(57)【要約】【課題】間充織幹細胞誘導方法を提供する。【解決手段】ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）コロニーあるいはその子孫を分散させることにより取得される細胞を用意し、支持細胞層が不在の状態において、ＦＧＦ２及び任意でＰＤＧＦ  ＡＢを含む血清非含有培地において当該細胞を増殖させる細胞培養物取得方法を記載する。ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）コロニーは、トリプシンである分散剤により分散させることが好適である。【選択図】図１Ａ
2009506769.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一の間充織幹細胞（ＭＳＣ）を取得する方法であって、
一の胚性幹（ＥＳ）細胞コロニー、あるいは一のその子孫を分散させることにより取得される一の細胞を用意する工程と、
ＦＧＦ２を含む一の血清非含有培地において、共培養物が不在の状態において前記細胞を増殖させる工程と
を含む方法。
【請求項２】
前記胚性幹細胞コロニーは、一のヒト胚性幹細胞コロニー（ｈＥＳＣ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記胚性幹細胞コロニーをトリプシンにより分散させる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
一のプレートにおけるコンフルエントな複数のヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を、該複数の細胞をプレーティングする前に、分散させる工程を含む、請求項１、２、又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記共培養物が不在の状態は、前記複数の細胞を一の支持細胞層なしで培養することを含む、先行する任意の請求項に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞を一の培養基板上で増殖させる、先行する任意の請求項に記載の方法。
【請求項７】
前記培養基板は、一のゼラチン化プレートを含む、先行する任意の請求項に記載の方法。
【請求項８】
前記血清非含有培地は、約５ｎｇ／ｍｌの濃度においてＦＧＦ２を含む、先行する任意の請求項に記載の方法。
【請求項９】
前記血清非含有培地は、好適には約５ｎｇ／ｍｌの濃度においてＰＤＧＦ  ＡＢを更に含む、先行する任意の請求項に記載の方法。
【請求項１０】
前記血清非含有培地に血清代替物培地を添加する、先行する任意の請求項に記載の方法。
【請求項１１】
前記複数の細胞がコンフルエントになったときに、トリプシン処理により１：４に分割する、先行する任意の請求項に記載の方法。
【請求項１２】
増殖させた前記複数の細胞から一の間充織幹細胞を、一の細胞表面マーカーに基づいて選択する工程を更に含む、
先行する任意の請求項に記載の方法。
【請求項１３】
ＡＮＰＥＰ  （ＣＤ１３；ＬＡＰ１；ＰＥＰＮ；ｇｐ１５０：  ＮＭ＿００１１５０．１）；  ＥＮＧ  （ＥＮＤ；ＯＲＷ；ＨＨＴ１；ＯＲＷ１；ＣＤ１０５：  ＮＭ＿０００１１８．１）；  ＳＣＮ９Ａ  （ＰＮ１；ＮＥ−ＮＡ：  ＮＭ＿００２９７７．１）；  ＴＲＰＶ２  （ＶＲＬ；ＶＲＬ１；ＶＲＬ−１；ＭＧＣ１２５４９：  ＮＭ＿０１６１１３．３）；  ＲＡＭＰ１  （：  ＮＭ＿００５８５５．１）；  Ｆ２ＲＬ２  （ＰＡＲ３：  ＮＭ＿００４１０１．２）；  ＮＴＳＲ１  （ＮＴＲ：  ＮＭ＿００２５３１．１）；  ＧＡＢＲＡ２  （：  ＮＭ＿０００８０７．１）；  ＳＬＣ１６Ａ４  （ＭＣＴ４：  ＮＭ＿００４６９６．１）；  ＩＴＧＡ４  （ＣＤ４９Ｄ：  ＮＭ＿０００８８５．２）；  ＮＣＡＭ２  （ＮＣＡＭ２１；ＭＧＣ５１００８：  ＮＭ＿００４５４０．２）；  ＩＬ１Ｒ１  （Ｐ８０；ＩＬ１Ｒ；ＩＬ１ＲＡ；ＣＤ１２１Ａ；Ｄ２Ｓ１４７３；ＩＬ−１Ｒ−ａｌｐｈａ：  ＮＭ＿０００８７７．２）；  ＰＤＧＦＲＡ  （ＣＤ１４０Ａ；ＰＤＧＦＲ２：  ＮＭ＿００６２０６．２）；  ＶＣＡＭ１  （ＩＮＣＡＭ−１００：  ＮＭ＿０８０６８２．１）；  ＳＳＦＡ２  （ＣＳ１；ＣＳ−１；ＫＲＡＰ；ＳＰＡＧ１３；ＫＩＡＡ１９２７：  ＮＭ＿００６７５１．３）；  ＴＲＨＤＥ  （ＰＡＰ−ＩＩ：  ＮＭ＿０１３３８１．１）；  ＥＤＧ２  （ＬＰＡ１；ｅｄｇ−２；ｖｚｇ−１；Ｇｐｃｒ２６；Ｍｒｅｃ１．３；ｒｅｃ．１．３：  ＮＭ＿００１４０１．３）；  ＮＴ５Ｅ  （ｅＮ；ＮＴ５；ＮＴＥ；ｅＮＴ；ＣＤ７３；Ｅ５ＮＴ：  ＮＭ＿００２５２６．１）；  ＦＬＲＴ２  （ＫＩＡＡ０４０５：  ＮＭ＿０１３２３１．２）；及びＦＡＰ  （ＦＡＰＡ；ＤＰＰＩＶ；ＳＥＰＲＡＳＥ：  ＮＭ＿００４４６０．２）からなる群から選択される一つ以上の表面マーカーの発現が増加している一の細胞を選択することにより、前記間充織幹細胞を取得する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記表面マーカーは、ＣＤ１０５（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＭ＿０００１１８．１）を含む、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記表面マーカーは、ＣＤ７３（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＭ＿００２５２６．１）を含む、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１６】
ＩＴＧＢ１ＢＰ３  （ＭＩＢＰ：  ＮＭ＿０１４４４６．１）；  ＰＴＰＲＺ１  （ＰＴＰＺ；ＨＰＴＰＺ；ＰＴＰ１８；ＰＴＰＲＺ；ＲＰＴＰＢ：  ＮＭ＿００２８５１．１）；  ＣＮＴＮ１  （Ｆ３；ＧＰ１３５：  ＮＭ＿１７５０３８．１）；  ＰＣＤＨ１  （ＰＣ４２；ＰＣＤＨ４２；ＭＧＣ４５９９１：  ＮＭ＿００２５８７．３）；  ＰＯＤＸＬ  （ＰＣＬＰ；Ｇｐ２００：  ＮＭ＿００５３９７．２）；  ＧＰＲ６４  （ＨＥ６；ＴＭ７ＬＮ２：  ＮＭ＿００５７５６．１）；  ＰＲＯＭ１  （ＡＣ１３３；ＣＤ１３３；ＰＲＯＭＬ１：  ＮＭ＿００６０１７．１）；  ＧＰＲＣ５Ｃ  （ＲＡＩＧ３；ＲＡＩＧ−３：  ＮＭ＿０２２０３６．２）；  ＣＤ２４  （ＣＤ２４Ａ：  ＮＭ＿０１３２３０．１）；  ＣＬＤＮ３  （ＲＶＰ１；ＨＲＶＰ１；ＣＰＥ−Ｒ２；ＣＰＥＴＲ２：  ＮＭ＿００１３０６．２）；  ＴＡＣＳＴＤ１  （ＥＧＰ；ＫＳＡ；Ｍ４Ｓ１；ＭＫ−１；ＥＧＰ４０；ＭＩＣ１８；ＴＲＯＰ１；Ｅｐ−ＣＡＭ；ｈＥＧＰ−２；ＣＯ１７−１Ａ；ＧＡ７３３−２：  ＮＭ＿００２３５４．１）；  ＨＴＲ３Ａ  （ＨＴＲ３：  ＮＭ＿０００８６９．１）；  ＦＧＦＲ４  （ＴＫＦ；ＪＴＫ２：  ＮＭ＿０２２９６３．１）；  ＡＤＣＹ１  （：  ＮＭ＿０２１１１６．１）；  ＦＧＦＲ３  （ＡＣＨ；ＣＥＫ２；ＪＴＫ４；ＨＳＦＧＦＲ３ＥＸ：  ＮＭ＿０２２９６５．１）；  ＩＬ１７ＲＢ  （ＣＲＬ４；ＥＶＩ２７；ＩＬ１７ＢＲ；ＩＬ１７ＲＨ１；ＭＧＣ５２４５：  ＮＭ＿０１８７２５．２）；  ＳＯＲＬ１  （ＬＲ１１；ＬＲＰ９；ＳＯＲＬＡ；ｇｐ２５０；ＳｏｒＬＡ−１：  ＮＭ＿００３１０５．３）；  ＧＰＭ６Ｂ  （Ｍ６Ｂ：  ＮＭ＿００５２７８．２）；  ＫＣＮＳ３  （ＫＶ９．３；ＭＧＣ９４８１：  ＮＭ＿００２２５２．３）；及び  ＦＺＤ３  （Ｆｚ−３；ｈＦｚ３：  ＮＭ＿０１７４１２．２）からなる群から選択される一つ以上の表面マーカーの発現が減少している一の細胞を選択することにより、前記間充織幹細胞を取得する、請求項１２乃至１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記表面マーカーは、ＣＤ２４（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＭ＿０１３２３０．１）を含む、請求項１２乃至１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
ＣＤ１０５＋ＣＤ２４−である細胞を選択することにより前記間充織幹細胞を取得する、請求項１２乃至１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記表面抗原に対する一の抗体により細胞を標識することにより前記間充織幹細胞を選択する、請求項１２乃至１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）により前記間充織幹細胞を選択する、請求項１２乃至１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記複数の細胞を、３５世代よりも少なく継代させる、先行する任意の請求項に記載の方法。
【請求項２２】
前記複数の細胞を、約１４日間、好適には約７日間増殖させる、先行する任意の請求項に記載の方法。
【請求項２３】
前記胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）コロニーは、ｈｕＥＳ９コロニーを含む、先行する任意の請求項に記載の方法。
【請求項２４】
前記胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）コロニーは、Ｈ１  ＥＳＣコロニーを含む、先行する任意の請求項に記載の方法。
【請求項２５】
取得した前記間充織幹細胞（ＭＳＣ）は、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ４９ａとｅ＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ１６６＋、ＣＤ３４−、及びＣＤ４５−の一つ以上、好適には全てである一の表面抗原プロファイルを示す、先行する任意の請求項に記載の方法。
【請求項２６】
取得した前記間充織幹細胞（ＭＳＣ）は、ＨＥＳＸ１、ＰＯＵＦＬ５、ＳＯＸ−２、ＵＴＦ−１、及びＺＦＰ４２の一つ以上、好適には全ての発現の減少を示す、先行する任意の請求項に記載の方法。
【請求項２７】
取得した前記間充織幹細胞（ＭＳＣ）は、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、及びＳＯＸ２の一つ以上、好適には全ての発現の減少を示す、先行する任意の請求項に記載の方法。
【請求項２８】
取得した前記間充織幹細胞（ＭＳＣ）は、検出可能なアルカリ性ホスファターゼ活性を示さない、先行する任意の請求項に記載の方法。
【請求項２９】
取得した前記間充織幹細胞（ＭＳＣ）は、複数のＳＣＩＤマウスに移植したとき催奇性を示さない、先行する任意の請求項に記載の方法。
【請求項３０】
取得した細胞培養物は、マウスに特異的なｃ−ｍｏｓ反復配列について陰性であり、ヒトに特異的なａｌｕ反復配列について陽性である、先行する任意の請求項に記載の方法。
【請求項３１】
取得した間充織幹細胞（ＭＳＣ）は、骨形成、脂質生成、あるいは軟骨形成の過程を通過することができ、好適には、骨細胞、含脂肪細胞、あるいは軟骨細胞へと分化することができる、先行する任意の請求項に記載の方法。
【請求項３２】
取得した細胞培養物は、ｈｕＥＳ９．Ｅ１、ｈｕＥＳ９．Ｅ３、あるいはＨ１．Ｅ２を含む、先行する任意の請求項に記載の方法。
【請求項３３】
該方法により選択される複数の間充織幹細胞の二つ以上、好適には全てが、実質的に同一の遺伝子発現プロファイルを示す、先行する任意の請求項に記載の方法。
【請求項３４】
該方法により取得される複数の間充織幹細胞のいずれの二つ以上の分離株間における遺伝子発現相関係数も、０．９を超える、先行する任意の請求項に記載の方法。
【請求項３５】
該方法により取得される複数の間充織幹細胞のいずれの二つ以上の分離株、好適には全ての分離株も、実質的に互いに類似している、あるいは同一である（好適には同種である）、先行する任意の請求項に記載の方法。
【請求項３６】
該方法により取得される一の間充織幹細胞と、一の親培養物における複数の細胞との間の遺伝子発現相関係数は、０．８を超える、先行する任意の請求項に記載の方法。
【請求項３７】
一の間充織幹細胞株を取得する方法であって、
先行する任意の請求項に記載の一の方法を実行する工程と、
そこから選択される前記細胞から一の細胞株を誘導する工程と
を含む方法。
【請求項３８】
一の分化した間葉細胞を取得する方法であって、
請求項１乃至３６のいずれかに記載の一の方法により一の間充織幹細胞を取得、あるいは請求項３７に記載の一の方法により一の間充織幹細胞株を取得する工程と、
細胞培養物、つまり前記間充織幹細胞あるいは前記間充織幹細胞株を分化させる工程と
を含む方法。
【請求項３９】
前記分化した間葉細胞は、一の骨細胞、一の含脂肪細胞、あるいは一の軟骨細胞である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
先行する任意の請求項に記載の一の方法により取得可能な細胞あるいは細胞株。
【請求項４１】
一の胚性幹細胞から一の細胞培養物を誘導する方法であって、
（ａ）一の胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）コロニーを用意する工程と、
（ｂ）前記ｈＥＳＣコロニーを分散させる工程と、
（ｃ）（ｉ）一のフィーダー層が不在の状態において、（ｉｉ）ＦＧＦ２が存在する血清非含有培地において、前記分散による複数の細胞を増殖させる工程と、
（ｄ）そこから一の細胞培養物を誘導する工程と
を含む方法。
【請求項４２】
請求項１乃至３６のいずれかに記載の一の特徴を更に含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
一の疾患の治療方法であって、
請求項１乃至３９のいずれかに記載の一の間充織幹細胞、間充織幹細胞株、あるいは分化後の間充織幹細胞を取得する工程と、
一の間充織幹細胞あるいは間充織幹細胞株から一の分化した細胞を誘導する任意の工程と、
前記間充織幹細胞、間充織幹細胞株、あるいは前記分化後の細胞を一の患者へと投与する工程と
を含む方法。
【請求項４４】
請求項１乃至３９のいずれかに記載の一の方法により取得できる一の間充織幹細胞、間充織幹細胞株、あるいは分化後の間充織幹細胞の、一の個体における一の疾患の治療あるいは予防のための一の薬剤の調製における使用。
【請求項４５】
請求項１乃至３９のいずれかに記載の一の方法により取得できる一の間充織幹細胞、間充織幹細胞株、あるいは分化後の間充織幹細胞を、製薬上容認可能な賦形剤あるいは担体とともに含む薬剤組成。
【請求項４６】
前記疾患は、心不全；骨髄疾患；皮膚疾患；熱傷；糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病等の変性疾患；及び癌からなる群から選択される、請求項４３又は４４に記載の方法。
【請求項４７】
一の細胞培養培地を条件付ける方法であって、
請求項１乃至３９のいずれかに記載の一の方法により取得された一の間充織幹細胞、間充織幹細胞株、あるいは分化後の間充織幹細胞を一の細胞培養培地において培養する工程と、
前記細胞培養培地を分離する任意の工程と
を含む方法。
【請求項４８】
請求項４７に記載の一の方法により取得できる条件付け培地。
【請求項４９】
実施例１０乃至１４のいずれかに記載の一のポリペプチドを取得する方法であって、
請求項１乃至３９に記載の一の間充織幹細胞、間充織幹細胞株、あるいは分化後の間充織幹細胞を取得する工程と、
前記間充織幹細胞、間充織幹細胞株、あるいは分化後の間充織幹細胞から前記ポリペプチドを分離する工程と
を含む方法。
【請求項５０】
請求項４８に記載の一の条件付け培地の、一の個体における一の疾患を治療する一の方法における使用。
【請求項５１】
複数の添付図面における図１乃至９を参照して実質的に以上において記載した通りの、かつ複数の添付図面における図１乃至９に示す通りの、一の細胞培養物を取得する方法。
【請求項５２】
複数の添付図面における図１乃至９を参照して実質的に以上において記載した通りの、かつ複数の添付図面における図１乃至９に示す通りの、一の間充織幹細胞を取得する方法。
【請求項５３】
複数の添付図面における図１乃至９を参照して実質的に以上において記載した通りの、かつ複数の添付図面における図１乃至９に示す通りの、一の細胞培養物を取得する方法。
【請求項５４】
複数の添付図面における図１乃至９を参照して実質的に以上において記載した通りの、かつ複数の添付図面における図１乃至９に示す通りの、細胞培養物、間充織幹細胞、間充織幹細胞株、あるいは分化した間葉細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
２００５年９月２日出願の米国仮特許出願第ＵＳ６０／７１３，９９２号を参照する。
【０００２】
上記の出願、本願及び上記の出願のそれぞれの出願手続き期間におけるものも含めこれらの出願において引用もしくは参照される各文献（「出願及び条文により引用される文献」）、及び上記の出願及び条文のそれぞれ及び出願及び条文により引用される文献のそれぞれにおいて引用もしくは言及されるいかなる製品についてのいかなる製造者による指示書あるいはカタログをも本明細書において参照として取り込むものとする。さらに、本明細書において引用するあらゆる文献、本明細書において引用する文献において引用もしくは参照されるあらゆる文献、及び本明細書あるいは本明細書に取り込んだいかなる文献において引用もしくは参照されるいかなる製品についてのいかなる製造者による指示書あるいはカタログも本明細書において参照として取り込むものとする。本明細書に参照として取り込んだ文献あるいはそれらの教示内容を本発明を実施するべく用いてよい。本明細書に参照として取り込んだ文献は先行技術であると自認するものでない。
【０００３】
本発明は、開発、細胞生物学、分子生物学、及び遺伝学の分野に関する。特に、本発明は、胚性幹細胞から間充織幹細胞を誘導する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
幹細胞は、分化した細胞と異なり、分裂することにより表現型と機能が異なる娘細胞へと自己複製もしくは分化することができる（Ｋｅｌｌｅｒ、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２００５；１９：１１２９−１１５５；Ｗｏｂｕｓ  ａｎｄ  Ｂｏｈｅｌｅｒ、Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ．２００５；８５：６３５−６７８；Ｗｉｌｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．１９９３；２２５：９００−９１８；Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２００５；１０５：３５９−３６８）。
【０００５】
マウスの胚性幹細胞（ＥＳＣ）に多能性があって三つの胚葉全てから細胞へと分化することができることにより、胚性幹細胞は多くの疾患及び組織損傷に対する再生療法に用いられる細胞の理想的な供給源となる（Ｋｅｌｌｅｒ、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２００５；１９：１１２９−１１５５；Ｗｏｂｕｓ  ａｎｄ  Ｂｏｈｅｌｅｒ、Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ．２００５；８５：６３５−６７８）。しかし、胚性幹細胞のまさにこの特性により独特の課題が投げかけられているが、それはつまり、特定の病変組織あるいは損傷組織の治療について治療効果を保証するべく適切な細胞型を十分な量において十分に同質的に生成し、その一方で組織修復及び再生に有害効果をもたらす可能性のあるその他の細胞型の生成を阻害することである。現在、胚性幹細胞が特定の系統へと分化するのを強化し、及び／又は特定の組織の細胞型を濃縮する手順は非常に非効率的であり、癌を発症する可能性のある不均一な細胞集団を産生してしまうことも一般的である（Ｋｅｌｌｅｒ、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２００５；１９：１１２９−１１５５；Ｗｏｂｕｓ  ａｎｄ  Ｂｏｈｅｌｅｒ、Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ．２００５；８５：６３５−６７８）。
【０００６】
間充織幹細胞（ＭＳＣ）は、筋骨格障害の治療、循環器疾患における心臓機能の改善、及びＧＶＨＤの重篤性の軽減において治療効果を有することが立証された多能性幹細胞である（Ｌｅ  Ｂｌａｎｃ  ａｎｄ  Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ、２００５）。間充織幹細胞は、系統が制限されているので、たとえば含脂肪細胞、軟骨細胞、及び骨細胞等の間葉系細胞型へと分化する制限的ではあるが確実な可能性を有しており、奇形腫が形成されるリスクもごく僅かである。宿主による移植ＭＳＣに対する免疫拒絶は、一般的に自己移植もしくは同種異系移植を行うことにより回避する。ＭＳＣは、骨髄（ＢＭ）、脂肪組織（ａｄ）、臍帯血等のいくつかの成体組織から分離して生体外で拡大することができる。しかし、組織を分離できるかについては限られた可能性しかなく、そのためには危険な侵襲的手技を用いる必要があり、ＭＳＣの生体外拡大は有効ではあるが限度がある。
【０００７】
代替的なＭＳＣ供給源としては、無限に拡大可能であり危険性が潜在的に潜む侵襲的技術を用いる必要がなく、かつ多能性である無限に供給され得るヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）が挙げられる。ｈＥＳＣ由来ＭＳＣ（ｈＥＳＣ−ＭＳＣ）に対する宿主の免疫拒絶は、治療型クローニングにより生成した自己移植用のｈＥＳＣ、もしくはｈＥＳＣ株のバンクが拡充されたときには免疫的に適合する同種異系のｈＥＳＣを用いることにより回避することができるであろう。
【０００８】
ｈＥＳＣからＭＳＣあるいはＭＳＣ様細胞を分離することについては既に説明がなされている。Ｂａｒｂｅｒｉらは（２００５）ＰＬｏＳ  Ｍｅｄ２、ｅ１６１において、血清が存在する状態で４０日間にわたってｈＥＳＣをマウスのＯＰ９細胞と共培養し、その後、全細胞集団の約５％を構成するＣＤ７３＋細胞を分類することを含む手順について記載している。Ｘｕ，Ｃ．らは（２００４）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２２、９７２−８０において、ｈＥＳＣ由来胚様体にｈＴＥＲＴを発現したレトロウィルスを感染させることを含む手順について記載している（Ｘｕら）。しかし、これらの手順における重要な要素、つまり、外来性ＤＮＡウィルスへの感染、マウス細胞との接触、及び血清の使用により、腫瘍原性及び異種動物への感染等の受容し難いリスクが持ち込まれ、これらＭＳＣを臨床用途において用いることを不可能としている。
【０００９】
本発明は、当業技術における方法に関するこの、及びその他の問題を解決することを目的とする。
【発明の開示】
【００１０】
請求項に記載する通りの間充織幹細胞（ＭＳＣ）、間充織幹細胞株、分化後の間充織幹細胞、及びこれらを取得し、これらを使用する方法を本発明により提供する。好適実施形態を請求項と説明において記載する。
【００１１】
本発明の実施においては、当業者の能力の範囲内である化学、分子生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ、及び免疫学における従来技術を、断りがない限り用いる。このような技術は、文献において説明されている。たとえば、Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｅ．  Ｆ．  Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＴ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  １９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｂｏｏｋｓ  １−３，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．  Ｍ．ら（１９９５と定期的補遺；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｃｈ．  ９，  １３，及び１６、  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．）； Ｂ．  Ｒｏｅ，  Ｊ．  Ｃｒａｂｔｒｅｅ及びＡ．  Ｋａｈｎ，  １９９６，  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；  J. M.  Ｐｏｌａｋ及びＪａｍｅｓ  Ｏ'Ｄ．  ＭｃＧｅｅ，１９９０，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｉｒｌ  Ｐｒｅｓｓ；  Ｄ．  Ｍ．  Ｊ．  Ｌｉｌｌｅｙ及びＪ．  Ｅ．  Ｄａｈｌｂｅｒｇ，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：  ＤＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐａｒｔ  Ａ：  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；  Ｅｄｗａｒｄ  Ｈａｒｌｏｗ、Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ、Ｅｄ  ＨａｒｌｏｗによるＵｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ＮＯ．  Ｉ （１９９９，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−５４４−７）；Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ（編集者）、Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（編集者）によるＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （１９８８，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３１４−２），  １８５５；  及びＪａｎｅ  Ｒｏｓｋａｍｓ及びＬｉｎｄａ  Ｒｏｄｇｅｒｓ編集によるＬａｂ  Ｒｅｆ：  Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｒｅｃｉｐｅｓ，  Ｒｅａｇｅｎｔｓ，  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｂｅｎｃｈ  ２００２，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−６３０−３を参照されたい。これら一般的テキストのそれぞれを、本明細書において参照として取り込むものとする。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ−１Ｇ】図１Ａ−１Ｇは、ｈＥＳＣ−ＭＳＣ培養物の特性を示す。図１Ａは、位相コントラスト下の細胞形態を示す。図１Ｂは、ｈＥＳＣ−ＭＳＣにおける多能性に関連する遺伝子の発現を示す。転写量は、Ｔａｑｍａｎ型定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定してｈＥＳＣの転写量に対して正規化した。ｈＥＳＣにおける転写量は、ＨｕＥＳ９とＨ１  ｈＥＳＣ株の平均から導出した。図１Ｃは、ＨｕＥｓ９とＨ１  ｈＥＳＣ株、ＨｕＥＳ９．Ｅ１  ＨｕＥＳ９．Ｅ３及びＨ１．Ｅ２  ｈＥＳＣ−ＭＳＣ培養物、及びＥ１４マウスＥＳＣ株における多能性に関連する遺伝子についてのウェスタンブロット分析を示す。図１Ｄは、ＨｕＥＳ９及びＨｕＥＳ９．Ｅ１の腎臓被膜下移植を示す。ＨｕＥ９．Ｅ１（上図）あるいはＨｕＥＳ９（下図）を移植して四ヵ月後の腎臓をパラフィン包埋し、Ｈ−Ｅ染色した断面図である。図１Ｄは、ヒトＨｕＥＳ９  ＥＳＣ株、マウスＥ１４  ＥＳＣ株、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダ、及びＨｕＥＳ９．Ｅ１におけるアルカリ性ホスファターゼ活性を示す。図１Ｆは、ヒトＡｌｕとマウスｃ−ｍｏｓの反復配列が存在するかについてのＰＣＲによるゲノムＤＮＡ分析を示す。図１Ｇは、Ｇバンド（上図）及び分光染色体分析（ＳＫＹ）（中図）によるＨｕＥＳ９．Ｅ１の染色体分析を示す。染色体番号９の逆位を下図に示す。
【００１３】
【図２Ａ−２Ｂ】図２Ａ−２Ｂは、ＦＡＣＳ分析による表面抗原プロファイルを示す。図２Ａは、ＨｕＥＳ９．Ｅ１  ＨｕＥＳ９．Ｅ３及びＨ１Ｅ．２  ｈＥＳＣ−ＭＳＣ、ＨｕＥＳ９  ｈＥＳＣ、及びマウス胚性線維芽細胞支持細胞をＣｙａｎ  ＬＸ（Ｄａｋｏ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ社、カリフォルニア州カーピンテリア所在）器具上で染色して、ＷｉｎＭＤＩソフトウェアを用いて分析したものを示す。細胞が類似した複数のアリコートをイソタイプが一致したマウスモノクローナル抗体と共に定温放置すると、非特異的蛍光発光が測定される。図２Ｂは、ＨｕＥＳ９．Ｅ１とＨｕＥＳ９．Ｅ３  ｈＥＳＣ−ＭＳＣを血清含有ＢＭ−ＭＳＣ培地において二代継代させた後に、ＦＡＣＳ分析によりＢＭ−ＭＳＣと並列的に分析したものを示す。
【００１４】
【図３Ａ−３Ｃ】図３Ａ−３Ｃは、ＨｕＥＳ９．Ｅ１の分化を示す。標準的手順を用いてＨｕＥＳ９．Ｅ１細胞を脂質生成、軟骨形成、及び骨形成へと誘発する。図３Ａは、脂質生成を示す。ｉ）脂質生成を生じてから１４日目に細胞を油滴についてオイルレッドにより染色する；ｉｉ）７日目と１４日目にＰＰＡＲγｍＲＮＡをＴａｑｍａｎ定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定して全ての値をＨｕＥＳ９．Ｅ１の値に対して正規化する；ｉｉｉ）ＨｕＥＳ９とＨＩ  ｈＥＳＣと、それらからの派生物であるＭＳＣ細胞培養物（ＨｕＥＳ９．Ｅ１、ＨｕＥＳ９．Ｅ３、及びＨ１．Ｅ２）と、成体組織由来ＭＳＣ（ＢＭ−ＭＳＣ及びａｄ−ＭＳＣ）とにおけるＴａｑｍａｎ定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した相対的ＰＰＡＲγｍＲＮＡ量を示す。全ての値は、ＨｕＥＳ９．Ｅ１の値に対して正規化されている。図３Ｂは、軟骨形成を示す。ｉ）軟骨形成を生じてから２１日目に細胞をプロテオグリカンについてアルシアンブルーにより染色し（左）、ＨＲＰに基づいた可視化検定（ＨＲＰ−ｂａｓｅｄ  ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）を用いてコラーゲン種類ＩＩに対して免疫活性する；ｉｉ）７日目と１４日目におけるアグレカンとＰＰＡＲγｍＲＮＡをＴａｑｍａｎ定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定し、全ての値をＨｕＥＳ９．Ｅ１の値に対して正規化する；ｉｉｉ）ＨｕＥＳ９とＨＩ  ｈＥＳＣと、それらからの派生物であるＭＳＣ細胞培養物（ＨｕＥＳ９．Ｅ１、ＨｕＥＳ９．Ｅ３、及びＨ１．Ｅ２）と、成体組織由来ＭＳＣ（ＢＭ−ＭＳＣとａｄ−ＭＳＣ）とにおけるＴａｑｍａｎ定量的ＲＴＰＣＲにより測定した相対的ＰＰＡＲγｍＲＮＡ量を示す。全ての値は、ＨｕＥＳ９．Ｅ１の値に対して正規化されている。図３Ｃは、骨形成を示す。ｉ）軟骨形成を生じてから２１日目に細胞を鉱物化についてフォンコッサ染色により染色する；ｉｉ、ｉｉｉ）７日目と１４日目における骨特異的アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）と骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）ｍＲＮＡをＴａｑｍａｎ定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定する。全ての値をＨｕＥＳ９．Ｅ１の値に対して正規化する。
【００１５】
【図４Ａ−４Ｄ】図４Ａ−４Ｄは、遺伝子発現分析を示す。図４ＡはＨｕＥＳ９．Ｅ１、ＨｕＥＳ９．Ｅ３、及びＨ１．Ｅ２により構成される三つのｈＥＳＣ−ＭＳＣ培養物、三つのＢＭＭＳＣ試料、三つのａｄ−ＭＳＣ試料、及びＨｕＥＳ９、Ｈ１、及びＨｅｓ３により構成される三つのｈＥＳＣ株において発現された遺伝子の階層的クラスタリングを示す。図４Ｂは、ｈＥＳＣ−ＭＳＣとＢＭＭＳＣとの間の対ごとの遺伝子発現比較（左）と、ｈＥＳＣ−ＭＳＣとｈＥＳＣとの間の対ごとの遺伝子発現比較（右）を示す。図４Ｃは、ｈＥＳＣ−ＭＳＣとＢＭ−ＭＳＣにおいて共通に発現した遺伝子（２フォールド未満の差異）の分析を示す。Ｐａｎｔｈｅｒによる分類システムを用いて遺伝子を生体内作用に分類する。各生体内作用について２３，４８１種の遺伝子からなるＮＣＢＩ：ホモサピエンス遺伝子データベースにおける遺伝子頻度期待値に対して遺伝子頻度の観察値を比較することにより、各生体内作用において著しく過大表現あるいは過少表現（ｐ＜０．０１）されているかを判断する。著しく過大あるいは過少に表現された作用をグループ化して図に示した。図４Ｄは、ｈＥＳＣ−ＭＳＣとＢＭ−ＭＳＣにおいて異なる発現をした遺伝子（２フォールドを超える差異）の分析を示す。ｈＥＳＣ−ＭＳＣあるいはＢＭ−ＭＳＣにおいて高度に発現した遺伝子により著しく過大にあるいは過少に（ｐ＜０．０１）に表現される生体内作用をグループ化して図に示した。
【００１６】
【図５Ａ−５Ｄ】図５Ａ−５Ｄは、ｈＥＳＣ−ＭＳＣの生成についてのポジティブとネガティブの分類を示す。図５Ａは、ＦＡＣＳ分析を示す。ＨｕＥＳ９．Ｅ１  ＨｕＥＳ９．Ｅ３、及びＨ１．Ｅ２  ｈＥＳＣ−ＭＳＣ、ＨｕＥＳ９  ｈＥＳＣ、及びマウス胚性線維芽細胞支持細胞を染色して、Ｃｙａｎ  ＬＸ（Ｄａｋｏ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ社、カリフォルニア州カーピンテリア所在）器具上でＷｉｎＭＤＩソフトウェアを用いてＣＤ２４が存在するかについて分析する。細胞が類似した複数のアリコートをイソタイプが一致したマウスモノクローナル抗体と共に定温放置すると、非特異的蛍光発光が測定される。図５Ｂは、トリプシン処理し、ＰＤＧＦとＦＧＦ２を添加した培地においてフィーダなしで一週間増殖させたＨｕＥＳ９細胞からのＣＤ１０５＋細胞とＣＤ２４−細胞の分類を示す。Ｑ４に示すＣＤ１０５＋細胞とＣＤ２４−細胞を培養するべく選択する。図５Ｃは、Ｑ４．１とその他のＱ４培養物、つまりＱ４．２乃至Ｑ４．５との間の対ごとの遺伝子発現比較を示す。図５Ｄは、全Ｑ４培養物と、ＨｕＥＳ９．Ｅ１、ＨｕＥＳ９．Ｅ３、及びＨ１．Ｅ２により構成されるｈＥＳＣ−ＭＳＣとの間の対ごとの遺伝子発現比較と、全Ｑ４培養物とＢＭ−ＭＳＣとの間の対ごとの遺伝子発現比較を示す。ｅ）は、Ｑ４．３のＳＫＹ分析を示す。
【００１７】
【図６】図６は、ＨｕＥＳ９．Ｅ１  ＭＳＣ培養物により条件付けた培地のタンパク質分析を示す。８０％コンフルエントなＨｕＥＳ９．Ｅ１細胞培養物をＰＢＳにより三回洗浄して、フェノールレッドを含まず、ＩＴＳ、５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２、５ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ  ＡＢ、グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン、及びβ−メルカプトエタノールを添加したＤＭＥＭ培地により構成される化学的に定義された培地において一晩培養する。次に、培養物をＰＢＳにより三回洗浄して、定義された新たな培地に交換する。培地のアリコートを、０時間、２４時間、４８時間、及び７２時間後に除去し、５００×ｇにおいて遠心分離し、その浮遊物を０．２μフィルターにかける。培地の１０μｌを４−１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離して銀に染色する。
【００１８】
【図７】図７は、抗体アレイを示す。条件付け培地（ＣＭ）あるいは非条件付け培地（ＮＣＭ）の１ｍｌをＲａｙＢｉｏ（登録商標）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｒｒａｙを用いて、製造者（ＲａｙＢｉｏ  Ｎｏｒｃｒｏｓｓ社、ジョージア州所在）の指示に従って定温放置する。各アレイの抗体マップを実施例に示す。リガンドの特定的な抗体への結合を、ＨＲＰ型化学発光検定に基づいて可視化する。各膜の異なる露出（ｅｘｐｏｓｕｒｅ）を分析する。ＣＭと交配した膜上に信号が存在し、ＮＣＭと交配した膜上に信号が存在しないならば抗原は存在するものとする。ＣＭとＮＣＭの四つの個別のバッチについての分析から得られたデータを実施例において要約する。
【００１９】
【図８】図８は、２０１種の遺伝子産物の生体内作用への分類を示す。２０１種の遺伝子を、ＧＯ分類システムにおける各生体内作用へと分類する。Ｕｎｉｇｅｎｅ、Ｅｎｔｒｅｚ、及びＧｅｎＢａｎｋから照会したデータベースにおける遺伝子頻度に比較して、ｐ値＜０．０５において、分泌されたプロテオームにおける遺伝子頻度により過大に表現される５８種の生体内作用を三つの大分類、つまり、代謝、防御応答、及び組織分化へと分類する。
【００２０】
【図９】図９は、２０１種の遺伝子産物の経路への分類を示す。２０１種の遺伝子を、ＧＯ分類システムにおける各経路へと分類する。Ｕｎｉｇｅｎｅ、Ｅｎｔｒｅｚ、及びＧｅｎＢａｎｋから照会したデータベースにおける遺伝子頻度に比較して、ｐ値＜０．０５において、分泌されたプロテオームにおける遺伝子頻度により過大に表現される３０種の生体内作用をいくつかの大分類、つまり、受容体結合、シグナル変換、細胞間相互作用、細胞移動、免疫反応、及び代謝へと分類する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
間充織幹細胞（ＭＳＣ）の取得
間充織幹細胞（ＭＳＣ）あるいはＭＳＣ様細胞をｈＥＳＣから取得する従来方法においては、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）遺伝子を分化過程にあるｈＥＳＣへとトランスフェクションすること（Ｘｕら、２００４）、あるいはマウスＯＰ９細胞株と共培養すること（Ｂａｒｂｅｒｉら、２００５）が行われる。これらの誘導手順においては外来性遺伝物質及びマウス細胞を用いるので、腫瘍原性あるいは異種動物からの感染体への感染という受容し難いリスクが持ち込まれる。
【００２２】
対照的に、本方法においては類似した、あるいは同一の（好ましくは同種の）ＭＳＣ集団を分化中のｈＥＳＣから分離するための臨床的に意義があり再現性のある手順を提供する。全般的に、本方法においては胚性幹（ＥＳ）細胞コロニーを細胞へと分散させることが含まれる。次に細胞をプレーティングして増殖させる。細胞は、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）を含む血清非含有培地において共培養物が存在しない状態で増殖させて、間充織幹細胞（ＭＳＣ）を取得する。
【００２３】
したがって、本手順においては、血清、マウス細胞の使用、及び遺伝子操作が必要でなく作業と時間が節約されるので拡張性が高い。実施例においては、二種の異なるｈＥＳＣ株、つまりＨｕＥＳ９及びＨ−１から、及び第三の種であるＨｅｓ−３２３からＭＳＣを分離する方法について記載し、手順の確実性を証明する。本明細書に記載する方法及び組成により取得されるヒトＥＳ細胞由来ＭＳＣ（ｈＥＳＣ−ＭＳＣ）は骨髄由来ＭＳＣ（ＢＭ−ＭＳＣ）に非常に類似している。
【００２４】
好適実施形態においては、胚性幹細胞培養はヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の培養を含む。
【００２５】
一実施形態においては、間充織幹細胞（ＭＳＣ）を生成する方法には、ＦＧＦ２及び任意でＰＤＧＦ  ＡＢを添加した培地においてフィーダを用いずにｈＥＳＣをトリプシン処理して増殖させ、ＣＤ１０５＋細胞、ＣＤ２４−細胞を分類することが含まれる。
【００２６】
好適実施形態においては、方法にはＦＧＦ２及び任意でＰＤＧＦ  ＡＢを添加した培地においてフィーダなしで増殖した一週間後にトリプシン処理したｈＥＳＣからＣＤ１０５＋細胞、ＣＤ２４−細胞を分類し、少なくともいくつかの、好適には実質的に全ての、より好適には全ての細胞が互いに類似あるいは同一（好適には同種）であるｈＥＳＣ−ＭＳＣ細胞培養物を生成することが含まれる。
【００２７】
ＢＭ−ＭＳＣに物理的、生物学的、機能的に類似かつ臨床的意義を有するｈＥＳＣＭＳＣ培養物を生成するための本明細書に記載する方法により、多くの臨床的、前臨床的動物実験において治療効果を示したＢＭ−ＭＳＣを分離する元であるＢＭの供給が得難いことの不便が軽減される可能性がある１０、２５。これにより、さらに、危険性のある侵襲的ＢＭ吸引手順が不要となり、待機時間と患者ごとにＢＭ−ＭＳＣを調製するコストとが節減され、かつバッチごとのバラツキが低減する。さらに、ｈＥＳＣ等の定義された細胞型からＭＳＣが誘導される確実性により、現在広範に臨床的及び前臨床的利用がなされているにも関わらず解明されていない点を残すＭＳＣの誘導および生態について研究しより良い理解を構築するための利便的なモデルが提供される９。
【００２８】
本プロセスにより生成される間充織幹細胞のその他の用途としては、臨床的あるいは前臨床的用途における成体組織由来ＭＳＣに対する代替、ヒトＥＳＣ等のその他の細胞型を増殖させるためのフィーダとしての成体組織由来ＭＳＣに対する代替、臍帯血もしくは骨髄の幹細胞集団の拡大、及びＭＳＣにより条件付ける循環器疾患治療用培地の調製が挙げられる。
【００２９】
胚性幹細胞コロニーの分解
間充織幹細胞を生成する本方法には、胚性幹細胞コロニーを細胞へと分散あるいは分解することが含まれる。
【００３０】
胚性幹細胞コロニーにはｈｕＥＳ９コロニー（Ｃｏｗａｎ  ＣＡ、Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ  Ｉ、ＭｃＭａｈｏｎ  Ｊ、Ａｔｉｅｎｚａ  Ｊ、Ｗｉｔｍｙｅｒ  Ｊらによる（２００４）  Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５０：１３５３−１３５６）、あるいはＨ１  ＥＳＣコロニー（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＪＡ、Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒ  Ｊ、Ｓｈａｐｉｒｏ  ＳＳ、Ｗａｋｎｉｔｚ  ＭＡ、Ｓｗｉｅｒｇｉｅｌ  ＪＪらによる（１９９８）  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ２８２：１１４５−１１４７）がある。
【００３１】
好適には、コロニーに含まれる細胞を相当程度に、つまり少なくともクランプレベルへと分解し、あるいは分散させる。より好適には、コロニーに含まれる細胞の全てが単体となる、つまりコロニーが完全に分解されるまでコロニーを分解し、あるいは分散させる。
【００３２】
分散剤を用いて分解を行ってよい。
【００３３】
分散剤は、コロニーに含まれる胚性幹細胞の少なくともいくつかを互いから分離することができるものであればいかなるものであってもよい。分散剤は、コロニーに含まれる細胞間の接着、細胞と基板との接着、あるいはこの両方を分離する試薬を含んでいることが好適である。分散剤は、プロテアーゼを含んでいることが好適である。
【００３４】
好適実施形態においては、分散剤はトリプシンを含む。トリプシンを用いた処理をたとえば摂氏３７度において約三分間継続してよい。次に細胞をプレーティング前に中和し、遠心分離して、培地に再懸濁してよい。
【００３５】
好適実施形態においては、本方法には、プレート上のコンフルエントなヒト胚性幹細胞をトリプシンを用いて分散させ、細胞をプレーティングすることが含まれる。
【００３６】
分解処理には以下の手順の少なくともいくつかを含めてよく、それらは、吸引、洗浄、トリプシン処理、定温放置（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）、ディスロッジ（ｄｉｓｌｏｄｇｉｎｇ）、抑制（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）、再シード、及びアリコート単位への分割（ａｌｉｑｕｏｔｉｎｇ）である。サンディエゴ所在のカリフォルニア大学のＨｅｄｒｉｃｋ研究所からの以下の手順を適合させる（ｈｔｔｐ：／／ｈｅｄｒｉｃｋｌａｂ．ｕｃｓｄ．ｅｄｕ／Ｐｒｏｔｏｃｏｌ／ＣＯＳＣｅｌｌ．ｈｔｍｌ）。
【００３７】
吸引工程においては、培地を吸引する、あるいは一般的に説明すると、フラスコ等の容器から取り出す。洗浄工程においては、好適にはＣａ２＋及びＭｇ２＋を含まないたとえば５乃至１０ミリリットルの緩衝化した溶剤により細胞を洗浄する。たとえば、カルシウムとマグネシウムを含まないＰＢＳにより細胞を洗浄してよい。トリプシン処理工程においては、緩衝液中のある量の分散剤を容器に加え、容器を回転して成長面に分散剤溶液を塗布する。たとえば、ハンクス液中における１ミリリットルのトリプシンをフラスコに加えてよい。
【００３８】
定温放置工程においては、一定に維持された温度下に細胞をしばらく放置する。たとえば、細胞を摂氏３７度において数分間（たとえば、２乃至５分間）放置してよい。ディスロッジ工程においては、機械的動作により、たとえば容器の側面を手でこすったり強く打ったりすることにより細胞を固定された位置から取り外してよい。細胞はシート状にはがれ、容器側面を滑落するはずである。
【００３９】
抑制工程においては、ある量の培地をフラスコに加える。培地には分散剤の作用を停止させる中和剤が含まれていることが好適である。たとえば、分散剤がトリプシン等のプロテアーゼである場合、プロテアーゼの作用を掃討する血清タンパク質等のタンパク質を培地に含めてよい。特定例においては、３ミリリットルの血清含有細胞培養培地をフラスコに加えて全体で４ミリリットルの培地を生成してよい。細胞をピペットで採取することにより細胞をディスロッジし、もしくは分散させてよい。
【００４０】
再シード工程においては、細胞を新たな培養容器に再シードし、未使用の培地を添加する。再シードを分割比を変更して何通りか行ってよい。たとえば、細胞の再シードを１／１５希釈及び１／５希釈において行ってよい。特定例においては、培養物に再シードするべく１滴の細胞を２５ｃｍ２のフラスコに添加し、３滴の細胞を別の２５ｃｍ２フラスコに添加し、次に７乃至８ミリリットルの培地を各々に添加して、たとえば７５ｃｍ２フラスコにおいて１／１５希釈及び１／５希釈を調製することにより細胞の再シードを行ってよい。アリコート分割工程においては、細胞を未使用の皿へとアリコート単位で、あるいは所望のいかなる分割比において分配し、培地を添加する。
【００４１】
細胞培養物として保存
分解した細胞をプレーティングして細胞培養物として保存する。
【００４２】
細胞を培養容器あるいはゼラチン化プレート等の基板にプレーティングしてよい。極めて重要なことであるが、共培養物の存在がなくても、たとえば支持（フィーダ）細胞が不在の状態においても細胞は成長し増殖する。
【００４３】
細胞培養物に含まれる細胞は、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）等の一種以上の成長因子及び任意で血小板由来増殖因子ＡＢ（ＰＤＧＦ  ＡＢ）を添加した血清を含有しない培地において、たとえば１ミリリットル当たり５ナノグラムとなるまで成長させる。細胞培養物に含まれる細胞がコンフルエントになったときに、１対４で好適には分割して、トリプシン処理を施し、洗浄し、再プレーティングすることにより継代培養を行う。
【００４４】
共培養物の不在
非常に好ましい実施形態においては、本方法によると共培養物が不在の状態において細胞を培養する。用語「共培養」は、たとえば間質支持細胞等を含む二種以上の異なる種類の細胞を混合して共に成長させることを指す。
【００４５】
したがって、通常のＥＳ細胞培養においては、マウスの胚性皮膚細胞にこれら細胞の分離を防ぐ処理を施して形成したフィーダ層で培養皿の内面を通常被覆する。フィーダ層が接着面となりＥＳ細胞が付着して成長することが可能となる。また、支持細胞は培養培地中にＥＳ細胞の成長に必要となる栄養物を放つ。本明細書において記載する方法及び組成においては、このような共培養物が不在の状態でＥＳ細胞とＭＳＣ細胞を培養する。
【００４６】
好適には、細胞を単分子層として、つまり支持細胞が不在の状態で培養する。本明細書に記載の方法の好適実施形態によると、支持細胞が不在の状態で胚性幹細胞を培養して間充織幹細胞（ＭＳＣ）を樹立する。
【００４７】
好適実施形態においては、解離／分解した胚性幹細胞を培養基板上に直接的にプレーティングする。培養基板はペトリ皿等の組織培養容器であってよい。容器には事前処理を施してよい。好適実施形においては、ゼラチン化した組織培養プレート上に細胞をプレーティングし、その上で成長させる。
【００４８】
皿に対するゼラチン被覆手順の例を述べる。０．１％のゼラチン蒸留水溶液を調製して加圧滅菌処理する。これを室温で保存してよい。組織培養皿の底面をゼラチン溶液で覆って５乃至１５分間定温放置する。ゼラチンを除去するとプレートは使用可能となる。低張溶解を防止するには細胞を添加する前に培地を添加すべきである。
【００４９】
血清非含有培地
解離／分解した胚性幹細胞を好適には血清を含まない培地において培養する。
【００５０】
用語「血清非含有培地」の定義には、たとえばウシ胎仔血清等の血清タンパク質が含まれない細胞培養培地が含まれる。血清非含有培地は当業技術分野において周知であり、たとえば米国特許第５，６３１，１５９号及び第５，６６１，０３４号において記載されている。血清非含有培地は、たとえばＧｉｂｃｏ−ＢＲＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社が市販している。
【００５１】
血清非含有培地は、タンパク質、加水分解物、及び未知の組成の成分を含まないのでタンパク質非含有と言ってもよい。血清非含有培地は、全ての成分が既知の化学構造を有する既知組成培地であってよい。既知組成の血清非含有培地は、バラツキがなく、再現性が向上してより一貫した性能を持ち、外来物質による汚染の可能性が低減した完全に定義されたシステムを可能とするので有利である。
【００５２】
好適実施形態においては、血清非含有培地は、ノックアウトＤＭＥＭ培地（ニューヨーク州グランドアイランド所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ社）である。
【００５３】
血清代替物培地等の一種以上成分をたとえば濃度５％、１０％、１５％等において血清非含有培地に添加してよい。好適には、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ社（ニューヨーク州グランドアイランド所在）から入手できる１０％の血清代替物培地を血清非含有培地に添加する。
【００５４】
成長因子
解離／分解した胚性幹細胞が培養された血清非含有培地には、好適には一種以上の成長因子が含まれる。当業技術分野においては多数の成長因子が知られており、それらには、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−ａ、ＦＧＦ、ＮＧＦ、エリスロポエチン、ＴＧＦ−ｂ、ＩＧＦ−Ｉ、及びＩＧＦ−ＩＩが含まれる。
【００５５】
好適実施形態においては、成長因子は、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）である。培地には、血小板由来増殖因子ＡＢ（ＰＤＧＦ  ＡＢ）等のその他の成長因子も含めてよい。これら成長因子は両方とも当業技術分野において周知である。非常に好適な実施形態よると、本方法においては、ＦＧＦ２とＰＤＧＦ  ＡＢの両方を含む培地で細胞を培養する。
【００５６】
ＦＧＦ２は、多くの組織と細胞型においては低レベルで発現し、脳と下垂体において高濃度である広域の分裂促進、血管新生、神経栄養因子である。ＦＧＦ２は、四肢発生、血管形成、創傷治癒、腫瘍成長等の多数の生理学的病理学的なプロセスに関連してきた。ＦＧＦ２は、たとえばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ社（ニューヨーク州グランドアイランド所在）から市販されている。
【００５７】
血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）は、線維芽細胞、平滑筋、及び結合組織を含む広範囲の細胞型に対する潜在的な分裂促進因子である。Ａ鎖とＢ鎖の二本の鎖による二量体から構成されるＰＤＧＦは、ＡＡあるいはＢＢのホモ二量体、あるいはＡＢのヘテロ二量体として存在することができる。ヒトＰＤＧＦ−ＡＢは、１３．３ｋＤａのＡ鎖と１２．２のＢ鎖から構成される２５．５ｋＤａのホモ二量体タンパク質である。ＰＤＧＦ  ＡＢは、たとえばＰｅｐｒｏｔｅｃｈ社（ニュージャージー州ロッキーヒル所在）が市販している。
【００５８】
成長因子は、好適にはＦＧＦ２であり、任意にＰＤＧＦ  ＡＢを用いてよいが、培地中に好適には約１００ｐｇ／ｍｌ、好適には約５００ｐｇ／ｍｌ、好適には約１ｎｇ／ｍｌ、好適には約２ｎｇ／ｍｌ、好適には約３ｎｇ／ｍｌ、好適には約４ｎｇ／ｍｌ、最も好適には約５ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する。好適実施形態においては、培地には、約５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２が含まれる。培地には、好適には約５ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ  ＡＢも含めてよい。
【００５９】
細胞分割
培養中の細胞は、一般的に、接触阻止により細胞分裂と成長が停止するコンフルエントな状態になるまで成長し続ける。これら細胞を次に、基板あるいはフラスコから解離させて「分割」し、組織培養培地に希釈して再プレーティングすることにより継代培養し、何代か継代させる。
【００６０】
本明細書に記載する方法と組成においては、したがって、培養中に継代あるいは分割を行ってよい。好適には、細胞培養物に含まれる細胞を１：２あるいはそれ以上の比、好適には１：３、より好適には１：４、１：５あるいはそれ以上の比において分割する。用語「継代」は、細胞株のコンフルエントな培養物のアリコートを採取して、新たな培地に植菌し、コンフルエントな状態つまり飽和状態に達するまで株を培養することを含むプロセスを指す。
【００６１】
選択、スクリーニング、あるいは分類工程
非常に好適な実施形態によると、本方法においては、さらに間充織幹細胞を分離し選択するための選択あるいは分類工程をさらに行う。
【００６２】
選択あるいは分類工程においては、一種以上の表面抗原マーカーにより細胞培養物から間充織幹細胞（ＭＳＣ）を選択する。選択あるいは分類工程を行うことにより、分類や選択におけるＭＳＣ選択性の厳重性がより一層増し、出発物質としてのｈＥＳＣ等の胚性幹細胞、及びその他のｈＥＳＣ派生物等が混入する可能性が低減される可能性がある。これによりさらに奇形腫が形成されるリスクが低減し、ここに記載する手順の臨床的関連が増すであろう。
【００６３】
抗原発現に基づく選択あるいは分類の方法が数多く知られており、これらのいずれを本明細書に記載する選択あるいは分類工程において用いてもよい。特に好適な実施形態においては、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）により選択あるいは分類を行う。したがって、当業技術分野において周知であるように、ＦＡＣＳにおいては、細胞が発現する抗原に結合して標識する標識抗体等のレポーターに細胞を暴露する。抗体を産生して標識することによりレポーターを形成する方法は当業技術分野において周知であり、たとえばＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅに記載されている。次に細胞をＦＡＣＳ機にかけ、細胞は、標識に基づいて互いに対して分類される。
【００６４】
たとえばＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＡＮＰＥＰ、ＩＴＧＡ４（ＣＤ４９ｄ）、ＰＤＧＦＲＡ等のＭＳＣに関連する多くの表面抗原候補が知られている一方で、たとえばＣＤ２９とＣＤ４９ｅ等のいくつかのＭＳＣ関連表面抗原はｈＥＳＣ等のＥＳ細胞においても高度に発現されることが判明し、ＥＳ細胞におけるそれらの発現をＦＡＣＳ分析により認証した。表面抗原がＭＳＣと関連性を有するというだけではその抗原をｈＥＳＣ等のＥＳ細胞からＭＳＣを分離するための選択マーカーとして認証するのに十分ではないおそれがある。したがって、選択あるいは分類工程においては、好適にはＭＳＣとＥＳ細胞とでは異なって発現される抗原を用いる。
【００６５】
本方法における選択あるいは分類工程においては、抗原発現に基づいて間充織幹細胞をポジティブに選択してよい。ｈＥＳＣ及びｈＥＳＣＭＳＣの遺伝子発現プロファイルを実施例に記載するように比較することによりこれら抗原を同定してよい。特定的な実施形態によると、選択あるいは分類においては、以下に示す表Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂに示す抗原のいずれを用いてもよい。
【００６６】
好適実施形態によると、本方法の選択あるいは分類工程においては、ＭＳＣ上での発現が確認されるが、ｈＥＳＣ等のＥＳ細胞上での発現が確認されない抗原が発現されたことに基づいて間充織幹細胞をポジティブに選択してよい。
【００６７】
したがって、実施例において示すように、ＣＤ７３がＭＳＣ上において高度に発現され３、ｈＥＳＣ上では高度に発現されないことを実例により説明する（図４Ａ）。さらに、実施例において実例説明するように、ＣＤ７３とＣＤ１０５はともに、ＭＳＣにおいて高度に発現される表面抗原であり、ｈＥＳＣに比較してｈＥＳＣ−ＭＳＣにおいて高度に発現される上位二十位の表面抗原（図３、表）のうち、ＣＤ７３あるいはＣＤ１０５（あるいは両方）を推定ＭＳＣに対する選択マーカーとして用いることは、ｈＥＳＣが分化することにより生成される推定ＭＳＣを分類する上ではどちらも等分に有効である。
【００６８】
選択あるいは分類工程においては、上記の代替として、あるいは上記に追加して、ｈＥＳＣ−ＭＳＣ等の間充織幹細胞でなくｈＥＳＣ等の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）上で表面抗原として高度に発現される表面抗原に基づいて抗原を選択しないネガティブな方法を行ってよい。ｈＥＳＣに対して特異的なＭＩＢＰ、ＩＴＧＢ１ＢＰ３、ＰＯＤＸＬ２２、ＣＤ２４等の周知の、つまり既に同定されている表面抗原に基づいて選択あるいは分類を行ってよい。
【００６９】
実施例においては、ＦＡＣＳ分析によりＣＤ２４がｈＥＳＣにおいては発現されｈＥＳＣ−ＭＳＣにおいては発現されなかったことが確認されたことを示す。したがって、分化中のｈＥＳＣ培養物から推定ＭＳＣを分離するべく、ネガティブな選択／分類マーカーをそれ単体で、あるいはポジティブ選択マーカーとしてのＣＤ１０５と共に用いてよい。
【００７０】
重要なことであるが、間充織幹細胞は、自己複製を継続させるのに形質転換させる必要がない。したがって、本明細書に記載する方法においては間充織幹細胞を生成するにおいて、たとえば、癌細胞あるいは癌細胞株等の不死化細胞との融合、ＳＶ４０、ＥＢＶ、ＨＢＶあるいはＨＴＬＶ−１等の形質転換ウィルスに細胞株をウィルス感染させること、たとえばラージＴ抗原配列を含むＳＶ４０ベクター（Ｒ．Ｄ．Ｂｅｒｒｙら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、５７、２８７−２８９、１９８８）、テロメラーゼ（Ｂｏｄｎａｒ−Ａ−Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）２７９：ｐ．３４９−５２）、あるいはヒト・パピローマウィルスのＤＮＡ配列を含むベクター（米国特許第５，３７６，５４２号）等の目的に特化して調節したベクターを用いたトランスフェクション、優性癌遺伝子の導入、突然変異等の周知の形質転換処理は必要でない。
【００７１】
好適実施形態においては、間充織幹細胞と細胞株（あるいは、これらから誘導される分化細胞）は胚性幹細胞の特質の一以上を示さない。そのような特質の好適なものとしては、ＯＣＴ４遺伝子の発現とアルカリ性ホスファターゼ活性が挙げられる。好適には、間充織幹細胞は多能性を示す一以上の特徴的なマーカーの発現量が少ない。このような多能性マーカーを以下に更に詳細に記載するが、Ｎａｎｏｇ、ＢＭＰ４、ＦＧＦ５、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ−２、及びＵｔｆ１が含まれる。
【００７２】
本明細書に記載の方法により生成した間充織幹細胞は、非発癌性であることが好適である。好適には、免疫機能が低下した、あるいは免疫不全の宿主動物に移植したときに間充織幹細胞は腫瘍とならず、これは、移植することにより腫瘍形成に至る親の胚性幹細胞とは対照的である。好適には、免疫機能が低下した、あるいは免疫不全の宿主動物はＳＣＩＤマウスあるいはＲａｇ１‐／‐マウスである。好適には、間充織幹細胞は、移植後に好適には二週間超、より好適には二ヶ月超、最も好適には九ヶ月超の長期間が経過しても腫瘍を形成しない。発癌性検査のための詳細な手順を実施例において記載する。
【００７３】
さらに、本明細書に記載する方法により生成した間充織幹細胞は好適には以下の特徴の一以上を示す。つまり、間充織幹細胞は、好適には少なくとも十世代に亘り細胞培養物中で維持しても、染色体数から判断される核型が実質的に安定している。さらに、間充織幹細胞は、好適には世代が変わっても実質的に安定した遺伝子発現パターンを示す。この記載により、選択した遺伝子セットにおける一種以上、好適には実質的に全ての遺伝子の発現レベルにはある世代の間充織幹細胞とその次世代の間充織幹細胞との間で有意なバラツキが示されないということを示唆するものである。
【００７４】
好適には、遺伝子セットには、以下に示すうちの一種以上、サブセット、あるいは全てが含まれる：ケルベロス（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿００９８８７、ＡＦ０３１８９６、ＡＦ０３５５７９）、ＦＡＢＰ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿００７９８０、Ｍ６５０３４、ＡＹ５２３８１８、ＡＹ５２３８１９）、Ｆｏｘａ２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿０１０４４６、Ｘ７４９３７、Ｌ１０４０９）、Ｇａｔａ−１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿００８０８９、Ｘ１５７６３、ＢＣ０５２６５３）、Ｇａｔａ−４（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿００８０９２、ＡＦ１７９４２４、Ｕ８５０４６、Ｍ９８３３９、ＡＢ０７５５４９）、Ｈｅｓｘ１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿０１０４２０、Ｘ８００４０、Ｕ４０７２０、ＡＫ０８２８３１）、ＨＮＦ４ａ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿００８２６１、Ｄ２９０１５、ＢＣ０３９２２０）、ｃ−ｋｉｔ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿０２１０９９、Ｙ００８６４、ＡＹ５３６４３０、ＢＣ０７５７１６、ＡＫ０４７０１０、ＢＣ０２６７１３、ＢＣ０５２４５７、ＡＫ０４６７９５）、ＰＤＧＦＲα（ＮＭ＿０１１０５８、Ｍ５７６８３、Ｍ８４６０７、ＢＣ０５３０３６）、Ｏｃｔ４（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿０１３６３３、Ｘ５２４３７、Ｍ３４３８１、ＢＣ０６８２６８）、Ｒｕｎｘ１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿００９８２１、Ｄ２６５３２、ＢＣ０６９９２９、ＡＫ０５１７５８）、Ｓｏｘ１７（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿０１１４４１、Ｄ４９４７４、Ｌ２９０８５、ＡＫ００４７８１）、Ｓｏｘ２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿０１１４４３、Ｕ３１９６７、ＡＢ１０８６７３）、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（ＮＭ＿００９３０９、Ｘ５１６８３）、ＴＤＧＦ１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿０１１５６２、Ｍ８７３２１）、及びＴｉｅ−２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿０１３６９０、Ｘ６７５５３、Ｘ７１４２６、Ｄ１３７３８、ＢＣ０５０８２４）。
【００７５】
本明細書に記載する方法により、間充織幹細胞と間充織幹細胞のクローン子孫である分化細胞の産生が可能になる。細胞の「クローン子孫」 との用語は、実質的にいかなる形質転換処理も施さず遺伝子変化も生じていない細胞の子孫を指す。このようなクローン子孫は、実質的にゲノム変異を生じておらず、親細胞もしくは祖先、好適には胚性幹細胞と実質的に遺伝学的に同一である（能力は減少している）。用語「間充織幹細胞」は、間充織幹細胞由来の細胞株、つまり間充織幹細胞株も好適には定義範囲に含むべきであり、間充織幹細胞株との用語にも間充織幹細胞を定義範囲に含めるべきである。
【００７６】
前駆細胞の誘導
好適実施形態によると、本明細書に記載の方法には、更に間充織幹細胞を選択あるいはスクリーニングする工程を含めてよい。
【００７７】
この追加工程は、上記の工程の前に、上記の工程の間に、上記の工程の後に行ってよい。実際に追加工程は、独立に実行してよく、具体的には、ＥＳ細胞から一以上の前駆細胞あるいは細胞株を誘導することを行ってよい。
【００７８】
したがって、間充織幹細胞を誘導する代替的方法を開示する。この方法には、（ａ）胚性幹（ＥＳ）細胞を用意すること、（ｂ）胚性幹細胞から前駆細胞株を樹立するにおいて、前駆細胞株をその自己複製能力に基づいて選択することが含まれる。
【００７９】
しかし、好適には、これら方法は並列に実施してよい。したがって、たとえば、これら方法においては、分散工程あるいは増殖工程の前、最中、あるいは後に胚性幹細胞から前駆細胞あるいは前駆細胞株を誘導する。したがって、本方法においては、たとえば、胚性幹（ＥＳ）細胞コロニーあるいはその子孫を分散させることにより取得される細胞を用意し、胚性幹細胞から一以上の前駆細胞あるいは前駆細胞株を誘導してＦＧＦ２を含む血清非含有培地において共培養物が不在の状態において細胞を増殖させることにより間充織幹細胞（ＭＳＣ）を取得してよい。
【００８０】
好適には、前駆細胞株をその自己複製能力に基づいて選択し、あるいは、本方法においては、体細胞をその自己複製不能性に基づいて選択しないことにより、あるいはこの両方により前駆細胞株の選択を行ってよい。
【００８１】
好適実施形態においては、共培養物が不在の状態において、好適には支持細胞が不在の状態において前駆細胞株を誘導あるいは樹立する。共培養物が不在であることにより、胚性幹細胞が選択されるのが阻まれることが好適である。
【００８２】
好適実施形態においては、前駆細胞株を形質転換させることなしに樹立する。胚性幹細胞あるいはその子孫を、推定前駆細胞の自己複製を促進する条件下に暴露することにより前駆細胞株を樹立してよい。自己複製促進条件は、胚性幹細胞の増殖を阻害する条件であることが好適である。
【００８３】
自己複製促進条件とは、富栄養培地で成長を行うことであってよい。自己複製促進条件とは、ＬＩＦが不在の状態において細胞を成長させることであることが更に好適である。自己複製促進条件には、連続的に継代させることが含まれることが好適である。自己複製促進条件として、少なくとも１２世代に亘る継代を行うことを挙げることが好適である。
【００８４】
好適実施形態においては、前駆細胞株は、胚性幹細胞に比較して能力が低下している。前駆細胞株は系統が制限されており、好適には多能性でないことが好適である。前駆細胞株は、発癌性でないことが好適である。
【００８５】
前駆細胞株を誘導する工程には、特定の系統への分化を強化する条件に胚性幹細胞を暴露する工程が含まれることが好適である。分化強化条件としては、胚性幹細胞から胚様体を生成することが好適である。多能性を喪失させた後に細胞を分化強化条件から解放することが好適である。
【００８６】
細胞を系統制限促進条件から解放するには、胚様体を分解することが好適である。本方法においては、３日ないし６日間成長させた胚様体を分解することが好適である。
【００８７】
好適実施形態においては、前駆細胞株はＯＣＴ４及びアルカリ性ホスファターゼ活性のいずれかあるいは両方の発現が減少しているか、あるいは実質的に全く発現させない。
【００８８】
前駆細胞株は、その由来元である胚性幹細胞に比較して、Ｎａｎｏｇ、ＢＭＰ４、ＦＧＦ５、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ−２、Ｕｔｆ１からなる群から選択されることが好適である多能性マーカーの発現が減少する。
【００８９】
好適実施形態においては、前駆細胞株は、以下の特性の一以上を示す：（ａ）４０世代を超えて細胞培養物中で維持可能である、（ｂ）少なくとも１０世代に亘って細胞培養物に維持しても、核型あるいは染色体数が実質的に安定している、（ｃ）世代が変わっても遺伝子発現パターンが実質的に安定している。
【００９０】
前駆細胞株は、レシピエント動物、好適には免疫機能が低下したレシピエント動物に移植した後、好適には三週間、より好適には二乃至九ヶ月が経過しても奇形腫の形成を生じないことが好適である。
【００９１】
胚性幹細胞あるいは前駆細胞株は、哺乳類の、好適にはマウスあるいはヒトの胚性幹細胞あるいは前駆細胞株であることが好適である。
【００９２】
前駆細胞株は、内皮前駆細胞株、好適にはＥ−ＲｏＳＨ細胞株であることが好適である。あるいは、もしくは更に、前駆細胞株は、間葉系前駆細胞株、好適にはｈｕＥＳ９．Ｅ１細胞株であってよい。
【００９３】
いくつかの実施形態においては、本方法にはさらに（ｄ）前駆細胞株から分化細胞を誘導する工程が含まれる。
【００９４】
前駆細胞株は、分化させるに先立って、少なくとも５世代に亘って増殖させることが好適である。
【００９５】
（ａ）胚性幹細胞から前駆細胞株を誘導し、（ｂ）前駆細胞株を増殖させ、（ｃ）前駆細胞株から分化細胞を誘導することを含む胚性幹（ＥＳ）細胞から分化細胞を生成する方法を提供する。
【００９６】
（ａ）胚性幹（ＥＳ）細胞を用意し、（ｂ）胚性幹細胞から前駆細胞を誘導し、（ｃ）自己複製能力により選択した前駆細胞から前駆細胞株を樹立することを含む方法を提供する。
【００９７】
本方法は具体的には、胚性幹（ＥＳ）細胞から分化細胞を生成するために用いる。分化細胞は内皮細胞あるいは間葉細胞であることが好適である。分化細胞は、含脂肪細胞あるいは骨細胞であることがより好適である。
【００９８】
本発明の上記のいずれかの観点に係る方法により産生される前駆細胞株を提供する。
【００９９】
本明細書に記載する方法及び組成には、選択あるいはスクリーニングあるいはその両方を行うに当たって上記のようなＭＳＣのその他の要因あるいは特性を利用する工程を更に含めてよい。
【０１００】
分化の偏倚
好適実施形態においては、特定の系統の胚性幹細胞由来前駆細胞株を生成する方法には、更に、胚性幹細胞の分化を所望の特定の系統あるいは懸案の系統へと偏倚させる第一工程を含めることが好適である。本方法においては、推定前駆細胞の自己複製を促進し、胚性幹細胞の増殖を阻害する第二工程を含めてもよい。
【０１０１】
第一工程においては、懸案の特定系統への成長あるいは増殖を促進してよい。懸案の特定系統についての多様な前駆細胞株の生成を、これら懸案の系統への分化を促進する条件に細胞を暴露することにより行ってよい。たとえば、分化を促進あるいは可能にする成長因子あるいはリガンド等の小分子に胚性幹細胞を暴露してよい。
【０１０２】
したがって、特定の系統についての胚性幹細胞由来細胞株を樹立する本明細書に記載の方法には、当該特定系統への胚性幹細胞の分化を強化する工程が含まれる。分化強化工程を所定時間実行することが好適である。したがって、胚性幹細胞もしくはその子孫を一時的に分化強化環境に暴露することが好適である。
【０１０３】
分化を強化あるいは偏倚させる方法を選択するかは、前駆細胞を産生することが望まれる懸案の特定細胞系統に依る。当業者には、種々の細胞について用い得る多様な方法が認識されるであろう。
【０１０４】
内胚葉前駆細胞
胚性幹細胞の分化を組織の内胚葉型へと偏倚させることが望まれる場合、たとえば、胚様体を形成して分解してよい（後述する）。内胚葉への分化を誘発する成長因子あるいは薬剤あるいはそれらを組み合わせたものへと、分解した胚様体を暴露してよい。このような成長因子及び薬剤の例には、アクチビンＡ、ＦＧＦ４、デキサメタゾン、及びレチノイン酸が含まれる。
【０１０５】
造血性及び内皮性の前駆細胞
他方で、胚性幹細胞の分化を造血系統あるいは内皮系統へと偏倚させることが望まれる場合、造血分化あるいは内皮分化を誘発する成長因子あるいは薬剤あるいはそれらを組み合わせたものへと分解した胚様体を暴露してよい。このような成長因子及び薬剤の例には、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ−３、エリスロポエチン、トロンボポエチン、ＴＮＦα、及びラパマイシンが含まれる。
【０１０６】
心臓中胚葉及び骨格筋芽細胞の前駆細胞
他方、胚性幹細胞の分化を心臓中胚葉系統あるいは骨格筋芽細胞系統へと偏倚させることが望まれる場合、心臓中胚葉分化あるいは骨格筋芽細胞分化を誘発する成長因子あるいは薬剤あるいはそれらを組み合わせたものへと分解した胚様体を暴露してよい。このような成長因子及び薬剤の例には、デキサメタゾン、ＰＰＡＲγ阻害剤、及びテストステロンあるいはその類似体が含まれる。
【０１０７】
第二工程においては、分化中の細胞を富栄養培地にプレーティングしてよい。このような実施形態においては、増殖を継続させることにより前駆細胞を選択的に濃縮し、その選択的に濃縮した前駆細胞のクローニングをその後行うことができる。
【０１０８】
胚様体の形成
いくつかの実施形態によると、分化強化工程においては、胚性幹細胞から胚様体を形成する。胚様体及びその産生方法は当業技術分野において周知である。用語「胚様体」は、胚性幹細胞を懸濁液で成長させることにより産生された培養物において見受けられる球状コロニーを指す。胚様体においては細胞型が混在しており、特定の細胞型の出現分布と出現時期は胚において観察される当該細胞型の出現分布と出現時期に対応する。胚性幹細胞を半固体状培地、好適には、ＬｉｍらによるＢｌｏｏｄ．１９９７；９０：１２９１−１２９９に記載されるメチルセルロース培地にプレーティングすることにより胚様体を生成することが好適である。胚様体は、３日乃至６日間成長させることが好適である。
【０１０９】
このような実施形態によると、たとえば、コラゲナーゼ処理あるいはトリプシン処理により胚様体を分解、つまり構成細胞を互いから分離して、細胞を系統制限促進条件下から解放する。
【０１１０】
好適実施形態による方法には、所望の特定系統についての推定前駆細胞を選択する工程が含まれる。細胞の形態あるいはマーカーの発現等に基づいて選択を行ってよい。遺伝子発現プロファイルあるいは抗原プロファイルを用いて所望の系統についての特定的な前駆細胞を選択してもよい。選択した、所望の特定の系統についての推定前駆細胞を次に培養してよく、あるいは、それに対して更に選択工程を実行してよい。
【０１１１】
好適実施形態によると、分化強化工程の後、推定前駆細胞の自己複製を促進し、胚性幹細胞の増殖を阻害する条件に分化中の細胞を暴露する。好適には、このような条件とは、共培養物あるいは支持細胞（上述）が不在の状態において培養することであってよい。
【０１１２】
富栄養培地
または、あるいは更に、このような条件には富栄養培地にプレーティングすることが含まれる。本文書において用いる用語「富栄養培地」とは、栄養分に富んだ培地を指すことが意図される。そのような培地には、対象の細胞の成長に必要な必須栄養分が含まれていることが好適である。富栄養培地には血清が含有されていることが好適である。対象細胞の成長に必要な栄養分の実質的に全てが含有されていることがより好適である。富栄養培地とは、対象の細胞の成長を支持、促進、支援する培地であることが最も好適である。非常に好適な実施形態においては、対象の細胞とは懸案の前駆細胞あるいは懸案の推定前駆細胞である。富栄養培地の例としては、４５００ｍｇ／ｌのＤ−グルコースを含み、２０％のウシ胎仔血清、非必須アミノ酸、Ｌ−グルタミン、及びβ−メルカプトエタノールを添加したＤＭＥＭがある。
【０１１３】
好適実施形態によると、このような富栄養培地には、胚性幹細胞の成長を可能にし、促進、支援する更なる成長調節剤あるいはホルモン、たとえば白血病抑制因子（ＬＩＦ）は含まれない。
【０１１４】
このような実施形態によると、増殖を継続させることにより前駆細胞を選択的に濃縮し、その選択的に濃縮した前駆細胞のクローニングをその後行うことができる。
【０１１５】
培養物における長期維持
本明細書に記載の方法においては、胚性幹細胞あるいはその子孫を一世代より長く培養する。５世代より長く、１０世代より長く、１５世代より長く、２０世代より長く、２５世代より長く、５０世代より長く、４０世代より長く、４５世代より長く、５０世代より長く、１００世代より長く、２００世代より長く、５００世代より長く、あるいは８００世代より長く細胞を培養することが好適である。特に、細胞株は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、２００、あるいは５００世代以上維持してよい。
【０１１６】
培養中の細胞は、一般的に、接触阻止により細胞分裂と成長が停止するコンフルエントな状態になるまで成長し続ける。これら細胞を次に、基板あるいはフラスコから解離させて「分割」し、組織培養培地へ希釈して再プレーティングすることにより何代か継代させる。従って、前駆細胞を継代させる、つまり培養中に分割してよい；前駆細胞を１：２以上、好適には１：３、より好適には１：４、１：５以上の比で分割することが好適である。用語「継代」は、細胞株のコンフルエントな培養物のアリコートを採取して、新たな培地に植菌し、コンフルエントな状態つまり飽和状態に達するまで株を培養することを含むプロセスを指す。
【０１１７】
しかし、本明細書に記載の方法に従って誘導した前駆細胞をその自己複製能力に基づいて多数世代に亘って維持してよい。他方、有機体から直接的に誘導した「正常な」細胞（つまり、非形質転換体細胞）は不死ではないことが定立している。言い換えると、このような体細胞は培養寿命が限られている（致死性である）。このような体細胞は無制限には成長し続けず、所定数の世代を経ると最終的に増殖あるいは分裂する能力を喪失する。約５０世代を経て「危機段階」に達すると、このような細胞は死滅する。したがって、このような体細胞は限られた回数だけしか継代させることができないであろう。
【０１１８】
重要なことであるが、前駆細胞は形質転換する必要なしに自己複製を持続することができる。したがって、本明細書に記載する方法においては前駆細胞株を生成するにおいて、たとえば、癌細胞あるいは癌細胞株等の不死化細胞との融合、ＳＶ４０、ＥＢＶ、ＨＢＶあるいはＨＴＬＶ−１等の形質転換ウィルスに細胞株をウィルス感染させること、たとえばラージＴ抗原配列を含むＳＶ４０ベクター（Ｒ．Ｂｅｒｒｙら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、５７、２８７−２８９、１９８８）、テロメラーゼ（Ｂｏｄｎａｒ−Ａ−Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）２７９：ｐ．３４９−５２）、あるいはヒト・パピローマウィルスのＤＮＡ配列を含むベクター（米国特許第５，３７６，５４２号）等の専用に調節したベクターによるトランスフェクション、優性癌遺伝子の導入、突然変異等の周知の形質転換処理は必要でない。
【０１１９】
本明細書に記載の方法の好適実施形態においては、前駆細胞を形質転換させることなく５０世代より長く増殖させてよい。好適実施形態においては、前駆細胞を前駆細胞株として、形質転換させることなく無制限に増殖させてよい。前駆細胞及び前駆細胞株は、それらの親である胚性幹細胞よりも系統が制限されていることが好適である。特に、これらは三つの胚葉のいずれも発生させることができない。非常に好適な実施形態においては、前駆細胞株は多能性でないことが好適である。
【０１２０】
前駆細胞の特性
好適実施形態においては、前駆細胞と細胞株（あるいはこれらから誘導した分化細胞）は胚性幹細胞の特性のうち一以上を示さない。そのような特性の好適なものとしては、ＯＣＴ４遺伝子の発現とアルカリ性ホスファターゼ活性が挙げられる。好適には、前駆細胞
は多能性を示す一以上の特徴的なマーカーの発現量が少ない。このような多能性マーカーを以下に更に詳細に記載するが、Ｎａｎｏｇ、ＢＭＰ４、ＦＧＦ５、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ−２、及びＵｔｆ１が含まれる。
【０１２１】
本明細書に記載の方法により生成した前駆細胞は、非発癌性であることが好適である。好適には、免疫機能が低下した、あるいは免疫不全の宿主動物に移植したときに前駆細胞は腫瘍とならず、これは、移植することにより腫瘍形成に至る親の胚性幹細胞とは対照的である。好適には、免疫機能が低下した、あるいは免疫不全の宿主動物はＳＣＩＤマウスあるいはＲａｇ１‐／‐マウスである。好適には、前駆細胞は、移植後に好適には二週間超、より好適には二ヶ月超、最も好適には九ヶ月超の長期間が経過しても腫瘍を形成しない。発癌性検査のための詳細な手順を実施例において記載する。
【０１２２】
さらに、本明細書に記載する方法により生成した前駆細胞は好適には以下の特徴の一以上を示す。つまり、前駆細胞は、好適には少なくとも十世代に亘り細胞培養物中に維持しても、染色体数から判断される核型が実質的に安定している。さらに、前駆細胞は、好適には世代が変わっても実質的に安定した遺伝子発現パターンを示す。この記載により、選択した遺伝子セットにおける一種以上、好適には実質的に全ての遺伝子の発現レベルにはある世代の前駆細胞とその次世代の前駆細胞との間で有意なバラツキが示されないということを示唆するものである。
【０１２３】
好適には、遺伝子セットには、以下に示すうちの一種以上、サブセット、あるいは全てが含まれる：ケルベロス（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿００９８８７、ＡＦ０３１８９６、ＡＦ０３５５７９）、ＦＡＢＰ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿００７９８０、Ｍ６５０３４、ＡＹ５２３８１８、ＡＹ５２３８１９）、Ｆｏｘａ２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿０１０４４６、Ｘ７４９３７、Ｌ１０４０９）、Ｇａｔａ−１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿００８０８９、Ｘ１５７６３、ＢＣ０５２６５３）、Ｇａｔａ−４（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿００８０９２、ＡＦ１７９４２４、Ｕ８５０４６、Ｍ９８３３９、ＡＢ０７５５４９）、Ｈｅｓｘ１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿０１０４２０、Ｘ８００４０、Ｕ４０７２０、ＡＫ０８２８３１）、ＨＮＦ４ａ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿００８２６１、Ｄ２９０１５、ＢＣ０３９２２０）、ｃ−ｋｉｔ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿０２１０９９、Ｙ００８６４、ＡＹ５３６４３０、ＢＣ０７５７１６、ＡＫ０４７０１０、ＢＣ０２６７１３、ＢＣ０５２４５７、ＡＫ０４６７９５）、ＰＤＧＦＲα（ＮＭ＿０１１０５８、Ｍ５７６８３、Ｍ８４６０７、ＢＣ０５３０３６）、Ｏｃｔ４（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿０１３６３３、Ｘ５２４３７、Ｍ３４３８１、ＢＣ０６８２６８）、Ｒｕｎｘ１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿００９８２１、Ｄ２６５３２、ＢＣ０６９９２９、ＡＫ０５１７５８）、Ｓｏｘ１７（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿０１１４４１、Ｄ４９４７４、Ｌ２９０８５、ＡＫ００４７８１）、Ｓｏｘ２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿０１１４４３、Ｕ３１９６７、ＡＢ１０８６７３）、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（ＮＭ＿００９３０９、Ｘ５１６８３）、ＴＤＧＦ１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿０１１５６２、Ｍ８７３２１）、及びＴｉｅ−２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿０１３６９０、Ｘ６７５５３、Ｘ７１４２６、Ｄ１３７３８、ＢＣ０５０８２４）。
【０１２４】
本明細書に記載する方法により、前駆細胞と前駆細胞株、及び前駆細胞のクローン子孫である分化細胞の産生が可能になる。細胞の「クローン子孫」 との用語は、実質的にいかなる形質転換処理も施さず遺伝子変化も生じていない細胞の子孫を指す。このようなクローン子孫は、実質的にゲノム変異を生じておらず、親細胞もしくは祖先、好適には胚性幹細胞と実質的に遺伝学的に同一である（能力は減少している）。用語「前駆細胞」は、前駆細胞由来の細胞株、つまり前駆細胞株も好適には定義範囲に含むべきであり、前駆細胞株との用語にも前駆細胞を定義範囲に含めるべきである。
【０１２５】
自己複製と分化の調節剤
自己複製あるいは分化に対する推定調節剤を同定するべく本方法を用いてもよい。本方法によると、調節剤の候補分子が存在する状態及び不在の状態において前駆細胞株あるいは分化細胞を産生するべく記載の本方法を実行し、当該分子の存在がプロセスになんらかの効果を有しているかを確認する。たとえば、前駆細胞あるいは分化細胞の産生を加速する分子を、分化に対するポジティブな調節剤（あるいは自己複製阻害剤）として用いてよい。反対に、プロセスを遅滞させる分子は、分化阻害剤あるいは自己複製促進剤と見做すことができる。
【０１２６】
好適実施形態においては、本方法により取得可能な、選択した系統の細胞、好適には前駆体を提供する。従来の前駆体の取得においては、任意に取り上げた細胞についてそれが前駆細胞であるかを調べると、不純物が混在していることが非常に多かった。本発明に係る実質的に１００％純粋な前駆体の取得を可能にする培養法によると、単一の前駆体の分離が可能である。
【０１２７】
好適実施形態において、複数の細胞を含有し、当該細胞の大半が選択した系統の前駆細胞である組成を更に提供する。細胞の少なくとも６０％が選択した系統の前駆細胞であることが好適である。細胞の少なくとも６０％が前駆細胞であることがより好適である。さらに、本発明により、分離された前駆細胞を提供する。好適には、細胞株との用語は、培養物中に維持し成長させることができ、不死である、つまり無限寿命を有する細胞を指す。
【０１２８】
本明細書に参照として取り込む米国特許出願第６０／６０９，２１６号に記載される、ｍＴＯＲの活性を低下させて分化を促進することを、本明細書に記載の方法に組み合わせてよい。
【０１２９】
前駆細胞の利用法
本方法によると、多様な型の前駆細胞と細胞株を産生することができる。
【０１３０】
たとえば、末梢血前駆細胞（ＰＢＰＣ）、神経前駆細胞、造血前駆細胞、脊髄前駆細胞、上皮前駆細胞、骨髄間質細胞、骨格筋前駆細胞、膵島前駆細胞、間葉前駆細胞、心臓中胚葉幹細胞、肺上皮前駆細胞、肝前駆細胞、及び内胚葉前駆細胞を産生する方法を開示する。
【０１３１】
本明細書に記載の方法により産生される前駆細胞は、商業的に重要な多様な研究、診断、及び治療目的に用いることができる。これらの用途は当業技術分野において一般的に周知であるが、ここで簡単に記載する。
【０１３２】
たとえば、幹細胞は、再生療法用の前駆細胞集団を生成するべく用いてよい。前駆細胞は、生体外拡大により産生してよく、あるいは直接患者に投与してよい。これらは外傷後の損傷した組織の再生（ｒｅ−ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）に用いてもよい。
【０１３３】
したがって、造血前駆細胞は骨髄置換に用いてよく、心臓前駆細胞は心不全患者に対して用いてよい。皮膚前駆細胞は、患者に対する植皮片を成長させるべく用いてよく、内皮前駆細胞は、ステントあるいは人工心臓等の人工補綴物の内皮化（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｚａｔｉｏｎ）に用いてよい。
【０１３４】
胚性幹細胞及びその組織幹細胞派生物は、糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病等の変性疾患に対する治療用の前駆細胞の供給源として用いてよい。たとえば、幹細胞は、癌に対する免疫療法用のナチュラルキラー細胞あるいは樹脂状細胞の前駆細胞の供給源として用いてよく、当該前駆細胞は、本明細書に記載の方法及び組成により産生してよい。
【０１３５】
本明細書に記載の方法及び組成によって前駆細胞を産生することができることは明らかであり、産生した前駆細胞は、当然であるが、当業技術分野において周知の方法を用いて分化させてよい。したがって、分化細胞をどのように用いようとも、これら分化細胞が由来元である前駆細胞に等しく結合する。
【０１３６】
本明細書に記載の方法及び組成により産生される前駆細胞は、疾患治療用に、あるいは、疾患治療のための薬剤組成物の調製用に用いてよい。このような疾患としては、再生療法により治療可能な疾患があげられ、それらには、心不全、骨髄疾患、皮膚疾患、熱傷、あるいは糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病等の変性疾患、及び癌が含まれる。
【０１３７】
したがって、（ａ）胚性幹（ＥＳ）細胞を用意すること、（ｂ）胚性幹細胞から前駆細胞株を樹立するにおいて、前駆細胞株をその自己複製能力に基づいて選択すること、（ｄ）任意で前駆細胞株から分化細胞を誘導すること、及び（ｅ）前駆細胞株あるいは分化細胞を患者に投与することを含む疾患治療法を記載する。
【０１３８】
取得したＭＳＣの特性
本明細書に記載の方法及び組成により取得したＭＳＣは、当業技術分野において周知であるように、ＭＳＣを同定するべく一般的に用いられる形態学上、表現型上、及び機能上の基準を満たしていること９が好適である。本明細書に記載の方法及び組成により取得した間充織幹細胞、特にヒト胚性幹細胞から誘導した間充織幹細胞を、呼称を簡略化するべく「ｈＥＳＣ−ＭＳＣ」とする。
【０１３９】
したがって、本明細書に記載の方法及び組成により取得したＭＳＣは、好適には、間充織幹細胞の形態学的特性の一以上を示してよい。たとえば、取得したＭＳＣは、線維芽細胞の表現型を持つ粘着性の単分子層を形成してよい。
【０１４０】
さらに、取得したＭＳＣは、好適には、間充織幹細胞と類似した、あるいは同一の表面抗原プロファイルを示してよい。したがって、取得したＭＳＣの表面抗原プロファイルは、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ４９ａとｅ＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ１６６＋、ＣＤ３４−、及びＣＤ４５−の一以上、好適には全てであってよい９−１１。
【０１４１】
当業技術分野において周知の方法及び以下に記載する方法を用いることにより、取得したＭＳＣをいかなる間葉系統に分化させてもよい。したがって、本明細書に記載の方法及び組成により取得したＭＳＣは、脂質生成、軟骨形成、骨形成等の分化能を示してよい９。
【０１４２】
記載したごとく取得した間充織幹細胞、たとえばｈＥＳＣ−ＭＳＣは、実質的なインビトロでの増殖能を有している可能性がある。いくつかの実施形態においては、取得した間充織幹細胞を、通常の２倍体核型を維持させつつ少なくとも１０回集団倍加させてよい。しかし、ＭＳＣは、通常の２倍体核型を維持させつつ少なくとも２０乃至３０回集団倍加させることができることが好適である。好適実施形態においては、ＭＳＣは、この集団倍加の全期間を通して安定した遺伝子発現と表面抗原プロファイルを示す。
【０１４３】
取得したＭＳＣは、染色体異常および／または遺伝子発現変化当のいかなる欠陥も示さないことが好適である。好適実施形態においては、このような欠陥は、継代を１０代終了するまで、好適には１３代終了するまで、より好適には１５代終了するまで現れない。
【０１４４】
ｈＥＳＣ−ＭＳＣプロテオーム
実施例において、ヒトＥＳＣ由来ＭＳＣ（ｈＥＳＣ−ＭＳＣ）プロテオームの解析実験について記載する。
【０１４５】
実施例７乃至１５に示すように、ｈＥＳＣ−ＭＳＣは成体骨髄由来ＭＳＣ（ＢＭ−ＭＳｃ）に類似した発現プロファイルを有する。これら実験の結果は、本方法により誘導したＭＳＣは、その骨髄由来相当物に対して有意な生物学上の類似点、たとえば、傍分泌因子分泌する能力を有することを示す。したがって、ＢＭ−ＭＳＣを利用することが適切であるいかなる用途にもｈＥＳＣ−ＭＳＣを用いてよい。
【０１４６】
さらに、ｈＥＳＣ−ＭＳＣ培養物により条件付けた培地を提供する。このような条件付け培地は、ｈＥＳＣ−ＭＳＣが分泌する分子を含み、二百一種の特異な遺伝子産物を含む。このような条件付け培地、及び特にタンパク質あるいはポリペプチド等のそこに含まれる分子のどのような組み合わせも、たとえば疾患を治療あるいは予防する目的でｈＥＳＣ−ＭＳＣの活性を補うべく、あるいはｈＥＳＣ−ＭＳＣの代替として用いてよい。
【０１４７】
ｈＥＳＣ−ＭＳＣのプロテオームの解析により、発現するタンパク質は三つの生物学的プロセス、つまり代謝、防御応答、及び脈管化、血液生成と骨格発達を含む組織分化に関与することが示された。したがって、これらの機能が役割を担う疾患、あるいは回復もしくは治療にこれらの生物学的プロセスのいずれか一以上が関わる疾患の治療にｈＥＳＣ−ＭＳＣを用いてよい。同様に、ｈＥＳＣ−ＭＳＣが発現するタンパク質を単体で、あるいは組み合わせて、好適には条件付け培地の形態で、たとえばこのような疾患を治療あるいは予防する目的でｈＥＳＣ−ＭＳＣの活性を補うべく、あるいはｈＥＳＣ−ＭＳＣの代替として用いてよい。
【０１４８】
ｈＥＳＣ−ＭＳＣが発現する二百一種の遺伝子産物は、信号血管生物学上において、また骨の発達及び血液生成において重要な信号伝達系である、たとえばＪａｋ−ＳＴＡＴ、ＭＡＰＫ、トール様受容体、ＴＧＦ−β信号伝達系、ｍＴＯＲ信号伝達系等を活性化することが示された。したがって、ｈＥＳＣ−ＭＳＣ及びそれらが発現するタンパク質等を用いることにより、これらの信号伝達系のいずれかが関与する疾患、あるいは原因論においてこれら信号伝達系のいずれか一以上における一以上の欠陥が関与するとされる疾患を治療あるいは予防してよい。
【０１４９】
さらに、本明細書に記載するＭＳＣが分泌するいずれか一以上のタンパク質を、その条件付け培地形態のものも含み、本明細書に記載のＢＭ−ＭＳＣと同一の目的において用いてよい。
【０１５０】
ｈＥＳＣ−ＭＳＣを自身が分泌あるいは発現するタンパク質のいずれの供給源として用いてもよく、それらタンパク質を実施例１０乃至１４において、特にそこにおける表においてリストする。したがって、ここに記載した如く間充織幹細胞を取得し、間充織幹細胞を培養してポリペプチドを間充織幹細胞から、好適には間充織幹細胞が成長している培地から分離することを含む、実施例１０乃至１４のいずれかに示すポリペプチドを産生する方法を提供する。
【０１５１】
同質性
好適実施形態においては、本明細書に記載の方法により産生した間充織幹細胞は、性質が類似し、あるいは同一（好適には、同種）である。つまり、本手順により分離した間充織幹細胞（ＭＳＣ）クローンは、表現型上であろうとその他の点においてであろうと互いに高度の類似性もしくは同一性を示す。
【０１５２】
類似性あるいは同一性は多くの方法により計測してよく、一以上の特性により測定してよい。好適実施形態においては、クローンは遺伝子発現において類似し、あるいは同様である。本方法に従うと、本方法により選択したいずれか二つ以上の間充織幹細胞は、実質的に同一の、あるいは類似した遺伝子発現プロファイル、つまり発現した遺伝子の同一性とその遺伝子が発現したレベルの組み合わせを示すプロファイルを持つようになることが好適である。分離した間充織幹細胞の実質的に全てが実質的に同一の、あるいは類似した遺伝子発現プロファイルを示すことが好適である。
【０１５３】
遺伝子発現の同質性を多くの方法により測定してよい。実施例に記載するように、たとえばＲＮＡを抽出してアレイ上で交配させることによりゲノム全般について遺伝子プロファイルを行うことが好適である。総ＲＮＡを抽出して相補的ＤＮＡに変換し、関連するゲノムからの複数の遺伝子配列を含むアレイチップにそれを交配させてよい。全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のスタッフ及びその協力者により引き続き認証、注釈、監督が行われており、十分に特性が明らかにされている遺伝子であるＮＣＢＩ参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）遺伝子をアレイに含めることが好適である。
【０１５４】
次に、解析ソフトウェアを用いて試料間でその遺伝子発現を比較する。好適実施形態においては、遺伝子発現の類似度あるいは同一度を「相関係数」として表す。このような測定においては、二つの試料間における相関係数が高いということは、当該二つの試料の遺伝子発現パターン間の類似度が高いということである。反対に、二つの試料間における相関係数が低いということは、当該二つの試料の遺伝子発現パターン間の類似度が低いということを示す。解析の前に正規化を行うことにより、手順上のバラツキあるいは偏り（強度上の偏り、空間的バイアス、プレートの偏り、背景条件的な偏りを含む）を是正してよい。
【０１５５】
相関試験は当業技術分野において周知であり、たとえば、Ｈｉｌｌ、Ｔ．とＬｅｗｉｃｋｉ、Ｐ．による（２００６）．Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ＳｔａｔＳｏｆｔ、Ｔｕｌｓａ、ＯＫ、ＩＳＢＮ：１８８４２３３５９７（及びＳｔａｔＳｏｆｔ，Ｉｎｃ．（２００６）．Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ．Ｔｕｌｓａ、ＯＫ：ＳｔａｔＳｏｆｔ．ウェブ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｔａｔｓｏｆｔ．ｃｏｍ／ｔｅｘｔｂｏｏｋ／ｓｔａｔｈｏｍｅ．ｈｔｍｌ）に記載されるＴ−検定及びピアソン検定が含まれる。Ｋｈｏｊａｓｔｅｈらによる２００５、Ａ  ｓｔｅｐｗｉｓｅ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｒｒａｙ  ＣＧＨ  ｄａｔａ、ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ２００５、６：２７４を引用することをここに記す。上記のＫｈｏｊａｓｔｅｈらの著作に記載されるクラス内相関係数を用いてもよい。
【０１５６】
好適実施形態においては、ピアソン検定を実施してピアソン相関係数を生成してよい。相関係数が１．０であれば、理想的な遺伝子発現パターンであることを示す。
【０１５７】
好適実施形態においては、相補的ＤＮＡをＳｅｎｔｒｉｘ  ＨｕｍａｎＲｅｆ−８  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＢｅａｄＣｈｉｐに交配させ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＢｅａｄＳｔａｔｉｏｎ  ５００ｘを用いてスキャンする。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＢｅａｄＳｔｕｄｉｏ（米国カリフォルニア州サンディエゴ所在のＩｌｌｕｍｉｎａ社）を用いてデータの抽出、正規化、解析を行うことが好適である。しかし、いかなる適切なチップ及び（相関測定値を出力する）スキャン用ハードウェアとソフトウェアを用いて遺伝子発現プロファイルの類似性を試験してよいことは読者には明らかであろう。
【０１５８】
好適には上記の手段により測定した任意の二つの分離株間の遺伝子発現相関係数は、０．６５超、好適には０．７０超、より好適には０．８０超、より好適には０．８５超、より好適には０．９０超、最も好適には０．９５超であることが好適である。
【０１５９】
いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の方法により取得した間充織幹細胞からの二つ以上の分離株の間における遺伝子発現相関係数が、所定期間ずらして、たとえば一ヶ月ずらして測定した同一ＲＮＡ試料からのこれらの技術的複製物間の相関係数と同位であるか僅かに低位であるような間充織幹細胞を本方法により生成する。その他の実施形態においては、間充織幹細胞の二以上の分離株間の遺伝子発現相関係数は０．９０超、好適には０．９５超である。
【０１６０】
上記した選択あるいは分類手順を行った細胞についての遺伝子発現相関係数はこのような範囲にあることが好適である。分離株の大半、好適には全分離株間の遺伝子発現相関係数がこのような範囲にあることが好適である。
【０１６１】
したがって、実施例に示すように、取得した五つの間充織幹細胞培養物間の類似度が高いことが相関係数により示されており、当該株のうち四つの間の相関係数が０．９６であり、残りの一つとの相関係数が０．９０である；比較すると、一ヶ月ずらして解析したＲＮＡ試料の技術的複製物間の相関係数は０．９７乃至０．９８である。
【０１６２】
したがって、互いに実質的に類似しているか同一（好適には、同種）である間充織幹細胞を生成する方法が提供される。分離株はほぼ同一の遺伝子発現プロファイルを示すことが好適である。
【０１６３】
上記の「内部的な」同質性（つまり、本方法によるＭＳＣの分離株間の同質性）だけでなく、これら分離株とその他の細胞もしくは細胞型との間においても同質性を検査してよい。特に、その他の方法により誘導した間充織幹細胞、たとえば骨髄由来の間充織幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）との比較を行ってよい。好適実施形態においては、本明細書に記載の方法及び組成により取得したＭＳＣは、ＢＭ−ＭＳＣと類似する、あるいは同質もしくは同一である遺伝子発現プロファイルを示す。したがって、取得したＭＳＣは、０．５超、好適には０．６超、好適には０．７超のＢＭ−ＭＳＣに対する遺伝子発現相関係数を示してよい。
【０１６４】
したがって、実施例に示すように、三つの独立に誘導したｈＥＳＣ−ＭＳＣ集団と三つの独立なＢＭ−ＭＳＣ試料との間で対ごとに遺伝子発現比較を行うと、相関係数０．７２で類似することが観察された。
【０１６５】
間充織幹細胞形成調節剤
胚性幹細胞から間充織幹細胞を形成するための調節剤となると推定されるものを同定するべく本方法を用いてもよい。本方法によると、候補分子が存在する状態および候補分子が不在の状態において間充織幹細胞を産生する記載した方法を実施し、当該分子の存在がプロセスになんらかの効果を有するかを確認する。たとえば、間充織幹細胞の産生を加速する分子を、間充織幹細胞形成のポジティブな調節剤として用いてよい。反対に、当該プロセスを遅滞させる分子は、間充織幹細胞形成の阻害剤であると見做すことができる。
【０１６６】
好適実施形態においては、本方法によ取得可能な細胞、好適には間充織幹細胞も提供される。従来の間充織幹細胞の調製においては、不純物が混在することが非常に多く、あるいは（たとえば、遺伝子発現に関して）表現型が実質的に類似せず、もしくは同一とならず、臨床的用途に適さなかったのは、間充織幹細胞が共培養物あるいは血清の存在が介在する方法により産生されたからである。本発明に係る培養物によると、実質的に１００％純粋な、互いに類似し、あるいは同一（好適には同種）である間充織幹細胞の調製が可能となる。
【０１６７】
さらに、分化細胞の産生プロセスであって、本明細書に記載の方法により間充織幹細胞を取得し、間充織幹細胞を分化させることを含む方法について記載する。たとえば、含脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞当に分化させる方法を提供する。さらに、このような方法により取得可能な分化細胞を提供する。このような間充織幹細胞と分化細胞から産生される細胞株も提供する。細胞株との用語は、培養物中に維持し成長させることができ、不死性つまり無限寿命を示す細胞を指すことが好適である。
【０１６８】
本明細書に参照として取り込む米国特許出願第６０／６０９，２１６号に記載されるｍＴＯＲの活性を低下させて分化を促進することを、本明細書に記載の方法に組み合わせてよい。
【０１６９】
用途
本明細書に記載の方法及び組成は、細胞の間葉マーカーあるいは内皮マーカーの発現を上方調節するべく用いてよい。代わりに、細胞の幹細胞マーカーあるいは多能性マーカーの発現を下方調節するべくこれらを用いてもよい。本明細書に記載の方法及び組成は、幹細胞の自己複製あるいは分化を促進あるいは遅滞させることができる因子の同定に用いてよい。このような方法においては、候補分子が存在する状態において前述の任意の方法を実施して、この方法に現れる効果を判定する。
【０１７０】
本明細書に記載の方法及び組成は、以下に示すいずれか一つに対する治療用、あるいは以下に示すいずれか一つに対する治療用の薬剤組成の調製用の前駆細胞株あるいは分化細胞の産生においても用いてよい：再生療法により治療可能な疾患、心不全、骨髄疾患、皮膚疾患、熱傷、及び糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病等の変性疾患、及び癌。
【０１７１】
本明細書に記載の方法により産生される間充織幹細胞と分化細胞は、商業的に重要な多様な研究、診断、及び治療目的に用いることができる。これらの用途は当業技術分野において一般的に周知であるが、ここで簡単に記載する。
【０１７２】
たとえば、幹細胞は、再生療法用の間充織幹細胞と分化細胞集団を生成するための用いてよい。間充織幹細胞と分化細胞は、生体外拡大により産生してよく、あるいは直接患者に投与してよい。これらは外傷後の損傷した組織の再生（ｒｅ−ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）に用いてもよい。
【０１７３】
したがって、再建外科あるいは形成外科において腔ないし窪みを埋めるべく含脂肪細胞あるいはそれから得られる脂肪組織を用いてよい。軟骨細胞を軟骨修復に用いてよく、骨細胞を骨修復に用いてよい。本明細書に記載の方法及び組成により産生された間充織幹細胞をこれらの細胞型のいずれかに分化させて記載した目的において用いてよい。
【０１７４】
胚性幹細胞とその派生物である組織幹細胞は、糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病等の変性疾患の治療用の間充織幹細胞と分化細胞の供給源として用いてよい。たとえば、幹細胞は、癌に対する免疫療法用のナチュラルキラー細胞あるいは樹脂状細胞とすべき間充織幹細胞と分化細胞の供給源として用いてよく、当該間充織幹細胞と分化細胞は、本明細書に記載の方法及び組成により産生してよい。
【０１７５】
本明細書に記載の方法及び組成によって間充織幹細胞を産生することができることは明らかであり、産生した前駆細胞は、当然であるが、当業技術分野において周知の方法を用いて分化させてよい。したがって、分化細胞をどのように用いようとも、これら分化細胞が由来元である間充織幹細胞に等しく結合する。
【０１７６】
本明細書に記載の方法及び組成により産生される間充織幹細胞と分化細胞は、疾患治療用に、あるいは、疾患治療のための薬剤組成物の調製用に用いてよい。このような疾患としては、再生療法により治療可能な疾患が挙げられ、それらには、心不全、骨髄疾患、皮膚疾患、熱傷、あるいは糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病等の変性疾患、及び癌が含まれる。
【０１７７】
したがって、（ａ）胚性幹（ＥＳ）細胞を用意すること、（ｂ）胚性幹細胞から間充織幹細胞株を樹立するにおいて、胚性幹（ＥＳ）細胞コロニーあるいはその子孫を分散させてＦＧＦ２を含有する血清非含有培地において共培養物が存在しない状態で細胞を増殖させることにより間充織幹細胞を取得すること、（ｄ）任意で間充織幹細胞株から分化細胞を誘導すること、及び（ｅ）間充織幹細胞株あるいは分化細胞を患者に投与することを含む疾患治療法を記載する。培地には任意でＰＤＧＦ  ＡＢを含有させてよい。
【０１７８】
本方法は、細胞の間葉マーカーあるいは内皮マーカーの発現を上方調節するべく用いてよい。代わりに、あるいは更に、細胞の幹細胞マーカーあるいは多能性マーカーの発現を下方調節するべくこれらを用いてもよい。
【０１７９】
さらに、以下に示すいずれか一つに対する治療用、あるいは以下に示すいずれか一つに対する治療用の薬剤組成の調製用の前駆細胞株あるいは分化細胞を産生するための本発明の上記の観点のいずれかに係る方法を提供する：再生療法により治療可能な疾患、心不全、骨髄疾患、皮膚疾患、熱傷、もしくは糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病等の変性疾患、及び癌。
【０１８０】
さらに、本発明の上記の観点のいずれかに係る方法により産生される分化細胞を提供する。
【０１８１】
分化細胞
記載した方法に従って産生した間充織幹細胞あるいは細胞株から最終分化細胞等の分化細胞を誘導してよい。したがって、記載したように間充織幹細胞あるいは細胞株を生成し、これらから分化細胞を誘導する分化細胞生成方法を開示する。本明細書に記載の方法及び組成により産生した間充織幹細胞をこれら細胞型のいずれかに分化させて記載した目的において用いてよい。
【０１８２】
本明細書に記載の方法に従って産生してよい分化細胞は以下のいずれかあるいは全てであってよい。
【０１８３】
ｉ）含脂肪細胞：身体全体、特に皮下に観察される脂肪機能細胞もしくは脂肪組織である。含脂肪細胞は、エネルギー、熱調節、および機械的衝撃に対する緩衝としての脂肪を蓄積および合成する。
【０１８４】
ｉｉ）心筋細胞：心臓を連続的かつ律動的に拍動させる心臓の筋肉機能細胞である。
【０１８５】
ｉｉｉ）軟骨細胞：関節軟骨、外耳道、気管、喉頭蓋、喉頭、椎骨と肋骨の先端との間の椎間板を形成する機能細胞型である。
【０１８６】
ｉｖ）線維芽細胞：身体の大半の組織内において観察される結合細胞もしくは支持細胞である。線維芽細胞は、特定の器官の機能細胞型が正しく機能するのを助ける指令的支持骨格となる。
【０１８７】
ｖ）肝細胞：代謝廃棄物を解毒する酵素、赤血球を破壊し、かつその構成成分を再生する酵素、及び血漿タンパク質を合成する酵素を産生する肝臓の機能細胞型である。
【０１８８】
ｖｉ）造血細胞：血液を産生する機能細胞型である。造血細胞は、成人の骨髄内で観察される。胎児に関しては、造血細胞は肝臓、脾臓、骨髄、及び子宮内の胎児を取り囲む支持組織において観察される。
【０１８９】
ｖｉｉ）筋細胞：筋肉の機能細胞型である。
【０１９０】
ｖｉｉｉ）神経細胞：インパルス伝導に特化された脳の機能細胞型である。
【０１９１】
ｉｘ）骨芽細胞：骨を形成する役割の機能細胞型である。
【０１９２】
ｘ）島細胞：インスリン、グルカゴン、ガストリン、及びソマトスタチンの分泌を担う膵臓の機能細胞型である。これらの分子が共同することにより、炭水化物と脂肪の代謝、血糖値、胃への酸分泌を含む多くのプロセスが調節される。
【０１９３】
間充織幹細胞と分化細胞の用途
本明細書に記載の方法及び組成により産生した間充織幹細胞と分化細胞を、商業的に重要な様々の研究、診断、及び治療目的に用いてよい。
【０１９４】
たとえば、分化細胞集団を用いることにより、分化表現型に対して特異的な抗体と相補的ＤＮＡのライブラリーを調製してよい。抗体の育成、浄化、修飾に用いられる一般的技術、及び免疫学的検定と免疫分離法における抗体の利用法については、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＷｅｉｒとＢｌａｃｋｗｅｌｌ編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ他編）、及びＭｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｍａｓｓｅｙｅｆｆ他編、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ：ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇｓ  ＧｍｂＨ）に記載されている。ｍＲＮＡと相補的ＤＮＡのライブラリー調製に関する一般的技術についてはＲＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ（Ｒ．Ｅ．Ｆａｒｒｅｌｌ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９８）、ｃＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（ＣｏｗｅｌｌとＡｕｓｔｉｎ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）、及びＦｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ＨｕｎｔとＬｉｖｅｓｅｙ編集、２０００年）に記載されている。薬剤スクリーニングと治療用途においては比較的同質的な細胞集団が特に適している。
【０１９５】
間充織幹細胞と分化細胞のこれら及びその他の用途は以下に、及び本文書のその他の部分においてより詳細に記載されている。間充織幹細胞と分化細胞は、特に、疾患治療用の薬剤組成の調製に用いてよい。このような疾患には再生療法により治療可能な疾患があり、それには心不全、骨髄疾患、皮膚疾患、熱傷、もしくは糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病等の変性疾患、及び癌が含まれる。
【０１９６】
実施例に示すように、本明細書に記載の方法及び組成により産生される間充織幹細胞は骨髄由来間充織幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）と類似した、あるいは同一の特性を有する。したがって、間充織幹細胞、及びそれから産生されるいかなる分化細胞も、ＢＭ−ＭＳＣの利用が知られる用途、あるいはＢＭ−ＭＳＣを用いることが可能な用途のいずれにおいて用いてもよい。
【０１９７】
薬剤スクリーニング
本明細書に記載の方法及び組成に従って産生される間充織幹細胞と分化細胞は、間充織幹細胞あるいは分化細胞の特性に影響する要因（たとえば、溶剤、小分子薬剤、ペプチド、ポリヌクレオチド等）あるいは環境条件（たとえば、培養条件あるいは取り扱い）をスクリーニングするべく用いてもよい。
【０１９８】
いくつかの用途においては、間充織幹細胞と分化細胞は、これら細胞を長期培養するにあたって、細胞の成熟を促進、あるいは細胞の増殖、持続を促進する因子をスクリーニングするために用いられる。たとえば、成熟因子あるいは成長因子の候補の試験としては、複数のウェルに入れられた間充織幹細胞あるいは分化細胞へとそれらを添加して、その結果生じる表現型の変化を細胞を更に培養させるものであるかの所望の基準、及び細胞の用途に関する所望の基準に従って判定してよい。
【０１９９】
さらに、間充織幹細胞と分化細胞の遺伝子発現プロファイルを用いてこれらの細胞に特異的な、あるいはこれらの細胞において高度に発現される受容体、転写因子、及びシグナル伝達分子を同定してよい。これら受容体、転写因子、及びシグナル伝達分子に対して特異的なリガンド、小分子阻害剤、あるいは活性剤を用いて間充織幹細胞と分化細胞の分化と特性を変調させてよい。
【０２００】
特定のスクリーニング用途は、薬剤研究における医薬品の試験との関連を有する。一般的なものとしては、標準的テキストとして「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９７７、及び米国特許第５，０３０，０１５号を、また本文書のその他の部分における薬剤スクリーニングについての全般的な記載を読者には紹介する。候補医薬品の活性の検査においては、一般的に、分化細胞を候補化合物と化合させて、細胞の形態、マーカー表現型、あるいは代謝活性において当該化合物に起因する変化が生じたかを判定し（なんらの処理をしない細胞あるいは不活性化合物で処理した細胞と比較して）、その後当該化合物の効果と観察された変化とを相互に関連付ける。
【０２０１】
たとえば、特定の細胞型に対して薬理効果を発揮するよう化合物が構成されているので、あるいは別の部分において効果を発揮するよう構成される化合物が意図しない副作用を有するおそれがあるのでスクリーニングを行ってよい。二種以上の薬剤を組み合わせて試験することにより（同時あるいは順次的に細胞と化合させることにより）、薬剤間の相互作用があるかを検出することができる。いくつかの用途においては、化合物をまず毒性があるかについてスクリーニングする（Ｃａｓｔｅｌｌら、「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」３７５−４１０頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７年）。細胞毒性は、まず第一に、細胞の生存能力、生命力、形態、及び特定のマーカー、受容体、あるいは酵素の発現もしくは放出に対する作用により判定することができる。染色体ＤＮＡに対する薬剤の作用は、ＤＮＡの合成あるいは修復を測定することにより判定することができる。〔３Ｈ〕チミジンあるいはＢｒｄＵの取り込みは、特に細胞周期において予定されない時期に生じた場合、あるいは細胞複製に必要とされるレベル以上で生じた場合、薬剤の作用に一致する。望ましくない作用としては、姉妹染色分体の交換率が有糸分裂中期において拡大することにより判定される、率の異常性も挙げられる。更なる詳細については、読者にはＡ．Ｖｉｃｋｅｒｓによる（「Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」３７５−４１０頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７年）を紹介する。
【０２０２】
組織再生
本明細書に記載の方法及び組成に従って産生される間充織幹細胞と分化細胞は、組織再構成あるいは再生を必要とするヒト患者の組織再構成あるいは再生において用いてもよい。細胞の投与は、細胞が目的の組織部位に接合して機能性を欠く領域を再構成あるいは再生できるような方法により行う。
【０２０３】
たとえば、本明細書に記載の方法及び組成を用いて幹細胞の分化を変調させてよい。間充織幹細胞と分化細胞は、植皮片の成長等の再生医療において用いてよい。人工臓器あるいは人工組織の生物工学あるいはステント等の補綴において幹細胞分化の変調を行ってよい。
【０２０４】
癌
本明細書に記載の方法及び組織により産生される間充織幹細胞と分化細胞を癌治療に用いてよい。
【０２０５】
用語「癌」及び「癌性」とは、通常は無秩序な細胞成長により特徴付けられる哺乳類における生理学的状態を指し、あるいは記述する。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０６】
癌の更に特定的な例としては、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃癌、膵臓癌、あるいはグリア芽腫及び神経線維腫症等のグリア細胞腫瘍、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌（ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、膀胱癌、肝臓癌（ｈｅｐａｔｏｍａ）、乳癌（ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ  ｃａｎｃｅｒ）、腎臓癌（ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌（ｈｅｐａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、及び様々な種類の頭部癌と頚部癌が挙げられる。更なる例としては、結腸癌、乳癌（ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）、肺癌、前立腺癌等の固形癌腫瘍、白血病（ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ腫等の造血器悪性腫瘍、ホジキン病、再生不良性貧血、皮膚癌、及び馴染み深い腺腫様ポリープがある。更なる例には、脳腫瘍、結腸直腸腫瘍、乳癌（ｂｒｅａｓｔ  ｎｅｏｐｌａｓｍ）、頸新生物、眼新生物、肝臓新生物、肺新生物、膵臓腫瘍、卵巣新生物、前立腺腫瘍、皮膚新生物、精巣悪性腫瘍、新生物、骨新生物、栄養膜新生物、卵管新生物、直腸新生物、結腸腫瘍、腎臓新生物、胃新生物、及び上皮小体腫瘍がある。乳癌（ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、悪性黒色腫、白血病（ｌｅｕｋａｅｍｉａ）、リンホマ（ｌｙｍｐｙｈｏｍａ）、卵巣癌、子宮頸癌、及び胆道癌も含まれる。
【０２０７】
本明細書に記載の方法及び組成に従って産生される間充織幹細胞と分化細胞は、さらに、エンドスタチン、アンギオスタチン等の抗癌剤、あるいは細胞毒性薬、あるいは化学療法剤と組み合わせて用いてよい。たとえば、アドリアマイシン、ダウノマイシン、シスプラチン、エトポシド、タクソール、タキソテール、及びビンクリスチン等のアルカロイド、及びメトトレキサート等の代謝拮抗物質の薬剤である。本明細書において用いる用語「細胞毒性薬」は、細胞の機能を阻害あるいは阻止し、及び／又は細胞破壊を引き起こす物質を指す。この用語は、放射性同位体（たとえば、Ｉ、Ｙ、Ｐｒ）、化学療法剤、及び毒素、たとえば植物由来又は動物由来の細菌性及び菌性の酵素活性毒素あるいはそれらのフラグメントを定義範囲に含めることを意図する。
【０２０８】
また、この用語には、ＷＯ９４／２２８６７に開示される二環式アンサマイシン、ＥＰ６００８３２に開示される１，２−ビス（アリールアミノ）安息香酸誘導体、ＥＰ６００８３１に開示される６，７−ジアミノ−フタラジン−１−１誘導体、ＥＰ５１６５９８に開示される４，５−ビス（アリールアミノ）−フタルイミド誘導体、あるいはチロシン・キナーゼのＳＨ２含有基板タンパク質への結合を阻害するペプチド（たとえば、ＷＯ９４／０７９１３参照）等の癌遺伝子産物／チロシン・キナーゼ阻害剤が含まれる。「化学療法剤」は、癌治療に有用な化合物である。化学療法剤の例には、アドリアマイシン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、タクソール、メトトレキサート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ＶＰ−１６、酒石酸ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、ニコチンアミド、エスペラミシン（米国特許第４，６７５，１８７号参照）、メルファラン、及びその他関連のナイトロジェン・マスタード、及び内分泌物治療（たとえば、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）、タモキシフェン、ＬＨＲＨ拮抗薬、プロゲスチン、抗黄体ホルモン等）が含まれる。
【０２０９】
幹細胞
本文書において用いる用語「幹細胞」は、分裂するに当たり成長の経路が二つある細胞を指す：娘細胞となる場合は元の細胞と同一である（自己複製）；より特化した細胞型の前駆体となる場合もある（分化）。したがって、幹細胞は一方の経路あるいは他方の経路を採ることができる（更なる経路もあり、そこでは各細胞型のうちの一つが形成される）。したがって、幹細胞は最終分化していない細胞であり、その他の型の細胞を産生することができる。
【０２１０】
本文書において言及する幹細胞は、全能性幹細胞、多能性幹細胞、及び複能性幹細胞であってよい。
【０２１１】
全能性幹細胞
用語「全能性」幹細胞とは、成人の体におけるどのような細胞型、あるいは胚体外膜（たとえば、胎盤）のどのような細胞にも成長する能力のある細胞である。したがって、唯一の全能性細胞とは、受精卵と、その卵割により産生される最初の四細胞期辺りである。
【０２１２】
多能性幹細胞
「多能性幹細胞」とは真の幹細胞であり、体内のどのような分化細胞をも産生する能力を有する。しかし、この細胞は、栄養膜から誘導される胚体外膜の産生には寄与できない。何種かの多能性幹細胞が発見されている。
【０２１３】
胚性幹細胞
胚性幹（ＥＳ）細胞は、移植された胚の発育段階である胚盤胞の内細胞塊（ＩＣＭ）から分離してよい。
【０２１４】
胚性生殖細胞
胚性生殖（ＥＧ）細胞は、流産あるいは中絶された胎児おける性腺の前駆体から分離してよい。
【０２１５】
胚性癌腫細胞
胚性癌腫（ＥＣ）細胞は、胎児の性腺に時折発生する腫瘍である奇形癌から分離してよい。上記の二種とは異なり、これら細胞は通常異数性である。これら多能性幹細胞の三種の全ては胚性あるいは胎生組織だけから分離することができ、培養にて成長させることができる。当業技術分野において、これら多能性細胞の分化を防止する方法が周知である。
【０２１６】
成体幹細胞
成体幹細胞には、神経系、皮膚系、及び骨髄移植における活性成分である造血幹細胞を含む広範な種類がある。後者の幹細胞型は、臍帯由来幹細胞を主に特徴付けるものでもある。成体幹細胞は、実験室においても身体においても機能的なより特化した細胞型へと成熟することができるが、細胞型の種類の正確な数は選んだ幹細胞の型により制限される。
【０２１７】
複能性幹細胞
複能性幹細胞は、真の幹細胞であるが、限られた数の型にしか分化することができない。たとえば、血液の全細胞を発生させるがその他の型の細胞は発生させない複能性幹細胞が骨髄には含まれる。複能性幹細胞は成獣において観察される。身体において複能性幹細胞が死滅あるいは損傷した細胞に取って代わることができるあらゆる器官（脳、肝臓）においてこれら複能性幹細胞が含まれると考察される。
【０２１８】
幹細胞を特性付ける方法が当業技術分野において周知であり、クローン検定、フローサイトメトリー、長期培養、及びＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、サザンブロット法等の分子生物学的手法等の標準的試験方法の利用が挙げられる。
【０２１９】
形態的相違点に加えて、ヒト及びネズミの多能性幹細胞は、細胞表面抗原（幹細胞マーカー）数の発現において異なる。発生段階依存的胚抗原１と４（ＳＳＥＡ−１とＳＳＥＡ−４）及び腫瘍拒絶抗原１−６０と１−８１（ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１）を含む幹細胞マーカー同定用の抗体はたとえばＣｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ（米国カリフォルニア州テメキュラ所在）が市販している。モノクローナル抗体を用いたこれら抗原の免疫学的検出法は、多能性幹細胞の特性化において広く用いられてきた（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ  Ｍ．Ｊ．ら（１９９８年）ＰＮＡＳ  ９５：１３７２６−１３７３１；Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒ  Ｍ．ら（２０００年）．ＰＮＡＳ  ９７：１１３０７−１１３１２；Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｊ．Ａ．ら（１９９８年）．Ｓｃｉｅｎｃｅ２８２：１１４５−１１４７；Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  Ｂ．Ｅ．ら（２０００年）．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：３９９−４０４；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  Ｊ．Ｋ．ら（２００２年）．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２０：３２９−３３７；Ｐｅｒａ  Ｍ．ら（２０００年）．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１３：５−１０．）。
【０２２０】
幹細胞源
以下に示す非限定的例のものを含む多様な型の幹細胞を間充織幹細胞と分化細胞を産生するべく本明細書に記載の方法及び組成において用いてよい。
【０２２１】
米国特許第５，８５１，８３２号においては、脳組織から取得される複能性神経幹細胞が報告されている。米国特許第５，７６６，９４８号においては、新生児の大脳半球から神経芽細胞を産生することが報告されている。米国特許第５，６５４，１８３号及び米国特許第５，８４９，５５３号においては、哺乳類の神経堤幹細胞の利用について報告されている。米国特許第６，０４０，１８０号においては、哺乳類の複能性ＣＮＳ幹細胞の培養物から分化神経細胞を体外で生成することについて報告されている。国際特許公報第ＷＯ９８／５０５２６号及びＷＯ９９／０１１５９号においては、神経上皮幹細胞、乏突起膠細胞−星状膠細胞前駆体、及び系統が制限された神経前駆体の生成と分離について報告されている。米国特許第５，９６８，８２９号においては、胚前脳部分から取得してグルコース、トランスフェリン、インスリン、セレン、プロゲステロン、及びその他いくつかの成長因子を含む培地において培養した神経幹細胞が報告されている。
【０２２２】
最初の肝細胞培養物は、ヒト生体あるいは外科的に摘出した組織からコラゲナーゼとヒアルロニダーゼを適切に組み合わせたものを用いたかん流により取得することができる。あるいは、ＥＰ  ０  ９５３  ６３３  Ａ１においては、細分化したヒトの肝組織を用意し、濃縮した組織細胞を成長培地に再懸濁して培養により細胞を拡大することにより肝細胞を分離することについて報告されている。成長培地には、グルコース、インスリン、トランスフェリン、Ｔ３、ＦＣＳ、及び悪性形質転換を生じずに肝細胞を成長させる多様な組織抽出物が含まれる。肝臓の細胞には、肝実質細胞、クッパー細胞、類洞内皮、及び胆管上皮を含む特化細胞、及び成熟肝細胞あるいは胆管上皮細胞に分化する能力を有する前駆細胞（「肝芽」あるいは「卵形細胞」と呼称される）があると考えられている（Ｌ．Ｅ．ＲｏｇｌｅｒとＡｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５０：５９１、１９９７年；Ｍ．Ａｌｉｓｏｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０：７１０、１９９８年；Ｌａｚａｒｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：５１４、１９９８年）。
【０２２３】
米国特許第５，１９２，５５３号においては、ヒトの新生児あるいは胎児の造血幹細胞あるいは前駆細胞を分離する方法が報告されている。米国特許第５，７１６，８２７号においては、Ｔｈｙ−１陽性の前駆体であるヒト造血細胞とそれを体外で再生する適切な成長培地が報告されている。米国特許第５，６３５，３８７号においては、ヒト造血細胞とその前駆体を培養する方法と装置が報告されている。米国特許第６，０１５，５５４号においては、ヒトのリンパ球様細胞と樹枝状細胞を再構成する方法が記載されている。
【０２２４】
米国特許第５，４８６，３５９号においては、骨、軟骨、腱、靱帯、及び皮膚等の一を超える種類の結合組織型へと分化することができるヒト間充織幹細胞の均質集団について報告されている。この細胞は、骨髄あるいは骨膜から取得される。間充織幹細胞を拡大するための培養条件についても報告されている。国際特許公報第ＷＯ９９／０１１４５号においては、Ｇ−ＣＳＦあるいはＧＭ−ＣＳＦ等の成長因子で処理した個体の末梢血から分離されるヒト間充織幹細胞が報告されている。国際特許公報第ＷＯ００／５３７９５号においては、含脂肪細胞と赤血球を実質的に含まない脂肪由来幹細胞と脂肪由来格子状物質が報告されている。これらの細胞は、拡大して培養することによりホルモンと条件付け培養培地を産生することができると報告されている。
【０２２５】
どのような脊椎動物種の幹細胞を用いてもよい。それには、ヒトと、ヒトでない霊長類、家畜、家畜類、及び齧歯動物、ネズミ、ラット等のその他ヒトでない哺乳類の幹細胞が含まれる。
【０２２６】
本発明において用いるのに適した幹細胞には、胚盤胞、あるいは妊娠期のいずれの時期かにおいて採取された胎児組織あるいは胚性組織等の妊娠後に形成される組織に由来する霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞がある。非限定的例としては、胚性幹細胞の初期の培養物あるいは胚性幹細胞からの樹立株が挙げられる。
【０２２７】
培地と支持細胞
多能性幹細胞を分離して増殖させる培地は、取得される細胞が所望の特性を持ち、さらなる増殖が可能であればいくつかの異なる配合のいずれであってもよい。
【０２２８】
適切なソースには以下のものがある：ダルベッコ修飾イーグルス培地（ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ社第１１９６５−０９２号；ノックアウトダルベッコ修飾イーグルス培地（ＫＯ  ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ社第１０８２９−０１８号；２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ社第１５０３９−０２７号；非必須アミノ酸溶液、Ｇｉｂｃｏ社第１１１４０−０５０号；ベータ−メルカプトエタノール、シグマ社第Ｍ７５２２号；ヒト組み換え塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、Ｇｉｂｃｏ社第１３２５６−０２９号。模範的な血清含有胚性幹（ＥＳ）培地は、８０％のＤＭＥＭ（通常ＫＯ  ＤＭＥＭ）、加熱不活性化していない２０％の合成ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのＬ−グルタミン、及び０．１ｍＭのベータ−メルカプトエタノールにより生成する。培地をろ過して摂氏４度において２週間未満保存する。血清非含有胚性幹（ＥＳ）培地は、８０％のＫＯ  ＤＭＥＭ、２０％の血清代替物、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのＬ−グルタミン、及び０．１ｍＭのベータ−メルカプトエタノールにより生成する。有効な血清代替物としては、Ｇｉｂｃｏ社第１０８２８−０２８号が挙げられる。培地をろ過して摂氏４度において２週間未満保存する。用いる直前に４ｎｇ／ｍＬの最終濃度にヒトｂＦＧＦを添加する（Ｂｏｄｎａｒら、Ｇｅｒｏｎ  Ｃｏｒｐ、国際特許公報第ＷＯ９９／２０７４１号）。
【０２２９】
好適実施形態においては、培地は、ノックアウトＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ社、ニューヨーク州グランドアイランド所在）に、１０％の血清代替物培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ社、ニューヨーク州グランドアイランド所在）、５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ社、ニューヨーク州グランドアイランド所在）、及び５ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ  ＡＢ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、ニュージャージー州ロッキーヒル所在）を添加したものである。
【０２３０】
支持細胞（用いる場合）は、９０％のＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社第１１９６５−０９２号）、１０％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社第３００７１−０３号）、及び２ｍＭのグルタミンを含むｍＥＦ培地において増殖させる。ｍＥＦをＴ１５０フラスコ（Ｃｏｍｉｎｇ社第４３０８２５号）において増殖させ、１日おきにトリプシンにより細胞を１：２に分割し、細胞をサブコンフルエントな状態に維持する。支持細胞層を調製するべく、増殖を阻害するが、ヒト胚性幹細胞を担持する重要な因子が合成されるのを可能にする線量（約４０００ラッドのガンマ線）を細胞に照射する。ウェルを六個有する培養プレート（たとえばＦａｌｃｏｎ社第３０４号）を一晩摂氏３７度において定温放置することにより、ウェルに１個当たり１ｍＬの０．５％ゼラチンを被覆してウェル１個当たり３７５，０００個の照射ｍＥＦをプレーティングする。支持細胞層はプレーティング後、通常５時間乃至４日間使用する。ｐＰＳ細胞をシードする直前に培地を新たなヒト胚性幹（ＥＳ）培地にに交換する。
【０２３１】
その他の幹細胞を培養するための条件が周知であり、細胞型に従って適切に最適化することができる。上記の項において言及した特定の細胞型用の培地と培養技術は、引用文献において提供されている。
【０２３２】
胚性幹細胞
霊長類のメンバーの胚盤胞から胚性幹細胞を分離することができる（Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：７８４４、１９９５年）。ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞をヒト胚盤胞からＴｈｏｍｓｏｎら（米国特許第５，８４３，７８０号；Ｓｃｉｅｎｃｅ２８２：１４５、１９９８年、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：１３３ｆｆ．、１９９８年）とＲｅｕｂｉｎｏｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：３９９、２０００年が記載する技術を用いて調製することができる。
【０２３３】
簡潔に説明すると、ヒト胚盤胞は、ヒトの生体内の着床前胚から取得される。あるいは、体外受精（ＩＶＦ）した胚を用いることもでき、あるいは単細胞のヒトの胚を胞胚期に拡大することもできる（Ｂｏｎｇｓｏら、Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ４：７０６、１９８９年）。ヒトの胚は、１．２世代及び２．２世代の培地において胞胚期まで培養させる（Ｇａｒｄｎｅｒら、Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．６９：８４、１９９８年）。発育した胚盤胞を選択して胚性幹細胞を分離する。胚盤胞をプロナーゼ（シグマ社）に短時間暴露することにより胚盤胞から透明帯を除去する。胚盤胞を１：５０希釈のウサギ抗ヒト脾臓細胞抗血清に３０分間暴露し、次にＤＭＥＭにおいて５分間にわたり３回洗浄し、１：５希釈のモルモット補体（Ｇｉｂｃｏ社）に３分間暴露する免疫手術（ＳｏｌｔｅｒらによるＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７２：５０９９、１９７５年参照）により内細胞塊を分離する。ＤＭＥＭにおいて更に２回洗浄した後、原状のままの内細胞塊（ＩＣＭ）から穏便にピペット採取することにより溶解栄養外胚葉を除去し、ＩＣＭをｍＥＦ支持細胞層上にプレーティングする。
【０２３４】
９乃至１５日後、内細胞塊由来生成物を、カルシウムとマグネシウムを含有せず、１ｍＭのＥＤＴＡを含有するリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に暴露することにより、あるいはジスパーゼ又はトリプシンに暴露することにより、あるいはマイクロピペットによる機械的解離によりクランプへと解離させ、新たな培地におけるｍＥＦ上に再プレーティングする。解離した細胞を新たな胚性幹（ＥＳ）培地におけるｍＥＦ支持層上に再プレーティングし、コロニー形成を観察する。非分化形態を示すコロニーを個別にマイクロピペットにより選択し、クランプ状へと機械的に解離させ、再プレーティングする。胚性幹細胞様形態は、核−細胞質比率が明らかに高く、核小体が突出した小型のコロニーであると特性化される。次に、結果として得られた胚性幹細胞を、短時間のトリプシン処理、ダルベッコＰＢＳ（カルシウムとマグネシウムを含有せず、２ｍＭのＥＤＴＡを含有する）への暴露、型ＩＶのコラゲナーゼ（約２００Ｕ／ｍＬ；Ｇｉｂｃｏ社）への暴露、あるいはマイクロピペットによるコロニーの個別選択により１−２週間ごとに定期的に分割する。約５０乃至１００個の細胞に相当するクランプサイズが最適である。
【０２３５】
胚性生殖細胞
ヒト胚性生殖（ｈＥＧ）細胞は、最後の月経期間から約８乃至１１週間後に採取されるヒト胎児物質に存在する始原生殖細胞から調製することができる。適切な調製方法がＳｈａｍｂｌｏｔｔらによるＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：１３７２６、１９９８年及び米国特許第６，０９０，６２２号において記載されている。
【０２３６】
簡潔に説明すると、生殖隆起を等張緩衝液により洗浄して、０．１ｍＬの０．０５％トリプシン及び０．５３ｍＭのＥＤＴＡナトリウム溶液（ＢＲＬ社）に入れ、１ｍｍ３未満の塊に切断する。次に当該組織を１００／μＬチップに通過させるピペット採取により更に細胞を分解する。それを約５分間摂氏３７度において定温放置し、その後約３．５ｍＬのＥＧ成長培地を添加する。ＥＧ成長培地は、ＤＭＥＭ、４５００ｍｇ／ＬのＤ−グルコース、２２００ｍｇ／ＬのｍＭ重炭酸ナトリウム；１５％の胚性幹（ＥＳ）により条件付けたウシ胎仔血清（ＢＲＬ社）；２ｍＭのグルタミン（ＢＲＬ社）；１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ＢＲＬ社）；１０００乃至２０００Ｕ／ｍＬのヒト組み換え白血病抑制因子（ＬＩＦ、Ｇｅｎｚｙｍｅ社）；１−２ｎｇ／ｍｌのヒト組み換え塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ、Ｇｅｎｚｙｍｅ社）；及び１０μＭのホルスコリン（１０％のＤＭＳＯにおける）である。代替的方法においては、ＥＧ細胞をヒアルロニダーゼ／コラゲナーゼ／デオキシリボヌクレアーゼを用いて分離する。腸間膜を有する性腺原基あるいは生殖隆起を胎児物質を解剖することにより取得し、生殖隆起をＰＢＳにより洗浄し、その後０．１ｍｌのＨＣＤ消化溶液（０．０１％のヒアルロニダーゼ種類Ｖ、０．００２％のデオキシリボヌクレアーゼＩ、０．１％のコラゲナーゼ種類ＩＶ、全てシグマ社製であり、ＥＧ成長培地において調製される）に入れる。組織を細分化して１時間あるいは一晩摂氏３７度において定温放置し、１乃至３ＬのＥＧ成長培地に再懸濁し、支持層上にプレーティングする。
【０２３７】
９６個のウェルを有する組織培養プレート上に、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ、及びホルスコリンを含有しない修飾ＥＧ成長培地において３日間培養し、５０００ラッドのｙ線照射により不活性化した支持細胞のサブコンフルエントな層を調製する。ＳＴＯ細胞（ＡＴＣＣ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＣＲＬ  １５０３）が支持細胞として適切である。０．２ｍＬの始原生殖細胞（ＰＧＣ）懸濁液を各ウェルに加える。ＥＧ成長培地において７乃至１０日経過した後に第一継代を行うべく、照射ＳＴＯマウス線維芽細胞（ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ  ＳＴＯ  ｍｏｕｓｅ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）を予め調製したウェルを２４個有する培養皿の１個のウェルに各ウェルを転移する。ＥＧ細胞と一致する細胞形態が観察されるまで、通常は７乃至３０日が経過もしくは１乃至４回の継代が終了するまで、毎日培地を交換して細胞を培養する。
【０２３８】
自己複製と分化
自己複製
自己複製している幹細胞は、たとえば、形態学、免疫組織化学、分子生物学等の当業技術分野において周知の多様な手段により同定してよい。
【０２３９】
このような幹細胞においては、Ｏｃｔ４及び／又はＳＳＥＡ−１の発現が増加していることが好適である。Ｆｌｋ−１、Ｔｉｅ−２、及びｃ−ｋｉｔのいずれか一以上の発現が減少していることが好適である。自己複製している幹細胞は、自己複製していない幹細胞に比較して細胞周期が短いことが好適である。
【０２４０】
たとえば、二次元の標準的顕微鏡画像においては、ヒト胚性幹細胞は、画像平面において核−細胞質比率が高く、核小体が突出しており、細胞間結合が認識しにくい小型コロニーが形成されている。細胞株は、標準的なＧバンド技術（カリフォルニア州オークランド所在のＣｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｌａｂ等の所定の染色体分析サービスを提供する多くの臨床用診断学研究所において利用可能）により染色体を分析して公表されているヒト核型と比較することができる。
【０２４１】
ヒト胚性幹細胞とヒト胚性生殖細胞も発現した細胞マーカーにより特性化してよい。一般的に、本開示において議論する組織特異性マーカーは、膜結合性マーカー用のフローサイトメトリー、細胞内マーカー用の免疫組織化学、培地に分泌されたマーカー用の酵素結合型免疫学的検定等の適切な免疫学的技術を用いて検出することができる。タンパク質マーカーの発現は、逆転写酵素ＰＣＲによりマーカーに対して特異的なプライマーを用いてｍＲＮＡレベルで検出することもできる。更なる詳細については米国特許第５，８４３，７８０号を参照されたい。
【０２４２】
特定の胚性細胞型においては、発生段階依存的胚抗原（ＳＳＥＡ）が特徴的である。ＳＳＥＡマーカーに対する抗体は、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ（メリーランド州ベテスダ所在）から入手可能である。Ｔｒａ−１−６０とＴｒａ−１−８１と命名される抗体を用いてその他の有用なマーカーを検出することができる（Ｅ．Ｊ．ロバートソンにおけるＡｎｄｒｅｗｓらによる、Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｒｎ  Ｃｅｌｌ  Ｔｕｍｏｒｓ、１９８７年、上記を参照）。通常、ヒト胚性幹細胞は、ＳＳＥＡ−１について陰性であり、ＳＳＥＡ−４について陽性である。ｈＥＧ細胞は、通常、ＳＳＥＡ−１について陽性である。ｐＰＳ細胞を体外で分化させると、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、及びＴｒａ−１−８１が発現せず、ＳＳＥＡ−１の発現が増加する。ｐＰＳ細胞は、アルカリ性ホスファターゼ活性の存在によっても特性化することができ、基板Ｖｅｃｔｏｒ  Ｒｅｄの製造者（カリフォルニア州バーリンゲーム所在のＶｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）が説明するように、ｐＰＳ細胞を４％のパラホルムアルデヒドで凝固させ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｒｅｄを基板として用いて成長させることによりアルカリ性ホスファターゼ活性は検出することができる。
【０２４３】
また、胚性幹細胞は通常、テロメラーゼについて陽性であり、ＯＣＴ−４について陽性である。テロメラーゼ活性は、市販のキット（ＴＲＡＰｅｚｅ．ＲＴＭ．ＸＫ  Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、カタログ番号ｓ７７０７；ニューヨーク州所在のＩｎｔｅｒｇｅｎ社購買部、あるいはＴｅｌｏＴＡＧＧＧ．ＴＭ．  Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ＰＣＲ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｌｕｓ、カタログ番号．２，０１３，８９；インディアナポリス所在のＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いたＴＲＡＰ活性検定（ＫｉｍらによるＳｃｉｅｎｃｅ  ２６６：２０１１、１９９７年）により判定することができる。ｈＴＥＲＴ発現は、ＲＴ−ＰＣＲによりｍＲＮＡレベルで数値化することもできる。研究目的のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＴｅｌｏＴＡＧＧＧ．ＴＭ．ｈＴＥＲＴ定量化キット（カタログ番号．３，０１２，３４４；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）が市販されている。
【０２４４】
分化
間充織幹細胞とそれに由来する分化細胞を含む分化中の細胞は、４Ｅ−ＢＰ１及び／又はＳ６Ｋ１の脱リン酸化が強められていること好適である。これら分化細胞は、Ｏｃｔ４及び／又はＳＳＥＡ−１の発現が減少していること好適である。Ｆｌｋ−１、Ｔｉｅ−２、及びｃ−ｋｉｔのいずれか一以上の発現が増加していることが好適である。Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＡＦＰ、ｎｅｓｔｉｎ、ｎｕｒｒｌのいずれか一以上の発現が増加していることが好適である。自己複製している幹細胞は、自己複製していない幹細胞に比較して細胞周期が長いことが好適である。
【０２４５】
分化中の幹細胞、つまり分化の道程を開始した、あるいは分化の道程にある細胞は、表現型に関する多数の基準、特に転写変化にしたがって、特性化することができる。基準としては、形態学的状態の特性化、発現した細胞マーカーと酵素活性の検出と定量化、生体内での細胞の機能特性の遺伝子発現と測定があるが、これらに限定されない。一般的に、分化中の幹細胞は分化過程の最終生成物、つまり分化後細胞の細胞型における一以上の特性を有するようになる。たとえば、対象の細胞型が筋細胞であるならば、筋細胞に分化する過程にある幹細胞は、たとえばミオシン発現という特性を表すであろう。
【０２４６】
したがって、多くの観点において、基準は分化中の幹細胞が終着するものに依拠した基準となるが、多様な細胞型についての全般的な説明を以下に展開する。
【０２４７】
分化後、あるいは分化中の神経系細胞についての関心対象となるマーカーには、神経細胞の特性であるベータ−チューブリンＥＩＩＩ又は神経フィラメント；星状膠細胞に存在するグリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）；乏突起膠細胞の特性であるガラクトセレブロシド（ｇａｌａｃｔｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄｅ（ＧａＩＣ））又はミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）；未分化のヒト胚性幹細胞の特性であるＯＣＴ−４；神経系前駆体とその他の細胞の特性であるｎｅｓｔｉｎがある。Ａ２Ｂ５とＮＣＡＭは、それぞれグリア前駆体と神経系前駆体の特性である。細胞の検定を、特徴的な生物活性物質を分泌するかについて行うこともできる。たとえば、ＧＡＢＡを分泌する神経細胞は、グルタミン酸脱炭酸酵素あるいはＧＡＢＡの産生により同定することができる。ドーパミン作動性ニューロンは、ドーパ脱炭酸酵素、ドーパミン、あるいはチロシン水酸化酵素の産生により同定することができる。
【０２４８】
分化後、あるいは分化中の肝細胞についての関心対象となるマーカーには、アルファ−フェトプロテイン（肝前駆体）；アルブミン、α１−抗トリプシン、グルコース−６−ホスファターゼ、シトクロムｐ４５０活性、トランスフェリン、アシアロ糖タンパク受容体、及びグリコーゲン貯蔵（肝細胞）；ＣＫ７、ＣＫ１９、及びガンマ−グルタミルトランスフェラーゼ（胆上皮）がある。肝細胞分化には、転写因子ＢＮＦ−４アルファが必要であることが報告されている（Ｌｉら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１４：４６４、２０００年）。ＨＮＦ−４アルファの発現に無関係なマーカーには、アルファ１−抗トリプシン、アルファ−フェトプロテイン、アポＥ、グルコキナーゼ、インスリン成長因子１と２、ＩＧＦ−１受容体、インスリン受容体、及びレプチンがある。ＨＮＦ−４アルファの発現に依存するマーカーには、アルブミン、アポＡＩ、アポＡＩＩ、アポＢ、アポＣＩＩＩ、アポＣＩＩ、アルドラーゼＢ、フェニルアラニン水酸化酵素、Ｌ型脂肪酸結合タンパク質、トランスフェリン、レチノール結合タンパク質、及びエリスロポエチン（ＥＰＯ）がある。
【０２４９】
ｐＰＳ細胞に由来する混合細胞集団における細胞型は、特徴的な形態とそれが発現するマーカーにより認識することができる。骨格筋については、ミオＤ、ミオゲニン、及びミフ−５がある。内皮細胞については、ＰＥＣＡＭ（血小板内皮細胞接着分子）、Ｆｌｋ−１、ｔｉｅ−ｉ、ｔｉｅ−２、血管内皮（ＶＥ）カドヘリン、ＭＥＣＡ−３２、及びＭＥＣ−１４．７がある。平滑筋細胞については、特異的なミオシン重鎖がある。心筋細胞については、ＧＡＴＡ−４、Ｎｋｘ２．５、心臓トロポニンＩ、アルファ−ミオシン重鎖、及びＡＮＦがある。膵臓細胞については、ｐｄｘ及びインスリン分泌がある。造血細胞とその前駆体については、ＧＡＴＡ−１、ＣＤ３４、ＡＣ１３３、β−主要グロブリン、及びβ−主要グロブリン様遺伝子ＰＨ１がある。
【０２５０】
細胞表面マーカー用のフロー免疫細胞化学、細胞内マーカーあるいは細胞表面マーカー用の免疫組織化学（たとえば、固定細胞あるいは組織切片についての）、細胞抽出物のウェスタンブロット分析、培地に分泌された細胞抽出物あるいは生産物用の酵素結合型免疫学的検定、等の免疫学的技術により、本開示に列挙される、あるいは当業技術分野において周知の特定の組織特異性マーカーを検出することができる。組織特異性遺伝子産物の発現も、ノザーンブロット分析、ドットブロット交配分析、あるいは標準的な増幅方法において配列特異的プライマーを用いた逆転写酵素により開始されるポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によりｍＲＮＡレベルで検出することができる。本開示に列挙する特定のマーカーについての配列データは、ＧｅｎＢａｎｋ（ＵＲＬ  ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ：８０／ｅｎｔｒｅｚ）等の公共のデータベースから入手できる。
【０２５１】
実施例
実施例１．方法
ｈＥＳＣ−ＭＳＣ（間充織幹細胞）の誘導
Ｈｕｅｓ９とＨ１  ｈＥＳＣを上記した通りに成長させる６、７。
ｈＥＳＣを分化させるには、ｈＥＳＣのコンフルエントな６ｃｍのプレートを３分間、摂氏３７度においてトリプシン処理し、中和し、遠心分離して、１０％血清代替物培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ社、ニューヨーク州グランドアイランド所在）、５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ社、ニューヨーク州グランドアイランド所在）、及び５ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ  ＡＢ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、ニュージャージー州ロッキーヒル所在）を添加した１０ｃｍのゼラチン化プレート上のノックアウトＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ社、ニューヨーク州グランドアイランド所在）に再懸濁する。細胞がコンフルエントな状態になったときにトリプシン処理して１：４に分割する。
【０２５２】
ｈＥＳＣをトリプシン処理した一週間後にＣＤ１０５＋とＣＤ２４−の分類を行う。分化中のｈＥＳＣを３分間トリプシン処理し、中和し、遠心分離して、培養培地に再懸濁し、細菌培養皿上にプレーティングする。摂氏３７度のＣＯ２インキュベータ内で２時間経過した後、細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄し、ＣＤ２４−ＰＥとＣＤ１０５−ＦＩＴＣ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社、カリフォルニア州サンディエゴ所在）を用いて室温にて９０分間定温放置する。
【０２５３】
次に細胞をＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、カリフォルニア州サンディエゴ所在）を用いてＦＡＣＳ  Ａｒｉａ上で分類する。ＢＭ  ＭＳＣを上記の通りに調製する２６。ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン、非必須アミノ酸、及び１０％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ社、ニューヨーク州グランドアイランド所在）を添加したＤＭＥＭで細胞を培養する。
【０２５４】
上記した通りに、含脂肪細胞、軟骨細胞、及び骨細胞へと分化させる３。標準的技術を用いてオイルレッド、アルシアンブルー、フォンコッサ染色を行う。ヤギの抗コラーゲンa１  種類ＩＩとＨＲＰ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社、カリフォルニア州サンタクルス所在）を共役させたロバの抗ヤギＩｇＧ抗体とを用いてパラホルムアルデヒドに固定され、パラフィンに包埋した部分に対してコラーゲン種類ＩＩに対する免疫活性を行う。
【０２５５】
染色体分析
細胞は、ペトリ皿において約８０％コンフルエントになったときに採取する。核分裂を停止させるべく細胞をコルセミドで処理し、標準的な低張処理とメタノール：酢酸（３：１）固定により採取する。標準的な風乾法によりスライドを用意し、ＳＫＹ塗装プローブＡＳＩ）と交配させる。交配後の洗浄は、製造者により提供され我々の研究所において確立した手順により行う。培養物当たり２０乃至３０個の中期細胞が存在した。各培養物の核型は、中期細胞の８０％超を代表するものである。
【０２５６】
移植研究
上記した通りに、２×１０６個の細胞を３０μｌの生理食塩水に再懸濁して、腎臓皮膜下の領域に移す２７。４ヵ月後、マウスを犠牲にして腎臓を取り出し、４％のパラホルムアルデヒドに固定し、パラフィンに包埋させ、４μＭに切断して、Ｈ−Ｅ染色する。
【０２５７】
ウェスタンブロット分析
標準的手順を用いる２８。簡潔に説明すると、細胞をＲＩＰＡ緩衝液内で溶解し、摂氏４度で１５分間、１４，０００ｒｐｍで遠心分離する。その浮遊物の２０μｇを変性させ、１０  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上にて切断（ｓｅｐａｒａｔｅ）し、ニトロセルロース膜上に電気ブロットし、一次抗体、次にＨＲＰ共役二次抗体あるいはビオチニル化二次抗体、その後ニュートロアビジン−ＨＲＰ、最後にＨＲＰ強化化学発光基板ＥＳＣ（ピアス社、イリノイ州ロックフォード所在）を順次用いて当該膜を定温放置する。
【０２５８】
用いた一次抗体は、抗ＯＣＴ４抗体、抗ＳＯＸ−２抗体、及びβ−アクチン抗体の１：２００希釈（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、カリフォルニア州）であり、二次抗体はヤギのＨＲＰ共役抗ウサギ抗体、ウサギの抗ヤギ抗体、及びウサギの抗マウス抗体である。
【０２５９】
ＰＣＲ
マウスとヒトに特異的な反復配列用のゲノムＰＣＲは、上記した通りに行う８。マウスとヒトに特異的な反復配列用のゲノムＰＣＲは、上記した通りに行う８。リアルタイムのＲＴ−ＰＣＲは、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ａｒｃｈｉｖｅ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州フォスターシティ所在）を用いて１μｇの総ＲＮＡを逆転写することにより行う。相補的ＤＮＡは、水で十倍に希釈し、Ｔａｑｍａｎプライマー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州フォスターシティ所在）により４０周期にわたり増幅する。
【０２６０】
表面抗原分析
ｈＥＳＣ−ＭＳＣ上及びｈＥＳＣ上の細胞表面抗原をＦＡＣＳを用いて分析する。細胞を５分間トリプシン処理し、遠心分離し、培養培地に再懸濁して、細菌培養皿に入れ、摂氏３７度、５％ＣＯ２インキュベータにおいて２乃至３時間定温放置する。ｈＥＳＣ−ＭＳＣ上とｈＥＳＣ上の細胞表面抗原をＦＡＣＳにより分析する。
【０２６１】
細胞を一分間トリプシン処理し、遠心分離して、ＰＢＳで洗浄し、室温にて０．５時間にわたり４％のパラホルムアルデヒドに固定して洗浄し、２％のＦＣＳに室温にて０．５時間にわたり撹拌しつつ固定する。次に、１．５×１０５個の細胞を以下の共役モノクローナル抗体のそれぞれを用いて、室温にて９０分間定温放置する：ＣＤ２４−ＰＥ、ＣＤ２９−ＰＥ、ＣＤ４４−ＦＩＴＣ、ＣＤ４９ａ―ＰＥ、ＣＤ４９ｅ―ＰＥ、ＣＤ１０５−ＦＩＴＣ、ＣＤ１６６−ＰＥ、ＣＤ３４−ＦＩＴＣ、ＣＤ４５−ＦＩＴＣ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社、カリフォルニア州サンディエゴ所在）。
【０２６２】
定温放置後、細胞を洗浄してＰＢＳに再懸濁する。細胞が類似した複数のアリコートをイソタイプが一致したマウスモノクローナル抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社、カリフォルニア州サンディエゴ所在）と共に定温放置すると、非特異的蛍光発光が測定される。Ｃｙａｎ  ＬＸ（Ｄａｋｏ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ社、カリフォルニア州カーピンテリア所在）器具上での２０、０００個の事象を収集してＷｉｎＭＤＩソフトウェアを用いてデータを分析する。細胞が類似した複数のアリコートをイソタイプが一致したマウスモノクローナル抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社、カリフォルニア州サンディエゴ所在）と共に、あるいは二次抗体だけと共に定温放置すると、非特異的蛍光発光が測定される。
【０２６３】
Ｉｌｌｕｍｉｎａジーン・チップ解析
ＨｕＥＳ９．Ｅ１、ＨｕＥＳ９．Ｅ３、ＨｕＥＳ９．Ｅ１及び三つの未分化ｈＥＳＣ株、つまりＨ１、Ｈｅｓ３、ＨｕＥＳ９のうちの二つの生物学的副生物からなる一次ＢＭと脂肪由来ＭＳＣである三種の試料における総ＲＮＡ（２μｇ）をＩｌｌｕｍｉｎａ  ＲＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社、テキサス州オースティン所在）を用いて製造者の指示に従いビオチニル化相補的ＲＮＡに変換する。
【０２６４】
ＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州バレンシア所在）を用いて試料を浄化する。Ｓｅｎｔｒｉｘ  ＨｕｍａｎＲｅｆ−８  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＢｅａｄＣｈｉｐ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社、カリフォルニア州サンディエゴ所在）への交配、洗浄、及びスキャンをＩｌｌｕｍｉｎａ  ＢｅａｄＳｔａｔｉｏｎ  ５００ｘ手引書に従って行う。製造者が提供するＩｌｌｕｍｉｎａ  ＢｅａｄＳｔｕｄｉｏを用いてデータを抽出して正規化し、分析する。９９％の信頼度で検出限界（ＬＯＤ）を下回る転写シグナルは、発現しなかった遺伝子であるとして排除する。
【０２６５】
実施例２．ヒト胚性幹細胞株からのＭＳＣ培養物の生成
ｈＥＳＣコロニーをトリプシンにより分散させ、フィーダーが不在の状態においてゼラチン化組織培養プレート上で血清代替物培地であるＦＧＦ２、及び任意でＰＤＧＦ  ＡＢを添加した血清非含有培地により継代させると、互いに類似した、あるいは同一（好適には、同種）である線維芽細胞様細胞の培養物が二週間以内に生成される。
【０２６６】
培養物は、ＢＭ−ＭＳＣに似た線維芽細胞形態を有する（図１Ａ）。これらの線維芽細胞様細胞を生成するにおいて、ｈＥＳＣコロニーをコラゲナーゼにより分散させることは効率的でない。
【０２６７】
二つのポリクローナル培養物、ｈｕＥＳ９．ＥＳ１とｈｕＥＳ９．Ｅ３は、ｈｕＥＳ９  ＥＳＣ株から独立に生成され、第三のＨ１．Ｅ２はＨ１  ＥＳＣ株から生成される。いつかの多能性に関連する遺伝子の発現は通常減少する。たとえば、ＨＥＳＸ１、ＰＯＵＦＬ５、ＳＯＸ−２、ＵＴＦ−１、及びＺＦＰ４２の転写量はｈＥＳＣにおけるそれらの転写量より１０１−５を超えるフォールド分（＞１０１−５  ｆｏｌｄ）小さい（図１Ｂ）。ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、及びＳＯＸ２のタンパク質レベルも減少する（図１Ｃ）。ｈｕＥＳ９．Ｅ１に典型されるように、これら細胞は検出可能なアルカリ性ホスファターゼ活性を有していなかった（図１Ｄ）。
【０２６８】
親のＨｕＥＳ９細胞とは異なり、ＨｕＥＳ９．Ｅ１細胞はそれを１×１０６個、免疫機能が低下したＳＣＩＤマウスの腎臓皮膜下に移植しても４ヶ月の観察期間の間、奇形腫の形成を生じなかった（図１Ｅ）。これらの細胞がマウスの支持細胞に汚染あるいは融合される可能性を検査すべく８、これらの培養物を試験してマウスに特異的なｃ−ｍｏｓ反復配列について陰性であり、ヒトに特異的なａｌｕ反復配列について陽性であることを証明する（図１Ｆ）。
【０２６９】
ＨｕＥＳ９．Ｅ１、ＨｕＥＳ９．Ｅ３、及びＨ１．Ｅ２の平均的な集団倍加時間は、それぞれ７２時間、７２時間、及び１２０時間である。集団倍加時間は、細胞密度に高度に依存し、３０乃至８０％のコンフルエント状態において最適となる。約８０時間の集団倍加時間の後、ＨｕＥＳ９．Ｅ１は、４６  ＸＸ  ｉｎｖ（９）（ｐ１３ｑ１２の核型を現す。親ｈｕＥＳ９  ｈＥＳＣ株からの染色体９番の逆位が生じた６。ＨｕＥＳ９．Ｅ３も３６時間の集団倍加時間の後、４６  ＸＸ  ｉｎｖ（９）（ｐ１３ｑ１２の核型を現し、Ｈ１．Ｅ１は３２時間の集団倍加時間の後、ＸＹ核型をを現す。３５時間の集団倍加時間の後、細胞はその〜１０乃至３０％において、異常な非クローンの染色体異常を現し始める（データ不図示）ことが観察され、３５時間の集団倍加時間後の細胞は用いられない。
【０２７０】
実施例３．表面抗原プロファイル
ＨｕＥＳ９．Ｅ１、ＨｕＥＳ９．Ｅ３、及びＨ１．Ｅ２をＦＡＣＳ分析により表面抗原プロファイルすると、ＢＭＭＳＣ、つまり、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ４９ａとｅ＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ１６６＋、ＣＤ３４−、及びＣＤ４５−について定義されたものと定性的に類似した表面抗原プロファイルが得られた９−１１（図２Ａ）。蛍光標識の強度と、標識細胞の分布は、ｈＥＳＣ−ＭＳＣ培養物ごとに異なった（図２Ａ）。
【０２７１】
これら細胞の表面抗原プロファイルをＢＭ−ＭＳＣの表面抗原プロファイルに比較するべく、ＨｕＥＳ９．Ｅ１、ＨｕＥＳ９．Ｅ３及びＨ１．Ｅ１を、１０％のウシ胎仔血清を添加した同一のＢＭ−ＭＳＣ培養培地で二回継代を行って成長させる。培養条件の変化にも関わらず、ＨｕＥＳ９．Ｅ１、ＨｕＥＳ９．Ｅ３、及びＨ１．Ｅ１は、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ４９ａ＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ１６６＋、ＣＤ３４−、及びＣＤ４５−へと変化し続け（図２Ｂ；Ｈ１．Ｅ１についてのデータは不図示）、ＢＭ−ＭＳＣと大きく類似した表面抗原プロファイルとなった。ＢＭ−ＭＳＣにおいてはずっと少量の発現を示したＣＤ４９ａは例外である。これらのデータにより、ｈＥＳＣ−ＭＳＣは、安定的でこれら細胞の微環境の変化によっては著しい影響を被らない特徴的なＢＭ−ＭＳＣ表面抗原プロファイルを示すことが示された。
【０２７２】
実施例４．ｈＥＳＣ−ＭＳＣの分化能：脂質生成、軟骨形成、骨形成
ＭＳＣに関連する表面抗原の全てがその他多くの細胞型にも発現され、これら表面抗原の発現は多様であるので、ＭＳＣになると推定されるものの同定は従来は機能パラメータに依っていた９。培養中のＭＳＣの既定（ｄｅｆａｕｌｔ）の分化経路は骨形成であり、脂質生成と軟骨形成の度合いは変化すると報告されている９。
【０２７３】
したがって、ＨｕＥＳ９．Ｅ１細胞の分化能の試験は、公表された手順を利用し、脂質生成、軟骨形成、及び骨形成についての標準的な分化条件を用いて行う３。
【０２７４】
含脂肪細胞への分化は非常に効率的であり、細胞の９９％超において油滴が観察された（図３Ａ）。脂質生成における重要な転写因子としてのその役割に一致して１２、ｈＥＳＣ由来ＭＳＣにおけるＰＰＡＲγｍＲＮＡは、それらＭＳＣ各々の親であるＥＳＣ株におけるよりも約１０乃至１００フォールド高レベルであったのが、更に２フォールド高レベルになった（図３Ａ）。
【０２７５】
軟骨形成、つまり軟骨の形成も効率的であり、細胞の９０％超が、アルシアンブルー染色により検出されたごとく、細胞外基質のプロテオグリカンを産生し（図３Ｂ）、細胞の〜２０％がコラーゲンＩＩに対して免疫的に活性となった。軟骨特異的な細胞外基質タンパク質であるアグレカンも増加した１３（図３Ｂ）。しかし、軟骨特異的な細胞外基質タンパク質の別の例であるコラーゲンＩＩの転写量は、基質においてコラーゲンＩＩへの免疫反応性が存在するにも関わらず、減少した。理由は不明であるが、いくつかのｍＲＮＡ、特にＡとＵが豊富な要素は、翻訳されると不安定化することが知られている１４、１５。
【０２７６】
ＨｕＥＳ９．Ｅ１細胞が、骨形成、つまり骨の形成過程へと誘発されたとき、骨特異的なアルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）と骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）１６の発現は、２乃至３フォールド分だけ上方調節された（図３Ｃ）。しかし、骨形成のさらに進行した段階である石灰化１７は、フォンコッサ染色により測定したところ、貧弱であった（図３Ｃ）。分化後培養物において染色に対して陽性であったのは１％未満であった。
【０２７７】
実施例５．遺伝子発現プロファイル
ｈＥＳＣ−ＭＳＣの遺伝子発現プロファイルは、１）ｈＥＳＣ−ＭＳＣ培養物の成体組織由来ＭＳＣに対する関連性を三つの異なる個体から採取したＢＭ−ＭＳＣと脂肪由来（ａｄ）ＭＳＣ、及び三つのヒトＥＳＣ株を用いて検査し、２）当該三つのｈＥＳＣ−ＭＳＣ培養物の互いに対する関連性を検査し、３）ｈＥＳＣ由来ＭＳＣとＢＭ由来ＭＳＣとの類似性と相違性を比較するために行う。
【０２７８】
総ＲＮＡ  ＲＮＡから調製した標識相補的ＤＮＡを、約２４，０００個の特異的特性を有するＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙに交配させる。三つのｈＥＳＣ−ＭＳＣ培養物、つまりＨｕＥＳ９．Ｅ１、ＨｕＥＳ９．Ｅ３、及びＨ１．Ｅ２、三つのＢＭ−ＭＳＣ試料、及び三つの脂肪由来（ａｄ）ＭＳＣ試料における発現遺伝子の階層的クラスタ分析によると、ｈＥＳＣ−ＭＳＣの遺伝子発現プロファイルは、これらの親であるｈＥＳＣよりも成人組織由来のＭＳＣ、つまりＢＭ−ＭＳＣとａｄ−ＭＳＣの遺伝子発現プロファイルにより近接したものであることが明らかとなった（図４Ａ）。
【０２７９】
興味深いことであるが、ＭＳＣはその由来元の組織にしたがってクラスタ化され、更に、ｈＥＳＣ−ＭＳＣと、それとは異なるグループであるａｄ−ＭＳＣとＢＭＭＳＣとにより示される成体−胚性組織の境界が定められる。ｈＥＳＣ−ＭＳＣとＭＢ−ＭＳＣとの間の対ごとの遺伝子発現比較によると、相関係数が０．７２であり、ｈＥＳＣ−ＭＳＣとＢＭ−ＭＳＣの両方において遺伝子発現が顕著に保存的である一方で、著しい相違も存在する（図４Ｂ）が示される。ｈＥＳＣ−ＭＳＣとｈＥＳＣとの間の対ごとの比較によると、相関係数が０．６５と低く（図４Ｃ）、ｈＥＳＣ−ＭＳＣのｈＥＳＣとの差異が確認された。
【０２８０】
三つのｈＥＳＣ−ＭＳＣ培養物の互いに対する関連性を検査するべく、ＨｕＥＳ９．Ｅ１、Ｈ１．Ｅ２、及びＨｕＥＳ９．Ｅ３を、ＨｕＥＳ９．Ｅ１、Ｈ１．Ｅ２、及びＨｕＥＳ９．Ｅ３からなる同一の基準とそれぞれ比較する。同一基準に対するＨｕＥＳ９．Ｅ１、Ｈ１．Ｅ２、及びＨｕＥＳ９．Ｅ３の相関係数は、実質的に等しく、つまり０．９３、０．９５、及び０．９３であり、それぞれＨｕＥＳ９．Ｅ１、Ｈ１．Ｅ２、及びＨｕＥＳ９．Ｅ３が非常に類似したものであることを示唆する（図４Ｃ）。
【０２８１】
それぞれｈＥＳＣ−ＭＳＣとＢＭ−ＭＳＣにおいて９９％の信頼度で検出限界を上回って発現した８,６９９種と８,５０５種の遺伝子のうち、６,３７６種の遺伝子がｈＥＳＣ−ＭＳＣとＢＭ−ＭＳＣの両方において２．０フォールド未満の差異で発現した。これらの遺伝子はＭＳＣの基礎生物学的特性への洞察となる可能性があるので、これら遺伝子が推進する生体内作用を調べた。共通に発現した６,３７６種の遺伝子のうち、４,０６４種がＰａｎｔｈｅｒによる分類の遺伝子リストに載っている（２００６年３月、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐａｎｔｈｅｒｄｂ．ｏｒｇ／）。
【０２８２】
これらの遺伝子を異なる生体内作用に分類すると、生体内作用のいくつかにおける遺伝子頻度は、ＮＣＢＩのホモサピエンス遺伝子データベースにおける２３,４８１種の遺伝子からなる基準リストに比較して、著しく過大あるいは過少に表現される（ｐ＜０．０１）ことが明らかになった。たとえば、推定幹細胞の成長と自己複製にとり重要である可能性のある代謝過程においてその遺伝子は過大に表現された。これらの過程には、異化作用とタンパク同化作用を取り持つ基礎代謝過程、たとえばグリコシル化等の広範な翻訳後修飾を必要とする分泌産物の生合成過程、及び細胞増殖過程がある（図４Ｃ）。
【０２８３】
ＭＳＣの間葉への分化能に一致して、外胚葉分化、特に神経発生に関わる遺伝子は過少に表現された。遺伝子発現分析によると、ＢＭ−ＭＳＣとｈＥＳＣ−ＭＳＣの両方においてＭＡＰＫＫＫシグナリングが顕著であることも示された。少なくとも三つのサブファミリー、つまり従来的なＭＡＰＫ（ＥＲＫとしても知られる）、ストレス活性化タンパク質キナーゼであるｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）、及びｐ３８キナーゼから構成されるＭＡＰＫＫＫシグナリングは、増殖、分化、発生、細胞ストレスへの応答調節、細胞周期、死滅、及び生存に関連する１８−２１。
【０２８４】
ｈＥＳＣ−ＭＳＣとＢＭ−ＭＳＣの遺伝子発現プロファイルを更に分析すると、１,１４２種及び１,１３４種の遺伝子がそれぞれ２．０を超えるフォールドでｈＥＳＣ−ＭＳＣとＢＭ−ＭＳＣにおいて発現したことが示された。これらのうち、それぞれ７３８種と８８０種の遺伝子がＰａｎｔｈｅｒによる分類の遺伝子リストに載っており（２００６年３月、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐａｎｔｈｅｒｄｂ．ｏｒｇ／）、生体内作用に分類される。ＮＣＢＩのホモサピエンス遺伝子データベースにおける２３,４８１種の遺伝子からなる基準リストに比較すると著しく過大あるいは過少に表現された生体内作用を選択した。
【０２８５】
ＢＭ−ＭＳＣにおいて多く発現される遺伝子は、代謝過程、細胞構造、分化、及び情報伝達に関わる生体内作用にクラスタ化され、ｈＥＳＣ−ＭＳＣにおいて多く発現される遺伝子は、増殖、分化、免疫、及びシグナル変換に関わる作用にクラスタ化される（図３Ｃ）。増殖に関連する生体内作用における遺伝子の過大表現は、ｈＥＳＣ−ＭＳＣがＢＭ−ＭＳＣより増殖能が高いことと一致する。
【０２８６】
ｈＥＳＣ−ＭＳＣあるいはＢＭ−ＭＳＣのいずれかにおいて高度に発現する遺伝子は分化と情報伝達という全般的な分類において過大に表現されるが、各分類の下位の生体内作用に関してはｈＥＳＣ−ＭＳＣとＢＭ−ＭＳＣとでは異なって表現される。たとえば、胚形成、分節等の初期胚発生に関連する分化過程は、ｈＥＳＣ−ＭＳＣにおいて過大に表現されるが、骨格発達、筋発生等の後期胚発生に関連する分化過程はＢＭ−ＭＳＣにおいて過大に表現される。同様に、細胞外基質タンパク質を媒介とした情報伝達とＭＡＰＫＫＫカスケード構造は、ＢＭ−ＭＳＣにおいて過大に表現される。まとめると、これらの観察により、ｈＥＳＣ−ＭＳＣとＢＭ−ＭＳＣにおける分化能と情報伝達経路の利用は同一ではないことが示唆された。
【０２８７】
実施例５．単一細胞由来ＭＳＣ集団の分離のための、ｈＥＳＣとｈＥＳＣ由来ＭＳＣとにおける表面マーカー類別
ｈＥＳＣ−ＭＳＣとｈＥＳＣのいずれかにおいて高度に発現する、膜タンパク質をコードして分化中のｈＥＳＣからのＭＳＣの分離を容易にする遺伝子についてのゲノム全般にわたる発現について照会した。ｈＥＳＣ−ＭＳＣとｈＥＳＣのいずいれかにおいて膜タンパク質になると推定されるものをコードする、高度発現上位２０種の遺伝子のリストから、当該遺伝子産物に対する抗体が市販されているものを候補遺伝子として選択した（以下に示す表Ｅ１ＡとＥ１Ｂ）。ｈＥＳＣ由来において高度に発現する候補遺伝子のうち、
【表１】
2009506769.tif 000003
表Ｅ１Ａ．ｈＥＳＣよりもｈＥＳＣ由来ＭＳＣにおいて高度に発現する膜タンパク質
【表２】
2009506769.tif 000004
表Ｅ１Ｂ．ｈＥＳＣ由来ＭＳＣよりもｈＥＳＣにおいて高度に発現する膜タンパク質
【０２８８】
上掲の表Ｅ１ＡとＥ１Ｂにおいては、ｈＥＳＣ由来ＭＳＣにおいて高度に発現する表面抗原コード遺伝子（表Ｅ１Ａ）、あるいはその親であるｈＥＳＣ（表Ｅ１Ｂ）を示す。マイクロアレイ交配による遺伝子発現分析に基づき、ｈＥＳＣ（ＨｕＥＳ９、Ｈ１、及びＨｅｓ３  ｈＥＳＣ）でなくｈＥＳＣ由来ＭＳＣ（ＨｕＥＳ９．Ｅ１、ＨｕＥＳ９．Ｅ３、及びＨ１．Ｅ２）において高度に発現した上位２０種の遺伝子（表Ｅ１Ａ）、及びその逆（表Ｅ１Ｂ）を示す。
【０２８９】
ＭＳＣは、成体組織由来のＭＳＣの特徴的表面マーカーであるＥＮＧ（ＣＤ１０５）、ＩＴＧＡ４（ＣＤ４９ｄ）、ＰＤＧＦＲＡ、ＮＴ５Ｅ（ＣＤ７３）であり９−１１、ｈＥＳＣにおいて高度に発現する候補遺伝子は、ｈＥＳＣに特異的に高度に発現する遺伝子である旨を上記において示したＩＴＧＢ１ＢＰ３、ＰＯＤＸＬ２２、及びＣＤ２４であり、これらの発現はｈＥＳＣと関連付けられていなかった。ＣＤ２４はｈＥＳＣ−ＭＳＣよりもｈＥＳＣにおいて高度に発現することを確認した（図５Ａ）。
【０２９０】
実施例６．同質的ｈＥＳＣ−ＭＳＣ集団の誘導
次に、ｈＥＳＣ−ＭＳＣの同質性を強化するためのこれらマーカーの利用について試験した。トリプシン処理と、血清代替物、ＦＧＦ２、及び任意でＰＤＧＦ  ＡＢを添加した培地における培養の一週間後、培養物中の細胞をＣＤ１０５について肯定的に、ＣＤ２４について否定的に分類した。
【０２９１】
ＣＤ１０５＋細胞とＣＤ２４−細胞は、培養物の〜５％を構成した（図５Ｂ）。９６個のウェルをそれぞれ有する１０枚のプレート上にウェル１個当たり細胞１個の割合で、２４個のウェルを有する１枚のプレート上にウェル１個当たり細胞１００個の割合で、かつ６個のウェルをそれぞれ有する３枚のプレート上にウェル１個当たり細胞１０００個の割合で、分類した細胞をプレーティングした。これらのうち、１０００個の細胞を割り当てられた１８個のウェルのうち５個のウェルにおいてだけＭＳＣ様培養物が生成され、これにより、これら培養物は単一細胞から生成され易いことが示された。
【０２９２】
これら５個の培養物Ｑ４．１乃至Ｑ４．５におけるゲノム全般についての遺伝子発現プロファイルを約２４,０００個の特異的特性を有するＩｌｌｕｍｉｎａ  ＢｅａｄＡｒｒａｙを用いて行うと、５個の培養物における類似性が高度であり、これら株のうち４個における相関係数が０．９６であり、残りの１個に対するそれらの相関係数が０．９０であることが示された（図５Ｃ）。同一ＲＮＡ試料を用いて一ヶ月ずらして測定した技術的複製物間の相関係数は、いつも０．９７乃至０．９８の範囲にある。また、Ｑ４．１乃至Ｑ４．５は、ｈｕＥＳ９．Ｅ１、Ｈ１．Ｅ２、及びｈｕＥＳ９．Ｅ３から構成されるｈＥＳＣ−ＭＳＣと、ＢＭ−ＭＳＣとに対しても高度に類似しており、それぞれに対する相関係数が０．８７及び０．８１である（図５Ｄ）。
【０２９３】
対照的に、Ｑ４．１乃至Ｑ４．５の、それらの親であるＨｕＥＳ９．Ｅ１  ｈＥＳＣ株に対する相関係数は０．５５と低い（図５Ｄ）。ＧバンドとＳＫＹを用いた染色体分析をランダムに選択したＱ４．３培養物に対して行った。Ｑ４．３は、その親であるＨｕＥＳ９  ｈＥＳＣ株から派生した、染色体９番が逆位した正常な核型を有する（図５Ｅ）６。まとめると、ｂＦＧＦ２、及び任意でＰＤＧＦ  ＢＢを添加した培地で一週間増殖した後、トリプシン処理したｈＥＳＣ培養物をＣＤ１０５について肯定的に、ＣＤ２４について否定的に分類を行うことにより、高度に同質的なＭＳＣ培養物を生成することができることがこれらの観察により示された。
【０２９４】
肯定的かつ否定的に選択可能なマーカーを誘導手順に取り込むことにより、互いにほぼ同一であるゲノム全般についての発現プロファイルを有する５個のモノクローナルな分離株が誘導される結果となり、選択あるいは分類のための基準の特異性が確認された。５個の分離株間における各対ごとの全般的な遺伝子発現を比較すると、同一のＲＮＡ試料を用いた技術的複製物について観察されたものと同程度の、互いにほぼ等しい遺伝子発現プロファイルが得られた。
【０２９５】
実施例７乃至１５においては、ヒトＥＳＣ由来ＭＳＣ（ｈＥＳＣ−ＭＳＣ）のプロテオームを分析する実験について記載する。これらの実験においては、血清を含有しない化学的に定義された培養培地をヒトＥＳＣ由来ＭＳＣ（ｈＥＳＣ−ＭＳＣ）により条件付け、臨床的規格に準拠した手順により分析した。多次元タンパク質同定技術（ＭｕＤＰＩＴ）とサイトカイン抗体アレイ分析により条件付け培地を分析することにより、２０１種の特異な遺伝子産物の存在が明らかとなった。
【０２９６】
これらの遺伝子産物の８６乃至８８％がマイクロアレイあるいはｑＲＴ−ＰＣＲ検定により検出可能な転写量を有していた。コンピュータ分析によると、これらの遺伝子産物は生体内作用の主要な三種、つまり、代謝作用、防御応答、及び組織分化（脈管化、血液生成、及び骨格発達を含む）を顕著に推進することが予測された。これによると、２０１種の遺伝子産物は、心臓血管生物学的作用、骨の発達、及び血液生成において重要な情信号伝達経路である、たとえば、Ｊａｋ−ＳＴＡＴ、ＭＡＰＫ、トール様受容体、ＴＧＦ−β信号伝達系、ｍＴＯＲ信号伝達系等を活性化することが更に予測された。
【０２９７】
実施例７．ヒトＥＳＣ由来ＭＳＣ（ｈＥＳＣ−ＭＳＣ）のプロテオーム分析：材料と方法
条件付け培地の調製
ＨｕＥＳ９．Ｅ１細胞を上記のように培養した。８０％コンフルエントなＨｕＥＳ９．Ｅ１細胞をＰＢＳにより三回洗浄し、フェノールレッド（カタログ番号３１０５３；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ社、ニューヨーク州グランドアイランド所在）を含まず、ＩＴＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ社、ニューヨーク州グランドアイランド所在）と、５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ社、ニューヨーク州グランドアイランド所在）と、５ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ  ＡＢ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、ニュージャージー州ロッキーヒル所在）と、グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシンと、β−メルカプトエタノールとを添加したＤＭＥＭ培地により構成される化学的に定義された培地において一晩培養した。次に、培養物をＰＢＳにより三回洗浄し、その後、新たな定義済み培地に交換した。三日後、培地を採集し、５００×ｇにおいて遠心分離し、その浮遊物を０．２μフィルターにかけた。ＬＣ  ＭＳ／ＭＳ分析を行うべく、条件付け培地を分画分子量が３５００の透析カセット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、イリノイ州ロックフォード所在）に設置し、１０ｖｏｌ．の０．９％ＮａＣｌを三回取り替えて透析し、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いて二十回濃縮し、その後１００ｖｏｌ．の０．９％ＮａＣｌを十回取り替えて透析し、０．２μフィルターによりろ過した。条件付けた培地と並列的に、同一量の条件付けていない培地を透析、濃縮した。
【０２９８】
サイトカイン抗体ブロット分析
１ｍｌの条件付け、あるいは非条件付け培地をサイトカインとその他のタンパク質が存在するかについて、ＲａｙＢｉｏ（登録商標）サイトカイン抗体アレイを用い、製造者（ＲａｙＢｉｏ  Ｎｏｒｃｒｏｓｓ社、ジョージア州所在）の指示に従って分析した。
【０２９９】
ＬＣ  ＭＳ／ＭＳ分析
２ｍｌの透析した条件付け（ＣＭ）、あるいは非条件付け（ＮＣＭ）培地におけるタンパク質を{Ｗａｓｈｂｕｒｎ、第２９９７号、２００１年}において記載されているように還元、アルキル化、及びトリプシン消化した。次に、消化された混合物を条件付けＳｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ−１８  ＳＰＥカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ社、米国マサチューセッツ州ミルフォード所在）を通過させることにより試料を脱塩し、３％アセトニトリル（ＡＣＮ）（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ社、ニュージャージー州フィリップスバーグ所在）と０．１％ギ酸（ＦＡ）緩衝剤により二回洗浄し、７０％ＡＣＮと０．１％ＦＡ緩衝剤に溶出した。次に、溶出した試料をｓｐｅｅｄｖａｃにより、その本来の量の約１０％まで脱水し、０．１％ギ酸により５０μｌとなるよう調節した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の前まで、試料を摂氏４度に維持した。
【０３００】
脱塩ペプチド混合物をＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステム（ＬＴＱ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇｎ社、米国カリフォルニア州サンノゼ所在）を用い、ＭｕｄＰＩＴにより分析した。試料を強カチオン交換（ＳＣＸ）カラム（Ｂｉｏｂａｓｉｃ  ＳＣＸ、５ｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ社、米国サンノゼ所在）に充填し、第一次元において、５０ｕｌの緩衝剤（５％ＡＣＮと０．１％ＦＡにおける、それぞれ０、２、５、１０、１００、及び１０００ｍＭの塩化アンモニウム）を用いた六段階の塩溶（ｓａｌｔ）工程により分画した。ＳＣＸカラムから溶出したペプチドをＺｏｒｂａｘペプチドトラップ（Ａｇｉｌｅｎｔ社、米国カリフォルニア州パロアルト所在）において濃縮、脱塩する。ナノ孔を開けた（ｎａｎｏｂｏｒｅｄ）自家充填のＣ１８カラム（７５ｕｍ  ｉ．ｄ×１０ｃｍ、５μｍの粒子）を用い、２００ｎＬ／分の流量で１２０分の勾配を設けて、第二次元において、ピコレベルフリットのナノスプレイチップ（ｐｉｃｏ−ｆｒｉｔ  ｎａｎｏｓｐｒａｙ  ｔｉｐ）（Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ社、米国マサチューセッツ州ウォバーン所在）へと直接的にクロマトグラフ分離した。
【０３０１】
ＬＴＱをデータ依存モード（ｄａｔａ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｏｄｅ）で操作し、ＭＳ／ＭＳスキャンを行って、各ＭＳスキャンから最強度のピークのうち三つを得た。各実験において、六段階の塩溶（ｓａｌｔ）工程におけるｍｓ／ｍｓ（ｄｔａ）スペクトルを自家製プログラムにより合成して単一マスコットで示す包括的ファイル（ｓｉｎｇｌｅ  ｍａｓｃｏｔ  ｇｅｎｅｒｉｃ  ｆｉｌｅ）にまとめた。タンパク質同定は、インハウスのＭａｓｃｏｔサーバを通じて合成データをＩＰＩヒトタンパク質データベースと比較検索することにより行った。検索パラメータは、トリプシンにより最大で二回、分裂機会を逸していること；固定的な修飾がカルバミンメチル化であり、可変的な修飾がメチオニンの酸化とタンパク質Ｎ末端アセチル化であること、である。質量の許容誤差は、ペプチド前駆体と断片イオンについてそれぞれ０．２と０．８Ｄａに設定した。タンパク質同定においては、二個の異なるペプチドがスコア５０以上において観察された場合、真陽性であると認証する。多くの成長因子とサイトカインは小タンパク質／小ペプチドであり少量で分泌されるので、対応するＭＳ／ＭＳスペクトルは弱小であり、タンパク質当たり一個のペプチドが同定されるであろう。２０乃至５０のＭａｓｃｏｔスコアを有するペプチドについては、ＭＳ／ＭＳスペクトルを手作業により認証する。
【０３０２】
バイオインフォマティクス
認証したタンパク質については、非条件付け培地において同定される周囲のタンパク質を除去することにより照合した。次に、各タンパク質についてのＩＰＩ識別子をタンパク質相互参照表を用いて遺伝子記号に変換した。遺伝子産物は、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ＧＸ７．３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カリフォルニア州パロアルト所在）のＧＯ分類システムであるＧｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ；遺伝子オントロジー）分類における生体内作用もしくは経路のそれぞれへと分類し、各作用あるいは経路における遺伝子頻度をＧｅｎｂａｎｋヒトゲノムデータベースにおける対応物と比較するが、遺伝子頻度が比較物より顕著に高い（ｐ＜０．０５）作用あるいは経路は、ＭＳＣの分泌により著しく変調されたものであると想定される。
【０３０３】
ｑＲＴ−ＰＣＲ
総ＲＮＡをＨｕＥＳ９．Ｅ１細胞からＴｒｉｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）により抽出してスピンカラム（Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ＲＮＡ  ＩＩ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．社、ドイツ、デュレン市所在）上で、製造者が指示する手順に従って浄化した。１μｇの総ＲＮＡを、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ａｒｃｈｉｖｅ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国カリフォルニア州フォスターシティ所在）を用いて５０μｌの反応体積において、ランダムなプライマーを有する相補的ＤＮＡへと変換した。相補的ＤＮＡを蒸留水で希釈して１００μｌの体積にした。経路特定的なＲＴ２  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  ＰＣＲ  Ａｒｒａｙｓ（ＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ社、米国フレデリック所在）において、製造者が指示する手順に従って、各プライマーセット当たり１μｌを用いた。分析に用いたプレートは、Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ  ＆  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ＰＣＲ  Ａｒｒａｙ（カタログ番号ＡＰＨ−０２２）、ＮＦｋＢ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐａｔｈｗａｙ  ＰＣＲ  Ａｒｒａｙ（カタログ番号ＡＰＨ−０２５）、Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ＆  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ＰＣＲ  Ａｒｒａｙ（カタログ番号ＡＰＨ−０１１）、Ｃｏｍｍｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＰＣＲ  Ａｒｒａｙ（カタログ番号ＡＰＨ−０２１）、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐａｔｈｗａｙ  ＰＣＲ  Ａｒｒａｙ（カタログ番号ＡＰＨ−０３９）である。
【０３０４】
実施例８．ヒトＥＳＣ由来ＭＳＣ（ｈＥＳＣ−ＭＳＣ）のプロテオーム分析：条件付け培地（ＣＭ）及び非条件付け培地（ＮＣＭ）の調製
血清代替物培地等の培地添加物による条件付け培地の汚染を最小限とするべく、ＨｕＥＳ９．Ｅ１  ＭＳＣを約８０％コンフルエントな状態まで成長させ、ＰＢＳにより三回洗浄し、ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン、及びセレンタンパク質）、５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２、５ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ  ＡＢ、グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン、及びβ−メルカプトエタノールを添加したＤＭＥＭにより構成される化学的に定義された培地において一晩定温放置する。ＨｕＥＳ９．Ｅ１  ＭＳＣは、この最少培地において少なくとも一週間増殖させることができる。翌日に、細胞培養物を再度ＰＢＳにより三回洗浄し、新たな定義培地において定温放置した。
【０３０５】
培地を、三日間の条件付けの後に採集した。条件付け培地（ＣＭ）は、常に等量の非条件付け培地（ＮＣＭ）と並列的に分析もしくは処理する。ＬＣ  ＭＳ／ＭＳ分析を行うべく、試料及び方法記載において述べられているように、０．９％生理食塩水に対する広範な透析を行う前に培地を〜１０倍まで濃縮した。濃縮ＣＭ及びＮＣＭにおける平均的タンパク質濃度は、それぞれ９８．０±１７．９μｇ／ｍｌ及び４１．６±１．２μｇ／ｍｌ（ｎ＝３）であった。ＭＳＣによる培地条件付けは、培地のアリコートをタンパク質ゲル上に走らせることにより監視する。培地のタンパク質組成は時間の経過に従って複雑性を増した（図６）。ＣＭは、ＮＣＭよりも複雑なタンパク質組成となった。
【０３０６】
実施例９．ヒトＥＳＣ由来ＭＳＣ（ｈＥＳＣ−ＭＳＣ）のプロテオーム分析：ＭＳＣ条件付け培地のＬＣ  ＭＳ／ＭＳと抗体アレイによる分析
ＬＣ  ＭＳ／ＭＳにより、二つの個別に調製したＣＭバッチに存在し、同様に処理したＮＣＭには存在しない２５０種のタンパク質が同定／識別された。これらは、以下の通りである。
【０３０７】
１．ＩＰＩ０００２１４２８  アクチン、アルファ骨格筋；  ２．ＩＰＩ００４１４０５７  アクチン  アルファ１骨格筋タンパク質；  ３．ＩＰＩ００００８６０３  アクチン、大動脈平滑筋；  ４．ＩＰＩ０００２１４３９  アクチン、細胞質１；  ５．ＩＰＩ０００２３００６  アクチン、アルファ心臓（ａｌｐｈａ  ｃａｒｄｉａｃ）；  ６．ＩＰＩ０００２１４４０  アクチン、細胞質２；  ７．ＩＰＩ０００２５４１６  アクチン、ガンマ−腸平滑筋；  ８．ＩＰＩ００４７９９２５  アグリン；  ９．ＩＰＩ０００１５１０２  ＣＤ１６６  抗原前駆体；  １０．ＩＰＩ００００７４２３  酸性富ロイシン核リンタンパク質３２  ファミリーメンバーＢ；  １１．ＩＰＩ００４１３３３１  ３６ｋＤａ  タンパク質；  １２．ＩＰＩ００４１２５７７  ３４ｋＤａ  タンパク質；  １３．ＩＰＩ００４１３５０６  ３３ｋＤａ  タンパク質；  １４．ＩＰＩ００４１８１６９  仮想的タンパク質  ＤＫＦＺｐ６８６Ｐ０３１５９；  １５．ＩＰＩ００００３８１５  Ｒｈｏ  ＧＤＰ−分解抑制剤１；  １６．ＩＰＩ００００４６５６  ベータ−２−ミクログロブリン前駆体；  １７．ＩＰＩ００２１８０４２  骨形成タンパク質１前駆体のスプライスアイソフォームＢＭＰ１−５；  １８．ＩＰＩ００００９０５４  骨形成タンパク質１前駆体のスプライスアイソフォームＢＭＰ１−３；  １９．ＩＰＩ０００１４０２１  骨形成タンパク質１前駆体のスプライスアイソフォームＢＭＰ１−１；  ２０．ＩＰＩ００２１８０４０  骨形成タンパク質１前駆体のスプライスアイソフォームＢＭＰ１−４；  ２１．ＩＰＩ００００６９８０  タンパク質  Ｃ１４ｏｒｆ１６６；  ２２．ＩＰＩ００２９６１６５  補体Ｃ１ｒサブコンポーネント前駆体；  ２３．ＩＰＩ００１５２５４０  ＯＴＴＨＵＭＰ００００００１６７４８；  ２４．ＩＰＩ００３０５０６４  ＣＤ４４抗原前駆体のスプライスアイソフォームＣＤ４４；  ２５．ＩＰＩ００２９７１６０  仮想的タンパク質  ＤＫＦＺｐ４５１Ｋ１９１８；  ２６．ＩＰＩ００２９３５３９  カドヘリン−１１前駆体のスプライスアイソフォーム２；  ２７．ＩＰＩ００３０４２２７  カドヘリン−１１前駆体のスプライスアイソフォーム１；  ２８．ＩＰＩ００３８６４７６  カドヘリン１１、種類２、アイソフォーム１プレプロタンパク質；  ２９．ＩＰＩ０００２４０４６  カドヘリン−１３前駆体；
【０３０８】
３０.ＩＰＩ００２９００８５  神経カドヘリン前駆体；  ３１．ＩＰＩ０００２９７３９  補体因子Ｈ前駆体のスプライスアイソフォーム１；  ３２．ＩＰＩ０００１２０１１  コフィリン、非筋肉アイソフォーム；  ３３．ＩＰＩ００００７２５７  カルシンテニン１アイソフォーム２；  ３４．ＩＰＩ００２１８５３９  コラーゲンアルファ−１（ＸＩ）鎖前駆体のスプライスアイソフォームＢ；  ３５．ＩＰＩ００４７７３５０  コラーゲン、種類ＸＩ、アルファ１；  ３６．ＩＰＩ００３２９５７３  コラーゲンアルファ−１（ＸＩＩ）鎖前駆体のスプライスアイソフォームロング；  ３７．ＩＰＩ００２２１３８４  コラーゲンアルファ−１（ＸＩＩ）鎖前駆体のスプライスファイソフォームショート；  ３８．ＩＰＩ００４００９３５  コラーゲンアルファ−１（ＸＶＩ）鎖前駆体；  ３９．ＩＰＩ００２９７６４６  コラーゲンアルファ−１（Ｉ）鎖前駆体；  ４０．ＩＰＩ００１６４７５５  プレプロ−アルファ２（Ｉ）コラーゲン前駆体；  ４１．ＩＰＩ００３０４９６２  コラーゲンアルファ−２（Ｉ）鎖前駆体；  ４２．ＩＰＩ０００２１０３３  コラーゲンアルファ−１（ＩＩＩ）鎖前駆体；  ４３．ＩＰＩ００１６７０８７  ＣＯＬ３Ａ１タンパク質；  ４４．ＩＰＩ０００２１０３４  コラーゲンアルファ−１（ＩＶ）鎖前駆体；  ４５．ＩＰＩ００４７９３２４  アルファ２種類ＩＶコラーゲンプレプロタンパク質；  ４６．ＩＰＩ００３０６３２２  コラーゲンアルファ−２（ＩＶ）鎖前駆体；  ４７．ＩＰＩ００３０３３１３  コラーゲンアルファ−１（Ｖ）鎖前駆体；  ４８．ＩＰＩ００４７７６１１  １８４ｋＤａ  タンパク質；  ４９．ＩＰＩ００２９３８８１  ＣＯＬ５Ａ２タンパク質；  ５０．ＩＰＩ０００１８２７９  コラーゲンアルファ−３（Ｖ）鎖前駆体；  ５１．ＩＰＩ００２９１１３６  コラーゲンアルファ−１（ＶＩ）鎖前駆体；  ５２．ＩＰＩ００３０４８４０  コラーゲンアルファ−２（ＶＩ）鎖前駆体のスプライスアイソフォーム２Ｃ２；  ５３．ＩＰＩ００２２０６１３  コラーゲンアルファ−２（ＶＩ）鎖前駆体のスプライスアイソフォーム２Ｃ２Ａ；  ５４．ＩＰＩ０００２２２００  アルファ３種類ＶＩコラーゲンアイソフォーム１前駆体；  ５５．ＩＰＩ０００７２９１８  アルファ３種類ＶＩコラーゲンアイソフォーム４前駆体；  ５６．ＩＰＩ００２２０７０１  コラーゲンアルファ−３（ＶＩ）鎖前駆体のスプライスアイソフォーム２；  ５７．ＩＰＩ０００７２９１７  アルファ３種類ＶＩコラーゲンアイソフォーム３前駆体；  ５８．ＩＰＩ０００２１８２８  シスタチンＢ；  ５９．ＩＰＩ００００７７７８  Ｄｉ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｈｉｔｏｂｉａｓｅ前駆体；  ６０．ＩＰＩ００２９５７４１  カテプシンＢ前駆体；
【０３０９】
６１.ＩＰＩ００２９９２１９  タンパク質ＣＹＲ６１前駆体；  ６２．ＩＰＩ００５１４９００  ４２ｋＤａタンパク質；  ６３．ＩＰＩ００３３３７７０  細胞質分裂タンパク質１０のデディケータ（ｄｅｄｉｃａｔｏｒ）に類似；  ６４．ＩＰＩ００４７８３３２  細胞質分裂タンパク質９のデディケータに類似；  ６５．ＩＰＩ０００００８７５  伸長因子１−ガンマ；  ６６．ＩＰＩ００４６５２４８  アルファ−エノラーゼ；  ６７．ＩＰＩ０００１３７６９  アルファ−エノラーゼ、肺特異的；  ６８．ＩＰＩ００２１６１７１  ガンマ−エノラーゼ；  ６９．ＩＰＩ００２１８８０３  フィブリン−１前駆体のスプライスアイソフォームＢ；  ７０．ＩＰＩ００２９６５３７  フィブリン−１前駆体のスプライスアイソフォームＣ；  ７１．ＩＰＩ００３２８１１３  フィブリリン−１前駆体；  ７２．ＩＰＩ０００１９４３９  フィブリリン２前駆体；  ７３．ＩＰＩ００３８５６４５  線維芽細胞増殖因子１７前駆体のスプライスアイソフォーム２；  ７４．ＩＰＩ００２１６６０２  線維芽細胞増殖因子受容体２前駆体のスプライスアイソフォーム５；  ７５．ＩＰＩ００２１６６０４  線維芽細胞増殖因子受容体２前駆体のスプライスアイソフォーム８；  ７６．ＩＰＩ０００３４０９９  仮想的タンパク質ＦＬＪ２１９１８；  ７７．ＩＰＩ００３３３５４１  フィラミン−Ａ；  ７８．ＩＰＩ００３０２５９２  フィラミンＡ、アルファ；  ７９．ＩＰＩ００３３９２２７  仮想的タンパク質ＤＫＦＺｐ６８６Ｏ１１６６；  ８０．ＩＰＩ００４１４２８３  フィブロネクチン前駆体（ＦＮ）（寒冷不溶性グロブリン）（ＣＩＧ）．スプライスアイソフォーム３；  ８１．ＩＰＩ００３３９２２５  フィブロネクチン前駆体のスプライスアイソフォーム５；  ８２．ＩＰＩ００３３９３１９  フィブロネクチン前駆体のスプライスアイソフォーム１１；  ８３．ＩＰＩ００５５６６３２  フィブロネクチン前駆体のスプライスアイソフォーム１２；  ８４．ＩＰＩ００４１１４６２  仮想的タンパク質ＤＫＦＺｐ６８６Ｂ１８１５０；  ８５．ＩＰＩ０００２９７２３  ホリスタチン関連タンパク質１前駆体；  ８６．ＩＰＩ００００５４０１  ポリペプチド  Ｎ−アセチルガラクトスアミニルトランスフェラーゼ５；  ８７．ＩＰＩ００２１９０２５  Ｇｌｕｔａｒｅｄｏｘｉｎ−１；  ８８．ＩＰＩ００１７１４１１  ゴルジリンタンパク質２；  ８９．ＩＰＩ０００２６３１４  ゲルゾリン前駆体；
【０３１０】
９０．ＩＰＩ００２１９７５７  グルタチオンＳ−トランスフェラーゼＰ；  ９１．ＩＰＩ０００２７５６９  不均一核リボヌクレオタンパク質Ｃ様１；  ９２．ＩＰＩ００００３８８１  ＨＮＲＰＦ  タンパク質；  ９３．ＩＰＩ００４４２２９４  ニューロトリミン前駆体のスプライスアイソフォーム１；  ９４．ＩＰＩ００００３８６５  熱ショックコグネート７１ｋＤａタンパク質のスプライスアイソフォーム１；  ９５．ＩＰＩ０００３７０７０  熱ショックコグネート７１ｋＤａタンパク質のスプライスアイソフォーム２；  ９６．ＩＰＩ００２２０３６２  １０ｋＤａ熱ショックタンパク質、ミトコンドリア；  ９７．ＩＰＩ０００２４２８４  基底膜特異性ヘパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質前駆体；  ９８．ＩＰＩ００２９７２８４  インスリン様成長因子結合タンパク質２前駆体；  ９９．ＩＰＩ００２９７２８４  インスリン様成長因子結合タンパク質２前駆体；  １００．ＩＰＩ０００２９２３６  インスリン様成長因子結合タンパク質５前駆体；  １０１．ＩＰＩ０００２９２３６  インスリン様成長因子結合タンパク質５前駆体；  １０２．ＩＰＩ０００２９２３５  インスリン様成長因子結合タンパク質６前駆体；  １０３．ＩＰＩ０００２９２３５  インスリン様成長因子結合タンパク質６前駆体；  １０４．ＩＰＩ０００１６９１５  インスリン様成長因子結合タンパク質７前駆体；  １０５．ＩＰＩ０００１６９１５  インスリン様成長因子結合タンパク質７前駆体；  １０６．ＩＰＩ００３２８１６３  Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１タンパク質；  １０７．ＩＰＩ０００２１３９６  血管内皮成長因子受容体２前駆体；  １０８．ＩＰＩ００２９８２８１  ラミニンガンマ−１鎖前駆体；  １０９．ＩＰＩ００２１９２１９  ガレクチン−１；  １１０．ＩＰＩ０００２３６７３  ガレクチン−３結合タンパク質前駆体；  １１１．ＩＰＩ０００２１４０５  ラミン−Ａ／ＣのスプライスアイソフォームＡ；  １１２．ＩＰＩ００２１６９５３  ラミン−Ａ／ＣのスプライスアイソフォームＡＤｅｌｔａ１０；  １１３．ＩＰＩ００１８０１７３  予測通り：トロポミオシン４に類似；  １１４．ＩＰＩ００４０１６１４  予測通り：ＦＫＳＧ３０に類似；  １１５．ＩＰＩ００３７４３９７  予測通り：トロポミオシン４に類似；  １１６．ＩＰＩ００３７４７３２  予測通り：ＰＰＩＡタンパク質に類似；  １１７．ＩＰＩ００４０２１０４  予測通り：ペプチジルプロリル異性化酵素Ａアイソフォーム１に類似；サイクロフィリンＡ；ペプチジル−プロ；  １１８．ＩＰＩ００４５５４１５  予測通り：不均一核リボヌクレオタンパク質Ｃ様ｄＪ８４５Ｏ２４．４に類似；  １１９．ＩＰＩ００４５４７２２  予測通り：ホスファチジルエタノールアミン結合タンパク質に類似；  １２０．ＩＰＩ００４５４８５２  予測通り：奇形癌由来成長因子１に類似；
【０３１１】
１２１．ＩＰＩ００００２８０２  タンパク質−リジン６−酸化酵素前駆体；  １２２．ＩＰＩ００４１０１５２  潜在形質転換成長因子ベータ結合タンパク質１アイソフォームＬＴＢＰ−１Ｌ；  １２３．ＩＰＩ００２２０２４９  潜在形質転換成長因子ベータ結合タンパク質、アイソフォーム１Ｌ前駆体；  １２４．ＩＰＩ００２２０２４９  潜在形質転換成長因子ベータ結合タンパク質、アイソフォーム１Ｌ前駆体"；  １２５．ＩＰＩ００４１０１５２  潜在形質転換成長因子ベータ結合タンパク質１アイソフォームＬＴＢＰ−１Ｌ；  １２６．ＩＰＩ０００２０９８６  ルミカン前駆体；  １２７．ＩＰＩ００２９１００６  リンゴ酸脱水素酵素、ミトコンドリア前駆体；  １２８．ＩＰＩ００００５７０７  マクロファージマンノース受容体２前駆体；  １２９．ＩＰＩ０００２０５０１  ミオシン−１１；  １３０．ＩＰＩ０００１９５０２  ミオシン−９；  １３１．ＩＰＩ００６０４６２０  ヌクレオリン；  １３２．ＩＰＩ００２２０７４０  ヌクレオフォスミンのスプライスアイソフォーム２；  １３３．ＩＰＩ００２１９４４６  ホスファチジルエタノールアミン結合タンパク質；  １３４．ＩＰＩ００２９９７３８  プロコラーゲンンＣ−エンドペプチダーゼエンハンサー１前駆体；  １３５．ＩＰＩ０００１５９０２  ベータ血小板由来成長因子受容体前駆体；  １３６．ＩＰＩ００２１６６９１  プロフィリン−１；  １３７．ＩＰＩ００１６９３８３  ホスホグリセリン酸塩キナーゼ１；  １３８．ＩＰＩ００２１９５６８  ホスホグリセリン酸塩キナーゼ、睾丸特異性；  １３９．ＩＰＩ００２９６１８０  ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子前駆体；  １４０．ＩＰＩ００２１５９４３  プレクチン１のスプライスアイソフォーム３；  １４１．ＩＰＩ００２１５９４２  プレクチン１のスプライスアイソフォーム２；  １４２．ＩＰＩ０００１４８９８  プレクチン１のスプライスアイソフォーム１；  １４３．ＩＰＩ００３９８７７７  プレクチン１アイソフォーム８；  １４４．ＩＰＩ００３９８７７６  プレクチン１アイソフォーム７；  １４５．ＩＰＩ００１８６７１１  プレクチン１アイソフォーム６；  １４６．ＩＰＩ００４２００９６  プレクチン１アイソフォーム３；  １４７．ＩＰＩ００３９８７７９  プレクチン１アイソフォーム１１；  １４８．ＩＰＩ００３９８７７８  プレクチン１アイソフォーム１０；  １４９．ＩＰＩ００３９８００２  プレクチン１アイソフォーム１；  １５０．ＩＰＩ００４１９５８５  ペプチジル−プロリルシストランス異性化酵素Ａ；
【０３１２】
１５１．ＩＰＩ００４７２７１８  ペプチジルプロリル異性化酵素Ａアイソフォーム２；  １５２．ＩＰＩ０００００８７４  ペルオキシレドキシン−１；  １５３．ＩＰＩ０００２４９１５  ペルオキシレドキシン−５、ミトコンドリア前駆体；  １５４．ＩＰＩ００３７５３０６  ペルオキシレドキシン５前駆体、アイソフォームｂ；  １５５．ＩＰＩ０００１２５０３  前駆賦活体ポリペプチド前駆体のスプライスアイソフォームＳａｐ−ｍｕ−０；  １５６．ＩＰＩ００３７４１７９  プロテアソーム活性化因子サブユニット１アイソフォーム２；  １５７．ＩＰＩ０００３０１５４  プロテアソーム活性化因子錯体サブユニット１；  １５８．ＩＰＩ００１６８８１２  ＰＴＫ７タンパク質チロシン・キナーゼ７アイソフォームｄ前駆体；  １５９．ＩＰＩ００４１９９４１  ＰＴＫ７タンパク質チロシン・キナーゼ７アイソフォームａ前駆体；  １６０．ＩＰＩ００００３５９０  Ｑｕｉｅｓｃｉｎ  Ｑ６、アイソフォームａ；  １６１．ＩＰＩ０００１５９１６  骨由来成長因子（フラグメント）；  １６２．ＩＰＩ０００１５９１６  骨由来成長因子；  １６３．ＩＰＩ００２９８２８９  レティキュロン−４のスプライスアイソフォーム２；  １６４．ＩＰＩ０００２１７６６  レティキュロン−４のスプライスアイソフォーム１；  １６５．ＩＰＩ０００１３８９５  カルギザリン；  １６６．ＩＰＩ０００１０４０２  仮想的タンパク質；  １６７．ＩＰＩ００２１８７３３  スーパーオキシドジスムターゼ；  １６８．ＩＰＩ０００１４５７２  ＳＰＡＲＣ前駆体；  １６９．ＩＰＩ００００５６１４  スペクトリンベータ鎖のスプライスアイソフォームロング、脳１；  １７０．ＩＰＩ００００８７８０  スタニオカルシン−２前駆体；  １７１．ＩＰＩ００３０１２８８  ＳＥＬ−ＯＢタンパク質；  １７２．ＩＰＩ００２１６１３８  トランスゲリン；  １７３．ＩＰＩ０００１８２１９  形質転換成長因子ベータ誘導タンパク質ｉｇ−ｈ３前駆体；  １７４．ＩＰＩ００３０４８６５  形質転換成長因子、ベータ受容体ＩＩＩ"；  １７５．ＩＰＩ００２９６０９９  トロンボスポンジン−１前駆体；  １７６．ＩＰＩ０００３２２９２  メタロプロテイナーゼ阻害剤１前駆体；  １７７．ＩＰＩ０００２７１６６  メタロプロテイナーゼ阻害剤２前駆体；  １７８．ＩＰＩ００２２０８２８  サイモシンベータ−４；  １７９．ＩＰＩ００１８０２４０  サイモシン様３；
【０３１３】
１８０．ＩＰＩ００２９９６３３  ＯＴＴＨＵＭＰ００００００３１２７０（フラグメント）；  １８１．ＩＰＩ００４６５０２８  トリオースリン酸異性化酵素１異変株（フラグメント）；  １８２．ＩＰＩ００４５１４０１  トリオースリン酸異性化酵素のスプライスアイソフォーム２；  １８３．ＩＰＩ０００１０７７９  トロポミオシン４；  １８４．ＩＰＩ００２１６９７５  トロポミオシンアルファ−４鎖のスプライスアイソフォーム２；１８５．ＩＰＩ００１８０６７５  チューブリンアルファ−３鎖；  １８６．ＩＰＩ００２１８３４３  チューブリンアルファ−６鎖；  １８７．ＩＰＩ００２１６２９８  チオレドキシン；  １８８．ＩＰＩ００４７２１７５  ＣＤＮＡ  ＦＬＪ４６６７２ｆｉｓ、クローンＴＲＡＣＨ３００９００８、チオレドキシン還元酵素に高度に類似；  １８９．ＩＰＩ００４５０４７２  ユビキチン抱合酵素Ｅ２Ｉ；  １９０．ＩＰＩ０００１８３５２  ユビキチンカルボキシ末端加水分解酵素アイソザイムＬ１；  １９１．ＩＰＩ０００１０２０７  ユビキチンフォールド修飾因子１前駆体；  １９２．ＩＰＩ００２６０６３０  ＵＲＢ；  １９３．ＩＰＩ０００２１２６３  １４−３−３タンパク質ゼータ／デルタ；  １９４．ＩＰＩ００６４２９９１  仮想的タンパク質ＤＫＦＺｐ６８６Ｆ１０１６４；  １９５．ＩＰＩ００４７０９１９  仮想的タンパク質ＤＫＦＺｐ６８６Ｋ０８１６４；  １９６．ＩＰＩ００７１９０８８  コラーゲン、種類ＶＩ、アルファ１前駆体；  １９７．ＩＰＩ００６５４６８５  ＳＰＡＲＣ前駆体に類似；  １９８．ＩＰＩ００６４１９６１  コラーゲン、種類ＸＩＩ、アルファ１；  １９９．ＩＰＩ００６４５８４９  細胞外基質タンパク質１；  ２００．ＩＰＩ００５５４７８６  チオレドキシン還元酵素１；  ２０１．ＩＰＩ００６４５０１８  プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ；  ２０２．ＩＰＩ００５５２３３９  メタロプロテイナーゼ１の組織阻害剤；  ２０３．ＩＰＩ００６４２９９７  アクチン、細胞質２；  ２０４．ＩＰＩ００７１９７７８  アネクシンＡ２に類似；  ２０５．ＩＰＩ００６４７９１５  トランスゲリン２；  ２０６．ＩＰＩ００５５２８１５  コラーゲン、種類Ｖ、アルファ１；  ２０７．ＩＰＩ００５５２９８１  ＣＤＮＡ  ＰＳＥＣ０２６６ｆｉｓ、クローンＮＴ２ＲＰ３００３６４９、ホモサピエンスフィブリン−１ＤｍＲＮＡに高度に類似；  ２０８．ＩＰＩ００１８０７７６  ２９ｋＤａタンパク質；  ２０９．ＩＰＩ００５５２４１６フィラミンＡ、アルファ；
【０３１４】
２１０．ＩＰＩ００６４０６９８  アクチン、ガンマ−腸平滑筋；  ２１１．ＩＰＩ００５１４５３０  アクチン、アルファ１、骨格筋；  ２１２．ＩＰＩ００５５６４４２  インスリン様成長因子結合タンパク質２異変株（フラグメント）；  ２１３．ＩＰＩ００５１３７８２  ゲルゾリン；  ２１４．  ＩＰＩ００４７８７３１  ２９ｋＤａタンパク質；  ２１５．ＩＰＩ００３９６４７９  ２４ｋＤａタンパク質；  ２１６．ＩＰＩ００３３４６２７  ３９ｋＤａタンパク質；  ２１７．ＩＰＩ００５５５７６２  ＰＴＫ７タンパク質チロシン・キナーゼ７アイソフォームａ異変株（フラグメント）；  ２１８．ＩＰＩ００６５８２０２  ９７ｋＤａタンパク質；  ２１９．ＩＰＩ００００６２７３  ＣＹＲ６１  タンパク質；  ２２０．ＩＰＩ００７１９４０５  ＴＭＳＬ６タンパク質；  ２２１．ＩＰＩ００６５８０９６  サイモシンベータ−４；  ２２２．ＩＰＩ００３７６１６３  ５ｋＤａタンパク質；  ２２３．ＩＰＩ００５５６２１７  フィグリリン１異変株（フラグメント）；  ２２４．ＩＰＩ００５１４８１７  ラミンＡ／Ｃに類似；  ２２５．ＩＰＩ００６４４０８７  プロジェリン；  ２２６．  ＩＰＩ００６５５８１２  横紋筋肉腫抗原ＭＵ−ＲＭＳ−４０．１２；  ２２７．ＩＰＩ００６０４５１７  ヌクレオリンに類似；  ２２８．ＩＰＩ００４４４２６２  ＣＤＮＡ  ＦＬＪ４５７０６ｆｉｓ、クローンＦＥＢＲＡ２０２８４５７、ヌクレオリンに高度に類似；  ２２９．ＩＰＩ００４１２４７３  タンパク質；  ２３０．ＩＰＩ００４１４４８９  タンパク質；  ２３１．ＩＰＩ００４１１４６３  タンパク質；  ２３２．ＩＰＩ００５５６４１５  トランスゲリン異変株（フラグメント）；  ２３３．ＩＰＩ００７１８８２５  カルモジュリン；  ２３４．ＩＰＩ００４７８１５６  １７ｋＤａタンパク質；  ２３５．ＩＰＩ００３８６６２１  ＣＡＬＭ３タンパク質；  ２３６．ＩＰＩ００６４７００１  酸性；  ２３７．ＩＰＩ００６４２６５０  スタニオカルシン２前駆体に類似；  ２３８．ＩＰＩ００６４１４７１  コラーゲン様タンパク質；  ２３９．ＩＰＩ００５１４６６９  ＳＨ３ドメイン結合富グルタミン酸タンパク質様３（ＳＨ３  ｄｏｍａｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ−ｒｉｃｈ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｋｅ  ３）；  ２４０．ＩＰＩ００７１９４２２  トリオースリン酸異性化酵素（フラグメント）；  ２４１．ＩＰＩ００００３７３４  推定Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｈ＿ＮＨ０４５６Ｎ１６．１（Ｐｕｔａｔｉｖｅ  Ｓ１００  ｃａｌｃｉｕｍ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｈ＿ＮＨ０４５６Ｎ１６．１）；  ２４２．ＩＰＩ０００２９５７４  １１ｋＤａ  タンパク質；  ２４３．ＩＰＩ００６４１０４７  ゲルゾリン；  ２４４．ＩＰＩ００６４７５５６  ゲルゾリン；  ２４５．ＩＰＩ００６５４８２１  仮想的タンパク質ＬＯＣ５４８４５  アイソフォーム１；  ２４６．ＩＰＩ００６４７５７２  Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質−３前駆体；  ２４７．ＩＰＩ００６３９８７９  細胞質分裂タンパク質ｓｅｐＡに類似；  ２４８．ＩＰＩ００６５７７４６  細胞質分裂タンパク質８のデディケータに類似；  ２４９．ＩＰＩ００５５５９９３  血管内皮成長因子受容体３異変株；  ���５０．ＩＰＩ００５５２５４５  細胞質分裂タンパク質８のデディケータ。
【０３１５】
まとめると、これら２５０種のタンパク質は、１３２種の固有の既知の遺伝子にコードされる：ＡＣＴＡ１；ＣＯＬ５Ａ２；ＨＳＰＡ８；ＰＳＡＰ；ＡＣＴＡ２；ＣＯＬ５Ａ３；ＨＳＰＥ１；ＰＳＭＥ１；ＡＣＴＢ；ＣＯＬ６Ａ１；ＨＳＰＧ２；ＰＴＫ７；ＡＣＴＣ；ＣＯＬ６Ａ２；ＩＧＦＢＰ２；ＱＳＣＮ６；ＡＣＴＧ１；ＣＯＬ６Ａ３；ＩＧＦＢＰ５；ＲＴＮ４；ＡＣＴＧ２；ＣＳＴＢ；ＩＧＦＢＰ６；Ｓ１００Ａ１１；ＡＧＲＮ；ＣＴＢＳ；ＩＧＦＢＰ７；ＳＨ３ＢＧＲＬ３；ＡＬＣＡＭ；ＣＴＳＢ；Ｋ−ＡＬＰＨＡ―１；ＳＯＤ１；ＡＮＰ３２Ｂ；ＣＹＲ６１；ＫＤＲ；ＳＰＡＲＣ；ＡＮＸＡ２；ＤＯＣＫ１０；ＬＡＭＣ１；ＳＰＴＢＮ１；ＡＲＨＧＤＩＡ；ＤＯＣＫ８；ＬＧＡＬＳ１；ＳＴＣ２；Ｂ２Ｍ；ＥＣＭ１；ＬＧＡＬＳ３ＢＰ；ＳＶＥＰ１；ＢＭＰ１；ＥＥＦ１Ｇ；ＬＭＮＡ；ＴＡＧＬＮ；Ｃ１４ｏｒｆ１６６；ＥＮＯ１；ＬＯＸ；ＴＡＧＬＮ２；Ｃ１Ｒ；ＥＮＯ１Ｂ；ＬＴＢＰ１；ＴＧＦＢＩ；ＣＡＬＭ１；ＥＮＯ２；ＬＵＭ；ＴＧＦＢＲ３；ＣＤ１０９；ＦＢＬＮ１；ＭＤＨ２；ＴＨＢＳ１；ＣＤ４４；ＦＢＮ１；ＭＲＣ２；ＴＩＭＰ１；ＣＤＨ１１；ＦＢＮ２；ＭＹＨ１１；ＴＩＭＰ２；ＣＤＨ１３；ＦＧＦ１７；ＭＹＨ９；ＴＭＳＢ４Ｘ；ＣＤＨ２；ＦＧＦＲ２；ＮＣＬ；ＴＭＳＬ３；ＣＦＨ／ＨＦ１；ＦＬＪ２１９１８；ＮＰＭ１；ＴＭＳＬ６；ＣＦＬ１；ＦＬＮＡ；ＰＢＰ；ＴＰＩ１；ＣＬＳＴＮ１；ＦＮ１；ＰＣＯＬＣＥ；ＴＰＭ４；ＣＯＬ１１Ａ１；ＦＳＴＬ１；ＰＤＧＦＲＢ；ＴＵＢＡ３；ＣＯＬ１２Ａ１；ＧＡＬＮＴ５；ＰＦＮ１；ＴＵＢＡ６；ＣＯＬ１６Ａ１；ＧＬＲＸ；ＰＧＫ１；ＴＸＮ；ＣＯＬ１Ａ１；ＧＯＬＰＨ２；ＰＧＫ２；ＴＸＮＲＤ１；ＣＯＬ１Ａ２；ＧＳＮ；ＰＬＡＵ；ＵＢＥ２Ｉ；ＣＯＬ３Ａ１；ＧＳＴＰ１；ＰＬＥＣ１；ＵＣＨＬ１；ＣＯＬ４Ａ１；ＨＮＲＰＣＬ１；ＰＰＩＡ；ＵＦＭ１；ＣＯＬ４Ａ２；ＨＮＲＰＦ；ＰＲＤＸ１；ＵＲＢ；ＣＯＬ５Ａ１；ＨＮＴ；ＰＲＤＸ５；ＹＷＨＡＺ。
【０３１６】
未知のタンパク質が３２種存在した：ＩＰＩ００６４２９９１  仮想的タンパク質ＤＫＦＺｐ６８６Ｆ１０１６４；  ＩＰＩ００４７０９１９  仮想的タンパク質ＤＫＦＺｐ６８６Ｋ０８１６４；  ＩＰＩ００６５４６８５  ＳＰＡＲＣ前駆体に類似；  ＩＰＩ００７１９７７８  アネクシンＡ２に類似；  ＩＰＩ００５５２９８１  ＣＤＮＡ  ＰＳＥＣ０２６６  ｆｉｓ、クローンＮＴ２ＲＰ３００３６４９、ホモサピエンスフィブリン−１Ｄ  ｍＲＮＡに高度に類似；  ＩＰＩ００１８０７７６  ２９ｋＤａタンパク質；  ＩＰＩ００４７８７３１  ２９ｋＤａタンパク質；  ＩＰＩ００３９６４７９  ２４ｋＤａタンパク質；  ＩＰＩ００３３４６２７  ３９ｋＤａタンパク質；  ＩＰＩ００６５８２０２  ９７ｋＤａタンパク質；  ＩＰＩ００３７６１６３  ５ｋＤａタンパク質；  ＩＰＩ００５１４８１７  ラミンＡ／Ｃに類似；  ＩＰＩ００６４４０８７  タンパク質；  ＩＰＩ００６５５８１２  横紋筋肉腫抗原ＭＵ−ＲＭＳ−４０．１２；  ＩＰＩ００６０４５１７  ヌクレオリンに類似；  ＩＰＩ００４４４２６２  ＣＤＮＡ  ＦＬＪ４５７０６  ｆｉｓ、クローンＦＥＢＲＡ２０２８４５７、ヌクレオリンに高度に類似；  ＩＰＩ００４１２４７３  タンパク質；  ＩＰＩ００４１４４８９  タンパク質；  ＩＰＩ００４１１４６３  タンパク質；  ＩＰＩ００４７８１５６  １７ｋＤａタンパク質；  ＩＰＩ００３８６６２１  ＣＡＬＭ３タンパク質；  ＩＰＩ００６４７００１  酸性；  ＩＰＩ００６４２６５０  スタニオカルシン２前駆体に類似；  ＩＰＩ００６４１４７１  コラーゲン様タンパク質；  ＩＰＩ００５１４６６９  ＳＨ３ドメイン結合富グルタミン酸タンパク質様３；  ＩＰＩ００００３７３４推定Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｈ＿ＮＨ０４５６Ｎ１６．１；  ＩＰＩ０００２９５７４  １１  ｋＤａタンパク質；  ＩＰＩ００６５４８２１  仮想的タンパク質ＬＯＣ５４８４５アイソフォーム１；  ＩＰＩ００６４７５７２  Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質−３前駆体；  ＩＰＩ００６３９８７９  細胞質分裂タンパク質ｓｅｐＡに類似；  ＩＰＩ００６５７７４６  細胞質分裂タンパク質８のデディケータに類似；  ＩＰＩ００５５５９９３  血管内皮成長因子受容体３異変株。
【０３１７】
したがって、これらタンパク質のいずれか、あるいは全て、あるいはこれらタンパク質が分泌あるいは発現するいずれかのタンパク質、あるいはその他の分子の供給源として本文書に記載するＭＳＣを用いることができる。
【０３１８】
ＭＳＣは、細胞にその周囲において影響を与える広範なサイトカインと成長因子を分泌することが示された８。これら因子の多くは、ショットガンＬＣ  ＭＳ／ＭＳ分析時に容易には検出されない小分子である。したがって、ＣＭとＮＣＭの分析は、１０１種のサイトカイン／成長因子に対する抗体を全体で担持する五つの異なる抗体アレイに交配させることによっても行った（図７も参照）。
【０３１９】
抗体アレイのレイアウト
【表３】
2009506769.tif 000005
ＲａｙＢｉｏ（登録商標）血管形成アレイＩ
【表４】
2009506769.tif 000006
ＲａｙＢｉｏ（登録商標）ヒトケモカイン抗体アレイＩ
【表５】
2009506769.tif 000007
ＲａｙＢｉｏ（登録商標）マトリクス・メタロプロテイナーゼ抗体アレイＩ
【表６】
2009506769.tif 000008
ＲａｙＢｉｏ（登録商標）ヒトサイトカイン抗体アレイＩ
【表７】
2009506769.tif 000009
ＲａｙＢｉｏ（登録商標）ヒトサイトカイン抗体アレイＶ
【０３２０】
サイトカイン／成長因子のうち７２種は、ＨｕＥＳ９．Ｅ１  ＭＳＣにより再現的に、つまり個別に調製した四つのＣＭのうち少なくとも三つにおいて分泌され、ＮＣＭにおいては分泌されないことが観察された。抗体アレイにより同定された７２種のタンパク質は以下の通りである（名前、遺伝子記号、遺伝子ＩＤの順）：１．ＭＤＣ  ＡＤＡＭ１１  ＧＩ＿１１４９６９９７―Ａ；  ２．アンギオジェニン  ＡＮＧ  ＧＩ＿４２７１６３１２―Ｓ；  ３．ＢＤＮＦ  ＢＤＮＦ  ＧＩ＿３４１０６７０９―Ａ；  ４．Ｉ−３０９  ＣＣＬ１  ＧＩ＿４５０６８３２―Ｓ；  ５．エオタキシン  ＣＣＬ１１  ＧＩ＿２２５３８３９９；  ６．ＭＩＰ−１δ  ＣＣＬ１５  ＧＩ＿３４３３５１８０―Ａ；  ７．ＨＣＣ−４  ＣＣＬ１６  ＧＩ＿２２５３８８００；  ８．ＭＣＰ−１  ＣＣＬ２  ＧＩ＿２２５３８８１２―Ｓ；  ９．Ｃｋβ８−１  ＣＣＬ２３  ＧＩ＿２２５３８８０７―Ａ；  １０．エオタキシン−２  ＣＣＬ２４  ＧＩ＿２２１６５４２６―Ｓ；  １１．  エオタキシン−３  ＣＣＬ２６  ＧＩ＿２２５４７１５１―Ｓ；  １２．ＲＡＮＴＥＳ  ＣＣＬ５  ＧＩ＿２２５３８８１３；  １３．ＭＣＰ−３  ＣＣＬ７  ＧＩ＿１３４３５４０１―Ｓ；  １４．ＭＣＰ−２  ＣＣＬ８  ＧＩ＿２２５３８８１５―Ｓ；  １５．ＭＣＳＦ  ＣＳＦ１  ＧＩ＿２７２６２６６６−Ｉ；  １６．ＧＭ−ＣＳＦ  ＣＳＦ２  ＧＩ＿２７４３７０２９―Ｓ；  １７．ＧＣＳＦ  ＣＳＦ３  ＧＩ＿２７４３７０４８；  １８．フラクタルキン  ＣＸ３ＣＬ１  ＧＩ＿４５０６８５６―Ｓ；  １９．ＧＲＯ−ａ  ＣＸＣＬ１  ＧＩ＿４５０４１５２―Ｓ；  ２０．Ｉ−ＴＡＣ  ＣＸＣＬ１１  ＧＩ＿１４７９０１４５―Ｓ；  ２１．ＳＤＦ−１  ＣＸＣＬ１２  ＧＩ＿４０３１６９２３；  ２２．ＢＬＣ  ＣＸＣＬ１３  ＧＩ＿５４５３５７６―Ｓ；  ２３．ＥＮＡ−７８  ＣＸＣＬ５  ＧＩ＿４１８７２６１３―Ｓ；  ２４．ＩＰ−１０  ＣＸＣＲ３  ＧＩ＿４５０４０９８―Ｓ；  ２５．ＥＧＦ  ＥＧＦ  ＧＩ＿６０３１１６３―Ｓ；  ２６．ＦＧＦ−４  ＦＧＦ４  ＧＩ＿４５０３７００；  ２７．ＦＧＦ−６  ＦＧＦ６  ＧＩ＿１０３３７５８６；  ２８．ＦＧＦ−７  ＦＧＦ７  ＧＩ＿１５１４７３４４；  ２９．ＦＧＦ−９  ＦＧＦ９  ＧＩ＿４５０３７０６―Ｓ；  ３０．Ｆｉｔ３リガンド  ＦＬＴ３ＬＧ  ＧＩ＿３８４５５４１５―Ｓ；  ３１．ＧＤＮＦ  ＧＤＮＦ  ＧＩ＿４０５４９４１０；  ３２．ＧＣＰ−２  ＧＯＬＧＡ４  ＧＩ＿４５３５９８５４―Ｓ；  ３３．ＨＧＦ  ＨＧＦ  ＧＩ＿３３８５９８３４―Ｓ；  ３４．ＩＦＮ−γ  ＩＦＮＧ  ＧＩ＿１０８３５１７０―Ｓ；  ３５．ＩＧＦ−Ｉ  ＩＧＦ１  ＧＩ＿１９９２３１１１―Ｓ；  ３６．ＩＧＦＢＰ−１  ＩＧＦＢＰ１  ＧＩ＿４５０４６１４―Ｓ；  ３７．ＩＧＦＢＰ−２  ＩＧＦＢＰ２  ＧＩ＿１０８３５１５６―Ｓ；  ３８．ＩＧＦＢＰ−４  ＩＧＦＢＰ４  ＧＩ＿１０８３５０２０―Ｓ；  ３９．ＩＬ−１０  ＩＬ１０  ＧＩ＿２４４３０２１６―Ｓ；  ４０．ＩＬ−１２ｐ４０ｐ７０  ＩＬ１２Ｂ  ＧＩ＿２４４９７４３７―Ｓ；  ４１．ＩＬ−１３  ＩＬ１３  ＧＩ＿２６７８７９７７―Ｓ；  ４２．ＩＬ−１６  ＩＬ１６  ＧＩ＿２７２６２６５４―Ａ；  ４３．ＩＬ−１ａＩＬ１Ａ  ＧＩ＿２７８９４３２９―Ｓ；  ４４．ＩＬ���１β  ＩＬ１Ｂ  ＧＩ＿２７８９４３０５―Ｓ；  ４５．ＩＬ−２  ＩＬ２  ＧＩ＿２８１７８８６０―Ｓ；  ４６．ＩＬ−３  ＩＬ３  ＧＩ＿２８４１６９１４―Ｓ；  ４７．ＩＬ−６  ＩＬ６  ＧＩ＿１０８３４９８３―Ｓ；  ４８．ＩＬ−７  ＩＬ７  ＧＩ＿２８６１０１５２―Ｓ；  ４９．ＩＬ−８  ＩＬ８  ＧＩ＿２８６１０１５３―Ｓ；  ５０．ＳＣＦ  ＫＩＴＬＧ  ＧＩ＿４５８０４１９―Ａ；  ５１．レプチン  ＬＥＰ  ＧＩ＿４５５７７１４―Ｓ；  ５２．ＬＩＦ  ＬＩＦ  ＧＩ＿６００６０１８―Ｓ；  ５３．ＭＩＦ  ＭＩＦ  ＧＩ＿４５０５１８４―Ｓ；  ５４．ＭＭＰ−１  ＭＭＰ１  ＧＩ＿１３０２７７９８―Ｓ；  ５５．ＭＭＰ−１０  ＭＭＰ１０  ＧＩ＿４５０５２０４―Ｓ；  ５６．ＭＭＰ−１３  ＭＭＰ１３  ＧＩ＿１３０２７７９６―Ｓ；  ５７．ＭＭＰ３  ＭＭＰ３  ＧＩ＿１３０２７８０３―Ｓ；  ５８．ＭＭＰ−９  ＭＭＰ９  ＧＩ＿４８２６８３５―Ｓ；  ５９．ＰＡＲＣ  ＰＡＲＣ  ＧＩ＿２４３０７９９０；  ６０．ＰＤＧＦ−ＢＢ  ＰＤＧＦＢ  ＧＩ＿１５４５１７８５―Ａ；  ６１．ＰＩＧＦ  ＰＩＧＦ  ＧＩ＿２７８９４２８９―Ａ；  ６２．ＴＧＦ−β１  ＴＧＦＢ１  ＧＩ＿１０８６３８７２；  ６３．ＴＧＦ−β２  ＴＧＦＢ２  ＧＩ＿４５０７４６２―Ｓ；  ６４．トロンボポエチン  ＴＨＰＯ  ＧＩ＿４０８０５８７１―Ｓ；  ６５．ＴＩＭＰ−１  ＴＩＭＰ１  ＧＩ＿４５０７５０８―Ｓ；  ６６．ＴＩＭＰ−２  ＴＩＭＰ２  ＧＩ＿９２５７２４７―Ｓ；  ６７．ＴＩＭＰ−３  ＴＩＭＰ３  ＧＩ＿２１５３６４３１―Ｓ；  ６８．ＴＩＭＰ−４  ＴＩＭＰ４  ＧＩ＿４５０７５１４―Ｓ；  ６９．ＴＮＦ−α  ＴＮＦ  ＧＩ＿２５９５２１１０；  ７０．オステオプロテジェリン  ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ  ＧＩ＿２２５４７１２２―Ｓ；  ７１．ＶＥＧＦ  ＶＥＧＦ  ＧＩ＿３０１７２５６３―Ｓ；  ７２．リンフォタクチン  ＸＣＬ１  ＧＩ＿４５０６８５２―Ｓ。
【０３２１】
抗体アレイにより検出されない２９種のタンパク質は以下の通りである（名前、遺伝子記号、遺伝子ＩＤの順）：ｂＦＧＦ  ＣＣＬ２３  ＧＩ＿２２５３８８０７―Ａ；  ＭＣＰ−４  ＣＣＬ１３  ＧＩ＿２２５３８７９９―Ｓ；  ＴＡＲＣ  ＣＣＬ１７  ＧＩ＿２２５３８８０１―Ｓ；  ＭＩＰ−３ｂ  ＣＣＬ１９  ＧＩ＿２２１６５４２４―Ｓ；  ＭＩＰ−３ａ  ＣＣＬ２０  ＧＩ＿４７５９０７５―Ｓ；  ＭＰＩＦ−１  ＣＣＬ２３  ＧＩ＿２２５３８８０７―Ａ；  ＴＥＣＫ  ＣＣＬ２５  ＧＩ＿２２５３８７９７―Ａ；  ＣＴＡＣＫ  ＣＣＬ２７  ＧＩ＿２２１６５４２８―Ｓ；  ＣＣＬ２８  ＣＣＬ２８  ＧＩ＿２２５３８８１０―Ａ；  ＭＩＰ−１ｂ  ＣＣＬ４  ＧＩ＿４５０６８４４―Ｓ；  ＳＤＦ−１ａ  ＣＸＣＬ１２  ＧＩ＿４０３１６９２３−Ｉ；  ＳＤＦ−１ｂ  ＣＸＣＬ１２  ＧＩ＿４０３１６９２３−Ｉ；  ＣＸＣＬ１６  ＣＸＣＬ１６  ＧＩ＿１１５４５７６４―Ｓ；  ＭＩＧ  ＣＸＣＬ９  ＧＩ＿４５０５１８６―Ｓ；  ＭＩＰ−１ａ  ＣＸＣＲ６  ＧＩ＿５７３０１０５―Ｓ；  ＩＧＦＢＰ−３  ＩＧＦＢＰ３  ＧＩ＿１９９２３１１０―Ｓ；  ＩＬ−１５  ＩＬ１５  ＧＩ＿２６７８７９７９―Ａ；  ＩＬ−４  ＩＬ４  ＧＩ＿２７４７７０９１―Ａ；  ＩＬ−５  ＩＬ５  ＧＩ＿２８５５９０３２―Ｓ；  ＴＮＦ−ｂ  ＬＴＡ  ＧＩ＿６８０６８９２―Ｓ；  ＭＭＰ−２  ＭＭＰ２  ＧＩ＿１１３４２６６５―Ｓ；  ＭＭＰ−８  ＭＭＰ８  ＧＩ＿４５０５２２０―Ｓ；  ＮＡＰ−２  ＮＡＰ１Ｌ４  ＧＩ＿２１３２７７１１―Ｓ；  ＮＴ−３  ＮＴＦ３  ＧＩ＿４５３５９８６９―Ｓ；  ＮＴ−４  ＮＴＦ５  ＧＩ＿３４３２８９３３―Ｓ；  オンコスタチンＭ  ＯＳＭ  ＧＩ＿２８１７８８６２―Ｓ；  ＴＧＦ−ｂ１  ＴＧＦＢ１  ＧＩ＿１０８６３８７２―Ｓ；  ＬＩＧＨＴ  ＴＮＦＳＦ１４  ＧＩ＿２５９５２１４６―Ａ；  ＶＥＧＦ−Ｄ  ＶＥＧＦＤ  ＧＩ＿１９９２４２９７―Ｓ。
【０３２２】
しかし、ＬＣ  ＭＳ／ＭＳ分析によっても検出されたのは三種の遺伝子産物だけ、つまり、ＩＧＦＢＰ２、ＴＩＭＰ１、及びＴＩＭＰ２だけであるのは、おそらくサイトカインと成長因子の多くは小分子であり、従来のＬＣ  ＭＳ／ＭＳ分析時に検出可能でないためである。
【０３２３】
ＬＣ  ＭＳ／ＭＳにより同定された１３２種の遺伝子産物のリストと抗体アレイ分析により同定された７２種の遺伝子産物リストには、共通する三種の遺伝子があり、それらはＩＧＦＢＰ２、ＴＩＭＰ１、及びＴＩＭＰ２である。したがって、最終集計すると、合計で２０１種の固有の遺伝子産物が同定された（下表Ｅ２）。
【表８】
2009506769.tif 000010
表Ｅ２．ＬＣ−ＭＳ／ＭＳと抗体アレイにより同定された２０１種の固有の遺伝子産物のアルファベット順リスト。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳと抗体アレイにより同定されたタンパク質をまとめ、それらの遺伝子記号により表した。各遺伝子の転写量は、高スループットのＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｂｅａｄａｒｒａｙを用いて検査した。
【０３２４】
これら遺伝子産物のうち２９種、つまり、ＥＮＡ−７８、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−９、ＧＣＰ−２、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＲＯ−ａ、ＨＣＣ−４、ＨＧＦ、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＰ−１０、ＬＩＦ、ＭＣＰ−１、ＭＣＳＦ、ＭＩＦ、オステオプロテジェリン、ＰＡＲＣ、ＰＩＧＦ、ＳＣＦ、ＴＧＦ−β２、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、及びＶＥＧＦは、成体組織由来ＭＳＣ（１３、１６、１９−２１）により分泌されることが既に報告されている。成人組織由来ＭＳＣにより分泌されることが報告されているその他四種のタンパク質、つまりＩＧＦＢＰ−３、ＭＩＰ−３α、オンコスタチンＭ、及びＴＧＦ−β３（上記参照）は、この２０１種の遺伝子産物リストには存在しない。
【０３２５】
実施例１０．ヒトＥＳＣ由来ＭＳＣ（ｈＥＳＣ−ＭＳＣ）のプロテオーム分析：ゲノム全般の遺伝子発現分析の認証
総ＲＮＡをＩｌｌｕｍｉｎａ  ＢｅａｄＡｒｒａｙに交配させることにより生成したｈＥＳＣ−ＭＳＣのゲノム全般についての遺伝子発現プロファイルに対して２０１種の遺伝子産物を比較した結果、遺伝子産物のうち１３４種、つまり６７％は、遺伝子転写量が９９％の信頼度で検出限界（ＬＯＤ）を上回ったことが示された（表Ｅ２）。ＬＣ  ＭＳ／ＭＳにより同定された１３２種の遺伝子産物のうち１１５種、つまり８８％は転写量が検出できたのに対し（表Ｅ２）、抗体アレイにより同定された７２種の遺伝子産物は、そのうち２７種、つまり３８％の転写量が検出でき、４５種、つまり６２％は転写量が検出されなかった（表Ｅ２）。遺伝子産物の二種、ＥＮＯ１ＢとＳＶＥＰ１に対するプローブは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＢｅａｄＡｒｒａｙ上に存在しない。７２種の遺伝子の大半については、サイトカイン／ケモカインをコードするｍＲＮＡには、翻訳時にｍＲＮＡの急速な劣化を生じる、ＡとＵが豊富な要素が含まれていることが知られているので、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＢｅａｄＡｒｒａｙで検出するには、それらの転写量は存在度の観点において低すぎる可能性がある（２２、２３）。
【０３２６】
したがって、より検知性が高いｑＲＴ−ＰＣＲ検定を行った。７２種の遺伝子産物のうち４２種をランダムに選択して試験した。４２種の遺伝子産物のうち３６種、つまり８６％は転写量が検出でき、それらの正規化値Ｃｔは３５未満であると定義された（下表Ｅ３）。この頻度は、ＬＣ  ＭＳ／ＭＳにより同定され、遺伝子転写がＩｌｌｕｍｉｎａ  ＢｅａｄＡｒｒａｙにより検出された遺伝子産物について観察された８８％の頻度と類似している。また、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＢｅａｄＡｒｒａｙにより転写量が検出された１５種の全てが、ｑＲＴ−ＰＣＲによっても転写量が検出された（表Ｅ３）。２７種（７８％）の遺伝子産物のうち、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＢｅａｄＡｒｒａｙにより転写量が検出されなかった２１種は、ｑＲＴ−ＰＣＲにより転写量が検出された（表Ｅ３）。
【表９】
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表Ｅ３．転写の存在を検査する定量的ＲＴ−ＰＣＲ。抗体アレイにより同定された７２種の遺伝子産物のうち４２種をｑＲＴ−ＰＣＲ分析するべくランダムに選択した。１２種の遺伝子産物の転写量が、ゲノム全般についての高スループットの遺伝子発現検定であるＩｌｌｕｍｉｎａ  ＢｅａｄＡｒｒａｙ上において９９％の信頼度で検出限界（ＬＯＤ）を上回った。各遺伝子のＣｔ値は、βアクチンに対して正規化した。
【０３２７】
実施形態１１．ヒトＥＳＣ由来ＭＳＣ（ｈＥＳＣ−ＭＳＣ）のプロテオーム分析：分泌タンパク質により変調された生体内作用
分泌された産物に損傷した組織あるいは器官を修復する能力があるかを検査するべく、まず、遺伝子産物をその生体内作用あるいは経路に関して、Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）に従って分類した。次に、各作用あるいは経路について分泌されたＭＳＣのプロテオームにおける各固有の遺伝子の頻度を、Ｕｎｉｇｅｎｅ、Ｅｎｔｒｅｚ、及びＧｅｎＢａｎｋから照会したデータベースにおける各経路あるいは作用における遺伝子頻度に対して比較した。比較対象に対して著しく遺伝子頻度が高い（ｐ＜０．０５）ものは、５８種の生体内作用と３０種の経路に対応する。
【表１０】
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２０１種の固有の遺伝子産物により変調されたＧＯ分類上の生体内作用
【表１１】
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【０３２８】
５８種の生体内作用は、代謝、防御応答、及び組織分化の三つの大分類に近似することができ、一方、３０種の経路は、受容体結合、シグナル変換、細胞間相互作用、細胞移動、免疫反応、及び代謝へと広範囲に分類される（図８、図９）。エネルギー生産、分解、巨大分子の生合成と分泌、及び損傷組織の除去と新たな組織への再生に必須のプロセスを変調する細胞代謝に対して、分泌されたタンパク質は大きな影響を与えることが、想定された生体内作用と経路の両方により示される（図８、図９）。
【０３２９】
ＭＳＣにより条件付けた培地においてサイトカインとケモカインが顕著に存在することと一致して、たとえば走化性、走性、多くの免疫反応等の外部刺激に依存的な多くの細胞応答が、分泌された因子により引き出され得ることもこの分析により予測された（図８）。特に、条件付け培地により、組織分化において重要な生体内作用、特に、脈管化、血液生成、及び骨の発達を促す作用が誘発され得る（図８）。分泌されたプロテオームにより変調されると予測された経路においては、受容体を媒介としたサイトカインの結合とＥＣＭ経路は、分泌されたプロテオームにおいてサイトカインとＥＣＭ成分が顕著であることと一貫する（図９）。分泌されたプロテオームにより活性化され得る主なシグナル変換経路には、Ｊａｋ−ＳＴＡＴ信号伝達経路、ＭＡＰＫ信号伝達経路、トール様受容体信号伝達経路、ＴＧＦ−ベータ信号伝達経路、ｍＴＯＲ信号伝達経路、ＦｃイプシロンＲＩ信号伝達経路、及びヘリコバクターピロリ感染における上皮細胞信号伝達がある。分泌されたプロテオームのコンピュータ分析によっても、ＭＳＣ分泌により細胞間相互作用、移動、及び免疫反応が強められることが示された。
【０３３０】
実施例１２．ヒトＥＳＣ由来ＭＳＣ（ｈＥＳＣ−ＭＳＣ）のプロテオーム分析：考察
ＭＳＣは、多くの疾患を治療するべく前臨床試験及び臨床試験において用いられてきた（３−５、２４−２７）。しかし、根本的なメカニズムは詳細には理解されていないままであった。ＭＳＣには、たとえば、損傷組織を修復あるいは再生する可能性のある内皮細胞、心筋細胞、軟骨細胞等の多くの細胞型へと分化する能力があるが、組織修復の媒介となるには、あるいは組織機能を回復させるにはＭＳＣは全般的に分化の効率性が低すぎるので、ＭＳＣによる治療効果は、ＭＳＣ由来の修復細胞型の生成によってだけでは媒介され得ない。ＭＳＣによる治療効果のいくつかは、ＭＳＣが分泌する傍分泌因子によって媒介されている可能性についての示唆が増えている（８）。ここでは、二つの技術、ＬＣ−ＬＣ−ＭＳと抗体アレイの組み合わせを通じて、ｈＥＳＣ−ＭＳＣの分泌プロテオームの組成について記載した。
【０３３１】
ＬＣ−ＬＣ−ＭＳによるショットガンプロテオーム分析は、検知性が高い技術であり、高スループット性能を有するが、小分子／小ペプチド―サイトカイン、ケモカイン、及び成長因子の大半が小分子／小ペプチドであるが―を検出するのは困難であった。抗体アレイの利用により、この困難性は部分的に軽減された。二つの技術を用いると、ＭＳＣ分泌の定量的プロテオームプロファイルは再現性が高くなる。ＬＣ  ＭＳ／ＭＳにより同定されたタンパク質は、二つの個別に調製したＣＭバッチに存在し、抗体アレイにより同定されたタンパク質は、四つの個別に調製したＣＭバッチの少なくとも三つににおいて存在した。結果として得られたｈＥＳＣ−ＭＳＣが分泌するプロテオームのプロファイルには、成体組織由来ＭＳＣが分泌すると既に報告された因子のほぼ全て（１３、１６、１９−２１）と、まだ記述されていないその他多くの因子が含まれた。プロテオームプロファイリングの確実性は、高スループットのマイクロアレイを用いた遺伝子発現分析によるプロテオームプロファイルにおける遺伝子産物の８６乃至８８％に関して転写が検出されたことにより更に立証された。
【０３３２】
広い観点からＭＳＣ分泌物の潜在的な機能について評価／検査するべく、翻訳後修飾タンパク質ではなく遺伝子産物に基づいて遺伝子発現を分析するためのより身近な計算ツールを用いた。分泌物においてサイトカインとケモカインが顕著であることに一致して、サイトカインとケモカインの機能、たとえば走化性、走性、外部刺激に対する細胞応答、分解、巨大分子の生合成と分泌、サイトカイン間受容体相互作用、細胞間通信、及びグルコースとアミノ酸の代謝等の基礎代謝に一般的に対応付けられる多くの作用と経路が計算分析により予測された。これらの機能が役割を担う疾患の治療に本明細書に記載するＭＳＣを用いることができる。
【０３３３】
これらの作用と経路は、任意の特定的な細胞型もしくは組織型における損傷、修復、及び再生のプロセスに特異的ではないが、これらにより損傷部位への免疫細胞の移動、ＥＣＭリモデリング、及び細胞代謝の亢進が促進されることにより、損傷組織あるいは病変組織の大半において修復効果が現れる。
【０３３４】
サイトカインとケモカインに関連付けられるこれら全般的な経路とは別に、計算分析によって更に、脈管化、血液生成、及び骨の発達に関わる多くの作用が分泌されたタンパク質により調節されることが予測された。偶然にも、ＭＳＣが媒介となる、報告されている組織修復あるいは再生の大半は、心臓血管組織、造血組織、及び筋骨格組織に関連する（３−５、２４−２７）。経路分析により更に、ＭＳＣの傍分泌作用のいくつかに介在している可能性のある候補経路が発見された。事実、これら候補経路の多くは、心臓血管生物学、造血生物学、及び筋骨格生物学の多くの観点における関連が既に示されている。たとえば、Ｊａｃ−ＳＴＡＴ信号伝達は、心臓保護（２８）、血液生成（２９、３０）、及び骨格修復とリモデリング（３１、３２）に関連し、ＭＡＰＫ信号伝達は、心臓血管系応答（３３、３４）、骨格修復とリモデリング（３２、３５）、及び血液生成（３６）の多くの観点において重大な役割を担っており、トール様受容体信号伝達は心臓血管病理学（３７）の創始と発展、および先天性免疫と適応免疫（３８）の変調に関連してきており、ＴＧＦ−ベータ信号伝達は、正しい心臓発生と心臓リモデリング、心不全と脈管化（３９−４１）への進行、血液生成（４２）、骨と軟骨（２７、４３）の形成とリモデリング、及び一般的な創傷治癒（４４）において重要であり、細胞の成長と増殖に関する重要な調節剤としてのｍＴＯＲは、通常の生理機能と疾患（４５−４７）において非特異的ではあるが重要な役割を担っている。
【０３３５】
結論としては、成体組織由来ＭＳＣにより分泌されることが報告されているサイトカインの多くを含む、ｈＥＳＣ由来ＭＳＣにより分泌されるプロテオームの分析により、当該分泌されるプロテオームは、特に、心臓血管組織、造血組織、及び筋骨格組織における組織修復と再生に対して変調作用を発揮する可能性があり、したがってＭＳＣ移植研究において組織修復と再生に関してのＭＳＣが媒介となる傍分泌作用に関して分子的観点からの裏づけとなることが示された。また、この分泌プロテオームにより、ＭＳＣが媒介する組織修復の分子レベルのメカニズムと、組織修復と再生とを変調する「薬剤化可能（ｄｒｕｇｇａｂｌｅ）」なターゲットについての試験性（ｔｅｓｔａｂｌｅ）の高い多くの仮説が発見された。ｈＥＳＣ由来ＭＳＣと成体組織由来ＭＳＣとの間の顕著な類似性は、どちらのＭＳＣ培養物により条件付けた培地であっても類似した生物活性を有する可能性を示す。
【０３３６】
したがって、これにより本方法によって誘導したＭＳＣは、骨髄由来のそれらの対応物と著しい生物学的類似性を有することが証明された。これらの発見は、傍分泌因子を分泌する能力におけるｈＥＳＣ−ＭＳＣのＢＭ由来ＭＳＣに対する類似性を証明するものである。更に、条件付け培地形態のタンパク質も含む、本明細書に記載するＭＳＣが分泌する一以上のタンパク質を、本明細書に記載するＭＳＣと同じ目的で用いてよい。
【０３３７】
しかし、ｈＥＳＣ由来ＭＳＣは、成体組織由来ＭＳＣに比較していくつか利点を有する。ｈＥＳＣ細胞株をＭＳＣの組織源として用いると、無限に複製／拡大可能な組織源が得られることとなり、ＭＳＣ、ひいてはＣＭのバッチごとの調製における再現性と一貫性が臨床的規格に準拠した態様で強めらる。また、これによりＣＭ調製の規模拡大性と低コストの市販薬の開発可能性が高められる。また、ｈＥＳＣ由来ＭＳＣ  ＣＭを調製するための血清非含有の化学的に定義された培地の開発により、血清あるいは血清代替物培地等の複合的培地添加物に関連する交絡的かつ不定的な汚染が減少する。したがって、ＣＭについての本明細書における解明は、ＭＳＣに基づく生物製剤の臨床的用途への転用に非常な関連を有する。
【０３３８】
実施例１３．５８種の生体内作用のそれぞれにおける２０１種の遺伝子のリスト
【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【表２８】
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【表２９】
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【表３０】
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【表３１】
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【表３２】
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【表３３】
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【表３４】
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【表３５】
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【表３６】
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【表３７】
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【表３８】
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【表３９】
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【表４０】
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【表４１】
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【表４２】
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【表４３】
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【表４４】
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【表４５】
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【表４６】
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【表４７】
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【表４８】
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【表４９】
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【表５０】
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【表５１】
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【表５２】
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【表５３】
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【表５４】
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【表５５】
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【表５６】
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【表５７】
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【表５８】
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【表５９】
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【表６０】
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【表６１】
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【表６２】
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【表６３】
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【表６４】
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【表６５】
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【表６６】
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【表６７】
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【０３３９】
実施例１４．３０種の経路のそれぞれにおける２０１種の遺伝子のリスト
【表６８】
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【表６９】
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【表７０】
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【表７１】
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【表７２】
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【表７３】
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【表７４】
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【表７５】
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【表７６】
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【表７７】
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【表７８】
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【表７９】
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【表８０】
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【表８１】
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【表８２】
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【表８３】
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【表８４】
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【表８５】
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【表８６】
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【表８７】
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【表８８】
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【表８９】
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【表９０】
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【表９１】
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【表９２】
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【表９３】
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【表９４】
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【表９５】
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【表９６】
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【０３４０】
実施例１５．実施例７乃至１４に関する参照文献
１．  Ｌｅ  Ｂｌａｎｃ，  Ｋ．，  ａｎｄ  Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ，  Ｍ．  （２００５）  Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ７，  ３６−４５
２．  Ｒｅｉｓｅｒ，  Ｊ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｘ．  Ｙ．，  Ｈｅｍｅｎｗａｙ，  Ｃ．  Ｓ．，  Ｍｏｎｄａｌ，  Ｄ．，  Ｐｒａｄｈａｎ，  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｌａ  Ｒｕｓｓａ，  Ｖ．  Ｆ．  （２００５）  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ５，  １５７１−１５８４
３．  Ｈｕｉ，  Ｊ．  Ｈ．，  Ｏｕｙａｎｇ，  Ｈ．  Ｗ．，  Ｈｕｔｍａｃｈｅｒ，  Ｄ．  Ｗ．，  Ｇｏｈ，  Ｊ．  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｌｅｅ，  Ｅ．  Ｈ．  （２００５）  Ａｎｎ  Ａｃａｄ  Ｍｅｄ  Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ  ３４，  ２０６−２１２
４．  Ｃａｐｌａｎ，  Ａ．  Ｉ．  （２００５）  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  １１，  １１９８−１２１１
５．  Ｍｅｎａｓｃｈｅ，  Ｐ．  （２００５）  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ７，  ２９３−２９９
６．  Ｌａｆｌａｍｍｅ，  Ｍ．  Ａ．，  ａｎｄ  Ｍｕｒｒｙ，  Ｃ．  Ｅ．  （２００５）  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３，  ８４５−８５６
７．  Ｋｉｎｎａｉｒｄ，  Ｔ．，  Ｓｔａｂｉｌｅ，  Ｅ．，  Ｂｕｒｎｅｔｔ，  Ｍ．  Ｓ．，  Ｓｈｏｕ，  Ｍ．，  Ｌｅｅ，  Ｃ．  Ｗ．，  Ｂａｒｒ，  Ｓ．，  Ｆｕｃｈｓ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｅｐｓｔｅｉｎ，  Ｓ．  Ｅ．  （２００４）  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０９，  １５４３−１５４９
８．  Ｃａｐｌａｎ，  Ａ．  Ｉ．，  ａｎｄ  Ｄｅｎｎｉｓ，  Ｊ．  Ｅ．  （２００６）  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ
９．  Ｌｅｅｄｈａｍ，  Ｓ．  Ｊ．，  Ｂｒｉｔｔａｎ，  Ｍ．，  ＭｃＤｏｎａｌｄ，  Ｓ．  Ａ．，  ａｎｄ  Ｗｒｉｇｈｔ，  Ｎ．  Ａ．  （２００５）  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ９，  １１−２４
１０．  Ｔｏｇｅｌ，  Ｆ．，  Ｈｕ，  Ｚ．，  Ｗｅｉｓｓ，  Ｋ．，  Ｉｓａａｃ，  Ｊ．，  Ｌａｎｇｅ，  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｗｅｓｔｅｎｆｅｌｄｅｒ，  Ｃ．  （２００５）  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２８９，  Ｆ３１−４２
１１．  Ｐａｔｓｃｈａｎ，  Ｄ．，  Ｐｌｏｔｋｉｎ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｇｏｌｉｇｏｒｓｋｙ，  Ｍ．  Ｓ．  （２００６）  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６，  １７６−１８３
１２．  Ｍｉｙａｈａｒａ，  Ｙ．，  Ｎａｇａｙａ，  Ｎ．，  Ｋａｔａｏｋａ，  Ｍ．，  Ｙａｎａｇａｗａ，  Ｂ．，  Ｔａｎａｋａ，  Ｋ．，  Ｈａｏ，  Ｈ．，  Ｉｓｈｉｎｏ，  Ｋ．，  Ｉｓｈｉｄａ，  Ｈ．，  Ｓｈｉｍｉｚｕ，  Ｔ．，  Ｋａｎｇａｗａ，  Ｋ．，  Ｓａｎｏ，  Ｓ．，  Ｏｋａｎｏ，  Ｔ．，  Ｋｉｔａｍｕｒａ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｍｏｒｉ，  Ｈ．  （２００６）  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １２，  ４５９−４６５
１３．  Ｇｎｅｃｃｈｉ，  Ｍ．，  Ｈｅ，  Ｈ．，  Ｎｏｉｓｅｕｘ，  Ｎ．，  Ｌｉａｎｇ，  Ｏ．  Ｄ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｌ．，  Ｍｏｒｅｌｌｏ，  Ｆ．，  Ｍｕ，  Ｈ．，  Ｍｅｌｏ，  Ｌ．  Ｇ．，  Ｐｒａｔｔ，  Ｒ．  Ｅ．，  Ｉｎｇｗａｌｌ，  Ｊ．  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｄｚａｕ，  Ｖ．  Ｊ．  （２００６）  Ｆａｓｅｂ  Ｊ  ２０，  ６６１−６６９
１４．  Ｇｎｅｃｃｈｉ，  Ｍ．，  Ｈｅ，  Ｈ．，  Ｌｉａｎｇ，  Ｏ．  Ｄ．，  Ｍｅｌｏ，  Ｌ．  Ｇ．，  Ｍｏｒｅｌｌｏ，  Ｆ．，  Ｍｕ，  Ｈ．，  Ｎｏｉｓｅｕｘ，  Ｎ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｌ．，  Ｐｒａｔｔ，  Ｒ．  Ｅ．，  Ｉｎｇｗａｌｌ，  Ｊ．  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｄｚａｕ，  Ｖ．  Ｊ．  （２００５）  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １１，  ３６７−３６８
１５．  Ｍａｙｅｒ，  Ｈ．，  Ｂｅｒｔｒａｍ，  Ｈ．，  Ｌｉｎｄｅｎｍａｉｅｒ，  Ｗ．，  Ｋｏｒｆｆ，  Ｔ．，  Ｗｅｂｅｒ，  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｗｅｉｃｈ，  Ｈ．  （２００５）  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ９５，  ８２７−８３９
１６．  Ｎａｋａｇａｍｉ，  Ｈ．，  Ｍａｅｄａ，  Ｋ．，  Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ，  Ｒ．，  Ｉｇｕｃｈｉ，  Ｓ．，  Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，  Ｔ．，  Ｔａｋａｍｉ，  Ｙ．，  Ｋｉｋｕｃｈｉ，  Ｙ．，  Ｓａｉｔｏ，  Ｙ．，  Ｔａｍａｉ，  Ｋ．，  Ｏｇｉｈａｒａ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｋａｎｅｄａ，  Ｙ．  （２００５）  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ  ２５，  ２５４２−２５４７
１７．  Ｖａｎ  Ｏｖｅｒｓｔｒａｅｔｅｎ−Ｓｃｈｌｏｇｅｌ，  Ｎ．，  Ｂｅｇｕｉｎ，  Ｙ．，  ａｎｄ  Ｇｏｔｈｏｔ，  Ａ．  （２００６）  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  ７６，  ４８８−４９３
１８．  Ｃｈｅｎｇ，  Ｌ．，  Ｑａｓｂａ，  Ｐ．，  Ｖａｎｇｕｒｉ，  Ｐ．，  ａｎｄ  Ｔｈｉｅｄｅ，  Ｍ．  Ａ．  （２０００）  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １８４，  ５８−６９
１９．  Ｌｉｕ，  Ｃ．  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｈｗａｎｇ，  Ｓ．  Ｍ．  （２００５）  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ３２，  ２７０−２７９
２０．  Ｈａｙｎｅｓｗｏｒｔｈ，  Ｓ．  Ｅ．，  Ｂａｂｅｒ，  Ｍ．  Ａ．，  ａｎｄ  Ｃａｐｌａｎ，  Ａ．  Ｉ．  （１９９６）  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １６６，  ５８５−５９２
２１．  Ｋｉｎｎａｉｒｄ，  Ｔ．，  Ｓｔａｂｉｌｅ，  Ｅ．，  Ｂｕｒｎｅｔｔ，  Ｍ．  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｅｐｓｔｅｉｎ，  Ｓ．  Ｅ．  （２００４）  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ９５，  ３５４−３６３
２２．  Ｂａｒｒｅａｕ，  Ｃ．，  Ｐａｉｌｌａｒｄ，  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｏｓｂｏｒｎｅ，  Ｈ．  Ｂ．  （２００５）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３，  ７１３８−７１５０
２３．  Ｅｓｐｅｌ，  Ｅ．  （２００５）  Ｓｅｍｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １６，  ５９−６７
２４．  Ｂｈａｔｉａ，  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｈａｒｅ，  Ｊ．  Ｍ．  （２００５）  Ｃｏｎｇｅｓｔ  Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌ  １１，  ８７−９１；  ｑｕｉｚ  ９２−８３
２５．  Ｍａｕｎｅｙ，  Ｊ．  Ｒ．，  Ｖｏｌｌｏｃｈ，  Ｖ．，  ａｎｄ  Ｋａｐｌａｎ，  Ｄ．  Ｌ．  （２００５）  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  １１，  ７８７−８０２
２６．  Ｚｉｍｍｅｔ，  Ｊ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｈａｒｅ，  Ｊ．  Ｍ．  （２００５）  Ｂａｓｉｃ  Ｒｅｓ  Ｃａｒｄｉｏｌ  １００，  ４７１−４８１
２７．  Ｌｉｎ，  Ｚ．，  Ｗｉｌｌｅｒｓ，  Ｃ．，  Ｘｕ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｚｈｅｎｇ，  Ｍ．  Ｈ．  （２００６）  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ
２８．  Ｎｅｇｏｒｏ，  Ｓ．，  Ｋｕｎｉｓａｄａ，  Ｋ．，  Ｔｏｎｅ，  Ｅ．，  Ｆｕｎａｍｏｔｏ，  Ｍ．，  Ｏｈ，  Ｈ．，  Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｙａｍａｕｃｈｉ−Ｔａｋｉｈａｒａ，  Ｋ．  （２０００）  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ４７，  ７９７−８０５
２９．  Ｗａｒｄ，  Ａ．  Ｃ．，  Ｔｏｕｗ，  Ｉ．，  ａｎｄ  Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，  Ａ．  （２０００）  Ｂｌｏｏｄ  ９５，  １９−２９
３０．  Ｕｎｇｕｒｅａｎｕ，  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｓｉｌｖｅｎｎｏｉｎｅｎ，  Ｏ．  （２００５）  Ｓｃｉ  ＳＴＫＥ  ２００５，  ｐｅ４９
３１．  Ｂｌａｉｒ，  Ｈ．  Ｃ．，  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  Ｌ．  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｚａｉｄｉ，  Ｍ．  （２００５）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３２８，  ７２８−７３８
３２．  Ｍａｌｅｍｕｄ，  Ｃ．  Ｊ．  （２００４）  Ｃｌｉｎ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｌａｔ  Ｒｅｓ，  Ｓ１４５−１５１
３３．  Ｎｉｇｒｏ，  Ｊ．，  Ｏｓｍａｎ，  Ｎ．，  Ｄａｒｔ，  Ａ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｌｉｔｔｌｅ，  Ｐ．  Ｊ．  （２００６）  Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ  ２７，  ２４２−２５９
３４．  Ｐａｎｄｙａ，  Ｎ．，  Ｓａｎｔａｎｉ，  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｊａｉｎ，  Ｓ．  （２００５）  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｖ  ２３，  ２４７−２５４
３５．  Ｂｅｒｅｎｂａｕｍ，  Ｆ．  （２００４）  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  １６，  ６１６−６２２
３６．  Ｐｌａｔａｎｉａｓ，  Ｌ．  Ｃ．  （２００３）  Ｂｌｏｏｄ  １０１，  ４６６７−４６７９
３７．  ｄｅ  Ｋｌｅｉｊｎ，  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｐａｓｔｅｒｋａｍｐ，  Ｇ．  （２００３）  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ６０，  ５８−６７
３８．  Ｏｚａｔｏ，  Ｋ．，  Ｔｓｕｊｉｍｕｒａ，  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｔａｍｕｒａ，  Ｔ．  （２００２）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｓｕｐｐｌ，  ６６−６８，  ７０，  ７２  ｐａｓｓｉｍ
３９．  Ｅｕｌｅｒ−Ｔａｉｍｏｒ，  Ｇ．，  ａｎｄ  Ｈｅｇｅｒ，  Ｊ．  （２００６）  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６９，  １５−２５
４０．  Ｂｅｒｔｏｌｉｎｏ，  Ｐ．，  Ｄｅｃｋｅｒｓ，  Ｍ．，  Ｌｅｂｒｉｎ，  Ｆ．，  ａｎｄ  ｔｅｎ  Ｄｉｊｋｅ，  Ｐ．  （２００５）  Ｃｈｅｓｔ  １２８，  ５８５Ｓ−５９０Ｓ
４１．  Ｂｏｂｉｋ，  Ａ．  （２００６）  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ
４２．  Ｒｕｓｃｅｔｔｉ，  Ｆ．  Ｗ．，  Ａｋｅｌ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｂａｒｔｅｌｍｅｚ，  Ｓ．  Ｈ．  （２００５）  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２４，  ５７５１−５７６３
４３．  Ｊａｎｓｓｅｎｓ，  Ｋ．，  ｔｅｎ  Ｄｉｊｋｅ，  Ｐ．，  Ｊａｎｓｓｅｎｓ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｈｕｌ，  Ｗ．  （２００５）  Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ  ２６，  ７４３−７７４
４４．  Ｆａｌｅｒ，  Ｂ．  Ｊ．，  Ｍａｃｓａｔａ，  Ｒ．  Ａ．，  Ｐｌｕｍｍｅｒ，  Ｄ．，  Ｍｉｓｈｒａ，  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｓｉｄａｗｙ，  Ａ．  Ｎ．  （２００６）  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  Ｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ  Ｅｎｄｏｖａｓｃ  Ｔｈｅｒ  １８，  ５５−６２
４５．  Ｗｕｌｌｓｃｈｌｅｇｅｒ，  Ｓ．，  Ｌｏｅｗｉｔｈ，  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，  Ｍ．  Ｎ．  （２００６）  Ｃｅｌｌ  １２４，  ４７１−４８４
４６．  Ｐｒｏｕｄ，  Ｃ．  Ｇ．  （２００４）  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ６３，  ４０３−４１３
４７．  Ｔｅｅ，  Ａ．  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｂｌｅｎｉｓ，  Ｊ．  （２００５）  Ｓｅｍｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １６，  ２９−３７
【０３４１】
一般参照文献
１．  Ｌｅ  Ｂｌａｎｃ，  Ｋ．  ＆  Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ，  Ｍ．  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｔｏｗａｒｄ  ｐｒｏｍｉｓｅ．  Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ７，  ３６−４５  （２００５）．
２．  Ｘｕ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２２，  ９７２−８０  （２００４）．
３．  Ｂａｒｂｅｒｉ，  Ｔ．，  Ｗｉｌｌｉｓ，  Ｌ．Ｍ．，  Ｓｏｃｃｉ，  Ｎ．Ｄ．  ＆  Ｓｔｕｄｅｒ，  Ｌ．  Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  ＰＬｏＳ  Ｍｅｄ  ２，  ｅ１６１  （２００５）．
４．  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｓ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｓｐｏｎｄ  ｔｏ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ．  Ｈｕｍ  Ｃｅｌｌ  １０，  ４５−５０  （１９９７）．
５．  Ｋｉｌｉａｎ，  Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｒｅｓ  ９，  ３３７−４４  ）２００４）．
６．  Ｃｏｗａｎ，  Ｃ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５０，  １３５３−６  （２００４）．
７．  Ｔｈｏｍｓｏｎ，  Ｊ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２，  １１４５−１１４７  （１９９８）．
８．  Ｑｕｅ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｒｏｍ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｆｅｅｄｅｒ．  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ａｎｉｍ  ４０，  １４３−９  （２００４）．
９．  Ｊａｖａｚｏｎ，  Ｅ．Ｈ．，  Ｂｅｇｇｓ，  Ｋ．Ｊ．  ＆  Ｆｌａｋｅ，  Ａ．Ｗ．  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：  ｐａｒａｄｏｘｅｓ  ｏｆ  ｐａｓｓａｇｉｎｇ．  Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ３２，  ４１４−２５  （２００４）．１０．  Ｂａｒｒｙ，  Ｆ．Ｐ．  ＆  Ｍｕｒｐｈｙ，  Ｊ．Ｍ．  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Cｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３６，  ５６８−８４  （２００４）．
１１．  Ｍａｊｕｍｄａｒ，  Ｍ．Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｓｃｉ  １０，２２８−４１  （２００３）．
１２．  Ｒｏｓｅｎ，  Ｅ．Ｄ．  Ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ａｄｉｐｏｃｙｔｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ  Ｌｅｕｋｏｔ  Ｅｓｓｅｎｔ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ  ７３，  ３１−４  （２００５）．
１３．  Ｏｋａｚａｋｉ，  Ｋ．  ＆  Ｓａｎｄｅｌｌ，  Ｌ．Ｊ．  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．  Ｃｌｉｎ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｌａｔ  Ｒｅｓ，  Ｓ１２３−８  （２００４）．
１４．  Ｂａｒｒｅａｕ，  Ｃ．，  Ｐａｉｌｌａｒｄ，  Ｌ．  ＆  Ｏｓｂｏｒｎｅ，  Ｈ．Ｂ．  ＡＵ−ｒｉｃｈ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ：  ａｒｅ  ｔｈｅｒｅ  ｕｎｉｆｙｉｎｇ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ？  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３，  ７１３８−５０  （２００５）．
１５．  Ｅｓｐｅｌ，  Ｅ．  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＵ−ｒｉｃｈ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｍＲＮＡｓ  ｉｎ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．  Ｓｅｍｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １６，  ５９−６７  （２００５）．  ２１
１６．  Ｇｅｒｓｔｅｎｆｅｌｄ，  Ｌ．Ｃ．  ＆  Ｓｈａｐｉｒｏ，  Ｆ．Ｄ．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅｓ  ｂｙ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ｅｎｄｏｃｈｏｎｄｒａｌ  ｂｏｎｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６２，  １−９  （１９９６）．
１７．  Ｋｎｏｔｔ，  Ｌ．  ＆  Ｂａｉｌｅｙ，  Ａ．Ｊ．  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｓ  ｉｎ  ｍｉｎｅｒａｌｉｚｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅｓ：  ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅｉｒ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｅｌｅｖａｎｃｅ．  Ｂｏｎｅ  ２２，  １８１−７  （１９９８）．１８．  Ｓｕ，  Ｂ．  ＆  Ｋａｒｉｎ，  Ｍ．  Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｃａｓｃａｄｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８，  ４０２−１１  （１９９６）．
１９．  Ｔｏｒｒｅｓ，  Ｍ．  ＆  Ｆｏｒｍａｎ，  Ｈ．Ｊ．  Ｒｅｄｏｘ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ  ｐａｔｈｗａｙｓ．  Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ  １７，  ２８７−９６  （２００３）．
２０．  Ｍａｔｓｕｋａｗａ，  Ｊ．，  Ｍａｔｓｕｚａｗａ，  Ａ．，  Ｔａｋｅｄａ，  Ｋ．  ＆  Ｉｃｈｉｊｏ，  Ｈ．  Ｔｈｅ  ＡＳＫ１−ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ  ｃａｓｃａｄｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｓｔｒｅｓｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  （Ｔｏｋｙｏ）  １３６，  ２６１−５  （２００４）．
２１．  Ｓｅｋｉｎｅ，  Ｙ．，  Ｔａｋｅｄａ，  Ｋ．  ＆  Ｉｃｈｉｊｏ，  Ｈ．  Ｔｈｅ  ＡＳＫ１−ＭＡＰ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ＥＲ  Ｓｔｒｅｓｓ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅ−ｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．  Ｃｕｒｒ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ６，  ８７−９７  （２００６）．
２２．  Ｃａｉ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈＥＳＣ  ｌｉｎｅｓ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  （２００５）．
２３．  Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ，  Ｂ．Ｅ．，  Ｐｅｒａ，  Ｍ．Ｆ．，  Ｆｏｎｇ，  Ｃ．Ｙ．，  Ｔｒｏｕｎｓｏｎ，  Ａ．  ＆  Ｂｏｎｇｓｏ，  Ａ．  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ：  ｓｏｍａｔｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １８，  ３９９−４０４  （２０００）．
２４．  Ｌｉｍ，  Ｓ．Ｃ．  ＆  Ｏｈ，  Ｓ．Ｈ．  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＣＤ２４  ｉｎ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａｓ．  Ｐａｔｈｏｌ  Ｒｅｓ  Ｐｒａｃｔ  ２０１，  ４７９−８６  （２００５）．
２５．  Ｂｈａｔｉａ，  Ｒ．  ＆  Ｈａｒｅ，  Ｊ．Ｍ．  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：  ｆｕｔｕｒｅ  ｓｏｕｒｃｅ  ｆｏｒ  ｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．  Ｃｏｎｇｅｓｔ  Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌ  １１，  ８７−９１；  ｑｕｉｚ  ９２−３  （２００５）．
２６．  Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ，  Ｍ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｓｅｌｌｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４，  １４３−１４７  （１９９９）．
２７．  Ｄａｍｊａｎｏｖ，  Ｉ．，  Ｄａｍｊａｎｏｖ，  Ａ．  ＆  Ｓｏｌｔｅｒ，  Ｄ．  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｆｒｏｍ  ｅｍｂｒｙｏｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  ｔｏ  ｅｘｔｒａ−ｕｔｅｒｉｎｅ  ｓｉｔｅｓ．  ｉｎ  Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：  ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ．  （ｅｄ．  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，  Ｅ．Ｊ．）  １−１７  （ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  １９８７）．
２８．  Ｙｉｎ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  ＡＦＰ（＋），  ＥＳＣ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｅｎｇｒａｆｔ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ  ｉｎｔｏ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  Ｖｉｖｏ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２０，  ３３８−３４６  （２００２）．
【０３４２】
本文書において言及した各出願と各特許、及びこれら出願と特許のそれぞれにおいて引用あるいは参照された各文書は、各出願と特許の手続き期間におけるもの（「出願時引用文献」）及び各出願と特許及び出願時引用文献のいずれにおいて引用あるいは言及されるいかなる製品に関するいかなる製造者の指示あるいはカタログも含め、本明細書に参照として取り込むものとする。更に、本文において引用する全ての文書、本文において引用する文書において引用あるいは参照される全ての文書、及び本文において引用あるいは参照するいかなる製品に関するいかなる製造者の指示あるいはカタログも、本明細書に参照として取り込むものとする。
【０３４３】
本発明の記載した方法とシステムについての本発明の範囲と趣旨から逸脱しない多様な修正と変更が当業者には明らかとなろう。本発明を特定の好適実施形態に関連付けて記載したが、権利請求する本発明をこれら特定の実施形態に不当に限定するべきでなく、本発明の範囲内において多くの修正と追加をこれら実施形態に為し得ることは理解されるべきである。事実、記載した本発明の実施態様について、分子生物学あるいは関連の分野における当業者には明らかである多様な修正が請求項の範囲に存在することが意図されている。更に、本発明の範囲から逸脱することなく、以下に示す従属項の特徴を独立項の特徴と多様に組み合わせることができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｇ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ−１】
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【図４Ｄ−２】
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【図４Ｄ−３】
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【図４Ｅ−１】
2009506769.tif 000113
【図４Ｅ−２】
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【図４Ｅ−３】
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【図５Ａ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｆ】
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【図３Ａ−ＣＯＮＴＩＮＵＥＤ１】
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【図３Ａ−ＣＯＮＴＩＮＵＥＤ２】
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【図３Ｂ−ＣＯＮＴＩＮＵＥＤ１】
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【図３Ｂ−ＣＯＮＴＩＮＵＥＤ２】
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【図３Ｃ−ＣＯＮＴＩＮＵＥＤ１】
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【図３Ｃ−ＣＯＮＴＩＮＵＥＤ２】
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【図４Ｂ−ＣＯＮＴＩＮＵＥＤ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｂ−ＣＯＮＴＩＮＵＥＤ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図８−ＣＯＮＴＩＮＵＥＤ１】
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【図８−ＣＯＮＴＩＮＵＥＤ２】
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【図９】
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【図９−ＣＯＮＴＩＮＵＥＤ】
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【国際調査報告】
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