(57)【要約】  免疫グロブリン定常領域の１つ以上の、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの少なくともいずれかを備える結合タンパク質であって、当該１つ以上の、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインのいずれかは、１つ以上のアミノ酸の挿入及び除去の少なくともいずれかがなされ、それによって当該結合タンパク質は少なくとも、１つ以上の対応受容体（たとえばＦｃ受容体）に対して変化した結合親和性及び特異性の少なくともいずれかを示すか、又は改造されていない結合タンパク質には存在しない新たな結合特異性（例えば、改造されていない結合タンパク質が結合する対応受容体の分類とは異なる別の分類の受容体）を当該ヒンジ領域及び定常領域の少なくともいずれかに与える。本発明による結合タンパク質は、例えば、改造された抗体、抗体断片、遺伝子組み換えタンパク質、及び小モジュラー免疫薬製品（ＳＭＩＰ）を含む分子的に設計された結合ドメイン−免疫グロブリン・フュージョンタンパク質を含む。【選択図】  図２【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリン定常領域の、１つ以上のヒンジドメイン、１つ以上のＣＨ２ドメイン及び１つ以上のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかを備える結合タンパク質であって、
前記１つ以上のヒンジドメイン、１つ以上のＣＨ２ドメイン及び１つ以上のＣＨ３ドメインのいずれかは、１つ以上のアミノ酸の挿入及び除去の少なくともいずれかがなされ、
前記結合タンパク質は１つ以上の対応Ｆｃ受容体に対して変化した結合親和性を示すことを特徴とする結合タンパク質。
【請求項２】
前記結合タンパク質は、抗体、抗体断片及び小モジュラー免疫薬製品（ＳＭＩＰ）の１つであることを特徴とする請求項１に記載の結合タンパク質。
【請求項３】
前記結合タンパク質は、ＩｇＧ免疫グロブリン重鎖の改造された１つ以上のヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの少なくともいずれかを備え、
前記ＩｇＧ免疫グロブリン重鎖の、１つ以上のヒンジドメイン、１つ以上のＣＨ２ドメイン及び１つ以上のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかは、１つ以上のアミノ酸の挿入及び１つ以上のアミノ酸の除去の少なくともいずれかによって改造され、
前記改造された結合タンパク質は、ＩｇＧ免疫グロブリン重鎖の改造されていない、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの少なくともいずれかを備える対応する結合タンパク質に比べて、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の群から選択された１つのＦｃ受容体に対して高い親和性で結合することを特徴とする請求項１に記載の結合タンパク質。
【請求項４】
前記改造されたＩｇＧドメインは、改造されたＩｇＧ１のＣＨ２ドメイン、改造されたＩｇＧ２のＣＨ２ドメイン、改造されたＩｇＧ３のＣＨ２ドメイン及び改造されたＩｇＧ４のＣＨ２ドメインの少なくともいずれかであることを特徴とする請求項３に記載の結合タンパク質。
【請求項５】
前記改造されたＩｇＧは、改造されたＩｇＧ１のＣＨ２ドメイン及び改造されたＩｇＧ３のＣＨ２ドメインの少なくともいずれかであり、
前記改造されたＩｇＧ１のＣＨ２ドメイン及び改造されたＩｇＧ３のＣＨ２ドメインの少なくともいずれかは、ヒンジドメインの近位ループ構造であるＬ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｐ内に１つ以上のアミノ酸の除去及び１つ以上のアミノ酸の挿入の少なくともいずれかがなされていることを特徴とする請求項４に記載の結合タンパク質。
【請求項６】
前記結合タンパク質は、前記ヒンジの近位ループ構造であるＬ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｐ内に１つ以上のアミノ酸の挿入が１つ以上されていることを特徴とする請求項５に記載の結合タンパク質。
【請求項７】
前記ヒンジの近位ループ構造は、少なくとも１〜２０のアミノ酸の挿入を示す“＊”の位置に１つ以上のアミノ酸が挿入されて、その結果、前記ヒンジの近位ループ構造はＬ−Ｌ−＊−Ｇ−Ｇ−Ｐ、Ｌ−Ｌ−Ｇ−＊−Ｇ−Ｐ、及びＬ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−＊−Ｐの群から選択された配列を備えることを特徴とする請求項６に記載の結合タンパク質。
【請求項８】
前記“＊”はＡｌａ，Ｇｌｙ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ及びＶａｌからなる群から選択された１つ以上のアミノ酸を備えることを特徴とする請求項７に記載の結合タンパク質。
【請求項９】
前記改造されたＩｇＧドメインは、改造されたＩｇＧ１のＣＨ２ドメイン、改造されたＩｇＧ２のＣＨ２ドメイン及び改造されたＩｇＧ３のＣＨ２ドメインの少なくともいずれかであり、
前記改造されたＩｇＧ１のＣＨ２ドメイン、改造されたＩｇＧ２のＣＨ２ドメイン及び改造されたＩｇＧ３のＣＨ２ドメインの少なくともいずれかは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ３のＣＨ２ドメインの少なくともいずれかのＢＣループ構造であるＤ−Ｖ−Ｓ−Ｈ−Ｅ内からの１つ以上のアミノ酸の除去、及び、前記Ｄ−Ｖ−Ｓ−Ｈ−Ｅ内への１つ以上のアミノ酸の挿入がなされていることを特徴とする請求項４に記載の結合タンパク質。
【請求項１０】
前記結合タンパク質は、ＢＣループ構造であるＤ−Ｖ−Ｓ−Ｈ−Ｅ内に１つ以上のアミノ酸の挿入が１つ以上されていることを特徴とする請求項９に記載の結合タンパク質。
【請求項１１】
前記ＢＣループ構造は、少なくとも１〜２０のアミノ酸の挿入を示す“＊”の位置に１つ以上のアミノ酸が挿入されており、その結果、Ｄ−Ｖ−＊−Ｓ−Ｈ−Ｅ及びＤ−Ｖ−Ｓ−＊−Ｈ−Ｅからなる群から選択された配列を備えることを特徴とする請求項１０に記載の結合タンパク質。
【請求項１２】
前記“＊”はＡｌａ，Ｇｌｙ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ及びＶａｌからなる群から選択された１つ以上のアミノ酸を備えることを特徴とする請求項１１に記載の結合タンパク質。
【請求項１３】
前記改造されたＩｇＧドメインは、改造されたＩｇＧ１ＣＨ２ドメイン及び改造されたＩｇＧ３ＣＨ２ドメインの少なくともいずれかであり、
前記改造されたＩｇＧ１ＣＨ２ドメイン及び改造されたＩｇＧ３ＣＨ２ドメインの少なくともいずれかは、ＦＧループ構造であるＡ−Ｌ−Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｉ内からの１つ以上のアミノ酸の除去及び前記Ａ−Ｌ−Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｉ内への１つ以上のアミノ酸の挿入がなされていることを特徴とする請求項４に記載の結合タンパク質。
【請求項１４】
前記結合タンパク質は、前記ＦＧループ構造であるＡ−Ｌ−Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｉ内に１つ以上のアミノ酸の挿入が１つ以上されていることを特徴とする請求項１３に記載の結合タンパク質。
【請求項１５】
前記ＦＣループ構造は少なくとも１〜２０のアミノ酸の挿入を示す“＊”の位置に１つ以上のアミノ酸が挿入され、その結果、前記ＦＣループ構造はＡ−Ｌ−＊−Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｉ，Ａ−Ｌ−Ｐ−＊−Ａ−Ｐ−Ｉ及びＡ−Ｌ−Ｐ−Ａ−＊−Ｐ−Ｉからなる群から選択された１つの配列を備えることを特徴とする請求項１４に記載の結合タンパク質。
【請求項１６】
前記“＊”はＡｌａ，Ｇｌｙ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ及びＶａｌからなる群から選択された１つ以上のアミノ酸を備えることを特徴とする請求項１５に記載の結合タンパク質。
【請求項１７】
前記結合タンパク質は、ＩｇＧ重鎖の改造された、１つ以上のヒンジドメイン、１つ以上のＣＨ２ドメイン及び１つ以上のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかを備え、
前記ＩｇＧ重鎖の改造された、１つ以上のヒンジドメイン、１つ以上のＣＨ２ドメイン及び１つ以上のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかは、天然のグリコシル化配列の、１つ以上の近位及び遠位の少なくともいずれかに、１つ以上のＮ−結合型グリコシル化配列を挿入することで改造され、前記グリコシル化配列は挿入位置でＮ−結合型グリコシル化を行うのに十分であり、
前記改造された結合タンパク質は、改造されていないＩｇＧ免疫グロブリン重鎖の、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの少なくともいずれかを備える対応する結合タンパク質に比べ、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）からなる群から選択された１つのＦｃ受容体に対してより高い親和性で結合することを特徴とする請求項１に記載の結合タンパク質。
【請求項１８】
前記ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの少なくともいずれかは、Ｎ−結合型グリコシル配列であるＮ−Ｘ−（Ｓ／Ｔ）が１つ以上挿入された、ＩｇＧ１のヒンジドメイン、ＩｇＧ１のＣＨ２ドメイン及びＩｇＧ１のＣＨ３ドメイン、Ｎ−結合型グリコシル配列であるＮ−Ｘ−（Ｓ／Ｔ）が１つ以上挿入された、ＩｇＧ２のヒンジドメイン、ＩｇＧ２のＣＨ２ドメイン及びＩｇＧ２のＣＨ３ドメイン、Ｎ−結合型グリコシル配列であるＮ−Ｘ−（Ｓ／Ｔ）が１つ以上挿入された、ＩｇＧ３のヒンジドメイン、ＩｇＧ３のＣＨ２ドメイン及びＩｇＧ３のＣＨ３ドメイン、Ｎ−結合型グリコシル配列であるＮ−Ｘ−（Ｓ／Ｔ）が１つ以上挿入された、ＩｇＧ４のヒンジドメイン、ＩｇＧ４のＣＨ２ドメイン及びＩｇＧ４のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかであり、
Ｘは対応する天然ＩｇＧ免疫グロブリンのヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの少なくともいずれかのＮ−結合型グリコシル化部位から近位、及び、前記Ｎ−結合型グリコシル化部位から遠位の少なくともいずれかからのいかなるアミノ酸であることを特徴とする請求項１７に記載の結合タンパク質。
【請求項１９】
前記結合タンパク質は、ＩｇＧのＣＨ２ドメインを備え、
前記ＣＨ２ドメインは、前記ＩｇＧのＣＨ２ドメインにＤＥループ内にある天然のＮ−Ｓ−Ｔ配列に対して、隣接した位置、アミノ末端方向のアミノ酸１００個以下の位置、及びカルボキシ末端方向のアミノ酸１００個以下の位置の少なくともいずれかに、１つ以上のＮ−Ｘ−（Ｓ／Ｔ）が挿入されていることを特徴とする請求項１８に記載の結合タンパク質。
【請求項２０】
前記ＩｇＧのＣＨ２ドメインは天然のＮ−Ｓ−Ｔ配列に対して、隣接した位置、アミノ末端方向のアミノ酸１００個以下の位置、及びカルボキシ末端方向のアミノ酸１００個以下の位置の少なくともいずれかに、前記挿入されたＮ−Ｓ−Ｔのアミノ酸配列を備え、その結果、前記天然の配列であるＸ−Ｎ−Ｓ−Ｔ−Ｚは、（ＡＡａ）−Ｎ−Ｓ−Ｔ（ＡＡｂ）−Ｎ−Ｓ−Ｔ−（ＡＡｃ）に改造されており、
ＡＡａ、ＡＡｂ及びＡＡｃは、夫々独立して１〜１００のアミノ酸を指すことを特徴とする請求項１９に記載の結合タンパク質。
【請求項２１】
前記ＩｇＧのＣＨ２ドメインは、改造され、前記天然のＮ−Ｓ−Ｔ配列から１つのアミノ酸以内の位置にＮ−Ｓ−Ｔのアミノ酸配列が挿入されており、その結果、前記天然のアミノ酸配列であるＸ−Ｎ−Ｓ−Ｔ−Ｚは、Ｘ−Ｎ−Ｓ−Ｔ−Ｚ−Ｎ−Ｓ−Ｔ−Ｚに改造され、
ＸとＺは、夫々独立してＴｙｒ（Ｙ）又はＰｈｅ（Ｆ）から選択されることを特徴とする請求項２０に記載の結合タンパク質。
【請求項２２】
前記Ｎ−結合型グリコシル化配列は,１つ以上のＩｇＧ１、１つ以上のＩｇＧ２、１つ以上のＩｇＧ３及び１つ以上のＩｇＧ４の少なくともいずれかのＣＨ２にあるＮ−結合型グリコシル部位より遠位に位置する、前記1つ以上のＩｇＧ１、１つ以上のＩｇＧ２、１つ以上のＩｇＧ３及び１つ以上のＩｇＧ４の少なくともいずれかのＣＨ３ドメインの前記ＢＣループ構造に挿入され、その結果、前記天然アミノ酸配列Ｙ−Ｐ−Ｓ−Ｄ−Ｉ−Ａは、Ｙ−Ｐ−Ｎ−Ｓ−Ｔ−Ｄ−Ｉ−Ａ又はＹ−Ｎ−Ｓ−Ｔ−Ｐ−Ｓ−Ｄ−Ｉ−Ａに改造されることを特徴とする請求項１８に記載の結合タンパク質。
【請求項２３】
前記結合タンパク質は、ＩｇＡ、ＩｇＤ，ＩｇＥ，ＩｇＧ及びＩｇＭの中から選択された第１の免疫グロブリン分類の重鎖の１つ以上のドメイン、１つ以上のＣＨ２ドメイン及び１つ以上のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかを備え、
前記結合タンパク質は、第１の免疫グロブリン分類の重鎖の前記１つ以上のドメイン、１つ以上のＣＨ２ドメイン及び１つ以上のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかの一次アミノ酸配列に施された、アミノ酸の置き換え及びアミノ酸の挿入の少なくともいずれかによって改造され、前記第１の免疫グロブリン分類とは異なる第２の免疫グロブリン分類の１つ以上のＦｃ受容体に結合できる結合タンパク質を生成することを特徴とする請求項３に記載の結合タンパク質。
【請求項２４】
前記第１の免疫グロブリン分類はＩｇＧであり、
前記第２の免疫グロブリン分類はＩｇＡであることを特徴とする請求項２３に記載の結合タンパク質。
【請求項２５】
前記結合タンパク質は（ａ）ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）からなる群から選択された１つのＦｃ受容体と、（ｂ）ＦｃαＲ（ＣＤ８９）とに特異的に結合できることを特徴とする請求項２４に記載の結合タンパク質。
【請求項２６】
前記結合タンパク質は、前記ＩｇＧのＣＨ３にあるＦＧループ内への１つ以上のアミノ酸の置き換え、及び、前記ＩｇＧのＣＨ３にあるＣＤループ内での１つ以上のアミノ酸の置き換えの少なくともいずれかを備えることを特徴とする請求項２５に記載の結合タンパク質。
【請求項２７】
前記結合タンパク質は、前記Ｃ−Ｓ−Ｖ−Ｍ−Ｈ−Ｅ−Ａ−Ｌ−Ｈ−Ｎ−Ｈ−Ｙ−Ｔ−Ｑのアミノ酸配列又はその一部を備える前記ＩｇＧのＣＨ３にあるＦＧループを、前記Ｃ−Ｍ−Ｖ−Ｇ−Ｈ−Ｅ−Ａ−Ｌ−Ｐ−Ｌ−Ａ−Ｆ−Ｔ−Ｑのアミノ酸配列又は対応する一部を備える前記ＩｇＡのＣＨ３にあるＦＧループで置き換えたことを特徴とする請求項２６に記載の結合タンパク質。
【請求項２８】
前記結合タンパク質は、前記Ｑ−Ｐ−Ｅ−Ｎのアミノ酸配列又はその一部を備える前記ＩｇＧのＣＨ３にあるＣＤループを、前記Ｑ−Ｅ−Ｌ−Ｐ−Ｒ−Ｅのアミノ酸配列又はその一部を備える前記ＩｇＡのＣＨ３にあるＣＤループで置き換えたことを特徴とする請求項２７に記載の結合タンパク質。
【請求項２９】
前記結合タンパク質は、前記Ｃ−Ｓ−Ｖ−Ｍ−Ｈ−Ｅ−Ａ−Ｌ−Ｈ−Ｎ−Ｈ−Ｙ−Ｔ−Ｑのアミノ酸配列又はその一部を備える前記ＩｇＧのＣＨ３にあるＦＧループを、前記Ｃ−Ｍ−Ｖ−Ｇ−Ｈ−Ｅ−Ａ−Ｌ−Ｐ−Ｌ−Ａ−Ｆ−Ｔ−Ｑのアミノ酸配列又は対応する一部を備える前記ＩｇＡのＣＨ３にあるＦＧループで置き換え、かつ、前記Ｑ−Ｐ−Ｅ−Ｎのアミノ酸配列又はその一部を備える前記ＩｇＧのＣＨ３にあるＣＤループを、前記Ｑ−Ｅ−Ｌ−Ｐ−Ｒ−Ｅのアミノ酸配列又はその一部を備える前記ＩｇＡのＣＨ３にあるＣＤループで置き換えたことを特徴とする請求項２８に記載の結合タンパク質。
【請求項３０】
Ｋ−Ｄ−Ｔ−Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｓ−Ｒ−Ｔのアミノ酸配列にあるＩｇＧ重鎖のＣＨ３アミノ酸配列の第２８個目のアミノ酸であるＭｅｔをアミノ酸Ｌｅｕに置き換え、その結果、前記結合タンパク質が前記Ｋ−Ｄ−Ｔ−Ｌ−Ｌ−Ｉ−Ｓ−Ｒ−Ｔのアミノ酸配列を更に備えることを特徴とする請求項２７乃至請求項２９のいずれかの１項に記載の結合タンパク質。
【請求項３１】
前記Ｄ−Ｉ−Ａ−Ｖ−Ｅ−Ｗ−Ｅ−Ｓ−Ｎのアミノ酸配列にある前記ＩｇＧ重鎖のＣＨ３アミノ酸配列の第１５７個目のアミノ酸であるＧｌｕをアミノ酸Ａｒｇに置き換え、その結果、前記結合タンパク質が前記Ｄ−Ｉ−Ａ−Ｖ−Ｒ−Ｗ−Ｅ−Ｓ−Ｎのアミノ酸配列を更に備えることを特徴とする請求項２７乃至請求項２９のいずれかの１項に記載の結合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学、タンパク質化学、及び分子生物学に関するものである。具体的に、本発明は、免疫グロブリンの、１つ以上のヒンジドメイン、１つ以上のＣＨ２ドメイン及び１つ以上のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかを備えた結合タンパク質であり、当該１つ以上のヒンジドメイン、１つ以上のＣＨ２ドメイン及び１つ以上のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかには、当該タンパク質の対応（ｃｏｇｎａｔｅ）受容体（例：ＦＣ受容体）に対する結合親和性及びは結合特異性の少なくともいずれかを変化させる改造、及び改造されていない結合タンパク質には存在しない１つ以上の新たな結合特異性（例：改造されていないタンパク質が結合する対応受容体とは異なる親和性）の少なくともいずれかを当該ヒンジ及びＣＨ領域の少なくともいずれかに与える改造が施されている。本発明による結合タンパク質は、例えば、改造された抗体、抗体の断片、組み換え結合タンパク質、及び小モジュラー免疫薬製品（ｓｍａｌｌ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ：ＳＭＩＰ（登録商標））を含む分子工学的に設計された結合領域と免疫グロブリンの融合タンパク質を含む。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリンは、鎖間ジスルフィド結合によって１つの高分子の複合体に結ばれる一致する二つのの軽鎖ポリペプチドと、一致する二つの重鎖ペプチドで構成される多量体タンパク質である。鎖内ジスルフィド結合は、１つのポリペプチドの異なる領域を結ぶことによってループを形成し、隣接したアミノ酸と共に免疫グロブリン領域を構成する。
【０００３】
各軽鎖と重鎖は、アミノ末端において、抗体ごとにアミノ酸配合が著しく異なる可変領域を持つ。軽鎖の可変領域（ＶＬ）は重鎖の可変領域（ＶＨ）と共に、免疫グロブリンの抗原結合部位（ＦＶ）を形成する。軽鎖は１つの定常領域（ＣＨ１）を持ち、重鎖は複数の定常領域を持つ。ＩｇＧ、ＩｇＡ，及びＩｇＤの分類は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３と指名された三つの重鎖定常領域を持つ。ＩｇＧとＩｇＥの分類はＣＨ１，ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４の四つの重鎖定常領域を持つ。免疫グロブリンの構造と機能は非特許文献１及び非特許文献２にレビューされている。
【０００４】
免疫グロブリンの重鎖は、Ｆｄ領域、ヒンジ領域、及びＦｃ（Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ）領域の三つの機能領域に分けることができる。Ｆｄ領域はＶＨとＣＨ１領域を含み、軽鎖と共にＦａｂと呼ばれる抗原結合断片を形成する。Ｆｃ断片は、例えば補体結合及びエフェクター細胞に存在する対応Ｆｃ受容体への結合を含む免疫グロブリン・エフェクター機能に関与する。ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＤ分類の免疫グロブリンに見られるヒンジ領域は、Ｆａｂ部位をＦｃ領域に対して自由に動かせる柔軟なスペーサの役割を持つ。定常領域に比べ、ヒンジ領域は構造的に多様であり、免疫グロブリンの分類観及び下位分類間で異なる配列及び長さのヒンジが存在する。
【０００５】
結晶を用いる研究によると、免疫グロブリンのヒンジ領域は更に上部、中部、そして下部の３つの領域に分割することができる（非特許文献３）。ヒンジの上部はＣＨ１のカルボキシ末端側のアミノ酸から、ヒンジの動きを制限する通常２つの重鎖間のジスルフィド結合を形成するシステイン残基までを含む。ヒンジの上部の長さは抗体の部分的な柔軟性と直接相関している。ヒンジの中部領域は重鎖間のジスルフィド架橋を含む。ヒンジの下部領域は、アミノ末端側と、ＣＨ２領域に含まれるアミノ酸とを結ぶ（同文献）。
【０００６】
ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域の中部はＣｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓの配列を含み、この配列はジスルフィド結合による二重化の際、旋回軸としての役割を持つと思われるシクリック・オクタペプチド（ｃｙｃｌｉｃ  ｏｃｔａｐｅｐｔｉｄｅ）になり、柔軟性を与える。免疫グロブリン・ヒンジ領域のポリペプチド配列の構造とその柔軟性によって可能になる構造変化は、抗体のＦｃ部位のエフェクター機能に影響を与え得る。
【０００７】
Ｆｃ領域と関連付けられたエフェクター機能の３つの一般的な分類は１）典型的な補体カスケードの活性化、２）エフェクター細胞との相互作用、そして３）免疫グロブリンの区分化、を含む。ヒトＩｇＧの様々な下位分類は、それらと共に固定補体を行うものとの相対的な有効性、または補体カスケードのステップの活性化及び増幅の相対的な有効性において異なる（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、及び非特許文献８などを参照）。補体依存性細胞毒性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，ＣＤＣ）は、腫瘍細胞などの標的細胞の除外（ｃｌｅａｒａｎｃｅ）において重要なメカニズムであると考えられる。通常は、ＩｇＧ１とＩｇＧ３が最も有効に固定補体し、次にＩｇＧ２が有効であり、ＩｇＧ４は活性補体を起こさない。補体活性は、カスケードの第一のコンポーネント、Ｃ１のサブユニットであるＣ１ｑが、抗体抗原の複合体に結合することによって開始される。
【０００８】
Ｃ１ｑの結合部位は抗体のＣＨ２領域に位置するが、ヒンジ領域はカスケードを活性化させる抗体の機能に影響を与える。例えば、ヒンジ領域が欠けている組み換え免疫グロブリンは、活性補体を行うことができない（非特許文献３）。ヒンジ領域による柔軟性がない場合、抗原に結合した抗体のＦａｂ部位は、Ｃ１ｑがＣＨ２に結合するために必要な立体構造をとることができない可能性がある（非特許文献３）。ヒンジの長さと局部的な柔軟性は、補体活性と限定的に相関する。従って、ヒトＩｇＧ４のヒンジ領域のように硬直に改造されたヒンジ領域を持つヒトＩｇＧ３分子であっても、補体カスケードを活性化させる能力を温存している。
【０００９】
ヒンジ領域はまた、糖鎖が付加できる幾つかの異なる構造の部位を含む１つ以上のグリコシル化部位を持ち得る。例えば、ＩｇＧ１のヒンジ領域の１７アミノ酸セグメントには５つのグリコシル化部位が存在し、それによって腸内プロティアーゼに対する著しい耐性が与えられる。この機能は分泌性免疫グロブリンとしては有利な性質であると考えられる。
【００１０】
ヒンジ領域の欠乏、または機能的なヒンジ領域の欠如は、幾つかのヒト免疫グロブリンが持つ免疫エフェクター細胞のＦｃ受容体に結合する能力を左右し得る。免疫グロブリンのＦｃ受容体への結合は、抗体依存細胞媒介性細胞毒性（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，ＡＤＣＣ）を促進し、これは腫瘍細胞の除外において重要なメカニズムであると推定される。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）ファミリは、ＩｇＧと高い親和性で結合し得るＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）と、低い親和性受容体であるＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）とを含む３つの分類に分けられる。ヒトＩｇＡ  Ｆｃ受容体はＦｃαＲ（ＣＤ８９）である。実験上の証拠によると、ＣＨ２領域のヒンジ近位部位にある残基は、免疫グロブリンと様々なＦｃ受容体との特異的な相互作用において大事である。これは、ヒンジ領域を持たないＩｇＧ１骨髄腫タンパク及び組替えＩｇＧ３キメラ抗体がＦｃγＲＩに結合できないという結果によって支持され、このような結果はＣＨ２領域へのアクセスし易さが低下したためと考えられる（非特許文献９）。  Ｆｃγ受容体は、非特許文献１０と、非特許文献１１に全般的にレビューされている。又、非特許文献１２も参照。
【００１１】
ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）はマクロファージ及び樹枝状細胞で発現され、ファゴサイトーシス、呼吸性バースト、及びサイトカイン刺激において所定の役割を果たしている。ＦｃγＲＩの発現は、ＧＭ−ＣＳＦやγインタフェーロン（γーＩＦＮ）によって増加され、インターロイキンー４（ＩＬ−４）によって減少される。全ての活性化受容体がノックアウトされたマウスは免疫複合体媒介炎症から保護される。同様に、ＦｃγＲＩがノックアウトされたマウスはある程度の保護が見られる。
【００１２】
ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）は、ＦｃγＲＩＩａ〜ｃの３つの種類が同定されている。ＦｃγＲＩＩａは多形核白血球（Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ，ＰＭＮ）、マクロファージ、樹枝状細胞及びマスト細胞において発現される。ＦｃγＲＩＩａは、ファゴサイトシス、呼吸性バースト及びサイトカイン刺激において所定の役割を果たしている。ＦｃγＲＩＩａの発現はＧＭ−ＣＳＦ及びγーＩＦＮによって増加され、ＩＬ−４によって減少される。全ての活性化受容体がノックアウトされたマウスは免疫複合体媒介炎症から保護される。ＦｃγＲＩＩａはＣ反応性タンパク（ＣＲＰ）多形Ｈ１３１と高い親和性で結合し、ＣＲＰ多形Ｒ１３１とは低い親和性で結合する。一般の人口において二つの多形の分布は、約５０：５０で、Ｒ１３１は感染やループス腎炎（Ｌｕｐｕｓ  Ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）になり易い。ＦｃγＲＩＩｂはＢ細胞、ＰＭＮ，マクロファージ及びマスト細胞で発現される。ＦｃγＲＩＩｂは、免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ，  ＩＴＡＭ）媒介反応を抑制する。したがってＦｃγＲＩＩｂは抑制性受容体である。ＦｃγＲＩＩｃの発現は静注用免疫グロブリンやＩＬ−４によって増加され、γ−ＩＦＮによって減少される。ＦｃγＲＩＩｂノックアウトマウスは抗体反応が増加し、自己免疫疾患になり易く、ＣＤ３２がノックアウトされた濾胞樹状細胞（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ，  ＦＤＣ）は、Ｂ細胞リコール反応が衰える。ＦｃγＲＩＩｃはＮＫ細胞で発現されているが、その機能と発現の制御については不明のところが多い。
【００１３】
ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は、ＦｃγＲＩＩＩａとｂの２つが同定されている。ＦｃγＲＩＩＩａはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、マスト細胞及び血小板で発現されている。この受容体はファゴサイトシス、呼吸性バースト、サイトカイン刺激、血小板凝集、脱顆粒及びＮＫ細胞媒介のＡＤＣＣに関与する。ＦｃγＲＩＩＩの発現はＣ５ａ、ＴＧＦβ及びγ−ＩＦＮによって増加され、ＩＬ−４によって減少される。全ての活性化受容体がノックアウトされたマウスは免疫複合体媒介炎症から保護される。ＦｃγＲＩＩＩは多形性であり、その中Ｆ１７６が最も多く、Ｖ−１７６が少ない。Ｆ−１７６のＩｇＧに対する親和性はより弱く、紅斑性狼瘡（Ｌｕｐｕｓ  Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）と関連付けられている。ＦｃγＲＩＩＩｂはＧＰＩが付いた受容体であり、ＰＭＮにおいて発現される。ＦｃγＲＩＩＩｂの遺伝的欠損は存在するが、それによる表現型は知られていない。ＦｃγＲＩＩＩｂ  ＮＡ１／ＮＡ２の多形は同種免疫性新生児好中球減少症（ｉｓｏｉｍｍｕｎｅ  ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉａ）において重要である。
【００１４】
モノクローナル抗体技術や遺伝工学方法は、人間が患う病気の診断や治療のための免疫グロブリンの急速な発展を導いた。また、抗原に対する抗体の親和性を改善させるため、注射されるポリペプチドの免疫原性に関する問題を減少させるため、そして抗体のエフェクター機能を改造するためにタンパク質工学が適用されてきた。免疫グロブリンのドメイン構造は、遺伝子組み換え工学によって改造しやすくなっており、抗原結合ドメインやエフェクター機能に関するドメインは免疫グロブリン分類間（例：ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＥ）、又は下位分類間（例：ＩｇＧ１,ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４など）に交換することができる。
【００１５】
更に、免疫グロブリンをそのまま使用する治療法に関する問題を解消するため、より小さい免疫グロブリンが作られた。例えば、一本鎖免疫グロブリン可変領域断片ポリペプチド（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｏｌｂｕｌｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，  ｓｃＦｖ）は、短いリンカーペプチドを介して軽鎖可変領域に結ばれた免疫グロブリンの重鎖可変領域を備える（非特許文献１３）。ｓｃＦｖ分子は小さいため、プラズマや組織において早くクリアされ、免疫グロブリンそのまま使用する場合より効率的な組織浸透性を持つ（非特許文献１４等を参照）。抗腫瘍ｓｃＦｖは、対応するキメラ抗体より速い腫瘍への浸透性及び均一な分布を示した（非特許文献１５）。毒素などの分子をｓｃＦｖと融合すると、ｓｃＦｖの小さいサイズやその特異的な抗体抗原結合を利用して標的組織に毒素を運ぶことができる（非特許文献１６、非特許文献１７）。
【００１６】
ｓｃＦｖの血清療法には、利点の反面、幾つかの欠点も存在する。ｓｃＦｖのクリアランス（Ｃｌｅａｒａｎｃｅ）は速いため一般細胞に与える毒性効果は軽減できるが、そのような早いクリアランスでは、最小有効量を標的組織へ運ぶことを妨げ得る。患者に注射するために十分な量のｓｃＦｖを製造することも、ｓｃＦｖの発現や精製などの問題で収率に悪影響を与えるため、困難であった。発現の際、ｓｃＦｖ分子は安定性が乏しく、異なる分子の可変領域が結合してしまい、塊になる。更に、哺乳類の発現システムにおけるｓｃＦｖ製造レベルは低く、ｓｃＦｖ分子の治療法での使用可能性を制限する（非特許文献１８、非特許文献１９）。製造量向上のための対策も、可変領域にグリコシル化部位を加えるなど、様々なものがなされている（特許文献１、非特許文献２０等）。
【００１７】
ｓｃＦｖを治療に使用する際に更なる欠点としては、エフェクター機能の欠如である。細胞傷害性機能、ＡＤＣＣ及びＣＤＣが欠如したｓｃＦｖは、病気の治療には効果を発揮しない可能性がある。ｓｃＦｖの開発は既に２０年以上されているにもかかわらず、治療目的で承認されたｓｃＦｖ商品はまだ存在しない。代替戦略である毒素が接合又は融合されたｓｃＦｖは、効能で抗原特異的な分子であるが、そのような接合物やキメラは、毒素から由来する過剰な毒性及び非特異性の毒性の少なくともいずれかによって制限される。このような毒性効果は、肝臓酵素の生理的な正常値を超える過剰な分泌、血液漏出症候群、及び望ましくない他の効果などを含み得る。その上、患者に注射された免疫抗毒素は、そのもの自体が免疫原性であり、免疫抗毒素に対して生成された患者の抗体は、同じ患者に対する免疫抗毒素の反復使用の可能性を制限する。
【００１８】
病気の治療において免疫グロブリンの定常領域に関連するエフェクター機能の利点は、定常領域を持つ、可変領域を免疫グロブリンの配列でないペプチドに入れ替えた融合タンパク質の開発を促した。例えば、ＨＩＶによって認識されるＴ細胞表面タンパク質であるＣＤ４は、遺伝子組み換えによって免疫グロブリンＦｃエフェクタードメインと融合された（非特許文献２１）。このような分子の生物活性は、その一部分において、選択された免疫グロブリン分類または下位分類の定常領域によって異なる。例えば、ＩＬ−２ＩｇＧ１融合タンパク質はＩＬ−２受容体を持つ細胞の補体媒介溶解をもたらす（非特許文献２１）。これらの融合タンパク質又は異なる融合タンパク質を作成するための免疫グロブリンの定常領域の利用は更に、向上した薬物速度論的特性を与え得る。
【特許文献１】米国特許第５８８８７７３号明細書
【非特許文献１】Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，”Ｃｈａｐｔｅｒ  １４（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  １９８８）（ハルブロー等著、「抗体：研究所マニュアル」、第１４章、コールド・スプリング・ハーバ、１９８８）
【非特許文献２】Ｌｏ，Ｅｄ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，”Ｐａｒｔ１（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｔｏｗａ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，  ２００４（ロー著、「抗体工学：方法とプロトコール」、パート１、ヒューマナ出版、トトワ、ニュー・ジャージ州、２００４）
【非特許文献３】Ｓｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １３０：８７  （１９９２）（シン等著、「免疫レビュー」、１３０：８７  （１９９２））
【非特許文献４】Ｋｉｒｓｃｈｆｉｎｋ，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．１８０：１７７（２００１）カーシフィンク著、「免疫レビュー」、１８０：１７７（２００１））
【非特許文献５】Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ  １２：６０７（２０００）（チャクラボーティ等著、「細胞シグナル」、１２：６０７（２０００））
【非特許文献６】Ｋｏｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ。３６：８９３（１９９９）（コール等著、「分子免疫学」、３６：８９３（１９９９））
【非特許文献７】Ｍａｒｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．８：５５７（１９９９）（マーシュ等著、「腎臓学と高血圧における現在の意見」、８：５５７（１９９９））
【非特許文献８】Ｓｐｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｗｉｅｎ  Ｋｌｉｎ．  Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ．  １１１：３７８（１９９９）（スペーツ等著、「中央ヨーロッパ医学誌」、１１１：３７８（１９９９））
【非特許文献９】Ｓｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔｅｒｎ，  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １０：１７７、１７８−７９（１９９３）（シン等著、「国際免疫学レビュー」、１０：１７７、１７８−７９（１９９３））
【非特許文献１０】Ｉｎｇｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  Ｆｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，”Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：２９−５５（１９９７）（インマー等著、“ヒトＩｇＧのＦｃ受容体”、「国際免疫学レビュー」、１６：２９−５５（１９９７））
【非特許文献１１】Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｂｏｌｌａｎｄ、“ＩｇＧ  Ｆｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，”Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：２７５−９０（２００１）（ラベッチ及びボーランド著、“ＩｇＧのＦｃ受容体”「年刊免疫学レビュー」、１９：２７５−９０（２００１））
【非特許文献１２】Ｇｅｔａｈｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：５２６９−５２７６（２００４）（ゲタフーン等著、「免疫学誌」、１７２：５２６９−５２７６（２００４））
【非特許文献１３】Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，８５：５８７９−８３（１９８８）（ヒューストン等筆、「米国科学アカデミー紀要」、８５：５８７９−８３（１９８８））
【非特許文献１４】Ｊａｉｎ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：８１４ｓ−８１９ｓ（１９９０）（ジェイン著、「癌研究」、５０：８１４ｓ−８１９ｓ（１９９０））
【非特許文献１５】Ｙｏｋｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓ．５２：３４０２−０８（１９９２）（ヨコタ等著、「癌研究」、５２：３４０２−０８（１９９２））
【非特許文献１６】Ｃｈａｕｄａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３３９：３９４（１９８９）（シャーンドリ等著、「ネイチャー」、３３９：３９４（１９８９））
【非特許文献１７】Ｂａｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：２２００（１９９１）（バトラ等著、「分子細胞生物学」、１１：２２００（１９９１））
【非特許文献１８】Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１０４１０−１８（１９９０）（デイビース等著、「生物化学誌」、２６５：１０４１０−１８（１９９０））
【非特許文献１９】Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５−５９（１９９１）（トローネッカ等著、「ＥＭＢＯ誌」、１０：３６５５−５９（１９９１））
【非特許文献２０】Ｊｏｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２６２６７−７３（１９９４）（ジョースト等筆、「生物化学誌」、２６９：２６２６７−７３（１９９４））
【非特許文献２１】Ｓｅｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６５：１２９−１５８（１９９７）（センセール等著、「化学的免疫学」、６５：１２９−１５８（１９９７））
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
上記のように、Ｆｃ受容体の結合親和性及び特異性（そして関連するＡＤＣＣ）、結合タンパク質のインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）半減期、及び補体固定等の１つ以上のエフェクター機能を変化させるためにヒンジ及びＦｃドメインの少なくともいずれかが改造された、免疫グロブリン由来の結合タンパク質の分野において、未だに遂げていない技術向上のニーズが残っている。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、とりわけ、Ｆｃエフェクター機能を変化させるように改造された１つ以上の免疫グロブリン・ヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域の少なくともいずれかを備えた結合タンパク質を提供することによって上記の問題を含む様々な関連するニーズを解消することを目的とする。ここに説明される発明は、免疫グロブリンヒンジ領域及びＦｃ領域の少なくともいずれかを改造した結合タンパク質であり、当該改造は対応（ｃｏｇｎａｔｅ）受容体（例：ＦＣ受容体）に対する結合親和性及び結合特異性の少なくともいずれかを変化させる改造、及び改造されていない結合タンパク質には存在しない１つ以上の新たな結合特異性（例：改造されていないタンパク質が結合する対応受容体とは異なる親和性）の少なくともいずれかを、当該ヒンジ及びＣＨ領域の少なくともいずれかに与える改造である。
【００２１】
本発明による結合タンパク質は、免疫グロブリンのヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３の少なくともいずれかにおいて１つ以上のアミノ酸配列が変更されている、改造された抗体、抗体断片、組み換え結合タンパク質、及び小モジュラー免疫薬製品（ＳＭＩＰ）を含む、分子工学的に設計された結合領域と免疫グロブリンの融合タンパク質等を含む。ある実施形態においては、当該結合タンパク質は、受容体結合親和性及び特異性の少なくともいずれかを決定するヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３の少なくともいずれかのアミノ酸配列上の変更を１つ以上含む。
【００２２】
ある特徴によると、本発明は具体的に１つ以上の免疫グロブリン重鎖の、１つ上のヒンジドメイン、１つ以上のＣＨ２ドメイン，及び１つ以上のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかを含む結合タンパク質を提供し、当該結合タンパク質は改造された（即ち、増加又は減少）結合親和性及び特異性の少なくともいずれかで１つ以上の免疫グロブリン特異的なＦｃ受容体に結合する。
【００２３】
ここに説明される発明は、ＩｇＧ免疫グロブリンの重鎖の、１つ以上のヒンジドメイン、１つ以上のＣＨ２ドメイン及び１つ以上のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかを備えた結合タンパク質であり、前期タンパク質は改造によって１つ以上のＩｇＧ免疫グロブリン特異的Ｆｃ受容体に対する結合親和性及び特異性の少なくともいずれかが変化しており、当該ＩｃＧ免疫グロブリン特異的Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａとＦｃγＲＩＩｂとＦｃγＲＩＩｃとを含むＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２），及びＦｃγＲＩＩＩａとＦｃγＲＩＩＩｂを含むＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）である。この種類の結合タンパク質は、例えばＦｃγ−受容体の結合にかかわる領域、ドメイン、ターン、及びループ構造の少なくともいずれかのアミノ酸配列から１つ以上のアミノ酸が挿入及び除去された結合タンパク質の少なくともいずれかを含む。このような改造は、免疫グロブリン特異的Ｆｃ受容体と結合した際その受容体（ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を含む）内の１つ以上のアミノ酸と直接に接する１つ以上のアミノ酸の、間及び隣の少なくともいずれかに、挿入された１つ以上のアミノ酸及び除去された１つ以上のアミノ酸の少なくともいずれかを含むが、これに限られない。
【００２４】
本発明の具体的な実施形態は、ＩｇＧ１,ＩｇＧ２、及びＩｇＧ３の少なくともいずれかのＣＨ２ドメインを１つ以上備える結合タンパク質を提供する。そのような幾つかの実施形態は、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２の少なくともいずれかのＣＨ２ドメインにあるヒンジ近位ループ構造であるＬ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｐの配列内に１つ以上のアミノ酸の除去及び挿入の少なくともいずれかを備えた結合タンパク質を提供する。ここに具体的に説明されるものは、次に述べるヒンジ近位ループ構造内の“＊”で示された１つの位置に１つのアミノ酸が挿入された結合タンパク質である。したがって、ここで提供されるものはＬ−Ｌ−＊−Ｇ−Ｇ−Ｐ，Ｌ−Ｌ−Ｇ−＊−Ｇ−Ｐ、及びＬ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−＊−Ｐのヒンジ近位ループ構造を備える結合タンパク質である。ここで更に提供するものは、Ｌ−Ｌ−＊−Ｇ−Ｇ−Ｐ，Ｌ−Ｌ−Ｇ−＊−Ｇ−Ｐ、及びＬ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−＊−Ｐのヒンジ近位ループ構造内に“＊”で示された１つの位置に２つ以上のアミノ酸が挿入された結合タンパク質である。したがって、これらの実施形態においては、“＊”は少なくとも２、３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０個のアミノ酸の挿入を示す。このような改造されたヒンジ近位ループ構造を持つ結合タンパク質を生成するために適切なアミノ酸は、典型的にＡｌａ，Ｇｌｙ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ、及びＶａｌを含むグループから選ばれる。
【００２５】
他の類似する実施形態は、ＩｇＧ１,ＩｇＧ２、及びＩｇＧ３の少なくともいずれかのＣＨ２ドメインを１つ以上備える結合タンパク質を提供する。そのような幾つかの実施形態は、ＩｇＧ１のＢＣループ構造であるＤ−Ｖ−Ｓ−Ｈ−Ｅの配列内に１つ以上のアミノ酸の除去及び挿入の少なくともいずれかを備えた結合タンパク質を提供する。ここに具体的に説明されるものは、次に述べるＢＣループ構造内の“＊”で示された１つの位置に１つのアミノ酸が挿入された結合タンパク質である。したがって、ここで提供されるものはＤ−Ｖ−＊−Ｓ−Ｈ−Ｅ，及びＤ−Ｖ−Ｓ−＊−Ｈ−Ｅに改造されたＢＣループ構造を備える結合タンパク質である。ここで更に提供するものは、Ｄ−Ｖ−＊−Ｓ−Ｈ−Ｅ，及びＤ−Ｖ−Ｓ−＊−Ｈ−ＥのＢＣループ構造内に“＊”で示された１つの位置に２つ以上のアミノ酸が挿入された結合タンパク質である。したがって、これらの実施形態においては、“＊”は少なくとも２、３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０個のアミノ酸の挿入を示す。このような改造されたＢＣループ構造を持つ結合タンパク質を生成するために適切なアミノ酸は、典型的にＡｌａ，Ｇｌｙ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ、及びＶａｌを含むグループから選ばれる。
【００２６】
更なる類似する実施形態は、ＩｇＧ１,及びＩｇＧ３のＣＨ２ドメインの少なくともいずれかを１つ以上備える結合タンパク質を提供する。そのような幾つかの実施形態は、ＣＨ２ドメインのＦＧループ構造であるＡ−Ｌ−Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｉの配列内に１つ以上のアミノ酸の除去及び挿入の少なくともいずれかを備えた結合タンパク質を提供する。ここに具体的に説明されるものは、次に述べるＦＧループ構造内の“＊”で示された１つの位置に１つのアミノ酸が挿入された結合タンパク質である。したがって、ここで提供されるものはＡ−Ｌ−＊−Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｉ，Ａ−Ｌ−Ｐ−＊−Ａ−Ｐ−Ｉ及びＡ−Ｌ−Ｐ−Ａ−＊−Ｐ−Ｉに改造されたＦＣループ構造を備える結合タンパク質である。ここで更に提供するものは、Ａ−Ｌ−＊−Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｉ，Ａ−Ｌ−Ｐ−＊−Ａ−Ｐ−Ｉ及びＡ−Ｌ−Ｐ−Ａ−＊−Ｐ−ＩのＦＧループ構造内に“＊”で示された１つの位置に２つ以上のアミノ酸が挿入された結合タンパク質である。したがって、これらの実施形態においては、“＊”は少なくとも２、３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０個のアミノ酸の挿入を示す。このような改造されたＦＧループ構造を持つ結合タンパク質を生成するために適切なアミノ酸は、典型的にＡｌａ，Ｇｌｙ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ、及びＶａｌを含むグループから選ばれる。
【００２７】
異なる特徴によると、本発明はＩｇＧ重鎖の、１つ以上のヒンジドメイン、１つ以上のＣＨ２ドメイン、及び１つ以上のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかを備える結合タンパク質を提供し、当該結合タンパク質は当該ＩｇＧ重鎖の、１つ以上のヒンジドメイン、１つ以上のＣＨ２ドメイン、及び１つ以上のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかに１つ以上の改造を含んでおり、当該改造は、改造される位置でのＮ−結合型グリコシル化及びＯ−結合型グリコシル化の少なくともいずれかを行うに十分であり、そのグリコシル化によって免疫グロブリン特異的なＦｃ受容体に対する結合タンパク質の親和性及び特異性の少なくともいずれかを変化させる（即ち、増加又は減少）１つ以上のＮ−結合型グリコシル化配列及びＯ−グリコシル化配列の少なくともいずれかの挿入を含む改造である。このような結合タンパク質は、改造されていない結合タンパク質のグリコシル化にかかわる領域、ドメイン、及びループ構造の少なくともいずれかの、近位及び遠位の少なくともいずれかに位置するアミノ酸の変化を備えるタンパク質等を含む。
【００２８】
ここに説明されるものはＩｇＧ重鎖の、１つ以上のヒンジドメイン、１つ以上のＣＨ２ドメイン、及び１つ以上のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかを備える結合タンパク質であり、当該結合タンパク質は当該ＩｇＧ重鎖の、１つ以上のヒンジドメイン、１つ以上のＣＨ２ドメイン、及び１つ以上のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかに１つ以上の改造を含んでおり、当該改造は、改造される位置でのＮ−結合型グリコシル化及びＯ−結合型グリコシル化の少なくともいずれかを行うに十分であり、そのグリコシル化によって、対応する改造されていないＩｇＧ重鎖の、１つ以上のヒンジドメイン、１つ以上のＣＨ２ドメイン、及び１つ以上のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかを備える結合タンパク質に比べ、免疫グロブリン特異的なＦｃ受容体（ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａとＦｃγＲＩＩｂとＦｃγＲＩＩｃとを含むＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２），及びＦｃγＲＩＩＩａとＦｃγＲＩＩＩｂを含むＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６））に対する結合タンパク質の親和性及び特異性の少なくともいずれかを変化させる（即ち、増加又は減少）１つ以上のＮ−結合型グリコシル化配列及びＯ−グリコシル化配列の少なくともいずれかの挿入を含む改造である。
【００２９】
本発明のこれらの特徴に関する具体的な実施形態によると、本発明はＩｇＧ重鎖の、１つ以上のヒンジドメイン、１つ以上のＩｇＧのＣＨ２ドメイン、及び１つ以上のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかを備える結合タンパク質を提供し、当該ＩｇＧ重鎖の、１つ以上のヒンジドメイン、１つ以上のＩｇＧのＣＨ２ドメイン、及び１つ以上のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４の少なくともいずれかの、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインの少なくともいずれかである。このような幾つかの実施形態は、対応する天然ＩｇＧ免疫グロブリンのヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの少なくともいずれかのＮ−結合型グリコシル化部位及びＯ−結合型グリコシル化部位の少なくともいずれかの近位及び遠位の少なくともいずれかに、Ｎ−結合型グリコシル化配列であるＮ−Ｘ−（Ｓ／Ｔ）を１つ以上、及びＯ−結合型グリコシル化配列であるＸ−Ｐ−Ｘ−Ｘ（少なくとも１つのＸはＴ）、Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｘ（少なくとも１つのＸはＴ）、Ｘ−Ｘ−Ｔ−Ｘ（少なくとも１つのＸはＲ又はＴ）及びＳ−Ｘ−Ｘ−Ｘ（少なくとも１つのＸはＳ）の少なくともいずれかを、少なくともいずれか１つ以上含む結合タンパク質を提供する。これらの実施形態の特徴において、当該結合タンパク質は変化した（即ち、増加又は減少）ＦｃγＲ結合親和性及び特異性の少なくともいずれかを示す。
【００３０】
ここに説明されたものは１つ以上のＩｇＧ重鎖の、１つ以上のヒンジドメイン、１つ以上のＩｇＧのＣＨ２ドメイン、及び１つ以上のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかを備える結合タンパク質についての実施形態であって、当該結合タンパク質には更に１つ以上のＮ−結合型グリコシル化配列であるＮ−Ｘ−（Ｓ／Ｔ）（Ｘは任意のアミノ酸）が挿入される。例えば、本発明は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の少なくともいずれかのＣＨ２ドメインの天然のＮ−Ｓ−Ｔ配列に隣接した位置に、１つ以上のＮ−Ｘ−（Ｓ／Ｔ）を挿入した結合タンパク質を提供する。これらの実施形態の特徴において、当該結合タンパク質は変化した（即ち、増加又は減少）ＦｃγＲ結合親和性及び特異性の少なくともいずれかを示す。
【００３１】
このような具体的な実施形態において、１つ以上のＩｇＧ１、１つ以上のＩｇＧ２、１つ以上のＩｇＧ３及び１つ以上のＩｇＧ４の少なくともいずれかのＣＨ２ドメインのＤＥループ内にあるＮ−結合型グリコシル化配列はＮ−Ｓ−Ｔというアミノ酸配列を含み、天然Ｎ−Ｓ−Ｔ配列に隣接した位置及び、アミノ末端側及び、カルボキシ末端側の少なくともいずれかの１００アミノ酸以内に挿入される。したがって天然アミノ酸配列であるＸ−Ｎ−Ｓ−Ｔ−Ｚは（ＡＡａ）−Ｎ−Ｓ−Ｔ−（ＡＡｂ）−Ｎ−Ｓ−Ｔ−（ＡＡｃ）に改造され、ＡＡａ、ＡＡｂ及びＡＡｃは夫々独立的に１〜１００アミノ酸を指定する。そのような具体的な実施形態において、当該１つ以上のＩｇＧ１、１つ以上のＩｇＧ２、１つ以上のＩｇＧ３及び１つ以上のＩｇＧ４の少なくともいずれかのＣＨ２ドメインのＤＥループ内にあるＮ−結合型グリコシル化配列は、Ｎ−Ｓ−Ｔのアミノ酸配列を備え、天然のＮ−Ｓ−Ｔに隣接するように挿入される。したがって、天然のＸ−Ｎ−Ｓ−Ｔ−Ｚのアミノ酸配列はＸ−Ｎ−Ｓ−Ｔ−Ｚ−Ｎ−Ｓ−Ｔ−Ｚに改装され、ここのＸとＺは夫々独自にＴｙｒ（Ｙ）及びＰｈｅ（Ｆ）から選択される。
【００３２】
そのような代替の実施形態においては、１つ以上のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の少なくともいずれかのＢＣループに挿入された当該Ｎ−結合型グリコシル化配列は、天然のＮ−Ｓ−Ｔの配列の遠位に挿入されたＮ−Ｓ−Ｔのアミノ酸配列を含み、したがって天然のアミノ酸配列Ｙ−Ｐ−Ｓ−Ｄ−Ｉ−ＡはＹ−Ｐ−Ｎ−Ｓ−Ｔ−Ｉ−Ｄ−Ａ及びＹ−Ｎ−Ｓ−Ｔ−Ｐ−Ｓ−Ｄ−Ｉ−Ａに改造される。
【００３３】
更なる特徴において、本発明は具体的に第１免疫グロブリン類（例：ＩｇＡ、ＩｇＤ，ＩｇＥ，ＩｇＧ，又はＩｇＭ）重鎖の、１つ以上のヒンジドメイン、１つ以上のＣＨ２ドメイン及び１つ以上のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかを備えるタンパク質を提供し、当該結合タンパク質は第１免疫グロブリン類とは異なる第２の免疫グロブリン類の対応受容体を１つ以上結合できるように、当該第１の免疫グロブリン類の重鎖の、１つ以上のヒンジドメイン、１つ以上のＣＨ２ドメイン及び１つ以上のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかの一次アミノ酸配列が改造されている（即ち、アミノ酸の置き換え及びアミノ酸の挿入の少なくともいずれか）。そのような改造は、例えば、１つ以上のループを持つ第１の免疫グロブリンドメインの１つ以上の、ループ、アミノ酸及びペプチド部分の少なくともいずれかを、第２の免疫グロブリンドメインのループ、アミノ酸及びペプチド部分の少なくともいずれかで、置き換え及び再設計の少なくともいずれかを行ったものを含み、当該第２の免疫グロブリンドメインは第２の免疫グロブリンドメイン特異的Ｆｃ受容体との結合にかかわる結合配列の少なくとも一部を形成する１つ以上のアミノ酸を含む。本発明のこれらの特徴による結合タンパク質は、ＦｃαＲに特異的に結合することができるだけではなく、更にＦｃγＲＩ，ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩの少なくともいずれかに特異的に結合することができる。
【００３４】
ここに説明される発明はＩｇＧ重鎖の、１つ以上のヒンジドメイン、１つ以上のＣＨ２ドメイン及び１つ以上のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかを備える結合タンパク質であり、当該結合タンパク質はＩｇＡ免疫グロブリン特異的受容体ＦｃαＲ（ＣＤ８９）を含む１つ以上の非ＩｇＧ免疫グロブリン特異的受容体に結合するように改造されている。このような結合タンパク質は、例えば、Ｆｃα受容体結合などの非ＩｇＧ免疫グロブリン特異的Ｆｃ受容体結合を可能にするアミノ酸配列を作る改造（例えば、アミノ酸の置き換え及びアミノ酸の挿入の少なくともいずれか）を一次アミノ酸配列に含むＩｇＧ重鎖の、１つ以上のヒンジドメイン、１つ以上のＣＨ２ドメイン及び１つ以上のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかを備える。
【００３５】
そのような特定な実施形態は、ＩｇＧ重鎖の、１つ以上のヒンジドメイン、１つ以上のＣＨ２ドメイン及び１つ以上のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかを備える結合タンパク質を提供し、当該結合タンパク質はＩｇＧ免疫グロブリン特異的受容体であるＦｃαＲ（ＣＤ８９）に結合するように改造されている。そのような例示的な結合タンパク質はうな例示的な結合タンパク質は、アミノ酸配列Ｃ−Ｓ−Ｖ−Ｍ−Ｈ−Ｅ−Ａ−Ｌ−Ｈ−Ｎ−Ｈ−Ｙ−Ｔ−Ｑまたはその一部を含むＩｇＧのＣＨ３ＦＧループの代わりに、アミノ酸配列Ｃ−Ｍ−Ｖ−Ｇ−Ｈ−Ｅ−Ａ−Ｌ−Ｐ−Ｌ−Ａ−Ｆ−Ｔ−Ｑまたはその一部を含むＩｇＡのＣＨ３ＦＧループ配列を備える。
【００３６】
異なる結合タンパク質の一例は、アミノ酸配列Ｑ−Ｐ−Ｅ−Ｎまたはその一部を含むＩｇＧのＣＨ３ＣＤループの代わりに、アミノ酸配列Ｑ−Ｅ−Ｌ−Ｐ−Ｒ−Ｅまたはその一部を含むＩｇＡのＣＨ３ＣＤループを備える。更なる結合タンパク質の一例は、アミノ酸配列Ｃ−Ｓ−Ｖ−Ｍ−Ｈ−Ｅ−Ａ−Ｌ−Ｈ−Ｎ−Ｈ−Ｙ−Ｔ−Ｑまたはその一部を含むＩｇＧのＣＨ３ＦＧループの代わりに、アミノ酸配列Ｃ−Ｍ−Ｖ−Ｇ−Ｈ−Ｅ−Ａ−Ｌ−Ｐ−Ｌ−Ａ−Ｆ−Ｔ−Ｑまたはその一部を含むＩｇＡのＣＨ３ＦＧループと、アミノ酸配列Ｑ−Ｐ−Ｅ−Ｎまたはその一部を含むＩｇＧのＣＨ３ＣＤループの代わりに、アミノ酸配列Ｑ−Ｅ−Ｌ−Ｐ−Ｒ−Ｅまたはその一部を含むＩｇＡのＣＨ３ＣＤループとを備える。
【００３７】
上記の結合タンパク質の実施形態はいずれも、ＩｇＧ重鎖のＣＨ３にあるＭｅｔ（Ｋ−Ｄ−Ｔ−Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｓ−Ｒ−Ｔの配列の中にあるＣＨ３アミノ酸配列の第２８番目のアミノ酸）をＬｅｕに置き換え、Ｋ−Ｄ−Ｔ−Ｌ−ＬーＩ−Ｓ−Ｒ−Ｔのアミノ酸配列を更に備え得る。代わりに、及び／又は追加的に、上記の結合タンパク質の実施形態はいずれも、ＩｇＧ重鎖ＣＨ３にあるＧｌｕ（Ｄ−Ｉ−Ａ−Ｖ−Ｅ−Ｗ−Ｅ−Ｓ−Ｎの配列の中にあるＣＨ３アミノ酸配列の第１５７番目のアミノ酸）をＡｒｇに置き換え、Ｄ−Ｉ−Ａ−Ｖ−Ｒ−Ｗ−Ｅ−Ｓ−Ｎのアミノ酸配列を更に備え得る。
【００３８】
本発明のこれらの特徴及び他の特徴は、次の詳細な説明と図面に明確に説明される。本文で引用される全ての公開文献、特許、及び特許出願は、参考文献として本文に組み込まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
上記のように、本発明は１つ以上の免疫グロブリン定常領域の、１つ以上のヒンジドメイン、１つ以上のＣＨ２ドメイン及び１つ以上のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかを備える結合タンパク質を提供し、当該１つ以上のヒンジドメイン、１つ以上のＣＨ２ドメイン及び１つ以上のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかは結合タンパク質のＦｃエフェクター機能を１つ以上変化させるように改造されている。ここに説明されるのは対応受容体に対して変化した結合親和性及び特異性の少なくともいずれかを得るための改造、及び改造されていない結合タンパク質には存在しない新たな結合特異性（例：改造されていない結合タンパク質が特異的に結合する１つ以上の対応受容体とは異なる１つ以上のＦｃ受容体に対する親和性）をＦｃ領域に与えるための改造の少なくともいずれかがされた免疫グロブリンヒンジＦｃ領域を持つ結合タンパク質である。
【００４０】
具体的に、ここに開示される改造された結合タンパク質は、次のようなものを含む：
（１）免疫グロブリンヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域の少なくともいずれかに１つ以上のアミノ酸が挿入された結合タンパク質であり、当該免疫グロブリンは１）ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、２）ＦｃγＲＩＩａ，ＦｃγＲＩＩｂ、及びＦｃγＲＩＩｃを含むＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、及び３）ＦｃγＲＩＩＩａとＦｃγＲＩＩＩｂを含むＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の３つの少なくともいずれかの１つ以上に対して変化した（即ち、増加又は減少）結合親和性及び特異性の少なくともいずれかを示す。
【００４１】
（２）野生型の免疫グロブリンＦｃ領域のＮ−結合型グリコシル化部位及びＯ−結合型グリコシル化部位の少なくともいずれかの近位及び遠位の少なくともいずれかに、１つ以上のＮ−結合型グリコシル化配列、及びＯ−結合型グリコシル化配列の少なくともいずれか（例えば、１つ以上のＮ−結合型グリコシル化配列であるＮ−Ｘ−（Ｓ／Ｔ）、及び１つ以上のＯ−結合型グリコシル化配列であるＸ−Ｐ−Ｘ−Ｘ（少なくとも１つのＸはＴ）、Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｘ（少なくとも１つのＸはＴ）、Ｘ−Ｘ−Ｔ−Ｘ（少なくとも１つのＸはＲ又はＴ）及びＳ−Ｘ−Ｘ−Ｘ（少なくとも１つのＸはＳ）の少なくともいずれか）を備えた結合タンパク質であり、当該結合タンパク質はＦｃγＲＩに対して変化された（即ち、増加又は減少）結合親和性及び特異性の少なくともいずれかを持つ。
【００４２】
（３）１つ以上のＩｇＧのＣＨ２及び／又はＣＨ３領域に１つ以上のアミノ酸の挿入及びアミノ酸の置き換えの少なくともいずれかを備える結合タンパク質であって、当該１つ以上のアミノ酸の挿入及びアミノ酸の置き換えの少なくともいずれかはＩｇＡ免疫グロブリンのＣＨ２領域及びＣＨ３領域の少なくともいずれかの１つ以上のアミノ酸を備え、当該ＩｇＡ免疫グロブリンのＣＨ２領域及びＣＨ３領域の少なくともいずれかの１つ以上のアミノ酸はＩｇＡ免疫グロブリンの対応Ｆｃα受容体に対する特異的な結合にかかわるものであり、当該結合タンパク質は特異的にＦｃαＲに結合することができる。
【００４３】
これより、本発明に関する実施形態を夫々具体的に説明する。
【００４４】
本発明の実施は、他に指示がない限り、免疫学、分子生物学、タンパク質化学などの一般常識を採用する。そのような常識の多くは、発明をより理解するために以下に説明される。そのような技術は既に公開されており、そのような出版物は例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”  （２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）（サンブルーク等著、「分子クローニング：研究所マニュアル」、第２版、１９８９）  “ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ｖｏｌ．Ｉ  ＆  ＩＩ”  （Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，  ｅｄ．）（「ＤＮＡクローニング：実践的なアプローチ」、Ｖｏｌ．Ｉ及びＩＩ、Ｄ．グローバー扁）、  “Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”  （Ｎ．Ｇａｉｔ，ｅｄ，１９８４）（「オリゴヌクレオチド合成」Ｎ．ゲイット扁、１９８４）、  ”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”  （Ｂ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ，  ｅｄｓ．，  １９８５）（「核酸ハイブリダイゼーション」、Ｂ．ヘイムズ及びＳ．ヒギンズ扁、１９８５）、  Ｐｅｒｂａｌ，  ”Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”  （１９８４）（パーバル著「分子クローニングの実践的なガイド」、１９８４）、  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  １９８７）（オースベル等著、「分子生物学におけるの現在のプロトコール」、ニューヨーク、ジョーンワイリ・アンド・サンズ出版、１９８７）、  Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  １９９９）（ボニファチーノ等著、「細胞生物学におけるの現在のプロトコール」、ニューヨーク、ジョーンワイリ・アンド・サンズ出版、１９９９）  Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ，  ”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  １９９９）（コリガン等著、「免疫学における現在のプロトコール」、ニューヨーク、ジョーンワイリ・アンド・サンズ出版、１９９９）、  非特許文献１、及び非特許文献２がある。変異型を作る２つの技術はこの分野において周知技術である。例えば、特定の変異は、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”に記載の部位特異的突然変異誘発法を用いて行うことができる。所定の場所内のランダム変異は、例えばＧｕｌｉｃｋ  ａｎｄ  Ｆａｈｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，９２：８１４０−８１４４（１９９５）（グーリック及びファール著、「米国科学アカデミー紀要」、９２：８１４０−８１４４（１９９５））に記載の強制進化（ｆｏｒｃｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）を用いて挿入することができる。
【００４５】
定義
ここに使われる“結合タンパク質”とは、免疫グロブリンの重鎖の、１つ以上のヒンジドメイン、１つ以上のＣＨ２ドメイン及び１つ以上のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかを備えるタンパク質を意味する。“結合タンパク質”は、好ましくは抗体、又はその生物学的又は機能的同等物を含み、更にそれらの一部、断片、前駆体型、派生物、変種、及び遺伝子組み換え型を含み、それらの化学標識化及び放射標識化なども含む。“結合タンパク質”は“免疫グロブリン”、“抗体”、“モノクローナル抗体”、“キメラ抗体”、“ヒト化抗体”、及び、免疫グロブリンヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの少なくともいずれかの１つ以上のアミノ酸配列が改造された“小モジュラー免疫薬製品”（ＳＭＩＰ）等を非限定的に含む。ある実施形態においては、改造された結合タンパク質は、受容体への結合親和性及び特異性の少なくともいずれかにかかわるヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの少なくともいずれかに１つ以上の配列の変化が含む。
【００４６】
“免疫グロブリン”及び“抗体”は、抗体の全ての分類と下位分類を広く含み、ＩｇＭ，ＩｇＤ、ＩｇＧ１,ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ，ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２を含む。“抗体”は“モノクローナル抗体”を含み、ここで使われる意味では実質的に同質の抗体の集団から得られた抗体を意味する。即ち、当該集団を形成する抗体は同一のものであり、抗体結合特異性、親和性及び活性の少なくともいずれかに実質的な影響は与えないような自然に起こる変異体を含む。“モノクローナル抗体”は非ヒト（ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ）モノクローナル抗体、キメラモノクローナル、ヒト化モノクローナル、及び完全ヒト（ｆｕｌｌｙ−ｈｕｍａｎ）モノクローナル抗体を含み、更には生物学的断片、抗原結合断片及びそれらの一部の少なくともいずれかを含むが、これに限られない。
【００４７】
ここで意味する“キメラ抗体”とは、非ヒト抗体の可変領域がヒト定常領域に操作可能な形で融合されたモノクローナル抗体である。キメラ抗体は、一般的に完全非ヒトモノクローナル抗体に比べ、軽減した抗原性を示す。
【００４８】
ここで意味する“ヒト化抗体”とは、１つ以上の非ヒト相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）、ヒト可変ドメインフレームワーク領域（Ｆｒａｍｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ、ＦＲ）、及びＩｇＧ１,ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の重鎖定常ドメインのようなヒト重鎖定常ドメインと、ＩｇＬａｍｂｄａとＩｇＫａｐｐａの軽鎖定常ドメインのようなヒト軽鎖定常ドメインとを備えるモノクローナル抗体である。ここで意味する“ヒト化抗体”は、その相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、望ましい特異性、親和性及び容量を持つマウス、ラット、又は兎などの人間以外の動物（ドナー抗体）のＣＤＲの残基で置き換えられたヒトモノクローナル抗体（レシピエント抗体）を含む。ある場合は、ヒト抗体の可変領域のフレームワーク残基は、対応する非ヒト抗体の残基で置き換えられる。ヒト化された抗体は更に、レシピエント抗体、挿入したＣＤＲ又はフレームワーク配列に存在しない残基を備え得る。非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野において周知技術である。一般的に、ヒト化された抗体は１つ以上の非ヒト抗体由来のアミノ酸残基を含む。抗体のヒト化は、適切なヒト抗体定常ドメインとの融合の前に、ＣＤＲをヒト支持ＦＲに移植することで得られる。Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）（ジョンズ等著、「ネイチャー」、３２１：５２２−５２５（１９８６））及びＶｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）（ベルホーイェン等著、「サイエンス」２３９：１５３４−１５３６（１９８８））を参照。
【００４９】
ここで意味する“完全ヒト抗体”とは、ヒト可変領域に加え、ヒトフレームワークと定常領域を備える免疫グロブリンである。そのような抗体は周知の様々な技術を用いて作ることができる。例えば、ヒト抗体の組み換えライブラリをバクテリオファージに提示するファージ提示法が、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０）（マックカフェルティ等著、「ネイチャー」３４８：５５２−５５４（１９９０））、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）（フーゲンブーム及びウィンター著、「分子生物誌」、２２７：３８１（１９９１））、及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１（１９９１）（マークス等著、「分子生物誌」、２２２：５８１（１９９１））に記載されている。
【００５０】
或いは、“完全ヒト抗体”とは、遺伝子再構成と免疫グロブリンの組立に必要なヒト免疫グロブリンのレパートリとツールを備えたトランスジェニック動物を用いて作り得る。望ましい特異性を持つ抗原特異的な完全ヒト抗体はハイブリドーマ技術を用いて作り、選ぶことができる。そのようなトランスジェニック動物システムの一例として、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３−２１（１９９４）（グリーン等著、「ネイチャー・ジェネティックス」、７：１３−２１（１９９４））に記載のＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）種がある。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）種は、コアの可変領域と定常領域の配列を含むヒト重鎖遺伝子座とカッパ軽鎖遺伝子座に夫々対応する２４５ｋｂと１９０ｋｂの生殖系列仕様の断片を含む酵母人工染色体（Ｙｅａｓｔ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，  ＹＡＣｓ）を用いて設計されている。ＹＡＣｓを含むヒトＩｇＧは、抗体の再構成及び発現において互換性があり、不活性化マウスＩｇ遺伝子の代わりになり得る。つい最近、メンデーズ（Ｍｅｎｄｅｚ）等は、ヒト抗体レパートリの約８０％を挿入できる百万残基単位（メガベース）の生殖系列仕様のヒト重鎖遺伝子座とカッパ軽鎖遺伝子座のＹＡＣ断片をＮａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１５：１４６−１５６（１９９７）（「ネイチャー・ジェネティックス」、１５：１４６−１５６（１９９７））において報告した。本発明による完全ヒト抗体を作るために適したトランスジェニック動物システムは、米国特許第６１５０５８４号、第５５４５８０７号、第５５４５８０６号、第５６２５１２６号、第５６３３４２５号、第５６６１０１６号、更にはＪａｋｏｂａｖｉｔｓ，Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ．  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．３１：３３−４２（１９９８）（ジャコバビーッツ著、「高度な薬物配達のレビュー」、３１：３３−４２（１９９８））、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）（マークズ等著、「バイオ／テクノロジ」、１０：７７９−７８３（１９９２））、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）（ロンバーグ等著、「ネイチャー」、３６８：８５６−８５９（１９９４））、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８１２−１３  （１９９４）（モリソン著、「ネイチャー」、３６８：８１２−１３  （１９９４））、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−５１  （１９９６）（フィッシュワイルド等著、「ネイチャー・バイオテクノロジ」、１４：８４５−５１  （１９９６））、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８２６  （１９９６）（ニューバーガ著、「ネイチャー・バイオテクノロジ」、１４：８２６  （１９９６））、及びＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，  Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）（ロンバーグ及びフーザー著、「国際免疫学レビュー」、１３：６５−９３（１９９５））等にも紹介されている。
【００５１】
完全ヒト抗体を作る異なるの方法においては、Ｉｇ遺伝子座からの遺伝子断片を含むことによって、外生的なＩｇ遺伝子座を模倣する“ミニ遺伝子座”を用いる。したがって、１つ以上のＶＨ遺伝子、１つ以上のＤＨ遺伝子、１つ以上のＪＨ遺伝子、１つのｍｕ定常領域、及び第２の定常領域（通常ガンマ定常領域）が１つのコンストラクトを形成し、動物に挿入される。この方法はＳｕｒａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ）（スラニ等（医学研究議会））の米国特許第５５４５８０７号とＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｋａｙ（ＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ）（ロンバーグ及びケイ（ジェンファームインタナショナル株式会社））の米国特許第５５４５８０６号と第５６２５８２５号に記載されており、更にはＴａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６：５７９−５９１（１９９４）（テイラー等著、「国際免疫学」、６：５７９−５９１（１９９４））、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５：６４７−６５６（１９９３）（チェン等著、「国際免疫学」、  ５：６４７−６５６（１９９３））、Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：３７２０−３７２４  （１９９３）（テゥアリオン等著、「米国科学アカデミー紀要」、９０：３７２０−３７２４  （１９９３））、Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：６４５３−６４６５（１９９５）（テゥアリオン等筆、「免疫学誌」、１５４：６４５３−６４６５（１９９５））、  Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４：１１７−１２３（１９９３）（チョイ等著、「ネイチャー・ジェネティックス、４：１１７−１２３（１９９３））、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）（ロンバーグ等著、「ネイチャー」、３６８：８５６−８５９（１９９４））、及びＴａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５（１９９２）（テイラー等著、「核酸レビュー」、２０：６２８７−６２９５（１９９２））にも記載されている。
【００５２】
ヒト抗体は、マウスやラットの可変領域及び定常領域の少なくともいずれかを持つ抗体が抱える問題点を回避することができる。そのようなマウスやラット由来の配列は、抗体の素早いクリアランス、又は抗体に対する患者の免疫反応を引き起こす可能性がある。したがって、完全ヒト抗体を用いることによって継続して抗体を投与する必要がある炎症、自己免疫、癌などの長期的で再発しやすい病気を治療する際に重要な利点になり得る。
【００５３】
ここで意味する“小モジュラー免疫薬製品”（ＳＭＩＰ）とは、モノクローナル抗体及び組み換え抗体より強化された薬物特性をもつ非常にモジュラーである化合物の種類である。小モジュラー免疫薬製品（ＳＭＩＰ）は、例えば抗体の可変領域に基づくターゲット特異的結合ドメインを含む１つのポリペプチドを備え、望ましいエフェクタ細胞種（例えばマクロファージとナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）を特異的に採用及び補体媒介死の少なくともいずれかを特異的に採用する可変なＦＣ領域も更に備える。ここで意味する“小モジュラー免疫薬製品”又は“ＳＭＩＰ”と名づけられた融合タンパク質（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）とは、共同所有の米国特開第２００３／１３３９３９号、第２００３／０１１８５９２号、及び第２００５／０１３６０４９と、共同所有の国際特開ＷＯ０２／０５６９１０。ＷＯ２００５／０３７９８９とＷＯ２００５／０１７１４８に記載されており、これらの文献は参考として組み込まれる。
【００５４】
本発明による結合タンパク質は、エフェクタ機能を変化させるように改造されており、その結果ａ）１つ以上の対応Ｆｃ受容体、及びｂ）１つ以上の異なるＦｃ受容体、に対して増加又は減少した親和性及び特異性の少なくともいずれかで結合する。結合タンパク質は、検出可能なレベルでターゲット受容体との反応が行われる場合（例えば、ＥＬＩＳＡ分析などにおいて）、対応又は非対応（ｎｏｎ−ｃｏｇｎａｔｅ）受容体に“特異的に結合”することができ、同条件において関連性のないポリペプチドの反応は検出できないレベルに止まる。このような意味での“特異的な結合”とは一般的に、抗体のＦｃ領域とその領域に対して特異的な受容体の間に起こる非共有相互作用を意味する。
【００５５】
“特異的結合”相互作用の強度、即ち、その親和性は、解離定数（Ｋｄ）で表現することができる。Ｋｄが小さいほど、より強い親和性を意味する。結合特性はこの分野の周知の技術を用いて計ることができる。そのような方法のひとつは、ターゲット特異的結合タンパク質／Ｆｃ受容体複合体の形成率（即ち、結合）を計ることを要し、これらの形成率は複合体の構成要素の濃度、相互作用の親和性、そして結合（ＯＮ）と解離（ＯＦＦ）の両方向に同等の影響を与える幾何学的媒介変数等に依存する。したがって、“ＯＮ率定数”（ＫＯＮ）と“ＯＦＦ率定数”（ＫＯＦＦ）は、濃度や、実際の結合率と解離率を計算することで測定できる。Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９−４７３（１９９０）（デイビーズ等著、「年刊生物化学レビュー」、５９：４３９−４７３（１９９０））を参照。ここで“特異的に結合”が意味するのは、少なくとも１０−６〜１０−９Ｍの解離定数、より一般的には少なくとも１０−７〜１０−９Ｍの解離定数で、結合タンパク質がターゲットＦｃ受容体に結合することを示す。
【００５６】
免疫グロブリン定常領域の構造
本発明の結合タンパク質は、機能できる組合せとして、ＩｇＭ，ＩｇＤ，ＩｇＧ１,ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ，ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２の群から選ばれた１つ以上の免疫グロブリン由来の一つ以上のヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域の少なくともいずれかを備える。例示的な結合タンパク質は、ＩｇＧ１,ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４から選ばれたＩｇＧ免疫グロブリンの１つ以上のヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ２ドメインの少なくともいずれかを備える。ここに具体的に開示されるように、本発明の結合タンパク質は、天然グロブリンのヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの少なくともいずれかに１つ以上のアミノ酸を挿入、除去、及び置き換えの少なくともいずれかを行い、アミノ酸の配列を変化させている。
【００５７】
免疫グロブリンのヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの配列は次の表１に示されており、これらの配列は、アミノ酸配列が公開されるＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＭＧＴ）の、例えばｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／などのホームページから提供されており、ここにおいては配列ＩＤ番号１〜２７として開示する。
【００５８】
表１
ヒト免疫グロブリンＦｃ領域のヒンジドメイン及びＣＨドメインの一次アミノ酸配列
2009538273.tif 000002
2009538273.tif 000003
【００５９】
免疫グロブリンヒンジ領域ペプチドはＩｇＧ，ＩｇＡ，及びＩｇＤ分類の免疫グロブリンに自然発生する。ＩｇＧ１,ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の主な構造的な違いはヒンジ領域の長さである。免疫グロブリン重鎖において、野生型免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドはＣＨ１とＣＨ２領域の間に位置しており、鎖間ジスルフィド結合にかかわるシステイン残基を含む。
【００６０】
この分野において周知であるように、免疫グロブリンは全般的なアミノ酸配列の多大な多様性を見せるが、免疫グロブリンの一次構造は、特定の領域に限っては高い配列保存率を示す。特にこの配列保存率は、そのスルフヒドリル基を介して他のスルフヒドリル基とのジスルフィド結合を可能にするシステイン残基に関しては著しく高い。したがって、本発明による野生型免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドは、１つ以上の高度に保存されたシステイン残基を持つペプチドを含む。野生型のヒトＩｇＧ１のヒンジ領域ポリペプチドは、隣接していない３つのシステイン残基を含み、夫々野生型ヒンジ領域の第１システイン、野生型ヒンジ領域の第２システイン、及び野生型ヒンジ領域の第３システインと呼ばれる。この順番はポリペプチドのアミノ末端からカルボキシ末端への順番である。
【００６１】
免疫グロブリンＩｇＡ，ＩｇＤ，及びＩｇＧのＦｃ領域は１つのＣＨ２そして１つのＣＨ３ドメインを含み、ＩｇＥとＩｇＭのＦｃ領域は１つのＣＨ２、１つのＣＨ３そして１つのＣＨ４ドメインを含む。４つののＩｇＧ下位分類のＦｃ領域（ＩｇＧ１,ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）は９５％を超える配列同一性を示すが、それらの領域は夫々、ＦｃγＲ結合領域に対して劇的に異なる特異性を示す（表２を参照）。
【００６２】
表２
ＩｇＧ免疫グロブリン下位分類間の相対的なヒトＦｃγ受容体認識特異性
2009538273.tif 000004
【００６３】
ある実施形態においては、本発明の結合タンパク質は、ＡＤＣＣ、補体依存性細胞毒性ＣＤＣ及び補体固定の少なくともいずれかを行うことができる。本発明は、１つ以上の対応受容体及び非対応受容体の少なくともいずれかに対する結合タンパク質の結合親和性及び特異性の少なくともいずれかが変化されているにもかかわらず、結合タンパク質が持つＡＤＣＣ、ＣＤＣ及び補体固定の少なくともいずれかによる以外な利点を提供する。抗体の定常領域ドメインをエンコードする配列の操作はモリソン及びオイ（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｉ）による米国特許第６２１８１４９号を参照。
【００６４】
ＩｇＧに基づいた免疫グロブリンのＦｃγ−受容体結合親和性及び特異性の少なくともいずれかを変化させるアミノ酸挿入変異
ある特徴によると、本発明は具体的にＩｇＧ重鎖の、１つ以上のヒンジドメイン、１つ以上のＣＨ２ドメイン及び１つ以上のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかを備える結合タンパク質を提供し、当該結合タンパク質は１つ以上の免疫グロブリン特異的なＦｃ受容体に対する変化された（即ち、増加又は減少）結合親和性及び特異性の少なくともいずれかで結合するように改造されている。ここに提供されるタンパク質は、定常領域の１つ以上のアミノ酸配列に１つ以上のアミノ酸が挿入されたものも含む。ある特徴においては、受容体と直接に接触する１つ以上のアミノ酸配列、受容体と直接に接触するアミノ酸配列に隣接した１つ以上のアミノ酸配列、受容体と直接に接触するアミノ酸配列の遠位に位置する１つ以上のアミノ酸配列、又はこれらの様々な組合せに、夫々１つ以上のアミノ酸残基が挿入される。挿入されるアミノ酸残基は、免疫グロブリンの３次元構造に、局部的又は全体的な構造変化をもたらすことができ、対応受容体に対する結合親和性及び結合特異性の少なくともいずれかを変化させる。
【００６５】
ある実施形態においては、当該挿入されたアミノ酸残基は、対応受容体との結合の際直接に接触する結合タンパク質のヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの少なくともいずれかに既存のアミノ酸配列と同一するアミノ酸配列を含む。そのような実施形態のひとつにおいては、受容体と直接に接触する１つ以上のアミノ酸配列は、受容体に結合する“野生型”のアミノ酸配列に隣接した位置に配置される。ここで意味する“野生型”とは、改造が施される前の結合タンパク質の配列であり、又はそのような結合タンパク質をエンコードするポリヌクレオチドの配列である。
【００６６】
異なる特徴によれば、当該結合タンパク質は、結合タンパク質の定常領域にある野生型の受容体結合配列と同じ鎖の遠位、及び受容体結合配列と異なる鎖の少なくともいずれかに挿入された、野生型の受容体結合配列と同じ受容体結合配列を１つ以上備える。挿入されるアミノ酸の正確な本質とその配列にかかわらず、このような配列の改造はこの分野において日常的に行われるものであり、上記のサンブルーク等による「分子クローニング：研究所マニュアル」などに説明されている。
【００６７】
ここに説明されているのは、具体的にＩｇＧ重鎖の、１つ以上のヒンジドメイン、１つ以上のＣＨ２ドメイン及び１つ以上のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかを備える結合タンパク質であり、当該結合タンパク質は、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の少なくともいずれかを含む１つ以上のＩｇＧ免疫グロブリン特異的受容体を含むが、それらに限られない１つ以上の免疫グロブリン特異的Ｆｃ受容体に対して変化した（即ち、増加又は減少）結合親和性及び特異性の少なくともいずれかで結合するように改造されている。このような結合タンパク質は、当該ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの少なくともいずれかに存在するＦｃγ受容体との結合にかかわる一次配列に１つ以上のアミノ酸が挿入された結合タンパク質を含む。そのような改造は、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の少なくともいずれかを含む１つ以上の免疫グロブリン特異的Ｆｃ受容体に結合する際に、直接に受容体に接触するアミノ酸の間及び隣の少なくともいずれかに挿入される１つ以上のアミノ酸を含むが、これに限られない。
【００６８】
本発明のこれらの特徴に関する具体的な実施形態は、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３の少なくともいずれかのＣＨ２ドメインを１つ以上備える結合タンパク質を含む。そのような実施形態のいくつかは、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３の少なくともいずれかのＣＨ２ドメインにあるヒンジ近位ループ構造であるＬ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｐに１つ以上のアミノ酸の除去及び１つ以上のアミノ酸の挿入の少なくともいずれかを備える結合タンパク質を提供する。ここに具体的に説明されるのは、次のヒンジ近位ループ構造内に“＊”で示される位置に１つのアミノ酸の挿入を１つ備える。したがって、ここに提供されるのは、改造されたヒンジ近位構造であるＬ−Ｌ−＊−Ｇ−Ｇ−Ｐ、Ｌ−Ｌ−Ｇ−＊−Ｇ−Ｐ及びＬ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−＊−Ｐを備える結合タンパク質である。更にここに提供されるのは、Ｌ−Ｌ−＊−Ｇ−Ｇ−Ｐ、Ｌ−Ｌ−Ｇ−＊−Ｇ−Ｐ及びＬ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−＊−Ｐのヒンジ近位ループ構造内に“＊”で示される位置に２個以上のアミノ酸の挿入を１つ備える。したがって、これらの実施形態においては、“＊”は少なくとも２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９又は２０個のアミノ酸の挿入を示す。典型的に、そのように改造されたヒンジ近位ループ構造を持つ結合タンパク質を作るために適切なアミノ酸はＡｌａ，Ｇｌｙ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ及びＶａｌから選ばれる。
【００６９】
他の類似した実施形態は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ３の少なくともいずれかのＣＨ２ドメインを１つ以上備える結合タンパク質を含む。そのような実施形態のいくつかは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ３の少なくともいずれかのＣＨ２ドメインにあるＢＣループ構造であるＤ−Ｖ−Ｓ−Ｈ−Ｅに１つ以上のアミノ酸の除去及びアミノ酸の挿入の少なくともいずれかを備える結合タンパク質を提供する。ここに具体的に説明されるのは、ＢＣループ構造内に“＊”で示された位置に１つのアミノ酸の挿入を１つ備えた結合タンパク質である。したがって、ここに提供されるのは、改造されたＢＣループ構造であるＤ−Ｖ−＊−Ｓ−Ｈ−ＥとＤ−Ｖ−Ｓ−＊−Ｈ−Ｅを備える結合タンパク質である。更にここに提供されるのは、Ｄ−Ｖ−＊−Ｓ−Ｈ−ＥとＤ−Ｖ−Ｓ−＊−Ｈ−ＥのＢＣループ構造内に“＊”で示される位置に２個以上のアミノ酸の挿入を１つ備える結合タンパク質である。したがって、これらの実施形態においては、“＊”は少なくとも２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９又は２０個のアミノ酸の挿入を示す。典型的に、そのように改造されたＢＣループ構造を持つ結合タンパク質を作るために適切なアミノ酸はＡｌａ，Ｇｌｙ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ及びＶａｌから選ばれる。
【００７０】
更なる類似した実施形態は、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３の少なくともいずれかのＣＨ２ドメインを１つ以上備える結合タンパク質を提供する。このような実施形態のいくつかはＣＨ２ドメインのＦＣループ構造であるＡ−Ｌ−Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｉ内に１つ以上のアミノ酸の除去及びアミノ酸の挿入の少なくともいずれかを備える結合タンパク質を提供する。ここに具体的に説明されているのは、ＦＣループ構造内に“＊”で示された位置に１つのアミノ酸の挿入を１つ備えた結合タンパク質である。したがって、ここに提供されるのは、改造されたＦＣループ構造であるＡ−Ｌ−＊−Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｉ、Ａ−Ｌ−Ｐ−＊−Ａ−Ｐ−Ｉ及びＡ−Ｌ−Ｐ−Ａ−＊−Ｐ−Ｉを備える結合タンパク質である。更にここに提供されるのは、Ａ−Ｌ−＊−Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｉ、Ａ−Ｌ−Ｐ−＊−Ａ−Ｐ−Ｉ及びＡ−Ｌ−Ｐ−Ａ−＊−Ｐ−ＩのＦＣループ構造内に“＊”で示される位置に２個以上のアミノ酸の挿入を１つ備える結合タンパク質である。したがって、これらの実施形態においては、“＊”はの少なくとも２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９又は２０個のアミノ酸の挿入を示す。典型的に、そのように改造されたＦＣループ構造を持つ結合タンパク質を作るために適切なアミノ酸はＡｌａ，Ｇｌｙ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ及びＶａｌから選ばれる。
【００７１】
挿入された１つ目の受容体結合配列と挿入された２つ目の受容体結合配列の間、又は挿入された２つ目の受容体結合配列と挿入された３つ目の受容体結合配列の間などに挟れるアミノ酸の数は０個のアミノ酸残基から約２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０、３１、３２、３３、３４、３５，３６，３７，３８，３９，４０，４１，４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９，５０又はそれ以上のアミノ酸残基までに及ぶ。挿入された１つ目の受容体結合配列と挿入された２つ目の受容体結合配列の間、又は挿入された２つ目の受容体結合配列と挿入された３つ目の受容体結合配列の間などにアミノ酸が挟れる場合、そのの正確な数は受容体結合親和性を向上させる幅広い数が適用される。２つ以上の受容体結合部位を備える改造された結合タンパク質において、受容体結合配列の間に挟まれるアミノ酸残基の数は同じでも良く、異なっても良い。このようなスペーサ領域のアミノ酸残基は、結合親和性を分析することによって具体的に選んでも良く、ランダムに選んでも良い。
【００７２】
ある例示的な実施形態においては、結合タンパク質の機能、例えばＧ−ＳＭＩＰ機能は、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６）の少なくともいずれかに対する結合を増加又は減少させるように変化させ得る。これらの実施形態のある特徴においては、免疫グロブリンのそのような機能変化は、対応するＡＤＣＣを増加又は減少させるために効果的である。そのような実施形態においては、当該結合タンパク質は、Ｆｃγループに上記のようなアミノ酸を挿入及び除去の少なくともいずれかを行うことによって機能が変化されたＧ−ＳＭＩＰである。関連する実施形態においては、当該結合タンパク質は、ＦｃγＲ及びＣ１ｑの少なくともいずれかに接続するループの部位を変更することによって機能が変化されたＧ−ＳＭＩＰである。例えば、ＦｃγＲとの結合する表面を変化させるため、又はＣ１ｑへの結合を減少させるために、アミノ酸の挿入及び除去の少なくともいずれかを行い得る。
【００７３】
結合タンパク質のアミノ酸配列に挿入されるアミノ酸残基は、例えば、免疫グロブリンアミノ酸配列をエンコードするポリヌクレオチドへの挿入変異、又はここに説明される特定の領域におけるランダム変異によって挿入することができる。
【００７４】
ＦｃγＲＩとの結合、ＦｃγＲＩＩとの結合、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃαＲＩＩＩとの結合は、下記のような周知の方法を用いて夫々ＣＤ６４，ＣＤ３２、ＣＤ１６，及びＣＤ８９との結合を測ることで行うことができる。
【００７５】
ＩｇＧに基づいた免疫グロブリンＦｃγ受容体結合親和性及び特異性の少なくともいずれかを変化させるグリコシル化配列を含む変異
ここに説明されるように、本発明の結合タンパク質は、特定の実施形態によれば追加的にグリコシル化部位を好ましく備える。当該グリコシル化は、例えば単糖又は多糖のような炭水化物の共有結合を意味する。ポリペプチドのグリコシル化の基質となるアミノ酸配列を挿入することは、関係する分野の範囲内にあり、例えば、典型的なＮ−（アスパラギン）結合型グリコシル化の配列であるＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、又はＯ−結合型グリコシル化に適切なＳｅｒ又はＴｈｒを含む配列、又はＣ−結合型マンノシル化される配列、グライピデーション（ｇｌｙｐｉｄａｔｉｏｎ）／グリコシルフォスファティディルイノシトール（ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）改造、又はフォスフォグリケーション（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃａｔｉｏｎ）など全て周知である（例えばＳｐｉｒｏ，  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １２：４３Ｒ（２００２）（スパイロ著、「グリコバイオロジ」、１２：４３Ｒ（２００２））ポリペプチド配列を得るために使われる遺伝子工学的又はタンパク質工学的方法を含む。
【００７６】
免疫グロブリンのＣＨ２のＤＥループにおけるＮ−結合型グリコシル化はそのＣＨ２ドメインの構造を変化させ、糖質とＦｃγＲとの直接な接触を提供する。免疫グロブリン糖型における改造は、アミノ酸配列ＹＮＳＴＹのようなＮ−結合型グリコシル化部位を備えるアミノ酸配列を１つ以上挿入することで達成し得る。そのような新たな糖型はＦｃγＲ結合特性を持ち得る。そのような実施形態における異なる特徴によれば、ＣＨ２のＤＥループに２番目のＮ−結合型グリコシル化部位を挿入し得る。例えば、野生型のＹＮＳＴＹをＹＮＳＴＹＮＳＴＹに変換し得る。そのような免疫グロブリンの改造はＦｃγＲ結合を大いに影響し、したがってＡＤＣＣにも大いに影響する。
【００７７】
Ｎ−結合型グリコシル化、特にＡｓｎ２９７におけるＮ−結合型グリコシル化は、ＩｇＧ分類の免疫グロブリン対応Ｆｃγ受容体に対する結合に不可欠なものであることが証明されている。したがって、例えばＡｓｎ２９７をＡｌａ２９７に変異させるとＦｃγＲＩが認識されなくなる。同様に、Ａｓｎ２９７にＮ−結合型グリコシル化がされていない場合、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ（更に補体Ｃ１ｑ）の認識及び／又は活性化はなくなるが、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａとリウマチ因子の結合は影響されない。Ｎ−又はＯ−結合型グリコシル化配列は周知であり、例えばＧｏｏｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．１７８：１１９４−１２０１（１９９１）（グーリ等著、「ＢＢＲＣ誌」、１７８：１１９４−１２０１（１９９１））及びＰｉｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３：４２９−４３５（１９９３）（ピサノ等著、「グリコバイオロジ」、３：４２９−４３５（１９９３））等に説明されている。
【００７８】
特定の特徴においては、本発明は、1つ以上のＯ−結合型グリコシル化部位及び1つ以上のＮ−結合型グリコシル化部位のいずれかを備える1つ以上の、ヒンジ領域免疫グロブリンループ、及び定常領域免疫グロブリンループの少なくともいずれかにされる1個以上の、アミノ酸の挿入及び1個以上のアミノ酸の除去の少なくともいずれかを含む改造を提供する。
【００７９】
したがって、本発明は、具体的に重鎖の、１つ以上のヒンジドメイン、１つ以上のＣＨ２ドメイン及び１つ以上のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかを備える結合タンパク質を提供し、当該結合タンパク質は、当該重鎖のヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの少なくともいずれかに1つ以上の改造を備えており、当該改造は、1つ以上のＮ−結合型グリコシル化配列の挿入及び1つ以上のＯ−結合型グリコシル化配列の挿入の少なくともいずれかを備え、当該グリコシル化配列は、挿入位置でＮ−結合型グリコシル化及びＯ−結合型グリコシル化の少なくともいずれかを行うのに十分であり、その結果1つ以上の免疫グロブリン特異的Ｆｃ受容体又は他のターゲットタンパク質に対する当該結合タンパク質の結合親和性及び特異性の少なくともいずれかを変化させる（即ち、増加又は減少）。このような分類のタンパク質としては、例えば、改造されていない結合タンパク質に存在するグリコシル化にかかわる、領域、ドメイン及びループ構造の少なくともいずれかの、近位及び遠位の少なくともいずれかの位置にある一次アミノ酸配列に改造を備えるタンパク質を含む。
【００８０】
ここに説明されるのはＩｇＧ重鎖の、1つ以上のヒンジドメイン、１つ以上のＣＨ２ドメイン及び１つ以上のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかを備える結合タンパク質であり、当該結合タンパク質は当該ＩｇＧ重鎖の、1つ以上のヒンジドメイン、１つ以上のＣＨ２ドメイン及び１つ以上のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかに1つ以上の改造を備え、当該改造は1つ以上のＮ−結合型グリコシル化配列の挿入及び1つ以上のＯ−結合型グリコシル化配列の挿入の少なくともいずれかを備え、当該グリコシル化配列は、挿入位置でＮ−結合型グリコシル化及びＯ−結合型グリコシル化の少なくともいずれかを行うのに十分であり、その結果、対応するＩｇＧ重鎖の、改造されていない1つ以上のヒンジドメイン、改造されていない１つ以上のＣＨ２ドメイン及び改造されていない１つ以上のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかを備える結合タンパク質に比べ、1つ以上の、免疫グロブリン特異的Ｆｃ受容体であるＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の少なくともいずれかに対する、当該結合タンパク質の結合親和性及び特異性の少なくともいずれかを変化させる（即ち、増加又は減少）。
【００８１】
本発明のこれらの特徴に関する具体的な実施形態は、ＩｇＧの、１つ以上のヒンジドメイン、１つ以上のＣＨ２ドメイン及び１つ以上のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかを備える結合タンパク質であり、当該ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの少なくともいずれかは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の少なくともいずれかの、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの少なくともいずれかである。そのような実施形態の幾つかは、対応する天然ＩｇＧ免疫グロブリンのＩｇＧ１の、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインの少なくともいずれかにあるＮ−結合型グリコシル化部位及びＯ−結合型グリコシル化部位の少なくともいずれかの、近位及び遠位の少なくともいずれかに、１）1つ以上のＮ−結合型グリコシル化配列であるＮ−Ｘ−（Ｓ／Ｔ）（Ｘは如何なるアミノ酸）と、２）1つ以上のＯ−グリコシル化配列である、Ｘ−Ｐ−Ｘ−Ｘ（少なくとも1つのＸはＴ）、Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｘ（少なくとも1つのＸはＴ）、Ｘ−Ｘ−Ｔ−Ｘ（少なくとも1つのＸはＲ又はＫ）及びＳ−Ｘ−Ｘ−Ｘ（少なくとも1つのＸはＳ）の少なくともいずれかとの、２つグリコシルか配列の少なくともいずれかが挿入される結合タンパク質である。このような実施形態の特定の特徴においては、当該結合タンパク質はＦｃγＲに対する結合親和性及び特異性の少なくともいずれかが変化される（即ち、増加又は減少）。
【００８２】
ここに説明されるのはそのような実施形態であり、当該結合タンパク質は、1つ以上のＩｇＧヒンジドメイン、1つ以上のＩｇＧのＣＨ２ドメイン、及び1つ以上のＩｇＧのＣＨ３ドメインの少なくともいずれかを備えており、当該結合タンパク質は更に、Ｎ−結合型グリコシル化配列であるＮ−Ｘ−（Ｓ／Ｔ）（Ｘは如何なるアミノ酸）が1つ以上挿入されている。例えば、本発明は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のＣＨ２ドメインの少なくともいずれかにあるＤＥループに存在する天然のＮ−Ｓ−Ｔ配列に隣接した位置に1つ以上のＮ−Ｘ−（Ｓ／Ｔ）配列が挿入された結合タンパク質を提供する。これらの実施形態の特定な特徴においては、当該結合タンパク質は、変更された（即ち、増加又は減少）ＦｃγＲに対する結合親和性及び特異性の少なくともいずれかを示す。
【００８３】
そのような具体的な実施形態においては、当該ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のＣＨ２ドメインの少なくともいずれかにあるＤＥループに存在するＮ−結合型グリコシル化配列はＮ−Ｓ−Ｔのアミノ酸配列を備えており、天然のＮ−Ｓ−Ｔ配列に隣接した位置、アミノ末端方向のアミノ酸100個以内の位置、及びカルボキシ末端方向のアミノ酸１００個以内の位置の少なくともいずれかに挿入され、その結果、天然アミノ酸配列であるＸ−Ｎ−Ｓ−Ｔ−Ｚは（ＡＡａ−Ｎ−Ｓ−Ｔ−（ＡＡｂ）−Ｎ−Ｓ−Ｔ−（ＡＡｃ）に改造され、ＡＡａ、ＡＡｂ及びＡＡｃは、夫々１から１００個のアミノ酸を独立して指す。
【００８４】
そのような具体的な実施形態において、当該ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のＣＨ２ドメインの少なくともいずれかにあるＤＥループに存在するＮ−結合型グリコシル化配列はＮ−Ｓ−Ｔのアミノ酸配列を備え、天然のＮ−Ｓ−Ｔ配列に隣接した位置に挿入され、その結果、天然のアミノ酸配列Ｘ−Ｎ−Ｓ−Ｔ−Ｚは、Ｘ−Ｎ−Ｓ−Ｔ−Ｚ−Ｎ−Ｓ−Ｔ−Ｚに改造され、ここのＸとＺは、独立して、Ｔｙｒ（Ｙ）及びＰｈｅ（Ｆ）から選ばれる。
【００８５】
そのような異なる実施形態においては、当該ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかにあるＢＣループに挿入されたＮ−結合型グリコシル化配列は、Ｎ−Ｓ−Ｔのアミノ酸配列を備えており、天然のＮ−Ｓ−Ｔ配列の遠位に挿入され、その結果、天然のアミノ酸配列であるＹ−Ｐ−Ｓ−Ｄ−Ｉ−ＡはＹ−Ｐ−Ｎ−Ｓ−Ｔ−Ｓ−Ｄ−Ｉ−Ａ及びＹ−Ｎ−Ｓ−Ｔ−Ｐ−Ｓ−Ｄ−Ｉ−Ａに改造される。
【００８６】
異なる特徴においては、本発明は具体的に、ＩｇＧ重鎖の、1つ以上のヒンジドメイン、１つ以上のＣＨ２ドメイン及び１つ以上のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかを備えた結合タンパク質を提供し、当該結合タンパク質は当該ＩｇＧ重鎖の、1つ以上のヒンジドメイン、１つ以上のＣＨ２ドメイン及び１つ以上のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかにおいて少なくとも１つ以上の改造を備えており、当該改造は1つ以上のＮ−結合型グリコシル化配列及び1つ以上のＯ−グリコシル化配列の少なくともいずれかの挿入を備え、当該グリコシル化配列は、挿入位置でＮ−結合型グリコシル化及びＯ−結合型グリコシル化の少なくともいずれかを行うのに十分であり、その結果、対応するＩｇＧ重鎖の、改造されていない1つ以上のヒンジドメイン、改造されていない１つ以上のＣＨ２ドメイン及び改造されていない１つ以上のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかを備える結合タンパク質に比べ、1つ以上の、免疫グロブリン特異的Ｆｃ受容体であるＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の少なくともいずれかに対する当該結合タンパク質の結合親和性及び特異性の少なくともいずれかを変化させる（即ち、増加又は減少）。このような分類のタンパク質としては、例えば、改造されていない結合タンパク質に存在するグリコシル化にかかわる領域、ドメイン及びループ構造の少なくともいずれかの、近位及び遠位の少なくともいずれかの位置にある一次アミノ酸配列に改造を備えるタンパク質を含む。
【００８７】
そのような改造は、例えば、結合した際に、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の少なくともいずれかを含む1つ以上の免疫グロブリン特異的Ｆｃ受容体と接触するアミノ酸の間及びそのようなアミノ酸に隣接した位置にＮ−結合型グリコシル化のためのＹＮＳ配列を含む３個以上のアミノ酸の挿入を含む。
【００８８】
ここで説明される実施形態におけるこのような特徴は、Ｇ−ＳＭＩＰと呼ばれるＩｇＧ部類の免疫グロブリンのＣＨ２ドメインにあるＤＥループ内に、改造を提供する。Ｇ−ＳＭＩＰはＮ−結合型グリコシル化部位でありＦｃγＲと接触する部位であるＹＮＳＴＹのアミノ酸配列を1つ以上含む。
【００８９】
対応受容体と他の受容体に対する結合特異性を両方持つ結合タンパク質
更なる特徴において、本発明は第１の免疫グロブリン部類の1つ以上の免疫グロブリンループを、第２の免疫グロブリン部類の1つ以上の第２の免疫グロブリンループで置き換えることによって新たな機能が与えられた結合タンパク質を提供し、当該第２の免疫グロブリンループは、対応する改造されていない結合タンパク質には存在しない新たな結合特異性を与える。
【００９０】
本発明のこれらの特徴による結合タンパク質は、第１の免疫グロブリン分類（即ち、ＩｇＡ，ＩｇＤ、ＩｇＥ，ＩｇＧ又はＩｇＭ）重鎖の、1つ以上のヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインの少なくともいずれかを備え、当該結合タンパク質は第１の免疫グロブリン部類の重鎖の、１つ以上のヒンジドメイン、１つ以上のＣＨ２ドメイン、及び１つ以上のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかの１次アミノ酸配列が改造され（即ち、アミノ酸の置き換え及びアミノ酸の挿入の少なくともいずれか）、その結果、第１の免疫グロブリン部類とは異なる第２の免疫グロブリン部類に対する１つ以上の対応Ｆｃ受容体に結合できる結合タンパク質が生成される。そのような改装は、例えば、第１の免疫グロブリンドメインの１つ以上の、ループ又はそのアミノ酸及びペプチド部分の少なくともいずれかを、第２の免疫グロブリンドメインの１つ以上の、ループ又はそのアミノ酸及びペプチド部分の少なくともいずれかを用いてされた置き換え及びリモデリングの少なくともいずれかを含み、当該第２の免疫グロブリンドメインは、第２免疫グロブリン特異的Ｆｃ受容体との結合する配列の少なくとも一部を形成する１つ以上のアミノ酸を備える。本発明のこれらの特徴による結合タンパク質は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩの少なくともいずれかに特異的に結合でき、さらにＦｃαＲに特異的に結合できる。
【００９１】
ここに説明されるのはＩｇＧ重鎖の、１つ以上のヒンジドメイン、１つ以上のＣＨ２ドメイン及び１つ以上のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかを備える結合タンパク質であり、当該結合タンパク質は、ＩｇＡ免疫グロブリン特異的受容体であるＦｃαＲ（ＣＤ８９）を非限定的に含む１つ以上の非ＩｇＧ免疫グロブリン特異的Ｆｃ受容体に結合するように改造されている。このような結合タンパク質は、たとえば、ＩｇＧ重鎖の、１つ以上のヒンジドメイン、１つ以上のＣＨ２ドメイン及び１つ以上のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかの１次アミノ酸配列の改造を備える結合タンパク質を含み、その改造は、例えばＦｃα受容体のような非ＩｇＧ免疫グロブリン特異的Ｆｃ受容体に結合できるアミノ酸配列を生成する。
【００９２】
そのような特定な実施形態においては、ＩｇＧ重鎖の、１つ以上のヒンジドメイン、１つ以上のＣＨ２ドメイン及び１つ以上のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかを備える結合タンパク質が提供され、当該結合タンパク質はＩｇＡ免疫グロブリン特異的受容体のＦｃαＲ（ＣＤ８９）に結合するように改造されている。そのような例示的な結合タンパク質は、ＩｇＧのＣＨ３ＦＧループ及びＩｇＧのＣＨ３ＣＤループの少なくともいずれかに、１つ以上のアミノ酸の置き換えを備える。
【００９３】
例えば、そのような結合タンパク質の一例として、アミノ酸配列Ｃ−Ｓ−Ｖ−Ｍ−Ｈ−Ｅ−Ａ−Ｌ−Ｈ−Ｎ−Ｈ−Ｙ−Ｔ−Ｑを含むＩｇＧのＣＨ３ＦＧループを、アミノ酸配列Ｃ−Ｍ−Ｖ−Ｇ−Ｈ−Ｅ−Ａ−Ｌ−Ｐ−Ｌ−Ａ−Ｆ−Ｔ−Ｑ又はその一部を含むＩｇＡのＣＨ３ＦＧループで置き換えた改造を備える。
【００９４】
もう１つの例示的な結合タンパク質は、アミノ酸配列Ｑ−Ｐ−Ｅ−Ｎを含むＩｇＧのＣＨ３ＣＤループを、アミノ酸配列Ｑ−Ｅ−Ｌ−Ｐ−Ｒ−Ｅ又はその一部を含むＩｇＡのＣＨ３ＣＤループで置き換えた改造を備える。
【００９５】
更なる例示的な結合タンパク質は、アミノ酸配列Ｃ−Ｓ−Ｖ−Ｍ−Ｈ−Ｅ−Ａ−Ｌ−Ｈ−Ｎ−Ｈ−Ｙ−Ｔ−Ｑを含むＩｇＧのＣＨ３ＦＧループを、アミノ酸配列Ｃ−Ｍ−Ｖ−Ｇ−Ｈ−Ｅ−Ａ−Ｌ−Ｐ−Ｌ−Ａ−Ｆ−Ｔ−Ｑ又はその一部を含むＩｇＡのＣＨ３ＦＧループで置き換えた改造と、かつ、アミノ酸配列Ｑ−Ｐ−Ｅ−Ｎを含むＩｇＧのＣＨ３ＣＤループを、アミノ酸配列Ｑ−Ｅ−Ｌ−Ｐ−Ｒ−Ｅ又はその一部を含むＩｇＡのＣＨ３ＣＤループで置き換えた改造を、両方備える。
【００９６】
上記の結合タンパク質の実施形態はいずれも、ＩｇＧ重鎖ＣＨ３にあるＭｅｔ（Ｋ−Ｄ−Ｔ−Ｌ−Ｍ２８−Ｉ−Ｓ−Ｒ−Ｔの配列の中にあるＣＨ３アミノ酸配列の第２８番目のアミノ酸）をＬｅｕに置き換え、Ｋ−Ｄ−Ｔ−Ｌ−Ｌ２８ーＩ−Ｓ−Ｒ−Ｔのアミノ酸配列を更に備え得る。代わりに又は追加的に、上記の結合タンパク質の実施形態はいずれも、ＩｇＧ重鎖ＣＨ３にあるＧｌｕ（Ｄ−Ｉ−Ａ−Ｖ−Ｅ１５７−Ｗ−Ｅ−Ｓ−Ｎの配列の中にあるＣＨ３アミノ酸配列の第１５７番目のアミノ酸）をＡｒｇに置き換え、Ｄ−Ｉ−Ａ−Ｖ−Ｒ１５７−Ｗ−Ｅ−Ｓ−Ｎのアミノ酸配列を更に備え得る。
【００９７】
ここに説明されるように、特定の実施形態においては、ＩｇＧ重鎖の、１つ以上のヒンジドメイン、１つ以上のＣＨ２ドメイン及び１つ以上のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかを備えるＩｇＧに基づいた結合タンパク質に、非ＦｃγＲとの結合接触部を含むループを挿入し、当該結合タンパク質は１つ以上の、ＩｇＡ免疫グロブリン特異的Ｆｃ受容体であるＦｃαＲ（ＣＤ８９）を非限定的に含む非ＩｇＧ免疫グロブリン特異的Ｆｃ受容体に結合するように改造されている。このような結合タンパク質は、例えばＦｃα受容体のような非ＩｇＧ免疫グロブリン特異的Ｆｃ受容体に結合できるアミノ酸配列を生成する１つ以上の改造を、ＩｇＧ重鎖の、１つ以上のヒンジドメイン、１つ以上のＣＨ２ドメイン及び１つ以上のＣＨ３ドメインの少なくともいずれかに備えた結合タンパク質を含む。そのような改造は、例えば、１つ以上のＩｇＧ免疫グロブリンループを、非ＩｇＧ免疫グロブリンループ及びそのアミノ酸部分の少なくともいずれかで置き換え及びリモデリングの少なくともいずれかを行い、当該非ＩｇＧ免疫グロブリンループは非ＩｇＧ免疫グロブリン特異的Ｆｃ受容体に結合する配列を備える。
【００９８】
特定の実施形態においては、当該結合タンパク質はＧ−ＳＭＩＰであり、当該Ｇ−ＳＭＩＰの機能は変化されており、その結果、当該Ｇ−ＳＭＩＰはＣＤ８９のような１つ以上のＦｃαに結合する。ＩｇＧのＣＨ３ドメインにある複数のループは、新たな分子相互作用及び改造された分子相互作用の少なくともいずれかを提供するために、上記のように加工されている。例えば、ＩｇＧのヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３の少なくともいずれかのアミノ酸は、ＩｇＡとＦｃαＲとの結合にかかわる、ＩｇＡのヒンジのアミノ酸、ＣＨ２のアミノ酸及びＣＨ３のアミノ酸で置き換えられ得る。例えば、上記に結合タンパク質全般に関して述べたように、当該ＩｇＧのＣＨ３にあるＦＣループは、ＩｇＡのＣＨ３のＦＧループとその他のＦｃαＲと接触するアミノ酸で置き換えられ得る。変わりに又は追加的に、当該ＩｇＧのＣＨ３にあるＣＤループは、ＩｇＡのＣＨ３のＣＤループとその他のＦｃαＲと接触するアミノ酸で置き換えられ得る。例示的なＧ−ＳＭＩＰは、２Ｈ７−０１８０１４と指名された、ヒト化された抗体のアミノ末端を備える。例えばＦｃαＲに結合する機能を与えるようなアミノ酸を備えるＧ−ＳＭＩＰは、改造されていないＧ−ベースＳＭＩＰの利点をそのまま持っており、その利点とは、例えば長いインビボ半減期、プロテインＡによる精製の容易さ及びＩｇＧエフェクター機能の少なくともいずれかである。
【００９９】
更なる実施形態は、当該結合タンパク質の、例えばＴ細胞表面のタンパク質、骨髄性細胞表面のタンパク質、及び非免疫性細胞タンパク質などの非抗体受容体に対する結合特異性に関する改造を提供する。
【０１００】
変化されたエフェクター昨日を持つ結合タンパク質の生成、発現、そして機能評価の方法
ここに提供されているように、結合タンパク質が一旦設計されると、当該結合タンパク質をエンコードするＤＮＡを含むポリヌクレオチドは、全体又は部分的に、Ｓｉｎｈａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１２：４５３９−４５５７（１９８４）（シンハ等著、「核酸レビュー」、１２：４５３９−４５５７（１９８４））に記載のオリゴヌクレオチド合成、又はＩｎｎｉｓ，  Ｅｄ．“ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９０）（イニス扁、「ＰＣＲプロトコール」（アカデミックプレス出版、１９９０））そしてＢｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２６７：１６７１２−１６１１８（１９９２）（ベター等著、「生物化学誌」、２６７：１６７１２−１６１１８（１９９２））に記載のＰＣＲによって作ることができる。このような改造された、又は改造されていない結合タンパク質の配列分析、クローニング、そして発現は、例えばＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９）（オースベル等著、「分子生物学におけるの現在のプロトコール」、ニューヨーク、ジョーンワイリ・アンド・サンズ出版、１９８７）、そしてＲｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ２：８４−９３（１９９１）（ロビンソン等著、「ヒト抗体ハイブリドーマズ」、２：８４−９３（１９９１））などから分かるように、この分野において周知技術である。本発明の結合タンパク質は真核細胞系で発現し（例えば、ＣＨＯ細胞系）、プロテインＡクロマトグラフィーを用いて精製、そして機能分析で評価し得る。
【０１０１】
発現は、この分野に周知の一般的な哺乳類発現システムであればどれでも良く、該結合タンパク質をエンコードするＤＮＡ断片を、例えばｐＤ１８のような哺乳類発現ベクターの中にクローンすることで行い得る。陽性のクローンはＱＩＡＧＥＮプラスミドプレパレーションキット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて増幅し得る。これから得られた組み換えプラスミドＤＮＡは、可欠領域を切断する適切な制限エンドヌクリアーゼで線状化し、フェノール抽出で精製、そして組織培養基（例えば、Ｅｘｃｅｌｌ  ３０２，カタログ番号１４３１２‐７９Ｐ、ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ）に再懸濁し得る。トランスフェクションに適合な細胞は、例えば、対数増殖期のＣＨＯ  ＤＧ４４細胞などがある。細胞はトランスフェクション毎に集められ、線状化されたＤＮＡはトランスフェクション又はエレクトロポレーションを行うために細胞に加える。例えば、本発明の結合タンパク質は、例えば、ＣＭＶプロモータ制御の下に配置された、結合タンパク質をエンコードするｃＤＮＡを含むｐＤ１８のような選択、増幅可能なプラスミドをＣＨＯ細胞にエレクトロポレーションすることで、安定した生成が得られ得る。（全ての細胞系はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから入手できる）。当該結合タンパク質のｃＤＮＡを含む発現カセットは、適合なプロモータ（例えばＣＭＶプロモータ）の下流にサブクローンされ得る。
【０１０２】
トランスフェクションされた細胞は、非選択的培養基で一晩回復させ、次に９６ウェルの平らな底面を持つプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に、選択剤（例えば、ＤＨＦＲに対する抵抗力を持つ場合は、１００ｎＭのメトトレキサート）を含む適合な培養基（例えばＥｘｃｅｌｌ３０２コンプリート・ミディアム）を用いる連続希釈法で、例えば１２５細胞／ウェル〜２０００細胞／ウェルのような異なる密度で選択的プレーティングを行う。マスターウェルからの培養上清液は連続希釈され、該当する結合タンパク質のリガンドを発現する細胞へ結合するかスクリーニングされる。
【０１０３】
結合タンパク質を発現するＣＨＯ細胞の上清液を集め、０．２μＭフィルタにろ過し、プロテインＡ−アガロース（ＩＰＡ３００クロースリンク・アガロース）コラム（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ，  Ｎｅｅｄｈａｍ、ＭＡ）にろ過する。このコラムはＰＢＳでワッシュされ、コラムに結合したタンパク質はｐＨ３の０．１Ｍクエン酸塩バッファー液で溶離される。溶離されたタンパク質のフラクションは集められ、１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０のバッファー液で中性化され、次にＰＢＳで透析される。精製された結合タンパク質の濃度は２８０ｎｍでの吸収を用いて測定し得る。
【０１０４】
結合タンパク質は、例えばＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃαＲの少なくともいずれかとの結合、又は特定の抗原に対する結合活性、及びＨａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｄｓ．“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，”第１４章（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８８）（ハルブロー等著、「抗体：研究所マニュアル」、第１４章、コールド・スプリング・ハーバ、１９８８）及びＭｕｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０−２３９（１９８０）（マンソン等著、「分析生物化学」、１０７：２２０−２３９（１９８０））に記載の具体的な抗原結合活性、更には周知であるＡＤＣＣ及びＣＤＣなどの、希望される機能に関して分析され得る。ＡＤＣＣ分析法及びＣＤＣ分析法、二次インビトロ抗体反応、周知のマーカ抗原システムを用いる様々な抹消血又はリンパ性単核球の部分母集団（ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）のフローイミュノサイトフロロメトリック分析（ｆｌｏｗ  ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎａｌｙｓｅｓ）、免疫組織化学、及び他の該当分析法は、全てＲｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｄｓ．“Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，１９９７）（ローズ等著及び扁、「臨床研究免疫学のマニュアル」、米国微生物学会、ワシントンＤＣ、１９９７）を参照し、ここに提供する。
【０１０５】
結合タンパク質のＡＤＣＣを引き起こす能力は、適合な如何なる細胞系と末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）をエフェクター細胞として測定し得る。例えば、ＣＤ２０特異的結合タンパク質の場合、適合な細胞系はＢ細胞系のＲａｍｏｓ及びＢｊａｂを含む。エフェクターとターゲットの比率は、例えば、１００：１、５０：１、及び１０：１等、典型的に様々であり、この比率は、ウェル当りの細胞数を一定に保ちながらＰＢＭＣｓの数を変えることによって調整する。ターゲット細胞は５１Ｃｒ（例えばＮａ２５１ＣｒＯ４）でラベルされ、ウェル当り５ｘ１０４細胞の密度で等分される。１０μｇ／ｍｌの精製された結合タンパク質が様々なＰＭＢＣｓの希釈液に加えられる。自然放出は、ＰＢＭＣｓ及び結合タンパク質を加えずに測り、最大放出は該当するウェルに界面活性剤（１％のＮＰ−４０）を加えて測る。インキュベーション後、培養上清液は集められ、ガンマシンチレーション・カウンタ（例えば、Ｌｕｍａｐｌａｔｅ；Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で数えられる。総細胞溶解と自然細胞溶解は、ターゲット細胞を夫々０．２％ＳＤＳと完全培養基でインキュベートして測定する。細胞溶解の割合は次の関数で計算される：
細胞溶解（％）＝（サンプルの放出−自然放出）／（総溶解放出−自然放出）Ｘ１００
細胞溶解の割合は、Ｐｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．1：５１−６３（１９８１）（プロス等著、「臨床免疫学誌」、1：５１−６３（１９８１））に記載の指数フィット関数（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｆｉｔ  ｅｑｕａｔｉｏｎ）を用いて得られるＬＵ（溶解単位、Ｌｙｓｉｓ  Ｕｎｉｔ）で表現される。１ＬＵは、２０％のターゲット細胞の溶解を得られるエフェクター細胞の数であると定義されている。
【０１０６】
ＣＤＣも（上記ＡＤＣＣのように）同様に、ＰＢＭＣｓの存在下で５１Ｃｒでラベルされたターゲット細胞を用いて行い得る。ラベルされた細胞は一般的に、夫々異なる濃度の結合タンパク質を含む９６ウェルのプレートに、１ウェル当り２０００細胞の密度でプレートされ、１：１００の最終希釈比率のラビット補体（Ｐｅｉ−Ｆｒｅｅｚ，  Ｒｏｇｅｒｓ，  ＡＫ）を加え３７℃で１時間インキュベートする。ターゲット細胞が含まれたウェルに正常なドナー（供血者）からのヒト血清を加え３７℃でインキュベートする。コントロールとして加熱不活性化した血清を用い、補体特異的細胞溶解のみを測れるようにしても良い。結合タンパク質によるＣＤＣは、補体だけによるターゲット細胞溶解をさし引くことで決定される。
【０１０７】
ＦｃＲ結合は、溶解性のＦｃＩｇ（例えば、ＣＤ６４Ｉｇ、ＣＤ３２Ｉｇ、ＣＤ１６Ｉｇ、及びＣＤ８９Ｉｇ）及びそれらのＦｃ受容体を発現する細胞（例えば、ＣＤ６４＋、ＣＤ３２＋、ＣＤ１６＋及びＣＤ８９＋）の少なくともいずれかに対する結合を評価することによって分析及び定量化できる。ＦｃＲの関与と活性化は、例えば、白血球（例えばＵ９３７細胞）によるスーパーオキシドの生成を介して測り得る。
【０１０８】
変化されたエフェクター機能を持つ結合タンパク質の考えられる使用法
本発明の結合タンパク質は、様々な治療への応用に役に立つ。
【０１０９】
上記及び下記に説明されるように、特定の実施形態において、本発明は１つ以上のアミノ酸が挿入された免疫グロブリンの、ヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域の少なくともいずれかを備える結合タンパク質を提供し、当該免疫グロブリンは、１つ以上のＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の少なくともいずれかに対して、変化した（即ち、増加又は減少）結合親和性及び特異性の少なくともいずれかを示す。
【０１１０】
この部類の結合タンパク質の考えられる使用法は、例えば、Ａ）少ない数のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は機能の低下したＮＫ細胞を持つ患者、及びＢ）改良された効能を持つ改造された結合タンパク質を利用することによって良い効果を得られる患者、の少なくともいずれかにおいて、細胞数のターゲットされた減少などを含む。そのような結合タンパク質の考えられる異なる使用法は、細菌性、寄生性及びウイルス性の少なくともいずれかによる感染の治療を含み、その場合１つ以上のＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩの少なくともいずれかに対する結合の増加又は減少は、病原体の中性化又は除去を増加させる。このようなＦｃγＲとの結合活性の変化は、感染病の治療に役に立ち、感染はＨＩＶ−１などを非限定的に含む病気における抗体とＦｃγＲとの相互作用によって促進され得る。
【０１１１】
代替の実施形態では、野生型の免疫グロブリンＦｃ領域のＮ−結合型及びＯ−結合型グリコシル化部位の少なくともいずれかの、近位及び遠位の少なくともいずれかに、１つ以上のＮ−結合型グリコシル化配列及びＮ−結合型グリコシル化配列の少なくともいずれか（例えば、１つ以上のＮ−結合型グリコシル化配列であるＮ−Ｘ−（Ｓ／Ｔ）、及び、１つ以上のＯ−結合型グリコシル化配列であるＸ−Ｐ−Ｘ−Ｘ（少なくとも１つのＸはＴ）、Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｘ（少なくとも１つのＸはＴ）、Ｘ−Ｘ−Ｔ−Ｘ（少なくとも１つのＸはＲ又はＴ）及びＳ−Ｘ−Ｘ−Ｘ（少なくとも１つのＸはＳ）、の少なくともいずれか）を備えた結合タンパク質であり、当該結合タンパク質は、Ｃ１ｑ、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の少なくともいずれかに対して変化した結合親和性など、ＦｃγＲに対して変化された（即ち、増加又は減少）結合親和性及び特異性の少なくともいずれかを持つ。
【０１１２】
特定の実施形態において、この部類の結合タンパク質の考えられる使用法は、当該結合タンパク質の半減期の保存と、それによるクロースリンクの可能性の低下に基づくものである。例えば、本発明は、低下されたクロスリンクを介した細胞内シグナリング（例えばＣＤ３及びＣＤ２８シグナリング）を持つ１つ以上の、Ｃ１ｑ，ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の少なくともいずれかをターゲットする際に使われ得る。この部類の結合タンパク質の考えられる他の使用法は、細胞を減少させる可能性の低い半減期の保存と、クロスリンクは望ましいが、ターゲット細胞減少は望ましくない場合のクロスリンクの保存を含む。例えばＥＰＯ−ＲのアゴニストであるＳＭＩＰ。
【０１１３】
本発明の更なる実施形態は、ＩｇＧ免疫グロブリンのＣＨ２領域及びＣＨ３領域の少なくともいずれかに１つ以上のアミノ酸の挿入及び置き換えの少なくともいずれかを備える結合タンパク質を提供しており、当該アミノ酸の挿入及び置き換えのいずれかはＩｇＡ免疫グロブリンのＣＨ２領域及びＣＨ３領域の少なくともいずれかの１つ以上のアミノ酸であり、当該ＩｇＡ免疫グロブリンのＣＨ２領域及びＣＨ３領域の少なくともいずれかの１つ以上のアミノ酸は、対応ＦｃαＲ受容体とＩｇＡ免疫グロブリンとの特異的結合にかかわり、当該改造されたタンパク質は特異的にＦｃαＲに結合することができる。
【０１１４】
この部類の結合タンパク質の考えられる使用法は、ターゲットされた細胞減少を含み、例えば、１つ以上のＩｇＧのＣＨ２領域及びＣＨ３領域の少なくともいずれかと、１つ以上のＩｇＡのＣＨ２領域及びＣＨ３領域の少なくともいずれかとの組合せを備える結合タンパク質は１つ以上の、ＣＤ１６，ＣＤ３２及びＣＤ６４の少なくともいずれかに結合でき、かつＣＤ８９にも結合できる。そのような結合タンパク質は、ターゲット細胞の除去のために、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞／単核白血球エフェクタに加え、多核白血球エフェクタも利用できるようにする。ここに説明される結合タンパク質のそのような結合特異性の変化は、その変化にしたがって、改良された効能と増加した有効性を幅広い患者に与える。
【０１１５】
免疫グロブリンのヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域の少なくともいずれかに１つ以上のアミノ酸が挿入された結合タンパク質に関する上記の記述のように、ＩｇＧの、１つ以上のＣＨ２領域及び１つ以上のＣＨ３領域のいずれかと、ＩｇＡの、１つ以上のＣＨ２領域及び１つ以上のＣＨ３領域のいずれかとの組合せに対する結合特異性を持つ結合タンパク質は、細菌性、寄生性及びウイルス性の少なくともいずれかによる感染の治療に役に立ち、ＦｃγＲ及びＦｃαＲに対する結合の改良は、病原体の中性化又は除去を増加させ得る。ＦｃγＲ及びＦｃαＲに対する結合の変化は感染病の治療にも役に立ち、感染は例えばＨＩＶ−１に関連する病気等、抗体とＦｃＲとの相互作用によって促進され得る。
【０１１６】
次の実例は説明として提案されており、本発明を限定するものではない。
【０１１７】
実施例
［第１の実施例］
ＩｇＧ免疫グロブリンのヒンジ及びＣＨ２ドメインの少なくともいずれかに含まれるループの改造は、改善されたＦｃＲγＩＩＩ結合親和性を与える
ＩｇＧ部類の抗体はＣＤ１６（ＦｃＲγＩＩＩ）に特異的に結合する。例示的なＩｇＧ抗体のループドメイン内の変異は、対応Ｆｃ受容体であるＣＤ１６に対するＩｇＧ結合親和性を変化させるために作られた。ターゲットされる部位は、具体的に二つの接点においてＣＤ１６分子と接触するＩｇＧのＣＨ２ドメインの４つのループである。Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ，Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０６（６７９３）：２６７−７３（２０００）に説明された結晶構造に基づくと、１つの接点は、ＣＨ２のアルファ鎖にある、ヒンジループ及びＦＧループと、ＣＤ１６との相互作用を含む。もう１つの接点は、ＣＨ２のベータ鎖の、ヒンジ領域ループ、ＢＣループ、ＤＥループ（即ち、炭水化物ループ）及びＦＧループと、ＣＤ１６分子との相互作用を含む。これらの接点は図１を参照。
【０１１８】
（１）ヒンジ領域ループ（２）ＢＣループ、及び（３）ＦＧループの三つの非炭水化物ループにある二つの接点を変化させるために、挿入突然変異を用いた。そのような挿入突然変異のライブラリは、１つ以上のＦｃＲγ受容体との望ましい結合親和性を持つ個別の突然変異を選択するために適している。図２の下向きの矢印は、ここに説明された本発明の特徴による挿入突然変異体を得るためにアミノ酸が挿入される位置を示す。
【０１１９】
挿入突然変異のライブラリは、三つのヒンジ領域夫々のＮＷＮ配列のためのコーディング領域内にポリヌクレオチド配列を挿入して作成した。１Ａ，１Ｂ及び１Ｃのライブラリはヒンジ領域のループにおいて作られ、２Ａ及び２ＢはＢＣループ、そして３Ａ、３Ｂ及び３ＣはＦＧループにおいて作られた。総９６個を含むライブラリは、８つの異なる位置に１２の独特な配列を挿入することによって作られた。長い側鎖又は大きい側鎖を持つアミノ酸：フェニルアラニン（Ｆ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ），メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、チロシン（Ｙ）、ヒスチジン（Ｈ），グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）、リジン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）。
【０１２０】
１Ａ，１Ｂ、１Ｃ，２Ａ及び２Ｂの夫々のライブラリのｃＤＮＡ配列は、６つのオリゴヌクレオチド・プライマ（配列は表３を参照）を用いて、重複ＰＣＲ延長方法（Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ＰＣＲ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）で作成された。１Ａのライブラリを生成するためのオリゴヌクレオチドは、Ｌｉｂ１Ａ＿Ｆ１、Ｌｉｂ１Ａ＿Ｆ２、Ｌｉｂ１Ａ＿Ｆ３、Ｌｉｂ１Ａ＿Ｒ１、Ｌｉｂ１Ａ＿Ｒ２、及びＬｉｂ１Ａ＿Ｒ３である。１Ｂのライブラリを生成するためのオリゴヌクレオチドは上記のものと同じであるが、Ｌｉｂ１Ａ＿Ｆ２の代わりにＬｉｂ１Ｂ＿Ｆ２、そしてＬｉｂ１Ａ＿Ｒ１の代わりにＬｉｂ１Ｂ＿Ｒ１を用いた。１Ｃのライブラリを生成するためのオリゴヌクレオチドは上記のものと同じであるが、Ｌｉｂ１Ａ＿Ｆ２の代わりにＬｉｂ１Ｃ＿Ｆ２、そしてＬｉｂ１Ａ＿Ｒ１の代わりにＬｉｂ１Ｃ＿Ｒ１を用いた。２Ａのライブラリを生成するためのオリゴヌクレオチドは、Ｌｉｂ１Ａ＿Ｆ１、Ｌｉｂ２Ａ＿Ｆ２、Ｌｉｂ２Ａ＿Ｆ３、Ｌｉｂ２Ａ＿Ｒ１、Ｌｉｂ２Ａ＿Ｒ２、及びＬｉｂ２Ａ＿Ｒ３である。２Ｂのライブラリを生成するためのオリゴヌクレオチドは２Ａのライブラリに使われるものと同じであるが、Ｌｉｂ２Ａ＿Ｆ３の代わりにＬｉｂ２Ｂ＿Ｆ３、そしてＬｉｂ２Ａ＿Ｒ２の代わりにＬｉｂ２Ｂ＿Ｒ２を用いた。
【０１２１】
夫々のライブラリ毎に、夫々２０ｎＭの濃度の６つの長いオリゴヌクレオチドプライマーと、夫々１μＭの濃度の２つの短いオリゴヌクレオチドプライマ（Ｂｃｌ−Ｉの制限酵素認識部位を含むフォワードプライマと、Ｓａｃ−ＩＩの制限酵素認識部位を含むリバースプライマ）を混ぜた。ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳｕｐｅｒｍｉｘ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ）を用いて、次の条件にしたっがてＰＣＲ反応を用意した。
【０１２２】
（Ａ）最初に９４℃での溶解を１分、（Ｂ）９４℃で１分、５０℃で２分、７２℃で３分のサイクルを３０回。
表３
１Ａ、１Ｂ，１Ｃ，２Ａ及び２Ｂの抗体ライブラリの生成に使用されるオリゴヌクレオチドプライマ
2009538273.tif 000005
【０１２３】
増幅された断片は、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＴＯＰＯベクターにライゲーション反応で挿入され、ＴＯＰ１０バクテリア細胞にトランスフォームされた。２００個を超えるコロニーを１つに集め、１５のクローンの配列分析によってライブラリ夫々の複雑性を測定した。断片は次に、Ｂｃｌ−ＩとＳａｃ−ＩＩでダイジェストされ、同じくＢｃｌ−ＩとＳａｃ−ＩＩでダイジェストされた対ＣＤ２０・ＳＭＩＰをエンコードするｐＤ１８ベクターにライゲーション反応で挿入された。このベクタは更に、余分なＳａｃ−ＩＩ制限酵素認識部位を１つ除去するように、そして終止コドン及び野生型ＣＨ２ドメインを含むバックグラウンドベクターの線状化を可能にするためのユニークな制限酵素認識部位（Ｎｏｔ−Ｉ）を含むように設計された。
【０１２４】
３Ａ，３Ｂ，及び３Ｖのライブラリの遺伝子はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ方法を用いて生成された。ＮＷＮのアミノ酸配列（即ち、アスパラギン−トリプトファン−アスパラギン）をエンコードするヌクレオチドを挿入しやすくするために、３３の塩基対のセンス及びアンチセンスのオリゴヌクレオチドプライマが設計された。これらのオリゴヌクレオチドの配列は表４に記載されている。３ＢのライブラリのオリゴヌクレオチドはＬｉｂ３Ｂ−Ｆ及びＬｉｂ３Ｂ−Ｒである。３ＣのライブラリのオリゴヌクレオチドはＬｉｂ３Ｃ−Ｆ及びＬｉｂ３Ｃ−Ｒである。
表４
３Ａ、３Ｂ及び３Ｃの抗体ライブラリの生成に使用されるオリゴヌクレオチドプライマ
2009538273.tif 000006
【０１２５】
各ライブラリ毎の１００μＬのＰＣＲ反応混合物は、テンプレートＤＮＡ（即ち、ＣＤ３７特異的ＳＭＩＰをエンコードするｐＤ１８ベクター）を２０ｎｇ、フォワード及びリバース方向のリゴヌクレオチド・プライマをそれぞれ１２５ｎｇ、ｄＮＴＰを５００ｎＭ、そしてＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＵｌｔｒａ  Ｐｆｕ  ＤＮＡを２．５ユニット含む。ＰＣＲ反応には次の条件が用いられた。（Ａ）最初に９５℃での溶解を１分、（Ｂ）９５℃で１分、６０℃で１分、６８℃で６．５分のサイクルを１８回。各ＰＣＲ反応後、野生型ベクターは、Ｄｐｎ−１という制限酵素と一緒に２時間インキュベートし、ダイジェストされた。次に、ＤＮＡ混合物はＴＯＰ１０バクテリア細胞にトランスフォームされた。１つのライブラリ由来の２００個を超えるコロニーを１つに集め、１５のクローンの配列分析によってライブラリ夫々の複雑性を測定した。ライブラリはＳａｃ−ＩＩ及びＢｓｒ−Ｇ１制限酵素でダイジェストされた。ダイジェストされたライブラリは、アンチＣＤ３７のフロントエンド、１つ余分のＳａｃ−ＩＩ制限酵素認識部位、終止コドン及び野生型ＣＨ２ドメインを含むバックグラウンドベクターの線状化を可能にするためのユニークなＮｏｔ−Ｉ制限酵素認識部位を含むｐＤ１８にライゲーション反応で挿入された。
【０１２６】
各ライブラリのメンバークローンは９６ウェル又は２４ウェルのプレートに培養されたＣＯＳ細胞において発現された。これらのクロンとＣＤ１６との結合は、ヒト（ＨｕＩｇ）またはマウス（ＭｕＩｇ）の免疫グロブリン・テール（ｔａｉｌ）を持つビオチニル化されたＣＤ１６を用いて標準のＥＬＩＳＡ方法でテストすることが可能であり、そのようなテストを行う際には、プロテインＡでコーティングされたプレートに個々の候補を含む上清を加え、次にＣＤ１６  ＨｕＩｇ−ＢｉｏｔｉｎとＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰを入れる。その後、ＣＤ１６に対して野生型ＳＭＩＰより高い特異的親和性を示す分子を選び、ＡＤＣＣ解析やプロテインＡとの相互作用による更なる評価を行い得る。
【０１２７】
［第２の実施例］
ＩｇＧ免疫グロブリンのＣＨ３ドメインにあるループの改造は独特な結合特異性を与える
この例は、新たな人工的な認識表面及びそれによる新たな結合特異性を与える、ＩｇＧのＣＨ３領域における例示的な改造を開示する。
【０１２８】
ＩｇＧのＣＨ３領域にあるいくつかのループは、ＩｇＡ特異的結合相互作用を提供するように設計されている（以下ＩｇＧ／Ａルーパに省略）。次の３つのＩｇＧ／Ａルーパ・コンストラクトを作成し、ＣＯＳ細胞に発現した。Ａ）ＩｇＧのＣＨ３ドメインのアミノ酸を、Ｆｃα−受容体（即ち、ＣＤ８９）と直接に接触する野生型のＩｇＡのＣＨ３ドメインのアミノ酸とＣＤループの２個のアミノ酸で置き換たもの、Ｂ）ＩｇＧのＣＨ３ドメインのアミノ酸を、ＩｇＡのＦＧループのアミノ酸及び他のＦｃα−受容体と接触するアミノ酸で置き換たもの、そしてＣ）ＩｇＧのＣＨ３ドメインのアミノ酸を、ＩｇＡのＣＤループのアミノ酸及び他のＦｃα−受容体と接触するアミノ酸で置き換たもの。すべてのケースにおいて、変異ＩｇＧ・ＳＭＩＰの産物のフロントエンドはヒト化２Ｈ７−１０８０１４である。
【０１２９】
ＦｃＲα受容体の結合部位への結合の特異性及び親和性の少なくともいずれかは、ＣＨ３のＣＤループ及びＦＣループのアミノ酸を変えることによって改造された。図１はＩｇＧとＩｇＡの、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの配列アラインメントを示す図である。ＩｇＧとＩｇＡの３次構造は非常に似ており、それはバックボーンを重ねたとき、１．７オングストロームだけのずれが生じることから明らかである。
【０１３０】
３つの遺伝子は、重複ＰＣＲ延長方法を用いて作られた。遺伝子ごとに、２０ｎＭの４つの長いオリゴヌクレオチドと、１μＭの２つの短いオリゴヌクレオチド（短いＦと短いＲ）とを混ぜた。ＰＣＲ反応は、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳｕｐｅｒｍｉｘ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて、次の条件で行った。（１）最初に９４℃での溶解を１分、（Ｂ）９４℃で１分、５０℃で２分、７２℃で３分のサイクルを３０回。増幅された断片はＢｓｒ−Ｇ１とＸｂａ−Ｉでダイジェストされ、野生型ＣＨ３ドメインを除去するためにＢｓｒ−Ｇ１とＸｂａ−ＩでダイジェストされたアンチＣＤ２０のＳＭＩＰを含むｐＤ１８ベクタの中に挿入された。オリゴヌクレオチドの配列は表５に示されている。
【０１３１】
表５
ＩｇＧ免疫グロブリンのＣＨ３ドメインにあるループの改造に使われるオリゴヌクレオチド・プライマ
2009538273.tif 000007
【０１３２】
ＣＨ２の先頭部分にあるＭＩのアミノ酸をＬＬに置き換えるためにＰＣＲ突然変異生成を用いた。この２つのアミノ酸は、ＩｇＡのアイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）とその対応受容体ＣＤ８９（ＦｃαＲ）との結合において、追加的な接触点になる。図２を参照。改造された３つのＩｇＧに基づいたＳＭＩＰの夫々の配列は確認され、それらを含むｐＤ１８ベクタはＣＯＳ細胞にトランスフェクトされ、発現される。Ｗｉｌ２Ｓ細胞を染色し、フローサイトメトリー分析を行うことによって、ＣＤ２０との結合が検査される。
【０１３３】
ＩｇＡ受容体に結合するために突然変異された２Ｈ７  ＳＭＩＰ・ＣＨ３のＣＤ２０染色
上清は先ず、氷の上でＷｉｌ２Ｓ細胞と一緒に３０分間インキュベートされた。細胞は次に２回ワッシュされ、１：１００に希釈されたＰＥ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧを加えた。細胞は再びワッシュされ、フローサイトメトリーで各サンプルのＭＦが測定された。改造された３つの免疫グロブリンは夫々、スタンダードカーブに比較し約２〜４μｇ／ｍＬのレベルで発現された。
【０１３４】
これらの分子のＩｇＡに対する結合をテストするために、Ｗｉｌ２Ｓ細胞を上清と３０分間インキュベートし、次に１％のＢＳＡ／ＰＢＳを用いて２回ワッシュし、更に５μｇ／ｍｌのＣＤ８９（ＩｇＡ受容体）ヒトＩｇのＰＢＳとインキュベートした。細胞は再びワッシュされ、１％ＢＳＡ／ＰＢＳに１：１００に希釈されたＰＥ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａを５０μｌ加え、３０分間インキュベートした。その後サンプルを１％ＢＳＡ／ＰＢＳでワッシュし、１００ｍｌのワッシュバッファーに再懸濁し、フローサイトメトリを用いて分析した。
【０１３５】
改造された３つの免疫グロブリンは夫々、約２〜４μｇ／ｍＬの濃度で発現され、プロテインＡ親和性コラムで精製された。その後、ＣＤ８９ＨｕＩｇとＰＥ標識プロテインＡを用いた一般的なフローサイトメトリでＷｉｌ２Ｓ細胞とＣＤ８９に対する特異的な結合を評価した。
【０１３６】
［配列の説明］
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １はヒトＩｇＡ１ヒンジ領域のアミノ酸配列である（ＶＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳ）。
【０１３７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２はヒトＩｇＡ１のＣＨ２領域のアミノ酸配列である（ＣＣＨＰＲＬＳＬＨＲＰＡＬＥＤＬＬＬＧＳＥＡＮＬＴＣＴＬＴＧＬＲＤＡＳＧＶＴＦＴＷＴＰＳＳＧＫＳＡＶＱＧＰＰＥＲＤＬＣＧＣＹＳＶＳＳＶＬＰＧＣＡＥＰＷＮＨＧＫＴＦＴＣＴＡＡＹＰＥＳＫＴＰＬＴＡＴＬＳＫＳ）。
【０１３８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３はヒトＩｇＡ１のＣＨ３領域のアミノ酸配列である（ＧＮＴＦＲＰＥＶＨＬＬＰＰＰＳＥＥＬＡＬＮＥＬＶＴＬＴＣＬＡＲＧＦＳＰＫＤＶＬＶＲＷＬＱＧＳＱＥＬＰＲＥＫＹＬＴＷＡＳＲＱＥＰＳＱＧＴＴＴＦＡＶＴＳＩＬＲＶＡＡＥＤＷＫＫＧＤＴＦＳＣＭＶＧＨＥＡＬＰＬＡＦＴＱＫＴＩＤＲＬＡＧＫＰＴＨＶＮＶＳＶＶＭＡＥＶＤＧＴＣＹ）。
【０１３９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４はひとＩｇＡ２ヒンジ領域のアミノ酸配列である（ＶＰＰＰＰＰ）。
【０１４０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５はヒトＩｇＡ２のＣＨ２領域のアミノ酸配列である（ＣＣＨＰＲＬＳＬＨＲＰＡＬＥＤＬＬＬＧＳＥＡＮＬＴＣＴＬＴＧＬＲＤＡＳＧＡＴＦＴＷＴＰＳＳＧＫＳＡＶＱＧＰＰＥＲＤＬＣＧＣＹＳＶＳＳＶＬＰＧＣＡＱＰＷＮＨＧＥＴＦＴＣＴＡＡＨＰＥＬＫＴＰＬＴＡＮＩＴＫＳ）。  
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６はヒトＩｇＡ２のＣＨ３領域のアミノ酸配列である（ＧＮＴＦＲＰＥＶＨＬＬＰＰＰＳＥＥＬＡＬＮＥＬＶＴＬＴＣＬＡＲＧＦＳＰＫＤＶＬＶＲＷＬＱＧＳＱＥＬＰＲＥＫＹＬＴＷＡＳＲＱＥＰＳＱＧＴＴＴＦＡＶＴＳＩＬＲＶＡＡＥＤＷＫＫＧＤＴＦＳＣＭＶＧＨＥＡＬＰＬＡＦＴＱＫＴＩＤＲＬＡＧＫＰＴＨＶＮＶＳＶＶＭＡＥＶＤＧＴＣＹ）。
【０１４１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７はヒトＩｇＤのヒンジ領域のアミノ酸配列である（ＥＳＰＫＡＱＡＳＳＶＰＴＡＱＰＱＡＥＧＳＬＡＫＡＴＴＡＰＡＴＴＲＮＴＧＲＧＧＥＥＫＫＫＥＫＥＫＥＥＱＥＥＲＥＴＫＴＰ）。
【０１４２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８はヒトＩｇＤのＣＨ２領域のアミノ酸配列である（ＥＣＰＳＨＴＱＰＬＧＶＹＬＬＴＰＡＶＱＤＬＷＬＲＤＫＡＴＦＴＣＦＶＶＧＳＤＬＫＤ  ＡＨＬＴＷＥＶＡＧＫＶＰＴＧＧＶＥＥＧＬＬＥＲＨＳＮＧＳＱＳＱＨＳＲＬＴＬＰＲＳＬＷＮＡＧＴＳＶＴＣＴＬＮＨＰＳＬＰＰＱＲＬＭＡＬＲＥＰ）。
【０１４３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９はヒトＩｇＤのＣＨ３領域のアミノ酸配列である（ＡＡＱＡＰＶＫＬＳＬＮＬＬＡＳＳＤＰＰＥＡＡＳＷＬＬＣＥＶＳＧＦＳＰＰＮＩＬＬＭＷＬＥＤＱＲＥＶＮＴＳＧＦＡ  ＰＡＲＰＰＰＱＰＲＳＴＴＦＷＡＷＳＶＬＲＶＰＡＰＰＳＰＱＰＡＴＹＴＣＶＶＳＨＥＤＳＲＴＬＬＮＡＳＲＳＬＥＶＳＹＶＴＤＨＧＰＭＫ）。
【０１４４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０はヒトＩｇＥのＣＨ２領域のアミノ酸配列である（ＶＣＳＲＤＦＴＰＰＴＶＫＩＬＱＳＳＣＤＧＧＧＨＦＰＰＴＩＱＬＬＣＬＶＳＧＹＴＰＧＴＩＮＩＴＷＬＥＤＧＱＶＭＤＶＤＬＳＴＡＳＴＴＱＥＧＥＬＡＳＴＱＳＥＬＴＬＳＱＫＨＷＬＳＤＲＴＹＴＣＱＶＴＹＱＧＨＴＦＥＤＳＴＫＫＣＡ）。
【０１４５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１はヒトＩｇＥのＣＨ３領域のアミノ酸配列である（ＤＳＮＰＲＧＶＳＡＹＬＳＲＰＳＰＦＤＬＦＩＲＫＳＰＴＩＴＣＬＶＶＤＬＡＰＳＫＧＴＶＮＬＴＷＳＲＡＳＧＫＰＶＮＨＳＴＲＫＥＥＫＱＲＮＧＴＬＴＶＴＳＴＬＰＶＧＴＲＤＷＩＥＧＥＴＹＱＣＲＶＴＨＰＨＬＰＲＡＬＭＲＳＴＴＫＴＳ）。
【０１４６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２  はヒトＩｇＥのＣＨ４領域のアミノ酸配列である（ＧＰＲＡＡＰＥＶＹＡＦＡＴＰＥＷＰＧＳＲＤＫＲＴＬＡＣＬＩＱＮＦＭＰＥＤＩＳＶＱＷＬＨＮＥＶＱＬＰＤＡＲＨＳＴＴＱＰＲＫＴＫＧＳＧＦＦＶＦＳＲＬＥＶＴＲＡＥＷＥＱＫＤＥＦＩＣＲＡＶＨＥＡＡＳＰＳＱＴＶＱＲＡＶＳＶＮＰＧＫ）。
【０１４７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １３はヒトＩｇＧ１のヒンジ領域のアミノ酸配列である（ＥＰＫＳＣＤＫＴＴＣＰＰＣＰ）。
【０１４８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １４はヒトＩｇＧ１のＣＨ２領域のアミノ酸配列である（ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫ）。
【０１４９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １５はヒトＩｇＧ１のＣＨ３領域のアミノ酸配列である（ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ）。
【０１５０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １６はヒトＩｇＧ２のヒンジ領域のアミノ酸配列である（ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ）．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １７はヒトＩｇＧ２のＣＨ２領域のアミノ酸配列である（ＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫ）。
【０１５１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １８はヒトＩｇＧ２のＣＨ３領域のアミノ酸配列である（ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ）。
【０１５２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １９はヒトＩｇＧ３のヒンジ領域のアミノ酸配列である（ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰ）。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２０はヒトＩｇＧ３のＣＨ２領域のアミノ酸配列である（ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＫＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫ）。  
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２１はヒトＩｇＧ３のＣＨ３領域のアミノ酸配列である（ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ）。
【０１５３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２２はヒトＩｇＧ４のヒンジ領域のアミノ酸配列である（ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ）。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２３はヒトＩｇＧ４のＣＨ２領域のアミノ酸配列である（ＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫ）。
【０１５４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２４はヒトＩｇＧ４のＣＨ３領域のアミノ酸配列である（ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ）。
【０１５５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２５はヒトＩｇＭのＣＨ２領域のアミノ酸配列である（ＶＩＡＥＬＰＰＫＶＳＶＦＶＰＰＲＤＧＦＦＧＮＰＲＫＳＫＬＩＣＱＡＴＧＦＳＰＲＱＩＱＶＳＷＬＲＥＧＫＱＶＧＳＧＶＴＴＤＱＶＱＡＥＡＫＥＳＧＰＴＴＹＫＶＴＳＴＬＴＩＫＥＳＤＷＬＧＱＳＭＦＴＣＲＶＤＨＲＧＬＴＦＱＱＮＡＳＳＭＣＶＰ）。
【０１５６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２６はヒトＩｇＭのＣＨ３領域のアミノ酸配列である（ＤＱＤＴＡＩＲＶＦＡＩＰＰＳＦＡＳＩＦＬＴＫＳＴＫＬＴＣＬＶＴＤＬＴＴＹＤＳＶＴＩＳＷＴＲＱＮＧＥＡＶＫＴＨＴＮＩＳＥＳＨＰＮＡＴＦＳＡＶＧＥＡＳＩＣＥＤＤＷＮＳＧＥＲＦＴＣＴＶＴＨＴＤＬＰＳＰＬＫＱＴＩＳＲＰＫ）。
【０１５７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２７はヒトＩｇＭのＣＨ４領域のアミノ酸配列である  （ＧＶＡＬＨＲＰＤＶＹＬＬＰＰＡＲＥＱＬＮＬＲＥＳＡＴＩＴＣＬＶＴＧＦＳＰＡＤＶＦＶＱＷＭＱＲＧＱＰＬＳＰＥＫ  ＹＶＴＳＡＰＭＰＥＰＱＡＰＧＲＹＦＡＨＳＩＬＴＶＳＥＥＥＷＮＴＧＥＴＹＴＣＶＶＡＨＥＡＬＰＮＲＶＴＥＲＴＶＤＫＳＴＧＫＰＴＬＹＮＶＳＬＶＭＳＤＴＡＧＴＣＹ）。
【０１５８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２８は、これよりＢｃｉ−Ｉ  Ｆｏｒｗａｒｄと指名するオリゴヌクレオチドプライマのヌクレオチド配列である（ｔｔｃ  ｔｔｃ  ｔｇａ  ｔｅａ  ｇｇａ  ｇｃｃ  ｃａａ  ａｔ）。
【０１５９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２９は、これよりＳａｃ−ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅと指名するオリゴヌクレオチドプライマのヌクレオチド配列である（ＧＣＴ  ＣＣＴ  ＣＣＣ  ＧＣＧ  ＧＣＴ  ＴＴＧ  ＴＣＴ  ＴＧＧ）。
【０１６０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３０は、これよりＬｉｂｌＡ＿Ｆｌと指名するオリゴヌクレオチドプライマのヌクレオチド配列である（ｔｔｃ  ｔｔｃ  ｔｇａ  ｔｅａ  ｇｇａ  ｇｃｃ  ｃａａ  ａｔｅ  ｔｔｃ  ｔｇａ  ｃａａ  ａａｃ  ｔｅａ  ｃａｃ  ａｔｅ  ｔｅｃ  ａｃｅ  ｇｔｇ  ｃｃｃ  ａｇ）。
【０１６１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３１は、これよりＬｉｂｌＡ＿Ｆ２と指名するオリゴヌクレオチドプライマのヌクレオチド配列である（ｇｇｇ  ａｃｅ  ｇｔｃ  ａｇｔ  ｃｔｔ  ｃｃｔ  ｃｔｔ  ｃｃｃ  ｃｃｃ  ａａａ  ａｃｅ  ｃａａ  ｇｇａ  ｃａｃ  ｃｃｔ  ｃａｔ  ｇａｔ  ｅｔｃ  ｃｃｇ  ｇａ）。
【０１６２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３２は、これよりＬｉｂｌＡ＿Ｆ３と指名するオリゴヌクレオチドプライマのヌクレオチド配列である（ｔｇｔ  ｇｇｔ  ｇｇａ  ｃｇｔ  ｇａｇ  ｃｃａ  ｃｇａ  ａｇａ  ｃｃｃ  ｔｇａ  ｇｇｔ  ｃａａ  ｇｔｔ  ｃａａ  ｃｔｇ  ｇｔａ  ｃｇｔ  ｇｇａ  ｃｇｇ  ｃｇ）。
【０１６３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３３は、これよりＬｉｂｌＡ＿Ｒｌと指名するオリゴヌクレオチドプライマのヌクレオチド配列である（ＡＧＡ  ＧＧＡ  ＡＧＡ  ＣＴＧ  ＡＣＧ  ＧＴＣ  ＣＡＣ  ＣＮＷ  ＮＣＡ  ＡＧＡ  ＧＴＴ  ＣＡＧ  ＧＴＧ  ＣＴＧ  ＧＧＣ  ＡＣＧ  ＧＴＧ  ＧＡＧ  ＡＴＧ  ＴＧＴ）。
【０１６４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３４は、これよりＬｉｂｌＡ＿Ｒ２と指名するオリゴヌクレオチドプライマのヌクレオチド配列である（ＣＧＴ  ＧＧＣ  ＴＣＡ  ＣＧＴ  ＣＣＡ  ＣＣＡ  ＣＣＡ  ＣＧＣ  ＡＴＧ  ＴＧＡ  ＣＣＴ  ＣＡＧ  ＧＧＧ  ＴＣＣ  ＧＧＧ  ＡＧＡ  ＴＣＡ  ＴＧＡ  ＧＧＧ  ＴＧＴ）。
【０１６５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３５は、これよりＬｉｂｌＡ＿Ｒ３と指名するオリゴヌクレオチドプライマのヌクレオチド配列である（ＧＣＴ  ＣＣＴ  ＣＣＣ  ＧＣＧ  ＧＣＴ  ＴＴＧ  ＴＣＴ  ＴＧＧ  ＣＡＴ  ＴＡＴ  ＧＣＡ  ＣＣＴ  ＣＣＡ  ＣＧＣ  ＣＧＴ  ＣＣＡ  ＣＧＴ  ＡＣＣ  ＡＧＴ  ＴＧＡ）。
【０１６６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３６は、これよりＬｉｂｌＢ＿Ｆ２と指名するオリゴヌクレオチドプライマのヌクレオチド配列である（ｗｇｇ  ａｃｅ  ｇｔｃ  ａｇｔ  ｃｔｔ  ｃｃｔ  ｃｔｔ  ｃｃｃ  ｃｃｃ  ａａａ  ａｃｅ  ｃａａ  ｇｇａ  ｃａｃ  ｃｃｔ  ｃａｔ  ｇａｔ  ｅｔｃ  ｃｃｇ  ｇａ）。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３７は、これよりＬｉｂｌＢ＿Ｒｌと指名するオリゴヌクレオチドプライマのヌクレオチド配列である（ＡＧＡ  ＧＧＡ  ＡＧＡ  ＣＴＧ  ＡＣＧ  ＧＴＣ  ＣＮＷ  ＮＡＣ  ＣＣＡ  ＡＧＡ  ＧＴＴ  ＣＡＧ  ＧＴＧ  ＣＴＧ  ＧＧＣ  ＡＣＧ  ＧＴＧ  ＧＡＧ  ＡＴＧ  ＴＧＴ）。
【０１６７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３８は、これよりＬｉｂｌＣ＿Ｆ２と指名するオリゴヌクレオチドプライマのヌクレオチド配列である（ｇｎｗ  ｎｃｃ  ｇｔｃ  ａｇｔ  ｃｔｔ  ｃｃｔ  ｃｔｔ  ｃｃｃ  ｃｃｃ  ａａａ  ａｃｅ  ｃａａ  ｇｇａ  ｃａｃ  ｃｃｔ  ｃａｔ  ｇａｔ  ｅｔｃ  ｃｃｇ  ｇａ）。
【０１６８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３９は、これよりＬｉｂｌＣ＿Ｒｌと指名するオリゴヌクレオチドプライマのヌクレオチド配列である（ＡＧＡ  ＧＧＡ  ＡＧＡ  ＣＴＧ  ＡＣＧ  ＧＮＷ  ＮＴＣ  ＣＡＣ  ＣＣＡ  ＡＧＡ  ＧＴＴ  ＣＡＧ  ＧＴＧ  ＣＴＧ  ＧＧＣ  ＡＣＧ  ＧＴＧ  ＧＡＧ  ＡＴＧ  ＴＧＴ）。
【０１６９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４０は、これよりＬｉｂ２Ａ＿Ｆ２と指名するオリゴヌクレオチドプライマのヌクレオチド配列である（ｇｃｃ  ｇｔｃ  ａｇｔ  ｃｔｔ  ｃｃｔ  ｃｔｔ  ｃｃｃ  ｃｃｃ  ａａａ  ａｃｅ  ｃａａ  ｇｇａ  ｃａｃ  ｃｃｔ  ｃａｔ  ｇａｔ  ｅｔｃ  ｃｃｇ  ｇａｃ  ｃｃ）。
【０１７０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４１は、これよりＬｉｂ２Ａ＿Ｆ３と指名するオリゴヌクレオチドプライマのヌクレオチド配列である（ｔｇｔ  ｇｇａ  ｃｇｔ  ｇｎｗ  ｎａｇ  ｃｃａ  ｃｇａ  ａｇａ  ｃｃｃ  ｔｇａ  ｇｇｔ  ｃａａ  ｇｔｔ  ｃａａ  ｃｔｇ  ｇｔａ  ｃｇｔ  ｇｇａ  ｅｇｇ  ｅｇ）。
【０１７１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４２は、これよりＬｉｂ２Ａ＿Ｒｌと指名するオリゴヌクレオチドプライマのヌクレオチド配列である（ＧＧＡ  ＡＧＡ  ＧＧＡ  ＡＧＡ  ＣＴＧ  ＡＣＧ  ＧＴＣ  ＣＡＣ  ＣＣＡ  ＡＧＡ  ＧＴＴ  ＣＡＧ  ＧＴＧ  ＣＴＧ  ＧＧＣ  ＡＣＧ  ＧＴＧ  ＧＡＧ  ＡＴＧ  ＴＧＴ）。
【０１７２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４３は、これよりＬｉｂ２Ａ＿Ｒ２と指名するオリゴヌクレオチドプライマのヌクレオチド配列である（ＣＧＴ  ＧＧＣ  ＴＮＷ  ＮＣＡ  ＣＧＴ  ＣＣＡ  ＣＣＡ  ＣＣＡ  ＣＧＣ  ＡＴＧ  ＴＧＡ  ＣＣＴ  ＣＡＧ  ＧＧＧ  ＴＣＣ  ＧＧＧ  ＡＧＡ  ＴＣＡ  ＴＧＡ  ＧＧ）。
【０１７３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４４は、これよりＬｉｂ２Ｂ＿Ｆ３と指名するオリゴヌクレオチドプライマのヌクレオチド配列である（ｔｇｔ  ｇｇａ  ｃｇｔ  ｇａｇ  ｃｎｗ  ｎｃａ  ｃｇａ  ａｇａ  ｃｃｃ  ｔｇａ  ｇｇｔ  ｃａａ  ｇｔｔ  ｃａａ  ｃｔｇ  ｇｔａ  ｃｇｔ  ｇｇａ  ｅｇｇ  ｅｇ）。
【０１７４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４５は、これよりＬｉｂ２Ｂ＿Ｒ２と指名するオリゴヌクレオチドプライマのヌクレオチド配列である（ＣＧＴ  ＧＮＷ  ＮＧＣ  ＴＣＡ  ＣＧＴ  ＣＣＡ  ＣＣＡ  ＣＣＡ  ＣＧＣ  ＡＴＧ  ＴＧＡ  ＣＣＴ  ＣＡＧ  ＧＧＧ  ＴＣＣ  ＧＧＧ  ＡＧＡ  ＴＣＡ  ＴＧＡ  ＧＧＧ）。
【０１７５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４６は、これよりｌｉｂ３Ａ−Ｆと指名するオリゴヌクレオチドプライマのヌクレオチド配列である（ｇｔｃ  ｔｅｃ  ａａｃ  ａａａ  ｇｃｃ  ｎｗｎ  ｅｔｃ  ｃｃａ  ｇｃｃ  ｃｃｃ  ａｔｅ）。
【０１７６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４７は、これよりｌｉｂ３Ａ−Ｒと指名するオリゴヌクレオチドプライマのヌクレオチド配列である（ＧＡＴ  ＧＧＧ  ＧＧＣ  ＴＧＧ  ＧＡＧ  ＮＷＮ  ＧＧＣ  ＴＴＴ  ＧＴＴ  ＧＧＡ  ＧＡＣ）。
【０１７７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４８は、これよりＬｉｂ３Ｂ−Ｆと指名するオリゴヌクレオチドプライマのヌクレオチド配列である（ｃｃｃ  ａａｃ  ａａａ  ｇｃｃ  ｅｔｃ  ｎｗｎ  ｃｃａ  ｇｃｃ  ｃｃｃ  ａｔｅ  ｇａｇ）。
【０１７８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４９は、これよりＬｉｂ３Ｂ−Ｒと指名するオリゴヌクレオチドプライマのヌクレオチド配列である（ＣＴＣ  ＧＡＴ  ＧＧＧ  ＧＧＣ  ＴＧＧ  ＮＷＮ  ＧＡＧ  ＧＧＣ  ＴＴＴ  ＧＴＴ  ＧＧＡ  Ｇ）。
【０１７９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５０は、これよりＬｉｂ３Ｃ−Ｆと指名するオリゴヌクレオチドプライマのヌクレオチド配列である（ｃａｃ  ａａａ  ｇｃｃ  ｅｔｃ  ｃｃａ  ｎｗｎ  ｇｃｃ  ｃｃｃ  ａｔｅ  ｇａｇ  ａａａ  ａｃ）。
【０１８０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１は、これよりＬｉｂ３Ｃ−Ｒと指名するオリゴヌクレオチドプライマのヌクレオチド配列である（ＧＴＴ  ＴＴＣ  ＴＣＧ  ＡＴＧ  ＧＧＧ  ＧＣＮ  ＷＮＴ  ＧＧＧ  ＡＧＧ  ＧＣＴ  ＴＴＧ  ＴＴＧ）。
【０１８１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５２は、これよりＦｌ＿ｖｅｒｌと指名するオリゴヌクレオチドプライマのヌクレオチド配列である（ｃａｇ  ａａｃ  ｃａｃ  ａｇｇ  ｔｇｔ  ａｃａ  ｃｃｃ  ｔｇｃ  ｃｃｃ  ｃａｔ  ｃｃｃ  ｇｇｇ  ａｔｇ  ａｇｅ  ｔｇａ  ｃｃａ  ａｇａ  ａｃｅ  ａｇｇ）。
【０１８２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５３は、これよりＦ２＿ｖｅｒｌと指名するオリゴヌクレオチドプライマのヌクレオチド配列である（ａｇｅ  ｔｔｃ  ｔａｔ  ｃｃａ  ａｇｅ  ｇａｃ  ａｔｅ  ｇｃｃ  ｇｔｇ  ｃｇｔ  ｔｇｇ  ｇａｇ  ａｇｅ  ａａｔ  ｇｇｇ  ｃａｇ  ｇａｇ  ｃｔｇ  ｃｃｇ）。
【０１８３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５４は、これよりＦ３＿ｖｅｒｌと指名するオリゴヌクレオチドプライマのヌクレオチド配列である（ｃｃｃ  ｃｇｔ  ｇｅｔ  ｇｇａ  ｅｔｃ  ｃｇａ  ｅｇｇ  ｅｔｃ  ｃｔｔ  ｃｔｔ  ｃｃｔ  ｅｔａ  ｃａｇ  ｃａａ  ｇｅｔ  ｃａｃ  ｃｇｔ  ｇｇａ  ｃａａ）。
【０１８４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５５は、これよりＦ４−＿ｖｅｒｌと指名するオリゴヌクレオチドプライマのヌクレオチド配列である（ｇｅｔ  ｔｃｔ  ｃｃｔ  ｇｃａ  ｔｇｇ  ｔｇａ  ｔｇｃ  ａｔｇ  ａｇｇ  ｅｔｃ  ｔｇｃ  ｃａｃ  ｔｅｇ  ｃｃｔ  ｔｅａ  ｃｇｃ  ａｇａ  ａｇａ  ｇｃｃ）。
【０１８５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５６は、これよりＲｌ＿ｖｅｒｌと指名するオリゴヌクレオチドプライマのヌクレオチド配列である（ｔｇｃ  ｔｔｇ  ｇａｔ  ａｇａ  ａｇｅ  ｃｔｔ  ｔｇａ  ｃｃａ  ｇｇｃ  ａｇｇ  ｔｅａ  ｇｇｃ  ｔｇａ  ｃｃｔ  ｇｇｔ  ｔｃｔ  ｔｇｇ  ｔｅａ  ｇｅｔ）。
【０１８６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５７は、これよりＲ２＿ｖｅｒｌと指名するオリゴヌクレオチドプライマのヌクレオチド配列である（ｃｇａ  ｇｔｃ  ｃａｇ  ｃａｃ  ｇｇｇ  ａｇｇ  ｃｇｔ  ｇｇｔ  ｃｔｔ  ｇｔａ  ｇｔｔ  ｇｔｔ  ｅｔｃ  ｅｇｇ  ｃａｇ  ｅｔｃ  ｃｔｇ  ｃｃｃ  ａｔｔ）。
【０１８７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５８は、これよりＲ３＿ｖｅｒｌと指名するオリゴヌクレオチドプライマのヌクレオチド配列である（ｃｃｃ  ａｔｇ  ｃａｇ  ｇａｇ  ａａｇ  ａｃｇ  ｔｔｃ  ｃｃｃ  ｔｇｃ  ｔｇｃ  ｃａｃ  ｃｔｇ  ｅｔｃ  ｔｔｇ  ｔｅｃ  ａｃｇ  ｇｔｇ  ａｇｅ  ｔｔｇ）。
【０１８８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５９は、これよりＲ４＿ｖｅｒｌと指名するオリゴヌクレオチドプライマのヌクレオチド配列である（ｃｇｃ  ｔａｔ  ａａｔ  ｅｔａ  ｇａｔ  ｃａｔ  ｔｔａ  ｃｃｃ  ｇｇａ  ｇａｃ  ａｇｇ  ｇａｇ  ａｇｇ  ｅｔｃ  ｔｔｃ  ｔｇｃ  ｇｔｇ  ａａｇ  ｇ）。
【０１８９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６０は、これよりｓｈｏｒｔ−Ｆと指名するオリゴヌクレオチドプライマのヌクレオチド配列である（ｃａｇ  ａａｃ  ｃａｃ  ａｇｇ  ｔｇｔ  ａｃａ  ｃｃｃ  ｔｇｃ  ｃｃ）。
【０１９０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６１は、これよりｓｈｏｒｔ−Ｒと指名するオリゴヌクレオチドプライマのヌクレオチド配列である（ｃｃｔ  ａｔａ  ａｔｅ  ｔａｇ  ａｔｅ  ａｔｔ  ｔａｃ  ｃ）。
【０１９１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６２は、これよりＦ４＿ｖｅｒ２と指名するオリゴヌクレオチドプライマのヌクレオチド配列である（ｇｔｃ  ｔｔｃ  ｔｅｃ  ｔｇｃ  ａｔｇ  ｇｔｇ  ｇｇｃ  ｃａｃ  ｇａｇ  ｇｃｃ  ｃｔｇ  ｃｃｇ  ｃｔｇ  ｇｃｃ  ｔｔｃ  ａｃａ  ｃａｇ  ａａｇ  ａｃｅ  ａ）。
【０１９２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６３は、これよりＲ４＿ｖｅｒ２と指名するオリゴヌクレオチドプライマのヌクレオチド配列である（ｃｇｃ  ｔａｔ  ａａｔ  ｅｔａ  ｇａｔ  ｃａｔ  ｔｔａ  ｃｃｃ  ｇｃｃ  ａａｇ  ｅｇｇ  ｔｅｇ  ａｔｇ  ｇｔｃ  ｔｔｃ  ｔｇｔ  ｇｔｇ  ａａｇ  ｇ）。
【０１９３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６４は、これよりＦ２＿ｖｅｒ３と指名するオリゴヌクレオチドプライマのヌクレオチド配列である（ａｇｇ  ｃｔｔ  ｅｔａ  ｔｅｃ  ａａｇ  ｃｇａ  ｃａｔ  ｃｇｃ  ｃｇｔ  ｔｅｇ  ｃｔｇ  ｇｅｔ  ｇｃａ  ｇｇｇ  ｇｔｃ  ａｃａ  ｇｇａ  ｇｅｔ  ｇｃｃ  ｃ）。
【０１９４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６５は、これよりＲ２＿ｖｅｒ３と指名するオリゴヌクレオチドプライマのヌクレオチド配列である（ｃｇａ  ｇｔｃ  ｃａｇ  ｃａｃ  ｇｇｇ  ａｇｇ  ｃｇｔ  ｇｇｔ  ｃｔｔ  ｇｔａ  ｃｔｔ  ｅｔｃ  ｇｃｇ  ｇｇｇ  ｃａｇ  ｅｔｃ  ｃｔｇ  ｔｇａ  ｃｃｃ）。
【図面の簡単な説明】
【０１９５】
【図１】ＩｇＧとＩｇＡのＣＨ２ドメインの配列アラインメントを示す図である。
【図２】野生型のＩｇＧのＣＨ２−ＣＨ３領域のアラインメントと、その領域において本発明による結合タンパク質の生成に適した三つの例示的な改造を示す図である。
【図３】ＩｇＡ１，ＩｇＡ２，ＩｇＭ，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３、ＩｇＧ１，ＩｇＧ４のＣＨ２及びＣＨ２領域と、対応する免疫グロブリンループのアラインメントを示す図である。（Ｈｅｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４２３：６１４−５２０（２００３）（ヘール等著、「ネイチャー」４２３：６１４−５２０（２００３））より）
【図１】
2009538273.tif 000008
【図２】
2009538273.tif 000009
【図３】
2009538273.tif 000010
【国際調査報告】
2009538273.tif 000011