(57)【要約】  本発明は、リボース−５−リン酸、リブロース−５−リン酸またはキシルロース−５−リン酸が生合成の前駆体様であるリボフラビン（ビタミンＢ２）、ＦＡＤ、ＦＭＮ、リン酸ピリドキサール（ビタミンＢ６）、グアノシン、ＧＭＰ、アデノシン、ＡＭＰのような化合物の生物工学的生産のための改善された方法に関する。本発明は、さらに、これらの化合物を産生する生物体の生成に関する。さらに、産生菌株に導入されたときにグルコースでは正常の増殖を可能にするが、グルコナートでの増殖を低下させる変異型トランスケトラーゼの生成と、これらをコードするポリヌクレオチドに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変された酵素の比活性が対応する改変されていない野生型酵素と比較して調節されるように、改変型トランスケトラーゼのアミノ酸配列が少なくとも１つの変異を含有する改変型トランスケトラーゼ。
【請求項２】
前記改変型トランスケトラーゼのアミノ酸配列が、配列番号２に示されるような枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）トランスケトラーゼの位置３５７に相当するアミノ酸位置において変異を含有する請求項１に記載のトランスケトラーゼ。
【請求項３】
野生型アミノ酸アルギニンが、ヒスチジン、アラニン、リジン、セリン、スレオニン、ロイシン、バリン、イソロイシン、メチオニン、グリシン、グルタミン、またはアスパラギンによって置換される請求項２に記載のトランスケトラーゼ。
【請求項４】
野生型アミノ酸アルギニンが、ヒスチジン、アラニン、リジン、セリン、スレオニン、アスパラギン、またはグリシンによって置換される請求項２に記載のトランスケトラーゼ。
【請求項５】
バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アシュビア・ゴシッピー（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）、エレモテシウム・アシュビイ（Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ  ａｓｈｂｙｉｉ）またはコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）からの野生型トランスケトラーゼの改変である請求項１〜４のいずれか一項に記載のトランスケトラーゼ。
【請求項６】
前記野生型トランスケトラーゼがバシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に由来する請求項５に記載のトランスケトラーゼ。
【請求項７】
前記野生型トランスケトラーゼが枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来する請求項６に記載のトランスケトラーゼ。
【請求項８】
前記少なくとも１つの変異は、宿主細胞の前記野生型トランスケトラーゼを改変型で置換した後、ペントースリン酸経路によってのみに代謝される炭素源における生成された新しい菌株の増殖速度が前記野生型トランスケトラーゼを含有する最初の宿主細胞と比較して低下されるようなものであり、好ましくは、前記野生型トランスケトラーゼを含有する宿主細胞と比較して１０〜９０％の間の増殖速度まで、より好ましくは２０〜８０％の間の増殖速度まで、さらにより好ましくは２５〜７５％の間の増殖速度まで低下されるようなものである請求項１に記載の改変型トランスケトラーゼ。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のトランスケトラーゼをコードする遺伝子を含むポリヌクレオチド配列。
【請求項１０】
配列番号１によるヌクレオチド配列を含む請求項９に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項１２】
宿主細胞の野生型トランスケトラーゼ遺伝子を置換する請求項９または１０に記載のポリヌクレオチドもしくは請求項１１に記載のベクターによって遺伝子操作された宿主細胞であって、ペントースリン酸経路によってのみに代謝される炭素源での前記宿主細胞の増殖速度が、前記野生型トランスケトラーゼを含有する前記宿主細胞と比較して低下された宿主細胞。
【請求項１３】
前記増殖速度が、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％だけ低下された請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
改変型トランスケトラーゼを発現することができる請求項１２または１３に記載の宿主細胞を産生するための方法であって、
（ｉ）それぞれの野生型酵素と比較して調節された活性を示す変異型トランスケトラーゼを生成するステップと、
（ｉ）ペントースリン酸経路によってのみに代謝されない炭素源では正常またはわずかに低下した増殖を可能にするが、ペントースリン酸経路によってのみに代謝される炭素源で生物体が増殖する際には増殖速度を低下させる同じ生物体または別の生物体からの改変型トランスケトラーゼによって、前記宿主細胞の野生型トランスケトラーゼを置換するステップと
を含む方法。
【請求項１５】
前記宿主細胞が、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、哺乳類／動物細胞、および植物細胞からなる群から選択される請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記宿主細胞が、エレモテシウム・アシュビイ（Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ  ａｓｈｂｙｉｉ）、アシュビア・ゴシッピー（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、またはバシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）からの生物体である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
リボース−５−リン酸、リブロース−５−リン酸、またはキシルロース−５−リン酸が生合成の前駆体である物質の産生方法であって、
ａ）ペントースリン酸経路によってのみに代謝されない炭素源ではわずかに低下されるかまたは全く低下されない増殖を可能にするが、前記ペントースリン酸経路によってのみに代謝される炭素源で増殖する際には生物体の増殖速度の低下を引き起こす酵素をコードする改変型トランスケトラーゼ遺伝子によって、前記野生型トランスケトラーゼ遺伝子が置換されている遺伝子操作された／組換えで産生された宿主細胞を、前記改変型トランスケトラーゼの発現を可能にする条件下で、適切な培地中で培養することと、
ｂ）発酵産物を前記培地から分離することと
を含む方法。
【請求項１８】
請求項１２または１３に記載の宿主細胞、もしくは請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法に従って産生された宿主細胞が使用される請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
発酵産物として、リボフラビン、リボフラビン前駆体、ＦＭＮ、ＦＡＤ、リン酸ピリドキサール、もしくはこれらの１つまたは複数の誘導体が産生される請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
リボフラビンまたはその誘導体が産生される請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、改変型トランスケトラーゼ酵素を提供する。野生型トランスケトラーゼの代わりに改変型トランスケトラーゼの１つを合成する微生物は芳香族アミノ酸の原栄養体であり、ペントースリン酸経路によって同化される炭素源の使用において損傷される。修飾酵素およびそれをコードするポリヌクレオチドは、例えば、リボフラビン、リボフラビン前駆体、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）およびこれらの誘導体などの、生合成のための基質としてリボース−５−リン酸、リブロース−５−リン酸、またはキシルロース−５−リン酸を使用する物質のための発酵方法で使用することができる。これらは、リン酸ピリドキサール（ビタミンＢ６）、グアノシンおよびアデノシン、ならびにこれらのヌクレオチドの誘導体の産生のためにも使用することができる。
【０００２】
リボフラビン（ビタミンＢ２）は全ての植物および多くの微生物によって合成されるが、高等動物では産生されない。リボフラビンは、炭水化物の酵素酸化において必要とされるフラビンアデニンジヌクレオチドおよびフラビンモノヌクレオチドなどの補酵素の前駆体なので、基礎代謝にとって不可欠である。高等動物では、リボフラビンが不十分であると、脱毛、皮膚炎症、視力低下、および成長障害が起こり得る。
【０００３】
グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）およびリブロース−５−リン酸からのリボフラビンの生合成を触媒するのに必要とされる酵素は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の４つの遺伝子（ｒｉｂＧ、ｒｉｂＢ、ｒｉｂＡ、およびｒｉｂＨ）によってコードされる。これらの遺伝子はオペロン内に位置し、その遺伝子配列順は、酵素により触媒される酵素反応の順序とは異なる。例えば、リボフラビン生合成の最初のステップを触媒するＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩは、オペロン内の第３の遺伝子ｒｉｂＡによってコードされる。ｒｉｂＡ遺伝子は、第２の酵素活性、すなわち、リブロース−５−リン酸から４炭素単位３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−リン酸（ＤＨＢＰ）への転化を触媒する３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−リン酸シンターゼ（ＤＨＢＰＳ）もコードする。デアミナーゼおよびレダクターゼは、オペロンの第１の遺伝子ｒｉｂＧによってコードされる。リボフラビン生合成の最後から２番目のステップは、最後のｒｉｂ遺伝子ｒｉｂＨの産物であるルマジンシンターゼによって触媒される。経路の最後のステップを制御するリボフラビンシンターゼは、オペロンの第２の遺伝子ｒｉｂＢによってコードされる。ｒｉｂオペロンの３’末端に位置する遺伝子の機能は現在のところ不明であるが、その遺伝子産物はリボフラビンの合成に必要ではない。
【０００４】
ｒｉｂＰ１プロモーターからのリボフラビンオペロンの転写は、ｒｉｂＰ１とｒｉｂＧとの間に位置する調節リーダー領域を伴う減衰機構によって制御される。このリーダー領域内のｒｉｂＯ変異は、リボフラビンオペロンの発現の調節解除を引き起こす。調節が解除された発現は、ｒｉｂＣ遺伝子のミスセンス変異を含有する菌株においても観察される。ｒｉｂＣ遺伝子は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のフラビンキナーゼ／ＦＡＤシンターゼをコードすることが示されている（マック（Ｍａｃｋ）Ｍ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８０：９５０〜９５５頁、１９９８年）。調節解除変異はｒｉｂＣ遺伝子産物のフラボキナーゼ活性を低下させ、その結果、リボフラビン調節系のエフェクター分子であるフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）の細胞内濃度の低下が起こる。
【０００５】
リボフラビンの産生速度および収率が増大したリボフラビン産生菌株の操作は、これまで多数の異なる方法で達成されている。例えば、（１）古典的な変異誘発を用いて、選り抜きの生物体のゲノムにランダム変異を有する変異型が生成された後、プリン類似体に対するより高い耐性の選択および／またはリボフラビンの増大した産生のスクリーニングが行われた。（２）あるいは、リボフラビン生合成の末端酵素、すなわちグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）およびリブロース−５−リン酸からリボフラビンへの転化を触媒する酵素が過剰発現され、その結果、標的産物に向かってより高い流束も生じた。生合成経路（例えば、リボフラビンの生合成経路）内への、そしてそこからの代謝流束は、この特定の経路の律速酵素の比活性と、これらの酵素のための基質の細胞内濃度とによって決定される。飽和基質濃度以上の場合にだけ、酵素はその最大活性で作用することができる。飽和基質濃度は、各酵素に特有の特徴である。例えば、リブロース−５−リン酸の細胞内濃度を、リボフラビン生合成経路の推定律速酵素である３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−リン酸シンターゼの飽和基質濃度よりも高いか、あるいはできるだけ近接するように維持することによって、リボフラビン経路内への代謝流束を増大させるか、あるいは高レベルに保つことができる。リブロース−５−リン酸の高細胞内濃度は、例えば、ペントースリン酸経路の非酸化的部分を通るリブロース−５−リン酸の中央代謝への排液を阻止または妨害することによって達成することができる。
【０００６】
ペントースリン酸経路の非酸化的部分における重要な酵素は、リボース−５−リン酸およびキシルロース−５−リン酸からセデュヘプツロース（ｓｅｄｕｈｅｐｔｕｌｏｓｅ）−７−リン酸およびグリセルアルデヒド−３−リン酸への可逆的転化を触媒するトランスケトラーゼ酵素である。さらに、トランスケトラーゼは、フルクトース−６−リン酸およびグリセルアルデヒド−３−リン酸からキシルロース−５−リン酸およびエリトロース−４−リン酸への転化も触媒する（コチェトフ（Ｋｏｃｈｅｔｏｖ）Ｇ．Ａ．１９８２年、「酵母、ラット肝臓、およびブタ肝臓からのトランスケトラーゼ（Ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｙｅａｓｔ，  ｒａｔ  ｌｉｖｅｒ，  ａｎｄ  ｐｉｇ  ｌｉｖｅｒ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、９０：２０９〜２３頁）。
【０００７】
遺伝子をコードするトランスケトラーゼにノックアウト変異を有するトランスケトラーゼ欠乏性の枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株が、発酵ブロス中に蓄積するリボースを産生することは以前に報告されている（デ・ウルフ（Ｄｅ  Ｗｕｌｆ）Ｐ．およびＥ．Ｊ．バンダム（Ｖａｎｄａｍｍｅ）１９９７年、「発酵によるＤ−リボースの産生（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄ−ｒｉｂｏｓｅ  ｂｙ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）」、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４８：１４１〜１４８頁、ササジマ（Ｓａｓａｊｉｍａ）Ｋ．およびヨネダ（Ｙｏｎｅｄａ）Ｍ．１９８４年、「微生物によるペントースの産生（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｎｔｏｓｅｓ  ｂｙ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ．２：１７５〜２１３頁）。明らかに、トランスケトラーゼノックアウト変異体では、細菌の生理学的必要量を超えて過剰のリボースの分泌を導くレベルまで増大した細胞内Ｃ５炭素糖プールが達成され得る。
【０００８】
上記のように、トランスケトラーゼに触媒される反応は、３つのタンパク新生芳香族アミノ酸を誘導するエリトロース−４−リン酸を産生するためにも必要とされる。従って、トランスケトラーゼ欠乏性の微生物はこれらのアミノ酸の栄養要求体である。これらの微生物は、これらのアミノ酸またはその生合成前駆体、例えばシキミ酸が培地によって供給されるときにだけ増殖することができる。
【０００９】
芳香族アミノ酸またはシキミ酸に対する好ましくない栄養要求性に加えて、トランスケトラーゼ欠乏性の枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）変異体は、グルコースでの増殖が非常に遅いこと、ホスホエノールピルビン酸依存性のホスホトランスフェラーゼ系の欠損、炭素異化産物抑制の調節解除、ならびに細胞膜および細胞壁組成物の変化というような多数の激しい多面発現効果を示す。（デ・ウルフ（Ｄｅ  Ｗｕｌｆ）Ｐ．およびＥ．Ｊ．バンダム（Ｖａｎｄａｍｍｅ）１９９７年）。
【００１０】
他のトランスケトラーゼ欠乏性のリボフラビン分泌枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株は、ゲルシャノビチ（Ｇｅｒｓｈａｎｏｖｉｃｈ）ら（ゲルシャノビチ（Ｇｅｒｓｈａｎｏｖｉｃｈ）ＶＮ、クカノバ（Ｋｕｋａｎｏｖａ）ＡＩａ、ガルスキナ（Ｇａｌｕｓｈｋｉｎａ）ＺＭ、ステパノフ（Ｓｔｅｐａｎｏｖ）ＡＩ（２０００年）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ．Ｖｉｒｕｓｏｌ．３：３〜７頁）によって記載された。
【００１１】
さらに、米国特許第６，２５８，５５４Ｂ１号明細書には、トランスケトラーゼ活性が欠乏しているリボフラビン過剰産生コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）菌株が開示される。米国特許第６，２５８，５５４Ｂ１号明細書の開示から、原栄養復帰細胞が、野生型トランスケトラーゼ背景を有するＣ．グルタミクム（ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）株と同様の量のリボフラビンを産生したので、トランスケトラーゼ活性の欠乏、およびその結果であるアミノ酸栄養要求性は、改善されたリボフラビンの生産性のために不可欠であったことに気付くことができる。
【００１２】
これらの不都合、すなわち芳香族アミノ酸の栄養要求性および上記のさらなる多面発現効果によって、トランスケトラーゼ欠乏性の変異体は、安定な工業過程（例えば、このような菌株内でのリボフラビンの工業生産など）のためにあまり好ましくない産生菌株であるとされる。
【００１３】
一般に、本発明の目的は、非改変型トランスケトラーゼよりも改変型トランスケトラーゼの触媒特性が高い細胞内リブロース−５−リン酸およびリボース−５−リン酸濃度を可能にするように修飾されるが、上記のトランスケトラーゼ欠乏性の菌株の不都合を有さないトランスケトラーゼ変異株を提供することである。
【００１４】
驚くことに、調節された比活性を有することによっていくらかの残留流束がペントースリン酸経路を通るようにする改変型トランスケトラーゼをコードする変異遺伝子で野生型遺伝子を置換することによって、例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの微生物を遺伝的に変化させることによって、例えばリボフラビンなどの発酵産物の産生は、原栄養特性を失うことなく著しく改善され得ることが今や分かった。
【００１５】
本発明は、改変型トランスケトラーゼと、上記の特性を有する改変型トランスケトラーゼをコードする遺伝子を含むポリヌクレオチド配列と、このようなポリヌクレオチド配列によって形質転換された宿主細胞と、変異型トランスケトラーゼをコードするポリヌクレオチドによって野生型トランスケトラーゼ遺伝子が安定的に置換されている宿主細胞に基づいて、例えば、リボフラビン、リボフラビン前駆体、ＦＭＮ、ＦＡＤ、リン酸ピリドキサールもしくはこれらの１つまたは複数の誘導体などの発酵産物を生物工学的に生産するための方法とに関する。
【００１６】
野生型トランスケトラーゼがこのような改変型トランスケトラーゼの１つによって置換された変異体を単離するための第１のステップとして、タンパク新生芳香族アミノ酸の栄養要求体であり、ペントースリン酸経路により同化される炭素源、例えばグルコナートでは増殖することができない欠失変異体が生成され得る。次に、トランスケトラーゼ欠失変異体は、様々なトランスケトラーゼ変異体をコードするＤＮＡ断片の混合物で形質転換され得る。原栄養形質転換体が単離され、その中から、グルコナートでの増殖速度の低下を示すものが選択される。この方法に従って単離された変異体は、栄養要求性増殖を防止するが、グルコナートの同化作用を妨げる役割を果たすために十分なエリトロース−４−リン酸の生合成を可能にする改変型トランスケトラーゼ酵素を合成することができる。さらに、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）トランスケトラーゼ欠失変異体で通常観察される望ましくない多面発現効果は防止され得る。米国特許第６，２５８，５５４Ｂ１号明細書には、栄養要求増殖から原栄養増殖への復帰と共に、リボフラビン分泌Ｃ．グルタミクム（ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）トランスケトラーゼ変異体は、野生型トランスケトラーゼ遺伝子を含有する類似菌株よりも多くのリボフラビンを産生する能力を失うことが示される。本発明の実施例において示されるように、上記で概説したように単離された原栄養性枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）トランスケトラーゼ変異体は、予想外にトランスケトラーゼ野生型親株よりも多くのリボフラビンを産生したが、トランスケトラーゼ欠失変異体は、そのリボフラビン産生能力の一部を失った。
【００１７】
ＤＮＡ断片に変異を導入するための方法は当該技術分野においてよく知られている。例えば、トランスケトラーゼ変異体は、アミノ酸配列の適切な位置を選択するために例えば酵母トランスケトラーゼの利用可能な３Ｄ構造の１つを用いるタンパク質工学（リンドクビスト（Ｌｉｎｄｑｖｉｓｔ）Ｙ．、Ｇ．シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）、Ｕ．エルムラー（Ｅｒｍｌｅｒ）、およびＭ．サンドストローム（Ｓｕｎｄｓｔｒｏｍ）、１９９２年、「２．５Ａの解像度におけるトランスケトラーゼ、チアミン二リン酸依存性酵素の三次元構造（Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ，  ａ  ｔｈｉａｍｉｎｅ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｎｚｙｍｅ，  ａｔ  ２．５Ａ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）」、Ｅｍｂｏ．Ｊ．１１：２３７３〜９頁）によって、あるいはランダム変異誘発によって生成することができる。いずれの場合にも、選択工程は上記のように実行され得る。改変型トランスケトラーゼ（野生型トランスケトラーゼの置換として使用される場合）は触媒特性、すなわち調節された比活性を示し、ペントースリン酸経路によってのみ代謝される炭素源（例えば、グルコナート）では、野生型トランスケトラーゼを含有する宿主細胞と比較して増殖速度が低下した宿主細胞の増殖を可能にする。これらの特性は、より高い細胞内リブロース−５−リン酸およびリボース−５−リン酸濃度ならびにペントースリン酸経路を通る残留流束を引き起こすので、栄養要求性の増殖を防止するために十分なエリトロース−４−リン酸が産生される。
【００１８】
本発明のために使用することができる「野生型酵素」または「野生型トランスケトラーゼ」には、本発明に従って変異体を設計するための出発点として使用される上記のトランスケトラーゼが含まれ得る。野生型トランスケトラーゼは、特に、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、エレモテシウム属（Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）またはアシュビア属（Ａｓｈｂｙａ）、好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リシェニフォルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．ハロドゥランス（ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｅ．ゴシッピー（ｇｏｓｓｙｐｉｉ）、Ｃ．フラレリ（ｆｌａｒｅｒｉ）またはＡ．ゴシッピー（ｇｏｓｓｙｐｉｉ）、もしくは図１に示されるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する任意のトランスケトラーゼから選択される真核生物または原核生物、好ましくは真菌または細菌の起源を有し得る。最も好ましくは、トランスケトラーゼは枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来する。「相同」とは、図１に示されるアミノ酸配列の１つまたは複数に対して、少なくとも約５０％同一、好ましくは少なくとも約６０％同一、より好ましくは少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９５％同一、そして最も好ましくは少なくとも約９８％同一であるトランスケトラーゼを指す。「野生型」は、本発明との関連では、自然から誘導できるトランスケトラーゼ配列、および合成トランスケトラーゼ酵素の変異型（図１に示される配列のいずれか１つに対して相同である限りは）の両方を含み得る。「野生型トランスケトラーゼ」および「非改変型トランスケトラーゼ」という用語は、本明細書では同義的に使用される。
【００１９】
「％の同一性」という用語は、当該技術分野において知られているように、場合によってはこのような配列のストリング間の適合によって決定されるようなポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の間の関連性の度合いを意味する。「同一性」は、既知の方法、例えばプログラムＢＥＳＴＦＩＴ（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．２、米国９２１２１−３７５２カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、スクラントンロード（Ｓｃｒａｎｔｏｎ  Ｒｏａｄ）９６８５のＡｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．）により、以下のパラメータ：ギャップ形成ペナルティー（ｇａｐ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）８、ギャップ伸長ペナルティー（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）２（デフォルトパラメータ）を用いて容易に決定することができる。
【００２０】
本明細書で使用される「変異体」、「変異体酵素」、「変異酵素」または「変異体トランスケトラーゼ」または「改変型トランスケトラーゼ」は、本発明の教示に従って所与の野生型酵素／トランスケトラーゼ（上記の定義による）から誘導可能な変異型を意味し、宿主生物体／細胞の野生型遺伝子を置換するために使用される場合には、例えばグルコナートおよび／またはリボースにおける増殖に対して影響を与えなければならない。本発明の範囲では、どのようにして変異体が得られたかは関係なく、このような変異体は、例えば、細胞全体／生物体の部位特異的変異誘発、飽和変異誘発、ランダム変異誘発／定向進化、化学またはＵＶ変異誘発などによって得ることができる。これらの変異体は、例えば、合成遺伝子を設計することによって生成することもできるし、インビトロの（無細胞）翻訳によって生じることもできる。比活性の試験のために、変異体は、当業者に既知の方法によって（過剰）発現させることができる。「変異体トランスケトラーゼ」、「改変型トランスケトラーゼ」または「変異型トランスケトラーゼ」は、本明細書では同義的に使用される。
【００２１】
「宿主細胞」は、所与の発酵産物を産生し、野生型トランスケトラーゼ、または本発明による改変型トランスケトラーゼをコードする核酸を含有することができる細胞である。適切な宿主細胞は、微生物の細胞を含む。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、「比活性」という用語は、コチェトフ（Ｋｏｃｈｅｔｏｖ）（コチェトフ（Ｋｏｃｈｅｔｏｖ）Ｇ．Ａ．１９８２年、「酵母、ラット肝臓、およびブタ肝臓からのトランスケトラーゼ（Ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｙｅａｓｔ，  ｒａｔ  ｌｉｖｅｒ，  ａｎｄ  ｐｉｇ  ｌｉｖｅｒ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ９０：２０９〜２３頁）において記載されるように適切に定義された反応条件下における野生型および変異体トランスケトラーゼ酵素の反応速度を示す。「比活性」は、定義された温度において所与の時間に、定義された量のタンパク質によって消費される基質および／または産生される産物の量を定義する。通常、「比活性」は、タンパク質１ｍｇあたり１分間に消費される基質または形成される産物がμｍｏｌで表される。通常、μｍｏｌ／分は、Ｕ（＝単位）で略記される。従って、μｍｏｌ／分／（タンパク質ｍｇ）またはＵ／（タンパク質ｍｇ）という比活性の単位の定義は、本明細書を通して同義的に使用される。本発明との関連では、比活性は、類似または好ましくは同一のポリペプチド鎖の長さに基づいて比較されなければならないことが理解される。
【００２３】
多くの変異は、グルコナートでの増殖が上記のように影響を受けるように、野生型トランスケトラーゼを変化させ得る。
【００２４】
本発明の目的は、上記で定義した特性を有する改変型トランスケトラーゼを提供することであり、改変型トランスケトラーゼのアミノ酸配列は、対応する非改変型トランスケトラーゼのアミノ酸配列と比較したときに少なくとも１つの変異を含有する。
【００２５】
少なくとも１つの変異は、付加、欠失および／または置換であり得る。
【００２６】
好ましくは、少なくとも１つの変異は少なくとも１つのアミノ酸置換であり、非改変型トランスケトラーゼのアミノ酸配列内に存在する所与のアミノ酸が、本発明の改変型トランスケトラーゼのアミノ酸配列内の異なるアミノ酸で置換される。改変型トランスケトラーゼのアミノ酸配列は、対応する非改変型トランスケトラーゼのアミノ酸配列と比較したときに少なくとも１つのアミノ酸置換を含有することができる。特に、本発明の改変型トランスケトラーゼは、配列番号２に示される枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）トランスケトラーゼアミノ酸配列のアミノ酸位置３５７に相当するアミノ酸位置に少なくとも１つの変異を含有する。
【００２７】
さらなる実施形態では、改変型トランスケトラーゼは、対応するトランスケトラーゼのアミノ酸配列と比較したときに少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたは少なくとも５つの置換を含有する。例えば、改変型トランスケトラーゼは、対応する非改変型トランスケトラーゼのアミノ酸配列と比較したときに１〜１０、１〜７、１〜５、１〜４、２〜１０、２〜７、２〜５、２〜４、３〜１０、３〜７、３〜５または３〜４のアミノ酸置換を含有する。
【００２８】
本発明の好ましい実施形態では、非改変型トランスケトラーゼは、配列番号２に示されるようなバシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、好ましくは枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から得られる。対応するＤＮＡ配列は、配列番号１に示される。改変型トランスケトラーゼは、配列番号２の位置３５７に少なくとも１つの変異を含有し、上記の特性を有する改変型トランスケトラーゼをもたらす。
【００２９】
配列番号２において示されるアミノ酸３５７に相当する位置にある非改変型トランスケトラーゼの少なくとも１つのアミノ酸置換は、置換Ｒ３５７Ｈ、Ｒ３５７Ａ、Ｒ３５７Ｓ、Ｒ３５７Ｎ、Ｒ３５７Ｔ、Ｒ３５７Ｋ、Ｒ３５７Ｉ、Ｒ３５７Ｖ、Ｒ３５７Ｇ、およびＲ３５７Ｌから選択され得る。
【００３０】
特に好ましい実施形態では、変異型トランスケトラーゼは、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸位置３５７に相当するアミノ酸位置に影響を与え、置換Ｒ３５７Ｈ、Ｒ３５７Ａ、Ｒ３５７Ｓ、Ｒ３５７Ｎ、Ｒ３５７Ｔ、Ｒ３５７Ｋ、Ｒ３５７Ｉ、Ｒ３５７Ｖ、Ｒ３５７Ｇ、およびＲ３５７Ｌから選択され得る１つの置換からなる。
【００３１】
他の好ましい実施形態では、改変型トランスケトラーゼは、対応する非改変型トランスケトラーゼのアミノ酸配列と比較したときに少なくとも２つのアミノ酸置換を含有し、少なくとも１つの変異は配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸位置３５７に相当し、置換Ｒ３５７Ｈ、Ｒ３５７Ａ、Ｒ３５７Ｓ、Ｒ３５７Ｎ、Ｒ３５７Ｔ、Ｒ３５７Ｋ、Ｒ３５７Ｉ、Ｒ３５７Ｖ、Ｒ３５７Ｇ、およびＲ３５７Ｌから選択され得る。
【００３２】
非改変型トランスケトラーゼに存在するアミノ酸は、好ましくは、位置３５７のアルギニンである。非改変型トランスケトラーゼの配列内のアミノ酸は、位置３５７においてヒスチジン、アラニン、セリン、アスパラギン、リジン、スレオニン、ロイシン、グリシン、イソロイシンまたはバリンに変化され得る。好ましくは、配列番号２に示される配列の位置３５７に相当するアミノ酸位置における置換は、ヒスチジンによるアルギニンの置換、アラニンによるアルギニンの置換、セリンによるアルギニンの置換、ロイシンによるアルギニンの置換、リジンによるアルギニンの置換、アスパラギンによるアルギニンの置換、スレオニンによるアルギニンの置換、グリシンによるアルギニンの置換、イソロイシンによるアルギニンの置換、バリンによるアルギニンの置換からなる。
【００３３】
本発明の改変型トランスケトラーゼは、好ましくはそのＮ末端またはＣ末端において外来性アミノ酸を含み得る。「外来性アミノ酸」は、天然の（自然中に存在する）トランスケトラーゼには存在しないアミノ酸、好ましくは、天然トランスケトラーゼには存在しない少なくとも約３、少なくとも約５、または少なくとも約７の隣接するアミノ酸の一続きを意味する。好ましい外来性アミノ酸の一続きとしては、組換えで産生された改変型トランスケトラーゼの精製を容易にする「タグ」があげられるが、これらに限定されない。このようなタグの例としては、「Ｈｉｓ６」タグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグなどがあげられるが、これらに限定されない。比活性の計算のために、これらの追加のアミノ酸に対して値を補正する必要がある（上記も参照）。
【００３４】
もう１つの実施形態では、改変型トランスケトラーゼは、対応する非改変型トランスケトラーゼのアミノ酸配列と比較したときに１つまたは複数、例えば２つの欠失を含有し得る。好ましくは、欠失は、対応する非改変型トランスケトラーゼのＮまたはＣ末端アミノ酸に影響を与え、酵素の機能特性、例えば比活性をあまり低下させない。
【００３５】
本発明は、さらに、本発明による改変型トランスケトラーゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに関する。本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」は、未修飾ＲＮＡまたはＤＮＡもしくは修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであり得るポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖、またはより一般的には二本鎖、または一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を含むが、これらに限定されない。「ポリヌクレオチド」という用語は、１つまたは複数の普通でない塩基、例えばイノシン、もしくは１つまたは複数の修飾塩基、例えばトリチル化塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
【００３６】
本発明のポリヌクレオチドは、非改変型トランスケトラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を修飾することによって簡単に得ることができる。非改変型トランスケトラーゼ酵素をコードするこのようなポリヌクレオチド配列の例としては図１のアミノ酸配列があるが、これらに限定されない。好ましくは、非改変型トランスケトラーゼは、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、特に枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来し、より好ましくは、配列番号２に示される非改変型トランスケトラーゼをコードするポリヌクレオチドである。
【００３７】
非改変型トランスケトラーゼをコードするヌクレオチド配列内に変異（例えば、付加、欠失および／または置換）を導入するための方法としては、部位特異的変異誘発およびＰＣＲに基づく方法があげられるが、これらに限定されない。
【００３８】
本発明のＤＮＡ配列は、例えば、ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、カリフォルニア州、米国）、欧州生命情報学研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（Ｈｉｎｓｔｏｎ  Ｈａｌｌ、ケンブリッジ、英国）、ＮＢＲＦ（ジョージタウン大学（Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、メディカルセンター（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ）、ワシントンＤＣ、米国）およびＶｅｃｂａｓｅ（ウィスコンシン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）、バイオテクノロジーセンター（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｒｅ）、マディソン、ウィスコンシン州、米国）から、あるいはインビトロの変異誘発法によって図１に開示される配列情報から入手可能であるような最新技術において知られているトランスケトラーゼ酵素をコードするゲノムまたはｃＤＮＡ配列から構築され得る。（例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨークを参照）。また本発明の実施に適し得る所与のＤＮＡ配列の変異のもう１つの可能性は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いることによる変異誘発である。出発材料としてのＤＮＡは、当該技術分野において既知の、例えばサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（分子クローニング）に記載されている方法によって、それぞれの菌株／生物体から単離することができる。しかしながら、本発明に従って構築／変異すべきトランスケトラーゼをコードするＤＮＡは、例えば、当該技術分野において既知の方法による合成遺伝子の構築によって、既知のＤＮＡ配列に基づいても調製可能であると理解される（例えば、ＥＰ７４７４８３号明細書に記載される）。
【００３９】
本発明の完全なＤＮＡ配列が得られたら、当該技術分野において既知の、例えばサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（上記参照）に記載されている方法によって、これらをベクターに組み込む、あるいは宿主生物体のゲノムに直接導入して、適切な宿主系においてコード化されたポリペプチドを（過剰）発現することができる。しかしながら、ＤＮＡ配列自体を用いて本発明の適切な宿主系を形質転換し、コード化ポリペプチドの（過剰）発現を得ることも可能であることは当業者には知られている。
【００４０】
好ましい実施形態では、本発明は、
（ｉ）上記のような少なくとも１つの変異を有する改変型トランスケトラーゼをコードし、特定の改変型トランスケトラーゼ酵素のＤＮＡ配列のいずれかと標準条件下でハイブリッド形成する、例えば配列番号１によるＤＮＡ配列とハイブリッド形成するＤＮＡ配列、または
（ｉｉ）上記のような少なくとも１つの変異を有する改変型トランスケトラーゼをコードするが、遺伝暗号の縮重のためにハイブリッド形成せず、しかし本発明の特定の改変型トランスケトラーゼ酵素のＤＮＡ配列のいずれかと標準条件下でハイブリッド形成するＤＮＡ配列と正確に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、または
（ｉｉｉ）このような改変ＤＮＡ配列の断片であり、ポリペプチド（これの断片である）の活性特性を保持するＤＮＡ配列
を提供する。
【００４１】
ハイブリダイゼーションのための「標準条件」とは、本発明との関連では、特定のハイブリダイゼーションシグナルを検出するために当業者によって通常使用され、例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「分子クローニング」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９年、ニューヨークによって記載される条件、あるいは当業者によく知られており、例えばサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（上記参照）において記載されている、好ましくはいわゆるストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび非ストリンジェントな洗浄条件、またはより好ましくはいわゆるストリンジェントなハイブリダイゼーションおよびストリンジェントな洗浄条件を意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の特定の例は、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中４２℃で一晩のインキュベーション（例えば、１５時間）の後、約６５℃、０．１×ＳＳＣ中におけるハイブリダイゼーション支持体の洗浄である。
【００４２】
もう１つの好ましい実施形態では、本発明はさらに、明確に記載されたＤＮＡ配列に基づいて設計された、図２に示されるようなＰＣＲプライマーによるいわゆるポリメラーゼ連鎖反応法（「ＰＣＲ」）によって得ることができるＤＮＡ配列を提供する。
【００４３】
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは、単離された形で提供される、そして好ましくは均一になるまで精製される。
【００４４】
「単離」とは、材料がその最初の環境（例えば、天然に存在する場合には自然環境）から取り出されることを意味する。例えば、生きている微生物中に含まれる天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、自然系に共存する材料のいくつかまたは全てから分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり、および／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であり得る。そして、このようなベクターまたは組成物はその自然環境の一部ではないという点でさらに単離され得る。
【００４５】
本明細書で使用される単離ポリヌクレオチドまたは核酸は、それが由来する生物体の天然に存在するゲノムにおいてそれが直接隣接する両方のコード配列（５’末端に１つおよび３’末端に１つ）と直接隣接しないＤＮＡでもＲＮＡでもよい。従って、１つの実施形態では、核酸は、コード配列に直接隣接する５’非コード（例えば、プロモーター）配列のいくつかまたは全てを含む。「単離ポリヌクレオチド」という用語は、従って、例えば、ベクター内、自己複製プラスミドまたはウィルス内、もしくは原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡ内に組み込まれるか、あるいは他の配列と無関係に別個の分子（例えば、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ処理によって産生されるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片）として存在する組換えＤＮＡを含む。また、実質的に細胞材料、ウィルス材料、または培地（組換えＤＮＡ技法により産生される場合）、もしくは化学前駆体または他の化学薬品（化学的に合成される場合）を含まない追加のポリペプチドをコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡも含まれる。さらに、「単離核酸断片」は断片として天然に存在しない核酸断片であり、自然状態では見られないであろう。
【００４６】
本明細書で使用される場合、単離ポリペプチドという用語は、実質的に他のポリペプチドを含まないポリペプチドを指す。単離ポリペプチドは、好ましくは、８０％を超える純度であり、より好ましくは９０％を超える純度であり、さらにより好ましくは９５％を超える純度であり、最も好ましくは９９％を超える純度である。純度は当該技術分野において既知の方法に従って、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびそれに続くタンパク質染色によって決定することができる。次に、デンシトメトリーによってタンパク質バンドを定量することができる。純度を決定するためのさらなる方法は、通常の技量レベルの範囲内である。
【００４７】
上記のように、本発明の改変型トランスケトラーゼおよび対応するポリヌクレオチドは、生合成のための基質としてリボース−５−リン酸、リブロース−５−リン酸、またはキシルロース−５−リン酸を使用する物質のための発酵方法においてより良好および効率的にするために、適切な宿主細胞の遺伝子操作において利用され得る。適切な宿主細胞内の前記改変型トランスケトラーゼの存在は、より高い細胞内リブロース−５−リン酸およびリボース−５−リン酸濃度ならびに前記組換え宿主内のペントースリン酸経路を通る残留流束を生じることができるので、栄養要求性増殖を防止するために十分なエリトロース−４−リン酸が産生され得る。
【００４８】
適切な宿主細胞は、例えば、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉ）（アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）またはアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）など）、またはトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）（トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）など）、またはアシュビア属（アシュビア・ゴシッピー（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）など）、またはエレモテシウム属（エレモテシウム・アシュビイ（Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ  ａｓｈｂｙｉｉ）など）のような真菌、もしくはサッカロミセス属（サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）など）、またはカンジダ属（カンジダ・フラレリ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｆｌａｒｅｒｉ）など）、またはピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）（ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）など）、またはハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（ＤＳＭ５２１５）など）のような酵母菌である。使用可能な細菌は、例えば、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）など）またはストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）（ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）など）である。使用され得る大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）は、例えば、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）Ｋ１２株、例えばＭ１５またはＨＢ１０１である。
【００４９】
従って、本発明は、ペントースリン酸経路によってのみ代謝される炭素源（例えば、グルコナート）において微生物が増殖できるが、野生型トランスケトラーゼを含有する宿主細胞と比較して低下された増殖速度を有するようにトランスケトラーゼの活性が改変された微生物に関する。通常、特定の生物体、例えば枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来して得られたトランスケトラーゼ変異体を再度同じ生物体に導入して、ここで宿主細胞として使用すること、あるいは得られた変異体を他の任意の関連の宿主細胞に導入することが可能である。
【００５０】
本明細書において使用される場合、「増殖速度」という用語は、以下のことを示す。細菌細胞は２つに分かれることにより再生する。増殖が制限されていなければ、一定の速度で倍加が続くので、細胞の数および集団の増加率はいずれも、連続したそれぞれの期間とともに２倍になる。このタイプの指数関数的な増殖では、時間（好ましくは、時間）に対して細胞の数の自然対数をプロットすると直線が生じる。この線の傾きは生物体の比増殖速度であり、単位時間における細胞あたりの分裂数の尺度である。食品では、得られる栄養物の量が限定されており、老廃物が蓄積し得るので、細菌は連続的に増殖することができない。これらの条件下では、増殖曲線はＳ字状の傾向がある。
【００５１】
本発明の目的は組換え宿主細胞を提供することであり、改変型トランスケトラーゼを有する本発明による前記組換え宿主細胞（例えば、微生物）の、ペントースリン酸経路によってのみ代謝される炭素源、特にグルコナートにおける増殖速度は、野生型生物体と比較したときに１００％未満である。特に、増殖速度は、野生型生物体の増殖速度と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％またはさらに９０％およびそれ以上低下され得る。好ましくは、増殖速度の低下は、野生型トランスケトラーゼ遺伝子を含有する細胞と比較して１０％〜９０％の間であり、より好ましくは２０％〜８０％の間、さらにより好ましくは２５％〜７５％の間である。
【００５２】
特に、本発明は、遺伝子操作された／組換えで産生された宿主細胞（組換え細胞または形質転換細胞とも呼ばれる）に関し、野生型トランスケトラーゼ遺伝子は、ペントースリン酸経路によってのみ代謝されるわけではない炭素源ではわずかに低下されるかまたは全く低下されない増殖を可能にするが、生物体がペントースリン酸経路によってのみ代謝される炭素源で増殖するときに明らかに低下された増殖速度を示す酵素をコードする改変型トランスケトラーゼ遺伝子によって置換されている。このような遺伝子操作された宿主細胞は、発酵産物の収率および産生方法の効率の改善を示し、望ましくない栄養要求性増殖および多面発現効果を防止することができるという利点を有する。
【００５３】
本発明は、さらに、本発明によるトランスケトラーゼを発現することができる宿主細胞を産生する方法に関し、
（ｉ）それぞれの野生型酵素と比較して調節された活性を示す変異型トランスケトラーゼを生成するステップ、すなわち、
ａ）適合される必要がある触媒特性を有する第１のまたは非改変型トランスケトラーゼをコードするポリヌクレオチドを提供するステップ、
ｂ）変異ポリヌクレオチド配列が、前記第１のトランスケトラーゼと比較したときに少なくとも１つのアミノ酸変異を含有する新しいまたは改変型トランスケトラーゼをコードするように、１つまたは複数の変異をポリヌクレオチド配列内に導入するステップであって、前記少なくとも１つのアミノ酸変異が配列番号２に示されるようなアミノ酸配列の位置３５７に相当するアミノ酸であり得るステップ、および
ｃ）任意で、ベクターまたはプラスミドに変異ポリヌクレオチドを挿入するステップと、
（ｉｉ）ペントースリン酸経路によってのみ代謝されるわけではない炭素源では正常またはわずかに低下した増殖を可能にするが、生物体がペントースリン酸経路によってのみ代謝される炭素源で増殖する場合には増殖速度に対する影響を示す同じ生物体または別の生物体からのトランスケトラーゼ変異型によって、宿主細胞の野生型トランスケトラーゼを置換するステップ、すなわち、
ａ）遺伝子の制御配列を変化させることなく適切な野生型宿主細胞の野生型トランスケトラーゼを置換するステップ、
ｂ）最少培地中、グルコナートにおける増殖速度を決定し、これを野生型宿主株と比較するステップ、および
ｃ）野生型菌株の１００％未満であるグルコナートでの増殖速度を可能にするトランスケトラーゼ変異体を選択するステップと
を含む。
【００５４】
本発明は、さらに、リボース−５−リン酸、リブロース−５−リン酸、またはキシルロース−５−リン酸の二次産物である物質を産生するための方法に関し、
ａ）ペントースリン酸経路によってのみ代謝されるわけではない炭素源ではわずかに低下するかまたは全く低下しない増殖を可能にするが、生物体がペントースリン酸経路によってのみ代謝される炭素源で増殖する場合には低下した増殖速度を示す酵素をコードする改変型トランスケトラーゼ遺伝子によって野生型トランスケトラーゼ遺伝子が置換されている遺伝子操作された／組換えで産生された宿主細胞を、改変型トランスケトラーゼの発現を可能にする条件下、適切な培地中で培養することと、
ｂ）発酵産物を培地から分離することと
を含む。
【００５５】
本明細書において使用される「発酵産物」は上記で定義される適切な宿主細胞によって産生される任意の産物でよく、その生合成は、リボース−５−リン酸、リブロース−５−リン酸、またはキシルロース−５−リン酸を基質として使用する。このような発酵産物の例としては、リボフラビン、リボフラビン前駆体、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）およびこれらの誘導体、リン酸ピリドキサール（ビタミンＢ６）、グアノシン、アデノシンおよびこれらのヌクレオチドの誘導体があげられるが、これらに限定されない。
【００５６】
「リボフラビン前駆体」および「リボフラビン、ＦＭＮまたはＦＡＤの誘導体」は、本発明との関連では、これらの（生）合成において中間体または基質としてリブロース−５−リン酸またはリブロース−５−リン酸を必要とする任意のおよび全ての代謝産物を含むべきである。本特許出願との関連では、このような（生）合成経路が天然であるか、あるいは非天然である（すなわち、天然において生じないが生物工学的に操作された経路）かは、無関係である。好ましくは、合成経路は、事実上、生化学的である。リボフラビン前駆体およびリボフラビン、ＦＭＮまたはＦＡＤの誘導体には、ＤＲＡＰＰ、５−アミノ−６−リボシルアミノ−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオン−５’−リン酸、２，５−ジアミノ−６−リビチルアミノ−４（３Ｈ）−ピリミジノン−５’−リン酸、５−アミノ−６−リビチルアミノ−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオン−５’−リン酸、５−アミノ−６−リビチルアミノ−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオン、６，７−ジメチル−８−リビチルルマジン（ＤＭＲＬ）、およびフラボタンパク質が含まれるがこれらに限定されない。また、「リボフラビン」という用語は、例えば、リボフラビン−５−リン酸などのこれらの誘導体およびその塩（例えば、リボフラビン−５−リン酸ナトリウム）なども含む。
【００５７】
本明細書において記載されるポリヌクレオチド、ポリペプチド、組換え宿主細胞および方法は、上記で定義した発酵産物のいずれか１つまたは複数の生物工学的生産のために使用することができる。
【００５８】
本発明による適切な宿主細胞の遺伝子および代謝工学方法は、当業者に知られている。同様に、例えば、リボフラビン、リボフラビン前駆体、ＦＭＮ、ＦＡＤ、リン酸ピリドキサール、もしくはこれらの１つまたは複数の誘導体のために（潜在的に）適切な精製方法は、ファインケミカル生合成および産生の分野においてよく知られている。
【００５９】
本発明に従って、例えば、リボフラビン、リボフラビン前駆体、ＦＭＮ、ＦＡＤ、リン酸ピリドキサール、もしくはこれらの１つまたは複数の誘導体などの発酵産物を生物工学的に生産するための方法が上記のような細胞全体の発酵方法に限定されず、例えば、透過処理した宿主細胞、粗細胞抽出物、例えば、遠心分離またはろ過によって細胞残留物から浄化された細胞抽出物、またさらには単離した酵素で再構成された反応経路を使用してもよいことは理解される。また、このような方法の組み合わせも本発明の範囲内である。無細胞生合成（再構成された反応経路などによる）の場合、単離した酵素が、宿主細胞により調製されて単離されたのか、インビトロ転写／翻訳によって調製されたのか、あるいはさらに他の手段によって調製されたのかは無関係である。
【００６０】
発酵培地は、適切な炭素基質を含有しなければならない。適切な基質は、グルコースまたはフルクトースなどの単糖類、ラクトースまたはスクロースなどのオリゴ糖類、デンプンまたはセルロースなどの多糖類、もしくはこれらの混合物および再生可能な原料からの未精製混合物を含み得るが、これらに限定されない。本発明において用いられる炭素源は様々な種類の炭素含有基質を包含することができ、生物体の選択によってのみ制限され得ることが考慮される。
【００６１】
本明細書で記載される本発明の様々な実施形態は相互に組み合わせることができる。
【００６２】
本発明は、これから以下の非限定的な実施例によってさらに詳細に説明されるであろう。これらの実施例は、図面を参照して記載される。
【００６３】
特に、図１は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ＴＫＴ＿ＥＣＯＬＩ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＴＫＴ＿ＢＡＣＳＵ）、バシラス・リシェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（ＴＫＴ＿ＢＡＣＬＤ）、バシラス・ハロドゥランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）（ＴＫＴ＿ＢＡＣＨＤ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）（ＴＫＴ＿ＣＯＲＧＬ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＴＫＴ＿ＹＥＡＳＴ）、およびアシュビア・ゴシッピー（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）（ＴＫＴ＿ＡＳＨＧＯ）からのトランスケトラーゼアミノ酸配列のプログラムｃｌｕｓｔａｌＷ（１．８３）によって計算されるマルチプル配列アライメントを示す。以下の実施例の１つにおいて議論される枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）トランスケトラーゼのアミノ酸残基３５７に相同／等価である位置は、ボールド文字である。これらの位置のために使用される番号付けは、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）野生型アミノ酸配列に従って行われる。このタイプのアライメントは、標準パラメータを用いてＣＬＵＳＴＡＬまたはＰＩＬＥＵＰにより行うことができる。図示されるように、トランスケトラーゼのアミノ酸配列は高度に保存される。特に、図示される全てのトランスケトラーゼにおいて、そしてそれよりはるかに多くの図示されないトランスケトラーゼにおいて、アルギニン３５７（枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）トランスケトラーゼによる番号付け）は保存される。従って、ここで報告される概念および変異を用いるタイプの実験は、リボース−５−リン酸、キシルロース−５−リン酸、またはリブロース−５−リン酸を前駆体として有するリボフラビン、リボフラビン誘導体または化合物の産生を改善するために、アシュビア・ゴシッピー（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）のような枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）トランスケトラーゼのアミノ酸配列の位置３５７に相同の位置にアルギニンを有する他のトランスケトラーゼと共に行うこともできる。また新しい生物体へのＤＮＡ配列の適応を有するまたは有さない位置３５７において変異された枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）トランスケトラーゼ変異体遺伝子によって、生物体の最初のトランスケトラーゼ遺伝子を置換することも可能である。トランスケトラーゼ変異体遺伝子は、それが導入されることになる生物体に由来することは必須ではない。別の宿主生物体に必要とされる実際のステップは公表されており、当業者に知られており、どこか他のところで概説されている。
【００６４】
［実施例１：枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からのゲノムＤＮＡの単離］
キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ、ＱＩＡＧＥＮ  Ｓｔｒ．１、４０７２４  Ｈｉｌｄｅｎ、独国）からのＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔを用い、供給業者の説明に従ってｇＤＮＡを調製した。３７℃（２５０ｒｐｍ）でインキュベートしたＶＹ液体培地（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ  ２１１５２、米国）中の枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の一晩の培養物３ｍｌのうちの１ｍｌを細菌細胞の原料として用いた。最後に、２００μｌのＡＥ緩衝液（Ｋｉｔで供給された）中にｇＤＮＡを溶出した。
【００６５】
［実施例２：枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からのトランスケトラーゼ遺伝子の増幅］
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＰＹ７９からのｇＤＮＡ（Ｐ．ヤングマン（Ｙｏｕｎｇｍａｎ）、Ｊ．パーキンス（Ｐｅｒｋｉｎｓ）およびＲ．ロジック（Ｌｏｓｉｃｋ）（１９８４年）、「枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）における転位またはランスポゾン由来のｅｒｍ遺伝子における発現に影響を与えることなく外来性ＤＮＡが挿入され得るＴｎ９１７の一方の端部付近のクローニング部位の構築（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｎｅａｒ  ｏｎｅ  ｅｎｄ  ｏｆ  Ｔｎ９１７  ｉｎｔｏ  ｗｈｉｃｈ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ＤＮＡ  ｍａｙ  ｂｅ  ｉｎｓｅｒｔｅｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ−ｂｏｒｎｅ  ｅｒｍ  ｇｅｎｅ）」、Ｐｌａｓｍｉｄ  １２：１〜９頁、実施例１を参照）をｔｋｔ遺伝子の増幅のために使用した。ゲノムＤＮＡ配列に従って、ｔｋｔ遺伝子は、そのコード配列（配列番号１）の内側に１つのＥｃｏＲＩ部位を含有する。ＥｃｏＲＩ制限部位は、通常、ｐＱＥ８０（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ、ＱＩＡＧＥＮ  Ｓｔｒ．１、４０７２４  Ｈｉｌｄｅｎ、独国）などの大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）発現ベクターへのクローニングのために使用されるので、フェニルアラニンコドンをＴＴＣからＴＴＴへ変化させるサイレント変異であるＴによるＣ３１５の置換によってその部位を検出した。このために、２つの別個のＰＣＲ  ＡおよびＢを実施した。ＰＣＲ  Ａのために以下のＰＣＲ条件を用いた：ＤＮＡポリメラーゼと共に供給される適切な緩衝液中の２μＭのプライマーｔｋｔ１Ｓ（配列番号３による、図２も参照）およびｔｋｔ２ＡＳ（配列番号４による、図２）、０．２ｍＭの各ヌクレオチド（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ、ＣＴＰ）、２．５ＵのプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｇｅｂｏｕｗ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、１１０１  ＣＢ  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  Ｚｕｉｄｏｏｓｔ、オランダ）、１００ｎｇのゲノムＤＮＡ（実施例１）。
【００６６】
温度調節は以下のとおりであった：
ステップ１：９５℃で３分間
ステップ２：９５℃で３０秒間
ステップ３：５２℃で３０秒間
ステップ４：７２℃で３０秒間
ステップ５：７２℃で５分間
ステップ２〜４を３５回繰り返した。
【００６７】
ＰＣＲ  Ｂを以下の条件下で実行した：ＤＮＡポリメラーゼと共に供給される適切な緩衝液中の２μＭのプライマーｔｋｔ２Ｓ（配列番号８による、図２）およびｔｋｔ１ＡＳ（配列番号１３による、図２）、０．２ｍＭの各ヌクレオチド（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ、ＣＴＰ）、２．５ＵのプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｇｅｂｏｕｗ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、１１０１  ＣＢ  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  Ｚｕｉｄｏｏｓｔ、オランダ）、１００ｎｇのゲノムＤＮＡ（実施例１）。
【００６８】
温度調節は以下のとおりであった：
ステップ１：９５℃で３分間
ステップ２：９５℃で３０秒間
ステップ３：５２℃で３０秒間
ステップ４：７２℃で２分間
ステップ５：７２℃で５分間
ステップ２〜４を３５回繰り返した。
【００６９】
アガロースゲル電気泳動を行い、その後キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ、ＱＩＡＧＥＮ  Ｓｔｒ．１、４０７２４  Ｈｉｌｄｅｎ、独国）からのＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてゲルから抽出することによって、２つのＰＣＲ産物ＡおよびＢを精製した。ＰＣＲ産物ＡおよびＢの重複領域を用いて、第３のＰＣＲによってこれらを構築することが可能であった：ＤＮＡポリメラーゼと共に供給される適切な緩衝液中の２μＭのプライマーＲｐｉＭｕｔＳ（配列番号５による、図２）およびｔｋｔ１ＡＳｏｈｎｅ（配列番号６による、図２）、０．２ｍＭの各ヌクレオチド（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ、ＣＴＰ）、２．５ＵのプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｇｅｂｏｕｗ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、１１０１  ＣＢ  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  Ｚｕｉｄｏｏｓｔ、オランダ）、１００ｎｇのＰＣＲ産物ＡおよびＰＣＲ産物Ｂ。
【００７０】
ステップ１：９５℃で３分間
ステップ２：９５℃で３０秒間
ステップ３：５３℃で３０秒間
ステップ４：７２℃で２．５分間
ステップ５：７２℃で５分間
ステップ２〜４を３５回繰り返した。
【００７１】
Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ、ＱＩＡＧＥＮ  Ｓｔｒ．１、４０７２４  Ｈｉｌｄｅｎ、独国）の助けを借りてＰＣＲ産物を精製し、５０μｌの溶出緩衝液中に溶出した。ＥｃｏＲＩ消化によってＰＣＲ産物を確認した。さらなる確認のために、プライマーｔｋｔ１Ｓ、ｔｋｔ２Ｓ、ｔｋｔ２ＡＳ、ｔｋｔ３Ｓ（配列番号９による、図２）、ｔｋｔ４Ｓ（配列番号１０による、図２）、ｔｋｔ５Ｓ（配列番号１１による、図２）、ｔｋｔ６Ｓ（配列番号１２による、図２）、ｔｋｔ１ＡＳを用いて配列決定した。
【００７２】
［実施例３：ｔｋｔ変異体の構築］
酵母トランスケトラーゼの３Ｄ構造は、酵母トランスケトラーゼの基質結合への影響を示す変異の選択と共に得られた（ニルソン（Ｎｉｌｓｓｏｎ）Ｕ．、Ｌ．メシャルキナ（Ｍｅｓｈａｌｋｉｎａ）、Ｙ．リンドクウィスト（Ｌｉｎｄｑｖｉｓｔ）、およびＧ．シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）、１９９７年。位置Ｒ３５９（枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）トランスケトラーゼにおける３５７番）において、最初のアルギニンをほとんど全ての他のアミノ酸で置換した。変異体の構築は、基本的に、実施例１に記載されるように実行した。酵母、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）および他の生物体からのトランスケトラーゼを含むアミノ酸配列アライメントは、図１に示される。
【００７３】
ＥｃｏＲＩを含まないｔｋｔ遺伝子をテンプレートとして用いて（実施例２）、ＥｃｏＲＩ部位の欠失について既に記載したように変異を導入した。ＰＣＲ  ＡおよびＢのために以下のＰＣＲ条件を使用した：ＤＮＡポリメラーゼと共に供給される適切な緩衝液中の２μＭのプライマーＲｐｉＭｕｔＳ（Ａ）またはｔｋｔ３５７ｎｎｎ−Ｓ（Ｂ）およびｔｋｔ３５７ＡＳ（Ａ）（配列番号１４による、図２）またはｔｋｔ１ＡＳｏｈｎｅ（Ｂ）、０．２ｍＭの各ヌクレオチド（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ、ＣＴＰ）、２．５ＵのプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｇｅｂｏｕｗ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、１１０１  ＣＢ  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  Ｚｕｉｄｏｏｓｔ、オランダ）、１００ｎｇのＥｃｏＲＩを含まないｔｋｔ遺伝子（実施例２）。ＰＣＲ  Ｂの場合、導入されるアミノ酸に従ってセンスプライマーを選択した：枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）トランスケトラーゼの位置３５７におけるアスパラギンの導入のためにｔｋｔ３５７Ｎ−Ｓ（配列番号１５による、図２）、グルタミンの導入のためにｔｋｔ３５７Ｑ−Ｓ（配列番号１６による、図２）、アラニンの導入のためにｔｋｔ３５７Ａ−Ｓ（配列番号１７による、図２）、リジンの導入のためにｔｋｔ３５７Ｋ−Ｓ（配列番号１８による、図２）、セリンの導入のためにｔｋｔ３５７Ｓ−Ｓ（配列番号１９による、図２）、スレオニンの導入のためにｔｋｔ３５７Ｔ−Ｓ（配列番号２０による、図２）、ヒスチジンの導入のためにｔｋｔ３５７Ｈ−Ｓ（配列番号２１による、図２）、バリンの導入のためにｔｋｔ３５７Ｖ−Ｓ（配列番号２２による、図２）、イソロイシンの導入のためにｔｋｔ３５７Ｉ−Ｓ（配列番号２３による、図２）、ロイシンの導入のためにｔｋｔ３５７Ｌ−Ｓ（配列番号２４による、図２）、メチオニンの導入のためにｔｋｔ３５７Ｍ−Ｓ（配列番号２５による、図２）、およびグリシンの導入のためにｔｋｔ３５７Ｇ−Ｓ（配列番号２６による、図２）を選択した。
【００７４】
温度調節は以下のとおりであった：
ステップ１：９５℃で３分間
ステップ２：９５℃で３０秒間
ステップ３：５２℃で３０秒間
ステップ４：７２℃で６０秒間
ステップ５：７２℃で５分間
ステップ２〜４を３５回繰り返した。
【００７５】
アガロースゲル電気泳動を行い、その後キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ、ＱＩＡＧＥＮ  Ｓｔｒ．１、４０７２４  Ｈｉｌｄｅｎ、独国）からのＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてゲルから抽出することによって、２つのＰＣＲ産物ＡおよびＢを精製した。ＰＣＲ産物ＡおよびＢの構築は、第３のＰＣＲにおいて行った：ＤＮＡポリメラーゼと共に供給される適切な緩衝液中の２μＭのプライマーＲｐｉ  ＭｕｔＳおよびｔｋｔ１ＡＳｏｈｎｅ、０．２ｍＭの各ヌクレオチド（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ、ＣＴＰ）、２．５ＵのプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｇｅｂｏｕｗ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、１１０１  ＣＢ  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  Ｚｕｉｄｏｏｓｔ、オランダ）、１００ｎｇのＰＣＲ産物ＡおよびＰＣＲ産物Ｂ。
【００７６】
ステップ１：９５℃で３分間
ステップ２：９５℃で３０秒間
ステップ３：５３℃で３０秒間
ステップ４：７２℃で２．５分間
ステップ５：７２℃で５分間
ステップ２〜４を３５回繰り返した。
【００７７】
Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ、ＱＩＡＧＥＮ  Ｓｔｒ．１、４０７２４  Ｈｉｌｄｅｎ、独国）によりトランスケトラーゼのＰＣＲ産物を精製し、５０μｌの溶出緩衝液中に溶出した。ＰＣＲ産物は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の形質転換のために用いた。
【００７８】
［実施例４：トランスケトラーゼ欠乏性の枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株の構築］
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ゲノムの最初のｔｋｔ座位に変異トランスケトラーゼ遺伝子を、マーカーを含まずに導入するために、トランスケトラーゼ欠乏性菌株を構築した。枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）トランスケトラーゼ遺伝子（配列番号２）の塩基対４５２〜１０４２および塩基対１５６２〜２００１を含むＰＣＲによって得られた２つのＤＮＡ断片を、ネオマイシン耐性遺伝子カセットと結合させた（Ｍ．イタヤ（Ｉｔａｙａ）、Ｋ．コンドウ（Ｋｏｎｄｏ）、およびＴ．タナカ（Ｔａｎａｋａ）、１９８９年、「枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）染色体の単一コピー状態において選択可能なネオマイシン耐性遺伝子カセット（Ａ  ｎｅｏｍｙｃｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｇｅｎｅ  ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｉｎ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｏｐｙ  ｓｔａｔｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １７：４４１０頁）。ＰＣＲ  Ａのために以下のＰＣＲ条件を用いた：ＤＮＡポリメラーゼと共に供給される適切な緩衝液中の２μＭのプライマーｔｋｔＲｅｃ１Ｓ（配列番号２７による、図２）およびｔｋｔＲｅｃ１ＡＳ（配列番号２８による、図２）、０．２ｍＭの各ヌクレオチド（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ、ＣＴＰ）、２．５ＵのプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｇｅｂｏｕｗ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、１１０１  ＣＢ  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  Ｚｕｉｄｏｏｓｔ、オランダ）、１００ｎｇの増幅した実施例２のｔｋｔ遺伝子。
【００７９】
温度調節は以下のとおりであった：
ステップ１：９５℃で３分間
ステップ２：９５℃で３０秒間
ステップ３：５２℃で３０秒間
ステップ４：７２℃で３０秒間
ステップ５：７２℃で５分間
ステップ２〜４を３０回繰り返した。
【００８０】
以下の条件下でＰＣＲ  Ｂを実行した：ＤＮＡポリメラーゼと共に供給される適切な緩衝液中の２μＭのプライマーｔｋｔＲｅｃ２Ｓ（配列番号２９による、図２）およびｔｋｔＲｅｃ２ＡＳ（配列番号３０による、図２）、０．２ｍＭの各ヌクレオチド（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ、ＣＴＰ）、２．５ＵのプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｇｅｂｏｕｗ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、１１０１  ＣＢ  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  Ｚｕｉｄｏｏｓｔ、オランダ）、１００ｎｇの増幅した実施例２のｔｋｔ遺伝子。
【００８１】
温度調節は以下のとおりであった：
ステップ１：９５℃で３分間
ステップ２：９５℃で３０秒間
ステップ３：５２℃で３０秒間
ステップ４：７２℃で２分間
ステップ５：７２℃で５分間
ステップ２〜４を３０回繰り返した。
【００８２】
アガロースゲル電気泳動を行い、その後キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ、ＱＩＡＧＥＮ  Ｓｔｒ．１、４０７２４  Ｈｉｌｄｅｎ、独国）からのＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてゲルから抽出することによって、２つのＰＣＲ産物ＡおよびＢを精製した。ネオマイシン耐性カセットの配列を有する２つのＰＣＲ産物ＡおよびＢの重複領域のために、第３のＰＣＲによってこれらを構築することが可能である：ＤＮＡポリメラーゼと共に供給される適切な緩衝液中の２μＭのプライマーｔｋｔＲｅｃ１ＳおよびｔｋｔＲｅｃ２ＡＳ、０．２ｍＭの各ヌクレオチド（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ、ＣＴＰ）、２．５ＵのプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｇｅｂｏｕｗ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、１１０１  ＣＢ  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  Ｚｕｉｄｏｏｓｔ、オランダ）、１００ｎｇのＰＣＲ産物Ａ、１００ｎｇのＰＣＲ産物Ｂ、および１００ｎｇのネオマイシン耐性カセット。
【００８３】
ステップ１：９５℃で３分間
ステップ２：９５℃で３０秒間
ステップ３：５５℃で３０秒間
ステップ４：７２℃で２．５分間
ステップ５：７２℃で５分間
ステップ２〜４を３５回繰り返した。
【００８４】
５つの構築ＰＣＲを貯蔵し、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ、ＱＩＡＧＥＮ  Ｓｔｒ．１、４０７２４  Ｈｉｌｄｅｎ、独国）で精製し、５０μｌの溶出緩衝液中に溶出した。アガロースゲル電気泳動により正確なＰＣＲ産物を確認し、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＰＹ７９の形質転換のために使用した。クンスト（Ｋｕｎｓｔ）ら、１９８８年（Ｆ．クンスト（Ｋｕｎｓｔ）、Ｍ．デバルボイル（Ｄｅｂａｒｂｏｕｉｌｌｅ）、Ｔ．ムサデク（Ｍｓａｄｅｋ）、Ｍ．ヤング（Ｙｏｕｎｇ）、Ｃ．マウエル（Ｍａｕｅｌ）、Ｄ．カラマタ（Ｋａｒａｍａｔａ）、Ａ．クリア（Ｋｌｉｅｒ）、Ｇ．ラポポート（Ｒａｐｏｐｏｒｔ）、およびＲ．デドンダ（Ｄｅｄｏｎｄｅｒ）、１９８８年、「枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｓａｃＵ座位によりコードされる推定ポリペプチドは、２成分センサー−制御因子系と相同性を共有する（Ｄｅｄｕｃｅｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｓａｃＵ  ｌｏｃｕｓ  ｓｈａｒｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｗｉｔｈ  ｔｗｏ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｓｅｎｓｏｒ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍｓ）」、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７０：５０９３〜１０１頁）に従って、コンピテントな枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞の調製を行った。２ｍｌのＭＮＧＥ＋Ｂａｃｔｏカサミノ酸（Ｃａｓａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ）（ＣＡＡ）（９ｍｌのＭＮ−培地（１３．６ｇ／ｌのＫ２ＨＰＯ４、６．０ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、０．８８ｇ／ｌのクエン酸ナトリウム＊２Ｈ２Ｏ）、１ｍｌのグルコース（２０％）、４０μｌのグルタミン酸カリウム（４０％）、５０μｌのクエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム（２．２ｍｇ／ｌ、新たに調製）、１００μｌのトリプトファン（８ｍｇ／ｌ）、３０μｌのＭｇＳＯ４（１Ｍ）、＋／−５０μｌのＢａｃｔｏカサミノ酸（２０％、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＡＧ、Ｐｏｓｔｆａｃｈ、ＣＨ−４００２  Ｂａｓｅｌ、スイス）を単一コロニーで接種し、３７℃および２５０ｒｐｍで一晩インキュベートした。この培養物を用いて、１０ｍｌのＭＮＧＥ＋ＣＡＡ（０．１の開始ＯＤ５００ｎｍ）を接種し、ＯＤ５００ｎｍが１．３になるまで振とう（２５０ｒｐｍ）しながら３７℃でインキュベートした。培養物を同体積のＭＮＧＥ（ＣＡＡを含まない）で希釈し、もう１時間インキュベートした。遠心分離工程（１０分、４０００ｒｐｍ、２０℃）の後、無菌管内に上澄みをデカントした。ペレットを保持した上澄みの１／８中に再懸濁した。３００μｌの細胞を、１．７ｍｌのＭＮ（１×）、４３μｌのグルコース（２０％）および３４μｌのＭｇＳＯ４（１Ｍ）中に希釈した。調製したＰＣＲ産物１０および２０μｌを希釈したコンピテント細胞４００μｌに添加し、３７℃で３０分間振とうさせた。１００μｌの発現混合物（５００μｌの５％酵母抽出物（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＡＧ、Ｐｏｓｔｆａｃｈ、ＣＨ−４００２  Ｂａｓｅｌ、スイス）、１２５μｌのＣＡＡ（２０％）、選択のために使用した場合には１／１００の最終抗生物質濃縮物（２μｇ／ｍｌのネオマイシン）、および７５０μｌの無菌ビデスト��ｂｉｄｅｓｔ）水）を添加し、細胞を３７℃で１時間振とうさせた。最後に、細胞を沈降させ、２００μｌの上澄み中に懸濁させ、２μｇ／ｍｌのネオマイシンを含有するＴＢＡＢプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＡＧ、Ｐｏｓｔｆａｃｈ、ＣＨ−４００２  Ｂａｓｅｌ、スイス）上にプレーティングした。
【００８５】
ＶＹ培地（５ｇ／ｌの酵母抽出物（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＡＧ、Ｐｏｓｔｆａｃｈ、ＣＨ−４００２  Ｂａｓｅｌ、スイス）、２５ｇ／ｌの子牛インフュージョンブロス（Ｓｉｇｍａ））中で２つの形質転換体を増殖させた。ＢＳ３４０２と指定される形質転換体の一方から、実施例１に記載されるようにゲノムＤＮＡを単離し、塩基対１０４３〜１５６１のトランスケトラーゼＤＮＡ断片のネオマイシン遺伝子カセットによる正確な置換を、ｔｋｔＲｅｃ１ＳおよびｔｋｔＲｅｃ２ＡＳをプライマーとして用いて標準ＰＣＲによって確認した。トランスケトラーゼ欠失変異体について予想されるように、菌株は、唯一の炭素源としてのリボースまたはグルコナートにおいては増殖することができず、増殖のために３つ全ての芳香族アミノ酸またはシキミ酸を必要とした。
【００８６】
［実施例５：トランスケトラーゼ変異型の遺伝子によるトランスケトラーゼ欠乏性枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＢＳ３４０２の形質転換］
増幅したトランスケトラーゼ遺伝子およびその変異型（実施例２および３）のＤＮＡ０．５および１μｇを用いて、実施例４に記載されるようにＢＳ３４０２を形質転換した。最少培地（ＳＭＳ培地（２ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１４ｇ／ｌのＫ２ＨＰＯ４、６ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ｌのクエン酸三ナトリウム、０．２ｇ／ｌのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１．５％の寒天（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＡＧ、Ｐｏｓｔｆａｃｈ、ＣＨ−４００２  Ｂａｓｅｌ、スイス）および微量元素（５００倍濃縮物：５．０ｇ／ｌのＭｎＳＯ４×１Ｈ２Ｏ、２．０ｇ／ｌのＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ、０．７５ｇ／ｌの（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４＊４Ｈ２Ｏ、０．５ｇ／ｌのＡｌＣ１３＊６Ｈ２Ｏ、０．３７５ｇ／ｌのＣｕＣｌ＊２Ｈ２Ｏ）中の２ｇ／ｌのグルコースおよびソルビトール）における増殖によって陽性コロニーを同定した。コロニーは、２４〜４８時間後に目に見えた。全ての形質転換体はネオマイシンに感受性があり、導入された野生型および変異ｔｋｔ遺伝子によるネオマイシン遺伝子の置換が示された。ゲノムＤＮＡを形質転換体から単離し、実施例１に記載されるようにＰＣＲによりｔｋｔ遺伝子を増幅した。導入された変異を配列決定によって確認した。さらなるヌクレオチドの交換は観察されなかった。生成された枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株は、Ｒ３５７Ａ−ＢＳ３４０３、Ｒ３５７Ｈ−ＢＳ３４８２、Ｒ３５７Ｋ−ＢＳ３４８４、Ｒ３５７Ｇ−ＢＳ３５１２、Ｒ３５７Ｖ−ＢＳ３４８７、Ｒ３５７Ｉ−ＢＳ３５０９、Ｒ３５７Ｌ−ＢＳ３５０７、Ｒ３５７Ｔ−ＢＳ３４９２、Ｒ３５７Ｓ−ＢＳ３４９０、Ｒ３５７Ｍ−ＢＳ３５０５、Ｒ３５７Ｎ−ＢＳ３４８６、Ｒ３５７Ｑ−ＢＳ３４８８と呼ばれた。
【００８７】
［実施例６：トランスケトラーゼ欠乏性の野生型菌株ＢＳ３４０２のバクテリオファージＰＢＳ−１ライセートによる枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＲＢ５０：：［ｐＲＦ６９］（ＥＰ０４０５３７０号明細書）の形質導入］
ファージＰＢＳ−１による形質導入作業は、ヘンキン（Ｈｅｎｋｉｎ）ら、１９８４年（ヘンキン（Ｈｅｎｋｉｎ）Ｔ．Ｍ．、およびＧ．Ｈ．チャンブリス（Ｃｈａｍｂｌｉｓｓ）、１９８４年、「枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）リボソームタンパク質Ｓ４に変化を引き起こす変異の遺伝子マッピング（Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃａｕｓｉｎｇ  ａｎ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓ４）」、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  １９３：３６４〜９頁）に記載されるように実行した。ＰＢＳ−１ライセートの調製のために、ＴＢＡＢプレート（５μｇ／ｍｌのネオマイシン）上で、菌株ＢＳ３４０２を３７℃で一晩増殖させた。細胞を用いて、２５ｍｌのＬＢ培地（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＡＧ、Ｐｏｓｔｆａｃｈ、ＣＨ−４００２  Ｂａｓｅｌ、スイス）をクレット２０〜３０のＯＤまで接種した。（グリーンフィルタを用いて）。細胞の５０％が運動性であるときに、０．２ｍｌのＰＢＳ−１ファージライセート（ヘンキン（Ｈｅｎｋｉｎ）Ｔ．Ｍ．、およびＧ．Ｈ．チャンブリス（Ｃｈａｍｂｌｉｓｓ）１９８４年、「枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）リボソームタンパク質Ｓ４に変化を引き起こす変異の遺伝子マッピング（Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃａｕｓｉｎｇ  ａｎ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓ４）」、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  １９３：３６４〜９頁）を０．８ｍｌの培養ブロスに添加した。３７℃、振とう下における３０分間のインキュベーションの後、９ｍｌのＬＢ培地を添加した。この後、３７℃でさらに３０分のインキュベーション工程を行った。次に、４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを添加し、さらに２時間インキュベーションを続けた。最後に、管を３７℃の乾燥恒温器に移し、一晩放置した。次の朝、培養物を０．４５μｍフィルタでろ過し、４℃で貯蔵するか、または形質導入のために直接使用した。
【００８８】
菌株ＲＢ５０：：［ｐＲＦ６９］を過剰産生するリボフラビンの形質導入のために、ＴＢＡＢプレートにおいて菌株を３７℃で一晩増殖させた。このプレートの細胞を用いて２５ｍｌのＬＢ培地（クレット２０〜３０）を接種した。培養物がクレット１７５に到達したら、０．８ｍｌの細胞を、上記のように調製した菌株ＢＳ３４０２からの０．２ｍｌのＰＢＳ−１ファージライセートと混合した。３７℃、振とう下における３０分のインキュベーションの後、細胞を沈降させ、１ｍｌのＶＹ培地中に懸濁した。この後、同一条件下で１時間のインキュベーションを行った。２００〜１０００μｌの形質導入細胞を、２μｇ／ｍｌのネオマイシンを含有する選択プレート上にプレーティングした。ネオマイシン耐性について、増殖したコロニーを試験した。ｇＤＮＡの単離（実施例１）の後、プライマーｔｋｔ１ＳおよびＲｅｃ２ＡＳを用いる標準ＰＣＲを行い、実施例４の構築物によるｔｋｔ野生型遺伝子の置換を確認した。確認した菌株は、ＢＳ３５２３と呼ばれた。
【００８９】
［実施例７：菌株ＢＳ３５２３への改変型トランスケトラーゼ遺伝子の導入］
菌株ＢＳ３４０３、ＢＳ３４８２、ＢＳ３４８４、ＢＳ３４８６、ＢＳ３４９０、およびＢＳ３５１２のＰＢＳ−１ライセートの調製のために、ＴＢＡＢプレート（５μｇ／ｍｌのネオマイシン）上でそれぞれの菌株を３７℃で一晩増殖させた。これらのプレートからの細胞を用いて、２５ｍｌのＬＢ培地を、クレット２０〜３０のＯＤまで接種した（グリーンフィルタを用いて）。細胞の５０％が運動性であるときに（クレット１５０付近）、０．２ｍｌのＰＢＳ−１ファージライセート（ヘンキン（Ｈｅｎｋｉｎ）Ｔ．Ｍ．、およびＧ．Ｈ．チャンブリス（Ｃｈａｍｂｌｉｓｓ）１９８４年、「枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）リボソームタンパク質Ｓ４に変化を引き起こす変異の遺伝子マッピング（Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃａｕｓｉｎｇ  ａｎ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓ４）」、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  １９３：３６４〜９頁）を０．８ｍｌの培養ブロスに添加した。３７℃、わずかに振とうまたは回転（ローラードラム）下における３０分間のインキュベーションの後、９ｍｌのＬＢ培地を細胞に添加した。これらを同じ条件下でさらに３０分間インキュベートした。クロラムフェニコールを４μｇ／ｍｌの濃度まで添加し、インキュベーションをさらに２時間続けた。管を振とうさせずに３７℃で一晩インキュベートした。次の朝、培養物を０．４５μｍフィルタでろ過し、４℃で貯蔵するか、または形質導入のために直接使用した。このために、ＴＢＡＢプレート上でトランスケトラーゼ欠乏性菌株ＢＳ３５２３（実施例６を参照）を３７℃で一晩増殖させた。プレートからの細胞を用いて、２５ｍｌのＬＢ培地（クレット２０〜３０）を接種した。培養物を振とう下３７℃でインキュベートした。培養物がクレット１７５に到達したら、０．８ｍｌの細胞を、上記のような菌株ＢＳ３４０３、ＢＳ３４８２、ＢＳ３４８４、ＢＳ３４８６、ＢＳ３４９０、およびＢＳ３５１２のそれぞれの０．２ｍｌのＰＢＳ−１ファージライセートと混合した。３７℃、振とう下における３０分間のインキュベーションの後、細胞を沈降させ、１ｍｌのＶＹ培地中に懸濁した。同一条件下における１時間のインキュベーションの後、細胞を再度沈降させ、０．２ｍｌの１×ＳＭＳ培地中に懸濁し、選択プレート（１ｇ／ｌグルコース、１ｇ／ｌのソルビトール、および１５％のアガロースを有する上記のような１×ＳＭＳ）上にプレーティングした。ネオマイシン耐性の損失について増殖したコロニーを試験した。ｇＤＮＡの単離（実施例１）の後、プライマーｔｋｔ１ＳおよびＲｅｃ２ＡＳを用いる標準ＰＣＲを行い、ゲノムＤＮＡからのｔｋｔ遺伝子を増幅した。インタクトなものによる不活性化ｔｋｔ遺伝子の置換を示すコロニーのｔｋｔ遺伝子を配列決定し、変異の存在を確認した。生成した菌株は、ＢＳ３５２５（ＢＳ３４８４ライセート）、ＢＳ３５２８（ＢＳ３４８２ライセート）、ＢＳ３５３０（ＢＳ３４８６）、ＢＳ３５３４（ＢＳ３４０３ライセート）、ＢＳ３５３５（ＢＳ３４９０ライセート）、ＢＳ３５４１（ＢＳ３５１２ライセート）と呼ばれた。
【００９０】
［実施例８：グルコースおよびグルコナートにおけるトランスケトラーゼ変異株の増殖］
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の生存率および増殖におけるトランスケトラーゼ変異の効果を評価するために、２ｇ／ｌのグルコースまたはグルコナートにおいて、生成した菌株の最大増殖速度を決定した。以下の培地を使用した：１×ＳＭＳ（２ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１４ｇ／ｌのＫ２ＨＰＯ４、６ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ｌのクエン酸三ナトリウム、０．２ｇ／ｌのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ）、２ｇ／ｌのグルコースまたはグルコナート、５００μｇ／ｌの酵母抽出物、および実施例５に示されるような微量元素溶液。３００ｍｌのバッフル付きフラスコ中の２５ｍｌの記載した培地を一晩の培養物（５ｍｌのＶＹ、１ｍｌの新たなＶＹ中に再懸濁）からクレット２０〜３０のＯＤまで接種した。これらを振とう下（２２０ｒｐｍ）３７℃でインキュベートした。誘導期の間、培養物のＯＤを１時間間隔で追跡した。対数期の間は、間隔を３０分に短縮した。最大増殖速度の決定のために、対数期中の少なくとも４つのデータポイントを用いた。
【００９１】
【表１】
2009514513.tif 000002
【００９２】
野生型菌株ＰＹ７９は、予想通り、両方の基質において最高の増殖速度を示した。トランスケトラーゼ位置３５７において異なる変異を導入することによって、グルコナートにおける増殖は、予想通り、グルコースにおける増殖よりもはるかにより影響を受けた。グルコナートにおける最大増殖速度の低下は、非酸化的なペントースリン酸シャントを通る流束およびペントースリン酸の蓄積に対するトランスケトラーゼ変異の効果のために尺度として使用した。示される変異によって広範囲の増殖速度が包含される。
【００９３】
［実施例９：振とうフラスコにおけるリボフラビンの産生］
クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍｌ）を含有する５ｍｌのＶＹを、リボフラビン産生菌株ＲＢ５０：：［ｐＲＦ６９］、ＢＳ３２５２５、ＢＳ３５２８、ＢＳ３４５３０、ＢＳ３４３４、ＢＳ３４３３５、およびＢＳ３４４１により接種した（実施例７を参照）。一晩のインキュベーションの後、細胞を沈降させ（１５分、４０００ｒｐｍ）、１ｍｌのスクリーニング培地（２×ＳＭＳ、１０ｇ／ｌのグルコース、１ｇ／ｌの酵母抽出物、および実施例５に記載されるような微量元素）中に懸濁した。２５ｍｌのスクリーニング培地を含有する２００ｍｌのバッフル付きフラスコを０．２５ｍｌの再懸濁細胞により接種した。水が飽和した雰囲気中で、培養物を３７℃で４８時間インキュベートした。４８時間のインキュベーション時間（この間に、供給したグルコースは培養物の全てにおいて使い果たされた）の後、０．５ｍｌのサンプルを培養物から取り出し、３５μｌの４ＮのＮａＯＨを添加し、混合物を１分間ボルテックスした。４６５μｌの１Ｍのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．８を後で直接添加した。１４０００ｒｐｍにおける５分の遠心分離（エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）遠心分離機５４１５Ｄ）によって混合物を清澄にした。上澄みを新しい管に移した。リボフラビンの測定のために２つの異なる方法を用いた。熱量測定のために、２００μｌの上澄みを８００μｌの水で希釈した。４４４ｎｍにおける吸収に０．０３３０５の係数を乗じて、培地１リットル当たりのリボフラビンのグラム数を得た。最終結果のために、得られた値を体積差について補正した。リボフラビン濃度は、実施例１０に従ってＨＰＬＣによっても測定した。結果は表２に示される。
【００９４】
【表２】
2009514513.tif 000003
【００９５】
トランスケトラーゼ変異を含有するほとんど全てのバシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株は、明らかに増大したリボフラビンの産生を示したが、トランスケトラーゼ陰性菌株は、コントロール菌株よりも少ないリボフラビンを産生した。Ｒ３５７Ｈ変異の場合、リボフラビン濃度はほぼ２倍であった。
【００９６】
［実施例１０：リボフラビンの発酵］
ＥＰ４０５３７０号明細書に記載されるように発酵運転を実施した。
【００９７】
菌株（１）ＲＢ５０：：［ｐＲＦ６９］、（２）ＢＳ３５３４（Ｒ３５７Ａ）、および（３）ＢＳ３５２８（Ｒ３５７Ｈ）と共に発酵を実行した。２４時間および４８時間の発酵時間で、培養ブロス中のリボフラビンの濃度およびバイオマス（細胞の乾燥重量）を測定した。表３に示されるように、親株ＲＢ５０：：［ｐＲＦ６９］は、４８時間で９．８ｇ／ｌのリボフラビンを産生した。基質に対する収率は、３．５９％（ｗ／ｗ）であった。バイオマスは、基質に対して２０．３％（ｗ／ｗ）の収率で産生された。改変型トランスケトラーゼ遺伝子を発現するＲＢ５０：：［ｐＲＦ６９］の誘導体は、リボフラビンの産生の著しい増大を示した。ＢＳ３５２８およびＢＳ３５３４は、それぞれ１１．７ｇ／ｌおよび１４．６ｇ／ｌを産生した。これは、それぞれＢＳ３５２８では４．２３％およびＢＳ３５３４では５．１４％のグルコースでの収率に相当する（表３）。これらの結果は、トランスケトラーゼ活性の改変がリボフラビンの生産性の増大をもたらすことを実証する。
【００９８】
【表３】
2009514513.tif 000004
【００９９】
［実施例１１：リボフラビンの測定のための分析方法］
リボフラビンの測定のために、以下の分析方法を用いることができる（ブレッツェル（Ｂｒｅｔｚｅｌ）ら、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２、１９〜２６頁、１９９９年）。
【０１００】
クロマトグラフィシステムは、バイナリポンプ、カラムサーモスタットおよび冷却オートサンプラーを備えたヒューレット・パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）１１００システムであった。ダイオードアレイ検出器および蛍光検出器の両方をインラインで使用した。２つのシグナル、２８０ｎｍにおけるＵＶおよび励起４４６ｎｍ、発光５２０ｎｍにおける蛍光トレースを記録した。
【０１０１】
ステンレス鋼Ｓｕｐｅｒｃｏｓｉｌ  ＬＣ−８−ＤＢカラム（１５０×４．６ｍｍ、３μｍ粒径）をガードカートリッジと一緒に使用した。移動相は、１００ｍＭの酢酸（Ａ）およびメタノール（Ｂ）であった。以下のスキームによるグラジエント溶出を用いた。
【０１０２】
【表４】
2009514513.tif 000005
【０１０３】
カラム温度を２０℃に設定し、流速は１．０ｍｌ／分であった。実行時間は２５分であった。
【０１０４】
発酵サンプルを希釈、ろ過、そしてさらに処理することなく分析した。リボフラビンは、外部標準との比較によって定量した。計算は、２８０ｎｍにおけるＵＶシグナルに基づいた。Ｆｌｕｋａ（９４７１  Ｂｕｃｈｓ、スイス）から購入したリボフラビンは、標準材料として使用した（純度  ９９．０％以上）。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】（既に上記で言及したように）非改変型トランスケトラーゼをコードするポリヌクレオチド配列の例を示す。
【図２】一組のプライマーを示す。
【図１】
2009514513.tif 000006
【図１−２】
2009514513.tif 000007
【図１−３】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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