(57)【要約】本発明は、フィブリンおよびα２−抗プラスミンに関連する種々の治療において用いるための抗プラスミン切断酵素の阻害剤と、例えばかかる阻害剤を特定するためのスクリーニング方法において用いることができるＡＰＣＥの基質に関する。本発明は、血漿α２−抗プラスミンの形態の比率を変更することによって、アテローム性動脈硬化症および血栓障害を処置または抑制する方法に関する。一実施形態において、本発明は、血漿Ｍｅｔ−α２−抗プラスミンの処置前のレベルおよび血漿Ａｓｎ−α２−抗プラスミンの処置前のレベルを有する対象における血漿α２−抗プラスミン比を変更する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血漿Ｍｅｔ−α２−抗プラスミンの処置前のレベルおよび血漿Ａｓｎ−α２−抗プラスミンの処置前のレベルを有する対象における血漿α２−抗プラスミン比を変更する方法であって、該方法は、抗プラスミン切断酵素の阻害剤で該対象を処置する工程を含み、
該阻害剤は、抗プラスミン切断酵素によるＭｅｔ−α２−抗プラスミンのＰｒｏ−Ａｓｎ切断部位の切断を特異的に阻害し、処置後に該対象は、該血漿Ｍｅｔ−α２−抗プラスミンの処置前のレベルよりも少なくとも５％高い血漿Ｍｅｔ−α２−抗プラスミンの処置後のレベルを有し、また該血漿Ａｓｎ−α２−抗プラスミンの処置前のレベルよりも少なくとも５％低い血漿Ａｓｎ−α２−抗プラスミンの処置後のレベルを有し、それによって該対象における該血漿α２−抗プラスミン比を変更する、方法。
【請求項２】
前記対象におけるα２−抗プラスミン比の変更は、該対象におけるフィブリン溶解を増進させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗プラスミン切断酵素の阻害剤による対象の処置は、アテローム性動脈硬化症、動脈血栓症、静脈血栓症、脳卒中、または肺塞栓症を抑制または処置するのための処置である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記血漿Ｍｅｔ−α２−抗プラスミンの処置後のレベルは、前記血漿Ｍｅｔ−α２−抗プラスミンの処置前のレベルよりも少なくとも１０％高く、前記血漿Ａｓｎ−α２−抗プラスミンの処置後のレベルは、前記血漿Ａｓｎ−α２−抗プラスミンの処置前のレベルよりも少なくとも１０％低い、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記血漿Ｍｅｔ−α２−抗プラスミンの処置後のレベルは、前記血漿Ｍｅｔ−α２−抗プラスミンの処置前のレベルよりも少なくとも１５％高く、前記血漿Ａｓｎ−α２−抗プラスミンの処置後のレベルは、前記血漿Ａｓｎ−α２−抗プラスミンの処置前のレベルよりも少なくとも１５％低い、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記血漿Ｍｅｔ−α２−抗プラスミンの処置後のレベルは、前記血漿Ｍｅｔ−α２−抗プラスミンの処置前のレベルよりも少なくとも２０％高く、前記血漿Ａｓｎ−α２−抗プラスミンの処置後のレベルは、前記血漿Ａｓｎ−α２−抗プラスミンの処置前のレベルよりも少なくとも２０％低い、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記血漿Ｍｅｔ−α２−抗プラスミンの処置後のレベルは、前記血漿Ｍｅｔ−α２−抗プラスミンの処置前のレベルよりも少なくとも２５％高く、前記血漿Ａｓｎ−α２−抗プラスミンの処置後のレベルは、前記血漿Ａｓｎ−α２−抗プラスミンの処置前のレベルよりも少なくとも２５％低い、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
Ｘａａ１−Ｓｐ１−Ｇｌｙ−Ｃｙｃ−Ｘａａ２−Ｓｐ２−Ｘａａ３の式を有する化合物であって、
式中、
Ｘａａ１は、アルギニン、ヒスチジン、またはリジンであり、
Ｓｐ１は、８−、１１−、または１４−アミノ−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデカン酸、ＰＥＧｎまたはＰＰＧｎ（ｎ＝１〜６）、ガンマアミノ酪酸、イプシロンアミノカプロン酸、セリン、グリシン、アラニン、またはβ−アラニン、またはこれらの組み合わせのうち少なくとも１つを含むスペーサーであって、Ｓｐ１は長さ０．３ｎｍ〜２．１ｎｍを有し、
Ｇｌｙは、グリシンであり；
Ｃｙｃは、炭素環式または複素環式化合物であり、
Ｘａａ２は、グルタミン、アスパラギン、セリン、ヒスチジン、チロシン、アラニン、またはフェニルアラニンであり、
Ｓｐ２は、ＰＥＧｎまたはＰＰＧｎ（ｎ＝ｌ〜５）、８−、１１−、または１４−アミノ−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデカン酸、ガンマアミノ酪酸、イプシロンアミノカプロン酸、セリン、グリシン、アラニン、β−アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはこれらの組み合わせのうち少なくとも１つを含むスペーサーであるか、あるいは存在せず、
Ｘａａ３は、グルタミン酸、アスパラギン酸、トリプトファン、チロシン、またはフェニルアラニンである、化合物。
【請求項９】
Ｃｙｃは、４、５、６、または７員炭素の炭素環である、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｃｙｃは、４、５、６、または７員炭素の複素環である、請求項８に記載の化合物。
【請求項１１】
前記炭素の複素環は、窒素へテロ原子を含む、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｓｐ１はＰＥＧｎであり、ｎ＝２〜５である、請求項８に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｓｐ１は長さ０．６ｎｍ〜１７．５ｎｍを有する、請求項８に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｘａａ１からＮ末端方向に延びるｌ〜８ｍｅｒのオリゴペプチドを含む、請求項８に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｘａａ３からＣ末端方向に延びる２〜１０ｍｅｒのオリゴペプチドを含む、請求項８に記載の化合物。
【請求項１６】
薬学的に許容される担体内に配置される、請求項８に記載の化合物。
【請求項１７】
アミノ酸残基を介してポリエチレングリコール担体分子に連結される、請求項８に記載の化合物。
【請求項１８】
抗プラスミン切断酵素の阻害剤をスクリーニングする方法であって、該方法は、
α２−抗プラスミン切断酵素によって切断可能であり、Ｐ１−Ｐ１’結合を含み、該Ｐ１−Ｐ１’結合によって隔てられるフルオロフォアおよび消光基を含む蛍光共鳴エネルギー移動ペプチドを提供する工程であって、ここで、Ｐ１はプロリンを含み、Ｐ１’はａｓｎ、ｐｈｅ、ｇｌｎ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｈｉｓ、またはａｌａを含み、ｇｌｙを含むＰ２残基を有する、工程と、
ある量のα２−抗プラスミン切断酵素を提供する工程と、
該α２−抗プラスミン切断酵素をα２−抗プラスミン切断酵素阻害剤候補に曝露して試験混合物を形成する工程と、
該試験混合物を該蛍光共鳴エネルギー移動ペプチドと合わせる工程と、
該α２−抗プラスミン切断酵素阻害剤候補がα２−抗プラスミン切断酵素の活性をいつ阻害するかを特定するために、該試験混合物からの蛍光放出を測定する工程と、
を含む、方法。
【請求項１９】
前記蛍光共鳴エネルギー移動ペプチドは、前記プロリン−アスパラギン結合の上流に前記消光基を含み、前記Ｐ１−Ｐ１’結合の下流に前記フルオロフォアを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記蛍光共鳴エネルギー移動ペプチドは、前記Ｐ１−Ｐ１’結合の下流に前記消光基を含み、該Ｐ１−Ｐ１’結合の上流に前記フルオロフォアを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記蛍光共鳴エネルギー移動ペプチドは、配列番号９を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１８に記載のスクリーニング方法によって特定される、α２−抗プラスミン切断酵素の阻害剤。
【請求項２３】
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ８（配列番号９）
を含む、α２−抗プラスミン切断酵素のオリゴペプチド基質であって、
式中、
Ｘ１は、ａｒｇ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ｔｈｒ、ｓｅｒ、ｔｒｐ、ｇｌｙ、ａｌａ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ｐｈｅ、ｖａｌ、ｐｒｏ、およびｔｙｒから選択され、
Ｘ２は、ａｒｇ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ｔｈｒ、ｓｅｒ、ｔｒｐ、ｇｌｙ、ａｌａ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ｐｈｅ、ｖａｌ、ｐｒｏ、およびｔｙｒから選択され、
Ｘ３は、ａｒｇ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ｔｈｒ、ｓｅｒ、ｔｒｐ、ｇｌｙ、ａｌａ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ｐｈｅ、ｖａｌ、ｐｒｏ、およびｔｙｒから選択され、
Ｘ４は、ｔｈｒ、ｓｅｒ、ｔｒｐ、ｇｌｙ、ａｌａ、ｇｌｎ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ｐｈｅ、ｖａｌ、ｐｒｏ、ｔｙｒ、ａｓｎ、およびｈｉｓから選択され、
Ｘ５は、ｔｈｒ、ｓｅｒ、ｔｒｐ、ｇｌｙ、ａｌａ、ｇｌｎ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ｐｈｅ、ｖａｌ、ｐｒｏ、ｔｙｒ、ａｓｎ、およびｈｉｓから選択され、
Ｘ８は、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｈｉｓ、ｔｙｒ、ａｌａ、ｐｈｅ、ｇｌｎから選択され、
Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３のうちの少なくとも１つは、ａｒｇ、ｈｉｓ、およびｌｙｓから選択され、
Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３のうちの１つまたは２つは不在であってもよく、該オリゴペプチドは、最大２８個のアミノ酸から成る、
α２−抗プラスミン切断酵素のオリゴペプチド基質。
【請求項２４】
Ｘ１からＮ末端方向に延びる１〜８ｍｅｒのオリゴペプチドをさらに含む、請求項２３に記載のオリゴペプチド。
【請求項２５】
Ｘ８からＣ末端方向に延びる２〜１０ｍｅｒのオリゴペプチドをさらに含む、請求項２３に記載のオリゴペプチド。
【請求項２６】
前記Ｇｌｙ−Ｐｒｏ結合の対向する側に消光基およびフルオロフォアをさらに含む、請求項２３に記載のオリゴペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、これらに限定されないが、α２−抗プラスミン切断酵素の基質および阻害剤に関し、またかかる阻害剤を特定するためのスクリーニング方法に関し、またプラークおよびクロット形成とアテローム性動脈硬化症とを含む、フィブリンおよびα２−抗プラスミンに関わる状態を処置するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
α２−抗プラスミン（α２ＡＰ）は、初期に血管内血小板−フィブリン沈着物として現れるか、部分的または完全に閉塞性の血栓として現れるかに関わらず、血液クロットを消化する酵素であるプラスミンを急速かつ特異的に阻害する血漿タンパク質である。同様に、プラスミンおよびα２ＡＰの活性は、炎症、創傷治癒、および事実上全ての形態の癌とその転移において生じるフィブリンの発生および残存にとって重要である。
α２−プラスミン阻害剤としても知られるヒトα２−抗プラスミン（α２ＡＰ）は、プラスミンの主要な阻害剤である。プラスミンは、フィブリンのタンパク質分解および組織再構築において重大な役割を果たす。α２ＡＰによるプラスミン阻害と、血液凝固およびフィブリン溶解のホメオスタシスとの生理学的関連性は、以下の所見によって裏付けられる：（１）α２ＡＰを循環させることによる遊離プラスミン不活化の速度は、プラスミンによるフィブリン（フィブリノゲン）消化よりもずっと速いため、全身の溶解状態および結果として起こる出血の可能性を排除する；（２）α２ＡＰは、活性化された血液凝固因子ＸＩＩＩ（ＦＸＩＩＩａ）によって形成中のフィブリンに架橋され、取り込まれた量に正比例してプラスミンを介した溶解を阻害する；（３）ホモ接合型α２ＡＰ欠損症を有する患者は深刻な出血傾向を示すが、ヘテロ接合体は大外傷後または大手術後にのみ出血する傾向がある。ヒトα２ＡＰは、まず肝臓内で合成され、血漿中を循環する間に、Ｎ末端としてメチオニンを有する４６４残基のタンパク質である、分泌された前駆型のＭｅｔ−α２−抗プラスミン（Ｍｅｔ−α２ＡＰ）が、Ｐｒｏ１２とＡｓｎ１３との間（Ｐ１−Ｐ１’の切れやすい結合）でタンパク質分解切断を受けて、Ｎ−末端としてアスパラギンを有する４５２残基形態のＡｓｎ−α２−抗プラスミン（Ａｓｎ−α２ＡＰ）を産生する。Ｍｅｔ−α２ＡＰは循環α２ＡＰのおよそ３０％を占め、Ａｓｎ−α２ＡＰはおよそ７０％を占める。
【０００３】
Ｍｅｔ型のα２ＡＰが血漿中に認められ、その遺伝子の配列が決定されたとき、初めは６番目のアミノ酸をコードするヌクレオチドのうちの１つに不一致があると思われた。２つのグループは、シチジン（Ｃ）が６番目のアミノ酸としてＡｒｇになることを発見し、１つのグループは、チミジン（Ｔ）がその位置でＴｒｐになることを発見した。この差異は、１つのグループがＤＮＡ源として肝臓癌細胞を用い、他の２つのグループが正常細胞を用いたことに起因することが示された。現在はＡｒｇ６型およびＴｒｐ６型のＭｅｔ−α２ＡＰは、ともに正常ヒト血漿試料中に存在することが究明されている。出血傾向を有する家族における変異α２ＡＰの研究は、このα２ＡＰ遺伝子において、無効なα２ＡＰの原因となる変異体と、さらにこのＣ／Ｔ単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含む３つの多型とを特定した。この研究は、３０名の健常血液提供者を検査し、Ｃ／Ｔ  ＳＮＰの対立遺伝子頻度０．８１／０．１９を報告した。大規模な健常集団の研究では、ホモ接合体とヘテロ接合体との頻度、あるいは遺伝子型が血漿中のＭｅｔ−α２ＡＰとＡｓｎ−α２ＡＰとの比率に影響を及ぼしうるかどうかは検討されていない。Ａｒｇ６Ｔｒｐ  ＳＮＰは、恐らくサイレント多型であると思われるが、誘導体形態であるＡｓｎ−α２ＡＰ産生時のＭｅｔ−α２ＡＰの２つの多型形態の生化学検査、そのフィブリン中への取り込みおよびフィブリン溶解への影響は、本研究以前には評価されたことがない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の要旨
本発明は、フィブリンおよびα２−抗プラスミンに関連する種々の治療において用いるための抗プラスミン切断酵素の阻害剤を対象とし、また、例えばかかる阻害剤を特定するためのスクリーニング方法において用いることができる、ＡＰＣＥの基質を対象とする。本発明は、血漿α２−抗プラスミンの形態の比率を変更し、ＡＰＣＥを阻害することによって、アテローム性動脈硬化症および血栓障害を処置または抑制する方法もさらに対象とするが、これらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】全α２ＡＰ中の割合としての、遺伝子型によるＭｅｔ−α２ＡＰ。ＲＲ（ｎ＝１５）、ＲＷ（ｎ＝１５）、およびＷＷ（ｎ＝５）遺伝子型を有する人物のそれぞれの血漿からα２ＡＰを精製し、エドマン分解によってアミノ末端配列を決定した。第１サイクルにおけるＭｅｔおよびＡｓｎのピコモル回収率から、Ｍｅｔ−α２ＡＰの割合を計算した。
【図２】健常集団における、遺伝子型によって区分した血漿ＡＰＣＥ値。血漿試料中のＡＰＣＥ値は、ＥＬＩＳＡによって決定した。パネルＡは、健常集団（ｎ＝１０９）における、ＡＰＣＥ濃度のヒストグラムである。パネルＢは、Ｍｅｔ−α２ＡＰ遺伝子型によるＡＰＣＥ値。
【図３】Ｍｅｔ−α２ＡＰの多型形態のＡＰＣＥ切断。同量（４０μｇ）の精製されたＭｅｔ−α２ＡＰ（Ａｒｇ６）とＭｅｔ−α２ＡＰ（Ｔｒｐ６）をＡＰＣＥで消化した。選択した時間に反応を停止させた後、試料にエレクトロスプレー質量分析を実施し、それぞれのＭｅｔ−α２ＡＰ形態から産生されたアミノ末端１２アミノ酸ペプチドの量を評価した。
【図４】Ｍｅｔ−α２ＡＰ遺伝子型の血漿中Ａｓｎ−α２ＡＰ生成に対する経時的影響。ＲＲ、ＲＷ、またはＷＷ遺伝子型の人物からの血漿試料を２９℃でインキュベートし、選択した時間に各試料からα２ＡＰを精製し、アミノ末端配列分析を行なった。Ａｓｎ−α２ＡＰ／Ｍｅｔ−α２ＡＰの比率は、第１サイクルにおけるＭｅｔおよびＡｓｎのピコモル回収率から計算した。
【図５】Ｍｅｔ−α２ＡＰ遺伝子型による血漿クロット溶解時間（ＰＣＬＴ）。ＲＲ、ＲＷ、およびＷＷの人物からの血漿試料において、ＰＣＬＴを決定した。パネルＡでは、ＰＣＬＴ値を遺伝子型によって分け、全集団、男性のみ、女性のみの平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．としてプロットした。パネルＢは、各遺伝子型内における、全集団（ｎ＝２００）での割合と比較した、溶解しなかった血漿（ｎ＝１４）の割合である。
【図６】ＡＰＣＥ除去のＭｅｔ−α２−ＡＰからＡｓｎ−α２−ＡＰへの変換に対する経時的影響。血漿をＭｅｔ−α２ＡＰ遺伝子型がＲＲの人物から採取し、３アリコートに分割した。１アリコートをクロマトグラフィビーズに結合したＡＰＣＥ  Ｆ１９  ｍＡｂ（Ｆ１９）と混合し、４℃でインキュベートしてＡＰＣＥを除去した。第２のアリコートをビーズに結合した非特異的ウサギ抗ヤギＡｂ（ＲＡＧ）と共に４℃でインキュベートした。第３のアリコート（ＲＲ）には、処理を行なわなかった。ビーズの除去後、各試料を２９℃でインキュベートし、選択した時間にＡｓｎ−α２−ＡＰ／Ｍｅｔ−α２−ＡＰ比を決定した。さらに、Ｆ１９結合ビーズとＲＡＧ結合ビーズをＳＤＳと共に煮沸して、抗体結合タンパク質を除去した。試料を１０％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動させ、ニトロセルロースにブロットした。そのアミノ末端領域に対するヤギＡｂを用いたウエスタンブロット法によって、ＡＰＣＥ（９７ｋＤａ）を特定し、化学発光基質で可視化した。
【図７】図７は、ＡＰＣＥによるＭｅｔ−α２ＡＰのＡｓｎ−α２ＡＰへの変換に対する、Ｖａｌ−ｂｏｒｏＰｒｏの阻害作用を示す。
【図８】図８は、非限定的な例である、ＦＲＥＴペプチドの配列を示す（配列番号５）。
【図９】図９は、Ｐ２−Ｐ１−Ｐ１’基のＰ１’位に行なうことができる種々の置換と、Ｐ２残基上流（Ｎ末端方向）の残基およびＰ１’残基下流（Ｃ末端方向）の残基に行なうことができる種々の置換とを示す（配列番号６）。
【図１０】Ｐ７位（Ｐ１ｐｒｏ上流の６番目のアミノ酸）における基質選択性を決定するための、抗プラスミンペプチド（配列番号７）のＬＣ／ＭＳ分析。正電荷を持つＨｉｓ（Ｈ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、およびＡｒｇ（Ｒ）を有するものは、Ｐｒｏ１２−Ｎ１３結合の切断速度を向上させた。
【図１１】Ｐｒｏ−Ａｓｎの切れやすい結合に対するＡｒｇの位置の重要性。抗プラスミンアミノ末端配列（４〜１７）に基づく４つの類似ペプチドをＡＰＣＥによって消化し、その後ＬＣ／ＭＳ分析を行なった。各反応溶液は１つの実験用ペプチドおよび対照ペプチドを含有し、いずれの所定のペプチドもＰ８、Ｐ７、Ｐ６、Ｐ５、またはＰ４（図示せず）位にＡｒｇを、他の３つの可変位置にグリシンを有した。Ｐ４における置換は、Ｐ８とほぼ同様の結果を導いた。
【図１２】Ｐ４、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１位における基質選択性を決定するための、抗プラスミンペプチドのＬＣ／ＭＳ分析。ヒト抗プラスミン配列の６〜１７位を示すペプチドライブラリーをＡＰＣＥ（可溶性ＦＡＰとしても知られる）で処理した。赤色のフェニルアラニンを添加して、逆相ＨＰＬＣカラムとの結合を向上させた。タンパク質に共通するアミノ酸である、より少量のシステインを１つずつ、Ｐ１〜Ｐ４位のそれぞれで（配列番号８）置換した。Ｐｒｏ−Ａｓｎ結合切断の相対速度は、ＬＣ／ＭＳ分析によって決定した。
【図１３】図１３は、本発明のＦＲＥＴペプチドまたは阻害剤の部分を含む、アミノ酸配列（配列番号９）の代替実施形態を示す。この配列は、例えば、Ｎ１３からＮ末端方向に、あるいはＮ１３からＣ末端方向に延びる図９に示される配列によって、Ｃ末端方向に延ばすことができる。
【図１４】図１４は、プロリンがピペコリン酸で置換された、種々の阻害性ペプチド模倣薬（配列番号１１〜１３）の阻害剤濃度２０μＭでのＡＰＣＥ阻害作用を示している。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
発明の詳細な説明
ヒトＭｅｔ−α２ＡＰは、Ｐｒｏ１２−Ａｓｎ１３間のタンパク質分解切断が、より活性な誘導体であるＡｓｎ−α２ＡＰを産生し、これがＦＸＩＩＩａによってＭｅｔ−α２ＡＰよりも著しく速くフィブリンに架橋し、結果としてプラスミンによる消化に対するフィブリンの耐性を向上させることから、生理学的に重要なＡＰＣＥの基質である。ヒトＡＰＣＥは、より迅速な架橋形態（すなわち、Ａｓｎ−α２ＡＰ）の可用性を増加させることによってフィブリン溶解の阻害を増強させるため、本明細書に記載されるように発見されたＡＰＣＥの強力かつ選択的な阻害剤は、ｉｎ  ｖｉｖｏ値を下げるためのＡｓｎ−α２ＡＰ産生の滴定を可能にし、それによって内因性および外因性のフィブリン溶解（フィブリン除去）を増進させる。α２ＡＰ欠損に関してヘテロ接合の人物の出血のリスクはごくわずかであるとの所見に基づくと、出血性合併症に本明細書に記載の処置を用いる可能性は低い。従って、健康な人物においてα２ＡＰ機能を低下させるための安全な適量が存在する。特に、フィブリン形成の可能性が高い臨床場面では、ＡＰＣＥ阻害剤は、血栓の発生または炎症の進行に伴い、フィブリンへの架橋に使用できるＡｓｎ−α２ＡＰの量の減少をもたらすであろう。生成された内因性レベルのプラスミン、または少量のプラスミノゲン活性化因子の投与により産生されたプラスミンは、血管開存性および臓器機能が維持され、出血リスクが最小限に抑えられるように、フィブリン除去をもたらすのに十分であると考えられる。上記のように、ＡＰＣＥは、Ｍｅｔα２ＡＰを切断して誘導体Ａｓｎα２ＡＰにするが、これはよりフィブリン中に効率的に取り込まれ、その結果プラスミン消化に対し顕著な耐性を示させる。従って、ＡＰＣＥは、Ａｓｎ−α２ＡＰのより少ない生成、つまりはより少ない取り込みが、アテローム発生、血栓症、および炎症の状態中に、プラスミンによるより迅速なフィブリン除去につながることから、薬理学的調節とフィブリン溶解系阻害の新しい標的となる。
【０００７】
本発明は、フィブリンおよびα２−抗プラスミン、およびＡＰＣＥの基質に関連する種々の治療において用いるための抗プラスミン切断酵素の阻害剤を対象とし、これは例えばかかる阻害剤を特定するためのスクリーニング方法において用いることができる。本発明は、血漿α２−抗プラスミンの形態の比率を変更することによって、アテローム性動脈硬化症および血栓障害を処置または抑制する方法もさらに対象とするが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、ＡＰＣＥの阻害は、本明細書においては、例えば阻害剤の濃度２０μＭで、ＡＰＣＥ活性の少なくとも５０％の阻害として定義される。
【０００８】
Ａｓｎ−α２ＡＰは、Ｍｅｔ−α２ＡＰよりも約１３倍速い速度でフィブリンに架橋する。より速い架橋速度によって、より多数の抗プラスミン分子が新しく形成されたフィブリンに結合し、結果としてフィブリン溶解に対する耐性が向上する。血漿ＡＰＣＥの阻害は、従って架橋される抗プラスミン分子の数を減少させることができ、それによってフィブリン溶解中により容易に除去されるクロットをもたらす。従って、ＡＰＣＥに対して特異的な阻害剤を用いて、フィブリン溶解を調整することができる。上記のように、ヒトＭｅｔ−α２ＡＰは、成熟配列の６位に２つの多型形態で存在し、アルギニンが優勢であり、トリプトファンはより少ない割合を占める。本明細書において、ＡＰＣＥの阻害が、血漿中のα２ＡＰ比をおよそ３０％  Ｍｅｔ−α２ＡＰ：７０％  Ａｓｎ−α２Ｐから、およそ６０％〜７０％  Ｍｅｔ−α２ＡＰ：４０％〜３０％  Ａｓｎ−α２ＡＰに変更することができることが明らかにされている。
【０００９】
α２−抗プラスミン比の調節
本研究では、我々は、さらに大きい健常集団において多型患者数を決定し、その後、それがα２ＡＰの阻害機能に関連するか否かを評価した。本明細書において、以下に関する結果が示されている：（１）Ｍｅｔ−α２ＡｐにおけるＡｒｇ６Ｔｒｐ  ＳＮＰの遺伝子型頻度；（２）それぞれの形態がＡＰＣＥによる切断に対する感受性にどのように影響するか；（３）２つの多型それぞれについての血漿中のＭｅｔ−α２ＡＰの割合；（４）遺伝子型に関連した血漿クロット溶解時間；（５）循環ＡＰＣＥの除去が、Ｍｅｔ−α２ＡＰのＡｓｎ−α２ＡＰへの変換を防止することの証拠。
【００１０】
材料と方法
材料
タンパク質精製のための新鮮な凍結ヒト血漿をＳｙｌｖａｎ  Ｇｏｌｄｍａｎ  Ｂｌｏｏｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（米国オクラホマ州オクラホマシティ）から購入した。Ｆ１９抗体を分泌するハイブリドーマ細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（米国バージニア州マナッサス）から購入し、無血清培地で成長させ、ＭＥＰ−Ｈｙｐｅｒｃｅｌクロマトグラフィ（Ｐａｌｌ、米国ニューヨーク州イーストヒルズ）を用いて、培養液からＦ１９抗体を精製した。これらの試験に対し、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｏｋｌａｈｏｍａ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｅｎｔｅｒから治験審査委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｂｏａｒｄ、ＩＲＢ）の承認を得た（ＩＲＢ＃１０１４２および１２１８９）。
【００１１】
α２ＡＰの単離
親和性マトリクスとしてのＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂに付着したプラスミノゲンクリングル１〜３を用いる、公開されている精製工程の修正形態によって、Ｍｅｔ−α２ＡＰとＡｓｎ−α２ＡＰの混合物を単離した。Ｍｅｔ−α２ＡＰとＡｓｎ−α２ＡＰとは、前述のように、免疫親和性クロマトグラフィによって分離した。血漿試料中のＭｅｔ−α２ＡＰのＡｓｎ−α２ＡＰに対する比率は、エドマン分解による自動タンパク質配列決定（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｒｏｃｉｓｅ  ４９２型、米国カリフォルニア州フォスターシティ）における１サイクル目のＭｅｔ対Ａｓｎのピコモル回収率の比較によって決定した。
【００１２】
ＡＰＣＥの単離
ＡＰＣＥは、以前に記載されているように（米国特許出願第１０／７７４，２４２号）、ヒト血漿から精製した。簡潔に述べると、精製に、硫安沈殿、疎水性相互作用、および免疫親和性クロマトグラフィの組み合わせを用いた。−８０℃で保管する前に、純ＡＰＣＥにグリセロールを添加して、最終濃度２０％とした。
【００１３】
α２ＡＰ遺伝子型の決定
健常集団における遺伝子型頻度および血漿クロット溶解時間（ＰＣＬＴ；次項を参照）を決定するために、健康であり急性の疾患を有さないと自己申告する、任意に応じた健常志願者２００名を血液提供に採用した。ＡｑｕａＰｕｒｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）を用いて、各提供者の全血からＤＮＡを単離した。オリゴヌクレオチドプライマー（５’−ＧＡＣＣＴＣＣＴＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣＣＴＴＴ（配列番号１）および５’−ＣＴＧＧＴＴＣＧＧＣＣＣＧＣＴＡＧＴＴＡＧ（配列番号２））、ｄＮＴＰ（Ｔａｋａｒａ  Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ、米国ウィスコンシン州マディソン）、およびＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州カールズバッド）を用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、ＤＮＡのＡｒｇ６Ｔｒｐ  ＳＮＰを含む部分を増幅した。増幅後、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｏｐｅｒｏｎ、米国カリフォルニア州アラメダ）を用いてＰＣＲ産物を精製し、ＡＢＩ３７３０自動ＤＮＡ配列決定装置を用いて配列決定した。
【００１４】
血漿クロット溶解時間の測定
血漿クロット溶解時間（ＰＣＬＴ）を測定するために、１ユニット／ｍｌトロンビン、１６ｍＭ  ＣａＣｌ２、および４５ＩＵ／ｍｌウロキナーゼ（ｕＰＡ）（Ａｂｂｏｔｔ、米国イリノイ州シカゴ）の混合物を各志願者の血漿に添加して、本質的に瞬時のフィブリンクロット形成を触媒し、フィブリン溶解を開始した。血漿クロット溶解速度は、マイクロタイタープレート比濁法によって決定した。
【００１５】
切断速度の決定
同量（４０ｕｇ）の純Ｍｅｔ−α２ＡＰ（Ａｒｇ６）と純Ｍｅｔ−α２ＡＰ（Ｔｒｐ６）を含有する反応混合物をＡＰＣＥによって消化した。選択された時間に、トリフルオロ酢酸でｐＨを７．５から４．０に低下させることによって、消化を停止させた。３０ｋＤａのカットオフ膜を用いたＭｉｃｒｏｃｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国マサチューセッツ州ベッドフォード）遠心限外濾過法によって、混合物からタンパク質を除去した。ガラス製精製キャピラリ（Ｐｒｏｘｅｏｎ、デンマーク、オーデンセ）内に装填されたＰＯＲＯＳ−５０逆相媒体（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州フォスターシティ）に結合することによって、限外濾過された消化混合物からペプチドを単離した。次にペプチドをＰＯＲＯＳ−５０から、２．０μｌの０．５％酢酸を含むメタノール／水１：１を含む金属コートガラス製ナノスプレーキャピラリ内に直接溶出した。Ａｎａｌｙｓｔ  ＱＳソフトウェアバージョン１．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州フォスターシティ）の下、イオンスプレー電圧１４００ボルトで操作されるＱＳＴＡＲ  ＥＳＩ−Ｑｕａｄ−ＴＯＦ質量分析計のナノスプレーイオン化源に、ナノスプレーキャピラリを搭載した。質量範囲３００〜１５００Ｄａにわたってデータを収集した。産生された２つのα２ＡＰのアミノ末端１２アミノ酸ペプチドである、ＭＥＰＬＧＲＱＬＴＳＧＰ（配列番号３）、Ｍｅｔ−α２ＡＰ（Ａｒｇ６）のＭｒ＝１２８４．６５と、ＭＥＰＬＧＷＱＬＴＳＧＰ（配列番号４）、Ｍｅｔ−α２ＡＰ（Ｔｒｐ６）のＭｒ＝１３１４．６３との相対量は、観察された各ペプチドの電荷形態の４つの最も豊富な同位体ピークの面積を合計することによって決定した。各時点のデータは、添加されたプロリンを含有しない不活性内部標準ペプチドの同様の定量化によって正規化した。
【００１６】
ＡＰＣＥ抗原値の決定
酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を展開し、ヒト血漿中の抗原値を決定した。カルボキシル末端を介して７つのリジンのコアペプチドに連結したアミノ末端ペプチドの８つの複製を含有するように我々の研究所で構築した多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）を免疫原として使用し、ＡＰＣＥのアミノ末端１５アミノ酸配列に対するヤギ抗体を調製した。このヤギＭＡＰ（アミノ末端１５残基ＡＰＣＥペプチド）抗体を白色の高結合性ポリスチレンアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国ニューヨーク州コーニング）に結合させ、捕捉抗体として使用した。血漿の希釈物とのインキュベーション後、市販のＦ１９ハイブリドーマ（ＡＴＣＣ、米国バージニア州マナッサス）から精製したモノクローナル抗体を塗布し、その後ペルオキシダーゼ接合抗マウス抗体（Ｓｉｇｍａ、米国ミズーリ州セントルイス）を塗布した。化学発光基質であるＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ（Ｐｉｅｒｃｅ、米国イリノイ州ロックフォード）を添加し、ＢＩＯ−ＴＥＫ  ＦＬ６００プレートリーダー（米国バーモント州ウィヌースキ）を用いて発光をモニターした。標準物質として精製したヒトＡＰＣＥを用いて、抗原値を定量化した。
【００１７】
血漿からのＡＰＣＥ除去
Ｆ１９  ｍＡｂをＰＯＲＯＳ  ＥＰ  ２０ポリ（スチレンジビニルベンゼン）灌流クロマトグラフィビーズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州フォスターシティ）に連結させ、非特異的抗体であるウサギ抗ヤギを同種の媒体に連結させた。ＲＲ遺伝子型の単一の提供者からの血漿を３アリコートに分割してＰＢＳで１：１に希釈し、非特異的ＡｂまたはＦ１９  ｍＡｂの２つのビーズ連結抗体それぞれとともに、別々に４℃で一晩インキュベートした。第３のアリコートには、処理を行なわなかった。濾過によって血漿からビーズを除去し、次に血漿を２９℃でインキュベートした。ゼロ時間、２４時間、および４８時間で、アリコートを除去した。各アリコートからα２ＡＰを精製し、前述のようにＡｓｎ−α２ＡＰ／Ｍｅｔ−α２ＡＰ比を決定した。血漿からの除去後、Ｆ１９  ｍＡｂビーズを２５ｍＭ  Ｎａ  ＰＯ４／０．５Ｍ  ＮａＣｌで洗浄し、次にＳＤＳ泳動用緩衝液と共に煮沸した。次にＳＤＳ緩衝液抽出物を１０％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州カールズバッド）上で電気泳動によって分離し、ニトロセルロースにブロットした。この方法の項で既に説明したように、ヤギアミノ末端ＭＡＰ抗体を用いたウエスタンブロット法によって、ＡＰＣＥを特定し、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、米国イリノイ州ロックフォード）を用いて可視化した。
【００１８】
結果
α２ＡＰ遺伝子型決定
約２年を隔てそれぞれおよそ１００人の２組に採用された２０１名の健常志願者群が、α２ＡＰのＣ／Ｔ  ＳＮＰ頻度を決定するための血液試料を提供した。集団全体は、２１〜６９歳の男性６１人と女性１３９人から成り、民族性は米国国勢調査ウェブサイト（ｆａｃｔｆｉｎｄｅｒ．ｃｅｎｓｕｓ．ｇｏｖ）上に２０００年に関して記載されたオクラホマ州人口の人口統計と厳密に適合する。２００名の対象について、遺伝子型を決定した。１つのＤＮＡ試料のみが、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅されなかったが、これはプライマーのうちの１つの結合を妨げた変異体によると思われるが、これについてはさらに調査を行なわなかった。２つの健常集団の遺伝子型頻度は本質的に同様で、いずれの遺伝子型についても１％未満の差異であった。２組を混合した後、集団全体の頻度は、ＲＲ６２．５％、ＲＷ３４．０％、ＷＷ３．５％であった。Ｒ対立遺伝子の頻度は７９．５％であり、Ｗ対立遺伝子の頻度は２０．５％であった。男性と女性では、遺伝子型頻度に差異はなかった。集団の７２％はコーカサス人種であり、残りの２８％が６つの民族カテゴリーに分かれるため、民族群間で遺伝子型が異なるかどうかを決定することは不可能であった。
【００１９】
血漿中Ｍｅｔ−α２ＡＰおよびＡｓｎ−α２ＡＰ値
ＲＲ遺伝子型の１５人、ＲＷ遺伝子型の１５人、およびＷＷ遺伝子型の５人の血漿からα２ＡＰを精製した。α２ＡＰはエドマン分解によって配列決定し、Ｍｅｔ−α２ＡＰとＡｓｎ−α２ＡＰとの割合を計算するために、ＭｅｔとＡｓｎとのピコモル回収率を第１サイクルについて決定した。図１は、Ｍｅｔ−α２ＡＰの最も高い割合を有するＷＷ（５６．４％）、最も低いＲＲ（２３．６％）、およびその中間のＲＷ（４０．６％）と、遺伝子型によって分けられる有意に異なる（ｐ＜０．００１）結果を示している。
【００２０】
ヒト血漿中Ｍｅｔ−α２ＡＰの割合の変動の機序を理解するために、我々は、Ｍｅｔ−α２ＡＰをＡｓｎ−α２ＡＰに変換する酵素、すなわちＡＰＣＥの値の変動が、遺伝子型間の差異を説明しうるかどうかを検討した。この可能性を研究するために、我々はＥＬＩＳＡ法を展開して血漿中のＡＰＣＥ抗原値を定量化し、次に本研究の健常集団の対象１０９名からの血漿中のＡＰＣＥ濃度を決定した。図２ａに示されるように、正常ヒト血漿中のＡＰＣＥ値の分布は、３８〜１５９ｎｇ／ｍｌの範囲であり、これは年齢または性別とは相関していない。また、ＡＰＣＥ値の遺伝子型との関連の可能性が示唆されているが（ＲＲ：７０．４±２６；ＲＷ：６６．６±２４．５；ＷＷ：６４．７±１０．１）、この差異は統計学的に有意でない（図２ｂ）。従って、ＡＰＣＥ値は、遺伝子型間のＭｅｔ−α２ＡＰ値の変動を説明するとは思われない。
【００２１】
検討した３つの遺伝子型において異なるＭｅｔ−α２ＡＰの割合の別の説明は、Ｍｅｔ−α２ＡＰ（Ａｒｇ６）がＭｅｔ−α２ＡＰ（Ｔｒｐ６）よりも良好なＡＰＣＥの基質であるということであった。この仮説をテストするために、ＲＲおよびＷＷ血漿からα２ＡＰを精製し、１２残基アミノ末端ペプチドの生成を経時的にモニターするための質量分析法を用い、Ｍｅｔ−α２ＡＰ（Ａｒｇ６）およびＭｅｔ−α２ＡＰ（Ｔｒｐ６）の各多型形態の切断速度を決定した。図３に示されるように、反応速度の比較は、初期の時点の線形回帰分析に基づき、ＡＰＣＥがＭｅｔ−α２ＡＰ（Ａｒｇ６）をＭｅｔ−α２ＡＰ（Ｔｒｐ６）よりもおよそ８倍速く切断することを示した。
【００２２】
６位におけるＲまたはＷの存在に基づき、全血漿中のＭｅｔ−α２ＡＰの切断速度が類似の結果を示すかどうかを検討するために、遺伝子型がＲＲ、ＲＷ、およびＷＷであると決定された個人から新鮮な血漿試料を取得し、２９℃でインキュベートし、それぞれのＡｓｎ−α２ＡＰ／Ｍｅｔ−α２ＡＰ比を０、２４、および４８時間後に分析した。α２ＡＰを各試料から精製し、エドマン分解の第１サイクルにおけるアミノ末端残基のピコモル回収率によって、２つの多型形態の比率を決定した。図４に示されるように、Ａｓｎ−α２ＡＰは、ＲＲ遺伝子型の健常志願者からの血漿中で、ＲＷまたはＷＷ遺伝子型患者のいずれよりもかなり速い速度で増加した。これらの結果は、ＡＰＣＥがＭｅｔ−α２ＡＰ（Ａｒｇ６）をＭｅｔ−α２ＡＰ（Ｔｒｐ６）のおよそ８倍の速さで切断することを示す、純α２ＡＰとＡＰＣＥとの反応混合物による結果と明白に一致する。
【００２３】
血漿クロット溶解
血漿クロット溶解時間（ＰＣＬＴ）は、健常集団を含む２００名の女性と男性からの血液試料において決定した。我々は、活性化因子放出、活性化因子−阻害剤相互作用、フィブリノゲン値によって、あるいは酵素−基質機序への脂質の影響によって発生することが知られているクロット溶解の変動の制御は意図しなかった。従って、性別、年齢、アドレナリン作用状態、喫煙、肥満、アルコール摂取、血清脂質およびフィブリノゲン測定値、投薬、日中の活動などは、本試験における志願参加の資格として無視された。代わりに、試験参加者の溶解時間は、あらゆる時点でそれぞれの遺伝子型内の全ての生理学的／薬理学的影響の「平均」を事実上反映するはずであると考え、また実際に多型が我々の条件下で血漿クロット溶解に検出可能なように影響する場合、その潜在的重要性が強調されるであろうと考え、健康であると自己申告する限り「希望者全員」を登録した。重視すべきは、男性の平均ＰＣＬＴは、女性の値と比較して、有意に長かったことである（ｐ＝０．０００２）。図５に示されるように、ＲＲ、ＲＷ、およびＷＷ遺伝子型群の平均ＰＣＬＴは顕著な線形減少を示しているが、３つの遺伝子型間の平均ＰＣＬＴの差異は統計学的に有意でなかった。図５のパネルＡに示されるように、性別によって遺伝子型を分けた後、遺伝子型間の平均ＰＣＬＴの差異は、男性と女性の双方において、ＷＷ遺伝子型がより短い溶解時間となる明らかな傾向が示された。ＰＣＬＴの分布が非対称であることから、ノンパラメトリック統計法を使用して、データを分析した。ＲＲおよびＲＷの中央値は類似し、分布は重複しており、Ｒ対立遺伝子が優性であることが示された。性別による変動を明らかにした後、ＲＲおよびＲＷ群を結合してＷＷと比較したとき、差異がほぼ有意に達した（ｐ＝０．０６１）。図５のパネルＢに示されるように、ＲＲ遺伝子型のうちの１２名（１０％）とＲＷ遺伝子型のうちの２名（３％）は、全１時間のアッセイ時間にわたって完全に無傷のままの血漿クロットを有し、溶解時間＞２１００秒を有するＷＷ遺伝子型の人物はいなかった。
【００２４】
血漿からのＡＰＣＥ除去
ＡＰＣＥがＭｅｔ−α２ＡＰのＡｓｎ−α２ＡＰへの変換に関与する酵素であるということを明確に証明するための試みにおいて、我々は、ＰＯＲＯＳクロマトグラフィビーズに共有結合したＦＡＰ特異的モノクローナル抗体であるＦ１９と共に血漿をインキュベートすることによって、血漿からＡＰＣＥを除去した。ビーズの除去後、２９℃での血漿のインキュベーションを選択した時間継続し、Ｍｅｔ−α２ＡＰをＡｓｎ−α２ＡＰに変換させた。図６のグラフは、ＰＯＲＯＳ結合抗体と共にインキュベートしていない対照血漿におけるＡｓｎ−α２ＡＰ／Ｍｅｔ−α２ＡＰ比を示しているが、これは２．６２から４８時間後のインキュベーション後に６．１２まで上昇した。第２の対照、すなわちＰＯＲＯＳクロマトグラフィビーズに結合した非特異的抗体と共にインキュベートした血漿においては、Ａｓｎ−α２ＡＰ／Ｍｅｔ−α２ＡＰ比の２．５４から５．２への有意な上昇が、４８時間後に発生した。しかし、Ｆ１９抗体と共にインキュベートした血漿は、同じインキュベーション期間にわたって、２．４から２．１７と、比率の上昇を示さず、これによってＦ１９抗体によるＡＰＣＥの除去を示した。これらの結果は、血漿からのＡＰＣＥの除去は、Ｍｅｔ−α２ＡＰが、より短く迅速なフィブリン架橋形態であるＡｓｎ−α２ＡＰに変換することを妨げるということを明確に実証している。この結論のさらなる裏付けとして、我々はまた、ウエスタンブロット分析によって、ビーズ連結Ｆ１９  ｍＡｂに結合、除去されたのが実際にＡＰＣＥであることを証明した。図６に示されるウエスタンブロット分析は、Ｆ１９連結ビーズから溶出された、試料中のＡＰＣＥモノマーの９７ｋＤａのバンドを示しているが、このようなバンドはウサギ抗ヤギ（ＲＡＧ）Ａｂ連結ビーズ上には存在しなかった。他の目に見えるバンドは、ＳＤＳ中での煮沸による抽出中にビーズから浸出する、試料中の免疫グロブリンへの二次Ａｂの非特異的結合の結果であった。
【００２５】
本研究では、別々の期間に分析した健常志願者の２集団は、収集された遺伝子型の頻度がＲＲ６２．５％、ＲＷ３４．０％、およびＷＷ３．５％であり、本質的に同一であった。対立遺伝子頻度の値０．７９５／０．２０５は、我々が認識している唯一の他の研究と一致するが、これはＬｉｎｄおよびＴｈｏｒｓｅｎの研究であり、健常血液提供者３０名において、単一ヌクレオチド変異の値０．８１／０．１９を報告している。この多型がより長い前駆形態のα２ＡＰから除去される１２残基アミノ末端ペプチドで発生することから、また正電荷を持つ親水性アルギニン（Ｒ）が疎水性アミノ酸であるトリプトファン（Ｗ）で置換されることを考えると、我々は、かかる差異がＡＰＣＥによるペプチドの切断速度と、その後の形成中のフィブリン中への取り込みとに影響しうるか否かに疑問を呈した。我々は、純ＡＰＣＥが、ＲＲの個人の血漿からの純Ｍｅｔ−α２ＡＰと比較したとき、約８倍の遅さでＷＷ遺伝子型の純Ｍｅｔ−α２ＡＰを切断することを発見した。図４は、Ｍｅｔ−α２ＡＰの２つの多型形態のそれぞれを含有する血漿試料中の天然前駆体Ｍｅｔ−α２ＡＰ／誘導体Ａｓｎ−α２ＡＰ比が、新しく採取した血漿を２９℃でインキュベートしたときに自発的に経時変化することを明確に示している。この切断は、図６に示されるように、特異的モノクローナル抗体でのＡＰＣＥの除去が、同じインキュベーション期間中に誘導体Ａｓｎ−α２ＡＰの生成を完全に中断したことから、天然のＡＰＣＥ血漿値に起因するに違いない。この切断が循環血液内で自発的に発生することから、前駆体Ｍｅｔ−α２ＡＰ／誘導体Ａｓｎ−α２ＡＰの比率は、３つの遺伝子型からの循環血漿内で異なるはずであり、これは実際我々が、分析された３５人それぞれの前駆体／誘導体α２ＡＰ形態の定量的なアミノ末端分析によって実証した。予測されるように、ＲＲ遺伝子型の人物は、最少量の循環Ｍｅｔ−α２ＡＰ（２３．６％）を有し、ＲＷは中間であり（４０．６％）、ＷＷは最高であった（５６．４％）。本研究結果は、図２ｂに示されるように、３つの遺伝子型間で抗原値が有意に異ならないことから、ＡＰＣＥ値の変異によって説明することができない。
【００２６】
ＲＲ、ＲＷ、およびＷＷ遺伝子型の間の関係、および対応するＭｅｔ−α２ＡＰ／Ａｓｎ−α２ＡＰ比は、後者が個人のフィブリン溶解活性に影響を与え、それにより生涯にわたり血管内に生成されたフィブリンの内因性フィブリン溶解に対する脆弱性と、つまりはその残存が、Ｍｅｔ−α２ＡＰ遺伝子型によって差別的に影響される可能性を高めた。結果として、ＷＷ遺伝子型の人物はＡＰＣＥによる切断によってＡｓｎ−α２ＡＰに変換されにくいＭｅｔ−α２ＡＰを有するであろうため、形成中のフィブリンに取り込まれる効率が低く、それによって生成されるあらゆるフィブリンをプラスミンによって消化されやすくする。これを実証するために、可能な限り自然条件に近似するように、全血漿を用いて実験を行なった。前項に記したように、実際にＷＷ遺伝子型群のフィブリン溶解時間が短いのであれば、多くの場合この状況である確立が高いはずであるという前提で、全試料を健康な志願者から採取する際の条件を標準化するために最小限の努力のみ行なった。フィブリン溶解時間に急性的にあるいは慢性的に影響を与えることで知られる摂動因子のほとんどは、一生にわたって作用するが、そのような影響にかかわらず、我々は、平均的には、フィブリン溶解の状態がＭｅｔ−α２ＡＰ遺伝子型によって分かれるであろうと仮定した。注目すべきは、我々の全ての分析において、ＲＲ遺伝子型の人物は最長の平均ＰＣＬＴを有し、ＲＷ群は中間であり、ＷＷ遺伝子型では最短であったことであり、これはＷＷの人物が、慢性的にＲＷ群よりも活性の高いフィブリン溶解系を有し、ＲＲ遺伝子型を有する人物よりも確実に高い活性を有することを示す。ＲＲ遺伝子型は、フィブリンが溶解されない人物を予想よりも高い割合で含み、これらに本試験の任意の人物の最大測定値を１秒上回るＰＣＬＴ値が与えられた場合、男性に関して、平均溶解時間のＲＲおよびＲＷとの関連が、ｐ＜０．０５レベルで有意となった。本研究の結果は、生涯にわたり、成長中の血管内血栓のプラスミンによる除去に対する感受性を高め、それによりアテローム性動脈硬化症のリスクを低下させることによって、Ｗ対立遺伝子が「防御因子」（周知の用語である「危険因子」と対比して）としての機能を果たしうることを示した。
【００２７】
さらに、これらの結果は、Ｍｅｔ−α２ＡＰ／Ａｓｎ−α２ＡＰ比を増加させてフィブリン溶解を加速するものに近付けることの有用性を実証する。α２ＡＰ作用のヘテロ接合体欠損、および持続される慢性レベルの内因性溶解活性に例示されるように、本質的には唯一のプラスミンのｉｎ  ｖｉｖｏ阻害剤であるα２ＡＰの作用を大出血のリスクがほとんどないレベルまで低下させることにより、アテローム性動脈硬化過程における血管内フィブリン・血小板血栓の残存および関与を減少させることができる。別の研究では、我々がＡＰＣＥの非特異的阻害剤であると実証した経口Ｖａｌ−ｂｏｒｏＰｒｏ（タラボスタット）で実験的に処置を受けている転移性結腸癌患者から血漿試料を採取した。図７は、ＡＰＣＥ阻害剤であるＶａｌ−ｂｏｒｏＰｒｏが、血漿中のＭｅｔ−α２ＡＰの割合を上昇させ、ＡＰＣＥによるＭｅｔ−α２ＡＰのＡｓｎ−α２ＡＰへの変換が減少したことを示している。
【００２８】
フィブリンは、血小板がプラーク発生の最も初期の段階において動脈壁の損傷部位に付着、凝集する際の、血小板安定化の鍵である。フィブリンは、酸化脂質とマクロファージが損傷部位に浸潤する際に沈着され続け、プラークが成長して徐々に内腔の直径を侵害し、破裂および急性閉塞性血栓形成のリスクを伴う。これら全ての段階において、フィブリンのα２プラスミン含有量が高いかあるいは最大である場合、内因性フィブリン溶解系による除去に対するフィブリンの脆弱性は、フィブリンがより少ない量のα２ＡＰ阻害剤を含有する場合よりも低下する。より高い循環血中前駆体α２ＡＰ値（Ｍｅｔ−α２ＡＰ）により、フィブリンに架橋するα２ＡＰ全体が減少し、それによりフィブリン溶解酵素であるプラスミンによって、フィブリンがより容易に消化され、プラーク部位から取り除かれる。しかし、その誘導体Ａｓｎ−α２ＡＰが優勢である場合、フィブリンは、フィブリン溶解による除去に対してより耐性を示す。ＡＰＣＥを阻害することによって、Ｍｅｔ−α２ＡＰの血中濃度が上昇し、形成するあらゆるフィブリンが、それ自体のィブリン溶解系によって、より容易に除去される。
【００２９】
蛍光共鳴エネルギー移動ペプチド基質
本発明は一実施形態において、Ｐ−Ｎ（プロリン−アスパラギン）の切れやすい結合（Ｐ１−Ｐ１’）を有し、Ｐ１プロリン上流のＰ２位にＧ（グリシン）を有する、蛍光共鳴エネルギー移動ペプチド（ＦＲＥＴペプチド）を意図している。ＦＲＥＴペプチドは、Ｐ１Ｐ１’結合の片側に例えばＤＡＢＣＹＬなどの消光基を含み、この切れやすい結合の対向する側に例えばＥＤＡＮＳなどのフルオロフォア基を含む。好ましくは、ＦＲＥＴペプチドは、Ｐ１プロリンの上流に最大１３個のアミノ酸残基を有し、Ｐ１’アスパラギン残基の下流に最大１３残基を有する（すなわち、ペプチド全体は、最大２８個のアミノ酸を含む）。消光基（例えば、リジン）を持つアミノ酸は、Ｐ１−Ｐ１’基の上流または下流の最大１３個のアミノ酸のうちの１つでよく、フルオロフォア基（例えば、グルタミン酸）を持つアミノ酸は、Ｐ１−Ｐ１’基の上流または下流の最大１３個のアミノ酸のうちの１つでよい。好ましくは、クエンチング基およびフルオロフォア基はＦＲＥＴペプチドの離れた両端にあり、また好ましくは、ペプチドの少なくとも一端がアルギニン残基（またはその他の正電荷を持つアミノ酸）で終結するか、あるいは一端が正電荷を持つアミノ酸を有し、他端が負電荷を持つアミノ酸を有してもよい。
【００３０】
「複素環」または「複素環式」という用語は、環状構造を指すが、好ましくは４、５、６、または７員環状構造であり、より好ましくは、その環状構造が窒素、硫黄、または酸素などのへテロ原子１〜４個を含む５〜６員環である。複素環式基は、チオフェン、フラン、ピラン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、イソチアゾール、イソオキサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、およびピリダジンを含むが、これらに限定されない。
【００３１】
複素環式の環は、１つ以上の位置で、例えば、ハロゲン、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホン酸、ホスフィン酸、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル部分、芳香族部分、または複素環式芳香族部分、ＣＦ３、ＣＮなどの置換基で置換することができる。
【００３２】
本明細書で使用する「炭素環」または「炭素環式」という用語は、環の各原子が炭素である芳香族または非芳香族環を指し、好ましくは４、５、６、または７炭素環を指し、より好ましくは５および６炭素環を指す。
【００３３】
本発明のペプチド模倣化合物のプロリンアナログおよび誘導体は、特定の幾何学形態または立体異性形態で存在してもよい。本発明は、シスおよびトランス異性体、ＲおよびＳ鏡像異性体、ジアステレオマー、（Ｄ）‐異性体、（Ｌ）‐異性体、それらのラセミ混合物、およびそれらの他の混合物を含む全てのかかる化合物を、本発明の範囲に包含されるものとして意図している。さらなる不斉炭素原子が、アルキル基などの置換基に存在してもよい。全てのかかる異性体、およびそれらの混合物は、本発明に含まれるものとする。
【００３４】
図８は、Ａｒｇ６形態のＭｅｔ−α２−ＡＰのＰ１−Ｐ１’結合周辺の天然アミノ酸配列を有するＦＲＥＴペプチド（配列番号５）の例を示している。この例では、Ｍｅｔ−α２−ＡＰのＮ末端ペプチドの基質特性を模倣するために使用されるＦＲＥＴペプチドの全体的に好ましい最大の配列が示されている。切断結合の両側に最大１３残基を含む論理的根拠は、このレベルの対称性は、酵素と基質が結合してＰ１２−Ｎ１３（Ｐ１−Ｐ１’）結合を切断するときの立体配置に関する潜在的な問題を最小限に抑えることから、Ｐ１−Ｐ１’結合の両側に同様の数のアミノ酸残基を含むためである。この実施形態では、各末端の任意のアルギニン基は、−Ｐ−Ｎ−結合の切断時に、ペプチド誘導体の溶解度を向上させる。Ｇ１１およびＰ１２（Ｐ２−Ｐ１）は、ペプチドが切断可能な基質であることを目的としている場合には、他の天然型アミノ酸によって置換できない好ましいアミノ酸である。プロリンは、阻害剤としての使用を意図したペプチドにおいて、別のプロリン誘導体またはアナログ、あるいはプロリン様アミノ酸で置換できる。Ｐ１２−Ｎ１３−は、切れやすい結合である。記載されるように、Ｐ１２を置換して、阻害剤を形成することができる。ＦＲＥＴペプチドの蛍光基および消光基は、アミノ酸にそれぞれ結合しているが、これは本実施形態では、末端近くのＥやＫなどである。Ｍ１は、前駆体α２ＡＰの天然配列のＮ末端メチオニン残基である。
【００３５】
図９は、図８のペプチドのアミノ酸８〜１８を含むペプチドの特定の位置において許容される置換アミノ酸の可能な順列を有する、代替のＦＲＥＴペプチド配列（配列番号６）を示している。
【００３６】
ＦＲＥＴペプチドの好ましい実施形態では、消光基とフルオロフォア基は、切れやすい結合のいずれかの側にある、好ましくは切れやすい結合から１．０〜５．０ｎｍ以内にあるアミノ酸残基にそれぞれ結合している。別の好ましい実施形態では、クエンチング基およびフルオロフォア基は、それぞれＰ２グリシン残基上流、またはＰ１’（アスパラギンまたは適切に置換されたアミノ酸）残基の下流のいずれかの残基に付着し、消光基はＰ２またはＰ１’残基の片側にあり、フルオロフォア基はＰ２またはＰ１’残基の消光基と反対側にある。
【００３７】
抗プラスミンの切断部位およびその付近の構造変形形態（アミノ酸の置換）が、ＡＰＣＥによる抗プラスミンの切断にどのように影響するかを究明するために、ペプチド基質を用いて実験を行なった。
【００３８】
抗プラスミン切断酵素（Ｐｒｏ−Ａｓｎ）によって切断されるＰ１−Ｐ１’結合周辺のＭｅｔ−α２ＡＰのアミノ酸配列をガイドとして用い、様々な長さの同一の合成ペプチドを作成して、切断速度は結合に比例すると仮定して、ペプチドの切断を増進させるために重要な残基を決定した。Ｐ１位のプロリン（あるいは炭素環式または複素環式プロリンアナログまたは置換体）は、ＡＰＣＥに結合するために必要な残基であり、プロリンまたはプロリン置換体あるいはアナログ残基の上流に隣接するＰ２位のグリシンも同様である。Ｐ１プロリンから上流の種々の残基における一連の置換体を検討し、我々は、Ｐ７（すなわちプロリン上流の６番目の残基）あるいはＰ５またはＰ６位の正電荷を持つアミノ酸（例えば、アルギニン、リジン、またはヒスチジン）が、ＡＰＣＥとの結合、つまりは切断速度を最大限にするのに特に有利であることを発見した（図１０および１１）。Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７に関して本明細書に示される表示は、切れやすい結合のＰｒｏ残基からＮ末端方向に数が増加する残基を指す。例えば、ＰｒｏはＰ１であり、下付き番号は上流方向に増加する。
【００３９】
図１０は、上流のアルギニン、または任意の正電荷を持つアミノ酸が、配列番号７を有するペプチドにおいて、ＡＰＣＥによるＰ１−Ｐ１’結合の切断速度を最大にするために重要であることを示している。図１１は、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、およびＰ８のａｒｇを置換することによって、Ｐ５およびＰ６は少なくとも天然のＰ７位のａｒｇと同じくらい有効であり、Ｐ６が最も有効であると決定したことを示している。Ｐ４およびＰ８は著しく劣り、切れやすい結合の切断を増進しなかった。切れやすい結合の切断に対する加速効果を有するＰ５、Ｐ６、またはＰ７における正電荷の存在に加え、正電荷の効果を最大にするための間隔の要求もある。
【００４０】
Ｐ７位において、ａｒｇは、ｌｙｓ（ａｒｇの速度の約７０％）を除く他のアミノ酸よりも約５〜１０倍速い相対切断速度を有する最適なアミノ酸であった（図１０）。アルギニンがＰ６またはＰ５位（すなわち、Ｐ１−Ｐ１’結合の４または５残基上流）にあるときのＰ７位のアルギニン（Ｐ１プロリンから上流の６番目の残基）の増進効果も観察したが（図１１）、ａｒｇがＰ１−Ｐ１’結合のＰ８、Ｐ４、Ｐ３、またはＰ２位にあるときには、切断速度は減少した（図１１および１２）。図１２は、例えば、ペプチド（配列番号８）におけるアミノ酸配列Ｐ１〜Ｐ４位のそれぞれにおいて、１９個のアミノ酸それぞれを置換することの効果、およびＡＰＣＥによるペプチドのＰ１−Ｐ１’結合切断の反応速度への効果を示している。正電荷を持つ残基であるｌｙｓおよびｈｉｓは、Ｐ７、Ｐ６、およびＰ５位でａｒｇを置換することができ（Ｐ７について図１０を参照）、Ｐ１−Ｐ１’の切断速度への効果が、実質的に正電荷に依存することを示している（ただし、ｐｒｏ、ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、およびその他のいくつかのアミノ酸は、部分的レベルの活性を有する（図１０））。
【００４１】
代替実施形態では、本発明のＦＲＥＴペプチドは、図１３に示すペプチド配列（配列番号９）を含む。Ｘ１〜Ｘ５およびＸ８の位置は、Ｘ１〜Ｘ５およびＸ８それぞれの下に示されるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸を含みてよいが、ただしＸ１〜Ｘ３のうち少なくとも１つは、Ｒ、Ｈ、およびＫ（正電荷を持つアミノ酸）から選択される。さらに、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３のうち少なくとも１つは、不在であってもよい。上述のように、配列番号９を含むＦＲＥＴペプチド（あるいは任意のペプチドまたはペプチド模倣薬）は、好ましくは２８個以下のアミノ酸を含む。
【００４２】
配列番号９を含むＦＲＥＴペプチドは、好ましくは消光基とフルオロフォアとをｇｌｙ−ｐｒｏ結合の対向する側に含む。配列番号９は、Ｎ末端アミノ酸の上流にＮ末端方向に１〜ｌ０ｍｅｒのペプチドをさらに備えてもよく、これは２０の天然アミノ酸のうちのいずれを含みてもよく、またＣ末端アミノ酸の下流にＣ末端方向に１〜ｌ０ｍｅｒのペプチドをさらに備えてもよく、これは２０の天然アミノ酸のうちのいずれを含みてもよい。
【００４３】
上記のように、蛍光共鳴エネルギー移動ペプチド基質は、Ｐ１−Ｐ１’結合の上流に消光基を、Ｐ１−Ｐ１’結合の下流にフルオロフォアを含みてよく、あるいは蛍光共鳴エネルギー移動ペプチドは、消光基をＰ１−Ｐ１’結合の下流に、フルオロフォアをＰ１−Ｐ１’結合の上流に備えてもよい。Ｐ１は好ましくはプロリンまたは有効なプロリンアナログまたは置換体であり、本明細書に記載のようにＰ１’は好ましくはアスパラギンであり、Ｐ１上流のＰ２基は好ましくはグリシンである。
【００４４】
ＡＰＣＥ阻害剤のスクリーニング
特定の実施形態では、本発明は、抗プラスミン切断酵素の阻害剤をスクリーニングする方法を含む。この方法は、Ｐ１−Ｐ１’結合を含み、Ｐ１−Ｐ１’結合によって隔てられるフルオロフォア基（例えば、ＥＤＡＮＳ）および消光基（例えば、ＤＡＢＣＹＬ）を含み、それによりα２−抗プラスミン切断酵素によってペプチドを切断することができる、本明細書において意図される蛍光共鳴エネルギー移動ペプチドを提供する工程と、ある量のα２−抗プラスミン切断酵素を提供する工程と、α２−抗プラスミン切断酵素をα２−抗プラスミン切断酵素阻害剤候補に曝露して試験混合物を形成する工程と、試験混合物を蛍光共鳴エネルギー移動ペプチドと合わせる工程と、α２−抗プラスミン切断酵素阻害剤候補がα２−抗プラスミン切断酵素の活性をいつ阻害するかを特定するために、試験混合物からの蛍光放出を測定する工程とを含む。
【００４５】
ＡＰＣＥ阻害剤
本書に記載されるように、ＦＲＥＴペプチドおよびα２ＡＰの切れやすい結合周辺のペプチド配列の種々の配列変形例が、阻害剤を発生させるために、本明細書において使用されてきた。具体的には、切れやすい結合のプロリンをプロリンアナログと置換することによって、本明細書に記載される特異的ＡＰＣＥ阻害剤の発生が導かれた。従って、本発明は、最大２８個あるいはそれ以上のアミノ酸を有し、表Ｉに示されるものがあるがこれらに限定されないプロリンアナログおよび誘導体を含む、Ｐ１プロリン置換体として用いるためのプロリンアナログおよび誘導体を含む、ＡＰＣＥ−阻害性ペプチド模倣薬を意図している。ペプチド模倣薬は、好ましくは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８個のアミノ酸を含み、化合物の一部のアミノ酸を隔てるためのスペーサー化合物、あるいはＰＥＧまたはその他のポリマー材料もしくは担体など、ペプチドの血清寿命を延長するために結合または複合された化合物を含まない。
【００４６】
好ましくはＰ１−Ｐ１’の切れやすい結合上流の４〜７残基の長さに相当する距離（３．５〜２４Å、すなわち０．３５ｎｍ〜２．４ｎｍ）を隔てて正電荷を持つ残基を有するＡＰＣＥ阻害剤は、迅速かつ強力に結合する有効なＡＰＣＥ阻害剤として使用できる。さらに、かかる阻害剤は、例えば米国特許第６，９４９，５１４号に記載されるように、近似する酵素である線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）の阻害、つまりはＦＡＰに関する障害の処置に有用となり得る。
【００４７】
Ｐ１−Ｐ１’の切れやすい結合からＰ５、Ｐ６、またはＰ７のどの位置にある正電荷までの間隔も関連する決定要因であり、従って、おおよその長さ（０．３５ｎｍ〜２．４ｎｍ）に達するためにこの間隔を埋めるあらゆるアミノ酸または不活性または中性物質で構築されたその他のスペーサーは、ＡＰＣＥ／ＦＡＰ阻害剤を構築するのに有効であろう。ＦＲＥＴペプチドまたはＡＰＣＥ阻害剤の特に有利な実施形態では、アルギニン（またはその他の正電荷を持つアミノ酸）は、切れやすい結合のプロリン（またはＰ１残基置換体）から６〜２１Å（０．６ｎｍ〜２．１ｎｍ）以内にある。
【００４８】
好ましい変形形態の阻害剤は、正電荷を持つアミノ酸（例えば、アルギニン、リジン、またはヒスチジン）を含む、Ｐ１−Ｐ１’結合からＮ末端方向にアミノ酸２〜６個を有する配列を含み、また必ずではないが好ましくはＰ１−Ｐ１’にｐｒｏ−ａｓｎ連結を含み、好ましくはＰ２にグリシンを含み、Ｐ１−Ｐ１’結合から下流（Ｃ末端方向）の位置に負電荷を持つアミノ酸または芳香族アミノ酸（例えば、ａｓｐ、ｇｌｕ、ｔｒｐ、ｔｙｒ、およびｐｈｅ）を含む。
【００４９】
本発明の阻害剤またはＦＲＥＴペプチドの好ましい実施形態では、化合物は切れやすい結合とＮ末端側の正電荷を持つアミノ酸との間にスペーサー（リンカーまたはフィラー）基を含みてもよく、例えばａｒｇ、ｈｉｓ、またはｌｙｓなどの正電荷を持つアミノ酸が、Ｐ７、Ｐ６、またはＰ５（例えば、図１４を参照）に相当する位置にある。切れやすい結合基とＰ５、Ｐ６、またはＰ７位にある正電荷を持つアミノ酸との間のスペーサー（リンカーまたはフィラー）は、例えば、複数の電荷を持たない中性のアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、メチオニン、トリプトファン、チロシン、トレオニン、セリン、また最も好ましくは、セリン、グリシン、アラニン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、イプシロンアミノカプロン酸；または８−、１１−、または１４−アミノ−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデカン酸などのアミノ−ＰＥＧ誘導体、およびＰＥＧオリゴマー（例えば、ｎ＝２〜６））を含みてもよい。これらのスペーサーは、同種（例えば、全てのグリシン、アラニンなど、またはその他の単一アミノ酸）であっても、または異種（例えば、１種以上のアミノ酸またはハイブリッドアミノ酸／ＰＥＧ分子）であってもよく、好ましくは長さ３．５〜２１Å（０．３５ｎｍ〜２．１ｎｍ）（または１〜７個のアミノ酸）である。スペーサーは、例えばエチレングリコールなどの中性モノマー、またはその他類似のモノマーユニット（例えば、プロピレングリコール）から成ってもよく、また長さ３．５〜２１Å（０．３５ｎｍ〜２．１ｎｍ）を有することによって、スペーサーが切れやすい結合のプロリン、またはプロリン置換体もしくはアナログから約５〜２５Å（０．５ｎｍ〜２．５ｎｍ）以内にアルギニン（またはその他の正電荷を持つアミノ酸）を配置する。
【００５０】
従って、本明細書において定義される距離内における正電荷を持つアミノ酸の存在は、ＡＰＣＥ配列に結合する特異性に著しく寄与する本発明の態様である。さらに、この空間内のアミノ酸が長さ３．５〜２１Å（０．３５ｎｍ〜２．１ｎｍ）のポリエチレングリコールで置換される場合、Ｐ１２−Ｎ１３結合の切断速度は、以下のペプチドに対して依然として最大となる：Ｘ−Ｒ６−（ＰＥＧ３）−Ｇ１１−Ｐ１２−Ｎ１３−Ｑ１４−Ｅ１５（配列番号１０）（（ＰＥＧ３）が３つのエチレングリコールユニットを含むポリエチレングリコールを表し、Ｘが任意のアミノ酸である）。Ｐ１２（Ｐ１）から一定の距離内になくてはならない正電荷効果の特異性を考慮すると、このペグ化されたペプチドは、ＡＰＣＥのプロテイナーゼ活性を阻害するための、プロリン（Ｐ１２）を選択的に修飾または置換することによる阻害剤発生の基礎である。図１４は、Ｐｒｏｌ２がプロリンアナログであるピペコリン酸で置換された場合の、示される配列を有するいくつかのペプチド（配列番号１１〜１３）のＡＰＣＥ阻害作用を示している（各ペプチドは２０μＭ）。
【００５１】
好ましい実施形態では、本発明は、式：Ｘａａ１-Ｓｐ１−Ｇｌｙ−Ｃｙｃ−Ｘａａ２−Ｓｐ２−Ｘａａ３（式Ｉ）を有する化合物を含む。この実施形態では、Ｘａａ１は、アルギニン、ヒスチジン、またはリジンを含むがこれらに限定されない正電荷を持つアミノ酸である。Ｓｐ１は、好ましくはセリン、グリシン、アラニン、またはβ−アラニン、またはガンマアミノ酪酸、イプシロンアミノカプロン酸、８−アミノ−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデカン酸、ｌｌ−アミノ−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデカン酸、１４−アミノ−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデカン酸、あるいはＰＥＧｎまたはＰＰＧｎ（ｎ＝ｌ〜６エチレングリコールまたはプロピレングリコールユニット）を含む中性アミノ酸である、アミノ酸１〜６個を含むスペーサー分子であり、Ｓｐ１は長さ３Å〜２１Å（０．３ｎｍ〜２．１ｎｍ）を有する。Ｇｌｙは、グリシンである。Ｃｙｃは、炭素環式または複素環式の環である。炭素環式環は、炭素原子４、５、６、または７個を含みてもよく、複素環式の環は、例えば少なくとも１つの原子は窒素などのへテロ原子である、原子４、５、６、または７個を含みてもよい。Ｘａａ２は、好ましくはグルタミン、アスパラギン、セリン、ヒスチジン、チロシン、アラニン、またはフェニルアラニン、あるいは本発明の化合物のＰ１−Ｐ１’の切れやすい結合としての機能を果たすことができるあらゆる天然アミノ酸である。Ｓｐ２はスペーサー分子であり、不在であってもよく、好ましくはセリン、グリシン、アラニン、β−アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはガンマアミノ酪酸、イプシロンアミノカプロン酸、８−アミノ−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデカン酸、ｌｌ−アミノ−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデカン酸、１４−アミノ−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデカン酸、またはＰＥＧｎまたはＰＰＧｎ（ｎ＝ｌ〜６エチレングリコールまたはプロピレングリコールユニット）を含む中性アミノ酸である、アミノ酸１〜６個を含みてもよく、Ｓｐ１は長さ３Å〜２１Å（０．３ｎｍ−２．１ｎｍ）を有する。Ｘａａ３は、グルタミン酸、アスパラギン酸、トリプトファン、チロシン、またはフェニルアラニン、あるいはあらゆる負電荷を持つアミノ酸、または芳香族アミノ酸である。化合物は、Ｘａａ１からＮ末端方向に延びるアミノ酸１〜１０個を有するＮ末端オリゴペプチドと、Ｘａａ３からＣ末端方向に延びるアミノ酸１〜１０個を有するＣ末端オリゴペプチドとをさらに含んでもよく、Ｎ末端オリゴペプチドおよびＣ末端オリゴペプチドは、２０の天然型アミノ酸のうちの１つ以上を含みてもよい。化合物は、好ましくは、本明細書の他の部分に記載されるように、薬学的に許容される担体中に配置される。
【００５２】
一実施例では、本発明は、血漿Ｍｅｔ−α２−抗プラスミンの処置前のレベルおよび血漿Ａｓｎ−α２−抗プラスミンの処置前のレベルを有する対象における血漿α２−抗プラスミン比を変更する方法である。具体的には、本方法は、抗プラスミン切断酵素の阻害剤で対象を処置する工程を含み、阻害剤は、抗プラスミン切断酵素によるＭｅｔ−α２−抗プラスミンのＰｒｏ−Ａｓｎ切断部位の切断を特異的に阻害し、処置後に対象は、血漿Ｍｅｔ−α２−抗プラスミンの処置前のレベルよりも少なくとも５％高い血漿Ｍｅｔ−α２−抗プラスミンの処置後のレベルを有し、また血漿Ａｓｎ−α２−抗プラスミンの処置前のレベルよりも少なくとも５％低い血漿Ａｓｎ−α２−抗プラスミンの処置後のレベルを有し、それによって対象における血漿α２−抗プラスミン比を変更する。本方法では、対象におけるα２−抗プラスミン比の変更は、好ましくは対象におけるフィブリン溶解を向上させる。具体的には、本方法は、アテローム性動脈硬化症、動脈血栓症、静脈血栓症、脳卒中、または肺塞栓症を抑制または処置するための処置である。
【００５３】
本方法の一実施形態では、血漿Ｍｅｔ−α２−抗プラスミンの処置後のレベルは、血漿Ｍｅｔ−α２−抗プラスミンの処置前のレベルよりも少なくとも１０％高く、血漿Ａｓｎ−α２−抗プラスミンの処置後のレベルは、血漿Ａｓｎ−α２−抗プラスミンの処置前のレベルよりも少なくとも１０％低い。本方法の別の実施形態では、血漿Ｍｅｔ−α２−抗プラスミンの処置後のレベルは、血漿Ｍｅｔ−α２−抗プラスミンの処置前のレベルよりも少なくとも１５％高く、血漿Ａｓｎ−α２−抗プラスミンの処置後のレベルは、血漿Ａｓｎ−α２−抗プラスミンの処置前のレベルよりも少なくとも１５％低い。本方法の別の実施形態では、血漿Ｍｅｔ−α２−抗プラスミンの処置後のレベルは、血漿Ｍｅｔ−α２−抗プラスミンの処置前のレベルよりも少なくとも２０％高く、血漿Ａｓｎ−α２−抗プラスミンの処置後のレベルは、血漿Ａｓｎ−α２−抗プラスミンの処置前のレベルよりも少なくとも２０％低い。本方法の別の実施形態では、血漿Ｍｅｔ−α２−抗プラスミンの処置後のレベルは、血漿Ｍｅｔ−α２−抗プラスミンの処置前のレベルよりも少なくとも２５％高く（また、例えば、任意の割合高く）、血漿Ａｓｎ−α２−抗プラスミンの処置後のレベルは、血漿Ａｓｎ−α２−抗プラスミンの処置前のレベルよりも少なくとも２５％低い（また、例えば、任意の割合低い）。
【００５４】
一実施形態では、本発明は、好ましくは、血漿Ｍｅｔ−α２−抗プラスミンの処置前のレベルおよび血漿Ａｓｎ−α２−抗プラスミンの処置前のレベルを有する対象において、対象におけるα２−抗プラスミン値を変更することによって、アテローム性動脈硬化症、動脈血栓症、静脈血栓症、脳卒中、または肺塞栓症を処置または抑制する方法である。本方法は、抗プラスミン切断酵素の阻害剤で対象を処置する工程を含み、阻害剤は、抗プラスミン切断酵素によるＭｅｔ−α２−抗プラスミンのＰｒｏ−Ａｓｎ切断部位の切断を特異的に阻害し、処置後に対象は、血漿Ｍｅｔ−α２−抗プラスミンの処置前のレベルよりも少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、または２５％高い（または任意の割合高い）血漿Ｍｅｔ−α２−抗プラスミンの処置後のレベルを有し、またＡｓｎ−α２−抗プラスミンの処置前のレベルよりもそれぞれ少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、または２５％低い（または任意の割合低い）Ａｓｎ−α２−抗プラスミンの処置後のレベルを有し、それによって対象における血漿α２−抗プラスミン比を変更する。対象におけるα２−抗プラスミン比の変更は、好ましくは、対象においてフィブリン溶解を向上させることによって生じる。
【００５５】
本発明は、参考として本明細書で援用される、米国特許第６，９４９，５１４号に記載されるもののような、ＦＡＰに関する癌および障害を処置するための治療化合物をさらに意図している。この治療化合物は、タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）を含むがこれに限定されない、細胞膜を通過できる担体化合物に接合された、本明細書に記載される本発明のＡＰＣＥ阻害剤を含む。ＰＴＤは、細胞膜脂質二重層を通過する、正電荷を持つペプチドまたはペプチド様分子である。典型的には、ＰＴＤは、いくつかのアルギニン残基を含み、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、または小分子などの別の物質を細胞膜を通してサイトゾル内に送達する。あるＰＴＤは、アルギニンオリゴマーを合成することによって形成される、εＡＣＡに代わる非常に効率的な分子輸送体である。本発明で使用できるＰＴＤの例は、開示内容全体が参考として本明細書で援用される、米国特許第７，１６６，６９２号；第７，２１７，５３９号；第７，０５３，２００号；第６，８３５，８１０号；第６，６４５，５０１号；および米国特許出願公開第２００２／０００９４９１号；第２００３／００３２５９３号；第２００３／０１６２７１９号；第２００６／０１５９７１９号；第２００６／０２９３２３４号；および第２００７／０１０５７７５号に示されている。
【００５６】
有用性
本発明の有用性は、以下を含むがこれらに限定されない。
（１）アテローム硬化性プラークの発生および進行の、特に高リスク患者における、予防および低減。
（２）動脈血または静脈血クロット形成（アテローム血栓および静脈血栓障害）の発生の、特にそのようなクロットのリスクが高いと認められる状態（すなわち、心臓発作または脳卒中）における予防および低減。
（３）場合により低用量のプラスミノゲン活性剤の同時投与と関連した、ＡＰＣＥの阻害剤の継続投与による血管開存性維持の向上。
（４）全ての形態の関節炎などの炎症状態、臓器線維症、望ましくない瘢痕、および癌とその転移に関連する持続性の急性または慢性症状を発症する可能性があるフィブリン形成の予防および低減。
（５）フィブリン中に架橋されていないときに、α２ＡＰａｃｔと同様にα２ＡＰＰｒｏが溶液状態のプラスミンを阻害するという前提で、過剰フィブリン溶解状態が誘導された際の出血のリスクの低減。
（６）冠状動脈血栓症などのアテローム血栓性疾患、脳卒中、肺塞栓症、その他全ての形態の動脈および静脈血栓症、炎症状態、および癌とその転移に見られる可能性がある臓器機能を妨げるフィブリン沈着の予防および治療の援助。
（７）対象がα２−抗プラスミン中にＴｒｐ６またはＡｒｇ６多型を有するかどうかの決定。
（８）抗プラスミン切断酵素の阻害剤のスクリーニング。
【００５７】
従って、本発明の種々の実施形態は、以下を含むがこれらに限定されない。
（１）対象に有効量の抗プラスミン切断酵素阻害剤を投与する工程を含む、ｉｎ  ｖｉｖｏでのフィブリン消化を促進させる治療方法。
（２）ＡＰＣＥの基質としての機能を果たす蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ペプチド。
（３）阻害剤がポリマースペーサー、リンカー、または担体を含みても、あるいはそれらに連結されてもよい、抗プラスミン切断酵素の阻害剤。
（４）抗プラスミン切断酵素のα２−抗プラスミン結合部位、またはα２−抗プラスミンｐｒｏ−ａｓｎ切断部位に、結合する、またはそれらを遮断するのに有効な抗プラスミン切断酵素の阻害剤。
（５）クロット消化またはクロット予防を必要とする対象に、ある量のプラスミノゲン活性化因子と抗プラスミン切断酵素阻害剤とを同時にまたは順次提供する工程を含み、プラスミノゲン活性化因子の分量は、抗プラスミン切断酵素阻害剤を用いない標準治療プロトコルで提供される量よりも少ない、ｉｎ  ｖｉｖｏでフィブリン消化を向上させる方法。
（６）本明細書において意図されるＦＲＥＴペプチドまたは阻害ペプチドをコードするＤＮＡ、およびそのＤＮＡを含有するプラスミドベクターまたは宿主。
【００５８】
本発明の別の実施形態は、治療有効量の本明細書に記載される化合物のうちの１つ以上を含み、１つ以上の薬学的に許容される担体（添加剤）および／または希釈剤と共に配合された、薬学的に許容される組成物を提供する。下記に詳述するように、本発明の医薬組成物は、固体または液体状態で投与するために特別に配合することができ、これには以下に適応するものが含まれる：（１）例えば、水性または非水性の溶液または懸濁液、口内、舌下、全身吸収を目的としたものなどの錠剤、ボーラス、粉剤、顆粒剤、舌に塗布するためのペースト剤などの経口投与；（２）例えば、滅菌した溶液または懸濁液、あるいは徐放性製剤としての、例えば、皮下、筋肉内、静脈内、または硬膜外注射による非経口投与；（３）例えば、皮膚に塗布されるクリーム、軟膏、あるいは放出制御パッチまたはスプレーなどとしての局所投与；（４）例えば、クリームまたは泡沫としての膣内または直腸内投与；（５）舌下投与；（６）眼内投与；（７）経皮的投与；または（８）経鼻的投与。
【００５９】
本明細書において「治療有効量」という語句は、化合物、材料、または本発明の化合物を含む組成物の量が、あらゆる医療処置に適用することができる合理的な効果／リスク比で、ある動物における細胞の少なくとも部分集団において、ある所望の治療効果を生じるのに有効であることを意味する。
【００６０】
本明細書で用いられる「薬学的に許容される」という語句は、正常な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、またはその他の問題または合併症を伴わずに、合理的な効果／リスク比に見合うように、ヒトおよび動物の組織に接触させて使用するのに適した、化合物、材料、組成物、および／または剤形を指す。
【００６１】
本明細書において、「薬学的に許容される担体」という語句は、対象化合物をある器官または身体の一部から別の器官または身体の一部に運搬または輸送することに関与する、液体または固体の充てん剤、希釈剤、賦形剤、または溶剤封入物質などの薬学的に許容される物質、組成物または媒体を意味する。各担体は、配合物の他の原料と適合していて、患者に有害ではないという意味で、「許容される」ものでなければならない。薬学的に許容される担体としての機能を果たしうる物質の例のいくつかには、（１）ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの糖類；（２）とうもろこしデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；（３）セルロース、およびその誘導体である、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースなど；（４）トラガカント粉末；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）ココアバターおよび坐剤ワックスなどの賦形剤；（９）ピーナッツ油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、および大豆油などの油類；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなどのポリオール；（１２）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェンを含まない水；（１７）等張食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネート、および／またはポリ酸無水物；および（２２）医薬配合物に使用される、その他の非毒性の適合物質などがある。
【００６２】
上記に記載されているように、本化合物の一部の実施形態は、アミノまたはアルキルアミノなどの塩基性官能基を含み、従って薬学的に許容される酸と共に薬学的に許容される塩を形成することができる。この点において、「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明の化合物の比較的非毒性の、無機および有機酸付加塩を指す。これらの塩は、投与媒体または剤形製造プロセスにおいてｉｎ  ｓｉｔｕで、またはその後の精製中に、本発明の精製された化合物をその遊離塩基形態で好適な有機または無機酸と別個に反応させ、こうして形成された塩を単離することによって調製することができる。代表的な塩には、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、およびラウリルスルホン酸塩などがある。
【００６３】
対象化合物の薬学的に許容される塩には、例えば非毒性の有機酸または無機酸からの、化合物の従来の非毒性塩または第四アンモニウム塩がある。例えば、このような従来の非毒性塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などの無機酸から誘導されたもの、および酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イソチオン酸などの有機酸から調製された塩がある。
【００６４】
別の場合には、本発明の化合物は、１つ以上の酸性官能基を含んでもよく、従って、薬学的に許容される塩基と共に薬学的に許容される塩を形成することができる。これらの例における「薬学的に許容される塩」という用語は、発明の化合物の比較的非毒性の無機または有機塩基付加塩を指す。これらの塩も同様に、投与媒体または剤形製造プロセスにおいてｉｎ  ｓｉｔｕで、または精製された化合物をその遊離酸形態で、薬学的に許容される金属カチオンの水酸化物塩、炭酸塩または重炭酸塩などの好適な塩基と、アンモニアと、あるいは薬学的に許容される有機第一、第二または第三アミンと、別個に反応させることによって調製することができる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類塩には、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、およびアルミニウムの塩などがある。塩基付加塩の形成に有用な代表的な有機アミンには、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジンなどがある。
【００６５】
ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの湿潤剤、乳化剤、および潤滑剤、ならびに着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味料、香味料および香料、保存料、および酸化防止剤も組成物中に存在してもよい。
【００６６】
薬学的に許容される酸化防止剤の例には、（１）アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性酸化防止剤；（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなどの油溶性酸化防止剤；および（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート剤などがある。
【００６７】
上述のように、本発明の配合物には、経口、経鼻、局所（口内および舌下を含む）、直腸、膣、および／または非経口投与に好適なものが含まれる。これらの配合物は、単位剤形中に便利に備えられてもよく、また薬学分野で周知のいかなる方法によって調製されてもよい。単一の剤形を作り出すために担体材物質と組み合わせることができる活性成分の量は、治療を受ける宿主、個々の投与方式によって変動するであろう。単一の剤形を作り出すために担体材物質と組み合わせることができる活性成分の量は、一般的には、治療効果を生じさせる化合物量である。一般的に、１００パーセント中、この量は、約１％から約９９％まで、好ましくは約５％から約７０％まで、最も好ましくは約１０％から約３０％までの範囲の活性成分である。
【００６８】
一部の実施形態では、本発明の配合物は、シクロデキストリン、リポソーム、例えば胆汁酸などのミセル形成剤、および例えばポリエステルやポリ酸無水物などのポリマー担体から成る群から選択される賦形剤を含む。
【００６９】
これらの配合物または組成物を調製する方法は、本発明の化合物を担体と、また場合により１つ以上の副成分と結び付ける工程を含んでもよい。一般的に、配合物は、本発明の化合物を液体担体、または微粉化固体担体、あるいはその両方に均一かつ密接に結び付け、その後必要であれば、生成物を成形することによって調製される。
【００７０】
経口投与に適した本発明の配合物は、それぞれが活性成分として既定量の本発明の化合物を含む、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、舐剤（風味付けされた基剤、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガカントを用いる）、粉剤、顆粒剤の形態で、あるいは水性または非水性液中の溶液または懸濁液として、または油中水型または水中油型の液体乳剤として、またはエリキシル剤もしくはシロップ剤として、または香錠（ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアなどの不活性基剤を用いる）、および／または洗口液としてのものであってもよい。本発明の化合物は、ボーラスまたはペースト剤として投与することもできる。
【００７１】
本発明の経口投与のための固形剤形（カプセル剤、錠剤、丸剤、粉剤、顆粒剤など）では、活性成分は、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムなどの１つ以上の薬学的に許容される担体、および／または以下のもののいずれかと混合される：（１）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および／またはケイ酸などの充填剤または増量剤；（２）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、および／またはアカシアなどの結合剤；（３）グリセロールなどの保湿剤；（４）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、一部のケイ酸塩、および炭酸ナトリウムなどの崩壊剤；（５）パラフィンなどの溶解遅延剤；（６）４級アンモニウム化合物などの吸収促進剤；（７）例えば、セチルアルコール、グリセロールモノステアリン酸塩、および非イオン界面活性剤などの湿潤剤；（８）カオリンおよびベントナイト粘土などの吸収剤；（９）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物などの潤滑剤；および（１０）着色剤。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、医薬組成物は、緩衝剤も含んでよい。同様の種類の固体組成物は、ラクトースまたは乳糖、およびに高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を用いたソフトおよびハードシェルゼラチンカプセルの充填剤として使用することもできる。
【００７２】
錠剤は、場合により１つ以上の副成分と共に、圧縮または成形によって作製することができる。圧縮錠剤は、結合剤（例えばゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えばデンプングリコール酸ナトリウム、または架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤または分散剤を用いて調製することができる。成形錠剤は、不活性液体希釈剤で湿潤させた粉末化合物の混合物を適切な機械中で成形することによって作製することができる。
【００７３】
錠剤、および本発明の医薬組成物のその他の固体剤形である糖衣剤、カプセル剤、丸剤および顆粒剤などは、場合により、腸溶コーティングおよびその他薬剤製剤分野で周知のコーティングなどのコーティングやシェルによって、分割または調製することもできる。またそれらは、例えば、所望の放出特性を提供するための種々の割合のヒドロキシプロピルメチルセルロース、その他のポリマーマトリクス、リポソーム、および／またはミクロスフェアを用いて、含有する活性成分の持続放出または制御放出を提供するように配合することもできる。それらは、例えば凍結乾燥など、迅速放出用に配合してもよい。それらは、例えば、細菌保持フィルターによる濾過によって、あるいは使用直前に滅菌水または他の何らかの滅菌注射可能媒体に溶かすことができる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を組み込むことによって、滅菌することができる。またこれらの組成物は、場合によって、乳白剤を含有してもよく、また胃腸管のある特定の部分のみで、またはそこで優先的に、場合によって遅延するように、活性成分を放出する組成物であってもよい。使用できる包埋組成物の例には、ポリマー物質およびワックスがある。活性成分は、適当であれば、１つ以上の上記の賦形剤と共にマイクロカプセル化された形態にすることもできる。
【００７４】
本発明の化合物の経口投与用の液体剤形には、薬学的に許容される乳剤、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ剤、およびエリキシル剤などがある。活性成分に加えて、液体剤形は、例えば水や他の溶媒などの当該技術分野で一般に使用される不活性希釈剤、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油類（具体的には、綿実油、落花生油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステルなどの可溶化剤および乳化剤、およびそれらの混合物を含んでもよい。
【００７５】
不活性希釈剤以外に、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味料、香味剤、着色剤、香料および保存料などのアジュバントを含有してもよい。
【００７６】
懸濁液は、活性化合物に加えて、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカント、ならびにそれらの混合物などの懸濁剤を含有してもよい。
【００７７】
直腸または膣投与用の本発明の医薬組成物の配合物は、坐剤であってよいが、この坐剤は、例えばココアバター、ポリエチレングリコール、坐薬ワックスまたはサリチル酸を含む１つ以上の好適な非刺激性賦形剤または担体に、１つ以上の本発明の化合物を混合することによって調製することができ、また室温では固体であるが体温では液体となるため、直腸または膣腔で融解し、活性化合物を放出することになる。
【００７８】
膣投与に好適な本発明の配合物には、当該技術分野において適当であることが知られている担体を含む、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡沫、またはスプレー配合物も含まれる。
【００７９】
本発明の化合物の局所投与または経皮投与用の剤形には、粉剤、スプレー剤、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、溶液、パッチ剤、および吸入剤が含まれる。活性化合物は、滅菌条件下で、薬学的に許容される担体と、また必要であるかもしれないあらゆる保存剤、緩衝剤、または噴霧剤と混合することができる。
【００８０】
軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、およびゲル剤は、本発明の活性化合物に加え、動物性および植物性の脂肪、油類、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、および酸化亜鉛、またはそれらの混合物などの賦形剤を含有してもよい。
【００８１】
粉剤およびスプレー剤は、本発明の化合物に加え、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、およびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物などの賦形剤を含有してもよい。スプレー剤は、クロロフルオロ炭化水素、およびブタンやプロパンなどの揮発性非置換炭化水素など、常用の噴霧剤をさらに含有してもよい。
【００８２】
経皮パッチ剤は、本発明の化合物を制御しながら身体に送達できるようにするという、さらなる利点を有する。このような剤形は、適当な媒体中に化合物を溶解または分散させることによって作製することができる。吸収促進剤を用いて、皮膚にわたる化合物の流動を高めることができる。このような流動速度は、律速膜を設けるか、あるいはポリマーマトリクスまたはゲル中に化合物を分散させることによって制御することができる。
【００８３】
点眼製剤、眼用の軟膏剤、粉剤、溶液なども、本発明の範囲内にあるものとする。
【００８４】
非経口投与に適した本発明の医薬組成物は、１つ以上の本発明の化合物を、１つ以上の薬学的に許容される滅菌した等張水性または非水性溶液、分散液、懸濁液または乳剤、あるいは使用直前に滅菌注射溶液または分散液に再形成することができる滅菌粉剤と共に含むが、これは糖類、アルコール類、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤、配合物を対象とする受容者の血液と等張にする溶質、または懸濁剤もしくは増粘剤を含んでもよい。
【００８５】
本発明の医薬組成物において使用できる、好適な水性および非水性の担体には、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適切な混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルなどがある。適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材を用いることによって、分散液の場合には必要とされる粒径を維持することによって、また界面活性剤を用いることによって維持することができる。
【００８６】
これらの組成物は、保存料、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などのアジュバントを含むこともできる。対象化合物に対する微生物の作用は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸など、種々の抗細菌剤および抗真菌剤を含むことによって、確実に防止することができる。組成物中に糖類、塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことも望ましいかもしれない。さらに、注射用医薬形態の持続的吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる物質を含むことによって実現することができる。
【００８７】
一部の例では、薬剤の効果を持続させるために、皮下注射または筋肉内注射からの薬剤の吸収を遅らせることが望ましい。これは、水溶性が低い結晶性または非晶性物質の液体懸濁液を用いることによって実現することができる。薬剤吸収速度はその溶解速度に依存し、溶解速度は結晶サイズおよび結晶形状に依存しうる。あるいは、非経口投与される剤形の吸収の遅延は、薬剤を油性媒体に溶解または懸濁することによっても達成される。
【００８８】
注射用の持効性形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生物分解性ポリマー中に対象化合物のマイクロカプセル化マトリクスを形成することによって作製される。ポリマーに対する薬剤の比率、および使用される個々のポリマーの性質によって、薬剤放出速度を制御することができる。その他の生物分解性ポリマーの例には、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）などがある。持効性注射用配合物は、身体組織と適合するリポソームまたはマイクロエマルジョン中に薬剤を捕捉することによっても調製することができる。
【００８９】
本発明の化合物を医薬品としてヒトおよび動物に投与する場合、それ自体で、あるいは例えば０．１〜９９．５％（より好ましくは、０．５〜９０％）の活性成分を薬学的に許容される担体と共に含む医薬組成物として投与することができる。
【００９０】
本発明の製剤は、経口、非経口、局所、または直腸投与することができる。それらは、言うまでもなく、それぞれの投与経路に適した形態で投与される。例えば、それらは錠剤またはカプセル形態で、また注射、吸入、目薬、軟膏、坐剤などによって投与される（注射、輸液、吸入による投与；ローションまたは軟膏による局所投与；および坐剤による直腸投与）。経口投与が好ましい。
【００９１】
本明細書で使用される「非経口投与」および「非経口的に投与される」という語句は、経腸および局所投与以外の投与方式を意味し、通常は注射によるものであり、これには静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、包内、眼窩内、心腔内、真皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、および胸骨内への注射および輸液が含まれるが、これらに限定されない。
【００９２】
本明細書で使用される「全身投与」、「全身的に投与される」、「末梢投与」、および「末梢的に投与される」という語句は、直接中枢神経系に入らずに、患者の系内に入り、それによって代謝またはその他類似のプロセスを受けるような、化合物、薬剤、またはその他の物質の投与を意味し、これには例えば皮下投与がある。
【００９３】
これらの化合物は、ヒトおよびその他の動物に、好適なあらゆる投与経路によって、治療のために投与することができるが、これには経口、例えばスプレーによる経鼻、直腸、膣内、非経口、大槽内、および例えば粉剤、軟膏、またはドロップ剤による口内および舌下を含む局所投与などがある。
【００９４】
選択される投与経路に関わらず、好適な水和物形態で使用できる本発明の化合物、および／または本発明の医薬組成物は、当業者に既知の従来の方法によって、薬学的に許容される剤形に配合される。
【００９５】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、個々の患者、組成物、および投与方式に対し、所望の治療反応を達成するのに有効な量の活性成分が得られるように、患者に対して毒性を持たないように、変更することができる。
【００９６】
選択される投与量レベルは、使用される個々の本発明の化合物、あるいはそのエステル、塩、またはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用される個々の化合物の排泄または代謝速度、処置の期間、使用される個々の化合物と併用されるその他の薬剤、化合物および／または物質、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全体的な健康、および以前の病歴、医療分野で周知の同様の要因を含む、種々の要因に依存するであろう。
【００９７】
当分野における通常の技能を有する医師または獣医師は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に判断し、処方することができる。例えば、医師または獣医師は、医薬組成物中に使用する本発明の化合物の用量を、所望の治療効果を達成するために必要とされるものよりも低いレベルから開始し、所望の効果が達成されるまで、徐々に投与量を増やすことができるであろう。
【００９８】
一般的に、本発明の化合物の好適な日用量は、治療効果を生じるのに有効な最低用量の化合物量となる。このような有効用量は、一般に、上述の要因に依存することとなる。一般的に、患者に対する本発明の化合物の静脈内、脳室内、および皮下用量は、必要とされる鎮痛効果のために使用される場合、１日に体重１キログラム当たり約０．０００１〜約１００ｍｇの範囲となる。
【００９９】
希望であれば、活性化合物の有効な日用量は、１日を通して適当な間隔で別々に投与される２，３，４，５，６、またはそれ以上のサブ用量として、場合によって単位剤形で、投与してもよい。
【０１００】
本発明の化合物は、単独で投与することが可能であるが、化合物を医薬配合物（組成物）として投与することが好ましい。
【０１０１】
別の態様では、本発明は、上述のように、１つ以上の薬学的に許容される担体（添加剤）および／または希釈剤と共に配合された治療有効量の１つ以上の対象化合物を含む、薬学的に許容される組成物を提供する。下記に詳述するように、本発明の医薬組成物は、固体または液体状態で投与するために、特別に配合することができるが、これには以下に適応するものが含まれる：（１）例えば、水性または非水性の溶液または懸濁液、錠剤、ボーラス、粉剤、顆粒剤、舌に塗布するためのペースト剤などの経口投与；（２）例えば、例えば皮下、筋肉内、または静脈内注射による、滅菌した溶液または懸濁液としての非経口投与；（３）例えば、皮膚、肺、または口腔に塗布されるクリーム、軟膏、またはスプレーとしての局所投与；（４）例えば、ペッサリー、クリーム、または泡沫としての膣内または直腸内投与；（５）舌下投与；（６）眼内投与；（７）経皮的投与；または（８）経鼻的投与。
【０１０２】
本発明による化合物は、他の医薬品から類推して、ヒトまたは動物医療での使用に便利なあらゆる方法での投与のために配合することができる。
【０１０３】
「処置」という用語は、予防、治療、および治癒も包含するものとする。
【０１０４】
この処置を受ける患者は、必要とするあらゆる動物であり、これには霊長類（特にヒト）、およびウマ、ウシ、ブタ、およびヒツジなどのその他の哺乳類、ならびに全般的な家禽およびペットが含まれる。
【０１０５】
本発明の化合物は、それ自体で、あるいは薬学的に許容される担体との混合物として投与することができ、またペニシリン、セファロスポリン、アミノグリコシド、およびグリコペプチドなどの抗菌剤と併用して投与することもできる。併用治療には、最初に投与されたものの治療効果が、次のものが投与されたときに完全に消失していない形での、活性化合物の連続投与、同時投与、および個別投与が含まれる。
【０１０６】
本明細書で使用される「対象」または「患者」という用語は、好ましくは、特定の炎症性の病状を有する哺乳類などの温血動物を指す。モルモット、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、ヒツジ、およびヒトが、この用語の意味の範囲内の動物の例であることは、理解されるであろう。
【０１０７】
本明細書に記載される処置において使用される化合物の治療有効量は、当業者としての担当診断医が、従来の技法を用いて、また類似の状況下で得られた結果を観察することによって、容易に判断することができる。治療有効用量を判断する際には、担当診断医によって多数の要因が考慮される。これらの要因には、哺乳類の種；その大きさ、年齢、および全体的健康；関与している特定の疾患または状態；疾患または状態の程度または関与もしくは重症度；個々の対象の反応；投与される個々の化合物；投与方式；投与される製剤の生物学的利用性の特徴；選択される用法；併用薬の使用；およびその他の関連する状況が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０８】
本発明の組成物の治療有効量は、一般に、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ（活性成分の重量／患者の体重）を送達するのに十分な活性成分（すなわちＡＰＣＥまたはその阻害剤）をほぼ含有することになる。組成物は、好ましくは少なくとも０．５μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは少なくとも１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇを送達するであろう。
【０１０９】
本発明の方法の実行には、上記の投与量を送達するのに有効な量で、あらゆる好適な全身用または局所用の配合物として、治療有効量の活性成分を対象に投与することが含まれる。この投与量は、所望の治療効果により、１回で、あるいは（例えば）１日１〜５回、または週１回もしくは２回、あるいは静脈点滴または別の手段によって継続的に投与することができる。
【０１１０】
記載されているように、投与の好ましい量および方式は、当業者が判断することができる。製剤調製の分野の当業者は、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」の最新号（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）に記載されている、当該技術分野において既知の製剤技術を用いて、選択された化合物の個々の特徴、処置される病状、病期、およびその他の関連する状況に応じて、適当な投与の形態および方式を容易に選択することができる。
【０１１１】
医薬組成物は、当該技術分野において既知の技法を使用して製造することができる。典型的には、治療有効量の化合物は、薬学的に許容される担体と混合されることになる。
【０１１２】
本明細書に記載の分子の半減期は、当該技術分野において既知の方法を用いて、それらの分子を別のポリマーなどの分子に接合して、薬物−ポリマー複合体を形成することによって延長させることができる。例えば、分子は、「ペグ化」として知られる方法におけるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の分子など、当該技術分野にておいて既知の不活性ポリマーの分子に結合させることができる。ペグ化は、その結果、分子のｉｎ  ｖｉｖｏでの寿命、つまりは治療有効性を延長させることができる。
【０１１３】
ＰＥＧ分子は、例えば、Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ，  Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  Ｐｈａｒａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ」，  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ，  ２００１：４０（７）；  ５３９−５５１に示されるように、官能基によって修飾することができ、それに分子のアミノ末端、または存在するのであればシステイン残基、あるいは含まれるその他の連結アミノ酸を連結させることができ、ＰＥＧ分子は、１種類以上の分子を複数有することができる。
【０１１４】
「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」は、カップリング剤、あるいはカップリング部分または活性化部分と（例えば、チオール、トリフレート、トレシレート、アジリジン、オキシランと、または好ましくはマレイミド部分と）の誘導体化を伴う、あるいは伴わない、ポリアルキレングリコール化合物またはその誘導体を意味する。マレイミドモノメトキシＰＥＧなどの化合物は、例となる、あるいは活性化された本発明のＰＥＧ化合物である。ポリプロピレングリコールなどのその他のポリアルキレングリコール化合物を本発明に用いてもよい。その他の適当なポリマー複合体には、非ポリペプチドポリマー、以下の種類の荷電または中性ポリマー：デキストラン、コロミン酸、またはその他の炭水化物ベースのポリマー、ビオチン誘導体、およびデンドリマーなどが含まれるが、これらに限定されない。ＰＥＧという用語は、ポリアルキレンオキシド類のその他のポリマー類も含むように意図されている。
【０１１５】
ＰＥＧは、本明細書に記載される分子のいかなるＮ末端アミノ酸に連結してもよく、および／またはＮ末端アミノ酸の下流のアミノ酸残基である、例えばリジン、ヒスチジン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびシステイン、または当業者に既知のその他のかかるアミノ酸などに連結することもできる。
【０１１６】
ペプチドに付着したＰＥＧ担体部分は、分子量約２００〜２０，０００ＭＷの範囲であってよい。ＰＥＧ部分は、好ましくは約１，０００〜８，０００ＭＷ、より好ましくは約３，２５０〜５，０００ＭＷ、最も好ましくは約５，０００ＭＷとなる。本発明の分子ごとに共有結合しているＰＥＧ分子の実数は、所望の安定性（血清半減期）により大きく異なってもよい。本明細書において意図される分子は、例えば、それぞれの明細書および図面が参考として本明細書で援用される、米国特許第４，１７９，３３７号；第５，３８２，６５７号；第５，９７２，８８５号；第６，１７７，０８７号；第６，１６５，５０９号；第５，７６６，８９７号；および第６，２１７，８６９号に示される技法（ただし、これらに限定されない）を用いて、ＰＥＧ分子に連結することができる。
【０１１７】
あるいは、分子は、例えばコアセルベーション技法によって、または界面重合によって調製したマイクロカプセル中に捕捉することも（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン−マイクロカプセル、およびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）、コロイド状薬剤送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）中に捕捉することも、あるいはマクロエマルジョン中に捕捉することも可能である。かかる技法は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」の最新号に開示されている。
【０１１８】
米国特許第４，７８９，７３４号は、生化学物質をリポソーム中にカプセル化するための方法を記載しているが、これは開示内容全体が参考として本明細書で援用される。原則的に、水性水溶液に物質を溶解し、適当なリン脂質と脂質を必要であれば界面活性剤と共に加え、必要であれば物質を透析または超音波分解する。既知の方法の概説は、Ｇ．  Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓによる、Ｃｈａｐｔｅｒ  １４．  “Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ”，  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ｐｐ．  ２８７−３４１  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９７９）に記載されている。ポリマーまたはタンパク質から形成されたミクロスフェアは、当業者には周知であり、胃腸管から直接血流中に通過するように調整することができる。あるいは、薬剤を組み込み、ミクロスフェアまたはミクロスフェアの複合体を注入して、数日から数ヶ月の範囲のある期間にわたって徐放することもできる。例として、参考として本明細書で援用される、米国特許第４，９０６，４７４号；第４，９２５，６７３号；および第３，６２５，２１４号を参照されたい。
【０１１９】
組成物が注射可能な物質として使用される場合には、従来の注射可能な担体に配合される。好適な担体には、生体適合性であり、薬学的に許容されるリン酸塩緩衝生理食塩水があるが、これは好ましくは等張性である。
【０１２０】
本発明による凍結乾燥生成物の再形成のために、滅菌希釈剤を使用することができるが、これは、生理学的条件に近似することが一般に認められている物質、および／または政府規制に定められる物質を含んでもよい。この点において、滅菌希釈剤は、生理学的に許容されるｐＨ値を得るために、塩化ナトリウム、生理食塩水、リン酸塩緩衝生理食塩水、および／またはその他の生理学的に許容され、および／または安全に使用できる物質などの緩衝剤を含有してもよい。一般的に、ヒトにおける静脈内注射用の物質は、当業者が参照できる、食品医薬品局によって規定された規制に準拠すべきである。
【０１２１】
医薬組成物は、凍結乾燥生成物の再形成のための上述のものと同じ物質のうちの多数を含有する水性溶液の形態であってもよい。
【０１２２】
化合物は、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、およびリン酸などの無機酸、およびギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸などの有機酸との反応によって、あるいは水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなどの無機塩基、およびモノアルキル、ジアルキル、トリアルキル、およびアリールアミンならびに置換エタノールアミンなどの有機塩基との反応によって形成される、薬学的に許容される酸または塩基付加塩として投与してもよい。
【０１２３】
上述のように、本発明の化合物は、治療目的で使用できる医薬製剤中に組み込むことができる。ただし、「医薬製剤」という用語は、本明細書においてはより広い意味で解釈され、治療目的でだけでなく、当該技術分野において既知の試薬または診断目的で、あるいは組織培養のためにも使用される、本発明によるグリコスルホペプチド組成物を含有する製剤を包含するものとする。治療上の使用を目的とする医薬製剤は、本明細書に定義される、「薬学的に許容される」または「治療有効量の」分子を含有すべきである。
【０１２４】
本明細書に記載の全ての検定方法は、本明細書において提供される教示を踏まえ、当業者が十分に対応できる範囲にある。
【０１２５】
本明細書で引用する全ての参考文献、特許、および特許出願は、開示内容全体が参考として本明細書で援用される。特に米国特許出願第１０／７７４，２４２号、第６０／４４５，７７４号、第６０／８１１，５６８号、および第６０／８３６，３６５号は、開示内容全体が参考として本明細書で援用される。
【０１２６】
本発明およびその効果を詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨または適用範囲から逸脱することなく、種々の変更、置換、および改変を行なうことができることを理解すべきである。さらに、本出願の範囲は、本明細書に記載されるプロセス、製造、組成物、手段、方法、および工程の特定の実施形態に限定されるものではない。当業者が本発明の開示から容易に理解するように、本明細書に記載される相当する実施形態と実質的に同様の機能を果たす、あるいは実質的に同様の結果を達成する、現存する、またはのちに開発されることとなるプロセス、製造、組成物、手段、方法、または工程は、本発明によって使用することができる。従って、添付の特許請求の範囲は、その範囲に、そのようなプロセス、製造、組成物、手段、方法、または工程を含むものとする。
【０１２７】
参考文献
【０１２８】
【化１】
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【０１２９】
【化２】
2009539853.tif 000003
【０１３０】
【化３】
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【０１３１】
【化４】
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表Ｉ．環状アミンおよびプロリンアナログ
【０１３２】
【表１−１】
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【０１３３】
【表１−２】
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【０１３４】
【表１−３】
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【０１３５】
【表１−４】
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【０１３６】
【表１−５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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