(57)【要約】  導入されるゲノムは自然に生じることができ、自動化に拘らずに人造的であるか、又は、自然に生じる物質と人造物質とのハイブリッドでもよい。ゲノムは、最小のダメージで、細胞外で得られる。タンパク質、RNA、ポリカチオン、核様体結合タンパク質、又は、遺伝子翻訳システムなどの物質は、遺伝子を伴うことができる。ゲノムは、自然に生じる細胞にインストールされるか、又は、人造的な細胞様システムにインストールされる。（本発明により）提供された方法の実施の結果により生じる細胞様システム又は合成細胞は、所望のタンパク質などの遺伝子発現産物を産出するよう、設計及び使用できる。物質及び膜のタイプを伴い、広汎で様々なゲノムを含んでいる細胞又は細胞様システムの合成を可能にすることによって、（本発明により）提供された方法は、従来方法を用いて可能である場合以上の実験及び生物工学のより拡大する分野を可能にする。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成細胞を作成するための方法であって、該方法は、
細胞内でないゲノムを得るステップと、
該ゲノムを細胞又は細胞様システムに導入するステップとを含む、方法。
【請求項２】
前記ゲノムを導入するステップは、ゲノムを含んでいる細胞に前記ゲノムを導入するステップをさらに含み、前記細胞を親細胞の自然に生じるゲノムを有する娘細胞と、前記導入されたゲノムを有する合成の娘細胞とに分割するようにするステップをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項３】
前記ゲノムを導入するステップは、一つの種の細胞からのゲノムを異なる種の細胞に導入するステップをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項４】
前記ゲノムは、裸のDNA（naked DNA）を含む、請求項１の方法。
【請求項５】
前記ゲノムは、自然に生じるゲノムを含む、請求項１の方法。
【請求項６】
前記ゲノムは、人造ゲノムを含む、請求項１の方法。
【請求項７】
前記ゲノムは、一以上の自然に生じる構成成分と、一以上の人造的な構成成分とを含んでいるハイブリッドゲノムを含む、請求項１の方法。
【請求項８】
前記ゲノムは、遺伝子配列以外の一以上の特徴を提供する一以上の核酸配列を含む、請求項１の方法。
【請求項９】
前記ゲノムは、最小のゲノムを含む、請求項１の方法。
【請求項１０】
前記ゲノムは部分ゲノムであり、一以上の染色体又は染色体断片を含んでいる、請求項１の方法。
【請求項１１】
前記細胞様システムは、膜に境界付けられた容量（membrane-bound volume）を含む、請求項１の方法。
【請求項１２】
前記細胞様システムは、脂質小胞を含む、請求項１の方法。
【請求項１３】
前記細胞様システムは、一以上の細胞内構成成分が取り除かれた細胞を含む、請求項１の方法。
【請求項１４】
前記細胞様システムは、ゲノムが取り除かれた細胞を含む、請求項１の方法。
【請求項１５】
関心のある産物を生成する方法であって、該関心のある産物を生成するための効果的な条件下で、請求項１の方法によって生成される、一以上の合成細胞を培養するステップを含んでいる、方法。
【請求項１６】
細胞内でないゲノムを得るステップと、該ゲノムを細胞又は細胞様システムに導入するステップとによって生成される、合成細胞。
【請求項１７】
前記（細胞内でないゲノムを得るステップにより）得られたゲノムは、部分ゲノムであり、一以上の染色体又は染色体断片を含んでいる、請求項１６の合成細胞。
【請求項１８】
前記ゲノムは、一つの種の細胞から得られ、別の種の細胞に導入される、請求項１６の合成細胞。
【発明の詳細な説明】
【連邦政府支援研究開発に関する宣言】
【０００１】
本発明は、合衆国政府の支援で成された（DOE許可番号.DE-FG02-02ER63453）。合衆国政府は本発明の所定の権利を有する。
【関連出願】
【０００２】
この出願は、2005年12月23日に出願された米国仮出願番号第60/752,965、代理人事件整理番号（Attorney Docket#）40921-226812“微生物へのゲノムの導入”に基づく利益及び優先権を主張し、引照により本願開示中に組込まれる。
【技術分野】
【０００３】
本発明は、一般的に細胞生物学に関し、より詳細には、細胞又は細胞様システムの合成に関する。
【背景技術】
【０００４】
細胞のゲノム及び膜を改変する方法は、オーダーメイドのゲノムによる細胞モデル、設計された（designer）細胞及び生命体の生物工学のためと同様に、細胞生物学の分野における仮説をテストするためにも有用である。細胞の設計又は改変への、一つの最近のアプローチは、自然に生じるゲノムよりも小さいゲノムを有する細胞であるが、それにも拘らず増殖などの一定の機能を維持できる細胞を得るために、細菌細胞から遺伝子をノックアウトすることである。そのようなアプローチはゲノムの機能及び設計（design）について学ぶのに、幾らか有用である一方、ゲノムの内容物（全部）、細胞膜及び細胞の容量のより完全な制御を可能にするアプローチは、優れた実験上の制御及び生物工学的可能性によって、科学的、技術的な進展をもたらすであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
所望のゲノムが標的細胞、小胞又は他の膜で境界付けられた容積ないし容量（membrane-bound volume）に導入ないしインストールされる（installed）よう、細胞又は細胞様システムを合成するための方法が望まれている。いかなるゲノム（自然のゲノム、人造的なゲノム、又は天然と人造の核酸配列のハイブリッドの何であれ）の使用を許容し、細胞及びゲノム環境（様々なスケールにおける物質の摂取若しくは排出など（例えば、低分子、タンパク質、及び／又はリボソーム又は核酸の翻訳及び／又は転写システム））のオーダーメイドを許容し、ならびに、細胞膜の設計（再度、自然の膜、水性区画の形成を可能にする人造物質、又はそのような膜と物質のハイブリッドから引き出す）を許容するアプローチは、ゲノム及び細胞の実験の広大な視野、ならびに基礎研究及び生物工学的発展に向かう設計を拓くであろう。
（発明の概要）
【０００６】
ゲノムを細胞又は細胞様システムにインストールする（installing）ための方法が提供される。（本発明により）インストールないし導入されるゲノムは、自然に生じるものでよく、自動化の有無に拘らずに人造的であるか、又は、自然のもの（ゲノム）と人造物質のハイブリッドでもあり得る。繊細なゲノムは、最小の損傷で細胞外から得られる。ゲノムを安定させるか、又は、レシピエント細胞若しくは細胞様システム（例えば、タンパク質、RNA、ポリカチオン、若しくは、遺伝子翻訳システムにおけるようなシステムも）に移動するようにさせる物質は、ゲノムを伴うことができる。ゲノムの幾つかのDNAヌクレオチドはメチル化されるか、あるいは、ゲノムを天然の染色体に一層類似するように修飾されることができる。ゲノムは緩和（relaxed）されてもよく、スーパーコイルとなることもでき、又は、通常の形態が環状であれば、線形でもありうる。ゲノムは、自然の細胞に導入されるか、又は、人造的な細胞様システム（脂質小胞若しくは自然のゲノムが抑制されるか除去されたゴーストセル（ghost cell）など）に導入される。細胞様システム又は（本発明により）提供される方法の実施から生じる合成細胞は、設計されることができ、所望のタンパク質などの遺伝子発現産物を産出するよう、用いられるか、又は、新規な人造の細菌種（その設計されたゲノムは、いかなる天然細胞によっても実行されない、特別な活性を可能にできる（例えば、標準的な２０のアミノ酸以外から構成されるペプチドの合成など））を生じるよう、用いられることができる。物質（materials）及び膜のタイプ（複数）を伴い、広汎で様々なゲノムを含む細胞又は細胞様システムの合成を可能にすることによって、（本発明により）提供される方法は、従来方法を用いて可能である場合より拡い分野の実験及び生物工学を可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
ゲノム、膜、及び細胞質又は膜で境界付けられた水性容積ないし容量（membrane-bound aqueous volume）を含んでいる、細胞又は細胞様システムを設計する能力は、細胞生物学及び生物工学の分野で特に有用である。
【０００８】
本発明の実施態様は、細胞又は細胞様システムを合成するための方法を提供する。“細胞様システム”は、自然に生じる細胞に近似するが、人為的な関与なしでは生じないシステムである。細胞様システムは、ゲノム又は部分ゲノムがインストールされた（若しくは“導入された”）哺乳類の赤血球細胞（哺乳類の赤血球は自然にはゲノムを含まない）；ゲノムが導入された“ゴーストセル”；ゲノムが導入されたリン脂質二重層（自然に生じる細胞膜、人造物、又は自然に生じる構成成分と人造的な構成成分とのハイブリッドのいずれかより派生）によって包含された水性容積（aqueous volume enclosed by a phospholipid bilayer）；及びゲノムが導入された脂質小胞によって包含（囲）された水性容積を含む。ゴーストセルは、ゲノムを自然に包含する細胞であるが、幾つかの細胞をゲノムフリー（genome-free）にさせる遺伝子プログラミング（genetic programming）の結果として、又は、ゲノムが取り除かれるか、若しくは不活性化されることで、細胞から自然に生じるゲノムを欠いている、細胞である。部分ゲノム（partial genome）は、一以上の染色体、又は染色体断片を含む。例えば、部分ゲノムは、自然に生じるゲノムの任意の画分、一以上の自然に生じる染色体の一以上の断片、又は、一以上の自然に生じる染色体の一以上の断片、及び一以上の人造的な核酸の配列、一以上の人造的核酸の配列若しくは人造的な核酸の断片などである。
【０００９】
ゴーストセルは、紫外線及びガンマ線照射などの物理的な方法、ミニセル（minicell）を含む遺伝子方法、並びに、抗生物質及びペルオキサイドなどの化学物質での処理に限定されないが、これらを含む任意の手段によって合成されてよい。一つの例示的な実施態様において、自然に生じる（本書において「自然の」とも言う）ゲノムは、マイコプラズマ・ニューモニエの細胞、及びマイコプラズマ・ゲニタリウムの細胞から取り除かれ、マイコプラズマ.ゲニタリウムのゲノムは、マイコプラズマ・ニューモニエのゴーストセルに導入される。幾つかの実施態様において、ゴーストセル（複数）は、マイコプラズマ・アリガトリス（M. alligatoris）及び／又はマイコプラズマ・カプリコラム（M.capricolum）から生成される。それらゴーストセルの両者が迅速に成長するので、それらの使用の収量は、３週間で顕微鏡レベルのコロニーを形成するのに３週間かかるM.ゲニタリウムの場合よりも、又は、コロニー形成に数日かかるM.ニューモニエの場合よりもさらに迅速である。
【００１０】
自然のゲノムは、任意の方法、例えば、溶解及び消化によって、細胞から取り除くことができる。一つの例示的な実施態様において、フラスコに懸濁、又は付着された、SP4倍地に約１０１０ないし約１０１３のマイコプラズマ細胞の成長は、ｐH７．４で２７２mＭのスクロースを有する８ｍMのHEPESを含んでいるエレクトロポレーションバッファにより洗浄される。洗浄された細胞は、４℃で２．５ｍLのエレクトロポレーションバッファに添加され、細胞の凝集塊（クランプ）を破砕するよう倍散（triturated）され、さらに、４℃で１０分間４，５７５ｇの遠心分離によってペレットにされる。上澄みがデカントされ、残存の上澄みを最小限にするよう、遠心分離チューブは数分間にわたって逆さにされる。細胞は、１０％グリセロールを加えた１００μｌのエレクトロポレーションバッファで再懸濁され、等量の２％低融点アガロース又はアガロースによって約５６℃で混合される。生じる細胞の懸濁は長方形ブロックにキャスト成型（cast）され、一方、アガロースは未だに液状である。次いで、各ブロック、ないしは“プラグ（plug）”は、プラグ１ｍL当たり約５０℃ないし５６℃の５mＬのプロテイナーゼK反応カクテル（pＨ８．０の１００mＭのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、０．２％デオキシコール酸ナトリウム、１％ラウリルサルコシンナトリウム（sodium lauryl sarcosine）、２％ドデシル硫酸ナトリウム、及び１ｍｇ／mＬプロテイナーゼKを含有する）にてオーバーナイトで消化される。次いで、プラグは、pＨ８．０の２０ｍMのTrisバッファ及び５０ｍMのEDTAを含有する洗浄バッファにおいて３０分間で４回の攪拌にて洗浄される。第二又は第三の洗浄のための洗浄バッファもまた、１mＭのフェニルメチルスルホニルフルオライド（phenylmethylsulfonylfluoride）を含む。また、合成ゲノムも、細胞又は細胞様システムに導入される前に、この手法で処理できる。
【００１１】
この時点において、ゲノムDNAは、比較的、タンパク質及び他の細胞質成分がなく、ゲノムDNAの切断分解を保護し、かつ、ｐH７．４で２７２mＭのスクロースを有する８ｍMのHEPESの次の任意の段階の透析（dialysis）でゲノムを断片にする他の力から保護し、又は他の処理から保護する、アガロースに懸濁される。ゲノムDNAは、断片化されたゲノムから未完物（完全でないもの（intact））を分離するように、任意に、パルスフィールドゲル（pulsed-field gel）電気泳動を施すことができる。共有結合で閉じられた環状ゲノムは、パルスフィールドゲル電気泳動で比較的不動であり、一方で、線形のDNA分子、RNA、及び残存のペプチドは、アガロースプラグ（agarose plugs）から電気泳動で出てくる。したがって、パルスフィールドゲル電気泳動後、プラグは、共有結合で閉じられた環状の二本鎖DNAゲノムが富化（濃縮）される。ゲノムを含有するアガロースプラグは、パルスフィールドゲルから取り除くことができ、細胞又は細胞様システムに導入するために処理できる。切片化されたプラグ（excised plug）は、pＨ７．５の１０ｍMのTrisバッファ、１ｍMのEDTA、２００μMのスペルミン（又は、ポリエタノールアミンなどの他のポリアミン、若しくは、Dpsなどの核様体濃縮タンパク質（nucleoid condensation protein））及び２５ｍMの塩化ナトリウムにより室温３０分間で透析でき（dialyzed）、DNAの負電荷のスクリーニングによって、DNAをさらにコンパクトにする。任意に、４μｇ／mＬの低分子量のポリ‐L‐リジンを添加した後、アガロースは、アガラーゼで消化でき、トランスフェクションにより細胞又は細胞様システムにゲノムを導入するために有用な混合物を産出するために、市販のリポソーム合成試薬が添加できる。合成ゲノムもまた、細胞又は細胞様システムに導入される前に、この手法で処理できる。
【００１２】
細胞から自然に生じるゲノムを得る、他の実施例は、アガロースの場合よりも、液体での溶解及び消化を含む。４℃で１０分間の４，５７５ｇの遠心分離によってペレットにした後、終濃度で１％のドデシル硫酸ナトリウムを添加することによって細胞は溶解される。EDTAは１００ｍMの終濃度に添加され、RNaseAは１０U／ｍLで添加されて、その混合物は３７℃で３０分間インキュベートされ、次いで、プロテイナーゼKが約２０ないし約１００μｇ／ｍLの濃度で添加され、その混合物は５５℃で約３ないし約１６時間インキュベートされる。次いで、ゲノムDNAは３倍量のエタノール（3 volumes of ethanol）で沈殿され、DNAが管の壁に付着するように沈殿の管は穏やかに回転して、液体が取り除かれ、DNAは冷７０％エタノールで数回洗浄され、TEバッファ（ｐH７．４で１０ｍMのTris‐HCｌ、及び１ｍMのEDTAを含有する）で一度洗浄される。エタノール／TEバッファは除去され、DNAは乾燥され、次いで、５％スクロースを追加したTEバッファで再懸濁される。合成ゲノムもまた、細胞又は細胞様システムに導入する前に、最小のDNA破損による、この手法で処理できる。
【００１３】
導入されたゲノムは、任意のゲノムであってよく、例えば、自然に生じるゲノム、バイオインフォマティクス若しくは他の理論的若しくはコンピュータ的な方法の支援の有無に拘らずに作成されたゲノム、又は、一以上の自然に生じるゲノム及び／若しくは人造ゲノムのハイブリッド若しくはキメラである。例えば、一以上の生物又はオルガネラで自然に生じる遺伝子のクラスタは、自動化実験機器の支援の有無に拘らず、微生物又はオルガネラの自然に生じる遺伝子に挿入されてよい。幾つかの実施態様において、導入されたゲノムは、最小限（minimal）のゲノムであり、例えば、E.coliの最小ゲノム又はM.ゲニタリウムの最小ゲノムなどである。
【００１４】
一つの例示的な実施態様において、ゲノムは任意のパスウェイ（pathway）で、相互転換可能（interchangeable）な核酸“カセット（cassettes）”のアセンブル（assembling）によって調製される。カセットは、一以上の遺伝子又は遺伝子断片、及び、任意で、一以上の調節、構造、又は実験上の配列を含むよう、設計された、任意の長さのヌクレオチド配列である。カセットに含まれる遺伝子は、任意の順番であってよく（例えば、自然に生じる順番から“シャッフル”されたもの）、複数回生じても（あっても）よく、さらに、遺伝子若しくは遺伝子の部分などの他の核酸セグメントによって不完全であっても、又は中断（interrupted）されていてもよい。カセットに含まれるヌクレオチド配列は自然のものでよく、自動化若しくはコンピュータ支援の有無に拘らずに人造的であるか、又は、一以上の自然の配列と一以上の人造的な配列とのハイブリッドであってもよい。
【００１５】
導入されたゲノムは、任意の種類の核酸分子を含むことができる。例えば、導入されたゲノムは、修飾若しくは置換されたヌクレオチドの有無に拘らず、一以上のDNA（デオキシリボ核酸）、RNA（リボ核酸）、又はPNA（タンパク質‐核酸）の一以上のストレッチ（stretches）から構成されてよい。修飾又は置換されたヌクレオチドは、生物学的に派生した核酸分子で普通に生じないものを含み、例えば、それらは、ビオチン化ヌクレオチド及び改変された環状、リン酸若しくは糖モイエティ部位（phosphate or sugar moities）を備えるヌクレオチドである。核酸分子は、一以上のタンパク質若しくは他の物質のための結合部位、又は、基質への付加のために、若しくは任意の他の目的のために設計された部位などの非コード化領域だけでなく、遺伝子を含むことができる。導入された核酸分子は、任意のソースから派生することができ、任意のソースは、動物、植物、又は、古細菌を含む原生生物、ウイルス、細胞内オルガネラ及び／又は化学合成の細胞を含む。導入された核酸分子は、例えば、非標準的なアミノ酸のためのアミノアシルｔRNAシンセターゼ（aminoacyl tRNA synthetase）などの自然に生じない、タンパク質又は酵素の初めからのアブイニシオ設計（ab initio design）の結果であってよい。核酸分子は、任意で、フォールドされるか、スーパーコイルされるか、あるいは圧縮（compressed）される。一つの例示的な実施態様において、導入された核酸分子は二本鎖であるが、一本鎖の核酸分子又は他の立体形態の核酸分子は、（本発明により）提供された発明に包含される。
【００１６】
ゲノムの導入は、任意の手段によって実行できる。例えば、ゲノム又は他の核酸分子は、リポソーム若しくはミセルのいずれかに封入されるか、又はリポソーム若しくはミセルのいずれかとの複合体にでき、リポソーム若しくはミセルは、さらに、タンパク質分子をサポートするような他の物質、転写及び翻訳のためのシステム、原素のイオン、塑性（plastic）あるいは他の粒子並びに／若しくは低分子化合物を含んでも、含まなくてもよい。次いで、ゲノムを含むリポソーム若しくはミセル、又は、ゲノムとの複合体としてのリポソーム若しくはミセルは、細胞に小胞の内容物の取り込みを促進する環境下で、標的の宿主細胞と接触されることができる。レシピエント細胞又は細胞様システムにゲノムをインストール（installation）するための他の方法は、物理的なアプローチ、化学的なアプローチ、及び生物学的なアプローチを含み、物理的なアプローチは、光学的ピンセット、磁気支援型トランスフェクション（導入されるべきゲノムが磁性ナノビーズに結合され、次いで、磁石によってレシピエント細胞内に引き込まれる）、レーザー増強型形質転換、弾道的アプローチ（導入されるべきゲノム的DNAは金又はタングステンのナノ粒子と複合し、次いで、高速度でレシピエント細胞内に射出される）、及び、エレクトロポレーションなどであり、化学的なアプローチ（方法）は、ポリエチレングリコール媒介法、環状ペプチドを用いて細胞に生成した合成孔を介する導入、後の取り込み（subsequent incorporation）でレシピエント細胞に導入されるDNAのカルシウム媒介沈殿、及び、DNAの酢酸リチウム媒介沈殿などであり、生物学的なアプローチは、DNAの取り込み、膜融合性ペプチド（fusogenic peptide）、及び自然の能力の誘発が後続するレシピエント細胞への寒天プラグ（agar plugs）中のDNAの単純な適用などである。
【００１７】
一つの例示的な実施態様において、抗生物質耐性マーカー（tetMなど）を含んでいるM.ゲニタリウムの染色体は、リポフェクション（上述したように、標的細胞にリポソームの内容物を送達するための標的細胞とのリポソームの融合）を介して一以上のM.ゲニタリウム又はM.ニューモニエ細胞に導入される。一以上の標的細胞は抗生物質耐性マーカーを欠くことが予期され、したがって、導入されたゲノムが耐性である、テトラサイクリンに対して感受性が残存する。リポフェクションの一日後、テトラサイクリンが一以上の標的細胞のための成長培地に添加されて、その結果、単に、ゲノムが導入された、一以上の標的細胞が成長する。レシピエント細胞への抗生物質耐性マーカーの組換えを防ぐために、レシピエント細胞の相同組換えタンパク質（RecA）を不能にする必要がある。
【００１８】
別の例示的な実施態様において、マイコプラズマ・ミコイデスからのゲノムDNAは上述のようにアガロースでの消化を介して分離される。精製されたDNAを含んでいる一以上のアガロースプラグは溶解されてポリエチレンイミン及びカチオン性のリポソーム（例えば、LIPOFECTAMINE（商標）２０００（インビトロジェン））と混合され、ゲノムDNAはリポフェクションを介して一以上のM.カプリコラム細胞に導入される。一つの例示的な実施態様において、マイコプラズマ・ミコイデスの大きなコロニーからの裸のゲノムDNA（naked genome DNA）は、ポリエチレングリコール媒介法を用いて、一以上のM.カプリコラム細胞に導入される。
【００１９】
ゲノムは細胞又は細胞様システムに導入できる。例示的な実施態様は、in vivo、培地中、あるいは他の環境のいずれかにおいて、生きている植物、動物、真菌、酵母、ミトコンドリア、葉緑体、若しくは他の細胞あるいはオルガネラにゲノムを導入すること、自然に生じるゲノムが取り除かれた細胞にゲノムを導入すること、及び／又は、水溶液中の赤血球細胞若しくは人造の脂質小胞など、任意の方法によって派生した膜で境界付けられた容積（membrane-bound volume）にゲノムを導入することを含む。例えば、ゲノムは、溶解及び消化によって水生の原生生物から取り除かれ、エレクトロポレーションによってゴーストセルに導入できる（上記で引照した、米国仮出願番号第60/752,965も参照のこと）。あるいは、抗生物質耐性遺伝子又は他の選択マーカーを含んでいるゲノムは、一時的に細胞又はオルガネラが、導入されたゲノムと細胞又はオルガネラ自身のゲノムを含むよう、生きている植物、動物、真菌、酵母、ミトコンドリア、葉緑体、又は他の細胞若しくはオルガネラに導入できる。次いで、その後に続く細胞又はオルガネラの分割は、新たな娘細胞又はオルガネラに導入されたゲノムを分離（segregate）する。かくて、その細胞又はオルガネラは、導入されたゲノムによってプログラムされた表現型を表す。
【００２０】
幾つかの実施態様において、合成細胞が生成され、その生成された合成細胞は自己複製能力を有するか又は有しないことがありうる。一つの例示的な実施態様において、ゲノムは、自然に生じるゲノムを既に含む細胞に導入され、その細胞は２つの細胞に分割（分裂）し、一つの細胞は自然に生じるゲノムを含み、他方の細胞は導入されたゲノムを含む。合成細胞は、例えば、自然に生じるゲノムが取り除かれ、かつ、異なるゲノムが導入された細胞などの改変（engineered）された細胞として認識できる他の微生物と同様に、導入されたゲノムを含有する細胞を含む。
【００２１】
一つの例示的な実施態様において、複製可能な一以上の合成細胞は、ある条件下で一以上の特定の遺伝子産物を発現するように設計されたゲノムを含む。例えば、自然に生じるゲノムはE.coli細胞から取り除かれることができ、導入されたゲノムは、既知の成長媒体でE.coliのための最小のゲノムと、インスリンペプチドなどの一以上の治療的ペプチドを発現するためのカセットとを含む。一以上の改変又は合成細胞は、それら細胞の複製及び治療的ペプチドの発現を促進する条件下で培養され、次いで、それら細胞は収集される。当業者は、細胞の複製及び一以上の所望の遺伝子産物の発現のために適切な条件を容易に決定できるであろう。
【実施例】
【００２２】
図１は、細胞又は細胞様システムにゲノム又は部分ゲノム（partial genome）をインストールするための一つの例示的な方法を説明する図である。細胞外のゲノムは、例えば、裸のDNA（不図示）、又は、一以上のスカフォールドタンパク質１０４を有する一以上のスーパーコイル状の核酸分子１０２、又は、一以上のスカフォールドタンパク質１０４及び一以上のリボソーム１０６（正確な縮尺ではない）を有する一以上のスーパーコイル状の核酸分子１０２、又は、一以上のスカフォールドタンパク質１０４を有する一以上のスーパーコイル状の核酸分子１０２、一以上のリボソーム１０６、並びに一以上の付随する低分子１０８及び一以上の一本鎖核酸分子１１０を含む。一以上のゲノムは、脂質小胞などの膜で境界付けられた水性容積（membrane bound aqueous volume）１１２に導入できる。一つの例示的な実施態様において、トマトタンパク質を生成するために添加されたカセット及び添加されたマーカーヌクレオチドを有する最小限のM.ゲニタリウムのゲノムを含んでいるゲノムは、自然のゲノムを依然として含むE.coli細胞に寒天プラグ（agar plug）において導入される。
【００２３】
図２は、スーパーコイルDNA２０２、スカフォールドタンパク質２０４、及びリボソーム２０６（正確な縮尺ではない）を含んでいるゲノム又は部分ゲノムを自然に生じるゲノム２１０を依然として含むE.coli細胞２０８にインストールするための一つ例示的な方法を説明する図である。この例示的な実施態様において、２つのゲノムを有する細胞は、自然に生じるE.coliのゲノム２１０を有する娘細胞と導入されたゲノム２０２を有する合成の娘細胞とを生成するよう、図中の仮想の三重線に沿って分割（分裂）する。これらの娘細胞（複数）は、さらなる自己複製ができる。
【００２４】
図３は、一以上の合成細胞を用いて、関心のある遺伝子発現産物を生成するための一つの例示的な方法を説明する図である。一つの例示的な実施態様において、合成ゲノム３０２は、所望のタンパク質をコードするための人造カセットがスプライスされており、かつ天然細胞から除去分離された、自然に生じるゲノムを含む。ゲノム３０２は、スカフォールドタンパク質３０４を有する、二本鎖のスーパーコイルDNAの形態である。ゲノム３０２は、例えば、光学的ピンセットを用いて、ゴーストセル３０６に導入される。そのようなゲノム３０２を有する、一以上のそのような合成細胞３０８は調製され、成長培地３１０上に蒔いて培養されて、一以上のコロニー３１２を形成し、かつ所望のタンパク質を発現し、自己複製能を備える、合成細胞３０８を提供する。
【００２５】
様々な実施態様が記載されたが、単に実施例の手法によって示されるだけであり、制限されないことを理解するべきである。例えば、（本発明により）提供される方法を達成する、任意の他のセットのエンドヌクレアーゼ反応の構成成分が使用できる。したがって、好ましい実施態様の特許請求の範囲がおよぶ領域及び範囲は、任意の上述した例示的な実施態様によって制限されるべきでない。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ゲノム又は部分ゲノムを、細胞又は細胞様システムにインストールするための一つの例示的な方法を例示する図である。
【図２】スーパーコイルDNA、スカフォールドタンパク質、及びリボソーム（正確な縮尺ではない）を含むゲノム又は部分ゲノムを、自然に生じるゲノムを含むE.coli細胞にインストールするための一つ例示的な方法を説明する図である。
【図３】一以上の合成細胞を用いて、関心のある遺伝子発現産物を生成するための一つの例示的な方法を説明する図である。
【符号の説明】
【００２７】
１０２  一以上のスーパーコイル状の核酸分子
１０４  一以上のスカフォールドタンパク質
１０６  一以上のリボソーム
１０８  一以上の付随する低分子
１１０  一以上の一本鎖核酸分子
１１２  膜で境界付けられた水性容積
２０２  スーパーコイルDNA
２０４  スカフォールドタンパク質
２０６  リボソーム
２０８  E.coli細胞
２１０  ゲノム又は部分ゲノムを自然に生じるゲノム
３０２  合成ゲノム
３０４  スカフォールドタンパク質
３０６  ゴーストセル
３０８  合成細胞
３１０  成長培地
３１２  一以上のコロニー
2009521229.tif 000003
2009521229.tif 000004
2009521229.tif 000005
【国際調査報告】
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