(57)【要約】  本発明は、遊離対結合化合物を検出する新規の試薬及び方法を提供する。結合トロンビンとの反応から立体的に遮蔽された修飾基質を用いてＡ２Ｍと結合するトロンビンの存在下で、Ａ２Ｍに結合していない場合のトロンビンを検出するのに特に有用である。【選択図】図２
2009521236.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遊離酵素と反応し得、そして分子トラップ中に結合した酵素とは反応し得ない修飾基質であって、該修飾基質がスペーサーを介して高分子に結合している基質を含む修飾基質。
【請求項２】
スペーサーが３乃至５０原子を含む、請求項１に記載の修飾基質。
【請求項３】
スペーサーが９乃至１５原子を含む、請求項２に記載の修飾基質。
【請求項４】
スペーサーが１２原子を含む、請求項３に記載の修飾基質。
【請求項５】
前記基質がペプチドでありそして前記酵素がプロテイナーゼである、請求項１に記載の修飾基質。
【請求項６】
前記酵素が、トロンビン、第Ｘａ因子、活性化タンパク質Ｃ、プラスミン、組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、コラゲナーゼ、スブチリシン、サーモリシン、パパイン、及びカテプシンＢからなる群より選ばれる、請求項５に記載の修飾基質。
【請求項７】
前記酵素がトロンビンである、請求項６に記載の修飾基質。
【請求項８】
前記高分子が、アガロースビーズ、セファロースビーズ、ポリスチレンビーズ、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリエチレンオキシド、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルボネート、ダクロン、デキストラン、ポリテトラフルオロエチレン、タンパク質、多糖、及びポリヌクレオチドからなる群より選ばれる、請求項１に記載の修飾基質。
【請求項９】
前記高分子がアガロースビーズである、請求項８に記載の修飾基質。
【請求項１０】
前記高分子がポリスチレンである、請求項８に記載の修飾基質。
【請求項１１】
検体中の遊離対結合酵素を検出する方法であって、該方法は、
ｉ．請求項１に定義したような修飾基質を得る工程；
ｉｉ．基質を検体と結合させる工程；そして
ｉｉｉ．発色、蛍光又は化学発光による信号を検出する工程；を含む方法。
【請求項１２】
前記修飾基質が、容器の表面に非−共有結合する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記修飾基質が、容器の表面に共有結合する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記酵素がトロンビンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
遊離酵素活性を測定するためのキットであって、該キットが請求項１において定義したような修飾基質を含むものであるキット。
【請求項１６】
さらに、反応緩衝液及び組織因子を含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記修飾基質が反応容器の表面に結合されているものである、請求項１５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、修飾基質及び遊離対結合タンパク質実体を測定するための修飾基質を用いるアッセイ及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  α−２−マクログロブリン（Ａ２Ｍ）及び関連タンパク質は分子トラップとして作用する機能を共有する。ホルモン、成長因子、サイトカイン及びタンパク質のような種々の型の化合物がＡ２Ｍにより“トラップ”され得る。Ａ２Ｍは宿主及び外来のペプチド及び粒子の両方に結合し得る。Ａ２Ｍは、さまざまなプロテイナーゼと相互作用し得るため、時にはパンプロテイナーゼ（全プロテイナーゼ）阻害剤と呼ばれる。Ａ２Ｍにより捕捉された場合、プロテイナーゼは大きなプロテイナーゼ阻害剤及び大きな基質から保護されるが、しかしそれにも関わらず小さな阻害剤及び基質と相互作用し得る。【０００３】  よく研究されているＡ２Ｍ−プロテイナーゼの関連性の１つはＡ２Ｍ中にトロンビンを捕捉することである。【０００４】  トロンビンは、とりわけ、フィブリノーゲンを活性化しフィブリンを形成し得（非特許文献４，非特許文献５）、フィードバックして凝固カスケード中の上流の第ＸＩ因子、第ＶＩＩＩ因子及び第Ｖ因子を活性化し得そして血小板を活性化し得る（非特許文献２）ため、凝固カスケードにおける中枢の酵素（非特許文献２，非特許文献３）である。トロンビンの制御は、部分的には、血漿タンパクアンチトロンビン（ＡＴ）、ヘパリンコファクターＩＩ及びＡ２Ｍからの阻害を経て起こる。ＡＴとの反応は、しばしば成人におけるトロンビン活性の制御の主要な阻害機構である。しかし、新生児及び小児においては、Ａ２Ｍとの反応は、成人のそれと比較してＡ２Ｍの高い血漿濃度により重要だと考えられている（非特許文献６，非特許文献７，非特許文献８）。トロンビン活性化は、Ａ２Ｍポリペプチド鎖の切断を介してＡ２Ｍにより障害され、Ａ２Ｍ三次元構造中の立体構造の変化を生じ、トロンビンがＡ２Ｍ分子内で捕捉された生成物を形成する（非特許文献９，非特許文献１０，非特許文献１１）。このトロンビン−Ａ２Ｍ複合体中で、トロンビンはまた、Ａ２Ｍ上のチオール−ラクトン基とトロンビンのアミノ基の更なる反応を通じてＡ２Ｍに共有結合され得る（非特許文献９，非特許文献１２）。【０００５】  凝固系におけるトロンビンの重要性を考慮すると、止血状態を評価するために患者からの血漿又は血液中のトロンビン生成能の測定系の開発がますます必要になりつつある。従来のトロンビン生成を測定する方法は、活性化血漿を前サンプリングしトロンビン活性を測定する方法（非特許文献１３，非特許文献１４，非特許文献１５）か又はトロンビンが生成している活性化血漿中へ混合された基質を用いて連続的にトロンビンを検出する方法（非特許文献１６，非特許文献１７，非特許文献１８）のどちらかが関与している。トロンビン生成を測定する従来の手順の主要な欠点は、トロンビン活性を検出するために用いる試薬が、Ａ２Ｍと結合するトロンビン並びにＡ２Ｍと結合していないトロンビンを検出することである。サブサンプリング法の場合において、基質とのトロンビン−Ａ２Ｍ反応のアッセイにおける活性（添加されたＡＴ及びヘパリンにより未結合の遊離トロンビンの中和後に検出）は、総トロンビン活性のアッセイから生理学的に活性のある遊離トロンビン濃度を得るために差し引かれる。しかし、これらの実験は、手間がかかりそし��それぞれの血漿検体において行われる２つのトロンビン生成のアッセイを必要とする。さらに、サブサンプリング分析は、凝固血漿又は血液では不可能である。活性化トロンビン生成系（血漿、血液等）へ添加されたトロンビン基質を用いてトロンビン生成を連続的に測定する方法は、Ａ２Ｍへ結合しないトロンビンの生成を直接的に測定することができない。連続的アッセイにおいて、生理学的に活性のあるトロンビンの理論値は、測定されたトロンビン及びトロンビン−Ａ２Ｍのデータより、トロンビン−Ａ２Ｍ生成の計算された推論的カーブを差し引くことにより測定される。【０００６】  血漿及び血液中のトロンビン能を測定し得るアッセイを開発する種々の試みがなされてきた。例えば、Ｈｅｍｋｅｒ等への米国特許第５，１９２，６８９号明細書は、血漿及び血液の内因性トロンビン能を測定する方法に関する。しかし、この特許の方法は、トロンビン単独並びにＡ２Ｍと結合したトロンビンを含む総トロンビン活性を測定している。トロンビン活性は少量の発色／蛍光性基質を用いて測定され、次いでＡ２Ｍに結合しているトロンビンの概算計算値を出し、その数値はその後総トロンビン活性から差し引かれて、生理学的に活性のある遊離トロンビンの概算値を得る。【０００７】  豪州特許出願第２００３２４８５８９号明細書はトロンビン能を測定するためのその他の方法に関する。しかし、この方法はまた、総トロンビン活性からの、小さな基質により検出されるトロンビン−Ａ２Ｍ複合体の減法を含む。【０００８】  米国特許出願第２００５／０２２１４１４号明細書は、患者の血漿又は血液検体中のトロンビン生成能を測定するためのキットに関する。この公報中に記載されているキットにおいて、活性化剤、基質、ＣａＣｌ２等のような剤の全ての試薬はアッセイに加えられる血漿又は血液を待つ容器中に乾燥混合物として入っている。かさねて、しかしながら、このキットは遊離トロンビン及びＡ２Ｍに結合したトロンビンの両方を測定するであろう。【０００９】  Ｈｅｍｋｅｒへの米国特許第６，７４０，４９６号明細書は、遊離のタンパク分解酵素と比較してプロテアーゼ−Ａ２Ｍ複合体に対する反応性を減じた立体障害基質系について記載している。しかし、クレームされた基質の発明は、１０ｋＤａの最小サイズをもつ水溶性基質分子に完全に限定されている。可溶性立体障害性基質による遊離トロンビン測定は：タンパク質又は細胞によるクエンチングに起因するリポーター分子の不確定な検出、細胞又は高分子化したフィブリン上の基質の吸収または凝集の可能性、及び極めて大きな分子の表面の立体障害から生じる基質が遊離トロンビン自身と反応できないこと、のような幾つかの問題に起因して、凝固血漿又は血液中に限定されている。
【特許文献１】米国特許第５，１９２，６８９号明細書
【特許文献２】豪州特許出願第２００３２４８５８９号明細書
【特許文献３】米国特許出願第２００５／０２２１４１４号明細書
【特許文献４】米国特許第６，７４０，４９６号明細書
【非特許文献１】Ｓｃｈｅｎｏｎｅ  Ｍ，Ｆｕｒｉｅ  ＢＣ，Ｆｕｒｉｅ  Ｂ．，「血液凝固カスケード」（Ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｃａｓｃａｄｅ），Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１１巻４号：２７２−２７７頁，２００４年。
【非特許文献２】Ｗａｌｓｈ  ＰＮ．、“血小板凝固−タンパクの相互作用”（Ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）、Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．、３０巻４号：４６１−４７１頁，２００４年。
【非特許文献３】Ｓｕｏ  Ｚ，Ｃｉｔｒｏｎ  ＢＡ，Ｆｅｓｔｏｆｆ  ＢＷ．、“トロンビン：神経外傷及び神経変性障害における可能性のある起炎症性メディエーター”（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ：ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）、Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  Ｉｎｆｌａｍｍ．Ａｌｌｅｒｇｙ．、３巻１号：１０５−１１４，２００４年。
【非特許文献４】Ｓｔａｎｄｅｖｅｎ  ＫＦ，Ａｒｉｅｎｓ  ＲＡ，Ｇｒａｎｔ  ＰＪ、“フィブリン構造／機能の分子生理学及び病理学”（Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｆｉｂｒｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｆｕｎｃｔｉｏｎ）、Ｂｌｏｏｄ．Ｒｅｖ．、１９巻５号：２７５−２８８頁，２００５年。
【非特許文献５】Ｗｅｉｓｅｌ  ＪＷ．“フィブリノーゲンとフィブリン”（Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ  ａｎｄ  Ｆｉｂｌｉｎ）、Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．、７０巻：２４７−２９９頁，２００５年。
【非特許文献６】Ａｎｄｒｅｗ  Ｍ，Ｐａｅｓ  Ｂ，Ｍｉｌｎｅｒ  Ｒ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  Ｍ，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  Ｌ，Ｔｏｌｌｅｆｓｅｎ  ＤＭ，Ｐｏｗｅｒｓ  Ｐ．、“満期出産乳児に於けるヒト凝固系の発達”（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｕｌｌｔｅｒｍ  ｉｎｆａｎｔ）、Ｂｌｏｏｄ．、７０巻１号：１６５−１７２頁，１９８７年。
【非特許文献７】Ａｎｄｒｅｗ  Ｍ，Ｐａｅｓ  Ｂ，Ｍｉｌｎｅｒ  Ｒ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  Ｍ，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  Ｌ，Ｔｏｌｌｅｆｓｅｎ  ＤＭ，Ｃａｓｔｌｅ  Ｖ，Ｐｏｗｅｒｓ  Ｐ．、“健康未熟児に於けるヒト凝固系の発達”（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｉｎｆａｎｔ）、Ｂｌｏｏｄ．、７２巻５号１６５１−１６５７頁，１９８８年。
【非特許文献８】Ａｎｄｒｅｗ  Ｍ，Ｖｅｇｈ  Ｐ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  Ｍ，Ｂｏｗｋｅｒ  Ｊ，Ｏｆｏｓｕ  Ｆ，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  Ｌ．、“小児期における止血系の成熟”（Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ．）、Ｂｌｏｏｄ、８０巻８号：１９９８−２００５頁，１９９２年。
【非特許文献９】Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ  Ｌ．、“α−マクログロブリン：構造、形状及びプロテイナーゼ複合体形成の機構”（Ａｌｐｈａ−ｍａｃｒｏｇｌｏｂｌｉｎｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｓｈａｐｅ，ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４巻２０号：１１５３９−１１５４２頁，１９８９年。
【非特許文献１０】Ｎｉｅｍｕｌｌｅｒ  ＣＡ，Ｒａｎｄａｌｌ  ＫＪ，Ｗｅｂｂ  ＤＪ，Ｇｏｎｉａｓ  ＳＬ，Ｌａｍａｒｒｅ  Ｊ．、“α−２−マクログロブリン構造はアクチビンＡとの結合親和性及びアクチビンＡ／α−２−マクログロブリン複合体の血漿クリアランスを決定する”（Ａｌｐｈａ−２−ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｆｆｉｎｉｙ  ｆｏｒ  ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ  ａｎｄ  ｐｌａｓｍａ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ／ａｌｐｈａ−２−ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１３６巻１２号：５３４３−５３４９頁，１９９５年。
【非特許文献１１】Ｓｔｅｉｎｅｒ  ＪＰ，Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ  Ｐ，Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ  ＤＫ、“ヒトα−２−マクログロブリンのトロンビン誘発構造変化：２つの機能ドメインのエビデンス”（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ−ｉｏｎｄｕｃｅｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｌｐｈａ−２−ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｗｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｏｍａｉｎｓ．）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２４巻１２号：２９９３−２３００頁，１９８５年。
【非特許文献１２】Ｆｅｉｎｍａｎ  ＲＤ，Ｙｕａｎ  ＡＩ，Ｗｉｎｄｗｅｒ  ＳＲ，Ｗａｎｇ  Ｄ．、“トロンビン及びアルファ−２−マクログロブリンの反応速度”（Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ａｎｄ  ａｌｐｈａ  ２−ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２３１巻２号：４１７−４２３頁，１９８５年。
【非特許文献１３】Ｍａｓｓｉｃｏｔｔｅ  Ｐ，Ｌｅａｋｅｒ  Ｍ，Ｍａｒｚｉｎｏｔｔｏ  Ｖ，Ａｄａｍｓ  Ｍ，Ｆｒｅｅｄｏｍ  Ｒ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｗ，Ｖｅｇｈ  Ｐ，Ｂｅｒｒｙ  Ｌ，Ｓｈａｈ  Ｂ，Ａｎｄｒｅｗ  Ｍ，“成人に比較して小児におけるワルファリン治療中の増殖したトロンビン調節”（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｗａｒｆａｒｉｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｔｏ  ａｄｕｌｔｓ）、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．、８０巻４号：５７０−５７４頁，１９９８年。
【非特許文献１４】Ａｎｄｒｅｗ  Ｍ，Ｂｅｒｒｙ  Ｌ，Ｏ‘Ｂｒｏｄｏｖｉｃｈ  Ｈ．，“胎児の末梢肺上皮によるトロンビン阻害は胎児と成人血漿とは異なる。”（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ｆｅｔａｌ  ｄｉｓｔａｌ  ｌｕｎｇ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ｉｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｉｎ  ｆｅｔａｌ  ａｎｄ  ａｄｕｌｔ  ｐｌａｓｍａ）、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１１巻１号：３５−４１頁，１９９４年。
【非特許文献１５】Ｃｖｉｒｎ  Ｇ，Ｇａｌｌｉｓｔｌ  Ｓ，Ｋｏｅｓｔｅｎｂｅｒｇｅｒ  Ｍ，Ｋｕｔｓｃｈｅｒａ  Ｊ，Ｌｅｓｃｈｎｉｋ  Ｂ，Ｍｕｎｔｅａｎ  Ｗ．“α−２−マクログロブリンは臍帯及び成人血漿における抗凝固タンパクＣ／タンパクＳ系の阻害によりプロトロンビン活性及びトロンビン能を増強する。”（Ａｌｐｈａ２−ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ／ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｃｏｒｄ  ａｎｄ  ａｄｕｌｔ  ｐｌａｓｍａ．）、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．、１０５巻５号：４３３−４３９頁，２００２年。
【非特許文献１６】Ｈｅｍｋｅｒ  ＨＣ，Ｗｉｅｌｄｅｒｓ  Ｓ，Ｋｅｓｓｅｌｓ  Ｈ，Ｂｅｇｕｉｎ  Ｓ．、“血漿中のトロンビン生成の継続的記録、そのトロンビン能の測定のための使用”（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ，ｉｔｓ  ｕｓｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．、７０巻４号：６１７−６２４頁，１９９３年。
【非特許文献１７】Ｋｅｓｓｅｌｓ  Ｈ，Ｗｉｌｌｅｍｓ  Ｇ，Ｈｅｍｋｅｒ  ＨＣ．、“血漿中のトロンビン生成の解析”（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ）、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、２４巻４号：２７７−２８８頁，１９９４年。
【非特許文献１８】Ｈｅｍｋｅｒ  ＨＣ，Ｇｉｅｓｅｎ  ＰＬ，Ｒａｍｊｅｅ  Ｍ，Ｗａｇｅｎｖｏｏｒｄ  Ｒ，Ｂｅｇｕｉｎ  Ｓ．、“トロンボグラム：多血小板血漿におけるトロンビン生成のモニタリング”（Ｔｈｅ  ｔｈｒｏｍｂｏｇｒａｍ：ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｒｉｃｈ  ｐｌａｓｍａ）、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．、８３巻４号：５８９−５９１頁，２０００年。
【非特許文献１９】Ｓｔｒｅｉｆ  Ｗ，Ｐａｅｓ  Ｂ，Ｂｅｒｒｙ  Ｌ，Ａｎｄｒｅａｓｅｎ  ＲＢ，Ｃｈａｎ  ＡＫ．、“満期出産乳児及び未熟児の臍帯血漿中のトロンビン生成における外因性第ＶＩＩａ因子の影響”（Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩａ  ｏｎ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｏｒｄ  ｐｌａｓｍａ  ｏｆ  ｆｕｌｌ−ｔｅｒｍ  ａｎｄ  ｐｒｅ−ｔｅｒｍ  ｎｅｗｂｏｒｎｓ）、Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌ．Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ．、１１巻４号：３４９−３５７頁，２０００年。
【非特許文献２０】Ｍｅｄｄａｈｉ  Ｓ，Ｂａｒａ  Ｌ，Ｆｅｓｓｉ  Ｈ，Ｓａｍａｍａ  ＭＭ．、“ヒト精製プロトロンビンをヒト血栓へ添加後のプロトロンビナーゼ活性化の測定：血栓結合トロンビン及びプロトロンビン活性化における、ヒルジン、活性化第ＩＩ因子阻害剤、とＤＸ９０６５ａ、活性化第Ｘ因子阻害剤、との比較。”（Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ａｄｄｉｎｇ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｃｌｏｔ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｈｉｒｕｄｉｎ，ａｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  ＩＩ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｗｉｔｈ  ＤＸ９０６５ａ，ａｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  Ｘ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｏｎ  ｃｌｏｔ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ａｎｄ  ｏｎ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）、Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌ．Ｆｉｂｒｎｏｌｙｓｉｓ、１６巻２号：１２５−１３３頁，２００５年。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】  この分野の多くの進歩にもかかわらず、遊離トロンビン及びＡ２Ｍに結合したトロンビンの両方を測定するのに対して遊離トロンビンのみを測定し得るアッセイのためのまだ対処されていない必要性が残っている。本発明は、そのような方法の必要性を解決するためのものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】  発明の概要
本発明は、大量出血又はプロトロンビン傾向を評価するためのみならず、並びに抗止血剤及び抗凝固剤の評価のための標準的方法及び試薬を提供する。本発明の１つの特徴において、Ａ２Ｍに結合していないトロンビン（遊離トロンビン）は、Ａ２Ｍに結合したトロンビン（トロンビン−Ａ２Ｍ複合体）と区別し得る。【００１２】  本発明の１つの特徴において、遊離酵素と反応し得、そして分子トラップ中で結合した酵素と反応し得ない修飾基質が提供される。修飾基質は好ましくは、スペーサーを介して高分子と結合している基質を含む。好ましい実施態様において、スペーサーは３乃至５０原子、好ましくは９乃至１５原子、より好ましくは１２原子を含む。好ましい実施態様において、酵素はプロテイナーゼ、好ましくはトロンビンである。【００１３】  高分子は、アガロースビーズ、セファロースビーズ、ポリスチレンビーズ、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリエチレンオキシド、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルボネート、ダクロン、デキストラン、ポリテトラフルオロエチレン、タンパク質、多糖、及びポリヌクレオチドからなる群より選ばれ得る。好ましい実施態様においては、アガロースビーズである。その他の好ましい実施態様においては、ポリスチレンである。【００１４】  その他の実施態様において、本発明は基質を修飾する方法を提供する。該方法は結合酵素と相互作用し得ないように基質を修飾することを含む。１つの実施態様において、該方法はアガロースビーズのような大きな分子に基質を結合させることを含む。その他の実施態様において、該方法は、酵素に結合した分子により反発されるように、基質の荷電、疎水性、親水性を変化させることを含む。さらにその他の実施態様において、基質は、結合酵素の曝露されている活性部位から離れたところにある酵素結合分子の領域への親和性を持つよう修飾される。【００１５】  本発明はまた、検体の遊離対結合酵素を検出する方法を提供する。該方法は、上記に定義したような修飾基質を得る工程、基質を検体と混合する工程、そして、発色、蛍光又は化学発光による信号を検出する工程を含む。【００１６】  更なる特徴において、本発明はまた、遊離酵素のみと反応するよう修飾された基質を含む酵素活性を測定するためのキットを提供する。【００１７】  この本発明の概要は、必ずしも本発明の全ての特徴を記載したものではない。【００１８】  図面の簡単な説明
本発明のこれらの及びその他の特徴は、下記の添付の図面によって参照される以下の記載からより明確に理解されるであろう：
図１は、従来技術のアッセイの概略図を示すものである；
図２は、本発明の実施態様に従っている修飾基質がどのように結合し得るかを示す図である；
図３は、スペーサーの長さがどのように結合に影響し得るかを示す図である；
図４は、本発明の１つの特徴のアッセイを示す図である；そして
図５は、トロンビン生成アッセイからの結果を示す図である。【００１９】  以下の記載は好ましい実施態様を示すものである。【００２０】  本発明は、遊離対結合分子に対して遊離分子の検出に用いられ得る新規の方法及び試薬を提供する。特に、遊離プロテイナーゼは、Ａ２Ｍと結合したプロテイナーゼから区別され得る。該方法及び試薬はまた、“遊離”対“結合”状態における多様な機能のその他のタンパク質を検出するために用いられ得る。【００２１】  ここで用いられる用語“遊離”とは、複合体中に存在しない構成成分を指す。用語“遊離トロンビン”とは、その他の分子と結合し得るが、Ａ２Ｍと結合していないトロンビンを指す。【００２２】  ここで用いられる用語“結合”とは複合体を形成する構成成分を指す。用語“結合トロンビン”とはＡ２Ｍ中に捕捉されるトロンビンを指す。【００２３】  用語“基質”及び“酵素”とは、相互作用する成分を指すためにここで制限されずに用いられる。“基質”は、分子トラップ中で隔離し得るその他の構成成分と反応し得る任意の構成成分を指す。本発明はここにトロンビン及びその基質を特定の参照として記載したが、本発明は多くのその他のタンパク質−タンパク質、レセプター−リガンド、酵素−基質反応に適用し得ることは明確に理解される。【００２４】  遊離対結合化合物は、遊離化合物と反応し得るが、しかし結合化合物との反応からは立体的に障害されるシグナル試薬を用いて検出される。シグナル試薬は、直接的又は間接的のどちらかで標識され得る。シグナル試薬の１つの例は、遊離酵素上の活性部位に接近し得るがしかし結合酵素の活性部位には接近し得ない化学発光基質である。【００２５】  本発明の１つの実施態様において、修飾基質が提供される。基質は修飾され、その結果遊離酵素と反応し得るが、しかし分子ケージの中にトラップされた酵素とは反応し得ない。これは、大きな担体への基質のカップリングさせることにより、疎水性又は親水性を変化させることにより、又は親和性を変化させることにより達成し得る。好ましい実施態様において、小さな基質は、アガロースビーズ、セファロースビーズ、ポリスチレンビーズ、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリエチレンオキシド、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルボネート、ダクロン、デキストラン、ポリテトラフルオロエチレン、タンパク質、多糖、及びポリヌクレオチドのような高分子とカップリングし得る。基質が大きな分子と結合する場合、分子トラップ中に隔離された酵素の活性部位の接近から立体的に障害される。【００２６】  本発明はまた、活性的に遊離の酵素の量及び／又は活性を測定する方法及びアッセイを提供する。該方法は、上記のような基質を修飾しそして溶液中で酵素との反応能を測定することを含む。酵素−基質反応は、シグナルを生じる切断された生成物を検出することにより測定され得る。【００２７】  酵素活性を測定するためのキットもまた、提供される。該キットは遊離の酵素とのみ反応する修飾基質を含む。該キットはまた、反応緩衝液及び、標準化酵素対照又は組織因子のような、その他の反応物を含み得る。該キットは、修飾基質でコートされたマイクロタイタープレート等のウェルのような表面を含み得る。【００２８】  好ましい実施態様において、Ａ２Ｍによりトラップされたトロンビンへの接近から障害される、トロンビン−反応性基質が提供される。Ａ２Ｍ（結合したトロンビンを含む）は、基質をＡ２Ｍ−結合したトロンビンの活性部位と相互作用することから物理的に障害するか、反発するか又は抑制する。１つの実施態様において、これは、トロンビンＡ２Ｍ複合体のＡ２Ｍ部分の周囲に突き出、そしてＡ２Ｍにより捕捉されたトロンビンの活性部位に接近（接触）するためには、大きすぎる基質又は基質のトロンビン切断部分のために短すぎるスペーサーの構築によって達成される。その他の実施態様において、Ａ２Ｍ上の領域と反発し（荷電、疎水性／親水性等により）、基はトロンビン切断基質と結合し得、したがって、トロンビン−Ａ２Ｍ複合体中でのトロンビンへの基質の動きを妨げる。さらなる実施態様において、基は、トロンビン−Ａ２ＭのＡ２Ｍ成分の、又は領域又は複数の領域と親和性を有する、トロンビン切断基質上において設計し得、その結果、基質のトロンビン切断可能な部分はＡ２Ｍ上の遠方の魅力的な位置での結合に起因して、Ａ２Ｍ−結合トロンビンの活性部位と離れて保持される。【００２９】  修飾基質を用いたトロンビン活性を測定する方法及びアッセイが提供され、並びに該方法を行うためのキットが提供される。【００３０】  トロンビン活性を測定する、現在入手可能な市販のアッセイは、遊離トロンビン並びにＡ２Ｍ内部に結合しているトロンビンとも反応する基質を利用している。これを図１中に図示した。遊離トロンビン（１０）及びＡ２Ｍ（１４）中の結合トロンビン（１２）は基質（１６）とどちらも反応することが示される。したがって、遊離トロンビンの概算値を得るために、理論上のトロンビン−Ａ２Ｍ活性量を差し引く必要がある。【００３１】  従来技術の問題点は図２中の概略図に説明したように大きなマトリックスへトロンビンに特異的な基質を結合させることにより打開された。トロンビンは、遊離トロンビン（１０）及びＡ２Ｍ（１４）中の結合トロンビン（１２）のように示される。トロンビンは、基質（１６）と反応し得る活性部位（１５）を含む。基質（１６）が大きなマトリックス（１８）へ結合した場合、Ａ２Ｍ中にトラップされたトロンビンに接近することが立体的に妨げられる。遊離（１０）及び結合（１２）トロンビンの間の最適な区別を達成するために、マトリックス（１８）への基質の表面の結合（１６）は注意深く調整されるべきである。非常に短いスペーサー（２０）が用いられた場合、マトリックスの表面は、基質との反応から遊離酵素さえも障害され得る（図３Ａ参照）。スペーサー（２０）が長すぎると、基質は結合酵素と接近するのに十分束縛されない（図３Ｂ参照）。遊離トロンビンを検出するために、約５乃至１５原子のスペーサー（２０）が好ましい。このスペーサーは、遊離酵素と反応するのを許容するのに十分な長さであるが、しかし結合酵素に接近するのを許容するのに十分な長さでない（図３Ｃ参照）。８乃至１４の、好ましくは１２原子のスペーサーが、基質がアガロースビーズとカップリングするために特に有用である。【００３２】  図４は、本発明の修飾基質がどの��うにアッセイに使用され得るかを図示したものである。３０穴のマイクロタイタープレートをマトリックスを修飾した化学発光のトロンビン基質（３２）でコートする。血漿又は血液（３４）をウェルへ添加する。活性化された血液又は血漿からのトロンビンが基質と反応し、シグナルが発生され、そして発光分析計により検出される。化学発光分析計を用いることが好ましいが、当業者に知られるその他の検出手段が、遊離酵素への修飾基質の結合を検出するために用いられ得ることが明確である。修飾基質はまた、試験管及び管類のようなその他の表面上へコートされ得る。また、修飾基質のコーティングは共有結合又は非共有結合のどちらかを介し得ることが理解されるべきである。【００３３】  図５はどのように本発明がトロンビン生成の測定に用いられ得るかを図示したものである。結果は、本発明の修飾基質が遊離トロンビン及びトロンビン−Ａ２Ｍ複合体の間を区別し得ることを示す。【００３４】  本発明は、トロンビン−Ａ２Ｍ複合体の存在下において、トロンビン−Ａ２Ｍを検出することなくＡ２Ｍに結合していないトロンビンが直接検出される、新規な方法を提供する。本発明は、生成した遊離トロンビンを更なる操作又は数学的誘導を行うことなしに測定する、単純な遊離トロンビン量を測定する方法を提供する。本発明の修飾基質はＡ２Ｍへ結合したトロンビンとの反応を制限する。しかし、幾つかの表面に局在するトロンビンは、Ａ２Ｍ複合体中に保持されるトロンビンへの接近から立体的に障害されている基質と反応し得る。これは、最適な長さのスペーサーが反応性基質への立体障害している高分子を結合するために用いられる本発明の特別な特徴により達成し得る。表面（フィブリン又は血小板のような）上でトロンビンと反応し得るがＡ２Ｍへ結合したトロンビンとは反応しない基質は、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で生成したトロンビンとのフィブリノーゲン（又はその他の生物学的高分子／系）の反応性を模倣し得る。【００３５】  本発明の基質のその他の利点は、トロンビン反応性基質が沈殿され、手作業で除去され、イオン的に抽出され又は疎水的に吸着されるのに十分大きな分子へ結合する場合、基質を反応性トロンビンから分離することを可能とする。【００３６】  本発明の方法は、単独のアッセイ（１工程）を用いてトロンビン−Ａ２Ｍの存在下Ａ２Ｍへ結合していないトロンビンを測定することを可能とする。連続的なトロンビン生成の分析が凝固血漿又は血液中で行われる場合、従来の方法は、血漿／血液中で反応する蛍光性トロンビン基質に期待していた。しかし、これらの実験における蛍光性生成物は、血漿又は、血液中の分子及び細胞からの励起干渉及び発光消光を受ける。本発明は、このトロンビン基質の容器内壁への付着による液相中の蛍光の検出によりこれ等干渉を打開し、血漿／血液環境から離れて（通しての代わりに）容器壁を通じて移動する生成物の光を直接観測することによりトロンビン切断生成物からの如何なるシグナルも測定され得る。【００３７】  本発明は、トロンビン−Ａ２Ｍの汚染測定の抽出をすることをせずに生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で時間と共に血漿又は血液内のトロンビン生成を直接的に測定するために用いられ得る。基質（又は複数の基質）を検出する直接的なトロンビン活性は、血漿又は血液中のトロンビン能の単純で能率的なアッセイを可能とし、そして通常臨床過程での大量出血又はプロトロンビン傾向の標準測定、並びに抗止血剤又は抗凝固剤の評価の、標準的な測定方法を提供する。【００３８】  透明容器の内部表面への共有結合／非共有結合を介したトロンビン−Ａ２Ｍとの反応から立体的に障害された基質は、反応混合物中の他の分子（血漿／血液タンパク質のような）からの如何なる干渉もなしにトロンビン基質切断生成物（即ち、発色、蛍光又は化学発光生成物）を検出することを可能とする。【００３９】  さららにまた、トロンビンに高い親和性を有する基がＡ２Ｍに結合したトロンビンと結合することを立体的に障害する表面へ固定化される場合、この物質は、媒体からの非−Ａ２Ｍ結合トロンビンを単離するために用いられ得る。これは免疫学的な、微細構造の及びその他の研究に有用である。【００４０】  さらに、修飾基質が液相中のトロンビンと結合し、そしてＡ２Ｍの領域を分離するためのサイズ、荷電又は親和性の何れかによりＡ２Ｍ結合を阻害する場合、その他の結合機構に依存する次いで起こるトロンビンの相互作用、即ち種々の条件下で血小板又は血管内皮細胞表面のどちらかに結合するトロンビンの局在を含み、研究され得る。【００４１】  本発明の好ましい実施態様を詳細にわたり記載してきたが、遊離の形において反応するように修飾されたが酵素と結合しない基質は、種々のアッセイ及び適用において有用であろうことは明らかである。【００４２】  上記の開示は本発明を一般的に説明するものである。当業者は、先行する記述を用いて本発明の組成物を製造及び使用、そして方法を実施し得ると考えられる。より完全な理解は以下の特定の実施例の参照により得ることができる。これらの実施例は説明の目的のみのために記載されており、そして本発明の範囲を限定することを意図しない。形態の変化および等価物の置換は、状況が都合が良いことを示唆するか都合を良くするときに考慮される。その他の一般的な形態は当業者に明白であろう。全ての学術論文及びここに引用されている特許又は特許出願のような他の文献はここに参照として取り込まれる。
【実施例】
【００４３】  特定の用語がこれらの実施例において用いられているが、そのような用語は、記述的な意味を意図するものであり、限定を意図するものではない。本開示で言及されているが明確に記載されていない生化学及び化学の方法は、化学文献において報告され、また当業者に良く知られている。【００４４】実施例１．Ｓ２２３８−アガロース修飾基質の製造
トロンビン基質Ｓ２２３８（ダイアファーマ製、米国オハイオ州ウエストチェスター）をエポキシアガロース（シグマ製、カナダ国オンタリオ州ミシサーガ；反応性エポキシド官能性基中の１２原子のスペーサー末端を有するアガロースビーズマトリックス）と反応させＳ２２３８−アガロース（アガロースと１２原子のスペーサー基を介して架橋したＳ２２３８）を製造会社の指示に基づき製造した。１ビン中のダイアファーマ製の２５ｍｇのＳ２２３８及びその他の固体（ロット番号Ｎ０５４８８７０）を２ｍＬの水に溶解し、そして得られた溶液の１ｍＬを１ｇの乾燥エポキシ活性化アガロース（ビーズは、Ｓ２２３８と混合するに先立ち、膨張させそして洗浄した。）との共役に用いた。リン酸塩ｐＨ９．０を共役反応（反転により混合した反応溶液を２３℃において１６時間）に用いた。過剰のエポキシ基は１Ｍのトリス塩酸ｐＨ９．０を用いて４時間の反応によりブロックした。最終反応混合液からのビーズは、濃塩酸を用いてｐＨ４．０に滴定された０．１Ｍ酢酸ナトリウム（酢酸緩衝液）及び０．１Ｍ  Ｈ３ＢＯ３  ０．５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．０を用いて交互に洗浄した。Ｓ２２３８−アガロースビーズはその後、４℃において酢酸緩衝液中の５０％懸濁液として保存した。【００４５】実施例２．基質及び修飾基質の反応性の比較
トロンビン基質Ｓ２２３８及びＳ２２３８−アガロースの、遊離トロンビン及びトロンビンＡ２Ｍ複合体との反応性を測定した。【００４６】  ０．０５ＭのＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．５（ＨＢＳ）を調整した。トロンビン−Ａ２Ｍを、４０μＬの５ｍｇ  Ａ２Ｍ（シグマ製）／ｍＬ＋４０μＬの０．２ｍｇトロンビン（エンザイムリサーチラボラトリー製、米国インディアナ州サウスベント）／ｍＬ  ＨＢＳを用い２３℃において４０乃至６０分間反応させることにより調製した（溶液番号１）。４０μＬの５ｍｇ  Ａ２Ｍ／ｍＬ＋４０μＬ  ＨＢＳ（溶液番号２）及び４０μＬの０．２ｍｇのトロンビン／ｍＬ＋４０μＬ  ＨＢＳ（溶液番号３）を調製した。
Ｓ２２３８との以下の反応を９６穴のプレートウェルで実施した。
１．  ５μＬの溶液番号１を１０μＬの０．５ｍｇのアンチトロンビン（精製したアンチトロンビンＩＩＩタンパク、アフィニティバイオロジカルズ製、カナダ国オンタリオ州）／ｍＬ  ＨＢＳ溶液、１μＬの１００ユニット・ヘパリン（レオラボラトリーズ製、カナダ国オンタリオ州アジャックス）／ｍＬ  ＨＢＳ溶液及び７４μＬのＨＢＳ溶液へ添加した。１０分後、１０μＬ  ３．１９２ｍｇのＳ２２３８／ｍＬ  Ｈ２Ｏを混合しながら添加し、１００秒間にわたり１０秒毎に測定された４０５ｎｍにおける吸光度の数値及びこの時間帯に於ける吸光度の変化（△Ａ）を記録した。
２．  ５μＬの溶液番号２を１０μＬの０．５ｍｇのアンチトロンビン／ｍＬ  ＨＢＳ溶液、１μＬの１００ユニット・ヘパリン／ｍＬ  ＨＢＳ溶液及び７４μＬのＨＢＳ溶液へ添加した。１０分後、１０μＬの３．１９２ｍｇのＳ２２３８／ｍＬ  Ｈ２Ｏを混合しながら添加し、１００秒間にわたり１０秒毎に測定された４０５ｎｍにおける吸光度の数値及びこの時間帯に於ける吸光度の変化（△Ａ）を記録した。
３．  ５μＬの溶液番号３を１０μＬの０．５ｍｇのアンチトロンビン／ｍＬ  ＨＢＳ溶液、１μＬの１００ユニット・ヘパリン／ｍＬ  ＨＢＳ溶液及び７４μＬのＨＢＳ溶液へ添加した。１０分後、１０μＬの３．１９２ｍｇのＳ２２３８／ｍＬ  Ｈ２Ｏを混合しながら添加し、１００秒間にわたり１０秒毎に測定された４０５ｎｍにおける吸光度の数値及びこの時間帯に於ける吸光度の変化（△Ａ）を記録した。
４．  ５μＬの溶液番号１を８５μＬのＨＢＳ溶液へ添加した。１０分後、１０μＬの３．１９２ｍｇのＳ２２３８／ｍＬ  Ｈ２Ｏを混合しながら添加し、１００秒間にわたり１０秒毎に測定された４０５ｎｍにおける吸光度の数値及びこの時間帯に於ける吸光度の変化（△Ａ）を記録した。
５．  ５μＬの溶液番号２を８５μＬのＨＢＳ溶液へ添加した。１０分後、１０μＬの３．１９２ｍｇのＳ２２３８／ｍＬ  Ｈ２Ｏを混合しながら添加し、１００秒間にわたり１０秒毎に測定された４０５ｎｍにおける吸光度の数値及びこの時間帯に於ける吸光度の変化（△Ａ）を記録した。
６．  ５μＬの溶液番号３を８５μＬのＨＢＳ溶液へ添加した。１０分後、１０μＬの３．１９２ｍｇのＳ２２３８／ｍＬ  Ｈ２Ｏを混合しながら添加し、１００秒間にわたり１０秒毎に測定された４０５ｎｍにおける吸光度の数値及びこの時間帯に於ける吸光度の変化（△Ａ）を記録した。
Ｓ２２３８−アガロースビーズ（等容積の酢酸緩衝液に保存した）をよく混合しそして０．２５ｍＬの得られた均一分散液の別量をエッペンドルフチューブへ加えた。遠心分離、及び上澄を注意深く除去した後、それぞれのチューブ中のビーズを０．５ｍＬの０．０２Ｍトリス塩酸０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  ０．６％ポリエチレングリコール８０００  ｐＨ７．４（ＴＳＰ）と混合し、遠心分離しそして上澄を除去した。ビーズはＴＳＰと再び混合し、遠心分離しそして種々の物質と反応させるための準備のために、上澄を注意深く除去した。洗浄したＳ２２３８−アガロースビーズを用いた以下の反応を実施した。
１．  ３０μＬの溶液番号１を、エッペンドルフチューブ内で５７０μＬのＨＢＳ及び０．２５ｍＬの洗浄したビーズと混合して得られた溶液と混合した。２３℃において３分又は１０分の後に、チューブを１分間遠心分離し、そして上澄を速やかに（但し注意深く）エッペンドルフチューブへ移した。１００μＬの反応上澄を９６穴プレートのウェルへ移しそして４０５ｎｍにおける吸光度を測定（終点の読み）した。
２．  ３０μＬの溶液番号３を、エッペンドルフチューブ内で５７０μＬのＨＢＳ及び０．２５ｍＬの洗浄したビーズと混合して得られた溶液と混合した。２３℃において３分又は１０分の後に、チューブを１分間遠心分離し、そして上澄を速やかに（但し注意深く）エッペンドルフチューブへ移した。１００μＬの反応上澄を９６穴プレートのウェルへ移しそして４０５ｎｍにおける吸光度を測定（終点の読み）した。
３．  ３０μＬの溶液番号３を、エッペンドルフチューブ内で６０μＬの０．５ｍｇのアンチトロンビン／ｍＬ  ＨＢＳ、６μＬの１００ユニット・ヘパリン／ｍＬ  ＨＢＳ、５０４μＬのＨＢＳ及び０．２５ｍＬの洗浄したビーズと混合して得られた溶液と混合した。２３℃において３分又は１０分の後に、チューブを１分間遠心分離し、そして上澄を速やかに（但し注意深く）エッペンドルフチューブへ移した。１００μＬの反応上澄を９６穴プレートのウェルへ移しそして４０５ｎｍにおける吸光度を測定（終点の読み）した。
４．  ０．２５ｍＬのＨＢＳを、エッペンドルフチューブ内で、洗浄したビーズと混合した。２３℃において３分又は１０分の後に、チューブを１分間遠心分離し、そして上澄を速やかに（但し注意深く）エッペンドルフチューブへ移した。１００μＬの反応上澄を９６穴プレートのウェルへ移しそして４０５ｎｍにおける吸光度を測定（終点の読み）した。
反応の結果を下記表１及び２に示す。
表１．可溶化Ｓ２２３８との反応．
【表１】
2009521236.tif 000003
表２．Ｓ２２３８−アガロースとの反応．
【表２】
2009521236.tif 000004
上記の表１及び２に示されたデータは、Ｓ２２３８は容易に遊離トロンビン又はトロンビン−Ａ２Ｍのどちらかと反応する一方で、Ｓ２２３８−アガロースビーズは有意に遊離トロンビンと反応するがしかしトロンビン−Ａ２Ｍとは反応しなかったことを示す。【００４７】実施例３．反応性の更なる比較
トロンビン及びトロンビン−Ａ２ＭをＳ２２３８及びＳ２２３８−アガロースの検体へ添加した。吸光度の変化を検出しそしてその結果を下記表３に示す。
【表３】
2009521236.tif 000005
【００４８】  結果は、修飾基質Ｓ２２３８−アガロースは遊離トロンビンと強く反応したが、しかし結合トロンビンとは反応しなかったことを示している。【００４９】実施例４．ＣＮＢｒ−活性化セファロースとのＳ２２３８の反応により固定化されたＳ２２３８とトロンビンの反応．
基質及び障害している高分子表面の間のスペーサー中の原子の最小数の必要条件を確認するために、トロンビンの反応を、小さなＣＮＢｒ活性化基によりセファロースビーズと結合したＳ２２３８を用いて試験した。【００５０】Ｓ２２３８−セファロースの製造
２５ｍｇのＳ２２３８（クロモジェニックス製、ロット番号５２６８７３）を含む未懸濁（乾燥）粉末のボトルを、２ｍＬの水に懸濁させた。１ｍＬの懸濁液を除去し、そして０．７５ｍＬの１．７５ｍＬの０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ３  １Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ  ８．０とともに５０ｍＬのキャップ付きの遠心分離用試験管へ移した。
１ｇのＣＮＢｒ−活性化セファロース（アマシャムバイオサイエンス製、ロット番号２９９５９４）を、１０ｍＬの０．００１Ｍ  ＨＣｌ中へ懸濁させ（膨張させ）、そしてその後焼結したガラスフィルター上で２００ｍＬの０．００１Ｍ  ＨＣｌで洗浄した。洗浄したＣＮＢｒ−活性化セファロースをＳ２２３８溶液と一緒に試験管へ移し、そして２３℃において２時間揺動プレート上でインキュベートし、次いで４℃において１８時間揺動プレート上でインキュベートした。反応後、反応溶液中のビーズを、焼結したガラスフィルター上で１００ｍＬの０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３  ０．５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．０を用いて洗浄した。洗浄したビーズを１５ｍＬの０．１Ｍトリス塩酸ｐＨ８．０を含む５０ｍＬのキャップ付きの遠心分離試験管へ移し、そして２３℃において２時間揺動プレート上でインキュベートした。ビーズはその後焼結したグラスフィルター上で１０ｍＬの０．１Ｍトリス塩酸  ０．５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．０を用いて洗浄し、次いで２０ｍＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム０．５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ４．０を用いて洗浄した。このトリス塩酸／ＮａＣｌ及び酢酸ナトリウム／ＮａＣｌを用いた後者の洗浄をさらに５回繰り返した。最後に、等容量（押し固められたビーズの）の０．１Ｍ酢酸ナトリウム  ０．５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ４．０を加えたビーズをキャップ付きのプラスチック試験管に４℃において保存した。この保存したビーズのストックをＳ２２３８−セファロースとした。等容量の４Ｍ  ＮａＯＨを用いたＳ２２３８−セファロースビーズ懸濁液の少量の副検体の混合物は、液相中で強い黄色の着色（４０５ｎｍにおける吸収）を与え、セファロースビーズへの無傷のＳ２２３８基質の付着を確認した。【００５１】トロンビンの反応
０．５ｍＬの再懸濁化させたＳ２２３８−セファロースビーズをそれぞれの２マイクロフュージ試験管（１．５ｍＬ容量）へ移し、次いで１２０００ｇにおいて１分間遠心分離しそして生じた上澄を除去した。それぞれの試験管中のビーズを０．５ｍＬの０．０２Ｍトリス塩酸  ０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  ０．６％  ポリエチレングリコール８０００  ｐＨ７．４（ＴＳＰ）中に懸濁させ、１分間遠心分離しそして得られた上澄を捨てた。１００ｎＭのヒトαトロンビン（エンザイムリサーチラボラトリーズ製）のＴＳＰ溶液を調製した。０．５ｍＬのトロンビンを押し固められたＳ２２３８−セファロースビーズの１つの試験管に添加し（試験管１）、そして、０．５ｍＬのＴＳＰを他方のＳ２２３８−セファロースビーズの試験管へ添加した（試験管２）。別の空の試験管へ、０．０５ｍＬの遊離（ビーズと結合していない）Ｓ２２３８原液（１２．５ｍｇのＳ２２３８／ｍＬの水溶液）、０．１５ｍＬのＴＳＰ及び０．５ｍＬの１００ｎＭトロンビンを加えた（試験管３）。最後に、別の空の試験管へ、０．０５ｍＬの遊離Ｓ２２３８原液及び０．６５ｍＬのＴＳＰを添加した（試験管４）。全ての試験管はキャップをしてそして試験管及び内容物を、手で持ち反転することにより２３℃において１０分間緩やかに振った。次いで転倒混合し、試験管を１２０００ｇにおいて１分間遠心分離しそして０．２ｍＬのそれぞれの試験管からの上澄液を速やかに９６穴マイクロタイタープレートの個々のウェルに移し、４０５ｎｍにおける吸収を測定した。
結果：
異なるインキュベーション混合物からの吸光度の数値は以下の通りであった。
【表４】
2009521236.tif 000006
【００５２】  これらのデータはＣＮＢｒ活性基（即ち、−ＮＨ−（Ｃ＝ＮＨ）−Ｏ−結合）を介して高分子ビーズに付着したＳ２２３８は、それ自身トロンビンとは反応を可能としないことを明らかに示したものである。このように、比較的小さな原子数を含むスペーサーによる基質及び高分子表面の結合は、基質と反応する遊離酵素についてでさえも立体障害の解消を十分に可能とするものではない。【００５３】実施例５．遊離Ｓ２２３８又はＳ２２３８−アガロースのどちらかにより測定された血漿トロンビン生成．
血漿を取りそしてフィブリノーゲンをアンクロド酵素を用いた反応によりフィブリン血栓を形成して、それを絡み付かせて除去し、脱繊維素血漿を得た。反応開始時間において組織因子（トロンボレルＳ）、ＣａＣｌ２を添加し、予め保温した脱繊維素血漿中のトロンビン生成を開始させた。一定の時間点において、反応混合液から副検体をＮａ２ＥＤＴＡへとり更なるトロンビン生成をＣａ２＋のキレート化により停止させた。時間点における検体中のトロンビン活性（遊離トロンビン及びα−２−マクログロブリン（Ａ２Ｍ）へ結合するトロンビンをここで、緩衝液中に懸濁させた遊離Ｓ２２３８基質又は立体障害されたＳ２２３８基質（Ｓ２２３８アガロースビーズ）のどちらかを混合することにより検出した。トロンビン−Ａ２Ｍを検出するための遊離Ｓ２２３８又はＳ２２３８−アガロースの能力を決定するために、全ての遊離トロンビンが基質のインキュベーションに先立ちアンチトロンビン及びヘパリンと混合することにより阻害されることを除いて、上記方法と同様の実験を行った。血漿トロンビン生成の時間経過の間、プロトロンビンは最初にトロンビンへ変換されそしてその後遊離トロンビンが血漿アンチトロンビン（遊離Ｓ２３３８に対し発色活性のない）又はＡ２Ｍ（小さな発色のＳ２２３８基質に対し活性を有するＡ２Ｍと結合しているトロンビン）のどちらかにより、徐々に阻害される。このように、初期の時間点の検体（即ち、６０秒）は、トロンビン−Ａ２Ｍよりもより多くの遊離トロンビンを含むであろうが、一方、後期の時間点の検体（即ち３００秒）は、遊離トロンビンよりもより多くのトロンビン−Ａ２Ｍを含むであろう。【００５４】血漿中の総トロンビン（遊離トロンビン及びトロンビン−Ａ２Ｍ）生成の測定
１２ｍｍ（内径）ｘ７５ｍｍ（長）のポリカーボネートプラスチック試験管を血漿トロンビン生成に用いた。
１．  血漿の脱繊維素：
ａ．  ８００μＬの血漿を１０μＬの３０Ｕ／ｍＬのアンクロド原液を用い３７℃において１０分間インキュベートした。
ｂ．  インキュベーションの後、形成したフィブリン血栓をプラスチック棒上に巻き取り、上澄の脱繊維素血漿を残した。
ｃ．  試験管を氷中に１０分間置いた。
ｄ．  １０分のインキュベーションの後、如何なる更なる血栓も巻き取られなかった。
ｅ．  脱繊維素血漿を氷中に保存した。
２．  活性剤溶液（１２．５μＬのトロンボレルＳ及び４．０μＬ  １Ｍ  ＣａＣｌ２及び１８３．５μＬ  ＨＢＳ）を試験管中で３７℃に温めた。別個の試験管中へ１５０μＬの脱繊維素血漿を３７℃に温めた。
３．  ｔ＝０において、１５０μＬの活性剤溶液を、３７℃において１５０μＬの脱繊維素血漿と混合した。
４．  ｔ＝６０及びｔ＝３００秒の両方において、２５μＬの反応混合物を除去しそして速やかに氷上において４７５μＬの０．００５Ｍ  Ｎａ２ＥＤＴＡを添加した。
５．  いったん全ての時間点で、ＥＤＴＡを用いて中和した後、５０μＬのそれぞれのＥＤＴＡ／時間検体を１３５μＬのＨＢＳ（ビーズ懸濁液中の最終Ｓ２２３８濃度が０．３５ｎＭの、約７５μＬの押し固められたビーズ）へ懸濁させたビーズとマイクロフュージチューブ中で３７℃において混合した。時間検体の別量及びビーズ懸濁液を続いてのインキュベーションの間中反転により混合した。
６．  別個の試験管内に、５０μＬのＥＤＴＡ／時間検体を、１１０μＬの０．０００１６Ｍ  Ｓ−２２３８のＨＢＳ溶液へ３７℃において添加した。
７．  遊離Ｓ２２３８基質又はＳ２２３８−アガロースビーズのどちらかとのインキュベーションを１０分行った後、４０μＬの５０％酢酸をそれぞれの試験管へ添加し、基質の加水分解を停止させた。
８．  酢酸で中和したビーズ懸濁液を含むマイクロフュージ試験管を、１分間マイクロ遠心分離した。
９．  それぞれの検体の上澄の２００μＬの別量を９６穴プレートのウェルへ移しそして４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。【００５５】血漿中のトロンビン−Ａ２Ｍ生成の測定
工程４において、２５μＬの時間検体を、５μＬの５０ユニット・アンチトロンビン／ｍＬ  ＰＢＳ（７．２ｍｇアンチトロンビン／ｍＬ）及び２μＬの１００ユニット・ヘパリン／ｍＬ  ０．１５Ｍ  ＮａＣｌへ氷上で添加した以外は、上記に記載の実験を繰り返した。１分後、４６８μＬの０．００５Ｍ  Ｎａ２ＥＤＴＡを添加しそして前記のように手順を続けた。４０５ｎｍにおいて検出された吸光度は基本的にトロンビン−Ａ２Ｍ単独（遊離トロンビンはアンチトロンビン及びヘパリンにより中和されている）との基質反応に依存する。【００５６】  時間検体中の遊離トロンビンによる基質の切断に起因する吸光度は、最初の実験（この時間検体は、アンチトロンビン及びヘパリンにより中和されずそして遊離トロンビン及びトロンビン−Ａ２Ｍの両方を含む）における吸光度からトロンビンＡ２Ｍに起因する吸光度を差し引くことにより測定し得る。【００５７】  図５に示すデータは、生成した遊離トロンビン及びＡ２Ｍと複合体を形成したトロンビンを含む血漿検体において、有意な活性が、血漿活性化後６０秒で、可溶化（遊離）Ｓ２２３８及びＳ２２３８−アガロースビーズの両方で検出されたことを図示する。血漿活性化後３００秒において、有意なトロンビン基質活性が可溶化Ｓ２２３８で測定されたが、しかしＳ２２３８−アガロースビーズは比較的減少した量のトロンビン活性を与えた（４０５ｎｍにおける吸光度）。しかし、生成したトロンビン−Ａ２Ｍ複合体、しかし遊離トロンビンは生成しない、が残っている（遊離トロンビンはアンチトロンビン及びヘパリンにより中和されている）血漿検体において、有意なトロンビン活性は可溶化Ｓ２２３８（特に３００秒の時間点における）により検出された一方、ベースラインのバックグラウンド吸光度のみが立体障害されたＳ２２３８−アガロースビーズにより測定された。生成した遊離トロンビン及びトロンビン−Ａ２Ｍを含む血漿検体の、トロンビン−Ａ２Ｍのみ含むものとの比較は、カルシウム及び組織因子の添加後３００秒において、大部分の可溶化Ｓ２２３８活性はトロンビン−Ａ２Ｍに起因していることが示された。Ｓ２２３８−アガロースビーズの場合においては、遊離トロンビンのみが６０秒又は３００秒のどちらかの時間点において検出された。【００５８】  全ての引用文献はここに参照として取り込まれる。【００５９】  本発明は１つ又はそれ以上の実施態様に関して記載された。しかしながら請求項に記載された請求の範囲から逸脱することなく、数々の変法及び変更が可能なことは当業者には明白であろう。【００６０】参考文献
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【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は、従来技術のアッセイの概略図を示すものである。
【図２】図２は、本発明の実施態様に従っている修飾基質がどのように結合し得るかを示す図である。
【図３】図３は、スペーサーの長さがどのように結合に影響し得るかを示す図である。
【図４】図４は、本発明の１つの特徴のアッセイを示す図である。
【図５】図５は、トロンビン生成アッセイからの結果を示す図である。
【図１】
2009521236.tif 000007
【図２】
2009521236.tif 000008
【図３】
2009521236.tif 000009
【図４】
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【図５】
2009521236.tif 000011
【国際調査報告】
2009521236.tif 000012
2009521236.tif 000013