(57)【要約】  本発明は、チオコラリンの生合成に関与する遺伝子およびその異種産生に関する。本発明により、チオコラリンの生合成を担う遺伝子クラスターが同定およびクローニングされた。この遺伝子クラスターは、抗腫瘍活性および抗菌活性を有するチオコラリンの異種産性に使用することができる。
2009502187.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの生合成チオコラリン産生経路タンパク質またはその生物学的に活性な断片をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、単離された核酸分子。
【請求項２】
総ての生合成チオコラリン産生経路タンパク質またはそれらの生物学的に活性な断片をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
配列番号１で示されるヌクレオチド配列またはその相補鎖を含んでなる、請求項１または２に記載の核酸分子。
【請求項４】
請求項３に記載の核酸分子とハイブリダイズし、かつ、少なくとも１つの生合成チオコラリン産生経路タンパク質またはその生物学的に活性な断片をコードする、核酸分子。
【請求項５】
生合成チオコラリン産生経路タンパク質またはその生物学的に活性な断片をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項６】
配列番号１のヌクレオチド２〜５３５を含んでなる核酸分子（ｏｒｆ１）；
配列番号１のヌクレオチド９９３〜１１３０ｃを含んでなる核酸分子（ｏｒｆ２）；
配列番号１のヌクレオチド１５１７〜２１３１を含んでなる核酸分子（ｔｉｏ３）；
配列番号１のヌクレオチド２１５４〜２８２２ｃを含んでなる核酸分子（ｔｉｏ４）；
配列番号１のヌクレオチド２９７０〜３７９１ｃを含んでなる核酸分子（ｔｉｏ５）；
配列番号１のヌクレオチド３７９４〜４７７７ｃを含んでなる核酸分子（ｔｉｏ６）；
配列番号１のヌクレオチド４９０４〜５６１１を含んでなる核酸分子（ｔｉｏ７）；
配列番号１のヌクレオチド５７０１〜６４２６ｃを含んでなる核酸分子（ｔｉｏ８）；
配列番号１のヌクレオチド６４２６〜７６８８ｃを含んでなる核酸分子（ｔｉｏ９）；
配列番号１のヌクレオチド７７３３〜８５２４ｃを含んでなる核酸分子（ｔｉｏ１０）；
配列番号１のヌクレオチド８７９１〜１０００２を含んでなる核酸分子（ｔｉｏ１１）；
配列番号１のヌクレオチド１０００２〜１１５９０ｃを含んでなる核酸分子（ｔｉｏ１２）；
配列番号１のヌクレオチド１１８４７〜１３６３４を含んでなる核酸分子（ｔｉｏ１３）；
配列番号１のヌクレオチド１３７３４〜１５００５ｃを含んでなる核酸分子（ｔｉｏ１４）；
配列番号１のヌクレオチド１５００５〜１６３５４ｃを含んでなる核酸分子（ｔｉｏ１５）；
配列番号１のヌクレオチド１６４４１〜１８７４４ｃを含んでなる核酸分子（ｔｉｏ１６）；
配列番号１のヌクレオチド１８７７４〜１９０５５ｃを含んでなる核酸分子（ｔｉｏ１７）；
配列番号１のヌクレオチド１９２６０〜２００３６を含んでなる核酸分子（ｔｉｏ１８）；
配列番号１のヌクレオチド２０１４６〜２０８８０ｃを含んでなる核酸分子（ｔｉｏ１９）；
配列番号１のヌクレオチド２１１８８〜２８９６９を含んでなる核酸分子（ｔｉｏ２０）；
配列番号１のヌクレオチド２８９７９〜３８３９８を含んでなる核酸分子（ｔｉｏ２１）；
配列番号１のヌクレオチド３８４４９〜３８６６１を含んでなる核酸分子（ｔｉｏ２２）；
配列番号１のヌクレオチド３８６４２〜４１２６３を含んでなる核酸分子（ｔｉｏ２３）；
配列番号１のヌクレオチド４１８３５〜４２３６８を含んでなる核酸分子（ｔｉｏ２４）；
配列番号１のヌクレオチド４２３９５〜４３２５５ｃを含んでなる核酸分子（ｔｉｏ２５）；
配列番号１のヌクレオチド４３３４０〜４３７４１ｃを含んでなる核酸分子（ｔｉｏ２６）；
配列番号１のヌクレオチド４４１５２〜４９５６３を含んでなる核酸分子（ｔｉｏ２７）；
配列番号１のヌクレオチド４９６３５〜５３６６９を含んでなる核酸分子（ｔｉｏ２８）；
配列番号１のヌクレオチド５３７４９〜５５３０５ｃを含んでなる核酸分子（ｏｒｆ２９）；
配列番号１のヌクレオチド５５３８４〜５７２２２ｃを含んでなる核酸分子（ｏｒｆ３０）；
配列番号１のヌクレオチド５７８９５〜５８４６７ｃを含んでなる核酸分子（ｏｒｆ３１）；
配列番号１のヌクレオチド５８５３５〜５９２０６ｃを含んでなる核酸分子（ｏｒｆ３２）；
配列番号１のヌクレオチド５９２９８〜５９５６４ｃを含んでなる核酸分子（ｏｒｆ３３）；
配列番号１のヌクレオチド５９６１１〜６０１１４ｃを含んでなる核酸分子（ｏｒｆ３４）；
配列番号１のヌクレオチド６０２０２〜６０８８８を含んでなる核酸分子（ｏｒｆ３５）；
配列番号１のヌクレオチド６０９６０〜６２２４０を含んでなる核酸分子（ｏｒｆ３６）；
配列番号１のヌクレオチド６２３００〜６２８３３を含んでなる核酸分子（ｏｒｆ３７）；
配列番号１のヌクレオチド６２９２５〜６４６５０を含んでなる核酸分子（ｏｒｆ３８）；または
生合成チオコラリン産生経路タンパク質の生物学的に活性な断片をコードするそれらの断片からなる群から選択される、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
２以上の生合成チオコラリン産生経路タンパク質またはそれらの生物学的に活性な断片をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項８】
ｏｒｆ１、ｏｒｆ２、ｔｉｏ３、ｔｉｏ４、ｔｉｏ５、ｔｉｏ６、ｔｉｏ７、ｔｉｏ８、ｔｉｏ９、ｔｉｏ１０、ｔｉｏ１１、ｔｉｏ１２、ｔｉｏ１３、ｔｉｏ１４、ｔｉｏ１５、ｔｉｏ１６、ｔｉｏ１７、ｔｉｏ１８、ｔｉｏ１９、ｔｉｏ２０、ｔｉｏ２１、ｔｉｏ２２、ｔｉｏ２３、ｔｉｏ２４、ｔｉｏ２５、ｔｉｏ２６、ｔｉｏ２７、ｔｉｏ２８、ｏｒｆ２９、ｏｒｆ３０、ｏｒｆ３１、ｏｒｆ３２、ｏｒｆ３３、ｏｒｆ３４、ｏｒｆ３５、ｏｒｆ３６、ｏｒｆ３７、ｏｒｆ３８として同定されている遺伝子、および生合成チオコラリン産生経路タンパク質の生物学的に活性な断片をコードするそれらの断片から選択される２以上の遺伝子を含んでなる、請求項７に記載の核酸分子。
【請求項９】
少なくとも１つの生合成チオコラリン産生経路タンパク質、またはその生物学的に活性な断片、またはその突然変異体もしくは変異体をコードするヌクレオチド配列を含んでなり、前記タンパク質が、ＯＲＦ１（配列番号２）、ＯＲＦ２（配列番号３）、Ｔｉｏ３（配列番号４）、Ｔｉｏ４（配列番号５）、Ｔｉｏ５（配列番号６）、Ｔｉｏ６（配列番号７）、Ｔｉｏ７（配列番号８）、Ｔｉｏ８（配列番号９）、Ｔｉｏ９（配列番号１０）、Ｔｉｏ１０（配列番号ｌｌ）、Ｔｉｏ１１（配列番号１２）、Ｔｉｏ１２（配列番号１３）、Ｔｉｏ１３（配列番号１４）、Ｔｉｏ１４（配列番号１５）、Ｔｉｏ１５（配列番号１６）、Ｔｉｏ１６（配列番号１７）、Ｔｉｏ１７（配列番号１８）、Ｔｉｏ１８（配列番号１９）、Ｔｉｏ１９（配列番号２０）、Ｔｉｏ２０（配列番号２１）、Ｔｉｏ２１（配列番号２２）、Ｔｉｏ２２（配列番号２３）、Ｔｉｏ２３（配列番号２４）、Ｔｉｏ２４（配列番号２５）、Ｔｉｏ２５（配列番号２６）、Ｔｉｏ２６（配列番号２７）、Ｔｉｏ２７（配列番号２８）、Ｔｉｏ２８（配列番号２９）、ＯＲＦ２９（配列番号３０）、ＯＲＦ３０（配列番号３１）、ＯＲＦ３１（配列番号３２）、ＯＲＦ３２（配列番号３３）、ＯＲＦ３３（配列番号３４）、ＯＲＦ３４（配列番号３５）、ＯＲＦ３５（配列番号３６）、ＯＲＦ３６（配列番号３７）、ＯＲＦ３７（配列番号３８）、ＯＲＦ３８（配列番号３９）として同定されているタンパク質、およびそれらの組合せからなる群から選択されるものである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１０】
ｏｒｆ１、ｏｒｆ２、ｔｉｏ３、ｔｉｏ４、ｔｉｏ５、ｔｉｏ６、ｔｉｏ７、ｔｉｏ８、ｔｉｏ９、ｔｉｏ１０、ｔｉｏ１１、ｔｉｏ１２、ｔｉｏ１３、ｔｉｏ１４、ｔｉｏ１５、ｔｉｏ１６、ｔｉｏ１７、ｔｉｏ１８、ｔｉｏ１９、ｔｉｏ２０、ｔｉｏ２１、ｔｉｏ２２、ｔｉｏ２３、ｔｉｏ２４、ｔｉｏ２５、ｔｉｏ２６、ｔｉｏ２７、ｔｉｏ２８、ｏｒｆ２９、ｏｒｆ３０、ｏｒｆ３１、ｏｒｆ３２、ｏｒｆ３３、ｏｒｆ３４、ｏｒｆ３５、ｏｒｆ３６、ｏｒｆ３７、ｏｒｆ３８、およびそれらの組合せ、またはその対応する領域、突然変異体もしくは変異体からなる群から選択されるｏｒｆを含む核酸配列を含んでなる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１１】
ミクロモノスポラ種から単離された、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１２】
少なくとも１つの請求項１〜１１のいずれか一項に記載の核酸分子を含んでなる、組成物。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の核酸分子またはその断片を含んでなる、プローブ。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の核酸分子または請求項１２に記載の組成物を含んでなる、ベクター。
【請求項１５】
本発明のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた、宿主細胞。
【請求項１６】
微生物、好ましくは細菌である、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
前記細菌が、グラム陽性菌、好ましくはアクチノミセス属またはストレプトミセス属である、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
本発明の核酸分子によりコードされる、タンパク質。
【請求項１９】
ＯＲＦ１（配列番号２）、ＯＲＦ２（配列番号３）、Ｔｉｏ３（配列番号４）、Ｔｉｏ４（配列番号５）、Ｔｉｏ５（配列番号６）、Ｔｉｏ６（配列番号７）、Ｔｉｏ７（配列番号８）、Ｔｉｏ８（配列番号９）、Ｔｉｏ９（配列番号１０）、Ｔｉｏ１０（配列番号１１）、Ｔｉｏ１１（配列番号１２）、Ｔｉｏ１２（配列番号１３）、Ｔｉｏ１３（配列番号１４）、Ｔｉｏ１４（配列番号１５）、Ｔｉｏ１５（配列番号１６）、Ｔｉｏ１６（配列番号１７）、Ｔｉｏ１７（配列番号１８）、Ｔｉｏ１８（配列番号１９）、Ｔｉｏ１９（配列番号２０）、Ｔｉｏ２０（配列番号２１）、Ｔｉｏ２１（配列番号２２）、Ｔｉｏ２２（配列番号２３）、Ｔｉｏ２３（配列番号２４）、Ｔｉｏ２４（配列番号２５）、Ｔｉｏ２５（配列番号２６）、Ｔｉｏ２６（配列番号２７）、Ｔｉｏ２７（配列番号２８）、Ｔｉｏ２８（配列番号２９）、ＯＲＦ２９（配列番号３０）、ＯＲＦ３０（配列番号３１）、ＯＲＦ３１（配列番号３２）、ＯＲＦ３２（配列番号３３）、ＯＲＦ３３（配列番号３４）、ＯＲＦ３４（配列番号３５）、ＯＲＦ３５（配列番号３６）、ＯＲＦ３６（配列番号３７）、ＯＲＦ３７（配列番号３８）、ＯＲＦ３８（配列番号３９）として同定されているタンパク質、およびそれらの組合せまたはそれらの生物学的に活性な断片からなる群から選択される、請求項１８に記載のタンパク質。
【請求項２０】
請求項１８または１９に記載のチオコラリンの生合成に関与するタンパク質を製造する方法であって、好適な条件下でチオコラリン産生生物を増殖させること、および所望によりチオコラリンの生合成に関与する１以上の前記タンパク質を単離することを含んでなる、方法。
【請求項２１】
チオコラリンを製造する方法であって、チオコラリンの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子のコピー数が増加されたチオコラリン産生生物を該化合物の産生に好適な条件下で増殖させること、および所望によりチオコラリンを単離することを含んでなる、方法
【請求項２２】
チオコラリンを製造する方法であって、チオコラリンの生合成を担うタンパク質をコードする遺伝子の発現が、チオコラリンの生合成に関与するタンパク質をコードする１以上の遺伝子を操作もしくは置換することにより、または前記遺伝子の発現の調節を担う配列を操作することにより調節されているチオコラリン産生生物を、前記化合物の産生に好適な条件下で増殖させること、および所望によりチオコラリンを単離することを含んでなる、方法。
【請求項２３】
前記チオコラリン産生生物がアクチノミセス属であり、好ましくはクロモノスポラ種である、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
チオコラリンを製造する方法であって、前記化合物の産生に好適な条件下で、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の宿主細胞を増殖させること、および所望によりチオコラリンを単離することを含んでなる、方法。
【請求項２５】
前記宿主細胞がアクチノミセス属またはストレプトミセス属である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ミクロモノスポラ種ＭＬ１由来のチオコラリン生合成を担う遺伝子の使用に基づく、別のアクチノミセス属における該化合物の製造のための方法であって、
（１）チオコラリン生合成経路の特定の遺伝子に改変を有する突然変異体を得ること；
（２）チオコラリンの生合成を担う遺伝子クラスターを含むミクロモノスポラ種ＭＬ１染色体領域を単離すること；
（３）チオコラリンの生合成を担う遺伝子クラスターのヌクレオチド配列を得て分析すること；および
（４）他のアクチノミセス属でチオコラリンを異種産生させること
を含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、チオコラリンの生合成に関与する遺伝子クラスターおよびチオコラリンの異種産生におけるその使用に関する。
【０００２】
発明の背景
チオコラリン（Ｉ）：
【化１】
2009502187.tif 000003
は、海洋アクチノミセス属から、具体的にはミクロモノスポラ科から単離された環式二量体チオデプシペプチドである(Perez Baz et al, J. Antibiotics, 50(9), 738-741, 1997; Romero et al., J. Antibiotics, 50(9), 734-737, 1997)。チオコラリンはミクロモノスポラ・マリナ(Micromonospora marina)またはミクロモノスポラ種(Micromonospora sp.)Ｌ−１３−ＡＣＭ−０９２から得られるという記載があるが、その後の研究で、モザンビークのインド洋沿岸で発見された海洋軟体動物から単離されたアクチノミセス属ミクロモノスポラ種ＭＬ１からも単離可能であることが示されている(Espliego, F. Ph.D. Thesis, 1996, University of Leon; de la Calle, F. Ph.D. Thesis, 1998, Autonomous University of Madrid)。
【０００３】
in vitro研究では、黒色腫、乳癌、非小細胞肺癌および結腸癌などの種々の種類の固形腫瘍の細胞系統の増殖を阻害するチオコラリンの能力が示されている。チオコラリンはまた、ヒト癌腫異種移植片に対するin vivoアッセイおいて顕著な抗腫瘍活性を有することも示されている(Faircloth et al. Eur. J. Cancer, 33, 175, 1997 (abstract))。チオコラリンはさらに、グラム陽性菌に対して抗菌活性を示す。
【０００４】
前記の海洋アクチノミセス属（ミクロモノスポラ種ＭＬ１）からチオコラリンを得るのは、小規模では実現可能であるが、この微生物で見られる生産の変動のため、大規模でのこのような取得は制限される。実際に、この生物からのチオコラリンの生産は、この生物の増殖速度が遅いために時間がかかり、バッチの違いにより生産収量が大きく異なる。
【０００５】
従って、一方では該海洋アクチノミセス属からのチオコラリンの取得が極めて制限されていること、また他方で、チオコラリン分子も複雑な構造を持ち、その合成は産業レベルでは煩雑となりかねないということから、方向性を持った様式でその取得方法を改善する手段を作り出すために、その生合成の遺伝的基礎を理解することが望ましい。天然産生株が一般に低濃度かつ極めて不規則な様式でしか生成物を産生しないことを考えれば、これはチオコラリンの産生量に増加をもたらし得る。同様に、この化合物を天然に産生しない宿主におけるチオコラリンの産生も可能となる。
【０００６】
組換えＤＮＡ技術の発達により、主としてアクチノミセス属の細菌の、このような生物活性化合物の生合成に関与する遺伝子を操作する手段により生物活性化合物を作出および産生するための興味深い研究分野が拓かれている。天然株は通常、対象とする代謝物を低濃度でしか産生しないので、これらの技術は既知の天然化合物の産生を向上させるために使用可能である。
【０００７】
遺伝子操作および発酵に適した他のアクチノミセス属における、チオコラリンの生合成に関与する遺伝子クラスターの異種発現によっても、同様に、短い発酵時間でより高い生産収量で該化合物を産生することが可能となる。
【０００８】
周知のとおり、いくつかの細菌および真菌が、抗腫瘍性および抗菌性などをはじめ、非リボゾーム起源を有する多様な生物活性ペプチドを合成する。この化合物ファミリーの生合成は、モジュール方式の触媒ドメイン機構を有する多機能酵素である非リボゾームペプチドシンセターゼ（ＮＲＰＳ）によって行われる。これらの各モジュールは延長サイクルを行い、すなわち、化合物の最終構造を活性化し、そこに特定のアミノ酸を組み込む。最小のモジュールは、（ｉ）特定のアミノ酸の選択と、ＡＴＰを用いることによりそのアデニル化アミノアシル型の形成を担うアデニル化ドメイン（Ａ、およそ５５０のアミノ酸を有する）、（ｉｉ）補因子として働き、共有結合によりＰドメインと結合するホスホパンテテイン（ＰＰ）補欠分子族を含むペプチジル担体ドメイン（Ｐ、およそ８０のアミノ酸を有する）（このドメインは、次の反応中心に移る前に活性化されたアデニル化アミノ酸を固定することを担う）、および（ｉｉｉ）２つの連続するＰドメインに存在する２つのアデニル化アミノアシル部分の間に新しいペプチド結合を作り出す縮合ドメイン（Ｃ、およそ４５０のアミノ酸を有する）の３つのドメインによって形成される。Ｃドメインには、この系の最初のアミノ酸を活性化するモジュールがない。いくつかのＮＲＰＳは、Ｄ−アミノ酸を生じるエピマー化、Ｎ型またはＣ型のメチル化、Ｌ−ＣｙｓまたはＬ−Ｓｅｒアミノ酸に作用する環化などの特定の働きを行う付加的ドメインを有する。最後のモジュールの後に存在する最後のドメインは、一般に直鎖または環状ペプチドを生じる中間体酵素の放出を担う。一般規則として、種々のモジュールの構造は生成ペプチドの最終的なアミノ酸配列を反映している。この同一線上の規則により、ＮＲＰＳにおける各モジュールへの特定の活性化機能の割付が可能となる。ＮＲＰＳに関する情報は、例えば、Quing-Tao, S. et al., 2004. Dissecting and Exploiting Nonribosomal Peptide Synthetases. Acta Biochimica et Biophysica. Sinica, 36 (4): 243-249に見出すことができる。
【発明の概要】
【０００９】
本発明の重要な目的は、チオコラリンの産生を担うタンパク質をコードする完全ヌクレオチド配列を単離および同定することである。これに基づき、チオコラリンの生合成に関与するタンパク質を構成するアミノ酸配列の機能を単離および決定することができる。この目的は、完全生合成チオコラリン産生経路に関連するタンパク質を総てコードする、単離され、かつ所望により精製された新規な核酸分子を提供することにより達成することができる。
【００１０】
本発明者らはチオコラリンの生合成を担う総ての遺伝子、すなわち、チオコラリンの生合成に関与する遺伝子クラスターを同定およびクローニングし、これにより、方向性を持った様式でこの化合物の産生を向上および操作するための遺伝的基礎を提供することができた。
【００１１】
非リボゾームペプチドシンセターゼ（ＮＲＰＳ）アデニル化ドメインのコンセンサス配列に由来するイニシエーターオリゴヌクレオチドを用いることで、ミクロモノスポラ種ＭＬ１染色体の６断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅したが、これらの断片は総て、ＰＳＶ１、ＰＳＶ２、ＰＳＶ３、ＰＳＶ４、ＰＳＶ５およびＰＳＶ６と呼ばれる推定（仮定）ＮＲＰＳアデニル化ドメイン断片を含む（実施例３）。該アデニル化ドメインの、挿入による不活性化は、そのうち２つ（ＰＳＶ２およびＰＳＶ５）がチオコラリンを産生しない突然変異体を生じたが、このことはそれらがチオコラリンの生合成に関与していることを示している（実施例７および１０）。
【００１２】
およそ６４．６キロベース（ｋｂ）のＤＮＡ領域（配列番号１）の配列決定は、３６の完全なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と別の２つの不完全なＯＲＦの存在を示した（実施例１２、表１）。ストレプトミセス・コエリコロル(Streptomyces coelicolor)、ストレプトミセス・アルブス(Streptomyces albus)およびストレプトミセス・リビダンス(Streptomyces lividans)における、前記ＯＲＦのうちの２６を含む、およそ５３ｋｂの領域の異種発現により、該アクチノミセス属のチオコラリンの産生がもたらされた（実施例１９）。
【００１３】
チオコラリンの生合成を担う遺伝子クラスターを図１に模式的に示す。驚くことに、チオコラリン遺伝子のクラスターはペプチド骨格のアミノ酸の数をもとに予測されるものよりも多くのＮＲＰＳコード遺伝子を含む。同定されたタンパク質のうちのいくつかは、例えばＴｉｏ１２、Ｔｉｏ１７、Ｔｉｏ１８、Ｔｉｏ１９、Ｔｉｏ２０、Ｔｉｏ２１、Ｔｉｏ２２、Ｔｉｏ２７およびＴｉｏ２８として同定されているＮＲＰＳのいくつかのものなど、チオコラリンペプチド構造の形成に関与している。Ｔｉｏ２０およびＴｉｏ２１として同定されているタンパク質はおそらくチオコラリン骨格の生合成に関与するＮＲＰＳを形成し、そして、おそらくは、Ｔｉｏ２７およびＴｉｏ２８として同定されている他の２つのＮＲＰＳがミクロモノスポラ種ＭＬ１におけるチオコラリンの生合成の調節に関与し得る小ペプチドの生合成を担っている可能性がある。また、Ｔｉｏ５、Ｔｉｏ６およびＴｉｏ２３など、耐性プロセスに関連している可能性のあるタンパク質がいくつかある。配列決定された領域において同定されたチオコラリン経路の可能性のあるレギュレーターは、Ｔｉｏ３、Ｔｉｏ４、Ｔｉｏ７、Ｔｉｏ２４およびＴｉｏ２５に相当する。最後に、イニシエーターユニット３−ヒドロキシ−キナルデート、Ｔｉｏ８、Ｔｉｏ９、Ｔｉｏ１０およびＴｉｏ１１の生成に関連するタンパク質がいくつかある。その遺伝子分断によりチオコラリンを産生しない表現型が生じる遺伝子は、図１においてアステリスクで示されている（ｔｉｏ２０、ｔｉｏ２７およびｔｉｏ２８）。
【００１４】
よって、本発明は、チオコラリンの生合成を担う遺伝子クラスターの同定およびクローニングに関する。チオコラリンの生合成および好適な宿主細胞におけるその発現を担う該遺伝子クラスターは、チオコラリンの効率的な産生を可能とする。
【００１５】
従って、一つの態様では、本発明は、少なくとも１つの生合成チオコラリン産生経路タンパク質またはその生物学的に活性な断片をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、単離された核酸分子に関する。
【００１６】
別の態様では、本発明は、本発明により提供される少なくとも１つの核酸分子を含んでなる組成物に関する。
【００１７】
別の態様では、本発明は、本発明により提供される核酸分子またはその断片を含んでなるプローブに関する。
【００１８】
別の態様では、本発明は、本発明により提供される核酸分子を含んでなるベクターに関する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、本発明により提供されるベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞に関する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、本発明により提供される核酸分子によりコードされるタンパク質に関する。
【００２１】
別の態様では、本発明は、チオコラリンの生合成に関与するタンパク質を製造するための方法であって、そのゲノムが操作されたチオコラリン産生生物の使用を含む方法に関する。
【００２２】
別の態様では、本発明は、別のアクチノミセス属におけるチオコラリンの製造のための、ミクロモノスポラ種ＭＬ１由来のチオコラリンの生合成を担う遺伝子の使用に基づく方法に関する。
【発明の具体的説明】
【００２３】
本発明によれば、完全な生合成チオコラリン産生経路に関与するタンパク質の全部または一部をコードする、単離され、所望により精製された新規な核酸分子が提供される。
【００２４】
よって、一つの態様では、本発明は、少なくとも１つの生合成チオコラリン産生経路タンパク質またはその生物学的に活性な断片をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子（以下「本発明の核酸分子」という）、好ましくは、所望により単離され、精製された核酸分子に関する。この生合成チオコラリン産生経路タンパク質は、一般的に言えば非リボゾームペプチドシンセターゼ（ＮＲＰＳ）である。ＮＲＰＳはチオコラリンの生合成を担っている。
【００２５】
本明細書において生合成チオコラリン産生経路タンパク質に用いられる「生物学的に活性な断片」とは、全長タンパク質の活性機能を保持するタンパク質構造の一部を意味する。この生物学的に活性な断片は、本発明の核酸分子の対応する領域によりコードされていてもよい。本発明の核酸分子の領域の大きさは広い範囲で異なってよいが、ある特定の実施態様では、該領域は少なくとも１０、１５、２０、２５、５０、１００、１，０００、２，５００、５，０００、１０，０００、２０，０００、２５，０００またはそれを超えるヌクレオチド長であり得る。該領域は通常、１００〜１０，０００ヌクレオチド長、好ましくは１００〜７，５００ヌクレオチド長であり、生物学的に機能があり、すなわち、生合成チオコラリン産生経路タンパク質の生物学的に活性な断片をコードし得る。
【００２６】
本発明の核酸分子は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）分子であり得る。本発明の核酸分子はまた、一本鎖核酸分子または誘導された二本鎖核酸分子であり得る。本発明の核酸分子の限定されない例としては、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）分子、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子およびｍＲＮＡ分子に対する相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子が挙げられる。
【００２７】
本発明の核酸分子の突然変異体および変異体は、本発明の範囲内に含まれる。このような突然変異体および変異体としては、少なくとも１つの分子が変更、置換、欠失または挿入された本発明の核酸分子が挙げられる。例としては、本発明の核酸分子の突然変異体および変異体は、１、２、３、４、５、１０、１５、２５、５０、１００、２００、５００およびそれを超えるヌクレオチド変異（変更、置換、欠失および挿入）を有し得る。同じタンパク質をコードする縮重変異体、ならびに違うタンパク質をコードする非縮重変異体もあり得る。該突然変異体および変異体のヌクレオチド配列は、チオコラリンの生合成を担う遺伝子クラスターのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）にコードされている対応するタンパク質の少なくとも１つの生物活性または機能を保存しているタンパク質、またはその生物学的に活性な断片をコードする。該クラスターの遺伝子の対立遺伝子型ならびに多型も本発明の範囲内に含まれる。
【００２８】
ある特定の実施態様では、本発明の核酸分子は、総ての生合成チオコラリン産生経路タンパク質またはそれらの生物学的に活性な断片をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、所望により精製され、単離された核酸分子である。この場合、本発明の核酸分子は、チオコラリンの生合成を担う完全な遺伝子クラスターを含むヌクレオチド配列を含んでなる。
【００２９】
チオコラリンの生合成を担う完全な遺伝子クラスターのヌクレオチド配列は、配列番号１、ミクロモノスポラ種の６４，６５０塩基対（ｂｐ）ゲノムＤＮＡ配列に含まれる。また、本発明の範囲には、配列番号１で示されるヌクレオチド配列の相補鎖、すなわち、配列番号１で示されるものと相補的なヌクレオチドからなるもの（例えば、ＡがＴに置き換わり、ＣがＧに置き換わったもの、またはその逆）および／または逆転ヌクレオチド配列［すなわち、例えば、（５’→３’）から（３’→５’）に読み取り方向が変わることにより生じる配列］が含まれる。
【００３０】
本発明はさらに、配列番号１で示されるヌクレオチド配列またはその相補鎖を有する本発明の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子を含み、該分子はチオコラリン産生生物から単離することができ、少なくとも１つの生合成チオコラリン産生経路タンパク質をコードする。当業者に公知の典型的なハイブリダイゼーション技術および条件は、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)に記載されている。相同プローブのためには、通常のまたは厳密なハイブリダイゼーション技術が用いられるが、標的核酸分子配列と１００％未満の相同性の部分的に相同なプローブには、厳密性の低いハイブリダイゼーション技術が用いられる。後者（部分的に相同なプローブ）の場合、種々の条件でサザンまたはノーザンハイブリダイゼーションを行うことができる。例として、ホルムアミドを含有する溶媒中でハイブリダイゼーションが行われる場合、好ましい条件は、一定温度、およそ４２℃、６×ＳＳＣおよび５０％ホルムアミドを含有する溶液のイオン強度の使用を含む。厳密性の低いハイブリダイゼーション条件でも同じ温度およびイオン強度を使用することができるが、アニーリングバッファー中のホルムアミド量を低くする（およそ４５％から０％に）。あるいは、ハイブリダイゼーションは、ホルムアミドを含まない水溶液中で行うこともできる。一般に、水性媒体中でのハイブリダイゼーションでは、水溶液のイオン強度は同じ強度、一般にはおよそ１Ｍ  Ｎａ＋に維持するが、アニーリング温度は６８℃から４２℃に引き下げることができる。
【００３１】
チオコラリンの生合成を担う完全な遺伝子クラスターの配列決定（配列番号１）により、３６の完全オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と別の２つの不完全なＯＲＦ（ＯＲＦ１およびＯＲＦ３８、下記参照）の存在が示された。表１（実施例１２）は、生合成チオコラリン産生経路に含まれる種々のＯＲＦの位置、ならびに該ＯＲＦにコードされているアミノ酸配列を示す。
【００３２】
チオコラリンの産生に必須の全生合成タンパク質をコードする、チオコラリンの生合成を担う遺伝子クラスターを含む完全染色体（ゲノム）ＤＮＡ分子は、２つのプラスミド、具体的にはコスミドＳｕｐｅｒＣｏｓ１およびｐＫＣ５０５に効率的にパッケージングされている（実施例１および２）。チオコラリンの生合成を担う遺伝子クラスターを含むこれらの２つのコスミドは、チオコラリンの産生のための完全な生合成経路を再生するに十分なものである。よって、ある特定の実施態様では、本発明は、２つのコスミド中に、チオコラリン産生に実質的により効率的な手段を与える生合成チオコラリン遺伝子の完全クラスターを提供する。
【００３３】
ある特定の実施態様では、本発明の核酸分子は、生合成チオコラリン産生経路タンパク質またはその生物学的に活性な断片をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、所望により精製、単離された核酸分子である。ある特定の実施態様では、本発明の核酸分子は、
配列番号１のヌクレオチド２〜５３５を含んでなる核酸分子（ｏｒｆ１）；
配列番号１のヌクレオチド９９３〜１１３０ｃを含んでなる核酸分子（ｏｒｆ２）；
配列番号１のヌクレオチド１５１７〜２１３１を含んでなる核酸分子（ｔｉｏ３）；
配列番号１のヌクレオチド２１５４〜２８２２ｃを含んでなる核酸分子（ｔｉｏ４）；
配列番号１のヌクレオチド２９７０〜３７９１ｃを含んでなる核酸分子（ｔｉｏ５）；
配列番号１のヌクレオチド３７９４〜４７７７ｃを含んでなる核酸分子（ｔｉｏ６）；
配列番号１のヌクレオチド４９０４〜５６１１を含んでなる核酸分子（ｔｉｏ７）；
配列番号１のヌクレオチド５７０１〜６４２６ｃを含んでなる核酸分子（ｔｉｏ８）；
配列番号１のヌクレオチド６４２６〜７６８８ｃを含んでなる核酸分子（ｔｉｏ９）；
配列番号１のヌクレオチド７７３３〜８５２４ｃを含んでなる核酸分子（ｔｉｏ１０）；
配列番号１のヌクレオチド８７９１〜１０００２を含んでなる核酸分子（ｔｉｏ１１）；
配列番号１のヌクレオチド１０００２〜１１５９０ｃを含んでなる核酸分子（ｔｉｏ１２）；
配列番号１のヌクレオチド１１８４７〜１３６３４を含んでなる核酸分子（ｔｉｏ１３）；
配列番号１のヌクレオチド１３７３４〜１５００５ｃを含んでなる核酸分子（ｔｉｏ１４）；
配列番号１のヌクレオチド１５００５〜１６３５４ｃを含んでなる核酸分子（ｔｉｏ１５）；
配列番号１のヌクレオチド１６４４１〜１８７４４ｃを含んでなる核酸分子（ｔｉｏ１６）；
配列番号１のヌクレオチド１８７７４〜１９０５５ｃを含んでなる核酸分子（ｔｉｏ１７）；
配列番号１のヌクレオチド１９２６０〜２００３６を含んでなる核酸分子（ｔｉｏ１８）；
配列番号１のヌクレオチド２０１４６〜２０８８０ｃを含んでなる核酸分子（ｔｉｏ１９）；
配列番号１のヌクレオチド２１１８８〜２８９６９を含んでなる核酸分子（ｔｉｏ２０）；
配列番号１のヌクレオチド２８９７９〜３８３９８を含んでなる核酸分子（ｔｉｏ２１）；
配列番号１のヌクレオチド３８４４９〜３８６６１を含んでなる核酸分子（ｔｉｏ２２）；
配列番号１のヌクレオチド３８６４２〜４１２６３を含んでなる核酸分子（ｔｉｏ２３）；
配列番号１のヌクレオチド４１８３５〜４２３６８を含んでなる核酸分子（ｔｉｏ２４）；
配列番号１のヌクレオチド４２３９５〜４３２５５ｃを含んでなる核酸分子（ｔｉｏ２５）；
配列番号１のヌクレオチド４３３４０〜４３７４１ｃを含んでなる核酸分子（ｔｉｏ２６）；
配列番号１のヌクレオチド４４１５２〜４９５６３を含んでなる核酸分子（ｔｉｏ２７）；
配列番号１のヌクレオチド４９６３５〜５３６６９を含んでなる核酸分子（ｔｉｏ２８）；
配列番号１のヌクレオチド５３７４９〜５５３０５ｃを含んでなる核酸分子（ｏｒｆ２９）；
配列番号１のヌクレオチド５５３８４〜５７２２２ｃを含んでなる核酸分子（ｏｒｆ３０）；
配列番号１のヌクレオチド５７８９５〜５８４６７ｃを含んでなる核酸分子（ｏｒｆ３１）；
配列番号１のヌクレオチド５８５３５〜５９２０６ｃを含んでなる核酸分子（ｏｒｆ３２）；
配列番号１のヌクレオチド５９２９８〜５９５６４ｃを含んでなる核酸分子（ｏｒｆ３３）；
配列番号１のヌクレオチド５９６１１〜６０１１４ｃを含んでなる核酸分子（ｏｒｆ３４）；
配列番号１のヌクレオチド６０２０２〜６０８８８を含んでなる核酸分子（ｏｒｆ３５）；
配列番号１のヌクレオチド６０９６０〜６２２４０を含んでなる核酸分子（ｏｒｆ３６）；
配列番号１のヌクレオチド６２３００〜６２８３３を含んでなる核酸分子（ｏｒｆ３７）；
配列番号１のヌクレオチド６２９２５〜６４６５０を含んでなる核酸分子（ｏｒｆ３８）；または
生合成チオコラリン産生経路タンパク質の生物学的に活性な断片をコードするそれらの断片からなる群から選択される。
【００３４】
別の特定の実施態様では、本発明の核酸分子は、２以上の生合成チオコラリン産生経路タンパク質またはそれらの生物学的に活性な断片をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、所望により精製、単離された核酸分子である。ある特定の実施態様では、本発明の核酸分子は、ｏｒｆ１、ｏｒｆ２、ｔｉｏ３、ｔｉｏ４、ｔｉｏ５、ｔｉｏ６、ｔｉｏ７、ｔｉｏ８、ｔｉｏ９、ｔｉｏ１０、ｔｉｏ１１、ｔｉｏ１２、ｔｉｏ１３、ｔｉｏ１４、ｔｉｏ１５、ｔｉｏ１６、ｔｉｏ１７、ｔｉｏ１８、ｔｉｏ１９、ｔｉｏ２０、ｔｉｏ２１、ｔｉｏ２２、ｔｉｏ２３、ｔｉｏ２４、ｔｉｏ２５、ｔｉｏ２６、ｔｉｏ２７、ｔｉｏ２８、ｏｒｆ２９、ｏｒｆ３０、ｏｒｆ３１、ｏｒｆ３２、ｏｒｆ３３、ｏｒｆ３４、ｏｒｆ３５、ｏｒｆ３６、ｏｒｆ３７、ｏｒｆ３８として同定されている遺伝子、および生合成チオコラリン産生経路タンパク質の生物学的に活性な断片をコードするそれらの断片から選択される２以上の遺伝子を含んでなる。
【００３５】
別の特定の実施態様では、本発明の核酸分子は、少なくとも１つの生合成チオコラリン産生経路タンパク質、またはその生物学的に活性な断片、またはその突然変異体もしくは変異体をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、所望により、精製、単離された核酸分子であり、該タンパク質は、ＯＲＦ１（配列番号２）、ＯＲＦ２（配列番号３）、Ｔｉｏ３（配列番号４）、Ｔｉｏ４（配列番号５）、Ｔｉｏ５（配列番号６）、Ｔｉｏ６（配列番号７）、Ｔｉｏ７（配列番号８）、Ｔｉｏ８（配列番号９）、Ｔｉｏ９（配列番号１０）、Ｔｉｏ１０（配列番号ｌｌ）、Ｔｉｏ１１（配列番号１２）、Ｔｉｏ１２（配列番号１３）、Ｔｉｏ１３（配列番号１４）、Ｔｉｏ１４（配列番号１５）、Ｔｉｏ１５（配列番号１６）、Ｔｉｏ１６（配列番号１７）、Ｔｉｏ１７（配列番号１８）、Ｔｉｏ１８（配列番号１９）、Ｔｉｏ１９（配列番号２０）、Ｔｉｏ２０（配列番号２１）、Ｔｉｏ２１（配列番号２２）、Ｔｉｏ２２（配列番号２３）、Ｔｉｏ２３（配列番号２４）、Ｔｉｏ２４（配列番号２５）、Ｔｉｏ２５（配列番号２６）、Ｔｉｏ２６（配列番号２７）、Ｔｉｏ２７（配列番号２８）、Ｔｉｏ２８（配列番号２９）、ＯＲＦ２９（配列番号３０）、ＯＲＦ３０（配列番号３１）、ＯＲＦ３１（配列番号３２）、ＯＲＦ３２（配列番号３３）、ＯＲＦ３３（配列番号３４）、ＯＲＦ３４（配列番号３５）、ＯＲＦ３５（配列番号３６）、ＯＲＦ３６（配列番号３７）、ＯＲＦ３７（配列番号３８）、ＯＲＦ３８（配列番号３９）として同定されているタンパク質からなる群から選択される。該タンパク質は、チオコラリンの生合成を担う遺伝子（配列番号１）のクラスターの対応する上記ｏｒｆ（ｏｒｆ１、ｏｒｆ２、ｔｉｏ３、ｔｉｏ４、ｔｉｏ５、ｔｉｏ６、ｔｉｏ７、ｔｉｏ８、ｔｉｏ９、ｔｉｏ１０、ｔｉｏ１１、ｔｉｏ１２、ｔｉｏ１３、ｔｉｏ１４、ｔｉｏ１５、ｔｉｏ１６、ｔｉｏ１７、ｔｉｏ１８、ｔｉｏ１９、ｔｉｏ２０、ｔｉｏ２１、ｔｉｏ２２、ｔｉｏ２３、ｔｉｏ２４、ｔｉｏ２５、ｔｉｏ２６、ｔｉｏ２７、ｔｉｏ２８、ｏｒｆ２９、ｏｒｆ３０、ｏｒｆ３１、ｏｒｆ３２、ｏｒｆ３３、ｏｒｆ３４、ｏｒｆ３５、ｏｒｆ３６、ｏｒｆ３７、ｏｒｆ３８）から、また、その対応する領域、突然変異体または変異体から得ることができる。
【００３６】
別の特定の実施態様では、本発明の核酸分子は、生合成チオコラリン産生経路タンパク質の少なくとも１つの変異体またはその生物学的に活性な断片をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、所望により精製、単離された核酸分子であり、該変異体は、そのアミノ酸配列が配列番号２〜３９に示されているタンパク質から選択されるタンパク質またはその生物学的に活性な断片と少なくとも３０％、有利には５０％、好ましくは６０％、より好ましくは７０％、いっそうより好ましくは８０％、特に９０％、より特定的には９５％以上のアミノ酸配列同一性を有する。該変異体は、チオコラリン生合成を担う遺伝子のクラスターのｏｒｆのいずれかにコードされている対応するタンパク質の少なくとも１つの生物活性を保存している。
【００３７】
別の態様では、本発明は、少なくとも１つの本発明の核酸分子、好ましくは単離された核酸分子を含んでなる組成物に関する。ある特定の実施態様では、該組成物は、一つの本発明の核酸分子を含んでなる。別の特定の実施態様では、該組成物は、２以上の本発明の核酸分子を含んでなる。該核酸分子はＤＮＡおよびＲＮＡのいずれであってもよい。
【００３８】
本発明の核酸分子は、チオコラリンの生合成を担う遺伝子クラスターが好適な宿主細胞に挿入されているので、天然または組換えいずれかの、いずれのチオコラリン産生生物からでも単離することができるが、ある特定の実施態様では、本発明の核酸分子は海洋アクチノミセス属ミクロモノスポラ種ＭＬ１から単離されたものである（実験の部、工程１、実施例１〜４参照）。
【００３９】
好適な宿主細胞からの（染色体）ゲノムＤＮＡおよびクローニングされた組換えＤＮＡの単離および同定は、好適な遺伝子ライブラリーを追跡するためのプローブとして全ヌクレオチド配列またはその一部を用い、通常または厳密なハイブリダイゼーション法により行うことができる。
【００４０】
よって、別の態様では、本発明は、本発明の核酸分子またはその断片を含んでなるプローブに関する。一般に、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０またはそれを超えるヌクレオチドの配列を含むのが好適である。２０〜６０ヌクレオチド長の配列が好ましい。ある特定の実施態様では、該プローブは、ミクロモノスポラ種のチオコラリンの生合成に関与する遺伝子を検出するために使用できる。チオコラリンの生合成に関連する、例えばｇＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡなどの核酸を検出するための該プローブの使用は、本発明のさらなる態様をなす。
【００４１】
あるいは、好適な宿主細胞からの（染色体）ゲノムＤＮＡ、また、クローニングされた組換えＤＮＡの単離および同定は、核酸の酵素的増幅に基づく技術により行うことができる。例としては、例えばＰＣＲなどの酵素的増幅反応に使用可能なイニシエーターオリゴヌクレオチドを設計し（チオコラリンの生合成に関与するＤＮＡおよびタンパク質の既知配列に基づく）、他の同一または関連の配列を増幅し、同定することができる。
【００４２】
本発明の核酸分子は、常法により単離および所望により精製することができる。本発明の核酸分子は一般に組換え体または単離法により得られるが、本発明ではまた、本発明の核酸分子が化学合成により得られることも意図しており、これらの分子は野生型（ｗｔ）および突然変異体双方のチオコラリン産生生物に由来するものと同じ、または実質的に同じ構造を有する。
【００４３】
別の態様では、本発明は、少なくとも１つの生合成チオコラリン産生経路タンパク質またはその生物学的に活性な断片をコードする本発明の核酸分子を含んでなるベクター（以下「本発明のベクター」という）に関する。ある特定の実施態様では、本発明のベクターは、クローニングベクターまたは発現ベクターなどの生物学的に機能的なベクターまたはプラスミドである。
【００４４】
ある特定の実施態様では、本発明のベクターはクローニングベクター、好ましくはコスミドである。好ましいクローニングベクターは、それらが大きなＤＮＡ配列（例えば、目的生成物の生合成に関与する完全な遺伝子クラスター）を組み込めるかどうかによって選択される。該ベクターは一般に従来のベクターであり、市販されている。本発明はさらに、遺伝物質が当業者に公知の技術による遺伝子操作により単一のクローニングベクターまたはプラスミド（例えば、コスミド）に最終的に含まれるように減量できることを意図する。このような再配列は、クローニング、ＰＣＲもしくは合成遺伝子または当技術分野の現状において既知のこれら技術の組合せにより行うことができる。
【００４５】
別の特定の実施態様では、本発明のベクターは、好適な宿主細胞への挿入に好適な発現ベクターである。該ベクターの該好適な宿主細胞への挿入は、従来の遺伝物質導入法（例えば、形質転換、トランスフェクションなど）のいずれによって行うこともできる。
【００４６】
よって、別の態様では、本発明は、本発明のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞（以下「本発明の宿主細胞」という）に関する。本発明の宿主細胞は、１以上の本発明の核酸分子を含む。ある特定の実施態様では、本発明の宿主細胞は、単一の本発明の核酸分子を含む。別の特定の実施態様では、本発明の宿主細胞は２以上の本発明の核酸分子を含み、この場合、本発明の核酸分子は互いに同じであっても異なっていてもよい。
【００４７】
好ましい本発明の宿主細胞は、少なくとも１つの生合成チオコラリン産生経路タンパク質またはその生物学的に活性な断片をコードするヌクレオチド配列を含んでなる本発明の（外因性）核酸分子を含んでなる本発明のベクターで、チオコラリンの生合成および／または再配列を指示するのに十分な様式で安定的に形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞である。この宿主細胞は、好ましくは微生物、より好ましくは細菌である。ある特定の実施態様では、該宿主細胞は、例えば、アクチノミセス属、ストレプトミセス属などのグラム陽性菌である。
【００４８】
本発明の実施例では、ストレプトミセス・コエルコロル(Streptomyces coelicolor)、ストレプトミセス・リビダンス(Streptomyces lividans)、ストレプトミセス・アルブス(Streptomyces albus)およびストレプトミセス・アベルミチリス(Streptomyces avermitilis)などの種々のストレプトミセス種を用いたが、チオコラリンの生合成に関与する遺伝子の異種発現は、本発明のベクターで、好ましくは安定的に形質転換可能な限り、他のストレプトミセス属、アクチノミセス属で行うこともできる。タンパク質のin vitro発現は所望により常法を用いて行うことができる。
【００４９】
ある特定の実施態様では、本発明は、例えば、本発明の核酸分子の少なくとも１領域が、対応する非組換え宿主、すなわち、野生型チオコラリン産生細胞（細菌）に比べて変更されたチオコラリンレベルを産生する、組換え細菌などの組換え宿主細胞を生じるように変更されている組換え細菌などの組換え宿主細胞を提供する。このために、例えば、チオコラリンの産生に関与するＮＲＰＳの最も重要なドメインを担う遺伝子のコピー数を増やすか、または当技術分野の現状において既知の遺伝子操作技術によりこれらの遺伝子の遺伝子発現調節配列を増やして、チオコラリン産生の収量を高めることを含む、当業者に公知の常法を使用することができる。
【００５０】
別の態様では、本発明は、本発明の核酸分子にコードされているタンパク質（以下「本発明のタンパク質」という）に関する。
【００５１】
本明細書において「タンパク質」とは、チオコラリン産生のための生合成経路に含まれる、本発明の核酸分子にコードされているポリペプチドおよび酵素などを意味する。本発明のタンパク質は、アミノ酸部分が共有ペプチド結合により連結されている、全長アミノ酸鎖などの様々な鎖長のアミノ酸鎖、ならびにチオコラリンの生合成に関与する該タンパク質の生物学的に活性な断片、ならびにその生物学的に活性な変異体を含む。本発明のタンパク質は、天然型であっても組換え型であっても合成品であってもよい。例として、チオコラリンの生合成に関与する該タンパク質は、従来の組換えＤＮＡ技術により、またはそのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を好適な発現ベクターに挿入し、そのタンパク質を好適な宿主細胞内で発現させること、または、例えば、アミノ酸が１個ずつ連続的にアミノ酸鎖に連結されるMerrifield (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963))の固相ペプチド合成法によるなどの従来の化学的ペプチド合成により製造することができる。あるいは、本発明のタンパク質は、種々の製造業者（例えば、Perkin-Elmer, Inc.）が販売している自動タンパク質合成装置を用いて合成することもできる。
【００５２】
本発明の範囲内に含まれる生物学的に活性な変異体は、本発明の核酸分子にコードされているアミノ酸配列の少なくとも１つの生物学的に活性な断片、そのタンパク質の活性な機能を保持したタンパク質構造の一部、例えば、ｔｉｏ１８遺伝子にコードされているＴｉｏ１８タンパク質と同じ、または実質的に同じ活性を有する、ｔｉｏ１８遺伝子にコードされているチオエステラーゼ部分（すなわち、これは、少なくとも同じ、または少なくともおよそ７０％、有利には少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは約９５％の力を有する）を含む。
【００５３】
本発明のタンパク質の生物学的に活性な変異体は、アミノ酸、天然に存在する対立遺伝子などが除去、置換または付加されている活性なアミノ酸構造を含む。生物学的に活性な断片は、断片を調製するために全長タンパク質に化学的または酵素的消化を施した後、全長タンパク質と同じまたは実質的に同じ生物活性を保存しているアミノ酸構造断片をアッセイすることにより容易に同定することができる。
【００５４】
ある特定の実施態様では、本発明のタンパク質は、ｏｒｆ１、ｏｒｆ２、ｔｉｏ３、ｔｉｏ４、ｔｉｏ５、ｔｉｏ６、ｔｉｏ７、ｔｉｏ８、ｔｉｏ９、ｔｉｏ１０、ｔｉｏ１１、ｔｉｏ１２、ｔｉｏ１３、ｔｉｏ１４、ｔｉｏ１５、ｔｉｏ１６、ｔｉｏ１１、ｔｉｏ１８、ｔｉｏ１９、ｔｉｏ２０、ｔｉｏ２１、ｔｉｏ２２、ｔｉｏ２３、ｔｉｏ２４、ｔｉｏ２５、ｔｉｏ２６、ｔｉｏ２７、ｔｉｏ２８、ｏｒｆ２９、ｏｒｆ３０、ｏｒｆ３１、ｏｒｆ３２、ｏｒｆ３３、ｏｒｆ３４、ｏｒｆ３５、ｏｒｆ３６、ｏｒｆ３７およびｏｒｆ３８として同定される遺伝子からなる群から選択される遺伝子にコードされている、チオコラリンの生合成に関与する、所望により精製、単離されたタンパク質である。
【００５５】
別の特定の実施態様では、本発明のタンパク質は、ＯＲＦ１（配列番号２）、ＯＲＦ２（配列番号３）、Ｔｉｏ３（配列番号４）、Ｔｉｏ４（配列番号５）、Ｔｉｏ５（配列番号６）、Ｔｉｏ６（配列番号７）、Ｔｉｏ７（配列番号８）、Ｔｉｏ８（配列番号９）、Ｔｉｏ９（配列番号１０）、Ｔｉｏ１０（配列番号１１）、Ｔｉｏ１１（配列番号１２）、Ｔｉｏ１２（配列番号１３）、Ｔｉｏ１３（配列番号１４）、Ｔｉｏ１４（配列番号１５）、Ｔｉｏ１５（配列番号１６）、Ｔｉｏ１６（配列番号１７）、Ｔｉｏ１７（配列番号１８）、Ｔｉｏ１８（配列番号１９）、Ｔｉｏ１９（配列番号２０）、Ｔｉｏ２０（配列番号２１）、Ｔｉｏ２１（配列番号２２）、Ｔｉｏ２２（配列番号２３）、Ｔｉｏ２３（配列番号２４）、Ｔｉｏ２４（配列番号２５）、Ｔｉｏ２５（配列番号２６）、Ｔｉｏ２６（配列番号２７）、Ｔｉｏ２７（配列番号２８）、Ｔｉｏ２８（配列番号２９）、ＯＲＦ２９（配列番号３０）、ＯＲＦ３０（配列番号３１）、ＯＲＦ３１（配列番号３２）、ＯＲＦ３２（配列番号３３）、ＯＲＦ３３（配列番号３４）、ＯＲＦ３４（配列番号３５）、ＯＲＦ３５（配列番号３６）、ＯＲＦ３６（配列番号３７）、ＯＲＦ３７（配列番号３８）、ＯＲＦ３８（配列番号３９）として同定されているタンパク質、ならびにそれらの組合せ、またはそれらの生物学的に活性な断片からなる群から選択される、チオコラリンの生合成に関与する、所望により精製、単離されたタンパク質である。これらタンパク質の推定機能は表１に含まれている。
【００５６】
チオコラリンの生合成に関与するタンパク質をコードし、該化合物の生合成を担う遺伝子クラスターのｏｒｆは、常法を用いて同定することができる。このような技術の限定されない例としては、停止コドンおよび開始コドンの位置決定、それらコドンの頻度に基づくリーディングフレームの推定位置、他のアクチノミセスで発現される遺伝子との類似性によるアライメントなどのためのコンピューター解析を含む。よって、本発明のタンパク質は本発明のヌクレオチド配列を用いて同定することができ、ｏｒｆまたはそれらにコードされているタンパク質を単離および所望により精製すること、あるいは化学法により合成することができる。ｏｒｆに基づく該産物の発現のための遺伝子構築物が設計可能であり、好適な発現調節エレメント（プロモーター、ターミネーターなど）を含めることができ、該遺伝子構築物を、１以上のｏｒｆにコードされているタンパク質を発現させるために好適な宿主細胞に導入することができる。
【００５７】
本発明のタンパク質は、常法により単離し、所望により精製することができる。これらのタンパク質は実質的に純粋な形態で得られることが好ましいが、より低い純度、一般におよそ８０％〜９０％の純度でも許容される。本発明はまた、本発明のタンパク質が化学合成により得られることも意図しており、それらのタンパク質は野生型（ｗｔ）および突然変異型双方のチオコラリン産生生物に直接由来するものと同じまたは実質的に同じ構造を有する。
【００５８】
別の態様では、本発明は、チオコラリンの生合成に関与する本発明のタンパク質を製造する方法であって、チオコラリン産生生物を好適な（栄養および環境）条件下で増殖させること、および所望によりチオコラリンの生合成に関与する１以上のタンパク質を単離することを含む方法に関する。所望により、本発明のタンパク質は、これまでに記載されているものなどの常法により単離および精製することができる。
【００５９】
別の態様では、本発明は、チオコラリンを製造する方法であって、チオコラリンの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子のコピー数が増加されたチオコラリン産生生物を該化合物の産生に好適な条件下で増殖させること、および所望によりチオコラリンを単離することを含む方法に関する。
【００６０】
ある特定の実施態様では、チオコラリン産生生物は、チオコラリンの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子のコピー数が増加された、例えばミクロモノスポラ種などのアクチノミセス属である。チオコラリンの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子のコピー数の増加は、当業者に公知の常法により行うことができる。この場合、これまでに記載されている方法は、チオコラリンの産生に関与する遺伝子の発現に好適な栄養および環境条件下で該生物を発酵させることを含む。所望により、産生されたチオコラリンを常法により培養培地から単離および精製することができる。
【００６１】
別の態様では、本発明は、チオコラリンの生合成を担うタンパク質をコードする遺伝子の発現が、チオコラリンの生合成に関与するタンパク質をコードする１以上の遺伝子を操作もしくは置換することにより、または該遺伝子の発現の調節を担う配列を操作することにより調節されているチオコラリン産生生物を、該化合物の産生に好適な条件下で増殖させること、および所望によりチオコラリンを単離することを含む、チオコラリンの製造方法に関する。チオコラリンの生合成を担う該タンパク質をコードする遺伝子の発現は向上されていることが好ましい。このために、チオコラリン生合成過程に必須でない遺伝子配列を除去することもできるし、あるいは該遺伝子の遺伝子発現調節配列の効率を当業者に公知の一連の遺伝子工学により高めることもできる。こうして、チオコラリンの産生の収量を高めることができる。チオコラリン生合成過程に必須でない遺伝子配列を除去するため、または該遺伝子の遺伝子発現調節配列の効率を高めるための遺伝子操作は、当業者に公知の遺伝子工学技術により行うことができる。
【００６２】
ある特定の実施態様では、このチオコラリン産生生物は、チオコラリンの生合成を担うタンパク質をコードする遺伝子の発現が、チオコラリンの生合成に関与するタンパク質をコードする１以上の遺伝子を操作または置換することにより、あるいは該遺伝子の発現の調節を担う配列を操作することにより調節されている（当業者に公知の常法により行うことができる）、例えばミクロモノスポラ種などのアクチノミセス属である。この場合、上述の方法は、該生物を、チオコラリンの産生に関与する遺伝子の発現に好適な栄養および環境条件下で発酵させることを含む。所望により、産生されたチオコラリンを常法により培養培地から単離および精製することができる。
【００６３】
別の態様では、本発明は、チオコラリンの生合成を担う遺伝子クラスターを含んでなる本発明のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた本発明の宿主細胞を、該化合物の産生に好適な条件下で増殖させること、および所望によりチオコラリンを単離することを含む、チオコラリンの製造方法に関する。（栄養、環境などの）条件は、宿主細胞の性質によって選択する。
【００６４】
ある特定の実施態様では、本発明の宿主細胞は、チオコラリンを天然で産生する生物、チオコラリンを天然で産生しない生物およびチオコラリンの産生のために遺伝的に操作された生物から選択される。ある特定の実施態様では、本発明の宿主細胞は、アクチノミセス属またはストレプトミセス属である。
【００６５】
別の態様では、本発明は、ミクロモノスポラ種ＭＬ１由来のチオコラリン生合成を担う遺伝子の使用に基づく、別のアクチノミセス属における該化合物の製造のための方法であって、
（１）チオコラリン生合成経路の特定の遺伝子に改変を有する突然変異体を得ること；
（２）チオコラリンの生合成を担う遺伝子クラスターを含むミクロモノスポラ種ＭＬ１染色体領域を単離すること；
（３）チオコラリンの生合成を担う遺伝子クラスターのヌクレオチド配列を得て分析すること；および
（４）他のアクチノミセス属でチオコラリンを異種産生させること
を含む方法に関する。
【００６６】
チオコラリンの生合成を担う遺伝子クラスターを含むミクロモノスポラ種ＭＬ１染色体領域の同定および単離、ならびに該クラスターのヌクレオチド配列の分析は、本明細書中の実施例で非限定的に例示される、本発明により提供される技術に基づいて行うことができる。
【００６７】
チオコラリン生合成経路の特定の遺伝子に改変を有する突然変異体は、常法により同定することができる。ある特定の実施態様では、該突然変異体は、培養し、例えば実施例５に記載されているようなＨＰＬＣ−ＭＳなどの常法によりチオコラリンの産生を測定することによって確認することができる。
【００６８】
チオコラリンの生合成を担う遺伝子クラスターの全部または一部は、チオコラリンの産生に好適な条件下で好適な栄養培地を用いて発酵させることによるチオコラリンの異種産生のために、例えば形質転換またはトランスフェクションなどの常法によりアクチノミセス属に導入することができ、このようにして得られたチオコラリンは、所望により常法により単離および／または精製することができる。
【００６９】
チオコラリンの生合成を担う遺伝子クラスターの同定は、商業上大きな重要性を持っている。本発明により提供されるチオコラリンの生合成を担う遺伝子クラスターが単離され、完全に記載されれば、チオコラリンの産生およびチオコラリン産生生物の操作が可能となる。この意味で、チオコラリンの産生に関与するＮＲＰＳの最も重要なドメインを担う遺伝子のコピー数を増加させることもできるし、あるいはそれらの遺伝子の遺伝子発現調節配列の効率を、当技術分野の現状において既知の遺伝子工学技術により高めることもでき、このようにしてその産生収量を高めることができる。
【００７０】
本発明により提供されるチオコラリン遺伝子の完全クラスターの同定およびクローニングに伴うもう１つの利点は、チオコラリンの効率的産生に関する。実際、これにより少ない工程数で対象化合物を得ることができる。クラスター突然変異体における生合成過程に必須でない配列の除去は、対象化合物の産生に必要な時間を大幅に短縮する。残った配列は、チオコラリンの産生に十分なものであり、チオコラリンを産生するためのそれらの機能を保持している。
【実施例】
【００７１】
実験の部
本発明の実験手順は、当技術分野の現状において通常の分子生物学的方法を含む。本明細書では説明されない技術に関する詳細は、Kieser et al. (Practical Streptomyces genetics. The John Innes Foundation, Norwich, Great Britain, 2000)およびSambrook et al. (Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA, 2001)の手引き書に示されている。限定されるものではないが、以下の工程は、本発明を詳細に説明するものである。
【００７２】
工程１．チオコラリン生合成経路遺伝子を含むミクロモノスポラ種ＭＬ１染色体領域の単離
実施例１：ミクロモノスポラ種ＭＬ１染色体ＤＮＡ由来のＳｕｐｅｒＣｏｓ１における遺伝子ライブラリーの構築
染色体ＤＮＡは、Pharma Mar, S.A.カルチャーコレクションにおいて、ＭＩＡＭ２培地（５ｇ／ｌの酵母抽出物、３ｇ／ｌの食肉抽出物、５ｇ／ｌのトリプトン、５ｇ／ｌのグルコース、２０ｇ／ｌのデキストリン、４ｇ／ｌのＣａＣＯ３、１０ｇ／ｌの海塩ｐＨ６．８）中で入手できるミクロモノスポラ種ＭＬ１培養物(Espliego, F. Ph.D. Thesis, 1996, University of Leon; de la Calle, F. Ph.D. Thesis, 1998, Autonomous University of Madrid)から脱塩プロトコール(Kieser et al. 2000)を用いて得た。この染色体ＤＮＡをＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼで部分消化し、得られた断片を用いて、ＢａｍＨＩで消化したコスミドＳｕｐｅｒＣｏｓ  １(Stratagene)において遺伝子ライブラリーを作製した。大腸菌ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  ＭＲ(Stratagene)におけるこの遺伝子ライブラリーの生成は、既に記載されている手順(Sambrook et al. 2001)に従い、in vitroパッケージングキットＧｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  Ｇｏｌｄパッケージング抽出キット(Stratagene)で行った。
【００７３】
１，０００個の大腸菌形質導入コロニーをナイロン膜に付着させ、通常のプロトコール(Sambrook et al. 2001)によりin situコロニーハイブリダイゼーション分析を行った。
【００７４】
実施例２：ミクロモノスポラ種ＭＬ１染色体ＤＮＡからのｐＫＣ５０５における遺伝子ライブラリーの構築
染色体ＤＮＡは、ＭＩＡＭ２培地中のミクロモノスポラ種ＭＬ１培養物から脱塩プロトコール(Kieser et al. 2000)を用いて得た。この染色体ＤＮＡをＳａｕ３ＡＩエンドヌクレアーゼで部分消化し、得られた断片を用いて、ＢａｍＨＩで消化した二機能性コスミド大腸菌(Escherichia coli)／ストレプトミセスｐＫＣ５０５(Richardson at al. 1987, Gene 61, 231-241)において遺伝子ライブラリーを作製した。大腸菌ＥＤ８７６７におけるこの遺伝子ライブラリーの作製は、すでに記載されている手順(Sambrook et al. 2001)に従い、in vitroパッケージングキットＧｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  Ｇｏｌｄパッケージング抽出キット(Stratagene)で行った。
【００７５】
３，３００の大腸菌形質導入コロニーを、ＴＳＢ培地(Merck)を２５μｇ／ｍｌのアプラマイシンを含む９６ウェルマイクロタイタープレートに付着させ、３０℃で２４時間インキュベートした。これらのクローンを、２５μｇ／ｍｌのアプラマイシンを含むＴＳＡ(Tryptic Soy Agar)に複製させ、３０℃で一晩の後、コロニーをナイロン膜に移し、通常のプロトコール(Sambrook et al. 2001)によりin situコロニーハイブリダイゼーションを行った。
【００７６】
実施例３：ＮＲＰＳにおけるアデニル化ドメインに特異的なオリゴヌクレオチドの設計およびミクロモノスポラ種ＭＬ１染色体ＤＮＡからのそれらのＰＣＲ増幅
チオコラリンの構造に基づけば、その生合成を担うＮＲＰＳは、Ｌ−システインを活性化する１〜３のアデニル化ドメインと１つのグリシン活性化ドメインを持つと予測された。これを基礎に、ＮＲＰＳアデニル化ドメイン内で保存されている領域に基づき、ＮＲＰＳアデニル化ドメインの増幅に関して文献に記載されているオリゴヌクレオチドと組み合わせたＮＲＰＳアデニル化ドメインをコードするＤＮＡ断片を特異的に増幅し得る縮重したオリゴヌクレオチドを設計した。
【００７７】
イニシエーターオリゴヌクレオチド：
ＭＴＦ２（５’−ＧＣＮＧＧＹＧＧＹＧＣＮＴＡＹＧＴＮＣＣ−３’；Neilan et al. 1999. J. Bacteriol. 181(13):4089-4097)および
ＰＳＶ−４（５’−ＳＡＧＳＡＧＧＳＷＧＴＧＧＣＣＧＣＣＳＡＧＣＴＣＧＡＡＧＡＡ−３’）
を用いてＰＣＲ増幅を行ったところ、１．３ｋｂのバンドが得られ、これをＰＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター(Promega)にクローニングした。用いたＰＣＲプログラムは、９５℃−２分；６０℃−１５分；７２℃−６分の初期サイクルの後、９５℃−１分；６０℃−２分；７２℃−２分の２０サイクルであった。ミクロモノスポラ種ＭＬ１染色体ＤＮＡを鋳型として用いた。
【００７８】
これらのクローンを制限断片長多型（ＲＦＬＰ）により分析したところ、ペプチドシンセターゼｐＧＰＳＶ１、ｐＧＰＳＶ２およびｐＧＰＳＶ３に相当する３つの異なるクローンが存在することが示され、これらはそれぞれＰＳＶ１、ＰＳＶ２およびＰＳＶ３と呼ばれるアデニル化ドメイン断片を含んでいた。
【００７９】
次に、これらのクローンの挿入部をＥｃｏＲＩ消化で遊離させ、その断片をｐＢＢＲ１−ＭＣＳ２(Kovach, M.E. et al. 1995. Gene. 166:175-176)にクローニングし、それぞれプラスミドｐＢＰＳＶ１、ｐＢＰＳＶ２およびｐＢＰＳＶ３を構築し、これらはそれぞれＰＳＶ１、ＰＳＶ２およびＰＳＶ３と呼ばれるアデニル化ドメイン断片を含んでいた。
【００８０】
イニシエーターオリゴヌクレオチドＭＴＦ２およびＰＳ４で得られたＰＣバンドから、イニシエーターオリゴヌクレオチドＰＳ２−ＴＧ：５’−ＡＣＮＧＧＮＭＲＮＣＣＮＡＡＲＧＧ−３’およびＭＴＲ：５’−ＣＣＮＣＧＤＡＴＹＴＴＮＡＣＹ−３’(Neilan et al. 1999. J. Bacteriol. 181(13):4089-4097)を用いてネスティッド−ＰＣＲ（９５℃−１分；６０℃−１分；７２℃−１分の３０サイクル）を行い、７５０ｂｐのバンドを得、これをＰＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター(Promega)にクローニングした。これらのクローンをＲＦＬＰにより分析したところ、ペプチドシンセターゼｐＧＰＳＶ４およびｐＧＰＳＶ５にそれぞれ相当する２つの異なる新たなクローン種が存在することを示し、それぞれＰＳＶ４およびＰＳＶ５と呼ばれるアデニル化ドメイン断片を含んでいた。
【００８１】
イニシエーターオリゴヌクレオチドＰＳ２Ｍ：５’−ＴＡＣＡＣＳＧＧＣＷＳＳＡＣＳＧＧ−３’およびＰＳＶ−４を用いてＰＣＲ増幅を行ったところ１．３ｋｂのバンドが得られ、ＰＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクターへクローニングした。用いたプログラムは、アニーリング温度７２℃５サイクルによるタッチダウンスタートの後、７０℃のアニーリング１０サイクル、最後に６８℃での２０サイクル（９６℃−１分；７２℃−６８℃−２分；７２℃−３分）であった。これらのクローンをＲＦＬＰにより分析したところ、ペプチドシンセターゼｐＧＰＳＶ６に相当する新たなクローン種であることが示され、これはＰＳＶ６と呼ばれるアデニル化ドメイン断片を含んでいた。
【００８２】
実施例４：コロニーハイブリダイゼーションによる遺伝子ライブラリーの分析
ＳｕｐｅｒＣｏｓ１およびｐＫＣ５０５で構築された遺伝子ライブラリー（実施例１および２）に対し、ＤＩＧ  ＤＮＡ標識および検出キット系(Roche)を用いて、in situコロニーハイブリダイゼーション分析(Sambrook et al. 2001)を個々に行った。ＰＳＶ１〜ＰＳＶ６と呼ばれる６つのアデニル化ドメイン断片をプローブとして用いた。
【００８３】
以下のものがＳｕｐｅｒＣｏｓ１で構築された遺伝子ライブラリーから得られた。
・断片ＰＳＶ１とハイブリダイズした、ｐＣＴ１ａ、ｐＣＴ１ｂおよびｐＣＴ１ｃと呼ばれる３つの陽性コスミド（クローン）
・断片ＰＳＶ２とハイブリダイズした、ｐＣＴ２ａ、ｐＣＴ２ｂおよびｐＣＴ２ｃと呼ばれる３つの陽性コスミド（クローン）（これらの断片のうち、ｐＣＴ２ｃは断片ＰＳＶ５ともハイブリダイズした）
・断片ＰＳＶ３とハイブリダイズした、ｐＣＴ３ａおよびｐＣＴ３ｂと呼ばれる２つの陽性コスミド（クローン）（さらに、双方ともＰＳＶ６ともハイブリダイズした）および
・断片ＰＳＶ４とハイブリダイズした、ｐＣＴ４ａと呼ばれる１つの陽性コスミド（クローン）。
【００８４】
ｐＫＣ５０５で構築された遺伝子ライブラリーからは５５の陽性コスミドが得られた。
・断片ＰＳＶ２とハイブリダイズした、ｃｏｓＶｌ−Ｆ８、ｃｏｓＶ７−Ｄ２、ｃｏｓＶ７−Ｄ１２、ｃｏｓＶ１４−Ｈ４、ｃｏｓＶ１９−Ｂ４、ｃｏｓＶ２９−Ｂ９、ｃｏｓＶ３１−Ｂ１１、ｃｏｓＶ３１−Ｈ１０、ｃｏｓＶ３３−Ｄ１２、ｃｏｓＶ３３−Ｆ７と呼ばれる１０の陽性コスミド（クローン）
・断片ＰＳＶ５とハイブリダイズした、ＣＯＳＶ１−Ｂ６、ｃｏｓＶ６−Ｈ８、ｃｏｓＶｌｌ−Ｆ１０、ｃｏｓＶ２０−Ｆ８、ｃｏｓＶ２２−Ｆ７、ｃｏｓＶ２５−Ｂ３、ｃｏｓＶ３２−Ｂ４と呼ばれる７つの陽性コスミドおよび
・断片ＰＳＶ１、ＰＳＶ３、ＰＳＶ４またはＰＳＶ６とハイブリダイズした、ｃｏｓＶ１−Ｂ７、ｃｏｓＶ１−Ｆ５、ｃｏｓＶ２−Ｅ５、ｃｏｓＶ２−Ｆ１１、ｃｏｓＶ３−Ｄ９、ｃｏｓＶ４−Ｄ２、ｃｏｓＶ５−Ｄ７、ｃｏｓＶ５−Ｇ６、ｃｏｓＶ６−Ａ７、ｃｏｓＶ６−Ａ１２、ｃｏｓＶ７−Ｅ７、ｃｏｓＶ８−Ｆ８、ｃｏｓＶ９−Ｈ７、ｃｏｓＶ１０−Ａ３、ｃｏｓＶ１１−Ｂ４、ｃｏｓＶ１１−Ｇ２、ｃｏｓＶ１２−Ｂ１２、ｃｏｓＶ１３−Ｂ２、ｃｏｓＶ１６−Ｈ１１、ｃｏｓＶ１７−Ａ３、ｃｏｓＶ１９−Ｆ４、ｃｏｓＶ２０−Ｂ３、ｃｏｓＶ２０−Ｈ５、ｃｏｓＶ２１−Ｈ６、ｃｏｓＶ２２−Ｂ１１、ｃｏｓＶ２３−Ｆ８、ｃｏｓＶ２６−Ｈ１１、ｃｏｓＶ２８−Ｇ１、ｃｏｓＶ２９−Ｅ１、ｃｏｓＶ２９−Ｇ６、ｃｏｓＶ３０−Ｇ５、ｃｏｓＶ３１−Ａ１２、ｃｏｓＶ３１−Ｅ１０、ｃｏｓＶ３２−Ａ７、ｃｏｓＶ３２−Ｄ１０、ｃｏｓＶ３３−Ａ８、ｃｏｓＶ３３−Ｄ１０、ｃｏｓＶ３３−Ｆ１０と呼ばれる３８の陽性コスミド。
【００８５】
工程２：単離された６つのアデニル化領域における突然変異体の作出
【００８６】
ミクロモノスポラ種ＭＬ１染色体ＤＮＡ（ＰＳＶ１、ＰＳＶ２、ＰＳＶ３、ＰＳＶ４、ＰＳＶ５およびＰＳＶ６）から従前に増幅した６つのアデニル化ドメイン断片を、チオコラリンの生合成に関与する領域を評価することを目的とした独立した遺伝子分断実験に用いた（実施例６〜１１）。
【００８７】
接合性プラスミド大腸菌／ストレプトミセスｐＯＪ２６０(Bierman et al. 1992, Gene 116, 43-49)を用い、それぞれＰＳＶ１〜ＰＳＶ６を含む構築物ｐＦＬ９０３、ｐＦＬ９０４、ｐＦＬ９０５、ｐＦＬ９０６、ｐＦＬ９４０およびｐＦＬ９４１を作出した。これらの構築物を接合性大腸菌ＥＴ１２５６７（ｐＤＢ３０７）株(Kieser et al. 2000)に導入し、そしてここから、記載の手順(Kieser et al. 2000)を用い、接合によりミクロモノスポラ種ＭＬ１株に導入した。これらの交差接合クローンをアプラマイシンで選択し、適切な染色体領域に組み込まれているかどうか、アデニル化ドメイン断片ＰＳＶ１〜ＰＳＶ６の相当する領域を用い、サザンハイブリダイゼーションにより確認した。ＰＳＶアデニル化ドメイン（ＰＳＶ１〜ＰＳＶ６）を各領域から選択した交差接合体をチオコラリン産生培地ＭＴ４で増殖させ、次に、それらの菌糸体をアセトニトリルで抽出し、ＨＰＬＣ−ＭＳにより分析した（実施例５）。アデニル化ドメインＰＳＶ２およびＰＳＶ５に作用する突然変異は、チオコラリンを産生しない表現型を有する（実施例７および１０）。ＰＳＶ１、ＰＳＶ３、ＰＳＶ４およびＰＳＶ６に欠失を有する突然変異体におけるチオコラリンの産生は、野生株ｗｔと同様であった（実施例６、８、９および１１）。これらの実験は、アデニル化ドメインＰＳＶ２およびＰＳＶ５がチオコラリンの生合成に関与していることを示した。
【００８８】
実施例５：チオコラリン産生のＨＰＬＣ検出
分析した種々の株のアセトニトリル抽出物をロータリーエバポレーターで濃縮し、ＤＭＳＯに再懸濁させた後、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析に用いた。
【００８９】
サンプル（１０μ１）を、アセトニトリルおよび水中０．１％のトリフルオロ酢酸の混合物を溶媒とし、逆相カラム（Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ１８、２．１×１５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ）を用いてＨＰＬＣにより分析した。最初の４分間は、移動相の濃度をアセトニトリル１０％で一定に維持した。次に、３０分まで、１０％〜１００％のアセトニトリルの直線勾配を開始した。用いた流速は０．２５ｍｌ／分であった。スペクトル検出およびピーク同定はフォトダイオード検出器を用い、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍコンピューターソフトウエア（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて行った。クロマトグラムは２３０ｎｍの吸光度で抽出したものである。
【００９０】
実施例６：ＰＳＶ１領域における遺伝子分断
ＰＳＶ１領域はプラスミドｐＢＰＳＶ１から１．３ｋｂのＥｃｄＲＩバンドとして得、接合性プラスミド大腸菌／ストレプトミセスｐＯＪ２６０のＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、ｐＦＬ９０３を作出した。ｐＯＪ２６０はストレプトミセスにアプラマイシン耐性を付与する遺伝子を含み、これらの細胞では、それは自殺プラスミドである。
【００９１】
この構築物ｐＦＬ９０３を接合性大腸菌ＥＴ１２５６７（ｐＵＢ３０７）に導入し、そしてここから、記載の手順(Kieser et al. 2000)を用い、接合によりミクロモノスポラ種ＭＬ１株に導入した。これらの交差接合クローンを２５μｇ／ｍｌのアプラマイシンで選択し、それらの染色体ＤＮＡから、このＰＳＶ１領域が本当に分断されているかどうかをサザンハイブリダイゼーションにより確認した。この場合、用いたプローブはＰＳＶ１バンドであった。
【００９２】
突然変異体ミクロモノスポラ種ΔＰＳＶ１をチオコラリン産生培地ＭＴ４で増殖させ、次にその菌糸体をアセトニトリルで抽出し、ＨＰＬＣ−ＭＳにより分析し（実施例５参照）、チオコラリン産生体であることが分かった。培養培地ＭＴ４  １リットル当たりの組成は次の通りである：６ｇのダイズ粉末、２．５ｇの麦芽抽出物、２．５ｇのペプトン、５ｇのデキストロース、２０ｇのデキストリン、４ｇのＣａＣＯ３、１０ｇの海塩、ｐＨ６．８に調整。
【００９３】
実施例７：ＰＳＶ２領域における遺伝子分断
ＰＳＶ２領域はプラスミドｐＢＰＳＶ２から１．３ｋｂのＥｃｏＲＩバンドとして得、プラスミドｐＯＪ２６０のＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、ｐＦＬ９０４を作出した。
【００９４】
この構築物ｐＦＬ９０４を接合性大腸菌ＥＴ１２５６７株（ｐＵＢ３０７）に導入し、そしてここから、接合によりミクロモノスポラ種ＭＬ１株に導入した。これらの交差接合クローンを２５μｇ／ｍｌのアプラマイシンで選択し、それらの染色体ＤＮＡから、このＰＳＶ２領域が本当に分断されているかどうかをサザンハイブリダイゼーションにより確認した。この場合、用いたプローブはＰＳＶ２バンドであった。
【００９５】
突然変異体ミクロモノスポラ種ΔＰＳＶ２をチオコラリン産生培地ＭＴ４で増殖させ、次にその菌糸体をアセトニトリルで抽出し、ＨＰＬＣ−ＭＳにより分析したところ（実施例５）、結果としてこの株はチオコラリンを産生しないことが分かった。
【００９６】
実施例８：ＰＳＶ３領域における遺伝子分断
ＰＳＶ３領域はプラスミドｐＢＰＳＶ３から１．４ｋｂのＥｃｏＲＩバンドとして得、プラスミドｐＯＪ２６０のＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、ｐＦＬ９０５を作出した。
【００９７】
この構築物ｐＦＬ９０５を接合性大腸菌ＥＴ１２５６７（ｐＵＢ３０７）株に導入し、そしてここから接合によりミクロモノスポラ種ＭＬ１株に導入した。これらの交差接合クローンを２５μｇ／ｍｌのアプラマイシンで選択し、それらの染色体ＤＮＡから、このＰＳＶ３領域が本当に分断されているかどうかをサザンハイブリダイゼーションにより確認した。この場合、用いたプローブはＰＳＶ３バンドであった。
【００９８】
突然変異体ミクロモノスポラ種ΔＰＳＶ３をチオコラリン産生培地ＭＴ４で増殖させ、次にその菌糸体をアセトニトリルで抽出し、ＨＰＬＣ−ＭＳにより分析したところ（実施例５）、チオコラリン産生体であることが分かった。
【００９９】
実施例９：ＰＳＶ４領域における遺伝子分断
ＰＳＶ４領域はプラスミドｐＧＰＳＶ４から１．２ｋｂのＥｃｏＲＩバンドとして得、プラスミドｐＯＪ２６０のＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、ｐＦＬ９０６を作出した。
【０１００】
この構築物ｐＦＬ９０６を接合性大腸菌ＥＴ１２５６７（ｐＵＢ３０７）株に導入し、そしてここから接合によりミクロモノスポラ種ＭＬ１株に導入した。これらの交差接合クローンを２５μｇ／ｍｌのアプラマイシンで選択し、それらの染色体ＤＮＡから、このＰＳＶ４領域が本当に分断されているかどうかをサザンハイブリダイゼーションにより確認した。この場合、用いたプローブはＰＳＶ４バンドであった。
【０１０１】
突然変異体ミクロモノスポラ種ΔＰＳＶ４をチオコラリン産生培地ＭＴ４で増殖させ、次にその菌糸体をアセトニトリルで抽出し、ＨＰＬＣ−ＭＳにより分析したところ（実施例５）、チオコラリン産生体であることが分かった。
【０１０２】
実施例１０：ＰＳＶ５領域における遺伝子分断
ＰＳＶ５領域はプラスミドｐＧＰＳＶ５から１．１ｋｂのＥｃｏＲＩバンドとして得、プラスミドｐＯＪ２６０のＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、ｐＦＬ９４０を作出した。
【０１０３】
この構築物ｐＦＬ９４０を接合性大腸菌ＥＴ１２５６７（ｐＵＢ３０７）株に導入し、そしてここから接合によりミクロモノスポラ種ＭＬ１株に導入した。これらの交差接合クローンを２５μｇ／ｍｌのアプラマイシンで選択し、それらの染色体ＤＮＡから、このＰＳＶ５領域が本当に分断されているかどうかをサザンハイブリダイゼーションにより確認した。この場合、用いたプローブはＰＳＶ５バンドであった。
【０１０４】
突然変異体ミクロモノスポラ種ΔＰＳＶ５をチオコラリン産生培地ＭＴ４で増殖させ、次にその菌糸体をアセトニトリルで抽出し、ＨＰＬＣにより分析したところ、結果としてこの株はチオコラリンを産生しないことが分かった。
【０１０５】
実施例１１：ＰＳＶ６領域における遺伝子分断
ＰＳＶ６領域はプラスミドｐＧＰＳＶ６から１．１ｋｂのＥｃｏＲＩバンドとして得、プラスミドｐＯＪ２６０のＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、ｐＦＬ９４１を作出した。
【０１０６】
この構築物ｐＦＬ９４１を接合性大腸菌ＥＴ１２５６７（ｐＵＢ３０７）株に導入し、そしてここから接合によりミクロモノスポラ種ＭＬ１株に導入した。これらの交差接合クローンを２５μｇ／ｍｌのアプラマイシンで選択し、それらの染色体ＤＮＡから、このＰＳＶ６領域が本当に分断されているかどうかをサザンハイブリダイゼーションにより確認した。この場合、用いたプローブはＰＳＶ６バンドであった。
【０１０７】
突然変異体ミクロモノスポラ種ΔＰＳＶ６をチオコラリン産生培地ＭＴ４で増殖させ、次にその菌糸体をアセトニトリルで抽出し、ＨＰＬＣにより分析したところ、チオコラリン産生体であることが分かった。
【０１０８】
工程３：チオコラリンの生合成を担う遺伝子クラスターのヌクレオチド配列の取得および分析
その遺伝子分断がチオコラリンを産生しない表現型を生じたものはアデニル化ドメインＰＳＶ２およびＰＳＶ５の増幅領域だけであったというこれまでの結果に基づき、２つの重複するコスミドｃｏｓＶ３３Ｄ１２（アデニル化ドメインＰＳＶ２の領域を含む）およびｐＣＴ２ｃ（アデニル化ドメインＰＳＶ２およびＰＳＶ５の領域を含む）を配列決定のために選択した。該コスミドから得られた６４，６５０ｂｐの分析を行ったところ、３６の完全ＯＲＦと２つの不完全ＯＲＦの存在が示され、その構成を図１に示す。種々の遺伝子から推定される産物のデータベースに存在するタンパク質配列と比較することで、それらのほとんどに関する機能の推定が可能であった（表１）。
【０１０９】
実施例１２：コスミドｃｏｓＶ３３−Ｄ１２とｐＣＴ２ｃの挿入部のヌクレオチド配列の同定および分析
通常の方法およびウィスコンシン大学のthe Genetics Computer GroupからのプログラムパッケージＧＣＧを用いて両コスミドを配列決定し、配列のコンピューター分析に用いた(Devereux et al. 1984, Nucleic Acid Res. 12, 387-395)。
【０１１０】
このようにして６４，６５０ヌクレオチドの配列が得られ、そのコンピューター分析を行ったところ、３８のＯＲＦ［３６の完全ＯＲＦと２つの不完全ＯＲＦ］の存在が示され、その構成を図１に示す。これらのＯＲＦの遺伝子発現産物をＢＬＡＳＴプログラム(Altschul et al. 1997, Nucleic Acid Res. 25, 3389-3402)を用い、データベースに存在する既知の機能を有するタンパク質と比較し、これにより、これらのＯＲＦのほとんどのものの推定機能が割り付けられた（表１）。
【０１１１】
【表１】
2009502187.tif 000004
2009502187.tif 000005
【０１１２】
同定されたタンパク質のいくつかは、例えば同定されたＮＲＰＳの、Ｔｉｏ１２、Ｔｉｏ１７、Ｔｉｏ１８、Ｔｉｏ１９、Ｔｉｏ２０、Ｔｉｏ２１、Ｔｉｏ２２、Ｔｉｏ２７およびＴｉｏ２８のいくつかなどの、チオコラリンペプチド構造の形成に関与する。Ｔｉｏ５、Ｔｉｏ６およびＴｉｏ２３などの耐性過程に関連する可能性のあるタンパク質もいくつかある。これらの配列領域において同定された可能性のあるチオコラリン経路レギュレーターはＴｉｏ３、Ｔｉｏ４、Ｔｉｏ７、Ｔｉｏ２４、Ｔｉｏ２５に相当する。最後に、イニシエーターユニット３−ヒドロキシ−キナルデート、Ｔｉｏ８、Ｔｉｏ９、Ｔｉｏ１ＯおよびＴｉｏ１１の形成に関連するタンパク質もいくつかある。
【０１１３】
その遺伝子分断がチオコラリンを産生しない表現型を生じる遺伝子が図１にアスタリスクで示されている（ｔｉｏ２０、ｔｉｏ２７およびｔｉｏ２８）。
【０１１４】
実施例１３：ｔｉｏ２８における遺伝子分断
チオコラリンの生合成においてＴｉｏ２８タンパク質が関与するかどうかを証明するために、ｔｉｏ２８遺伝子の遺伝子分断およびアデニル化ドメインの１つだけの特異的遺伝子分断による不活性化を行った。
【０１１５】
このアデニル化ドメイン内の２つのイニシエーターオリゴヌクレオチド（ＦＬ−Ｔ−１０２ｕｐおよびＦＬ−Ｔ−１０２ｒｐ）をデザインし、ｔｉｏ２８における１，４２８塩基対を増幅するために用いた。このイニシエーターオリゴヌクレオチドの配列は次の通りである。
ＦＬ−Ｔ−１０２ｕｐ：５’−ＡＣＣＴＧＡＧＧＴＡＣＴＧＧＧＣＧＣＡＧＣ−３’（２１ヌクレオチド）
ＦＬ−Ｔ−１０２ｒｐ：５’−ＣＣＧＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＧＴＧＧＣ−３’（２０ヌクレオチド）
【０１１６】
ＰＣＲプログラムは、９４℃２分、３０サイクル（９４℃３０秒、５３℃６０秒、６８℃９０秒）、６８℃５分および４℃１５分であった。ＰＣＲ反応混合物は、１μｌのコスミドｐＣＴ２ｃ  鋳型ＤＮＡ、１μｌの各オリゴヌクレオチド３０ｐｍｏｌ／μｌ濃度、７．５μｌの２ｍＭ  ｄＮＴＰ溶液（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ）、１μｌの５０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、５μｌのＰｆｘ反応バッファー(Invitrogene)、５μｌのＰｆｘエンハンサー溶液(Invitrogene)、２８μｌの蒸留水および０．５μｌのＰｆｘポリメラーゼ(Invitrogene)。
【０１１７】
ＰＳＶ７と呼ばれる、得られたＰＣＲ産物をプラスミドｐＯＪ２６０のＥｃｏＲＶ部位にクローニングし、ｐＦＬ９７１を作出した。
【０１１８】
この構築物ｐＦＬ９７１を接合性大腸菌ＥＴ１２５６７（ｐＵＢ３０７）株に導入し、そしてここから接合によりミクロモノスポラ種ＭＬ１株に導入した。交差接合クローンを２５μｇ／ｍｌのアプラマイシンで選択し、それらの染色体ＤＮＡから、このＰＳＶ７領域が本当に分断されているかどうかをサザンハイブリダイゼーションにより確認した。この場合、用いたプローブはＰＣＲ産物ＰＳＶ７であった。
【０１１９】
突然変異体ミクロモノスポラ種ΔＰＳＶ７をチオコラリン産生培地ＭＴ４で増殖させ、次にその菌糸体をアセトニトリルで抽出し、ＨＰＬＣＭＳにより分析したところ（実施例５）、結果としてこの株はチオコラリンを産生しないことが分かった。
【０１２０】
工程４：他のアクチノミセス属におけるチオコラリンの異種発現
チオコラリンの生合成における同定された遺伝子の関与を確認するため、いくつかのストレプトミセス種におけるチオコラリン遺伝子クラスターの異種発現をアッセイした。配列番号１の１，３９３番（ＭｓｅＩ制限部位）と５４，３０１番（ＡｃｌＩ制限部位）の間に含まれるＤＮＡ領域を大腸菌で複製可能なプラスミドに、その後、大腸菌で複製可能であって、ストレプトミセス属の組み込みが可能なプラスミドにクローニングするＤＮＡ断片として選択した。このＤＮＡ領域はｔｉｏ３とｔｉｏ２８（双方とも含み、完全である）の間に位置する総てのＯＲＦを含む（図１）。このＤＮＡ領域の選択は、Ｔｉｏ３タンパク質とＴｉｏ２８タンパク質が、二次代謝タンパク質と類似性を示した配列決定領域内で最も外側のタンパク質であるということによった。
【０１２１】
そのサイズが大きいため、該ＤＮＡ領域は、３つの異なるコスミド（ｃｏｓＶ３３−Ｄ１２、ｃｏｓＶ１９−Ｂ４およびｐＣＴ２ｃ）から得られた３つの独立したＤＮＡ断片：
・断片Ａ（２０．２ｋｂ）：ＭｓｅＩ（配列番号１の１，３９３番）〜ＮｓｉＩ（配列番号１の２１，５８５番）；
・断片Ｂ（１９ｋｂ）：ＮｓｉＩ（配列番号１の２１，５８５番）〜ＥｃｏＲＩ（配列番号１の４０，６３６番）；および
・断片Ｃ（１３．７ｋｂ）：ＥｃｏＲＩ（配列番号１の４０，６３６番）〜ＡｃｌＩ（配列番号１の５４，３０１番）
を連結する複数段階で得た。
【０１２２】
サブクローニングを助けるため、完全ＤＮＡ断片をまず、大腸菌ｐＯＪ２６０で複製可能なプラスミドにサブクローニングした（実施例１４）。この挿入部をレスキューし、エリスロマイシン耐性プロモーター（ｅｒｍＥｐ）（ｐＡＲＰ）［実施例１６］を含む、または該プロモーターを含まない（ｐＡＲ１５ＡＴ）［実施例１５］、大腸菌で複製可能であって、ストレプトミセス属の組み込みが可能なベクターにサブクローニングした。選択されたこのＤＮＡ領域をストレプトミセスの組み込みが可能なプラスミドｐＡＲ１５ＡＴに双方向で（実施例１７）、また、ｐＡＲＰ（実施例１８）にクローニングした。最後に、該構築物を属間接合により数種のストレプトミセスに導入した（実施例１９）。
【０１２３】
実施例１４：選択されたＤＮＡ領域の、大腸菌プラスミドｐＯＪ２６０へのクローニング
制限部位ＥｃｏＲＩ（配列番号１の４０，６３６番）とＡｃｌＩ（配列番号１の５４，３０１番）の間に位置するＤＮＡ領域を、コスミドｐＣＴ２（図２）から常法(Sambrook et al. 2001)により得た。このＤＮＡ断片を大腸菌プラスミドｐＵＫ２１(Vieira et al. 1991, Gene 100, 189-194)のユニークな制限部位ＥｃｏＲＩおよびＣｌａＩにクローニングし、構築物ｐＦＬ１０２３を作出した（図３）。
【０１２４】
制限部位ＮｓｉＩ（配列番号１の２１，５８５番）とＥｃｏＲＩ（配列番号１の４０，６３６番）の間に位置するＤＮＡ領域をコスミドｃｏｓＶ１９−Ｂ４から常法(Sambrook et al. 2001)により得た。このＤＮＡ断片を大腸菌プラスミドｐＧＥＭ−１１Ｚｆ(Promega)のユニークな制限部位ＮｓｉＩとＥｃｏＲＩにクローニングし、構築物ｐＦＬ１０２２（図３）を作出した。
【０１２５】
これら２つのＤＮＡ断片を次に連結した。このため、ｐＦＬ１０２２に位置する制限部位ＮｓｉＩ（配列番号１の２１，５８５番）とＥｃｏＲＩ（配列番号１の４０，６３６番）の間に位置するＤＮＡ断片を制限酵素ＨｉｎｄｉＩＩ（ＮｓｉＩ制限部位の直前の多重クローニング部位に位置する）およびＥｃｏＲＩで消化することによりレスキューした。次に、この断片を構築物ｐＦＬ１０２３に存在する制限部位ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩにクローニングし、プラスミドｐＦＬ１０２４（図３）を作出した。
【０１２６】
ｐＦＬ１０２４にクローニングされた全領域をＳｐｅＩバンドとしてレスキューし（ｐＵＫ２１の多重クローニング部位の両末端にこれら２つの制限部位が存在するため）、プラスミドｐＯＪ２６０のユニークなＳｐｅＩ部位にクローニングし、プラスミドｐＦＬ１０３６（図３）を作出した。
【０１２７】
最後に、コスミドｃｏｓＶ３３−Ｄ１２から切断部位ＭｓｅＩ（配列番号１の１，３９３番）およびＮｓｉＩ（配列番号１の２１，５８５番）の間に位置する断片を得、これをｐＦＬ１０３６のそれぞれＮｄｅＩ部位とＮｓｉＩ部位にクローニングし、ｐＯＪ２６０(Bierman et al. 1992 Gene 116, 43-49)に配列番号１の１，３９３番（ＭｓｅＩ制限部位）と５４，３０１番（ＡｃｌＩ制限部位）の間、すなわち、ＯＲＦ  ｔｉｏ３〜ｔｉｏ２８（双方とも含み、完全である）からなる全領域を含む構築物ｐＦＬ１０４１（図４）を作出した。さらに、ｐＦＬ１０４１では、この領域は２つのＳｐｅＩ制限部位にフランキングされている。ｐＦＬ１０４１は大腸菌で複製可能なプラスミドである。
【０１２８】
実施例１５：ストレプトミセスｐＡＲ１５ＡＴの組み込みが可能なプラスミドの構築
プラスミドｐＡＣＹＣ１８４(Rose 1988, Nucleic Acids Res. 16, 355)の複製起点ｏｒｉ  ｐ１５ＡをＳｇｒＡＩ−Ｘｂａｌ断片をとして得、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片で処理した。この複製起点をプラスミドｐＵＫＡのＳｍａＩ部位にクローニングし、プラスミドｐＵ０１５Ａ（図５）を得た。ｐＵＫＡは、コスミドｐＫＣ５０５(Richardson at al. 1987, Gene 61, 231-241)からＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩバンドとして得られ、そのＰｓｔＩ−ＡｃｃＩ制限部位にクローニングされたアプラマイシン耐性遺伝子プラスミドを含むｐＤＫ２１の誘導体である(Vieira et al. 1991, Gene 100, 189-194)。
【０１２９】
アプラマイシン耐性遺伝子ａａｃ（３）ＩＶの後にｏｒｉ  ｐ１５Ａを含むＤＮＡ断片は、ｐＤＯ１５ＡのＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ消化によって得られた。この断片を、同じ制限酵素を用い、プラスミドｐＯＪ４３６にクローニングし(Bierman et al. 1992, Gene 116, 43-49)、構築物ｐＯＪ１５Ａ（図５）を得た。
【０１３０】
プラスミドｐＯＪ２６０に由来し、接合起点ｏｒｉＴを含むＤｒａＩ−ＢｇｌＩＩ断片（クレノウで処理）を、ｐＯＪ１５ＡのＰｖｕＩＩ制限部位にクローニングした。このようにして最終的にプラスミドｐＡＲ１５ＡＴを得た（図５）。
【０１３１】
実施例１６：ストレプトミセスｐＡＲＰの組み込みが可能なプラスミドの構築
プラスミドｐＧＢ１５(Blanco et al. 2001, Chem. Biol. 8, 253-263)から得られたクレノウで処理したＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ＤＮＡ断片としての、エロラマイシン生合成経路由来のｅｌｍＧＴグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子を、ｐＳＬ１１８０(Amersham Pharmacia)のＥｃｌ１３６ＩＩ制限部位にクローニングした。このようにして、ｅｌｍＧＴ遺伝子が構成的ｅｒｍＥエリスロマイシン耐性遺伝子プロモーター（ＰｅｒｍＥ）の制御下にある構築物ｐＳＬｅｌｍＧＴａを得た（図６）。
【０１３２】
ＰｅｒｍＥ−ｅｌｍＧＴを含むｐＳＬｅｌｍＧＴａから得られたＳｐｅＩ−ＮｈｅＩ断片を、実施例１５に記載されているプラスミドｐＡＲ１５ＡＴのＸｂａＩ部位にクローニングし、構築物ｐＡＲ１５ＡＴＧ＊を得た（図６）。
【０１３３】
プラスミドｐＡＲ１５ＡＴＧ＊のＸｂａＩ消化とその後の再連結により、ｅｌｍＧＴ遺伝子を除去し、ＰｅｒｍＥプロモーターが維持され、プラスミドｐＡＲＰを得た（図６）。
【０１３４】
実施例１７：選択されたＤＮＡ領域の、ストレプトミセスｐＡＲ１５ＡＴの組み込みが可能なプラスミドへの双方向でのクローニング
配列番号１の１，３９３番（ＭｓｅＩ制限部位）と５４，３０１番（ＡｃｌＩ制限部位）からなる領域を含む、ｐＦＬ１０４１からのＳｐｅＩ  ＤＮＡ断片（図４）をプラスミドｐＡＲ１５ＡＴのＸｂａＩ制限部位に双方向でクローニングした（図５）。このようにして、アプラマイシン耐性遺伝子を有し、大腸菌において複製可能であり、ストレプトミセスに組み込み可能である、ｐＦＬ１０４８およびｐＦＬ１０４８と呼ばれる２つの新たなプラスミド（図７）を、φＣ３１ファージのａｔｔＰ領域を用いる系により作出した。
【０１３５】
実施例１８：選択されたＤＮＡ領域の、ストレプトミセスｐＡＲＰの組み込みが可能なプラスミドのＥｒｍＥ遺伝子プロモーターの後へのクローニング
同様にして、配列番号１の１，３９３番（ＭｓｅＩ制限部位）と５４，３０１番（ＡｃｌＩ制限部位）からなる領域を含む、ｐＦＬ１０４１（図４）由来のＳｐｅＩ  ＤＮＡ断片を、プラスミドｐＡＲＰのＸｂａＩ制限部位にクローニングした（図６）。このようにして、ｔｉｏ３（配列番号４）に相当するＯＲＦが、ｐＡＲＰに存在する構成的プロモーターＰｅｒｍＥの制御下にあるｐＦＬ１０４９（図７）を作出した。このプラスミドはアプラマイシン耐性遺伝子を有し、φＣ３１ファージのａｔｔＰ領域を用いる系により、大腸菌で複製可能であり、ストレプトミセスにおいて組み込み可能である。
【０１３６】
実施例１９：種々のストレプトミセスにおけるチオコラリン生合成経路の異種発現
プラスミドｐＦＬ１０４８（図７）を接合により、大腸菌ＥＴ１２５６７（ｐＵＢ３０７）株(Kieser et al. 2000)からストレプトミセス・リビダンスＴＫ２１(Kieser et al. 2000)およびストレプトミセス・アルブスＪ１０７４種(Chater et al. 1980, J. Gene. Microbiol. 116, 323-334)へ導入した。
【０１３７】
プラスミドｐＦＬ１０４９（図７）を接合により、大腸菌ＥＴ１２５６７（ｐＵＢ３０７）株からストレプトミセス・コエリコロルＭ１４５(Redenbach et al., 1996, Mol. Microbiol., 21, 77-96)、ストレプトミセス・リビダンスＴＫ２１、ストレプトミセス・アルブスＪ１０７４およびストレプトミセス・アベルミチリスＡＴＣＣ  ３１２６７種に導入した。
【０１３８】
最後に、プラスミドｐＦＬ１０４８ｒ（図７）を接合により、大腸菌ＥＴ１２５６７株（ｐＵＢ３０７）からストレプトミセス・リビダンスＴＫ２１種に導入した。
【０１３９】
ストレプトミセス・アルブス（ｐＦＬ１０４９）クローンの、産生培地Ｒ５Ａ(Fernandez et al. 1998, J. Bacteriol. 180, 4929-4937)における培養結果を図８Ａに示す。図８Ｂは、このクロマトグラムで、保持時間２７分を有するピークの吸収スペクトルとその質量スペクトルを示し（図８Ｃ）、それは双方とも精製チオコラリンのものと同一であった。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】配列決定されたミクロモノスポラ種ＭＬ１染色体領域の遺伝子編成を含む、チオコラリン遺伝子およびそれを取り囲む遺伝子のクラスターの模式図。チオコラリン遺伝子クラスターの異種発現のためのプラスミドの構築に用いた制限部位を示す。
【図２】コスミドｃｏｓＶ３３−Ｄ１２およびｐＣＴ２ｃの模式図。ｏｒｉ：大腸菌(E. coli)の複製起点。ＳＣＰ２：ストレプトミセス属の複製起点。ａａｃ（３）ＩＶ：アプラマイシン耐性遺伝子。ｎｅｏ：ネオマイシン耐性遺伝子。ｂｌａ：アンピシリン耐性遺伝子。ＳＶ４０  ｏｒｉ：エピソーム複製の真核生物起点
【図３】プラスミドｐＦＬ１０３６を構築するために行ったクローニングを示す図。ｏｒｉ：大腸菌の複製起点。Ｍ１３  ｏｒｉ：Ｍ１３ファージの複製起点。ｏｒｉＴ：接合移入起点。ｌａｃＺ：β−ガラクトシダーゼ遺伝子。ｋａｎＲ：カナマイシン耐性遺伝子。ａａｃ（３）ＩＶ：アプラマイシン耐性遺伝子。ｂｌａ：アンピシリン耐性遺伝子。
【図４】プラスミドｐＦＬ１０４１を構築するために行ったクローニングを示す図。ｏｒｉ：大腸菌の複製起点。ＳＣＰ２：ストレプトミセスの複製起点。ｏｒｉＴ：接合移入起点。ｌａｃＺ：β−ガラクトシダーゼ遺伝子。ａａｃ（３）ＴＶ：アプラマイシン耐性遺伝子。
【図５】プラスミドｐＡＲ１５ＡＴを構築するために行ったクローニングを示す図。ｏｒｉ  ｐ１５Ａ：大腸菌の複製起点。ｏｒｉＴ：接合移入起点。ｉｎｔφＣ３１：φ３１ファージインテグラーゼ遺伝子。ａｔｔＰ：部位特異的組換え部位。ｋａｎＲ：カナマイシン耐性遺伝子。ａａｃ（３）ＩＶ：アプラマイシン耐性遺伝子。Ｋ：大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片で処理した切断部位。
【図６】プラスミドｐＡＰＲを構築するために行ったクローニングを示す図。ｏｒｉ  ｐ１５Ａ：大腸菌の複製起点。ｏｒｉＴ：接合移入起点。ｏｒｉ  Ｍ１３：Ｍ１３ファージの複製起点。ｏｒｉ：大腸菌の複製起点。ｌａｃＺ：β−ガラクトシダーゼ遺伝子。ｌａｃＩ：ラクトースオペロンレプレッサー遺伝子。ｉｎｔφＣ３１：φＣ３１ファージインテグラーゼ遺伝子。ａｔｔＰ：部位特異的組換え部位。ｋａｎＲ：カナマイシン耐性遺伝子。ａａｃ（３）ＩＶ：アプラマイシン耐性遺伝子。Ｋ：大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片で処理した切断部位。ＰｅｒｍＥ：ｅｒｍＥ遺伝子プロモーター。
【図７】プラスミドｐＦＬ１０４８、ｐＦＬ１０４８ｒおよびｐＦＬ１０４９の図。ｏｒｉ  ｐ１５Ａ：大腸菌の複製起点。ｏｒｉＴ：接合移入起点。ｉｎｔφＣ３１：φＣ３１ファージインテグラーゼ遺伝子。ａｔｔＰ：部位特異的組換え部位。ａａｃ（３）ＩＶ：アプラマイシン耐性遺伝子。
【図８Ａ】７日間のＲ５Ａ培地での増殖後のストレプトミセス・アルブス（ｐＦＬ１０４９）培養抽出物のＨＰＬＣクロマトグラム。チオコラリンに対応するピークとその保持時間、２７分を示す。
【図８Ｂ】図８Ａに示されている２７分ピークに存在する生成物（チオコラリン）のＵＶ吸収スペクトル。
【図８Ｃ】図８Ａに示されている２７分ピークに存在する生成物（チオコラリン）の質量スペクトル。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図８Ａ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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