(57)【要約】  本発明は、動物DNAウイルス由来複製タンパク質の該ウイルス複製起点への結合を阻害するための亜鉛フィンガータンパク質及び／又は該亜鉛フィンガータンパク質をコードする核酸を含む抗ウイルス剤に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工の亜鉛フィンガータンパク質（ZFP）及び／又は該ZFPをコードする核酸を含む抗ウイルス剤であって、該ZFPが動物DNAウイルス由来複製タンパク質の該ウイルス複製起点への結合を阻害することができる抗ウイルス剤。
【請求項２】
請求項１に記載の抗ウイルス剤であって、該複製タンパク質が該DNAウイルスの複製起点において2以上の結合部位を有しており、該ZFPが該2以上の結合部位に結合して該複製起点への該複製タンパク質の結合を阻害する抗ウイルス剤。
【請求項３】
動物DNAウイルスがヒトパピローマウイルスである請求項１又は２に記載の抗ウイルス剤。
【請求項４】
ヒトパピローマウイルスがヒトパピローマウイルス18 (HPV18)である請求項３に記載の抗ウイルス剤。
【請求項５】
該複製タンパク質がヒトパピローマウイルスのE2タンパク質であり、該ZFPがE2結合部位3（E2BS3）及びE2結合部位4（E2BS4）の位置に、近傍に、又はオーバーラップして結合する請求項１ないし４のいずれか１項に記載の抗ウイルス剤。
【請求項６】
該ZFPがGAAAACGGTCGGGACCGAA又はGGTCGGGACCGAAAACGGTで表されるDNAを標的とする請求項５に記載の抗ウイルス剤。
【請求項７】
該ZFPが6個の亜鉛フィンガードメインを含み、該ドメインが0から10個のアミノ酸残基と共有結合しており、該ドメインの-1、2、3、及び6位の該アミノ酸が、この順にそれぞれ
ドメイン1についてGln、Thr、His 及び Glu; 
ドメイン2についてGlu、Ser、Asn 及び Arg;
ドメイン3についてArg、Asp、His 及び Glu;
ドメイン4についてThr、Ser、His 及び Arg;
ドメイン5についてGlu、Asp、Asn 及び Gln; 並びに
ドメイン6についてGln、Thr、Asn 及び Arg
である請求項６に記載の抗ウイルス剤。
【請求項８】
該ZFPが配列番号２のアミノ酸配列を含む請求項７に記載の抗ウイルス剤。
【請求項９】
該ZFPが6個の亜鉛フィンガードメインを含み、該ドメインが0から10個のアミノ酸残基と共有結合しており、該ドメインの-1、2、3、及び6位の該アミノ酸が、この順にそれぞれ
ドメイン1についてArg、Asn、His 及び Glu; 
ドメイン2についてGln、Ser、Asn 及び Gln;
ドメイン3についてGln、Thr、His 及び Glu; 
ドメイン4についてGlu、Ser、Asn 及び Arg;
ドメイン5についてArg、Asp、His 及び Glu; 並びに
ドメイン6についてThr、Ser、His 及び Arg
である請求項６に記載の抗ウイルス剤。
【請求項１０】
該ZFPが配列番号３のアミノ酸配列を含む請求項９に記載の抗ウイルス剤。
【請求項１１】
該ZFPが互いに0〜10個のアミノ酸残基で共有結合した少なくとも3つの亜鉛フィンガードメインを含み、該亜鉛フィンガードメインのα-ヘリックスの-1、2、3、及び6位のアミノ酸が以下のとおり選択される：
-1位のアミノ酸が、アルギニン、グルタミン、トレオニン、メチオニン、又はグルタミン酸であり；
2位のアミノ酸が、セリン、アスパラギン、トレオニン、又はアスパラギン酸であり；
3位のアミノ酸が、ヒスチジン、アスパラギン、セリン、又はアスパラギン酸であり；かつ
6位のアミノ酸が、アルギニン、グルタミン、トレオニン、チロシン、ロイシン、又はグルタミン酸である
請求項１ないし５のいずれか１項に記載の抗ウイルス剤。
【請求項１２】
該ZFPが少なくとも3つの亜鉛フィンガードメインを含み、各亜鉛フィンガードメインは独立して下記の式：
−X3-Cys-X2-4-Cys-X5-Z-1-X-Z2-Z3-X2-Z6-His-X3-5-His-X4-
（式中、Xは独立に任意のアミノ酸を示し、Xnはポリペプチド鎖中のXの出現数を示し；
Z-1は、アルギニン、グルタミン、トレオニン、メチオニン、又はグルタミン酸であり；
Z2は、セリン、アスパラギン、トレオニン、又はアスパラギン酸であり；
Z3は、ヒスチジン、アスパラギン、セリン、又はアスパラギン酸であり；かつ
Z6は、アルギニン、グルタミン、トレオニン、チロシン、ロイシン、又はグルタミン酸である。）で表され、該ドメインが独立して互いに0〜10個のアミノ酸残基で共有結合する請求項１１に記載の抗ウイルス剤。
【請求項１３】
該ZFPがさらに核局在シグナル（NLS）及び／又は細胞透過ペプチド（CPP）を含む請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の抗ウイルス剤。
【請求項１４】
該NLS及び該CPPが該ZFPのN末端に位置する請求項１３に記載の抗ウイルス剤。
【請求項１５】
該NLS及び該CPPが該ZFPのC末端に位置する請求項１３に記載の抗ウイルス剤。
【請求項１６】
ZFPタンパク質である請求項１ないし１５のいずれか１項に記載の抗ウイルス剤。
【請求項１７】
該ZFPタンパク質をコードする核酸である請求項１ないし１５のいずれか１項に記載の抗ウイルス剤。
【請求項１８】
請求項１ないし１７のいずれか１項に記載のZFP又は核酸であるウイルス複製阻害剤。
【請求項１９】
人工の亜鉛フィンガータンパク質（ZFP）及び／又は該ZFPをコードする核酸の抗ウイルス剤の製造のための使用であって、該ZFPが動物DNAウイルス由来複製タンパク質の該ウイルス複製起点への結合を阻害することができるものである上記使用。
【請求項２０】
動物ウイルス感染の予防及び／又は治療方法であって、請求項１ないし１７のいずれか１項に記載の抗ウイルス剤の予防及び／又は治療有効量を動物に投与することにより該ウイルス感染を処置し、軽減し、又は改善する方法。
【請求項２１】
動物の生体内において動物ウイルスの複製を阻害する方法であって、人工の亜鉛フィンガータンパク質（ZFP）（ただし該ZFPは動物DNAウイルス由来複製タンパク質の該ウイルス複製起点への結合を阻害することができる）及び／又は該ZFPをコードする核酸の有効量を投与し、それにより該ウイルスの複製を阻害する工程を含む方法。
【請求項２２】
該動物がヒトである請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
該動物ウイルスがヒトパピローマウイルス（HPV）である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
該HPVがHPV16、18、31、35、39、45、51、52、58、又は59型である請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
該HPVがHPV18である請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物DNAウイルスに対する抗ウイルス剤及びウイルス複製阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス複製タンパク質の複製起点への結合を阻害する従来の方法の一つは、例えばウイルス複製タンパク質のDNA結合部位のみを有する変異体である該タンパク質の「ドミナント・ネガティブ変異体」を用いる方法である（Orozco et al.(2000) J. Biol. Chem., 275: 6114-6122）。そのようなドミナント・ネガティブ変異体はウイルスの複製起点に結合するとウイルス複製の開始を誘起するタンパク質の複製起点への結合を阻害する。
【０００３】
ドミナント・ネガティブ変異体の結合能は標的のウイルス複製タンパク質とほぼ同等であるため、該変異体と野生型複製タンパク質の競合によって複製起点への結合を効果的に阻害するには多量のドミナント・ネガティブ変異体を発現させなければならない。しかしながら、複製起点への結合を阻害するのに十分な量の変異タンパク質を生体内で発現させることは極めて困難であるという問題がある。また、ドミナント・ネガティブ変異体の高レベルでの発現が可能であったとしても、そのように高いレベルは所望の標的配列以外の配列に対して該変異体の非特異的結合による細胞毒性を引き起こすかもしれない。より低い発現レベルで使用可能であることから高い親和性を有するDNA結合タンパク質が求められている。
【０００４】
本発明者は特定のゲノム配列を認識する人工DNA結合タンパク質(亜鉛フィンガータンパク質：ZFP)のデザイン及び作成法を確立した｛特表2004-519211号公報；世良、米国特許出願公開2003/0082561A1（以下、「世良特許出願」と呼ぶ。）、及びSera et al. (2002) Biochemistry, 41: 7074-7081｝。これらで報告されたZFPは合理的にデザインされたZFPを用いて植物のウイルス感染を防除する手段を提供しようとするものである。例えば、人工ZFPによる植物DNAウイルス感染予防がSera (2005) J. Virology, 79: 2614-2619により報告されている。
【０００５】
また、世良特許出願にはZFPがDNA及びRNAウイルスに対する抗ウイルス剤及びウイルス複製阻害剤として機能することが開示されている。デザインされたZFP及びその使用についての情報もWO 03/62455に示されている。しかしながら、これらの出願におけるいずれのデータも野生型（又は天然）のウイルス複製タンパク質の存在下においてDNAウイルスの複製を阻害するために十分な特異性を有するZFPのデザインを実証ないし課題とするものではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、ヒトを含む動物に対して有害なウイルスに対する抗ウイルス剤及びウイルス複製阻害剤を提供することにある。上記の課題を達成するために、動物ウイルスの複製タンパク質の該ウイルスの複製起点に対する結合を阻害することによりウイルス複製を効果的に抑制できることを本発明により提供する。そのような結合阻害に基づいて優れた抗ウイルス剤を得ることができる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明により、以下の抗ウイルス剤及びウイルス複製阻害剤が提供され、これらは動物DNAウイルス由来の複製タンパク質の該ウイルスの複製起点に対する結合を阻害する物質を有効成分として含み、前記物質は亜鉛フィンガータンパク質である。特に、本発明の一つの観点により人工亜鉛フィンガータンパク質（ZFP）及び／又は該ZFPをコードする核酸を含む抗ウイルス剤が提供され、該ZFPは動物DNAウイルス由来の複製タンパク質の該ウイルスの複製起点に対する結合を阻害することができる。いくつかの態様では、該複製タンパク質は該DNAウイルスの複製起点に2以上の結合部位を有することができる。そのような場合には該ZFPは1又は2以上の該結合部位に結合することができ、複製起点における該複製タンパク質の結合を阻害する。
【０００８】
ある態様では該抗ウイルス剤はヒトパピローマウイルス、好ましくはHPV18用であり、HPV16、31、35、39、45、51、52、58、又は59などの他の高リスクHPV用のものであってもよい。HPVに対して好ましい標的複製タンパク質はE2タンパク質であり、該人工ZFPはE2結合部位3（E2BS3）及び／又はE2結合部位4（E2BS4）の位置に、近傍に、又はオーバーラップして結合する。好ましい態様では、HPVに対する該抗ウイルス剤はGAAAACGGTCGGGACCGAA又はGGTCGGGACCGAAAACGGTで表されるDNAを標的とする。
ある態様では該抗ウイルス剤のZFPは6個の亜鉛フィンガードメインを含み、該ドメインは0から10個のアミノ酸残基で共有結合している。これらのZFPについては、該亜鉛フィンガードメインのα-ヘリックスの-1、2、3、及び6位の該アミノ酸（これらは認識アミノ酸と呼ばれる場合がある）は、この順にそれぞれ
ドメイン1についてGln、Thr、His 及び Glu; 
ドメイン2についてGlu、Ser、Asn 及び Arg;
ドメイン3についてArg、Asp、His 及び Glu;
ドメイン4についてThr、Ser、His 及び Arg;
ドメイン5についてGlu、Asp、Asn 及び Gln; 並びに
ドメイン6についてGln、Thr、Asn 及び Arg
である。または、該ドメインの1、2、3、及び6-位の該アミノ酸は、この順にそれぞれ
ドメイン1についてArg、Asn、His 及び Glu; 
ドメイン2についてGln、Ser、Asn 及び Gln;
ドメイン3についてGln、Thr、His 及び Glu; 
ドメイン4についてGlu、Ser、Asn 及び Arg;
ドメイン5についてArg、Asp、His 及び Glu; 並びに
ドメイン6についてThr、Ser、His 及び Arg
である。例えば、これらの認識アミノ酸は下記の式：
-X3-Cys-X2-4-Cys-X5-Z-1-X-Z2-Z3-X2-Z6-His-X3-5-His-X4-
（式中、Z-1、Z2、Z3及びZ6は該亜鉛フィンガードメインのα-ヘリックスの-1、2、3及び6位のアミノ酸を示す）で表される構造の一部である。
最も好ましい態様では該ZFPは配列番号2又は3のアミノ酸配列を含む。
【０００９】
また、本発明の抗ウイルス剤はZFPを含み、該ZFPは互いに0〜10個のアミノ酸残基で共有結合した少なくとも3つの亜鉛フィンガードメインを含み、亜鉛フィンガーのα-ヘリックスの-1、2、3、及び6位のアミノ酸は以下のように選択される：
-1位のアミノ酸が、アルギニン、グルタミン、トレオニン、メチオニン、又はグルタミン酸であり；
2位のアミノ酸が、セリン、アスパラギン、トレオニン、又はアスパラギン酸であり；
3位のアミノ酸が、ヒスチジン、アスパラギン、セリン、又はアスパラギン酸であり；かつ
6位のアミノ酸が、アルギニン、グルタミン、トレオニン、チロシン、ロイシン、又はグルタミン酸である。
【００１０】
同様に、本発明の抗ウイルス剤はZFPを含み、該ZFPは少なくとも3つの亜鉛フィンガードメインを含み、各亜鉛フィンガードメインは独立して下記の式：
−X3-Cys-X2-4-Cys-X5-Z-1-X-Z2-Z3-X2-Z6-His-X3-5-His-X4-
（Xは独立に任意のアミノ酸を示し、Xnはポリペプチド鎖中のXの出現数を示し；
Z-1は、アルギニン、グルタミン、トレオニン、メチオニン、又はグルタミン酸であり；
Z2は、セリン、アスパラギン、トレオニン、又はアスパラギン酸であり；
Z3は、ヒスチジン、アスパラギン、セリン、又はアスパラギン酸であり；かつ
Z6は、アルギニン、グルタミン、トレオニン、チロシン、ロイシン、又はグルタミン酸である。）で表され、該ドメインは独立して互いに0〜10個のアミノ酸残基で共有結合する。
上記のZFPにおいて、該ZFPはさらに核局在シグナル（NLS）及び／又は細胞透過ペプチド（CPP）を含むことができ、これらはZFPオープンリーディングフレーム（ORF）のN-又はC-末端に位置することができる。
【００１１】
本発明のその他の観点では、上記の任意のZFP又はこれらのZFPをコードする核酸は抗ウイルス剤であり、該抗ウイルス剤は請求項1ないし17のいずれかに記載のZFP又は核酸である。
本発明のさらに別の観点は、抗ウイルス剤の製造のための本発明の任意のZFP及び／又は該ZFPをコードする核酸の使用に関する。
本発明の他の態様により、本発明の抗ウイルス剤の予防及び／又は治療有効量を動物に投与することにより該ウイルス感染を処置し、軽減し、又は改善する動物ウイルス感染の予防及び／又は治療方法が提供される。
【００１２】
さらに本発明の別の態様は、動物の生体内において動物ウイルスの複製を阻害する方法であって、本発明のZFP及び／又は本発明のZFPをコードする核酸の有効量を投与し該ウイルスの複製を阻害する工程を含む方法に関する。好ましくは該方法はヒトにおいてヒトDNAウイルスを阻害するために用いられ、該ウイルスにはHPV、好ましくはHPV16、18、31、35、39、45、51、52、58、又は59などガンの高いリスクを伴うHPV型が包含される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明において用いられるZFPについての用語及びZFPの設計について以下に述べる。
本発明において、動物ウイルスとしてはヒト、家畜を含む哺乳動物、ニワトリを含む鳥類、養殖の対象となる魚介類などに感染可能な多様な動物DNAウイルスが挙げられる。例えば、パピローマウイルス、ヘルペスウイルス、EBウイルス、ロタウイルス、HBVなどの肝炎ウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルスなどのヒトウイルスが挙げられ、特にヒトパピローマウイルス（HPV）が挙げられる。HPVのうち特にHPV-16、HPV-18などは子宮頸癌を引き起こすとされており、パピローマウイルスの複製を抑制することによって子宮頸癌の予防又は治療効果が得られると期待される。従って、ヒトパピローマウイルスは本発明の抗ウイルス剤の好ましい標的である。
【００１４】
抗ウイルス作用又はウイルス複製阻害作用を有するいくつかの亜鉛フィンガータンパク質が世良出願及び対応の米国以外の出願、2002年の世良文献などに開示されている。これらのZFPは一般的に植物ウイルスを阻害するためのものである。
本発明の抗ウイルス剤の有効成分として利用可能なZFPは、1フィンガーあたり、例えば動物DNAウイルスの複製起点における2本鎖DNAの特定の4つの塩基を認識して特異的に結合することが好ましい。該亜鉛フィンガータンパク質は1つの複製タンパク質の結合部位に結合してもよいが、2以上の異なる複製タンパク質の結合部位に結合可能な2以上のユニットを有していてもよい。本発明の抗ウイルス剤を製造するために複製起点における任意の個数の結合部位をZFP結合のための標的としてもよい。
【００１５】
動物DNAウイルスは、複製起点に結合してウイルス複製を開始することができる1以上の固有の複製タンパク質を有している。例えば、ヒトパピローマウイルスは、複製タンパク質であるE1とE2を有し、これらの複製タンパク質の一方又は両方の結合を阻害するとヒトパピローマウイルスの複製が阻害される。ZFPを本発明の抗ウイルス剤として用いる場合には、その標的としてE2結合サイトがより好ましい。E2結合サイトは複製起点に4つの結合部位(E2BS-1、E2BS-2、E2BS-3、及びE2BS-4)を含んでいる。これらのうち図4に示されるE2BS-3及び E2BS-4がZFPの標的としてより好ましい。E2BS-3及び E2BS-4はそれぞれHPV-18ゲノムの全7857塩基対上の42〜53及び58〜69位に該当しており、適宜のDNA配列を比較することにより当業者はHPV-18以外のパピローマウイルスにおける対応位置を容易に特定できる。
【００１６】
HPVを標的とする抗ウイルス剤ではE2BS-3及びE2BS-4の両方に結合できるようにZFPの配列をデザインすることが好ましい。例えば、ZFPが6個のドメイン（各ドメインは4個の塩基を認識する）を有し、19個の連続する塩基配列を認識する場合、HPV-18のゲノム上の42〜60、43〜61、44〜62、45〜63、46〜64、47〜65、48〜66、49〜67、50〜68、及び51〜69位の10種の異なる塩基配列を認識するようにHPV-18のE2複製タンパク質を標的とする亜鉛フィンガータンパク質をデザインすることが好ましい。この点に関して、実施例において詳細に説明するZFPHPV-1及びZFPHPV-2はそれぞれ44〜62及び51〜69の標的配列用にデザインした。
複製起点において複製タンパク質が2以上の結合部位を有する場合、これらの2以上の結合部位を横断して結合するようにZFPをデザインすることにより、複製タンパク質の複製起点への結合をより特異的に阻害できる。
【００１７】
本発明の抗ウイルス剤として好適に利用可能な亜鉛フィンガータンパク質は、例えば、4塩基対標的配列を用いた亜鉛フィンガードメインを少なくとも1つ有する。より長い標的配列用に設計されたマルチフィンガー（マルチドメイン）ZFPは下記に述べるように本発明の抗ウイルス剤として有用である。
【００１８】
「亜鉛フィンガータンパク質」（ZFP）は、亜鉛によって安定化されたDNA結合ドメインを有するポリペプチドを意味する。各DNA結合ドメインは典型的には「フィンガー」又は「亜鉛フィンガードメイン」と呼ばれ、ZFPは少なくとも1つのフィンガー、より典型的には少なくとも2つのフィンガー、より好ましくは少なくとも3つのフィンガー、さらに好ましくは少なくとも4つ又は5つのフィンガー、あるいは少なくとも6つ以上のフィンガーを有する。一般的に、各フィンガーが3つ又は4つのDNA塩基対に結合することにより、ZFPは標的核酸配列と呼ばれる核酸配列に特異的に結合する。各フィンガーは通常は約30個のアミノ酸の亜鉛キレート化DNA結合サブドメインを含んでいる。1つの群であるCys2-His2群における代表的なモチーフは-Cys-(X)2-4-Cys-(X)12-His-(X)3-5-His（式中、Xは任意のアミノ酸である）であり、このモチーフを含むZFPは2個の不変ヒスチジン残基を含むαヘリックス及び1つのβターンの2個のシステイン残基からなり(Berg et al., Science 271: 1081-1085(1996))亜鉛カチオンに結合する。
【００１９】
好ましい態様によれば、亜鉛フィンガータンパク質は、下記式：
−X3-Cys-X2-4-Cys-X5-Z-1-X-Z2-Z3-X2-Z6-His-X3-5-His-X4-
（式中、Xは任意のアミノ酸であり、Xnはポリペプチド鎖中のXの出現数を示し、従って、XはCys2-His2亜鉛フィンガードメインのフレームワークを示す）の亜鉛フィンガードメインを1以上、好ましくは3〜40，より好ましくは3〜15個有する。
【００２０】
4塩基標的配列についての本発明の好ましい態様は以下のとおりである：
(i)第1の塩基がGの場合、Z6はアルギニンであり、
第1の塩基がAの場合、Z6はグルタミンであり、
第1の塩基がTの場合、Z6はトレオニン、チロシン、又はロイシンであり、
第1の塩基がCの場合、Z6はグルタミン酸であり、
(ii)第2の塩基がGの場合、Z3はヒスチジンであり、
第2の塩基がAの場合、Z3はアスパラギンであり、
第2の塩基がTの場合、Z3はセリンであり、
第2の塩基がCの場合、Z3はアスパラギン酸であり、
【００２１】
(iii)第3の塩基がGの場合、Z-1はアルギニンであり、
第3の塩基がAの場合、Z-1はグルタミンであり、
第3の塩基がTの場合、Z-1はトレオニン又はメチオニンであり、
第3の塩基がCの場合、Z-1はグルタミン酸であり、
(iv)第４の塩基の相補物がGの場合、Z2はセリンであり、
第4の塩基の相補物がAの場合、Z2はアスパラギンであり、
第4の塩基の相補物がTの場合、Z2はトレオニンであり、
第4の塩基の相補物がCの場合、Z2はアスパラギン酸である。
より好ましい態様では、第1の塩基がTの場合、Z6はトレオニンであり、第3の塩基がTの場合、Z-1はトレオニンである(表１)。
【００２２】
別の好ましい態様として、以下の態様を挙げることができる。
(i)第1の塩基がGの場合、Z6はアルギニン又はリジンであり、
第1の塩基がAの場合、Z6はグルタミン又はアスパラギンであり、
第1の塩基がTの場合、Z6はトレオニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、又はメチオニンであり、
第1の塩基がCの場合、Z6はグルタミン酸又はアスパラギン酸であり、
(ii)第２の塩基がGの場合、Z3はヒスチジン又はリジンであり、
第2の塩基がAの場合、Z3はアスパラギン又はグルタミンであり、
第2の塩基がTの場合、Z3はセリン、アラニン、又はバリンであり、
第2の塩基がCの場合、Z3はアスパラギン酸又はグルタミン酸であり、
【００２３】
(iii)第3の塩基がGの場合、Z-1はアルギニン又はリジンであり、
第3の塩基がAの場合、Z-1はグルタミン又はアスパラギンであり、
第3の塩基がTの場合、Z-1はトレオニン、メチオニン、ロイシン、又はイソロイシンであり、
第3の塩基がCの場合、Z-1はグルタミン酸又はアスパラギン酸であり、
(iv)第4の塩基の相補物がGの場合、Z2はセリン又はアルギニンであり、
第4の塩基の相補物がAの場合、Z2はアスパラギン又はグルタミンであり、
第4の塩基の相補物がTの場合、Z2はトレオニン、バリン、又はアラニンであり、
第4の塩基の相補物がCの場合、Z2はアスパラギン酸又はグルタミン酸である。
【００２４】
本発明の抗ウイルス剤の有効成分として用いられる亜鉛フィンガータンパク質は、各亜鉛フィンガードメインが独立して上記の式で示されるマルチドメインZFPであってもよい。この場合、標的核酸配列は3N+1塩基対長を有する（Nは標的中の重複4塩基対セグメントの数であって、標的核酸配列を重複4塩基対セグメントに分割することにより得られる数であり、N-1セグメントまでの各セグメントの第4の塩基は直後のセグメントにおける第1の塩基である）。
【００２５】
本発明の抗ウイルス剤の有効成分として用いられる亜鉛フィンガータンパク質の他の好ましい態様は、互いに0個〜10個のアミノ酸残基で共有結合した少なくとも3つの亜鉛フィンガードメインを含み、該亜鉛フィンガーのα-ヘリックスの-1位、2位、3位、及び6位のアミノ酸は上記に述べた好ましい態様から選択することができる。好ましい態様のZFPは、それぞれ独立に下記式：
−X3-Cys-X2-4-Cys-X5-Z-1-X-Z2-Z3-X2-Z6-His-X3-5-His-X4-
で示される少なくとも3つの亜鉛フィンガードメインを含み、該ドメインは0個〜10個のアミノ酸残基で互いに共有結合する（式中、Xは任意のアミノ酸であり、Xnはポリペプチド鎖中のXの出現数を示し、このポリペプチドが当業界で公知でない場合においては、Z-1、Z2、Z3、及びZ6は表１の認識コードによって決定される(公知のZFPのリストについては世良出願を参照のこと)）。
【００２６】
上記のように、XはCys2−His2亜鉛フィンガードメインのフレームワーク中のアミノ酸を示し、既知の亜鉛フィンガーフレームワーク、コンセンサスフレームワーク、これらの任意のフレームワークの配列を変化させることによって得られるフレームワーク、又は亜鉛フィンガードメインの全体構造を維持した任意の人工的なフレームワークであってもよい。好ましくは、既知のフレームワークを使用して各Xの同一性を決定することができる。好ましいフレームワークはSp1c及びZig268由来のものである。さらに好ましいフレームワークはSp1C由来のドメイン2である。
【００２７】
本発明の抗ウイルス剤に好適に用いられるZFPは、3個〜40個の亜鉛フィンガードメイン、好ましくは3個〜15個のドメイン、3個〜12個のドメイン、3個〜9個のドメイン、又は3個〜6個のドメインを含み、または3個、4個、5個、6個、7個、8個、又は9個のドメインを有するZFPである。
【００２８】
さらに好ましいZFPは、独立に又は任意の組み合わせとして、少なくとも1つの亜鉛フィンガードメインにおいてZ-1がメチオニンであり；少なくとも1つの亜鉛フィンガードメインにおおいてZ-1がグルタミン酸であり；少なくとも1つの亜鉛フィンガードメインにおいてZ2がトレオニンであり；少なくとも1つの亜鉛フィンガードメインにおいてZ2がセリンであり；少なくとも1つの亜鉛フィンガードメインにおいてZ2がアスパラギンであり；少なくとも1つの亜鉛フィンガードメインにおいてZ6がグルタミン酸であり；少なくとも1つの亜鉛フィンガードメインにおいてZ6がトレオニンであり；少なくとも1つの亜鉛フィンガードメインにおいてZ6がチロシンであり；少なくとも1つの亜鉛フィンガードメインにおいてZ6がロイシンであり、及び／又は少なくとも1つの亜鉛フィンガードメインにおいてZ2がアスパラギン酸であり、かつ同一のドメインにおいてZ-1がアルギニンではないZFPである。
【００２９】
本発明のさらに別の態様によれば、本発明の抗ウイルス剤として用いられるZFPは1以上の核局在シグナル(NLS)及び／又は1以上の細胞膜透過ペプチド（CPP）を含んでいてもよい。抗ウイルス剤がタンパク質である場合にはこれらのCPP及びNLSを付加することが特に有用である。本発明の抗ウイルス剤の有効成分は好ましくは核局在シグナル及び細胞透過ペプチドの両者を含み、ZFP ORFのN末端又はC末端のいずれかに配置される。それらの具体例として以下の構成が挙げられる。
CPP-NLS-ZFP;
NLS-CPP-ZFP;
CPP-NLS-CPP-ZFP;
CPP-ZFP-NLS;
ZFP-CPP-NLS;
ZFP-NLS-CPPなど。
【００３０】
上記ZFP及び上記ZFPをコードする核酸はCPP及びNLSの両者を含むことが好ましい。
NLSは、真核細胞の核膜構造を介して該細胞の核内にタンパク質を局在化するために必要なアミノ酸配列である。NLSが核内にタンパク質を局在化させる作用を有するものである限りNLSの種類は特に重要ではない。例えば、SV40 large-T antigen由来のNLS (large-T antigenの126〜132番目のアミノ酸の領域をコードするポリヌクレオチド、Proc. Natl. Acad. Sci. (1989)86:9327-9331)、HIF-1αのNLSなどが好ましい。
【００３１】
CPPはZFPの細胞内透過を促進する任意の配列とすることができる。例えば、Tatペプチド、ポリリジンなど多数の塩基性アミノ酸を含むペプチドが好ましい。
膜透過ペプチドの具体例を以下に挙げるが、これらに限定されることはない。
天然のタンパク質由来のもの：
HIV TAT （アミノ酸47〜57）
--- TyrGlyArgLysLysArgArgGlnArgArgArg
Antp homeodomain (アミノ酸43〜58）
--- ArgGlnIsoLysIsoTrpPheGlnAsnArgArgMetLysTrpLysLys
VP22 (アミノ酸267〜300）
--- AspAlaAlaThrAlaThrArgGlyArgSerAlaAlaSerArgProThr
GluArgProArgAlaProAlaArgSerAlaSerArgProArgArgProValGlu；
及び人工物：
PTD4 --- TyrAlaArgAlaAlaAlaArgGlnAlaArgAla;
R9 --- ArgArgArgArgArgArgArgArgArg。
【００３２】
CPP及び／又はNLSをZFPに連結する方法は特に限定されない。例えば、大腸菌、昆虫細胞、動物細胞、又は発現系として用いられる任意の細胞において、切断可能なペプチドリンカー（プロテアーゼ切断部位を有していてもよい）を用いて、又は用いずにこれらのドメインをコードするDNAをZFPをコードするDNAに直接結合することができる。あるいは、スクシンイミド及び/又はマレイミドを含む二官能性又は多官能性のリンカーを介してCPP及び／又はNLSドメインをZFPに対して化学的に結合することもできる。また、このようなタンパク質はcJun-cFosのようなタンパク質相互作用を利用した非共有結合による会合物として調製することもできる。例えばcJunに対してCPPを結合させた結合物とZFPに対してcFosを結合させた結合物とをそれらの会合物を調整するために用いることができる。
【００３３】
上記に説明した亜鉛フィンガータンパク質のほか、本発明の抗ウイルス剤及びウイルス複製阻害剤の有効成分は、亜鉛フィンガータンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターなどの亜鉛フィンガータンパク質を発現可能なポリヌクレオチドであってもよい。発現ベクターは、哺乳動物細胞等の動物細胞においてタンパク質を発現可能なDNA又はRNAウイルスベクターやプラスミドベクターを用いて公知の方法により構築することができる[モレキュラー・クローニング、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、ア・ラボラトリー・マニュアル(1989)又は他の組換えDNAについての成書を参照のこと]。発現ベクターとしては、pCR4、pCR2.1、pBR322、pBR325、pUC12、pUC13などの大腸菌由来プラスミド、酵母由来プラスミド（pSH19、pSH15等）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなどの動物ウイルスなどを用いることができる。これらの発現ベクターは必要な場合にはリポソーム（特にカチオン系リポソーム）や当業者に知られている他の技術を用いて動物（特にヒト）細胞に導入することができる。亜鉛フィンガータンパク質を有効成分として含む抗ウイルス剤を動物に投与する場合、少なくともCPPとの融合タンパク質として投与することが好ましい。
【００３４】
ZFPの用語及びデザインの概説
亜鉛フィンガードメインにおいて核酸が接触する4種の残基は、主に特異性及び親和性の決定を担っており、第1のコンセンサスヒスチジン及び第2のコンセンサスシステインに対して同一の位置にある。第1の残基は、第1のコンセンサスヒスチジンのN末端側の7つの残基及び第2のコンセンサスシステインのC末端側の6つの残基である。以下、この残基を「-1位」の残基と呼ぶ。他の3種の残基は、-1位の残基のC末端から2つ、3つ、及び6つ離れた残基であり、以下、これらをそれぞれ「2位」、「3位」、及び「6位」の残基と呼ぶ。あるいはこれらの位置をZ-1位、Z2位、Z3位、及びZ6位とも呼ぶ。これらのアミノ酸残基を「塩基接触アミノ酸」と呼ぶ（認識アミノ酸と呼ぶ場合もある）。-1位は亜鉛フィンガードメインにおけるαヘリックスの始点である。亜鉛フィンガードメインにおける-1位、2位、3位、及び6位のアミノ酸の位置、並びに4塩基対DNA標的配列においてそれらが接触する塩基を図１に概略的に示す。
【００３５】
亜鉛フィンガー核酸認識コードを表１に示すが、この組み合わせは既知及び可能な塩基-アミノ酸相互作用に基づくものである（図2）。図2に列挙したいくつかの相互作用は、H-T-Hタンパク質、cro、及びλ抑制因子などの異なるタンパク質においても同定されている。4塩基対領域における第1及び第3のDNA塩基の認識のために、より長い側鎖を含むアミノ酸を選択することができる。また、第2及び第4の塩基の認識のために、より短い側鎖を含むアミノ酸を選択することができる。例えば、グアニン塩基認識の場合、-1位及び6位のアミノ酸としてアルギニンを選択し、3位のアミノ酸としてヒスチジンを選択し、かつ2位のアミノ酸としてセリンを選択することができる。表１に示す全てのアミノ酸は、水素結合によって標的となる複製起点の特定のDNA塩基（例えば実施例ではパピローマウイルスのE2タンパク結合部位）と安定に相互作用する。チミジン塩基認識の場合、疎水性側鎖を有するアミノ酸も選択される（すなわち、第1のチミジン塩基についてはロイシン、第3のチミジン塩基にはメチオニン）。他のDNA塩基−アミノ酸相互作用も可能であり、より高い親和性を有するアミノ酸を選択することができる。例えば、リジンはグアニンに結合するが、さらなる水素結合形成のためにアルギニンを好ましく選択することができる。
【００３６】
【表１】
2009506025.tif 000002
【００３７】
2位のアミノ酸による4塩基対DNA配列（3'トリプレットDNA付近の第１の塩基）中の4つの塩基の認識を図3に示す。亜鉛フィンガードメインの2位のAsp、Thr、Asn、及びSerは、それぞれC、T、A、及びGに優先的に結合する。第4の塩基はアンチセンス核酸鎖中に存在する。
【００３８】
表1において（及び標的配列の各4塩基対部分については）塩基は常に5'〜3'の方向で示す。表中の第4の塩基は常に標的配列中における第4の塩基の相補物である。例えば、標的配列がATCCで記述される場合、5'-ATCC-3'のセンス鎖標的配列及び3'-TAGG-5'のアンチセンス鎖を意味する。従って、センス鎖配列ATCCを上記の表からアミノ酸に翻訳する場合、第1の塩基Aは6位にグルタミンがあることを意味し、第2の塩基Tは3位にセリンがあることを意味し、第3の塩基Cは-1位にグルタミンがあることを意味するが、Cと記載される第4の塩基では、Cの相補物（すなわち、表中に見出され2位のアミノ酸の同定に使用されるG）を意味する。この場合、2位のアミノ酸はセリンである。
【００３９】
また、第1の塩基がTである場合にZ6がトレオニンであり、第3の塩基がTである場合にZ-1がトレオニンである場合も好ましい。表1の認識コードに存在するものについてさらに保存的なアミノ酸を一般的に示すように拡大した認識コードを以下の表2に示す。表2において、各欄に列挙したアミノ酸の順序は、左から右に、その位置において最も好ましいアミノ酸から最低限好ましいものを示す。
【００４０】
【表２】
2009506025.tif 000003
【００４１】
Xの同一性によって決定されるフレームワークは、フレームワークの変化が亜鉛フィンガードメインの全体構造を維持している限りにおいて、既知の亜鉛フィンガーフレームワーク、コンセンサスフレームワーク、又はこれらのフレームワークの任意の１つの改変体であってもよい。好ましいフレームワークは、Sp1C及びZif268由来のものである。より好ましいフレームワークは、Sp1C由来のドメイン2である。
【００４２】
当業界において周知の任意の多様な技術を用いて、合成的に又は組換えのいずれかにより、好ましくは組換えにより設計した亜鉛フィンガードメインを含むタンパク質を調製することができる。タンパク質を（例えば、ZFPをコードするDNAを介して）組換えにより調製する場合には、ZFPを発現させるべき生物において高発現するようにコドン使用を最適化することができる。このような生物には、細菌、真菌、酵母、動物、又は昆虫が含まれるが、これらの例に限定されることはない。例えば、抗ウイルス剤をZFPタンパク質とすべき場合には、これらの任意の生物のタンパク発現において該タンパク質を大量に発現させることができ、該タンパク質を生成して動物への投与に用いることができる。
【００４３】
特にドメインが連続していない場合、マルチドメイン（すなわち、マルチフィンガー）ZFPの設計は上記の単一ドメインの設計方法（例えばSp1C由来のドメイン2などの好ましいフレームワークを使用する方法）に従えばよい。4塩基対を超える標的配列に対する複数の連続するドメイン（又は本明細書に記載のリンカーによって分離されたドメイン）を有するZFPについて、特に該ZFP中に3つを超える亜鉛フィンガードメインが存在する場合には、標的配列を重複する4塩基対セグメントに分割することによって設計されたZFPがコンテント独立性の亜鉛フィンガー認識コードを与え、それによりZFP、典型的には高結合親和性を有するZFPが得られることが見出された。
【００４４】
この方法において、標的配列は3N+1塩基対長を有する（Nは標的中の重複4塩基対セグメントの数であり、標的配列を重複4塩基対セグメントに分割することによって決定され、N-1セグメントまでの各セグメントにおける第4の塩基が直後のセグメントの第1の塩基である）。各4塩基対セグメントの設計方法のその他の部分は、各X、Z-1、Z2、Z3、及びZ6の同一性の決定に関しての単一ドメインの設計方法に従う。この方法は、3個〜15個のドメイン（Nは3〜15の任意の数）、より好ましくは3個〜12個のドメイン、3個〜9個のドメイン、又は3個〜6個のドメインを有するZFPの設計に有用である。40個を超えるドメインを有するZFPが当分野において既知であり、所望であればNは少なくとも40までの範囲であってもよい。
【００４５】
設計された亜鉛フィンガードメインを互いに直接共有結合させるか、又は1個〜10個のアミノ酸又はペプチドのリンカー領域により分離することができる。リンカーのアミノ酸は柔軟性又はある程度の構造剛性を与えることができる。必ずしも必要というわけではないが、リンカーの選択は同種の標的配列に対してのZFPの所望の親和性により決定することができる。同種の標的配列に対するZFPの結合親和性を改善するために種々のリンカー配列をテストして最適化することは当業者がなし得ることである。ZFPとその標的との間の結合親和性の測定法は周知である。典型的には、ゲルシフトアッセイを使用することができるが、本明細書の実施例に示すように例えば一過性発現アッセイも使用できる。1つの態様では、3つの各フィンガードメインがその標的配列に独立して結合し、互いの結合の立体障害を回避できるようにアミノ酸リンカーが柔軟であることが好ましい。
本発明の抗ウイルス剤であるZFPには、表１の認識コードで示される-1位、2位、3位、及び6位のアミノ酸の1以上の組合せを有する任意のZFPが包含される。
【００４６】
医薬製剤
CPP及びNLSドメインを有するか若しくは有しない本発明のZFP又はこれらZFPをコードする核酸を有効成分として含む抗ウイルス剤又はウイルス複製阻害剤は、生理学的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤などの製剤用添加物を用いて、例えば凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で調製することができる。製剤用添加物としては、例えば、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンズエトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル又はプロピルパラベンなど）、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、3-ペンタノール、及びm-クレゾールなど）；低分子量（約10残基未満）のポリペプチド；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンなど）；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジンなど）；単糖類、二糖類、及び他の炭水化物（グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む）；キレート剤（EDTAなど）；糖類（スクロース、マンニトール、トレハロース、又はソルビトールなど）；塩形成性対イオン（ナトリウムなど）；金属複合体（例えば、亜鉛-タンパク質複合体）；及び／又は非イオン性界面活性剤（TWEEN（登録商標）、PLURONICS（登録商標）、又はポリエチレングリコール（PEG））などが挙げられるが、これらに限定されることはない。製剤の無菌化は、例えば滅菌濾過膜を使用した濾過により行うことができる。
【００４７】
本発明の抗ウイルス剤又はウイルス複製阻害剤には、本発明により提供される有効成分に悪影響を与えない範囲で他の医薬成分を配合してもよい。このような医薬成分は、意図する予防及び／又は治療目的に有効な量で組み合わせることができる。例えば、既知の抗ウイルス剤などと組み合わせてもよい。
【００４８】
本発明により提供される抗ウイルス剤の有効成分は、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）、コロイド状の薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）、又はマクロエマルジョンに担持させることができる。このような技術は、「レミントンの薬科学（Remington's Pharmaceutical Science）」、第16版、A. オソール編、（1980）又は新版に開示されている。
【００４９】
本発明の抗ウイルス剤又はウイルス複製阻害剤を徐放性製剤として調製してもよい。徐放性製剤を調製するための好適な徐放性基質の例としては、例えばポリペプチド変異体を含む固体疎水性ポリマーの半透性基質が挙げられ、この基質は成形した製品（例えば、フィルム又はマイクロカプセル）として提供されている。徐放性基質の例としては、ポリエステルヒドロゲル（例えば、ポリ（2-ヒドロキシエチル-メタクリレート）又はポリ（ビニルアルコール）、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号）、L-グルタミン酸とL-グルタミン酸エチルのコポリマー、非分解性エチレン-ビニルアセテート、分解性乳酸-グリコール酸のコポリマー（LUPRONDEPOT（登録商標）（乳酸-グリコール酸のコポリマー及び酢酸ロイプロリドで構成される注射用ミクロスフェア）など）、及びポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸などが挙げられる。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸などのポリマーは、100日間にわたって分子を放出することができるが、あるヒドロゲルは短時間にタンパク質を放出させることもできる。安定化に関しては、例えば、封入された抗体が体内に長期間とどまる場合には、37℃の水分と接触する結果として抗体が変性又は凝集し、それにより生物活性が失われて免疫原性が変化する可能性がある。不安定化の機構に応じて、安定化のための合理的な対策を案出することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド相互交換による細胞間S-S結合形成であることが分かった場合には、スルフヒドリル残基の改変、酸性溶液からの凍結乾燥、適切な添加物を使用した水分含量の調節、及び特異的ポリマーマトリクス組成物を開発するなどの手段によって安定化することができる。
【００５０】
本発明の抗ウイルス剤又はウイルス複製阻害剤の投与量は特に限定されないが、当業者は有効成分の種類、投与対象となる動物の種類や体重、動物ウイルスの種類、ウイルス感染症の種類や症状などに応じて投与量を選択できる。
ここに説明した本発明についてはその範囲から逸脱することなく種々の省略、付加、及び改変を加えることは当業者に理解されるところであり、そのようないかなる修飾又は変更も添付の請求の範囲に規定される本発明の範囲に包含されることが意図されている。全ての参照文献、特許、特許出願、及び他の刊行物の全てを参照により本明細書に含める。
【実施例】
【００５１】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されることはない。
以下の実施例では、複製起点が組み込まれた一過性発現ベクターを使用してウイルスゲノム複製の阻害を評価した。HPVのDNA複製の研究においてこの種の試験系はすでに確立されており、この系を使用してヒトに感染する完全なHPVでのDNA複製阻害能を証明することが可能である。
【００５２】
例１
(1)プラスミド作成
ヒトパピローマウイルスの複製起点に対するE2結合を防ぐために、図4に示すDNA配列に対して2種類のZFP（ZFPHPV-1及びZFPHPV-2）をデザインし、世良ら(Biochemistry (2002) 41: 7074-7081)に記載されたように構築した。図5にそれぞれ6つのメインを有するZFPHPV-1とZFPHPV-2の亜鉛フィンガードメインのアミノ酸配列を示す。これらのタンパク質を大腸菌で発現させるためにpET-21a (Novagen)にクローニングした。コントロールのZFP(ZFPAlaと呼ぶ)を同様の系で、ただし全認識アミノ酸をアラニンで置き換えて構築した（すなわち各亜鉛フィンガードメインにおける-1、2、3、及び6位がアラニンである）。
【００５３】
HPV-18 E2をコードする大腸菌発現プラスミドはpHPV-18(アメリカン・タイプ・カルチャーコレクション)由来のE2オープンリーディングフレーム（ORF）（HPV-18のヌクレオチド(nt)番号2817-3914）をpET-21aのEcoRI/HindIII部位にクローニングすることにより調製した。
ZFPHPV-2についてCPP及びNLSドメインを有するZFPを以下のように調製した。第一のZFPをPTD4-ZFPHPV-2と呼び、これはPTD4配列（TyrAlaArgAlaAlaAlaArgGlnAla ArgAla）、3個のグリシンリンカー、NLS配列（ProLysLysLysArgLysVal）、付加リンカー(GlyGlyGlyGlySer)、pET-21aにおけるZFPHPV-2 ORFのN末端の前方にT7タグ(MetAlaSerMetThrGlyGlyGlnGlnMetGly)を有する。このT7タグはウェスタンブロッティングでタンパク質を検出するため、及びエキソプロテアーゼによる分解作用からPTD4を保護するために用いる。
【００５４】
第二のZFPをZFPHPV-2-R9と呼び、これはC末端においてリンカー(GlyGlyGlyGlySer)と結合したZFPHPV-2 ORF、同一のNLS配列、3個のグリシンリンカー、R9配列(ArgArg ArgArgArgArgArgArgArg)、及びpET21aにおけるV5-タグ（(GlyLysProIleProAsnPro LeuLeuGlyLeuAspSerThr) を有する。ZFPHPV-2 ORFのN末端の前方には同一のT7タグを有する。V5の存在により細胞内エキソプロテアーゼによる分解作用からR9が保護される。
【００５５】
PTD4-NLS及びNLS-R9の構造を以下に示す。
【表３】
2009506025.tif 000004
【００５６】
pRL-E1、pRL-E2及びpUC-Ori177（一過性ウイルスDNA複製実験用）を以下のように構築した。pRL-E1及びpRL-E2ベクターはE1遺伝子（HPV-18遺伝子由来のヌクレオチド904〜2887）及びE2遺伝子（HPV-18遺伝子由来のヌクレオチド 2817〜3914）をそれぞれpRL-SV40ベクター(Promega)のNheI/XbaI部位にクローニングすることにより構築した。HPV-18複製起点を有するベクターであるpUC-Ori177は、Ori177と呼ばれHPV-18の複製起点を含む177塩基対のAluI/BamHIフラグメント（HPV-18遺伝子のヌクレオチド7800〜7857及び1〜119）をpUC19のHincII/BamHI部位にクローニングすることにより構築した。
【００５７】
動物細胞においてそれぞれZFPHPV-1、ZFPHPV-2 及びZFPAlaを発現するための哺乳類発現ベクターpCMV-ZFPHPV-1、pCMV-ZFPHPV-2 及びpCMV-ZFPAlaはそれぞれのZFP ORFを修飾pcDNA3.1 (Invitrogen)にクローニングすることにより構築した。この修飾プラスミドはN末端T7タグ、SV40ラージT抗原由来の核局在シグナル、及びZFP挿入のためのマルチクローニング部位を含んでいる。
【００５８】
(2)タンパク質精製
DNA結合実験に使用したタンパク質（ZFPHPV-1、ZFPHPV-2及びE2）及び複製阻害実験に用いたPTD4-ZFPHPV-2及びZFPHPV-2-R9は、大腸菌株BL21(DE3)又はBL21(DE3)ｐLysS（Novagen）を用いて発現させた。37℃培養でOD600値が0.6になったときに1 mM IPTGを加えてタンパク質発現を誘導した。3時間培養後に大腸菌を超音波破砕し、概ね世良論文(2002)に記載されているとおり目的のタンパク質をBi-Rex 70陽イオン交換樹脂カラム(Bio-Rad)を用いて精製した。得られたタンパク質の純度はSDS-PAGE上で95％以上であり、タンパク質濃度はProtein Assay ESL (Roche Molecular Biochemicals)で決定した。
【００５９】
(3)DNA結合
(a)Kdの推定
DNA結合アッセイは2個のE2結合サイト（E2結合サイトには下線を付した）を有する56塩基対の2重鎖DNAプローブ 5'-(TA)4GGAGTAACCGAAAACGGTCGGGACCGAAAACGGTG TATAT(TA)4-3'（配列番号４）、又は1個のE2結合サイトを有する40塩基対の 2重鎖DNAプローブ 5'-(TA)4GGAGTAACCGAAAACGGTGTATAT(TA)4-3'（配列番号５）を用いた。各プローブは[α-32P]dATP 又は[α-32P]dTTP及びクレノウフラグメントを用いてラベルした。
【００６０】
ZFPとの結合反応には、0.03 fmolのラベル化56塩基対及び表示濃度の精製ZFPを氷上で10μlの結合反応バッファー（10 mM Tris-HCl (pH 7.5)/100 mM NaCl/5 mM MgCl2/0.1 mM ZnCl2/0.05% BSA/10% グリセリン）中で1μgのポリ(dA-T)2とともに1時間インキュベートした。E2との結合反応には、0.03 fmolのラベル化40塩基対DNA プローブ及び表示濃度の精製E2を同様の条件下でインキュベートした。
反応終了後、反応混合物を非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（6%ゲル、45 mM Tris-ホウ酸バッファー、140 V、4℃で2時間）でのゲルシフトアッセイにより分離及び分析した。
【００６１】
図6はDNAに対するZFPHPV-1及びZFPHPV-2の結合結果を示し（左の2つの図）、これらのZFPがHPVのE2結合部位に約10 pMの濃度で結合することを示している。同一条件下で（すなわち過剰量の非ラベル化ポリ(dA-dT)2の存在下で）最大結合量の半値が観察されるE2タンパク質のみかけの解離定数（Kd）は約40 nMであった。従って、ZFPHPV-1及びZFPHPV-2は共にDNAに対してE2よりも約4000倍高い親和性を有している。
もう一つのDNA結合実験を行い、図10のaに示す9個の変異プローブを用いてZFPHPV-1（10、100、及び1000 pMの濃度）及びZFPHPV-2（10、100、及び1000 pMの濃度）のDNA結合特異性を調べた。これらの変異体は56塩基対DNAプローブに対するものである。結果を図10のb〜gに示す。
【００６２】
最後にコントロールのタンパク質であるZFPAlaは過剰量の競合DNAである非ラベル化(dA-dT)2の存在下で標的DNAを1μMにおいてもシフトさせることができなかったが、これは19塩基対標的DNAを認識するためにZFPHPV-1及びZFPHPV-2の両者における特異的認識アミノ酸が必要であることを示す。
上記の実験の結果によりZFPHPV-1及びZFPHPV-2がHPV複製起点（標的DNA配列）に特異的に結合することが証明された。
【００６３】
(b)競争的結合
競合結合実験では、上記と同一条件下においてラベル化56塩基対DNAプローブにE2 (最終濃度100 nM)とZFPHPV-1又はZFPHPV-2 (最終濃度0.1、1、10、又は100 nM)とを同時に加えた。図8におけるレーン8から5はZFPHPV-1の結果を示し、レーン12から9はZFPHPV-2の結果を示すが、ZFPHPV-1及びZFPHPV-2が共にHPVのDNA複製を阻害し、ZFPHPV-2が強力な複製阻害作用を有することを示している。レーン1から4はそれぞれ遊離DNA、E2結合DNA、ZFPHPV-1結合DNA、及びZFPHPV-2結合DNAのバンド位置を示す。
【００６４】
未改変E2複製タンパク質の結合部位を残し、かつZFPのリンカー部位における結合部位CGGG(WT)からCGGT(MT2)、CTGT(MT10)、ATAT(MT11)、又はATATATAT(MT12)のみを変異させて変異複製起点を有する一過性ウイルス複製系（以下に説明する）を調製した。これらの変異プローブも図11の上段に示す。pCMV-ZFPHPV-2と共トランスフェクトしたDNAプローブについてのゲルシフトアッセイの結果を図11のbに示す。pCMV-ZFPHPV-2と共トランスフェクトした変異oriプラスミドについてのゲルシフトアッセイの結果を図11のcに示す。一過性変異ウイルス起点の複製阻害は認められず(図11のc)、ZFPHPV-2はこの変異複製起点に結合しないことが示唆された。
【００６５】
従って、インビトロにおけるZFPHPV-2の結合選択性が細胞内においても発揮されることが確認された。この結果は、天然由来の複製起点を含む一過性ウイルス複製系において観察された上記の亜鉛フィンガータンパク質の複製阻害作用が復籍起点に対するZFPの特異的結合により生じることを示唆している。
【００６６】
(4)一過性ウイルスDNA複製
(a)ZFP遺伝子による複製阻害
１ウェルあたり全部で8×105個のヒト細胞293H (Invitrogen)をバイオコートポリ-D-リジン12ウェルプレート（Becton Dickinson）に蒔き、0.1 mM非必須アミノ酸及び10%ウシ胎児血清（Invitrogen）を加えたダルベッコ改変イーグル培地（Invitrogen）で維持した。播種の後、細胞を一過性複製に必要な3種のベクター: 1.5μのpRL-E1、0.17μgのpRL-E2、及び0.17μgのpUC-Ori177、並びに動物細胞での発現のための0.17μgの適宜のZFPベクター: pCMV-ZFPHPV-1、pCMV-ZFPHPV-2、pCMV-ZFPAla、又はpcDNA3.1（ZFP発現のコントロール; Invitrogen）をリポフェクタミン2000 (Invitrogen)を用いて製造元のプロトコールに従って共トランスフェクトした。37℃で5% CO2下で3日間培養した後、細胞からプラスミドをHirt抽出法により単離し(Hirt (1967) J. Mol. Biol. 26: 365-369)、HindIIIで消化して直線化した。
【００６７】
複製されたDNA及び非複製DNAを区別するために各サンプルの半量を過剰のDpnIで処理して非複製のメチル化された挿入DNA PUC-Ori177を除去した。直線化した各サンプルの残りの半量の1パーセントを用い、各一過性複製アッセイに用いられたプラスミドが同じ量で293細胞に導入されたことを確認した。このDNAサンプルを電気泳動（0.5×Tris-ホウ酸-EDTAバッファーを用いた0.8% アガロース中）で分離してサザンブロットハイブリダイゼーションに付した。
【００６８】
この分析には、ジゴキシゲニン（DIG）でラベルしたpUC-Ori177におけるアンピシリン耐性遺伝子を検出するための200塩基対DNA プローブを用い、シグナルは抗-DIG-AP及びCDP-Star (Roche Molecular Biology)を用いて検出した。X線フィルム上のDNAバンド強度を数値化してUN-SCAN-IT(Silk Science, Inc.)で定量した。複製されたpUC-Ori誘導体のDNAバンドの平均強度を4回の独立した実験から計算し、入力したpUC-Ori誘導体のDNAバンド強度を標準化した。ZFPALAはネガティブコントロールである。
【００６９】
図7に示す結果はZFPHPV-1及び ZFPHPV-2がDNA複製を阻害したことを示す。特にZFPHPV-2はコントロールであるpcDNA3.1の約12%まで複製レベルを低下させた。同一の条件下でコントロールのタンパク質であるZFPALAはDNA複製を阻害しておらず（図7、レーン4）、ZFPHPV-1及び ZFPHPV-2における特異的認識アミノ酸（すなわち-1、2、3,及び6位のもの）が阻害に必要であることが示された。
【００７０】
(b)ZFPによる複製阻害
これらの実験のためPTD4-ZFPHPV-2又はZFPHPV-2-R9を表示した最終濃度で8×105個（12ウェルプレートの1ウェルあたり）の293H細胞に加えた。細胞を1時間培養し、pRL-E1 (1.5μg)、pRL-E2 (0.17μg)及びpUC-Ori177 (0.17μg)でトランスフェクトした。pUC-Ori177の複製を上記(a)と同様にして分析した。
【００７１】
図9に示す結果はZFPHPV-2-R9を一過性ウイルス複製システムに添加すると細胞に入り、核内に移行してウイルス複製を阻害できることを示している。従って、このタンパク質は抗ウイルス剤又はウイルス複製阻害剤として有効に作用できる。
R9ドメイン（細胞透過能の付与）をE2タンパク質（すなわちドミナント-ネガティブ変異体）のC末端（アミノ酸番号283から365）に位置するDNA結合ドメインに組換え手法により融合させてE2C-R9タンパク質を調製した。一過性ウイルス複製のE2C-R9による阻害を調べたところ、ドミナント-ネガティブ変異体E2C-R9よりもZFPHPV-2-R9のほうが強い複製阻害能を有することが示された。高いDNA結合能を有するZFPが抗ウイルス剤として高い有効性を発揮できることが同様に示唆された（図12）。
【００７２】
(c)ZFP取り込みの検証
１ウェルあたり4×105個の293H動物細胞を24ウェルプレートに蒔き、細胞培地にZFPHPV-2-R9又はPTD4-ZFPHPV-2を最終濃度250 nMで添加した。細胞を37℃で5％ CO2濃度下で指定の時間培養した。各時間において、細胞を1×PBS 1 mlで2回洗浄し、1×Passive Lysis Buffer (Promega) 100μlを加えて溶解させた。さらに1×Passive Lysis Buffer 100μlでウェルを洗浄し、そのバッファーを細胞溶解液に加えた。遠心により細胞の破片を除き、上清中の上記ZFPの量をZFPHPV-2-R9及びPTD4-ZFPHPV-2に対しそれぞれ抗V5タグ抗体及び抗T7タグ抗体を一次抗体として用いてウェスタンブロット法により測定した。二次抗体は抗マウスIg-HRPとしてECL Plus (Amersham)を用いてシグナルを検出した。結果を図13に示す。ZFPHPV-2-R9及びPTD4-ZFPHPV-2を細胞培地に添加して10分以内に細胞中に大量の該タンパク質が検出可能であったことが示された。このようにZFPHPV-2-R9及びPTD4-ZFPHPV-2は細胞膜を透過しており、従って細胞に取り込まれていた。ZFPHPV-2-R9はより効率的に取り込まれており、このタンパク質により示されたより高い複製阻害能に一致していた。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明の抗ウイルス剤及びウイルス複製阻害剤は動物ウイルス感染症の予防及び／又は治療に有用である。特に、細胞膜透過能を有するペプチド及び核局在シグナルと連結された亜鉛フィンガータンパク質を有効成分として含む抗ウイルス剤又はウイルス複製阻害剤は、従来の抗ウイルス剤に比べて顕著に高い効果を有しており、医薬として極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図１は亜鉛フィンガードメイン1単位の4塩基対DNA標的部位への結合を示す概略図である。-1位、2位、3位、及び6位の残基は、それぞれ独立して1つの塩基に接触している。-1位は亜鉛フィンガードメイン中のα-ヘリックスの始点である。
【図２】図２は既知及び可能な塩基とアミノ酸との相互作用を示す。グアニン（G）とヒスチジン（His）との間の相互作用に類似した相互作用は水素結合のドナーとなる他のアミノ酸（セリン及びリジンなど）によっても形成される。チミジンとトレオニンとの間の相互作用に類似した相互作用は他の疎水性アミノ酸によっても形成される。チミジンとトレオニン／セリンとの間で形成される相互作用に類似した相互作用は水素結合のドナーとなる他のアミノ酸によっても形成される。
【図３】図３は亜鉛フィンガードメインの2位のアミノ酸による４塩基対DNA標的配列中の第4番目の塩基の認識を示した図である。
【図４】図４はZFP（亜鉛フィンガードメイン）標的配列を示し、特にHPV-18複製起点の構成及びZFPがDNA複製を阻害するためのアミノ酸配列を示す。四角はそれぞれE2-結合部位（E2BS）E2BS-3及びE2BS-4を示し、E2タンパク質により認識される12塩基対のDNA配列を示す。四角の下の数字はHPV-18ゲノムにおける該配列の位置（ヌクレオチド番号）を示す。ZFPHPV-1及びZFPHPV-2のために選択した19塩基対の標的DNAも示した。
【図５】図５は各ZFPHPV-1及びZFPHPV-2の6個の亜鉛フィンガードメインのアミノ酸配列を示した図である。各フィンガードメインの下線部アミノ酸は該フィンガードメインのα-ヘリックス中の-1、2、3、及び6位における認識アミノ酸を示す。
【図６】図６はZFPHPV-1及びZFPHPV-2（左の2つの図）及びE2（右図）のDNA結合アッセイのオートラジオグラフを示した図である。ZFPHPV-1及びZFPHPV-2にはE2BS-3及びE2BS-4を含む32Pでラベルした56塩基対のプローブを用いた。E2タンパク質には単独のE2BSを含む32Pでラベルした40塩基対のプローブを用いた。DNA-ZFP複合体及び遊離DNAの位置を示した。
【図７】図７はZFP遺伝子を用いた一過性複製アッセイにおけるHPV-18DNA複製阻害を示す。一過性複製アッセイは各レーンの下に示すZFP発現プラスミドとともにpRL-E1、pRL-E2、及びpUC-Ori177を用いて行なった。アンピシリン耐性遺伝子のpUC-Ori177に特異的なプローブを用いたサザンブロットハイブリダイゼーションの前にHirt抽出サンプルをDpnIで消化した。
【図８】図８はZFPによるE2結合の阻害を示した図である。ZFPHPV-1又はZFPHPV-2とE2との競合結合実験はE2BS-3及びE2BS-4を含む32Pでラベルした56塩基対のプローブとともに一定濃度のE2タンパク質（100 nM）を用い、ZFPHPV-1についてレーン8からレーン5まで、ZFPHPV-2についてレーン12からレーン9まで濃度（nM）を増加させたZFP の存在下で行なった。レーン1から4はそれぞれレーン5から12のマーカとして用いた遊離DNA、E2結合DNA、ZFPHPV-1結合DNA、及びZFPHPV-2結合DNAのバンド位置を示す。使用したZFP及びE2タンパク質の濃度は各レーンの下に示した。
【図９】図９は細胞透過ドメイン及び核局在シグナルを有するZFPによる一過性複製アッセイを用いたHPV-18 DNA複製阻害を示す。
【図１０】図10は変異DNAプローブを用いて複製起点に結合したZFPHPV-1又はZFPHPV-2 DNAのインビトロにおける特異的結合を示した図である。最上部の図(a)は変異プローブのDNA配列を示す。変異は下線で示し、レーン番号は図aからgにおいて示されたものに対応している。図b、d、及びfはZFPHPV-1の10、100、及び1000 pMでのオートラジオグラフを示す。図c、e、及びｇはZFPHPV-2の10、100、及び1000 pMでのオートラジオグラフを示す。DNA-ZFP複合体及び遊離DNAの位置を示した。
【図１１】図11は一過性複製アッセイにおいて測定された細胞内での人工DNA結合タンパク質の複製起点に対する特異的結合を示す。変異プローブ及び変異oriプラスミドを図aに示す。変異によるHPV-18 DNA複製へのネガティブな影響を最小にするために変異はE2BS-3及びE2BS-4の間に位置する4塩基対のDNAスペーサー(すなわち5_-CGGG-3_)に導入した。図bは変異プローブのゲルシフトアッセイを示し、図cはHPV-18変異oriプラスミドの一過性複製を示す。一過性複製アッセイではpRL-E1、pRL-E2、及びpUC-Ori177誘導体をレーンの下に示すようにpCMV-ZFPHPV-2又はpcDNA3.1とともに用いた。
【図１２】図12は一過性複製アッセイにおけるE2C-R9及びZFPHPV-2-R9によるウイルス複製阻害の比較を示す。
【図１３】図13はZFPHPV-2-CPP（細胞膜透過ペプチド）融合タンパク質を細胞培地に添加した後に細胞により取り込まれた該タンパク質量を経時的にウェスタンブロット分析した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年2月29日(2008.2.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工の亜鉛フィンガータンパク質（ZFP）及び／又は該ZFPをコードする核酸を含むヒトパピローマウイルスに対する抗ウイルス剤であって、該ZFPがヒトパピローマウイルス由来複製タンパク質の該ウイルス複製起点への結合を阻害することができ、該複製タンパク質がのE2タンパク質であり、該ZFPがE2結合部位3（E2BS3）及びE2結合部位4（E2BS4）の位置に、近傍に、又はオーバーラップして結合する抗ウイルス剤。
【請求項２】
ヒトパピローマウイルスがヒトパピローマウイルス18 (HPV18)である請求項１に記載の抗ウイルス剤。
【請求項３】
該ZFPがGAAAACGGTCGGGACCGAA又はGGTCGGGACCGAAAACGGTで表されるDNAを標的とする請求項１又は２に記載の抗ウイルス剤。
【請求項４】
該ZFPが6個の亜鉛フィンガードメインを含み、該ドメインが0から10個のアミノ酸残基と共有結合しており、該ドメインの-1、2、3、及び6位の該アミノ酸が、この順にそれぞれ
ドメイン1についてGln、Thr、His 及び Glu; 
ドメイン2についてGlu、Ser、Asn 及び Arg;
ドメイン3についてArg、Asp、His 及び Glu;
ドメイン4についてThr、Ser、His 及び Arg;
ドメイン5についてGlu、Asp、Asn 及び Gln; 並びに
ドメイン6についてGln、Thr、Asn 及び Arg
である請求項３に記載の抗ウイルス剤。
【請求項５】
該ZFPが配列番号２のアミノ酸配列を含む請求項４に記載の抗ウイルス剤。
【請求項６】
該ZFPが6個の亜鉛フィンガードメインを含み、該ドメインが0から10個のアミノ酸残基と共有結合しており、該ドメインの-1、2、3、及び6位の該アミノ酸が、この順にそれぞれ
ドメイン1についてArg、Asn、His 及び Glu; 
ドメイン2についてGln、Ser、Asn 及び Gln;
ドメイン3についてGln、Thr、His 及び Glu; 
ドメイン4についてGlu、Ser、Asn 及び Arg;
ドメイン5についてArg、Asp、His 及び Glu; 並びに
ドメイン6についてThr、Ser、His 及び Arg
である請求項３に記載の抗ウイルス剤。
【請求項７】
該ZFPが配列番号３のアミノ酸配列を含む請求項６に記載の抗ウイルス剤。
【請求項８】
該ZFPが互いに0〜10個のアミノ酸残基で共有結合した少なくとも3つの亜鉛フィンガードメインを含み、該亜鉛フィンガードメインのα-ヘリックスの-1、2、3、及び6位のアミノ酸が以下のとおり選択される：
-1位のアミノ酸が、アルギニン、グルタミン、トレオニン、メチオニン、又はグルタミン酸であり；
2位のアミノ酸が、セリン、アスパラギン、トレオニン、又はアスパラギン酸であり；
3位のアミノ酸が、ヒスチジン、アスパラギン、セリン、又はアスパラギン酸であり；かつ
6位のアミノ酸が、アルギニン、グルタミン、トレオニン、チロシン、ロイシン、又はグルタミン酸である
請求項１に記載の抗ウイルス剤。
【請求項９】
該ZFPが少なくとも3つの亜鉛フィンガードメインを含み、各亜鉛フィンガードメインは独立して下記の式：
−X3-Cys-X2-4-Cys-X5-Z-1-X-Z2-Z3-X2-Z6-His-X3-5-His-X4-
（式中、Xは独立に任意のアミノ酸を示し、Xnはポリペプチド鎖中のXの出現数を示し；
Z-1は、アルギニン、グルタミン、トレオニン、メチオニン、又はグルタミン酸であり；
Z2は、セリン、アスパラギン、トレオニン、又はアスパラギン酸であり；
Z3は、ヒスチジン、アスパラギン、セリン、又はアスパラギン酸であり；かつ
Z6は、アルギニン、グルタミン、トレオニン、チロシン、ロイシン、又はグルタミン酸である。）で表され、該ドメインが独立して互いに0〜10個のアミノ酸残基で共有結合する請求項８に記載の抗ウイルス剤。
【請求項１０】
該ZFPがさらに核局在シグナル（NLS）及び／又は細胞透過ペプチド（CPP）を含む請求項１ないし９のいずれか１項に記載の抗ウイルス剤。
【請求項１１】
該NLS及び該CPPが該ZFPのN末端に位置する請求項１０に記載の抗ウイルス剤。
【請求項１２】
該NLS及び該CPPが該ZFPのC末端に位置する請求項１０に記載の抗ウイルス剤。
【請求項１３】
ZFPタンパク質である請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の抗ウイルス剤。
【請求項１４】
該ZFPタンパク質をコードする核酸である請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の抗ウイルス剤。
【請求項１５】
請求項１ないし１４のいずれか１項に記載のZFP又は核酸であるウイルス複製阻害剤。
【請求項１６】
人工の亜鉛フィンガータンパク質（ZFP）及び／又は該ZFPをコードする核酸の抗ウイルス剤の製造のための使用であって、該ZFPが動物DNAウイルス由来複製タンパク質の該ウイルス複製起点への結合を阻害することができるものである上記使用。
【国際調査報告】
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