模倣体設計（デザイン）および合成が、如何なる特定のペプチド（本発明のペプチドのような）のアミノ酸に関しても置換でき、過度の実験を必要としないと理解する。例えば、Ｒｉｐｋａら、１９９８年；Ｋｉｅｂｅｒ−Ｅｍｍｏｎｓら、１９９７年；Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ、１９９９年参照。
【００２６】
本ペプチドは、３３量体を、如何なる他の部分、例えば、当該３３量体が由来したＥＦ−Ｇもしくはもう１種別のＥＦ−Ｇに対応している更なるアミン酸もしくは模倣体；抗体結合部位（例えば、当該ペプチドを、特定の臓器もしくは特定の型の細胞に標的化させるために）のようなもう１種別の蛋白もしくはペプチド、もう１種別の機能のペプチド（例えば、特定の受容体を活性化させ、当該ペプチドに２種類の機能の活性を与えるサイトカインもしくは蛋白）、もしくは、Ｈｉｓ−６部分（当該ペプチドの精製を容易化させるために）；放射活性もしくは蛍光部分（当該ペプチドの検出および／または定量を容易化させるために）；ＰＥＧ部分（伸ばされた放出特徴を与えるために）；あるいは、薬剤のような小分子と共に含み得る。
【００２７】
好ましい実施形態において、本ペプチドが、１００未満のアミノ酸もしくは模倣体である。より好ましい実施形態において、本ペプチドが、３３アミノ酸もしくは模倣体からなり、例えば、配列ＩＤ番号：１である。
【００２８】
本ペプチドは、配列ＩＤ番号：１４を持っているＥ．ｃｏｌｉの延長因子−Ｇ（ＥＦ−Ｇ）のアミノ酸６７１〜７０３に対応している如何なる３３量体をも、含み得る。例は、配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：４、配列ＩＤ番号：５、配列ＩＤ番号：６、配列ＩＤ番号：７、配列ＩＤ番号：８、配列ＩＤ番号：９、配列ＩＤ番号：１０、配列ＩＤ番号：１１、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１５、配列ＩＤ番号：１６、および配列ＩＤ番号：１７を包含する。如何なるこのようなペプチドであっても、上記したＭＳＨ活性を持つと期待される。好ましくは、本ペプチドは、配列ＩＤ番号：１を含む。
【００２９】
上で論じたとおり、本発明のペプチドは、好ましくは、関連３３量体、例えば、配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：４、配列ＩＤ番号：５、配列ＩＤ番号：６、配列ＩＤ番号：７、配列ＩＤ番号：８、配列ＩＤ番号：９、配列ＩＤ番号：１０、配列ＩＤ番号：１１、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１５、配列ＩＤ番号：１６、もしくは配列ＩＤ番号：１７だけからなる。最も好ましい実施形態において、本ペプチドは、配列ＩＤ番号：１からなる。
【００３０】
上で論じたとおり、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ、およびＢ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎのＥＦ−ＧのＣ−末配列を持っている３３量体（つまり、ＭＥＣＯ−１＝配列ＩＤ番号：１）が、ヒトＥＦ−Ｇ１およびＥＦ−Ｇ２の対応している配列同様、上記したＭＳＨ活性を持つので、当業者であれば、他の微生物（如何なる原核生物もしくは真核生物をも包含して）からの対応しているＥＦ−ＧのＣ−末配列が、同一活性を持つと期待する。このようなバクテリアの配列は、ＭＥＣＯ−１に似ており、配列ＩＤ番号：５〜１３および１５〜１７として与えられている。この解析に基づけば、当業者であれば、配列ＩＤ番号：２により含まれた如何なるペプチドであっても、上記したＭＳＨ活性を持つと期待する。下の付録における配列ＩＤ番号：２の記載において、スラッシュ（／）により分けられた部分が、その部分に関する代わりのアミノ酸もしくは模倣体を与える。例えば、配列ＩＤ番号：２における第２部分が、該付録において、（Ｌ／Ｑ／Ｓ）として記載されているので、その部分が、ロイシン（「Ｌ」）、グルタミン（「Ｑ」）、もしくはセリン（「Ｓ」）たり得る。これは、図１において与えられた複数のＥＦ−Ｇの対応しているＣ−末配列からの第２部分での代替の可能性を表す。
【００３１】
これゆえ、他の実施形態において、本発明は、６８０未満のアミノ酸もしくは模倣体の単離精製ペプチドに関している。これらペプチドが、配列ＩＤ番号：２を持っている３３アミノ酸もしくは模倣体を含む。好ましい実施形態において、本ペプチドが、哺乳類メラノコルチン受容体を活性化させる。より好ましい実施形態において、該メラノコルチン受容体が、メラノコルチン−４受容体、メラノコルチン−３受容体、もしくはメラノコルチン−１受容体である。上記した実施形態を用いる場合、これらの実施形態の如何なる特定のペプチドも、過度の実験なく、メラノコルチン受容体を活性化できる能力に関してテストされ得る。
【００３２】
他の好ましい実施形態において、本ペプチドが、１００未満のアミノ酸もしくは模倣体からなり；より好ましくは、本ペプチドが、３３アミノ酸もしくは模倣体からなる。
【００３３】
これらの実施形態において、本ペプチドが、好ましくは、配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：４、配列ＩＤ番号：５、配列ＩＤ番号：６、配列ＩＤ番号：７、配列ＩＤ番号：８、配列ＩＤ番号：９、配列ＩＤ番号：１０、配列ＩＤ番号：１１、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１５、配列ＩＤ番号：１６、もしくは配列ＩＤ番号：１７を含む。より好ましい実施形態において、本ペプチドが、配列ＩＤ番号：１を含む。本ペプチドが、好ましくは、３３アミノ酸もしくは模倣体からなるので、本ペプチドが、より好ましくは、配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：４、配列ＩＤ番号：５、配列ＩＤ番号：６、配列ＩＤ番号：７、配列ＩＤ番号：８、配列ＩＤ番号：９、配列ＩＤ番号：１０、配列ＩＤ番号：１１、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１５、配列ＩＤ番号：１６、もしくは配列ＩＤ番号：１７からなり；最も好ましくは、配列ＩＤ番号：１である。
【００３４】
上記したペプチドが有用に、遺伝子的に産生され得、当該ペプチドをコード化しているベクターを使用する。これゆえ、本発明は加えて、上のペプチドをコード化しているベクターに関している。ある幾つかの実施形態において、該ベクターが、原核生物を感染させることができ、容易に当該ペプチドをバクテリア培養において産生させる。このようなベクターを含んでいる原核生物も、哺乳類に摂取するのに使用され得、ここで、当該哺乳類の腸中におけるこの遺伝子導入（トランスジェニック）ペプチド産生が、治療的たり得る（下の処置方法の議論参照）。
【００３５】
上記したベクターも、過度の実験なく、有用に調製され得、哺乳類細胞に感染していくことができる。このようなベクターが、直接哺乳類細胞に感染させるのに使用され得、この場合、当該哺乳類細胞が次いで、この遺伝子導入ペプチドを産生する。好ましい実施形態において、これらのベクターが、ウィルスベクターである。
【００３６】
更なる実施形態において、本発明は、上のベクターを含んでいる遺伝子導入細胞に関している。上で指し示されたとおり、このような遺伝子導入細胞が、原核生物たり得る。好ましくは、該原核生物が適合されていて、哺乳類の腸中において定住する。最も好ましくは、該原核生物が、Ｅ．ｃｏｌｉである。該遺伝子導入細胞が、哺乳類細胞でもあり得る。
【００３７】
本発明は、哺乳類細胞からの炎症サイトカイン放出を抑えるかもしくは防いでいく方法にも、関している。これら方法が、該細胞を、哺乳類メラノコルチン受容体（好ましくは、メラノコルチン−１受容体）を活性化させる上のペプチドのいずれかと、該炎症サイトカイン放出を抑えるかもしくは防ぐに充分な様式で、接触させてみることを含む。このような炎症サイトカインの非限定例は、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン（ＩＬ）−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１８、およびＨＭＧＢ１である。好ましい実施形態において、該炎症サイトカインが、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、もしくはＨＭＧＢ−１であり、これらの３種のサイトカインの存在が特に、下の実施例において、ＭＥＣＯ−１を用いた処置後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、抑えられていると示されて以来である。この結果に基づくと、しかしながら、他の炎症サイトカイン、例えば、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１８が、本発明のペプチドを用いた処置により抑えられると期待される。
【００３８】
好ましい実施形態において、本細胞が、マクロファージであり、マクロファージが、哺乳類の炎症サイトカインの主要な産生者であるからである。中枢神経系（ＣＮＳ）投与も、末梢の炎症を抑圧すると期待される。
【００３９】
これらの実施形態において、本細胞が、本ペプチドを用いて直接処置され得、例えば、本細胞を本ペプチド溶液とｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて接触させてみることによるか、もしくは、本ペプチドを本細胞を持っている哺乳類に投与してみることによる。あるいは、本細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば、本細胞を持っている哺乳類に）において、本細胞を感染させることのできる上記したベクターを用いて処置され得る。これらの実施形態の細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて処置されており、更に、ｅｘ  ｖｉｖｏプロトコルにおいて、生存哺乳類中に移植され得る。これら細胞も、天然もしくは遺伝子導入して、もう１種別の哺乳類細胞によるかもしくは原核生物により産生された本ペプチドにより処置され得、ここで、本ペプチドが、拡散するか、または、標的化細胞に循環されるかさもなくば輸送される。
【００４０】
上で指し示したとおり、これらの方法の本細胞が、本ペプチドが投与される生存哺乳類において存在し得る。これらの実施形態の細胞において、本ペプチドが、医薬組成物において存在しているのが好ましい。
【００４１】
上記した組成物が、過度の実験なく、ヒトを包含して哺乳類に対する投与用に、その特定の適用に適切なよう、製剤され得る。加えて、適正な用量のこれら組成物が、過度の実験なく、標準用量応答プロトコルを使用しながら、求められ得る。
【００４２】
従って、経口、腸、舌、舌下、直腸内、口腔、および口腔内投与用に設計（デザイン）されたこれら組成物が、過度の実験なく、当業界においてよく知られた手段によりなされ得、例えば、不活性稀釈剤を用いるかもしくは食べられる担体を用いる。これら組成物が、ゼラチンカプセル中において閉じ込められていても、錠剤（タブレット）へと圧縮されていてもよい。経口治療投与目的で、本発明の医薬組成物が、賦形剤と共に取り込まれていても、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁、シロップ、ウェハウス、チューイングガム、および同様のものの形で使用されていてもよい。
【００４３】
錠剤、ピル、カプセル、トローチ、および同様のものが、バインダー、レシピエント、崩壊剤、潤滑剤、甘味料、および香料も含有してもよい。ある幾つかの例のバインダーが、微結晶セルロース、トラガカントガム、もしくはゼラチンを包含する。賦形剤の例が、スターチもしくはラクトースを包含する。ある幾つかの例の崩壊剤が、アルギン酸、コーンスターチ、および同様のものを包含する。潤滑剤の例が、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸カリウムを包含する。ある１例の潤滑剤が、コロイド二酸化硅素である。ある幾つかの例の甘味料が、スクロース、サッカリン、および同様のものを包含する。香料の例が、ペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジ香料、および同様のものを包含する。これらの種々の組成物を調製していくのに使用された材料は、使用された量において、医薬として純粋で非毒性であるべきである。
【００４４】
本発明の組成物が容易に、例えば、静脈内、筋内、蜘蛛膜内、もしくは皮下注射によるような非経口で、投与され得る。非経口投与が、本発明の組成物を、溶液もしくは懸濁中に取り込んでいって達成され得る。このような溶液もしくは懸濁が、注射用水、生理食塩水、固定化油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、もしくは他の合成用溶媒のような無菌稀釈剤をも包含してもよい。非経口製剤が、例えば、ベンジルアルコールもしくはメチルパラベンのような抗菌剤、例えば、アスコルビン酸もしくは重亜硫酸ナトリウムのような抗酸化剤、ならびに、ＥＤＴＡのようなキレート剤をも包含してもよい。酢酸塩、クエン酸塩、もしくは燐酸塩のような緩衝剤（バッファー）、ならびに、塩化ナトリウム（食塩）もしくはデキストロースのような浸透圧調整剤も、加えられていてもよい。この非経口調製物が、アンプル、使い捨てシリンジ、または、ガラスもしくはプラスチックでできた多数回投薬バイアル中において閉じ込められ得る。
【００４５】
直腸投与が、該医薬組成物を、直腸もしくは大腸中に投与していくことを包含する。これは、坐薬もしくは浣腸を使用しながら達成され得る。坐薬製剤が容易に、当業界において知られた方法により、調製され得る。例えば、坐薬製剤が、グリセリンを約１２０℃に熱していき、該組成物を該グリセリンに溶かしていき、熱せられた該グリセリンを混ぜていき、この後、精製水が加えられてよく、この熱い混合物を坐薬型中に注いでいって、調製され得る。経皮投与が、該組成物の、皮膚を通しての経皮吸収を包含する。経皮製剤が、パッチ（よく知られたニコチンパッチのような）、外用薬、クリーム、ゲル、軟膏、および同様のものを包含する。
【００４６】
本発明は、哺乳類に、治療有効量の該組成物を、鼻から投与していくことを包含する。本明細書において使用された場合、鼻から投与もしくは経鼻投与が、該組成物を、患者の鼻道もしくは鼻腔の粘膜に投与していくことを包含する。本明細書において使用された場合、組成物の経鼻投与用医薬組成物が、よく知られた方法により調製された投与されるべき治療有効量の当該組成物を、例えば、鼻用スプレー、鼻用ドロップ、懸濁、ゲル、外用薬、クリーム、もしくは粉末として包含する。該組成物の投与が、鼻用栓もしくは鼻用スポンジを使用しながらでも、行われてもよい。
【００４７】
これらの実施形態の幾つかの態様において、本細胞が生存哺乳類において存在している場合、当該哺乳類が、炎症サイトカインカスケードにより媒介された病状を持つ。このような病状の非限定例が、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、もしくは十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性、偽膜性、急性、もしくは虚血性大腸炎、腸閉塞、憩室炎、喉頭蓋炎、無弛緩症、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、クローン病、腸管炎、ホウィップル病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合疾患、臓器虚血、再灌流障害、臓器壊死、枯草熱、敗血症、敗血、内毒素ショック、悪液質、超高熱、好酸球肉芽腫、肉芽腫症、類肉腫症、敗血症流産、副睾丸炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、気腫、鼻炎、膵嚢胞性繊維症、肺炎、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、インフルエンザ、気道多核ウィルス感染、ヘルペス感染、ＨＩＶ感染、Ｂ型肝炎ウィルス感染、Ｃ型肝炎ウィルス感染、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、糸状虫症、アメーバ症、包虫嚢胞、火傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日焼け、蕁麻疹、疣、蕁麻疹、血管炎、脈管炎、心内膜炎、動脈炎、粥状（アテローム）硬化症、血栓性静脈炎、心膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リューマチ熱、アルツハイマー病、腹腔病、鬱血性心不全、成人呼吸困難症候群、髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、脳梗塞、脳塞栓症、ギラン・バレー症候群、神経炎、神経痛、脊髄障害、麻痺、葡萄膜炎、関節炎、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、リューマチ関節炎、滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎、全身エリテマトーデス狼瘡、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、移植拒絶、移植対宿主病、Ｉ型糖尿病、強直性脊椎炎、ＩＩ型糖尿病、強直性脊椎炎、バージャー病、ルティエ症候群、およびホジキン病を包含する。ある幾つかの好ましい実施形態において、本病状が、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、もしくは十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性、偽膜性、急性、および虚血性大腸炎、肝炎、クローン病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、臓器虚血、再灌流障害、臓器壊死、枯草熱、敗血症、敗血、内毒素ショック、悪液質、敗血症流産、播種性菌血症、火傷、アルツハイマー病、腹腔病、鬱血性心不全、成人呼吸困難症候群、脳梗塞、脳塞栓症、脊髄障害、麻痺、移植拒絶、あるいは移植対宿主病である。最も好ましい実施形態において、本病状が、敗血症、敗血、もしくは内毒素ショック、消化性潰瘍、胃潰瘍、もしくは十二指腸潰瘍、潰瘍性、偽膜性、急性、もしくは虚血性大腸炎、腸閉塞、憩室炎、喉頭蓋炎、無弛緩症、胆管炎、胆嚢炎、クローン病、腸管炎、あるいはホウィップル病である。
【００４８】
これらの方法が、如何なる哺乳類にも有用であり、ラット、マウス、およびモルモットのような実験動物；馬、豚、牛、および羊のような家畜；犬、猫、ハムスター、およびフェレットのようなペット；動物園の動物のような飼育動物；ならびに、ヒトを包含している。好ましくは、該哺乳類が、ヒトである。
【００４９】
関連した実施形態において、本発明は、炎症サイトカインカスケードにより媒介された病状を患っている哺乳類を処置していく方法に関している。これら方法は、該哺乳類に、哺乳類メラノコルチン受容体（好ましくは、メラノコルチン−１受容体）を活性化させる上のペプチドのいずれかを、該炎症サイトカインカスケードを抑えるに充分な様式で、投与していくことを含む。
【００５０】
上記した関連方法を用いる場合、該ペプチドが、該哺乳類に、医薬組成物として、投与され得る。あるいは、該ペプチドが、該哺乳類に、導入遺伝子から当該ペプチドを発現している原核生物、もしくは、当該ペプチドの充分量を発現するよう選択された天然起源原核生物の投与により、または、該哺乳類の細胞に感染して当該ペプチドを発現していけるベクターを投与していくことにより、投与される。これら原核生物の投与が例えば、ピルとして、もしくは、食物中において、あり得る。このような原核生物が、これら自体を腸内ミクロ細菌叢において樹立していくことにより、共生効果を与え得、ここで、これらが継続して、当該ペプチドを産生する。
【００５１】
好ましい実施形態において、少なくとも１種の炎症サイトカイン、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１８、もしくはＨＭＧＢ１のレベルが、該哺乳類において、抑えられる。より好ましくは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、もしくはＨＭＧＢ１のレベルが、該哺乳類において、抑えられる。
【００５２】
これらの実施形態のある幾つかの態様において、本細胞が生存哺乳類において存在している場合、当該哺乳類が、炎症サイトカインカスケードにより媒介された病状を持つ。このような病状の非限定例が、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、もしくは十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性、偽膜性、急性、もしくは虚血性大腸炎、腸閉塞、憩室炎、喉頭蓋炎、無弛緩症、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、クローン病、腸管炎、ホウィップル病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合疾患、臓器虚血、再灌流障害、臓器壊死、枯草熱、敗血症、敗血、内毒素ショック、悪液質、超高熱、好酸球肉芽腫、肉芽腫症、類肉腫症、敗血症流産、副睾丸炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、気腫、鼻炎、膵嚢胞性繊維症、肺炎、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、インフルエンザ、気道多核ウィルス感染、ヘルペス感染、ＨＩＶ感染、Ｂ型肝炎ウィルス感染、Ｃ型肝炎ウィルス感染、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、糸状虫症、アメーバ症、包虫嚢胞、火傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日焼け、蕁麻疹、疣、蕁麻疹、血管炎、脈管炎、心内膜炎、動脈炎、粥状（アテローム）硬化症、血栓性静脈炎、心膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リューマチ熱、アルツハイマー病、腹腔病、鬱血性心不全、成人呼吸困難症候群、髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、脳梗塞、脳塞栓症、ギラン・バレー症候群、神経炎、神経痛、脊髄障害、麻痺、葡萄膜炎、関節炎、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、リューマチ関節炎、滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎、全身エリテマトーデス狼瘡、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、移植拒絶、移植対宿主病、Ｉ型糖尿病、強直性脊椎炎、ＩＩ型糖尿病、強直性脊椎炎、バージャー病、ルティエ症候群、およびホジキン病を包含する。
【００５３】
好ましくは、本病状が、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、もしくは十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性、偽膜性、急性、および虚血性大腸炎、肝炎、クローン病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、臓器虚血、再灌流障害、臓器壊死、枯草熱、敗血症、敗血、内毒素ショック、悪液質、敗血症流産、播種性菌血症、火傷、アルツハイマー病、腹腔病、鬱血性心不全、成人呼吸困難症候群、脳梗塞、脳塞栓症、脊髄障害、麻痺、移植拒絶、あるいは移植対宿主病である。最も好ましい実施形態において、本病状が、敗血症、敗血、もしくは内毒素ショック、消化性潰瘍、胃潰瘍、もしくは十二指腸潰瘍、潰瘍性、偽膜性、急性、もしくは虚血性大腸炎、腸閉塞、憩室炎、喉頭蓋炎、無弛緩症、胆管炎、胆嚢炎、クローン病、腸管炎、あるいはホウィップル病である。
【００５４】
他の好ましい実施形態において、前記哺乳類が、ヒトである。
【００５５】
本発明は更に、炎症サイトカインカスケードにより媒介された病状に関するリスクにある哺乳類を処置してく方法に関している。これら方法が、該哺乳類に、哺乳類メラノコルチン受容体（好ましくは、メラノコルチン−１受容体）を活性化させる上のペプチドのいずれかを、該炎症サイトカインカスケードを抑えるに充分な様式で、投与していくことを含む。
【００５６】
好ましい実施形態において、少なくとも１種の炎症サイトカイン、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１８、もしくはＨＭＧＢ１のレベルが、該哺乳類において、抑えられる。より好ましくは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、もしくはＨＭＧＢ１のレベルが、該哺乳類において、抑えられる。
【００５７】
これらの実施形態のある幾つかの態様において、本細胞が生存哺乳類において存在している場合、当該哺乳類が、炎症サイトカインカスケードにより媒介された病状を持つ。このような病状の非限定例が、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、もしくは十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性、偽膜性、急性、もしくは虚血性大腸炎、腸閉塞、憩室炎、喉頭蓋炎、無弛緩症、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、クローン病、腸管炎、ホウィップル病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合疾患、臓器虚血、再灌流障害、臓器壊死、枯草熱、敗血症、敗血、内毒素ショック、悪液質、超高熱、好酸球肉芽腫、肉芽腫症、類肉腫症、敗血症流産、副睾丸炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、気腫、鼻炎、膵嚢胞性繊維症、肺炎、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、インフルエンザ、気道多核ウィルス感染、ヘルペス感染、ＨＩＶ感染、Ｂ型肝炎ウィルス感染、Ｃ型肝炎ウィルス感染、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、糸状虫症、アメーバ症、包虫嚢胞、火傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日焼け、蕁麻疹、疣、蕁麻疹、血管炎、脈管炎、心内膜炎、動脈炎、粥状（アテローム）硬化症、血栓性静脈炎、心膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リューマチ熱、アルツハイマー病、腹腔病、鬱血性心不全、成人呼吸困難症候群、髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、脳梗塞、脳塞栓症、ギラン・バレー症候群、神経炎、神経痛、脊髄障害、麻痺、葡萄膜炎、関節炎、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、リューマチ関節炎、滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎、全身エリテマトーデス狼瘡、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、移植拒絶、移植対宿主病、Ｉ型糖尿病、強直性脊椎炎、ＩＩ型糖尿病、強直性脊椎炎、バージャー病、ルティエ症候群、およびホジキン病を包含する。
【００５８】
好ましくは、本病状が、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、もしくは十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性、偽膜性、急性、および虚血性大腸炎、肝炎、クローン病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、臓器虚血、再灌流障害、臓器壊死、枯草熱、敗血症、敗血、内毒素ショック、悪液質、敗血症流産、播種性菌血症、火傷、アルツハイマー病、腹腔病、鬱血性心不全、成人呼吸困難症候群、脳梗塞、脳塞栓症、脊髄障害、麻痺、移植拒絶、あるいは移植対宿主病である。最も好ましい実施形態において、本病状が、敗血症、敗血、もしくは内毒素ショック、消化性潰瘍、胃潰瘍、もしくは十二指腸潰瘍、潰瘍性、偽膜性、急性、もしくは虚血性大腸炎、腸閉塞、憩室炎、喉頭蓋炎、無弛緩症、胆管炎、胆嚢炎、クローン病、腸管炎、あるいはホウィップル病である。
【００５９】
他の好ましい実施形態において、該哺乳類が、ヒトである。
【００６０】
他の実施形態において、本発明は、哺乳類における炎症サイトカインレベルを抑制していく方法に関している。これら方法が、該哺乳類に、哺乳類メラノコルチン受容体（好ましくは、メラノコルチン−１受容体）を活性化させる上のペプチドのいずれかを、該炎症サイトカインレベルを抑制するに充分な様式で、投与していくことを含む。
【００６１】
これらの実施形態のある幾つかの態様において、該炎症サイトカインが、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１８、もしくはＨＭＧＢ１である。好ましくは、該炎症サイトカインが、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、もしくはＨＭＧＢ１である。
【００６２】
これらの方法を用いて、該哺乳類が好ましくは、炎症サイトカインカスケードにより媒介された病状を患っているかもしくはリスクにある。これらの実施形態の幾つかの態様において、本細胞が生存哺乳類において存在している場合、当該哺乳類が、炎症サイトカインカスケードにより媒介された病状を持つ。このような病状の非限定例が、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、もしくは十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性、偽膜性、急性、もしくは虚血性大腸炎、腸閉塞、憩室炎、喉頭蓋炎、無弛緩症、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、クローン病、腸管炎、ホウィップル病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合疾患、臓器虚血、再灌流障害、臓器壊死、枯草熱、敗血症、敗血、内毒素ショック、悪液質、超高熱、好酸球肉芽腫、肉芽腫症、類肉腫症、敗血症流産、副睾丸炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、気腫、鼻炎、膵嚢胞性繊維症、肺炎、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、インフルエンザ、気道多核ウィルス感染、ヘルペス感染、ＨＩＶ感染、Ｂ型肝炎ウィルス感染、Ｃ型肝炎ウィルス感染、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、糸状虫症、アメーバ症、包虫嚢胞、火傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日焼け、蕁麻疹、疣、蕁麻疹、血管炎、脈管炎、心内膜炎、動脈炎、粥状（アテローム）硬化症、血栓性静脈炎、心膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リューマチ熱、アルツハイマー病、腹腔病、鬱血性心不全、成人呼吸困難症候群、髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、脳梗塞、脳塞栓症、ギラン・バレー症候群、神経炎、神経痛、脊髄障害、麻痺、葡萄膜炎、関節炎、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、リューマチ関節炎、滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎、全身エリテマトーデス狼瘡、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、移植拒絶、移植対宿主病、Ｉ型糖尿病、強直性脊椎炎、ＩＩ型糖尿病、強直性脊椎炎、バージャー病、ルティエ症候群、およびホジキン病を包含する。
【００６３】
ある幾つかの好ましい実施形態において、本病状が、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、もしくは十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性、偽膜性、急性、および虚血性大腸炎、肝炎、クローン病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、臓器虚血、再灌流障害、臓器壊死、枯草熱、敗血症、敗血、内毒素ショック、悪液質、敗血症流産、播種性菌血症、火傷、アルツハイマー病、腹腔病、鬱血性心不全、成人呼吸困難症候群、脳梗塞、脳塞栓症、脊髄障害、麻痺、移植拒絶、あるいは移植対宿主病である。最も好ましい実施形態において、本病状が、敗血症、敗血、もしくは内毒素ショック、消化性潰瘍、胃潰瘍、もしくは十二指腸潰瘍、潰瘍性、偽膜性、急性、もしくは虚血性大腸炎、腸閉塞、憩室炎、喉頭蓋炎、無弛緩症、胆管炎、胆嚢炎、クローン病、腸管炎、あるいはホウィップル病である。
【００６４】
他の好ましい実施形態において、該哺乳類が、ヒトである。
【００６５】
上で論じたとおり、メラノコルチン−４受容体の低活性化を持つ個体が、体重オーバーであり気晴らしであるが、恐らく、彼らの食物摂取抑圧機構（メカニズム）が不全であるからである。これゆえ、本発明のペプチドを用いるこのような個体の処置が、体重オーバーの哺乳類の有効な処置であると期待されている。ＭＥＣＯ−１の食物摂取抑圧効果が、実施例３において確認されている。
【００６６】
これゆえ、本発明は加えて、体重オーバーの哺乳類を処置していく方法に関している。これら方法が、該哺乳類に、哺乳類メラノコルチン受容体、好ましくはメラノコルチン−４受容体を活性化させる上記したペプチドのいずれかを、投与していくことを含む。好ましくは、このペプチド投与が、該哺乳類において、体重減少を引き起こさせる。他の好ましい実施形態において、該哺乳類が、ヒトであるが、いずれの哺乳類においても、有効であると期待されている。
【００６７】
これらの方法の更なる好ましい実施形態において、該哺乳類が、メラノコルチン不全、好ましくはプロオピオメラノコルチン遺伝子不全によるものを持つ。
【００６８】
上記した関連方法を用いる場合、該ペプチドが、該哺乳類に、医薬組成物として、投与され得る。あるいは、該ペプチドが、該哺乳類に、導入遺伝子から当該ペプチドを発現している原核生物、もしくは、当該ペプチドの充分量を発現するよう選択された天然起源原核生物の投与により、または、該哺乳類の細胞に感染して当該ペプチドを発現していけるベクターを投与していくことにより、投与される。これら原核生物の投与が例えば、ピルとして、もしくは、食物中において、あり得る。このような原核生物が、これら自体を腸内ミクロ細菌叢において樹立していくことにより、共生効果を与え得、ここで、これらが継続して、当該ペプチドを産生する。
【００６９】
更なる実施形態において、本発明は、哺乳類において、食欲を減らしていき、食物摂取を減らしていき、体重を減らしていき、および／または、エネルギー変換を減らしていく方法に関している。これら方法が、該哺乳類に、哺乳類メラノコルチン受容体、好ましくはメラノコルチン−４受容体を活性化させる上のペプチドのいずれかを、該哺乳類において、食欲を減らし、食物摂取を減らし、体重を減らし、および／または、エネルギー変換を減らすに充分な様式で、投与していくことを含む。
【００７０】
ある幾つかの実施形態において、該哺乳類が体重オーバーである。好ましい実施形態において、該哺乳類が、ヒトであるが、いずれの哺乳類においても、有効であると期待されている。
【００７１】
上記した関連方法を用いる場合、該ペプチドが、該哺乳類に、医薬組成物として、投与され得る。あるいは、該ペプチドが、該哺乳類に、天然起源原核生物、もしくは、導入遺伝子から当該ペプチドを発現している原核生物の投与により（共生として）、または、該哺乳類の細胞に感染して当該ペプチドを発現していけるベクターを投与していくことにより、投与される。
【００７２】
本発明は、哺乳類の消化器系における先天免疫を阻害していく方法にも、関している。これら方法は、該哺乳類に、哺乳類メラノコルチン受容体（好ましくは、メラノコルチン−１受容体）を活性化させる上のペプチドのいずれかを、該哺乳類における先天免疫を阻害するに充分な様式で、投与していくことを含む。
【００７３】
好ましい実施形態において、該哺乳類が、ヒトであるが、いずれの哺乳類においても、有効であると期待されている。
【００７４】
上記した関連方法を用いる場合、該ペプチドが、該哺乳類に、医薬組成物として、投与され得る。あるいは、該ペプチドが、該哺乳類に、導入遺伝子から当該ペプチドを発現している原核生物の投与により、または、該哺乳類の細胞に感染して当該ペプチドを発現していけるベクターを投与していくことにより、投与される。
【００７５】
本発明のペプチドが、全メラノコルチン受容体を活性化させると期待されているので、これらペプチドが、メラノコルチン−４受容体を活性化させていくことにより、皮膚を暗くさせると期待されている。これゆえ、本発明は加えて、哺乳類の皮膚を暗くさせていく方法に関している。これら方法が、皮膚に、哺乳類メラノコルチン受容体を活性化させる上のペプチドのいずれかを、皮膚を暗くさせるに充分な様式で、投与していくことを含む。好ましくは、該哺乳類が、ヒトである。
【００７６】
本発明は、上のペプチドのメラノコルチン受容体刺激能力を評価していくｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイをも、提供する。本ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイは、実施例における盲腸結紮および穿刺（ＣＬＰ）手順に関与し；本ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、当該ペプチドの、細胞からの炎症サイトカイン放出を、阻害剤もしくはメラノコルチン受容体存在下にもしくは非存在下に、阻害できる能力に関与する（実施例参照）。
【００７７】
これゆえ、本発明は、上記したペプチドのいずれかのメラノコルチン受容体刺激能力を評価していく方法にも、関している。これら方法が、盲腸結紮および穿刺を受けた動物における敗血症を阻害できる当該ペプチドの能力を求めていくことを含む。敗血症の阻害が、当業界において知られた如何なる手段によっても、求められ得、当該動物の死の阻害、当該動物における細胞からの炎症サイトカイン放出の阻害の決定を包含しているがこれらに限られていない。
【００７８】
更なる実施形態において、本発明は、上記ペプチドのいずれかのメラノコルチン受容体刺激能力を評価してみる更なる方法に関している。これら方法が、当該ペプチドの、細胞からの炎症サイトカイン放出を、メラノコルチン受容体阻害剤存在下にもしくは非存在下に、阻害できる能力を求めていくことを含む。これらの実施形態の細胞が、炎症サイトカインを産生できる能力を持たなくてはならず（例えば、マクロファージもしくはマクロファージ様細胞−実施例参照）、通常、刺激されて炎症サイトカインを産生しなくてもならず、例えば、ＬＰＳ処置による。これゆえ、好ましい実施形態において、該細胞が、ＬＰＳを用いて処置されている。
【００７９】
メラノコルチン受容体のいずれの阻害剤も、ここで、使用され得る。ある幾つかの実施形態において、メラノコルチン受容体阻害剤が、ａｇｏｕｔｉである。
【００８０】
これらの方法のある幾つかの好ましい実施形態において、当該ペプチドのメラノコルチン受容体刺激能力が、もう１種別のメラノコルチン受容体刺激剤に相対的に、定量化される。
【００８１】
更なる実施形態において、本発明は、上記ペプチドのいずれかを産生している原核生物のメラノコルチン受容体刺激能力を評価してみる方法に関している。これら方法が、該原核生物を、哺乳類の腸管に投与してみることを含み、次いで、盲腸結紮および穿刺を受けている哺乳類における敗血症効果を阻害できる投与された原核生物の能力を求めてみる。
【００８２】
同様に、本発明は加えて、上記ペプチドのいずれかを産生している原核生物の、メラノコルチン受容体刺激能力を評価していく他の方法に関している。これら方法が、該原核生物を、炎症サイトカインを産生していくことのできる細胞と組み合わせてみることを含み、次いで、細胞からの炎症サイトカイン放出を、メラノコルチン受容体阻害剤存在下にもしくは非存在下に阻害できる該原核生物の能力を求めてみる。上記方法に似て、該細胞が好ましくはＬＰＳを用いて処置されており、その阻害剤が好ましくはａｇｏｕｔｉである。
【００８３】
本発明のペプチドを作っている原核生物のメラノコルチン受容体刺激能力を評価してみる上の方法が、天然起源原核生物（例えば、食物に共生として加えられ得るもの）を用いて、もしくは、遺伝子導入により当該ペプチドを産生する原核生物を用いて、使用され得る。
【００８４】
本発明は、食物摂取を、哺乳類において増やしていく方法にも、関している。これら方法が、ＭＥＣＯ−１活性を、該哺乳類において抑圧していくことを含む。
【００８５】
これらの方法は、ＭＥＣＯ−１活性を、該哺乳類において抑圧していく如何なる特定の方法にも、限られていない。ＭＥＣＯ−１活性が、ＭＥＣＯ−１アンタゴニストを、該哺乳類に投与していくことにより、抑圧されている。ここで、特異的にＭＥＣＯ−１に結合する抗体もしくはアプタマーが包含されている。ＭＥＣＯ−１アンタゴニストであるペプチドもしくは小有機化合物も、既知の方法により、調製され得る。ＭＥＣＯ−１活性が、該哺乳類を、ＭＥＣＯ−１に対して免役していくと、抑圧される。
【００８６】
これらの方法が特に、酪農動物に有用であり、当該動物の腸の微生物からのＭＥＣＯ−１および類似化合物の食物摂取抑圧能力を阻害する。これらの方法が、摂食疾患を有するかもしくは消耗を引き起こす疾患を有するヒトにも、使用され得る。
【００８７】
本発明の好ましい実施形態が、以降の実施例において記載されている。本明細書における請求項の範囲内の他の実施形態が、本明細書において開示されたとおりの本発明の特定もしくは実際の考慮から、当業者に対して明らかとなる。これら実施例と一緒に本明細書が、例示的なだけであると意図されていると共に本発明の範囲および精神が、本願請求項により指し示されており、これら実施例に続く。
【実施例】
【００８８】
実施例１．Ｅ．ｃｏｌｉから放出されたペプチドが、敗血症マウスを死から救うに当たり、α−ＭＳＨよりも、潜在能力がある
実施例のまとめ
ＭＥＣＯ−１が、新規なＥ．ｃｏｌｉペプチドであり、条件を整えられた培地から単離されたが、この構造が、延長因子−Ｇ（ＥＦ−Ｇ）の３３アミノ酸Ｃ−末端に対応する。ＭＥＣＯ−１の合成複製体が、非経口投与された場合、これが、ヒトメラノコルチンα−ＭＳＨを、腹腔炎および敗血症を伴う孔の開いた虫垂実験モデルたる盲腸結紮および穿刺（ＣＬＰ）による死から、マウスを救い出すことにおいて、模倣した。ＣＬＰを有するこれらのマウスにおいて、ＭＥＣＯ−１およびα−ＭＳＨの投与も、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、インターロイキン（ＩＬ）−６、および高移動グループボックス蛋白１（ＨＭＧＢ１）の血清レベルの上昇を平滑化させたが、３種の＜＜炎症サイトカインカスケード＞＞サイトカインが、敗血症と他の炎症の病気もしくは病状と関連した罹患率および致死率に寄与する。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、リポ多糖／内毒素（ＬＰＳ）に応答しているマウスマクロファージ様ＲＡＷ２６４．７細胞からのＨＭＧＢ１の放出が顕著に、１００ｐＭでの、ＭＥＣＯ−１、α−ＭＳＨ、およびＡＣＴＨにより、平滑化された。同様に、ＲＡＷ細胞からのＨＭＧＢ１により発生させられたＴＮＦ放出の何倍もの増加が実質的に、１ｐＭでの、ＭＥＣＯ−１、α−ＭＳＨ、およびＡＣＴＨにより、消失させられた。単離されたてのヒト末梢血単核細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて培養され、次いで、ＨＭＧＢ１に晒された場合、ＴＮＦ放出の顕著な高まりが、ピコモル濃度の、ＭＥＣＯ−１、α−ＭＳＨ、およびＡＣＴＨにより、平滑化された。ＴＮＦ放出へのＨＭＧＢ１の効果を平滑化させるＭＥＣＯ−１のおよびα−ＭＳＨの特性が、メラノコルチン−１受容体（ＭＣ１Ｒ）をブロックする２種の物質により妨げられたが、これらが、（ｉ）この受容体に対する抗体および（ｉｉ）ＭＣ１Ｒへのメラノコルチンの効果をブロックする内因性ペプチドたるａｇｏｕｔｉである。Ｅ．ｃｏｌｉから放出されたＭＥＣＯ−１、および、他の大腸内バクテリアからのこれのような他のペプチドが、宿主細胞上のメラノコルチン−１受容体（ＭＣ１Ｒ）と継続して相互作用し、炎症応答を抑圧すると仮定されている。バクテリアに対するおよびバクテリア成分に対するこの応答におけるこの宿主の先天免疫系のこの抑圧が恐らく、非常に大きく濃い塊の微生物を、この宿主内で協調して共存させるのに必要である。古典的な原炎症効果と腸管叢中のバクテリアの新たに記載された抗炎症効果との間の平衡（バランス）における乱れが、ヒトの病気における役割を演じることがある。
【００８９】
はじめに
ここで、腸叢の古典的構成員たるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉが、潜在的メラノコルチン様ペプチドを放出し、これが低ピコモル濃度において積極的に、先天免疫系成分をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて抑圧し得、致死的な敗血症からマウスを救い出すことにおいて、少なくともα−メラノサイト刺激ホルモン（ＭＳＨ）と同じく潜在的であることが、示されている。これが、これら腸バクテリア自体が通常、ホルモン様分子を産生しているとの示唆に至り、これらが、その宿主の先天免疫系を、その宿主の内因性ホルモン特異的受容体と相互作用していくことにより、抑圧する。
【００９０】
総じて合成の培地において育ったＥ．ｃｏｌｉが急速に、１種以上のメラノコルチン関連ペプチドを、該培地中に放出する。これらのうちの１種が、３３アミノ酸ペプチド（配列ＩＤ番号：１）であり、この延長因子−Ｇ（ＥＦ−Ｇ）のＣ−末端に対応し、本明細書において、特徴化されている。このペプチドが、合成複製体の形でテストされたが、一連の抗ＡＣＴＨ抗体と相互作用し、ラット副腎からのコルチコステロン放出も、力強く刺激する（α−ＭＳＨとおよそ同様）。ここで、このペプチドが、α−ＭＳＨのように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、マクロファージ上のＭＣ１Ｒと低ピコモル濃度において相互作用し、早期に敗血症において放出された２種のサイトカインたる腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αおよびインターロイキン−６（ＩＬ−６）の放出を阻害することが、樹立されている。これは、敗血症由来の死にリンクされている潜在的な後期に放出されたサイトカインたるＨＭＧＢ１産生も、阻害する（Ｄｕｍｉｔｒｉｕら、２００５年；ＬｏｔｚｅおよびＴｒａｃｅｙ、２００５年；Ｙａｎｇら、２００５年；Ｗａｎｇら、２００４年；Ｗａｎｇら、１９９９年；Ｌｉら、２００４年；Ｌｉら、２００３年）。
【００９１】
Ｅ．ｃｏｌｉ由来のペプチド（＜＜メラノコルチン−Ｅ．ｃｏｌｉ−１＞＞もしくはＭＥＣＯ−１と命名され、ＭＥＥ−ｋｏｅ−ｗｕｎと発音された）が少なくとも、ヒトにおける腹腔炎を伴う孔の開いた虫垂に似ている実験モデルたる盲腸結紮および穿刺により誘導された致死的な敗血症からマウスを救い出すことにおいて、α−ＭＳＨと同じく潜在的である。
【００９２】
材料および方法
材料
組み換えラットＨＭＧＢ１が、以前記載されたとおり調製され（Ｗａｎｇら、１９９９年）、ポリミキシンＢカラムを通過させられ、如何なるＬＰＳ混入をも、除去した；ＬＰＳ混入のＨＭＧＢ１を遊離させるのに使用された手順の詳細が他でも（Ｌｉら、２００４年）、カバーされている。最終のＬＰＳ含量が、カブトガニアメーバ細胞溶解物（ＬＡＬ）アッセイ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｉｎｃ．、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を使用しながら求められ、以前記載されたとおりであった（Ｌｉら、２００４年；Ｌｉら、２００３年）。ＬＰＳ（ＬＰＳ、Ｅ．ｃｏｌｉ．０１１１：Ｂ４）およびマクロファージコロニー刺激因子が、シグマ・ケミカル（セント・ルイス、ＭＯ）から購入された。抗ＭＣ１Ｒ抗体が、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）から購入された。マウスａｇｏｕｔｉ（９３〜１３２）−ＮＨ２が、Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｌｍｏｎｔ、ＣＡ）から購入された。ＡＣＴＨ（１〜３９）およびα−ＭＳＨが、Ｂａｃｈｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．（Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ、ＰＡ）から得られた。
【００９３】
ペプチド合成
ＭＥＣＯ−１（Ｅ．ｃｏｌｉの延長因子−ＧのＣ−末端に等価な３３アミノ酸ペプチド）が合成され、ユタ州立大学バイオテクノロジーセンターにおいて（Ｌｏｇａｎ、ユタ、米国）、８８．９％純度においてＨＰＬＣ精製された。ＬＰＳは、この合成ペプチド調製物において、上で記載されたとおりカブトガニアメーバ細胞溶解物（ＬＡＬ）アッセイ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｉｎｃ．、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）により測定された場合、検出可能でなかった。
【００９４】
ＭＥＣＯ−１のアミノ酸配列の比較
コンピューター支援データーベースを使用しながら、適合（マッチング）配列が、ＢＬＡＳＴネットワークサービス（ｈｔｔｐ：／／ｃａ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｂｌａｓｔ，ＥｘＰＡＳｙ  ＢＬＡＳＴ２  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）を使用しながら、ＭＥＣＯ−１と比較された。両ペプチド配列が整列され、対での％での類似性が、Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｐｅａｒｓｏｎの整列プログラム（マトリックスファイル：ＢＬＯＳＵＭ５０を使用しており、ギャップ・ペナルティー：−１４／−４）を使用しながら、算出された（ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ）（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４年）（図１）。
【００９５】
動物実験
Ｉｎ  ｖｉｖｏにおける研究が、ＮＩＨのガイドラインならびに北海岸ロングアイランドユダヤ健康システム研究所動物愛護および使用委員会（ＩＡＣＵＣ）の認可に従って、実施された。マウスにおいて、敗血症が、盲腸の外科結紮および穿刺により誘導されたが、広く使用された技術であり、盲腸結紮および穿刺（ＣＬＰ）として知られている（Ｗｉｃｈｍａｎｎら、１９９６年）。端的に、雄のＢＡＬＢ／ｃマウス（７〜８週齢、２０〜２５ｇ）が、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（８ｍｇ／ｋｇ）の混合物を筋内で用いて麻酔され、１５ｍｍ中線切開がなされ、盲腸を露出させた。６．０絹縫合糸を用いた、回盲−盲腸弁接合部下での盲腸結紮後、この結紮された盲腸の切り口が一旦、２２−ゲージ針を用いて、孔を開けられた。盲腸が次いで丁寧に絞られ、少量の糞便を、この孔の部位を通して、押し出した。盲腸が、その通常の腹内の位置に再保管され、この開腹が、６．０絹縫合糸を用いて閉じられた。ＣＬＰ術直後、全動物が、通常の生理食塩水溶液（皮下２０ｍＬ／ｋｇ体重）を用いて蘇生され、単回用量の抗生物質（プリマキシン０．５ｍｇ／ｋｇ）を与えられた。擬似手術された動物において、盲腸が一時的に結紮されたが、腸は穿刺されなかった；これら動物が、抗生物質処置および蘇生液を受けた。全動物が次いで、彼らの籠（ケージ）に戻され、食餌および水に自由にアクセスさせた（Ｙａｎｇら、２００４年）。ＣＬＰ後２４時間において、動物が無作為に（ランダムに）グループ分けされ、ＭＥＣＯ−１（０．５もしくは５ｍｇ／ｋｇ）、α−ＭＳＨ（５ｍｇ／ｋｇ）、もしくはコントロールビヒクル（等張生理食塩水、０．２ｍＬ）を、腹腔内で、ＣＬＰ後２４時間において受け取った。プロトコルＡにおいて、ペプチド（もしくはビヒクル）が日に２回、術後の、第２日、第３日、および第４日に投与された。生存者が日に２回２週間、モニターされた。平行実験たるプロトコルＢにおいて、ペプチドもしくはビヒクルが１回、２４時間において投与された。生存者が術後日に２回、モニターされた。全動物が４０時間において殺され、選択されたサイトカインの血清レベルを測定した。
【００９６】
細胞培養
マウスマクロファージ様ＲＡＷ２６４．７細胞が、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得られ、Ｄｕｌｂｅｃｃｏの修飾Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）において成育され、これは、１０％（体積／体積）加熱不活化牛胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂ．Ｉｎｃ．、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）、ペニシリン１００Ｕ／ｍＬ、およびストレプトマイシン１００ｍｇ／ｍＬ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｉｎｃ．、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を含有していた。細胞が、培地に再懸濁され、２４−および４８−ウェル組織培養プレートにおいて終夜、湿ったインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）において、インキュベートされた。成長培地が除去され、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  無血清培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）により、終夜置き換えられた。これら実験において、細胞の単層が、ＨＭＧＢ１もしくはＬＰＳを用いて、ＭＥＣＯ−１もしくはα−ＭＳＨ非存在下にもしくは存在下に刺激され；無細胞上清が、ＴＮＦ用にＥＬＩＳＡにより、もしくは、ＨＭＧＢ１用にウェスタンブロットにより、アッセイされた。
【００９７】
ヒト末梢血単核細胞が、密度勾配により、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＴＭ  ＰＬＵＳ遠心（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を通して単離され、ＲＰＭＩ  １６４０に再懸濁され、これは、１０％（体積／体積）加熱不活化ヒト血清（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｉｎｃ．、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）、ペニシリン１００Ｕ／ｍＬ、およびストレプトマイシン１００ｍｇ／ｍＬを含有しており、３７℃において、５％ＣＯ２雰囲気を有する湿ったインキュベーター中において、終夜インキュベートされた。非接着細胞が、捨てられた。接着単球が２回、ＰＢＳを用いて洗浄され、次いで、１２−および２４−ウェル組織培養プレートに再懸濁され、更に、２．５ｎｇ／ｍＬのマクロファージコロニー刺激因子を用いて富栄養化された同一培地において、５〜７日間インキュベートされた（Ｒｅｎｄｏｎ−Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、２００３年）。この成長培地が除去され、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  無血清培地により、終夜置き換えられた。細胞の単層が、ＨＭＧＢ１と共に、ＭＥＣＯ−１もしくはα−ＭＳＨ非存在下にもしくは存在下にインキュベートされ、上清が、ＴＮＦ用にアッセイされた。
【００９８】
ウェスタン免疫（免役）ブロット解析
培養培地もしくはマウス血清におけるＨＭＧＢ１のレベルが、ウェスタン免疫ブロットにより、以前記載されたとおり（Ｗａｎｇら、１９９９年）測定された。ウェスタンブロットが、銀画像（イメージ）スキャナー（Ｓｉｌｖｅｒｓｃａｎｅｒ  ＩＩ、Ｌａｃｉｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ、ＯＲ）を用いてスキャンされ、その相対的バンド強度が、ＮＩＨ画像１．５９ソフトウェアを使用しながら、定量化された。ＨＭＧＢ１のレベル（％最大効果として表現された）が、精製ｒＨＭＧＢ１を用いて発生された標準曲線を参照して算出され、４実験の平均±ＳＥＭとして表現された。
【００９９】
サイトカインアッセイ
ＴＮＦおよびＩＬ−６の濃度が各々、市販の酵素リンク免疫（免役）吸光アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ．、ミネアポリス、ＭＮ）を使用しながら、以前記載されたとおり求められた（Ｒｅｎｄｏｎ−Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、２００３年）。ＴＮＦもしくはＩＬ−６のレベルが、標準曲線を参照して、算出された。
【０１００】
統計解析
Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ解析が使用され、マウス生存者における差の統計的有意さを求めた。Ｐ≦０．０５が、有意であると見なされた。本図面における値が、独立の２〜３実験の平均±ＳＥＭとして表現されたが、ここで、各実験の点が、２重もしくは３重由来であった。Ｓｔｕｄｅｎｔの２尾ｔ−検定が使用され、群（グループ）間でこれら平均を比較した。Ｐ−値０．０５未満が、統計的に有意と見なされた。
【０１０１】
結果
ＭＥＣＯ−１が、ＬＰＳ誘導致死率に対して、保護する
致死用量のリポ多糖（リポポリサッカライド）内毒素を用いて注射されたマウスが、α−ＭＳＨ、もしくは、Ｅ．ｃｏｌｉから放出されたメラノコルチンたるＭＥＣＯ−１の同時投与により、救われた（図２Ａ）。２実験において、生理食塩水処理マウスのうちのいずれも、生き残らなかった（１９匹のうちの０匹）一方、ＭＳＨが２５％（２０匹のうちの５匹）を救い、ＭＥＣＯ−１が５０％（３０匹のうちの１５匹）を救った。
【０１０２】
ＭＥＣＯ−１が、ＣＬＰ誘導致死率に対して、保護する
盲腸結紮および穿刺（ＣＬＰ）、腹腔炎を伴う孔の開いた虫垂に似ている敗血症モデルマウスを用いて、これらマウスのうちの、５０％だけが第３日まで、１５％が第１４日まで、生きていた（図２Ｂ）。α−ＭＳＨが、予期されたとおり（Ｃａｔａｎｉａら、２００４年；Ｄｅｌｇａｄｏら、１９９８年）顕著に、生存を第１４日において、５０％前後にまで、向上させた（図２Ｂ）。ＭＥＣＯ−１が少なくとも有効であったが（図２Ｂ）、こうして、比較できる（もしくは更により小さい）用量において、これらマウスのうちの８０％が生き残った（ｐ＜０．０１）。注射が、術後２４時間において開始され、第４日を通して継続された（日に２回、合計６用量投与された）。３実験において、ＣＬＰを有する動物の２３％（３９匹のうちの９匹）が生き残った。α−ＭＳＨを用いると、６８％（２２匹のうちの１５匹）が生き残った一方、ＭＥＣＯ−１を用いると、６６％（６４匹のうちの４２匹）が生き残った。高用量のＭＥＣＯ−１が、ｍｇ／ｋｇで、高用量のα−ＭＳＨに等しいが、モル基準で、半分未満であることを記す。低用量のＭＥＣＯ−１が、高用量のＭＥＣＯ−１よりも、１０分の１未満であり、高用量のα−ＭＳＨよりも、モル基準で、１２分の１未満である。このデーターが、マウスを死から保護していくことにおいて、ＭＥＣＯ−１が、α−ＭＳＨよりも、３０倍潜在的であるように見える一方、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて（図４）、これらが、およそ等しく潜在的であることを指し示す。
【０１０３】
ＭＥＣＯ−１が、血清サイトカインのＣＬＰ誘導上昇を、弱める
平行実験において（「方法」においてプロトコルＢと命名）、擬似手術もしくはＣＬＰが実施された；１処置が（ペプチドもしくは生理食塩水）、２４時間において；そして４０時間において与えられ、血清サイトカインが測定された（図３）。これらＣＬＰ手術生理食塩水処理動物の９匹のうちの４匹だけが、４０時間にまで生き残った。これら生存者が、敗血症早期段階の特徴的な２種のサイトカインたるＴＮＦおよびＩＬ−６の、非常に高い血清レベルを持った。１０匹のα−ＭＳＨ処理動物のうちの６匹、ならびに、ＭＥＣＯ−１処理動物のうちの全１０匹が、４０時間にまで生き残った。これら生存者において、４０時間において、α−ＭＳＨおよびＭＥＣＯ−１処理動物が、ＴＮＦのおよびＩＬ−６の有意に（ｐ＜０．０５）静まった応答を示した。主要な遅効性サイトカインたるＨＭＧＢ１が、４匹の生理食塩水処理ＣＬＰ動物のうちの３匹において上昇したが、α−ＭＳＨもしくはＭＥＣＯ−１を用いて処理されたもののうちのいずれにおいても、上昇しなかった（図３）。
【０１０４】
ＭＥＣＯ−１が、マクロファージによるＬＰＳ誘導ＨＭＧＢ１放出を、抑圧する
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞系が用いられており、更に、原炎症サイトカインへのＭＥＣＯ−１の効果を探索した。図４が、４実験の複合であるが、終夜インキュベート後のマクロファージ様ＲＡＷ細胞によるＨＭＧＢ１のＬＰＳ誘導放出が有意に、α−ＭＳＨにより、および、ＭＥＣＯ−１により、１００ｐＭ（ｐ＜０．０１）において平滑化されていることを示す。ＡＣＴＨ（１〜３９）が、同一モル濃度において、α−ＭＳＨから区別不可能な結果を与えた。
【０１０５】
ＭＥＣＯ−１が、ＨＭＧＢ１誘導ＴＮＦ放出を、抑圧する
ＨＭＧＢ１が、ＲＡＷ細胞によるＴＮＦ放出の急速な何倍もの増加を刺激し、これは実質的に、１ｐＭおよび１００ｐＭのＭＥＣＯ−１（図５Ａ）およびα−ＭＳＨ（図５Ｂ）により、平滑化されている。ＨＭＧＢ１放出へのこれら２種のペプチドの平滑化効果が、ＬＰＳ添加後４〜１６時間の期間に亘り観察され（図５Ａ、Ｂ）、最大差が、６時間において検出された。６時間のインキュベートを用いると、両ペプチドが用量依存性を示し、有意な効果が両方とも１０−１４Ｍにおいて記された（図５Ｃ、Ｄ）。ＡＣＴＨ（１〜３９）が、非常に似ている結果を与え（データーは示さなかった）、高度に有意な抑圧を、ピコモル以下の範囲において有した。
【０１０６】
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いると、α−ＭＳＨおよびＭＥＣＯ−１が、ＨＭＧＢ１誘導ＴＮＦ放出の非常に似ている減衰を引き起こし、ピコモル範囲において有意な効果を有した（図６）。ＡＣＴＨ（１〜３９）が、非常に似ている結果を与えた（データーは示さなかった）。
【０１０７】
ＭＥＣＯ−１およびα−ＭＳＨの効果が、ＭＣ１Ｒブロッカーにより、ブロックされている
ＭＥＣＯ−１およびα−ＭＳＨの効果の完全な中和が、メラノコルチン−１受容体（ＭＣ１Ｒ）に対して向けられた抗体を用いて得られた（図７）。これは、他の直接の（つまり、超アドレナリン的）＜＜抗炎症＞＞過程（プロセス）（Ｃｏｎｅ、２０００年；Ｃａｔａｎｉａら、２００４年；Ｄｅｌｇａｄｏら、１９９８年）同様、マクロファージ／単核細胞へのα−ＭＳＨの殆ど全ての効果のメディエーターとして関連付けられた受容体である。α−ＭＳＨおよびＭＥＣＯ−１を用いると、抗メラノコルチン−１受容体抗血清が、ＴＮＦ放出を復旧させ、ＨＭＧＢ１単独を用いて達成されたレベルと等しくなったことを記す（加えられたα−ＭＳＨおよびＭＥＣＯ−１非存在下に）。対照的に、Ｌｉｐｔｏｎらが、受容体抗体が、ＴＮＦ放出を引き起こし、ＬＰＳ単独により誘導されたものを超えたことを見出し、彼らは、マクロファージが、内因性α−ＭＳＨを放出したことを提案した（Ｔａｈｅｒｚａｄｅｈら、１９９９年）。
【０１０８】
ａｇｏｕｔｉ（Ｃｏｎｅ、２０００年）は、ＭＣ１Ｒを介したα−ＭＳＨ作用のｉｎ  ｖｉｖｏにおけるアンタゴニストであるが、α−ＭＳＨおよびＭＥＣＯ−１によるＬＰＳ誘導ＴＮＦ放出の減衰を保存した。ａｇｏｕｔｉ＋ＬＰＳが、ＴＮＦレベルを有意に、ＬＰＳ単独を用いて観察されたものの上に高めたことを記し（表１）、これは、ＭＣ１Ｒ受容体が、ａｇｏｕｔｉによりスイッチオフされ得る画定している基礎活性を持つとの最近の観察と一致しており（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｍａｓら、２００４年）、これは、逆アゴニストとして作用し、ＭＣ１Ｒの抗炎症基礎特性を抑圧する（Ｃｈａｉら、２００３年）。
【０１０９】
【表１】
2009506773.tif 000002
【０１１０】
受容体後経路
メラノコルチン受容体が、ＭＣ１Ｒを包含して、典型的に、Ｇ−蛋白を介して、アデニル酸環化酵素（シクラーゼ）ｃＡＭＰおよび蛋白キナーゼＡにリンクされている。ＲＡＷ細胞において、ＡＣＴＨおよびＭＳＨが、ｃＡＭＰ産生を、用量依存的に刺激した（図８）。ＭＥＣＯ−１が、非常に似ている結果を与えた（図８）。最高濃度において、これら３種のペプチドが、ｃＡＭＰを、同一の系において殆どフォルスコリン単独により達成されたレベルにまで刺激した（データーは示さなかった）。１実験において、抗ＭＣ１Ｒ抗体の添加が、その曲線を、ｃＡＭＰのＭＥＣＯ−１刺激に関し、３ｌｏｇ単位右にシフトさせた（データーは示さなかった）。ＬＰＳ４ｎｇ／ｍＬもしくはＨＭＧＢ１  １００ｎｇ／ｍＬを用いた同時インキュベート（６実験）が、ｃＡＭＰ刺激への僅かな効果しか持たなかった（データーは示さなかった）。
【０１１１】
蛋白キナーゼＡの役割
蛋白キナーゼＡの役割を実証するために、ＲＡＷ細胞が、ＨＭＧＢ１と共にインキュベートされた。ＴＮＦの蓄積が顕著に増強され、ＴＮＦの蓄積が実質的に、範囲１０−１２〜１０−１８モル中の濃度における、ＭＥＣＯ−１、α−ＭＳＨ、もしくはＡＣＴＨを用いた同時インキュベートにより、抑制された。蛋白キナーゼＡ特異的阻害剤たるＨ８９の添加が、これら３種のペプチドの効果を阻害した（図９）。実際、ＴＮＦの蓄積が、Ｈ８９の存在下に、しばしば、ＨＭＧＢ１単独により得られたものを超えた。これら結果が、実験が、ヒトから得られたての末梢血単核細胞を用いて繰り返された場合（データーは示さなかった）、抜群に似ていた。
【０１１２】
核因子−κＢ（ＮＦ−κＢ）への効果
増強されたサイトカイン放出を用いたマクロファージの活性化が、サイトカイン関連現象の主要なレギュレーターである核転写因子ＮＦ−κＢの活性の増大と関連している多くの免疫系のシナリオの１つである。ＭＥＣＯ−１およびα−ＭＳＨが、これらがマクロファージからのサイトカイン放出を弱めた条件下に、ＮＦ−κＢ活性の高まりを弱めていくことにおいて、等しく活性であった。これは、ＭＣ１Ｒを介して媒介されたα−ＭＳＨ媒介抗炎症効果が、ＮＦ−κＢ活性化の減弱と関連していたことを示した他の結果と調和している（Ｃａｔａｎｉａら、２００４年）。
【０１１３】
構造機能：ＬＰＳ刺激ＴＮＦ放出の阻害
マクロファージ様ＲＡＷ細胞が、ＬＰＳ４ｎｇ／ｍＬ存在下に、約１０倍多いＴＮＦを、培地において６時間に亘り蓄積する。手を付けられていないＭＥＣＯ−１（つまり、１〜３３）が、１ｐＭにおいて、ＴＮＦ蓄積を３０％以上、１０ｎＭにおいて、約７０％抑圧する。ＭＥＣＯ−１の合成断片（１〜１９、８〜２７、および１８〜３３）が個々におよび組み合わせて、１，０００〜１０，０００倍より不活性であったが；１０ｎＭにおいて、我々が、約３０％のＴＮＦ放出の抑圧を観察した。
【０１１４】
ＭＥＣＯ−１は、Ｅ．ｃｏｌｉの延長因子−Ｇ（ＥＦＧ）の３３アミノ酸のＣ−末端であるが、原核生物および真核生物の両方の数多くの微生物のＥＦＧのＣ−末端と、構造的類似性を分かち合う（図１Ｃ）。Ｅ．ｃｏｌｉは、ヒトにおける通常の腸叢の少数派の構成員である。通常の叢の主要な代表の２種であるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓおよびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎのＣ−末端の合成複製体が、テストされた。両方が、多くのアミノ酸の置換にもかかわらず、ＴＮＦ放出を全範囲の用量応答曲線に亘り抑圧していることにおいて、ＭＥＣＯ−１とおよそ同じく活性であった。Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓに関して、表１Ｃにおいて示された残基６８１〜７０３からなっている３３量体が、７０４〜７１３＝ＱＤＫＬＩＫＤＦＥＳにより伴われて、使用された。Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎに関して、表１Ｃにおいて示された残基６８１〜７０３からなっている３８量体が、７０４〜７１８＝ＱＤＫＬＩＫＤＦＥＡＫＱＴＥＥにより伴われて、使用された。
【０１１５】
同様の結果が、ヒトミトコンドリアのＥＦＧのＣ−末端でできた合成複製体を用いて得られた（ＥＦＧ−１に関して２８アミノ酸およびＥＦＧ−２に関して３３アミノ酸、図１Ｂにおいて示されたとおり）。これらＥＦＧの両方が、核ＤＮＡにおいてコードされているが、ミトコンドリアに輸送され、ここでこれらが、ミトコンドリアの蛋白産生用の延長因子として、機能する。これらミトコンドリアのＥＦＧのＣ−末端が互いに対して、各々がＥ．ｃｏｌｉの構造に対するように、類似している（図１Ｂ）。合成複製体が各々、多くのアミノ酸の置換にもかかわらず、ＴＮＦ放出を全範囲の用量応答曲線に亘り抑圧していることにおいて、ＭＥＣＯ−１と同じく活性である。
【０１１６】
議論
孔の開いた虫垂の実験モデルたるマウスが盲腸結紮および穿刺（ＣＬＰ）に付されている場合、広範な大部分が、敗血症により１〜２週以内で死ぬ（Ｙａｎｇら、２００４年；Ｃａｔａｎｉａら、２００４年）。メラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）が、術後２４時間から開始して３日間与えられたが、これらマウス（マイス）を、用量依存的に救った。ＭＥＣＯ−１が少なくとも、これらマウスを致死的な敗血症から救い出すことにおいて、α−ＭＳＨと同じく潜在的であった。殆どの形の敗血症において、盲腸結紮により産生されたものを包含して、当該動物の死が、その宿主の広範な細胞型から放出された豊富なメニューのサイトカインにより引き起こされている。早期サイトカインの間で、我々は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびインターロイキン（ＩＬ）−６を研究した。盲腸結紮後４０時間において測定されたのだが、ＴＮＦおよびＩＬ−６の両方の血清レベルが、予期されたとおり上昇した。２４時間における１用量のＭＳＨもしくはＭＥＣＯ−１の投与が、これらのサイトカインの両方のレベルを抑制した。
【０１１７】
敗血症における致死率に寄与している非常に重要なサイトカインが、高移動グループボックス１（ＨＭＧＢ１）であることが、知られている（ＬｏｔｚｅおよびＴｒａｃｅｙ、２００５年；Ｙａｎｇら、２００５年；Ｙａｎｇら、２００４年）。このヌクレオゾーム蛋白（この役割から、ある１種の転写因子として分離）が、ＬＰＳおよび敗血症からの死の潜在的な遅効性の体液性メディエーターである。ＨＭＧＢ１を抗体を用いてブロックし、もしくは、特異的な受容体ブロックペプチドを用いて細胞に対するその結合をブロックすると、動物を、敗血症開始後２４時間もの遅きに開始された場合でさえ、致死率から救う（ＬｏｔｚｅおよびＴｒａｃｅｙ、２００５年；Ｙａｎｇら、２００５年；Ｙａｎｇら、２００４年）。この研究において、α−ＭＳＨおよびＭＥＣＯ−１の両方が顕著に、敗血症により産生されているＨＭＧＢ１の上昇したレベルを抑えた。我々は、これらマウス（マイス）の救出を、サイトカイン放出の制御（コントロール）、特に、ＨＭＧＢ１レベルの顕著な抑制に帰する。
【０１１８】
哺乳類において、原炎症剤および抗炎症剤が、戦争のさなかにあり、微生物の侵入者に打ち勝ち、尚、その宿主体を、これ自体の先天免疫系の傷害効果により殺傷されていくことから防ぐことを狙っている（ＪａｎｅｗａｙおよびＭｅｄｚｈｉｔｏｖ、２００２年；ＰａｓａｒｅおよびＭｅｄｚｈｉｔｏｖ、２００４年；Ｈｏｅｂｅら、２００４年）。典型的に、バクテリアは、原炎症性である。Ｅ．ｃｏｌｉが、潜在的な抗炎症ペプチドを放出するとの認識は、これら微生物が同様に、原炎症力および抗炎症力の両方の混合を発生させる可能性を高める。Ｅ．ｃｏｌｉが、潜在的な抗炎症メディエーターを産生し得るとの知見が、もう１つ別の矛盾への光を遮ることがある。Ｅ．ｃｏｌｉが、腸管叢の代表として、使用されたが、腸管微生物の間で記されたほぼ１，０００のバクテリア種の間で、少数派の構成員である（Ｅｃｋｂｕｒｇら、２００５年；Ｂａｃｋｈｅｄら、２００５年）。通常の腸管が、１００，０００，０００，０００，０００までの微生物に対する本拠地（ホーム）であり、体内の細胞の合計数の約１０倍超えている（Ｂａｃｋｈｅｄら、２００５年）。しかし、通常の腸管は、通常の宿主体同様、僅かなもしくは全くそれらに対して向かわない応答を示さない（Ｓｔｅｉｎｈｏｆｆ、２００５年；ＳｍｉｔｈおよびＮａｇｌｅｒ−Ａｎｄｅｒｓｏｎ、２００５年；Ｂａｃｋｈｅｄら、２００５年；Ｃｈａｎｄｒａｎら、２００３年；ＭａｃｄｏｎａｌｄおよびＭｏｎｔｅｌｅｏｎｅ、２００５年；Ａｂｒｅｕら、２００５年）。これは、少数の微生物、もしくは、体の他の部における無細胞微生物産物さえにも対して示された激しい原炎症応答に対照的である。Ｌ．Ｅ．Ｓｍｙｔｈｉｅｓらが、「腸管粘膜に動員された血液単球が、貪欲なスカベンジャーおよび宿主防御機能を保持するが、深遠な炎症抗原反応不顕性（アネルギー）を獲得し、これにより、免疫刺激バクテリアの近くの近傍にもかかわらず、通常の腸管粘膜の炎症の特徴の非存在を促進していく」と結論する（Ｓｍｙｔｈｉｅｓら、２００５年）。この作業からの仮説が、ＭＥＣＯ−１、および、非常に密な濃度の（どこかで記録された最高細胞密度の間で）腸内微生物からの恐らく他の分泌産物が集約的に、抗炎症効果を生み、通常の非炎症状態を維持できることである。同様に、これらの抗炎症経路における分断が、腸管の炎症疾患に寄与することがある（Ｂａｃｋｈｅｄら、２００５年；Ｃｈａｎｄｒａｎら、２００３年；Ｓａｒｔｏｒ、１９９７年；Ｅｃｋｍａｎｎ、２００４年；Ｓａｒｔｏｒ、２００３年）。原炎症的な影響としてのバクテリア由来産物の考えられる役割が、主要な炎症腸疾患、潰瘍性大腸炎、およびクローン病、ならびに、リューマチ関節炎のような他の炎症疾患に関する大きく払われた注意を受け付けてきた（Ｓａｒｔｏｒ、１９９７年）。ここで、我々は、潜在的な抗炎症的な影響の源としての通常の叢に関する更なる基準を与え；このおよび他の抗炎症剤を用いた損失もしくは干渉が、腸におけるおよび恐らく越える病気の過程（プロセス）に寄与していることがある。
【０１１９】
ここで、ＭＥＣＯ−１がこの抗炎症効果を、ＧＩ管において住んでいる細胞局所的に作用することにより生むと、仮定されている。これらは、上皮裏打ち細胞、免疫細胞、分泌細胞（外分泌および内分泌）、および神経要素を包含すると思われる。ＭａｃｄｏｎａｌｄおよびＭｏｎｔｅｌｅｏｎｅは、最近の総説における腸の抗原の彼らの議論において、巨大分子が腸の上皮の障壁（バリア）を越えられる数多くの機序（メカニズム）をカタログ化する（ＭａｃｄｏｎａｌｄおよびＭｏｎｔｅｌｅｏｎｅ、２００５年）。α−ＭＳＨがこの抗炎症効果の多くを中心的に生み出すと、知られている（Ｌｉｐｔｏｎら、１９９１年；Ｃａｔａｎｉａら、１９９９年）。これゆえ、ＭＥＣＯ−１が、腸管腔を越えた部位において、恐らくＣＮＳを包含して、作用するかも知れない（ＧｅｂｂｅｒｓおよびＬａｉｓｓｕｅ、２００４年；Ｇａｒｓｉｄｅら、２００４年）。ＭＥＣＯ−１が極めてｉｎ  ｖｉｖｏにおいて安定であり、恐らくα−ＭＳＨよりもそうであるとの観察が、ＭＥＣＯ−１がこの消化管における局所効果に加え、より距離のある部位においても、作用している可能性を高める。「結果」において記したとおり、ＭＥＣＯ−１およびα−ＭＳＨが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて等しく潜在的であった一方、ＭＥＣＯ−１が、敗血症マウスにおいて恐らく多重に（何倍も）より効果的であるように見えた。
【０１２０】
原炎症過程（プロセス）が深刻に、粥状（アテローム）硬化および痴呆、ならびに、加齢と共に認知および肉体的衰えを包含しているより広範な異常な病状において関係づけられてきた（Ｇｅｔｚ、２００５年；Ｈａｎｓｓｏｎ、２００５年；ＭｃＧｅｅｒおよびＭｃＧｅｅｒ、２００４年；Ｙａｆｆｅら、２００４年；Ｗｉｌｓｏｎら、２００２年）。論理的治療アプローチが、ＭＥＣＯ−１および通常の叢由来の他の考えられる抗炎症剤の抗炎症能を、試して一覧とすべきと思われる。
【０１２１】
哺乳類において、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、これらメラノコルチンおよびこれらの受容体が、性機能、振る舞い、学習、および、広範な他の過程（プロセス）において、関係づけられてきた（Ｃｏｎｅ、２００２年）。特に突出しているのは、α−ＭＳＨの、食物摂取、エネルギー支出、および体重を規制していくことにおける役割であり、ＭＣ４Ｒが、ＭＣ３Ｒよりも、遙かに重要である（ＢａｄｍａｎおよびＦｌｉｅｒ、２００５年；ＫｏｒｎｅｒおよびＬｅｉｂｅｌ、２００３年）。ＭＣ４Ｒに関する遺伝子の１対立遺伝子だけにおける突然変異が頻繁に、大肥満および気晴らし摂食（過食）と関係している（ＦａｒｏｏｑｕおよびＯ’Ｒａｈｉｌｌｙ、２００５年）。以前の作業（Ｂａｃｋｈｅａｄら、２００５年；ＢａｄｍａｎおよびＦｌｉｅｒ、２００５年）に基づけば、これらのホルモン様物質が、その宿主の食物摂取およびエネルギーバランスへの効果を発揮しながら、その宿主自体の細胞間コミュニケーションシステム内で介在していく可能性が、高められている。ＰＯＭＣ遺伝子が、広範な細胞型において発現されており、これらペプチド前駆体をホルモンに加工する（プロセシングする）血縁の変換酵素であるようである（Ｃｏｎｅ、２０００年）。尚より広く分布しているのが、メラノコルチン受容体である（Ｃｏｎｅ、２０００年）。これらの受容体がピコモル濃度のＭＳＨにより活性化されていることが、全身循環において更に非常に控えめな量のＭＥＣＯ−１が、広く広がった効果を持つ可能性を切り開く。
【０１２２】
ＭＥＣＯ−１が明らかに、生物学的に組織化された様式で、手を付けられていないバクテリアから放出されており、その培養を開始後、メラノコルチン様ペプチドが培地において非常に速く蓄積するとの観察に基づいた。同時に、培地におけるその出現が、バクテリアの死を古典的に反映する細胞内酵素たるピロホスファターゼの非存在が、記されている。これは、ＭＥＣＯ−１関連ペプチドの蓄積が、細胞死および破壊が典型的に増える時間であるその培養が時間を経るに連れ、遅くなったとの観察とも、一致している。記すべきことに、規制膜内蛋白溶解（Ｒｉｐ）と命名された過程（プロセス）が、広く真核生物および原核生物において記載されたが、最近細胞間コミュニケーションにおいて関係づけられてきている（ＵｒｂａｎおよびＦｒｅｅｍａｎ、２００２年）。最近の研究が、猩々蠅において上皮成長因子リガンドを放出する膜内プロテアーゼ、および、グラム陰性バクテリアＰｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｓｔｕａｒｔｉｉにおいて微生物の密度依存成育を規制する細胞外シグナルを発生させるプロテアーゼの機能の互換性を示し、各々の感覚での過程（プロセス）の一部である（Ｇａｌｌｉｏら、２００２年）。
【０１２３】
フェロモンは、同一種の２種の器官間をシグナル伝達するリガンドであり、今や広く微生物において認められている。単細胞真核生物が例えば、生殖および摂食を規制し、哺乳類の対応部に似ているリガンドおよび受容体、例えば、ＧＴＰａｓｅ７回膜貫通ドメイン活性化部位に結合する小ペプチドを用い、遺伝子転写を規制する核結合蛋白に結合し活性化させるステロイド関連リガンドをも用いる（Ｂａｒｄｗｅｌｌ、２００４年；ＲｉｅｈｌおよびＴｏｆｔ、１９８４年）。
【０１２４】
フェロモンが広く広範なバクテリアにおいて記載され、各々の感覚で、細胞密度に対して応答性である細胞間コミュニケーション過程（プロセス）を完遂している。このように、バクテリアコミュニティーが、この振る舞いおよび遺伝子発現を規制するが、病原因子分泌、バイオフィルム形成、生殖過程、および胞子形成を包含している（ＨｅｎｋｅおよびＢａｓｓｌｅｒ、２００４年）。
【０１２５】
今、これらのリガンドが、もう１種別の微生物にも影響を及ぼし得る幾つもの例がある。これら標的（ターゲット）が、他のバクテリア、単細胞、もしくは多細胞真核生物であることがある。盗み、騙し、拮抗、協力、および、病気の修飾が、種間のコミュニケーションの成り行きの間にある（Ｓｃｈｕｉｌｉｎｇ、２００４年；Ｍａｔｈｅｓｉｕｓら、２００３年；ＦｅｄｅｒｌｅおよびＢａｓｓｌｅｒ、２００３年；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ、２００３年）。１器官から送られたもう１器官における受容体を活性化させる分子シグナルは、両者が同一種のものである場合、フェロモンである。送り手および受け手の種が異なる場合、このシグナル分子は、アロモンもしくはカイロモンであると考えられ、それぞれ、当該送り手もしくは当該受け手に対して有益である場合である（Ｊｅｒｒｏｌｄ  Ｍｅｉｎｗａｌｄ、私信）。この仮説構築において、ＭＥＣＯ−１が恐らく、両者としての資質がある。
【０１２６】
バクテリアが、腸内において高密度において、非炎症環境を維持するとの仮説も、脳および他の体の部位における菌塊に適用してよく、ここで再び、大きな濃縮されたバクテリアの集団がしばしば、炎症の兆候を殆どもしくは全く生じさせない。Ｈ．Ｈｏｕｓｔｏｎ  Ｍｅｒｒｉｔｔが彼の今や古典的なテキストの第１版において、「脳の菌塊の症候が本質的に、脳の如何なる（無菌）拡大病巣のものとも、同一である。感染の症候が、当該菌塊に対して当たった病巣が尚活性でなければ、欠けている。頻繁に、脳もしくは小脳における菌塊の症候は、結果的に頭蓋内圧上昇を与えていくものに限られている。」と記した（Ｍｅｒｒｉｔｔ、１９５５年）。
【０１２７】
ここで、アポトーシスが、同様の減少を包含するかも知れないと、思索されている。酵素および他の蛋白の複雑な相互作用（ｉｉ）によりプログラムされた細胞のけばけばしい溶解（ｉ）に加えて、アポトーシスが、炎症応答の顕著な不存在（ｉｉｉ）、および、ミトコンドリアからのシトクロームＣおよび他の蛋白の漏出（ｉｖ）により、特徴付けられている。殆どのミトコンドリアの蛋白が、当該ミトコンドリア自体のＤＮＡにおいて、もしくは、核のＤＮＡにおいてコードされたものであっても、バクテリアに対する最近のリンクを持つと考えられており、ミトコンドリアが、真核細胞中において進化的に移住し、永久的な居住を勝ち取ったバクテリア要素であるとの現在の信仰を反映している。ヒトミトコンドリア内で機能するこれら２種の延長因子ＥＦ−Ｇ１（ｍｔ）およびＥＦ−Ｇ２（ｍｔ）（核においてコードされたが）が、構造において、ヒト細胞質同族体延長因子−２（ＥＦ−２）に対してよりも、Ｅ．ｃｏｌｉのおよび他のバクテリアの延長因子に対して（Ｂｈａｒｇａｖａら、２００４年；Ｈａｍｍａｒｓｕｎｄら、２００１年；Ｇａｕら、２００１年；図１および直下の段落も、参照）、類似している。興味あることに、ヒトＥＦ−Ｇ１（ｍｔ）が、ヒトリボゾーム同様、バクテリアリボゾームにおけるトランスロカーゼとして活性であると見出された（Ｂｈａｒｇａｖａら、２００４年）。ＥＦ−Ｇ１（ｍｔ）のＣ−末端からの２８アミノ酸ペプチドの合成複製体が、ＭＥＣＯ−１におけると同一である１３アミノ酸を持つが、４ｎｇ／ｍＬでのリポ多糖（リポポリサッカライド）に対する被曝後、マクロファージ（ＲＡＷ）様細胞からのＴＮＦ放出を抑圧していくことにおいて、ＭＥＣＯ−１およびα−ＭＳＨとおよそ等しく潜在的であった（Ｑｉａｎｇ，ＸおよびＲｏｔｈ，Ｊ、非公開の観察）。この断片がこうして、典型的にアポトーシスと関連した抗炎症条件に寄与する候補者となる。
【０１２８】
ＡＣＴＨおよびα−ＭＳＨが、同一前駆体の代わりのプロセシングを代表し、４種のメラノコルチン受容体（ＭＣ２Ｒ以外全て）との非常に似た相互作用を持つ。例えば、Ｅｂｅｒｌｅ、２０００年；ＨｒｕｂｙおよびＨａｎ、２０００年参照。アミノ酸１〜１３の１次配列が、ＡＣＴＨおよびα−ＭＳＨにおいて同一である一方、後者が、２種の翻訳後部分、Ｎ−末端アセチル、およびＣ−末端アミドを持ち、これらが、α−ＭＳＨの全潜在力に重要と考えられている。丁度、ＡＣＴＨの１４〜３９Ｃ−末端ペプチドが、これら翻訳後部分非存在下に全活性を可能とするように、ＭＥＣＯ−１の１８〜２９Ｃ−末端ペプチドも、そうである。重要さが、ＡＣＴＨ２６〜３８とＭＥＣＯ−１におけるアミノ酸１８〜２９との間の多重の同一性および類似性に付与され得ないのは、ＡＣＴＨ１〜２４が、これらの重なりを配列において欠いているのに、充分ＡＣＴＨと同様生物学的に活性であるからである。研究された全脊椎動物のＡＣＴＨ、α−ＭＳＨ、β−ＭＳＨ、およびγ−ＭＳＨにおいて不変であるので、八目鰻のＭＳＨ−ＡおよびＭＳＨ−Ｂならびに鮫のδ−ＭＳＨ同様、ＡＣＴＨおよびα−ＭＳＨの位置６〜９におけるＨＦＲＷ配列が、標準的であると考えられてきた（「全ＭＳＨ配列を特徴付けている構造の特徴およびＡＣＴＨのそれは、その核のテトラペプチドＨｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐであり、これらのペプチドの受容体との相互作用に関して、これゆえ、これらの生物活性に関して、中心点である」）（Ｅｂｅｒｌｅ、２０００年）。これゆえ、ＭＥＣＯ−１の全生物活性が、驚きであった。ＭＥＣＯ−１において、および、多くの他のバクテリアにおいて、ＨＦＲＷが、ＦＬＫＹにより置き換えられており、同一性および似ていると考えられている３アミノ酸が全くない。α−ＭＳＨにおけるその標準的な配列のＮ−末端である５アミノ酸のうち、４アミノ酸が同一であり、１アミノ酸がＭＥＣＯ−１において＜＜似ている＞＞として同定されている。興味あることに、専門家が、＜＜１、２、３（１２および１３）位における＞＞α−ＭＳＨ＜＜残基が相対的により重要でなく＞＞、その残基４、５、および１０が適切なコンフォメーションを樹立していくことにおいて重要であるかも知れないと示唆する。
【０１２９】
纏めると、ここで、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにより放出されたメラノコルチン様ペプチドたるＭＥＣＯ−１が記載され、哺乳類のホルモンＭＳＨおよびＡＣＴＨのように、（ｉ）哺乳類のマクロファージのメラノコルチン−１受容体を活性化させ、（ｉｉ）その宿主の先天免疫系の要素を抑圧し、（ｉｉｉ）致死的な敗血症からマウスを救い得る。
【０１３０】
ある１種のシナリオがここで仮定され、ここで、ＭＥＣＯ−１（および他の腸のバクテリアから放出されたそのまだ未発見の親類）が、腸のマクロファージ上の１種の分類（クラス）のメラノコルチン受容体に対する重要なホルモン様シグナルに応答性である。更に、ＭＥＣＯ−１およびこれらのような他のシグナルが、腸における大量のバクテリアを、その宿主との、特にそのマクロファージおよび他の腸関連リンパ要素との平和な協調において共存するようにさせるかも知れないと仮定されている。
【０１３１】
ホルモン（もしくはより適正に、ホルモン様物質）を発見していくのに加え、これは、腸叢とこれらの哺乳類宿主との間の細胞間での遣り取り（コミュニケーション）の新規な系（システム）であるかも知れない。該系がここで、新たに記載されている一方、これは、微生物のシグナルに関する何十もの作業上で築かれており、各々の受け取り方で包含されたもの（ＨｅｎｋｅｔおよびＢａｓｓｌｅｒ、２００４年；Ｓｃｈｕｉｌｉｎｇ、２００４年；Ｍａｔｈｅｓｉｕｓら、２００３年；ＦｅｄｅｒｌｅおよびＢａｓｓｌｅｒ、２００３年；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ、２００３年）および脊椎動物のメッセンジャー分子のような特徴を持つもの（Ｍａｃｃｈｉａら、１９６７年；ＬｅＲｏｉｔｈら、１９８６年；Ｒｏｔｈら、１９８６年；Ｌｅｎａｒｄ、１９９２年）を包含している。
【０１３２】
実施例２．大腸炎および他の形の炎症腸疾患へのＭＥＣＯ−１の効果
はじめに
バクテリアおよびこれらの産物が高度に、その宿主の免疫系に対して刺激性であり、宿主細胞を活性化させ、サイトカインおよび他の原炎症剤の放出を刺激している。本研究が、通常腸に住まうタイプのバクテリアも、抗炎症性であり、その宿主における原炎症応答を抑圧できる物質を産生し放出することを示している。
【０１３３】
仮説
我々の仮説は、（ｉ）大腸炎および他の炎症性の腸の病気が、原炎症力と抗炎症力との間のアンバランスを代表し、（ｉｉ）バクテリア起源の抗炎症剤［ここで記載されたＥ．ｃｏｌｉ由来のＭＥＣＯ−１のような］が有意に、その通常のバランスに寄与し、ならびに、（ｉｉｉ）これらの抗炎症剤が、炎症性の腸の病気を有する患者における治療に使用され得、そのバランス、つまり健康を保ち得ることである。
【０１３４】
ＭＥＣＯ−１の受容体
我々は、［ここで報告された研究において］ＭＥＣＯ−１がこの抗炎症力を、ホルモン様ペプチドα−ＭＳＨおよび他の内因性ヒトペプチドにより使用されている同一受容体たるメラノコルチン受容体亜型（サブタイプ）ＭＣ１Ｒに結合していくことにより発揮することを示している。我々は、一連の実験を、これらの仮説を裏付ける動物大腸炎モデルを用いて完遂している。
【０１３５】
実験Ａ．
遺伝子的に操作され、ＭＣ１Ｒに関する遺伝子コピーを両方欠くマウスが、実験室での広く使用された穏やかな大腸炎の刺激剤たるＤＳＳを与えられるまで、通常に思われることが、既に観察されていた。この受容体を失っている動物において、そのＤＳＳ大腸炎は劇症化していき、しばしば致死性であった（Ｍａａｓｅｒら、２００６年）。
【０１３６】
補完実験が、実施された。通常のマウスが、同一の負荷の大腸炎刺激剤ＤＳＳを与えられた。ＭＣ１Ｒ受容体の欠損が、深刻な大腸炎を誘発させるのであれば、この時は、通常の受容体を泊めている通常のマウスが、ＭＥＣＯ−１、および、腸において存在するＭＣ１Ｒ受容体の他の類似の内因性活性化剤を不活化させて、深刻なＤＳＳ大腸炎へと押しやられ得ると、理由付けられた。これらのＤＳＳ処理マウスが、抗ＭＥＣＯ−１抗体を用いて日に２回直腸内点滴された場合、その大腸炎が、血清を用いて直腸内処理されたコントロールのマウスにおける大腸炎よりも、遙かにより深刻であった。抗ＭＥＣＯ−１抗体が、ＭＥＣＯ−１、ならびに、他の腸内在住菌（バクテリア）により産生された比較できるＭＥＣＯ−１様抗炎症ペプチドを不活化させると仮定されている。ＤＳＳが典型的に、緩和な大腸炎の刺激剤であるが、ＭＣ１Ｒ上で作用するバクテリア由来抗炎症ペプチドにより、一部においてチェックされていて保たれていると結論されている。これらの抗炎症ペプチドの不適切な供給が、非常に深刻な大腸炎に至る。
【０１３７】
実験Ｂ．
上の実験が、他の大腸炎モデルに拡大された。マウスが、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓから派生した毒原性バクテリアを経口投与され、これは典型的に大腸炎を生み、これは同一微生物の非毒原性変異体により誘発された大腸炎よりも深刻であり、これが今度は、コントロールの緩衝液処理マウスにおいて観察されたものよりも悪い。腸における重量減少および組織学的変化が、該大腸炎の深刻さの測定値であり、更なる終点として、死を有する。毎群において、ＭＥＣＯ−１抗体腹腔内注入が、該大腸炎の悪化を引き起こした（通常の非免疫血清を、コントロールとして使用しながら）。これらの結果が、抗ＭＥＣＯ−１抗体が、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＭＥＣＯ−１および他の腸内バクテリア由来の類似の抗炎症剤に結合し中和していくことにより、原炎症側への平衡（バランス）を傾けるとの仮説と一致している。これは、大腸炎、消化管の他の炎症疾患、および、炎症過程（プロセス）がその病理生理学における有意な役割を演じる多くの他の病気用に提案された治療適用と一致している。
【０１３８】
実験Ｃ．
抗ＭＥＣＯ抗体が大腸炎を悪化させた実験Ｂにおける研究を補完するべく、ＭＥＣＯ−１投与が、該大腸炎を良化させると仮定された。この一連の研究において、該大腸炎が、緩衝液（バッファー）、非毒原性バクテリア、もしくは毒原性バクテリアを投与していく前５日間、ＤＳＳ２％を飲み水に加えていくことにより、促進された。該緩衝液処理動物および非毒原性バクテリア群（グループ）において、当該大腸炎が、ＭＥＣＯ−１腹腔内注入により良化され、予測されたとおりであった。毒原性バクテリアを用いて処理されたＤＳＳ投与を背景とした群において、その死亡率が、素速く非常に広く拡がった。
【０１３９】
実施例３．ＭＥＣＯ−１を用いた食物摂取およびエネルギーバランスの規制
はじめに背景
メラノコルチンおよびメラノコルチン受容体の免疫にリンクされた効果に加え、（ｉ）食物摂取および体重規制におけるα−ＭＳＨおよびメラノコルチン４−受容体（ＭＣ４Ｒ）の中心的な役割ならびに（ｉｉ）脳の下垂体領域に対する関門（ゲートウェイ）である広く開いた（窓の開いた）毛細管（キャピラリー）をリコールし、ここで、食物摂取にリンクされたＭＣ４Ｒ受容体が存在する。下垂体におけるα−ＭＳＨおよびＭＣ４Ｒが作用し、摂食を駆り立てるＮＰＹ系を抑圧していくことにより、食物摂取を直接および間接にも限る。
【０１４０】
エネルギーバランスに対するα−ＭＳＨおよびＭＣ４Ｒの関連が、ＭＣ４Ｒに関する遺伝子における突然変異を有し大肥満および気晴らし摂食を示す患者により、ハイライトされている。同様に、α−ＭＳＨの親分子たるプロオピオメラノコルチンにおける突然変異を有する患者も、大肥満を示す。
【０１４１】
最近の研究が、一般循環中への腸におけるペプチドのアクセスを示した。腸微生物から血中への、および、そこから下垂体および関連した脳領域へのメラノコルチンのアクセスも、あることが多く、ここで、食物摂取を鈍らせるシグナルに寄与する。このような経路が、無菌齧歯類とバクテリアコロニー化対旋律齧歯類との間の代謝の差の幾つかを計算する機序（メカニズム）の一部であることがある。直感に反して、しかし上の知見および仮説と一致して、これら無菌齧歯類が、微生物叢を有するマウスよりも、２０％多いカロリーを消費する。同様に、抗生物質処理動物が、より多い体重を得る。
【０１４２】
実験Ａ．
メラノコルチン４−受容体の分子生物学的構築体たるＭＣ４Ｒが、ＨＥＫ組織培養細胞中にトランスフェクションされた。これらの細胞において、ＭＥＣＯ−１が、ＭＣ４Ｒ経路にリンクされたルシフェラーゼの活性化として測定されて、この受容体を刺激していくことにおいて、α−ＭＳＨ程度活性であった。ＭＥＣＯ−１が、α−ＭＳＨをＭＣ１ＲおよびＭＣ２Ｒ受容体において模倣していることに加え、α−ＭＳＨをＭＣ４Ｒ受容体において模倣すると結論される。
【０１４３】
ＭＣ３Ｒが、もう１種別のメラノコルチン受容体であり、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける満腹とエネルギーとの平衡（バランス）に関している。ＭＥＣＯ−１が、ＭＣ４Ｒを研究するのに使用された系（システム）に似ているトランスフェクション系においてＭＣ３Ｒを用いてテストされた場合、α−ＭＳＨのものに非常に似ている活性を与えた。ＭＥＣＯ−１（および、他の系の他のＥＦＧ−由来ＭＥＣＯ様ペプチドに対する推論により）が、ＭＣ１Ｒ、ＭＣ２Ｒ、ＭＣ３Ｒ、およびＭＣ４Ｒを、α−ＭＳＨに関して記載されたものに非常に似ている様式で、活性化させると結論される。
【０１４４】
実験Ｂ．
Ｉｎ  ｖｉｖｏの世界に対する、細胞培養におけるこの観察の関連性を示すために、我々は、摂食の開始および停止と最も関連した脳の一部たる下垂体の弓状核の部位において開く細いプラスチックのカニューラを持つ以外、全て正常であるマウスを研究した。僅かな量のα−ＭＳＨが点滴されている場合、これら動物が１回の「食事」当たり、しばしばであるが約半分の多さのペレットを摂食消費し、結果的に、全般的な食物摂取の減少を与えている（図１２）。ＭＥＣＯ−１が、この態様の満腹における通常のシグナル分子であるα−ＭＳＨを用いて観察されたものから区別できない結果を生む。この領域の脳が、多くの他の脳の領域のようでなく、血液および血中物質に対する開かれたアクセスを持つことを記す。
【０１４５】
これらのデーターが、微生物、および、ミトコンドリアのような他の源からのＭＥＣＯ−１およびＭＥＣＯ−１様ペプチドが充分、α−ＭＳＨの代わりに置換し得るとの結論と、一致している。これらのＭＥＣＯ−１様物質の各々が、α−ＭＳＨおよびこの同類に関して提案されている全範囲の治療用の、よりコスト面で有効で効率的な物質を代表してよい。
【０１４６】
上に鑑みると、本発明の幾つかの利点が達成されており、他の利点が獲得されたことが分かる。
【０１４７】
本発明範囲から逸脱してしまうことなく、上の方法および組成物において種々の変更がなされ得るので、上の記載において含有され、添付の図面において示された全事項が、例示として、限定している感覚ではなく解釈されると意図されている。
【０１４８】
本明細書において引用された全文献が、本明細書において援用されている。本明細書におけるこれら文献に関する議論が単に、それらの著者によりなされた主張を要約すると意図されており、いずれの文献も、先行技術を構成するとは、全く認められていない。出願人は、これら引用された文献の精確さおよび適切さに挑む権利を確保する。
【０１４９】
付録−配列番号（SEQ ID Nos）
SEQ ID NO: 1 -ＭＥＣＯ−１
SLTKGRASYTMEFLKYDEAPSNVAQAVIEARGK
SEQ ID N0: 2 -ＭＥＣＯ−１に対応している種々の延長因子からのコンセンサス配列ＥＦ−Ｇ
(S/T)(L/Q/C)(T/S)(K/E/G/Q/S)G(R/S/K)(A/G)(S/E/T)(Y/H/F)(T/S/A/I)(M/L)(E/K)(F/Y/L/P)(L/S/K/A)(K/R/T/E/S/H)Y(D/N/E/A/Q)(E/P/A/D/L)(A/C/M/V)(P/L/N)(S/P/N/K/T)(N/S/Q)(V/T/D/I)(A/Q)(Q/E/N/K/D/A)(A/D/T/S/K/E)(V/L/I)(I/L)(E/N/A/K)(A/R/S/D)(R/F)(G/S/E)(K/G/S/A)
SEQ ID NO: 3 -ＭＥＣＯ−１に対応しているヒトＥＦ−Ｇ１配列
SCTEGKGEYTMEYSRYQPCLPSTQEDVI 
SEQ ID NO: 4 -ＭＥＣＯ−１に対応しているヒトＥＦ−Ｇ２配列
TLTSGSATFALELSTYQAMNPQDQNTLLNRRSGLT
SEQ ID NO: 5 -ＭＥＣＯ−１に対応しているSalmonella typhimuriumＥＦ−Ｇ配列
SLTKGRASYTMEFLKYDDAPNNVAQAVIEARGK
SEQ ID NO: 6 -ＭＥＣＯ−１に対応しているErwinia carotovoraＥＦ−Ｇ配列
SLTKGRASYSMEFLKYDDAPNNVAQAVIEARGK
SEQ ID NO: 7 -ＭＥＣＯ−１に対応しているPhotorhabdus luminescensＥＦ−Ｇ配列
SQTQGRASYSMEFLKYNEAPSNVAQAIIEAR
SEQ ID NO: 8 -ＭＥＣＯ−１に対応しているYersinia pseudotuberculosisＥＦ−Ｇ配列
SQTQGRASYSMEFLEYAEAPSNVAKAVIEARGK
SEQ ID NO: 9 -ＭＥＣＯ−１に対応しているCoxiella burnetiiＥＦ−Ｇ配列
SLSQGRATYTMEFLKYAEAPSNIAEAII
SEQ ID NO: 10 -ＭＥＣＯ−１に対応しているBordetella pertussisＥＦ−Ｇ配列
SLTQGRATYTMEFKHYAEAPKNVADEVIAARGK
SEQ ID NO: 11 -ＭＥＣＯ−１に対応しているPasteurella multocidaＥＦ−Ｇ配列
SQTQGRASYSMEPLKYAEAPKNVADAIIEAR
SEQ ID NO: 12 -ＭＥＣＯ−１に対応しているCandidates blochmannia floridanusＥＦ−Ｇ配列
SQTQGRASHSMEFLKYNEVPNNIAQSIIESR
SEQ ID NO: 13 -ＭＥＣＯ−１に対応しているＭａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ配列
SQTQGRASYSMEPLKYAEAPTSVAAAVIEAR
SEQ ID NO: 14-Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＦ−Ｇ配列
1 marttpiary rnigisahid agktttteri lfytgvnhki gevhdgaatm dwmeqeqerg
61 ititsaatta fwsgmakqye phriniidtp ghvdftieve rsmrvldgav mvycavggvq
121 pqsetvwrqa nkykvpriaf vnkmdrmgan flkvvnqikt rlganpvplq laigaeehft
181 gvvdlvkmka inwndadqgv tfeyedipad mvelanewhq nliesaaeas eelmekylgg
241 eelteaeikg alrqrvlnne iilvtcgsaf knkgvqamld avidylpspv dvpaingild
301 dgkdtpaerh asddepfsal afkiatdpfv gnltffrvys gvvnsgdtvl nsvkaarerf
361 grivqmhank reeikevrag diaaaiglkd vttgdtlcdp dapiilerme fpepvisiav
421 epktkadqek mglalgrlak edpsfrvwtd eesnqtiiag mgelhldiiv drmkrefnve
481 anvgkpqvay retirqkvtd vegkhakqsg grgqyghvvi dmyplepgsn pkgyefindi
541 kggvipgeyi pavdkgiqeq lkagplagyp vvdmgirlhf gsyhdvdsse lafklaasia
601 fkegfkkakp vllepimkve vetpeentgd vigdlsrrrg mlkgqesevt gvkihaevpl
661 semfgyatql rsltkgrasy tmeflkydea psnvaqavie argk
SEQ ID NO: 15 -ＭＥＣＯ−１に対応しているＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ配列
SLTKGRASYTMEFLKYDEAPSNVAQAVIEARGK
SEQ ID NO: 16 -ＭＥＣＯ−１に対応しているBacterioides fragilis配列
SLTGGRASFIMKFASYELVPSDVQDKLIKDFES
SEQ ID NO: 17 -ＭＥＣＯ−１に対応しているBacterioides thetaiotamicron配列
SLTGGRASFIMKFASYELVPTDVQDKLIKDFEA
SEQ ID NO: 18 -ＭＥＣＯ−１に対応している種々の延長因子からのコンセンサス配列ＥＦ−Ｇ。これら比較された配列の間で、少なくとも２アミノ酸だけが、包含されている。
S(L/Q)T(K/Q/G)GRA(S/T)(Y/F)(T/S/I)M(E/K)F(L/S/A)(K/S)Y(D/N/E/A/Q)(E/L/D)(A/V)P( S/P/N/K/T)(N/S/D)(V/I)(A/Q)(Q/E/D)(A/K)(V/L/I)I(E/K)(A/D)(R/F)(G/E)K
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】関連配列解析を示す。パネルＡが、哺乳類共通のメラノコルチンの全４種の配列を示し、これらは、１種のプロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）前駆体由来である。パネルＢが、ヒトミトコンドリアの２種の延長因子のＣ−末端を示し、ＭＥＣＯ−１に比較された。これらの各々がおよそ、互いに対してと同じく、ＭＥＣＯ−１に近いことを記す。パネルＣが、ＭＥＣＯ−１とのこれら数種の配列の適合を示し、ＢＬＡＳＴ解析を使用している。
【図２】ＭＥＣＯ−１の、ＬＰＳを受けたマウスおよび致死的な敗血症を持っているマウスを救い出せる能力を実証しているグラフである。パネルＡ．Ｂａｌｂ／ｃマウスが１回、ＬＤ７５であると推定された用量でのＬＰＳを用いて、腹腔内注射された。この直後、第１回の用量の、０．５ｍｇ／ｋｇでのＭＥＣＯ−１（低用量、ｎ＝１０）、５ｍｇ／ｋｇでのＭＥＣＯ−１（高用量、ｎ＝１０）、５ｍｇ／ｋｇでのα−ＭＳＨ（高用量、ｎ＝１０）、もしくは生理食塩水（ｎ＝１０）が、腹腔内投与された。ペプチドもしくは生理食塩水が日に２回３日間、合計６回の用量に関して、与えられた。生存者が毎日２週間、モニターされた。ＭＥＣＯ−１およびα−ＭＳＨの恩恵の生存者が各々、対生理食塩水処理マウスで、統計的に有意であった（＊＊ｐ＜０．０１−対数（ｌｏｇ）ランクテスト）。パネルＢ．Ｂａｌｂ／ｃマウスが、盲腸結紮および穿刺（ＣＬＰ）に付された。術後２４時間から開始して、処置が開始され、日に２回３日間、合計６回用量；０．５ｍｇ／ｋｇ（低用量、ｎ＝１０）でのＭＥＣＯ−１および５ｍｇ／ｋｇ（高用量、ｎ＝１０）でのＭＥＣＯ−１が、生理食塩水単独（ｎ＝１３）および５ｍｇ／ｋｇ（高用量、ｎ＝１０）でのα−ＭＳＨに比較された。動物が１４日間、生存に関してモニターされた。ＭＥＣＯ−１の恩恵の生存者が、統計的に有意であった（高用量＊＊ｐ＜０．０１および低用量＊ｐ＜０．０５−対数（ｌｏｇ）ランクテスト）。この研究において、１匹のα−ＭＳＨの動物が、この実験の最終日に死亡し、こうして、α−ＭＳＨの恩恵が、有意さを逃した（ｐ＝０．０８、ｐ＜０．０５から変わった）。高用量のＭＥＣＯ−１が、ｍｇ／ｋｇで高用量のα−ＭＳＨに等しいが、モル基準で、半分未満であることを記す。低用量ＭＥＣＯ−１が、高用量のＭＥＣＯ−１よりも、１０分の１少ないが、モル基準で、高用量のα−ＭＳＨよりも、１２分の１少ない。ＣＬＰ（そしてＬＰＳを用いた）を用いたデーターが、マウスを死から護っていくことにおいて、ＭＥＣＯ−１が、α−ＭＳＨよりも、３０倍まで潜在的である可能性を示唆する一方、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、これらが等しく潜在的であるように見える。
【図３】ＭＥＣＯ−１が、盲腸結紮後の血中でのＨＭＧＢ１および他のサイトカインの蓄積を弱めることを樹立させている実験結果のグラフである。Ｂａｌｂ／Ｃマウスが、「材料」および「方法」において記載したとおり、ＣＬＰを受けた。術後２４時間において、これらマウスが、１回用量の、生理食塩水（ｎ＝９）、５ｍｇ／ｋｇでのＭＥＣＯ−１（ｎ＝１０）、もしくは、５ｍｇ／ｋｇでのα−ＭＳＨ（ｎ＝１０）を、腹腔内投与された。術後４０時間における生存者が殺され、血液がサイトカイン測定用に得られた。ＴＮＦおよびＩＬ−６の血清レベルが、ＥＬＩＳＡにより求められ、重なった（２回）独立の２実験の平均±ＳＥＭとして表現された（＊ｐ＜０．０５、対ＣＬＰ単独）。血清ＨＭＧＢ１レベルが、ウェスタンブロット解析により、精製ＨＭＧＢ１の標準曲線を参照して求められた。血清におけるＨＭＧＢ１レベルが、各個々の動物に関してプロットされている。生理食塩水単独を用いて処理された９匹のうちの５匹が、４０時間の前に死亡し、これらの結果が包含されていないことを記す。４０時間前に死亡したマウスのうちの何匹かが、生存したものよりも高かったサイトカインレベルを持っていたかも知れないと、ならびに、ここで報告されたＣＬＰ対ＣＬＰ＋メラノコルチン間の違いが、より早い時点において観察された筈のものよりも少ないと、信じられている。
【図４】ＭＥＣＯ−１がｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、バクテリアＬＰＳ誘導ＨＭＧＢ１放出を阻害したことを樹立させている実験結果のグラフである。マウスマクロファージ様ＲＡＷ２６４．７細胞がＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）と共に、１００ｐＭでのＭＥＣＯ−１もしくはα−ＭＳＨ非存在下にもしくは存在下に、インキュベートされた。刺激後１６〜２０時間において、分取した無細胞培地が審査された。この（条件を整えられた）培養培地におけるＨＭＧＢ１レベルが、独立の４実験の平均±ＳＥＭとして表現され、そのピクレベルが（ＬＰＳを用いて得られた）、１００％において設定された。ＭＥＣＯ−１による、および、α−ＭＳＨによる、ＨＭＧＢ１の抑制が、有意であった（＊＊Ｐ＜０．０１）。
【図５】ＭＥＣＯ−１が、培養マクロファージによるＨＭＧＢ１誘導ＴＮＦ放出を弱めることを樹立している実験結果のグラフである。マウスマクロファージ様ＲＡＷ２６４．７細胞が２４時間まで、精製組み換えＨＭＧＢ１（０．１ｍｇ／ｍＬ）と共に、１０−１０もしくは１０−１２ＭでのＭＥＣＯ−１（パネルＡ）もしくはα−ＭＳＨ（パネルＢ）非存在下にもしくは存在下に、インキュベートされた。培養培地におけるＴＮＦレベルが、ＥＬＩＳＡにより求められ、独立の２実験（重ねて２回）の平均±ＳＥＭとして表現された。対コントロール（＜＜ＨＭＧＢ１単独＞＞）＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。第３の実験において、非常に似た結果が得られたが、最大ＴＮＦ放出が１６〜２４時間において観察された（示さなかった）ことを除き、これは、ヒト内皮細胞を用いた他の（Ｇｅｒｓｔら、１９８８年）結果に似ていた。パネルＣおよびＤにおいて、細胞が、ＨＭＧＢ１と共に６時間、ＭＥＣＯ−１もしくはα−ＭＳＨ（０〜１０−６Ｍ）と共にインキュベートされた。データーは、重ねて（２回）実施された独立の３実験の平均±ＳＥＭを表す。１０−１４Ｍペプチドにおいて、結果が＊ｐ＜０．０５において有意であり、１０−１２Ｍ以上において典型的に、＊＊ｐ＜０．０１であった。
【図６】ＭＥＣＯ−１が、ヒト培養マクロファージによるＨＭＧＢ１誘導ＴＮＦ放出を弱めることを樹立させている実験データーのグラフである。ヒト末梢血単核細胞（ＨｕＰＢＭＣ）が、密度勾配遠心により、Ｆｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅＴＭ  ＰＬＵＳを通して単離され、５〜７日間、マクロファージコロニー刺激因子（２．５ｎｇ／ｍＬ）を含有している培地において培養された（Ｒｅｎｄｏｎ−Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、２００３年）。これら分化したヒトマクロファージが引き続き６時間、ＨＭＧＢ１（０．１ｍｇ／ｍＬ）と共に、指し示された濃度でのＭＥＣＯ−１もしくはα−ＭＳＨ非存在下にもしくは存在下に、インキュベートされた。無血清培地におけるＴＮＦ含量が、ＥＬＩＳＡにより求められ、重ねて（２回）実施された独立の３実験の平均±ＳＥＭとして表現された。対コントロール（＝ＨＭＧＢ１単独、加えられたメラノコルチンペプチドなし）で、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図７】ＭＣ１Ｒに対する抗体が、α−ＭＳＨおよびＭＥＣＯ−１の効果をブロックすることを樹立させている実験結果のグラフである。マウスマクロファージ様ＲＡＷ２６４．７細胞が、α−ＭＳＨ受容体−１（ＭＣ１Ｒ）（＜＜抗ＭＣ１Ｒ  Ａｂ＞＞）に対する特異的な抗体を用いてＨＭＧＢ１添加前１０分間、１０−１２ＭでのＭＥＣＯ−１もしくはα−ＭＳＨ非存在下にもしくは存在下に、前処理された。６時間において、無血清培地のＴＮＦ含量がＥＬＩＳＡにより求められ、重ねて（２回）実施された独立の２実験の平均±ＳＥＭとして表現された。我々の結果がここで、Ｔａｈｅｒｚａｄｅｈら（１９９９年）のものと異なり、彼らは同様の実験において、抗ＭＣ１Ｒが、ＬＰＳ単独を用いて観察されたものよりも、高レベルにまで、ＬＰＳに対して応答して、ＴＮＦ放出を増加させたことを見出した。ＡＣＴＨが同一濃度において、α−ＭＳＨおよびＭＥＣＯ−１のものから区別不可能であった結果を与えた。
【図８】環状（サイクリック）−ＡＭＰ産生のＭＥＣＯ−１刺激を実証している実験結果のグラフである。ＲＡＷ細胞が、ペプチドと共に３０分間３７℃において、１ｍＭでの３−イソブチル−１−メチルキサンチンを含有しているＯｐｔｉ−ｍｅｍ−１無血清培地においてインキュベートされた。細胞溶解物が抽出され、ｃ−ＡＭＰ測定が、市販キット（ｃ−ＡＭＰ、Ｂｉｏｔｒａｃｋ−Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙシステム、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）を使用しながら実施され、ｃ−ＡＭＰ標準曲線を、その製造元により推奨されたとおり用いた。ＭＳＨ単独を用いた４実験において、統計的に有意であった刺激が、１０−９Ｍにおいて３回、１０−１０Ｍにおいて１回記された。ＭＥＣＯ−１単独が、肯定の結果を、２実験において１０−１０Ｍにおいて与え、更なる実験において１０−９および１０−８Ｍにおいて与えた。ＡＣＴＨを用いた実験だけが、上で示されている。リガンド刺激ｃ−ＡＭＰへの４ｎｇ／ｍＬでのＬＰＳの、および、リガンド存在下での１００ｎｇ／ｍＬでのＨＭＧＢ１の、如何なる効果も、極めて適度であり、やや不一致であった。これらのデーターが、他の系における観察と一致しており、そこでは、生物学的応答の終点を測定している感度が、ｃ−ＡＭＰ産生に関する標準曲線の左ｌｏｇ単位１以上にあり、これは、下流経路が、ｃ−ＡＭＰ濃度の低レベルおよび小変化に対して抜群に感受性であると指し示すと解釈されている。
【図９】蛋白キナーゼＡ阻害によるＭＥＣＯ−１活性の予防を示している実験結果のグラフである。ＲＡＷ細胞が６時間、ＨＭＧＢ１（０．１μｇ／ｍＬ）と、１０−１０Ｍでのメラノコルチンペプチド存在下にもしくは非存在下にインキュベートされ、図５Ｃおよび５Ｄに対する凡例において記載されたとおりであった。Ｈ８９が、１μＭにおいて存在していた（他の試薬の１０分前に加えられた）。データーは、重ねて（２回）実施された独立の２実験の平均±ＳＥＭを表す（＊＊ｐ＜０．０１）。
【図１０】ＮＦ−κＢ活性へのメラノコルチンペプチドの効果を示している実験結果のグラフである。ＲＡＷ細胞が、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）と共に、１０−８Ｍおよび１０−６でのＭＥＣＯ−１もしくはα−ＭＳＨありなしで２時間、インキュベートされた。核抽出物が、ＮＦ−κＢ結合部位を含有しているビオチン標識オリゴヌクレオチドと混合され、次いで、ＥＭＳＡにおける４〜２０％ＲｅａｄｙゲルＴＢＥゲル上を走らされた。これら活性転写因子に関する濃度計の値が、ＧＳ−８００Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ  Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒソフトウェア（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用しながら、得られた。データーは、別の２実験の平均±ＳＥＭを表す。
【図１１】ＭＥＣＯ−１の生物活性類似体（アナログ）の活性を示しているグラフである。マクロファージ様細胞を用いた実験条件は、ＬＰＳ濃度が４ｎｇ／ｍＬであったこと以外、以前記載されたものと同一であった。ＭＥＣＯ−１に加えて、４種のペプチドが調製されたが、これら自体のＥＦ−ＧのＣ−末端の当該部分に見合った（マッチした）ものであり、ＭＥＣＯ−１に最も良く対応するように思われた。ＢＡＣＴＮとは、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎを言い；ＢＡＣＦＲとは、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓを言い；ＥＦＧ−２とは、ヒトミトコンドリアＥＦＧ−２を言う。他の実験において、ヒトミトコンドリアＥＦ−Ｇ１主体の合成ペプチドが、ＥＦ−Ｇ２から区別不可能な結果を与えた（データーは示さなかった）。代表的な実験が、示されている。同様の結果が、他の４実験において、観察された。この特別な実験において、ＭＥＣＯ−１が、１００ｐＭにおいて効果を示したが、１ｐＭにおいて示さなかった。殆どの実験において、１ｐＭにおいて有効であった。対ＬＰＳ単独で＊ｐ＜０．０５。
【図１２】マウスにおける食物摂取抑圧へのＭＥＣＯ−１の効果を示しているグラフである。パネルＡが、食事累積数へのＭＥＣＯ−１の効果を示す。これらＭＥＣＯ−１処理マウス（各対の棒（バー）の右手のメンバー）が、１時間での食事回数の僅かな増加を持つが、６時間までに、適度な（ざっと２０％）の抑制を持つ。パネルＢが、食事量へのＭＥＣＯ−１の効果を示す。ＭＥＣＯ−１を用いて処理されたマウス（棒（バー）の対の右半分）が、食事量の顕著な減少を、１時間、２時間、および６時間において示す。合計食物摂取の減少に関する主要な機序（メカニズム）が食事量の減少であることが、メラノコルチンの証拠であり、これら観察の生物学的関連に言及する。パネルＣが、ＭＥＣＯ−１処理マウスによる累積食物摂取を示す。この図が、下垂体の弓状核中にある用量のＭＥＣＯ−１を受け取ったマウスによる、６時間に亘る累積食物摂取抑制を示し、緩衝液（バッファー）コントロールを受け取ったマウスと比較されている。この結果が、否定のシグナルたるα−ＭＳＨを用いた結果に、非常に似ている。
【図１Ａ−Ｂ】
2009506773.tif 000003
【図１Ｃ】
2009506773.tif 000004
【図２Ａ】
2009506773.tif 000005
【図２Ｂ】
2009506773.tif 000006
【図３】
2009506773.tif 000007
【図４】
2009506773.tif 000008
【図５】
2009506773.tif 000009
【図６】
2009506773.tif 000010
【図７】
2009506773.tif 000011
【図８】
2009506773.tif 000012
【図９】
2009506773.tif 000013
【図１０】
2009506773.tif 000014
【図１１】
2009506773.tif 000015
【図１２Ａ】
2009506773.tif 000016
【図１２Ｂ】
2009506773.tif 000017
【図１２Ｃ】
2009506773.tif 000018