(57)【要約】抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）を検出するための方法が本明細書において記載される。本発明の方法は標識を使用せず、接着性細胞に対してリアルタイムで行うことができる。本発明の方法は、例えば、(a)アッセイ培地における標的細胞の成長を支援する非導電性基体における電極間のインピーダンスをモニターする工程；および(b)エフェクター細胞と、標的細胞に結合する抗体とをアッセイ培地に加える工程を含むことができ、ここで、エフェクター細胞および抗体を加えた後での基体における電極間のインピーダンスにおける任意の低下により、ADCC機能がアッセイ培地において引き起こされていることが示される。2009522583.tif 000009
2009522583.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)アッセイ培地における標的細胞の成長を支援する非導電性基体における電極間のインピーダンスをモニターする工程；および
(b)エフェクター細胞と、標的細胞に結合する抗体とをアッセイ培地に加える工程
を含み、
エフェクター細胞および抗体を加えた後での基体における電極間のインピーダンスにおける低下により、ADCC機能がアッセイ培地において引き起こされていることが示され、かつ、エフェクター細胞および抗体を加えた後での基体における電極間のインピーダンスにおける増大または無変化により、ADCC機能がアッセイ培地において引き起こされていないことが示される、抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）をアッセイする方法。
【請求項２】
インピーダンスを一定の間隔で測定する工程を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
方法が、細胞指数（CI）をそれぞれのインピーダンス測定値から導く工程、および細胞指数における変化が生じているかどうかを判定する工程を含み、ここで、細胞指数が、それぞれのインピーダンス測定値から下記の式を使用して導かれ、
2009522583.tif 000008
式中、Rb(f)およびR細胞(f)はそれぞれ、細胞が存在しない場合、または細胞が存在する場合の周波数依存的な電極抵抗であり、Nが、インピーダンスが測定される周波数点の数である、請求項2記載の方法。
【請求項４】
RT-CES（登録商標）システムを使用して行われる、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
インピーダンス測定値が15分毎に得られる、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
標的細胞をプレーティングする工程をさらに含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
標的細胞が、抗体およびエフェクター細胞を加える前の18時間〜24時間平板培養される、請求項6記載の方法。
【請求項８】
標的細胞が基体における単層で存在する、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
標的細胞がウエルあたり2K〜100Kの間の密度で平板培養される、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
標的細胞がウエルあたり15K〜25Kの間の密度で平板培養される、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
標的細胞がウエルあたり約20Kの密度で平板培養される、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
エフェクター細胞対標的細胞の比率（E:T）が25:1である、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
E:Tが10:1よりも大きい、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
E:Tが50:1よりも大きい、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
E:Tが100:1よりも大きい、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
抗体が約1μg/ml〜約100μg/mlの間の濃度で加えられる、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
抗体が約1μg/ml〜約50μg/mlの間の濃度で加えられる、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
抗体が約2μg/ml〜約8μg/mlの間の濃度で加えられる、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
標的細胞に結合する2つ以上の抗体をアッセイ培地に加える工程を含む、請求項1〜18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
標的細胞に結合する3つ以上の抗体をアッセイ培地に加える工程を含む、請求項1〜18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
標的細胞に結合する4つ以上の抗体をアッセイ培地に加える工程を含む、請求項1〜18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
標的細胞が先端抗原(apical antigen)を発現する、請求項1〜21のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
標的細胞を先端抗原の発現についてスクリーニングする予備工程を含む、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
標的細胞がガン細胞またはウイルス感染細胞である、請求項1〜23のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
標的細胞がガン細胞である、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
ガン細胞が細胞株に由来する、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
ガン細胞がSKBR3細胞またはMG63細胞である、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
エフェクター細胞が、末梢血単核細胞（PBMC）、ナチュラルキラー（NK）細胞、単球、細胞傷害性T細胞または好中球を含む、請求項1〜27のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
エフェクター細胞がPBMCである、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
工程(b)が、エフェクター細胞について部分的に濃縮されている全血を標的細胞に加えることを含む、請求項1〜27のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
工程(b)が、全血をエフェクター細胞に加えることを含み、該全血がエフェクター細胞を含む、請求項1〜27のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
(a)アッセイ培地における標的細胞の成長を支援する非導電性基体における電極間のインピーダンスをモニターする工程；および
(b)エフェクター細胞と、標的細胞に結合する候補抗体とをアッセイ培地に加える工程
を含み、
エフェクター細胞および抗体を加えた後での基体における電極間のインピーダンスにおける低下により、候補抗体が標的細胞に対するADCC機能を引き起こすことができることが示され、かつ、エフェクター細胞および抗体を加えた後での基体における電極間のインピーダンスにおける増大または無変化により、候補抗体が標的細胞に対するADCC機能を引き起こすことができないことが示される、標的細胞に対するADCCを誘導する能力について候補抗体をスクリーニングする方法。
【請求項３３】
(a)疾患に関連する標的細胞の成長を支援する非導電性基体における電極間のインピーダンスをモニターする工程；
(b)患者から単離されたPBMCと、候補抗体とを標的細胞に加える工程；および
(c)基体における電極間のインピーダンスにおける変化が、PBMCおよび抗体を加えた後で生じているかどうかを判定する工程であって、電極間のインピーダンスにおける低下により、患者が抗体による処置についての適合性を有することが示され、かつ、PBMCおよび抗体を加えた後での基体における電極間のインピーダンスにおける増大または無変化により、患者が抗体による処置についての適合性を有しないことが示される工程
を含む、候補抗体による処置に適した標的細胞に関連する疾患を有する患者を特定する方法。
【請求項３４】
(a)アッセイ培地における標的細胞の成長を支援する非導電性基体における電極間のインピーダンスをモニターする工程；
(b)エフェクター細胞と、標的細胞に結合する抗体とを候補化合物の存在下および非存在下でアッセイ培地に加える工程；および
(c)エフェクター細胞および抗体を候補化合物の存在下で加えた後での基体における電極間のインピーダンスにおける任意の変化を、エフェクター細胞および抗体を候補化合物の非存在下で加えた後での基体における電極間のインピーダンスにおける任意の変化と比較する工程であって、候補化合物の非存在下でのインピーダンスにおける任意の変化よりも大きい、候補化合物の存在下でのインピーダンスにおける変化により、候補化合物が、ADCCを調節する能力を有することが示される工程
を含む、ADCCを調節する能力について候補化合物をスクリーニングする方法。
【請求項３５】
スクリーニングされる化合物により、自己免疫に関連したADCCが調節される、請求項34記載のスクリーニング方法。
【請求項３６】
ハイスループットアッセイである前記請求項のいずれか記載の方法であって、ここで、非導電性基体が2つ以上のマイクロタイターウエルを含み、それぞれのウエルが、少なくとも2つの電極を含み、それぞれのウエルにおける電極間のインピーダンスをモニターする、方法。
【請求項３７】
抗体が自己免疫障害の患者に由来する、請求項1記載の方法。
【請求項３８】
(a)アッセイ培地における標的細胞の成長を支援する非導電性基体における電極間のインピーダンスをモニターする工程；および
(b)エフェクター細胞と、標的細胞に結合する抗体とをアッセイ培地に加える工程
を含み、
エフェクター細胞および抗体を加えた後での基体における電極間のインピーダンスにおける低下により、抗体が、ADCC誘導における使用のために販売許可されるのに好適であることが示され、かつ、エフェクター細胞および抗体を加えた後での基体における電極間のインピーダンスにおける増大または無変化により、抗体が、ADCC誘導における使用のために販売許可されるのに好適でないことが示される、抗体についての品質管理アッセイ。
【請求項３９】
(a)アッセイ培地における標的細胞の成長を支援する非導電性基体における電極間のインピーダンスをモニターする工程；
(b)エフェクター細胞と、標的細胞に結合する抗体とをアッセイ培地に加える工程；および
(c)エフェクター細胞および抗体を加えた後での基体における電極間のインピーダンスにおける任意の変化を、エフェクター細胞および対照抗体を加えた後での対照サンプルについてのインピーダンスにおける任意の変化と比較する工程
を含み、
エフェクター細胞および対照抗体を加えた後での対照サンプルについてのインピーダンスにおける任意の低下よりも大きい、エフェクター細胞および抗体を加えた後でのインピーダンスにおける低下により、抗体が、ADCC誘導における使用のために販売許可されるのに好適であることが示され、かつ、エフェクター細胞および対照抗体を加えた後での対照サンプルについてのインピーダンスにおける任意の低下よりも大きい、エフェクター細胞および抗体を加えた後でのインピーダンスにおける低下がないことにより、抗体が、ADCC誘導における使用のために販売許可されるのに好適でないことが示される、抗体についての品質管理アッセイ。
【請求項４０】
エフェクター細胞および対照抗体を加えた後での対照サンプルについてのインピーダンスにおける低下よりも少なくとも25％大きい、エフェクター細胞および抗体を加えた後でのインピーダンスにおける低下により、抗体が、ADCC誘導における使用のために販売許可されるのに好適であることが示される、請求項39記載の品質管理アッセイ。
【請求項４１】
(a)アッセイ培地における標的細胞の成長を支援する非導電性基体における電極間のインピーダンスをモニターする工程であって、ここで、標的細胞が健康な細胞である、工程；
(b)エフェクター細胞および抗体を候補化合物の存在下および非存在下でアッセイ培地に加える工程であって、ここで、抗体が標的細胞に結合し、エフェクター細胞が、自己免疫疾患と診断された対象に由来するPBMCである、工程；および
(c)候補化合物の存在下でのインピーダンスにおける任意の変化を候補化合物の非存在下でのインピーダンスにおける任意の変化と比較する工程であって、候補化合物の存在下でのインピーダンスにおける任意の低下よりも大きい、候補化合物の非存在下でのインピーダンスにおける低下により、候補化合物が自己免疫疾患に対する治療剤として好適であることが示され、かつ、候補化合物の存在下でのインピーダンスにおける任意の低下よりも大きい、候補化合物の非存在下でのインピーダンスにおける低下がないことにより、候補化合物が自己免疫疾患に対する治療剤として好適でないことが示される工程
を含む、自己免疫疾患に対する治療剤としての使用について候補化合物をスクリーニングする方法。
【請求項４２】
(a)自己免疫疾患に関連する標的細胞の成長を支援する非導電性基体における電極間のインピーダンスをモニターする工程；および
(b)候補抗体と、対象から単離されたPBMCとを標的細胞に加える工程；および
(c)基体における電極間のインピーダンスにおける変化が、PBMCおよび候補抗体を加えた後で生じているかどうかを判定する工程であって、電極間のインピーダンスにおける低下により、抗体が、対象を処置するのに好適であることが示され、かつ、電極間のインピーダンスにおける低下がないことにより、抗体が、対象を処置するのに好適でないことが示される工程
を含む、候補抗体が、自己免疫疾患を有する対象を処置するのに好適であるかどうかを判定する方法。
【請求項４３】
(a)アッセイ培地における標的細胞の2つ以上のサンプルの成長を支援する非導電性基体における電極間のインピーダンスをモニターする工程；および
(b)エフェクター細胞および抗体を標的細胞の該2つ以上のサンプルに加える工程であって、ここで、抗体が標的細胞に結合し、抗体が標的細胞の該2つ以上のサンプルに異なる濃度で加えられる、工程
を含み、
エフェクター細胞および抗体を加えた後での基体における電極間のインピーダンスにおける低下により、ADCC機能がアッセイ培地において引き起こされていることが示され、かつ、インピーダンスにおける最大の低下を生じさせる抗体の濃度が最適な濃度であると決定される、ADCC応答を誘導するための抗体の最適な濃度を決定するための方法。
【請求項４４】
(a)アッセイ培地における標的細胞の成長を支援する非導電性基体における電極間のインピーダンスをモニターする工程；および
(b)エフェクター細胞および抗体を標的細胞に加える工程
を含み、
エフェクター細胞および抗体を加えた後での基体における電極間のインピーダンスにおける低下により、抗体が標的細胞上の先端抗原に結合することが示される、抗体が標的細胞上の先端抗原に結合するかどうかを判定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2006年1月4日に出願された米国特許仮出願第60/756,301号の優先権の恩典を主張する。
【０００２】
技術分野
本出願は、抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）をアッセイするための方法に関し、いくつかの態様では、ADCCを、標識された細胞を必要とすることなく、リアルタイムでアッセイすることを可能にする方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
ADCCは、IgG抗体が病原性標的細胞または腫瘍形成性標的細胞の表面の抗原に結合し、その抗原をNKエフェクター細胞による破壊のために特定する免疫応答の構成要素である。Fcγ受容体（FcγR）を有するエフェクター細胞が、標的細胞に結合した抗体のFc領域を認識し、そのFc領域に結合する。従って、抗体は、これら2つの細胞タイプの間での架橋を形成し、その後、溶解性顆粒を放出するエフェクター細胞によって媒介される標的細胞の殺傷に対する特異性を与える。
【０００４】
いくつかの治療用抗体は、その生物学的活性を、ADCCを増進させることによって達成する。例えば、Herceptin（登録商標）（乳ガンを処置するために使用されるヒト化抗体）は、ガン細胞の表面のHER-2抗原に結合することによってADCCを増進させる。同様に、Rituxan（登録商標）（非ホジキンリンパ腫を処置するために使用されるキメラ抗体）は、リンパ腫細胞の表面のCD20抗原に結合することによってADCCを増進させる。
【０００５】
抗体がADCCを誘導するかどうかを判定するための技術は、典型的には、標的細胞を放射性物質（例えば、Cr51など）または蛍光性色素（例えば、カルセインAMなど）により標識することを伴う。標識された細胞が、抗体およびエフェクター細胞（NK細胞またはPBMCなど）とインキュベートされ、ADCCによる標的細胞の殺傷が放射能または蛍光の放出によって検出される。そのようなアッセイにおける標的細胞の標識化では、接着性細胞を標識化のために剥離することが要求される。標識した後、アッセイが、懸濁状態にある標的細胞を用いて行われるが、懸濁状態は接着性細胞については正常な状態ではない。そのうえ、ADCCによって媒介される細胞殺傷の程度は一般に、標的細胞をエフェクター細胞および抗体と混合した後の数時間で1つだけの時点で測定される。標識を用いないアッセイが開発されており、この場合、細胞殺傷が、溶解された細胞の細胞質から無細胞上清への乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）の放出を測定することによって求められる。しかしながら、このLDH法はリアルタイムでのアッセイではなく、また、このLDH法では、両方のタイプの細胞がLDHを溶解時に放出するので、標的細胞の死と、エフェクター細胞の死とが区別されない。
【０００６】
現在販売されているか、または、開発中である治療用抗体製造物の数を考慮すると、抗体のADCC活性を測定することを可能にするためのインビトロアッセイが求められている。具体的には、ADCCをリアルタイムでモニターすることを可能にし、かつ、接着性細胞の剥離を必要としない、処理能力が大きく、標識を用いないADCCアッセイが求められている。
【発明の開示】
【０００７】
概要
本出願は、ADCCをインビトロでアッセイする方法を提供する。本方法は標識を用いないか、または、標識の低下したレベルを必要とし、従って、標識された細胞を必要とするアッセイよりも容易かつ安全に行うことができる。いくつかの態様において、本方法はまた、懸濁状態の細胞ではなく、接着性細胞に対して行われる。加えて、本方法はリアルタイムで行うことができ、このことは、ADCC反応の速度論を追跡することを可能にし、その結果、異なる抗体のADCC速度論を比較することができる。本明細書において提供される方法はまた、標準的なADCCアッセイよりも高感度であり、このことは、異なる抗体のADCC速度論におけるわずかな違いを検出することを可能にする。さらに、いくつかの態様において、本明細書において提供される方法の簡便さは、本明細書において提供される方法が標準的なADCCアッセイよりも迅速であり、また、ADCC活性のハイスループットスクリーニングのために最適化される潜在的可能性もまた有することを意味する。
【０００８】
本明細書において提供される方法は、(a)アッセイ培地における標的細胞の成長を支援する非導電性基体における電極間のインピーダンスをモニターする工程；および(b)エフェクター細胞と、標的細胞に結合する抗体とをアッセイ培地に加える工程を含む。エフェクター細胞および抗体を加えた後での基体における電極間のインピーダンスにおける低下により、ADCCがアッセイ培地において引き起こされていることが示さる。エフェクター細胞および抗体を加えた後での基体における電極間のインピーダンスにおける増大または無変化により、ADCC機能がアッセイ培地において引き起こされていないことが示され得る。
【０００９】
1つの局面において、本出願は、下記の工程を含む、抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）をアッセイする方法を特徴とする。(a)アッセイ培地における標的細胞の成長を支援する非導電性基体における電極間のインピーダンスをモニターする工程；および(b)エフェクター細胞と、標的細胞に結合する抗体とをアッセイ培地に加える工程；この方法では、エフェクター細胞および抗体を加えた後での基体における電極間のインピーダンスにおける低下により、ADCC機能がアッセイ培地において引き起こされていることが示され、また、エフェクター細胞および抗体を加えた後での基体における電極間のインピーダンスにおける増大または無変化により、ADCC機能がアッセイ培地において引き起こされていないことが示される。この方法は、インピーダンスを一定の間隔で測定する工程を含むことができる。この方法は、細胞指数（CI）をそれぞれのインピーダンス測定値から導き、細胞指数における変化が生じているかどうかを判定する工程を含むことができ、この場合、細胞指数は、それぞれのインピーダンス測定値から、下記の式
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（式中、Rb(f)およびR細胞(f)はそれぞれ、細胞が存在しない場合、または、細胞が存在する場合の周波数依存的な電極抵抗であり、Nは、インピーダンスが測定される周波数点の数である）
を使用して導かれる。この方法は、RT-CES（登録商標）システムを使用して行うことができる。インピーダンス測定値を15分毎に得ることができる。
【００１０】
この方法はさらに、標的細胞をプレーティングすることができる。標的細胞は、抗体およびエフェクター細胞を加える前の18時間〜24時間平板培養することができる。標的細胞は基体における単層で存在させることができる。標的細胞はウエルあたり2K〜100Kの間の密度（例えば、ウエルあたり15K〜25Kの間の密度、または、ウエルあたり約20Kの密度）で平板培養することができる。エフェクター細胞対標的細胞の比率（E:T）は25:1とすることができる。E:Tを10:1よりも大きくすることができ、50:1よりも大きくすることができ、または、100:1よりも大きくすることができる。
【００１１】
抗体を、約1μg/ml〜約100μg/mlの間の濃度で、約1μg/ml〜約50μg/mlの間の濃度で、または、約2μg/ml〜約8μg/mlの間の濃度で加えることができる。この方法は、標的細胞に結合する2つ以上の抗体、標的細胞に結合する3つ以上の抗体、または、標的細胞に結合する4つ以上の抗体をアッセイ培地に加えることを含むことができる。抗体は自己免疫障害の患者に由来することができる。
【００１２】
標的細胞は先端抗原(apical antigen)を発現することができる。この方法は、標的細胞を先端抗原の発現についてスクリーニングする予備工程を含むことができる。標的細胞はガン細胞またはウイルス感染細胞が可能である。ガン細胞は細胞株に由来することができる。ガン細胞はSKBR3細胞またはMG63細胞が可能である。
【００１３】
エフェクター細胞は、末梢血単核細胞（PBMC）、ナチュラルキラー（NK）細胞、単球、細胞傷害性T細胞または好中球を含むことができる。本方法の工程(b)は、エフェクター細胞について部分的に濃縮されている全血を標的細胞に加えることを含むことができる。本方法の工程(b)は、全血をエフェクター細胞に加えることを含むことができ、この場合、全血はエフェクター細胞を含む。
【００１４】
別の局面において、本出願は、下記の工程を含む、標的細胞に対するADCCを誘導する能力について候補抗体をスクリーニングする方法を特徴とする。(a)アッセイ培地における標的細胞の成長を支援する非導電性基体における電極間のインピーダンスをモニターする工程；および(b)エフェクター細胞と、標的細胞に結合する候補抗体とをアッセイ培地に加える工程；この方法では、エフェクター細胞および抗体を加えた後での基体における電極間のインピーダンスにおける低下により、候補抗体が標的細胞に対するADCC機能を引き起こすことができることが示され、また、エフェクター細胞および抗体を加えた後での基体における電極間のインピーダンスにおける増大または無変化により、候補抗体が標的細胞に対するADCC機能を引き起こすことができないことが示される。
【００１５】
別の局面において、本出願は、下記の工程を含む、候補抗体による処置に適した標的細胞に関連する疾患を有する患者を特定する方法を特徴とする。(a)疾患に関連する標的細胞の成長を支援する非導電性基体における電極間のインピーダンスをモニターする工程；(b)患者から単離されたPBMCと、候補抗体とを標的細胞に加える工程；および(c)基体における電極間のインピーダンスにおける変化が、PBMCおよび抗体を加えた後で生じているかどうかを判定する工程であって、電極間のインピーダンスにおける低下により、患者が抗体による処置についての適合性を有することが示され、また、PBMCおよび抗体を加えた後での基体における電極間のインピーダンスにおける増大または無変化により、患者が抗体による処置についての適合性を有しないことが示される工程。
【００１６】
さらに別の局面において、本出願は、下記の工程を含む、ADCCを調節する能力について候補化合物をスクリーニングする方法を特徴とする。(a)アッセイ培地における標的細胞の成長を支援する非導電性基体における電極間のインピーダンスをモニターする工程；(b)エフェクター細胞および抗体を候補化合物の存在下および非存在下でアッセイ培地に加える工程（ただし、抗体は標的細胞に結合する）；および(c)エフェクター細胞および抗体を候補化合物の存在下で加えた後での基体における電極間のインピーダンスにおける任意の変化を、エフェクター細胞および抗体を候補化合物の非存在下で加えた後での基体における電極間のインピーダンスにおける任意の変化と比較する工程であって、候補化合物の非存在下でのインピーダンスにおける任意の変化よりも大きい、候補化合物の存在下でのインピーダンスにおける変化により、候補化合物が、ADCCを調節する能力を有することが示される工程。スクリーニングされる化合物は、自己免疫に関連したADCCを調節することができる。
【００１７】
本出願はまた、ハイスループットアッセイである本明細書において記載されるような方法を特徴とし、この場合、非導電性基体は、それぞれのウエルが少なくとも2つの電極を含む2つ以上のマイクロタイターウエルを含み、このアッセイは、それぞれのウエルにおける電極間のインピーダンスをモニターすることを含む。
【００１８】
別の局面において、本出願は、下記の工程を含む、抗体についての品質管理アッセイを特徴とする。(a)アッセイ培地における標的細胞の成長を支援する非導電性基体における電極間のインピーダンスをモニターする工程；および(b)エフェクター細胞および抗体をアッセイ培地に加える工程（ただし、抗体は標的細胞に結合する）；この品質管理アッセイでは、エフェクター細胞および抗体を加えた後での基体における電極間のインピーダンスにおける低下により、抗体が、ADCC誘導における使用のために販売許可されるのに好適であることが示され、また、エフェクター細胞および抗体を加えた後での基体における電極間のインピーダンスにおける増大または無変化により、抗体が、ADCC誘導における使用のために販売許可されるのに好適でないことが示される。
【００１９】
さらに別の局面において、本出願は、下記の工程を含む、抗体についての品質管理アッセイを特徴とする。(a)アッセイ培地における標的細胞の成長を支援する非導電性基体における電極間のインピーダンスをモニターする工程；(b)エフェクター細胞および抗体をアッセイ培地に加える工程（ただし、抗体は標的細胞に結合する）；および(c)エフェクター細胞および抗体を加えた後での基体における電極間のインピーダンスにおける任意の変化を、エフェクター細胞および対照抗体を加えた後での対照サンプルについてのインピーダンスにおける任意の変化と比較する工程；この品質管理アッセイでは、エフェクター細胞および対照抗体を加えた後での対照サンプルについてのインピーダンスにおける任意の低下よりも大きい、エフェクター細胞および抗体を加えた後でのインピーダンスにおける低下により、抗体が、ADCC誘導における使用のために販売許可されるのに好適であることが示され、また、エフェクター細胞および対照抗体を加えた後での対照サンプルについてのインピーダンスにおける任意の低下よりも大きい、エフェクター細胞および抗体を加えた後でのインピーダンスにおける低下がないことにより、抗体が、ADCC誘導における使用のために販売許可されるのに好適でないことが示される。この品質管理アッセイにおいて、エフェクター細胞および対照抗体を加えた後での対照サンプルについてのインピーダンスにおける低下よりも少なくとも25％大きい、エフェクター細胞および抗体を加えた後でのインピーダンスにおける低下により、抗体が、ADCC誘導における使用のために販売許可されるのに好適であることが示され得る。
【００２０】
本出願はまた、下記の工程を含む、自己免疫疾患に対する治療剤としての使用について候補化合物をスクリーニングする方法を特徴とする。(a)アッセイ培地における標的細胞の成長を支援する非導電性基体における電極間のインピーダンスをモニターする工程（ただし、標的細胞は健康な細胞である）；(b)エフェクター細胞および抗体を候補化合物の存在下および非存在下でアッセイ培地に加える工程（ただし、抗体は標的細胞に結合し、エフェクター細胞は、自己免疫疾患と診断された対象に由来するPBMCである）；および(c)候補化合物の存在下でのインピーダンスにおける任意の変化を候補化合物の非存在下でのインピーダンスにおける任意の変化と比較する工程であって、候補化合物の存在下でのインピーダンスにおける任意の低下よりも大きい、候補化合物の非存在下でのインピーダンスにおける低下により、候補化合物が自己免疫疾患に対する治療剤として好適であることが示され、また、候補化合物の存在下でのインピーダンスにおける任意の低下よりも大きい、候補化合物の非存在下でのインピーダンスにおける低下がないことにより、候補化合物が自己免疫疾患に対する治療剤として好適でないことが示される工程。
【００２１】
別の局面において、本出願は、下記の工程を含む、候補抗体が、自己免疫疾患を有する対象を処置するのに好適であるかどうかを判定する方法を特徴とする。(a)自己免疫疾患に関連する標的細胞の成長を支援する非導電性基体における電極間のインピーダンスをモニターする工程；および(b)候補抗体と、対象から単離されたPBMCとを標的細胞に加える工程；および(c)基体における電極間のインピーダンスにおける変化が、PBMCおよび候補抗体を加えた後で生じているかどうかを判定する工程であって、電極間のインピーダンスにおける低下により、抗体が、対象を処置するのに好適であることが示され、また、電極間のインピーダンスにおける低下がないことにより、抗体が、対象を処置するのに好適でないことが示される工程。
【００２２】
さらに別の局面において、本出願は、下記の工程を含む、ADCC応答を誘導するための抗体の最適な濃度を決定するための方法を特徴とする。(a)アッセイ培地における標的細胞の2つ以上のサンプルの成長を支援する非導電性基体における電極間のインピーダンスをモニターする工程；および(b)エフェクター細胞および抗体を標的細胞の該2つ以上のサンプルに加える工程（ただし、抗体は標的細胞に結合し、抗体は標的細胞の該2つ以上のサンプルに異なる濃度で加えられる）；この場合、エフェクター細胞および抗体を加えた後での基体における電極間のインピーダンスにおける低下により、ADCC機能がアッセイ培地において引き起こされていることが示され、また、インピーダンスにおける最大の低下を生じさせる抗体の濃度が最適な濃度であると決定される。
【００２３】
別の局面において、本出願は、下記の工程を含む、抗体が標的細胞上の先端抗原に結合するかどうかを判定する方法を特徴とする。(a)アッセイ培地における標的細胞の成長を支援する非導電性基体における電極間のインピーダンスをモニターする工程；および(b)エフェクター細胞および抗体を標的細胞に加える工程；この場合、エフェクター細胞および抗体を加えた後での基体における電極間のインピーダンスにおける低下により、抗体が標的細胞上の先端抗原に結合することが示される。
【００２４】
別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が関連する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を、本発明を実施するために使用することができるが、好適な方法および材料が下記において記載される。本明細書において述べられるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献はその全体が参照により組み入れられる。矛盾する場合には、定義を含めて、本明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は単に例示に過ぎず、限定であることは意図されない。
【００２５】
本発明の一つまたは複数の態様の詳細が、添付された図面および下記の説明において示される。本発明の他の特徴、目的および利点が、説明および図面から、また、請求項から明らかになる。
【００２６】
詳細な説明
本出願は、細胞が平板培養される表面に存在する電極の間におけるインピーダンスを測定することによってADCCを検出するための材料および方法を提供する。インピーダンスを測定するための任意の好適なデバイスを使用することができる。いくつかの態様において、ADCCを、多数の電極アレイがその表面に配置されている非導電性基体を有するデバイス（この場合、アレイはインピーダンスアナライザーに接続される）を使用して検出することができる。例えば、ADCCを、電極アレイが下部チャンバー内の基体に配置され、下部チャンバーが膜によって上部チャンバーから隔てられるデバイスを使用して測定することができる。そのようなデバイスはまた、上部チャンバーから下部チャンバーへの細胞の遊走を検出するために使用することができ、この場合、下部チャンバー内の基体に対する接着が、下部チャンバー内のアレイでの電極間のインピーダンスにおける増大によって検出される。そのようなデバイスが、例えば、国際公開公報第2004/010103号および国際公開公報第2004/010102号に開示される。
【００２７】
そのようなデバイスはまた、その中における細胞に対する化合物の細胞傷害性を評価するために使用することができる。例えば、化合物を、電極を含有する基体の表面で成長している細胞に加えることができ、電極間のインピーダンスに対する化合物の影響をモニターをすることができ、この場合、電極間のインピーダンスにおける低下により、細胞死が示される。例えば、国際公開公報第2005/77104号および国際公開公報第2005/047482号を参照のこと。米国特許出願公開第2005/0112544号もまた参照のこと（これは、タモキシフェンにより誘導される細胞の細胞傷害性を評価するためにインピーダンスを測定することを含む方法を開示する）。
【００２８】
上記参考文献はどれも、ADCCを評価するために、それらにおいて開示されるデバイスを使用することを開示していない。候補化合物を標的細胞に加えることを単に伴う従来の細胞傷害性アッセイとは異なり、ADCCアッセイでは、(a)標的細胞に結合する抗体と、(b)その抗体に結合するエフェクター細胞とを加えることが伴う。インピーダンスの測定では、標的細胞、エフェクター細胞および抗体が基体に接着することが予想されるので、ADCCアッセイにおける標的細胞の数の正確な指示をもたらさないことが予想される。従って、高いインピーダンス読み取りは、i)標的細胞が基体に接着すること（これは、抗体およびエフェクター細胞がADCCを誘導していなかったからである）のためであり得るか、または、ii)エフェクター細胞および抗体がADCCによる標的細胞の殺傷の後で基体に接着するのためであり得る。従って、上記で開示されたデバイスなどのデバイスは、ADCCアッセイにおいて有用でないことが予想される。
【００２９】
しかしながら、驚くべきことに、本発明者らは、国際公開公報第2005/77104号および国際公開公報第2005/047482号に記載されるデバイスなどのデバイスがADCCのためのアッセイにおいて使用され得ることを見出している。具体的には、本発明者らは、エフェクター細胞が電極含有基体に著しく接着しないこと、また、好適な数の標的細胞、エフェクター細胞対標的細胞（E:T）比および抗体濃度により、基体上の電極間のインピーダンスにおける変化が標的細胞の数の正確な指示をもたらし得ることを見出している。
【００３０】
ADCCを、標的細胞が成長する基体における電極の間でのインピーダンスにおける変化を検出することによってアッセイすることは、標準的なADCCアッセイを上回るいくつかの著しい利点を有する。ほとんどの標準的なADCCアッセイとは異なり、いくつかの態様において、本明細書において提供される方法では、標識が用いられない。いくつかの態様において、本明細書において提供される方法は、細胞を放射性標識または他の標識により標識することを伴わず、このことにより、本アッセイは、標識された細胞を必要とするアッセイよりも容易かつ安全に行うことができる。さらに、上記で議論されたように、標準的なADCCアッセイでは、接着性細胞が、細胞が標識され得るように、成長している表面から剥離され、ADCCアッセイが懸濁状態で行われる。本明細書において提供される方法では、標識が用いられないので、細胞を剥離する必要がなく、それにより、接着性細胞の乱れに起因する可能性のある誤差源を取り除く必要がない。代わりに、ADCCアッセイが、基体に接着した細胞を用いて行われる。
【００３１】
加えて、ほとんどの標準的なADCCアッセイとは異なり、いくつかの態様において、本明細書において提供される方法は、細胞の数を、抗体およびエフェクター細胞を加えた後での様々な時点でインピーダンスを測定することによってリアルタイムで追跡することを可能にする。従って、本明細書において提供される方法では、ADCC反応の速度論を追跡することが可能になり、その結果、異なる抗体のADCC速度論を比較することができるようになる。いくつかの態様において、本明細書において提供される方法は標準的なADCCアッセイよりも高感度であり、このことは、異なる抗体のADCC速度論におけるわずかな違いを検出することを可能にする。加えて、本明細書において提供される方法の簡便さは、本明細書において提供される方法が標準的なADCCアッセイによりもはるかに迅速であり、また、ADCC活性のハイスループットスクリーニングのために最適化される潜在的可能性を有することを意味する。
【００３２】
本明細書において提供される方法は、国際公開公報第2004/010102号、国際公開公報第2004/010103号、国際公開公報第2005/077104号または国際公開公報第2005/047482号に記載されるデバイス、あるいは、これらの設計に基づくデバイスを使用して行うことができる。いくつかの態様において、本明細書において提供される方法は、ACEA Biosciences（San Diego、CA）によって製造されるRT-CES（登録商標）システムを使用して行うことができる。ACEA RT-CES（登録商標）システムは、3つの構成要素、すなわち、電子工学センサーアナライザー、デバイスステーション、および、16ウエルのマイクロタイタープレートを含む。読者は、このシステムの作業場での小さな変形が当業者の範囲内であることを理解する。例えば、このデバイスは、より多くのアッセイを同時に行うことを可能にするために、16ウエルのマイクロタイタープレートではなく、96ウエルのマイクロタイタープレートまたは256ウエルのマイクロタイタープレートを有することができる。
【００３３】
微小電極センサーアレイを、リソグラフィー微細加工法を使用してガラス製スライドガラスの上に製造することができ、また、電極含有のスライドガラスを、電極含有ウエルを形成するためにプラスチックトレーに対して組み立てることができる。
【００３４】
デバイスステーションはマイクロタイタープレート（例えば、16ウエル、256ウエルまたは96ウエルのマイクロタイタープレート）を収容することができ、また、ウエルの任意の1つをインピーダンス測定のためにセンサーアナライザーに電子的に切り換えることを可能にすることができる。操作において、細胞がウエルにおいて培養されるデバイスをデバイスステーションに接続し、インキュベーターの内部に設置することができる。電気ケーブルにより、デバイスステーションをセンサーアナライザーに接続することができる。RT-CES（登録商標）ソフトウエアによる制御を使用して、センサーアナライザーは、測定されるウエルを自動的に選択することができ、インピーダンス測定を連続して行うことができる。アナライザーからのインピーダンスデータはコンピューターに転送され、分析され、統合ソフトウエアによって処理され得る。
【００３５】
個々のウエルにおいて電極間で測定されたインピーダンスは典型的には、電極の幾何形状、ウエルにおけるイオン濃度、および、電極に接着した細胞が存在するかどうかに依存する。細胞が存在しない場合、電極のインピーダンスは、主に、電極/溶液の境界におけるイオン環境、および、溶液全体におけるイオン環境によって決定される。細胞が存在する場合、電極のセンサー表面に結合した細胞は電極/溶液の境界における局所的なイオン環境を変化させることができ、これにより、インピーダンスの増大を引き起こす。多くの細胞が電極上に存在するほど、細胞-電極のインピーダンスにおける増大が大きくなる。
【００３６】
測定された細胞-電極のインピーダンスに基づいて細胞を定量化するために、細胞指数（CI）と呼ばれるパラメーターが下記の式に従って導かれる。
2009522583.tif 000004
式中、Rb(f)は、細胞を伴わない場合の周波数依存的な電極抵抗（インピーダンスの構成要素）であり、R細胞(f)は、細胞が存在する場合の周波数依存的な電極抵抗であり、Nは、インピーダンスが測定される周波数点の数である。
【００３７】
従って、細胞指数は電極含有ウエルにおける細胞の量的尺度である。同じ生理学的条件のもとでは、電極に結合したより多くの細胞はより大きいR細胞(f)値をもたらし、これにより、より大きい細胞指数の値がもたらされる。
【００３８】
本明細書において提供される方法は、インピーダンスを一定の間隔で測定し、細胞指数を、上記で示された式に従ってこれらのインピーダンス測定値から導くことを含むことができ、従って、ADCC反応を追跡することを可能にする。インピーダンス測定値が得られる間隔は、どのくらい密に反応の速度論を追跡することが所望されるかに依存し得る。例えば、ADCCを誘導することが既に公知の抗体のADCC速度論を追跡することが所望されるならば、短い間隔が好ましい場合があり、これに対して、アッセイを行うことの主目的が、与えられた抗体がADCCを少しでも誘導することができるかどうかを確認することであるならば、より長い間隔が十分である場合がある。本明細書において提供される方法は、インピーダンス測定値を、様々な時点で、例えば、30分毎に、15分毎に、10分毎に、9分毎に、8分毎に、7分毎に、6分毎に、5分毎、4分毎に、3分毎に、または、2分毎に、1分毎に、あるいは、1分毎よりも頻繁に得ることを含むことができる。
【００３９】
本明細書において記載される方法はさらに、エフェクター細胞および抗体を加える前に、標的細胞を基体上にプレーティングすることを含むことができる。例えば、エフェクター細胞および抗体を加える前に、標的細胞を基体上で平板培養し、所定の期間にわたって成長させることができる。標的細胞を、エフェクター細胞および抗体を加える前にプレーティングすることより、標的細胞を基体に接着させ、成長させることができ、これにより、エフェクター細胞および抗体を加えた後でのインピーダンスにおける低下の検出を容易し得るインピーダンスにおける増大もたらすことができる。しかしながら、標的細胞は、典型的には、過度に成長させてはならない。基体に結合した標的細胞は、細胞が細胞の上に成長することのために、抗体に接近することができなくなることがあるからである。そのような場合、ADCCを検出することが不可能であると考えられる。実験を行って、標的細胞が、エフェクター細胞および抗体を加える前に平板培養されなければならない最適な時間の長さを決定することは、十分に当業者の能力の範囲内である。いくつかの態様において、標的細胞は、エフェクター細胞および抗体を加える前の10時間〜30時間、基体上で平板培養することができる。例えば、標的細胞を、エフェクター細胞および抗体を加える前の18時間〜24時間（例えば、19時間〜21時間）、基体上で平板培養することができる。
【００４０】
標的細胞が平板培養される密度は、細胞のサイズ、および、細胞が成長する速度に依存し得る。検出システムは典型的には、細胞のさらなる成長をそれ以上では検出することができない最大限界を有する。従って、標的細胞は、細胞の死に起因するインピーダンスにおける変化が検出されることを可能にするために、この限界よりも低い密度で平板培養されなければならない。しかしながら、標的細胞はまた、細胞が成長の初期期間の期間中におけるインピーダンスに対する影響を有することを可能にし、その結果、エフェクター細胞および抗体を加えた後でのインピーダンスにおける任意の低下が検出され得るようにするために十分に高い密度で平板培養されなければならない。いくつかの態様において、標的細胞は、19.6mm2の標準的なウエルにおいて2K〜100Kの間での密度（例えば、19.6mm2の標準的なウエルにおいて10K〜60Kの間での密度、19.6mm2の標準的なウエルにおいて15K〜25Kの間での密度、または、19.6mm2の標準的なウエルにおいて約20Kの密度）で平板培養することができる。
【００４１】
インピーダンス測定が行われる時間の長さ、すなわち、アッセイの長さは、標的細胞のプレーティングと、エフェクター細胞および抗体の添加との間の期間に依存して変化し得る。ADCCに起因するインピーダンスにおける低下は一般には、フェクター細胞および抗体を加えた後の数時間以内で検出することができる。しかしながら、いくつかの場合には、細胞死の程度を求めるために、また、細胞の再成長が生じるかどうか、および、細胞の再成長がいつ生じるかを確認するために、ADCCによる細胞殺傷が開始された後の一定の期間についてインピーダンスをモニターすることを継続することが望ましい場合がある。従って、本明細書において提供される方法は、インピーダンス測定値を、例えば、限定されることはないが、標的細胞をプレーティングした後の24時間、36時間、48時間、72時間、100時間、200時間または200時間超にわたって得ることを含むことができる。
【００４２】
本明細書において提供される方法では、上記で議論されたように、標的細胞の数が、ADCCの正確な検出を妨げるほど多くないならば、任意の数のエフェクター細胞および任意の数の標的細胞を用いることができる。本明細書において提供される方法では、標的細胞よりも多いエフェクター細胞を用いることができる。エフェクター細胞対標的細胞の比率（E:T）は、例えば、10:1よりも大きくすることができ、または、20:1よりも大きくすることができ、または、50:1よりも大きくすることができ、または、100:1よりも大きくすることができ、または、約25:1とすることができる。
【００４３】
抗体は標的細胞に任意の濃度で加えることができる。例えば、抗体を、平板培養された標的細胞に、例えば、約1μg/ml〜約1000μg/mlの間の濃度で、約1μg/ml〜約500μg/mlの間の濃度で、約1μg/ml〜約100μg/mlの間の濃度で、約1μg/ml〜約75μg/mlの間の濃度で、約1μg/ml〜約50μg/mlの間の濃度で、約1μg/ml〜約25μg/mlの間の濃度で、約1μg/ml〜約10μg/mlの間の濃度で、約2μg/ml〜約8μg/mlの間の濃度で、または、約4μg/ml〜約6μg/mlの間の濃度で加えることができる。
【００４４】
いくつかの態様において、本明細書において記載される方法は、異なる抗体濃度を使用して得られたADCC応答を比較することによって、ADCC応答を誘導する抗体の最適な濃度を決定するために使用することができる。例えば、1つの方法では、(a)アッセイ培地における標的細胞の2つ以上（例えば、2、3、4、5または6以上）のサンプルの成長を支援する非導電性基体における電極間のインピーダンスをモニターする工程；および(b)エフェクター細胞および抗体を標的細胞の該2つ以上のサンプルに加える工程（ただし、抗体は標的細胞に結合し、抗体は標的細胞の該2つ以上のサンプルに異なる濃度で加えられる）を含むことができ、この方法では、エフェクター細胞および抗体を加えた後での基体における電極間のインピーダンスにおける低下により、ADCC機能がアッセイ培地において引き起こされていることが示され、また、インピーダンスにおける最大の低下を生じさせる抗体の濃度が最適な濃度であると決定される。
【００４５】
エフェクター細胞および抗体は標的細胞培地に同時または別々に加えることができる。例えば、エフェクター細胞を抗体の前に培地に加えることができ、または、抗体をエフェクター細胞の前に加えることができる。本明細書において記載される方法では、標的細胞、エフェクター細胞および抗体の任意の組合せを用いることができ、方法において使用される標的細胞、エフェクター細胞および抗体の選択は、アッセイの目的に依存し得る。本明細書において提供される方法において使用される好適な標的細胞、エフェクター細胞および抗体の例が、これらの標的細胞、エフェクター細胞および抗体を用いるアッセイの様々な可能な適用が議論されるように、下記において議論される。
【００４６】
いくつかの態様において、標的細胞は接着性細胞である。いくつかの態様において、標的細胞は先端抗原を発現する。多くの細胞が分極し、異なる抗原をその先端面および基底面において発現する（Nelson et al.,(2003),Nature,422:766-774）。例えば、上皮細胞は種々の先端抗原および基底抗原を発現する。標準的なADCCアッセイが懸濁状態で行われるとき、抗体は先端抗原および基底抗原の両方に結合するかもしれない。しかしながら、本明細書において提供される方法では、細胞が基体に接着する場合、抗体は先端抗原に結合するだけであり得る。従って、抗体がADCCを誘導することができることにより、抗体が標的細胞上の先端抗原に結合することが明らかにされる。従って、本明細書において提供される方法は、特定の抗体が標的細胞上の先端抗原に結合するかどうかを判定するために使用することができる。例えば、1つの方法では、(a)アッセイ培地における標的細胞の成長を支援する非導電性基体における電極間のインピーダンスをモニターする工程；および(b)エフェクター細胞および抗体を標的細胞に加える工程を含むことができ、この方法では、エフェクター細胞および抗体を加えた後での基体における電極間のインピーダンスにおける低下により、抗体が標的細胞上の先端抗原に結合することが示される。いくつかの治療用抗体は先端抗原にインビボで接近することができるだけである。例えば、いくつかの抗体は、腫瘍の表面に発現される先端抗原に接近し、結合することができるだけである。従って、抗体が、先端抗原に結合することによってADCCを誘導することができることは、インビボでの抗体の治療的有効性の指標となり得る。
【００４７】
本明細書において提供される方法は、標的細胞を先端抗原の発現についてスクリーニングする予備工程を含むことができる。そのような予備工程では、例えば、本明細書において提供される方法における使用に好適であり得る、先端抗原を発現する標的細胞を特定するために、RT-PCRまたはFACSを用いることができる。
【００４８】
任意の好適な標的細胞を使用することができる。先端抗原を発現する細胞の例には、限定されることはないが、腫瘍細胞および上皮細胞（例えば、当技術分野において公知の細胞など）が含まれる。例えば、ムチン糖タンパク質（例えば、DF3抗原およびMUC1など）が上皮細胞の先端面で発現し、上皮腫瘍の先端面では過剰発現する（Snijdewint et al.,(2001),Int. J. Cancer,93:97-106；およびHayes et al., (1990),J. Immunol.,145:962-970）。加えて、様々な腫瘍細胞が、葉酸に対する大きい親和性を有する細胞表面受容体をその先端面で発現する（Lu et al., (2002),Cancer Immunol. Immunother.,51:153-162）。
【００４９】
標的細胞は病変細胞が可能であり、例えば、ガン細胞またはウイルス感染細胞などが可能である。これらの標的細胞は、細胞株バンクから得られる細胞株である場合がある。あるいは、細胞は、疾患または障害を有する個体から得ることができる。例えば、標的細胞をガン患者の腫瘍生検物から得ることができる。
【００５０】
標的細胞として使用することができるガン細胞には、ホジキン病、非ホジキンB細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、悪性リンパ腫、リンパ肉腫白血病、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性障害、好酸球増加症候群、好酸球性白血病、多発性骨髄腫、X連鎖リンパ増殖性障害、食道ガン、胃ガン、結腸ガン、結腸直腸ガン、膵臓ガンおよび胆嚢ガン、副腎皮質のガン、ACTH産生腫瘍、膀胱ガン、脳ガン（例えば、神経芽細胞腫および神経膠腫）、ユーイング肉腫、頭頸部ガン（例えば、口腔ガンおよび咽頭ガン）、腎臓ガン（例えば、腎細胞ガン）、肝臓ガン、肺ガン（例えば、小細胞肺ガンおよび非小細胞肺ガン）、悪性腹水、悪性胸水、皮膚ガン（例えば、悪性メラノーマ、ヒト皮膚ケラチノサイトの腫瘍進行、上皮細胞ガン、扁平上皮細胞ガン、基底細胞ガン）、中皮腫、カポジ肉腫、骨ガン（例えば、骨腫および肉腫（例えば、線維肉腫および骨肉腫など））、女性生殖管のガン（例えば、子宮ガン、子宮内膜ガン、卵巣ガンおよび子宮頸ガン）、乳ガン、前立腺ガン、網膜芽細胞腫、精巣ガンおよび甲状腺ガンに関連する細胞が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００５１】
標的細胞として使用することができるガン細胞株は、例えば、細胞バンクから得られる任意の不死化された接着性細胞株が可能である。好適な接着性の不死化細胞株の例には、SKBR3、MG63、CCD-1070Sk、hTERT-HME1 [ME16C]、BJ、ATRFLOX [Mutatect]、KEL FIB、HT-1197、LL 97A (AlMy)、NCI-H510A [H510A；NCI-H510]、HT-29、SW756、293、IMR-90 [IMR90]、HIAE-55［Wistar Special Collectionの一部］、SW1417 [SW-1417]、Hs 737.T、NCI-H661 [H661]、CCD 841 CoN、Hs 792(C).M、Per Sel、NCI-H810 [H810]、Panc 05.04、ZR-75-30、T-47D、WISH、HBE135-E6E7、ARPE-19/HPV-16、10.014 pRSV-T、GH354、MDA-MB-436、T98G [T98-G]、Calu-6、BEAS-2B、G-292、クローンA141B1、Detroit 539、MNNG/HOS Cl #5 [R-1059-D]、BT-549、NCI-H1915 [H1915]、Hs 181.Sk、Hs 839.T、RD、SK-N-MC、20B8、NCI-H292 [H292]、Hs 863.T、Hs 181.Tes、Malme-3M、Hs 617.Mg、JAR、Hs 144.We、Hs 742.Sk、Hs 875.T、TE 161.T、Hs 738.St/Int、Hs 895.T、RWPE-1、TE 130.T、TE 84.T、HCC1008、Hs 894(E).Lu、SK-LMS-1、HFF-1、MRC-5 [MRC5]、IRR-MRC-5 [ATCC X-55；ATCC X55；放射線照射MRC-5]、WI-38 [WI-38]、HeLa、HEK001、FHs 74 Int、Detroit 548、Detroit 573、SW-13、293T/17、C 211、Amdur II、IMR-32、HeLa [Chang Liver]、CHP 3 (M.W.)、CHP 4、LL 47 (MaDo)、HEL 299、Detroit 562、CCD-11Lu、KB、A549 [A-549]、MDA-MB-134-VI、HLF-a、TE 354.T、HeLa 229、HeLa S3、COLO 320DM、クローン1-5c-4 [Chang結膜のWong-Kilbourne誘導体(D)]、CCD-13Lu、CCD-8Lu、CCD-19Lu、CCD-16Lu、AV3、Hs888Lu、CCD-25Lu、COLO 320HSR [COLO 320 HSR]、DLD-1、COLO 205、COLO 201、HCT-15、SW837 [SW-837]、LoVo、SW48 [SW-48]、SW1463 [SW 1463；SW-1463]、SW 1353 [SW 1353；SW-1353]、1205Lu [Wistar Special Collectionの一部]、HCT-8 [HRT-18]、AGS、HCT 116、T84、SNU-C2B、SNU-C2A、NCI-H716 [H716]、NCI-H747 [H747]、NCI-H498 [H498]、LS123、NCI-H1688 [H1688]、CFPAC-1、L-132、TE 353.Sk、腸407、FL、Detroit 525、Detroit 510、C32、WI-38 VA-13亜系統2RA [Wistar Special Collectionの一部]、シトルリン血症、Cri du Chat、WI-26 VA4 [Wistar Special Collectionの一部]、BeWo、WM35 [Wistar Special Collectionの一部]、MSTO-211H、WRL 68、NCI-H295 [H295]、MCF 10A、MCF 10F、RWPE2-W99、SV-HUC-1、HCC202、C3A [HepG2/C3A；Hep G2 (ATCC HB-8065)の誘導体]、MCF-10-2A、293 c18、F.thy 62891、Lei Cap、Sal Mat、HCE-2 [50.Bl]、A2058、RWPE-2、Am Ric、Lo Ren、Ron Har、H69AR、hFOB 1.19、Mar Vin、SCC-4、Be Sal、Hs27、B-3、Lu  Vin、Ma San、El Don、SK-N-AS、NCI-H1734 [H-1734；H1734]、LNZTA3WT4 [LNZTA3p53WT4；WT4]、LNZTA3WT11 [LNZTA3p53WT11；WT11]、Lo Wen、NCI-H2227 [H2227]、COLO 829、HKB-11、Ce Ar、90.74、HRT-18G、Be Ar、Em Ar、Win Mec、Ce Geg、TOV-21G、TOV-112D、OV-90、Ja Bos、Fe Bos、La Bel、Bo Gin、HS-5、Le Ana、Mel Neg、La Bel II、HEP G2/2.2.1、ProPakA.6 [PPA.6；ProPak-A.6]、LNCaPクローンFGC [LNCaP.FGC]、HCN-1A、HX [HT1080 xeno]、HP [HT1080 poly]、2A、Ne Loc、Jay Sen、Bi FinおよびRay Hotが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００５２】
標的細胞として使用することができるウイルス感染細胞には、例えば、エプスタインバールウイルス、HIV、インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、単純ヘルペスウイルス、デング熱ウイルス、パピローマウイルス、呼吸器合胞体ウイルスまたは狂犬病ウイルスが感染した細胞が含まれる。
【００５３】
本明細書において提供される方法において使用される標的細胞はまた、健康な細胞が可能である。ADCCは、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性甲状腺障害、重症筋無力症、リウマチ様関節炎、全身性エリテマトーデス、（ペニシリン誘導による）免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎（AIH）、グレーブス眼症、HIV［CD4欠乏］、自己免疫性腸症、セリアック病、重症筋無力症（MG）、ベーチェット病、甲状腺関連眼症、自己免疫性甲状腺炎、ウイルス性心筋炎、自己免疫性心臓疾患、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、シャーガス病、白斑、クローン病、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性好中球減少症、小児期てんかん、川崎病、自己免疫性慢性活動性肝炎、真性糖尿病、多発性硬化症、抗糸球体基底膜（GBM）腎炎、慢性活動性肝臓疾患（CALD）、（免疫複合体由来の）糸球体腎炎、血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）、不明な男性不妊、および、移植片拒絶など）の患者における健康な細胞を殺すことに関与する場合がある。従って、健康な細胞を、本明細書において提供される方法において標的細胞として使用することは、抗体およびエフェクター細胞がどのように、自己免疫疾患または移植片拒絶においてADCCにより健康な細胞を殺すかの研究において有用であり得る。標的細胞が健康な細胞である場合、標的細胞は、例えば、細胞バンクから得られる細胞株、または、自己免疫疾患を有する個体の組織から得られた細胞が可能である。
【００５４】
いくつかの場合には、2つ以上のタイプの標的細胞の組合せを、例えば、抗体が、いくつかの細胞タイプを含む器官および組織を標的とし得るインビボでの状況をより綿密に再現するために使用することができる。従って、標的細胞は2つ以上の細胞株を含むことができ、または、2つ以上の組織に由来する細胞を含むことができる。いくつかの態様において、標的細胞は2つ以上または3つ以上の細胞タイプを含む。
【００５５】
本明細書において記載される方法は、ADCC応答を誘導する能力について任意の抗体をスクリーニングするために使用することができる。従って、本出願は、標的細胞に対するADCCを誘導する能力について候補抗体をスクリーニングするための方法を提供する。この方法は、(a)アッセイ培地における標的細胞の成長を支援する非導電性基体における電極間のインピーダンスをモニターする工程；および(b)エフェクター細胞および候補抗体（例えば、標的細胞に結合する抗体）をアッセイ培地に加える工程を含み、この方法では、エフェクター細胞および抗体を加えた後での基体における電極間のインピーダンスにおける低下により、候補抗体が標的細胞に対するADCCを引き起こすことができることが示される。
【００５６】
本明細書において使用される場合、「インピーダンスにおける低下」は、標的細胞が平板培養されている基体における電極の間でのインピーダンスにおける任意の減少を示す。インピーダンスにおける変化は、例えば、以前に求められたインピーダンスと比較したとき、インピーダンスにおける約1％以上の減少、約5％以上の減少、約10％以上の減少、約15％以上の減少、約20％以上の減少、約25％以上の減少、約40％以上の減少、約50％以上の減少、約60％以上の減少、約75％以上の減少、約80％以上の減少、約90％以上の減少または約100％の減少であり得る。
【００５７】
本明細書において提供される方法において使用される抗体または候補抗体は、例えば、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体が可能である。本明細書において記載される方法において使用することができる抗体にはまた、治療的可能性を有するとして特定されている抗体（例えば、臨床試験を既に受けている抗体）が含まれる。
【００５８】
本明細書において使用される用語「抗体」は、標的細胞に結合することができる無傷の分子、ならびに、そのフラグメント（例えば、Fab、F(ab')2およびFvなど）を示す。「標的細胞に結合する」によって、抗体が、標的細胞の抗原（例えば、標的細胞上の先端抗原）について免疫特異的であることが意味される。
【００５９】
用語「免疫特異的」は、抗体が、他のタンパク質（例えば、他の関連したタンパク質）についての親和性よりも実質的に大きい、標的細胞上の抗原についての親和性を有することを意味する。
【００６０】
「よりも実質的に大きい親和性」によって、抗体が、標的細胞上の抗原について、公知の免疫グロブリンドメイン含有の細胞表面認識分子についての親和性と比較したとき、測定可能なほどにより大きい親和性を有することが意味される。例えば、親和性は、標的細胞上の抗原について、公知の免疫グロブリンドメイン含有の細胞表面認識分子の場合よりも少なくとも1.5倍、2倍、5倍、10倍、100倍、103倍、104倍、105倍または106倍大きいことが可能である。
【００６１】
本明細書において提供される方法はまた、品質管理（QC）目的のための販売許可アッセイまたは安定性アッセイとして使用することができる。例えば、本明細書において記載されるような方法は、抗体製造ロットを検査するために使用することができ、この場合、ADCC活性の存在またはADCC活性のレベルが、（例えば、GMP（優良製造規範）または他の標準における）品質管理指針を満たすとして抗体製造物を証明するために使用される。いくつかの場合には、ADCC活性の単なる存在を、抗体が品質管理指針を満たし、販売許可のために適するという定性的決定として使用することができる。従って、そのような方法では、インピーダンスが、検査されている抗体の存在下で低下するという決定を越える解釈を全く必要とし得ない。いくつかの態様において、証明されるべきADCC抗体のロットのサンプルは意図的に劣化させることができ、販売許可されるべき抗体ロットとの比較のための陰性対照として使用することができる。これら2つのサンプルについてのリアルタイムでのADCC読み取り曲線を比較することができ、定性的または定量的なカットオフを品質管理証明のために確立することができる。正確な濃度依存的応答およびアッセイパラメーターを試行錯誤によって決定することができる。
【００６２】
同様に、本明細書において記載される方法は、QCおよび安定性の目的のために、ADCC活性の小分子阻害剤または他の阻害剤を、標的細胞へのそれらの添加に応答したリアルタイムのADCCシグナルにおける低下をモニターすることによって証明するために使用することができる。
【００６３】
ADCCを介して作用し得る利用可能な抗体の例には、限定されることはないが、アレルギーおよび喘息を処置するための抗体、例えば、ダクリズマブ（Protein Design Labs/Roche）およびCAT-354（Cambridge Antibody Technology）など；自己免疫障害を処置するための抗体、例えば、MDX-H210（Medarex/Novartis）、Campath*アレムツズマブ（ILEX Oncology）およびダクリズマブ（Protein Design Labs/Roche）など；ガンを処置するための抗体、例えば、Campath（登録商標）（ILEX Oncology）、R1550（huHMFG1、Therex、Antisome/Roche）、Herceptin（登録商標）（Genentech）、Omnitarg（Genentech）、タスツズマブ-DMI1（Genentech/Immunogen）、MDX-010（Medarex）、Avastin（登録商標）（Genentech）、Mab-17-I（エドレコロマブ-IGN101、Igeneon、EDRまたはPanorex-GSK）、ラベツズマブ（IMMU 105）（Immunomedics）、Tarvacin（Peregrine）、Theragyn、Therevex（ペムツモマブ）（Antisoma/Roche）、TheraCIM hR3（YM Biosciences/Oncoscience）、HuMax-EGFr（Genmab）、SGN-40（Seattle Genetics）、SGN-30（Seattle Genetics）、Rituxan（登録商標）（Rituzan（登録商標）Genentech/BiogenIdec）、HuMax-CD4（Genmab）、MDX-060（Medarex）、シプリズマブ（MedImmune）、AME-133（Applied Molecular Evolution/Lilly）、ガリキシマブ（抗CD80 Mab BiogenIdec）、HuMax-DC20（HuMax cd2O）（Genmab）、LymphoCide（商標）（エプラツズマブ、Immunomedics）、MDX-010+gp100ペプチド（Medarex）、MDX-010+/-化学療法（Medarex）、MDX-010+メラノーマペプチド（Medaex）、AHM（Roche/Chugai）、OvaRex（AltaRex/Unither Pharma-ceuticals）、J59I（Biovation/Millennium）、Rencarex（WX-G250）（Wilex/Centocor/Johnson & Johnson）、WX-G250+IL-2/IFN（Wilex）、TRAIL-R1mAb（HGS-ETR1Cambridge Antibody Technology/Human Genome Sciences）、TRAIL-R2mAb（HGS-ETR2Cambridge Antibody Technology/Human Genome Sciences）、Vitaxin（MEDI-522 MedImmune）、WX-K931（Wilex）、MT201（Micromet/Serano）、MDX-214（Medarex）、Erbitux（セツキシマブ、IMC-C255 Imclone、Bristol-Myers Squibb）、MEDI-507（Medimmune）、TRU-015（抗体誘導体、Trubion）、マツズマブ（EMD-72000、EMD Pharmaceuticals/Merck KGaA）、Mab ICR62、CHIR-12.12（Chiron/XOMA）、huG1-M195（NCI）、MOR102（MorphoSys）、Remitogen（1D10、抗MHCクラスII、Protein Design Labs）およびIGN312（Igeneon）など；心臓血管疾患を処置するための抗体、例えば、ABC-48（AERES）など；感染性疾患を処置するための抗体、例えば、MDX-010（Medarex）など；炎症性疾患を処置するための抗体、例えば、Humira（商標）（Cambridge Antibody Technology/Abbott)、抗CD11a MAb（Biovation）、MLN02（Millennium/Genentech/Roche）、ダクリズマブ（Protein Design Labs）、Enbrel（TNF受容体およびIgG1の融合体、Amgen/Wyeth）、Remicade（Centocor）およびTRU-016（抗体誘導体、Trubion）など；腎臓疾患を処置するための抗体、例えば、Humira（商標）（Cambridge Antibody Technology/Abbott）およびRituxan（登録商標）（Genentech/BiogenIdec）など；ならびに他の抗体、例えば、骨粗鬆症のためのAMG162（Amgen）、Erbitux-C255、BTI-322、エタネルセプトおよびインフリキシマブなどが含まれる。
【００６４】
本明細書において提供される方法が、自己免疫疾患におけるADCC応答を調べるために使用される場合、抗体は、例えば、自己免疫疾患を有する個体から得られる自己抗体が可能である。そのような抗体は、例えば、当業者には公知の方法（例えば、アフィニティー精製）を使用して得ることができる。
【００６５】
いくつかの場合には、例えば、ADCCを誘導する能力に関して、抗体が相乗的に作用するか、または、抗体が互いに妨害するかどうかを判定するために、2つ以上の抗体をアッセイ培地に加えることが望ましい場合がある。従って、本明細書において提供される方法は、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つ以上の抗体をアッセイ培地に加えることを含むことができる。
【００６６】
本明細書において提供される方法において使用されるエフェクター細胞は典型的には、一つまたは複数のFcγ受容体を発現する細胞である。好適なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（PBMC）、ナチュラルキラー（NK）細胞、単球、細胞傷害性T細胞および好中球が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００６７】
数ファミリーのFcγ受容体が存在し、種々のエフェクター細胞が異なるFc受容体を発現する。例えば、好中球は一般に、FcγR1（CD64）、FcγRII（CD32）、および、FcγRIII（CD16）の脂質結合型イソ型を発現し、これに対して、ナチュラルキラー（NK）細胞はFcγRIIIの膜貫通イソ型のみを発現する。そのうえ、多型体がFc受容体には存在する。例えば、NK細胞上のFcγRIIIは、IgGの結合に影響を及ぼすことが示されている158位でのPhe/Val多型を含有する。本明細書において記載される方法において使用されるエフェクター細胞は、エフェクター細胞が発現するFc受容体、および、いくつかの態様では、エフェクター細胞が発現するFc受容体の多型形態に基づいて選択することができる。従って、本明細書において記載される方法は、抗体と、公知のFcγ受容体（例えば、特定の多型を有するFcγ受容体）を発現するエフェクター細胞との特定の組合せが標的細胞をADCCによって殺傷することができるかどうかを判定するために使用することができる。そのような研究は、Fc受容体によるIgG結合の機構の全般的な研究において有用であり得るし、また、結合のために非常に重要である、Fc受容体およびIgGのFc領域の両方における残基の特定を可能にし得る。その結果として、そのような研究は、エフェクター細胞上のFc受容体との最適な結合を示し、従って、ADCCを最大にするFc領域の配列を有する治療用抗体の開発を可能にし得る。そのような研究はまた、既存の治療用抗体がADCC応答を誘導することができるための最適なエフェクター細胞の遺伝子型を決定するために使用することができ、その結果、見込みのある患者が、最適な遺伝子型を有するFc受容体の存在について試験され得るようになる。
【００６８】
いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において使用されるエフェクター細胞はPBMCである。PBMCは、全血から、例えば、当技術分野および下記の実施例において記載される標準的な実験プロトコルを使用して単離することができる、単球およびリンパ球の混合物である。PBMCに見出される細胞の多様性は、基体に対する非特異的な接着のためにインピーダンス読み取りにおける混乱をもたらすことが予想される。しかしながら、驚くべきことに、本発明者らは、抗体およびPBMCを加えた後でのインピーダンスまたは細胞指数における変化が、標的細胞のADCCを正確に示すものであることを見出している。全血、あるいは、全血がエフェクター細胞（例えば、PBMC）について濃縮または部分的に濃縮されるように少なくとも部分的に精製されている血液もまた、本明細書において提供される方法において有用であり得る。
【００６９】
本明細書において提供される方法は広範囲の様々な臨床的適用を有する。上記で議論されたように、エフェクター細胞が抗体と結合する能力に対する影響を有し、従って、エフェクター細胞がADCCを媒介する能力に影響を及ぼす多型体がヒトFc受容体には存在する。個体におけるエフェクター細胞が治療用抗体と結合する能力は、抗体の臨床的効力に対する大きな影響を有し得る。例えば、Bリンパ増殖性悪性腫瘍の処置において使用される抗CD20 IgG抗体のRituxan（登録商標）は、おそらくは、FcγIII158Vを有するNK細胞がより効果的にRituxan（登録商標）のRc領域に結合するという事実のために、FcγIII158Vの遺伝子型についてホモ接合性の患者では、FcγIII158Fの遺伝子型についてホモ接合性の患者の場合よりも良好な臨床結果を生じさせることができる。
【００７０】
個体（例えば、患者）由来のPBMCをエフェクター細胞として使用することができることは、本明細書において提供される方法が、特定の治療用抗体が、標的細胞に関連する疾患または障害を有する特定の患者の処置に適しているかどうかを判定するために使用され得ることを意味する。従って、いくつかの態様において、エフェクター細胞は、標的細胞に関連する疾患を有する患者から得られるPBMCが可能であり、抗体は、その患者を処置するための候補の治療用抗体が可能である。従って、本出願は、対象を、候補抗体による処置に適した標的細胞に関連する疾患を有するとして特定する方法を提供する。この方法は、(a)疾患に関連する標的細胞の成長を支援する非導電性基体における電極間のインピーダンスをモニターする工程；(b)患者から単離されたPBMCと、候補抗体とを標的細胞に加える工程；および(c)基体における電極間のインピーダンスにおける変化が、PBMCおよび抗体を加えた後で生じているかどうかを判定する工程であって、電極間のインピーダンスにおける低下により、ADCCが示され、従って、患者が抗体による処置についての適合性を有することが示される工程を含むことができる。
【００７１】
いくつかの態様において、標的細胞は、Bリンパ増殖性悪性腫瘍に関連する細胞が可能であり、候補抗体はRituxan（登録商標）が可能である。そのような態様によれば、本明細書において提供されるような方法は、Bリンパ増殖性悪性腫瘍を有する患者がRituxan（登録商標）による処置に適しているかどうか判定するために使用することができる。この方法は、当然のことではあるが、患者の処置のための最適な抗体を特定するための本明細書において記載される他の抗体および標的細胞のいずれかとの組合せで、特定の患者に由来するPBMCとともに行うことができる。さらに、PBMCが、特定の抗体との組合せでADCCを誘導することができるとして特定されるときには、PBMCがその抗体による処置に適していることを判定するために、標準的な遺伝子型決定法を使用して、PBMCの遺伝子型を決定することができ、また、他の個体のPBMCを試験することができる。
【００７２】
個体由来のPBMCがエフェクター細胞として使用される場合、標的細胞もまた、個体由来の細胞（例えば、生検物から得られるガン細胞）であってもよく、その結果、この方法は、対象のPBMCとの組合せでの特定の候補抗体が患者における細胞をADCCによって殺傷することができるかどうかを明らかにする個人専用の方法となる。より多くの抗体製造物が利用可能になるので、本明細書において提供される方法は、特定の患者における臨床結果を最適化するための、最も良好な抗体製造物の選択を可能にする。
【００７３】
本明細書において提供される方法はまた、エフェクター細胞および抗体の種々の組合せにより誘導されるADCCを増大または低下させる能力について化合物をスクリーニングするために適合化することができる。従って、本出願は、ADCCを調節する能力について化合物をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、(a)アッセイ培地における標的細胞の成長を支援する非導電性基体における電極間のインピーダンスをモニターする工程；(b)化合物と、エフェクター細胞と、標的細胞に結合する抗体とをアッセイ培地に加える工程；および(c)化合物がADCCを調節するどうかを、エフェクター細胞および抗体を化合物の存在下で加えた後での基体における電極間のインピーダンスにおける任意の変化を、エフェクター細胞および抗体を化合物の非存在下で加えた後での基体における電極間のインピーダンスにおける任意の変化と比較することによって判定する工程を含むことができる。
【００７４】
本明細書において議論されるように、エフェクター細胞および抗体を加えた後でのインピーダンスにおける低下により、ADCCがアッセイ培地において引き起こされていることが示される。スクリーニングされている化合物の存在下で観測されるインピーダンスにおけるさらなる低下は、化合物がADCCを増大させるということを示すものであり得る。逆に、化合物の存在下でのインピーダンスにおける増大は、化合物がADCCを低下させるということを示すものであり得る。いくつかの状況では、ADCCを増大させる化合物を特定することが望ましい場合がある。例えば、この方法は、ガン細胞に対する、治療用抗体およびPBMCにより誘導されるADCC応答を増大させる化合物を特定するために使用することができる。他の状況では、ADCCを低下させる化合物を特定することが望ましい場合がある。例えば、この方法は、健康な標的細胞に対する、抗体と、自己免疫疾患の患者に由来するPBMCとにより誘導されるADCC応答を低下させる化合物を特定するために使用することができる。化合物がADCCの調節因子として作用しないという知見もまた、いくつかの状況では有用であり得る。これは、そのことにより、そのような化合物（これ自身が別の治療目的を有する場合がある）は、特定のエフェクター細胞-抗体の組合せがADCCを誘導する能力を妨害しないことが示されるからである。
【００７５】
そのような方法では、本明細書において記載される標的細胞、エフェクター細胞および抗体のいずれかを用いることができる。いくつかの態様において、用いられるエフェクター細胞-抗体の組合せは、問題としている標的細胞に対するADCC応答を誘導することができるとして既に特定される組合せが可能である。スクリーニングされる化合物は、エフェクター細胞および抗体と同時に標的細胞に加えることができる。あるいは、スクリーニングされる化合物は、エフェクター細胞および抗体の前に、または、エフェクター細胞および抗体の後で標的細胞に加えることができる。
【００７６】
本明細書において提供される方法でADCCを調節する能力についてスクリーニングすることができる化合物には、ペプチド、ペプトイド、タンパク質、脂質、金属、小さい有機分子、RNAアプタマー、抗生物質および他の公知の医薬品、ポリアミン、および、それらの組合せまたは誘導体が含まれるが、これらに限定されるわけではない。小さい有機分子は典型的には、約50ダルトン〜約2,500ダルトンの分子量（例えば、約300ダルトン〜約800ダルトンの分子量）を有する。候補化合物は合成化合物または天然化合物の大きなライブラリーに由来することができる。例えば、様々な合成化合物ライブラリーが、MayBridge Chemical Co.（Revillet、Cornwall、UK）またはAldrich（Milwaukee、WI）から市販されている。あるいは、細菌、菌類、植物および動物の抽出物の形態での天然化合物のライブラリーを使用することができる。加えて、候補化合物は、個々の化合物として、または、混合物として、そのいずれかで、コンビナトリアル化学を使用して合成的に製造することができる。
【００７７】
いくつかの態様において、スクリーニングされる化合物は、標的細胞が関連する疾患の処置において既に使用される化合物が可能であり、抗体は、その疾患を処置するために開発された抗体である場合がある。例えば、標的細胞がガン細胞である場合、スクリーニングされる化合物は化学療法剤が可能であり、抗体は、ガンを処置するために開発された治療用抗体が可能である。従って、本明細書において提供されるような方法は、化学療法剤が、抗体による標的細胞の殺傷をADCCによって増大または低下させるかどうかを判定するために使用することができる。同様に、スクリーニングされる化合物は、自己免疫障害の患者においてADCCを調節する化合物が可能である。そのような場合には、加えられる抗体は、自己免疫疾患の患者においてADCCを介して自己免疫活性を引き起こす抗体が可能である。
【００７８】
いくつかの態様において、本明細書において記載される方法は、抗体、エフェクター細胞および標的細胞の多数の組合せが、ADCCを応答を、ADCC応答を調節し得る化合物が場合により存在するもとでもたらすことができるかを同時に評価するハイスループット方法が可能である。そのような態様では、標的細胞を、それぞれのウエルが少なくとも2つの電極を含む2つ以上のウエルを含有する非導電性基体上で平板培養することができ、この方法は、それぞれの個々のウエルでの電極間のインピーダンスにおける任意の変化をモニターすることを含むことができる。本明細書において記載されるRT-CES（登録商標）システムおよび関連ソフトウエアがハイスループットアッセイにおける使用のために適合化される。
【００７９】
いくつかの態様において、それぞれのウエルに加えられた標的細胞、抗体およびエフェクター細胞は、アッセイの目的に依存して、同じあってもよく、または、異なっていてもよい。いくつかの態様において、例えば、この方法は、多数の候補の治療用抗体が、1人の患者に由来するPBMC、または、数人の患者に由来するPBMCの存在下で、様々な標的細胞に対してADCCを誘導する能力を同時に試験するために使用することができる。そのようなハイスループット方法はまた、1つだけの候補抗体が、同じエフェクター細胞の存在下、様々な抗体濃度で、同じ標的細胞または様々な異なる標的細胞に対してADCCを誘導する能力を同時に試験するために使用することができる。加えて、そのようなハイスループット方法は、様々な異なる抗体のADCC速度論を同時に比較するために使用することができる。ハイスループットアッセイはまた、上記で議論されたように、ADCC応答を調節する能力について化合物をスクリーニングするために使用することができる。
【００８０】
さらに、ハイスループット方法の一部としての本明細書において記載されるような方法の使用は、対照実験を、上記で記載された、ADCC活性をアッセイするための方法と並行して行うことを可能にする。例えば、好適な対照アッセイでは、標的細胞をプレーティングし、成長させ、インピーダンスをエフェクター細胞および抗体の非存在下でモニターすることを含むことができる。さらなる対照実験は、平板培養された標的細胞にエフェクター細胞を単独で加えること、または、平板培養された標的細胞に抗体を単独で加えることを含むことができる。
【００８１】
本発明はさらに下記の実施例において記載され、しかし、下記の実施例により、特許請求の範囲において記載される本発明の範囲は限定されない。
【００８２】
実施例
1．序論
ACEA Biosciences（San Diego、CA）のRT-CES（登録商標）（Real Time Cell Elctronic Sensor）システムは、細胞の状態をリアルタイムで非浸襲的に定量化するためにインピーダンスの電子的読み取りを利用する。細胞が、マイクロ電子工学センサーアレイと一体化されるE-Plateマイクロタイタープレート（ACEA Biosciences）に播種される。細胞と、微小電極表面との相互作用は細胞-電極のインピーダンス応答の生成をもたらし、これにより、細胞の状態が、形態学、接着量および数に関して示される。
【００８３】
このACEAシステムを使用して、接着性細胞のためのリアルタイムADCCアッセイを開発した。2つの細胞株を使用した。SKBR3（乳腺腺ガン細胞株）およびMG63（骨芽細胞細胞株）。SKBR3は、HER-2抗原を過剰発現する接着性細胞である。Herceptin（登録商標）（HER-2に対するヒト化抗体）はエフェクター細胞の存在下でのADCCによるSKBR3細胞の殺傷を媒介する。MG63は、M-SCFを過剰発現する接着性細胞である。Chir-RX1（M-SCFに対するヒト化IgG1抗体）はエフェクター細胞の存在下でMG63細胞に対するADCCを媒介する。
【００８４】
実験を、ACEAシステムが、PBMCエフェクター細胞と、Herceptin（登録商標）またはRX-1のいずれかとにより媒介されるADCCによるSKBR3標的細胞およびMG63標的細胞のリアルタイムでの殺傷をモニターするために使用できるかどうかを判定するために行った。
【００８５】
2．標的細胞、抗体およびPBMC調製
SKBR3細胞（ATCC、Manassas、VA；カタログ#HTB-30）をDME-15培地で培養した。
【００８６】
ヒト化抗体のHerceptin（登録商標）（Genentech Corporation、South San Francisco、CA；商品名、トラスツズマブ）を水により再構成して、21mg/mlのストック溶液を使用前に作製した。Herceptin（登録商標）は再構成後30日間安定である。
【００８７】
ヒトPBMCを、健康な志願者提供者から得られたヒト血液から調製した。ヒト静脈血サンプル（8.5ml）をイエロートップ（yellow-top）クエン酸アンモニウム（ACD-A）チューブに採取した。チューブを10回〜15回反転し、全血をそれぞれのイエロートップチューブから取り出し、1つの50mlの円錐チューブに移した。血液を2%FBSにおけるPBSにより1:3希釈した。12mlのFicoll-Hypaque（Amersham Biosciences、Piscataway、NJ；cat #17-1440-02）を血液/PBS混合物の下側にゆっくり分注した。サンプルを室温で2350rpmにおいて30分間遠心分離し、その後、上層（血漿/PBS）を吸引により除いた。軟膜を無菌ピペットにより集め、50mlの円錐チューブにプールした。WBSの目に見える塊が依然として軟膜の下側にあるならば、WBC物のすべてを、過剰なFicoll-Hypaqueを取り出さないように注意して集めた。無菌のPBS-2%FBSを加えて、体積を30mlにし、混合物を反転によって混合した。希釈されたPBMC懸濁物を250xg（Beckman GH3.8ローターについて1046rpm）において室温で17分間遠心分離し、細胞ペレットを集めた。PBMCペレットを2.5mlのR-2培地（2%の熱不活化FBSを含むRPMI-1640培地）に懸濁し、十分に混合し、15mlの円錐チューブに移した。PBMCをR-2培地により1回洗浄し、生細胞の数をトリパンブルー（Invitrogen cat.#15250-061または同等物）排除によって調べた。
【００８８】
3．Herceptin（登録商標）およびPBMCによるSKBR3細胞のADCC殺傷のアッセイ
ADCCアッセイを行う前に、数回の実験を、RT-CES（登録商標）システムからの細胞指数読み取りに対する、Herceptin（登録商標）抗体またはPBMCエフェクター細胞によるSKBR3細胞単独の影響を評価するために行った。
【００８９】
SKBR3細胞を、ウエルあたり40K、20K、10Kまたは5Kで平板培養し、RT-CES（登録商標）リーダーに入れた。新鮮な培地を20時間後に加え、細胞指数を100時間モニターした。図1に示されるように、細胞指数は、SKBR3細胞が増殖するに従って増大した。細胞指数はウエルあたり60K〜160Kの最大検出限界を有した。
【００９０】
その後の実験において、SKBR3細胞をウエルあたり40Kで平板培養した。20時間後、新鮮な培地を一群のウエルに加え、Triton X-100を含有するPBSを別の一群のウエル加え、プレートをリーダーに戻した。図2に示されるように、細胞指数における低下が、Triton X-100を加えた後で生じた。これは細胞死を示している。
【００９１】
さらなる実験において、SKBR3細胞をウエルあたり20Kで平板培養し、培地単独、Herceptin（登録商標）またはIgG対照抗体を20時間後に加えた。Herceptin（登録商標）またはIgGのいずれかを単独で加えたとき、細胞指数は、抗体が加えられなかったときの細胞指数と比較して著しく変化しなかった（図3）。
【００９２】
その後、ウエルあたり20Kで平板培養されたSKBR3細胞の細胞指数を、ウエルあたり5X105細胞の最終濃度で培地単独に加えられたPBMCの細胞指数と比較した。驚くべきことに、PBMCは細胞指数に対する著しい影響を有していなかった（図4）。このことは、PBMCをADCCアッセイにおけるエフェクター細胞として使用することはSKBR3細胞の死の正確な検出を妨害しないことを示している。PBMCが、ウエルあたり20Kで平板培養されたSKBR3細胞を含有するウエルに加えられたとき、細胞指数が低下した（図5）。このことは、PBMCエフェクターは単独で、SKBR3標的細胞に対するNK殺傷作用を有することを示している。
【００９３】
その後、アッセイを、PBMCエフェクターの存在下での標的抗体のHerceptin（登録商標）によるSKBR3細胞のADCC殺傷を検出するために行った。標的細胞を、ADCCアッセイを開始する20時間前にウエルあたり20Kで平板培養した。ADCCアッセイを開始するとき、プレートを、抗体およびエフェクター細胞を加えるためにACEAシステムから一時的に取り出した。
【００９４】
PBMCエフェクター細胞を、5μg/mlの最終濃度でのHerceptin（登録商標）抗体と一緒に、25:1のエフェクター：標的の比率でSKBR3標的細胞に加えた。その後、細胞指数をその後の48時間にわたって連続してモニターするために、細胞プレートをACEAシステムに戻した。図6は、SKBR3細胞単独の細胞指数、PBMCを伴うSKBR3細胞の細胞指数、および、Herceptin（登録商標）抗体と、PBMCとを伴うSKBR3細胞の細胞指数の比較を示す。細胞指数における劇的な低下が、PBMCおよびHerceptin（登録商標）を加えた後で記録された。これはADCCによるSKBR3細胞の殺傷を反映している。
【００９５】
実験を、5μg/mlの濃度でのHerceptin（登録商標）を伴って、または伴うことなく、SKBR3細胞を50:1または12.5:1のE:T比でのPBMCエフェクターとともに使用して繰り返した。図7は、下記の式に従って計算された細胞溶解割合に関して測定されたときのこれらの実験におけるADCC殺傷の経時変化を示す。
2009522583.tif 000005
【００９６】
図7における結果は、Herceptin（登録商標）およびPBMCの存在下での細胞溶解がADCCの結果として劇的に増大することを判定する。
【００９７】
4．リアルタイムADCCアッセイと、カルセインAM放出ADCCアッセイとの比較
実験を、リアルタイムADCCアッセイを使用して検出された％溶解を、標準的なカルセインAM放出ADCCアッセイを使用して検出された％溶解と比較するために行った。
【００９８】
カルセイン-AMアッセイを、下記のプロトコルを使用して行った。乾燥DMSOにおける1mg/mlの溶液でのカルセインAM（Molecular Probes、Eugene、OR；カタログ#C-3099）の1つのバイアルを解凍し、ピペッティングによって穏やかに混合した。
【００９９】
SKBR3細胞を標識するために、培地を除き、単層物を10mlのPBS単独（ウシ胎児血清（FBS）非含有）により洗浄した。単層物を、5mlのEDTA/PBSを加え、37℃で10分までインキュベーションすることによって剥離させた。10mlの新鮮なR10（10%の熱不活化FBS、Pen/Strep（100μg/mlの最終濃度）およびL-グルタミン（2mMの最終濃度）を含むRPMI-1640培地）を加えた。細胞を集め、遠心分離し、計数し、2.5x106個の細胞を新鮮な15mlチューブに移した。細胞を15mlの円錐チューブにおいて2.5mlのR-10に懸濁し、12.5μlのカルセインAM（5μMの最終濃度）をそれぞれのチューブに加えた。チューブを、キャップをゆるくなっていることを確実にして、加湿された5％CO2において37℃で30分間インキュベートした。細胞を10分毎に穏やかに混合して、沈降することを回避した。標識された細胞を10mlのR-2（2%の熱不活化FBSを含むRPMI-1640培地）により2回洗浄した。細胞をR-10培地に懸濁して、5x105細胞/mlを達成した。
【０１００】
標的のSKBR3細胞をADCCアッセイのためにウエルあたり20Kで平板培養した。ADCCアッセイを開始するとき、PBMCエフェクター細胞を、図8に示される濃度での対照抗体IgGまたはHerceptin（登録商標）と一緒に、標的細胞に25:1の比率で加えた。標的細胞、エフェクター細胞および抗体の混合物を37℃で4時間インキュベートさせた。インキュベーションが終了したとき、細胞をペレット化し、カルセインAMの放出を上清から測定した。
【０１０１】
それぞれの標的についての平均バックグラウンド培地対照を分析前のそれぞれの個々の標的細胞株について引き、パーセント最小対最大を、下記の式を使用して計算した。
2009522583.tif 000006
【０１０２】
アッセイは、最小放出対最大放出のパーセントが37%を越えたならば、無効であると見なした。百分率での比溶解を、下記の式を使用して三連の点の平均値から計算した。
2009522583.tif 000007
【０１０３】
カルセイン-AMアッセイを使用して検出されたパーセント溶解が図8Bに示される。図8Aは、RT-CES（登録商標）システムを使用して行われた並行アッセイにおいて検出されたパーセント溶解を示す。SKBR3標的細胞を、PBMCエフェクター細胞およびIgG抗体またはHereceptin（登録商標）抗体をカルセイン-AMアッセイの場合と同じ比率および濃度で加える前の18時間〜20時間で平板培養した。RT-CESシステムを使用して検出されたパーセント溶解は、カルセイン-AM標識化を使用して検出されたパーセント溶解よりも約2倍大きかった。これは、カルセイン-AMアッセイが、細胞が懸濁状態にあることを必要として、これに対して、細胞がRT-CESアッセイでは接着性であるという事実のためであるかもしれない。
【０１０４】
5．RX-1モノクローナル抗体およびPBMCによるMG63細胞のADCC殺傷のアッセイ
MG63細胞およびSKBR3細胞をウエルあたり20Kで平板培養し、細胞指数を24時間モニターした。SKBR3細胞の成長は細胞指数との直線関係を有し、これに対して、MG63細胞の成長は一般に、細胞指数との直線関係を有しなかった（図9）。しかしながら、約7時間〜約17時間の間で、MG63細胞の成長は細胞指数とのほぼ直線的な関係にあった。このことは、ADCCアッセイがMG63細胞についてはこの時間の範囲内でおそらくは行われるであろうことを示唆している。
【０１０５】
ADCCアッセイを、ウエルあたり20Kで平板培養されたMG63標的細胞を用いて行った。MG63細胞単独についての細胞指数を、PBMC、PBMCおよびIgG対照抗体、または、PBMCおよびRX1抗体が18時間後〜20時間後に加えられたMG63細胞の細胞指数と比較した。それぞれの実験におけるPBMCエフェクター対MG63標的細胞の比率は50:1であり、抗体を5μg/mlの濃度で加えた。図10Aに示されるように、細胞指数が、MG63細胞のADCCの結果として、PBMCおよびRX1を加えた後で低下した。しかしながら、ADCCの速度論は、同じ実験が、PBMC、PBMCおよびIgG、または、PBMCおよびHerceptin（登録商標）の存在下でSKBR3細胞を用いて繰り返されたときに観測された速度論とは異なっていた（図10B）。これらの結果から、ADCC速度論に関する詳細な情報を提供することにおけるリアルタイムADCCアッセイの有用性が明らかにされる。
【０１０６】
6．結論
本明細書において記載されるADCCアッセイは、ADCCをアッセイするための現在の方法を上回る改善を提供する。標準的なアッセイとは異なり、RT-CES（登録商標）に基づくアッセイは、ADCC殺傷をリアルタイムで追跡するために使用することができ、また、ADCCの速度論を詳細に追跡することを可能にする。本アッセイは、現在利用可能である他のADCCアッセイよりも高感度であり、かつ、より迅速であり、また、ハイスループットスクリーニングのために最適化される潜在的可能性を有する。加えて、本アッセイは標識を用いず、また、非放射性であり、または、低下したレベルの標識を必要とし、このことは、本アッセイを、例えば、放射性標識化を伴うアッセイよりも安全にする。本アッセイは、プレートからの剥離を伴うことなく、接着性細胞に対して行うことができるので、インビボでの細胞に対するADCCのより正確な評価を可能にする。従って、本明細書において記載されるADCCアッセイは、候補の治療用抗体をADCC活性についてアッセイすることができることを改善する。
【０１０７】
そのうえ、本明細書において提供されるADCCアッセイは、特定の抗体による処置に適している患者集団を特定するために使用することができる。上記で議論されたように、本アッセイは、PBMCをエフェクター細胞として使用して行うことができる。エフェクター細胞が標的特異的な抗体に結合する能力、従って、ADCCを媒介する能力に影響を及ぼし得る多型体がPBMCエフェクター細胞上のFc受容体には存在する。本明細書において提供されるADCCアッセイは、特定の患者に由来するPBMCが、治療用抗体との組合せで、標的細胞のADCCを媒介することができるかどうかを判定するために使用することができる迅速かつ容易なアッセイである。
【０１０８】
まとめると、本明細書において提供されるADCCアッセイ方法は、薬物開発のために産業界において、また、抗体により媒介される免疫応答を研究するために基礎研究において、その両方で、ADCCが測定される様式を変化させる潜在的可能性を有する。
【０１０９】
他の態様
本発明がその詳細な説明と併せて記載されている一方で、前記の記載は、添付された請求項の範囲によって定義される本発明の範囲を例示することが意図され、添付された請求項の範囲によって定義される本発明の範囲を限定することは意図されないことを理解しなければならない。他の局面、利点および改変は下記の請求項の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】示されるように、ウエルあたり40K、20K、10Kまたは5Kの2倍連続希釈で平板培養されたSKBR3細胞についての経時的な細胞指数をプロットするグラフを示す。
【図２】20時間後、細胞死を誘導するために、さらなる新鮮な培地により処置された平板培養されているSKBR3細胞（「細胞単独」）、または、Triton X-100により処置された平板培養されているSKBR3細胞（「細胞＋Triton」）についての経時的な細胞指数をプロットするグラフを示す。
【図３】20時間後、新鮮な培地により処置された平板培養されているSKBR3細胞（「標的単独」）、Herceptinにより処置された平板培養されているSKBR3細胞（「標的＋Herceptin」）、または、IgG対照抗体より処置された平板培養されているSKBR3細胞（「標的＋IgG」）についての経時的な細胞指数をプロットするグラフを示す。
【図４】SKBR3細胞単独（「標的」）またはPBMC（「エフェクター」）についての経時的な細胞指数をプロットするグラフを示す。
【図５】SKBR3細胞単独、PBMC単独、または、20時間後にPBMCにより処置されたSKBR3細胞についての経時的な細胞指数をプロットするグラフを示す。
【図６】SKBR3細胞単独、20時間でPBMCにより処置されたSKBR3細胞、または、20時間後にPBMCおよびHerceptin（登録商標）により処置されたSKBR3細胞についての経時的な細胞指数をプロットするグラフを示す。
【図７】示されるようにHerceptin（登録商標）mABの存在下および非存在下での、50:1または12.5:1のE:T比でのPBMCエフェクター（E）によるSKBR3標的細胞（T）溶解の経時変化を示すグラフを示す。
【図８Ａ】PBMC単独により処置されたSKBR3標的細胞、PBMC＋示された濃度のHerceptin（登録商標）により処置されたSKBR3標的細胞、または、PBMC＋対照IgGにより処置されたSKBR3標的細胞についての、本明細書において記載されるような方法を使用して求められた溶解割合をプロットするグラフを示す。
【図８Ｂ】PBMC単独により処置されたSKBR3標的細胞、PBMC＋示された濃度のHerceptin（登録商標）により処置されたSKBR3標的細胞、または、PBMC＋対照IgGにより処置されたSKBR3標的細胞についての、標準的なカルセイン-AMアッセイを使用して求められた溶解割合をプロットするグラフを示す。
【図９】SKBR3細胞およびMG63細胞についての経時的な細胞指数をプロットするグラフを示す。
【図１０Ａ】18時間〜20時間で、PBMC単独により処置されたMG63細胞、RX1標的特異的抗体とともにPBMCにより処置されたMG63細胞、または、IgG対照抗体とともにPBMCにより処置されたMG63細胞についての細胞指数をプロットするグラフを示す。
【図１０Ｂ】18時間〜20時間で、PBMC単独により処置されたSKBR3細胞、Herceptin （登録商標）標的特異的抗体とともにPBMCにより処置されたSKBR3細胞、または、IgG対照抗体とともにPBMCにより処置されたSKBR3細胞についての細胞指数をプロットするグラフを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【国際調査報告】
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