(57)【要約】本発明は、神経疾患を治療するための方法および組成物に関し、より詳細には、神経疾患を治療するために神経系細胞にｉＲＮＡ剤を送達する方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
投与部位よりも遠位の神経系細胞における標的遺伝子の発現を下方制御する方法であって、該方法は、
ｉＲＮＡ剤と神経系細胞とを、該ｉＲＮＡ剤の該細胞内への取り込みと該ｉＲＮＡ剤の軸索輸送とが可能な十分な時間接触させることを含み、
（ｉ）ｉＲＮＡ剤はＲＮＡ二重鎖を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、（ｉｉ）ｉＲＮＡ剤は親油性部分を含み、かつ（ｉｉｉ）ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖の配列は、標的遺伝子から発現されるＲＮＡのうち約１８〜２５ヌクレオチドの標的配列に対し十分相補的なヌクレオチド配列を含むを特徴とする方法。
【請求項２】
親油性部分はコレステロールである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
親油性部分はセンス鎖に結合される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
親油性部分はセンス鎖の３’末端に結合される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
アンチセンス配列は表２に列挙されたアンチセンス配列との違いが４ヌクレオチド以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
アンチセンス鎖は表２に列挙されたアンチセンス鎖から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ｉＲＮＡ剤はホスホロチオエートまたは２’‐ＯＭｅ修飾をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ｉＲＮＡ剤はトランスフェクション試薬を含まない溶液中に提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ヒトを治療する方法であって、該方法は、
神経障害を有するかまたは神経障害を発症するリスクを有するヒトを特定すること、および
前記ヒトに、投与部位よりも遠位の神経系細胞において発現される遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を投与すること、を含み、
該遺伝子の発現が神経障害の症状と関連し、ならびに（ｉ）ｉＲＮＡ剤はＲＮＡ二重鎖を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、（ｉｉ）ｉＲＮＡ剤は親油性部分を含み、かつ（ｉｉｉ）ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、標的遺伝子から発現されるＲＮＡのうち約１８〜２５ヌクレオチドの標的配列に対し十分相補性なヌクレオチド配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
親油性部分はコレステロールである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
親油性部分はセンス鎖に結合される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
親油性部分はセンス鎖の３’端に結合される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
ｉＲＮＡ剤はホスホロチオエートまたは２’‐ＯＭｅ修飾をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
アンチセンス配列は表２に列挙されたアンチセンス配列との違いが４ヌクレオチド以下
である、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
アンチセンス鎖は表２に列挙されたアンチセンス鎖から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、ハンチンチン（ｈｔｔ）ＲＮＡの多型を含む配列に対し相補的な配列を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
前記ヒトはＰａｒｋｉｎ遺伝子またはユビキチンカルボキシ末端加水分解酵素Ｌ１（ＵＣＨＬ１）遺伝子に遺伝的変異を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
神経障害はハンチントン病である、請求項９に記載の方法。
【請求項１９】
神経障害はパーキンソン病である、請求項９に記載の方法。
【請求項２０】
神経障害はアルツハイマー病、多系統萎縮症、またはレーヴィ小体痴呆である、請求項９に記載の方法。
【請求項２１】
ｉＲＮＡ剤は１〜４個の非対合ヌクレオチドを有するヌクレオチド突出部を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項２２】
ｉＲＮＡ剤はトランスフェクション試薬を含まない溶液中に提供される、請求項９に記載の方法。
【請求項２３】
対象の神経系細胞中のハンチンチン（ｈｔｔ）ＲＮＡの量を低減する方法であって、該方法は、
神経系細胞をｉＲＮＡ剤と接触させることを含み、
前記神経系細胞は作用部位よりも遠位にあり、ｉＲＮＡ剤はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖はＲＮＡ二重鎖を形成し、アンチセンス鎖は表２に列挙されたアンチセンス配列との違いが４ヌクレオチド以下であるヌクレオチド配列を含み、かつｉＲＮＡ剤は親油性部分を含むことを特徴とする方法。
【請求項２４】
ｉＲＮＡ剤はホスホロチオエートまたは２’‐ＯＭｅ修飾をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ｉＲＮＡ剤は、表２に列挙されたアンチセンス鎖から選択された配列を含むアンチセンス鎖を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
ｉＲＮＡ剤は、表２に列挙されたセンス鎖から選択されたセンス鎖を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
ｉＲＮＡ剤は、ｈｔｔ  ＲＮＡの多型を含む配列に対し相補的な配列を含むアンチセンス鎖を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
多型は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２１１１の配列の１７１位におけるＡ→Ｃである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ｉＲＮＡ剤は１〜４個の非対合ヌクレオチドを有するヌクレオチド突出部を含む、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経疾患を治療するための方法および組成物に関し、より詳細には、神経疾患を治療するために神経系細胞にｉＲＮＡ剤を送達する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本願は、２００５年８月１８日に出願された米国仮特許出願番号第６０／７０９，９８５号および２００６年７月２５日に出願された米国仮特許出願番号第６０／８３３，２３４号の優先権を主張する。これらの仮出願の内容はその全体を本願明細書に援用する。
【０００３】
［政府の支援］
本明細書に記載の研究は、米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）に
よって授与された助成番号３８１９４の下、米国政府からの資金を少なくとも部分的に使用して実行された。従って米国政府は本発明において一定の権利を有し得る。
【０００４】
［背景］
ＲＮＡ干渉または「ＲＮＡｉ」は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が線虫に導入されると遺伝子発現を阻止することが可能であるという観察を説明するために、ファイア（Ｆｉｒｅ）および共同研究者らによって最初に作られた用語である（非特許文献１）。短いｄｓＲＮＡは、脊椎動物を含む多くの生物において遺伝子特異的な転写後サイレンシングをもたらし、かつ遺伝子の機能を研究するための新規なツールを提供してきた。
【非特許文献１】ファイア（Ｆｉｒｅ）ら、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ  第３９１巻、ｐ．８０６〜８１１（発明の開示）  本発明の態様は、神経障害を治療するための組成物および該組成物の使用方法に関する。１つの態様では、本発明は、神経障害を有するかまたは神経障害を発症するリスクを有する対象を、神経系細胞内で発現される遺伝子の発現を阻害するｉＲＮＡ剤を投与することにより治療する方法を特徴とする。１つの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は神経系細胞内への該ｉＲＮＡ剤の取り込みを促進する結合物を含む。好ましい実施形態において、結合物は親油性部分であり、例えばコレステロールである。別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、神経疾患または神経障害に関与する神経系細胞内で発現される遺伝子の発現を阻害する。さらに別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、神経障害を有するかまたは神経障害を発症するリスクを有する患者を治療するために使用される。１つの実施形態では、神経系細胞内への取り込み強化のために修飾されたｉＲＮＡ剤は、ハンチントン病（ＨＤ）であるかまたはハンチントン病を発症するリスクを有するヒトにおいて、ハンチンチン（ｈｔｔ）遺伝子の発現を阻害するかまたは低下させることができる。
【０００５】
好ましい実施形態において、対象はヒトなどの哺乳動物、例えば、神経障害を有するかまたは神経障害を発症するリスクを有すると診断された対象である。
１つの実施形態では、ｉＲＮＡ剤のセンス鎖は該オリゴヌクレオチド剤のアンチセンス鎖内に少なくとも１つのミスマッチを含みうる。このミスマッチは、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）によるアンチセンス鎖の選択を増強することなどによりｉＲＮＡ剤に利点をもたらすことができる。１つの実施形態では、ミスマッチはセンス鎖の３’端ヌクレオチドから少なくとも１、２、３、４または５ヌクレオチド離れている。
【０００６】
１つの実施形態では、ｉＲＮＡ剤はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２１１１（２００５年８月８日）に規定された配列を含むかまたは該配列と重複するヒトｈｔｔ遺伝子領域によりコードされる配列とほぼ相補的なアンチセンス鎖を含む。
【０００７】
ある実施形態では、ｉＲＮＡ剤はｈｔｔ  ＲＮＡを標的とし、表１または表２に列挙されたセンス配列またはアンチセンス配列のうち少なくともいずれかを含みうる。好ましい実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、神経系細胞内への取り込み強化のための親油性部分に加えて少なくとも１つの修飾を含む。この少なくとも１つの追加修飾は、例えばホスホロチオエートまたは２’Ｏ−メチル（２’ＯＭｅ）修飾の場合がある。
【０００８】
【表１】
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【０００９】
【表２】
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好ましい実施形態において、親油性物質と結合したｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、表１または表２に列挙されたアンチセンス鎖の配列を有するか、あるいは表１または表２に列挙されたアンチセンス鎖との違いが１、２、３、４または５ヌクレオチド以下である。別の好ましい実施形態では、親油性物質と結合したｉＲＮＡ剤のセンス鎖は、表１または表２に列挙されたアンチセンス鎖の配列を有するか、あるいは表１または表２に列挙されたアンチセンス鎖との違いが１、２、３、４または５ヌクレオチド以下である。別の好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は表１または表２に記載の修飾（例えば、コレステロール、２’−ＯＭｅ、ホスホロチオエート、またはＣｙ３（ＴＭ）による修飾）を少なくとも１つ有する。別の好ましい実施形態では、アンチセンス鎖が表１または表２に示した修飾を有することになる。ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、例えば表１または表２に示した種類の１つ以下の修飾を有してもよいし、例えば表１または表２に示した種類の追加修飾を１つ以上有してもよい。別の好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤のセンス鎖は表１または表２に記載の修飾（例えば、コレステロール、２’−ＯＭｅ、ホスホロチオエート、またはＣｙ３（ＴＭ）による修飾）を少なくとも１つ有する。別の好ましい実施形態では、センス鎖が表１または表２に示した修飾を有することになる。ｉＲＮＡ剤のセンス鎖は、例えば表１または表２に示した種類の１つ以下の修飾を有してもよいし、例えば表１または表２に示した種類の追加修飾を１つ以上有してもよい。
【００１０】
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤はｈｔｔの核酸を標的とする。１つの実施形態では、ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、本明細書に記載のアンチセンス配列、例えば表１または表２に列挙されたアンチセンス配列を含む。別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤のセンス鎖は、本明細書に記載のセンス鎖のヌクレオチド配列、例えば表１または表２に列挙されたセンス配列を含む。さらに別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、本明細書に記載のアンチセンス配列、例えば表１または表２に列挙されたアンチセンス配列と、例えば少なくとも１、５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個のヌクレオチドが重複する。同様に、ｉＲＮＡ剤のセンス鎖は、本明細書に記載のセンス配列、例えば表１または表２に列挙されたセンス配列と、例えば１、５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個のヌクレオチドが重複する。
【００１１】
特に好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は神経疾患に関与する核酸を標的とする。ｉＲＮＡ剤は、標的とする核酸のヌクレオチド配列に相補的なアンチセンス鎖と、該アンチセンス鎖にハイブリダイズするのに十分な相補性を有するセンス鎖とを有する。ｉＲＮＡ剤は、神経系細胞内への取り込み強化のための親油性部分も含む。好ましい実施形態では、親油性部分はコレステロールである。別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、生体試料中におけるｉＲＮＡ剤の安定性または分布を改善する修飾を含む。ｉＲＮＡ剤はさらに単離形態であってもよいし、本明細書に記載の方法に使用される医薬組成物、特に神経系細胞内に送達するために製剤化されたかまたは非経口投与用に製剤化された医薬組成物の一部であってもよい。医薬組成物は１以上のｉＲＮＡ剤を含むことが可能であり、一部の実施形態では、２以上のｉＲＮＡ剤を含むこともある。１つの実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、２’修飾ヌクレオチド、例えば２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤はホスホロチオエートを含む。
【００１２】
別の実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、神経障害の発症に関与する野生型の核酸、例えば野生型ｈｔｔ  ＲＮＡを標的とし、さらに別の実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、該核酸の多型または突然変異を標的とする。ある実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、オープンリーディングフレームのコドン中の配列、神経障害に関与する遺伝子のｍＲＮＡ転写物の３’ＵＴＲまたは５’ＵＴＲを標的とし得る。１つの実施形態において、ｉＲＮＡ剤はスプライシングされたｍＲＮＡアイソフォームを標的とする。
【００１３】
１つの実施形態において、ＣＡＧトリヌクレオチドリピートが例えば３０個を超えるＣＡＧトリヌクレオチドリピート（例えば３５、４０、５０、６０、７０，８０，９０、１００またはそれ以上のＣＡＧトリヌクレオチドリピート）に伸長し、その結果としてハンチンチンポリペプチドの正常なポリグルタミン鎖が伸長している異常型ハンチンチンポリペプチドを生じる、ある種類のハンチンチン遺伝子をヒトが有している。別の実施形態では、ヒトがハンチントン病（ＨＤ）であると診断されている。１つの実施形態では、ヒトはハンチンチン遺伝子に多型または突然変異を有している。例えば、ヒトは、ハンチンチン遺伝子内に、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２１１１（２００５年８月８日）における該配列の番号付けで１７１位の多型、例えばＡ１７１Ｃ多型を有する場合がある。別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ハンチンチンタンパク質と相互作用することが知られているポリペプチドをコードする核酸を標的とする。例えば、ｉＲＮＡ剤はハンチンチン結合タンパク質１（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１：ＨＡＰ−１）の核酸を標的とする場合がある。
【００１４】
好ましい実施形態では、神経系細胞内への取り込み強化のために修飾されたｉＲＮＡ剤は、α−シヌクレイン（ＳＮＣＡ）ＲＮＡを標的としない。
別の実施形態では、神経系細胞内への取り込み強化のために修飾された、例えばコレステロールと結合されたｉＲＮＡ剤は、少なくとも２１ヌクレオチド長であってセンスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖を含み、アンチセンスＲＮＡ鎖の長さは２５ヌクレオチド以下であり、ｉＲＮＡ剤の二重鎖領域の長さは１８〜２５ヌクレオチドである。ｉＲＮＡ剤はさらに、１〜４個の非対合ヌクレオチドを有するヌクレオチド突出部を含む場合もあり、非対合ヌクレオチドは少なくとも１つのホスホロチオエートによるジヌクレオチド結合を有することもある。ヌクレオチド突出部は、例えばｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖の３’端にあってもよい。
【００１５】
１つの態様では、本発明は、神経系細胞内における標的遺伝子の発現を下方制御（ダウンレギュレーション）する方法を特徴とする。１つの実施形態において該方法は、ｉＲＮＡ剤と神経系細胞とを、ｉＲＮＡ剤が該細胞内に取り込まれるのに十分な時間接触させることを含む。別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＲＮＡ二重鎖を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。ｉＲＮＡ剤は、親油性部分例えばコレステロールも含み、ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は標的遺伝子から発現されるＲＮＡの約１８〜２５ヌクレオチドの標的配列に十分相補的なヌクレオチド配列を含んでなる。好ましい実施形態では、親油性部分は、センス鎖の少なくとも一端、例えばセンス鎖の３’端に結合される。別の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖は、表１または表２に列挙されたセンス鎖およびアンチセンス鎖から選択された配列を有する。
【００１６】
別の態様では、本発明は、神経障害を有するかまたは神経障害を発症するリスクを有すると診断されたヒトを特定することと、神経系細胞内で発現される遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤をそのヒトに投与することとを含む、ヒトを治療する方法を特徴とする。１つの実施形態では、該遺伝子の発現は神経障害の症状と関連している。別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤はＲＮＡ二重鎖を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、かつｉＲＮＡ剤は親油性部分（例えばコレステロール）を含む。別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤のアン
チセンス鎖は、標的遺伝子から発現されるＲＮＡの約１８〜２５ヌクレオチドの標的配列に十分相補的なヌクレオチド配列を含む。好ましい実施形態において親油性部分は、センス鎖の少なくとも一端、例えばセンス鎖の３’端に結合され、別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤はホスホロチオエートまたは２’修飾、例えば２’ＯＭｅ修飾または２’Ｏ−フルオロ修飾を含む。１つの実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖は、表１または表２に列挙されたセンス鎖およびアンチセンス鎖から選択された配列を含む。
【００１７】
１つの実施形態では、ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖はｈｔｔ  ＲＮＡの多型に相補的な配列を含む。別の実施形態では、ヒトはハンチントン病であるかまたはハンチントン病を発症するリスクを有する。別の実施形態では、ヒトはＰａｒｋｉｎ遺伝子またはユビキチンカルボキシ末端加水分解酵素Ｌ１（ＵＣＨＬ１）遺伝子に遺伝的変異を有し、かつそのヒトはパーキンソン病であるかまたはパーキンソン病を発症するリスクを有する。別の実施形態では、ヒトはアルツハイマー病、多系統萎縮症、またはレーヴィ小体痴呆であるかまたは該疾患を発症するリスクを有する。
【００１８】
別の態様では、本発明は、神経系細胞内への取り込み強化のために親油性部分と結合された、例えばコレステロール分子と結合されたｉＲＮＡ剤と、薬学的に許容可能な担体とを含んでなる医薬組成物を特徴とする。好ましくは、ｉＲＮＡ剤は神経疾患または神経障害に関与する核酸を標的とする。
【００１９】
特に好ましい実施形態では、医薬組成物は、ｈｔｔ核酸を標的とするｉＲＮＡ剤と薬学的に許容可能な担体とを含む。ｉＲＮＡ剤は、ｈｔｔ  ＲＮＡのヌクレオチド配列に相補的なアンチセンス鎖と、該アンチセンス鎖にハイブリダイズするのに十分な相補性を有するセンス鎖とを有する。１つの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、神経系細胞内への取り込みを促進する親油性部分を含む。１つの実施形態では、親油性部分はカチオン基を含むリガンドである。別の実施形態では、親油性部分は、ｉＲＮＡ剤の一方または両方の鎖の一端または両端に取り付けられる。好ましい実施形態では、親油性部分は、ｉＲＮＡ剤のセンス鎖の一端に取り付けられ、別の好ましい実施形態では、リガンドはセンス鎖の３’端に取り付けられる。ある実施形態では、親油性物質は例えばコレステロール、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＡ、葉酸またはＣｙ３のようなカチオン染料である。好ましい実施形態では、親油性部分はコレステロールである。
【００２０】
別の実施形態では、医薬組成物のｉＲＮＡ剤は、生体試料中におけるｉＲＮＡ剤の安定性または分布を改善する修飾を含む。ｉＲＮＡ剤はさらに単離形態であってもよいし、本明細書に記載の方法に使用される医薬組成物、特に神経系細胞内に送達するために製剤化されたかまたは非経口投与用に製剤化された医薬組成物の一部であってもよい。医薬組成物は１以上のｉＲＮＡ剤を含むことが可能であり、一部の実施形態では、２以上のｉＲＮＡ剤を含むこともある。１つの実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、２’修飾ヌクレオチド、例えば２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤はホスホロチオエートを含む。
【００２１】
特に好ましい実施形態では、神経系細胞のｈｔｔ  ＲＮＡレベルは、対象の神経系細胞を、神経系細胞内への取り込み強化のために修飾されたｉＲＮＡ剤と接触させることにより低下する。好ましい実施形態では、リガンドはコレステロールである。
【００２２】
別の態様では、本発明は、神経系細胞で発現される核酸を標的とし、かつ神経系細胞内への取り込み強化のために修飾されたｉＲＮＡ剤を、製造する方法を特徴とする。該方法は、標的ｍＲＮＡ（例えばｈｔｔ  ｍＲＮＡ）のヌクレオチド配列から長さ１８〜２５ヌクレオチドのヌクレオチド配列を選択することと、ｉＲＮＡ剤を合成することとを含む。ｉＲＮＡ剤のセンス鎖は標的ＲＮＡから選択されたヌクレオチド配列を含み、アンチセン
ス鎖は該センス鎖にハイブリダイズするのに十分な相補性を有する。該方法は、ｉＲＮＡ剤に、例えばｉＲＮＡ剤のセンス鎖の少なくとも一端に、少なくとも１つの親油性部分を組み込むことを含む。好ましい実施形態では、親油性部分はｉＲＮＡ剤のセンス鎖の３’端に組み込まれる。１つの実施形態では、カチオン染料（例えばＣｙ３）がｉＲＮＡ剤の少なくとも一方の鎖に、例えばｉＲＮＡ剤の３’端または５’端に組み込まれる。１つの実施形態では、２以上の親油性部分、例えば２以上の異なる種類の親油性部分がｉＲＮＡ剤に組み込まれる。ある実施形態では、ｉＲＮＡ剤は表１または表２に例証されたリガンド結合体を含む。他の実施形態では、ｉＲＮＡ剤を製造する方法は、表１または表２に例証された構成単位の使用を含む。さらに他の実施形態では、本発明において主要な方法は、ｈｔｔ  ＲＮＡを標的とする表１または表２に列挙されたｉＲＮＡ剤を製造する方法を含む。１つの実施形態では、該方法はさらに、ｉＲＮＡ剤を、対象に、例えば哺乳類の対象に、例えばヒト対象に、例えば神経疾患もしくは神経障害であるかまたは神経疾患もしくは神経障害を発症するリスクを有するヒトに、投与することを含む。１つの実施形態では、ヒトはＨＤであるかまたはＨＤを発症するリスクを有する。
【００２３】
別の態様では、本発明は、ｉＲＮＡ剤、例えば神経系細胞内への取り込み強化のために親油性物質と結合されたｉＲＮＡ剤を評価する方法を特徴とする。該方法は、神経系細胞内への取り込み強化のために修飾された、例えばコレステロール分子と結合された候補ｉＲＮＡ剤を提供することと、ｉＲＮＡ剤が神経系細胞内へ取り込まれるかどうか測定することとを含む。１つの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、検出可能なマーカー、例えばＣｙ３またはＣｙ５のような蛍光マーカーと結合され、細胞内への取り込みが蛍光によって分析される。別の実施形態では、例えば本明細書に記載の試験系のうち１以上を使用することによって、前記候補剤が標的遺伝子の発現を変化させる（例えば阻害する）かどうか分析される。
【００２４】
好ましい実施形態では、該方法は、第１の試験系でｉＲＮＡ剤を評価することと、所定レベルの遺伝子発現が観察された場合に、該候補を第２の、好ましくは異なる試験系で評価することと、を含む。特に好ましい実施形態では、第２の試験系は、動物の神経系細胞に候補ｉＲＮＡ剤を投与することと、該動物における標的遺伝子の発現に対する候補剤の作用を評価することと、を含む。
【００２５】
試験系は、候補ｉＲＮＡ剤と標的核酸（例えばｈｔｔ  ＲＮＡのような神経系細胞で発現される核酸）とを接触させることを含む。ｉＲＮＡを好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで標的核酸と接触させ、相互作用、例えば標的への候補剤の結合があるかどうかを測定する。試験系は、候補剤と神経系細胞とを接触させることと、神経遺伝子の発現（例えばｈｔｔ遺伝子の発現）の変化を評価することとを含むこともできる。例えばこの試験系は、ｈｔｔ  ＲＮＡ（内因性遺伝子由来または外因性構築物由来）を発現することができる神経系細胞と候補ｉＲＮＡ剤とを接触させることと、ｈｔｔレベルまたはｈｔｔ  ＲＮＡレベルを評価することとを含むことができる。好ましい実施形態では、候補ｉＲＮＡ剤は、神経系細胞内への候補ｉＲＮＡ剤の取り込みを強化する修飾を含む。特に好ましい実施形態では、該修飾はコレステロール分子、例えばｉＲＮＡ剤のセンス鎖（例えばセンス鎖の３’端）に取り付けられたコレステロールである。別の実施形態では、試験系は、異種配列（例えばマーカータンパク質であって例えばＧＦＰのような蛍光タンパク質）に連結された神経系細胞遺伝子の一部（その構築物は染色体上にあってもエピソーム上にあってもよい）由来のＲＮＡまたはタンパク質を発現する細胞と候補剤とを接触させることと、ＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルに対する作用を測定することとを含みうる。試験系はまた、候補ｉＲＮＡ剤をｉｎ  ｖｉｔｒｏで、組織試料（例えば脳組織試料であって例えば薄片または切片、視覚組織試料、または神経組織を含むその他の試料）と接触させることと、神経のポリペプチドまたはＲＮＡ（例えばｈｔｔポリペプチドまたはＲＮＡ）のレベルを評価することとを含むこともできる。試験系は、動物に候補ｉＲＮＡ剤をｉｎ  ｖｉｖ
ｏで投与することと、神経のポリペプチドまたは神経のＲＮＡ（例えばｈｔｔポリペプチドまたはｈｔｔ  ＲＮＡ）のレベルを評価することとを含むこともできる。これらのうちいずれにおいても、神経遺伝子の発現に対する候補剤の作用は、遺伝子発現を所定の標準（例えば対照であって例えば未処置の細胞、組織または動物）と比較することを含むことができる。遺伝子発現は、例えば候補ｉＲＮＡ剤と接触させる前と後とで比較することができる。該方法により、ｉＲＮＡ剤がｈｔｔ遺伝子の発現を阻害するのに役立つかどうか測定することが可能になる。
【００２６】
「神経遺伝子」とは、神経系細胞内で発現される遺伝子である。神経遺伝子は神経系細胞内でのみ発現されるものでもよいし、あるいは神経系細胞に加えて他の種類の細胞内でも発現されるものでもよい。
【００２７】
１つの実施形態において、神経遺伝子の発現は、神経のＲＮＡレベルを調べる方法（例えば、ノーザンブロット分析、ＲＴ−ＰＣＲ、またはＲＮＡｓｅ保護アッセイ）または神経のポリペプチドレベルを調べる方法（例えば、ウエスタンブロット法、免疫組織化学法、または自己蛍光アッセイ（例えばＧＦＰまたはルシフェラーゼの発現を検出））によって評価可能である。
【００２８】
「神経系細胞」とは、神経系（例えば末梢神経系または中枢神経系）の細胞である。神経系細胞は、神経細胞（すなわちニューロン）、例えば感覚ニューロンまたは運動ニューロンでもよいし、グリア細胞でもよい。ニューロンの例には、脊髄の後根神経節、脊髄運動ニューロン、網膜双極細胞、脳の皮質細胞および線条体細胞、海馬錐体細胞、ならびに小脳のプルキンエ細胞が挙げられる。グリア細胞の例には、中枢神経系のオリゴデンドロサイトおよびアストロサイト、ならびに末梢神経系のシュワン細胞が挙げられる。
【００２９】
「神経系細胞内への取り込みの強化」とは、修飾および非修飾の各タイプのｉＲＮＡ剤に曝露される細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件またはｉｎ  ｖｉｖｏ条件の同じ条件下で処理される場合、非修飾ｉＲＮＡ剤よりも多くの修飾ｉＲＮＡ剤が神経系細胞に取り込まれることを意味する。
【００３０】
１つの実施形態において、例えば、第２の試験として、薬剤を動物に、例えば哺乳動物（マウス、ラット、ウサギ、ヒト、またはヒト以外の霊長類など）に投与し、この動物を同剤の作用についてモニタする。例えば、脳組織など動物の組織を、神経遺伝子の発現に対する薬剤の作用について調べる。組織を、例えば、神経のＲＮＡおよび／またはタンパク質の存在について調べてもよい。１実施形態では、動物を観察して認知的症状の改善または安定化についてモニタする。薬剤は、任意の方法によって、例えば経口的に、またはクモ膜下腔内もしくは実質への注射により、例えば、脳への立体視による注射により動物に投与可能である。
【００３１】
特に好ましい実施形態において、本発明は、神経系細胞において発現される核酸（例えばｈｔｔ核酸）を標的とするｉＲＮＡ剤、例えば本明細書に記載のｉＲＮＡ剤を評価する方法を特徴とする。この方法は、神経系細胞において発現される核酸（例えば、ｈｔｔ  ＲＮＡ）を標的とするｉＲＮＡ剤を提供する工程と；該核酸を含み、かつ発現可能である細胞とｉＲＮＡ剤とを接触させる工程と；該核酸の発現に対するｉＲＮＡ剤の作用を、例えば、遺伝子発現を（例えば、細胞内で）対照と比較することによって評価する工程とを包含する。遺伝子発現は、例えば、細胞とｉＲＮＡ剤とを接触させる前後で比較することができる。この方法により、ｉＲＮＡ剤が遺伝子発現を阻害するために有用であるか否かを測定することが可能となる。例えば、ｉＲＮＡ剤が、例えば所定の基準値と比較して（例えば、細胞と該ｉＲＮＡ剤とを接触させる前の神経のＲＮＡまたはタンパク質の量と比較して）、発現を所定の量（例えば、１０％、２５％、５０％、７５％、または９０％）
低減する場合、該ｉＲＮＡ剤は神経遺伝子の発現を阻害するために有用であると測定することができる。神経遺伝子は内在性として発現されてもよいし外来性として発現されてもよい。
【００３２】
本発明において特徴付けられる方法および組成物、例えば、本明細書に記載の神経障害を治療するための方法およびｉＲＮＡ剤は、本明細書に記載される任意の投薬量および／または製剤で、かつ本明細書に記載される任意の投与経路を用いて使用可能である。
【００３３】
したがって、別の態様では、本発明は、神経系細胞における遺伝子の発現を阻害する薬剤を投与することにより対象を治療する方法を特徴とする。好ましい実施形態では、対象はヒトなどの哺乳動物であり、例えば神経疾患もしくは神経障害を有するかまたは神経疾患もしくは神経障害を発症するリスクを有すると診断された対象である。神経遺伝子の発現を阻害する薬剤には、ｈｔｔ  ＲＮＡを標的とするｉＲＮＡ剤およびアンチセンス分子が挙げられる。
【００３４】
「ほぼ同一な」配列は、標的遺伝子に対して十分相同な領域を含み、かつｉＲＮＡ剤（例えば神経系細胞への取り込み強化のために親油性部分に結合されたｉＲＮＡ剤）またはそのフラグメントが標的遺伝子の下方制御を仲介可能な十分な長さのヌクレオチド数を有する。標的遺伝子にほぼ同一なｉＲＮＡ剤の配列は、典型的には二本鎖ｉＲＮＡ剤のセンス鎖上の配列である。
【００３５】
「ほぼ相補的な」配列は、標的遺伝子に対して十分相補的な領域を含み、かつｉＲＮＡ剤（例えば神経系細胞への取り込み強化のために親油性部分に結合されたｉＲＮＡ剤）またはそのフラグメントが標的遺伝子の下方制御を仲介可能な十分な長さのヌクレオチド数を有する。標的遺伝子にほぼ相補的なｉＲＮＡ剤の配列は、典型的には二本鎖ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖上の配列である。したがって、ｉＲＮＡ剤は、標的のＲＮＡ転写物（例えば、神経系細胞内で発現されるＲＮＡ転写物）に対して少なくとも部分的に、またある実施形態においては完全に相補的な領域であるか、またはそのような領域を含む。ｉＲＮＡ剤と標的との間に完全な相補性が存在する必要性はないが、両者の対応は、ｉＲＮＡ剤またはその切断産物が、例えば、標的ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）のＲＮＡｉ切断による配列特異的サイレンシングをもたらすことができるように十分でなければならない。標的鎖との相補性、または相同性の程度は、アンチセンス鎖において最も重要である。特にアンチセンス鎖において完全な相補性が望まれることが多いが、ある実施形態は、特にアンチセンス鎖において、１つ以上であるが好ましくは６、５、４、３、２個以下の（標的ＲＮＡに対する）ミスマッチを含み得る。このミスマッチは、特にアンチセンス鎖において、末端領域において最も許容されやすく、存在する場合は、５’末端および／または３’末端から例えば６、５、４、または３ヌクレオチド以内の末端領域中にあることが好ましい。センス鎖は、分子の全体的な二本鎖の性質を維持する程度にアンチセンス鎖と十分に相補的でありさえすればよい。
【００３６】
「ＲＮＡ剤」は、本明細書において使用される場合、非修飾ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、またはヌクレオシド代用物であり、これらのすべてが本明細書において記載されているかまたはＲＮＡ合成の分野でよく知られている。多数の修飾ＲＮＡおよびヌクレオシド代用物が記載されるが、好ましい例には、非修飾ＲＮＡよりもヌクレアーゼ分解に対して耐性の高いものが含まれる。好ましい例には、２’糖修飾、一本鎖突出部（好ましくは３’一本鎖突出部）における修飾、または、特に一本鎖の場合、１つまたは複数のリン酸基もしくは１つまたは複数のリン酸基アナログを含む５’修飾を有するものが含まれる。
【００３７】
「ｉＲＮＡ剤」（「干渉（ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）ＲＮＡ剤」の略語）は、本明細書において使用される場合、標的遺伝子、好ましくは神経系細胞内で発現される内在性また
は病原体由来の標的ＲＮＡ、の発現を下方制御可能なＲＮＡ剤である。理論によって束縛されることは望まないが、ｉＲＮＡ剤は、当技術分野においてＲＮＡｉと呼ばれることもある標的ｍＲＮＡの転写後切断、または転写前もしくは翻訳前のメカニズムを含む多数のメカニズムのうち１つ以上によって作用する可能性がある。ｉＲＮＡ剤は、二本鎖（ｄｓ）ｉＲＮＡ剤であることが好ましい。
【００３８】
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細について、添付の図面および以下の説明において述べる。本発明の他の特徴、目的、および利点は、この説明から、また特許請求の範囲から明らかであろう。本願は、引用されたすべての参考文献、特許、および特許出願の全体を、すべての目的のために本願明細書に援用する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られるプロセスを通してｍＲＮＡの配列特異的サイレンシングをもたらす。このプロセスは、哺乳動物および他の脊椎動物を含めた広範な種々の生物に存在する。
【００４０】
ｄｓＲＮＡの２１〜２３ｎｔフラグメントが、例えばＲＮＡの分解を引き起こすことによるＲＮＡサイレンシングの配列特異的メディエータであることが実証されてきた。理論によって束縛されることは望まないが、これらの２１〜２３ｎｔフラグメント中に存在する、特定の長さのフラグメントにすぎない分子シグナルが、ＲＮＡｉを仲介する細胞因子を発動している可能性がある。本明細書に記載されるのは、これらの２１〜２３ｎｔフラグメントおよび他のｉＲＮＡ剤を調製および投与するための方法、ならびに神経系細胞における遺伝子機能を特異的に不活性化するための前記２１〜２３ｎｔフラグメントおよび他のｉＲＮＡ剤の使用についてである。ｉＲＮＡ剤（または同一もしくは類似の性質を有する組換え生産もしくは化学合成されたオリゴヌクレオチド）の使用により、哺乳動物細胞におけるサイレンシングのために特定のｍＲＮＡを標的とすることが可能となる。さらに、より長いｄｓＲＮＡ剤フラグメントも、例えば後述のようにして使用可能である。
【００４１】
哺乳動物細胞において、長いｄｓＲＮＡは、有害であることの多いインターフェロン応答を誘導し得るが、短いｄｓＲＮＡ（ｓＲＮＡ）は、少なくとも細胞および宿主に対して有害なほどはインターフェロン応答を誘発しない。特に、ｓＲＮＡ剤中のｉＲＮＡ剤の鎖の長さは、例えば、有害なインターフェロン応答を誘導しないように十分に短く、３１、３０、２８、２５、または２３ｎｔ未満とすることができる。したがって、哺乳動物細胞へのｓＲＮＡ剤の組成物（例えば、本明細書に記載されるように製剤化された組成物）の投与は、インターフェロン応答を回避しながら標的遺伝子の発現をサイレンシングするために使用され得る。さらに、個別の種類のｉＲＮＡ剤の使用により、例えば、対立遺伝子についてヘテロ接合の対象において、標的遺伝子の一方の対立遺伝子を選択的に標的とすることが可能である。
【００４２】
さらに、１つの実施形態において、哺乳動物細胞は、インターフェロン応答の構成因子（例えば、ｄｓＲＮＡで活性化されるプロテインキナーゼＰＫＲ）を破壊するｉＲＮＡ剤で処理される。このような細胞は、標的ＲＮＡに相補的な配列を含みかつ前記処理がなければインターフェロン応答を誘発しうる長さを有する第２のｉＲＮＡ剤で処理することができる。
【００４３】
代表的な実施形態において、対象は、ウシ、ウマ、マウス、ラット、イヌ、ブタ、ヤギ、または霊長類などの哺乳動物である。対象は、乳用哺乳類（例えばウシまたはヤギ）またはその他の飼育動物（例えばニワトリ、シチメンチョウ、ヒツジ、ブタ、魚、エビ）であってもよい。より好ましい実施形態において、対象はヒトであり、例えば、健常人、あるいは、神経疾患もしくは神経障害を有するか、神経疾患もしくは神経障害を有すると診
断されるか、または神経疾患もしくは神経障害になる素因を有する人である。
【００４４】
神経疾患または神経障害は、神経系（中枢神経系または末梢神経系）に影響するあらゆる疾患または障害である。典型的な神経疾患および神経障害には、ハンチントン病（ＨＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、レーヴィ体痴呆、多系統萎縮症、球脊髄性筋萎縮症（ケネディ病）、トゥーレット症候群、常染色体優性遺伝性脊髄小脳変性症（ＳＣＡ）（例えば、タイプ１のＳＣＡ１、タイプ２のＳＣＡ２、タイプ３（マシャド−ジョセフ病）のＳＣＡ３／ＭＪＤ、タイプ６のＳＣＡ６、タイプ７のＳＣＡ７、タイプ８のＳＣＡ８、フリードライヒ失調症および歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症ＤＲＰＬＡ／Ｈａｗ‐Ｒｉｖｅｒ症候群）、統合失調症、加齢に伴う記憶障害、自閉症、注意欠陥障害、双極性障害および抑うつが挙げられる。
【００４５】
オリゴヌクレオチド剤によって仲介される調節は、オリゴヌクレオチド剤組成物の投与後数日間持続するので、多くの場合において、組成物の投与は１日当たり１回未満の頻度とすることが可能であり、また場合によっては、治療計画全体について１回のみとすることが可能である。例えば、ある種のがん性神経系細胞の治療は単回ボーラス投与によってなされるかもしれないし、慢性のウイルス感染症には定期的な（例えば、１週間に一度または１か月に一度の）投与が必要かもしれない。例えば、星状細胞腫の治療は、親油性物質に結合させたｉＲＮＡ剤の単回ボーラス投与で扱われるかもしれない。
【００４６】
神経疾患および神経障害の治療
神経疾患および神経障害のあらゆる患者が、本明細書に記述された方法または組成物を用いる治療に対する候補である。発症前の対象者も、神経系細胞に対して標的設定されたｉＲＮＡ剤を用いる治療の候補になりうる。例えば、ＨＤのリスクを有すると判定された発症前のヒトは、神経系細胞への送達のために親油性分子（例えばコレステロール分子）に結合させた抗ｈｔｔ  ｉＲＮＡ剤を用いる治療の候補である。１つの実施形態では、発症前の候補者は、リスク要因のプロファイリングおよび機能的な神経画像検査のうちいずれかまたは両方により（例えばフルオロドーパおよび陽電子放射断層撮影により）特定される。例えば、候補対象者はリスク要因のプロファイリング後に機能的な神経画像検査を行うことにより特定することができる。
【００４７】
特定の遺伝子型を有する個人は治療候補である。いくつかの実施形態では、患者は、その患者が神経系の障害（例えばＨＤ）を発症するリスクを高くする特定の遺伝子突然変異を有するであろう。例えば、ｈｔｔ中にＣＡＧトリヌクレオチドの伸長（例えば、リピート数が３６より多い）を有する人はＨＤを発症するリスクが高く、本発明でされたｉＲＮＡ剤、例えば、神経系細胞内への取り込み強化のためにコレステロール分子に結合されたｉＲＮＡ剤を用いる治療の候補である。ｉＲＮＡ剤は好ましくはｈｔｔ遺伝子を標的とする。さらに、ｈｔｔ遺伝子中のＳＮＰは、ＨＤを誘発する伸長ＣＡＧリピートの存在の指標であることが分かった。このＳＮＰは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２１１１における該配列の番号付けで１７１位におけるＡ→Ｃ多型である。したがって、このＳＮＰを有している人は、本発明で着目されたｉＲＮＡ剤を用いる治療の候補であるか、あるいは少なくとも、その人が、ｈｔｔを標的としかつニューロンへの送達を強化するために修飾されたｉＲＮＡ剤を用いる治療に対する候補かどうかをさらに判断することになるさらなる遺伝学的検討（ＣＡＧリピートの伸長に関する試験など）の候補である。
【００４８】
別の実施例において、ＰＤに関する非遺伝性のリスク要因には、年齢（例えば年齢が３０、３５、４０、４５、または５０歳を超える年代）、性別（男性は一般に女性よりリスクが高い）、農薬への曝露、重金属への曝露、および頭部外傷が含まれる。一般的に、内在性および外因性の要因であって、ユビキチンプロテアソーム経路を破壊するもの、もしくはより特異的にプロテアソームを阻害するもの、またはミトコンドリア機能を破壊する
もの、または酸化的ストレスを生じるものが、ある人がＰＤを発症するリスクを増大させる可能性があり、かつＰＤの病因に寄与する可能性がある。これらの要因を、神経系細胞内への取り込み強化のために修飾された（例えば、コレステロール分子に結合させた）ｉＲＮＡ剤を用いる治療の候補対象者のリスク因子を評価する際に考慮することができる。
【００４９】
ｉＲＮＡ剤の設計および選択
候補ｉＲＮＡ剤は、例えば遺伝子ウォーキング分析を実行することによって設計可能である。転写される領域の全体または一部に対応する、重複し、隣接し、または近接しているが間隔のあいた候補薬剤を作製し試験することが可能である。各ｉＲＮＡ剤について、標的遺伝子の発現を下方制御する能力に関して試験および評価することが可能である（後述する「候補ｉＲＮＡ剤の評価」を参照のこと）。
【００５０】
ｉＲＮＡ剤は、配列情報および所望の特徴に基づいて合理的に設計することができる。例えば、ｉＲＮＡ剤を、候補二重鎖の相対的融解温度に従って設計することができる。一般的に、二重鎖は、アンチセンス鎖の３’末端よりもアンチセンス鎖の５’末端において低い融解温度を有することになる。合理的設計についてのこの要素および他の要素は、以下により詳細に議論される（例えば、「パリンドローム」「非対称性」および「Ｚ−Ｘ−Ｙ」、ならびに「末端における二重鎖の安定性についての差別的修飾」および「ワトソン−クリック以外の対合」と記された節を参照のこと）。
【００５１】
候補ｉＲＮＡ剤の評価
候補ｉＲＮＡ剤（例えば親油性部分に結合させた候補ｉＲＮＡ剤）を、神経系細胞内に取り込まれる能力について評価することができる。例えば、親油性部分に結合させた候補ｉＲＮＡ剤を、余分な親油性部分や、細胞内への取り込みを促進するトランスフェクション試薬を含んでいない溶液中に提供する。「トランスフェクション試薬」には、オリゴヌクレオチド剤に対する細胞の透過性を大きく変化させるイオンまたはその他の物質が挙げられる。典型的なトランスフェクション剤には、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＴＭ）（米国カリフォルニア州カールスバード所在のインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ＴＭ）、ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ（ＴＭ）（米国ウィスコンシン州マディソン所在のマイラス（Ｍｉｒｕｓ））、ＦｕＧＥＮＥ６（米国インディアナ州インディアナポリス所在のロッシュ（Ｒｏｃｈｅ））、ポリエチレンイミン、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  Ｑ２（米国インディアナ州インディアナポリス所在のロッシュ）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＳＰＥＲ、Ｍｅｔａｆｅｃｔｅｎｅ（ＴＭ）（ドイツ国ミュンヘン所在のビオンテクス（Ｂｉｏｎｔｅｘ））、あるいはその他のトランスフェクション試薬が挙げられる。
【００５２】
親油性部分に結合させた候補ｉＲＮＡ剤を、神経系細胞培養物中などの細胞培養系で評価することができる。神経系細胞内への取り込みについて所定のレベルが観察される場合、その候補ｉＲＮＡ剤を動物で（例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコまたはサルにおいて）評価することができる。細胞培養物は、マウス、ラットまたはヒトの細胞培養物のような、哺乳動物の細胞培養物でよい。典型的な神経系細胞培養物には、皮質細胞株、線条体細胞株（例えばＳＴ１４Ａ）、褐色細胞腫細胞株（例えばＰＣ１２）、神経芽腫細胞株（例えばＮ２ａ）などが含まれる。細胞培養物は例えば非腫瘍由来または腫瘍由来のニューロン細胞株でもよく、例えば神経膠腫、膠芽腫、髄芽腫、網膜芽細胞腫または神経内分泌系の細胞株に由来するものでよい。典型的な細胞株はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（米国ヴァージニア州マナッサス）より供給を受けることができる。
【００５３】
親油性部分（例えばコレステロール）を含んでいる候補ｉＲＮＡ剤は、神経系細胞内の標的ＲＮＡ（例えばｈｔｔ  ＲＮＡ）に十分に相補的なアンチセンス鎖を含むことができ
、ｉＲＮＡ剤を評価する方法は、同剤が細胞内の標的ＲＮＡの発現を減少させるかどうか測定することを含みうる。
【００５４】
神経系細胞内へ取り込まれうる候補ｉＲＮＡ剤を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける神経系細胞内への取り込みに関してさらに試験することができる。例えば、動物体内への（例えば動物の脳内への）直接注射などによってｉＲＮＡ剤を投与した後、注射部位の組織をｉＲＮＡ剤の取り込みについて調べることができる。ｉＲＮＡ剤の検出は様々な方法によって遂行することができる。例えば、ｉＲＮＡ剤がＣｙ３、Ｃｙ５、ローダミンまたはＦＩＴＣ標識のような蛍光分子で標識される場合、ｉＲＮＡ剤の取り込みはこの蛍光標識の取り込みをモニタリングすることにより分析可能である。検出はまた、例えばｉＲＮＡの存在を検出するために、オリゴヌクレオチドプローブを用いたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって遂行することもできる。標的遺伝子の生成物（標的ＲＮＡまたは標的タンパク質）を検出する分析も、神経系細胞内への候補ｉＲＮＡ剤の取り込みをモニタするために使用することができる。検出は、例えば、標的ＲＮＡを検出するオリゴヌクレオチドプローブを用いたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションまたは標的ポリペプチドを検出する免疫組織化学法によるものでよい。別例として、神経系細胞を含んでいる組織から標的ＲＮＡまたは標的タンパク質を単離し、ＲＮＡを例えばノーザンブロット分析、ＲＴ−ＰＣＲ、またはＲＮＡｓｅ防護アッセイにより、標的タンパク質をウエスタンブロット法により検出することが可能である。ＲＮＡまたはタンパク質のレベルの減少が検出される場合は、観察されたようなＲＮＡまたはタンパク質の発現の減少を引き起こすのに十分な量のｉＲＮＡ剤が細胞内に入っていると判断することができる。
【００５５】
例えば、親油性部分に結合させた候補ｉＲＮＡ剤を提供し、神経系細胞、例えばｈｔｔ遺伝子などの標的遺伝子を発現する神経系細胞と接触させることが可能である。候補ｉＲＮＡ剤との接触の前後における標的遺伝子の発現レベルを比較することができる。標的遺伝子は、細胞内の内在性遺伝子でも外来遺伝子でもよい。標的遺伝子から発現されるＲＮＡまたはタンパク質の量がｉＲＮＡ剤との接触後に低くなることが測定されれば、該ｉＲＮＡ剤が標的遺伝子の発現を下方制御すると結論付けることができる。細胞中の標的ＲＮＡまたは標的タンパク質のレベルは、所望の任意の方法によって測定可能である。例えば、標的ＲＮＡのレベルは、ノーザンブロット分析、ポリメラーゼ連鎖反応を伴う逆転写反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、またはＲＮＡｓｅ保護アッセイによって測定可能である。タンパク質のレベルは、例えばウエスタンブロット分析によって測定可能である。
【００５６】
親油性部分（例えばコレステロール）に結合させたｉＲＮＡ剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの系およびｉｎ  ｖｉｖｏの系のうち少なくともいずれかにおいて試験可能である。例えば、標的遺伝子またはそのフラグメントを、プラスミド上のレポーター遺伝子に融合させることが可能である。このプラスミドをｉＲＮＡ剤候補とともに用いて細胞（例えば神経系細胞）をトランスフェクションすればよい。ｉＲＮＡ剤の効力は、レポーター遺伝子の発現をモニタすることによって評価可能である。このレポーター遺伝子は、例えば、蛍光またはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法などによってｉｎ  ｖｉｖｏでモニタ可能である。典型的な蛍光レポーター遺伝子には、緑色蛍光タンパク質およびルシフェラーゼが含まれるがこれらに限定されない。レポーター遺伝子の発現は、上記のような、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡｓｅ保護アッセイ、またはウエスタンブロット分析によってモニタすることができる。
【００５７】
親油性部分（例えばコレステロール）に結合させたｉＲＮＡ剤の効力は、哺乳動物の細胞株（例えば、哺乳動物の神経系細胞株、例えばヒト神経芽細胞腫の細胞株など）において試験可能である。例えば、抗ｈｔｔ  ｉＲＮＡ剤の効力を試験するために有用な細胞株は、線条体細胞株（例えばＳＴ１４Ａ細胞株）である。親油性部分に結合させたｉＲＮＡ剤を取り込むことが可能なその他の哺乳動物の神経系細胞株には、ニューロンに分化した
褐色細胞腫（例えばＰＣ１２細胞）、ニューロン初代培養物（例えばマウスまたはラットから単離してすぐに培養したもの）、および神経芽細胞腫細胞株が挙げられる。神経芽細胞腫の細胞株には、ＢＥ（２）−Ｍ１７、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（いずれもヒト）、およびＮ２ａ（マウス）が挙げられる。
【００５８】
対照には、
（１）例えば、内在性または外来性の、標的ではない（標的外の）ＲＮＡまたはタンパク質の発現と比較することによって、標的遺伝子の発現の減少についてアッセイし、ｉＲＮＡ剤の効力および特異性を試験すること；および
（２）標的遺伝子の発現に対する効果の特異性を、「機能しない」ｉＲＮＡ剤を投与することによって試験すること
が含まれる。
【００５９】
対照の機能しないｉＲＮＡ剤は、
（ａ）細胞中で発現されない遺伝子を標的とするもの；
（ｂ）ナンセンス配列（例えば、試験ｉＲＮＡを乱雑化（スクランブル）したもの）であるもの；または
（ｃ）標的遺伝子に対して相補的な配列を有するが、遺伝子発現をサイレンシングする能力を欠くことが事前の実験によってわかっているもの
であってよい。
【００６０】
親油性分子に結合させた候補ｉＲＮＡ剤は、ヌクレアーゼ耐性のための他の修飾を含むこともできる。分解性物質に対する耐性は以下のように評価することができる。修飾された候補ｉＲＮＡ剤（および好ましくは対照分子であって通常はヌクレアーゼ耐性に必要であると考えられている修飾を含まないもの）を、分解条件に曝露、例えば、分解性物質（例えばヌクレアーゼ）を含んでいる環境に曝露することができる。例えば、生体試料、例えば治療的使用において遭遇するかもしれない環境に類似の試料、例えば血液または細胞分画（例えば無細胞のホモジェネートまたは破砕した細胞）を使用することができる。その後、候補剤および対照を、多くの手法のうち任意のものによって耐分壊性について評価することができるであろう。例えば、候補剤および対照を、好ましくは曝露の前に、例えば放射標識もしくは酵素標識、またはＣｙ３またはＣｙ５のような蛍光標識で標識することができるであろう。対照ＲＮＡおよび修飾ＲＮＡを、分解性物質および任意選択で対照物（例えば不活性化（例えば熱で不活性化）した分解性物質）とともにインキュベートすることができる。次いで、修飾型分子および対照分子の物理的パラメータ（例えばサイズ）を測定する。パラメータは、物理的方法によって、例えば、分子がその元の長さを維持しているかどうかを評価するためにポリアクリルアミドゲル電気泳動法またはサイズ分離用カラムによって測定してもよいし、あるいは機能によって評価してもよい。別例として、ノーザンブロット分析を用いて未標識の修飾型分子の長さを分析することもできる。
【００６１】
候補剤を評価するために機能分析を使用することもできる。機能分析を、最初に、または初期の非機能的分析（例えば耐分解性に関するアッセイ）の後に適用して、修飾が該分子の遺伝子発現サイレンシング能力を変化させるかどうか測定することもできる。例えば、細胞（例えばマウス細胞またはヒト細胞のような哺乳動物細胞）を、蛍光性タンパク質（例えばＧＦＰ）を発現するプラスミドと、該蛍光性タンパク質をコードする転写物に対して相同な候補ＲＮＡ剤とともに同時トランスフェクションすることができる。例えば、ＧＦＰのｍＲＮＡに相同な修飾ｓｉＲＮＡを、ＧＦＰ発現を阻害する能力について、トランスフェクションに候補ｓｉＲＮＡを含めなかった対照細胞、例えば物質を何も加えない対照または非修飾ＲＮＡを加えた対照のうち少なくともいずれか一方との比較として細胞の蛍光の減少をモニタすることにより、分析することができる。遺伝子発現に対する候補剤の効力は、修飾および非修飾ｉＲＮＡ剤の存在下での細胞の蛍光を比較することにより
評価することができる。
【００６２】
標的ＲＮＡのレベルに対する修飾ｉＲＮＡ剤の作用は、陰性対照との比較として、標的ｍＲＮＡのレベルの減少について分析するノーザンブロット法により、または標的タンパク質のレベルの減少について分析するウエスタンブロット法により、確認することができる。対照には、物質を何も加えない細胞または非修飾ｉＲＮＡ剤を加えた細胞のうち少なくともいずれか一方を含めることができる。
【００６３】
アッセイには、ｉＲＮＡ剤によるサイレンシングの安定性および持続時間をモニタする経時的実験、ならびに分裂中の細胞と分裂していない細胞との比較モニタリングが含まれる。おそらく、分裂中の細胞においては、ｉＲＮＡは時間の経過とともに希釈され、したがってサイレンシング効果の持続時間が減少する。この意味するところは、ｉｎ  ｖｉｖｏでは投薬量を調整しなければならないこと、および／またはサイレンシング効果を維持するためにｉＲＮＡ剤をより頻繁に投与しなければならないことである。分裂していない細胞をモニタするためには、血清の使用を中止して細胞を分裂停止させればよい。ニューロンは分裂終了細胞であり、したがって神経系細胞は、神経系の障害（例えばＨＤのような神経障害）の治療のための治療用組成物において使用するためのｉＲＮＡ剤（例えば、抗ｈｔｔ  ｉＲＮＡ剤）の安定性をアッセイするために適している。
【００６４】
ｉＲＮＡ剤候補を、種間の交差反応性について評価することも可能である。例えば、異なる種（例えば、マウス対ヒト）から誘導された細胞株、または異なる種から単離された生体試料（例えば、血清または組織抽出物）を、親油性部分（例えばコレステロール）に結合させた候補ｉＲＮＡ剤でトランスフェクションすることができる。ｉＲＮＡ剤の効力を、異なる種由来の細胞について測定すればよい。
【００６５】
ｉＲＮＡ剤の安定性試験、修飾、および再試験
神経系細胞への取り込み強化のために親油性物質と結合させた候補ｉＲＮＡ剤を、該ｉＲＮＡ剤が対象の身体に導入される場合などの、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼによる切断に対する感受性に関して評価することができる。修飾、特に切断（例えば、対象の体内に見出される成分による切断）に感受性を有する部位を同定するための方法を利用可能である。この成分（例えば、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼ）は、特定の組織、器官、または体液（例えば、血液、血漿、または血清）などの身体の特定の領域に特異的である可能性がある。身体の特定の領域におけるエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼによる切断のいずれかに感受性を有する、ｉＲＮＡ剤中の部位は、身体の他の領域における切断に対しては耐性である可能性がある。例示的な方法には：
（１）対象の体内に存在する物質、および好ましくは治療用ｄｓＲＮＡが導入されるはずの身体のコンパートメント（治療剤が直接導入されるコンパートメント（例えば、循環系）ならびに治療剤が最終的に標的とするコンパートメントがあるが、場合によっては（例えば、眼および脳）、２つのコンパートメントは同じである））中に存在する成分が、ｄｓＲＮＡ（例えば、ｉＲＮＡ剤）を切断する箇所を決定する工程、および
（２）ｄｓＲＮＡ中の、（例えば、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、またはその両方による）１つまたは複数の切断箇所を同定する工程
が含まれる。任意選択で、この方法はさらに、このような部位における切断を阻害するために修飾されたＲＮＡを提供する工程を包含する。
【００６６】
これらの工程は、以下のアッセイのうち１つ以上を使用することによって達成可能である。
（ｉ）（ａ）候補ｄｓＲＮＡ剤（例えば、ｉＲＮＡ剤）を試験物質（例えば、生体物質）と接触させる、
（ｂ）サイズに基づくアッセイ（例えば、ゲル電気泳動）を使用して、ｉＲＮＡ剤が切断されるか否かを決定する。好ましい実施形態では、経時変化が測定され、異なる時間インキュベートされた多数の試料がサイズに基づくアッセイに供される。好ましい実施形態では、候補のｄｓＲＮＡは標識されない。この方法は、「ステインオール（ｓｔａｉｎｓ  ａｌｌ）」方法であってもよい。
【００６７】
（ｉｉ）（ａ）放射標識された候補ｄｓＲＮＡ（例えば、ｉＲＮＡ剤）を供給する；
（ｂ）試験物質と候補ｄｓＲＮＡを接触させる、
（ｃ）サイズに基づくアッセイ（例えば、ゲル電気泳動）を使用して、ｉＲＮＡ剤が切断されるか否かを決定する。好ましい実施形態では、経時変化が測定されるが、その場合は多数の試料が異なる時間インキュベートされてサイズに基づくアッセイに供される。好ましい実施形態において、測定は、フラグメント中に存在するヌクレオチド数の決定が可能な条件下でなされる。例えば、インキュベートされた試料を、切断産物の長さを決定可能にするマーカーを有するゲルで泳動する。このゲルは、「ラダー」状の消化物である標準品を含んでもよい。センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかを標識してもよい。好ましくは、一方の鎖のみが特定の実験において標識される。標識は、５’末端、３’末端、または内部の位置に組み込むことが可能である。フラグメントの長さ（およびしたがって切断箇所）は、上記のラダーに基づくフラグメントのサイズ、およびＲＮＡｓｅ  Ｔ１などの部位特異的エンドヌクレアーゼを用いたマッピングから決定可能である。
【００６８】
（ｉｉｉ）任意の方法（例えば、上記のうちの１つ）によって生じたフラグメントを質量分析法によって分析可能である。試験物質とｉＲＮＡ剤を接触させた後、ｉＲＮＡ剤を、例えば、フェノール−クロロホルム抽出とその後の沈殿処理によって精製（例えば、部分精製）可能である。次いで、液体クロマトグラフィを使用してフラグメントを分離可能であり、そして質量分析法を使用して各フラグメントの分子量を決定することができる。このことにより、切断のメカニズム、例えば、５’または３’エキソヌクレアーゼ切断などの直接的なリン酸の切断によるものか、または環状リン酸の形成を介して２’ＯＨによって仲介されているかを決定することができる。
【００６９】
２以上のｉＲＮＡ剤（例えば、抗ｈｔｔ  ｉＲＮＡ剤）を評価することが可能である。この評価を用いて、治療用ｉＲＮＡ剤に使用する配列を選択することが可能である。例えば、評価することによって、対象の体内の関連コンパートメント中に存在する物質（例えば、酵素）によって切断される最適な（通常最小の）数の部位を有する配列を選択することが可能になる。最適化された配列を選択するために、２以上のｉＲＮＡ候補を評価すればよい。例えば、２以上の候補を評価し、最適な特性を有するもの（例えば、切断部位がより少ないもの）を選択することが可能である。
【００７０】
切断部位に関する情報は、修飾（例えば、切断を減少させるための修飾）のためのバックボーンの原子、糖、または塩基を選択するために使用可能である。
例示的な修飾には、本明細書に記載される修飾などの、エンドヌクレアーゼによる分解を阻害する修飾が含まれる。特に好ましい修飾には：２’−修飾、例えば、センス鎖またはアンチセンス鎖（とりわけセンス鎖）のＵへの２’ＯＭｅ部分の付与；バックボーンの修飾、例えば、リン酸バックボーン内のＯをＳに置換する修飾、例えば、特にアンチセンス鎖のＵまたはＡまたはその両方へのホスホロチオエート修飾の付与；ＵからＣ５アミノリンカーへの置換；ＡからＧへの置換（配列の変化はセンス鎖上に配置されアンチセンス鎖上には配置されないことが好ましい）；および２’位、６’位、７’位、または８’位の修飾、が含まれる。好ましい実施形態は、これらの修飾のうち１つ以上がセンス鎖上に存在するがアンチセンス鎖上には存在しない実施形態、またはアンチセンス鎖が有するこのような修飾がより少ない実施形態である。
【００７１】
例示的な修飾には、エキソヌクレアーゼによる分解を阻害する修飾も含まれる。エキソヌクレアーゼによる分解を阻害する修飾の例は本明細書において見出され得る。特に好ましい修飾には：２’−修飾、例えば、３’突出部の例えば３’末端（３’末端とは、文脈から示されるように、分子の３’位の原子または最も３’側の構成部分、例えば最も３’側のＰまたは２’位を意味する）への２’ＯＭｅ部分の付与；バックボーンの修飾、例えば、ＰからＳへの置換を伴う修飾、例えば、ホスホロチオエート修飾の付与、または３’突出部の例えば３’末端におけるメチル化Ｐの使用；２’−修飾の組み合わせ、例えば、２’ＯＭｅ部分およびバックボーンの修飾（例えば、ＰからＳへの置換を伴う修飾、例えば、ホスホロチオエート修飾の供給、または３’突出部の例えば３’末端におけるメチル化Ｐの使用）の付与；３’アルキルを用いる修飾；３’突出部の例えば３’末端における脱塩基ピロリジンを用いる修飾；ナプロキセン、イブプロフェン、または分解を阻害する他の部分を用いる３’末端の修飾、が挙げられる。
【００７２】
これらの方法は、神経系細胞への取り込み強化のために親油性部分（例えばコレステロール）に結合させた治療用ｉＲＮＡ剤を選択およびまたは最適化するために使用可能である。
【００７３】
該方法は、親油性部分に結合させた候補ｉＲＮＡ剤、および修飾（例えば、分解を阻害する修飾、ｄｓＲＮＡ分子を標的とする修飾、またはハイブリダイゼーションを調節する修飾）をさらに含む候補ｉＲＮＡ剤を評価するために使用可能である。このような修飾は本明細書に記載されている。切断アッセイを、修飾または非修飾の候補が標的をサイレンシングする能力を測定するためのアッセイと組み合わせることも可能である。例えば、標的（または標的でない配列）をサイレンシングする能力を評価するために候補剤を（任意選択で）試験し、切断に対する感受性を評価し、修飾された候補剤を作製するために候補剤を（例えば、本明細書に記載されるように、例えば、分解を阻害するために）修飾し、修飾された候補剤を、サイレンシング能力および分解耐性のうち一方または両方について試験することができよう。この手順を繰り返しても良い。修飾は、一度に１つ導入してもよいし、まとめて導入してもよい。ｉＲＮＡ剤がサイレンシングする能力をモニタするために、細胞を用いる方法を使用することもできる。これに続いて、活性を確認するために異なる方法（例えば、動物全体を用いる方法）を実施することも可能である。
【００７４】
試験物質とは、生体物質、例えば、生体試料、組織抽出物もしくは調製物、血清、ｄｓＲＮＡを修飾（例えば、切断）することが知られている既知の酵素またはその他の分子（例えば、エンドヌクレアーゼ）を指す。試験物質は、ＲＮＡｉ剤が曝露されることになる体内コンパートメントに存在し得る。例えば、神経組織に（例えば、脳または脊髄に）直接的に投与されるｉＲＮＡ剤については、試験物質は脳組織抽出物または脊髄液であり得る。眼に直接的に供給されるｉＲＮＡ剤は、眼の抽出物とともにインキュベートすればよい。
【００７５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ試験
親油性部分と結合され、かつ培養中の神経系細胞に侵入する能力が強化されていると同定されたｉＲＮＡ剤を、動物モデル（例えば、マウスまたはラットなどの哺乳動物のモデル）においてｉｎ  ｖｉｖｏでの機能性について試験することができる。例えば、ｉＲＮＡ剤を動物に投与して、該ｉＲＮＡ剤の生体内分布（例えば神経系細胞への取り込み）、安定性、および神経系細胞内の標的遺伝子の発現を阻害する能力に関して評価することができる。
【００７６】
ｉＲＮＡ剤は、ヒトに投与するのと同じ様式で動物モデルに投与することができる。例えば、ｉＲＮＡ剤を脳の標的領域に（例えば、皮質、黒質、淡蒼球、海馬、または線条体に）直接注射し、一定時間の後に脳を採取し組織薄片を同剤の分布について調べることが
できる。
【００７７】
ｉＲＮＡ剤について、その細胞内分布についても評価することができる。この評価は、ｉＲＮＡ剤が細胞に取り込まれたか否かを測定することを包含し得る。この評価は、ｉＲＮＡ剤の安定性（例えば、半減期）を測定することを包含し得る。ｉｎ  ｖｉｖｏでのｉＲＮＡ剤の評価は、追跡可能なマーカー（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ、ローダミン、またはフルオレセインなどの蛍光マーカー；３２Ｐ、３３Ｐ、もしくは３Ｈなどの放射活性標識；金粒子；または免疫組織化学法のための抗原粒子）と結合させたｉＲＮＡ剤の使用によって容易となりうる。
【００７８】
生体内分布をモニタするために有用なｉＲＮＡ剤は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子サイレンシング活性を欠いていてもよい。例えば、該ｉＲＮＡ剤は、その動物には存在しない遺伝子を標的としていてもよいし（例えば、マウスに注射されるｉＲＮＡ剤がルシフェラーゼを標的としていてもよい）、またはｉＲＮＡ剤がいかなる遺伝子も（例えば、内在性のいかなる遺伝子も）標的としないナンセンス配列を有していてもよい。ｉＲＮＡの局在化／生体内分布は、ｉＲＮＡ剤に結合された追跡可能な標識、例えば、上記の追跡可能な薬剤などによってモニタ可能である。
【００７９】
親油性部分に結合されたｉＲＮＡ剤を、標的遺伝子の発現を下方制御する能力に関して評価することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏでの標的遺伝子の発現レベルは、例えばｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、またはｉＲＮＡ剤に曝露させる前後に組織からＲＮＡを単離することによって測定可能である。標的ＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、またはＲＮＡａｓｅ保護アッセイを含むがこれらに限定されない任意の所望の方法によって検出可能である。代替例として、または追加として、標的遺伝子の発現を、ｉＲＮＡ剤で処理された組織抽出物についてウエスタンブロット分析を実行することによってモニタすることが可能である。
【００８０】
神経系細胞内への取り込み強化のために親油性物質に結合されたｉＲＮＡ剤を、マウスの神経疾患モデルで試験することができる。例えば、親油性物質に結合されたｉＲＮＡ剤を、ヒトｈｔｔ遺伝子の野生型コピーを有しているマウスのようなマウスのＨＤモデルで、あるいは突然変異型のヒトｈｔｔ（例えば、伸長したＣＡＧリピートを有しているｈｔｔ遺伝子）を有しているマウスで試験することができる。治療処理したマウスモデルを、ＨＤに伴う症状の減少（例えばクラスピングの減少）について観察することができる。治療処理したマウスを、他の表現型、例えば、脳細胞（例えば脳の中型有棘ニューロン）内のＤＡＲＰＰタンパク質の発現について評価することもできる。１つの実施形態では、そのような第２のアッセイには、ウエスタンブロット分析または有棘ニューロンを含む脳組織のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の、マウス脳の解剖が必要である。
【００８１】
ｉＲＮＡの化学
本明細書中に記載されているのは、ＲＮＡｉを仲介する単離ｉＲＮＡ剤（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）である。このｉＲＮＡ剤は、神経系細胞への取り込み強化のために、該ｉＲＮＡを少なくとも１つの親油性部分（例えば、コレステロール分子）に結合させることにより修飾されている。
【００８２】
概して、本発明において着目されたｉＲＮＡ剤は、該ｉＲＮＡ剤またはそのフラグメントが標的遺伝子の下方制御を仲介することができるように、標的遺伝子（例えば、神経系細胞内で発現される標的遺伝子）に対して十分な相同性を有する領域を含み、かつヌクレオチドの長さが十分であるべきである。ｉＲＮＡ剤と標的との間に必ずしも完全な相補性が存在する必要はないが、その一致は、ｉＲＮＡ剤またはその切断産物が、例えば、標的ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）のＲＮＡｉ切断によって、配列特異的なサイレンシングをも
たらすのを可能にするために十分でなくてはならない。したがって、本発明で着目されるｉＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖からなる薬剤を含み、各鎖は、鎖あたり１、２、または３個以下のヌクレオチドがそれぞれ他のヌクレオチドで置換されている（例えばアデノシンがウラシルに置き換えられる）ことを除いて、神経系細胞中で発現される遺伝子の配列と（以下に定義されるように）本質的に同一の、少なくとも１６、１７または１８ヌクレオチドの配列を含んでなり、同時に哺乳動物細胞における標的遺伝子の発現を阻害する能力は本質的に保持している。したがって、典型的なｉＲＮＡ剤は、標的遺伝子の配列と同一の少なくとも１５ヌクレオチドを有するが、ただし標的ｍＲＮＡの配列に関して、またはセンス鎖とアンチセンス鎖との間に、１、２または３塩基のミスマッチが導入されているものでよい。特にアンチセンス鎖における、標的ｍＲＮＡの配列に対するミスマッチは、末端領域において最も寛容性が高く、存在する場合、好ましくは末端領域にあり、例えば、５’末端および／または３’末端の６ヌクレオチド以内、５ヌクレオチド以内、４ヌクレオチド以内、または３ヌクレオチド以内にあり、もっとも好ましくは、センス鎖の５’末端またはアンチセンス鎖の３’末端の６ヌクレオチド以内、５ヌクレオチド以内、４ヌクレオチド以内、または３ヌクレオチド以内にある。センス鎖には、該分子の二本鎖全体の性質を維持するために十分なアンチセンス鎖との相補性があればよい。
【００８３】
ｉＲＮＡ剤の一本鎖領域は、修飾されているかまたはヌクレオシド代用物を含むことが多く、例えば、ヘアピン構造の対合していない領域（例えば、２つの相補性領域をつなぐ領域）は、修飾またはヌクレオシド代用物を有し得る。ｉＲＮＡ剤の３’末端もしくは５’末端のうち一方または両方を、例えば、エキソヌクレアーゼに対して安定化するために修飾すること、またはアンチセンスｓＲＮＡ剤をＲＩＳＣ内に優先的に入れるために修飾することも好ましい。修飾は、Ｃ３（またはＣ６、Ｃ７、Ｃ１２）アミノリンカー、チオールリンカー、カルボキシルリンカー、非ヌクレオチド性スペーサー（Ｃ３、Ｃ６、Ｃ９、Ｃ１２、脱塩基、トリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール）、特殊なビオチン、あるいは、ホスホロアミダイトとして提供され、かつ新たなＤＭＴ保護されたヒドロキシル基を有し、ＲＮＡ合成の際に複数のカップリングを可能にするフルオレセイン試薬を含むことが可能である。本明細書中の他所で議論するように、ｉＲＮＡ剤は修飾されるか、またはヌクレオチド代用物に加えてＳＲＭＳを含むことが多いであろう。ＳＲＭＳはリボヌクレオチドのリボース糖を、別の部分、例えば糖質以外の（好ましくは環式の）担体で置換する。ＳＲＭＳについては後に詳細に説明する。
【００８４】
哺乳動物の細胞において、長いｄｓ  ｉＲＮＡ剤は、有害なことの多いインターフェロン応答を誘導する可能性があるが、短いｄｓ  ｉＲＮＡ剤は、少なくとも細胞または宿主に対して有害なほどにはインターフェロン応答を誘発しない。本発明のｉＲＮＡ剤は、哺乳動物の細胞においてインターフェロン応答を誘発しない十分に短い分子を含む。従って、ｉＲＮＡ剤の組成物（例えば、本明細書に記載のように製剤化されたもの）を哺乳動物の細胞に投与して、神経系細胞において発現される遺伝子（例えばｈｔｔ遺伝子）の発現をサイレンシングすると同時にインターフェロン応答を回避することが可能である。インターフェロン応答を誘発しない程度に十分短い分子は、本明細書中では、ｓＲＮＡ剤または短いｉＲＮＡ剤と呼ばれる。「ｓＲＮＡ剤または短いｉＲＮＡ剤」は、本明細書中で使用される場合、ｉＲＮＡ剤であって、例えば、ヒト細胞において有害なインターフェロン応答を誘導しない十分に短い二本鎖ＲＮＡ剤または一本鎖ＲＮＡ剤を指し、例えば、同ＲＮＡ剤は、６０ヌクレオチド対未満、しかし好ましくは５０、４０、または３０ヌクレオチド対未満の二本鎖領域を有する。
【００８５】
標的ＲＮＡに対する相同性および標的遺伝子を下方制御する能力に加えて、ｉＲＮＡ剤は好ましくは以下の特性のうち１つ以上を有することになる：
（１）後述の式１、２、３、または４のものである；
（２）一本鎖である場合、１つ以上のリン酸基または１つ以上のリン酸基アナログを含
む５’修飾を有する；
（３）非常に多数の塩基が修飾されていても、特異的な塩基対を形成し、かつ標的ＲＮＡとともに熱力学的安定性が十分な二重鎖構造を形成して標的ＲＮＡの活性を変化させることが可能である；
（４）非常に多数またはすべてのヌクレオシドが修飾されているにもかかわらず、なお「ＲＮＡ様の」特性を有する。すなわち、リボヌクレオチドに基づく含量では独占的でなく、または部分的でさえあるにも関わらす、ＲＮＡ分子の全体的な構造上の特性、化学的特性および物理的特性を有する。例えば、すべてのヌクレオチド糖が２’ヒドロキシルの代わりに例えば２’ＯＭｅまたは２’フルオロを含むことが可能である。このようなデオキシリボヌクレオチド含有剤は、なおＲＮＡ様の特性を示すことが予測されうる。理論によって束縛されることは望まないが、電気的に陰性のフッ素は、リボースのＣ２’位に結合されたときに軸方向に配向する傾向がある。このフッ素の空間的な優先傾向は、ひいては、糖のＣ３’内部にくぼみを形成させる。これは、ＲＮＡ分子中で観察されるのと同じくぼみ形成様式であり、ＲＮＡに特徴的なＡファミリー型ヘリックスを生じる。さらに、フッ素は良好な水素結合のアクセプターであるので、ＲＮＡ構造を安定化させることが知られている水分子と同じ水素結合相互作用に関与することが可能である。一般的には、糖の２’位で修飾された部分は、デオキシリボヌクレオチドの２’‐Ｈ部分よりも、リボヌクレオチドの２’‐ＯＨ部分により特徴的である水素結合に参加することができることが好ましい。好ましいｉＲＮＡ剤は：その糖の全体または少なくとも５０、７５、８０、８５、９０、もしくは９５％において、Ｃ３’内部にくぼみを示し；ＲＮＡに特徴的なＡファミリー型ヘリックスを生じることが可能な程度に十分な量の糖においてＣ３’内部のくぼみを示し；Ｃ３’内部のくぼみ構造ではない２０個、１０個、５個、４個、３個、２個、または１個以下の糖を有する。これらの制限はアンチセンス鎖において特に好ましく；
糖のＣ３’内部のくぼみを備えた好ましい２’修飾には：
２’‐ＯＨ、２’‐Ｏ‐Ｍｅ、２’‐Ｏ‐メトキシエチル、２’‐Ｏ‐アミノプロピル、２’‐Ｆ、２’‐Ｏ‐ＣＨ２‐ＣＯ‐ＮＨＭｅ、２’‐Ｏ‐ＣＨ２‐ＣＨ２‐Ｏ‐ＣＨ２‐ＣＨ２‐Ｎ（Ｍｅ）２、ＬＮＡが含まれる；
（５）修飾の性質にかかわらず、またオリゴヌクレオチド剤がデオキシヌクレオチドまたは修飾デオキシヌクレオチドを含むことが可能であるとしても、ＤＮＡ分子、あるいは、分子中のヌクレオチドの５０、６０、もしくは７０％より多くがデオキシリボヌクレオチドであるかまたは２’位がデオキシである修飾デオキシリボヌクレオチドである任意の分子は、オリゴヌクレオチド剤の定義から除外することが好ましい。
【００８６】
「ｄｓ  ｉＲＮＡ剤」（「二本鎖（ｄｓ）ｉＲＮＡ剤」の略語）は、本明細書中で使用される場合、鎖間のハイブリダイゼーションにより二本鎖構造を形成することが可能な、２以上、好ましくは２本の鎖を含むｉＲＮＡ剤である。
【００８７】
二本鎖ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０、または５０ヌクレオチド長に等しいか、または少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０、または５０ヌクレオチド長であるべきである。この鎖は、６０、５０、４０、または３０ヌクレオチド長以下であるべきである。好ましい範囲は、１５〜３０、１７〜２５、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチド長である。
【００８８】
二本鎖ｉＲＮＡ剤のセンス鎖は、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０、または５０ヌクレオチド長に等しいか、あるいは少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０、または５０ヌクレオチド長であるべきである。該センス鎖は、６０、５０、４０、または３０ヌクレオチド長以下であるべきである。好ましい範囲は、１７〜２５、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチド長である。
【００８９】
二本鎖ｉＲＮＡ剤の二本鎖部分は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２９、４０、または５０ヌクレオチド対の長さであるか、または少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２９、４０、または５０ヌクレオチド対の長さであるべきである。該二本鎖部分は、６０、５０、４０、または３０ヌクレオチド対以下の長さであるべきである。好ましい範囲は、１５〜３０、１７〜２３、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチド対の長さである。
【００９０】
二本鎖ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖およびセンス鎖の一方または両方を修飾することが望ましい場合がある。ある例において、これらの鎖は同じ修飾または同じ部類の修飾を有するが、他の例において、センス鎖およびアンチセンス鎖は異なる修飾を有し、例えば、ある例ではセンス鎖のみが修飾されることが望ましい。センス鎖のみを、例えばセンス鎖を不活性化するために修飾することが望ましい場合があり、例えば、センス鎖は、センス鎖を不活性化し、かつ活性なｉＲＮＡ／タンパク質またはＲＩＳＣの形成を妨害するために修飾可能である。これは、センス鎖の５’リン酸化を妨害する修飾によって、例えば、５’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを用いる修飾によって達成可能である（ニーケネン（Ｎｙｋａｅｎｅｎ）ら、（２００１）「ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway.」Ｃｅｌｌ  第１０７巻、ｐ．３０９〜３
２１を参照のこと）。リン酸化を妨害する他の修飾、例えば、単に５’−ＯＨをＯ−ＭｅではなくＨによって置換することもまた使用可能である。代替例として、大きな嵩高い基が５’リン酸基に付加されてこの基がホスホジエステル結合に転換されてもよいが、これは、ホスホジエステラーゼがこのような結合を切断して機能的なｓＲＮＡ５’末端を生じる可能性があるので、あまり望ましくないかもしれない。アンチセンス鎖の修飾には、５’リン酸化ならびに本明細書中で議論される任意の他の５’修飾が含まれる。
【００９１】
センス鎖およびアンチセンス鎖は、ｄｓ  ｉＲＮＡ剤が該分子の一端または両端に一本鎖領域または非対合領域を含むように選択されることが好ましい。したがって、ｄｓ  ｉＲＮＡ剤は、好ましくは突出部（例えば、１つまたは２つの５’または３’突出部であるが好ましくは２〜３ヌクレオチドの３’突出部）を含むように対合したセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。多くの実施形態は３’突出部を有する。好ましいｉＲＮＡ剤は、一本鎖突出部、好ましくは、各々の末端に１〜４（または好ましくは２〜３）ヌクレオチド長の３’突出部を有する。この突出部は、ある鎖が他の鎖よりも長い結果として生じてもよいし、または、ずれを有する同じ長さの２つの鎖から生じてもよい。５’末端はリン酸化されることが好ましい。
【００９２】
二重鎖領域についての好ましい長さは、例えば、上記に議論したｉＲＮＡ剤の範囲において、１５〜３０ヌクレオチド長、最も好ましくは１８、１９、２０、２１、２２、および２３ヌクレオチド長である。ｉＲＮＡ剤は、長さおよび構造において、長いｄｓＲＮＡ由来の天然のＤｉｃｅｒ処理産物に類似していてもよい。ｓＲＮＡ剤の２つの鎖が連結される（例えば、共有結合される）実施形態もまた含まれる。ヘアピン、または他の一本鎖構造物であって必要とされる二本鎖領域および好ましくは３’突出部を提供するものもまた、本発明の範囲内にある。
【００９３】
本明細書中で使用される場合、語句「ＲＮＡｉを仲介する」とは、ある作用物質が配列特異的な様式で標的遺伝子をサイレンシングする能力をいう。「標的遺伝子のサイレンシング」とは、該作用物質と接触していないときには標的遺伝子の一定の産物を含有かつ／または分泌している神経系細胞が、該作用物質と接触すると、その遺伝子産物を、該作用物質と接触しなかった同じ神経系細胞と比べて少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％少なく含有かつ／または分泌するようになるプロセスを意味する。例えば、標的遺伝子のそのような産物は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、タンパク質、または調節因子であってよい。理論によって束縛され
ることを望まないが、本明細書に記載の作用物質によるサイレンシングは、ＲＮＡｉの機構またはプロセスおよびガイドＲＮＡ（例えば、１５〜３０ヌクレオチド対のｉＲＮＡ剤）を使用すると考えられる。
【００９４】
本明細書中で使用される場合、用語「相補的」は、安定かつ特異的な結合が本発明の化合物と標的ＲＮＡ分子（例えば、ｈｔｔ  ｍＲＮＡ分子）との間に起こるような、十分な程度の相補性を示すために使用される。特異的結合には、特異的結合が望まれる条件下で、すなわち、インビボアッセイもしくは治療的処置の場合においては生理学的条件下で、またはインビトロアッセイの場合においてはそのアッセイが実行される条件下で、オリゴマー化合物が非標的配列に非特異的に結合するのを回避するために十分な程度の相補性が必要である。非標的配列は、一般的には少なくとも４ヌクレオチド異なる。
【００９５】
本明細書において使用されるように、ｉＲＮＡ剤は、該ｉＲＮＡ剤が標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の産生を低減する場合、標的ＲＮＡ（例えば、標的ｍＲＮＡ）に「十分に相補的」である。ｉＲＮＡ剤はまた、標的ＲＮＡに対して（ＳＲＭＳ含有サブユニットを除外して）「厳密に相補的」であってもよく、例えば、標的ＲＮＡおよびｉＲＮＡ剤は、好ましくは、厳密に相補的な領域においてワトソン−クリック塩基対のみから構成されるハイブリッドを形成するようにアニールすることができる。「十分に相補的な」標的ＲＮＡは、標的ＲＮＡ（例えば、ｈｔｔ  ＲＮＡ）に厳密に相補的である領域（例えば、少なくとも７ヌクレオチドの領域）を含み得る。さらに、ある実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、単一ヌクレオチドの違いを特異的に区別する。
【００９６】
神経系細胞への取り込み強化のために親油性物質と結合させたｉＲＮＡ剤には、例えば、効力を改善するためにさらに修飾されたｉＲＮＡ剤、およびヌクレオシド代用物のポリマーが含まれる。未修飾のＲＮＡとは、核酸の成分、すなわち、糖、塩基、およびリン酸の部分が、天然に存在する、好ましくは人体において天然に存在するのと同じかまたは実質的に同じである分子をいう。当該分野では、修飾ＲＮＡのような、希少または異常であるが天然に存在するＲＮＡについて言及されており、例えば、リンバック（Ｌｉｍｂａｃｈ）ら、（１９９４）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２１８３〜２１９６を参照されたい。しばしば修飾ＲＮＡと呼ばれるこのような希少ＲＮＡまたは異常ＲＮＡは、一般的には転写後修飾の結果であるが、本明細書中で使用される場合には用語「非修飾ＲＮＡ」の範囲内にある。修飾ＲＮＡは、本明細書中で使用される場合、１つ以上の核酸の成分、すなわち、糖、塩基、およびリン酸の部分が、天然に存在するものと異なる、好ましくは人体において存在するものと異なる分子をいう。これらは修飾ＲＮＡと呼ばれるが、当然、修飾されているので厳密に言えばＲＮＡではない分子を含むことになる。ヌクレオシド代用物は、リボリン酸バックボーンが、塩基が正しい空間的関係に提示され、その結果ハイブリダイゼーションがリボリン酸バックボーンの場合に見られるのとほぼ同じになることを可能にする非リボリン酸構築物（例えば、リボリン酸バックボーンの非荷電型模倣物）で置き換えられている分子である。上記のすべての例について本明細書中で議論する。
【００９７】
以下の議論の多くが一本鎖分子に言及する。しかしながら、当然であるがｄｓ  ｉＲＮＡ剤（例えば、部分的なｄｓ  ｉＲＮＡ剤）が必要または好適である。したがって、当然ながら、以下に記載される一本鎖構造から作られる二本鎖構造（例えば、２つの別々の分子が接触して二本鎖領域を形成する場合、または二本鎖領域が分子内対合によって形成される場合（例えば、ヘアピン構造））は本発明の範囲内にある。好ましい長さについては本明細書中の他の箇所に述べる。
【００９８】
核酸は、サブユニットまたはモノマーの重合物であるので、以下に記載される修飾の多くが核酸内で反復される位置に存在する（例えば、塩基、またはリン酸部分、またはリン
酸部分の結合していないＯの修飾）。ある場合において修飾は核酸中の対象位置すべてに存在するが、しかし、多くの場合および実際上大部分においては、そうではない。例として、修飾は、３’または５’末端位置にのみ存在する場合があり、末端領域（例えば、末端ヌクレオチド上の位置または鎖の最後の２、３、４、５、もしくは１０ヌクレオチド）にのみ存在する場合もある。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域、または両方に存在することができる。修飾は、ＲＮＡの二本鎖領域中にのみ存在してもよいし、またはＲＮＡの一本鎖領域にのみ存在してもよい。リガンドが、３’末端、５’末端、または内側の位置、またはこれらを組み合わせた位置に結合していてもよい。例えば、リガンドは３’末端および５’末端にあってもよいし；３’末端と１以上の内側の位置にあってもよいし；５’末端と１以上の内側の位置にあってもよいし；３’末端、５’末端および１以上の内側の位置にあってもよい。例えば、結合していないＯの位置のホスホロチオエート修飾が、一方もしくは両方の末端にのみ存在してもよいし、末端領域（例えば、末端ヌクレオチド上の位置または鎖の最後の２、３、４、５、もしくは１０ヌクレオチド内）にのみ存在してもよいし、または二本鎖および一本鎖の領域に、特に末端に存在することも可能である。同様に、修飾はセンス鎖上でも、アンチセンス鎖上でも、両方の鎖上にあってもよい。ある場合には、センス鎖およびアンチセンス鎖は同じ修飾または同じ部類の修飾を有するが、別の場合にはセンス鎖およびアンチセンス鎖は異なる修飾を有し、例えばある例では一方の鎖（例えばセンス鎖）のみを修飾することが望ましい。５’末端がリン酸化されてもよい。特定の好ましい実施形態では、センス鎖はコレステロールの付加により３’末端が修飾される。
【００９９】
ある実施形態では、一本鎖突出部（例えば、５’もしくは３’突出部、もしくはその両方）において、例えば、安定性を増強すること、突出部に特定の塩基を含めること、または修飾ヌクレオチドもしくはヌクレオチド代用物を含めることが特に好ましい。例えば、突出部にプリンヌクレオチドを含めることが望ましいことがあり得る。ある実施形態において、３’または５’の突出部の塩基のすべてまたは一部の塩基が、例えば、本明細書中に記載される修飾を用いて修飾される。修飾には、例えば、リボース糖の２’ＯＨ基の修飾の使用、例えば、リボヌクレオチドの代わりとしてのデオキシリボヌクレオチド（例えば、デオキシチミジン）の使用、およびリン酸基の修飾（例えば、ホスホチオエート修飾）が含まれうる。突出部は、標的配列と相同である必要はない。
【０１００】
修飾およびヌクレオチド代用物について以下に議論する。
【０１０１】
【化１】
2009504782.tif 000007
上記に式１において提示される骨格はリボ核酸の一部分を表す。基本成分はリボース糖、塩基、末端のリン酸、およびヌクレオチド間リン酸リンカーである。塩基が天然に存在する塩基（例えば、アデニン、ウラシル、グアニン、またはシトシン）であり、糖が非修飾２’ヒドロキシルリボース糖（示されているとおり）であり、かつＷ、Ｘ、およびＺがすべてＯである場合、式１は天然に存在する非修飾オリゴリボヌクレオチドを表す。
【０１０２】
非修飾オリゴリボヌクレオチドは、ある適用においては最適とはいえない場合があり、例えば、非修飾オリゴリボヌクレオチドは、例えば細胞のヌクレアーゼによる分解を受けやすい可能性がある。ヌクレアーゼは核酸のホスホジエステル結合を加水分解することができる。しかし、上記のＲＮＡ成分の１つ以上を化学修飾すると特性を改善することが可能であり、例えば、オリゴリボヌクレオチドをヌクレアーゼに対してより安定性にすることが可能である。未修飾のオリゴリボヌクレオチドはまた、ｉＲＮＡ剤にリガンドまたは他の構成部分を結合するための係留地点を提供するという観点で最適とはいえない場合もある。
【０１０３】
修飾核酸およびヌクレオチド代用物は、以下の１つ以上を含むことが可能である：
（ｉ）変更、例えば、結合していないリン酸の酸素（ＸおよびＹ）の一方もしくは両方の置換、および／または結合しているリン酸の酸素（ＷおよびＺ）の１つ以上の置換（リン酸が末端位置にある場合、位置ＷまたはＺの１つは、天然に存在するリボ核酸中ではさらなるエレメントにリン酸を結合しないことになる。しかし、用語の単純化のために、別途注記される場合以外は、核酸の５’末端のＷ位置および核酸の３’末端のＺ位置は、本明細書中で使用される用語「結合していないリン酸の酸素」の範囲内にある）；
（ｉｉ）変更、例えば、リボース糖の構成成分（例えば、リボース糖上の２’ヒドロキシル）の置換、またはリボース糖の、リボース以外の構造（例えば、本明細書中に記載されるようなもの）による大規模置換；
（ｉｉｉ）リン酸部分（括弧Ｉ）の、「リンを含まない（ｄｅｐｈｏｓｐｈｏ）」リンカーによる大規模置換；
（ｉｖ）天然に存在する塩基の修飾または置換；
（ｖ）リボース−リン酸バックボーン（括弧ＩＩ）の置換または修飾；
（ｖｉ）ＲＮＡの３’末端もしくは５’末端の修飾、例えば、末端リン酸基の除去、修飾、または置換、あるいはＲＮＡの３’末端もしくは５’末端のいずれかへの、構成部分（例えば、蛍光標識部分）の結合。
【０１０４】
用語「置換」、「修飾」、「変更」などは、この文脈で使用される場合、任意のプロセスの限定を意味するものではなく、例えば、修飾とは、標準のまたは天然に存在するリボ核酸を用いて開始しかつそれを修飾して修飾リボ核酸を産生しなくてはならないことを意味するものではなく、「修飾された」とは、単に天然に存在する分子との違いを意味する。
【０１０５】
当然のことであるが、ある化学的実体の実際の電子的構造を、たった１つの標準的な型（すなわち、ルイス構造）によって十分に表すことは可能ではない。理論によって束縛されることを望まないが、実際の構造はそうではなく、共鳴型または共鳴構造として集合的に知られる２以上の標準的な型の何らかの混合物または加重平均であり得る。共鳴構造は、個別の化学的実体ではなく、紙の上でのみ存在する。これらは、特定の化学的実体についての結合電子および非結合電子の配置または「局在」においてのみ、互いに異なっている。１つの共鳴構造が他の構造よりも高い程度で混合物に寄与することが可能である。したがって、本発明の実施形態について記載かつ図示される説明は、特定の種類についての主要な共鳴型として当該分野で認識されているものに関してなされる。例えば、すべてのホスホロアミデート（結合していない酸素の窒素による置換）は、上記の図においてはＸ＝ＯおよびＹ＝Ｎで表される。
【０１０６】
リン酸基の置換
リン酸基は、リン以外のものを含む接続部によって置換可能である（上記の式１中の括弧Ｉを参照のこと）。理論によって束縛されることは望まないが、荷電したホスホジエステル基はヌクレアーゼ分解における反応中心なので、この基を中性の構造模倣物で置換するとヌクレアーゼ安定性が強化されるはずであると考えられる。やはり理論によって束縛されることは望まないが、ある実施形態においては、荷電したリン酸基を中性部分によって置換する変更を導入することが望ましい可能性がある。
【０１０７】
リン酸基を置換することが可能な構成部分の例には、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキサイドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノが挙げられる。好ましい置換基には、メチレンカルボニルアミノ基およびメチレンメチルイミノ基が含まれる。
【０１０８】
候補の修飾は後述のようにして評価可能である。
リボリン酸バックボーンの置換
リン酸リンカーおよびリボース糖がヌクレアーゼ耐性のヌクレオシドまたはヌクレオチド代用物によって置換されている、オリゴヌクレオチドを模倣するバックボーンを構築することも可能である（上記の式１の括弧ＩＩを参照のこと）。理論によって束縛されることは望まないが、反復的に荷電したバックボーンが存在しなければ、ポリアニオンを認識するタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ）への結合が減少すると考えられる。やはり理論によって束縛されることは望まないが、ある実施形態においては、塩基を中性の代用バックボーンに連結する変更を導入することが望ましい可能性がある。
【０１０９】
例には、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）など
のヌクレオシド代用物が含まれる。好ましい代用物はＰＮＡ代用物である。
候補の修飾は後述のようにして評価可能である。
【０１１０】
末端修飾
オリゴヌクレオチドの３’末端および５’末端を修飾することが可能である。このような修飾は、分子の３’末端、５’末端、または両方の末端にあってもよい。該修飾には、末端のリン酸全体の、または末端リン酸基の１つ以上の原子の、修飾または置換が含まれうる。例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端および５’末端を、他の機能的分子実体、例えば標識部分（例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素もしくはＣｙ５色素などのフルオロフォア）または保護基（例えば、硫黄、ケイ素、ホウ素、もしくはエステルを含む基など）に結合させることが可能である。前記機能的分子実体は、リン酸基またはスペーサーのうち少なくともいずれか一方を介して糖に結合することが可能である。スペーサーの末端原子は、該リン酸基の連結原子または糖のＣ−３’もしくはＣ−５’のＯ、Ｎ、Ｓ、もしくはＣ基を接続または置換することが可能である。代替例として、スペーサーは、ヌクレオチド代用物（例えば、ＰＮＡ）の末端原子を接続または置換することが可能であってもよい。これらのスペーサーまたはリンカーは、例えば、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮ−、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−（ＣＨ２）ｎＳ−、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＨ（例えば、ｎ＝３または６）、脱塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、またはモルホリノなど、またはビオチン試薬およびフルオレセイン試薬を含み得る。「スペーサー／リン酸‐機能的分子実体‐スペーサー／リン酸」という配列構造が、ｉＲＮＡ剤の２つの鎖の間に介在するとき、この配列構造は、ヘアピン型ＲＮＡ剤中のヘアピンＲＮＡループの代わりに機能することが可能である。３’末端は−ＯＨ基であり得る。理論に束縛されることは望まないが、特定の部分を結合することにより、輸送、ハイブリダイゼーションおよび特異性についての特性を改善することが可能であると考えられる。やはり理論に束縛されることは望まないが、ヌクレアーゼ耐性を改善する末端の変更を導入することが望ましい可能性がある。
【０１１１】
末端修飾の他の例には、色素、インターカレート剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サッフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性担体（例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コール酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド結合体（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射線標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール結合体、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋錯体）が含まれる。
【０１１２】
末端修飾は、本明細書中の他の箇所で議論されるような理由など多くの理由から、活性を調節するために、または分解に対する耐性を調節するために、付与可能である。好ましい修飾には、最も３’端側の結合へのメチルホスホネートの付与；３’−Ｃ５−アミノアルキル−ｄＴ；３’カチオン基；または３’−５’エキソヌクレアーゼ分解を阻害するその他の３’結合物が挙げられる。
【０１１３】
活性を調節するために有用な末端修飾には、リン酸またはリン酸アナログによる５’末端の修飾が含まれる。例えば、好ましい態様において、ｉＲＮＡ剤、とりわけアンチセンス鎖は、５’リン酸化されるか、または５’末端にリン酸基アナログを含む。５’リン酸修飾には、ＲＩＳＣ介在性の遺伝子サイレンシングと適合可能であるものが含まれる。適切な修飾には、５’一リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’二リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’三リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化）（７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、および任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’モノチオリン酸（ホスホロチオエート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’ モノジチオリ
ン酸（ホスホロジチオエート；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’ホスホロチオール酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５’）；酸素／硫黄で置換された一リン酸、二リン酸、および三リン酸の任意のさらなる組合せ（例えば、５’−α−チオ三リン酸、５’−γ−チオ三リン酸など）、５’−ホスホロアミデート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−アルキルホスホン酸（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ−５’−ＣＨ２−）、５’−アルキルエーテルホスホン酸（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２−）、エトキシメチルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−）が挙げられる。
【０１１４】
末端修飾はまた、分布をモニタするためにも有用でありうるが、そのような場合において、付加されるべき好ましい基には、フルオロフォア、例えば、フルオレセインまたはＡｌｅｘａ色素（例えば、Ａｌｅｘａ  ４８８）が含まれる。末端修飾はまた、取り込みを増強するために有用でありうるが、このために有用な修飾にはコレステロールが含まれる。末端修飾はまた、ＲＮＡ剤を別の部分に架橋するためにも有用でありうるが、このための有用な修飾にはマイトマイシンＣが含まれる。
【０１１５】
ヌクレアーゼ耐性の強化
神経系細胞内への取り込み強化のために親油性部分に結合されたｉＲＮＡ剤のヌクレアーゼ耐性を強化することができる。
【０１１６】
ヌクレアーゼ耐性または標的への結合親和性のうち少なくともいずれか一方を強化するために、ｉＲＮＡ剤、例えば、ｉＲＮＡ剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖のうち少なくともいずれか一方に、例えば、２’修飾型リボース・ユニットまたはホスホロチオエート結合のうち少なくともいずれか一方を含めることができる。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）を修飾するか、あるいは多くの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基に置き換えることができる。
【０１１７】
「オキシ」型の２’ヒドロキシル基修飾の例には、アルコキシまたはアリールオキシ（ＯＲ、例えばＲ＝Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ）；２’ヒドロキシルが例えばメチレン架橋によって同じリボース糖の４’炭素に接続されている「ロックされた」核酸（ＬＮＡ）；Ｏ−ＡＭＩＮＥおよびアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ２）ｎＡＭＩＮＥ（例えば、ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）が挙げられる。注目すべきことは、メトキシエチル基（ＭＯＥ）、（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ＰＥＧ誘導体）のみを含んでいるオリゴヌクレオチドが、強健なホスホロチオエート修飾で修
飾されたものに匹敵するヌクレアーゼ安定性を示すことである。
【０１１８】
「デオキシ」修飾には、水素（つまり、部分的ｄｓＲＮＡの突出部に特に関連しているデオキシリボース糖）；ハロ（例えばフルオロ）；アミノ（例えばＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸）；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ）、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（Ｒ＝アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖）、シアノ；メルカプト；アルキルチオアルキル；チオアルコキシ；ならびに、任意選択で例えばアミノ官能性で置換されている場合もあるアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニルおよびアルキニル、が挙げられる。
【０１１９】
好ましい置換基は、２’−メトキシエチル、２’−ＯＣＨ３、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、および２’−フルオロである。
ある態様では、ｉＲＮＡ剤のヌクレアーゼ耐性は、ヌクレアーゼ感受性の部位を特定し、切断を阻害するために当該部位を修飾することによって強化される。例えば、ジヌクレオチド５’−ＵＡ−３’、５’ＵＧ３’、５’−ＣＡ−３’、５’ＵＵ−３’、または５’−ＣＣ−３’は、切断部位としての役割を果たす可能性がある。したがって、ヌクレアーゼ耐性の強化は、５’ヌクレオチドを修飾して、例えば、ウリジンが２'−修飾ヌクレ
オチドである少なくとも１つの５'−ウリジン−アデニン−３'（５'−ＵＡ−３'）ジヌクレオチド；５'−ウリジンが２'−修飾ヌクレオチドである少なくとも１つの５'−ウリジ
ン−グアニン−３'（５'−ＵＧ−３'）ジヌクレオチド；５'−シチジンが２'−修飾ヌク
レオチドである少なくとも１つの５'−シチジン−アデニン−３'（５'−ＣＡ−３'）ジヌクレオチド；５'−ウリジンが２'−修飾ヌクレオチドである少なくとも１つの５'−ウリ
ジン−ウリジン−３'（５'−ＵＵ−３'）ジヌクレオチド；または５'−シチジンが２'−
修飾ヌクレオチドである少なくとも１つの５'−シチジン−シチジン−３'（５'−ＣＣ−
３'）ジヌクレオチドを生じることにより達成可能である。ｉＲＮＡ剤は、このようなジ
ヌクレオチドを少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、または少なくとも５個含み得る。ある実施形態では、ｉＲＮＡ剤の全てのピリミジンが２’−修飾を有し、したがって該ｉＲＮＡ剤は高いエンドヌクレアーゼ耐性を有する。
【０１２０】
ヌクレアーゼ耐性を最大にするために、２’修飾を１以上のリン酸リンカー修飾（例えばホスホロチオエート）と組み合わせて使用することができる。いわゆる「キメラ」オリゴヌクレオチドは、２以上の異なる修飾を含むものである。
【０１２１】
オリゴヌクレオチドのバックボーン中にフラノース糖を含めることによっても、エンドヌクレアーゼによる切断を減少させることができる。ｉＲＮＡ剤は、３’カチオン基を含めることにより、あるいは３’−末端のヌクレオシドを３’−３’結合を用いて逆向きにすることにより、さらに修飾することができる。別の代替例では、３’末端をアミノアルキル基（例えば３’Ｃ５アミノアルキルｄＴ）でブロックすることができる。その他の３’結合物も３’−５’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害することができる。理論に束縛されることは望まないが、３’結合物、たとえばナプロキセンまたはイブプロフェンは、エキソヌクレアーゼがオリゴヌクレオチドの３’末端に結合するのを立体的に妨害することによりエキソヌクレアーゼによる切断を阻害するのかもしれない。小さなアルキル鎖、アリール基もしくはヘテロシクリルの結合物、または修飾された糖（Ｄリボース、デオキシリボース、グルコースなど）でも、３’−５’エキソヌクレアーゼを妨害することができる。
【０１２２】
同様に、５’結合物は５’−３’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害することができる。理論に束縛されることは望まないが、５’結合物、たとえばナプロキセンまたはイブプロフェンは、エキソヌクレアーゼがオリゴヌクレオチドの５’末端に結合するのを立体的に妨害することによりエキソヌクレアーゼによる切断を阻害するのかもしれない。小さなアルキル鎖、アリール基もしくはヘテロシクリルの結合物、または修飾された糖（Ｄリボース、デオキシリボース、グルコースなど）でも、３’−５’エキソヌクレアーゼを妨害することができる。
【０１２３】
二重鎖ｉＲＮＡ剤が少なくとも一端に一本鎖ヌクレオチド突出部を含んでいる場合、該ｉＲＮＡ剤は高いヌクレアーゼ耐性を有することができる。好ましい実施形態では、ヌクレオチド突出部は１〜４個、好ましくは２〜３個の非対合ヌクレオチドを有している。好ましい実施形態では、末端のヌクレオチド対に直接隣接している一本鎖突出部の非対合ヌクレオチドはプリン塩基を含み、末端のヌクレオチド対はＧ‐Ｃ塩基対であるか、または最後の４対の相補的ヌクレオチド対のうち少なくとも２つがＧ‐Ｃ塩基対である。さらなる実施形態では、ヌクレオチド突出部は１〜２個の非対合ヌクレオチドを有する場合もあり、典型的な実施形態ではヌクレオチド突出部は５’−ＧＣ−３’である。好ましい実施形態では、ヌクレオチド突出部はアンチセンス鎖の３’末端上にある。１つの実施形態では、ｉＲＮＡ剤はアンチセンス鎖の３’末端にモチーフ５’−ＣＧＣ−３’を含み、２ｎｔの突出部５’−ＧＣ−３’が形成されるようになっている。
【０１２４】
したがって、ｉＲＮＡ剤は、分解（例えば、対象の体内に見出される、例えばエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼなどのヌクレアーゼによる分解）を阻害するような修飾を含むことができる。これらのモノマーは、本明細書ではＮＲＭ、すなわちヌクレアーゼ耐性促進モノマー（Ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ
Ｍｏｎｏｍｅｒ）と呼ばれ、対応する修飾はＮＲＭ修飾と呼ばれる。多くの場合、これらの修飾は、ｉＲＮＡ剤の他の特性、例えばタンパク質（例えば輸送タンパク質（例えば血清アルブミン）またはＲＩＳＣ構成物）と相互作用する能力、または第１および第２の配列が互いに二重鎖を形成するかもしくは別の配列（例えば標的分子）と二重鎖を形成する能力をも同様に変化させることになろう。
【０１２５】
１以上の異なるＮＲＭ修飾を、１つのｉＲＮＡ剤あるいはｉＲＮＡ剤の１つの配列中に導入することができる。ＮＲＭ修飾は、１つの配列または１つのｉＲＮＡ剤中で２回以上使用することができる。
【０１２６】
ＮＲＭ修飾には、末端にのみ配置可能なものと、任意の位置に配置可能なその他のものとが含まれる。一般に、これらの修飾はハイブリダイゼーションを阻害する可能性があるので、末端領域でのみ該修飾を使用することが好ましく、対象の配列または遺伝子を標的とする配列であって特にアンチセンス鎖上の配列の切断部位または切断領域には該修飾を使用しないことが好ましい。ただしｄｓ  ｉＲＮＡ剤の２つの鎖の間に十分なハイブリダイゼーションが維持されるのであれば、センス鎖内の任意の場所に該修飾を使用することができる。いくつかの実施形態では、ＮＲＭをセンス鎖の切断部位または切断領域に置くことが望ましいが、これは標的外のサイレンシングを最小限にすることができるからである。
【０１２７】
ほとんどの場合、ＮＲＭ修飾はセンス鎖に含まれるかまたはアンチセンス鎖に含まれるかに依存して様々に分配されることになる。アンチセンス鎖上の場合、エンドヌクレアーゼ切断を妨害または阻害する修飾は、ＲＩＳＣを仲介した切断の対象領域（例えば切断部位または切断領域）に挿入されるべきではない。本明細書で使用されるように、切断部位とは、標的上の、または標的にハイブリダイズするｉＲＮＡ剤の鎖上の、切断部位のいずれかの側のヌクレオチドを指す。切断領域とは、切断部位からいずれかの方向に１、２ま
たは３ヌクレオチド以内にあるヌクレオチドを意味する。
【０１２８】
そのような修飾は、末端領域内に、例えば、末端位置または末端から２、３、４、もしくは５位以内に導入することができる。
リボース模倣体
本明細書に記載のモノマーおよび方法を用いて、リボース模倣体を組み込んだオリゴヌクレオチド剤を調製することができる。
【０１２９】
したがって、本発明の１態様は、ｉＲＮＡ剤の有効性の増大または同剤へのヌクレアーゼ耐性の付与のうち少なくともいずれか一方が可能である、第二級ヒドロキシル基を含むｉＲＮＡ剤を特徴とする。ヌクレアーゼ、例えば細胞ヌクレアーゼは、核酸のホスホジエステル結合を加水分解することが可能であり、その結果核酸は部分的または完全に分解される。第二級ヒドロキシル基は、この修飾を欠くｉＲＮＡと比べて、ｉＲＮＡ剤がヌクレアーゼ分解を受ける傾向を低下させることによって、ｉＲＮＡ剤にヌクレアーゼ耐性を付与する。理論によって縛られることは望まないが、ｉＲＮＡ剤上の第二級ヒドロキシル基の存在が３’リボースのヒドロキシル基の構造上の模倣体として働くことによって、ｉＲＮＡ剤が分解を受けにくくなると考えられる。
【０１３０】
第二級ヒドロキシル基とは、２つの他の炭素および１つの水素によって置換された炭素原子に結合している「ＯＨ」基を指す。上記のようにヌクレアーゼ耐性を与える第二級ヒドロキシル基は、任意の非環式炭素含有基の一部であってよい。該ヒドロキシル基は、任意の環式炭素含有基の一部であってもよく、以下の条件、すなわち（１）ヒドロキシル基と末端リン酸基の間にリボース部分が存在しないこと、または（２）該ヒドロキシル基は塩基と結合した糖部分には存在しないこと、のうち１つ以上に見合うことが好ましい。該ヒドロキシル基は、ｉＲＮＡ剤の末端リン酸基のリンから、少なくとも２結合（化学結合２個）の位置にある（例えば、少なくとも３結合離れて、少なくとも４結合離れて、少なくとも５結合離れて、少なくとも６結合離れて、少なくとも７結合離れて、少なくとも８結合離れて、少なくとも９結合離れて、少なくとも１０結合離れている、など）。好ましい実施形態では、末端リン酸基のリンと第二級ヒドロキシル基との間に５つの介在結合が存在する。
【０１３１】
末端リン酸基のリンと第二級ヒドロキシル基との間に５つの介在結合を有する、好ましいｉＲＮＡ剤送達モジュールは、以下の構造を有する（以下の式Ｙを参照）：
【０１３２】
【化２】
2009504782.tif 000008
式Ｙを参照すると、Ａは、本明細書に記載の任意のｉＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤である。該ｉＲＮＡ剤は、リン酸基の「Ｗ」と直接結合していてもよいし、間接的に（例えばスペーサーまたはリンカーを介して）結合していてもよい。これらのスペーサーまたはリンカーには、例えば−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮ−、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−（ＣＨ２）ｎＳ−、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＨ（例えば、ｎ＝３または６）、脱塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、もしくはモルホリノ、またはビオチン試薬およびフルオレセイン試薬が挙げられる。
【０１３３】
ｉＲＮＡ剤の末端リン酸基は、非修飾状態（例えば、Ｗ、Ｘ、Ｙ、およびＺがＯ）であっても修飾されていてもよい。修飾されているリン酸基では、ＷおよびＺは独立にＮＨ、ＯまたはＳであってよく；ＸおよびＹは独立にＳ、Ｓｅ、ＢＨ３−、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｈ、Ｏ、Ｏ−、アルコキシまたはアミノ（アルキルアミノ、アリールアミノなどを含む）であってよい。Ｗ、ＸおよびＺがＯであり、ＹがＳであることが好ましい。
【０１３４】
Ｒ１およびＲ３はそれぞれ独立に、水素；またはＣ１〜Ｃ１００アルキルであり、Ｃ１〜Ｃ１００アルキルは任意選択でヒドロキシル、アミノ、ハロ、リン酸または硫酸基で置換されているか、あるいは任意選択でＮ、Ｏ、Ｓ、アルケニルまたはアルキニルが挿入されているかのうち少なくともいずれかである。
【０１３５】
Ｒ２は、水素；Ｃ１〜Ｃ１００アルキルであって任意選択でヒドロキシル、アミノ、ハロ、リン酸または硫酸基で置換されているか、あるいは任意選択でＮ、Ｏ、Ｓ、アルケニルまたはアルキニルが挿入されているかのうち少なくともいずれかであるＣ１〜Ｃ１００アルキルであり；あるいは、ｎが１であるとき、Ｒ２がＲ４またはＲ６と合わさって５〜１２原子の環を形成してもよい。
【０１３６】
Ｒ４は、水素；Ｃ１〜Ｃ１００アルキルであって任意選択でヒドロキシル、アミノ、ハロ、リン酸または硫酸基で置換されているか、あるいは任意選択でＮ、Ｏ、Ｓ、アルケニルまたはアルキニルが挿入されているかのうち少なくともいずれかであるＣ１〜Ｃ１００アルキルであり；あるいは、ｎが１であるとき、Ｒ４がＲ２またはＲ５と合わさって５〜１２原子の環を形成してもよい。
【０１３７】
Ｒ５は、水素、Ｃ１〜Ｃ１００アルキルであって任意選択でヒドロキシル、アミノ、ハロ、リン酸または硫酸基で置換されているか、あるいは任意選択でＮ、Ｏ、Ｓ、アルケニルまたはアルキニルが挿入されているかのうち少なくともいずれかであるＣ１〜Ｃ１００アルキルであり；あるいは、ｎが１であるとき、Ｒ５がＲ４と合わさって５〜１２原子の環を形成してもよい。
【０１３８】
Ｒ６は、水素、Ｃ１〜Ｃ１００アルキルであって任意選択でヒドロキシル、アミノ、ハロ、リン酸または硫酸基で置換されているか、あるいは任意選択でＮ、Ｏ、Ｓ、アルケニルまたはアルキニルが挿入されているかのうち少なくともいずれかであるＣ１〜Ｃ１００アルキルであり、あるいは、ｎが１であるとき、Ｒ６がＲ２と合わさって６〜１０原子の環を形成してもよい。
【０１３９】
Ｒ７は水素、Ｃ１〜Ｃ１００アルキル、またはＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｑＣ（Ｏ）ＮＨＲ９であり；Ｔは水素または官能基であり；ｎおよびｑはそれぞれ独立に１〜１００であり；Ｒ８はＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ６〜Ｃ１０アリールであり；かつＲ９は水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリールまたは固形支持体物質である。
【０１４０】
好ましい実施形態は、以下のｉＲＮＡ剤送達モジュールのサブセットのうち１つまたは複数を含むことが可能である。
ＲＮＡｉ剤送達モジュールの１つのサブセットでは、Ａは該ＲＮＡ剤の末端３’または５’リボース糖の炭素を介して、直接的あるいは間接的に結合することが可能である。
【０１４１】
ＲＮＡｉ剤送達モジュールの他のサブセットでは、Ｘ、ＷおよびＺがＯであり、ＹがＳである。
ＲＮＡｉ剤送達モジュールのさらに他のサブセットでは、ｎは１であり、Ｒ２とＲ６が合わさって６原子を含む環を形成し、Ｒ４とＲ５が合わさって６原子を含む環を形成する。環系はトランス−デカリンであることが好ましい。例えば、このサブセットのＲＮＡｉ剤送達モジュールは、式（Ｙ−１）の化合物を含むことが可能である：
【０１４２】
【化３】
2009504782.tif 000009
官能基は例えば、標的設定（ターゲティング）基（例えばステロイドまたは糖質）、レポーター基（例えばフルオロフォア）、または標識（同位元素で標識された部分）であってよい。標的設定基にはさらに、タンパク質結合物質、内皮細胞に向けて標的設定する基（例えばＲＧＤペプチドおよびＲＧＤ模倣体）、癌細胞に向けて標的設定する基（例えば葉酸ビタミンＢ１２、ビオチン）、骨細胞に向けて標的設定する基（例えばビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸）、多価マンノース（例えばマクロファージ試験用）、ラクトース、ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、モノクローナル抗体、糖タンパク質、レクチン、メラノトロピン、またはチロトロピンが挙げられる。
【０１４３】
当業者には理解され得るように、本明細書中の式の化合物を合成する方法は当業者には明らかであろう。合成した化合物を反応混合物から分離し、カラムクロマトグラフィ、高
速液体クロマトグラフィ、または再結晶化などの方法によってさらに精製することが可能である。さらに、様々な合成工程を他の順序または順番で実施して所望の化合物を得ることも可能である。本明細書に記載した化合物を合成する際に有用な、合成化学変換および保護基に関する方法（保護および脱保護）は当分野で知られており、例えばＲ．ラロック（Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ）、「Comprehensive Organic Transformations」、ＶＣＨ出版（Ｖ
ＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）（１９８９）；Ｔ．Ｗ．グリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）およびＰ．Ｇ．Ｍ．ワッツ（Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ）、「Protective Groups in Organic Synthesis」、第２版、ジョンワイリーアンドサンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ
Ｓｏｎｓ）（１９９１）；Ｌ．ファイザー（Ｌ．Ｆｉｅｓｅｒ）およびＭ．ファイザー（Ｍ．Ｆｉｅｓｅｒ）、「Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis」、
ジョンワイリーアンドサンズ（１９９４）；およびＬ．パケッテ（Ｌ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ）編「Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis」、ジョンワイリーアンドサンズ（１９９５）、ならびにその後続版に記載されたものなどを含む。
【０１４４】
糖置換修飾サブユニット
神経系細胞への取り込み強化のため修飾されるｉＲＮＡ剤は、リガンド、例えば親油性リガンドに接続される。該リガンドは該オリゴヌクレオチド剤に対し、モノマー（例えばオリゴヌクレオチド剤の中に組み込まれる化学修飾モノマー）を介して接続される。好ましい実施形態では、この接続は本明細書に記載の係留部またはリンカー（または両方）により行われ、該複合物は式：
リガンド‐［リンカー］任意‐［係留部］任意‐オリゴヌクレオチド剤
で表される。
【０１４５】
多くの場合、実施形態はいくつかのヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド剤に関して説明されるが、本発明は以下の構造：
リガンド‐［リンカー］任意‐［係留部］任意‐モノマー
を有するモノマーサブユニットを包含する。
【０１４６】
モノマーを製造してオリゴヌクレオチド剤に組み込む方法、および該オリゴヌクレオチド剤の使用方法は、本発明に含まれる。
好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチド剤の糖（例えば、ヌクレオチド（例えば、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、または修飾ヌクレオチド）の１または複数のリボース糖）サブユニットは、他の構成部分、例えば非糖質の（好ましくは環式の）担体で置換することが可能である。ヌクレオチド・サブユニットであって該サブユニットの糖がそのように置換されているものを、本願明細書では糖置換修飾サブユニット（ＳＲＭＳ）と呼ぶ。これは本明細書において「係留部」と呼ばれることも多い。環式担体は炭素環系（すなわち、すべての環原子が炭素原子）であってもよいし、あるいはヘテロ環系（すなわち、１つまたは複数の環原子がヘテロ原子、例えば窒素、酸素、イオウ）であってもよい。環式担体は単環系であってもよいし、あるいは２つ以上の環、例えば縮合環を含むことも可能である。環式担体は完全に飽和した環系であってもよいし、あるいは１つまたは複数の二重結合を含んでいてもよい。
【０１４７】
担体はさらに、（ｉ）少なくとも２つの「バックボーン結合点」および（ｉｉ）少なくとも１つの「係留結合点」を含む。本願明細書で使用する「バックボーン結合点」とは、官能基（例えばヒドロキシル基）、または一般的に、バックボーン（例えばリボ核酸のリン酸バックボーンまたはイオウを含むなどの修飾リン酸バックボーン）への担体の取り込みに利用可能かつ好適な結合を指す。本願明細書で使用する「係留結合点」とは、環式担体の構成環原子、例えば炭素原子またはヘテロ原子（バックボーン結合点を提供する原子とは異なるもの）であって、選択した構成部分と結合する原子を指す。選択した構成部分は、例えばリガンド（例えば標的設定部分または送達成分）、または物理的性質を変化さ
せる構成部分であってよい。最も好ましい構成部分の１つは、細胞内への侵入を促進する構成部分、例えば親油性部分（例えば、コレステロール）である。理論に束縛されることは望まないが、親油性物質の結合によりオリゴヌクレオチド剤の親油性が増大すると考えられる。場合によっては、選択した構成部分を、係留部を介在させて環式担体と接続する。したがって選択した構成部分は、官能基（例えばアミノ基）を含むか、または一般的に、他の化学的実体（例えば構成環に対するリガンド）の取り込みまたは連結に適した結合を与えることが多くなる。
【０１４８】
本願明細書に記載の１または複数のＳＲＭＳをオリゴヌクレオチド剤中に取り込むことにより、特に適切な実体に係留させた場合、１または複数の新しい性質を該オリゴヌクレオチド剤に付与し、かつ／あるいは該オリゴヌクレオチド剤の１または複数の既存の性質を変更、強化、または調節することが可能である。例えば、親油性またはヌクレアーゼ耐性のうち１つまたは複数を変更することが可能である。本願明細書に記載の１または複数のＳＲＭＳをオリゴヌクレオチド剤中に組み込むことによって、特にＳＲＭＳが適切な実体に係留された場合、標的ＲＮＡ（例えば対象または対象の病原体のプレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）に対するオリゴヌクレオチド剤の結合親和性を調節する（例えば増大させる）ことが可能である。１または複数のＳＲＭＳを組み込むことにより、分布を変化させること、オリゴヌクレオチド剤の標的を身体の特定部分に向けること、（例えばＲＩＳＣ形成時および鎖の分離時の）核酸結合タンパク質との相互作用を改変すること、あるいは（例えば的外れな標的指向性を抑制するための）配列特異性の増大が可能である。
【０１４９】
したがって、１態様では、本発明は、好ましくは式（Ｉ）の構造を有する少なくとも１つのサブユニットを含んでなるオリゴヌクレオチド剤を特徴とする。
【０１５０】
【化４】
2009504782.tif 000010
（式中、
ＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７、ＮＲ７またはＣＨ２であり；
ＹはＮＲ８、Ｏ、Ｓ、ＣＲ９Ｒ１０であるかまたは存在せず；
ＺはＣＲ１１Ｒ１２であるかまたは存在せず；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０のそれぞれは独立にＨ、ＯＲａ、ＯＲｂ、（ＣＨ２）ｎＯＲａ、または（ＣＨ２）ｎＯＲｂであって、ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０のうち少なくとも１つはＯＲａまたはＯＲｂであり、かつＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０のうち少なくとも１つは（ＣＨ２）ｎＯＲａ、または（ＣＨ２）ｎＯＲｂであり（ＳＲＭＳが末端に存在するとき、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０のうち１つはＲａを含み、かつ１つはＲｂを含み；ＳＲＭＳＳが内部に存在するとき、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０のうち２つがそれぞれＲｂを含む）；さらに、ＯＲａは（ＣＨ２）ｎＯＲｂとともにのみ存在し、（ＣＨ２）ｎＯＲａはＯＲｂとともにのみ存在することが好ましく；
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１１、およびＲ１２のそれぞれは独立に、Ｈ、任意選択で１〜３個のＲ１３で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、またはＣ（Ｏ）ＮＨＲ７であり；あるいは、Ｒ５およびＲ１１が合わさって、任意選択でＲ１４により置換されたＣ３〜Ｃ８シクロアルキルをなし；
Ｒ７はリガンドであってよく、例えばＲ７はＲｄであってもよいし、あるいはＲ７は担体に間接的に（例えば、係留部分を介して）係留されたリガンド、例えばＮＲｃＲｄで置換されたＣ１〜Ｃ２０アルキル；またはＮＨＣ（Ｏ）Ｒｄで置換されたＣ１〜Ｃ２０アルキルであり；
Ｒ８はＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ１３はヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、またはハロであり；
Ｒ１４はＮＲｃＲ７であり；
Ｒａは、
【０１５１】
【化５】
2009504782.tif 000011
であり；
Ｒｂは、
【０１５２】
【化６】
2009504782.tif 000012
であり；
ＡおよびＣのそれぞれは独立に、ＯまたはＳであり；
ＢはＯＨ、Ｏ−、または
【０１５３】
【化７】
2009504782.tif 000013
であり；
ＲｃはＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
ＲｄはＨまたはリガンド（例えば親油性リガンド、例えばコレステロール）であり；
ｎは１〜４である。）
実施形態は、以下の特徴のうち１以上を含むことができる。
【０１５４】
Ｒ１がＣＨ２ＯＲａでＲ３がＯＲｂであるか；Ｒ１がＣＨ２ＯＲａでＲ９がＯＲｂであるか；Ｒ１がＣＨ２ＯＲａでＲ２がＯＲｂであってよい。
Ｒ１がＣＨ２ＯＲｂでＲ３がＯＲｂであるか；Ｒ１がＣＨ２ＯＲｂでＲ９がＯＲｂであるか；Ｒ１がＣＨ２ＯＲｂでＲ２がＯＲｂであるか；Ｒ１がＣＨ２ＯＲｂでＲ３がＯＲａであるか；Ｒ１がＣＨ２ＯＲｂでＲ９がＯＲａであるか；Ｒ１がＣＨ２ＯＲｂでＲ２がＯＲａであってよい。
【０１５５】
Ｒ１がＯＲａでＲ３がＣＨ２ＯＲｂであるか；Ｒ１がＯＲａでＲ９がＣＨ２ＯＲｂであるか；Ｒ１がＯＲａでＲ２がＣＨ２ＯＲｂであってよい。
Ｒ１がＯＲｂでＲ３がＣＨ２ＯＲｂであるか；Ｒ１がＯＲｂでＲ９がＣＨ２ＯＲｂであるか；Ｒ１がＯＲｂでＲ２がＣＨ２ＯＲｂであるか；Ｒ１がＯＲｂでＲ３がＣＨ２ＯＲａであるか；Ｒ１がＯＲｂでＲ９がＣＨ２ＯＲａであるか；Ｒ１がＯＲｂでＲ２がＣＨ２ＯＲａであってよい。
【０１５６】
Ｒ３がＣＨ２ＯＲａでＲ９がＯＲｂであるか；Ｒ３がＣＨ２ＯＲａでＲ４がＯＲｂであってよい。
Ｒ３がＣＨ２ＯＲｂでＲ９がＯＲｂであるか；Ｒ３がＣＨ２ＯＲｂでＲ４がＯＲｂであるか；Ｒ３がＣＨ２ＯＲｂでＲ９がＯＲａであるか；Ｒ３がＣＨ２ＯＲｂでＲ４がＯＲａであってよい。
【０１５７】
Ｒ３がＯＲｂでＲ９がＣＨ２ＯＲａであるか；Ｒ３がＯＲｂでＲ４がＣＨ２ＯＲａであるか；Ｒ３がＯＲｂでＲ９がＣＨ２ＯＲｂであるか；Ｒ３がＯＲｂでＲ４がＣＨ２ＯＲｂであってよい。
【０１５８】
Ｒ３がＯＲａでＲ９がＣＨ２ＯＲｂであるか；Ｒ３がＯＲａでＲ４がＣＨ２ＯＲｂであってよい。
Ｒ９がＣＨ２ＯＲａでＲ１０がＯＲｂであってよい。
【０１５９】
Ｒ９がＣＨ２ＯＲｂでＲ１０がＯＲｂであるか；Ｒ９がＣＨ２ＯＲｂでＲ１０がＯＲａであってよい。
好ましい実施形態では、リボースはピロリン骨格または４−ヒドロキシプロリン由来の骨格で置換され、かつＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹはＣＲ９Ｒ１０であり、かつＺは存在しない。
【０１６０】
Ｒ１およびＲ３はシス位にあってもよいし、Ｒ１およびＲ３はトランス位にあってもよい。
ｎは１でよい。
【０１６１】
ＡはＯまたはＳでよい。
Ｒ１が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでＲ３がＯＲｂであるか；Ｒ１が（ＣＨ２）ｎＯＲａでＲ３がＯＲｂであってよい。
【０１６２】
Ｒ７は（ＣＨ２）５ＮＨＲｄまたは（ＣＨ２）５ＮＨＲｄであってよい。Ｒｄは、葉酸基；コレステロール基；糖質基；ビタミンＡ基；ビタミンＥ基；ビタミンＫ基から選択することができる。好ましくは、Ｒｄはコレステロール基である。
【０１６３】
Ｒ１がＯＲｂでＲ３が（ＣＨ２）ｎＯＲｂであるか；Ｒ１がＯＲｂでＲ３が（ＣＨ２）ｎＯＲａであるか；Ｒ１がＯＲａでＲ３が（ＣＨ２）ｎＯＲｂであるか；Ｒ１が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでＲ９がＯＲａであってよい。
【０１６４】
Ｒ１およびＲ９はシス位にあってもよいし、Ｒ１およびＲ９はトランス位にあってもよい。
Ｒ１がＯＲａでＲ９が（ＣＨ２）ｎＯＲｂであるか；Ｒ１が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでＲ９がＯＲｂであるか；Ｒ１が（ＣＨ２）ｎＯＲａでＲ９がＯＲｂであるか；Ｒ１がＯＲｂでＲ９が（ＣＨ２）ｎＯＲｂであるか；Ｒ１がＯＲｂでＲ９が（ＣＨ２）ｎＯＲａであってよい。
【０１６５】
Ｒ３が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでＲ９がＯＲａであるか；Ｒ３が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでＲ９がＯＲｂであるか；Ｒ３が（ＣＨ２）ｎＯＲａでＲ９がＯＲｂであるか；Ｒ３がＯＲａでＲ９が（ＣＨ２）ｎＯＲｂであるか；Ｒ３がＯＲｂでＲ９が（ＣＨ２）ｎＯＲｂであるか；Ｒ３がＯＲｂでＲ９が（ＣＨ２）ｎＯＲａであってよい。
【０１６６】
Ｒ３およびＲ９はシス位にあってもよいし、Ｒ３およびＲ９はトランス位にあってもよい。
別の実施形態では、リボースはピペリジン骨格で置換され、かつＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹはＣＲ９Ｒ１０であり、かつＺはＣＲ１１Ｒ１２である。
【０１６７】
Ｒ９が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでＲ１０がＯＲａであってよい。
ｎは１または２でよい。
Ｒ９が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでＲ１０がＯＲｂであるか；Ｒ９が（ＣＨ２）ｎＯＲａでＲ１０がＯＲｂであってよい。
【０１６８】
ＡはＯまたはＳでよい。
Ｒ７は（ＣＨ２）５ＮＨＲｄまたは（ＣＨ２）５ＮＨＲｄであってよい。Ｒｄは、葉酸基；コレステロール基；糖質基；ビタミンＡ基；ビタミンＥ基；ビタミンＫ基から選択することができる。好ましくは、Ｒｄはコレステロール基である。
【０１６９】
Ｒ３が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでＲ４がＯＲａであるか；Ｒ３が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでＲ４がＯＲｂであるか；Ｒ３が（ＣＨ２）ｎＯＲａでＲ４がＯＲｂであってよい。
Ｒ１が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでＲ２がＯＲａであるか；Ｒ１が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでＲ２がＯＲｂであるか；Ｒ１が（ＣＨ２）ｎＯＲａでＲ２がＯＲｂであってよい。
【０１７０】
Ｒ３が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでＲ９がＯＲａであってよい。
Ｒ３およびＲ９はシス位にあってもよいし、Ｒ３およびＲ９はトランス位にあってもよい。
【０１７１】
Ｒ３が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでＲ９がＯＲｂであるか；Ｒ３が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでＲ９がＯＲａであるか；Ｒ３が（ＣＨ２）ｎＯＲａでＲ９がＯＲｂであってよい。
Ｒ１が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでＲ３がＯＲａであってよい。
【０１７２】
Ｒ１およびＲ３はシス位にあってもよいし、Ｒ１およびＲ３はトランス位にあってもよい。
Ｒ３がＯＲａでＲ９が（ＣＨ２）ｎＯＲｂであってよい。
【０１７３】
Ｒ１がＯＲａでＲ３が（ＣＨ２）ｎＯＲｂであってよい。
別の実施形態では、リボースはピペラジン骨格で置換され、かつＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹはＮＲ８であり、かつＺはＣＲ１１Ｒ１２である。
【０１７４】
Ｒ１が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでＲ３がＯＲａであってよい。
Ｒ１およびＲ３はシス位にあってもよいし、Ｒ１およびＲ３はトランス位にあってもよ
い。
【０１７５】
ｎは１でよい。
Ｒ１が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでＲ３がＯＲｂであるか；Ｒ１が（ＣＨ２）ｎＯＲａでＲ３がＯＲｂであってよい。
【０１７６】
ＡはＯまたはＳでよく、好ましくはＳである。
Ｒ７は（ＣＨ２）５ＮＨＲｄまたは（ＣＨ２）５ＮＨＲｄであってよい。Ｒｄは、葉酸基；コレステロール基；糖質基；ビタミンＡ基；ビタミンＥ基；ビタミンＫ基から選択することができる。好ましくは、Ｒｄはコレステロール基である。
【０１７７】
Ｒ８はＣＨ３でよい。
Ｒ１がＯＲａでＲ３が（ＣＨ２）ｎＯＲｂであってよい。
別の実施形態では、リボースはモルホリノ骨格で置換され、かつＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹはＯであり、かつＺはＣＲ１１Ｒ１２である。
【０１７８】
Ｒ１が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでＲ３がＯＲａであってよい。
Ｒ１およびＲ３はシス位にあってもよいし、Ｒ１およびＲ３はトランス位にあってもよい。
【０１７９】
ｎは１でよい。
Ｒ１が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでＲ３がＯＲｂであるか；Ｒ１が（ＣＨ２）ｎＯＲａでＲ３がＯＲｂであってよい。
【０１８０】
ＡはＯまたはＳでよい。
Ｒ７は（ＣＨ２）５ＮＨＲｄまたは（ＣＨ２）５ＮＨＲｄであってよい。Ｒｄは、葉酸基；コレステロール基；糖質基；ビタミンＡ基；ビタミンＥ基；ビタミンＫ基から選択することができる。好ましくは、Ｒｄはコレステロール基である。
【０１８１】
Ｒ８はＣＨ３でよい。
Ｒ１がＯＲａでＲ３が（ＣＨ２）ｎＯＲｂであってよい。
別の実施形態では、リボースはデカリン骨格で置換され、かつＸはＣＨ２であり；ＹはＣＲ９Ｒ１０であり；かつＺはＣＲ１１Ｒ１２であり；かつＲ５およびＲ１１は一体となってＣ６シクロアルキルをなす。
【０１８２】
Ｒ６はＣ（Ｏ）ＮＨＲ７でよい。
Ｒ１２は水素でよい。
Ｒ６およびＲ１２はトランス位にあってよい。
【０１８３】
Ｒ３がＯＲａでＲ９が（ＣＨ２）ｎＯＲｂであってよい。
Ｒ３およびＲ９はシス位にあってもよいし、Ｒ３およびＲ９はトランス位にあってもよい。
【０１８４】
ｎは１または２でよい。
Ｒ３がＯＲｂでＲ９が（ＣＨ２）ｎＯＲｂであるか；Ｒ３がＯＲｂでＲ９が（ＣＨ２）ｎＯＲａであってよい。
【０１８５】
ＡはＯまたはＳでよい。
Ｒ７は（ＣＨ２）５ＮＨＲｄまたは（ＣＨ２）５ＮＨＲｄであってよい。Ｒｄは、葉酸基；コレステロール基；糖質基；ビタミンＡ基；ビタミンＥ基；ビタミンＫ基から選択す
ることができる。好ましくは、Ｒｄはコレステロール基である。
【０１８６】
別の実施形態では、リボースはデカリン／インダン骨格で置換され、例えば、ＸはＣＨ２であり；ＹはＣＲ９Ｒ１０であり；かつＺはＣＲ１１Ｒ１２であり；かつＲ５およびＲ１１は一体となってＣ５シクロアルキルをなす。
【０１８７】
Ｒ６はＣＨ３でよい。
Ｒ１２は水素でよい。
Ｒ６およびＲ１２はトランス位にあってよい。
【０１８８】
Ｒ３がＯＲａでＲ９が（ＣＨ２）ｎＯＲｂであってよい。
Ｒ３およびＲ９はシス位にあってもよいし、Ｒ３およびＲ９はトランス位にあってもよい。
【０１８９】
ｎは１または２でよい。
Ｒ３がＯＲｂでＲ９が（ＣＨ２）ｎＯＲａであるか；Ｒ３がＯＲｂでＲ９が（ＣＨ２）ｎＯＲａであってよい。
【０１９０】
ＡはＯまたはＳでよい。
Ｒ１４はＮ（ＣＨ３）Ｒ７でよい。Ｒ７は（ＣＨ２）５ＮＨＲｄまたは（ＣＨ２）５ＮＨＲｄであってよい。Ｒｄは、葉酸基；コレステロール基；糖質基；ビタミンＡ基；ビタミンＥ基；ビタミンＫ基から選択することができる。好ましくは、Ｒｄはコレステロール基である。
【０１９１】
別の態様において、本発明は式（ＩＩ）の構造を有する少なくとも１つのサブユニットを含んでなるオリゴヌクレオチド剤を特徴とする。
【０１９２】
【化８】
2009504782.tif 000014
（式中、
ＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり；
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立にＯＲａ、ＯＲｂ、（ＣＨ２）ｎＯＲａ、または（ＣＨ２）ｎＯＲｂであって、ただし、Ｒ１およびＲ２のうち一方がＯＲａまたはＯＲｂで他方が（ＣＨ２）ｎＯＲａまたは（ＣＨ２）ｎＯＲｂであり（ＳＲＭＳが末端にあるとき、Ｒ１またはＲ２のうち１つがＲａを含み、かつ１つがＲｂを含むことになり、ＳＲＭＳＳが内部にあるとき、Ｒ１およびＲ２の両方がそれぞれＲｂを含むことになる）；さらに、ＯＲａは（ＣＨ２）ｎＯＲｂとともにのみ存在し、（ＣＨ２）ｎＯＲａはＯＲｂとともにのみ存在することが好ましく；
Ｒ７はＮＲｃＲｄで置換されたＣ１〜Ｃ２０アルキルであり；
Ｒ８はＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ１３はヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、またはハロであり；
Ｒ１４はＮＲｃＲ７であり；
Ｒａは、
【０１９３】
【化９】
2009504782.tif 000015
であり；
Ｒｂは、
【０１９４】
【化１０】
2009504782.tif 000016
であり；
ＡおよびＣのそれぞれは独立に、ＯまたはＳであり；
ＢはＯＨ、Ｏ−、または
【０１９５】
【化１１】
2009504782.tif 000017
であり；
ＲｃはＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
ＲｄはＨまたはリガンドであり；
ｎは１〜４である。）
結合体中のオリゴヌクレオチド剤は実質的に一本鎖であり、約１２〜約２９個のサブユニット、好ましくは約１５〜約２５個のサブユニットを含んでなる。実質的に一本鎖のオリゴヌクレオチド剤は、少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％以上の、二重鎖を成さないヌクレオチドを含む。
【０１９６】
実施形態は、上述の特徴のうち１つ以上を含むことができる。
さらなる態様では、本発明は、式（Ｉ）または式（ＩＩ）を含む少なくとも１つのサブユニットを有するオリゴヌクレオチド剤を特徴とする。
【０１９７】
１つの態様では、本発明は、式（Ｉ）または式（ＩＩ）のうち少なくともいずれかを含む少なくとも２つのサブユニットを有するオリゴヌクレオチド剤を特徴とする。
別の態様では、本発明は、式（Ｉ）または（ＩＩ）のうち少なくともいずれかを含む少なくとも１つのサブユニットを有する本明細書に記載のオリゴヌクレオチド剤を製造する方法を提供する。さらなる態様では、本発明は、標的遺伝子の発現を調節する方法を提供する。該方法は、式（Ｉ）または（ＩＩ）のうち少なくともいずれかを含む少なくとも１
つのサブユニットを有する本明細書に記載のオリゴヌクレオチド剤を、対象に投与することを含む。
【０１９８】
１つの態様では、本発明は、式（Ｉ）または（ＩＩ）のうち少なくともいずれかを含む少なくとも１つのサブユニットを有する本明細書に記載のオリゴヌクレオチド剤と、薬学的に許容可能な担体とを有する、医薬組成物を特徴とする。
【０１９９】
本明細書に記載のＳＲＭＳまたは係留部は、本明細書に記載の任意のオリゴヌクレオチド剤に組み込むことが可能である。オリゴヌクレオチド剤は、本明細書に記載のＳＲＭＳを１つ以上含みうる。ＳＲＭＳはオリゴヌクレオチド剤中の１箇所または複数個所に導入することができる。ＳＲＭＳは、オリゴヌクレオチドの３’または５’末端に、あるいは該末端の近く（１、２または３位以内）に配置可能である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの５’末端またはその近く（１、２または３位以内）にはＳＲＭＳを有していないことが好ましい。ＳＲＭＳは内側にあってもよく、標的への結合に重要ではない領域に配置されることが好ましい。
【０２００】
ある実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は３’末端（または３’末端から１、２または３位以内）にＳＲＭＳを有する場合がある。
別の実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は内側の位置にＳＲＭＳを有する場合がある。他の実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、３’末端に１つのＳＲＭＳ、および内側の位置に１つのＳＲＭＳを有する場合がある。
【０２０１】
本明細書に記載の糖、塩基またはバックボーンへの他の修飾を、オリゴヌクレオチド剤に組み込むこともできる。
オリゴヌクレオチド剤は、本明細書に記載のアーキテクチャまたは構造をとることができる。
【０２０２】
オリゴヌクレオチド剤は、本明細書に記載の遺伝子のうち任意のものなど広範囲の任意の遺伝子を標的とするように選択可能である。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は本明細書に記載のアーキテクチャ（アーキテクチャとは、全長のうち１つ以上を指す）を有する。本明細書に記載のオリゴヌクレオチド剤のＳＲＭＳ含有塩基に加えて、ヌクレアーゼ耐性モノマー（ＮＲＭ）を含むことができる。
【０２０３】
別の態様では、本発明は、オリゴヌクレオチド剤であって、親油性部分（例えばコレステロール）が例えば該オリゴヌクレオチド剤のＳＲＭＳへの結合によって結合している、オリゴヌクレオチド剤を特徴とする。好ましい実施形態では、親油性部分は、細胞内へのオリゴヌクレオチド剤の侵入を強化する。好ましい実施形態では、細胞は、生物、組織または細胞株（例えば初代細胞株、不死化された細胞株、もしくは本明細書に記載の任意の種類の細胞株）の一部である。したがって、該結合オリゴヌクレオチド剤は、生物（例えば哺乳動物、例えばヒト）における標的遺伝子の発現を阻害するため、あるいは細胞株または生物体外にある細胞における標的遺伝子の発現を阻害するために、使用することができる。
【０２０４】
親油性部分は、例えば、脂質、コレステロール、オレイル基、レチニル基、コレステリル基、コール酸、アダマンタン酢酸、１‐ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３‐ビス‐Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルギリセロール、ボルネオール、メントール、１，３‐プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３‐（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３‐（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３（オレオイル）コラン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサ
ジンから成る群から、選択することができる。好ましい親油性部分はコレステロールである。
【０２０５】
オリゴヌクレオチド剤には、式（Ｉ）または式（ＩＩ）を有する少なくとも１つのサブユニットが組み込まれていてよい。オリゴヌクレオチド剤は本明細書に記載の１以上の任意の特徴を有することができる。例えば、サブユニットが式（Ｉ）のものである場合、Ｒｄはコレステロールであってよく；ＸがＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７、ＹがＣＲ９Ｒ１０、Ｚが存在せず、Ｒ１が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでＲ３がＯＲａであってもよいし；ＸがＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７、ＹがＣＲ９Ｒ１０、ＺがＣＲ１１Ｒ１２、Ｒ９が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでＲ１０がＯＲａであってもよいし；ＸがＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７、ＹがＮＲ８、ＺがＣＲ１１Ｒ１２、Ｒ１が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでＲ３はＯＲａであってもよいし；ＸがＣＨ２；ＹがＣＲ９Ｒ１０；ＺがＣＲ１１Ｒ１２であって、このときＲ６がＣ（Ｏ）ＮＨＲ７であってもよく；あるいは、ＸがＣＨ２；ＹがＣＲ９Ｒ１０；ＺがＣＲ１１Ｒ１２であって、このときＲ１１またはＲ１２はＣ（Ｏ）ＮＨＲ７であるか、Ｒ５およびＲ１１が合わさってＮ（ＣＨ３）Ｒ７で置換されたＣ５またはＣ６シクロアルキルをなしてもよい。
【０２０６】
係留されるリガンド
種々様々な物をオリゴヌクレオチド剤に（例えばリガンド結合モノマーの担体に）係留することができる。リガンド結合モノマーに関連して以下に例を述べるが、それは単に１つの好ましい実施形態にすぎない。オリゴヌクレオチド剤に対し他の接点で物を接続することもできる。
【０２０７】
オリゴヌクレオチド剤（例えば、ｍｉＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチド剤）に係留されたリガンドは、同剤に対し好ましい効果を有することができる。例えば、リガンドは安定性、標的核酸とのハイブリダイゼーション熱力学、特定の組織または細胞種に対する標的設定、あるいは細胞透過性（例えば、エンドサイトーシス依存的または非依存的メカニズムによるもの）を改善することができる。リガンドおよび関連する修飾は、配列特異性を増大させる結果として的外れな標的設定を減少させることもできる。
【０２０８】
係留されるリガンドには、インターカレータとして機能することができる１以上の修飾された塩基または糖が挙げられる。これらは、ｍｉＲＮＡ／標的二重鎖のバルジ内など、内側領域に位置することが好ましい。インターカレータは、芳香族化合物、例えば多環式芳香族化合物またはヘテロ環式芳香族化合物であってよい。多環式インターカレータはスタッキング能を有することができ、２つ、３つまたは４つの縮合された環を備えた系を含むことができる。本明細書に記載のユニバーサル塩基をリガンドに含めることもできる。
【０２０９】
１つの実施形態では、リガンドは、標的核酸の切断による標的遺伝子の阻害に寄与する、切断用の基を含むことができる。切断用の基は、例えば、ブレオマイシン（例えばブレオマイシン−Ａ５、ブレオマイシン−Ａ２、またはブレオマイシン−Ｂ２）、ピレン、フェナントロリン（例えばＯ−フェナントロリン）、ポリアミン、トリペプチド（例えばｌｙｓ−ｔｙｒ−ｌｙｓトリペプチド）あるいは金属イオンキレート基であってよい。金属イオンキレート基には、例えばＬｕ（ＩＩＩ）またはＥＵ（ＩＩＩ）の大環状錯体、Ｚｎ（ＩＩ）２，９−ジメチルフェナントロリン誘導体、Ｃｕ（ＩＩ）テルピリジン、あるいは、Ｌｕ（ＩＩＩ）のような遊離金属イオンによって標的ＲＮＡのバルジ部位における選択的切断を促進することができるアクリジンが挙げられる。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡの（例えばバルジ領域での）切断を促進するために、ペプチドリガンドをｍｉＲＮＡに係留することができる。例えば、標的ＲＮＡの切断を促進するために、１，８−ジメチル−１，３，６，８，１０，１３−ヘキサアザシクロテトラデカン（サイクラム（ｃｙｃｌａｍ））をペプチドに（例えばアミノ酸誘導体により）結合させることができる。
【０２１０】
係留されるリガンドは、オリゴヌクレオチド剤のハイブリダイゼーション特性または配列特異性の改善をもたらしうるアミノグリコシド・リガンドであってもよい。典型的なアミノグリコシドには、グリコシル化ポリリシン、ガラクトシル化ポリリシン、ネオマイシンＢ、トブラマイシン、カナマイシンＡならびにアミノグリコシドのアクリジン結合体、例えばＮｅｏ−Ｎ−アクリジン、Ｎｅｏ−Ｓ−アクリジン、Ｎｅｏ−Ｃ−アクリジン、Ｔｏｂｒａ−Ｎ−アクリジンおよびＫａｎａＡ−Ｎ−アクリジンが挙げられる。アクリジン・アナログの使用により配列特異性を増大させることができる。例えば、ネオマイシンＢはＤＮＡに比べてＲＮＡに対し高い親和性を有するが、配列特異性は低い。アクリジン・アナログであるＮｅｏ−Ｓ−アクリジンは、ＨＩＶのＲＲＥ（Ｒｅｖ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ
ｅｌｅｍｅｎｔ）に対する親和性が高められている。いくつかの実施形態では、アミノグリコシド・リガンドのグアニジン・アナログ（グアニジノグリコシド）がオリゴヌクレオチド剤に係留される。グアニジノグリコシドでは、アミノ酸上のアミン基がグアニジン基に交換されている。グアニジン・アナログを結合させることにより、オリゴヌクレオチド剤（例えば、ｍｉＲＮＡまたはプレｍｉＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチド剤）の細胞透過性を強化することができる。
【０２１１】
係留されるリガンドは、オリゴヌクレオチド剤の細胞への取り込みを強化することができるポリアルギニンペプチド、ペプトイドまたはペプチド模倣体であってもよい。
好ましい構成部分はリガンドであり、リガンドは、好ましくは共有結合により、直接的あるいは係留部を介在させて間接的に、リガンド結合担体に接続される。好ましい実施形態では、リガンドは係留部を介在させて担体に結合される。先に論じたように、リガンドまたは係留リガンドは、モノマーが伸長する鎖に組み込まれるときにモノマー上に存在していてもよい。いくつかの実施形態では、「前駆体」リガンド結合モノマーを伸長する鎖に組み込ませた後に、「前駆体」リガンド結合モノマーサブユニットにリガンドを組み込むことが可能である。例を挙げれば、例えばアミノ末端を有する係留部（例えばＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＮＨ２）を備えたモノマーを、伸長するオリゴヌクレオチド鎖に組み込むことが可能である。後の操作において、すなわち前駆体モノマーを鎖に組み込ませた後、続いて、求電子基（例えばペンタフルオロフェニルエステルまたはアルデヒド基）を有するリガンドを、リガンドの求電子基と前駆体モノマーサブユニット係留部の末端求核基とのカップリングによって、前駆体モノマーサブユニットと結合させることが可能である。
【０２１２】
好ましい実施形態では、リガンドは、同リガンドが組み込まれたオリゴヌクレオチド剤の分布、標的指向性または寿命を変化させる。好ましい実施形態では、リガンドは、例えばこのようなリガンドが存在しない分子種と比較して、選択された標的、例えば分子、細胞または細胞種、コンパートメント（例えば細胞または器官のコンパートメント）、組織、器官または身体の領域に対する高い親和性をもたらす。
【０２１３】
好ましいリガンドは、輸送、ハイブリダイゼーション、および特異性を向上させることが可能であり、生成する天然または修飾オリゴリボヌクレオチド、または本願明細書に記載のモノマーおよび／または天然もしくは修飾リボヌクレオチドの任意の組合せを含んでなるポリマー分子の、ヌクレアーゼ耐性を向上させることも可能である。
【０２１４】
一般的なリガンドとしては、例えば取り込みを増大させるための治療用調節物質；例えば分布をモニタするための診断用化合物またはレポーター基；架橋剤；ヌクレアーゼ耐性を与える構成部分；ならびに天然核酸塩基または異常核酸塩基が挙げられる。一般例には、親油性物質、脂質、ステロイド（例えば、ウバオール、ヘシゲニン（ｈｅｃｉｇｅｎｉｎ）、ジオスゲニン（ｄｉｏｓｇｅｎｉｎ））、テルペン類（例えば、トリテルペン、例えばサルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導リトコール酸）、ビタミン（例えば、葉酸、ビタミンＡ，ビオチン、ピリドキサール）、糖質、タンパク質、タ
ンパク質結合物質、インテグリン指向性分子、ポリカチオン、ペプチド、ポリアミン、およびペプチド模倣体がある。
【０２１５】
リガンドには、天然に存在する物質、（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、またはグロブリン）；糖質（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸）；アミノ酸、または脂質が挙げられる。リガンドは組換え分子でも合成分子でもよく、例えば合成ポリマー、例えば合成ポリアミノ酸であってもよい。ポリアミノ酸の例には、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−アクリル酸エチル）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンがある。ポリアミンの例には、ポリエチレンイミン、ポリリシン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、プソイドペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩、またはαらせん状ペプチドがある。
【０２１６】
リガンドはまた、標的設定基、例えば細胞または組織を標的とする物質、例えばレクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば腎臓細胞などの特定の細胞種と結合する抗体も含み得る。標的設定基は、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントプロテインＡ、ムチン、炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化されたポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、あるいはＲＧＤペプチドまたはＲＧＤペプチド模倣体でよい。
【０２１７】
リガンドの他の例には、染料、インターカレート剤（例えばアクリジンおよび置換型アクリジン）、架橋剤（例えばソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン、フェナントロリン、ピレン）、ｌｙｓ−ｔｙｒ−ｌｙｓトリペプチド、アミノグリコシド、グアニジンアミノグリコシド、人工エンドヌクレアーゼ（例えばＥＤＴＡ）、親油性分子、例えば、コレステロール（およびそのチオアナログ）、コール酸、コラン酸、リトコール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、グリセロール（例えば、エステル（例えば、モノ、ビス、トリス脂肪酸エステル、例えばＣ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、もしくはＣ２０脂肪酸）およびそのエーテル、例えばＣ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、もしくはＣ２０アルキル；例えば、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、１，３−ビス−Ｏ（オクタデシル）グリセロール）、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メンソール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ステアリン酸（例えば、ジステアリン酸グリセリル）、オレイン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コール酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）、およびペプチド複合体（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えばＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射標識マーカー、酵素、ハプテン（例えばビオチン）、輸送／吸収促進物質（例えばアスピリン、ナプロキセン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダ
ゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋錯体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、またはＡＰがある。
【０２１８】
リガンドは、タンパク質（例えば糖タンパク質）またはペプチドであってよく、例えば共通のリガンドに関する特異的親和性を有する分子、または抗体（例えばがん細胞、内皮細胞、または骨細胞などの特定の細胞種と結合する抗体）であってよい。リガンドは、ホルモンおよびホルモン受容体も含み得る。リガンドは、脂質、レクチン、糖質、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン多価マンノース、または多価フコースなどの、非ペプチド性の分子種も含み得る。リガンドは、例えば、リポ多糖、ｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性化因子、またはＮＦκＢの活性化因子であってよい。
【０２１９】
リガンドは、例えば細胞の細胞骨格を破壊することによって（例えば細胞の微小管、マイクロフィラメント、および／または中間径フィラメントを破壊することによって）細胞内へのオリゴヌクレオチド剤の取り込みを増大させることが可能な物質、例えば薬物であってよい。該薬物は例えば、タキソン（ｔａｘｏｎ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノライド（ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホライドＡ、インダノシン（ｉｎｄａｎｏｃｉｎｅ）、またはミオセルビン（ｍｙｏｓｅｒｖｉｎ）であってよい。
【０２２０】
リガンドは、例えば、炎症応答を活性化することによって細胞内へのオリゴヌクレオチド剤の取り込みを増大させることが可能である。このような効果を有すると思われる例示的なリガンドには、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−１β、またはγインターフェロンがある。
【０２２１】
１態様では、リガンドは脂質または脂質系分子である。このような脂質または脂質系分子は、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と結合しやすい。ＨＳＡ結合性リガンドは、標的組織（例えば身体の腎臓以外の標的組織）に本発明の結合体が分布するのを可能にする。例えば、標的組織は肝臓（肝臓の肝実質細胞を含む）である。ＨＳＡと結合することが可能である他の分子も、リガンドとして使用することが可能である。例えば、ネプロキシンまたはアスピリンを使用することが可能である。脂質または脂質系リガンドは、（ａ）結合体の分解耐性を増大させること、（ｂ）標的の細胞または細胞膜への標的指向性または輸送を増大させることが可能であり、かつ／あるいは（ｃ）血清タンパク質、例えばＨＳＡとの結合を調節するために使用することが可能である。
【０２２２】
脂質系リガンドを使用して、結合体と標的組織との結合を調節（例えば制御）することが可能である。例えば、より強くＨＳＡと結合する脂質または脂質系リガンドは、腎臓に対する標的指向性がより低くなると思われ、したがって身体からより除去されにくくなると思われる。より弱くＨＳＡと結合する脂質または脂質系リガンドは、結合体を腎臓に向かわせるために使用することができる。
【０２２３】
好ましい実施形態では、脂質系リガンドはＨＳＡと結合する。脂質系リガンドは、結合体が非腎臓組織に優先的に分布するように、十分な親和性でＨＳＡと結合することができる。しかしながら、その親和性は、ＨＳＡとリガンドとの結合が不可逆的であるほど強くはないことが好ましい。
【０２２４】
別の実施形態では、脂質系リガンドは、結合体が腎臓に優先的に分布するように、ＨＳＡと弱く結合するかまたは全く結合しない。腎臓細胞を標的としうるその他の構成部分も、脂質系リガンドの代わりに、または脂質系リガンドに加えて使用することが可能である。
【０２２５】
他の態様では、リガンドは、標的細胞（例えば増殖している細胞）によって取り込まれる構成部分、例えばビタミンである。これらのリガンドは、望ましくない細胞増殖、例えば悪性または非悪性型の細胞増殖、例えばがん細胞の増殖によって特徴付けられる障害を治療するのに特に有用である。例示的なビタミンには、ビタミンＡ、Ｅ、およびＫがある。他の例示的なビタミンには、Ｂビタミン、例えば葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール、あるいはがん細胞によって取り込まれるその他のビタミンまたは栄養素がある。ＨＳＡおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）も含まれる。
【０２２６】
他の態様では、リガンドは、細胞透過性物質、好ましくはらせん状の細胞透過性物質である。該物質は両親媒性であることが好ましい。例示的な物質は、ｔａｔまたはアンテナペディアなどのペプチドである。該物質がペプチドである場合、ペプチジル模倣体、インバートマー、非ペプチド結合または偽ペプチド結合、およびＤ−アミノ酸の使用を含めて、該ペプチドを修飾することが可能である。らせん状物質は、好ましくは親油性の相および撥油性の相を有する、αらせん状物質であることが好ましい。
【０２２７】
増殖している細胞中に豊富なマーカーを標的とするペプチドを使用することもできる。例えば、ＲＧＤ含有ペプチドおよびペプチド模倣体は、がん細胞、特にαｖβ３インテグリンを提示する細胞を標的とすることができる。したがって、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤを含んでいる環状ペプチド、Ｄ−アミノ酸を含んでいるＲＧＤペプチド、ならびに合成ＲＧＤ模倣体を使用することが可能であろう。ＲＧＤに加えて、αｖβ３インテグリン・リガンドを標的とする他の部分を使用することもできる。一般に、そのようなリガンドは、増殖している細胞および血管新生を制御するために使用することができる。このタイプの好ましい結合体は、ＰＥＣＡＭ−１、ＶＥＧＦ、または他のがん遺伝子（例えば本明細書に記載のがん遺伝子）を標的とするオリゴヌクレオチド剤を含んでいる。
【０２２８】
本発明のオリゴヌクレオチド剤は、肝臓に向けて標的設定する場合に特に有用である。例えば、本発明で着目した一本鎖オリゴヌクレオチド剤は、肝臓に豊富なｍｉＲＮＡを標的とすることが可能であり、該オリゴヌクレオチド剤は、肝臓への送達を高めるためのリガンドを含むことができる。肝臓を標的とするリガンドで誘導体化されたモノマーを組み込むことにより、オリゴヌクレオチド剤を肝臓に向けて標的設定することができる。例えば、肝臓を標的とする物質は親油性部分でよい。好ましい親油性部分には、脂質、コレステロール、オレイル、レチニル、またはコレステリル残基がある。肝臓を標的とする物質として機能しうるその他の親油性部分には、コール酸、アダマンタン酢酸、１‐ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３‐ビス‐Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３‐プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３‐（オレイル）リトコール酸、０３‐（オレイル）コラン酸、ジメトリシトリチル、またはフェノキサジンがある。
【０２２９】
オリゴヌクレオチド剤は、ラクトシル化ＬＤＬのような低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）との会合によって肝臓に向けて標的設定することもできる。糖残基とともに複合体化されたポリマー担体も、オリゴヌクレオチド剤を肝臓に向けて標的設定する機能を果たすことができる。
【０２３０】
糖（例えば、ガラクトースおよび／またはそのアナログ）を組み込んだ標的設定物質は特に有用である。これらの物質は、特に、肝臓の肝実質細胞を標的とする。例えば、標的設定部分は、２以上または好ましくは２〜３個の、互いに約１５オングストローム間隔のガラクトース部分を含むことができる。別例として標的設定部分は、ガラクトースに連結されたグルコースであるラクトース（例えば３個のラクトース部分）でもよい。標的設定
部分はＮ‐アセチルガラクトサミン、Ｎ−Ａｃ−グルコサミンであってもよい。マンノースまたはマンノース−６−リン酸を標的とする部分は、マクロファージへの標的設定のために使用することができる。
【０２３１】
リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣体であってよい。ペプチド模倣体（本願明細書ではオリゴペプチド模倣体とも呼ぶ）は、天然のペプチドと同様の一定の３次元構造にフォールディングすることが可能な分子である。ペプチドおよびペプチド模倣体と、オリゴヌクレオチド剤が結合することによって、細胞の認識および吸収を高めることなどにより、ｉＲＮＡの薬物動態学的分布に影響を与えることが可能である。ペプチドまたはペプチド模倣体の構成部分は、約５〜５０アミノ酸長、例えば約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長であってよい（例えば表３を参照）。
【０２３２】
【表３】
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ペプチドまたはペプチド模倣体は、例えば細胞透過性ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド（例えば、主にＴｙｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅから構成されるもの）であってよい。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、制約型（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）ペプチドまたは架橋ペプチドであってよい。ペプチド部分は、Ｌ−ペプチドでもＤ−ペプチドでもよい。他の代替例では、ペプチド部分は、疎水性の膜移行配列（ＭＴＳ）を含むことが可能である。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号４６）を有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含むＲＦＧＦアナログ（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号４７））も、標的設定部分となり得る。該ペプチド部分は、ペプチド、オリゴヌ
クレオチド、およびタンパク質を含めた大きな極性分子を、細胞膜を横切って運ぶことができる「送達」ペプチドとなりうる。例えば、ＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質由来の配列（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号４８））、およびショウジョウバエのアンテナペディア・タンパク質由来の配列（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号４９））は、送達ペプチドとして機能しうることが見出されている。ペプチドまたはペプチド模倣体は、ファージ・ディスプレイ・ライブラリ、または１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアル・ライブラリから同定されたペプチドなど、ランダムなＤＮＡ配列によってコードされてもよい（ラム（Ｌａｍ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、３５４：８２〜８４、１９９１）。取り込まれたモノマーユニットを介してｉＲＮＡ剤に係留されるペプチドまたはペプチド模倣体は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）ペプチド、またはＲＧＤ模倣体などの、細胞を標的とするペプチドであることが好ましい。ペプチド部分の長さは、約５アミノ酸〜約４０アミノ酸の範囲であってよい。ペプチド部分は、安定性を増大させるため、あるいは立体構造上の特性を指定するためなどの、構造上の修飾を有することもできる。以下に記載する任意の構造上の修飾を使用することが可能である。
【０２３３】
「細胞透過性ペプチド」は、細胞、例えばヒト細胞などの哺乳動物の細胞に浸透することが可能である。細胞透過性ペプチドは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む場合もある。例えば、細胞透過性ペプチドは、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１の融合ペプチドドメインとＳＶ４０大型Ｔ抗原のＮＬＳとに由来するＭＰＧなどの、２部分からなる両親媒性ペプチドであってよい（シメオニ（Ｓｉｍｅｏｎｉ）ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２７１７〜２７２４、２００３）。
【０２３４】
１実施形態では、ＳＲＭＳに係留される標的設定ペプチドは、両親媒性のαらせん状ペプチドであってよい。例示的な両親媒性のαらせん状ペプチドには、セクロピン、ライコトキシン、パラダキシン、ブフォリン、ＣＰＦ、ボンビニン様ペプチド（ＢＬＰ）、カテリシディン、セラトトキシン、サッカメーバ・クラバ（Ｓ．ｃｌａｖａ）のペプチド、メクラウナギ腸管の抗菌性ペプチド（ＨＦＩＡＰ）、マガイニン、ブレビニン−２、ダーマセプチン、メリチン、プレウロシディン、Ｈ２Ａペプチド、アフリカツメガエルのペプチド、エスカレンチン−１、およびカエリンがあるが、これらに限定はされない。らせんの安定性を完全に保つために、いくつかの要因を考慮することが好ましいであろう。例えば、らせん安定化残基を最大数使用し（例えばｌｅｕ、ａｌａ、またはｌｙｓ）、らせん不安定化残基を最小数とする（例えばプロリン、または環状モノマーユニット）。キャッピング残基も考慮する（例えば、ＧｌｙはＮ‐キャッピング残基の例であり、かつ／あるいはＣ末端アミド化を使用して、らせんを安定化させるために追加のＨ結合を与えることが可能である）。ｉ±３、あるいはｉ±４位離れた、正反対の電荷を有する残基間の塩架橋の形成によって、安定性をもたらすことができる。例えば、リシン、アルギニン、ホモアルギニン、オルニチンまたはヒスチジンなどのカチオン性残基は、アニオン性の残基であるグルタミン酸またはアスパラギン酸と塩架橋を形成することが可能である。
【０２３５】
ペプチドおよびペプチド模倣体のリガンドには、天然型または修飾型ペプチド、例えばＤまたはＬペプチド；α、β、またはγペプチド；Ｎ−メチルペプチド；アザペプチド；１つまたは複数のアミドを有するペプチド、すなわち１つまたは複数の尿素、チオ尿素、カルバメート、またはスルホニル尿素結合で結合が置換されたペプチド；または環状ペプチド、を有するリガンドがある。
【０２３６】
ｉＲＮＡ剤を製造するための方法
神経系細胞内への取り込み強化のために親油性部分に結合させたｉＲＮＡ剤は、修飾塩基または非天然塩基、例えば本願明細書に記載の塩基を含むことが可能である。さらに、ｉＲＮＡ剤は、修飾塩基または非天然塩基と、本願明細書に記載するその他の要素とを有することができる。
【０２３７】
オリゴヌクレオチド・ペプチド結合体の合成および精製は、確立されている方法によって実施することが可能である。例えば、テゥルーフェルト（Ｔｒｕｆｅｒｔ）ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、５２：３００５、１９９６；およびエス  ティー  クルーク（Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ）編「Antisense Drug Technology」、２００１年、マルセル  デッカー
インコーポレイティッド（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）の中のマノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）著「Oligonucleotide Conjugates in Antisense Technology」を参照のこと。
【０２３８】
本発明の１実施形態では、ペプチド模倣体を修飾して、明確で特異的な好ましい立体構造をとる制約型ペプチドを製造することが可能であり、該立体構造によってペプチドの効力および選択性を増大させることが可能である。例えば、制約型ペプチドはアザペプチドであってよい（ガンテ（Ｇａｎｔｅ）、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、４０５〜４１３、１９８９）。アミノ酸側鎖の構造を変えずに、該アミノ酸のα炭素を窒素原子で置換することによって、アザペプチドが合成される。例えば、伝統的なペプチド合成カップリング法においてヒドラジンを使用し、ヒドラジンを「カルボニル・ドナー」、例えばクロロギ酸フェニルと反応させることなどによって、アザペプチドを合成することが可能である。
【０２３９】
本発明の１実施形態では、ペプチドまたはペプチド模倣体（例えば、ＳＲＭＳに係留されるペプチドまたはペプチド模倣体）は、Ｎ−メチルペプチドであってよい。Ｎ−メチルペプチドはＮ−メチルアミノ酸から構成されるが、Ｎ−メチルアミノ酸はペプチドのバックボーン中に追加のメチル基を与えることによってタンパク質分解酵素による切断に対する追加の抵抗手段を与える可能性がある。Ｎ−メチルペプチドは、当分野で知られている方法によって合成することが可能である（例えば、リンドグレン（Ｌｉｎｄｇｒｅｎ）ら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２１：９９、２０００；「Cell Penetrating Peptides:Processes and Applications」、ランゲル（Ｌａｎｇｅｌ）編、米国フロリダ州ボカラトン所在のＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、２００２；フィッシェ（Ｆｉｓｃｈｅ）ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ．Ｃｈｅｍ．１２：８２５、２００１；ワンダー（Ｗａｎｄｅｒ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２４：１３３８２、２００２を参照）。例えば、ＡｎｔペプチドまたはＴａｔペプチドが、Ｎ−メチルペプチドであってもよい。
【０２４０】
本発明の１実施形態では、ペプチドまたはペプチド模倣体（例えば、ＳＲＭＳに係留されるペプチドまたはペプチド模倣体）は、β−ペプチドであってよい。β−ペプチドは、溶液中でらせん、プリーツ・シート、ターンおよびヘアピンなどの安定した２次構造を形成する。β−ペプチドの環状誘導体は、固体状態で折りたたまれてナノチューブになりうる。β−ペプチドは、タンパク質分解酵素による分解に対して耐性がある。β−ペプチドは、当分野で知られている方法によって合成することが可能である。例えば、ＡｎｔペプチドまたはＴａｔペプチドがβ−ペプチドであってもよい。
【０２４１】
本発明の１実施形態では、ペプチドまたはペプチド模倣体（例えば、ＳＲＭＳに係留されるペプチドまたはペプチド模倣体）は、ペプチド模倣体のアミド結合が尿素部分で置換されているオリゴ尿素結合体（またはオリゴチオ尿素結合体）であってよい。アミド結合の置換によって、タンパク質分解酵素、例えば胃腸管のタンパク質分解酵素による分解に対する耐性が増大する。１実施形態では、オリゴ尿素結合体を、経口送達において使用するためにｉＲＮＡ剤に係留させる。オリゴ尿素ペプチド模倣体のそれぞれの繰り返しユニット中のバックボーンは、天然アミノ酸と比較して１炭素原子分だけ広がる可能性がある。１炭素原子の広がりによって、例えばペプチドの安定性および親油性が増大する可能性がある。したがってオリゴ尿素ペプチドは、ｉＲＮＡ剤が細菌細胞壁の通過を目的とするとき、あるいは神経障害の治療などのためにｉＲＮＡ剤が血液−脳関門を横断しなければならないときに、有利である可能性がある。１実施形態では、受容体との高い親和性を生
み出すために、水素結合ユニットをオリゴ尿素ペプチドに結合させる。例えば、ＡｎｔペプチドまたはＴａｔペプチドが、オリゴ尿素結合体（またはオリゴチオ尿素結合体）であってもよい。
【０２４２】
本発明のｄｓＲＮＡ・ペプチド結合体は、ｉＲＮＡ剤上の様々な位置に存在するＳＲＭＳと関連付ける、例えば係留させることが可能である。例えば、ペプチドを、センス鎖上またはアンチセンス鎖上のいずれかにおいて末端に結合させてもよいし、ペプチドをビス結合してもよい（１つのペプチドがそれぞれの末端に係留され、一端がセンス鎖に結合し、一端がアンチセンス鎖に結合する）。他の選択肢では、ペプチドは、短いヘアピン構造のｉＲＮＡ剤のループ中など、内部に結合し得る。さらに他の選択肢では、ペプチドはペプチド−担体複合体などの複合体と関連付けられてもよい。
【０２４３】
オリゴヌクレオチド剤を対象に投与するために使用可能ないくつかの例示的な送達経路について述べる。さらに、オリゴヌクレオチド剤を、本明細書に記載の例示的な方法に従って製剤化することができる。
【０２４４】
ＲＧＤペプチド部分は、内皮系腫瘍細胞または乳がん腫瘍細胞のような腫瘍細胞を標的とするために使用することができる（ツィツマン（Ｚｉｔｚｍａｎｎ）ら、Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．、６２：５１３９−４３、２００２年）。ＲＧＤペプチドは、オリゴヌクレオチド剤（例えば、ｍｉＲＮＡまたはプレｍｉＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチド剤）を肺、腎臓、脾臓または肝臓を含む様々なその他の組織の腫瘍に対して標的設定するのを容易にすることもできる（アオキ（Ａｏｋｉ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：７８３−７８７、２００１年）。好ましくは、ＲＧＤペプチドは、オリゴヌクレオチド剤を腎臓に対して標的設定するのを容易にするだろう。ＲＧＤペプチドは直線状でも環状でもよく、また、例えば、特定の組織に対する標的設定を容易にするためのグリコシル化またはメチル化など、修飾されていてもよい。例えば、グリコシル化ＲＧＤペプチドは、αｖβ３を発現している腫瘍細胞にオリゴヌクレオチド剤を送達することができる（ホーブナー（Ｈａｕｂｎｅｒ）ら、Ｊｏｕｒ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．、４２：３２６−３３６、２００１年）。
【０２４５】
増殖している細胞中に豊富なマーカーを標的とするペプチドを使用することもできる。例えば、ＲＧＤ含有ペプチドおよびペプチド模倣体は、がん細胞、特にαｖβ３インテグリンを提示する細胞を標的とすることができる。したがって、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤを含んでいる環状ペプチド、Ｄ−アミノ酸を含んでいるＲＧＤペプチド、ならびに合成ＲＧＤ模倣体を使用することが可能であろう。ＲＧＤに加えて、αｖβ３インテグリン・リガンドを標的とする他の部分を使用することもできる。一般に、そのようなリガンドは、増殖している細胞および血管新生を制御するために使用することができる。このタイプの好ましい結合体には、ＰＥＣＡＭ−１、ＶＥＧＦ、または他のがん遺伝子（例えば本明細書に記載のがん遺伝子）を標的とするオリゴヌクレオチド剤が含まれる。
【０２４６】
「細胞透過性ペプチド」は、細胞（例えば細菌または真菌の細胞などの微生物細胞、あるいはヒト細胞のような哺乳動物細胞）に浸透することができる。微生物細胞透過性ペプチドは、例えばαらせん状直鎖ペプチド（例えばＬＬ−３７またはセクロピンＰ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えばα‐デフェンシン、β‐デフェンシンまたはバクテネシン）、またはわずか１〜２個の中心的なアミノ酸を含んでいるペプチド（例えばＰＲ−３９、インドリシジン）であってよい。細胞透過性ペプチドは核移行シグナル（ＮＬＳ）を含むこともできる。例えば、細胞透過性ペプチドは、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１の融合ペプチドドメインとＳＶ４０大型Ｔ抗原のＮＬＳとに由来するＭＰＧなどの、２部分からなる両親媒性ペプチドであってよい（シメオニ（Ｓｉｍｅｏｎｉ）ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２７１７〜２７２４、２００３）。
【０２４７】
１実施形態では、リガンド結合モノマーに係留される標的設定ペプチドは、両親媒性のαらせん状ペプチドであってよい。例示的な両親媒性のαらせん状ペプチドには、セクロピン、ライコトキシン、パラダキシン、ブフォリン、ＣＰＦ、ボンビニン様ペプチド（ＢＬＰ）、カテリシディン、セラトトキシン、サッカメーバ・クラバ（Ｓ．ｃｌａｖａ）のペプチド、メクラウナギ腸管の抗菌性ペプチド（ＨＦＩＡＰ）、マガイニン、ブレビニン−２、ダーマセプチン、メリチン、プレウロシディン、Ｈ２Ａペプチド、アフリカツメガエルのペプチド、エスカレンチン−１、およびカエリンがあるが、これらに限定はされない。らせんの安定性を完全に保つために、いくつかの要因を考慮することが好ましいであろう。例えば、らせん安定化残基を最大数使用し（例えばｌｅｕ、ａｌａ、またはｌｙｓ）、らせん不安定化残基を最小数使用する（例えばプロリン、または環状モノマーユニット）。キャッピング残基も考慮し（例えば、ＧｌｙはＮ‐キャッピング残基の例である）、かつ／あるいはＣ末端アミド化を使用して、らせんを安定化させるために追加のＨ結合を与えることも可能である。ｉ±３、あるいはｉ±４位離れた、正反対の電荷を有する残基間の塩架橋の形成によって、安定性をもたらすことができる。例えば、リシン、アルギニン、ホモアルギニン、オルニチンまたはヒスチジンなどのカチオン性残基は、アニオン性の残基であるグルタミン酸またはアスパラギン酸と塩架橋を形成することが可能である。
【０２４８】
ペプチドおよびペプチド模倣体のリガンドには、天然型または修飾型ペプチド、例えばＤまたはＬペプチド；α、β、またはγペプチド；Ｎ−メチルペプチド；アザペプチド；１つまたは複数のアミドを有するペプチド、すなわち１つまたは複数の尿素、チオ尿素、カルバメート、またはスルホニル尿素結合で結合が置換されたペプチド；または環状ペプチド、を有するリガンドがある。
【０２４９】
一部の実施形態では、ペプチドはカチオン性または疎水性のうち少なくともいずれか一方である部分を有することができる。
一部の実施形態では、リガンドは本明細書に記載の核酸塩基のうち任意のものであってよい。
【０２５０】
一部の実施形態では、リガンドは置換アミン（例えばジメチルアミノ）であってよい。一部の実施形態では、置換アミンを例えばプロトン化またはアルキル化によって四級化し、カチオンにすることができる。一部の実施形態では、置換アミンは、比較的疎水性の高い係留部（例えばアルキレン）の末端位置にあってもよい。
【０２５１】
一部の実施形態では、リガンドは次のトリテルペンのうちの１つであってよい。
【０２５２】
【化１２】
2009504782.tif 000019
一部の実施形態では、リガンドは置換または非置換のコレステロール、あるいはその立体異性体、あるいは次のステロイドのうち１つであってよい。
【０２５３】
【化１３】
2009504782.tif 000020
一部の実施形態では、係留されるリガンドは、対応する未係留または未結合リガンドよりも１つ以上多い原子を含むことができる（例えば、ヘテロ原子を含む官能基の１以上のプロトンまたはヘテロ原子を含む官能基全体が、担体または係留部へのリガンドの結合時に未結合のリガンドから除かれる場合がある）。例えば、コレステロールの３−ヒドロキシル基のプロトンは係留部によって置換される可能性があり（例えば、コレステロール−３−ＯＨ（未結合状態）およびコレステロール−３−Ｏ−係留部（結合状態））、あるいはコレステロールの３−ヒドロキシル基全体が硫黄原子によって置換される可能性がある（例えばコレステロール−３−ＯＨ（未結合状態）およびコレステロール−３−Ｓ−係留部（結合状態、例えばチオコレステロール））。
【０２５４】
オリゴヌクレオチド剤を製造する方法
本明細書に記載の異常塩基を含んでいるリボヌクレオシドのリストは、パミラ  Ｆ．クレイン（Ｐａｍｅｌａ  Ｆ．  Ｃｒａｉｎ）、ジェフ  ロゼンスキー（Ｊｅｆ  Ｒｏｚｅｎｓｋｉ）およびジェームズ  Ａ．マックロスキー（Ｊａｍｅｓ  Ａ．  ＭｃＣｌｏｓｋｅｙ）（米国８４１１２ユタ州ソルトレークシティ所在のユタ大学、Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）によって維持されている「ＲＮＡ修飾データベース（RNA Modification Database）」に記載されている。
【０２５５】
５’シリル保護基をリボヌクレオシドの２’位の酸不安定なオルトエステルと共に使用して、ホスホロアミダイト法によってオリゴヌクレオチドを合成することができる。最後の脱保護条件は、ＲＮＡ生成物をそれほど分解しないことが分かっている。異常塩基およびユニバーサル塩基上の官能基は、実施される本明細書に記載の操作に適合した保護基を用いて、オリゴヌクレオチド合成の際にブロッキングされる。合成はすべて任意の自動または手動シンセサイザにおいて、大規模、中規模、または小規模で行うことができる。この合成は、マルチウェルプレートまたはスライドガラスで行うこともできる。
【０２５６】
５’‐Ｏ‐シリル基は、フッ化物イオンへの接触によって除去することが可能であり、該フッ化物イオンには、任意のフッ化物イオン供給源、例えば無機カウンターイオンと組み合わせてフッ化物イオンを含む塩類（例えばフッ化セシウムおよびフッ化カリウム）、または有機カウンターイオンと組み合わせてフッ化物イオンを含む塩類（例えばフッ化テトラアルキルアンモニウム）が挙げられる。クラウンエーテル触媒を無機フッ化物と組み合わせて脱保護反応に利用することができる。好ましいフッ化物イオン供給源は、フッ化テトラブチルアンモニウムまたはフッ化水素酸アミン（例えばＨＦ水溶液と二極性の非プロトン性溶媒（例えばジメチルホルムアミド）中のトリエチルアミンとの組み合わせ）である。
【０２５７】
亜リン酸トリエステルおよびホスホトリエステルに使用する保護基の選択により、フッ化物に対するトリエステルの安定性を変更することができる。ホスホトリエステルまたは亜リン酸トリエステルのメチル基保護は、フッ化物イオンに対抗して結合を安定させて、工程歩留まりを改善することができる。
【０２５８】
リボヌクレオシドは反応性の２’ヒドロキシル置換基を有するので、ＲＮＡ中のこの反応性の２’位を、５’‐Ｏ‐シリル保護基と両立する保護基（例えば、フッ化物に対し安定なもの）で保護することが望ましいかもしれない。オルトエステルはこの基準を満たし、最終的な酸脱保護ステップで容易に除去可能であり、ＲＮＡの分解を最小限にすることができる。
【０２５９】
テトラゾール触媒を標準的なホスホロアミダイトカップリング反応に使用することができる。好ましい触媒には、例えばテトラゾール、Ｓ−エチル−テトラゾール、ｐ−ニトロフェニルテトラゾールがある。
【０２６０】
一般的なプロセスは以下のとおりである。ヌクレオシドを適切に保護処理し、固相または液相のＲＮＡオリゴヌクレオチド合成に使用するために官能化する。リボヌクレオチド中の２’−ヒドロキシル基は、トリス・オルトエステル試薬を使用して修飾することができる。酸性触媒（例えばｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム）の存在下でリボヌクレオシドをトリス・オルトエステル試薬と反応させることにより、２’−ヒドロキシルを修飾して２’‐Ｏ‐オルトエステル・ヌクレオシドを生成させることができる。この反応は当業者には周知である。その後、生成物を、当業者に周知の反応によってオリゴヌクレオチドまたはポリマー内に組み込むための所望の試薬（例えばヌクレオシド・ホスホロアミダイト）を生成するために、さらなる保護基反応（例えば５’‐Ｏ‐シリル化）ならびに官能化（例えば３’‐Ｏ‐ホスフィチル化）に供することができる。
【０２６１】
好ましいオルトエステルには、アシル保護基またはエステル保護基で保護されたエチレングリコール・リガンドを含んでいるものがある。具体的には、好ましいアシル基はアセチルである。次いで、当業者であれば、該ヌクレオシド試薬を市販のシンセサイザ（例えばＧｅｎｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ  Ｐｌｕｓ（ファルマシア）、３８０Ｂ（アプライド・バイオシステムズ））でＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成するために使用することができる。オリゴヌクレオチドまたはポリマーの合成（液相または固相のいずれか）に続き、生成物を、非酸性の試薬を使用して１以上の反応に供することができる。これらの反応のうち１つは強塩基条件（例えば４０％メチルアミン水溶液、５５℃で１０分間）の場合があり、エチレングリコール・リガンドからアシル保護基を除去するがオルトエステル部分は結合したまま残ることになる。得られたオルトエステルは、ポリマーまたはオリゴヌクレオチドがその後の用途に使用される時に結合したままでもよいし、最終的な弱酸性反応、例えば５０ｍＭ酢酸（ｐＨ３．０）中５５℃で１０分間、続いて等容の１５０ｍＭトリス緩衝液を添加して５５℃で１０分間の反応で除去されてもよい。
【０２６２】
ユニバーサル塩基は、「Survey and Summary: The Applications of Universal DNA base analogues」、ロークス、Ｄ．（Ｌｏａｋｅｓ，Ｄ．）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００１年、２９、ｐ．２４３７に記載されており、同文献は参照によってその全体を組み入れる。具体例は以下の文献に記載されている：Liu, D.; Moran, S.; Kool, E. T. Chem. Biol., 1997, 4, 919-926; Morales, J. C.; Kool, E. T. Biochemistry, 2000, 39, 2626-2632; Matray, T, J.; Kool, E. T., J. Am. Chem. Soc, 1998, 120, 6191-6192; Moran, S. Ren, R. X.-F.; Rumney IV, S.; Kool, E. T., J. Am. Chem. Soc, 1997, 119, 2056-2057; Guckian, K. M.; Morales, J. C.; Kool, E. T., J. Org. Chem., 1998, 63, 9652-9656; Berger, M.; Wu. Y.; Ogawa, A. K.; McMinn, D. L.;
Schultz, P.G.; Romesberg, F. E., Nucleic Acids Res., 2000, 28, 2911-2914; Ogawa, A. K.; Wu, Y.; McMinn, D. L.; Liu, J.; Schultz, P. G.; Romesberg, F. E., J. Am. Chem. Soc, 2000, 122, 3274-3287; Ogawa, A. K.; Wu. Y.; Berger, M.; Schultz, P.
G.; Romesberg, F. E., J. Am. Chem. Soc, 2000, 122, 8803-8804; Tae, E. L.; Wu, Y.; Xia, G.; Schultz, P. G.; Romesberg, F. E., J. Am. Chem. Soc, 2001, 123, 7439-7440; Wu, Y.; Ogawa, A. K.; Berger, M.; McMinn, D. L.; Schultz, P. G.; Romesberg, F. E., J. Am. Chem. Soc, 2000, 122, 7621-7632; McMinn, D. L.; Ogawa. A. K.; Wu, Y.; Liu, J.; Schultz, P. G.; Romesberg, F. E., J. Am. Chem. Soc, 1999, 121, 11585-11586; Brotschi, C; Haberli, A.; Leumann, C, J. Angew. Chem. Int. Ed., 2001,
40, 3012-3014; Weizman, H.; Tor, Y., J. Am. Chem. Soc, 2001, 123, 3375- 3376; Lan, T.; McLaughlin, L. W., J. Am. Chem. Soc, 2000, 122, 6512-13。
【０２６３】
上記に議論されるように、本明細書に記載のモノマーおよび方法は、修飾ＲＮＡ分子、すなわちポリマー分子であって本明細書に記載のモノマー化合物および／または天然リボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチド（１以上のサブユニットが異常塩基もしくはユニバーサル塩基を含んでいる）の任意の組み合わせを含んでなるポリマー分子の調製に使用可能である。修飾ＲＮＡ分子には、例えば化学的または立体化学的に修飾されたヌクレオシド（例えば、１以上のバックボーン修飾（例えばホスホロチオエートまたはＰ−アルキル）を有するもの；１以上の糖修飾（例えば２’−ＯＣＨ３、２’−Ｆ）を有するもの；または１以上の塩基修飾（例えば５−アルキルアミノまたは５−アリルアミノ）を有するもののうち少なくともいずれか）あるいはヌクレオシド代用物を含んでいる分子が挙げられる。
【０２６４】
５’−ヒドロキシル基をホスホロアミダイトとカップリングすると亜リン酸エステル中間物が形成され、これが次いで（例えばヨウ素で）酸化されてリン酸塩ジエステルになる。別例として、該亜リン酸エステルを、例えば硫黄、セレン、アミノ、およびホウ素試薬
で処理して修飾リン酸バックボーンを形成してもよい。本明細書に記載のモノマーとヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド鎖との間の結合も、ヨウ素、硫黄、セレン、アミノおよびホウ素試薬で処理して、非修飾および修飾リン酸バックボーンをそれぞれ形成することができる。同様に、本明細書に記載のモノマーを、本明細書に記載の、任意の修飾を含むヌクレオシドもしくはオリゴヌクレオチドまたはヌクレオシド代用物と結合させてもよい。
【０２６５】
オリゴヌクレオチド・ペプチド結合体の合成および精製は、確立されている方法によって実施することが可能である。例えば、テゥルーフェルト（Ｔｒｕｆｅｒｔ）ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、５２：３００５、１９９６；およびＳ．Ｔ．クルーク（Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ）編「Antisense Drug Technology」、２００１年、マルセル  デッカー  イン
コーポレイテッド（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）の中のマノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）著「Oligonucleotide Conjugates in Antisense Technology」を参照のこと。
【０２６６】
本発明の１実施形態では、ペプチド模倣体を修飾して、明確で特異的な好ましい立体構造をとる制約型ペプチドを製造することが可能であり、該立体構造によってペプチドの効力および選択性を増大させることが可能である。例えば、制約型ペプチドはアザペプチドであってよい（ガンテ（Ｇａｎｔｅ）、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、４０５〜４１３、１９８９）。アミノ酸側鎖の構造を変えずに、該アミノ酸のα炭素を窒素原子で置換することによって、アザペプチドが合成される。例えば、伝統的なペプチド合成カップリング法においてヒドラジンを使用し、ヒドラジンを「カルボニル・ドナー」、例えばクロロギ酸フェニルと反応させることなどによって、アザペプチドを合成することが可能である。
【０２６７】
本発明の１実施形態では、ペプチドまたはペプチド模倣体（例えば、リガンド結合モノマーに係留されるペプチドまたはペプチド模倣体）は、Ｎ−メチルペプチドであってよい。Ｎ−メチルペプチドはＮ−メチルアミノ酸から構成されるが、Ｎ−メチルアミノ酸はペプチドのバックボーン中に追加のメチル基を与えることによってタンパク質分解酵素による切断に対する追加の抵抗手段を与える可能性がある。Ｎ−メチルペプチドは、当分野で知られている方法によって合成することが可能である（例えば、リンドグレン（Ｌｉｎｄｇｒｅｎ）ら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２１：９９、２０００；ランゲル（Ｌａｎｇｅｌ）編「Cell Penetrating Peptides:Processes and Applications」、米国フロリダ州ボカラトン所在のＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、２００２；フィッシェ（Ｆｉｓｃｈｅ）ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ．Ｃｈｅｍ．１２：８２５、２００１；ワンダー（Ｗａｎｄｅｒ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２４：１３３８２、２００２を参照）。例えば、ＡｎｔペプチドまたはＴａｔペプチドが、Ｎ−メチルペプチドであってもよい。
【０２６８】
本発明の１実施形態では、ペプチドまたはペプチド模倣体（例えば、リガンド結合モノマーに係留されるペプチドまたはペプチド模倣体）は、β−ペプチドであってよい。β−ペプチドは、溶液中でらせん、プリーツ・シート、ターンおよびヘアピンなどの安定した２次構造を形成する。β−ペプチドの環状誘導体は、固体状態で折りたたまれてナノチューブになりうる。β−ペプチドは、タンパク質分解酵素による分解に対して耐性がある。β−ペプチドは、当分野で知られている方法によって合成することが可能である。例えば、ＡｎｔペプチドまたはＴａｔペプチドがβ−ペプチドであってもよい。
【０２６９】
本発明の１実施形態では、ペプチドまたはペプチド模倣体（例えば、リガンド結合モノマーに係留されるペプチドまたはペプチド模倣体）は、オリゴカルバメートであってよい。オリゴカルバメートペプチドは、カルバメート輸送体により促進される輸送経路により細胞内に取り込まれる。例えば、ＡｎｔペプチドまたはＴａｔペプチドがオリゴカルバメ
ートであってもよい。
【０２７０】
本発明の１実施形態では、ペプチドまたはペプチド模倣体（例えば、リガンド結合モノマーに係留されるペプチドまたはペプチド模倣体）は、ペプチド模倣体のアミド結合が尿素部分で置換されているオリゴ尿素結合体（またはオリゴチオ尿素結合体）であってよい。アミド結合の置換によって、タンパク質分解酵素、例えば胃腸管のタンパク質分解酵素による分解に対する耐性が増大する。１実施形態では、オリゴ尿素結合体を、経口送達において使用するためにオリゴヌクレオチド剤に係留させる。オリゴ尿素ペプチド模倣体のそれぞれの繰り返しユニット中のバックボーンは、天然アミノ酸と比較して１炭素原子分だけ広がる可能性がある。１炭素原子の広がりによって、例えばペプチドの安定性および親油性が増大する可能性がある。したがってオリゴ尿素ペプチドは、オリゴヌクレオチド剤が細菌細胞壁の通過を目的とするとき、あるいは神経障害の治療などのためにオリゴヌクレオチド剤が血液−脳関門を横断しなければならないときに、有利である可能性がある。１実施形態では、受容体との高い親和性を生み出すために、水素結合ユニットをオリゴ尿素ペプチドに結合させる。例えば、ＡｎｔペプチドまたはＴａｔペプチドが、オリゴ尿素結合体（またはオリゴチオ尿素結合体）であってもよい。
【０２７１】
本発明のｓｉＲＮＡ・ペプチド結合体は、オリゴヌクレオチド剤上の様々な位置に存在するリガンド結合モノマーと関連付ける、例えば係留させることが可能である。例えば、ペプチドを、センス鎖上またはアンチセンス鎖上のいずれかにおいて末端に結合させてもよいし、ペプチドをビス結合してもよい（それぞれの末端に１つのペプチドが係留され、一端がセンス鎖に結合し、一端がアンチセンス鎖に結合する）。他の選択肢では、ペプチドは、短いヘアピン構造のオリゴヌクレオチド剤のループ中など、内側に結合し得る。さらに他の選択肢では、ペプチドはペプチド−担体複合体などの複合体と関連付けられてもよい。
【０２７２】
ペプチド‐担体複合体は、少なくとも、（生物系および／または細胞への送達などのために）１以上のオリゴヌクレオチド剤を封入することができる担体分子と、該担体分子の外側に係留された、担体複合体を特定の組織または細胞種に向けて標的指定するためなどのペプチド部分とで構成される。担体複合体は、該複合体の外表面上に追加の標的指定分子を、あるいは細胞への送達を援助する融合剤を担持することもできる。担体内に封入される１以上のオリゴヌクレオチド剤は、担体内部への同剤の送達を援助することができる親油性分子に結合されていてもよい。
【０２７３】
担体分子または担体構造体は、例えばミセル、リポソーム（例えばカチオン性リポソーム）、ナノ粒子、ミクロスフェアあるいは生分解性ポリマーであってよい。ペプチド部分は、様々な結合、例えばジスルフィド結合、酸不安定な結合、ペプチドを用いた結合、オキシアミノ結合あるいはヒドラジン結合などによって担体分子に係留することができる。例えば、ペプチドを用いた結合はＧＦＬＧペプチドであってよい。特定の結合は特定の長所を有することになり、その長所（あるいは短所）は、組織標的または意図される用途によって考慮することができる。例えば、ペプチドを用いた結合は血流中では安定であるが、リソソーム中の酵素的切断には弱い。
【０２７４】
保護されたモノマー化合物を反応液から分離し、カラムクロマトグラフィ、高圧液体クロマトグラフィ、または再結晶のような方法によってさらに精製することができる。当業者には当然のことであるが、本明細書中の式の化合物を合成する別の方法は当分野の通常の技術者には明らかである。さらに、様々な合成ステップを、所望の化合物を得るために別の順序または順番で実施することもできる。本明細書に記載の化合物を合成するのに有用なその他の合成化学変換、保護基（例えば、塩基上にあるヒドロキシル、アミノなど）および保護基の方法論（保護および脱保護）は当分野で周知であり、例えば、以下の文献
、すなわちＲ．ラロック（Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ）、「Comprehensive Organic Transformations」、ＶＣＨ出版（ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）（１９８９）；Ｔ．Ｗ．グリーン
（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）およびＰ．Ｇ．Ｍ．ワッツ（Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ）、「Protective Groups in Organic Synthesis」、第２版、ジョンワイリーアンドサンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）（１９９１）；Ｌ．ファイザー（Ｌ．Ｆｉｅｓｅｒ）およびＭ．ファイザー（Ｍ．Ｆｉｅｓｅｒ）、「Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis」、ジョンワイリーアンドサンズ（１９９４）；およびＬ．パケッテ
（Ｌ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ）編「Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis」、ジョンワイリーアンドサンズ（１９９５）、ならびにその後続版に記載されたものなどがある。
【０２７５】
本発明の保護されたモノマー化合物は、１つ以上の不斉中心を含む可能性があり、従ってラセミ化合物およびラセミ混合物、単一立体異性体、個々のジアステレオマーおよびジアステレオマー混合物として生じる可能性がある。これらの化合物のそのような異性体はすべて、明らかに本発明に含まれる。本明細書に記載の化合物は、さらに結合（例えば炭素‐炭素結合および炭素窒素結合、例えばアミド）あるいは結合の回転を制限しうる（例えば環または二重結合の存在に起因する制限を与えうる）置換を含むことができる。従って、シス／トランス、Ｅ／Ｚ異性体、および回転異性体（ロータマー）はすべて、明らかに本願に含まれる。本発明の化合物は、そのような例においては、複数の互変異性体で表わすことも可能であり、本発明は本明細書に記載の化合物のすべての互変異性体を明らかに含んでいる（例えば、環系のアルキル化により複数の部位がアルキル化される可能性があるが、本発明は明らかにそのような反応生成物をすべて含んでいる）。そのような化合物のそのような異性体はすべて本発明に明らかに含まれている。本明細書に記載の化合物のすべての結晶形は本発明に明らかに含まれている。
【０２７６】
本明細書に記載の代表的なリガンド結合モノマー、ならびにリガンド結合モノマーおよび関連化合物を調製するための典型的な合成法については後述する。他所で議論されるように、リガンド結合モノマーのヒドロキシル基のための保護基（例えばＯＦＧ１）には、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴ）が挙げられるが、これに限定はされない。例えば、一部の実施形態においては、保護基としてＯＦＧ１の代わりにシリコン系保護基を使用することが望ましいこともある。したがって、シリコン系保護基は、必要または所望に応じて、ＤＭＴ基と併用してもよいしＤＭＴ基の代わりに使用してもよい。したがって、以下に示すリガンド結合モノマーおよび合成法は、ＯＦＧ１用の保護基としてＤＭＴ保護基を特色としているが、本発明をどのようにも限定するものと解釈すべきではない。
【０２７７】
【化１４】
2009504782.tif 000021
【０２７８】
【化１５】
2009504782.tif 000022
【０２７９】
【化１６】
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【０２８０】
【化１７】
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【０２８１】
【化１８】
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【０２８２】
【化１９】
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【０２８３】
【化２０】
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【０２８４】
【化２１】
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【０２８５】
【化２２】
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【０２８６】
【化２３】
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【０２８７】
【化２４】
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【０２８８】
【化２５】
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【０２８９】
【化２６】
2009504782.tif 000033
【０２９０】
【化２７】
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【０２９１】
【化２８】
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【０２９２】
【化２９】
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【０２９３】
【化３０】
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【０２９４】
【化３１】
2009504782.tif 000038
【０２９５】
【化３２】
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【０２９６】
【化３３】
2009504782.tif 000040
【０２９７】
【化３４】
2009504782.tif 000041
リガンド結合モノマーの例
【０２９８】
【化３５】
2009504782.tif 000042
【０２９９】
【化３６】
2009504782.tif 000043
【０３００】
【化３７】
2009504782.tif 000044
【０３０１】
【化３８】
2009504782.tif 000045
【０３０２】
【化３９】
2009504782.tif 000046
【０３０３】
【化４０】
2009504782.tif 000047
【０３０４】
【化４１】
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【０３０５】
【化４２】
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【０３０６】
【化４３】
2009504782.tif 000050
【０３０７】
【化４４】
2009504782.tif 000051
オリゴヌクレオチド剤へのリガンドの結合
オリゴヌクレオチド剤、例えば、ｍｉＲＮＡまたはプレｍｉＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチド剤にリガンドを結合すると、同剤の調整作用に好ましい影響を及ぼす可能性がある。例えば、オリゴヌクレオチド剤の薬物動態、安定性または組織特異性のうち少なくともいずれかが向上する可能性がある。
【０３０８】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド剤（以下のＯＴ−Ｉ〜ＯＴ−ＩＶにおいて「ＮＡ」とされる、例えばＲＮＡ、ＤＮＡ、キメラ状態のＲＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ−ＲＮＡもしくはＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ）は、リガンドを含む部分の結合により化学修飾されていてもよく、該部分はオリゴヌクレオチドまたは核酸に対して該リガンド（Ｌ）を結合するための１以上の化学結合を有している。オリゴヌクレオチド剤のリガンドは、係留部およびリンカーのうち一方または両方により連結可能である。下記の略図では、典型的な化学結合がＸ、ＹおよびＺとして表わされている。これらは係留部またはリンカーの一部であってよい。
【０３０９】
【化４５】
2009504782.tif 000052
リガンドは、３’端、５’端のうち一方または両方、および内側の位置に結合させることができる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、式ＯＴ−Ｉを有する１以上の部分を結合させることにより化学修飾することができる。表４は、様々な結合体について示している。
【０３１０】
【表４】
2009504782.tif 000053
典型的なリガンドを表５に列挙し、また本明細書の他所で議論する。表５に示す典型的なリガンド（Ｌ）が好ましい。
【０３１１】
【表５】
2009504782.tif 000054
典型的なＸ、ＹおよびＺ部分を表６に示す。Ｘ、ＹおよびＺ部分は互いに独立に選択することができる。
【０３１２】
【表６】
2009504782.tif 000055
典型的な係留部を表７に示す。
【０３１３】
【表７】
2009504782.tif 000056
本明細書に記載の化合物は、本明細書に記載の方法により、または市販の試薬および出発物質から従来の方法により調製することができる。
【０３１４】
化合物１は、フレーザー（Ｆｒａｓｅｒ）らの報告（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．４１：１５２３、２０００年）のようにして調製される。ステップ（ｉｉ）、（ｉｉｉ）（ａ）、（ｉｉｉ）（ｃ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）は、文献の手順（フレーザー（Ｆｒａｓｅｒ）ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．４１：１５２３、２０００年）に従って行なわれる。ステップ（ｉｉｉ）（ｂ）および（ｖ）（ｂ）は、文献（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１３：１７１３、２００３年）に報告さ
れるようにして実施される。ステップ（ｉｖ）は、文献（コーリー（Ｃｏｒｅｙ）およびベンケイテスバール（Ｖｅｎｋａｔｅｓｗａｒｌｕ）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９４：６１９０、１９７２年）に報告されるようにして実施される。
【０３１５】
【化４６】
2009504782.tif 000057
ある化合物の合成について以下のスキーム２に述べる。ステップ（ｉ）はデュボウィック（Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ）およびラディア（Ｒａｄｉａ）の報告（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３８：５２５７、１９９７年）のようにして実施し；ステップ（ｉｉ）は
コーリー（Ｃｏｒｅｙ）およびベンケイテスバール（Ｖｅｎｋａｔｅｓｗａｒｌｕ）の報告（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９４：６１９０、１９７２年）のようにして実施し；ステップ（ｉｉｉ）はフレーザー（Ｆｒａｓｅｒ）らの報告（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．４１：１５２３、２０００年）のようにして実施し；ステップ（ｉｖ）はミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら著（「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、２０００、２．５．１−２．５．３６、ジョンワイリーアンドサンズ社）に記載されているようにして実施する。
【０３１６】
【化４７】
2009504782.tif 000058
ある化合物の合成は以下のスキーム３に記載のようにして実施する。ステップ（ｉ）は、ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら著（「Current Protocol in Nucleic Acids Chemistry」、
２０００、２．５．１−２．５．３６、ジョンワイリーアンドサンズ社）に記載されているようにして実施し；ステップ（ｉｉ）は、コーリー（Ｃｏｒｅｙ）およびベンケイテスバール（Ｖｅｎｋａｔｅｓｗａｒｌｕ）の報告（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９４：６１９０、１９７２年）のようにして実施し、ステップ（ｉｉｉ）は、フレーザー（Ｆｒａ
ｓｅｒ）らの報告（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．４１：１５２３、２０００年）のようにして実施する。
【０３１７】
【化４８】
2009504782.tif 000059
ある化合物の合成は以下のスキーム４に記載のようにして実施する。ステップ（ｉｉ）は、コーリー（Ｃｏｒｅｙ）およびベンケイテスバール（Ｖｅｎｋａｔｅｓｗａｒｌｕ）の報告（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９４：６１９０、１９７２年）のようにして実施し、ステップ（ｉｉｉ）は、フレーザー（Ｆｒａｓｅｒ）らの報告（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．４１：１５２３、２０００年）のようにして実施する。
【０３１８】
【化４９】
2009504782.tif 000060
ある化合物の合成について以下のスキーム５に述べる。ステップ（ｉ）は、ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら著（「Current Protocol in Nucleic Acids Chemistry」、２０００、２
．５．１−２．５．３６、ジョンワイリーアンドサンズ社）に記載されているようにして実施し；ステップ（ｉｉ）は、コーリー（Ｃｏｒｅｙ）およびベンケイテスバール（Ｖｅｎｋａｔｅｓｗａｒｌｕ）の報告（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９４：６１９０、１９７２年）のようにして実施し、ステップ（ｉｉｉ）は、フレーザー（Ｆｒａｓｅｒ）らの報告（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．４１：１５２３、２０００年）のようにして実施する。
【０３１９】
【化５０】
2009504782.tif 000061
ある化合物の合成について以下のスキーム６に述べる。スキーム６に示す化合物１３０は、リウ（Ｌｉｕ）およびオースティン（Ａｕｓｔｉｎ）の報告（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６６：８６４３、２００１年）のようにして得られる。ステップ（ｉ）および（ｉｉｉ）（ｂ）は、文献（Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．、１９５４年、第５４巻、ｐ．１）に報告されているようにして実施し；ステップ（ｉｉ）（ａ）は、文献の手順（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９９３年、第５８巻、ｐ．２３３４）に従って実施し；ステップ（ｉｉ）（ｂ）、（ｉｉｉ）（ａ）および（ｉｖ）（ｂ）は、文献（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、２００３年、第１３巻、ｐ．１７１３）に報告されているようにして実施し；ステップ（ｉｉｉ）（ｃ）は、デュボウィック（Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ）およびラディア（Ｒａｄｉａ）の報告（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３８：５２５７、１９９７年
）のようにして実施し；ステップ（ｉｖ）（ａ）は、文献（Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔ．、２００１年、第３巻、ｐ．１８０９）に報告されているようにして実施し；ステップ（ｖ）は、コーリー（Ｃｏｒｅｙ）およびベンケイテスバール（Ｖｅｎｋａｔｅｓｗａｒｌｕ）の報告（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９４：６１９０、１９７２年）のようにして実施し、ステップ（ｖｉ）は、フレーザーら（Ｆｒａｓｅｒ）らの報告（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．４１：１５２３、２０００年）のようにして実施する。
【０３２０】
【化５１】
2009504782.tif 000062
ある化合物の合成について以下のスキーム７に述べる。化合物１４６は、リウ（Ｌｉｕ
）およびオースティン（Ａｕｓｔｉｎ）の報告（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６６：８６４３、２００１年）のようにして得られる。ステップ（ｉ）（ｂ）および（ｉｉｉ）（ｃ）は、文献（Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．、１９５４年、第５４巻、ｐ．１）に報告されているようにして実施し；ステップ（ｉｉ）（ａ）は、文献の手順（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９９３年、第５８巻、ｐ．２３３４）に従って実施し；ステップ（ｉｉ）（ｂ）、（ｉｉｉ）（ｂ）および（ｉｖ）（ｂ）は、文献（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、２００３年、第１３巻、ｐ．１７１３）に報告されているようにして実施し；ステップ（ｉｉｉ）（ｄ）は、デュボウィック（Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ）およびラディア（Ｒａｄｉａ）の報告（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３８：５２５７、１９９７年）のようにして実施し；ステップ（ｉｖ）（ａ）は、文献（Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔ．、２００１年、第３巻、ｐ．１８０９）に報告されているようにして実施し；ステップ（ｖ）は、コーリー（Ｃｏｒｅｙ）およびベンケイテスバール（Ｖｅｎｋａｔｅｓｗａｒｌｕ）の報告（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９４：６１９０、１９７２年）のようにして実施し、ステップ（ｖｉ）は、フレーザーら（Ｆｒａｓｅｒ）らの報告（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．４１：１５２３、２０００年）のようにして実施する。
【０３２１】
【化５２】
2009504782.tif 000063
ある化合物の合成について以下のスキーム８に述べる。化合物１６３は、リウ（Ｌｉｕ）およびオースティン（Ａｕｓｔｉｎ）の報告（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６６：８６４３、２００１年）のようにして得られる。
【０３２２】
【化５３】
2009504782.tif 000064
ある化合物の合成について以下のスキーム９に述べる。化合物１８０は、リウ（Ｌｉｕ）およびオースティン（Ａｕｓｔｉｎ）の報告（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６６：８６４３、２００１年）のようにして得られる。
【０３２３】
【化５４】
2009504782.tif 000065
リガンド結合モノマーサブユニットならびにオリゴヌクレオチド合成用モノマー
定義
用語「ハロ」は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素の任意の基を指す。
【０３２４】
用語「アルキル」は、示した数の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を指す。例えば、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルとは、該基が（全部で）１個〜１２個の炭素原子をその中に有しうることを示す。用語「ハロアルキル」は、１つまたは複数の水素原子がハロによって置換されているアルキルを指し、すべての水素がハロによって置換されているアル
キル部分（例えばペルフルオロアルキル）を含む。アルキルおよびハロアルキル基は、任意選択でＯ、Ｎ、またはＳが挿入されていてもよい。用語「アラルキル」は、アルキル水素原子がアリール基によって置換されているアルキル部分を指す。アラルキルは、２つ以上の水素原子がアリール基によって置換されている基を含む。「アラルキル」の例には、ベンジル基、９−フルオレニル基、ベンズヒドリル基、およびトリチル基がある。
【０３２５】
用語「アルケニル」は、２〜８個の炭素原子を含み、１つまたは複数の二重結合を有することを特徴とする、直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を指す。典型的なアルケニルの例には、アリル基、プロペニル基、２−ブテニル基、３−ヘキセニル基および３−オクテニル基があるが、これらに限定はされない。用語「アルキニル」は、２〜８個の炭素原子を含み、１つまたは複数の三重結合を有することを特徴とする、直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を指す。典型的なアルキニルのいくつかの例は、エチニル、２−プロピニル、および３−メチルブチニル、およびプロパルギルである。ｓｐ２およびｓｐ３炭素が、任意選択で、それぞれアルケニル基およびアルキニル基の取り付け部位としての役割を果たしてもよい。
【０３２６】
用語「アルキルアミノ」および「ジアルキルアミノ」は、それぞれ‐ＮＨ（アルキル）基および‐ＮＨ（アルキル）２基を指す。用語「アラルキルアミノ」は、‐ＮＨ（アラルキル）基を指す。用語「アルコキシ」は‐Ｏ‐アルキル基を指し、用語「シクロアルコキシ」および「アラルコキシ」はそれぞれ‐Ｏ‐シクロアルキル基およびＯ‐アラルキル基を指す。用語「シロキシ」は、Ｒ３ＳｉＯ‐基を指す。用語「メルカプト」はＳＨ基を指す。用語「チオアルコキシ」は、‐Ｓ‐アルキル基を指す。
【０３２７】
用語「アルキレン」は、２価アルキル（すなわち‐Ｒ‐）、例えば‐ＣＨ２‐、‐ＣＨ２ＣＨ２‐、および‐ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２‐を指す。用語「アルキレンジオキソ」は、構造‐Ｏ‐Ｒ‐Ｏ‐（Ｒはアルキレンを表す）の２価の分子種を指す。
【０３２８】
用語「アリール」は、芳香族性の単環、二環、または三環炭化水素環系を指し、任意の環原子が置換されていてよい。アリール部分の例には、フェニル、ナフチル、アントラセニル、およびピレニルがあるが、これらに限定はされない。
【０３２９】
本願明細書で使用する用語「シクロアルキル」は、３〜１２個の炭素を有する飽和単環、二環、三環、または多環炭化水素基を含み、任意の環原子が置換されていてよい。本願明細書に記載するシクロアルキル基は、縮合環も含み得る。縮合環は、共通の炭素−炭素結合または共通の炭素原子を共有する環（例えば、スピロ縮合環）である。シクロアルキル部分の例には、シクロヘキシル、アダマンチル、ノルボルニル、およびデカリンがあるが、これらに限定はされない。
【０３３０】
用語「ヘテロシクリル」は、非芳香族性の３〜１０員の単環、８〜１２員の二環、または１１〜１４員の三環の環系であって、単環の場合１〜３個のヘテロ原子、二環の場合１〜６個のヘテロ原子、または三環の場合１〜９個のヘテロ原子を有し、前記ヘテロ原子がＯ、Ｎ、またはＳから選択されることを特徴とする環系（例えば炭素原子と、Ｎ、ＯまたはＳのヘテロ原子を単環、二環、または三環の場合にそれぞれ１〜３個、１〜６個、または１〜９個）であり、任意の環原子が置換されていてよい。本願明細書に記載するヘテロシクリル基は、縮合環も含み得る。縮合環は、共通の炭素−炭素結合または共通の炭素原子を共有する環（例えば、スピロ縮合環）である。ヘテロシクリルの例には、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、ピペリジニル、モルホリノ、ピロリニルおよびピロリジニルがあるが、これらに限定はされない。
【０３３１】
本明細書で使用する用語「シクロアルケニル」は、部分的に不飽和の、非芳香族性の、
単環、二環、三環、または多環の５〜１２個の炭素（好ましくは５〜８個の炭素）を有する炭化水素基を含み、任意の環原子が置換されていてよい。本明細書に記載のシクロアルケニル基は、縮合環も含み得る。縮合環は、共通の炭素−炭素結合または共通の炭素原子を共有する環（例えば、スピロ縮合環）である。シクロアルケニル部分の例には、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニル、またはノルボネニルがあるが、これらに限定はされない。
【０３３２】
用語「ヘテロシクロアルケニル」は、部分的に飽和した、非芳香族性の、５〜１０員の単環、８〜１２員の二環、または１１〜１４員の三環の環系であって、単環の場合１〜３個のヘテロ原子、二環の場合１〜６個のヘテロ原子、または三環の場合１〜９個のヘテロ原子を有し、前記ヘテロ原子がＯ、Ｎ、またはＳから選択されることを特徴とする環系（例えば炭素原子と、Ｎ、ＯまたはＳのヘテロ原子を単環、二環、または三環の場合にそれぞれ１〜３個、１〜６個、または１〜９個）を指し、任意の環原子が置換されていてよい。本明細書に記載のヘテロシクロアルケニル基は、縮合環も含み得る。縮合環は、共通の炭素−炭素結合または共通の炭素原子を共有する環（例えば、スピロ縮合環）である。ヘテロシクロアルケニルの例には、テトラヒドロピリジルおよびジヒドロピランがあるが、これらに限定はされない。
【０３３３】
用語「ヘテロアリール」は、芳香族性の５〜８員の単環、８〜１２員の二環、または１１〜１４員の三環の環系であって、単環の場合１〜３個のヘテロ原子、二環の場合１〜６個のヘテロ原子、または三環の場合１〜９個のヘテロ原子を有し、前記ヘテロ原子がＯ、Ｎ、またはＳから選択されることを特徴とする環系（例えば炭素原子と、Ｎ、ＯまたはＳのヘテロ原子を単環、二環、または三環の場合にそれぞれ１〜３個、１〜６個、または１〜９個）を指し、任意の環原子が置換されていてよい。本明細書に記載のヘテロアリール基は、共通の炭素−炭素結合を共有する縮合環も含み得る。
【０３３４】
用語「オキソ」は、炭素と結合している場合はカルボニルを形成し、窒素と結合している場合はＮ−オキシドを形成し、イオウと結合している場合はスルホキシドまたはスルホンを形成する酸素原子を指す。
【０３３５】
用語「アシル」は、いずれも置換基によってさらに置換することが可能な、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロシクリルカルボニル、またはヘテロアリールカルボニル置換基を指す。
【０３３６】
用語「置換基」は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロシクリル、ヘテロシクロアルケニル、シクロアルケニル、アリール、またはヘテロアリール基上で該基の任意の原子について「置換された」基を指す。適切な置換基には、制限を設けるものではないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、ＳＯ３Ｈ、硫酸、リン酸、ペルフルオロアルキル、ペルフルオロアルコキシ、メチレンジオキシ、エチレンジオキシ、カルボキシル、オキソ、チオオキソ、イミノ（アルキル、アリール、アラルキル）、Ｓ（Ｏ）ｎアルキル（ｎは０〜２）、Ｓ（Ｏ）ｎアリール（ｎは０〜２）、Ｓ（Ｏ）ｎヘテロアリール（ｎは０〜２）、Ｓ（Ｏ）ｎヘテロシクリル（ｎは０〜２）、アミン（モノ−、ジ−、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、ヘテロアラルキル、およびこれらの組合せ）、エステル（アルキル、アラルキル、ヘテロアラルキル）、アミド（モノ−、ジ−、アルキル、アラルキル、ヘテロアラルキル、およびこれらの組合せ）、スルホンアミド（モノ−、ジ−、アルキル、アラルキル、ヘテロアラルキル、およびこれらの組合せ）、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、非置換ヘテロシクリル、および非置換シクロアルキルがある。１態様では、基上の置換基は独立に、前述の置換基のいずれか１つ、またはいずれかのサブセットである。
【０３３７】
用語「アデニニル、シトシニル、グアニニル、チミニル、およびウラシリル」などは、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、およびウラシルの基を指す。
「保護された」部分とは、反応性を有する官能基（例えばヒドロキシル基もしくはアミノ基）、または１つ以上の官能基を有する分子種（例えば糖）であって、該官能基の反応性が、保護基の結合によって一時的に阻害されているものを指す。本明細書に記載のモノマーおよび方法に有用な保護基は、例えば、グリーン、Ｔ．Ｗ．（Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．）著「Protective Groups in Organic Synthesis」（ジョンワイリーアンドサンズ：ニューヨーク）、１９８１年に見出すことができる。同文献は参照によって本願に組み込まれる。
【０３３８】
本願明細書で使用する「異常」核酸塩基は、以下のうち任意のものを含みうる：
２−メチルアデニニル、
Ｎ６−メチルアデニニル、
２−メチルチオ−Ｎ６−メチルアデニニル、
Ｎ６−イソペンテニルアデニニル、
２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニニル、
Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデニニル、
２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデニニル、
Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデニニル、
Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデニニル、
２−メチルチオ−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデニニル、
Ｎ６−メチル−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデニニル、
Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニニル、
２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニニル、
Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニニル、
３−メチルシトシニル、
５−メチルシトシニル、
２−チオシトシニル、
５−ホルミルシトシニル、
【０３３９】
【化５５】
2009504782.tif 000066
Ｎ４−メチルシトシニル、
５−ヒドロキシメチルシトシニル、
１−メチルグアニニル、
Ｎ２−メチルグアニニル、
７−メチルグアニニル、
Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアニニル、
【０３４０】
【化５６】
2009504782.tif 000067
Ｎ２，７−ジメチルグアニニル、
Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアニニル、
１−メチルグアニニル、
７−シアノ−７−デアザグアニニル、
７−アミノメチル−７−デアザグアニニル、
プソイドウラシリル、
ジヒドロウラシリル、
５−メチルウラシリル、
１−メチルプソイドウラシリル、
２−チオウラシリル、
４−チオウラシリル、
２−チオチミニル
５−メチル−２−チオウラシリル、
３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシリル、
５−ヒドロキシウラシリル、
５−メトキシウラシリル、
ウラシリル５−オキシ酢酸、
ウラシリル５−オキシ酢酸メチルエステル、
５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシリル、
５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシリルメチルエステル、
５−メトキシカルボニルメチルウラシリル、
５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシリル、
５−アミノメチル−２−チオウラシリル、
５−メチルアミノメチルウラシリル、
５−メチルアミノメチル−２−チオウラシリル、
５−メチルアミノメチル−２−セレノウラシリル、
５−カルバモイルメチルウラシリル、
５−カルボキシメチルアミノメチルウラシリル、
５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシリル、
３−メチルウラシリル、
１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）プソイドウラシリル、
５−カルボキシメチルウラシリル、
５−メチルジヒドロウラシリル、または
３−メチルプソイドウラシリル。
【０３４１】
ユニバーサル塩基は、天然のＤＮＡ／ＲＮＡ塩基の各々の間の区別をほとんどせずに該塩基と塩基対を形成することができる。一般に、ユニバーサル塩基は、スタッキング相互作用により例えば二重鎖ＲＮＡまたはＲＮＡ様分子を安定化することが可能な、非水素結合する疎水性の芳香族部分である。ユニバーサル塩基は水素結合する置換基を含むこともできる。
【０３４２】
概要
オリゴヌクレオチド剤（例えば結合オリゴヌクレオチド剤）であって、限定するものではないが好適なリガンド結合モノマーサブユニットを含むものを、式（ＩＩ）として以下に示す。担体（一部の実施形態では「リンカー」とも呼ばれる）は、環式部分でも非環式部分でもよく、２つの「バックボーン結合点」（例えばヒドロキシル基）および１つのリガンドを含んでいる。リガンドは、担体に直接取り付けられてもよいし（例えば、結合させる）、あるいは、係留部（例えば１以上の原子の非環式の鎖；または核酸塩基、例えば任意選択で１以上の化学修飾、例えば異常塩基を有する天然の核酸塩基；またはユニバーサル塩基）を介在させて担体に間接的に取り付けられて（例えば、結合されて）もよい。したがって担体は、それぞれリガンドおよび係留部／係留部付リガンドのための「リガンドまたは係留結合点」も含んでいる。
【０３４３】
リガンド結合モノマーサブユニットはＲＮＡ分子の５’末端または３’末端のサブユニットであってもよい、つまり２つの「Ｗ」基のうちの一方がヒドロキシル基で、他方の「Ｗ」基が２以上の非修飾リボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドの鎖であってもよい。別例として、リガンド結合モノマーサブユニットは内側の位置を占める場合もあり、両方の「Ｗ」基が１以上の非修飾リボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドであってもよい。２以上のリガンド結合モノマーサブユニットが１つのＲＮＡ分子（例えばオリゴヌクレオチド剤）の中に存在してもよい。係留部付リガンド結合モノマーサブユニット（例えば、親油性部分（例えばコレステロール）が担体に係留されているもの）を含めるのに好適な位置は、３’末端、５’末端、または内側の位置である。
【０３４４】
【化５７】
2009504782.tif 000068
式（ＩＩ）の修飾ＲＮＡ分子は当技術分野で既知のオリゴヌクレオチド合成法を使用して得ることができる。好ましい実施形態では、式（ＩＩ）の修飾ＲＮＡ分子は、例えばホスホロアミダイトまたはＨ−ホスホネートを連結する手法を利用して、成長している鎖に１以上の対応するモノマー化合物（例えば下記のＡ、Ｂ、Ｃを参照）を組み込むことにより調製することができる。
【０３４５】
モノマー、例えばリガンド結合モノマーは、一般に、２つの異なる官能化を施されたヒドロキシル基（ＯＦＧ１およびＯＦＧ２）であって担体分子に連結される（下記のＡを参照）ヒドロキシル基と、リガンド／係留結合点とを含んでいる。本明細書で使用されるように、用語「官能化を施されたヒドロキシル基」は、ヒドロキシルプロトンが別の置換基に置き換えられていることを意味する。以下の代表的な構造ＢおよびＣに示されるように、担体上の一方のヒドロキシル基（ＯＦＧ１）は保護基（ＰＧ）で官能化される。他方のヒドロキシル基（ＯＦＧ２）は、（１）直接またはリンカー（Ｂに示すＬ）を介して間接的に、液相または固相合成の支持体試薬（塗りつぶした円）で官能化されてもよいし、（２）リン含有部分、例えばＣに示すようなホスホロアミダイトで官能化されてもよい。係留結合点は、成長している鎖にモノマーが組み込まれる時に、水素原子、適切な保護基、係留部、または係留部付リガンドに接続されていてよい（以下のＡにおける変更可能な「Ｒ」を参照）。したがって、係留されるリガンドは、成長している鎖にモノマーが組み込まれる時にモノマーに取り付けられていてもよいが、必ずしも取り付けられることが必要ではない。ある実施形態では、係留部、リガンドまたは係留部付リガンドは、「前駆体」リガンド結合モノマーサブユニットが鎖に組み込まれた後で「前駆体」リガンド結合モノマーサブユニットに連結されてもよい。下記に（ならびに本明細書の他所で）使用される波線は接続を表し、構成部分と結合点との間、または構成部分と係留分子（構成部分と結合点との間に置かれる）との間の直接の結合を表わすことができる。直接係留される、とは、該部分が結合点に直接結合することを意味する。間接的に係留される、とは、結合点と部分との間に係留分子が置かれていることを意味する。
【０３４６】
【化５８】
2009504782.tif 000069
（ＯＦＧ１）保護基は、例えばＴ．Ｗ．グリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）およびＰ．Ｇ．Ｍ．ワッツ（Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ）、「Protective Groups in Organic Synthesis」第２版、ジョンワイリーアンドサンズ（１９９１）から所望に応じて選択可能である。保護基は、アミダイト合成条件、貯蔵条件およびオリゴヌクレオチド合成条件の下で安定であることが好ましい。ヒドロキシル基（‐ＯＨ）は求核基（すなわちルイス塩基）であって、酸素を介して求電子（すなわちルイス酸）と反応する。水素が保護基（例えばトリアリールメチル基またはトリアルキルシリル基）に置き換えられているヒドロキシル基は、置換反応において求核分子としての反応性をほとんど有していない。したがって、保護されたヒドロキシル基は、例えばオリゴヌクレオチド合成の際に構造Ｃを例とする化合物のホモ結合を防ぐのに有用である。いくつかの実施形態では、好ましい保護基はジメトキシトリチル基である。他の実施形態では、好ましい保護基は下式：
【０３４７】
【化５９】
2009504782.tif 000070
を有するシリコン系保護基である。
【０３４８】
Ｘ５’、Ｘ５”、およびＸ５”’は、置換または非置換のアルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、アルコキシ、シクロアルコキシ、アラルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、またはシロキシ（すなわちＲ３ＳｉＯ‐、３
つの「Ｒ」基は上記に列挙された基の任意の組み合わせでよい）から選択することができる。Ｘ５’、Ｘ５”、およびＸ５”’はすべて同じであっても異なっていてもよく；Ｘ５’、Ｘ５”、およびＸ５”’のうちの２つが同一で３番目が異なっている組み合わせとして考えることもできる。ある実施形態では、Ｘ５’、Ｘ５”、およびＸ５”’は少なくとも１つのアルコキシ基またはシロキシ基を含んでいる。好ましい組み合わせとしては、Ｘ５’、Ｘ５”＝トリメチルシロキシおよびＸ５”’＝１，３‐（トリフェニルメトキシ）‐２‐プロポキシまたはシクロドデシルオキシが挙げられる。
【０３４９】
Ｘ５’、Ｘ５”、およびＸ５”’のその他の好ましい組み合わせには、以下に述べる脱保護および安定性の基準を満たすＯＦＧ１基が得られるものが挙げられる。該ＯＦＧ１基は、アミダイト合成条件、貯蔵条件およびオリゴヌクレオチド合成条件の下で安定であることが好ましい。シリル基は、例えば支持体に結合したオリゴヌクレオチドから迅速に（すなわち１分未満で）除去することが望ましい。迅速な除去により合成時間を縮小することによって、成長しているオリゴヌクレオチド鎖が試薬に曝露される時間を縮小することができるからである。シリル保護基が（例えば発色団シリル置換基の付加により）脱保護中に視認可能であれば、オリゴヌクレオチド合成が改善されうる。
【０３５０】
シリル保護基の選択は、安定性および除去し易さという最も重要な特性の競合しあう要求、ならびにこれらの競合する目的のバランスをとる必要から、複雑になる可能性がある。安定性を増大させるほとんどの置換基は、シリル基の除去に必要な反応時間も増大させ、おそらくはこの基の除去の難しさを増大させる可能性がある。
【０３５１】
ＯＦＧ１シリコン含有保護基へのアルコキシ置換基およびシロキシ置換基の付加は、該保護基のシリルエーテル結合のフッ化物切断に対する感受性を増加させる。該置換基の立体化学的な嵩を増加させると、安定性は保存されると同時にフッ化物不安定性は同じ程度までは減少しない。シリル基上の置換基の適切なバランスにより、シリルエーテルが実現可能なヌクレオシド保護基になる。
【０３５２】
ＯＦＧ１シリコン含有保護基の候補を、候補ＯＦＧ１基を担持した好ましい担体のテトラヒドロフラン溶液を室温で５モル等量のテトラヒドロフランに曝露することにより、試験することができる。反応時間は、薄層クロマトグラフィによる出発物質の消失をモニタすることにより決定することができる。
【０３５３】
Ｂの中のＯＦＧ２が、可溶性または不溶性の支持体試薬に接続されたリンカー（例えば比較的長い有機リンカー）を含んでいる場合、ＯＦＧ１が脱保護されて求核分子として自由に求電子基（例えばアミダイト基）を含む別のヌクレオシドまたはモノマーと反応するようになれば、液相または固相合成の技術を使用して、天然リボヌクレオチドおよび／または修飾リボヌクレオチドの鎖を構築することができる。別例として、天然または修飾リボヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオチド鎖を、アミダイト基またはＨ‐ホスホネートを介してモノマーＣのＯＦＧ２に接続することができる。この操作に続いて、ＯＦＧ１を脱保護し、回復した求核性のヒドロキシル基を、求電子基を含む別のヌクレオシドまたはモノマーと反応させることができる。Ｒ’は置換または非置換のアルキルまたはアルケニルであってよい。好ましい実施形態では、Ｒ’はメチル、アリルまたは２‐シアノエチルである。Ｒ”は、Ｃ１‐Ｃ１０アルキル基であってよく、好ましくは、３つ以上の炭素を含んでいる分枝を有する基（例えばイソプロピル）である。
【０３５４】
ＢにおけるＯＦＧ２がリンカーで官能化されたヒドロキシルであって、該リンカーがさらにリンカーの他端に液相または固相合成の支持体試薬を含んでいてもよい。支持体試薬は本明細書に記載のモノマーを支持することができる任意の支持媒体であってよい。モノマーをリンカー（Ｌ）によって不溶性の支持体に取り付け、モノマー（および成長してい
る鎖）が該支持体の置かれた溶媒中で可溶化されうるようにすることができる。可溶化されたが固定化されているモノマーは、周囲の溶媒中の試薬と反応することが可能であり；未反応の試薬および可溶性の副産物を、モノマーまたはモノマー由来生成物が取り付けられている固体支持体から容易に洗い流すことができる。別例として、モノマーを可溶性の支持体部分、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に取り付けることも可能であり、液相合成技術を用いて鎖を構築することができる。リンカーおよび支持媒体の選択は当分野の技術範囲内にある。一般に、リンカーは‐Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｑＣ（Ｏ）‐、または‐Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｑＳ‐（式中、ｑは０、１、２、３または４でよい）であってよく；好ましくは、オキサリル、スクシニルまたはチオグリコリルである。標準的な多孔質ガラスの固相合成支持体は、該ガラスがフッ化物によって分解し、完全長の生成物の量が著しく減少するので、フッ化物に不安定な５’シリル保護基と共に使用することはできない。フッ化物に安定なポリスチレン系支持体またはＰＥＧが好ましい。
【０３５５】
リガンド／係留結合点は、任意の二価、三価、四価、五価、六価の原子であってよい。いくつかの実施形態では、リガンド／係留結合点は、炭素、酸素、窒素または硫黄原子であってよい。例えば、リガンド／係留結合点の前駆体官能基は、求核性のヘテロ原子（例えば‐ＳＨ、‐ＮＨ２、第二級アミノ、ＯＮＨ２、またはＮＨ２ＮＨ２）を有しうる。別例として、リガンド／係留結合点の前駆体官能基は、オレフィン、例えば、‐ＣＨ＝ＣＨ２またはディールスアルダー（Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ）ジエンもしくはジエノフィルであってよく、該前駆体官能基は、例えば、遷移金属で触媒される炭素‐炭素（例えばオレフィンメタセシス）プロセスまたは付加環化（例えばディールスアルダー）を使用して、リガンド、係留部、または係留部付リガンドに結合させることができる。さらなる例として、リガンド／係留結合点の前駆体官能基は求電子性部分（例えばアルデヒド）であってよい。担体が環式担体である場合、リガンド／係留結合点は、環内の原子（つまり環式部分の中の構成原子、例えば窒素原子）であってもよいし、環外の原子（つまり、環式部分の中の構成原子に結合している原子または原子団）であってもよい。
【０３５６】
担体は、ＯＦＧ１、ＯＦＧ２およびリガンドのための結合点を含んだ任意の有機分子であってよい。ある実施形態では、担体は環式分子であってヘテロ原子（例えばＯ、ＮまたはＳ）を含みうる。例えば、担体分子はアリール（例えばベンゼン、ビフェニルなど）、シクロアルキル（例えばシクロヘキサン、シスまたはトランスデカリンなど）、またはヘテロシクリル（ピペラジン、ピロリジンなど）を含みうる。他の実施形態では、担体は非環式部分、例えば、セリノールを主成分としていてもよい。上記の環系のうち任意のものが、ＯＦＧ１、ＯＦＧ２およびリガンドに加えて置換基を含む場合もある。
【０３５７】
糖を主成分としたモノマー
一部の実施形態では、担体分子は酸素を含んだヘテロ環である。好ましくは、担体は構造ＬＣＭ−Ｉに示すようなリボース糖である。この実施形態では、リガンド結合モノマーはヌクレオシドである。
【０３５８】
【化６０】
2009504782.tif 000071
「Ｂ」は核酸塩基、例えば任意選択で１以上の化学修飾（例えば異常塩基）を有する天然の核酸塩基；またはユニバーサル塩基を表す。
【０３５９】
本願明細書で使用する「異常」核酸塩基は、以下のうち任意のものを含みうる：
２−メチルアデニニル、
Ｎ６−メチルアデニニル、
２−メチルチオ−Ｎ６−メチルアデニニル、
Ｎ６−イソペンテニルアデニニル、
２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニニル、
Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデニニル、
２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデニニル、
Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデニニル、
Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデニニル、
２−メチルチオ−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデニニル、
Ｎ６−メチル−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデニニル、
Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニニル、
２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニニル、
Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニニル、
３−メチルシトシニル、
５−メチルシトシニル、
２−チオシトシニル、
５−ホルミルシトシニル、
【０３６０】
【化６１】
2009504782.tif 000072
Ｎ４−メチルシトシニル、
５−ヒドロキシメチルシトシニル、
１−メチルグアニニル、
Ｎ２−メチルグアニニル、
７−メチルグアニニル、
Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアニニル、
【０３６１】
【化６２】
2009504782.tif 000073
Ｎ２，７−ジメチルグアニニル、
Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアニニル、
１−メチルグアニニル、
７−シアノ−７−デアザグアニニル、
７−アミノメチル−７−デアザグアニニル、
プソイドウラシリル、
ジヒドロウラシリル、
５−メチルウラシリル、
１−メチルプソイドウラシリル、
２−チオウラシリル、
４−チオウラシリル、
２−チオチミニル
５−メチル−２−チオウラシリル、
３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシリル、
５−ヒドロキシウラシリル、
５−メトキシウラシリル、
ウラシリル５−オキシ酢酸、
ウラシリル５−オキシ酢酸メチルエステル、
５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシリル、
５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシリルメチルエステル、
５−メトキシカルボニルメチルウラシリル、
５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシリル、
５−アミノメチル−２−チオウラシリル、
５−メチルアミノメチルウラシリル、
５−メチルアミノメチル−２−チオウラシリル、
５−メチルアミノメチル−２−セレノウラシリル、
５−カルバモイルメチルウラシリル、
５−カルボキシメチルアミノメチルウラシリル、
５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシリル、
３−メチルウラシリル、
１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）プソイドウラシリル、
５−カルボキシメチルウラシリル、
５−メチルジヒドロウラシリル、または
３−メチルプソイドウラシリル。
【０３６２】
ユニバーサル塩基は、天然のＤＮＡ／ＲＮＡ塩基の各々の間の区別をほとんどせずに該塩基と塩基対を形成することができる。一般に、ユニバーサル塩基は、スタッキング相互作用により例えば二重鎖ＲＮＡまたはＲＮＡ様分子を安定化することが可能な、非水素結合する疎水性の芳香族部分である。ユニバーサル塩基は水素結合する置換基を含むこともできる。
【０３６３】
本願明細書で使用するように、「ユニバーサル塩基」は、アントラセン、ピレン、または以下のうち任意のものを含みうる：
【０３６４】
【化６３】
2009504782.tif 000074
【０３６５】
【化６４】
2009504782.tif 000075
いくつかの実施形態では、Ｂは、担体にリガンドを接続する係留部の一部を形成することができる。例えば、係留部はＢ−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）５−ＮＨＣ（Ｏ）−リガンドであってよい。好ましい実施形態では、二重結合はトランス型であり、リガンドは置換または非置換のコレステロリル基（例えば、Ｄ環側鎖またはＣ−３ヒドロキシルを介して結合されたもの）；アラルキル部分であって少なくとも１つの立体中心および少なくとも１つの置換基を該アラルキル基のアリール部分上に有するもの；あるいは核酸塩基である。ある実施形態では、上述の係留部において、Ｂはウラシリルまたはユニバーサル塩基（例えばアリール部分、例えばフェニルであって任意選択で追加の置換基（例えば１以上のフルオロ基）を有するもの）である。Ｂは、係留部の残りの部分のどの原子が置換されていてもよい。
【０３６６】
Ｘ２は、２’−ＯＨの代わりに「オキシ」または「デオキシ」置換基を含んでいてもよいし、リガンドまたは係留部付きリガンドであってもよい。
「オキシ」置換基の例には、アルコキシまたはアリールオキシ（ＯＲ、例えばＲ＝Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、糖、または保護基）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ；２’ヒドロキシルが例えばメチレン架橋によって同じリボース糖の４’位の炭素に接続されている「ロックされた」核酸（ＬＮＡ）；Ｏ−保護ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）およびアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ２）ｎ保護ＡＭＩＮＥ（例えばＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）、ならびにオルトエステルが挙げられる。アミン保護基には、ホルミル、アミド、ベンジル、アリルなどがある。
【０３６７】
好ましいオルトエステルは一般式Ｊを有する。基Ｒ３１およびＲ３２は同じであっても異なっていてもよい。好ましいオルトエステルは「ＡＣＥ」基であり、構造Ｋとして以下に示す。
【０３６８】
【化６５】
2009504782.tif 000076
「デオキシ」置換基には、水素（つまりデオキシリボース糖）；ハロ（例えばフルオロ）；保護されたアミノ（例えばＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはすべてのアミノが保護されているアミノ酸）；完全に保護されたポリアミノ（例えばＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２‐ＡＭＩＮＥ、ここでＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノであり、かつアミノ基がすべて保護されている）、‐ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（Ｒ＝アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖）、シアノ；アルキルチオアルキル；チオアルコキシ；ならびにアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニルおよびアルキニルであって任意選択で例えば保護されたアミノ官能基で置換されているもの、が挙げられる。好ましい置換基は２’‐メトキシエチル、２’‐ＯＣＨ３、２’‐Ｏ‐アリル、２’‐Ｃ‐アリルおよび２’‐フルオロである。
【０３６９】
Ｘ３は上記のＯＦＧ２について説明したとおりである。
ＰＧは、トリアリールメチル基（例えば、ジメトキシトリチル基）またはＳｉ（Ｘ５’）（Ｘ５”）（Ｘ５”’）（式中、（Ｘ５’）、（Ｘ５”）および（Ｘ５”’）については別記のとおり）であってよい。
【０３７０】
糖置換系モノマー
環式の糖置換系モノマー、例えば糖置換系のリガンド結合モノマーは、本明細書では糖置換モノマーサブユニット（ＳＲＭＳ）モノマー化合物とも呼ばれる。好ましい担体は以下に示す一般式（ＬＣＭ−２）を有する。その構造では、好ましいバックボーン結合点は、Ｒ１またはＲ２；Ｒ３またはＲ４；あるいはＹがＣＲ９Ｒ１０の場合はＲ９およびＲ１０から選択することができる（２つのバックボーン結合点を生じるために２つの位置（例えばＲ１とＲ４、またはＲ４とＲ９）が選ばれる）。好ましい係留結合点には、Ｒ７；ＸがＣＨ２である場合はＲ５またはＲ６が挙げられる。該担体については、鎖に組み込むことができる実体として以下に説明する。したがって、当然ながら、該構造はさらに、結合点（例えばＲ１またはＲ２；Ｒ３またはＲ４；あるいはＲ９またはＲ１０（ＹがＣＲ９Ｒ
１０である場合））のうちの１つ（末端位置の場合）または２つ（内側位置の場合）が、リン酸バックボーンまたは修飾（例えば硫黄を含む）リン酸バックボーンに接続されている状態をも包含する。例えば、上記に命名されたＲ基のうちの１つが、‐ＣＨ２‐であって結合の１つが担体に、１つがバックボーンの原子（例えば連結している酸素または中央のリン原子）に接続されているものであってもよい。
【０３７１】
【化６６】
2009504782.tif 000077
（上記式中、
ＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７、ＮＲ７またはＣＨ２であり；
ＹはＮＲ８、Ｏ、Ｓ、ＣＲ９Ｒ１０であり；
ＺはＣＲ１１Ｒ１２であるかまたは存在せず；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９およびＲ１０の各々は、独立に、Ｈ、ＯＲａまたは（ＣＨ２）ｎＯＲｂであり、ただしＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９およびＲ１０のうち少なくとも２つはＯＲａまたは（ＣＨ２）ｎＯＲｂのうち少なくともいずれかであり；
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１１およびＲ１２の各々は、独立に、リガンド、Ｈ、任意選択で１〜３個のＲ１３で置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、またはＣ（Ｏ）ＮＨＲ７であるか；あるいはＲ５とＲ１１とが一緒になって、任意選択でＲ１４で置換されたＣ３−Ｃ８シクロアルキルをなし；
Ｒ７はリガンドであってもよいし（例えばＲはＲｄであってよい）、あるいはＲ７は該担体に間接的に（例えば係留部分を介して）係留されたリガンド、例えばＮＲｃＲｄで置換されたＣ１−Ｃ２０アルキルまたはＮＨＣ（Ｏ）Ｒｄで置換されたＣ１−Ｃ２０アルキルであってよく；
Ｒ８はＨまたはＣ１−Ｃ６アルキルであり；
Ｒ１３はヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、またはハロであり；
Ｒ１４はＮＲＣＲ７であり；
Ｒ１５は、任意選択でシアノで置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、またはＣ２−Ｃ６アルケニルであり；
Ｒ１６はＣ１−Ｃ１０アルキルであり；
Ｒ１７は液相または固相の支持体試薬であり；
Ｌは‐Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｑＣ（Ｏ）‐、または‐Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｑＳ‐であり；
Ｒａは保護基、例えばＣＡｒ３（例えばジメトキシトリチル基）またはＳｉ（Ｘ５’）（Ｘ５”）（Ｘ５”’）（式中、（Ｘ５’）、（Ｘ５”）、および（Ｘ５”’）は他所で説明したとおり）であり；
Ｒｂは、Ｐ（Ｏ）（Ｏ−）Ｈ、Ｐ（ＯＲ１５）Ｎ（Ｒ１６）２またはＬ−Ｒ１７であり；
ＲｃはＨまたはＣ１−Ｃ６アルキルであり；
ＲｄはＨまたはリガンドであり；
Ａｒはそれぞれ独立に、任意選択でＣ１−Ｃ４アルコキシで置換されたＣ６−Ｃ１０アリールであり；
ｎは１−４であり；ｑは０−４である。
【０３７２】
典型的な担体には、例えば、ＸがＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７、ＹがＣＲ９Ｒ１０、およびＺが存在しないもの；あるいはＸがＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７、ＹがＣＲ９Ｒ１０、およびＺがＣＲ１１Ｒ１２であるもの；あるいはＸがＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７、ＹがＮＲ８、およびＺがＣＲ１１Ｒ１２であるもの；あるいはＸがＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７、ＹがＯ、およびＺがＣＲ１１Ｒ１２であるもの；あるいはＸがＣＨ２；ＹがＣＲ９Ｒ１０；ＺがＣＲ１１Ｒ１２、およびＲ５とＲ１１とが一緒になってＣ６シクロアルキルを形成するもの（Ｈ、ｚ＝２）、あるいはインダン環系、例えばＸがＣＨ２；ＹがＣＲ９Ｒ１０；ＺがＣＲ１１Ｒ１２、およびＲ５とＲ１１とが一緒になってＣ５シクロアルキルを形成するもの（Ｈ、ｚ＝１）が挙げられる。
【０３７３】
ある実施形態では、担体はピロリン環系または４‐ヒドロキシプロリン環系を基本とするもの、例えば、ＸがＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７、ＹがＣＲ９Ｒ１０、およびＺが存在しないもの（Ｄ）であってよい。
【０３７４】
【化６７】
2009504782.tif 000078
ＯＦＧ１は、５員環の炭素のうちの１つに接続している第１級炭素、例えば環外のアルキレン基（例えばメチレン基）に取り付けられることが好ましい（Ｄにおける‐ＣＨ２ＯＦＧ１）。ＯＦＧ２は、５員環の炭素のうちの１つに直接取り付けられることが好ましい（Ｄにおける‐ＯＦＧ２）。ピロリン系の担体については、‐ＣＨ２ＯＦＧ１がＣ‐２に取り付けられ、ＯＦＧ２がＣ‐３に取り付けられてもよいし、または‐ＣＨ２ＯＦＧ１がＣ‐３に取り付けられ、ＯＦＧ２がＣ‐４に取り付けられてもよい。ある実施形態では、ＣＨ２ＯＦＧ１およびＯＦＧ２で上述の炭素のうち１つがジェミナル置換されてもよい。３‐ヒドロキシプロリン系担体については、‐ＣＨ２ＯＦＧ１がＣ‐２に取り付けられ、ＯＦＧ２がＣ‐４に取り付けられてよい。従って、ピロリン系および４‐ヒドロキシプロリン系のモノマーは、連結（例えば炭素‐炭素結合）であってその特定の連結の周囲で結合回転が制限される（例えば環の存在により制限される）連結を含む場合がある。よって、ＣＨ２ＯＦＧ１およびＯＦＧ２は上記の対のいずれにおいても互いにシス位でもトランス位でもよい。従って、すべてのシス／トランス異性体が明らかに含まれる。モノマーは１以上の不斉中心を含む場合もあり、従ってラセミ化合物およびラセミ混合物、単一立体異性体、個々のジアステレオマーおよびジアステレオマー混合物として生じる可能性がある。モノマーのそのような異性体はすべて明らかに含まれる（例えば、ＣＨ２ＯＦＧ１およびＯＦＧ２を担持する中心が両方ともＲ配置であってもよいし；両方ともＳ配置であってもよいし；一方の中心がＲ配置で他方の中心がＳ配置であってもよいし、その逆でもよい）。係留結合点は窒素であることが好ましい。担体Ｄの好ましい例としては、以下のものが挙げられる。
【０３７５】
【化６８】
2009504782.tif 000079
【０３７６】
【化６９】
2009504782.tif 000080
ある実施形態では、担体はピペリジン環系（Ｅ）であってよく、例えば、ＸがＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７、ＹがＣＲ９Ｒ１０、およびＺがＣＲ１１Ｒ１２であるものである。
【０３７７】
【化７０】
2009504782.tif 000081
ＯＦＧ１は、６員環の炭素のうちの１つに接続している第１級炭素、例えば環外のアルキレン基（例えばメチレン基（ｎ＝１）またはエチレン基（ｎ＝２））に取り付けられることが好ましい［Ｅにおける‐（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１）。ＯＦＧ２は、６員環の炭素のうちの１つに直接取り付けられることが好ましい（Ｅにおける‐ＯＦＧ２）。‐（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１およびＯＦＧ２は環上でジェミナル位に配置されうる、すなわち、両方の基が同じ炭素、例えばＣ‐２、Ｃ‐３、またはＣ‐４に取り付けられる場合がある。別例として、‐（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１およびＯＦＧ２は環上でビシナル位に配置されうる、すなわち、両方の基が隣接する環炭素原子に取り付けられる場合があり、例えば‐（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１がＣ‐２に取り付けられＯＦＧ２がＣ‐３に取り付けられてもよいし；‐（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１がＣ‐３に取り付けられＯＦＧ２がＣ‐２に取り付けられてもよいし；‐（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１がＣ‐３に取り付けられＯＦＧ２がＣ‐４に取り付けられてもよいし；‐（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１がＣ‐４に取り付けられＯＦＧ２がＣ‐３に取り付けられてもよい。従って、ピペリジン系のモノマーは、連結（例えば炭素‐炭素結合）であってその特定の連結の周囲で結合回転が制限される（例えば環の存在により制限される）連結を含む場合がある。よって、‐（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１およびＯＦＧ２は上記の対のいずれにおいても互いにシス位でもトランス位でもよい。従って、すべてのシス／トランス異性体が明らかに含まれる。モノマーは１以上の不斉中心を含む場合もあり、従ってラセミ化合物およびラセミ混合物、単一立体異性体、個々のジアステレオマーおよびジアステレオマー混合物として生じる可能性がある。モノマーのそのような異性体はすべて明らかに含まれる（例えば、ＣＨ２ＯＦＧ１およびＯＦＧ２を担持する中心が両方ともＲ配置であってもよいし；両方ともＳ配置であってもよいし；一方の中心がＲ配置で他方の中心がＳ配置であってもよいし、その逆でもよい）。係留結合点は窒素であることが好ましい。
【０３７８】
ある実施形態では、担体は、ピペラジン環系（Ｆ）であって、例えば、ＸがＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７、ＹがＮＲ８、およびＺがＣＲ１１Ｒ１２であるものでもよいし、あるいはモルホリン環系（Ｇ）であって、例えば、ＸがＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７、ＹがＯ、およびＺがＣＲ１１Ｒ１２であるものでもよい。
【０３７９】
【化７１】
2009504782.tif 000082
ＯＦＧ１は、６員環の炭素のうちの１つに接続している第１級炭素、例えば環外のアルキレン基（例えばメチレン基）に取り付けられることが好ましい［ＦまたはＧにおける‐ＣＨ２ＯＦＧ１］。ＯＦＧ２は、６員環の炭素のうちの１つに直接取り付けられることが好ましい（ＦまたはＧにおける‐ＯＦＧ２）。ＦおよびＧのいずれについても、‐ＣＨ２ＯＦＧ１がＣ‐２に取り付けられ、ＯＦＧ２がＣ‐３に取り付けられてもよいし、またはその逆でもよい。ある実施形態では、ＣＨ２ＯＦＧ１およびＯＦＧ２で上述の炭素のうち１つがジェミナル置換されてもよい。従って、ピペラジン系およびモルホリン系のモノマーは、連結（例えば炭素‐炭素結合）であってその特定の連結の周囲で結合回転が制限される（例えば環の存在により制限される）連結を含む場合がある。よって、ＣＨ２ＯＦＧ１およびＯＦＧ２は上記の対のいずれにおいても互いにシス位でもトランス位でもよい。従って、すべてのシス／トランス異性体が明らかに含まれる。モノマーは１以上の不斉中心を含む場合もあり、従ってラセミ化合物およびラセミ混合物、単一立体異性体、個々のジアステレオマーおよびジアステレオマー混合物として生じる可能性がある。モノマーのそのような異性体はすべて明らかに含まれる（例えば、ＣＨ２ＯＦＧ１およびＯＦＧ２を担持する中心が両方ともＲ配置であってもよいし；両方ともＳ配置であってもよいし；一方の中心がＲ配置で他方の中心がＳ配置であってもよいし、その逆でもよい）。Ｒ”’は例えばＣ１−Ｃ６アルキル、好ましくはＣＨ３である。ＦおよびＧのいずれにおいても係留結合点は窒素であることが好ましい。
【０３８０】
ある実施形態では、担体は、デカリン環系であって、例えば、ＸがＣＨ２；ＹがＣＲ９Ｒ１０；ＺがＣＲ１１Ｒ１２、およびＲ５とＲ１１とが一緒になってＣ６シクロアルキルを形成するもの（Ｈ、ｚ＝２）であってもよいし、あるいはインダン環系であって、例えば、ＸがＣＨ２；ＹがＣＲ９Ｒ１０；ＺがＣＲ１１Ｒ１２、およびＲ５とＲ１１とが一緒になってＣ５シクロアルキルを形成するもの（Ｈ、ｚ＝１）であってもよい。
【０３８１】
【化７２】
2009504782.tif 000083
ＯＦＧ１は、Ｃ‐２、Ｃ‐３、Ｃ‐４、またはＣ‐５のうちの１つに接続している第１級炭素、例えば環外のメチレン基（ｎ＝１）またはエチレン基（ｎ＝２）に取り付けられることが好ましい［Ｈにおける‐（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１］。ＯＦＧ２は、Ｃ‐２、Ｃ‐３、Ｃ‐４、またはＣ‐５のうちの１つに直接取り付けられることが好ましい（Ｈにおける‐ＯＦＧ２）。‐（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１およびＯＦＧ２は環上でジェミナル位に配置されうる、すなわち、両方の基が同じ炭素、例えばＣ‐２、Ｃ‐３、Ｃ‐４、またはＣ‐５に取り付けられる場合がある。別例として、‐（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１およびＯＦＧ２は環上でビシナル位に配置されうる、すなわち、両方の基が隣接する環炭素原子に取り付けられる場合があり、例えば‐（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１がＣ‐２に取り付けられＯＦＧ２がＣ‐３に取り付けられてもよいし；‐（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１がＣ‐３に取り付けられＯＦＧ２がＣ‐２に取り付けられてもよいし；‐（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１がＣ‐３に取り付けられＯＦＧ２がＣ‐４に取り付けられてもよいし；‐（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１がＣ‐４に取り付けられＯＦＧ２がＣ‐３に取り付けられてもよいし；‐（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１がＣ‐４に取り付けられＯＦＧ２がＣ‐５に取り付けられてもよいし；‐（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１がＣ‐５に取り付けられＯＦＧ２がＣ‐４に取り付けられてもよい。従って、デカリン系またはインダン系のモノマーは、連結（例えば炭素‐炭素結合）であってその特定の連結の周囲で結合回転が制限される（例えば環の存在により制限される）連結を含む場合がある。よって、‐（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１およびＯＦＧ２は上記の対のいずれにおいても互いにシス位でもトランス位でもよい。従って、すべてのシス／トランス異性体が明らかに含まれる。モノマーは１以上の不斉中心を含む場合もあり、従ってラセミ化合物およびラセミ混合物、単一立体異性体、個々のジアステレオマーおよびジアステレオマー混合物として生じる可能性がある。モノマーのそのような異性体はすべて明らかに含まれる（例えば、ＣＨ２ＯＦＧ１およびＯＦＧ２を担持する中心が両方ともＲ配置であってもよいし；両方ともＳ配置であってもよいし；一方の中心がＲ配置で他方の中心がＳ配置であってもよいし、その逆でもよい）。好ましい実施形態では、Ｃ‐１およびＣ‐６の置換基は互いにトランス位にある。係留結合点はＣ‐６またはＣ‐７であることが好ましい。
【０３８２】
別の担体には、３‐ヒドロキシプロリン系のものが挙げられる（Ｊ）。
【０３８３】
【化７３】
2009504782.tif 000084
上述のように、‐（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１およびＯＦＧ２は互いにシス位でもトランス位でもよい。従って、すべてのシス／トランス異性体が明らかに含まれる。モノマーは１以上の不斉中心を含む場合もあり、従ってラセミ化合物およびラセミ混合物、単一立体異性体、個々のジアステレオマーおよびジアステレオマー混合物として生じる可能性がある。モノマーのそのような異性体はすべて明らかに含まれる（例えば、ＣＨ２ＯＦＧ１およびＯＦＧ２を担持する中心が両方ともＲ配置であってもよいし；両方ともＳ配置であってもよいし；一方の中心がＲ配置で他方の中心がＳ配置であってもよいし、その逆でもよい）。係留結合点は窒素であることが好ましい。
【０３８４】
糖置換系モノマー（非環式）
非環式の糖置換系モノマー、例えば糖置換系のリガンド結合モノマーは、本明細書では糖置換モノマーサブユニット（ＳＲＭＳ）モノマー化合物とも呼ばれる。好ましい非環式担体は以下に示す式ＬＣＭ−３またはＬＣＭ−４を有する。
【０３８５】
【化７４】
2009504782.tif 000085
一部の実施形態では、ｘ、ｙ、およびｚの各々は、互いに独立に０、１、２、または３であってよい。式ＬＣＭ−３において、ｙおよびｚが異なるとき、第３級炭素はＲ配置またはＳ配置のいずれかを有しうる。好ましい実施形態では、式ＬＣＭ−３においてｘがゼロでｙおよびｚが各々１であり（例えば、セリノール系）、式ＬＣＭ−３においてｙおよびｚが各々１である。式ＬＣＭ−３またはＬＣＭ−４はそれぞれ任意選択で、例えばヒドロキシ、アルコキシ、ペルハロアルキルによって、置換されていてもよい。
【０３８６】
係留部
ある実施形態では、構成部分、例えば、リガンドは、介在する係留部を仲介として担体に間接的に接続される場合がある。係留部は担体の係留結合点（ＴＡＰ）に接続され、任意のＣ１−Ｃ１００炭素含有部分（例えばＣ１−Ｃ７５、Ｃ１−Ｃ５０、Ｃ１−Ｃ２０、Ｃ１−Ｃ１０；Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９またはＣ１０）
であって好ましくは少なくとも１つの窒素原子を有するものを挙げることができる。好ましい実施形態では、窒素原子は、係留部上の末端のアミノ基もしくはアミド（ＮＨＣ（Ｏ）−）基の一部を形成し、該基はリガンド用の接続点として役立つ場合がある。好ましい係留部（下線部）には、ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＮＨ−；ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＨ−：ＴＡＰ−ＮＲ””（ＣＨ２）ｎＮＨ−、ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）−；ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−；ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−；ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−；ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−；ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）−；ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）−；ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−；ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎ−；またはＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（式中、ｎは１〜２０（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０）であり、Ｒ””はＣ１−Ｃ６アルキルである）がある。好ましくは、ｎは５、６、または１１である。他の実施形態では、窒素は、末端のオキシアミノ基（例えば−ＯＮＨ２）、またはヒドラジノ基（−ＮＨＮＨ２）の一部を形成しうる。係留部は、任意選択で例えばヒドロキシ、アルコキシ、ペルハロアルキルで置換されているか、または１以上の追加のヘテロ原子（例えばＮ、Ｏ、またはＳ）が任意選択で挿入されているかのうち少なくともいずれかであってよい。好ましい係留リガンドには、例えばＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＮＨ（リガンド）；ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＨ（リガンド）；ＴＡＰ−ＮＲ””（ＣＨ２）ｎＮＨ（リガンド）；ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＯＮＨ（リガンド）；ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＯＮＨ（リガンド）；ＴＡＰ−ＮＲ””（ＣＨ２）ｎＯＮＨ（リガンド）；ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＮＨＮＨ２（リガンド）、ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＨＮＨ２（リガンド）；ＴＡＰ−ＮＲ””（ＣＨ２）ｎＮＨＮＨ２（リガンド）；ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）（リガンド）；ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）Ｏ（リガンド）；ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ（リガンド）；ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（リガンド）；ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ（リガンド）；ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（リガンド）；ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）（リガンド）；ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）（リガンド）；ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）Ｏ（リガンド）；ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎ（リガンド）；またはＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（リガンド）がある。いくつかの実施形態では、アミノ末端を有する係留部（例えばＮＨ２、ＯＮＨ２、ＮＨ２ＮＨ２）は、リガンドとともにイミノ結合（すなわちＣ＝Ｎ）を形成することができる。いくつかの実施形態では、アミノ末端を有する係留部（例えばＮＨ２、ＯＮＨ２、ＮＨ２ＮＨ２）は、例えば、Ｃ（Ｏ）ＣＦ３でアシル化されていてもよい。
【０３８７】
いくつかの実施形態では、係留部は、メルカプト基（すなわちＳＨ）またはオレフィン（例えばＣＨ＝ＣＨ２）を末端としていてもよい。例えば、係留部は、ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎ−ＳＨ、ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＳＨ、ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎ−（ＣＨ＝ＣＨ２）、またはＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ（ＣＨ＝ＣＨ２）（式中、ｎは別途記載のとおりである）であってよい。ある実施形態では、オレフィンはディールスアルダー反応のジエンまたはジエノフィルであってよい。係留部は、任意選択で例えばヒドロキシ、アルコキシ、ペルハロアルキルで置換されているか、または１以上の追加のヘテロ原子（例えばＮ、Ｏ、またはＳ）が任意選択で挿入されているかのうち少なくともいずれかであってよい。二重結合は、シス型でもトランス型でもよいし、Ｅ型でもＺ型でもよい。
【０３８８】
他の実施形態では、係留部は（好ましくは係留部の末端位置に）求電子部分を含みうる。好ましい求電子部分には、例えばアルデヒド、ハロゲン化アルキル、メシレート、トシレート、ノシレート、もしくはブロシレート、または活性カルボン酸エステル（例えばＮＨＳエステルまたはペンタフルオロフェニルエステル）が挙げられる。好ましい係留部（下線部）には、ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＣＨＯ；ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＣＨＯ；またはＴＡＰ−ＮＲ””（ＣＨ２）ｎＣＨＯ（式中、ｎは１−６であり、Ｒ””はＣ１−Ｃ６アルキルである）；あるいはＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＯＮＨＳ；ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ
）（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＯＮＨＳ；またはＴＡＰ−ＮＲ””（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＯＮＨＳ（式中、ｎは１−６であり、Ｒ””はＣ１−Ｃ６アルキルである）；ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＯＣ６Ｆ５；ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＯＣ６Ｆ５；またはＴＡＰ−ＮＲ””（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＯＣ６Ｆ５（式中、ｎは１−１１であり、Ｒ””はＣ１−Ｃ６アルキルである）；あるいは、−（ＣＨ２）ｎＣＨ２ＬＧ；ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＣＨ２ＬＧ；またはＴＡＰ−ＮＲ””（ＣＨ２）ｎＣＨ２ＬＧ（式中、ｎは別途記載のとおりであり、Ｒ””はＣ１−Ｃ６アルキルである）（ＬＧは脱離基、例えばハロゲン化物、メシレート、トシレート、ノシレート、ブロシレートでよい）がある。係留は、リガンドの求核基（例えばチオール基またはアミノ基）を係留部の求電子基とカップリングすることにより行うことができる。
【０３８９】
他の実施形態では、該リガンド結合モノマーまたはあるリガンド結合モノマーが係留部の末端位置にフタルイミド基（Ｋ）を含むことが望ましい。
【０３９０】
【化７５】
2009504782.tif 000086
他の実施形態では、その他の保護されたアミノ基、例えばアロック、モノメトキシトリチル（ＭＭＴ）、トリフルオロアセチル、Ｆｍｏｃ、アリールスルホニル（例えば、アリール基を含む部分がオルト‐ニトロフェニルまたはオルト，パラ‐ジニトロフェニルであってよい）が係留部の末端位置にあってもよい。
【０３９１】
本明細書に記載の係留部のうち任意のものが、１以上の追加の連結基、例えば、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＳ−、−（ＣＨ２）ｎ−、または−（ＣＨ＝ＣＨ）−をさらに含みうる。
【０３９２】
非対称的な修飾
ＲＮＡ、例えばｉＲＮＡ剤は、本明細書中に記載するように、かつ２００４年３月８日付けで出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／０７０７０号（参照により本願に援用される）に記載されるように、非対称的に修飾することができる。
【０３９３】
非対称的に修飾されたｉＲＮＡ剤とは、ある鎖が他方の鎖上に存在しない修飾を有しているｉＲＮＡ剤である。非対称的な修飾とは、一方の鎖上に見られるが、他方の鎖上には見られない修飾である。任意の修飾、例えば本明細書中に記載する任意の修飾は、非対称的な修飾として存在し得る。非対称的な修飾により、修飾に伴う望ましい特性のうち任意のもの、例えば本明細書中で論述した特性を付与することができる。例えば、非対称的な修飾は、分解に対する耐性、半減期の変更をもたらすこともできるし、ｉＲＮＡ剤を特定の標的（例えば、特定の組織）に対して標的設定することもできるし、鎖の相補体又は標的配列に対する該鎖の親和性を調節（例えば、増大又は低減）することもできるし、あるいは末端部分の修飾（例えば、キナーゼ又はＲＩＳＣ機構の経路に関与する他の酵素による修飾）を妨害又は促進することもできる。ある修飾について１つの特性を有するものと
して指定しても、該修飾が他の特性を有していないことを意味するわけではない（例えば、安定化を促進する修飾として言及される修飾が、標的設定を増強することもありうる）。
【０３９４】
理論又はいかなる特定の機構モデルによっても拘束されることは望まないが、非対称的な修飾により、ｉＲＮＡ剤をセンス鎖及びアンチセンス鎖の異なる機能すなわち「非対称的な」機能という観点で最適化させることが可能であると考えられる。例えば、両方の鎖がヌクレアーゼ耐性を増大するように修飾されてもよいが、変更によってはＲＩＳＣ活性を阻害しうるものがあるため、そのような変更はセンス鎖に関して選択することができる。さらに、一部の修飾、例えば標的設定部分は、例えばＲＩＳＣ複合体の切断活性を妨害しうる大きな嵩高い基を付加する可能性があるので、そのような修飾はセンス鎖に配置されることが好ましい。したがって、標的設定部分、特に嵩高い標的設定部分（例えば、コレステロール）は、センス鎖に優先的に付加される。一実施形態では、バックボーンのリン酸をＳで置換する非対称的修飾、例えばホスホロチオエート修飾がアンチセンス鎖に存在し、かつ２’修飾、例えば２’ＯＭｅがセンス鎖に存在する。標的設定部分は、ｉＲＮＡ剤のセンス鎖の５’又は３’末端のいずれか（又は両方）に存在し得る。好ましい例では、アンチセンス鎖においてはバックボーンのＰがＳで置き換えられ、２’ＯＭｅがセンス鎖に存在し、標的設定部分がｉＲＮＡ剤のセンス鎖の５’又は３’末端のいずれかに付加される。
【０３９５】
好ましい実施形態では、非対称的に修飾されたｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖上では見られない修飾をセンス鎖上に有し、アンチセンス鎖は、センス鎖上では見られない修飾を有する。
【０３９６】
鎖はそれぞれ、１以上の非対称的修飾を包含し得る。例を挙げると、一方の鎖がｉＲＮＡ剤に第１の特性を付与する第１の非対称的修飾を包含し、他方の鎖がｉＲＮＡに第２に特性を付与する第２の非対称的修飾を有することができる。例えば、一方の鎖、例えばセンス鎖がｉＲＮＡ剤の標的をある組織に対して設定する修飾を有し、他方の鎖、例えばアンチセンス鎖が標的遺伝子配列とのハイブリダイゼーションを促進する修飾を有することができる。
【０３９７】
一部の実施形態では、両方の鎖が同じ特性を最適化するように、例えば核酸分解に対する耐性を増大させるように両鎖を修飾することができるが、例えば該修飾がさらに他の特性に対して影響を及ぼすという理由から、センス鎖及びアンチセンス鎖に関して異なる修飾が選ばれる。例えば、ある種の変更はＲＩＳＣ活性に影響を及ぼし得るため、そのような修飾はセンス鎖について選ばれる。
【０３９８】
ある実施形態では、一方の鎖が非対称的な２’修飾、例えば２’ＯＭｅ修飾を有し、他方の鎖がリン酸バックボーンの非対称的修飾、例えばホスホロチオエート修飾を有する。したがって、一実施形態では、アンチセンス鎖が非対称的な２’ＯＭｅ修飾を有し、センス鎖が非対称的なホスホロチオエート修飾を有する（あるいは、その逆でもよい）。特に好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、センス鎖上に非対称的な２’−Ｏアルキル（好ましくは２’−ＯＭｅ）修飾を、アンチセンス鎖には非対称的なバックボーンのＰ修飾（好ましくはホスホロチオエート修飾）を有することになる。１つまたは複数の２’−ＯＭｅ修飾が存在することができ、例えば、センス鎖の少なくとも２個、３個、４個、５個又は６個のサブユニットを２’−ＯＭｅ修飾することができる。１つまたは複数のホスホロチオエート修飾が存在することができ、例えば、アンチセンス鎖の少なくとも２個、３個、４個、５個又は６個のサブユニットをホスホロチオエート修飾することができる。センス鎖上に複数の２’−ＯＭｅ修飾及びアンチセンス鎖上に複数のホスホロチオエート修飾が存在するｉＲＮＡ剤を有することが好ましい。一方又は両方の鎖上のすべてのサブユニッ
トを前記のように修飾することもできる。両方の鎖における複数の非対称的修飾の特に好ましい実施形態は、長さが約２０〜２１サブユニット、好ましくは１９サブユニットの二本鎖領域、及び長さが約２サブユニットの１個又は２個の３’突出部を有する。
【０３９９】
非対称的な修飾は、ヌクレアーゼ、例えばエンドヌクレアーゼによる分解に対する耐性を促進するのに有用である。ｉＲＮＡ剤は、分解に対する耐性を促進する１以上の非対称的修飾を包含することができる。好ましい実施形態では、アンチセンス鎖上の修飾は、標的のサイレンシングを妨害しない修飾、例えば標的の切断を妨害しない修飾である。鎖上の、すべてではないにしてもほとんどの部位が、エンドヌクレアーゼによる分解に対してある程度不安定である。相対的に不安定な部位を特定し、分解を阻害する非対称的修飾を挿入することができる。多くの場合、ｉＲＮＡ剤においてＵＡ部位の非対称的修飾を提供することが望ましく、場合によっては、両方の鎖上のＵＡ配列に非対称的修飾を提供することが望ましい。エンドヌクレアーゼによる分解を阻害する修飾の例は、本明細書中に見出すことができる。特に好適な修飾としては、２’位修飾（例えば特にセンス鎖上のＵへの２’ＯＭｅ部分の付与）、バックボーンの修飾（例えば、特にアンチセンス鎖上のＵ若しくはＡ又はその両方についてリン酸バックボーンのＯをＳで置き換えること（例えば、ホスホロチオエート修飾の提供）による修飾）、ＵをＣ５アミノリンカーで置き換えること、ＡをＧで置き換えること（配列の変更は、センス鎖上に位置し、アンチセンス鎖上には位置しないことが好ましい）、及び２’、６’、７’又は８’位の修飾が挙げられる。好ましい実施形態は、１以上のこれらの修飾がセンス鎖上に存在するが、アンチセンス鎖上には存在しない実施形態、あるいはアンチセンス鎖のほうがこのような修飾の数が少ない実施形態である。
【０４００】
非対称的な修飾は、エキソヌクレアーゼによる分解を阻害するために使用することができる。非対称的な修飾としては、一方の鎖のみが修飾されるもの、ならびに両方が修飾されるものを挙げることができる。好ましい実施形態では、アンチセンス鎖上の修飾は、標的のサイレンシングを妨害しない修飾、例えば標的の切断を妨害しない修飾である。一部の実施形態は、センス鎖上、例えば３’突出部の例えば３’末端と、アンチセンス鎖上、例えば３’突出部の例えば３’末端に、非対称的修飾を有することになる。これらの修飾により異なる大きさの構成部分が導入される場合、大きいほうがセンス鎖上に存在することが好ましい。修飾により異なる電荷の構成部分が導入される場合、より大きな電荷を有する部分がセンス鎖上に存在することが好ましい。
【０４０１】
エキソヌクレアーゼによる分解を阻害する修飾の例は、本明細書中に見出すことができる。特に好適な修飾としては、２’位修飾（例えば３’突出部の例えば３’末端への２’ＯＭｅ部分の提供（３’末端とは、文脈により示されるように、分子の３’位の原子または最も３’側の構成部分、例えば最も３’側のＰ又は２’位を意味する））；バックボーンの修飾、例えばＰをＳで置き換えることによる修飾（例えば、ホスホロチオエート修飾の提供）もしくは３’突出部の例えば３’末端にメチル化Ｐを使用することによる修飾；２’位修飾（例えば、２’ＯＭｅ部分の提供）と、バックボーンの修飾（例えばＰをＳで置き換えること（例えば、ホスホロチオエート修飾の提供）もしくは３’突出部の例えば３’末端におけるメチル化Ｐの使用）との組合せ；３’アルキルによる修飾；３’突出部の例えば３’末端における脱塩基ピロリジンによる修飾；ナプロキセン、イブプロフェン又はその他の分解を阻害する構成部分による３’末端の修飾が挙げられる。好ましい実施形態は、１以上のこれらの修飾がセンス鎖上に存在するが、アンチセンス鎖上には存在しないもの、あるいはアンチセンス鎖のほうがこのような修飾の数が少ない実施形態である。
【０４０２】
標的設定に影響を及ぼす修飾、例えば本明細書中に記載の修飾を、非対称的修飾として提供することが可能である。例えば標的の切断を阻害することによりサイレンシングを阻
害する可能性のある標的設定修飾は、センス鎖の非対称的修飾として提供され得る。体内分布を変化させる構成部分（例えばコレステロール）は、センス鎖における１以上（例えば、２つ）の非対称的修飾として提供され得る。比較的大きな分子量（例えば４００、５００又は１，０００ダルトンを上回る分子量）を有する構成部分を導入する標的設定修飾、あるいは電荷を有する構成部分（例えば、２以上の正電荷又は１つの負電荷を有する構成部分）を導入する標的設定修飾は、センス鎖上に配置することができる。
【０４０３】
鎖の相補体又は標的に対する該鎖の親和性を調節する（例えば、増大又は低下させる）修飾、例えば本明細書中に記載の修飾は、非対称的修飾として提供され得る。これらの修飾としては、５メチルＵ、５メチルＣ、プソイドウリジン、ロックされた核酸、２チオＵ及び２−アミノ−Ａが挙げられる。一部の実施形態では、これらのうち１つ以上がアンチセンス鎖上に提供される。
【０４０４】
ｉＲＮＡ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を有する規定構造を有し、多くの場合、例えば２または３ヌクレオチドの短い一本鎖の突出部が一方又は両方の３’末端に存在する。非対称的な修飾を使用して、例えばｉＲＮＡ内に選択的に配置することにより、このような構造体の活性を最適化することができる。例えば、センス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の３’末端により規定されるｉＲＮＡ剤の末端領域は、機能上重要である。この領域には、末端の２、３または４対のヌクレオチド対と任意の３’突出部とが含まれうる。好ましい実施形態では、以下の修飾、すなわち、センス鎖のキナーゼ活性化を阻害するセンス鎖５’末端の修飾（例えば、該分子を標的設定する結合体を取り付けること、又は５’エキソヌクレアーゼによる分解に対して保護的に作用する修飾の使用など）；あるいはいずれか一方の鎖（好ましくはセンス鎖）の修飾であってセンス鎖とアンチセンス鎖との間の結合を増強することにより分子のこの末端の「緊密な」構造をより緊密にする修飾、のうち１以上を生じる非対称的修飾が使用される。
【０４０５】
センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の５’末端により規定されるｉＲＮＡ剤の末端領域もまた機能にとって重要である。この領域には、末端の２、３または４対のヌクレオチド対と任意の３’突出部とが含まれうる。好ましい実施形態は、いずれか一方の鎖、好ましくはセンス鎖に、センス鎖とアンチセンス鎖との間の結合を弱めることにより分子のこの末端の「開放的な」構造をより開放的にする非対称的修飾を包含する。このような修飾としては、該分子を標的設定する結合体を配置すること、あるいはこの領域におけるセンス鎖のヌクレアーゼ耐性を促進する修飾が挙げられる。キナーゼ活性化を阻害するアンチセンス鎖の修飾は、好ましい実施形態では回避される。
【０４０６】
センス鎖に非対称的に配置される例示的な修飾としては、以下のものが挙げられる。
（ａ）バックボーン修飾（例えば、バックボーンのＰの修飾）であって、ＰをＳで置き換えること、またはアルキルもしくはアリル（例えば、Ｍｅ）で置換されたＰ、及びジチオエート（Ｓ−Ｐ＝Ｓ）を含むもの；これらの修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するのに使用することができる；
（ｂ）２’−Ｏアルキル（例えば、２’−ＯＭｅ）、３’−Ｏアルキル（例えば、３’−ＯＭｅ）（末端及び内側位置の少なくともいずれかを修飾）；これらの修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するため、又はアンチセンス鎖へのセンス鎖の結合を増強するために使用することができ、３’位修飾は、ＲＩＳＣによるセンス鎖活性化を回避するためにセンス鎖の５’末端で使用することができる；
（ｃ）２’−５’結合（２’−Ｈ、２’−ＯＨ及び２’−ＯＭｅによるもの、及びＰ＝Ｏ又はＰ＝Ｓによるもの）；これらの修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するため、又はアンチセンス鎖へのセンス鎖の結合を阻害するために使用することもできるし、あるいはＲＩＳＣによるセンス鎖活性化を回避するためにセンス鎖の５’末端で使用することもできる；
（ｄ）Ｌ糖（例えば、２’−Ｈ、２’−ＯＨ及び２’−ＯＭｅを有するＬ−リボース、Ｌ−アラビノース）；これらの修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するため、又はアンチセンス鎖へのセンス鎖の結合を阻害するために使用することもできるし、あるいはＲＩＳＣによるセンス鎖活性化を回避するためにセンス鎖の５’末端で使用することもできる；
（ｅ）修飾糖（例えば、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、ヘキソース核酸（ＨＮＡ）及びシクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ））；これらの修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するため、又はアンチセンス鎖へのセンス鎖の結合を阻害するために使用することもできるし、あるいはＲＩＳＣによるセンス鎖活性化を回避するためにセンス鎖の５’末端で使用することもできる；
（ｆ）核酸塩基修飾（例えば、Ｃ−５修飾ピリミジン、Ｎ−２修飾プリン、Ｎ−７修飾プリン、Ｎ−６修飾プリン）；これらの修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するために、又はアンチセンス鎖へのセンス鎖の結合を増強するために使用することができる；
（ｇ）カチオン基及び双性イオン基（末端にあることが好ましい）；これらの修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するために使用することができる；
（ｈ）結合体基（末端位置にあることが好ましい）、例えば、ナプロキセン、ビオチン、コレステロール、イブプロフェン、葉酸、ペプチド及び糖質；これらの修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するため、又は分子を標的設定するために使用することもできるし、あるいはＲＩＳＣによるセンス鎖活性化を回避するためにセンス鎖の５’末端で使用することもできる。
【０４０７】
アンチセンス鎖に非対称的に配置される例示的な修飾としては、以下のものが挙げられる：
（ａ）バックボーン修飾（例えば、バックボーンのＰの修飾）であって、ＰをＳで置き換えること、又はアルキルもしくはアリル（例えば、Ｍｅ）で置換されたＰ、及びジチオエート（Ｓ−Ｐ＝Ｓ）を含むもの；
（ｂ）２’−Ｏアルキル（例えば、２’−ＯＭｅ）（末端位置を修飾）；
（ｃ）２’−５’結合（２’−Ｈ、２’−ＯＨ及び２’−ＯＭｅによるもの）、例えば３’末端での末端修飾；例えばＰ＝Ｏ又はＰ＝Ｓによる好ましくは３’末端の修飾；これらの修飾は、キナーゼ活性のようなＲＩＳＣ酵素活性を妨害し得るため、５’末端領域からは排除されることが好ましい；
（ｄ）Ｌ糖（例えば、２’−Ｈ、２’−ＯＨ及び２’−ＯＭｅを有するＬ−リボース、Ｌ−アラビノース）；例えば、３’末端での末端修飾；例えばＰ＝Ｏ又はＰ＝Ｓによる好ましくは３’末端の修飾；これらの修飾は、キナーゼ活性を妨害し得るため、５’末端領域から排除されることが好ましい；
（ｅ）修飾糖（例えば、ＬＮＡ、ＨＮＡ及びＣｅＮＡ）；これらの修飾は、センス鎖とアンチセンス鎖との間の対合の望ましくない増強に寄与し得るが、多くの場合は５’領域において「緩い」構造を有することが好ましいので、さらに該修飾はキナーゼ活性を妨害し得るので、５’末端領域からは排除されることが好ましい；
（ｆ）核酸塩基修飾（例えば、Ｃ−５修飾ピリミジン、Ｎ−２修飾プリン、Ｎ−７修飾プリン、Ｎ−６修飾プリン）；
（ｇ）カチオン基及び双性イオン基（末端にあることが好ましい）；
核酸塩基修飾としての、糖の２’位、糖の３’位にあるカチオン基及び双性イオン基（例えば、Ｃ−５修飾ピリミジン、Ｎ−２修飾プリン、Ｎ−７修飾プリン、Ｎ−６修飾プリン）；
結合体基（末端位置にあることが好ましい）、例えば、ナプロキセン、ビオチン、コレステロール、イブプロフェン、葉酸、ペプチド及び糖質であるが、但し、嵩高い基又は概してＲＩＳＣ活性を阻害する基はあまり好ましくないはずである。
【０４０８】
アンチセンス鎖の５’−ＯＨは、活性を促進するように遊離型に保たれるべきである。幾つかの好ましい実施形態では、ヌクレアーゼ耐性を促進する修飾は、３’末端、特に３
’突出部に包含されるべきである。
【０４０９】
別の態様では、本発明は、ｉＲＮＡ剤を最適化する方法、例えば安定化する方法を特徴とする。該方法は、活性を有する配列を選択すること、該配列に１つ又はそれ以上の非対称的な修飾を導入することを包含し、非対称的な修飾の導入によりｉＲＮＡ剤の特性が最適化されるが、活性の減少はもたらされない。
【０４１０】
活性の減少とは、予め選択されたレベルの減少よりも小さい減少とすることができる。好ましい実施形態では、活性の減少とは、修飾が導入されないこと以外は同じｉＲＮＡと比較した場合に、５％、１０％、２０％、４０％又は５０％未満の減少であることを意味する。活性は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで計測することができ、いずれにおける結果も、所要の活性維持を実証するのに十分である。
【０４１１】
最適化される特性は、本明細書中に記載する任意の特性、特に本明細書中の非対称的な修飾に関するセクションで論じる特性であり得る。修飾は、任意の非対称的な修飾、例えば、本明細書中の非対称的な修飾に関するセクションに記載の非対称的な修飾であり得る。特に好ましい非対称的な修飾は、特にセンス配列における２’−Ｏアルキル修飾（例えば２’−ＯＭｅ修飾）、及びアンチセンス鎖におけるバックボーンのＯの修飾、特にホスホロチオエート修飾である。
【０４１２】
好ましい実施形態では、センス配列が選択されて非対称的な修飾が付与される一方で、他の実施形態ではアンチセンス配列が選択されて非対称的な修飾が付与される。幾つかの実施形態では、センス配列及びアンチセンス配列がともに選択され、それぞれ１つ又はそれ以上の非対称的な修飾が付与される。
【０４１３】
多数の非対称的な修飾が、センス配列及びアンチセンス配列の一方又は両方に導入され得る。配列は、少なくとも２個、４個、６個、８個又はそれ以上の修飾を有することができ、配列のすべてのモノマー又はほぼすべてのモノマーを修飾することもできる。
【０４１４】
末端における二重鎖の安定性についての差別的修飾
一態様では、本発明は、末端における二本鎖の安定性についての差別的修飾（ＤＭＴＤＳ）を有することができるｉＲＮＡ剤を特徴とする。
【０４１５】
さらに、本発明は、ＤＭＴＤＳ及び本明細書中に記載の別の要素を有するｉＲＮＡ剤を包含する。例えば、本発明は、本明細書中に記載のｉＲＮＡ剤、例えば、パリンドローム構造のｉＲＮＡ剤、非標準的な対合を有するｉＲＮＡ剤、本明細書中に記載の遺伝子（例えば、ｈｔｔ遺伝子）を標的とするｉＲＮＡ剤、本明細書中に記載のアーキテクチャ又は構造を有するｉＲＮＡ剤、本明細書中に記載の両親媒性送達物質と結合されたｉＲＮＡ、本明細書中に記載の薬物送達モジュールと結合されたｉＲＮＡ、本明細書中に記載するように投与されるｉＲＮＡ剤、又は本明細書中に記載するように製剤化されるｉＲＮＡ剤であって、ＤＭＴＤＳも取り入れたｉＲＮＡ剤を包含する。
【０４１６】
ｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖二重鎖の５’末端の領域において、該二重鎖が解離又は融解する傾向を増大させること（二重鎖の会合の自由エネルギーを減少させること）により最適化することができる。このことは、例えば、アンチセンス鎖の５’末端の領域に、二重鎖が解離又は融解する傾向を増大させるサブユニットを含めることにより達成することができる。また、５’末端の領域に、二重鎖が解離又は融解する傾向を増大させるリガンドを取り付けることにより達成することもできる。理論により拘束されることは望まないが、その効果は、ヘリカーゼのような酵素の作用を促進すること、例えばアンチセンス鎖の５’末端に近接した酵素の作用を促進することに起因し得る。
【０４１７】
本発明者等はまた、アンチセンス鎖二重鎖の３’末端の領域において、該二重鎖が解離又は融解する傾向を減少させること（二重鎖の会合の自由エネルギーを増大させること）により最適化することができることも発見した。このことは、例えばアンチセンス鎖の３’末端の領域に、二重鎖が解離又は融解する傾向を減少させるサブユニットを含めることにより達成することができる。また、５’末端の領域に、二重鎖が解離又は融解する傾向を減少させるリガンドを取り付けることにより達成することもできる。
【０４１８】
二重鎖の５’末端が解離する傾向を増大させる修飾は、単独で、あるいは本明細書中に記載の他の修飾と、例えば二重鎖の３’末端が解離する傾向を減少させる修飾と組み合わせて使用することができる。同様に、二重鎖の３’末端が解離する傾向を減少させる修飾は、単独で、あるいは本明細書中に記載の他の修飾と、例えば二重鎖の５’末端が解離する傾向を増大させる修飾と組み合わせて使用することができる。
【０４１９】
二重鎖のＡＳ  ５’末端の安定性の減少
サブユニット対は、解離又は融解を促進する傾向に基づいて順位付けすることができる（例えば、特定の対の会合又は解離の自由エネルギーに関して、最も簡単なアプローチは、個々の対ごとに対を検査することであるが、次の同類又は同様の分析もまた使用することができる）。解離を促進するという観点では、
Ａ：Ｕは、Ｇ：Ｃよりも好ましく、
Ｇ：Ｕは、Ｇ：Ｃよりも好ましく、
Ｉ：Ｃは、Ｇ：Ｃよりも好ましく（Ｉ＝イノシン）；
ミスマッチ、例えば非標準的な対合すなわち標準的対合以外の対合（本明細書中の他の箇所に記載するようなもの）は、標準的な対合（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）よりも好ましく；
ユニバーサル塩基を含む対合は、標準的な対合よりも好ましい。
【０４２０】
典型的なｄｓ  ｉＲＮＡ剤は、以下の通りに図示することができる：
Ｓ    ５’  Ｒ１Ｎ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４Ｎ５［Ｎ］Ｎ−５Ｎ−４Ｎ−３Ｎ−２Ｎ−１Ｒ２  ３’
ＡＳ  ３’  Ｒ３Ｎ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４Ｎ５［Ｎ］Ｎ−５Ｎ−４Ｎ−３Ｎ−２Ｎ−１Ｒ４  ５’
Ｓ：ＡＳ    Ｐ１Ｐ２Ｐ３Ｐ４Ｐ５［Ｎ］Ｐ−５Ｐ−４Ｐ−３Ｐ−２Ｐ−１  ５’
Ｓはセンス鎖を示し、ＡＳはアンチセンス鎖を示し、Ｒ１は任意選択の（かつ好ましくない）５’センス鎖突出部を示し、Ｒ２は任意選択の（しかし、好ましい）３’センス鎖突出部を示し、Ｒ３は任意選択の（しかし、好ましい）３’アンチセンス鎖突出部を示し、Ｒ４は任意選択の（かつ好ましくない）５’アンチセンス鎖突出部を示し、Ｎはサブユニットを示し、［Ｎ］は、さらなるサブユニット対が存在し得ることを示し、Ｐｘは、センス鎖のＮｘとアンチセンス鎖のＮｘとの対を示す。Ｐの図では突出部は示していない。一部の実施形態では、本明細書中の他の箇所に記載するように、３’ＡＳ突出部は領域Ｚに相当し、二重鎖領域は領域Ｘに相当し、３’Ｓ鎖突出部は領域Ｙに相当する。（図は、最大又は最小の長さを暗に示すことを意味するものではない。長さに関する案内は、本明細書中の他の箇所に提供されている）。
【０４２１】
二重鎖を形成する傾向を減少させる対合が、二重鎖のＡＳ鎖５’末端の１箇所以上の位置において使用されることが好ましい。末端の対（ＡＳ鎖に関して最も５’側の対）をＰ−１とし、それに続く二重鎖内の対合の位置（ＡＳ鎖から見ると３’方向に向かっていく）は、Ｐ−２、Ｐ−３、Ｐ−４、Ｐ−５等とする。二重鎖形成を変更または調節するための好ましい領域は、Ｐ−５〜Ｐ−１、より好ましくはＰ−４〜Ｐ−１、さらに好ましくはＰ−３〜Ｐ−１である。Ｐ−１の修飾は特に好ましく、単独でも、あるいは他の位置（複
数可）（例えば、上記に同定された位置のいずれか）の修飾（複数可）との併用でもよい。上述の領域のうち１つの少なくとも１個、より好ましくは２個、３個、４個又は５個の対は、独立に、以下の群、すなわち
Ａ：Ｕ
Ｇ：Ｕ
Ｉ：Ｃ
ミスマッチな対、例えば非標準的すなわち標準的なもの以外の対合、あるいはユニバーサル塩基を含む対合
から選ばれることが好ましい。
【０４２２】
好ましい実施形態では、解離を促進する対合を達成するのに必要とされるサブユニット変更はセンス鎖内で行われるが、一部の実施形態では該変更がアンチセンス鎖内で行われる。
【０４２３】
好ましい実施形態では、Ｐ−１〜Ｐ−４における少なくとも２個又は３個の対が、解離を促進する対である。
好ましい実施形態では、Ｐ−１〜Ｐ−４における少なくとも２個又は３個の対は、Ａ：Ｕである。
【０４２４】
好ましい実施形態では、Ｐ−１〜Ｐ−４における少なくとも２個又は３個の対は、Ｇ：Ｕである。
好ましい実施形態では、Ｐ−１〜Ｐ−４における少なくとも２個又は３個の対は、Ｉ：Ｃである。
【０４２５】
好ましい実施形態では、Ｐ−１〜Ｐ−４における少なくとも２個又は３個の対は、ミスマッチな対、例えば、非標準的すなわち標準的なもの以外の対である。
好ましい実施形態では、Ｐ−１〜Ｐ−４における少なくとも２個又は３個の対は、ユニバーサル塩基を含む対である。
【０４２６】
二重鎖のＡＳ  ３’末端の安定性の増大
サブユニット対は、安定性を促進し、かつ解離又は融解を阻害する傾向に基づいて順位付けすることができる（例えば、特定の対の会合又は解離の自由エネルギーに関して、最も簡単な手法は、個々の対ごとに対を検査することであるが、次の同類又は同様の分析もまた使用することができる）。二重鎖の安定性を促進するという観点では、
Ｇ：Ｃは、Ａ：Ｕよりも好ましく、
ワトソン−クリックの対合（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）は、非標準的な対合すなわち標準的なもの以外の対合よりも好ましく、
安定性を増大させるアナログは、ワトソン−クリックの対合（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）よりも好ましく、
２−アミノ−Ａ：Ｕは、Ａ：Ｕよりも好ましく、
２−チオＵまたは５Ｍｅ−チオ−Ｕ：Ａは、Ｕ：Ａよりも好ましく、
Ｇ−クランプ（４個の水素結合を有するＣのアナログ）：Ｇは、Ｃ：Ｇよりも好ましく、
グアナジニウム−Ｇ−クランプ：Ｇは、Ｃ：Ｇよりも好ましく、
プソイドウリジン：Ａは、Ｕ：Ａよりも好ましく、
結合を増強する糖修飾、例えば２’位修飾（例えば、２’Ｆ、ＥＮＡまたはＬＮＡ）は、非修飾部分よりも好ましく、二重鎖の安定性を増強するために一方又は両方の鎖上に存在することができる。二重鎖を形成する傾向を増大させる対合が、二重鎖のＡＳ鎖の３’末端の１以上の位置に使用されることが好ましい。末端の対（ＡＳ鎖から見て最も３’側の対）をＰ１とし、これに続く二重鎖内の対合の位置（ＡＳ鎖から見て５’方向に向かっ
ていく）は、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５等とする。二重鎖形成を調節するための修飾を施すための好ましい領域は、Ｐ５〜Ｐ１、より好ましくはＰ４〜Ｐ１、さらに好ましくはＰ３〜Ｐ１である。Ｐ１での修飾は特に好ましく、単独でも、あるいは他の位置（複数可）（例えば、上記に同定された位置のいずれか）の修飾（複数可）と併用されてもよい。上述の領域に存在する少なくとも１個、より好ましくは２個、３個、４個又は５個の対は、独立に、以下の群、すなわち
Ｇ：Ｃ
ワトソン−クリックの対合（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）よりも安定性を増大させるアナログを有する対
２−アミノ−Ａ：Ｕ
２−チオＵまたは５Ｍｅ−チオ−Ｕ：Ａ
Ｇ−クランプ（４個の水素結合を有するＣのアナログ）：Ｇ
グアナジニウム−Ｇ−クランプ：Ｇ
プソイドウリジン：Ａ
一方又は両方のサブユニットが、結合を増強する糖修飾、例えば２’位修飾（例えば、２’Ｆ、ＥＮＡ又はＬＮＡ）を有する対
から選ばれることが好ましい。
【０４２７】
好ましい実施形態では、Ｐ−１〜Ｐ−４における少なくとも２個又は３個の対は、二重鎖の安定性を促進する対である。
好ましい実施形態では、Ｐ１〜Ｐ４における少なくとも２個又は３個の対は、Ｇ：Ｃである。
【０４２８】
好ましい実施形態では、Ｐ１〜Ｐ４における少なくとも２個又は３個の対は、ワトソン−クリックの対合よりも安定性を増大させるアナログを有する対である。
好ましい実施形態では、Ｐ１〜Ｐ４における少なくとも２個又は３個の対は、２−アミノ−Ａ：Ｕである。
【０４２９】
好ましい実施形態では、Ｐ１〜Ｐ４における少なくとも２個又は３個の対は、２−チオＵまたは５Ｍｅ−チオ−Ｕ：Ａである。
好ましい実施形態では、Ｐ１〜Ｐ４における少なくとも２個又は３個の対は、Ｇ−クランプ：Ｇである。
【０４３０】
好ましい実施形態では、Ｐ１〜Ｐ４における少なくとも２個又は３個の対は、グアニジニウム−Ｇ−クランプ：Ｇである。
好ましい実施形態では、Ｐ１〜Ｐ４における少なくとも２個又は３個の対は、プソイドウリジン：Ａである。
【０４３１】
好ましい実施形態では、Ｐ１〜Ｐ４における少なくとも２個又は３個の対は、一方又は両方のサブユニットが、結合を増強する糖修飾、例えば２’位修飾（例えば、２’Ｆ、ＥＮＡまたはＬＮＡ）を有する対である。
【０４３２】
Ｇ−クランプ及びグアニジニウムＧ−クランプについては、以下の参照文献で論じられている。ホルムズ（Ｈｏｌｍｅｓ）及びガイト（Ｇａｉｔ）「The Synthesis of 2'-O-Methyl G-Clamp Containing Oligonucleotides and Their Inhibition of the HIV-1 Tat-TAR Interaction」、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ、第２２巻：１２５９〜１２６２ページ、２００３年；ホルムズ（Ｈｏｌｍｅｓ）ら「Steric inhibition of human immunodeficiency virus type-1 Tat-dependent
trans-activation in vitro and in cells by oligonucleotides containing 2'-O-methyl G-clamp ribonucleoside analogues」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ、第３１巻：２７５９〜２７６８ページ、２００３年；ワイルズ（Ｗｉｌｄｓ）ら「Structural basis for recognition of guanosine by a synthetic tricyclic cytosine analogue:Guanidinium G-clamp」、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ、第８６巻：９６６〜９７８ページ、２００３年；ラジェエエフ（Ｒａｊｅｅｖ）ら「High-Affinity Peptide Nucleic Acid Oligomers Containing Tricyclic Cytosine Analogues」、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、第４巻：４３９５〜４３９８ページ、２００２年；アウシン（Ａｕｓｉｎ）ら「Synthesis of Amino- and Guanidino-G-Clamp PNA Monomers」、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、第４巻：４０７３〜４０７５ページ、２００２年；マイヤー（Ｍａｉｅｒ）ら「Nuclease resistance of oligonucleotides containing the tricyclic cytosine analogues phenoxazine and 9-(2-aminoethoxy)-phenoxazine ("G-clamp") and origins of their nuclease resistance properties」、Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ、第４１巻：１３２３〜７ページ、２００２年；フラナガン（Ｆｌａｎａｇａｎ）ら「A cytosine analog that confers enhanced potency to antisense oligonucleotides」、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ
Ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ、第９６巻：３５１３〜８ページ、１９９９年。
【０４３３】
二重鎖のＡＳ  ５’末端の安定性の減少と二重鎖のＡＳ  ３’末端の安定性の増大とを同時に行うこと
上述のように、ｉＲＮＡ剤は、二重鎖のＡＳ  ５’末端の安定性を減少させ、かつ二重鎖のＡＳ  ３’末端の安定性を増大させるように修飾することができる。このことは、二重鎖のＡＳ  ５’末端における１以上の安定性を減少させる修飾を、二重鎖のＡＳ  ３’末端における１以上の安定性を増加させる修飾と組み合わせることにより達成することができる。したがって、好ましい実施形態は、Ｐ−５〜Ｐ−１、より好ましくはＰ−４〜Ｐ−１、さらに好ましくはＰ−３〜Ｐ−１における修飾を包含する。Ｐ−１での修飾は特に好ましく、単独でも、あるいは他の位置（例えば、上記に同定された位置）との併用でもよい。二重鎖領域のＡＳ  ５’末端の上述の領域の１つに存在する少なくとも１個、より好ましくは２個、３個、４個又は５個の対は、独立に、以下の群から選ばれることが好ましく、その群とは、
Ａ：Ｕ
Ｇ：Ｕ
Ｉ：Ｃ
ミスマッチな対、例えば非標準的な対合、すなわち標準的なもの以外のユニバーサル塩基を含む対合、ならびに
Ｐ５〜Ｐ１、より好ましくはＰ４〜Ｐ１、さらに好ましくはＰ３〜Ｐ１での修飾である。Ｐ１での修飾は特に好ましく、単独でも、あるいは他の位置（例えば、上記に同定された位置）との併用でもよい。二重鎖領域のＡＳ  ３’末端の上述の領域の１つに存在する少なくとも１個、より好ましくは２個、３個、４個又は５個の対は、独立に、以下の群から選ばれることが好ましく、その群とは、
Ｇ：Ｃ
ワトソン−クリックの対合（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）よりも安定性を増大させるアナログを有する対
２−アミノ−Ａ：Ｕ
２−チオＵまたは５Ｍｅ−チオ−Ｕ：Ａ
Ｇ−クランプ（４個の水素結合を有するＣのアナログ）：Ｇ
グアナジニウム−Ｇ−クランプ：Ｇ
プソイドウリジン：Ａ
一方又は両方のサブユニットが、結合を増強する糖修飾、例えば２’位修飾（例えば、２’Ｆ、ＥＮＡ又はＬＮＡ）を有する対
である。
【０４３４】
本発明はまた、ＤＭＴＤＳを有するｉＲＮＡ剤を選択および作製する方法を包含する。例えば、ｉＲＮＡ剤として使用するための候補配列に関して標的配列をスクリーニングする場合、本明細書中に記載のＤＭＴＤＳ特性を有する配列、または、所望のレベルのＤＭＴＤＳを付与するために、好ましくはできる限り変化を少なく、特にＡＳ鎖に対して修飾を施すことができる配列を選択することができる。
【０４３５】
本発明はまた、ｉＲＮＡ剤候補配列を提供すること、ならびに、ＤＭＴＤＳ  ｉＲＮＡ剤を提供するためにＰ−５〜Ｐ−１における少なくとも１個のＰまたはＰ５〜Ｐ１における少なくとも１個のＰのうち少なくともいずれかを修飾することを包含する。
【０４３６】
ＤＭＴＤＳ  ｉＲＮＡ剤は、本明細書中に記載の任意の方法において、例えばｈｔｔのＲＮＡをサイレンシングするために、本明細書中に記載の任意の障害（例えば、神経変性障害）を治療するために、本明細書中に記載の任意の製剤中で、ならびに一般に本明細書中の他の箇所に記載する方法及び組成物において、かつ／または該方法及び組成物とともに、使用することができる。ＤＭＴＤＳ  ｉＲＮＡ剤は、本明細書中に記載の他の修飾、例えば標的設定物質を取り付けること又は安定性を増強する修飾を含めること（例えばヌクレアーゼ耐性モノマーを含めること）もしくは自己会合して鎖内二重鎖構造を形成する一本鎖突出部（例えば、３’ＡＳ鎖突出部及び／又は３’Ｓ鎖突出部）を含めること、を取り入れることができる。
【０４３７】
好ましくは、これらのｉＲＮＡ剤は、本明細書中に記載のアーキテクチャを有する。
その他の実施形態
ＲＮＡ、例えばｉＲＮＡ剤は、例えば細胞内へ送達される外来のＤＮＡ鋳型から、ｉｎ
ｖｉｖｏで細胞において産生され得る。例えば、該ＤＮＡ鋳型をベクターに挿入して、遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターは、例えば静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号）により、あるいは定位注射（例えば、チェン（Ｃｈｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  第９１巻：３０５４〜３０５７ページ、１９９４年を参照）により対象へ送達することができる。遺伝子治療ベクターの医薬調製物は、許容可能な希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含めることもできるし、あるいは該遺伝子送達ビヒクルを包埋する徐放性マトリックスを含むこともできる。例えば、ＤＮＡ鋳型は、２つの転写ユニット（１つはｉＲＮＡ剤の上鎖を包含する転写物を産生するもの、１つはｉＲＮＡ剤の下鎖を包含する転写物を産生するもの）を包含することができる。鋳型が転写されると、ｉＲＮＡ剤が産生され、プロセシングを受けて遺伝子サイレンシングを仲介するｓＲＮＡ剤断片となる。
【０４３８】
生理学的作用
本明細書中に記載のｉＲＮＡ剤は、該ｉＲＮＡ剤と、ヒトの配列およびヒト以外の動物の配列の両方との相補性によって、治療上の毒性の測定がより容易になされるように設計することができる。これらの方法では、ＲＮＡ剤は、ヒト由来の核酸配列および少なくとも１種類のヒト以外の動物（例えばヒト以外の哺乳類、例えば、げっ歯類、反すう類又は霊長類）由来の核酸配列に完全に相補的である配列から構成され得る。例えば、ヒト以外の哺乳類は、マウス、ラット、イヌ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、サル、ピグミーチンパンジー、ナミチンパンジー、アカゲザル又はカニクイザルであり得る。ｉＲＮＡ剤の配列は、ヒト以外の哺乳類及びヒトの相同遺伝子、例えば発がん遺伝子又は腫瘍抑制遺伝子の中の配列に相補的であるということもありうる。ヒト以外の哺乳類におけるｉＲＮＡ剤の毒性を測定することにより、ヒトにおけるｉＲＮＡ剤の毒性を推定することができる。より厳しい毒性試験のためには、ｉＲＮＡ剤を、ヒト及び２以上（例えば２種類又は３種類又はそれ以上）のヒト以外の動物に対して相補的とすることができる。
【０４３９】
本明細書中に記載の方法は、ヒトに対するｉＲＮＡ剤の任意の生理学的作用、例えば毒性作用のような任意の望ましくない作用、または任意の好ましい作用、すなわち所望の作用を関連付けるのに使用することができる。
【０４４０】
両親媒性送達物質
本明細書中に記載のｉＲＮＡ剤は、本明細書中に記載のものなどの両親媒性送達結合体またはモジュールとともに使用することができる。
【０４４１】
両親媒性分子は、疎水性領域および親水性領域を有する分子である。このような分子は、脂質（例えば、細胞の脂質二重層）と相互作用する（例えば、浸透又は破壊する）ことができる。したがって、両親媒性分子は、関連付けられた（例えば、結合された）ｉＲＮＡ（例えば、本明細書中に記載のｉＲＮＡ又はｓＲＮＡ）のための送達物質として作用することができる。本明細書中に記載の組成物（例えば、本明細書中に記載の両親媒性ｉＲＮＡ構築物）で使用されるべき好ましい両親媒性分子は、ポリマーである。該ポリマーは、二次構造、例えば反復性の二次構造を有し得る。
【０４４２】
両親媒性ポリマーの一例は、両親媒性ポリペプチド、例えば該ポリペプチドが親水面及び疎水面を有するような二次構造を有するポリペプチドである。両親媒性ペプチド構造物（例えば、αらせん状ポリペプチド）の設計は、当業者には日常的な作業である。例えば、以下の参照文献に手引きが提供されている：グレル（Ｇｒｅｌｌ）ら（２００１年）、Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ  第７巻（３）：１４６〜５１ページ；チェン（Ｃｈｅｎ）ら（２００２年）、Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｒｅｓ  第５９巻（１）：１８〜３３ページ；イワタ（Ｉｗａｔａ）ら（１９９４年）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  第２６９巻（７）：４９２８〜３３ページ；コーナット（Ｃｏｒｎｕｔ）ら（１９９４年）、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  第３４９巻（１）：２９〜３３ページ；ネグレート（Ｎｅｇｒｅｔｅ）ら（１９９８年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  第７巻（６）：１３６８〜７９ページ。
【０４４３】
両親媒性ポリマーの別の例は、２以上の両親媒性サブユニット、例えば環状部分（例えば、１つ以上の親水性基及び１つ以上の疎水性基を有する環状部分）を含有する２以上のサブユニットから構成されるポリマーである。例えば、該サブユニットは、ステロイド（例えばコール酸）又は芳香族部分を含有してもよい。このような構成部分は、それらがポリマー構造中にあるときに対向する親水面及び疎水面を形成することができるように、アトロプ異性を示すことができることが好ましい。
【０４４４】
推定上の両親媒性分子の、脂質膜（例えば、細胞膜）と相互作用する能力は、日常作業的な方法により、例えば無細胞アッセイ又は細胞アッセイにおいて試験することができる。例えば、試験化合物を、合成脂質二重層、細胞膜分画又は細胞と混合するかまたは接触させて、試験化合物が、その脂質二重層、細胞膜又は細胞と相互作用するか、浸透するか、あるいは破壊する能力に関して評価する。試験化合物を、脂質二重層、細胞膜又は細胞との相互作用の検出のために標識することもできる。別のタイプのアッセイでは、試験化合物をレポーター分子又はｉＲＮＡ剤（例えば、本明細書中に記載のｉＲＮＡ又はｓＲＮＡ）に連結させて、そのレポーター分子又はｉＲＮＡ剤が脂質二重層、細胞膜又は細胞に浸透する能力を評価する。２工程アッセイを実施することも可能であり、該２工程アッセイでは、第１のアッセイが、試験化合物単独の、脂質二重層、細胞膜または細胞と相互作用する能力を評価し、第２のアッセイが、試験化合物とレポーターまたはｉＲＮＡ剤とを含む構築物（例えば、本明細書中に記載の構築物）の、脂質二重層、細胞膜または細胞と相互作用する能力を評価する。
【０４４５】
本明細書中に記載の組成物において有用な両親媒性ポリマーは、少なくとも２個、好ましくは少なくとも５個、より好ましくは少なくとも１０個、２５個、５０個、１００個、
２００個、５００個、１，０００個、２，０００個、５０，０００個またはそれ以上のサブユニット（例えば、アミノ酸又は環状サブユニット）を有する。１つの両親媒性ポリマーを、１つ又はそれ以上、例えば２個、３個、５個、１０個又はそれ以上のｉＲＮＡ剤（例えば、本明細書中に記載のｉＲＮＡ又はｓＲＮＡ剤）に連結させることもできる。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーは、アミノ酸および環状サブユニット（例えば、芳香族サブユニット）の両方を含有することができる。
【０４４６】
本発明は、両親媒性分子と関係付けられたｉＲＮＡ剤（例えば、本明細書中に記載のｉＲＮＡ又はｓＲＮＡ）を包含する組成物を特徴とする。このような組成物は、本明細書中では「両親媒性ｉＲＮＡ構築物」とも呼ばれる。このような組成物及び構築物は、ｉＲＮＡ剤の送達又は標的設定、例えばｉＲＮＡ剤を細胞へと送達又は標的設定するのに有用である。理論により拘束されることは望まないが、このような組成物及び構築物は、例えばｉＲＮＡ剤の細胞内への進入が可能となるように、脂質（例えば、細胞の脂質二重層）の多孔性を増大させる（例えば、浸透又は崩壊させる）ことができる。
【０４４７】
一態様では、本発明は、両親媒性分子に連結されたｉＲＮＡ剤（例えば、本明細書中に記載のｉＲＮＡ剤又はｓＲＮＡ剤）を含む組成物に関する。該ｉＲＮＡ剤および両親媒性分子は、共有結合又は非共有結合のいずれかにより、互いに持続的に接触した状態に保持されていてもよい。
【０４４８】
該組成物又は構築物の両親媒性分子は、リン脂質以外である、例えばミセル、膜または膜断片以外であることが好ましい。
組成物又は構築物の両親媒性分子は、好ましくはポリマーである。該ポリマーは、２以上の両親媒性サブユニットを含みうる。１以上の親水性基及び１以上の疎水性基がポリマー上に存在してもよい。ポリマーは、反復性の二次構造ならびに第１の面および第２の面を有してもよい。反復性の二次構造に沿った親水性基及び疎水性基の分布は、ポリマーの一方の面が親水面であり、かつポリマーの他方の面が疎水面であるような分布であり得る。
【０４４９】
両親媒性分子は、ポリペプチド、例えばその二次構造としてαらせん構造を含むポリペプチドであってもよい。
一実施形態では、両親媒性ポリマーは、１つ以上の環状部分（例えば、１以上の親水性基または１以上の疎水性基のうち少なくともいずれかを有する環状部分）を含有する１つ以上のサブユニットを包含する。一実施形態では、ポリマーは、環状部分が交互に疎水性基及び親水性基を有するような環状部分のポリマーである。例えば、サブユニットは、ステロイド（例えば、コール酸）を含有してもよい。別の例では、サブユニットは、芳香族部分を含有してもよい。芳香族部分は、アトロプ異性を示すことができるもの、例えば２，２’−ビス（置換）−１，１’−ビナフチルまたは２，２’−ビス（置換）ビフェニルであり得る。サブユニットは、式（Ｍ）：
【０４５０】
【化７６】
2009504782.tif 000087
を有する芳香族部分を含んでもよい。
【０４５１】
本発明は、両親媒性分子と関連付けられたｉＲＮＡ剤（例えば、本明細書中に記載のｉＲＮＡ又はｓＲＮＡ）を包含する組成物を特徴とする。このような組成物は、本明細書中では「両親媒性ｉＲＮＡ構築物」と呼ばれ得る。このような組成物及び構築物は、ｉＲＮＡ剤の送達または標的設定、例えば細胞へのｉＲＮＡ剤の送達または標的設定において有用である。理論により拘束されることは望まないが、このような組成物及び構築物は、例えばｉＲＮＡ剤の細胞内への進入が可能となるように、脂質（例えば、細胞の脂質二重層）の多孔性を増大させる（例えば浸透または破壊する）ことができる。
【０４５２】
式Ｍを参照すると、Ｒ１は、任意選択でアリール、アルケニル、アルキニル、アルコキシまたはハロで置換されているか、任意選択でＯ、Ｓ、アルケニルまたはアルキニルが挿入されているかのうち少なくともいずれかであるＣ１〜Ｃ１００アルキル；Ｃ１〜Ｃ１００ペルフルオロアルキル；あるいはＯＲ５である。
【０４５３】
Ｒ２は、ヒドロキシ、ニトロ、サルフェート、リン酸、リン酸エステル、スルホン酸、ＯＲ６、あるいは、任意選択でヒドロキシ、ハロ、ニトロ、アリールスルフィニルもしくはアルキルスルフィニル、アリールスルホニルもしくはアルキルスルホニル、サルフェート、スルホン酸、リン酸、リン酸エステル、置換もしくは非置換アリール、カルボキシル、カルボン酸、アミノカルボニルまたはアルコキシカルボニルで置換されているか、任意選択でＯ、ＮＨ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、アルケニルまたはアルキニルが挿入されているかのうち少なくともいずれかであるＣ１〜Ｃ１００アルキルである。
【０４５４】
Ｒ３は、水素であるか、またはＲ４と一体となって融合フェニル環を形成する。
Ｒ４は、水素であるか、またはＲ３と一体となって融合フェニル環を形成する。
Ｒ５は、任意選択でアリール、アルケニル、アルキニル、アルコキシまたはハロで置換されているか、任意選択でＯ、Ｓ、アルケニルまたはアルキニルが挿入されているかのうち少なくともいずれかであるＣ１〜Ｃ１００アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ１００ペルフルオロアルキルであり、Ｒ６は、任意選択でヒドロキシ、ハロ、ニトロ、アリールスルフィニルもしくはアルキルスルフィニル、アリールスルホニルもしくはアルキルスルホニル、
サルフェート、スルホン酸、リン酸、リン酸エステル、置換もしくは非置換アリール、カルボキシル、カルボン酸、アミノカルボニルまたはアルコキシカルボニルで置換されているか、任意選択でＯ、ＮＨ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、アルケニルまたはアルキニルが挿入されているかのうち少なくともいずれかであるＣ１〜Ｃ１００アルキルである。
【０４５５】
ｉＲＮＡ剤は、２００４年３月８日出願の共願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０号に記載されているようなＺＸＹ構造を有することができる。
ｉＲＮＡ剤のセンス配列およびアンチセンス配列はパリンドロームであってもよい。パリンドロームｉＲＮＡ剤の典型的な特徴は、２００４年３月８日出願の共願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０号に記載されている。
【０４５６】
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤はモジュラー複合体を特徴とする送達物質と複合体化されうる。該複合体は、（ａ）縮合剤（例えば、核酸を例えばイオン相互作用または静電相互作用により誘引（例えば、結合）することが可能な物質）、（ｂ）融合剤（例えば、細胞膜と融合すること、または細胞膜を通過して輸送されることのうち少なくともいずれかが可能な物質）、及び（ｃ）標的設定基、例えば、細胞または組織を標的とする物質（例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質または特定の種類の細胞に結合するタンパク質（例えば抗体）、のうち１つ以上（好ましくは２つ又はそれ以上、より好ましくは３つすべて）、に連結させた担体物質を包含することができる。送達物質と複合体化されたｉＲＮＡ剤については、２００４年３月８日出願の共願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０号に記載されている。
【０４５７】
ｉＲＮＡ剤は、標準的ではない対合を、例えばｉＲＮＡ二重鎖のセンス配列とアンチセンス配列の間に有することができる。標準的ではないｉＲＮＡ剤の典型的な特徴は、２００４年３月８日出願の共願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０号に記載されている。
【０４５８】
ｄｓＲＮＡの細胞内取り込みの増大
本発明の方法は、ｉＲＮＡ剤、ならびにｉＲＮＡ剤の細胞内への取り込みに影響を及ぼす薬物の投与を包含し得る。該薬物は、ｉＲＮＡ剤が投与される前に、ｉＲＮＡ剤が投与された後に、あるいはｉＲＮＡ剤が投与されるのと同時に投与され得る。薬物は共有結合によりｉＲＮＡ剤に連結されてもよい。薬物は、細胞に対する一過性の作用を有していてもよい。
【０４５９】
薬物は、例えば細胞の細胞骨格を崩壊させることにより、例えば細胞の微小管、ミクロフィラメントおよび中間フィラメントのうち少なくともいずれかを崩壊させることにより、ｉＲＮＡ剤の細胞内への取り込みを増大させることができる。該薬物は、例えば、タキソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノライド（ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホライド（ｓｗｉｎｈｏｌｉｄｅ）Ａ、インダノシン（ｉｎｄａｎｏｃｉｎｅ）またはミオセルビン（ｍｙｏｓｅｒｖｉｎ）であり得る。
【０４６０】
ｉＲＮＡ結合体
神経系細胞内への取り込みを強化するために親油性物質に結合されたｉＲＮＡ剤を、第２の作用物質にカップリング（例えば、共有結合）させることができる。例えば、特定の神経障害を治療するのに使用されるｉＲＮＡ剤は、第２の治療薬、例えばｉＲＮＡ剤以外の作用物質にカップリングさせることができる。第２の治療薬は、同じ神経障害の治療を目的とするものであってよい。例えば、ＨＤを治療するのに使用されるｉＲＮＡの場合では、ｉＲＮＡ剤を、ＨＤの治療に有用であることが知られている第２の作用物質にカップリングさせることができる。
【０４６１】
ｉＲＮＡの生産
ｉＲＮＡは、例えば大量に、各種方法により生産することができる。例示的な方法としては、有機合成及びＲＮＡ切断（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの切断）が挙げられる。
【０４６２】
有機合成
ｉＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ分子の各々の鎖を別個に合成することにより作製することができる。次に、構成成分の鎖をアニーリングさせることができる。
【０４６３】
大型のバイオリアクタ（例えば、ファルマシア  バイオテクＡＢ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃ  ＡＢ）（スウェーデン国ウプサラ所在）のＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ（商標）ＩＩ）を用いて、所定のｉＲＮＡ用の特定のＲＮＡ鎖を大量に生産することができる。ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔＩＩリアクタは、わずか１．５モル濃度過剰のホスホロアミダイトヌクレオチドを使用して、効率的にヌクレオチドをカップリングすることができる。ＲＮＡ鎖を作製するためには、リボヌクレオチドアミダイトが使用される。標準的なモノマー添加サイクルを使用して、ｉＲＮＡ用の２１〜２３ヌクレオチドの鎖を合成することができる。通常、２つの相補的な鎖を別個に生産し、次いで、例えば固体支持体から放出させて脱保護した後にアニーリングさせる。
【０４６４】
有機合成を使用して、別個のｉＲＮＡ種を生産することもできる。特定の標的遺伝子に対する該ｉＲＮＡ種の相補性を、正確に指定することができる。例えば、該ｉＲＮＡ種は、多型、例えば一塩基多型を含む領域に相補的であってもよい。さらに、多型の位置を正確に規定することも可能である。一部の実施形態では、多型は、内側領域、例えば末端の一方または両方から少なくとも４、５、７または９ヌクレオチドの位置にある。
【０４６５】
ｄｓＲＮＡ切断
ｉＲＮＡはまた、より大きなｄｓ  ｉＲＮＡを切断することにより作製することもできる。切断は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでもｉｎ  ｖｉｖｏでも実現され得る。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの切断によりｉＲＮＡを生産するために、以下の方法を使用することができる。
【０４６６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写：  核酸（ＤＮＡ）セグメントを両方向に転写することによりｄｓＲＮＡが生産される。例えば、ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）ＲＮＡｉ転写キット（ニュー
イングランド  バイオラブス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））は、ベクターと、該ベクター内でいずれかの側にＴ７プロモータが隣接する位置にクローニングされた核酸セグメントに関してｄｓＲＮＡを生産する方法とを提供する。ｄｓＲＮＡ用の２つの相補鎖のＴ７転写用に、別個の鋳型が生成される。該鋳型は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの添加によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写され、ｄｓＲＮＡが生産される。ＰＣＲ及び／又は他のＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３ポリメラーゼ又はＳＰ６ポリメラーゼ）を用いる同様の方法を使用することもできる。一実施形態では、この方法により生成されるＲＮＡは、組換え酵素の調製物に混入している可能性のあるエンドトキシンを除去するように慎重に精製される。
【０４６７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断：  ｄｓＲＮＡは、例えばダイサー（Ｄｉｃｅｒ）または匹敵するＲＮＡアーゼＩＩＩ系の活性を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで切断されてｉＲＮＡとなる。例えば、ｄｓＲＮＡは、ショウジョウバエ由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ抽出物中で、あるいは精製された成分（例えば、精製ＲＮＡアーゼまたはＲＩＳＣ複合体（ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体））を用いて、インキュベートすることができる。例えば、ケッテイング（Ｋｅｔｔｉｎｇ）ら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ２００１年１０月１５日、第１５巻（２０）：２６５４〜９ページおよびハモンド（Ｈａｍｍｏｎｄ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００
１年８月１０日；第２９３巻（５５３２）：１１４６〜５０ページを参照されたい。
【０４６８】
ｄｓＲＮＡの切断により、概して複数のｉＲＮＡ種が生産され、それぞれがもとのｄｓＲＮＡ分子の特定の２１〜２３ｎｔフラグメントである。例えば、もとのｄｓＲＮＡ分子の重なり合う領域や隣接する領域に相補的な配列を含むｉＲＮＡが存在し得る。
【０４６９】
合成方法にかかわらず、ｉＲＮＡ調製物は、製剤化に適した溶液（例えば、水溶液および／または有機溶液）中で調製することができる。例えば、ｉＲＮＡ調製物は、純粋な二重に蒸留した蒸留水中で沈殿および再溶解され、凍結乾燥されてもよい。続いて、乾燥させたｉＲＮＡは、意図される製剤化プロセスに適した溶液中に再懸濁させることができる。
【０４７０】
修飾ｉＲＮＡ剤およびヌクレオチド代用物のｉＲＮＡ剤の合成は後述する。
製剤化
本明細書中に記載のｉＲＮＡ剤は、対象への投与用に製剤化することができる。
【０４７１】
説明を簡略化するために、本項での製剤、組成物及び方法は、主として非修飾ｉＲＮＡ剤に関して論述する。しかしながら、これらの製剤、組成物及び方法は、他のｉＲＮＡ剤、例えば修飾ｉＲＮＡ剤を用いて実施することができ、かつそのような実施は本発明の範囲内にあることが理解されるべきである。
【０４７２】
製剤化されたｉＲＮＡ組成物は、様々な状態であると仮定することができる。幾つかの例では、組成物は、少なくとも部分的に結晶性であるか、一様に結晶性であるか、かつ／または無水（例えば、水分が８０％未満、５０％未満、３０％未満、２０％未満又は１０％未満）である。別の例では、ｉＲＮＡは水相中（例えば水を含む溶液中）に存在する。
【０４７３】
水相組成物または結晶性組成物は、例えば送達ビヒクル、例えばリポソーム（特に水相に関して）または粒子（例えば、結晶性組成物に関して適切であり得るような微粒子）に組み込むことができる。概して、ｉＲＮＡ組成物は、意図される投与方法と相性の良い様式で製剤化される。
【０４７４】
特定の実施形態では、組成物は、以下の方法：噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、蒸発、流動床乾燥（ｆｌｕｉｄ  ｂｅｄ  ｄｒｙｉｎｇ）またはこれらの技法の組合せ、あるいは液体を用いた超音波処理、フリーズドライ、凝縮およびその他の自己集合、のうち少なくとも１つにより調製される。
【０４７５】
ｉＲＮＡ調製物は、別の作用物質、例えば別の治療薬またはｉＲＮＡを安定化する作用物質（例えば、ｉＲＮＡと複合体形成してｉＲＮＰを形成するタンパク質）と組み合わせて製剤化することができる。さらに別の作用物質としては、例えばＥＤＴＡなどのキレート化剤（例えば、Ｍｇ２＋のような二価カチオンを除去するため）、塩、ＲＮＡアーゼ阻害剤（例えば、ＲＮＡｓｉｎのような広域特異性のＲＮＡアーゼ阻害剤）等が挙げられる。
【０４７６】
一実施形態では、ｉＲＮＡ調製物は、別のｉＲＮＡ剤、例えば第２の遺伝子または同じ遺伝子に関してＲＮＡｉを仲介することができる第２のｉＲＮＡを包含する。さらに別の調製物は、少なくとも３個、５個、１０個、２０個、５０個もしくは１００個またはそれ以上の異なるｉＲＮＡ種を包含することができる。このようなｉＲＮＡは、同様の数の異なる遺伝子に関してＲＮＡｉを仲介することができる。
【０４７７】
一実施形態では、ｉＲＮＡ調製物は、少なくとも１つの第２の治療薬（例えば、ＲＮＡ
又はＤＮＡ以外の作用物質）を包含する。例えば、神経疾患、例えば神経変性疾患（例えば、ＰＤ）の治療用のｉＲＮＡ組成物が、既知のＰＤ治療剤（例えば、レバドパ（ｌｅｖａｄｏｐａ）またはデプロニル（ｄｅｐｒｏｎｉｌ））を含むことが考えられよう。
【０４７８】
標的設定
説明を簡略化するために、本項での製剤、組成物および方法は、主として非修飾ｉＲＮＡ剤に関して論述する。しかしながら、これらの製剤、組成物および方法は、他のｉＲＮＡ剤、例えば修飾ｉＲＮＡ剤を用いて実施することができ、かつかかる実施は本発明の範囲内にあることが理解されるべきである。
【０４７９】
一部の実施形態では、ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤、またはｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいはＤＮＡであって例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）は、特定の細胞に対して標的設定される。例えば、ｉＲＮＡを包含するリポソームもしくは粒子または他の構造は、標的細胞上の特定の分子を認識する標的設定部分を包含することもできる。標的設定部分は、標的細胞に関して特異的な親和性を有する分子であり得る。標的設定部分には、標的細胞の表面上に見られるタンパク質に対する抗体、あるいは標的細胞の表面上に見られる分子に関するリガンドまたはリガンドの受容体結合部分を挙げることができる。
【０４８０】
ｉＲＮＡを脳内の神経系細胞に対して標的設定するために抗原を使用することも可能である。
一実施形態では、標的設定部分はリポソームに取り付けられる。例えば、米国特許第６，２４５，４２７号明細書は、タンパク質またはペプチドを用いてリポソームを標的設定する方法について記載している。別の例では、リポソームのカチオン性脂質成分が、標的設定部分で誘導体化される。例えば、国際公開公報第９６／３７１９４号パンフレットは、Ｎ−グルタリルジオレオイルホスファチジルエタノールアミンをＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルに変換することについて記載している。該生成物は続いてＲＧＤペプチドにカップリングされた。
【０４８１】
治療方法および送達経路
神経系細胞で発現する遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を含む組成物は、種々の経路によって対象に送達可能である。例示的な経路には、クモ膜下腔内、（例えば、脳内の）実質、鼻、および眼への送達が含まれる。組成物は、例えば静脈内、皮下または筋肉内注射により全身へ送達することも可能であり、これはｉＲＮＡ剤を末梢ニューロンに送達するのに特に有用である。好ましい送達経路は、脳への直接送達、例えば脳室内または視床下部内、あるいは脳の側部領域または後部領域である。神経系細胞への送達用のｉＲＮＡ剤は、投与に適した医薬組成物中に組み込まれ得る。例えば、組成物は、１種以上のｉＲＮＡ剤および薬学的に許容可能な担体を含み得る。本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容可能な担体」とは、薬学的投与に適合しうる任意のあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むことを意図する。薬学的に許容可能な担体には、本発明のｉＲＮＡ剤に結合される親油性部分に追加されるトランスフェクション試薬または神経系細胞への取り込みを容易にする試薬は含まれない。薬学的に活性な物質のためにこのような媒体および薬剤を使用することは、当該分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤は、活性化合物とは相容れない場合を除き、本発明の組成物中における使用が意図される。補助的な活性化合物もまた、組成物に組み込み可能である。
【０４８２】
本発明の医薬組成物は、局所治療が所望されるか全身治療が所望されるかにより、また治療すべき領域により、多数の方法で投与可能である。投与は、局所（点眼、鼻内投与、
経皮投与など）でもよいし、経口でも非経口でもよい。非経口投与には、静脈内点滴、皮下、腹腔内、もしくは筋肉内の注射、またはクモ膜下腔内もしくは脳（心）室内（例えば、脳室内）への投与がある。
【０４８３】
送達経路は、患者の障害によって変わりうる。例えば、ＨＤと診断された対象に、親油性物質と結合させた抗ｈｔｔ  ｉＲＮＡ剤を、脳内に直接（例えば、淡蒼球内または基底核の線条体内、および線条体の中型有棘ニューロン付近に）投与可能である。多系統萎縮症と診断された対象には、脳内に、例えば、脳の線条体および黒質の領域に、および脊髄にｉＲＮＡ剤を直接投与可能である。レーヴィ小体痴呆と診断された対象には、脳内に直接、例えば、脳の皮質内に直接ｉＲＮＡ剤を投与可能であり、かつ投与は拡散性のものであってよい。神経系細胞への送達強化のために修飾されたｉＲＮＡ剤に加えて、二次療法、例えば、緩和治療および／または疾患特異的な治療を患者に施しても良い。二次療法は、例えば、対症的なもの（例えば症状の軽減のため）でもよいし、神経を保護するもの（例えば、疾患の進行を減速または停止するため）でもよいし、あるいは回復させるもの（例えば、疾患の進行を逆行させるため）でもよい。対象は抗ＳＮＣＡ  ｉＲＮＡを投与されていないことが好ましい。
【０４８４】
ＨＤの治療については、例えば、対症療法として薬物のハロペリドール、カルバマゼピン、またはバルプロエートが挙げられる。その他の治療には、心理療法、理学療法、言語療法、コミュニケーションおよび記憶の補助（装置）、社会的支援活動、ならびに食事療法の指導が挙げられる。
【０４８５】
パーキンソン病の治療については、対症療法として薬物のカルビドパ／レボドパ、エンタカポン、トルカポン、プラミペキソール、ロピネロール、ペルゴリド、ブロモクリプチン、セレゲリン、アマンタジン、および数種の抗コリン作用剤が挙げられる。脳深部刺激手術ならびに定位脳手術もまた、対症的軽減をもたらす可能性がある。神経を保護する治療には、例えば、カルビドパ／レボドパ、セレゲリン、ビタミンＥ、アマンタジン、プラミペキソール、ロピネロール、コエンザイムＱ１０、およびＧＤＮＦが含まれる。回復治療には、例えば、幹細胞の外科的移植が含まれ得る。
【０４８６】
親油性部分が結合しているｉＲＮＡ剤を脳の神経系細胞に送達することができる。組成物が血液脳関門を通過する必要のない送達方法を利用することができる。例えば、ｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物を、疾患の影響を受けた細胞を含む領域へ直接注射することによって患者に送達可能である。例えば、医薬組成物を、脳内への直接的注射によって送達可能である。この注射は、脳の特定の領域（例えば、黒質、皮質、海馬、線条体、または淡蒼球）への定位的な注射であり得る。ｉＲＮＡ剤は、中枢神経系の複数の領域に（例えば、脳の複数の領域に、および／または脊髄に）送達可能である。ｉＲＮＡ剤は、脳の広範な領域に送達可能である（例えば、脳の皮質への拡散性送達）。
【０４８７】
１つの実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、組織、例えば、脳（例えば、脳の黒質、海馬、線条体、または淡蒼球）に一端が移植されたカニューレまたは他の送達デバイスによって送達可能である。カニューレはｉＲＮＡ剤のリザーバに接続可能である。フローまたは送達は、ポンプ、例えば、浸透圧ポンプまたはミニポンプ（例えば米国カリフォルニア州クパチーノ所在のデュレクト（Ｄｕｒｅｃｔ）のＡｌｚｅｔ（Ｒ）ポンプ）によって調節可能である。１つの実施形態において、ポンプまたはリザーバは組織から離れた領域に、例えば、腹部に移植され、送達は、ポンプまたはリザーバから放出部位まで通じている導管によって行われる。脳への送達のためのデバイスは、例えば、米国特許第６，０９３，１８０号および同第５，８１４，０１４号明細書に記載されている。
【０４８８】
親油性部分（例えばコレステロール）に結合されたｉＲＮＡ剤は、血液脳関門を通過で
きるようにさらに修飾可能である。例えば、ｉＲＮＡ剤は、該薬剤が血液脳関門を通過できるようにする分子に結合されてもよい。このような修飾ｉＲＮＡ剤は、任意の所望の方法によって、例えば、脳室内もしくは筋肉内注射によって、または肺送達によって投与可能である。
【０４８９】
神経系細胞内への取り込み強化のために親油性部分に結合されたｉＲＮＡ剤は、例えば、網膜の障害（例えば、網膜症）を治療するために眼に投与可能である。例えば、医薬組成物を、眼の表面または周辺組織、例えば、瞼の内部に施用可能である。該組成物は、局所的に、例えば、噴霧することによって、点眼として、眼洗浄液として、または軟膏として施用可能である。軟膏または点眼液は、当該分野で既知の眼への送達系、例えば、アプリケータまたは点眼器によって送達されてもよい。このような組成物は、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、もしくはポリ（ビニルアルコール）などの粘膜模倣物、ソルビン酸、ＥＤＴＡ、もしくはベンジルクロミウムクロライドなどの保存剤、ならびに通常の量の希釈剤および／または担体を含み得る。医薬組成物はまた、眼の内部に投与可能であり、かつ選択された領域または構造に組成物を導入することが可能な針または他の送達デバイスによって導入可能である。ｉＲＮＡ剤を含む組成物はまた、眼用パッチを介して施用可能である。
【０４９０】
投与は、投与対象者によって為されても良いし、または別の人、例えば、別の介護者によって為されても良い。介護者は、ヒトを介護することに関与する任意の存在であってよく：例えば、病院、ホスピス、医院、外来診察室；医師、看護師、もしくは他の実務者などの医療従事者；または配偶者もしくは保護者（例えば、親）などである。投薬は、計測された用量で、または計量された用量を送達するディスペンサで供給可能である。
【０４９１】
対象を、浮腫または脳内出血などの治療に対する反応についてモニタすることが可能である。例えば、患者をＭＲＩによって、例えば、注射後毎日または毎週、または注射後定期的な時間間隔でモニタすることが可能である。
【０４９２】
対象を、疾患の症状の改善または安定化についてモニタすることも可能である。このようなモニタリングは、例えば、経時的な臨床評価（例えば、統合パーキンソン病評価尺度を使用して）、または機能的神経画像化によって達成可能である。モニタリングはまた、未治療の対象から収集した規準データに対して治療した対象を比較する、線条体ドーパミン作動性機能の経時的な定量的計測値（例えば、フルオロドーパおよびポジトロン放出断層撮影）を含み得る。別の成果尺度には、生存ならびに緩和治療および診療所への入所なしでの生存を含み得る。治療した対象および未治療の対象についてのこれらの計測値および成果における統計学的に有意な違いは、治療効力の証拠である。
【０４９３】
神経系細胞内への取り込み強化のために親油性部分に結合されたｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物は、ＨＤなどの神経障害を有するかまたは発症するリスクがあると診断された任意の患者に投与可能である。１つの実施形態において、患者は神経障害を有すると診断され、その患者は他の点では概して良好な健康状態にある。例えば、この患者は末期症状にはなく、かつこの患者は診断後少なくとも２年、３年、５年、または１０年またはそれ以上生存すると思われる。この患者は診断後すぐに治療されてもよいし、または患者がより消耗性の症状（例えば、ＰＤ患者における動揺性動作障害および運動障害）を経験するまで治療を遅延してもよい。別の実施形態において、患者は疾患の重症な段階に達しておらず、例えば、患者は、ホーン（Ｈｏｅｈｎ）およびヤール（Ｙａｈｒ）のＰＤの段階５に達していない（ホーン（Ｈｏｅｈｎ）およびヤール（Ｙａｈｒ）、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  第１７巻、４２７〜４４２ページ、１９６７年）。一般的に、親油性部分に結合されたｉＲＮＡ剤は、任意の適切な方法によって投与可能である。本明細書において使用される場合、局所送達とは、身体の任意の表面（眼、粘膜、体腔の表面、または任意の内部表面など
）へのｉＲＮＡ剤の直接的施用を指すことが可能である。局所投与のための製剤には、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点眼剤、スプレー、およびリキッド剤が含まれうる。従来の薬学的担体、水性、粉末、または油性の基剤、増粘剤などが必要であるか、または望ましい場合がある。局所投与は、対象の表皮もしくは真皮、または表皮もしくは真皮の特定の層、または下層組織にｉＲＮＡ剤を選択的に送達するための手段としても使用可能である。
【０４９４】
クモ膜下腔内投与または脳（心）室内（例えば、脳室内）投与のための組成物は滅菌水性溶液を含んでもよく、該水性溶液はさらに緩衝剤、希釈剤、および他の適切な添加剤を含んでもよい。クモ膜下腔内投与または脳（心）室内投与のための組成物は、ｉＲＮＡ剤に取り付けられた親油性部分以外にトランスフェクション試薬または追加の親油性部分を含まないことが好ましい。
【０４９５】
非経口投与のための製剤は滅菌水性溶液を含んでもよく、該水性溶液はさらに緩衝剤、希釈剤、および他の適切な添加物を含んでもよい。脳室内注射は、例えばリザーバに連結された脳室内カテーテルによって容易に実施可能である。静脈内で使用するためには、溶質の総濃度を調節して、調製物を等張にするべきである。
【０４９６】
神経系細胞内への取り込み強化のために親油性部分に結合されたｉＲＮＡ剤は、肺送達によって対象に投与されてもよい。肺送達組成物は、患者が分散物を吸入することによって、分散物中の組成物、好ましくはｉＲＮＡが肺に到達可能となり、肺において肺胞領域を介して血液循環中に直接容易に吸収されうるように送達することができる。肺送達は、全身への送達、および肺の疾患を治療するための局所送達のいずれにおいても有効であり得る。１つの実施形態において、肺送達によって投与されるｉＲＮＡ剤は、血液脳関門を通過可能であるように修飾されている。
【０４９７】
肺送達は、霧状、エアロゾル状、ミセル状、および乾燥粉末状の製剤の使用など、種々の手法によって達成可能である。送達は、液体噴霧器、エアロゾル系の吸入器、および乾燥粉末分散物用デバイスを用いて達成可能である。計量式デバイスが好ましい。アトマイザまたは吸入器を使用する利点の１つは、デバイスが内蔵型であるために夾雑物混入の可能性が最小化される可能性があることである。乾燥粉末分散物用デバイスは、例えば、乾燥粉末として容易に製剤化可能な薬物を送達する。ｉＲＮＡ組成物は、単独または適切な粉末担体と組み合わせて凍結乾燥粉末もしくは噴霧乾燥粉末として安定に保存可能である。吸入用組成物の送達は投薬調節要素を介して行うことも可能であり、該投薬調節要素には、デバイスに組み込まれたときに、エアロゾル医薬の投与時における用量の追跡、服薬の監視、および／または患者への投薬開始を可能にする、タイマー、用量計測器、時間計測デバイス、または時間表示器が含まれ得る。
【０４９８】
用語「治療有効量」は、治療される対象において期待の生理学的応答を生じさせる所望の薬物レベルを提供するために必要な、組成物中に存在する量である。
用語「生理学的有効量」は、所望の緩和効果または治癒効果を与えるために対象に送達される量である。
【０４９９】
用語「薬学的に許容可能な担体」とは、その担体が、肺に対して有意な毒性副作用を伴わずに肺に取り込まれ得ることを意味する。
担体として有用である医薬賦形剤の種類には、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの安定剤、糖質、アミノ酸、およびポリペプチドなどの充填剤；ｐＨ調整剤または緩衝剤；塩化ナトリウムなどの塩；その他が含まれる。これらの担体は、結晶型でもアモルファス型でもよく、またはこの２つの混合物であってもよい。
【０５００】
特に有用な充填剤には、共用可能な糖質、ポリペプチド、アミノ酸、またはそれらの組み合わせが含まれる。適切な糖質には、ガラクトース、Ｄ−マンノース、ソルボースなどの単糖；ラクトース、トレハロースなどの二糖；２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなどのシクロデキストリン；およびラフィノース、マルトデキストリン、デキストランなどの多糖；マンニトール、キシリトールなどのアルジトールが含まれる。好ましい糖質の群には、ラクトース、トレハロース、ラフィノース、マルトデキストリン、およびマンニトールが含まれる。適切なポリペプチドにはアスパルテームが含まれる。アミノ酸には、アラニンおよびグリシンが含まれ、グリシンが好ましい。
【０５０１】
適切なｐＨ調整剤または緩衝剤には、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウムなどの有機酸および有機塩基から調製した有機塩が含まれ；クエン酸ナトリウムが好ましい。
【０５０２】
神経系細胞内への取り込み強化のために親油性部分に結合されたｉＲＮＡ剤は、経口および経鼻送達によって投与可能である。例えば、これらの膜を通して投与される薬物は、作用開始が迅速であり、治療的な血漿レベルを提供し、肝代謝の初回通過効果を回避し、かつ敵対的な胃腸（ＧＩ）環境に対する薬物の曝露を回避する。さらなる利点には、薬物が容易に適用、局在化、および除去されうるように膜部位へ接近しやすいことが含まれる。１つの実施形態において、経口または経鼻送達によって投与されるｉＲＮＡ剤は、血液脳関門を通過可能であるように修飾されている。
【０５０３】
１つの実施形態において、ｉＲＮＡを含む組成物の単位用量または計測された用量が、移植されたデバイスによって投薬される。このデバイスは、対象の体内のパラメータをモニタするセンサを含み得る。例えば、このデバイスは、浸透圧ポンプなどのポンプ、および任意選択で関連する電子部品を備え得る。
【０５０４】
ｉＲＮＡ剤は、ウイルスの天然のカプシドにパッケージングされてもよいし、化学的もしくは酵素的に作製された人工のカプシドまたはそこから誘導される構造物にパッケージングされてもよい。
【０５０５】
投薬量：  神経系細胞内への取り込み強化のために修飾されたｉＲＮＡ剤は、体重１ｋｇ当たり約１．４ｍｇ未満の単位用量、または体重１ｋｇ当たり１０、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、もしくは０．００００１ｍｇ未満の単位用量で投与可能であり、体重１ｋｇ当たり２００ナノモル未満（例えば、約４．４×１０１６コピー）のＲＮＡ剤、または体重１ｋｇ当たり１５００、７５０、３００、１５０、７５、１５、７．５、１．５、０．７５、０．１５、０．０７５、０．０１５、０．００７５、０．００１５、０．０００７５、０．０００１５ナノモル未満のＲＮＡ剤の単位用量で投与可能である。この単位用量を、例えば、注射（例えば、静脈内注射もしくは筋肉内注射、クモ膜下腔内注射、または脳への直接的な注射）、吸入投薬、または局所的施用によって投与可能である。特に好ましい投薬量は、体重１ｋｇあたり２、１、または０．１ｍｇ未満である。
【０５０６】
器官への直接的な（例えば、脳への直接的な）ｉＲＮＡ剤の送達は、器官当たり約０．００００１ｍｇ〜約３ｍｇ、または好ましくは器官当たり約０．０００１〜０．００１ｍｇ、器官当たり約０．０３〜３．０ｍｇ、眼当たり約０．１〜３．０ｍｇ、または器官当たり約０．３〜３．０ｍｇのオーダーの投薬量であり得る。
【０５０７】
投薬量は、神経疾患または神経障害、例えばＨＤを治療または予防するために有効な量であり得る。
１つの実施形態において、単位用量は、１日に１回未満の頻度で、例えば、２日毎、４
日毎、８日毎、または３０日毎に１回未満の頻度で投与される。別の実施形態において、単位用量は、一定の頻度で投与されない（例えば、定期的な投与頻度ではない）。例えば、単位用量が単回投与されてもよい。
【０５０８】
１つの実施形態において、有効用量が他の従来の治療様式と一緒に投与される。１つの実施形態において、対象はＰＤを有し、該治療様式はｉＲＮＡ剤以外、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤またはｓＲＮＡ剤以外の治療剤である。この治療様式は、例えば、レバドパまたはデプロニルであり得る。
【０５０９】
１つの実施形態において、対象に、初回用量および１回以上の維持用量のｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えば、プロセシングされてｓＲＮＡ剤になる大きなｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤（例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓＲＮＡ剤、またはそれらの前駆体）をコードするＤＮＡ）が投与される。維持用量は、一般的に初回用量よりも少なく、例えば、初回用量の半分である。維持投薬計画は、１日につき体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ〜１．４ｍｇの範囲、例えば、１日につき体重１ｋｇ当たり１０、１、０．１、０．０１、０．００１、または０．００００１ｍｇの用量で対象を治療することを包含し得る。維持用量は、５日、１０日、または３０日毎に１回以下投与されることが好ましい。さらに、治療計画の継続期間は、特定の疾患の性質、その重症度、および患者の全身状態に依存して変化しうる。好ましい実施形態において、投薬量は、１日に１回以下、例えば、２４時間、３６時間、４８時間、またはそれ以上の時間当たりで１回以下、例えば、５日毎または８日毎に１回以下送達されうる。治療後、患者の状態の変化について、および疾患状態の症状の緩和について患者をモニタしてもよい。化合物の投薬量は、患者が現在の投薬量レベルに対して有意に応答しない場合には増加してもよいし、疾患状態の症状の緩和が観察される場合、疾患状態が除去された場合、もしくは望ましくない副作用が観察される場合には用量を減少してもよい。
【０５１０】
有効用量は、特定の状況下で所望されるかまたは適切と考えられるように、単回投与または２回以上の投与として投与可能である。反復または頻繁な注入を容易にすることが所望される場合、送達デバイス（例えば、ポンプ、半永久ステント（例えば、静脈内、腹腔内、槽内、または嚢内））、またはリザーバの移植が推奨されることがある。
【０５１１】
１つの実施形態において、ｉＲＮＡ剤の医薬組成物は、複数種のｉＲＮＡ剤を含む。別の実施形態において、複数種の該ｉＲＮＡ剤の配列は、天然に存在する標的配列に関して別の種類のｉＲＮＡ剤と重複せず、かつ隣接しない。別の実施形態において、複数種のｉＲＮＡ剤は、天然に存在する異なる標的遺伝子に特異的である。別の実施形態において、ｉＲＮＡは対立遺伝子特異的である。
【０５１２】
治療に成功した後、疾患状態の再発を予防するために、患者に維持治療を受けさせることが望ましいことがある。該維持治療において、本発明の化合物は、体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ〜１００ｇの範囲の維持用量で投与される（米国特許第６，１０７，０９４号明細書を参照のこと）。
【０５１３】
ｉＲＮＡ剤組成物の濃度は、障害の治療もしくは予防に有効であるために十分な量、またはヒトにおける生理学的状態を調節するために十分な量である。投与されるｉＲＮＡ剤の濃度または量は、同剤について測定されるパラメータ、および投与方法（例えば、鼻、口腔、または肺）に依存する。例えば、点鼻用製剤は、鼻腔の刺激および炎症を回避するために、一部の成分を非常に低濃度とする必要がある傾向を有する。適切な点鼻用製剤を提供するために、経口製剤を１０〜１００倍まで希釈することが望ましい場合がある。
【０５１４】
疾患または障害の重症度、以前の治療、対象の全体的な健康状態および／または年齢、
ならびに存在する他の疾患など（これらに限定されない）の特定の要因は、対象を有効に治療するために必要な投薬量に影響を与える可能性がある。さらに、治療有効量のｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えば、プロセシングされてｓＲＮＡ剤となりうる大きなｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤（例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓＲＮＡ剤、またはそれらの前駆体）をコードするＤＮＡ）を用いる対象の治療は、単回の治療を含んでもよいし、好ましくは、一連の治療を含んでもよい。当然のことながら、治療のために使用されるｉＲＮＡ剤（例えば、ｓＲＮＡ剤）の有効投薬量が特定の治療の過程にわたって増加または減少されてもよい。投薬量の変化は、本明細書に記載されるような診断アッセイの結果に起因することもあり、かつ該結果から明らかとなることもある。例えば、ｉＲＮＡ剤組成物の投与後に対象をモニタ可能である。モニタリングからの情報に基づいて、追加量のｉＲＮＡ剤組成物を投与することができる。
【０５１５】
投薬は、治療される疾患状態の重症度および応答性に依存し、治療の期間は数日から数カ月まで続くか、または治癒がもたらされるまで、もしくは疾患状態の減少が達成されるまでである。最適な投薬スケジュールは、患者の身体における薬物の蓄積の計測から計算可能である。当業者は、最適な投薬量、投薬方法論、および反復の程度を容易に決定可能である。最適投薬量は、個々の化合物の相対的効力に依存して変化しうるものであり、一般的には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの動物モデルにおいて有効であることが見出されたＥＣ５０に基づいて推定することができる。一部の実施形態において、動物モデルは、ヒト遺伝子（例えば、標的ＲＮＡ（例えば、神経系細胞で発現されるＲＮＡ）を産生する遺伝子）を発現するトランスジェニック動物を含む。トランスジェニック動物は、対応する内在性ＲＮＡが欠損していてもよい。別の実施形態において、試験のための組成物は、動物モデル中の標的ＲＮＡとヒト中の標的ＲＮＡとの間で保存されている配列に対して、少なくとも内側領域において相補的であるｉＲＮＡ剤を含む。
【０５１６】
キット：  特定の他の態様において、本発明は、ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えば、プロセシングされてｓＲＮＡ剤になりうる大きなｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤（例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓＲＮＡ剤、またはそれらの前駆体）をコードするＤＮＡ）の医薬製剤を含む適切な容器を含むキットを提供する。特定の実施形態において、医薬製剤の個々の成分は１つの容器中で提供され得る。別例として、医薬製剤の成分を２つ以上の容器中で別々に提供する、例えば、１つの容器はｉＲＮＡ剤調製物用とし、少なくとももう１つの容器は担体化合物用とすることが望ましい場合もある。キットは、多数の異なる構成（例えば、単一の箱の中に１つまたは複数の容器など）としてパッケージすることが可能である。異なる成分を、例えば、キットとともに提供される指示書に従って組み合わせることが可能である。成分を、例えば医薬組成物を調製および投与するために、本明細書に記載の方法に従って組み合わせることが可能である。キットが送達デバイスを含むこともできる。
【０５１７】
本発明を以下の実施例によってさらに例証するが、実施例はさらなる限定と解釈されるべきではない。
【実施例１】
【０５１８】
コレステロールが結合したｓｉＲＮＡは線条体の一次ニューロンに取り込まれる。
線条体の一次ニューロンを、妊娠１５．５日のマウス胎児組織から単離した。この単離細胞を、ＮｅｕｒｏＢａｓａｌ（ＴＭ）培地（Ｇｉｂｃｏ）で７日間培養した。ＧＦＰを標的とする、コレステロールおよびＣｙ３と結合されたｓｉＲＮＡ（Ｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３と呼ぶ）のＰＢＳ溶液を、マウスから単離された線条体の一次ニューロン培養物に導入した（終濃度＝５０ｎＭ）。細胞をＣｈｏｌ−ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３とともに６〜１２時間培養し、次に培地を交換して細胞内に取り込まれなかったあらゆるＣｈｏｌ−ｓ
ｉＲＮＡ−Ｃｙ３を洗い流した。トランスフェクション試薬は使用しなかった。ほぼすべての一次ニューロンが、ニューロンの細胞質にＣｈｏｌ−ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３を含んでいることが観察された。ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３（コレステロールの結合なし）は、一次ニューロンが同じ条件下で培養された時、コレステロールが結合したｓｉＲＮＡよりも非常に少ない程度までしか一次ニューロンに取り込まれないことが見出された。
【実施例２】
【０５１９】
コレステロールが結合したｓｉＲＮＡをｉｎ  ｖｉｖｏでニューロンに投与した。
ＧＦＰを標的とするＣｈｏｌ−ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３を、単回の直接注射により、ならびにＡｌｚｅｔ（Ｒ）ポンプ（米国カリフォルニア州クパチーノ所在のデュレクト株式会社（ＤＵＲＥＣＴ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））によって７日間にわたり、マウス線条体中に投与した。直接注射にはＰＢＳ中５０μＭ溶液１μｌを含め、Ａｌｚｅｔポンプは１日当たり１μｌ中５０μＭを送達するものとした。Ｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡを、高用量の非結合型ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３と、同じ投薬量で比較した。蛍光顕微鏡法によって、いずれのｓｉＲＮＡセットも多くの脳細胞に入ることが見出された。観察の結果、Ｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３は、Ａｌｚｅｔポンプによる投与において非結合型ｓｉＲＮＡよりも細胞に入る頻度が高かった。Ｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３の直接注射では１週間後にＣｙ３  ｓｉＲＮＡの存在が示されたが、非結合型ｓｉＲＮＡの直接注射では１週間後にＣｙ３標識はほとんど示されなかった。
【０５２０】
別の実験では、ＰＢＳ中５０μＭのＣｈｏｌ−ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３（２μｌ）を、マウスの線条体に注射した。３日後、マウスを潅流し、ＤＡＲＲＰ３２の免疫蛍光分析（ＦＩＴＣ）のために線条体の切片を調製した。ＤＡＲＲＰ３２は、中型有棘ニューロン（ハンチントン病で影響を受けるニューロンのタイプ）のマーカーとしての役割を果たす。データから、試験に用いた体積のＣｈｏｌ−ｓｉＲＮＡが線条体の範囲の至る所に広がり、中型有棘ニューロン内に入ることが示された。切片を６０×油浸で観察し、Ｃｙ３標識がニューロンの表面ではなく内部に存在することを確認した。３つの線条体領域それぞれの切片について計数した（全部で１１１３個の細胞）。各々の線条体領域の細胞の９８％において、ＦＩＴＣ（ＤＡＲＲＰ３２）およびＣｙ３（Ｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡ）が共局在化していた。これらの試験的研究は、修飾ｓｉＲＮＡが脳に送達され、ニューロンに入ることができることを支持している。
【０５２１】
コレステロールが結合したｓｉＲＮＡ（以下、コレステロール結合ｓｉＲＮＡとする）がｉｎ  ｖｉｖｏで線条体の細胞に対し有毒かどうかを調べるために、細胞を、アポトーシス細胞死のマーカーであるｆｌｕｏｒｏｊａｄｅ（Ｒ）で染色した。Ｆｌｕｏｒｏｊａｄｅ染色は注射部位に沿って観察されたが、周囲の細胞中には観察されなかった。陽性対照実験では、ｆｌｕｏｒｏｊａｄｅ染色は、ＮＭＤＡ受容体アゴニストであるキノリン酸（ニューロンの細胞死を引き起こすことが知られている）の注入後にｉｎ  ｖｉｖｏで線条体の細胞において観察された。これらの実験から、Ｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡがｉｎ  ｖｉｖｏで線条体の細胞に対し有毒ではないことが示された。
【実施例３】
【０５２２】
ＧＦＰの発現は、ＧＦＰ−ｈｔｔで安定的にトランスフェクションされたＰＣ１２細胞中で阻害された。
ＧＦＰを標的とするＣｈｏｌ−ｓｉＲＮＡがＧＦＰの発現をノックダウンできるかどうかを試験し、さらにこのＲＮＡｉ活性の期間も調べた。ＧＦＰに対するＣｈｏｌ−ｓｉＲＮＡ（終濃度５０ｎＭ）を、１００‐Ｑの増幅を有するヒトｍｕｔ−ｈｔｔに融合させたＧＦＰで安定的にトランスフェクションされたＰＣ１２細胞に加えた（チン（Ｑｉｎ）ら、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．、１２：３２３１−４４、２００３年、電子版２００３年１０月２１日）。プロナステロン（ｐｒｏｎａｓｔｅｒｏｎｅ）で処理すると、プロモ
ータによるＧＦＰ−ｈｔｔタンパク質の発現は増大するが、安定的にトランスフェクションされた細胞におけるＧＦＰの蛍光は著しく縮小する。対照のプロナステロン処理されたＰＣ１２培養物を、ルシフェラーゼを標的とするＣｈｏｌ−ｓｉＲＮＡのＰＢＳ溶液（終濃度＝１００ｎＭ）で処理し；試験用のプロナステロン処理されたＰＣ１２細胞培養物を、ＧＦＰを標的とするＣｈｏｌ−ｓｉＲＮＡ（終末濃度１００ｎＭ）で処理した。トランスフェクション試薬は使用しなかった。Ｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡを培地中に６〜１２時間維持した後、培地を交換し、したがって細胞内に取り込まれなかったＣｈｏｌ−ｓｉＲＮＡを洗い流した。細胞の蛍光に対する影響を評価するために、１週間後に撮像した。ＧＦＰの蛍光は、ルシフェラーゼを標的とするＣｈｏｌ−ｓｉＲＮＡで処理された細胞中よりも、ＧＦＰを標的とするＣｈｏｌ−ｓｉＲＮＡで処理された細胞においてはるかに大きく減少した。
【実施例４】
【０５２３】
ｓｉＲＮＡはハンチンチンにより引き起こされるニューロンの機能不全を防止する。
Ｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡが脳細胞に入って標的遺伝子の発現をノックダウンすることができるという証拠（上記参照）から、１００‐Ｑの増幅を有するヒトｍｕｔ−ｈｔｔに対してＣｈｏｌ−ｓｉＲＮＡをｉｎ  ｖｉｖｏで試験した。ハンチントン病のマウスモデルでは、レンチウイルス−ｍｕｔ−ｈｔｔ（１μｌ、１×１０１０個の粒子）を導入すると、５日後にクラスピングが生じる。本発明者らは４匹のマウスの皮質および線条体にレンチウイルス−ｍｕｔ−ｈｔｔを注射した。マウスのうち２匹については、ｈｔｔ  ｍＲＮＡに対するＣｈｏｌ−ｓｉＲＮＡを同時に注射した。１匹のマウスについては、ルシフェラーゼを標的とするＣｈｏｌ−ｓｉＲＮＡを同時に注射し、別のマウスについてはビヒクルを同時に注射した。ｈｔｔに対するＣｈｏｌ−ｓｉＲＮＡを注射された２匹のマウスは、７日目においてクラスピングを示さなかった。対照のマウスは予想通りにクラスピングを起こした。結果を表８に示す。
【０５２４】
【表８】
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【実施例５】
【０５２５】
レンチウイルス−ｍｕｔ−ｈｔｔで処理されたマウスではハンチントン病の特徴が見い出される。
マウスは、片側の線条体にレンチウイルス−ｍｕｔ−ｈｔｔを投与した後７か月の間クラスピングを示し続ける。他の点では、マウスは予想通りの成長と動きを示した。更に、レンチウイルス−ＷＴ−ｈｔｔ（ＣＡＧリピートは１８個）で処理したマウスは、注射後３週までとした実験計画書の期間ではクラスピングの証拠を示していない。図１Ａ‐１Ｄ
の像は、レンチウイルス−ｍｕｔ−ｈｔｔを注射した７か月後のマウスの線条体から得たものである。免疫組織化学分析のために、組織をハンチンチンのＮ末端に対する抗血清（Ａｂ１）で処理した。顕著な表現型としては、成人発病のヒトＨＤで見い出だされるのに似た核封入体（矢じり表示）および異栄養神経突起（矢印表示）がある（ディフィリア（ＤｉＦｉｇｌｉａ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７７：１９９０−３、１９９７年を参照）。レンチウイルスモデルの使用は、ｓｉＲＮＡの同時注射とともに使用するのに便利である。同時注射により、トランスジェニックマウスのモデルにおけるｓｉＲＮＡの送達を複雑にする可能性のある時間的および空間的不具合を低減することが可能である。
【実施例６】
【０５２６】
ハンチンチンを標的とするｓｉＲＮＡの線条体内への単回投与により、ハンチントン病のマウスモデルにおける神経病理が低減する。
ハンチンチンを標的とするｓｉＲＮＡの作用を、ハンチントン病のＡＡＶマウスモデルで評価した。このハンチントン病マウスモデルでは、１００個のＣＡＧリピートからなるポリグルタミン増幅を有する変異型ヒトハンチンチン遺伝子の一部を、ウイルス（ＡＡＶ）送達によって脳内に導入する。０．５ナノモル（７．５ｕｇ）のｓｉＲＮＡの線条体内への単回注射を施した場合、ハンチンチンを標的とするコレステロール結合ｓｉＲＮＡであるＡＬ−ＤＰ−１７９９（Ｅ１−４）は、ルシフェラーゼを標的とする非生理的なｓｉＲＮＡであるＡＬ−ＤＰ−１９５６と比較して、線条体（図２，３）および皮質（図３Ａ）における封入体の大きさを縮小し、線条体におけるニューロピル凝集体を縮小した（図３Ｂ）。さらに、線条体中のハンチンチン免疫反応性の細胞の数は著しく増加し、これは線条体へのＡＬ−ＤＰ−１７９９の単回注射後における線条体ニューロンの存続の増大と一致していた（図３）。
【０５２７】
成体雌のＳＪＬ／Ｂ６マウス（６月齢）に、力価１．１×１０１３ユニットのＡＡＶ−ｈｔｔ−１００Ｑ（３ｕＬ）を、０．５ナノモル（７．５ｕｇ）のｓｉＲＮＡと一緒に注射した。ＡＡＶ−ｈｔｔ−１００Ｑは、アミノ酸１〜４００をコードするヒトハンチンチン遺伝子の一部を１００個のＣＡＧリピート（１００Ｑ）とともに送達するためにＡＡＶ血清型８を含むものとした。試験するｓｉＲＮＡは、ハンチンチンを標的とするコレステロール結合ｓｉＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−１７９９、下記）あるいはルシフェラーゼを標的とする無関係のコレステロール結合ｓｉＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−１９５６）のいずれかとした。各マウスについて、０．５ｕＬの１ｍＭ  ｓｉＲＮＡを線条体の片側に１００ｎＬ／分の速度で注射した。注射の座標は、ＡＰ＋１．０ｍｍ、外側＋１．８ｍｍ、腹側２．３ｍｍとした。免疫組織化学分析については、マウスをｓｉＲＮＡ注射の１４日後に屠殺し、４％のパラホルムアルデヒドで心臓潅流した。脳を摘出し、３０〜４０μｍ厚のビブラトーム凍結切片を切り出した。ヒトおよびマウスのハンチンチンの両方を認識するハンチンチンに対する一次抗体（Ａｂ１）を、以前に記述されているようにして作製した（ディフィリア  Ｍ（ＤｉＦｉｇｌｉａ  Ｍ）、サップ  Ｅ（Ｓａｐｐ  Ｅ）、チェイス  Ｋ（Ｃｈａｓｅ  Ｋ）、シュワルツ  Ｃ（Ｓｃｈｗａｒｚ  Ｃ）、メローニ  Ａ（Ｍｅｌｏｎｉ
Ａ）、ヤング  Ｃ（Ｙｏｕｎｇ  Ｃ）、マーティン  Ｅ（Ｍａｒｔｉｎ  Ｅ）、ボンサッテル  Ｊ−Ｐ（Ｖｏｎｓａｔｔｅｌ  Ｊ−Ｐ）、キャラウェイ  Ｒ（Ｃａｒｒａｗａｙ
Ｒ）、リーブス  ＳＡ（Ｒｅｅｖｅｓ  ＳＡ）、ボイス  ＦＭ（Ｂｏｙｃｅ  ＦＭ）、キャラウェイ  Ｒ（Ｃａｒｒａｗａｙ  Ｒ）およびアロニン  Ｎ（Ａｒｏｎｉｎ  Ｎ）、「Huntingtin is a cytoplasmic protein associated with vesicles in human and rat brain neurons.」、Ｎｅｕｒｏｎ  １４：１０７５−１０８１、１９９５年；アロニン  Ｎ（Ａｒｏｎｉｎ  Ｎ）、チェイス  Ｋ（Ｃｈａｓｅ  Ｋ）、ヤング  Ｃ（Ｙｏｕｎｇ  Ｃ）、サップ  Ｅ（Ｓａｐｐ  Ｅ）、シュワルツ  Ｃ（Ｓｃｈｗａｒｚ  Ｃ）、マッタ  Ｎ（Ｍａｔｔａ  Ｎ）、コルンライヒ  Ｒ（Ｋｏｒｎｒｅｉｃｈ  Ｒ）、シース  Ａ（Ｓｈｅｔｈ  Ａ）、ランドベールマイヤー  Ｂ（Ｌａｎｄｗｅｈｒｍｅｙｅｒ  Ｂ）、バード  Ｅ（Ｂｉｒｄ  Ｅ）、ボンサッテル  Ｊ−Ｐ（Ｖｏｎｓａｔｔｅｌ  Ｊ−Ｐ）、スミ
ス  Ｔ（Ｓｍｉｔｈ  Ｔ）、キャラウェイ  Ｒ（Ｃａｒｒａｗａｙ  Ｒ）、ボイス  ＦＭ（Ｂｏｙｃｅ  ＦＭ）、ビール  ＭＦ（Ｂｅａｌ  ＭＦ）、ヤング  ＡＢ（Ｙｏｕｎｇ  ＡＢ）、ペニー  ＪＢ（Ｐｅｎｎｅｙ  ＪＢ）およびディフィリア  Ｍ（ＤｉＦｉｇｌｉａ  Ｍ）、「CAG expansion affects the expression of mutant huntingtin in the Huntington' s disease brain.」、Ｎｅｕｒｏｎ  １５：１１９３−１２０１、１９９５年
）。免疫吸着させた抗血清Ａｂ１は、１μｇ／ｍｌの濃度で使用した。二次抗体はヤギ抗ウサギ抗体（米国カリフォルニア州所在のベクターラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））とし、１：１０，０００で使用した。ＤＡＢの組織学的処理については、キットを使用した（米国イリノイ州所在のピアスラボラトリ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。
【０５２８】
【化７７】
2009504782.tif 000089
ＡＡＶ−ｈｔｔ−１００Ｑを注射されたマウスは、注射されたのがルシフェラーゼを標的とするコレステロール結合ｓｉＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−１９５６；図２Ａ）であるか、あるいはハンチンチンを標的とするコレステロール結合ｓｉＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−１７９９；図２Ｄ）であるかにかかわらず、同側の線条体および皮質にハンチンチン免疫反応性を示した。しかしながら、ＡＡＶ−ｈｔｔ−１００Ｑを注射されたマウスにおけるハンチンチンに関する細胞内染色の様子は、封入体の大きさが、ＡＬ−ＤＰ−１９５６（ルシフェラーゼを標的とするコレステロール結合ｓｉＲＮＡ、図２Ｃ）で処理されたマウスの同側の線条体よりもＡＬ−ＤＰ−１７９９（ハンチンチンを標的とするコレステロール結合ｓｉＲＮＡ、図２Ｆ）で処理されたマウスの同側の線条体においてより小さく見えるという点で、明白に異なっていた。反対側の線条体は、ＡＡＶ−ｈｔｔ−１００Ｑを注射されたマウスにおいて、該マウスがルシフェラーゼを標的とするコレステロール結合ｓｉＲＮＡを注射されたか（ＡＬ−ＤＰ−１９５６；図２Ｂ）あるいはハンチンチンを標的とするコレステロール結合ｓｉＲＮＡを注射されたか（ＡＬ−ＤＰ−１７９９；図２Ｅ）にかかわらず、ハンチンチンに関し弱い染色を示した。ＡＬ−ＤＰ−１９５６で処理されたマウス（ｎ＝８）およびＡＬ−ＤＰ−１７９９で処理されたマウス（ｎ＝８）において、同側の線条体および皮質における封入体の大きさを定量すると（マウス１匹当たり７０〜１００個の封入体を計測）、封入体の大きさは、ＡＬ−ＤＰ−１９５６で処理されたマウスに比べてＡＬ−ＤＰ−１７９９で処理されたマウスで著しく（ｐ＜０．０２）縮小していた。同側の皮質および線条体に関する封入体の大きさのメジアンを図３Ａに散布図として示す。したがって、ハンチンチンを標的とするコレステロール結合ｓｉＲＮＡの線条体への単回注射は、線条体および皮質の病理を低減し、ハンチントン病の有効治療の提供への新たなアプローチを表わしている。
【０５２９】
さらに、同じマウスを線条体におけるニューロピル凝集体について評価すると（図３Ｂ）、ＡＡＶ−ｈｔｔ−１００ＱおよびＡＬ−ＤＰ−１７９９（ハンチンチンを標的とするコレステロール結合ｓｉＲＮＡ）を注射されたマウスは、ＡＡＶ−ｈｔｔ−１００ＱおよびＡＬ−ＤＰ−１９５６（ルシフェラーゼを標的とするコレステロール結合ｓｉＲＮＡ）
を注射されたマウスと比較してニューロピル凝集体の数のおよそ３分の２が低減されていた（ｐ＜０．０２）。ニューロピル凝集体の総数を、マウス１匹当たり６つの切片を使用して２５００ｕｍ２の面積について計測した。これらのデータは、ハンチンチンを標的とするコレステロール結合ｓｉＲＮＡの線条体への単回注射の結果、神経病理が減少し、かつ該注射がハンチントン病の有効治療の提供への新たなアプローチを表わすという、さらなる証拠を提供するものである。
【０５３０】
ハンチンチン免疫反応性の細胞の数を、ＡＡＶ−ｈｔｔ−１００ＱおよびＡＬ−ＤＰ−１７９９（ハンチンチンを標的とするコレステロール結合ｓｉＲＮＡ、「Ｈｔｔ」）を注射された８匹のマウス、ならびにＡＡＶ−ｈｔｔ−１００ＱおよびＡＬ−ＤＰ−１９５６（ルシフェラーゼを標的とするコレステロール結合ｓｉＲＮＡ、「ｌｕｃ」）を注射された８匹のマウスの、皮質および線条体についてスコア化した。線条体（図４）では、統計的に有意な増加（ｐ＜０．００１）が見出されたのは、ＡＬ−ＤＰ−１７９９（ハンチンチンを標的とするコレステロール結合ｓｉＲＮＡ）で処理されたマウスにおける面積２５００ｕｍ２あたりのハンチンチン免疫反応性の細胞総数の平均数を、ＡＬ−ＤＰ−１９５６（ルシフェラーゼを標的とするコレステロール結合ｓｉＲＮＡ）で処理されたマウスと比較した場合であった。皮質（図４）では、ＡＬ−ＤＰ−１７９９（ハンチンチンを標的とするコレステロール結合ｓｉＲＮＡ）で処理されたマウスにおける面積２５００ｕｍ２あたりのハンチンチン免疫反応性の細胞総数の平均数が、ＡＬ−ＤＰ−１９５６（ルシフェラーゼを標的とするコレステロール結合ｓｉＲＮＡ）で処理されたマウスと比較して増加する傾向があった。核封入体および細胞質内凝集体を有する細胞（「＋ｉｎｃ／＋ｃｙｔｏ」）を、核封入体を有するが細胞質内凝集体を含まない細胞（「＋ｉｎｃ／−ｃｙｔｏ」）とは別々にスコア化した場合、線条体において、核封入体および細胞質内凝集体を有する細胞の数が統計的に有意に増加していた（ｐ＜０．００１）。この結果に関する１つの説明は、ＡＡＶ−ｈｔｔ−１００Ｑを注射され、かつＡＬ−ＤＰ−１７９９（ハンチンチンを標的とするコレステロール結合ｓｉＲＮＡ）で処理されたマウスではより多くの線条体ニューロンが生き残っているということである。これらのデータは、ハンチンチンを標的とするコレステロール結合ｓｉＲＮＡの線条体への単回注射の結果として線条体ニューロンが保護されること、ならびに該注射がハンチントン病の有効治療の提供への新たなアプローチを表わしていることを示唆するものである。
【実施例７】
【０５３１】
ハンチンチンを標的とするｓｉＲＮＡの線条体への単回投与は、ハンチントン病のマウスモデルにおける異常なクラスピング行動を低減する。
ハンチンチンを標的とするｓｉＲＮＡの作用を、ハンチントン病のＡＡＶマウスモデルにおいて、クラスピング行動（ハンチントン病の動物モデルに特徴的な常同かつ異常行動）の評価によってさらに検討した。後で病理学的に評価される同じマウスにおいて、クラスピングを１４日間にわたり毎日のｙｅｓ／ｎｏの二択の評価としてスコア化し、次いでクラスピングが観察された日の割合（％）をマウスごとに測定した。クラスピングした日の割合（％）の平均は、ハンチンチンを標的とするコレステロール結合ｓｉＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−１７９９）で処理されたマウス（「Ｈｔｔ」、図５）では、ルシフェラーゼを標的とする非生理学的なｓｉＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−１９５６）で処理されたマウス（「Ｌｕｃ」、図５）と比較して、およそ半分（ｐ＜０．０１）が低減された。これらのデータは、ハンチンチンを標的とするコレステロール結合ｓｉＲＮＡの線条体への単回注射の結果、機能が改善し、したがって該注射はハンチントン病の有効治療の提供への新たなアプローチを表わしていることを実証するものである。
【０５３２】
その他の実施形態
本発明のいくつかの実施形態に関して説明してきた。しかしながら、本発明の思想および範囲を逸脱することなく種々の変更を施すことが可能であることは理解されよう。従っ
て、その他の実施形態は添付の特許請求の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【０５３３】
【図１】レンチウイルス−ｍｕｔ−ｈｔｔで処理されたマウスに見い出されたハンチントン病の病理学的特徴のｉｎ  ｓｉｔｕ染色像を示す図。染色はｈｔｔタンパク質に対する免疫組織化学法による。１Ａは線条体組織のｉｎ  ｓｉｔｕ染色である。１Ｂ、１Ｃおよび１Ｄは淡蒼球近くの線条体のｉｎ  ｓｉｔｕ染色である。スケールバー＝２５μｍ。
【図２】ハンチンチンを標的とするコレステロール結合ｄｓＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−１７９９）の線条体内への注射により、ハンチントン病のマウスモデルにおける細胞のハンチンチン免疫反応性パターンが変化することを示す図。
【図３】ハンチンチンを標的とするコレステロール結合ｄｓＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−１７９９）の線条体内への注射により、ハンチントン病のマウスモデルにおいて、皮質および線条体におけるハンチンチン免疫反応性の封入体の大きさが縮小し、かつニューロピル凝集体が減少することを示す図。
【図４】ハンチンチンを標的とするコレステロール結合ｄｓＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−１７９９）の線条体内への注射により、ハンチントン病のマウスモデルにおいて線条体中のハンチンチン免疫反応性の細胞数が増加することを示す図。
【図５】ハンチンチンを標的とするコレステロール結合ｄｓＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−１７９９）の線条体内への注射により、ハンチントン病のマウスモデルにおいて異常なクラスピング行動が減少することを示す図。
【図１】
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【図２】
2009504782.tif 000091
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2009504782.tif 000096
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