(57)【要約】  本発明は、アトピー性皮膚炎に罹患した患者を治療するための医薬または食品サプリメントの生増のための、ラクトースを、特にラクトースベースの培地を組み合わせた生きたラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus) 細菌の使用であって、前記細菌は、ラクトースを発酵することができる使用に関する。本発明の好ましい態様において、使用される細菌は、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）Lcr35株に由来し、小児アトピー性皮膚炎の治療のために、例えばラクトースおよびその培養培地での細菌の発酵によって生じる随意の代謝産物であるプレバイオティックと組み合わせたプロバイオティックとして使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アトピー性皮膚炎である患者を治療するための薬物または食品サプリメントの製造のための、生きた形態のラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）細菌とラクトースとを含む製品の使用であって、前記細菌は、ラクトースを発酵させることができる使用。
【請求項２】
前記ラクトースがラクトースベースの培地の形態である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記細菌がラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）Lcr35である、請求項1または請求項2に記載の使用。
【請求項４】
前記製品が凍結乾燥されている、請求項1、2または3のいずれか1項に記載の使用。
【請求項５】
前記ラクトースベースの培地がジャガイモデンプンを含む、請求項2または請求項3に記載の使用。
【請求項６】
前記細菌が前記培地で少なくとも24時間培養された、請求項2または請求項3に記載の使用。
【請求項７】
前記細菌が前記培地で少なくとも48時間培養された、請求項6に記載の使用。
【請求項８】
前記細菌が前記培地で約72時間培養された、請求項6に記載の使用。
【請求項９】
前記患者が15歳未満のヒトである、請求項1または請求項2に記載の使用。
【請求項１０】
前記患者が2歳以上のヒトである、請求項1、2または9に記載の使用。
【請求項１１】
前記患者がラクトース・アレルギーを有する、請求項請求項1、2、9および10のいずれか1項に記載の使用。
【請求項１２】
前記製品が凍結製品または乾燥製品の1mlあたりまたはグラムあたり1×108〜1×1010コロニー形成単位の範囲で培地中の細菌の濃度を含む、請求項6〜8のいずれか1項に記載の使用。
【請求項１３】
前記薬物または食品サプリメントが1グラムあたり1×108細胞以上の細菌を含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の使用。
【請求項１４】
前記薬物または食品サプリメントが1グラムあたり1×108〜1×1010の範囲の細胞を含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の使用。
【請求項１５】
前記治療期間が2週〜1年の範囲、好ましくは2週〜6月の範囲である、請求項1〜14のいずれか1項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、プロバイオティクス（probiotics）は、その宿主の健康に有益な生きている微生物である。この有益な効果は、腸内フローラの平衡における向上によって特に説明される(1)。最もよく知られているものは、乳酸菌（lactobacillae）およびビフィズス菌（bifidobacteria）であり、これらは腸内において増殖することによって、単純な競争により潜在的に病原性の細菌の数を減少させることができる。
【０００２】
プレバイオティクス（Prebiotics）は、生物体によって消化することができない物質、および／または大腸内に常在する非病原性微生物の増殖または活性を刺激することによって、それらを消費するヒトに有益な効果を与える物質である。
【０００３】
しかしながら、プロバイオティクスの限られた寿命と低い生存率は、依然として治療においてそれらを使用する大きな障害である。したがって、プロバイオティクスの効果における顕著な向上を得るために、適切なプレバイオティクスについての、ならびにプレバイオティクスおよびプロバイオティクス（シンバイオティクス(symbiotics)）の最適な組み合わせについての要望がある。このような組み合わせは、アトピー障害、特に、アトピー皮膚炎（AD）の治療についての利益を明らかに有する。
【０００４】
アトピー性皮膚炎の治療におけるプレバイオティクスまたはシンバイオティクスの使用に関するデータは現在のところ存在しない。
【０００５】
アトピー性皮膚炎は、西部の州の子供たちの10%〜25%の間で認められる皮膚病である(2, 3)。その展開は、思春期においてしばしば慢性的である。見苦しく、毎日のケアを必要とするそう痒性障害の慢性的な性質のために、中症および重症の場合には強い心理的効果をもたらしうる。基礎的な治療は、衛生−食事療法と関連した皮膚軟化剤の規則的な塗布において成り立っている。重篤な発症には、局所的形態におけるコルチコイドまたは免疫抑制薬の塗布を必要とする。しかしながら、再発は頻繁であり、その慢性的な性質は、患者およびその家族の生活の質を悪化させる場合がある。また、治療の延長された使用は副作用を引き起こす。
【０００６】
アトピー性皮膚炎の病因は、Th2型反応の優位性による、Th1/Th2比における不均衡を含む細胞免疫の調節不全にある。西部の州のアトピー性皮膚炎の有病率における一定の増加は、衛生の向上と関連づけられている。子どもたちは、生後数か月および数年間の間に病原菌にさらされる機会が減り、その結果、優先的なTh2反応が発達する(4-7)。この免疫の調節異常を修正することができる治療手段は今のところ市場には存在しない。
【０００７】
プロバイオティクスは、Th1型反応を促進する、抗アレルギー特性を有する消化管内において生きている微生物である(8,9)。しかしながら、すべてのプロバイオティクスには同じ免疫学的な特性があるとは限らない。マウス樹状細胞に関する最近の記事において、乳酸菌 ラクトバチルス・ラムノサス (Lactobacillus rhamnosus) は、IL-10の産生を増加することなく（Th2反応におけるその活性の役割について知られた）、著しくTh1反応を促進するサイトカイン(すなわち、インターロイキンIL-12、IL-6、腫瘍壊死因子αTNFα)の産生を誘導することを示した(10)。この株は、従って、アトピー性皮膚炎の治療において大きな興味の対象である。
【０００８】
ラクトバチルス・ラムノサス (L rhamnosus) GGは、アトピー性皮膚炎の予防において効果的であり（11, 12）、幼い子どもたちの治療においてある程度は有効であることが示されている(13-15)。これらの研究は、非常に幼い子供たちで行なわれ、治療の効果は腸内ミクロフローラの初期コロニー形成によるものである。しかしながら、プロバイオティクスの免疫調節効果はまた、子供および大人において観察され、これらの年齢層において効果的が認められた（16)。現在、ある1つの研究は、生後６ヶ月以上の子供において、ちょうど6週間にわたってプロバイオティクスの使用を評価した(17)。この研究はプロバイオティクスがアトピー性皮膚炎に持続する腸の炎症を軽減しうることを示しているが、アトピー性皮膚炎の治療におけるプロバイオティクスの使用の長期間にわたる効力は認められなかった。
【０００９】
従って、プロバイオティックの生存の良好な程度を保証し、かつアトピー性皮膚炎を治療することができる、プレバイオティックおよびプロバイオティックのシンバイオティックな組み合わせについての明確な要求が存在する。
【００１０】
本発明は、特に、２歳に超えた子供におけるアトピー性皮膚炎の予防および治療において、シンバイオティック（ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus) プロバイオティックおよびプレバイオティクス）の効果を示す。
【００１１】
特に、本発明は、アトピー性皮膚炎の治療においてラクトースに関連した(特に、ラクトースベースの培地に関連した)ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus) Lcr35株(プロバイオティック)の使用に関する。用語「アトピー性皮膚炎の治療」は、治療および／または予防的治療を意味する。本発明はまた、アトピー性皮膚炎の治療におけるラクトースの重要性を強調する。
【００１２】
ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)Lcr35株は、生物種ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)（Lactobacillus casei subsp rhamnosusとしても知られる)（後者は登録番号ATCC 7469でATCCに寄託されている）に由来する。特定の株ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)Lcr35は、例１において定義されたプロトコルを使用して得てもよい。
【００１３】
本発明は、アトピー性皮膚炎の治療においてラクトースに関連したラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)細菌を含む産物の使用に関する。好ましくは、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)細菌は、ラクトースベースの培地中に存在する。好ましくは、その使用は、アトピー性皮膚炎に悩まされている患者を治療するための、あるいはそのような悩みの予防のための、薬剤、食品サプリメントなどの生産のためにある。本発明の内容において、治療または予防には、アレルギーの危険性を減らし、かつ患者の健康を増進することが含まれる。
【００１４】
従って、発明の産物は、プロバイオティック(ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)細菌)およびプレバイオティック(ラクトース、より具体的にはラクトースベースの培地)の組み合わせである。このような産物は、シンバイオティックと名付けることができる。ラクトースは、実際にはそのプレバイオティックな効果について知られている；それは非形質転換された形態において腸内に至り、腸内フローラにおいて一定の細菌数のための食物を構成し、プレバイオティックとしてのその指摘を正当化している。
【００１５】
ラクトースは牛乳アレルギーに結び付けられるので、本発明によるプレバイオティックとしてのラクトースの使用は、特に独自のものである。
【００１６】
好ましくは、製品組成物中において使用された細菌は、ラクトースを発酵させることができる。
【００１７】
本発明は、プロバイオティックの生存率が、前記プロバイオティックがその増殖のために必要な要素と関連しているときに実質的に増加することを示す。従って、本発明の1つの産物には、ラクトースを発酵させることができるプロバイオティックと、プロバイオティックが生存するために必要であるラクトースとが含まれる。
【００１８】
特に好ましい本発明の態様において、前記細菌は、細菌ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)Lcr35である。ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)Lcr35は、ラクトースを発酵させる能力を有するが、例えば、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)GGにはその能力はない。
【００１９】
本発明において定義されたシンバイオティックには、明らかに少なくとも２以上の異なるプロバイオティクスが含まれうる。それは他の属の細菌を含むラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus) 細菌であってもよいし、あるいは、異なる生物種のLactobacillus属からの少なくとも１以上の細菌であってもよい。
【００２０】
好ましくは記載されたシンバイオティックな産物には、生きている細菌が含まれる。用語「生きている」は、細胞保全が保存され、細胞プロセスが生じるか、細菌が適切な条件下で培地中において培養される。全ての生細菌は、適切な培養培地上および適切な条件下で複数回にわたって再び播種されてもよい。
【００２１】
従って、本発明は、凍結乾燥または凍結形態においてラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)Lcr35の使用を含む。
【００２２】
本発明の産物は、シンバイオティックになると考えられる。細菌はプロバイオティックであり、一方、特にラクトースベースの培地がプレバイオティックである。
【００２３】
用語「薬剤または食品製剤または食品サプリメントなど」は、当業者に周知である、任意の薬学的に許容可能な形態、特に、赤ん坊のための製剤の形態、幼い子供を対象とした製品、食事療法および食事製品、経口食事療法サプリメント、衛生製品、特定の医療目的（または特別な目的）のための食物または食事療法物質、医療装置、または任意の他の適切な形態を意味する。製品は、好ましくは経口投与に適用された生薬形態、例えば飲料可能な懸濁液またはゲル様物質(gelule)の形態が好ましい。また、食品または飲料に加えるために、あるいは吸引のために粉末または顆粒の形態とすることができる。
【００２４】
また、用語「アトピー性皮膚炎」は、アトピー性皮膚炎またはアトピー性湿疹であると診断された全ての障害、およびその症状が本質的に同一であり、同一の治療を受けるアトピー性障害を意味する。
【００２５】
記載された製品を受ける治療される患者は、好ましくはヒトであり、より好ましくは子供である。用語「子供」は、18歳未満、好ましくは15歳未満または12歳未満の全てのヒトを意味する。患者は、好ましくは1歳以上の子供であり、より具体的には、2歳以上の子供である。
【００２６】
代わりに、患者はヒト以外の哺乳類(例えば、サル、イヌ、ネコまたはウサギ)であってもよい。
【００２７】
本発明の使用に適した好ましい分類上の患者は、2〜12歳の間で子供によって構成される。
【００２８】
本発明に基づいた製品を受ける患者の他の集団は、ラクトース・アレルギー、特に、牛乳に対するアレルギーをもつ被験者によって構成される。好ましくは、考慮中のアレルギーは、良性または適度なラクトース・アレルギーである。
【００２９】
用語「アトピー性皮膚炎治療」は、アトピー性皮膚炎の症状を克服するかまたは軽減することを目指した全ての作用、およびそれらの外観を防ぐか、遅延されるか、遅くする傾向がある任意の予防作用を意味する。
【００３０】
治療持続時間は、アトピー性皮膚炎の進行の関数として定義することができ、好ましくは２週間以上である。３ヶ月以上、特に、少なくとも6か月または１年とすることができる。数年間、例えば2、5または8年間にわたる継続的な治療が、特に、予防的適用のケースにおいて適切である。
【００３１】
好ましくは、アトピー性皮膚炎の治療または予防において、本発明の製品は、１週間に少なくとも一度、好ましくは１日に少なくとも一度投与される。本発明の内容において、好ましい投薬は、1日当たり3回である。
【００３２】
本発明の製品は、任意の形態にすることができる。適切な形態は当業者に周知である。特に、これらはプロバイオティックが生きていることを保証しなければならない。もし、プロバイオティックが摂取後に生存できなければ、シンバイオティックの有利な効果は失われてしまう。大気、湿度および温度の３つの本質的な因子を考慮に入れることは非常に重要である。プロバイオティクスを保存する様々な方法が、当業者に周知である。
【００３３】
好ましくは、製品は、凍結乾燥された形態にある。この形態は、優れた保存を与えるだけでなく、また、本発明の製品の任意の生きている細菌形態の一部を保存することができる。本発明の凍結乾燥された製品を得るときにプロバイオティックの数を決定することは重要である。
【００３４】
産物中に含まれる細菌は、ただ凍結乾燥された要素であってもよい。しかし、好ましくは、細菌は、ラクトースベースの培地を含む産物で凍結乾燥される。当然ながら、製品には、細菌および培地、特にラクトースを含む培地に加えて、追加の成分が含まれてもよい。このような成分は、他の成分を凍結乾燥する前またはその後に加えられる（例えば、生産される生薬形態の製品が生産されることを可能にする賦形剤の場合)。
【００３５】
ラクトースベースの培地は、少なくとも5重量％のラクトース、好ましくは少なくとも20重量％を含む培地である。
【００３６】
前記培地は、好ましくはプロバイオティックを播種する前は無菌である。
【００３７】
好ましくは、前記培地は、このように他の物質を含む培養培地(発酵)である。培地は、好ましくはミルク（例えばスキムミルク）によって本質的に構成された培地である。
【００３８】
ラクトースベースの培地はまた、有利にジャガイモの澱粉質を含んでいる。また、それはマルトース デキストリンを含んでいてもよい。他の薬理学的に許容可能な化合物または賦形剤もまた、定義されたラクトースベースの培地の組成物の一部を形成してもよい。
【００３９】
本発明の好ましい実施態様において、ラクトースベースの培地は、本発明の製品において含まれたプロバイオティック細菌によるラクトースの発酵に適合した培養培地に相当する。従って、本発明の1つの好ましい実施態様において、細菌は、本発明に基づいた製品、すなわちシンバイオティック（プロバイオティックおよびプレバイオティックの組み合わせ）を形成するために任意的にその後に補充される培養培地上で培養される。このような状況は、本出願の実験の部における例において詳述する（例１を参照）。
【００４０】
特に有利には、ラクトースベースの培地は、プロバイオティック培養培地に由来する。従って、製品を生産するとき、プロバイオティック培地を変化させる意味はない。これは、多すぎる遠心分離工程を回避する；遠心分離の間、微生物の細胞壁は、生存が難しい損傷を受ける。プロバイオティック培地の変化を避け、かつ多数の遠心工程を減少させることによって、プロバイオティックは生き残りのより良い機会を確立する。好ましくは、使用されるプロバイオティックはMRS上で播種または培養されない。
【００４１】
プロバイオティックは、プロバイオティクス（細菌）に適合した培養培地に相当する。本発明の製品が経口摂取されるとき（および、特にそれが凍結乾燥形態にあり、摂取前に懸濁液中において取り込まれるとき）、細菌は直ちにその生存に適合した培地中に入れられる。従って、プロバイオティクスの生存率が増加する。
【００４２】
好ましくは、細菌は、特に、本発明の製品を形成するために任意的に補充されたラクトースベースの培養培地上で少なくとも４時間、少なくとも12時間、好ましくは24〜48時間、より好ましくは例えば約72時間にわたって培養される。
【００４３】
本発明は、シンバイオティックによって、すなわちプロバイオティック（ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）種由来の細菌）およびプレバイオティック（ラクトース、好ましくはラクトースベースの培地の形態）の組み合わせによって得られる効果に属する。得られる効果は、細菌をとりわけラクトースに基づいた培地で培養したときに、より有利である。これらの条件下において、培地には、前記培養により生じる代謝産物も含む。一定の前記代謝産物には、特に有利な抗微生物性を有する（31）。これらの化合物（プロバイオティクス、プレバイオティクスおよび代謝産物）の関連が、アトピー性皮膚炎に対する有益効果に寄与する。
【００４４】
本発明の製品において、製品のグラムあたり細菌数または細胞数は、好ましくは1×108〜1×1010の範囲である。
【００４５】
本発明のシンバイオティック製品の任意の凍結乾燥法の前には、一般に液体状態である。こうした状況では、アトピー性皮膚炎の治療に使用するために、製品には、好ましくは1mlあたり1×108 CFU（コロニー形成単位または細胞）の培地中濃度を含む。アトピー性皮膚炎の予防または治療に適用するためには、患者には、用量あたり約1×108〜1×1010 CFUのラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）で投与される。１日あたり数回の用量を、例えば3回の１日量の形態で投与してもよい。用量は、特に、治療される患者の体サイズおよび治療に対する任意の反応の関数として調整してもよい。
【００４６】
上記のパラグラフで述べたとおり、ラクトースを発酵させることができるラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）種（Lactobacillus casei subsp. rhamnosusと同じ）の特に好ましい細菌は、実施例1で定義したプロトコルを使用して得られるであろうLcr35株である。その他のプロトコルが当業者に公知である。
【００４７】
本発明の製品を得るためにプロバイオティックを選択するときには、病原性効果を有さず、かつ好ましくはその生存率に関しては優れた特性を有することが公知である細菌を研究することが必須である。考慮するもう一つのパラメーターは、技術的処理に対するその耐性である。また、問題のプロバイオティックが、大部分の従来の抗生物質に耐性であることも有利であろう。対照的に、プロバイオティックが、好ましくは大部分の公知の抗生物質に感受性である状況もあろう。
【００４８】
さらに、本発明に使用するための株は、腸管内菌叢にコロニーを作る能力も有さなければならない。
【００４９】
特定のラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）Lcr35株は、これが前述の種々の利点を享受するため、特に本発明の状況に好ましい。また、これは、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、エリスロマイシン、ナリジクス酸、ピペミド酸、フシジン酸、コリスチン、ポリミキシン、スルファメトキサゾールおよびトリメトプリムに耐性である。
【００５０】
前記株の発酵特性は、特に有利である。あるいは、本発明は、またアトピー性皮膚炎の治療または予防におけるラクトース単独の、またはプロバイオティックと組み合わせた使用に関する。
【実施例】
【００５１】
実施例1。凍結乾燥させたラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）Lcr35株の入手およびパッキング。
【００５２】
再活性化：
市販の細胞（Lyocentre LaboratoriesからのBacilor（登録商標））またはLyocentre Laboratories株ライブラリーから、100〜200mgの凍結乾燥された製品と共に、10mlの濃縮（グルコース15g/l（酵母抽出物5g/l））スキムミルク培地に接種することによって再活性化させた。このチューブを乾燥器に37℃にて72時間置いた。
【００５３】
第1のチューブからの1mlの培養液を10mlの無菌の濃縮ミルク培地を含む第2のチューブに投入し；チューブを37℃にて72時間の乾燥器に置いた。1mlあたり1×109細胞を越えるできる限り大きな集団を得るために、この操作を数回やり直した。
【００５４】
保存液の調製：
1mlのこの再活性化した株を180mlの滅菌された濃縮スキムミルクを含むフラスコに投入し、次いで37℃にて72時間培養して；この保存液を使用してフラスコに播種した。
【００５５】
培地：
Lactobacillus casei var. rhamnosus（ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）としても知られる）の凍結乾燥させた培養液を適切な力価で得るために、これを2つの異なる培養法を使用して：
・簡略培地で；
・栄養強化培地で、
同時に作製した。
【００５６】
a）培地の成分：
1. 簡略培地：
粉末状スキムミルク  100g
水、qsp  1.000 l。
【００５７】
2. 栄養強化培地：
粉末状スキムミルク  16.650 g
グルコース  4.450 g
硫酸マンガン  0.028 g
クエン酸ナトリウム  0.560 g
リン酸一カリウム  1.780 g
リン酸二カリウム  3.560 g
ビール酵母自己分解物  1.670 g
水、qsp  1.000 l。
【００５８】
b）培地の調製および滅菌：
1. 簡略培地：
配合成分：
粉末状スキムミルク  100g
水、qsp  1.000 l。
【００５９】
方法：
200リットルの水を容器内で測定し、28kgの粉末状スキムミルクを少しの画分で、穏やかに撹拌しながら添加する。完全に分散後、これを水で280 lに調整する。このミルクを容器に分配し、これを正確に封着し、次いでオートクレーブにおいて115℃にて30分間滅菌する。
【００６０】
2. 栄養強化培地：
2000リットルの容器のための配合成分
粉末状スキムミルク式  30.00 kg
グルコース  8.00 kg
硫酸マンガン  0.05 kg
クエン酸ナトリウム  1.00 kg
リン酸一カリウム  3.20 kg
リン酸二カリウム  6.40 kg
ビール酵母自己分解物  3.00 kg
水、qsp  1800.00 l。
【００６１】
方法：
容器内に1000 lの水を置き、次いでミルクを添加し、迅速に撹拌する；完全に分散後、グルコース、硫酸マンガン、クエン酸ナトリウム、リン酸一および二カリウムならびに最後にビール酵母自己分解物を添加する。完全に分散後、水で1800リットルに調整する。
【００６２】
最後に、さらに撹拌しながら、115℃にて30分間培地を滅菌して、37℃まで冷却する。
【００６３】
接種および培養
a）簡略培地：
垂直層流フード内において、容器あたり1〜2mlの保存液からのプレカルチャーを投入する。
【００６４】
次に、これらの容器を37℃プラスあるいはマイナス2℃にて細菌乾燥器に72時間置く。
【００６５】
b）栄養強化培地：
2.4リットルの保存液からのプレカルチャーをそれぞれ1800リットルの容器に投入する。穏やかに撹拌しながら適切なサーモスタット制御した装置を使用して37℃にて温度を48時間維持する。
【００６６】
凍結乾燥法のための培養液の調製：
a）簡略培地：
成分：
・Lactobacillus casei var. rhamnosusの培養液  136.8 l
・ジャガイモデンプン  35.0 kg
・ラクトース  15.0 kg
・水酸化カルシウムの懸濁液、pH = 7.0中和のためのqs
調製方法：
得られた培養を層流フード下で200リットルのタンク内に、凝乳を壊すために激しく撹拌しながら注ぎ、次いで激しく撹拌しながらジャガイモデンプンおよびラクトースを添加する。完全に分散したときにpHを測定すると、約3であるはずである。次に、混合物を、水酸化カルシウムを使用して7.0±0.1のpHに中和する。
【００６７】
b）栄養強化培地
成分：
・Lactobacillus casei var. rhamnosusの培養液  1800.0 l
・ジャガイモデンプン  6.6 kg
・ラクトース  3.3 kg
・マルトースデキストリン  6.0 kg
・水酸化カルシウムの懸濁液、pH = 7.0中和のためのqs
調製方法：
Lactobacillus casei var. rhamnosusの培養液を遠心機において連続して遠心分離し、完全に上清を除去する。ペレットを層流フード下で回収し、凍結乾燥された賦形剤と共に迅速に撹拌することで混合した。次に、混合物を、水酸化カルシウムを使用して7.0±0.1のpHに中和する。
【００６８】
凍結乾燥
凍結乾燥法のためのLactobacillus casei var. rhamnosusの培養液の標品をステンレス鋼板に無菌的に分配する。
【００６９】
これを-40℃に迅速に凍結させ、次いで-22℃にて昇華を行う。製品が0℃の閾値を通過したときに、これを+37℃まで乾燥器で加熱する。
【００７０】
使用される標品に応じて、乾燥した凍結乾燥産物の得られる量は、およそ以下の通りである：
Lactobacillus casei var. rhamnosusの凍結乾燥させた培養液
簡略培地        57kg
栄養強化培地    17kg。
【００７１】
粉砕、混合、パッケージング
a）粉砕
凍結乾燥させたLactobacillus casei var. rhamnosusの培養液を回収して、粉砕し、除湿された雰囲気の（50%未満のRHであり、かつ濾過した（99.999の濾過））部屋において60メッシュ格子で提供される発振型較正機を通して篩にかける；試料採取して乳酸菌（lactobacillae）を計数する。
【００７２】
製品は、密封して封止した容器内に貯蔵する。
【００７３】
生きているLactobacillus casei var. rhamnosusの力価測定後、製品をホモジナイズして所望の力価をもつ出発材料を得る。
【００７４】
b）混合
1グラムあたり1×109〜1×1010細胞の範囲の力価をもつ200〜225kgのLactobacillus casei var. rhamnosusの凍結乾燥させた培養液のバッチを得るために、以下の方法を使用してゆっくりとミキサー内で混合を行う：
・簡略培地におけるLactobacillus casei var. rhamnosusの凍結乾燥させた培養液のqs；
・栄養強化培地におけるLactobacillus casei var. rhamnosusの凍結乾燥させた培養液のqs、その結果、最終混合物の重量が、1グラムあたり1×109〜1×1010細胞の力価である200〜225kgの範囲の粉末となる。
【００７５】
c）パッケージング
混合後、試料を対照として採取する。残りの混合物は、必要に応じて適切な密封して封止した容器内にパックする。
【００７６】
次いで、粉末をガレノス形態に変化させる。
【００７７】
実施例2：Lcr35に基づいた製品のアトピー性皮膚炎に対する効果の研究
この研究の目的は、第１に、中症および重症の小児アトピー性皮膚炎の治療においてプレバイオティックに関連したLactobacillus casei var. rhamnosusの有効性を研究すること、並びに本療法の副作用および臨床許容性を評価することである。
【００７８】
研究のタイプ：
対象前向き二重盲検対偽薬研究。  
第2相研究。  
現在の知識。
【００７９】
1）アトピー性皮膚炎
アトピー性皮膚炎は、一般的皮膚病である（西欧諸国において10%〜25%との間と見積もられる有病率）（2、3）。その展開は、思春期においてしばしば慢性的である。見苦しく、毎日のケアを必要とするそう痒性障害の慢性的な性質のために、中症および重症の場合には強い心理的効果をもたらし得るし、親／子関係を変化させて、子供と家族の生活の質に影響を及ぼし得る。
【００８０】
基礎的な治療は、衛生−食事療法と関連した皮膚軟化剤の規則的な塗布において成り立っている。重篤な発症には、局所的形態におけるコルチコイドまたは免疫抑制薬の塗布を必要とする。
【００８１】
アトピー性皮膚炎の病因は、Th2型反応の優位性による、Th1/Th2比における不均衡を含む細胞免疫の調節不全にある。この免疫の調節異常を修正することができる治療手段は今のところ市場には存在しない。
【００８２】
2.プロバイオティクス
プロバイオティクスは、Th1型反応を促進する、抗アレルギー特性を有する消化管内において生きている微生物である(8,9)。これらは、子供および成人における下痢の対症療法にほぼ40年間使用されてきた。しかしながら、すべてのプロバイオティクスには同じ特性があるとは限らない。マウス樹状細胞における研究では、乳酸菌 ラクトバチルス・カゼイ (Lactobacillus casei) は、IL-10の産生を増加することなく（Th2反応における主要なインターロイキン）、低濃度でTh1反応を促進するサイトカイン(IL-12、IL-6、TNFα)の産生を誘導することが示された(10)。
【００８３】
プロバイオティクスは、アトピー性疾患の第一次予防に（11）、および乳児の治療の程度をより少なくすることに（13）有効なことがすでに示されている。これらの研究は、非常に幼い子供たちで行なわれ、治療の効果は腸内ミクロフローラの初期コロニー形成によるものである。しかしながら、プロバイオティクスの免疫調節効果はまた、大部分は子供および大人において観察され、これらの年齢層においても効果が認められた（16)。最後に、ほんの少数のまれな心内膜炎および敗血症の場合のみが、高度に免疫抑制性の被験体において記述されているだけであるので、このような治療は、特に安全であることがわかる。
【００８４】
L. caseiの供与源としてのLcr35株の使用は、多くの利点をもたらす：
・この株は、下痢の対症療法において（商品名Antibiophilus（登録商標）、次いでBacilor（登録商標）、01/12/1959、AMM29／03/1974の下で）1967年から販売されてきた。
【００８５】
・これは、優れた許容性を有する。望ましくない効果は、フランスまたは海外で観察されていない。
【００８６】
・これは、今回アトピー性徴候の治療および予防における有望なプロバイオティックであると思われるLactobacillus casei var. rhamnosus（ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）としても知られる）を含む。
【００８７】
材料および方法
1）包含基準
研究は、17月の期間にわたって行った。中症および重症の過敏性皮膚炎を示す2〜12年歳の子供の患者を、彼らの親から、更に理解する年齢の子供から書面による同意を得た後に、この研究に含めた。アトピー性皮膚炎の診断は、標準化された基準（18）を使用して行った。15を上回るSCORAD患者のみを研究に含めた。
【００８８】
2）非包含基準
3月前の間に公知の免疫抑制（先天性または後天性）をした患者および一般的な免疫抑制を誘導し得る治療（全身性コルチコイドまたは免疫抑制剤）を受けたか、または受けていた者は、研究に含めなかった。
【００８９】
3）二重盲検試験条件
子供は、2群にランダムに分けた。
【００９０】
第1群は、シンバイオティックを受け（Bacilor（登録商標）の形態でLactobacillus casei var. rhamnosusを含む；第2群は、プレバイオティクス（Lactobacillus casei var. rhamnosus）のみを受けた。ランダム化は、アトピー性皮膚炎の重症度に応じて（SCORAD＜または40）、および季節（冬、春、夏、秋）に応じて、研究が開始される前におこなった。
【００９１】
プロバイオティクス（+プレバイオティクス+代謝産物）を含む小包は、患者によっても、または医師によってもプレバイオティックのみを含む小包と区別できなかった。
【００９２】
4）投与手順
Lactobacillus casei var. rhamnosusを含むシンバイオティックは、1.5gのBacilor（登録商標）（ Lyocentre Laboratories, Aurillac, Franceによって製造）の小包の形態で経口投与した。それぞれ1.5g用量を空気から封鎖したアルミニウム小包に貯蔵した。シンバイオティックの用量には、約1.2×109コロニー形成単位（または細胞）のラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）Lcr35 + 細菌によって分泌されたプレバイオティックの特定の標品および代謝産物を含んだ。
【００９３】
プレバイオティック標品は、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）Lcr35発酵培地に由来し、粉末状スキムミルク（平均して0.344g-ウシタンパク質33%、ラクトース52%）、ジャガイモデンプン（平均して0.759g）およびラクトース（平均して0.397g）を含む。
【００９４】
シンバイオティックおよびプレバイオティックの標品の用量は、飲むことができる懸濁液のための粉末の形態で、3月の間毎日3回与えた。患者には、水における、またはそ任意の他の好ましい冷液に標品を溶解するように求めた。患者の誰もが、研究の期間の間に彼らの食餌療法を変更しなかった。
【００９５】
研究期間の間、アトピー性皮膚炎のための患者の通常の治療は変更しないままとし；全ての患者に緩和剤を適用し、ほとんど全てにおいて、皮膚コルチコイドまたは局部的免疫抑制薬を使用した。規則的または時々であるかにかかわらず、局所治療、並びに他剤摂取の全てを記述した。局部的皮膚コルチコイドおよび免疫抑制薬の消費は、それぞれの来診時に使用したチューブの数を見積もることによって定量的に評価した。
【００９６】
5）治療効果を評価するための基準
患者もしく親または調査する皮膚科医のいずれも患者に治療が施されることを知らなかった。
【００９７】
臨床評価は、治療の導入の1月（M1）、2月（M2）および3月（M3）前に行った。それぞれの患者をそれぞれの来診時に同じ皮膚科医によって調べた。総体症状の発生および治療効果は、全体的な重力スコア：アトピー性皮膚炎のための欧州タスクフォースによって開発されたSCORAD（SCORing Atopic Dermatitis）（19）によって定量化した。この厳密な臨床スコアは、アトピー性皮膚炎治療を評価する際の基準を構成する。
【００９８】
SCORADスコアは、臨床評価の強度および症候の程度を、視覚的スケールで患者、親または両方によって示されるそう痒および不眠症に連関した主観的スコアと組み合わせる。目的SCORADは、0〜83の範囲である。そう痒および不眠症に付加するときは、スコアは、0〜103の間であってもよい。
【００９９】
最初の来診時に、患者は、中程度群（16〜39の間のSCORAD）または重篤群（SCORAD 40を超える）に分類された。それぞれの来診時に、目的SCORADおよび総SCORADを算出した。また、IGA（以下のカテゴリーを含む6レベルのスケールの研究者の総合評価：0、何もない；1、ほとんど何もない；2、軽度；3、中程度；4、重篤；5、非常に重篤）をそれぞれの来診時に評価した。また、前月の間の発赤の数および局部的皮膚コルチコイドまたは免疫抑制薬の使用、並びに可能性のある副作用を記述した。最後の来診の間に、治療効果（悪化、不変、改善）および許容性に対する患者および／または親の意見を記述した。
【０１００】
最後に、治療を止めた後に彼らが疾患の再発を観察したかどうかを決定するために、研究の終わりの6〜12月後に親に連絡をとった。
【０１０１】
6）副作用のモニタリング
モニタリングは、専ら臨床的に、かつ毎月とした。
【０１０２】
7）統計分析
16の標準偏差、5%の第１種過誤（α）、80%の能力（power）および20%の臨床試験の間に除外される患者の最大割合で2群の間のSCORADの15ポイントの相違を証明するために必要な患者数は、従って、群あたり22人のであった。
【０１０３】
性別、その他のアトピー性疾患に、および2群の間の局所治療の使用に連鎖した潜在的な相違は、χ2試験（または場合に応じてFisher完全試験（Fisher's exact test）を使用して解析した。年齢についてのベースライン（任意の介入前の開始レベル）、月あたりの発赤の数、局所治療の使用、SCORAD（総）および目的SCORADをt検定（または母数によらないデータについては、クラスカルワリス検定）を使用して2群間で比較した。
【０１０４】
研究期間の終わりに、それぞれの処理群のベースラインを指すSCORADおよび目的SCORADの変化を対応スチューデントt検定を使用して解析した：M3での2群の間の目的SCORADおよびSCORADは、独立した試料についてt検定を使用して比較した。また、この解析は、その他のアトピー性徴候を示す患者の下位群でも行った。研究（一次結果およびM3に利用可能なSCORAD）を終える者のみを、これらの解析に含めた。
【０１０５】
しかしながら、解析は、M3にて利用可能なデータに基づいて、それぞれの処理群における平均SCORADによりM3にて失うSCORADを置き換えた後に、研究集団の全体にわたって繰り返した。
【０１０６】
また、M3にてベースラインに関して50%以上または90%以上のSCORAD減少を得たそれぞれの群の患者についての結果を、完全フィッシャー検定を使用して解析した。IGAスコアは、ウィルコクソンおよびマン-ホイットニー検定法を使用して同様の方法で解析した。
【０１０７】
最後に、発赤の総数および研究期間の間に使用した局所治療の量は、研究前の月について、および研究の最後の月について、2群の間を比較した（対試料についてのクラスカルワリスの検定およびフリードマン検定）。
【０１０８】
統計分析は、Windows（登録商標）ソフトウェアのためのSPPSを使用することにより行った。
【０１０９】
結果：
密度調査：
研究に含まれる48人の患者の中で、9人（シンバイオティック群、n=7；プレバイオティック群、n=2；P=0.13）を研究から除外した。これらの除外の理由は、予定された診察に対して患者が現れなかったこと（シンバイオティック群、n=5；プレバイオティック群、n=2）またはインフォームドコンセントの撤回（シンバイオティック群、n=2）である。39人の患者（平均年齢5.82歳、平均SCORAD = 39.7）は、この研究を完了した。研究集団の特徴を表1に示してある。年齢、その他のアトピー性徴候の存在、毎月の発赤の数、局部的皮膚コルチコイドまたは免疫抑制薬の使用、並びに目的SCORADおよび総SCORADに基付づいた2群の間の統計的相違は観察されなかった。目的SCORADのための基礎レベルは、29.1（プレバイオティック群= 29.4に対し、シンバイオティック群= 28.7）であり、平均SCORAD基準は、39.2（プレバイオティック群= 39.3と対し、シンバイオティック群= 39.1）であった。
【０１１０】
臨床効果
2群における目的および総SCORADの進展をそれぞれ表2および3に示してある。シンバイオティック群では、平均SCORADは、3月の治療後の20.7に対して、処理前の39.1（n=24）であった（17人の完了した観察に基づいて、n=17；P<0.0001）。プレバイオティック群では、平均SCORADは、3月後の24.0に対して、処理前3の9.3（n=24）であった（n=22；P<0.0001）。
【０１１１】
2つの処理群間の相違は、3月の治療後に、目的SCORADの観点から、およびSCORADの観点の両方から明らかであるが、統計学的にわずかであった（それぞれP = 0.418およびP=0.535）。これらの結果は、M3にてSCORADおよび目的SCORADについての欠側値を置き換えることによって行われた解析で得られたものと適合する。
【０１１２】
治療に対する反応は、1歳以上の子供で行われた第1の研究（17）での非アレルギー患者と比較して、アレルギーの患者においてより顕著であり、また、本発明者らは、その他のアトピー性徴候の存在またはその他を考慮することによって結果を解析した。25人の患者は、その他のアトピー性徴候を示した（プレバイオティック群における13人およびシンバイオティック群における12人）。基本レベル（ベースライン）にて、SCORADは、シンバイオティック群における49.6±16.8（P=0.181）に対して、プレバイオティック群における41.7±11.4であった。2群では、治療の3月後に、彼らのSCORADスコアの実質的減少を示したが：しかし、2群間で観察された相違は、統計学的に有意ではなかった。
【０１１３】
IGAスコアの変化は、SCORADスコアのものと同様であった。シンバイオティクスを受けている群では、平均IGAスコアが治療の3月後の2.41（CI：1.75-3.07）（17人の完了した観察に基づいて、n=17；P=0.002）に対して、処理前の3.33（信頼区間：2.97-3.70）（n=24）であった。プレバイオティクスを受けている群では、平均IGAスコアが治療の3月後の2.73（CI：2.31-3.14）、（n=22；P=0.006）に対して、処理前の3.42（信頼区間3.20-3.63）（n=24）であった。
【０１１４】
局所的薬物の使用
患者によって使用される局所治療は、3群に分類された：皮膚コルチコイド（n=34）；活性成分としてカルシニューリン阻害剤を有する軟膏（n=11）および緩和剤（n=3）。タクロリムス0.03%軟膏は、カルシニューリン阻害剤群で使用された唯一の製品であった。2群（プレバイオティクスおよびシンバイオティクス）のそれぞれにおいて研究の全期間の間の軟膏のチューブの消費を比較することによっては、統計的相違が観察されなかった（P=0.966）。同様の結果は、研究（P=0.919）の最後の月の間の使用を比較することによっても得られた。2群のにおいて、研究の前月の間の皮膚コルチコイドまたは活性成分としてカルシニューリン阻害剤を含むポマード（タクロリムス）の使用は、M3月の間よりも高かった（プレバイオティック、P=0.005；シンバイオティック、P=0.07）。
【０１１５】
治療に対する許容性
治療は、2群において十分に許容された。重大な副作用は、観察されなかった；3件−シンバイオティックを受けている群における2件およびプレバイオティックを受けている群における1件の軽度の腹痛事例のみが報告された。
【表１】
2009506016.tif 000002
示した値は、特に明記しない限りn（%）である。  
SCORAD =アトピー性皮膚炎スコアリング；IQR =四分位数間領域。
【表２】
2009506016.tif 000003
SCORAD =アトピー性皮膚炎スコアリング；IQR =四分位数間領域；CI =信頼区間。
【表３】
2009506016.tif 000004
SCORAD =アトピー性皮膚炎スコアリング；IQR =四分位数間領域；CI =信頼区間。
【０１１６】
追跡調査：
治療の間にアトピー性皮膚炎の改善が観察された子供の全てが、2つとは別に、治療（シンバイオティクスによるか、またはプレバイオティクスによるかのいずれも）終了の少なくとも2〜4月後に疾患の再発またはにおける皮膚の状態の悪化を受けた。
【０１１７】
考察：
研究終了後のアトピー性皮膚炎の改善は、患者の両群（プレバイオティックを受けている群およびシンバイオティックを受けている群）において満足な高レベルで観察された。シンバイオティックを受けている患者群の改善は、プレバイオティックを受けている患者群よりも統計学的にわずかに優れているだけであった。
【０１１８】
それぞれのプロバイオティック細菌株は、消化管において増殖および生存する特性および能力を有する。本研究に使用したラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）Lcr35株は、多数の有利な特性を有する。それは、16S-23S配列と比べると、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）GGと96%の相同性を有する。ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）Lcr35株についてのこの特徴配列を図1に示してある。
【０１１９】
さらに、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）Lcr35株は、ラクトースを発酵させる能力を有し、一方のラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）GG株は、有さない。最後に、以前の研究では、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）Lcr35のその経口投与後の腸粘膜の長期コロニー形成を実行する能力が証明された（20）。
【０１２０】
適切なプレバイオティクスとの組み合わせにより、摂取後のプロバイオティック株の生存率を改善することができるので（21）、アトピー性皮膚炎の治療におけるシンバイオティクスの有効性の評価は、重要である。
【０１２１】
したがって、本発明者らは、プレバイオティクス-プロバイオティクスの組み合わせが、プロバイオティクス単独と比較して、アトピー性皮膚炎の治療においてより優れた結果を生じることができると仮定した。最近の結果は、ラクトースおよびジャガイモデンプンがプレバイオティクスであると考えられるであろうことを示す（22、23）。しかし、具体的なプレバイオティック標品（上記のようなもの）の使用は、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）Lcr35株のインビトロでの増殖および生存を増強するその能力に依存する。
【０１２２】
面白いことに、使用されるプレバイオティック標品は、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）Lcr35（育種地）のための発酵培地であるので、シンバイオティック治療は、そのプロバイオティックによって分泌されるプレバイオティクス、プロバイオティック、更には代謝産物を含む培地で構成される。これらの代謝産物は、ユーバイオティクス（eubiotics）と定義され得る。組み合わせ（プロバイオティック、プレバイオティック、ユーバイオティク）は、Lyocentre Laboratoriesによって販売されるBacilor（登録商標）中に存在する。下痢の対症療法におけるその有効性が認識されており、この製品は、その適応症について販売されている。
【０１２３】
研究期間は、治療の効果を決定するために十分な期間からの利益を得るが、疾患の強度の自発的な変化による干渉の確率を制限するために、3月に固定した。
【０１２４】
シンバイオティクス[プレバイオティクス+ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）Lcr35株（1.2×109コロニー形成単位、毎日3回）］による2歳以上歳の子供におけるアトピー性皮膚炎の治療は、単にプレバイオティクスで構成される治療よりも有効であったが、相違は、わずかのみであった。これは、研究の間のSCORADの変化だけでなく、治療の有効性に関する患者による主観的な評価の両方によって証明される。病変の重症度および有意差は、一定のままであるが、シンバイオティクスでの治療は、発赤の数および局所的薬物の使用を減少させたように見える。しかし、これらの2つのパラメーターについての統計的相違は、わずかなままであった。
【０１２５】
実際に、平均SCORADにおけるより大きな減少は、シンバイオティック群（15.6と対比しての20.5）において観察されたが、この相違は、統計学的に、有意差限度の範囲内であった。
【０１２６】
現在では、研究により、アトピー性皮膚炎の治療における、またはその他の任意のアトピー性疾患におけるシンバイオティクスおよびプレバイオティクスの有効性が評価されていない。しかし、プレバイオティクスおよびプロバイオティクス（対偽薬）が潜在的に中毒性発酵製品の生成および蓄積を有意に減少させることができることが、健康な患者において最近証明された（24）。
【０１２７】
したがって、プレバイオティクスは、それ自体腸管内菌叢に対して重要な影響を及ぼし得るし、また免疫変化を誘導し得る。補足的研究が必要であるが、準備データは、プレバイオティクスの消費が細胞性免疫に連関したパラメーターに対して影響を有し得るし、したがってTh1／Th2比を変更させ得ることを示唆する（25、26）。それ故、特定のプレバイオティクスは、腸管内菌叢に対して作用して、アトピー性皮膚炎徴候の減少に有益であろう免疫調節を誘導し得る。
【０１２８】
本結果は、プレバイオティクス（特にシンバイオティクスを形成するためにプロバイオティクスと組み合わせたもの）の重要性を証明するが、患者の状態の改善を説明するために、治療以外の要因も調査した。
【０１２９】
患者の包含は、1年の全体にわたって行ったので、季節的効果は除去することができ、また季節を考慮するようにランダム化を行った。しかし、来診の頻度および疾患の改善が見られることを望んだ臨床試験における包含は、患者にとって、および彼らの家族にとって好ましい心理的役割を果たすことができた。
【０１３０】
現実の偽薬（プレバイオティクスは、偽薬であるとみなされることはできない）との比較が無いことにより、決定的な結論を描くことができなかったが；しかし、偽薬の心理的影響に関係なく、一般に5ポイントを超えるSCORADの改善を誘導することができなかった（13、17、27〜29）。しかし、本研究において、プレバイオティックで、およびシンバイオティックでの（および代謝産物）での治療は両方とも、15ポイントを超えるSCORADの減少を生じた（それぞれ15.6および20.5ポイント）。
【０１３１】
さらに、この改善は、皮膚コルチコイドまたは局部的免疫抑制薬の消費の増大に連関させることができない。対照的に、このような物質の使用は、本研究終了後に実質的に減少れた。最後に、ほとんど全ての患者に対する治療を止めて2〜4月後を観察される疾患における再発は、また、改善がランダムでないこと、またはアトピー性皮膚炎の自然変化にあったことを示唆する。全てのこれらのデータは、アトピー性皮膚炎（AD）の治療におけるプレバイオティクス（特に、シンバイオティクス）の有効性を証明する。
【０１３２】
本結果は、ADの治療におけるプロバイオティクス（しかし、シンバイオティクスでない）の使用を評価したその他の研究で観察される臨床状態の改善と同じ傾向を示す。大きな効果は、2歳未満の子供におけるプロバイオティクスの有効性を評価する最初の研究で観察されたが（13）、子供が少なくとも１歳の年齢であった第2の研究で観察された改善は、実質的にあまり有意ではなかった（17）。
【０１３３】
これらの研究（13および17）間の有効性の相違は、研究（13）における患者の包含基準（「非常に特異的」）によって説明することができる：
・2歳未満の患者；
・牛乳アレルギーが証明されている。
【０１３４】
プレバイオティクスおよびシンバイオティクスの両者による本研究において観察されたSCORADの改善は、Rosenfeldt（17）によって実施された研究において観察されるものよりも優れているように見える。この相違は、治療期間の相違によって説明することができる[本研究における3月に対して、Rosenfeldtの研究における6週（17）］。しかし、プロバイオティクス／プレバイオティクス／代謝産物の組合せの使用が、観察される相違に重要な役割を果たす可能性も非常に高い。Rosenfeldtの研究は、プロバイオティックのみで行われた。
【０１３５】
しかし、免疫系を調整する際のプロバイオティクス、プレバイオティクス、シンバイオティクスおよび代謝産物のそれぞれの役割に関して、ごくわずかなデータしか利用できない点に留意すべきである。最近の研究は、プロバイオティクスおよびプレバイオティクスが異なる機構を介して作用することができることを示唆した（30）。
【０１３６】
偽薬を伴う2つの二重盲検試験が最近報告されており、両方とも28月未満の年齢のADである子供を治療するために、プロバイオティクスで行われた。
【０１３７】
第1のものでは、ラクトバチルス・（Lactobacillus）GG、4株のプロバイオティクスの混合物および偽薬を4週（14）のために牛乳に対するアレルギーであることが疑われるADである患者に与えた。処置群の間には、治療の直後または4週ごのいずれにおいても相違が観察されなかったが、亜群[免疫グロブリンE（IgE）に感受性の子供］では、ラクトバチルス・（Lactobacillus）群が、プラセボ群に関して、SCORADの統計学的に優れた減少を示した。第2の研究では、L. fermentumおよび偽薬を8週間投与した（15）。期間の間のSCORADの減少は、プロバイオティック群において有意であったが、プラセボ群ではなかった。
【０１３８】
これらの2つの研究では、プラセボ群についてのSCORADの減少が観察されたことに留意すべきである（研究に応じて-20および-10ポイント）。使用した偽薬のより正確な観察は、ADの治療における偽薬の異常な効果の説明を提供することができる。セルロースおよびマルトデキストリンは、それぞれWestonら（15）およびViljanenら（14）による研究で使用された。偽薬に選ばれた物質は、両方ともプレバイオティクスであるとみなすることができるの物質であった。したがって、それらの研究におけるこのような「偽薬」で得られた結果は、本研究におけるプレバイオティック群において得られたものと同様であり得る。また、これらの結果は、プレバイオティクス、プロバイオティクスまたはシンバイオティクスでのADに対する臨床試験の間に、真の偽薬（およびプレバイオティック特性をもたない化合物でない）を選択することの重要性を強調する。
【０１３９】
結論として、シンバイオティック化合物（ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）Lcr35プラスするプレバイオティック）は、2歳以上の子供におけるアトピー性皮膚炎の徴候を改善することができる。この研究で観察される改善の量は、アトピー性皮膚炎の治療におけるプレバイオティクスおよびシンバイオティクスの重要性を強調する。
【０１４０】
実施例3：ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）Lcr35の特徴配列
同定は、PCR、次いで16sリボソームRNAおよび16-23sの遺伝子間部分の遺伝子をシーケンスすることによって行った。シーケンシングは、二本鎖シーケンシング（LI-COR法）、続くその他の株の配列との整列によって行った。結果およびストラテジーは、図1および2に示してある。
【０１４１】
16S部分配列の解析の結果
位置：16S
長さ：1320塩基対
読み曖昧性< 5%
【表４】
2009506016.tif 000005
【０１４２】
16-23S部分配列の解析の結果
位置：16-23S
長さ：483の塩群対
読み曖昧性< 5%
【表５】
2009506016.tif 000006
【０１４３】
解析した株は、下位種Lactobacillus casei subsp. rhamnosusに属する。16Sリボソームの遺伝子のほとんど全体のシーケンシングは、Lactobacillus casei subsp caseiをLactobacillus casei subsp. rhamnosus（また名付けられたラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus））から区別することができない。
【０１４４】
Lactobacillus casei subsp. rhamnosusの特徴配列は、16-23S遺伝子間部分にある。
【０１４５】
実施例4：ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）Lcr35のAPIプロフィールとラクトバチルス・（Lactobacillus）GGのものとの間の比較。
【０１４６】
図3Aおよび3Bは、24および48時間の時間の間のラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）Lcr35およびラクトバチルス・（Lactobacillus）GG株のAPI 50 CH代謝プロフィールを示す。API 50 CHプロフィールは、49の糖の代謝を研究するための解析ストリップ（strip）であり、以下に適応される：
・約48時間においてAPI 50 CHB培地でバシラス属（Bacillus）を同定すること；
・48時間においてAPI 50コレステロール培地でラクトバチルス（Lactobacillus）を同定すること；
・48時間においてAPI 50 CHE培地で腸内細菌を同定し、およびバイオタイピングすること；
・糖代謝を研究するためのその他の任意の「解析的」適用。
【０１４７】
API（R）同定は、当業者に周知である。
【０１４８】
2つのラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）Lcr35株およびラクトバチルス・（Lactobacillus）GG株は、特にラクトースに対して必ずしも同じプロフィールを有しないことが明らかである。糖代謝に関するインビトロでの挙動の相違は、インビボでの挙動の相違を暗示する。
【参照文献】
【０１４９】
1. Matricardi PM, Bjorksten B, Bonini S, Bousquet J, Djukanovic R, Dreborg S et al. Microbial products in allergy prevention and therapy. Allergy 2003;58:461-471. 
2. Williams HC. Is the prevalence of atopic dermatitis increasing? Clin Exp Dermatol 1992;17:385-391. 
3. Williams H, Robertson C, Stewart A,Ait-Khaled N, Anabwani G, Anderson R et al. Worldwide variations in the prevalence of symptoms of atopic eczema in the International Study of Asthma and Allergies in Childhood. J Allergy Clin Immunol 1999;103:125-138. 
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【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】図1：ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）Lcr35株の遺伝子タイピング。図1A：16S-23S rDNAインター遺伝子配列；図1B：16S rDNA。
【図２】図2：ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）Lcr35のシーケンスした領域の表示。
【図３Ａ】図3A：ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）Lcr35およびラクトバチルス・（Lactobacillus）GG株の50 API CH代謝性のプロフィールの比較。
【図３Ｂ】図3B：ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）Lcr35およびラクトバチルス・（Lactobacillus）GG株の50 API CH代謝性のプロフィールの比較。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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