(57)【要約】  本発明はサンプル中のBKウイルスの迅速、高感度、かつ特異的な核酸に基づく（例えばDNAに基づく）検出法を提供する。一般に、この方法はBKウイルスゲノムの保存領域の標的配列を有する標的核酸の検出を伴う。本発明は、本発明の方法に使用する組成物（プライマー、プローブ、およびキットを含む）も特徴とする。
2009502196.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のBKウイルス（BKV）核酸を検出する方法であって、BKV核酸を含有する疑いのあるサンプル中の少なくとも第1の核酸の存在または非存在を検出することを含み、第1の核酸は以下の標的配列：
AACAAAAAAAAGAGCTCAGAGGATTTTTATTTTTATTTTAGAGCTTTTGC TGGAATTTTGTAGAGGTGAAGACAGTGTAGACGGGAAAAACAAAGGTAC CACTGCTTTACCTGCTGTAAAAGACTCTGTAAAAGACTCCTAGGTAAGTAAT  (SEQ ID NO:01)
またはその相補配列の少なくとも20個の連続するヌクレオチドを有し、第1の核酸の5’および3’末端はSEQ ID NO:1内に含有され；
標的配列を有する核酸の存在の検出は、サンプルがBKV核酸を含有することを示す、上記方法。
【請求項２】
該検出が核酸に基づく増幅によるものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
増幅産物が約30ヌクレオチド長またはそれ未満である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
BKV核酸を含有する疑いのあるサンプル中の少なくとも第2の核酸の存在または非存在を検出することを更に含み、第2の核酸は以下の標的配列：
TGTACATTCAGGAGAGTTTATAGAAAAAACTATTGCCCCAGGAGGTGCTA ATCAAAGAACTGCTCCTCAATGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTAC GGGACTGTAACACCTGCTCTTGAAGCAT (SEQ. ID NO:02)
またはその相補配列の少なくとも20個の連続するヌクレオチドを有する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
BKV核酸を含有する疑いのあるサンプル中の少なくとも第2の核酸の存在または非存在を検出することを更に含み、第2の核酸は以下の標的配列：
AGTAAGTATTCCTTATTAACACCCTTACAAATTAAAAAACTAAAGGTACA CAGCTTTTGACAGAAATTATTAATTGCAGAAACTCTATGTCTATGTGGAG TTAAAAAGAATATAATATTATGCCCAGCACACATGTGTCTACTAATGAAA GTTACAGAATATTTTTCCATAAGTATTTTTTATAACAGAATTTGAGCTTTTTCT TTAGTAGTATACACAGCAAAGCAGGCAAGGGTTCTATTACTAAATACAGC TTGACTAAGAAACTGGTGTAGATCAGAGGGAAAGTCTTTAGGGTCTTCTA CCTTTCTCTTTTTCTTGGGTGGTGTGGAGTGTTGAGAATCTGCTGTTGCTT CTTCATCACTGGCAAACATATCTTCATGGCAAAATAAATCTTCATCCCATT TTTCATTAAAGGAGCTCCACCAGGACTCCCACTCTTCTGTTCCATAGGTTG GCACCTATAA (SEQ ID NO:03)
またはその相補配列の少なくとも20個の連続するヌクレオチドを有する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
BKV核酸を含有する疑いのあるサンプル中の少なくとも第2の核酸の存在または非存在を検出することを更に含み、第2の核酸は以下の標的配列：
ATGGGTGCTGCTCTAGCACTTTTGGGGGACCTAGTTGCCAGTGTATCTGA GGCTGCTGCTGCCACAGGATTTTCAGTGGCTGAAATTGCTGCTGGGGAGG CTGCTGCTGCTATAGAAGTTCAAATTGCATCCCTTGCTACTGTAGAGGGC ATAACAAGTACCTCAGAGGCTATAGCTGCCATAGGCCTAACTCCTCAAAC ATATGCTGTAATTGCTGGTGCTCCTGGGGCTATTGCTGGGTTTGCTGCTTT AA (SEQ ID NO:04)
またはその相補配列の少なくとも20個の連続するヌクレオチドを有する、請求項１記載の方法。
【請求項７】
BKV核酸を含有する疑いのあるサンプル中の少なくとも第2の核酸の存在または非存在を検出することを更に含み、第2の核酸は以下の標的配列：
GGGGCTGAAGTATCTGAGACTTGGGAAGAGCATTGTGATTGGGATTCAGT GCTTGATCCATGTCCAGAGTCTTCAGTTTCTGAATC (SEQ ID NO:05)
またはその相補配列の少なくとも20個の連続するヌクレオチドを有する、請求項１記載の方法。
【請求項８】
サンプル中のBKウイルス（BKV）核酸を検出する方法であって、BKV核酸を含有する疑いのあるサンプル中の少なくとも第1の核酸の存在または非存在を検出することを含み、第1の核酸は以下の標的配列：
TGTACATTCAGGAGAGTTTATAGAAAAAACTATTGCCCCAGGAGGTGCTA ATCAAAGAACTGCTCCTCAATGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTAC GGGACTGTAACACCTGCTCTTGAAGCAT (SEQ ID NO:02)
またはその相補配列の少なくとも20個の連続するヌクレオチドを含有し、第1の核酸の5’および3’末端はSEQ ID NO:2内に含有され；
標的配列を有する核酸の非存在の検出は、サンプルがBKV核酸を含有することを示す、上記方法。
【請求項９】
該検出が核酸に基づく増幅によるものである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
増幅産物が約30ヌクレオチド長またはそれ未満である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
BKV核酸を含有する疑いのあるサンプル中の少なくとも第2の核酸の存在または非存在を検出することを更に含み、第2の核酸は以下の標的配列：
AACAAAAAAAAGAGCTCAGAGGATTTTTATTTTTATTTTAGAGCTTTTGC TGGAATTTTGTAGAGGTGAAGACAGTGTAGACGGGAAAAACAAAGGTAC CACTGCTTTACCTGCTGTAAAAGACTCTGTAAAAGACTCCTAGGTAAGTAAT  (SEQ ID NO:01)
またはその相補配列の少なくとも20個の連続するヌクレオチドを含有する、請求項８記載の方法。
【請求項１２】
BKV核酸を含有する疑いのあるサンプル中の少なくとも第2の核酸の存在または非存在を検出することを更に含み、第2の核酸は以下の標的配列：
AGTAAGTATTCCTTATTAACACCCTTACAAATTAAAAAACTAAAGGTACA CAGCTTTTGACAGAAATTATTAATTGCAGAAACTCTATGTCTATGTGGAG TTAAAAAGAATATAATATTATGCCCAGCACACATGTGTCTACTAATGAAA GTTACAGAATATTTTTCCATAAGTTTTTTATACAGAATTTGAGCTTTTTCT TTAGTAGTATACACAGCAAAGCAGGCAAGGGTTCTATTACTAAATACAGC TTGACTAAGAAACTGGTGTAGATCAGAGGGAAAGTCTTTAGGGTCTTCTA CCTTTCTCTTTTTCTTGGGTGGTGTGGAGTGTTGAGAATCTGCTGTTGCTT CTTCATCACTGGCAAACATATCTTCATGGCAAAATAAATCTTCATCCCATT TTTCATTAAAGGAGCTCCACCAGGACTCCCACTCTTCTGTTCCATAGGTTG GCACCTATAA (SEQ ID NO:03)
またはその相補配列の少なくとも20個の連続するヌクレオチドを含有する、請求項８記載の方法。
【請求項１３】
BKV核酸を含有する疑いのあるサンプル中の少なくとも第2の核酸の存在または非存在を検出することを更に含み、第2の核酸は以下の標的配列：
ATGGGTGCTGCTCTAGCACTTTTGGGGGACCTAGTTGCCAGTGTATCTGA GGCTGCTGCTGCCACAGGATTTTCAGTGGCTGAAATTGCTGCTGGGGAGG CTGCTGCTGCTATAGAAGTTCAAATTGCATCCCTTGCTACTGTAGAGGGC ATAACAAGTACCTCAGAGGCTATAGCTGCCATAGGCCTAACTCCTCAAAC ATATGCTGTAATTGCTGGTGCTCCTGGGGCTATTGCTGGGTTTGCTGCTTTAA (SEQ ID NO:04)
またはその相補配列の少なくとも20個の連続するヌクレオチドを含有する、請求項８記載の方法。
【請求項１４】
BKV核酸を含有する疑いのあるサンプル中の少なくとも第2の核酸の存在または非存在を検出することを更に含み、第2の核酸は以下の標的配列：
GGGGCTGAAGTATCTGAGACTTGGGAAGAGCATTGTGATTGGGATTCAGT GCTTGATCCATGTCCAGAGTCTTCAGTTTCTGAATC (SEQ ID NO:05)
またはその相補配列の少なくとも20個の連続するヌクレオチドを含有する、請求項８記載の方法。
【請求項１５】
サンプル中のBKウイルス（BKV）核酸を検出する方法であって、BKV核酸を含有する疑いのあるサンプル中の少なくとも第1の核酸の存在または非存在を検出することを含み、第1の核酸は以下の標的配列：
ATGGGTGCTGCTCTAGCACTTTTGGGGGACCTAGTTGCCAGTGTATCTGA GGCTGCTGCTGCCACAGGATTTTCAGTGGCTGAAATTGCTGCTGGGGAGG CTGCTGCTGCTATAGAAGTTCAAATTGCATCCCTTGCTACTGTAGAGGGC ATAACAAGTACCTCAGAGGCTATAGCTGCCATAGGCCTAACTCCTCAAAC ATATGCTGTAATTGCTGGTGCTCCTGGGGCTATTGCTGGGTTTGCTGCTTTAA (SEQ ID NO:04)
またはその相補配列の少なくとも20個の連続するヌクレオチドを含有し、第1の核酸の5’および3’末端はSEQ ID NO:4内に含有され；
標的配列を有する核酸の存在の検出は、サンプルがBKV核酸を含有することを示す、上記方法。
【請求項１６】
該検出が核酸に基づく増幅によるものである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
増幅産物が約30ヌクレオチド長またはそれ未満である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
BKV核酸を含有する疑いのあるサンプル中の少なくとも第2の核酸の存在または非存在を検出することを更に含み、第2の核酸は以下の標的配列：
AACAAAAAAAAGAGCTCAGAGGATTTTTATTTTTATTTTAGAGCTTTTGC TGGAATTTTGTAGAGGTGAAGACAGTGTAGACGGGAAAAACAAAGGTAC CACTGCTTTACCTGCTGTAAAAGACTCTGTAAAAGACTCCTAGGTAAGTAAT  (SEQ ID NO:01)
またはその相補配列の少なくとも20個の連続するヌクレオチドを含有する、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
BKV核酸を含有する疑いのあるサンプル中の少なくとも第2の核酸の存在または非存在を検出することを更に含み、第2の核酸は以下の標的配列：
AGTAAGTATTCCTTATTAACACCCTTACAAATTAAAAAACTAAAGGTACA CAGCTTTTGACAGAAATTATTAATTGCAGAAACTCTATGTCTATGTGGAG TTAAAAAGAATATAATATTATGCCCAGCACACATGTGTCTACTAATGAAA GTTACAGAATATTTTTCCATAAGTATTTTTTATAACAGAATTTGAGCTTTTTCT TTAGTAGTATACACAGCAAAGCAGGCAAGGGTTCTATTACTAAATACAGC TTGACTAAGAAACTGGTGTAGATCAGAGGGAAAGTCTTTAGGGTCTTCTA CCTTTCTCTTTTTCTTGGGTGGTGTGGAGTGTTGAGAATCTGCTGTTGCTT CTTCATCACTGGCAAACATATCTTCATGGCAAAATAAATCTTCATCCCATT TTTCATTAAAGGAGCTCCACCAGGACTCCCACTCTTCTGTTCCATAGGTTG GCACCTATAA (SEQ ID NO:03)
またはその相補配列の少なくとも20個の連続するヌクレオチドを含有する、請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
BKV核酸を含有する疑いのあるサンプル中の少なくとも第2の核酸の存在または非存在を検出することを更に含み、第2の核酸は以下の標的配列：
TGTACATTCAGGAGAGTTTATAGAAAAAACTATTGCCCCAGGAGGTGCTA ATCAAAGAACTGCTCCTCAATGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTAC GGGACTGTAACACCTGCTCTTGAAGCAT (SEQ ID NO:02)
またはその相補配列の少なくとも20個の連続するヌクレオチドを含有する、請求項１５記載の方法。
【請求項２１】
BKV核酸を含有する疑いのあるサンプル中の少なくとも第2の核酸の存在または非存在を検出することを更に含み、第2の核酸は以下の標的配列：
GGGGCTGAAGTATCTGAGACTTGGGAAGAGCATTGTGATTGGGATTCAGT GCTTGATCCATGTCCAGAGTCTTCAGTTTCTGAATC (SEQ ID NO:05)
またはその相補配列の少なくとも20個の連続するヌクレオチドを含有する、請求項１５記載の方法。
【請求項２２】
サンプル中のBKウイルス（BKV）核酸を検出する方法であって、BKV核酸を含有する疑いのあるサンプル中の少なくとも第1の核酸の存在または非存在を検出することを含み、第1の核酸は以下の標的配列：
GGGGCTGAAGTATCTGAGACTTGGGAAGAGCATTGTGATTGGGATTCAGT GCTTGATCCATGTCCAGAGTCTTCAGTTTCTGAATC (SEQ ID NO:05)
またはその相補配列の少なくとも20個の連続するヌクレオチドを含有し、第1の核酸の5’および3’末端はSEQ ID NO:5内に含有され；
標的配列を有する核酸の存在の検出は、サンプルがBKV核酸を含有することを示す、上記方法。
【請求項２３】
該検出が核酸に基づく増幅によるものである、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
増幅産物が約30ヌクレオチド長またはそれ未満である、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
BKV核酸を含有する疑いのあるサンプル中の少なくとも第2の核酸の存在または非存在を検出することを更に含み、第2の核酸は以下の標的配列：
AACAAAAAAAAGAGCTCAGAGGATTTTTATTTTTATTTTAGAGCTTTTGC TGGAATTTTGTAGAGGTGAAGACAGTGTAGACGGGAAAAACAAAGGTAC CACTGCTTTACCTGCTGTAAAAGACTCTGTAAAAGACTCCTAGGTAAGTAAT  (SEQ ID NO:01)
またはその相補配列の少なくとも20個の連続するヌクレオチドを含有する、請求項２２記載の方法。  
【請求項２６】
BKV核酸を含有する疑いのあるサンプル中の少なくとも第2の核酸の存在または非存在を検出することを更に含み、第2の核酸は以下の標的配列：
AGTAAGTATTCCTTATTAACACCCTTACAAATTAAAAAACTAAAGGTACA CAGCTTTTGACAGAAATTATTAATTGCAGAAACTCTATGTCTATGTGGAG TTAAAAAGAATATAATATTATGCCCAGCACACATGTGTCTACTAATGAAA GTTACAGAATATTTTTCCATAAGTATTTTTTATAACAGAATTTGAGCTTTTTCT TTAGTAGTATACACAGCAAAGCAGGCAAGGGTTCTATTACTAAATACAGC TTGACTAAGAAACTGGTGTAGATCAGAGGGAAAGTCTTTAGGGTCTTCTA CCTTTCTCTTTTTCTTGGGTGGTGTGGAGTGTTGAGAATCTGCTGTTGCTT CTTCATCACTGGCAAACATATCTTCATGGCAAAATAAATCTTCATCCCATT TTTCATTAAAGGAGCTCCACCAGGACTCCCACTCTTCTGTTCCATAGGTTG GCACCTATAA (SEQ ID NO:03)
またはその相補配列の少なくとも20個の連続するヌクレオチドを含有する、請求項２２記載の方法。
【請求項２７】
BKV核酸を含有する疑いのあるサンプル中の少なくとも第2の核酸の存在または非存在を検出することを更に含み、第2の核酸は以下の標的配列：
TGTACATTCAGGAGAGTTTATAGAAAAAACTATTGCCCCAGGAGGTGCTA ATCAAAGAACTGCTCCTCAATGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTAC GGGACTGTAACACCTGCTCTTGAAGCAT (SEQ ID NO:02)
またはその相補配列の少なくとも20個の連続するヌクレオチドを含有する、請求項２２記載の方法。
【請求項２８】
BKV核酸を含有する疑いのあるサンプル中の少なくとも第2の核酸の存在または非存在を検出することを更に含み、第2の核酸は以下の標的配列：
ATGGGTGCTGCTCTAGCACTTTTGGGGGACCTAGTTGCCAGTGTATCTGA GGCTGCTGCTGCCACAGGATTTTCAGTGGCTGAAATTGCTGCTGGGGAGG CTGCTGCTGCTATAGAAGTTCAAATTGCATCCCTTGCTACTGTAGAGGGC ATAACAAGTACCTCAGAGGCTATAGCTGCCATAGGCCTAACTCCTCAAAC ATATGCTGTAATTGCTGGTGCTCCTGGGGCTATTGCTGGGTTTGCTGCTTTAA (SEQ ID NO:04)
またはその相補配列の少なくとも20個の連続するヌクレオチドを含有する、請求項２２記載の方法。
【請求項２９】
標的領域I、II、III、IV、またはVの1またはそれ以上のヌクレオチド配列の増幅産物の生成に好適なプライマー・ペアを含むキット。
【請求項３０】
増幅産物の検出のためのプローブを更に含む、請求項２９記載のキット。
【請求項３１】
キットが標的領域の少なくとも２つの増幅産物の生成のための少なくとも２つのプライマー・ペアを含む、請求項２９記載のキット。
【請求項３２】
以下のいずれか：
(i) AACAAAAAAAAGAGCTCAGAGGATTTTTATTTTTATTTTAGAGCTTTTG
CTGGAATTTTGTAGAGGTGAAGACAGTGTAGACGGGAAAAACAAAGGTACCAC
TGCTTTACCTGCTGTAAAAGACTCTGTAAAAGACTCCTAGGTAAGTAAT  (SEQ ID NO:01)
またはその相補配列（核酸は約151ヌクレオチド長を超えない）；
(ii) TGTACATTCAGGAGAGTTTATAGAAAAAACTATTGCCCCAGGAGGTG
CTAATCAAAGAACTGCTCCTCAATGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTACGG
GACTGTAACACCTGCTCTTGAAGCAT (SEQ ID NO:02) 
またはその相補配列（核酸は約128ヌクレオチド長を超えない）；
(iii) ATGGGTGCTGCTCTAGCACTTTTGGGGGACCTAGTTGCCAGTGTATCT
GAGGCTGCTGCTGCCACAGGATTTTCAGTGGCTGAAATTGCTGCTGGGGAGGCT
GCTGCTGCTATAGAAGTTCAAATTGCATCCCTTGCTACTGTAGAGGGCATAACA
AGTACCTCAGAGGCTATAGCTGCCATAGGCCTAACTCCTCAAACATATGCTGTA
ATTGCTGGTGCTCCTGGGGCTATTGCTGGGTTTGCTGCTTTAA (SEQ ID NO:04)
またはその相補配列（核酸は約253ヌクレオチド長を超えない）；
(iv) GGGGCTGAAGTATCTGAGACTTGGGAAGAGCATTGTGATTGGGATTC
AGTGCTTGATCCATGTCCAGAGTCTTCAGTTTCTGAATC (SEQ ID NO:05), 
またはその相補配列（核酸は約86ヌクレオチド長を超えない）
の少なくとも20個の連続するヌクレオチドの単離された核酸。
【請求項３３】
核酸が検出可能なように標識されている、請求項３２記載の単離された核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する分野
本発明はBKウイルスの検出に関する。
【０００２】
相互参照
本出願は米国仮出願第60/705,217号（2005年8月2日出願）および米国特許出願第11/246,904号（2005年10月6日出願）に基づく優先権を主張する（これらの出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
BK型ヒトポリオーマウイルス（BKウイルス）はエンベロープを有さない約5,300bpの環状2本鎖DNAゲノムである。BKウイルスは1971年、腎移植患者の尿から単離された後、ポリオーマウイルス・ファミリーのメンバーとして初めて認識された。その後の研究により、世界的な血清陽性率は成人の80％を超えることが明らかになった。一般に、BKウイルスへの一次感染は小児期に呼吸経路を介して起こり、その後ウイルスは尿生殖路に潜伏する。尿中のウイルスの無症候からの再活性化および断続的発芽は免疫正常者で自然発生的に起こるが、細胞性免疫が変化している人、例えば妊婦、化学療法を受けている癌患者、HIV-1感染者、および腎臓または他の同種移植のレシピエントではより頻度が高い。BKウイルス感染による顕在的な疾患は稀であり、明らかに免疫抑制の程度と関係する。
【０００４】
BKウイルス関連腎症は、腎移植患者における腎不全の原因として次第に認識されるようになってきている。遡及的研究によれば、BKウイルス腎症は腎移植患者の1から5％で発症し、45％に上る罹患患者が同種移植片不全を起こす。BKウイルスに特異的な抗ウイルス療法はないが、維持免疫抑制の度合いを低下させることによってBKウイルスの複製を制御しうる場合もある。最近の証拠によって示唆されているところによれば、BKウイルスDNAの検出はBKウイルス腎症の経過に密接に従っており、診断およびモニタリングの非侵襲的手段として役立ちうる。従って腎移植患者におけるBKウイルス量の定量は、BKウイルス腎症の診断および治療（すなわち免疫抑制の低下）に対する応答のモニタリングのいずれにも有用である。更に、BKウイルスは他の疾患、例えば前立腺癌とも関与すると見られている。
【０００５】
従って、低力価のウイルスでも検出できる感度でBKウイルスを検出し、更に、異なるBKウイルス遺伝子型を検出できる信頼性の高い診断試験の開発が依然として必要とされている。更に、BKウイルスと他のポリオーマウイルス、例えばJCウイルスを識別するための信頼性の高い診断試験が今なお必要とされている。それらのアッセイは血液および血漿誘導体を介する、または密接な個人間の接触によるウイルスの感染を予防するために重要である。本発明はこれらの必要性の問題を取り扱う。
【０００６】
文献
関係する文献には以下がある：
【特許文献１】US 5,213,796
【特許文献２】US 6,605,602
【特許文献３】WO92/19774
【非特許文献１】Watzingerら，Journal of Clinical Microbiology，42(11):5189-5198（2004）
【非特許文献２】Anna Marta Degenerら，J Medical Virology 58:413（1999）
【非特許文献３】Stonerら，American J of Kidney Diseases 33:1102（2002）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
本発明は、サンプル中のBKウイルスの検出のための核酸に基づく（例えばDNAに基づく）迅速、高感度、かつ高度に特異的な方法および組成物を提供する。一般に、この方法は、BKウイルスゲノムの保存領域の標的配列を有する標的核酸を検出することを伴う。本発明はまた、本発明の方法に使用するための組成物（プライマー、プローブ、およびキットを含む）を特徴とする。
【０００８】
本発明の利点は、遺伝子的に密接に関係するウイルスを検出せずにBKウイルスを検出できることである。従って、本発明は偽陽性の頻度を低減する。
【０００９】
本発明の別の利点は、BKウイルスの遺伝子変異体（例えば異なる遺伝子型または株のBKウイルス）を検出できないことから起こりうる偽陰性結果の頻度が低減されることである。
【００１０】
更に別の利点は、本発明が相対的に短い標的配列の検出しか必要としない態様を含むことである。これは、増幅に基づく技術、例えばリアルタイムPCRをアッセイに使用する場合に特に有益である。
【００１１】
本発明から、リファレンス研究施設または病院においてBKウイルスの診断に使用するためのアッセイの開発またはキットの製造を行うことができる。また、アッセイを利用して、BKV感染によって起こる疾患の治療薬の開発および臨床試験を行うこともできる。
【００１２】
これら、および他の利点は本明細書を読む際に当業者に容易に明らかとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
図面の簡単な説明
図１A-図１AAAに32個のBKウイルス遺伝子型の核酸配列のアラインメントを示す。本発明にかかるBKウイルス（BKV）検出のための標的核酸領域をBK1、BK2、BK3、BK4、およびBK5と称し（本明細書ではそれぞれ標的領域I、II、III、IV、およびVとも記載する）、下線、並びに開始および終了矢印で示す。
【００１４】
図の右側のナンバリングは、各遺伝子型についてのGenBankアクセッション番号に従った各遺伝子型の配列ナンバリング、またはシーケンシングしたゲノムのナンバリングを示す。本明細書における配列ナンバリングに関する記述は全て、特に記載しない限りGenBankアクセッション番号AY628224の配列ナンバリングに基づく。本発明の方法への使用に好適な標的領域I-V内の代表的なプライマーおよびプローブを太字で示す。本発明における使用に好適なプローブは、２つの選択したプライマーを使用して生成される増幅産物の配列内に位置する任意の配列を含む。
【００１５】
図2は、BK1、BK2、BK3、BK4、およびBK5のそれぞれについてのTaqmanリアルタイムアッセイに関する検量線を示す。テンプレート濃度は反応液当たり50コピーから50,000コピーの範囲とした。BK1アッセイ：傾き＝-3.58、切片＝43.428、およびR2＝0.997。BK2アッセイ：傾き＝-3.48、切片＝4.053、およびR2＝0.999。BK3アッセイ：傾き＝-3.49、切片＝44.819、およびR2＝0.999。BK4アッセイ：傾き＝-3.21、切片＝41.466、およびR2＝0.999。BK5アッセイ：傾き＝-3.61、切片＝47.324、およびR2＝0.994。
【００１６】
定義
本明細書で使用する“BKウイルス”または“BKV”という用語は、腎症および腎機能障害と関連付けられているポリオーマウイルス・ファミリーのウイルスをいう。BKウイルスはエンベロープを有さない小型のウイルスであり、そのゲノムは約5,300bpの環状2本鎖DNA分子を含有する。
【００１７】
“ポリヌクレオチド”、“オリゴヌクレオチド”、“核酸”、および“核酸分子”という用語は、本明細書ではいずれも互換的に使用され、多量体型ヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれも）を含む。この用語は分子の一次構造のみをいう。従って、用語は3本鎖、2本鎖、および1本鎖DNA、並びに3本鎖、2本鎖、および1本鎖RNAを含む。また、例えばメチル化および／またはキャッピングによる改変型、並びに非改変型ポリヌクレオチドを含む。更に特定すれば、“ポリヌクレオチド”、“オリゴヌクレオチド”、“核酸”、および“核酸分子”という用語はポリデオキシリボヌクレオチド（2-デオキシ-D-リボースを含有）、ポリリボヌクレチド（D-リボースを含有）、プリンまたはピリミジン塩基のN-またはC-グリコシドである任意の他の型のポリヌクレオチド、および非ヌクレオチド骨格を含有する他のポリマー、例えばポリアミド（例えばペプチド核酸（PNA））およびポリモルホリノ（Anti-Virals社（Corvallis, Oreg.）からNeugeneの商品名で販売されている）ポリマー、並びに他の配列特異的合成核酸ポリマー（ポリマーはDNAおよびRNAに見られるような塩基対形成および塩基スタッキングが可能となる立体配置で核酸塩基を含有する）を含む。
【００１８】
特に記載しない限り、“ポリヌクレオチド”、“オリゴヌクレオチド”、“核酸”、および”核酸分子”という用語の間で長さを区別する意図はなく、これらの用語は互換的に使用される。これらの用語は単に分子の一次構造をいう。従って、これらの用語は、例えば3’-デオキシ-2’,5’-DNA、オリゴデオキシリボヌクレオチドN3’P5’ホスホルアミデート、2’-O-アルキル-置換型RNA、2本鎖および1本鎖DNA、並びに2本鎖および1本鎖RNA、DNA:RNAハイブリッド、およびPNAとDNAまたはRNAとのハイブリッドを含み、また、例えば以下のような既知の型の修飾も含む：当該分野で周知の標識、メチル化、“キャップ”、類似体による1またはそれ以上の天然型ヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電結合（例えばメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）、負荷電結合（例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、および正荷電結合（例えばアミノアルキルホスホルアミデート、アミノアルキルホスホトリエステル）を有するもの、ペンダント部分（例えばタンパク質（ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ-L-リジンなどを含む）を有するもの、挿入物質（例えばアクリジン、ソラレンなど）を有するもの、キレート物質（例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を有するもの、アルキル化剤を有するもの、修飾型結合（例えばαアノマー核酸）を有するもの、並びに未修飾型のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。特に、DNAはデオキシリボ核酸である。
【００１９】
本明細書においては略号を使用してヌクレオチド（塩基とも記載する）を表すが、それらには複数のヌクレオチドを表す略号も含まれる。本明細書における使用では、G＝グアニン、A＝アデニン、T＝チミン、C＝シトシン、そしてU＝ウラシルである。更に、R＝プリンヌクレオチド（AまたはG）；Y＝ピリミジンヌクレオチド（AまたはT（U））；S＝CまたはG；W＝AまたはT（U）；M＝AまたはC；K＝GまたはT（U）；V＝A、C、またはG；そしてN＝任意のヌクレオチド（A、T（U）、C、またはG）である。ヌクレオチドは小文字または大文字のいずれでも記載する。また、理解されるように、本明細書においてDNAに関して記載するヌクレオチド配列はRNAのヌクレオチド配列も表し、この場合TはUで置換される。
【００２０】
本明細書で使用する“デオキシリボ核酸”および“DNA”という用語はデオキシリボヌクレオチドから成るポリマーを意味する。
【００２１】
本明細書で使用する“リボ核酸”および“RNA”という用語はリボヌクレオチドから成るポリマーをいう。理解されるように、核酸の配列をDNA配列のヌクレオチドを使用して記載する場合、それらの配列は相補的DNA配列を包含し、所定のDNA配列またはその相補配列に基づくRNA配列も更に包含し、その場合、DNA配列またはその相補配列中のチミン（T）はウラシル（U）で置換される。
【００２２】
2つのヌクレオチド配列の塩基対構成が相同であるとき、それらの分子は互いに“相補的”である。“相補的”ヌクレオチド配列は好適なハイブリダイゼーション条件下で特異性によって結合し、安定なデュプレックスを形成する。例えば第１の配列の一部分が第２の配列の一部分にアンチパラレルの向きで結合できる時、この２つの配列は相補的であり、この場合、各配列の3’末端が他の配列の5’末端に結合し、次いで、一方の配列の各A、T（U）、G、およびCがそれぞれ他方の配列のT（U）、A、C、およびGと整合する。RNA配列は相補的G=UまたはU=G塩基対を含んでもよい。従って本発明では、2つの配列が“相補配列”であるためには、完全に相同である必要はない。通常、分子の所定の長さにわたって、少なくとも約85％（好ましくは少なくとも約90％、そして最も好ましくは少なくとも約95％）のヌクレオチドで塩基対構成が共有されていれば、２つの配列は十分相補的である。
【００２３】
本明細書において、単離された化合物に関して使用する“単離された”という用語は、化合物が天然に存在するのとは異なる環境にある、目的の化合物をいう。“単離された”には、目的の化合物が実質的に濃縮されているサンプル中の化合物、および／または目的の化合物が部分的もしくは実質的に精製されているサンプル中の化合物を含むことを意図する。“単離された”という用語は、記述する物質が、通常その天然の状態では、好ましくは所定のサンプルにおいて重量比で総タンパク質量の少なくとも約0.5%、より好ましくは少なくとも約5％の割合で結合する物質の少なくとも一部を含有しない状態も含む。例えば、ポリヌクレオチドに関する“単離された”という用語は一般に、天然で通常それと結合している配列の全部もしくは一部が欠失した核酸分子；または天然に存在するのと同じ配列であるが非相同配列がそれに結合しているもの；または染色体から分離した分子をいう。
【００２４】
本明細書で使用する“精製した”という用語は、記述する物質が重量比で総物質量の少なくとも約75％、好ましくは少なくとも約80％、そして特に好ましくは少なくとも約90％を占めることを意味する。本明細書で使用する“実質的に純粋な”という用語は、天然の環境から除去され、天然では結合している他の成分の少なくとも60％、好ましくは75％、そして最も好ましくは90％が存在しない化合物を意味する。
【００２５】
所定の配列（例えば標的核酸の標的配列）“に由来する”または“に特異的な”ポリヌクレオチドとは、所定のヌクレオチド配列のある領域に対応する、すなわち相同または相補的である、少なくとも約６ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０-１２ヌクレオチド、そして更により好ましくは少なくとも約１５-２０ヌクレオチドの連続する配列を含むポリヌクレオチドをいう。誘導されたポリヌクレオチドは目的のヌクレオチドから物理的に誘導される必要はなく、生成は任意の方法（限定されるわけではないが化学合成、複製、逆転写、または転写を含む）により、ポリヌクレオチドが由来する、または特異的である領域（単数または複数）中の塩基配列に関する情報に基づいて行ってもよい。所定の配列“に由来する”または“に特異的な”ポリヌクレオチドには、元のポリヌクレオチドに対してセンスまたはアンチセンスで配向するポリヌクレオチドが含まれる。
【００２６】
“相同性”とは、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド部分間の同一性％をいう。配列が分子中の所定の長さにわたって少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約75%、より好ましくは少なくとも約80%、少なくとも約85%、好ましくは少なくとも約90%、そして最も好ましくは少なくとも約95%または少なくとも約98%の配列同一性を示す場合、２つのDNAまたは２つのポリペプチド配列は互いに“実質的に相同”である。本明細書の使用では、実質的相同性とは、特定のDNAまたはポリペプチド配列と完全な同一性を示す配列も指す。
【００２７】
一般に、“同一性”とは、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のそれぞれヌクレオチド?ヌクレオチドまたはアミノ酸?アミノ酸のが正確に一致していることをいう。同一性％の測定は、配列をアラインさせ、アラインさせた2つの配列間の正確な一致数を計数し、より短い配列の長さで除し、結果に100を乗じて行う。
【００２８】
簡単に入手できるコンピュータープログラムを使用して相同性および同一性の分析を容易にしてもよく、それらにはDNASTAR社のLazergeneおよびALIGN（Dayhoff，M.O.，Atlas of Protein Sequence and Structure M.O.Dayhoff編，5 Suppl．3:353-358，National biomedical Research Foundation，Washington，DC。これはペプチド分析のためのSmithおよびWatermanの局所的相同性演算（Advances Appl.Math.2:482-489，1981）を改変したものである）がある。ヌクレオチド配列の相同性を測定するためのプログラムはWisconsin Sequence Analysis Package, Version 8（Genetics Computer Group，Madison，Wis.から入手可）で得られる（例えばBESTFIT、FASTA、およびGAPプログラム（これらもSmithおよびWatermanの演算に基づく））。これらのプログラムは、製造者が推奨する初期パラメーターおよび上記のWisconsin Sequence Analysis Packageに記載される初期パラメーターを用いて容易に利用できる。例えば特定のヌクレオチド配列の参照配列に対する相同性％の測定は、SmithおよびWatermanの相同性演算と初期値スコア表および６個のヌクレオチド位のギャップペナルティーを共に用いて行うことができる。
【００２９】
本発明に関連して相同性％を確立する別の方法はMPSRCHプログラムパッケージを使用することであり、この著作権はUniversity of Edinburghに帰属し、John F. CollinsおよびShane S. Sturrokが開発し、IntelliGenetics社（Mountain View，Calif.）から販売されている。この好適なパッケージからSmith-Waterman演算を利用し、初期パラメーターをスコア表に使用することができる（例えばギャップオープンペナルティー：12、ギャップ伸長ペナルティー：１、およびギャップ：６）。得られるデータから、“マッチ”値は“配列相同性”を反映する。配列間の同一性％または類似性％を算出する他の好適なプログラムは一般に当業界で周知であり、例えば別のアラインメントプログラムはBLASTであり、初期パラメーターと共に使用する。例えば、BLASTNおよびBLASTPを、以下の初期値を用いて使用してもよい：genetic code=standard；filter=none；strand=both；cutoff=60；expect=10；Matrix=BLOSUM62；Descriptions=50 sequences；sort by=HIGH SCORE；Databases=non-redundant, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR。これらのプログラムの詳細はNational Center for Biotechnology Information（NCBI）およびthe National Library of Medicineが提供するインターネット・ウェブサイト上で見られる（www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST参照）。
【００３０】
あるいはまた、相同性の測定は、相同な領域間で安定なデュプレックスが形成される条件下でのハイブリダイゼーション、それに続く1本鎖特異的ヌクレアーゼ（単数または複数）での消化、および消化したフラグメントのサイズ測定によって行うことができる。実質的に相同なDNA配列は、例えばその特定の系に対して定義されるストリンジェントな条件下におけるサザンハイブリダイゼーション実験で同定できる。好適なハイブリダイゼーション条件を規定することは当業者の技術範囲内である。例えばSambrookら（上記）；DNAクローニング（上記）；Nucleic Acid Hybridization（上記）参照。
【００３１】
本明細書において核酸分子の記述に使用する“組換え体”とは、ゲノム、cDNA、哺乳動物、細菌、ウイルス、半合成、合成、または他の起源のポリヌクレオチドであって、その起源の特性、操作、またはその両方によって、天然では結合するポリヌクレオチドの全部または一部と結合しないものをいう。本明細書でタンパク質またはポリヌクレオチドに関して使用する“組換え体”という用語は、組換え体ポリヌクレオチドの発現によって生成するポリペプチドを意味する。
【００３２】
“制御要素”とは、それが結合するヌクレオチド配列の転写および／または翻訳を容易にするポリヌクレオチド配列をいう。用語はプロモーター、転写終結配列、上流制御ドメイン、ポリアデニル化シグナル、非翻訳領域（5’-UTRおよび3’-UTRを含む）、そして必要によりリーダー配列およびエンハンサーで、ホスト細胞におけるコード配列の転写および翻訳を行う、または促進するものを含む。
【００３３】
“DNA依存的DNAポリメラーゼ”は、DNAテンプレートから相補的DNAコピーを合成する酵素である。例としてE.coli由来のDNAポリメラーゼIおよびバクテリオファージT7 DNAポリメラーゼがある。全ての既知のDNA依存型DNAポリメラーゼは合成を開始するために相補的なプライマーを必要とする。好適な条件下で、DNA依存型DNAポリメラーゼはRNAテンプレートから相補的なDNAコピーを合成しうる。
【００３４】
本明細書で使用する“標的核酸領域”または“標的核酸”または“標的分子”という用語は、（例えば増幅によって）検出すべき“標的配列”を有する核酸分子をいう。標的核酸は1本鎖または2本鎖のいずれでもよく、標的配列以外に他の配列を含んでも含まなくてもよい（例えば標的核酸は標的配列の上流または5’側に隣接する配列を含んでも含まなくてもよく、下流または3’側に隣接する配列を含んでも含まなくてもよく、そして態様によっては上流（5’）または下流（3’）核酸配列のいずれも含まなくてもよい。検出が増幅によるものである場合、標的配列に加えてこれらの他の配列を標的配列と共に増幅しても、しなくてもよい。
【００３５】
“標的配列”、または“標的核酸配列”という用語は、（例えば増幅を介して）検出すべき標的核酸の特定のヌクレオチド配列をいう。標的配列は標的分子内に含有されるプローブ・ハイブリダイズ領域を含んでもよく、プローブは所望の条件下でこれと安定なハイブリッドを形成する。“標的配列”は複合体形成配列を含んでもよく、オリゴヌクレオチド・プライマーはこれと複合体を形成し、標的配列をテンプレートにして伸長される。標的核酸が1本鎖である場合、“標的配列”という用語は標的核酸中に存在する“標的配列”に相補的な配列もさす。“標的核酸”が本来2本鎖である場合、“標的配列”という用語はプラス（＋）およびマイナス（?）鎖の両方をいう。本発明はまた、本明細書に記載する完全長の配列を有する標的領域、並びにそれらの標的領域のフラグメントまたはサブ配列、およびそれらに相補的な配列にも関する。“フラグメント”および“サブ配列”という用語はこの点に関して、互換的に使用される。更に、“標的配列”の配列を本明細書に記載する場合、理解されるように、配列はDNAまたはRNAのいずれであってもよい。従って、DNA配列について記載する場合はRNA配列も企図され、DNA配列の“T”を“U”で置換することによって容易にRNA配列が得られる。
【００３６】
本明細書で使用する“プライマー”または“オリゴヌクレオチド・プライマー”という用語は、プライマー伸長産物の合成が誘導される条件下（例えばヌクレオチドおよび重合化誘導物質（例えばDNAまたはRNAポリメラーゼ）の存在下で好適な温度、pH、金属濃度、および塩濃度）に配すると相補的核酸鎖の合成を開始するように作用するオリゴヌクレオチドをいう。プライマーは一般にプライマー伸長産物の合成への使用に適合する長さのものであり、通常、8から100ヌクレオチド長、例えば10から75、15から60、15から40、18から30、20から40、21から50、22から45、25から40などであり、より典型的には18-40、20-35、21-30ヌクレオチド長の範囲、および記載する範囲内の任意の長さのものである。典型的なプライマーは10-50ヌクレオチド長の範囲、例えば15-45、18-40、20-30、21-25など、および記載する範囲内の任意の長さのものであってもよい。ある態様では、プライマーは通常、約10、12、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、または70ヌクレオチド長を超えない。
【００３７】
一般にプライマーは最大限の増幅効率とするために1本鎖であるが、必要により2本鎖であってもよい。2本鎖の場合、通常、まずプライマーを処理して鎖を分離した後、伸長産物の調製に使用する。この変性段階は一般に熱によって行うが、必要により、アルカリを使用した後に中和して行ってもよい。従って、“プライマー”はテンプレートに相補的であり、テンプレートと水素結合またはハイブリダイゼーションによって複合体を形成し、ポリメラーゼによる合成開始のためのプライマー／テンプレート複合体となり、これはDNA合成過程において、テンプレートに相補的なその3’末端に塩基を共有結合で付加することによって伸長される。
【００３８】
本明細書で使用する“プライマー・ペア”とは、核酸に基づく標的核酸の増幅に好適な核酸配列を有する第1および第2のプライマーをいう。それらのプライマー・ペアは一般に、標的核酸の第1の部分と同一または類似した配列を有する第1のプライマー、および標的核酸の第2の部分に相補的な配列を有する第2のプライマーを含み、標的核酸またはそのフラグメントの増幅に供される。本明細書における“第1”および“第2”のプライマーという記述は、特に記載しない限り任意のものである。例えば第1のプライマーを“フォワードプライマー”（標的核酸の5’末端から核酸合成を開始する）または“リバースプライマー”（フォワードプライマーから開始された合成で生じた伸長産物の5’末端から核酸合成を開始する）として設計できる。同様に、第2のプライマーをフォワードプライマーまたはリバースプライマーとして設計できる。
【００３９】
本明細書で使用する“プローブ”または“オリゴヌクレオチド・プローブ”という用語は互換的に使用され、上記のように標的核酸分析物（例えば核酸増幅産物）中に存在する核酸配列に相補的な核酸配列を含有するポリヌクレオチドを含む構造をいう。プローブのポリヌクレオチド領域はDNAおよび／もしくはRNA、並びに／または合成ヌクレオチド類似体から成ってもよい。プローブは一般に、標的核酸の標的配列の全部または一部の特異的検出への使用に適合する長さのものであり、通常、8から100ヌクレオチド長の範囲、例えば8から75、10から74、12から72、15から60、15から40、18から30、20から40、21から50、22から45、25から40などであり、より典型的には18-40、20-35、21-30ヌクレオチド長の範囲、および記載する範囲内の任意の長さのものである。典型的なプローブは10-50ヌクレオチド長の範囲、例えば15-45、18-40、20-30、21-28、22-25など、および記載する範囲内の任意の長さのものである。ある態様では、プローブは通常、約10、12、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、または70ヌクレオチド長を超えない。
【００４０】
本明細書で企図するプローブは検出可能な標識を含有するプローブを含む。例えば“オリゴヌクレオチド・プローブ”が5’ヌクレアーゼアッセイ（例えばTaqManTMアッセイ）に使用するためのものである場合、プローブは少なくとも1つの蛍光発光体および少なくとも１つのクエンチャーを含有し、これは反応に使用されるポリメラーゼの5’エンドヌクレアーゼ活性によって消化され、それによって、増幅された標的オリゴヌクレオチド配列が検出される。この点で、オリゴヌクレオチド・プローブは、結合したプローブが使用する5’→3’ヌクレアーゼ活性によって十分に分解されて蛍光発光体とクエンチャーに分離するように、十分な数のホスホジエステル結合をその5’末端に隣接して含有する。オリゴヌクレオチド・プローブをTMA法に用いる場合、下記のように好適に標識を行う。
【００４１】
本明細書で使用する“標識”および“検出可能な標識”という用語は検出可能な分子をいい、それらには、限定されるわけではないが放射性同位体、蛍光発光体、化学発光体、発色団、酵素、酵素基質、酵素補助因子、酵素阻害剤、発色団、色素、金属イオン、金属ゾル、リガンド（例えばビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、またはハプテン）などがある。“蛍光発光体”という用語は、検出可能な範囲の蛍光を発する能力のある物質またはその一部をいう。
【００４２】
“ハイブリダイズ”および“ハイブリダイゼーション”という用語は、ワトソン・クリック塩基対合を介して複合体を形成するのに十分な相補性を有するヌクレオチド配列間の複合体の形成をいう。プライマーが標的（テンプレート）に“ハイブリダイズ”する場合、それらの複合体（またはハイブリッド）は、例えばDNA合成を開始するDNAポリメラーゼに必要とされるプライミング機能を与えるに十分な安定性を有する。
【００４３】
“ストリンジェントな条件”という用語は、プライマーがその相補的結合パートナーと優先的に、または特異的に結合し、他の配列とはそれより低い度合いでしか、または全く結合しないような条件をいう。換言すれば、本明細書で使用する“ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件”とは、アレイ表面上での相補的結合メンバー間、例えばプローブとサンプル中の相補的標的間のデュプレックス（例えば核酸プローブ（例えばDNAプローブ）とサンプル中に存在するそれに対応する核酸標的（例えばサンプル中に存在するそれに対応するmRNA分析物）とのデュプレックス）の生成に適合する条件をいう。
【００４４】
本明細書で使用する“結合ペア“という用語は、互いに特異的に結合する第1および第2の分子、例えば核酸デュプレックスを形成する能力のある相補的ポリヌクレオチド・ペアをいう。サンプル中での結合ペアの第1のメンバーの、結合ペアの第2のメンバーへの“特異的結合”は、第1のメンバーの第2のメンバーへの結合、または逆に、サンプル中の他の成分に対するよりも高い親和性および特異性によって証明される。結合ペアのメンバー間の結合は一般に非共有結合である。
【００４５】
“選択的結合”とは、分子が目的の標的に優先的に結合するか、または他の分子に対するよりも高い親和性で標的に結合することを意味する。例えばDNA分子は実質的に相補的な配列に結合し、関連のない配列には結合しない。
【００４６】
核酸のハイブリダイゼーション（例えばアレイ、サザン、またはノザンハイブリダイゼーション）に関係して使用する“ストリンジェントなハイブリダイゼーション”および“ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件”は配列に依存し、異なる環境パラメーター下で異なる。本発明の範囲内で核酸の同定に使用できるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、例えば以下がある：50%ホルムアミド、5xSSC、および1％SDSを含有するバッファー中、42℃でのハイブリダイゼーション、または5xSSCおよび1％SDSを含有するバッファー中、65℃でのハイブリダイゼーション（いずれも0.2xSSCおよび0.1%SDS（65℃）で洗浄）がある。代表的なストリンジェント・ハイブリダイゼーション条件には40%ホルムアミド、1M NaCl、および1%SDSから成るバッファー中、37℃でのハイブリダイゼーション、および1xSSC（45℃）での洗浄がある。あるいはまた、0.5M NaHPO4、7%ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、1mM EDTA中、65℃で、フィルターに結合したDNAにハイブリダイズさせ、0.1xSSC／0.1%SDS中、68℃で洗浄してもよい。更に別のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、60℃以上、3xSSC（450mM塩化ナトリウム／45ｍM酢酸ナトリウム）でのハイブリダイゼーション、または30％ホルムアミド、1M NaCl、0.5%サルコシン酸ナトリウム、50mM MESを含有する溶液（pH6.5）中、42℃でのインキュベーションがある。当業者に容易に認識されるように、これとは異なるがこれに匹敵するハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を利用して同様のストリンジェンシーを有する条件を得てもよい。
【００４７】
ある態様では、洗浄条件のストリンジェンシーが核酸がプローブと特異的にハイブリダイズするかどうかを決定する条件を示す。核酸の同定に使用する洗浄条件には、例えば以下がある：ｐH7で約0.02モルの塩濃度および少なくとも約50℃または約55℃から約60℃の温度；または約0.15M NaClの塩濃度で72℃、約15分間；または約0.2xSSCの塩濃度で少なくとも約50℃もしくは約55℃から約60℃の温度、約15から約20分間；または、ハイブリダイゼーション複合体を0.1%SDSを含有する約2xSSCの塩濃度の溶液を用い、室温で15分間の洗浄を2回行い、次いで0.1%SDSを含有する0.1xSSCを用い、68℃で15分間の洗浄を2回行う；またはそれと同等の条件。ストリンジェントな洗浄条件は、0.2xSSC/0.1%SDS、42℃であってもよい。例えば核酸分子がデオキシオリゴヌクレオチド（“オリゴ”）である場合、ストリンジェント条件には、6xSSC/0.05%ピロリン酸ナトリウム中、37℃（14塩基オリゴの場合）、48℃（20塩基オリゴの場合）、55℃（20塩基オリゴの場合）、および60℃（23塩基オリゴの場合）での洗浄がある。同等のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件、並びに試薬およびバッファー（例えばSSCバッファーおよび同等の試薬並びに条件）に関する詳細な説明については、Sambrook、Ausubel、またはTijssen（下記）を参照されたい。
【００４８】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、少なくとも上記の典型的な条件と同等にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件であり、上記の特定のストリンジェント条件の少なくとも約80%、一般的には少なくとも約90％のストリンジェンシーを有すれば、その条件は少なくとも同等にストリンジェントであると見なされる。他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は当業者に周知であり、適宜それらを使用してもよい。
【００４９】
2本鎖DNAの“融解温度”または“Tm”は、熱または他の（例えば酸またはアルカリ処理などによる）塩基対間の水素結合の解離によってDNAのらせん構造の半数が失われる温度と定義される。DNA分子のTmはその長さおよび塩基組成に依存する。GC塩基対含量の高いDNA分子はAT塩基対含量の高いものよりTmが高い。分離されたDNAの相補鎖は、温度がTmより低くなると自発的に再会合またはアニールしてデュプレックスDNAを形成する。核酸ハイブリダイゼーションの速度が最も高くなるのはTmより約25℃低い温度である。以下の関係を用いてTmを概算してもよい：Tm=69.3+0.41（GC）％（Marmurら（1962）J. Mol. Biol. 5:109-118）。
【００５０】
本明細書で使用する“生体サンプル”とは被験体から単離した組織または体液のサンプルをいい、本発明の観点からは一般にBKウイルスの核酸および／またはウイルス粒子を含有する疑いのあるサンプルであり、必要に応じた処理を行った後、インビトロアッセイで分析することができるものをいう。代表的な目的サンプルには、それらに限定される訳ではないが呼吸分泌物（例えば鼻腔、肺などの体液または組織から得られるサンプル）、血液、血漿、血清、血液細胞、脳脊髄液、糞便、尿、涙、唾液、母乳、臓器、生検組織、並びに腸管および気道からの分泌物がある。また、サンプルにはインビトロ細胞培養液成分のサンプルがあり、これには、それに限定されるわけではないが、培養液中の細胞および組織（例えば組換え細胞）の増殖によって得られる条件培地、並びに細胞成分がある。
【００５１】
“評価する”という用語には任意の型の測定が含まれ、ある成分が存在するか否かを判定することが含まれる。“判定する”、“測定する”、“見積もる”、“評価する”、および“アッセイを行う”という用語は互換的に使用され、それらには定量的および定性的測定が含まれる。評価は相対的または絶対的であってもよい。“の存在を評価すること”には、存在するものの量を測定し、そして／またはそれが存在するか否かを判定することを含む。本明細書で使用する“判定する”、“測定する”、“評価する”、および“アッセイを行う”という用語は互換的に使用され、定量的および定性的測定の両方を含む。
【００５２】
標的配列の核酸に基づく増幅を伴う方法に関連する“参照範囲”という用語は、サンプル（例えば患者標本）がBKウイルス陰性であることを示していると見なされる結果を示すBKウイルス陰性標本からのCT（閾値サイクル）値の範囲をいう。
【００５３】
標的配列の核酸に基づく増幅を伴う方法に関連する“レポート可能な（reportable）範囲”という用語は、BKウイルス陽性患者標本としてレポートされる結果を示すBKウイルス陽性患者の標本から得られるCT値の範囲をいう。
【００５４】
本明細書で使用する“分析特異性”とは、標的ウイルスを特異的に検出するが、他の関連ウイルス、または確認が行われている標本に見られる病原性もしくは共生細菌叢を検出しない検出系の能力をいう。例えばBKウイルスプライマーおよびプローブを用いるアッセイに関連する“分析特異性”とは、標的ウイルスを特異的に増幅および検出し、関連するウイルス、または確認が行われている標本に見られる病原性もしくは共生細菌叢は検出しない、この分析系の能力をいう。
【００５５】
標的配列の核酸に基づく増幅を伴う方法に関連する“分析感度”とは、確認された各タイプの標本で検出できるBKウイルス標的DNAの測定可能な最少量をいう。
【００５６】
“精度”とは、所定のサンプルで同じ、または匹敵する結果が再現性を持って得られるアッセイの能力をいう。
【００５７】
“確度”とは、陽性および陰性標本の両方を含む盲検パネルにおいて標的分子を正確に検出するアッセイの能力をいう。
【００５８】
更に留意されるように、特許請求の範囲は更なる要素を除外するように記載されることもある。従って本明細書は、特許請求の要素に関する記述に関連してそれらの排他的用語を“単に”、“唯一の”などとして使用する、または“ネガティブな”限定を使用する根拠としての役割を果たすことを意図する。
【００５９】
本発明について更に記載する前に、理解されるように、本発明は記載する特定の態様に限定されるものではなく、当然多様でありうる。また理解されるように、本明細書で使用する用語は単に特定の態様を記述するためのものであって限定することを意図するものではなく、これは本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるためである。
【００６０】
数値の範囲を記載する場合、理解されるように、介在する数値のそれぞれは特に明記しない限り下限の10分の1の単位まででその範囲の上限と下限の間にあり、そして、その記述される範囲内の任意の他の記載値またはその間にある値は、本発明の範囲に包含される。これらの小範囲の上限および下限は独立して同小範囲に含有されてもよく、これも、規定の範囲における特定の除外限界を条件として、本発明の範囲内に含まれる。規定の範囲が一方または両方の限界を含む場合、それらの含まれる限界の一方または両方を除く範囲も本発明に含まれる。
【００６１】
特に記載しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および化学用語は本発明が属する分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載するものと類似または同等の方法および物質を本発明の実施または試験に使用してもよいが、ここで好ましい方法および物質を記載する。本明細書に記載する全ての文献は、文献の引用が関連する方法および／または物質を開示および記述するための参照により、本明細書に組み込まれる。
【００６２】
本明細書および添付の特許請求の範囲で単数形を使用する場合、特に明記しない限り複数形の指示対象も含むことに留意しなければならない。従って、例えば“オリゴヌクレオチド・プライマー”という記述は複数のそれらプライマーも含み、“プライマー”という記述は1またはそれ以上のプライマーおよび当業者に周知の同等物などへの言及を含む。
【００６３】
本明細書に記載する文献は、単に本明細書に出願日以前にそれが開示されたために提供するものである。本明細書のいずれの記載も、本発明が従前の発明の効力によってそれらの文献に先行する権利がないことを容認すると解釈されるものではない。更に、記載する文献の日付は実際の文献の日付と異なる場合があり、それらは個々に確認する必要がありうる。
【００６４】
本発明の実施には、特に記載しない限り当業者の技術範囲内の慣例的な化学、生化学、組換えDNA、およびウイルス学的方法を用いる。それらの技術は文献に十分記述されている。例えば以下を参照されたい：Fundamental Virology，第2版，vol.IおよびII（B. N. FieldsおよびD. M.Knipe編）；A. L.Lehninger，Biochemistry（Worth Publishers，社，現行版）；Sambrookら，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，1989）；Methods In Enzymology（S.ColowickおよびN. Kaplan編，Academic Press社）；Oligonucleotide Synthesis（N. Gait編，1984）；A Practical Guide to Molecular Cloning（1984）。
【００６５】
以下に本発明について、より詳細に記載する。
【００６６】
発明の詳細な説明
本発明は、サンプル（特に生体サンプル）中のBKVを特異的かつ高感度で検出するための標的核酸配列（本明細書では標的配列とも記載する）を含有する、BKウイルス（BKV）ゲノム内のコンセンサス標的核酸領域の発見に基づく。特に、1またはそれ以上の標的核酸配列領域の検出によってサンプル中のBKVの検出が可能となると同時に、一般に、BKVおよびJCウイルス（JCV）、並びに／またはBKVおよびSV40間の識別が可能となる。これらのアッセイの特異性および簡便性により、一般に、迅速で信頼性が高く、安価なBKV検出アッセイを得ることが容易になる。本発明は種々の適用（例えば研究、医療、創薬、および診断への適用）における利用法が見いだされる。
【００６７】
一般に、本法はBKVゲノムの標的核酸配列の検出によるサンプル（例えば生体サンプル）中のBKVウイルスの検出を提供する。５つのそれら標的核酸領域を、図１に示すように標的領域I-Vと記載する。
【００６８】
ある態様では、本発明の方法はサンプル（例えば生体サンプル）中のBKV分離株の検出を提供する。それらの態様では、この方法は標的領域内の配列に対応するプライマーおよびプローブの使用によって、標的核酸領域またはそのフラグメントを検出する。本発明の方法での使用に好適な標的領域I-V内の代表的なプライマーを表1に記載する。本発明での使用に好適なプローブには、選択したプライマーを用いて生成される増幅産物の配列内に位置する任意の配列が含まれる。それらの態様と共に使用するのに好適なプローブは、検出すべき種々のBKV分離株間でヌクレオチド配列が共有される領域と一致するように選択する。
【００６９】
本明細書に記載する配列、特にコンセンサス配列はDNA配列で記載する。理解されるように、記載するDNA配列は1本鎖または2本鎖であってもよく、また、以下のDNA配列の記載のように相補配列も同様に含まれることを意図する。
【００７０】
本発明の組成物および方法について更に詳細に記載する。
【００７１】
標的核酸領域
種々のBKV単離株ゲノムのアラインメントにより、標的核酸配列領域の同定を行った。本発明は、1もしくはそれ以上の標的核酸領域、またはその一部を検出することによるサンプル（例えば生体サンプル）中のBKVの同定法を提供する。一般に検出は核酸の増幅によって行い、ある態様では、その後ハイブリダイゼーション・プローブを用いて増幅産物を検出する。標的核酸領域については、以下に更に詳細に記載する。
【００７２】
認識されるように、BKVが含有する2本鎖DNAゲノムから複製の際にRNAが生成されるので、本明細書に記載するプライマーおよびプローブは本明細書に記載する核酸配列を有するもの、並びにそれら核酸配列の相補体を有するプライマーおよびプローブを包含する。
【００７３】
更に、理解されるように、本発明に有用なプライマー・ペアは本明細書に記載するBKV配列と同一または類似の配列を有する第1のプライマー、および本明細書に記載するBKV配列に相補的な配列を有する第2のプライマーを含み、本明細書に記載するBKV標的核酸領域またはそのフラグメントを増幅する（例えば第1のプライマーは“フォワード”プライマーであり、第2のプライマーは“リバース”プライマーである）。更に理解されるように、本発明において有用なプライマー・ペアは本明細書に記載するBKV配列に相補的な配列を有する第1のプライマー、および本明細書に記載するBKV配列と同一または類似の配列を有する第2のプライマーを含み、本明細書に記載するBKV標的核酸領域またはそのフラグメントを増幅する（例えば第1のプライマーは“リバース”プライマーであり、第2のプライマーは“フォワード”プライマーである）。
【００７４】
また、理解されるように、本明細書に記載するプローブの核酸配列は本明細書に記載するBKV配列またはその相補体と同一または類似していてもよい。更に、本明細書に記載するプライマーをプローブとして用い、例えば増幅産物の検出を行ってもよい。
【００７５】
標的領域I（BK1）
ある態様では、本発明はサンプル（例えば生体サンプル）中のBKVの検出法を提供し、これは以下の標的核酸配列領域I（図1、標的領域I（別名BK1）、GenBankアクセッション番号AY628224のナンバリングに基づくアラインメント位置は435-585）：
AACAAAAAAAAGAGCTCAGAGGATTTTTATTTTTATTTTAGAGCTTTTGCTGGAAT TTTGTAGAGGTGAAGACAGTGTAGACGGGAAAAACAAAGGTACCACTGCTTTACC TGCTGTAAAAGACTCTGTAAAAGACTCCTAGGTAAGTAAT (SEQ ID NO:01)
もしくはその相補体、またはそれらのフラグメントの検出によるものであり、ここで、核酸の５’および3’末端はSEQ ID NO:1内に包含される。このBKVゲノム中の保存された配列を図1にアラインさせて示す。特に興味深い態様では、標的領域は標的領域Iのサブ配列、例えば以下：
ACAAAAAAAAGAGCTCAGAGGATTTTTATTTTAGAGCTTTTGCTGGAATT TTGTAGAGGTGAAGACAGTGTAGACGGAAAAACAAAAAGTACCACTGCTTTACCT GCTGTAA (SEQ ID NO:55)
もしくはその相補体、またはそれらのフラグメントである。
【００７６】
標的領域I核酸を増幅するためのプライマーの設計に好適で、かつ本発明の方法での使用に好適な核酸配列の例を図1に下線を付して示す。標的領域I核酸の増幅のためのプライマーに好適な配列はSEQ ID NO:1のヌクレオチド配列のヌクレオチド1-26および94-119、またはその相補体に相当する。
【００７７】
本発明での使用に好適なプローブの設計は、2つの選択したプライマーを用いて生成される増幅産物の配列内に位置する任意の配列から行ってもよい。標的領域I核酸の検出のためのプローブとして使用するのに好適な配列はSEQ ID NO:1のヌクレオチド配列のヌクレオチド57-90またはその相補体に相当する。
【００７８】
ある態様では、標的領域I核酸の検出は、SEQ ID NO:1の少なくとも151個、少なくとも145個、少なくとも140個、少なくとも135個、少なくとも130個、少なくとも125個、少なくとも120個、少なくとも115個、少なくとも110個、少なくとも105個、少なくとも100個、少なくとも95個、少なくとも90個、少なくとも85個、少なくとも80個、少なくとも75個、少なくとも70個、少なくとも65個、少なくとも60個、少なくとも55個、少なくとも50個、少なくとも45個、少なくとも40個、少なくとも35個、少なくとも30個、少なくとも28個、少なくとも26個、少なくとも24個、少なくとも22個、少なくとも20個の連続するヌクレオチドの増幅産物の生成を伴う。
【００７９】
本発明の方法は、標的領域I核酸を単独で検出するか、または本明細書に記載する標的領域II-Vの1もしくはそれ以上の検出と併せて行ってもよい。例えば、本発明の方法は以下の検出を伴ってもよい：標的領域I（BK1）および標的領域II（BK2）；標的領域I（BK1）および標的領域III（BK3）；標的領域I（BK1）および標的領域IV（BK4）；標的領域I（BK1）および標的領域V（BK5）；標的領域I（BK1）、標的領域II（BK2）、および標的領域III（BK3）；標的領域I（BK1）、標的領域IV（BK4）、および標的領域V（BK5）；標的領域I（BK1）、標的領域III（BK3）、および標的領域V（BK5）など。理解されるように、標的領域I-Vのあらゆる組み合わせの検出は全て、本発明の方法で企図される。
【００８０】
代表的なプライマーおよびプローブについては、以下に更に詳しく記載する。
【００８１】
標的配列II（BK2）
ある態様では、本発明はサンプル（例えば生体サンプル）中のBKVの検出法を提供し、これは以下の標的核酸配列領域II（図1、標的領域II（別名BK2）、GenBankアクセッション番号AY628224のナンバリングに基づくアラインメント位置は1418-1545）：
TGTACATTCAGGAGAGTTTATAGAAAAAACTATTGCCCCAGGAGGTGCTAATCAA AGAACTGCTCCTCAATGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTACGGGACTGTAAC ACCTGCTCTTGAAGCAT (SEQ ID NO:02)
もしくはその相補体、またはそれらのフラグメントの検出によるものであり、ここで、核酸の５’および3’末端はSEQ ID NO:2内に包含される。BKVゲノム中に見られるこの保存された配列を図1にアラインさせて示す。特に興味深い態様では、標的領域は標的領域IIのサブ配列、例えば以下：
TTGCCCCAGGAGGTGCTAATCAAAGAACTGCTCCTCAATGGATGTTGCCTTTACTT CTAGGCCTGTACGGGA (SEQ ID NO:56)
もしくはその相補体、またはそれらのフラグメントである。
【００８２】
標的領域II 核酸を増幅するためのプライマーの設計に好適で、かつ本発明の方法での使用に好適な核酸配列の例を図1に下線を付して示す。標的領域II核酸の増幅のためのプライマーに好適な配列はSEQ ID NO:2のヌクレオチド配列のヌクレオチド33-50および82-104、またはその相補体に相当する。
【００８３】
本発明での使用に好適なプローブの設計は、2つの選択したプライマーを用いて生成される増幅産物の配列内に位置する任意の配列から行ってもよい。標的領域II核酸の検出のためのプローブとして使用するのに好適な配列はSEQ ID NO:2のヌクレオチド配列のヌクレオチド52-80またはその相補体に相当する。
【００８４】
ある態様では、標的領域II核酸の検出は、SEQ ID NO:2の少なくとも128個、少なくとも120個、少なくとも110個、少なくとも100個、少なくとも90個、少なくとも80個、少なくとも75個、少なくとも70個、少なくとも65個、少なくとも60個、少なくとも55個、少なくとも50個、少なくとも45個、少なくとも40個、少なくとも35個、少なくとも30個、少なくとも28個、少なくとも26個、少なくとも24個、少なくとも22個、少なくとも20個の連続するヌクレオチドの増幅産物の生成を伴う。
【００８５】
本発明の方法は、標的領域II核酸を単独で検出するか、または本明細書に記載する標的領域IおよびIII-Vの1もしくはそれ以上の検出と併せて行ってもよい。例えば、本発明の方法は以下の検出を伴ってもよい：標的領域II（BK2）および標的領域I（BK1）；標的領域II（BK2）および標的領域III（BK3）；標的領域II（BK2）および標的領域IV（BK4）；標的領域II（BK2）および標的領域V（BK5）；標的領域I（BK1）、標的領域II（BK2）、および標的領域III（BK3）；標的領域II（BK2）、標的領域IV（BK4）、および標的領域V（BK5）；または、標的領域II（BK2）、標的領域III（BK3）、および標的領域V（BK5）など。理解されるように、標的領域I-Vのあらゆる組み合わせの検出は全て、本発明の方法で企図される。
【００８６】
代表的なプライマーおよびプローブについては、以下に更に詳しく記載する。
【００８７】
標的配列III（BK3）
別の態様では、本発明はサンプル（例えば生体サンプル）中のBKVの検出法を提供し、これは以下の標的核酸配列領域III（図1、標的領域III（別名BK3）、GenBankアクセッション番号AY628224のナンバリングに基づくアラインメント位置は4097-4560）：
AGTAAGTATTCCTTATTAACACCCTTACAAATTAAAAAACTAAAGGTACACAGCTT TTGACAGAAATTATTAATTGCAGAAACTCTATGTCTATGTGGAGTTAAAAAGAATA TAATATTATGCCCAGCACACATGTGTCTACTAATGAAAGTTACAGAATATTTTTCC ATAAGTTTTTTATACAGAATTTGAGCTTTTTCTTTAGTAGTATACACAGCAAAGCA GGCAAGGGTTCTATTACTAAATACAGCTTGACTAAGAAACTGGTGTAGATCAGAG GGAAAGTCTTTAGGGTCTTCTACCTTTCTCTTTTTCTTGGGTGGTGTGGAGTGTTGA GAATCTGCTGTTGCTTCTTCATCACTGGCAAACATATCTTCATGGCAAAATAAATC TTCATCCCATTTTTCATTAAAGGAGCTCCACCAGGACTCCCACTCTTCTGTTCCATA GGTTGGCACCTATAA (SEQ ID NO:03)
もしくはその相補体、またはそれらのフラグメントの検出によるものであり、ここで、核酸の５’および3’末端はSEQ ID NO:3内に包含される。このBKVゲノム中の保存された配列を、3つのゲノムをアラインさせて図1に示す。特に興味深い態様では、標的領域は標的領域IIIのサブ配列、例えば以下：
GGAAAGTCTTTAGGGTCTTCTACCTTTCTCTTTTTCTTGGGTGGTGTGGAGTGTTGA GAATCTGCTGTTGCTTCTTCATCACTGGCAAACATATCTTCATG (SEQ ID NO:57)
もしくはその相補体、またはそれらのフラグメントである。
【００８８】
標的領域III核酸を増幅するためのプライマーの設計に好適で、かつ本発明の方法での使用に好適な核酸配列の例を図1に下線を付して示す。標的領域III核酸の増幅のためのプライマーに好適な配列はSEQ ID NO:3のヌクレオチド配列のヌクレオチド280-306および355-380、またはその相補体に相当する。
【００８９】
本発明での使用に好適なプローブの設計は、2つの選択したプライマーを用いて生成される増幅産物の配列内に位置する任意の配列から行ってもよい。標的領域III核酸の検出のためのプローブとして使用するのに好適な配列はSEQ ID NO:3のヌクレオチド配列のヌクレオチド330-354またはその相補体に相当する。
【００９０】
ある態様では、標的領域IV核酸の検出は、SEQ ID NO:3の少なくとも464個、少なくとも425個、少なくとも400個、少なくとも375個、少なくとも350個、少なくとも325個、少なくとも300個、少なくとも275個、少なくとも250個、少なくとも225個、少なくとも200個、少なくとも175個、少なくとも150個、少なくとも125個、少なくとも120個、少なくとも115個、少なくとも110個、少なくとも100個、少なくとも95個、少なくとも90個、少なくとも85個、少なくとも80個、少なくとも75個、少なくとも70個、少なくとも65個、少なくとも60個、少なくとも55個、少なくとも50個、少なくとも45個、少なくとも40個、少なくとも35個、少なくとも30個、少なくとも28個、少なくとも26個、少なくとも24個、少なくとも22個、少なくとも20個の連続するヌクレオチドの増幅産物の生成を伴う。
【００９１】
本発明の方法は、標的領域III核酸を単独で検出するか、または本明細書に記載する標的領域I-IIおよびIV-Vの1もしくはそれ以上の検出と併せて行ってもよい。例えば、本発明の方法は以下の検出を伴ってもよい：標的領域III（BK3）および標的領域IV（BK4）；標的領域III（BK3）および標的領域V（BK5）；標的領域III（BK3）および標的領域I（BK1）；標的領域III（BK3）および標的領域II（BK2）；標的領域I（BK1）、標的領域II（BK2）、および標的領域III（BK3）；標的領域III（BK3）、標的領域IV（BK4）、および標的領域V（BK5）；または、標的領域III（BK3）、標的領域I（BK1）、および標的領域V（BK5）など。理解されるように、標的領域I-Vのあらゆる組み合わせの検出は全て、本発明の方法で企図される。
【００９２】
代表的なプライマーおよびプローブについては、以下に更に詳しく記載する。
【００９３】
標的配列IV（BK4）
別の態様では、本発明はサンプル（例えば生体サンプル）中のBKVの検出法を提供し、これは以下の標的核酸配列領域IV（図1、標的領域IV（別名BK4）、GenBankアクセッション番号AY628224のナンバリングに基づくアラインメント位置は612-864）：
ATGGGTGCTGCTCTAGCACTTTTGGGGGACCTAGTTGCCAGTGTATCTGAGGCTGC TGCTGCCACAGGATTTTCAGTGGCTGAAATTGCTGCTGGGGAGGCTGCTGCTGCTA TAGAAGTTCAAATTGCATCCCTTGCTACTGTAGAGGGCATAACAAGTACCTCAGAG GCTATAGCTGCCATAGGCCTAACTCCTCAAACATATGCTGTAATTGCTGGTGCTCC TGGGGCTATTGCTGGGTTTGCTGCTTTAA (SEQ ID NO:04)
もしくはその相補体、またはそれらのフラグメントの検出によるものであり、ここで、核酸の５’および3’末端はSEQ ID NO:4内に包含される。このBKVゲノム中の保存された配列を、3つのゲノムをアラインさせて図1に示す。特に興味深い態様では、標的領域は標的領域IVのサブ配列、例えば以下：
ATGGGTGCTGCTCTAGCACTTTTGGGGGACCTAGTTGCCAGTGTATCTGAGGCTGC TGCTGCCACAGGATTTTCAGTGGCTGAAATTGCTGCTGG (SEQ ID NO:58)
もしくはその相補体、またはそれらのフラグメントである。
【００９４】
標的領域IV核酸を増幅するためのプライマーの設計に好適で、かつ本発明の方法での使用に好適な核酸配列の例を図1に下線を付して示す。標的領域IV核酸の増幅のためのプライマーに好適な配列はSEQ ID NO:4のヌクレオチド配列のヌクレオチド1-19および76-95、またはその相補体に相当する。
【００９５】
本発明での使用に好適なプローブの設計は、2つの選択したプライマーを用いて生成される増幅産物の配列内に位置する任意の配列から行ってもよい。標的領域IV核酸の検出のためのプローブとして使用するのに好適な配列はSEQ ID NO:4のヌクレオチド配列のヌクレオチド36-62またはその相補体に相当する。
【００９６】
ある態様では、標的領域IV核酸の検出は、SEQ ID NO:4の少なくとも253個、少なくとも250個、少なくとも225個、少なくとも200個、少なくとも175個、少なくとも150個、少なくとも125個、少なくとも120個、少なくとも115個、少なくとも100個、少なくとも95個、少なくとも90個、少なくとも85個、少なくとも80個、少なくとも75個、少なくとも70個、少なくとも65個、少なくとも60個、少なくとも55個、少なくとも50個、少なくとも45個、少なくとも40個、少なくとも35個、少なくとも30個、少なくとも28個、少なくとも26個、少なくとも24個、少なくとも22個、少なくとも20個の連続するヌクレオチドの増幅産物の生成を伴う。
【００９７】
本発明の方法は、標的領域IV核酸を単独で検出するか、または本明細書に記載する標的領域I-IIIおよびVの1もしくはそれ以上の検出と併せて行ってもよい。例えば、本発明の方法は以下の検出を伴ってもよい：標的領域IV（BK4）および標的領域I（BK1）；標的領域IV（BK4）および標的領域II（BK2）；標的領域IV（BK4）および標的領域III（BK3）；標的領域IV（BK4）および標的領域V（BK5）；標的領域I（BK1）、標的領域II（BK2）、および標的領域IV（BK4）；標的領域III（BK3）、標的領域IV（BK4）、および標的領域V（BK5）；または、標的領域I（BK1）、標的領域IV（BK4）、および標的領域V（BK5）など。理解されるように、標的領域I-Vのあらゆる組み合わせの検出は全て、本発明の方法で企図される。
【００９８】
代表的なプライマーおよびプローブについては、以下に更に詳しく記載する。
【００９９】
標的配列V（BK5）
別の態様では、本発明はサンプル（例えば生体サンプル）中のBKVの検出法を提供し、これは以下の標的核酸配列領域V（図1、標的領域V（別名BK5）、GenBankアクセッション番号AY628224の番号に基づくアラインメント位置は2810-2895）：
GGGGCTGAAGTATCTGAGACTTGGGAAGAGCATTGTGATTGGGATTCAGTGCTTG ATCCATGTCCAGAGTCTTCAGTTTCTGAATC (SEQ ID NO:05)
もしくはその相補体、またはそれらのフラグメントの検出によるものであり、ここで、核酸の５’および3’末端はSEQ ID NO:5内に包含される。このBKVゲノム中の保存された配列を、3つのゲノムをアラインさせて図1に示す。特に興味深い態様では、標的領域は標的領域Vのサブ配列、例えば以下：
GGGCTGAAGTATCTGAGACTTGGGAAGAGCATTGTGATTGGGATTCAGTGCTTGAT CCATGTC (SEQ ID NO:59)
もしくはその相補体、またはそれらのフラグメントである。
【０１００】
標的領域V核酸を増幅するためのプライマーの設計に好適で、かつ本発明の方法での使用に好適な核酸配列の例を図1に下線を付して示す。標的領域V核酸の増幅のためのプライマーに好適な配列はSEQ ID NO:5のヌクレオチド配列のヌクレオチド2-18および47-64、またはその相補体に相当する。
【０１０１】
本発明での使用に好適なプローブの設計は、2つの選択したプライマーを用いて生成される増幅産物の配列内に位置する任意の配列から行ってもよい。標的領域V核酸の検出のためのプローブとして使用するのに好適な配列はSEQ ID NO:5のヌクレオチド配列のヌクレオチド19-41またはその相補体に相当する。
【０１０２】
ある態様では、標的領域V核酸の検出は、SEQ ID NO:5の少なくとも86個、少なくとも80個、少なくとも75個、少なくとも70個、少なくとも65個、少なくとも60個、少なくとも55個、少なくとも50個、少なくとも45個、少なくとも40個、少なくとも35個、少なくとも30個、少なくとも28個、少なくとも26個、少なくとも24個、少なくとも22個、少なくとも20個の連続するヌクレオチドの増幅産物の生成を伴う。
【０１０３】
本発明の方法は、標的領域V核酸を単独で検出するか、または本明細書に記載する標的領域I-IVの1もしくはそれ以上の検出と併せて行ってもよい。例えば、本発明の方法は以下の検出を伴ってもよい：標的領域V（BK5）および標的領域I（BK1）；標的領域V（BK5）および標的領域II（BK2）；標的領域V（BK5）および標的領域III（BK3）；標的領域IV（BK4）および標的領域V（BK5）；標的領域V（BK5）、標的領域II（BK2）、および標的領域III（BK3）；標的領域III（BK3）、標的領域IV（BK4）、および標的領域V（BK5）；または、標的領域I（BK1）、標的領域III（BK3）、および標的領域V（BK5）など。理解されるように、標的領域I-Vのあらゆる組み合わせの検出は全て、本発明の方法で企図される。
【０１０４】
代表的なプライマーおよびプローブについては、以下に更に詳しく記載する。
【０１０５】
プライマーおよびプローブ
上記のように、標的核酸配列領域I-Vは種々のBKV遺伝子型において保存されている核酸領域である。これらのアッセイに使用するためのプライマーおよびプローブは、好ましくは上記の標的核酸配列領域I-Vから誘導する。特に興味深い態様では、本アッセイで使用するプライマーおよびプローブは、標的核酸配列領域I-Vの高度に保存されたヌクレオチド配列から設計する。
【０１０６】
一般に、プライマーにより標的核酸が増幅され、標的核酸増幅産物（別名“アンプリコン”）が生成される。プライマーはプローブと結合させて使用してもよく、またそれが好ましい。5’プライマーは一般に、領域に結合して標的核酸を増幅し、好ましくは図1に例示するように標的配列の5’部分に結合する。3’プライマーは一般に、図1に例示するように、5’プライマーからの伸長によって生成する核酸の3’部分に相補的な配列に結合する。5’および3’プライマーは約10、20、30、または40個の連続するヌクレオチドで隔てられてもよく、通常約30個の連続するヌクレオチドで隔てられる。ある態様では、標的領域配列内の1もしくはそれ以上の変異ヌクレオチドに相補的な配列、および／または標的領域の配列の変異ヌクレオチドに隣接する3’末端を有するようにプライマーを設計する。一般にプローブは、標的領域配列内の1またはそれ以上のヌクレオチドに相補的な配列を有するように設計する。増幅に基づく検出を伴う態様では、増幅のために使用される1またはそれ以上のプライマーに相補的な配列（単数または複数）が隣接する配列に相補的な配列を有するようにプローブの設計を行う。
【０１０７】
本明細書に記載するアッセイに使用するプライマーおよびプローブは本明細書に開示する配列に基づいて設計し、標準的な技術（例えばホスホルアミダイト化学による固相合成）によって容易に合成されるが、それらについては以下に開示されている：米国特許第4,458,066号および4,415,732号（参照により本明細書に組み込まれる）；Beaucageら（1992）Tetrahedron 48:2223-2311；およびApplied Biosystems User Bulletin No.13（1987年4月1日）。他の化学合成法には、例えばホスホトリエステル法（Narangら，Meth. Enzymol.（1979）68:90）およびホスホジエステル法（Brownら，Meth. Enzymol.（1979）68:109）がある。ポリ（A）もしくはポリ（C）、または他の非相補的ヌクレオチド伸長鎖をこれらと同じ方法を用いてプローブに導入してもよい。当該分野で周知の方法によってヘキサエチレンオキシド伸長鎖をプローブに結合させてもよい（Cloadら（1991）J. Am. Chem. Soc. 113:6324-6326；米国特許第4,914,210号（Levensonら）；Durandら（1990）Nucleic Acids Res. 18:6353-6359；およびHornら（1986）Tet. Lett. 27:4705-4708）。
【０１０８】
一般に，プライマー配列は10-75ヌクレオチド長の範囲内、例えば10から70、12から65、15から60、20から55、25から50、30から45などである。より一般的には，プライマーは18から40、19から35、20から30、21から29、22から28、23から27、24-25ヌクレオチド長、および記載する範囲内の任意の長さである。約20から22ヌクレオチド長のプライマーが特に興味深い。
【０１０９】
典型的なプローブは10-50ヌクレオチド長の範囲、例えば10から50、12から45、15から40、20から35、25から30などである。より一般的には、プローブは18から40、19から35、20から30、21から29、22から28、23から27、24-25ヌクレオチド長の範囲、および記載する範囲内の任意の長さである。約20から22ヌクレオチド長のプローブが特に興味深い。
【０１１０】
ある態様では、本発明の方法はサンプル（例えば生体サンプル）中の任意のBKV遺伝子型の検出を提供する。それらの態様では、この方法は，標的領域内の配列に対応するプライマーおよびプローブを用いて標的核酸領域またはそれらのフラグメントを検出する。本発明の方法で使用するのに好適な標的領域I-V内のプライマーの例を図1に太字で示す。本発明で使用するのに好適なプローブは2つの選択したプライマーを用いて生成される増幅産物の配列内に位置する任意の配列から設計できる。それらの態様で使用するのに好適なプローブは、検出すべき種々のBKV遺伝子型間でヌクレオチド配列が共有される領域に対応するように選択する。
【０１１１】
他の態様では、本発明の方法はサンプル（例えば生体サンプル）中の種々の遺伝子型を検出および識別する。それらの態様では、この方法は，標的領域内の配列に対応するプライマーおよびプローブを用いて標的核酸領域またはそれらのフラグメントを検出する。本発明の方法で使用するのに好適な標的領域I-V内のプライマーの例を図1に太字で示す。本発明で使用するのに好適なプローブは2つの選択したプライマーを用いて生成される増幅産物の配列内に位置する任意の配列から設計できる。それらの態様では、検出すべき種々のBKV遺伝子型間で配列中の1またはそれ以上のヌクレオチドが異なる領域に対応するようにプローブの配列を選択する。
【０１１２】
本発明のアッセイでプライマーおよびプローブとして使用するのに好適なBKV遺伝子型の核酸配列の例を表1に示す。表1に示す配列のナンバリングは図1のGenBankアクセッション番号AY628224のナンバリングである。
【０１１３】
【表１】
2009502196.tif 000003
【０１１４】
プローブは、検出のための標識に結合させてもよい。標識の付加を可能にする反応性を有するオリゴヌクレオチドを誘導するための方法および組成物が知られている。例えば、アビジンを介して放射性、蛍光、化学発光、酵素、または高電子密度標識を結合させることができるようにプローブをビオチニル化するための方法がある。例えばBrokenら，Nucl. Acids Res.（1978）5:363-384（フェリチン-アビジン-ビオチン標識の使用を開示）；およびCholletら，Nucl. Acids Res.（1985）13:1529-1541（アミノアルキルホスホルアミド結合アームを介するオリゴヌクレオチドの5’末端のビオチニル化を開示）参照。蛍光、またはアミノ反応基（例えばイソチオシアネート、N-ヒドロキシスクシンイミドなど）によって誘導した他の型の化合物で容易に標識できるアミノ誘導型オリゴヌクレオチドを合成するための方法がある。例えばConnolly（1987）Nucl. Acids Res. 15:3131-3139，Gibsonら（1987）Nucl. Acids Res. 15:6455-6467、および米国特許第4,605,735号（Miyoshiら）参照。チオール特異的標識と反応するスルフヒドリル誘導型オリゴヌクレオチドを合成するための方法がある。例えば米国特許第4,757,141号（Fungら）、Connollyら（1987）Nuc. Acids Res. 13:4485-4502、およびSpoatら（1987）Nucl. Acids Res. 15：4837-4848参照。DNAフラグメントを標識するための方法論の総説はMatthewsら，Anal. Biochem.（1988）169:1-25に記載されている。
【０１１５】
例えば、蛍光分子をプローブの非ライゲート末端に結合させて、プローブの蛍光標識を行ってもよい。好適な蛍光標識の選択のための手引きは以下に記載されている：Smithら，Meth. Enzymol.（1987）155:260-301；Kargerら，Nucl. Acids Res.（1991）19:4955-4962；Haugland（1989）Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals（Molecular Probes社，Eugene, Oreg.）。好ましい蛍光標識にはフルオレセインおよびその誘導体、例えば米国特許第4,318,846号およびLeeら,Cytometry（1989）10:151-164に開示されているもの、並びに6-FAM、JOE、TAMRA、ROX、HEX-1、HEX-2、ZOE、TET-1、またはNAN-2などがある。
【０１１６】
更に、プローブをアクリジニウムエステル（AE）で標識してもよい。最新技術によれば、プローブ内の任意の位置にAE標識を配することが可能である。例えばNelsonら（1995）“Detection of Acridinium Esters by Chemiluminescence”，Nonisotopic Probing, Blotting and Sequencing，Kricka L. J.（編）Academic Press，San Diego，Calif.；Nelsonら（1994）“Application of the Hybridization Protection Assay（HPA）to PCR”，The Polymerase Chain Reaction，Mullisら（編）Birkhauser，Boston，Mass；Weeksら，Clin. Chem.（1983）29:1474-1479；Berryら，Clin. Chem.（1988）34:2087-2090参照。ヌクレオチドに基づくリンカーアーム化学以外を用いてAE分子をプローブに直接結合させ、プローブ内の任意の位置に標識を配してもよい。例えば米国特許第5,585,481号および第5,185,439号参照。
【０１１７】
（例えばプローブを用いて標的核酸のアンプリコンを捕捉するために）固相支持体をアッセイに使用する場合、種々の方法でオリゴヌクレオチド・プローブを固相支持体に結合させてもよい。例えばプローブの3’または5’末端ヌクレオチドを固相支持体に結合させることによって、プローブを固相支持体に結合させてもよい。更に好ましくは、固相支持体とプローブ間に間隔を置く役割をするリンカーによってプローブを固相支持体に結合させる。リンカーは通常少なくとも15-30原子長、より好ましくは少なくとも15-50原子長である。必要とされるリンカーの長さは使用する特定の固相支持体に依存する。例えば、高架橋ポリスチレンを固相支持体として使用する場合、一般に6原子長のリンカーで十分である。
【０１１８】
オリゴヌクレオチド・プローブを固相支持体に結合させるために使用できる種々の方法が当該分野で知られている。リンカーは、固相支持体に結合したプローブへの標的配列のハイブリダイゼーションに有意に干渉しない,任意の化合物で形成されてもよい。リンカーは、自動合成で容易にリンカーに添加できるようなホモポリマー・オリゴヌクレオチドで形成されてもよい。あるいはまた、官能基を有するポリエチレングリコールのようなポリマーをリンカーとして使用することができる。それらのポリマーは、プローブの標的オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションに有意に干渉しないため、ホモポリマー・オリゴヌクレオチドよりも好ましい。ポリエチレングリコールは特に好ましい。
【０１１９】
固相支持体、リンカー、およびプローブ間の結合は、通常、高温での塩基性条件下で塩基保護基を除去する際に開裂されない。好ましい結合の例にはカーバメートおよびアミド結合がある。
【０１２０】
オリゴヌクレオチド・プローブの固定化のための好ましい型の固相支持体の例には制御多孔ガラス、ガラスプレート、ポリスチレン、アビジン・コーティング・ポリスチレンビーズ、セルロース、ナイロン、アクリルアミドゲル、および活性デキストランがある。
【０１２１】
ある態様では、内部コントロール（IC）または内部標準を添加し、陰性結果がアッセイの不具合によるものではないことを示すコントロールとする。ICの使用により、分離工程、増幅工程、および検出系の制御が可能となり、アッセイ挙動のモニタリングおよびサンプル（単数または複数）の定量化が可能となる。ICは任意の好適な時点で、例えば溶解バッファー中に含有させてもよい。ある態様では、ICはファージ核酸を含む。固相支持体をアッセイに使用する場合、固相支持体は内部標準（ICプローブ）に特異的なプローブを更に含み、これによってICプローブを使用する際の捕捉を容易にさせてもよい。必要によりICプローブを、標的配列の検出可能な標識とは異なる検出可能な標識と結合させてもよい。検出可能な標識が蛍光体である態様では、ICは分光光度法および検出限界実験により測定できる。
【０１２２】
サンプル中のBKVの検出
ある観点では、アッセイはサンプル中のBKVの存在を検出する。それらの観点では、アッセイは変性プライマーおよびプローブを使用する、増幅に基づくアッセイであり、プライマーおよびプローブはBKVゲノムの標的核酸配列領域を増幅するように設計する。
【０１２３】
上記のように、アッセイは1もしくはそれ以上の標的核酸領域（例えば標的領域I-V）またはその一部の存在を検出する。標的核酸配列領域I-Vは異なるBKV遺伝子型において保存されている核酸領域である。これらのアッセイに使用するためのプライマーおよびプローブは、好ましくは上記の標的核酸配列領域I-Vから誘導する。本明細書に記載するアッセイと共に使用するのに特に好ましいプライマーおよびプローブは、標的核酸配列領域I-Vの高度に保存されたヌクレオチド配列から設計する。
【０１２４】
上記のように、ある態様ではプライマーおよび／またはプローブは、上記の標的核酸配列（例えば標的核酸配列領域I-V）を有する標的核酸の核酸に基づく検出（特に増幅法）のために設計される。すなわち、それらの態様では、上記の核酸配列（例えば標的核酸配列領域I-V）の核酸配列を有する標的配列を増幅するようにプライマーを設計する。
【０１２５】
別の態様では、上記の標的核酸配列（例えば標的核酸配列領域I-V）のフラグメントである核酸配列を有する標的核酸の核酸に基づく検出（特に増幅法）のためにプライマーおよび／またはプローブを設計する。すなわち、それらの態様では、上記の核酸配列全長（例えば標的核酸配列領域I-V）より小さい部分の核酸配列を有する標的配列を増幅するようにプライマーを設計する。
【０１２６】
サンプル中のBKV核酸の特異的検出は、一般に1もしくはそれ以上の標的配列領域I-V、またはそれらのフラグメントの検出によって達成される。ある態様では、標的配列領域Vの配列上に設計したプライマーおよびプローブの使用によってBKV標的核酸を検出する。
【０１２７】
特に興味深い態様では、以下の配列：
ATGGGTGCTGCTCTAGCAC （5’プライマー）（SEQ ID NO:15）
GTGGCTGAAATTGCTGCTGG （3’プライマー）（SEQ ID NO:16）
を有するプライマーを使用して標的配列を検出し、そして以下の配列：
TGCCAGTGTATCTGAGGCTGCTGCTGC （SEQ ID NO:17）
を有するプローブが特に興味深い。
【０１２８】
別の特に興味深い態様では、以下の配列：
GGGCTGAAGTATCTGAG （5’プライマー）（SEQ ID NO:18）
CAGTGCTTGATCCATGTC （3’プライマー）（SEQ ID NO:19）
を有するプライマーを使用して標的配列を検出し、そして以下の配列：
CTTGGGAAGAGCATTGTGATTGG （SEQ ID NO:20）
を有するプローブが特に興味深い。
【０１２９】
特に興味深いものは、2重標識したTaqManプローブをこれらのプライマーおよびプローブと共にリアルタイムRT PCR法に使用して、サンプル中のBKVを検出することである。
【０１３０】
検出法
本発明はサンプル中のBKVを検出するためのDNAに基づくアッセイを提供する。検出は種々の方法を用いて行ってもよく、それらには直接シーケンシング、配列特異的オリゴマーとのハイブリダイゼーション、ゲル電気泳動、および質量分析がある。これらの方法は不均一または均一系、同位体または非同位体標識を使用するか、全く標識を使用しなくてもよい。
【０１３１】
好ましくは、本発明の方法はサンプルからの核酸の増幅を伴う。診断核酸が得られれば、サンプル中のBKVの存在を示す。一般に、この方法は上記のような検出プライマーおよび少なくとも１つの他のプライマーを用いてサンプルから核酸を増幅すること、および増幅した核酸を評価することを伴う。この方法は高感度であり、反応当たりわずか５コピーのBKV（これは標本mL当たり200コピーのDNAに相当する ）をも検出しうるが、検出は直線範囲内の検出に限定されうる。従って、本発明は一般に、BKVが標本mL当たりに少なくとも200コピーのDNAが存在する場合の、サンプル中のBKVの検出を提供する。
【０１３２】
当該分野で知られるように、増幅された核酸を多くの方法、例えば核酸の存在もしくは非存在の測定、核酸のサイズの測定、または別の増幅産物に対する核酸の存在量の測定によって評価してもよい。ほとんどの態様では、増幅された核酸は電気泳動、核酸ハイブリダイゼーション、シーケンシング、および／または増幅された核酸に結合した標識からのシグナルの検出を用いて測定する。（例えばポリメラーゼ連鎖反応による）核酸の増幅方法、プライマー伸長の方法、および核酸の測定法は当該分野で周知であるので（例えばAusubelら，Short Protocols in Molecular Biology，第3版，WileyおよびSons，1995；およびSambrookら，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版（2001）Cold Spring Harbor，N.Y.参照）、これ以上詳細に記載する必要はない。
【０１３３】
例えば、上記のプライマーおよびプローブをポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に基づく技術に用いて生体サンプル中のBKVを検出してもよい。PCRは核酸分子または分子の混合物中に含有される所望の標的核酸配列を増幅する技術である。PCRでは一ペアのプライマーを過剰量で使用し、標的核酸の相補鎖にハイブリダイズさせる。プライマーはテンプレートとして標的核酸を使用し、ポリメラーゼによってそれぞれ伸長される。伸長産物は元の標的鎖から解離した後、それ自身が標的配列となる。その後新たなプライマーハイブリダイズしてポリメラーゼによって伸長され、サイクルの反復によって標的配列分子の数は幾何学的に増加する。サンプル中の標的核酸配列を増幅するためのPCR法は当業者に周知であり、例えば以下に記載されている：Innisら（編）PCR Protocols（Academic Press，NY 1990）;Taylor（1991）Polymerase chain reaction：basic principles and automation，in PCR：A Practical Approach，McPhersonら（編）IRL Press，Oxford；Saikiら（1986）Nature 324：163；並びに、米国特許第4,683，195号、第4,683,202号、および4,889,818号（全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１３４】
特に、PCRは増幅すべき標的ヌクレオチド配列に隣接した相対的に短いオリゴヌクレオチド・プライマーを使用し、それらの3’末端が互いに向かい合い、各プライマーが他方に向かって伸長されるように配する。ポリヌクレオチドサンプルを抽出および変性させ（好ましくは熱によって）、過剰モル存在する第1および第2のプライマーとハイブリダイズさせる。重合化は４つのデオキシリボヌクレオチド3リン酸（dNTP：dATP、dGTP、dCTP、およびdTTP）の存在下で、プライマーおよびテンプレート依存的ポリヌクレオチド重合化剤の使用によって触媒され、それらにはプライマー伸長産物を生成する能力のある酵素、例えば以下がある：E.coli DNAポリメラーゼI、DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメント、T4 DNAポリメラーゼ、Thermus aquaticus（Taq）（種々の供給元、例えばPerkin Elmerから入手可）、Themus thermophilus（United States Biochemicals）、Bacillusstereothermophilus（Bio-Rad）、またはThermococcus litoralis（“Vent”ポリメラーゼ、New England Biolabs）から単離された熱安定性DNAポリメラーゼ。これによって、新たに合成された、元の鎖の相補鎖に、その5’末端で共有結合した各プライマーを含む２つの“長鎖産物”が得られる。
【０１３５】
その後、（例えば温度の低下、変性剤の不活化、または更なるポリメラーゼの添加によって）反応混液を重合化条件に戻し、第2のサイクルを開始する。第2のサイクルでは、2本の元の鎖、第1サイクルからの2本の長鎖産物、元の鎖から複製された2本の新たな産物、および長鎖産物から複製された2本の“短鎖産物”が得られる。短鎖産物は標的配列、およびそれぞれの末端にプライマーを有する。更なるサイクルではそれぞれ、更に2本の長鎖産物が生成され、  短鎖産物の数は前のサイクルの最後に残存した長鎖および短鎖産物の数に等しい。従って、標的配列を含有する短鎖産物の数はサイクル毎に指数関数的に増加する。好ましくは、PCRは市販のサーマルサイクラー（例えばPerkin Elmer）を用いて行う。
【０１３６】
TAQMANTMアッセイ（Perkin-Elmer）として知られる蛍光発光5’ヌクレアーゼ・アッセイは核酸標的の有力かつ多様性のあるPCR検出系である。TAQMANTMアッセイ,並びにそれに使用する試薬および条件の詳細については、例えば以下を参照されたい：Hollandら,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.（1991）88:7276-7280；米国特許第5,538,848号、5,723,591号、および5,876,930号（全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。従って、本明細書に記載するBKVゲノムの領域由来のプライマーおよびプローブをTAQMANTM分析に使用して、生体サンプル中の感染の存在を検出できる。蛍光シグナルの発生をモニタリングすることによって熱サイクルと同時に分析を行う。アッセイ系はゲル電気泳動分析を必要とせず、標的コピー数の測定を可能とする定量データを得ることが可能である。
【０１３７】
蛍光発光5’ヌクレアーゼ・アッセイは、例えば蛍光レポーター色素およびクエンチャーで標識した内部オリゴヌクレオチド・プローブを消化するための内在性5’ヌクレアーゼ活性を有するAMPLITAQ GOLDTM DNAポリメラーゼを用いて便宜に行う（Hollandら,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A（1991）88:7276-7280；およびLeeら,Nucl. Acids Res.（1993）21:3761-3766参照）。アッセイ結果の検出は増幅サイクル中に起こる蛍光の変化を測定することによって行われるが、これは蛍光プローブが消化され、色素およびクエンチャー標識が解離し、標的核酸の増幅に比例して蛍光シグナルが増加することによるものである。
【０１３８】
増幅産物の検出は、溶液中でまたは固相支持体を用いて行うことができる。この方法では、所望のPCR産物内の標的核酸にハイブリダイズするようにTAQMANTMプローブを設計する。TAQMANTMプローブの5’末端は蛍光レポーター色素を含有する。プローブの3’末端はプローブの伸長を阻害するようにブロッキングされており、5’蛍光体の蛍光をクエンチングする色素を含有する。その後の増幅の際、5’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼが反応中に存在すれば、5’蛍光標識は開裂される。5’蛍光体の除去により,検出可能な蛍光が増加する。
【０１３９】
特に、プローブがハイブリダイズしていない時に少なくとも１つの1本鎖コンフォメーションで存在し、この時、クエンチャー分子はレポーター分子に十分近い位置にあって蛍光をクエンチングするように、オリゴヌクレオチド・プローブを構築する。また、オリゴヌクレオチド・プローブは標的ポリヌクレオチドへのハイブリダイズ時に、少なくとも1つの、クエンチャー分子がレポーター分子の蛍光をクエンチングするのに十分なほどレポーター分子の近くに位置しなくなるようなコンフォメーションで存在する。これらのハイブリダイズ時および非ハイブリダイズ時のコンフォメーションを採用することにより、プローブ上のレポーター分子およびクエンチャー分子は、プローブがハイブリダイズしている時としていない時で異なる蛍光シグナル強度を示す。結果として、レポーター分子、クエンチャー分子、またはそれらを組み合わせた蛍光強度の変化に基づいて、プローブがハイブリダイズしているかしていないかを測定できる。更に、プローブがハイブリダイズしていない時はクエンチャー分子がレポーター分子をクエンチングするようにプローブを設計できるため、プローブがハイブリダイズまたは消化されなければレポーター分子が限られた蛍光しか発しないようにプローブを設計できる。
【０１４０】
従って本発明は標的BKVヌクレオチド配列を増幅する方法に関し、方法には5’→3’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ、標的BKV配列またはその伸長産物にハイブリダイズする能力のある1またはそれ以上のプライマー、および標的BKV配列のプライマーの3’側にハイブリダイズする能力のあるオリゴヌクレオチド・プローブを使用する。増幅の際、オリゴヌクレオチド・プローブが標的配列にハイブリダイズしていればポリメラーゼによって消化され、それによってレポーター分子はクエンチャー分子から分離される。増幅を行う際、核酸増幅の発生に相当する蛍光について、レポーター分子の蛍光をモニタリングする。レポーター分子は好ましくはフルオレセイン色素であり、クエンチャー分子は好ましくはローダミンである。
【０１４１】
別の検出方法は、上記の標的配列に相補的な領域を含有する標的配列特異的オリゴヌクレオチド・プローブの使用を伴う。プローブをハイブリダイゼーション・プロテクション・アッセイ（HPA）に使用してもよい。この態様では、プローブを高度の蛍光発光性を有するアクリジニウム・エステル（AE）で便宜に標識する。例えば以下参照：Nelsonら（1995）“Detection of Acridinium Esters by Chemiluminescence”，Nonisotopic Probing，Blotting and Sequencing，Kricka L.J.（編）Academic Press，San Diego，Calif.；Nelsonら（1994）“Application of the Hybridization Protection Assay（HPA）to PCR”，The Polymerase Chain Reaction，Mullisら（編）Birkhauser，Boston，Mass.；Weeksら，Clin. Chem.（1983）29:1474-1479；Berryら，Clin. Chem.（1988）34:2087-2090。プローブ内の任意の位置に標識を配することを可能とする非ヌクレオチドリンカーアーム化学を用いて、１つのAE分子をプローブに直接結合させる。例えば米国特許第5,585,481号および5,185,439号参照。化学発光はアルカリ性過酸化水素との反応によって誘引されるが、反応によって励起状態のN-メチルアクリドンが生じ、次いでこれが崩壊して光子の放出と共に基底状態となる。更に、AEはエステル加水分解を誘引し、これによって非化学発光性メチルアクリジニウムカルボン酸を生ずる。
【０１４２】
AE分子が核酸プローブに共有結合している場合、加水分解は弱アルカリ性条件下で速やかに起こる。AE標識されたプローブが標的核酸と完全に相補的である場合、AE加水分解速度は大幅に低下する。従って、ハイブリダイズした、およびハイブリダイズしていないAE標識プローブは、物理的分離を必要とせずに、溶液中で直接検出できる。
【０１４３】
一般にHPAは以下の段階からなる：(a)AE標識したプローブを溶液中で約15から約30分間、標的核酸とハイブリダイズさせる。次いで弱アルカリ溶液を添加し、ハイブリダイズしていないプローブに結合したAEを加水分解する。この半に右派約5から10分間を要する。残存するハイブリッドに結合したAEを存在する標的の指標として検出する。この段階には約2から5秒を要する。好ましくは、判別的（differential）加水分解段階はハイブリダイゼーション段階と同じ温度(一般に50から70℃)で行う。あるいはまた、第2の判別的加水分解段階を室温で実施してもよい。これによって使用するpHを(例えば10-11)に上昇し、ハイブリダイズしたAE標識プローブとハイブリダイズしていないものとの加水分解速度の差を大きくすることができる。HPAは、例えば米国特許第6,004,745号、第5,948,899号、および第5,283,174号に詳述されている（これらの開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１４４】
本発明のオリゴヌクレオチド分子を核酸配列に基づく増幅法（nucleic acid sequence-based amplification；NASBA）に使用してもよい。この方法は、インビトロにおける特定の核酸の連続的、均質、かつ定温の増幅を誘導し、核酸のRNAコピーを提供するプロモーター依存性酵素過程である。NASBAを実施するための試薬にはプライマーを含有する5’テールを有する第1のDNAプライマー、逆転写酵素、RNase-H、T7 RNAポリメラーゼ、NTP’s、およびdNTP’sがある。NASBAの使用によって、大量の1本鎖RNAが1本鎖RNAもしくDNA,または2本鎖DNAのいずれかから生成される。RNAを増幅する場合、ssRNAがRNAポリメラーゼ認識部位を含有する第1のプライマーの伸長による第1のDNA鎖合成のためのテンプレートの役割を果たす。このDNA鎖は第2のプライマーの伸長による第2の相補的DNA鎖合成のテンプレートとなって2本鎖活性RNAポリメラーゼ・プロモーター部位となり、第2のDNA鎖はRNAポリメラーゼの助けによって第1のテンプレート、ssRNAの大量合成のためのテンプレートとなる。NASBA法は当該分野で周知であり、例えばヨーロッパ特許第329,822号、WO91/02814、および米国特許第6,063,603号、5,554,517号、および5,409,818号に記載されている（これらは全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１４５】
本明細書に記載するBKV配列は、分枝鎖DNA分子を使用する核酸のハイブリダイゼーションおよび増幅にも有用である。基本的な核酸ハイブリダイゼーションアッセイでは、1本鎖分析物核酸を標識された1本鎖核酸プローブにハイブリダイズさせ、生じる標識されたデュプレックスを検出する。この基本スキームの変法の開発が、検出すべきデュプレックスの外来物質からの分離を容易にするため、および／または検出するシグナルを増幅するために行われてきた。シグナルを増幅するためのある方法は増幅多量体を用い、この多量体は分析物核酸または分析物に結合した核酸鎖に特異的にハイブリダイズする第1のセグメント、および標識されたプローブに特異的にハイブリダイズする第2セグメントの反復を有するポリヌクレオチドである。理論的には、増幅は第2セグメントの反復数に比例する。多量体は直鎖または分枝鎖のいずれでもよい。２つの一般的な型の分枝鎖多量体、フォーク型およびクシ型がこれらの技術に有用である。分枝鎖核酸分子の生成および使用法は当該分野で周知であり、例えば米国特許第5,849,481号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１４６】
容易に認識されるように、本明細書に記載するアッセイの設計は非常に多様であり、多くのフォーマットが当該分野で知られている。上記は単に指針として提供する者であり、当業者は,当該分野で周知の技術を使用して上記のプロトコルを容易に改変できる。
【０１４７】
キット
本発明に関連して使用されるキットも提供する。上記のアッセイ試薬（プライマー、プローブ、プローブが結合した固相支持体を含む）および他の検出試薬を、好適な取扱説明書および他の必要な試薬と共にキットとして提供し、上記のアッセイを実施することができる。キットは通常、別個の容器に入ったプライマーおよびプローブ（すでに固体マトリクスに結合しているか、またはそれらをマトリクスに結合させるための試薬と別個で）の組み合わせ、コントロール製剤（陽性および／または陰性）、標識された試薬（アッセイフォーマットに必要とされる場合）、および、標識がシグナルを直接生成しない場合はシグナル生成試薬（例えば酵素基質）を含有する。通常、アッセイを実施するための取扱説明書（例えば文書、テープ、VCR、CD-ROMなど）がキットに含まれる。キットは、使用する特定のアッセイによって、容器に封入された他の試薬および物質（すなわち洗浄バッファーなど）を含んでもよい。例えば上記のような標準的なアッセイをこれらのキットを用いて実施できる。
【０１４８】
一般に、取扱説明書は好適な記録媒体に記録される。例えば取扱説明書は好適な素地、例えば紙またはプラスティックに印刷してもよい。取扱説明書は、それ自体、添付文書、キットまたはその内容物の容器の表示（例えば外包装または内包装に付随して）などとしてキットに包含されてもよい。他の態様では、取扱説明書は電子保存データファイルであって、コンピューターへの読み込み可能な好適な保存メディア、例えばCD-ROM、ディスケットなど（プログラムが存在するのと同一のメディアを含む）上に存在する。
【０１４９】
更に別の態様では、取扱説明書自体はキット中に含まれず、リモート・ソースから（例えばインターネットを介して）取扱説明書を得る方法を提供する。この態様の一例はウェブ・アドレスを含むキットであり、取扱説明書をこのアドレスから閲覧するか、またはダウンロードすることができる。
【０１５０】
更にキットは、取扱説明書をリモート・ソース（例えばインターネットまたはワールド・ワイド・ウェブ）から得るか、（are）ダウンロードするものであってもよい。ある型のアクセス保護または認証手続きを用いて本発明の使用権を与えられているものにアクセスを制限してもよい。取扱説明書の場合と同じように、取扱説明書の入手および／またはプログラミングの方法は、一般に好適な記録メディアに記録される。
【０１５１】
一般に、本発明のキットは上記のような少なくとも1つのプライマー、通常は少なくとも2つのプライマー（5’および3’プライマー）、通常は少なくとも2つのプライマーおよびプローブを含有する。キットは、キットを使用して上記の方法（上記PCR法を含む）でサンプル中のBKVを検出するための取扱説明書を含んでもよい。また同キットは同方法を実施するためのバッファー、dNTPs、およびコントロール（例えば陽性および陰性コントロール核酸）を含んでもよい。同キット中のプライマーは直接標識されてもよく、または標識されなくてもよい。
【実施例】
【０１５２】
実施例
以下の実施例は本発明を実施（make）および使用するための方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために記載するものであり、発明者がその発明と見なすものを制限することを意図するものではなく、また以下の実験が実施される実験の全てもしくは唯一であることを示すことを意図するものでもない。使用する数値（例えば量、温度など）に関しては正確を期すよう試みたが、ある程度の実験誤差および偏差は一定の割合を占めるはずである。特に記載しない限り、部分は重量による部分であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧は大気圧またはその付近である。
【０１５３】
材料および方法
以下の方法および材料を以下の実施例（単数または複数）に使用した。
【０１５４】
標本のタイプと操作。本発明にかかるBKVの検出に使用するサンプルは任意の好適な生体サンプル、例えば血清、血漿、羊水、および組織標本であってもよい。組織標本は生理食塩水またはリン酸バッファー（PBS）中、-20±10℃で保存する。血清、血漿、および羊水は-20±10℃で保存する。上記のタイプの標本は全て、ドライアイス上、翌日配達便で送付することができる。
【０１５５】
プライマーおよびプローブ。オリゴヌクレオチド・プライマーおよびプローブを設計し、標準的なプログラム（Primer Express, Applied Biosystems）を用いたコンピューター分析によってPCRおよびハイブリダイゼーションへの適合性を分析した。オリゴヌクレオチド・プライマーおよび蛍光発光プローブを認定ベンダーで合成した。オリゴヌクレオチド・プライマーを脱塩および凍結乾燥した。BKVの検出のためのオリゴヌクレオチド・プライマー・ペアは以下である：
【０１５６】
【表２】
2009502196.tif 000004
【０１５７】
“F”はフォワードプライマー、“R”はリバーズプライマー、そして“P”はプローブを表す。プローブは100μMの濃度で凍結する。プローブの作用濃度は5μMであり、10mM Tris-HCl（pH8.0）で1:10に希釈し、100μlアリコートに分配する。プローブは遮光して-20℃以下で保存できる。
【０１５８】
酵素。以下の酵素を使用する：2X TaqMan（登録商標）Universal PCR Master Mix Applied Biosystemsカタログ番号4304437または4318157（Applied BiosystemsのAmpliTaq Gold DNAポリメラーゼを含有する）。
【０１５９】
試薬およびバッファー。以下をアッセイに使用した：QIAmp DNA Blood Mini Kit（QIAGENカタログ番号51106）。
【０１６０】
装置：使用した装置にはABI PRISM（登録商標）Sequence Detecton System 7500がある。
【０１６１】
増幅。広範に使用されている上記のPCR法を用いてDNA増幅を行った（例えばPersingら，1993，Diagnostic Molecular Microbiology：Principles and Amplifications，American Society for Microbiology，Washing D.C.参照）。増幅されたDNA配列をTaqman法による二重標識オリゴヌクレオチド・プローブのハイブリダイゼーションおよび開裂によって検出した。増幅および検出のプロトコルを以下に簡潔に記載する：臨床標本から抽出したDNAを、500nMの各プライマー、100nMの二重標識プローブ（Taqmanプローブ）、200μMの4種の各dNTPを含有する25μlのPCR反応混液（PCR Master Mix、Applied Biosystems）中で増幅した。AmpliTaq Goldポリメラーゼを混合液に用いたが、これは増幅の特異度および感度を増加させる熱活性化（ホットスタート）酵素である。PCR反応液をABI7500 Real Time PCR Systemを用いて熱サイクル（95℃で10分間、次いで95℃で30秒、60℃で30秒を40サイクル）に施与した。増幅および検出をリアルタイムでモニタリングし、PCRサイクルの完了後、ABIの Sequence Detection Software（vl.2.2）を用いて分析した。
【０１６２】
特異度。シーケンシングしたDNAおよびGenBankで入手できる配列から誘導されたオリゴヌクレオチド・プライマーおよびプローブの特異度を、一群のBKV陽性および陰性の臨床サンプルについて試験した。プライマーおよびプローブは、JCV陽性および陰性サンプル、並びに多数のコントロールについても試験した。結果を、現在臨床検査で使用されているPCRアッセイで得た結果と比較した。増幅された核酸のいくつかについてシーケンシングを行い、アッセイの特異度を確認した。増幅した核酸のシーケンシングから、全てのPCRフラグメントが実際にBKV配列であることが確認された。これらの配列フラグメントは全て、JCV配列または他のいずれの種由来の配列とも関係が無かった。
【０１６３】
感度。一連の既知濃度であるBKV DNAの滴定、および濃度を検量線に変換することによって、アッセイの感度を分析した。異なる領域を標的としたいくつかのプライマー／プローブ・セットがあるため、感度は若干変化した。全体として、分析感度は反応チューブ毎に5コピーまたはそれ未満まで達した。サンプル調製法および容量調整プロトコルに基づき、この分析感度は臨床標本（例えば血清、尿、または他の型の液体標本）ml当たり約200コピーに相当した。
【０１６４】
実施例１  BKVゲノム全長の完全なシーケンシング
BKVのゲノム多様性を理解し、診断に適用するための候補配列を同定するために、ウイルスゲノム全長のシーケンシングを実施した。13検体のBKV陽性患者から尿サンプルを採取した。臨床的関係が密接になるのを防ぐため、これらの患者は地理的に多様なソースから選択し、あるいは無作為に選択した。通常の方法によってウイルスDNAをサンプルから抽出した。次いで、長鎖PCR法（Stratagene）によって、抽出したDNAからその5.1kbのゲノム全長を増幅した。増幅したウイルスDNAのシーケンシングを行うために、予め設計したシーケンシング・プライマー・セットを用いて４色ジデオキシ法を行い、ABI377シーケンサー・システムで分離した。各BKVゲノムについてのLasergene 6ソフトウェア解析により、配列断片を再構成して5.1-5.2kbの完全長コンティグを得た。
【０１６５】
13個の再構成したBKVコンティグを互いにアラインさせ、また全ての公開されているBKV配列に対してもアラインさせた。公開されている配列の情報は公開データベース（GenBank、EMBL、およびSwiss-Port）から入手した。32の完全長BKVゲノム配列を比較したが、それらには13の新たにシーケンシングされたBKV配列および19の公開されているBKV配列（GenBankアクセッション番号：AY628224、AY628225、AY628226、AY628227、AY628228、AY628229、AY628230、AY628231、AY628232、AY628233、AY628234、AY628235、AY628236、AY628237、AY628238、M23121、NC001538、V01108、およびV01109）が含まれた。
【０１６６】
まず、全てのBKV株由来配列を互いに比較した。次いで、BKV配列を他の近縁関係にある種のゲノムと比較した。全てのスクリーニングした種のうち、特に興味深いのは、ポリオーマウイルス・ファミリーの別のメンバーであるヒト・ポリオーマウイルスJCウイルス（JCV）であった。
【０１６７】
BKVゲノム内で完全に配列アラインメントを行うことにより、いくつかの診断検出のための候補となる配列領域を選択できた。これらの領域は32のBKVゲノム全てにわたる共通性を有し、それらの配列中の差異は最小限であった。これらの領域外の配列は共通ではないか、または高度な多型性を有し、そのため診断への適用において普遍的検出に使用するのは非常に困難である。公開データベース中の全ての他種由来の配列に対して、更に比較分析を行った。留意すべきことに、JCVはBKVと高度な相同性を有する。この相同性にも関わらず、JCVとBKVの選択された領域の比較により、配列の相違が明らかになった。これらの配列の相違は限られてはいるが、BKVとJCVを識別検出するのに重要な意味を有する。
【０１６８】
完全長ゲノムからの5100以上の塩基対のうち、総数142個の過去に公開されていないヌクレオチド変異体が同定された。これらのヌクレオチド変異体のうち105個はヌクレオチド置換（単一または複数塩基対）、37個は欠損または挿入（複数塩基対）であった。新規に同定された変異体は全BKVゲノムにわたって分布が見られた。新規に同定された配列変異体を公開データベースからの変異体と合わせてBKVの遺伝的多様性の詳細なマップを作成した。図1に示すように、このマップは高度に多様性を有する領域および相対的に保存的な領域を示す。この詳細マップの分析により、診断に適用するための候補配列の選択を行うことができる。
【０１６９】
実施例２  標的領域I(“BK1”)の同定
図1に示すように、全ての新規に完成した核酸配列および公開されている核酸配列にわたる配列の比較により、保存されていて、核酸に基づく生体サンプル中のBKVの存在または非存在の特異的かつ高感度検出をもたらす1より多い配列領域の選択を行った。GenBankアクセッション番号AY628224のヌクレオチド435から585を含むBK1領域を選択してPCRプライマーの設計を行った。BK1標的配列の核酸配列は以下である：
AACAAAAAAAAGAGCTCAGAGGATTTTTATTTTTATTTTAGAGCTTTTGCTGGAAT TTTGTAGAGGTGAAGACAGTGTAGACGGGAAAAACAAAGGTACCACTGCTTTACC TGCTGTAAAAGACTCTGTAAAAGACTCCTAGGTAAGTAAT (SEQ ID NO:01)
【０１７０】
核酸に基づく増幅のプライマー設計に使用する戦略は、全てのBKVゲノム配列および近縁関係にあるウイルスの配列の複数配列アラインメントの分析に基づく。この分析は全てのBKV変異体を含むように設計した。またこの分析を、近縁にはあるがBKV配列ではない配列（例えばJCVの配列）は除外するようにも設計した。これらのアラインメントを入念に分析することによって、全てのBKV変異体の配列は網羅するが他の近縁の属由来の配列とは識別されるオリゴヌクレオチド配列の選択を行うことができ、それによってBKVの属特異的増幅並びに偏在的な検出および同定が可能となった。BK1標的領域のプライマーおよびプローブの配列は以下である：
【０１７１】
【表３】
2009502196.tif 000005
【０１７２】
BKVの特異的検出を確認するために、BKV標本からのPCR増幅産物のシーケンシングおよび分析を行った。増幅産物の配列をBKVの配列と十分アラインさせたが、増幅産物の配列はいずれも、JCVまたは他の属のいずれの配列とも一致しなかった。アッセイの結果を図２に示す。テンプレート濃度は反応当たり50から50,000コピーの範囲であり、アッセイは二重で実施した。BK1アッセイ:傾き＝-3.58、切片＝43.428，R2＝0.997。
【０１７３】
実施例３  標的領域II（“BK2 ”）の同定
全ての新規に完成したBKV核酸配列および公開されているBKV核酸配列にわたる配列の比較により、BK2標的領域の選択を行った。BK2標的領域はGenBankアクセッション番号AY628224のヌクレオチド1418から1545を含む。BK2標的配列の核酸配列は以下である：
TGTACATTCAGGAGAGTTTATAGAAAAAACTATTGCCCCAGGAGGTGCTAATCAA AGAACTGCTCCTCAATGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTACGGGACTGTAAC ACCTGCTCTTGAAGCAT (SEQ ID NO:02)
【０１７４】
核酸に基づく増幅のプライマー設計に使用する戦略は、全てのBKV配列および近縁関係にあるウイルスの配列の複数配列アラインメントの分析に基づく。この分析は全てのBKV変異体を含むように設計した。またこの分析を、近縁にはあるがBK配列ではない配列（例えばJCVの配列）は除外するようにも設計した。これらのアラインメントを入念に分析することによって、全てのBKV変異体の配列は網羅するが他の近縁の属由来の配列とは識別されるオリゴヌクレオチド配列の選択を行うことができ、それによってBKVの属特異的増幅並びに偏在的な検出および同定が可能となった。BK2標的領域のプライマーおよびプローブの配列は以下である：
【０１７５】
【表４】
2009502196.tif 000006
【０１７６】
BKVの特異的検出を確認するために、BKV標本からのPCR増幅産物のシーケンシングおよび分析を行った。増幅産物の配列をBKVの配列と十分アラインさせたが、増幅産物の配列はいずれも、JCVまたは他の属のいずれの配列とも一致しなかった。アッセイの結果を図２に示す。テンプレート濃度は反応当たり50から50,000コピーの範囲であり、アッセイは二重で実施した。BK2アッセイ:傾き＝-3.48、切片＝44.053，R2＝0.999。
【０１７７】
実施例４  標的領域III（“BK3 ”）の同定
全ての新規に完成したBKV核酸配列および公開されているBKV核酸配列にわたる配列の比較により、BK3標的領域の選択を行った。BK3標的領域はGenBankアクセッション番号AY628224のヌクレオチド4097から4560を含む。BK3標的配列の核酸配列は以下である：
AGTAAGTATTCCTTATTAACACCCTTACAAATTAAAAAACTAAAGGTACACAGCTT TTGACAGAAATTATTAATTGCAGAAACTCTATGTCTATGTGGAGTTAAAAAGAATA TAATATTATGCCCAGCACACATGTGTCTACTAATGAAAGTTACAGAATATTTTTCC ATAAGTTTTTTATACAGAATTTGAGCTTTTTCTTTAGTAGTATACACAGCAAAGCA GGCAAGGGTTCTATTACTAAATACAGCTTGACTAAGAAACTGGTGTAGATCAGAG GGAAAGTCTTTAGGGTCTTCTACCTTTCTCTTTTTCTTGGGTGGTGTGGAGTGTTGA GAATCTGCTGTTGCTTCTTCATCACTGGCAAACATATCTTCATGGCAAAATAAATC TTCATCCCATTTTTCATTAAAGGAGCTCCACCAGGACTCCCACTCTTCTGTTCCATA GGTTGGCACCTATAA (SEQ ID NO:03) 
【０１７８】
核酸に基づく増幅のプライマー設計に使用する戦略は、全てのBKV配列および近縁関係にあるウイルスの配列の複数配列アラインメントの分析に基づく。この分析は全てのBKV変異体を含むように設計した。またこの分析を、近縁にはあるがBK配列ではない配列（例えばJCVの配列）は除外するようにも設計した。これらのアラインメントを入念に分析することによって、全てのBKV変異体の配列は網羅するが他の近縁の属由来の配列とは識別されるオリゴヌクレオチド配列の選択を行うことができ、それによってBKVの属特異的増幅並びに偏在的な検出および同定が可能となった。BK3標的領域のプライマーおよびプローブの配列は以下である：
【０１７９】
【表５】
2009502196.tif 000007
【０１８０】
BKVの特異的検出を確認するために、BKV標本からのPCR増幅産物のシーケンシングおよび分析を行った。増幅産物の配列をBKVの配列と十分アラインさせたが、増幅産物の配列はいずれも、JCVまたは他の属のいずれの配列とも一致しなかった。アッセイの結果を図２に示す。テンプレート濃度は反応当たり50から50,000コピーの範囲であり、アッセイは二重で実施した。BK3アッセイ:傾き＝-3.49、切片＝44.819，R2＝0.999。
【０１８１】
実施例５  標的領域IV（“BK4”）の同定
全ての新規に完成したBKV核酸配列および公開されているBKV核酸配列にわたる配列の比較により、BK4標的領域の選択を行った。BK4標的領域はGenBankアクセッション番号AY628224のヌクレオチド612から864を含む。BK4標的配列の核酸配列は以下である：
ATGGGTGCTGCTCTAGCACTTTTGGGGGACCTAGTTGCCAGTGTATCTGAGGCTGC TGCTGCCACAGGATTTTCAGTGGCTGAAATTGCTGCTGGGGAGGCTGCTGCTGCTA TAGAAGTTCAAATTGCATCCCTTGCTACTGTAGAGGGCATAACAAGTACCTCAGAG GCTATAGCTGCCATAGGCCTAACTCCTCAAACATATGCTGTAATTGCTGGTGCTCC TGGGGCTATTGCTGGGTTTGCTGCTTTAA (SEQ ID NO:04)
【０１８２】
核酸に基づく増幅のプライマー設計に使用する戦略は、全てのBKV配列および近縁関係にあるウイルスの配列の複数配列アラインメントの分析に基づく。この分析は全てのBKV変異体を含むように設計した。またこの分析を、近縁にはあるがBK配列ではない配列（例えばJCVの配列）は除外するようにも設計した。これらのアラインメントを入念に分析することによって、全てのBKV変異体の配列は網羅するが他の近縁の属由来の配列とは識別されるオリゴヌクレオチド配列の選択を行うことができ、それによってBKVの属特異的増幅並びに偏在的な検出および同定が可能となった。BK4標的領域のプライマーおよびプローブの配列は以下である：
【０１８３】
【表６】
2009502196.tif 000008
【０１８４】
BKVの特異的検出を確認するために、BKV標本からのPCR増幅産物のシーケンシングおよび分析を行った。増幅産物の配列をBKVの配列と十分アラインさせたが、増幅産物の配列はいずれも、JCVまたは他の属のいずれの配列とも一致しなかった。アッセイの結果を図２に示す。テンプレート濃度は反応当たり50から50,000コピーの範囲であり、アッセイは二重で実施した。BK4アッセイ:傾き＝-3.21、切片＝41.466，R2＝0.999。
【０１８５】
一連の既知濃度であるDNAの滴定によってオリゴヌクレオチド・プライマーおよびプローブの分析感度を試験し、検量線を用いて算出した。アッセイの分析感度は反応チューブ毎に5コピーまたはそれ未満まで達した。サンプル調製法および容量調整プロトコルから調整して、この分析感度は液体臨床標本ml当たり約200コピーに相当した。
【０１８６】
総数333の既に試験した臨床サンプル群について、プライマー／プローブ・セットの試験を行った。サンプル群は47験体の既知のBKV陽性（検出）サンプルおよび286検体の既知のBKV陰性（不検出）サンプルを含むものであった。オリゴヌクレオチド・プライマーおよびプローブは47検体全ての陽性サンプルを検出した。更に、284検体の陰性サンプルのうち34検体でBKV陽性の結果を得た。それらの“偽”陽性結果を確認するために28検体の増幅産物についてシーケンシングを行った。残りの6サンプルは、サンプル量が不十分でシーケンシングできなかった。全体として、臨床的に陰性のサンプルの少なくとも10%が新規のプライマー／プローブ法によってBKV陽性として検出され、シーケンシングによって真陽性と確認された。そのようなパーセンテージで真陽性が不検出となった原因は、変異部位上のプライマー／プローブのミスマッチもしくは不十分なPCR効率、またはその両方でありうる。
【０１８７】
実施例６  標的領域V（“BK5”）の同定
全ての新規に完成したBKV核酸配列および公開されているBKV核酸配列にわたる配列の比較により、BK4標的領域の選択を行った。BK4標的領域はGenBankアクセッション番号AY628224のヌクレオチド2810から2895を含む。BK5標的配列の核酸配列は以下である：
GGGGCTGAAGTATCTGAGACTTGGGAAGAGCATTGTGATTGGGATTCAGTGCTTG ATCCATGTCCAGAGTCTTCAGTTTCTGAATC (SEQ ID NO:05)
【０１８８】
核酸に基づく増幅のプライマー設計に使用する戦略は、全てのBKV配列および近縁関係にあるウイルスの配列の複数配列アラインメントの分析に基づく。この分析は全てのBKV変異体を含むように設計した。またこの分析を、近縁にはあるがBK配列ではない配列（例えばJCVの配列）は除外するようにも設計した。これらのアラインメントを入念に分析することによって、全てのBKV変異体の配列は網羅するが他の近縁の属由来の配列とは識別されるオリゴヌクレオチド配列の選択を行うことができ、それによってBKVの属特異的増幅並びに偏在的な検出および同定が可能となった。BK5標的領域のプライマーおよびプローブの配列は以下である：
【０１８９】
【表７】
2009502196.tif 000009
【０１９０】
BKVの特異的検出を確認するために、BKV標本からのPCR増幅産物のシーケンシングおよび分析を行った。増幅産物の配列をBKVの配列と十分アラインさせたが、増幅産物の配列はいずれも、JCVまたは他の属のいずれの配列とも一致しなかった。アッセイの結果を図２に示す。テンプレート濃度は反応当たり50から50,000コピーの範囲であり、アッセイは二重で実施した。BK2アッセイ:傾き＝-3.61、切片＝47.324，R2＝0.994。
【０１９１】
上記の結果および考察から、本発明が新規の重要なBKウイルスの検出並びに異なるBKウイルス遺伝子型または株間の識別のための方法を提供することは明らかである。As such、本発明の方法および系は種々の異なる適用、例えば研究、医療、治療、診断、軍事、およびその他の適用における利用法が見いだされる。従って、本発明は当該分野への重要な関わりを示す。本発明について、特定の態様に関連して記述したが、当業者に理解されるように、種々の変更を行ってもよく、本発明の真の意図および範囲から逸脱することなく、同等物を置換してもよい。更に、多くの修飾を施与して特定の状況、物質、目的の組成物、工程、工程段階（単数または複数）を本発明の目的、意図、および範囲に適合させてもよい。それらの修飾は全て、別添の特許請求の範囲内であることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【０１９２】
【図１】図１は32個のBKウイルス遺伝子型の核酸配列のアラインメントを示す。
【図２】図２は、BK1、BK2、BK3、BK4、およびBK5のそれぞれについてのTaqmanリアルタイムアッセイに関する検量線を示す。
【図１Ａ】
2009502196.tif 000010
【図１Ｂ】
2009502196.tif 000011
【図１Ｃ】
2009502196.tif 000012
【図１Ｄ】
2009502196.tif 000013
【図１Ｅ】
2009502196.tif 000014
【図１Ｆ】
2009502196.tif 000015
【図１Ｇ】
2009502196.tif 000016
【図１Ｈ】
2009502196.tif 000017
【図１Ｉ】
2009502196.tif 000018
【図１Ｊ】
2009502196.tif 000019
【図１Ｋ】
2009502196.tif 000020
【図１Ｌ】
2009502196.tif 000021
【図１Ｍ】
2009502196.tif 000022
【図１Ｎ】
2009502196.tif 000023
【図１Ｏ】
2009502196.tif 000024
【図１Ｐ】
2009502196.tif 000025
【図１Ｑ】
2009502196.tif 000026
【図１Ｒ】
2009502196.tif 000027
【図１Ｓ】
2009502196.tif 000028
【図１Ｔ】
2009502196.tif 000029
【図１Ｕ】
2009502196.tif 000030
【図１Ｖ】
2009502196.tif 000031
【図１Ｗ】
2009502196.tif 000032
【図１Ｘ】
2009502196.tif 000033
【図１Ｙ】
2009502196.tif 000034
【図１Ｚ】
2009502196.tif 000035
【図１ＡＡ】
2009502196.tif 000036
【図１ＢＢ】
2009502196.tif 000037
【図１ＣＣ】
2009502196.tif 000038
【図１ＤＤ】
2009502196.tif 000039
【図１ＥＥ】
2009502196.tif 000040
【図１ＦＦ】
2009502196.tif 000041
【図１ＧＧ】
2009502196.tif 000042
【図１ＨＨ】
2009502196.tif 000043
【図１ＩＩ】
2009502196.tif 000044
【図１ＪＪ】
2009502196.tif 000045
【図１ＫＫ】
2009502196.tif 000046
【図１ＬＬ】
2009502196.tif 000047
【図１ＭＭ】
2009502196.tif 000048
【図１ＮＮ】
2009502196.tif 000049
【図１ＯＯ】
2009502196.tif 000050
【図１ＰＰ】
2009502196.tif 000051
【図１ＱＱ】
2009502196.tif 000052
【図１ＲＲ】
2009502196.tif 000053
【図１ＳＳ】
2009502196.tif 000054
【図１ＴＴ】
2009502196.tif 000055
【図１ＵＵ】
2009502196.tif 000056
【図１ＶＶ】
2009502196.tif 000057
【図１ＷＷ】
2009502196.tif 000058
【図１ＸＸ】
2009502196.tif 000059
【図１ＹＹ】
2009502196.tif 000060
【図１ＺＺ】
2009502196.tif 000061
【図１ＡＡＡ】
2009502196.tif 000062
【図２】
2009502196.tif 000063
【配列表】
2009502196000001.xml