(57)【要約】改善された特性、たとえば臨床的長所を提供する特性を有する低分子量ヘパリン（LMWH）の調製物を本明細書において提供する。そのような調製物を作製および使用する方法、ならびにそのようなLMWH調製物の産生において、出発物質を分析する方法、中間体および最終産物を加工する方法を提供する。2009538386.tif 000053
2009538386.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
約5000〜9000 Daの重量平均分子量を有し、かつ
約70〜280の抗IIa活性を有する、
LMWH組成物。
【請求項２】
約100〜250 IU/mgの抗IIa活性を有する、請求項1記載のLMWH組成物。
【請求項３】
約5000〜9000 Daの重量平均分子量を有し、かつ
ACTまたはaPTTによって測定した場合にプロタミンによって少なくとも70％中和可能(neutralizable)である抗IIa活性を有する、
LMWH組成物。
【請求項４】
抗IIa活性がプロタミンの投与後約30分以内に少なくとも70％中和される、請求項3記載のLMWH組成物。
【請求項５】
約5000〜9000 Daの重量平均分子量を有し、かつ
組成物の5〜15％でΔUHNAc,6SGHNS,3S,6Sを有する、
LMWH組成物。
【請求項６】
二糖約9〜16個の平均鎖長を有し、かつ
組成物の5〜15％でΔUHNAc,6SGHNS,3S,6Sを有する、
LMWH組成物。
【請求項７】
重量平均分子量が約5500〜8500 Daである、請求項1、3、および5のいずれか一項記載のLMWH組成物。
【請求項８】
約100〜400 IU/mgの抗Xa活性をさらに含む、請求項1、3、5、および6のいずれか一項記載のLMWH組成物。
【請求項９】
約150〜300 IU/mgの抗Xa活性を有する、請求項8記載のLMWH組成物。
【請求項１０】
抗Xa活性がACTまたはaPTTによって測定した場合に少なくとも70％中和可能である、請求項8記載のLMWH組成物。
【請求項１１】
抗Xa活性がプロタミン投与後30分以内に少なくとも70％中和される、請求項10記載のLMWH組成物。
【請求項１２】
抗Xa活性が、血漿の抗Xa 100 IU当たり約1〜2 mgのLMWH組成物の用量で、プロタミンの投与後30分以内に、少なくとも70％中和されうる、請求項11記載のLMWH組成物。
【請求項１３】
5000〜9000 Daの重量平均分子量を有し、かつ
2：1またはそれ未満の抗Xa 対 抗IIa比を含む、
LMWH組成物。
【請求項１４】
重量平均分子量が約5500〜8500 Daである、請求項13記載のLMWH組成物。
【請求項１５】
組成物の活性がaPTTおよびACTによってモニターされうる、請求項1、3、5、6、および12のいずれか一項記載のLMWH組成物。
【請求項１６】
鎖の非還元末端でΔUおよびI/G構造の混合物を含む、請求項1、3、5、6、および12のいずれか一項記載のLMWH組成物。
【請求項１７】
組成物における鎖の総数の約15％〜35％が非還元末端でΔUを有する、請求項1、3、5、6、および12のいずれか一項記載のLMWH組成物。
【請求項１８】
組成物における鎖の総数の80％またはそれより多くが非還元末端で非硫酸化ΔUを有する、請求項17記載のLMWH組成物。
【請求項１９】
組成物における鎖の総数の5％未満が改変還元末端構造を有する、請求項1、3、5、6、および12のいずれか一項記載のLMWH組成物。
【請求項２０】
組成物における鎖の総数の少なくとも60％またはそれより多くが還元末端においてHNAcを含む、請求項1、3、5、6、および12のいずれか一項記載のLMWH組成物。
【請求項２１】
以下の一つまたは複数を有する、請求項1、3、5、6、または12のいずれか一項記載のLMWH組成物：
3％未満のカルシウム含有量；30％未満のナトリウム含有量；1000 ng/mg未満のへパリナーゼ酵素；1.0％w/w未満のメタノール；1.0％w/w未満のエタノール；2.0％未満の塩化物；10重量％未満の水；および2000 ppm未満の遊離の硫酸塩。
【請求項２２】
LMWHがエノキサパリンと比較してTFPI放出の少なくとも2倍の増加を提供する、請求項1、3、5、6、または12のいずれか一項記載のLMWH組成物。
【請求項２３】
約30分〜3時間の静脈内半減期を有する、請求項1、3、5、6、または12のいずれか一項記載のLMWH組成物。
【請求項２４】
約1.5〜2.5時間の皮下半減期を有する、請求項1、3、5、6、または12のいずれか一項記載のLMWH組成物。
【請求項２５】
以下の構造を有するLMWH組成物：
2009538386.tif 000048
式中
2009538386.tif 000049
RはHまたはSO3Naであり；
R1はSO3NaまたはCOCH3であり；
n＝2〜50であり；かつ
組成物は好ましくはnの平均値9〜16、または8〜15を有する。
【請求項２６】
以下の構造を有するLMWH組成物：
2009538386.tif 000050
式中
2009538386.tif 000051
XはNaまたはCaであり、RはHまたはSO3Naであり；
R1はSO3NaまたはCOCH3であり；
n＝2〜45であり；かつ
組成物は好ましくはnの平均値7〜13、または8〜12を有する。
【請求項２７】
以下の構造を有するLMWH組成物：
2009538386.tif 000052
式中、XはNaまたはCaであり、RはHまたはSO3Naであり；
R1はSO3NaまたはCOCH3であり；
n＝2〜50であり；かつ
組成物は好ましくはnの平均値9〜16、または8〜15を有する。
【請求項２８】
以下の特徴の一つまたは複数を含むLMWH組成物：
組成物が改変された還元末端構造を実質的に有しないこと；組成物の鎖の少なくとも60％が還元末端でHNAcを有すること；組成物の鎖の90％未満が非還元末端で硫酸化ΔUを有すること；組成物に連結領域が実質的に存在しないこと；組成物が3-O硫酸塩を有する鎖をエノキサパリンまたはダルテパリンより多く有すること；および組成物におけるΔUHNAc,6SGHNS,3S,6S 対 ΔU2SHNS,6SIHNAc,6SGHNS,3S,6Sの比が約4：1またはそれ未満であること。
【請求項２９】
組成物が、前記特徴の全てを有する、請求項28記載のLMWH組成物。
【請求項３０】
請求項1、3、5、6、12、または25のいずれか一項記載のLMWH組成物と薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
【請求項３１】
請求項1、3、5、6、12、または25のいずれか一項記載の組成物を対象に投与して、それによって障害を処置する段階を含む、血栓障害を有するまたはそのリスクを有する対象を処置する方法。
【請求項３２】
障害が急性冠動脈症候群（ACS）である、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
障害が心筋梗塞である、請求項31記載の方法。
【請求項３４】
障害がST上昇型心筋梗塞または非ST上昇型心筋梗塞である、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
障害が外科的介入に関連している、請求項31記載の方法。
【請求項３６】
外科的介入が、血管形成術、経皮的冠動脈インターベンション（PCI）、およびステント留置からなる群より選択される、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
対象が外科的介入を有しうる、外科的介入のリスクを有しうる、または外科的介入から回復しつつある、請求項35記載の方法。
【請求項３８】
対象が冠動脈バイパス移植手術（CABG）のリスクを有する、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
障害が安定または不安定狭心症である、請求項31記載の方法。
【請求項４０】
凝固アッセイを用いてLMWH組成物の活性をモニターする段階をさらに含む、請求項31記載の方法。
【請求項４１】
凝固アッセイが、活性化凝固時間（ACT）または活性化部分トロンボプラスチン時間（aPTT）である、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
LMWH組成物の抗Xa活性または抗IIa活性の一部または全てを中和するためにLMWH組成物の投与後に硫酸プロタミンを投与する段階をさらに含む、請求項31記載の方法。
【請求項４３】
LMWH組成物がCABGの前に中和される、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
目標ACT値を維持する必要がある対象に請求項1、3、5、6、または25のいずれか一項記載のLMWH組成物の多数回のボーラス注射を投与することによって、目標ACT値を維持する方法。
【請求項４５】
以下の段階を含む、患者における血栓障害を処置する方法：
請求項1、3、5、6、または25のいずれか一項記載のLMWH組成物を患者に投与する段階；
退院前に、外科的介入を必要としない、または外科的介入の候補者であると、患者を分類する段階；ならびに
患者が外科的介入の候補者であると分類される場合には、任意で、LMWH組成物をモニターする段階およびLMWH組成物を中和する段階の一方または双方を行う段階。
【請求項４６】
手術前、手術中、および手術後の一つもしくは複数、または全てでLMWH組成物の活性をモニターする段階をさらに含む方法であって、患者が外科的介入の候補者であると分類される、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
LMWH組成物の活性をモニターする段階、およびCABGの前に抗Xa活性、抗IIa活性、もしくはその双方の一部または全てを中和する段階の一方または双方をさらに含む方法であって、患者がCABGの候補者であると分類される、請求項45記載の方法。
【請求項４８】
以下の段階を含む、請求項1、3、5、6、または25のいずれか一項記載のLMWH組成物によって処置した対象をモニターする方法：
請求項1、3、5、6、または25のいずれか一項記載のLMWH組成物を投与された対象における活性化凝固時間（ACT）または活性化部分トロンボプラスチン時間（aPTT）を評価する段階。
【請求項４９】
以下の段階を含む、請求項1、3、5、6、または25のいずれか一項記載のLMWH組成物を投与された対象を処置する方法：
対象におけるLMWH組成物の抗Xa活性、抗IIa活性、または双方の一部または全てを中和するために、対象に硫酸プロタミンを投与する段階。
【請求項５０】
以下の段階を含む、LMWH組成物を製造する方法：
（1）未分画ヘパリン（UFH）試料を、極性の有機溶媒、極性の非有機溶媒、および塩による第一の沈殿に供して、第一の上清を提供する段階；
（2）第一の上清を、極性の有機溶媒および極性の非有機溶媒による第二の沈殿に供して、沈殿物を生じる段階；
（3）沈殿物を可溶化して、非硫酸化ウロン酸連結を切断する酵素によって可溶化沈殿物を切断する段階；
（4）切断された調製物を塩および極性の有機溶媒によって沈殿させて、二糖8〜14個の平均鎖長を有する固体を形成する段階；
（5）固体からの材料をサイズ選択段階に供して、二糖9〜16個の平均鎖長を有する調製物を提供し、それによってLMWH組成物を作製する段階。
【請求項５１】
以下の段階含む、二糖約9〜16個の平均鎖長を有するLMWH組成物を作製する方法：
二糖約8〜14個の平均鎖長を有する前駆体LMWH組成物を提供する段階；および
前駆体LMWH組成物を処理して、二糖約9〜16個の平均鎖長を有するLMWHを得る段階。
【請求項５２】
（1）未分画ヘパリン（UFH）試料を、極性の有機溶媒、極性の非有機溶媒、およびナトリウム塩による第一の沈殿に供して、第一の上清を提供する段階；ならびに
（2）第一の上清を、極性の有機溶媒、および極性の非有機溶媒による第二の沈殿に供して、沈殿物を生成する段階
を含み、それによってLMWH組成物を作製する、LMWH組成物を作製する方法。
【請求項５３】
UFH調製物に存在する一つまたは複数のN-アセチルおよびエポキシドの量を決定する段階、
その量を予め選択した基準と比較する段階、および
予め選択した基準を満たすか否かに基づいてUFH調製物に関する決定を下す段階
を含み、それによってUFH調製物を評価または加工する、
LMWH組成物への加工に対するUFH調製物の適切性を決定するために、未分画ヘパリン（UFH）調製物を評価または加工する方法。
【請求項５４】
中間体LMWH調製物における一つまたは複数の硫酸化イズロン酸、ウロン酸に連結したN-硫酸化ヘキソサミン、エポキシド、および6-O硫酸化ヘキソサミンの量を、未分画ヘパリン（UFH）出発物質における同じ構造部分の量と比較する段階、ならびに
出発物質と中間体LMWH調製物の間の予め選択した基準を満たすか否かに基づいて中間体LMWH調製物に関する決定を下す段階
を含み、それによって中間体LMWH調製物を評価または加工する、
LMWH組成物への加工に対する中間体調製物の適切性を決定するために、中間体LMWH調製物を評価または加工する方法。
【請求項５５】
以下の段階を含む、LMWH調製物を評価または加工する方法：
LMWH組成物を提供する段階、および
表10Aの構造が表10Aに提供される範囲に存在するか否かを決定し、それによってLMWH調製物を評価する段階。
【請求項５６】
以下の段階を含む、LMWH調製物を評価または加工する方法：
LMWH組成物を提供する段階、および
表11Aの構造が表11Aに提供される範囲に存在するか否かを決定し、それによってLMWH調製物を評価する段階。
【請求項５７】
LMWH組成物を2D NMRによって分析する段階；および
表11Aに記載されたピークの一つまたは複数が表11Aにおいて記述される範囲に存在するか否かを決定する段階
を含み、それによってLMWH調製物を評価する、LMWH調製物を評価する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その内容物が参照により本明細書に組み入れられる、2006年5月25日に提出された米国特許出願第60/809,136号、2006年10月4日に提出された第60/849,578号、および2006年10月5日に提出された第60/849,628号に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
背景
凝固は、哺乳動物における正常な止血の維持に関係する生理的経路である。血管の損傷が起こる条件において、凝固経路が刺激されて、血液の損失を防止するために凝血を形成する。血管損傷が起こった直後に、血小板は損傷部位で凝集し始めて漏出を停止させるために生理的な栓を形成する。さらに、損傷を受けた血管は血管収縮を受けて、その領域に対する血流を低減させてフィブリンが凝集し始めて不溶性のネットワークまたは凝血を形成し、これが破裂した領域を覆う。
【０００３】
凝固経路の不均衡が過度の凝固の方向にシフトすると、その結果血栓傾向が発生して、これは多くの場合、心臓発作、卒中、深部静脈血栓症、ならびに心筋梗塞および不安定狭心症のような急性冠動脈症候群として発現する。さらに、塞栓が血栓から切断されて、肺動脈塞栓症、または卒中もしくは一過性の虚血性発作が含まれる脳血管塞栓症が起こりうる。凝固経路の不均衡に関連する障害を処置するための現行の治療は多くのリスクを伴い、注意深く制御しなければならない。
【０００４】
内因性の起源から単離された複雑な硫酸化多糖類であるヘパリンおよび低分子量ヘパリン（LMWH）は、止血の強力な調節物質である。肥満細胞によって産生される高度硫酸化ヘパリン様グリコサミノグリカン（HLGAG）であるヘパリンは、広く用いられる臨床抗凝固剤であり、最初の生体高分子薬の一つであり、いくつかの炭水化物薬の一つである。ヘパリンおよびそれに由来する分子は、多様な臨床状況において、特に深部静脈血栓症および肺動脈塞栓症、動脈血栓症、ならびに心筋梗塞および不安定狭心症のような急性冠動脈症候群の予防および処置が含まれる血栓塞栓障害のために用いられる強力な抗凝固剤である。ヘパリンおよびLMWHは、凝固プロセスを阻害するために凝固カスケードの多数の成分と相互作用する。ヘパリンは主にその効果を、そのいずれもがアンチトロンビンIII（AT-III）の特異的五糖配列HNAc/S,6SGHNS,3S,6SI2SHNS,6Sに対する結合を伴う二つのメカニズムを通して誘発する。第一に、五糖にAT-IIIが結合すると、Xa因子の阻害を媒介するタンパク質においてコンフォメーションの変化を誘発する。第二に、トロンビン（IIa因子）も同様に五糖/AT-III結合部位に対して近位の位置でヘパリンに結合する。AT-III、トロンビン、およびヘパリンの間の三つの複合体の形成によって、トロンビンは不活化される。AT-III-五糖結合部位のみを必要とするその抗Xa活性とは異なり、ヘパリンの抗IIa活性は、AT-III、トロンビン、およびヘパリンの三つの複合体の効率的な形成に関する抗Xa活性の原因となる五糖単位に加え、サイズ依存的である。ヘパリンはまた、内皮細胞からの組織因子経路阻害剤（TFPI）の放出を媒介する。ヘパリン共因子であるTFPIは、第X因子に直接結合してこれを阻害するセリンプロテアーゼである。TFPIは、特にヘパリンと同時投与した場合に強力な抗血栓物質である。
【０００５】
ヘパリンは、多様な臨床状況において非常に有効であり、他の多くの状況において用いられる可能性を有するが、ヘパリン治療に関連する副作用は多く多様である。抗凝固は、65年もの間、未分画ヘパリン（UFH）に関する主な臨床的応用であった。その不安定な静脈内薬物動態および皮下での生物学的利用能の欠如により、UFHは静脈内注射によって投与されてきた。さらに、抗凝固剤としてのUFHの応用は、UFHと非特異的血漿タンパク質との結合に関連する多くの副作用によって妨害されている。
【０００６】
このことが、UFHに対する有効な代用物としての低分子量ヘパリン（LMWH）の生成および利用の急増につながった。LMWHは、UFHより予測可能な薬理作用、低減された副作用、およびより優れた生物学的利用能を提供する。市販のLMWH調製物は、プロタミンによって完全に中和されないことから、予想されない反応は、極端な副作用を有する可能性があり、エノキサパリンおよび他のLMWHの抗Xa活性は、≦2 mgプロタミン/100 IU抗Xa LMWHによって約40％程度中和可能(neutralizable)であるに過ぎない。抗IIa活性は、≦2 mgプロタミン/100 IU抗Xa LMWHによって約60％程度中和可能であるに過ぎない（一方、UFHの抗Xaおよび抗IIa活性は、≦2 mg硫酸プロタミン/100 IU抗Xa UFHによってほぼ完全に（＞90％）中和可能である）。
【０００７】
典型的にブタ小腸粘膜から単離されたこれらの多糖類の薬学的調製物は、長さおよび組成が不均一である。そのため、典型的な調製物のごく一部が抗凝固活性を保有するに過ぎない。最良の場合、ヘパリンまたはLMWHの薬学的調製物における多糖類の鎖の大部分が不活性であるが、最悪の場合、これらの鎖は、血漿タンパク質と非特異的に相互作用して、ヘパリン治療に関連する副作用を誘発する。したがって、UFHの抗凝固活性および他の望ましい活性を保持するが、副作用が低減された新規LMWHを開発することが重要である。LMWHは、本質的にその低減された鎖のサイズおよび分散度により、顕著により少ない非特異的血漿タンパク質結合を示す。しかし、現在市販されているLMWHは全て、UFHと比較して低減された抗IIa活性を保有する。活性が減少しているために、類似の抗Xaおよび抗IIa活性を達成するためにより高用量のLMWHが必要であり（UFHと比較して）、UFH活性に関する標準的な試験、すなわち活性化部分トロンボプラスチン時間（aPTT）または活性化凝固時間（ACT）は、それらが読み取りとして主に抗IIa活性に依存することから有用ではない。LMWHをモニターするために最も広く用いられている試験は、抗Xa活性試験であり、これは十分なレベルのアンチトロンビンIII（ATIII）を有する対象に依存し、これは常に当てはまるわけではない。この試験は費用が非常に高く（軽く100.00ドルを超える）、試料を一般的に分析のために外部の検査機関に送付しなければならないことからルーチンではなく、容易に利用できない。その結果、これまでLMWHの利用は、血栓の処置ではなくその予防にほぼ限定され、それを投与することができる患者集団は、中でも、小児患者、血液および尿におけるRFI、尿素、クレアチニン、燐、糸球体濾過速度（GFR）、またはBUN（血中尿素窒素レベル）によって測定された異常な腎機能を有する患者、ならびに心血管インターベンション患者集団を除き、限定されていた。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
本発明は、改善された特性、たとえば臨床的長所を提供する特性を有する、たとえば有するように設計されるLMWHの調製物の開発に一部基づく。そのような機能的特性には、例として硫酸プロタミンに反応する可逆性；予測可能なまたはそうでなければ改善された薬物動態；たとえばエノキサパリンと比較して改善された抗IIa活性；約30〜180分の時間での比較的一定な抗Xa活性 対 抗IIa活性比；モニター可能な(monitorable)活性レベル；皮下での生物学的利用能；およびヘパリン誘発血小板減少症（HIT）を引き起こす可能性の低減の、一つまたは複数が含まれる。本明細書において開示されるLMWHはまた、他の市販のLMWHとそれらを区別する構造特徴を有しうる。たとえば、本明細書において提供されるLMWH調製物は、以下の特徴の一つまたは複数を有しうる：実質的に検出不可能な連結領域；市販のLMWH調製物と比較した際の、3-O硫酸塩の量の増加；鎖のサブセットが非還元末端で非硫酸化ΔUを有すること；鎖のサブセット、たとえば鎖の大部分、たとえば実質的に全てが、還元末端でN-アセチル化ヘキソサミンを有すること；約1：1〜4：1（たとえば、約1：1、2：1、3：1、4：1）であるΔUHNAc,6SGHNS,3S,6S 対 ΔU2SHNS,6SIHNAc,6SGHNS,3S,6S比；および実質的に改変されていない還元末端構造。本発明には、これらの特性および特徴の一つまたは複数を有するLMWH調製物と共に、そのような調製物を作製および使用する方法が含まれる。本発明はまた、そのようなLMWH調製物の産生において、出発物質を分析する方法、中間体および最終産物を処理する方法を特色とする。
【０００９】
したがって、第一の局面において、本発明は、
約5000〜9000 Da、たとえば約5000〜8300 Da、たとえば約5500〜8000 Da、たとえば約5700〜7900 Da、たとえば約5800〜6800 Daの重量平均分子量；および
約50〜300、たとえば約70〜280、たとえば約90〜250 IU/mg、たとえば約100〜250 IU/mg、たとえば約100〜140 IU/mg、150〜200 IU/mg、約130〜190 IU/mg、たとえば約155〜195 IU/mgの抗IIa因子活性
を有するLMWH組成物を特色とする。
【００１０】
第二の局面において、本発明は、
約5000〜9000 Da、たとえば約5000〜8300 Da、たとえば約5000〜8000 Da、約5500〜8000 Da、たとえば約5700〜7900 Da、たとえば約5800〜6800 Daの重量平均分子量；および
たとえば、活性化部分トロンボプラスチン時間（ACT）または活性化部分トロンボプラスチン時間（aPTT）によって測定した場合に、プロタミンによって少なくとも50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％、または100％中和可能である抗IIa活性
を有するLMWH組成物を特色とする。好ましくは、LMWHの抗IIa活性は、プロタミンの投与後5、10、15、30分以内に少なくとも50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％、または100％中和される。
【００１１】
第三の局面において、本発明は、
約5000〜9000 Da、たとえば約5000〜8300 Da、たとえば約5500〜8000 Da、たとえば約5700〜7900 Da、たとえば約5800〜6800 Daの重量平均分子量、および
モル％によって測定した場合に組成物の5〜15％、たとえば7〜14％、たとえば9〜12％であるΔUHNAc,6SGHNS,3S,6S
を有するLMWH組成物を特色とする。好ましくは、分子の非還元末端でのΔUHNAc,6SGHNS,3S,6Sは、たとえばモル％によって測定した場合に組成物における鎖の約5〜15％、たとえば7〜14％、たとえば9〜12％である。
【００１２】
第四の局面において、本発明は、
二糖約9〜18個、または二糖8〜18個、たとえば二糖約9〜16個または8〜16個の平均鎖長、および
モル％によって測定した場合に組成物の5〜15％、たとえば7〜14％、たとえば9〜12％であるΔUHNAc,6SGHNS,3S,6Sを有するLMWH組成物を特色とする。好ましくは、分子の非還元末端でのΔUHNAc,6SGHNS,3S,6Sは、たとえばモル％によって測定した場合に組成物における鎖の約5〜15％、たとえば7〜14％、たとえば9〜12％である。
【００１３】
第五の局面において、本発明は、
約5000〜9000 Da、たとえば約5000〜8300 Da、たとえば約5500〜8000 Da、たとえば約5700〜7900 Da、たとえば約5800〜6800 Daの重量平均分子量、および
3：1もしくはそれ未満、たとえば2：1、たとえば1.6：1、1.5：1、1.4：1、1.3：1、1.2：1、1.1：1、1：1、または0.5：1である抗Xa 対 抗IIa比
を有するLMWH組成物を特色とする。
【００１４】
好ましくは、抗Xa 対 抗IIa比は、LMWH調製物の投与の過程において比較的一定のままであり、たとえば抗Xa 対 抗IIa比は、約30、60、120、180、240、300分の間に多くて約±1.5、±1、±0.5、または±0.2変化するに過ぎない。たとえば、抗Xa活性 対 抗IIa活性の最初の比が2である場合、初回投与後の2回目（たとえば、30、60、120、180、240、300分）に測定された比率は、好ましくは3未満であり、好ましくは2またはほぼ2であろう。
【００１５】
第七の局面において、本発明は、
任意で、約5000〜9000 Da、たとえば約5000〜8300 Da、たとえば約5500〜8000 Da、たとえば約5700〜7900 Da、たとえば約5800〜6800 Daの重量平均分子量を有し、かつ
へパリナーゼI、へパリナーゼII、およびへパリナーゼIIIによる消化ならびにキャピラリー電気泳動によって分析した場合に、表10Aのピーク1〜14のそれぞれが存在する、
LMWH組成物を特色とする。
【００１６】
好ましい態様において、へパリナーゼI、へパリナーゼII、およびへパリナーゼIIIによる消化ならびにキャピラリー電気泳動によって分析した場合のLMWH組成物のそれぞれのピークの量は、ほぼ表10Aにおいて見いだされる量であり、それぞれのピークの量は表10Aにおいて提供される範囲内であり、ピーク10および11の量は表10Aにおいて提供される範囲内である。
【００１７】
第八の局面において、本発明は、
任意で約5000〜9000 Da、たとえば約5000〜8300 Da、たとえば約5500〜8000 Da、たとえば約5700〜7900 Da、たとえば約5800〜6800 Daの重量平均分子量を有し、かつ
2D核磁気共鳴（NMR）によって分析した場合に、表11Aの構造のそれぞれに関してプロトンが存在する、
LMWH組成物を特色とする。
【００１８】
好ましい態様において、2D NMRによって分析した場合にLMWH組成物における構造のそれぞれの量は、ほぼ表11Aにおいて見いだされる量である。
【００１９】
第九の局面において、本発明は、以下の特徴の一つまたは複数を有するLMWH組成物を特色とする：
実質的に改変された還元末端構造を有しないこと（たとえば、鎖の少なくとも85％、90％、95％、またはそれより多くが有しないこと）；組成物の鎖の少なくとも60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％が還元末端でHNAcを有すること；組成物の鎖の90％、95％、98％、99％未満が非還元末端で硫酸化ΔUを有する、または全く有しないこと；組成物に実質的に連結領域が存在しないこと（たとえば、連結領域は0.1％未満）；組成物が、3-O硫酸塩を有する鎖を市販のLMWH、たとえばエノキサパリンまたはダルテパリンより多く有すること；および組成物におけるΔUHNAc,6SGHNS,3S,6S 対 ΔU2SHNS,6SIHNAc,6SGHNS,3S,6Sの比が約1：1〜4：1であること。
【００２０】
一つの態様において、組成物は、これらの特徴の二つ、三つ、四つ、五つ、または全てを有する。
【００２１】
第十の局面において、本発明は以下の構造を有するLMWH組成物を特徴とする：
2009538386.tif 000003
式中RはHまたはSO3Xであり；
R1はSO3XまたはCOCH3であり；
Xは一価または二価の陽イオンであり；
n＝2〜50、たとえば2〜40であり；かつ
組成物は好ましくはnの平均値9〜16、8〜16、または8〜15を有する。
【００２２】
一つの態様において、LMWH組成物は以下の構造を有する：
2009538386.tif 000004
式中
2009538386.tif 000005
RはHまたはSO3Xであり；
R1はSO3XまたはCOCH3であり；
Xは一価または二価の陽イオンであり；
n＝2〜50、たとえば2〜40であり；かつ
組成物は好ましくはnの平均値9〜16、8〜16、または8〜15を有する。
【００２３】
第十一の局面において、本発明は、以下の構造を有するLMWH組成物を特色とする：
2009538386.tif 000006
式中XはNaまたはCaであり、RはHまたはSO3Naであり；
R1はSO3NaまたはCOCH3であり；
n＝2〜45、たとえば2〜35であり；かつ
組成物は好ましくはnの平均値7〜11、または8〜12を有する。
【００２４】
一つの態様において、LMWH組成物は以下の構造を有する：
2009538386.tif 000007
式中
2009538386.tif 000008
式中XはNaまたはCaであり、RはHまたはSO3Naであり；
R1はSO3NaまたはCOCH3であり；
n＝2〜45、たとえば2〜35であり；かつ
組成物は好ましくはnの平均値7〜11、または8〜12を有する。
【００２５】
この組成物は、LMWHの産生における中間体として、たとえば速く移動する分画（本明細書において考察される）の酵素消化産物として存在しうる。
【００２６】
第十二の局面において、本発明は、以下の構造を有するLMWH組成物を特色とする：
2009538386.tif 000009
式中XはNaまたはCaであり、RはHまたはSO3Naであり；
R1はSO3NaまたはCOCH3であり；
n＝2〜50、たとえば2〜40であり；かつ
組成物は好ましくはnの平均値8〜15、たとえば10〜15または9〜16、たとえば11〜16を有する。
【００２７】
一つの態様において、LMWH組成物は以下の構造を有する：
2009538386.tif 000010
式中XはNaまたはCaであり、RはHまたはSO3Naであり；
R1はSO3NaまたはCOCH3であり；
n＝2〜50、たとえば2〜40であり；かつ
組成物は好ましくはnの平均値8〜15、たとえば10〜15、または9〜16、たとえば11〜16を有する。
【００２８】
この組成物は、LMWHの産生における中間体として、たとえば速く移動する分画（本明細書において考察される）を提供するための沈殿産物として存在しうる。
【００２９】
本明細書において記述されるいかなるLMWHも、他の特性を有しうる。たとえば、先に記述された組成物の一つはさらに、以下に記述される一つまたは複数の機能的または構造的特性を有しうる。
【００３０】
このように、一つの態様において、LMWH組成物は、約100〜400 IU/mg、たとえば約120〜380 IU/mg、たとえば約150〜350 IU/mg、たとえば約170〜330 IU/mg、たとえば約180〜300 IU/mg、たとえば約150〜200 IU/mg、200〜300 IU/mg、130〜220 IU/mg、225〜274 IU/mgの抗Xa活性を有する。
【００３１】
一つの態様において、LMWH組成物は、抗Xa活性、ACT、またはaPTTによって測定した場合に、少なくとも50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％、100％中和可能である抗Xa活性を有する。好ましくは抗Xa活性は、プロタミンの投与後5、10、15分以内に少なくとも50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％、または100％中和される。たとえば、抗Xa活性は、血漿の抗Xa 100 IUあたりLMWH約1、2、3 mgの用量でプロタミンの投与後5、10、15、30分以内に少なくとも50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％、または100％中和されうる。
【００３２】
もう一つの態様において、LMWH組成物は、以下の特性の一つまたは複数を有する：組成物の活性が、aPTTおよび/またはACTによってモニターされうること；組成物の多分散度が1.6未満、たとえば多分散度が約1.6〜1.1、たとえば1.5〜1.1、たとえば1.4〜1.1、たとえば1.3〜1.1、たとえば1.2〜1.1であること；組成物に存在する鎖の70％、60％、50％、45％、40％、35％、30％未満が、7500または8000 Daより大きい分子量を有すること；組成物に存在する鎖の40％、35％、30％、25％未満が、5500または5000 Da未満の分子量を有すること；組成物が、鎖の非還元末端でΔUおよびI/G構造の混合物を含むこと；ならびに組成物においてエノキサパリン、ダルテパリン、UFHより少ない鎖が、PF4結合部位を有すること。
【００３３】
一つの態様において、LMWH組成物における鎖の約 15％、20％、25％、30％、35％、45％、50％は、非還元末端でΔUを有する。好ましくは、組成物における鎖の約15％〜50％、たとえば15％〜35％、たとえば鎖の20％〜35％は、非還元末端においてΔUを有する。
【００３４】
一つの態様において、LMWH組成物は、エノキサパリンまたはダルテパリンより高い程度の硫酸化を有する。一つの態様において、LMWH組成物は、エノキサパリンまたはダルテパリンより多い三硫酸化二糖を有し、たとえばLMWH組成物は、モル％によって決定した場合に約50〜65％の三硫酸化二糖、たとえば55〜60％、55〜58％、57〜60％の三硫酸化二糖を有する。
【００３５】
一つの態様において、組成物は、エノキサパリン、ダルテパリン、および/またはUFHより高いレベルのΔUHNAc,6SGHNS,3S,6Sを有し、たとえば約5〜15モル％、たとえば7〜14モル％、たとえば9〜12モル％含む。
【００３６】
一つの態様において、LMWH組成物は、3％、2.5％、2％、1.5％、1.0％未満のカルシウム含有量、および/または30％、25％、20％、15％、10％未満のナトリウム含有量を有する。一つの態様において、LMWH組成物は、1000 ng/mg、750 ng/mg、500 ng/mg、250 ng/mg未満のへパリナーゼ酵素、たとえば本明細書において記述されるへパリナーゼ酵素；1.0％w/w、0.5％w/w、0.3％w/w未満のメタノール；1.0％w/w、0.5％w/w、0.3％w/w、0.1％w/w未満のエタノール；2.0％、1.75％、1.25％、1.0％、0.5％、0.3％、0.15％未満の塩化物；15重量重量％、10重量％、5重量％、2.5重量％未満の水；2000、1500、1000、950、900、850、800、750、700、650、600、550、500、450、400、350、300 ppm未満の遊離の硫酸塩を含む。
【００３７】
一つの態様において、LMWH組成物は、エノキサパリンと比較して増加したTFPI放出を提供する。一つの態様において、LMWHは、エノキサパリンと比較してTFPI放出の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40倍の増加を提供する。
【００３８】
一つの態様において、LMWH組成物は、約30分〜3時間、たとえば約1〜2時間の静脈内半減期を有する。一つの態様において、LMWH組成物は、約30分〜3.0または3.5時間の皮下半減期、たとえば約1.5〜2.5時間、たとえば約2時間の皮下半減期を有する。
【００３９】
第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、および第十の局面のいずれかの一つの態様において、LMWH組成物は、以下の特徴の一つまたは複数を有する：
組成物が、実質的に改変された還元末端構造を有しないこと（たとえば、鎖の少なくとも85％、90％、95％、またはそれより多くが有しないこと）；組成物の鎖の少なくとも60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％が、還元末端でHNAcを有すること；組成物の鎖の90％、95％、98％、99％未満が、非還元末端で硫酸化ΔUを有する、または全く有しないこと；組成物に実質的に連結領域が存在しないこと（たとえば、連結領域は0.1％未満）；組成物が、3-O硫酸塩を有する鎖を市販のLMWH、たとえばエノキサパリンまたはダルテパリンより多く有すること；および組成物におけるΔUHNAc,6SGHNS,3S,6S 対 ΔU2SHNS,6SIHNAc,6SGHNS,3S,6Sの比が約1：1〜4：1（たとえば、1：1、2：1、3：1、または4：1）であること。一つの態様において、LMWH組成物はこれらの特徴の二つ、三つ、四つ、五つ、または全てを有する。
【００４０】
もう一つの局面において、本発明は、以下の特性を有するLMWH組成物を特色とする：
約5000〜9000 Daの平均分子量；
50〜300 IU/mgの抗IIa活性約；
ACTまたはaPTTによって測定した場合にプロタミンによって少なくとも50％中和可能な抗IIa活性；
ΔUHNAc,6SGHNS,3S,6Sが組成物の5〜15％であり、好ましくは非還元末端でのΔUHNAc,6SGHNS,3S,6Sが組成物の約5〜15％であること；
二糖約9〜16個の平均鎖長；
3：1またはそれ未満の抗Xa 対 抗IIa比；
抗Xa 対 抗IIa比は、LMWHの投与の過程において比較的一定のままであり、たとえば抗Xa 対 抗IIa比は、約30、60、120、180、240、300分の間に多くて約±1.5、±1、±0.5、または±0.2変化するに過ぎないこと。たとえば、抗Xa活性 対 抗IIa活性の最初の比が2である場合、初回投与後の2回目（たとえば、30、60、120、180、240、300分）に測定された比率は、好ましくは3未満であり、好ましくは2またはほぼ2であろう。
【００４１】
好ましい態様において、LMWH組成物は以下の構造を有する：
2009538386.tif 000011
式中
2009538386.tif 000012
RはHまたはSO3Naであり；
R1はSO3NaまたはCOCH3であり；
n＝2〜50、たとえば2〜40であり；かつ
組成物は好ましくはnの平均値9〜16、または8〜15を有する。
【００４２】
好ましい態様において、LMWH組成物は、以下の特性を有する：
約100〜400 IU/mgの抗Xa活性；
たとえば抗Xa活性、ACT、またはaPTTによって測定した場合に、少なくとも50％中和可能である抗Xa活性；
1.6未満の多分散度；
組成物に存在する鎖の70％、60％、50％未満が7500 Daより大きい分子量を有すること；
組成物に存在する鎖の40％未満が分子量5000 Da未満を有すること；
これには鎖の比還元末端でΔUおよびI/G構造の混合物が含まれること；
これは、改変された還元末端構造を実質的に有しないこと；
組成物においてエノキサパリン、ダルテパリン、またはUFHより少ない鎖がPF4結合部位を有すること；
組成物の鎖の少なくとも60％、70％、80％、90％が還元末端でHNAcを有すること；
組成物における鎖の約15％〜35％が比還元末端でΔUを有すること；
組成物の鎖の90％、95％、98％、99％未満が非還元末端で硫酸化ΔUを有する、または全く有しないこと。
【００４３】
好ましい態様において、LMWH組成物は以下の特性を有する：
エノキサパリンまたはダルテパリンより高い程度の硫酸化を有すること；
エノキサパリンまたはダルテパリンより多くの三硫酸化二糖を組成物中に有する、たとえばLMWH組成物はモル％によって決定した場合に約50〜65％の三硫酸化二糖を有すること；
エノキサパリン、ダルテパリン、および/またはUFHより高いレベルのΔUHNAc,6SGHNS,3S,6Sを有し、たとえばΔUHNAc,6SGHNS,3S,6Sは、約5〜15モル％で存在すること。
【００４４】
好ましい態様において、LMWH組成物は以下の特性を有する：
3％未満のカルシウム含有量または20％未満のナトリウム含有量を有すること；
1000 ng/mg未満のへパリナーゼ酵素が含まれること；
1.0％w/w未満のメタノールを有すること；
1.0％w/w未満のエタノールを有すること；
2.0％未満の塩化物を有すること；
15重量％未満の水分を有すること；
2000 ppm未満の遊離の硫酸塩を有すること。
【００４５】
好ましい態様において、LMWH組成物は以下の特性を有する：
エノキサパリンと比較して増加した組織因子経路阻害剤（TFPI）の放出を提供すること。
【００４６】
好ましい態様において、LMWH組成物は、約30分〜3時間の静脈内半減期を有する。
【００４７】
もう一つの局面において、本発明は、LMWHを作製する方法を特色とする。この方法には、
低分子量分画を未分画ヘパリン（たとえば、速く移動する分画）から抽出して好ましくは二糖10〜16個の平均鎖長を有する第一の中間体を提供するために、UFHを一つのまたは連続して段階的に水性アルコール（たとえばエタノール）沈殿（ナトリウム塩により少なくとも一つ（またはカルシウム塩以外の塩））に供する段階；
第一の中間体を物質、たとえば非硫酸化ウロン酸のグリコシド連結を切断する酵素または化学物質、たとえば本明細書において記述される酵素を用いて、たとえば水性緩衝液中、たとえば水性塩緩衝液、たとえば酢酸ナトリウム緩衝液中において、pH約5〜9、たとえば7〜8で、25℃〜52℃、たとえば37℃で消化して、好ましくは二糖8〜14個、たとえば二糖8〜12個の平均鎖長を有する第二の中間体を産生する段階；
大きさに基づく段階、たとえばサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）によって、活性がより低い材料から第二の中間体の高分子量高抗Xa因子および抗IIa因子成分を分離して、好ましくは二糖9〜16個の平均鎖長を有する第三の中間体を産生する段階；ならびに任意で
第三の中間体を精製水に溶解して、たとえば0.2pmのフィルターを通して濾過し、薬物物質に凍結乾燥する段階が含まれる。
【００４８】
もう一つの局面において、本発明は、本明細書に記述の方法によって作製されるLMWH組成物を特色とする。
【００４９】
もう一つの局面において、方法には、本明細書において記述されるLMWHを作製または分析するための任意の方法からの中間体または反応混合物が含まれる。
【００５０】
もう一つの局面において、本発明は、本明細書において記述されるLMWH組成物が含まれる薬学的組成物を特色とする。
【００５１】
一つの態様において、薬学的組成物にはさらに、薬学的に許容される担体が含まれる。
【００５２】
一つの態様において、薬学的組成物は、全身投与にとって適した剤形である。好ましい態様において、薬学的組成物は、皮下、静脈内、動脈内、滑膜内、筋肉内、腹腔内、硝子体内、硬膜外、硬膜下、または鞘内投与にとって適している。一つの態様において、全身投与のための薬学的組成物は、等張溶液、たとえば保存剤を含むまたは含まない等張溶液となりうる。保存剤の例には、ベンジルアルコール、マンニトール、およびロイシンが含まれるがこれらに限定されるわけではない。本発明の薬学的組成物の単位投与量は、投与に適した包装または装置内に配置されうる。たとえば皮下送達にとって適した組成物は、皮下送達のために形成されたシリンジ内に配置されることができ、静脈内送達に適した組成物は、静脈内送達のために形成されたシリンジ内に、または静脈内送達のためのもう一つの装置内、たとえば静脈内点滴バッグまたはボトルに配置されうる。
【００５３】
一つの態様において、薬学的組成物は、局所侵襲性投与にとって適した剤形であり、たとえばコーティングされるかまたは埋め込みに適した装置内に存在する。埋め込みに適した装置の例には、ステント、および体外循環回路が含まれるがこれらに限定されるわけではない。一つの態様において、薬学的組成物は、皮下埋め込み、組織もしくは臓器への埋め込み（たとえば、冠動脈、頚動脈、腎動脈、他の末梢動脈、静脈、腎臓、心臓、角膜、硝子体、および小脳）、または組織もしくは臓器を取り囲む空間（たとえば、腎被膜、心膜、胸腔、または腹腔）への移植にとって適した剤形である。
【００５４】
一つの態様において、薬学的組成物は、非侵襲的投与、たとえば局所、経皮、肺内、鼻腔内、口腔内、外耳、直腸内、または膣内投与にとって適した剤形である。本発明の薬学的組成物の単位投与量は、そのような投与に適した包装または装置内に配置されうる。
【００５５】
一つの態様において、LMWH組成物は凍結乾燥される。もう一つの態様において、LMWH組成物は液体である。
【００５６】
一つの態様において、本発明は、薬学的組成物を含有する容器、たとえばアンプル、シリンジ、またはバイアルを特色とする。一つの態様において、LMWH組成物は、薬学的に許容される担体1 mLあたり1500 IU、2000 IU、2500 IU、3000 IU、3500 IU、4000 IU、4500 IU、5000 IU、5500 IU、6000 IUの抗Xa活性で存在する。
【００５７】
一つの態様において、薬学的組成物は、モル浸透圧約200〜400 mOsm/L、たとえば約250〜350 mOsm/L、約280〜330 mOsm/Lを有する。一つの態様において、薬学的組成物はさらに塩化ナトリウムおよび水を含む。
【００５８】
もう一つの局面において、本発明は、本明細書に開示されるLMWHを対象に投与する段階が含まれる、対象を処置する方法を特色とする。処置は治療的、たとえば、既に存在する望ましくない状態もしくはその症状を弱める、緩和する、もしくは改善する処置、または予防的、たとえば望ましくない状態もしくはその症状の発症を遅延、たとえば予防する処置となりうる。本明細書において記述されるLMWH組成物は、UFHによってまたは市販のLMWHによって、たとえばエノキサパリン、ダルテパリン、またはチンザパリンによって処置可能な障害を処置するために用いることができる。本発明には、以下からなる群より選択される障害または状態を有するまたはそのリスクを有する対象を処置する方法が含まれる：凝固に関連する障害、たとえば深部静脈血栓症（DVT）もしくは肺動脈塞栓症、血栓症、または心血管疾患、たとえば急性冠血管症候群（ACS）、安定もしくは不安定狭心症、心筋梗塞、たとえばST部分上昇型心筋梗塞（STEMI）、または非ST部分上昇型心筋梗塞（NSTEMI）、血管状態、または心房細動；偏頭痛；アテローム性動脈硬化症；自己免疫疾患またはアトピー性障害のような炎症障害、乾癬、関節炎、敗血症；播種性血管内凝固障害（DIC）；喘息、肺気腫、成人呼吸窮迫症候群（ARDS）、嚢胞性線維症、または肺再灌流障害のようなアレルギーまたは呼吸障害；狭窄または再狭窄；癌または転移障害；血管新生障害；主要臓器線維症、線維増殖障害、および外傷に関連する瘢痕化のような線維症障害；骨粗鬆症；アルツハイマー病；股関節骨折のような骨折。対象は、外科技法、たとえば臓器移植、整形外科手術、関節置換、たとえば股関節置換または膝関節置換手術、経皮的冠動脈インターベンション（PCI）、ステント留置、血管形成術、または冠動脈バイパス移植手術（CABG）を受けているまたは受けた人であり得る。本発明の組成物は、障害または状態を処置するために有効な量で、疾患の一つまたは複数を有するまたは発症するリスクを有する対象に投与される。
【００５９】
一つの態様において、方法にはさらに、凝固アッセイを用いて、たとえばACTおよび/またはaPTTを用いて対象におけるLMWH組成物の活性をモニターする段階が含まれる。
【００６０】
一つの態様において、方法にはさらに、LMWH組成物の活性、たとえば抗Xa活性および/または抗IIa活性の一部または全てを中和するためにLMWH組成物の投与後に硫酸プロタミンを投与する段階が含まれる。一つの態様において、LMWH組成物の抗IIa活性の50％、60％、70％、80％、90％、95％、または全てが中和され、たとえばLMWH組成物の抗IIa活性の50％、60％、70％、80％、90％、95％、または全てが、プロタミン投与後5、10、15、20、25、30、40分以内に中和される。一つの態様において、LMWH組成物の抗IIa活性の50％、60％、70％、80％、90％、95％、または全てが中和され、たとえばLMWH組成物の抗IIa活性の50％、60％、70％、80％、90％、95％、または全てが、プロタミン投与後5、10、15、20、25、30、40分以内に中和される。一つの態様において、硫酸プロタミンは、血漿の抗Xa 100 IUあたりLMWH組成物約1 mg、2 mg、3 mg、5 mgの用量で投与される。抗Xa活性および/または抗IIa活性の中和は、たとえばACTおよび/またはaPTTによって決定されうる。
【００６１】
もう一つの局面において、本発明は、対象における障害、たとえば血栓障害を処置（たとえば、治療的または予防的に処置）する方法を特色とする。方法には、それによって障害を処置する、好ましくは予防するために、本明細書に記述されるLMWH組成物を投与する段階が含まれる。一つの態様において、障害はACS、心筋梗塞、たとえばNSTEMI、またはSTEMI、安定狭心症および不安定狭心症の一つまたは複数である。好ましくは、血栓障害は、たとえばSTEMIが含まれる動脈血栓症である。障害は、たとえば外科的介入、たとえばPCI、ステント留置または血管形成術に関連しうる。たとえば、対象は、外科的介入、たとえば心血管インターベンション（たとえば、血管形成術、PCI、ステント留置）を有しうる、有するリスクを有しうる、またはそれらから回復しつつある。一つの態様において、対象は、外科的介入、たとえばCABGを受ける（たとえば検討されている）リスクを有する。
【００６２】
一つの態様において、LMWH組成物は対象に、たとえば約0.03 mg/kg〜0.45 mg/kg、たとえば0.03 mg/kg、0.05 mg/kg、0.1 mg/kg、0.15 mg/kg、0.2 mg/kg、0.22 mg/kg、0.25 mg/kg、0.27 mg/kg、0.3 mg/kg、0.35 mg/kg、0.37 mg/kg、0.4 mg/kg、0.44 mg/kgの用量で静脈内投与される。好ましい態様において、LMWH組成物は約 0.1〜0.3 mg/kg、たとえば0.1 mg/kg、0.15 mg/kg、0.20 mg/kg、0.22 mg/kg、0.25 mg/kg、0.27 mg/kg、または0.30 mg/kgの用量で静脈内投与される。もう一つの態様において、LMWH組成物は、たとえば約0.1 mg/kg、0.15 mg/kg、0.2 mg/kg、0.25 mg/kg、0.3 mg/kg、0.35 mg/kg、0.4 mg/kg、0.44 mg/kg、0.47 mg/kg、0.5 mg/kg、0.55 mg/kg、0.60 mg/kg、0.7 mg/kg、0.8 mg/kg、0.9 mg/kg、1.0 mg/kgの用量で対象に皮下投与される。好ましい態様において、LMWH組成物は、約0.15〜1.0 mg/kg、0.20〜0.9 mg/kg、0.25〜0.9 mg/kg、0.30〜0.50 mg/kg、たとえば0.30 mg/kg、0.35 mg/kg、0.40 mg/kg、0.42 mg/kg、0.44 mg/kg、0.47 mg/kg、または0.50 mg/kgの用量で皮下投与される。
【００６３】
一つの態様において、方法にはさらに、凝固アッセイ、たとえばACTおよび/またはaPTTを用いて対象におけるLMWH組成物の活性をモニターする段階が含まれる。一つの態様において、抗Xa活性および/または抗IIa活性は、外科的介入、たとえば血管形成術、PCI、ステント留置前、ステント留置中、および/またはステント留置後にたとえばACTおよび/またはaPTTによってモニターされる。一つの態様において、抗Xa活性および/または抗IIa活性は、LMWH組成物の投与前、投与中、および/または投与後に、たとえばACTおよび/またはaPTTによってモニターされる。いくつかの態様において、抗Xa活性および/または抗IIa活性は、ACTによってモニターされ、LMWHの用量はACT約200〜350秒を達成するように投与される。
【００６４】
一つの態様において、方法にはさらに、LMWH組成物の活性、たとえば抗Xa活性および/または抗IIa活性の一部または全てを中和するためにLMWH組成物の投与後に硫酸プロタミンを投与する段階が含まれる。一つの態様において、LMWH組成物の抗IIa活性の少なくとも約50％、60％、70％、80％、90％、95％、または全てが中和され、たとえばLMWH組成物の抗IIa活性の少なくとも約50％、60％、70％、80％、90％、95％、または全てが、プロタミン投与後5、10、15、20、25、30、40分以内に中和される。一つの態様において、LMWH組成物の抗IIa活性の少なくとも約50％、60％、70％、80％、90％、95％、または全てが中和され、たとえばLMWH組成物の抗IIa活性の少なくとも約50％、60％、70％、80％、90％、95％、または全てが、プロタミン投与後5、10、15、20、25、30、40分以内に中和される。一つの態様において、硫酸プロタミンは、血漿の抗Xa 100 IUあたりLMWH組成物約1〜5 mg、たとえば1 mg、2 mg、3 mg、5 mgの用量で投与される。抗Xa活性および/または抗IIa活性の中和は、たとえばACTおよび/またはaPTTによって決定されうる。一つの態様において、抗Xa活性および/または抗IIa活性は、硫酸プロタミン投与前、投与中、および/または投与後にたとえばACTおよび/またはaPTTによって決定されうる。一つの態様において、抗Xa活性および/または抗IIa活性は、外科的介入前、介入中、または介入後に中和される。たとえば、一つの態様において抗Xa活性および/または抗IIa活性は、血管形成術またはPCIのような外科的介入中または介入後に中和されうる。もう一つの態様において、LMWH組成物は、CABGのような外科的介入の前に中和される。
【００６５】
一つの態様において、方法にはさらに、負の反応、たとえば硬膜外または脊髄血腫、血液漏出、または出血に関して患者をモニターする段階が含まれる。
【００６６】
一つの態様において、LMWH組成物は静脈内投与または皮下投与される。
【００６７】
一つの態様において、LMWH組成物は、別の治療物質、たとえば抗凝固剤または抗血栓剤、たとえばビバリルジン（Angiomax）、ASA、GPIIbIIIa阻害剤（たとえば、エプチフィバチドまたはアブシキシマブ）、ADP阻害剤（たとえば、Plavix）、rPA、TNKアーゼ、アスピリン、P2Y12阻害剤、血小板阻害剤、ワルファリン、およびこれらの組み合わせと併用して投与される。
【００６８】
本明細書において開示される可逆的（中和可能な）およびモニター可能なLMWH組成物によって、患者、たとえば入院患者または可能性がある心血管処置、たとえば手術に関して評価を受けている患者の処置において柔軟性が改善される。したがって、もう一つの局面において、本発明は、患者における障害、たとえば血栓または心血管障害を処置（たとえば、治療的または予防的に処置）する方法を特色とする。方法には以下の段階が含まれる：
任意で本明細書に記述の可逆的でモニター可能なLMWH組成物を患者に投与する段階；
退院前に、患者（LMWH組成物が投与されている、または投与されるであろう患者）を、外科的介入を必要としないとして分類する（たとえば退院前に外科的介入を必要としないとして患者を分類する）、または外科的介入の候補者であると分類する段階；
患者が外科的介入の候補者であると分類される場合、任意で、可逆的でモニター可能なLMWH組成物をモニターする段階（たとえば、本明細書において記述されるように、凝固アッセイによって、たとえばACTおよび/またはaPTTを用いて）および可逆的でモニター可能なLMWH組成物を中和する段階（たとえば、本明細書において記述されるように、たとえば硫酸プロタミンを投与することによって）の一方または双方を行う段階。
【００６９】
一つの態様において、LMWH組成物は、たとえば約0.03 mg/kg〜0.45 mg/kg、たとえば0.03 mg/kg、0.05 mg/kg、0.1 mg/kg、0.15 mg/kg、0.2 mg/kg、0.22 mg/kg、0.25 mg/kg、0.27 mg/kg、0.3 mg/kg、0.35 mg/kg、0.37 mg/kg、0.4 mg/kg、0.44 mg/kgの用量で対象に静脈内投与される。好ましい態様において、LMWH組成物は、約0.1〜0.3 mg/kg、たとえば0.1 mg/kg、0.15 mg/kg、0.20 mg/kg、0.22 mg/kg、0.25 mg/kg、0.27 mg/kg、または0.30 mg/kgの用量で静脈内投与される。もう一つの態様において、LMWH組成物は、約0.1 mg/kg、0.15 mg/kg、0.2 mg/kg、0.25 mg/kg、0.3mg/kg、0.35 mg/kg、0.4 mg/kg、0.44 mg/kg、0.47 mg/kg、0.5 mg/kg、0.55 mg/kg、0.60 mg/kg、0.7 mg/kg、0.8 mg/kg、0.9 mg/kg、1.0 mg/kgの用量で対象に皮下投与される。好ましい態様において、LMWH組成物は、約0.15〜1.0 mg/kg、0.20〜0.8 mg/kg、0.25〜0.90 mg/kg、0.30〜0.50 mg/kg、たとえば0.30 mg/kg、0.35 mg/kg、0.40 mg/kg、0.42 mg/kg、0.44 mg/kg、0.47 mg/kg、または0.50 mg/kgの用量で皮下投与される。
【００７０】
好ましい態様において、患者は、外科的介入、たとえばPCI、ステント留置、または血管形成術の候補者であると分類され、可逆的でモニター可能なLMWH組成物の効果がモニターされる。好ましい態様において、外科的介入が行われ、可逆的でモニター可能なLMWH組成物が、手術前、手術中、および手術後に1回またはそれより多く、または全てモニターされる。一つの態様において、患者はPCIのような外科的介入の前にACT約200〜350に関してモニターされる。
【００７１】
好ましい態様において、患者は、外科的介入、たとえばCABGの候補者であると分類され、可逆的でモニター可能なLMWH組成物の効果は、モニターされることおよび中和されることの一方または双方である。好ましい態様において、外科的介入が行われ、可逆的でモニター可能なLMWH組成物が、手術前、手術中、および手術後に1回またはそれより多く、または全てモニターされる。一つの態様において、患者はCABGのような外科的介入の前にACT約400〜600、たとえば400〜500に関してモニターされる。
【００７２】
好ましい態様において、対象は、血栓障害に関して処置されている。一つの態様において、障害は、ACS、心筋梗塞、たとえばNSTEMIまたはSTEMI、安定狭心症および不安定狭心症の一つまたは複数である。好ましくは、血栓障害は、たとえばST上昇（STEMI）が含まれる動脈血栓症である。
【００７３】
もう一つの局面において、本発明は、本明細書において記述されるモニター可能なLMWH組成物によって処置された対象をモニターする方法を特色とする。方法には、
任意で、本明細書に記述のモニター可能なLMWH組成物を対象に投与する段階、および
対象（モニター可能なLMWH組成物を投与されている）におけるaPTTおよび/またはACTを評価する段階
が含まれる。
【００７４】
一つの態様において、ベースラインaPTTおよび/またはACTは、LMWHによって対象を処置する前に決定される。一つの態様において、方法には、LMWHを投与された対象のaPTTおよび/またはACTを、ベースラインaPTTおよび/またはACTと比較する段階が含まれる。
【００７５】
一つの態様において、対象は、以下の段階：LMWH組成物の投与前、投与中、および投与後の一つもしくは複数、または全てでモニターされる。一つの態様において、対象は、外科的介入、たとえばPCI、ステント留置、または血管形成術前、血管形成術中、および/または血管形成術後にモニターされる。一つの態様において、LMWH組成物は、PCIのような外科的介入前および/または介入中にACT約200〜350に関してモニターされる。もう一つの態様において、LMWH組成物は、CABGの前にACT約400〜600、たとえば約400〜500に関してモニターされる。
【００７６】
もう一つの局面において、本発明は、本明細書に記述される可逆的なLMWH組成物を投与されている対象を処置する方法を特色とする。方法には、
任意で本明細書において記述される可逆性のLMWH組成物を対象に投与する段階；および
可逆性のLMWH組成物を中和する段階（たとえば、本明細書において記述されるように、たとえば硫酸プロタミンを投与することによって）
が含まれる。
【００７７】
一つの態様において、対象は、以下の段階：硫酸プロタミンの投与前、投与中、および投与後の一つまたは複数、または全てでモニターされる。
【００７８】
もう一つの局面において、本発明は、高い抗IIa活性を有するLMWH、たとえば本明細書において記述されるLMWH組成物の使用に関する説明書（たとえば、書面、口頭、またはコンピューター作成説明書）を助言または提供する方法を特色とする。方法には、たとえば異常な腎機能、糖尿病、または凝血結合トロンビンを有する患者；PCI、ステント留置、CABG、血管形成術等の候補者である患者；心血管インターベンション患者；これまでに投与されたLMWHの中和、たとえば硫酸プロタミンによる中和を必要とする患者；硬膜外または脊髄血腫、血液漏出、および/または出血のリスクを有する患者に、使用に関する説明書を提供する段階が含まれる。一つの態様において、説明書は、ACS、心筋梗塞、たとえばNSTEMIまたはSTEMI、安定狭心症および不安定狭心症のためにLMWH組成物を投与すること、たとえば異常な腎機能を有する患者または高齢者（たとえば年齢60歳より上の患者）のような患者の亜集団における投与に関する。一つの態様において、説明書は、血栓障害のために、たとえば外科的介入、たとえばPCI、ステント留置、または血管形成術に関連する血栓障害のためにLMWH組成物を投与することに関する。
【００７９】
もう一つの局面において、本発明は、ACTおよび/またはaPTTを用いて抗Xa活性および/または抗IIa活性のモニタリングに関する説明書を提供する段階が含まれる、本明細書において記述されるLMWH組成物の使用を助言する方法を特色とする。
【００８０】
もう一つの局面において、本発明は、LMWH組成物、たとえば本明細書に記述のLMWH組成物を製造する方法を特色とする。方法には、以下の段階の一つまたは複数が含まれる：
（1）グリコサミノグリカン（GAG）含有試料、たとえばUFHを、たとえば極性の有機溶媒（たとえば、アルコール、たとえばエタノール）、極性の非有機溶媒（たとえば、水）、および塩（たとえば、ナトリウム塩、たとえば酢酸ナトリウム、またはカルシウム塩、たとえば酢酸カルシウム）による第一の沈殿に供して、第一の上清を生じる段階；
（2）第一の上清を、たとえば極性の有機溶媒（たとえば、アルコール、たとえばエタノール）、および極性の非有機溶媒（たとえば、水）による第二の沈殿に供して、沈殿物（これを本明細書において他所で記述されているように速く移動する分画を提供するために用いることができる）を生じる段階；
（3）沈殿物を好ましくは水において可溶化して、たとえばN-アセチルグルコサミン残基に隣接する非硫酸化ウロン酸のグリコシド連結を切断する物質によって可溶化沈殿物を切断する段階。例は、好ましくは酢酸ナトリウムの存在下での、本明細書において記述されるへパリナーゼIII酵素、好ましくはMO11であり、好ましくはUV平衡によって示されるように完了するまで行い、切断調製物を提供する。
（4）切断された調製物を、たとえば塩、たとえばナトリウム塩、好ましくは塩化ナトリウム、および極性の有機溶媒、たとえばアルコール、たとえばメタノールによって沈殿させて、二糖8〜14個、たとえば二糖8〜12個の平均鎖長を有する糖類を有する固体を形成する段階。
（5）固体からの材料を精製段階、たとえばクロマトグラフィー精製段階、たとえばサイズ選択段階、たとえば排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、または濾過に供して、段階（4）より大きい平均分子量を有する調製物を提供する段階。好ましい態様において、より大きい平均分子量調製物は、二糖9〜16個の平均鎖長または平均分子量5000〜9000 Daを有する。
【００８１】
もう一つの局面において、本発明は、二糖約9〜16個の平均鎖長を有するLMWH組成物を作製する方法を特色とする。方法には、
二糖9〜16個、好ましくは二糖約8〜14個、たとえば二糖8〜12個の平均鎖長を有する前駆体LMWH組成物（たとえば、本明細書において記述される方法からの中間組成物）を提供する段階；および
前駆体LMWH組成物を処理して二糖約9〜16個の平均鎖長を有するLMWHを得る段階
が含まれる。
【００８２】
好ましくは、処理には、サイズに基づく選択、たとえばサイズ依存的分離、たとえばサイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、または濾過の一つまたは複数による分離が含まれる。
【００８３】
一つの態様において、前駆体LMWH組成物は、二糖約8〜14個、たとえば二糖8〜12個の平均鎖長を有する調製物である。好ましい態様において、これはより高分子量の調製物、たとえばUFHの塩沈殿および酵素消化が含まれる方法によって得られた。一つの態様において、塩は一価または二価の陽イオンの塩である。用いることができる一価および二価の陽イオンの例には、たとえばナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウム、バリウム、カルシウム、マグネシウム、ストロンチウム、およびこれらの組み合わせが含まれる。一つの態様において、一価または二価の陽イオンの塩は、一価または二価の陽イオンの酢酸塩である。
【００８４】
一つの態様において、消化のために用いられる酵素（または複数の酵素）は、たとえばN-アセチルグルコサミン残基に隣接する非硫酸化ウロン酸の一つまたは複数のグリコシド連結を切断する。用いることができる酵素の例には、たとえばへパリナーゼIII、へパリナーゼIIIの変異体、たとえば米国特許第5,896,789号において記述されるへパリナーゼIII変異体（たとえば、His 36、His105、His110、His139、His152、His225、His234、His241、His424、His469、およびHis539からなる群より選択される一つまたは複数のヒスチジン残基がアラニンに置換されているへパリナーゼIII変異体）、およびバクテロイデス・シータイオタオミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron）からのヘパリン硫酸グリコサミノグリカンリアーゼIIIが含まれる。好ましい態様において、消化のために用いられる酵素は、アミノ酸配列の残基225位のアラニンがアラニンによって置換された変異型へパリナーゼIIIである。
【００８５】
好ましい態様において、前駆体組成物は、以下によって得ることができる：
（1）グリコサミノグリカン（GAG）含有試料、たとえばUFHを、たとえば極性の有機溶媒（たとえば、アルコール、たとえばエタノール）、極性の非有機溶媒（たとえば、水）、および塩（たとえば、ナトリウム塩、たとえば酢酸ナトリウム、またはカルシウム塩、たとえば酢酸カルシウム）による第一の沈殿に供して、第一の上清を生じる段階；
（2）第一の上清を、たとえば極性の有機溶媒（たとえば、アルコール、たとえばエタノール）および極性の非有機溶媒（たとえば、水）による第二の沈殿に供して、沈殿物（これを本明細書において他所で記述されているように速く移動する分画を提供するために用いることができる）を生じる段階；
（3）任意で、沈殿物を可溶化して、好ましくは酢酸ナトリウムの存在下で、へパリナーゼIII酵素、好ましくはMO11によって、好ましくはたとえば9.8より大きいUV吸収によって示されるように完了するまで、可溶化沈殿物を切断して、切断された調製物を提供する段階。
【００８６】
一つの局面において、本発明は、LMWH組成物、たとえば本明細書において記述されるLMWH組成物を作製する方法を特色とする。方法には以下が含まれる：
（1）グリコサミノグリカン（GAG）含有試料、たとえばUFHを、たとえば極性の有機溶媒（たとえば、アルコール、たとえばエタノール）、極性の非有機溶媒（たとえば、水）、および塩（たとえば、酢酸ナトリウム）による第一の沈殿に供して、第一の上清を生じる段階；
（2）第一の上清を、たとえば極性の有機溶媒（たとえば、アルコール、たとえばエタノール）および極性の非有機溶媒（たとえば、水）による第二の沈殿に供して、沈殿物（これを本明細書において他所で記述されているように速く移動する分画を提供するために用いることができる）を生じる段階；
（3）任意で、沈殿物を可溶化して、好ましくは酢酸ナトリウムの存在下で、本明細書において記述される酵素によって、好ましくはたとえば9.8より大きいUV吸収によって示されるように完了するまで、可溶化沈殿物を切断して、切断された調製物を提供する段階；ならびに
（4）任意で分画を処理してLMWH調製物を産生する段階。
【００８７】
一つの態様において、消化のために用いられる酵素（または複数の酵素）は、たとえばN-アセチルグルコサミン残基に隣接する非硫酸化ウロン酸の一つまたは複数のグリコシド連結を切断する。用いることができる酵素の例には、たとえばへパリナーゼIII、へパリナーゼIIIの変異体、たとえば米国特許第5,896,789号において記述されるへパリナーゼIII変異体（たとえば、His 36、His105、His110、His139、His152、His225、His234、His241、His424、His469、およびHis539からなる群より選択される一つまたは複数のヒスチジン残基がアラニンに置換されているへパリナーゼIII変異体）、およびバクテロイデス・シータイオタオミクロンからのヘパリン硫酸グリコサミノグリカンリアーゼIIIが含まれる。好ましい態様において、消化のために用いられる酵素は、アミノ酸配列の残基225位のアラニンがアラニンによって置換された変異型へパリナーゼIIIである。
【００８８】
一つの態様において、消化された分画は最終産物である。他の態様において、方法には、最終産物を得るために一つまたは複数のさらなる処理段階が含まれうる。一つの態様において、方法には、二糖9〜16個の平均鎖長を有するLMWH組成物を得るために消化分画を処理する段階が含まれる。一つの態様において、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および/または濾過を用いて、二糖9〜16個の平均鎖長を有するLMWH組成物を得ることができる。
【００８９】
もう一つの局面において、本発明は、LMWH組成物、たとえば本明細書において記述されるLMWH組成物に加工するためのGAGの適切性を決定するために、UFHのようなGAGを評価または処理する方法を特色とする。方法には、GAG調製物に存在するN-アセチルの量を決定する段階、その量を予め選択した基準と比較する段階、および予め選択した基準と合致しているか否かに基づいてGAG調製物に関する決定を下す段階が含まれる。好ましい態様において、ある決定または段階が行われ、たとえばGAG調製物は分類、容認または廃棄され、薬物物質もしくは薬物産物に加工されるか、または予め選択した基準に合致しているか否かに応じて、決定を反映するように、記録が作成もしくは変更される。いくつかの態様において、予め選択した基準に合致していない場合、LMWH組成物の製造における一つまたは複数の段階を変化させることに関する決定を行うことができる。
【００９０】
一つの態様において、予め選択された基準は、モル％によって決定した場合に、総グルコサミン含有量と比較して、GAG調製物において約11％またはそれより多い量で存在するN-アセチルである。N-アセチル含有量がこの範囲内にあるGAG調製物は、LMWH組成物、たとえば本明細書に記述されるLMWH組成物に加工するために適したGAG調製物を示している。そのような態様において、この予め選択された基準に合致する場合、GAG調製物は容認されて中間体、薬物物質、または薬物産物へ加工される。
【００９１】
一つの態様において、GAG調製物に存在するN-アセチルの量は、たとえば核磁気共鳴（NMR）を用いて決定することができる。
【００９２】
好ましい態様において、本明細書において開示される方法は、プロセスの見地から、たとえばバッチ毎の一貫性もしくは質をモニターもしくは確保するために、または予め選択した基準に関して試料を評価するために有用である。
【００９３】
一つの局面において、本発明は、LMWH組成物に加工するための中間体調製物の適切性を決定するために、たとえば本明細書において記述された方法によって産生された中間体LMWH調製物を評価または処理する方法を特色とする。中間体LMWH調製物は、たとえば本明細書において記述される溶媒においてグリコサミノグリカン（GAG）含有試料のナトリウムまたは酢酸ナトリウムによる塩沈殿によって得られた速く移動する分画である。方法には、中間体LMWH調製物における一つまたは複数の構造部分、たとえば一つまたは複数の硫酸化イズロン酸、ウロン酸に連結したN-硫酸化ヘキソサミン、エポキシド、および6-0硫酸化ヘキソサミンの量を、未分画ヘパリン出発物質における同じ構造部分の量と比較する段階、ならびに出発物質と中間体LMWH調製物の間の予め選択された基準が合致するか否かに基づいて中間体LMWH調製物に関する決定を下す段階が含まれる。好ましい態様において、ある決定または段階が行われ、たとえば中間体LMWH調製物は、分類、容認、または廃棄され、薬物物質もしくは薬物産物に加工されるか、または予め選択された関係を満たすか否かに応じて、決定を反映するように、記録が作成または変更される。いくつかの態様において、予め選択された基準に合致しない場合、LMWH組成物の製造において一つまたは複数の段階の変更に関する決定を行うことができる。
【００９４】
一つの態様において、予め選択された基準は、出発物質と比較した際の中間体調製物における硫酸化イズロン酸の減少である。減少した硫酸化イズロン酸含有量を有する中間体調製物は、中間体調製物が、LMWH組成物、たとえば本明細書に記述されるLMWH組成物にさらに加工するために適していること示している。そのような態様において、予め選択された基準を満たす場合、中間体調製物は容認され、さらなる中間体、薬物物質、または薬物産物へと加工される。
【００９５】
一つの態様において、予め選択された基準は、出発物質と比較した際の中間体調製物におけるウロン酸（たとえば、イズロン酸および/またはグルクロン酸）に連結したN-硫酸化ヘキソサミンの増加である。ウロン酸に連結した増加したN-硫酸化ヘキソサミンを有する中間体調製物は、中間体調製物が、LMWH組成物、たとえば本明細書において記述されるLMWH組成物にさらに加工するために適していることを示している。そのような態様において、予め選択された基準を満たす場合、中間体調製物は容認され、さらなる中間体、薬物物質、または薬物産物へと加工される。
【００９６】
一つの態様において、予め選択された基準は、出発物質と比較した際の中間体調製物におけるエポキシドの減少である。エポキシド含有量が減少した中間体調製物は、中間体調製物が、LMWH組成物、たとえば本明細書に記述されるLMWH組成物にさらに加工するために適していること示している。そのような態様において、予め選択された基準を満たす場合、中間体調製物は容認され、さらなる中間体、薬物物質、または薬物産物へと加工される。
【００９７】
一つの態様において、予め選択された基準は、出発物質と比較した際の中間体調製物における6-O硫酸化ヘキソサミンの増加である。6-O硫酸化ヘキソサミンの増加を有する中間体調製物は、中間体調製物が、LMWH組成物、たとえば本明細書に記述されるLMWH組成物にさらに加工するために適していることを示している。そのような態様において、予め選択された基準を満たす場合、中間体調製物は容認され、さらなる中間体、薬物物質、または薬物産物へと加工される。
【００９８】
一つの態様において、出発物質および/または中間体調製物における構造部分の量は、核磁気共鳴（NMR）、キャピラリー電気泳動（CE）、および高速液体クロマトグラフィー（HPLC）の一つまたは複数を用いて決定される。
【００９９】
好ましい態様において、本明細書において開示される方法は、プロセスの見地から、たとえばバッチ毎の一貫性もしくは質をモニターもしくは確保するために、または予め選択した基準に関して試料を評価するために有用である。
【０１００】
一定の特徴によって、UFH試料を本発明のLMWHを作製するためのより好ましい出発物質にすることができる。したがって、もう一つの局面において、本発明は、本明細書において記述されるLMWH組成物を作製するための出発物質としてUFH調製物を評価する方法を提供する。
【０１０１】
方法には、本明細書において記述されるLMWHを作製するために用いられるUFH試料の適切性に関連するパラメータに関するUFH調製物の評価を提供する段階；および任意でパラメータに関して決定される値（たとえば、存在、量、分布、または非存在に相関する値）が予め選択された基準を満たすか否か、たとえば存在するか、または予め選択された範囲内に存在するか否かの決定を提供して、それによってUFH試料を評価する段階が含まれる。
【０１０２】
好ましい態様において、基準が満たされ、UFH試料が選択されてLMWHに加工される。
【０１０３】
好ましい態様において、パラメータは、表2において記載される構造、好ましくは、LMWHを作製する方法における段階の有効性に関連する構造、たとえばへパリナーゼによる切断を促進する、またはそれに正に相関する構造、たとえばHNAc（内部）の、存在または量である。
【０１０４】
好ましい態様において、方法には、UFH試料におけるHNAc（内部）の量が参照と既定の関係を有するか否か、たとえば予め選択された参照値に等しいかまたはそれより大きいかを決定する段階が含まれる。
【０１０５】
好ましい態様において、LMWHを作製するために用いられる中間体におけるパラメータの値も同様に決定され、任意でその値は、LMWHを作製するために用いられるUFHを選択するために既定の基準を満たさなければならない。
【０１０６】
一つの局面において、本発明は、本明細書において記述されるLMWH組成物を作製するための出発物質として、UFH調製物を評価する方法を提供する。
【０１０７】
方法には、任意で、中間体を提供するためにUFH試料において操作、たとえば沈殿を行う段階（好ましくは、この中間体を産生するために用いられる段階および中間体は、LMWHを作製するために用いられる方法の段階および中間体と同じである）；本明細書において記述されるLMWHを作製するために用いられるUFHの適切性に関連するパラメータに関する中間体調製物の評価を提供する段階；ならびに任意で、パラメータに関して決定される値（たとえば、存在、量、分布、または非存在に相関する値）が予め選択された基準を満たすか否か、たとえば存在するか、または予め選択された範囲内に存在するか否かの決定を提供して、それによってUFH試料を評価する段階
が含まれる。
【０１０８】
好ましい態様において、基準は満たされ、UFH試料が選択されて、LMWHに加工される。
【０１０９】
好ましい態様において、パラメータは、表2において記載される構造、好ましくは、LMWHを作製する方法における段階の有効性に関連する構造、たとえばへパリナーゼによる切断を促進する、またはそれに正に相関する構造、たとえばHNAc（内部）の、存在または量である。
【０１１０】
好ましい態様において、方法には、中間体試料におけるHNAc（内部）の量が参照と既定の関係を有するか否か、たとえば予め選択された参照値に等しいかまたはそれより大きいかを決定する段階が含まれる。
【０１１１】
好ましい態様において、UFHにおけるパラメータの値も同様に決定され、任意でその値は、LMWHを作製するために用いられるUFHを選択するために既定の基準を満たさなければならない。
【０１１２】
これらの方法のいずれかの好ましい態様において、決定または段階が行われ、たとえば試料は、予め選択された基準に合致するか否かに応じて、分類、選択、容認もしくは廃棄されるか、放出もしくは差し控えられるか、または薬物産物に加工される、輸送される、異なる場所に移動される、処方される、ラベル表示される、包装される。市場に出される、販売されるもしくは販売用に提供される、または決定を反映するように記録が作成もしくは変更される。たとえば、決定の結果、または一つもしくは複数の被験実体が存在するか否かに基づいて、または参照標準に対して比較して、試料が採取されるバッチを、たとえばまさに記述したように処理することができる。
【０１１３】
いずれかの方法において、好ましい態様には、試料をNMRによって分析する段階が含まれる。
【０１１４】
好ましい態様において、いずれかの方法には、パラメータに関して決定された値を参照値または複数の値と比較して、それによって試料を評価する段階が含まれうる。好ましい態様において、比較には、試験値が参照値と予め選択された関係を有するか否かを決定する段階、たとえば値が参照値に合致するか否かを決定する段階が含まれる。値は、数値である必要はなく、たとえば被験実体が存在するか否かの単なる指標となりうる。
【０１１５】
いずれかの方法の好ましい態様には、試験値が参照値に等しいもしくはそれより大きいか否か、試験値が参照値より小さいもしくはそれに等しいか否か、または試験値が範囲内に入るか否か（一方または双方のエンドポイントを含むまたは除外）を決定する段階が含まれうる。
【０１１６】
いずれかの方法の好ましい態様において、試験値、または予め選択された基準を満たすか否かの指標を、コンピューター読み取り可能な記録に記憶させることができる。
【０１１７】
いずれかの方法の好ましい態様において、中間体は、以下の段階の一つもしくは複数、または全てによって調製される：
（1）UFH試料を、たとえば極性の有機溶媒（たとえば、アルコール、たとえばエタノール）、極性の非有機溶媒（たとえば、水）、および塩（たとえば、ナトリウム塩、たとえば酢酸ナトリウム）による第一の沈殿に供して、第一の上清を生じる段階；
（2）第一の上清を、たとえば極性の有機溶媒（たとえば、アルコール、たとえばエタノール）および極性の非有機溶媒（たとえば、水）による第二の沈殿に供して、沈殿物（これを本明細書において他所で記述されているように速く移動する分画を提供するために用いることができる）を生じる段階；
（3a）沈殿物を、好ましくは水において可溶化する段階；
（3b）たとえばN-アセチルグルコサミン残基に隣接する非硫酸化ウロン酸のグリコシド連結を切断する酵素（または複数の酵素）、たとえばヘパリナーゼIII酵素、好ましくはMO11によって、好ましくは酢酸ナトリウムの存在下で、かつ好ましくはたとえば9.8より大きいUV吸収によって示されるように完了するまで、可溶化沈殿物を切断して、切断された調製物を提供する段階。
【０１１８】
好ましい中間体は、段階（2）または（3a）において産生される中間体であるが、方法は他の段階を用いることができる。
【０１１９】
もう一つの局面において、本発明は、本明細書において記述されるLMWH調製物を評価する方法を特色とする。方法には、本明細書において記述されるLMWH調製物を提供する段階；本明細書において記述される構造、活性、または機能が調製物に存在する、または調製物によって保持されるか否かを決定して、それによって、本明細書において記述されるLMWH調製物を評価する段階が含まれる。好ましい態様において、決定する段階には、構造、活性、または機能が予め選択されたレベルであるか、または予め選択された範囲であるか、たとえば本明細書において開示されるレベルまたは範囲内であるか否かを決定する段階が含まれる。
【０１２０】
したがって、一つの局面において、本発明は、本明細書において記述されるLMWH組成物を評価または処理する方法を提供する。方法には、表10Aにおいて記載されるピークに関連するパラメータの評価を提供する段階が含まれる。そのようなパラメータには、ピークの存在、相対分布、もしくは量が含まれ、またはそれらの関数となりえて、任意で、パラメータに関して決定された値（たとえば、存在、量、分布、または非存在に相関する値）は、予め選択された基準を満たすか否か、たとえば存在するか、または予め選択された範囲内に存在するか否かの決定を提供して、それによって混合物を評価または処理する。
【０１２１】
好ましい態様において、方法には、へパリナーゼI、へパリナーゼII、へパリナーゼIIIによる消化による試料の消化物を、電気泳動、たとえばキャピラリー電気泳動によって分析、たとえば分離する段階が含まれる。
【０１２２】
好ましい態様において、方法には、表10Aにおいて記載されるピークの一つまたは複数が存在するか否かを決定するために試料を評価する段階が含まれる。
【０１２３】
好ましい態様において、方法には、パラメータに関して決定された値と参照値または複数の参照値との比較を提供して、それによって試料を評価する段階が含まれる。好ましい態様において、比較には、試験値が参照値と予め選択された関係を有するか否かを決定する段階、たとえば試験値が参照値に合致するか否かを決定する段階が含まれる。値は、数値である必要はなく、たとえば、単に被験実体が存在するか否かの指標であることもできる。
【０１２４】
好ましい態様において、方法には、試験値が参照値に等しいもしくはそれより大きいか否か、試験値が参照値より小さいもしくはそれに等しいか、または試験値が範囲内に入るか否か（一方または双方のエンドポイントを含むまたは除外）を決定する段階が含まれる。例として、表10Aにおいて記載されるピークの量を決定することができ、任意で予め選択された範囲内、たとえば表10Aの範囲に対応する範囲内に入ることが示される。好ましい態様において、それぞれのピークの量は、表10Aにおいて見いだされる量についてのものであり、それぞれのピークの量は表10Aにおいて提供される範囲内である；ピーク10および11の量は、表10Aにおいて提供される範囲内である。
【０１２５】
好ましい態様において、試験値、または予め選択された基準を満たすか否かの指標を、たとえばコンピューター読み取り可能な記録に記憶させることができる。
【０１２６】
好ましい態様において、決定または段階がなされ、たとえば試料は、予め選択された基準に合致するか否かに応じて、分類、選択、容認、もしくは廃棄されるか、放出もしくは差し控えられるか、薬物産物に加工される、輸送される、異なる場所に移動される、処方される、ラベル表示される、包装される、市場に出される、販売される、もしくは販売用に提供されるか、または決定を反映するように記録が作成もしくは変更される。たとえば、決定の結果、または一つもしくは複数の被験実体が存在するか否かに基づいて、または参照標準に対して比較して、試料が採取されるバッチを、たとえばまさに記述したように処理することができる。
【０１２７】
表10Aにおける構造はCEを用いて、および必要であれば他の分析法を用いて決定することができる。
【０１２８】
もう一つの局面において、本発明は、本明細書において記述されるLMWH調製物を評価または処理する方法を特色とする。方法には、
へパリナーゼI、へパリナーゼII、へパリナーゼIIIによって消化され、CEのような分離技術によって分離されたLMWH調製物を提供する段階；
表10Aにおいて記載されるピークの一つまたは複数が存在するか否かを決定する段階
が含まれる。
【０１２９】
好ましい態様において、方法には、表10Aにおいて記載されたピークが表10Aから予め選択された範囲内に入るか否かを決定する段階が含まれる。好ましい態様において、それぞれのピークの量は、表10Aにおいて見いだされる量についてのものであり、それぞれのピークの量は表10Aにおいて提供される範囲内であり、ピーク10および11の量は表10Aにおいて提供される範囲内である。
【０１３０】
もう一つの局面において、本発明は、本明細書において記述されるLMWH組成物を評価または処理する方法を提供する。
【０１３１】
方法には、表11Aの構造または複数の構造に関連するパラメータの評価を提供する段階が含まれる。そのようなパラメータには、構造の存在、相対分布、または量が含まれ、またはそれらの関数となりえ、任意で、パラメータに関して決定された値（たとえば、存在、量、分布、または非存在に相関する値）は、予め選択された基準を満たすか否か、たとえば存在するか、または予め選択された範囲内に存在するか否かの決定を提供して、それによって混合物を評価または処理する。
【０１３２】
好ましい態様において、方法には、2D-NMRを用いて組成物を分析する段階が含まれる。
【０１３３】
好ましい態様において、方法には、表11Aにおいて提供される構造の一つまたは複数が存在するか否かを決定するために試料を評価する段階が含まれる。
【０１３４】
好ましい態様において、方法には、パラメータに関して決定された値を参照値または複数の値と比較して、それによって試料を評価する段階が含まれうる。好ましい態様において、比較には、試験値が参照値と予め選択された関係を有するか否かを決定する段階、たとえば値が参照値に合致するか否かを決定する段階が含まれる。値は、数値である必要はなく、たとえば、単に被験実体が存在するか否かの指標であることができる。
【０１３５】
好ましい態様において、方法には、試験値が参照値に等しいもしくはそれより大きいか否か、試験値が参照値より小さいもしくはそれに等しいか否か、または試験値が範囲内に入るか否か（一方または双方のエンドポイントを含むまたは除外）を決定する段階が含まれうる。例として、表11Aにおいて提供された構造の量を決定することができ、任意で予め選択された範囲、たとえば表11Aの範囲に対応する範囲内に入ることが示される。好ましい態様において、それぞれの構造の量は、表11Aにおいて見いだされる量についてのものであり、それぞれの構造の量は表11Aにおいて提供される範囲内である。
【０１３６】
好ましい態様において、試験値または予め選択された基準を満たすか否かの指標は、たとえばコンピューター読み取り可能な記録に記憶させることができる。
【０１３７】
好ましい態様において、ある決定または段階が行われ、たとえば試料は、予め選択された基準に合致するか否かに応じて、分類、選択、容認、もしくは廃棄されるか、放出もしくは差し控えられるか、薬物産物に加工される、輸送される、異なる場所に移動される、処方される、ラベル表示される、包装される、市場に出される、販売される、もしくは販売用に提供されるか、または決定を反映するように記録が作成または変更される。たとえば、決定の結果、または一つもしくは複数の被験実体が存在するか否かに応じて、または参照標準に対して比較して、試料が採取されるバッチを、たとえばまさに記述したように処理することができる。
【０１３８】
表11Aにおける構造は、2D NMRを用いて、必要であれば他の分析法を用いて決定することができる。
【０１３９】
もう一つの局面において、本発明は、本明細書において記述されるLMWH調製物を評価または処理する方法を特色とする。方法には、2D NMRを用いて分析されたLMWH調製物を提供する段階；表11Aにおいて記載された構造の一つまたは複数が存在するか否かを決定する段階が含まれる。
【０１４０】
好ましい態様において、方法には、表11Aにおいて記載された構造が予め選択された範囲内、たとえば表11Aの範囲1に対応する範囲内に入るか否かを決定する段階が含まれる。好ましい態様において、それぞれの構造の量は、表11Aにおいて見いだされる量についてのものであり、それぞれの構造の量は表11Aにおいて提供される範囲内である。
【０１４１】
本明細書において記述されるいくつかの方法には、被験実体が予め選択されたレベルまたは予め選択された範囲内に存在するか否かの決定を行う段階が含まれ、そのレベルまたは範囲は、特定の測定単位、たとえばX-Yモル％の範囲内に存在する、たとえばモル％で表記される。被験実体の量をモル％に関して決定することによって方法を行うことができ、その後モル％で表記した参照値、この場合X-Yモル％で表記した参照値と比較することができる。しかし、モル％に関して測定を行う必要はなく、これをモル％で表記された参照値と比較する。試料は、モル％の単位で記述された場合にX-Yとして表記することができる試験実体の実際のレベルを有する。その実際のレベルはまた、他の単位で、たとえば重量％で表記することができる。表記される単位によらず、実際のレベルは同じである。方法におけるモル％の詳述は、被験実体の実際の量を単に示すに過ぎない。被験実体のレベルは、他の単位に関して測定することができ、他の単位に関して表記されている参照値が、本実施例におけるモル％、たとえばX-Yモル％で表記された参照値と同じ量の試験実体に対応する限り、参照値を他の単位に関して表記することができる。このように、被験実体がX-Yモル％で存在することを示すことを必要とする方法は、被験実体が代わりの測定単位、たとえば重量％、鎖長、または％AUCで表記される範囲に存在することを示すことによって行うことができ、代わりの測定単位で記述される範囲は、本実施例においてX-Yモル％と呼ばれるモル％を生じるであろう被験実体の同じ量に対応する。
【０１４２】
当技術分野において公知の方法を本明細書と共に応用することによって、代わりの測定単位に関して機能的に同等の範囲を確立することができる。たとえば、X-Yモル％の範囲で試料を提供して、次に代わりの測定単位に関してそれらの試料に関する対応する範囲を確立することができる。
【０１４３】
本発明の他の特色および長所は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【０１４４】
詳細な説明
最適化されたLMWH
多くの臨床状況において、LMWHはより予測可能な薬物動態を有し、皮下投与できることから、市販のLMWH調製物はUFH調製物より好ましい。しかし、現在利用可能なLMWH調製物は、実質的な抗IIa活性、硫酸プロタミンによる可逆性（または中和性）、およびモニター可能性(monitorability)のようなUFHの望ましい特性の多くを欠損する。このように、LMWHが最適または実際の処置選択ではない臨床状況が存在する。本発明は、たとえば他の市販のLMWH調製物およびUFH調製物に対して臨床的に有利である特性を有するように設計されたLMWH調製物を特色とする。そのような特性には、硫酸プロタミンによる可逆性；予測可能な薬物動態、抗IIa活性；実質的に一定の抗Xa活性 対 抗IIa活性比；たとえばACTまたはaPTTのような標準的な試験によるモニター可能な活性レベル；皮下での生物学的利用能；およびHITの発生の低減の、一つまたは複数が含まれる。
【０１４５】
抗IIa活性
抗IIa活性、たとえば約50〜300 IU/mg、約70〜280 IU/mg、約90〜250 IU/mg、約100〜140 IU/mg、約100〜140 IU/mg、約150〜約200 IU/mg、約130〜190 IU/mg、約155〜195 IU/mgの抗IIa活性を提供するために、十分な長さ（たとえば、調製物の平均鎖長および/または調製物の重量平均分子量に関して記述することができる）の鎖の有意な数が含まれるLMWH調製物が本明細書において開示される。抗IIa活性は、平行線検定に関する統計学的方法を用いて抗IIa活性の国際単位/mgで計算される。本明細書において記述される抗IIa活性レベルは、以下の原理を用いて測定される。
M118＋ATIII → [M118・ATIII]
IIa
M118・ATIII → [M118・ATIII・IIa]＋IIa（過剰量）
IIa（過剰量）＋基質 → ペプチド＋pNA（分光光度法によって測定）
【０１４６】
抗IIa因子活性は、トロンビンの阻害におけるアンチトロンビン（ATIII）に及ぼす試料増強効果によって決定される。トロンビンの過剰量は分光光度法によって間接的に測定することができる。抗IIa因子活性は、たとえばDiagnostica StagoアナライザーまたはChromogenix（S-2238基質、トロンビン（53nkat/vial）、およびアンチトロンビン）の試薬を用いてACL Futura（商標）凝固システム、または任意の同等のシステムにおいて測定することができる。アナライザーの反応は、第二回低分子量ヘパリン国際標準を用いて較正される。
【０１４７】
鎖長/分子量
LMWH調製物に十分な鎖長の鎖が含まれるか否かの決定は、たとえばLMWH調製物における鎖の平均鎖長を決定することによって、および/またはLMWH調製物内の鎖の重量平均分子量を決定することによって行うことができる。平均鎖長を決定する場合、二糖約5〜20個、たとえば7〜18個、好ましくは9〜16個または8〜14個の反復単位の平均鎖長は、LMWH調製物における鎖の有意な数が十分な鎖長の数であることを示している。
【０１４８】
本明細書において用いられるように、「平均鎖長」は、鎖内で起こるウロン酸/ヘキソサミン二糖反復単位の平均鎖長を指す。非ウロン酸および/または非ヘキソサミン構築ブロック（たとえば付着したPEG部分）は、平均鎖長の決定に含まれない。平均鎖長は、数平均分子量（Mn）を、二糖の数平均分子量（500 Da）で除することによって決定される。数平均分子量を決定する方法は、SEC MALSを用いて以下に記述される。
【０１４９】
そのようなLMWH調製物の例には、以下が含まれる：
2009538386.tif 000013
式中、RはHまたはSO3Xであり；
R1はSO3XまたはCOCH3であって、Xは一価または二価の陽イオン（たとえば、NaまたはCa）であり；かつ
nの平均値は9〜16、または8〜15である；
2009538386.tif 000014
式中
2009538386.tif 000015
RはHまたはSO3Xであり；
R1はSO3XまたはCOCH3であって、Xは一価または二価の陽イオン（たとえば、NaまたはCa）であり；かつ
nの平均値は9〜16、または8〜15である；
2009538386.tif 000016
式中、Xは一価または二価の陽イオン（たとえば、NaまたはCa）であり；
RはHまたはSO3Xであり；
R1はSO3XまたはCOCH3であり；かつ
nの平均値は約8〜12、または7〜11である；
2009538386.tif 000017
式中、Xは一価または二価の陽イオン（たとえば、NaまたはCa）であり；
RはHまたはSO3Xであり；
R1はSO3XまたはCOCH3であり；
nの平均値は8〜12、または7〜11であり；かつ
2009538386.tif 000018
である。
【０１５０】
調製物の重量平均分子量を決定する場合、重量平均分子量約5000〜9000 Da、約5000〜8300 Da、好ましくは約5500〜8000 Da、約5700〜7900、または約5800〜6800 Daは、LMWH調製物における鎖の有意な数が十分な鎖長の数であることを示している。
【０１５１】
本明細書において用いられるように、「重量平均分子量」は、ウロン酸/ヘキソサミン二糖反復単位の鎖のダルトンでの平均重量を指す。非ウロン酸および/または非ヘキソサミン構築ブロックの存在は、重量平均分子量の決定に含まれない。このように、調製物における鎖または複数の鎖内での非ウロン酸および非ヘキソサミン構築ブロックの分子量は、重量平均分子量の決定に含まれてはならない。重量平均分子量（Mw）は、以下の等式：Mw＝Σ(cimi)/Σciから計算される。変数ciは、スライスiでの高分子の濃度であり、Miはスライスiでの高分子の分子量である。総和は、データの多くのスライスを含有するクロマトグラフィーピークに対してなされる。データのスライスは、クロマトグラフィーピーク対時間のプロットにおいて垂直な線として描くことができる。したがって、溶出ピークを多くのスライスに分割することができる。重量平均分子量の計算は、濃度および分子量の全てのスライスの総和に依存する平均値である。重量平均モル重量は、たとえばWyatt Astraソフトウェアまたは任意の適したソフトウェアを用いて測定することができる。本明細書において記述される重量平均分子量は、二つのカラムを連続で用いる高速液体クロマトグラフィー、たとえば多角度光散乱（MALS）検出器および屈折率測定検出器に連続して連結させたTSK G3000 SWXLおよびG2000 SWXLによって決定される。用いた溶出剤は、0.2硫酸ナトリウム、pH 5.0、および流速0.5 mL/分である。
【０１５２】
非還元末端構造
鎖長のほかに、調製物における鎖の約5〜15モル％、7〜14モル％、または9〜12モル％が、鎖の非還元末端から単糖約2、4、または6個で、またはその内部でΔUHNAc,6SGHNS,3S,6Sを有しうる。この構造を定量するために用いることができる方法には、たとえばキャピラリー電気泳動（CE）および高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、たとえば逆相高速液体クロマトグラフィー（RPHPLC）が含まれる。LMWH調製物におけるΔUHNAc,6SGHNS,3S,6Sのモル％を定量するために、ΔUHNAc,6SGHNS,3S,6Sに関する反応因子（RF）を決定することができる。決定にはまた、たとえばCEまたはHPLCを用いて、たとえば本明細書において記述されるCE法を用いて、得られた全ての種に関するRFを決定する段階が含まれうる。CE、たとえば本明細書において記述されるCEによって得られた種または全ての種に関するRFを得るために、種または種の一つもしくは複数の標準物質の公知の濃度をCEに注入して、これを用いてそれぞれに関するRFを決定することができる。次に、RFを用いてモル％を決定することができる。本明細書において記述されるように、試料は、モル％の単位で記述される場合たとえば5〜15のように表記することができる構造の実際レベルを有する。その実際のレベルはまた、他の単位、たとえば重量％で表記することができる。実際のレベルは、それが発現される単位によらず同じである。方法におけるモル％の詳述は単に、構造の実際の発生率を示すためである。構造のレベルは他の単位に関して測定することができ、別の単位に関して表記された参照値が、モル％で表記された参照値、本実施例において5〜15モル％と同じ量の構造に対応する限り、参照値を他の単位に関して表記することができる。このように、構造が5〜15モル％で存在することを示すことを必要とする方法は、構造が別の測定単位、たとえば重量％、鎖数、または％AUCで表記された範囲に存在することを示すことによって行うことができ、別の測定単位で記述される範囲は、本実施例において5〜15モル％と呼ばれるモル％を生じるであろう構造の同じ量に対応する。
【０１５３】
本明細書において記述されるLMWH調製物は、調製物における鎖の非還元末端でΔUとイズロン酸（I）/グルクロン酸（G）の混合物を有しうる。命名「ΔU」は、たとえばへパリナーゼのリアーゼ作用、HSGAGリアーゼ、または類似の基質特異性を有する他の酵素の結果として、4〜5位で導入された二重結合を有する不飽和ウロン酸（イズロン酸（I）、グルクロン酸（G）、またはガラクツロン酸）を指す。好ましくは、調製物における鎖の総数の約15％〜35％、20％〜30％（たとえば、15％、20％、25％、30％、35％）は、鎖の非還元末端でΔUを有する。試料内の鎖の非還元末端でのΔUおよび/またはI/Gの量は、たとえば2D-NMRを用いて決定することができる。そのような方法において、還元末端でアセチル化ヘキソサミン（HNAc）を有する鎖の総数および/または還元末端での開環コンフォメーションの数を用いて、調製物内の鎖の総数を決定することができる。非還元末端でΔUおよび/またはI/Gを有する鎖の総百分率は、調製物における鎖の総数と比較することができる。好ましくは、本明細書において記述されるLMWH調製物において、調製物における鎖の90％、95％、98％、99％未満が非還元末端で硫酸化ΔUを有するか、または全く有しない。
【０１５４】
還元末端構造
いくつかの例において、本明細書において提供されるLMWH調製物は実質的に改変されない還元末端構造を有する。好ましい態様において、LMWH調製物における鎖の少なくとも85％、90％、95％、98％、99％または全てが非改変還元末端構造を有する。
【０１５５】
「改変還元末端構造」は、天然起源から調製物を単離または調製するプロセスによって調製物における鎖の還元末端で生じる構造を指す。たとえば、市販の多くのLMWH調製物は、主に多糖類の鎖の化学的または酵素的脱重合化を通して未分画ヘパリンに由来する。LMWHを作製するために用いられるプロセスは、天然起源からの出発物質の多糖類鎖の還元末端に対して一つまたは複数の独自の構造改変を引き起こしうる。たとえば、ヘパリンの亜硝酸脱重合化によって還元末端で2,5-アンヒドロマンノースが形成され、これは還元されてアルコールを形成し、ウロン酸上のカルボキシレート官能基のエステル化による脱重合の後にβ脱離によって、いくつかの鎖の還元末端で1,6-アンヒドロ構造が形成される。このように、2,5-無水マンノースおよび1,6アンヒドロ構造は、LMWHのいくつかの鎖において見いだされうる改変還元末端構造の例である。本明細書において提供されるLMWH調製物における鎖は、たとえば還元末端でアセチル化ヘキソサミンを有する鎖の少なくとも60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％、99％または全てが含まれうる。
【０１５６】
抗Xa活性
LMWH調製物の抗Xa活性は、LMWH調製物の生物活性において役割を有する。好ましくは、本明細書において提供されるLMWH調製物は、約100〜400 IU/mg、たとえば約120〜380 IU/mg、たとえば約150〜350 IU/mg、たとえば約170〜330 IU/mg、たとえば約180〜300 IU/mg、たとえば約150〜200 IU/mg、200〜300 IU/mgの抗Xa活性を有する。LMWH調製物の抗Xa活性は、平行線検定に関する統計学的方法を用いてミリグラムあたりの抗Xa因子活性の国際単位で計算される。本明細書において記述されるLMWH調製物の抗Xa因子活性は、以下の原理を用いて測定される：
M118＋ATIII → [M118・ATIII]
FXa
M118・ATIII → [M118・ATIII・FXa]＋FXa（過剰量）
FXa（過剰量）＋基質 → ペプチド＋pNA（分光光度法によって測定）
【０１５７】
抗Xa因子活性は、活性化Xa因子（FXa）の阻害におけるアンチトロンビン（ATIII）に対する試料増強効果によって決定される。Xa因子の過剰は、分光光度法によって間接的に測定することができる。抗Xa因子活性は、たとえばStachrom（登録商標）ヘパリン試験キットと共にDiagnostica Stagoアナライザーにおいて、またはChromogenixのCoatest（登録商標）ヘパリンキットと共にACL Futura（商標）凝固システム、または任意の同等のシステムにおいて測定することができる。アナライザーの反応は、NIBSC低分子量ヘパリン国際標準を用いて較正されうる。
【０１５８】
抗Xa/IIa比
いくつかの局面において、本明細書において提供されるLMWH調製物は、抗Xa活性 対 抗IIa活性の比3：1またはそれ未満、たとえば2：1、1.6：1、1.5：1、1.4：1、1.3：1、1.2：1、1.1：1、1：1を有する。抗Xa因子活性および抗IIa因子活性を決定する方法は、先に記述されている。抗Xa因子活性 対 抗IIa因子活性の比は、抗Xa因子活性（乾燥物(dried basis)）を抗IIa因子活性（乾燥物）によって除することによって決定される。
【０１５９】
ヘパリンおよびLMWH調製物の抗Xa活性および抗IIa活性はいずれも、調製物に存在する鎖内で構造ΔUHNAc,6SGHNS,3S,6Sによって表される特定の配列に対するアンチトロンビンIII（ATIII）の結合を伴う。この配列に対するATIIIの結合は、抗Xa活性を媒介する。さらに、トロンビン（IIa因子）は、ATIII結合部位に対して近位の部位でヘパリンに結合する。ATIII結合部位のみを必要とする抗Xa活性とは異なり、抗IIa活性は、ATIII結合部位の存在と共にATIII結合に対して遠位の十分な長さの鎖を必要とする。本明細書において提供されるLMWH調製物の抗IIa活性は、少なくとも部分的にLMWH調製物内での非還元末端またはその近傍でのΔUHNAc,6SGHNS,3S,6Sの存在と共に、調製物に存在する鎖の多くの長さに帰因させることができる。この組み合わせによって、調製物において抗Xa活性および抗IIa活性の双方に寄与する鎖が得られる可能性がある。抗Xa活性および抗IIa活性がいずれも同じ鎖または複数の鎖によって提供される場合、その鎖または複数の鎖の消失によって、抗Xa活性および抗IIa活性の双方の減少が起こりうる。そのため、抗Xa活性および抗IIa活性は、投与の過程において比較的一定のままとなりうる。したがって、いくつかの局面において、本明細書において提供されるLMWH調製物は、抗IIa活性に対する抗Xa活性をLMWHの投与の過程において比較的一定にし、たとえば抗Xa活性 対 抗IIa活性の比の変化は、約30、60、120、180、240、300分の期間で±1.5、±1、±0.5、または±0.2である。たとえば、抗Xa活性 対 抗IIa活性の初回の比が2である場合、初回投与後2回目（たとえば、30、60、120、180、240、300分）に測定された比は、好ましくは3未満、および好ましくは2またはほぼ2であろう。
【０１６０】
中和
本明細書において提供されるLMWH調製物は、硫酸プロタミンによって中和されうる。たとえば抗IIa活性および/または抗Xa活性は、プロタミンの投与によって少なくとも50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％、または100％中和されうる。硫酸プロタミンは、たとえばEli Lilly and Companyから販売されている。抗Xa活性および抗IIa活性の中和は、たとえばそのいずれもが本明細書においてさらに記述されるACTおよびaPTTのような標準的な凝固アッセイによって測定することができる。硫酸プロタミンは、たとえば血漿中のLMWH調製物の抗Xa 100 IUあたり約1、2、3 mgの用量で静脈内投与されうる。好ましくは抗Xa活性および/または抗IIa活性のプロタミンによる中和は、硫酸プロタミンの投与後5、10、15、20、25、または30分以内に起こる。
【０１６１】
多分散度
本明細書において提供されるLMWH調製物の多分散度は、約1.6またはそれ未満、たとえば約1.6または1.5〜1.1、およびその間の数値である。
【０１６２】
「多分散」または「多分散度」という用語は、数平均分子量（Mn）で除した組成物の重量平均分子量（Mw）を指す。数平均分子量（Mn）は、以下の等式：Mn＝Σci/(Σci/mi)から計算される。変数ciは、スライスiでの多糖類の濃度であり、Miはスライスiでの多糖類の分子量である。総和は、データの多くのスライスを含有するクロマトグラフィーピークに対して得られる。データのスライスは、クロマトグラフィーピーク対時間のプロットにおいて垂直な線として描くことができる。したがって、溶出ピークを多くのスライスに分割することができる。数平均分子量は、データのそれぞれのスライスでの分子量および濃度に依存する計算である。重量平均分子量を決定する方法は、先に記述されたとおりであり、同様に多分散度を決定するために用いられた。
【０１６３】
本明細書において記述される任意の範囲に関して、たとえば所定の構造または活性に関して、範囲は、他の範囲と同様に開示されるそれらの範囲となりうる。たとえば所定の構築ブロックまたは活性に関して一つの範囲の下側のエンドポイントから構築される範囲を、たとえば所定の構築ブロックまたは活性に関してもう一つの範囲の上側のエンドポイントと組み合わせて、ある範囲を生じることができる。
【０１６４】
「単離された」または「精製された」LMWH調製物は、LMWHが由来する細胞または組織源からの細胞材料または他の混入タンパク質を実質的に含まない。または化学合成される場合には化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。「実質的に含まない」とは、LMWHの調製物が少なくとも50％純粋（重量/重量）であることを意味する。好ましい態様において、LMWHの調製物は、非ヘパリン多糖類、タンパク質、または化学前駆体、またはたとえば製造の際の他の化学物質の約30％、20％、10％未満、より好ましくは5％（乾燥重量で）を有する。これらも同様に本明細書において「混入物質」と呼ばれる。本明細書において提供されるLMWH調製物に存在しうる混入物質の例には、カルシウム、ナトリウム、へパリナーゼ酵素（または類似の基質特異性を有する他の酵素）、メタノール、エタノール、塩化物、硫酸塩、デルマタン硫酸、およびコンドロイチン硫酸が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【０１６５】
LMWH調製物の活性をモニターする方法
本明細書において提供されるLMWH調製物の活性は、標準的な抗凝固アッセイによってモニターすることができる。そのようなアッセイには、たとえばその双方が病院において、特に病院の手術室においてルーチンとして実践されているACTおよびaPTTが含まれる。
【０１６６】
ACTはヘパリン治療の有効性をモニターするために用いられる試験である。ACTは、たとえば肺塞栓症、体外膜酸素飽和（ECMO）、および血液透析を受けている患者に関して、ベッドサイドで行うことができる。ACTは、たとえば心肺バイパス（CPB）手術、PCI、およびステント留置のような外科的介入の前、介入中、および介入後に最も頻繁に用いられる。ACTに関する参照値は70〜180秒の間となりうる。しかし、CPBのような一定の技法に関して、望ましい範囲は400〜500秒を超えうる。ACTは凝血形成時間の決定に関する陰電荷粒子を利用する。用いることができる様々な粒子の例には、ACTの正常な長さが約100〜170秒であるセライト、ACTの正常な長さが約90〜150秒であるカオリン、およびACTの正常な長さが約190〜300秒であるガラス粒子が含まれる。ACTを測定するための適した機器には、たとえばHemochronおよびMedtronic HemoTecが含まれる。
【０１６７】
aPTT（「部分トロンボプラスチン時間」または「PTT」とも呼ばれる）試験において、接触活性化因子を用いて、高分子量キニノーゲン、カリクレイン、およびXIIa因子の機能のための表面を提供することによって、XIIa因子の産生を刺激する。この接触活性化を一定期間進行させる。次に、カルシウムを加えてさらなる反応を誘発させ、凝血形成に必要な時間を測定する。リン脂質は、第X因子およびプロトロンビンを活性化する複合体を形成するために必要である。APTTはIL TestTM APTT-SP（液体）によって測定することができる。aPTTに関する参照値は、約25〜35秒である。持続的なaPTTは、たとえばヘパリンまたはLMWH処置により凝血が予想されるより長くかかることを示している。
【０１６８】
LMWH調製物を作製する方法
LMWH調製物、たとえば本明細書において記述されるLMWH調製物を作製する様々な方法も同様に企図される。たとえば、そのような方法には、二糖約8〜16または9〜16個の平均鎖長を有するLMWH調製物を作製する方法が含まれる。方法には、二糖8個未満〜16個、または9〜16個の鎖長を有する前駆体LMWH調製物を提供する段階、および二糖約8〜16個または9〜16個の平均鎖長を有するLMWH調製物を得るために前駆体LMWH調製物を処理する段階が含まれる。好ましくは、前駆体は、二糖約8〜14個、たとえば8〜12個の平均鎖長を有する。たとえば前駆体LMWH調製物は以下の構造を有しうる：
2009538386.tif 000019
式中、Xは一価または二価の陽イオン（たとえば、NaまたはCa）であり；
RはHまたはSO3Xであり；
R1はSO3XまたはCOCH3であり；
n＝2〜45、たとえば2〜35であり；かつ
組成物は好ましくはnの平均値7〜13、たとえば7〜11、または8〜12を有する。
【０１６９】
本方法において用いられる前駆体LMWH調製物は、塩沈殿の後に（および）酵素消化が含まれる方法によって得ることができる。一価または二価の陽イオンの塩を前駆体LMWH調製物を得る方法において用いることができる。用いることができる一価および二価の陽イオンの例には、たとえばナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウム、バリウム、カルシウム、マグネシウム、ストロンチウム、およびこれらの組み合わせが含まれる。塩はたとえば一価または二価の陽イオンの酢酸塩となりうる。LMWH前駆体を得るための酵素消化には、非硫酸化ウロン酸の一つまたは複数のグリコシド連結で切断する一つまたは複数の酵素を用いることが含まれうる。例としての酵素には、へパリナーゼIII、へパリナーゼIIIの変異体、およびバクテロイデス・シータイオタオミクロンのHSGAGリアーゼIIIが含まれる。へパリナーゼIIIはたとえば、米国特許第5,681,733号および第5,919,693号において記述される。へパリナーゼIIIの変異体は、米国特許第5,896,789号において記述される。好ましいへパリナーゼIII変異体は、His 36、His105、His110、His139、His152、His225、His234、His424、His469、およびHis539での一つまたは複数のヒスチジンがアラニンに置換されている変異体である。
【０１７０】
前駆体LMWH調製物は、たとえばサイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および濾過のようなサイズ依存的分離によって処理されうる。たとえば薬物産物を得るために、サイズ依存的分離の前または後にさらなる処理段階を用いることができる。
【０１７１】
「薬物産物」という用語は、薬学的使用のために必要とされる純度を有し、かつ薬学的使用のために製剤化されているLMWH調製物を指す。
【０１７２】
「薬物物質」という用語は、薬学的使用のための多糖類構成成分を有するが、必ずしもその最終製剤に存在せず、および/または一つまたは複数の非産物混入物（たとえば、硫酸塩、塩化物、タンパク質混入物、へパリナーゼ、カルシウム、ナトリウムのようなプロセス副産物のような一つまたは複数の無機産物）を含むLMWH調製物を指す。
【０１７３】
本明細書において提供されるLMWH調製物を作製する他の方法には、グリコサミノグリカン（GAG）含有試料、たとえばUFHから「速く移動する分画」を提供する段階が含まれる。速く移動する分画は以下のように作製されうる：
（1）GAG含有試料、たとえばUFHを、たとえば極性の有機溶媒（たとえば、アルコール、たとえばエタノール）、極性の非有機溶媒（たとえば、水）、および塩（好ましくはナトリウム塩、たとえば酢酸ナトリウム）による第一の沈殿に供して、第一の上清を生じる段階；
（2）第一の上清を、たとえば極性の有機溶媒（たとえば、アルコール、たとえばエタノール）、および極性の非有機溶媒（たとえば、水）による第二の沈殿に供して、沈殿物（この沈殿物は速く移動する分画を含有する）を生じる段階；
（3）および好ましくは沈殿物を可溶化する段階。
【０１７４】
（GAG）含有試料、たとえば他の方法によって作製されたが実質的に同等の分画を産生するUFHの分画、たとえば二糖9〜16個の平均鎖長を有する分画も同様に、速く移動する分画として用いることができる。
【０１７５】
いくつかの態様において、速く移動する分画は以下の構造を有する：
2009538386.tif 000020
式中XはNaまたはCaであり：
RはHまたはSO3Naであり；
R1はSO3NaまたはCOCH3であり；
n＝2〜50、たとえば2〜40であり；かつ
組成物は好ましくはnの平均値9〜16、または8〜15を有する。
【０１７６】
本組成物は、速く移動する分画（本明細書において考察されるように）を提供するために、たとえば沈殿物の産物としてLMWHの産生における中間体として起こりうる。
【０１７７】
速く移動する分画は、本発明のLMWHを提供するためにさらに処理することができる。速く移動する分画の処理には、たとえば本明細書において記述される品質および特徴を有する調製物を生じるために、非硫酸化ウロン酸の一つまたは複数のグリコシド連結、たとえばN-アセチルグルコサミン残基に隣接する非硫酸化ウロン酸の一つまたは複数のグリコシド連結を切断する化学物質または酵素によって速く移動する分画を消化する段階が含まれうる。酵素を、以下の段階によって基質特異性によって評価することができる：（1）ヘパリンよりヘパラン硫酸に対して選択性を有する酵素が選択される、異なる硫酸化密度を有する二つのHSGAG基質、たとえばヘパリンおよびヘパラン硫酸に対する酵素活性の機能的スクリーニング；（2）基質特異性を査定するための、段階1の切断された基質の断片のマッピング；（3）酵素を用いるM118-REH段階I中間体またはダルテパリンのようなLMWHの切断、続いて；（4）インビトロアッセイを用いる切断基質の抗Xa因子活性および抗IIa因子活性の査定；ならびに（5）ゲル透過クロマトグラフィー（GPC）および/または多角度光散乱にインターフェースで接続したサイズ排除クロマトグラフィー（SEC-MALS）を用いる、切断基質の分子量分布（または平均鎖長）の査定。
【０１７８】
段階1は、切断産物の非還元末端で不飽和C4-C5結合を生成できることによって同定されるHSGAGリアーゼとして酵素が作用できるか否かと共に、ヘパラン硫酸のような低硫酸化（undersulfated）基質の酵素選択性を査定する。酵素活性は、232 nmでのUV吸収をモニターすることによって分光光度法によって追跡することができる。この波長での吸光度は、切断産物の非還元末端での非硫酸化ウロン酸の形成を示す。酵素活性は、速度論的に（産物形成の初速度）および完全な消化（約12〜15時間）後の総産物形成の双方に関してモニターされる。好ましい酵素はヘパリンよりヘパラン硫酸に対して約2倍の選択性を有し、総活性に約2倍より大きい（たとえば、3〜5倍）差を有する。
【０１７９】
第二段階は、酵素の切断特異性を査定する。本明細書において記述されるLMWH組成物を作製するために適した酵素は、ヘパリンまたはヘパラン硫酸の低硫酸化領域を選択的に切断する。用いる基質がUFHである場合、この選択性は、基質の明らかな消化不良（より長いオリゴ糖の存在によって示されるように）によって証明され、産生されるいかなる二糖も低い硫酸塩密度を有する。対照的に、基質がヘパラン硫酸である場合、消化によって、より高い切断頻度を示すよりも多数の二糖が得られる。
【０１８０】
残りの段階3〜5は、本明細書において他所で記述されるように行うことができる。
【０１８１】
酵素の例には、へパリナーゼIII、へパリナーゼIIIの変異体、およびバクテロイデス・シータイオタオミクロンからのHSGAGリアーゼが含まれる。いくつかの態様において、速く移動する分画は、ヘパリナーゼIIIのアミノ酸配列の残基225位でヒスチジンの代わりにアラニンを有する変異へパリナーゼIIIによって少なくとも部分的に処理される。この酵素は本明細書において「MO11」と呼ばれる。
【０１８２】
消化されたLMWH調製物は、最終産物、たとえば薬物物質もしくは薬物産物となり得、または最終産物、たとえば薬物物質もしくは薬物産物を得るためにさらに処理することができる。濃縮されたLMWH調製物は、たとえばサイズ依存的分離（たとえば、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および濾過）、および濾過の一つまたは複数によってさらに処理することができる。好ましくは、濃縮LMWH調製物は、サイズ依存的分離によってさらに処理され、この段階から得られたLMWH調製物は二糖約9〜16個の平均鎖長を有する。
【０１８３】
LMWH調製物を評価または処理する方法
キャピラリー電気泳動
酵素
M118-REH調製物のようなLMWH調製物のCEを用いる分析には、たとえば一つまたは複数のヘパリン分解酵素によって調製物を消化する段階が含まれる。ヘパリン分解酵素は、たとえば一つまたは複数のへパリナーゼ、ヘパリンリアーゼ、HSGAGリアーゼ、同様にヘパリンを分解することができるGAGリアーゼとして記述されるリアーゼ、および/またはヒドロラーゼ、スルファターゼ/スルホヒドロラーゼ、またはグリコシルヒドロラーゼ/グリコシダーゼとして記述される任意のポリペプチドとなりうる。たとえば、LMWH調製物は、不飽和グルクロニルヒドロラーゼ（たとえば、F. ヘパリニウム（F. heparinum）Δ4,5グリクロニダーゼ、B. シータイオタオミクロンΔ4,5グリクロニダーゼ）；グルクロニルヒドロラーゼ（たとえば、哺乳動物のα-イズロニダーゼ、β-グルクロニダーゼ）；スルホヒドロラーゼ（たとえば、F. ヘパリニウムの2-O-スルファターゼ、6-O-スルファターゼ、3-O-スルファターゼ、B. シータイオタオミクロン6-O-スルファターゼ、ムチン脱硫酸化酵素、哺乳動物N-アセチルグルコサミン-6-スルファターゼ、哺乳動物イズロン酸-2-スルファターゼ）；N-スルファミダーゼ（たとえば、F. ヘパリニウムN-スルファミダーゼ、哺乳動物ヘパラン-N-スルファターゼ）；アリールスルファターゼ；ヘキソサミニダーゼ；グリコシルヒドロラーゼ（たとえば、エンド-N-アセチルグルコサミニダーゼ）；へパリナーゼ（たとえば、フラボバクテリウム・ヘパリニウム（Flavobacterum heparinum）へパリナーゼI、フラボバクテリウム・ヘパリニウムへパリナーゼII、フラボバクテリウム・ヘパリニウムへパリナーゼIII、フラボバクテリウム・ヘパリニウムへパリナーゼIV）；エンドグルコロニダーゼ（たとえば、哺乳動物のヘパラナーゼ）；ヘパリン/ヘパラン硫酸リアーゼ（たとえば、バクテロイデス・シータイオタオミクロンのHSGAGリアーゼI、バクテロイデス・シータイオタオミクロンのHSGAGリアーゼII、バクテロイデス・シータイオタオミクロンのHSGAGリアーゼIII、バクテロイデス・シータイオタオミクロンのGAGリアーゼIV）；ならびにその機能的断片および変種の、一つまたは複数によって消化されうる。これには同様に、フラボバクテリウム・ヘパリニウム（ペドバクター・ヘパリヌス（Pedobacter heparinus）としても知られる）またはバクテロイデス・シータイオタオミクロン以外の微生物に由来する、先に記述したポリペプチド（たとえば、へパリナーゼまたはヘパリン/ヘパリン硫酸リアーゼ）が含まれうる。たとえば、ハロアーキュラ・マリスモルツイ（Haloarcula marismortui）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Streptococcus agalactiae）、ストレプトコッカス・インターメディウス（Streptococcus intermedius）、ストレプトコッカス・スイス（Streptococcus suis）、エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ニトロバクター・ウィノグラドスキイ（Nitrobacter winogradskyi）、ニトロバクター・ハンブルゲンシス（Nitrobacter hamburgensis）、ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobium japonicum）、リゾビウム・メロリティ（Rhizobium meloliti）、メソリゾビウム・ロティ（Mesorhizobium loti）、スピンゴバクテリウム種（Spinghobacterium sp.）、ウシ流産菌次亜種（Brucella abortus biovar）、マルタ熱菌（Brucella melitensis）、ソリバクター・ウシタツス（Solibacter usitatus）、アシドバクテリウム・カプスラーツム（Acidobacterium capsulatum）、ミクロブルビファー・デグラダンス（Microbulbifer degradans）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、バークホルデリア・シュードモナセパシア（Burkholderia pseudomonascepacia）、ゲオバクター・メタリレデュセンス（Geobacter metallireducens）、プレボテラ種（Prevotella sp.）、霊菌（Serrata marcescens）、コリネバクテリウム種（Cornybacterium sp.）、アナエロミクソバクター・デハロゲナンス（Anaeromyxobacter dehalogenans）、ロドピレルラ・バルチカ（Rhodopirellula baltica）、ピレルラ・マリナ（Pirellula marina）、および/またはゲンマタ・オブスクリグロブス（Gemmata obscuriglobus）。
【０１８４】
好ましくは、消化に用いられる少なくとも一つの酵素は、ヘパリン内の特異的連結でこれを切断することから選択される。たとえば、酵素はへパリナーゼIおよび/またはHSGAGリアーゼIであることができる。一つの態様において、LMWH調製物は、フラボバクテリウム・ヘパリニウムへパリナーゼIによって消化される。他の態様において、ヘパリン調製物は、バクテロイデス・シータイオタオミクロンのHSGAGリアーゼIによって消化される。
【０１８５】
へパリナーゼI、II、およびIIIを用いるだけでは解決できない構造を分解する消化において用いるために他の酵素を選択することができる。本明細書において記述される任意の酵素を、機能的に同等の活性を有する酵素に置換することができる。
【０１８６】
好ましい態様において、消化は完全に行われ、または表10Aにおいて見いだされる産物の全てを有する消化物を提供するために少なくとも十分であるだけ行われ、好ましくは非消化材料を実質的に含まない。
【０１８７】
消化の前に、試料を凍結乾燥することができる。たとえば、試料を真空乾燥機においてたとえば約20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、43℃、46℃、49℃、52℃、または55℃で、約2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、または24時間乾燥させることができる。たとえば、試料を凍結乾燥しておよび/または以下の条件の一つで乾燥させることができる：たとえば、試料を凍結乾燥しておよび/または以下の条件の一つで乾燥させることができる：40℃で12時間；46℃で8時間；49℃で6時間；52℃で4時間。試料は水または適した緩衝液（たとえば、1 mM酢酸カルシウム、25 mM酢酸ナトリウム、pH 7.0、および5％グリシン）に濃度約1、2、5、10、20、50、100、200、または500 mg/mLで懸濁させることができる。一つまたは複数のヘパリン分解酵素を試料に加えることができる。いくつかの態様において、へパリナーゼIまたはHSGAGリアーゼI（またはこれらの酵素の組み合わせ）、へパリナーゼIIまたはHSGAGリアーゼII（またはこれらの酵素の組み合わせ）、およびへパリナーゼIIIまたはHSGAGリアーゼIII（またはこれらの酵素の組み合わせ）を試料に加える。試料を、温度約18℃、25℃、30℃、37℃、または45℃で約6、12、16、18、20、または24時間、たとえば約25℃で24時間、30℃で約18時間、約37℃で12時間消化する。
【０１８８】
消化後、酵素または複数の酵素を、たとえばNi2+カラム、サイズ排除カラム、透析、限外濾過等を用いて、試料混合物から除去する。酵素または酵素は、消化後に加熱（たとえば、65℃で20分間）することによって不活化することができる。試料はたとえば、分析するまでの期間、-85℃、-70℃、-20℃、4℃、18℃、または25℃で保存することができる。
【０１８９】
本明細書において記述される方法によって分離される種は、多数の手段によって、たとえば紫外線吸収（たとえば波長約232 nmで）、蒸発光散乱、蛍光、パルスアンペロメトリック検出、および質量分析によって検出することができる。いくつかの態様において、二つまたはそれより多い検出手段を同じ試料にたとえば連続してまたは同時に利用することができる。
【０１９０】
さらなる酵素消化を用いて試料を消化することができる。たとえば、へパリナーゼIまたはHSGAGリアーゼI（またはこれらの酵素の組み合わせ）、へパリナーゼIIまたはHSGAGリアーゼII（またはこれらの酵素の組み合わせ）、へパリナーゼIIIまたはHSGAGリアーゼIII（またはこれらの酵素の組み合わせ）、および2-Oスルファターゼ、Δ4,5グリクロニダーゼ、および/またはへパリナーゼIまたはHSGAGリアーゼI（またはこれらの酵素の組み合わせ）、へパリナーゼIIまたはHSGAGリアーゼII（またはこれらの酵素の組み合わせ）、へパリナーゼIIIまたはHSGAGリアーゼIII（またはこれらの酵素の組み合わせ）の組み合わせを消化のために用いることができ、たとえば先に記述した方法によって検出することができる。
【０１９１】
消化産物はAgilent 3Dキャピラリー電気泳動機器を用いて分析する。キャピラリーは、長い光路のベア（bare）ヒューズドシリカキャピラリー75μm ID、有効長72 cmである。トリス（50 mM）、10 μM硫酸デキストラン、pH 2.5をCE緩衝液として用いる。試料を30 mbarの圧力で20秒間注入する。負の極性で分離を行い、被検体を参照波長310 nmで232 nmでモニターする。新しいキャピラリーを水、1 N水酸化ナトリウム、水、および分離緩衝液の順に前処置する。それぞれの試料分析に関して、キャピラリーを緩衝液によって5分間予め条件を整える。
【０１９２】
本明細書において記述される方法にとって有用なさらなる情報は、たとえば、Linhardt et al. (1988) Biochem. J., 254:781-787；Chuang et al. (2001) J. Chromatogr. A, 932:65-74；およびYates et al. (2004) J. Med. Chem., 47:277-280、およびRhomberg et al. (1988) Proc Natl Acad Sci U S A. 95(8):4176-81において見いだされうる。
【０１９３】
キャピラリー電気泳動
たとえば非コーティングヒューズドシリカキャピラリーを用いるCEを用いて、LMWH、たとえば本明細書において記述されるLMWH調製物を分析することができる。低いpH条件では、分離はほぼ被検体の電気泳動移動度のみによって左右される。全てのLMWH関連糖が、カルボキシレートおよび硫酸塩部分により真の陰電荷を有するという事実により、分離は逆の極性で行われる。さらに、硫酸デキストランによる低いpH（pH 2.5）緩衝液の補足により、陰イオンヘパリン様材料の非特異的吸収が防止され、対称的なピーク形状および正確な定量が可能となる。
【０１９４】
LMWH調製物における種は一連の五つの消化物（本明細書において他所で詳細に考察される）によって分解されうる；それぞれの消化物を、内部標準のモノスルホン酸ナフタレンを加えた後にキャピラリー電気泳動に供する。
【０１９５】
個々の成分14個（たとえば、本明細書における表10を参照されたい）をCEにおいて分解する。
【０１９６】
組成分析方法論における質量の回復を以下のように評価した。この分析は二つのレベルで起こった：（1）酵素消化後の質量回復、および（2）キャピラリー電気泳動による分離後の質量回復。
【０１９７】
NMR
最小のシグナルオーバーラップで、シグナルを部分的に分解して同定する手段として、二次元の核磁気共鳴分光法（2D NMR）を用いることができる。2D NMRシグナルの積分の後に単純な計算を行うと、本明細書において記述されるようなLMWH調製物の分析のような多糖類混合物の定量的単糖類組成分析を容易にすることができる。
【０１９８】
その上、2D NMRは、二糖構成成分、たとえばH-U二糖の連結環境に関する情報を提供することができ、定性的および定量的分析の双方が含まれる二糖連結の分析を提供する。いくつかの態様において、2D NMR分析は、H-U連結のエピマー形成状態に関する情報を提供することができ、たとえばエピマー形成状態がイズロン酸残基であるか、またはグルクロン酸残基であるか（すなわちIまたはUであるか）に関する情報を提供することができる。
【０１９９】
いくつかの態様において、2Dプロトン-炭素相関分光（HSQC）実験は、一つまたは複数のグリコサミノグリカンに関する定量的組成分析を提供することができる。たとえば、いくつかの態様において、2D NMR分析は単糖類の還元末端での最近接（nearest neighbor）に関する情報を提供することができる。この情報は、たとえば特定の単糖類が多糖類混合物、たとえば本明細書において記述されるLMWH調製物のようなLMWHにおいて存在する配列状況を提供することができる。
【０２００】
いくつかの態様において、2D NMR法によって、内部残基と還元末端残基とを識別することができる。特に、還元N-アセチルグルコサミンの測定可能な量の同定は、本明細書において記述されるLMWHに特有である。
【０２０１】
いくつかの態様において、2D NMR分析は、LMWH鎖の非還元末端に関する情報、すなわち酵素消化によって生成されたΔUAp2-OHの量を提供することができる。
【０２０２】
いくつかの態様において、2D NMRを用いて、デルマタン硫酸のような一つまたは複数の不純物の存在に関して多糖類混合物を評価することができる。たとえば、プロトンNMRにおける2.06〜2.09 ppmでのシグナルが存在しないことを用いて、デルマタン硫酸が、機器の検出レベル（たとえば、約1％より高いレベル）より高いレベルで存在しないことを確認することができる。
【０２０３】
好ましい態様において、糖類構造は、2D NMRを用いて評価され、たとえば多糖類混合物の試料をD2Oによって置換して、終夜凍結乾燥して、D2Oに再度溶解する。次に、試料を分析のためにNMR試験管に入れて、5 mm TXIプローブを備えたBruker Avance 600 MHz分光計によって303 Kで分析を行う。勾配増強HSQCスペクトルを収集時に炭素のデカップリングにより記録する。次にデータを間接的13C観測軸において256回の増加毎に16回のスキャンによって収集する。分極移動の遅延は、155 Hzの1JCHスカラー結合での最適な移動に関して2.941 msに設定する。
【０２０４】
一般的に次にデータを処理して、たとえば行列サイズ1K×256を、フーリエ変換の前に余弦の二乗の関数を応用することによって2K×1Kにゼロ充填する。クロスピークを、たとえばMestreC 4.5ソフトウェアを用いて積分して、陽性ピークのみを積分に用いる。積分をN-硫酸化グルコサミンのH2/C2ピーク（3.26/60.5 ppm）に標準化する。ピークは一般的に、公表されたケミカルシフトならびにCOSYおよびTOCSY実験による実験割付を用いて割付される。
【０２０５】
組成物（％）をアノマーの交差ピーク体積を用いて計算し、これに関して、全てのウロン酸残基は全てのグルコサミン残基と類似の1JCHカップリングを有する。オーバーラップにより正確な定量ができないグルコサミンアノマーピークに関しては、代わりにH2/C2シグナルを積分する。あらゆる単糖類の量は、総グルコサミンまたはウロン酸含有量の百分率として表記される。6-O-硫酸化 対 6-O-脱硫酸化の比率は、H6/C6シグナル積分から計算する。
【０２０６】
組成物（％）データを表11Aに提供する。
【０２０７】
本明細書において見いだされる方法にとって有用なさらなる情報は、たとえばGuerrini et al. (2005) Anal. Biochem., 337: 35-47において見いだされうる。
【０２０８】
薬学的組成物
薬学的に許容される担体と共に製剤化される、本明細書において記述されるLMWH調製物が含まれる組成物、たとえば薬学的に許容される組成物が提供される。
【０２０９】
本明細書において用いられるように、「薬学的に許容される担体」には、生理的に適合性である任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、等張剤、および吸収遅延剤等が含まれる。担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、直腸内、脊髄内、または表皮投与（たとえば、注射または注入による）にとって適切となりうる。
【０２１０】
本発明の組成物は多様な剤形であってもよい。これらには、たとえば、液体溶液（たとえば、注射液または注入液）、分散剤または懸濁剤、リポソーム、および坐剤のような、液体、半固体、および固体投与剤形が含まれる。好ましい剤形は、意図される投与様式および治療応用に依存する。典型的な好ましい組成物は、注射または注入溶液の剤形である。好ましい投与様式は非経口（たとえば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。好ましい態様において、LMWH調製物は、静脈内注入または注射によって投与される。もう一つの好ましい態様において、LMWH調製物は、筋肉内または皮下注射によって投与される。
【０２１１】
本明細書において用いられる「非経口投与」および「経口投与される」という句は、経腸および局所投与以外の、通常、注射による投与様式を意味し、これには静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、被膜内、眼窩内、硝子体内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外、および胸骨内の注射および注入が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【０２１２】
治療組成物は典型的に無菌的でなければならず、製造および保存条件で安定であるべきである。組成物は、溶液、微小乳液、分散液、リポソーム、または高濃度にとって適した他の秩序だった構造として製剤化されうる。滅菌注射液は、活性化合物（たとえば、必要量のLMWH）を先に列挙した成分の一つまたは組み合わせと共に適当な溶媒に組み入れて、必要に応じて濾過滅菌を行うことによって調製されうる。一般的に、分散液は、基礎分散培地および先に列挙された成分から必要な他の成分を含有する滅菌媒体に活性化合物を組み入れることによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製法は、予め濾過滅菌したその溶液から活性成分プラス任意のさらなる所望の成分の粉末を生じる、真空乾燥および凍結乾燥である。溶液の適切な流動性はたとえばレシチンのようなコーティングを用いることによって、分散剤の場合には必要な粒子径を維持することによって、および界面活性剤を用いることによって維持することができる。注射用組成物の持続的な吸収は、吸収を遅らせる物質、たとえば様々な高分子、モノステアリン酸塩、およびゼラチンを組成物に含めることによってもたらされうる。
【０２１３】
LMWH調製物は、当技術分野において公知の多様な方法によって投与することができるが、多くの治療的応用に関して好ましい経路/投与様式は静脈内注射または注入である。当業者によって認識されるように、投与経路および/または様式は、望ましい結果に応じて変化するであろう。一定の態様において、活性化合物は、インプラント、経皮パッチ、および微小封入送達システムが含まれる徐放性製剤のような、化合物を急速な放出から保護するであろう担体と共に調製してもよい。エチレン酢酸ビニル、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような、生体分解性の生体適合性の高分子を用いることができる。そのような製剤を調製するための多くの方法に特許が与えられるか、または一般的に当業者に公知である。たとえばSustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。
【０２１４】
注射用製剤は、単位投与剤形、たとえばアンプルまたは多用量容器で、たとえば保存剤を添加して表されてもよい。組成物は、油性または水性媒体における懸濁剤、液剤、または乳剤のような剤形をとってもよく、懸濁剤、安定化剤、および/または分散剤のような処方物質を含有してもよい。
【０２１５】
特定の態様において、本明細書において提供されるLMWH調製物は、たとえば不活性希釈剤または同化可能な食用担体と共に経口投与することができる。化合物（および望ましければ他の成分）はまた、硬および軟ゼラチンカプセルに封入してもよく、錠剤に圧縮してもよく、または対象の食事に直接組み入れてもよい。経口治療的投与の場合、化合物は、賦形剤と共に組み入れられ、摂取可能な錠剤、口腔内錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウェーハ等の剤形で用いられてもよい。本発明の化合物を非経口投与以外によって投与するために、化合物をその不活化を防止する材料によってコーティングするか、またはその材料と化合物を同時投与する必要がある場合がある。
【０２１６】
糖衣錠のコアは適したコーティングと共に提供される。この目的に関して濃縮糖溶液を用いてもよく、これらは任意で、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコール、および/または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適した有機溶媒または溶媒混合物を含有してもよい。活性化合物用量の同定のためまたは異なる組み合わせを特徴付けするために、染料または色素を錠剤または糖衣錠のコーティングに加えてもよい。経口で用いることができる薬学的組成物には、ゼラチン製のプッシュフィットカプセルと共にゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールのような可塑剤で作製された軟密封カプセルが含まれる。プッシュフィットカプセルは、乳糖のような増量剤、デンプンのような結合剤、および/またはタルクまたはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、および任意で安定化剤と混合して活性成分を含有しうる。軟カプセルにおいて、活性化合物を脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールのような適した液体に溶解または懸濁してもよい。さらに、安定化剤を加えてもよい。経口投与のために製剤化されるミクロスフェアも同様に用いてもよい。そのようなミクロスフェアは当技術分野において十分に定義されている。経口投与に関する全ての製剤は、そのような投与にとって適した用量であるべきである。
【０２１７】
口腔内投与の場合、組成物は、従来の方法で製剤化された錠剤またはロゼンジの剤形をとってもよい。
【０２１８】
吸入投与の場合、LMWH調製物は、適した噴射剤、たとえばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適した気体を用いて加圧パックまたはネブライザーからエアロゾルスプレーの提示剤形で簡便に送達されてもよい。加圧エアロゾルの場合、用量単位は、一定用量を送達するための弁を提供することによって決定されてもよい。インヘラーまたは吸入器において用いるための、化合物の粉末混合物および乳糖またはデンプンのような適した粉末基剤を含有する、たとえばゼラチンのカプセル剤およびカートリッジを製剤化してもよい。さらに、吸入治療のための乾燥粉末製剤は本発明の範囲内である。そのような乾燥粉末製剤は、WO02/32406において開示されるように調製してもよい。
【０２１９】
組成物はまた、たとえばカカオバターまたは他のグリセリドのような通常の坐剤基剤を含有する坐剤または浣腸のような直腸内または膣内組成物に製剤化してもよい。
【０２２０】
既に記述された組成物のほかに、化合物はまた、デポー調製物として製剤化されてもよい。そのような長時間作用型の製剤は、適した高分子もしくは疎水性材料（たとえば、許容される油における乳剤として）またはイオン交換樹脂と共に、または溶解度の低い誘導体、たとえば溶解度の低い塩として製剤化されてもよい。
【０２２１】
薬学的組成物はまた、適した固体またはゲル相の担体または賦形剤を含んでもよい。そのような担体または賦形剤には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールのような高分子が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【０２２２】
非経口送達（非侵襲性送達）のために用いることができる組成物の例には、肺内送達のためのインヘラー；経口投与のために処方された投与単位を有する錠剤；皮膚を通して用量単位を送達するための経皮パッチ；および所望の投与単位を直腸内または膣内に送達するための坐剤が含まれる。組成物は、投与説明書と共に容器、パック、またはディスペンサーに含まれうる。
【０２２３】
LMWH調製物はまた、短期または長期の埋め込み装置と共に投与することができる。調製物は、皮下に埋め込むことができ、組織または臓器（たとえば、冠動脈、頚動脈、腎動脈、および他の末梢動脈、静脈、腎臓、心臓、角膜、硝子体、脳等）に埋め込むことができ、または組織および臓器（たとえば、腎被膜、心膜、胸腔、または腹腔間隙）周辺の生理的間隙に埋め込むことができる。
【０２２４】
LMWH調製物はまた、様々な医学装置をコーティングするために用いることができる。たとえば、LMWH調製物は、ステントまたは体外循環回路をコーティングするために用いることができる。LMWH調製物のそのような製剤には、たとえば徐放性ビーズ、ゲル、またはミクロスフェアと共にPLGA、セルロース、アルギネート、または他の多糖類のような様々な高分子を用いることを包含しうる。
【０２２５】
投与療法は、最適な所望の反応（たとえば、治療反応）を提供するように調節される。たとえば、1回のボーラスを投与してもよく、いくつかの分割用量を一定期間に投与してもよく、または用量は、治療状況の緊急性によって示されるように比例的に低減もしくは増加させてもよい。投与の容易さおよび投与の均一性のために、非経口組成物を単位投与剤形において製剤化することが特に都合がよい。本明細書において用いられる投与単位剤形は、処置される対象にとって単位用量として適している物理的に個別の単位を指し；それぞれの単位は、必要な薬学的担体に関連して所望の治療効果を産生するように計算された活性化合物の既定の量を含有する。本発明の投与単位剤形の仕様は、（a）活性化合物の独自の特徴および達成される特定の治療効果、ならびに（b）個体における感受性の処置のためのそのような活性化合物の合成に関する当技術分野における固有の制限に左右され、直接依存する。
【０２２６】
用量の値は、緩和される状態のタイプおよび重症度によって変化する可能性があることに注意されたい。さらに、任意の特定の対象に関して、特異的投与療法は、個体の必要性および組成物を投与するまたは投与を管理する人の専門的判断に従って経時的に調節されるべきであることが理解される。
【０２２７】
本発明の薬学的組成物には、LMWH調製物の「治療的有効量」または「予防的有効量」が含まれてもよい。「治療的有効量」は、必要な用量および必要な期間で所望の治療結果を達成するために有効な量を指す。LMWH調製物の治療的有効量は、個体において望ましい反応を誘発するために、個体の疾患の状態、年齢、性別、および体重、ならびにLMWH調製物のような要因に従って変化する可能性がある。治療的有効量はまた、治療的に有用な効果がLMWH調製物の任意の毒性または有害な効果を上回る量である。「治療的有効量」は好ましくは、たとえばACTまたはaPTTによって測定した場合に、測定可能なパラメータ、たとえば凝固または血栓を、無処置の対象と比較して少なくとも約20％、より好ましくは少なくとも約40％、さらにより好ましくは少なくとも約60％、なおより好ましくは少なくとも約80％阻害する。測定可能なパラメータ、たとえば凝固または血栓を化合物が阻害する能力は、ヒトにおける有効性を予測する動物モデル系において評価することができる。または、組成物のこの特性は、インビトロアッセイにおいて化合物の能力を調べることによって評価することができる。LMWH調製物の静脈内投与のための例示的な用量は、約IU/kg〜200 IU/kg、たとえば1 IU/kg、2 IU/kg、3 IU/kg、4 IU/kg、5 IU/kg、6 IU/kg、7 IU/kg、8 IU/kg、9 IU/kg、10 IU/kg、11 IU/kg、12 IU/kg、13 IU/kg、14 IU/kg、15 IU/kg、16 IU/kg、17 IU/kg、18 IU/kg、19 IU/kg、20 IU/kg、21 IU/kg、22 IU/kg、25 IU/mg、30IU/kg、40 IU/kg、50IU/kg、70 IU/kg、100IU/kg、125 IU/kg、150IU/kg、175 IU/kg、200 IU/kgである。LMWH調製物の静脈内投与のための他の例示的な用量は、約0.03 mg/kg〜0.45 mg/kg、たとえば0.03 mg/kg、0.05 mg/kg、0.1 mg/kg、0.15 mg/kg、0.2 mg/kg、0.22 mg/kg、0.25 mg/kg、0.27 mg/kg、0.3 mg/kg、0.35 mg/kg、0.37 mg/kg、0.4 mg/kg、0.44 mg/kg、好ましくは約0.1 mg/kg、0.15 mg/kg、0.2 mg/kg、0.25 mg/kg、0.3mg/kg、0.35 mg/kg、0.4 mg/kg、0.44 mg/kg、0.47 mg/kg、0.5 mg/kg、0.55 mg/kg、0.60 mg/kg、0.7 mg/kg、好ましくは約0.30〜0.50 mg/kg、たとえば0.30 mg/kg、0.35 mg/kg、0.40 mg/kg、0.42 mg/kg、0.44 mg/kg、0.47 mg/kg、または0.50 mg/kgである。
【０２２８】
「予防的有効量」は、所望の予防効果を達成するために必要な用量および期間で有効である量を指す。典型的に、予防的用量は、疾患の初期段階の前または初期段階の対象において用いられることから、予防的有効量は治療的有効量より少ないであろう。
【０２２９】
同様に、本明細書において提供されるLMWH調製物を含むキットが本発明の範囲に含まれる。キットには、使用説明書；他の試薬、たとえば治療物質または硫酸プロタミン；投与のためのLMWH調製物を調製するための装置または他の材料；薬学的に許容される担体；および対象に投与するための装置または他の材料が含まれる一つまたは複数の他の要素が含まれうる。使用説明書には、ACTおよびaPTTのような凝固アッセイを用いて抗Xa活性および/または抗IIa活性をモニターするための説明書が含まれうる。説明書には、たとえば障害、たとえば本明細書において記述される障害を有する患者において提案される用量および/または投与様式が含まれる治療応用のための説明書が含まれうる。他の説明書には、硫酸プロタミンを用いて抗Xa活性および/または抗IIa活性を逆転させることに関する説明書が含まれうる。キットはさらに、一つまたは複数の異なる薬学的調製物において適切に製剤化された診断または治療物質、たとえば本明細書において記述される診断または治療物質のような少なくとも一つのさらなる試薬を含有することができる。
【０２３０】
予防的および治療的使用
LMWH調製物は、対象を処置するために用いることができる。本明細書において用いられるように、「処置する」または「処置」という用語は、対象、たとえば患者に対するLMWH調製物の適用または投与、または対象、たとえば患者に戻される患者からの単離組織もしくは細胞の適用もしくは投与として定義される。対象は障害（たとえば、本明細書において記述される障害）、障害の症状、または障害に対する素因を有する患者となりうる。処置は、障害、障害の症状、または障害に対する素因を治癒（cure）、治癒（heal）、緩和、軽減、変更、治療、回復、緩和、改善、または影響を及ぼす処置となりうる。本明細書において用いられるように、対象は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、または齧歯類のような脊椎動物である。対象は、たとえば実験動物、獣医学動物、またはヒト対象となりうる。処置は治療的、たとえば障害もしくは障害の症状を治癒、治癒、緩和、軽減、変更、治療、回復、緩和、改善、もしくは影響を及ぼす、既存の望ましくない状態もしくはその症状を弱める、緩和する、もしくは回復させる処置であることができ、または予防的、たとえば望ましくない状態もしくはその症状の発生を遅らせる、たとえば予防する処置であり得る。
【０２３１】
ヘパリンおよびLMWHは多くの治療的有用性を有する。本明細書において提供されるLMWH調製物は、ヘパリンまたはLMWH治療が有用である任意のタイプの状態の処置のために用いることができる。このように、調製物および方法は、多様なインビトロ、インビボ、およびエクスビボ法において有用である。たとえば、ヘパリンおよびLMWHは、アルツハイマー病のような認知症、凝固に関連する障害（たとえば、DVTおよびPE）、線維障害（たとえば、主要な臓器の線維症、線維増殖障害、および外傷に関連する瘢痕化）、血栓障害（たとえば、ACS、安定または不安定狭心症、MI（たとえば、STEMIおよびNSTEMI））、または心血管疾患（アテローム性動脈硬化症）、血管状態または動脈（arterial）細動、アレルギー、または呼吸障害（たとえば、喘息、肺気腫、成人呼吸窮迫症候群（ARDS）、嚢胞性線維症、および肺再灌流損傷）、循環性ショックおよび関連障害、血管新生障害、癌および転移障害、敗血症、狭窄および再狭窄、ならびに骨粗鬆症を予防および処置するために有用であることは公知である。本明細書において提供されるLMWH調製物はまた、骨折（たとえば股関節骨折）を有する対象、または外科的介入（たとえば、臓器移植、整形外科手術、股関節置換、膝関節置換、PCI、ステント留置、血管形成術、CABG）の前、その最中、またはその後の対象に用いることができる。これらの障害のそれぞれは当技術分野において周知であり、たとえば参照により本明細書に組み入れられる、Harrison's Principles of Internal Medicine（McGraw Hill, Inc., New York）において記述されている。様々な治療法におけるHLGAG組成物の使用は、Huang, J. and Shimamura, A., Coagulation Disorders, 12, 1251-1281 (1998)において記述および要約されている。
【０２３２】
このように、LMWH調製物は、凝固に関連する障害を処置または予防するために有用である。凝固経路における不均衡が過剰な凝固の方向にシフトする場合、結果は血栓傾向の発生であり、これは多くの場合心臓発作、卒中、DVT、ACS、安定および不安定狭心症、ならびに心筋梗塞として出現する。本明細書において用いられる「凝固関連疾患」は、たとえば心筋梗塞もしくは脳梗塞、または末梢血管疾患の場合に認められるような、組織に対する血液の供給に責任を有する血管の遮断の結果として起こる可能性がある、または動脈細動、DVT、もしくはPEのような状態に関連する塞栓形成の結果として起こる可能性がある、組織に対する血液供給の中断または低減に起因しうる局所炎症を特徴とする状態を指す。手術、麻酔を受ける人、および長期間ベッドに横たわっている人、または他の非活動性は多くの場合、下肢および/または骨盤における静脈血の凝固である深部静脈血栓症、またはDVTとして知られる状態に罹りやすい。この凝固は、静脈血を押し出すために必要な下肢の筋肉活動が存在しないこと（うっ血）、局所血管損傷、または高凝固状態によって起こる。凝血が肺まで移動して、「肺動脈塞栓症」が起こると、または心血管循環を妨害すると、この状態は生命を脅かしうる。ある処置法は、抗凝固剤の投与を伴う。
【０２３３】
方法は、血栓障害および心血管疾患を処置するために有用である。心血管疾患には、アテローム性動脈硬化症、および動脈細動が含まれるがこれらに限定されるわけではない。心房細動は、感情的ストレスの結果としてまたは手術、運動、もしくは急性アルコール中毒後に一般的に発生する不整脈の一般型である。動脈細動は、表面ECGにおいて個別のP波が存在しない秩序が失われた動脈活性を特徴とする。この秩序が失われた活性によって、心房における不適切な血流および血栓形成が起こりうる。これらの血栓は、塞栓を引き起こし得て、それによって脳虚血および他の障害が起こりうる。
【０２３４】
血栓障害には、ACS、たとえばMI、安定および不安定狭心症が含まれるがこれらに限定されるわけではない。心筋梗塞は、時に、アテローム性動脈硬化症によって既に狭くなった冠動脈の血栓による閉塞の後に続く冠動脈血流の突然の減少によって起こる疾患である。そのような損傷は、タバコの喫煙、高血圧症、および脂質蓄積のような要因によって産生または促進される可能性がある。狭心症は一過性の心筋梗塞が原因である。この障害は通常、胸骨下の重苦しさ、圧迫、締め付け、息苦しさ、または窒息感に関連する。事例は通常、運動または感情によって引き起こされるが、時に安静時に起こりうる。「Q波心筋梗塞」とも呼ばれるSTEMIは異常なエコー心電図を有するMIを指す。NSTEMIまたは「非Q波心筋梗塞」は、エコー心電図の異常に関連しない。安定狭心症は特異的な量の運動または活動後に予想された時間で起こる。不安定狭心症は、安定狭心症の通常パターンの変化として起こる可能性がある。これには胸痛が含まれる可能性があり、胸痛は安静時または運動が少ない時期に起こり、より重度でより長くなる可能性がある、またはニトログリセリンに対する反応性がより低い。不安定狭心症は、血流がおそらく、狭窄の増加または冠動脈において形成する小さい凝血によって悪化したことを意味する。不安定狭心症は心筋梗塞がまもなく起こる可能性があることの警告徴候である。
【０２３５】
LMWH調製物は、心血管疾患のリスクを低減させるために、または心血管疾患を処置するために、単独または他の治療物質と併用して血栓および心血管障害の処置のために用いることができる。たとえば、併用治療には、一つまたは複数のさらなる治療物質、たとえば本明細書において記述される一つまたは複数の治療物質と同時に製剤化される、および/または同時投与されるLMWH調製物が含まれうる。本明細書において用いられる「併用」投与されるとは、二つ（またはそれより多い）異なる処置が、対象が障害に罹患している間に対象に送達されること、たとえば対象が障害を有すると診断された後、障害のリスクを有すると同定された後、および障害が予防、治癒、または消失される前に、二つまたはそれより多い処置が送達されることを意味する。いくつかの態様において、第二の送達が始まる場合に一つの処置の送達はなお起こっており、重なりがある。これは本明細書において時に、「同時」または「同時送達」と呼ばれる。他の態様において、一つの処置の送達は他の処置の送達が始まる前に終わる。送達は、第二の処置が送達される場合に、送達される第一の処置の効果がなお検出可能であるような送達でありうる。他の治療物質には、抗炎症剤、抗血栓剤、抗血小板剤、線維素溶解剤、血栓溶解剤、脂質還元剤、直接トロンビン阻害剤、抗Xa因子阻害剤、抗IIa因子阻害剤、糖タンパク質IIb/IIIa受容体阻害剤、および直接トロンビン阻害剤が含まれるがこれらに限定されるわけではない。本明細書に提供されるLMWH調製物と併用して投与することができる物質の例には、ビバリルジン、ヒルジン、ヒルゲン、Angiomax、アガトロバン、PPACK、トロンビンアプタマー、アスピリン、GPIIb/IIIa阻害剤（たとえば、Integrelin）、P2Y12阻害剤、チエノピリジン、チクロピジン、およびクロピドグレルが含まれる。
【０２３６】
ACTおよびaPTTのような標準的な抗凝固アッセイによってモニター可能であると共に、本明細書において提供されるLMWH調製物の可逆性により、入院して、可能性がある心血管手術に関する評価を受けている患者のような患者を処置する場合の柔軟性が改善された。そのような利点は、以下のシナリオによって強調される。患者は、安定狭心症、不安定狭心症、およびMIが含まれるACSのような様々な血栓障害に関連しうる症状を訴えて病院に行く。本明細書において提供されるLMWH調製物のモニター可能性および可逆性によって、可能性がある心血管手術に関して患者を評価する間、そのような調製物を使用することができる。患者がPCIまたはステント留置のような外科的介入を受けることが決定される場合、LMWH調製物のモニター可能性、LMWH調製物の抗Xa活性および抗IIa活性を技法の間モニターすることができ、必要であれば、これらの活性を維持するために技法の間またはその後にLMWH調製物の一つまたは複数のさらなる用量を与えることができる。患者がCABGのような外科的介入を受けることが決定される場合、LMWH調製物の抗Xa活性および抗IIa活性を外科的介入の前に硫酸プロタミンによって中和することができる。さらに、抗Xa活性および抗IIa活性は、手術の前に活性が確実に十分に減少するように患者においてモニターすることができる。
【０２３７】
本明細書において提供されるLMWH調製物はまた、血管状態を処置するために有用である。血管状態には、DVT、末梢血管疾患、卒中が含まれる脳虚血、およびPEのような障害が含まれるがこれらに限定されるわけではない。脳虚血性発作または脳虚血は、脳に対する血液供給が遮断される虚血状態の型である。脳に対する血液供給のこの中断または低減は、血管そのものの内因性の遮断または閉塞、遠隔部位の閉塞起源、灌流圧の減少、またはそれによって不適切な脳血流が起こる血液粘度の増加、またはクモ膜下腔もしくは脳内組織における血管の破裂が含まれる多様な原因に起因する可能性がある。方法は脳虚血を処置するために有用である。脳虚血によって、一過性または永続的な欠損が起こる可能性があり、脳虚血を経験した患者における神経損傷の重篤性は、虚血事象の強度および期間に依存する。一過性の虚血性発作は、脳に対する血流が短期間に限って中断され、一時的な神経欠損を引き起こす発作であり、これは多くの場合24時間未満に消失する。TIAの症状には、顔または四肢のしびれまたは虚脱、明瞭に話すことができない、および/または他人の言語を理解できない、視力の喪失またはぼやけた視力、およびめまい感が含まれる。卒中とも呼ばれる永続的な脳虚血発作は、血栓または塞栓のいずれかに起因する脳に対する血流のより長い中断または低減によって引き起こされる。卒中は、典型的にニューロンの損失を引き起こし、それによって改善する可能性はあるが完全には寛解しない神経欠損が起こる。
【０２３８】
血栓塞栓発作は、血栓または塞栓による頭蓋外または頭蓋内血管の閉塞が原因である。卒中が血栓または塞栓のいずれによって引き起こされたかを識別することは難しいことから、これらのメカニズムのいずれかによって引き起こされた卒中を扱うために「血栓塞栓症」という用語を用いる。
【０２３９】
方法はまた、本明細書において提供されるLMWH調製物を用いる急性の血栓塞栓卒中の処置にも向けられる。急性の卒中は、脳に対する血液供給の中断または低減である虚血事象に起因する神経損傷を伴う医学症候群である。
【０２４０】
卒中の処置のために、単独または別の治療物質と併用したLMWH調製物の有効量は、卒中に起因するインビボ脳損傷を低減させるために十分な量である。脳損傷の低減は、本明細書において記述される処置がなければ血栓塞栓卒中を経験する対象においてそうでなければ起こるであろう脳に対する損傷の任意の予防である。たとえば、処置前の患者パラメータ、無処置卒中患者、または血栓溶解剤単独で処置した卒中患者と比較して、より小さい梗塞サイズ、改善された局所脳血流、および頭蓋内圧の減少が含まれる、いくつかの生理的パラメータを用いて脳損傷の低減を査定してもよい。
【０２４１】
LMWH調製物は、凝固に関連した疾患を処置するために、単独または治療物質と併用して用いてもよい。凝固に関連する疾患の処置において有用な治療物質の例には、抗凝固剤、抗血小板剤、および血栓溶解剤が含まれる。
【０２４２】
抗凝固剤は血液成分の凝固を防止し、したがって凝血形成を防止する。抗凝固剤には、ワルファリン、クマジン、ジクマロール、フェンプロクモン、アセノクマロール、エチルビスクマセテート、およびインダンジオン誘導体が含まれるがこれらに限定されるわけではない。「直接のトロンビン阻害剤」には、ヒルジン、ヒルゲン、Angiomax、アガトロバン、PPACK、トロンビンアプタマーが含まれる。抗血小板剤は血小板の凝集を阻害し、一過性の虚血性発作または卒中を経験した患者における血栓塞栓卒中を予防するためにしばしば用いられる。血栓溶解剤は、血栓塞栓卒中を引き起こす凝血を溶解する。血栓溶解剤は、急性の静脈血栓塞栓症および肺動脈塞栓症の処置において用いられており、当技術分野において周知である（たとえば、Hennekens et al, J Am Coll Cardiol; v. 25 (7 supp), p. 18S-22S (1995)；Holmes, et al, J Am Coll Cardiol; v.25 (7 suppl), p. 10S-17S(1995)を参照されたい）。
【０２４３】
本明細書において用いられる肺動脈塞栓症は、肺動脈の管腔における凝血の捕獲に関連し、重度の呼吸機能障害を引き起こす障害を指す。肺動脈塞栓は多くの場合下肢静脈を起源とし、そこで凝血が深部脚静脈において形成されて静脈循環を経て肺まで移動する。このように、肺動脈塞栓症は多くの場合下肢静脈における深部静脈血栓症の合併症として発生する。肺動脈塞栓症の症状には、息切れ、胸痛（呼吸により悪化）、ならびに速い心拍数および呼吸数が含まれる。患者によってはヘモプチシス（haemoptysis）を経験することがある。
【０２４４】
調製物および方法はまた、アテローム性動脈硬化症を処置または予防するために有用である。ヘパリンは、様々な実験モデルにおいてアテローム性動脈硬化症を予防するために有益であることが示されている。アテローム性動脈硬化症は、ほとんどの冠動脈疾患、大動脈瘤、および下肢の心房（atrial）疾患の原因であると考えてられていると共に脳血管疾患に関与する動脈硬化症の一つの型である。
【０２４５】
LMWH調製物はまた、外科および透析技法の前、その間、またはその後に有用である。手術患者、特に年齢40歳以上の患者はDVTを発症するリスクの増加を有する。このように、外科技法に関連する血栓症の発症を予防するために、本明細書において記述されるLMWH調製物を用いることが企図される。経皮的介入（たとえば、経皮冠動脈介入（PCI））、PCTA、ステント、および他の類似のアプローチ、股関節または膝関節置換、心肺バイパス手術、冠血管再生術、整形外科手術、および人工器官置換術のような一般的な外科技法のほかに、方法はまた、組織もしくは臓器移植を受ける対象において、または股関節骨折のような骨折の処置において有用である。
【０２４６】
さらに、本明細書において提供されるLMWH調製物は、嚢胞性線維症、喘息、アレルギー、肺気腫、成人呼吸窮迫症候群（ARDS）、肺再灌流損傷、および肺の虚血-再灌流損傷のような呼吸器疾患の処置にとって有用である。
【０２４７】
嚢胞性線維症は、呼吸器系に影響を及ぼす慢性の進行性疾患である。嚢胞性線維症の一つの重篤な結末は、緑膿菌による肺の感染症であり、それ自身嚢胞性線維症における罹患率および死亡率のほぼ90％を占める。嚢胞性線維症を処置するための治療には、病原菌感染症を処置するための抗菌剤が含まれる。
【０２４８】
喘息は、炎症、気道の狭窄、および吸入物質に対する気道の反応性の増加を特徴とする呼吸器系の障害である。喘息は多くの場合、独占的ではないがアトピーまたはアレルギー症状に関連する。喘息にはまた、運動誘発喘息、気管支刺激剤に対する気管支収縮反応、遅延型過敏症、自己免疫性脳脊髄炎および関連障害が含まれる可能性がある。アレルギーは一般的にアレルゲンに対するIgE抗体産生によって引き起こされる。肺気腫は、肺胞間中隔の破壊による末端の細気管支に対して遠位の空気腔の膨満である。肺気腫は、エラスターゼ誘発肺損傷によって発生する。成人呼吸窮迫症候群は、重度の心房の低酸素症を伴う多様なイデオロギーの急性の多くの浸潤性肺病変を含む用語である。ARDSの最も頻繁な原因の一つは敗血症である。
【０２４９】
炎症疾患には、自己免疫疾患およびアトピー障害が含まれるがこれらに限定されるわけではない。本明細書において提供されるLMWH調製物によって処置可能な他のタイプの炎症疾患は、難治性潰瘍性大腸炎、クローン病、多発性硬化症、自己免疫疾患、非特異的潰瘍性大腸炎、敗血症、および間質性膀胱炎である。
【０２５０】
LMWH調製物は、主要臓器線維症、線維増殖障害、および外傷に関連する瘢痕化のような線維障害を処置するために用いることができる。主要臓器線維症には、間質性肺疾患（ILD）、肝硬変、腎疾患（たとえば、糖尿病および無処置の高血圧疾患）、心疾患、および眼の障害（たとえば、黄斑変性、網膜または硝子体網膜症）が含まれるがこれらに限定されるわけではない。線維増殖障害の例には、全身および局所強皮症、ケロイド、および肥厚性瘢痕、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、線維肉腫、およびリウマチ性関節炎が含まれる。外傷に関連する瘢痕化の例には、手術による瘢痕化、化学療法剤誘発線維症、放射線誘発線維症、損傷または火傷に関連する瘢痕化が含まれる。
【０２５１】
一つの態様において、LMWH調製物は、血管新生を阻害するために用いられる。本明細書において用いられる血管新生は、新しい血管の不適切な形成である。「血管新生」は多くの場合、腫瘍において内皮細胞が、内皮に対して分裂促進性であって内皮細胞の伸長および増殖を引き起こす一群の増殖因子を分泌して、それによって新しい血管が生成される場合に起こる。血管新生マイトゲンのいくつかは、内皮細胞増殖因子に関連するヘパリン結合ペプチドである。血管新生の阻害は、動物モデルにおいて腫瘍の退縮を引き起こすことができ、治療的抗癌剤として用いることを示唆している。血管新生障害には、眼の新血管新生障害、骨粗鬆症、乾癬、関節炎、癌、および心血管障害が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【０２５２】
LMWH調製物はまた、癌細胞の成長および転移を阻害するために用いられてもよい。このように、方法は、対象における腫瘍細胞の増殖または転移を処置および/または予防するために有用である。癌は、悪性または非悪性の癌でありうる。癌または腫瘍には、胆管癌；脳癌；子宮頚癌；絨毛癌；結腸癌；子宮内膜癌；食道癌；胃癌；上皮内新生物；白血病；リンパ腫；肝臓癌；肺癌（たとえば、小細胞および非小細胞）；黒色腫；神経芽種；口腔癌；卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；直腸癌；肉腫；皮膚癌；精巣癌；甲状腺癌；および腎臓癌と共に他の癌腫および肉腫が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【０２５３】
癌の処置を必要とする対象は、癌を発症する可能性が高い対象であってもよい。これらの対象には、たとえばその存在が癌発症のより高い確率に相関して関連していることが証明されている遺伝的異常を有する対象、およびタバコ、アスベスト、または他の化学毒素のような癌を引き起こす物質に曝露される対象、または癌に関して既に処置されて、明らかに寛解している対象が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【０２５４】
癌の処置を受ける患者に投与する場合、LMWH調製物は、他の抗癌剤を含有するカクテルで投与されてもよい。LMWH調製物はまた、制吐剤、放射線保護剤等のような、放射線治療の副作用を処置する物質を含有するカクテルで投与されてもよい。
【０２５５】
本明細書において提供される処置にはさらに、たとえば抗凝固剤または抗血栓剤はもはや必要でなくなった場合に、LMWH調製物の抗Xa活性および/または抗IIa活性を中和するために硫酸プロタミンを投与する段階が含まれうる。硫酸プロタミンは、たとえば抗Xa活性100 IUあたり硫酸プロタミン約1、2、3 mgの用量で静脈内投与によって投与することができる。抗Xa活性のIUは、たとえば本明細書において記述される凝固アッセイを用いて決定することができる。
【０２５６】
他の態様
本発明は、以下の実施例によってさらに説明するが、これらは限定として解釈されるべきではない。本明細書を通して引用した全ての参考文献、特許、および公表された特許出願の内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０２５７】
実施例
M118-REHを製造する方法
製造プロセス
M118-REHを産生するために用いられるプロセスの描写を図1に示す。簡単に説明すると、プロセスの第1段階において、市販の未分画ヘパリン、USP（UFH）に、低分子量であるUFHの一部（実質的に速く移動する分画である部分とも呼ばれる）を抽出するために酢酸カルシウム 対 UFHの質量 対 質量比3：1で酢酸カルシウムによる水溶性エタノール沈殿の段階的シリーズに供した。段階1分画の得られた産物を中間体1と指定した。
【０２５８】
段階2は、中間体2を産生するために、酢酸ナトリウム水性緩衝液pH7.2中37℃で、アミノ酸残基225でヒスチジンの代わりにアラニンの置換を有する改変へパリナーゼIII酵素（MO11）を用いる中間体1の消化を伴った。MO11は、N-アセチルグルコサミン残基と、非還元末端でΔ4,5ウロン酸基を有し還元末端でN-アセチルグルコサミンを有する鎖を産生する低硫酸化ウロン酸との間のβ脱離によって切断した。消化が完了した場合、熱を切って、約2％w/vの最終溶液濃度を達成するように、塩化ナトリウムを加えた。
【０２５９】
段階3において、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を用いて、より低い活性材料から中間体2の高い抗Xa因子および抗IIa因子成分を分離した。この段階の産物を中間体3と指定した。
【０２６０】
段階4において、個々のまたは合わせた中間体3材料を精製水に溶解して、0.2 pmフィルターを通して濾過し、凍結乾燥してM118-REH薬物物質を産生した。
【０２６１】
M118-REHの製造における出発物質
出発物質の仕様書
M118-REHを作製するための出発物質であるUFHナトリウム（米国薬局方（USP））は、ブタ腸粘膜起源の材料である。USP試験のほかに、さらなる対照が置かれている。これらの対照を表1に記載する。
【０２６２】
（表１）DMFに追加的なUFHアッセイおよび詳述
2009538386.tif 000021
【０２６３】
アガロースゲル電気泳動（AGE）は、その電気泳動移動度に基づいてデルマタン硫酸およびコンドロイチン硫酸としてヘパリンに基づく材料の様々な成分を半定量的に分離する。0.5％アガロースゲルにおける水平方向の分離を、酢酸バリウム緩衝液pH 5.8の後に1,3-ジアミノプロパンアセテートpH 9緩衝液において行った。特殊な電気泳動タンクを用いて、それによって液体緩衝液を含有する電極チャンバーに、水に不混和性の低密度有機溶媒（たとえば石油エーテルまたはヘプタン）を重ねた。この設計は、アガロースゲルプレートと氷を充填した金属冷却トレイとの間の効率的な熱移動を提供した。
【０２６４】
低分子量ヘパリンは、従来、USP等級のUFHから調製される。より高い効率の低分子量ヘパリン薬物物質を達成するために、M118-REHプロセスのためのUFH出発物質を、160 IU/mgより大きい抗力を有する材料に限定した。デルマタン硫酸およびコンドロイチン硫酸のレベルを制御するために、これらをUFH出発物質において測定し、M118-REH製造プロセスの段階1において制御した。
【０２６５】
中間体の構造分析
M118-REH製造プロセスにおける段階を先に概説し、図1に示す。糖の構造を調べるための特徴付け技術は、それぞれの段階でUFHをこのプロセスに供した場合に変化する構造属性の理解を提供する。この情報によって、出発物質の選択が含まれるプロセスからの制御および再現性が可能となる。
【０２６６】
異なる段階2材料（または中間体1試料）およびそれらを調製するために用いる出発UFH試料の分析は、2D-NMR（HSQC）分析およびキャピラリー電気泳動を用いて行った。
【０２６７】
中間体と共に出発物質を構成する構築ブロックを同定して定量した。調べた段階2材料のいくつかは、次の段階（酵素消化）の理想的な基質ではなく、好ましい段階2材料を示す属性が同定された。
【０２６８】
出発UFHと段階2材料との間の差を図示する2D NMR分析からのデータを以下の表2および表3に示す。この分析によって、M118-REH製造プロセスの段階1を通して進行する場合の構造属性における全体的な差の決定が可能となる。異なる分析から得られた全てのデータに基づいて、出発物質、中間体、および製造プロセスに関する一定の結論を下した。
【０２６９】
（表２）UFHおよびそれらから得られた段階2材料の2D NMR分析
これらの材料は好ましい段階2材料を表す。
2009538386.tif 000022
【０２７０】
段階2材料は、出発物質と比較した場合により低い相対的I2S含有量を有し、これはまた、表に示されるようにHNS-(I2S)構造の減少によって反映された。これは、予想されるようにHNS-(I)およびHNS-(G)構造の同時の増加を伴った。興味深いことに、同様に6-O-硫酸化ヘキソサミン（H6S）の量の相対的増加も認められた。
【０２７１】
（表３）UFHおよびそれらから得られた段階2材料の2D NMR分析
これらの材料はあまり好ましくない段階2材料を表す。
2009538386.tif 000023
【０２７２】
「好ましい」段階2材料は、プロセスにおける次の段階、すなわちMO11による酵素消化に関して良好な基質である材料であるが、「あまり好ましくない」段階2材料はより不良な基質である。HNAc（内部）の相対量を比較する場合、「好ましい」段階2材料において、HNAc含有量は実際に段階1の後に増加するが、「あまり好ましくない」段階2材料では、これは低減される（表2および3を参照されたい）。もう一つの知見は、「好ましい」段階2材料と比較して「あまり好ましくない」段階2において、極めてより大きい程度にG-HNAc単位の相対量が低減されたことであった。これらの知見は、非硫酸化グルクロン酸（すなわち、HNAc-G）に隣接する連結に優先的に作用するMO11の基質特異性の状況においては妥当であった。
【０２７３】
分析を通して、UFHから段階2材料まで進行する製造プロセスの第一の段階（沈殿）の際に変化する構造属性が同定された。段階2材料におけるN-アセチル含有量は、その後の酵素消化段階にとって重要であるように思われることから、沈殿後に段階2材料をより良好に産生させる可能性があるより高いN-アセチル含有量を有する出発UFHを用いることが望ましい。したがって、この分析に基づいて、M118-REH製造プロセスをよりよく制御および評価することができる出発UFHに関する予め選択された基準が割り出されている。
【０２７４】
他のアッセイおよびプロセス中間体の詳細を表4において示し、以下に詳細に記述する。
【０２７５】
（表４）中間体に関するアッセイおよび詳述
2009538386.tif 000024
【０２７６】
アガロースゲル電気泳動プロセスは先に記述されたとおりである。
【０２７７】
抗Xa因子活性は本明細書において記述されるように測定された。抗Xa因子活性をStachrom（登録商標）ヘパリン試験キットによるDiagnostica Stagoアナライザー、またはChromogenixのCoatest（登録商標）ヘパリンキットによるACL Futura（商標）凝固システムのいずれかによって測定した。アナライザーの反応は、低分子量ヘパリンのNIBSC国際標準、ロット01/608または現在のロットを用いて較正した。M118-REH薬物物質の抗力は、平行線検定に関する統計的方法を用いてミリグラムあたりの抗Xa因子活性の国際単位で計算した。
【０２７８】
抗IIa因子活性は、本明細書において記述されるように以下の原理を用いて測定した。第IIa因子活性は、Diagnostica Stagoアナライザー、またはACL Futura（商標）凝固システムのいずれかにおいて、Chromogenix（S-2238基質、トロンビン（53nkat/vial）、およびアンチトロンビン）の試薬によって測定した。アナライザーの反応は、低分子量ヘパリンの第二回国際標準、ロット01/608または同等物を用いて較正した。M118-REH薬物物質の抗力は、平行線検定に関する統計的方法を用いてミリグラムあたりの抗IIa因子活性の国際単位で計算した。
【０２７９】
M118-REH中間体の重量平均モル質量、多分散度、およびモル質量分布を、USP<621>、最新版に従って、Wyatt miniDAWN多角度光散乱（MALS）検出器、または任意の他の適したMALS検出器、およびOptilab rEX干渉測定屈折率測定器（RID）または他の適したRIDを取り付けたサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）システムを用いて測定した。SECカラムセットは、高分解能L20パッキングを充填したカラム、たとえばTosoh TSKgel G3000SWXLおよびTosoh TSKgel G2000SWXLを連続して取り付けたTosoh SWXLガードカラムからなった。システムを、そのpHを硫酸によって5.0に調節した0.2 M硫酸ナトリウム移動相の0.5 mL/分によって平衡にした。アジ化ナトリウムを0.05％で移動相に加えた。注入前に、M118-REH中間体を移動相に溶解して10 mg/mL溶液を得た。重量平均モル質量、多分散度、および分布パラメータを、Wyatt Astraソフトウェアまたは他の任意のソフトウェアを用いて測定した。分布は、モル質量が5,500 Da（M5500）より小さい鎖の百分率およびモル質量8,000 Da（M8000）より大きい鎖の百分率、またはモル質量が5,000 Da（M5500）より小さい鎖の百分率およびモル質量7,500 Da（M8000）より大きい鎖の百分率を特徴とした。
【０２８０】
M118-REHプロセスの段階2において、中間体1をMO11酵素によって消化した。酵素が中間体1基質を消化すると、特徴的なUV232吸光度を保有するΔ4,5ウロン酸残基を含有する中間体2を生成した。消化の進行をモニターするために、反応溶液を定期的にサンプリングして、232 nmでの吸光度を測定した。段階2の消化は、232 nmでの吸光度が1時間で2 AUより多く変化しなかった場合に完了したと見なされた。
【０２８１】
表5は、M118-REHの様々な調製物の重量平均分子量および分布を示す。表6は、M118-REH、LMW、およびUFH産物の比較を示す。
【０２８２】
（表５）M118-REHの異なるロットの分子量、多分散度、および鎖長特徴
2009538386.tif 000025
* MWはM118-REH材料において測定されたdn/dcを用いて計算した。
【０２８３】
（表６）M118、LMWH、およびUFH産物の比較
2009538386.tif 000026
1 * M118-REH薬物産物製剤において用いられたロットの値；UFHに関する文献データから推定したdn/dcを用いて処理した平均MW。
2 Lovenoxの添付文書。
3 USPヘパリンのモノグラフ。
【０２８４】
M118-REHの構造の特徴付け：M118-REHの構造特徴の同定
補足的なデータの組を提供するいくつかの異なる分析技術を伴うM118-REHの特徴付けに対するアプローチを開発した。
【０２８５】
これはM118-REHの特徴付けを提供し、これによって他のLMWHと比較して何がM118-REHを独特にするかを理解することができる。これらの役立つ特徴付け技術からの知見の要約は、独特な混合物としてM118-REHを定義する。
【０２８６】
未分画ヘパリン（UFH）およびLMWH産物の特徴付けを、一連の分析技術を用いて完了し、それによって所定のLMWHに対して独自の化学構造、いくつかの異なるLMWHにおいて様々な量で存在する構造、およびヘパリンの生物特性に責任を有する構造が同定された。
【０２８７】
M118-REHのような複雑なLMWH混合物の分析は、ヘパリンの生合成によって発生する固有の構造多様性のみならず、酵素的切断および製造プロセスによって発生する構造を説明する必要がある。これは、混合物に存在する天然の特徴のみならず、改変された（もしあれば）還元および非還元末端の特徴を分解することによって取り組むことができる。同時に、親UFH分子によって定義される二糖単位の相対的「秩序」が、製造プロセスによって影響されないこともまた確認する必要がある。したがって、これらの改変または天然の構築ブロックがM118-REHの鎖に存在する配列状況を提供する必要がある。これらの要因を説明するために、独自で補足的なデータの組を提供する異なる分析技術から得られたデータを用いることを伴うM118-REHの特徴付けに対するアプローチが開発されている。
【０２８８】
組成分析をCEによって行い、M118-REH鎖を含む個々の構築ブロックを同定して定量した。これらの方法はまた、「抗Xa構築ブロック」と呼ばれる抗Xa活性に関与する構築ブロック構造を同定する。
【０２８９】
構築ブロック分析/複合分析
キャピラリー電気泳動（CE）による複合分析
簡単に説明すると、この方法は、M118-REHのその構成成分の構築ブロックへの酵素的消化の後にCEを用いる分離を行うことを伴う（図2Aおよび2B）。
【０２９０】
CEは、高分解能の分離技術であり、UFHおよび他のグリコサミノグリカンの分析において広く用いられている。現在の方法は、非コーティングヒューズドシリカキャピラリーにおけるキャピラリーゾーン電気泳動を用いた。キャピラリー電気泳動によって、最も高度に硫酸化された種は、キャピラリーの中を最も速く移動して最初に検出される。
【０２９１】
代表的データ
CEによって観察されたM118-REHに関する酵素消化のプロフィールを図2に示す。特に、UFHに既に存在するブロック以外の非改変構築ブロックは、M118-REHにおいて観察されなかった（エノキサパリンについて観察される1,6構造によって示される）。もう一つの興味深い知見は、3-O-硫酸化種の量がエノキサパリンと比較してM118-REHにおいてほぼ倍加した（AT-IIIの4本のピークによって示される）ことであった。これは、この混合物に関して観察されたより高い抗Xa因子活性と良好に相関して、M118-REHの産生に関する方法論と一致した。全体的な硫酸化の程度もまた、この技術に基づいてM118-REHに関してエノキサパリンよりわずかに高いことが示された。
【０２９２】
この技術はまた、M118-REHの構築ブロック糖成分のそれぞれの存在および量を決定するために用いられた（表12）。
【０２９３】
（表７）M118-REHのCE分析において観察された構築ブロック糖
2009538386.tif 000027
【０２９４】
定量的に、1,6-アンヒドロ構築ブロック（エノキサパリンにおいて観察）または2,5-アンヒドロ構造（ダルテパリンにおいて観察）は、M118-REHプロフィールにおいて観察されなかった。これらの構造の定量的分析からいくつかの興味深い知見が生じる。エノキサパリンとM118-REHとのピーク10（ΔUHNAc,6SGHNS,3S,6S）の相対的モル％を比較すると、より多い量のピークがM118-REHに存在し（表6）、M118-REH製造プロセスによってヘパリンにおける活性な抗凝固配列に関して濃縮されたことを確認した。三糖類（ΔU2SHNS,,6SI2S）の量は、エノキサパリンと比較してM118-REHにおいて比較的低かった。これは製造プロセスの反映である。エノキサパリンを作製するために用いられる化学プロセスによって、オリゴ糖の還元末端からの「剥離」が起こり、それによって奇数鎖の数が増加する。これは、M118-REHの場合には当てはまらず、三糖類のレベルは出発UFHにおいて観察された三糖類の直接結果であった。この分析は、CE方法論がLMWHの製造のために用いられる異なるプロセスを示すこれらの変化を実際に取り上げるために十分に感度がよく、非常に識別的となりうることを示している。
【０２９５】
（表８）選択した構造の定量的比較：M118-REHおよびエノキサパリン
2009538386.tif 000028
【０２９６】
2D NMRによる組成分析
NMR分光法は、多糖類における主要なまたは軽微な構造特色に関連するシグナルを検出および定量するために首尾よく用いられている。NMR分光法はまた、混合物におけるイズロン酸およびグルクロン酸成分の効率的な定量を可能にする唯一の技術の一つでもある。二次元（2D）NMR分光法は、単糖類残基の一定の集団に対応する異なるシグナルを分解および同定する手段として用いられている。このアプローチによって、混合物の基礎単糖類構成成分を定量することができるのみならず、その連結環境を定量的に査定することができる。
【０２９７】
二次元NMRは、CEによるM118-REHの組成分析に対して補足的な技術を提供する。2D NMRは、H-U連結二糖に関する情報を提供して、それによって二糖の連結に関する相補的分析を提供する。2D プロトン-炭素相関分光法（HSQC）実験を用いる最近の方法論は、グリコサミノグリカンについてこの定量的組成分析を得ることができることを証明した。
【０２９８】
2D プロトン-炭素相関分光法（HSQC）を用いて測定したM118-REHのアノマー領域のスペクトルを図4に表す。アノマー領域におけるクロスピークを図に示す。
【０２９９】
M118-REHのアノマー領域の分析は、他のLMWHと比較してM118-REHを独特にするものに関するいくつかの非常に興味深い情報を提供した。第一に、アノマー領域は、エノキサパリンのような他のLMWHと比較した場合に非常に単純である。第二に、鎖の還元末端残基を分析する場合、鎖の大部分がN-アセチルグルコサミンで終わり、N-スルホグルコサミンで終わる鎖はごく少量であることが観察された。これは、M118-REHを調製するために用いた酵素の特異性の結果として生じる。第三に、NMRデータは、鎖の約30％が非還元末端でΔU残基を有することを示しているが、これもまた酵素特異性の結果である。第四に、M118-REHではG-HNAc二糖は観察されなかった。最後に、NMRスペクトルにおいて連結領域の糖類は観察されなかった。M118-REHにおける単糖の組成百分率およびその連結環境を表7に報告する。NMR分析によって、M118-REHに関するイズロン酸/グルクロン酸比の定量を行うこともできる。
【０３００】
（表９）M118におけるグルコサミンおよびウロン酸残基の組成（％）（二つの実験の結果）
2009538386.tif 000029
【０３０１】
結論
M-118-REHの構造属性として以下が同定された：
・  既存のLMWHおよびUFH出発物質と比較した際の相対的モル％に基づく3-O-硫酸塩含有糖鎖（AT-III結合三糖類）の濃縮；
・  優勢な還元末端構造（HNAc）の生成；
・  観察された唯一の改変非還元末端構造がΔUであること；
・  他のLMWHにおいて観察されるプロセス関連変化の導入が限定的であるUFHの天然の二糖骨格構造の維持；
・  抗Xa因子または抗IIa因子（トロンビン）結合にとって必要ではないUFH成分の混合物からの除去、それによってより定義されたヘパリンが作製されること；
・  M118-REH脱重合化プロセスの特異性が、抗IIa活性を保持するために、必要な鎖長および結合部位の近位分離を保持すること。
【０３０２】
LMWH産物の重要な属性は、より長い多糖類鎖が図5において描写されるように多様な脱重合化法によってより小さい断片に切断される点である。化学または酵素反応のいずれかによって引き起こされうるこの切断事象によって、分子の還元および非還元末端の双方で特徴的な特色が得られる。M118-REHに存在する特徴的な末端基を以下に記述する。
【０３０３】
非還元末端での構造
新しい非還元末端（AUと省略）の形成が起こる酵素的切断の特異性によって、多糖類鎖内でAT-III結合部位を配置することが可能となった。
【０３０４】
還元末端での構造
M118-REH鎖上の新しい還元末端でのグルコサミン構造は、プロセスにおいて用いられる酵素の特異性の反映であった。その結果、M118-REHにおける還元末端構造の大部分がN-アセチル化ヘキソサミン（HNAc）残基であった。
【０３０５】
M118-REHと未分画ヘパリンの構造の差
1）M118-REHは、出発の未分画ヘパリン（UFH）と比較してより高いモル％のアンチトロンビン結合糖配列を有する。
2）M118-REHは、出発UFHと比較して無視できる量の連結領域を有する。
3）M118-REHは、鎖の非還元末端でΔ4,5グルクロン酸の一定の百分率を有するが、UFHは非還元末端でこの改変残基を含有しない。
【０３０６】
要約すると、M118-REHは、独特な物理的および機能的属性を有するヘパリン産物である。
【０３０７】
先に考察した構造属性のほとんどは、M118-REHを調製するために用いられた酵素の特性の直接の結果であった。これらには、主要な還元末端構造（HNAc）、唯一の改変された非還元末端構造（ΔU）と共に、連結領域の除去が含まれる。同様に、酵素は好ましくはヘパリン混合物において低硫酸化が低いドメインまたは非硫酸化ドメインを優先的に切断することから、酵素はAT-III結合配列には影響を及ぼさず、その結果M118-REHにおいて濃縮される。
【０３０８】
先に定義した特徴付けプロトコールを用いて、M118-REHのバッチ4個を分析した。この分析は、M118-REHとして定義されるものの製造における一貫性を確認する。
【０３０９】
（表１０）M118-REHのいくつかのバッチのCE分析
2009538386.tif 000030
【０３１０】
（表１０Ａ）好ましいピーク範囲
2009538386.tif 000031
【０３１１】
（表１１）M118-REHグルコサミンおよびウロン酸残基の組成（％）
2009538386.tif 000032
2009538386.tif 000033
【０３１２】
（表１１Ａ）好ましい構造範囲
2009538386.tif 000034
2009538386.tif 000035
【０３１３】
薬物産物M118-REH注射剤の説明および組成
薬物産物M118-REH注射剤は、3 mLの1回使用の1型ガラスバイアルに入ったクロロブチルストッパーによって密封されてアルミニウムのクリンプによってさらに密封された、透明で無色からわずかに黄色の溶液である。それぞれのバイアルは、2 mL中に名目上抗Xa因子活性5000 IUを含有する。
【０３１４】
M118-REH注射剤の定量的組成を表11に示す。組成は、表示容積2 mLに関して与えられる。それぞれのバイアルには、USPにより推奨される過剰量と一致する2.15 mLを充填した。
【０３１５】
（表１２）M118-REH注射剤の組成
2009538386.tif 000036
1 M118-REH薬物物質の量は、抗Xa因子活性（乾燥物に基づく）および乾燥減量に基づいて計算する。抗Xa因子活性200 IU/mgを仮定すると、M118-REH薬物物質の量は25 mg/バイアルである。
2 モル浸透圧280〜330 mOsm/Lを達成するために必要な塩化ナトリウムの量はおよそ8 mg/mL、または16 mg/バイアルである。
【０３１６】
希釈剤はM118-REH注射剤に用いられない。
【０３１７】
M118-REH注射剤の成分
M118-REH注射剤は、M118-REH薬物物質を注射用水に溶解することによって製造した。M118-REH薬物物質は、水溶液に非常に溶解性であり、したがって薬物物質の粒子径分布は、薬物産物の性能に影響を及ぼさなかった。
【０３１８】
塩化ナトリウム（USP）は、M118-REH注射剤（およそ8 bg/mLの濃度で）において用いられる唯一の賦形剤であった。塩化ナトリウムは、投与後に注射部位の不快感および血液透析を回避するためにモル浸透圧調節物質として選択された。
【０３１９】
M118-REH注射剤の製造プロセスの開発
M118-REH注射剤の製造プロセスは、M118-REH物質を注射用水（USP）に溶解する段階、およびモル浸透圧を塩化ナトリウム（USP）によって調節する段階からなった。処方溶液を0.2 pmフィルター2枚に連続して濾過して、バイアルに無菌的に充填した。ヘパリンナトリウム産物は非常に高温では分解され、したがって最終的に滅菌することができない。M118-REH注射剤のプロセスフローダイアグラムを図6（以下に記述）に紹介する。
【０３２０】
図6は、M118-REH注射剤のプロセスフローダイアグラムを示す。それぞれのバッチに加えられるM118-REH薬物物質の量は、アッセイ（抗Xa因子活性）および以下の計算に従う分析証明書からの乾燥減量値に基づいて計算した：
2500 IU/mL/アッセイ（IU/mg）×100/（100−乾燥減量％）×バッチサイズ（mL）÷1000 mg/g＝加えた薬物物質の量（g）
【０３２１】
最終バッチ重量のおよそ75％と同等の注射用水を処方容器に加えて、混合を開始した。M118-REH薬物物質の計算量を容器に徐々に加えて、全ての固体が溶解するまで混合した。塩化ナトリウム（USP）の最初の量を加えて、全ての固体が溶解するまで溶液を混合した。注射用水を最終バッチ重量に加えて、溶液をさらに5〜15分間混合した。モル浸透圧を測定して、モル浸透圧280〜330 mOsm/Lを達成するために必要であれば、さらなる塩化ナトリウム（USP）を加えた。
【０３２２】
予め滅菌したMillipak 20 PVDF（フッ化ポリビニリデン）0.22μmフィルター2枚を連続して用いてM118-REHバルク薬物産物を滅菌した。産物を充填用リザーバーの中に濾過して、濾過終了時にフィルターの完全性を調べた。
【０３２３】
M118-REHの生物学的および薬理学的特性
M118-REHは、それによって脱重合化低分子量ヘパリンが得られる酵素消化産物である。脱重合化されたプールを活性な抗凝固および抗血栓分画に関して濃縮するが、これは特異的グリコサミノグリカンリアーゼによる部位特異的消化の結果である可能性がある。この酵素による特異的部位および方向の脱重合化によって、M118-REHは、動脈損傷の保護に対して非常に有効な分子となった。さらに、M118-REHは、可逆的でベッドサイドの凝固アッセイによって容易にモニターされる属性を有する。
【０３２４】
M118-REHの試験は、M118-REHの薬理学的および生物特性を明らかにするために行われ、このプロセスを通して、その作用様式はインビトロおよびインビボの双方で探索されている。抗凝固および抗血栓機能のメカニズムが研究されている。これらの研究において、予備的な構造活性相関（SAR）に取り組んでいる。これらの研究およびその結果を以下のように記述するが、これはM118-REHの生物薬理学的活性のプロフィールを生成するための最初の分析である。
【０３２５】
凝固活性のインビトロ分析
インビトロにおいて、M118-REHの抗Xa因子活性は、第二回国際低分子量ヘパリン標準物質に基づいて180〜300 IU/mgの範囲である。インビトロ抗Xa/抗IIa活性がより高いM118-REH調製物は、3-O-硫酸化部分を含有するΔUHNac,6sGHNS,3S,6Sとしてその分画に比例する。
【０３２６】
インビトロでのM118-REHの抗IIa活性は、第二回国際低分子量ヘパリン標準物質に基づいて100〜250 IU/mgの範囲である。
【０３２７】
M118-REHは、インビトロで2.4μg/mLでaPTTを40秒から80秒に延長させることができ、aPTTの変化は抗Xaおよび抗IIa活性に比例する。
【０３２８】
抗Xa活性によって測定した硫酸プロタミンによるインビトロ中和
プロタミンは、ヒト血漿において1 mg：抗Xa 100 IUの比率でM118-REHの抗Xa活性を完全に逆転させることができる。これを他のLMWH調製物と比較することができる。たとえば、プロタミンは、ヒト血漿において3 mg：抗Xa 100 IUの比率でエノキサパリンの抗Xa活性を60％中和できるに過ぎない。これらの結果を図7に示す。
【０３２９】
インビトロヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）は組織因子経路阻害剤（TFPI）を放出する
ATCCからのHUVECをECGSを含まない2％FBS F12K改変培地において生育させた。M118-REH、Lovenox、およびUFHを同じ培地において最終濃度0.01 mg/mLおよび0.005 mg/mLに調製した。各群の細胞のウェル3個を37℃、5％CO2、および95％O2において24および48時間インキュベートした。ADIのELISAキットを用いてTFPI放出試験のために上清を採取した。
【０３３０】
図8において示されるように、0.005 mg/mLおよび0.01 mg/mLのM118-REHは、24時間および48時間でHUVECからのTFPI放出を有意に増加させた。M118-REHによって、未分画ヘパリンより多いHUVECからの細胞培地へのTFPI放出が起こった。Lovenoxは、対照と比較して有意に高いTFPI放出を引き起こさなかった。
【０３３１】
インビボでのM118-REHの薬物動態
Sprague-DawleyラットおよびB16B16マウスのような齧歯類モデルにおいて、M118-REHはUFHより長い消失半減期を有し、かつ静脈内注射後のエノキサパリンの消失半減期と同等である。M118-REHは、皮下注射後急速に吸収され、Tmaxは1時間〜3時間の範囲である。
【０３３２】
ニュージーランドホワイトウサギのようなウサギモデルにおいて、M118-REHの皮下注射は、抗Xaおよび抗IIa活性の双方に関してUFHより高い生物学的利用能を生じ、生物学的利用能は静脈内注射と比較して50％〜100％の範囲であった。M118-REHの薬物動態はエノキサパリンと同等であり、消失半減期は3〜5時間の範囲であり、主要な消失メカニズムは腎排泄を通してである。
【０３３３】
（表１３）ウサギおよびラットモデルにおける静脈内注射後のM118-REH、エノキサパリン、およびUFHの薬物動態パラメータ
2009538386.tif 000037
【０３３４】
サイトモロガス（Cytomologus）サルのようなNHPにおいて、M118-REHの消失半減期は20分〜50分の範囲であった。静脈内注射後の抗Xa/IIa比は、PKの過程において一定に維持され、0.5〜2の範囲であり、M118-REHは循環系に分布して薬物動態パラメータの分析に基づいて腎経路を通して排泄された。表14はNHPモデルにおけるM118-REHの薬物動態を描写する。
【０３３５】
（表１４）NHPにおけるM118-REHの薬物動態
2009538386.tif 000038
M118-REHの薬物動態は一次消失を表す。
【０３３６】
インビボTFPI濃度は、M118-REH投与後24時間の間、高レベルで維持された。ACTおよびaPTTはいずれも抗Xa活性と非常に良好に相関した。
【０３３７】
インビボでのM118-REHの薬力学試験
Sprague-Dawleyラットのような齧歯類モデルにおいて、M118-REHおよびUFHを頚静脈を通して1または2 mg/kgで静脈内注射し、エノキサパリンは0.5または1 mg/kgで投与した。ACT（活性化凝固時間）をHemochron Jrによって測定した。このモデルにおいて、活性化部分トロンボプラスチン時間（aPTT）および活性化凝固時間は、M118-REHの増加用量に対して用量反応を示した。ACTは0.5 mg/kgでのM118-REHの送達後に1.5〜3倍増加したが、1 mg/kgの静脈内注射後では2〜4倍増加した。薬力学プロフィールは抗Xa/IIa測定に関して薬物動態プロフィールと類似であった；消失半減期は0.15〜0.5時間の範囲である。
【０３３８】
ニュージーランドホワイトウサギのようなウサギモデルにおいて、aPTTおよびACTをM118-REHの静脈内送達後に測定した。aPTTおよびACTは、M118-REHの用量に比例して増加した。抗Xa/IIa比は、1.5 mg/kgの静脈内投与および皮下投与後の双方において一貫した。M118-REHとは対照的に、静脈内投与後のエノキサパリンおよびUFHに関する抗Xa/IIa比はいずれも、その間に有意に変動した。
【０３３９】
図9において示されるように、カニクイザルのようなNHPモデルにおいて、結果は、aPTTおよびACTがM118-REHの抗Xa 150 IU/kgで静脈内投与後に2〜4倍および1.5〜3倍有意に増加することを示した。
【０３４０】
M118-REHの静脈内ボーラス注射は、血流へのTFPIの放出を2〜20倍増強し、そのような効果は24時間より長く持続する。
【０３４１】
M118-REHの静脈内ボーラス注射後の持続的注入の効果をさらに、重度の電気分解損傷によって誘発されたイヌ深部動脈欠損症モデルにおいても調べた。この試験に関するより詳しい詳細を、「ビーグル電気分解誘発大腿動脈損傷モデル」と題する以下の実施例において提供する。
【０３４２】
前臨床モデルにおけるM118-REHの有効性試験
塩化第二鉄誘発頚動脈損傷
M118-REHおよびエノキサパリンの比較試験は、閉塞血栓の用量依存的阻害を生じた。M118-REHは、0.5 mg/kgの用量で生理食塩液と比較して閉塞までの時間（TTO）を有意に（p＜0.05）延長した（それぞれ、28.5±7.1分 対 11.1±0.9分）。0.5 mg/kg M118-REHを注射された損傷頚動脈の25％（2/8）が、全60分の観察期間において開口したままであった。対照的に、生理食塩液を注射したラットでは、損傷頚動脈は全て（9/9）、60分間の観察期間内で閉鎖した。1 mg/kg M118-REHを投与すると、TTOはさらに増加して（55.3±3.6分）、血管の83％（10/12）が60分の観察期間の終了時に開口していた。2、3、または4 mg/kgエノキサパリンを投与したラットは全て、生理食塩液を注射した動物より有意に長いTTOを有した（それぞれ、19.1±1.4、36.0±5.6、および40.2±6.3分）。2 mg/kg用量では頚動脈は全て（7/7）60分間の観察期間以内に閉鎖したが、3および4 mg/kgエノキサパリンを投与したラットではそれぞれ、62％（7/13）および55％（6/11）の血管が閉鎖した。M118-REH（1 mg/kg）は、3 および4 mg/kg用量のエノキサパリンより低い抗Xa因子活性にもかかわらず、血栓症からの保護の最大の程度を生じた。結果を図10および表15に描写する。
【０３４３】
（表１５）有効性データの統計分析（スチューデントのt-検定）
2009538386.tif 000039
* p＜0.05、対照群と比較；** p＜0.01、対照群と比較；# p＜0.01、3 mg/kgエノキサパリンナトリウムと比較。
【０３４４】
ビーグル電気分解誘発大腿動脈損傷モデル（Lucchesi'sモデル）
M118-REHの抗血栓および抗凝固効果を重度の電気分解損傷によって誘発されたイヌ深部動脈塞栓症モデルにおいて調べた。
【０３４５】
外科技法
動物に、IVプロポフォル（4〜8 mg/kg）による麻酔の誘導の少なくとも10〜15分前に、硫酸アトロピン（0.02 mg/kg）の筋肉内（IM）注射およびアセプロマジン（0.2 mg/kg、≦3 mg/動物）のIM注射を前投薬した。動物に挿管して、イソフルラン吸入剤による麻酔下で従量式呼吸器によって維持した。
【０３４６】
頚動脈の上に存在する組織に対するアクセスを獲得するために頚部の内側腹側表面に縦方向の切開部を作製した。頚動脈および双方の頚静脈（一つはバックアップ）を鈍器による解剖によっておよそ2 cm露出して、近位末端および遠位末端で保留結紮によって支持した。腹部で始まってそれぞれの大腿骨の66％〜75％を覆う距離まで恥骨筋に沿って遠位まで伸長する他の二つの切開部を作製した。各切開部で筋膜を開き、その下の大腿動脈を約2〜3 cm露出した。
【０３４７】
動物の器具配置
24時間麻酔したビーグル犬に、左右大腿動脈壁を通して血管内電極を挿入して脈管内膜に直接接触するように配置した。それぞれの電極を定電力源に接続して、陰極を遠位の皮下部位に留置した。電極に対してすぐ遠位に狭窄装置を配置し、経血管ドップラーフロープローブを電極に対して近位に配置して、カテーテルを頚動脈に挿入して、動脈圧、血流、および心拍数を連続的にモニターするために、その全てをGould Ponemah Physiological Platform（Linton Instrumentation, Norfolk, UK）に接続した。採血のために第二のカテーテルを頚静脈に挿入した。最後に、静脈ラインを試験処置注入のために末梢静脈に挿入して、心電図のために脚のリードを配置した（リードIIで測定）。
【０３４８】
大腿動脈電気分解損傷モデル
器具の配置後、各動物に溶媒（0.9％滅菌生理食塩液）の連続的IV注入を90分間行った。注入開始後15分で、電流（300μA）を、血管内電極を通して右大腿動脈（対照）に適用して、ドップラーフローのベースライン値の≦2％への低減によって定義される完全な血栓が形成されるまで、または血管が開口したままである場合には電気分解損傷の開始後180分での観察期間の終了まで持続的に適用した。この後に、血管を電気分解損傷部位の近位および遠位で結紮して、その区画を採取して、存在すればいかなる血栓も重量を測定した。
【０３４９】
このモデルにおいて、血小板に富む血管内血栓が遠位動脈狭窄の近位に形成される。したがって、物理的閉塞に対するベースライン反応の≦80％まで低酸素症誘発反応性充血を制限するように、狭窄装置を調節した（ベースライン反応性充血は、媒体または活性処置注入の直前に各大腿動脈で決定した）。損傷部位での血行力学特性が、大腿動脈を通しての正常な血流に確実に近似するように、平均動脈圧および心拍数の目標を、イソフルラン麻酔処置によってそれぞれ、およそ70 mmHgおよび100拍/分とした。
【０３５０】
右大腿動脈で各動物におけるベースライン血栓パラメータを評価するために先の実験の完了後に、左大腿動脈（活性物質処置）においてM118-REHまたはUFH注入の存在下で同一の技法を行った。動物を4つの処置群に割付した（n＝6）。三つの群にM118-REHの抗Xa 37.5、75、および150 IU/kgをそれぞれIVボーラス投与した後、M118-REHの抗Xa 1.0 IU/kg/分の90分間持続的注入を行った。第四の群にはUFH 75 U/kgのIVボーラスを行った後にUFHの1.0 U/kg/分の持続的注入を90分間行った。連続的電気分解損傷をボーラス処置の15分後に開始して、その後の分析を媒体群と同一に行った。
【０３５１】
皮膚出血時間（CBT）のアッセイおよび採血は、プロトコールに明記された時点で行った（以下を参照されたい）。技法を通してモニターされる生理的パラメータには、心拍数、呼吸数、直接血圧、直腸温、1回換気量、呼吸終期二酸化炭素レベル、およびO2飽和が含まれる。
【０３５２】
血液学および凝固測定
血液学および凝固測定に関して、全血試料（およそ100μL）をACTの測定のために15、30、45、60、75、90、105、120、135、150、165、および180分に採取した。ACTは、HEMOCHRON（登録商標）Jr. Signature + Microcoagulation System（ITC, Edison, NJ, USA）において製造元の説明書に従って査定した。応用可能であれば、血液学およびさらなる凝固アッセイのために、全血の二つのアリコート（それぞれ、およそ1.3 mL）を15分、60分、および180分のいずれかで採取した。血液学パラメータ（WBC、RBC、HGB、CHT、MCV、MCH、MCHC、PLT、RTC、ARTC、およびWBC分画）をAdvia 120 Hematology System（Bayer Diagnostics Norden, Lyngby, Denmark）を用いて製造元の説明書に従ってアッセイした。凝固アッセイ（プロトロンビン時間[PT]、活性化部分トロンボプラスチン時間[aPTT]、およびフィブリノーゲンレベル[FIB]）をMLA Electra 1400C Coagulation Analyzer（Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA）を用いて製造元の説明書に従って行った。
【０３５３】
抗Xa因子および抗IIa因子レベルを決定するために、処置開始後0、15、および60分で採取したクエン酸加全血試料を冷蔵遠心機において3,000 gでおよそ10分間遠心した。血漿を採取して、-20℃で瞬間凍結し、色素産生アッセイによる試験の準備ができるまで-80℃で保存した。Stachromeヘパリン抗Xaキット（Diagnostica Stago, Asnieres sur Seine, France）ならびに基質S2238、ウシトロンビン、およびヒトアンチトロンビンIII（Chromogenix, Milano, Italy）からなる試薬を、抗Xa因子および抗IIa因子アッセイのために用いた。色素産生アッセイは全て、抗Xa因子および抗IIa因子活性測定のために、STA-Rアナライザ（Diagnostica Stago）においてMomenta Pharmaceuticals, Inc.のSOPに従って定量した。CBTは、15分、60分、および180分または適用可能であれば閉塞時に決定した。CBT査定は、試験施設のSOPを用いてMielke法によって前肢で行った。
【０３５４】
統計学
値は、特に明記していなければ平均値±標準偏差（SD）として報告した。異なる処置群における等しい分散を仮定して、平均値をStudentのt-検定を用いて比較した。対照に対してオッズ比を計算して、z検定を用いてP-値を誘導することによって、閉塞の発生率を処置群の間で比較した。全ての試験に関する有意レベルを0.05に設定した。
【０３５５】
抗Xa因子および抗IIa因子血漿活性
M118-REHの様々な用量をUFHの標準用量（75 U/kg）と比較した。M118-REHは、Xa因子およびIIa因子の双方の用量依存的な阻害を示し、M118-REHの最高用量（150 IU/kg）は、UFHと比較して類似の抗Xa因子活性を証明する（図13および表16）。抗IIa因子活性は、M118-REHおよびUFHの双方に関して抗Xa因子活性に比例して増加したが、相関係数はUFH（r2＝0.465）よりM118-REH（r2＝0.890）のほうが大きかった（図14）。最後に、経時的な抗Xa因子活性 対 抗IIa因子血漿活性の比は、一般的にUFHよりM118-REHのほうがより一定であり、大きい多分散性のUFH分子について知られている多様な代謝と矛盾しない（図15）。
【０３５６】
（表１６）選択された血液学エンドポイントの要約
2009538386.tif 000040
ACT、活性化凝固時間；IU、国際単位；SD、標準偏差；UFH、未分画ヘパリン
* 試験物質注入開始後60分で記録；†ボーラス投与；‡P＜0.05、M118-REH 対 UFH；§P＜0.01、M118-REH 対 対照；¶P＜0.01、UFH 対 対照。
【０３５７】
凝固アッセイ
次に、M118-REHの抗凝固活性を、UFHの標準用量と比較した。凝固のM118-REH用量依存的阻害は、全ての凝固アッセイにおいて15分以内に観察され、60分の観察期間の間、維持された（図16）。60分の時点で、M118-REHの抗Xa 37.5または75 IU/kgより有意に長い凝固時間がUFH処置後にACTアッセイにおいて観察された（図16）。ACTアッセイにおけるUFHとM118-REHの差は、M118-REHを抗Xa 150 IU/kgで投与した場合には有意ではなかった（図16）。対照実験により、凝固アッセイにおける処置群の差は、フィブリノーゲン基質の濃度の変化に帰することはできないことが証明された（データ非提示）。
【０３５８】
抗血栓効果
抗Xa 150 IU/kgの用量でのM118-REHは、標準用量の75 U/kgでのヘパリンと類似の抗凝固特性を有するという知見に基づいて、抗Xa 150 IU/kgおよびより低用量でのM118-REHの抗血栓有効性を、イヌ深部動脈血栓症モデルにおいてUFHと比較した。媒体の注入時、対照動脈の完全な閉塞は、180分間の観察期間において動物24/24[100％]において起こった（図17）。UFH処置群において動物5/6（83.3％）は、モデルが定義したドップラーフローの減少に達した。比較すると、完全な閉塞は、M118-REHのボーラス用量の抗Xa因子活性37.5、75、および150 IU/kgを投与した動物のそれぞれ、3/6（50％）、2/6（33.3％）、および1/6（16.7％）において起こり、用量反応関係と一致する。閉塞率に関するM118-REH処置動脈と媒体処置動脈との間の処置の差は、全てのM118-REHボーラス用量において統計学的に有意（P＜0.05）であった。ボーラス用量の抗Xa 150 IU/kgでのM118-REHとUFHとの差も同様に有意であった（P＜0.05）。このように、M118-REHとUFHの抗凝固活性はこれらの用量で同等であるという事実にもかかわらず、抗Xa 150 IU/kgでのM118-REHは、75 U/kgでのUFHより優れた有効性を示した。より低い抗凝固活性に関連する調べたより低用量（抗Xa 37.5および75 IU/kg）でのM118-REHは、より一般的にUFHと類似である抗血栓効果を有した。
【０３５９】
閉塞までの平均時間は、媒体、UFH、M118-REH（抗-Xa 37.5 IU/kg）、M118-REH（抗-Xa 75 IU/kg）、およびM118-REH（抗-Xa 150 IU/kg）によって処置した動物においてそれぞれ、59±25、132±42、165±23、161±41、および165±36分であった。特にM118-REH処置群において、多くの動脈が予め指定された180分のエンドポイントまでに完全には閉塞しなかったことから（そのような動脈は任意で分析のために180分の閉塞時間を割付された）、活性処置動脈における平均閉塞時間は、これらの真の値の過小評価であったことに注目すべきである。平均血栓重量は、媒体処置動脈において24.0±9.15 mg、UFH処置動脈において19.4±9.47 mg、ならびにM118-REHの抗Xa 37.5、75、および150 IU/kg処置動脈においてそれぞれ、24.5±12.17 mg、19.8±6.24 mg、および12.8±5.99 mgであった。閉塞するまでの平均時間および平均血栓重量に関する処置群の差は、統計学的有意性に達しなかった。
【０３６０】
皮膚出血時間
CBTは全ての群においてプロトコールに明記された時点で媒体の投与の際に80±15.5〜160±52.5秒まで変動した（表17）。UFHおよびM118-REH処置によって、CBTの最小の増加が起こり、効果は非常に変動が大きかった。群の平均値はUFH処置後135±90.5〜275±306.8秒の範囲であり、M118-REH投与後では全ての時点で110±36.3〜190±86.3秒の範囲であった。
【０３６１】
（表１７）皮膚出血時間
2009538386.tif 000041
UFH 未分画ヘパリン、SD 標準偏差、IU 国際単位、U 単位。
【０３６２】
血行力学パラメータ
実験の過程において、心血管パラメータまたは臨床化学において臨床的に意味のある変化は観察されなかった。試験集団において、媒体および活性物質処置動脈での狭窄後充血反応の差は、全ての動物において≦13 mL/分であった。低酸素症誘発充血反応を、物理的閉塞に対するベースライン反応の≦80％まで制限するという目標は、二つの動脈を除く全ての動脈において満たされ；そのうちの一つでは、反応は81％（M118-REH[抗Xa 75 IU/kg]；対照動脈）であり、もう一つでは反応は88％（M118-REH[抗Xa 75 IU/kg]；活性物質処置動脈）であった。全ての処置群における技法の過程での平均動脈圧および心拍数は、それぞれ68〜78 mmHgおよび96〜111 bpmであり、プロトコールにおいて予め明記された目標の70 mmHgおよび100 bpmに近かった。任意の所定の動物における媒体および活性物質処置動脈の間での平均動脈圧および心拍数の最大の差はそれぞれ、6 mmHgおよび5拍/分であった（差に関するP値は有意ではなかった）。
【０３６３】
要約
M118-REHとUFHは、これらの濃度でACT、aPTT、およびPTアッセイにおいて同等の活性を示したという事実にもかかわらず、M118-REHは抗Xa 150 IU/kgで、UFHの標準用量（75 U/kg）に対して統計学的に優れた抗血栓有効性を示した。このように、大腿動脈における完全な血栓誘発閉鎖の発生率は、M118-REH処置動物においてUFH処置動物より統計学的に低かった（それぞれ1/6[16.7％] 対 5/6[83.3％]；P＜0.05）。
【０３６４】
M118-REH処置群において観察された抗血栓効果は、合併症の証拠なく達成された。自然発生出血の例は報告されず、CBTにおけるごくわずかな増加が全てのM118-REH濃度および実験時点において観察された。さらに、予測されない死亡または心血管パラメータおよび臨床化学における臨床的に意味のある変化も認められなかった。
【０３６５】
本試験における凝固データの二つの特徴は注目に値した。第一にM118-REHはポイントオブケアACTアッセイによって用量依存的に測定可能であった。そのACT反応はUFHと比較して抗Xa因子活性に良好に相関した。この特色は、介入および外科の状況においてLMWHの投与を単純にする可能性がある。第二に、M118-REHはインビトロで抗Xa因子活性のみならず、有意な抗IIa因子活性を示し、これはM118-REHを現在入手可能なLMWHの選択肢とさらに区別する特徴である（J. Hirsh et al. "Heparin and low-molecular-weight heparin: mechanisms of action, pharmacokinetics, dosing, monitoring, efficacy, and safety," Chest. 2001;119:64S-94S）。たとえばエノキサパリンは、抗Xa因子活性 対 抗IIa因子活性の比17.2を特徴とし、比較するとUFHに関する類似の比は3.3である（U. Cornelli and J. Fareed. "Human pharmacokinetics of low molecular weight heparins," Semin Thromb Hemost. 1999; 25 Suppl 3:57-61）。本試験において、M118-REHはおよそ2〜2.5である抗Xa因子 対 抗IIa因子活性比を有し（図15）、他のLMWHに対して増強された抗IIa因子活性を証明した。比は一般的に、大きく多分散性のUFH分子の公知の多様な代謝によって予測されるように、UFHより経時的に一貫していた。
【０３６６】
（表１８）血栓および選択された血液学エンドポイントの要約表
2009538386.tif 000042
TTO＝閉塞までの時間；ACT＝活性化凝固時間；RFA＝右大腿動脈。
UFH＝未分画ヘパリン；Grp＝群。
a TTO＞180分は180分とした。
b 試験物質注入開始後60分で記録された値。
c 対照に対してP＜0.05。
d UFHに対してP＜0.05。
e 対照に対してP＜0.01。
【０３６７】
インビボ中和
Sprague-Dawleyラットおよびニュージーランドウサギを用いてインビボ試験を行った。M118-REH、エノキサパリン、または二つの未分画ヘパリン（UFH）をt＝0で異なる用量で静脈内投与した。これらの処置のそれぞれの薬理効果の中和を、t 0の5分後に硫酸プロタミンを0.5および1 mg 対 抗Xa 100 IU（またはUFHの場合には100 USP単位または1 mg）の比率で尾静脈に注射することによって評価した。血液試料を得て、ベースライン（プロタミン注射の直前）、硫酸プロタミンの投与後5、30、および60分に抗Xa因子および抗IIa因子活性に関して試験した。
【０３６８】
インビボでの硫酸プロタミンによるM118-REHの抗Xa活性の完全かつ迅速な中和が、硫酸プロタミンの静脈内送達後5分でラットにおいて0.5 mg：抗Xa 100 IUの比率で（＞98％）、および1 mg：抗Xa 100 IU（ラットでは99％を上回り、ウサギでは95％を上回る）で達成された。硫酸プロタミンの投与後1時間以内に抗Xa活性の「リバウンド」は観察されなかった。
【０３６９】
抗Xa活性の中和は、0.5 mgおよび1 mg 対 抗Xa 100 IU（または100 USP単位または1 mg UFH）の比率でM118-REHとUFHの間で同等であった。40％および20％より大きい抗Xa活性が、エノキサパリンを投与したラットにおいて0.5および1 mg：抗Xa因子活性 100 IUの比率での硫酸プロタミンの投与の5分後に残っていた。エノキサパリン1 mg：抗Xa活性 100 IUの硫酸プロタミンを投与したウサギではおよそ38％の抗Xa活性が残っていた。ヘパリンのそれぞれの投与後に90％より多くの抗IIa活性が0.5および1 mg 対 抗Xa 100 IUの比率で中和された。硫酸プロタミンによる抗IIa活性の逆転の程度は三つの処置、すなわちM118-REH、エノキサパリン、またはUFHにおいて同等であった。結果を図11に描写する。
【０３７０】
カニクイザルにおいて、硫酸プロタミン（PS）は、M118-REHの抗Xaおよび抗IIa活性の双方を類似の程度に用量依存的に逆転させた。M118-REHを意識のあるカニクイザルに静脈内投与して、場合によってその後にPSを投与した。血液試料を得て、抗Xaおよび抗IIa活性によって測定したM118-REH濃度ならびに凝固プロフィールに関して評価した。血液学、皮膚出血時間、および臨床毒性の徴候を24時間モニターした。
【０３７１】
M118-REH活性は、抗Xa 150 IU/kgの用量で静脈内投与の直後に検出可能であった。M118-REHに関する一次消失速度論は、0.50±0.04時間（抗Xa）および0.68±0.05時間（抗IIa）のt1/2で観察された。さらに、PSはM118-REHの抗Xaおよび抗IIa活性を用量依存的に急速に逆転させた。抗Xa（93.6±1.2％）および抗IIa（90.14±1.2％）活性は、調べた高いほうの用量である1.5 mg PS/抗Xa 100 IUの比率でPSによって急速に中和された。ACTおよびaPTT測定は抗Xa活性に密接に相関した（それぞれ、r2＝0.95および0.99）。M118-REHは、ACTを2〜3倍増加させ、PSの静脈内投与後5分以内にベースライン値に戻った。臨床毒性または有害な出血の徴候を認められなかった。
【０３７２】
M118-REHの投与は、PSの注射によって急速に逆転可能である一貫した急速な抗凝固作用を引き起こす。M118-REHの抗凝固は、ACTおよびaPTTによって容易に測定およびモニターされる。M118-REHの可逆性およびモニター可能性は、他の市販のLMWHと比較して独特である。
【０３７３】
NHPモデルにおけるM118-REHの中和試験の結果を以下の表19〜21に表す。
【０３７４】
（表１９）NHPモデルにおけるM118-REHの中和試験の中和−ほとんどのaPTTおよびACTは投与後正常に戻った
2009538386.tif 000043
NS：UFHと比較して有意差なし。
* いくつかの試料においてaPTT＞212秒。
† UFHの投与後にベースラインより1/2低い。
^ 150 IU/kgで静脈内投与したM118-REH。
^^ 75 IU/kgで投与したM118-REH、75 IU/kgで投与したUFH。
【０３７５】
（表２０）NHPモデルにおけるM118-REHの中和試験−有意な抗Xa/IIa活性が維持された
2009538386.tif 000044
【０３７６】
（表２１）NHPモデルにおけるM118-REHの中和試験−プロタミン後の異なるパラメータの低減（％）
2009538386.tif 000045
† 等式（M118-REH後−プロタミン後）* 100/M118-REH後
* アッセイは不安定
【０３７７】
前臨床モデルにおけるインビボベッドサイドモニタリング試験
M118-REH、エノキサパリン、および未分画ヘパリンをラットまたはウサギにおいて異なる用量で静脈内投与した。血液試料をACT測定および抗Xa試験のために得た。Hemachron JuniorおよびACT plusキュベットをACT測定のために用い、抗XaはCoag-A-Mate MTX IIによって測定した。抗XaとACTとの間の相関をこれらの三つのヘパリンにおいて比較した。ニュージーランドホワイトウサギにおいて、1 mg/kg M118-REHおよびUFHを耳の辺縁静脈から注射した。血液試料をヘパリン送達後5'、15'、30'、1、2、3、4時間後に採取した。Sprague-Dawleyラットにおいて、M118-REHおよびUFHを0.5および1 mg/kgで投与したが、エノキサパリンは1 mg/kgおよび2 mg/kgで投与した。これらの用量は、ラットおよびウサギの双方において有意な抗XaおよびACT上昇を達成した。M118-REHに関して、抗Xa対ACTの相関係数（r2）はウサギにおいて0.79およびラットにおいて0.85であった。UFHに関する抗XaとACTとの相関係数（r2）は、ウサギにおいて0.31およびラットにおいて0.79だったが、エノキサパリンに関しては、ラットにおける0.66のみであった。結果を図12に示す。
【０３７８】
NHPモデルにおいて、静脈内注射後、M118-REHは、抗Xaおよび抗IIa測定によってそれぞれ、0.50±0.04または0.68±0.05時間としての半減期を有する一次消失を示した。分布容積（Vd）は、それぞれ32.01±2.21（抗Xa）または48.58±0.95 mL/kg（抗IIa）である。クリアランス（Cl）は37.24±4.65（抗Xa）および43.92±5.38（抗IIa）mL/hr/kgである。ACTおよびaPTTの結果は抗Xa活性に密接に相関した（相関比はそれぞれ、r＝0.95および0.99）。
【０３７９】
インビボ血液漏出試験
低分子量ヘパリンは、異なる化学または酵素プロセスによる未分画ヘパリンの脱重合によって生成される。出血時間の測定は、出血のリスクの指標として、新しい抗血栓剤の開発においてしばしば用いられている。この試験のこの目的は、M118-REHの標準的な出血時間測定によって出血のリスクを調べ、そのリスクを、エノキサパリンおよび未分画ヘパリンのような比較可能な処置によって提起されるリスクと比較することであった。
【０３８０】
M118-REH、エノキサパリン、および未分画ヘパリンをウサギの辺縁耳静脈により0.5 mg/kgの1回ボーラス用量で静脈内投与した。出血時間（BT）測定は、ベースラインおよび試験物質の投与後5、15、30、60、120、および180分後に行った。M118-REHは投与後60分と比較して、5分でBTを3〜4倍増加させた（p＜0.05）。BTにおける類似の反応は、エノキサパリンおよびUFHによる処置によって認められた。出血時間は120分までに正常範囲に回復し、残りの時点でほぼベースライン値を維持した。他の有害な臨床知見は、調べた用量でいかなる処置群においても観察されなかった。
【０３８１】
表22において示されるように、NHPモデルにおいて、M118-REHは、静脈内注射後の皮膚出血時間（CBT）の延長を引き起こしたが、ベースラインと統計学的に有意差を示さなかった（p＜0.05）。
【０３８２】
（表２２）NHPモデルにおける抗Xa 150 IU/kgでの静脈内注射後のM118-REHのCBT
2009538386.tif 000046
【０３８３】
ビーグルにおいて、UFHはボーラス注射および持続的注入後にM118-REHより長いCBTを生じた。
【０３８４】
インビボ凝固システム：
血小板の相互作用
NHPモデルにおいて、M118-REHのボーラス静脈内投与後にADPによって誘発された血小板凝集に対する影響に関して知見を認めなかった。
【０３８５】
繊維素溶解経路の介入
NHPモデルにおいて、以下の表18に示すように、M118-REHの静脈内ボーラス注射後のフィブリノーゲンレベルは一貫しており、ベースラインからの統計学的有意差は認められなかった。
【０３８６】
（表２３）NHPモデルにおける抗Xa 150 IU/kgでのM118-REHの静脈内注射後のフィブリノーゲンおよびプロトロンビン時間（PT）
2009538386.tif 000047
【０３８７】
多数回増加用量試験
ラットにおける反復投与IV試験において、M118に対する曝露の増加は、試験日0および13日目で用量の増加と比例するように思われた。雄性のラットにおいて、M118に対する曝露は、全体的な抗Xa活性に関して0日目から13日目まで増加したが、全体的な抗IIa活性に関しては類似のままであった。雌性ラットにおいて、M118に対する曝露は0日目から13日目まで減少した。雌性ラットは0日目では雄性ラットよりM118に対して高い曝露を有するように思われたが13日目ではM118に対する曝露は両性間で類似であった。イヌにおける反復投与IV試験において、M118に対する全身曝露は、用量が5〜50 mg/kg/日の範囲にわたって増加すると増加した。しかし、M118に対する曝露は、一般的にM118の増加に比例して増加しなかった。14日間で蓄積の証拠を認めなかった。イヌ血漿における抗Xaおよび抗IIa活性の半減期は1.0〜3.2時間の範囲であり、用量または性別に関連して特定の傾向を認めなかった。半減期は13日目では0日目より短い傾向があった。抗Xaおよび抗IIa活性の見かけの全身クリアランスまたは見かけの分布容積に関して、M118の用量に関連する一貫した傾向は認められなかった。
【図面の簡単な説明】
【０３８８】
図面を簡単に説明する。
【０３８９】
【図１】M118-REHの製造プロセスの四つの段階を描写するフローチャートである。
【図２】図2Aは、へパリナーゼI、へパリナーゼII、およびへパリナーゼIIIによって消化したエノキサパリンのキャピラリー電気泳動プロフィールを描写するグラフである。図2Bは、へパリナーゼI、へパリナーゼII、およびへパリナーゼIIIによって消化したM118-REHのキャピラリー電気泳動プロフィールを描写するグラフである。
【図３】イオン対RP HPLCによって分析したM118-REHの消化物に関するポスト-カラム標識によって生成されたUVおよび蛍光プロフィールの比較を描写するグラフである。上の軌跡はUV232 nmでの検出を反映し、下の軌跡は410 nmでの蛍光検出を反映する。矢印で表示した種は、主に蛍光プロフィールで現れ、UVプロフィールでは観察されない；それらは出発UFHから生じるM118-REH鎖の非還元末端糖を表す。
【図４】M118-REHの二次元NMR HSQC分析を描写するグラフである。
【図５】還元および非還元末端の形成を描写するダイアグラムである。
【図６】M118-REH注射剤の製造プロセスのフローダイアグラムである。
【図７】硫酸プロタミンによるLMWHのインビトロ中和を描写するグラフである。「M118」（この図においてM118-REHの略語）は、より明るい点によって表される；エノキサパリンナトリウムはより暗い点によって表される。残留抗Xa活性の百分率をプロタミン 対 LMWH活性比に対してグラフをプロットした。
【図８】0.01 mg/mLの異なるヘパリンによるヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）からのTFPI放出を描写するグラフである（ウェルn＝3、平均±STDEM）。24および48時間インキュベーション後でのM118（この図におけるM118-REHの略語）（各群において左からの二番目の棒グラフ）と対照群（各群において一番左の棒グラフ）および対照群（p＜0.01）の間に統計学的有意差が存在する。
【図９】NHPモデルにおいて静脈内注射後のACTおよびaPTTを測定することによるM118-REHの薬力学を描写するグラフである。
【図１０】塩化第二鉄誘発血栓モデルにおいて、静脈内注射されたM118-REHの0.5（三番目の欄）および1 mg/kg（6番目の欄）のTTOと、エノキサパリンナトリウム2、3、および4 mg/kg（それぞれ、2、4、および5番目）との比較を描写するグラフである。処置群は全て、対照（1番目の欄）と比較して有意により長いTTOを有する。M118-REH（1 mg/kg）とエノキサパリンナトリウム3 mg/kgの間に統計学的有意差が存在する（p＜0.01）。
【図１１】Sprague-Dawleyラットモデル（M118-REH、エノキサパリンナトリウム、およびUFH）における硫酸プロタミンによるヘパリンの抗Xa活性の中和を描写するグラフである。グラフを、プロタミン 対 ヘパリン比、0.5または1 mg：抗Xa 100 IUの比での、時間に対する残留抗Xa活性（％）についてプロットした（またはUFHの場合には0.5または1 mg：1 mg）。
【図１２】M118-REH（▲および実線）、エノキサパリン（●および破線）、およびUFH（■および破線）のACT測定と抗Xa活性との相関を表すグラフである。このデータは、明記された用量でのM118-REHが、エノキサパリンまたはUFHと比較した場合にACTと抗Xa活性との最もよい相関を証明することを示唆する（r2＝0.85）。
【図１３】イヌ深部動脈血栓症モデル（Lucchesi'sモデル）における、時間に対する抗Xa因子活性（上部）および抗IIa因子活性（下部）。グラフに示される媒体対照群に、次にM118-REHを150 IU/kgで投与した。エラーバーは±SEである。UFH、未分画ヘパリン。
【図１４】イヌ深部動脈血栓症モデル（Lucchesi'sモデル）における抗Xa因子および抗IIa因子活性の相関。個々の点は、動物1匹からのデータを表す。全ての処置群における動物を全て示す。相関係数（r2）はM118-REHおよび未分画ヘパリン（UFH）群においてそれぞれ、0.890および0.465であった。
【図１５】イヌ深部動脈血栓症モデルにおける経時的な抗Xa因子：抗IIa因子比。エラーバーは+ SE（明確さを最大限にするために上半分のみを示す）である。UFH、未分画ヘパリン。
【図１６】イヌ深部動脈血栓症モデルにおいてACT（上部）、aPTT（中央）、およびPT（下部）アッセイによって査定した凝固活性対時間。グラフに示される媒体対照群にその後M118-REHを150 IU/kgで投与した。エラーバーは±SEである。UFH、未分画ヘパリン。
【図１７】イヌ深部動脈血栓症モデルにおいて閉塞した大腿動脈を有する動物の百分率。動物を電流開始後180分までドップラーフローによってモニターした。閉塞は、ベースラインフローの≦2％である損傷動脈を通しての血流として定義した。UFH、未分画ヘパリン。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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