(57)【要約】  本発明は、ＬＯＸ−１タンパク質をコードするＯＬＲ１遺伝子の新規選択的スプライシングアイソフォーム、治療に関連した使用及び方法と、心血管疾患の危険度の予測とに関する。
2009502119.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化低密度リポタンパク質受容体１（ＬＯＸ−１）をコードするＯＬＲ１遺伝子の選択的スプライシングアイソフォームであって、ヒトＯＬＲ１転写産物（ＮＭ００２５４３）の対応する天然オリゴヌクレオチド配列又はその相補配列と比較して、ヌクレオチド５６５からヌクレオチド６８０までのエキソン５が切除されていることを特徴とする選択的スプライシングアイソフォーム。
【請求項２】
以下のオリゴヌクレオチド配列、すなわち
2009502119.tif 000005
又はその相補配列を含む、請求項１に記載の選択的スプライシングアイソフォーム。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチド配列がＲＮＡ又はＤＮＡである、請求項１又は２のいずれか一項に記載の選択的スプライシングアイソフォーム。
【請求項４】
前記アイソフォームが標識されているか、或いはタンパク質マーカーをコードするオリゴヌクレオチド配列と融合している、請求項３に記載の選択的スプライシングアイソフォーム。
【請求項５】
前記タンパク質がルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びその変種、蛍光タンパク質、モノクローナル又はポリクローナル抗体によって認識されるｃ−ｍｙｃ又はタグエピトープ、蛍光色素、ビオチンから成る群から選択される、請求項４に記載の選択的スプライシングアイソフォーム。
【請求項６】
医学分野で使用するための、請求項１から５までのいずれか一項に記載の選択的スプライシングアイソフォーム。
【請求項７】
請求項１から５までのいずれか一項に記載の選択的スプライシングアイソフォームによってコードされているアミノ酸配列。
【請求項８】
以下のアミノ酸配列、すなわち
2009502119.tif 000006
を含む、請求項７に記載のアミノ酸配列。
【請求項９】
医学分野で使用するための、請求項７及び８のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
【請求項１０】
請求項８に記載のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列又はその相補配列。
【請求項１１】
請求項１から６までのいずれか一項に記載の選択的スプライシングアイソフォームのオリゴヌクレオチド配列、又は請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド配列若しくはその相補配列を含むベクター。
【請求項１２】
医学分野で使用するための、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
動脈硬化プラークの不安定性を抑制する抗アポトーシス薬を調製するための、請求項１から６までのいずれか一項に記載の選択的スプライシングアイソフォーム、若しくは請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド配列、又は請求項７から９までのいずれか一項に記載のアミノ酸配列、又は請求項１１から１２までのいずれか一項に記載のベクターの使用。
【請求項１４】
心血管疾患の危険度を判定するマーカーであって、好ましくは対応する天然アイソフォームの量と前記マーカーの量との間の比率を測定することによって判定するマーカーとしての、請求項１から５までのいずれか一項に記載の選択的スプライシングアイソフォーム、又は請求項７から８までのいずれか一項に記載のアミノ酸配列、又は請求項１１に記載のベクターの使用。
【請求項１５】
前記心血管疾患が、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、アテローム硬化性冠状動脈疾患、卒中発作、虚血、急性及び慢性の末梢血管疾患から成る群から選択される、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
心血管疾患の危険度を判定する方法であって、
ａ）生物試料中におけるＬＯＸ−１、及び請求項１から３まで又は請求項１０に記載の選択的スプライシングアイソフォームのｍＲＮＡレベルの定量検出を行うステップと、
ｂ）比率Ｒ、すなわちＬＯＸ−１の天然転写産物／請求項１から３まで又は請求項１０に記載の選択的スプライシングアイソフォームの転写産物の値を決定し、以下の値、すなわち
低危険度  Ｒ＜０．６
中程度の危険度  Ｒが０．７〜０．８の間
高危険度  Ｒ＞０．９
に基づいて相対危険度を判定するステップと
を含む方法。
【請求項１７】
ステップａ）の検出を、少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプローブと、天然ＬＯＸ−１及び／又は請求項１から３まで若しくは請求項１０に記載の選択的スプライシングアイソフォームのｍＲＮＡに特異的な少なくとも１対の特異的プライマーとを介したリアルタイムＰＣＲによって行う、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記検出を、２種のアイソフォーム、すなわちＬＯＸ−１及び選択的スプライシングＬＯＸＩＮアイソフォームを選択的に定量化できる２種のオリゴヌクレオチドプローブ及び２対のプライマーを介して行い、前記プローブが以下のオリゴヌクレオチド配列、すなわち
ｉ）ＬＯＸ−１プローブ  ５’−ＦＡＭ−ＡＧＣＴＧＡＴＣＴＧＧＡＣＴＴ−３’（配列番号３）、
ｉｉ）ＬＯＸＩＮプローブ  ５’−ＶＩＣ−ＣＡＧＣＴＧＡＴＣＴＧＡＴＴＴ−３’（配列番号４）
を含み、前記２対のプライマーが、
ｉｉｉ）ＬＯＸ−１  Ｆｗプライマー  ５’−ＴＧＣＣＡＡＧＴＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＴＡＡＴＡＧＣ−３’（配列番号５）、
ｉｖ）ＬＯＸ−１  Ｒｖプライマー  ５’−ＡＡＣＴＧＧＡＡＴＡＧＧＡＡＡＴＴＧＣＴＴＧＣＴ−３’（配列番号６）、
ｖ）ＬＯＸＩＮ  Ｆｗプライマー  ５’−ＴＧＣＣＡＡＧＴＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＴＡＡＴＡＧＣ−３’（配列番号７）、
ｖｉ）ＬＯＸＩＮ  Ｒｖプライマー  ５’−ＴＧＡＡＧＧＧＴＡＴＧＴＣＴＧＧＧＡＧＡＣＡ−３’（配列番号８）
を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記心血管疾患が、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、アテローム硬化性冠状動脈疾患、卒中発作、虚血、急性及び慢性の末梢血管疾患から成る群から選択される、請求項１６から１８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記生物試料が末梢血である、請求項１６から１９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
天然ＬＯＸ−１アイソフォーム用、及び請求項１から３まで若しくは請求項１０に記載の選択的スプライシングアイソフォームＬＯＸＩＮ用のオリゴヌクレオチドプローブ及び特異的プライマーを含む、心血管疾患の危険度を予測するための診断キットであって、前記プローブが下記のオリゴヌクレオチド配列、すなわち
ｉ）ＬＯＸ−１プローブ  ５’−ＦＡＭ−ＡＧＣＴＧＡＴＣＴＧＧＡＣＴＴ−３’（配列番号３）、
ｉｉ）ＬＯＸＩＮプローブ  ５’−ＶＩＣ−ＣＡＧＣＴＧＡＴＣＴＧＡＴＴＴ−３’（配列番号４）
を含み、前記対のプライマーが以下のオリゴヌクレオチド配列、すなわち
ｉｉｉ）ＬＯＸ−１  Ｆｗプライマー  ５’−ＴＧＣＣＡＡＧＴＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＴＡＡＴＡＧＣ−３’（配列番号５）、
ｉｖ）ＬＯＸ−１  Ｒｖプライマー  ５’−ＡＡＣＴＧＧＡＡＴＡＧＧＡＡＡＴＴＧＣＴＴＧＣＴ−３’（配列番号６）、
ｖ）ＬＯＸＩＮ  Ｆｗプライマー  ５’−ＴＧＣＣＡＡＧＴＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＴＡＡＴＡＧＣ−３’（配列番号７）、
ｖｉ）ＬＯＸＩＮ  Ｒｖプライマー  ５’−ＴＧＡＡＧＧＧＴＡＴＧＴＣＴＧＧＧＡＧＡＣＡ−３’（配列番号８）
を含む診断キット。
【請求項２２】
前記心血管疾患が、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、アテローム硬化性冠状動脈疾患、卒中発作、虚血、急性及び慢性の末梢血管疾患から成る群から選択される、請求項２０に記載のキット。
【請求項２３】
請求項１から３まで若しくは請求項１０に記載の選択的スプライシングアイソフォームＬＯＸＩＮを検出するためのプローブであって、以下のヌクレオチド配列、すなわち
５’−ＣＡＧＣＴＧＡＴＣＴＧＡＴＴＴ−３’（配列番号４）
を含むプローブ。
【請求項２４】
蛍光色素、放射性同位元素、発光物質から成る群から選択された物質で標識されている、請求項２３に記載のプローブ。
【請求項２５】
請求項１から３まで若しくは請求項１０に記載の選択的スプライシングアイソフォームＬＯＸＩＮを増幅するためのプライマーであって、以下のオリゴヌクレオチド配列、すなわち
Ｆｗ  ５’−ＴＧＣＣＡＡＧＴＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＴＡＡＴＡＧＣ−３’（配列番号７）、
Ｒｖ  ５’−ＴＧＡＡＧＧＧＴＡＴＧＴＣＴＧＧＧＡＧＡＣＡ−３’（配列番号８）
を含むプライマー。
【請求項２６】
天然ＬＯＸ−１アイソフォームを検出するためのプローブであって、以下のオリゴヌクレオチド配列、すなわち
５’−ＡＧＣＴＧＡＴＣＴＧＧＡＣＴＴ−３’（配列番号３）
を含むプローブ。
【請求項２７】
蛍光色素又は放射性同位元素の間で選択された物質で標識されている、請求項２６に記載のプローブ。
【請求項２８】
前記蛍光色素が６カルボキシルフルオレセインである、請求項２４及び２７のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項２９】
ＬＯＸ−１の天然アイソフォームを増幅するためのプライマーであって、以下のオリゴヌクレオチド配列、すなわち
Ｆｗ  ５’−ＴＧＣＣＡＡＧＴＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＴＡＡＴＡＧＣ−３’（配列番号５）、
Ｒｖ  ５’−ＡＡＣＴＧＧＡＡＴＡＧＧＡＡＡＴＴＧＣＴＴＧＣＴ−３’（配列番号６）
を含むプライマー。
【請求項３０】
請求項１１に記載のベクターで形質移入されている細胞。
【請求項３１】
１つ又は複数の薬理学的に許容できるアジュバント及び／又は賦形剤と共に、請求項１から６までのいずれか一項に記載の選択的スプライシングアイソフォーム又は請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド配列、又は請求項７から９までのいずれか一項に記載のアミノ酸性配列、又は請求項１１から１２までのいずれか一項に記載のベクターを有効成分として含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＬＯＸ−１タンパク質をコードするＯＬＲ１遺伝子の新規選択的スプライシングアイソフォーム、治療に関連した使用及び方法と、心血管病理学の危険度の予測とに関する。より詳細には、本発明は、アテローム性動脈硬化、心筋梗塞、冠状動脈病、卒中発作、虚血、急性及び慢性の末梢血管病態などの心血管病態を発症する危険度を予測する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アテローム硬化症は、工業国における死亡率及び罹患率の主要原因となっている遺伝子成分を有する多因子遺伝病である。アテローム硬化症の主な臨床徴候は、冠状動脈病（ＣＡＤ）、急性の心筋梗塞（ＡＭＩ）、卒中発作、及び末梢血管疾患によって代表される。最近の研究は、アテローム発生がもはや加齢の必然的結果ではなく、その発生が個々の因子、主として強い遺伝子成分（高血圧症、高コレステロール血症、糖尿病）及び環境（喫煙、食物、ストレス）に起因する慢性病であることを示している（Ｂｉｎｄｅｒ  ＣＪら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．８；１２１８−１２２６；Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，Ｄ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．８；１２１１−１２１７）。
【０００３】
最近、いくつかの疫学研究によって、アテローム性動脈硬化の発病機序で等しく重要なものとして現れつつある新たに特定された非伝統的危険因子が注目された（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，Ｄ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．８；１２１１−１２１７）。このうち、酸化低密度リポタンパク質（ＯｘＬＤＬ）は、アテローム発生の全過程で基礎的な役割を演じていると考えられている。ＯｘＬＤＬは、アテローム性動脈硬化プラークの開始における重要段階である内皮機能不全、反応性酸素分子種（フリーラジカル）の優先的産生、酸化窒素合成の阻害及び活性内皮細胞への単球接着の促進を引き起こす（Ｍｅｈｔａ  ＪＬ及びＴｈｅｍ  Ｄ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．３９；１４２９−１４３５；Ｃｈｅｎ  Ｍら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．９５；８９−１０）。
【０００４】
加えて、ＯｘＬＤＬは、平滑筋細胞の遊走及び増殖の誘導と、アテローム発生の重要事象である泡沫細胞形成に関与している（Ｃｈｅｎ  Ｍら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ  ９５；８９−１０）。ＯｘＬＤＬの血漿レベルの増大は、プラークの不安定性、及び急性冠状動脈症候群（ＭＩ及び不安定狭心症）に関連している。実際、示されているように、血漿ＯｘＬＤＬレベルは、急性冠状動脈症候群及び動脈硬化病変の重度と、有意な正の相関を示す。不安定プラークは、ＯｘＬＤＬ陽性マクロファージ（Ｅｈａｒａ  Ｓら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１０３；１９５５−１９６０）及びアポトーシス細胞を有意に高い割合で含有する。このシナリオに従って、ＯｘＬＤＬは、アテローム発生の過程に関与する様々な細胞（平滑筋細胞、内皮細胞、及びマクロファージ）の壊死及びアポトーシスを誘導することによって細胞傷害性となっていることが示されている（Ｃｈｅｎ  Ｊら、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．９４；２６９−２７０；Ｈａｒｄｗｉｃｋ  ＳＪら、Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １７９；２９４−３０２；Ｓａｔａ  Ｍら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１０２；１６８２−１６８２；Ｌｅｅ  ＴＳ及びＬｅｅ  ＹＣ、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２８０；７０９−７１８）。これらの過程は、動脈硬化プラークの不安定化、及びそれに続く、急性アテローム血栓性閉塞性血管障害及び組織梗塞を伴った破裂へと導くと提唱されている。
【０００５】
上述した影響の大部分は、ＯｘＬＤＬと、ＬＯＸ−１と名付けられたそれらの主要な受容体との相互作用によって決定される。ＬＯＸ−１受容体は、ＯＬＲ１遺伝子にコードされている。この遺伝子は、１２ｐ１２．３−１３．２の染色体領域にマッピングされ、６つのエキソン及び５つのイントロンによって構成されている。
【０００６】
ＬＯＸ−１は、Ｃ型レクチンファミリーに属するＩＩ型膜タンパク質である。ＬＯＸ−１は、４つのドメイン、すなわち短いＮ末端細胞質ドメイン、膜貫通領域、接続ネック部、及びＣ末端レクチン様ドメインから成り、Ｃ末端レクチン様ドメインの完全性は、その結合活性に決定的に必要である（Ｓａｗａｍｕｒａ  Ｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８６；７３−７７；Ｓｈｉ  Ｘ、ら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１４；１２７３−１２８２）。ＬＯＸ−１は、内皮細胞、マクロファージ、平滑筋細胞、及び血小板で発現される。さらに、ＬＯＸ−１は、アテローム由来の細胞で存在し、ヒト及び動物における動脈硬化病変で過剰発現される（Ｋａｔａｏｋａ  Ｈら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９９；３１１０−３１１７）。
【０００７】
上記の科学的証拠に基づいて、本発明の発明者らは、ＯＬＲ１遺伝子の多型と心筋梗塞の罹病性との間における統計的に有意な関連性を報告した（Ｍａｎｇｏ  Ｒら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ４０；９３３−９３６）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記の観点に照らして、明らかに、例えば心筋梗塞、脳血管不全、及び末梢血管疾患などの心血管疾患の危険度を評価するための新規の迅速かつ侵襲的でない方法を有する必要性がある。また、例えば動脈硬化プラークの形成、進行、及び不安定化の阻害を介して上記の心血管疾患を治療するための新規な治療標的を有することができることも望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の発明者らは、ついに、ＬＯＸＩＮと名付けられたタンパク質をコードする、ＯＬＲ１／ＬＯＸ−１遺伝子のスプライシングアイソフォームを同定及び性質決定した。ＬＯＸＩＮは、心筋梗塞などの心血管疾患を発症する危険性に対して保護的であることが示されている。
【００１０】
リアルタイムＰＣＲ、クローニング、及びウェスタンブロット分析による機能研究を介して、本発明者らは、ＬＯＸＩＮと名付けられた、ＬＯＸ−１受容体の新規なタンパク質アイソフォームを同定するのに成功した。ＬＯＸＩＮは、ＯＬＲ１遺伝子の選択的スプライシングによって産生される。ＯＬＲ１遺伝子転写産物に関して行われた機能研究は、ＯＬＲ１遺伝子のイントロン４、５、及び３’ＵＴＲに位置する、以前に本発明者らによって同定された多型によって、いかにして上記２つのアイソフォーム（ＯＬＲ１／ＬＯＸ−１完全長及びＬＯＸＩＮ）の発現が調節されているかを示した。詳細には、連鎖不平衡ブロックに位置する多型に心筋梗塞の危険性ハプロタイプを保持する対象は、ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルで、ＬＯＸＩＮの発現低下及びＬＯＸ−１の発現増大を示す。
【００１１】
したがって、本発明者らは、例えば心筋梗塞、脳血管不全、及び末梢血管疾患などの心血管疾患の危険度を予測するために、リアルタイムＰＣＲ（ＡＢＩ７０００装置）を用いて、末梢血から始めて、ＬＯＸＩＮ及びＬＯＸ−１転写産物を定量する迅速、経済的、かつ信頼できる方法を定めた。
【００１２】
加えて、フローサイトメトリー及び免疫蛍光法実験によって示される通り、新規に同定されたＬＯＸＩＮアイソフォームは、ＯｘＬＤＬによって誘導される細胞障害性を軽減し、アポトーシスの程度を４０％低減することができる。アポトーシスは動脈硬化プラーク不安定化の重要段階であるので、ＯｘＬＤＬで処理された細胞培養物又はＬＯＸ−１で形質移入された細胞培養物における、ＬＯＸＩＮ添加後のアポトーシス係数の低下に関する実験証拠は、ＬＯＸＩＮを、治療上の意味におけるプラーク不安定化の潜在的分子マーカー及び動脈硬化プラークの分子安定化剤として指定するものである。そのようなデータは、心筋梗塞を有する対象で行われたｉｎ  ｖｉｖｏ実験によって支持されている。これらの実験は、そのような患者のマクロファージが、より少ない量のＬＯＸＩＮを発現し、ｏｘＬＤＬによって誘導されるアポトーシス損傷に、より影響されやすいことを示している（図５パネルＡ）。
【００１３】
したがって、本発明の目的は、酸化低密度リポタンパク質受容体１（ＬＯＸ−１）をコードする、ＯＬＲ１遺伝子の選択的スプライシングアイソフォームであって、ヒトＯＬＲ１転写産物（ＮＭ００２５４３）の対応する天然オリゴヌクレオチド配列又はその相補配列と比較して、ヌクレオチド５６５からヌクレオチド６８０までのエキソン５が切除されていることを特徴とする選択的スプライシングアイソフォームである。
【００１４】
本発明の好ましい実施形態では、上記選択的スプライシングアイソフォームが以下のオリゴヌクレオチド配列、すなわち
2009502119.tif 000003
又はその相補配列を含む。
【００１５】
本発明のさらなる実施形態によれば、上記特定の選択的スプライシングアイソフォームは、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）又はＤＮＡ（ｃＤＮＡ）のオリゴヌクレオチド配列を含む。
【００１６】
本発明による上述の選択的スプライシングアイソフォームは、好ましくはルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びその変種、並びに様々なタイプの蛍光タンパク質、様々なタイプのエピトープ、ｃ−ｍｙｃ、モノクローナル若しくはポリクローナル抗体によって認識されるタグ、蛍光色素、ビオチンから成る群からは選択されるタンパク質マーカーで標識するか、或いはこれをコードするオリゴヌクレオチド配列と融合させることができる。
【００１７】
本発明の別の目的は、医学分野で使用するための上記特定の選択的スプライシングアイソフォームである。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、上記に定義した選択的スプライシングアイソフォームによってコードされているアミノ酸配列によって代表される。前記アミノ酸性配列は、以下のアミノ酸配列、すなわち
2009502119.tif 000004
を含むことが好ましい。
【００１９】
本発明のさらなる目的は、医学分野で使用するための上述のアミノ酸配列によって構成されている。
【００２０】
さらに本発明は、上述のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列又はその相補配列に関する。
【００２１】
本発明は、さらに、上記選択的スプライシングアイソフォームのオリゴヌクレオチド配列、又は上記に定義したタンパク質をコードするオリゴヌクレオチド配列を含むベクターに関する。加えて、本発明は、医学分野で使用するための上記特定のベクターに関する。
【００２２】
本発明の別の目的は、動脈硬化プラークの不安定性を抑制する抗アポトーシス薬を調製するための、上記に定義した選択的スプライシングアイソフォーム、又はアミノ酸配列、又はベクターの使用である。
【００２３】
本発明の目的は、上記に定義した選択的スプライシングアイソフォーム、又はアミノ酸配列、又はベクターの、心血管疾患の危険度を判定するマーカーとしての使用によって構成されている。心血管疾患の危険度の予測は、天然のオリゴヌクレオチド又はアミノ酸ＬＯＸ−１アイソフォームと、対応するマーカーとの間の定量的な比率を推定することによって行われることが好ましい。前記心血管疾患は、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、アテローム硬化性冠状動脈疾患、卒中発作、虚血、急性及び慢性の末梢血管疾患から成る群から選択されることがより好ましい。
【００２４】
さらに、本発明は、好ましくはアテローム性動脈硬化、心筋梗塞、アテローム硬化性冠状動脈疾患、卒中発作、虚血、急性及び慢性の末梢血管疾患から成る群から選択される心血管疾患の危険度を判定する方法に関し、この方法は、
ａ）生物試料中、好ましくは末梢血中における、天然ＬＯＸ−１及び本発明による選択的スプライシングアイソフォームのｍ−ＲＮＡレベルの定量検出を行うステップと、
ｂ）比率Ｒ、すなわちＬＯＸ−１転写産物／請求項１から３に記載の選択的スプライシングアイソフォームの転写産物の値を決定し、以下の値、すなわち
低危険度  Ｒ＜０．６
中程度の危険度  ０．７＜Ｒ＜０．８
高危険度  Ｒ＞０．９
に基づいて相対危険度を判定するステップとを含む。
【００２５】
ステップａ）の検出は、リアルタイムＰＣＲ、並びに天然ＬＯＸ−１及び／又は本発明による選択的スプライシングアイソフォームｍＲＮＡの少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプローブ及び少なくとも１対の特異的プライマーによって行われることが好ましい。本発明の方法の好ましい実施形態によれば、検出を、２種のアイソフォーム、すなわちＬＯＸ−１及び選択的スプライシングアイソフォームＬＯＸＩＮを選択的に定量化できる２種のオリゴヌクレオチドプローブ及び２対のプライマーを介して行い、前記プローブが以下のオリゴヌクレオチド配列、すなわち
ｉ）ＬＯＸ−１プローブ  ５’−ＦＡＭ−ＡＧＣＴＧＡＴＣＴＧＧＡＣＴＴ−３’（配列番号３）、
ｉｉ）ＬＯＸＩＮプローブ  ５’−ＶＩＣ−ＣＡＧＣＴＧＡＴＣＴＧＡＴＴＴ−３’（配列番号４）
を含み、前記２対のプライマーが、
ｉｉｉ）ＬＯＸ−１  Ｆｗプライマー  ５’−ＴＧＣＣＡＡＧＴＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＴＡＡＴＡＧＣ−３’（配列番号５）、
ｉｖ）ＬＯＸ−１  Ｒｖプライマー  ５’−ＡＡＣＴＧＧＡＡＴＡＧＧＡＡＡＴＴＧＣＴＴＧＣＴ−３’（配列番号６）、
ｖ）ＬＯＸＩＮ  Ｆｗプライマー  ５’−ＴＧＣＣＡＡＧＴＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＴＡＡＴＡＧＣ−３’（配列番号７）、
ｖｉ）ＬＯＸＩＮ  Ｒｖプライマー  ５’−ＴＧＡＡＧＧＧＴＡＴＧＴＣＴＧＧＧＡＧＡＣＡ−３’（配列番号８）
を含む。
【００２６】
本発明の目的は、心血管疾患の危険度を予測するための、天然ＬＯＸ−１アイソフォーム用及び本発明による選択的スプライシングＬＯＸＩＮアイソフォーム用のオリゴヌクレオチドプローブ及び特異的プライマーを含む診断キットであり、前記プローブは、以下のオリゴヌクレオチド配列、すなわち
ｉ）ＬＯＸ−１プローブ  ５’−ＦＡＭ−ＡＧＣＴＧＡＴＣＴＧＧＡＣＴＴ−３’（配列番号３）、
ｉｉ）ＬＯＸＩＮプローブ  ５’−ＶＩＣ−ＣＡＧＣＴＧＡＴＣＴＧＡＴＴＴ−３’（配列番号４）を含み、前記対のプライマーは以下のオリゴヌクレオチド配列、すなわち
ｉｉｉ）ＬＯＸ−１  Ｆｗプライマー  ５’−ＴＧＣＣＡＡＧＴＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＴＡＡＴＡＧＣ−３’（配列番号５）、
ｉｖ）ＬＯＸ−１  Ｒｖプライマー  ５’−ＡＡＣＴＧＧＡＡＴＡＧＧＡＡＡＴＴＧＣＴＴＧＣＴ−３’（配列番号６）、
ｖ）ＬＯＸＩＮ  Ｆｗプライマー  ５’−ＴＧＣＣＡＡＧＴＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＴＡＡＴＡＧＣ−３’（配列番号７）、
ｖｉ）ＬＯＸＩＮ  Ｒｖ  プライマー５’−ＴＧＡＡＧＧＧＴＡＴＧＴＣＴＧＧＧＡＧＡＣＡ−３’（配列番号８）
を含む。
【００２７】
前記心血管疾患は、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、アテローム硬化性冠状動脈疾患、卒中発作、虚血、急性及び慢性の末梢血管疾患から成る群から選択されることが好ましい。
【００２８】
本発明は、以下の核酸配列、すなわち
５’−ＣＡＧＣＴＧＡＴＣＴＧＡＴＴＴ−３’（配列番号４）
を含む、本発明による選択的スプライシングアイソフォームＬＯＸＩＮを検出するためのプローブ、並びに以下の核酸配列、すなわち
５’−ＡＧＣＴＧＡＴＣＴＧＧＡＣＴＴ−３’（配列番号３）
を含む、天然ＬＯＸ−１アイソフォームを検出するためのプローブにも関する。前記プローブは、蛍光色素及び放射性同位元素から成る群から選択される物質で標識されることが好ましく、前記蛍光色素は、６−カルボキシルフルオレセインであることがより好ましい。
【００２９】
本発明のさらに別の目的は、以下のオリゴヌクレオチド配列、すなわち
Ｆｗ  ５’−ＴＧＣＣＡＡＧＴＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＴＡＡＴＡＧＣ−３’（配列番号７）、
Ｒｖ  ５’−ＴＧＡＡＧＧＧＴＡＴＧＴＣＴＧＧＧＡＧＡＣＡ−３’（配列番号８）
を含む、上記に定義した選択的スプライシングアイソフォームＬＯＸＩＮの増幅プライマー、並びに以下のオリゴヌクレオチド配列、すなわち
Ｆｗ  ５’−ＴＧＣＣＡＡＧＴＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＴＡＡＴＡＧＣ−３’（配列番号５）、
Ｒ  ｖ５’−ＡＡＣＴＧＧＡＡＴＡＧＧＡＡＡＴＴＧＣＴＴＧＣＴ−３’（配列番号６）
を含む、天然ＬＯＸ−１アイソフォームの増幅プライマーである。
【００３０】
本発明によるベクターで形質移入された細胞も、本発明の目的である。
【００３１】
最後に、本発明は、１つ又は複数の薬学的に許容されるアジュバント及び／又は賦形剤と共に、上記に定義した選択的スプライシングアイソフォーム、又はアミノ酸配列、又はベクターを有効成分として含む医薬組成物に関する。
【００３２】
以下に、限定ではなく例示を目的として、添付した図及び実施例を特に参照して、好ましい実施形態に従って本発明の記述を行う。
【実施例】
【００３３】
（実施例１）
ＯＬＲ１遺伝子の選択的アイソフォームの同定
この研究は、最初に、ＯＲＬ１遺伝子の新規な機能的アイソフォームの同定及び特性分析を報告し、ＯＲＬ１遺伝子内のＳＮＰと心筋梗塞との間の遺伝的関連性の機能的特性分析を提供する。
【００３４】
２種の転写産物、すなわちＯＬＲ１（天然転写産物）及びＬＯＸＩＮ（選択的スプライシングアイソフォーム）の相対量が連鎖不平衡（ＬＤ）ブロック内に位置するＳＮＰによって調節されることが実証されている。新規スプライス変種ＬＯＸＩＮが完全長受容体ＬＯＸ−１と同様なレベルで発現されていることは、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験の両方が示している。「非危険」ハプロタイプを保持する対象のマクロファージは、より多くのＬＯＸＩＮを発現し、ｏｘＬＤＬ誘導の際に、アポトーシスを行う細胞がより少ない結果となる。マクロファージは、脂肪線条の発生から最終的にプラーク破裂及び心筋梗塞に寄与する過程まで、アテローム性動脈硬化プラーク形成のすべてのフェーズで重要な役割を果たしている（Ｌｉ  ＡＣ、Ｇｌａｓｓ  ＣＫ、「治療介入の標的としてのマクロファージ泡沫細胞（Ｔｈｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｆｏａｍ  ｃｅｌｌ  ａｓ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）」、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．８；１２３５−１２４２；Ｋａｖｕｒｍａ  ＭＭ、Ｂｈｉｎｄｉ  Ｒ、Ｌｏｗｅ  ＨＣ、Ｃｈｅｓｔｅｒｍａｎ  Ｃ、Ｋｈａｃｈｉｇｉａｎ  ＬＭ、「血管壁アポトーシス及び動脈硬化プラークの不安定性（Ｖｅｓｓｅｌ  ｗａｌｌ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｐｌａｑｕｅ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ）」、Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ３；４６５−４７２；Ｔａｂａｓ  Ｉ、「アテローム硬化症におけるアポトーシス及びプラーク不安定化：コレステロールによって誘導されるマクロファージアポトーシスの役割（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｌａｑｕｅ  ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）」、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．１１；１２−１６）。実際、病理学的研究からの証拠は、プラーク常在マクロファージのアポトーシスを、動脈硬化病変の破裂及び血栓症、並びにそれに続く、急性血管合併症の発症と結びつけている。
【００３５】
詳細には、マクロファージの大規模なアポトーシスは、プラーク破裂の部位でのみ起こり、破裂及び血栓症の過程に寄与するものである可能性があると提唱されている（Ｋｏｌｏｄｇｉｅ  ＦＤ、Ｎａｒｕｌａ  Ｊ、Ｂｕｒｋｅ  ＡＰ、Ｈａｉｄｅｒ  Ｎ、Ｆａｒｂ  Ａ、Ｈｕｉ−Ｌｉａｎｇ  Ｙ、Ｓｍｉａｌｅｋ  Ｊ、Ｖｉｒｍａｎｉ  Ｒ、「冠動脈突然死におけるアポトーシスマクロファージのプラーク破裂部位局在性（Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｐｌａｑｕｅ  ｒｕｐｔｕｒｅ  ｉｎ  ｓｕｄｄｅｎ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｄｅａｔｈ）」、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １５７；１２５９−１２６８）。ＬＯＸＩＮレベルの増大及びマクロファージのアポトーシスレベルの低減は、今度はこれが脆弱なプラークの性質に影響を与えることによってプラーク安定化をもたらすかもしれないことを示唆していると、本発明者らは見出した。この研究は、２種のアイソフォームの細胞局在の相違を、免疫蛍光法研究によって示す。ＬＯＸＩＮ−ＧＦＰコンストラクトで形質移入された株化細胞において、本発明者らは、形質移入された細胞の９０％で、ＬＯＸＩＮアイソフォームの表面発現が見られないことを示す。これは小胞体ＥＲでのＬＯＸＩＮの保持と、核周囲領域におけるこのタンパク質の蓄積とに起因している。原形質膜へのＬＯＸ−１受容体の細胞輸送の調節は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるその機能の制御に必須な機構を提供し得る。この文脈では、Ｃ末端側ドメインにおける様々なスプライス変種アイソフォームが、グルタミン酸受容体など、他の受容体で報告されている。この場合、上記ドメインは、シナプス膜でグルタミン酸受容体の輸送及び安定化に関与するタンパク質の相互作用部位であり、その結果として、シナプス強度及び可塑性で役割を果たしていることが示されている（バリー  ＭＦ、Ｚｉｆｆ  ＥＢ、「興奮性シナプスの受容体輸送及び可塑性（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ  ｓｙｎａｐｓｅｓ）」、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  １２；２７９−２８６；Ｃａｒｒｏｌｌ  ＲＣ、Ｚｕｋｉｎ  ＲＳ、「ＮＭＤＡ受容体輸送及びターゲッティング：シナプス伝達及び可塑性における意味（ＮＭＤＡ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ）」、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ２５；５７１−５７７）。
【００３６】
ＬＯＸＩＮが、ＬＯＸ−１とヘテロマー受容体を形成し、その細胞内輸送をｉｎ  ｖｉｖｏで調節するかどうかは研究中である。
【００３７】
ＬＯＸ−１受容体は、線維芽細胞で異所発現された場合、毒性であり、アポトーシスを行う細胞の割合が高くなる結果をもたらす。本発明者らは、ＬＯＸ−１受容体と同時発現された場合に、ＬＯＸＩＮ分子が防護的役割を有し、アポトーシス表現型から救出できることをここで実証する。ＬＯＸＩＮが、それによって防護的役割を行う機構は知られていないが、本発明者らは様々な仮説を提唱する。第１に、ＬＯＸＩＮは不活性なヘテロ二量体を形成することによって、ＬＯＸ−１受容体に影響を与えている可能性がある。ＬＯＸＩＮスプライス変種はエキソン５を欠失しているので、それはｏｘ−ＬＤＬの結合領域を欠失している。細胞内ＬＯＸＩＮの相対量を増大させることによって、ｏｘＬＤＬに結合できる機能的受容体の数が低減される可能性がある。ｏｘＬＤＬはマクロファージのアポトーシスを誘導するので、それによって、ｏｘＬＤＬ結合部位を減少させれば、アポトーシスを行う細胞がより少なくなるであろう。第２に、ＬＯＸＩＮは、細胞膜に向けたＬＯＸ−１受容体の輸送に作用し、それらがＥＲに入るのを阻止し、それらの膜発現を下方制御している可能性がある。第３に、ＬＯＸＩＮ自体が抗アポトーシス活性を有している可能性さえある。これらの様々な仮説がさらなる研究を行う根拠となっている。
【００３８】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける両アイソフォームの発現レベルが類似していることに留意することが重要である。「非危険」ハプロタイプに関してホモ接合型である対象は、「危険」ハプロタイプに関してホモ接合型であるものと比較して、ＬＯＸＩＮ発現のわずかな増大を示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験は、２種のアイソフォーム間のこの微細なバランスを確認した。少量のＬＯＸＩＮは、ＯＬＲ１遺伝子のＬＤブロックに局在するＬＯＸ−１多型によって誘導される致死表現型を救出するのに十分であり、それらの機能的役割と併せて、心筋梗塞の罹病性を予測するための重要な遺伝的危険因子である可能性がある。さらにＬＯＸＩＮは、動脈硬化プラークの進行及び不安定化を阻止するための新標的となる可能性があろう。したがって、ＬＯＸＩＮの発現を優先的に増大させる新研究又は治療戦略は、プラーク不安定性の阻止に有効である可能性があろう。
【００３９】
材料及び方法
ＲＴ−ＰＣＲ実験
全ＲＮＡは、単球由来マクロファージ及びＣＯＳ７細胞から、ＲＮｅａｓｙミニ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した。ポリＡ＋ＲＮＡは、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ（商標）ｍＲＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した。逆転写は、Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ａｒｃｈｉｖｅキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて行った。ＲＴ産物は、順方向のＯＬＲ１−ＦＷプライマー（５’−ＴＧＴＴＧＡＡＧＴＴＣＧＴＧＡＣＴＧＣＴＴ−３’（配列番号９））及び逆方向のＯＬＲ１−ＲＷプライマー（５−’ＴＴＣＴＧＣＡＧＣＣＡＧＣＴＡＡＡＴＧＡ−３’（配列番号１０））を用いて増幅し、その後、ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてサブクローニングした。
【００４０】
ＤＮＡコンストラクト
ミニ遺伝子：選択的スプライシングされた、ＯＬＲ１遺伝子のエキソン５を囲むゲノム配列を増幅するために、本発明者らは、ＯＬＲ１  Ｘｈｏｌ  Ｆ（５’−ＡＣＡ  ＧＴＣ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＧＴＧ  ＡＧＴ  ＧＴＴ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＴＡＴ  ＴＴＧ−３’（配列番号１１））  及びＯＬＲ１−ＥｃｏＲＩＲ（５’ＴＧＴ  ＧＴＧ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＧＴＡ  ＧＧＡ  ＡＡＡ  ＡＣＡ  ＡＡＡ−３’（配列番号１２））のプライマー対を用いた。本発明者らは、ＯＬＲ１遺伝子のＬＤブロックにおける「危険」又は「非危険」ハプロタイプに関してホモ接合型であるヒトゲノムＤＮＡをＰＣＲ鋳型として用いた。これらのＰＣＲ産物は、ＯＬＲ１ＳＥＱＦ（５’−ＧＴＴ  ＴＣＣ  ＴＡＴ  ＴＣＴ  ＴＴＧ  ＣＴＧ  ＡＡＣ−３’（配列番号１３））及びＯＬＲ１ＳＥＱＲ（５’−ＧＴＧ  ＧＧＧ  ＡＧＴ  ＡＡＴ  ＧＴＴ  ＴＣＴ  ＧＡＧ−３’（配列番号１４））プライマーを用いて、ｐＳＰＬ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングし、配列決定した。
【００４１】
組換え体タンパク質：ＬＯＸ−１−ＧＦＰ及びＬＯＸＩＮ−ＧＦＰコンストラクトを作製するために、ＯＬＲ１遺伝子及びスプライシング変種ＬＯＸＩＮのコード配列を、ヒト心臓ポリＡ＋ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社）に由来するｃＤＮＡから、選択されたオリゴを用いて、ＰＣＲによって増幅させた。ＯＬＲ１を増幅するには、Ｆ１（５’ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣＣＴＡＡＡＧ３’（配列番号１５））及びＦ２（５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴ  ＧＴＧＣＴＣＴＴＡＧＧＴＴＴＧＣ３’（配列番号１６））プライマーを用いた。ＬＯＸＩＮを増幅するには、Ｆ１及びＦ３（５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＣＡ  ＧＡＴＣＡＧＣＴＧＴＧＣＴＡＴＴ３’（配列番号１７））プライマーを用いた。ＰＣＲ産物は、Ｘｈｏｌ／ＢａｍＨｌで消化されたｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社）にクローニングし、ＣＥＱ２０００（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔａｒｄ社）を用いて配列決定した。
【００４２】
定量的リアルタイムＰＣＲ
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、ＴａｑＭＡＮ  ＡＢＩ７０００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で行った。本発明者らは、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ２．０ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、天然転写産物（ＯＬＲ１）及び選択的にスプライシングされたアイソフォームの特異的な定量分析に用いるプライマー及びＭＧＢプローブを設計した。上記プライマー及びＭＧＢプローブの配列は以下の通りである。
ｉ）ＬＯＸ−１プローブ  ５’−ＦＡＭ−ＡＧＣＴＧＡＴＣＴＧＧＡＣＴＴ−３’（配列番号３）
ｉｉ）ＬＯＸＩＮプローブ  ５’−ＶＩＣ−ＣＡＧＣＴＧＡＴＣＴＧＡＴＴＴ−３’（配列番号４）
そして、前記対のプライマーは、以下のオリゴヌクレオチド配列を含む。
ｉｉｉ）ＬＯＸ−１  Ｆｗプライマー  ５’−ＴＧＣＣＡＡＧＴＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＴＡＡＴＡＧＣ−３’（配列番号５）
ｉｖ）ＬＯＸ−１  Ｒｖプライマー  ５’−ＡＡＣＴＧＧＡＡＴＡＧＧＡＡＡＴＴＧＣＴＴＧＣＴ−３’（配列番号６）
ｖ）ＬＯＸＩＮ  Ｆｗプライマー  ５’−ＴＧＣＣＡＡＧＴＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＴＡＡＴＡＧＣ−３’（配列番号７）
ｖｉ）ＬＯＸＩＮ  Ｒｖプライマー  ５’−ＴＧＡＡＧＧＧＴＡＴＧＴＣＴＧＧＧＡＧＡＣＡ−３’（配列番号８）
【００４３】
試料ごとに添加されたｃＤＮＡ量を正規化するには、市販のＰｒｅｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ＴａｑＭａｎ内在性参照ＧＡＰＤＨの遺伝子（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いた。ＲＮＡ発現の相対定量を測定するには、比較ＣＴ法を用いた。すべてのＰＣＲ反応は三つ組で行った。
【００４４】
結果は、対照遺伝子（ＧＡＰＤＨ）に対して正規化された天然転写産物（ＯＬＲ１）の発現レベルと、対照遺伝子（ＧＡＰＤＨ）に対して正規化された選択的スプライシングアイソフォーム（ＬＯＸＩＮ）の発現レベルとの間の比率として表される。
【００４５】
細胞培養及び形質移入
ヒト単球は、「危険」及び「非危険」ハプロタイプに関してホモ接合型である対象の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離した。本発明者らは、以前の記載（Ｓａｗａｍｕｒａ  Ｔら、Ｎａｔｕｒｅ、３８６；７３−７７）に従って、マクロファージへのそれらの移行をｉｎ  ｖｉｔｒｏで促進させた。分化は、抗ＣＤ３６  ＦＩＴＣモノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリーによって判定した（細胞純度＞９５％）。ＣＯＳ−７線維芽細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＰＢＳ）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で培養した。ＣＯＳ−７の一過性形質移入は、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット（Ａｍｅｘａ  Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ社）を用いて行った。１μｇのプラスミドＤＮＡを、１００μｌのヒト皮膚線維芽細胞Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液（Ａｍｅｘａ  Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ社）中に懸濁された５×１０５のＣＯＳ−７に添加した。高密度の形質移入には、Ａ−２４プログラムを選択した。すべての対象にインフォームドコンセントを与え、研究プロトコールは、Ｔｏｒ  Ｖｅｒｇａｔａ大学倫理委員会によって承認されたものである。
【００４６】
アポトーシスの評価
分化したマクロファージを無血清で１５時間培養し、その後、ｏｘＬＤＬ（１００μｇ／ｍｌ；Ｉｎｔｒａｃｅｌ社）と共に、アポトーシス検出の前の８時間インキュベートした。アポトーシスは、多パラメータフローサイトメトリーによって、アポトーシス、壊死、又は生存のリンパ系細胞からの核を識別する方法を用いて評価した（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ  Ｃら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ３５；１４５−１５３）。単離した核は、ＦＡＣＳｓｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｋｉｎｓｏｎ社）を用いて、蛍光によって、そして、フォワード及びサイドアングル散乱多パラメータ分析によって分析した。各試料あたり最少５０００回のイベントを収集した。アポトーシス線維芽細胞は、以前に記載されている通りに（Ｆｉｌｅｓｉ  Ｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１５；１８０３−１８１３）、青色蛍光色素ヘキスト３３３４２（Ｓｉｇｍａ社）による染色及びホスファチジルセリンアッセイによって可視化した。ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＬＯＸ−１−ＧＦＰ、及びＬＯＸＩＮ−ＧＦＰ組換え体タンパク質で形質移入された細胞から、アネキシンＶ及びヘキスト３３３４２陽性細胞を計数した。
【００４７】
免疫蛍光法染色
免疫蛍光法は、記載されている通りに行った（Ｈｅｉｎｌｏｔｈ  Ａら、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  １６２；９３−１０１）。アフィニティー精製した抗ウサギＬＯＸ−１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）、ヤギ抗カルネキシン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）、及びマウス抗ゴルジ５８Ｋ（Ｓｉｇｍａ社）タンパク質を一次抗体として用いた。テクサスレッドヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）、テクサスレッドヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）、及びローダミンレッド−Ｘ結合ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅウサギ抗ヤギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅａｓｅａｒｃｈ社）を２次抗体として用いた。ヘキスト３３３４２色素は１μｇ／ｍｌで用いた。試料は、ＣＣＤカメラを装備したＤＭＲＡ  Ｌｅｉｃａ蛍光顕微鏡で検査した。後天的なイメージは、Ｌｅｉｃａ  Ｑ−ｆｌｕｏｒｏソフトウェアを用いて解析し、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを用いて処理した。
【００４８】
ウェスタンブロット分析及び酵素分解
ＰＢＭＣ及びＣＯＳ７細胞を、氷冷細胞抽出緩衝液（ＥＢ）（１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、０．５％ノニデットＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌペプスタチンＡ、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、及び０．３μＭ／Ｌアプロチニン）中で３０分間溶解させた。４℃、２９０ｇ、１０分間の遠心分離によって核及び大きな破片を除去した。その後、５倍容量のＭｅＯＨ、−２０℃で、２時間、上清を沈殿させた。遠心分離（１６０００ｇ、１０分間、４℃）の後、４試料緩衝液（５００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、４０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴ、及び０．０２％ブロムフェノールブルー）中にタンパク質ペレットを溶解させ、９５℃で、５分間加熱した。
【００４９】
ブロットは、ウサギ抗ＬＯＸ−１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）でプローブした。
【００５０】
免疫反応性のバンドを、ヒツジ抗ウサギＩｇＧホースラディシュペルオキシダーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いて検出し、ＥＣＬ（Ｓｉｇｍａ社）によって可視化した。酵素的脱グリコシル化は以前に記載されている通りに行った（Ｃａｒｄｉｎａｌ  Ｔｏら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３４；１７１−１７８）。
【００５１】
統計的分析
すべての統計的分析は、ＳＰＳＳバージョン１３ソフトウェアを用いて行った。データは、平均±１標準偏差（ＳＤ）として表される。連続的変量の正規分布は、リルファーズ（Ｌｉｌｌｅｆｏｒｓ）補正を用いたコルモゴロフ−スミルノフによって検証した。連続的変量の平均における相違は、必要に応じて、対応のないｔ検定又はＡＮＯＶＡによって分析した。多重比較にはボンフェローニ補正を用いた。
【００５２】
結果
選択的スプライス型ＯＬＲ１遺伝子の同定
本発明者らは、ヒトＯＬＲ１遺伝子のＲＮＡスプライシングに対する、ＬＤブロック内に位置するＳＮＰの潜在的影響を試験するために、ヒト単球由来マクロファージの全ＲＮＡ又はポリ（Ａ）＋ＲＮＡから開始し、それに逆転写を施した。本発明者らは、ＯＬＲ１遺伝子の５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲに位置するプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、増幅された断片の配列決定を行った。この分析によって、エキソン５（ＯＬＲ転写産物の配列のヌクレオチド５６５からヌクレオチド６８０まで）付近における選択的スプライシングの再現可能なパターンを同定した。詳細には、本発明者らは、両方のＲＮＡ画分に、２種のＯＬＲ１転写産物を同定した。これらの産物の１つは完全長転写産物（ＯＬＲ１）に対応していたが、もう一方はエキソン５を欠失していた。本発明者らは、それをＬＯＸＩＮ（図１Ｂ）と命名した。新規のスプライシングｍＲＮＡは、翻訳産物の中途での終止に導くオープンリーディングフレーム中の終止コドンを有し、レクチン様ドメイン（図１Ｃ）の２／３を欠失した予測タンパク質を生成する。いくつかの細胞型（内皮細胞、線維芽細胞、及び平滑筋細胞）及び組織（心臓、腎臓、及び脳）で、両アイソフォームが検出された。これは、それらがＯＬＲ１遺伝子（図１Ｂ）の発現の生理的パターンを反映していることを示す。
【００５３】
ＬＤブロック内に位置するＳＮＰはｍＲＮＡアイソフォームのレベルを調節する
ＬＤブロック内に位置するＳＮＰが２つのｍＲＮＡアイソフォームのレベルを調節することのｉｎ  ｖｉｖｏの証拠を見出すために、本発明者らは、ＯＬＲ１遺伝子の「危険」及び「非危険」ハプロタイプを保持する選択された患者のヒト単球由来マクロファージの全ＲＮＡから開始して、アイソフォーム特異的なリアルタイムＰＣＲを行った。この分析によって、本発明者らは、ハプロタイプに応じてｍＲＮＡ比（ＯＬＲ１／ＬＯＸＩＮ）が著しく異なっていることに気づいた。詳細には、「危険」ハプロタイプに関してホモ接合型である対象のヒト単球由来マクロファージでは、「非危険」ハプロタイプに関してホモ接合型であるもと比較して、ＯＬＲ１／ＬＯＸＩＮ  ｍＲＮＡ比が３３％高かった（図２Ａ）。
【００５４】
ＯＬＲ１／ＬＯＸＩＮ  ｍＲＮＡの比率Ｒは、心筋梗塞の危険度に相関していた。すなわち
低危険度  Ｒ＜０．６
中程度の危険度  Ｒ  ０．７〜０．８
高危険度  Ｒ＞０．９
「非危険」ハプロタイプを保持する対象で、ＬＯＸＩＮ転写産物の相対量が有意に多かったという新知見は、ＬＯＸＩＮ  ｍＲＮＡのレベルと、ヒトにおける心筋梗塞の発症との間における負の連結を強く示唆する。
【００５５】
上記イントロン多型の調節的役割をさらに確認するために、本発明者らは、イントロン４、エキソン５、及びイントロン５を含有するゲノム配列と共に「危険」及び「非危険」ハプロタイプを保持するミニ遺伝子を構築することによってこれらの研究を拡張した（図２Ｂ）。これらのコンストラクトをＣＯＳ−７線維芽細胞に形質移入し、非スプライス（エキソン５＋）対スプライス（エキソン５−）転写産物の比率を、リアルタイムのアイソフォーム特異的ＰＣＲによって分析した。図２Ｃで見ることができるように、非スプライス型（５＋）対スプライス型（５−）の比率は、「危険」ハプロタイプを保持するミニ遺伝子で形質移入された細胞から抽出されたＲＮＡで、２７％高かった。これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験は、２つのアイソフォームの相対的量が、ＬＤブロック内のイントロンＳＮＰマッピングによって調節されることを示唆するだけでなく、以前に記載されたｉｎ  ｖｉｖｏ結果も確認するものである（図２Ａ）。
【００５６】
ＬＯＸ−１及びＬＯＸＩＮスプライス変種の細胞内分布及び膜分布
天然転写産物（ＯＬＲ１）及びスプライス変種の細胞局在を調査するために、本発明者らは、哺乳類細胞における、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）にＣ末端で融合したＬＯＸ−１及びＬＯＸＩＮの効率的発現を可能にする２つのプラスミドを構築した。形質移入されたＣＯＳ−７線維芽細胞の免疫蛍光分析は、完全長ＬＯＸ−１−ＧＦＰの細胞内発現が細胞致死表現型を引き起こすことを明らかにした。多くの形質移入細胞が、丸い形になり、培養皿から脱離する傾向を有する。反対に、ＬＯＸＩＮ−ＧＦＰアイソフォームは効率的に発現され、その発現は細胞障害性をもたらさない。毒性効果にもかかわらず、多くのＬＯＸ−１−ＧＦＰ形質移入細胞が正常な形態学を保持し、これによって、本発明者らによる細胞内分布の研究が可能となった。
【００５７】
図４Ａ（パネルＡ〜Ｃ）に示す通り、ＬＯＸ−１は、ＥＲ及びゴルジ装置に分布していた。形質移入の２４時間後には、ＬＯＸ−１は専らゴルジ５８Ｋタンパク質と共在していた。これは、合成の初期フェーズにあるＬＯＸ−１受容体は分泌経路に沿って輸送されることを示す。対照的に、ＬＯＸＩＮ−ＧＦＰは、透過処理を受けたＣＯＳ７細胞のゴルジ片中では検出できなかった。これらの細胞では、本発明者らは、典型的なＥＲ分布の特徴である、より広範囲な染色を観察した。ＬＯＸＩＮ−ＧＦＰで形質移入された細胞の４０％から５０％で、核周囲領域における蛍光の蓄積も検出された（図４Ａ、パネルＤ〜Ｆ）。ＧＦＰタグの付いた上記２種のアイソフォームは、生存細胞の表面受容体も標識した（図３Ｂ及び４）。形質移入の２４時間後には、ＬＯＸ−１−ＧＦＰを発現する９０％以上の細胞が、典型的な断続的原形質膜関連蛍光を示した（図４Ｂ、パネルＣ）。注目すべきことに、ＬＯＸＩＮ−ＧＦＰで形質移入されたＣＯＳ７細胞の１０％未満が表面染色を示した（図３Ｂ、パネルＦ）。原形質膜におけるＬＯＸＩＮの非常に低い発現は、ＬＯＸＩＮタンパク質におけるＣ末端部分の欠失が、原形質膜へのこのタンパク質の細胞輸送における重大な影響を引き起こしていることを実証している。
【００５８】
形質移入された線維芽細胞における、２種のアイソフォームの発現レベルをウェスタンブロットで確認した。ＬＯＸ−１−ＧＦＰ及びＬＯＸＩＮ−ＧＦＰ融合タンパク質に対応する単一バンドが検出された（図４Ａ、レーン１及び２）。これらのバンドの分子量は、非グリコシル化タンパク質の予測された分子量に対応していた。しかし、ＬＯＸ−１−ＧＦＰバンドは、おそらく、このコンストラクトが有する上述の細胞傷害効果のため、はるかに弱いものであった（図４Ａ、レーン２）。
【００５９】
ＬＯＸ−１及びＬＯＸＩＮアイソフォームのｉｎ  ｖｉｖｏ発現
ＬＯＸＩＮ転写産物がｉｎ  ｖｉｖｏで実際に翻訳されているかどうかを確認するため、そしてその発現のレベルを分析するために、本発明者らは、様々なハプロタイプを有する選択された対象から得られたＰＢＭＣにおける２種のアイソフォームの相対量を、ウェスタンブロットを用いて検査した。図４Ｂに示す通り、細胞溶解物中の免疫反応は、２種のアイソフォームの予測された分子量に対応する、３４及び２２ｋＤａの２本の主要バンドを示した。興味深いことに、「非危険」ハプロタイプに関してホモ接合型である対象から得られた細胞におけるＬＯＸＩＮの量に、相対的増大があることに本発明者らは気づいた（図４Ｂ、レーン２及び４）。ＰＮＧａｓｅ消化によるＮ結合型多糖類の除去（図４Ｂ、レーン３及び４）は、いくつかの弱いバンドの消滅をもたらした。これは、２本のバンド（３４及び２２ｋＤａ）がＬＯＸ−１及びＬＯＸＩＮの非グリコシル化タンパク質に対応することを示す。図４Ｂに示すものを含めた多くのゲルで、２６ｋＤａの第３バンドも観察された。このバンドは、本発明者らが現在研究しているＬＯＸ−１タンパク質の分解産物を表すものでありうる。
【００６０】
ＬＯＸ−１のｉｎ  ｖｉｖｏアポトーシス促進効果及びＬＯＸＩＮによる救助
本発明者らは、２種のアイソフォームの間におけるバランスの変化がアポトーシスの起こしやすさの増大と関係しているであろうと考えた。
【００６１】
この概念を試験するために、本発明者らは、ｏｘＬＤＬで誘導されるアポトーシスを、単球／マクロファージｉｎ  ｖｉｖｏアッセイで分析した（Ｈｅｉｎｌｏｔｈ  Ａら、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉ、１６２；９３−１０１）。ＯＬＲ１遺伝子のＬＤブロックにおける「危険」及び「非危険」ハプロタイプを保持する健常ドナーの白血球層からヒト単球を単離した。フィコール勾配遠心分離の後、単球を分離して、マクロファージの分化を誘導した。アポトーシスを誘導するには、これらの細胞に１００μｇ／ｍｌのｏｘＬＤＬを添加した。注目すべきことに、「非危険」ハプロタイプに関してホモ接合型である対象から得られたマクロファージのフローサイトメトリー分析は、「危険」ハプロタイプに関してホモ接合型であるものと比較して、ｏｘＬＤＬで処理した際に、２４％のアポトーシス細胞数の減少を示した（図５Ａ）。本発明者らのデータは、マクロファージにおける、ＬＯＸＩＮレベルの増大が、アポトーシスのレベルの低減と関係している可能性のあることを示している。
【００６２】
上記ハプロタイプに関連した異なったバランスで、２種のアイソフォームがＰＢＭＣ内で生理的に同時発現しており、ＬＯＸＩＮレベルの増大が「非危険」ハプロタイプと関係しているので、本発明者らは、ＬＯＸＩＮアイソフォームがアポトーシスに対して防御効果を有し得るという可能性を調査した。この仮説を試験するために、本発明者らは、ＣＯＳ−７線維芽細胞を、ＬＯＸＩＮ−ＧＦＰ及びＬＯＸ−１−ＧＦＰをコードするＤＮＡ単独で形質移入するか、或いは一定量のＬＯＸ−１プラスミドと、増大する濃度のＬＯＸＩＮ−ＧＦＰプラスミドとで同時形質移入した（図５Ｂに示す通り）。形質移入細胞の表現型は、２種のアポトーシスマーカーを用いて分析した。最初に、本発明者らはアネキシンＶを用いた。これは、原形質膜レベルの変化を検出する。次に、本発明者らは、青色蛍光ヘキスト３３３４２色素の摂取を検査した。これは、アポトーシス細胞の凝縮染色質を、非アポトーシス細胞の染色質より明るく染色する。これらの色素の複合染色パターンに基づいて、本発明者らは、正常細胞、アポトーシス細胞、及び死亡細胞を識別できた。
【００６３】
上述の通り、ＬＯＸ−１−ＧＦＰ融合タンパク質を発現する細胞はよく増殖せず、それら細胞の多くは細胞収縮を示したが、これはアポトーシスの特徴である。したがって、ＬＯＸ−１−ＧＦＰのみでは、３６％の細胞がアポトーシスを発生する結果となった。対照的に、ＬＯＸＩＮ発現は毒性ではなく、アポトーシス細胞の数は、ニセの形質移入細胞における数と同程度であった。
【００６４】
興味深いことに、ＬＯＸＩＮ−ＧＦＰの同時発現は、ＬＯＸ−１−ＧＦＰによって誘導される表現型の完全に用量依存的な救出をもたらした。ＬＯＸ−１と１：４の比率に対応する極低用量のＬＯＸＩＮによって、７２％のアポトーシス細胞数の減少がもたらされ、上記２種のプラスミドを１：１の比率で形質移入に用いると、上記表現型が完全に阻止されたことは注目に値する。この新知見は、ＬＯＸ−１／ＬＯＸＩＮバランスのわずかな相違、特にＬＯＸＩＮ発現のわずかな増大が、ｉｎ  ｖｉｖｏでも、細胞傷害性表現型に非常に重大な影響を有している可能性のあることを示唆している。
【００６５】
本発明は、その人の好ましい形態の認識に従って、限定ではなく、例示的標題に関して記載されている。しかし、その変形形態、すなわち当業者によって導入し得る改変も、これが添付した特許請求の範囲によって定義される請求の範囲を逸脱しない限り、意図されている。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】パネルＡはＯＬＲ１遺伝子のゲノム構成を示す。ＯＬＲ１遺伝子のエキソンイントロン構造を、３’非コーディング領域の最初の部分における、完全連鎖不平衡（ＬＤ）内のＳＮＰ位置と共に示す。サイドボックスは、ＬＤブロックにおける「危険」及び「非危険」ハプロタイプを表す。パネルＢは、示されている様々な細胞型及び組織におけるＯＬＲ１遺伝子の選択的スプライス型の同定及び発現パターンを示す。パネルＣは、予測タンパク質の模式図である。
【図２】ＬＤブロック（連鎖不平衡）内に位置するＳＮＰが、いかにしてＯＬＲ１  ｍＲＮＡアイソフォームのレベルを調節するか示す図である。パネルＡは、定量的リアルタイムＰＣＲを用いた、ＯＬＲ１及びＬＯＸＩＮ転写産物の定量を示す。グラフは、ＯＬＲ１アイソフォーム（エキソン５を含有する）と、ＬＯＸＩＮアイソフォーム（エキソン５を欠失している）との間の比率として定量化された２種の発現アイソフォームの相対量を示す。パネルＢは、それぞれ「危険」ハプロタイプ及び「非危険」ハプロタイプに関してホモ接合型であるゲノム配列を含有する２種のミニ遺伝子プラスミドのＰ１及びＰ２のマップを示す。パネルＣは、Ｐ１及びＰ２ミニ遺伝子発現の定量化を示す。グラフは、エキソン５を含有する転写産物と、エキソン５を欠失している転写産物との間の比率を示す。
【図３】ＬＯＸ−１及びＬＯＸＩＮアイソフォームの細胞内分布を示す図である。パネルＡ及びパネルＤは、それぞれＬＯＸ−１−ＧＦＰ及びＬＯＸＩＮ−ＧＦＰで形質移入されたＣＯＳ７細胞を示す。パネルＢ及びパネルＥは、ゴルジ５８Ｋタンパク質及びカルネキシンに対する抗体で同時染色された同じ細胞を示す。パネルＣ及びＦは、複合イメージを表す。パネルＢでは、透過化処理されていない形質移入ＣＯＳ７細胞が、抗ＬＯＸ−１抗体で免疫染色されている。
【図４】ＬＯＸ−１及びＬＯＸＩＮアイソフォームの細胞内発現を示す図である。パネルＡは、ニセの形質移入されたＣＯＳ７細胞（レーン３）、又はＬＯＸＩＮ−ＧＦＰ（レーン１）及びＬＯＸ−１−ＧＦＰ（レーン２）をコードするＤＮＡで一時的に形質移入されたＣＯＳ７細胞から得られた細胞溶解物のウェスタンブロット分析を示す。上記２種のアイソフォームは、ウサギ抗ＬＯＸ−１抗体で検出した。パネルＢは、「危険」（レーン１及び３）及び「非危険」（レーン２及び４）ハプロタイプを保持する対象から得られたＰＢＭＣの細胞溶解物のウェスタンブロット分析を示す。上記ブロットは、示されている通り、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ（１０００Ｕ）と共に３時間インキュベートされた。
【図５】ＬＯＸＩＮ発現の防御効果を示す図である。パネルＡは、「危険」ハプロタイプに関してホモ接合型の１０人の対象と、「非危険」ハプロタイプに関してホモ接合型の１０人の対象のＰＢＭＣから単離された単離単球−マクロファージ試料におけるアポトーシス細胞の割合を示す。パネルＢは、ＬＯＸＩＮ−ＧＦＰ及びＬＯＸ−１−ＧＦＰをコードするベクトルのみで一時的に形質移入されたＣＯＳ−７線維芽細胞、又は一定量のＬＯＸ−１プラスミドと、増大する濃度のＬＯＸＩＮ−ＧＦＰプラスミド（示されている通り）とで同時形質移入されたＣＯＳ−７線維芽細胞を示す。すべての実験ポイントから、ＧＦＰ単独で形質移入された細胞におけるアポトーシス細胞の割合の平均（６％）を引いた。示されている結果は、３回の独立した実験の平均を表す。
【図６】ＬＯＸＩＮ  ｃＤＮＡ、そのＦｗ及びＲｖプライマー、並びにＶＩＣ蛍光色素で標識されたプローブの配列を示す図である。
【図１】
2009502119.tif 000007
【図２】
2009502119.tif 000008
【図３】
2009502119.tif 000009
【図４】
2009502119.tif 000010
【図５】
2009502119.tif 000011
【図６】
2009502119.tif 000012
【配列表】
2009502119000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年4月23日(2007.4.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化低密度リポタンパク質受容体１（ＬＯＸ−１）をコードするＯＬＲ１遺伝子の選択的スプライシングアイソフォームであって、ヒトＯＬＲ１転写産物（ＮＭ００２５４３）の対応する天然オリゴヌクレオチド配列又はその相補配列と比較して、ヌクレオチド５６５からヌクレオチド６８０までのエキソン５が切除されていることを特徴とする選択的スプライシングアイソフォーム、又は前記選択的スプライシングアイソフォームのオリゴヌクレオチド配列を含むベクター、又はそれによってコードされているアミノ酸配列の、動脈硬化プラークの不安定性を抑制する抗アポトーシス薬を調製するための使用。
【請求項２】
酸化低密度リポタンパク質受容体１（ＬＯＸ−１）をコードするＯＬＲ１遺伝子の選択的スプライシングアイソフォームであって、ヒトＯＬＲ１転写産物（ＮＭ００２５４３）の対応する天然オリゴヌクレオチド配列又はその相補配列と比較して、ヌクレオチド５６５からヌクレオチド６８０までのエキソン５が切除されていることを特徴とする選択的スプライシングアイソフォーム、又は前記選択的スプライシングアイソフォームのオリゴヌクレオチド配列を含むベクター、又はそれによってコードされているアミノ酸配列の、心血管疾患の危険性を判定するマーカーであって、好ましくは対応する天然アイソフォームの量と前記マーカーの量との間の比率を測定することによって判定するマーカーとしての使用。
【請求項３】
前記心血管疾患が、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、アテローム硬化性冠状動脈疾患、卒中発作、虚血、急性及び慢性の末梢血管疾患から成る群から選択される、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記天然オリゴヌクレオチド配列が、以下のオリゴヌクレオチド配列、すなわち
2009502119.tif 000018
又はその相補配列を含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチド配列がＲＮＡ又はＤＮＡである、請求項１から４までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記アイソフォームが標識されているか、或いはタンパク質マーカーをコードするオリゴヌクレオチド配列と融合している、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記タンパク質がルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びその変種、蛍光タンパク質、モノクローナル又はポリクローナル抗体によって認識されるｃ−ｍｙｃ又はタグエピトープ、蛍光色素、ビオチンから成る群から選択される、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
以下のアミノ酸配列、すなわち
2009502119.tif 000019
を含む、請求項１から７までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記選択的スプライシングアイソフォームのオリゴヌクレオチド配列が、請求項８に記載のアミノ酸配列をコードする、請求項１から７までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
心血管疾患の危険度を判定する方法であって、
ａ）生物試料中におけるＬＯＸ−１、及び請求項２から９までのいずれか一項に記載の選択的スプライシングアイソフォームのｍＲＮＡレベルの定量検出を行うステップと、
ｂ）比率Ｒ、すなわちＬＯＸ−１の天然転写産物／請求項２から９までのいずれか一項に記載の選択的スプライシングアイソフォームの転写産物の値を決定し、以下の値、すなわち
低危険度  Ｒ＜０．６
中程度の危険度  Ｒが０．７〜０．８の間
高危険度  Ｒ＞０．９
に基づいて相対危険度を判定するステップと
を含む方法。
【請求項１１】
ステップａ）の検出を、少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプローブと、天然ＬＯＸ−１及び／又は請求項２から９までのいずれか一項に記載の選択的スプライシングアイソフォームのｍＲＮＡに特異的な少なくとも１対の特異的プライマーとを介したリアルタイムＰＣＲによって行う、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記検出を、２種のアイソフォーム、すなわちＬＯＸ−１及び選択的スプライシングＬＯＸＩＮアイソフォームを選択的に定量化できる２種のオリゴヌクレオチドプローブ及び２対のプライマーを介して行い、前記プローブが以下のオリゴヌクレオチド配列、すなわち
ｉ）ＬＯＸ−１プローブ  ５’−ＦＡＭ−ＡＧＣＴＧＡＴＣＴＧＧＡＣＴＴ−３’（配列番号３）、
ｉｉ）ＬＯＸＩＮプローブ  ５’−ＶＩＣ−ＣＡＧＣＴＧＡＴＣＴＧＡＴＴＴ−３’（配列番号４）
を含み、前記２対のプライマーが、
ｉｉｉ）ＬＯＸ−１  Ｆｗプライマー  ５’−ＴＧＣＣＡＡＧＴＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＴＡＡＴＡＧＣ−３’（配列番号５）、
ｉｖ）ＬＯＸ−１  Ｒｖプライマー  ５’−ＡＡＣＴＧＧＡＡＴＡＧＧＡＡＡＴＴＧＣＴＴＧＣＴ−３’（配列番号６）、
ｖ）ＬＯＸＩＮ  Ｆｗプライマー  ５’−ＴＧＣＣＡＡＧＴＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＴＡＡＴＡＧＣ−３’（配列番号７）、
ｖｉ）ＬＯＸＩＮ  Ｒｖプライマー  ５’−ＴＧＡＡＧＧＧＴＡＴＧＴＣＴＧＧＧＡＧＡＣＡ−３’（配列番号８）
を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記心血管疾患が、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、アテローム硬化性冠状動脈疾患、卒中発作、虚血、急性及び慢性の末梢血管疾患から成る群から選択される、請求項１０から１２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記生物試料が末梢血である、請求項１０から１３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
天然ＬＯＸ−１アイソフォーム用、及び請求項２から９までのいずれか一項に記載の選択的スプライシングアイソフォームＬＯＸＩＮ用のオリゴヌクレオチドプローブ及び特異的プライマーを含む、心血管疾患の危険度を予測するための診断キットであって、前記プローブが下記のオリゴヌクレオチド配列、すなわち
ｉ）ＬＯＸ−１プローブ  ５’−ＦＡＭ−ＡＧＣＴＧＡＴＣＴＧＧＡＣＴＴ−３’（配列番号３）、
ｉｉ）ＬＯＸＩＮプローブ  ５’−ＶＩＣ−ＣＡＧＣＴＧＡＴＣＴＧＡＴＴＴ−３’（配列番号４）
を含み、前記対のプライマーが以下のオリゴヌクレオチド配列、すなわち
ｉｉｉ）ＬＯＸ−１  Ｆｗプライマー  ５’−ＴＧＣＣＡＡＧＴＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＴＡＡＴＡＧＣ−３’（配列番号５）、
ｉｖ）ＬＯＸ−１  Ｒｖプライマー  ５’−ＡＡＣＴＧＧＡＡＴＡＧＧＡＡＡＴＴＧＣＴＴＧＣＴ−３’（配列番号６）、
ｖ）ＬＯＸＩＮ  Ｆｗプライマー  ５’−ＴＧＣＣＡＡＧＴＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＴＡＡＴＡＧＣ−３’（配列番号７）、
ｖｉ）ＬＯＸＩＮ  Ｒｖプライマー  ５’−ＴＧＡＡＧＧＧＴＡＴＧＴＣＴＧＧＧＡＧＡＣＡ−３’（配列番号８）
を含む診断キット。
【請求項１６】
前記心血管疾患が、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、アテローム硬化性冠状動脈疾患、卒中発作、虚血、急性及び慢性の末梢血管疾患から成る群から選択される、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
請求項２から９までに記載の選択的スプライシングアイソフォームＬＯＸＩＮを検出するためのプローブであって、以下のヌクレオチド配列、すなわち
５’−ＣＡＧＣＴＧＡＴＣＴＧＡＴＴＴ−３’（配列番号４）
を含むプローブ。
【請求項１８】
蛍光色素、放射性同位元素、発光物質から成る群から選択された物質で標識されている、請求項１７に記載のプローブ。
【請求項１９】
１つ又は複数の薬理学的に許容されるアジュバント及び／又は賦形剤と共に、請求項１から５までのいずれか一項に記載の選択的スプライシングアイソフォーム、又は前記選択的スプライシングアイソフォームのオリゴヌクレオチド配列を含むベクター、又はそれによってコードされているアミノ酸配列を有効成分として含む医薬組成物。
【請求項２０】
以下のアミノ酸配列、すなわち
2009502119.tif 000020
を含む、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記選択的スプライシングアイソフォームのオリゴヌクレオチド配列が、請求項２０に記載のアミノ酸配列をコードする、請求項１９に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
2009502119.tif 000021
2009502119.tif 000022
2009502119.tif 000023
2009502119.tif 000024
2009502119.tif 000025
2009502119.tif 000026