(57)【要約】  本発明は特に、長鎖ジカルボン酸を直鎖飽和炭化水素（トリデカン）を基質として含む液体培地中で産生することができるカンジダ・ビニ、カンジダ・エンタモフィア、カンジダ・ブランキィ及びピキア・フェリノサに属する微生物を培養することにより長鎖ジカルボン酸を産生することができる、発見された菌株に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上の飽和ジカルボン酸を、同じ数の炭素原子を有する１以上の対応する飽和炭化水素から調製する方法であって、出発物質の立体構造が維持され、カンジダ・ビニ、カンジダ・エンタモフィア、カンジダ・ブランキィ及びピキア・フェリノサからなる群から選択される菌株を、飽和炭化水素を基質として含む液体培地中で培養することを含む、前記方法。
【請求項２】
使用される飽和炭化水素基質の濃度が５-１５％(v/v)である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
液体培地が、金属塩及び有機補助因子を含む請求項１記載の方法。
【請求項４】
培養が、２０〜３５℃の温度で、３日までの期間行われる生化学的酸化を含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
使用される飽和炭化水素が、１３個の炭素原子と両端にメチル基をもつ直鎖炭化水素である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
飽和ジカルボン酸が培地から任意の従来手段により回収される、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記使用される飽和炭化水素がトリデカンであり、及び産生される対応するジカルボン酸がブラシル酸である、請求項５記載の方法。
【請求項８】
長鎖ジカルボン酸の製造方法であって、直鎖炭化水素を基質として含む液体培地中で直鎖炭化水素を同化することができる、カンジダ・ビニ、カンジダ・エンタモフィア、カンジダ・ブランキィ及びピキア・フェリノサからなる群から選択される酵母菌株を培養し、前記炭化水素に対応する長鎖ジカルボン酸を含む発酵ブロスを得ること、及び前記飽和長鎖ジカルボン酸を回収することを含む前記方法。
【請求項９】
培養が、好気条件下で行われる請求項１記載の方法。
【請求項１０】
微生物菌株を最初にn-デカン及びn-ドデカン及び微生物により同化可能なものから選択される異なる炭素源を含む培地中で培養し、続いて微生物が十分に成長した後に培地に飽和炭化水素を添加し、好気条件下で酸化を継続し、飽和ジカルボン酸を産生する、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
培養の初期段階における培地のpH値が６.０〜７.０の範囲であり、その後の培養状態において７．０である請求項１０記載の方法。 
【請求項１２】
H2O2、アルカン、及びそれらの混合物からなる群から選択される１以上の収量誘導物質を液体培地に添加する、請求項１又は１０記載の方法。
【請求項１３】
液体培地を、ヘキサンで抽出して未反応炭化水素のような不要物を取り除き、モノカルボン酸のような副生成物を効果的に除去して発酵ブロス中に前記ジカルボン酸を残し、次に水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムからなる群から選択されるアルカリ溶液を発酵ブロスに添加して溶液のpHを１０〜１３に好ましくは１１〜１２に調整してジカルボン酸を前記発酵ブロスに溶解し、続いて発酵ブロスのpHを塩酸、硫酸、リン酸、及び臭素酸からなる群から選択される鉱酸を用いてpH２に調整して溶解したジカルボン酸を沈降し、次にジカルボン酸をエーテルで抽出する、請求項１又は１０記載の方法。
【請求項１４】
微生物の成長用培地が、３.０gの酵母エキス、３.０gの麦芽エキス、５.０gのペプトン、１０gのグルコース及び１Lの蒸留水を含み、pH ７.０である、請求項１〜１３いずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
ジカルボン酸の産生試験用培地が、１０gの(NH4)2HPO4、２gのK2HPO4、０.３gのMgSO4、１０mgのFeSO4.７H2O、８mgのZnSO4.７H2０、８mgのMnSO4、９mlのトリデカン及び９００mlの蒸留水を含み、pH ７.０である、請求項１〜１４いずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
発酵のための休止細胞及び種培養の調製用培地が、２０gのD-ソルビトール、１０gの(NH4)2HPO4、２gのK2HPO4、０.３gのMgSO4、１０mgのFeSO4.７H2O、８mgのZnSO4.７H2０、８mgのMnSO4、２gの酵母エキス、１００μgのビオチン及び９００mlの蒸留水を含み、pH ７.０である、請求項１〜１５いずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
培地が、５％ v/vのトリデカン、５gの酢酸ナトリウム、２gのK2HPO4、０.３gのMgSO4、１０mgのFeSO4.７H2O、８mgのZnSO4.７H2０、８mgのMnSO4、２gの酵母エキス及び９００mlの蒸留水を含み、pH ７.０である、請求項１〜１６いずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
ピキア・フェリノサのトリデカンの酸化によるブラシル酸への選択性が７３.８１％であり、変換％が２１.５９である、請求項１又は１０記載の方法。
【請求項１９】
カンジダ・ブランキィのトリデカンの酸化によるブラシル酸への選択性が４５.６８％であり、変換％が５.２２である、請求項１又は１０記載の方法。
【請求項２０】
カンジダ・ビニのトリデカンの酸化によるブラシル酸への選択性が９９.１８％であり、変換％が２.８０である、請求項１又は１０記載の方法。
【請求項２１】
カンジダ・エンタモフィアのトリデカンの酸化によるブラシル酸への選択性が２３.５８％であり、変換％が２８.７０である、請求項１又は１０記載の方法。
【請求項２２】
培地が、窒素源および無機塩からなる群から選択される１以上の付加的栄養素を含む、請求項１又は１０記載の方法。
【請求項２３】
使用される窒素源がペプトン、尿素、リン酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムからなる群から選択される、請求項２２記載の方法。 
【請求項２４】
使用される無機塩が、リン酸、硫酸及び塩酸の、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、鉄、ニッケル及び亜鉛塩からなる群から選択され、KH2PO4、K2HPO4、Na2HPO4.１２H2O、MgSO4７H2O、FeSO4.７H2O、ZnSO4.７H2O及びNaClからなる群からそれぞれ選択される、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
酵母エキス、肉エキス及びD-ビオチンからなる群から選択される一以上の従来の栄養素を酵母の成長を補助するために培地に加える、請求項１又は１０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は微生物を利用した直鎖炭化水素からの長鎖ジカルボン酸の有利な製造方法に関する。
【０００２】
（発明の背景技術）
いくつかの酵母の菌株は、アルカン又は脂肪酸を炭素源として培養した際の副生成物としてアルファ、オメガ-ジカルボン酸類を排出することが知られている。特に、C.アルビカンス(C. albicans)、C.クロアカエ(C. cloacae)、C.グイリエルモンディ(C. guillermondii)、C.インターメディア(C. intermedia)、C.リポリティカ(C. lipolytica)、C. マルトーサ(C. maltosa)、C. パラプシローシス(C. parapsilosis)及びC.ゼイレノイデス(C. zeylenoides)のようなカンジダ属に属する酵母は前記ジカルボン酸類を産生することが知られている (Isamu Shiio and RyousukeUchio, Agr. Biol. Chem. １９７１, ３５: ２０３３-２０４２)。C.トロピカリス(C. tropicalis)において、オメガ-酸化経路における第１段階は、チトクロームP４５０モノオキシゲナーゼ及びNADPH-チトクロームレダクターゼを含む膜結合性酵素複合体（オメガ-ヒドロキシラーゼ複合体）により触媒される。このヒドロキシラーゼ複合体はアルカン及び脂肪酸における末端メチル基の一次酸化の要因である(Michele Gilewicz, Marcelle Zacek, Jean-Claude Bertrand, and Edgard Azoulay, Can. J. Microbiol., １９７９, ２５, ２０１)。
【０００３】
炭化水素基質は酵母のミクロソーム内で触媒的に酸化されることが確立されている。細胞内への輸送に続き、n-アルカン基質は例えば、特定のシトクロムP４５０系により脂肪族アルコールへヒドロキシル化される。アルコールオキシダーゼ及びアルデヒドデヒドロゲナーゼによって触媒されたさらなる２つの酸化工程により対応する脂肪酸に通じる。脂肪酸は同じ経路を通り対応するジカルボン酸へとさらに酸化することができる(Colin Ratledge, J. Am. Oil Chem. Soc., １９８４, ６１(２), ４４７-４５３)。二末端基酸化は脂肪族炭化水素からの、酵母によるジカルボン酸の産生に通じる (Shigeo Ogino, Keiji Yano, Gakuzo Tamura and Kei Arima, Agri.Biol.Chem., １９６５, ２９(１１),１００９-１０１５)。
【０００４】
脂肪酸のオメガ-酸化はCoAの活性化の必要性なしにオメガ-ヒドロキシ-脂肪酸及びそのアルデヒド誘導体を介して対応するジカルボン酸に進む。しかしながら、脂肪酸及びジカルボン酸の両方は、対応するアシル-CoAエステルの活性化の後にペルオキシソーム内におけるβ-酸化経路により分解され(Atsuo Tanaka and saburo Fukui, In: The Yeasts, Vol.３, Metabolism and physiology of Yeasts, Edited by A.H.Rose and J.S.Harrison, ２nd Edition, Academic Press, Harcourt Brace Jovanovich, Publishers)、鎖の短縮が起こる。酵母において、ベータ-酸化はペルオキシソーム内で単独で行われる(Mitsuyoshi Ueda, Kazunori Yamanoi, Tadashi Morikawa, Hirofumi Okada and Atsuo Tanaka, Agr. Biol. Chem., １９８５, ４９, １８２１-１８２８)。
【０００５】
C.トロピカリスを含む多くの酵母による発酵により産生されるジカルボン酸は、本来の基質より１組以上の炭素原子分短く、混合物であることが一般的である(Shigeo Ogino, Keiji Yano, Gakuzo Tamura and Kei Arima, Agr. Biol. Chem., １９６５, ２９(１１), １００９-１０１５., Shio and Uchio, Agr. Biol. Chem., １９７１, ３５(１３), ２０３３-２０４２)。これらの望まない副生成物は、度々ジカルボン酸の生物学的産生に付随する。 
【０００６】
適切な変異株の使用によって二酸の形成が実質的に増加することが知られている (RyousukeUchio and Isamu Shiio, Agri.Biol.Chem, １９７２, ３６(３), ４２６-４３３)。野生型酵母はたとえあったとしても極少量のジカルボン酸を産生する。しばしば、変異株はジカルボン酸の収量を増加させるアルカン、脂肪酸又はジカルボン酸基質を用いて成長する能力が部分的に欠損している。しかしながら、これらの変異体は成長のための炭素源としてこれらの化合物を利用するそれらの減少している能力を超えて特徴付けられていない。ほぼ確実に、それらのジカルボン酸を産生する能力はベーター酸化経路の部分的な遮断で高められる。さらに、ベータ-酸化を阻害することが知られている化合物(すなわち、アクリレート)もまた、ジカルボン酸収量を増加させる。
【０００７】
さらに、そのような変異体の使用は、不飽和、ヒドロキシル化又は鎖の短縮のような、ベータ酸化を通過することに付随する望まない鎖の修飾を防止すべきである。
【０００８】
多くの生物は、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)及びシュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、コリネバクテリウム種(Corynebacterium sp.)及び少なくとも２つのカンジダ菌株、つまりC.クロアカエ及びC.トロピカリスを含む形質転換を行う(Kenneth D.Green, Michael K.Turner, Johm M.Woodley, Enzyme and Microbial Technology, ２０００, ２７, ２０５-２１１)。
【０００９】
細菌性細胞を用いる仕事は野生型生物を使用し、そこでは、溶剤、洗剤及び固定のすべてが、改良された変換をもたらす。(E.C.Chan and J.Kuo, Biotransformation of dicarboxylic acid by immobilized Cryptococcus cells. Enzyme Microb Technol, １９９７, ２０, ５８５-５８９)。対象的に、酵母菌株を用いる仕事は通常、脂肪酸のベータ酸化が損なわれた、カンジダ・トロピカリスの変異株を用いる。ベータ酸化のいくつかの重要な酵素が欠損しているC.トロピカリスの操作菌株は特にこれらの酸化に効果的な触媒である。これはω酸化に代謝の流れを向け、n-アルカンはより効率的に、対応する二酸に変換される。
【００１０】
（発明の目的）
本発明の主な目的は対応する長鎖炭化水素から微生物を使用することで改良された収量及び選択性を有する飽和ジカルボン酸の製造方法を提供することである。本発明の他の目的は以下の記載から明らかになるだろう。
【００１１】
(発明の概要)
本発明は同じ炭素原子数を有する１以上の対応する飽和炭化水素からの１以上の飽和ジカルボン酸の製造方法を提供する。前記方法においては、出発化合物の立体構造が維持され、カンジダ・ビニ(Candida vini)、カンジダ・エンタモフィア(Candida entamophila)、カンジダ・ブランキィ(Candida blankii)及びピキア・フェリノサ(Pichia farinosa)からなる群から選択される菌株を基質として飽和炭化水素を含む液体培地中で培養することを含む。
【００１２】
本発明の一実施態様において、飽和炭化水素基質の濃度は５-１５％(v/v)である。本発明の他の実施態様において液体培地は金属塩及び有機補助因子（organic cofactors）を含む。
【００１３】
本発明の他の実施態様において、培養は２０〜３５℃の温度で３日間までの期間行われる生化学的酸化を含む。
【００１４】
本発明の他の実施態様において、飽和炭化水素は１３個の炭素原子及び両端にメチル基を有する直鎖炭化水素である。
【００１５】
本発明の他の実施態様において、飽和ジカルボン酸は任意の従来の手段によって回収される。
【００１６】
本発明の他の実施態様において、飽和炭化水素はトリデカンであり、対応する産生された飽和ジカルボン酸はブラシル酸（Brassylic acid）である。
【００１７】
本発明の他の実施態様において、長鎖ジカルボン酸の製造方法は、直鎖炭化水素を前記炭化水素に対応する長鎖ジカルボン酸を含む発酵ブロスを得る為の基質として含む液体培地中で直鎖炭化水素を同化することができるカンジダ・ビニ、カンジダ・エンタモフィア、カンジダ・ブランキィ及びピキア・フェリノサからなる群から選択される酵母菌株を培養すること及び前記飽和長鎖ジカルボン酸を回収することを含む。
本発明の他の実施態様において、培養は好気条件下で行う。
【００１８】
本発明の他の実施態様において、微生物菌株を最初にn-デカン及びn-ドデカン及び微生物により同化可能なものから選択される異なる炭素源を含む培地中で培養し、続いて微生物が十分に成長した後に培地に飽和炭化水素を添加し、好気条件下で酸化を継続し、飽和ジカルボン酸を産生する。
【００１９】
本発明の他の実施態様において、培養の初期段階における培地のpH値が６.０〜７.０の範囲であり、その後の培養状態において７．０である。 
【００２０】
本発明の他の実施態様において、H2O2、アルカン及びそれらの混合物からなる群から選択される１以上の収量誘導物質（yield inducers）が液体培地に添加される。
【００２１】
本発明の他の実施態様において、液体培地を、ヘキサンで抽出して未反応炭化水素のような不要物を取り除き、モノカルボン酸のような副生成物を効果的に除去して発酵ブロス中に前記ジカルボン酸を残し、次に水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムからなる群から選択されるアルカリ溶液を発酵ブロスに添加して溶液のpHを１０〜１３に好ましくは１１〜１２に調整してジカルボン酸を前記発酵ブロスに溶解し、続いて発酵ブロスのpHを塩酸、硫酸、リン酸、及び臭素酸からなる群から選択される鉱酸を用いてpH２に調整して溶解したジカルボン酸を沈降し、次にジカルボン酸をエーテルで抽出する、
【００２２】
本発明の他の実施態様において微生物の成長用培地は３.０gの酵母エキス、３.０gの麦芽エキス、５.０gのペプトン、１０gのグルコース及び１Lの蒸留水を含み、pH ７.０である。
【００２３】
本発明の他の実施態様においてジカルボン酸の産生試験用培地は１０gの(NH4)2HPO4、２gのK2HPO4、０.３gのMgSO4、１０mgのFeSO4.７H2O、８mgのZnSO4.７H2０、８mgのMnSO4、９mlのトリデカン及び９００mlの蒸留水を含み、pH ７.０である。
【００２４】
本発明の他の実施態様において、発酵のための休止細胞及び種培養の調製用培地は２０gのD-ソルビトール、１０gの(NH4)2HPO4、２gのK2HPO4、０.３gのMgSO4、１０mgのFeSO4.７H2O、８mgのZnSO4.７H2０、８mgのMnSO4、２gの酵母エキス、１００μgのビオチン及び９００mlの蒸留水を含み、pH ７.０である。
【００２５】
本発明の他の実施態様において発酵のための培地は、５％ v/vのトリデカン、５gの酢酸ナトリウム、２gのK2HPO4、０.３gのMgSO4、１０mgのFeSO4.７H2O、８mgのZnSO4.７H2０、８mgのMnSO4、２gの酵母エキス及び９００mlの蒸留水を含み、pH ７.０である
【００２６】
本発明の他の実施態様において、ピキア・フェリノサのトリデカンの酸化によるブラシル酸への選択性は７３.８１ ％であり、変換％は２１.５９ である。
【００２７】
本発明の他の実施態様において、カンジダ・ブランキィのトリデカンの酸化によるブラシル酸への選択性は４５.６８％であり、変換％は５.２２である。
【００２８】
本発明の他の実施態様において、カンジダ・ ビニのトリデカンの酸化によるブラシル酸への選択性は９９.１８％であり、変換％は２.８０である。
【００２９】
本発明の他の実施態様において、カンジダ・ エンタモフィアのトリデカンの酸化によるブラシル酸への選択性は２３.５８％であり、変換％は２８.７０である。
【００３０】
本発明の他の実施態様において、培地は窒素源及び無機塩から選択される１以上の付加的窒素源を含む。
【００３１】
本発明の他の実施態様において、窒素源はペプトン、尿素、リン酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムからなる群から選択される。
【００３２】
本発明の他の実施態様において、無機塩は、リン酸、硫酸及び塩酸の、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、鉄、ニッケル及び亜鉛塩からなる群から選択され、KH2PO4、K2HPO4、Na2HPO4.１２H2O、MgSO4７H2O、FeSO4.７H2O、ZnSO4.７H2O及びNaClからなる群からそれぞれ選択される、
【００３３】
本発明の他の実施態様において、酵母エキス、肉エキス及びD-ビオチンからなる群から選択される一以上の従来の栄養素を、酵母の成長を補助するために培地に加える。
【００３４】
（発明の詳細な説明）
本発明において開示されるのは、直鎖飽和炭化水素(トリデカン)を基質として含む液体培地中で長鎖ジカルボン酸を産生することができるカンジダ・ビニ、カンジダ・エンタモフィア、カンジダ・ブランキィ及びピキア・フェリノサに属する微生物の培養による、長鎖ジカルボン酸の製造方法である。
【００３５】
本発明は、前記酵母菌株の使用による飽和炭化水素からの前記飽和ジカルボン酸の製造方法に関する。
【００３６】
本発明の一実施態様において、長鎖ジカルボン酸の製造は、直鎖炭化水素を基質として含む液体培地中で直鎖炭化水素を同化することができる、カンジダ・ビニ、カンジダ・エンタモフィア、カンジダ・ブランキィ及びピキア・フェリノサからなる群から選択される酵母菌株を培養することを含む
飽和ジカルボン酸の調製のための出発物質として採用される炭素源は、１３個の炭素原子を有する飽和炭化水素である。
【００３７】
本発明において、飽和炭化水素は好気条件下、１３個の炭素原子を有する飽和ジカルボン酸を製造する為の、上記微生物の培養の為の炭素源として採用される。代わりに、微生物は、最初に上記飽和炭化水素よりもむしろn-デカン、n-ドデカンのような微生物が同化可能な異なる炭素源を含む培地内で培養することができる。前記飽和炭化水素はその後、微生物が十分に成長した後に培地に添加され、好気条件下培養を継続し、飽和ジカルボン酸を製造する。
【００３８】
本発明のさらに他の実施態様において、上記酵母の休止細胞は以下の方法に従って、飽和ジカルボン酸の調製の為に採用することができる。第１に微生物を、飽和炭化水素すなわち出発物質とは異なる、微生物が同化可能な炭素源を含む培地内で培養する。続いて、微生物を飽和炭化水素を含む培地、すなわちジカルボン酸の産生の試験用培地である培地B内で培養し、かくして培養した微生物を、発酵実験の為の休止細胞及び種培養の調製用培地Dに移す。休止細胞は上記飽和炭化水素を触媒酸化し、飽和ジカルボン酸を得る為に採用される。この反応は培地Dを取り除き培地E、すなわち発酵培地に適切な量の飽和炭化水素を添加した後に、微生物を懸濁させることによって行うことができる。微生物の休止細胞が使用される工程において微生物の培養及び前記飽和炭化水素の酸化は別々に行われる。酸化工程において前記微生物は炭素源がないのでもはや培養することができない。酸化工程で使用される前記出発物質である飽和炭化水素は、微生物の培養には使用されない。
【００３９】
前記飽和炭化水素は好ましくは、前記飽和炭化水素が液体である為、一般的に十分に激しく攪拌又は振とうすることにより水相及び微生物と接触した状態で維持される。必要であれば、界面活性剤等を加えることにより十分な接触を達成することができる。
【００４０】
本発明の培養工程は前述の炭素源及び窒素源及び無機塩のような他の従来の栄養素を含む培地中で行われる。適切な窒素源にはペプトン、尿素、リン酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムのような有機及び無機窒素含有化合物が挙げられる。無機塩の例には、KH2PO4、K2HPO4、Na2HPO4.１２H2O、MgSO4７H2O、FeSO4.７H2O、ZnSO4.７H2O 及びNaClのような、リン酸、硫酸及び塩酸の、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、鉄、ニッケル及び亜鉛塩が挙げられる。さらに、酵母エキス、肉エキス及びD-ビオチンのような他の栄養素も、酵母の成長を補助する為に添加することができる。
【００４１】
培養は室温又は室温より少し高い温度で行い、温度は２０℃〜３５℃の範囲が好ましい。培養の初期段階における培地のpH値が６.０〜７.０の範囲であり、その後の培養状態において７．０であり、pHはアンモニア、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムのような中和剤の添加により調整する。
【００４２】
培養はさらに、通気下での振とう又は攪拌のような好気条件下で行う。これらの方法は、出発化合物として使用される飽和炭化水素、液体培地及び空気相間の良好な接触を引き起こすことができる。
【００４３】
上記培養において、前記微生物は前記飽和炭化水素を酸化するために成長させ、前記飽和ジカルボン酸は培地に蓄積する。
【００４４】
D-ビオチンが栄養素及び前記飽和炭化水素としてD-ソルビトールのような他の炭素源と共に導入された場合は、微生物ははじめに飽和炭化水素よりむしろ炭素源を用いて成長する。休止細胞培地はD-ビオチン、およびD-ソルビトールを含み、かくして成長させた微生物はその後発酵培地内において飽和炭化水素の酸化を始める。
【００４５】
培地内で産生し、同化された前記飽和ジカルボン酸は回収及び単離することができる。   例えば、有機溶媒による抽出又は液体培地のpH値の調整による沈降が一般的に採用される。液体培地はもし必要であれば遠心又はろ過のような適切な方法で微生物を取り除くことができる。こうして処置した液体培地は次に酸性化した後にジエチルエーテルによる抽出のような適切な方法を前記所望の生成物を有効に単離するために行う。
【００４６】
前記飽和ジカルボン酸生成物は以下のように同定される。液体培地又は反応溶液は飽和ジカルボン酸を溶解するために水酸化カリウムでアルカリ化する。溶液を採り、濃塩酸で酸性化しジエチルエーテルで抽出する。エーテル抽出物は続いてメチル化のためにジアゾメタンで処理し、ガスクロマトグラフィ及びGC-MS（ガスクロマトグラフフィー及び質量スペクトル測定）で分析する。
【００４７】
前述したように、本発明は現在のところ、合成的手法では非常に調製するのが難しい前記飽和ジカルボン酸について、前記飽和炭化水素に微生物を用いた工程を適用する前記飽和ジカルボン酸の製造方法を提供する。
【００４８】
本発明の顕著な特徴は、前記炭化水素に対応する長鎖ジカルボン酸を含む発酵ブロスを得る為の基質として直鎖炭化水素を含む液体培地中で直鎖炭化水素を同化することができるカンジダ・ビニ、カンジダ・エンタモフィア、カンジダ・ブランキィ及びピキア・フェリノサに属する４種の酵母にある。
【００４９】
全ての関連する微生物菌株を表１に記載する。
表１:直鎖飽和炭化水素(トリデカン)を基質として含む液体培地中で長鎖ジカルボン酸を産生すことができることが明らかとなった微生物菌株の一覧
2009521918.tif 000002
【００５０】
（材料及び方法）
微生物: ジカルボン酸を生産すると同様にn-アルカンを利用する微生物は、培養ストックからスクリーニングした。７５種中４種がn-アルカンから前記ジカルボン酸を産生する点において陽性とスクリーニングされた。ピキア・フェリノサ、カンジダ・ビニ、カンジダ・エンタモフィア、カンジダ・ブランキィがトリデカンからブラシル酸を産生する為にスクリーニングされた。
【００５１】
培地: 以下の培地を採用した
培地 A: 微生物の成長培地
酵母エキス ３.０g、麦芽エキス ３.０g、ペプトン ５.０g、グルコース １０g及び蒸留水 １L、pH ７.０
【００５２】
培地B:ジカルボン酸の生産試験用培地 
(NH4)2HPO4 １０g、K2HPO4 ２g、MgSO4 ０.３g、FeSO4.７H2O １０mg、ZnSO4.７H2０ ８mg、MnSO4 ８mg、トリデカン ９ml及び蒸留水 ９００ml、pH ７.０
【００５３】
培地D:発酵実験用の休止細胞及び種培養の調製用培地
D-ソルビトール ２０g、(NH4)2HPO4 １０g、K2HPO4 ２g、MgSO4 ０.３g、FeSO4.７H2O １０mg、ZnSO4.７H2０ ８mg、MnSO4 ８mg、酵母エキス ２g、ビオチン １００μg及び蒸留水９００ml、pH ７.０.
【００５４】
培地E:ジカルボン酸の生産の為の発酵用培地
トリデカン ５％ v/v、酢酸ナトリウム ５g、K2HPO4 ２g、MgSO4 ０.３g、FeSO4.７H2O １０mg、ZnSO4.７H2０ ８mg、MnSO4 ８mg、酵母エキス ２g及び蒸留水 ９００ml、pH ７.０
【００５５】
培養
培地Aは微生物の成長用である。前記微生物は栄養培地寒天斜面から、培地Aに移し振とう培養器で３０℃、２００rpmで２日間インキュベートした。１０mlの種菌を培地Aから１００mlの培地Bへ５００mlフラスコ内で移し、培養は３０℃、２００rpmで２日間振とう培養器で行い、ジカルボン酸の産生をチェックした。休止細胞の調製の為に、１０mlの種菌を培地Bから２００mlの培地Dに５００ml円錐フラスコ内で移し、培養は３０℃、２００rpmで２日間行った。
【００５６】
回転式振とう培養器で２００rpm、２日間培養した後、前記有機体を含む培地Dを８,０００rpm、１０分間遠心し、細胞ペレットを集めた。前記酵母の細胞ペレットを培地E、つまり前記飽和炭化水素を基質として含む液体培地から前記ジカルボン酸を生成するための発酵培地に移した。
【００５７】
本発明で使用可能な微生物は、直鎖炭化水素から長鎖ジカルボン酸を生成する能力を有する、カンジダ・ビニ、カンジダ・エンタモフィア、カンジダ・ブランキィ及びピキア・フェリノサに属するものである。本発明の他の目的は、前記微生物を誘導物質と共に使用して直鎖炭化水素からの前記ジカルボン酸の収量の増加を提供することである。H2O2、アルカン、H2０2及びアルカンの組み合わせのような誘導物質は飽和炭化水素を基質として含む液体培地からの前記ジカルボン酸の生成の収量を増加させる為に使用される。
【００５８】
長鎖ジカルボン酸を産生するカンジダ・ビニ、カンジダ・エンタモフィア、カンジダ・ブランキィ及びピキア・フェリノサに属する酵母は、基質として直鎖飽和炭化水素、特に炭素数１３のものを含む培地に播種及び培養し、培地のpHを培養の初期段階において６.０〜７.０の範囲、その後残りの培養過程において７．０に調整する。pHは好ましくはアンモニア、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムのような中和剤で調整し、このことにより、高収量の、培地の基質として使用される炭化水素に対応した長鎖ジカルボン酸を産生する。炭化水素(基質としての)及びアルカリ性物質の添加のための手段としては、あらかじめ混合し、及び適当な方法で乳剤を作ることによってそれらを同時に加えてもよく、又はそれらを互いに別々に加えても良い。培養はさらに、通気下での振とう又は攪拌のような好気条件下で行う。これらの方法は、出発化合物として使用される飽和炭化水素、液体培地及び空気相間の良好な接触を引き起こすことができる。
【００５９】
D-ビオチンが栄養素及び前記飽和炭化水素としてD-ソルビトールのような他の炭素源と共に導入された場合は、微生物ははじめに飽和炭化水素よりむしろ炭素源を用いて成長する。休止細胞培地はD-ビオチン、およびD-ソルビトールを含み、かくして成長した微生物はその後発酵培地内において飽和炭化水素の酸化を始める。
【００６０】
前記ジカルボン酸産生酵母を培養の初期段階において培地のpHを６.０〜７.０に調整した前記培地中で培養することにより、培養の過程で培地中に混入した他の微生物の混合及び成長により引き起こされる前記酵母のジカルボン酸産生能力の損傷を防ぐことが可能となる。前記ジカルボン酸産生酵母の培養期間は 培養開始時の培地ｐHを維持しながら行うべきである。
【００６１】
上記培養において、前記微生物が前記飽和炭化水素を酸化させるために育てられ、前記飽和ジカルボン酸は培地に蓄積する。
【００６２】
液体培地は、未反応炭化水素やモノカルボン酸のような副生成物のような発酵ブロス中に長鎖ジカルボン酸と混合物として存在する物を取り除く為にヘキサンで抽出し、前記ジカルボン酸を前記ブロス中に残して効果的に除去され、次にジカルボン酸を前記発酵ブロスに溶解するために、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムのようなアルカリ溶液を前記培養で得た発酵ブロスに添加して溶液のpHを１０〜１３に好ましくは１１〜１２に調整する。前記発酵ブロスはpH２に調整する。溶解したジカルボン酸を沈降させる適切な強鉱酸の非限定的な例としては塩酸、硫酸、リン酸、臭素酸が挙げられ、実質的に溶解した状体で存在する長鎖ジカルボン酸をエーテルで抽出した。得られた生成物はガスクロマトグラフィーにより定量した。
【００６３】
GCアッセイ法
GC条件は充填カラム及びキャピラリーカラムで標準化されている。
2009521918.tif 000003
アルカン酸化経路のスキームは以下に示す通りである。
微生物酸化
H3C-(CH2)11-CH3→HOOC-(CH2)11-COOH
【００６４】
本発明はここで以下の例証的な実施例を参照しさらに詳細について記載する。
【００６５】
実施例１:ピキア・フェリノサを用いたトリデカンの発酵によるブラシル酸の産生
１白金耳（loopful）のピキア・フェリノサ(MTCC９９８)を、栄養培地寒天斜面から、培地Aに移し、回転式振とう培養器で３０℃、２００rpmで２日間インキュベートした。１０mlの種菌を培地Aから１００mlの培地Bへ５００mlフラスコ内で移し、培養は３０℃、２００rpmで２日間振とう培養器で行い、ジカルボン酸の産生を試験した。休止細胞の調製の為に、１０mlの種菌を培地Bから２００mlの培地Dに５００ml円錐フラスコ内で移し、培養は３０℃、２００rpmで２日間行った。
【００６６】
本発明の一つの態様は前記微生物を誘導物質と共に使用して直鎖炭化水素からの前記ジカルボン酸の収量の増加を提供することである。０.１％H2O2及び０.１％アルカンは培地D中で誘導物質として使用された。回転式振とう培養器で２００rpm、２日間培養した後、前記微生物を含んだ培地Dを８,０００rpm、１０分間遠心した。前記酵母を含む前記ブロスの遠心により、１０.０８gm(２００mlの培地Dに対し)の細胞ペレットを得た。全ての培地は１２１℃で２０分間滅菌した。
【００６７】
得られた前記酵母の細胞ペレットを、液体培地から前記ジカルボン酸(ブラシル酸)を産生するための５％(v/v)の前記飽和炭化水素(トリデカン)を有する培地E、発酵培地に移す。
【００６８】
炭素源は好ましくは水相及び微生物と接触した状態に維持される。酸化は室温で行われ、２０℃〜３５℃の範囲の温度が好ましい。培養の初期段階における培地のpH値が６.０〜７.０の範囲であり、その後次の培養状態において７．０であり、pHは好ましくはアンモニア、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムのような中和剤の添加により調整する。
【００６９】
液体培地は、未反応炭化水素やモノカルボン酸のような副生成物のような発酵ブロス中に長鎖ジカルボン酸と混合物として存在する物を取り除く為ヘキサンで抽出し、前記ジカルボン酸を前記ブロス中に残して効果的に除去される、次にジカルボン酸を前記発酵ブロスに溶解するために、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムのようなアルカリ溶液を前記培養で得た発酵ブロスに添加して溶液のpHを１０〜１３に好ましくは１１〜１２に調整する。前記発酵ブロスはpH２に調整する。溶解したジカルボン酸を沈降させる適切な強鉱酸の非限定的な例としては塩酸、硫酸、リン酸、臭素酸が挙げられ、実質的に溶解した状体で存在する長鎖ジカルボン酸をエーテルで抽出した。
【００７０】
得られた生成物はガスクロマトグラフィーにより定量し、GC-MSで同定した。生成物のGC-MSデータが基準試料のものと一致したので、生成物はブラシル酸として同定された。
【００７１】
ピキア・フェリノサは、７３.８１％の選択性を有するトリデカンの酸化により３８７６.７１mg/Lのブラシル酸を産生し、変換％は２１.５９である。
【００７２】
実施例 ２: カンジダ・ビニを用いたトリデカンの発酵によるブラシル酸の産生
１白金耳のカンジダ・ビニ(MTCC１３８７)を、栄養培地寒天斜面から、培地Aに移した。培養は回転式振とう培養器で３０℃、２００rpmで２日間行った。培養は実施例１に記載されたものと同じ方法で行った。
【００７３】
本発明において、前記微生物を用いた直鎖炭化水素からの前記ジカルボン酸の収量は、培地D内で０．１％アルカンを誘導物質として用いることで増加した。回転式振とう培養器で２００rpm、２日間培養した後、前記微生物を含んだ培地Dを８,０００rpm、１０分間遠心した。前記酵母を含む前記ブロスの遠心により、３.０９８gm(２００mlの培地-Dに対し)の細胞ペレットを得た。全ての培地は１２１℃で２０分間滅菌した。
【００７４】
得られた前記酵母の細胞ペレットを、液体培地から前記ジカルボン酸を産生するための５％(v/v)の前記飽和炭化水素を有する培地E、発酵培地に移す。
【００７５】
前記ジカルボン酸を同定するための液体培養ブロスの抽出は、実施例１に記載したように行った。
【００７６】
得られた生成物はガスクロマトグラフィーにより定量し、GC-MSで同定した。生成物のGC-MSデータが基準試料のものと一致したので、生成物はブラシル酸として同定された。
【００７７】
カンジダ・ビニは、９９.１８％の選択性を有するトリデカンの酸化により３５１.８６mg/Lのブラシル酸を産生し、変換％は２.８０である。
【００７８】
実施例３:カンジダ・エンタモフィアを用いたトリデカンの発酵によるブラシル酸の産生
１白金耳のカンジダ・エンタモフィア(MTCC１０３０)を、栄養培地寒天斜面から、培地Aに移した。培養は回転式振とう培養器で３０℃、２００rpmで２日間行った。培養は実施例１に記載されたものと同じ方法で行った。
【００７９】
本発明において、前記微生物を用いた直鎖炭化水素からの前記ジカルボン酸の収量は、培地D内で０.１％H2O2及び０．１％アルカンを誘導物質として用いることで増加した。回転式振とう培養器で２００rpm、２日間培養した後、前記微生物を含んだ培地Dを８,０００rpm、１０分間遠心した。前記酵母を含む前記ブロスの遠心により、６.７９gm(２００mlの培地-Dに対し)の細胞ペレットを得た。全ての培地は１２１℃で２０分間滅菌した。
【００８０】
得られた前記酵母の細胞ペレットを、液体培地から前記ジカルボン酸を産生するための５％(v/v)の前記飽和炭化水素を有する培地E、発酵培地に移す。
【００８１】
前記ジカルボン酸を単離するための液体培養ブロスの抽出は、実施例１に記載したように行った。得られた生成物はガスクロマトグラフィーにより定量し、GC-MSで同定した。生成物のGC-MSデータが基準試料のものと一致したので、生成物はブラシル酸として同定された。
【００８２】
カンジダ・エンタモフィアは、２３.５８％の選択性を有するトリデカンの酸化により７７８.０２mg/Lのブラシル酸を産生し、変換％は２８.７０である。
【００８３】
実施例 ４:カンジダ・ブランキィを用いたトリデカンの発酵によるブラシル酸の産生
１白金耳のカンジダ・ブランキィ(MTCC ６２４)を、栄養培地寒天斜面から、培地Aに移した。培養は回転式振とう培養器で３０℃、２００rpmで２日間行った。培養は実施例１に記載されたものと同じ方法で行った。
【００８４】
本発明において、前記微生物を用いた直鎖炭化水素からの前記ジカルボン酸の収量は、培地D内で０.１％H2O2及び１％アルカンを誘導物質として用いることで増加した。回転式振とう培養器で２００rpm、２日間培養した後、前記微生物を含んだ培地Dを８,０００rpm、１０分間遠心した。前記酵母を含む前記ブロスの遠心により、６.７９gm(２００mlの培地Dに対し)の細胞ペレットを得た。全ての培地は１２１℃で２０分間滅菌した。
【００８５】
得られた前記酵母の細胞ペレットを、液体培地から前記ジカルボン酸を産生するための５％(v/v)の前記飽和炭化水素を有する培地E、発酵培地に移す。
【００８６】
前記ジカルボン酸を単離するための液体培養ブロスの抽出は、実施例１に記載したように行った。
得られた生成物はガスクロマトグラフィーにより定量し、GC-MSで同定した。生成物のGC-MSデータが基準試料のものと一致したので、生成物はブラシル酸として特定された。
【００８７】
カンジダ・ブランキィは２７４.０９mg/Lのブラシル酸を４５.６８％の選択性を有するトリデカンの酸化により産生し、変換％は５.２２である。
2009521918.tif 000004
【００８８】
本発明の主な利点は、
n-アルカンの微生物による酸化により生成することができる脂肪族長鎖α,ω-ジカルボン酸(DC)は、香料、ポリマー、接着剤、マクロライド系抗生物質及び高品質潤滑剤のような合成製品の原材料として広く使用される。医薬品分野の適用において、１,１３-ジカルボン酸は冠状動脈性心臓病及び関節の炎症の治療のための漢方薬の有効成分である合成ムスコンの調製において価値がある。通常、天然ムスコンは雄の成体ジャコウジカの香腺から抽出される。化学的経路を用いた長鎖アルファ、オメガジカルボン酸の合成により、より短い鎖の長さを含む混合物を得る。結果として、近年、微生物を利用する発酵工程により前記長鎖ジカルボン酸を生産する方法に対する関心が増大しているが、それゆえに大規模な精製工程が必要である。本発明の顕著な特徴は、前記炭化水素に対応する長鎖ジカルボン酸を含む発酵ブロスを得る為の基質として直鎖炭化水素(トリデカン)を含む液体培地中で直鎖炭化水素を同化することができるカンジダ・ビニ、カンジダ・エンタモフィア、カンジダ・ブランキィ及びピキア・フェリノサに属する４種の酵母にある。
【００８９】
本発明の他の利点は前記微生物と誘導物質を用いた直鎖炭化水素からの前記ジカルボン酸の増加した収量を産生することである。H2O2、アルカン、H2O2及びアルカンの組み合わせのような誘導物質、アルカンは基質としての飽和炭化水素を含む液体培地からの前記ジカルボン酸の収量を増加させるために使用される。
【国際調査報告】
2009521918.tif 000005
2009521918.tif 000006
2009521918.tif 000007