(57)【要約】  本発明は、特に癌などの増殖性疾患等の疾患の治療および増殖性疾患の治療に使用される薬剤の製造に使用される式（I)の化合物を提供する。本発明はまた、該化合物の製造方法および該化合物を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。2009523776.tif 000018
2009523776.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2009523776.tif 000016
［式中、Ｒ１は水素またはメチルであり、Ｒ２はメチルまたはエチルである］
の化合物またはその医薬的に許容される塩。
【請求項２】
Ｒ２がメチルである、請求項１に記載の化合物またはその医薬的に許容される塩。
【請求項３】
Ｒ２がエチルである、請求項１に記載の化合物またはその医薬的に許容される塩。
【請求項４】
Ｒ１が水素である、請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物またはその医薬的に許容される塩。
【請求項５】
Ｒ１がメチルである、請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物またはその医薬的に許容される塩。
【請求項６】
Ｎ−（２，３−ジフルオロフェニル）−２−［４−（｛７−メトキシ−５−［（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメトキシ］キナゾリン−４−イル｝アミノ）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］アセトアミド、およびＮ−（２，３−ジフルオロフェニル）−２−［４−（｛７−メトキシ−５−［（２Ｒ）−１−メチルピペリジン−２−イルメトキシ］キナゾリン−４−イル｝アミノ）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］アセトアミド、から選択される請求項１に記載の化合物またはその医薬的に許容される塩。
【請求項７】
Ｎ−（２，３−ジフルオロフェニル）−２−［４−（｛７−エトキシ−５−［（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメトキシ］キナゾリン−４−イル｝アミノ）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］アセトアミド、およびＮ−（２，３−ジフルオロフェニル）−２−［４−（｛７−エトキシ−５−［（２Ｒ）−１−メチルピペリジン−２−イルメトキシ］キナゾリン−４−イル｝アミノ）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］アセトアミド、から選択される請求項１に記載の化合物またはその医薬的に許容される塩。
【請求項８】
請求項１に記載の化合物またはその医薬的に許容される塩を医薬的に許容される希釈剤または担体と共に含んでなる医薬組成物。
【請求項９】
薬剤として使用するための、請求項１に記載の化合物またはその医薬的に許容される塩。
【請求項１０】
過剰増殖性疾患の治療用薬剤の製造における、請求項１に記載の化合物またはその医薬的に許容される塩の使用。
【請求項１１】
過剰増殖性疾患が結腸直腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、膀胱癌、腎癌、膵癌などの癌、白血病、またはリンパ腫である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
一種以上のオーロラキナーゼの阻害が有益な疾患を患うヒトを治療する方法であって、治療に有効な量の請求項１に記載の化合物またはその医薬的に許容される塩を治療が必要なヒトに投与する工程を含む、該治療方法。
【請求項１３】
癌、特に結腸直腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、膀胱癌、腎癌、または膵癌またはそれらが併発している癌、白血病、リンパ腫などの過剰増殖性疾患を患うヒトを治療する方法であって、治療に有効な量の請求項１に記載の化合物またはその医薬的に許容される塩を治療が必要なヒトに投与する工程を含む、該治療方法。
【請求項１４】
Ｒ１がメチルである請求項１に記載の化合物の製造方法であって、Ｒ１が水素である式（Ｉ）の化合物をギ酸中でホルムアルデヒドと５０℃ないし１００℃の高温で３０分ないし２時間反応させ、その後必要に応じて、
ｉ）保護基を除去し、および／または
ｉｉ）その医薬的に許容される塩を形成する、
ことを含む、該方法。
【請求項１５】
Ｒ１が水素である請求項１に記載の化合物の製造方法であって、式（ＩＩ）：
【化２】
2009523776.tif 000017
［式中、ＰＧはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）または９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）などの適当な保護基であり、Ｌはクロロなどの適当な脱離基である］の化合物を２−（４−アミノ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−Ｎ−（２，３−ジフルオロフェニル）アセトアミドと反応させ、その後必要に応じて、
ｉ）保護基を除去し、および／または
ｉｉ）その医薬的に許容される塩を形成する、
ことを含む、該方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、特に癌などの増殖性疾患等の疾患の治療および増殖性疾患の治療に使用される薬剤の製造に使用されるキナゾリン誘導体に関する。本発明はまた、キナゾリン誘導体の製造方法およびキナゾリン誘導体を有効成分として含有する医薬組成物に関する。
【０００２】
癌（およびその他の過剰増殖性疾患）は、細胞の無制御な増殖を特徴としている。正常な制御を喪失した細胞増殖は、多くの場合、細胞周期を介する成長を制御する細胞経路の遺伝子損傷により引き起こされる。
【０００３】
真核生物では、タンパク質リン酸化反応の順序付けられたカスケードが細胞周期を制御すると考えられている。現在、このカスケードにおいて重要な役割を担っているいくつかのプロテインキナーゼファミリーが同定されている。これらキナーゼの多くは、ヒト腫瘍においてその活性が正常組織に比較して上昇している。この上昇は、タンパク質の発現量の増加（例えば、遺伝子増幅の結果として）、またはコアクチベーターまたは阻害タンパク質の発現の変化により起こり得る。
【０００４】
これらの細胞周期の調節物質として、最初に同定され最も広く研究されているのがサイクリン依存性キナーゼ（またはＣＤＫｓ）である。さらに、近年、ＣＤＫファミリーと構造的に異なる、細胞周期の制御に重要な役割を果たすと共に腫瘍形成に重要であると思われる、プロテインキナーゼが同定された。該プロテインキナーゼは、ショウジョウバエオーロラおよび酵母Ｉｐｌ１タンパク質のヒトホモログを含んでいる。これらオーロラＡ，オーロラＢおよびオーロラＣ（それぞれ、オーロラ２、オーロラ１およびオーロラ３としても知られている）遺伝子の３つのヒトホモログは、Ｇ２および有糸分裂を介して発現のピークおよびキナーゼ活性を示す細胞周期制御セリン・スレオニンプロテインキナーゼをコードしている（Adamsら、Trends in Cell Biology, 11(2), 49-54, 2001に要約されている）。また、ヒトオーロラタンパク質が癌にかかわっているといういくつかの所見もある。
【０００５】
オーロラＡ遺伝子は、乳房および大腸の腫瘍などのヒトの腫瘍において増幅されることが多い染色体２０ｑ１３上に位置していることが知られている。ヒト原発性結腸直腸癌の５０％以上において、オーロラＡのＤＮＡが増幅され、ｍＲＮＡが過剰発現しているので、オーロラＡはこのアンプリコンの主たる標的遺伝子である可能性がある。これらの腫瘍では、オーロラＡタンパク質の量が隣接する正常組織に比較して非常に増加している。さらに、げっ歯類の線維芽細胞をヒトオーロラＡでトランスフェクションすると形質転換が起こり、軟寒天中で成長できるようになり、ヌードマウスに腫瘍を形成する（Bischoffら, The EMBO Journal, 17(11), 3052-3065, 1998)。他の研究（Zhouら, Nature Genetics, 20(2), 189-93, 1998）は、オーロラＡを人工的に過剰発現させると、癌の進行において起こることが知られている中心体数の増加および異数性の増加を引き起こすことを示している。
【０００６】
また、正常細胞に比較して、腫瘍細胞ではオーロラＢ（Adamsら, Chromsoma, 110(2), 65-74, 2001）およびオーロラＣ（Kimuraら, Journal of Biological Chemistry, 274(11), 7334-40, 1999）の発現が増加していることが報告されている。オーロラＢはまた、癌細胞において過剰発現し、オーロラＢの増加量は結腸直腸癌の病期の進行に相関することが示されている（Katayamaら, J Natl. Cancer Inst., 91, 1160, 1999）。さらに、他の報告では、オーロラＢの過剰発現がヒストンＨ３のセリン１０のリン酸化を高めて異数性を誘導すること、オーロラＢを過剰発現している細胞は転移を起こす、より攻撃的な腫瘍を形成することを示唆している（Ota,T.ら, Cancer Res., 62, 5168-5177, 2002）。オーロラＢは、少なくともサービビン（Survivin）、インセンプ（INCENP）およびボレアリン（Borealin）の３つの他のパッセンジャータンパク質と安定な複合体を作って存在する染色体パッセンジャータンパク質である（Carmena Mら, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 4, 842-854, 2003）。サービビンも癌では亢進されており、バキュロウィルスＩＡＰリピート（Baculovirus Inhibitor of apoptosis protein (IAP) Repeat：ＢＩＲ）ドメインを有しているので、アポトーシスおよび／または分裂期崩壊から腫瘍細胞を保護する役目を果たしていると思われる。
【０００７】
オーロラＣに関しては、多くの癌株において過剰発現されていることが知られているが、精巣ではその発現が制限されていると考えられる（Katayama Hら, Cancer and Metastasis Reviews, 22, 451-464, 2003）。
【０００８】
重要なことには、ヒト腫瘍細胞株をアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理してオーロラＡの発現と機能を阻害すると（WO97/22702およびWO99/37788）、細胞周期が停止され、これらの腫瘍細胞株の増殖が抑制されることが示されている。さらに、ｓｉＲＮＡ処理によりオーロラＢの発現のみを選択的に阻害した場合（Ditchfieldら, Journal of Cell Biology, 161(2), 267-280, 2003）のように、オーロラＡおよびオーロラＢの小分子阻害剤はヒト腫瘍株に対して増殖抑制効果を有することが示されている（Keenら, Poster #2455, American Association of Cancer research annual meeting, 2001）。これは、オーロラＡおよび／またはオーロラＢの機能を阻害することにより、ヒト腫瘍や他の過剰増殖性疾患の治療に有用であると思われる増殖抑制効果が得られることを示唆している。そのような疾患の治療方法として、１つまたは複数のオーロラキナーゼを阻害することは、細胞周期の上流のシグナル伝達経路（例えば、上皮細胞増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）やその他のレセプターなどの成長因子レセプターチロシンキナーゼにより活性化されるもの）を標的とする際に著しい利点を有していると考えられる。特定のシグナル伝達分子（例えば、ＥＧＦＲ）に向けられた方法は、それらのレセプターを発現する腫瘍細胞の一部にのみ有効であると考えられるが、細胞周期はさまざまなシグナル伝達のすべてにおいて最下流にあるので、１つまたは複数のオーロラキナーゼの阻害などの細胞周期に向けられた治療は、すべての増殖性腫瘍細胞に対して有効であると予想される。また、１つの要素を阻害しても他の要素により補償されることを意味する「クロストーク」が、シグナル伝達経路間では著しいとされている。
【０００９】
多数のキナゾリン誘導体を１つまたは複数のオーロラキナーゼの阻害に使用することが既に提案されている。WO04/94410には、ピラゾール環により置換されたキナゾリン誘導体が記載されている。これらの化合物は１つまたは複数のオーロラキナーゼを阻害し、ヒト腫瘍細胞株ＳＷ６２０の細胞の成長を阻害することができる。そのような化合物の例の一つが次の化合物である。
【００１０】
【化１】
2009523776.tif 000003
【００１１】
上記のような活性を有するさらに有効な化合物が求められており、そのような化合物が化学療法剤に耐性を有する細胞、特に排出トランスポーターを過剰発現する細胞に対しても有効であるならば、有利である。排出トランスポーターとしては、例えば、ｐ−糖タンパク質、多剤耐性関連タンパク質１、２、３、４および５、ＢＣＲＰ、ＢＳＥＰ、およびｓＰｇｐなどが挙げられる。
【００１２】
そのような化合物が、癌のような過剰増殖性疾患の治療により有効に使用できる有利な物理的特性を有していたならば、さらに有用である。
驚くべきことに、化合物の小規模選出群（大部分はWO04/94410に記載されている、オーロラキナーゼ酵素に対して優れた活性を有する化合物の選択されたサブグループである）が、細胞、特に耐性細胞に対して有効であることが見出された。該化合物はまた、さらに優れた物理的特性を有している可能性がある。
【００１３】
該化合物は特にオーロラＡキナーゼおよび／またはオーロラＢキナーゼの効果を阻害するため、癌のような過剰増殖性疾患の治療に有用である。特に、該化合物は充実性または血液性腫瘍の治療に使用され、特に結腸直腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、膀胱癌、腎癌、膵癌などの癌またはそれらが併発している癌、白血病、またはリンパ腫の治療に使用することができる。
【００１４】
したがって、本発明の１つの側面は、式（Ｉ）：
【００１５】
【化２】
2009523776.tif 000004
【００１６】
［式中、Ｒ１は水素またはメチルであり、Ｒ２はメチルまたはエチルである］
の化合物またはその塩またはプロドラッグを提供する。
他の側面として、式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容される塩が提供される。
【００１７】
本発明の化合物はコンピューターソフトウェア（ACD/Name version 8.0）を用いて命名した。
本発明において、本発明の化合物は互変異性現象を示すことがあるが、当然のことながら、本明細書内に示される式は可能な互変異性型の１つのみを表している。本発明は、オーロラキナーゼ阻害活性、特にオーロラＡおよび／またはオーロラＢキナーゼ阻害活性を有するあらゆる互変異性型を包含するものであり、当然のことながら、式に示される１つの互変異性型のみに限定されるものではない。
【００１８】
本発明の特定の化合物およびその塩は、非溶媒和物の形及び溶媒和の形、例えば水和物のような形、で存在できることが理解されよう。さらに、本発明はオーロラキナーゼ阻害活性、特にオーロラＡおよび／またはオーロラＢキナーゼ阻害活性を有するすべての溶媒和の形を包含する。
【００１９】
本発明は、本明細書において定義される式（Ｉ）の化合物およびその塩に関する。医薬組成物に使用される塩は医薬的に許容される塩であるが、他の塩も式（Ｉ）の化合物およびその医薬的に許容される塩の製造に有用である可能性がある。本発明の医薬的に許容される塩としては、例えば、酸付加塩の形成に十分な塩基性を有する、本明細書において定義される式（Ｉ）の化合物の酸付加塩が挙げられる。そのような酸付加塩としては、これらに限定されないが、フマル酸塩、メタンスルホン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、およびリン酸および硫酸により形成される塩が挙げられる。また、酸性が高い式（Ｉ）の化合物の場合には、塩は塩基性塩であり、例えば、これらに限定されないが、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属塩、トリエチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、モルホリン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン、ジベンジルアミンまたはリジンなどのアミノ酸、などの有機アミン塩を挙げることができる。
【００２０】
式（Ｉ）の化合物は、ヒトまたは動物の体内で式（Ｉ）の化合物に変化するプロドラッグの形で投与されてもよい。さまざまな形のプロドラッグが当技術分野で周知であり、プロドラッグ誘導体については、例えば、以下を参照されたい：
a) Design of Prodrugs, H. Bundgaard編, (Elsevier, 1985)およびMethods in Enzymology, Vol. 42, pp. 309-396, K. Widderら編 (Academic Press, 1985)；
b) A Textbook of Drug Design and Development, Krogsgaard-Larsen, H. Bundgaard編, Chapter 5 “Design and Application of Prodrugs”, H. Bundgaard, pp. 113-191 (1991)；
c) H. Bundgaard, Advanced Drug Delivery Reviews, 8, 1-38 (1992)；
d) H. Bundgaardら, Journal of Pharmaceutical Sciences, 77, 285 (1988)；および
e) N. Kakeyaら, Chem. Pharm. Bull., 32, 692 (1984)。
【００２１】
本発明の１つの側面において、Ｒ２はメチルである。Ｒ２がメチルの場合、本発明は式（ＩＡ）： 
【００２２】
【化３】
2009523776.tif 000005
【００２３】
［式中、Ｒ１は水素またはメチルである］
の化合物またはその塩またはプロドラッグを提供する。
Ｒ２がメチルでＲ１が水素である式（Ｉ）の化合物は、Ｎ−（２，３−ジフルオロフェニル）−２−［４−（｛７−メトキシ−５−［（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメトキシ］キナゾリン−４−イル｝アミノ）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］アセトアミドである。Ｒ２がメチルでＲ１がメチルである式（Ｉ）の化合物は、Ｎ−（２，３−ジフルオロフェニル）−２−［４−（｛７−メトキシ−５−［（２Ｒ）−１−メチルピペリジン−２−イルメトキシ］キナゾリン−４−イル｝アミノ）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］アセトアミドである。
【００２４】
本発明の１つの側面において、Ｒ２はエチルである。Ｒ２がエチルの場合、本発明は式（ＩＢ）： 
【００２５】
【化４】
2009523776.tif 000006
【００２６】
［式中、Ｒ１は水素またはメチルである］
の化合物またはその塩またはプロドラッグを提供する。
Ｒ２がエチルでＲ１が水素である式（Ｉ）の化合物は、Ｎ−（２，３−ジフルオロフェニル）−２−［４−（｛７−エトキシ−５−［（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメトキシ］キナゾリン−４−イル｝アミノ）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］アセトアミドである。Ｒ２がエチルでＲ１がメチルである式（Ｉ）の化合物は、Ｎ−（２，３−ジフルオロフェニル）−２−［４−（｛７−エトキシ−５−［（２Ｒ）−１−メチルピペリジン−２−イルメトキシ］キナゾリン−４−イル｝アミノ）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］アセトアミドである。
【００２７】
さらに、本発明は、Ｒ１がメチルである式（Ｉ）の化合物の製造方法を提供する。該方法は、Ｒ１が水素である式（Ｉ）の化合物をギ酸中でホルムアルデヒドと５０℃ないし１００℃の高温で３０分ないし２時間反応させ、その後必要に応じて、
ｉ）保護基を除去し、および／または
ｉｉ）その塩またはプロドラッグを形成する、
ことを含む。
【００２８】
Ｒ１が水素である式（Ｉ）の化合物の製造方法は、式（ＩＩ）：
【００２９】
【化５】
2009523776.tif 000007
【００３０】
［式中、ＰＧはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）または９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）などの適当な保護基であり、Ｌはクロロなどの適当な脱離基である］
の化合物を、２−（４−アミノ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−Ｎ−（２，３−ジフルオロフェニル）アセトアミドと反応させ、その後必要に応じて、
ｉ）保護基を除去し、および／または
ｉｉ）その塩またはプロドラッグを形成する、
ことを含む。
【００３１】
この反応は、文献に記載されている条件範囲において行われてよく、例えば、式（ＩＩ）の化合物を、イソプロパノールやジメチルアセトアミドなどの溶媒中で塩酸などの酸触媒の存在または非存在下に２０ないし１００℃で３０分ないし２４時間、２−（４−アミノ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−Ｎ−（２，３−ジフルオロフェニル）アセトアミドと反応させる。
【００３２】
さらに、本発明は、式（ＩＩ）の化合物の製造方法を提供する。該方法は、式（ＩＩＩ）：
【００３３】
【化６】
2009523776.tif 000008
【００３４】
［式中、ＰＧはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）または９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）などの適当な保護基である］
の化合物を、１，２−ジクロロエタンやアセトニトリルなどの適当な溶媒中でジイソプロピルエチルアミンなどの適当な塩基の存在下に０ないし８０℃で２ないし２４時間、オキシ塩化リンなどの適当な塩素化剤と反応させることを含む。
【００３５】
この方法は、ＰＧがｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）または９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）などの適当な保護基である式（ＩＩＩ）の化合物を製造する工程をさらに含んでいてもよい。該工程は、式（ＩＶ）： 
【００３６】
【化７】
2009523776.tif 000009
【００３７】
の化合物と、ＰＧ１が水素であるか、またはベンジルなどの適当な保護基である式（Ｖ）： 
【００３８】
【化８】
2009523776.tif 000010
【００３９】
の化合物、との反応、続いて保護基の変換を含んでなる。
この反応は、文献に記載されている条件範囲において行われてよく、例えば、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドまたは１−メチル−２−ピロリジノンなどの溶媒中で、水素化ナトリウムやカリウムｔｅｒｔ−ブトキシドなどの塩基を用いて、２０ないし１００℃で２時間ないし２４時間、行われてよい。
【００４０】
ＰＧ１が水素またはベンジルなどの適当な保護基である式（Ｖ）の化合物は、当技術分野で公知のものであっても、当技術分野で公知の他の化合物から文献から明らかである従来の方法により得られるものであってもよい。
【００４１】
式（ＩＶ）の化合物は、式（ＶＩ）：
【００４２】
【化９】
2009523776.tif 000011
【００４３】
の化合物と触媒量の硫酸などの鉱酸の存在下、例えば、１００℃で２ないし２４時間、ギ酸と反応させることにより製造することができる。
式（ＶＩ）の化合物は、当技術分野で公知であるか、または、当技術分野で公知の他の化合物から文献から明らかである従来の方法により得ることができ、または、実施例に記載のように製造してもよい。
【００４４】
さらに、本発明は、２−（４−アミノ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−Ｎ−（２，３−ジフルオロフェニル）アセトアミドの製造方法を適用する。該方法は、Ｎ−（２，３−ジフルオロフェニル）−２−｛４−［（ジフェニルメチレン）アミノ］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル｝アセトアミドを酢酸エチルなどの適当な溶媒中で塩酸などの濃酸性水溶液の存在下に加水分解することを含む。
【００４５】
Ｎ−（２，３−ジフルオロフェニル）−２−｛４−［（ジフェニルメチレン）アミノ］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル｝アセトアミドは、式（ＶＩＩ）：
【００４６】
【化１０】
2009523776.tif 000012
【００４７】
（式中、Ｘはブロモ、ヨードなどのハロゲンである）の化合物とベンゾフェノンイミンとの反応を含む方法により製造することができる。この反応は、文献に記載の条件範囲、例えば、１，４−ジオキサンなどの溶媒中でナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、炭酸セシウム、炭酸カリウム、リン酸カリウムなどの適当な塩基性触媒、（９，９−ジメチル−９Ｈ−キサンテン−４，５−ジイル）ビス（ジフェニルホスフィン）、１，１’−ビナフタレン−２，２’−ジイルビス（ジフェニルホスフィン）、または１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセンなどの適当なリガンド、およびトリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）または酢酸パラジウムなどの適当な触媒の存在下に、式（ＶＩＩ）の化合物をベンゾフェノンイミンと共に、例えば、９０℃で３０分ないし６時間加熱して行ってもよい。
【００４８】
この方法は、式（ＶＩＩ）の化合物の製造工程をさらに含んでもよい。該工程は、式（ＶＩＩＩ）：
【００４９】
【化１１】
2009523776.tif 000013
【００５０】
（式中、Ｘはブロモ、ヨードなどのハロゲンである）
の化合物と式（ＩＸ）：
【００５１】
【化１２】
2009523776.tif 000014
【００５２】
（式中、Ｌはクロロまたはブロモなどの脱離基である）
の化合物との反応を含む。この反応は、文献に記載される条件範囲、例えば、炭酸カリウムなどの塩基の存在下にジメチルアセトアミドのような溶媒中で、例えば、２０℃で１４ないし４８時間、式（ＶＩＩＩ）の化合物を式（ＩＸ）の化合物と反応させることにより行なうことができる。
【００５３】
式（ＶＩＩＩ）および（ＩＸ）の化合物は、当技術分野で公知であるか、または、当技術分野で公知の他の化合物から文献から明らかである従来の方法により得ることができる。
【００５４】
また、２−（４−アミノ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−Ｎ−（２，３−ジフルオロフェニル）アセトアミドは、Ｎ−（２，３−ジフルオロフェニル）−２−（４−ニトロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）アセトアミドの還元により製造することができる。この反応は、文献に記載される条件範囲、例えば、気圧１ないし５バールの水素雰囲気下、エタノールおよび／または酢酸エチルなどの適当な溶媒中、酸化白金やパラジウム炭素などの適当な触媒の存在下に、適当な温度、例えば、２０℃で０．５ないし５時間、Ｎ−（２，３−ジフルオロフェニル）−２−（４−ニトロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）アセトアミドを還元することにより行なうことができる。
【００５５】
Ｎ−（２，３−ジフルオロフェニル）−２−（４−ニトロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）アセトアミドは、（４−ニトロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）酢酸と２，３−ジフルオロアニリンとの反応により製造することができる。この反応は、文献に記載される条件範囲、例えば、ジクロロメタンなどの溶媒中、０ないし２０℃で２ないし３時間、（４−ニトロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）酢酸と２，３−ジフルオロアニリンをオキシ塩化リンおよびピリジンでカップリングさせることにより行なうことができる。
【００５６】
（４−ニトロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）酢酸と２，３−ジフルオロアニリンは当技術分野において公知である。
当然のこととして、本発明の化合物の種々の環置換基のあるものは、本発明の製造方法に関する側面に含まれるように、前述の工程の前あるいは直後に、芳香族置換基の標準的な反応により導入されてもよく、公知の官能基修飾により生成することができる。そのような反応および修飾としては、例えば、芳香族置換反応による置換基の導入、置換基の還元、置換基のアルキル化、および置換基の酸化が挙げられる。そのような方法の試薬および反応条件は、化学技術分野において周知である。芳香族置換反応の具体的な例としては、濃硝酸を使用するニトロ基の導入、フリーデル・クラフツ条件下に、例えば、ハロゲン化アシルとルイス酸（例えば、三塩化アルミニウム）を使用するアシル基の導入、フリーデル・クラフツ条件下にハロゲン化アルキルとルイス酸（例えば、三塩化アルミニウム）を使用するアルキル基の導入、およびハロゲン基の導入が挙げられる。修飾の具体的な例としては、ニッケル触媒による接触水素化や加熱しながら塩酸の存在下に鉄で処理するなどのニトロ基のアミノ基へ還元、アルキルチオのアルキルスルフィニルやアルキルスルホニルへの酸化が挙げられる。
【００５７】
当然のこととして、本明細書に記載されている反応の中には、化合物の反応性の高い基を保護することが必要または望ましいものがある。保護が必要または望ましい例と、それらの適切な保護の方法は当業者に周知である。従来の保護基を標準的な方法にしたがって使用することができる（例えば、T.W. Green, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, 1991）。したがって、反応物質がアミノ、カルボニルまたはヒドロキシなどの基を含んでいる場合には、本明細書に記載された反応の中には該基を保護することが望ましいものもある。
【００５８】
アミノ基またはアルキルアミノ基の適当な保護基としては、例えば、アシル基、例えば、アセチルなどのアルカノイル基、メトキシカルボニル、エトキシカルボニルまたはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基などのアルコキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニルなどのアリールメトキシカルボニル基、またはベンゾイルなどのアロイル基などが挙げられる。上記の保護基を脱保護するための条件は、保護基によって必然的に変化する。例えば、アルカノイル基、アルコキシカルボニル基またはアロイル基などのアシル基は、例えば、水酸化リチウムまたは水酸化ナトリウムなどのアルカリ金属水酸化物などの適当な塩基による加水分解により除去することができる。あるいは、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基のようなアシル基は、例えば、塩酸、硫酸、またはリン酸またはトリフルオロ酢酸などの適当な酸で処理して除去してもよい。ベンジルオキシカルボニル基などのアリールメトキシカルボニル基は、例えば、パラジウム炭素などの触媒により水素化して、またはトリス（トリフルオロ酢酸）ホウ素などのルイス酸により処理して除去してもよい。第１級アミノ基の適当な他の保護基としては、例えば、フタロイル基が挙げられ、その基は、例えば、ジメチルアミノプロピルアミンなどのアルキルアミンまたはヒドラジンで処理することにより除去することができる。
【００５９】
ヒドロキシ基の適当な保護基としては、例えばアシル基、例えば、アセチルなどのアルカノイル基、ベンゾイルなどのアロイル基、またはベンジルなどのアリールメチル基などが挙げられる。上記の保護基を脱保護するための条件は、保護基によって必然的に変化する。例えば、アルカノイル基やアロイル基などのアシル基は、例えば、水酸化リチウムまたは水酸化ナトリウムなどのアルカリ金属水酸化物などの適当な塩基による加水分解により除去することができる。あるいは、ベンジル基などのアリールメチル基は、例えば、パラジウム炭素などの触媒による水素化により除去することができる。
【００６０】
カルボキシ基の適当な保護基としては、例えば、水酸化ナトリウムなどの塩基による加水分解により除去することができるメチルまたはエチル基、またはトリフルオロ酢酸などの有機酸などの酸で処理することにより除去することができるｔｅｒｔ−ブチル基、またはパラジウム炭素などの触媒による水素化により除去することができるベンジル基などのエステル化基が挙げられる。
【００６１】
保護基は、化学技術分野において周知である従来の方法を用いて、合成法のどの段階で除去されてもよい。
本発明のさらに別の側面は、本明細書において定義される式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容される塩またはプロドラッグと共に医薬的に許容される希釈剤または担体を含有する医薬組成物を提供する。
【００６２】
本発明の組成物は、経口使用（例えば、錠剤、トローチ剤、硬または軟カプセル、水性または油性懸濁液、乳液、懸濁可能な粉末または顆粒、シロップまたはエリキシル剤）、局所的使用（例えば、クリーム、軟膏、ジェル、水性または油性溶液または懸濁液）、吸入投与（例えば、微粉または液体エアロゾル）、注入投与（例えば、微粉）、または非経口投与（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、または筋肉内投薬用の滅菌水性または油性溶液、または直腸投薬用の坐薬）に適切な剤型であってよい。
【００６３】
本発明の組成物は、本技術分野で周知の医薬的賦形剤を使用する従来の方法により調製してよい。したがって、経口使用用の組成物は、例えば、着色剤、甘味料、香味剤および／または保存剤の１つ以上を含有してもよい。
【００６４】
錠剤に使用する医薬的に許容される適当な賦形剤としては、例えば、ラクトース、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、炭酸カルシウムなどの不活性希釈剤、コーンスターチやアルゲン酸などの造粒剤や崩壊剤、デンプンなどの結合剤、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルクなどの潤滑剤、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルまたはプロピルなどの保存剤、アスコルビン酸などの抗酸化剤などが挙げられる。錠剤は、コーティングされなくてもあるいは胃腸管内での崩壊とその後の有効成分の吸収性を変更する、または安定性および／または外観を改良するためにコーティングされてもよく、どちらの場合も、当技術分野において周知のコーティング剤および方法を使用してよい。
【００６５】
経口使用の組成物は、有効成分が炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、カオリンなどの不活性固体希釈剤と混合されている硬ゼラチンカプセルの形であってもよく、または有効成分が水またはピーナッツ油、流動パラフィン、大豆油、ココナッツ油、好ましくはオリーブ油などの油、または他の許容される賦形剤と混合されている軟ゼラチンカプセルの形であってもよい。
【００６６】
水性懸濁液は、通常、微粉状の有効成分と共に、１つあるいは複数の懸濁剤（カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニル−ピロリドン、トラガカント・ガム、アカシアガムなど）、分散剤または湿潤剤（レシチン、アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合物（例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン）、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、酸化エチレンの脂肪酸とポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートなどのヘキシトールとから得られる部分エステルとの縮合物、酸化エチレンの長鎖脂肪族アルコールとの縮合物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、エチレンオキシドと脂肪酸とポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートなどのヘキシトールとから得られる部分エステルとの縮合物、またはエチレンオキシドと脂肪酸とポリエチレンソルビタンモノオレエートなどのヘキシトール無水物とから得られる部分エステルとの縮合物）を含有する。水性懸濁液はさらに、１つまたは複数の防腐剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルまたはプロピル）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）、着色剤、香味剤および／または甘味料（例えば、スクロース、サッカリン、またはアスパルテーム）を含有してもよい。
【００６７】
油性懸濁液は、有効成分を植物油（例えば、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油、またはココナッツ油）または鉱油（例えば、流動パラフィン）に懸濁させて製剤することができる。油性懸濁液は、蜜ロウ、固形パラフィン、セチルアルコールなどの増粘剤を含有してもよい。上述のような甘味料および香味剤を加えて、口当たりのよい製剤としてもよい。これらの組成物は、アスコルビン酸のような抗酸化剤を添加して保存してもよい。
【００６８】
水の添加による水性懸濁液または溶液の調製に適した分散性のまたは凍結乾燥した粉末および顆粒は、通常、有効成分と共に分散剤または湿潤剤、懸濁剤および１つあるいは複数の保存剤を含有する。好ましい分散剤または湿潤剤および懸濁剤としては、上述したものを挙げることができる。その他の賦形剤、例えば、甘味料、香味剤、着色剤などを共存させてもよい。
【００６９】
本発明の医薬組成物は、水中油型の乳液の形であってもよい。油相は、オリーブ油、ラッカセイ油などの植物油、流動パラフィンなどの鉱油、あるいはそれらの混合物であってよい。好ましい乳化剤としては、例えば、アカシアゴムやトラガカント・ガムなどの天然ゴム、大豆、レシチンなどの天然リン脂質、脂肪酸とヘキシトール無水物（例えば、ソルビタンモノオレエート）とから得られるエステルまたは部分エステルおよび該部分エステルのエチレンオキシドとの縮合物（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートなど）が挙げられる。乳液はさらに、甘味料、香味剤および保存剤を含有してもよい。
【００７０】
シロップおよびエリキシル剤はグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、アスパルテーム、スクロースなどの甘味料を用いて製剤してよく、さらに粘滑剤、保存剤、香味剤および／または着色剤を含有してもよい。
【００７１】
医薬組成物は、無菌注入用水性または油性懸濁液、溶液、乳液、あるいは他のシステムであってもよく、上述の分散剤または湿潤剤および懸濁剤の適切な１つまたは複数を使用して公知方法にしたがって製剤することができる。無菌の注入用製剤は、無毒な非経口的に許容される、例えば、ポリエチレングリコールなどの希釈剤または溶媒の溶液または懸濁液の無菌製剤であってもよい。
【００７２】
坐薬製剤は、有効成分を、常温では固体であるが直腸温度では液体であるため直腸で溶けて薬を放出する適当な非刺激性賦形剤と混合して調製することができる。好ましい賦形剤としては、例えば、ココアバターやポリエチレングリコールが挙げられる。
【００７３】
クリーム、軟膏、ゲル、および水性または油性溶液または懸濁液などの局所製剤は、通常、有効成分を従来の局所適用可能な賦形剤または希釈剤と共に本技術分野で周知の方法により製剤することにより得ることができる。
【００７４】
注入による投与用の組成物は、例えば、３０μｍ以下、好ましくは５μｍ以下、より好ましくは５μｍから１μｍの平均粒径を有する粒子を含有する微粉の形であってよく、該微粉自体は、有効成分のみであっても、ラクトースなどの１つまたは複数の生理的に許容される担体で希釈された有効成分であってもよい。注入用の微粉はその後、公知薬剤であるクロモグリク酸ナトリウムの吸入に使用されているようなターボ吸入器の使用に便利なように、例えば、１から５０ｍｇの有効成分を含有するようにカプセル中に収められる。
【００７５】
吸入による投与用の組成物は、微粉を含有するエアゾールまたは液滴として有効成分を分注するように、従来の加圧エアゾールの形であってもよい。揮発性フッ素化炭化水素や炭化水素などの従来のエアゾール用噴射剤を使用してよく、エアゾール器は一定量の有効成分を分注するように設計されている。
【００７６】
製剤に関するさらに詳しい情報については、Comprehensive Medicinal Chemistry, Volume 5 (Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board), Pergamon Press, 1990の25.2章を参照されたい。
【００７７】
したがって、本発明の他の側面は、治療のために使用される式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容される塩またはプロドラッグを提供する。さらに、薬剤として使用するための、式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容される塩またはプロドラッグを提供する。本発明のさらに別の側面は、癌、特に結腸直腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、膀胱癌、腎癌、または膵癌またはそれらが併発している癌、白血病、リンパ腫などの過剰増殖性疾患を治療するための薬剤として使用するための、式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容される塩またはプロドラッグを提供する。
【００７８】
さらに、式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容される塩またはプロドラッグは、ヒトなどの温血動物の治療を伴う処置のために提供される。本発明の他の側面は、癌などの過剰増殖性疾患、特に結腸直腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、膀胱癌、腎癌、または膵癌またはそれらが併発している癌、白血病、リンパ腫などの治療に使用される式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容される塩またはプロドラッグを提供する。
【００７９】
本発明の他の側面では、１つまたは複数のオーロラキナーゼの阻害が有益である疾患の治療用薬剤の製造における、式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容される塩またはプロドラッグの使用を提供する。特に、オーロラＡキナーゼおよび／またはオーロラＢキナーゼの阻害が有益であると考えられる。好ましくは、オーロラＢキナーゼの阻害が有益である。本発明の他の側面では、癌、特に結腸直腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、膀胱癌、腎癌、または膵癌またはそれらが併発している癌、白血病、リンパ腫などの過剰増殖性疾患の治療用薬剤の製造における、式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容される塩またはプロドラッグの使用を提供する。
【００８０】
さらに他の側面では、１つまたは複数のオーロラキナーゼの阻害が有益である疾患を患っているヒトの治療法において使用される式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容される塩、エステルまたはプロドラッグを提供する。該治療方法は、治療に有効な量の式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容される塩またはプロドラッグを治療が必要なヒトに投与する工程を含んでなる。特に、オーロラＡキナーゼおよび／またはオーロラＢキナーゼの阻害が有益であると考えられる。好ましくは、オーロラＢキナーゼの阻害が有益である。さらに、癌、特に結腸直腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、膀胱癌、腎癌、または膵癌またはそれらが併発している癌、白血病、リンパ腫などの過剰増殖性疾患を患っているヒトの治療法において使用される式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容される塩またはプロドラッグを提供する。該治療方法は、治療に有効な量の式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容される塩またはプロドラッグを治療が必要なヒトに投与する工程を含んでなる。上述のヒトの治療法における式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容される塩またはプロドラッグの使用もまた、本発明の側面である。
【００８１】
上記の治療的使用では、投与量は使用される化合物、投与方法、治療の目的、治療すべき障害および動物または患者の年齢、性別により異なる。したがって、投与量は周知の薬物療法の原則に従って算出される。
【００８２】
治療または予防の目的で式（Ｉ）の化合物を使用する場合、その１日の投与量は通常、例えば、０．０５ないし５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲（特に、体重１ｋｇあたり０．０５ないし１５ｍｇ）であり、必要に応じて分割して投与される。一般に、非経口経路での投与の場合には、その投与量は少なくなる。したがって、例えば、静脈内投与の場合には、その投与量は通常、例えば、０．０５ないし２５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲（特に、体重１ｋｇあたり０．０５ないし１５ｍｇ）である。同様に、吸入による投与の場合には、その投与量は、例えば、０．０５ないし２５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲（特に、体重１ｋｇあたり０．０５ないし１５ｍｇ）である。
【００８３】
本明細書で定義される抗癌治療は、単独療法として行われても、あるいは本発明の化合物投与に加えて従来の外科手術、放射線治療あるいは化学療法を併せて行ってもよい。化学療法は以下に示す抗腫瘍薬のカテゴリーの１つまたは複数を含んでよい。
（ｉ）癌内科治療において使用されている、他の抗増殖／抗腫瘍薬およびそれらの組み合わせ、例えば、アルキル化剤（例えば、シス−プラチン、オキサリプラチン、カロボプラチン、シクロフォスファミド、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、クロラムブチル、ブスルファン、テモゾラミド、およびニトロソウレア類）、代謝拮抗剤（例えば、ゲムシタビン、５−フルオロウラシルやテガフルのようなフルオロピリミジン類などの抗葉酸剤、ラルチトレクスド、メトトレキサート、シトシンアラビノシド、ヒドロキシウレア）、抗腫瘍性抗生物質（例えば、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシン−Ｃ、ダクチノマイシン、ミトラマイシンのようなアントラサイクリン類）、抗分裂剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビンのようなビンカアルカロイド類、タキソール、タキソテールのようなタキソイド類、およびポロキナーゼ阻害剤）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシド、テニポシドのようなエピポドフィロトキシン類、アムサクリン、トポテカン、およびカンプトテシン）；
（ｉｉ）細胞増殖抑制剤、例えば、抗エストロゲン剤（例えば、タモキシフェン、フルベストラント、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、ヨードキシフェン）、抗アンドロゲン剤（例えば、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、酢酸シプロテロン）、ＬＨＲＨ拮抗剤またはＬＨＲＨ作動剤（例えば、ゴセレリン、ロイプロレリン、ブセレリン）、プロゲストゲン（例えば、酢酸メゲストロール）、アロマターゼ阻害剤（例えば、アナストロゾール、レトロゾール、ボラゾール、エキセメスタン）、フィナステリドなどの５α−還元酵素の阻害剤；
（ｉｉｉ）抗浸潤剤（例えば、４−（６−クロロ−２，３−メチレンジオキシアニリノ）−７−[２−（４−メチルピペラジン−１−イル）エトキシ]−５−テトラヒドロピラン−４−イルオキシキナゾリン（ＡＺＤ０５３０：国際特許出願WO01/94341）およびＮ−（２−クロロ−６−メチルフェニル）−２−｛６−[４−（２−ヒドロキシエチル)ピペラジン−１−イル]−２−メチルピリミジン−４−イルアミノ}チアゾール−５−カルボキサミド（ダサチニブ、ＢＭＳ−３５４８２５：Ｊ. Med. Chem., 47, 6658-6661, 2004）のようなｃ−Ｓｒｃキナーゼファミリー阻害剤、マリマスタットのようなメタロプロテナーゼ阻害剤、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーターレセプター機能阻害剤、抗ヘパラナーゼ抗体）；
（ｉｖ）成長因子機能阻害剤：例えば、成長因子抗体および成長因子レセプター抗体などの阻害剤（例えば、抗−ｅｒｂＢ２抗体トラスツズマブ（ハーセプチンＴＭ）、抗−ＥＧＦＲ抗体パニツムマブ、抗−ｅｒｂＢ１抗体セツキシマブ（エルビタックス、Ｃ２２５）、およびSternら, Critical reviews in oncology/haematology, Vol. 54, pp. 11-29, 2005に記載の成長因子抗体または成長因子レセプター抗体）、チロシンキナーゼ阻害剤などの阻害剤、上皮細胞増殖因子ファミリーの阻害剤（例えば、Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−メトキシ−６−（３−モルホリノプロポキシ）キナゾリン−４−アミン（ゲフィチニブ、ＺＤ１８３９）、Ｎ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−４−アミン（エルロチニブ、ＯＳＩ−７７４）、６−アクリルアミド−Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−（３−モルホリノプロポキシ)キナゾリン−４−アミン（ＣＩ１０３３）などのＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤、ラパチニブなどのｅｒｂＢ２チロシンキナーゼ阻害剤、肝細胞増殖因子ファミリーの阻害剤、イマチニブなどの血小板由来成長因子ファミリーの阻害剤、セリン・スレオニンキナーゼの阻害剤（例えば、ファルネシル転移酵素阻害剤などのＲａｓ／Ｒａｆシグナル伝達阻害剤、例えば、ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６））、ＭＥＫおよび／またはＡＫＴキナーゼを介する細胞シグナル伝達の阻害剤、肝細胞増殖因子ファミリーの阻害剤、ｃ−ｋｉｔ阻害剤、ａｂｌキナーゼ阻害剤、ＩＧＦレセプター（インスリン様成長因子）キナーゼ阻害剤、オーロラキナゼ阻害剤（例えば、ＡＺＤ１１５２、ＰＨ７３９３５８、ＶＸ−６８０、ＭＬＮ８０５４、Ｒ７６３、ＭＰ２３５、ＭＰ５２９、ＶＸ−５２８、およびＡＸ３９４５９)、ＣＤＫ２および／またはＣＤＫ４阻害剤などのシクリン依存キナーゼ阻害剤；
（ｖ）血管内皮成長因子の効果を阻害するような血管新生阻害剤（例えば、抗血管内皮細胞成長因子抗体、ベバシズマブ（アバスチンＴＭ）、４−（４−ブロモ−２−フルオロアニリノ）−６−メトキシ−７−（１−メチルピペリジン−４−イルメトキシ)キナゾリン（ＺＤ６４７４：WO 01/32651の実施例２）、４−（４−フルオロ−２−メチルインドール−５−イルオキシ）−６−メトキシ−７−（３−ピロリジン−１−イルプロポキシ)キナゾリン（ＡＺＤ２１７１：WO 00/47212の実施例２４０）などのＶＥＧＦレセプターチロシンキナーゼ阻害剤、バタラニブ（ＰＴＫ７８７：WO98/35985）、ＳＵ１１２４８（スニチニブ：WO01/60814)、国際特許出願WO97/22596、WO97/30035、WO97/32856およびWO98/13354に記載されている化合物、および他の機構により機能する化合物（例えば、リノミド、インテグリンαｖβ３機能の阻害剤、およびアンギオスタチン））；
（ｖｉ）コンブレタスタチンＡ４などの血管損傷剤および国際特許出願WO99/02166、WO00/40529、WO00/41669、WO01/92224、WO02/04434およびWO02/08213に記載されている化合物；
（ｖｉｉ）アンチセンス療法、例えば、上述の目的物に対するＩＳＩＳ２５０３、抗−ｒａｓアンチセンスなど；
（ｖｉｉｉ）遺伝子療法アプローチ、例えば、異常ｐ５３または異常ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２のような異常遺伝子を置換するアプローチ、シトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼまたは細菌性ニトロ還元酵素を使用するようなＧＤＥＰＴ（gene-directed enzyme pro-drug therapy:遺伝子標的酵素プロドラッグ療法）アプローチ、および多剤耐性遺伝子療法などの化学療法または放射線療法に対する患者の耐容性を増大するアプローチなど；および
（ｉｘ）免疫療法アプローチ、例えば、インターロイキン２、インターロイキン４、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子のようなサイトカインのトランスフェクションのような、患者の腫瘍細胞の免疫原性を増大する体外および体内アプローチ、Ｔ細胞アネルギーを低減するアプローチ、サイトカインによりトランスフェクトされた樹状細胞のようなトランスフェクト免疫細胞を使用するアプローチ、サイトカインによりトランスフェクトされた腫瘍細胞系を用いるアプローチ、および抗イディオタイプ抗体を用いるアプローチなど。
【００８４】
本発明の化合物またはその医薬的に許容される塩またはプロドラッグは、１つまたは複数の細胞周期阻害剤、特にｂｕｂ１、ｂｕｂＲ１またはＣＤＫを阻害する細胞周期阻害剤と組み合わせて使用してもよい。
【００８５】
このような併用治療は、個々の治療成分を、同時に、連続して、または別々に投与することによって達成してよい。そのような組合製品は、本明細書中で前述した用量範囲内の本発明の化合物と、認可されている用量範囲内のその他の医薬的に活性な薬剤とを使用する。
【００８６】
治療薬としての使用に加えて、式（Ｉ）の化合物およびその医薬的に許容される塩またはプロドラッグは、新しい治療薬の探索方法の一部として、ネコ、イヌ、ウサギ、サル、ラット、マウスなどの実験動物における細胞周期活性の阻害効果を評価する、生体外および生体内試験システムの開発および標準化の薬理学的道具としても有用である。
【００８７】
上記の他の医薬組成物、工程、方法、使用および薬剤製造の特徴は、本明細書中に記載の本発明の化合物の代替の好ましい態様にも適用される。
本発明の化合物はオーロラキナーゼのセリン・スレオニンキナーゼ活性を阻害し、特に、オーロラＡキナーゼおよび／またはオーロラＢキナーゼを阻害し、結果、細胞周期および細胞増殖を阻害する。オーロラＢキナーゼを阻害する化合物は特に重要である。本発明の化合物はさらに、耐性細胞において活性を有し、有利な物理的性質を有している。これらの特性は、例えば、下記の手段の１つまたは複数を用いて評価できる。
【００８８】
（ａ）インビトロでのオーロラＡキナーゼ阻害試験
本アッセイは、試験化合物のセリン・スレオニンキナーゼ活性を阻害する能力を測定する。オーロラＡをコードするＤＮＡは、全遺伝子を合成してもよいし、またはクローニングにより得てもよい。このＤＮＡを適当な発現系により発現させて、セリン・スレオニンキナーゼ活性を有するポリペプチドを得ることができる。オーロラＡの場合、コード配列をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりｃＤＮＡから単離し、バキュロウィルス発現ベクターpFastBac Htc（ギブコＢＲＬライフテクノロジー社）のＢａｍＨ１およびＮｏｔ１制限エンドヌクレアーゼ部位にクローニングした。５’ＰＣＲプライマーは、オーロラＡのコード配列の５’の制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨ１を認識する配列を含む。これにより、pFastBac Htcベクターによってコードされる６個のヒスチジン残基、スペーサー領域およびｒＴＥＶプロテアーゼ切断部位を有するフレームにオーロラＡ遺伝子が挿入される。３’ＰＣＲプライマーは、オーロラＡの終止コドンを追加のコード配列で置き換え、ついで終止コドン、制限エンドヌクレアーゼＮｏｔ１を認識する配列が続く。この追加コード配列（５’ＴＡＣＣＣＡＴＡＣＧＡＴＧＴＴＣＣＡＧＡＴＴＡＣＧＣＴＴＣＴＴＡＡ３’）はポリペプチド配列ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＳをコードしている。インフルエンザ凝集素タンパク質に由来するこの配列は、特異的モノクローナル抗体により認識されるタグエピトープ配列として頻繁に使用されている。組換えｐＦａｓｔＢａｃベクターは、Ｎ−末端に６ヒスチジンタグを、Ｃ−末端にインフルエンザ凝集素エピトープタグを有するオーロラＡタンパク質をコードしている。組換えＤＮＡ分子を組み立てる方法の詳細は、標準的なテキスト、例えば、Sambrookら, 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory pressおよびAusubelら, 1999, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons Inc.に記載されている。
【００８９】
組換えウィルスは、ギブコＢＲＬの製造者プロトコールに従って作製できる。簡単に説明すると、オーロラＡ遺伝子を含むｐＦａｓｔＢａｃ−１ベクターを、バキュロウィルスゲノム（bacmid DNA）を含有する大腸菌ＤＨ１０Ｂａｃ細胞に組み込み、細胞内での転移を介して、ゲンタマイシン耐性遺伝子とバキュロウィルスポリヘドリンプロモーターを含むオーロラＡ遺伝子を含むｐＦａｓｔＢａｃベクターの領域が、直接bacmid DNA中に置き換えられる。ゲンタマイシン、カナマイシン、テトラサイクリンおよびＸ−ｇａｌによる選択により得られた白色のコロニーは、オーロラＡをコードする組換えbacmid DNAを含有するはずである。数個の白色のＢＨ１０Ｂａｃコロニーを小規模培養した後、bacmid DNAを抽出し、このbacmid DNAを、セルフェクチン(ＣｅｌｌＦＥＣＴＩＮ)試薬（ギブコＢＲＬ）を製造者指示書に従って使用して、１０％の血清を含有するＴＣ１００培地（ギブコＢＲＬ）中で成長したヨトウガＳｆ２１細胞にトランスフェクトした。このトランスフェクションの７２時間後に、細胞培養培地を回収してウィルス粒子を採取した。０．５ｍＬの培地を使用して１００ｍＬの１×１０７個／ｍＬの細胞を含有するＳｆ２１ｓの浮遊培養液を感染させた。感染の４８時間後に細胞培養培地を採取し、ウィルスの力価を標準プラーク分析法により測定した。組換えオーロラＡタンパク質の発現を確認するために、保存ウィルスにより、重複感染度（ＭＯＩ）３でＳｆ９および“Ｈｉｇｈ５”細胞を感染させた。
【００９０】
オーロラ−Ａキナーゼ活性の大規模発現のために、２８℃で、ＴＣ１００培地（１０％ウシ胎児血清（Ｖｉｒａｌｅｘ）および０．２％Ｆ６８プルロニック(Ｐｌｕｒｏｎｉｃ)（シグマ）添加）中で、３ｒｐｍのウィートン・ローラー・リグ(Wheaton roller rig)で、Ｓｆ２１昆虫細胞を成長させた。細胞密度が１ｍＬ当たり１．２×１０６細胞に達したら、プラーク（純粋なオーロラＡ組換えウイルス）を重複感染度１で該細胞に感染させ、４８時間後に回収した。それに続くすべての精製工程は、４℃で行った。凍結させた昆虫細胞ペレット（合計２．０×１０８細胞を含む）を融解させ、溶解緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］）、ｐＨ７．４、４℃、１００ｍＭのＫＣｌ、２５ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、１ｍＭのＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）、２ｍＭの２−メルカプトエタノール、２ｍＭのイミダゾール、１μｇ／ｍＬのアプロチニン、１μｇ／ｍＬのペプスタチン、１μｇ／ｍＬのロイペプチン）を、３×１０７細胞あたり１．０ｍＬ用いて希釈した。ダウンス型ホモジナイザーを用いて溶解し、続いて、溶解産物を４１０００ｇで３５分間遠心分離した。吸引した上清を、溶解緩衝液中で平衡化させた５００μＬのＮｉＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）アガロース（キアゲン、製品番号３０２５０）を充填した直径５ｍｍのクロマトグラフィーカラムにポンプで送り出した。溶離液のＵＶ吸光度が基準レベルに達するように、１２ｍＬの溶解緩衝液、続いて、７ｍＬの洗浄緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、４℃、１００ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール、２ｍＭの２−メルカプトエタノール）でカラムを洗浄した。結合しているオーロラ−Ａタンパク質を、溶出緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、４℃、１００ｍＭのＫＣｌ、４００ｍＭのイミダゾール、２ｍＭの２−メルカプトエタノール）を用いてカラムから溶出した。ＵＶ吸光度のピークに対応する溶出フラクション（２．５ｍＬ）を回収した。活性オーロラ−Ａキナーゼを含む該溶出フラクションを、透析緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、４℃、４５％グリセロール（ｖ／ｖ）、１００ｍＭのＫＣｌ、０．２５％ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０（ｖ／ｖ）、１ｍＭのジチオスレイトール）に対して十分に透析した。
【００９１】
このアッセイでは、それぞれの新しいオーロラＡ酵素のバッチを、酵素希釈剤（２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１２．５ｍＭのＫＣｌ、０．６ｍＭのＤＴＴ）で希釈し滴定した。代表的なバッチ（アップステート社より入手）においては、保存酵素を酵素希釈剤で１μｍ／ｍＬになるように希釈し、希釈酵素の２０μＬを各分析ウェルに用いる。試験化合物（１０ｍＭジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液）を水で希釈し、希釈化合物の１０μＬを、アッセイプレートのウェルに移した。「トータル」および「ブランク」コントロールウェルには、化合物の代わりに２．５％ＤＭＳＯを加えた。２０μＬの新しく希釈した酵素を、「ブランク」ウェル以外のすべてのウェルに加えた。２０μＬの酵素希釈剤を、「ブランク」ウェルに加えた。次に、０．２μＣｉ［γ３３Ｐ］ＡＴＰ（アマシャム・ファルマシア、比放射能≧２５００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を含む２０μＬの反応ミックス（２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、７８．４ｍＭのＫＣｌ、２．５ｍＭのＮａＦ、０．６ｍＭのジチオスレイトール、６．２５ｍＭのＭｎＣｌ２、２５ｍＭのＡＴＰ、７．５μＭのペプチド基質［ビオチン−ＬＲＲＷＳＬＧＬＲＲＷＳＬＧＬＲＲＷＳＬＧＬＲＲＷＳＬＧ］）を、すべての試験ウェルに加え、反応を開始した。プレートを室温で６０分間インキュベートした。この反応を停止させるために、１００μＬの２０％（ｖ／ｖ）オルトリン酸を、すべてのウェルに加えた。ペプチド基質を、正電荷を帯びたニトロセルロースＰ３０フィルターマット（ワットマン）上に、９６−ウェルプレートハーベスター（ＴｏｍＴｅｋ）を用いて捕獲し、次に、ベータプレートカウンターを用いて３３Ｐの取り込みを測定した。「ブランク」（酵素なし）および、「トータル」（化合物なし）のコントロール値を用いて、酵素活性の５０％を阻害する試験化合物の希釈範囲（ＩＣ５０値）を求めた。本発明の化合物は、通常、０．１ｎＭないし５μＭのＩＣ５０値を有する。
（ｂ）インビトロでのオーロラＢキナーゼ阻害試験
このアッセイは、試験化合物のセリン・スレオニンキナーゼ活性を阻害する能力を求める。オーロラＢをコードするＤＮＡは、全遺伝子を合成してもよいし、またはクローニングにより得てもよい。このＤＮＡを適切な発現系により発現させて、セリン・スレオニンキナーゼ活性を有するポリペプチドを得る。オーロラＢの場合、コード配列をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりｃＤＮＡから単離し、オーロラＡに関して上述した方法と類似の方法でｐＦａｓｔＢａｃ系にクローニングした（すなわち、６−ヒスチジンタグを付されたオーロラＢタンパク質を直接発現させる）。
【００９２】
オーロラＢキナーゼ活性の大規模発現のために、２８℃で、ＴＣ１００培地（１０％ウシ胎児血清（Ｖｉｒａｌｅｘ）、および、０．２％Ｆ６８プルロニック（シグマ）添加）中で、３ｒｐｍのウィートン・ローラー・リグで、Ｓｆ２１昆虫細胞を成長させた。細胞密度が１ｍＬ当たり１．２×１０６細胞に達したら、プラーク（純粋なオーロラＢ組換えウイルス）を重複感染度１で該細胞に感染させ、４８時間後に回収した。それに続くすべての精製工程は、４℃で行った。凍結させた昆虫細胞ペレット（合計２．０×１０８細胞を含む）を融解させ、溶解緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］）ｐＨ７．５、４℃、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、１ｍＭのＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）、１ｍＭのジチオスレイトール、１μｇ／ｍＬのアプロチニン、１μｇ／ｍＬのペプスタチン、１μｇ／ｍＬのロイペプチン）を、２×１０７細胞あたり１．０ｍＬ用いて希釈した。超音波ホモジナイザーを用いて溶解し、続いて、溶解産物を４１０００ｇで３５分間遠心分離した。吸引した上清を、溶解緩衝液中で平衡化させた１．０ｍＬのＣＭセファロース・ファスト・フロー（アマシャム・ファルマシア・バイオテク）を充填した直径５ｍｍのクロマトグラフィーカラムにポンプで送り出した。溶離液のＵＶ吸光度が基準レベルに達するように、１２ｍＬの溶解緩衝液、続いて、７ｍＬの洗浄緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、４℃、１ｍＭのジチオスレイトール）でカラムを洗浄した。結合したオーロラＢタンパク質を、溶出緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、４℃、０．６ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのジチオスレイトール）の濃度勾配（流速０．５ｍＬ／分で、１５分間かけて、０％溶出緩衝液から１００％溶出緩衝液へ変化させた）を用いてカラムから溶出させた。ＵＶ吸光度のピークに対応する溶出フラクション（１．０ｍＬ）を回収した。溶出フラクションを、透析緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、４℃、４５％グリセロール（ｖ／ｖ）、１００ｍＭのＫＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）ＩＧＥＰＡＬ−ＣＡ６３０（シグマ・アルドリッチ）、１ｍＭのジチオスレイトール）に対して十分に透析した。透析されたフラクションのオーロラＢキナーゼ活性を測定した。
【００９３】
オーロラＢ−ＩＮＣＥＮＰ酵素（アップステート社より入手）は、オーロラＢ（５μＭ）を５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭのＥＧＴＡ、０．１％の２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭのバナジン酸ナトリウム、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１ｍＭのＡＴＰ中で０．１ｍｇ／ｍＬのＧＳＴ−ＩＮＣＥＰＴ［８２６−９１９］を用いて３０℃で３０分間活性化することにより調製した。
【００９４】
このアッセイでは、それぞれの新しいオーロラＢ−ＩＮＣＥＮＰ酵素のバッチを、酵素希釈剤（２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１２．５ｍＭのＫＣｌ、０．６ｍＭのＤＴＴ）で希釈することによって滴定した。代表的なバッチにおいては、保存酵素１に対して酵素希釈剤４０を用いて希釈し、希釈酵素の２０μＬを各分析ウェルに用いる。試験化合物（１０ｍＭジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液）を水で希釈し、希釈化合物の１０μＬを、分析プレートのウェルに移した。「トータル」および「ブランク」コントロールウェルには、化合物の代わりに２．５％ＤＭＳＯを加えた。２０μＬの新しく希釈した酵素を、「ブランク」ウェル以外のすべてのウェルに加えた。２０μＬの酵素希釈剤を、「ブランク」ウェルに加えた。次に、０．２μＣｉ［γ３３Ｐ］ＡＴＰ（アマシャム・ファルマシア、比放射能≧２５００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を含む２０μＬの反応ミックス（２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１２．７ｍＭのＫＣｌ、２．５ｍＭのＮａＦ、０．６ｍＭのジチオスレイトール、６．２５ｍＭのＭｎＣｌ２、１５ｍＭのＡＴＰ、６．２５μＭのペプチド基質［ビオチン−ＬＲＲＷＳＬＧＬＲＲＷＳＬＧＬＲＲＷＳＬＧＬＲＲＷＳＬＧ］）を、すべての試験ウェルに加え、反応を開始した。プレートを室温で６０分間インキュベートした。この反応を停止させるために、１００μＬの２０％（ｖ／ｖ）オルトリン酸を、すべてのウェルに加えた。ペプチド基質を、正電荷を帯びたニトロセルロースＰ３０フィルターマット（ワットマン）上に、９６−ウェルプレートハーベスター（ＴｏｍＴｅｋ）を用いて捕獲し、次に、ベータプレートカウンターを用いて３３Ｐの取り込みを測定した。「ブランク」（酵素なし）および「トータル」（化合物なし）のコントロール値を用いて、酵素活性の５０％を阻害する試験化合物の希釈範囲（ＩＣ５０値）を求めた。本発明の化合物は、通常、０．０５ｎＭないし０．５μＭ、特に０．０５ｎＭないし２ｎＭの範囲のＩＣ５０値を有する。特に、化合物１は１．４ｎＭのＩＣ５０値を有し、化合物２は１．４ｎＭのＩＣ５０値を有する。
（ｃ）インビトロでの細胞表現型と基質リン酸化アッセイ
このアッセイでは、インビトロでのヒト大腸腫瘍細胞ＳＷ６２０に対する化合物の細胞効果を測定する。化合物は通常、リン酸化ヒストンＨ３量の阻害および細胞の核領域の増加をもたらす。
【００９５】
１０４個のＳＷ６２０細胞を１０％のＦＣＳおよび１％のグルタミンを含有する１００μＬのＤＭＥＭ培地（ＤＭＥＭはダルベッコ改変イーグル培地（シグマＤ６５４６）を意味する）を含むコスター(ｃｏｓｔａｒ)９６ウェルプレートの各ウェルに入れ、３７℃で５％ＣＯ２中に一晩放置して、接着させた。該細胞に培地で希釈した化合物（化合物の濃度が０．０００１５ないし１μＭとなるように各ウェルに培地５０μＬを加えた）を添加し、化合物での処理の２４時間後に細胞を固定した。
【００９６】
細胞をまず光学顕微鏡で観察し、細胞に形態的変化があるかを記録した。次いで、１００μＬの３．７％ホルムアルデヒドを各ウェルに加え、プレートを室温で少なくとも３０分間放置した。プレートをペーパータオル上に傾け、軽くたたいて固定剤を除去した。自動プレート洗浄器を用いてプレートをＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（シグマＤ８５３７））中で１回洗浄した。１００μＬのＰＢＳと０．５％トライトンＸ−１００を加え、プレートを５分間シェーカー上で振盪した。プレートを１００μＬのＰＢＳ中で洗浄し、溶液を傾けて除去した。５０μＬの一次抗体（抗−リン酸化ヒストンＨ３ウサギ抗体のＰＢＳ（１％のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）および０．５％のツイーン含有）液、１：５００）を加えた。抗−リン酸化ヒストンＨ３ウサギポリクローナル抗体０６−７５０はアップステート・バイオテクノロジー社から購入した。プレートを室温で１時間シェーカー上で振盪した。
【００９７】
翌日、抗体を傾けて除去し、プレートをＰＢＳで２回洗浄した。照明のない場所で、５０μＬの二次抗体（１％のＢＳＡおよび０．５％のツイーンを含有するＰＢＳ中の１：１００００Ｈｏｅｃｈｓｔ及び１：２００Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗−ウサギＩｇＧヤギ抗体（カタログ番号：１１００８分子プローブ））を加えた。プレートをスズ箔で包み、そして１時間室温で振盪した。抗体を傾けて除去し、プレートをＰＢＳで２回洗浄した。２００μＬのＰＢＳをそれぞれのウェルに加え、そしてプレートを１０分間振盪し、ＰＢＳを除去した。１００μＬのＰＢＳをそれぞれのウェルに加え、プレートを分析の準備のために密封した。分析は、リン酸化ヒストンＨ３の細胞レベルおよび核領域の変化をＡｒｒａｙｓｃａｎ Ｔａｒｇｅｔ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎアルゴリズムにより測定して行った。結果は、リン酸化ヒストンＨ３量の５０％阻害、および同様に細胞の核領域の５０％の増加を与えるために必要な有効濃度（ＥＣ５０値）として示した。本発明の化合物は、一般的に０．５ｎＭないし１μＭのリン酸化ヒストンＨ３量の阻害に対するＥＣ５０値を有する。
（ｄ）インビトロでの薬剤耐性細胞の表現型及び基質のリン酸化アッセイ
このアッセイは、インビトロでの薬剤耐性ＭＣＦ７−ＡＤＲヒト乳房腫瘍細胞に対する化合物の影響を決定するために使用される。
【００９８】
ＭＣＦ７細胞を、アドリアマイシン（Dr. Hickinson, Molecular Oncology lab, ICRF, University of Oxford Institute of Molecular Medicine, Headington, Oxford）の多数回投与で前処理し、細胞による薬剤耐性タンパク質の過剰発現を誘導した。化合物は、一般的には、処理された細胞のリン酸化ヒストンＨ３量の阻害及び核領域の増加を起こすが、化合物が過剰発現した排出タンパク質の基質である場合には、このアッセイではこれらの活性は、先のＳＷ６２０アッセイより低くなる。
【００９９】
ウェル当り０．８×１０４個のＭＣＦ７−ＡＤＲ細胞を、１００μＬのＤＭＥＭ培地（１０％のＦＣＳ（ウシ胎児血清）及び１％のグルタミンを含有）を含むコスター９６ウェルプレートの中に入れ、そして一晩３７℃で、５％ＣＯ２中に放置して、付着させた。
【０１００】
その他はすべて、ＳＷ６２０細胞を使用する上記のアッセイと同一に行った。
本発明の化合物は、一般的に、０．０５ｎＭないし０．１μＭ、特に０．５ｎＭないし１μＭ、さらには０．５ｎＭないし０．５μＭのリン酸化ヒストンＨ３量の阻害に対するＥＣ５０値を有する。特に、化合物１は１ｎＭより小さいＥＣ５０値を有し、化合物２は２０ｎＭのＥＣ５０値を有している。従来技術の化合物（Ｉ）は、１２０ｎＭのＥＣ５０値を有することが知られている。
【０１０１】
本発明を以下の実施例により説明するが、当業者に周知の標準的技術および該実施例中に記載されるものと類似の技術を適宜使用してよく、実施例は他に記載しない限り以下のように行われた。
（ｉ）蒸発は、回転蒸発器によって真空中で行われ、後処理は、乾燥剤のような残留固体を濾過により除去した後に行った；
（ｉｉ）操作は、周囲温度で、典型的には１８〜２５℃の範囲で、特に明記しない限り、または当業者が他の方法としてアルゴンのような不活性ガスの雰囲気下で操作するものである場合を除き、空気中で行った；
（ｉｉｉ）カラムクロマトグラフィー（フラッシュ法による）および中圧液体クロマトグラフィー（ＭＰＬＣ）は、メルク社製キーゼルゲル（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ）シリカ（Ａｒｔ．９３８５）で行った；
（ｉｖ）収率は、例示のためにのみ与えられ、必ずしも達成された最大値ではない；
（ｖ）式（Ｉ）の最終生成物の構造は、通常、核（一般的にプロトン）磁気共鳴（ＮＭＲ）および質量スペクトル法によって確認された；プロトン磁気共鳴の化学シフト値は、重水素化ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯｄ６）中で、（他に明記しない限り）デルタ値（ｐｐｍ、内部標準：テトラメチルシラン）として、以下の４つの装置の一つを使用して測定した：
−３００ＭＨｚの磁場強度で操作されるＶａｒｉａｎ Ｇｅｍｉｎｉ ２０００分光計
−３００ＭＨｚの磁場強度で操作されるＢｒｕｋｅｒ ＤＰＸ３００分光計
−４００ＭＨｚの磁場強度で操作されるＪＥＯＬ ＥＸ４００分光計
−５００ＭＨｚの磁場強度で操作されるＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ５００分光計
ピークの多重度は、次のように示す：ｓ、一重線；ｄ、二重線；ｄｄ、二重の二重線；ｔ、三重線；ｑ、四重線；ｑｕ、五重線；ｍ、多重線；ｂｒｓ、幅広な一重線；
（ｖｉ）ロボット合成は、Ｚｙｍａｔｅ ＸＰロボットを用いて、ザイメイト・マスター・ラボラトリー・ステーション（Ｚｙｍａｔｅ Ｍａｓｔｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｔｉｏｎ）による溶液添加、Ｓｔｅｍ ＲＳ５０００ Ｒｅａｃｔｏ−Ｓｔａｔｉｏｎによる２５℃での撹拌により行われた；
（ｖｉｉ）ロボット合成からの反応混合物の後処理及び精製は、次のように行った：蒸発は、真空中でＧｅｎｅｖａｃ ＨＴ４を使用して行った；カラムクロマトグラフィーは、メルクシリカ（６０μｍ、２５ｇ）が充填された２７ｍｍ直径のカラムを使用してＡｎａｃｈｅｍ Ｓｙｍｐｕｒ ＭＰＬＣ装置を使用して行った；最終生成物の構造は、ウォーターズ２８９０／ZMD micromass systemのＬＣＭＳ（液体クロマトグラフィー質量分光法）によって、以下を使用して確認し、分での保持時間（ＲＴ）として示される：
カラム：ウォーターズ・シンメトリーＣ１８、３.５μｍ、４．６×５０ｍｍ
溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ
溶媒Ｂ：ＣＨ３ＣＮ
溶媒Ｃ：ＭｅＯＨ＋５％ＨＣＯＯＨ
流量：２．５ｍＬ／分
操作時間：Ｃの０〜１００％の勾配の４．５分を含む５分
波長：２５４ｎｍ、１０ｎｍのバンド幅
質量検出器：ZMD micromass
注入体積：０．００５ｍＬ
（ｖｉｉｉ）ロボット合成によらずに調製された化合物のＬＣＭＳ分析は、ウォーターズ・アライアンスＨＴ装置によって、以下を使用して確認し、分での保持時間（ＲＴ）として示される：
カラム：２．０ｍｍ×５ｃｍ、フェノメネック・マックス−ＲＰ ８０Ａ
溶媒Ａ：水
溶媒Ｂ：アセトニトリル
溶媒Ｃ：メタノール／１％ギ酸または水／１％ギ酸
流量：１．１ｍＬ／分
操作時間：Ｂの０〜９５％の勾配の４．５分＋５％の溶媒Ｃの一定を含む５分
波長：２５４ｎｍ、１０ｎｍのバンド幅
注入体積：０．００５ｍＬ
質量検出器：Micromass ZMD
（ｉｘ）分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、
ウォーターズ分取用ＬＣＭＳ装置により、分で測定される保持時間（ＲＴ）で：
カラム：β−塩基性ハイパーシル（Ｈｙｐｅｒｃｉｌ）（２１×１００ｍｍ）５μｍ
溶媒Ａ：水／０．１％炭酸アンモニウム
溶媒Ｂ：アセトニトリル
流量：２５ｍＬ／分
操作時間：Ｂの０〜１００％の勾配の７．５分を含む１０分
波長：２５４ｎｍ、１０ｎｍのバンド幅
注入体積：１〜１．５ｍＬ
質量検出器：Micromass ZMD
または、ギルソン分取用ＨＰＬＣ装置により、分で測定される保持時間（ＲＴ）で：
カラム：２１ｍｍ×１５ｃｍ、フェノメネックス・ルナ２ Ｃ１８
溶媒Ａ：水＋０．１％トリフルオロ酢酸
溶媒Ｂ：アセトニトリル＋０．１％トリフルオロ酢酸
流量：２１ｍＬ／分
操作時間：変化するＢの５〜１００％の勾配の１０分を含む２０分
波長：２５４ｎｍ、１０ｎｍのバンド幅
注入体積：０．１〜４．０ｍＬ
により行われた。
（ｘ）中間体は、通常、完全には分析せず、純度は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ＨＰＬＣ、赤外（ＩＲ）、ＭＳまたはＮＭＲ分析によって評価した。
【０１０２】
【表１】
2009523776.tif 000015
【０１０３】
実施例１
表１の化合物１：Ｎ−（２，３−ジフルオロフェニル）−２−［４−（｛７−エトキシ−５−［（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメトキシ］キナゾリン−４−イル｝アミノ）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］アセトアミドの調製
トリフルオロ酢酸（２．５ｍＬ）を、（２Ｒ）−２−［（｛４−［（１−｛２−［（２，３−ジフルオロフェニル）アミノ］−２−オキソエチル｝−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−７−エトキシキナゾリン−５−イル｝オキシ）メチル］ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルの塩酸塩（４００ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１０ｍＬ）溶液に加え、反応混合物を室温で３０分間攪拌した。得られた溶液を濃縮し、残留物を５％炭酸ナトリウム水溶液（４０ｍＬ）と混合した後、１０％メタノール含有ジクロロメタン（２×４０ｍＬ）で抽出した。有機抽出液を併せ、硫酸マグネシウムで乾燥後、濃縮した。残留物を、０〜２％の７Ｎメタノール性アンモニアを含有する５％メタノール含有ジクロロメタンを溶出液とするシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、Ｎ−（２，３−ジフルオロフェニル）−２−［４−（｛７−エトキシ−５−［（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメトキシ］キナゾリン−４−イル｝アミノ）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル｝アセトアミド（２８８ｍｇ、収率：９１％）を得た。
1H NMR (DMSO d6): 10.2 (br s, 1H), 9.85 (br s, 1H), 8.43 (s, 1H), 8.28 (s, 1H), 7.72 (s, 1H), 7.71 - 7.66 (m, 1H), 7.19 - 7.11 (m, 2H), 6.74 (d, 1H), 6.64 (d, 1H), 5.09 (s, 2H), 4.29 - 4.11 (m, 4H), 3.15 - 3.09 (m, 1H), 3.08 - 3.02 (m, 1H), 2.72 - 2.66 (m, 1H), 1.86 - 1.80 (m, 1H), 1.71 - 1.65 (m, 1H), 1.60 - 1.54 (m, 1H), 1.52 - 1.29 (m, 6H).
MS (+ve ESI): 538 (M+H)+
出発物質として使用された、（２Ｒ）−２−［（｛４−［（１−｛２−［（２，３−ジフルオロフェニル）アミノ］−２−オキソエチル｝−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−７−エトキシキナゾリン−５−イル｝オキシ｝メチル｝ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルは以下のように調製した。
【０１０４】
ａ）硫酸ジエチル（１３．１ｍＬ、０．１０ｍｏｌ）を、氷水浴中で冷やした３，５−ジフルオロフェノール（１３．０ｇ、０．１０ｍｏｌ）および炭酸カリウム（２０．９ｇ、０．１５ｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（２００ｍＬ）溶液に加え、得られた混合物を８０℃に１．５時間加熱した。さらに、硫酸ジエチル（３．３ｍＬ、２５ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（５．２ｇ、３７．５ｍｍｏｌ）を加え、混合物をさらに２時間加熱した。得られた溶液を室温にまで冷却した後、水に注ぎ、ジエチルエーテルで２回抽出した。ジエチルエーテルの抽出液を併せ、水で洗浄した。硫酸マグネシウムで乾燥した後、濃縮し、１−エトキシ−３，５−ジフルオロベンゼンを黄色油（１３．５９ｇ、収率：８６％）として得た。
1H-NMR (DMSO d6): 6.77-6.65 (m, 3H), 4.06 (q, 2H), 1.32 (t, 3H).
MS (+ve EI) : 158 (M+)
ｂ）ｎ−ブチルリチウム（１．６Ｍのヘキサン溶液として１３．５ｍＬ、２１．６ｍｍｏｌ）を１−エトキシ−３，５−ジフルオロベンゼン（３．４２ｇ、２１．６ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（３０ｍＬ）溶液に攪拌しながら窒素雰囲気下−７８℃で滴下した。混合物を−７８℃で２時間攪拌した後、過剰の固体二酸化炭素ペレットを加えた。反応混合物を室温に戻し、得られた溶液を水に注いだ。混合物に水酸化ナトリウムの水溶液を添加して塩基性にした後、混合物をジエチルエーテルで抽出した。混合物を分離し、水相に希塩酸を添加して酸性にした。混合物をジエチルエーテルで２回抽出した。ジエチルエーテル抽出液を併せ、水で洗浄した。硫酸マグネシウムで乾燥した後、濃縮し、４−エトキシ−２，６−ジフルオロ安息香酸を無色固体（３．８７ｇ、収率：８９％）として得た。
1H-NMR (DMSO d6): 13.36 (br. s, 1H), 6.82-6.76 (m, 2H), 4.11 (q, 2H), 1.33 (t, 3H).
MS (+ve CI) : 203 (M+H)+
ｃ）塩化オキサリル（３．１７ｍＬ、３６．４ｍｍｏｌ）を４−エトキシ−２，６−ジフルオロ安息香酸（３．５ｇ、１７．３ｍｍｏｌ）およびジメチルホルムアミド(５滴）のジクロロメタン（５０ｍＬ）懸濁液に攪拌しながら滴下した。得られた溶液を室温で４時間攪拌した後、濃縮した。残留物をテトラヒドロフランに溶解した後、３５％アンモニア水（６０ｍＬ）に激しく攪拌しながら滴下した。混合物をろ過し、残留物を氷冷した水で洗浄した後、減圧乾燥して４−エトキシ−２，６−ジフルオロベンズアミドを無色固体（３．２３ｇ、収率：９３％）として得た。
1H-NMR (DMSO d6): 7.91 (br. s, 1H), 7.65 (br. s, 1H), 6.78-6.71 (m, 2H), 4.08 (q, 2H), 1.32 (t, 3H).
MS (+ve EI) : 201 (M+)
ｄ）塩化トリクロロアセチル（１．９４ｍＬ、１７．４ｍｍｏｌ）を、４−エトキシ−２，６−ジフルオロベンズアミド（３．１８ｇ、１５．８ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（４．４４ｍＬ、３１．６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（２５ｍＬ）懸濁液に攪拌しながら０〜５℃で添加した。混合物を０〜５℃で５分間攪拌した。得られた溶液を続けて水、希塩酸、希水酸化ナトリウム溶液、希塩酸、そして最後に水で洗浄した。有機溶液を硫酸マグネシウムで乾燥した後、濃縮し４−エトキシ−２，６−ジフルオロベンゾニトリルを淡黄色固体（２．５６ｇ、収率：８９％）として得た。
1H-NMR (DMSO d6): 7.06-7.03 (m, 2H), 4.17 (q, 2H), 1.34 (t, 3H).
MS (+ve CI) : 184 (M+H)+
ｅ）４−エトキシ−２，６−ジフルオロベンゾニトリル（８．０ｇ、４４ｍｍｏｌ）とアンモニアの飽和エタノール（２７０ｍＬ）溶液の混合物をオートクレーブ中で１６時間、１５０℃に加熱した。得られた溶液を濃縮して、残留物をジクロロメタンに溶解した後、水で洗浄した。有機溶液を硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した後、ジクロロメタンで溶出するシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、２−アミノ−４−エトキシ−６−フルオロベンゾニトリルを無色固体（６．０７ｇ、収率：７７％）として得た。
1H-NMR (DMSO d6): 6.32 (s, 2H), 6.14-6.10 (m, 2H), 3.99 (q, 2H), 1.30 (t, 3H).
MS (+ve EI) : 180 (M+)
ｆ）２−アミノ−４−エトキシ−６−フルオロベンゾニトリル（２．５ｇ、１３．９ｍｍｏｌ）を、１００℃に加熱されたギ酸（２０ｍＬ）と濃硫酸（５滴）の混合液に、２０分かけて少量ずつ添加した。得られた混合液を１００℃で５時間加熱した後、室温に冷却した。混合液を氷水（８０ｍＬ）に注ぎ、得られた沈殿物をろ過により回収し、水、次いででジエチルエーテルで洗浄した後、減圧乾燥し、７−エトキシ−５−フルオロキナゾリン−４（３Ｈ）−オンを無色固体（２．０２ｇ、収率：７０％）として得た。
1H-NMR (DMSO d6): 12.06 (br s. 1H), 8.01 (s, 1H), 6.91-6.85 (m, 2H), 4.17 (q, 2H), 1.36 (t, 3H).
MS (+ve ESI) : 209 (M+H)+
ｇ）水素化ナトリウム（２６４ｍｇ、６．６０ｍｍｏｌ、６０重量％鉱油分散物）のジメチルホルムアミド（５ｍＬ）懸濁液に、[（２Ｒ）−１−ベンジルピペリジン−２−イル]メタノール（６７８ｍｇ、３．３０ｍｍｏｌ）含有ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）を滴下し、得られた反応混合物を室温で３０分攪拌した。７−エトキシ−５−フルオロキナゾリン−４（３Ｈ）−オン（６００ｍｇ、２．９ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を６０℃に加熱した。１時間後に、さらに水素化ナトリウム（２６４ｍｇ、６．６０ｍｍｏｌ）を添加し、さらに２．５時間加熱した。得られた溶液を２０％塩化アンモニウム水溶液（４０ｍＬ）に注ぎ、得られた沈殿物をろ過により回収し、水で洗浄した後、減圧乾燥し、５−｛[（２Ｒ）−１−ベンジルピペリジン−２−イル]メトキシ}−７−エトキシキナゾリン−４（３Ｈ）−オン（１．０５ｇ、収率：９７％）を得た。
1H NMR (DMSO d6): 7.83 (s, 1H), 7.34 - 7.16 (m, 5H), 6.63 (d, 1H), 6.50 (d, 1H), 4.32 - 4.29 (m, 1H), 4.17 - 4.02 (m, 4H), 3.55 (d, 1H), 2.81 - 2.75 (m, 1H), 2.27 - 2.21 (m, 1H), 1.95 - 1.89 (m, 1H), 1.72 - 1.59 (m, 2H), 1.56 - 1.34 (m, 7H).
MS (+ve ESI): 394 (M+H)+
出発物質として使用された、［（２Ｒ）−１−ベンジルピペリジン−２−イル］メタノールは以下のように調製した。
【０１０５】
ボラン−メチルスルフィド錯体（７．３１ｍＬ、７６．０ｍｍｏｌ）を（２Ｒ）−１−［（ベンジルオキシ）カルボニル］ピペリジン−２−カルボン酸（１０．０ｇ、３８．０ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）溶液に室温でゆっくりと添加した。得られた溶液を加熱して４時間還流した後、室温に冷却し、メタノール（８ｍＬ）でクエンチした。２Ｎの水性ＨＣｌ（８０ｍＬ）を添加し、得られた混合液を酢酸エチルで抽出した。有機抽出液を併せ、塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過後、濃縮して無色の油を得た。この粗生成物を５％メタノール含有ジクロロメタンで溶出するシリカゲルクロマトグラフィーで精製した。生成物を含有するフラクションを濃縮し、残留物を５０℃で減圧乾燥し、（２Ｒ）−２−（ヒドロキシメチル）ピペリジン−１−カルボン酸ベンジル（８．８７ｇ、収率：９４％）を得た。
1H NMR (DMSO d6): 7.40 - 7.29 (m, 5H), 5.08 (s, 2H), 4.72 - 4.67 (m, 1H), 4.18 - 4.11 (m, 1H), 3.93 - 3.87 (m, 1H), 3.56 - 3.43 (m, 2H), 2.87 - 2.81 (m, 1H), 1.79 - 1.76 (m, 1H), 1.61 - 1.24 (m, 5H).
MS (+ve ESI): 250 (M+H)+
パラジウム炭素（５００ｍｇ、１０％含有）を（２Ｒ）−２−（ヒドロキシメチル)ピペリジン−１−カルボン酸ベンジル（５．００ｇ、２０．０６ｍｍｏｌ）の酢酸エチル（７０ｍＬ）溶液に添加し、得られた反応混合物を室温で水素雰囲気下に４時間攪拌した。混合物をろ過し、ろ液に新たに触媒（３００ｍｇ）を加えた後、得られた混合物を水素雰囲気下にさらに３時間攪拌した。混合物をろ過し、ろ液を濃縮して茶色の油を得た。この粗生成物をクーゲルロール蒸留により精製し、（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール（１．５１ｇ、収率：６５％）を得た。
1H NMR (CDCl3): 3.53 - 3.48 (m, 1H), 3.36 - 3.31 (m, 1H), 3.02 (d, 1H), 2.61 - 2.53 (m, 2H), 2.35 (s, 2H), 1.75 - 1.73 (m, 1H), 1.56 - 1.47 (m, 2H), 1.40 - 1.25 (m, 2H), 1.14 - 1.03 (m, 1H).
臭化ベンジル（２．３４ｍＬ、１９．５３ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（８．１ｇ、５８．６ｍｍｏｌ）を（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール（２．２５ｇ、１９．５３ｍｍｏｌ）を含むエタノール（４０ｍＬ）および水（６ｍＬ）の溶液に添加した。得られた溶液を攪拌しながら８０℃で６．５時間加熱した後、室温に冷却した。反応混合物を濃縮し、残留物を水（５０ｍＬ）に懸濁した後、ジエチルエーテル（２×５０ｍＬ）で抽出した。有機抽出液を併せ、硫酸マグネシウムで乾燥した後濃縮した。残留物を０〜２％のメタノール性アンモニアを含有する５％メタノール含有ジクロロメタンで溶出するシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、[（２Ｒ）−１−ベンジルピペリジン−２−イル]メタノール（２．８６ｇ、収率：７１％）を得た。
1H NMR (DMSO d6): 7.32 - 7.27 (m, 4H), 7.24 - 7.18 (m, 1H), 4.41 (t, 1H), 4.08 (d, 1H), 3.67 - 3.62 (m, 1H), 3.47 - 3.42 (m, 1H), 3.24 (d, 1H), 2.66 - 2.62 (m, 1H), 2.32 - 2.26 (m, 1H), 2.01 - 1.95 (m, 1H), 1.71 - 1.60 (m, 2H), 1.48 - 1.41 (m, 1H), 1.39 - 1.21 (m, 3H).
MS (+ve ESI): 207 (M+H)+
ｈ）Ｐｄ／Ｃ（１００ｍｇ）を５−｛［（２Ｒ）−１−ベンジルピペリジン−２−イル］メトキシ｝−７−エトキシキナゾリン−４（３Ｈ）−オン（１．００ｇ、２．５４ｍｍｏｌ）および二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（６１０ｍｇ、２．８０ｍｍｏｌ）を含有するジメチルホルムアミド（１５ｍＬ）溶液に添加し、得られた反応混合物を室温で水素雰囲気下に４時間攪拌した。二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（３０５ｍｇ、１．４０ｍｍｏｌ）をさらに加え、さらに１時間攪拌を続けた。混合物をセライトでろ過し、ろ液を濃縮した。残留物を０〜５％のメタノールを含有するジクロロメタンで溶出するシリカゲルクロマトグラフィーで精製した。目的とするフラクションを併せ、濃縮して（２Ｒ）−２−｛［（７−エトキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロキナゾリン−５−イル）オキシ］メチル｝ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（５１５ｍｇ、収率：５０％）を得た。
1H NMR (DMSO d6): 7.83 (s, 1H), 6.65 (d, 1H), 6.59 (d, 1H), 4.46 - 4.41 (m, 1H), 4.24 - 4.06 (m, 4H), 3.90 - 3.84 (m, 1H), 3.07 - 2.99 (m, 1H), 2.08 - 2.02 (m, 1H), 1.73 - 1.49 (m, 5H), 1.40 - 1.35 (m, 12H).
MS (+ve ESI): 404 (M+H)+
ｉ）オキシ塩化リン（０．３７ｍＬ、３．９７ｍｍｏｌ）を（２Ｒ）−２−｛［（７−エトキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロキナゾリン−５−イル）オキシ］メチル｝ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（５００ｍｇ、１．２４ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．７３ｍＬ、４．２１ｍｍｏｌ）を含有する１，２−ジクロロエタン（１５ｍＬ）溶液に添加した。反応混合物を８５℃に１．５時間加熱した後、室温に冷却した。得られた溶液を濃縮し、残留物をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）で洗浄した。有機相を分離し、硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過後濃縮した。残留物を酢酸エチルで溶出するシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、（２Ｒ）−２−｛［（４−クロロ−７−エトキシキナゾリン−５−イル）オキシ］メチル｝ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（３７５ｍｇ、収率：７２％）を得た。
MS (+ve ESI): 422 (M+H)+
ｊ）２−（４−アミノ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−Ｎ−（２，３−ジフルオロフェニル）アセトアミド（２２２ｍｇ、０．８８ｍｍｏｌ）を（２Ｒ）−２−｛［（４−クロロ−７−エトキシキナゾリン−５−イル）オキシ］メチル｝ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（３７０ｍｇ、０．８８ｍｍｏｌ）のプロパン−２−オール溶液に添加し、混合物を７０℃で１５分間加熱した後、室温に冷却し、高粘度の沈殿物を得た。混合物をジエチルエーテルで希釈し、沈殿物をろ過により回収し、ジエチルエーテルで洗浄後、減圧乾燥して（２Ｒ）−２−［（｛４−［（１−｛２−［（２，３−ジフルオロフェニル）アミノ］−２−オキソエチル｝−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−７−エトキシキナゾリン−５−イル｝オキシ）メチル］ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルの塩酸塩（４２３ｍｇ、収率：７１％）を得た。
1H NMR (DMSO d6): 8.67 (s, 1H), 8.33 (s, 1H), 7.96 (s, 1H), 7.69 - 7.64 (m, 1H), 7.15 - 7.05 (m, 2H), 7.01 (d, 1H), 6.85 (d, 1H), 5.11 (s, 2H), 4.81 - 4.79 (m, 2H), 4.35 (q, 1H), 4.25 (q, 2H), 3.92 - 3.86 (m, 1H), 3.10 - 3.02 (m, 1H), 1.82 - 1.75 (m, 1H), 1.72 - 1.57 (m, 4H), 1.42 - 1.36 (m, 4H), 1.21 (s, 9H).
MS (+ve ESI): 638
出発物質として使用された２−（４−アミノ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−Ｎ−（２，３−ジフルオロフェニル）アセトアミドは以下のように調製した。
【０１０６】
ａ）２，３−ジフルオロアニリン（１２．９ｇ、１００ｍｍｏｌ）を含有するジエチルエーテル（１００ｍＬ）溶液を１Ｍの水性水酸化ナトリウム（９８ｍＬ、９８ｍｍｏｌ）で処理し、塩化クロロアセチル（１３．３ｇ、１１７ｍｍｏｌ）のジエチルエーテル（１００ｍＬ）溶液を５℃で２０分かけて滴下する間、激しく攪拌した。混合物を１時間かけて２０℃に温めた後、酢酸エチル（１００ｍＬ）を加えた。有機相を分離し、２０％水性炭酸水素カリウムで洗浄し、乾燥した後、濃縮して白い固体を得た。該固体を沸騰テトラヒドロフラン（２０ｍＬ）に溶解した後、シクロヘキサン（３００ｍＬ）およびイソヘキサン（１００ｍＬ）で希釈した。混合液を濃縮しておよそ２５０ｍＬとし、冷却後ろ過し、２−クロロ−Ｎ−（２，３−ジフルオロフェニル）アセトアミドを白い結晶（１８．４８ｇ、収率：９０％）として得た。
1H-NMR (DMSO d6): 10.26 (br s, 1H), 7.67 (m, 1H), 7.19 (m, 2H), 4.36 (s, 2H).
MS (+ve ESI): 206, 204 (M+H)+
ｂ）２−クロロ−Ｎ−（２，３−ジフルオロフェニル）アセトアミド（１０．２８ｇ、５０ｍｍｏｌ）および４−ブロモピラゾール（７．３５ｇ、５０ｍｍｏｌ）のジメチルアセタミド（２０ｍＬ）溶液を炭酸カリウム（８．２９ｇ、６０ｍｍｏｌ）で処理し、窒素下２０℃で１８時間攪拌した。混合物を水（３００ｍＬ）に注ぎ、ろ過し、固体を水（５００ｍＬ）で洗浄し、風乾した。固体を沸騰テトラヒドロフラン（８０ｍＬ）に溶解し、ろ過、シクロヘキサン（１００ｍＬ）で希釈後、約１００ｍＬに濃縮した。得られたスラリーをイソヘキサン（１００ｍＬ）で希釈し、冷却、ろ過して２−（４−ブロモ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−Ｎ−（２，３−ジフルオロフェニル）アセトアミドを白色固体（１３．０９ｇ、収率：８３％）として得た。
1H-NMR (DMSO d6): 10.32 (br s, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.70 (m, 1H), 7.59 (s, 1H), 7.19 (m, 2H), 5.14 (s, 2H).
MS (+ve ESI): 316, 318 (M+H)+    
ｃ）２−（４−ブロモ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−Ｎ−（２，３−ジフルオロフェニル）アセトアミド（９．４８ｇ、３０ｍｍｏｌ）および（９，９−ジメチル−９Ｈ−キサンテン−４，５−ジイル）ビス（ジフェニルホスフィン）（１．７４ｇ、３ｍｍｏｌ）の無水１，４−ジオキサン（５０ｍＬ）溶液をトリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（１．３７ｇ、１．５ｍｍｏｌ）で処理し、混合物を窒素下で５分間攪拌した。ベンゾフェノンイミン（５．７ｇ、３１．５ｍｍｏｌ）を一度に加え、次いで、ナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（８．６４ｇ、９０ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を窒素で脱気した後、窒素下で９０℃に４時間加熱した。混合物を冷却し、ジエチルエーテル（１００ｍＬ）で希釈後、飽和水性塩化アンモニウム（１００ｍＬ）に注いだ。混合物をセライトでろ過し、層分離を行った。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮して得た油を沸騰シクロヘキサン（２００ｍＬ、１００ｍＬ）で２回抽出した。シクロヘキサン溶液を濃縮して得た粘性物質を、イソヘキサン：ジエチルエーテル（１：１）から結晶化し、Ｎ−（２，３−ジフルオロフェニル）−２−｛４−［（ジフェニルメチレン）アミノ］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル｝アセトアミドを淡黄色固体（５．５０ｇ、収率：４４％）として得た。
1H-NMR (DMSO d6): 10.21 (br s, 1H), 7.66 (m, 3H), 7.56 (m, 3H), 7.44 (m, 3H), 7.35 (s, 1H), 7.24 (m, 2H), 7.18 (m, 2H), 6.48 (s, 1H), 4.98 (s, 2H).
MS (+ve ESI): 417 (M+H)+
ｄ）Ｎ−（２，３−ジフルオロフェニル）−２−｛４−［（ジフェニルメチレン）アミノ］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル｝アセトアミド（２．０８ｇ、５ｍｍｏｌ）の酢酸エチル（２５ｍＬ）溶液を十分に攪拌し、３７％塩酸水溶液（０．４９６ｍＬ、６ｍｍｏｌ）を室温で１分かけて滴下処理した。混合物を１時間攪拌した後、ろ過した。残留物を酢酸エチルおよびジエチルエーテルで洗浄した後、風乾して２−（４−アミノ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−Ｎ−（２，３−ジフルオロフェニル）アセトアミド塩酸塩を白色粉体（１．３５ｇ、収率：９３％）として得た。
1H NMR (DMSO d6): 10.48 (s, 1H); 10.22 (br s, 3H); 8.03 (s, 1H); 7.68 (m, 1H); 7.60 (s, 1H); 7.19 (m, 2H); 5.20 (s, 2H).
MS (+ve ESI): 253 (M+H)+
ｅ）２−（４−アミノ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−Ｎ−（２，３−ジフルオロフェニル）アセトアミド塩酸塩（１．６８５ｇ、５．８４ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（７０ｍＬ）と飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（３５ｍＬ）の混合物に懸濁させた後、１時間攪拌した。透明な層を分離し、水相を酢酸エチル（４×３０ｍＬ）で洗浄した。有機溶液を併せて、硫酸マグネシウムで乾燥した後、濃縮して得た固体をジエチルエーテルで洗浄して２−（４−アミノ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−Ｎ−（２，３−ジフルオロフェニル）アセトアミドをピンク色の固体（１．３７７ｇ、収率：９４％）として得た。
1H NMR (DMSO d6): 10.06 (br s, 1H); 7.70 (m, 1H); 7.17 (m, 2H); 7.08 (s, 1H); 6.98 (s, 1H): 4.90 (s, 2H); 3.84 (br s, 2H).
MS (+ve ESI): 253 (M+H)+
実施例２
表１の化合物２：Ｎ−（２，３−ジフルオロフェニル）−２−［４−（｛７−メトキシ−５−［（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメトキシ］キナゾリン−４−イル｝アミノ）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］アセトアミドの調製
出発物質として、（２Ｒ）−２−［（｛４−［（１−｛２−［（２，３−ジフルオロフェニル）アミノ］−２−オキソエチル｝−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−７−メトキシキナゾリン−５−イル｝オキシ）メチル］ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルの塩酸塩（３２５ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）を使用して、実施例１に記載の反応と同様の反応により、表１の化合物２（２１０ｍｇ、収率：８１％）を得た。
1H NMR (DMSO d6): 10.40 (s, 1H), 10.28 (s, 1H), 8.47 (s, 1H), 8.36 (s, 1H), 7.72 (m, 1H), 7.67 (s, 1H), 7.24 - 7.16 (m, 2H), 6.76 (d, 1H), 6.68 (d, 1H), 5.15 (s, 2H), 4.27 (m, 1H), 4.10 (m, 1H), 3.89 (s, 3H), 3.13 (m, 1H), 2.99 (m, 1H), 2.67 (t, 1H), 1.86 - 1.77 (m, 1H), 1.68 - 1.52 (m, 2H), 1.51 - 1.24 (m, 3H).
MS (+ve ESI): 524 (M+H)+.
出発物質として使用された、（２Ｒ）−２−［（｛４−［（１−｛２−［（２，３−ジフルオロフェニル）アミノ］−２−オキソエチル｝−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−７−メトキシキナゾリン−５−イル｝オキシ）メチル］ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルは以下のように調製した。
【０１０７】
ａ）２−アミノ−６−フルオロ−４−メトキシベンゾニトリル（１．３ｇ、７．８３ｍｍｏｌ）を出発物質として使用し、実施例１ｆと同様の反応により、５−フルオロ−７−メトキシキナゾリン−４（３Ｈ）−オン（１．１５ｇ、収率：７６％）を得た。
1H NMR (DMSO d6): 12.08 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 6.94 (m, 1H), 6.90 (d, 1H), 3.89 (s, 3H).
MS (+ve ESI): 195 (M+H)+.
２−アミノ−６−フルオロ−４−メトキシベンゾニトリルは、ＷＯ０３／０７６４２７に記載されており、その製造方法は参照により本明細書に組み込まれる。
ｂ）５−フルオロ−７−メトキシキナゾリン−４（３Ｈ）−オン（５００ｍｇ、２．５８ｍｍｏｌ）を出発物質として使用し、実施例１ｇと同様の反応により、５−｛［（２Ｒ）−１−ベンジルピペリジン−２−イル］メトキシ｝−７−メトキシキナゾリン−４（３Ｈ）−オン（８２８ｍｇ、収率：８５％）を得た。
MS (+ve ESI): 380 (M+H)+.
ｃ）５−｛［（２Ｒ）−１−ベンジルピペリジン−２−イル］メトキシ｝−７−メトキシキナゾリン−４（３Ｈ）−オン（８２８ｍｇ、２．１８ｍｍｏｌ）を出発物質として使用し、実施例１ｈと同様の反応により、（２Ｒ）−２−｛［（７−メトキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロキナゾリン−５−イル）オキシ］メチル｝ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（６０６ｍｇ、収率：７１％）を得た。
MS (+ve ESI): 390 (M+H)+.
ｄ）（２Ｒ）−２−｛［（７−メトキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロキナゾリン−５−イル）オキシ］メチル｝ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（６０６ｍｇ、１．５６ｍｍｏｌ）を出発物質として使用し、実施例１ｉと同様の反応により、（２Ｒ）−２−｛［（４−クロロ−７−メトキシキナゾリン−５−イル）オキシ］メチル｝ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（５０６ｍｇ、収率：８０％）を得た。
【０１０８】
ｅ）（２Ｒ）−２−｛［（４−クロロ−７−メトキシキナゾリン−５−イル）オキシ］メチル｝ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（２５３ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）を出発物質として使用し、実施例１ｊと同様の反応により、（２Ｒ）−２−［（｛４−［（１−｛２−［（２，３−ジフルオロフェニル）アミノ］−２−オキソエチル｝−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−７−メトキシキナゾリン−５−イル｝オキシ）メチル］ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルの塩酸塩（３２５ｍｇ、収率：７９％）を得た。
MS (+ve ESI): 624 (M+H)+.
【国際調査報告】
2009523776.tif 000019
2009523776.tif 000020
2009523776.tif 000021