(57)【要約】本発明は、ＣＯＰ１分子およびＣＯＰ１活性のモジュレーターならびにその診断上の使用および治療上の使用など、これらの使用法を提供する。こうした分子は、被験体のＤＮＡ損傷の検出ならびにＤＮＡ損傷およびｐ５３活性に対する応答の調節に有用である可能性がある。さらに、本発明は、ＣＯＰ１活性を調節できる試験化合物のスクリーニングに用いる試薬およびキットも提供する。一態様では、本発明は、細胞のＣＯＰ１ポリペプチドを検出することにより、ＡＴＭポリペプチドを含む細胞のＤＮＡ損傷を検出する方法を提供し、この方法において、ＡＴＭポリペプチドによるＣＯＰ１ポリペプチドのリン酸化または対照との比較でのＣＯＰ１ポリペプチドレベルの低下からＤＮＡ損傷が示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＴＭポリペプチドを含む細胞のＤＮＡ損傷を検出する方法であって：
該細胞のＣＯＰ１ポリペプチドを検出する工程を含み、対照との比較での該ＡＴＭポリペプチドによる該ＣＯＰ１ポリペプチドのリン酸化または該ＣＯＰ１ポリペプチドの発現レベルの低下がＤＮＡ損傷を示す、
方法。
【請求項２】
前記ＡＴＭポリペプチドは、ヒトＡＴＭポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＣＯＰ１ポリペプチドは、ヒトＣＯＰ１ポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記リン酸化は、セリンのリン酸化である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＣＯＰ１ポリペプチドは、該ＣＯＰ１ポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いて検出される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体は、ヒトＣＯＰ１ポリペプチドのアミノ酸残基３７７〜４００と実質的に同一のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体は、ヒトＣＯＰ１ポリペプチドのセリン３８７と相同であるアミノ酸配列を含むペプチドを認識する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ペプチドは、ヒトＣＯＰ１ポリペプチドのセリン３８７と相同であるリン酸化可能なアミノ酸残基上でリン酸化される、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＡＴＭポリペプチドを検出する工程をさらに含み、前記ＣＯＰ１分子の該ＡＴＭ分子への結合は、ＤＮＡ損傷を示す、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ＣＯＰ１  Ｅ３−リガーゼ活性の活性化、ＣＯＰ１自己ユビキチン化の活性化、ｐ５３−ＣＯＰ１複合体の破壊、ＣＯＰ１依存性ｐ５３ユビキチン化の減少、ＣＯＰ１の細胞質−核の比率の上昇、ＣＯＰ１ポリペプチドのターンオーバーおよびＣＯＰ１ポリペプチドの分解からなる群の１つまたは複数を検出する工程をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞のｐ５３分子を検出する工程をさらに含み、対照との比較での該ｐ５３分子の発現レベルの上昇またはｐ５３活性の増強は、ＤＮＡ損傷を示す、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｐ５３分子は、ヒトｐ５３分子である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ｐ５３分子は、野生型ｐ５３分子である、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ｐ５３分子は、ｐ５３ポリペプチドである、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｐ５３ポリペプチドは、該ｐ５３ポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いて検出される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｐ５３活性は、ｐ５３依存性トランス活性化の活性化、ｐ５３誘導性アポトーシスの活性化、ｐ２１分子の活性化、ｐ２１プロモーターの誘導、ｐ２１のｍＲＮＡレベルの上昇およびＰＵＭＡプロモーターの誘導からなる群の１つまたは複数から選択される、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＤＮＡ損傷は、放射線または化合物（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）によって引き起こされる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記放射線は、電離放射線または紫外線である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記放射線は、放射線治療に由来する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記化合物（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）は、アルキル化剤または化学療法剤である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞は、ＤＮＡ損傷を有するか、またはＤＮＡ損傷の危険がある、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞は、癌細胞である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記癌細胞は、乳癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌および移行細胞癌からなる群の１つまたは複数から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記癌細胞は、癌治療を受けている被験体から取得される、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記癌治療は、ＤＮＡ損傷を引き起こすことが既知であるか、あるいは、ＤＮＡ損傷の原因になる疑いがある、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記被験体は、ヒトである、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
細胞のＤＮＡ損傷に対する応答を増強する方法であって、該細胞をＣＯＰ１ポリペプチドの分解を高める化合物に曝露する工程を含む、方法。
【請求項２８】
前記化合物は、ＡＴＭ分子を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＡＴＭ分子は、活性化されたＡＴＭポリペプチドである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記化合物は、前記ＣＯＰ１ポリペプチドのＡＴＭポリペプチドへの結合を強化するか、または、ＡＴＭポリペプチドによる該ＣＯＰ１ポリペプチドのリン酸化を増強する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
ＣＯＰ１ポリペプチドとＡＴＭポリペプチドとの相互作用を増強する方法であって、該ＣＯＰ１ポリペプチドおよび該ＡＴＭポリペプチドと、該ＣＯＰ１ポリペプチドの該ＡＴＭポリペプチドへの結合を強化する化合物とを接触させる工程を含む、方法。
【請求項３２】
前記結合は、前記ＣＯＰ１ポリペプチドの分解、ＣＯＰ１  Ｅ３−リガーゼ活性の活性化、ＣＯＰ１自己ユビキチン化の活性化、ＣＯＰ１−ｐ５３複合体の破壊、ＣＯＰ１依存性ｐ５３ユビキチン化の減少、ＣＯＰ１ポリペプチドの細胞質／核の比率の上昇およびｐ５３分子の発現レベルの上昇の１つまたは複数をもたらす、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記接触は、細胞のＤＮＡ損傷に対する応答を増強させる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞は、ＤＮＡ損傷を有するか、またはＤＮＡ損傷の危険がある、請求項２７〜３０および請求項３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞は、Ａ−Ｔ細胞である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞は、癌細胞である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
ＤＮＡ損傷に対する前記応答は、細胞アポトーシスまたはｐ５３活性化を含む、請求項２７〜３０および請求項３３〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記ｐ５３活性化は、ｐ５３依存性トランス活性化の活性化、ｐ５３誘導性アポトーシスの活性化、ｐ２１分子の活性化、ｐ２１プロモーターの誘導およびＰＵＭＡプロモーターの誘導からなる群の１つまたは複数から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＣＯＰ１ポリペプチドは、ヒトＣＯＰ１ポリペプチドである、請求項２６〜３８のいずれか１項に記載の方法
【請求項４０】
前記ＡＴＭポリペプチドは、ヒトＡＴＭポリペプチドである、請求項２８〜３９のいずれか１項に記載の方法
【請求項４１】
前記化合物は、ヒトＣＯＰ１ポリペプチドのセリン３８７と相同であるアミノ酸残基のリン酸化を増強する、請求項２７〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記化合物は、ヒトＣＯＰ１ポリペプチドのセリン３８７のリン酸化を増強する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記化合物は、ヒトＣＯＰ１ポリペプチドのセリン３８７と相同である残基を含むＣＯＰ１ポリペプチドまたはそのフラグメントを含む、請求項２７〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記化合物は、ヒトＣＯＰ１ポリペプチドのアミノ酸残基３７７〜４００と実質的に同一の配列を含むポリペプチドを含む、請求項２７〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記化合物は、リン酸化が可能であるアミノ酸残基のリン酸化を含む、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記アミノ酸残基は、ヒトＣＯＰ１ポリペプチドのセリン３８７と相同である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記化合物は、ヒトＣＯＰ１ポリペプチドのセリン３８７と相同である残基でのセリンからトレオニン、グルタミン酸塩またはアスパラギン酸塩への置換を含むＣＯＰ１ポリペプチドを含む、請求項２７〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記化合物は、ＣＯＰ１模倣体化合物を含む、請求項２７〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
ＡＴＭ分子を含む細胞のＤＮＡ損傷に対する応答を増強させる化合物を同定する方法であって、該方法は、該細胞のＤＮＡ損傷を促進するのに好適な条件下、試験化合物の存在下または非存在下でＣＯＰ１ポリペプチドをインキュベートする工程と、該試験化合物の存在下で、該ＣＯＰ１ポリペプチドの分解が増強されるか否かを判定する工程とを含み、該ＣＯＰ１ポリペプチドの分解を高める化合物は、ＤＮＡ損傷に対する応答を増強する化合物である、方法。
【請求項５０】
前記判定する工程は、対照との比較で行われる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＡＴＭ分子は、前記ＣＯＰ１ポリペプチドをリン酸化できる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
ＣＯＰ１  Ｅ３−リガーゼ活性の活性化、ＣＯＰ１自己ユビキチン化の活性化、ＣＯＰ１−ｐ５３複合体の破壊、ＣＯＰ１依存性ｐ５３ユビキチン化の減少、ＣＯＰ１ポリペプチドの細胞質／核の比率の上昇、ｐ５３活性の増強およびｐ５３分子の発現レベルの上昇からなる群の１つまたは複数が、前記化合物によって増強されるか否かを判定する工程をさらに含み、このような増強は、前記化合物がＤＮＡ損傷に対する応答を増強する化合物であることを示す、請求項４９〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記ｐ５３活性は、ｐ５３依存性トランス活性化の活性化、ｐ５３誘導性アポトーシスの活性化、ｐ２１分子の活性化、ｐ２１プロモーターの誘導およびＰＵＭＡプロモーターの誘導からなる群の１つまたは複数から選択される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
ＤＮＡ損傷の促進に好適な前記条件は、照射である、請求項４９〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
ＤＮＡ損傷に対する前記応答は、細胞アポトーシスまたはｐ５３活性化を含む、請求項４９〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
ＣＯＰ１ポリペプチドとＡＴＭポリペプチドとの相互作用を増強する化合物を同定するための方法であって：
ａ）試験化合物の存在下または非存在下でＡＴＭポリペプチドとともにＣＯＰ１ポリペプチドをインキュベートする工程と；
ｂ）該試験化合物が該ＣＯＰ１ポリペプチドの該ＡＴＭポリペプチドへの結合を増大または安定化させるか否かを判定する工程と、
を含み、
該ＣＯＰ１ポリペプチドの該ＡＴＭポリペプチドへの結合を増大または安定化させる試験化合物は、ＣＯＰ１ポリペプチドとＡＴＭポリペプチドとの相互作用を増強する化合物である、方法。
【請求項５７】
本質的にヒトＣＯＰ１のアミノ酸残基３７７〜４００と実質的に同一または相同であるアミノ酸配列からなる、単離されたペプチド。
【請求項５８】
本質的に図６に示したようなアミノ酸配列からなる、単離されたペプチド。
【請求項５９】
前記ペプチドは、ＳＱモチーフのセリンの置換を含む、請求項５７または５８に記載のペプチド。
【請求項６０】
前記置換は、アスパラギン酸塩置換またはグルタミン酸塩置換である、請求項５９に記載のペプチド。
【請求項６１】
ヒトＣＯＰ１ポリペプチドのＳ３８７と相同であるリン酸化を含む、単離されたリン酸化ＣＯＰ１ペプチドまたは組換えリン酸化ＣＯＰ１ペプチド。
【請求項６２】
ヒトＣＯＰ１ポリペプチドのＳ３８７と相同であるアミノ酸残基でのアスパラギン酸塩置換またはグルタミン酸塩置換を含む、単離されたＣＯＰ１ペプチドまたは組換えＣＯＰ１ペプチド。
【請求項６３】
請求項５７〜６２のいずれか１項に記載のペプチドのＣＯＰ１模倣体化合物。
【請求項６４】
請求項５７〜６２のいずれか１項に記載のペプチドまたは請求項６３に記載の模倣体をコードする、核酸分子。
【請求項６５】
プロモーターに作動的に連結された、請求項６４に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項６６】
プロモーターに作動的に連結されたＡＴＭ核酸分子をさらに含む、請求項６５に記載のベクター。
【請求項６７】
請求項６５または６６に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項６８】
ヒトＣＯＰ１のセリン３８７と相同であるアミノ酸残基でリン酸化されているアミノ酸配列に特異的に結合する、試薬。
【請求項６９】
前記アミノ酸配列は、Ｓ３８７リン酸化ヒトＣＯＰ１である、請求項６８に記載の試薬。
【請求項７０】
前記試薬は、抗体である、請求項６９に記載の試薬。
【請求項７１】
請求項６８に記載の試薬または請求項７０に記載の抗体をコードする、核酸分子。
【請求項７２】
プロモーターに作動的に連結された、請求項７１に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項７３】
請求項７２に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項７４】
細胞のリン酸化ＣＯＰ１分子を検出するための説明書が付いた、請求項６８に記載の試薬または請求項７０に記載の抗体を含む、キット。
【請求項７５】
請求項５７〜６２のいずれか１項に記載のペプチドまたは請求項６３に記載の模倣体または該ペプチドまたは模倣体をコードする核酸配列を含む、医薬組成物。
【請求項７６】
処置を必要とする被験体のＤＮＡ損傷または癌を処置する方法であって、該被験体に治療有効量の請求項５７〜６２のいずれか１項に記載のペプチドまたは請求項６３に記載の模倣体を投与することを含む、方法。
【請求項７７】
処置を必要とする被験体のＤＮＡ損傷または癌を処置する方法であって、該被験体に治療有効量で請求項６４に記載の核酸を投与することを含む、方法。
【請求項７８】
被験体のＤＮＡ損傷を受けた細胞または癌を処置する方法であって、ＣＯＰ１ポリペプチドとＡＴＭポリペプチドとの結合を増強する化合物と、ＡＴＭポリペプチドによる該ＣＯＰ１ポリペプチドのリン酸化を増強する化合物とからなる群から選択される化合物を該被験体に投与することを含む、方法。
【請求項７９】
前記化合物は、前記ＤＮＡ損傷を受けた細胞または癌のＣＯＰ１ポリペプチドのリン酸化を増大するのに有効な量で投与される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
請求項４９または請求項５６に記載の方法に従って同定される、化合物。
【請求項８１】
被験体のＤＮＡ損傷または癌を処置する薬物を調製するための、請求項５７〜６２のいずれか１項に記載のペプチド、請求項６３に記載の模倣体または請求項８０に記載の化合物の、使用。
【請求項８２】
ＣＯＰ１分子をコードする組換え核酸分子およびＡＴＭ分子をコードする組換え核酸分子を含む、哺乳類細胞。
【請求項８３】
ｐ５３分子をコードする組換え核酸分子をさらに含む、請求項８２に記載の哺乳類細胞。
【請求項８４】
前記ＡＴＭ分子は、活性化されている、請求項８２または８３に記載の哺乳類細胞。
【請求項８５】
前記ＣＯＰ１分子は、構成的にリン酸化されているか、あるいは、構成的にリン酸化されない、請求項８２〜８４のいずれか１項に記載の哺乳類細胞。
【請求項８６】
前記ＣＯＰ１分子は、Ｓ３８７のＣＯＰ１リン酸化を抑えるＳ３８７の変異により、Ｓ３８７で構成的にリン酸化されない、請求項８５に記載の哺乳類細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
この出願は、２００５年１２月３１日に出願された米国仮出願第６０／７５５，４１２号（この明細書は、その全体が本明細書に援用される）への優先権およびその利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ＣＯＰ１ならびにＤＮＡ損傷の診断および治療の分野のものである。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
哺乳類においては、ゲノムの完全性は、細胞および組織のホメオスタシスを維持するための必須条件である。このため、ゲノムが崩れるのを防ぐように設計された回路に、特殊なタンパク質群が関係している。毛細血管拡張性運動失調（Ａ−Ｔ）は、まれな常染色体劣性疾患であるが、発症した個体では、細胞レベルでゲノムが非常に不安定になる１（非特許文献１）。毛細血管拡張性運動失調変異タンパク質キナーゼ（ＡＴＭ）の変異は、Ａ−Ｔに起因しており、ＡＴＭは、ゲノムの完全性を維持するように構成されたＤＮＡ損傷の応答ネットワークの重要成分として知られる２（非特許文献２）。ＡＴＭの機能は、１つには、ｐ５３、ＢＲＣＡ１およびＣｈｋ２など、主要な基質をリン酸化することである。ＡＴＭの基質のリン酸化については、ＤＮＡ損傷後および腫瘍発生の初期に検出されている９。
【０００４】
腫瘍サプレッサーであるｐ５３は、ＤＮＡ損傷の活性化経路に関与している。マウスのｐ５３ヌルでは一般に、異数性を示すリンパ腫および肉腫が発現する１０が、細胞周期停止だけが可能な変異ｐ５３を持つマウスでは、２倍体の染色体数を持つ腫瘍が形成される１１。ｐ５３は、その腫瘍サプレッサーの特質を用いて、遺伝子構造の発現を誘発するストレス活性化転写因子として機能しているが、その遺伝子構造の産物は、細胞周期停止、老化またはアポトーシスに関係している。塩基対変異で体細胞の増殖を遅延させれば、体細胞は、それ自体のゲノムの複製または細胞分裂の前にこうしたミスマッチを修復することができる。転写コアクチベーターｐ３００の補充を促進し１３、ｐ５３標的遺伝子のトランス活性化の活性化を高めるのはＳ１５であるが、ＡＴＭは、Ｓ１５のＮ末端でｐ５３を直接リン酸化する１２。さらに、ＡＴＭは、ＭＤＭ２およびＭＤＭＸをリン酸化するため１４〜１６、ｐ５３を負に制御するＭＤＭ２およびＭＤＭＸの能力を低下させる。ｐ５３は、乳癌および卵巣癌に過剰発現するＣＯＰ１３，４など、Ｅ３ユビキチンリガーゼによって負の制御を受ける５。
【非特許文献１】Ｃｈｕｎ，Ｈ．Ｈ．およびＧａｔｔｉ，Ｒ．Ａ．  ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ（Ａｍｓｔ）（２００４）３，１１８７−９６
【非特許文献２】Ｓｈｉｌｏｈ，Ｙ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ（２００３）３，１５５−６８
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の概要
一態様では、本発明は、細胞のＣＯＰ１ポリペプチドを検出することによって、ＡＴＭポリペプチドを含む細胞のＤＮＡ損傷を検出する方法であって、ＡＴＭポリペプチドによるＣＯＰ１ポリペプチドのリン酸化または対照との比較でのＣＯＰ１ポリペプチドレベルの低下からＤＮＡ損傷が示される、方法を提供する。
【０００６】
ＡＴＭポリペプチドは、ヒトＡＴＭポリペプチドおよび／またはＣＯＰ１ポリペプチドであってもよいし、ヒトＣＯＰ１ポリペプチドであってもよい。リン酸化は、セリンのリン酸化であってもよい。ＣＯＰ１ポリペプチドについては、ヒトＣＯＰ１ポリペプチドのアミノ酸残基３７７〜４００と実質的に同一のアミノ酸配列またはヒトＣＯＰ１ポリペプチドのセリン３８７と相同であるアミノ酸残基を含むペプチドなど、ＣＯＰ１ポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いて検出することができる。このペプチドは、ヒトＣＯＰ１ポリペプチドのセリン３８７と相同であるリン酸化可能なアミノ酸残基がリン酸化されていてもよい。
【０００７】
本発明の方法は、ＣＯＰ１分子のＡＴＭ分子への結合がＤＮＡ損傷を示すＡＴＭポリペプチドを検出する工程をさらに含んでもよく、および／またはＣＯＰ１  Ｅ３−リガーゼ活性の活性化、ＣＯＰ１自己ユビキチン化の活性化、ｐ５３−ＣＯＰ１複合体の破壊、ＣＯＰ１依存性ｐ５３ユビキチン化の減少、ＣＯＰ１の細胞質−核の比率の上昇、ＣＯＰ１ポリペプチドのターンオーバーまたはＣＯＰ１ポリペプチドの分解を検出する工程をさらに含んでもよく、および／または対照との比較でのｐ５３分子の発現レベルの上昇またはｐ５３活性の増強からＤＮＡ損傷が示される細胞のｐ５３分子を検出する工程をさらに含んでもよい。ｐ５３分子は、ヒトｐ５３分子および／または野生型ｐ５３分子であってもよい。ｐ５３分子は、ｐ５３ポリペプチドであっても構わない。ｐ５３ポリペプチドの検出には、ｐ５３ポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いてもよい。ｐ５３活性は、ｐ５３依存性トランス活性化の活性化、ｐ５３誘導性アポトーシスの活性化、ｐ２１分子の活性化、ｐ２１プロモーターの誘導、ｐ２１のｍＲＮＡレベルの上昇またはＰＵＭＡプロモーターの誘導であってもよい。
【０００８】
ＤＮＡ損傷の原因は、放射線（電離放射線もしくは紫外線または放射線治療など）または化合物（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）（化学療法剤などのアルキル化剤等）であってもよい。細胞（乳癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌等の癌細胞または移行細胞癌（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｎｃｅｒ）細胞など）は、ＤＮＡ損傷があってもよいし、ＤＮＡ損傷の危険があるものでもよい。癌細胞については、癌治療を受けている、あるいは、ＤＮＡ損傷を来す可能性がある放射線または化合物（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）に曝露されている被験体（ヒトなど）から取得してもよい。癌治療は、ＤＮＡ損傷の原因になることが分かっているものであってもよいし、ＤＮＡ損傷の原因になる疑いがあるものでも構わない。
【０００９】
別の態様では、本発明は、細胞をＣＯＰ１ポリペプチドの分解を高める化合物に曝露することで、細胞のＤＮＡ損傷に対する応答を増強する方法を提供する。化合物は、活性化されたＡＴＭポリペプチドなど、ＡＴＭ分子を含んでいてもよい。化合物は、ＣＯＰ１ポリペプチドのＡＴＭポリペプチドへの結合を強化してもよいし、ＡＴＭポリペプチドによりＣＯＰ１ポリペプチドのリン酸化を強化してもよい。
【００１０】
別の態様では、本発明は、ＣＯＰ１ポリペプチドおよびＡＴＭポリペプチドと、ＣＯＰ１ポリペプチドのＡＴＭポリペプチドへの結合を強化する化合物とを接触させて、ＣＯＰ１ポリペプチドとＡＴＭポリペプチドとの相互作用を増強する方法を提供する。
【００１１】
別の実施形態では、この方法は、結合が、ＣＯＰ１ポリペプチドの分解、ＣＯＰ１  Ｅ３−リガーゼ活性の活性化、ＣＯＰ１自己ユビキチン化の活性化、ＣＯＰ１−ｐ５３複合体の破壊、ＣＯＰ１依存性ｐ５３ユビキチン化の減少、ＣＯＰ１ポリペプチドの細胞質／核の比率の上昇またはｐ５３分子の発現レベルの上昇を来したかどうかを判定するステップをさらに含んでもよい。この接触で、ＤＮＡ損傷があるまたはＤＮＡ損傷の危険がある細胞など（Ａ−Ｔ細胞または癌細胞など）、細胞のＤＮＡ損傷に対する応答が高まることがある。ＤＮＡ損傷に対する応答には、細胞アポトーシスまたはｐ５３活性化を含めてもよい。ｐ５３活性化は、ｐ５３依存性トランス活性化の活性化、ｐ５３誘導性アポトーシスの活性化、ｐ２１分子の活性化、ｐ２１プロモーターの誘導またはＰＵＭＡプロモーターの誘導であってもよい。ＣＯＰ１ポリペプチドは、ヒトＣＯＰ１ポリペプチドであってもよいし、および／またはＡＴＭポリペプチドは、ヒトＡＴＭポリペプチドであってもよい。
【００１２】
本発明は、ヒトＣＯＰ１ポリペプチドのセリン３８７と相同であるアミノ酸残基のリン酸化を増強する、および／またはヒトＣＯＰ１ポリペプチドのセリン３８７のリン酸化を増強することができる化合物を意図している。
【００１３】
さらに、本発明は、ヒトＣＯＰ１ポリペプチドのセリン３８７と相同である残基を持つポリペプチド；ヒトＣＯＰ１ポリペプチドのアミノ酸残基３７７〜４００と実質的に同一の配列を含むポリペプチド；リン酸化が可能であるアミノ酸残基がリン酸化しているポリペプチド（ヒトＣＯＰ１ポリペプチドのセリン３８７と相同であるポリペプチドなど）；ヒトＣＯＰ１ポリペプチドのセリン３８７と相同である残基でのセリンからトレオニン、グルタミン酸塩またはアスパラギン酸塩への置換を含むＣＯＰ１ポリペプチド；およびＣＯＰ１模倣体化合物など、ＣＯＰ１ポリペプチドまたはそのフラグメントも提供する。一実施形態では、ポリペプチドは、Ｓ３８７での別の残基への残基変化を含むＣＯＰ１ポリペプチド配列を含むものである。
【００１４】
別の態様では、本発明は、細胞のＤＮＡ損傷の促進に好適な条件下、試験化合物の存在下または非存在下でＣＯＰ１ポリペプチドをインキュベートし、試験化合物の存在下でＣＯＰ１ポリペプチドの分解が増強されるか否かを判定することで、ＡＴＭ分子を含む細胞のＤＮＡ損傷に対する応答を増強させる化合物を同定する方法であって、ＣＯＰ１ポリペプチドの分解を促す化合物は、ＤＮＡ損傷に対する応答を高める化合物である、方法を提供する。その判定は、対照との比較で行ってもよい。ＡＴＭ分子は、ＣＯＰ１ポリペプチドをリン酸化する能力があっても構わない。
【００１５】
別の実施形態では、この方法は、ＣＯＰ１  Ｅ３−リガーゼ活性の活性化、ＣＯＰ１自己ユビキチン化の活性化、ＣＯＰ１−ｐ５３複合体の破壊、ＣＯＰ１依存性ｐ５３ユビキチン化の減少、ＣＯＰ１ポリペプチドの細胞質／核の比率の上昇、ｐ５３活性の増強またはｐ５３分子の発現レベルの上昇が、化合物によって増強したかどうかを判定する選択肢をさらに含み、このような増強により、この化合物がＤＮＡ損傷に対する応答を増強する化合物であることが示される、方法である。ｐ５３活性は、ｐ５３依存性トランス活性化の活性化、ｐ５３誘導性アポトーシスの活性化、ｐ２１分子の活性化、ｐ２１プロモーターの誘導またはＰＵＭＡプロモーターの誘導であってもよい。ＤＮＡ損傷の促進に好適な条件は、照射であって構わない。ＤＮＡ損傷に対する応答は、細胞アポトーシスまたはｐ５３活性化を含んでもよい。
【００１６】
別の態様では、本発明は、試験化合物の存在下または非存在下でＡＴＭポリペプチドとともにＣＯＰ１ポリペプチドをインキュベートし、試験化合物がＣＯＰ１ポリペプチドのＡＴＭポリペプチドへの結合を増大または安定化させるか否かを判定することで、ＣＯＰ１ポリペプチドとＡＴＭポリペプチドとの相互作用を増強する化合物を同定する方法であって、ＣＯＰ１ポリペプチドのＡＴＭポリペプチドへの結合を増大または安定化させる試験化合物は、ＣＯＰ１ポリペプチドとＡＴＭポリペプチドとの相互作用を増強する化合物である、方法を提供するものである。
【００１７】
別の態様では、本発明は、本質的にヒトＣＯＰ１のアミノ酸残基３７７〜４００と実質的に同一または相同であるアミノ酸配列からなる単離されたペプチドまたは本質的に図６に示したようなアミノ酸配列からなる単離されたペプチドを提供するものである。別の実施形態では、ペプチドは、ＳＱモチーフのセリンの置換（アスパラギン酸塩置換またはグルタミン酸塩置換など）を含んでいても構わない。
【００１８】
別の態様では、本発明は、ヒトＣＯＰ１ポリペプチドのＳ３８７と相同であるリン酸化を含む単離されたリン酸化ＣＯＰ１ペプチドもしくは組換えリン酸化ＣＯＰ１ペプチド、またはヒトＣＯＰ１ポリペプチドのＳ３８７と相同であるアミノ酸残基でのアスパラギン酸塩置換またはグルタミン酸塩置換を含む単離されたＣＯＰ１ペプチドもしくは組換えＣＯＰ１ペプチド、またはＣＯＰ１模倣体化合物を提供するものである。
【００１９】
別の実施形態では、本発明は、本発明によるペプチドまたは模倣体をコードする核酸分子を提供する。核酸分子は、プロモーターに作動的に連結されたベクター内にあってもよい。ベクターは、プロモーターに作動的に連結されたＡＴＭ核酸分子をさらに含んでもよい。ベクターは、宿主細胞にあっても構わない。
【００２０】
別の態様では、本発明は、ヒトＣＯＰ１のセリン３８７と相同であるアミノ酸残基がリン酸化されているアミノ酸配列に特異的に結合する抗体または他の試薬を提供するものである。別の実施形態では、本発明は、抗体をコードする核酸分子；プロモーターに作動的に連結された核酸分子を含むベクター；ベクターを含む宿主細胞；および／または細胞のリン酸化ＣＯＰ１分子を検出するための説明書が付いた、抗体を含むキットを提供するものである。
【００２１】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載するようなポリペプチド、ペプチドもしくは模倣体またはポリペプチドもしくはペプチドの配列をコードする核酸を含む医薬組成物など、被験体のＤＮＡ損傷またはｐ５３活性に対する応答を調節する医薬組成物を提供するものである。
【００２２】
別の態様では、本発明は、ＣＯＰ１分子をコードする組換え核酸分子およびＡＴＭ分子をコードする組換え核酸分子を含む哺乳類細胞を提供するものである。哺乳類細胞は、ｐ５３分子をコードする組換え核酸分子をさらに含んでもよい。ＡＴＭ分子は、活性化されていてもよく、および／またはＣＯＰ１分子は、構成的にリン酸化または非リン酸化（Ｓ３８７の変異によるなど）されていてもよい。
【００２３】
さらに、本発明は、処置を必要とする被験体のＤＮＡ損傷または癌を処置する方法であって、ペプチドまたは本発明の模倣体を治療有効量で被験体に投与することを含む、方法も提供するものである。加えて、本発明は、処置を必要とする被験体のＤＮＡ損傷または癌を処置する方法であって、ポリペプチドをコードする化合物または核酸を治療有効量で被験体に投与することを含み、化合物またはポリペプチドは、ＣＯＰ１ポリペプチドのＡＴＭポリペプチドへの結合を強化するか、またはＡＴＭポリペプチドにより前記ＣＯＰ１ポリペプチドのリン酸化を増強する、方法も提供する。一実施形態によれば、化合物またはポリペプチドは、ＣＯＰ１に特異的に結合する。別の実施形態によれば、化合物またはポリペプチドは、ＡＴＭに特異的に結合する。なお別の実施形態によれば、化合物またはポリペプチドは、非リン酸化ＣＯＰ１に特異的に結合する。なお別の実施形態によれば、ＤＮＡ損傷を受けた細胞または癌のＣＯＰ１ポリペプチドのリン酸化を増強するのに有効な量で化合物を投与する。
【００２４】
本発明は、本発明の方法により同定される化合物を提供する。さらに、本発明では、被験体のＤＮＡ損傷または癌を処置する薬物を調製する際に、本発明のペプチド、模倣体、核酸および化合物を使用することを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
本発明は、１つには、ＤＮＡ損傷またはクロマチン構造の変化後にＡＴＭがＣＯＰ１と相互に作用し、ＣＯＰ１をリン酸化することを示す。ＡＴＭによるこうした共有結合による修飾は、ＣＯＰ１−ｐ５３複合体を破壊し、ＣＯＰ１によるユビキチン化、分解およびｐ５３の腫瘍サプレッサー機能に対する負の制御を阻害する。さらに、ＣＯＰ１のリン酸化は、Ｅ３の自己分解機構に関与し、それによってＣＯＰ１をトランスユビキチンリガーゼ活性からシスユビキチンリガーゼ活性に転換するが、これが、リン酸化によるリング−Ｅ３リガーゼの活性化の第１の例である。ＣＯＰ１のリン酸化は、ＣＯＰ１の細胞質／核の局在の比率を高める。したがって、ＡＴＭによるＣＯＰ１のリン酸化またはＣＯＰ１の分解により、ｐ５３依存性腫瘍サプレッサー機能を負に制御するＣＯＰ１の能力が低下する。特定の仮説に拘泥するものではないが、ＡＴＭによるＣＯＰ１のリン酸化またはＣＯＰ１の分解によって、ｐ５３経路（図４Ｉ）における、Ａ−Ｔ患者のゲノム異常に対する応答を大きく遅延させることがさらに説明される可能性がある。
【００２６】
これを踏まえれば、ＡＴＭによるＣＯＰ１のリン酸化またはＣＯＰ１の分解を用いて、ＤＮＡ損傷の検出が可能である。
【００２７】
本明細書では、本発明の種々の代替実施形態および実施例を記載している。これらの実施形態および実施例は、例示であり、本発明の範囲を限定するものとして解釈してはならない。
【００２８】
ＤＮＡ損傷
「ＤＮＡ損傷」とは、ＤＮＡを共有結合的に修飾するか、あるいは、そうした修飾により通常の二重螺旋構造から逸脱させることで、ＤＮＡの通常機能に影響を与える、ＤＮＡに対する障害をいう。ＤＮＡ損傷には、複製および転写に干渉する構造の歪みばかりでなく、塩基対の破壊とＤＮＡ配列の変更とが可能な点突然変異も含まれる。一般に、細胞がＤＮＡ損傷を受けると、２つのチェックポイント（Ｇ１／ＳまたはＧ２／Ｍ）の１つで細胞周期が停止する。細胞周期が停止すると、ＤＮＡ修復プロセスの活性化（比較的小さなＤＮＡ損傷の場合）またはアポトーシスの誘導（破局的ＤＮＡ損傷の場合）を来す可能性がある。
【００２９】
ＤＮＡ損傷は、正常な代謝から生成される反応性酸素およびフリーラジカルによる塩基の酸化とＤＮＡ鎖の切断の発生、塩基のメチル化、脱プリン（水中のＤＮＡ反応に起因するなど）、脱ピリミジン、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ複製中の塩基のミスマッチなど、内在性プロセスによって自然に起きることもある。ＤＮＡ損傷はまた、放射線（紫外線、Ｘ線、ガンマ線、電離放射線など）、天然毒素（植物毒素など）、合成毒素、薬物（癌化学療法剤、放射線治療剤など）、アルキル化剤など、環境障害が原因になることもある。
【００３０】
ＤＮＡ損傷は、遺伝的遺伝子障害および環境障害への曝露が原因の障害など、種々の障害をもたらすか、あるいは、種々の障害に起因する可能性がある。ＤＮＡ損傷が悪化因子である障害には、ルイ−バール症候群または小脳性失調−眼皮膚毛細血管拡張とも呼ばれる毛細血管拡張性運動失調（Ａ−Ｔ）、色素性乾皮症、コケーン症候群、硫黄欠乏性毛髪発育異常症、ファンコニー貧血、ブルーム症候群およびアルツハイマー病がある。また、ＤＮＡ損傷は、喫煙によっても起こり、たとえば、心臓疾患、あるいは、他の疾患の治療が原因で癌などをもたらす可能性もある。
【００３１】
癌
「癌」、「新生物」、「新形成」、「癌腫」または「腫瘍」とは、生理的機能を持たない細胞の望ましくない任意の成長をいう。一般に、新生細胞など、新生物または癌の細胞は、正常な細胞分裂制御から解放されており、すなわち、細胞環境において、成長または増殖が正常な生化学的影響および物理的影響によって調節されていない細胞であり、無秩序な成長、局部組織浸潤、転移などの特性を示す。通常、新生細胞は、増殖して良性または悪性のいずれかである細胞のクローンを形成する。したがって、癌または新生物は、専門的には良性であるが、悪性になる危険がある細胞成長を含むものである。「悪性」とは、任意の細胞タイプまたは組織の異常成長または増殖をいう。悪性細胞または悪性組織は、同じタイプの正常細胞または正常組織と比較して、分化／配向の退形成または消失を阻害する場合があり、浸潤能力および転移能力を示すことがある。
【００３２】
ほとんどの癌は、圧倒的に多い癌であり、上皮細胞または臓器、腺もしくは他の身体構造（皮膚、子宮、肺、乳房、前立腺、胃、腸など）の外表面または内壁面を覆う細胞の癌であり、転移（ｍｅｓｔａｓｔａｓｉｚｅ）しやすい、癌腫；結合組織または支持組織（骨、軟骨、腱、靱帯、脂肪、筋肉など）に由来する、肉腫；および骨髄およびリンパ組織に由来する、血液腫瘍の大まかに３つの組織学的分類に該当する。癌腫は、腺癌（臓器または乳房、肺、結腸、前立腺もしくは膀胱など分泌能力のある腺に発現するのが一般的）であることもあるし、扁平上皮癌（扁平上皮から発生し、通常、ほとんどの身体部位で発現する）であることもある。肉腫は、骨肉腫または骨原性肉腫（骨）、軟骨肉腫（軟骨）、平滑筋肉腫（平滑筋）、横紋筋肉腫（骨格筋）、中皮肉腫または中皮腫（体腔の膜の裏打ち）、線維肉腫（線維組織）、血管肉腫または血管内皮種（血管）、脂肪肉腫（脂肪組織）、神経膠腫または星状細胞腫（脳に見られる神経原性の結合組織）、粘液肉腫（原始胚結合組織）、間葉腫または混合性中胚葉腫（混合性結合組織タイプ）であることもある。血液腫瘍は、骨髄の形質細胞から発生する骨髄腫；「液性癌」であることもあり、骨髄の癌であり、骨髄性白血病または顆粒球性白血病（骨髄白血球および顆粒球白血球）、リンパ性白血病、リンパ球性白血病またはリンパ芽球性白血病（リンパ血液細胞およびリンパ球血液細胞）等、急性リンパ性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性単球性白血病、急性前骨髄球性白血病、慢性骨髄性白血病等、または真性赤血球増加症または赤血病（血球成分は様々だが、赤血球が圧倒的である）であることもある、白血病；または充実性腫瘍であることもあり、リンパ系の腺または節に発現し、ホジキンまたは非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫などを含むこともある、リンパ腫であることもある。さらに、腺扁平上皮癌、混合性中胚葉腫、癌肉腫または奇形癌など、混合型癌も存在する。
【００３３】
癌はまた、たとえば、乳房、脳、肺、肝臓、皮膚、前立腺、精巣、膀胱、結腸および直腸、頚部、子宮の癌など、癌が発生する臓器、すなわち、「原発部位」に基づき名付けられることもある。こうした呼称は、癌が原発部位と異なる別の身体部位に転移する場合でも存続し、本発明による癌は、原発癌および転移している癌を含むものである。
【００３４】
原発部位に基づき名付けられた癌は、組織学的分類と相関することがある。たとえば、肺癌は通常、扁平上皮癌、腺癌または大細胞癌腫であることもある小細胞肺癌または非小細胞肺癌であり、皮膚癌は通常、基底細胞癌、扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｎｃｅｒｓ）または悪性黒色腫などの黒色腫である。リンパ腫は、頭部、首および胸部に付随するリンパ節に発生することがあり、さらに腹部リンパ節または腋窩リンパ節もしくは鼠径リンパ節に発生することもある。癌のタイプおよびステージの同定および分類は、たとえば、米国の癌の発生率および生存率に関する情報の権威ある情報源であり、世界中で認められている米国国立癌研究所のＳｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ，Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｎｄ  Ｒｅｓｕｌｔｓ（ＳＥＥＲ）プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｓｅｅｒ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｐｕｂｌｉｃｄａｔａ／ａｃｃｅｓｓ．ｈｔｍｌ）が提供する情報を用いて行うことができる。ＳＥＥＲプログラムの発生率および生存率のデータを用いて、特定の癌の部位およびステージの標準的な生存率を入手できる。たとえば、最適な比較群を確保するには、具体的な判定基準を、診断日および正確なステージを含むデータベースから選択すればよい。また、癌の同定については、たとえば、Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，第１７版，Ｍ．Ｈ．ＢｅｅｒｓおよびＲ．Ｂａｒｋｏｗ編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９９年などの診断マニュアルに記載されている情報を用いて行ってもよい。
【００３５】
癌または新生物の例として、当該技術分野において公知のように、形質転換細胞および不死化細胞、充実性腫瘍、骨髄増殖性疾患、芽腫、扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｎｃｅｒ）（上皮性扁平上皮癌など）、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌腫など）、腹膜の癌、肝細胞癌、消化癌を含む胃（ｇａｓｔｒｉｃまたはｓｔｏｍａｃｈ）癌、膵臓癌、膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーム、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、漿液性腺癌、類子宮内膜腺癌、明細胞腺癌、粘液性腺癌、ブレンナー腫瘍、奇形腫、未分化胚細胞腫、絨毛癌、線維腫、顆粒膜細胞腫、セルトリ−ライディッヒ細胞腫、未分化卵巣癌、唾液腺癌、腎（ｋｉｄｎｅｙまたはｒｅｎａｌ）癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、頭部および／または首の癌、ユーイング肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、脂肪肉腫、末梢神経上皮腫、滑膜肉腫、ホジキン病などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００３６】
ポリペプチド、核酸分子および化合物
本発明による化合物は、ＣＯＰ１またはＡＴＭの核酸分子、ポリペプチドおよび／またはアイソフォーム、変異体、模倣体、ホモログ、類似体またはこれらのフラグメントを含むものであるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、本発明はまた、ｐ５３、ｐ２１およびこれ以外の核酸分子、ポリペプチドおよび／またはアイソフォーム、変異体、模倣体、ホモログ、類似体またはこれらのフラグメントも利用するものである。
【００３７】
ＣＯＰ１化合物
本明細書で使用する場合、「ＣＯＰ１分子」とは、ＣＯＰ１ポリペプチド；ＣＯＰ１ポリペプチドをコードしている核酸分子；ＣＯＰ１核酸分子；ならびにアイソフォーム、変異体、模倣体、ホモログ、類似体またはこれらのフラグメントと実質的に同一の分子をいう。ＣＯＰ１分子は、受託番号ＡＦ５０８９４０（ヒト）、ＡＡＨ８２８０４（マウス）、ＮＰ＿０３６０６１（マウス）、ＮＰ＿００１００１７４０（ヒト、アイソフォームｄ２４）、ＮＰ＿０７１９０２（ヒト、アイソフォームａ）、ＸＰ＿４６８０１１（イネ）、ＸＰ＿４６８０１０（イネ）、ＸＰ＿４６３８６６（イネ）、ＡＡＭ３４６９２（ヒト）、ＡＡＨ３９７２３（ヒト）、ＢＡＢ４５２３９（ヒト）、Ｐ＿ＡＢＧ０８２４３（ヒト）、ＡＡＤ５１０９４（マウス）、ＡＡＮ８６５５３（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  ｓｕｂｓｐ．Ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ）、ＣＡＡ９８７１８（サッカロマイセスセレビシエ）、ＣＡＡ０４１６８（シロイヌナズナ）、ＸＭ＿４７７８９６（イネ）、ＸＭ＿４７９１６４（イネ）、ＢＫ０００４３８（ヒト）、ＡＦ５０８９４０（ヒト）、ＡＦ１５１１１０（マウス）、Ｌ２４４３７（シロイヌナズナ）、Ｐ＿ＡＡＹ６０００８（ヒト）、Ｐ＿ＡＢＪ１９３９８（ヒト）、Ｐ＿ＡＢＢ１１５７６（ヒト）、Ｐ＿ＡＢＧ９５２４７（ヒト）、Ｐ＿ＡＡＷ７４７９７（ヒト）、Ｐ＿ＡＢＰ６９１８０（ヒト）、Ｐ＿ＡＡＢ９２７９８（ヒト）、ＸＰ＿０６４８１５（ヒト）および／またはＰ＿ＡＡＧ０２５９１（ヒト）ならびにアイソフォーム、変異体、模倣体、ホモログ、類似体またはこれらのフラグメントに記載のものと実質的に同一の配列を含むポリペプチド分子または核酸分子を含んでいてもよいが、これに限定されるものではない。ＣＯＰ１分子は、Ｂｉａｎｃｈｉら６、Ｗａｎｇら７またはＹｉら１９に記載されているような分子でも構わない。
【００３８】
「実質的に同一の」配列とは、本明細書で論じるような１つまたは複数の保存的置換だけ、あるいは、アミノ酸分子または核酸分子の生物学的機能を破壊しない配列位置にある１つまたは複数の非保存的置換、欠失または挿入が参照配列と異なる、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列である。こうした配列は、アミノ酸またはヌクレオチドレベルで比較のための配列に対して１０％〜９９％までの任意の値、つまり、より一般的には少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０、５５％または６０％、あるいは、少なくとも６５％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％、あるいは、たとえば、Ａｌｉｇｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ１８またはＦＡＳＴＡを用いて最適に配列させる場合、最大９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。ポリペプチドの場合、比較配列の長さは、少なくとも２アミノ酸、５アミノ酸、１０アミノ酸もしくは１５アミノ酸または少なくとも２０アミノ酸、２５アミノ酸もしくは３０アミノ酸であってもよい。別の実施形態では、比較配列の長さは、少なくとも３５アミノ酸、４０アミノ酸もしくは５０アミノ酸または６０アミノ酸、８０アミノ酸もしくは１００アミノ酸を超えても構わない。核酸分子の場合、比較配列の長さは、少なくとも５ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、２０ヌクレオチドもしくは２５ヌクレオチドまたは少なくとも３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチドもしく５０ヌクレオチドであってもよい。別の実施形態では、比較配列の長さは、少なくとも６０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、８０ヌクレオチドもしくは９０ヌクレオチドまたは１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチドまたは５００ヌクレオチドを超えても構わない。配列同一性については、一般に入手可能な配列解析ソフトウェア（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，マディソン，ウィスコンシン州；５３７０５のＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅまたはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅから市販されている、あるいは本明細書に記載するようなＢＬＡＳＴソフトウェアなど）を用いて容易に測定することができる。有用なソフトウェアの例として、Ｐｉｌｅ−ｕｐプログラムおよびＰｒｅｔｔｙＢｏｘプログラムが挙げられる。こうしたソフトウェアは、相同性の程度を種々の置換、欠失、置換およびこれ以外の修飾に割り当てることで類似配列をマッチさせる。実質的に同一の配列は、本明細書に記載するようなまたは当該技術分野において公知の非ヒト種由来のＣＯＰ１関連の配列など、相同である配列を含むものである。
【００３９】
これに代わり、またはこれに加えて、ハイストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行う場合、２つの核酸配列は、「実質的に同一」であり得る。いくつかの実施形態では、ハイストリンジェントな条件は、たとえば、０．５ＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）と、７％ＳＤＳと、１ｍＭのＥＤＴＡと、１％ＢＳＡ（ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ）とを温度６５℃で含む緩衝液または４８％ホルムアミドと、４．８×ＳＳＣと、０．２Ｍのトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．６）と、１×デンハルト溶液と、１０％デキストラン硫酸と、０．１％ＳＤＳとを温度４２℃で含む緩衝液において、長さが少なくとも５００ヌクレオチドのＤＮＡプローブにより起こるハイブリダイゼーションと同程度のハイブリダイゼーションを可能にする条件である。（これらは、ハイストリンジェントなノーザンハイブリダイゼーションまたはサザンハイブリダイゼーションの典型的な条件である。）ハイブリダイゼーションについては、約２０〜３０分または約２〜６時間または約１０〜１５時間かけて、あるいは、２４時間以上かけて行ってもよい。また、ハイストリンジェントなハイブリダイゼーションは、ハイストリンジェントなＰＣＲ、ＤＮＡシークエンシング、一本鎖高次構造多型解析およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなど、分子生物学者が日常的に実施する多くの技法の成功に依拠している。ノーザンハイブリダイゼーションおよびサザンハイブリダイゼーションとは異なり、これらの技法については、ほとんどの場合、比較的短いプローブ（通常、ＰＣＲまたはシークエンシングの場合、約１６ヌクレオチド以上およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの場合、約４０ヌクレオチド以上など）で実施する。これらの技法に用いるハイストリンジェントな条件は、分子生物学の当業者において周知であり、その例を、たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌら８の文献で確認することができ、これを参照によって本明細書に援用する。
【００４０】
いくつかの実施形態では、ヒトＣＯＰ１分子は、受託番号ＡＦ５０８９４０に記載の配列またはそのフラグメントを含むものである。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ヒトＣＯＰ１核酸分子は、以下の配列またはそのフラグメントを含むものである：
【００４２】
【化１】
2009521925.tif 000002
いくつかの実施形態では、ヒトＣＯＰ１ポリペプチドは、以下の配列またはそのフラグメントを含むものである：
【００４３】
【化２】
2009521925.tif 000003
いくつかの実施形態では、ＣＯＰ１ポリペプチドは、ヒトＣＯＰ１ポリペプチドのアミノ酸３７７〜４００またはそのフラグメントを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、ＣＯＰ１ペプチドは、：ＤＳＲＴＡＳＱＬＤＥＦＣ、ＳＲＴＡＳＱ、ＲＴＡＳＱ、ＴＡＳＱ、ＡＳＱ、ＳＱＬＤＥ、ＳＱＬＤ、ＳＱＬ、ＡＳＱＬ、ＴＡＳＱＬＤ、ＲＴＡＳＱＬＤＥもしくはＳＲＴＡＳＱＬＤＥＦの配列またはこれらと実質的に同一の配列を含んでいても構わないが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、ＣＯＰ１ペプチドは、アミノ酸配列がヒトＣＯＰ１ポリペプチドのＳ３８７と相同である配列を含む５アミノ酸、７アミノ酸、１０アミノ酸、１２アミノ酸または１５アミノ酸など、３アミノ酸から２０アミノ酸の任意の値のアミノ酸配列を含んでいても構わないが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、ＣＯＰ１ポリペプチドは、ＡＴＭポリペプチドに直接結合することができてもよいし、ＡＴＭポリペプチドによりリン酸化されていてもよい。いくつかの実施形態では、ＣＯＰ１ポリペプチドは、ＡＴＭによりリン酸化され得る本明細書に記載のアミノ酸配列と実質的に同一の分子を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、ＣＯＰ１ポリペプチドは、ヒトＣＯＰ１ポリペプチドのＳ３８７と相同である残基がリン酸化されている、あるいは、リン酸化され得るポリペプチドであってもよい。ヒトＣＯＰ１ポリペプチドのＳ３８７と相同である配列については、たとえば、図６に記載する。いくつかの実施形態では、ＣＯＰ１分子は、ヒトＣＯＰ１ポリペプチドのセリン３８７と相同であるアミノ酸残基が構成的にリン酸化されているＣＯＰ１ポリペプチドを含むものである。いくつかの実施形態では、ＣＯＰ１分子は、リン酸化可能なアミノ酸残基からヒトＣＯＰ１ポリペプチドのセリン３８７への置換を含むＣＯＰ１ポリペプチドを含むものである。
【００４４】
「リン酸化」ＣＯＰ１タンパク質またはポリペプチドは、インビボでリン酸化の可能な任意のアミノ酸残基（セリン、トレオニン、チロシン、ヒスチジンなど）が翻訳後に修飾を受けている。本発明においては、リン酸化ＣＯＰ１ポリペプチドは通常、ヒトＣＯＰ１ポリペプチドのセリン３８７（Ｓ３８７）と相同であるアミノ酸残基がリン酸化されている。「非リン酸化」ＣＯＰ１ポリペプチドは、インビボでリン酸化され得るアミノ酸残基が、たとえば、その残基がリン酸化され得ないアミノ酸に変異することで、リン酸化され得ない可能性がある。ポリペプチド配列においてセリンがアラニンに変異すると、たとえば、ポリペプチド配列のその特定の位置がリン酸化され得ないタンパク質になる。ヒトＣＯＰ１ポリペプチドの３８７番目と相同である位置にセリンではなくアラニンを持つＣＯＰ１ポリペプチドは、こうした「非リン酸化」ＣＯＰ１ポリペプチドである。非リン酸化ＣＯＰ１ポリペプチドはまた、たとえば、Ｓ３８７がインビボでリン酸化され得るものの、たとえば、ＡＴＭキナーゼ阻害剤といったキナーゼ阻害剤などの阻害剤が存在すること；抗体がリン酸化反応部位に干渉すること；またはホスファターゼの活性が原因でリン酸化されていないポリペプチドであってもよい。「構成的にリン酸化された」ＣＯＰ１ポリペプチドとは、たとえば、インビボでリン酸化され得るヒトＣＯＰ１ポリペプチドのＳ３８７と相同であるアミノ酸残基の変異を有するポリペプチドであり、この変異は、その残基がリン酸化反応を模倣し、その結果生じるポリペプチドは、リン酸化ポリペプチドの生物活性を有するものである。通常、リン酸化可能な残基がグルタミン酸残基またはアスパラギン酸残基に変異すると、構成的リン酸化反応が起こる。いくつかの実施形態では、リン酸化または構成的にリン酸化されたＣＯＰ１ペプチドは：ＤＳＲＴＡ（ｐＳ／Ｔ／Ｙ／Ｄ／Ｅ）ＱＬＤＥＦＣ、ＳＲＴＡ（ｐＳ／Ｔ／Ｙ／Ｄ／Ｅ）Ｑ、ＲＴＡ（ｐＳ／Ｔ／Ｙ／Ｄ／Ｅ）Ｑ、ＴＡ（ｐＳ／Ｔ／Ｙ／Ｄ／Ｅ）Ｑ、Ａ（ｐＳ／Ｔ／Ｙ／Ｄ／Ｅ）Ｑ、（ｐＳ／Ｔ／Ｙ／Ｄ／Ｅ）ＱＬＤＥ、（ｐＳ／Ｔ／Ｙ／Ｄ／Ｅ）ＱＬＤ、（ｐＳ／Ｔ／Ｙ／Ｄ／Ｅ）ＱＬ、Ａ（ｐＳ／Ｔ／Ｙ／Ｄ／Ｅ）ＱＬ、ＴＡ（ｐＳ／Ｔ／Ｙ／Ｄ／Ｅ）ＱＬＤ、ＲＴＡ（ｐＳ／Ｔ／Ｙ／Ｄ／Ｅ）ＱＬＤＥ、ＳＲＴＡ（ｐＳ／Ｔ／Ｙ／Ｄ／Ｅ）ＱＬＤＥＦの配列を持つが、これに限定されるものではなく、「ｐＳ／Ｔ／Ｙ／Ｄ／Ｅ」は、セリンのリン酸化、トレオニンのリン酸化もしくはチロシンのリン酸化、あるいは、アスパラギン酸塩もしくはグルタミン酸塩からリン酸化可能なセリンへの置換を示す。
【００４５】
いくつかの実施形態では、本発明による化合物は、ＣＯＰ１ポリペプチドの模倣体を含むものである。模倣体化合物には、たとえば、本明細書に記載のペプチドと実質的に同一であるＣＯＰ１ポリペプチドまたはＳ３８７と相同であるアミノ酸残基がリン酸化されているＣＯＰ１ポリペプチドなど、非リン酸化またはリン酸化ＣＯＰ１ポリペプチド等のＣＯＰ１ポリペプチドをベースにしているものが一般的であるが、たとえば、ペプチド様二次構造を持つ化合物を含めても構わない。模倣体化合物は、ＣＯＰ１の活性または選択性を増強するか、または模倣体の作用を延長させるため分解特性を抑制することができる。模倣体化合物は、アゴニストであってもよいし、アンタゴニスト（阻害剤）であってもよい。模倣体化合物は、環状ペプチド、ペプチド類似体、制限ペプチド、骨格模倣体、非ペプチド性模倣体、ペプチド核酸等を含んでいても構わない。模倣体化合物は、結合親和性が少なくとも５００ｎＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ、１０ｐＭ等など、０．００１ｐｍ〜１ｕＭの任意の値であるＡＴＭポリペプチドに結合していてもよい。模倣体化合物の分子量は、１５００Ｄａ、１０００Ｄａまたは５００Ｄａなど、２０００Ｄａ未満であってもよい。例示的ＣＯＰ１模倣体化合物として：「ＳＱ」モチーフのセリンがリン酸化または構成的にリン酸化されているＳＲＴＡＳＱ、ＲＴＡＳＱ、ＴＡＳＱ、ＡＳＱ、ＳＱＬＤＥ、ＳＱＬＤ、ＳＱＬ、ＡＳＱＬ、ＴＡＳＱＬＤ、ＲＴＡＳＱＬＤＥ、ＳＲＴＡＳＱＬＤＥＦの配列を含む化合物および／またはペプチドの構造または配列が本明細書に記載するように修飾されているまたは当該技術分野において公知の化合物が挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、本発明による化合物は、リン酸化ＣＯＰ１分子またはそのリン酸化フラグメントを模倣しているＣＯＰ１模倣体化合物を含むものである
いくつかの実施形態では、本発明による化合物は、ヒトＣＯＰ１ポリペプチドのセリン３８７と相同であるアミノ酸残基がリン酸化されているＣＯＰ１ペプチド等のリン酸化ＣＯＰ１などのＣＯＰ１、あるいは、以下の配列：ＳＲＴＡＳＱ、ＲＴＡＳＱ、ＴＡＳＱ、ＡＳＱ、ＳＱＬＤＥ、ＳＱＬＤ、ＳＱＬ、ＡＳＱＬ、ＴＡＳＱＬＤ、ＲＴＡＳＱＬＤＥ、ＳＲＴＡＳＱＬＤＥＦを含むペプチドに特異的に結合する抗体または他の試薬（ペプチボディなど）を含むものである。こうした抗体は、たとえば、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体でもよく、ヒト化抗体であっても構わない。こうしたペプチボディは、免疫グロブリン抗体のＦｃ部分（ＩｇＧ１〜４など）に融合したＣＯＰ１に特異的に結合するペプチドであってもよい。抗体またはこれ以外の試薬は、抗原を認識しこれに結合する場合、抗原に「特異的に結合する」が、サンプル中の他の分子を認識し結合することは実質的にない。たとえば、ＣＯＰ１抗体は、ＣＯＰ１分子に特異的に結合しているが、癌細胞もしくは癌組織またはＤＮＡ損傷を持つ細胞に存在するそれ以外の分子に結合することは実質的にない。いくつかの実施形態では、ＣＯＰ１抗体またはこれ以外の試薬は、ヒトＣＯＰ１分子に特異的に結合することができるが、他の種に由来するＣＯＰ１分子には特異的に結合することができない。いくつかの実施形態では、ＣＯＰ１抗体またはこれ以外の試薬は、リン酸化ＣＯＰ１分子に特異的に結合することができるが、非リン酸化ＣＯＰ１分子には特異的に結合することができない。いくつかの実施形態では、ＣＯＰ１抗体またはこれ以外の試薬は、ヒトＣＯＰ１ポリペプチドのＳ３８７など、特定のアミノ酸残基がリン酸化されているＣＯＰ１分子に特異的に結合することができるが、これ以外のアミノ酸残基がリン酸化されているＣＯＰ１分子には特異的に結合することができない。抗原に特異的に結合する抗体またはこれ以外の試薬の抗原に対する親和性は、サンプル中の別の参照分子に対する抗体または試薬の親和性と比べて、たとえば、少なくとも１０倍、１００倍、１０００倍または１００００倍である。
【００４６】
いくつかの実施形態では、ＣＯＰ１分子は、ＣＯＰ１ポリペプチドをコードする、あるいは、ＣＯＰ１ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはこれ以外の試薬をコードするＣＯＰ１核酸分子を含むものである。
【００４７】
その他の化合物
本明細書で使用する場合、「毛細血管拡張性運動失調変異」または「ＡＴＭ分子」とは、ＡＴＭポリペプチド；ＡＴＭポリペプチドをコードする核酸分子；ＡＴＭ核酸分子；ならびにこれらのアイソフォーム、フラグメント、ホモログ、類似体または変異体と実質的に同一分子をいう。ＡＴＭ分子は、受託番号Ｑ１３３１５（ヒト）、ＮＭ＿００７４９９（マウス）、ＮＭ＿１３８２９２（ヒト）、ＮＭ＿００００５１（ヒト）、ＮＭ＿１１４６８９（シロイヌナズナ）、ＢＣ０２２３０７（ヒト）、ＢＣ０６１５８４（ヒト）、ＸＭ＿７７７４３２（ウニ）、ＢＣ００７０２３（ヒト）、ＸＭ＿６８００１５（ゼブラフィッシュ）、ＸＭ＿２３６２７５（ラット）、ＡＡＢ６５８２７（ヒト）等に記載のものと実質的に同一の配列を含むポリペプチドまたは核酸分子を含んでいても構わないが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、ＡＴＭポリペプチドは活性化されており、キナーゼ活性を有するものである。一般に、ＡＴＭポリペプチドは、野生型ＣＯＰ１分子、あるいは、ヒトＣＯＰ１ポリペプチドのセリン３８７と相同であるアミノ酸残基がリン酸化され得るＣＯＰ１分子をリン酸化することができる。ＡＴＭキナーゼ活性については、たとえば、電離放射線などによるＤＮＡ損傷またはＤＮＡ損傷の原因となり得る化合物（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）により生じ得るものである。ＡＴＭキナーゼ活性は、本明細書に記載するようにまたは当該技術分野において公知のように評価することができる。いくつかの実施形態では、ＡＴＭ分子は、ＣＯＰ１分子に結合できるおよび／またはＣＯＰ１分子をリン酸化できるＡＴＭポリペプチドまたはそのフラグメントを含むものである。
【００４８】
「ｐ５３」は、３９３アミノ酸リンタンパク質をコードする強力な腫瘍サプレッサータンパク質である。ｐ５３は、多くの癌において負の制御を受けるか、変異するものである。ｐ５３の欠損または不活性化は、癌の一因となり得る。ｐ５３の変異は、多岐にわたる。「野生型」ｐ５３は、通常の、すなわち、非癌性の細胞で見られるｐ５３または癌と相関する変異を持たないｐ５３である。サンプルにおけるｐ５３の状態（サンプルが野生型または突然変異のｐ５３を含むかどうかなど）については、たとえば、Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎらに付与された米国特許第６，０９０，５６６号に記載のように、あるいは、本明細書に記載するようなまたは当該技術分野において公知の標準的な技法を用いて評価することができる。ｐ５３分子は、たとえば、受託番号Ｐ０４６３７に記載のものと実質的に同一の配列を含むポリペプチドまたは核酸分子を含んでいても構わないが、これに限定されるものではない。
【００４９】
ｐ２１または「ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１」については最初、サイクリン依存性キナーゼの一般的な阻害剤として説明されていた。ｐ２１は、ｐ５３依存性機構によってもｐ５３非依存性機構によっても誘導され、細胞増殖の阻害剤として知られている。
【００５０】
ポリペプチド、核酸分子および試験化合物の調製
ポリペプチドの構造の場合、そのペプチドの生物学的機能を実質的に変えずに、ある程度の修飾および変更を行い、たとえば、高い安定性など、所望の特性を持つ生物学的に等価なポリペプチドを得ることができることは、当該技術分野において周知である。さらに、本発明の一態様では、本発明の化合物を、アミノ酸置換または生物学的機能に影響を与えない他の置換によっても、生物学的に等価なペプチドまたは本発明のＣＯＰ１ポリペプチドの配列と一部異なる模倣体まで拡大させる。
【００５１】
たとえば、ＣＯＰ１化合物については、ＣＯＰ１ペプチドまたはＣＯＰ１ペプチドの類似体もしくは模倣体の任意の位置、たとえば、ヒトＣＯＰ１ポリペプチドのセリン３８７と相同である位置で、ヒトＣＯＰ１ポリペプチドのセリン３８７の代わりに、他の保存的アミノ酸残基、すなわち、トレオニン、グルタミン酸塩またはアスパラギン酸塩など、類似の物理的、生物学的または化学的性質を持つ残基により、あるいは、非保存的アミノ酸残基により、アミノ酸残基の交換、欠失または挿入を行ってから、たとえば、この化合物がＡＴＭポリペプチドに結合する能力、または活性化されたＡＴＭポリペプチドによりリン酸化される能力、またはｐ５３／ＣＯＰ１複合体を破壊する能力をスクリーニングすることで調製することができる。こうした化合物については、本発明の診断上の方法、治療上の方法、スクリーニングの方法等、どのような方法にも用いることができる。
【００５２】
本明細書で使用する場合、「保存されたアミノ酸置換」という語は、あるアミノ酸と、重要な機能を実質的に失うことなく置換を行うことができる、ペプチドの一定の位置での別のアミノ酸との置換をいう。こうした変更を行う際には、たとえば、大きさ、電荷、疎水性、親水性などが比較的類似している側鎖置換基をベースとして、似ているアミノ酸残基を置換することができ、こうした置換がペプチドの機能に及ぼす作用については、日常的な試験により、アッセイを行うことができる。いくつかの実施形態では、保存されたアミノ酸置換とは、ヒトＣＯＰ１ポリペプチドのセリン３８７と相同であるアミノ酸残基と、トレオニンもしくはチロシンなどのリン酸化可能なアミノ酸またはグルタミン酸塩もしくはアスパラギン酸塩などのリン酸化模倣体との交換をいう。
【００５３】
本明細書で使用する場合、「アミノ酸」という語は、天然タンパク質、Ｄ−アミノ酸および修飾されているときのアミノ酸に一般に見られるＬ−アミノ酸をいう。したがって、本発明のアミノ酸には、たとえば：２−アミノアジピン酸；３−アミノアジピン酸；β−アラニン；β−アミノプロピオン酸；２−アミノ酪酸；４−アミノ酪酸；ピペリジン酸；６−アミノカプロン酸；２−アミノヘプタン酸；２−アミノイソ酪酸；３−アミノイソ酪酸；２−アミノピメリン酸；２，４  ジアミノ酪酸；デスモシン；２，２’−ジアミノピメリン酸；２，３−ジアミノプロピオン酸；Ｎ−エチルグリシン；Ｎ−エチルアスパラギン；ヒドロキシリシン；ａｌｌｏ−ヒドロキシリシン；３−ヒドロキシプロリン；４−ヒドロキシプロリン；イソデスモシン；ａｌｌｏ−イソロイシン；Ｎ−メチルグリシン；サルコシン；Ｎ−メチルイソロイシン；６−Ｎ−メチルリシン；Ｎ−メチルバリン；ノルバリン；ノルロイシン；およびオルニチンを含めてもよい。
【００５４】
いくつかの実施形態では、あるアミノ酸残基と、親水性の値が類似している（値がプラスマイナス２．０またはプラスマイナス１．５またはプラスマイナス１．０またはプラスマイナス０．５以内など）別のアミノ酸残基とを置換する、保存されたアミノ酸置換を行ってもよく、以下：Ａｒｇ（＋３．０）；Ｌｙｓ（＋３．０）；Ａｓｐ（＋３．０）；Ｇｌｕ（＋３．０）；Ｓｅｒ（＋０．３）；Ａｓｎ（＋０．２）；Ｇｌｎ（＋０．２）；Ｇｌｙ（０）；Ｐｒｏ（−０．５）；Ｔｈｒ（−０．４）；Ａｌａ（−０．５）；Ｈｉｓ（−０．５）；Ｃｙｓ（−１．０）；Ｍｅｔ（−１．３）；Ｖａｌ（−１．５）；Ｌｅｕ（−１．８）；Ｉｌｅ（−１．８）；Ｔｙｒ（−２．３）；Ｐｈｅ（−２．５）；およびＴｒｐ（−３．４）は、Ｔｙｒ（−１．３）またはＰｒｏ（−１．６）など、（本明細書に援用する米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されているように）アミノ酸残基に付与されるハイドロパシックインデックスが約−１．６であるアミノ酸であり得るものである。
【００５５】
別の実施形態では、あるアミノ酸残基と、ハイドロパシックインデックスが類似している（値がプラスマイナス２．０またはプラスマイナス１．５またはプラスマイナス１．０またはプラスマイナス０．５以内など）別のアミノ酸残基とが置換される場合、保存的アミノ酸置換が可能である。こうした実施形態では、疎水性および電荷特性に基づき、各アミノ酸残基に、以下のとおりハイドロパシックインデックスを割り当てる：Ｉｌｅ（＋４．５）；Ｖａｌ（＋４．２）；Ｌｅｕ（＋３．８）；Ｐｈｅ（＋２．８）；Ｃｙｓ（＋２．５）；Ｍｅｔ（＋１．９）；Ａｌａ（＋１．８）；Ｇｌｙ（−０．４）；Ｔｈｒ（−０．７）；Ｓｅｒ（−０．８）；Ｔｒｐ（−０．９）；Ｔｙｒ（−１．３）；Ｐｒｏ（−１．６）；Ｈｉｓ（−３．２）；Ｇｌｕ（−３．５）；Ｇｌｎ（−３．５）；Ａｓｐ（−３．５）；Ａｓｎ（−３．５）；Ｌｙｓ（−３．９）；およびＡｒｇ（−４．５）。
【００５６】
別の実施形態では、一般に入手可能な類似のマトリックスファミリーにより保存的アミノ酸置換が可能である２３〜２９。ＰＡＭマトリックスは、進化モデルから得られる計算結果をベースにしている一方、Ｂｌｏｓｕｍマトリックスは、アラインメント内で高度に保存されたブロックから得られる計算結果を用いる。ＰＡＭマトリックスまたはＢｌｏｓｕｍマトリックスのいずれかにおけるゼロを超える類似性のスコアを用いて、保存的アミノ酸置換を行うことができる。
【００５７】
別の実施形態では、あるアミノ酸残基と、同じクラスの別のアミノ酸残基とを置換する、保存的アミノ酸置換が可能であり、アミノ酸を非極性：Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ；酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；塩基性：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；中性：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒのように非極性クラス、酸性クラス、塩基性クラスおよび中性クラスに分類する。
【００５８】
保存的アミノ酸の変更は、対応するＤ−アミノ酸、保存的Ｄ−アミノ酸または非遺伝的にコードされた天然形態のアミノ酸によるＬ−アミノ酸の置換ばかりでなく、Ｌ−アミノ酸の保存的置換を含んでいてもよい。非遺伝的にコードされた天然のアミノ酸には、β−アラニン、３−アミノ−プロピオン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、アルファ−アミノイソ酪酸、４−アミノ−酪酸、Ｎ−メチルグリシン（サルコシン）、ヒドロキシプロリン、オルニチン、シトルリン、ｔ−ブチルアラニン、ｔ−ブチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、２−ナプチルアラニン、ピリジルアラニン、３−ベンゾチエニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、２−フルオロフェニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、ペニシラミン、１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリン−３−カルボン酸、β−２−チエニルアラニン、メチオニンスルホキシド、ホモアルギニン、Ｎ−アセチルリシン、２−アミノ酪酸、２−アミノ酪酸、２，４，−ジアミノ酪酸、ｐ−アミノフェニルアラニン、Ｎ−メチルバリン、ホモシステイン、ホモセリン、システイン酸、イプシロン−アミノヘキサン酸、デルタ−アミノ吉草酸または２，３−ジアミノ酪酸がある。
【００５９】
別の実施形態では、保存的アミノ酸の変更は、親水性もしくは疎水性、大きさもしくは量または電荷を考慮した変更を含むものである。アミノ酸は通常、主にアミノ酸側鎖の特性により、疎水性または親水性なものとして特徴付けることができる。Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇらの正規化コンセンサス疎水性スケール３０によれば、疎水性アミノ酸はゼロを超える疎水性を示し、親水性アミノ酸はゼロ未満の親水性を示す。遺伝的にコードされた疎水性アミノ酸は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＭｅｔおよびＴｒｐを含み、遺伝的にコードされた親水性アミノ酸は、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、ＳｅｒおよびＬｙｓを含むものである。非遺伝的にコードされた疎水性アミノ酸には、ｔ−ブチルアラニンがあり、非遺伝的にコードされた親水性アミノ酸には、シトルリンおよびホモシステインがある。
【００６０】
側鎖の特徴に基づき、疎水性または親水性アミノ酸をさらに細分することができる。たとえば、芳香族アミノ酸は、側鎖に少なくとも１つの芳香環または芳香族複素環を持つ疎水性アミノ酸であり、芳香環または芳香族複素環は、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＮ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＯ２、−ＮＯ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−ＮＲＲ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲなど、１つまたは複数の置換基を含んでいてもよく、Ｒは独立に、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルケニル、置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキニル、置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルキニル、（Ｃ５〜Ｃ２０）アリール、置換（Ｃ５〜Ｃ２０）アリール、（Ｃ６〜Ｃ２６）アルカリル、置換（Ｃ６〜Ｃ２６）アルカリル、５〜２０員ヘテロアリール、置換５〜２０員ヘテロアリール、６〜２６員アルケテロアリールまたは置換６〜２６員アルケテロアリールである。遺伝的にコードされた芳香族アミノ酸は、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐを含み、非遺伝的にコードされた芳香族アミノ酸は、フェニルグリシン、２−ナプチルアラニン、β−２−チエニルアラニン、１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリン−３−カルボン酸、４−クロロフェニルアラニン、２−フルオロフェニルアラニン３−フルオロフェニルアラニンおよび４−フルオロフェニルアラニンを含むものである。
【００６１】
無極性アミノ酸は、生理的ｐＨで無電荷であり、通常、２個の原子が共有する１対の電子を、その２個の原子それぞれが均等に保有している（すなわち、側鎖に極性がない）結合を有する側鎖を持つ疎水性アミノ酸である。遺伝的にコードされた無極性アミノ酸は、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、ＡｌａおよびＭｅｔを含み、非遺伝的にコードされた無極性アミノ酸は、シクロヘキシルアラニンを含むものである。無極性アミノ酸については、さらに細分して、脂肪族炭化水素側鎖を持つ疎水性アミノ酸である脂肪族アミノ酸を含めてもよい。遺伝的にコードされた脂肪族アミノ酸は、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ＶａｌおよびＩｌｅを含み、非遺伝的にコードされた脂肪族アミノ酸は、ノルロイシンを含むものである。
【００６２】
極性アミノ酸は、生理的ｐＨで無電荷だが、２個の原子が共有する１対の電子を、その原子の１個がより引きつけている１つの結合を有する側鎖を持つ親水性アミノ酸である。遺伝的にコードされた極性アミノ酸は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎを含み、非遺伝的にコードされた極性アミノ酸は、シトルリン、Ｎ−アセチルリシンおよびメチオニンスルホキシドを含むものである。
【００６３】
酸性アミノ酸は、側鎖のｐＫａ値が７未満の親水性アミノ酸である。酸性アミノ酸は一般に、水素イオンの喪失により側鎖が生理的ｐＨで負電荷を帯びている。遺伝的にコードされた酸性アミノ酸は、ＡｓｐおよびＧｌｕを含むものである。塩基性アミノ酸は、側鎖のｐＫａ値が７を超える親水性アミノ酸である。塩基性アミノ酸は一般に、ヒドロニウムイオンとの会合により側鎖が生理的ｐＨで正電荷を帯びている。遺伝的にコードされた塩基性アミノ酸は、Ａｒｇ、ＬｙｓおよびＨｉｓを含み、非遺伝的にコードされた塩基性アミノ酸は、非環式アミノ酸オルニチン、２，３，−ジアミノプロピオン酸、２，４−ジアミノ酪酸およびホモアルギニンを含むものである。
【００６４】
当業者であるならば、上記の分類が絶対的なものではなく、アミノ酸を複数のカテゴリーに分類できることを理解するであろう。さらに、アミノ酸については、既知の挙動およびまたは特定のアッセイに基づくあるいは既に同定されたアミノ酸との比較による特有の化学的、物理的または生物学的特質を基準に分類することもできる。さらに、アミノ酸には、アミノ酸様側鎖を持つ二官能性部分を含めてもよい。
【００６５】
また、保存的変更は、たとえば、アミノ酸の官能性側鎖を反応性させることで、化学的に誘導体化された部分と非誘導体化残基との置換を含んでもよい。このため、これらの置換には、遊離アミノ基を誘導体化してアミンヒドロクロリド、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基にしてある化合物を含めることができる。同様に、遊離カルボキシル基を誘導体化して塩、メチルエステルおよびエチルエステルもしくはこれ以外のタイプのエステルまたはヒドラジドを形成し、側鎖を誘導体化して、遊離ヒドロキシル基の代わりにＯ−アシル誘導体もしくはＯ−アルキル誘導体またはヒスチジンのイミダゾール窒素の代わりにＮ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを形成することができる。また、ペプチド類似体または模倣体には、たとえば、メチル化、エチルアミン、エタノールアミンまたはエチレンジアミンなどのアルキルアミンによるＣ末端アミノ酸のアミド化、あるいは、アミノ酸側鎖のアシル化またはメチル化（リシンのイプシロンアミノ基のアシル化など）により化学変化しているアミノ酸を含めてもよい。さらに、ペプチドの類似体または模倣体は、ペプチドのアミド結合と、置換アミド（たとえば、式−Ｃ（Ｏ）−ＮＲで、式中、Ｒは、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキニル、置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルケニルまたは置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルキニルである基）またはアミド結合のイソスター（たとえば、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ）、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−または−ＣＨ２ＳＯ−）との置き換えを含んでいてもよい。
【００６６】
この化合物については、たとえば、ポリメリゼーションまたはコンジュゲーションにより共有結合させ、ホモポリマーまたはヘテロポリマーを形成することができる。生理条件下で無電荷のアミノ酸など、一般に中性小分子からなるスペーサーおよびリンカーを用いてもよい。リンケージについては、多くの方式で行うことができる。たとえば、ペプチド末端にシステイン残基を付加して、酸化を調節することで複数のペプチドを共有結合させることができる。あるいは、ジスルフィド／アミド形成剤またはチオエーテル／アミド形成剤など、ヘテロ二機能性剤を用いてもよい。この化合物を、たとえば、癌細胞またはＤＮＡ損傷細胞を標的にする、あるいは、癌細胞またはＤＮＡ損傷細胞の成長または増殖を抑制する、あるいは、癌細胞またはＤＮＡ損傷細胞の死を誘発することが可能な別の化合物に結合させることもできる。また、たとえば、環状部分を与えることで、この化合物を制限することもできる。
【００６７】
ペプチドまたはペプチドの類似体もしくは模倣体については、標準的な化学的技法、たとえば、液相合成法または固相合成法を用いた自動合成により合成することができる。当該技術分野において周知の技法を用いた自動ペプチドシンセサイザーが、市販されている。さらに、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら３１またはＡｕｓｕｂｅｌら８の文献に記載の方法など、標準的な方法を用いた組換えＤＮＡ技術により、ペプチドおよびペプチドの類似体または模倣体を調製することもできる。
【００６８】
いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、ＣＯＰ１もしくはＡＴＭの核酸分子またはこれらのフラグメントと実質的に同一の、あるいは、ＣＯＰ１もしくはＡＴＭの核酸分子またはこれらのフラグメントと相補的な核酸分子を含むものである。本発明のアッセイおよび方法では、こうした核酸分子を、たとえば、プローブまたはプライマーとして用いてもよい。「プローブ」または「プライマー」は、相補配列（標的）を含む第２のＤＮＡまたはＲＮＡ分子と塩基対合することができる定義された配列の一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。得られるハイブリッド分子の安定性は、起こる塩基対合の程度によって決まり、プローブと標的分子との相補性の程度およびハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーの程度などのパラメータの影響を受ける。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーの程度については、温度、塩濃度およびホルムアミドなどの有機分子の濃度など、パラメータにより影響受けるもので、当業者に公知の方法によって測定する。本明細書に記載の核酸配列に特異的なプローブもしくはプライマーまたはその部分の長さは、プローブまたはプライマーを用いる目的および条件にもよるが、任意の整数単位で少なくとも８ヌクレオチドから５００ヌクレオチド超まで、その間の任意の値を含めて幅があってもよい。たとえば、プローブまたはプライマーは、８ヌクレオチド長、１０ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長または２５ヌクレオチド長でもよく、あるいは、少なくとも３０ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長または６０ヌクレオチド長でもよく、あるいは、１００ヌクレオチド長、２００ヌクレオチド長、５００ヌクレオチド長または１０００ヌクレオチド長を超えても構わない。本明細書に記載の核酸分子に特異的なプローブまたはプライマーは、本明細書に記載の核酸配列に対する配列同一性が２０〜３０％を超えるまたは少なくとも５５〜７５％または少なくとも７５〜８５％または少なくとも８５〜９９％または１００％であってもよい。
【００６９】
プローブまたはプライマーについては、たとえば、増幅によりゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡから、あるいは、クローン化ＤＮＡセグメントから得てもよく、単一個体に由来する単一遺伝子の全部または一部に相当するゲノムＤＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列のいずれかを含んでも構わない。プローブは、配列が独特（ＣＯＰ１またはＡＴＭの核酸分子に対する同一性が１００％など）および／または公知である可能性もある。プローブまたはプライマーを化学的に合成してもよい。
【００７０】
プローブまたはプライマーについては、当業者に公知の方法により、放射性物質または非放射性物質のどちらかで検出可能に標識することができる。核酸ハイブリダイゼーションに関する方法、たとえば、核酸シークエンシング、ポリメラーゼ連鎖反応法による核酸増幅、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）解析、制限断片多型（ＲＦＬＰ）解析、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）および当業者に公知のこれ以外の方法には、プローブまたはプライマーを用いることができる。
【００７１】
核酸分子は、たとえば、細胞の標的分子の発現を抑制するのに使用できるアンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ分子または三重螺旋分子であっても構わない。
【００７２】
いくつかの実施形態では、試験化合物は、有機小分子を含むものである。「有機小分子」とは、分子量が約５０ダルトンより大きく約２５００ダルトン未満、好ましくは約２０００ダルトン未満、好ましくは約１００〜約１０００ダルトン、一層好ましくは約２００〜約５００ダルトンである天然または合成の有機分子をいう。
【００７３】
本発明のいくつかの実施形態では、試験化合物は、リン酸化または結合など、ＣＯＰ１／ＡＴＭ相互作用を誘発できるペプチド、核酸分子、模倣体または小分子、抗体または他の試薬を含むものである。
【００７４】
候補化合物または試験化合物については、天然物または合成（もしくは半合成）抽出物の両方の大きなライブラリーあるいは当該技術分野において公知の方法による化学ライブラリーから特定することができる。創薬および薬剤開発分野の当業者であれば、被検抽出物または化合物の正確な供給源が本発明の方法（単数または複数）にとって決定的には重要でないことを理解するであろう。したがって、実質的には、本明細書に記載の例示的方法により、どのような化学抽出物または化合物をスクリーニングしても構わない。こうした抽出物または化合物の例として、植物ベースの抽出物、真菌ベースの抽出物、原核生物ベースの抽出物または動物ベースの抽出物、発酵ブロスおよび合成化合物ならびに既存の化合物の変形があるが、これに限定されるものではない。さらに、多くの方法を利用して、糖類ベースの化合物、脂質ベースの化合物、ペプチドベースの化合物および核酸ベースの化合物を含むが、これに限定されるものではく、どのような化合物（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）もランダム合成または指向性合成（半合成または全合成など）を行うことができる。合成化合物のライブラリーは、市販されている。あるいは、細菌抽出物、真菌抽出物、植物抽出物および動物抽出物の形態での天然化合物のライブラリーも、Ｂｉｏｔｉｃｓ（英国、Ｓｕｓｓｅｘ）、Ｘｅｎｏｖａ（英国、Ｓｌｏｕｇｈ）、Ｈａｒｂｏｒ  Ｂｒａｎｃｈ  Ｏｃｅａｎｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（米国フロリダ州、Ｆｔ．Ｐｉｅｒｃｅ）および米国マサチューセッツ州のＰｈａｒｍａＭａｒなど、多くの供給元から市販されている。また、天然ライブラリーおよび合成製造ライブラリーについては、必要に応じて、標準的な抽出法および分画法など、当該技術分野において公知の方法に従っても製造できるものである。さらに、必要に応じて、どのようなライブラリーまたは化合物も、標準的な化学的方法、物理的方法または生化学的な方法により容易に修飾を行うこともできる。
【００７５】
粗抽出物が、たとえば、ＣＯＰ１／ＡＴＭ相互作用を高めることが判明した場合、その観察された作用に関与する化学成分を単離するため、正リードの抽出物をさらに分画することが必要になる。このため、抽出、分画および精製プロセスの目的は、活性を高めるＣＯＰ１／ＡＴＭ相互作用を有する粗抽出物中の化学物質のキャラクタリゼーションおよび同定を慎重に行うことにある。化合物の混合物における活性を検出する本明細書に記載の同じアッセイを用いて、活性成分の精製およびその誘導体の試験を行ってもよい。こうした異種抽出物の分画および精製の方法は、当該技術分野において公知である。処置に有用な薬剤であることが示された化合物については、当該技術分野において公知の方法に従って、必要に応じて化学修飾を行う。続いて、治療上、予防上、診断上またはその他の価値が認められた化合物を、癌または放射線損傷の観点から、たとえば、任意の動物モデルを用いて解析してもよい。
【００７６】
診断的、治療的、予防的および／またはスクリーニングの使用、アッセイおよび試薬
本発明による化合物、組成物（医薬組成物など）および方法を用いて、ＤＮＡ損傷の診断または検出、被験体におけるＤＮＡ損傷および／またはｐ５３活性に対する応答の調節、あるいは被験体におけるＤＮＡ損傷および／またはｐ５３に対する応答の調節に有用な試験化合物のスクリーニングまたは同定を行うことができる。
【００７７】
本明細書で使用する場合、被験体は、ヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、雌ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ハエ、蠕虫等であってもよい。被験体は、臨床患者、治験ボランティア、実験動物等であってもよい。被験体は、癌またはＤＮＡ損傷があるあるいは癌またはＤＮＡ損傷が生じる危険があると疑われても、癌またはＤＮＡ損傷と診断されていても、癌またはＤＮＡ損傷がないと確認されている対照被験体であっても、ＤＮＡ損傷または癌が誘発される被験体であっても構わない。好ましい一実施形態では、被験体はヒトである。
【００７８】
本明細書で論じているように、ＣＯＰ１の発現レベルの低下を測定することで、ＤＮＡ損傷を診断または検出し、ＣＯＰ１発現の低下からＤＮＡ損傷が示されてもよいし、ＣＯＰ１リン酸化を測定することで、ＤＮＡ損傷を診断または検出し、ヒトＣＯＰ１ポリペプチドのセリン３８７と相同であるアミノ酸でＣＯＰ１リン酸化が起こることから、ＤＮＡ損傷が示されてもよい。
【００７９】
「検出」は、物質の有無の判定または物質の量の定量化を含むことを意図している。したがって、この語は、本発明の化合物、組成物および方法を用いて、定性的および定量的判定を行うことを指す。一般に、本発明の実施にあたり、検出に使用する具体的手法は、決定的には重要ではない。たとえば、本発明による「検出」は、当該技術分野において公知のまたは以下に記載の方法による、ＣＯＰ１ポリペプチド、たとえば、ヒトＣＯＰ１ポリペプチドのＳ３８７と相同であるアミノ酸残基のリン酸化の変化；ＣＯＰ１、ＡＴＭ、ｐ２１もしくはｐ５３の遺伝子、ゲノムまたは核酸分子あるいはＣＯＰ１、ＡＴＭ、ｐ２１またはｐ５３のポリペプチドの有無；ＣＯＰ１、ＡＴＭ、ｐ２１またはｐ５３の遺伝子の変異；ＣＯＰ１、ＡＴＭ、ｐ２１またはｐ５３の核酸分子、たとえば、ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルの変化；ＣＯＰ１ポリペプチドの生物学的機能／活性の変化（ＣＯＰ１リガーゼ活性、ｐ５３ターンオーバー、ｐ５３依存性トランス活性化の活性化の抑制など）またはｐ５３ポリペプチドの生物学的機能／活性の変化（ｐ５３結合、ｐ５３依存性トランス活性化、ＣＯＰ１結合、ｐ２１のトランス活性化等など）の検出を含んでもよい。いくつかの実施形態では、「検出」には、野生型ｐ５３の検出を含めてもよい。いくつかの実施形態では、「検出」は、変異ｐ５３の検出を含んでもよい。検出は、対照と比較して、１０％〜９０％の任意の値または３０％〜６０％の任意の値または１００％を超える任意の値の変化（増加または減少）の定量化を含んでも構わない。検出は、対照と比較して、３倍、５倍、７倍など、２倍から１０倍の任意の値の変化、あるいはそれ以上、たとえば、５０倍または１００倍などの変化の定量化を含んでもよい。
【００８０】
応答の「増強」または結合もしくはリン酸化などの相互作用の増強は、応答または相互作用の促進、あるいは、対照と比較して１０％〜９０％または３０％〜６０％または１００％を超える任意の値だけ、既存の応答または相互作用の強化を含んでもよい。増強は、対照と比較して、３倍、５倍、７倍など、２倍〜１０倍の任意の値、あるいはそれ以上、たとえば、５０倍または１００倍などの増加を含んでもよい。たとえば、本発明による「増強」は、当該技術分野において公知のまたは以下に記載の方法による、ＣＯＰ１ポリペプチド、たとえば、ヒトＣＯＰ１ポリペプチドのＳ３８７と相同であるアミノ酸残基のリン酸化の変化；ＣＯＰ１、ＡＴＭ、ｐ２１またはｐ５３の核酸分子、たとえば、ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルの変化；ＣＯＰ１ポリペプチドの生物学的機能／活性の変化（ＣＯＰ１リガーゼ活性、ｐ５３ターンオーバー、ｐ５３依存性トランス活性化の活性化の抑制など）またはｐ５３ポリペプチドの生物学的機能／活性の変化（ｐ５３結合、ｐ５３依存性トランス活性化、ＣＯＰ１結合、ｐ２１のトランス活性化等など）の増加または促進を含んでもよい
発現の「低下」とは、実質的にＤＮＡ損傷がない細胞における通常の発現レベルなどの対照と比較してＣＯＰ１のような特定の分子のポリペプチドの発現が減ることをいう。ＣＯＰ１分子の発現の低下を示す細胞は、ｐ５３分子（ｐ５３ポリペプチドなど）の発現の増加またはｐ２１分子（ｐ２１ｍＲＮＡなど）の発現の増加またはｐ５３活性もしくはｐ２１活性の増強を示すことがある。こうした増減は、対照と比較して１０％〜９０％の任意の値または３０％〜６０％の任意の値または１００％を超える任意の値でもよく、対照と比較して３倍、５倍、７倍など、２倍から１０倍の任意の値の変化、あるいはそれ以上、たとえば、５０倍または１００倍などの変化であってもよい。過剰発現または減少が統計的に有意であれば、過剰発現もしくは増加または低下もしくは減少の正確な量は、決定的には重要ではない。
【００８１】
「対照」は、ベースラインの発現または活性の測定用に得たサンプルを含めてもよい。したがって、（標準的な技法で判断された）ＤＮＡ損傷のない細胞；被験体の腫瘍細胞または癌細胞の周囲の細胞などに由来する非癌性の細胞または組織；癌またはＤＮＡ損傷による障害のない被験体；癌またはＤＮＡ損傷が生じる危険がないと思われる被験体；またはこうした被験体から得られる細胞または細胞系などから、多くの手段によって対照サンプルを得ることができる。さらに、対照には、既に確立された基準を含めてもよい。したがって、本発明により行われる任意の試験またはアッセイと、確立された基準とを比較検討してもよく、比較を行うごとに対照サンプルを得る必要はないかもしれない。インビトロでのユビキチン化アッセイでは、対照は、ｐ５３分子をユビキチン化する能力が低下しているＣＯＰ１分子（ＣＯＰ１Δリングなどのリガーゼドメインが欠損している分子等）であってもよい。インビトロまたはインビボでのキナーゼアッセイでは、対照は、リン酸化されていることが分かっているまたはリン酸化され得ないＣＯＰ１分子など、キナーゼ失活のＡＴＭであってもよい。
【００８２】
本発明による試薬は、本明細書に記載するような化合物を含むものである。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載するような化合物を含む哺乳類細胞などの細胞を包含する。たとえば、哺乳類細胞については、組換え技法などにより操作して、組換えＡＴＭ、組換えＣＯＰ１および／または組換えｐ５３分子を含ませてもよい。こうした哺乳類細胞を用いて、たとえば、ＣＯＰ１／ＡＴＭ相互作用（結合および／またはリン酸化など）を増強する、ｐ５３／ＣＯＰ１結合を破壊するあるいはｐ５３またはＣＯＰ１活性を増加させる試験化合物をスクリーニングすることができる。こうした細胞を試験化合物とともにインキュベートし、細胞周期、ＡＴＭキナーゼ活性、ｐ２１発現、ｐ５３誘導性アポトーシス、ｐ５３依存性トランス活性化、ＣＯＰ１リガーゼ活性等の変化についてアッセイすることもできる。ｐ２１−ルシフェラーゼなど、レポーターベースのコンストラクトを、バックグラウンドとして内部標準のウミシイタケルシフェラーゼレポーターと一緒に、さらにはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ技法と一緒に用いてもよい。こうした哺乳類細胞については、たとえば、ｐ５３野生型細胞系（Ｕ２−ＯＳ細胞）、ｐ５３ヌル細胞系（Ｈ１２９９）、ＡＴＭヌル細胞系（ＧＭ０２０５２またはＧＭ０９６０７）など、既存の細胞系において操作することが可能で、ＣＯＰ１分子、ＡＴＭ分子またはｐ５３分子を発現するように操作してもよい。したがって、ＣＯＰ１分子またはＡＴＭ分子については、Ａ−Ｔ細胞、癌細胞、組織または細胞可溶化物に導入してもよいし、組換え技法を用いて構築してもよい。細胞および／または細胞系を米国ヴァージニア州ＭａｎａｓｓａｓにあるＡＴＣＣなどの商業的供給源から入手することもできる。
【００８３】
本発明によるアッセイについては、標準的供給源および標準的手順により取得したサンプルを用いてインビボ、インビトロまたはエキソビボで行うことができる。組織マイクロアレイなどのマイクロアレイを用いてもよい。癌またはＤＮＡ損傷に関しては、米国メイン州Ｂａｒ  ＨａｒｂｏｒにあるＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙなどから入手できる好適な動物モデルにおいてインビボアッセイを行ってもよい。
【００８４】
いくつかの実施形態では、ＡＴＭ、ＣＯＰ１またはｐ５３の発現または活性が欠損している動物モデルを用いても構わない。「サンプル」は、癌またはＤＮＡ損傷がある哺乳類から単離したサンプルなど、被験体から単離した任意の臓器、組織、細胞または細胞抽出物であってもよい。たとえば、サンプルとして、骨、脳、乳房、結腸、筋肉、神経、卵巣、前立腺、網膜、皮膚、骨格筋、腸、精巣、心臓、肝臓、腎臓、胃、膵臓、子宮、副腎、扁桃、脾臓、軟部組織、末梢血、全血、赤血球濃縮物、濃厚血小板、白血球濃縮物、血球タンパク質、血漿、多血小板血漿、血漿濃縮物、血漿の任意分画による沈殿物、血漿の任意分画による上清、血漿タンパク質画分、精製されたもしくは部分的に精製された血液タンパク質またはその他の成分、血清、精液、哺乳類の初乳、乳、尿、便、唾液、脳脊髄液、心膜液、腹膜水、胎盤抽出物、羊水、クリオプレシピテート、寒冷上清、細胞可溶化物、哺乳類細胞培養液または培地、発酵産物、腹水、血液細胞にあるタンパク質、充実性腫瘍（ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｕｒｓ）または患者（ヒトまたは動物）、被験者または実験動物から取得したこれ以外の検体もしくはその任意の抽出物に由来する細胞または組織（生検または剖検由来など）が挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、サンプル中の癌性の細胞と非癌性細胞とをまたはＤＮＡ損傷のある細胞と損傷を受けていない細胞とを区別することが望ましい場合がある。
【００８５】
サンプルは、正常細胞または形質転換細胞（組換えＤＮＡまたはモノクローナル抗体の技術によるなど）による細胞培養液で生成される産物を含んでいてもよいが、これに限定されるものではない。さらに、サンプルは、昆虫または蠕虫など、非哺乳動物の被験体から単離した任意の器官、組織、細胞または細胞抽出物を含んでいても構わないが、これに限定されるものではない。「サンプル」はまた、被験体から直接単離されたものではない、実験条件下で作製された細胞または細胞系であってもよい。さらに、サンプルは、無細胞のもの、人工的に調製したものまたは合成したものであっても構わない。サンプルは、癌であるまたはＤＮＡ損傷があると分かっている、癌であるまたはＤＮＡ損傷があることが疑われる、あるいは、癌ではないまたはＤＮＡ損傷がない（正常サンプルまたは対照サンプルなど）と考えられる細胞または組織由来であってもよい。
【００８６】
ＣＯＰ１、ｐ５３もしくはＡＴＭの核酸分子またはポリペプチドの発現または活性あるいはＣＯＰ１／ＡＴＭ結合またはＣＯＰ１／ｐ５３結合については、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、ノーザンブロッティング、ポリメラーゼ連鎖反応法（リアルタイム定量ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲなど）、抗体ベースのアッセイ（免疫沈降、免疫蛍光、ウエスタンブロッティング等）など、種々の技法を用いてアッセイを行うことができる。たとえば、サンプルから得られたＰＣＲ産生物のシークエンシング、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）解析または制限断片長多型（ＲＦＬＰ）解析などの方法を用いて、ＣＯＰ１またはｐ５３遺伝子の変異を検出することができ、免疫沈降、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロッティングを用いて、ＣＯＰ１またはＡＴＭまたはｐ５３のポリペプチドのレベルまたは結合を測定することができ、ノーザンブロッティングを用いて、ＣＯＰ１またはｐ５３のｍＲＮＡレベルを測定することができ、あるいは、ＰＣＲを用いて、ＣＯＰ１またはＡＴＭまたはｐ５３の核酸分子のレベルを測定することができる。こうしたアッセイは、前駆体、フラグメント（細胞内タンパク質分解による生成など）、翻訳後の修飾体など、ＣＯＰ１またはＡＴＭまたはｐ５３の一部またはすべての形態の検出を含むものである。本発明の方法は、自己ユビキチン化、ｐ５３の分解、ｐ５３のユビキチン化、ｐ５３トランス活性化の抑制、ｐ５３誘導性アポトーシスの抑制、ｐ２１ｍＲＮＡの減少等、ＣＯＰ１に関連する生物学的活性のアッセイを包含する。本発明の方法は、キナーゼ活性などのＡＴＭに関連する生物学的活性のアッセイを包含するものである。
【００８７】
いくつかの実施形態では、インビボで被験体の細胞を、放射性同位元素など、任意に検出可能に標識された抗体（ＣＯＰ１抗体および任意にＡＴＭまたはｐ５３抗体など）に曝露させてもよく、放射能の外部スキャンまたは生検の解析などにより抗体の細胞への結合を評価することが可能である。検出可能に標識された分子、すなわち、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー、遺伝子またはそのフラグメント、ペプチドまたはｃＤＮＡ分子など、目印を付けて分子の存在を同定する任意の手段を用いて、アッセイを行ってもよい。分子を検出可能に標識する方法については、当該技術分野において周知であり、放射性物質による標識（たとえば、３２Ｐまたは３５Ｓなどの同位元素の使用）および酵素標識（たとえば、西洋わさびペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼの使用）、化学発光標識、蛍光標識（たとえば、フルオレセインの使用）、生物発光標識またはプローブに結合したリガンドの抗体検出などの非放射性物質による標識が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに、本明細書の定義には、たとえば、第１の部分（ビオチン）と結合し、さらに、観察またはアッセイが可能な第２の部分に結合している分子（フルオレセイン標識ストレプトアビジンなど）など、間接的な手段により検出可能に標識される分子も含まれる。また、標識は、ジゴキシゲニン、ルシフェラーゼおよびエクオリンも含むものである。
【００８８】
いくつかの実施形態では、インビボで被験体の細胞を本明細書に記載するようなＣＯＰ１化合物に曝露させ、ＤＮＡ損傷またはｐ５３活性に対する応答を調節してもよい。ＣＯＰ１化合物は、ＣＯＰ１ポリペプチドまたはこれらのフラグメント、類似体、模倣体または変異体をコードする核酸分子であってもよい。
【００８９】
医薬組成物、投与量および投与
本発明の化合物については、リポソーム、アジュバントまたは任意の薬学的に許容されるキャリアの存在下で、単独あるいは他の化合物（たとえば、核酸分子、小分子、模倣体、ペプチドまたはペプチド類似体）と組み合わせて、たとえば、ヒト、マウス等の哺乳類への投与に好適な形態で提供することができる。たとえば、被験体において、本発明の化合物を用いて、ＤＮＡ損傷、ｐ５３活性、ＣＯＰ１活性またはＡＴＭ活性に対する応答を調節することができる。
【００９０】
いくつかの実施形態では、本発明による治療用化合物は、ＣＯＰ１の分子もしくは核酸分子または小分子、模倣体、ペプチドもしくはそのペプチド類似体、たとえば、ヒトＣＯＰ１ポリペプチドのＳ３８７と相同であるリン酸化可能なアミノ酸残基を持つＣＯＰ１ポリペプチドを含むものである。本発明による化合物については、慢性的にまたは断続的に与えてもよい。「慢性」投与とは、当初の治療上の作用（活性）を維持する目的で、短期間に急性用量を投与するのではなく、化合物（単数または複数）を長期間に持続的に投与することをいう。「断続的」投与とは、その特定の化合物の処置を行わない期間が組み入れられている処置である。
【００９１】
通常の医療慣行に従って、好適な製剤または組成物を準備し、癌を患っているまたは癌の前駆症状の被験体に化合物を投与してもよい。適切な投与経路であれば、たとえば、非経口投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、頭蓋内投与、眼窩内投与、点眼投与、脳室内投与、嚢内投与、髄腔内投与、クモ膜下投与、大槽内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、エアロゾル投与、局所投与または経口投与など、どのような経路を用いてもよい。治療用製剤は、溶液状または懸濁液状であってもよく、経口投与の場合、製剤は、錠剤状またはカプセル状であってもよいし、鼻腔内製剤の場合は、粉末状、点鼻液状またはエアロゾル状であってもよい。
【００９２】
当該技術分野において製剤を製造するための周知の方法は、たとえば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（第１９版），Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編，１９９５年，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ペンシルベニア州Ｅａｓｔｏｎに見られる。非経口投与用の製剤は、たとえば、賦形剤、滅菌水もしくは生理食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物性油または水素化ナプタレンを含んでいてもよい。生体適合性かつ生分解性のラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマーまたはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーを用いて、この化合物の放出を制御してもよい。これ以外に有用な非経口送達系になり得るものとして、エチレン−酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、移植可能な注入系およびリポソームが挙げられる。吸入用の製剤は、賦形剤、たとえば、ラクトースを含んでいてもよく、たとえば、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココラートおよびデオキシコラートを含む水溶液であってもよいし、点鼻液状のまたはゲルとしての投与用油性溶液であっても構わない。新生物の成長の治療用または予防用（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃまたはｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）組成物の場合は、癌および所望の結果にもよるが、この化合物をＤＮＡ損傷または癌の成長もしくは憎悪を予防する、抑制する、あるいは遅延させるのに十分な量で個体に投与することができる。腫瘍成長を処置する化合物の有効性の尺度として、ＤＮＡ損傷細胞数の減少；癌細胞数の減少または癌細胞の消失、腫瘍の大きさの縮小；癌細胞の周辺臓器への浸潤の抑制（すなわち、予防、抑制、遅延または停止）；腫瘍の転移の抑制（すなわち、予防、抑制、遅延または停止）；ある程度の腫瘍成長の抑制；および／または特定の癌と関連する１つまたは複数の症状のある程度の緩和ならびに罹患率および死亡率の低下のうち１つまたは複数の観測可能および／または測定可能な減少または消失、または癌細胞もしくはＤＮＡ損傷がある細胞のアポトーシスまたは細胞死の増加が挙げられる。
【００９３】
本発明による化合物の「有効量」は、治療有効量または予防有効量を含むものである。「治療有効量」とは、ＤＮＡ損傷細胞数の減少；癌細胞数の減少または癌細胞の消失、腫瘍の大きさの縮小；癌細胞の周辺臓器への浸潤の抑制（すなわち、予防、抑制、遅延または停止）；腫瘍の転移の抑制（すなわち、予防、抑制、遅延または停止）；ある程度の腫瘍成長の抑制；および／または特定の癌と関連する１つまたは複数の症状のある程度の緩和ならびに罹患率および死亡率の低下のうち１つまたは複数の観測可能および／または測定可能な減少または消失、または癌細胞もしくはＤＮＡ損傷がある細胞のアポトーシスまたは細胞死の増加など、所望の治療結果を実現するために必要な投与量および期間に応じた有効量をいう。化合物の治療有効量は、個体の病状、年齢、性別および体重ならびに個体において所望の応答を惹起する化合物の能力などの要因次第で変化する場合がある。最適な治療応答を与えるためには、投与計画を調整してもよい。治療有効量はまた、化合物に有毒または有害な作用があれば、治療上の有益な作用がこうした作用を上回る量でもある。「予防有効量」とは、ＤＮＡ損傷細胞数の減少；癌細胞数の減少または癌細胞の消失、腫瘍の大きさの縮小；癌細胞の周辺臓器への浸潤の抑制（すなわち、予防、抑制、遅延または停止）；腫瘍の転移の抑制（すなわち、予防、抑制、遅延または停止）；ある程度の腫瘍成長の抑制；および／または特定の癌と関連する１つまたは複数の症状のある程度の緩和ならびに罹患率および死亡率の低下のうち１つまたは複数の観測可能および／または測定可能な減少または消失、または癌細胞もしくはＤＮＡ損傷がある細胞のアポトーシスまたは細胞死の増加など、所望の治療結果を実現するために必要な投与量および期間に応じた有効量をいう。被験体には、予防有効量が治療有効量よりも少なくなるように、疾患になる前またはその初期に予防用量を用いるのが一般的である。化合物の治療有効量または予防有効量の好ましい範囲は、０．１ｎＭ〜０．１Ｍ、０．１ｎＭ〜０．０５Ｍ、０．０５ｎＭ〜１５μＭまたは０．０１ｎＭ〜１０μＭの任意の値をとり得る。
【００９４】
投与量の値は、緩和される症状の重症度により異なることに留意されたい。任意の特定の被験体の場合、個体の必要性と、組成物を投与するまたは組成物の投与を監督する個人の専門的な判断とにより、個々の投与計画を経時的に調整してもよい。本明細書に記載する投与量の範囲は、例示的なものにとどまっており、開業医が選択できる投与量の範囲を限定するものではない。組成物における活性化合物（単数または複数）の量は、個体の病状、年齢、性別および体重などの要因により異なっても構わない。最適な治療応答を与えるように、投与計画を調整してもよい。たとえば、単回ボーラス投与を行ってもよいし、用量をいくつかに分けて経時的に投与してもよいし、治療状況の急迫性に合わせて、用量を比例的に増減させてもよい。投与のしやすさおよび投与量の均一性の観点から、投薬単位剤形で非経口組成物を調剤すると都合がよい場合がある。
【００９５】
一般に、本発明の化合物については、有害作用をあまり起こさないように用いるべきである。本発明の化合物の有害作用に関しては、標準的な技法、たとえば、細胞培養液または実験動物で試験を行い、治療係数、すなわち、ＬＤ５０（個体群の５０％致死用量）〜ＬＤ１００（個体群の１００％致死用量）の比率を測定することで判定することができる。しかしながら、時として、重篤な病状では、組成物のかなり過剰な投与が必要な場合がある。
【００９６】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本発明による化合物（ＣＯＰ１のポリペプチドもしくは核酸分子または小分子、模倣体、ペプチドもしくはそのペプチド類似体など）と一緒に薬学的に許容されるキャリアをコードしている核酸分子を含んでいてもよい。こうした医薬組成物に関しては、ウイルスベクター系などの任意の適切な手法を用いて投与することができる。好適なウイルスベクターとして、アデノウイルス、ワクシニアウイルスまたはこれ以外のポックスウイルス、疱疹ウイルスなどが挙げられ、こうしたベクターを投与する任意の方法を用いることができる。
【実施例】
【００９７】
実施例１：材料および方法
発現ベクター、組換えタンパク質および抗体
ＦＬＡＧ−ＣＯＰ１、ｐｃＤＮＡ３．１＋ｐ５３、ｐ２１−Ｌｕｃ、ｂａｘ−Ｌｕｃ、ｐＧＥＸ４Ｔｌ−ｐ５３およびｐＧＥＸ６Ｐｌ−ＣＯＰ１については前述した３、２１。ＧＳＴ−Ｓ３８７ペプチドは、ヒトＣＯＰ１ポリペプチドのアミノ酸３７７〜４００を含むものであり、ＧＳＴ−Ｓ３８７−Ａペプチドは、Ｓ３８７がアラニン変異しているものである。ＦＬＡＧ−ＡＴＭおよびＦＬＡＧ−ＡＴＭ−ＫＤについては、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｋａｓｔａｎ教授（Ｓｔ．Ｊｕｄｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、テネシー州）が明らかにしたものである。すべての変異コンストラクトをＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により作製した。すべてのＧＳＴ組換えタンパク質を、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）コドン＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に発現させた後、グルタチオンセファロース４Ｂのバッチ法（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。抗ｐ５３（ＤＯ−１）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、抗ｐ５３ｐｓ１５（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）、抗ｐ２１（Ａｂ−１）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、抗ＦＬＡＧ（Ｍ２）（Ｓｉｇｍａ）、抗Ｍｙｃ（９Ｅ１０）（Ｒｏｃｈｅ）、抗アクチン（ＩＣＮ）、抗チューブリン（Ａｂ６１６１）（Ａｂｅａｍ）、抗ヒストン−Ｈ１（ＳＣ８０３０）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＧＳＴ（ＲＰＮ１２３６）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および抗ＨＡ（Ｒｏｃｈｅ）を、製造者の推奨に従って用いた。抗ＣＯＰ１については、前述した３、２２。抗ｐＳ３８７は、ペプチドＡｃ−ＤＳＲＴＡ（ｐＳ）ＱＬＤＥＦＣ−ＮＨ２を抗原として用いてリン酸化ペプチドおよび非リン酸化ペプチドのアフィニティー精製により順次精製を行い、ＱＣＢによって作製したウサギポリクローナル抗体である。
【００９８】
細胞、形質移入およびレポーターアッセイ
Ｕ２−ＯＳ細胞、Ｓａｏｓ−２細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＨ１２９９細胞をＡＴＣＣから購入し、ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１０％ＦＢＳとともに維持した。ＧＭ０２０５２線維芽細胞、ＧＭ０３４９０線維芽細胞、ＧＭ０６３７線維芽細胞およびＧＭ０９６０７線維芽細胞をＣｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓから取得し、ＭＥＭ（ＡＴＣＣ）で１５％ＦＢＳとともに維持した。すべての形質移入を製造者の推奨に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。細胞質および核の抽出を、１０ＧｙのＩＲで処理したＧＭ０３４９０およびＧＭ０２０５２または種々のＣＯＰ１コンストラクト１００ｎｇを形質移入したＨＥＫ２９３細胞およびＵ２−ＯＳ細胞を含むＮＥ−ＰＥＲ（Ｐｉｅｒｃｅ）キットを用いて行った。定常状態レベルのｐ５３に与えるＣＯＰ１の作用を評価するため、１５０ｎｇのｐｃＤＮＡ３．１＋ｐ５３とともに、ＦＬＡＧ−ＣＯＰ１またはＦＬＡＧ−ＣＯＰ１−Ｓ３８７Ｄを増量（０．５μｇ、１μｇおよび２μｇ）しながら、Ｓａｏｓ−２細胞に形質移入した。レポーターアッセイの場合は、ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＯＰ１またはｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＯＰ１−Ｓ３８７Ｄを増量（０．５、１および２μｇ）しながらあるいは増量せずに、１５０ｎｇのｐｃＤＮＡ３．１＋ｐ５３、１００ｎｇのｐ２１−Ｌｕｃおよび１０ｎｇのｐＲＬ−ＴＫを一過性でＳａｏｓ−２細胞に形質移入した。製造者の指示（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従って、デュアルルシフェラーゼアッセイを実施した。
【００９９】
免疫沈降、ＧＳＴプルダウンアッセイおよびパルスチェイス解析
細胞を放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）緩衝液（０．１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％デオキシコレート、５０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＤＴＴおよびプロテアーゼ阻害剤の混合物）に溶解させ、前処理してから、標的抗体およびプロテインＡ／Ｇプラスビーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともに免疫沈降させた。インビトロプルダウンアッセイに関しては、ＧＳＴまたはＧＳＴ−ｐ５３と、ＰＢＳＴ（０．１％のツイーン２０および１ｍＭのＤＴＴを含むＰＢＳ）中で哺乳類細胞から精製したＦＬＡＧ−ＣＯＰ１またはＦＬＡＧ−ＣＯＰ１−Ｓ３８７Ｄとを組み合わせて、緩やかに回転させながら室温で１時間インキュベートして行った。ＦＬＡＧペプチド（Ｓｉｇｍａ）でＣＯＰ１結合タンパク質を溶出させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけてから、抗ＦＬＡＧおよび抗ＧＳＴでイムノブロットした。シクロヘキサアミド追跡実験については、１００μｇ／ｍｌのＣＨＸとともに細胞をインキュベートし、指定の時点で採取して行った。
【０１００】
インビトロユビキチン化およびキナーゼアッセイ
ＦＬＡＧ−ＣＯＰ１−ＷＴまたはＦＬＡＧ−ＣＯＰ１−Ｓ３８７ＤをＨＥＫ２９３Ｔ細胞から精製し、５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、２ｍＭのＡＴＰ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、２０μＭのＺｎＣｌ２、２ｍＭのＤＴＴおよび２μＭのユビキチンアルデヒドを含む緩衝液中で、１０μｇのユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ）、２μｇのＢｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ−ユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ）、２０ｎｇのＵｂｃＨ５ｂ（Ａ．Ｇ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２０ｎｇのウサギＥ１（Ｓｉｇｍａ）とともにインキュベートした。指示がある場合、大腸菌から精製した１００ｎｇのＧＳＴ−ｐ５３をこの反応液に加えた。緩やかに撹拌しながら３０℃で２時間インキュベートした後、反応物を、１％ＳＤＳを含むＰＢＳＴ中で５分間煮沸し、次いで、抗ＦＬＡＧまたは抗ｐ５３（ＦＬ３９３）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともに再免疫沈降を行うため、ＰＢＳＴで０．１％ＳＤＳに希釈した。最後に、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけてから、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でイムノブロットして、ＣＯＰ１またはｐ５３のユビキチン化種を検出した。内在性ＡＴＭおよび外来性ＡＴＭにより、前述のようにキナーゼアッセイを行った２０。指示のとおり、ワートマニン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）およびカフェイン（Ｓｉｇｍａ）を用いた。
【０１０１】
コロニー形成アッセイ
Ｈ１２９９細胞を１０ｃｍのペトリ皿に蒔き、２４時間後、この細胞に指定の発現ベクターを形質移入した。ゼオシン（６００μｇ／ｍｌ）で１０日間トランスフェクト細胞の選択を行った。次いで、この培地を除去し、コロニーをＰＢＳで２回洗浄し、氷冷メタノールにて−２０℃で１０分間固定した後、メタノールを吸引して０．５％クリスタルバイオレット溶液とともに１０分間インキュベートした。その後、このプレートを蒸留水で洗浄し、風乾させた。２０を超える細胞を含む染色したコロニーを、倒立顕微鏡で記録して数えた。このような独立した実験を３回実施し、計算はそれぞれ二重反復で行った。
【０１０２】
実施例２：ＩＲに曝露するとＣＯＰ１は翻訳後に修飾される
本発明者らは、１０ＧｙのＩＲにより誘発されたＤＮＡ損傷後のＣＯＰ１の定常状態のレベルを、ＧＭ０６３７線維芽細胞を用いて調べた。ＣＯＰ１に対する抗体でプローブしたライセートから、ＩＲ後早くも３０分で、ＣＯＰ１の定常状態レベルが低下し始め、１時間（図１Ａ）でほとんどゼロになることが明らかになった。とりわけ、ｐ５３の定常状態のレベルは、ＣＯＰ１レベルが低下し始めると増加しており、このことは、下流の標的遺伝子ｐ２１（図１Ａおよび図１Ｂ）の活性化と整合していた。こうしたＣＯＰ１タンパク質の減少の機序を明らかにするため、リアルタイムＰＣＲを実施してＣＯＰ１遺伝子座の遺伝子活性を評価した。ＩＲによる刺激後に、ＣＯＰ１ｍＲＮＡのレベルは、若干増加した。さらに、ＩＲ障害後には、２つの古典的なｐ５３依存性プロモーターであるｐ２１およびＰＵＭＡプロモーターも誘発されたが、規模は、ＣＯＰ１プロモーターよりもはるかに大きかった。したがって、これらのデータから、ＣＯＰ１タンパク質レベルの低下が、ＣＯＰ１のｍＲＮＡレベルの低下に起因し得ないことが示される。このため、シクロヘキサアミド（ＣＨＸ）パルスチェイス実験を行って、こうした制御が翻訳後レベルでのものかどうかを判定した。ＧＭ０６３７線維芽細胞内では、ＣＯＰ１の半減期は３０分を超える一方、細胞を１０ＧｙのＩＲに曝露すると、７分強まで劇的に短縮した（図１Ｃ）。こうしたデータから、ＣＯＰ１は、ＩＲへの曝露を受けて、翻訳後に修飾されることが示される。
【０１０３】
実施例３：ＣＯＰ１の修飾はＡＴＭ依存性である
ＡＴＭは、ＤＮＡ損傷のシグナル伝達経路に対する一次応答物質であるため、ＡＴＭリン酸化が起こり得る部位を決定した。ＣＯＰ１には、５種類のＳＱモチーフ（図１Ｄ）があるが、ＳＱ３（Ｓ３８７）は、このセリン残基がアラニンに変異すると、ＩＲ後のＣＯＰ１の定常状態レベルでの低下を抑えるため、最も重要であった（図１Ｅ）。Ｓ３８７がＡＴＭを介したリン酸化の本物の標的であるどうかを判定するため、ＧＳＴペプチドを大腸菌から精製し、ＡＴＭ野生型またはＡＴＭヌルの線維芽細胞から免疫沈降させたＡＴＭと一緒にインビトロキナーゼアッセイの基質として用いた（図２Ａ）。実際、ＡＴＭは、Ｓ３８７（ＧＳＴ−ＣＯＰ１−ＷＴ）およびｐ５３Ｓ１５（ＧＳＴ−ｐ５３）、古典的ＡＴＭ基質を含むペプチドをリン酸化することができた１７。これに対して、ＡＴＭは、Ｓ３８７Ａ変異（ＧＳＴ−ＣＯＰ１−Ａ）を含むペプチドをリン酸化することができなかった。全長ＣＯＰ１がＡＴＭの基質であり、Ｓ３８７がＣＯＰ１の主要なＳＱ部位であったことを確認するため、インビトロキナーゼアッセイでは、全長ＣＯＰ１およびＣＯＰ１−Ｓ３８７Ａを大腸菌から精製し、組換えＡＴＭまたはＡＴＭ−ＫＤとともにインキュベートした（図５）。ＣＯＰ１をＡＴＭ−ＫＤでなくＡＴＭとともにインキュベートすると、ＣＯＰ１−Ｓ３８７Ａ変異タンパク質とは対照的に、ＣＯＰ１から強いリン酸シグナルが発生した。これらのデータから、Ｓ３８７がインビトロでＡＴＭの主要部位であることが示される。したがって、リン酸化Ｓ３８７に対する、リン酸特異的なポリクローナル抗体をウサギで産生し、精製してから、ペプチドＥＬＩＳＡ（図７）およびＡＴＭを用いたインビトロキナーゼアッセイによって（図８）特徴付けを行った。ＡＴＭがインビボでＣＯＰ１をリン酸化することができるかどうかを判定するために、ＡＴＭまたはＡＴＭ−ＫＤとともにあるいはＡＴＭまたはＡＴＭ−ＫＤ無しで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＦＬＡＧ−ＣＯＰ１を形質移入した。ライセートをＦＬＡＧ抗体とともに免疫沈降させ、抗ｐＳ３８７抗体を用いてウエスタンブロッティングにかけた（図２Ｂ）。ＡＴＭを同時形質移入した場合、ｐＳ３８７ＣＯＰ１に対応する特異的な結合だけが検出されたが、λホスファターゼ処理で消滅した。
【０１０４】
インビボでＡＴＭとＣＯＰ１との相互作用が存在するかどうかを判定するために、ＦＬＡＧ−ＡＴＭを単独であるいはＨＡ−ＣＯＰ１とともに、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質移入し、エトポシドによるＤＮＡ損傷処理またはビヒクル対照であるＤＭＳＯ処理に付した（図２Ｃ）。ＦＬＡＧ−ＡＴＭとともにＨＡ−ＣＯＰ１を形質移入したときだけ、ＡＴＭは、わずかではあるが抗ＨＡビーズでプルダウンされた。一方、細胞をエトポシドで処理すると、ＨＡ−ＣＯＰ１でプルダウンされるＡＴＭの量は著しく増加した。これは、ＣＯＰ１とＡＴＭとの相互作用がＤＮＡ損傷誘導性であることを示唆するものである。ＩＲ後のＣＯＰ１の定常状態レベルの低下およびターンオーバーの増加（それぞれ、図１Ａおよび図１Ｃ）は、ＡＴＭの存在に起因していたかどうかを評価するため。Ａ−Ｔ患者由来の線維芽細胞（ＧＭ０９６０７）をＩＲで処理し、ウエスタンブロッティング用に様々な時点で採取した。興味深いことに、ＡＴＭヌルの線維芽細胞では、ＣＯＰ１タンパク質の定常レベルの低下は、軽度であった（図２Ｄ）。これは、ｐ５３の安定化の消失およびｐ２１タンパク質の誘発と相関した。次に、抗ｐＳ３８７抗体を用いて、ＡＴＭ−ＷＴおよびＡ−Ｔの線維芽細胞のＡＴＭ−リン酸化ＣＯＰ１を探索した（図２Ｅ）。とりわけ、ＡＴＭ−ＷＴの線維芽細胞内では、ＤＮＡ損傷誘導剤であるブレオマイシンの存在下でのみ、ＣＯＰ１ｐＳ３８７が検出されたのが目立った。ＡＴＭ−ＷＴの線維芽細胞では、ｐ５３ｐＳ１５が検出された一方、Ａ−Ｔの線維芽細胞では、ほとんど検出できなかった。Ａ−Ｔ細胞でｐＳ３８７ＣＯＰ１を検出できなかったところを見ると、この部位の修飾は、ＡＴＭ依存性であろう。
【０１０５】
実施例４：自己ユビキチン化を促進することで、ＡＴＭＳによる３８７のリン酸化は、ＣＯＰ１のターンオーバーを増加させるのに十分になる
外来性ＡＴＭをＳａｏｓ−２細胞に導入し、外来性および内在性ＣＯＰ１タンパク質の定常状態のレベルを評価した。外来性ＡＴＭを導入すると、外来性および内在性ＣＯＰ１タンパク質のレベルは、劇的に低下した（それぞれ、図２Ｆおよび図９）が、対照的にＡＴＭ−ＫＤは、外来性ＣＯＰ１または内在性ＣＯＰ１のどちらの定常状態レベルにも何ら作用を及ぼさなかった。ＩＲに曝露した後、ＣＯＰ１をターンオーバーさせるため、本発明者らは、ＡＴＭを介したこのターンオーバーが２６Ｓプロテアソームによるものかどうかを確認したいと考えた。このため、ＨＡ−ＣＯＰ１およびＦＬＡＧ−ＡＴＭを形質移入した後に、Ｓａｏｓ−２細胞をプロテアソーム阻害剤で処理した（図２Ｇ）。ＡＴＭを形質移入すると、ＣＯＰ１が著しく減少したものの、プロテアソーム阻害剤で細胞を処理すると、これが完全に抑制された。このことから、ＡＴＭによるＣＯＰ１のリン酸化は、ＣＯＰ１のプロテアソーム依存性分解を促進していることが示される。本発明者らは、ＡＴＭの活性化に応答してＣＯＰ１がユビキチン化されるかどうかを調査した。Ｈ１２９９細胞に、ＨＡタグ付ユビキチンと、ＡＴＭまたはＡＴＭ−ＫＤと、ＣＯＰ１とを形質移入し、ライセートを採取する前にユビキチン化産物が蓄積するようにプロテアソーム阻害剤で前処理した。ＣＯＰ１を抗ＦＬＡＧとともに免疫沈降させ、抗ＨＡでユビキチン化種を検出した（図２Ｈ）。ＣＯＰ１単独の形質移入した場合、検出可能なユビキチン産物は少量であったが、ＣＯＰ１とともにＡＴＭを同時形質移入した場合は、ＡＴＭ−ＫＤを同時形質移入した場合と対照的に、ユビキチン化ＣＯＰ１を示す著しいシグナルが見られた。ＡＴＭがＣＯＰ１のユビキチン化およびその後の分解を促進するという事実に鑑み、本発明者らは、ＡＴＭがＣＯＰ１のリング変異（Ｃ１３６／１３９Ｓ）の分解のシグナル伝達を行うかどうかを判定したいと考えた。ＣＯＰ１自体が自己ユビキチン化するならば、ＡＴＭはＣＯＰ１のリング変異の分解を促進できないであろうというのがその根拠である。Ｓａｏｓ−２細胞に、ＦＬＡＧ−ＣＯＰ１またはＦＬＡＧ−Ｃ１３６／１３９Ｓと、ＡＴＭまたはＡＴＭ−ＫＤとを形質移入し、イムノブロッティングでＣＯＰ１タンパク質の定常状態レベルを評価した（図２１）。前の実験で確認されたように、ＡＴＭでは、ＣＯＰ１の定常状態レベルが急低下した一方、ＡＴＭ−ＫＤの作用は見られなかった。これに対し、リング変異は、ＡＴＭによる分解に抵抗性を示した。これらのデータから、ＡＴＭによりリン酸化されると、ＣＯＰ１の自己ユビキチン化およびその後の分解が促進されることが示される。この問題にさらに取り組むため、ＣＯＰ１−ＷＴおよびＣＯＰ１−リング変異をそれぞれ陽性対照および陰性対照として用いてインビトロの自己Ｅ３ユビキチン化アッセイ（図２Ｊ）ができるように、ＣＯＰ１−Ｓ３８７Ｄ変異を作製し、このセリン残基のリン酸化を模倣するため、これを哺乳類細胞から精製した（図１０）。ＣＯＰ１−ＷＴでは、自己Ｅ３活性が適度に見られたが、ＣＯＰ１のリング変異では、自己ユビキチン化が見られなかった。対照的に、Ｓ３８７Ｄ  ＣＯＰ１変異では、著しい自己Ｅ３リガーゼ活性が見られ���これは、ＡＴＭによるリン酸化により自己Ｅ３の機序を介してＣＯＰ１ユビキチン化が増強されるという考え方と整合する。Ｓ３８７Ｄ変異がインビトロの自己Ｅ３リガーゼ活性を増強すると考えると、この変異は、インビボではさらに速い速度でターンオーバーされるはずである。この可能性に取り組むため、ＦＬＡＧ−ＣＯＰ１またはＦＬＡＧ−Ｓ３８７Ｄを形質移入したＵ２−ＯＳ細胞でＣＨＸパルスチェイス実験を実施し、ＣＨＸとともにインキュベートした後、指定の時点で細胞を採取した（図２Ｋ）。ライセートのウエスタンブロッティングを行ったところ、トランスフェクトＣＯＰ１では半減期が約５０分であるのに対し、Ｓ３８７Ｄ変異では、対照的にターンオーバーが早く、半減期が約１５分であることが明らかになった。よって、これらのデータから、自己ユビキチン化を促進することで、ＡＴＭによるＳ３８７のリン酸化は、ＣＯＰ１のターンオーバーを増加させることが示される。
【０１０６】
実施例５：ＡＴＭによるＳ３８７でのＣＯＰ１の修飾は、ＤＮＡ損傷に応答するＣＯＰ１の細胞質プールを促進するのに十分である
本発明者らは、免疫蛍光を用いてＨ１２９９細胞のおける、ＩＲの前後の外来性ＣＯＰ１の局在を調べた（図１１）。局在の解析によれば、ＤＡＰＩによる同時染色および像のオーバーラップにより評価した場合、ＣＯＰ１が核コンパートメントに主に局在していることが明らかになった。驚いたことに、１０ＧｙのＩＲで２時間曝露すると、ＣＯＰ１は、主に細胞質コンパートメントに局在していた。次に、本発明者らは、ＡＴＭを対象とした野生型（ＧＭ０３４９０）または切断型（ＧＭ０２０５２）の初代線維芽細胞内の生化学的分画により、内在性ＣＯＰ１の局在を評価した。ＤＮＡ損傷剤をまったく用いなかった場合、内在性ＣＯＰ１は、Ｈ１２９９細胞の外来性ＣＯＰ１研究（図１０）と同様に、野生型線維芽細胞およびＡ−Ｔ線維芽細胞の核画分にもっぱら局在していた（図３Ａ）。逆に、エトポシドで処理すると、ＣＯＰ１のおよそ５０％がＧＭ０３４９０線維芽細胞の細胞質画分に存在したが、Ａ−Ｔ線維芽細胞では、検出可能な細胞質ＣＯＰ１は検出されなかった。これらのデータから、細胞質コンパートメント内のＣＯＰ１の局在は、ＡＴＭ依存性であることが示唆される。ＡＴＭはＳ３８７でＣＯＰ１をリン酸化する能力があるため、本発明者らは、このＳ３８７での修飾が細胞質局在にとって十分であるかどうかを判定したいと考えた。このため、１０ＧｙのＩＲの前後でＣＯＰ１−Ｓ３８７Ｄの局在を解析し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の野生型ＣＯＰ１と比較検討した（図３Ｂ）。ＷＴ−ＣＯＰ１は、細胞質コンパートメントおよび核コンパートメントにおよそ１：１で局在していた。これに対し、ＣＯＰ１−Ｓ３８７Ｄタンパク質は、ＤＮＡ損傷剤をまったく加えなかった場合、細胞質／核の局在が４：１と著しい比率を示した。また、細胞をＩＲで処理した場合、ＣＯＰ１−Ｓ３８７Ｄの細胞質／核の比率をさらに高めることができなかったのに対し、ＷＴ−ＣＯＰ１の細胞質／核の比率は１：１からおよそ３：１まで上昇した。これらのデータから、Ｓ３８７でのＡＴＭによるＣＯＰ１の修飾は、ＤＮＡ損傷に応答するＣＯＰ１の細胞質プールを促進するのに十分であることが示唆される。
【０１０７】
実施例６：ＣＯＰ１−Ｓ３８７Ｄは、ｐ５３の分解で傷害され、ｐ５３依存性の遺伝子トランス活性化を示す
Ｈ１２９９細胞（ｐ５３−ｌ−）に、ＨＡ−ｐ５３とともにあるいはＨＡ−ｐ５３無しで、ＦＬＡＧ−ＣＯＰ１をコードするコンストラクトを形質移入し、これをブレオマイシンで２時間処理し、ＣＯＰ１とｐ５３との相互作用を免疫沈降によって判定した（図４Ａ）。抗ＦＬＡＧ抗体を用いてＣＯＰ１のウエスタンブロッティングを行ったところ、ＨＡビーズとの結合は、ＨＡ−ｐ５３を同時形質移入したときにだけ見られたが、ブレオマイシンがＤＮＡ損傷を誘導すると、この相互作用は、著しく阻害された。ＨＡ−ｐ５３を抗ＦＬＡＧビーズとともに免疫沈降させた逆ＩＰの場合も、ＦＬＡＧ−ＣＯＰ１を同時形質移入したときにだけ、同様の結果が得られた（図４Ｂ）。ＤＮＡ損傷後にＳ３８７でＣＯＰ１がリン酸化されると見られることから、本発明者らは、この修飾がｐ５３／ＣＯＰ１複合体の破壊に関与しているかどうかを判定したいと考えた。このため、本発明者らは、免疫沈降により、細胞においてＣＯＰ１−Ｓ３８７Ｄ変異が、ＷＴ−ＣＯＰ１との比較でｐ５３との複合体を形成する能力を保持しているかどうかを評価した（図４Ｄ）。ＩＰのウエスタンブロッティングを行ったところ、ＷＴ−ＣＯＰ１とは対照的に、ＣＯＰ１−Ｓ３８７Ｄと複合体を形成できるｐ５３は、かなり少ないことが明らかになった（デンシトメトリーによる評価では、約３分の１）。さらに、本発明者らは、これらの観察結果を、精製ＣＯＰ１−Ｓ３８７Ｄ（図９）および大腸菌由来の精製ＧＳＴ−ｐ５３を用いてインビトロで再現し、ｐ５３結合が約５分の１に減少することを検出することができた（図４Ｄ）。ＣＯＰ１とｐ５３との相互作用が完全に消失したわけではないが、Ｓ３８７がリン酸化すると、インビトロおよびインビボでのＣＯＰ１のｐ５３との結合は、少なくとも３分の１に減少することは明らかである。さらに、このことは、ＣＯＰ１−Ｓ３８７Ｄがインビトロでｐ５３をユビキチン化する能力の低下と相関する（図４Ｅ）。したがって、これらの観察結果から、ＡＴＭがＳ３８７でＣＯＰ１を修飾すれば、ｐ５３の腫瘍サプレッサー機能を抑制するＣＯＰ１の能力を阻害する可能性があることが示唆される。そこで、一過性形質移入アッセイで、ＣＯＰ１−Ｓ３８７Ｄがｐ５３を分解する能力を保持するかどうかを判定する実験を行った。Ｓａｏｓ−２細胞に、ＣＯＰ１−ＷＴまたはＣＯＰ１−Ｓ３８７Ｄの滴定量を増やしながら、ｐ５３を形質移入した（図４Ｆ）。ライセートを採取し、抗ｐ５３を用いてウエスタンブロットを行ったところ、ＣＯＰ１−ＷＴを同時形質移入した場合、ｐ５３の定常状態レベルが急低下するのに対し、ＣＯＰ１−Ｓ３８７Ｄを同時形質移入した場合には、ｐ５３のレベルは、わずかな低下にとどまった。これらのデータは、ｐ２１タンパク質のレベルおよびｐ２１遺伝子トランス活性化の能力のレベル（それぞれ、図４Ｆおよび図４Ｇ）とも相関していた。故に、これらのデータによれば、ＣＯＰ１−Ｓ３８７Ｄは、ｐ５３の分解およびｐ５３依存性の遺伝子トランス活性化の抑制時に傷害されることが示唆される。これが適切な生理学的読み出しと相関することを検証するため、コロニー形成アッセイを行い、Ｈ１２９９細胞中でｐ５３依存性機能を阻害する際のＣＯＰ１−ＷＴおよびＣＯＰ１−Ｓ３８７Ｄの長期的な作用をモニターした（図４Ｈ）。ｐ５３を形質移入した場合、生存コロニーはほとんど見られなかった一方、ＣＯＰ１をｐ５３とともに同時形質移入した場合には、ｐ５３だけの場合（６×１０３ｃｆｕ）およびＣＯＰ１−ＷＴだけの入場合（７２×１０３ｃｆｕ）と比べて、かなりの数のコロニー（２５×１０３ｃｆｕ）をレスキューした。まったく対照的に、ＣＯＰ１−Ｓ３８７Ｄでは、ｐ５３とともに同時形質移入した場合（６×１０３ｃｆｕ）に、ｐ５３だけの場合（６×１０３ｃｆｕ）およびＣＯＰ１−Ｓ３８７Ｄだけの場合（７７×１０３ｃｆｕ）と比べて、コロニーの数をあまり回復させることができなかった。
【０１０８】
（参考文献）
以下の刊行物は、参考として本明細書に援用される。
【０１０９】
【化３】
2009521925.tif 000004
【０１１０】
【化４】
2009521925.tif 000005
【０１１１】
【化５】
2009521925.tif 000006
その他の実施形態
本明細書では、本発明の種々の実施形態を開示しているが、当業者の共通一般知識によれば、本発明の範囲内で多くの適合および変更が可能である。こうした変更には、本発明の任意の態様と周知の等価物とを置換して、実質的に同じ要領で同じ結果を得ることが含まれる。本明細書で使用する場合、受託番号とは、ヌクレオチド配列に関するＧｅｎＢａｎｋ、欧州分子生物学研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（ＥＭＢＬ）、日本ＤＮＡデータベース（ＤＤＢＪ）またはゲノム配列データベース（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ  Ｂａｓｅ）（ＧＳＤＢ）など、およびＰｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＰＩＲ）、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ、蛋白質研究奨励会（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）（ＰＲＦ）および蛋白質構造データバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ）（ＰＤＢ）（解析された構造の配列）などの複数のデータベースに加えてポリペプチド配列に関する、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪまたはＲｅｆＳｅｑのヌクレオチド配列の注釈付きコード領域からの翻訳の受託番号をいう。数値の範囲は、その範囲を規定する数を含む。本明細書では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語を非限定的な用語として用いており、「含むが、これに限定されるものではない」という慣用句と実質的に等価であり、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という語は、対応する意味を持つものである。本明細書で参考文献を引用していても、こうした参考文献が本発明の従来技術であることを認めているものと解釈してはならない。すべての公報については、個々の公報を具体的に個々に示して参照によって本明細書に援用しているように、および、本明細書に全体を記載しているように本明細書に援用する。さらに、２００５年１２月３１日に出願された米国特許仮出願第６０／７５５，４１２号についても、参照によってその全体を本明細書に緩用する。本発明は、上文に記載したような、ならびに、実施例および図面に関連する、実質的にすべての実施形態および変形を含むものである。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１Ａ】図１Ａ〜図１Ｅは、ＣＯＰ１がＩＲ後にターンオーバーされ、Ｓ３８７に依存的であることを示す。図１Ａでは、ＩＲに曝露した場合、ＣＯＰ１の定常状態レベルが低下している。
【図１Ｂ】図１Ａ〜図１Ｅは、ＣＯＰ１がＩＲ後にターンオーバーされ、Ｓ３８７に依存的であることを示す。図１Ｂでは、ＣＯＰ１のｍＲＮＡレベルは低下していないが、ＩＲに曝露した場合には上昇している。
【図１Ｃ】図１Ａ〜図１Ｅは、ＣＯＰ１がＩＲ後にターンオーバーされ、Ｓ３８７に依存的であることを示す。図１Ｃでは、シクロヘキサアミドパルスチェイスで評価すると、ＣＯＰ１がＩＲ後にターンオーバーされている。
【図１Ｄ】図１Ａ〜図１Ｅは、ＣＯＰ１がＩＲ後にターンオーバーされ、Ｓ３８７に依存的であることを示す。図１Ｄは、ＣＯＰ１にあると考えられるＳＱモチーフである。
【図１Ｅ】図１Ａ〜図１Ｅは、ＣＯＰ１がＩＲ後にターンオーバーされ、Ｓ３８７に依存的であることを示す。図１Ｅでは、ＩＲに曝露した場合、ＣＯＰ１−Ｓ３８７Ａは、分解に対して抵抗性を示す。
【図２Ａ】図２Ａ〜図２Ｋは、ＡＴＭがＣＯＰ１を負に制御する。図２Ａでは、内在性ＡＴＭがインビトロでＳ３８７を含むＣＯＰ１  ＧＳＴ−ペプチドをリン酸化できる。
【図２Ｂ】図２Ａ〜図２Ｋは、ＡＴＭがＣＯＰ１を負に制御する。図２Ｂでは、ＡＴＭがインビボでＳ３８７リン酸化する。
【図２Ｃ】図２Ａ〜図２Ｋは、ＡＴＭがＣＯＰ１を負に制御する。図２Ｃでは、ＣＯＰ１がインビボでＡＴＭと相互に作用し、ＤＮＡ損傷後に増加する。
【図２Ｄ】図２Ａ〜図２Ｋは、ＡＴＭがＣＯＰ１を負に制御する。図２Ｄでは、ＣＯＰ１が定常状態レベルで減少し、ＡＴＭ依存性である。
【図２Ｅ】図２Ａ〜図２Ｋは、ＡＴＭがＣＯＰ１を負に制御する。図２Ｅでは、ＩＲ後のＳ３８７でのＣＯＰ１のリン酸化は、ＡＴＭのキナーゼ活性に依存的である。
【図２Ｆ】図２Ａ〜図２Ｋは、ＡＴＭがＣＯＰ１を負に制御する。図２Ｆでは、外来性ＡＴＭは、Ｓａｏｓ−２細胞におけるＣＯＰ１の定常状態レベルの低下を促進する。
【図２Ｇ】図２Ａ〜図２Ｋは、ＡＴＭがＣＯＰ１を負に制御する。図２Ｇでは、ＡＴＭによるＣＯＰ１の減少に２６Ｓプロテアソームが関与する。
【図２Ｈ】図２Ａ〜図２Ｋは、ＡＴＭがＣＯＰ１を負に制御する。図２Ｈでは、ＡＴＭは、キナーゼ依存的にＣＯＰ１のユビキチン化を促進する。
【図２Ｉ】図２Ａ〜図２Ｋは、ＡＴＭがＣＯＰ１を負に制御する。図２Ｉでは、ＣＯＰ１−Ｃ１３６／１３９Ｓのリング変異は、ＡＴＭ誘導分解に対して抵抗性を示す。
【図２Ｊ】図２Ａ〜図２Ｋは、ＡＴＭがＣＯＰ１を負に制御する。図２Ｊでは、Ｓ３８７のリン酸塩−模倣体は、インビトロでＣＯＰ１の自己ユビキチン化を促進する。
【図２Ｋ】図２Ａ〜図２Ｋは、ＡＴＭがＣＯＰ１を負に制御する。図２Ｋでは、ＣＯＰ１−Ｓ３８７Ｄは、ターンオーバー能力の向上を示す。
【図３】図３では、ＡＴＭは、細胞質へのＣＯＰ１の局在化を促進する。図３Ａでは、ＣＯＰ１は、ＤＮＡ損傷後にＡＴＭ依存的に細胞質に局在する。図３Ｂでは、ＣＯＰ１−Ｓ３８７Ｄは、主に細胞質コンパートメントに局在する。
【図４Ａ】図４Ａ〜図４Ｉでは、ＣＯＰ１によるｐ５３の負の制御は、ＡＴＭによるＳ３８７での修飾により弱められる。図４Ａでは、ＤＮＡ損傷に曝露された場合、ＣＯＰ１とｐ５３との相互作用は、抑制される。
【図４Ｂ】図４Ａ〜図４Ｉでは、ＣＯＰ１によるｐ５３の負の制御は、ＡＴＭによるＳ３８７での修飾により弱められる。図４Ｂでは、ＤＮＡ損傷に曝露された場合、ＣＯＰ１とｐ５３との相互作用は、抑制される。
【図４Ｃ】図４Ａ〜図４Ｉでは、ＣＯＰ１によるｐ５３の負の制御は、ＡＴＭによるＳ３８７での修飾により弱められる。図４Ｃでは、ＣＯＰ１−Ｓ３８７Ｄは、ｐ５３に結合する際の有効性が低下している。
【図４Ｄ】図４Ａ〜図４Ｉでは、ＣＯＰ１によるｐ５３の負の制御は、ＡＴＭによるＳ３８７での修飾により弱められる。図４Ｄでは、ｐ５３は、インビトロでＣＯＰ１−Ｓ３８７Ｄに結合する能力の低下を示す。
【図４Ｅ】図４Ａ〜図４Ｉでは、ＣＯＰ１によるｐ５３の負の制御は、ＡＴＭによるＳ３８７での修飾により弱められる。図４Ｅでは、ＣＯＰ１によるインビトロでのｐ５３のユビキチン化は、Ｓ３８７Ｄ変異により阻害される。
【図４Ｆ】図４Ａ〜図４Ｉでは、ＣＯＰ１によるｐ５３の負の制御は、ＡＴＭによるＳ３８７での修飾により弱められる。図４Ｆでは、ＣＯＰ１−Ｓ３８７Ｄは、ｐ５３を分解する際の有効性が低下している。
【図４Ｇ】図４Ａ〜図４Ｉでは、ＣＯＰ１によるｐ５３の負の制御は、ＡＴＭによるＳ３８７での修飾により弱められる。図４Ｇでは、ＣＯＰ１−Ｓ３８７Ｄは、ｐ５３依存性トランス活性化を阻害する際の力が低下している。
【図４Ｈ】図４Ａ〜図４Ｉでは、ＣＯＰ１によるｐ５３の負の制御は、ＡＴＭによるＳ３８７での修飾により弱められる。図４Ｈでは、ＣＯＰ１−Ｓ３８７Ｄは、ｐ５３腫瘍サプレッサー機能を負に制御できない。
【図４Ｉ】図４Ａ〜図４Ｉでは、ＣＯＰ１によるｐ５３の負の制御は、ＡＴＭによるＳ３８７での修飾により弱められる。図４Ｉは、ｐ５３軸に関するＡＴＭ  ＤＮＡ損傷の応答経路のモデルである。
【図５】図５では、全長ＣＯＰ１のＳ３８７は、インビトロでのＡＴＭリン酸化の主要部位である。
【図６】図６では、Ｓ３８７のＣＯＰ１  ＳＱ３は、哺乳類のオーソログで高度に保存されている。
【図７】図７は、ＥＬＩＳＡによるｐＳ３８７  ＣＯＰ１抗体のキャラクタリゼーションである。ｐＳ３８７抗体の濃度を変えながら、１ｎｇのペプチドをそれぞれ、ＥＬＩＳＡプレートにコーティングした。ＨＲＰ二次抗体およびＥＣＬは、ペプチドに結合している抗体を検出した。
【図８】図８は、インビトロキナーゼアッセイによるｐＳ３８７抗体のキャラクタリゼーションである。図示したように阻害剤を使用してあるいは使用せずに、ＦＬＡＧ−ＡＴＭおよびＧＳＴ−ＣＯＰ１またはＧＳＴ−ＣＯＰ１−Ｓ３８７Ａをインキュベートした。
【図９】図９では、ＡＴＭをＳａｏｓ−２に同時形質移入した場合、内在性ＣＯＰ１の定常状態レベルが低下している。１０ｕｇのＡＴＭまたはＡＴＭ−ＫＤを２４時間形質移入し、各レベルをウエスタンブロッティングで評価した。
【図１０】図１０では、ＨＥＫ２９３Ｔ由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥのＩｍｐｅｒｉａｌ  ｓｔａｉｎで、ＦＬＡＧ−ＣＯＰ１−ＷＴ、ＦＬＡＧ−ＣＯＰ１−Ｓ３８７ＤおよびＦＬＡＧ−ＣＯＰ１−リングｍｔを精製した。
【図１１】図１１では、ＣＯＰ１は、ＩＲ処置後に細胞質に局在している。１０ＧｙのＩＲで処置した後、Ｈ１２９９細胞のトランスフェクトＦＬＡＧ−ＣＯＰ１の免疫蛍光から、かなりの比率のＣＯＰ１がＣＯＰ１の核画分よりも細胞質に局在したことが示される。メタノール個体法およびビオチン−ストレプトアビジン増幅法で免疫蛍光法を行い、検出には、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ顕微鏡のＣｙ５フェルタキューブを用いた。ＤＮＡの染色には、ＤＡＰＩ入りのＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
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【図２Ｋ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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