(57)【要約】  タウオパチーを診断する方法、及び、被験体がタウオパチーを発症するか否かを予測する方法が提供される。ｔｙｒ３９４及び／又はｔｙｒ３１０でリン酸化されたタウに対して特異的に結合する抗体製剤もまた提供される。細胞においてタウリン酸化を阻害する方法、及びタウオパチーを有する被験体を治療する方法が、さらに提供される。タウオパチーの危険性を有する被験体を治療する方法もまた提供される。さらに、ａｂｌチロシンキナーゼをコードする導入遺伝子を含むヒト以外の哺乳類が提供される。化合物がタウオパチーの発症を阻害するか否かについて評価する方法もまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体のタウオパチーを診断する方法であって、該被験体がｔｙｒ３９４又はｔｙｒ３１０でのタウのリン酸化を有するか否かを判断することを含み、該被験体におけるタウのｔｙｒ３９４又はｔｙｒ３１０でのリン酸化が、該被験体がタウオパチーを有することを示す、該方法。
【請求項２】
前記被験体のタウのｔｙｒ３９４でのリン酸化の有無を判断することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記被験体のタウのｔｙｒ３１０でのリン酸化の有無を判断することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記被験体が、タウの第２のアミノ酸残基でのリン酸化を有するか否かを判断することをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記被験体のタウのｔｙｒ３９４及びｓｅｒ３９６でのリン酸化の有無を判断することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
タウのｔｙｒ３９４及びｓｅｒ３９６でのリン酸化が、ｔｙｒ３９４及びｓｅｒ３９６でリン酸化されたタウに対して特異的に結合する抗体を使用して測定される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体が、抗体ＹＰ３又は抗体ＹＰ４である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記第２のアミノ酸残基がチロシンである、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記被験体のタウのｔｙｒ３９４及びｔｙｒ３１０でのリン酸化の有無を判断することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記タウオパチーが、前頭側頭認知症、進行性核上麻痺、ピック病、大脳皮質基底核変性症、パーキンソン病、レーヴィ小体痴呆、又はアルツハイマー病である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記タウオパチーがアルツハイマー病である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
タウのｔｙｒ３９４又はｔｙｒ３１０でのチロシンリン酸化が、前記被験体の体液において測定される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記体液が末梢血又は脳脊髄液である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記タウのチロシンリン酸化が、ｔｙｒ３９４又はｔｙｒ３１０でリン酸化されたタウに対して特異的な抗体を使用して測定される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
被験体がタウオパチーを発症するか否かを予測する方法であって、該被験体がｔｙｒ３９４又はｔｙｒ３１０でリン酸化されたタウを有するか否かを判断することを含み、該被験体におけるｔｙｒ３９４又はｔｙｒ３１０でのリン酸化されたタウの存在は、該被験体が該タウオパチーを発症するだろうということを示す方法。
【請求項１６】
前記被験体のタウのｔｙｒ３９４でのチロシンリン酸化の有無を判断することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記被験体のタウのｔｙｒ３１０でのリン酸化の有無を判断することを含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記被験体が、タウの第２のアミノ酸残基でのリン酸化を有するか否かを判断することをさらに含む、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記被験体のタウのｔｙｒ３９４及びｓｅｒ３９６でのリン酸化の有無を判断することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
タウのｔｙｒ３９４及びｓｅｒ３９６でのリン酸化が、ｔｙｒ３９４及びｓｅｒ３９６でリン酸化されたタウに対して特異的に結合する抗体を使用して測定される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体が、抗体ＹＰ３又は抗体ＹＰ４である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第２のアミノ酸残基がチロシンである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記被験体のタウのｔｙｒ３９４及びｔｙｒ３１０でのリン酸化の有無を判断することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記タウオパチーが、前頭側頭認知症、進行性核上麻痺、ピック病、大脳皮質基底核変性症、パーキンソン病、レーヴィ小体痴呆、又はアルツハイマー病である、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記タウオパチーがアルツハイマー病である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
タウのｔｙｒ３９４又はｔｙｒ３１０でのチロシンリン酸化が、前記被験体の体液において測定される、請求項１５〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記体液が末梢血又は脳脊髄液である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記タウのチロシンリン酸化が、ｔｙｒ３９４又はｔｙｒ３１０でリン酸化されたタウに対して特異的な抗体を使用して測定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２９】
ｔｙｒ３９４及び／又はｔｙｒ３１０でリン酸化されたタウに対して特異的に結合する抗体製剤。
【請求項３０】
ｔｙｒ３９４でリン酸化されたタウに対して特異的に結合する、請求項２９に記載の抗体製剤。
【請求項３１】
ｔｙｒ３１０でリン酸化されたタウに対して特異的に結合する請求項２９に記載の抗体製剤。
【請求項３２】
ｔｙｒ３９４又はｔｙｒ３１０のいずれかでリン酸化されたタウに対して特異的に結合する、請求項２９に記載の抗体製剤。
【請求項３３】
ｔｙｒ３９４又はｔｙｒ３１０のいずれか及び別のアミノ酸でリン酸化されたタウに対して特異的に結合し、該別のアミノ酸は前記ｔｙｒ３９４又は前記ｔｙｒ３１０に近接する、請求項２９に記載の抗体製剤。
【請求項３４】
ｔｙｒ３９４及びｓｅｒ３９６でリン酸化されたタウに対して特異的に結合する、請求項２９に記載の抗体製剤。
【請求項３５】
ＹＰ３抗体又はＹＰ４抗体を含む、請求項３４に記載の抗体製剤。
【請求項３６】
モノクローナル抗体を含む、請求項２９〜３５のいずれか一項に記載の抗体製剤。
【請求項３７】
細胞においてタウリン酸化を阻害する方法であって、該細胞においてタウリン酸化を阻害するのに十分な様式で、ａｂｌチロシンキナーゼの阻害因子と該細胞を組み合わせることを含む方法。
【請求項３８】
前記ａｂｌチロシンキナーゼがａｂｌ１である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ａｂｌチロシンキナーゼがａｂｌ２である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記タウリン酸化がｔｙｒ３９４及び／又はｔｙｒ３１０で行われる、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記タウリン酸化がｔｙｒ３９４で行われる、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記タウリン酸化がｔｙｒ３１０で行われる、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞がニューロンである、請求項３７〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記ニューロンが生存する哺乳類中にある、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記生存する哺乳類が、前頭側頭認知症、進行性核上麻痺、ピック病、大脳皮質基底核変性症、パーキンソン病、レーヴィ小体痴呆、又はアルツハイマー病の危険性があるか、又はそれらを有するヒトである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記生存する哺乳類が、アルツハイマー病の危険性があるか、又はそれを有するヒトである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記阻害因子が、非受容体チロシンキナーゼに対して選択的である、請求項３７〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記阻害因子が、ａｂｌチロシンキナーゼに対して選択的である、請求項３７〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記阻害因子が、低分子量の有機分子である、請求項３７〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記阻害因子が、ＳＴＩ５７１、ＣＧＰ５７１４８、ＡＧ１１１２、ＡＰ２３４６４又はＰＰ１である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記阻害因子が、前記ａｂｌチロシンキナーゼに対して特異的に結合する抗体又はアプタマーである、請求項３７〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記阻害因子が、前記ａｂｌチロシンキナーゼをコードする細胞のポリヌクレオチドの一部に相同の核酸配列を含むベクターである、請求項３７〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記核酸配列が、前記ポリヌクレオチドの転写又は翻訳を阻害する、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、又はリボザイムであるか、又はそれらをコードするものである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記阻害因子が、哺乳類の血液脳関門を通過する化合物の能力を促進する医薬組成物中に配合される、請求項３７〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
タウオパチーを有する被験体を治療する方法であって、該被験体のニューロンのタウチロシンリン酸化を阻害するのに十分な様式で、該被験体にａｂｌチロシンキナーゼの阻害因子を投与することを含む方法。
【請求項５６】
前記ａｂｌチロシンキナーゼがａｂｌ１である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ａｂｌチロシンキナーゼがａｂｌ２である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記タウオパチーが、前頭側頭認知症、進行性核上麻痺、ピック病、大脳皮質基底核変性症、パーキンソン病、レーヴィ小体痴呆、又はアルツハイマー病である、請求項５５〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記タウオパチーが、アルツハイマー病である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記阻害因子が、非受容体チロシンキナーゼに対して特異的である、請求項５５〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記阻害因子が、ａｂｌチロシンキナーゼに対して特異的である、請求項５５〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記阻害因子が、低分子量の有機分子である、請求項５５〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記阻害因子が、ＳＴＩ５７１、ＣＧＰ５７１４８、ＡＧ１１１２、ＡＰ２３４６４又はＰＰ１である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記阻害因子が、前記ａｂｌチロシンキナーゼに対して特異的に結合する抗体又はアプタマーである、請求項５５〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記阻害因子が、前記ａｂｌチロシンキナーゼをコードする細胞のポリヌクレオチドの一部に相同の核酸配列を含むベクターである、請求項５５〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記核酸配列が、前記ポリヌクレオチドの転写又は翻訳を阻害する、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、又はリボザイムであるか、又はそれらをコードするものである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記阻害因子が、哺乳類の血液脳関門を通過する化合物の能力を促進する医薬組成物中に配合される、請求項５５〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記阻害因子が前記哺乳類の脳に直接投与される、請求項５５〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
タウオパチーの危険性を有する被験体を治療する方法であって、該被験体のニューロンのタウチロシンリン酸化を阻害するのに十分な様式で、該被験体にａｂｌチロシンキナーゼの阻害因子を投与することを含む方法。
【請求項７０】
前記ａｂｌチロシンキナーゼがａｂｌ１である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記ａｂｌチロシンキナーゼがａｂｌ２である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
前記タウオパチーが、前頭側頭認知症、進行性核上麻痺、ピック病、大脳皮質基底核変性症、パーキンソン病、レーヴィ小体痴呆、又はアルツハイマー病である、請求項６９〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記タウオパチーが、アルツハイマー病である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記阻害因子が、非受容体チロシンキナーゼに対して特異的である、請求項６９〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記阻害因子が、ａｂｌチロシンキナーゼに対して特異的である、請求項６９〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記阻害因子が、低分子量の有機分子である、請求項６９〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記阻害因子が、ＳＴＩ５７１、ＣＧＰ５７１４８、ＡＧ１１１２、ＡＰ２３４６４又はＰＰ１である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記阻害因子が、前記ａｂｌチロシンキナーゼに対して特異的に結合する抗体又はアプタマーである、請求項６９〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記阻害因子が、前記ａｂｌチロシンキナーゼをコードする細胞のポリヌクレオチドの一部に相同の核酸配列を含むベクターである、請求項６９〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記核酸配列が、前記ポリヌクレオチドの転写又は翻訳を阻害する、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、又はリボザイムであるか、又はそれらをコードするものである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記阻害因子が、哺乳類の血液脳関門を通過する化合物の能力を促進する医薬組成物中に配合される、請求項６９〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記阻害因子が前記哺乳類の脳に直接投与される、請求項６９〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
ａｂｌチロシンキナーゼをコードする導入遺伝子を含むヒト以外の哺乳類であって、該ａｂｌチロシンキナーゼが該哺乳類のニューロンにおいて発現される、ヒト以外の哺乳類。
【請求項８４】
前記ａｂｌチロシンキナーゼがヒトａｂｌ１である、請求項８３に記載のヒト以外の哺乳類。
【請求項８５】
前記ａｂｌチロシンキナーゼがヒトａｂｌ２である、請求項８３に記載のヒト以外の哺乳類。
【請求項８６】
前記哺乳類の前記ニューロンにおいてヒトａｂｌ１及びヒトａｂｌ２の両方を発現する、請求項８３〜８５のいずれか一項に記載のヒト以外の哺乳類。
【請求項８７】
前記ａｂｌチロシンキナーゼの発現が誘導可能である、請求項８３〜８６のいずれか一項に記載のヒト以外の哺乳類。
【請求項８８】
前記ａｂｌチロシンキナーゼの発現が、前記哺乳類のニューロンに限定される、請求項８３〜８７のいずれか一項に記載のヒト以外の哺乳類。
【請求項８９】
マウスである、請求項８３〜８８のいずれか一項に記載のヒト以外の哺乳類。
【請求項９０】
化合物がタウオパチーの発症を阻害するか否かを評価する方法であって、ａｂｌチロシンキナーゼと化合物を組み合わせること、及び、該化合物が該ａｂｌチロシンキナーゼを阻害するか否かを判断することを含み、該ａｂｌチロシンキナーゼを阻害する化合物が該タウオパチーの発症を阻害する、該方法。
【請求項９１】
前記ａｂｌチロシンキナーゼがａｂｌ１である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記ａｂｌチロシンキナーゼがａｂｌ２である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９３】
前記ａｂｌチロシンキナーゼが、ヒトａｂｌチロシンキナーゼである、請求項９０〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
前記ａｂｌチロシンキナーゼがヒトａｂｌ１である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９５】
前記ａｂｌチロシンキナーゼがヒトａｂｌ２である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９６】
前記タウオパチーが、前頭側頭認知症、進行性核上麻痺、ピック病、大脳皮質基底核変性症、パーキンソン病、レーヴィ小体痴呆、又はアルツハイマー病である、請求項９０〜９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
前記タウオパチーがアルツハイマー病である、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記ａｂｌチロシンキナーゼが、請求項８３に記載のヒト以外の哺乳類中に存在する、請求項９０に記載の方法。
【請求項９９】
タウオパチーを有する被験体のタウオパチーの治療に対する医薬品の生産のためのａｂｌチロシンキナーゼの阻害因子の使用。
【請求項１００】
前記タウオパチーが、前頭側頭認知症、進行性核上麻痺、ピック病、大脳皮質基底核変性症、パーキンソン病、レーヴィ小体痴呆、又はアルツハイマー病である、請求項９９に記載の阻害因子の使用。
【請求項１０１】
前記タウオパチーがアルツハイマー病である、請求項９９に記載の阻害因子の使用。
【請求項１０２】
前記阻害因子が、低分子量の有機分子である、請求項９９〜１０１のいずれか一項に記載の阻害因子の使用。
【請求項１０３】
前記阻害因子が、ＳＴＩ５７１、ＣＧＰ５７１４８、ＡＧ１１１２、ＡＰ２３４６４又はＰＰ１である、請求項１０２に記載の阻害因子の使用。
【請求項１０４】
前記阻害因子が、前記ａｂｌチロシンキナーゼに対して特異的に結合する抗体又はアプタマーである、請求項９９〜１０１のいずれか一項に記載の阻害因子の使用。
【請求項１０５】
前記阻害因子が、前記ａｂｌチロシンキナーゼをコードする細胞のポリヌクレオチドの一部に相同の核酸配列を含むベクターである、請求項９９〜１０１のいずれか一項に記載の阻害因子の使用。
【請求項１０６】
前記核酸配列が、前記ポリヌクレオチドの転写又は翻訳を阻害する、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、又はリボザイムであるか、又はそれらをコードするものである、請求項１０５に記載の阻害因子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的にはタウオパチーの診断及び治療に関する。より詳細には、本発明は、ａｂｌチロシンキナーゼによるタウのリン酸化、そのリン酸化に関するアルツハイマー病を含むタウオパチーの診断及び治療に関する。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２００５年８月４日に出願された米国特許仮出願番号６０／７０５，５８５の利益を主張する。
【０００３】
［連邦政府による資金提供を受けた研究又は開発に関する記載］
米国政府は、本発明における払込済みライセンスを有しており、米国国立精神衛生研究所(The National Institutes for Mental Health)により授与されたＮＩＭＨ３８６２３の条件によって与えられるように、適切な条件で他者へのライセンスを特許権者に要請する、限られた状況における権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
［参考文献］
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【０００５】
アルツハイマー病の特徴の１つは神経原線維濃縮体（ＮＦＴ）であり、微小管結合タンパク質（タウ）の線維状ポリマーの凝集体を含む(Binder et al., 2005; Friedhoff et al., 2000)。タウの過剰リン酸化はＮＦＴに関係し、異常なタウを伴う他の疾患(タウオパチー)に関与する(Stoothoff and Johnson, 2005; Lee et al., 1998; Lee et al., 2004; Andreasen, 2003; Trojanowski and Lee, 1995; Ferrer et al., 2001)。このリン酸化は残基１８におけるチロシン（ｔｙｒｌ８）に加えて、いくつかのセリン残基及びトレオニン残基で同定された（Stoothoff and Johnson, 2005; Lee et al., 2004）。ｔｙｒ１８は、ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼであるｆｙｎによってリン酸化されると考えられる(Lee et al., 2004)。
【０００６】
チロシンキナーゼａｂｌは、タウについての効果に対しては以前には評価されていなかったが、ａｂｌ阻害因子のグリーベック（Gleevec）（メシル酸イマチニブ、ＳＴＩ５７１）は、ニューロン及びモルモット脳でＡβ（アルツハイマー病に関連する別のタンパク質）の産生を抑制する(Netzer et al., 2003)。しかしながら、グリーベックのタウリン酸化に対する効果、又はアルツハイマー病若しくはその動物モデルにおける効果については評価されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
タウのチロシンリン酸化、及びアルツハイマー病を含むタウオパチーに対するタウのチロシンリン酸化の効果のさらなる評価が必要である。本発明はその必要性に対処するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本発明は、ａｂｌチロシンキナーゼがタウをリン酸化し、アルツハイマー病患者における神経原線維濃縮体中に存在するという発見に基づく。
【０００９】
したがって、ある実施の形態において、本発明は、被験体のタウオパチー(tauopathy)を診断する方法に関する。この方法は、被験体がｔｙｒ３９４又はｔｙｒ３１０でのタウのチロシンリン酸化を有するか否かを判断することを含み、被験体におけるタウのｔｙｒ３９４又はｔｙｒ３１０でのチロシンリン酸化が被験体がタウオパチーを有することを示す。
【００１０】
他の実施の形態において、本発明は、被験体がタウオパチーを発症するか否かを予測する方法に関する。この方法は、被験体がｔｙｒ３９４又はｔｙｒ３１０でリン酸化されたタウを有するか否かを判断することを含み、被験体におけるｔｙｒ３９４又はｔｙｒ３１０でリン酸化されたタウの存在が、被験体がタウオパチーを発症するだろうということを示す。
【００１１】
本発明は、ｔｙｒ３９４及び／又はｔｙｒ３１０でリン酸化されたタウに特異的に結合する抗体製剤にも関する。
【００１２】
さらなる実施の形態において、本発明は、細胞においてタウリン酸化を阻害する方法に関する。この方法は、細胞においてタウリン酸化を阻害するのに十分な様式で、ａｂｌチロシンキナーゼの阻害因子と細胞を組み合わせることを含む。
【００１３】
さらに、本発明は、タウオパチーを有する被験体を治療する方法に関する。この方法は、被験体のニューロンにおけるタウのチロシンリン酸化を阻害するのに十分な様式で、ａｂｌチロシンキナーゼの阻害因子を被験体へ投与することを含む。
【００１４】
本発明は、タウオパチーの危険性を有する被験体を治療する方法にも関する。この方法は、被験体のニューロンにおけるタウのチロシンリン酸化を阻害するのに十分な様式で、ａｂｌチロシンキナーゼの阻害因子を被験体へ投与することを含む。
【００１５】
本発明はさらに、ａｂｌチロシンキナーゼが哺乳類のニューロン中に発現されるように、ａｂｌチロシンキナーゼをコードする導入遺伝子を含むヒト以外の哺乳類に関する。
【００１６】
さらなる実施の形態において、本発明は、化合物がタウオパチーの発症を阻害するか否かを評価する方法に関する。この方法は、ａｂｌチロシンキナーゼと化合物を組み合わせること、及び、化合物がａｂｌチロシンキナーゼを阻害するか否かを判断することを含む。これらの実施の形態において、ａｂｌチロシンキナーゼを阻害する化合物は、タウオパチーの発症を阻害する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明者等は、ａｂｌチロシンキナーゼがタウをリン酸化し、アルツハイマー病患者の神経原線維濃縮体中に存在することを発見した。実施例を参照。この発見、並びに濃縮体におけるａｂｌの結合とアルツハイマー病の病因とをともに結び付けるａｂｌ及び細胞周期活性化（実施例で記載されたように）の間の関係の認識に一部基づいて、本発明者等は、アルツハイマー病を含むタウオパチーの診断及び治療のための方法及び組成物を開発した。
【００１８】
したがって、本発明は被験体のタウオパチーを診断する方法に関する。この方法は、被験体がｔｙｒ３９４又はｔｙｒ３１０でのタウのチロシンリン酸化を有するか否かを判断することを含み、被験体におけるｔｙｒ３９４又はｔｙｒ３１０でのタウのチロシンリン酸化が、被験体がタウオパチーを有することを示す。
【００１９】
実施例１において確立されるように、ａｂｌは斑(plaque)及び濃縮体(tangle)と関連してアルツハイマー病患者の脳中に存在し、ａｂｌはタウのｔｙｒ３９４をリン酸化する。タウ中のｔｙｒ３１０を取り囲むアミノ酸が、ｔｙｒ３９４を取り囲むアミノ酸に非常に類似している（配列番号１を参照）ので、当業者はａｂｌがｔｙｒ３１０をリン酸化することを予測するだろう。この予測は、実施例２中に記述される実験において確認される。
【００２０】
本明細書において使用されるように、タウは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＨ００５８９５のヒト染色体の配列から翻訳された微小管結合タンパク質、又は自然発生的ほ乳類のその変異型である。知られているように、選択的スプライシングのために、タウタンパク質のいくつかのアイソフォームがある。ヒト脳のタウの６つのアイソフォームが現在既知である（Brandt, 1996）。最短の既知のアイソフォーム（ｔａｕ３５２）は、配列番号１として本明細書において提供され、最長の既知のアイソフォーム（ｔａｕ４４１）には配列番号２の配列を有する。慣例により、アミノ酸は、最長のアイソフォーム（配列番号２−４４１アミノ酸）の番号付けに従って命名される。そのアイソフォームは、アミノ酸１８、アミノ酸２９、アミノ酸１９７、アミノ酸３１０及びアミノ酸３９４でチロシンを有する。しかしながら、本明細書において使用されるように、すべてのアイソフォーム中にある、それらの５つのチロシンは、アイソフォームのすべてと同じアミノ酸名称を有する。したがって、チロシン−３９４（ｔｙｒ３９４又はＹ３９４）は、いずれのアイソフォーム（３９４未満のアミノ酸を持つアイソフォームでさえ）についても、相似のチロシン残基を伴うその名称を有する。同様に、チロシン−３１０（ｔｙｒ３１０又はＹ３１０）は、いずれのアイソフォームについても、相似のチロシン残基を伴うその名称を有する。
【００２１】
これらの方法は好ましくは、被験体が、第２のアミノ酸残基又はより多くのアミノ酸残基でタウのリン酸化を有するか否か判断することをさらに含む。第２のアミノ酸残基は、チロシン又は今や既知の若しくは後にタウオパチーにおいてリン酸化を受けることが発見された他のタウアミノ酸残基であり得る。例えば、Johnson and Stoothoff, 2004を参照。
【００２２】
タウのセリン３９６は、アルツハイマー病で常にリン酸化される(Uboga and Price, 2000; Weaver et al., 2000)。したがって、ａｂｌ１又はａｂｌ２活性は、２重リン酸化部位のフォスフォチロシン３９４／フォスフォセリン３９６を生ずるべきである。このエピトープの存在は、実施例２中に記述される実験において確認された。したがってこの方法は、被験体がタウのｔｙｒ３９４及びｓｅｒ３９６でリン酸化されるか否かを判断することを好ましくは含む。ｔｙｒ３９４及びｓｅｒ３９６でのタウのリン酸化は、好ましくはｔｙｒ３９４及びｓｅｒ３９６でリン酸化されたタウに特異的に結合する抗体を使用して測定される。そのような抗体の好ましい例は、ＹＰ３又はＹＰ４である。
【００２３】
第２のアミノ酸残基のリン酸化が測定される場合には、好ましくは第２のアミノ酸残基もまたチロシンになり得る。これらの局面において、この方法は、被験体がタウのｔｙｒ３９４及びｔｙｒ３１０でリン酸化されているか否かを判断することをさらに含む。
【００２４】
これらの方法は、リン酸化チロシンを有するタウに関連した任意のタウオパチーの診断に役立つ。これらの実施形態中に含まれるタウオパチーは、前頭側頭認知症（frontotemportal dementia）、進行性核上麻痺（supernuclear palsy）、ピック病、大脳皮質基底核変性症、パーキンソン病及びレーヴィ小体痴呆である（例えば、Ferrer et al., 2001, Forman et al., 2002; Marsh, 1998; Johnson and Stoothoff, 2004を参照)。好ましくは、タウオパチーはアルツハイマー病である。
【００２５】
好ましくは、タウのｔｙｒ３９４又はｔｙｒ３１０でのチロシンリン酸化は、被験体の体液、好ましくは末梢血又は脳脊髄液において測定される。
【００２６】
タウのｔｙｒ３９４又はｔｙｒ３１０でのリン酸化は、任意の既知の方法により測定することができる。好ましい実施形態において、ｔｙｒ３９４又はｔｙｒ３１０でのタウのチロシンリン酸化は、ｔｙｒ３９４又はｔｙｒ３１０でリン酸化されたタウに対して特異的な抗体を使用して、例えばウェスタンブロットによって測定される（例えば実施例及びHampel et al., 2004を参照)。
【００２７】
本発明は、被験体がタウオパチーを発症するか否かを予測する方法にも関する。この方法は、被験体がｔｙｒ３９４又はｔｙｒ３１０でリン酸化されたタウを有するかを決定することを含み、ｔｙｒ３９４又はｔｙｒ３１０でリン酸化されたタウの被験体での存在がタウオパチーを発症するであろう。ある実施形態において、ｔｙｒ３９４でのリン酸化が測定され、他の実施形態において、ｔｙｒ３１０でのリン酸化が測定される。
【００２８】
以前に記述された方法によるように、これらの方法は、被験体がタウの第２のアミノ酸残基又はより多くのアミノ酸残基でリン酸化を有するか否かを判断することを好ましくはさらに含む。第２のアミノ酸残基はチロシン又は今や既知の若しくは後にリン酸化を受けることが発見された他のタウアミノ酸残基となることができる。好ましくは、これらの方法は、被験体がタウのｔｙｒ３９４及びｓｅｒ３９６でのリン酸化を有するか否かを判断し、最も好ましくは、ｔｙｒ３９４及びｓｅｒ３９６でリン酸化されたタウに特異的に結合する抗体、例えば、抗体ＹＰ３又は抗体ＹＰ４を使用することをさらに含む。
【００２９】
第２のアミノ酸残基のリン酸化が測定される場合には、好ましくは第２のアミノ酸残基もまたチロシンになり得る。これらの態様において、この方法は、被験体がタウのｔｙｒ３９４及びｔｙｒ３１０でリン酸化を有するか否かを判断することをさらに含む。
【００３０】
上記のタウオパチーを診断する方法によるように、これらの方法は、リン酸化チロシンを有するタウに関連した任意のタウオパチーの診断に役立つ。これらの実施形態中に含まれるタウオパチーは、前頭側頭認知症、進行性核上麻痺、ピック病、大脳皮質基底核変性症、パーキンソン病及びレーヴィ小体痴呆である。好ましくは、タウオパチーはアルツハイマー病である。
【００３１】
好ましくは、これらの方法において、タウのｔｙｒ３９４又はｔｙｒ３１０でのチロシンリン酸化は、被験体の体液、好ましくは末梢血又は脳脊髄液において測定される。
【００３２】
これらの方法において、タウのｔｙｒ３９４又はｔｙｒ３１０でのリン酸化は、任意の既知の方法により測定することができる。好ましい実施形態において、タウのｔｙｒ３９４又はｔｙｒ３１０でのチロシンリン酸化は、ｔｙｒ３９４又はｔｙｒ３１０でリン酸化されたタウに対して特異的な抗体を使用して、例えばウェスタンブロットにより測定される。
【００３３】
本発明は、ｔｙｒ３９４及び／又はｔｙｒ３１０でリン酸化されたタウに特異的に結合する抗体製剤にも関する。ｔｙｒ３９４でリン酸化されたタウに対して特異的な抗体、ｔｙｒ３１０でリン酸化されたタウに対して特異的な抗体、及びｔｙｒ３９４、ｔｙｒ３１０のいずれか又は両方でリン酸化されたタウに対して特異的な抗体がここに含まれる。
【００３４】
ｔｙｒ３９４又はｔｙｒ３１０に近接する他のアミノ酸残基がリン酸化される場合、これらの製剤の抗体は好ましくはｔｙｒ３９４又はｔｙｒ３１０に結合する。これらの実施形態において、付加的なアミノ酸残基は、ｔｙｒ３９４又はｔｙｒ３１０に三次元的に近接するものであり、一次配列においてｔｙｒ３９４又はｔｙｒ３１０に近接することは必ずしも必要でない。近接するアミノ酸の一例はｓｅｒ３９６である。したがって、好ましい抗体製剤は、ｔｙｒ３９４及びｓｅｒ３９６でリン酸化されたタウに特異的に結合する。そのような製剤の例は、抗体ＹＰ３及び／又は抗体ＹＰ４を含む。
【００３５】
これらの製剤は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一体鎖抗体、抗体結合部位（例えばＦａｂ断片又はＦａｂ２断片）を含む抗体フラグメント、又はファージディスプレイ技術を使用して産生された抗体のような（しかしこれらに限定されない）遺伝子工学方法を使用して産生された抗体若しくは抗体フラグメントであり得る。さらに、抗体結合部位を含む異種のタンパク質がここに含まれる。
【００３６】
さらなる実施形態において、本発明は細胞においてタウリン酸化を阻害する方法に関する。この方法は、細胞においてタウリン酸化を阻害するのに十分な様式で、ａｂｌチロシンキナーゼの阻害因子と細胞を組み合わせることを含む。
【００３７】
本明細書において使用されるように、ａｂｌチロシンキナーゼは、配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列を有する哺乳類のタンパク質、又はチロシンキナーゼ活性のある哺乳類のその変異型である。それらの配列は、ａｂｌ１（ｃ−ａｂｌとしてもまた既知である）（Shaul et al., 2000）及びａｂｌ２（ａｒｇとしてもまた既知である）である。
【００３８】
これらの方法のある実施形態において、ａｂｌチロシンキナーゼはａｂｌ１であり、他の実施形態において、ａｂｌチロシンキナーゼはａｂｌ２である。これらの実施形態において、タウリン酸化はｔｙｒ３９４又はｔｙｒ３１０、又は両方のアミノ酸であり得る。
【００３９】
これらの方法はタウにより形質転換された任意の真核生物細胞、原核生物細胞又は古細菌細胞を含む任意の細胞においてタウリン酸化を阻害するために使用することができる。好ましい実施形態において、細胞は哺乳類のニューロンである。ニューロンは、培養物又は生存する哺乳類中に存在し得る。哺乳類がヒトである場合には、好ましくは、ヒトは、前頭側頭認知症、進行性核上麻痺、ピック病、大脳皮質基底核変性症、パーキンソン病、レーヴィ小体痴呆、又は好ましくはアルツハイマー病のようなタウオパチーを発症する危険性があるか、又はそのようなタウオパチーを有する。
【００４０】
これらの方法において、阻害因子は好ましくは非受容体チロシンキナーゼ、最も好ましくはａｂｌチロシンキナーゼに対して選択的である。さらなる好ましい実施形態において、阻害因子は低分子量の有機分子である。いくつかのそのような阻害因子は既知である。好ましい例はＳＴＩ５７１（グリーベック、メシル酸イマチニブ）、ＣＧＰ  ５７１４８、ＡＧ１１１２、ＡＰ２３４６４、ＣＧＰ７６０３０、又はＰＰ１を含む(Netzer et al., 2003; Dan et al., 1998; Deininger et al., 1997; O'Hare et al., 2004; Warmuth et al., 2003)。
【００４１】
阻害因子は、代替的にはａｂｌチロシンキナーゼに特異的に結合する高分子、例えば抗体（以前に論じられたように、抗体フラグメント、又は抗体結合部位を含む異種のタンパク質を含む）又はアプタマーであり得る。
【００４２】
アプタマーは、タンパク質又は低分子（例えばステロイド、薬剤等）のような特定の標的分子と結合する、一本鎖オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログである。したがって、アプタマーは抗体と類似するオリゴヌクレオチドである。しかしながら、アプタマーは、一般に５０〜１００ｎｔで、範囲の抗体よりも小さい。それらの結合は、アプタマーオリゴヌクレオチドによって形成された二次構造に高く依存する。ＲＮＡ及び一本鎖ＤＮＡ（又はアナログ）の両方のアプタマーは既知である。例えば米国特許第５，７７３，５９８号明細書、同第５，４９６，９３８号明細書、同第５，５８０，７３７号明細書、同第５，６５４，１５１号明細書、同第５，７２６，０１７号明細書、同第５，７８６，４６２号明細書、同第５，５０３，９７８号明細書、同第６，０２８，１８６号明細書、同第６，１１０，９００号明細書、同第６，１２４，４４９号明細書、同第６，１２７，１１９号明細書、同第６，１４０，４９０号明細書、同第６，１４７，２０４号明細書、同第６，１６８，７７８号明細書、及び同第６，１７１，７９５号明細書を参照。
【００４３】
実質的には、任意の特定の標的に結合するアプタマーは、指数関数的な濃縮によるリガンドの系統的の進化を表わす、セレックス（ＳＥＬＥＸ）と呼ばれる反復プロセスの使用によって選択することができる。このプロセスを改良し、特定の状況下でその使用を可能にする、セレックスのいくつかの変形が開発されている。例えば米国特許第５，４７２，８４１号明細書、同第５，５０３，９７８号明細書、同第５，５６７，５８８号明細書、同第５，５８２，９８１号明細書、同第５，６３７，４５９号明細書、同第５，６８３，８６７号明細書、同第５，７０５，３３７号明細書、同第５，７１２，３７５号明細書、及び同第６，０８３，６９６号明細書を参照。ベクターからアプタマーを発現する方法は、近年開発されている（ＰＣＴ国際公開第０３／１０２１４６号パンフレット）。
【００４４】
これらの阻害因子は、ａｂｌチロシンキナーゼをコードする、細胞のポリヌクレオチドの一部に相同である核酸配列を含むベクターでもよい。そのような核酸配列の非限定例は、ａｂｌチロシンキナーゼをコードするポリヌクレオチドの転写又は翻訳を阻害する、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ及びリボザイムであるか、又はそれらをコードするものである。当業者によって、過度な実験をともなわず、そのような阻害因子を産生することができるかもしれない。
【００４５】
最も好ましくは、阻害因子は、哺乳類の血液脳関門を通過する化合物の能力を促進する医薬組成物中に配合される。「医薬上許容される」とは、（ｉ）意図した目的のために組成物を不適切にすることなく、組成物の他の成分と適合し、（ｉｉ）不必要な有害な副作用（毒性、炎症、及びアレルギー反応のような）なしに、本明細書において提供されるような被験体への使用に適切である物質を意味する。それらの危険性が、組成物によって与えられる利益より勝る場合、副作用は「不必要」である。医薬上許容される担体の非限定的例は、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、油／水エマルジョンのようなエマルジョン、マイクロエマルジョン等のような標準の医薬的担体のいずれかを含むが、これらに限定されない。
【００４６】
上記化合物は、特定の用途に適切なように、ヒトを含む哺乳類への投与のために過度の実験をともなわずに配合することができる。さらに、組成物の適切な投与量は、標準用量反応プロトコルを使用して、過度の実験をともなわずに測定することができる。
【００４７】
したがって、経口、舌、舌下、口腔及び頬内の投与のために設計された組成物は、例えば不活性希釈剤又は食用の担体をともなう当技術分野において既知の手段によって、過度の実験をともなわずに作製することができる。組成物は、ゼラチンカプセル剤で包まれるか、又は錠剤に圧縮成形されてもよい。治療的経口投与のために、本発明の医薬組成物は賦形剤に組み込まれ、錠剤、トローチ、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液、シロップ剤、ウエハース、チューインガム等の形で使用されてもよい。
【００４８】
錠剤、ピル、カプセル剤、トローチ等は、さらに結合剤、レシピエント、崩壊剤、滑剤、甘味剤、及び香味剤を含有してもよい。結合剤のいくつかの例としては、微結晶性セルロース、トラガカントゴム又はゼラチンが挙げられる。賦形剤の例としては、スターチ又はラクトースが挙げられる。崩壊剤のいくつかの例としては、アルギン酸、コーンスターチ等が挙げられる。滑沢剤の例としては、ステアリン酸マグネシウム又はステアリン酸カリウムが挙げられる。流動促進剤の一例は、コロイド状二酸化ケイ素である。甘味剤のいくつかの例としては、ショ糖、サッカリンが挙げられる。香味剤の例としては、ペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジ香味剤等が挙げられる。これらの様々な組成物の調製に使用する物質は、使用量において医薬的に純粋で無毒である必要がある。
【００４９】
化合物は、例えば静脈内注射、筋肉内注射、鞘内注射又は皮下注射による非経口投与を容易に行なうことができる。非経口投与は、溶液又は懸濁液に化合物を組み込むことによって達成することができる。そのような溶液又は懸濁液は、注射用水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒のような無菌の希釈剤も含んでもよい。非経口製剤は、例えばベンジルアルコール又はメチルパラベンのような抗菌剤、例えばアスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤、及びＥＤＴＡのようなキレート剤もまた含んでもよい。酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩のような緩衝液、及び塩化ナトリウム又はデキストロースのような弾力性の調節のための試薬も添加されてもよい。非経口製剤は、ガラス製又はプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器又はマルチプルドーズバイアルで封入することができる。
【００５０】
直腸投与は、直腸又は大腸への、医薬組成物中の化合物の投与を含む。これは坐剤又は浣腸剤を使用して達成することができる。座剤製剤は、当技術分野において既知の方法によって容易に作製することができる。例えば、座剤製剤は、グリセリンを約１２０℃まで加熱すること、グリセリン中の組成物を溶解すること、加熱したグリセリンと混合した後に精製水を添加すること、及び坐剤流し込み型へ熱い混合物を注ぐことによって調製することができる。
【００５１】
経皮的投与は、皮膚を介する組成物の経皮吸収を含む。経皮的製剤は、貼付剤（既知のニコチンパッチのような）、軟膏、クリーム、ゲル、膏薬等を含む。
【００５２】
本発明は、哺乳類に治療上効果的な量の化合物を経鼻的に投与することを含む。本明細書において使用されるように、経鼻的に投与すること又は鼻腔投与は、患者の鼻通路又は鼻腔の粘膜に化合物を投与することを含む。本明細書において使用されるように、化合物の鼻腔投与の医薬組成物は、例えば鼻内噴霧器、点鼻液、懸濁液、ゲル、軟膏、クリーム又は粉末として投与される既知の方法によって調製される治療上効果的な量の化合物を含む。化合物の投与は、鼻タンポン又は鼻スポンジを使用して行なわれてもまたよい。
【００５３】
化合物が血液脳関門を通過しなければならないように化合物が末梢投与される場合には、化合物は、好ましくは哺乳類の血液脳関門を通過する化合物の能力を促進する医薬組成物の中に配合される。そのような製剤は当技術分野において既知であり、吸収を増進するために親油性化合物を含む。非親油性化合物の吸収は、親油性物質との組み合わせによって促進することができる。鼻粘液を通って化合物の送達を促進することができる親油性物質としては、脂肪酸（例えば、パルミチン酸）、ガングリオシド（例えば、ＧＭ−１）、リン脂質（例えば、フォスファチジルセリン）、及び乳化剤（例えば、ポリソルベート８０）、デオキシコール酸ナトリウムのような胆汁酸塩、及び例えばツイーン（登録商標）のようなポリソルベート８０を含む界面活性剤様物質、トリトン（登録商標）Ｘ−１００のようなオクトキシノール、及びタウロ−２４，２５−ジヒドロフシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）が挙げられるが、これらに限定されない。Lee et al., Biopharm., April 1988 issue:3037を参照。
【００５４】
化合物は、親油性物質で構成されたミセルと組み合わせることができる。そのようなミセルは、化合物の吸収を促進するために鼻粘膜の透過性を変更することができる。適切な親油性ミセルとしては、ガングリオシド（例えば、ＧＭ−１ガングリオシド）、及びリン脂質（例えば、フォスファチジルセリン）が挙げられるが、これらに限定されない。胆汁酸塩及びそれらの誘導体並びに界面活性剤様物質もミセル製剤中に含むことが可能である。化合物は、１つ又はいくつかの型のミセルと組み合わせることができ、ミセル内にさらに含むことができるか、又はミセルの表面に結合させることができる。
【００５５】
化合物を、化合物の親油性を増大させる（それにより血液脳関門の浸透を増大させる）薬剤又は能動輸送される薬剤に、結合又は連結することもまた可能である。そのような薬剤は、当技術分野において既知である。
【００５６】
代替的に、化合物は吸収を促進するためにリポソーム（脂質小胞）と組み合わせることができる。化合物は、リポソーム内に含まれているか、若しくは溶解されているか、及び／又はリポソーム表面に結合させることができる。適切なリポソームは、リン脂質（例えば、フォスファチジルセリン）及び／又はガングリオシド（例えば、ＧＭ−１）を含んでいる。リン脂質小胞を作製する方法については、例えばRoberts et al.に対する米国特許第４，９２１，７０６号明細書、及びYiournas et al.に対する米国特許第４，８９５，４５２号明細書を参照。胆汁酸塩及びそれらの誘導体並びに界面活性剤様物質もリポソーム製剤中に含むことが可能である。
【００５７】
本発明は、タウオパチーを有する被験体を治療する方法にも関する。この方法は、被験体のニューロンにおけるタウのチロシンリン酸化を阻害するのに十分な様式で、ａｂｌチロシンキナーゼの阻害因子を被験体に投与することを含む。上記された方法と類似していることから、ａｂｌチロシンキナーゼはａｂｌ１又はａｂｌ２であり得る。さらに、タウオパチーは、チロシンリン酸化をともなう任意のタウオパチー、例えば前頭側頭認知症、進行性核上麻痺、ピック病、大脳皮質基底核変性症、パーキンソン病、レーヴィ小体痴呆であり得る。好ましくは、タウオパチーはアルツハイマー病である。
【００５８】
これらの方法において、阻害因子は、好ましくは非受容体チロシンキナーゼ、最も好ましくはａｂｌチロシンキナーゼに対して選択的である。さらなる好ましい実施形態において、阻害因子は低分子量の有機分子である。いくつかのそのような阻害因子は既知である。好ましい例としては、ＳＴＩ５７１、ＣＧＰ５７１４８、ＡＧ１１１２、ＡＰ２３４６４たはＰＰ１が挙げられる。
【００５９】
代替的には、阻害因子は、ａｂｌチロシンキナーゼと特異的に結合する高分子、例えば抗体又はアプタマーであり得る。
【００６０】
阻害因子は、ａｂｌチロシンキナーゼをコードする、細胞のポリヌクレオチドの一部に相同である核酸配列を含むベクターにもなり得る。そのような核酸配列の例は、ａｂｌチロシンキナーゼをコードするポリヌクレオチドの転写又は翻訳を阻害する、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムであるか、又はそれらをコードするものである。
【００６１】
好ましくは、阻害因子は、哺乳類の血液脳関門を通過する化合物の能力を促進する医薬組成物中に配合される。阻害因子も、哺乳類の脳に直接投与することができる。
【００６２】
本発明は、タウオパチーの危険性がある被験体を治療する方法にも関する。この方法は、被験体のニューロンにおけるタウのチロシンリン酸化を阻害するのに十分な様式で、ａｂｌチロシンキナーゼの阻害因子を被験体に投与することを含む。上記された方法と類似して、ａｂｌチロシンキナーゼはａｂｌ１又はａｂｌ２であり得る。さらに、タウオパチーは、チロシンリン酸化をともなう任意のタウオパチー、例えば前頭側頭認知症、進行性核上麻痺、ピック病、大脳皮質基底核変性症、パーキンソン病、レーヴィ小体痴呆であり得る。好ましくは、タウオパチーはアルツハイマー病である。
【００６３】
これらの方法において、阻害因子は、好ましくは非受容体チロシンキナーゼ、最も好ましくはａｂｌチロシンキナーゼに対して選択的である。さらなる好ましい実施形態において、阻害因子は低分子量の有機分子である。いくつかのそのような阻害因子は既知である。好ましい例としてはＳＴＩ５７１、ＣＧＰ５７１４８、ＡＧ１１１２、ＡＰ２３４６４又はＰＰ１が挙げられる。
【００６４】
代替的には、阻害因子は、ａｂｌチロシンキナーゼと特異的に結合する高分子、例えば抗体又はアプタマーであり得る。
【００６５】
阻害因子は、ａｂｌチロシンキナーゼをコードする、細胞のポリヌクレオチドの一部に相同である核酸配列を含むベクターでもよい。そのような核酸配列の例は、ａｂｌチロシンキナーゼをコードするポリヌクレオチドの転写又は翻訳を阻害する、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムであるか、又はそれらをコードするものである。
【００６６】
好ましい実施形態において、阻害因子は、哺乳類の血液脳関門を通過する化合物の能力を促進する医薬組成物中に配合される。阻害因子は、哺乳類の脳にも直接投与することが可能である。
【００６７】
本発明はさらに、ａｂｌチロシンキナーゼが哺乳類のニューロン中に発現されるように、ａｂｌチロシンキナーゼをコードする導入遺伝子を含むヒト以外の哺乳類に関する。ａｂｌチロシンキナーゼは哺乳類ニューロンにおいて活性があり、タウオパチーに関与するという、本明細書において提供される知識を前提として、これらの実施形態の哺乳類は、これらのタウオパチーの研究及びこれらのタウオパチーのための可能性のある治療法のスクリーニングに役立つ。これらの哺乳類は、過度の実験をともなわずに産生することができる。
【００６８】
これらの哺乳類におけるａｂｌチロシンキナーゼは、ａｂｌ１若しくはａｂｌ２、又はその後発見された他のａｂｌチロシンキナーゼであり得る。さらに、ａｂｌチロシンキナーゼをコードする導入遺伝子は、任意の哺乳類由来であり得るか、又は２つ以上の哺乳類からのキメラであり得るか、又は天然に存在しないヌクレオチドを含むことができる。導入遺伝子は、そのような置換の効果を検討するために、天然に存在しないアミノ酸もコードすることができる。しかしながら、好ましい実施形態において、哺乳類は少なくとも１つの自然発生的ａｂｌチロシンキナーゼ、最も好ましくは、ヒトａｂｌチロシンキナーゼを発現する。さらなる好ましい実施形態において、哺乳類は、哺乳類のニューロンにおいて、ヒトａｂｌ１及びヒトａｂｌ２の両方を発現する。
【００６９】
哺乳類を利用する研究の目標によって、これらの哺乳類において、ａｂｌチロシンキナーゼの発現は誘導可能又は構成的であり得る。好ましくは、ａｂｌチロシンキナーゼの発現は哺乳類のニューロンに限定される。
【００７０】
これらの実施形態の哺乳類は任意の種であり得るが、好ましくはイヌ、ネコ、モルモット、ラット、又は好ましくはマウスのような実験動物であり得る。
【００７１】
本発明はさらに、化合物がタウオパチーの発症を阻害するか否かを評価する方法に関する。この方法は、ａｂｌチロシンキナーゼと化合物を組み合わせること、及び化合物がａｂｌチロシンキナーゼを阻害するか否かを判断することを含む。これらの実施形態において、ａｂｌチロシンキナーゼを阻害する化合物は、タウオパチーの発症を阻害する。本明細書では、ａｂｌチロシンキナーゼはａｂｌ１又はａｂｌ２であり得る。好ましくは、チロシンキナーゼはヒトａｂｌチロシンキナーゼ、最も好ましくは、ヒトａｂｌ１又はヒトａｂｌ２である。
【００７２】
本明細書でのタウオパチーは、チロシンリン酸化をともなう任意のタウオパチー、例えば前頭側頭認知症、進行性核上麻痺、ピック病、大脳皮質基底核変性症、パーキンソン病、レーヴィ小体痴呆であり得る。好ましくは、タウオパチーはアルツハイマー病である。
【００７３】
これらの方法は、阻害について試験されるａｂｌチロシンキナーゼがヒト以外の哺乳類にある場合には、上記されたヒト以外の哺乳類もまた利用することができる。
【００７４】
本発明の好ましい実施形態は、以下の実施例に記述される。本明細書における特許請求の範囲内の他の実施形態は、明細書の考察又は本明細書において開示されるような本発明の実行から、当業者に明らかになる。明細書は、実施例に従う請求項によって示されている本発明の範囲及び精神により、実施例と共に単に例示的であると考えられることが意図される。
【実施例】
【００７５】
（実施例１）
ａｂｌによるタウのリン酸化、並びにアルツハイマー病及び他のタウオパチーに対するその関係
アルツハイマー病のようなタウオパチーを有する患者のニューロンにおける、活発な細胞分裂機構の発見から約１０年たっており、多数の論文は、細胞分裂のいくつかの局面が、この疾患において変性するニューロン中で実際に行なわれることを立証した。成体の脳の分化したニューロンは細胞分裂しないことは非常に十分に立証されていたので、この発見は最初は非常に論争の的となっていた。細胞分裂を妨げる非常に強固な機構が明らかに存在しており、腫瘍は分化したニューロンから生じず、神経芽細胞腫は、成体において全く知られていない。他方では、細胞分裂機構がアルツハイマー病の患者のニューロン中で活性化されたという証拠が非常に強固であり、近年の報告から、脳梗塞の周囲のニューロンにおける細胞周期の活性化も示唆されている。これにより２つの無視できない問題が残った：
１．  何がアルツハイマー病（及び恐らく以下の脳梗塞）の患者のニューロンにおいて細胞周期を活性化するのか。
２．  細胞周期活性化の影響は何か。
【００７６】
白血球（リンパ球）における細胞周期の最も顕著な活性化因子の１つは、非受容体チロシンキナーゼのｃ−ａｂｌ（ａｂｌ−１とも呼ばれる）である。ａｂｌの異常が、リンパ球の分裂が正常に制御されない場合に起こる癌である白血病に関連していることは、長年の間明白であった。ｃ−ａｂｌの異常が白血病を引き起こす可能性がある３つの異なる方法は、異常なｃ−ａｂｌ含有遺伝子を生み出す染色体再配置による、ｃ−ａｂｌ遺伝子自体の変異による、及び細胞のｃ−ａｂｌ遺伝子に類似する遺伝子を保有するウイルスへの感染によるものである。これら３つすべての異常は、細胞の相当物よりも活性の高いａｂｌタンパク質の産生をもたらす。これらの異常が、制御されない細胞分裂を引き起こすのは、ａｂｌキナーゼの活性が増大することによる。グリーベックのような化合物によるａｂｌキナーゼ活性の阻害は、白血病の多くの症例の非常に効果的な治療法であり、この治療法がうまくいかない場合は、ほとんどいつもａｂｌキナーゼ活性が阻害に対して耐性になるためである。
【００７７】
非癌細胞において、ａｂｌキナーゼ活性は厳重に制御されるが、ＤＮＡの損傷（環境有害物質又は放射線による）又は酸化ストレスによって活性化することができる。有害物質又は放射線がニューロンにおけるａｂｌの活性化を誘導したという少数の報告があったが、これらはアルツハイマー病の機構と無関係な研究に狭く焦点を合わせたものだった。
【００７８】
上記の論理的根拠に基づいた、ａｂｌとアルツハイマー病との間での潜在的な関係を調査することによって、本発明者等は、タウ及びａｂｌが、アルツハイマー病の神経原線維濃縮体において共局在することを立証した(Conrad, 2003)。
【００７９】
本発明者等は、さらにアルツハイマー病のタウのリン酸化におけるａｂｌの役割を評価した。Derkinderen et al. (2005)は、ｃ−ａｂｌとタウとの相互作用をさらに研究した。
【００８０】
アルツハイマー病の脳切片を抗ａｂｌ抗体により染色した。濃縮体は、ａｂｌについて陽性に染色された（図１）。さらに、リン酸化されていないタウではなく、ｔｙｒ１８又はｔｙｒ２９でリン酸化されたタウのみを認識する抗体は、正常成人ヒト脳の切片ではなくアルツハイマー病患者の切片に結合した（図２）。パネルＡ〜パネルＤは、アルツハイマー病の初期の症例をともなう患者からのものである。パネルＡは、この患者の脳におけるニューロンを示す。このニューロンは濃縮体を有しないので、非常に薄く染色される。パネルＢは、濃縮体を有する１つの細胞（左下）、及び明らかに初期の濃縮体を有する１つ細胞（右上）の２個の細胞を示す。パネルＣは、濃縮体を有する細胞がその細胞の全体にわたって染色されること及び細胞突起を有する細胞がはっきり見えることを示す。パネルＤは、この初期のアルツハイマー病の症例においてでさえ、アミロイド沈着を囲む神経突起（斑の中の突起）も、チロシンがリン酸化されたタウについて染色されたことを示す。パネルＥは、より進行したアルツハイマー病の症例におけるチロシンリン酸化を示す。多量の染色がある。斑及び濃縮体の染色の両方が明確に見える。パネルＦは、進行したアルツハイマー病の症例からである。この切片は、斑における神経突起の強い染色を示す。
【００８１】
次に、細胞におけるタウのリン酸化を評価した。トランスジェニックのタウを発現したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、ｆｙｎ又はａｂｌを発現するベクターでトランスフェクションした。次にこの細胞由来のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、リン酸化されたタウ又はリン酸化されないタウを認識した抗体によるウェスタンブロットを行なった。結果は図３に示される。ａｂｌは、ｆｙｎよりもはるかに多い程度までタウをリン酸化した。
【００８２】
図４は、タウのｔｙｒ３９４がリン酸化されることを立証する実験の結果を示す。５つの変異体タウタンパク質が合成された。各々の変異体は、フェニルアラニン（Ｆ）変異に対して異なるｔｙｒ（Ｙ）を有していた。Ｙ１８Ｆはｔｙｒ１８等で変異させたものである。フェニルアラニンは、構造においてチロシンに非常に類似しているが、リン酸化することができない。図３により記述されるように、変異タンパク質をａｂｌと共に細胞にトランスフェクションし、次に溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットにかけた。ａｂｌは、チロシン３９４を最もリン酸化し、さらに視覚的な観察によって、ｔｙｒ１８及びｔｙｒ１９７をリン酸化したように見えた。この実験は、ｔｙｒ２９又はｔｙｒ３１０のリン酸化もまた除外しない。実際は、ｔｙｒ３１０残基がｔｙｒ３９４に非常に類似しているアミノ酸により、ａｂｌによるｔｙｒ３１０のリン酸化は予測されるだろう。
【００８３】
（実施例２）
ａｂｌによる、タウのリン酸化のさらなる研究
ウェスタンブロット及びＥＬＩＳＡは、タウのチロシン−３９４（Ｙ３９４）及びチロシン３１０（Ｙ３１０）でのａｂｌ２（Ａｒｇ）リン酸化を評価するために利用された。実施例１に記述されるチロシンからフェニルアラニンへの変異体を発現する細胞を、ａｂｌ２により共トランスフェクションし、溶解物をウェスタンブロット及びＥＬＩＳＡにかけた。図５Ａは、抗フォスフォチロシン（抗ｐＹ）、抗タウ、及び抗ａｂｌ２（抗Ａｒｇ）によるそれらの溶解物の染色の結果を示す。ａｂｌ２は、Ｙ３９４を強くリン酸化し、Ｙ１９７及びＹ３１０をより低いレベルでリン酸化する。変異体タウの長いアイソフォーム（４Ｒ）及び短いアイソフォーム（３Ｒ）（それぞれ、配列番号２及び配列番号１）が、ａｂｌ２（ａｒｇ）と共に共トランスフェクションされた場合、Ｙ３９４はａｂｌ２リン酸化の主な部位だった（図５Ｂ）。サンドイッチＥＬＩＳＡにより、タウの最長アイソフォーム（図５Ｃ）及び最短アイソフォーム（図５Ｄ）についての主要なリン酸化部位としてＹ３９４を示すウェスタンブロットの結果が確認される。
【００８４】
Ｙ３１０でリン酸化されたタウを特異的に認識するモノクローナル抗体（ＹＰ２１）が開発された。様々なリン酸化チロシン含有タウペプチドに対する抗体の親和性を測定するためにＥＬＩＳＡを使用して、その抗体の特異性を確立した（図６Ａ）。この抗体を、ａｂｌ２（ａｒｇ）（図６Ｂ）及びａｂｌ１（図６Ｃ）の両方と共にタウを共トランスフェクションしたもの由来の細胞溶解物によるウェスタンブロットにおいて使用し、タウのＹ３１０でのリン酸化、及びＹ３１０が変異した場合のＹＰ２１免疫反応性の完全な消失を実証した。
【００８５】
独立してタウをリン酸化するａｂｌ１及びａｂｌ２の能力を評価するために、グリーベック（メシル酸イマチニブ）（Young et al．， 2006）に耐性のあるａｂｌ１及びａｂｌ２のＴ３６１Ｉ型を作製し、ａｂｌ１又はａｂｌ２で細胞へトランスフェクションし、溶解物を、ウェスタンブロット（図７Ａ［ａｂｌ１］及び図７Ｂ［ａｂｌ２］）及びＥＬＩＳＡ（図７Ｃの［ａｂｌ１］及び図７Ｄ［ａｂｌ２］）によって評価した。グリーベックの存在下において、両方の型はタウをリン酸化することができた。これは、ａｂｌの活性化によるａｂｌ２の活性がタウリン酸化をもたらさないこと、又はａｂｌ１でもそれが成立することを立証する。グリーベック処理にかかわらず、タウのチロシンのリン酸化が各々の薬剤耐性型のＡｂｌファミリーキナーゼの存在下において保持されるので、細胞にトランスフェクションされたａｂｌ１又はａｂｌ２は直接タウをリン酸化するものである。
【００８６】
タウのセリン３９６は、アルツハイマー病において常にリン酸化される（Uboga and Price， 2000; Weaver et al．， 2000）。したがって、ａｂｌ１又はａｂｌ２活性は、２重リン酸化部位のフォスフォチロシン３９４／フォスフォセリン３９６を産生する必要がある。ＹＰ３及びＹＰ４と呼ばれる部位に対する２つのモノクローナル抗体が開発された（図８）。チロシン３９４のみがリン酸化される場合、これらの抗体はタウを認識せず、また３９６のみがリン酸化される場合、これらの抗体はタウを認識しないが、２重リン酸化に対しては特異的である（図８）。これらの抗体に対して免疫反応性の部位は、斑、濃縮体及び異常な神経炎と関連したアルツハイマー病の脳に大量に存在する（図９Ａ及び図９Ｂ）。正常脳でこれらの抗体の反応性は見出されない（図９ＣはＹＰ３についてのみ示したが、正常組織はＹＰ４でもまた陰性である）。
【００８７】
上記を考慮して、本発明のいくつかの利点が達成され、及び他の利点が獲得されることが理解されるだろう。
【００８８】
本発明の範囲を逸脱することなく、上記の方法及び組成物において様々な変更を行なうことができるので、上記の記載に含まれ、添付の図面において示されるすべての事柄が例示として解釈され、限定する意味ではないことが意図される。
【００８９】
本明細書に引用された参考文献はすべて、参照によって本明細書に援用される。本明細書における参考文献の考察は、単に著者によって行なわれた主張を要約することを意図し、いかなる参考文献も先行技術を構成する承認は為されない。出願人は、引用された参考文献の正確性及び妥当性に異議を唱える権利を留保する。
【００９０】
配列番号
配列番号１  ヒトのタウ、アイソフォーム４（ｔａｕ３５２）アミノ酸配列。ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ０５８５２５より、チロシンは太字であり、長いアイソフォーム４（配列番号２）の１８、２９、１９７、３１０、３９４に対応している。
【００９１】
【表１】
2009506302.tif 000002
【００９２】
配列番号２  ヒトのタウ、アイソフォーム２（ｔａｕ４４１）アミノ酸配列。ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ００５９０１より、チロシンは太字である−１８、２９、１９７、３１０、３９４。
【００９３】
【表２】
2009506302.tif 000003
【００９４】
配列番号３  ａｂｌ１アミノ酸配列。ＧｅｎＢａｎｋ  Ｐ００５１９より
【００９５】
【表３】
2009506302.tif 000004
【００９６】
配列番号３  ａｂｌアミノ酸配列。ＧｅｎＢａｎｋ  Ｐ４２６８４より
【００９７】
【表４】
2009506302.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】ａｂｌ抗体により染色されたアルツハイマー病（ＡＤ）脳組織切片の顕微鏡写真を示す図である。パネル（Ａ〜Ｄ）は、抗ａｂｌ抗体Ｋ１２（Santa Cruz Biotechnology）により染色された切片である。パネルＡは、ａｂｌタンパク質により交差吸収されたＫ１２抗体製剤により染色されたアルツハイマー病脳切片を示す。パネルＢ及びパネルＣは、斑及び濃縮体の両方と関連したａｂｌの存在を示す初期のＡＤ症例からの画像である。パネルＤは、ａｂｌ抗体によって染色された初期のＡＤにおける濃縮体の拡大図である。パネルＥ〜パネルＨは、抗ａｂｌ抗体ＡＢ−１（Oncogene Biosciences）の写真である。パネルＥは、ａｂｌタンパク質で交差吸収された抗体ＡＢ−１により染色された切片を示す。パネルＦは、ＡＤの中等度の症例からの画像である。パネルＧは、ＡＤの中等度の症例からのより高い倍率の画像である。パネルＨは、ＡＤの中等度の症例からのさらに高い倍率の画像である。
【図２】チロシン１８又はチロシン２９のいずれかでリン酸化された場合にタウを認識するモノクローナル抗体により染色された、ＡＤ脳組織切片の顕微鏡写真を示す図である。この抗体は、正常成人ヒト脳においては何も認識しない。パネル（Ａ〜Ｄ）は、アルツハイマー病の初期の症例から得られた画像である。パネルＡは、初期のＡＤ患者の脳におけるニューロンを示す。パネルＢは、濃縮体を有する１個の細胞（左下）、及び明らかに初期の濃縮体を有する１個の細胞（右上）の２個の細胞を示す。パネルＣは、細胞の全体にわたって染色された濃縮体及び細胞突起を有する細胞がはっきり見えることを示す。パネルＤは、アミロイド沈着を取り囲む神経突起を示す。パネルＥは、より進行したＡＤ症例におけるチロシンリン酸化を示す。パネルＦは、進行したＡＤ症例の他の図を示す。
【図３】ａｂｌ（Ａｂｌ）、ｆｙｎ（Ｆｙｎ）によりトランスフェクションした細胞、又は何もトランスフェクションしていない（ＮＴ）細胞由来のタウを電気泳動したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのブロットの写真を示す図である。次にこのブロットを、タウに結合するマウスモノクローナル抗体により処理し、次に、ホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウスＩｇＧにより処理し、次にＨＲＰ基質により発色して撮影した。抗体ＣＰ２７は、リン酸化されてもリン酸化されなくとも、タウのすべての型に結合し、抗体９Ｇ３は、チロシン１８及びチロシン２９でリン酸化されるタウにのみに結合し、抗体４Ｇ１０は、いかなるチロシンでもリン酸化されるタウに結合する。
【図４】ａｂｌによってリン酸化された５つの変異体のタウタンパク質の、図３中のように染色されたブロットの写真を示した図である。５つの変異体の各々は、ひとつのチロシンが１８残基（Ｙ１８Ｆ）、２９残基（Ｙ２９Ｆ）、１９７残基（Ｙ１９７Ｆ）、３１０残基（Ｙ３１０Ｆ）、及び３９４残基（Ｙ３９４Ｆ）で、フェニルアラニンと置換された。電気泳動及びブロッティング後に、ブロットを、上記の図３の簡単な説明中に示された抗体により染色した。
【図５−１】ａｂｌ２がチロシン３９４（Ｙ３９４）及びチロシン３１０（Ｙ３１０）で、タウをリン酸化することをさらに立証するウェスタンブロットのグラフ及び写真を示す図である。パネルＡは、Ｙ１９７及びＹ３１０におけるより低レベルのリン酸化を有し、主要なリン酸化部位としてＹ３９４を示す、チロシンからフェニルアラニンへの変異体の細胞溶解物のウェスタンブロットを示す。パネルＢは、タウの短かいアイソフォーム（３Ｒ）及びタウの長いアイソフォーム（４Ｒ）において、Ｙ３９４がａｂｌ２リン酸化の主な部位であることをさらに立証するウェスタンブロットを示す。
【図５−２】パネルＣ及びパネルＤは、タウの最長アイソフォーム（Ｃ）及びタウの最短アイソフォーム（Ｄ）の両方に対して主要なリン酸化部位としてのＹ３９４を示すウェスタンブロット結果を確認する、サンドイッチＥＬＩＳＡの結果のグラフである。
【図６−１】Ｙ３１０でリン酸化されたタウを特異的に認識するモノクローナル抗体（ＹＰ２１）を使用して、Ｙ３１０がａｂｌ１（Ａｂｌ）及びａｂｌ２（Ａｒｇ）の両方によってリン酸化されることをさらに立証するウェスタンブロットのグラフ及び写真を示す図である。パネルＡは、リン酸化Ｙ３１０に対するＹＰ２１の特異性を示すＥＬＩＳＡの結果のグラフである。
【図６−２】パネルＢ及びパネルＣは、タウのＹ３１０でのリン酸化、及びＹ３１０を変異させる場合のＹＰ２１の免疫反応性の完全な消失を実証するウェスタンブロットを示す。
【図７】ａｂｌ１及びａｂｌ２が、タウのチロシンリン酸化を各々独立して媒介することができることを立証するウェスタンブロットのグラフ及び写真を示す図である。パネルＡ及びパネルＢは、グリーベック耐性ａｂｌ１又はａｂｌ２によるリン酸化ではなく、野生型のａｂｌ１（Ａ）又はａｂｌ２（Ｂ）によるＹ３１０のリン酸化が、メシル酸イマチニブ（グリーベック）によって阻害されることを立証するウェスタンブロットを示す。パネルＣ及びパネルＤは、サンドイッチＥＬＩＳＡによりウェスタンブロットのデータをさらに支持する。
【図８】ＹＰ３抗体及びＹＰ４抗体が、フォスフォチロシン３９４／フォスフォセリン３９６の２重リン酸化を有するタウに対して特異的であることを示すＥＬＩＳＡ結果のグラフを示す図である。
【図９】斑、濃縮体及び異常な神経突起と関連して、アルツハイマー病の脳において大量のフォスフォチロシン３９４／フォスフォセリン３９６のタウの存在を示す、ＹＰ３又はＹＰ４の抗体により脳組織の染色を示す顕微鏡写真を示す図である。パネルＡは、ＹＰ３によるアルツハイマー病組織の染色を示し、パネルＢは、ＹＰ４によるアルツハイマー病組織の染色を示し、パネルＣは、ＹＰ３による正常脳の染色を示す。
【図１】
2009506302.tif 000006
【図２】
2009506302.tif 000007
【図３】
2009506302.tif 000008
【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
2009506302.tif 000012
【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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2009506302.tif 000018
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