(57)【要約】  本発明は、Ｔｒａｂｉｄ活性を調節することを含む、Ｗｎｔシグナル伝達を調節する方法を提供する。好ましくは、Ｔｒａｂｉｄ活性を調節することは、Ｔｒａｂｉｄ活性を阻害することを含む。本発明はまた、Ｔｒａｂｉｄ活性を低減することを含む、ＴＣＦ転写を低減する方法を提供する。Ｔｒａｂｉｄの調節因子を同定するための方法であって、ユビキチンによりタグ部分にカップリングした検出可能な部分を含む、Ｔｒａｂｉｄ基質を用意すること、前記基質の第１及び第２の部分を固定化すること、前記第１の部分に調節因子候補を添加すること、第１及び第２の部分をＴｒａｂｉｄと接触させること、インキュベートしてＴｒａｂｉｄを作用させること、検出可能な部分からタグを分離することによりユビキチンの切断をアッセイすることを含み、第１の部分から分離された検出可能な部分の量が、第２の部分から分離された検出可能な部分の量と異なるときに、前記候補を、Ｔｒａｂｉｄの調節因子として同定する方法も提供される。本発明は、医薬品としてのＴｒａｂｉｄ及びＴｒａｂｉｄ阻害剤の使用を提供する。
2009538124.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｒａｂｉｄ活性を調節することを含む、Ｗｎｔシグナル伝達を調節する方法。
【請求項２】
Ｔｒａｂｉｄ活性を調節することが、Ｔｒａｂｉｄ活性を阻害することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｔｒａｂｉｄ活性を低減することを含む、ＴＣＦの転写を低減する方法。
【請求項４】
Ｔｒａｂｉｄ活性が、Ｔｒａｂｉｄに対するｓｉＲＮＡを用いて低減される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Ｔｒａｂｉｄ活性が、ドミナントネガティブＴｒａｂｉｄを用いて低減される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ＴＣＦ転写が、Ｄｖｌに刺激される、Ｗｎｔ３Ａに刺激される、ＬｉＣｌに刺激される、ＡＰＣの喪失若しくは突然変異に刺激される、β−カテニンの活性化若しくは突然変異に刺激される、又はｍβ−ＴｒＣｐ−ΔＦに刺激されるＴＣＦの転写である、請求項３〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ＴＣＦの転写が、Ｄｖｌに刺激されるＴＣＦの転写である、請求項３〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
対象におけるＴｒａｂｉｄシグナル伝達を調節することを含む、前記対象における家族性大腸ポリポーシスを治療する方法。
【請求項９】
対象におけるＴｒａｂｉｄシグナル伝達を調節することを含む、前記対象における結腸直腸癌を治療する方法。
【請求項１０】
Ｔｒａｂｉｄが阻害される、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
ポリペプチドの脱ユビキチン化におけるＴｒａｂｉｄの使用。
【請求項１２】
脱ユビキチン化がＫ６３ユビキチンの切断を含む、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
Ｔｒａｂｉｄが少なくともＣ末端卵巣腫瘍（ＯＴＵ）ドメインを含む、請求項１１に記載の使用。
【請求項１４】
ＴｒａｂｉｄがＮ末端ＮＺＦフィンガーモチーフを含む、請求項１１に記載の使用。
【請求項１５】
Ｔｒａｂｉｄが完全長ヒトＴｒａｂｉｄポリペプチドを含む、請求項１１に記載の使用。
【請求項１６】
医薬品として使用するためのＴｒａｂｉｄ阻害剤。
【請求項１７】
結腸直腸癌のための医薬品の製造におけるＴｒａｂｉｄ阻害剤の使用。
【請求項１８】
家族性大腸ポリポーシスのための医薬品の製造におけるＴｒａｂｉｄ阻害剤の使用。
【請求項１９】
結腸直腸癌の治療に使用するためのＴｒａｂｉｄ阻害剤。
【請求項２０】
家族性大腸ポリポーシスの治療に使用するためのＴｒａｂｉｄ阻害剤。
【請求項２１】
Ｔｒａｂｉｄ阻害剤が、Ｔｒａｂｉｄに対するｓｉＲＮＡであるか、又はＴｒａｂｉｄ  Ｃ４４３Ｓである、請求項２６、１９、若しくは２０のいずれかに記載のＴｒａｂｉｄ阻害剤又は請求項１７若しくは１８に記載の使用。
【請求項２２】
ユビキチンを含むポリペプチドの沈殿におけるＴｒａｂｉｄの使用。
【請求項２３】
β−カテニンの調節におけるＴｒａｂｉｄの使用。
【請求項２４】
細胞接着の調節におけるＴｒａｂｉｄの使用。
【請求項２５】
細胞接着の調節が、カドヘリンによって調節される細胞接着である、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
ＴＣＦの転写の維持又は刺激におけるＴｒａｂｉｄの使用。
【請求項２７】
Ｔｒａｂｉｄの調節因子を同定する方法であって、
（ｉ）ユビキチンによりタグ部分にカップリングした検出可能な部分を含む、Ｔｒａｂｉｄ基質を用意すること、
（ii）前記基質の第１及び第２の部分を固定化すること、
（iii）前記第１の部分に調節因子候補を添加すること、
（iv）前記第１及び第２の部分をＴｒａｂｉｄと接触させること、
（ｖ）インキュベートしてＴｒａｂｉｄを作用させること、並びに
（vi）前記検出可能な部分から前記タグを分離することにより前記ユビキチンの切断をアッセイすること
を含み、第１の部分から分離された検出可能な部分の量が、第２の部分から分離された検出可能な部分の量と異なるときに、前記候補を、Ｔｒａｂｉｄの調節因子として同定する方法。
【請求項２８】
検出可能な部分からのタグの分離が、前記検出可能な部分の上清への放出をアッセイすることにより測定される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
検出可能な部分からのタグの分離が、固定化された物質における前記検出可能な部分の保持をアッセイすることにより測定される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
基質の第１及び第２の部分がタグ部分を介して固定化される、請求項２７〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
第１の部分から分離された検出可能な部分の量が、第２の部分から分離された検出可能な部分の量よりも少ないときに、前記調節因子候補を、Ｔｒａｂｉｄの阻害剤として同定する、請求項２７〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
第１の部分から分離された検出可能な部分の量が、第２の部分から分離された検出可能な部分の量よりも多いときに、前記調節因子候補を、Ｔｒａｂｉｄの活性化因子として同定する、請求項２７〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
Ｔｒａｂｉｄ基質が、ＧＳＴ−ユビキチン−ユビキチン−Ｓ融合タンパク質を含む、請求項２７〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
検出可能な部分がＳを含み、タグ部分がＧＳＴを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
基質の第１及び第２の部分が、マイクロタイタープレートの別個のウェルに固定化される、請求項２７〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
固定化が、マイクロタイタープレートのウェルの内表面に予めコーティングされた抗ＧＳＴ抗体に付着させることによる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ＡＰＣをＴｒａｂｉｄと接触させることを含む、前記ＡＰＣのアルマジロリピートドメイン（ＡＲＤ）を調節する方法。
【請求項３８】
突然変異体ＡＰＣに結合する突然変異体Ｔｒａｂｉｄを同定する方法であって、
（ｉ）突然変異体Ｔｒａｂｉｄポリペプチドの候補を用意すること、
（ii）前記突然変異体Ｔｒａｂｉｄポリペプチドの候補を前記突然変異体ＡＰＣポリペプチドと接触させること、及び
（iii）前記突然変異体Ｔｒａｂｉｄポリペプチドの候補と前記突然変異体ＡＰＣポリペプチドとの間の会合をモニターすること
を含み、前記ポリペプチドの間の会合が、前記突然変異体Ｔｒａｂｉｄポリペプチドの候補が前記突然変異体ＡＰＣと結合することを示し、前記突然変異体ＡＰＣが、Ｎ５０７Ｋ  ＡＰＣ又はＮ１７５Ｋ  Ｅ−ＡＰＣである方法。
【請求項３９】
Ｃ４４３突然変異を含むＴｒａｂｉｄ又はその断片。
【請求項４０】
Ｔｒａｂｉｄが、受託番号ＣＡＢ６４４４９のアミノ酸配列を含むヒトＴｒａｂｉｄであって、Ｃ４４３突然変異がＣ４４３Ｓである、請求項３９に記載のＴｒａｂｉｄ。
【請求項４１】
請求項４０又は４１に記載のＴｒａｂｉｄ又はその断片をコードする核酸。
【請求項４２】
（ｉ）Ｔｒａｂｉｄのアミノ酸４〜３２、Ｔｒａｂｉｄのアミノ酸８４〜１１２、及びＴｒａｂｉｄのアミノ酸１４９〜１７７からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列、又は
（ii）（ｉ）の完全長アミノ酸配列と少なくとも２５％の同一性を有する少なくとも１つのアミノ酸配列であって、（ｉ）の前記アミノ酸配列の構造的ジンクフィンガーコア残基が保持されている配列
を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドが少なくとも２つのジンクフィンガードメインを含み、かつ前記ポリペプチドが完全長野生型Ｔｒａｂｉｄを含む場合に、前記ポリペプチドがそれに加えて少なくとも１つのさらなるアミノ酸を含むポリペプチド。
【請求項４３】
（ii）の少なくとも１つのアミノ酸配列が、（ｉ）の完全長アミノ酸配列と少なくとも３３％の同一性を有し、（ｉ）のアミノ酸配列の構造的ジンクフィンガーコア残基が保持され、かつ疎水性界面におけるユビキチン結合残基が保持される、請求項４２に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
Ｋ６３結合のユビキチンに結合する、請求項４２又は４３に記載のポリペプチド。
【請求項４５】
（ｉ）所望のアミノ酸配列、及び
（ii）請求項４２〜４４のいずれかに記載のポリペプチド
を含むポリペプチド。
【請求項４６】
（ｉ）所望のアミノ酸配列、及び
（ii）Ｋ６３結合のユビキチンに結合するＴｒａｂｉｄポリペプチド
を含むポリペプチドであって、（ii）の前記Ｔｒａｂｉｄポリペプチドが、少なくとも２つのジンクフィンガードメインを含み、前記ジンクフィンガードメインが、Ｔｒａｂｉｄの少なくとも１つのＮＺＦジンクフィンガーからの少なくとも１つのジンクフィンガーシグネチャー配列を含むポリペプチド。
【請求項４７】
Ｋ６３結合のユビキチンへの所望の部分のターゲティングにおける、請求項４２〜４６のいずれかに記載のポリペプチドの使用、又は請求項４６に記載のＴｒａｂｉｄポリペプチドの使用。
【請求項４８】
所望の部分がプロテアーゼである、請求項４２〜４６のいずれかに記載のポリペプチド又は請求項４７に記載の使用。
【請求項４９】
所望の部分がラベルである、請求項４２〜４６のいずれかに記載のポリペプチド、又は請求項４７に記載の使用。
【請求項５０】
請求項４６に記載のＴｒａｂｉｄポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項５１】
請求項４２〜４６のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｗｎｔシグナル伝達経路及びその経路の欠損に関連する障害に関する。特に、本発明は、大腸腺腫性ポリポーシスタンパク質（ＡＰＣ，adenomatous polyposis coli）シグナル伝達及び結腸直腸癌などの障害の治療におけるそのエフェクターの改善又は低減に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｗｎｔシグナル伝達は、癌において重要であることが示された。実際に、Ｗｎｔシグナル伝達は、この経路の多数のレベル又は段階での遺伝的欠損による腫瘍の促進及び癌に関連づけられている。この話題は、Polakis（2000 Genes and Development vol 14 pages 1837-1851）により詳細に解説されている。
【０００３】
大腸腺腫性ポリポーシスタンパク質（ＡＰＣ）は、Ｗｎｔシグナル伝達経路において中心的な役割を果たす。ＡＰＣは、大多数の散発性結腸直腸癌及び遺伝性結腸直腸癌では機能が失われている重要な腫瘍抑制因子である。その最も理解されている機能は、Ｗｎｔシグナル伝達経路の主要なエフェクターであるβ−カテニンのダウンレギュレーションである。さらに、ＡＰＣタンパク質はまた、カドヘリン介在性細胞接着の維持に別個の機能を有すると思われ、この機能の喪失は、腫瘍から浸潤性悪性腫瘍への移行を加速するおそれがある。
【０００４】
ＡＰＣ遺伝子は、全ての結腸直腸癌の８０％超で不活性化されている。ＡＰＣ遺伝子は、結腸大腸腫瘍の素因のある優性遺伝病である家族性大腸ポリポーシス（ＦＡＰ，familial adenomatous polyposis）において欠損している。ＡＰＣ遺伝子の不活性化は、大部分の散発性腫瘍にもみられ、腫瘍形成における初期の、そして可能性のあることには開始となる事象である。
【０００５】
ＡＰＣは、Ｗｎｔシグナル伝達経路の負の調節因子である。ＡＰＣは、この経路の主要なエフェクターであるβ−カテニンに結合し、そのダウンレギュレーションを促進する。この経路が不活性な細胞では、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３βも含有するＡｘｉｎ分解複合体によりもたらされる、β−カテニンのＮ末端におけるリン酸化の結果として、β−カテニンは急速に分解する。Ｗｎｔシグナル伝達の状態では、β−カテニンは安定化され、核に移行し、そこでβ−カテニンはＴＣＦ／ＬＥＦ因子に結合し、Ｗｎｔ標的遺伝子の転写を活性化する。転写におけるこれらの変化は腫瘍形成の基礎であると考えられる。したがって、Ｗｎｔ標的遺伝子の転写を制御すること、又はその発現を弱めることが問題である。
【０００６】
目下の証拠は、ＡＰＣが、β−カテニンのように細胞接着に別個の機能も有しうることを示唆している。この証拠は、ショウジョウバエ（Drosophila）での研究から生じたが、ショウジョウバエでは、ＡＰＣ近縁のＥ−ＡＰＣが上皮におけるアドヘレンスジャンクションに関連し、細胞接着に影響すると思われる。これがヒト細胞にもあてはまるという証拠が明らかになってきており、ＡＰＣ腫瘍抑制因子は、様々な極性化哺乳動物細胞において接着性側膜に関連し、アドヘレンスジャンクションでのβ−カテニンの交換及び結腸直腸癌細胞の細胞接着に関連づけられている。カドヘリン介在性接着の喪失が良性腫瘍から浸潤癌への移行をしばしば伴うことから、これらの結果は、腫瘍の進行に潜在的に関係する。したがって、カドヘリン介在性接着などの細胞接着を促進又は維持することが問題である。
【０００７】
ＡＰＣタンパク質の最も保存されているドメインは、そのＮ末端アルマジロリピートドメイン（ＡＲＤ，Armadillo Repeat Domain）であり、これは推定上のタンパク質相互作用ドメインである。このドメインの最も近縁はβ−カテニン及びα−インポーチンに見出され、これらのＡＲＤの機能及び構造は、これらと機能的に関連するリガンドの多くとのこれらの正確な分子相互作用を含めて十分に公知である。対照的に、ＡＰＣタンパク質のＡＲＤの分子的機能はあまり理解されておらず、推定上のリガンドの報告はあったが、ＡＰＣに関するそれらのリガンドの機能的関連性はまだ明らかになっておらず未知であることが当技術分野における問題である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Polakis, 2000 Genes and Development vol 14 pages 1837-1851
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、従来技術に関連する問題を克服しようとするものである。
【００１０】
本発明者らは、生物学的に意味ある方法でＡＰＣタンパク質と相互作用する新しいタンパク質を発見した。このタンパク質は、それがＡＲＤリピートの特異的突然変異体ＡＰＣタンパク質とではなく、野生型タンパク質と相互作用する能力に基づき単離された。同定されたタンパク質はＴｒａｂｉｄである。Ｔｒａｂｉｄタンパク質は、従来技術で開示された生物学的機能を全く有さない。したがって、全く新しく、生物学的に重要なシグナル伝達の役割が、本研究によってこのタンパク質によるものとされた。
【００１１】
さらにＴｒａｂｉｄは、生化学的に特徴づけされた。Ｔｒａｂｉｄは、新しいデユビキチラーゼ酵素として同定された。ユビキチン結合ドメインが確定され、実験的に実証された。Ｔｒａｂｉｄは、Ｋ６３結合のユビキチンに結合特異性を有し、このことは確定され、実験的に実証された。この活性は、結腸直腸癌又はＷｎｔを刺激された細胞におけるＷｎｔ経路活性に必要とされる。デユビキチラーゼ活性が確定され、実験的に実証された。さらに、Ｔｒａｂｉｄの操作（特に阻害及び／又は枯渇）及びＴｒａｂｉｄ阻害剤の使用の効果は、Ｗｎｔシグナル伝達が活性化したヒト細胞系及び結腸直腸細胞系における生物学的に重要なＷｎｔエフェクターの調節を包含することが示された。したがって、ＴｒａｂｉｄとＷｎｔシグナル伝達／ＴＣＦ介在性転写との間の機能的結びつきが、最初に確立された。
【００１２】
本発明は、これらの顕著な成果に基づく。
【００１３】
したがって、本発明は、Ｔｒａｂｉｄ活性を調節することを含む、Ｗｎｔシグナル伝達を調節する方法を提供する。好ましくは、Ｔｒａｂｉｄ活性を調節することは、Ｔｒａｂｉｄ活性を阻害することを含む。
【００１４】
別の態様では、本発明は、Ｔｒａｂｉｄ活性を低減することを含む、ＴＣＦの転写を低減する方法を提供する。好ましくは、Ｔｒａｂｉｄ活性は、Ｔｒａｂｉｄに対するｓｉＲＮＡを用いて、又はドミナントネガティブＴｒａｂｉｄを用いて低減される。ドミナントネガティブＴｒａｂｉｄを用いる場合には、Ｔｒａｂｉｄ活性を低減することが望まれるシステムに、例えばドミナントネガティブＴｒａｂｉｄポリペプチドの供給により、又はそれをコードする核酸からの発現により（すなわち当技術分野で公知の任意の適切な手段により前記核酸を前記システムに導入することにより）導入される。好ましくは、前記ＴＣＦの発現は、β−カテニン−Ｌｅｆ融合体に刺激された転写ではない。好ましくは、前記ＴＣＦの転写は、Ｄｖｌに刺激される、Ｗｎｔ３Ａに刺激される、ＬｉＣｌに刺激される、又はｍβ−ＴｒＣｐ−ΔＦに刺激されるＴＣＦの転写である。好ましくは、前記ＴＣＦの転写は、Ｄｖｌに刺激されるＴＣＦの転写である。好ましくは、前記ＴＣＦ活性は、ＡＰＣの突然変異若しくは喪失により、及び／又はβ−カテニンの活性化により刺激されるＴＣＦ活性である。これらの特定の適用は、例えば共にＴｒａｂｉｄ活性に依存するＡＰＣ突然変異体癌細胞系ＳＷ４８０及びβ−カテニン突然変異体癌細胞系ＨＣＴ１１６（図に示す）に関連して、実施例の項に実証されている。
【００１５】
別の態様では、本発明は、Ｔｒａｂｉｄの阻害又はダウンレギュレーションを含むＴＣＲの転写の阻害方法に関する。
【００１６】
別の態様では、本発明は、対象におけるＴｒａｂｉｄシグナル伝達を調節することを含む、前記対象における家族性大腸ポリポーシを治療する方法を提供する。
【００１７】
別の態様では、本発明は、対象におけるＴｒａｂｉｄシグナル伝達を調節することを含む、前記対象における結腸直腸癌を治療する方法を提供する。結腸直腸癌への言及には、適切には結腸癌が含まれる。
【００１８】
好ましくは、Ｔｒａｂｉｄの調節はＴｒａｂｉｄの阻害である。
【００１９】
別の態様では、本発明は、脱ユビキチン化におけるＴｒａｂｉｄの使用、好ましくはポリペプチドからユビキチン部分を除去するためのＴｒａｂｉｄの使用、好ましくはポリペプチドの脱ユビキチン化におけるＴｒａｂｉｄの使用を提供する。
【００２０】
脱ユビキチン化は、１つ又は複数のユビキチンユニットを含むポリペプチドからそれを除去することを意味する。除去のための切断がどこで行われるかに応じて、放出されるユニットは、完全なユビキチンユニット、ポリユビキチン鎖、又はユビキチンの断片に対応することがある。好ましくは、完全なユビキチンユニットが放出される。好ましくは、脱ユビキチン化は、ポリペプチドからのユビキチンの完全な除去を意味し、好ましくは前記ポリペプチドから全てのユビキチン基を除去することを意味する。
【００２１】
好ましくは脱ユビキチン化は、Ｋ６３結合のユビキチンの切断を含む。好ましくは、Ｔｒａｂｉｄは、少なくともＣ末端卵巣腫瘍（ＯＴＵ，ovarian tumour）ドメインを含む。好ましくは、Ｔｒａｂｉｄは、Ｎ末端ＮＺＦフィンガーモチーフを含む。（ジンクフィンガーモチーフは、いくつかの異なる種類に分類される。Ｔｒａｂｉｄは、「ＲａｎＢＰ型フィンガー」及び「ＺｎＦ＿ＲＢＺフィンガー」としても公知であるＮＺＦ型フィンガーを有し、これらの用語は、本明細書において相互交換可能に使用される。）好ましくはＴｒａｂｉｄは、完全長ヒトＴｒａｂｉｄポリペプチドを含む。
【００２２】
別の態様では、本発明は、医薬品として使用するためのＴｒａｂｉｄ阻害剤を提供する。
【００２３】
別の態様では、本発明は、結腸直腸癌のための医薬品を製造するためのＴｒａｂｉｄ阻害剤の使用を提供する。
【００２４】
別の態様では、本発明は、家族性大腸ポリポーシスのための医薬品を製造するためのＴｒａｂｉｄ阻害剤の使用を提供する。
【００２５】
別の態様では、本発明は、結腸直腸癌の治療に使用するためのＴｒａｂｉｄ阻害剤を提供する。
【００２６】
別の態様では、本発明は、家族性大腸ポリポーシスの治療に使用するためのＴｒａｂｉｄ阻害剤を提供する。
【００２７】
好ましくは、前記Ｔｒａｂｉｄ阻害剤は、Ｔｒａｂｉｄに対するｓｉＲＮＡであるか、又はＴｒａｂｉｄ  Ｃ４４３ＳなどのドミナントネガティブＴｒａｂｉｄである。適切には、Ｔｒａｂｉｄ阻害剤は、ユビキチンアルデヒドなどのデユビキチナーゼ活性の阻害剤でありうる。適切には、Ｔｒａｂｉｄ阻害剤は、Ｋ６３結合のユビキチンの結合活性の阻害剤でありうる。
【００２８】
別の態様では、本発明は、Ｋ６３結合のユビキチンなどのユビキチンを含むポリペプチドの沈殿へのＴｒａｂｉｄの使用を提供する。これは、試薬がＴｒａｂｉｄに結合する能力のおかげで、例えば免疫沈降又は固定化ＡＰＣ（又は他の構成要素）の調製に有用な試薬である。
【００２９】
別の態様では、本発明は、β−カテニンの調節へのＴｒａｂｉｄの使用を提供する。特に、本発明は、Ｔｒａｂｉｄによるβ−カテニンの転写活性の調節へのＴｒａｂｉｄの使用を提供する。好ましくは、前記使用は、β−カテニンの単なる安定化よりもむしろβ−カテニンの転写活性の調節に作用する。別の態様では、本発明は、細胞接着の調節へのＴｒａｂｉｄの使用を提供する。好ましくは、前記細胞接着の調節は、カドヘリンによって調節される細胞接着である。
【００３０】
別の態様では、本発明は、ＴＣＦの転写の維持又は刺激へのＴｒａｂｉｄの使用を提供する。
【００３１】
別の態様では、本発明は、Ｔｒａｂｉｄ活性を低減することにより核のＴＣＦ３及び／又はＴＣＦ４を減少させる方法を提供する。
【００３２】
別の態様では、本発明は、Ｔｒａｂｉｄの調節因子を同定するための方法であって、ユビキチンによりタグ部分にカップリングした検出可能な部分を含む、Ｔｒａｂｉｄ基質を提供すること、前記基質の第１及び第２の部分を固定化すること、前記第１の部分に調節因子候補を添加すること、前記第１及び第２の部分をＴｒａｂｉｄと接触させること、インキュベートしてＴｒａｂｉｄを作用させること、並びに検出可能な部分からタグを分離することによりユビキチンの切断をアッセイすることを含み、前記第２の部分から分離された検出可能な部分の量と異なる量の検出可能な部分が、前記第１の部分から分離されることにより、前記候補はＴｒａｂｉｄの調節因子として同定される方法を提供する。
【００３３】
Ｔｒａｂｉｄは、Ｔｒａｂｉｄポリペプチド又はそれをコードする核酸を意味する。好ましくは、Ｔｒａｂｉｄは、ポリペプチドを表す。好ましくは、Ｔｒａｂｉｄポリペプチドは、Ｔｒａｂｉｄデユビキチラーゼ活性ドメインを含む。これを下にさらに詳細に説明する。
【００３４】
Ｔｒａｂｉｄがデユビキチラーゼ活性を有すること、及びＷｎｔシグナル伝達に関与することが初めて開示された。したがって広い態様では、本発明は、Ｗｎｔシグナル伝達の調節因子の同定のための方法であって、調節因子候補の存在下及び不在下でのＴｒａｂｉｄデユビキチラーゼ活性をアッセイすることを含み、調節因子候補の存在下と不在下との間でのデユビキチラーゼ活性の差により、その候補はＷｎｔシグナル伝達の調節因子として同定される方法に関する。別の態様では、本発明は、Ｔｒａｂｉｄの調節因子を同定するための方法であって、調節因子候補の存在下及び不在下でＴｒａｂｉｄデユビキチラーゼ活性をアッセイすることを含み、調節因子候補の存在下と不在下との間でのデユビキチラーゼ活性の差により、その候補はＴｒａｂｉｄの調節因子として同定される方法を提供する。好ましくは、前記調節因子候補は、阻害剤の候補であり、前記阻害剤の候補の存在下でのＴｒａｂｉｄ活性の低減により、その候補は、Ｗｎｔシグナル伝達及び／又はＴｒａｂｉｄの阻害剤として同定される。
【００３５】
調節因子候補は、化学的実体、生物学的高分子、又は他のそのような物質などの任意の実体でありうる。
【００３６】
好ましくは、前記調節因子を同定する方法は、有効量の前記調節因子を製造するステップをさらに含む。
【００３７】
好ましくは、前記調節因子を同定する方法は、対象に投与するために前記調節因子を製剤するステップをさらに含む。
【００３８】
好ましくは、前記調節因子を同定する方法は、前記調節因子を含む医薬品を製造するステップをさらに含む。
【００３９】
好ましくは、検出可能な部分からのタグの分離は、上清への検出可能な部分の放出についてアッセイすることにより測定される。このように、上清は、好都合には読出し信号を有する。別の実施形態では、好ましくは、検出可能な部分からのタグの分離は、固定化された物質における検出可能な部分の保持についてアッセイすることにより測定される。このように、洗浄され、固定化された容器を読出しのためにスキャンすることができる。
【００４０】
好ましくは、前記基質の前記第１及び第２の部分は、タグ部分を介して固定化される。
【００４１】
タグ部分及び検出可能な部分は、所望であればそれぞれ「タグ」でありうる。キーポイントは、それらを好ましくは区別できることである。この特徴は、典型的にはタグ部分及び検出可能な部分が異なることを意味するものであり、それは、これらが同じであれば、アッセイを読出し又は制御することが潜在的に困難と思われるからである。タグ部分及び検出可能な部分が同じであれば、アッセイの読出しは、アッセイ容器から上清を分離して別々の取り扱いに供することに頼るものであり、これは、アッセイ作業に労力を追加するおそれがある。
【００４２】
好ましくは、タグ部分及び検出可能な部分は異なる。この実施形態では、タグ部分は、好都合には固定化に適し（それ故に検出可能である必要はない）、潜在的にアッセイ物質の幅広い選択肢を与え、かつ／又はそのコストを低減する任意のもののことがある。
【００４３】
好ましくは、各処理におけるＴｒａｂｉｄの量は同じである。
【００４４】
好ましくは、前記第２の部分よりも低い量の検出可能な部分が前記第１の部分から分離されることにより、前記調節因子候補は、Ｔｒａｂｉｄの阻害剤として同定される。より低い量の放出は、より低いＴｒａｂｉｄ活性が原因と思われることから、阻害が行われたことを示す。
【００４５】
別の実施形態では、好ましくは、前記第２の部分よりも高い量の検出可能な部分が前記第１の部分の分離されることにより、前記調節因子候補は、Ｔｒａｂｉｄの活性化因子として同定される。次に、調節因子候補が、与えられた反応時間（インキュベーション時間）の間にＴｒａｂｉｄを活性化すると、より多量の基質が消化され、より大きな読出しを与えるものである。
【００４６】
好ましくは、前記Ｔｒａｂｉｄ基質は、ＧＳＴ−ユビキチン−ユビキチン−Ｓ融合タンパク質を含み、前記検出可能な部分はＳを含み、前記タグ部分はＧＳＴを含む。
【００４７】
好ましくは、基質の前記第１及び第２の部分は、マイクロタイタープレートの別個のウェルに固定化される。これは、好都合には高処理スクリーニング用の便利なプラットフォームである。
【００４８】
好ましくは、固定化は、マイクロタイタープレートのウェルの内表面に予めコーティングされた抗ＧＳＴ抗体に付着させることによる。
【００４９】
別の態様では、本発明は、ＡＰＣをＴｒａｂｉｄと接触させることを含む、前記ＡＰＣのＡｒｍａｄｉｌｌｏリピートドメイン（ＡＲＤ）を調節する方法を提供する。好ましくは、前記調節は、Ｔｒａｂｉｄの結合により、例えばＡＲＤドメインへの他のタンパク質の結合を遮断することによりもたらされる立体障害による。
【００５０】
別の態様では、本発明は、突然変異体ＡＰＣに結合する突然変異体Ｔｒａｂｉｄを同定する方法であって、突然変異体Ｔｒａｂｉｄポリペプチドの候補を用意すること、前記突然変異体Ｔｒａｂｉｄポリペプチドの候補を前記突然変異体ＡＰＣポリペプチドと接触させること、及び前記突然変異体Ｔｒａｂｉｄポリペプチドの候補と前記突然変異体ＡＰＣポリペプチドとの間の会合をモニターすることを含み、前記ポリペプチド間の会合が、突然変異体Ｔｒａｂｉｄポリペプチドの候補が前記突然変異体ＡＰＣと結合することを示す方法を提供する。好ましくは、前記突然変異体ＡＰＣは、Ｎ５０７Ｋ  ＡＰＣ又はＮ１７５Ｋ  Ｅ−ＡＰＣである。
【００５１】
広い態様では、本発明はＡＰＣポリペプチドに関し、前記ポリペプチドは、Ｎ１７５又はＮ５０７突然変異を含む。一実施形態では、好ましくは、前記ＡＰＣはヒトＡＰＣであり、前記突然変異はＮ５０７突然変異を含み、好ましくは、前記Ｎ５０７突然変異はＮ５０７Ｋである。別の実施形態では、好ましくは、前記ＡＰＣはＥ−ＡＰＣであり、前記突然変異はＮ１７５突然変異を含み、好ましくは前記Ｎ１７５突然変異はＮ１７５Ｋである。好ましくは上記のＡＰＣポリペプチドは、野生型ＡＰＣポリペプチドよりもＴｒａｂｉｄと結合する能力の低減を示す。好ましくは、本発明は、Ｗｎｔシグナル伝達の調節におけるこのＡＰＣポリペプチドの使用に関する。
【００５２】
突然変異体Ｔｒａｂｉｄポリペプチドの候補は、複数の突然変異体Ｔｒａｂｉｄポリペプチドの候補のライブラリーでありうる。好ましくは、前記ライブラリーは、前記突然変異体Ｔｒａｂｉｄポリペプチドの候補をコードする核酸からそれらの候補を産生する発現ライブラリーである。
【００５３】
別の態様では、本発明は、Ｔｒａｂｉｄ又はその断片を提供し、前記ＴｒａｂｉｄはＣ４４３突然変異を含む。好ましくは、前記Ｔｒａｂｉｄは、受託番号ＣＡＢ  ６４４４９のアミノ酸配列を含むヒトＴｒａｂｉｄであり、前記Ｃ４４３突然変異はＣ４４３Ｓである。別の態様では、本発明は、上記のＴｒａｂｉｄ又はその断片をコードする核酸を提供する。
【００５４】
別の態様では、本発明は、医薬品として使用するためのＴｒａｂｉｄを提供する。別の態様では、本発明は、結腸直腸癌のための医薬品を製造するためのＴｒａｂｉｄの使用を提供する。別の態様では、本発明は、家族性大腸ポリポーシスのための医薬品を製造するためのＴｒａｂｉｄの使用を提供する。別の態様では、本発明は、結腸直腸癌の治療に使用するためのＴｒａｂｉｄを提供する。別の態様では、本発明は、家族性大腸ポリポーシスの治療に使用するためのＴｒａｂｉｄを提供する。別の態様では、本発明は、幹細胞区画の維持及び／又は幹細胞活性の刺激に使用するためのＴｒａｂｉｄを提供する。別の態様では、本発明は、Ｅ３ユビキチンリガーゼとして組換え又は精製Ｔｒａｂｉｄを使用することを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】マイクロプレートアッセイの概略図である。
【図２】競合阻害曲線を示す図である。
【図３−１】３つの棒グラフ及び２つの写真である。
【図３−２】３つの棒グラフ及び２つの写真である。
【図４】図、配列、及び写真である。
【図５】写真である。
【図６−１】棒グラフ及び写真である。
【図６−２】棒グラフ及び写真である。
【図７】写真である。
【図８】ＴｒａｂｉｄがＫ６３結合のユビキチンを優先するＤＵＢであることを示す図である。（Ａ）ヒトＴｒａｂｉｄのドメイン並びにヒトＯＴＵファミリーの３メンバーの不変のシステイン及びヒスチジン（黒の影付き）のアライメント（触媒として作用しないＣ４４３Ｓ置換を示す）。大部分のＯＴＵタンパク質に見られるが、Ｔｒａｂｉｄファミリーのメンバーではアラニンに置換されている活性部位アスパラギン酸（四角で囲む）に留意。（Ｂ）ＷＴ  Ｔｒａｂｉｄ、及び表示したようにトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞から免疫沈降した突然変異体ＨＡタグ付きＴｒａｂｉｄをＫ４８又はＫ６３結合のユビキチン（ＵＢ２−７）とインキュベートしたものを用いたＤＵＢアッセイ。星印は触媒として作用しないＣ４４３Ｓと共に免疫共沈したユビキチン化タンパク質を示す。（Ｃ）細菌に発現したＴｒａｂｉｄのＷＴ又は突然変異体のＧＳＴタグ付きのＣ端末又はＮ末端断片を（左、図９Ｂも参照）、Ｋ６３結合のユビキチン（ＵＢ２〜７、右）と共にインキュベートしたもののインビトロＤＵＢアッセイ。Ｕｂ−Ａｌはユビキチンアルデヒド。
【図９】ＴｒａｂｉｄからＫ６３結合のユビキチンへの、ＴｒａｂｉｄのＮＺＦモチーフを介した優先的結合を示す図である。（Ａ）トランスフェクトされた２９３細胞から免疫沈降し、Ｋ４８又はＫ６３結合のユビキチン（ＵＢ２〜７）と共にインビトロでインキュベートしたＷＴ及び突然変異ＨＡ−Ｔｒａｂｉｄを用いたユビキチン結合アッセイ。星印は、ＷＴ及びＣ４４３Ｓと共に免疫共沈したユビキチン化タンパク質を示す（図８Ｂも参照）。（Ｂ）細菌に発現させ（左）、Ｋ４８又はＫ６３結合のユビキチンと共にインキュベートしたＴｒａｂｉｄのＧＳＴタグ付きＮ末端断片を用いたプルダウンアッセイ（図８Ｃも参照）。Ｋ６３結合の鎖への強い結合優先性に留意（レーン５及び６）。
【図１０−１】ＲＮＡｉ介在性Ｔｒａｂｉｄ枯渇がＴＣＦ依存性転写の喪失を引き起こすことを示す図である。（Ａ）対照及びＴｒａｂｉｄ特異的ｓｉＲＮＡ（内部対照、α−ＴＬＥ）をトランスフェクトされた２９３細胞における内因性Ｔｒａｂｉｄタンパク質の枯渇を示すウエスタンブロット。（Ｂ、Ｃ）（Ａ）と同様に２９３細胞にｓｉＲＮＡをトランスフェクト後に、表示したように対照馴化培地（Ｌ−ＣＭ）又はＷｎｔ３Ａ馴化培地（Ｗ３ａ−ＣＭ）で細胞を処理後に、Ｔｒａｂｉｄの転写の枯渇（左）及びＷｎｔ標的遺伝子であるＡＸＩＮ２、ＢＣＬ９、及びｃ−ＭＹＣの転写レベルをモニターするリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲアッセイ。（Ｄ）表示したようにＷＴ及び突然変異体ＨＡタグ付き△ｓｉＲＮＡ  Ｔｒａｂｉｄレスキュー構築物の再発現の存在下又は不在下で、ＳＷ４８０細胞にｓｉＲＮＡをトランスフェクト後のＴＯＰＦＬＡＳＨルシフェラーゼアッセイ。突然変異体ＴＣＦ結合部位を含有する対照ルシフェラーゼレポーターからのＦＯＰＦＬＡＳＨ値も示す。相対ルシフェラーゼ値は、誘導倍率（ｙ軸）として表現する。（下図）代表的な一実験からのＨＡ−Ｔｒａｂｉｄの発現を示すウエスタンブロット（α−チューブリンは負荷対照）。（Ｄ）（Ａ）と同様にｓｉＲＮＡをトランスフェクトされ、表示した発現ベクターを共トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞におけるＮＦ−κＢ依存的ルシフェラーゼレポーターアッセイ。（下図は発現レベルを示すウエスタンブロット）。この図及び次の図のエラーバーは、２〜３回の独立した実験（２回の繰り返しで行う）からの平均からの標準偏差である。
【図１０−２】ＲＮＡｉ介在性Ｔｒａｂｉｄ枯渇がＴＣＦ依存性転写の喪失を引き起こすことを示す図である。（Ａ）対照及びＴｒａｂｉｄ特異的ｓｉＲＮＡ（内部対照、α−ＴＬＥ）をトランスフェクトされた２９３細胞における内因性Ｔｒａｂｉｄタンパク質の枯渇を示すウエスタンブロット。（Ｂ、Ｃ）（Ａ）と同様に２９３細胞にｓｉＲＮＡをトランスフェクト後に、表示したように対照馴化培地（Ｌ−ＣＭ）又はＷｎｔ３Ａ馴化培地（Ｗ３ａ−ＣＭ）で細胞を処理後に、Ｔｒａｂｉｄの転写の枯渇（左）及びＷｎｔ標的遺伝子であるＡＸＩＮ２、ＢＣＬ９、及びｃ−ＭＹＣの転写レベルをモニターするリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲアッセイ。（Ｄ）表示したようにＷＴ及び突然変異体ＨＡタグ付き△ｓｉＲＮＡ  Ｔｒａｂｉｄレスキュー構築物の再発現の存在下又は不在下で、ＳＷ４８０細胞にｓｉＲＮＡをトランスフェクト後のＴＯＰＦＬＡＳＨルシフェラーゼアッセイ。突然変異体ＴＣＦ結合部位を含有する対照ルシフェラーゼレポーターからのＦＯＰＦＬＡＳＨ値も示す。相対ルシフェラーゼ値は、誘導倍率（ｙ軸）として表現する。（下図）代表的な一実験からのＨＡ−Ｔｒａｂｉｄの発現を示すウエスタンブロット（α−チューブリンは負荷対照）。（Ｄ）（Ａ）と同様にｓｉＲＮＡをトランスフェクトされ、表示した発現ベクターを共トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞におけるＮＦ−κＢ依存的ルシフェラーゼレポーターアッセイ。（下図は発現レベルを示すウエスタンブロット）。この図及び次の図のエラーバーは、２〜３回の独立した実験（２回の繰り返しで行う）からの平均からの標準偏差である。
【図１１】Ｔｒａｂｉｄの核機能を示すエピスタシス実験を示す図である。図１０ＢにおけるようにｓｉＲＮＡをトランスフェクトされ、（Ａ）ＨＡ−Ｗｎｔ３Ａ、（Ｂ）ドミナントネガティブＦＬＡＧ−β−ＴｒＣＰ（ΔＦ）、又は（Ｃ）安定化ＦＬＡＧ−β−カテニン（Δ４５Ｓ）を共トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞におけるＴＯＰＦＬＡＳＨアッセイ。（下図）内因性β−カテニン（Ａ）又は過剰発現したタンパク質（Ｂ、Ｃ）の発現レベルを示す代表的な実験からのウエスタンブロット。
【図１２】Ｔｒａｂｉｄの枯渇がＴＣＦ４及びＴＣＦ３レベル低減に付随することを示す図である。（Ａ）図１０ＢのようにｓｉＲＮＡをトランスフェクトされ、トランスフェクションの２４時間後にＤＭＳＯ（対照）、１０μＭ  ＭＧ１３２、又は２０ｍＭ  ＬｉＣｌを用いて４時間処理され、右に示す抗体で連続的に探索された２９３Ｔ細胞の細胞質画分及び核画分のウエスタンブロット。（Ｂ）（Ａ）と同様に調製及びｓｉＲＮＡを用いて処理された２９３細胞の核画分のウエスタンブロット（連続的に探索）。（Ｃ）（Ａ）と同様に調製された２９３細胞（１０μｇ）由来の核画分からの免疫共沈。ＩＰは抗ＴＣＦ４抗体；ウエスタンブロットは抗β−カテニン抗体。
【図１３】図１０ＢのようにｓｉＲＮＡをトランスフェクトされ、表示したように１〜１００ｎｇの空のベクター又はＬＥＦ１キメラを共トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞（キメラの発現レベルは、匹敵するレベルのトランス活性化を生じるように較正した）において、ＴｒａｂｉｄがＬＥＦ１−ＴＡＤキメラＴＯＰＦＬＡＳＨアッセイによるトランス活性化に必要ないことを示す図である。（下図）抗β−カテニン抗体を用いて探索した、ｃａｔＣ−ＬＥＦ１Δ５６の発現レベルを示す代表的な実験からのウエスタンブロット（約１０分の１活性のｃａｔＣ−ＬＥＦ１Δ５６に一致するように使用された低発現レベルでＶＰ１６−ＬＥＦ１Δ□が検出不可能であったことに留意）。
【図１４】ｄＴｒａｂｉｄが異所性Ｗｉｎｇｌｅｓｓシグナル伝達に対する応答の正の調節因子であることを示す図である。（Ａ）ＧＡＬ４又は（Ｂ〜Ｄ）Ｗｉｎｇｌｅｓｓ、（Ｅ、Ｆ）Ａｒｍａｄｉｌｌｏ又は（Ｇ、Ｈ）ＥＧＦ受容体のＡｒｇｏｓ阻害剤を発現しているｙ  ｗハエの眼。（Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｇ）＋／＋、（Ｃ、Ｆ、Ｈ）ｄＴｒａｂｉｄ／＋、（Ｄ）ｄＴＣＦ３／＋。ｄＴｒａｂｉｄのヘテロ接合性は、異所性Ａｒｇｏｓ（Ｈ）又はＲｈｏｍｂｏｉｄのいずれかが原因の表現型ではなく、異所性Ｗｉｎｇｌｅｓｓ又はＡｒｍａｄｉｌｌｏ（Ｃ、Ｆ）が原因のラフアイ表現型を抑制する。
【図１５】Ｔｒａｂｉｄの第３のＮＺＦモチーフがそのＤＵＢ活性に必要とされることを示す図である。（Ａ）ＷＴ及びＣ１５５Ａ突然変異体ＨＡ−Ｔｒａｂｉｄをトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の溶解液を抗ＨＡ抗体を用いて免疫沈降後のウエスタンブロット。（Ｂ）（Ａ）からの免疫沈降物をＫ４８又はＫ６３結合のユビキチン（ＵＢ２〜７）と共にインキュベートしたものを用いたＤＵＢアッセイ、セファロースビーズ２０μｌをユビキチン鎖と共に３０℃で１時間インキュベートした。
【図１６】異なるタンパク質からのＮＺＦモチーフのアライメントを示す図である。ヒトＴｒａｂｉｄ由来の３つのＮＺＦモチーフをヒトＴＡＢ２及びＴＡＢ３由来ＮＺＦモチーフ、並びにラットＮｐｌ４（このモチーフの創始者メンバー）と整列させる。不変のシステインに黒の影を付け、他の不変残基に灰色の影を付ける。３×Ｚｎ突然変異体では最初のシステイン（下線部）をアラニンに突然変異させた。
【図１７】Ｔｒａｂｉｄが細胞質タンパク質及び核タンパク質の両方であることを示す図である。（Ａ）図１０Ｂのように、ｓｉＲＮＡをトランスフェクトされた２９３細胞を対照馴化培地（Ｌ−ＣＭ）又はＷｎｔ３Ａ馴化培地（Ｗ３ａ−ＣＭ）で処理後の２９３細胞の細胞質及び核画分を、表示した抗体で探索したウエスタンブロット。（Ｂ〜Ｄ）ＨＡ−Ｔｒａｂｉｄをトランスフェクトされ、固定され、（核をラベルするために）抗ＨＡ抗体及びＤＡＰＩで染色された、表示した通りの種々のヒト細胞系。細胞をＰＢＳ（＋）で洗浄し、ＰＢＳ（−）中での４％パラホルムアルデヒドを予熱したもの１ｍｌに入れて室温で２０分間固定した。続いて、細胞をＰＢＳ（−）中の０．５％トリトンＸ−１００で１０分間透過化し、５％正常ヤギ血清で２０分間ブロッキングし、その後抗ＨＡ抗体（１％ヤギ血清を含有するＰＢＳ（＋）に希釈）と共に２時間インキュベートした。細胞をＰＢＳ（＋）で２回洗浄し（１回につき１０分間）、続いてＡｌｅｘａ４８８−抗ラット二次ヤギ抗体（Molecular Probes社製）と共に４０分間インキュベートし、ＰＢＳ（＋）で３回洗浄した。ＤＡＰＩを有するVectashield（Vector Laboratories社製）を使用してカバースリップをガラススライドに据え付けた。MRC1024共焦点顕微鏡を用いて蛍光を視覚化し、画像を倍率６００でスキャンした。ＳＷ４８０細胞におけるＨＡ−Ｔｒａｂｉｄの核蓄積に留意されたい。
【図１８】ＴｒａｂｉｄのＲＮＡｉ介在性枯渇の特異性を示す図である。（Ａ）半定量ＲＴ−ＰＣＲ分析。図１０ＤのようにｓｉＲＮＡをトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞における内因性Ｔｒａｂｉｄ転写体のレベルを示す。（Ｂ）図１０ＤのようにｓｉＲＮＡをトランスフェクトされ、ＨＡタグ付きＣｅｚａｎｎｅ及びＴｒａｂｉｄを共トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞からの溶解物を、抗ＨＡ抗体を用いて探索したウエスタンブロット。（Ｃ）図１０ＡのようにｓｉＲＮＡをトランスフェクトされ、Ｔｒａｂｉｄ  ｓｉＲＮＡを用いた枯渇に細胞を不応性にするサイレント突然変異を有するＨＡタグ付きＴｒａｂｉｄ（ΔｓｉＲＮＡ）を共トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞からの溶解物のウエスタンブロット。
【図１９】ＴｒａｂｉｄのＲＮＡｉ介在性枯渇がＷｎｔ３Ａで刺激された２９３Ｔ細胞におけるＴＣＦ依存性転写の喪失を引き起こすことを示す図である。表示するように、図１０ＤのようにｓｉＲＮＡと、ＷＴ及び突然変異体ΔｓｉＲＮＡ  Ｔｒａｂｉｄレスキュー構築物とを２９３Ｔ細胞に共トランスフェクション後に、Ｗｎｔ３Ａ刺激の存在下又は不在下で行ったＴＯＰＦＬＡＳＨアッセイ。（下図）内因性β−カテニン及びＨＡタグ付きＴｒａｂｉｄレスキュー構築物のレベルを示すウエスタンブロット。
【図２０】ＴｒａｂｉｄがＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ及びＧＳＫ３βの下で作用することを示す図である。（Ａ）Ｔｒａｂｉｄに対する２つの異なるｓｉＲＮＡ又は図１０ＤのようにＣｅｚａｎｎｅに対するｓｉＲＮＡをトランスフェクトされ、空のベクター又はＦＬＡＧ−Ｄｖｌ２を共トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞のＴＯＰＦＬＡＳＨアッセイ。（Ｂ）図１０ＢのようにｓｉＲＮＡをトランスフェクトされ、空のベクター、ＦＬＡＧ−Ｄｖｌ２若しくはＨＡ−Ｗｎｔ３Ａを共トランスフェクトされたか、又は１０ｍＭ  ＬｉＣｌで４時間処理された２９３Ｔ細胞におけるＴＯＰＦＬＡＳＨアッセイ（レーン４及び８）。
【図２１】Ｔｒａｂｉｄが結腸直腸癌細胞におけるＴＣＦ介在性転写に必要とされることを示す図である。対照ｓｉＲＮＡ、又はＴｒａｂｉｄ若しくはＣｅｚａｎｎｅに対するｓｉＲＮＡ（Ｔｒａｂｉｄについては２つの異なるｓｉＲＮＡ）及び比較としてβ−カテニンに対するｓｉＲＮＡをトランスフェクション後のＳＷ４８０又はＨＣＴ−１１６結腸直腸癌細胞のＴＯＰＦＬＡＳＨアッセイ。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
本発明は、ＡＰＣのＡＲＤドメインと相互作用するタンパク質、例えばＴｒａｂｉｄの機能を研究し、その理解を高めること、並びにＡＰＣの調節因子若しくはエフェクターとしての推定上の役割及び／又はＷｎｔシグナル伝達と細胞接着とに及ぼすそれらの効果を調べることに関する。したがって、本発明は、ＡＰＣ腫瘍抑制因子の、及びＷｎｔシグナル伝達だけではなく細胞接着に果たすその機能のよりよい理解を可能にする。さらに、本発明は、結腸直腸癌細胞におけるＷｎｔシグナル伝達活性を減弱又は遮断する分子及びメカニズムの同定を可能にする。
【００５７】
Ｔｒａｂｉｄ
Ｔｒａｂｉｄは、Ａ２０及びＣｅｚａｎｎｅも含有する哺乳動物ＯＴＵ（卵巣腫瘍）ドメインタンパク質の小ファミリーに属する。ＯＴＵドメインは古典的なシステインプロテアーゼシグネチャーを有し、Ａ２０及びＣｅｚａｎｎｅは、脱ユビキチン化（ＤＵＢ）活性を見せることが示された。Ａ２０は、ＮＦκＢシグナル伝達及び炎症の負の調節因子であり、Ｃｅｚａｎｎｅも、ＮＦκＢ介在性転写をダウンレギュレーションすることができる、Ｔｒａｂｉｄの機能は、本明細書において最初に開示される。
【００５８】
重要なことに、本発明者らは、Ｔｒａｂｉｄの機能喪失がＷｎｔ経路の活性を低減する結果、本発明により、Ｔｒａｂｉｄの（例えばその脱ユビキチン化活性の）任意の枯渇又は阻害は、結腸直腸癌及び／又は他のＷｎｔ関連障害若しくは疾患の治療に有益であることを示す。
【００５９】
Ｗｎｔ経路活性が、（例えば腸における、及び造血系などの他の細胞における）幹細胞区画の維持に必要であることに留意すべきである。したがって、Ｗｎｔ経路のアゴニスト（Ｔｒａｂｉｄ又はＴｒａｂｉｄの活性化因子／誘導因子など）は、幹細胞活性の刺激に適用を見出すことがある。明らかに、経路を過剰活性化する有益効果と任意の負の発癌効果との間でバランスをとるように、本発明の実施形態を実施する際には留意する必要があろう。
【００６０】
Ｔｒａｂｉｄの２つの顕著な特徴は、そのＯＴＵドメインの推定上の活性部位における保存されたＤ→Ａ置換及びそのＮ末端における複数のジンンクフィンガーであり、これらのジンクフィンガーは、Ａ２０にもＣｅｚａｎｎｅも見出されない。これらのジンクフィンガーはＮＺＦ型であり、ユビキチン結合モチーフである。特に、ショウジョウバエは、このＯＴＵタンパク質ファミリーのメンバーを１つだけを含有し、このメンバーはこれらの特徴の両方を見せることから、哺乳動物Ｔｒａｂｉｄのオルソログである。さらに、いくつかの構造的に異なる種類のユビキチン結合ドメインがあることに留意すべきであり、ジンクフィンガー型ドメインは、やっと最近記載された。これらのドメインは、広範囲のタンパク質に存在し、ユビキチナーゼ活性もデユビキチラーゼ活性も実証されていないタンパク質に存在する。
【００６１】
ＴｒａｂｉｄがＤＵＢ活性を有すると実証されたことが注目すべきであるのは、Ｔｒａｂｉｄがその推定上の触媒性トリアド（triad）にＤ→Ａ置換を有するからである。この置換は普通でなく、Ｔｒａｂｉｄがデユビキチラーゼ活性を有さないことを示していると受け止められるおそれもあろう。しかし、本発明者らは、この置換がＤＵＢ活性と両立できることを示す。理論に縛られることを望むわけではないが、このことは、好都合には他のＯＴＵドメインの活性部位には影響を及ぼすことができない阻害剤に選択的に感受性な特異的形状の活性部位につながりうるものであり、本発明による阻害剤にさらに高い選択性／特異性を可能にする。
【００６２】
本発明者らは、さらなるＴｒａｂｉｄ活性、すなわちＥ３ユビキチンリガーゼ活性も開示する。この証拠は実施例１２に示される（Ｔｒａｂｉｄの枯渇後にβ−カテニンのユビキチン化が減少し、タンパク質全体のユビキチン化が減少していることに留意）。したがって、本発明者らは、ＴｒａｂｉｄがＥ３ユビキチンリガーゼ活性を有すること、及びこの活性の阻害がＷｎｔ経路の活性低減に関連することを初めて実証する。このＴｒａｂｉｄ活性は、Ｅ３ユビキチンリガーゼ活性を仲介するか、又はその一因となるユビキチン結合モチーフをおそらく介してそのＮＺＦフィンガー領域によりおそらく仲介される。Ｔｒａｂｉｄ近縁のＡ２０がＤＵＢ活性とＥ３ユビキチンリガーゼ活性との両方を有し、両活性はその機能に重要であることに注目することは興味深い。したがって、本発明は、Ｅ３ユビキチンリガーゼとしての組換え又は精製Ｔｒａｂｉｄの使用に関する。本発明は、さらにＴｒａｂｉｄのＥ３ユビキチンリガーゼ活性の操作によるＷｎｔシグナル伝達の操作に関し、好ましくは本発明は、Ｔｒａｂｉｄ  Ｅ３ユビキチンリガーゼ活性の低減によるＷｎｔシグナル伝達の低減に関する。
【００６３】
ショウジョウバエＴｒａｂｉｄ（ｄＴｒａｂｉｄ）の配列は、受託番号ＮＰ＿６４９９３１（又はＡＡＦ５４４２９）に見出すことができる。用語「Ｔｒａｂｉｄ」は、タンパク質又はそのホモログを表す。好ましくは、本発明のＴｒａｂｉｄは哺乳動物Ｔｒａｂｉｄであり、好ましくは、マウスＴｒａｂｉｄ（受託番号ＣＡＤ６７５７６（又はＮＰ＿９９７１８５））であり、最も好ましくはヒトＴｒａｂｉｄ（受託番号ＣＡＢ６４４４９（又はＮＰ＿０６００５０））である。本明細書におけるＴｒａｂｉｄの言及は、状況により別のものが示されない限り、好ましくはヒト配列、好ましくはヒトアミノ酸配列に関する。ヒト配列は、家族性大腸ポリポーシス（ＦＡＰ）、結腸直腸癌、及び関連する態様などの本発明の治療的態様に最も臨床的に関連する。同じことは、本明細書に参照されるＴｒａｂｉｄについてのヌクレオチド配列に適用される。公的に入手可能なＴｒａｂｉｄヌクレオチド配列は、上に提供されるアミノ酸配列についての受託番号を用いて確認することができる。
【００６４】
Ｔｒａｂｉｄには、Ｔｒａｂｉｄの断片が含まれる。断片は任意のサイズであってもよく、Ｃ末端若しくはＮ末端からの欠失、又は１つ若しくは複数の内部欠失などの欠失、又は欠失の組み合わせなどを含んでもよい。Ｔｒａｂｉｄには、アミノ酸置換、例えばＣ４４３Ｓ突然変異などの突然変異体も含まれることがある。Ｔｒａｂｉｄは、例えばエピトープタグ若しくは他のマーカー、ヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ、又は精製を助けるための他のそのような部分の付加突然変異体などの突然変異体も含まれることがあるし、他の所望の配列を対象とするＴｒａｂｉｄ配列に付加してもよい。
【００６５】
欠失突然変異体並びに／又は置換及び／若しくは付加突然変異体、又はその組み合わせなどのＴｒａｂｉｄ変異体が、対象とする関連する生物学的機能を保持することが重要である。例えば、ユビキチンに結合するＴｒａｂｉｄを研究又はアッセイする場合に、ジンクフィンガーモチーフが存在することが重要である。同様に、Ｔｒａｂｉｄのデユビキチラーゼ活性を研究する場合に、触媒性トリアドが保存されていることが重要である。明らかに、機能を別々に研究する場合に、Ｔｒａｂｉｄ分子のうち別々の機能を提供する部分を分離することが許容されよう。例えば、ＴｒａｂｉｄのＮ末端ドメインはユビキチンの結合に関与するが、Ｃ末端ドメインはデユビキチラーゼ活性に関与する。当然、Ｔｒａｂｉｄ分子はその生物学的設定で全体として機能するため、好ましくは、全体の（完全長）Ｔｒａｂｉｄが本明細書に記載される方法及び技法に使用される。ＴｒａｂｉｄポリペプチドがＴｒａｂｉｄ断片としてみなされるためにはその機能を保持することが重要であるが、その機能が突然変異により故意に破壊又は損傷されうる本発明の実施形態があることにも留意しなければならない。このようなＴｒａｂｉｄ突然変異体の一例はＣ４４３Ｓ  Ｔｒａｂｉｄである。Ｃ４４３は触媒性トリアドの一つである。したがって、Ｃ４４３Ｓ突然変異体は、本発明に有用な、触媒不活性のＴｒａｂｉｄである。したがって一態様では、本発明は、Ｔｒａｂｉｄ又はその断片に関し、前記Ｔｒａｂｉｄ又は断片は、Ｃ４４３突然変異、好ましくはＣ４４３Ｓ突然変異を含む。
【００６６】
Ｔｒａｂｉｄの断片も、本発明に適用を見出すことがある。好ましくは、断片は、ヒト野生型Ｔｒａｂｉｄについての連続した少なくとも１０アミノ酸長、好ましくは連続した少なくとも２０アミノ酸長、好ましくは連続した少なくとも３０アミノ酸長、好ましくは連続した少なくとも５０アミノ酸長、好ましくは連続した少なくとも１００アミノ酸長、好ましくは連続した少なくとも１５０アミノ酸長、好ましくは連続した少なくとも２００アミノ酸長、好ましくは連続した少なくとも２５０アミノ酸長、好ましくは連続した少なくとも３００アミノ酸長、好ましくは連続した少なくとも３５０アミノ酸長、好ましくは連続した少なくとも４００アミノ酸長、好ましくは連続した少なくとも４５０アミノ酸長、好ましくは連続した少なくとも５００アミノ酸長、好ましくは連続した少なくとも５５０アミノ酸長、好ましくは連続した少なくとも６００アミノ酸長、好ましくは連続した少なくとも６５０アミノ酸長、好ましくは連続した少なくとも７００アミノ酸長、好ましくは連続した少なくとも７０７アミノ酸長、最も好ましくは完全長である。
【００６７】
本発明の好ましいＴｒａｂｉｄは、アミノ酸３５５〜７０８を含むＴｒａｂｉｄ断片である。これは、Ｔｒａｂｉｄデユビキチラーゼ活性の評定に特定の適用を見出す。本発明の好ましいＴｒａｂｉｄは、アミノ酸１〜３５４を含むＴｒａｂｉｄ断片である。これは、ユビキチンの結合の評定に特定の適用を見出す。
【００６８】
Ｔｒａｂｉｄポリペプチドとみなされるために、対象とするポリペプチドは、上に論じたヒトＴｒａｂｉｄのホモログでなければならない。これに関して、好ましくはそのＴｒａｂｉｄはヒトＴｒａｂｉｄと配列同一性を示し、好ましくはそのＴｒａｂｉｄ（又はその断片）はヒトＴｒａｂｉｄと少なくとも３０％の同一性、好ましくはヒトＴｒａｂｉｄと少なくとも４０％の同一性、好ましくはヒトＴｒａｂｉｄと少なくとも４５％の同一性、好ましくはヒトＴｒａｂｉｄと少なくとも５０％の同一性、好ましくはヒトＴｒａｂｉｄと少なくとも５５％の同一性、好ましくはヒトＴｒａｂｉｄと少なくとも６０％の同一性、好ましくはヒトＴｒａｂｉｄと少なくとも６５％の同一性、好ましくはヒトＴｒａｂｉｄと少なくとも７０％の同一性、好ましくはヒトＴｒａｂｉｄと少なくとも７５％の同一性、好ましくはヒトＴｒａｂｉｄと少なくとも８０％の同一性、好ましくはヒトＴｒａｂｉｄと少なくとも８５％の同一性、好ましくはヒトＴｒａｂｉｄと少なくとも９０％の同一性、好ましくはヒトＴｒａｂｉｄと少なくとも９５％の同一性、好ましくはヒトＴｒａｂｉｄと少なくとも９８％の同一性、好ましくはヒトＴｒａｂｉｄと少なくとも９９％の、又はさらにそれを超える同一性を表す。遺伝コードの縮重を考慮した変動も考慮しなければならない場合に、Ｔｒａｂｉｄをコードするヌクレオチド配列に同じことが適用される。同一性は、好ましくは対象とするＴｒａｂｉｄ（又はその断片）の長さに沿って判定される。
【００６９】
Ｔｒａｂｉｄのデユビキチラーゼ活性を研究又はアッセイする場合に、Ｔｒａｂｉｄのデユビキチラーゼ触媒ドメインを含むＴｒａｂｉｄポリペプチドを使用することが重要である。この触媒ドメインは、Ｔｒａｂｉｄの卵巣腫瘍ドメイン（ＯＴＵドメイン）に関連する。この触媒ドメインは、好ましくはＴｒａｂｉｄのＣ末端であり、好ましくはマウス又はヒトＴｒａｂｉｄのアミノ酸３５５〜７０８である。好ましくはｈＴｒａｂＣＴ３５５−７０８  Ｔｒａｂｉｄポリペプチドが使用される。
【００７０】
好ましくは、Ｔｒａｂｉｄは組換え又は精製Ｔｒａｂｉｄである。好ましくは、Ｔｒａｂｉｄは組換えＴｒａｂｉｄである。
【００７１】
Ｔｒａｂｉｄは、好ましくは組換え手段により調整される。典型的には、対象とするＴｒａｂｉｄポリペプチドは、大腸菌（E. coli）のプラスミド上で運ばれる適切なヌクレオチド配列から発現され、結果として生じるポリペプチドは、当業者に公知の標準的な手順を使用してそれから精製される。
【００７２】
「Ｔｒａｂｉｄ活性の調節」は、当技術分野においてその通常の意味を有し、すなわちＴｒａｂｉｄ活性を上下させることによりＴｒａｂｉｄ活性を操作することである。これは、例えば阻害剤、ドミナントネガティブＴｒａｂｉｄ構築物、又は他の適切な手段を使用して、Ｔｒａｂｉｄ自体の活性を操作することにより達成することができるし、例えばその発現を（例えば転写又は翻訳レベルで）上下させること、その分解を上下させること、隔離、又はＴｒａｂｉｄを除去若しくは喪失させる他の手段により、Ｔｒａｂｉｄのレベルを操作することにより達成することができる。好ましくは、調節は阻害を意味する。好ましくは、Ｔｒａｂｉｄ活性の阻害は、阻害剤若しくはドミナントネガティブＴｒａｂｉｄを使用して、又はＴｒａｂｉｄのレベルを低減することにより達成される。好ましくは、Ｔｒａｂｉｄ活性の阻害又は低減は、Ｔｒａｂｉｄの発現を低減する、Ｔｒａｂｉｄに対するｓｉＲＮＡを使用して、又はシグナル伝達活性などのＴｒａｂｉｄ活性を低減するドミナントネガティブＴｒａｂｉｄを使用して達成される。
【００７３】
本発明は、Ｔｒａｂｉｄ阻害剤、及びＴｒａｂｉｄとの対抗若しくはＴｒａｂｉｄに反対する効果発揮へのその阻害剤の使用にも関することに留意することが重要である。例えば、Ｔｒａｂｉｄは、ＴＣＦ／ＬＥＦの転写を誘導又は持続又は増加させるために使用することができるため、Ｔｒａｂｉｄ阻害剤は、ＴＣＦ／ＬＥＦの転写を除去、阻害、又は低減するために使用することができ、Ｔｒａｂｉｄは、タンパク質の脱ユビキチン化に使用することができるため、Ｔｒａｂｉｄ阻害剤は、タンパク質上のユビキチンの脱ユビキチン化阻害又は維持に使用することができ、同じことが本明細書に開示されるＴｒａｂｉｄの他の適用に、及びＴｒａｂｉｄ阻害剤を使用して好都合にもたらすことのできる反対の効果にあてはまる。
【００７４】
Ｔｒａｂｉｄ阻害剤は、Ｔｒａｂｉｄの機能の阻害剤を意味する。これは、好都合にはＴｒａｂｉｄ分子とは別の分子、例えばＴｒａｂｉｄに結合して阻害をもたらす分子でありうる。或いは、Ｔｒａｂｉｄ阻害剤は、Ｔｒａｂｉｄのレベルを低減する実体、例えばＴｒａｂｉｄの発現を低減するｓｉＲＮＡでありうる。或いは、Ｔｒａｂｉｄ阻害剤は、本明細書に開示される触媒不活性のＣ４４３Ｓ  Ｔｒａｂｉｄ又は阻害性Ｔｒａｂｉｄ断片などのドミナントネガティブＴｒａｂｉｄでありうる。ドミナントネガティブＴｒａｂｉｄは、Ｔｒａｂｉｄのａａ１〜３５０などのＴｒａｂｉｄのＮ末端のこともあるし、Ｔｒａｂｉｄ３５１〜７０８などのＴｒａｂｉｄのＣ末端のこともあるし、Ｔｒａｂｉｄ  Ｃ４４３突然変異体（例えばＴｒａｂｉｄ  Ｃ４４３Ｓ）又はその断片などの触媒不活性のＴｒａｂｉｄ突然変異体のこともある。好ましくはドミナントネガティブＴｒａｂｉｄは、触媒不活性のＴｒａｂｉｄ又はその断片、好ましくはＴｒａｂｉｄ３５１〜７０８  Ｃ４４３Ｓを含む。
【００７５】
好ましくは、Ｔｒａｂｉｄ阻害剤は、Ｔｒａｂｉｄに対するｓｉＲＮＡ又はＴｒａｂｉｄ  Ｃ４４３ＳなどのドミナントネガティブＴｒａｂｉｄである。
【００７６】
ユビキチン
多数の細胞シグナル伝達過程は、ユビキチンの付加又は除去によるタンパク質の翻訳後修飾により触媒又は制御される。ユビキチンは、７６アミノ酸残基の保存されたタンパク質である。この基本ユビキチンユニットは、ポリユビキチン鎖に重合することがある。これらの鎖の中の個別のユビキチンブロックは、一つのユビキチンの特異的リシン残基と次のユビキチンの残基Ｇ７６のカルボキシル基とを架橋するイソペプチド結合により接続される。このイソペプチド結合には少なくとも２つの様式、すなわちＫ４８及びＫ６３型がある。Ｋ４８結合から構築されたポリユビキチン鎖は、これが結合しているタンパク質のプロテアソーム分解をシグナル伝達する傾向にある。Ｋ６３結合を介して構築された鎖は、典型的にはタンパク質分解しない結末をシグナル伝達する。さらに、この鎖の化学構造及び長さもシグナル伝達事象に影響することがある。好ましくは、本発明のポリユビキチン鎖はＫ６３鎖である。
【００７７】
ユビキチンのインビトロ化学的性質は、当技術分野において十分に特徴づけられている。例えば、Pickart and Raasi（2005 Methods in Enzymology Volume 399 pages 21-36）は、かなり詳細にポリユビキチン鎖の制御合成について記載している。
【００７８】
ユビキチン基は、脱ユビキチン化酵素（デユビキチラーゼ、脱ユビキチン化酵素、又は「ＤＵＢ」）により除去される。脱ユビキチン化酵素の作用を研究するために、脱ユビキチン化作用後に視覚化可能な産物を生じる基質を含有するユビキチンが使用される。これらの酵素に高感度な基質として有用ないくつかの蛍光ユビキチン誘導体が、Tirat et al（2005 Analytical Biochemistry Volume 343 pages 244-255）に開示されている。
【００７９】
脱ユビキチン化酵素のファミリーには、いくつかのサブグループがある。ｏｔｕｂａｉｎは、卵巣腫瘍（ＯＴＵ）スーパーファミリーのタンパク質に属する最近同定されたファミリーの脱ユビキチン化酵素である。Nanao et al (2004 EMBO Volume 5 page 783-788)は、ヒトｏｔｕｂａｉｎの結晶構造を開示している。活性部位が記載され、ｏｔｕｂａｉｎ−ユビキチンの結合モデルが提案されている。ｏｔｕｂａｉｎファミリーの脱ユビキチン化酵素の概要は、Balakirev et al（2003 EMBO Volume 4 pages 517-522）に見いだすことができる。これらのプロテアーゼにより使用される（正確にユビキチン−ポリペプチドの接合部での）切断部位の詳細が発表され、このファミリーに属する新しいペプチダーゼが記載されている。抗ユビキチン抗体などの様々な試薬他が、これらの刊行物に記載されている。
【００８０】
Ｋ６３結合のユビキチン
本発明者らは、Ｋ６３結合のユビキチン鎖に対するＴｒａｂｉｄの結合特異性を観察した。さらに、この結合特異性はＴｒａｂｉｄのＺｎフィンガーにより仲介される。言い換えると、本発明者らは、Ｔｒａｂｉｄがそのジンクフィンガーを介してＫ６３結合のユビキチンに対する結合特異性を有することを開示する。Ｋ６３の選択性は著しい。これは、本発明のさらなる使用及び適用を可能にする。
【００８１】
したがって、本発明は、Ｋ６３結合のユビキチン鎖にタンパク質などの部分をターゲティングするための試薬としての、１つ若しくは複数のＴｒａｂｉｄ  Ｚｎクフィンガー、又はそれ由来のＺｎフィンガー配列を含むポリペプチドに、及びその使用に関する。特に、本発明はＮＦｋＢ経路に適用を見出し、この経路には、この種の機能的に関連する事象の確固とした例がある。
【００８２】
本発明の有用性／工業的適用の例証として、ＴｒａｂｉｄのＤＵＢ及び／又はＵｂ結合活性、特にＫ６３結合のユビキチン結合活性が、ＳＷ４８０結腸直腸癌細胞又はＷｎｔを刺激された細胞においてＴｒａｂｉｄが機能するために必要とされることに留意すべきである（実施例及び図１０Ｄ参照、図１９も参照）。
【００８３】
したがって、本発明は、
（ｉ）Ｔｒａｂｉｄのアミノ酸４〜３２、Ｔｒａｂｉｄのアミノ酸８４〜１１２、及びＴｒａｂｉｄのアミノ酸１４９〜１７７からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列、又は
（ii）（ｉ）の完全長アミノ酸配列と少なくとも２５％の同一性を有する少なくとも１つのアミノ酸配列であって、（ｉ）の前記アミノ酸配列の構造的ジンクフィンガーコア残基が保持されている配列
を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、少なくとも２つのジンクフィンガードメインを含み、前記ポリペプチドが完全長野生型Ｔｒａｂｉｄを含む場合、前記ポリペプチドがそれに加えて少なくとも１つのさらなるアミノ酸を含むポリペプチドを提供する。
【００８４】
別の態様では、本発明は、（ii）の少なくとも１つのアミノ酸配列が、（ｉ）の完全長アミノ酸配列と少なくとも３３％の同一性を有し、（ｉ）の前記アミノ酸配列の構造的ジンクフィンガーコア残基が保持され、疎水性界面におけるユビキチン結合残基が保持される、上に論じるポリペプチドを提供する。
【００８５】
別の態様では、本発明は、Ｋ６３結合のユビキチンに結合する、上に論じるポリペプチドを提供する。
【００８６】
別の態様では、本発明は、
（ｉ）対象とするアミノ酸配列、及び
（ii）上に論じるポリペプチド
を含むポリペプチドを提供する。
【００８７】
別の態様では、本発明は、
（ｉ）所望のアミノ酸配列、及び
（ii）Ｋ６３結合のユビキチンに結合するＴｒａｂｉｄポリペプチド
を含むポリペプチドであって、（ii）の前記Ｔｒａｂｉｄポリペプチドが、少なくとも２つのジンクフィンガードメインを含み、前記ジンクフィンガードメインが、Ｔｒａｂｉｄの少なくとも１つのＮＺＦジンクフィンガー由来の少なくとも１つのジンクフィンガーシグネチャー配列を含むポリペプチドを提供する。別の態様では、本発明は、そのように定義されたＴｒａｂｉｄポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００８８】
別の態様では、本発明は、Ｋ６３結合のユビキチンへの対象とする部分のターゲティングにおける、上に論じるポリペプチドの使用又は上に論じるＴｒａｂｉｄポリペプチドの使用を提供する。
【００８９】
適切には、所望の前記部分はプロテアーゼである。
【００９０】
適切には、所望の前記部分はラベルである。
【００９１】
別の態様では、本発明は、上に論じるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００９２】
好ましいＫ６３結合のユビキチン選択的Ｔｒａｂｉｄポリペプチドは、Ｔｒａｂｉｄ、好ましくはヒトＴｒａｂｉｄのアミノ酸ｘからｙまでを含み、ｘは１〜４から選択され、ｙは１７７〜３５４から選択され、適切にはｘは１又は４であり、ｙは１７７、３５０、又は３５４である。
【００９３】
Ｋ６３結合のユビキチンに特異的に結合する適切なＫ６３結合のユビキチン選択的Ｔｒａｂｉｄポリペプチドは、Ｔｒａｂｉｄ  ＮＴ（ＴｒａｂｉｄのＮ末端）１〜３５４である。
【００９４】
Ｋ６３結合のユビキチンに選択的な、適切な短鎖のＴｒａｂｉｄポリペプチドは、３つのＮＺＦフィンガーすべてにわたる領域、すなわちＴｒａｂｉｄ４〜１７７を含む。
【００９５】
ＴｒａｂｉｄのＺｎフィンガー
Ｔｒａｂｉｄの個別のＺｎフィンガーはＮＺＦ型ジンクフィンガーである。
【００９６】
これらのＺｎフィンガーのそれぞれは、中程度の親和性（１００〜４００μＭのＫｄ、Alam et al 2004（Embo J. vol 23, pp1411-1421、参照により本明細書に組み込まれている）を参照）でモノユビキチンに結合することができるが、それは、Ｎｐｌ４のＮＺＦ−ユビキチン複合体の構造に基づきAlam et al 2004（同書）により決定されたユビキチン結合ＮＺＦのシグネチャーにそれぞれが等しく十分に適合するからである。したがって、Ｔｒａｂｉｄの個別のＮＺＦは、一部の適用について同等であり、すなわち相互交換可能でさえあると思われる。
【００９７】
しかし、Ｎｐｌ４のＮＺＦが個別のユビキチンモノマーのよく認識される「Ｉ４４」表面に結合することから、個別のＮＺＦが、それだけでは（すなわち単一のＺｎフィンガーのみを含むポリペプチドとして）Ｋ６３結合鎖に特異性を表さないおそれがあることに留意しなければならない。したがって、好ましくは本発明によるＫ６３選択的Ｔｒａｂｉｄポリペプチドは、ＴｒａｂｉｄのＮＺＦなどの少なくとも２つのＺｎＦを含む。
【００９８】
「ＴｒａｂｉｄのＮＺＦ」は、ＴｒａｂｉｄのＺｎフィンガーの配列に対応するか、又はそれに由来するアミノ酸配列である。このアミノ酸配列がＴｒａｂｉｄ  Ｚｎフィンガーの配列に「由来する」場合に、これは、少なくとも１つのＴｒａｂｉｄ  Ｚｎフィンガー配列にある程度のアミノ酸配列同一性を有し、かつAlam et al 2004（同書）により決定されたユビキチン結合性ＮＺＦのコアシグネチャーを有することを意味する。配列同一性の程度は、上に論じる通りであり、好ましくは、コアＮＺＦシグネチャー配列を含めた配列に関係する。これらの実施形態では、好ましくは配列同一性は、ＴｒａｂｉｄのＮＺＦに対応する完全配列の全域、典型的には２８アミノ酸のＺｎＦドメイン自体の全域で判定される。
【００９９】
Ｔｒａｂｉｄ上の３つの個別のＺｎフィンガー（ＮＺＦ）の位置は、ＮＺＦ１が４〜３２、ＮＺＦ２が８４〜１１２、ＮＺＦ３が１４９〜１７７である。
【０１００】
Ｚｎフィンガーは、単一のポリペプチド上で組み合わせることができる。任意の２つのＮＺＦの組み合わせ（重複、例えば２つの同一フィンガーの繰り返しを含む）は、単一のＮＺＦよりも高い親和性でユビキチンに結合することができ、特異性を示すことがある。適切には、２つのフィンガーを使用する場合に、それらはＴｒａｂｉｄアミノ酸４〜１１２又は８４〜１７７により含まれるフィンガーである。Ｔｒａｂｉｄの全部で３つのＮＺＦの組み合わせは、ユビキチンにさらに高い親和性で結合し、Ｋ６３ユビキチンに高い特異性を示す見込みがある。３つを超えるＺｎＦなどのより多数のＺｎＦは、Ｋ６３ユビキチンに対する高い結合及び／又は高い特異性を提供することがある。好ましくは、３つのＮＺＦが複数で使用される（例えばＴｒａｂｉｄアミノ酸４〜１７７の重複）。
【０１０１】
本発明による単一のポリペプチド上での個別のＮＺＦの出現順序は、結合／特異性に有意に影響する見込みがない。熟練の技術者は、そのような順序を容易に最適化することができる。好ましくは、天然の順序が保持される。
【０１０２】
スペーシング
スペーサー配列（すなわち個別のＺｎＦの間に出現する配列）は、直接的に結合／特異性の一因となる見込みがない。好ましくは、天然のＴｒａｂｉｄのスペーシング及び／又はスペーサー配列が使用される。
【０１０３】
ＮＺＦ１〜ＮＺＦ２のスペーシングは５１アミノ酸であり、ＮＺＦ２〜ＮＺＦ３のスペーシングは３６アミノ酸であり、ＮＺＦ１〜ＮＺＦ３のスペーシングは１１６アミノ酸である。
【０１０４】
正確なスペーシングは変更できてもよく、操作者がこれを選択してもよい。例えば、スペーシングは、異なる種において異なるＴｒａｂｉｄオルソログの間で２１〜８５アミノ酸（ＮＺＦ１〜ＮＺＦ２）又は２６〜１１３アミノ酸（ＮＺＦ２〜ＮＺＦ３）の間で変動する。これにもかかわらず、各Ｔｒａｂｉｄオルソログは、２１〜５３アミノ酸という少なくとも１つの短い間隔を（典型的にはＮＺＦ１とＮＺＦ２との間に）有すると思われるため、ＺｎＦ間で２１〜５３アミノ酸という短い間隔が少なくとも１つあることが好ましい。好ましくは、スペーシングのアミノ酸配列は、個別のＺｎＦの間で２１〜１１３アミノ酸長である。
【０１０５】
ＮＺＦの推定上の構造コア残基（Ｎｐｌ４の構造に基づく、Wang et al 2003, JBC vol 278, pp20225-20234、参照により本明細書に組み込まれている)は、
Ｗ７、Ｃ１０、Ｃ１３、Ｎ１７、Ｃ２４、Ｃ２７（ＮＺＦ１）
Ｗ８８、Ｃ９０、Ｃ９３、Ｎ９７、Ｃ１０４、Ｃ１０７（ＮＺＦ２）
Ｗ１５３、Ｃ１５５、Ｃ１５８、Ｎ１６２、Ｃ１６９、Ｃ１７２（ＮＺＦ３）
を含む。これらの任意のものにおける（例えばアラニンへの）点突然変異は、コア構造を破壊することがあり、ユビキチンの結合及び／又はＫ６３の特異性を低減又は除去することがある。したがって、好ましくは本発明のポリペプチドは、対応するＺｎＦ配列にこれらの残基のそれぞれを保持する。
【０１０６】
疎水性界面における推定上のユビキチン結合残基（Ｎｐｌ４  ＮＺＦ−ユビキチン複合体に基づく、Alam et al, 2004）は、
（Ｃ１３）Ｔ１４、Ｙ１５、Ｍ２６（Ｃ２７）（ＮＺＦ１）
（Ｃ９３）Ｔ９４、Ｙ９５、Ｑ１０６（Ｃ１０７）（ＮＺＦ２）
（Ｃ１５８）Ｔ１５９、Ｙ１６０、Ｖ１７１（Ｃ１７２）（ＮＺＦ３）
を含む。ユビキチン結合シグネチャーは、ジンクに配位したＣ２及びＣ４に隣接する上記位置における「Ｔ、Ｙ／Ｆ、脂肪族」であり、ｈＴｒａｂｉｄではこれらの（第２及び第４のジンク配位性Ｃに隣接する）位置における残基はＴ、Ｙ、Ｍ（ＺｎＦ１）、Ｔ、Ｙ、Ｑ（ＺｎＦ２）、及びＴ、Ｙ、Ｖ（ＺｎＦ３）である。これらのうち任意のものにおける点突然変異（例えばＴ  Ｌ、Ｙ  Ｖ）は、ユビキチンの結合（及び／又はＫ６３の特異性）を低減又は除去しうるが、その構造を破壊する見込みはない。したがって、好ましくは本発明のポリペプチドは、対応するＺｎＦ配列にユビキチン結合シグネチャーを保持し、好ましくは本発明のポリペプチドは、対応するＺｎＦ配列にこれらの残基のそれぞれを保持する。
【０１０７】
所望の部分
タグ及び／又は標的配列などの所望の部分は、任意の適切な方法で本発明のポリペプチドに結合されることがある。適切には、それらは、本発明のポリペプチドに所望の要素を組み込んだポリペプチド（いわゆる「融合タンパク質」）の組換え産生により結合されることがある。この実施形態では、適切には、結合はＣ末端又はＮ末端に対し、好ましくはＣ末端に対する。
【０１０８】
Ｋ６３選択性又はＫ６３特異性
Ｋ６３特異性についてのアッセイを、実施例の項に提示する（特に図９Ａを参照し、その図における方法の項に説明）。
【０１０９】
Ｋ６３結合のユビキチン鎖に関するＫｄは、モノユビキチンに関する親和性（これは、モノユビキチンに関して約１００〜４００μＭと予想される、上記参照）よりも高いと予想される。
【０１１０】
Ｋ４８結合に比べてＫ６３結合のユビキチン鎖に関する優先性は、１０〜１００×と推定される。
【０１１１】
さらなる適用
Ｋ６３結合の試薬は、医学的使用及び／又は工業的使用においてＫ６３結合のユビキチンに部分をターゲティングするために有用である。
【０１１２】
例えば、本発明は、Ｋ６３ユビキチン鎖の細胞ホメオスタシスにおける変化を強制することに適用を見出す。Ｋ６３鎖依存性細胞生理に影響を及ぼすために、Ｋ６３結合特異性を採用して、Ｋ６３ユビキチン鎖の近傍にエフェクター実体をターゲティングすることができる。エフェクター実体は、例えばユビキチン鎖及び／若しくは基質タンパク質を切断若しくは分解するためのプロテアーゼドメイン、ユビキチン鎖及び／若しくは基質タンパク質を分解するためのＥ３ユビキチンリガーゼ、又はＫ６３ユビキチン鎖にターゲティングするために望ましい任意の他の部分を含むことがある。
【０１１３】
タグ化／ラベル化の実施形態について、本発明は、例えば以下の研究における遊離形態の、又は基質タンパク質に結合したＫ６３ユビキチン鎖の検出に適用することができる。
−  Ｋ６３ユビキチン鎖（及び／又は基質タンパク質）の細胞内検出
−  Ｋ６３ユビキチン鎖（及び／又は基質タンパク質）の生化学的濃縮。
【０１１４】
タグ／ラベルは、エピトープマーカー若しくはフルオル（fluor）若しくは酵素活性若しくは同位体、又は例えば化学ラベル（例えば、標準的な化学カップリングを用いたラベルの共有結合）、遺伝子ラベル（例えば、融合タンパク質又はタンパク質スプライス産物）を含む任意の他の適切な検出可能部分などの、当技術分野において公知の任意の適切なタグ又はラベルでありうる。
【０１１５】
さらなる機能的部分には、親和性ハンドル（affinity handle）（例えば単一又は複数の抗体タグ、タンデムタグなどのタンパク質親和性タグ、ストレプトアビジンタグ）、蛍光タグ（例えばＦＩＡｓＨタグ、ＦＩＴＣ又はＰＥなどの標準的な蛍光ラベル、量子ドット、ＧＦＰ又は他の蛍光タンパク質）、酵素タグ（例えばＨＲＰ）、Ｋ６３鎖関連タンパク質をターゲティングすることにより細胞生理を変化させるタグ（例えばＫ６３ユビキチン鎖の基質タンパク質を分解する可能性を有するプロテアーゼ又はＥ３ユビキチンリガーゼ）などのタグ又はラベルが挙げられる。
【０１１６】
ＴｒａｂｉｄのＫ６３結合領域の突然変異を作製することができる。このような突然変異には、１つ若しくは複数のＺｎフィンガーの突然変異、又はＣ１５５Ａ突然変異体、又はＫ６３結合活性に影響する他の突然変異が挙げられる。
【０１１７】
Ｗｎｔ／ＡＰＣ
用語「Ｗｎｔ経路活性」及び「ＴＣＦ転写活性」は、本明細書において相互交換可能に使用される。
【０１１８】
本発明が基づく研究は、強いショウジョウバエＡＰＣ突然変異に関係し、この突然変異は、そのＷｎｔシグナル伝達及び接着機能の両方を妨害する。このミスセンス突然変異は、従来技術ではＡＰＣにおける機能があまり理解されていない推定上のタンパク質相互作用ドメインである、ＡＰＣの最も保存されたドメイン（アルマジロリピートドメイン（ＡＲＤ）と呼ばれる）に影響を及ぼす。本発明者らは、生物学的機能が以前に知られていなかった保存されたタンパク質（Ｔｒａｂｉｄ）を同定した。本発明者らは、このタンパク質が突然変異ＡＲＤではなく野生型ＡＲＤに結合することを開示した。Ｔｒａｂｉｄは、脱ユビキチン化活性を有する核−細胞質タンパク質である。本発明者らの証拠は、Ｔｒａｂｉｄが結腸直腸癌細胞におけるＷｎｔシグナル伝達活性の一因であることを示している。
【０１１９】
本発明者らは、哺乳動物細胞及びショウジョウバエにおけるＴｒａｂｉｄの機能を開示し、それがＡＰＣの調節因子又はエフェクターとして作用するかどうかを検討する。Ｗｎｔシグナル伝達及び／又は細胞接着に果たすＴｒａｂｉｄの役割を調べることができ、並びに本発明により結腸直腸癌細胞においてそれらの機能的関連性が試験される。これは、好都合にはＡＰＣの分子機能及び結腸直腸癌とのそれらの関連性の理解を高め、このよくみられる疾患の診断、治療、及び／又は予防のための新しい達成方法を提供する。
【０１２０】
したがって本発明は、結腸直腸癌細胞を含む様々なヒト細胞系においてＲＮＡ干渉によるＴｒａｂｉｄ枯渇の結果としてのユビキチン化された候補タンパク質の出現を調べることによって、Ｗｎｔシグナル伝達経路の中のＴｒａｂｉｄの分子標的を同定することに関する。
【０１２１】
別の態様では、本発明は、Ｗｎｔ標的遺伝子の発現及び結腸直腸癌細胞の増殖へのＴｒａｂｉｄの必要性を試験するための機能喪失アプローチの使用、並びにショウジョウバエ及びアフリカツメガエル（Xenopus）を含む様々なモデル系を開発するときにそれがＷｎｔシグナル伝達に果たす役割の調査に関する。
【０１２２】
本発明は、好都合にはＷｎｔ標的遺伝子、特に図１０Ｂ、Ｃに示される遺伝子に適用される。
【０１２３】
アッセイ
本発明によるアッセイは、本明細書の特に実施例及び添付の図面に記載される
【０１２４】
本発明のアッセイの変形は、例えばβ−カテニンとＢＣＬ９との間の結合についてのプレートベースアッセイの開発を参照して容易に作ることができる（図１参照）。
【０１２５】
好ましくは本発明のアッセイは、Ｔｒａｂｉｄの阻害剤を同定するためのアッセイである。
【０１２６】
医薬組成物
本発明は、治療有効量のＴｒａｂｉｄ又は本発明のＴｒａｂｉｄ阻害剤、及び薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤（その組み合わせを含む）を含む医薬組成物も提供する。
【０１２７】
医薬組成物は、ヒト医学及び獣医学においてヒト又は動物に使用するためであってもよく、典型的には任意の１つ又は複数の薬学的に許容される希釈剤、担体、又は賦形剤を含むものである。治療に使用するための許容される担体又は希釈剤は、薬学の技術分野において十分に公知であり、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.（A. R. Gennaro edit. 1985）に記載されている。薬学的担体、賦形剤、又は希釈剤の選択は、意図される投与経路及び標準的な薬学的常法を考慮して選択することができる。医薬組成物は、担体、賦形剤、若しくは希釈剤として、又はそれに加えて、任意の適切な結合剤、滑沢剤、懸濁化剤、コーティング剤、可溶化剤を含むことがある。
【０１２８】
保存料、安定化剤、色素、及び着香料でさえも、医薬組成物に提供することができる。保存料の例には、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、及びｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルが挙げられる。抗酸化剤及び懸濁化剤も使用することができる。
【０１２９】
異なる送達系に応じて、異なる組成物／製剤の必要条件がありうる。例として、本発明の医薬組成物は、ミニポンプを使用して、又は粘膜経路により、例えば点鼻スプレー若しくは吸入用エーロゾルとして、又は経口摂取可能な液剤として、又は非経口的（例えば静脈内、筋肉内、若しくは皮下経路により送達するための注射用剤形に組成物が製剤される）に投与するために製剤することができる。あるいは、この製剤をいくつかの経路により投与するように設計することができる。
【０１３０】
薬剤を消化管粘膜を介して粘膜投与しようとする場合に、この製剤は、消化管を通過するときに安定を維持することができるべきであり、例えば、この製剤は、タンパク質分解に抵抗性で、酸性ｐＨで安定で、かつ胆汁の界面活性効果に抵抗性であるべきである。
【０１３１】
適切な場合には、医薬組成物は、吸入により、坐剤又はペッサリーの形態で、ローション、液剤、クリーム剤、軟膏、若しくは散布剤の形態で局所的に、皮膚用パッチの使用により、デンプン若しくはラクトースなどの賦形剤を含有する錠剤又は単独若しくは賦形剤と混合したカプセル剤若しくは卵形剤（ovule）の形態で、或いは着香料若しくは着色料を含有するエリキシル剤、液剤、若しくは懸濁剤の形態で投与することができるし、それらは、例えば静脈内、筋肉内、又は皮下に非経口的に注射することができる。非経口投与のために、この組成物は、他の物質、例えば溶液を血液と等張にするために十分な塩又は単糖を含有しうる滅菌水溶液の形態で最良に使用することができる。口腔又は舌下投与のために、この組成物は従来方法で製剤することができる錠剤又はトローチ剤の形態で投与することができる。
【０１３２】
いくつかの実施形態について、本発明のＴｒａｂｉｄ又はＴｒａｂｉｄ阻害剤は、シグロデキストリンと組み合わせても使用することができる。シクロデキストリンは、薬物分子と包接複合体及び非包接複合体を形成することが知られている。薬物−シクロデキストリン複合体の形成は、薬物分子の溶解度、解離速度、バイオアベイラビリティー、及び／又は安定性という性質を改変することがある。薬物−シクロデキストリン複合体は、全般的に大部分の剤形及び投与経路に有用である。薬物との直接的複合体形成の代替として、シクロデキストリンは、補助添加剤、例えば担体、希釈剤、又は可溶化剤として使用することができる。α−、β−、及びγ−シクロデキストリンは通常使用され、適切な例は、国際公開第９１／１１１７２号パンフレット、第９４／０２５１８号パンフレット、及び第９８／５５１４８号パンフレットに記載されている。
【０１３３】
Ｔｒａｂｉｄを使用する場合又はＴｒａｂｉｄ阻害剤がタンパク質を含む場合には、前記タンパク質は、治療される対象のインサイチュ（in situ）調整することができる。これに関して、前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、前記タンパク質が前記ヌクレオチド配列から発現される非ウイルス技法（例えばリポソームの使用により）及び／又はウイルス技法の使用により（例えばレトロウイルスベクターの使用により）送達することができる。
【０１３４】
好ましい実施形態では、本発明の医薬は、局所投与される。したがって、好ましくはこの医薬は局所送達に適する形態である。
【０１３５】
投与
用語「投与される」には、ウイルス技法又は非ウイルス技法による送達が含まれる。ウイルス送達メカニズムには、非限定的に、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ，adeno-associated viral）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、及びバキュロウイルスベクターが挙げられる。非ウイルス送達メカニズムには、脂質介在性トランスフェクション、リポソーム、イムノリポソーム、リポフェクチン、カチオン表面両親媒性物質（ＣＦＡ，cationic facial amphiphile）、及びその組み合わせが含まれる。
【０１３６】
本発明の構成要素は、単独で投与できるが、例えば構成要素が、意図される投与経路及び標準的な薬学的常法を考慮して選択される適切な薬学的賦形剤、希釈剤、又は担体と混合されている場合に、広くは医薬組成物として投与される。
【０１３７】
例えば、構成要素は、錠剤、カプセル剤、卵形剤、エリキシル剤、液剤、又は懸濁剤の形態で（例えば経口又は局所的に）投与することができ、この形態は、即時、遅延、改変、持続、パルス、又は制御放出への適用のために着香料又は着色料を含有することがある。
【０１３８】
医薬が錠剤ならば、この錠剤は微結晶セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、及びグリシンなどの賦形剤、デンプン（好ましくはトウモロコシデンプン、バレイショデンプン、又はタピオカデンプン）、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、及びある種の複合ケイ酸塩などの崩壊剤、並びにポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ，hydroxypropylmethylcellulose）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ，hydroxypropylcellulose）、スクロース、ゼラチン、及びアラビアゴムなどの造粒結合剤を含有することがある。追加的に、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル、及びタルクなどの滑沢剤ｆ含まれることがある。
【０１３９】
類似の種類の固体組成物は、ゼラチンカプセル中の増量剤としても採用することができる。これに関連する好ましい賦形剤には、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖、又は高分子量ポリエチレングリコールが挙げられる。水性懸濁剤及び／又はエリキシル剤については、この薬剤は、様々な甘味料、着香料、着色料又は色素と、乳化剤及び／又は懸濁化剤と、並びに水、エタノール、プロピレングリコール、及びグリセリン、並びにその組み合わせなどの希釈剤と組み合わせることができる。
【０１４０】
投与（送達）経路には、非限定的に以下のうち１つ又は複数が挙げられる。経口（例えば錠剤、カプセル剤、又は経口摂取可能な液剤として）、局所、粘膜（例えば点鼻スプレー又は吸入用エーロゾルとして）、経鼻、非経口（例えば注射用剤形により）、消化管、脊髄内、腹腔内、筋肉内、静脈内、子宮内、眼内、皮内、頭蓋内、気管内、膣内、脳室内、脳内、皮下、眼（硝子体内又は前房内を含む）、経皮、直腸、口腔、膣、硬膜外、舌下。
【０１４１】
好ましい態様では、医薬組成物は局所送達される。
【０１４２】
医薬の全構成要素を必ずしも同経路で投与する必要はないことを了解されたい。同様に、組成物が１つを超える活性構成要素を含む場合、それらの構成要素を異なる経路で投与してもよい。
【０１４３】
本発明の構成要素が非経口投与される場合、そのような投与の例には、構成要素を静脈内、動脈内、腹腔内、髄腔内、心室内、尿道内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内、若しくは皮下投与すること、及び／又は点滴技法を使用することによるもののうち一つ又は複数が挙げられる。
【０１４４】
非経口投与のために、この構成要素は、滅菌水性液剤の形態で最良に使用され、これは、他の物質、例えばその液剤を血液と等張にするために十分な塩類又はグルコースを含有しうる。この水性液剤は、必要に応じて適切に（好ましくは３〜９のｐＨに）緩衝化すべきである。滅菌条件での適切な非経口製剤の調製は、当業者に十分に公知の標準的な薬学的技法により容易に達成される。
【０１４５】
表示したように、本発明の構成要素は、鼻腔内に、又は吸入により投与することができ、乾燥粉末インヘラーの形態で、又は加圧した容器、ポンプ、スプレー若しくはネブライザーからのエーロゾルスプレー提示の形態で好都合に送達され、このとき、適切な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、ヒドロフルオロアルカン（１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ  １３４Ａ（商標））又は１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ  ２２７ＥＡ（商標））など）、二酸化炭素、又は他の適切な気体を用いる。加圧エーロゾルの場合に、投薬単位は、定量を送達するバルブを備えることにより決定することができる。加圧容器、ポンプ、スプレー、又はネブライザーは、例えばエタノールと噴射剤との混合物を溶媒として使用した、活性化合物の溶液又は懸濁液を中に含むことがあり、その溶媒は、追加的に滑沢剤、例えばトリオレイン酸ソルビタンを含有することがある。インヘラー又は吹入器に使用するためのカプセル及びカートリッジ（例えばゼラチン製）は、薬剤の粉末混合物と、ラクトース又はデンプンなどの適切な粉末基剤とを中に含むように製剤することができる。
【０１４６】
好ましくは、本発明の構成要素は、坐剤又はペッサリーの形態で投与することもできるし、ゲル、ヒドロゲル、ローション剤、液剤、クリーム剤、軟膏、又は散布剤の形態で局所適用することもできる。本発明の構成要素は、例えば皮膚パッチの使用により皮膚投与又は経皮投与することもできる。これらは、肺経路又は直腸経路によっても投与することができる。これらは、眼経路によっても投与することができる。眼科使用のために、この化合物は、等張で、ｐＨを調整した滅菌食塩水中の微粒子化懸濁剤として、又は好ましくは等張で、ｐＨを調整した滅菌食塩水中の液剤として、所望により塩化ベンジルアルコニウム（benzylalkonium chloride）などの保存料と組み合わせて製剤することができる。あるいは、これらは、ワセリンなどの軟膏に入れて製剤することができる。
【０１４７】
皮膚に局所適用するために、本発明の構成要素は、例えば以下、すなわち鉱物油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ろう、及び水のうち１つ又は複数との混合物中に懸濁又は溶解した活性化合物を含有する適切な軟膏として製剤することができる。あるいは、これは、例えば以下、すなわち鉱物油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリエチレングリコール、流動パラフィン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、及び水のうち１つ又は複数の混合物に懸濁又は溶解した適切なローション剤又はクリーム剤として製剤することができる。
【０１４８】
医薬配合剤
本発明のＴｒａｂｉｄ又はＴｒａｂｉｄ阻害剤は、１つ又は複数の他の医薬活性物質と共に投与することができる。例として、本発明は、本発明による薬剤と、１つ又は複数のステロイド、鎮痛薬、抗ウイルス剤、又は他の医薬活性物質とを用いた同時又は連続治療を包含する。
【０１４９】
これらの治療様式には、物質を連続して、同時に、又は一緒に投与することが含まれることが了解されている。
【０１５０】
用量レベル
典型的には、医師は、個別の対象に最も適する実際の投薬を決定するものである。任意の特定の患者についての特異的用量レベル及び投薬回数は変動することがあり、採用した特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性及び作用時間、年齢、体重、全身の健康状態、性別、食事、投与様式及び投与時間、排泄速度、薬物の配合、特定の状態の重症度、並びに個別に受けている治療を含む様々な要因に依存するものである。
【０１５１】
必要性に応じて、この薬剤は、０．０１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇなど、さらに好ましくは０．１〜１ｍｇ／ｋｇ体重などの用量で投与することができる。
【０１５２】
製剤
本発明の化合物は、当技術分野に公知の技法を使用して１つ又は複数の適切な担体、希釈剤、又は賦形剤と混合することなどによって医薬組成物に製剤することができる。
【０１５３】
治療
本明細書における治療についての全ての参照には、治癒的治療、緩和的治療、及び予防的治療のうち１つ又は複数が含まれることを認識されたい。好ましくは、治療という用語には、少なくとも治癒的治療及び／又は予防的治療が含まれる。治療は、本明細書に言及される１つ若しくは複数の障害又は関連する病訴の治療でありうる。
【０１５４】
さらなる適用
本発明は、Ｗｎｔシグナル伝達経路の欠損に関連する癌に適用を見出す。
【０１５５】
本発明は、肝細胞癌（ＨＣＣ，hepatocellular carcinoma）、ウィルムス腫よう（ＷＴ，Wilm's Tumour）、デスモイド、髄芽腫、及び未分化甲状腺癌などの甲状腺癌に適用を見出すことがある。
【０１５６】
本発明は、子宮内膜卵巣腫瘍、デニス−ドラッシュ症候群、黒色腫、及び前立腺癌に適用を見出すことがある。
【０１５７】
好ましくは、本発明は、ＴＣＦ／ＬＥＦ転写亢進に関連した任意の障害に適用を見出す。
【０１５８】
好ましくは、本発明は、β−カテニンの安定化及び／又は活性化に関連する任意の障害に用途を見出す。
【０１５９】
好ましくは、医学的適応は、Ｔｒａｂｉｄ阻害剤及び／又はＴｒａｂｉｄ活性の低減のための適応である。アッセイの実施形態の状況でのＴｒａｂｉｄ活性の低減は、典型的にはそのアッセイの他の構成要素、例えば阻害剤の候補により低減したＴｒａｂｉｄポリペプチドの生化学活性を表す。しかし、細胞又は生物の操作の状況でのＴｒａｂｉｄの活性低減は、加えてＴｒａｂｉｄの発現低減、Ｔｒａｂｉｄの分解増加、Ｔｒａｂｉｄの除去若しくは隔離の増加、又はＴｒａｂｉｄの存在若しくは量／濃度を低減することによりＴｒａｂｉｄ活性を低減する他の手段などの、Ｔｒａｂｉｄレベルの低減に関係することがある。
【０１６０】
当技術分野において、Ｗｎｔ経路におけるユビキチン化の唯一公知の役割は、タンパク質のターンオーバーに結びついたユビキチン化、特にβ−カテニンのユビキチン化であった。本明細書において、哺乳動物細胞のＷｎｔ応答が、Ｋ６３結合のユビキチンを優先するユビキチン結合及び脱ユビキチン化酵素であるＴｒａｂｉｄに依存しているという本発明者らの発見に基づき、本発明者らは、この経路におけるユビキチンの第２の別個の経路を報告する。本発明者らは、Ｔｒａｂｉｄのこれらの活性がＷｎｔを刺激されたヒト細胞系における効率的なＴＣＦ依存的転写に必要とされることを示すために、ＲＮＡｉ介在性枯渇を使用した。さらに、ショウジョウバエｔｒａｂｉｄをターゲティングした欠失は、異所性Ｗｉｎｇｌｅｓｓに対応したＴｒａｂｉｄの役割を明らかにしたが、これは、ＴｒａｂｉｄがＷｎｔ経路の保存された正の調節因子であることを示唆している。最終的に、本発明者らは、哺乳動物細胞におけるＮＦ−κＢシグナル伝達並びにショウジョウバエにおけるＥＧＦ受容体及びＮｏｔｃｈシグナル伝達を含む他のシグナル伝達経路も調べたが、これらにＴｒａｂｉｄ喪失の効果は見出されず、これは、Ｔｒａｂｉｄがシグナル伝達に広範囲には影響しないことを示唆している。
【０１６１】
本発明者らは、Ｔｒａｂｉｄが、インビトロ及びインビボでＫ６３結合のユビキチンを切断することができる真のＤＵＢであることを示す。この活性はそのＯＴＵドメインにあり、このドメインは内因性ＤＵＢ活性を有する。Ｔｒａｂｉｄオルソログは、別の状況では不変なアスパラギン酸が保存的にアミノ酸置換されているため、Ｔｒａｂｉｄオルソログのこの変異体ＯＴＵドメインが触媒活性であることは驚くべきである。本発明者らは、ＯＴＵドメインにＣｙｓ４４３及びＨｉｓ６２８を含む触媒性ダイアド（dyad）がＴｒａｂｉｄのＤＵＢ活性に重要であることを開示する。
【０１６２】
ＴｒａｂｉｄのインビボＤＵＢ活性は、ＴｒａｂｉｄのＮ末端ＮＺＦモチーフにより付与される、Ｋ６３結合のユビキチンへの結合性に追加的に依存することは興味深い。これらのモチーフは、Ｋ４８結合に比べてＫ６３結合のユビキチンへの結合に前例のない程度の優先性を表す。本発明者らは、これらのＮＺＦモチーフが、ＴＣＦ介在性転写に果たすＴｒａｂｉｄの機能に必要であるが、そのインビトロ内因性ＤＵＢ活性には必要ないため、これらのモチーフはインビボで補助的機能を有するおそれがあることを示す。ＴｒａｂｉｄのＮＺＦモチーフは、結合したＯＴＵドメインのＤＵＢ活性に関する基質として効率的にユビキチン化タンパク質に結合し、このタンパク質を動員するように働くことができる。
【０１６３】
Ｔｒａｂｉｄは、ＴＣＦ標的遺伝子のＷｎｔ介在性転写の正の調節因子である。Ｔｒａｂｉｄは、Ｗｎｔを刺激された細胞におけるＴＣＦ依存性転写に必要とされるが、β−カテニンの安定化には必要ない。これを支持するように、ＨＣＴ−１１６結腸直腸癌細胞（β−カテニンの活性化突然変異を有する）のＴＣＦ介在性転写はＴｒａｂｉｄに依存する。β−カテニンは、ユビキチン修飾されたＷｎｔエフェクターであることが唯一明確に確立されているが、明らかに、β−カテニンは、ＴｒａｂｉｄのＤＵＢ活性に関する直接的な標的ではない。これは、ＴｒａｂｉｄがＫ４８結合よりもＫ６３結合のユビキチンを優先することに完全に一致し、このことは、プロテアソーム分解にＴｒａｂｉｄが直接機能することに異論を唱えるものである。
【０１６４】
本発明者らは、Ｔｒａｂｉｄが、ＴＡＤ（ウイルスタンパク質ＶＰ１６由来のＴＡＤ又はβ−カテニンのＣ末端のいずれか）に直接融合したＬＥＦ１構築物の転写活性に不要であり、様々な転写補因子を動員することを示す。したがって、Ｔｒａｂｉｄは、Ｗｎｔシグナル伝達の際にＴＣＦ標的遺伝子でのＴＣＦ−β−カテニン複合体への共活性化因子の動員を制御する。
【０１６５】
Ｔｒａｂｉｄ枯渇細胞で観察されたβ−カテニン、ＴＣＦ３、及びＴＣＦ４の核レベルの小さいが一貫した低減は、これらのタンパク質の核保持にＴｒａｂｉｄが果たす役割を反映しているおそれがある。しかし、ＴＣＦ４及びβ−カテニンを再発現させても、これらの細胞のＴｒａｂｉｄ要求性は克服されない。
【０１６６】
本発明者らは、Ｗｎｔ経路活性がＡＰＣの突然変異性不活性化又はβ−カテニンの活性化が原因で活性亢進している結腸直腸癌細胞における効率的なＴＣＦ介在性転写にもＴｒａｂｉｄが必要とされることを示した。これは、活性化β−カテニンの下にＴｒａｂｉｄの機能を置く本発明者らのエピスタシス分析と完全に一致する。興味深いことに、本発明者らは、過剰発現したＴｒａｂｉｄがＳＷ４８０細胞の核に蓄積したことを見出したが、これは、その核での存在の高まりと、転写に果たすその機能との間の結びつきを示唆している。
【０１６７】
本発明者らの結果は、結腸直腸癌細胞における阻害薬に関する分子標的としてＴｒａｂｉｄを関係づけている。長所には、第１に、ＴｒａｂｉｄがＷｎｔ経路に作用するが、他のシグナル伝達経路及び転写に広い効果を及ぼさないことが挙げられる。第２に、ＴｒａｂｉｄのＤＵＢ活性は、ＴｒａｂｉｄがＴＣＦ介在性転写に果たす機能に重要であり、プロテアーゼは、特異的阻害剤についての魅力的な標的である。第３に、Ｔｒａｂｉｄがシステインプロテアーゼに通常見出される触媒性Ａｓｐ  Ｃｙｓ  Ｈｉｓトリアドに保存されたＤ→Ａ置換を有すると仮定すると、Ｔｒａｂｉｄは独特の触媒ポケットを有すると思われるため、他の経路で機能する他のＯＴＵドメインを含む他のプロテアーゼのポケットよりもこのポケットへの結合を優先する特異的阻害剤が潜在的に存在する。
【０１６８】
本発明者らは、Ｔｒａｂｉｄの枯渇がヒト胎児腎臓細胞におけるＴＣＦ３及びＴＣＦ４レベルの低減を伴うことを見出した。顕著には、ＴＣＦ３は、Ｗｎｔシグナル伝達の不在下でさえも皮膚幹細胞を未分化状態に維持することに役割を果たし、ＴＣＦ４は、腸上皮における幹細胞区画の維持に必要とされる。これらの区画に高レベルのＴｒａｂｉｄがあり、転写におけるＴＣＦ−β−カテニン複合体の活性促進にＴｒａｂｉｄが役割を果たしていると仮定すると、Ｔｒａｂｉｄは幹細胞の再生及び／又は分化に適用を有しうる。
［実施例］
【実施例１】
【０１６９】
Ｗｎｔシグナル伝達及び細胞接着にＡＰＣのＡＲＤが果たす機能を仲介するタンパク質の同定
Ｅ−ＡＰＣのＡＲＤは、アドヘレンスジャンクションとの関連及びＷｎｔシグナル伝達に果たすその機能に、特にインビボでそれがアキシンと複合体を形成する能力に重要である（とはいえ、ＡＰＣタンパク質のアキシン結合モチーフがＡＲＤの外側であることに留意）。実際に、これらの機能は、単一のミスセンス突然変異Ｎ１７５→Ｋ（ＡＰＣにおけるＮ５０７に対応）により打ち消され、この突然変異は、構造的考察に基づきＡＲＤからそのリガンドへの結合に影響を及ぼすと予想される。
【０１７０】
Ｗｎｔシグナル伝達及び細胞接着に果たすＡＰＣのＡＲＤの機能を仲介するタンパク質を同定するために、ベイトとしてＡＰＣの野生型ＡＲＤドメインを用いてマウス胚ライブラリーの酵母２ハイブリッドスクリーニングを行い、Ｎ５０７→Ｋ突然変異体ドメインを有する単離物をカウンタースクリーニングした。これは、Ｔｒａｂｉｄと呼ばれるタンパク質の同定につながった。
【０１７１】
続いて、突然変異体に比べた野生型ＡＲＤに対するＴｒａｂｉｄの結合特異性を免疫共沈によりインビボで確認した。
【実施例２】
【０１７２】
Ｗｎｔシグナル伝達に果たすＴｒａｂｉｄの機能
Ｔｒａｂｉｄが脱ユビキチン化酵素（「ＤＵＢ」酵素）であることを実証する。Ｔｒａｂｉｄが哺乳動物細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を促進することをさらに示す。
【０１７３】
ＲＮＡｉによる枯渇に基づく機能喪失分析から、（Ｃｅｚａｎｎｅではなく）ＴｒａｂｉｄがＡＰＣ又はβ−アクテニン（actenin）に関する結腸直腸癌突然変異体での効率的なＴＣＦ介在性転写に必要とされることが明らかとなった。
【０１７４】
同じアプローチに基づくエピスタシス分析は、Ｔｒａｂｉｄを活性化β−カテニンの下に置いた。重要なことには、Ｔｒａｂｉｄの枯渇はＮＦκＢ介在性転写に影響しないため、ＴＣＦ介在性転写に及ぼすＴｒａｂｉｄの効果は特異的であると思われる。
【０１７５】
ＴｒａｂｉｄのＯＴＵドメインは、インビボ及びインビトロでＤＵＢ活性を有し、ＴｒａｂｉｄのＮＺＦ領域は、Ｋ６３結合の鎖を優先してユビキチン鎖に結合する。まとめると、この証拠から、脱ユビキチン化ステップが効率的なＴＣＦ介在性転写に重要であると示唆される。ＴＣＦ標的遺伝子でのユビキチンのターンオーバーは、Ｗｎｔシグナル伝達の際のそれらの遺伝子の転写持続に必要でありうる。さらに、Ｔｒａｂｉｄを阻害薬の標的としても同定し、これを達成するための方法を提供する（下記実施例参照）。
【実施例３】
【０１７６】
生化学的及び生物学的特徴づけ
Ｔｒａｂｉｄを本発明により生化学的に特徴づけた。これにより、上に注記したＴｒａｂｉｄの機能の要素が確認され、アッセイのさらなる開発及び本発明の適用が可能になった。
【０１７７】
図３に、Ｔｒａｂｉｄの機能を確立する一連の生化学的結果を示す。特に、図３（ａ）及び（ｂ）は、Ｔｒａｂｉｄにより仲介される転写効果を示す。さらに、Ｔｒａｂｉｄの阻害がＴＣＦ介在性転写を減少させることを示す。
【０１７８】
具体的には、Ｔｒａｂｉｄの枯渇は、異なるＴｒａｂｉｄ阻害剤により仲介される。この実施例では、使用される２つのＴｒａｂｉｄ阻害剤は、Ｔｒａｂｉｄに対するｓｉＲＮＡである。この２つのｓｉＲＮＡ配列は、AGA GGT GTC TCA ACA AGC A（番号１）及びAGA GGC TTC TTC AAT AAT A（番号２）である。
【０１７９】
これらの阻害剤は、それぞれ２９３Ｔ細胞（図３ａ）において、並びに結腸直腸癌細胞系ＨＣＴ−１１６及びＳＷ−４８０（図３ｂ）においてＤｖｌに刺激されるＴＣＦ転写を低減する。
【０１８０】
２９３Ｔ細胞におけるエピスタシス実験は、転写調節に果たすＴｒａｂｉｄに関する機能を明らかにする。
【０１８１】
３つのＮＺＦフィンガーを含有するＴｒａｂｉｄのＮ末端が、ＧＳＴ−プルダウンアッセイにおいてＫ６３ユビキチンに優先的に結合することを実証する（図３ｄ）。
【０１８２】
さらに、Ｔｒａｂｉｄのデユビキチラーゼ活性を実験的に実証し、この活性がＴｒａｂｉｄのＣ末端に関連することをさらに実証する。したがって、Ｃ末端は、ＯＴＵ脱ユビキチン化ドメインをもち、Ｔｒａｂｉｄのこの活性は、インビトロでＫ６３ユビキチン鎖を優先的に切断する（図３ｅ参照）。
【０１８３】
したがって、Ｔｒａｂｉｄがヒト細胞におけるＷｎｔシグナル伝達に影響しているデユビキチラーゼであり、本発明の主要な疾患徴候（すなわち結腸直腸癌）由来の細胞系においてもそうであることが示される。
【実施例４】
【０１８４】
Ｗｎｔシグナル伝達におけるＴｒａｂｉｄの分子標的
Ｔｒａｂｉｄ及びＷｎｔシグナル伝達と結腸直腸癌との間の機能的関係のさらなる証拠が生まれる。
【０１８５】
本発明により、Ｗｎｔシグナル伝達の際に生理学的に関連するＴｒａｂｉｄ基質であるタンパク質を同定できるようになる。本発明者らの目下の証拠は、これらが活性化β−カテニン（とはいえ活性化β−カテニンはリン酸化されているため、もはやユビキチン化についての基質ではないことに留意）、Ｐｙｇｏｐｕｓ若しくはＬｇｓ／ＢＣＬ９、又はβ−カテニンにより動員される任意の他の共活性化因子などの核タンパク質であることを示す。Ｔｒａｂｉｄはまた、β−カテニンの転写活性にあまり直接的にではなく、例えばβ−カテニンの核搬出を促進することが最近示されたＲａｎＢＰ３を阻害することによって影響するおそれがある。
【０１８６】
これらのタンパク質に対する抗体（Sierra, J., Yoshida, T., Joazeiro, C. A. & Jones, K. A. Genes Dev 20, 586-600 (2006); Hendriksen, J. et al.  J Cell Biol 171, 785-97 (2005)）及びウエスタンブロットを使用して、樹立したヒト結腸直腸癌細胞系において（例えばＳＷ４８０細胞及びＨＣＴ１１６細胞において）又はＷｎｔを刺激された２９３Ｔ細胞においてＲＮＡｉが介在するＴｒａｂｉｄ枯渇後のＴｒａｂｉｄ依存性ユビキチン化形態の出現をチェックする。
【０１８７】
ユビキチン化は、ユビキチンに対する（又は過剰発現したタグ付きユビキチンに対する）抗体を用いた同時ブロッティングにより確認する。Ｔｒａｂｉｄの枯渇後に出現すると予想される短寿命ユビキチン化種を検出する機会を最大にするために、細胞をプロテアソーム阻害剤（例えばＭＧ１３２）で処理後に、これらの実験を好都合に実施する。
【０１８８】
これらの実験は、ＴＣＦ介在性転写の際のＤＵＢステップの性質に見通しを与え、それがＷｎｔシグナル伝達に影響を与えるメカニズムのさらなる詳細を明らかにすることができる。
【実施例５】
【０１８９】
Ｔｒａｂｉｄの機能分析
この実施例において、本発明者らは、ＴｒａｂｉｄのＲＮＡｉ介在性枯渇後に（前の実施例参照）、ＳＷ４８０及びＨＣＴ１１６結腸直腸癌細胞（それぞれＡＰＣ又はβ−カテニンについての突然変異体）において、又はＷｎｔを刺激された２９３Ｔ細胞においてアップレギュレーション（例えばｃ−ｍｙｃ、ＣＤ４４）又はダウンレギュレーション（例えばＨａｔｈ１）される内因性Ｗｎｔ標的遺伝子の発現を調べることによって、Ｔｒａｂｉｄの機能喪失に本発明者らの研究を広げる。
【０１９０】
特に、これらの条件での細胞の増殖速度を調べる。これらの実験から信頼できる結果を得るために、誘導可能なヘアピン構築物を有する安定系を作製することが有益でありうる（van de Wetering, M. et al. EMBO Rep 4, 609-15 (2003)）。
【０１９１】
相同組換えによりショウジョウバエＴｒａｂｉｄの欠失を作製した。これは、このタンパク質がショウジョウバエの発生時のＴＣＦ介在性転写に影響するかどうかを調べるために有用である。このＴｒａｂｉｄ突然変異体の分析は、核Ｗｎｔシグナル伝達構成要素であるＰｙｇｏｐｕｓ及びＬｅｇｌｅｓｓ／ＢＣＬ９について記載されたように行い、これらの機能は、発生時の、及び結腸直腸癌細胞におけるＡｒｍａｄｉｌｌｏ／β−カテニンの転写活性に必要とされる（Thompson B, Townsley FM, Rosin-Arbesfeld R, Musisi H & Bienz M. Nat Cell Biol 4, 367-373 (2002); Kramps, T. et al.  Cell 109, 47-60. (2002)参照）。
【０１９２】
モルフォリノ技法によるアフリカツメガエルＴｒａｂｉｄの枯渇がＷｎｔ様表現型を引き起こすかどうか、及びこれが胚発生時の任意のＴＣＦ介在性転写事象に影響を及ぼすかどうかを調べる（Liu, F., van den Broek, O., Destree, O. & Hoppler, S.  Development 132, 5375-85 (2005)）。
【０１９３】
理論に縛られることを望むわけではないが、これらの実験は、発生時のＷｎｔシグナル伝達に果たすＴｒａｂｉｄの役割を示すことができる。腸上皮におけるマウスＴｒａｂｉｄの条件付きノックアウトを作製して正常な発生時のこの組織及び腸腫瘍に果たすＴｒａｂｉｄの機能を調べることによって、このことをさらに解明することができる（Sansom, O. J. et al. Genes Dev 18, 1385-90 (2004)）。この組織におけるＴｒａｂｉｄの喪失は、Ｔｃｆ−４の喪失に類似した陰窩幹細胞区画の枯渇を生じると予想されるおそれがあり、腸腫瘍発生を促進する他の遺伝子と同様に、Ｍｉｎ突然変異体マウスにおける腸腫瘍の発生率及びサイズを抑制するおそれがある。
【実施例６】
【０１９４】
Ｔｒａｂｉｄのアッセイ
図３に記載するデユビキチラーゼアッセイの条件は次の通りである。
Ｔｒａｂｉｄ及びＴｒａｂｉｄ変異体をそれぞれ１．０μｇで用意する。
それらを緩衝液２０μｌ（１５０ｍＭ  ＫＣｌ、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ  ＤＴＴ、５％グリセロール、０．０１％トリトンＸ−１００）中でオリゴユビキチン鎖混合物（Affiniti社製）１．０μｇと共に３０℃で６０分間インキュベートする。
２×ＳＤＳ試料緩衝液（２０％グリセロール、１２５ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣＬ（ｐＨ６．８）、４％ＳＤＳ、０．０１ｍｇ／ｍｌブロモフェノールブルー、１０ｍＭ  ＤＴＴ）で反応を終了させる。
【０１９５】
試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分割し、視覚化する。
【０１９６】
結果を図３に示す。
【０１９７】
したがって、本発明によりＴｒａｂｉｄ活性をアッセイする。
【実施例７】
【０１９８】
Ｔｒａｂｉｄの阻害剤についての高処理量スクリーニング
この実施例では、Ｔｒａｂｉｄの阻害剤を同定するための方法を実証する。デユビキチラーゼとしてのＴｒａｂｉｄの生物学的活性を最初に開示する。この実施例では、Ｔｒａｂｉｄのデユビキチラーゼ活性の阻害剤を同定する方法を実証する。
【０１９９】
最初に、組換えＴｒａｂｉｄのインビトロ脱ユビキチン化活性を特徴づける（上記実施例参照）。今回、小分子阻害剤などのこの活性の阻害剤についてスクリーニングすることに有用なマイクロプレートに基づくアッセイを実証する。
【０２００】
上記実施例では、ＴＣＦ介在性転写に果たすＴｒａｂｉｄの機能を研究した。ここでは、Ｔｒａｂｉｄのデユビキチラーゼ（「ＤＵＢ」）活性についての高処理量マイクロプレートアッセイを開発する。
【０２０１】
最初に、組換えＴｒａｂｉｄのインビトロＤＵＢ活性を考慮すべきである。例えば、その活性を好都合に最適化し、その基質優先性を精査し、かつ／又はアッセイ条件を作業者の必要性に応じて選択することができる。
【０２０２】
例えばＴｒａｂｉｄの活性を高めるために、アッセイに使用されるＴｒａｂｉｄにＮＺＦドメインが含まれていてもよい。
【０２０３】
本発明のアッセイのための基礎の概観を図１に用意する。図１に、下記のようにＴｒａｂｉｄのＤＵＢ活性をアッセイするために改造したマイクロプレートアッセイの概略設計が示される。したがって、図１には、本明細書に記載するマイクロプレートアッセイの略図を示される。構成要素となるタンパク質はＡＲＤ（青）、ＨＤ２（赤）、及びキモトリプシン（緑）であり、概略図の下の記号表にもこれらに名称を示す。ＡＲＤ及びＨＤ２は、抗体相互作用を介してプレートに固定化されたＧＳＴ−ＡＲＤと、Ｓタグ付きＨＤ２との間の結合を共に阻害することができるが、キモトリプシンはそうできない（概略図の右側で反応容器（マイクロタイターウェル）外側に示す個別のブロックにより表示。上２つは阻害についての記号を示す（−−−｜）。ＧＳＴ−ＡＲＤドメイン構築物を大腸菌で組換え産生し、次にマイクロタイターウェルの内表面に予めコーティングした抗ＧＳＴ抗体に結合させることによって、これをマイクロタイターウェルの内部に付着させる。図２に競合阻害曲線を示すが、この曲線は、タグなしＡＲＤ又はＴｘタグ付きＨＤ２のいずれかを使用してＧＳＴ−ＡＲＤとＨＤ２との間の相互作用の飽和可能な阻害を実証する。キモトリプシンは、２０μＭ濃度でもこの相互作用を阻害することができない。
【０２０４】
Ｔｒａｂｉｄをアッセイするための方法に目を向けると、概観してこれは以下のように行われる。二重タグ付きユビキチン基質（例えばＧＳＴ−ｕｂ−ｕｂ−Ｓ）を合成し、固定化し、細菌に発現させたＴｒａｂｉｄを添加することによって切断後のＳタグの放出をモニターする。マイクロタイタープレートの個別のウェルは、個別のアッセイ条件についての能力、例えば異なるＴｒａｂｉｄ活性阻害剤の候補についての能力を提供する。特定条件でのＳタグの放出は、活性Ｔｒａｂｉｄの存在を示す。放出の欠如、又は適切な阻害されていないＴｒａｂｉｄ対照に比べて低レベルでの放出は、Ｔｒａｂｉｄ活性の阻害を示す。
【０２０５】
アッセイの形式は、好都合には作業者に必要なものに応じて変動することがあるが、本実施例は、Ｋ６３ユビキチン鎖をインビトロで切断する、細菌に発現させたＧＳＴ−Ｔｒａｂｉｄ−ＯＴＵドメイン構築物（Ｔｒａｂｉｄアミノ酸３５５〜７０８）に基づく好ましいアッセイを記載し、Ｋ６３ユビキチン鎖の切断活性は、ＯＴＵドメインの推定上の触媒トリアド（Ｃ４４３Ａ）における突然変異によって消滅させることができる（Nanao, M. H. et al. EMBO Rep 5, 783-8 (2004)）。
【０２０６】
第１のステップでは、二重タグ付きポリユビキチン基質を、当技術分野で公知の方法及び試薬を使用して作製する（Pickart, C. M. & Raasi, S. Methods Enzymol 399, 21-36 (2005)）。この基質を、タグの１つ、好ましくはＮ末端ＧＳＴタグによりマイクロタイタープレートに固定化する。このアッセイを、二重タグ付きポリユビキチン基質を使用して好都合に簡略化する。この基質を１つのタグによりマイクロタイターウェルに直接付着させて、好都合には（抗ＧＳＴ抗体）−（ＧＳＴ−基質）−（検出可能なタグ）又は固定化用の他のこのような配置の必要を回避することができる。好都合には（少しでもあるとすれば）Ｔｒａｂｉｄの切断後の放出検出に、第２のタグを使用する。
【０２０７】
次に、阻害剤の候補及び／又は媒体及び／又は公知の阻害剤を、適切な試験ウェル及び対照ウェルにそれぞれ適用する。
【０２０８】
必要であれば、（少しでも可能であれば）Ｔｒａｂｉｄ活性を可能にするように緩衝液を調整する。好ましくは緩衝液は実施例６の通りである。
【０２０９】
次に、Ｔｒａｂｉｄを添加する。
【０２１０】
次に、プレートをインキュベートして、任意のＴｒａｂｉｄ作用が起こるようにする。好ましくは、プレートを実施例６のようにインキュベートする。
【０２１１】
次に、Ｔｒａｂｉｄの不活性化及び／又は全てのウェルへの公知の阻害剤の添加により反応を停止させてもよい。あるいは、実施例６のようにＳＤＳ試料緩衝液を使用して反応を停止させることができる。
【０２１２】
次に、プレートを読み出す。
【０２１３】
アッセイの読出しは、Ｔｒａｂｉｄによる切断後の上清へのタグ（好ましくはＣ末端タグ）の放出の検出により、これをＴｒａｂｉｄが阻害された（又は対照ウェルで不活性／不在の）場合の放出低減（又はまさに放出の欠如）と比べることによる。
【０２１４】
代替の実施形態では、当技術分野で公知のものなどの蛍光ユビキチン誘導体を基質として使用することができよう（例えばTirat, A. et al. Anal Biochem 343, 244-55 (2005)参照）。これらの実施形態では、アッセイの読出しは、ユビキチナーゼの作用（又は前記作用の欠如）後のフルオルの放出（又は放出の欠如）をモニターすることによるであろう。
【０２１５】
不活性Ｃ４４３Ａ  Ｔｒａｂｉｄ突然変異体は、このアッセイに有用な陰性対照として働く。特に、このアッセイを較正するために、触媒不活性なＣ４４３Ａ  Ｔｒａｂｉｄ突然変異体の存在下での検出可能な部分の放出レベルをベースラインとして採用することができる。（任意の阻害剤も阻害剤の候補も有さない）触媒活性Ｔｒａｂｉｄ調製物の存在下での放出レベルは、陽性対照として採用することができる。次に、結果の解釈及びＴｒａｂｉｄ機能の阻害剤の同定を助けるために、阻害剤候補の存在下での被験試料を陽性及び陰性（ベースライン）対照と比較することができる。
【０２１６】
このアッセイは、ＴｒａｂｉｄのＤＵＢ活性の阻害剤について小分子ライブラリーをスクリーニングできるようにする。ＯＴＵドメインの公知の構造（Nanao, M. H. et al. EMBO Rep 5, 783-8 (2004)）及びこのドメインの特異的阻害剤の存在（Balakirev MY, Tcherniuk SO, Jaquinod M & Chroboczek J. EMBO Rep 4, 517-22 (2003)、好ましくはスクリーニングされる化合物はこの文献に記載される阻害剤に基づく）を仮定すると、Ｔｒａｂｉｄは、小分子阻害剤についての有望な生化学的標的である。
【０２１７】
さらに、触媒性トリアドにおける保存されたＤ→Ａ置換（Makarova, K. S., Aravind, L. & Koonin, E. V. Trends Biochem Sci 25, 50-2 (2000)）が、Ｔｒａｂｉｄの活性部位の正確な構築に影響を及ぼす見込みがあることから、本発明は、好都合にはＴｒａｂｉｄタンパク質のＯＴＵドメインの独特の形状を特異的に認識する阻害剤を同定できるようにする。
【０２１８】
これらのスクリーニングにより同定される阻害剤は、好都合には上記アッセイにおいてインビトロ及びインビボでさらに試験及び検証することができる。
【０２１９】
したがって、本実施例は、Ｔｒａｂｉｄ及びそのＤＵＢ活性の小分子阻害剤のさらなる生化学的特徴づけを記載する。さらに、Ｔｒａｂｉｄ活性の阻害剤についてのアッセイを実証する。
【実施例８】
【０２２０】
ＴｒａｂｉｄはＷｎｔシグナル伝達に関与する脱ユビキチン化酵素である
概要：
哺乳動物細胞におけるＷｎｔシグナル伝達の負の調節は、リン酸化（ＡＰＣ、アキシン、及びＧＳＫ−３βを含むタンパク質複合体による）及びユビキチン化（Ｅ３ユビキチンリガーゼ（β−ＴｒＣＰ）による）のためにβ−カテニンを構成的にターゲティングすることによって維持される。ユビキチン化されたβ−カテニンは、プロテアソームにより最終的に分解される。Ｗｎｔ経路の活性化の結果として、β−カテニンリン酸化複合体のＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ誘導性不活性化が生じる。非リン酸化β−カテニンは、分解に不応性であることから急速に蓄積し、核に移行する。核β−カテニンはＴＣＦ／Ｌｅｆ転写因子に結合し、それを共活性化し、Ｗｎｔ標的遺伝子の発現を推進する。
【０２２１】
結果
ベイトとして負のＷｎｔシグナル伝達構成要素ＡＰＣを用いた酵母２ハイブリッドスクリーニングで、以前は未知の生物学的機能を有するＴｒａｂｉｄと呼ばれるマウスタンパク質を同定した。Ｔｒａｂｉｄは、ＯＴＵ（卵巣腫瘍）ファミリーの脱ユビキチン化酵素に属し、このファミリーには、Ａ２０及びＣｅｚａｎｎｅが含まれる。Ｔｒａｂｉｄが脱ユビキチン化活性を有すること、及びそれがまた、Ｋ６３結合のユビキチン鎖にインビトロで優先的に結合することを示す。ＲＮＡｉによるＨＥＫ−２９３ＴからのＴｒａｂｉｄの枯渇の結果として、様々な正のＷｎｔ構成要素に対するこれらの細胞の有意な応答欠如が生じた。重要なことに、Ｔｒａｂｉｄの枯渇は、ＣＭＶ又はＮＦ−κＢなどの対照プロモーターからの転写に影響を及ぼさなかった。エピスタシス実験から、核Ｗｎｔシグナル伝達におけるＴｒａｂｉｄについての機能が示唆される。Ｔｒａｂｉｄ枯渇細胞におけるＴＣＦ転写因子のレベル低減を見出したが、これは、Ｗｎｔシグナル伝達への２９３Ｔ細胞などの哺乳動物細胞の応答性低減にＴｒａｂｉｄが有用であることを実証する。
【実施例９】
【０２２２】
Ｔｒａｂｉｄ脱ユビキチン化酵素である
図４に、Ｔｒａｂｉｄのデユビキチラーゼ活性を実証する証拠を示す。
【０２２３】
図４（Ａ）に、ｈＴｒａｂｉｄのドメイン組成並びにＯＴＵファミリーの３メンバーの保存されたＣＹＳ及びＨＩＳボックスのアライメントを示す。
【０２２４】
触媒性Ｃｙｓ４４３をセリンに置換することにより、タンパク質分解不活性なＴｒａｂｉｄ突然変異体（図４Ｃ、レーン３）を作製した。
【０２２５】
図４（Ｂ）に、ＮＺＦ（ＲａｎＢＰ２型ジンクフィンガー）を含有するＴｒａｂｉｄのＮ末端が、ＧＳＴプルダウンアッセイにおいてＫ６３ユビキチン鎖に優先的に結合することを示す（レーン６）。
【０２２６】
図４（Ｃ）に、ＯＴＵ脱ユビキチン化ドメインを有するＴｒａｂｉｄのＣ末端が、インビトロでＫ６３ユビキチン鎖を優先的に切断することを示す。記号：Ｕｂ−Ａｌ＝ユビキチンアルデヒド（デユビキチラーゼ阻害剤）
【実施例１０】
【０２２７】
ＴｒａｂｉｄはＷｎｔシグナル伝達の正の構成要素である
図５に、２９３Ｔ細胞におけるＲＮＡｉ実験の結果を示し、この実験は、ＴｒａｂｉｄがＷｎｔシグナル伝達の正の構成要素であることを実証する。
【０２２８】
図５（Ａ）に、ｓｉＲＮＡの特異性及び効率を示す。これらは、異所性発現したＨＡタグ付きＴｒａｂｉｄ及びＣｅｚａｎｎｅのウエスタンブロットにより、並びに内因性Ｔｒａｂｉｄ  ｍＲＮＡの枯渇レベルを標定するためのＲＴ−ＰＣＲにより測定した。
【０２２９】
図５（Ｂ）に、２つの異なるｓｉＲＮＡ（Ｔｒａｂ１及びＴｒａｂ２）に仲介されるＴｒａｂｉｄの枯渇が、Ｄｖｌに刺激されるＴＣＦ転写を有意に低減することを示す（ＴＯＰＦＬＡＳＨ）。ＦＯＰＦＬＡＳＨ＝陰性対照
【実施例１１】
【０２３０】
転写調節におけるＴｒａｂｉｄの機能
図６に、２９３Ｔ細胞でのエピスタシス実験を示し、この実験は、転写調節に果たすＴｒａｂｉｄの機能を実証する。
【０２３１】
図６（Ａ）に、Ｔｒａｂｉｄ枯渇細胞においてＴＣＦ転写のＷｎｔ−３Ａ、Ｄｖｌ２、及びＬｉＣｌ刺激が全て減弱したことを示すが、これは、ドミナントネガティブβ−ＴｒＣＰ（ΔＦ）によるＴＣＦ転写活性化（図６Ｂ）又は安定化β−カテニン突然変異体（Δ４５Ｓ）（図６Ｃ）でも同様であった。
【０２３２】
図４（Ｄ）に、対照的にＴｒａｂｉｄの枯渇が、ＮＦ−κＢ転写のＴＮＦＲ誘導性刺激に効果を及ぼさなかったことを示す。ＣＭＶプロモーターに推進される転写についても同じことがいえる。
【０２３３】
この証拠は、Ｗｎｔシグナル伝達に果たすＴｒａｂｉｄの特異的役割を実証する。
【実施例１２】
【０２３４】
Ｗｎｔ経路に及ぼすＴｒａｂｉｄ枯渇の効果
図７に、Ｔｒａｂｉｄ枯渇が哺乳動物細胞（本実施例では２９３Ｔ細胞）におけるＷｎｔ経路構成要素及びＷｎｔ標的遺伝子の細胞レベルに及ぼす効果を示す。
【０２３５】
図７（Ａ）に、Ｔｒａｂｉｄ枯渇細胞の核画分に（Ｌｅｆ１ではなく）ＴＣＦ転写因子３及び４のレベルの有意な低減が観察されたことを示す。
【０２３６】
ＴｒａｂｉｄがＥ３ユビキチンリガーゼ活性を有することをさらに実証する。この証拠を図７に提示する。特に、図７ＡにおけるＴｒａｂｉｄ枯渇後のβ−カテニンのユビキチン化低下及びタンパク質全体のユビキチン化低下は、この活性の証拠である。この活性の阻害又は低減は、Ｗｎｔ経路活性の低減に有用である。この活性は、ＴｒａｂｉｄのＮＺＦフィンガー領域に仲介される見込みがある。
【０２３７】
顕著にユビキチン化されたβ−カテニン種はプロテアソーム阻害時に検出できる（ＭＧ１３２、レーン３及び７）が、Ｔｒａｂｉｄ枯渇細胞ではあまり顕著ではない（レーン４及び８）。ユビキチン化タンパク質全体の低減が観察される（抗ユビキチン抗体）。図７（Ｂ）に、ＴＣＦ標的遺伝子であるｃ−ＭＹＣの発現がＴｒａｂｉｄ枯渇細胞でダウンレギュレーションされることを示す。したがって、本発明は、Ｔｒａｂｉｄ活性の低減によるｃ−ＭＹＣのダウンレギュレーションに関する。
【０２３８】
概要
Ｔｒａｂｉｄを脱ユビキチン化酵素（及びＥ３ユビキチンリガーゼ）として同定したが、Ｔｒａｂｉｄは、哺乳動物細胞におけるＷｎｔ経路の刺激に対する完全な応答及びＴＣＦ依存性転写に必要である。この証拠は、Ｔｒａｂｉｄにとっての核での役割、例えばＴＣＦ−３／４発現の調節因子としての役割を指し示す。Ｔｒａｂｉｄ枯渇細胞におけるＴＣＦ−３／４のレベル低減は律速要因であるおそれがあり、これにより、安定化形態のβ−カテニンを使用した場合にさえもＷｎｔ経路の活性化が抑制されることを説明することができよう（図６Ｃ）。Ｔｒａｂｉｄは、β−カテニンの効率的なユビキチン化にも必要とされることがある（図７Ａ）。したがって、核β−カテニンのターンオーバー調節は、連続的なＴＣＦ転写に重要でありうる。脱ユビキチン化酵素活性はＴＣＦ転写に重要である。Ｗｎｔ経路特異的タンパク質のレベルを調節することができ、それによってＴＣＦ依存性転写に直接影響する酵素としてＴｒａｂｉｄを同定した。ＴＣＦ依存性転写／Ｗｎｔシグナル伝達の調節におけるＴｒａｂｉｄの調節を実証する。
【実施例１３】
【０２３９】
ＣｅｚａｎｎｅのＯＴＵドメインは、ベイトとしてＡＰＣのＡｒｍａｄｉｌｌｏリピートドメインを用いた酵母２ハイブリッドスクリーニングにおける２つの単離体のうちの１つであり、これらの単離体は、野生型（ＷＴ）ドメインに特異的であったが、その突然変異体版には結合しなかった。このＷＴ特異的会合を、哺乳動物細胞及びショウジョウバエ細胞における比較用タンパク質断片の免疫共沈により確認した。それに続くＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）実験から、ＣｅｚａｎｎｅではなくＴｒａｂｉｄの枯渇が哺乳動物細胞におけるＴＣＦ介在性転写に影響したことが明らかとなった（下記参照）。したがって、Ｔｒａｂｉｄに関する本発明者らのさらなる分析に焦点を当てた。
【０２４０】
Ｔｒａｂｉｄはインビトロで優先的にＫ６３結合のユビキチンを切断する
Ｔｒａｂｉｄは７０８アミノ酸残基長であり、そのＣ末端にＯＴＵドメイン及びそのＮ末端に３つのＮＺＦ型ジンクフィンガーを含有する（図８Ａ）。後者はＴｒａｂｉｄオルソログの決定的な特徴であり、Ｔｒａｂｉｄオルソログは、ＯＴＵドメインの推定上の触媒ポケットにおけるＴｒａｂｉｄオルソログの保存されたＤ→Ａ置換により他のＯＴＵファミリーのメンバーと区別することもできる（図８Ａ、四角内）。実際に、置換されたアスパラギン酸残基はシステインプロテアーゼの活性部位に通常見出される触媒性Ａｓｐ  Ｃｙｓ  Ｈｉｓトリアド（図８Ａ）の一部分あり、Ｔｒａｂｉｄオルソログの機能に重要である。これは、Ｔｒａｂｉｄオルソログの変異体ＯＴＵドメインが実際にＤＵＢ活性を有するかどうかの疑問を提起する。
【０２４１】
ユビキチン切断アッセイ
これを試験するために、トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞からヘマグルチニン（ＨＡ）タグ付きＴｒａｂｉｄを免疫沈降させ、ユビキチンのＫ４８又はＫ６３を介して結合した合成ポリユビキチン（２〜７個のユビキチンモノマーからなる鎖；Ｕｂ２〜Ｕｂ７）と共にこれをインビトロでインキュベートした。実際に、ＨＡ−Ｔｒａｂｉｄは、Ｋ６３結合のユビキチンを切断することができたが、その活性は、大部分は混合物中の長鎖に対して向けられた（Ｕｂ６、Ｕｂ７；図８Ｂ、レーン８）。対照的に、Ｋ４８結合のユビキチン鎖に対するＨＡ−ＴｒａｂｉｄのＤＵＢ活性は検出可能でなかった（図８Ｂ、レーン２〜５）。予想通り、ＯＴＵドメインの触媒性システイン４４３からセリンへの置換（Ｃ４４３Ｓ）は、ＨＡ−ＴｒａｂｉｄのＤＵＢ活性を遮断した（図８Ｂ、レーン１０）。関心を引くことに、３つのＮＺＦフィンガー（３×ＺｎＦ）のそれぞれにおける、又は第３のフィンガーのみにおける１番目の不変システインのアラニン置換（Ｃ１５５Ａ）も、この活性を遮断した（図８Ｂ、レーン９；図１５）。これは、これらの突然変異体の発現レベルの低減が原因ではなかった（図８Ｂ、下図；図１５）。これにより、ＴｒａｂｉｄのＯＴＵドメインだけでなくそのＮＺＦモチーフも、ＴｒａｂｉｄのインビボＤＵＢ活性に関係づけられる（下記参照）。
【０２４２】
観察されたＤＵＢ活性がＨＡ−Ｔｒａｂｉｄと共に共沈する他のタンパク質が原因であったという可能性を排除するために、Ｔｒａｂｉｄのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ付きＣ末端（ＧＳＴ−Ｔｒａｂｉｄ  ＣＴ、アミノ酸３５５〜７０８）を細菌に発現させたものを用いたインビトロＤＵＢアッセイを行った（図８Ｃ、左欄）。実際に、ＧＳＴ−Ｔｒａｂｉｄ  ＣＴのＣ４４３Ｓ突然変異体版ではなくＷＴは、免疫沈降したＨＡ−Ｔｒａｂｉｄと同様に、Ｋ６３結合のユビキチン鎖にＤＵＢ活性を表した（図８Ｃ、レーン３、４）（図８Ｂ）。さらに、ＷＴ  ＧＳＴ−Ｔｒａｂｉｄ  ＣＴと、ＤＵＢ酵素の特異的阻害剤であるユビキチンアルデヒドとの予備インキュベーションは、そのＤＵＢ活性を遮断した（図８Ｂ、レーン５）。見たところ、ＴｒａｂｉｄのＮＺＦフィンガーは、細菌に発現させたタンパク質のインビトロＤＵＢ活性に必要なく、これは、ことによるとこのアッセイが比較的高いタンパク質濃度を必要とするからであろう。実際、ＴｒａｂｉｄのＮＺＦフィンガー自体はＤＵＢ活性をもたない。それは、ＴｒａｂｉｄのＮ末端に及ぶタンパク質断片を細菌に発現させたもの（ＧＳＴ−Ｔｒａｂｉｄ  ＮＴ、アミノ酸１〜３５４）が、ＤＵＢアッセイにおいて不活性であったからである（図８Ｂ、レーン６）。ＴｒａｂｉｄのＯＴＵドメインはＫ６３結合のユビキチンに優先的なＤＵＢ活性を有すると結論する。
【０２４３】
ＴｒａｂｉｄはインビトロでＫ６３結合のユビキチン鎖に選択的に結合する
ＴｒａｂｉｄのＮ末端ジンクフィンガーは、ＴＡＫ１キナーゼ複合体のＴＡＢ２及びＴＡＢ３アダプタータンパク質に見出されるユビキチン結合性ＮＺＦモチーフに明らかに関係する（Kanayama et al., 2004）（図１６）。Ｔｒａｂｉｄがユビキチンに結合するかどうかを試験するために、トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞から免疫沈降したＷＴ又は突然変異体ＨＡ−Ｔｒａｂｉｄと共に合成ユビキチン鎖をインキュベートすることによって、インビトロプルダウンアッセイを行った。これにより、ＷＴ  ＨＡ−Ｔｒａｂｉｄが、Ｋ４８結合ではなくＫ６３結合のＵｂ４〜Ｕｂ６に特異的に結合したことが明らかとなった（図９Ａ、矢印；Ｕｂ４、Ｕｂ５、及びＵｂ６は投入に比べて沈殿が大いに豊富であったことに留意；図９Ａ、レーン２及び６）。３×ＺｎＦ及びＣ１５５Ａ突然変異体を用いたときに有意に少ない結合を観察した（図９Ａ、レーン８、１２）。対照的に、Ｃ４４３Ｓ突然変異体は、Ｋ６３結合のユビキチンへの結合がＷＴと少なくとも同じ大きさを示した（図９Ａ、レーン１０）。したがって、ＴｒａｂｉｄのＮＺＦフィンガーは、Ｋ６３結合のユビキチンに強い優先性を示すユビキチン結合モチーフであるが、ＯＴＵドメインはこの結合に必要とされない。
【０２４４】
これを支持して、ＮＺＦ突然変異体のどれでもなくＣ４４３Ｓが、２９３Ｔ細胞溶解液から豊富な内因性ユビキチン化タンパク質と共沈したが（図９Ａ、レーン９及び１０、星印；図８Ｂ、レーン５及び１０も参照）、この共沈は、程度が低いがＷＴ沈殿でも検出可能である（図９Ａ、レーン５及び６）。これらは、ＷＴ  ＨＡ−ＴｒａｂｉｄのＮＺＦフィンガーに結合したユビキチン化基質及びＣ４４３Ｓ突然変異体の触媒不活性ＯＴＵドメインにトラップされたユビキチン化基質を表すと思われる。
【０２４５】
最終的に、インビトロＧＳＴプルダウンアッセイを使用し、ＧＳＴ−Ｔｒａｂｉｄ  ＮＴがＫ４８結合に比べてＫ６３結合のユビキチンへの結合に強い優先性を有することを示したが（図９Ｂ）、これは、この断片がＫ６３結合のユビキチンに結合するドメインを、最も確からしくはＮＺＦモチーフを含有することを示している。このことに基づき、そしてＮＺＦ突然変異体にＤＵＢ活性の喪失が観察されたことに基づき（図８Ｂ、図１５Ｂ）、Ｋ６３結合のユビキチンへのＴｒａｂｉｄのＮＺＦ介在性結合がＴｒａｂｉｄの効率的なインビボＤＵＢ活性に必要であると結論する。
【０２４６】
ＴｒａｂｉｄはＴＣＦ依存性転写に必要とされる
異なるヒト細胞系にＲＮＡｉを使用し、Ｗｎｔシグナル伝達に果たす内因性Ｔｒａｂｉｄ及びＣｅｚａｎｎｅの役割を調べた。ＴｒａｂｉｄのＮ末端に対する抗血清を作製し、Ｔｒａｂｉｄが２９３細胞の細胞質画分及び核画分の両方に発現することを確立した（図１７Ａ）。これに一致して、外因性ＨＡ−Ｔｒａｂｉｄも、これらの細胞及び２９３Ｔ細胞の細胞質及び核の両方から見出される（図１７Ｂ、Ｃ）。実際に、結腸直腸癌細胞系ＳＷ４８０（この細胞のＷｎｔ経路は、ＡＰＣの突然変異性不活性化が原因で活性である）では、核に大規模に過剰発現したＨＡ−Ｔｒａｂｉｄを観察した（図１７Ｄ）。
【０２４７】
次に、２つの異なるｓｉＲＮＡの特異性を試験するために、及びそれらの枯渇効率を最適化するために、ＨＡ−Ｔｒａｂｉｄ又はＨＡ−Ｃｅｚａｎｎｅをトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞を使用した（図１８）。Ｃｅｚａｎｎｅ特異的ｓｉＲＮＡではなくＴｒａｂｉｄ特異的ｓｉＲＮＡがこれらの細胞における内因性Ｔｒａｂｉｄ転写体のレベルを事実上検出不可能なレベルに（半定量ＲＴ−ＰＣＲで判定、図１８Ａ）、及び内因性Ｔｒａｂｉｄタンパク質のレベルを＜５０％に（図１０Ａ）低減したことをさらに確認した（図１０Ａ）。
【０２４８】
Ｔｒａｂｉｄが、Ｗｎｔを刺激された細胞における内因性ＴＣＦ標的遺伝子の転写に必要とされるかどうかを知るために、Ｗｎｔシグナル伝達の２つの十分に確立された転写標的であるｃ−ＭＹＣ及びＡＸＩＮ２の発現レベルを、定量ＲＴ−ＰＣＲを使用することによって測定した。対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトされた２９３細胞において、Ｗｎｔ３Ａに曝露後にｃ−ＭＹＣ及びＡＸＩＮ２の転写レベルが２倍を超えて誘導されたことを最初に確認した（図１０Ｂ、Ｃ）。最近発見されたＷｎｔシグナル伝達因子ＢＣＬ９のレベルが、これらの条件で２倍を超えて誘導されたことも見出した（図１０Ｂ）。しかし、３つのＷｎｔ標的遺伝子全てのＷｎｔ誘導性刺激は、Ｔｒａｂｉｄ枯渇２９３細胞で完全に遮断された（図１０Ｂ、Ｃ；Ｔｒａｂｉｄ転写体の効率的枯渇にも留意）。Ｔｒａｂｉｄの枯渇はまた、未刺激２９３細胞においてこれらのＷｎｔ標的遺伝子の発現を約５０％に低減した（図１０Ｂ、Ｃ）が、これは、これらの細胞におけるＷｎｔ経路活性の構成的レベルが低いことをおそらく反映している。したがって、Ｔｒａｂｉｄは、Ｗｎｔの刺激に応答した内因性ＴＣＦ標的遺伝子の転写に必要とされる。そのうえ、Ｔｒａｂｉｄ活性の低減がヒト細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を低減することを実証する。
【０２４９】
次に、ＳＷ４８０結腸直腸癌細胞中のＴｒａｂｉｄを枯渇させ、ＴＯＰＦＬＡＳＨアッセイを使用することにより、この効果をＷｎｔ経路活性の特異的定量的読出しとしてモニターした（複数のＴＣＦ結合部位に連結したルシフェラーゼレポーターに基づく）（Korinek et al., 1997 Science Vol. 275 pp 1784-1787）。ＳＷ４８０細胞に、対照ｓｉＲＮＡ又はＣｅｚａｎｎｅ若しくはＴｒａｂｉｄ特異的ｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、続いてＴＯＰＦＬＡＳＨレポーター及び内部対照（ＣＭＶ−ウミシイタケ（renilla））をトランスフェクトした。Ｔｒａｂｉｄの枯渇がＴＯＰＦＬＡＳＨ活性をＳＷ４８０細胞の正常レベルの約４０％まで低減したが、Ｃｅｚａｎｎｅの枯渇は効果を有さなかったことを見出した（図１０Ｄ）。突然変異ＴＣＦ結合部位を含有するルシフェラーゼレポーターの活性（ＦＯＰＦＬＡＳＨ）は影響を受けなかった（図１０Ｄ）。Ｔｒａｂｉｄの過剰発現がＴＣＦ介在性転写に影響を及ぼすかどうかも問うた。ＷＴ  ＨＡ−Ｔｒａｂｉｄを共トランスフェクトされた対照ｓｉＲＮＡ細胞（図１０Ｄ、レーン１及び７）でＴＯＰＦＬＡＳＨ活性の中程度であるが有意な増加が観察されたが、Ｃ１５５Ａ及びＣ４４３Ｓのどちらを共トランスフェクトされた細胞でも観察されなかった（図１０Ｄ、レーン８及び９）。まとめると、これらの結果は、これらの結腸直腸癌細胞においてＣｅｚａｎｎｅではなくＴｒａｂｉｄがＴＣＦ介在性転写の正の調節因子であることを示している。
【０２５０】
ＮＦ−κＢシグナル伝達
ＮＦ−κＢシグナル伝達に関するＴｒａｂｉｄの強い機能的結びつきを仮定して、ＮＦ−κＢ依存性転写がＴｒａｂｉｄの枯渇に感受性であるかどうかも試験した。複数のＮＦ−κＢ結合部位を含有するルシフェラーゼレポーターを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、ＴＮＦ受容体II（ＴＭＦＲ−II）の共トランスフェクションによりこれらの細胞を刺激した結果として、ベクター対照に比べてＮＦ−κＢ依存性転写の約７倍の増加が生じた（図１０Ｅ、レーン１及び４）。この活性は、Ｔｒａｂｉｄ枯渇細胞では影響を受けなかった（図１０Ｅ、レーン４及び１０）。この実験のさらなる対照には、ドミナントネガティブＩκＢ（ＩκＢ−ＤＮ）タンパク質（ＴＮＦＲ−II誘導を効率的に遮断した）及びＷｎｔ３Ａ（このＮＦ−κＢレポーターアッセイに影響しなかった）を共トランスフェクトすることが含まれた（図１０Ｅ）。したがって、Ｔｒａｂｉｄは、ＮＦ−κＢ介在性転写に必要とされず、これは、Ｔｒａｂｉｄの過剰発現に基づいた以前の結論と一致する。
【０２５１】
Ｔｒａｂｉｄのユビキチン結合及びＤＵＢ活性はＴｒａｂｉｄがＴＣＦ依存性転写に果たす機能に重要である
Ｔｒａｂｉｄ  ｓｉＲＮＡのオフターゲットの効果を除外するために、再発現したＴｒａｂｉｄを用いたレスキュー実験を行った。ＷＴ及び突然変異体ＨＡ−Ｔｒａｂｉｄレスキュー構築物に沈黙突然変異を導入し、この沈黙突然変異はこれらの構築物をＲＮＡｉ介在性枯渇に不応性にした（図１８Ｃ）。次に、Ｔｒａｂｉｄを枯渇したＳＷ４８０細胞におけるこれらの構築物のレスキュー活性についてこれらの構築物を試験し、ＷＴ  ＨＡ−Ｔｒａｂｉｄ構築物が対照のトランスフェクトされた細胞の約７０％のレベルまでＴＯＰＦＬＡＳＨ活性を回復させたことを見出した。（図１０Ｄ、レーン１、３、及び１０）。重要なことには、ＷＴに同様なレベル発現しているにもかかわらず（図１０Ｄ、下欄）、Ｃ４４３ＳもＣ１５５ＡもＴｒａｂｉｄ枯渇細胞におけるＴＯＰＦＬＡＳＨ転写を回復することができなかった（図１０Ｄ、レーン３、１１、及び１２）。Ｗｎｔ３Ａで刺激した２９３細胞でも同様の結果が観察された（図１９）。まとめると、これらの結果は、Ｔｒａｂｉｄのユビキチン結合及びＤＵＢ活性が、Ｗｎｔ経路活性が高まったヒト細胞におけるＴＣＦ介在性転写の際にＴｒａｂｉｄの機能に必要とされることを示している。
【０２５２】
エピスタシス分析は、Ｔｒａｂｉｄがβ−カテニンの安定化の下で作用することを示す
Ｔｒａｂｉｄを枯渇した２９３細胞におけるＴＯＰＦＬＡＳＨアッセイに基づきエピスタシス実験を行い、Ｔｒａｂｉｄが作用するＷｎｔシグナル伝達カスケード内のレベルを同定した。最初に、Ｗｎｔ３Ａをコードするプラスミドをトランスフェクトされた細胞を調べたところ、このプラスミドは、ベクター対照に比べてＴＯＰＦＬＡＳＨ活性を約６倍刺激する（図１８Ａ；これらの条件でβ−カテニンが蓄積することに留意（図１８Ａ、下欄、レーン１及び２）。Ｔｒａｂｉｄ  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトされた細胞では、Ｗｎｔ３Ａに誘導されるβ−カテニン安定化は影響を受けず、ＴＯＰＦＬＡＳＨ活性が対照細胞でのレベルの約３０％まで低減した（図１８Ａ、レーン２及び４）。これは、Ｔｒａｂｉｄがβ−カテニン安定化の下で、Ｗｎｔ経路の下流で作用することを示唆している。
【０２５３】
ユビキチンのコンジュゲーションに果たすβ−ＴｒＣＰの役割を仮定して、β−ＴｒＣＰの活性がＴｒａｂｉｄの枯渇に影響されうるかどうかも問うた。β−カテニンに結合するが、ＳＣＦ複合体には結合しないドミナントネガティブ形態のマウスβ−ＴｒＣＰ（β−ＴｒＣＰΔＦ）を使用し、これを２９３Ｔ細胞に発現させたところ、これは、用量依存的に高レベルのＷｎｔ経路活性を引き起こし、構築物２００及び４００ｎｇがトランスフェクトされたときのＴＯＰＦＬＡＳＨ活性は、ベクター対照に比べてそれぞれ約６倍及び１０倍刺激された（図１８Ｂ、レーン１〜３）。しかし、Ｔｒａｂｉｄ枯渇細胞では、同じ量のβ−ＴｒＣＰΔＦがトランスフェクトされたときのＴＯＰＦＬＡＳＨの刺激は有意に低減した（対照の約４０〜５０％まで；図１８Ｂ、レーン５及び６）が、β−ＴｒＣＰΔＦのレベルは影響を受けなかった（図１８Ｂ、下欄）。Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄの過剰発現又はＬｉＣｌによるＧＳＫ３β阻害の結果としてのβ−カテニン安定化がＴｒａｂｉｄ枯渇により影響されなかった一方で、これらの刺激が原因のＴＯＰＦＬＡＳＨ転写が＜５０％まで低減したことも見出した（図２０）。Ｔｒａｂｉｄはβ−カテニンの安定化よりもむしろその転写活性を制御するように作用すると結論する。
【０２５４】
これを直接実証するために、活性化形態のβ−カテニンであるβ−カテニンΔ４５Ｓ（Δ４５Ｓ）を２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした（Morin et al., 1997 Science Vol 275 pp 1787-1790）が、Δ４５Ｓは、リン酸化に不応性であることからＴＯＰＦＬＡＳＨ活性の強力な刺激因子である（ベクター対照に比べて約３５倍；図１１Ｃ、レーン１及び２）。しかし、Ｔｒａｂｉｄ枯渇細胞ではＴＯＰＦＬＡＳＨ刺激は約４０％まで低減した（図１１Ｃ、レーン２及び４）。これに一致して、ＨＣＴ−１１６結腸直腸癌細胞（同じΔ４５Ｓ突然変異を有する（Morin et al., 1997、同書)）におけるＴｒａｂｉｄ枯渇が対照細胞に比べてこの細胞のＴＯＰＦＬＡＳＨ活性に約５０％の低減を結果として生じたことを見出した（図２１）。これは、Ｔｒａｂｉｄがβ−カテニンの転写活性に必要とされるという本発明者らの結論の確証となる。
【０２５５】
Ｔｒａｂｉｄは、核β−カテニン、ＴＣＦ−４、及びＴＣＦ−３のレベルに影響を及ぼす
次いで、Ｔｒａｂｉｄの枯渇がＷｎｔ経路における潜在的核標的の安定性又はユビキチン化状態に影響を及ぼしたかどうかを問うた。したがって、ＬｉＣｌ処理によりＷｎｔ経路を刺激した２９３Ｔ細胞におけるＴｒａｂｉｄを枯渇させ、これらの細胞質画分及び核画分を調製し、核タンパク質に特異的に及ぼすＴｒａｂｉｄ枯渇の効果を評価した。
【０２５６】
最初にβ−カテニンレベルを調べたが、見出された唯一の一貫した変化は、Ｔｒａｂｉｄ枯渇細胞、特にＬｉＣｌで刺激された細胞における核β−カテニンレベルのわずかな減少であった（図１２Ａ、Ｃ、レーン１１及び１２）が、細胞質β−カテニンレベルは、どちらかといえばこれらの細胞でわずかに増加したように見えた（図１２Ａ、図１１Ａも参照）。Ｔｒａｂｉｄ枯渇２９３細胞から調製された核抽出物にも同様の効果が見られた（図１２Ｂ）。Ｔｒａｂｉｄ枯渇細胞におけるβ−カテニンのユビキチン化を調べるために、プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２で２９３Ｔ細胞を処理したが、この阻害剤は、ユビキチン化形態のβ−カテニンに対応した高分子量種の出現を生じる。（図１２Ａ、Ｃ、カッコ内）。しかし、Ｔｒａｂｉｄ枯渇後のＭＧ１３２処理細胞にユビキチン化β−カテニンの増加はなかった（図１２Ａ、Ｃ）が、どちらかといえばユビキチン化β−カテニンのわずかな減少がＴｒａｂｉｄ枯渇細胞質画分から検出できた（図１２Ａ、レーン３及び４）。したがって、Ｔｒａｂｉｄは、β−カテニンの核保持に幾分影響を及ぼすおそれがあるが、これはβ−カテニンのユビキチン化に必要とされず、このことは、Ｔｒａｂｉｄがβ−カテニンの分解に影響を及ぼさないという本発明者らの結論に一致する。
【０２５７】
Ｔｒａｂｉｄ枯渇細胞におけるＴＣＦ因子のレベルも調べた。これにより、Ｔｒａｂｉｄを枯渇した２９３Ｔ細胞におけるＴＣＦ３及びＴＣＦ４の核レベルのわずかであるが一貫した低減を明らかになった（図１２Ａ、レーン７及び８）が、これはＬｉＣｌ及びＭＧ１３２処理後にも見ることができる（図１２Ａ、レーン９〜１２）。核ＴＣＦ４レベルの同様の低減もＴｒａｂｉｄ枯渇２９３細胞から検出可能であった（図１２Ｂ）。対照的に、これらの細胞に低レベル発現するＴＣＦファミリーのメンバーであるＬＥＦ１の核レベル（図１２Ａ、Ｂ）も、β−カテニン結合タンパク質であるパラフィブロミンのレベル（図１２Ａ、Ｂ）も、Ｔｒａｂｉｄの枯渇に感受性ではなかった。これらの転写因子のどれもＭＧ１３２に応答した改変を全く示さず、これは、これらがユビキチン化されていないことを示している。したがって、Ｔｒａｂｉｄ枯渇の主な効果は、これらのヒト胎児腎臓細胞系における主なＴＣＦ因子であるＴＣＦ３及びＴＣＦ４のタンパク質レベルの穏やかであるが選択的な減少であった。
【０２５８】
Ｔｒａｂｉｄの枯渇がＴＣＦとβ−カテニンとの間の相互作用に影響するおそれがあるかどうかも調べた。したがって、２９３Ｔ細胞の核抽出物からＴＣＦ４を免疫沈降させ、対照細胞及びＴｒａｂｉｄ枯渇細胞由来の溶解液中のβ−カテニンの免疫共沈をウエスタンブロット分析により検出した。しかし、ＴＣＦ４及びβ−カテニンのレベルは、Ｔｒａｂｉｄの枯渇後に低減した（上記参照）ものの、ＴＣＦ４に会合したβ−カテニンのレベルに検出可能な変化はなかった（図１２Ｃ、レーン７〜１２）。Ｔｒａｂｉｄは、これらの細胞におけるβ−カテニンとＴＣＦ４との会合に不可欠ではないと結論する。
【０２５９】
ＶＰ１６又はβ−カテニンからＬＥＦ１へのトランス活性化ドメインの直接結合はＴｒａｂｉｄの必要を回避する
Ｔｒａｂｉｄ枯渇細胞に核β−カテニン及びＴＣＦレベルの低減が観察されたことから、ＴＣＦ介在性転写がこれらの条件でなぜ低減するかを説明できよう。しかし、これはありそうもなく、というのは、活性化β−カテニン又はＴＣＦ因子を過剰発現させてもＴｒａｂｉｄ枯渇細胞に正常レベルのＴＯＰＦＬＡＳＨ活性が回復しないからであり、これらのタンパク質のレベルは、過剰発現後に検出可能な程度には低減せず（図１１Ｃ）、Ｔｒａｂｉｄがβ−カテニン及びＴＣＦのレベルよりもむしろ転写に果たすこれらのタンパク質の機能を主に調節することを立証している。
【０２６０】
１つの可能性は、Ｔｒａｂｉｄが、ＴＣＦに会合したβ−カテニンのＣ末端（それ自体強力なトランス活性化ドメイン（ＴＡＤ，transactivation domain）である）への共活性化因子の動員に影響を及ぼすというものである。そうならば、ＴＡＤからＴＣＦへの結合により、ＴＣＦ介在性転写におけるＴｒａｂｉｄの必要を回避できよう。したがって、Ｎ末端の５６残基（β−カテニンの結合に必要とされる）を欠如したＬＥＦ１に、β−カテニンのＣ末端が直接融合したキメラ（ｃａｔＣ−ＬＥＦ１Δ５６、（Hsu et al., 1998 Mol.Cell.Biol.vol. 18 pp 4807-4818)）を試験したが、このキメラは、トランスフェクトされた２９３細胞にＴＯＰＦＬＡＳＨの強い用量依存的トランス活性化を仲介する（図１３、レーン１〜３）。ウイルスタンパク質ＶＰ１６由来ＴＡＤと、Ｎ末端を有さないＬＥＦ１との間の同様に活性なキメラも試験した（ＶＰ１６−ＬＥＦ１ΔＮ（Ishitani et al., 2005 Nat.Cell.Biol.Vol.7 pp 1106-1112））（図１３、レーン４及び５）。関心を引くことに、ｃａｔＣ−ＬＥＦ１Δ５６は、トランス活性化をごくわずかしかＴｒａｂｉｄに依存せず（図１３、レーン７及び８）、Δ４５Ｓよりも依存性が有意に低かった（図１１Ｃ）。その上、ＶＰ１６−ＬＥＦ１ΔＮはＴｒａｂｉｄに全く依存せず、Ｔｒａｂｉｄが枯渇しているにかかわらず本質的に同じＴＯＰＦＬＡＳＨの用量依存的トランス活性化を示す（図１３、レーン９及び１０）。これは、ＴｒａｂｉｄがＴＣＦ−β−カテニン複合体への共活性化因子の動員を制御するように作用することを立証している。
【０２６１】
ショウジョウバエＴｒａｂｉｄはＷｉｎｇｌｅｓｓ応答の正の調節因子である
序説に指摘したように、ショウジョウバエは典型的なＴｒａｂｉｄシグネチャーを有する単一のＴｒａｂｉｄオルソログ（ｄＴｒａｂｉｄ）を有する（図８Ａ；図１６）。相同組換えによりｄＴｒａｂｉｄを欠失させることにより、ｄＴｒａｂｉｄの喪失がショウジョウバエにおけるＷｎｔシグナル伝達にも影響を及ぼすかどうかを問うた。驚くことに、ｄＴｒａｂｉｄヌル突然変異体は、生存可能及び繁殖可能であったが、これは、ｄＴｒａｂｉｄが別の遺伝子と冗長性に機能しうることを示唆している。
【０２６２】
したがって、（ｄＴｒａｂｉｄヘテロ接合体における）Ｔｒａｂｉｄの用量を半分に下げることが、眼成虫原基におけるＷｉｎｇｌｅｓｓの発現によって起こるラフアイ表現型（rough eye phenotype）に影響を及ぼすかどうかを問うことによって、さらに感度の高いアッセイでｄＴｒａｂｉｄの機能を試験した（図１４Ａ、Ｂ）。これは実際にその通りであり、ｄＴｒａｂｉｄヘテロ接合性はこの表現型を抑制し（図１４Ｃ、Ｂと比較）、これはｄＴＣＦヘテロ接合性と同様であった（図１４Ｄ）。その上、ｄＴｒａｂｉｄヘテロ接合性は、Ａｒｍａｄｉｌｌｏ（ショウジョウバエのβ−カテニン）の過剰発現が原因のラフアイ表現型もある程度抑制した（図１４Ｆ、Ｅと比較）。対照的に、ｄＴｒａｂｉｄと、ハエの眼発生における分化を制御する経路であるＥＧＦ受容体シグナル伝達の構成要素との間の遺伝的相互作用は観察されなかった。例えば、この経路の阻害剤であるＡｒｇｏｓの過剰発現が原因のラフアイ表現型は、ｄＴｒａｂｉｄヘテロ接合体で不変のままであり（図１４Ｇ、Ｈ）、これは、この経路の活性化因子であるＲｈｏｍｂｏｉｄの過剰発現が原因の表現型と同様であった。同様に、Ｎｏｔｃｈ経路の撹乱（Ｎｏｔｃｈヘテロ接合性又はＤｅｌｔａの過剰発現）が原因のラフアイ表現型もｄＴｒａｂｉｄヘテロ接合性では影響を受けなかった。これらの結果は、ショウジョウバエにおけるＷｉｎｇｌｅｓｓ応答の正の調節因子としてｄＴｒａｂｉｄを意味づけ、これは、ヒト細胞系における本発明者らの結果と一致する。さらに、これらの結果は、ｄＴｒａｂｉｄが他のシグナル伝達経路に広範囲の効果を及ぼさないことを示唆している。したがって、Ｔｒａｂｉｄ改変の副作用は少ししかないことが本発明の長所である。
【０２６３】
実施例１３に関する方法：
プラスミド及び抗体
pHM6-HA-Trabid及びpHM6-HA-Cezanne（Evans et al., 2003; Evans et al., 2001）は、Paul Evans博士から親切に提供いただき、点突然変異体は、QuickChange（Stratagene社製）を使用して創出し、ＤＮＡ配列決定により確認した。ＧＳＴ−Ｔｒａｂｉｄ構築物について、細菌発現ベクターpGEX-6P-1のEcoRIとXhoIとの間に、ＰＣＲ増幅したＴｒａｂｉｄ  ｃＤＮＡ断片をクローニングした。使用した抗体は、以下の通り、すなわち抗ＴＣＦ４抗体、抗ＴＣＦ３／４抗体、及び抗ユビキチン抗体（Upstate社製）、抗β−カテニン抗体、及び抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（Sigma社製）、抗パラフィブロミン抗体（Bethyl Laboratories社製）、抗ＨＡ  ３Ｆ１０抗体（Roche社製）、抗ＬＥＦ１抗体及び抗ＴＬＥ抗体（Santa Cruz社製）、抗α−チューブリン抗体（Abcam社製）であった。Ｔｒａｂｉｄに対するポリクローナル抗体は、ＴｒａｂｉｄのＮ末端（アミノ酸１〜３５４）をラットに免疫し、ＧＳＴと融合させ、細菌から精製することにより作製した（Eurogentec社製）。ウエスタンブロットのために粗抗ラットＴｒａｂｉｄ抗血清を１：１００希釈して使用した。
【０２６４】
細胞、トランスフェクション、及び処理
ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＳＷ４８０、及びＨＣＴ−１１６細胞は、１０％ウシ胎仔血清を補充したダルベッコ変法イーグル培地中で維持した。Ｔｒａｂｉｄ及びＣｅｚａｎｎｅ  ｍＲＮＡをターゲティングするために使用した小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ，small interfering RNA）（Dharmacon社製）二本鎖は以下の通りである（センス鎖のみを示す）：Ｔｒａｂｉｄ＃１、AGA GGC UUC UUC AAU AAU AdTdT；Ｔｒａｂｉｄ＃２、AGA GGU GUC UCA ACA AGC AdTdT；Ｃｅｚａｎｎｅ＃１、GAA UCU AUC UGC CUU UGG AdTdT；Ｃｅｚａｎｎｅ＃２、AGA CUU CCG CAG CUU CAU AdTdT。陰性対照ｓｉＲＮＡはAmbion社から購入した（カタログ番号ＡＭ４６１１）。ｓｉＲＮＡ二本鎖及びプラスミドＤＮＡのトランスフェクションは、リポフェクタミン２０００（Invitrogen Life Technologies社製）を使用して行った。
【０２６５】
ＴＯＰＦＬＡＳＨ及びＮＦ−κＢレポーターアッセイ
細胞を１２ウェルプレートに０．８×１０５細胞／ｍｌの密度で蒔き、皿の表面に１２〜１６時間付着させてからトランスフェクションを行った。ＲＮＡｉ実験について、細胞に最初ｓｉＲＮＡ（終濃度１００ｎＭ）をトランスフェクトし、別に規定しない限り、２４時間後に２５０ｎｇのpTOPFLASH又はpFOPFLASH、２０ｎｇのpRL-CMV（ウミシイタケルシフェラーゼ内部対照）、及び１．０μｇのエフェクタープラスミドＤＮＡを再トランスフェクトした。ＮＦ−κＢアッセイについて、４×ＮＦ−κＢ結合部位を含有するルシフェラーゼレポーター（Clontech社製）と、示した場合にはpEAK12-HA-TNFRII及びpEAK12-IκB□DN（Ｓ３２Ａ、Ｓ３６Ａ）とを細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション１回あたりのＤＮＡの合計量は、空のベクターと等しくした。さらに２４時間後に、細胞を回収し、受動的溶解緩衝液（Dual Luciferase Reporter Assay System、Promega社製）中で溶解させた。タンパク質濃度は、クマシー系試薬（Pierce社製）で測定し、１０μｇの合計タンパク質を１試料につき使用した（ＴＯＰＦＬＡＳＨアッセイ又はウエスタンブロット用）。各転写アッセイについて、対照細胞からの相対ルシフェラーゼ活性を任意に１に設定し、実験的アッセイからの値を対照に対する誘導倍率として表現した。
【０２６６】
免疫沈降及びＧＳＴプルダウンアッセイ
接着細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＮＰ４０溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、５ｍＭ  ＮａＦ、０．５μｇ／ｍｌアプロチニン、１μｇ／ｍｌロイペプチン）に入れて氷上で１０分間インキュベートした。細胞を掻き取ることによって収集し、１４０００ｒｐｍで１０分間（４℃）遠心分離した。免疫沈降は、プロテインＧ−セファロースビーズ（１００μＬ、Zymed社製）の５０％溶液を用いて予備清澄化した細胞抽出物５００〜７００μｇを使用して免疫沈降を行い、その後表示した抗体４μｇと共に４℃で２時間インキュベートした。５０％プロテインＧビーズ１００μＬを用いて４℃で１時間抗体−抗原複合体を捕捉した。グルタチオン−セファロース４Ｂビーズ（５０μＬ、Amersham社製）の５０％溶液にカップリングした、細菌に発現させた１μｇのＧＳＴ又はＧＳＴ−Ｔｒａｂｉｄを用いてＧＳＴプルダウンアッセイを行い、上記のように５００〜７００μｇの細胞抽出物又はＫ４８若しくはＫ６３結合のユビキチン鎖（Ｕｂ２〜７、Affiniti社製）と共にインキュベートした。沈降したタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分割し、ウエスタンブロットにより分析した。核画分及び細胞質画分は、記載されたように調製した（Caruccio and Banerjee, 1999）。
【０２６７】
ＤＵＢアッセイ
アッセイは、記載されたものを改変して行った（Wang et al., 2004）。上記のようにＧＳＴ−Ｔｒａｂｉｄ構築物（１μｇ）を緩衝液（１５０ｍＭ  ＫＣｌ、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ  ＤＴＴ、５％グリセロール、０．０１％トリトンＸ−１００）２０μｌ中で３７℃で６０分間、合成ユビキチン鎖０．５μｇと共にインキュベートした。２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液で反応を終了させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分割し、ウエスタンブロットにより分析した。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）及びＧＳＴ−Ｔｒａｂｉｄタンパク質を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に発現させ、供給業者の説明書通りにグルタチオン−セファロースビーズ（Amersham社製）を使用して精製した。ユビキチンアルデヒドをCalbiochem社から購入した。
【０２６８】
リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ
２９３細胞を１２ウェルプレートに生育させ、ｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、２４時間後にＷｎｔ３Ａ馴化培地（Ｗｎｔ３Ａを安定発現するマウスＬ細胞由来）又は対照培地（マウスＬ細胞由来）と共にさらに６時間インキュベートした。細胞を氷冷ＰＢＳに回収し、説明通りにSuperscript IIIキット（Invitrogen社製）を用いたｃＤＮＡ合成に直接使用した。２回繰り返しのｃＤＮＡ試料をTaqMan Universal PCR Master Mix及び遺伝子特異的TaqMan TAMRAプローブを用いてABI Prism 7900HT機（Applied Biosystems社製）で増幅させた。標準曲線は、発現がＷ３ａ−ＣＭ処理に影響を受けないハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴに基づいた。結果をＨＰＲＴ値に対する割合として表現する。
【０２６９】
ショウジョウバエの交雑
相同組換えによりｄＴｒａｂｉｄ（ＣＧ９４４８）の欠失を作製した（Gong and Golic, 2003；Rong and Golic, 2001）。ｄＴｒａｂｉｄ／ＴＭ３又はｙ  ｗ対照ハエをｓｅｖ−ｗｇ（Brunner et al., 1997）、ＧＭＲ．ＧＡＬ４＞ＵＡＳ．Ａｒｍａｄｉｌｌｏ（Freeman and Bienz, 2001;Greaves et al., 1999）と交雑させ、２５℃で生育させた。結果として生じたヘテロ接合後代の眼を記載されたように評点した（Freeman and Bienz, 2001）。強いｄＴＣＦ３アレルを使用した（van de Wetering et al., 1997）。
【０２７０】
上記明細書に言及した全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれている。記載された本発明の方法及び組成物の様々な改変及び変形は、本発明の範囲から逸脱せずに当業者に明らかであろう。本発明を特定の好ましい実施形態に関連して記載したが、請求された本発明が、このような特定の実施形態に不当に限定されてはならないことを了解すべきである。実際に、生化学及びバイオテクノロジー又は関係する分野の技術者に明らかな、本発明を実施するための記載された様式の様々な改変は、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図される。
【０２７１】
略式の配列表
Ｔｒａｂｉｄに対するｓｉＲＮＡ（番号１）
AGA GGT GTC TCA ACA AGC A
Ｔｒａｂｉｄに対するｓｉＲＮＡ（番号２）
AGA GGC TTC TTC AAT AAT A
ｓｉＲＮＡ  Ｔｒａｂｉｄ＃１、AGA GGC UUC UUC AAU AAU AdTdT;
ｓｉＲＮＡ  Ｔｒａｂｉｄ＃２、AGA GGU GUC UCA ACA AGC AdTdT;
ｓｉＲＮＡ  Ｃｅｚａｎｎｅ＃１、GAA UCU AUC UGC CUU UGG AdTdT;
ｓｉＲＮＡ  Ｃｅｚａｎｎｅ＃２、AGA CUU CCG CAG CUU CAU AdTdT
【図１】
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【図２】
2009538124.tif 000004
【図３−１】
2009538124.tif 000005
【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
2009538124.tif 000009
【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2009538124.tif 000013
【図１０−１】
2009538124.tif 000014
【図１０−２】
2009538124.tif 000015
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年4月30日(2009.4.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｒａｂｉｄ活性を低減させることを特徴とするＴＣＦの転写低減剤。
【請求項２】
Ｔｒａｂｉｄに対するｓｉＲＮＡ又はドミナントネガティブＴｒａｂｉｄを用いて、Ｔｒａｂｉｄ活性を低減させることを特徴とする、請求項１に記載のＴＣＦの転写低減剤。
【請求項３】
ＴＣＦの転写が、Ｄｖｌ、Ｗｎｔ３Ａ、ＬｉＣｌ、ＡＰＣの喪失若しくは突然変異、β−カテニンの活性化若しくは突然変異、又は、ｍβ−ＴｒＣｐ−ΔＦによって刺激されることを特徴とする、請求項１又は２記載のＴＣＦの転写低減剤。
【請求項４】
Ｔｒａｂｉｄを含むことを特徴とするポリペプチドの脱ユビキチン化剤。
【請求項５】
脱ユビキチン化がＫ６３ユビキチンの切断を含む、請求項４に記載の脱ユビキチン化剤。
【請求項６】
Ｔｒａｂｉｄが少なくともＣ末端卵巣腫瘍（ＯＴＵ）ドメイン又はＮ末端ＮＺＦフィンガーモチーフを含む、請求項４又は５に記載の脱ユビキチン化剤。
【請求項７】
Ｔｒａｂｉｄが完全長ヒトＴｒａｂｉｄポリペプチドを含む、請求項４〜６のいずれかに記載の脱ユビキチン化剤。
【請求項８】
Ｔｒａｂｉｄ阻害剤を有効成分として含むことを特徴とする結腸直腸癌の治療用医薬組成物。
【請求項９】
Ｔｒａｂｉｄ阻害剤を有効成分として含むことを特徴とする家族性大腸ポリポーシスの治療用医薬組成物。
【請求項１０】
Ｔｒａｂｉｄ阻害剤が、Ｔｒａｂｉｄに対するｓｉＲＮＡであるか、又はＴｒａｂｉｄドミナントネガティブである、請求項８又は９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
Ｔｒａｂｉｄを含むことを特徴とするユビキチンを含むポリペプチドの沈殿剤。
【請求項１２】
Ｔｒａｂｉｄの調節因子を同定する方法であって、
（ｉ）ユビキチンによりタグ部分にカップリングした検出可能な部分を含む、Ｔｒａｂｉｄ基質を用意すること、
（ii）前記基質の第１及び第２の部分を固定化すること、
（iii）前記第１の部分に調節因子候補を添加すること、
（iv）前記第１及び第２の部分をＴｒａｂｉｄと接触させること、
（ｖ）インキュベートしてＴｒａｂｉｄを作用させること、並びに
（vi）前記検出可能な部分から前記タグを分離することにより前記ユビキチンの切断をアッセイすること
を含み、第１の部分から分離された検出可能な部分の量が、第２の部分から分離された検出可能な部分の量と異なるときに、前記候補を、Ｔｒａｂｉｄの調節因子として同定する方法。
【国際調査報告】
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