(57)【要約】  本発明は、活性化された重合体樹脂支持体上での間接的な共有結合／架橋を通してオキシダーゼ、特に植物オキシダーゼそして最も好ましくは茶ポリフェノールオキシダーゼといったような生物活性高分子を固定化するため１，１−カルボニルジイミダゾールで特殊化された官能基をもつアクリレートベースの重合体樹脂を活性化させることにより、きわめて効率のよい固体マトリクスを開発するための方法において、ここで該マトリクスは熱安定性があり、インビトロできわめて高い代謝回転数（「ｎ」回）を与え、このとき茶基質は生物活性の喪失なく生成物テアフラビンを排他的に形成ししかも該生成物をマトリクスへの接着なくインビトロにとどまらせ、かくしてマトリクスに対し、生成物毒性化及びマトリクスに結合した酵素系の生物活性のその後の部分的又は完全な喪失に向けた安全性を付与し、かくしてマトリクスをかかる系に基づくバイオリアクタに充分適合しかつかかるバイオリアクタに充分適したものにする方法に関する。これは、粗製基質又は精製済み基質の両方に関して種子及び花の基質といったような本来不経済な茶基質のテアフラビンへの再生利用可能性に関して独自のものである。
2009538598.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造式ＩＩＩ：
【化１】
2009538598.tif 000013
を有する固体マトリクスにおいて、Ｘが最高約３０であり、Ｚが重合体鎖長内のカルボキシル基１個あたり１であり、Ｅがポリフェノールオキシダーゼ酵素（ＰＰＯ）である、固体マトリクス。
【請求項２】
使用されるＰＰＯが、好ましくは茶又はライチ由来である任意の供給源から得られた酵素から選択されている、請求項１に記載のマトリクス。
【請求項３】
最高６０℃の温度で安定である、請求項１に記載のマトリクス。
【請求項４】
ＰＰＯで固定化されたマトリクスが、対応する生成物を得るべく同じ植物から選択された基質を転換するのに有用である、請求項１に記載の固体マトリクス。
【請求項５】
使用されるポリフェノールオキシダーゼが、茶基質をテアフラビンに転換するのに有用である茶ＰＰＯである、請求項１に記載の固体マトリクス。
【請求項６】
使用されるＰＰＯが、ライチ基質を、ライチ基質由来の重合されたキノンから誘導されたオレンジ色生成物へと転換するために有用であるライチＰＰＯである、請求項１に記載の固体マトリクス。
【請求項７】
酵素活性の喪失なく茶基質をテアフラビンに転換するべく少なくとも５０の代謝回転数の間有効に該マトリクスを使用できる、請求項１に記載のマトリクス。
【請求項８】
使用される重合体が、メチルアクリレート重合体、エチルアクリレート重合体又はブチルアクリレート重合体から成る樹脂から選択される、請求項１に記載のマトリクス。
【請求項９】
使用される重合体が好ましくはメチルアクリレートである、請求項１に記載のマトリクス。
【請求項１０】
以下の構造式ＩＩＩ：
【化２】
2009538598.tif 000014
を有する固体マトリクスの製造方法において、Ｘが最高３０であり、Ｚが重合体鎖長内のカルボキシ基１個あたり１であり、Ｅが任意の植物供給源からのポリフェノールオキシダーゼ酵素（ＰＰＯ）であり、
ａ）  ＲがＨ又はＣＨ3又はＣ2Ｈ5であり、Ｘが最高約３０であり、Ｙが最高約３０である一般構造式Ｉａの重合体、又はＲがＨ又はＣＨ3又はＣ2Ｈ5、Ｙが最高約３０である一般構造式Ｉｂの重合体と１，１−カルボニルジイミダゾールとを、ｐＨ約６．２のリン酸緩衝液中において、４℃〜２０℃の範囲内の温度で、３０分乃至１時間の範囲内の時間反応させて、
【化３】
2009538598.tif 000015
という構造式ＩＩのイミダゾール重合体を得る段階であって、式中Ｘは最高約３０、Ｚは重合体鎖長内のカルボキシル基１個あたり１である、段階、
ｂ）  段階（ｂ）でこのように形成された生成物をろ過し、その後続けてジクロロメタンで洗浄し乾燥させて所望のマトリクスを得る段階、
ｃ）  上述の構造式ＩＩの前記活性化された重合体上でＰＰＯ好ましくは茶ＰＰＯである標的分子を２０〜２５℃の範囲内の温度で１時間〜２時間の範囲内の時間、約ｐＨ６．２の適切な緩衝液好ましくはリン酸緩衝液内で固定化して、構造式ＩＩＩの固体マトリクスを得る段階、
を含む方法。
【請求項１１】
使用される標的部分が、任意の植物供給源、特に茶ＰＰＯから選択されるＰＰＯである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
使用される重合体が、約３０，０００〜１００，０００ダルトンの間の範囲内の分子量を有している、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
アクリレート重合体と１，１−カルボニルジイミダゾールのモル比が約２：１である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
オキシダーゼの固定化が、水溶性形態ならびに結合形態の両方の形態で発生し得る、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
ＰＰＯの結合能力がマトリクス１ｇあたり１１．５ｍｇである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
ＰＰＯで固定化されたマトリクスが、好ましくは茶カテキンである植物基質をテアフラビンへと転換するために有用である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
茶基質からテアフラビンへの転換が９０パーセントである、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
基質からテアフラビンへの転換方法において、
（ａ）  水中に溶解させた基質と請求項１に記載の固体マトリクスの混合物を、２５℃〜３７．５℃の範囲内の温度で、３０分〜２時間の範囲内の時間インキュベートする段階、
（ｂ）  混合物からマトリクスを分離して、生成物テアフラビンを含有するろ液を得、アセトンとそれに続いて水で洗浄した後マトリクスを再循環させる段階、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は特に固体マトリクス、その製造方法及びテアフラビンの製造方法に関する。
【０００２】
より特定的には、本発明は、精製済み茶基質ならびに粗製茶基質調製物の両方からの茶基質連続的バッチ生産及び茶基質からテアフラビンへの完全な転換のため、可溶性形態及び結合形態の両方の植物オキシダーゼ酵素特に茶ポリフェノールオキシダーゼ（ＥＣ１．１０．３．１）を固定化するためのきわめて効率の高い固体マトリクスの開発を目的とするプロセスにおいて、該マトリクスがつねに、利用可能な基質の全てをテアフラビンに転換し、かくして反応媒質内で利用可能な基質と正比例してテアフラビン（ｗ／ｗ）を作る手段を提供している、方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
テアフラビンは、表２に示されているような一般的構造をもつポリフェノール化合物の一群であり、紅茶製造中に、茶カテキン（フラバン−３−オール及びそのガレートエステル）をその基質として、茶の葉及び茶の木のその他の器官内に天然に見出される茶ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）（ＥＣ１．１０．３．１）の酵素媒介型反応によって形成される。この反応を形成するための基質は、頂部の二枚の葉及び付随する蕾を含む茶の木の若芽の中に最大量で存在し、茶の木の全ての部分に比較的少ない量で存在し、ＰＰＯ酵素についても同様である。Wickremsingle, R. L.及びPerera, K. P. W. C.（１９７２年）、Journal of National Science Council, SriLanka;1,111-21を参照のこと）。（同様にWickremsingle, R. L., Roberts. G. R.及びPerera, B. P. M.（１９６７年）、Tea quaterly; 38, 309-10も参照のこと）。一次基質化合物は、表１に示されているようにカテキンとして一般に知られているフラバン−３−オールの誘導体である。Yaminishi, Tei（１９９０年）、「食品科学の発達」、25, Russell L, Rouseff、「食品及び飲料中の苦味」、Elsevier London,（−）エピカテキン（ＥＣ）；（−）エピガロカテキン（ＥＧＣ）及びそのガレートエステルを内含することが記述されている第９章を参照のこと。少量の（＋）カテキン及び（＋）ガロカテキンも同様に見い出される。カテキンは、Assamica品種においては３０％にものぼり、Sinensis品種においてはわずか１０％前後にすぎない可能性がある。紅茶において、形成されるテアフラビンの量は部分的に紅茶の乾燥重量の０．３〜１．８パーセントであり、化合物の異種群であるテアルビギンが紅茶の葉の約９〜１９％を構成している、ということが報告されている、Sanderson G. W.（１９７２年）、「植物化学の構造的及び機能的側面」、Runecleles V. C. ed. Academic Press, New York., 271~280も参照のこと。茶の化学的性質及びその成分が詳細に論述されている、過去に公開されたテーマについてのさまざまな精査も参照のこと。マトリクス結合した茶ポリフェノールオキシダーゼは、茶基質に向かってのその高い反応度、活性を全く失わない「ｎ」回の反復的利用可能性、マトリクス結合型酵素系の生成物毒性化の恐れを軽減させるマトリクスに対する形成された生成物の非付着性、高まった熱安定性及び精製済み茶基質及び未精製茶基質の両方由来の茶基質からテアフラビン最終生成物への完全な転換、に関して独自のものである。
【化１】
2009538598.tif 000003
【０００４】
誘導体化されたアクリレートベースの重合体樹脂上に固定化されたポリフェノールオキシダーゼは、茶基質からのテアフラビンの生産を助ける。テアフラビンは、紅茶の加工中に生産される凝縮カテキンの一群である。（Goodsall Chri W., Safford Dick（１９９８年９月１〜３０日）、合成有機化学に関する第２回国際電子会議（ＥＣＳＯＣ−２）を参照のこと。これらは、茶浸出液のさわやかさ、明るさの原因であり、着色料、抗ガン物質及び重要な栄養補給食品として使用される好ましい潜在性をもつ遊離カテキンと同じ酸化防止特性を有する（Miller, N. J., Castelluccio, C; Tijburg, L., Rice-Evans, C.（１９９６年、８月１９日）、FEBS Lett. ; 392(1), 40~41ｐを参照のこと）。自然食品であるため、これらを錠剤ＮＡＤのためのコーティング着色物質として又は化粧用調製物中及び油及び脂肪中の酸敗臭防止化合物として使用することもできる。テアフラビンは、細胞培養中のシトクロムＰ４５０ＩＡＩを抑制することにより酸化物ストレスを阻害することによって、細胞ＤＮＡ損傷を防止する（Feng, Q., Trii, Y; Uchda, K; Nakamura, Y., Hara, Y 及びOsawa, T. J.（２００２年１月２日、Agri Food Chem; 50(1): 213-216を参照のこと）。テアフラビンは同様に腫瘍成長及び炎症をも阻害する（Dass, M; Sur, P; Gomes, A; Vedasiromoni, J. R.及びGanguly D. K.（２００２年）、Phytother. Res., 16, S40-S44を参照のこと。これに加えて、テアフラビンは同様に、抗染色体異常誘発効果及び抗突然変異誘発効果をも有している（Gupta S, Chaudhuri T, Seth P, Ganguly D. K.及びGiri A. K.（２００２年）、Phytother. Res., 16, 655-661を参照のこと。ただし、緑葉が最高で２０パーセント（乾燥重量）のカテキンを有していても、テアフラビンは紅茶の１．５〜２．５パーセント（乾燥重量）を構成しているにすぎない。（Harold, N及び Graham, P. D.（１９９２年）、緑茶の組成、消費及びポリフェノール化学反応、Preventive Med., 21, 334-350を参照のこと）。茶の芽の中に存在するテアフラビンの生成に関与する酵素ポリフェノールオキシダーゼ（Bajaj, K. L., Anan, T ; Tsushida, T & Ikegaya K.（１９８７年）、J, Agric. Biol. Chem., 51, 1767-1772を参照のこと）は、上述のマトリクス上で可溶化され固定化された。
【０００５】
本発明によって提供されるさらなる改良としては、生物学的活性の保持を最大限にしかつ／又は標的分子の活性を増大させ、生成物の毒性を最小限におさえ、生理学的ｐＨでの反応時間を最小限におさえ、生成物の汚染を低減させ、活性化された重合体の安定性を改善する能力が含まれる。
【０００６】
生物学的に活性な高分子を固定化するためのその他の方法が示す制限は、以下のようなことである：
１．  長いカップリング時間、
２．  標的分子の不活性化を導く非生理的ｐＨ、
３．  活性化又は不活性化重合体のいずれかでの生成物の汚染
４．  毒性のある重合体種又は副産物。
５．  水溶液中での使用に制限。
６．  活性化重合体構成体が不安定。
７．  塩化シアヌル方法（Abuchowskiら、（１９７７年ａ）、Journal of Biological Chemistry, 252, 3582-3586を参照のこと）及びカルボニルジイミダゾール方法（Beauchampら、（１９８３年）、Analytical Biochemistry, 131, 25-33を参照のこと）で頻繁に見られ、フェニルクロロホルメート（Veroneseら、（１９８５年）、Appl. Biochem. Biotechnol., 11, 141-152を参照のこと）及びスクシニメジル活性エステル方法（Shadle ら; Katreら、（１９８７年）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1487-1491を参照のこと）で時として見られる生物活性の実質的喪失。
８．  数多くの方法が、長いカップリング時間及び／又は非生理的ｐＨを推奨し、かくして標的部分を比較的活性度又は不活性度の低いものにする（例えばカルボニルジイミダゾール、塩化シアヌル、フェニルクロロホルメート及び一部のスクシニミジル活性エステル方法）。
９．  一部の方法は、水溶液中での使用に適しておらず、かくして、標的分子を、非水性溶液を許容するものに制限する（例えば、塩化トリフルオロメタンスルホニルを用いた有機ハロゲン化スルホニル方法（Mosbach & Nilson; Delgadoら、（１９９０年）、バイオテクノロジー及び応用生化学、12,119-128を参照のこと））。
１０．  数多くの方法は、活性化した重合体種を使用しかつ／又は広範な飲料において毒性でありかつ生成物と分離はされていなくてもインビボで潜在的に毒性である副産物を生産する（例えばフェニルクロロホルメート、塩化シアヌル方法）。本発明においては、前述した方法の大部分が、活性酵素：重合体アダクツと基質との反応中の生成物結合レベルが高いことからマトリクスの毒性化がひき起こされ、生物学的活性が部分的又は完全に失なわれること、そして活性マトリクスからの生成物の回収が不可能で、バイオリアクタ又は反復的使用のための材料として適さなくなっていることを理由として、不適切である。
【発明の開示】
【０００７】
本発明の主たる目的は、テアフラビンの調製を目的とした固体マトリクス、その調製プロセスを提供することにある。
【０００８】
本発明のもう１つの目的は、連続的バッチ生産及び茶基質からテアフラビンへの完全な転換のために茶ポリフェノールオキシダーゼ酵素を固定化する目的で固体マトリクスを使用することにある。
【０００９】
本発明のもう１つの目的は、オキシダーゼ、好ましくは植物オキシダーゼそして特に茶ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）の固定化のため特殊化した官能基を導入する目的で適切な誘導体化後のソース材料としてアクリレートベースの重合体樹脂を使用することにある。
【００１０】
本発明のさらにもう１つの目的は、固定化された茶ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）系に基づくバイオリアクタの助けをかりて経済的な形で原料（茶の木の葉、花の種）中で入手可能な基質量に正比例して、この量に至る収量（ｗ／ｗ）で茶基質からテアフラビンを調製することにある。
【００１１】
本発明のさらにもう１つの目的は、生成物の喪失、マトリクス結合型酵素系の生成物毒性化及びマトリクス結合酵素系の生物学的活性の低下又は完全な喪失の恐れなく、マトリクス結合型酵素系の反復的かつ無制限の使用を可能にする、形成された生成物のマトリクス系に対する付着が全くない状態でインビトロ反応条件下で、発達させた系から反復的生成物を作るべくマトリクス及び固定化されたマトリクス結合型酵素系を開発することにある。
【００１２】
本発明のさらにもう１つの目的は、茶基質を得これらを高価値のテアフラビンに転換させるために、茶の種子、茶の花及び剪定残物といったような茶の木由来の不経済な廃棄物材料を利用することにある。
【００１３】
本発明のさらにもう１つの目的は、茶基質を得それらを高価値のテアフラビンに転換させるために、フラッシングシーズン（flushing season）中に低価値の茶作物を利用することにある。
【００１４】
本発明のさらにもう１つの目的は、固定化を目的として高収量でかつ経済的に茶の葉及び茶の木のその他の部分から酵素ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）を可溶化することにある。
【００１５】
本発明のさらにもう１つの目的は、６０℃前後の温度で安定した状態にとどまり得るマトリクス系を提供することにある。
【００１６】
本発明のさらにもう１つの目的は、酵素活性の損失無く茶基質をテアフラビンに転換するためにマトリクスを少なくとも５０回使用できるということにある。
【００１７】
本発明のさらにもう１つの目的は、茶基質からテアフラビンへの転換が９０パーセント前後である方法を提供することにある。
【００１８】
本発明の概要
従って、本発明は、ＣＤＩ（１，１−カルボニルジイミダゾール）活性化されたアクリレートベースの重合体樹脂の調製を含む、連続的なバッチ生産と茶基質からテアフラビンへの完全な転換のために茶ポリフェノールオキシダーゼ酵素を固定化することを目的とするきわめて効率の良い固体マトリクスを開発するためのプロセスを提供しており、該プロセスには、氷浴中で４℃に維持された平底フラスコ中に取込んだ５０ｍｌのジクロロメタン内への２．０ｇの１，１−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）の添加が関与しており、１，１−カルボニルジイミダゾールの添加の後、上述の溶液に対し４．０ｇの重合体樹脂が添加され、混合物全体は半時間磁気撹拌機上で室温（２０℃）で撹拌され、このように形成された生成物は、Buchner漏斗を通しWhatmanろ紙Ｎｏ．２を用いてろ過され、ＣＤＩで活性化された重合体樹脂は次に２５ｍｌのジクロロメタンで洗浄され、真空下で乾燥され、さらに使用されるまで４℃で冷蔵庫内に保たれた。
【００１９】
入手可能な基質のインビトロでの転換の触媒として作用して、化学的には１，８−ビス（３，４−ジヒドロ−３，５，７−トリヒドロキシ−２Ｈ−１−ベンゾ−ピラ−２−イル）−３，４，６−トリヒドロキシ−５Ｈ−ベンゾシクロ−ヘンテン５−オンとして識別され一般にテアフラビンとして知られている生成物（テアフラビン）を優先的かつ完全に作るべく、固定化された酵素の生物学的特性を修正し改善するためにマトリクスの誘導体化された重合体部分と、茶の木Camellia sinensis (L(O), Kuntze)の葉及び花、種子、樹皮などといったようなその他の部分から８０％超の収量できわめて活性の高い状態で、我々のケースでは単離され水性形態で可溶化された酵素タンパク質ポリフェノールオキシダーゼ（ＥＣ１．１０．３．１）である標的分子の間接的共有結合。さまざまな濃度及び割合で茶の木の全ての部分に通常存在するこの反応のための基質は、そのような調製物の中に存在する利用可能な基質に正比例して最終生成物としてテアフラビンを得るために単離され、粗製又は精製済み調製物のいずれかとして使用された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の詳細な説明
従って、本発明は、
【化２】
2009538598.tif 000004
という構造式ＩＩＩの固体マトリクスにおいて、Ｘが最高約３０であり、Ｚが重合体鎖長内のカルボキシル基１個あたりつねに１であり、ＮＨ−Ｅがポリフェノールオキシダーゼ酵素（ＰＰＯ）である、固体マトリクスを提供する。
【００２１】
本発明の１実施形態においては、本発明で使用されるポリフェノールオキシダーゼは、茶及びライチから成る群から選択された植物から得られる。
【００２２】
本発明の１実施形態においては、マトリクスは同様に、６０℃前後の温度で安定している。
【００２３】
本発明の１実施形態においては、マトリクスは、茶から選択された基質を対応する生成物テアフラビンへと転換するのに有用である。
【００２４】
本発明の１実施形態においては、マトリクスは、酵素活性を喪失することなく茶基質をテアフラビンに転換するべく少なくとも５０回使用可能である。
【００２５】
本発明の１実施形態においては、使用される重合体は、メチルアクリレート重合体、エチルアクリレート重合体、プロピルアクリレート重合体、ブチルアクリレート重合体から成る樹脂から選択され、好ましくはメチルアクリレートである。
【００２６】
本発明の１実施形態においては、
Ｘが最高３０であり、Ｚの値が重合体鎖長内でカルボキシ基１個あたりつねに１であり、ＮＨ−ＥがＰＰＯである、
【化３】
2009538598.tif 000005
という構造式ＩＩＩの固体マトリクスの製造方法は、
ａ）
以下の：
【化４】
2009538598.tif 000006
で表されるＲが−Ｈ、−ＣＨ3、−Ｃ2Ｈ5であり、Ｙが最高約３０であり、Ｘが最高約３０である一般構造式Ｉａ、又はＲが−Ｈ、−ＣＨ3、−Ｃ2Ｈ5、Ｙが最高約３０である一般構造式Ｉｂの重合体と、１，１−カルボニルジイミダゾールとを、４℃〜２０℃の範囲内の温度で、３０分乃至１時間の範囲内の時間反応させ、
【化５】
2009538598.tif 000007
という構造式ＩＩの活性化されたイミダゾール重合体を得る段階であって、式中Ｘは最高約３０、Ｚの値は重合体鎖長内のカルボキシル基１個あたりつねに１である、段階、
ｂ）  段階（ａ）でこのように形成された生成物をろ過し、その後続けてジクロロメタンで洗浄し乾燥させて活性化されたアクリレート樹脂を得る段階、
ｃ）  構造式ＩＩの活性化された重合体を、水性リン酸緩衝液（ｐＨ６．２）媒質中で１時間から２時間の範囲内の時間、４℃〜２５℃の温度範囲で、ＰＰＯ、好ましくは茶ＰＰＯから選択された標的部分と反応させる段階；
ｄ）  活性化されたアクリレート樹脂上に生物学的に活性な高分子を固定化して、構造式ＩＩＩの所望のマトリクスを得る段階；
を含む。
【００２７】
本発明の１実施形態においては、使用される標的部分は、茶ＰＰＯ由来のＰＰＯのものである。
【００２８】
本発明の１実施形態においては、段階（ｄ）で使用されている生物学的に活性な高分子は、好ましくは茶の木由来のＰＰＯである。
【００２９】
本発明の１実施形態においては、アクリレート重合体と１，１−カルボニルジイミダゾールのモル比は約２：１である。
【００３０】
本発明の１実施形態においては、オキシダーゼの固定化は、水溶性形態及び結合形態の両方の形態で発生している。
【００３１】
本発明の１実施形態においては、ＰＰＯの結合能力は、マトリクス１ｇあたり１１．５ｍｇである。
【００３２】
本発明の１実施形態においては、茶基質からテアフラビンへの転換は、９０パーセントである。
【００３３】
本発明は、重合体上の活性化基から間接的に共有結合させられた重合体：標的分子アダクツを提供する。カップリング段階は、水性媒質中で実施され得、急速に発生し、かくして不安定な標的種に対する損傷を最小限におさえる。
【００３４】
従って、本発明は、以下の段階を含む、重合体と標的材料のアダクツを製造する方法を提供する：
（ａ）  カルボニルジイミダゾールと、
【化６】
2009538598.tif 000008
という一般構造式（Ｉ）の重合体とを反応させる段階であって、式中Ｒ＝Ｈ、ＣＨ3又はＣ2Ｈ5であり、ｘ及びｙは重合体の組成に応じて任意の数であり得る、段階；
（ｂ）
【化７】
2009538598.tif 000009
という構造式（ＩＩ）の活性化されたイミダゾール重合体を形成させる段階であって、ここでｘ及びｚは正の数である、段階；
（ｃ）  活性化された重合体（ＩＩ）を標的部分と反応させ、重合体と標的材料（ＩＩＩ）のアダクツを回収する段階であって、
【化８】
2009538598.tif 000010
ＮＨ−Ｅが標的部分（酵素）である、段階。
【００３５】
前記方法中、
（ｉ）  構造式（Ｉ）の重合体は、５０〜２００ミクロンの範囲内の粒子サイズをもつ不水溶性の乾燥した粉末として得られるか、又は０．１５〜０．３ｍｍの厚みの薄膜として得られる。
（ｉｉ）  段階（ｉ）で形成された重合体は、氷浴中で４℃に維持された平底フラスコ内に取込まれたジクロロメタン中でＣＤＩ（１，１−カルボニルジイミダゾール）と反応させられ、混合物全体は半時間磁気撹拌機上で室温（２０℃）で撹拌され、そのプロセス中このように形成されたイミダゾール活性化された重合体生成物は、
（ｉｉｉ）  Whatmanろ紙Ｎｏ．２を用いてBucher漏斗を通してろ過され、活性化された重合体樹脂は次に２５ｍｌのジクロロメタンで洗浄され、真空下で乾燥させられた。
（ｉｖ）  このように生産された構造式（ＩＩ）のイミダゾール活性化された重合体は、乾燥状態で回収され、さらに使用するまで冷蔵庫に４℃で保管した。
【００３６】
段階（ｉｖ）の生成物はその後段階（ｃ）で直接使用されるか又は、段階（ｃ）での使用まで加水分解を避けるように保管された。そして、
（ｖ）  標的材料と活性化された重合体との段階（ｃ）での反応は、標準材料との関係における非変性温度で非変性媒質内、好ましくはｐＨ６．２のリン酸緩衝液内で、実施された。
【００３７】
本発明中で使用された構造式（Ｉ）の重合体は全て、既知の容易に入手可能な重合体に基づくものである。重合体は市販されているままの状態で使用でき、そうでなければ既知の技術を用いて実験室内でこれを合成することもできる。
【００３８】
重合体及び／又は標的材料は多価であり得ることから、本発明のプロセスによりさまざまな重合体すなわち標的構造を生産することが可能である、ということはここで言及するに値する。
【００３９】
一般に、標的部分は、２つ以上の反応基を有する確率が高く、これらの反応基はこのとき活性化された重合体と反応し、従って、複雑な構造を形成する可能性をつねに考慮しなくてはならない。
【００４０】
従って、本発明は方法の以下の特定の実施形態を提供する：
１．  予め定められたモル比及び予め定められたモル濃度で、カルボニルジイミダゾール活性化重合体と標的部分を反応させて、重合体を標的部分の１：１のアダクツを生産して重合体：標的アダクツを生産する段階、及び段階（ｄ）に従ってアダクツを回収する段階を段階（ｃ）の中に含む、上述の通りの方法。
２．  予め選定された割合の反応基を反応させ特に高分子標的と共に重合体分子に連結されている重合体と標的のアダクツを形成させるように２つ以上の反応基をもつ標的部分と活性化された重合体とを、予め定められたモル比及びモル濃度で反応させる段階を、段階（ｃ）中に含む、上述の通りの方法。予め選定された割合は、例えば１〜１００％、好ましくは１０〜９０％例えば１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０％であり得る。
３．  予め定められたモル比及び予め定められたモル濃度で、カルボニルジイミダゾール活性化重合体と標的部分を反応させて、重合体と標的部分間に２つ以上の共有結合をもつ重合体と標的のアダクツを形成させる段階、そして次に段階（ｄ）に従ってアダクツを回収する段階を段階（ｃ）の中に含む上述の通りの方法。
【００４１】
発明の方法内で用いられる試薬は、以下のように記述される：
段階（ａ）で使用される試薬１，１−カルボニルジイミダゾールは、以下の構造をもつ化合物である：
本発明で使用される構造式（Ｉ）のアクリレート重合体は全て、本発明において使用されるカルボニル化試薬、特にカルボニルジイミダゾールに対する反応基特にカルボキシレートを一般に含有する既知で容易に入手可能な重合体に基づいている。構造式（Ｉ）の重合体は、アミド、ヒドロキシル又はカルボキシルといったようなカルボニル化試薬に対する官能基をもつ可変的鎖長のアクリレートであり、ここで好ましいカルボニル化試薬はカルボキシルである。
【化９】
2009538598.tif 000011
【００４２】
標準的には、重合体は、３０，０００〜１００，０００以上の範囲内の分子量をもつインビボ及びインビトロで不水溶性の非毒性のものである。媒質に放出された適切な基質と重合体標的アダクツの反応生成物を得る上で、重合体自身の固有の疎水性も同様に重要である。反応性カルボキシ基は、末端カルボキシル基であり、選択された重合体に応じて、かかる基は反応のためにすでに利用可能であり得、そうでなければ、予備的段階において従来の技術によりかかる基を導入することが必要であるかもしれない。一般に、カルボキシル基は、重合体の炭素原子に対する結合である。カルボキシル基は、カルボニル化試薬（１，１−カルボニルジイミダゾール）に対し反応する能力がなくてはならない。カルボキシル基は、これらが究極的に重合体と標的の間の所望の共有結合連結の形成を可能にするようなものである。かかるカルボキシルは１，１−カルボニルジイミダゾールと反応して活性化されたイミダゾール部分を形成する。
【００４３】
本発明のプロセス内で使用するための重合体の生産は、大部分の材料が市販で入手されるものの場合によってこのとき所望のカルボキシ反応基官能性を導入するように修正して、従来の技術によって達成可能である。本発明に従って使用するための好ましい重合体は、ｘ、ｙが３０，０００〜１００，０００ダルトンの範囲内の分子量のために充分な大きさである場合である。
【００４４】
標的材料
本発明に従って重合体を付着させることのできる適切な標的材料は、例えば薬学的及び栄養補助的重要性をもつ生成物を作るにあたって有用である、生物学的活性をもつ全ての材料、好ましくは可溶性形態及び結合形態の両方の形態の植物オキシダーゼ、特に茶ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）である。これらは、イミダゾール基に隣接する重合体の炭素原子上で求核攻撃を開始させる能力をもつ原子を含む少なくとも１つの反応基（以下「Ｎ」）基と呼ぶ）を含有している。反応基の例としては、一次及び二次アミノ基ならびに芳香族ヒドロキシル基が含まれる。
【００４５】
標的分子は同様に、より大きな分子構造の一部であってもよい。標的分子がかかる構造の一部である場合には、一般に各構造内に数多くの標的分子が存在することになるということがわかる。
【００４６】
発明人の調査から、これまでの重合体カップリング方法で見られることの多かった生物学的活性の喪失の多くが、不適切なカップリング反応、カップリング条件及び／又はバイオアッセイ内の汚染性有毒材料還元応答に起因し、さらに重大な形で、その後のマトリクス毒性化における適切な基質との反応中の生成物の結合及び生物学的活性の喪失をひき起こす、適切な疎水性を内部に有することのない重合体マトリクスの不適切な選択に起因するということが推測される。本プロセスは、大部分の分子についてのきわめて保存度の高い生物学的活性、さらには増強された生物学的活性をも伴う重合体及び標的のアダクツを生成する手段を提供する。
【００４７】
方法
本発明のプロセスは、以上で定義された通りのいくつかの制約に従って段階（ａ）及び段階（ｂ）を実施することに依存しており、特に段階（ａ）は、上述した通り段階（ｉ）〜（ｉｉｉ）を用いて実施されなくてはならない。
【００４８】
活性化された重合体は、これがその後の反応と干渉する活性マトリクス種の形成を導く分解の機会を最小限にしか付与しないことから、段階（ａ）に従ったその生産の直後に使用される。生成物を使用に先立ち貯蔵しなくてはならない場合、例えば後日さらに少量で使用するためバルクに形成させられる場合、それは、熱分解を回避するため充分に低い温度で、好ましくは冷蔵庫内で４℃で、加水分解を回避するようにそれを貯蔵しなくてはならない。
【００４９】
段階（ｃ）内の標的材料と活性化重合体との反応は、非変性媒質、数多くの生体材料については特に酵素の中で起こり、これは必然的に水性媒質、好ましくは適切な性質及びｐＨ及びイオン強度の緩衝液である。ｐＨ、濃度、タンパク質濃度及び安全性のためのその他の必要条件の選択は、ケースバイケースで決定される。当業者にとってこれに関するむずかしさは全くない。
【００５０】
段階（ａ）用の試薬が一定温度好ましくは４℃で混合されることが好ましい。反応混合物は２０℃の周囲温度で出てくることができる。
【００５１】
重合体Ｉが−ＣＯＯＨの代りにより多くの−ＯＨ基を有する場合、かかる重合体から生成された活性化された重合体標的アダクツは、適切な基質とのその後の反応における生成物に結合し、場合によってはマトリクスを毒性化し、生物学的活性の部分的又は完全な喪失が観察される。
【００５２】
重合体対１，１−カルボニルジイミダゾールの最も好ましいモル比は２：１である。
【００５３】
生成物
本発明は同様に、人間又は動物の体の治療的及び診断的処置方法における使用のためのこのような生成物、及び人間又は動物の体の治療的及び診断的処置方法において使用するための薬剤の製造におけるかかる生成物の使用、及び薬学的に受容可能な希釈剤及び担体と合わせて本発明の生成物を含む薬学組成物にも拡大され、好ましい生成物は、分光光度及びＨＰＬＣ分析により同定され図３及び４に示されているように３８０ｎｍ及び４６０ｎｍでの吸光度を示す参考基準（Sigma）と比較される通りのテアフラビンである（Coxon, D. T, ; Holmes, A ; Ollis, W. D.及びVora, V. C.（１９７０年）、Tetrahedron Letters, 5237~40を参照のこと）。紅茶から抽出された及び固定化された酵素系から生産されたテアフラビンの比較分光光度分析を表わす図２に、標準的なテアフラビンが示されている。該生成物は同様にFlavognort試薬（ジフェニルホウ酸エタノールアミン）とも反応して、天然化合物が行なうように緑色を生成し、かくしてさらにテアフラビンであるものとして同定する。
【００５４】
本発明のプロセスは、本発明の特殊な実施形態を成す以下のような構成体も生成する：
複数の同一の標的分子が単一の重合体部分に連結されている構成体；例えば２つ以上の反応性末端をもつ線状重合体が標的分子に連結されて、その生物学的活性を増強させ、そうでなければ３つ以上の反応性末端をもつ分岐重合体又は反応性ペンダントをもつ重合体が３つ以上の標的分子に連結される。線状重合体の両方の末端と異なる部位又は標的分子の反応又は標的分子上の２つ、３つ又はそれ以上の部位における分岐重合体の末端又はペンダント反応基の反応のいずれかにより、２つ以上の位置で標的分子に重合体部分が連結されている構成体。本発明の生成物は好ましくは、以上に記した重合体標的材料のうちのいずれか単数又は複数のものを含む。
【００５５】
本発明の特に好ましい生成物は、ポリアクリレート特にポリメチルアクリル酸又はポリエチルアクリル酸及びその重合体の異なる比率でのアダクツであり、酵素特異的基質と共に特異的に固定化された酵素媒介型生成物を生成するためには、特に事実上オキシダーゼ特に茶ポリフェノールオキシダーゼである標的材料のうちのいずれか単数又は複数のものが特に好ましく、最も好ましい生成物は、その基質との茶ポリフェノールオキシダーゼの反応によるテアフラビンである。
【００５６】
本発明の方法は、本発明の特定の実施形態を形成する以下のもののような構成体の生産を可能にする：
１．  標的材料が好ましくは茶由来の粗製可溶性ＰＰＯを含み、（ｂ）の場合のように規定された比率で生成された活性化重合体に架橋されている、構成体。
２．  その他の供給源からの類似の性質の酵素といったような、標的分子が異なっている上述の（１）にあるような構成体。
３．  本発明の生成物は好ましくは、上述の重合体材料のいずれか１つ及び上述の標的材料のうちのいずれか単数又は複数のもの、好ましくは茶ＰＰＯを含み、本発明の特に好ましい生成物は、メチルアクリレート、カルボキシル基官能性を有するエチルアクリレート重合体（ここで前者が最も好ましい）と、上述の標的材料（茶ＰＰＯが最も好ましい）とのアダクツである。
４．  ３において生成された活性化された重合体アダクツを単離し、茶基質と反応させて、ここでも重合体−標的アダクツの生物学的活性を失なうことなく、生成物テアフラビンを排他的に生成すること。
【００５７】
標的種が多価重合体にカップリングされるアダクツの生産は、本発明により克服できる特殊な問題点を提起する。この状況のためには、生成物を生産するための適切な手順には、以下の段階が関与している：標的（Ａ）、可溶性植物オキシダーゼ、特に可溶性茶ＰＰＯは、全ての酵素を重合体に完全に架橋させるべくカップリング比、反応時間及び／又はｐＨを微調整するため標的対重合体の特定の比率で活性化済み重合体（イミダゾール−アクリレート）に曝露され、標的：重合体アダクツを析出し、生成物形成において反復的に使用するため水性緩衝液でそれを洗浄する。
【００５８】
本発明の１実施形態においては、以下でＰＰＯと呼ぶ粗製茶ポリフェノールオキシダーゼ酵素（ＥＣ１．１０．３．１）は、葉、花、蕾、種子皮（barks）などのような茶の木の部分から抽出されたものであるが、最も好ましい供給源は、ここでは茶の芽と呼ばれる、２枚の葉と付属の蕾を含む茶の若芽である。該方法には、予冷した（４℃）アセトン中で新鮮な茶の芽を粉砕し、浸軟物を多孔度Ｇ３の焼結ガラス漏斗内を通過させかつ冷却したアセトンの新鮮なアリコートを用いて全ての緑色を２〜３回にわたり洗浄し、かくして得られた残渣を冷却された７０％のアセトン（アセトン：水；７０／３０ｖ／ｖ）を用いて洗浄し、そして最後に、先行する洗浄において残された水を除去するための冷却アセトンを用いてこのように得られた残渣を洗浄する段階が関与する。このように調製されたアセトン粉末を真空乾燥させた。アセトン粉末の調製中、冷却された（４０℃）７０％の水性アセトンでの洗浄は、接着していたフェノール樹脂の除去を助け、本来可溶化に影響を及ぼしうるフェノール系物質を含まない材料を提供した。ＰＰＯの可溶化のためには、このようにして調製された秤量済みのアセトン粉末をまず最初に精製水と共に粉砕し、穏やかな吸引の下で漏斗上で脱脂綿の栓を通してろ過してでんぷん及び望まれない可溶性タンパク質を除去した。このように洗浄した材料を、次に０．２ＭのＮａ2ＳＯ4溶液で溶出し、こうしてアセトン粉末からの８０〜９０％のＰＰＯ活性の可溶化がもたらされた。
【００５９】
本発明のもう１つの実施形態においては、茶基質は、茶の芽及び茶の種子皮（bark）から調製された。まず、新鮮な茶の蕾／茶の種皮（coat）を３分間蒸して、ポリフェノールオキシダーゼ酵素を不活性化し、次にビーカー内に取り出した３０％のアセトン中で浸軟させた。混合物全体をアルミホイルでカバーし、一晩放置した。その後、混合物を焼結ガラス漏斗を通してろ過した。残渣を拒絶し、ろ液を３〜４回２：１（ｖ／ｖ）の石油ベンジン（６０〜８０℃の留分）酢酸エチル混合物で分配した。有機層を拒絶し、水性層を酢酸エチルでくり返し抽出した。水性層を拒絶し、酢酸層を２体積の石油ベンジンと水のアリコートと共に振とうさせた。有機層を拒絶した後、水性基質相を噴霧乾燥した。
【００６０】
本発明のさらにもう１つの実施形態においては、重合体と標的材料のアダクツは、段階（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）に従って作られ、このように生成された（段階ａ−ｂ）活性化された固体マトリクスは、共有結合した生物学的活性をもつ高分子（段階ｃ）、特に植物オキシダーゼ（最も好ましいのは茶ＰＰＯ）を架橋して、インビトロで反復的にオキシダーゼ媒介型生成物、最も好ましくは固定化した茶ＰＰＯマトリクスを伴う茶基質由来の限定的なテアフラビンを生成するために使用された。
【００６１】
本発明のさらにもう１つの実施形態においては、このように生成された限定的で最も好ましい生成物テアフラビンは、大量に経済的にかつここでも同じ固相状態酵素マトリクスを用いてバッチ作業で反復的に単離され生産された。
【００６２】
以下の例は、例示を目的として提供されており、従って本発明の範囲を制限するものとみなされるべきではない。
【実施例】
【００６３】
例−Ｉ
プラスチック製ビーカー内の３ｍｌの６．２ｐＨのリン酸緩衝液中に０．３ｇのマトリクス（ＣＤＩ活性化アクリレートベースの重合体樹脂）を懸濁させ、これに対して茶の芽から抽出した２．０ｍｌの粗製ポリフェノールオキシダーゼ酵素（１．６６ｍｇ×２酵素タンパク質）を添加した；混合物全体をインキュベータ振とう機内において、２５℃、１００ｒ．ｐ．ｍ．で１時間インキュベートした。インキュベーションの後、混合物をグラスウールを通してろ過し、酵素活性が全く存在せずかくして酵素タンパク質の全体がマトリクスに結合したことを示していた茶基質を用いて酵素活性についてろ液を検査した。その後、マトリクス結合型の固定化された酵素を１０ｍｌの水で洗浄し、マトリクスに対する酵素の共有結合を標示する、ろ液中には検出されなかった残留酵素活性について、ろ液を再検査した；プラスチック製ビーカー内に取込み上述のマトリクスに対して、４．０ｍｌの水中に溶解させた茶基質０．０４ｇを加え、次に３７．５℃、１００ｒ．ｐ．ｍ．で半時間、インキュベータ振とう機の中でインキュベートし、反応中にこのように形成された生成物（テアフラビン）を凍結乾燥状態でろ過し、噴霧乾燥させるか又は溶剤（酢酸エチル）で抽出して、純粋な生成物を得、マトリクスを１５％のアセトンそしてそれに続いて水で洗浄し、同じ固定化された酵素系でｎ回同じ手順を反復して、１１．５ｍｇの酵素タンパク質／１．０ｇのマトリクスといった結合能力をもつマトリクスに対し共有結合された酵素系のいかなる非活性化もなく類似の生成物を得た；一般的な反応及び機序は、それぞれ、以下の図１（ａ）及び図１（ｂ）で示されている通りである。
【００６４】
【化１０】
2009538598.tif 000012
図１（ａ）  マトリクス活性化及び酵素固定化のための一般的反応
図１（ｂ）  マトリクス活性化及び酵素固定化のための反応機序
【００６５】
例−ＩＩ
プラスチック製ビーカー内の５ｍｌの６．２ｐＨのリン酸緩衝液の中に０．５ｇのマトリクス（ＣＤＩ活性化アクリレートベースの重合体樹脂）を懸濁させ、これに対してライチ（litchi chinensis）の芽から抽出した５．０ｍｌの粗製ポリフェノールオキシダーゼ酵素（１．１５ｍｇ×２酵素タンパク質）を添加した；混合物全体をインキュベータ振とう機内において２０℃、１００ｒ．ｐ．ｍ．で２時間インキュベートし、その終了時点で混合物をグラスウールを通してろ過し、酵素活性が全く存在せずかくして酵素タンパク質の全体がマトリクスに結合したことを示していたライチ基質を用いて酵素活性についてろ液を検査した。その後、マトリクス結合型の固定化された酵素を１０ｍｌの水で洗浄し、マトリクスに対する酵素の共有結合を標示する、ろ液中には検出されなかった残留酵素活性について、ろ液を再検査した；上述のマトリクスをプラスチック製ビーカー内に取込み、これに対して、５．０ｍｌの水中に溶解させた茶基質０．０５ｇを加え、次に２５℃、１００ｒ．ｐ．ｍ．で半時間、インキュベータ振とう機の中でインキュベートし、反応中にこのように形成された生成物をろ過し、マトリクスを水で洗浄し、ｎ回同じ手順を反復して、１１．５ｍｇの酵素タンパク質／１．０ｇのマトリクスといった結合能力をもつマトリクスに対し共有結合された酵素系のいかなる非活性化もなく類似の生成物を得た；（ａ）上述の通りのライチの葉からの粗製ポリフェノールオキシダーゼ酵素を、柔らかいライチの葉から抽出し、プロセスには、例Ｉに類似したアセトン粉末の調製が関与していた；このように調製されたアセトン粉末を真空乾燥させた秤量済みの量だけ２重精製水で溶出させ、こうしてアセトン粉末から８０〜９０％のポリフェノールオキシダーゼ活性の可溶化がもたらされた。そして（ｂ）上述の通りのライチ基質を茶基質の調製の場合と類似した新鮮なライチの葉から調製した。
【００６６】
本発明の主要な利点は以下の通りである：
１．  １，１−カルボニルジイミダゾールでの誘導体化後の、生物学的活性をもつ高分子特に植物オキシダーゼ、最も好ましくは茶ポリフェノールオキシダーゼの架橋／共有結合を通した固定化を目的とする効率のよいマトリクスとしての、特殊化された官能基をもつアクリレートベースの重合体樹脂の利用。
２．  （１）で言及された通りの活性化された重合体樹脂酵素アダクツは、熱安定でありかつ、室温（２０℃）又は最高６０℃の高温で酵素活性を全く失なうことなくテアフラビンへの茶基質の「ｎ」回の代謝回転数を示す。
３．  １，１−カルボニルジイミダゾールでの誘導体化の後の固定化マトリクスとしての（１）にあるような重合体樹脂の利用は、酵素基質（最も好ましくは茶基質）からテアフラビンへの排他的かつ完全な転換を助ける。
４．  （２）にあるような活性化重合体は、可溶性形態及び結合形態の両方の生物学的活性をもつ高分子特に植物オキシダーゼ（最も好ましいのは茶ポリフェノールオキシダーゼである）とのさらに強い結合を示した。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】紅茶から抽出され、固定化された酵素系から生産されたテアフラビンの比較分光光度分析。
【図２】紅茶から抽出され、固定化された酵素系から生産されたテアフラビンの比較分光光度分析を表わす。
【図３】分光光度及びＨＰＬＣ分析により識別され、３８０ｎｍと４６０ｎｍでの吸光度を示す参照基準（Sigma）と比較された、テアフラビンである好ましい生成物を示す。
【図４】分光光度及びＨＰＬＣ分析により識別され、３８０ｎｍと４６０ｎｍでの吸光度を示す参照基準（Sigma）と比較された、テアフラビンである好ましい生成物を示す。
【図１】
2009538598.tif 000016
【図２】
2009538598.tif 000017
【図３】
2009538598.tif 000018
【図４】
2009538598.tif 000019
【手続補正書】
【提出日】平成20年1月29日(2008.1.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造式ＩＩＩ：
【化１】
2009538598.tif 000020
を有する固体マトリクスにおいて、Ｘが最高約３０であり、Ｚが重合体鎖長内のカルボキシル基１個あたり１であり、Ｅがポリフェノールオキシダーゼ酵素（ＰＰＯ）である、固体マトリクス。
【請求項２】
使用されるＰＰＯが、茶又はライチから得られた酵素から選択されている、請求項１に記載のマトリクス。
【請求項３】
最高６０℃の温度で安定である、請求項１に記載のマトリクス。
【請求項４】
ＰＰＯで固定化されたマトリクスが、対応する生成物を得るべく同じ植物から選択された基質を転換するのに有用である、請求項１に記載の固体マトリクス。
【請求項５】
使用されるポリフェノールオキシダーゼが、茶基質をテアフラビンに転換するのに有用である茶ＰＰＯである、請求項１に記載の固体マトリクス。
【請求項６】
使用されるＰＰＯが、ライチ基質を、ライチ基質由来の重合されたキノンから誘導されたオレンジ色生成物へと転換するために有用であるライチＰＰＯである、請求項１に記載の固体マトリクス。
【請求項７】
酵素活性の喪失なく茶基質をテアフラビンに転換するべく少なくとも５０の代謝回転数の間有効に該マトリクスを使用できる、請求項１に記載のマトリクス。
【請求項８】
使用される重合体が、メチルアクリレート重合体、エチルアクリレート重合体又はブチルアクリレート重合体から成る樹脂から選択される、請求項１に記載のマトリクス。
【請求項９】
使用される重合体が好ましくはメチルアクリレートである、請求項１に記載のマトリクス。
【請求項１０】
以下の構造式ＩＩＩ：
【化２】
2009538598.tif 000021
を有する請求項１に記載の固体マトリクスの製造方法において、Ｘが最高３０であり、Ｚが重合体鎖長内のカルボキシ基１個あたり１であり、Ｅが任意の植物供給源からのポリフェノールオキシダーゼ酵素（ＰＰＯ）であり、
ａ）  ＲがＨ又はＣＨ3又はＣ2Ｈ5であり、Ｘが最高約３０であり、Ｙが最高約３０である一般構造式Ｉａの重合体、又はＲがＨ又はＣＨ3又はＣ2Ｈ5、Ｙが最高約３０である一般構造式Ｉｂの重合体と１，１−カルボニルジイミダゾールとを、ｐＨ約６．２のリン酸緩衝液中において、４℃〜２０℃の範囲内の温度で、３０分乃至１時間の範囲内の時間反応させて、
【化３】
2009538598.tif 000022
という構造式ＩＩのイミダゾール重合体を得る段階であって、式中Ｘは最高約３０、Ｚは重合体鎖長内のカルボキシル基１個あたり１である、段階、
ｂ）  段階（ｂ）でこのように形成された生成物をろ過し、その後続けてジクロロメタンで洗浄し乾燥させて所望のマトリクスを得る段階、
ｃ）  上述の構造式ＩＩの前記活性化された重合体上でＰＰＯ好ましくは茶ＰＰＯである標的分子を２０〜２５℃の範囲内の温度で１時間〜２時間の範囲内の時間、約ｐＨ６．２の適切な緩衝液好ましくはリン酸緩衝液内で固定化して、構造式ＩＩＩの固体マトリクスを得る段階、
を含む方法。
【請求項１１】
使用される標的部分が、任意の植物供給源、特に茶ＰＰＯから選択されるＰＰＯである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
使用される重合体が、約３０，０００〜１００，０００ダルトンの間の範囲内の分子量を有している、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
アクリレート重合体と１，１−カルボニルジイミダゾールのモル比が約２：１である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
オキシダーゼの固定化が、水溶性形態ならびに結合形態の両方の形態で発生し得る、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
ＰＰＯの結合能力がマトリクス１ｇあたり１１．５ｍｇである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
ＰＰＯで固定化されたマトリクスが、好ましくは茶カテキンである植物基質をテアフラビンへと転換するために有用である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
茶基質からテアフラビンへの転換が９０パーセントである、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
基質からテアフラビンへの転換方法において、
（ａ）  水中に溶解させた基質と請求項１に記載の固体マトリクスの混合物を、２５℃〜３７．５℃の範囲内の温度で、３０分〜２時間の範囲内の時間インキュベートする段階、
（ｂ）  混合物からマトリクスを分離して、生成物テアフラビンを含有するろ液を得、アセトンとそれに続いて水で洗浄した後マトリクスを再循環させる段階、
を含む方法。
【国際調査報告】
2009538598.tif 000023
2009538598.tif 000024