(57)【要約】  本発明は、化学走性活性を持つ細胞の亜集団を含有する、CD34+細胞の高密度集団を含む、化学走性造血幹細胞生成物を含有する薬理組成物、これら組成物の製法および梗塞状態にある心筋を包含する脈管傷害を治療または修復するための、これら組成物の使用に関する。
2009514950.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における脈管の損傷を修復するための薬理組成物であって、
(a) 治療上有効な量の、無菌の、単離された、化学走性造血幹細胞生成物、ここで該化学走性造血幹細胞生成物は、化学走性活性を持つ能力細胞の亜集団を含む、単離されたCD34+細胞の高密度集団を含み、および
(b) 安定化量の血清
を含み、該組成物は、カテーテルを通して、腸管外経路で該対象に投与され、かつ該カテーテルを通過する際に、該化学走性活性を持つ能力細胞の亜集団が、その能力を維持していることを特徴とする、上記薬理組成物。
【請求項２】
該単離されたCD34+細胞の高密度集団が、該対象から得た骨髄から精製されたものである、請求項1記載の薬理組成物。
【請求項３】
該単離されたCD34+細胞の高密度集団が、少なくとも70％の純度を持つ、請求項1記載の薬理組成物。
【請求項４】
該単離されたCD34+細胞の高密度集団が、該単離されたCD34+細胞の高密度集団の取得後、少なくとも約24時間に渡り、少なくとも70％の生存率を持つ、請求項1記載の薬理組成物。
【請求項５】
該単離されたCD34+細胞の高密度集団が、該単離されたCD34+細胞の高密度集団の取得後、少なくとも約48時間に渡り、少なくとも70％の生存率を持つ、請求項1記載の薬理組成物。
【請求項６】
該単離されたCD34+細胞の高密度集団が、該単離されたCD34+細胞の高密度集団の取得後、少なくとも約72時間に渡り、少なくとも70％の生存率を持つ、請求項1記載の薬理組成物。
【請求項７】
該治療上有効な量の該化学走性造血幹細胞生成物が、CXCR-4媒介化学走性活性を有する、少なくとも0.5×106個の能力CD34+細胞亜集団を含む、最少数の単離されたCD34+造血幹細胞を含有する、請求項1記載の組成物。
【請求項８】
該高密度CD34+細胞が、該高密度CD34+細胞を取得した後、少なくとも約24時間に渡って、インビトロにて、造血コロニーを生成することができるものである、請求項1記載の組成物。
【請求項９】
該高密度CD34+細胞が、該高密度CD34+細胞を取得した後、少なくとも約48時間に渡って、インビトロにて、造血コロニーを生成することができるものである、請求項1記載の組成物。
【請求項１０】
該高密度CD34+細胞が、該高密度CD34+細胞を取得した後、少なくとも約72時間に渡って、インビトロにて、造血コロニーを生成することができるものである、請求項1記載の組成物。
【請求項１１】
該血清が、該対象に対してオートロガスのヒト血清、または合成血清である、請求項1記載の組成物。
【請求項１２】
該安定化する量の血清が、少なくとも約10％(v/v)である、請求項1記載の組成物。
【請求項１３】
該能力細胞亜集団の該化学走性活性の少なくとも2％が、該単離されたCD34+細胞の高密度集団を取得した後、少なくとも24時間に渡って、該能力細胞亜集団により維持される、請求項1記載の組成物。
【請求項１４】
該能力細胞亜集団の該化学走性活性の少なくとも2％が、該単離されたCD34+細胞の高密度集団を取得した後、少なくとも48時間に渡って、該能力細胞亜集団により維持される、請求項1記載の組成物。
【請求項１５】
該能力細胞亜集団の該化学走性活性の少なくとも2％が、該単離されたCD34+細胞の高密度集団を取得した後、少なくとも72時間に渡って、該能力細胞亜集団により維持される、請求項1記載の組成物。
【請求項１６】
該化学走性活性を持つ能力細胞の亜集団を含む、該単離されたCD34+細胞の高密度集団が、少なくとも70％なる純度を持ち、少なくとも約70％なる生存率を有し、かつ該高密度集団を取得した後、少なくとも約24時間に渡って、インビトロにて、造血コロニーを生成することができるものである、請求項1記載の組成物。
【請求項１７】
該化学走性活性を持つ能力細胞の亜集団を含む、該単離されたCD34+細胞の高密度集団が、少なくとも70％なる純度を持ち、少なくとも約70％なる生存率を有し、かつ該高密度集団を取得した後、少なくとも約48時間に渡って、インビトロにて、造血コロニーを生成することができるものである、請求項1記載の組成物。
【請求項１８】
該化学走性活性を持つ能力細胞の亜集団を含む、該単離されたCD34+細胞の高密度集団が、少なくとも70％なる純度を持ち、少なくとも約70％なる生存率を有し、かつ該高密度集団を取得した後、少なくとも約72時間に渡って、インビトロにて、造血コロニーを生成することができるものである、請求項1記載の組成物。
【請求項１９】
該対象が、脈管再生された心筋梗塞患者である、請求項1記載の組成物。
【請求項２０】
該組成物を、該カテーテルを通して、梗塞関連動脈に、血管内投与する、請求項1記載の組成物。
【請求項２１】
該カテーテルが、流量調節型カテーテルである、請求項1記載の組成物。
【請求項２２】
該カテーテルが、バルーン式カテーテルである、請求項1記載の組成物。
【請求項２３】
該カテーテルが、少なくとも0.36mmなる内径を持つ、請求項1記載の組成物。
【請求項２４】
該組成物を、該カテーテルを通して、血管内放出装置によって、血管内投与する、請求項20記載の組成物。
【請求項２５】
該組成物を、該カテーテルを通して、心筋層に投与する、請求項1記載の組成物。
【請求項２６】
該薬理組成物が、更に少なくとも約0.5％のアルブミンをも含む、請求項1記載の組成物。
【請求項２７】
該薬理組成物が、更に少なくとも1種の適合性活性薬剤をも含む、請求項1記載の組成物。
【請求項２８】
該活性薬剤が、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、β-遮断薬、利尿薬、抗-不整脈薬、抗-狭心症薬、血管作動薬、抗-凝血薬、フィブリン溶解剤、および高コレステロール血症薬からなる群から選択される、請求項27記載の組成物。
【請求項２９】
該化学走性の造血性細胞生成物の無菌性を、以下の諸工程を含む方法によって確認する、請求項1記載の組成物：
(a) 該細胞生成物を遠心分離処理して、該単離されたCD34+細胞の高密度集団を含有するペレットを含む、分離された細胞生成物および上澄を生成する工程；
(b) 該分離された細胞生成物の細胞ペレットを乱すことなしに、該分離された細胞生成物の上澄を取出す工程；
(c) 該分離された細胞生成物の上澄の、無菌性を分析する工程；および
(d) 該分離された細胞生成物の、該細胞ペレットの無菌性を決定する工程。
【請求項３０】
血管に損傷を持つ対象に対して、脈管内放出するための薬理組成物を製造する方法であって、該薬理組成物が、治療上有効な量の、無菌の、化学走性を呈する造血幹細胞生成物を含み、ここで該化学走性造血幹細胞生成物は、化学走性活性を持つ能力細胞の亜集団を含む、単離されたCD34+細胞の高密度集団を含み、該方法が以下の諸工程：
(a) 無菌条件下で、該対象から、能力CD34+細胞の高密度集団を含む製剤を、化学走性細胞取得工程によって取得する工程；
(b) 場合により、該製剤を処理設備に輸送する工程；
(c) 該製剤から、化学走性活性を持つ能力細胞の亜集団を含有する、CD34+細胞を無菌的に精製する工程；
(d) 該化学走性活性を持つ能力細胞の亜集団を含有する、該精製したCD34+細胞を、無菌的に処方して、化学走性を呈する該造血細胞生成物を生成する工程；
(e) 該滅菌された化学走性を呈する該造血幹細胞生成物を、無菌的に処方して、薬理組成物を製造する工程；
(e) 該薬理組成物の無菌性を評価する工程；
(f) 該対象に注入するのに適したものとして、該無菌薬理組成物を放出する工程；
(g) 該薬理組成物の治療的な量を、脈管内放出装置に装填する工程；および
(h) 場合により、該治療上有効な量の該無菌薬理組成物を含む該放出装置を、該対象に脈管内投与するための、心臓カテーテル処置設備に輸送する工程、
を含むことを特徴とする、上記製造方法。
【請求項３１】
場合によって、更に該工程(a)と(b)との間で、該取得した製剤を保存する段階をも含む、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
該精製工程(c)を、該取得工程(a)の完了後、約12時間〜約24時間なる範囲の期間内に開始する、請求項30記載の方法。
【請求項３３】
該精製工程(c)を、該取得工程(a)の完了後、約12時間、約13時間、約14時間、約15時間、約16時間、約17時間、約18時間、約19時間、約20時間、約21時間、約22時間、約23時間、または約24時間以内の期間に開始する、請求項30記載の方法。
【請求項３４】
該放出工程(f)を、該無菌処方された細胞生成物が、該取得工程(a)の完了後、約48〜約72時間なる範囲の期間内に、該対象内に注入される場合においてのみ行う、請求項30記載の方法。
【請求項３５】
該放出工程(f)を、該無菌処方された細胞生成物が、該取得工程(a)の完了後、約48時間、約49時間、約50時間、約51時間、約52時間、約53時間、約54時間、約55時間、約56時間、約57時間、約58時間、約59時間、約60時間、約61時間、約62時間、約63時間、約64時間、約65時間、約66時間、約67時間、約68時間、約69時間、約70時間、約71時間または約72時間なる範囲の期間内に、該対象内に注入される場合においてのみ行う、請求項30記載の方法。
【請求項３６】
該精製工程(c)を、該取得工程(a)の完了後、約12時間〜約24時間なる範囲の期間内に開始し、かつ該放出工程(f)を、該無菌薬理組成物が、該取得工程(a)の完了後、約48〜約72時間なる範囲の期間内に、該対象内に注入される場合においてのみ行う、請求項30記載の方法。
【請求項３７】
該精製工程(c)を、該取得工程(a)の完了後、約12時間、約13時間、約14時間、約15時間、約16時間、約17時間、約18時間、約19時間、約20時間、約21時間、約22時間、約23時間、または約24時間以内の期間に開始し、かつ該放出工程(f)を、該無菌薬理組成物が、該取得工程(a)の完了後、約48時間、約49時間、約50時間、約51時間、約52時間、約53時間、約54時間、約55時間、約56時間、約57時間、約58時間、約59時間、約60時間、約61時間、約62時間、約63時間、約64時間、約65時間、約66時間、約67時間、約68時間、約69時間、約70時間、約71時間または約72時間なる範囲の期間内に、該対象内に注入される場合においてのみ行う、請求項30記載の方法。
【請求項３８】
該工程(a)における該化学走性細胞の取得工程が、微細-骨髄収穫技術である、請求項30記載の方法。
【請求項３９】
該微細-骨髄収穫技術による、該取得工程(a)が、更に以下の諸工程：
(i) 該対象から骨髄を収穫するのに先立って、収穫用シリンジに、予めヘパリンを装入する工程；
(ii) 該対象の左後部腸骨稜および右後部腸骨稜から、該収穫用シリンジおよび微細-骨髄収穫技術を利用して、該骨髄を吸入する工程；および
(iii) 該収穫した骨髄を、収集バッグに注入する工程；
を含む、請求項30記載の方法。
【請求項４０】
該工程(i)における該収穫用シリンジおよび該工程(iii)における該収集バッグが、保存剤を含まないヘパリン処理した溶液を含む、請求項38記載の方法。
【請求項４１】
該保存剤を含まないヘパリン処理した溶液中のヘパリンの最終濃度が、約20単位/mL〜約25単位/mLなる範囲にある、請求項39記載の方法。
【請求項４２】
該輸送工程(b)が、更に以下の諸工程：
(i) 該収穫した骨髄を、収集バッグに収容する工程；
(ii) 該収集バッグを、第二のバッグに収容する工程；
(iii) 該収集バッグを含む該第二のバッグを、開放式搬送容器内に収容する工程；
(iv) 該搬送容器を封止する工程；および
(v) 該搬送容器を上記処理設備に搬送する工程；
をも含む、請求項30記載の方法。
【請求項４３】
該工程(c)における該単離されたCD34+細胞の高密度集団が、少なくとも70％なる純度を持つ、請求項30記載の方法。
【請求項４４】
該工程(a)において、該単離されたCD34+細胞の高密度集団を取得した後に、該単離されたCD34+細胞の高密度集団が、少なくとも約24時間に渡り、少なくとも70％の生存率を持つ、請求項30記載の方法。
【請求項４５】
該工程(a)において、該単離されたCD34+細胞の高密度集団を取得した後に、該単離されたCD34+細胞の高密度集団が、少なくとも約48時間に渡り、少なくとも70％の生存率を持つ、請求項30記載の方法。
【請求項４６】
該工程(a)において、該単離されたCD34+細胞の高密度集団を取得した後に、該単離されたCD34+細胞の高密度集団が、少なくとも約72時間に渡り、少なくとも70％の生存率を持つ、請求項30記載の方法。
【請求項４７】
該工程(a)において、該高密度CD34+細胞を取得した後に、該高密度CD34+細胞が、少なくとも約24時間に渡って、インビトロにて、造血コロニーを生成することができるものである、請求項30記載の方法。
【請求項４８】
該工程(a)において、該高密度CD34+細胞を取得した後に、該高密度CD34+細胞が、少なくとも約48時間に渡って、インビトロにて、造血コロニーを生成することができるものである、請求項30記載の方法。
【請求項４９】
該工程(a)において、該高密度CD34+細胞を取得した後に、該高密度CD34+細胞が、少なくとも約72時間に渡って、インビトロにて、造血コロニーを生成することができるものである、請求項30記載の方法。
【請求項５０】
該工程(a)において、該単離されたCD34+細胞の高密度集団を取得した後に、少なくとも約24時間に渡って、該能力細胞亜集団の該化学走性活性の少なくとも2％が、該能力細胞亜集団により維持される、請求項30記載の方法。
【請求項５１】
該工程(a)において、該単離されたCD34+細胞の高密度集団を取得した後に、該能力細胞亜集団の該化学走性活性の少なくとも2％が、少なくとも48時間に渡って、該能力細胞亜集団により維持される、請求項30記載の方法。
【請求項５２】
該工程(a)において、該単離されたCD34+細胞の高密度集団を取得した後に、該能力細胞亜集団の該化学走性活性の少なくとも2％が、少なくとも72時間に渡って、該能力細胞亜集団により維持される、請求項30記載の方法。
【請求項５３】
該化学走性活性を持つ能力細胞の亜集団を含む、該単離されたCD34+細胞の高密度集団が、少なくとも70％なる純度を持ち、少なくとも約70％なる生存率を有し、かつ該工程(a)において、該単離されたCD34+細胞の高密度集団を取得した後に、少なくとも約24時間に渡って、インビトロにて、造血コロニーを生成することができるものである、請求項30記載の方法。
【請求項５４】
該化学走性活性を持つ能力細胞の亜集団を含む、該単離されたCD34+細胞の高密度集団が、少なくとも70％なる純度を持ち、少なくとも約70％なる生存率を有し、かつ該工程(a)において、該単離されたCD34+細胞の高密度集団を取得した後に、少なくとも約48時間に渡って、インビトロにて、造血コロニーを生成することができるものである、請求項30記載の方法。
【請求項５５】
該化学走性活性を持つ能力細胞の亜集団を含む、該単離されたCD34+細胞の高密度集団が、少なくとも70％なる純度を持ち、少なくとも約70％なる生存率を有し、かつ該工程(a)において、該単離されたCD34+細胞の高密度集団を取得した後に、少なくとも約72時間に渡って、インビトロにて、造血コロニーを生成することができるものである、請求項30記載の方法。
【請求項５６】
該工程(g)の該薬理組成物において、該化学走性造血幹細胞生成物の、該治療上有効な量が、CXCR-4媒介化学走性活性を有する、少なくとも0.5×106個のCD34+能力細胞亜集団を含む、最少数のCD34+造血幹細胞を含有する、請求項30記載の方法。
【請求項５７】
該無菌性を確認する工程(e)が、更に以下の諸工程：
(i) 該処方された細胞生成物を遠心分離処理に掛けて、該単離されたCD34+細胞の高密度集団を含む、細胞ペレットを含有する、分離された細胞生成物および上澄を製造する工程；
(ii) 該分離された細胞生成物の該上澄を、該分離された細胞生成物の該細胞ペレットを乱すことなしに、無菌的に取出す工程；
(iii) 該分離された細胞生成物の該上澄が、微生物により汚染されているか否かを分析する工程；および
(iv) このようにして、該分離された細胞生成物の該細胞ペレットの無菌性を決定する工程；
を含む、請求項30記載の方法。
【請求項５８】
該工程(g)の該脈管内放出装置が、
(i) 無菌四方型ストップコックに取付けられた注入シリンジ、ここで該注入シリンジは、該薬理組成物を含み；
(ii) 該無菌四方型ストップコックに取付けられた、洗浄溶液を含有する洗浄シリンジ；および
(iii) 該薬理組成物を該対象に放出するための、該無菌四方型ストップコックによって、該放出装置に取付けられたカテーテル；
を含む、請求項30記載の方法。
【請求項５９】
該カテーテルが、流量調節カテーテルである、請求項58記載の方法。
【請求項６０】
該カテーテルが、バルーン膨張式カテーテルである、請求項58記載の方法。
【請求項６１】
該カテーテルが、少なくとも0.36mmなる内径を持つ、請求項58記載の方法。
【請求項６２】
該組成物による治療を必要とする対象が、脈管再生された心筋梗塞患者である、請求項30記載の方法。
【請求項６３】
該カテーテルを通して、梗塞関連動脈に注入することによって、該薬理組成物を該対象に放出する、請求項62記載の方法。
【請求項６４】
該薬理組成物を、該カテーテルを通して、心筋層内に投与する、請求項62記載の方法。
【請求項６５】
脈管損傷の修復を必要とする対象における該脈管損傷を治療または修復する方法であって、該方法が、該対象に、カテーテルを通して、無菌薬理組成物を腸管外投与する工程を含み、該薬理組成物が、
(a) 治療上有効な量の、無菌の化学走性造血幹細胞生成物、ここで該化学走性造血幹細胞生成物は、化学走性活性を持つ能力細胞の亜集団を含む、単離されたCD34+細胞の高密度集団を含み、および
(b) 安定化量の血清
を含み、該カテーテルを通過する際に、該化学走性活性を持つ能力細胞の亜集団は、その能力を維持していることを特徴とする、上記方法。
【請求項６６】
該単離されたCD34+細胞の高密度集団が、少なくとも70％なる純度を持つ、請求項65記載の方法。
【請求項６７】
該単離されたCD34+細胞の高密度集団が、該単離されたCD34+細胞の高密度集団を取得した後に、少なくとも約24時間に渡り、少なくとも70％の生存率を持つ、請求項65記載の方法。
【請求項６８】
該単離されたCD34+細胞の高密度集団が、該単離されたCD34+細胞の高密度集団を取得した後に、少なくとも約48時間に渡り、少なくとも70％の生存率を持つ、請求項65記載の方法。
【請求項６９】
該単離されたCD34+細胞の高密度集団が、該単離されたCD34+細胞の高密度集団を取得した後に、少なくとも約72時間に渡り、少なくとも70％の生存率を持つ、請求項65記載の方法。
【請求項７０】
該治療上有効な量の該化学走性造血幹細胞生成物が、CXCR-4媒介化学走性活性を有する、少なくとも0.5×106個の能力CD34+細胞亜集団を含む、最少数の単離されたCD34+造血幹細胞を含有する、請求項65記載の方法。
【請求項７１】
該高密度CD34+細胞が、該高密度CD34+細胞を取得した後に、少なくとも約24時間に渡って、インビトロにて、造血性コロニーを生成することができるものである、請求項65記載の方法。
【請求項７２】
該高密度CD34+細胞が、該高密度CD34+細胞を取得した後に、少なくとも約48時間に渡って、インビトロにて、造血性コロニーを生成することができるものである、請求項65記載の方法。
【請求項７３】
該高密度CD34+細胞が、該高密度CD34+細胞を取得した後に、少なくとも約72時間に渡って、インビトロにて、造血性コロニーを生成することができるものである、請求項65記載の方法。
【請求項７４】
該能力細胞亜集団の該化学走性活性の少なくとも2％が、該単離されたCD34+細胞の高密度集団を取得した後に、少なくとも24時間に渡って、該能力細胞亜集団により維持される、請求項65記載の方法。
【請求項７５】
該能力細胞亜集団の該化学走性活性の少なくとも2％が、該単離されたCD34+細胞の高密度集団を取得した後に、少なくとも48時間に渡って、該能力細胞亜集団により維持される、請求項65記載の方法。
【請求項７６】
該能力細胞亜集団の該化学走性活性の少なくとも2％が、該単離されたCD34+細胞の高密度集団を取得した後に、少なくとも72時間に渡って、該能力細胞亜集団により維持される、請求項65記載の方法。
【請求項７７】
該化学走性活性を持つ能力細胞の亜集団を含む、該単離されたCD34+細胞の高密度集団が、少なくとも70％なる純度を持ち、少なくとも約70％なる生存率を有し、かつ該高密度集団を取得した後に、少なくとも約24時間に渡って、インビトロにて、造血性コロニーを生成することができるものである、請求項65記載の方法。
【請求項７８】
該化学走性活性を持つ能力細胞の亜集団を含む、該単離されたCD34+細胞の高密度集団が、少なくとも70％なる純度を持ち、少なくとも約70％なる生存率を有し、かつ該高密度集団を取得した後に、少なくとも約48時間に渡って、インビトロにて、造血性コロニーを生成することができるものである、請求項65記載の方法。
【請求項７９】
該化学走性活性を持つ能力細胞の亜集団を含む、該単離されたCD34+細胞の高密度集団が、少なくとも70％なる純度を持ち、少なくとも約70％なる生存率を有し、かつ該高密度集団を取得した後に、少なくとも約72時間に渡って、インビトロにて、造血性コロニーを生成することができるものである、請求項65記載の方法。
【請求項８０】
該血清が、該対象に対してオートロガスのヒト血清、または合成血清である、請求項65記載の方法。
【請求項８１】
該安定化する量の血清が、少なくとも約10％(v/v)なる量の血清である、請求項1記載の方法。
【請求項８２】
該対象が、脈管再生された心筋梗塞患者である、請求項65記載の方法。
【請求項８３】
該方法が、更に脈管内放出装置によって、梗塞関連動脈に、該組成物を脈管内経路で放出する工程をも含む、請求項65記載の方法。
【請求項８４】
該脈管内放出装置が、
(i) 無菌四方型ストップコックに取付けられた注入シリンジ、ここで該注入シリンジは、該薬理組成物を含み；
(ii) 該無菌四方型ストップコックに取付けられた、洗浄溶液を含有する洗浄シリンジ；および
(iii) 該薬理組成物を該対象に放出するための、該無菌四方型ストップコックによって、該放出装置に取付けられたカテーテル；
を含む、請求項83記載の方法。
【請求項８５】
該カテーテルが、流量調節カテーテルである、請求項65記載の方法。
【請求項８６】
該カテーテルが、バルーン膨張式カテーテルである、請求項65記載の方法。
【請求項８７】
該カテーテルが、少なくとも0.36mmなる内径を持つ、請求項65記載の方法。
【請求項８８】
該薬理組成物が、第一の時間および第二の時間によって規定される、特定の時間間隔中に、該対象に放出される、請求項82記載の方法。
【請求項８９】
該第一の時間が、該梗塞形成後少なくとも約5日であり、かつ該第二の時間が、該梗塞形成後約14日未満である、請求項88記載の方法。
【請求項９０】
該第一の時間が、該梗塞形成領域における、最大の炎症性サイトカインのカスケード生産後である、請求項88記載の方法。
【請求項９１】
該第二の時間が、該梗塞形成領域に、心筋の瘢痕を形成する前である、請求項88記載の方法。
【請求項９２】
該組成物を、脈管内放出装置によって、該カテーテルを通して、脈管内経路で投与する、請求項65記載の方法。
【請求項９３】
該組成物を、該カテーテルを通して、心筋層内に投与する、請求項65記載の方法。
【請求項９４】
該薬理組成物が、更に少なくとも1種の適合性のある活性薬剤をも含む、請求項65記載の方法。
【請求項９５】
該活性薬剤が、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、β-遮断薬、利尿薬、抗-不整脈薬、抗-狭心症薬、血管作動薬、抗-凝血薬、フィブリン溶解剤、および高コレステロール血症薬からなる群から選択される、請求項94記載の方法。
【請求項９６】
限られた体積を持つ、臨床的に有用な単離細胞生成物の、無菌性を評価する方法であって、該方法が、以下の諸工程：
(a) 該単離細胞生成物の細胞性成分を、非-細胞性成分から、無菌的に分離する工程；および
(b) 該非-細胞性成分を、微生物汚染に付きテストする工程；
を含み、これにより該臨床的に有用な単離細胞生成物の無菌性を決定することを特徴とする、上記方法。
【請求項９７】
該工程(a)において、該細胞性成分を、該非-細胞性成分から、遠心分離によって分離する、請求項96記載の方法。
【請求項９８】
該細胞性成分が、該単離細胞生成物の遠心分離の際に、細胞ペレットを生成する、請求項97記載の方法。
【請求項９９】
該非-細胞性成分が、該単離細胞生成物の遠心分離の際に、上澄を生成する、請求項97記載の方法。
【請求項１００】
該単離細胞生成物が、化学走性を示す造血幹細胞生成物である、請求項97記載の方法。
【請求項１０１】
該化学走性を示す造血幹細胞生成物が、CXCR-4媒介化学走性活性を有する、能力細胞亜集団を含む、単離されたCD34+細胞の高密度集団を含む、請求項97記載の方法。
【請求項１０２】
該上澄の無菌性を確認した後、治療上有効な量の無菌で化学走性を示す造血幹細胞生成物を、脈管内経路で対象に投与して、脈管の損傷を治療もしくは修復する、請求項97記載の方法。
【請求項１０３】
該無菌で化学走性を示す造血幹細胞生成物を、カテーテルを通して投与する、請求項102記載の方法。
【請求項１０４】
該対象が、脈管再生された心筋梗塞患者である、請求項102記載の方法。
【請求項１０５】
該脈管の損傷が、脈管機能不全である、請求項102記載の方法。
【請求項１０６】
該脈管機能不全が、少なくとも一つの冠動脈を冒している、請求項105記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願との相互引照）
本件特許出願は、2005年11月7日付で出願された、米国仮特許出願第60/734,151号の利益を請求するものである。該米国仮特許出願の内容全体を、本明細書に参考として組入れる。
本発明は、化学走性を示す造血幹細胞生成物を含む組成物、および梗塞状態にある心筋層を包含する脈管機能不全、並びに脈管機能不全と類似する、またはこれと関連するその他の脈管の状態によって引起される、損傷を修復する際における、該組成物の使用法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
急性心筋梗塞は、一般的であり、米国のみで、年間に、1,100,000症例の発症が報告されている(Antman, E.M., Braunwald, E., 内科学の原理における、急性心筋梗塞(Acute myocardial infarction, in Principles of Internal Medicine), 第15版, Braunwald, E.等編, N.Y., マグロウヒル(McGraw-Hill)(2001))。臨床前のまたは臨床データは、心筋梗塞に伴って、急激な心筋細胞の喪失およびそれに伴う周辺梗塞ゾーンの低循環は、迅速な心臓機能の低下を引起す、長期間に渡り永続する可能性のある、一連のカスケード事象をもたらすことを明らかにしている。該心筋細胞喪失の程度は、冠動脈閉塞期間、既存の側枝冠動脈循環および心臓の微小血管系に依存する。Paul等, Am. Heart J., 1996, 131:710-15; Pfeffer, M.A., Braunwald, E., Circulation, 1990, 81:1161-72; Sheiban, I.等, J. Am. Coll. Cardiol., 2001, 38:464-71; Braunwald E., Bristow, M. R., Circulation, 2000, 102:IV-14-23; Rich等, Am. J. Med., 1992, 92:7-13; Ren等, J. Histochem. Cytochem., 2002, 49:71-79; Hirai, T.等, Circulation, 1989, 79:791-96; Ejiri, M.等, J. Cardiology, 1990, 20:31-37。心筋細胞は、事実上再生能力を持たないので、心筋梗塞は、収縮性のある筋肉細胞の喪失による永続的な心臓機能不全、および非-機能性の線維状瘢痕による置換へと導く。Frangogiannis, N.G.等, Cardiovascular Res., 2002, 53(1):31-47。更に、生存する心筋の、該喪失を補う肥大は、微小血管系の機能不全に導き、該機能不全は、心筋の休止および該周辺閉塞ゾーンにおける、肥大した細胞のアポトーシスを引き起こすことによって、更に心臓機能の活動停止を招く。
【０００３】
心筋梗塞の生存者において、残される心臓機能は、心室の改変(損傷後の心臓における、サイズ、形状、および機能における変化、典型的には機能における低下を意味する)の程度により大きく影響される。心室形態における変更(心室の形状、配置、または形態を意味する)は、心筋梗塞後の閉塞されたおよび健康な心臓組織両者において発生する。Pfeffer, M.A., Braunwald, E., Circulation, 1990, 81:1161-72。心室の拡張(該心室の伸縮、拡張、またはその展延を意味する)は、全体的な心臓機能の低下を引起し、また該梗塞のサイズ、梗塞の治癒および心室壁に掛かる応力により大きく影響される。改変を最小化しようとの最近の努力は、前負荷療法および適当な後負荷管理の賢明な利用により、心室壁に掛かる応力を減じると共に、血栓溶解剤および機械的な介入(例えば、ステントの設置を含むが、これに限定されない)を利用した、迅速な再灌流(血流の回復を意味する)によって、梗塞サイズを制限することで成功した(同上文献)。これらの介入とは無関係に、かなりの割合の患者が、臨床的に関連性があり、かつ長期に及ぶ、心筋梗塞後の、心臓機能不全を経験している。Sheiban, I.等, J. Am. Coll. Cardiol., 2001, 38:464-71。梗塞関連動脈循環の脈管再生および心室壁応力を最小化するための適当な医学的な管理にも拘らず、かなりの割合の患者が、心室改変、永続的な心臓機能不全を経験しており、また死を含む有害な心臓に係る事象を経験する、高い生命の危機に曝されている。Paul等, Am. Heart J., 1996, 131:710-15; Pfeffer, M.A., Braunwald, E., Circulation, 1990, 81:1161-72。
【０００４】
細胞レベルにおいて、心筋梗塞直後に、一時的な全身性の心臓機能不全が、普通に発生する。冠動脈閉塞の短期間の(即ち、3分〜5分間継続)設定において、エネルギー代謝が阻害されて、明らかな心筋機能障害を引起し、これは即座に再灌流しても、48時間に及び持続する恐れがある。この所謂「人事不省的な(stunned)心筋の現象」は、再灌流に引続き、あるいはその後に発生し、また反応性の酸素種の存在に起因するものと考えられる。この過程は一過性のものであり、また炎症性応答に関連するものではない。Frangogiannis, N.G.等, Cardiovascular Res., 2002, 53(1):31-47。上首尾の脈管再生後に、人事不省からのかなりの回復が、3〜4日以内に起るが、完全な回復はより一層長期間を要する可能性がある。Boli, R., Prog. Cardiovascular Disease, 1998, 40(6):477-515; Sakata, K.等, Ann. Nucleic Med., 1994, 8:153-57; Wollert, K.C. 等, Lancet, 2004, 364:141-48。
【０００５】
より長期に及ぶ、即ち5分間を越える冠動脈の閉塞は、心筋の虚血(即ち、心筋の大部分に対する不十分な血流)に導き、また再灌流の直後に開始し、数週間に渡り持続する恐れのある、重大な炎症性応答と関連している。Frangogiannis, N.G.等, Cardiovascular Res., 2002, 53(1):31-47; Frangogiannis, N.G.等, Circulation, 1998, 98:687798。
【０００６】
再灌流後の該炎症過程は複雑である。先ず、これは心筋の損傷に寄与するが、その後治癒および瘢痕形成に導く。この複雑な過程は、2段階で起るものと思われる。その第一の「ホット(hot)」段階(初めの5日間)において、反応性の酸素種(虚血性心筋組織)および補足的な活性化は、白血球に関する化学走性シグナルを発生し(化学走性は、運動性細胞、生物、その部分の、誘引性と思われる環境条件に向かう、および/または忌避的であることが分かった環境から逃れる、直接的な運動である)またサイトカインカスケードを開始する。Lefer, D.J., Granger, D.N., Am. J. Med., 2000, 4:315-23; Frangogiannis, N.G.等, Circulation, 1998, 7:699-710。マスト細胞の脱顆粒、腫瘍壊死因子α(TNF-α)が遊離し、また高いインターロイキン-6(IL-6)、細胞間接着分子1(「ICAM-1」またはCD-54、典型的に内皮細胞および免疫系の細胞上で発現されるレセプタ)、セレクチン(L, EおよびP)、およびインテグリン(CD 11a、CD11bおよびCD18)の発現は、全て虚血性心筋層における好中球の蓄積および脱顆粒に寄与しているものと思われる。Frangogiannis, N.G.等, Circulation, 1998, 7:699-710; Kurrelmeyer, K.M等, Proc. Nat'l Acad. Sci., 2000, 10:5456-61; Lasky, L.A., Science, 1992, 258:964-69; Ma, X.L.等, Circulation, 1993, 88(2):649-58; Simpson, P.J.等, J. Clin. Invest., 1998, 2:624-29。好中球は、微小血管の閉塞および心臓筋細胞に対するリガンド-特異的接着後の、好中球の呼吸速発経路の活性化を通して、有意に心筋細胞の損傷および死に寄与する。Entman, M.L.等, J. Clin. Invest., 1992, 4:1335-45。該「ホット」段階中の、血管形成は、インターフェロンγ-誘発性タンパク質(IP 10)を包含する、血流停止物質の遊離のために阻害される。Frangogiannis, N.G.等, FASEB J., 2001, 15:1428-30。
【０００７】
該第二段階において、該心臓修復過程が開始され(約6日〜約14日)、該過程は、事実上瘢痕形成に導き(約14日〜約21日)、またその後の心室改変(約21日〜約90日)に導く。再灌流直後に、単球が該梗塞された心筋層を浸潤する。補足体(C5a)、形質転換成長因子B1(TGF-B1)および単球化学走性タンパク質1(MCP-1)によって誘発されて、単球は死亡した組織を掃去し、細胞外マトリックス代謝を調節し、かつ線維芽細胞の増殖を誘発することによって、該治癒過程を開始させるマクロファージに分化する。Birdshall, H.H.等, Circulation, 1997, 3:684-92。浸潤リンパ細胞によるインターロイキン-10(IL-10)の分泌も、炎症性サイトカインをダウンレギュレーションし、かつ組織の改変に影響を与えることにより、治癒を促進する。Frangogiannis, N.G.等, J. Immunol., 2000, 5:2798-2808。マスト細胞も、線維質の瘢痕組織の形成に関与することにより、心筋修復の後の段階に関与するものと思われる。幹細胞因子(SCF)は、マスト細胞の有力な誘引物質である。SCF mRNAは、イヌの心筋梗塞モデルの、虚血性心筋セグメントにおいて、上向き調節されることが示されており、結果的に虚血性心筋部分におけるマスト細胞の蓄積に寄与する可能性がある。Frangogiannis, N.G.等, Circulation, 1998, 98:687-798。マスト細胞生成物(TGF-B、基本的線維芽細胞成長因子(bFGF)、血管内皮成長因子(VEGF)、およびゼラチナーゼAおよびBを包含する)は、線維芽細胞の増殖を誘発し、細胞外マトリックス代謝に影響を与え、かつ血管形成を誘発する。Fang, K.C.等, J. Immunol., 1999, 162:5528-35; Takeshi, S.等, Cardiology, 2000, 93:168-74。
【０００８】
心筋梗塞に続いて、VEGFのレベル(VEGFは、約7日目にピークに達し、また徐々に約14日目〜約21日目にベースラインまで低下する)の上昇と一致して、該炎症性過程の該「ホット」段階が減少(約5日目)した後に、新血管形成が起る。該治癒過程のこの段階中に、内皮プリカーサ細胞(EPCs)が、該梗塞部位に移動し、かつ補充される。Shinitani, S.等, et al., Circulation, 2001, 103:2776-79。理論に拘泥することなしに、CD34+細胞によって発現されるCXCR-4ケモカインレセプタに対するリガンドである、ケモカインストローマ細胞由来のファクタ-1(SDF-1)も、虚血性損傷領域に対する細胞のホーミングにおいて、ある役割を演じている。Ceredini, D.J.等, Nature Medicine, 2004, 10:858-63; Askari, A.等, Lancet, 2003, 362:697703; Yamaguchi, J.等, Circulation, 2003, 107:1322-34。SDF-1は、血液生成においてある役割を演じており、また血液生成前駆細胞の移動、ホーミングおよび生存に関与しており、またSDF-1は、虚血性部位に対する、EPC補充量を増大することによって、インビボでの虚血性新血管形成に関連している(Yamaguchi等, Circulation, 2003, 107:1322-1328)が、新血管形成におけるSDF-1に役割は、明らかではない。SDF-1に関連する暗示的な証拠がある。例えば、SDF-1遺伝子発現は、低酸素症誘発性ファクタ-1により、低酸素症、即ち該組織における酸素欠乏中に、上向き調節される。更に、CD34+細胞は、梗塞状態にある心筋層を含む、SDF-1に富む虚血領域へのホーミングを可能とする。Askari等, Lancet, 2003, 362:697-703。更に、実質上全てのCD34+CXCR-4+細胞は、VEGF-2を同時発現し、従ってVEGF並びにSDF-1に応答して移動する。Peichev M.等, Blood, 2000, 95:952-58。一旦補充された、CD34+CXCR-4+VEGF-1細胞は、新血管形成に対して寄与することができる。Yamaguchi, J.等, Circulation, 2003, 107:1322-34。
【０００９】
これまでのところ、血管機能不全、特に心筋梗塞をもたらす重大な血管機能不全の、長期に渡る有害な結果を回避するための、理想的な治療法は存在しない。大きな血管の再生(上首尾のステントの設置を意味する)は、有望であると思われるが、これまでの研究は、補償性の心筋肥大によってもたらされる、多大な要求の処理においては、このような応用が不十分であることを示した。結果として、梗塞の拡大および線維質の置換が、普通に発生し、これは、大きな血管の再生、心室壁応力の適当な医学的管理、および有力な天然の、準最適なCD34+細胞-媒介新血管形成とは無関係である(心筋梗塞の基本的な原因に関連する理論の一つは、これら細胞を運動させる能力が、生物学的に限られている可能性があることにある)。
【００１０】
梗塞後の該心筋層の損傷を限定し、かつ心室の改変を制限し、また抑制する、内皮および心筋プリカーサ細胞の能力の評価において、多大な関心が示された。かなりの臨床前データおよび幾つかの臨床データは、心筋梗塞領域における、新血管形成、制限された心筋発生(主として融合による)、および筋肉の保存に寄与させるための、様々な細胞プリカーサ(特に、造血細胞)を利用して、細胞療法の安全性および効力を明らかにしている。例えば、Jackson等, J. Clin. Invest., 2001, 107:1395-1402; Edelberg, J.M.等, Cir. Res., 2002, 90:e89-e93; Schichinger, V.等, New Engl. J. Med., 2006, 355(12):1210-21 (骨髄由来の前駆細胞を利用); Assmus, B.等, New Engl. J. Med., 2006, 355(12):122232 (骨髄由来の前駆細胞を利用), 並びにLunde, K.等, New Eng. J. Med., 2006, 355(12):1199-209 (骨髄由来の前駆細胞を利用)を参照のこと。
【００１１】
骨髄は、様々なプリカーサおよび成熟細胞型からなり、造血細胞(成熟血液細胞のプリカーサ)およびストローマ細胞(広範囲に渡る結合組織細胞のプリカーサ)を包含し、これら両者は、他の細胞型に分化し得るものと思われる。Wang, J.S.等, J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 2001, 122:699705; Tomita, S.等, Circulation, 1999, 100(別冊II):247-256; Saito, T.等, Tissue Eng., 1995, 1:327-43。変性されていない(即ち、分画されていない)骨髄または血液-由来の細胞は、幾つかの臨床研究、例えばHamano, K.等, Japan Cir. J., 2001, 65:845-47; Strauer, B.E.等, Circulation, 2002, 106:1913-18; Assmus等, Circulation, 2002, 106:3009-3017; Dobert, N.等, Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging, 2004, 8:1146-51; Wollert, K.C.等, Lancet, 2004, 364:141-48において利用されている。骨髄の単核細胞画分は、ストローマ細胞、造血細胞プリカーサ、および内皮プリカーサを含むので、これら集団の、該観測された効果に対する相対的な寄与は、存在したとしても、未知である。
【００１２】
CD34は、ヒト骨髄、血液および胎児肝臓由来の、造血幹細胞および前駆細胞上に選択的に発現される、造血幹細胞抗原である。Yin等, Blood, 1997, 90:5002-5012; Miaglia, S.等, Blood, 1997, 90:5013-21。CD34を発現する細胞は、CD34+と命名される。ストローマ細胞はCD34を発現せず、従ってCD34-と命名される。ヒトの血液から単離されるCD34+細胞は、心筋細胞、内皮細胞、および平滑筋細胞に、インビボにて分化することができる。Yeh等, Circulation, 2003, 108:2070-73を参照のこと。CD34+細胞は、約1％の骨髄由来の有核細胞を表し、CD34抗原も、未成熟の内皮細胞プリカーサによって発現され、成熟の内皮細胞は、CD34+を発現しない。Peichev, M.等, Blood, 2000, 95:952-58。インビトロにおいて、成熟骨髄由来のCD34+細胞は、大部分の顆粒球/マクロファージ前駆細胞(CFU-GM)、幾つかのコロニー-形成単位の混合物(CFU-Mix)および原始赤血球前駆細胞(破裂箇所-形成単位、赤血球またはBFU-E)の少数の集団において生じる。Yeh等, Circulation, 2003, 108:2070-73。CD34+細胞は、また低頻度ではあるが、新規な心筋の筋肉に分化し、あるいはその発育に寄与する能力を持つものと考えられる。
【００１３】
免疫磁性ビーズ分離を利用した技術が、骨髄単核細胞から、高度に精製され、かつ生きたCD34+細胞集団を単離するために開発された。米国特許第5,536,475号、同第5,035,994号、同第5,130,144号、同第4,965,205号を参照のこと。これら米国特許各々の内容を、参考としてここに組入れる。2つの臨床的な研究は、心筋梗塞後の、骨髄由来のCD34+細胞の臨床的な応用を支持している。C. Stamm等, Lancet, 2003, 361:45-46; Herenstein, B.等, Blood Supplement Abs., 2004, p.2696を参照のこと。
【００１４】
しかし、これまでのところ、血管機能不全、特に心筋梗塞を発生する血管機能不全の、長期に渡る有害な結果を回避するための、理想的な治療法は存在しない。
【００１５】
本発明は、化学走性活性を持つ細胞の亜集団を含有する、単離されたCD34+細胞の高密度集団を含む、化学走性の造血幹細胞生成物を含む組成物が、製造できるか否か、また工業的な生存期間に渡り安定に維持され、また必要に応じて、対象に放出して、能力細胞が、梗塞状態にある心筋層を包含する、血管機能不全に掛かった部位をホーミングし、かつ修復し得るものと考えられるか否かに関する問題を扱う。
【発明の開示】
【００１６】
本発明は、薬理組成物に係り、該薬理組成物は、化学走性造血幹細胞生成物を含有し、該幹細胞生成物は、化学走性活性を持つ細胞の亜集団を含む、CD34+細胞の高密度集団を含有する。本発明は、またこれら組成物の製造方法および梗塞状態にある心筋を包含する、脈管の損傷を治療または修復するための、該組成物の使用にも係る。本発明は、対象における脈管の損傷を修復するための薬理組成物を提供するものであり、該組成物は、(a) 治療上有効な量の、無菌の、単離された、化学走性造血幹細胞生成物と、ここで該化学走性造血幹細胞生成物は、化学走性活性を持つ能力細胞の亜集団を含む、単離されたCD34+細胞の高密度集団を含み、(b) 安定化量の血清とを含み、該組成物は、カテーテルを通して、腸管外の経路で該対象に投与され、かつ該カテーテルを通過する際に、該化学走性活性を持つ能力細胞の亜集団が、その能力を維持していることを特徴とする。一態様によれば、該組成物の該化学走性をもつ造血幹細胞生成物中の、該単離されたCD34+細胞の高密度集団は、該対象から取得した骨髄から精製されたものである。もう一つの態様によれば、該単離されたCD34+細胞の高密度集団は、少なくとも70％の純度を持つ。更に別の態様によれば、該単離されたCD34+細胞の高密度集団は、該単離されたCD34+細胞の高密度集団を取得した後、少なくとも約24時間に渡り、少なくとも70％の生存率を持つ。更に別の態様によれば、該単離されたCD34+細胞の高密度集団は、該単離されたCD34+細胞の高密度集団を取得した後、少なくとも約48時間に渡り、少なくとも70％の生存率を持つ。更に別の態様によれば、該単離されたCD34+細胞の高密度集団は、該単離されたCD34+細胞の高密度集団を取得した後、少なくとも約72時間に渡り、少なくとも70％の生存率を持つ。更に別の態様によれば、該治療上有効な量の該化学走性造血幹細胞生成物は、CXCR-4媒介化学走性活性を有する、少なくとも0.5×106個の能力CD34+細胞の亜集団を含む、最少数の単離されたCD34+造血幹細胞を含有する。更に別の態様によれば、該高密度CD34+細胞は、該高密度CD34+細胞を取得した後、少なくとも約24時間に渡って、インビトロにて、造血コロニーを生成することができるものである。更に別の態様によれば、該高密度CD34+細胞は、該高密度CD34+細胞を取得した後、少なくとも約48時間に渡って、インビトロにて、造血コロニーを生成することができるものである。更に別の態様によれば、該高密度CD34+細胞は、該高密度CD34+細胞を取得した後、少なくとも約72時間に渡って、インビトロにて、造血コロニーを生成することができるものである。更に別の態様によれば、該血清は、該患者に対してオートロガスのヒト血清、または合成血清である。更に別の態様によれば、該安定化する量の血清は、少なくとも約10％(v/v)なる量である。更に別の態様によれば、該能力細胞亜集団の該化学走性活性の少なくとも2％は、該単離されたCD34+細胞の高密度集団を取得した後、少なくとも24時間に渡って、該能力細胞亜集団により維持される。更に別の態様によれば、該能力細胞亜集団の該化学走性活性の少なくとも2％は、該単離されたCD34+細胞の高密度集団を取得した後、少なくとも48時間に渡って、該能力細胞亜集団により維持される。更に別の態様によれば、該能力細胞亜集団の該化学走性���性の少なくとも2％は、該単離されたCD34+細胞の高密度集団を取得した後、少なくとも72時間に渡って、該能力細胞亜集団により維持される。更に別の態様によれば、該化学走性活性を持つ能力細胞の亜集団を含む、該単離されたCD34+細胞の高密度集団は、少なくとも70％なる純度を持ち、少なくとも約70％なる生存率を有し、かつ該高密度集団を取得した後、少なくとも約24時間に渡って、インビトロにて、造血コロニーを生成することができるものである。更に別の態様によれば、該化学走性活性を持つ能力細胞の亜集団を含む、該単離されたCD34+細胞の高密度集団は、少なくとも70％なる純度を持ち、少なくとも約70％なる生存率を有し、かつ該高密度集団を取得した後、少なくとも約48時間に渡って、インビトロにて、造血コロニーを生成することができるものである。更に別の態様によれば、該化学走性活性を持つ能力細胞の亜集団を含む、該単離されたCD34+細胞の高密度集団は、少なくとも70％なる純度を持ち、少なくとも約70％なる生存率を有し、かつ該高密度集団を取得した後、少なくとも約72時間に渡って、インビトロにて、造血コロニーを生成することができるものである。更に別の態様によれば、該対象は、脈管再生された心筋梗塞患者である。更に別の態様によれば、該組成物を、該カテーテルを通して、梗塞関連動脈に、血管内投与する。更に別の態様によれば、該カテーテルは、流量調節型カテーテルである。更に別の態様によれば、該カテーテルは、バルーン式カテーテルである。更に別の態様によれば、該カテーテルは、少なくとも0.36mmなる内径を持つ。更に別の態様によれば、該組成物を、該カテーテルを通して、血管内放出装置によって、血管内投与する。更に別の態様によれば、該組成物を、該カテーテルを通して、心筋層に投与する。更に別の態様によれば、該薬理組成物は、更に少なくとも約0.5％のアルブミンをも含む。更に別の態様によれば、該薬理組成物は、更に少なくとも1種の適合性活性薬剤をも含む。更に別の態様によれば、該活性薬剤は、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、β-遮断薬、利尿薬、抗-不整脈薬、抗-狭心症薬、血管作動薬、抗-凝血薬、フィブリン溶解剤および高コレステロール血症薬からなる群から選択される。更に別の態様によれば、該組成物の、該化学走性造血細胞生成物の無菌性を、以下の諸工程を含む方法によって確認する：(a) 該細胞生成物を遠心分離処理して、該単離されたCD34+細胞の高密度集団を含有するペレットを含む、分離された細胞生成物および上澄を生成する工程；(b) 該分離された細胞生成物の該細胞ペレットを乱すことなしに、該分離された細胞生成物の上澄を取出す工程；(c) 該分離された細胞生成物の上澄の、無菌性を分析する工程；および(d) 該分離された細胞生成物の、該細胞ペレットの無菌性を決定する工程。
【００１７】
本発明は、更に血管に損傷を持つ対象に対して、脈管内放出するための薬理組成物を製造する方法をも提供し、該薬理組成物は、無菌の、化学走性を呈する造血幹細胞生成物を含み、ここで該化学走性の造血幹細胞生成物は、化学走性活性を持つ能力細胞の亜集団を含む、単離されたCD34+細胞の高密度集団を含み、該方法は以下の諸工程を含む：(a) 無菌条件下で、該対象から、能力CD34+細胞の高密度集団を含む製剤を、化学走性細胞取得工程によって取得する工程；(b) 場合により、該製剤を処理設備に輸送する工程；(c) 該製剤から、化学走性活性を持つ能力細胞の亜集団を含有する、CD34+細胞を無菌的に精製する工程；(d) 該化学走性活性を持つ能力細胞の亜集団を含有する、該精製したCD34+細胞を、無菌的に処方して、化学走性を呈する該造血細胞生成物を生成する工程；(e) 該滅菌された化学走性を呈する該造血幹細胞生成物を、無菌的に処方して、薬理組成物を製造する工程；(e) 該薬理組成物の無菌性を評価する工程；(f) 該対象に注入するのに適したものとして、該無菌薬理組成物を放出する工程；(g) 該薬理組成物の治療的な量を、脈管内放出装置に装填する工程；および(h) 場合により、該治療上有効な量の該無菌薬理組成物を含む該放出装置を、該対象に脈管内注入するための、心臓カテーテル処置設備に輸送する工程。一態様によれば、該方法は、場合によって、更に該工程(a)と(b)との間で、該取得した製剤を保存する段階をも含む。別の態様では、該方法の精製工程(c)を、該取得工程(a)の完了後、約12時間〜約24時間なる範囲の期間内に開始する。更に別の態様によれば、該方法の該精製工程(c)を、該取得工程(a)の完了後、約12時間、約13時間、約14時間、約15時間、約16時間、約17時間、約18時間、約19時間、約20時間、約21時間、約22時間、約23時間、または約24時間以内の期間に開始する。更に別の態様によれば、該方法の該放出工程(f)を、該無菌処方された細胞生成物が、該取得工程(a)の完了後、約48〜約72時間なる範囲の期間内に、該対象内に注入される場合においてのみ行う。更に別の態様によれば、該放出工程(f)を、該無菌処方された細胞生成物が、該取得工程(a)の完了後、約48時間、約49時間、約50時間、約51時間、約52時間、約53時間、約54時間、約55時間、約56時間、約57時間、約58時間、約59時間、約60時間、約61時間、約62時間、約63時間、約64時間、約65時間、約66時間、約67時間、約68時間、約69時間、約70時間、約71時間または約72時間なる範囲の期間内に、該対象内に注入される場合においてのみ行う。更に別の態様によれば、該方法の精製工程(c)を、該取得工程(a)の完了後、約12時間〜約24時間なる範囲の期間内に開始し、かつ該放出工程(f)を、該無菌薬理組成物が、該取得工程(a)の完了後、約48〜約72時間なる範囲の期間内に、該対象内に注入される場合においてのみ行う。更に別の態様によれば、該方法の精製工程(c)を、該取得工程(a)の完了後、約12時間、約13時間、約14時間、約15時間、約16時間、約17時間、約18時間、約19時間、約20時間、約21時間、約22時間、約23時間、または約24時間以内の期間に開始し、かつ該方法の放出工程(f)を、該無菌薬理組成物が、該取得工程(a)の完了後、約48時間、約49時間、約50時間、約51時間、約52時間、約53時間、約54時間、約55時間、約56時間、約57時間、約58時間、約59時間、約60時���、約61時間、約62時間、約63時間、約64時間、約65時間、約66時間、約67時間、約68時間、約69時間、約70時間、約71時間または約72時間なる範囲の期間内に、該対象内に注入される場合においてのみ行う。更に別の態様によれば、該方法の工程(a)における、該化学走性細胞の取得工程は、微細-骨髄(mini-bone marrow)収穫技術である。更に別の態様によれば、該微細-骨髄収穫技術による、該取得工程(a)は、更に以下の諸工程を含む：(i) 該対象から骨髄を収穫するのに先立って、収穫用シリンジに、予めヘパリンを装入する工程；(ii) 該対象の左後部腸骨稜および右後部腸骨稜から、該収穫用シリンジおよび微細-骨髄収穫技術を利用し、該骨髄を吸入して、収穫骨髄を生成する工程；および(iii) 該収穫した骨髄を、収集バッグに注入する工程。更に別の態様によれば、該工程(i)における該収穫用シリンジおよび該工程(iii)における該収集バッグは、保存剤を含まないヘパリン処理した溶液を含む。更に別の態様によれば、該保存剤を含まないヘパリン処理した溶液中のヘパリンの最終濃度は、約20単位/mL〜約25単位/mLなる範囲内にある。更に別の態様によれば、該方法の輸送工程(b)は、更に以下の諸工程をも含む：(i) 該収穫した骨髄を、収集バッグに収容する工程；(ii) 該収集バッグを、第二のバッグに収容する工程；(iii) 該収集バッグを含む該第二のバッグを、開放式搬送容器内に収容する工程；(iv) 該搬送容器を封止する工程；および(v) 該搬送容器を上記処理設備に搬送する工程。更に別の態様によれば、該該方法の工程(c)における該単離されたCD34+細胞の高密度集団は、少なくとも70％なる純度を持つ。更に別の態様によれば、該方法の工程(a)において、該単離されたCD34+細胞の高密度集団を取得した後に、該単離されたCD34+細胞の高密度集団は、少なくとも約24時間に渡り、少なくとも70％の生存率を持つ。更に別の態様によれば、該方法の工程(a)において、該単離されたCD34+細胞の高密度集団を取得した後に、該単離されたCD34+細胞の高密度集団は、少なくとも約48時間に渡り、少なくとも70％の生存率を持つ。更に別の態様によれば、該方法の工程(a)において、該単離されたCD34+細胞の高密度集団を取得した後に、該単離されたCD34+細胞の高密度集団は、少なくとも約72時間に渡り、少なくとも70％の生存率を持つ。更に別の態様によれば、該本発明の方法の工程(a)において、該高密度CD34+細胞を取得した後に、該高密度CD34+細胞は、少なくとも約24時間に渡り、インビトロにて、造血性コロニーを生成することができるものである。更に別の態様によれば、該本発明の方法の工程(a)において、該高密度CD34+細胞を取得した後に、該高密度CD34+細胞は、少なくとも約48時間に渡り、インビトロにて、造血性コロニーを生成することができるものである。更に別の態様によれば、該本発明方法の工程(a)において、該高密度CD34+細胞を取得した後に、該高密度CD34+細胞は、少なくとも約72時間に渡り、インビトロにて、造血性コロニーを生成することができるものである。更に別の態様によれば、該本発明方法の工程(a)において、該単離されたCD34+細胞の高密度集団を取得した後に、少なくとも約24時間に渡り、該能力細胞亜集団の該化学走性活性の少なくとも2％は、該能力細胞亜集団によって維持される。更に別の態様によれば、該方法の工程(a)において���該単離されたCD34+細胞の高密度集団を取得した後に、該能力細胞亜集団の該化学走性活性の少なくとも2％は、少なくとも48時間に渡り、該能力細胞亜集団により維持される。更に別の態様によれば、該方法の工程(a)において、該単離されたCD34+細胞の高密度集団を取得した後に、該能力細胞亜集団の該化学走性活性の少なくとも2％は、少なくとも72時間に渡り、該能力細胞亜集団により維持される。更に別の態様によれば、該化学走性活性を持つ能力細胞の亜集団を含む、該単離されたCD34+細胞の高密度集団は、少なくとも70％なる純度を持ち、少なくとも約70％なる生存率を有し、かつ該方法の工程(a)において、該単離されたCD34+細胞の高密度集団を取得した後に、少なくとも約24時間に渡り、インビトロにて、造血性コロニーを生成することができるものである。更に別の態様によれば、該化学走性活性を持つ能力細胞の亜集団を含む、該単離されたCD34+細胞の高密度集団は、少なくとも70％なる純度を持ち、少なくとも約70％なる生存率を有し、しかも該方法の工程(a)において、該単離されたCD34+細胞の高密度集団を取得した後に、少なくとも約48時間に渡り、インビトロにて、造血性コロニーを生成することができるものである。更に別の態様によれば、該化学走性活性を持つ能力細胞の亜集団を含む、該単離されたCD34+細胞の高密度集団は、少なくとも70％なる純度を持ち、少なくとも約70％なる生存率を有し、かつ該方法の工程(a)において、該単離されたCD34+細胞の高密度集団を取得した後に、少なくとも約72時間に渡り、インビトロにて、造血性コロニーを生成することができるものである。更に別の態様によれば、該方法の工程(g)の該薬理組成物において、該化学走性の造血幹細胞生成物の、該治療上有効な量は、CXCR-4媒介化学走性活性を有する、少なくとも0.5×106個のCD34+能力細胞亜集団を含む、最少数のCD34+造血幹細胞を含有する。更に別の態様によれば、該無菌性を確認する該方法の工程(e)は、更に以下の諸工程を含む：(i) 該処方された細胞生成物を遠心分離処理に掛けて、該単離されたCD34+細胞の高密度集団を含む、細胞ペレットを含有する、分離された細胞生成物および上澄を製造する工程；(ii) 該分離された細胞生成物の該上澄を、該分離された細胞生成物の該細胞ペレットを乱すことなしに、無菌的に取出す工程；(iii) 該分離された細胞生成物の該上澄が、微生物により汚染されているか否かを分析する工程；および(iv) このようにして、該分離された細胞生成物の該細胞ペレットの無菌性を決定する工程。更に別の態様によれば、該方法の工程(g)の該脈管内放出装置は、(i) 無菌四方型ストップコックに取付けられた注入シリンジ、ここで該注入シリンジは、該薬理組成物を含み；(ii) 該無菌四方型ストップコックに取付けられた、洗浄溶液を含有する洗浄シリンジ；および(iii) 該薬理組成物を該対象に放出するための、該無菌四方型ストップコックによって、該放出装置に取付けられたカテーテルを含む。更に別の態様によれば、該カテーテルは、流量調節式カテーテルである。更に別の態様によれば、該カテーテルは、バルーン膨張式カテーテルである。更に別の態様によれば、該カテーテルは、少なくとも0.36mmなる内径を持つ。更に別の態様によれば、該組成物による治療を必要とする対象は、脈管再生され��心筋梗塞患者である。更に別の態様によれば、該薬理組成物は、これを、該カテーテルを通して、梗塞関連動脈に注入することによって、該対象に放出される。更に別の態様によれば、該薬理組成物は、該カテーテルを通して、心筋層内に投与される。
【００１８】
更に、本発明は、脈管損傷の修復を必要とする対象における該脈管損傷を治療または修復する方法を提供するものであって、該方法は、該対象に、カテーテルを通して、無菌薬理組成物を腸管外投与する工程を含み、該薬理組成物は、(a) 治療上有効な量の、無菌で化学走性の造血幹細胞生成物、ここで該化学走性の造血幹細胞生成物は、化学走性活性を持つ能力細胞の亜集団を含む、単離されたCD34+細胞の高密度集団を含み；および(b) 安定化する量の血清を含み、該カテーテルを通過する際に、該化学走性活性を持つ能力細胞の亜集団は、その能力を維持している。更に別の態様によれば、該単離されたCD34+細胞の高密度集団は、少なくとも70％なる純度を持つ。更に別の態様によれば、該単離されたCD34+細胞の高密度集団は、該単離されたCD34+細胞の高密度集団を取得した後に、少なくとも約24時間に渡り、少なくとも70％の生存率を持つ。更に別の態様によれば、該単離されたCD34+細胞の高密度集団は、該単離されたCD34+細胞の高密度集団を取得した後に、少なくとも約48時間に渡り、少なくとも70％の生存率を持つ。更に別の態様によれば、該単離されたCD34+細胞の高密度集団は、該単離されたCD34+細胞の高密度集団を取得した後に、少なくとも約72時間に渡り、少なくとも70％の生存率を持つ。更に別の態様によれば、該治療上有効な量の該化学走性の造血幹細胞生成物は、CXCR-4媒介化学走性活性を有する、少なくとも0.5×106個の能力CD34+細胞亜集団を含む、最少数の単離されたCD34+造血幹細胞を含有する。更に別の態様によれば、該高密度CD34+細胞は、該高密度CD34+細胞を取得した後に、少なくとも約24時間に渡って、インビトロにて、造血性コロニーを生成することができるものである。更に別の態様によれば、該高密度CD34+細胞は、該高密度CD34+細胞を取得した後に、少なくとも約48時間に渡り、インビトロにて、造血性コロニーを生成することができるものである。更に別の態様によれば、該高密度CD34+細胞は、該高密度CD34+細胞を取得した後に、少なくとも約72時間に渡り、インビトロにて、造血性コロニーを生成することができるものである。更に別の態様によれば、該能力細胞亜集団の該化学走性活性の少なくとも2％は、該単離されたCD34+細胞の高密度集団を取得した後に、少なくとも24時間に渡って、該能力細胞亜集団により維持される。更に別の態様によれば、該能力細胞亜集団の該化学走性活性の少なくとも2％は、該単離されたCD34+細胞の高密度集団を取得した後に、少なくとも48時間に渡って、該能力細胞亜集団により維持される。更に別の態様によれば、該能力細胞亜集団の該化学走性活性の少なくとも2％は、該単離されたCD34+細胞の高密度集団を取得した後に、少なくとも72時間に渡って、該能力細胞亜集団により維持される。更に別の態様によれば、該化学走性活性を持つ能力細胞の亜集団を含む、該単離されたCD34+細胞の高密度集団は、少なくとも70％なる純度を持ち、少なくとも約70％なる生存率を有し、かつ該高密度集団を取得した後に、少なくとも約24時間に渡って、インビトロにて、造血性コロニーを生成することができるものである。更に別の態様によれば、該化学走性活性を持つ能力細胞の亜集団を含む、該単離されたCD34+細胞の高密度集団は、少なくとも70％なる純度を持ち、少なくとも約70％なる生��率を有し、かつ該高密度集団を取得した後に、少なくとも約48時間に渡って、インビトロにて、造血性コロニーを生成することができるものである。更に別の態様によれば、該化学走性活性を持つ能力細胞の亜集団を含む、該単離されたCD34+細胞の高密度集団は、少なくとも70％なる純度を持ち、少なくとも約70％なる生存率を有し、かつ該高密度集団を取得した後に、少なくとも約72時間に渡って、インビトロにて、造血性コロニーを生成することができるものである。更に別の態様によれば、該血清は、該対象に対してオートロガスのヒト血清、または合成血清である。更に別の態様によれば、該安定化する量の血清は、少なくとも約10％(v/v)なる量の血清である。更に別の態様によれば、該対象は、脈管再生された心筋梗塞患者である。更に別の態様によれば、本発明の方法は、更に脈管内放出装置によって、梗塞関連動脈に、該組成物を脈管内経路で放出する工程をも含む。更に別の態様によれば、該脈管内放出装置は、(i) 無菌四方型ストップコックに取付けられた注入シリンジ、ここで該注入シリンジは、該薬理組成物を含み；(ii) 該無菌四方型ストップコックに取付けられた、洗浄溶液を含有する洗浄シリンジ；および(iii) 該薬理組成物を該対象に放出するための、該無菌四方型ストップコックによって、該放出装置に取付けられたカテーテルを含む。更に別の態様によれば、該カテーテルは、流量調節式カテーテルである。更に別の態様によれば、該カテーテルは、バルーン膨張式カテーテルである。更に別の態様によれば、該カテーテルは、少なくとも0.36mmなる内径を持つ。更に別の態様によれば、該薬理組成物は、第一の時間および第二の時間によって規定される、特定の時間間隔中に、該対象に放出される。更に別の態様によれば、該第一の時間は、該梗塞形成後少なくとも約5日であり、かつ該第二の時間は、該梗塞形成後約14日未満である。更に別の態様によれば、該第一の時間は、該梗塞形成領域における、最大の炎症性サイトカインのカスケード生産後である。更に別の態様によれば、該第二の時間は、該梗塞形成領域に、心筋の瘢痕を形成する前である。更に別の態様によれば、該組成物は、脈管内放出装置によって、該カテーテルを通して、脈管内経路で投与される。更に別の態様によれば、該組成物は、該カテーテルを通して、心筋層内に投与される。更に別の態様によれば、該薬理組成物は、更に少なくとも1種の適合性のある活性薬剤をも含む。更に別の態様によれば、該活性薬剤は、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、β-遮断薬、利尿薬、抗-不整脈薬、抗-狭心症薬、血管作動薬、抗-凝血薬、フィブリン溶解剤、および高コレステロール血症薬からなる群から選択されるものである。
【００１９】
更に、本発明は、限られた体積を持つ、臨床的に有用な単離細胞生成物の、無菌性を評価する方法を提供するものであって、該方法は、以下の諸工程：(a) 該単離細胞生成物の細胞性成分を、非-細胞性成分から、無菌的に分離する工程；および(b) 該非-細胞性成分を、微生物汚染に付きテストする工程を含み、これにより該臨床的に有用な単離細胞生成物の無菌性を決定する。一態様によれば、該方法の工程(a)において、該細胞性成分は、遠心分離によって該非-細胞性成分から分離される。別の態様では、該細胞性成分は、該単離細胞生成物の遠心分離の際に、細胞ペレットを生成する。更に別の態様によれば、該非-細胞性成分は、該単離細胞生成物の遠心分離の際に、上澄を生成する。更に別の態様によれば、該単離細胞生成物は、化学走性を示す造血幹細胞生成物である。更に別の態様によれば、該化学走性を示す造血幹細胞生成物は、CXCR-4媒介化学走性活性を有する、能力細胞亜集団を含む、単離されたCD34+細胞の高密度集団を含む。更に別の態様によれば、該上澄の無菌性を確認した後、治療上有効な量の無菌で化学走性を示す造血幹細胞生成物を、脈管内経路で対象に投与して、脈管の損傷を治療もしくは修復する。更に別の態様によれば、該無菌で化学走性を示す造血幹細胞生成物は、カテーテルを通して投与される。更に別の態様によれば、該対象は、脈管再生された心筋梗塞患者である。更に別の態様では、該脈管の損傷は、脈管機能不全である。更に別の態様によれば、該脈管機能不全は、少なくとも一つの冠動脈を冒している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下の定義は、本発明のパラメータを示す。
【００２１】
ここで使用する用語「脈管(血管)形成」とは、血管の形成および成長を意味する。
【００２２】
用語「c-キット」とは、幹細胞ファクタと結合する、幾つかの細胞の表面上のタンパク質(幾つかの型の細胞を成育させる物質)を意味する。このレセプタの改変型は、幾つかの型の癌と関連している可能性がある。
【００２３】
用語「心臓バイオマーカー」とは、診断または予後の目的で使用される、心臓機能、損傷または機能不全と関連する酵素、タンパク質およびホルモンを意味する。様々なバイオマーカーは、身体内におけるそのレベルが上昇し、ピークに達し、および降下する種々の時間を持ち、従って心臓発作進行の追跡のみならず、心臓発作が始まった際の、その評価並びに再発を監視するためにも利用することができる。これらテストの幾つかは、心臓に特異的なものであるが、他のものも、骨格筋の損傷に伴って高くなる。一般的な心臓バイオマーカーは、CK(クレアチンホスホキナーゼまたはクレアチンキナーゼ)およびCK-MB(クレアチンキナーゼ-ミオグロビンレベル(骨格筋と心筋との識別を補助するためのバイオマーカー))、トロポニン(トロポニンIおよびTの血中レベルは、心臓発作後の1-2週間は、高い値に維持されるであろう；トロポニンは、他の筋肉の損傷によっては、一般に影響されない)、ミオグロビン(筋肉、特に心筋が損傷を受けているか否かを決定するためのバイオマーカー)およびBNP(脳内ナトリウム排泄亢進ペプチド)またはNT-proBNP(N-末端プロホルモン、脳内ナトリウム排泄亢進ペプチド(心臓機能不全の診断を補助し、また該心臓機能不全の重篤度を等級付けするためのバイオマーカー))を含むが、これらに制限されない。
【００２４】
用語「心臓カテーテル処置(cardiac catheterization)」とは、カテーテルを、動脈を介して心臓まで、および冠動脈内に通す、処置を意味する。この処置は、冠動脈の血管造影図(即ち、X-線像)を与え、また左心室、即ち心臓の主ポンプ室は、肺動脈における圧力を測定し、また心臓機能を追跡するために利用できる。
【００２５】
本発明において使用する用語「CD34+」とは、造血肝細胞抗原「に対して正」、即ち、「発現性」であり、少なくともその亜集団は、CXCR4を発現し、また損傷領域まで移動できる、ヒトの骨髄由来の造血幹細胞および前駆細胞を意味する。
【００２６】
用語「CD38」とは、マクロファージ、樹状細胞、および活性化されたBおよびNK細胞上に存在するタンパク質マーカーを意味し、これらは、リンパ細胞と内皮細胞との接着を媒介することができる。
【００２７】
用語「CD45」および「通常の白血球抗原」とは、赤血球および血小板を除き、造血細胞中に位置する、タンパク質チロシンホスファターゼ（PTP)を意味する。
【００２８】
用語「CD59」とは、補体-媒介性溶解から、ヒトの細胞を保護する、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI-)-結合膜糖タンパク質を意味する。
【００２９】
用語「化学走性」とは、運動性細胞またはその部分の誘引性と思われる環境条件に向かうおよび/または忌避的であることが分かっている周囲から遠ざかる、直接的な運動を意味する。
【００３０】
ここで使用する用語「CXCR-4」とは、G-タンパク質-結合ケモカインレセプタを意味する。
【００３１】
ここで使用する用語「サイトカイン」とは、他の細胞に様々な作用を及ぼす、細胞によって分泌される、小さな可溶性タンパク物質を意味する。サイトカインは、成長、発生、創傷治癒、および免疫応答を含む、多くの重要な生理的機能を媒介する。これらは、細胞膜中に位置する、その細胞特異的レセプタと結合することによって作用し、これは明確なシグナル伝達カスケードを、該細胞内で開始することを可能とし、結局はターゲット細胞内に生化学的および表現型の変化を導く。一般に、サイトカインは局所的に作用する。これらは、多くのインターロイキン並びに数種の造血成長因子を包含するタイプIサイトカイン；インターフェロンおよびインターロイキン-10を包含するタイプIIサイトカイン；TNFおよびリンフォトキシンを含む、腫瘍壊死因子(TNF)-関連分子；インターロイキン1(IL-1)を含む免疫グロブリン上科構成員；および様々な免疫および炎症性機能において重要な役割を果たす一群の分子である、ケモカインを含む。同一のサイトカインは、該細胞の状態に依存して、細胞な様々な作用を及ぼすことができる。サイトカインは、しばしば他のサイトカインの発現を調節し、またカスケードを誘発する。
【００３２】
該用語「コロニー刺激因子」とは、白血球製造の調節を司るサイトカインを意味する。その型は、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)を含む。
【００３３】
該用語「造血幹細胞」とは、血液からあるいは骨髄から単離された細胞を意味し、該骨髄は、それ自体を再生し、様々な特異化された細胞に分化し、該骨髄から循環する血液中に移動し、プログラム化された細胞死(アポトーシス)を行うことができる。本発明の幾つかの態様においては、ヒト対象由来の造血幹細胞は、少なくとも1種の型の細胞表面マーカーを発現し、該マーカーは、CD34、CD38、HLA-DR、c-キット、CD59、Sca-1、Thy-1、および/またはCXCR-4、またはこれらの組み合わせを含むが、これらの限定されない。
【００３４】
「HLA-DR」は、数種の細胞型上に存在する、抗原-提示細胞、B細胞、単球、マクロファージおよび活性化T-細胞を包含する、ヒトクラスII組織適合性抗原を意味する。
【００３５】
ここで使用する用語「インターロイキン」とは、他の白血球との連絡手段として、白血球から分泌されるサイトカインを意味する。
【００３６】
用語「VEGF-1」または「血管内皮成長因子-1」とは、互換的に使用され、増殖、移動、侵入、生存、および透過性を含む、内皮細胞の多数の機能を媒介するサイトカインを意味する。VEGFは、血管形成にとって重大である。
【００３７】
ここで使用する用語「ケモカイン」とは、白血球を特定の方向に移動させるシグナルとして作用する、一群の化学走性サイトカインを意味する。「化学走性」なる用語は、化学物質の濃度差に沿って、化学的刺激に向かう、あるいはこれから遠ざかる、細胞の運動または定位を意味する。
【００３８】
用語「全血球計算」(CBC)とは、血液細胞型各々の量に関する詳細な情報を与える、研究室テストを意味する。これは、通常3種の主な血球(赤血球、白血球、および血小板)各々の測定値およびヘモグロビンおよびヘマトクリットの尺度を含む。用語「ヘモグロビン(数)」(HGB)とは、1 dLの血液中のヘモグロビングラム数(g/dL)を意味する。健常な成人のヒト対象における正常なヘモグロビン濃度は、男性に対して約14g/dL〜約18g/dLなる範囲にあり、また女性に対して、約12g/dL〜約16g/dLなる範囲にある。大まかな指標として、ヘモグロビンは、一般にヘマトクリットの約1/3であるべきである。「赤血球数」(RBC)は、所定量の血液中の全赤血球数を意味する。ヒト対象における正常なその範囲は、男性に対して約4.5×106細胞/mm3〜約6.0×106細胞/mm3なる範囲内にあり、また女性に対して、約4.0×106細胞/mm3〜約5.5×106細胞/mm3なる範囲内にある。「白血球数」(WBC)は、所定量の血液中の全白血球数を意味する。ヒト対象における正常なその範囲は、約4.3×103細胞/mm3〜約10. 8×103細胞/mm3なる範囲内にある。「ヘマトクリット」(HCT)は、全血液の体積に対する百分率としての、赤血球の割合を意味する。ヒト対象における正常なヘマトクリットは、男性に対して約約40％〜約55％なる範囲にあり、また女性に対して、約35％〜約45％なる範囲にある。
【００３９】
ここで使用する用語「疾患」または「障害」とは、健康の侵害または異常な機能状態を意味する。ここで使用する用語「症候群」とは、ある疾患または状態を示す、あるパターンの徴候を意味する。ここで使用する用語「状態」とは、様々な健康状態を意味し、任意の原因となるメカニズムまたは障害、損傷、および健康な組織および器官のプロモーションによって引起される、障害または疾患を含むことを意味する。
【００４０】
ここで使用する用語「炎症」とは、感染の傷害に対する応答を意味し、そこでは、解毒および修復に関与する細胞炎症媒介物によって、傷害を受けた部位に移動する。炎症は、しばしば該炎症部位における白血球、特に好中球(多形核細胞)の強力な浸潤により特徴付けられる。これらの細胞は、血管壁において、または損傷を受けていない組織内で、有害物質を放出することにより組織の損傷を促進する。
【００４１】
開始剤とは無関係に、急性炎症を伴う生理的な変化は、4つの主な特徴を含む：(1) 正味の血流の増加をもたらす、血管拡張は、急性の組織損傷の、最も初期の身体的な応答の一つであり；(2) 炎症性の刺激に応答して、細静脈を覆う内皮細胞が、収縮し、細胞内結合を拡大して、ギャップを生成し、血管からの血漿タンパクおよび血液細胞の漏洩をもたらす可能性のある、高い血管透過性に導き；(3) 炎症は、しばしば炎症部位における白血球、特に好中球(多形核細胞)の強力な浸潤により特徴付けられる。これらの細胞は、血管壁において、または損傷を受けていない組織内で、有害物質を放出することにより組織の損傷を促進し；また(4) 特定の刺激に応答して白血球から放出される発熱原によって熱が発生する。
【００４２】
該炎症過程において、該炎症性応答の可溶性炎症媒介物は、全身的に、肉体の急迫を引起す薬剤を収容しまた排除するために、細胞性成分と共に作用する。媒介物と関連して、ここで使用する用語「炎症性」または「免疫-炎症性」とは、該炎症性過程の分子状媒介物を意味する。これらの可溶性、拡散性分子は、局所的に組織損傷および感染部位およびより遠方の部位両者において作用する。幾つかの炎症性媒介物は、該炎症過程により活性化され、一方でその他のものは、急性の炎症に応答して、あるいは他の可溶性、炎症性媒介物によって、細胞源で合成およびまたはそこから放出される。該炎症性応答の炎症媒介物の例は、血症プロテアーゼ、補体キニン、血餅形成および繊維素溶解タンパク、脂質媒介体、プロスタグランジン、ロイコトリエン、血小板活性化因子(PAF)、ペプチドおよびアミン(例えば、ヒスタミンを含むが、これに限定されない)、セロトニン、および神経ペプチド、プロ炎症性サイトカイン(例えば、インターロイキン-1、インターロイキン-4、インターロイキン-6、インターロイキン-8、腫瘍壊死因子(TNF)、インターフェロン-γ、およびインターロイキン-12を含むが、これに限定されない)を含むが、これに限定されない。
【００４３】
用語「イン-デート(in-date)」とは、無菌条件下にある対象からの、能力CD34+細胞の高密度集団を含む調製物の、該対象からの獲得の完了と、該調製物から、能力CD34+細胞の無菌生成を開始するまでの時間間隔を意味する。用語「アウト-デート(out-date)」とは、無菌条件下にある対象からの、能力CD34+細胞の高密度集団を含む調製物の、該対象からの獲得の完了と、化学走性造血幹細胞生成物を含む該処方された薬理組成物を、該対象に注入するまでの時間間隔を意味する。
【００４４】
ここで使用する用語「注入する」または「注入」とは、血液以外の流体を、治療の目的で、ヒトを含む対象の血管に導入することを意味する。
【００４５】
自己(オートロガス)血清を含まない、本発明の「注入溶液」とは、25USP単位/mLのヘパリンおよび1％のヒト血清アルブミン(HAS)を補充した、リン酸緩衝塩水(PBS)を含む。幾つかの態様において、該注入溶液には、血清が補充されている。幾つかの態様において、該血清は自己由来のものである。
【００４６】
用語「傷害」とは、薬剤または物理的または化学的なものであり得る力に起因する対象の身体の、構造または機能に生じた損傷または傷害を意味する。用語「血管の損傷」とは、脈管系(即ち、脈管ネットワーク、即ち血管または流体、例えば血液またはリンパ液(これらに限定されない)を搬送する導管のネットワークを意味する)に対する傷害を意味する。
【００４７】
ここで使用する用語「マクロファージ」とは、骨髄における単球幹細胞から生じる、単核の活発に食菌する細胞を意味する。これらの細胞は、身体中に広く分布しており、また形態および運動性において変動する。食菌活性は、典型的に、幾つかの免疫グロブリンおよび補体系の成分を含む、血清識別因子によって媒介されるが、非-特異的であってもよい。マクロファージは、また抗体生産および細胞-媒介免疫応答両者、特にリンパ細胞に対する抗原の提示に関与している。これらは、様々な免疫調節分子を分泌する。
【００４８】
用語「細菌(バクテリア)」または「微生物」とは、小さくて肉眼では明瞭に見ることができない生物を意味するために、ここでは互換的に使用し、その例は、微視的な細菌、真菌類(カビ)、藻類、原生動物、およびウイルスを含むが、これらに限定されない。
【００４９】
ここで使用する用語「調節」とは、所定の尺度または割合に調節、変更、適合、または調節することを意味する。
【００５０】
用語「心筋梗塞」とは、心筋に対する死に至るまたは永続的な損傷を意味する。殆どの心臓発作は、心筋に対する血液および酸素の流れを阻止する、冠動脈の閉塞によって引起され、該領域における心臓細胞の死亡に導く。この損傷を受けた心筋は、その収縮能力を失って、結果として残りの心筋が、該弱められた領域の能力を、補償することになる。本発明は、心臓が鼓動している際のそのサイズ、形状、および機能に関するテストを利用して、該心臓の律動の変化を検出し、また損傷を受けた組織および閉塞された動脈を検出し、かつ評価することによる、本発明に従う治療に対する、対象の適正を評価することに関連する段階を含む。このようなテストの例は、心電図検査法、超音波心臓造影法、冠動脈血管造影法、および核心室造影法を含むが、これらに限定されない。心臓バイオマーカーも、本発明に従う治療に対する、対象の適正を評価するために使用される。
【００５１】
ここで使用する用語「能力のある」または「能力」とは、本発明の化学走性の造血幹細胞生成物の必要な生物学的な活性を意味し、即ち本発明の能力細胞は、生存製を維持しており、媒介運動性を発揮でき、また成長、即ちインビトロCFUアッセイにおいて造血細胞コロニーを形成することができる。
【００５２】
ここで使用する用語「前駆細胞」とは、添加された成長因子を含む培養皿において、骨髄細胞の懸濁液を成育することにより、単離することのできる骨髄中の未成熟細胞を意味する。前駆細胞は、血液細胞にまで成熟する、プリカーサ細胞へと成熟する。前駆細胞は、コロニー形成単位(CFU)またはコロニー形成細胞(CFC)と呼ばれる。前駆細胞の特異的な系統は、下付番によって示され、例えばCFU-E(赤血球)、CFU-GM(顆粒球/マクロファージ)、およびCFU-GEMM(多能性造血前駆体)を含むが、これらに限定されない。
【００５３】
ここで使用する名詞としての用語「修復」とは、機能を回復させる、任意の補正、強化、回復、治癒、補充、健全化、再生、改良、パッチング(patching)等を意味する。幾つかの態様において、「修復」は、完全な修復および部分的な修復を含む。
【００５４】
用語「Sca-1」または「幹細胞抗原-1」とは、間葉性の幹細胞の自己再生能力に影響を与える、シグナル経路における表面タンパク質成分を意味する。
【００５５】
用語「幹細胞」とは、娘細胞を生成することのできる自己再生能力を持つ、高い増殖能力を持つ未分化の細胞を意味し、該娘細胞は、終分化を行って、一つ以上の明確な細胞フェノタイプとなることができる。
【００５６】
用語「ステント」とは、動脈を開放支持するのに使用する、小さな管を意味する。このステントは、小径にまで圧潰され、バルーンカテーテル上に取付けられ、股間部(大体動脈)または腕部(上腕動脈)における主動脈を通して挿入され、該動脈の狭窄部/閉塞部まで、通される。これが正しい位置に達したら、該バルーンを僅かに膨張させ、任意のプラックを離すように押し、かつ該動脈を膨張させる(バルーン血管形成術)。該バルーンを膨張させた際に、該ステントは膨張し、その場に固定し、該動脈を開放状態に維持するように、足場を形成する。該ステントは、該動脈内に永久的に留まる。幾つかの対象においては、ステントは、バルーン血管形成術またはカテーテルを使用する他の手順後に起こる、再度の狭窄の発生を減じる。ステントは、また正常な血流を回復するのを補助し、また該バルーンカテーテルによって裂け、または損傷を受けている場合には、動脈を開放状態に維持することができる。再閉塞(再狭窄)は、該ステント処置に係る一問題である。薬物-溶出ステントは、徐々に放出される薬物で被覆されたステントである。これら薬物は、再閉塞から血管を防御し、該血管を維持することができる。
【００５７】
ここで使用する用語「対象」とは、ヒトを含む哺乳動物起源の動物種を包含する。
【００５８】
用語「Thy-1」とは、ゲッシ目およびヒトの免疫細胞および神経細胞上で発現される、Ig上科細胞表面糖タンパクThy-1を意味し、これはT細胞の分化、増殖、およびアポトーシスにおいて細胞接着およびシグナル伝達において機能するものと仮定される。
【００５９】
ここで使用する用語「処置(治療)」とは、状態の進行を、阻止し、実質的に阻害し、遅くし、または反転させ、状態の臨床的または感性的な症状を、実質的に改善し、状態の臨床的または感性的な症状を、実質的に予防し、かつ有害なまたは悩ましい刺激から保護することを包含する。
【００６０】
本発明の組成物
【００６１】
本発明の一局面において、本発明の造血幹細胞は、移動することができ、このことは、該細胞がある場所から、別の位置または領域に移動できることを意味する。一態様において、造血幹細胞の移動は、化学走性によって駆動される。
【００６２】
本発明は、薬理組成物および脈管機能不全に起因する損傷を、修復する方法を提供する。用語「処方物」および「組成物」とは、ここでは全ての活性なおよび不活性な原料を含む本発明の製品を意味するために、互換的に使用する。該用語「活性」とは、意図した治療効果の基となる、本発明の組成物の原料、成分または構成成分を意味する。ここで使用する用語「薬理処方物」または「薬理組成物」とは、ターゲット状態または疾患の予防、その重度の軽減、治癒またはさもなければ治療に使用される処方物または組成物を意味する。
【００６３】
本発明の脈管損傷を修復するための薬理組成物は、化学走性活性を持つ細胞の亜集団を含む、CD34+細胞の高密度集団を含有する、化学走性造血幹細胞生成物を含む。幾つかの態様において、この化学走性活性は、SDF-1、VEGF、および/またはCXCR-4によって媒介される。一態様によれば、該化学走性造血幹細胞生成物は、該対象から取得した、骨髄由来のCD34+造血幹細胞を単離または生成することによって製造される。本発明によれば、CD34+細胞に富む該化学走性造血幹細胞生成物は、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％または少なくとも約95％の、純粋なCD34+細胞を含む。他の態様では、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％または少なくとも約95％の該CD34+細胞は、該CD34+細胞の高密度集団の獲得後、少なくとも約24時間、少なくとも約48時間、または少なくとも約72時間に渡り生存性である。もう一つの態様において、該CD34+細胞は、インビトロにて、該CD34+細胞の高密度集団の獲得後、少なくとも約24時間、少なくとも約48時間、または少なくとも約72時間に渡り造血コロニーを生成することができる。
【００６４】
CD34+細胞は、当業者には公知の任意の技術に従って、富化し/選別することができる。例えば、幾つかの態様においては、CD34+細胞を含有する骨髄細胞の集団を、蛍光活性化細胞選別(FACS)法によって、CD34+細胞抗原およびCXCR4細胞抗原を発現する細胞に富むものとする。幾つかの態様においては、骨髄中のCD34+細胞は、正または負の免疫分離(immunoseparation)技術によって、富化/選別される。幾つかの態様においては、骨髄由来の造血幹細胞の単離および/または精製は、サイズおよび細胞密度、代謝性染料の流出、または細胞毒性薬剤に対する耐性に基く、細胞分画法を基本とする。一態様において、例えば骨髄中のCD34+細胞は、モノクローナル抗-CD34抗体および免疫磁気(immunomagnetic)分離技術を利用して、富化/選別される。
【００６５】
選別されたCD34+細胞は、当分野において公知の技術によって、同定し、定量しかつ特徴付けすることができる。例えば、幾つかの態様において、該骨髄および該化学走性の造血幹細胞生成物中のCD34+細胞の割合は、FACS分析によって決定することができる。他の態様では、CD34タンパク発現を、ウエスタンブロット法によって、定量する。該用語「ウエスタンブロット」とは、複雑な混合物中のタンパク質を同定する方法を意味し、ここではタンパク質を、ゲル媒体中で電気泳動によって分離し、該ゲルからタンパク結合シートまたはメンブランに転写し、かつ該分離されたタンパク質を含有するシートまたはメンブランを、対象とするタンパク質を結合し、局在化し、かつ可視化を可能とする、特定の抗体に暴露する。例えば、モノクローナル抗-CD34抗体を使用して、メンブランと結合したCD34タンパク質を、その場で検出することができる。
【００６６】
もう一つの態様によれば、該単離されたCD34+細胞中のCD34mRNAおよびDNAの発現が、定量化できる。ここで使用する用語「ノーザンブロット」とは、検体由来のRNAを、ゲル上で電気泳動によりその成分部分に分離し、特異的に変性された紙支持体に転写し、結果的に該mRNAを、その電気泳動位置に固定する。CD34関連配列を、リポーター分子、例えば制限はないが、放射性ラベルを含むプローブを用いて同定する。もう一つの態様によれば、CD34および/またはCXCR4発現のレベルは、定量的または半-定量的PCR法または逆転写酵素PCR(RT-PCR)技術によって測定される。略語「PCR」とは、ポリメラーゼ連鎖反応を意味し、これはDNAの量を増幅する技術であり、かくして該DNAの単離、クローニングおよび配列決定を容易にする。これについては、例えば米国特許第5,656,493号、同第5,333,675号、同第5,234,824号および同第5,187,083号を参照することができ、これら特許各々を、参考文献としてここに組入れる。
【００６７】
もう一つの態様において、本発明の該化学走性造血幹細胞生成物の該選別されたCD34+造血幹細胞は、CXCR-4媒介化学走性活性を持つCD34+細胞の亜集団を含む。好ましい一態様において、本発明の該造血幹細胞生成物は、最小数の単離されたCD34+造血幹細胞を、CXCR-4媒介化学走性活性を持つ、少なくとも0.5×106個のCD34+細胞の亜集団が存在するように含んでいる。もう一つの態様において、該CD34+細胞の該CXCR-4媒介化学走性活性の少なくとも約2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、または34％が、該CD34+細胞の高密度集団の獲得後、少なくとも約24時間、少なくとも約48時間、または少なくとも約72時間に渡り維持される。もう一つの態様において、該CD34+細胞の該CXCR-4媒介化学走性活性の、平均して少なくとも約17％が、該CD34+細胞の高密度集団の獲得後、少なくとも24時間、少なくとも48時間、または少なくとも72時間に渡り維持される。もう一つの態様において、該化学走性造血細胞生成物中の該CD34+細胞は、該CD34+細胞の高密度集団の獲得後、少なくとも72時間に渡り、該CXCR-4媒介化学走性活性の少なくとも約2%を維持している。
【００６８】
本発明の薬理組成物は、更に該組成物の少なくとも10体積％なる濃度にて、血清を含む。一態様において、該血清は自己由来のものである。もう一つの態様において、該血清は、合成または組換え血清である。該組成物中に存在する血清の最小濃度は、該組成物の最終体積100mL当たりのmL数で表して、少なくとも約10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、または70％である。本発明の該組成物中に存在する血清の最大濃度は、該組成物の最終体積100mL当たりのmL数で表して、約70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、または10％である。
【００６９】
幾つかの態様において、本発明の組成物は、賦形剤、担体、または媒介体、例えば溶媒を含むがこれに限定されない添加剤と共に処方することができる。ここで使用する用語「賦形剤」、「担体」または「媒介体」とは、ここに記載する化学走性造血幹細胞生成物の、処方および投与のために適した担体物質を意味する。本発明において有用な担体および媒介体は、無害であり、また他の成分と相互作用しない、当分野において公知の任意のこのような物質を包含する。ここで使用する熟語「製薬上許容される担体」とは、本発明の該化学走性造血幹細胞生成物が、安定性および生体利用性を維持するであろう、本発明の該組成物の処方および投与のために適した、あらゆる実質上無毒の担体を意味する。
【００７０】
該製薬上許容される担体は、これが、治療すべき哺乳動物に投与するのに適したものであるのに、十分に高純度であり、また十分に低毒性でなければならない。該担体は、また活性薬剤の安定性および生体利用性を維持すべきである。該製薬上許容される担体は、液状または固体状であり得、また該担体は、想定する投与方法に応じて、与えられた組成物の活性薬剤および他の成分を結合した際に、所定の嵩、稠度等を与えるように選択される。例えば、該製薬上許容される担体は、制限無しに、結合剤(例えば、予めゲル化させたトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース等)、フィラー(例えば、ラクトースおよび他の糖類、微晶質セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、リン酸水素カルシウム等)、潤滑剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアレート、水素化植物オイル、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等)、崩壊剤(例えば、デンプン、ナトリウムデンプングリコレート等)、または湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等)であり得る。本発明の組成物用の、他の適当な製薬上許容される担体は、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、珪酸、粘稠なパラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等を含むが、これらに限定されない。これらの担体溶液は、またバッファー、希釈剤、および他の適当な添加剤を含むこともできる。ここで使用する用語「バッファー」とは、化学的構成成分が、大幅にpHを変化させることなしに、酸または塩基を中和する、溶液または液体を意味する。本発明において目論まれているバッファーの例は、ドゥルベコのリン酸緩衝塩水(PBS)、リンゲル溶液、5％デキストロース水性分散物(D5W)、規定/生理塩水(0.9％NaCl)を含むが、これらに限定されない。幾つかの態様において、該注入用液は、対象の組織に対して、等張性のものである。腸管外投与用の本発明の組成物は、製薬上許容される担体、例えば滅菌水性溶液、通常の溶媒、例えばアルコール中の非水性溶液、または液状オイルを基本とする溶液を含むことができる。
【００７１】
幾つかの態様において、本発明の組成物の該担体は、放出剤、例えば徐放性または遅延放出性担体を含むことができる。このような態様において、該担体は、より効果的な投与を行う、例えば低頻度および/または該組成物の低用量をもたらし、取扱いの容易性を改善し、また疾患、疾病、状態、症候群等に及ぼす、諸効果を持続させ、または遅延する、該活性成分を徐放または遅延放出し、治療し、予防しあるいは促進することのできる、任意の物質であり得る。このような担体の非-限定的な例は、天然または合成ポリマー製のリポソーム、マイクロスポンジ、微小球、またはマイクロカプセル等を含む。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリン等の、様々なリン脂質から製造できる。
【００７２】
本発明の組成物は、無菌の注射可能な水性または油脂性懸濁液として腸管外投与することができる。ここで使用する用語「腸管外」または「腸管外(経路で)」とは、注入技術を含むが、これに限定されない注射(即ち、注射による投与)によって、身体内に導入することを意味する。化学走性造血幹細胞生成物を含有する本発明の組成物は、流体組成物(即ち、流動性の組成物)を、選択された解剖学的な構造体内に送達するのに適した、バルーンカテーテルによって、該対象に放出される。
【００７３】
本発明の無菌組成物は、無害な腸管外経路にとって許容される希釈剤または溶媒に分散させた無菌溶液または懸濁液であり得る。溶液は、一般に2またはそれ以上の物質の均一な混合物と考えられ、これは、必須ではないが、しばしば液体である。溶液において、その溶質の分子(または溶解した物質)は、その溶媒中に均一に分配されている。懸濁液は、分散体(混合物)であり、そこでは、微粉砕された種が、他の種との併合状態にあり、前者は極めて微細に粉砕かつ混合されており、結果としてこれは速やかに沈降してしまうことはない。毎日の生活において、最も一般的な懸濁液は、液状の水に固体を分散させたものである。使用可能な、許容される賦形剤および溶媒は、特に水、リンゲル溶液、および等張性塩化ナトリウム溶液(塩水)である。幾つかの態様において、高張液が使用される。無菌の固定油は、従来、溶媒または懸濁媒体として使用されている。腸管外用途に対して、特に適した賦形剤は、溶液、特に油性または水性溶液、並びに懸濁液、エマルション、またはインプラントからなる。水性懸濁液は、その粘性を高める物質を含むことができ、またその例は、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび/またはデキストランを包含する。
【００７４】
本発明の付随的な組成物は、当分野において公知の技術、例えばレミントンズファーマシューティカルサイエンスズ(Remington's Pharmaceutical Sciences), 第18または19版、ペンシルバニア州、イーストンのマック出版社(Mack Publishing Company)に記載されているような技術を利用して容易に製造できる。該刊行物を参考文献としてここに組入れる。
【００７５】
ここで使用する用語「治療上有効な」、「脈管損傷修復量」、「脈管機能不全修復量」、または「製薬上有効な量」とは、本発明の組成物を対象に投与した後に、治療効果または有利な効果をもたらす、該組成物の量を意味する。該脈管機能不全修復、脈管損傷修復、治療または薬理効果は、疾患または疾病を治癒、最小化、予防または改善することを可能とし、または任意の他の脈管機能不全-軽減、脈管損傷-修復または薬理的に有利な効果を持つことができる。該物質の濃度は、医師の判断の範囲内で、その脈管機能不全修復、脈管損傷修復、治療または薬理効果を及ぼすが、有意な副作用を回避するのに十分に低い値となるように選択される。該組成物の有効量は、治療すべき生物学的な対象の年齢および肉体的な状態、治療期間、同時に行われている治療の特性、注入のタイミング、使用する特定の化合物、組成物または他の活性成分、使用した特定の担体等のファクタに応じて変えることができる。
【００７６】
当業者は、本発明の組成物の有効量を、以下において「単位用量」と呼ぶ、所定の大きさ(強度)の効果を引出す、投与単位(使用単位を意味する)中の用量を決定することにより、決定することができる。用語「用量-強度関係」とは、個々のレシピエントにおける効果の強さと、用量とを関係付ける方法を意味する。一般的に選定される効果の強度は、最大強度の50％である。その対応する用量は、50％有効用量または個々のED50と呼ばれる。「個々の」なる用語の使用は、ここで使用する効果の強度に基く該ED50と、ある集団の応答データの頻度に基いて決定され、同様にED50と略記される、50％有効量とを区別する。ここで使用する「効力」なる用語は、所定の応答を達成するための、本発明の組成物の特性を意味し、また用語「最大効力」とは、達成し得る最大の効果を意味する。特定の疾患または状態の治療において効果的な、本発明の薬理組成物中の、該化学走性造血幹細胞生成物の量は、該疾患または状態の特性に依存し、また標準的な臨床的技術により決定できる。(これについては、例えばGoodmanおよびGilman's, 治療学の薬理学的基礎(THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS), Joel G. Harman, Lee E. Limbird編; マグローヒル(McGraw Hill), N.Y., 2001; 医師の机上の資料(THE PHYSICIAN'S DESK REFERENCE), メジカルエコノミックカンパニー社(Medical Economics Company, Inc.), オラデル(Oradell), N.J.州, 1995; および薬物の事実と比較(DRUG FACTS AND COMPARISONS), ファクツ＆コンパリスンス社(FACTS AND COMPARISONS, INC.), セントルイス(St. Louis), Mo.州, 1993を参照せよ)。本発明の処方物において使用すべき正確な用量は、また投与経路、および該疾患または疾病の重篤度に依存し、また開業医の判断および各対象の状況に従って決定すべきである。対象は、本発明の薬理組成物の多重投与からの利益を得ることができることをも、意図している。
【００７７】
本発明の薬理組成物は、医師の裁量で、腸管外投与のために、単位用量当たり、CXCR-4媒介化学走性活性を持つ、少なくとも0.5×106個のCD34+細胞の亜集団を含む、最小数のCD34+造血幹細胞を含んでいる。
【００７８】
本発明のもう一つの局面によれば、本発明の薬理組成物は、更に本発明の該単離された化学走性造血幹細胞生成物によって与えられる効果に加えて、別の薬理的効果を持つ組成物を与えることを目的とする、1またはそれ以上の相溶性の活性成分を含むことができる。ここで使用する用語「相溶性」とは、このような組成物の活性成分が、通常の使用条件下で、各活性成分または該組成物の効力を実質的に減じるような相互作用がないような方法で、該成分相互と組合わせることができることを意味する。幾つかの態様において、該組合せ療法は、対象に、必要に応じて、本発明の化学走性造血幹細胞生成物と、アンギオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤、β-遮断剤、利尿剤、抗-不整脈薬、抗-狭心症薬、血管作動薬または変力剤、抗-凝血薬、フィブリン溶解剤、および高コレステロール血症薬からなる群から選択される薬剤とを組合せとして含有する、薬理組成物を投与することを含む。
【００７９】
幾つかの態様において、本発明の組成物は、更に約0.5〜約5％なる範囲のアルブミンを含む。幾つかの態様において、アルブミンの最小量は、該組成物の体積100mL当たりのmLとして表して、約0.5％、約0.75％、約01.0％、約1.25％、約1.5％、約1.75％、約2.0％、約2.5％、約2.75％、約3.0％、約3.5％、約4.0％、約4.5％、または約5.0％である。幾つかの態様において、本発明の組成物におけるアルブミンの最大量は、該組成物の体積100mL当たりのmL数で表して、約5.0％、約4.75％、約4.5％、約4.25％、約4.0％、約3.75％、約3.5％、約3.25％、約3.0％、約2.75％、約2.5％、約2.25％、約2.0％、約1.75％、約1.5％、約1.25％、または約1.0％である。幾つかの態様において、該アルブミンは、ヒトアルブミンである。幾つかの態様において、該アルブミンは、組換えヒトアルブミンである。
【００８０】
本発明の方法：
もう一つの局面において、本発明は、治療を要する対象を治療するための、化学走性造血幹細胞生成物を含有する、薬理組成物の製造方法を提供する。この方法は、以下に列挙する諸工程を含む：
【００８１】
(1) 無菌条件下で、該対象から、能力CD34+細胞の高密度集団を含む製剤を、化学走性細胞取得工程によって取得する工程；
【００８２】
(2) 該製剤から、化学走性活性を持つ能力細胞の亜集団を含有する、能力CD34+細胞を無菌的に精製する工程；
【００８３】
(3) 該精製した能力CD34+細胞を、無菌的に処方して、該化学走性を呈する造血幹細胞生成物を生成する工程；
【００８４】
(4) 化学走性活性を持つ能力CD34+細胞の亜集団を含む、該化学走性を呈する該造血幹細胞生成物を、無菌的に処方して、薬理組成物を製造する工程；
【００８５】
(5) 該薬理組成物の無菌性を評価する工程；
【００８６】
(6) 該対象に注入するのに適したものとして、該無菌薬理組成物を放出する工程；
【００８７】
(7) 該薬理組成物の治療上有効な量を、脈管内放出装置に装填する工程；および
【００８８】
(8) 該化学走性の造血幹細胞生成物を含有する、該治療上有効な量の該無菌薬理組成物を含む該放出装置を、該対象に注入するための、心臓カテーテル処置設備に、場合により輸送する工程。
【００８９】
一態様においては、該工程(2)を、該取得工程(1)の完了後、約12時間〜約24時間なる範囲の期間内に開始する。もう一つの態様においては、該放出工程(7)を、該無菌処方された細胞生成物が、該取得工程(1)の完了後、約48〜約72時間なる範囲の期間内に、該対象内に注入されることになる場合においてのみ行う。別の態様では、該工程(2)を、該取得工程(1)の完了後、約12時間〜約24時間なる範囲の期間内に開始し、かつ該放出工程(6)を、該無菌処方された細胞生成物が、該取得工程(1)の完了後、約48〜約72時間なる範囲の期間内に、該対象内に注入されることになる場合においてのみ行う。
【００９０】
一態様において、該工程(5)、即ち該薬理組成物の無菌性を評価する工程は、更に以下の諸工程を含む：(i) 能力CD34+細胞を含む、該化学走性造血幹細胞生成物を遠心分離処理して、細胞ペレットおよび上澄を生成する工程、ここで該細胞ペレットは、該能力CD34+細胞を含む；(ii) 該細胞ペレットを乱すことなしに、該上澄を取出す工程；および(iii) 該上澄が、微生物によって汚染されているか否かを分析し、これにより該細胞ペレットの無菌性を決定する工程。
【００９１】
一態様の、該工程(a)において、該化学走性細胞の取得工程は、無菌条件下にある該対象の骨髄から、能力CD34+細胞の高密度集団を含む製剤を取得するのに利用する、微細-骨髄収穫技術である。該微細-骨髄収穫技術に関連して、この方法の該工程(a)は、更に以下の諸工程を含む：(i) 該対象から骨髄を収穫するのに先立って、収穫用シリンジに、予めヘパリンを装入する工程；(ii) 該対象の左後部腸骨稜および右後部腸骨稜から、該収穫用シリンジおよび微細-骨髄収穫技術を利用して、該骨髄を吸入する工程；および(iii) 該収穫した骨髄を、収集バッグに注入する工程。一態様において、該工程(i)における該収穫用シリンジおよび該工程(iii)における該収集バッグは、0.9％の標準の塩水を含み、保存剤を含まない、ヘパリン処理された溶液を含む。該ヘパリン処理された溶液中のヘパリンの最終濃度は、約20単位/mL〜約25単位/mLなる範囲にある。
【００９２】
場合により、この方法の一態様において、該収穫した骨髄は、該骨髄を収穫した設備とは異なる処理設備に輸送される。一態様において、該収穫した骨髄を該処理設備に輸送する方法は、更に以下の諸工程をも含む：(a) 該収穫した骨髄を、収集バッグに収容する工程；(b) 該収集バッグを、第二のバッグに収容する工程；(c) 該収集バッグを含む該第二のバッグを、凍結し、湿った氷および少なくとも一つの気泡ラップシートを含む、内部区画室を含む輸送用容器に収容する工程；(d) 該輸送容器の該内部区画室に、温度タグモニタを取付ける工程；(e) 該搬送容器を封止する工程；および(f) 該搬送容器を該処理設備に搬送する工程。
【００９３】
もう一つの局面において、本発明は、治療を要する対象内の、脈管機能不全による損傷を治療する方法を提供するものであり、該方法は、(a) 該対象が、本発明の薬理組成物で治療するのに適格であるか否かを評価する工程；(b) 化学走性の造血幹細胞生成物を含む、該薬理組成物を製造する工程；(c) 脈管内放出装置に、該薬理組成物を装填する工程；(d) 治療上有効な量の該薬理組成物を、該対象に脈管内経路(血管の内側を意味する)で放出する工程；および(e) 該対象の心臓機能を追跡する工程を含む。
【００９４】
本発明の一態様において、該治療を要する該対象は、血管再生の施された、心筋梗塞患者である。この態様において使用する用語「血管再生(の施された)」とは、ステントを首尾よく設置することを意味する。例えば、非-実験室的なテストを用いた、冠動脈機能不全の臨床的評価、心臓カテーテル挿入、炎症性サイトカインの測定、および心臓バイオマーカーの測定は、本発明の方法に従って該薬理組成物を投与するための適切な時間を決定するために利用することができる。幾つかの態様において、ピーク炎症性サイトカインカスケード生産の検出は、該投与を、該特定の対象に対して最も決定的な、適量で調製することを可能とする。幾つかの態様において、ピーク炎症性サイトカインカスケード生産は、血漿および/または尿中の該適当なサイトカインの濃度を測定することによって、決定される。他の態様では、該適当なサイトカインの濃度は、免疫化学的に、例えばサンドイッチ酵素イムノアッセイ、酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA)または多重ビードキット技術によって測定される。
【００９５】
一態様によれば、該組成物は、炎症性サイトカインカスケードの生産が、ピークに達した後に、該対象に投与される。幾つかの態様において、該組成物は、血管再生の施された、心筋梗塞患者に、梗塞発症後約5〜約14日目に投与される。該血管再生の施された、心筋梗塞患者に、該組成物を投与するための最小期間は、約5、6、7、8、9、10、11、12、13、または14日目である。該組成物を投与するための最長期間は、約14、12、11、10、9、8、7、6、または5日目である。
【００９６】
必要に応じて対象に、本発明の薬理組成物を放出するのに使用する、該脈管内放出装置は、注入シリンジ、洗浄シリンジ、四方型ストップコック、およびバルーンカテーテルを含む。一態様において、該脈管内放出装置は、(a) 無菌四方型ストップコックに取付けられた注入デバイス、ここで該注入デバイスは、本発明の化学走性造血幹細胞生成物を含有する、該薬理組成物を含み；(b) 該無菌四方型ストップコックに取付けられた洗浄デバイス、ここで該洗浄デバイスは、洗浄溶液を含有する；および(c) 該無菌四方型ストップコックによって、該放出装置に取付けられたカテーテルを含む。一態様によれば、該放出装置は、任意の適当な材料で作られたシリンジである。適当な四方型ストップコックの本体およびハンドルは、同一のまたは異なる材料で作ることができる。適当な四方型ストップコックは、限定されるものではないが、ポリカーボネート製本体/ポリカーボネート製ハンドルを有するストップコック、ポリエチレン製本体/ポリエチレン製ハンドル有するストップコック、ポリカーボネート製本体/ポリエチレン製ハンドル有するストップコック、または使捨て可能なストップコックを包含する。もう一つの態様において、あるデバイスが、更に該放出される溶液に及ぼされる圧力を調節するために、該ストップコックに取付けられる。幾つかの態様において、一体化洗浄デバイスまたはシリンジが、該ストップコックに取付けられる。一態様において、該カテーテルは、バルーンカテーテルである。該用語「バルーンカテーテル」とは、先端部に膨張性の「バルーン」を有する、「軟質」の薄い可撓性チューブを意味し、該バルーンは、身体内の狭窄した開口または通路を拡大するための、カテーテル挿入処置中に使用される。該減圧状態にあるバルーンカテーテルが、必要な処置を施すために配置され、膨張され、取り出すために再度減圧される。
【００９７】
能力CD34+細胞を含む、本発明の化学走性造血幹細胞生成物の生存能力および可能な効能は、該細胞がカテーテルを通過する際に、その能力を維持している該細胞に依存する。本発明の方法において使用する該カテーテルは、少なくとも0.36mmなる内径を持つ。少なくとも0.36mmなる内径を持つ任意の型のカテーテルが、本発明の薬理組成物を放出するのに効果的であり得る。
【００９８】
例えば、冠状動脈の脈管構造を通る血液の流出を遅らせる、流量調節カテーテルは、所定の時期に、血管壁を介して、組織に該細胞を送ることを可能とする。
【００９９】
幾つかの態様において、該カテーテルは、バルーンカテーテルである。例えば、限定されるものではないが、約0.36mmなる内径を持つ、コルディス、ボストンサイエンティフィック、メドトロニックおよびギダント(Cordis, Boston Scientific, Medtronic and Guidant)から入手できる、以下のバルーン膨張式カテーテルは、有効であると認められている(表1参照)。
【０１００】
【表１】
2009514950.tif 000003
【０１０１】
更に、該バルーンに隣接して、流体放出口を持つものとして記載されており、そのため該バルーンは、血管壁に抗して膨張して、該放出口から、該バルーンと対向する血流力学作用から、該放出サイトを分離することができる。該放出口は、該バルーンから遠位に位置していても良い。更に、バルーンカテーテルは、このカテーテルと近接して配置された、側部開口内で終端する内腔を持つものとして記載されており、これらのバルーンカテーテルは、一般に「バルーン/放出」カテーテルと呼ぶことができるが、詳細については、様々なデスクリプタ(descriptor)を参照することができる。例えば、Formanに付与された米国特許第5,415,636号を参照のこと。この特許を参考文献としてここに組入れる。
【０１０２】
幾つかの態様において、脈管傷害を治療または修復する本発明の方法は、本発明の組成物を、バルーンカテーテル挿入を通して、梗塞のある動脈に投与することを含む。幾つかの態様において、血管形成後の、放出用バルーンカテーテルは、大腿部動脈、例えば左後方下行冠状動脈に挿入される。幾つかの医学的状態は、治療を容易にするためには、バルーンカテーテルおよび流体放出カテーテル両者を必要とする。
【０１０３】
幾つかの態様においては、カテーテルを用いて、細胞を直接該心筋に注入する。
【０１０４】
ある範囲の値が与えられる場合、その間にある値各々は、特に述べない限り、該範囲の上限と下限との間の、該下限の1/10まで、および任意の他の記載されたまたは該記載された範囲内の値は、本発明の範囲内に入る。夫々独立に、より狭い範囲内に含めることができる、より狭い範囲の上限および下限も、本発明の範囲内に入るが、該述べられた範囲のあらゆる特別に排除された範囲の制限を受ける。該述べられた範囲が、該限界の一方または両者を含む場合、これら限界両者の何れかを排除している範囲も、本発明に含まれる。
【０１０５】
特に述べない限り、ここで使用するあらゆる技術的並びに科学的な用語は、本発明の属する当分野における当業者により、通常理解されているものと同一の意味を持つ。ここに記載するものと同様なまたは等価なあらゆる方法並びに材料は、本発明の実施またはテストにおいても使用できるが、好ましい方法並びに材料は、ここに記載されている。ここにおいて述べた全ての刊行物は、引用された該刊行物と関連する、該方法並びに材料を開示し、かつ説明するための参考としてここに組入れる。
【０１０６】
本明細書および添付した特許請求の範囲において使用される、単数形「a」、「an」および「the」は、特に述べない限り、複数の態様をも包含する。ここで使用するあらゆる技術的並びに科学的な用語は、同一の意味を持つ。
【０１０７】
ここで論じた刊行物は、本特許出願の出願日前の、該開示事項のみを与えている。本発明が、従来の発明によって、このような公開に先行する資格がないことを承認するものと解釈すべきではない。更に、与えられた公開日は、実際の公開日と異なっている可能性があり、該公開日は、個々に確認する必要があり得る。
【実施例】
【０１０８】
以下の実施例は、当業者に対して、本発明を築き上げ、また利用する方法の、完全な開示および説明を与えるために提示され、また本発明者らが考えているその発明の範囲を限定するものではなく、また以下の実施例が、実施した全てまたは唯一の実施した実験のみを提示しているものでもない。使用した数値(例えば、量、温度等)に関する精度を確認する努力を払ったが、幾分かの実験誤差およびずれを考慮すべきである。特に述べない限り、部とは、質量部であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は℃単位で表されており、また圧力は大気圧またはその近傍である。
【０１０９】
実施例1：適格な対象の選別
【０１１０】
心筋梗塞であると思われる症状および臨床上の所見を持つ対象/患者は、画一的なガイドラインに従って、緊急の診断および臨床的管理の下に置かれるであろう。経壁(壁を貫通することを意味する)心筋梗塞が確認された場合には、最初の症状の発生時点および首尾よくステントを設置した時期を記録する。血管再生処置が施された対象は、適当な医学的管理の下に置かれて、画一的なガイドラインに従って、心室壁の応力を減じる。この態様において使用する用語「血管再生(処置が施)された」とは、首尾よくステントを設置したことを意味する。薬物-溶出式ステント(例えば、パクリタクセルまたはシロリムス(sirolimus))を含むあらゆる型のステントが、梗塞関連動脈(IRA)の血管再生において使用するために許容される。細胞生成物を注入するために、バルーンカテーテルを用いた以前の研究は、該ステント設置のための標準の血管径に関する限界を報告していない。本研究は、該細胞生成物を該IRA循環系に分布させるように設計されているので、また損傷の可能性を、極めて小さな血管に制限する試みにおいて、本発明は、ステントを、本発明の該化学走性造血幹細胞生成物の注入に先立って、設置することを必要とする。
【０１１１】
ステント-関連薬物作用は、主として該ステントと該血管壁との接触部位において起る。バルーン膨張の結果、細胞注入中は、該ステントを横切る血流が制限され、結果として、該化学走性の造血幹細胞生成物中のCD34+細胞に、著しく有害な薬物-媒介作用が及ぼされることはない。その上、以前の臨床的研究は、薬物-溶出式ステントの設置後96時間だけ、パクリタクセルまたはシロリムス何れかの全血中レベルが、検出限界以下となる。従って、CXCR-4媒介化学走性活性を持つ注入されたCD34+細胞を移動させようとする、該心筋の部位における組織内レベルは、重要なものではないと予想される。これについては、Sousa, J.等, Circulation, 2003, 107:2274-79; 2383-89を参照のこと。
【０１１２】
血管再生中に、対象の心臓機能および灌流を、標準的な方法で評価する。心筋梗塞に伴う心臓機能の関連する測定値は、全体的および局所的噴出率、心室体積、静止および圧迫灌流、部分的な(segmented)壁の運動および梗塞のサイズの評価を含む。
【０１１３】
心臓エコー検査法、放射性核種走査法(例えば、マルチプルゲートアキジション(Multiple Gated Acquisition; MUGA)走査法、該心室、心房のポンプ機能、および心臓がどのように収縮するかを評価する核走査法)および左心室造影法は、全て容易に利用でき、また左心室の噴出率(LVEF)の正確な尺度である。心臓エコー検査法は、バイプレーンエアレアレングス(biplane area length)法を利用して、心臓の収縮終期および拡張終期体積を測定するのに利用されている。該左心室壁の運動の評点インデックス(WMSI)は、該左心室をセグメントに分割し、次いで心房壁の運動を等級付けし、以下のような半-定量的な評点インデックスにより厚くすることにより算出される：1=正常または運動亢進；2=運動低下；3=無運動；および4=運動異常。ここで使用する用語「運動亢進」とは、過度の運動または筋肉の活性を意味し；用語「運動低下」とは、低下したまたは緩慢な運動または筋肉の活性を意味し；用語「無運動」とは、運動または筋肉活性の欠如または喪失を意味し；用語「運動異常」とは、異常な運動または筋肉活性を意味する。次いで、WMSIは、該セグメント評点の和を、評価されたセグメント数で割ることにより得られる。Schiller, N.B.等, J. Am. Soc'y Echocardiogr., 1989, 2: 358-67を参照。より新しい心臓エコー検査の様相は、局所的な噴出率、心筋灌流、および圧迫後壁異常性の評価を可能とする。
【０１１４】
梗塞後の期間における心臓機能の他の尺度は、心拍血液量インデックスおよび周囲繊維の縮まりの評価を包含する。Strauer等, Circulation, 2002, 106: 1913-18参照。梗塞を起こした心筋の修復に関する評価は、またタリウムシンチグラフィーを利用した、梗塞部周囲領域の灌流の評価を含む。同上文献参照。極最近では、磁気共鳴撮像法(MRI)は、このような背景における心臓機能および生存性(梗塞のサイズ)を評価するための、最も有用な道具であると思われる。Yin, A.等, Blood, 1997, 90: 5002-5012を参照のこと。
【０１１５】
首尾よくステント設定した翌日、対象は、研究に対する適正が評価され、適当な場合には、本研究に参加するように、インフォームドコンセントが提案されるであろう。首尾よいステント設定前、三日間程度の間症状を示す対象を、退院前に、研究に対する適正を評価する。適正基準を満たすことが分かった対象(以下を参照)には、参加すべく、インフォームドコンセントを提案するであろう。同意した対象は、ステント設定後96時間経過したら直ぐに、心臓エコー検査法による研究に入る。対象は、該LVEFが心臓エコー検査において50以下であり、また部分心室壁の異常性が、該IRAにおいて観察された場合には、この研究を進めるのに適している。適正のある対象は、ベースライン心臓機能および灌流評価を即座に完了できる。
【０１１６】
具体的には、ベースライン心臓機能は、噴出率、収縮終期および拡張終期体積、および壁の運動評点インデックスおよび生存能力を評価するための、静止中および低用量のドブタミンを投与した際の経胸腔心臓エコー検査を含む。心筋造影剤心臓エコー検査法は、組織レベルにおける心筋の血流およびセグメント壁の運動を評価するのに利用される。心筋の歪の割合も評価される。灌流は、静止期および静脈内アデノシン注入後の、日常的なTc-99mセスタミビ(Sestamibi)放射性核種走査法を利用して、評価される。局部的および全体的な壁の運動、梗塞のサイズ、および左心室(LV)体積は、MRIを利用して測定される。対象は、走査中に、ガドリニウム造影剤の接種を受ける。MRI走査では、呼吸維持技術を利用する。全体的および局部的なLV機能を得るための、定常状態回転(precession)撮像は、ガドリニウム撮像と同様に行われる。左心室の収縮終期および拡張終期体積、LVEF、LV拡張終期寸法、該梗塞のある領域の収縮終期および拡張終期における壁厚、および梗塞のサイズは、経壁程度の梗塞を持つ、AHA/AVV 17-セグメントモデルを用いて、<25％、26-50％、51-75％および>76％であると報告される。コアレビュー研究室は、このコホート研究に関してブラインド状態にある判断者と共に、MRIを評価する。
【０１１７】
この研究のための選別のために、対象は、以下の臨床的な基準を全て満たす必要がある(包括基準)：
・年齢：18-75歳；
・ACC/AHA基準を満たす急性ST上昇心筋梗塞、承諾の3日以内に、胸部痛を含む症状を持つ。基準は(ST上昇：四肢誘導において>1mm；または2またはそれ以上の胸部誘導およびトロポニン、クレアチニンキナーゼMB(CPK MB)またはこれら両者の高いレベルにおいて、2mm), N.Y.ハートアソシエーション(N.Y. Heart Association: NYHA)損増疾患群I、IIまたはIII；
・経皮冠動脈介入(PCI)に対する適正；
・MRIに対する適正；
・シングルフォトン(Proton)ECT(SPECT)撮像に対する適正；
・承認された心臓エコー検査の検討後の、十分な心臓パラメータの評価能力に関する、心臓エコー検査研究所の結論；
・研究開始時点の心臓エコー検査図(ステント接地後、96-144時間{即ち、約4-約6日})、LVEF：心臓エコー検査において50％以下、および再灌流後の心臓エコー検査法による、IRA循環における部分的心室壁の異常性；
・対象は、書面によるインフォームドコンセントを与えることができなければならず、また全ての要求された研究の追跡評価に参加する意思のあるものである必要がある；
・対象は、ヘモグロビン含有率(Hgb)>10g/dL、白血球数(WBC)>3500細胞/mm3、血小板数>100,000細胞/mm3、および骨髄の採集前日の国際規格比(INR；血液凝集テスト)<2.0を持つ必要がある；
・対象は、骨髄の採集後7日以内に、血清クレアチニン<2.5；全ビリルビン<2.0を持つ必要がある；
・1箇所を越える血管に疾患が存在する場合に、IRAおよびターゲットの病巣が明確に同定できる必要がある；
・心筋梗塞における血栓溶解(TIMI)と共に、上首尾の再灌流および冠動脈ステント設置、2または3回の流出および再血管形成後<20％狭窄を持つIRA；
・対象は、知覚鎮静処置、微細骨髄収穫、および化学走性の造血幹細胞生成物注入用の第二のカテーテル挿入処置を受けるのに適格である必要がある；
・使用したステントの型、および挿入した時期および日付を記録する必要がある；
・薬物溶出式ステントを、パクリタクセルまたはシロリムス型に限定すべきである；
・参加対象は、少なくとも1年以上の生存性が予想されなければならず、また再灌流後に多数の血管疾患を持つべきではなく、あるいは研究開始後6ヶ月以内に介入を必要とすることが予想されるものである必要がある；
【０１１８】
以下の基準の何れか一つを満たした対象は、本研究にとって適格がなく、また本研究から排除される(排除基準)；
・経皮介入、知覚鎮静処置、MRI、SPECT撮像または微細骨髄収穫に関して候補者でない対象；
・再血管形成前の4日またはそれ以上前に、ニトレートによって軽減できない持続性の胸部痛を経験したもの；
・該梗塞関連冠動脈の再灌流に、または首尾よいステント設置に失敗した対象；
・承認心臓エコー検査の検討後、研究が、心臓パラメータを評価するのに不十分であるとの、心臓エコー検査研究所の結論；
・心臓性ショックを呈する対象(昇圧薬投与または大動脈内カウンターパルセーションの際の収縮期圧<80)；
・>2mmのターゲット病巣の側枝および再血管形成後の開口狭窄>50％径狭窄を持つ対象；
・アスピリン、クロピドグレルまたはチクロピジンを許容できない対象；
・ワルファリン投与を受けた対象は、2以下のINRを持つ必要があり、ここで用語「INR」とは、INR国際規格比を意味し、これは世界保健機構(WHO)および血液凝集(凝固)テストの結果を報告するための、インターナショナルコミッティーオンスロンボシス＆ヘモスタシス(International Committee on Thrombosis and Hemostasis)によって確立されたシステムである；
・重度の大動脈狭窄を持つ対象；
・重度の免疫不全症状態(例えば、AIDS)にある対象；
・活発な医学的管理を要する、肝硬変に罹っている対象；
・活発な治療を要する悪性疾患に罹っている対象(基底細胞皮膚癌を除く)；
・証明書類のある進行中の、アルコールおよび/またはその他の物質の乱用性が見られる対象；
・該微細骨髄収穫の7日以内に、妊娠テストが負であっても、子供を身籠っている可能性のある女性；
・研究開始時の心臓エコー検査で、50％を越える噴出部分のある対象(ステント設置後96-144時間)；
・インデックス手順後の計画された抗-血小板療法の、3ヶ月未満の対象；
・再血管形成後多重血管疾患を持ち、その後の、6ヶ月間に及ぶ、計画された介入を要する対象； 
・継続中の検討実験に参加している対象；
・全身的な抗生物質の投与を要する、活発な細菌感染症に罹っている対象。
【０１１９】
心臓機能および心臓灌流のベースライン評価は、計画された微細-骨髄収穫および該化学走性造血幹細胞生成物注入の、1日前に得られるであろう(以下の文献参照)。微細-骨髄収穫(MMH)は、心臓機能および心臓灌流のベースライン評価の翌日に行われるであろう。
【０１２０】
実施例2：心臓カテーテル挿入処置
無菌処置およびドレーピング
検査者が、インフォームドコンセントを受けた後に、該対象は、心臓カテーテル挿入研究室に送られる。該対象は、該心臓カテーテル挿入研究室において、無菌処置およびドレーピング処置を受ける。
【０１２１】
心臓カテーテル挿入処置
左右のソケイ部を用いて、標準的な技術によって血管アクセスを達成する。鞘を、大動脈または左右の上腕動脈内に配置する。冠動脈造影実験を、左右両冠動脈の標準的な投影図を得ることにより行う。多数の投影図を入手して、以前にステント設置した梗塞関連動脈を同定する。全対象は、通常の実務に従って、該カテーテル挿入中に、標準的な薬物治療を受ける。
【０１２２】
実施例3：引続きCD34+細胞で富化することのできる、化学走性造血幹細胞生成物を獲得するための、獲得工程
能力CD34+細胞を含む、該化学走性造血幹細胞生成物を獲得するのに適した、任意の獲得方法は、本発明の範囲内にあるが、以下の実施例は、ここにおいて微細-骨髄収穫技術と称する、このような方法の一つを例示する。
【０１２３】
収穫用シリンジの調製
骨髄収穫に先立って、約2mlの保存剤を含まない、ヘパリン処理した塩溶液(約100単位/mL〜約125単位/mL、APP Cat. No. 42592Bまたは等価なもの)を充填した、10mLなる容量のシリンジ40本を無菌条件下で調製する。ヘパリンは、無菌の0.9％規定塩水(「規定塩水」、ホスピラ(Hospira) Cat. No. 7983-09または等価なもの)の、二本の100-mLバッグ各々に、無菌開口を介して注入され、引続き各バッグから10mL〜12.5mLの規定塩水を取り出し、最終的なヘパリン濃度を約100単位/mL(U/mL)〜約125単位/mL(U/mL)とする。2-mL容量の、保存剤を含まない、ヘパリン溶液(約100U/mL〜約125U/mL)を、無菌条件下で、10mLなる容量のシリンジ40本各々に充填し、次いで該シリンジをキャップで封止し、収穫場所に輸送するために、無菌バッグに入れる。
【０１２４】
実施例1に記載したように、書面によるインフォームドコンセントを受けた後、対象は、骨髄収穫の準備に付される。知覚鎮静は、標準的な画一的手順およびガイドラインを用いて行う。骨髄収穫は、無菌条件下で行う。ここで用いる用語「無菌条件」とは、収穫を行う主治医および介助者が、無菌マスクおよびグローブを着用すると共に、適当に手洗いし、かつガウンを羽織ることを含む。該収穫手順は、手術室の外で、以下のようにして行うことができる：無菌処理およびドレーピング後に、各腸骨稜を、その各々に対して最小量の10mLを用いて、1％リドカイン溶液で麻酔すべきである。該麻酔領域は、計10cm程度の円形領域とすべきである。該収穫用の針は、該腸骨稜が穿刺されるまで挿入される。該キャップおよびスタイレットを取出し、2-mLの髄を、該2-mLのヘパリン溶液を含む、10-mLの収穫用シリンジ内に収穫する。該シリンジを、次に取出し、滅菌した場所に置く。該スタイレットを再度挿入した後、該収穫用の針を、僅かに前進させ、次いで90度回転させる。次いで、該スタイレットを取出し、更に2-mLの髄を、該滅菌場所から回収した該収穫用のシリンジ内に抜取る。この手順を、更に二回、該収穫用シリンジが、最終的ヘパリン濃度約20U/mL〜約25U/mLにて、全体でヘパリン処理した髄10-mLに対して8-mLの髄を含むようになるまで繰返す。最後に、該満たされた収穫シリンジを、収穫介助者に扱ってもらい、以下に記載するように、滅菌捕集バッグ内で振り混ぜ、かつその内容物を注ぎ出す。該収穫した医師は、次に予めヘパリン溶液で洗浄してある、他の収穫シリンジを取り、この工程を繰り返す。
【０１２５】
該満たされた収穫シリンジを、以下のようにして、該滅菌捕集バッグ内の全内容物を注ぎ出す。該収穫介助者は、該満たされた収穫シリンジを処理し、500-mL容量の捕集バッグに、該バッグに取付けられた無菌アダプタを介して注ぎ出して、該シリンジを空にする。次いで、該収穫用の針を、洗浄シリンジ内の該ヘパリン溶液で洗浄し、該滅菌場所に戻す。
【０１２６】
この収穫工程は、一つの腸骨稜について、約19シリンジ分が採取され、かつ該捕集バッグ内に放出されるまで繰返す。同一の工程を、他の腸骨稜について、別の約19シリンジ分が満たされるまで繰返す。両者の腸骨稜からの、全体で38本の8mL分の吸引(理想的には、各腸骨稜から19回)は、ヘパリン濃度約20U/mL〜約25U/mLにて、最終体積380mL中に、収穫した骨髄302-mLを与える。
【０１２７】
該捕集バッグを、3回該接続チューブを縛ることによって封止し、次いで該結束部の遠位において締結する。このバッグを、「ヒト骨髄捕集物」なる名称、および収集した最終体積を含む、該収穫手順の結果を、適切にラベル表示し、また任意の手順に関連する合併症を、マヨクリニカルリスクスコア(Mayo Clinical Risk Score: MCRS)症例報告書形式で記録する。この完成したラベルを、該骨髄バッグに添付する。次いで、このバッグを、滅菌搬送バッグに入れ、処置設備に送る。
【０１２８】
実施例4：搬送用の骨髄製品の調製
一態様において、該収穫した骨髄は、以下のようにして処置設備に搬送される。該臨床的部署が、該骨髄処方物を搬送すべく調製したら、24-時間の通知書を該処置設備に提出する。該処置研究室は、同日に該処置設備に配送するために、可能な限り迅速な積込み発送にて、搬送の手配を行う。該骨髄を捕集した直後に、該骨髄製品は、供給された搬送容器に収容される。該搬送容器は、凍結し、湿った氷の小さな2つのブロックおよび該湿った氷の上部の気泡ラップ(bubble wrap)を含む。該骨髄製品は、第二のバッグ内に収納され、該第二のバッグは、該気泡ラップ上に置かれる。温度タグモニタ(内部温度を監視するのに使用されるセンサ)を、該ボックスの内側に添付する。次に、もう一つの気泡ラップを、該搬送容器を封止する前に、該製品上に配置する。
【０１２９】
実施例5：収穫した骨髄製品からのCD34+細胞の選別
CD34+細胞を、該収穫した骨髄製品から単離する。一態様において、CD34+細胞は、抗-CD34モノクローナル抗体(Mab)、ダイナビーズ(DynabeadsTM) M-450ヒツジ抗-マウスIgG、およびアイソレックス300iマグネチックセルコレクションシステム(Isolex 300i Magnetic Cell Selection System) [バクスターヘルスケア社(Baxter Healthcare Corp.) Cat. No. 4R9734]のPR34+TM幹細胞放出剤成分を用いて、米国特許第5,536,475号、同第5,035,994号、同第5,130,144号、同第4,965,204号、同第5,968,753号、同第6,017,719号、同第6,251,295号、同第5,980,887号、同第6,676,937号、米国特許出願第2003/0232050号および該アイソレックス300iパッケージインサートに記載のようにして、単離される。これら文献を、参考としてここに組入れる。この作業システムは、本発明に従って、骨髄からCD34+細胞を単離するのに適している。
【０１３０】
該処置研究室に到着した際に、該収穫した骨髄製品(該捕集バッグ内の)は、即座に検査され、また該バッグは、あらゆる漏れについてチェックされる。この収集物は、見かけ上塊を含まない自由流動性のものであり、また溶血されていてはならない。該収集物は、該バッグの完全性が、如何様にも破損している場合には、使用されることはない。
【０１３１】
該骨髄製品は、検査後約12時間乃至約24時間以内に処理すべきである。300-mLまたは400-mL容量の搬送パック容器が得られ、血漿搬送セットが、該容器のサンプリング口に取付けられる。該骨髄製品は、該捕集バッグから該搬送パック容器に移される。プールした該骨髄捕集製品を、該容器を20回に渡り上下反転することによって、十分に混合する。
【０１３２】
次いで、該プールした該骨髄捕集製品を、分析のためにサンプリングする。一態様においては、全体積2.0mLの該製品を、取り出し、以下のようにアリコートに分割する：血液学的分析装置を用いて、二回の全血球数計算値(CBC)を求めるために、0.3mLを使用し；グラムステイン(Gram Stain) (グラムステインキット(Gram Stain Kit), VWR, Cat. No. BB231401)によってグラム陽性およびグラム陰性バクテリアを検出するための、75×100-mmのガラスチューブに、0.2-mLを分配し；無菌性の確認として、好気性バクテリア生育アッセイのために、トリプチックソイブロス(Tryptic Soy Broth (TSB)) (VWR, Cat. No.29446-184)ボトルに、0.6-mLを分配し；嫌気性バクテリア生育アッセイのために、フルードチオグリコレートメディア(Fluid Thioglycollate Media (FTM)) (VWR Cat. #29446-138)ボトルに、0.6-mLを分配し；またCD34+細胞の計数および細胞生存能力に関する流動分析で、0.3mLを使用する。
【０１３３】
該収集物を、電子天秤で計量し、該捕集バッグの適切な風袋の重量を記録する。該骨髄製品の体積対、該製品の重量の関係を、以下の関係式で表すことができる：
体積(mL)=[製品の重量(g) - バッグ風袋の重量(g)]÷1.06(g・mL) (式1)
【０１３４】
該骨髄製品中の全有核細胞数(TNC)を、以下の関係式に従って上記CBCから得た、白血球数(WBC)を用いて計算する：
TNC=WBC/μL×1000×[製品の体積(mL)]    (式2)
【０１３５】
該骨髄製品中のCD34+細胞数を、以下の関係式から計算する：
該骨髄製品中の全CD34+細胞=CD34+細胞数/μL×1,000×[製品の体積(mL)]   (式3)
【０１３６】
該骨髄捕集製品の赤血球(RBC)体積を、以下の関係式から計算する：
RBC体積(mL)=[製品の体積(mL)]×ヘマトクリット(％)/100     (式4)
【０１３７】
該捕集物が、20mLを越えるRBCを含む場合、赤血球を枯渇させる必要がある。RBCは、遠心分離により枯渇させる。周囲温度にて、1000xgにおける20分間の遠心分離処理を行って、該RBCから軟膜を分離する。該用語「軟膜」とは、白血球の殆どを含有する血液サンプルの、薄い灰白色の画分を意味する。遠心分離処理直後に、容量60mLのシリンジを、該遠心分離処理バッグの底部に取付け、該RBCを取り出す。2以上のシリンジが、該濃縮RBC全てを集めるために必要となる可能性がある。次いで、このRBCの枯渇した骨髄製品を洗浄して、脂質含有物を除去する。
【０１３８】
1-mL容量のシリンジを用いて、該製品バッグに取付けた移送セットを介して0.3mLの該RBC-枯渇骨髄細胞生成物を取出し、CBCを行う。該RBC-枯渇骨髄生成物のTNCを、以下の関係から決定する：
該RBC-枯渇生成物の全TNC=RBC-枯渇生成物のWBC/μL×1000×180-mL  (式5)
【０１３９】
元の生成物の計数値の少なくとも80％でなければならない、該RBC-枯渇生成物の該TNC回収率は、以下の関係式から計算される：
TNC回収率=該RBC-枯渇生成物のTNC÷該未処理生成物のTNC×100％    (式6)
【０１４０】
全RBC体積は、上に記載したように計算され；該RBC-枯渇生成物中の該RBC体積は、<20-mL未満でなければならない。
【０１４１】
本発明の一態様においては、上記アイソレックス300iシステムを使用して、該RBC-枯渇生成物または該骨髄生成物を処理する。該生成物のRBC体積は、以下の処理段階に従って、<20-mLとなる：
(i) 該骨髄を自動的に洗浄して、血小板を除去する；
(ii) CD34ポジティブ(CD34+)細胞を、該アイソレックス300iCD34モノクローナル抗体(Mab)と共にインキュベートして、選別のために特異的に標識する；
(iii) 未結合の試薬を、バッファー溶液で、該細胞懸濁液を洗浄することによって除去する；
(iv) 感作CD34+細胞(CD34 Mabで標識されたCD34+細胞を意味する)を、ダイナビーズM-450ヒツジ抗-マウスIgGによって捕獲する；
(v) 選別カラムを用いて、望ましからぬ細胞から、捕獲したCD34+細胞を含む、磁気的に標識したダイナビーズを分離し、該ビーズを、該選別カラムを通して洗浄し、ネガティブ画分バッグに集める；および
(vi) PR34+幹細胞放出剤で、該カラムからCD34+細胞を遊離させ、該CD34+細胞を最終製品バッグに集める。このシステムでは数回の洗浄段階を行い、該液体の殆どをバッファー廃棄バッグに棄却する。
【０１４２】
該アイソレックス(R)で選別されたCD34+画分を以下のようにアッセイして、WBCおよびCD34+細胞収率を決定する。CD34ポジティブ画分の体積は、最終製品バッグ中の細胞を混合することにより決定され、該バッグを手で穏やかに揉み、均等な細胞分布を保証する。移送セットを、該最終製品バッグのサンプリング口に挿入し、60-mLのシリンジを取付ける。該細胞懸濁液を、該シリンジに取り出し(一度に、最大50-mL)、その全体積を測定する。
【０１４３】
3-mLまたは5-mLのシリンジを用いて、クオリティーコントロールテストのために、該移送セットを通して、該最終製品バッグから、2.0-mLのサンプルを取出す。該サンプルのアリコート分割体積およびこれらサンプルについて行った分析は、前に記載した通りであり、即ちCBC：0.3-mL；グラムステイン：0.3-mL；CD34+細胞数の決定および細胞の生存能力：0.2-mL。
【０１４４】
CD34ポジティブ画分の全TNCは、以下の関係式から算出する：
該ポジティブ画分の全TNC=該ポジティブ画分のWBC/μL×1000×該ポジティブ画分の体積    (式7)
【０１４５】
元の生成物の計数値の15％未満でなければならない、該ポジティブ画分のTNCの回収率は、以下の関係式から算出する：
TNCの回収率=該ポジティブ画分の全TNC÷該未処置の生成物の全TNC×100  (式8)
【０１４６】
該ポジティブ画分中の生存性CD34+細胞の総数は、以下の関係式から算出する：
該ポジティブ画分中の全CD34+細胞=該最終生成物中のCD34+細胞数/mL×1,000×最終生成物の体積(mL)    (式9)
【０１４７】
該ポジティブ画分の該CD34+細胞の回収率は、以下の関係式から算出する：
CD34+細胞の回収率=該ポジティブ画分中の全CD34+細胞÷該未処置の生成物の全CD34+細胞×100    (式10)
【０１４８】
実施例6：輸液用の選別CD34+細胞の調製
該化学走性造血幹細胞生成物のサンプルを取出して、フローサイトメトリー(CD34+細胞数の計数および生存能力につき)によってWBC細胞数、グラムステイン、および無菌性につきアッセイする。
【０１４９】
CD34+細胞は、抗-CD34および抗-CD45抗体(ベックマンコールター(Beckman Coulter)、PN IM3630)によって二重標識することにより、CD34brightおよびCD45dim蛍光発光を特色とする、フローサイトメトリー分析により特徴付けする。CD34+細胞およびCD45+細胞の生存性は、介在DNA染料7-アミノアクチノマイシンD(7AAD)を取込む、死細胞を排除することにより決定される。これについては、Brocklebank AM, Sparrow RL. Cytometry, 2001, 46:254-261；Barnett D等, Br. J. Haematol., 1999, 106:1059-1062；Sutherland等, J. Hematotherapy, 1996, 5:213226；および米国特許第4,520,110号、同第4,859,582号、同第5,055,556号；欧州特許第76.695号；カナダ特許第1,179,942号(PE, APC)；米国特許第4,876,190号(PerCP)；米国特許第5,268,486号、同第5,486,616号、同第5,569,587号、同第5,569,766号、同第5,627,027号(Cy); 米国特許第4,714,680号、同第4,965,204号、同第5,035,994号(CD34)；米国特許第5,776,709号(溶解/洗浄ナシ法)；米国特許第5,723,218号および同第5,187,288号(TruCOUNTチューブ(Tubes))を参照のこと。これら特許各々の内容全体を、参考としてここに組入れる。
【０１５０】
任意のフローサイトメトリーまたは等価な他のデバイスを、CD34+細胞数の計数および生存性につき分析を行うために利用できる。一態様において、上記処置研究室は、BD ファックスキャリバー(FACSCaliburTM)フローサイトメーターを使用しており、またBD ファックスコンプ(FACSCompTM)ソフトウエアを使用して、装置のセットアップおよび追跡を行っている。説明文におけるラベルのテンプレートおよびパネルを、獲得および分析のために予め設置する。使用前に、試薬、即ちCD45FITC/CD34PE、幹細胞-計数フルオロスフェア(Fluorospheres)、濃厚塩化アンモニウム溶解溶液、および7AAD生存性確認染料(Viability Dye)を、室温まで昇温させる。CD34+細胞のコントロールは、正のコントロールとして実験して、この装置が、CD34+細胞を分析するように設定し、結果を、製造業者が予め決定したCD34の百分率範囲と比較する。
【０１５１】
未処置の骨髄生成物およびアイソレックス処理した化学走性造血幹細胞生成物を、多くの異なる手順で分析することができる。一態様、または実施例において、該サンプルを受取った直後に、該サンプルの該WBC細胞数が、2×107細胞/mLを越える場合には、該サンプルを、鞘液(Sheath fluid)で希釈し、約2×107WBC/mLなる細胞数を達成する。該希釈生成物100μLを、2つの15×100mmのチューブに等分する。マイクロピペットを用いて、20μLのCD45FITC/CD34PEおよび7-AAD生存性確認染料試薬を、各チューブに添加し、該サンプルを穏やかに撹乱させる。これらのチューブをアルミホイルで覆い、周囲温度にて15〜20分間放置する。RBCを、各チューブに1.5mLの1xの溶解溶液を添加して、溶解させ、穏やかに撹乱させる。これらのチューブを周囲温度にて10分間インキュベートし、光から保護する。該サンプルを、データの獲得が完了するまで、光から保護し、約2℃〜約8℃(即ち、氷浴上で)保存する。データの獲得は、該溶解バッファーの添加後、1時間以内に行う必要がある。データの獲得前に、幹細胞-計数フルオロスフェアは、転倒式回転によって(10回)再懸濁させる。100μLのフルオロスフェアを各チューブに添加し、気泡を生成しないように注意しつつ、穏やかに撹乱させる。この生成物中のCD34+細胞の絶対数は、以下の関係式から計算する：
【０１５２】
生存性のCD34+細胞数/生成物(μL)=(LCD34xFAC)/F    (式11)
ここで、LCD34は、生存CD34+/全CD45+事象の起こる平均数であり；「FAC」は、フルオロスフェアのアッセイに用いた濃度であり；またFは、計数したフルオロスフェアシングレットの平均数である。
【０１５３】
CD34+ポジティブ画分の体積は、所要の容量に必要なCD34+細胞数を得るために計算される。必要なポジティブ画分の体積(mL)は、以下のように定義される：
【０１５４】
(必要なCD34+細胞の容量)÷(該ポジティブ画分中の1μL当たりの全CD34+細胞)×1,000)    (式12)
【０１５５】
細胞の適当な数を、50mLの適当な三角チューブに分取し、500xgにて10分間遠心分離処理する。得られる上澄を、30mLの血清学的ピペットを用いて取出し、廃液として棄却し、一方でこの工程中に、該チューブ底部の細胞ペレットを分取しないように注意する。注入溶液(20mL)を、CD34+細胞ポジティブ画分を含むチューブに添加し、該細胞を、反復的にピペット処理することにより、10mLの血清学的ピペットを用いて分散させる。再懸濁した細胞を、500xgにて10分間遠心分離処理する。30mLの血清学的ピペットを用いて(該細胞ペレットを乱すことなしに)、該上澄/注入溶液を、添付された「ポジティブ画分上澄」なるラベルを持つ、容量50mLの三角チューブに移す。該上澄を含むチューブを撹乱させて、該溶液を均一にする。10mLの血清学的ピペットを使用して、10mLの該均質化した上澄を、該CD34+細胞ポジティブ画分チューブに戻す。該上澄チューブに残された10mLの懸濁液を、無菌性テストのために使用する(各5mLをTSB(トリプチカーゼソイブロス(Trypticase Soy Broth)ボトルおよびFTM(フルードチオグリコレート(Fluid Thioglycollate))ボトルに分取)。該CD34+細胞ポジティブ画分を徐々に取出し、10mLシリンジ(注入シリンジ)に取付けた、平滑末端を持つ針を通して吸引することによって、再懸濁させる。該細胞懸濁液を該シリンジに取り出し、あらゆる気泡を吸引除去し、また該平滑末端を持つ針を除去する。該注入シリンジを、四方ストップコックの注入口に取付ける。
【０１５６】
本発明の該化学走性造血幹細胞生成物は、このものが以下の基準を満たした場合においてのみ、注入用に放出される：
・CD34+細胞の純度が、少なくとも約70％、75％、80％、85％、90％、または95％である；
・選別されたポジティブ画分について、ネガティブなグラム染色結果が得られている；
・内毒素レベル：約0.5内毒素単位/mL未満；
・該「化学走性造血幹細胞生成物」の生存CD34+細胞収率が、治療コホートに関して、所要の容量を満足している；
・CD34+細胞が、7-AADによる生存率が、少なくとも約70％、75％、80％、85％、90％、または95％である；
・「ポジティブ画分上澄」に関するUSP無菌性の結果：ネガティブ(14日後)；および
・骨髄CD34+細胞選別が、骨髄収穫完了の約12時間〜約24時間以内に開始された。
【０１５７】
グラム染色および内毒素を含む無菌性の評価は、注入の目的で放出される前に行われる。USP無菌性(バクテリアおよび真菌)培養を行い、その結果を主任研究者に報告させる。ポジティブなUSP無菌性に関する結果においては、その対象および待機する主治医は、即座に届出をし、入手可能な場合には、該微生物を同定および感度が提出され、適正な抗生物質療法の資料および治療の結果は、研究部署およびスポンサーにより記録される。
【０１５８】
これら放出基準を満たした後、該化学走性造血幹細胞生成物は、注入の目的で放出され、またカテーテル挿入処置設備に配送すべく包装される。サンプルは、インビトロテストにも送る。生成物は、CD34+細胞の選別が骨髄収穫完了の約12時間〜約24時間以内に開始された場合のみ、また骨髄収穫完了の約48時間〜約72時間以内に注入されることとなる場合においてのみ、放出される。
【０１５９】
実施例7：CD34+細胞を含む、該化学走性造血幹細胞生成物の処方
該化学走性造血幹細胞生成物は、1％のHSA(ヒトアルブミン、USP、アルファ(Alpha)、Cat. #521303)(「注入溶液」)および少なくとも10％の自己由来の血清を補充した、10-mLの塩水(0.9%塩化ナトリウム、注射用、USP、ホスピラ(Hospira)、Cat. #7983-09)中で処方する。更に、使用され、また該化学走性造血幹細胞生成物の処理中に持込まれた、該幹細胞生成物中には、幾分かの痕跡の物質(その量は測定せず)が存在する可能性がある。これらの物質は、Ca++、Mg++を含まないドゥルベコリン酸緩衝塩水(D-PBS) (バクスター(Baxter), Cat. #EDR9865)、クエン酸ナトリウム(バクスター/フェンウォール(Fenwal)、Cat. #4B7867)、ヘタスターチ(Hetastarch) (アボットラボラトリーズ(Abbott Laboratories), Cat. #0074-7248-03)、IVIg(ガンマガードイムノグロブリンイントラビーナス(GammagardTM Immune Globulin Intravenous), バクスター, Cat. #060384)および上記アイソレックス(登録商標)300i幹細胞試薬キット(バクスター, Cat. #4R9734)中に含まれる試薬、例えば抗-CD34モノクローナル抗体、幹細胞放出剤およびヒツジ抗-マウス磁性ビーズを包含する。
【０１６０】
実施例8：化学走性造血幹細胞生成物の、カテーテル挿入設備への搬送
上記放出基準を満たす、該化学走性造血幹細胞生成物は、制御された無菌環境、例えば最低でもクラス(Class) 100,000細胞処置設備内に配置された、クラス100生物学的安全性キャビネットにて、無菌の10mLシリンジに装填する。ここでは、クラス10,000が好ましいが、必須ではない。該化学走性造血幹細胞生成物は、HSAを補充した10-mL PBS中に懸濁し、この容器を、放出基準に従ってラベル表示する。4群の投与コホートがあり、各コホートは、各5名の対象からなる。第一コホートは、約5×106 CD34+細胞の投与を受け、第二コホートは、約10×106 CD34+細胞の投与を受け、第三コホートは、約20×106 CD34+細胞の投与を受け、また第四コホートは、約30×106 CD34+細胞の投与を受ける。指定されたコホート用量を満たすために、不十分なCD34+細胞量を持つコホート2-4における対象は、可能な最大のCD34+細胞用量にて、先のコホートに加えられる。装填された注入シリンジを、洗浄シリンジと共に四方ストップコックに取付け、キャップし、またこれは漏れを防止するために適用された安全ガードを備えている。該放出装置は、二重滅菌バッグ内に封入され、また該心臓カテーテル挿入設備に搬送するために、安全な輸送ボックスに入れられる。該化学走性造血幹細胞生成物の放出およびコホートの割付後、該化学走性造血幹細胞生成物を、直接的梗塞-関連動脈注入(脈管内投与)のために、該カテーテル挿入部署に搬送する。
【０１６１】
実施例9：化学走性造血幹細胞生成物の冠状動脈内注入
該化学走性造血幹細胞生成物が、注入のために放出された(上記文献参照)ことを示す、該細胞処置設備からの通知の際に、該対象/患者は、該化学走性造血幹細胞生成物の到着と一致する時点において、該カテーテル挿入設備に到着したものとされる。
【０１６２】
心臓酵素(脳ナトリウム排泄亢進性ペプチド(BNP)、トロポニンおよびCPK MB)、全血球計算値、フルケミストリーパネル(full chemistry panel；腎臓および肝臓機能テスト)およびEKGを、該化学走性の造血幹細胞生成物の注入直前に実施する。N.Y.ハートアソシエーションズ(Heart Association's; NYHA)機能分類システムに従う、心臓機能不全段階の臨床的評価を記録する。
【０１６３】
該化学走性造血幹細胞生成物の受理および注入放出のための最終的な性能確認(ファクシミリによる)の際に、該対象は、上で詳述したように、心臓カテーテル挿入処置に付される。冠動脈造影を行って、該梗塞関連動脈の開放性(開通、即ち閉塞のないことを意味する)および心筋梗塞血管造影剤流における血栓溶解(TIMI)を評価する。ワイヤ上のバルーンカテーテルを、該梗塞関連動脈のステント設置セグメントに配意する。該化学走性造血幹細胞生成物の注入と適合する、少なくとも約0.36mmなる内径を持つ、任意の適当なバルーン膨張式カテーテルを使用することができる。設置後、該バルーンのワイヤは、除去される。該化学走性造血幹細胞生成物放出装置は、該搬送用のケースから取出される。
【０１６４】
該放出装置は、無菌バッグ内にあり、また該注入シリンジ(該化学走性造血幹細胞生成物を含む)および該洗浄用シリンジに取付けられた、安全ブロックを備える。この装置は、該注入シリンジ(10mLの該化学走性造血幹細胞生成物を含む)および該洗浄用シリンジ(6mLの洗浄液を含む)からなり、ここでこれら両者は、無菌四方ストップコックに取付けられている。該放出装置全体を穏やかに振とうさせて、該注入溶液中に該CD34+細胞を再懸濁させるべきである。該洗浄用シリンジを、該装置内の全ての気泡を排除する(空気の塞栓形成を防止する)目的で使用し、また次に該装置を、該ストップコックを介して、該バルーン膨張式カテーテルに取付ける。
【０１６５】
注入による該化学走性造血幹細胞生成物の該対象への放出は、以下のようにして進められる。先ず、該ストップコックを開放して、該洗浄用シリンジ(溶液6mL)と該バルーンカテーテル中央部の内腔とを連通させ、1mLの洗浄溶液を、15秒間に渡り、該カテーテル中央部の内腔に注入すべきである。第二に、該バルーンを該ステント内で、約0.2MPa(2気圧)なる圧力にて膨張させて、該冠動脈内皮に対する損傷の発生を防止し、次いで該ストップコックバルブを調節して、該膨張させたバルーン(上記ガードを取外した後)の遠位において、該化学走性造血幹細胞生成物の注入を可能とする。該膨張させたバルーンに関連して、該注入シリンジから約3mL〜約4mLを、約30秒〜約45秒なる期間(時間を計測し、文書化する)に渡り、手作業で注入する。該バルーンを膨張状態に維持して、該CD34+細胞の付着を可能とし、また全体で約2分〜約3分間(注入時間を含む)に渡り、逆流を防止する。注入-注入期間中、該バルーンを3分間収縮状態に維持して、血流の回復(再灌流)を可能とする。3回の注入が、該注入シリンジを空にするのに必要とされるものと予想される。第三に、該化学走性造血幹細胞生成物注入の完了時および該バルーンが収縮状態にある際に、該ストップコックのバルブを調節して、該洗浄シリンジからの、該注入シリンジの装填を可能とする。最後に、該バルーンを膨張させて(約2分〜約3分間)、今や該注入用シリンジ内にある洗浄溶液4mLを、約30秒〜約45秒なる期間に渡り注入して、該シリンジおよびカテーテルからの、あらゆる残留CD34+細胞を、上記IRA循環に移す。次いで、該カテーテルを取外す。
【０１６６】
注入関連虚血(不十分な血流)の評価は、該化学走性造血幹細胞生成物注入後の、最初の24時間の間に行う。約12時間および約24時間におけるEKGおよび約24時間渡る、約8時間毎の、心臓酵素(BNP、トロポニンおよびCPK MB)の分析化学情報を得る。不整脈の評価(24時間ホルター(Holter)モニター)は、該化学走性造血幹細胞生成物注入直後に行う。全体的および局所的な左心室の機能を評価するための、通常の経胸腔心臓エコー検査を、該化学走性造血幹細胞生成物注入後、該対象の退院前に行われる。
【０１６７】
全ての対象は、デジタル式体温計および管理日誌を携行しており、該化学走性造血幹細胞生成物の注入後、30日間に渡り、毎日二回測定した体温を記録する。対象は、体温の記録が約38℃(100.5°F)を越えた際には即座に、該研究者側に報告することが指示されている。適当な培養およびX-線写真撮影による評価に基く迅速で、適切な事後処置を、通常の臨床基準に従って行う。文書により明らかにされた、バクテリア感染は、該IRBおよび該FDAに報告される。
【０１６８】
安全性評価のための追加の事後処置訪問は、生成物注入後、1週間および2週間の時点における訪問を含む。訪問評価は、総合的な医学的履歴および肉体的検査、EKG、全血球計算値、フルケミストリーパネル(腎臓および肝臓機能テスト)、および血清心臓マーカー(BNP、トロポニンおよびCPK MB)の測定を包含する。NYHA機能群の臨床的な評価は、1週間および2週間の時点で記録される。
【０１６９】
注入後1週間の時点において、日常的な経胸腔心臓エコー検査を行う。
【０１７０】
化学走性造血幹細胞生成物の注入後4週間の時点において、EKGおよび心臓酵素(BNP、トロポニンおよびCPK MB)の結果が得られる。全体的および局所的な左心室の機能を評価するための、通常の経胸腔心臓エコー検査をも実施する。24ホルターモニターを使用して、不整脈につき評価する。NYHA機能群の臨床的評価結果を記録する。症状限定ブルースプロトコル(symptom limiting Bruce protocol)を用いたトレッドミルテストをも実施する。
【０１７１】
化学走性造血幹細胞生成物注入後の約3ヶ月および約6ヶ月の時点において、24時間ホルターモニターによる測定を行う。NYHA機能群の臨床的評価結果を記録する。化学走性造血幹細胞生成物注入後の約6ヶ月の時点において、該ブルースプロトコルを用いた、症状限定トレッドミル運動テストの結果を記録する。
【０１７２】
化学走性造血幹細胞生成物注入後の約12ヶ月の時点における安全性評価は、包括的な医学的病歴および肉体的検査、EKG、全血球計算値、フルケミストリーパネル(腎臓および肝臓機能テスト)、および血清心臓マーカー(BNP、トロポニンおよびCPK MB)の測定を包含する。全体的および局所的な左心室の機能を評価するための、通常の経胸腔心臓エコー検査をも実施する。24時間ホルターモニターによる評価を行う。NYHA機能群の臨床的評価結果を記録する。
【０１７３】
統計的解析
各対象が、該対象自身のコントロールとして機能する対をなす構想を、幾つかの態様において用いる。治療前後の対象当たりの差を、該4つの数値的な心臓機能(即ち、心筋収縮性、収縮終期体積、拡張終期体積、および灌流)各々につき分析する。線形回帰分析を利用して、増大する用量レベルの有意性を評価する。零仮説は、該回帰直線の傾き(独立変数として機能する用量レベルおよび「後」および「前」間の差は、従属変数として作用する)が、ゼロに等しいというものである。誤った零仮説を排斥する冪数は、用量と心臓機能の改善との間の、0.5という高い相関に対して、有意の0.05αレベルにおいて、0.68である。該回帰直線の傾きに関する95％なる信頼区間を用いて、投与レベルにおける増大の医学的有意性を評価する。該回帰直線の傾きが、ゼロとは有意に異なっていないが、該回帰直線の切片がゼロとは異なる場合、全ての治療群は併合され、また対とされたt-テストを行って、全体的な治療の有効性を評価する。該零仮説は、該差異の平均が、ゼロであるというものである。ウイルコクソンの承認したランクテストも、追加のテストとして行って、該治療の有効性を決定する。このテストは、該観測が正規分布していない場合におけるt-テストよりも、一層強力(誤った零仮説を排斥する)である。該t-テストの冪数は、0.05なるαレベルにおいて、誤った零仮説を排斥するためには、また医学的サイズ効果(medical size effect) (肉眼で認識できるのに十分に大きな効果)を得るためには、0.79である。該治療効果のサイズの医学的な有意性は、該差異(真の差異の平均は、テストしたサンプルの95％におけるこの区間にある)の平均に関する95％なる信頼区間を計算することにより決定される。
【０１７４】
灌流における完全性を評価するために、投与レベルを該独立変数とし、また灌流における変動(1=Yes; 0=No)を該従属変数として、ロジスティック回帰を利用する。該4種の投与レベルの奇数比は、指標群として機能する、5.0×106細胞を用いて別途計算される。
【０１７５】
二項式テストを利用して、CD34+細胞投与の灌流に及ぼす有意性を評価する。ベースライン灌流走査ライン上にある場合には、灌流における欠陥に、一過性の改善は見られないものと予想される。従って、6ヶ月目に評価され、またベースラインと比較した場合には、灌流欠陥におけるあらゆる臨床的に有意な改善は、治療効果であると考えられる。
【０１７６】
適格性を満たすが、CD34+細胞の投与を受けていない同時に使用された群(未処置のコントロール)は、該治療群と同様にして評価され、また心臓機能/灌流における改善性につき評価される。各研究部署は、治療および未治療コントロールの記入(accrual)を交互に行う。コイン投げを利用して、各部署において、最初の(治療または未治療)対象の順序を決定する。治療および未治療群同士の結果の比較を行う。主研究室は、治療または未治療に関してはブラインド状態にある。
【０１７７】
ある評価を、臨床的結果と、細胞(CD34+)含有率および/またはインビトロコロニー成長(CFU-GM、CFU-GEMM、BFU-E)、CXCR-4移動度、およびCXCR-4および/またはVEGF表面抗原の発現との間に相関性があるか否かを、決定するために行う。
【０１７８】
全体で20名の対象が、本発明の該化学走性造血幹細胞生成物の投与を受ける。4群の用量コホートがある(約5×106、約10×106、約20×106、および約30×106、個のCD34+細胞)。任意の対象における該化学走性造血幹細胞生成物含有率が、指定したコホートにとって不十分である場合には、該当する対象には、前のコホートに、その可能な最大の用量で、再度割り当てる。注入に利用できる細胞が、5×106CD34+細胞以下である対象は、本研究から排斥し、反復的なカテーテル挿入を行わず、また該20-対象の研究群の一部として数えない。更に、本発明の該化学走性造血幹細胞生成物が、放出基準を満たさない場合には、該対象には、該生成物の投与を行わず、次の対象で置換すべき、研究候補として数えられることはない。任意のコホート投与群において、対象が、急性の(注入後約7日目直後を意味する)、予想外の、該細胞生成物の注入に起因する(多分)ものと思われる、毒性を経験した場合には、投与量の増大を停止し、追加の3名の対象は、この投与量レベルに記入される。他の予想外の特性が観測されない場合には、投与量の増加を継続するが、全体で20名の対象は、超過しない。別の毒性がその用量レベルにおいて発生する場合には、全てのその後の対象は、次のより低用量レベルに記入される。
【０１７９】
本発明の該化学走性造血幹細胞生成物は、前の投与量コホート由来の全対象が、該生成物の投与後2週間の、追跡調査の評価を完了するまで、より高い用量のコホートにおける如何なる対象にも投与されない。
【０１８０】
実施例10：予備的研究の実験結果
以下のような目標を達成する試みにおいて、一連の予備的、臨床前研究を行う：
(1) 微細-骨髄収穫(MMH)のための、上記製造方法の最適化；
(2) インバウンド(inbound)MMH生成物および該アウトバウンド(outbound)造血細胞生成物の安定性の評価；
(3) 上記カテーテルの内径の許容度および安全性の評価；
(4) 該細胞生成物と、本研究において使用する該カテーテルとの相溶性の評価；
(5) 上記安定性テストにおいて、該最終的な造血細胞生成物として、該最終的な造血細胞生成物の上澄を使用することの妥当性に関する評価。
【０１８１】
研究1：微細-骨髄収穫(MMH)のための、上記製造方法の最適化
代表的な骨髄生成物からの、生存性のCD34細胞の収量に及ぼす、主な製造変数の作用を、評価した。45歳以上(45-57歳の範囲に基く)の、全体で6名の志願ドナーおよび30歳を下回る年齢(21-28歳の範囲に基く)の3名のドナーが、平均して45mL(31-54mLの範囲に基く)の骨髄を提供することに同意し、またこの手続きに対して、書面によるインフォームドコンセントが与えられた。使用した該髄の吸引技術は、上記の臨床的な規模でのMMHに関して実施したものと同一であった(実施例3、上記文献参照)。以下の表2に示したように、有核細胞(NC)および微細-骨髄収穫(MMH)由来の細胞のCD34+細胞の細胞数計測値は、関連する年齢と思われる志願ドナーから集めた。
【０１８２】
【表２】
2009514950.tif 000004
【０１８３】
高齢のドナー(N=6)由来の骨髄生成物の平均細胞計数値は、1mL当たり28.4×106個(15.8×106-49.5×106なる範囲に基く)の有核細胞[NC/mL]であり、7-AAD死亡細胞排除およびフローサイトメトリーにより決定した値として、90.42％(80.95％-98.21％なる範囲に基く)およびCD34+細胞含有率3.06×105/mL(1.27×105/mL -5.58×105/mLなる範囲に基く)であった。より若年の対象群(N=3)において、髄吸引により集められた平均細胞計数値は、46.2×106NC/mL(39.9×106NC/mL-50.6×106NC/mLなる範囲に基く)であり、平均7-AAD生存率93.5％(87.17％-96.90％なる範囲に基く)および全CD34+細胞含有率8.5×105/mL(5.99×105CD34+細胞/mL-11.60×105CD34+細胞/mLなる範囲に基く)であった。
【０１８４】
赤血球枯渇およびCD34の選別
【０１８５】
【表３】
2009514950.tif 000005
【０１８６】
表3に示したように、より高齢のドナーから集めた、MMH-由来の骨髄生成物の赤血球の枯渇に引続き、平均して、最初のMMHからのCD34細胞の79.83％(65.68％-92.36％なる範囲に基く)が回収された。最初のCD34細胞の純度(1.58％；1.09％-1.99％なる範囲に基く)と、赤血球枯渇後の該純度(1.57％；1.33％-1.84％なる範囲に基く)との間の有意な差は観測されなかった。
【０１８７】
【表４】
2009514950.tif 000006
【０１８８】
表4に示したように、免疫磁性ダイナビーズ(DynabeadsTM)および抗-CD34Mabを含む、上記アイソレックスシステムを使用したCD34の選別に引続いて、我々は、平均して、32.11％(15.31％-43.60％なる範囲に基く)のCD34細胞を回収したが、これは、平均純度73.32％(71.66％-73.64％なる範囲に基く)および平均生存率97.27％(93.80％-98.49％なる範囲に基く)を有していた。更に、これらCD34+細胞は、選別後、平均17.26％(2.60％-22.10％なる範囲に基く)なるCXCR-4移動度を示し、またメトカルブ(MethoCulb)培地中で、造血性コロニーを生成することができた(21.89コロニー/100 播種CD34+細胞(17.0コロニー/100 播種CD34+細胞〜27.5コロニー/100 播種CD34+細胞なる範囲に基く))。
【０１８９】
研究2：インバウンド微細骨髄収穫およびアウトバウンド化学走性造血細胞生成物の安定性の評価
健康な志願者を用いた一連の実験を行って、インバウンドMMHおよび本発明のアウトバウンド化学走性造血細胞生成物の安定性を評価した。該インバウンドおよびアウトバウンド生成物の機能上の生存性を、細胞生存性(7-AAD)、SDF-1/CXCR-4媒介CD34+細胞移動、およびメチルセルロース中での造血性コロニーの生成能力(CFUコロニー形成能)により評価した。
【０１９０】
輸送およびその後の作業の目的並びに臨床的スケジュールとの調整の目的で、該インバウンド生成物の安定性を評価するために、MMH生成物を、指定された通り、4〜8℃にて保存した。輸送およびその後の作業の目的で、該アウトバウンド生成物の安定性を評価するために、MMHに引続き、高密度で単離されたCD34+細胞を含有する、該化学走性造血細胞生成物を、指定された通り4〜8℃にて保存した。
【０１９１】
予備的な実験において、細胞各々を即座に処理し、または処理前に12時間、4-8℃にて維持した後処理して、注入用の適当な細胞製品の製造に及ぼす、輸送並びにその後の作業期間の影響を評価した。処理前に保存期間を設けたにも拘らず(インバウンド生成物の死亡)、結果は、有意に変化しなかった(データ提示せず)。
【０１９２】
別の一連の実験において、再度の評価に先立って、細胞を、約4〜約8℃にて、12時間および約24時間保存して、MMHに引続き、夫々約36時間および約48時間の時点において注入される製品を、シミュレートした。
【０１９３】
【表５】
2009514950.tif 000007
【０１９４】
表5に示したように、該化学走性造血幹細胞生成物の該単離されたCD34+細胞は、97.24％(96.90-97.59％なる範囲に基く)なる平均生存率および7.60％(7.50-7.70％なる範囲に基く)なる平均CXCR-4媒介移動能力を有していた。以下の表6に示すように、平均26.3時間(26.0-26.5時間なる範囲に基く)の保存後、これらの細胞は、96.81％(96.39-97.22％なる範囲に基く)なる平均生存率および4.75％(4.50-5.00％なる範囲に基く)なる平均CXCR-4媒介移動能力を有していた。更に、これらの細胞は、依然としてインビトロにて造血コロニーを生成する能力を維持していた。
【０１９５】
【表６】
2009514950.tif 000008
【０１９６】
このように、MMH後26.0-26.5時間の結果を表す、CD34+細胞選別後の平均13.3時間(13.0-13.5時間なる範囲に基く)において、該CD34+細胞集団は、97.24％(96.90-97.59％なる範囲に基く)なる平均生存率および7.60％(7.50-7.70％なる範囲に基く)なる平均CXCR-4媒介移動能力を有していた。MMH後、平均26.3時間(26.0-26.5時間なる範囲に基く)において、該細胞の平均生存率は、96.81％(96.39-97.2％なる範囲に基く)であり、また平均して4.75％(4.50-5.00％なる範囲に基く)なるCXCR-4媒介移動能力を維持していた。
【０１９７】
この生成物を含む本発明の組成物の処方は、MMHの採取後、平均して8時間(8.63±1.80；N=4)で行われ、またMMHの捕集後24時間以内に注入された。
【０１９８】
【表７】
2009514950.tif 000009
【０１９９】
以降の実験において、4つのMMH生成物(A-D)を集め、該アイソレックス手順によって、該CD34+細胞を単離する前に、平均12.8時間(12.5-13.0時間なる範囲に基く)、4℃にて保存した。「12時間インデート」群(約12時間というインデート期間内に該生成物を処方することを意味する)とする、この群を、MMHの収穫後の「24時間」(22.9h±1.63、N=4)、「33時間」(33.38h±1.11、N=2)、および「48時間」(48.33h±0.82、N=4)におけるアウトデートの機能上の生存率について評価した。表7-9にまとめたデータは、MMH後、豊富にCD34+細胞を含む該化学走性造血幹細胞生成物が、夫々1) 高い生存率(>90.0％なる平均生存率、表7)；2) 該細胞生成物のSDF-1/VEGF/CXCR-4媒介移動能力の76.85％(±21.66)(表8)；および3) インビトロにて造血細胞コロニーを形成する能力(表9)を維持していることを示している。
【０２００】
表8は、MMHの収穫後の時間の関数としての、SDF-1/VEGF/CXCR-4媒介CD34+細胞移動能力(CD34+細胞の移動割合(％))：12時間インデートおよび48時間アウトデート(全ての時間点は、MMHの完了時点から計算)を示す。MMH収穫後の時間の、該CD34+細胞移動能力に及ぼす影響を決定するために、時間点「X」を基準点とする。というのは、これが、MMH後の最も初期の時間点を表すように決定され、この時点で細胞が、最終の処方物において、該対象に戻されるものと、合理的に期待されるからである。その後の時間点(Y=33時間、Z=48時間)における残留する移動活性は、該24時間(X)時間点以降に残留する移動能力の割合として計算された。
【０２０１】
【表８】
2009514950.tif 000010
a：(Y÷X)×100％；b：(Z÷X)×100％
【０２０２】
表9の結果は、生存している播種されたCD34+細胞100個当たりの、コロニー形成単位(CFU)数を、MMH後の経過時間の関数として示すものである、12時間インデートおよび48時間アウトデート(全ての時間点は、MMHの完了時点から計算)。
【０２０３】
【表９】
2009514950.tif 000011
【０２０４】
夫々、12-時間(インデート)および48-時間(アウトデート)(12/48)由来のCD34+細胞を含有する、本発明の化学走性造血幹細胞生成物に関するインデートおよびアウトデート安定性パラメータ両者の、夫々24-時間(インデート)および72-時間(アウトデート)(24/72)への拡張の試みにおいて、CD34細胞を、MMH収穫後約12時間(12-時間インデート)およびMMH収穫後約24時間(24時間アウトデート)にて精製し、またMMH後の全時間約48時間および約72時間の時点において、機能上の生存性に関して解析した(夫々、48時間アウトデートおよび72時間アウトデート)。具体的には、本発明の2種のMMH/化学走性造血幹細胞生成物の機能上の生存率特性を、48時間および72時間の時点で評価した。得られたデータを、更に以前に12/48時間点において誘導された同一の指標(表7-9)と比較した。
【０２０５】
表10-12は、33時間(32.5±0.71、N=2に基く)、48時間(49時間における1データ点に基く)、および72時間(72.5h±0.71、N=2に基く)の時点において、本発明の化学走性造血幹細胞生成物の該単離されたCD34+細胞が、1) 90％を越える生存率(表10)；2) CD34+細胞のSDF-1/VEGF/CXCR-4媒介移動能力の102.19±32.69％(表11)；および3) 該細胞のインビトロでの造血細胞コロニー生成能(表12)を維持していることを示している。
【０２０６】
【表１０】
2009514950.tif 000012
【０２０７】
【表１１】
2009514950.tif 000013
【０２０８】
表11における％残留率比は、上記表8におけるように決定した。
【０２０９】
【表１２】
2009514950.tif 000014
【０２１０】
MMH後の、8時間(8.6±1.80、N=4)、12時間(12.87±1.92、N=4)、32時間(33.5hにおける一時間点)、48時間(47.5h±2.5、N=2)、および72時間(71.5h±0.50、N=2)における、本発明の単離されたCD34+細胞を含有する該化学走性造血幹細胞生成物の、機能上の生存性パラメータの更なる評価は、72時間後には、該生成物が、24-時間点におけるものと等価な、1) 生存率(表13)；2) SDF-1/VEGF/CXCR-4媒介移動能力(表14)；3) インビトロにて造血細胞コロニーを形成する能力(表15)を保持していることを示している。
【０２１１】
【表１３】
2009514950.tif 000015
【０２１２】
【表１４】
2009514950.tif 000016
*: (Y÷X)×100％
【０２１３】
全ての残留比は、上記表8と同様にして算出した。
【０２１４】
【表１５】
2009514950.tif 000017
【０２１５】
これらのデータに基けば、本発明のCD34+細胞の臨床的生成物に関連する、上記インデートの24時間(12-時間から)への、および上記アウトデートの72時間(48時間から)への拡張は、妥当である。
【０２１６】
図1は、72時間における本発明の化学走性造血細胞生成物の機能上の生存性と、48時間において評価された同一の指標との等価性を示している。
【０２１７】
研究3：カテーテルの安全性
CD34+細胞を含有する本発明の該化学走性造血幹細胞生成物の生存性および有力な効力は、該細胞がカテーテルを通過する際の、その能力の維持に依存する。本発明の方法において使用するカテーテルは、少なくとも0.36mmなる内径を持つ。少なくとも0.36mmなる内径を持つ任意の型のカテーテルが、本発明の該薬理組成物を放出するのに有効であり得る。
【０２１８】
一態様において、該カテーテルは、バルーンカテーテルである。バルーンカテーテルの安全性の研究を行って、高い細胞濃度およびその反復的な灌流が、細胞の生存性、細胞の回収率またはカテーテルの保全性に悪影響を与えるか否かを決定した。非-移動性の末梢血前駆細胞を使用して、分析に使用するに十分な細胞数を得た。カテーテルを、選別されたCD34+細胞を含有する本発明の該細胞生成物の、上記IRAを介する注入について評価した。テストした0.36mmなる内径を持つカテーテルの何れも、選別されたCD34+細胞の生存率、培地中での生育またはCXCR-4アッセイにおける移動性に、悪影響を及ぼすことはなかった。
【０２１９】
【表１６】
2009514950.tif 000018
【０２２０】
上記表16に示したように、テストした全てのカテーテルにおいて、平均のCD34+細胞生存率は、該カテーテルを通過した後に、70％またはそれ以上であった。
【０２２１】
該CD34+細胞生成物の注入が、使用した該カテーテルの安全性の侵害を、何ら示さないこと、および細胞生成物のかなりの割合が、該カテーテルの内壁に接着しないことを立証するために、カテーテルを、臨床的に使用される濃度よりも著しく高い細胞濃度を有する、CD34+細胞生成物の反復的注入を行った。4種のブランドのカテーテル(スプリンタ、ボイジャー、マベリックおよびラプタ)を、各型のカテーテル5本を用いて評価した。非-運動性のアフェレーシス生成物を使用して、該分析を行うのに十分な数の細胞を得た。試験として、治療として計画された細胞濃度の3倍高い細胞濃度、即ち注入溶液10mL中に、CD34+細胞を含む、160×106有核細胞を、各カテーテルに2度通した。該カテーテルの通過後の、平均のCD34+細胞の回収率は、100.59％(76.99〜228.70％なる範囲に基く)であった。
【０２２２】
全体で20本のカテーテルを、該有核細胞による2度の灌流後、メチレンブルー染料漏洩テストを利用して、保全性につきテストした。漏れの徴候は見出されず、また接触点およびカテーテルチップは、検査の際に正常であった。
【０２２３】
以下の表17aおよび17bに示したように、カテーテルを通しての細胞の灌流の、該細胞に及ぼす作用は、これらテストしたカテーテルの中で、カテーテルのモデルおよび製作法とは独立であると考えられ、また処理前および/またはCD34+細胞の選別後および灌流前の何れかにおいて、該細胞を保存した時間の長さに対して独立であって、該CD34+細胞の平均回収率96.0％(80.8-102.2％なる範囲)、および該カテーテルを介して灌流された該CD34+細胞の86.36％を含む、最終的な処方物をもたらした。更に、該細胞の平均生存率は、96.5％(92.5-98.6％なる範囲、N=16)であり；該細胞は、CXCR-4移動能力(データ示さず)およびメチルセルロース中で造血細胞コロニーを形成する能力(平均25.8CFU/100個の播種細胞(21.0-30.5％なる範囲))両者を維持していた。
【０２２４】
【表１７】
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【０２２５】
全体として、これら実験は、CD34+細胞を含有する化学走性造血幹細胞生成物の、少なくとも約0.36mmなる内径を持つ心臓カテーテルを介する連続的な通過が、カテーテルの保全性またはCD34+細胞の能力、即ちCD34+細胞の生存率、CFUコロニー成長、またはCD34+CXCR+媒介移動能力/移動性の何れかに悪影響を及ぼすことはないことを明らかにしている。
【０２２６】
研究4：該カテーテルと該細胞生成物との相溶性
CD34+細胞を含有する該化学走性造血幹細胞生成物の、本研究において該細胞生成物を放出するのに使用することのできる、該カテーテル各々との相溶性を、更にテストするために、各型のカテーテルに複数回に渡って通過させた後に、該細胞生成物をテストして、治療プロトコール中に予想される応力を超える、極端な応力印加状態の効果を評価した。
【０２２７】
MMH収穫後48時間の時点において、個々のドナーから得た、約5.73×106個〜約21.10×106個のCD34+細胞なる範囲(即ち、治療コホートを反映する投与量)で該細胞を含む、該化学走性造血幹細胞生成物を、同一のブランドの3種のカテーテル、即ち各ドナーに対して一つの型のカテーテル(スプリンタ、ボイジャーまたはマベリック)を介して継続的に注入し、また該細胞生成物を、CD34+細胞回収率、コロニー形成性および生存率につき評価した。
【０２２８】
【表１８】
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【０２２９】
表18に示したように、生存性のコロニー形成性細胞は、テストした3種のカテーテル全てに関する実験全てにおいて、回収された(細胞回収率：99％、99％および106％)。
【０２３０】
以下の表19に示すように、第三のカテーテルに通した後の、該CD34+細胞の平均生存率は、注入前の細胞生成物の96.01％なる値(94.18-97.93％なる範囲に基く)に対して、94.000％(93.55-94.40％なる範囲に基く)であった。
【０２３１】
【表１９】
2009514950.tif 000021
【０２３２】
以下の表20に示すように、該第三カテーテルを通した後の、該CD34+細胞から誘導した、コロニー形成単位(CFU)の生育率は、該注入生成物(即ち、CD34+細胞を含む該注入された化学走性造血幹細胞生成物)の、95.27％(43.47-163.64％なる範囲に基く)であった。
【０２３３】
【表２０】
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【０２３４】
カテーテル灌流の、CD34+細胞の移動度およびその培地中での生育性に及ぼす作用を決定するために、一連の実験を行ったが、そこでは、健康なドナーから得たMMH細胞を、アイソレックス処理を開始する前に、12〜24時間なる期間に渡り、4℃にて保存した。アイソレックス処理前に約12時間保存しておいた、単離したCD34+細胞を、次に該処理の終了後約36時間経過するまで、MMH後の全体として約48時間なる期間に渡り、4℃にて保存した。その時点において、内径(i.d.)0.36mmの心臓バルーンカテーテルを介する灌流前後に、SDF-1/CXCR-4移動度およびCFU成長性について、該細胞を評価した。同様に、24時間、アイソレックス処理前に保存した細胞を、次いで該アイソレックス処理の終了後48時間経過するまで、全体として72時間に渡り、4℃にて保存し、次いで評価した。
【０２３５】
【表２１】
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【０２３６】
表21の結果は、テストしたあらゆる時間点において、CD34+CXCR-4媒介細胞移動度も、細胞の培地中での成育性も、少なくとも0.36mmなる内径を持つカテーテルを介する灌流によって、悪影響を受けることがないことを立証している。
【０２３７】
血清の安定化効果
以下のデータは、選別されたCD34+細胞の移動能力に対する、血清の安定化効果の重要性を確証している。
【０２３８】
以下の表22に示すように、血清の使用なしに、化学走性造血幹細胞生成物を含有する本発明の組成物を処方した場合には、該カテーテル注入前のサンプルを含めて、テストした全てのサンプルについて、如何なるCXCR-4移動活性も観測されなかった。
【０２３９】
【表２２】
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【０２４０】
図2および3は、更にアイソレックスで選別されたCD34+細胞が、ヒト血清の存在下で処方された場合に、より長い移動能力を維持することを示している。アイソレックス処理後、選別されたCD34+細胞を含む該骨髄由来の造血幹細胞生成物は、(1) 1％のヒト血清アルブミン、25U/mLのヘパリンナトリウムおよび様々な濃度の(約0％、約10％、約20％、または約70％)自己血清を含む、リン酸緩衝塩水(ドゥルベコのリン酸緩衝塩水、Ca++、Mg++を含まない(バクスター(Baxter) Cat. No. EDR9865)) (PBS)；または(2) 1％のヒト血清アルブミン、25U/mLのヘパリンナトリウムおよび(約0％または約10％)の自己血清を含む、規定塩水(0.9％)の何れかにおいて処方された。SDF-1/CXCR-4媒介CD34+細胞移動能力を、最終的な製品の保存中(2℃〜8℃にて)の様々な時点において、また該細胞を、臨床的プロトコールにおいて予定されているものと同一の速度および期間に渡り、該カテーテルを介して通過させた後に、評価した。これら処方物の何れも、該カテーテルを通過させた後に、CD34+細胞の生存率およびCD34+細胞の回収率に影響を与えなかった。
【０２４１】
選別されたCD34+細胞を含む該骨髄由来造血幹細胞生成物が、(i) PBS-血清中で、または塩水-血清中で処方されたか否か、または(ii) 即座に該カテーテルに通されたか、あるいは約4℃〜約8℃にて、長期間の安定性テスト保存期間の経過後に、該カテーテルに通されたかとは無関係に、該細胞生成物は、平均して96.6％(92.5-98.6％なる範囲)なる生存率、および11.4％(2.4-30.6％なる範囲)なる平均のCXCR-4媒介移動能力を維持していた。このことは、収穫から移動度の分析までの全時間が48時間までであることを表している。
【０２４２】
図2のパネル(a)に示した如く、約25時間の時点においてPBSのみで処方した細胞は、そのCXCR-4媒介移動能力を約10％維持しており、該移動能力は、約48時間の時点においてほぼ0に低下した。パネル(b)に示したように、規定塩水のみで処方した細胞は、その移動能力を、あるとしても、殆ど維持していなかった。パネル(c)および(d)に示したように、少なくとも約10％の血清を含有するPBSを用いて処方した細胞は、約55時間まで(c)、その移動能力の約10-15％を維持しており、一方で、塩水と少なくとも約10％の血清とを用いて処方した細胞は、約50時間まで、その移動能力の約20％を維持していた。パネル(e)および(f)に示したように、より一層高い濃度の血清を補充したPBS中では、細胞は、より一層高い移動能力を維持していた。
【０２４３】
図3に示すように、選別されたCD34+細胞を含有する本発明の該生成物が、10％の血清中で処方された場合には、14.25％、<1％、6％、および5.8％のCD34+CXCR4-媒介移動能力を、夫々収穫後約24、約32、約48および約56時間維持した。図3は、更に選別されたCD34+細胞を含有する本発明の該生成物が、20％の血清中で処方された場合には、18.25％、10.25％、17％および11％の、そのCD34+-CXCR4-媒介移動能力を、夫々収穫後約24、約32、約48および約56時間維持することを示した。従って、ここで使用する用語「安定化する量」とは、選別されたCD34+細胞を含有する本発明の該生成物の処方中に含まれる場合に、これら細胞が、そのCXCR4-媒介化学走性活性および造血コロニー形成能力を維持できる、血清の量を意味する。
【０２４４】
研究5：最終生成物の無菌性のテスト
300-mLのMMHから得られるCD34+細胞の限られた収率のために、最終細胞生成物の無菌性は、該最終生成物の処方物から取出した上澄を用いて評価して、注入のために細胞生成物を保存する。上澄のサンプルを、注入のために使用するシリンジに、該細胞生成物を挿入するのに使用した方法と同一の方法で(上記文献を参照)、シリンジに挿入する。このようなサンプルが、該最終の細胞生成物処方の代表であることを明らかにするために、我々は、該最終生成物の遠心分離処理前に、注入溶液中の選別されたCD34+細胞を、C.スポロゲネス(sporogenes) (13 CFU/mL)、P.エルギノーザ(aeruginosa) (2 CFU/mL)、S.オーレウス(aureus) (18 CFU/mL)、A.ニガー(niger) (17 CFU/mL)、C.アルビカンス(albicans) (3 CFU/mL)およびB.ズブチリス(subtilis) (17 CFU/mL)と共にインキュベートした(表22参照)。遠心分離処理後、細胞ペレットおよび細胞を含まない上澄画分両者の無菌性を、USP嫌気性および好気性テストを利用して、評価した。
【０２４５】
【表２３】
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【０２４６】
以下の表24に示すように、全てのテストしたサンプル由来の該細胞ペレット画分および懸濁液画分両者は、接種された微生物の成長を示し、一方未接種のコントロールサンプルでは成長は見られなかった。更に、見かけ上の判別成長速度は、テストした全ての微生物に関して、細胞ペレット画分および懸濁液画分のテスト間で、全く観測されなかった。該処理手順の各段階前に、および該カテーテルを介する最終的な灌流後に採取したサンプルのテストしたもの全ては、微生物汚染に関して負であった。
【０２４７】
【表２４】
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a：流体チオグリコレート媒体；
b：トリプシンを作用させた大豆ブロス。
【０２４８】
臨床前研究のまとめ
全体として、これら臨床前データは、記載した製造並びにテスト手順が、十分な安定性を持ち、該バルーンカテーテルを介する流体注入の通常の利用に関連する問題以外の、安全性に係る付随的な問題を、該対象に及ぼすことのない様式で、輸送並びにカテーテルを介する灌流に耐える、十分な数の生存性の細胞を生成することができることを示している。
【０２４９】
以上本発明を、その特定の態様を参照しつつ説明してきたが、当業者は、本発明の精神並びに範囲から逸脱することなしに、様々な変更を行うことができ、また等価物で、置き換えることができることを理解すべきである。更に、本発明の目的、精神並びに範囲に、特定の状況、材料、組成物、方法、1または複数の加工段階を適合させることのできる、多くの改良を行うことが可能である。このような改良全ては、ここに添付した特許請求の範囲に含まれるはずである。
【図面の簡単な説明】
【０２５０】
【図１】72時間目における、本発明の該化学走性造血幹細胞生成物の機能上の生存性が、48時間目における機能上の生存性と等価であることを示す図である。
【図２】本発明のCD34+細胞を含有する、処方された化学走性造血幹細胞生成物の、移動効率を示す図である。
【図３】ヒト血清中に処方した、CD34+細胞の改善された安定性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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