(57)【要約】  背最長筋ピーク力、筋肉内脂肪、小売牛肉歩留および正味飼料摂取量および／またはその構成成分形質から成る群から選択されるウシ科動物における形質の査定方法であって、以下の：（１）ウシ科動物または屠体から核酸を提供し；（２）単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の出現に関して査定するが、この場合、本明細書中に記述されるような上記ヌクレオチド出現の同定が背最長筋ピーク力、筋肉内脂肪沈着、小売牛肉歩留または正味飼料摂取量に関連するステップを包含する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
背最長筋ピーク力、筋肉内脂肪、小売牛肉歩留および正味飼料摂取量および／またはその構成成分形質から成る群から選択されるウシ科動物における形質の査定方法であって、以下の：
（１）ウシ科動物または屠体から核酸を提供し；
（２）配列番号１〜１６３５のうちのいずれか１つで同定される単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の出現に関して査定するが、この場合、（ａ）配列番号１１７１〜１６３１のいずれか１つで記述されるような前記ヌクレオチド出現の同定が背最長筋ピーク力における変異と関連し；（ｂ）配列番号２１４〜８４２のいずれかでは、筋肉内脂肪沈着に関連し；（ｃ）配列番号８４３〜１１７０のいずれか１つでは、小売牛肉歩留に関連し；そして（ｄ）配列番号１〜２１３または１６３２〜１６３５のいずれか１つでは、正味飼料摂取量および／またはその構成成分形質に関連する
ステップを包含する方法。
【請求項２】
ウシ科動物の集団内のウシ科動物の選択方法であって、以下の：
（１）ウシ科動物から核酸試料を提供し；
（２）配列番号１〜１６３５のうちのいずれか１つで同定される単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の出現に関して査定するが、この場合、（ａ）配列番号１１７１〜１６３１のいずれか１つで記述されるような前記ヌクレオチド出現の同定が背最長筋ピーク力における変異と関連し；（ｂ）配列番号２１４〜８４２のいずれかでは、筋肉内脂肪沈着に関連し；（ｃ）配列番号８４３〜１１７０のいずれか１つでは、小売牛肉歩留に関連し；そして（ｄ）配列番号１〜２１３または１６３２〜１６３５のいずれか１つでは、正味飼料摂取量および／またはその構成成分形質に関連し；そして
（３）所望の形質の増強を示すウシ科動物を選択する
ステップを包含する方法。
【請求項３】
核酸がＤＮＡである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＤＮＡハイブリダイゼーション検定がヌクレオチド出現を検出するために用いられる、請求項３記載の方法。
【請求項５】
増幅検定がヌクレオチド出現を検出するために用いられる、請求項３記載の方法。
【請求項６】
増幅検定がＰＣＲである、請求項７記載の方法。
【請求項７】
ＤＮＡが多型を含有する少なくとも10連続ヌクレオチドの配列番号１〜１６３５のいずれか1つで記述される配列またはその断片を含む、請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ウシ科動物が畜牛である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
畜牛がアンガス、アンコレ・アトゥシ、エアーシャー、バザダイス、ビーファロー、ビーフマスター、ベルジャンブルー、ベルモントレッド、ブロンド・アキテーヌ、ボンスマラ、ブラフォード、ブラーマン、ブラーマウシン、ブランガス、ブラウンビュー、ブリティッシュホワイト、アメリカンブラウンスイス、ブエリンゴ、シャロレ、キアーナ、コリエンテ、アメリカンデボン、デクスターズ、ドラウトマスター、ギャロウエイ、ゲルブビュー、ガーンジー、ヘレフォード、ハイランド、ホルスタイン、ジャージー、リムーザン、ローライン、メイン・アンジョウ、マルキジャーナ、ミルキング・ショートホーン、モンベリエール、マレーグレイ、ノルマンディ、Parthenaise、ピエドモンテーゼ、ピンツガウアー、ロマニョーラ、サレール、Salorn、サンタ・ガートルーディス、シェトランド、ショートホーン、シンメンタール、サウスデボン、タランテーズ、テキサスロングホーンおよび和牛から成る群から選択される交雑種または純粋種である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
雌牛がアンガス、ショートホーン、ヘレフォード、マレーグレイ、ブラーマン、ベルモントレッドおよびサンタ・ガートルーディスから成る群から選択される交雑種または純粋種である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
別個の物理的位置に複数の核酸、例えば多型を含有する少なくとも10連続ヌクレオチドの配列番号１〜１６３５で記述される少なくとも1つの核酸またはその断片をその上に固定されて含む固体支持体または表面。
【請求項１２】
配列番号１〜１６３５のうちのいずれか１つで同定される単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の出現を検出することによる背最長筋ピーク力、筋肉内脂肪、小売牛肉歩留および正味飼料摂取量および／またはその構成成分形質から成る群から選択されるウシ科動物における形質の査定のためのキットであって、（ａ）配列番号１１７１〜１６３１のいずれか１つで記述されるような前記ヌクレオチド出現の同定が背最長筋ピーク力における変異と関連し；（ｂ）配列番号２１４〜８４２のいずれかでは、筋肉内脂肪沈着に関連し；（ｃ）配列番号８４３〜１１７０のいずれか１つでは、小売牛肉歩留に関連し；そして（ｄ）配列番号１〜２１３または１６３２〜１６３５のいずれか１つでは、正味飼料摂取量および／またはその構成成分形質に関連するキットであり、前記ヌクレオチド出現を確定するためのオリゴヌクレオチドプローブ、プライマーまたはプライマー対、あるいはその組合せを包含するキット。
【請求項１３】
配列番号１〜１６３５のいずれか一項で記述される単一ヌクレオチド多型の出現を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブ、プライマーまたはプライマー対。
【請求項１４】
背最長筋ピーク力、筋肉内脂肪、小売牛肉歩留および正味飼料摂取量および／またはその構成成分形質から成る群から選択されるウシ科動物における形質の査定方法であって、以下の：
（１）ウシ科動物または屠体から核酸を提供し；
（２）遺伝子における、例えば前記遺伝子中のコード配列、イントロン、プロモーターおよびその他の調節配列における多型の、あるいは前記遺伝子における多型との連鎖不均衡における多型の出現に関して査定するが、この場合、前記遺伝子がCLCA4〜CLCA3、ABCC4、RPL11、TULP3、TRPC4、C6orf32、TPT1、GTF3C2、SLC6A15、CTNNA3、DDX46、HS2ST1、NDUFS3、PMS2、TMEM47、CEP1、CAP2、IMPG2、BAZ2B、SENP7、IMPG2、EFCBP2、DCP2、XBPP1、LAMA3、シナプトタグミン X（SYT 10）、DMD、EMR2、ZNF33A、DNM1L、GBAS、SEC5L1、ATP1A1、YES1、BSN、POU4F1、SLIT3、ROBO1、KRT1-23、DDX10、GRM1およびBAATから成る群から選択され、前記ヌクレオチド出現の同定が、（ａ）CLCA4〜CLCA3、ABCC4、RPL11、TULP3、TRPC4およびC6orf32のいずれか１つでは、背最長筋ピーク力における変異と関連し；（ｂ）TPT1、GTF3C2、SLC6A15、CTNNA3、DDX46、HS2ST1、NDUFS3、PMS2およびTMEM47のいずれかでは、筋肉内脂肪沈着に関連し；（ｃ）CEP1、CAP2、IMPG2、BAZ2B、SENP7、IMPG2、EFCBP2、DCP2、XBPP1およびLAMA3のいずれか１つでは、小売牛肉歩留に関連し；そして（ｄ）シナプトタグミン X（SYT 10）、DMD、EMR2、ZNF33A、DNM1L、GBAS、SEC5L1、ATP1A1、YES1、BSN、POU4F1、ROBO1、KRT1-23、DDX10およびBAATのいずれか１つでは、正味飼料摂取量および／またはその構成成分形質に関連する
ステップを包含する方法。
【請求項１５】
ウシ科動物の集団内のウシ科動物の選択方法であって、以下の：
（１）ウシ科動物から核酸試料を提供し；
（２）遺伝子における、例えば前記遺伝子中のコード配列、イントロン、プロモーターおよびその他の調節配列における多型の、あるいは前記遺伝子における多型との連鎖不均衡における多型の出現に関して査定するが、この場合、前記遺伝子がCLCA4〜CLCA3、ABCC4、RPL11、TULP3、TRPC4、C6orf32、TPT1、GTF3C2、SLC6A15、CTNNA3、DDX46、HS2ST1、NDUFS3、PMS2、TMEM47、CEP1、CAP2、IMPG2、BAZ2B、SENP7、IMPG2、EFCBP2、DCP2、XBPP1、LAMA3、シナプトタグミン X（SYT 10）、DMD、EMR2、ZNF33A、DNM1L、GBAS、SEC5L1、ATP1A1、YES1、BSN、POU4F1、SLIT3、ROBO1、KRT1-23、DDX10、GRM1およびBAATから成る群から選択され、前記ヌクレオチド出現の同定が、（ａ）CLCA4〜CLCA3、ABCC4、RPL11、TULP3、TRPC4およびC6orf32のいずれか１つでは、背最長筋ピーク力における変異と関連し；（ｂ）TPT1、GTF3C2、SLC6A15、CTNNA3、DDX46、HS2ST1、NDUFS3、PMS2およびTMEM47のいずれかでは、筋肉内脂肪沈着に関連し；（ｃ）CEP1、CAP2、IMPG2、BAZ2B、SENP7、IMPG2、EFCBP2、DCP2、XBPP1およびLAMA3のいずれか１つでは、小売牛肉歩留に関連し；そして（ｄ）シナプトタグミン X（SYT 10）、DMD、EMR2、ZNF33A、DNM1L、GBAS、SEC5L1、ATP1A1、YES1、BSN、POU4F1、ROBO1、KRT1-23、DDX10およびBAATのいずれか１つでは、正味飼料摂取量および／またはその構成成分形質に関連する；そして
（３）所望の形質の増強を示すウシ科動物を選択する
ステップを包含する方法。
【請求項１６】
遺伝子における、例えば前記遺伝子中のコード配列、イントロン、プロモーターおよびその他の調節配列における単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の、あるいは前記遺伝子における多型との連鎖不均衡における多型の出現を検出することによる背最長筋ピーク力、筋肉内脂肪、小売牛肉歩留および正味飼料摂取量および／またはその構成成分形質から成る群から選択されるウシ科動物における形質の査定のためのキットであって、この場合、前記遺伝子がCLCA4〜CLCA3、ABCC4、RPL11、TULP3、TRPC4、C6orf32、TPT1、GTF3C2、SLC6A15、CTNNA3、DDX46、HS2ST1、NDUFS3、PMS2、TMEM47、CEP1、CAP2、IMPG2、BAZ2B、SENP7、IMPG2、EFCBP2、DCP2、XBPP1、LAMA3、シナプトタグミン X（SYT 10）、DMD、EMR2、ZNF33A、DNM1L、GBAS、SEC5L1、ATP1A1、YES1、BSN、POU4F1、SLIT3、ROBO1、KRT1-23、DDX10、GRM1およびBAATから成る群から選択され、前記ヌクレオチド出現の同定が、（ａ）CLCA4〜CLCA3、ABCC4、RPL11、TULP3、TRPC4およびC6orf32のいずれか１つでは、背最長筋ピーク力における変異と関連し；（ｂ）TPT1、GTF3C2、SLC6A15、CTNNA3、DDX46、HS2ST1、NDUFS3、PMS2およびTMEM47のいずれかでは、筋肉内脂肪沈着に関連し；（ｃ）CEP1、CAP2、IMPG2、BAZ2B、SENP7、IMPG2、EFCBP2、DCP2、XBPP1およびLAMA3のいずれか１つでは、小売牛肉歩留に関連し；そして（ｄ）シナプトタグミン X（SYT 10）、DMD、EMR2、ZNF33A、DNM1L、GBAS、SEC5L1、ATP1A1、YES1、BSN、POU4F1、ROBO1、KRT1-23、DDX10およびBAATのいずれか１つでは、正味飼料摂取量および／またはその構成成分形質に関連するキットであり、前記ヌクレオチド出現を確定するためのオリゴヌクレオチドプローブ、プライマーまたはプライマー対、あるいはその組合せを包含するキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、ウシ科動物における選択形質の査定方法に関する。特に本発明は、（１）背最長筋ピーク力（ＬＤＰＦ）（ワーナー・ブラッツラー剪断力（ＷＢＳ）とも呼ばれ、「肉の柔らかさ」として消費者に既知の（そして本明細書中で言及される）特質を示す背最長筋における肉の柔らかさの測定値である）、（２）動物における筋肉内脂肪沈着（これは順次、肉中の「霜降り」の特質に影響を及ぼす）、（３）小売牛肉歩留（ＲＢＹ）および（４）正味飼料摂取量（ＮＦＩ）から選択される形質の査定方法に関する。本発明は、育種のために、あるいは食用に解体処理されるよう予定された動物を選択するための望ましい肉の柔らかさ形質を示す動物の選択のために；肉中の高レベルの霜降りを生じる能力に関する動物の選択において；育種のためのまたは肥育加工におけるＲＢＹにおいて望ましい形質を示す動物の選択のために；そして同一生体重増加のためにより少なく食するウシを生産する目的での食物の利用の効率のための動物の選択において有用である。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
肉の柔らかさ、筋肉内脂肪、小売牛肉歩留および正味飼料摂取量という特質は、消費者需要ならびに牛肉生産の経済的側面に影響を及ぼすウシの重要な特質である。
肉の柔らかさは消費者にとって重要な問題であり、そして市場において特に柔らかい肉が高値で売れるのに十分に需要量に影響を及ぼし得るものである。死後期間中の筋肉構造における生理学的変化は複雑であるが、しかし明らかに肉の柔らかさにおける少なくとも1つの因子であると思われる。
【０００３】
内因性カルシウム依存性プロテイナーゼであるカルパインは、in vivo筋肉タンパク質分解を開始する、と理論的に想定されている。特にカルパインは、肉の柔らかさに密接に関連する筋原繊維の分解に関与する、と考えられる。タンパク質カルパスタチンは、カルパイン活性を調節する。リシルオキシダーゼの作用は、コラーゲン原繊維発生において架橋形成を開始することである。われわれの国際公開公報02/064820は、カルパスタチン（ＣＡＳＴ）をコードする遺伝子および／またはリシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）をコードする遺伝子中の遺伝子マーカーに関して試験することにより牛肉中の柔らかさを査定するための方法を記載する。
それにしても、遺伝子マーカーを用いて肉の柔らかさを改善するための包括的系は存在しない。
【０００４】
動物が脂肪を代謝するやり方は、農業および畜産業においてかなりの経済的有意性を有する。いくつかの市場において、小脂肪沈着物または「霜降り」の形態での、肉中の高含量の脂肪は非常に望ましいとみなされ、したがってウシにおける肉の重度の霜降りを誘導する努力がなされる。特に動物は、市場取引および解体処理前に少なくとも短時間、穀物を与えられる。他の市場では、非常に脂肪分の少ない肉が選択される。したがって筋肉中に脂肪を沈着するウシ科動物の性向が査定され得る方法に対する必要性が存在する。
【０００５】
筋肉内または霜降り脂肪は、筋肉の束間でウシ中に沈着され、そして通常は、動物が長期間高カロリー餌を与えられると発現する。霜降り脂肪の量は、脂質濃度として、または標準化霜降りスコア（例えばオーストラリアＡＵＳＭＥＡＴ基準）として表わされる。皮下または腎臓蓄積所に沈着される脂肪と違って、霜降り脂肪は動物の発達のかなり後期まで継続的に沈着され、そしてこの脂肪の量は筋肉束中に見出される脂肪細胞（fat cellまたはadipocyte）の数と強く相関する。脂肪細胞の分化において重要である因子のいくつかは既知であるが、しかし束間脂肪細胞の分化および発達ならびに脂肪の沈着における個体間の差に関与する遺伝因子は、高または低霜降りスコアをもたらす遺伝的変異体であったので、近年まで不明であった。
【０００６】
脂質代謝の遺伝的基礎は研究されており、そしてわれわれの国際公開公報WO99/23248は、（ａ）サイログロブリンをコードする遺伝子の５’非翻訳領域；（ｂ）レチノイン酸受容体ガンマ（ＲＡＲＧ）をコードする遺伝子；ならびに（ｃ）１１‐シス、９‐シスレチノールデヒドロゲナーゼ（ＲＤＨ５）と関連したＤＮＡマーカーが用いられたウシ科動物における脂質代謝を査定する方法を記載する。特に、いくつかのマーカーは、筋肉組織中の脂肪沈着増大と関連づけられた。レチノイド関連オーファン受容体Ｃ（ガンマ）（ＲＯＲＣ）における多型も、われわれの国際公開公報WO2004/070055に記載されたように、筋肉組織中の脂肪沈着増大と関連することが判明している。
【０００７】
したがって脂質代謝および霜降り作用と関連した多数のＤＮＡマーカーが報告されているが、しかし霜降りを改善するための包括的系は存在しない。
小売牛肉歩留は、屠体から得られるかまたは販売され得る肉の量である。明らかに、屠体のすべてが食肉用に販売され得るというわけではなく、かなりの量の脂肪が切り離されそして油を採取されるが、一方、骨は小売切片にほとんど含まれない。皮膚、蹄および角は直ちに副産物運搬レールに入る。そこで動物の屠体重量は分配され、そして小売歩留は副産物に関連した運搬レールに入るものより非常に高い価格を伴う。脂肪および骨の量は任意の重量での動物間で有意に変わるため、最終重量に関するウシの購入は効率的でなく、そして屠体から得られる小売牛肉歩留の量の予測方法が一般的に用いられるが、しかしいくつかの方法は精度に限界がある。
【０００８】
小売牛肉歩留は、屠体から徹底的に骨を除くことにより測定され得るが、これは多くの時間を要し且つ費用が掛かり、そして育種は直接的に測定され得ない雄親の育種値を参照することにより間接的に成され得るだけである。それは、ＶＩＡＳＣＡＮ技術により、あるいはＰ８脂肪厚および屠体重量の比較により、種々の程度の精度で概算され得る。それらの性質により、これは飼育場入場時に正確に動物を選択させるわけではなく、これらの方法を用いる育種は加工業者から生産者への強力なフィードバックを要する。このようなフィードバックは通常は、育種を増強するための垂直統合型企業で起こり得る。
小売牛肉歩留のために一般に履行されるＤＮＡマーカーは存在しない。
【０００９】
飼料効率のために直接的に選択することは、長い間、世界の生産者の目標であった。形質は、牛肉農業経営有益性の重要な素子であるが、但し、ウシ育種会社における飼料資源の約80％が育種雌により消費される。飼料効率増大は、飼料資源が不十分であるかまたは牧草地が乏しい地域における牛肉農業経営の持続可能性にも関連する。
【００１０】
育種目的は飼料転換効率の改良であるが、その現象を測定するために用いられる形質は「正味飼料摂取量」（ＮＦＩ）と呼ばれる。簡単に言えば、これはウシ動物体が食する飼料の量であり、動物のサイズ（体重）および成長率から予測される量より下であるかまたはそれを上回る。より効率的なウシは、同一体重増分に関してより少ない正味飼料摂取量を有する者であり、即ち、効率的なウシであるほどその動物のサイズおよび成長率が示唆するより食する量が少ない。
【００１１】
正味飼料摂取量は、測定するのに費用が掛かり且つ困難である。それは300ドル／動物までを要し、そして試験が成され得る限定認可施設が存在する。個々の飼料摂取量は一般に、70日の一試験期間組に亘って測定され、この時間標準中、中エネルギー干草および穀物飼料が提供される。試験ウシを定期的に計量し、それらの摂取量をそれらの成長実績と比較して、それらが予測よりも多く食べていたかまたは少なくて食べていたかを確定する。ＮＦＩ結果は、食べた餌のキログラム／日として報告され、そして一般的に品種平均より上かまたは下の量として表わされる。餌利用における動物（およびその子孫）は、数が負であるほど、効率は高い。
【００１２】
正味飼料摂取量は中等度に遺伝性であるため、形質は直接選択により改善され得る。正味飼料接触量を直接測定することの困難性にかんがみて、形質に関する遺伝子マーカー試験が望ましい。
インスリン様成長因子（ＩＧＦ‐１）に関する血液試験の使用は、National Beef Recording Scheme BREEDNOTE 04/1 - January 2004に記載されている。ＩＧＦ‐１は中等度遺伝性（0.4）であり、そしてＮＦＩと相関する（0.6 低ＩＧＦ‐１、より効率的）。当該試験は一般にアンガスおよびヘレフォード群に適用可能であり、そして他の品種はデータが利用可能になる場合に従う、と予測される。しかしながら当該試験は精密さを欠き、あるウシは依然として飼料摂取量に関して測定される必要がある。
【発明の開示】
【００１３】
発明の要約
本発明人等は、背最長筋ピーク力（ＬＤＰＦ）（肉の柔らかさを示す）、筋肉内脂肪沈着（これは霜降りを示す）、小売牛肉歩留および正味飼料摂取量特質に関する遺伝子マーカーとして作用する多数の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を同定した。したがって本発明は、関連形質に関する遺伝子変異に関する迅速且つ精確な試験を可能にし、これは、費用効果的やり方で、短期間の間に多数のウシが試験されるようにして、これらの特質を確立する。
【００１４】
本発明の第一の態様では、背最長筋ピーク力、筋肉内脂肪、小売牛肉歩留および正味飼料摂取量および／またはその構成成分形質から成る群から選択されるウシ科動物における形質の査定方法であって、以下の：
（１）ウシ科動物または屠体から核酸を提供し；
（２）配列番号１〜１６３５のうちのいずれか1つで同定される単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の出現に関して査定するが、この場合、（ａ）配列番号１１７１〜１６３１のいずれか１つで記述されるような上記ヌクレオチド出現の同定が背最長筋ピーク力における変異と関連し；（ｂ）配列番号２１４〜８４２のいずれかでは、筋肉内脂肪沈着に関連し；（ｃ）配列番号８４３〜１１７０のいずれか１つでは、小売牛肉歩留に関連し；そして（ｄ）配列番号１〜２１３または１６３２〜１６３５のいずれか１つでは、正味飼料摂取量および／またはその構成成分形質に関連する
ステップを包含する方法が提供される。
【００１５】
対立遺伝子または遺伝子型と値増大との関連は、しばしば品種および品種内の科全体に当てはまる、と理解される。しかしながら特定の対立遺伝子または遺伝子型が、品種全体の値増大と常に関連するわけではない；ある品種においては、対立遺伝子または遺伝子型は、値増大と関連し得るが、しかし別の品種では、それは値低減と関連し得るし、あるいは値の差異と関連しない。当業者は、関連の方向を確定し得る。
検定は、核酸試料中のＳＮＰの各形態のコピーの数を確定し得る定量的検定であるのが有益である。一実施形態では、検定は、配列番号１〜１６３５で記述されるＤＮＡ分子またはＳＮＰを含有するこれらの一部分、ならびにその相補体を増幅するよう設計された独特のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。しかしながら他のＤＮＡベースの方法、例えばプライマー伸長およびオリゴヌクレオチド結紮検定が用いられ得る。既知の配列のＤＮＡの増幅のための適切な方法は当業者により十分に理解され、そしてこのような技法の適用は、例えばWO03/031592（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に広範に記載されている。
【００１６】
本発明のさらなる態様によれば、ウシ科動物の集団内のウシ科動物の選択方法であって、以下の：
（１）ウシ科動物から核酸試料を提供し；
（２）配列番号１〜１６３５のうちのいずれか１つで同定される単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の出現に関して査定するが、この場合、（ａ）配列番号１１７１〜１６３１のいずれか１つで記述されるような上記ヌクレオチド出現の同定が背最長筋ピーク力における変異と関連し；（ｂ）配列番号２１４〜８４２のいずれかでは、筋肉内脂肪沈着に関連し；（ｃ）配列番号８４３〜１１７０のいずれか１つでは、小売牛肉歩留に関連し；そして（ｄ）配列番号１〜２１３または１６３２〜１６３５のいずれか１つでは、正味飼料摂取量および／またはその構成成分形質に関連し；そして
（３）所望の形質の増強を示すウシ科動物を選択する
ステップを包含する方法が提供される。
【００１７】
これに基づいて選択される動物は、動物の身体的特質を最大にするために、ウシ科動物の残りの集団から分類され、別の仕方で管理され得る。この方法により選択される動物は、上記の動物からの育種の目的のために選択され、あるいはこの特質を示す動物からの始原細胞はウシ科動物をクローニングするための方法に用いられ得る。
【００１８】
本発明の単一ヌクレオチド多型は、以下の表に記述されており、そして多型の説明を提示し、３‘＆５’フランキング配列を示す配列表は電子的にファイルされている。本発明の配列番号と多型との間の相関は、種々の表に列挙されている。したがって一実施形態では、本発明は、配列番号１〜１６３５で記述されるような核酸のいずれか1つの一部を検出することを包含する。
【００１９】
本発明のさらなる態様によれば、別個の物理的位置に複数の核酸、例えば多型を含有する少なくとも10連続ヌクレオチドの配列番号１〜１６３５で記述される少なくとも1つの核酸またはその断片をその上に固定されて含む固体支持体または表面が提供される。例えば本発明の核酸またはそれらの配列の一部は、マイクロアレイの一部または全部として用いられ得る。
【００２０】
付加的には、プライマーまたはプローブは、配列番号１〜１６３５のうちのいずれか１つ、またはその相補的配列とハイブリダイズするためにそこに記載されたように設計され得る。
本発明のさらなる態様によれば、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の出現を検出することによる背最長筋ピーク力、筋肉内脂肪、小売牛肉歩留および正味飼料摂取量および／またはその構成成分形質から成る群から選択されるウシ科動物における形質の査定のためのキットであって、（ａ）配列番号１１７１〜１６３１のいずれか１つで記述されるような上記ヌクレオチド出現の同定が背最長筋ピーク力における変異と関連し；（ｂ）配列番号２１４〜８４２のいずれかでは、筋肉内脂肪沈着に関連し；（ｃ）配列番号８４３〜１１７０のいずれか１つでは、小売牛肉歩留に関連し；そして（ｄ）配列番号１〜２１３または１６３２〜１６３５のいずれか１つでは、正味飼料摂取量および／またはその構成成分形質に関連するキットであり、ＳＮＰのヌクレオチド出現を確定するためのオリゴヌクレオチドプローブ、プライマーまたはプライマー対、あるいはその組合せを包含するキットが提供される。
【００２１】
キットがさらに１つまたは複数の検出可能標識を含むことは、有益である。
本発明のさらなる態様によれば、配列番号１〜１６３５のいずれか一項で記述されるような単一ヌクレオチド多型の出現を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブ、プライマーまたはプライマー対が提供される。
【００２２】
本発明のさらなる態様によれば、背最長筋ピーク力、筋肉内脂肪、小売牛肉歩留および正味飼料摂取量および／またはその構成成分形質から成る群から選択されるウシ科動物における形質の査定方法であって、以下の：
（１）ウシ科動物または屠体から核酸を提供し；
（２）遺伝子における、例えば上記遺伝子中のコード配列、イントロン、プロモーターおよびその他の調節配列における多型の、あるいは上記遺伝子における多型との連鎖不均衡における多型の出現に関して査定するが、この場合、上記遺伝子がCLCA4〜CLCA3、ABCC4、RPL11、TULP3、TRPC4、C6orf32、TPT1、GTF3C2、SLC6A15、CTNNA3、DDX46、HS2ST1、NDUFS3、PMS2、TMEM47、CEP1、CAP2、IMPG2、BAZ2B、SENP7、IMPG2、EFCBP2、DCP2、XBPP1、LAMA3、シナプトタグミン X（SYT 10）、DMD、EMR2、ZNF33A、DNM1L、GBAS、SEC5L1、ATP1A1、YES1、BSN、POU4F1、SLIT3、ROBO1、KRT1-23、DDX10、GRM1およびBAATから成る群から選択され、前記ヌクレオチド出現の同定が、（ａ）CLCA4〜CLCA3、ABCC4、RPL11、TULP3、TRPC4およびC6orf32のいずれか１つでは、背最長筋ピーク力における変異と関連し；（ｂ）TPT1、GTF3C2、SLC6A15、CTNNA3、DDX46、HS2ST1、NDUFS3、PMS2およびTMEM47のいずれかでは、筋肉内脂肪沈着に関連し；（ｃ）CEP1、CAP2、IMPG2、BAZ2B、SENP7、IMPG2、EFCBP2、DCP2、XBPP1およびLAMA3のいずれか１つでは、小売牛肉歩留に関連し；そして（ｄ）シナプトタグミン X（SYT 10）、DMD、EMR2、ZNF33A、DNM1L、GBAS、SEC5L1、ATP1A1、YES1、BSN、POU4F1、ROBO1、KRT1-23、DDX10およびBAATのいずれか１つでは、正味飼料摂取量および／またはその構成成分形質に関連する
ステップを包含する方法が提供される。
【００２３】
本発明のさらなる態様によれば、ウシ科動物の集団内のウシ科動物の選択方法であって、以下の：
（１）ウシ科動物から核酸試料を提供し；
（２）遺伝子における、例えば上記遺伝子中のコード配列、イントロン、プロモーターおよびその他の調節配列における多型の、あるいは上記遺伝子における多型との連鎖不均衡における多型の出現に関して査定するが、この場合、上記遺伝子がCLCA4〜CLCA3、ABCC4、RPL11、TULP3、TRPC4、C6orf32、TPT1、GTF3C2、SLC6A15、CTNNA3、DDX46、HS2ST1、NDUFS3、PMS2、TMEM47、CEP1、CAP2、IMPG2、BAZ2B、SENP7、IMPG2、EFCBP2、DCP2、XBPP1、LAMA3、シナプトタグミン X（SYT 10）、DMD、EMR2、ZNF33A、DNM1L、GBAS、SEC5L1、ATP1A1、YES1、BSN、POU4F1、SLIT3、ROBO1、KRT1-23、DDX10、GRM1およびBAATから成る群から選択され、上記ヌクレオチド出現の同定が、（ａ）CLCA4〜CLCA3、ABCC4、RPL11、TULP3、TRPC4およびC6orf32のいずれか１つでは、背最長筋ピーク力における変異と関連し；（ｂ）TPT1、GTF3C2、SLC6A15、CTNNA3、DDX46、HS2ST1、NDUFS3、PMS2およびTMEM47のいずれかでは、筋肉内脂肪沈着に関連し；（ｃ）CEP1、CAP2、IMPG2、BAZ2B、SENP7、IMPG2、EFCBP2、DCP2、XBPP1およびLAMA3のいずれか１つでは、小売牛肉歩留に関連し；そして（ｄ）シナプトタグミン X（SYT 10）、DMD、EMR2、ZNF33A、DNM1L、GBAS、SEC5L1、ATP1A1、YES1、BSN、POU4F1、ROBO1、KRT1-23、DDX10およびBAATのいずれか１つでは、正味飼料摂取量および／またはその構成成分形質に関連する；そして
（３）所望の形質の増強を示すウシ科動物を選択する
ステップを包含する方法が提供される。
【００２４】
本発明のさらなる態様によれば、遺伝子における、例えば上記遺伝子中のコード配列、イントロン、プロモーターおよびその他の調節配列における単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の、あるいは上記遺伝子における多型との連鎖不均衡における多型の出現を検出することによる背最長筋ピーク力、筋肉内脂肪、小売牛肉歩留および正味飼料摂取量および／またはその構成成分形質から成る群から選択されるウシ科動物における形質の査定のためのキットであって、この場合、上記遺伝子がCLCA4〜CLCA3、ABCC4、RPL11、TULP3、TRPC4、C6orf32、TPT1、GTF3C2、SLC6A15、CTNNA3、DDX46、HS2ST1、NDUFS3、PMS2、TMEM47、CEP1、CAP2、IMPG2、BAZ2B、SENP7、IMPG2、EFCBP2、DCP2、XBPP1、LAMA3、シナプトタグミン X（SYT 10）、DMD、EMR2、ZNF33A、DNM1L、GBAS、SEC5L1、ATP1A1、YES1、BSN、POU4F1、SLIT3、ROBO1、KRT1-23、DDX10、GRM1およびBAATから成る群から選択され、上記ヌクレオチド出現の同定が、（ａ）CLCA4〜CLCA3、ABCC4、RPL11、TULP3、TRPC4およびC6orf32のいずれか１つでは、背最長筋ピーク力における変異と関連し；（ｂ）TPT1、GTF3C2、SLC6A15、CTNNA3、DDX46、HS2ST1、NDUFS3、PMS2およびTMEM47のいずれかでは、筋肉内脂肪沈着に関連し；（ｃ）CEP1、CAP2、IMPG2、BAZ2B、SENP7、IMPG2、EFCBP2、DCP2、XBPP1およびLAMA3のいずれか１つでは、小売牛肉歩留に関連し；そして（ｄ）シナプトタグミン X（SYT 10）、DMD、EMR2、ZNF33A、DNM1L、GBAS、SEC5L1、ATP1A1、YES1、BSN、POU4F1、ROBO1、KRT1-23、DDX10およびBAATのいずれか１つでは、正味飼料摂取量および／またはその構成成分形質に関連するキットであり、上記ヌクレオチド出現を確定するためのオリゴヌクレオチドプローブ、プライマーまたはプライマー対、あるいはその組合せを包含するキットが提供される。
【００２５】
したがって本発明は、さらなる態様において、本発明の方法により選択される場合の動物に、それらの子孫に、そして育種のための選択動物およびそれらの子孫、ならびにこれらの動物からの肉に関する。
本発明の方法は、ウシ科動物、例えばウシ、水牛および野牛（これらに限定されない）に適用可能である。
【００２６】
本明細書中で用いる場合、ＮＦＩは、3つの主な形質、即ち（１）1日飼料摂取量；（２）給餌期間中の平均1日増加；および（３）体重（または典型的には代謝性中重量）の一関数として測定される複合表現型である、と理解される。ここで述べる場合、この技術の使用者の中には、主要形質レベルでの遺伝子試験の使用に関心がある者もいる、と理解される。ＮＦＩに関するＤＮＡマーカーは、ＤＮＡマーカーによって、主要形質により大きなまたはより少ない影響を及ぼす。
【００２７】
本明細書は、PatentInバージョン３．３を用いて調製されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列情報を含有する。各ヌクレオチド配列は、数的指標<210>とその後の配列鑑別子（例えば<210>1、<210>2、<210>3等）により配列表で同定される。配列（ＤＮＡ、タンパク質（ＰＲＴ）等）の長さおよび型、ならびに各ヌクレオチド配列に関する供給源生物体は、それぞれ数的指標フィールド<211>、<212>および<213>で提供される情報により示される。当該明細書中で言及されるヌクレオチド配列は、「配列番号」という用語と、その後の配列鑑別子（例えば配列番号１は<201>1と呼ばれる配列表中の配列を指し、そして配列情報はその直ぐ後に鑑別子<400>1を伴う）により定義される。配列中で、記号Ｙ、Ｒ、Ｍ、ＫＳおよびＷは、多型を示すために用いられている。したがって記号「Ｍ」は、Ａ／Ｔ多型を表わす、といった具合である。概して、多型は、200ヌクレオチドのフランキング配列が付加されたか、50ヌクレオチドかによって、位置２０１または位置５１で起こる。多型の側面に位置する配列は、公的に利用可能な配列情報から得られる。本発明は、完全ヌクレオチド配列の検出に制限されないし、あるいは如何なる点でも、完全ヌクレオチド配列の使用に制限されない。この情報は、オリゴヌクレオチド・プライマーおよびプローブの設計を手助けするために呈示されるが、しかしこのような配列はエラーを含有し、したがってそれらの設計を調整する、と当業者は認識する。
【００２８】
本明細書中で言及されるヌクレオチド残基の設計は、IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionにより推奨されるものであり、この場合、Ａはアデニンを表わし、Ｃはシトシンを表わし、Ｇはグアニンを表わし、Ｔはチミンを表わし、Ｙはピリミジン残基を表わし、Ｒはプリン残基を表わし、Ｍはアデニンまたはシトシンを表わし、Ｋはグアニンまたはチミンを表わし、Ｓはグアニンまたはシトシンを表わし、Ｗはアデニンまたはチミンを表わし、Ｈはグアニン以外のヌクレオチドを表わし、Ｂはアデニン以外のヌクレオチドを表わし、Ｖはチミン以外のヌクレオチドを表わし、Ｄはシトシン以外のヌクレオチドを表わし、そしてＮは任意のヌクレオチド残基を表わす。
【００２９】
この明細書全体を通して、別記しない限り、または状況が別のやり方を必要としない限り、単一ステップ、物質の組成物、ステップ群または物質の組成物群への言及は、1つまたは複数（即ち1つまたはそれより多く）のそれらのステップ、物質の組成物、ステップ群または物質の組成物群を包含するためになされる。
【００３０】
本明細書中で用いる場合、任意の範囲の数字は当該範囲内のすべてを包含し、そして「少なくとも1つの」という用語は、1、2、3、4・・・等、考え得る最大数までを意味する。したがって１つまたはそれより多くのＳＮＰへの言及は、本明細書中に記述された1つのＳＮＰ、あるいは2から総数までの任意数のＳＮＰを含む。本明細書中に記述されたＳＮＰは、単独でまたは任意の組合せで用いられ、したがって本発明は、本明細書中に記述されたＳＮＰの考え得る組合せのいずれかの検出を予見する。
【００３１】
本明細書中で用いる場合、「畜牛」という用語は、性別により限定する意図なしに個々の動物に言及するために用いられ、そして雌動物が言及されると推測することが状況から必要でない限り、そうすると理解されるべきでない。当該用語は、いずれかの性別の若い動物を包含すると理解されるべきでもある。
【００３２】
本発明は、例示のみの目的のために意図される本明細書中に記載された特定の実施形態による範囲に限定されない。機能的に等価の生成物、組成物および方法は、本明細書中に記載されるように、明らかに本発明の範囲内である。
【００３３】
本発明は、別記しない限り、分子生物学の慣用的技法を用いて過度の実験を伴わずに本明細書中の記載に従って実施され得る。このような手法は、当該明細書全体を通して言及される種々の出版物に記載されており、このような出版物の各々の記載内容は、参照により本明細書中で援用される。
【００３４】
この明細書および特許請求の範囲の全体に亘って、「〜を含む」、「〜を含む（単数）」および「〜からなる」という語は、状況が別のやり方を必要とする場合を除いて、非排他的意味で用いられる。
【００３５】
多数の従来技術出版物が本明細書中で言及されるが、しかしこの言及は、これらの文書のうちのいずれかが、当業界で、オーストラリアでまたは任意の他の国において共通の一般的知識の一部を構成することを容認するものではない、ということは明らかに理解される。
本明細書中に記載される本発明は、特定的に記載されるもの以外の変更および修正の余地がある、と当業者は理解する。本発明は、このような変更、ならびにこの明細書中で言及されるかまたは示される化合物を、個別にまたは集合的に、そして上記のステップまたは特徴の任意のおよびすべての組合せあるいはそのうちのいずれか2またはそれより多くを包含する、と理解されるべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
本発明の詳細な説明
本発明の方法は、育種またはクローニングのための動物の選択を含めてウシ科動物の管理を可能にする。当該方法は、好ましいＬＤＰＦ、筋肉内脂肪沈着、小売牛肉歩留および／または正味飼料摂取量特質を有する動物の同定を可能にする。好ましい特質は、単独でまたは組合せて、ある種の動物に存在し、そしてこれらの形質の測定は、１つまたは複数のこれらの形質を保有する個々の動物の管理を可能にして、個々の潜在的実績を最大にする。特に本発明の方法は、個々の動物が最も適切なやり方で処理されて、解体処理された場合に適切な質の肉を産生するよう、飼料摂取量、食餌組成および食餌関連因子、例えば食物添加剤、給餌方法の管理、ならびに飼料割当の導入のような管理を可能にする。
【００３７】
主な商業用ウシ科動物はウシであり、そしてウシの多数の品種が存在する。一実施形態では、畜牛は、アンガス、アンコレ・アトゥシ、エアーシャー、バザダイス、ビーファロー、ビーフマスター、ベルジャンブルー、ベルモントレッド、ブロンド・アキテーヌ、ボンスマラ、ブラフォード、ブラーマン、ブラーマウシン、ブランガス、ブラウンビュー、ブリティッシュホワイト、アメリカンブラウンスイス、ブエリンゴ、シャロレ、キアーナ、コリエンテ、アメリカンデボン、デクスターズ、ドラウトマスター、ギャロウエイ、ゲルブビュー、ガーンジー、ヘレフォード、ハイランド、ホルスタイン、ジャージー、リムーザン、ローライン、メイン・アンジョウ、マルキジャーナ、ミルキング・ショートホーン、モンベリエール、マレーグレイ、ノルマンディ、Parthenaise、ピエドモンテーゼ、ピンツガウアー、ロマニョーラ、サレール、Salorn、サンタ・ガートルーディス、シェトランド、ショートホーン、シンメンタール、サウスデボン、タランテーズ、テキサスロングホーンおよび和牛、最も特定的にはアンガス、ショートホーン、ヘレフォード、マレーグレイ、ブラーマン、ベルモントレッドおよびサンタ・ガートルーディスから成る群から排他的でなく選択される一品種（または交雑種）である。
【００３８】
さらに、対立遺伝子または遺伝子型と値増大との関連は、しばしば品種および品種内の科全体に当てはまる、と理解される。しかしながら特定の対立遺伝子または遺伝子型が、品種全体の値増大と常に関連するわけではない；ある品種においては、対立遺伝子または遺伝子型は、値増大と関連し得るが、しかし別の品種では、それは値低減と関連し得るし、あるいは値の差異と関連しない。当業者は、関連の方向を確定し得る。
【００３９】
したがって特定の種または品種における形質の適切な同定は、望ましい柔らかさおよび／または霜降り特質を有する肉を得るための動物の、および／またはより高い小売牛肉歩留および／または低正味飼料摂取量および／またはその構成成分形質を有する動物からの身体的特質の最大化を可能にする。したがって製品の品質およびその産生の経済性は、個々の動物に関して、その動物の管理により、あるいは所望の特質を有する動物の育種および／またはクローニングにより調整され得る。
【００４０】
単一ヌクレオチド多型は、単一ヌクレオチド差が一遺伝子座に存在する集団中で起こる対立遺伝子変異体である。本発明の方法は、一単一ヌクレオチド多型または1つより多いヌクレオチド多型の検出を包含し得るし、そして、同一染色体中に物理的に存在し、そして組換えが起きる場合以外は一緒に遺伝する傾向がある、本明細書中で用いる場合、2またはそれより多くの単一ヌクレオチド多型の群分類を指すハプロタイプの一部を構成するかその一部である単一ヌクレオチド多型の検出を包含し得る。核酸試料中のハプロタイプ対立遺伝子の同定方法は、当業者に既知である。これは、WO 2005/040400（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に記載されているハプロタイプ分類方法からである。
【００４１】
本発明の方法を実施するための好ましい試料は、ゲノムＤＮＡを含む容易に許容可能な試料である。例えばウシの遺伝的試験は、しばしば、例えば試験されるべき動物の尾から単離される毛嚢を用いて実施される。
容易に許容可能な試料の他の例としては、例えば体液またはその抽出物またはその分画が挙げられる。例えば容易に許容可能な体液としては、例えば全血、唾液、精液または尿が挙げられる。
別の実施形態では、生物学的試料は、例えば皮膚のような組織から得られる細胞、細胞抽出物またはその混合物を含む。
【００４２】
好ましくは生物学的試料は、例えば外科手術により、あるいは注射器または綿棒を用いて、被験者から予め単離されるかまたは得られた。
このような組織または細胞から得られる細胞調製物または核酸調製物は、除外されるべきでない。試料は、組織学的分析のために個体マトリックス上で、あるいは代替的には、例えば抽出緩衝液または懸濁液緩衝液のような適切な溶液中で調製され、そして本発明は明らかに、このように調製された生物学的溶液の試験に拡大される。
【００４３】
試料の分析は、多数の方法により実行され得る。本発明は、ウシ科動物における形質に関連した多数のＳＮＰを同定し、そしてその後、各ＳＮＰの好ましい対立遺伝子形態の存在または非存在を検出したし、あるいは複数のこれらのＳＮＰは、当該技術分野で既知の方法を用いて実行され得る。このような方法は、１つまたはそれより多くのオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー、例えば配列番号１〜１６３５のいずれか1つで記述される配列の一部または全部を含む標的ポリヌクレオチドと選択的にハイブリダイズする増幅プライマー対を用い得る。本発明の一実施形態において有用なオリゴヌクレオチドプローブは、当該ＳＮＰを含むポリヌクレオチドの一部と相補的であり且つ及ぶオリゴヌクレオチドを含む。したがってその位置での特定ヌクレオチドの存在（即ち対立遺伝子形態のＳＮＰの1つ）は、プローブがハイブリダイズする能力または別のやり方により検出される。このような方法は、標的ポリヌクレオチドおよびハイブリダイズ化オリゴヌクレオチドをエンドヌクレアーゼと接触し、そしてプローブの切断生成物の存在または非存在を検出することを包含する。
【００４４】
多型位置でのヌクレオチド出現を同定するために、オリゴヌクレオチド結紮検定も用いられ得るが、この場合、ＳＮＰの部位と、上流および隣接して、ならびに下流および隣接して、選択的にハイブリダイズする一対のプローブが調製され、そしてこの場合、プローブの1つはＳＮＰのヌクレオチド出現と相補的な末端ヌクレオチドを含む。プローブの末端ヌクレオチドがヌクレオチド出願と相補的である場合、リガーゼの存在下で、上流および下流オリゴヌクレオチドが結紮されるよう、選択的ハイブリダイゼーションは末端ヌクレオチドを含む。このようなものとして、結紮生成物の存在または非存在は、ＳＮＰ部位でのヌクレオチド出現を示す。
【００４５】
オリゴヌクレオチドは、例えばプライマー伸長反応のためのプライマーのためのプライマーとしても有用であり得るが、この場合、伸長反応の生成物（または生成物の非存在）はヌクレオチド出現を示す。さらに、ＳＮＰ部位を含む標的ポリヌクレオチドの一部を増幅するために有用なプライマー対は有用であり得るが、この場合、増幅生成物は、ＳＮＰ部位でのヌクレオチド出現を確定するために検査される。特に有用な方法としては、高処理量フォーマットに、多重フォーマットに、またはその両方に容易に適合可能であるものが挙げられる。プライマー伸長または増幅生成物は直接または間接的に検出可能であり、および／または当該技術分野で既知の種々の方法を用いてシーケンシングされ得る。ＳＮＰ遺伝子座に及ぶ増幅生成物は、伝統的配列方法（例えば「ジデオキシ媒介性鎖終結方法」（「サンガー法」（Sanger, F., et al. J. Molec. Biol. 94: 441 (1975)；Prober et al. Science 238: 336-340 (1987)）としても既知である））、ならびに「化学分解法」（「マキシマム・ギルバート法」（Maxam, A.M., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 74: 560 (1977)）としても既知）（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）を用いてシーケンシングされて、ＳＮＰ遺伝子座でのヌクレオチド出現を確定する。
【００４６】
当業者に明らかであるように、本発明の検定に用いられる特定のプローブまたはプライマーは、用いられる検定フォーマットによっている。プローブおよび／またはプライマーの設計方法、例えばＰＣＲまたはハイブリダイゼーションは当該技術分野で既知であり、例えばDieffenbach and Dveksler（Eds）（PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratories, NY, 1995）に、さらに近年では、P.-Y. Kwok （Ed）（Methods in Molecular Biology Vol 212 Human Press, Totowa New Jersey, 2003）に記載されている。多型の種々の部門は体系化され、そしてそれらの検出するために用いられる種々の方法が十分に概観されてきた（BARENDSE and FRIES 1999）。要するに、ＤＮＡ塩基の変化によるものと、塩基の挿入および欠失によるものの2つの種類の多型が存在するだけである。さらに、これらの多型の検出は本質的に同一の技術を用い、そしてそれはこれらの種類の多型の一方または他方だけのために用いられ得る稀な技法である。多型は、ＲＮＡに転写される配列中または付近にあるもの（Ｉ型多型）そしてＲＮＡに決して翻訳されないＤＮＡ中に存在するもの（ＩＩ型多型）にも分けられる。しかしながらこれらの多型のすべてが、同一種類の方法を用いて検出され得る。ＤＮＡ多型を検出するための方法は3つの主要局面を中心に展開するが、これらのすべてが全検出方法に用いられるというわけではなく、いくつかの方法はこれら3つの主要な種類のうちの1つではない技法を用いる。その要点は、大きく且つ絶えず増大する範囲の多型検出方法が存在し、したがって多型が如何に検出されるべきであるかについて規範的であることは可能でなく、むしろ、それは、一方または他方の検出方法にそれ自体役立つＤＮＡ配列である、というものである。これらの方法のほとんどが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に大いによっているが、しかしＰＣＲを用いずに容易に配列差を検出することは可能である。3つの技法は、１）サイズによるまたは組成によるＤＮＡの分離、２）特定ＤＮＡ配列を認識するためのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、そして３）ＤＮＡ可視化である。ＤＮＡ分離は、固体マトリックス上で実施され得るが、しかし液体マトリックス中で実施されることもある。ＤＮＡ配列の認識は、通常は、予定配列のオリゴヌクレオチドにより実施されるが、しかしいくつかの酵素は特定ＤＮＡ配列モチーフを認識するため、酵素的に実施されることもある。ＤＮＡ可視化は、通常光中で可視性である場合、いくつかの元素、例えば銀と結合するＤＮＡ上で直接実施され得し、それは、臭化エチジウムのようないくつかの分子と結合される場合、紫外線下で蛍光発光し、あるいはそれは、放射性ヌクレオチドが配列中に組入れられる場合、オートラジオグラフィーにより可視化され得る。さらに通常では、ＤＮＡは予め付着されたレポーター分子を有するＤＮＡオリゴヌクレオチドと結合される場合、可視化され、これは次に、レーザー励起後に検出され得る。多数の方法がＤＮＡに関する特定の反応の結果の報告によっており、そしてＤＮＡそれ自体を検出することさえないが、しかし残りは上首尾に検出し得る。これらの説明は単に、広範囲のそして多数の考え得るＤＮＡ検出の置換を示すことであり、そして特定的に言及されない方法を除外しない。
【００４７】
多型を検出するために用いられ得た方法のいくつかは以下に記載されるが、しかしそれらは唯一の考え得る方法ではない。プローブまたはプライマーの特定のハイブリダイゼーション、あるいは任意の核酸への変異性を検出するための他の方法は周知の規則を用いて予測され得るが、プローブまたはプライマーは、それがそれぞれのＤＮＡ配列と、あるいは遺伝子ファミリーの成員に共通の配列と結合するよう意図される場合、独特でなく、そこで、プローブおよびプライマーの予防的スクリーニングが、例えば畜牛およびその他のゲノムに対してＢＬＡＳＴを用いて実施されるべきである。多くの場合、これは十分であるというわけではなく、プローブまたはプライマーの妥当性は、当該技術分野で既知の方法を用いて経験的に確証される必要がある。この同一条件は、当業者により理解されるように、短いプローブおよびプライマーを用いるＤＮＡの検出方法のすべてに当てはまる。
【００４８】
以下は、ウシにおける多型を検出するより有用な最新高処理量方法のうちのいくつかの一覧であるが、しかしこれらは包括的一覧と解釈されるべきでなく、あるいはこれから開発されるべき新規の方法を除外するために用いられるべきでないが、この場合、それらは本質的に、基礎を成すＤＮＡ配列を同定するために用いられるものである。その点では、ＤＮＡ配列がＲＮＡに転写され、そしてＲＮＡが変異に関して試験される場合、あるいはＲＮＡがタンパク質に翻訳され、そしてタンパク質が変異に関して試験される場合、これらのＲＮＡおよびタンパク質検出方法は、基礎を成すＤＮＡ配列の検出方法でもある。上記のように、時として、検出方法は、ＤＮＡ分子を直接検出することなく上首尾の反応の結果を報告し、そして明らかに、これはＲＮＡおよびタンパク質に関して同様に当てはまる。
【００４９】
多型を検出する有用なＤＮＡベースの方法のいくつかは、タックマン（Taqman）検定（LIVAK 2003）（代替的ＤＮＡ配列に特異的なプローブの競合的ハイブリダイゼーションを用い、そしてこの場合、上首尾の反応はレポーター染料の遊離により検出される）、ＳＮＰｌｅＸ検定（Applied Biosystems Incorporated, Foster City, CA）（オリゴヌクレオチド結紮検定を用い、そしてこの場合、上首尾の反応は毛管ＤＮＡシーケンサーで分離されるZipchuteプローブにより報告される）、遺伝子マイクロアレイ技術に関連した高処理量分子反転プローブ（HARDENBOL et al. 2003; HARDENBOL et al. 2005）、ＭＡＳＳｅｘｔｅｎｄ（STORM et al. 2002）、あるいは一般プライマー伸長技法（CHEN et al. 1997）（それぞれ酵素反応により修飾されるプローブの質量分光分析またはレーザー蛍光法を用いる）である。
【００５０】
本発明は、上記の方法に用いられ得るキットにも関する。このようなキットは、典型的には、用いられるべき方法によって、オリゴヌクレオチドプローブ、プライマーまたはプライマー対、あるいはその組合せを含有する。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば本明細書中に記述されるようなＳＮＰを同定するために有用である。さらにキットは、非所望対立遺伝子形態のヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドを含む対照を含有し得る。さらにキットは、本発明の方法を実施するための試薬、例えば緩衝剤、検出可能標識、１つまたはそれより多くのポリメラーゼ（プライマー伸長または増幅手法を包含する方法のために有用であり得る）、そしてハイブリダイゼーション生成物を消化するためのヌクレアーゼ、またはリガーゼ（オリゴヌクレオチド結紮検定を実施するために有用であり得る）を含有する。プライマーまたはプローブは、標識化形態でキット中に包含され得る。
キットは、使用のための使用説明書も包含し得る。
【００５１】
個々の動物の管理と同様に、本発明は、育種プログラムのための動物の選択を可能にする。したがって増強された背最長筋ピーク力を有するよう望ましいＬＤＰＦ特質を示す、肉中の霜降りの特質を増大するよう望ましい筋肉内脂肪沈着を示す、より多くの牛肉産生特質を有する群れを生産するために望ましい牛肉歩留を示す、および／または試料使用の改良された効率を有し、したがって好ましい経済的特質を有する群れを生産するための低減された正味飼料摂取量を示す群れが開発され得る。上記のように、１つまたはそれより多くのこれらの形質が、育種プログラムで選択され得る。したがって当該方法は、１つまたはそれより多くのこれらの形質に関して、そして育種プログラムにおいてそれらを用いて、望ましい特質を有する選択動物を包含する。選択親の交配の子孫は、形質の最適組合せを含有し、したがって特定の特質を有する動物の一系統を作り出すと思われる。子孫は次に、その系統を継続するために品種改良するために用いられ、これは、元のＳＮＰマーカーを用いて純系度に関してモニタリングされ得る。
【００５２】
さらに本発明の方法は、動物のin vitro産生方法を可能にする。概して、方法という用語は、ウシ科動物における配列番号１〜１６３５で記述されるような１つまたはそれより多くのＳＮＰの同定、動物からの始原細胞の単離、そして始原細胞からの動物の生成を包含する。ウシ科動物のクローニング方法は、当業者に周知である。ウシのクローニングに関与する方法のためには、既知の方法が直接用いられ得る（例えばWilladsen “Cloning of sheep and cow embryos,” Genome, 31: 956 (1989)に記述）（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）。
【００５３】
一実施形態では、胚の発生後、１つまたはそれより多くの細胞がそれから単離され、そして上記のようにスクリーニングされる。背最長筋ピーク力（ＬＤＰＦ）、筋肉内脂肪沈着、小売牛肉歩留（ＲＢＹ）および正味飼料摂取量および／またはその構成成分形質（ＮＦＩ）から選択される単数または複数の所望の形質を有するかまたは保有すると思われる胚が次に選択され、そして適切なレシピエントに移植される。このようにして、給餌効率を有するかまたは有すると思われる動物が産生される。
【００５４】
一実施形態では、選択動物は、in vitro受精を用いて子孫を産生するために用いられる。このプロセスにおいて、例えば経膣的卵子吸引（ＯＰＵ）により、または腹腔鏡吸引により、本発明の１つまたはそれより多くのＳＮＰを含む畜牛から卵子が採取される。次に回収卵子は、受精前に成熟させられる。次に受精卵は、胚発生に適した時間および条件下で培養される。例えば受精卵は、一時的レシピエント（ヒツジまたはウサギ）の結紮卵管中で培養される。代替的には、受精卵は、限定培地中で、体細胞（例えば卵管上皮細胞、顆粒膜細胞等）とin vitroで同時培養される。代替的には、受精卵は、単一培地中で、例えば任意の体細胞支持なしで合成卵管液中でin vitroで培養される。
【００５５】
当該方法は、任意の補助品種改良技法を用いて産生される胚のスクリーニングを受け易いし、および／または本発明の方法を用いてスクリーニングされていない動物からの卵子／精子を用いて産生される胚のスクリーニングに応じるべきである。
【実施例】
【００５６】
実施例１
ＤＮＡ試料および表現型
各動物に関する正味飼料摂取量スコアを算定した。ＮＦＩは線状モデルに基づいた予測値であり、そして動物の生測定値ではない。最高〜最低ＮＦＩから動物すべてを等級分けして、上部200および下部200を抜き出した。7つの品種の各々の群れの各々に関して、できるだけ最良に整合させた動物を有する同一の群れからの上部200中の動物を下部200中の動物に整合させて（即ち両極値）、反対側動物が一連のコホートおよび市場終点を表わすということ、そして高ＮＦＩは、例えば低ＮＦＩの動物と比較した場合の市場またはコホートと系統的に混同されないということを保証した。ＤＮＡを定量した後、いくつかの動物は10,000ＳＮＰを遺伝子型分類するのに不十分なＤＮＡを有することが見出され、そこで、それらのＤＮＡ試料を、動物の群れの一部であるが、しかし反対側の極値が利用可能でない場合に、反対側極値200中にできるだけ近く存在する十分なＤＮＡを有する動物と取り替えた。最終試料は、41頭のアンガス、21頭のブラーマン、24頭のベルモントレッド、28頭のヘレフォード、20頭のマレーグレイ、28頭のサンタ・ガートルーディスおよび27頭のショートホーン種動物を表わす。189頭の動物は、去勢牛189頭および未経産雌牛1頭であり、そしてその1頭はさらなる分析から除外した。これらは、1〜4頭の範囲の子孫／種牛および中央値1頭／種牛を有する142頭の種牛を表わす。それらは1〜12頭の範囲の動物／群れおよび中央値5頭の去勢牛／群れを有する32の群れを表わす。それらは、1〜12頭／屠殺群の範囲で、中央値4頭／屠殺群を有する37屠殺群を表わす。各動物の同時期群は、その群れ．屠殺＿群．市場．性別である。試料に関する非調整ＮＦＩ値は−3.398〜3.805の範囲で、平均値0.07、標準偏差1.32である。この試料が取り出された全試料は、平均値0.00および標準偏差0.75を有したが、これは極値の使用が分析された試料の変異性を増大した、ということを示す。一方のＮＦＩ極値の平均は−1.06で、標準偏差1.63（Ｎ＝95）で、そして他方のＮＦＩ極値の平均は1.21、標準偏差は0.90（Ｎ＝94）であった。
【００５７】
メーカーの使用説明書に従ってQiagenカラムを用いて、血液からＤＮＡを抽出した。ピコグリーン染料を小試料に付加した後、蛍光を用いてＤＮＡを定量した。ＤＮＡは、ＵＶ分光測光法を用いても定量し、そして260対280 nmでの蛍光の比率を用いて純度を確定した。
【００５８】
ParAllele 10K標準ＳＮＰパネルを用いて、試料を遺伝子型分類した。ＳＮＰ遺伝子型分類の方法は、Hardenbol, P., Baner, J., Jain, M., Nilsson, M., Namsaraev, E.A., Karlin-Neumann, G.A., Fakhrai-Rad, H., Ronaghi, M., Willis, T.D., Landegren, U. and Davis, R.W. 2003 “Muliplex genotyping with sequence-tagged molecular inversion probes” Nature Biotechnology 21, 673-678 (2003)（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）で実証されている。約10,000のウシＳＮＰのパネルを、公的に利用可能なＤＮＡ配列から得て、MegAllele遺伝子型分類ウシ10KＳＮＰパネルと呼んでいる。ＳＮＰは、牛肉または酪農に偏向することなく、ウシ品種に関する連鎖マッピング試験を研究者が実施するのを可能にする。MegAllele遺伝子型分類ウシ10KＳＮＰパネルは、Affymetrix GeneChipスキャナー3000を用いて作動するよう意図される。
【００５９】
以下の実施例では、この明細書中に含入された表から、どの遺伝子型または対立遺伝子が列挙された形質のいずれかよりも優れているかを、当業者は確定し得る。この情報が単一ヌクレオチド多型での実際の塩基に関係なく回収され得るよう、遺伝子型は一貫スキームで暗号化された。遺伝子型は0、1、2および5として暗号化され、この場合、5は不明であり、1は常にヘテロ接合体であり、0は当該アルファベットより高いホモ接合体であり、そして2は当該アルファベットより低いホモ接合体である  ‐  そこで、ＡＡが代替的ホモ接合体である場合、ＣＣは2であり、したがって遺伝子型ＡＡ、ＡＣおよびＣＣを有するＡ／Ｃ  ＳＮＰに関する遺伝子型はそれぞれ0、1および2として暗号化される。Ｃ／Ｇ  ＳＮＰ（遺伝子型ＣＣ、ＣＧおよびＧＧ）に関しては、ホモ接合体ＣＣは0として暗号化され、ＣＧへテロ接合体は1として、ＧＧホモ接合体は2として暗号化される。
【００６０】
各ＳＮＰの作用を示す表では、各遺伝子型に関する平均値は、遺伝子型0に関しては平均＿0、遺伝子型1に関しては平均＿1および遺伝子型2に関しては平均＿2として示される。これらは、各遺伝子型の性能を明らかに示す。さらに、情報をより要約し易くするためには、各ＳＮＰの付加的効果、その優性偏差ｋ、およびアルファ（対立遺伝子置換の平均効果）も示される。ａに関するマイナス値は遺伝子型0の平均が遺伝子型2の平均より低いことを意味し、そしてアルファに関するマイナス値は対立遺伝子0に関する選択が集団中の当該形質の平均値を下げることを意味する。各ＳＮＰ鑑別子に関するａおよびアルファを比較することにより、そしてＳＮＰのＤＮＡ配列を調べることにより、例えばアルファが負である場合、そしてＳＮＰが例えばＣ／Ｔ  ＳＮＰである場合、それは、Ｃ対立遺伝子が集団中の当該形質値を低減することを意味する。他方で、アルファが正である場合、そしてＳＮＰが例えばＧ／Ｔ  ＳＮＰである場合、それは、Ｔ対立遺伝子が集団中の当該形質値を増大することを意味する。
【００６１】
実施例２
ＮＦＩおよびＤＮＡマーカー間の関連の分析
正味飼料摂取量は、ウシまたは他の種が飼料を用い得る効率を表わすウシの商業的に重要な形質である。極値正味飼料摂取量の動物の分岐対、7品種、即ちアンガス、ショートホーン、ヘレフォード、マレーグレイ、ブラーマン、ベルモントレッドおよびサンタ・ゲートルーディスに関する同時期群の範囲全体に及ぶ、あるいは実施例１に記載された各種牛からの2〜3の分岐対を、遺伝子型分類した。ParAllele遺伝子型分類系（表１）を用いて、350 kb未満の平均間隔で広がるウシゲノム全体の9,200より多くの単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）に関して、これらの動物を遺伝子型分類した。それぞれ表２および３に記述されるような、非常に強力な統計学的有意性を有する9のＳＮＰ、ならびにａ＝0.01閾値を有する約80のＳＮＰを、われわれは最初に見出した。
【００６２】
データは多数の同時期群、品種、コホートおよび市場を有するため、表現型を先ず分析して、これらの間に如何なる系統的差が存在するか否かを確定した。線状モデル：
Ｎｆｉ  ＝  平均＋系統＋品種（系統）＋市場＋市場＋系統*市場＋誤差
は、変異の20％を説明することが判明した。このモデルを有する系統において、各品種*系統*市場組合せに関する最小二乗平均ＮＦＩ値を算定し、したがって各動物のＮＦＩを調整した。各遺伝子型の調整平均ＮＦＩ値を算定し、各遺伝子座で、最大差を有する代替的遺伝子型平均を、ｔ検定を用いて比較した。ｔ検定の有意性を確定するために、各遺伝子座での遺伝子型の100,000の置換を算定し、より大きなｔ検定を生じる割合を算定した。この割合は、各比較に関する非パラメトリックＰ値である。
【００６３】
表１．
統計学的有意性の低い順に分類されたＤＮＡマーカーおよび正味飼料摂取量間の関連。遺伝子座は多型のParAllele鑑別子であり、Ｎは遺伝子型の数であり、Scaffold-v2はウシゲノム配列のドラフト２足場であり、ｂｐは足場内の塩基対であり、ＩＢＩＳＳ４はIBISS4データベース鑑別子であり、Scaffold-v1はウシゲノム配列のドラフト1足場であり、平均＿0は遺伝子型0に関する平均正味飼料摂取量であり、平均＿1は遺伝子型１に関する平均であり、そして平均＿2は遺伝子型２の平均であり、ＳＤは標準偏差であり、ａは付加的効果であり、ｋは優性効果であり、アルファは対立遺伝子置換の平均効果であり、ｔｍａｘはｔ検定の値であり、そしてlog（１／Ｐ）は正の整数として表わされる100,000置換検定から確定されるＰ値である。ａに関するマイナス値は遺伝子型0の平均が遺伝子型2の平均より低いことを意味し、そしてアルファに関するマイナス値は対立遺伝子0に関する選択が集団中の当該形質の平均値を下げることを意味する。
【００６４】
【表１】
2009502141.tif 000002
【００６５】
【表２】
2009502141.tif 000003
【００６６】
【表３】
2009502141.tif 000004
【００６７】
【表４】
2009502141.tif 000005
【００６８】
【表５】
2009502141.tif 000006
【００６９】
表２．
ＮＦＩと関連している高確率を有するＳＮＰ。Identは表１中ものであり、そしてParAllele鑑別子である。これらはＳＮＰ位置を示すＢＧＳＰ足場およびコンティグ上に突き止められる。これらの足場およびコンティグは、biolivesウエブサイト上の地図にグラフで位置を定められた。
【００７０】
【表６】
2009502141.tif 000007
【００７１】
表３．
配列足場、ＳＮＰを含有するBaylor College of Medicine配列コンティグ、ＤＮＡ配列のGenbank寄託番号、ならびに各ＳＮＰに関する代替的塩基を示すＮＦＩ（正味飼料摂取量）と関連したＳＮＰに関する平行鑑別子。各ＳＮＰの正確な位置は、配列足場中に示され、下線の後の数は足場の出発点からの正確な塩基対である。
【００７２】
【表７】
2009502141.tif 000008
【００７３】
【表８】
2009502141.tif 000009
【００７４】
【表９】
2009502141.tif 000010
【００７５】
実施例３
正味飼料摂取量に影響を及ぼす付加的遺伝子座を見出すために、全ゲノム精査のさらなる分析を実施した。先ず、全測定個体（全ゲノム精査において正確に189というわけではない）に関するＮＦＩ形質値を、同時期群（群れ＿コホート＿性別＿市場）により、そしてASREMLを用いて無作為因子としての種牛ＩＤにより調整した。次に、残りの正味飼料摂取量表現型は、さらなる分析のために利用可能であった。全ゲノム精査における各遺伝子型に関する残りのＮＦＩの平均および標準誤差を算定し、ｔ検定は、各比較に関してコンピューター計算した。100,000置換を用いて、最大平均差の統計学的有意性を算定した。
この分析の結果は、さらなる157の当該遺伝子座を（Ｐ＜0.01）、そしてＰ＜0.001のさらなる9遺伝子座を示す（表５）。
【００７６】
これらの遺伝子座は、13の上部遺伝子座の何らかの注釈と同様に、表４中に含入される。付加的遺伝子座は、正味飼料摂取量に関する候補遺伝子としての見込みを示す。これらのうち、ＤＮＭ１Ｌは、細胞の発電所であるミトコンドリアのサイズおよび形状に関与することが既知であり、ＢＡＡＴは腸における脂質の取り込みの差に関与することが既知であり、ＤＭＤは筋肉成長および肥大に関与することが既知であり、ＺＮＦ３３Ａは、ゲノムが倍加される細胞周期のＳ期または合成期への進入増大に関与し、そしてＡＴＰ１Ａ１は、多大な安静時代謝エネルギーを要するプロセスであるＮａ＋／Ｋ＋イオン勾配の保持に関与することが既知である。他の推論的候補はＧＢＡＳであり、これはおそらくは、シナプス小胞および膜ドッキングに関与し、そしてシナプス小胞勾配の保持は多大な安静時代謝エネルギーを、ならびにＳＥＣ５Ｌ１（エクソシスト複合体に関与し、そしてさらにまたニューロン膜輸送に関与すると思われる）を必要とする。
【００７７】
測定対立遺伝子または遺伝子型が、その遺伝子座であるいはより広範には遺伝子または遺伝子領域内で他のものと比較して値の増大を示すか否かを確定する方法は、当業者によく知られているが、しかしそれを簡単に説明する。要するに、考察中の遺伝子座と関連したメンデル形質成分に起因するものに、ならびに共有系統群に起因する多遺伝子成分に、当該形質に関連する分散を分割する。これを実行する前に、固定環境および遺伝効果に関して、共分散に関して、そして無作為遺伝効果、例えば種牛または雌牛に関して、形質値は調整されなければならない。これは通常は、一般線形混合モデルを用いて実施される。次に遺伝子型は、分散のｔ検定または一方向分析を用いて比較され得るし、そして統計学的有意性は、特に形質分布が非正規である場合、置換検定を用いて査定され得る。当該遺伝子座での対立遺伝子置換の平均効果は、対立遺伝子頻度、ホモ接合体および優性度間の差に由来するが、この場合、アルファ＝ａ［１＋ｋ（ｐ−（１−ｐ））］（式中、ａはホモ接合体間の差の半分であり、ｐは対立遺伝子頻度であり、そしてｋはｄ／ａ（ここで、ｄはヘテロ接合体間とホモ接合体間の距離の半分との差である））。このプロセスに関する良好な出発点は、Boerwinkle et al. 1986 Ann. Hum. Genet. 50, 181-194およびLynch and Walsh, 1997 (Sinauer Associates)（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）である。対立遺伝子または遺伝子型と値増大との関連は、しばしば、品種および品種内の系統群全体に当てはまる。しかしながら特定の対立遺伝子または遺伝子型は、品種全体の値の増大と常に関連付けられるわけではなく、一品種では、対立遺伝子または遺伝子型は値増大と関連し得るが、しかし別の品種では、それは値低減と関連し得るし、あるいは値の差と関連しない。ここに示された結果は、品種全体で統合される関連であり、これは、ほとんどの品種に関する値増大と関連する対立遺伝子または遺伝子型を表わす。値は品種に関して調整されたため、関連は品種全体でプールされ、そして品種中の対立遺伝子頻度の差は、シンプソンのパラドックスのため、スプリアス関連の発生を引き起こさない。
【００７８】
いくつかの品種は対立遺伝子または遺伝子型といくつかの実際の生物学的原因のうちの1つによる形質との間の異なる関連を有し得る、ということを、当業者は既知である。第一のそしておそらくは最も一般的なのは、測定対立遺伝子または遺伝子型が原因となるわけではなく、そこでそれは、原因となる対立遺伝子または遺伝子型と連鎖不均衡にある、ということである。測定中の対立遺伝子または遺伝子型が原因となる対立遺伝子または遺伝子型と逆遺伝子相にある場合が存在し、これは、いくつかの品種差に反映され得る。第二は、1つより多くの原因となる突然変異が異なる品種において異なる頻度で遺伝子中に存在し得るし、それゆえ、測定対立遺伝子または遺伝子型は異なる品種において異なる予測効率を示し、そして測定対立遺伝子または遺伝子型と異なる原因突然変異との間の複雑な関連のために逆遺伝的相関係を示すということである。第三は、遺伝子中の原因突然変異がゲノム中の他の箇所で遺伝子による影響を及ぼされ得ることである。これらの上位性または背景効果は数十年間既知であり、これらのいくつかは測定対立遺伝子または遺伝子型と形質値との間の関連に影響を及ぼし得る。
【００７９】
表４．
調整正味飼料摂取量に関連した高レベルの支持を有する遺伝子座。Ｓｎｐ＿ｉｄはParAllele鑑別子であり、Scaffold-v2はバージョン２足場であり、ｂｐは足場内のＳＮＰの位置であり、PermPは当該関連と関連づけられるＰ値であり、HsaはＳＮＰと関連するヒト染色体であり、そしてGeneはＳＮＰに最も近い遺伝子である。
【００８０】
【表１０】
2009502141.tif 000011
【００８１】
表５．
統計学的有意性の低い順に分類されたＤＮＡマーカーおよび正味飼料摂取量間の関連。遺伝子座は多型のParAllele鑑別子であり、Ｎは遺伝子型の数であり、平均＿0は遺伝子型0に関する平均正味飼料摂取量であり、平均＿1は遺伝子型１に関する平均であり、そして平均＿2は遺伝子型２の平均であり、ＳＥは標準誤差であり、ａは付加的効果であり、ｋは優性効果であり、アルファは対立遺伝子置換の平均効果であり、ｔｍａｘはｔ検定の値であり、そしてPermPは正の整数として表わされる100,000置換検定から確定されるＰ値である。ａに関するマイナス値は遺伝子型0の平均が遺伝子型2の平均より低いことを意味し、そしてアルファに関するマイナス値は対立遺伝子0に関する選択が集団中の正味飼料摂取量の平均値を下げることを意味する。
【００８２】
【表１１】
2009502141.tif 000012
【００８３】
【表１２】
2009502141.tif 000013
【００８４】
【表１３】
2009502141.tif 000014
【００８５】
【表１４】
2009502141.tif 000015
【００８６】
【表１５】
2009502141.tif 000016
【００８７】
【表１６】
2009502141.tif 000017
【００８８】
【表１７】
2009502141.tif 000018
【００８９】
【表１８】
2009502141.tif 000019
【００９０】
【表１９】
2009502141.tif 000020
【００９１】
【表２０】
2009502141.tif 000021
【００９２】
【表２１】
2009502141.tif 000022
【００９３】
【表２２】
2009502141.tif 000023
【００９４】
【表２３】
2009502141.tif 000024
【００９５】
【表２４】
2009502141.tif 000025
【００９６】
【表２５】
2009502141.tif 000026
【００９７】
【表２６】
2009502141.tif 000027
【００９８】
【表２７】
2009502141.tif 000028
【００９９】
【表２８】
2009502141.tif 000029
【０１００】
【表２９】
2009502141.tif 000030
【０１０１】
【表３０】
2009502141.tif 000031
【０１０２】
【表３１】
2009502141.tif 000032
【０１０３】
【表３２】
2009502141.tif 000033
【０１０４】
【表３３】
2009502141.tif 000034
【０１０５】
【表３４】
2009502141.tif 000035
【０１０６】
【表３５】
2009502141.tif 000036
【０１０７】
【表３６】
2009502141.tif 000037
【０１０８】
【表３７】
2009502141.tif 000038
【０１０９】
【表３８】
2009502141.tif 000039
【０１１０】
【表３９】
2009502141.tif 000040
【０１１１】
実施例４
筋肉内脂肪は、その代理である霜降りスコアによる屠体の価値の主要決定因子であるウシの商業的に重要な形質である。実施例２に記載したようなnir脂肪測定値の範囲に関して実施例１の動物の対を遺伝型分類した。ＤＮＡマーカーおよび筋肉内脂肪間に見出される関連を、表９に記述する。
【０１１２】
表９．
統計学的有意性の低い順に分類されたＤＮＡマーカーおよび筋肉内脂肪間の関連。遺伝子座は多型のParAllele鑑別子であり、Ｎは遺伝子型の数であり、平均＿0は遺伝子型0に関する平均正味飼料摂取量であり、平均＿1は遺伝子型１に関する平均であり、そして平均＿2は遺伝子型２の平均であり、ＳＤは標準偏差であり、ａは付加的効果であり、ｋは優性効果であり、アルファは対立遺伝子置換の平均効果であり、ｔｍａｘはｔ検定の値であり、そしてlog（１／Ｐ）は正の整数として表わされる100,000置換検定から確定されるＰ値である。ａに関するマイナス値は遺伝子型0の平均が遺伝子型2の平均より低いことを意味し、そしてアルファに関するマイナス値は対立遺伝子0に関する選択が集団中の筋肉内脂肪の平均値を下げることを意味する。
【０１１３】
【表４０】
2009502141.tif 000041
【０１１４】
【表４１】
2009502141.tif 000042
【０１１５】
【表４２】
2009502141.tif 000043
【０１１６】
【表４３】
2009502141.tif 000044
【０１１７】
【表４４】
2009502141.tif 000045
【０１１８】
【表４５】
2009502141.tif 000046
【０１１９】
【表４６】
2009502141.tif 000047
【０１２０】
【表４７】
2009502141.tif 000048
【０１２１】
【表４８】
2009502141.tif 000049
【０１２２】
【表４９】
2009502141.tif 000050
【０１２３】
【表５０】
2009502141.tif 000051
【０１２４】
【表５１】
2009502141.tif 000052
【０１２５】
【表５２】
2009502141.tif 000053
【０１２６】
【表５３】
2009502141.tif 000054
【０１２７】
表１０．
ＩＭＦと関連している高確率を有するＳＮＰ。identは表９中ものであり、そしてParAllele鑑別子である。これらはＳＮＰ位置を示すＢＧＳＰ足場およびコンティグ上に突き止められる。これらの足場およびコンティグは、biolivesウエブサイト上の地図にグラフで位置を定められた。
【０１２８】
【表５４】
2009502141.tif 000055
【０１２９】
ここに添付される配列表は、表１０中に記載されたコンティグに関するＤＮＡ配列を示し、コンティグが及ぶ塩基対を含めた足場の同定、そして多型の位置および性質の同定も包含する。例えば配列番号２１４はコンティグ346200に関するものであり、これは、位置２３９４から位置４５７５までの足場317931に及ぶ。この場合、ＳＮＰは位置３１５９に存在し、そして筋肉内脂肪沈着を促進する多型形態は、塩基３１５９がＡである形態である。
【０１３０】
表１１．
配列足場、ＳＮＰを含有するBaylor College of Medicine配列コンティグ、ＤＮＡ配列のGenbank寄託番号、ならびに各ＳＮＰに関する代替的塩基を示すＩＭＦ（nir脂肪）と関連した付加的ＳＮＰに関する平行鑑別子。各ＳＮＰの正確な位置は、配列足場中に示され、下線の後の数は足場の出発点からの正確な塩基対である。
【０１３１】
【表５５】
2009502141.tif 000056
【０１３２】
【表５６】
2009502141.tif 000057
【０１３３】
【表５７】
2009502141.tif 000058
【０１３４】
【表５８】
2009502141.tif 000059
【０１３５】
【表５９】
2009502141.tif 000060
【０１３６】
【表６０】
2009502141.tif 000061
【０１３７】
【表６１】
2009502141.tif 000062
【０１３８】
実施例５
筋肉内脂肪に影響を及ぼす遺伝子座を見出すために、全ゲノムＳＮＰ精査のさらなる分析を実施した。先ず、全測定個体（全ゲノム精査において正確に189というわけではない）に関するＮＩＲＦＡＴ形質値を、モデルnirfat〜mu群れ屠殺＿群齢！ASREMLを用いた種牛ＩＤを用いて調整したが、この場合、群れおよび屠殺＿群は固定効果であり、齢は共分散であり、種牛ｉｄは種牛の無作為効果である。次に、残りのＮＩＲＦＡＴ表現型は、さらなる分析のために利用可能であった。全ゲノム精査における各遺伝子型に関する残りのＮＩＲＦＡＴの平均および標準誤差を算定し、ｔ検定は、各比較に関してコンピューター計算した。100,000置換を用いて、最大平均差の統計学的有意性を算定した。
この分析の結果は、Ｐ＜0.001での当該遺伝子座を示す（表１３）。
【０１３９】
表１３．
高筋肉内脂肪に関連した高レベルの支持を伴う一組の遺伝子座。Ｓｎｐ＿ｉｄはParAlleleＳＮＰ鑑別子であり、Scaffold-v2はバージョン２足場であり、ｂｐは足場内のＳＮＰの位置であり、Scaffold-v1／ＩＢＩＳＳ４はＳＮＰへの直接的言及を示し、HsaはＳＮＰと関連するヒト染色体であり、そしてGeneはＳＮＰに最も近い遺伝子である。
【０１４０】
【表６２】
2009502141.tif 000063
【０１４１】
表１４．
統計学的有意性の低い順に分類されたＤＮＡマーカーおよび筋肉内脂肪間の関連。遺伝子座は多型のParAllele鑑別子であり、Ｎは遺伝子型の数であり、平均＿0は遺伝子型0に関する平均正味飼料摂取量であり、平均＿1は遺伝子型１に関する平均であり、そして平均＿2は遺伝子型２の平均であり、ＳＥは標準誤差であり、ａは付加的効果であり、ｋは優性効果であり、アルファは対立遺伝子置換の平均効果であり、ｔｍａｘはｔ検定の値であり、そしてPermPは正の整数として表わされる100,000置換検定から確定されるＰ値である。ａに関するマイナス値は遺伝子型0の平均が遺伝子型2の平均より低いことを意味し、そしてアルファに関するマイナス値は対立遺伝子0に関する選択が集団中の筋肉内脂肪の平均値を下げることを意味する。Scaffold-v2はドラフト・バージョン２ウシゲノム配列であり、ｂｐは足場中の塩基対の位置であり、そして塩基は代替的塩基である。
【０１４２】
【表６３】
2009502141.tif 000064
【０１４３】
【表６４】
2009502141.tif 000065
【０１４４】
【表６５】
2009502141.tif 000066
【０１４５】
表１６．
高筋肉内脂肪に関連したさらなる遺伝子座組。Ｓｎｐ＿ｉｄはParAlleleＳＮＰ鑑別子であり、Scaffold-v2はバージョン２足場であり、ｂｐは足場内のＳＮＰの位置であり、塩基はＳＮＰ中の代替塩基であり、平均0は当該アルファベットを有するものより高い遺伝子型の平均であり、ＳＥは平均の標準誤差であり、Ｎは総試料サイズであり、Freqは0対立遺伝子の頻度であり、ａはホモ接合体間の距離の半分であり、ｋは優性効果であり、アルファは残りのＲＢＹ中の対立遺伝子置換の平均効果であり、ｔｍａｘは残りのＲＢＹ中の最大差を有する遺伝子型間のｔ検定の値であり、そしてPermPはデータの100,000置換検定から確定されるＰ値である。これらは、表１７を参照することによりＤＮＡ配列（および配列番号）と相関され得るが、この場合、ＳＮＰ同定番号（表１７中の最初の列）は、番号順に列挙されている。
【０１４６】
【表６７】
2009502141.tif 000067
【０１４７】
【表６８】
2009502141.tif 000068
【０１４８】
【表６９】
2009502141.tif 000069
【０１４９】
【表７０】
2009502141.tif 000070
【０１５０】
【表７１】
2009502141.tif 000071
【０１５１】
【表７２】
2009502141.tif 000072
【０１５２】
【表７３】
2009502141.tif 000073
【０１５３】
【表７４】
2009502141.tif 000074
【０１５４】
【表７５】
2009502141.tif 000075
【０１５５】
【表７６】
2009502141.tif 000076
【０１５６】
【表７７】
2009502141.tif 000077
【０１５７】
【表７８】
2009502141.tif 000078
【０１５８】
【表７９】
2009502141.tif 000079
【０１５９】
【表８０】
2009502141.tif 000080
【０１６０】
【表８１】
2009502141.tif 000081
【０１６１】
【表８２】
2009502141.tif 000082
【０１６２】
【表８３】
2009502141.tif 000083
【０１６３】
【表８４】
2009502141.tif 000084
【０１６４】
【表８５】
2009502141.tif 000085
【０１６５】
【表８６】
2009502141.tif 000086
【０１６６】
【表８７】
2009502141.tif 000087
【０１６７】
【表８８】
2009502141.tif 000088
【０１６８】
【表８９】
2009502141.tif 000089
【０１６９】
【表９０】
2009502141.tif 000090
【０１７０】
【表９１】
2009502141.tif 000091
【０１７１】
【表９２】
2009502141.tif 000092
【０１７２】
【表９３】
2009502141.tif 000093
【０１７３】
【表９４】
2009502141.tif 000094
【０１７４】
【表９５】
2009502141.tif 000095
【０１７５】
【表９６】
2009502141.tif 000096
【０１７６】
【表９７】
2009502141.tif 000097
【０１７７】
【表９８】
2009502141.tif 000098
【０１７８】
【表９９】
2009502141.tif 000099
【０１７９】
【表１００】
2009502141.tif 000100
【０１８０】
実施例６
上記の実施例におけるのと同一動物に関して、そこに記載した方法を用いて、小売牛肉歩留（ＲＢＹ）の形質の分析を実施した。ＲＢＹに関して直接実施した分析を、Ｐ８脂肪および屠体重量の組合せに関して実施した分析と比較して、2つの方法により同定されたＳＮＰに如何なる共通点が認められるかを確定した。
【０１８１】
表１９．
統計学的有意性の低い順に分類されたＤＮＡマーカーおよび小売牛肉歩留間の関連。遺伝子座およびidentは多型のParAllele鑑別子であり、infは適正な試験のための各遺伝子型に対して十分な遺伝子型が存在するか否かであり、Ｎは遺伝子型の数であり、平均＿0は遺伝子型0に関する平均総骨抜き小売牛肉歩留であり、平均＿1は遺伝子型１に関する平均であり、そして平均＿2は遺伝子型２の平均であり、ＳＤは標準偏差であり、maxdは3つの遺伝子型のいずれかの間の最大差であり、ｔはｔ検定の値であり、Ｐは100,000置換検定から確定されるＰ値であり、そしてlog（１／Ｐ）は正の整数として表わされるＰ値である。
【０１８２】
【表１０１】
2009502141.tif 000101
【０１８３】
表２０．
統計学的有意性の低い順に分類されたＤＮＡマーカーおよび小売牛肉歩留間の関連。遺伝子座は多型のParAllele鑑別子であり、Ｎは遺伝子型の数であり、平均＿0は遺伝子型0に関する平均小売牛肉歩留であり、平均＿1は遺伝子型１に関する平均であり、そして平均＿2は遺伝子型２の平均であり、ＳＤは標準偏差であり、ａは付加的効果であり、ｋは優性効果であり、アルファは対立遺伝子置換の平均効果であり、ｔｍａｘはｔ検定の値であり、そしてlog（１／Ｐ）は正の整数として表わされる100,000置換検定から確定されるＰ値である。ａに関するマイナス値は遺伝子型0の平均が遺伝子型2の平均より低いことを意味し、そしてアルファに関するマイナス値は対立遺伝子0に関する選択が集団中の小売牛肉歩留の平均値を下げることを意味する。
【０１８４】
【表１０２】
2009502141.tif 000102
【０１８５】
【表１０３】
2009502141.tif 000103
【０１８６】
【表１０４】
2009502141.tif 000104
【０１８７】
【表１０５】
2009502141.tif 000105
【０１８８】
【表１０６】
2009502141.tif 000106
【０１８９】
表２１．
Ｐ８脂肪および屠体重量の分析後の小売牛肉歩留に関する最良の21のＳＮＰを考察する。ＲＢＹ階級およびidentは表２０に言及しており、expは実験または形質であり、rbyは小売牛肉歩留に関して、p8fはｐ８脂肪に関して、cwtは屠体重量に関してであり、retankは屠体重量およびｐ８脂肪厚の考察後の表１９からの小売牛肉歩留ＳＮＰの相対階級分類であり、そしてcomb_log(1/P)は3つの実験の組合せ有意性値である。
【０１９０】
【表１０７】
2009502141.tif 000107
【０１９１】
これは、上方5つの関連が純粋に小腰に関するものと同一であることを、しかしさらに下方の関連のいくつかが再階級分けされ、そして脂肪厚および屠体重量に基づいてより大きな重要性を生じるということを示す。結果は、配列同定番号により相関され得る（各表の第二列）。
【０１９２】
表２２．
Ｐ８脂肪および屠体重量の考察後の高確率のＲＢＹとの関連を有するＳＮＰ
【０１９３】
【表１０８】
2009502141.tif 000108
【０１９４】
これらの付加的な正の関連のいくつかは、同一ゲノム領域中にあるか、または表１９で同定された他のＳＮＰのような遺伝子であり、このことは、同一領域に対する多重ヒットを意味し、そしてこれらが真の関連であることを確証するのに役立つ。例は、ＫＩＦ５Ｃ領域およびＩＭＰＧ２にある。
【０１９５】
表２３．
配列足場、ＳＮＰを含有するBaylor College of Medicine配列コンティグ、ＤＮＡ配列のGenbank寄託番号、ならびに各ＳＮＰに関する代替的塩基を示すＲＢＹ（小売牛肉歩留）と関連したさらなるＳＮＰに関する平行鑑別子。各ＳＮＰの正確な位置は、配列足場中に示され、下線の後の数は足場の出発点からの正確な塩基対である。
【０１９６】
【表１０９】
2009502141.tif 000109
【０１９７】
【表１１０】
2009502141.tif 000110
【０１９８】
【表１１１】
2009502141.tif 000111
【０１９９】
【表１１２】
2009502141.tif 000112
【０２００】
【表１１３】
2009502141.tif 000113
【０２０１】
【表１１４】
2009502141.tif 000114
【０２０２】
【表１１５】
2009502141.tif 000115
【０２０３】
【表１１６】
2009502141.tif 000116
【０２０４】
【表１１７】
2009502141.tif 000117
【０２０５】
【表１１８】
2009502141.tif 000118
【０２０６】
【表１１９】
2009502141.tif 000119
【０２０７】
【表１２０】
2009502141.tif 000120
【０２０８】
実施例７
小売牛肉歩留に影響を及ぼす付加的遺伝子座を見出すために、全ゲノム精査のさらなる分析を実施した。先ず、全測定個体（全ゲノム精査において正確に189というわけではない）に関するＲＢＹ形質値を、ASREMLを用いたモデルrby〜mu群れ屠殺＿群齢！sireidを用いて調整した。次に、残りのＲＢＹ表現型は、さらなる分析のために利用可能であった。全ゲノム精査における各遺伝子型に関する残りのＲＢＹの平均および標準誤差を算定し、ｔ検定は、各比較に関してコンピューター計算した。100,000置換を用いて、最大平均差の統計学的有意性を算定した。
【０２０９】
表２５．
残留小売牛肉歩留に関連した高レベルの支持を有する一組の遺伝子座。Ｓｎｐ＿ｉｄはParAlleleＳＮＰ鑑別子であり、Scaffold-v2はバージョン２足場であり、ｂｐは足場内のＳＮＰの位置であり、Scaffold-v1／IBISS4はＳＮＰへの直接的言及を示し、HsaはＳＮＰと関連するヒト染色体であり、そしてGeneはＳＮＰに最も近い遺伝子である。
【０２１０】
【表１２１】
2009502141.tif 000121
【０２１１】
この分析の結果は、さらなる145の当該遺伝子座を（Ｐ＜0.01）（表２６および２７）を示し、そして前に取り扱われなかった上方遺伝子座は表２５中に注釈付きで示されている。
【０２１２】
表２６
ＲＢＹとの関連を有する上記されていない遺伝子座。統計学的有意性の低い順に分類されたＤＮＡマーカーおよび小売牛肉歩留間の関連。遺伝子座は多型のParAllele鑑別子であり、Ｎは遺伝子型の数であり、平均＿0は遺伝子型0に関する平均小売牛肉歩留であり、平均＿1は遺伝子型１に関する平均であり、そして平均＿2は遺伝子型２の平均であり、ＳＥは標準誤差であり、ａは付加的効果であり、ｋは優性効果であり、アルファは対立遺伝子置換の平均効果であり、ｔｍａｘはｔ検定の値であり、そしてPermPは正の整数として表わされる100,000置換検定から確定されるＰ値である。ａに関するマイナス値は遺伝子型0の平均が遺伝子型2の平均より低いことを意味し、そしてアルファに関するマイナス値は対立遺伝子0に関する選択が集団中の小売牛肉歩留の平均値を下げることを意味する。Scaffold-v2はドラフト・バージョン２ウシゲノム配列であり、ｂｐは足場中の塩基対の位置であり、そして塩基は代替的塩基である。
【０２１３】
【表１２２】
2009502141.tif 000122
【０２１４】
【表１２３】
2009502141.tif 000123
【０２１５】
表２７．
ＲＢＹと関連するさらなる遺伝子座。統計学的有意性の低い順に分類されたＤＮＡマーカーおよび小売牛肉歩留間の関連。遺伝子座は多型のParAllele鑑別子であり、Ｎは遺伝子型の数であり、平均＿0は遺伝子型0に関する平均小売牛肉歩留であり、平均＿1は遺伝子型１に関する平均であり、そして平均＿2は遺伝子型２の平均であり、ＳＥは標準誤差であり、ａは付加的効果であり、ｋは優性効果であり、アルファは対立遺伝子置換の平均効果であり、ｔｍａｘはｔ検定の値であり、そしてPermPは正の整数として表わされる100,000置換検定から確定されるＰ値である。ａに関するマイナス値は遺伝子型0の平均が遺伝子型2の平均より低いことを意味し、そしてアルファに関するマイナス値は対立遺伝子0に関する選択が集団中の小売牛肉歩留の平均値を下げることを意味する。Scaffold-v2はドラフト・バージョン２ウシゲノム配列であり、ｂｐは足場中の塩基対の位置であり、そして塩基は代替的塩基である。
【０２１６】
【表１２４】
2009502141.tif 000124
【０２１７】
【表１２５】
2009502141.tif 000125
【０２１８】
【表１２６】
2009502141.tif 000126
【０２１９】
【表１２７】
2009502141.tif 000127
【０２２０】
【表１２８】
2009502141.tif 000128
【０２２１】
【表１２９】
2009502141.tif 000129
【０２２２】
【表１３０】
2009502141.tif 000130
【０２２３】
【表１３１】
2009502141.tif 000131
【０２２４】
足場35329_4726に位置するident.245097を有するさらなるＳＮＰ（配列番号１１７０）も、ＲＢＹと関連づけられる。
【０２２５】
実施例８
上記と同一動物で、そして上記と同一の方法を用いて、ＬＤＰＦ（肉の柔らかさの指標）の分析を実施した。同定された関連を以下の表に記述する。
表２８．
統計学的有意性の低い順に分類されたＤＮＡマーカーおよび肉の柔らかさの間の関連。遺伝子座は多型のParAllele鑑別子であり、Ｎは遺伝子型の数であり、平均＿0は遺伝子型0に関する平均肉柔らかさであり、平均＿1は遺伝子型１に関する平均であり、そして平均＿2は遺伝子型２の平均であり、ＳＤは標準偏差であり、ａは付加的効果であり、ｋは優性効果であり、アルファは対立遺伝子置換の平均効果であり、ｔｍａｘはｔ検定の値であり、そしてlog（１／Ｐ）は正の整数として表わされる100,000置換検定から確定されるＰ値である。ａに関するマイナス値は遺伝子型0の平均が遺伝子型2の平均より低いことを意味し、そしてアルファに関するマイナス値は対立遺伝子0に関する選択が集団中の柔らかさの平均値を下げることを意味する。
【０２２６】
【表１３２】
2009502141.tif 000132
【０２２７】
【表１３３】
2009502141.tif 000133
【０２２８】
【表１３４】
2009502141.tif 000134
【０２２９】
【表１３５】
2009502141.tif 000135
【０２３０】
【表１３６】
2009502141.tif 000136
【０２３１】
【表１３７】
2009502141.tif 000137
【０２３２】
【表１３８】
2009502141.tif 000138
【０２３３】
【表１３９】
2009502141.tif 000139
【０２３４】
表２９．
ＬＤＰＦと関連しているもの最高確率を有するＳＮＰ。identは表２８中ものであり、そしてParAllele鑑別子である。これらはＳＮＰ位置を示すＢＧＳＰ足場およびコンティグ上に突き止められる。これらの足場およびコンティグは、biolivesウエブサイト上の地図にグラフで位置を定められた。
【０２３５】
【表１４０】
2009502141.tif 000140
【０２３６】
表３０．
配列足場、ＳＮＰを含有するBaylor College of Medicine配列コンティグ、ＤＮＡ配列のGenbank寄託番号、ならびに各ＳＮＰに関する代替的塩基を示すＬＤＰＦ（肉の柔らかさ）と関連したさらなるＳＮＰに関する平行鑑別子。各ＳＮＰの正確な位置は、配列足場中に示され、下線の後の数は足場の出発点からの正確な塩基対である。
【０２３７】
【表１４１】
2009502141.tif 000141
【０２３８】
【表１４２】
2009502141.tif 000142
【０２３９】
【表１４３】
2009502141.tif 000143
【０２４０】
【表１４４】
2009502141.tif 000144
【０２４１】
【表１４５】
2009502141.tif 000145
【０２４２】
【表１４６】
2009502141.tif 000146
【０２４３】
【表１４７】
2009502141.tif 000147
【０２４４】
【表１４８】
2009502141.tif 000148
【０２４５】
【表１４９】
2009502141.tif 000149
【０２４６】
【表１５０】
2009502141.tif 000150
【０２４７】
【表１５１】
2009502141.tif 000151
【０２４８】
【表１５２】
2009502141.tif 000152
【０２４９】
【表１５３】
2009502141.tif 000153
【０２５０】
実施例９
肉の柔らかさに影響を及ぼす付加的遺伝子座を見出すために、全ゲノムＳＮＰ精査のさらなる分析を実施した。先ず、全測定個体（全ゲノム精査において正確に189というわけではない）に関するＬＤＰＦ形質値を、ASREMLを用いたモデル1dpf〜mu群れ屠殺＿群齢！sireidを用いて調整した。次に、残りのＬＤＰＦ表現型は、さらなる分析のために利用可能であった。全ゲノム精査における各遺伝子型に関する残りのＬＤＰＦの平均および標準誤差を算定し、ｔ検定は、各比較に関してコンピューター計算した。100,000置換を用いて、最大平均差の統計学的有意性を算定した。
【０２５１】
表３２．
残留肉柔らかさに関連した高レベルの支持を有する一組の遺伝子座。Ｓｎｐ＿ｉｄはParAlleleＳＮＰ鑑別子であり、Scaffold-v2はバージョン２足場であり、ｂｐは足場内のＳＮＰの位置であり、Scaffold-v1／IBISS4はＳＮＰへの直接的言及を示し、HsaはＳＮＰと関連するヒト染色体であり、そしてGeneはＳＮＰに最も近い遺伝子である。
【０２５２】
【表１５４】
2009502141.tif 000154
【０２５３】
表３３
統計学的有意性の低い順に分類されたＤＮＡマーカーおよび肉の柔らかさ間の関連。遺伝子座は多型のParAllele鑑別子であり、Ｎは遺伝子型の数であり、平均＿0は遺伝子型0に関する平均肉柔らかさであり、平均＿1は遺伝子型１に関する平均であり、そして平均＿2は遺伝子型２の平均であり、ＳＥは標準誤差であり、ａは付加的効果であり、ｋは優性効果であり、アルファは対立遺伝子置換の平均効果であり、ｔｍａｘはｔ検定の値であり、そしてPermPは正の整数として表わされる100,000置換検定から確定されるＰ値である。ａに関するマイナス値は遺伝子型0の平均が遺伝子型2の平均より低いことを意味し、そしてアルファに関するマイナス値は対立遺伝子0に関する選択が集団中の肉の柔らかさの平均値を下げることを意味する。Scaffold-v2はドラフト・バージョン２ウシゲノム配列であり、ｂｐは足場中の塩基対の位置であり、そして塩基は代替的塩基である。
【０２５４】
【表１５５】
2009502141.tif 000155
【０２５５】
表３４
統計学的有意性の低い順に分類されたＤＮＡマーカーおよび肉の柔らかさ間の関連。遺伝子座は多型のParAllele鑑別子であり、Ｎは遺伝子型の数であり、平均＿0は遺伝子型0に関する平均肉柔らかさであり、平均＿1は遺伝子型１に関する平均であり、そして平均＿2は遺伝子型２の平均であり、ＳＥは標準誤差であり、ａは付加的効果であり、ｋは優性効果であり、アルファは対立遺伝子置換の平均効果であり、ｔｍａｘはｔ検定の値であり、そしてPermPは正の整数として表わされる100,000置換検定から確定されるＰ値である。ａに関するマイナス値は遺伝子型0の平均が遺伝子型2の平均より低いことを意味し、そしてアルファに関するマイナス値は対立遺伝子0に関する選択が集団中の肉の柔らかさの平均値を下げることを意味する。Scaffold-v2はドラフト・バージョン２ウシゲノム配列であり、ｂｐは足場中の塩基対の位置であり、そして塩基は代替的塩基である。
【０２５６】
【表１５６】
2009502141.tif 000156
【０２５７】
【表１５７】
2009502141.tif 000157
【０２５８】
【表１５８】
2009502141.tif 000158
【０２５９】
【表１５９】
2009502141.tif 000159
【０２６０】
【表１６０】
2009502141.tif 000160
【０２６１】
【表１６１】
2009502141.tif 000161
【０２６２】
【表１６２】
2009502141.tif 000162
【０２６３】
【表１６３】
2009502141.tif 000163
【０２６４】
【表１６４】
2009502141.tif 000164
【０２６５】
足場344371_609に位置するident.343614を有するさらなるＳＮＰ（配列番号１６３１）は、ＬＤＰＦと関連付けられることが判明している。
【０２６６】
実施例１０
正味飼料摂取量（ＮＦＩ）に関するParAlleleＳＮＰ343617周囲のＳＮＰの一クラスターの評価
ＳＮＰ343617（配列番号１６３２）はシナプトタグミンＸをコードする遺伝子（SYT 10）中に存在する、ということが確立されている。シナプトタグミンはＣａ（２＋）センサーとして役立つと考えられるシナプス小胞の内在性膜タンパク質である。それらは小胞性輸送に、そしてシナプスでの神経伝達物質の放出に関与する。理論に縛られずに考えると、代謝率は、細胞内プロセス、例えばミトコンドリア中での陽子運搬により影響を及ぼされるが、一方、細胞膜を貫通するナトリウムおよびカリウムポンプは基礎代謝率に大きな影響を及ぼす。神経伝達物質放出に関連した輸送は、バックグラウンド・エネルギー論の一部であると考えられるが、それは、神経伝達物質の一定放出および神経伝達物質勾配の再構成（すべてエネルギーを必要とする）が存在するためである。配列番号１６３２において、多型が足場35407の位置３４０１に存在し、そしてＴ／Ｃ多型（ＴＴホモ接合体はＮＦＩに関してはより悪い）である、ということに留意されたい。
【０２６７】
表３５
統計学的有意性の低い順に分類されたＤＮＡマーカーおよび正味飼料摂取量間の関連。遺伝子座およびidentは多型のParAllele鑑別子であり、infは適正な試験のための各遺伝子型に対して十分な遺伝子型が存在するか否かであり、Ｎは遺伝子型の数であり、平均＿0は遺伝子型0に関する平均ＮＦＩであり、平均＿1は遺伝子型１に関する平均であり、そして平均＿2は遺伝子型２の平均であり、ＳＤは標準偏差であり、maxdは3つの遺伝子型のいずれかの間の最大差であり、ｔはｔ検定の値であり、Ｐは100,000置換検定から確定されるＰ値であり、そしてlog（１／Ｐ）は正の整数として表わされるＰ値である。
【０２６８】
【表１６５】
2009502141.tif 000165
【０２６９】
表３６．
ＮＦＩと関連している高確率を有するＳＮＰ。identは表３５中ものと同じであり、そしてParAllele鑑別子である。これらはＳＮＰ位置を示すＢＧＳＰ足場およびコンティグ上に突き止められる。
【０２７０】
【表１６６】
2009502141.tif 000166
【０２７１】
この実施例は、ＮＦＩ測定値を用いて実施例のウシのすべてに関して遺伝子型分類したＳＹＴ１０遺伝子中の3つの付加的ＳＮＰの分析を説明する。これらのＳＮＰはParAlleleＳＮＰ343617と側面を接し、そしてＳＹＴ１０遺伝子のこの部分に利用可能な16の潜在的ＳＮＰの一部を構成する。ＳＮＰの1つであるＳＹＴＸ３４８６は、全試料に関して全体的Ｐ＜0.001を示し、そしてそれならびにＳＮＰ  ＳＹＴＸ６１４６は、ＮＦＩおよび遺伝子型間のより安定した関連を有する、ということが判明した。
【０２７２】
さらなる分析のために343617付近の他のＳＮＰを選択して、遺伝子中の他のＳＮＰがＮＦＩとのより安定した関連を示すか否かを確定した。ＳＹＴ１０に近接するウシゲノム配列プロジェクトからの生配列トレースを検査することにより、ＳＮＰを得た。タックマン検定（ABI, Foster City, CA）のための標準方法を用いて3つのＳＮＰを遺伝子型分類して、ＣＲＡレポート３の場合と同様に遺伝子型を分析した。4つの遺伝子座（343617を含む）に関する連鎖不均衡概算値を、表３７に示す。SYTX3486（配列番号１６３３）およびSYTX6146（配列番号１６３４）は、測定値Ｄ‘およびｒ2の両方に関して高値の連鎖不均衡を示すが、しかし他の比較はすべて、Ｄ‘およびｒ2間のより大きな不一致を示す。これは、表中のゼロの存在または非常に小さい整数を有するいくつかの細胞の存在のためであり、そしてＤ’は、ハプロタイプ頻度表中にゼロが存在すると直ぐに1.0になるが、一方、ｒ2はそうではない。
【０２７３】
ＳＮＰSYTX3486およびSYTX6146は、統計学的に有意であるＮＦＩとの全体的関連を示し、SYTX3486はＰ＝0.00091を有する。両ＳＮＰに関する好ましい対立遺伝子は、低頻度で存在し（それらの両方に関して全体的にｆ（0）＝0.07）、0.01の頻度を有する好ましい対立遺伝子を示す3つの品種を伴うが、しかしヘレフォード品種は、これらのＳＮＰの両方に関して約0.35の頻度を有する。これらのＳＮＰに関する優位性の程度の類似性は、ＬＤの両測定に関する高ＬＤ値と一致する。これらのＳＮＰは343617のいずれかの側の1つであり、このことは、原因性ＳＮＰがこの遺伝子中の低頻度の好ましい対立遺伝子を有する、ということを示唆する。さらなるＳＮＰ（SYTX10948  ‐  配列番号１６３５）も、関連を示す。
【０２７４】
表３７．
直接計数により得られる4つのＳＹＴ１０  ＳＮＰ間の連鎖不均衡測定値。ハプロタイプはh00〜h11であり、対立遺伝子頻度の接合頻度、各比較のLewontinＤ‘およびｒ2（Devlin and Risch, 1995）が示される。
【０２７５】
【表１６７】
2009502141.tif 000167
【０２７６】
実施例１１
試験するためのＤＮＡ試料は、動物の任意の組織から得られるが、しかし使用を容易にするためには、毛嚢、頬スワブ、耳パンチまたは皮膚掻爬物のような組織が最も容易なものである。血液試料も採取が容易であり、そして子孫試験プログラムにおいて存在し得る雄牛に関しては、精液試料もＤＮＡの容易で且つ便利な供給源である。さらに一般的二は、任意の非癌性組織は同一遺伝子型を示すはずであり、そしてこの遺伝子型は、その最初期段階で受精卵または胚からでも得られる。液体または固体組織からのＤＮＡの抽出方法は文献中に報告されており、そしてキットはそうするために在庫があって直ぐに入手可能であり、そして多数の方法が特定用途にあつらえられている。実際、当業者に既知であるように、広範な精製なしに、ある組織から直接的に、例えば血液の微量滴から直接、遺伝子型を得ることが可能である。
【０２７７】
ＤＮＡが抽出された場合、遺伝子型分類のいくつかの方法はＤＮＡの純度および濃度に感受性であるため、遺伝子型が不正確であるというのではないが、しかし結果があいまいで、遺伝子型がスコアされ得ないＤＮＡの濃度およびその純度を知ることは、有用であり得る。それにもかかわらず、遺伝子型分類開始前にＤＮＡを定量することが必要でない十分に確固とした当該技術分野で既知の方法が存在する。
【０２７８】
明らかに、あるものは、遺伝子型が正確であることを保証するために対照に入り得るが、しかし対照なしに遺伝子型分類を実施することが可能である。いくつかの対照は、それらがＤＮＡを含有しない場合は陰性であり、そしてこれは、真の遺伝子型からの反応におけるノイズを識別するために有用である。いくつかの陽性対照はまた、既知の遺伝子型を有する、そして良質のＤＮＡを有する動物に関して有用である。いくつかの場合、ＤＮＡは高品質を有するものでなく、そして確かな遺伝子型を有するものは、真の手本が言及され得るため、遺伝子型をスコアするのに役立つ。いくつかの場合、多数の試料が遺伝子型分類されていた場合、そして試料が96ウエルまたは他のフォーマットプレート中に置かれた場合、各プレートがブランクの独特のパターンを示すよう、既知の位置に、すべてのプレート中の異なる位置に、ブランク試料を有することは有用である。次に、いくつかの予期しない理由のために、誤差が標識中に生じる場合、ブランクはそれらが存在すべき場所に存在しないため、この誤差が検出され得る。
【０２７９】
試料が設定されると、遺伝子型分類が開始し得る。遺伝子型分類の適切な方法が選択されれば、結果が得られる。最新高処理量方法は、遺伝子型分類シグナルを電子的に捕捉し、デジタル媒体に上方を記録することを包含するが、しかしいくつかの最新方法は、例えばフィルム写真撮影により、またはノートに遺伝子型を記録することにより、アナログ媒体に遺伝子型を記録することをさらに包含する。
【０２８０】
遺伝子型分類の一実施形態は、タックマンTM反応によるものであるが、しかし明らかにこれは遺伝子型が収集され得る唯一の方法ではない。この明細書中に列挙されるＤＮＡ配列は分析に付されるが、この場合、プローブは、Applied Biosystems（Foster City, CA）（LIVAK 2003）により記述されたガイドラインに従って設計され得る。すべてのＤＮＡ配列がタックマンTM反応に適しているというわけではなく、これは、綿密な検査により、あるいはソフトウエアまたはメーカーにより提供される無料サービスを用いてコンピューター処理分析に配列を付した後に、確定され得る。それにもかかわらず、配列の98％が適切であり、一対のプローブ（各々が多型の代替的対立遺伝子に関する）が合成され得る。ポリメラーゼ連鎖反応のためのＤＮＡプライマーも、多型周囲のＤＮＡ配列を増幅するために必要とされる。プローブおよびプライマーは組合され、そして次にメーカーの使用説明書に従って、標準方法を用いて、動物のＤＮＡ上でポリメラーゼ連鎖反応が実施される。遺伝子型は、実時間ＰＣＲ機を用いて検出され、そしてレーザー蛍光およびデジタル画像捕捉を用いて試料が取り調べられた後に、生データが収集される；プローブはＤＮＡと結合し、そしてポリメラーゼはプローブと衝突して、それを破壊し、染料を放出し、これが次に蛍光を発する；各プローブは対立遺伝子に特異的であり、対の各成員は異なる蛍光分子を有し、したがってホモ接合体はＤＮＡと結合する2つのプローブのうちの一方のみを有するが、ヘテロ接合体は結合する両方のプローブを有する。そこで蛍光分子は、放出される蛍光分子の数および同一性により、どのプローブが破壊されたかに関して、それゆえ個々の遺伝子型に関して報告する。
【０２８１】
遺伝子型は、動物の遂行能力を予測するために用いられ得る。これは、それが保有する遺伝子の好ましい対立遺伝子のコピーの数に基づいて各動物に関して選択的階級分けスキームを割り当てることにより、簡単に実行され得る。これは少数の遺伝子に適しているが、それは多数の遺伝子に関しては扱いにくい。ＤＮＡ試験結果を履行する別の方法は、当該形質に関する平均値を各動物に与え、次に平均値から遺伝子型の平均値を加えるかまたは差し引く。これは1つまたは少数の多型に関して非常に正確であるというわけではないが、多型の数が増大すると、予測の制度は顕著に増大する。このような方法の利点は、それが遺伝子効果の適合を可能にするという点であり、この場合、効果は遺伝子型全体に亘って均等に間隔を置かれるわけではなく、例えばこの場合、一遺伝子型は他のものと全く異なり得る。最も有用な場合は、ヘテロ接合体が過優性作用を示す場合であり、これは付加的階級分けのスキームに容易に適合せず、即ち一ホモ接合体は低平均値を有し、ヘテロ接合体は中間平均値を有し、そして他のホモ接合体は高平均値を有するが、しかしむしろこの場合、ヘテロ接合体は性能において両ホモ接合体を容易に上回る。
【０２８２】
どの多型が遺伝子型分類されたかによって、1つまたは多数の形質に関する性能属性に動物が割り当てられると、これらの遺伝子型組合せおよび予測属性は記録され、所有者に報告し戻され、公開されるかまたは使用されて、種々の目的のために動物を選択し得る。使用のいくつかは、１）特定の形質または形質組に関して多かれ少なかれ望ましい属性を有する動物を品種改良すること、ならびに２）特定市場終点または顧客要件に関して動物を選択するために、例えば飼育場への入場時の一検定として、一連の遺伝子型に基づいて特定の目的のために動物を選択することである。
【化１】
2009502141.tif 000168
【配列表】
2009502141000001.app
【国際調査報告】
2009502141.tif 000169
2009502141.tif 000170
2009502141.tif 000171
2009502141.tif 000172
2009502141.tif 000173