(57)【要約】  直交化ｔＲＮＡ、直交化アミノアシル‐ｔＲＮＡシンテターゼ、およびｔＲＮＡ／シンテターゼの直交化の対を含む、タンパク質の生合成機構の要素の組成物、および該要素を製造する方法を提供する。また、これら直交化の対を同定する方法、およびこれら直交化の対を用いてタンパク質を製造する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、２、３、それらに相補的なポリヌクレオチド配列、およびそれらの保存的変種からなる群から選ばれる核酸配列を有しているｔＲＮＡを、含んでいる組成物。
【請求項２】
上記ｔＲＮＡが、アミノアシル化される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
上記ｔＲＮＡが、非天然にコードされるアミノ酸によりアミノアシル化される、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
上記非天然にコードされるアミノ酸が、パラ‐アセチルフェニルアラニンである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
上記ｔＲＮＡが化学的にアミノアシル化される、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
上記ｔＲＮＡが酵素的にアミノアシル化される、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
上記ｔＲＮＡが、ＲＳによって酵素的にアミノアシル化される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
上記ｔＲＮＡが、リボザイムによって酵素的にアミノアシル化される、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
ＲＳをさらに含んでおり、上記ｔＲＮＡが、アミノ酸によりアミノアシル化される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
上記アミノ酸が、非天然にコードされるアミノ酸である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
上記非天然にコードされるアミノ酸が、パラ‐アセチルフェニルアラニンである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
上記ｔＲＮＡが古細菌に由来する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
上記ｔＲＮＡがM. janneschiiに由来する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
翻訳系をさらに含んでいる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
上記翻訳系が無細胞翻訳系である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
上記翻訳系が細胞ライセートである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
上記翻訳系が再構成系である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
上記翻訳系が細胞翻訳系である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１９】
翻訳系を含んでいる細胞であって、該翻訳系が、請求項１に記載のｔＲＮＡを含んでいる細胞。
【請求項２０】
上記細胞が真核細胞である、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２１】
上記真核細胞が酵母細胞である、請求項２０に記載の細胞。
【請求項２２】
上記真核細胞が真菌細胞である、請求項２０に記載の細胞。
【請求項２３】
上記真核細胞が哺乳類細胞である、請求項２０に記載の細胞。
【請求項２４】
上記真核細胞が昆虫細胞である、請求項２０に記載の細胞。
【請求項２５】
上記真核細胞が植物細胞である、請求項２０に記載の細胞。
【請求項２６】
上記細胞が非真核細胞である、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２７】
上記非真核細胞がE. coli細胞である、請求項２６に記載の細胞。
【請求項２８】
興味のあるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドをさらに含んでおり、該ポリヌクレオチドは、ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含んでいる、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２９】
上記興味のあるポリペプチドが、ヒト成長ホルモンである、請求項２８に記載の細胞。
【請求項３０】
請求項１に記載のｔＲＮＡを含んでいるE. coli細胞。
【請求項３１】
請求項１に記載のｔＲＮＡを含んでいる酵母細胞。
【請求項３２】
請求項１に記載のｔＲＮＡを含んでいる真菌細胞。
【請求項３３】
請求項１に記載のｔＲＮＡを含んでいる哺乳類細胞。
【請求項３４】
請求項１に記載のｔＲＮＡを含んでいる昆虫細胞。
【請求項３５】
請求項１に記載のｔＲＮＡを含んでいる植物細胞。
【請求項３６】
配列番号１、２、３、それらに相補的なポリヌクレオチド配列、およびそれらの保存的変種からなる群から選ばれる核酸配列を有しているｔＲＮＡを、コードしているポリヌクレオチドを、含んでいるベクター。
【請求項３７】
上記ベクターが、プラスミド、コスミド、ファージ、またはウィルスを含んでいる、請求項３６に記載のベクター。
【請求項３８】
上記ベクターが発現ベクターである、請求項３６に記載のベクター。
【請求項３９】
請求項３６に記載のベクターを含んでいる細胞。
【請求項４０】
特定の位置に選択アミノ酸を有するポリペプチドを、細胞中において製造する方法であって、
適切な培養液中において細胞を成長させる工程と、選択アミノ酸を提供する工程とを含んでおり、
該細胞は、（ｉ）少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいるとともに、タンパク質をコードしている核酸、（ｉｉ）、細胞中において機能し、セレクターコドンを認識する直交化ｔＲＮＡ（Ｏ‐ｔＲＮＡ）、および（ｉｉｉ）直交化アミノアシル‐ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ‐ＲＳ）を含んでおり、
上記Ｏ‐ｔＲＮＡは、配列番号１、２、３、それらに相補的なポリヌクレオチド配列、およびそれらの保存的変種からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有しており、上記Ｏ‐ＲＳは、上記選択アミノ酸を用いて上記Ｏ‐ｔＲＮＡをアミノアシル化する、方法。
【請求項４１】
上記選択アミノ酸が、パラ‐アセチルフェニルアラニンである請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
請求項４０に記載の方法により製造されるポリペプチド。
【請求項４３】
上記選択アミノ酸がパラ‐アセチルフェニルアラニンである、請求項４０に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
上記ポリペプチドが、ヒト成長ホルモンである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
配列番号１、２、３、それらに相補的なポリヌクレオチド配列、およびそれらの保存的変種からなる群から選ばれる核酸配列を有しているポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔関連出願の相互参照〕
本出願は、米国仮特許出願第６０／７０９，３６４号明細書（２００５年８月１８日出願）の優先権を主張するものである。なお、上記明細書の全てが、本明細書に組み込まれる。
【０００２】
〔発明の分野〕
本発明は、翻訳生化学の分野に属する。本発明は、ｔＲＮＡを製造する方法およびｔＲＮＡ組成物、ならびにそれらの使用に関する。また、本発明は、上記ｔＲＮＡおよび関連する組成物を用いて、細胞中においてタンパク質を製造する方法に関する。
【０００３】
〔発明の背景〕
あらゆる知られた生物（細菌からヒトまで）の遺伝暗号は、２０の同じ共通のアミノ酸をコードしている。２０の同じ天然アミノ酸の異なる組み合わせから、複雑な生命活動（光合成からシグナル伝達および免疫反応まで）の全てを事実上司るタンパク質が形成される。タンパク質の構造と機能とを研究および修飾するために、科学者は、遺伝暗号とタンパク質のアミノ酸配列とを操作することを試みている。しかしながら、セレノシステインおよびピロリジンという稀な例外があるにせよ、遺伝暗号によって、２０の遺伝学的にコードされた標準の基礎的要素にタンパク質を限定するという制約が課され、この制約を除去することは困難であった。なお、セレノシステインについては、例えば「A. Bockら, (1991), Molecular Microbiology 5:515-20」を参照のこと。ピロリジンについては、例えば「G. Srinivasanら, (2002), Science 296:1459-62」を参照のこと。
【０００４】
これらの制約を除去するような進展が少しはあったが、この進展は限定されており、合理的にタンパク質の構造と機能とを制御する技術は、依然として未熟である。例えば、化学者は、低分子を合成する、および低分子の構造を操作する方法と戦略とを開発した（例えば、「E. J. Corey, & X.-M. Cheng, The Logic of Chemical Synthesis (Wiley-Interscience, New York, 1995)」を参照のこと）。全合成および半合成の方法論により、ペプチドと低分子タンパク質とを合成することが可能になったが、これら方法論は、１０キロダルトン（ｋＤａ）を越えるタンパク質についての実用性を制限している（なお、全合成の方法論は、例えば「B. Merrifield, (1986), Science 232:341-7 (1986)」、半合成の方法論は、例えば「D. Y. Jacksonら, (1994) Science 266:243-7」、および「P. E. Dawson, & S. B. Kent, (2000), Annual Review of Biochemistry 69:923-60」を参照のこと）。突然変異誘発法は、強力であるが、ある種の構造変化に制限される。多くの場合、タンパク質の至るところに共通アミノ酸に構造的に近縁な類似体を、競合的に組み込むことが可能である。例えば、「R. Furter, (1998), Protein Science 7:419-26」、「K. Kirshenbaumら, (2002), ChemBioChem 3:235-7」、および、「V. Doling ら, (2001), Science 292:501-4」を参照のこと。化学的なペプチドのライゲーション、および天然の化学ライゲーションは、米国特許第６，１８４，３４４号明細書、米国特許出願公開第２００４／０１３８４１２号明細書、米国特許出願公開第２００３／０２０８０４６号明細書、国際公開第０２／０９８９０２号パンフレット、および国際公開第０３／０４２２３５号パンフレットに記載されている。なお、これらの文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。Ｌｕらは、「MoI Cell. 2001 Oct;8(4):759-69」において、タンパク質と、非天然アミノ酸を含む合成ペプチドとを化学的にライゲーション（タンパク質のライゲーションと表現されている）する方法を記載した。
【０００５】
研究の初期において、E. coliの翻訳機構では、２０の共通アミノ酸と構造において類似しているアミノ酸が適応されることが実証された。「Hortin, G., and Boime, I. (1983) Methods Enzvmol. 96:777-784」を参照のこと。この研究は、内在性のE. coliシンテターゼの特異性を緩和することにより、さらに拡張された。これにより、上記シンテターゼが、非天然アミノ酸および該非天然アミノ酸と同種の天然アミノ酸を活性化することができた。さらに、編集ドメインにおける突然変異を利用して、内在性シンテターゼの基質範囲を拡張できることが示された。「Doring, V.ら, (2001) Science 292:501-504」を参照のこと。しかしながら、これらの戦略は、遺伝暗号を拡張するというよりは、むしろ遺伝暗号を再コードすることに限定されている。また、上記戦略では、１つの非天然アミノ酸が２０の共通アミノ酸のうちの１つと置換されるときに、様々な程度の置換がもたらされる。
【０００６】
その後、研究が進むにつれて、インビトロにおいて、非天然アミノ酸を、タンパク質中に部位特異的に組み込むことが可能になった。これは、化学的にアミノアシル化された直交化アンバーサプレッサーｔＲＮＡを、インビトロにおける転写／翻訳反応に加えることにより実現された。例えば、「Noren, C. J.ら (1989) Science 244:182-188」、「Bain, J. D.ら, (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:8013- 8014」、「Dougherty, D. A. (2000) Curr. Opin. Chem. Biol. 4, 645-652」、「Cornish, V. W.ら (1995) Angew. Chem.. Int. Ed. 34:621-633」、「J. A. Ellmanら, (1992), Science 255:197- 200」、および、「D. Mendelら, (1995), Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure 24:435-462」を参照のこと。これらの研究は、リボソームおよび翻訳因子が、多くの非天然アミノ酸に適合する（異常な構造を有する非天然アミノ酸であっても適合する）ことを示している。不幸なことに、ｔＲＮＡを化学的にアミノアシル化することは困難であり、この処理の化学量論的性質が、生成され得るタンパク質量を厳しく制限していた。
【０００７】
非天然アミノ酸は、細胞にマイクロインジェクションされていた。例えば、非天然アミノ酸は、アフリカツメガエルの卵母細胞におけるニコチン性アセチルコリン受容体に導入された（例えば、「M.W. Nowakら (1998), In vivo incorporation of unnatural amino acids into ion channels in Xenopus oocyte expression system, Method Enzvmol. 293:504-529」）。このことは、化学的にミスアシル化された（misacylated）テトラヒメナ好熱菌のｔＲＮＡ（例えば「M.E. Saksら (1996), An engineered Tetrahymena tRNAGln for in vivo incorporation of unnatural amino acids into proteins by nonsense suppression, J. Biol. Chem. 271:23169-23175」を参照のこと）、および関連するｍＲＮＡをマイクロインジェクションすることによって実施された。また、「D.A. Dougherty (2000), Unnatural amino acids as probes of protein structure and function, Curr. Opin. Chem. Biol. 4:645-652」、および、「M. W. Nowak, P. C. Kearney, J. R. Sampson, M. E. Saks, C. G. Labarca, S. K. Silverman, W. G. Zhong, J. Thorson, J. N. Abelson, N. Davidson, P. G. Schultz, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Science, 268:439 (1995)」も参照のこと。アフリカツメガエルの卵母細胞に、インビトロにおいて作製された２種のＲＮＡが、同時注入された（この２種のＲＮＡとは、興味のあるアミノ酸の位置に終止コドン（ＵＡＧ）を有し、標的タンパク質をコードしているｍＲＮＡ、および、所望の非天然アミノ酸を有し、アミノアシル化されたアンバーサプレッサーｔＲＮＡである）。その後、上記卵母細胞の翻訳機構は、ＵＡＧによって指定された位置に、非天然アミノ酸を挿入する。不幸なことに、この方法論は、マイクロインジェクションされ得る細胞中のタンパク質を限定する。また、関連するｔＲＮＡは、インビトロにおいて化学的にアシル化され、再アシル化されることはできないので、タンパク質の収率が非常に低い。
【０００８】
これらの限定を克服するために、新たな要素（例えば、直交化ｔＲＮＡ、直交化アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、およびそれらの対）を、原核生物のEscherichia coli（E. coli）（例えば「L. Wangら, (2001), Science 292:498-500」を参照のこと）、および真核生物のSacchromyces cerevisiae（S. cerevisiae）（例えば、「J. Chinら, Science 301:964-7 (2003)」を参照のこと）のタンパク質生合成機構に加えられた。これにより、インビボにおいて、遺伝的にコードされていないアミノ酸をタンパク質に組み込むことが可能になった。この方法論を用いることにより、新規の化学的、物理的または生物的特性を有する多くの新しいアミノ酸（光親和性標識されたアミノ酸、光異性化性アミノ酸、光架橋性アミノ酸（例えば、「Chin, J. W.ら(2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99:11020-11024」、および、「Chin, J. W.ら(2002) J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027」を参照のこと）、ケトアミノ酸（例えば、「Wang, L.ら(2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100:56-61」および「Zhang, Z.ら Biochem. 42(22):6735-6746 (2003)」を参照のこと）、重原子含有アミノ酸、ならびにグリコシル化アミノ酸など）が、アンバーコドン（ＴＡＧ）などに応じて、E. coliおよび酵母中において、タンパク質に効率よく、かつ高い忠実性でもって組み込まれた。例えば、「J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 3(11):1135-1137」、および、「L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem. Comm., 1;1-11」を参照のこと。
【０００９】
いくつかの他の直交化の対が、報告されている。S. cerevisiaeのｔＲＮＡおよびシンテターゼに由来するグルタミニル（例えば、「Liu, D. R., and Schultz, P. G. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96:4780-4785」を参照のこと）、アスパルチル（例えば、「Pasrrnak, M.ら (2000) Helv. Chim. Acta 83:2277-2286」を参照のこと）、およびチロシル（例えば、「Ohno, S.ら, (1998) J. Biochem. (Tokyo, Jpn.) 124:1065-1068」、および、「Kowal, A. K.ら, (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98:2268-2273」を参照のこと）の系が、E. coliにおいて非天然アミノ酸を組み込むことができる可能性について記載されている。また、E. coliのグルタミニル（例えば「Kowal, A. K.ら, (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98:2268-2273」を参照のこと）、および、チロシル（例えば、「Edwards, H., and Schimmel, P. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:1633-1641」を参照のこと）のシンテターゼのS. cerevisiaeにおける使用について記載されている。E. coliのチロシルの系は、３‐イオド‐Ｌ‐チロシンを、インビボにおいて組み込むために用いられている。「Sakamoto, K.ら, (2002) Nucleic Acids Res. 30:4692-4699」を参照のこと。通常、これらの系は、アンバー終止コドンを利用している。遺伝暗号をさらに拡張するために、改善および／または追加された生合成機構の要素（例えばｔＲＮＡ）を開発することが必要である。本発明は、上記必要性および他の必要性を満足させるものであり、以下の開示を校閲することにより明らかになるだろう。
【００１０】
〔本発明の要旨〕
遺伝暗号を拡張するために、本発明は、直交化ｔＲＮＡの組成物、および直交化ｔＲＮＡを製造する方法を提供する。アミノアシル‐ｔＲＮＡシンテターゼは、非天然にコードされるアミノ酸を用いて本発明のｔＲＮＡをアミノアシル化する。この翻訳要素を用いて、選択アミノ酸（選択されたアミノ酸）を、（核酸を翻訳する間の）成長中のポリペプチド鎖の特定の位置に、上記ｔＲＮＡによって認識されるセレクターコドンに応じて、組み込むことができる。
【００１１】
また、特定の位置に選択アミノ酸を有するタンパク質を、細胞中において製造する方法も、本発明の特徴である。例えば、本発明の方法は、適切な培養液中において細胞を成長させる工程と、選択アミノ酸を提供する工程とを含んでおり、該細胞は、少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいるとともに、タンパク質をコードしている核酸を含んでいる方法である。また、上記細胞は、（ｉ）細胞中において機能し、セレクターコドンを認識する直交化ｔＲＮＡ（Ｏ‐ｔＲＮＡ）、および（ｉｉ）選択アミノ酸を用いて該Ｏ‐ｔＲＮＡを選択的にアミノアシル化する、直交化アミノアシル‐ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ‐ＲＳ）をさらに含んでいる。通常、Ｏ‐ｔＲＮＡは、同種のシンテターゼの存在下における抑制活性を有している。この方法によって製造されるタンパク質も、本発明の特徴である。
【００１２】
〔図面の簡単な説明〕
図１は、ＴΨＣステムの突然変異部位を有するＪ１７ｔＲＮＡのクローバー型構造を示す図である。
【００１３】
図２において、ヒト成長ホルモンにおけるアンバー突然変異の抑制が、Ｊ１７またはＪ１７突然変異体（Ｆ１２、Ｆ１３、Ｆ１４）を用いて示されている。各試料の総細胞ライセートを、ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分析した。
【００１４】
図３において、Ｆ１３を用いたヒト成長ホルモンにおけるアンバー突然変異の抑制が、異なる細胞株について示されている。
【００１５】
〔定義〕
本発明を詳細に記述する前に、本発明は、特定の生物系に限定されず、また、特定の生物系は、当然に変更可能であることを理解されたい。また、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定され、本明細書で用いられる専門用語は、特定の実施の形態のみを記述する目的で用いられるのであって、本発明の範囲を限定することを意図ものではないことを理解されたい。本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という単数形の形態は、内容から明らかに分かるものを除いて、複数形の形態も含んでいる。しがたって、「a cell（１つの細胞）」は、２以上の細胞の組み合わせを含んでいるし、当業者に公知の同等物を含んでいる。「bacteria（複数の細菌）」の参照は、複数の細菌の混合物などを含んでいる。
【００１６】
本明細書および明細書の以下の注意において定義されない限り、本明細書で用いられた全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術における当業者の一人によって、一般的に理解される意味と同じ意味を有している。
【００１７】
本明細書で言及されている全ての刊行物および特許は、参照によって本明細書に組み込まれる。これは、今まさに記載されている発明と一緒に用いられ得る、上記刊行物に記載のコンストラクトや方法論などを、記載および開示することを目的としている。本明細書で検討されている刊行物は、本出願の出願日よりも前の開示だけを提供するものである。本明細書では、先行発明の長所または他の如何なる理由によって、本発明らが、上記開示よりも先行している資格を与えられないことを、承認していると解釈されることはない。
【００１８】
「相同（Homologous）」
タンパク質および／またはタンパク質配列が、共通の先祖タンパク質もしくはタンパク質配列に、天然もしくは人工的に由来するとき、該タンパク質および／またはタンパク質配列は、「相同」である。同様に、核酸および／または核酸配列が、共通の先祖核酸もしくは核酸配列に、天然もしくは人工的に由来するとき、該核酸および／または核酸配列は、相同である。例えば、任意の天然に生じる核酸を、任意の利用可能な突然変異誘発法によって、１以上のセレクターコドンを含むように、修飾することができる。その後、この突然変異を有する核酸を発現させたときに、該核酸は、１以上の選択アミノ酸（例えば非天然アミノ酸）を含んでいるポリペプチドをコードしている。当然、突然変異処理により、１以上の標準コドンをさらに変更することができ、これにより、得られる突然変異タンパク質において１以上の標準アミノ酸を変えることもできる。１以上の標準アミノ酸を、非天然アミノ酸に変更してもよいし、あるいは天然アミノ酸に変更してもよい。相同性は、一般的に、２以上の核酸もしくはタンパク質（またはそれらの配列）間の配列類似性に基づいて推測される。相同性を表すことに利用される配列間の類似性の正確な百分率は、問題となる核酸およびタンパク質により変化するが、２５％程度の低さの配列類似性は、相同性を表すことに通常用いられる。また、より高い値の配列類似性（例えば、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、もしくはそれ以上）を用いて、相同性を表すこともできる。配列類似性の百分率を決定する方法（例えば、既定のパラメーターを用いるＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ）が、本明細書に記載されており、一般的に利用可能である。
【００１９】
「直交化（orthogonal）」
本明細書で用いられる用語「直交化」は、興味のある系（例えば翻訳系（細胞など））によって用いられるときに、効率が減少している分子（例えば、直交化ｔＲＮＡ（ＯｔＲＮＡ）および／または直交化アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ‐ＲＳ））のことをいう。直交化は、直交化ｔＲＮＡおよび／または直交化ＲＳが、興味のある翻訳系において機能することができない、あるいは、機能するが効率が減少していることをいい、例えば、効率が２０％よりも低い、１０％よりも低い、５％よりも低い、あるいは１％よりも低いことをいう。例えば、興味のある翻訳系における直交化ｔＲＮＡは、興味のある翻訳系の任意の内在性ＲＳによってアミノアシル化されるが、このときの効率は、内在性ＲＳによる内在性ｔＲＮＡのアミノアシル化と比較して、減少しているか、あるいはゼロになっている。別の例では、直交化ＲＳは、興味のある翻訳系において任意の内在性ｔＲＮＡをアミノアシル化するが、このときの効率は、内在性ＲＳによる内在性ｔＲＮＡのアミノアシル化と比較して、減少しているか、あるいはゼロになっている。第１直交化分子と一緒に機能する第２直交化分子を、細胞内に導入することができる。例えば、直交化ｔＲＮＡ／ＲＳの対は、細胞内において、一緒に機能する導入性相補要素を含んでおり、アミノアシル化の効率は、内在性の対応するｔＲＮＡ／ＲＳの対のそれに対して、例えば約５０％の効率、約６０％の効率、約７０％の効率、約７５％の効率、約８０％の効率、約８５％の効率、約９０％の効率、約９５％の効率、もしくは約９９％の効率、またはそれ以上の効率である。「直交性における改善」は、出発原料または天然に生じるｔＲＮＡもしくはＲＳと比較して、増強された直交性のことをいう。
【００２０】
「同種（ｃｏｇｎａｔｅ）」
用語「同種」は、一緒に機能する要素のことをいい、例えば、ｔＲＮＡとアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼとが挙げられる。また、上記要素を、相補的であるということもできる。
【００２１】
「選択的アミノアシル化」
用語「選択的アミノアシル化」は、Ｏ‐ＲＳが選択アミノ酸（例えば非天然アミノ酸）を用いてＯ‐ｔＲＮＡをアミノアシル化するときの効率（例えば、約７０％の効率、約７５％の効率、約８０％の効率、約８５％の効率、約９０％の効率、約９５％の効率、もしくは約９９％の効率、またはそれ以上の効率）のことをいう。この効率は、Ｏ‐ＲＳによる、Ｏ‐ｔＲＮＡを生成するために用いられる天然に生じるｔＲＮＡまたは出発原料のアミノアシル化と比較したときの値である。非天然アミノ酸は、その後、成長中のポリペプチド鎖に、高い忠実性でもって組み込まれる。上記忠実性としては、例えば、所定のセレクターコドンについて約７０％よりも高い効率、所定のセレクターコドンについて約７５％よりも高い効率、所定のセレクターコドンについて約８０％よりも高い効率、所定のセレクターコドンについて約８５％よりも高い効率、所定のセレクターコドンについて約９０％よりも高い効率、所定のセレクターコドンについて約９５％よりも高い効率、または、所定のセレクターコドンについて約９９％よりも高い効率である。
【００２２】
「セレクターコドン」
用語「セレクターコドン」は、Ｏ‐ｔＲＮＡによって翻訳過程において認識されるが、内在性ｔＲＮＡによっては認識されないコドンのことをいう。Ｏ‐ｔＲＮＡのアンチコドンループによって、ｍＲＮＡ上のセレクターコドンが認識され、Ｏ‐ｔＲＮＡのアミノ酸（例えば選択アミノ酸（非天然アミノ酸など））がポリペプチドのこの部位に組み込まれる。セレクターコドンとしては、例えば、ナンセンスコドン（終止コドン（アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドンを含むが、これらに限定されない）、４塩基以上のコドン、レアコドン、および／または、天然もしくは人工の塩基対に由来するコドンなどが挙げられるが、これらに限定されない。所定の系（天然の３塩基のコドンを用いないか、あるいは稀に用いる内因性の系）に付いて言えば、セレクターコドンは、天然の３塩基コドンのうちの１つを含んでいる。例えば、この系は、天然の３塩基のコドンを認識するｔＲＮＡを欠損している系、および／または、天然の３塩基のコドンがレアコドンである系を含んでいる。
【００２３】
「サプレッサーｔＲＮＡ」
サプレッサーｔＲＮＡは、所定の翻訳系において、セレクターコドンに応じたポリペプチド鎖へのアミノ酸の組み込みを、機構に提供するなどによって、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）における読み取りを変更するｔＲＮＡである。例えば、サプレッサーｔＲＮＡは、終止コドン、４塩基コドン、またはレアコドンなどのコドンを読み通すことができる。
【００２４】
「抑制活性」
用語「抑制活性」は、セレクターコドンを読み通すためのｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ）の能力のことをいう。抑制活性を、対照（例えば同種のシンテターゼを欠損しているもの）と比較したときに観察される活性の百分率として表すことができる。
【００２５】
「翻訳系」
用語「翻訳系」は、天然に生じるアミノ酸を、成長中のポリペプチド鎖（タンパク質）中に組み込むために必要な要素のことをいう。翻訳系の要素には、リボソーム、ｔＲＮＡ、シンテターゼ、ｍＲＮＡなどが含まれる。本発明の要素を、インビトロまたはインビボの翻訳系に加えることができる。翻訳系の例としては、非真核細胞（例えば、E. coliなどの細菌）、真核細胞（例えば、酵母細胞、哺乳類細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、昆虫細胞）、および／または、無細胞翻訳系（例えば、細胞ライセート）などが含まれるが、これらに限定されない。
【００２６】
翻訳系は、細胞翻訳系であってもよいし、無細胞翻訳系であってもよいし、原核細胞であってもよいし、真核細胞であってもよい。細胞翻訳系としては、所望の核酸配列を、ｍＲＮＡに転写し、該ｍＲＮＡを翻訳することができる全細胞調製物（透過化処理された細胞または細胞培養物）が挙げられるが、これに限定されない。また、無細胞翻訳系は、市販されているものを利用することができ、多くの異なる種類および系が公知である。無細胞翻訳系としては、原核生物のライセート（Escherichia coliのライセートなど）、および真核生物のライセート（小麦胚抽出物、昆虫細胞のライセート、ウサギの網状赤血球のライセート、ウサギの卵母細胞のライセート、およびヒト細胞のライセート）が挙げられるが、これらに限定されない。得られるタンパク質を、グリコシル化もしくはリン酸化するか、または他の修飾をするときは、真核細胞の抽出物あるいはライセートが好ましい。というのも、そのような修飾の多くは、真核細胞の系のみにおいて行うことが可能であるからである。上記抽出物およびライセートのいくつかは、市販されている（Promega; Madison, Wis.; Stratagene; La Jolla, Calif; Amersham; Arlington Heights, I11.; GIBCO/BRL; Grand Island, N. Y）。また、分泌タンパク質を翻訳することに有用である膜抽出物（ミクロソーム膜を含んでいるイヌの膵臓抽出物）を利用することもできる。
【００２７】
さらに、再構成翻訳系を使用してもよい。また、（ｉ）ライセート、または精製された翻訳因子が添加されたライセートの組み合わせ、および、（ｉｉ）精製された翻訳因子の混合物を用いて、ｍＲＮＡからタンパク質を翻訳することができる。上記翻訳因子としては、開始因子‐１（ＩＦ‐１）、ＩＦ‐２、ＩＦ‐３（αまたはβ）、伸長因子Ｔ（ＥＦ‐Ｔｕ）、または終結因子などが挙げられる。また、無細胞系と、転写／翻訳系とを組み合わせてもよい。この転写／翻訳系では、「Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubelら editors, Wiley Interscience, 1993)」に記載されているように、ＤＮＡが該系に導入されて、ｍＲＮＡに転写され、このｍＲＮＡが翻訳される。なお、上記文献は、これによって、参照により明確に組み込まれる。真核生物の転写系において転写されたＲＮＡは、異核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）の形態であってもよいし、５’末端にキャップ（７‐メチルグアノシン）および、３’末端にポリＡを有する成熟ｍＲＮＡであってもよい。成熟ｍＲＮＡは、特定の翻訳系において有利になり得る。例えば、キャップされたｍＲＮＡは、網状赤血球ライセートの系において高効率でもって翻訳される。
【００２８】
「選択アミノ酸」
用語「選択アミノ酸」は、任意の所望の天然に生じるアミノ酸、または非天然アミノ酸のことをいう。本明細書で用いられるような用語「非天然アミノ酸」または「非天然にコードされるアミノ酸」は、天然に生じる２０の共通アミノ酸のうちの１つ、セレノシステイン、もしくはピロリジンではない、任意のアミノ酸、修飾されたアミノ酸、および／またはアミノ酸類似体のことをいう。用語「非天然にコードされるアミノ酸」および「非天然アミノ酸」と同義的に用いられ得る他の用語は、「非天然アミノ酸」、「非天然に生じるアミノ酸」、ならびに、それらの様々にハイフンで繋げられたもの、およびハイフンで繋げられていないものである。また、用語「非天然にコードされるアミノ酸」としては、天然にコードされたアミノ酸（２０の共通アミノ酸、またはピロリジンおよびセレノシステインなどが含まれるが、これらに限定されない）の修飾（例えば翻訳後修飾）によって生じるが、天然では翻訳複合体により成長中のポリペプチド鎖に組み込まれないアミノ酸が挙げられるが、これに限定されない。上記非天然に生じるアミノ酸としては、Ｎ‐アセチルグルコサミニル‐Ｌ‐セリン、Ｎ‐アセチルグルコサミニル‐Ｌ‐トレオニン、およびＯ‐ホスホチロシンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
「誘導体形態」
本明細書で用いられるような用語「誘導体形態」は、特定の分子または生物からの情報を用いて単離または作製された要素のことをいう。
【００３０】
「陽性選択マーカー」または「陽性スクリーニングマーカー」
本明細書で用いられるような用語「陽性選択マーカー」または「陽性スクリーニングマーカー」は、該マーカーが存在するときに（例えば発現されたときに、活性化されるときになど）、陽性選択マーカーを有する細胞を、陽性選択マーカーを有さない細胞から識別することを実現するマーカーのことをいう。
【００３１】
「陰性選択マーカー」または「陰性スクリーニングマーカー」
本明細書で用いられるような用語「陰性選択マーカー」または「陰性スクリーニングマーカー」は、該マーカーが存在するときに（例えば発現されたときに、活性化されるときになど）、（例えば、所望の特性を有している細胞と比べた場合に）所望の特性を有していない細胞を識別することができるマーカーのことをいう。
【００３２】
「レポーター」
本明細書で用いらる用語「レポーター」は、興味のある系の標的要素を選択するために用いることができる要素のことをいう。例えば、レポーターとしては、抗生物質への耐性もしくは感受性をもたらす酵素（β‐ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などが挙げられるが、これらに限定されない）、蛍光性スクリーニングマーカー（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰなど）、ＹＦＰ、ＥＧＦＰ、ＲＦＰなどが挙げられるが、これらに限定されない）、発光性マーカー（ホタルのルシフェラーゼタンパク質などが挙げられるが、これに限定されない）、親和性に基づくスクリーニングマーカー、または、陽性もしくは陰性選択マーカー遺伝子（ｌａｃＺ、β‐ｇａｌ／ｌａｃＺ（β‐ガラクトシダーゼ）、ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）、ｈｉｓ３、ｕｒａ３、Ｉｅｕ２、またはＩｙｓ２など）が挙げられる。
【００３３】
「真核生物」
本明細書で用いられるような用語「真核生物」は、系統発生領域（phylogenetic domain）の真核生物上界に属する生物のことをいい、動物（哺乳類、昆虫、爬虫類、鳥類などが挙げられるが、これらに限定されない）、繊毛虫類、植物（単子葉植物、双子葉植物、藻類などが挙げられるが、これらに限定されない）、真菌、酵母、鞭毛虫、微胞子虫、原生生物などが挙げられる。
【００３４】
「非真核生物」
本明細書で用いられるような用語「非真核生物」は、真核生物ではない生物のことをいう。例えば、非真核生物は、系統発生領域の真正細菌（Escherichia coli, Thermus thermophilus, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putidaなどが挙げられるが、これらに限定されない）、または、系統発生領域の古細菌（例えば、Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium(Haloferax volcaniiおよびHalobacterium種のNRC-1など), Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii, Aeuropyrum pernixなど）に属している。
【００３５】
「保存的バリアント」
用語「保存的バリアント」は、保存的バリアントの基になっている要素（例えばＯ‐ｔＲＮＡ、またはＯ‐ＲＳ）と同様の機能をするが、配列が異なる翻訳要素（例えば保存的バリアントであるＯ‐ｔＲＮＡ、または保存的バリアントであるＯ‐ＲＳ）のことをいう。例えば、Ｏ‐ＲＳが、相補的なＯ‐ｔＲＮＡ、または保存的バリアントであるＯ‐ｔＲＮＡを、選択アミノ酸（例えば非天然アミノ酸）を用いてアミノアシル化するが、上記Ｏ‐ｔＲＮＡ、または保存的バリアントであるＯ‐ｔＲＮＡは、同じ配列を有していない。同様に、ｔＲＮＡは、選択アミノ酸（例えば非天然アミノ酸）により、相補的なＯ‐ＲＳ、または保存的バリアントであるＯ‐ＲＳによってアミノアシル化されるが、上記Ｏ‐ＲＳおよびまたは保存的バリアントであるＯ‐ＲＳは、同じ配列を有していない。保存バリアントが、対応するＯ‐ｔＲＮＡまたはＯ‐ＲＳの相補的である限り、保存的バリアントは、例えば１つの変異、２つの変異、３つの変異、４つの変異、もしくは、５つの変異、あるいはそれ以上の変異を、配列中に有していてもよい。
【００３６】
「選抜剤」または「スクリーニング剤」
本明細書で用いられるような用語「選抜剤」または「スクリーニング剤」は、該剤が存在するときに、特定の要素を集団から選抜／スクリーニングすることができる剤のことをいう。例えば、選抜剤またはスクリーニング剤としては、栄養物、抗生物質、光の波長、抗体、または発現したポリペプチドなどが挙げられるが、これらに限定されない。また、選抜剤の濃度および強度などを変更することができる。
【００３７】
用語「効率よく認識されない」は、１つの生物に由来するＲＳが、Ｏ‐ｔＲＮＡをアミノアシル化するときの効率であって、例えば、約１０％よりも低い効率、約５％よりも低い効率、または約１％よりも低い効率のことをいう。
【００３８】
〔発明の詳細な説明〕
１以上の選択アミノ酸（例えば非天然アミノ酸）を含んでいるタンパク質の作製に適切な翻訳系は、「METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA-AMINOACYL tRNA SYNTHETASE PAIRS」と題された米国特許出願第１０／１２６，９３１号明細書、および、「IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS．」と題された米国特許出願第１０／１２６，９２７号明細書に記載されている。また、これらの他に、「EXPANDING THE EUKARYOTIC GENTIC CODE．」と題された米国特許出願第１０／８２５，８６７号明細書も参照のこと。これら出願は、それぞれ、その全てが参照によって本明細書に組み込まれる。上記翻訳系は、一般的に、直交化ｔＲＮＡ（Ｏ‐ｔＲＮＡ）、直交化アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ‐ＲＳ）、および選択されたアミノアシル（例えば非天然アミノ酸）を含んでいる細胞を含有しており、該Ｏ‐ＲＳは、選択アミノ酸を用いてＯ‐ｔＲＮＡをアミノアシル化するものである。本発明の直交化の対は、Ｏ‐ｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ、またはフレームシフトｔＲＮＡなど）およびＯ‐ＲＳから構成されている。Ｏ‐ｔＲＮＡは、第１セレクターコドンを認識し、同種のシンテターゼの存在下におけるセレクターコドンに応じた抑制活性を有している。細胞は、上記要素を用いて、選択アミノ酸を、成長中のポリペプチド鎖に組み込む。また、例えば、興味のあるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含んでいる核酸は、存在してもよく、該ポリヌクレオチドはＯ‐ｔＲＮＡによって認識されるセレクターコドンを含んでいる。また、翻訳系はインビトロの系であってもよい。本発明のｔＲＮＡ分子は、任意の翻訳系（翻訳においてリボソームを利用する系など）において有効である。
【００３９】
また、翻訳系は、インビトロの無細胞翻訳系であってもよい。この系は、鋳型としてｍＲＮＡ（インビトロでの翻訳）か、または鋳型としてＤＮＡ（インビトロでの転写と翻訳との組み合わせ）のどちらかを含んでおり、インビトロの合成は、リボソームにより管理される。無細胞のタンパク質発現系を開発するために、相当な努力が費やされた。例えば、「Kim, D.M. and J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 74 :309-316 (2001)」、「Kim, D.M. and J.R. Swartz, Biotechnology Letters, 22, 1537-1542, (2000)」、「Kim, D.M., and J.R. Swartz, Biotechnology Progress, 16, 385-390, (2000)」、「Kim, D.M., and J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 66, 180-188, (1999)」、および「Patnaik, R. and J.R. Swartz, Biotechniques 24, 862-868, (1998)」、米国特許第６，３３７，１９１号明細書、米国特許出願公開第２００２／００８１６６０号明細書、国際公開第００／５５３５３号パンフレット、国際公開第９０／０５７８５号パンフレットを参照のこと。なお、これらの文献は、参照により本明細書に組み込まれる。適用され得る他のアプローチには、ｍＲＮＡ‐ペプチド融合技術が含まれる。例えば、「R. Roberts and J. Szostak, Proc. Natl Acad. Sci. (USA) 94:12297-12302 (1997)」、「A. Frankelら, Chemistry & Biology 10:1043-1050 (2003)」を参照のこと。このアプローチでは、ピューロマイシンに連結されたｍＲＮＡの鋳型が、リボソームにおいてペプチドに翻訳される。１以上のｔＲＮＡが、修飾されている場合、同様に非天然のアミノ酸をペプチドに組み込むことができる。ｍＲＮＡの最後のコドンを読んだ後に、ピューロマイシンにより、ペプチドのＣ末端が捕らえられる。生じたｍＲＮＡ‐ペプチド接合体が、インビトロのアッセイにおいて、興味深い特性を有していることを発見された場合、ｍＲＮＡの配列から該接合体を、容易に同定することができる。このようにして、１以上の非天然にコードされるアミノ酸を含むポリペプチドのライブラリーをスクリーニングして、所望の特性を有するポリペプチドを同定することができる。最近では、精製要素を用いたインビトロのリボソームによる翻訳により、非天然にコードされるアミノ酸で置換されたペプチドを合成できることが、報告された。例えば「A. Forsterら, Proc. Natl Acad. Sci. (USA) 100:6353 (2003)」を参照のこと。
【００４０】
特定の実施の形態では、本発明のｔＲＮＡを含んでいるE. coli細胞は、上記翻訳系を含んでいる。例えば、本発明のE. coli細胞は、直交化ｔＲＮＡ（Ｏ‐ｔＲＮＡ）、直交化アミノアシル‐ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ‐ＲＳ）、選択アミノ酸、および興味のあるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含んでいる核酸を含有しており、上記Ｏ‐ｔＲＮＡは、セレクターコドンに応じた同種のシンテターゼの存在下における抑制活性を有し、上記ポリヌクレオチドは、Ｏ‐ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含んでいる。
【００４１】
また、本発明は、細胞中における複数のＯ‐ｔＲＮＡ／Ｏ‐ＲＳの対を特徴としている。これにより、２以上の選択アミノ酸を組み込むことができる。特定の実施の形態では、上記細胞は、別の異なるＯ‐ｔＲＮＡ／Ｏ‐ＲＳの対、および第２選択アミノ酸をさらに含んでおり、該Ｏ‐ｔＲＮＡは第２セレクターコドンを認識し、該Ｏ‐ＲＳは上記第２選択アミノ酸を用いて上記Ｏ‐ｔＲＮＡを選択的にアミノアシル化する。例えば、細胞は、Methanococcus jannaschiiのチロシル‐ｔＲＮＡシンテターゼに由来する、アンバーサプレッサーｔＲＮＡ‐アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの対などをさらに含んでいてもよい。
【００４２】
Ｏ‐ｔＲＮＡおよび／またはＯ‐ＲＳは、様々な生物から天然に生じるものであってもよいし、様々な生物から天然に生じるｔＲＮＡおよび／またはＲＳの突然変異によって得られるものであってもよい。上記突然変異としては、例えば、ｔＲＮＡのライブラリーおよび／またはＲＳのライブラリーを作製する突然変異が挙げられる。例えば、直交化ｔＲＮＡ／アミノアシル‐ｔＲＮＡシンテターゼの対を製造する１つの戦略には、異種のｔＲＮＡ／シンテターゼの対を、宿主細胞以外の１つの供給源または複数の供給源から、該宿主細胞に導入する工程を含んでいる。異種シンテターゼの候補の特性は、例えば任意の宿主細胞のｔＲＮＡに作用するものではなく、また異種ｔＲＮＡの候補の特性は、例えば任意の宿主細胞のシンテターゼによりアミノアシル化されないものである。さらに、異種ｔＲＮＡは、全ての宿主細胞のシンテターゼに対して直交である。
【００４３】
直交化の対を生成するための第２戦略は、突然変異ライブラリーを作製して、該突然変異ライブラリーからＯ‐ｔＲＮＡもしくはＯ‐ＲＳをスクリーニングおよび／または選抜する工程を含んでいる。また、上記戦略を組み合わせてもよい。
【００４４】
様々な実施の形態では、Ｏ‐ｔＲＮＡおよびＯ‐ＲＳは、少なくとも１つの生物に由来する。別の実施の形態では、Ｏ‐ｔＲＮＡは、第１生物において天然に生じるｔＲＮＡ、または天然に生じるｔＲＮＡが突然変異したｔＲＮＡに由来し、Ｏ‐ＲＳは第２生物において天然に生じるＲＳ、または天然に生じるＲＳが突然変異したＲＳに由来する。１実施の形態では、第１生物および第２生物は異なっている。例えば、直交化の対は、Methanobacterium thermoautotrophicumに由来するｔＲＮＡシンテターゼ、および古細菌のｔＲＮＡ（例えばHalobacterium sp. NRC-1）に由来するｔＲＮＡを含んでいてもよい。別の実施の形態では、第１生物および第２生物は同じである。なお、追加情報については、本明細書の「供給源および宿主生物」と題された項目を参照のこと。
【００４５】
本発明の特定の実施の形態では、本発明のＯ‐ｔＲＮＡは、（１）（ｉ）配列番号１、２または３で表されるポリヌクレオチド配列、あるいは（ｉｉ）それらに相補的なポリヌクレオチド配列または（ｉｉｉ）それらの保存的変種を含んでいるか、あるいは（２）それらによりコードされている。なお、本明細書の「核酸およびポリペプチドの配列、ならびにバリアント」と題された項目を参照のこと。
【００４６】
‐直交化ｔＲＮＡ（Ｏ‐ｔＲＮＡ）‐
直交化ｔＲＮＡ（Ｏ‐ｔＲＮＡ）は、Ｏ‐ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含んでいるポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質への、選択アミノ酸の組み込みを、例えばインビボまたはインビトロにおいて媒介するものである。本発明のＯ‐ｔＲＮＡを、任意の方法または技術により所望のアミノ酸を用いて、アミノアシル化してもよい。このアミノアシル化としては、化学的アミノアシル化または酵素的アミノアシル化が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のアミノアシル化Ｏ‐ｔＲＮＡを、翻訳系に直接加えてもよい。本発明のＯ‐ｔＲＮＡを、選択アミノ酸を用いてＲＳにより、インビトロまたはインビボにおいてアミノアシル化してもよい。また、上記ＲＳは、Ｏ‐ＲＳであってもよい。本発明のＯ‐ｔＲＮＡを、翻訳系に直接的に提供することができるし、あるいはＯ‐ｔＲＮＡもしくはその一部をコードしているポリヌクレオチドを提供することにより、翻訳系に提供することができる。上記翻訳系としては、例えば、インビトロの翻訳要素または細胞が挙げられる。例えば、Ｏ‐ｔＲＮＡまたはその一部は、配列番号１、２、または３で表されるポリヌクレオチド配列、あるいはそれに相補的なポリヌクレオチド配列またはそれの保存的変種によりコードされている。
【００４７】
本発明のＯ‐ｔＲＮＡは、同種シンテターゼの存在下におけるセレクターコドンに応じた抑制活性を有している。抑制活性を、技術的に知られている多くのアッセイの何れかにより決定することができる。例えば、β‐ガラクトシダーゼレポーターアッセイを用いることができる。プロモーターの制御下においてＬａｃＺ遺伝子を発現するプラスミドの誘導体が用いられる。該誘導体は、例えば、ｌａｃＺペプチドのＶＶＬＱＲＲＤＷＥＮにおけるＬｅｕ‐２５が、セレクターコドン（例えばＴＡＧ、ＴＧＡ、ＡＧＧＡなどのコドン）または、対照としてのセンスコドン（チロシン、セリン、ロイシンなどに対するセンスコドン）に置換されている。誘導化されたｌａｃＺプラスミドと本発明のＯ‐ｔＲＮＡを含んでいるプラスミドとを、適切な生物の細胞に導入する（該生物としては、例えば直交化の要素を用いることができる生物が挙げられる）。また、同種のシンテターゼを導入してもよい。このとき、同種シンテターゼは、ポリペプチドであってもよいし、または発現したときに該同種のシンテターゼをコードしているポリヌクレオチドであってもよい。上記細胞を培養液中において、所望の密度（例えばＯＤ６００が約０．５になるまで）まで成長させて、β‐ガラクトシダーゼアッセイを、ＢｅｔａＦｌｕｏｒ（登録商標）βガラクトシダーゼアッセイキット（β-Galactosidase Assay Kit (Novagen)）などを用いて実施する。抑制の百分率を、比較対照に対する試料の活性の百分率として計算する。この比較対照としては、例えば、誘導体化されたｌａｃＺコンストラクト（セレクターコドンではなく対応するセンスコドンを所望の位置に有しているコンストラクト）において観察された値が上げられる。
【００４８】
ｔＲＮＡ分子では、チミン（Ｔ）が、ウラシル（Ｕ）に置換されている。また、塩基へのさらに修飾が存在してもよい。また、本発明は、Ｏ‐ｔＲＮＡの保存的変種を含んでいる。例えば、Ｏ‐ｔＲＮＡの保存的変種は、Ｏ‐ｔＲＮＡと同様の機能をし、ｔＲＮＡのＬ字形構造を維持しているが、同じ配列を有していない分子を含んでいる。さらに、該保存的変種は、野生型ｔＲＮＡ分子以外の分子である。なお、「核酸およびポリペプチドの配列、ならびにバリアント」と題された項目を参照のこと。
【００４９】
Ｏ‐ｔＲＮＡを含んでいる組成物は、選択アミノ酸（非天然アミノ酸など）を用いてＯ‐ｔＲＮＡを選択的にアミノアシル化する直交化アミノアシル‐ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ‐ＲＳ）をさらに含有していてもよい。特定の実施の形態では、Ｏ‐ｔＲＮＡを含んでいる組成物は、翻訳系（インビトロまたはインビボの翻訳系など）をさらに含んでいてもよい。興味のあるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含んでいる核酸であって、該ポリヌクレオチドは、Ｏ‐ｔＲＮＡにより認識される１以上のセレクターコドンを含んでいる核酸、または１以上の該核酸の組み合わせは、細胞または他の翻訳系に存在してもよい。なお、本明細書の「直交化アミノアシル‐ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ‐ＲＳ）」と題された項目を参照のこと。
【００５０】
また、直交化ｔＲＮＡ（Ｏ‐ｔＲＮＡ）、Ｏ‐ｔＲＮＡなどを製造する方法も、本発明の特徴である。上記方法により製造されるｔＲＮＡ（Ｏ‐ｔＲＮＡなど）も本発明の特徴である。
【００５１】
直交化ｔＲＮＡを製造する方法は、セレクターコドンを認識することができるように、ｔＲＮＡの各プールのアンチコドンループを突然変異させて、複数の潜在的Ｏ‐ｔＲＮＡを提供する工程、および、該複数の潜在的Ｏ‐ｔＲＮＡのうちの１つの２次構造を分析して、２次構造における非標準塩基対を同定する工程を含んでいる。上記セレクターコドンとしては、例えば、アンバーコドン、オパールコドン、４塩基コドンなどが挙げられる。また、上記方法は、必要に応じて、非標準塩基対を突然変異させる工程を含んでいる（例えば、この工程では、非標準塩基対が、標準塩基対へと突然変異される）。非標準塩基対を、２次構造のステム領域に位置させることができる。Ｏ‐ｔＲＮＡは、所望のＲＳに対する親和性を維持したままで、その特徴または活性が１以上改善されていてもよい。例えば、Ｏ‐ｔＲＮＡの所望の生物についての直交性が、出発原料（複数のｔＲＮＡ配列）と比べて改善されていてもよい。
【００５２】
代替案では、１以上の分子（翻訳に影響を与えるか、もしくは翻訳機構の要素である分子）との相互作用または結合親和性を調節するために、公知のｔＲＮＡを突然変異させて、Ｏ‐ｔＲＮＡを発展させてもよい。上記要素としては、伸長因子が挙げられるが、これに限定されない。細菌の伸長因子であるＥＦ‐Ｔｕは、タンパク質合成における伸長工程において重要な役割を果たす分子である。ｔＲＮＡシンテターゼにより、ｔＲＮＡがアミノアシル化された後に、ＥＦ‐Ｔｕは、アミノアシル化ｔＲＮＡ（アミノアシル化されたｔＲＮＡ）に結合し、該ｔＲＮＡをリボソームへと導く。ＥＦ‐Ｔｕとアミノアシル化ｔＲＮＡとの結合により、荷電アミノ酸とｔＲＮＡとの間のエステル結合は、自然発生的加水分解から保護される。Ｓｔｏｒｔｃｈｅｖｏｉらは、E. coliの開始ｔＲＮＡｆＭｅｔのＴΨＣステムにおけるウォッブル塩基対（Ｕ５０：Ｇ６４）の変異を調査した。なぜなら、おそらくＥＦ‐Ｔｕ．ＧＴＰとアミノアシル化ｔＲＮＡとの間の相互作用が弱められることにより、この塩基対は、伸長においてｔＲＮＡの活性を妨害する負の２次決定因子になることが分かったからである（JBC 2003 278(20): 17672-17679）。ＬａＲｉｖｉｅｒｅらは、「Science 2001 Oct 5;294(5540): 165-8」に、ＥＦ‐Ｔｕへの総結合親和性に対する、アミノ酸およびｔＲＮＡ本体の熱力学的寄与を記載した。ＬａＲｉｖｉｅｒｅらによれば、ｔＲＮＡ本体およびアミノ酸の寄与は、互いに独立しており、それらの寄与は、ｔＲＮＡが正しくアシル化されたときに、互いに相殺するものであることが示された。ＥＦ‐Ｔｕ．ＧＴＰと非天然アミノ酸によりアミノアシル化されたｔＲＮＡとの相互作用を変えることにより、ｔＲＮＡをリボソームのＡ部位に積載する効率が変わることがある。また、ｔＲＮＡと他の翻訳機構の要素（ＥＦ‐Ｔｕなど）との複合体の結晶構造を分析することにより、潜在的変異部位が発見された。例えば、Ｎｉｓｓｅｎらは、ＥＦ‐Ｔｕ．ＧＴＰが、酵母のフェニルアラニル‐トランスファーＲＮＡ（Ｐｈｅ‐ｔＲＮＡ）のＴΨＣステムのリン酸骨格に直接結合することを示した（「Science 1995 270(5241): 1464-1472」）。
【００５３】
本発明の方法は、ｔＲＮＡおよび／またはアミノアシル‐ｔＲＮＡシンテターゼの相同性を分析して、特定の生物について直交であると考えられる、Ｏ‐ｔＲＮＡ、Ｏ‐ＲＳおよび／またはそれらの対の潜在的な候補を決定する工程を、必要に応じて含んでいる。公知のまたは本明細書に記載のコンピュータープログラムを、上記分析に用いることができる。１例を挙げると、原核生物に使用するための潜在的直交化翻訳要素を選ぶために、原核生物に対して異常な相同性を示さない、シンテターゼおよび／またはｔＲＮＡが選ばれる。
【００５４】
また、ｔＲＮＡのプールを、コンセンサス配列を利用する戦略から製造することができる。例えば、ｔＲＮＡのプールは以下の工程により製造される。すなわち、複数のｔＲＮＡ配列を整列させる工程、コンセンサス配列を決定する工程、および、コンセンサス配列の少なくとも１部、大部分、もしくは全てを用いてｔＲＮＡのライブラリーを作製する工程。例えば、コンセンサス配列を、コンピュータープログラム（ＧＣＧプログラムパイルアップ（GCG program pileup））を用いて編集することができる。必要に応じて、上記プログラムにより決定された縮重位置（degenerate position）を、該位置において最も頻繁な塩基に変える。ライブラリーを、コンセンサス配列を用いて公知の技術により合成する。例えば、オリゴヌクレオチドの重複伸長を用いて、ｔＲＮＡ遺伝子の各部位を、コンセンサス配列（９０％）と他の３塩基の混合物（１０％）とから構成されるドープされた混合物として合成し、上記コンセンサス配列に基づくライブラリーを提供することができる。また、他の混合物も用いることができる。例えば、コンセンサス配列（７５％）と他の３塩基の混合物（２５％）とから構成される混合物、コンセンサス配列（８０％）と他の３塩基の混合物（２０％）とから構成される混合物、ならびに、コンセンサス配列（９５％）と他の３塩基の混合物（５％）とから構成される混合物などが挙げられる。
【００５５】
突然変異ｔＲＮＡのライブラリーを、公知の様々な突然変異誘発技術を用いて作製することができる。例えば、突然変異ｔＲＮＡを、部位特異的突然変異誘発法、ランダム点変異誘発法、相同組み換え法、ＤＮＡシャッフリング法、または他の反復的な突然変異誘発法、キメラ体のコンストラクト、あるいは、それらの組み合わせにより作製することができる。
【００５６】
突然変異をさらに、ｔＲＮＡの所望のループもしくは領域における特定の位置（保存されていない位置、保存されている位置、無作為に選ばれる位置、またはそれらの組み合わせなど）に、導入してもよい。上記ｔＲＮＡの所望のループもしくは領域としては、例えば、アンチコドンループ、受容ステム、Ｄアームまたはループ、可変ループ、ＴΨＣアームまたはループ、ｔＲＮＡ分子の他の領域、あるいは、それらの組み合わせが挙げられる。突然変異は、ステム領域における一致した塩基対を含んでもよい。
【００５７】
通常、Ｏ‐ｔＲＮＡは、複数の潜在的Ｏ‐ｔＲＮＡのうちの１つを含んでいる第１種細胞の集団から陰性選抜を実施することにより得られる。陰性選抜により、上記細胞に内在のアミノアシル‐ｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化される複数の潜在的Ｏ‐ｔＲＮＡのうちの１つを含んでいる細胞が除去される。これにより、第１種細胞に対して直交であるｔＲＮＡのプールが得られる。
【００５８】
陰性選抜の特定の実施の形態では、セレクターコドンが、陰性選抜マーカーをコードしているポリヌクレオチドの重要ではない位置などに導入される。該マーカとしては、例えば、抗生物質への耐性を付与する酵素（β‐ラクタマーゼなど）、検出可能な産物を提供する酵素（β‐ガラクトシダーゼなど）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、バルナーゼ（barnase）などの毒性産物が挙げられる。スクリーニング／選抜を、選抜剤（例えば、アンピシリンなどの抗生物質）の存在下において、細胞集団を成長させることによって実施することができる。１実施の形態では、選抜剤の濃度を変更してもよい。
【００５９】
例えば、サプレッサーｔＲＮＡの活性を測定するために、選抜系が用いられる。この選抜系は、セレクターコドンのインビボにおける抑制（陰性選抜マーカーをコードしているポリヌクレオチド（β‐ラクタマーゼ（ｂｌａ）の遺伝子など）に導入されたナンセンス突然変異またはフレームシフト突然変異）に基づいている。例えば、特定の位置においてＴＡＧ、ＡＧＧＡ、およびＴＧＡを有するポリヌクレオチドのバリアント（ｂｌａのバリアント）を、コンストラクトする。細菌などの細胞を、これらのポリヌクレオチドを用いて形質転換する。内在性のE. coliシンテターゼから作用を効率よく受けない直交化ｔＲＮＡの場合、抗生物質耐性（アンピシリン耐性など）は、プラスミドにより形質転換されていない細菌のものとほぼ同じか、あるいはそれよりも低くなっているはずである。これに対し、ｔＲＮＡが直交でないか、ｔＲＮＡに作用することができる異種のシンテターゼが、系において共発現している場合、抗生物質（アンピシリンなど）へのより高い耐性が、観察される。プラスミドにより形質転換されていない細胞とほぼ同程度に、抗生物質入りのＬＢ寒天プレート上において成長することができない、細菌などの細胞を選択する。
【００６０】
毒性産物（リボヌクレアーゼのバルナーゼなど）の場合、複数の潜在的ｔＲＮＡのうちの１つは、宿主（Escherichia coliなど）における内在性のシンテターゼによりアミノアシル化されるときに（すなわち、複数の潜在的ｔＲＮＡのうちの１つは、宿主（Escherichia coli）のシンテターゼに対して直交ではない）、セレクターコドンは抑制され、毒性ポリヌクレオチド産物により細胞死が引き起こされる。一方、直交化ｔＲＮＡまたは非機能的ｔＲＮＡを収容する細胞は、生き残る。
【００６１】
１実施の形態では、所望の生物に対して直交であるｔＲＮＡのプールに、その後、陽性選抜を実施する。陽性選抜では、セレクターコドンを陽性選抜マーカーに配置する。陽性選抜マーカーとしては、例えば、薬物耐性遺伝子（β‐ラクタマーゼ遺伝子など）によりコードされるものが挙げられる。陽性選抜は、ｔＲＮＡのプールのうちの１つをコードしているか、あるいはこの１つを含んでいるポリヌクレオチド、陽性選抜マーカーをコードしているポリヌクレオチド、および、同種のＲＳをコードしているポリヌクレオチドを含んでいる細胞において実施される。これらのポリヌクレオチドを、細胞中に発現させ、それから該細胞を、アンピシリンなどの選抜剤の存在下において成長させる。その後、ｔＲＮＡを、共発現した同種のシンテターゼによりアミノアシル化される能力、および上記セレクターコドンに応じてアミノ酸を挿入する能力について選抜する。通常、上記細胞の抑制効率は、非機能的なｔＲＮＡ、または興味のあるシンテターゼにより効率的に認識され得ないｔＲＮＡを収容する細胞と比べて、増加する。非機能的なｔＲＮＡ、または興味のあるシンテターゼにより効率的に認識されないｔＲＮＡを収容する細胞は、抗生物質に対する感受性を有している。したがって、（ｉ）宿主（Escherichia coliなど）の内在性シンテターゼの基質ではなく、（ｉｉ）興味のあるシンテターゼによりアミノアシル化されることができ、（ｉｉｉ）翻訳において機能的である、ｔＲＮＡは両選抜において生き残る。
【００６２】
選抜（上記方法における陽性選抜、陰性選抜、または陽性および陰性選抜の両方など）のストリンジェンシーを、必要に応じて変えてもよい。例えば、バルナーゼは、非常に毒性の高いタンパク質であるので、バルナーゼ遺伝子に異なる数のセレクターコドンを導入すること、および／または、誘導性プロモーターを用いることにより陰性選抜のストリンジェンシーを制御してもよい。別の例では、選抜剤またはスクリーニング剤（アンピシリンなど）の濃度が変更される。１態様では、所望の活性が初期段階では低いことがあるので、ストリンジェンシーが変更される。したがって、より低いストリンジェンシーの選抜基準を、初期の段階で適用し、より高いストリンジェンシーの基準を、選抜の後期の段階で適用する。特定の実施の形態では、陽性選抜、陰性選抜、または陽性および陰性選抜の両方を、複数回にわたって繰り返し実施してもよい。複数の異なる陰性選抜マーカー、陽性選抜マーカー、または陽性および陰性選抜マーカーの両方を用いることができる。特定の実施の形態では、陰性選抜マーカーと陽性選抜マーカーとは同じであってもよい。
【００６３】
他の種類の選抜／スクリーニングを、直交化翻訳要素（Ｏ‐ｔＲＮＡ、Ｏ‐ＲＳ、およびＯ‐ｔＲＮＡ／Ｏ‐ＲＳの対など）を製造するための本発明に用いることができる。例えば、陰性選抜マーカー、陽性選抜マーカー、または陽性および陰性選抜マーカーの両方には、適切な反応物質の存在下において発光反応を触媒するか、または蛍光を発するマーカーが含まれる。別の実施の形態では、マーカーの産物は、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）または発光により検出される。必要に応じて、上記マーカーは、親和性に基づくスクリーニングマーカーを含んでいてもよい。「Francisco, J. A.ら, (1993) Production and fluorescence-activated cell sorting of Escherichia coli expressing a functional antibody fragment on the external surface. Proc Natl Acad Sci U S A. 90:10444- 8」を参照のこと。
【００６４】
組み換え直交化ｔＲＮＡを製造する別の方法が、「Methods and Compositions for the Production of Orthogonal tRNA-Aminoacyl tRNA Synthetase Pairs」と題された米国特許出願１０／１２６，９３１号明細書、および「In vivo Incorporation of Unnatural Amino Acids」と題された米国特許出願１０／１２６，１２７号明細書、および「EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE」と題された米国特許出願第１０／８２５，８６７号明細書に開示されている。また、「Forsterら, (2003) Programming peptidomimetic synthetases by translating genetic codes designed de novo. PNAS 100(11):6353-6357」、および、「Fengら, (2003), Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change, PNAS 100(10): 5676-5681」も参照のこと。
【００６５】
本発明のｔＲＮＡを、所望のアミノ酸を用いて、任意の方法または技術によりアミノアシル化してもよい。該アミノアシル化としては、化学的アミノアシル化または酵素的アミノアシル化などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
アミノアシル化を、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼにより、または他の酵素分子（リボザイムなど）により実施してもよい。用語「リボザイム」は、「触媒ＲＮＡ」と同義である。Ｃｅｃｈおよびその同僚（「Cech, 1987, Science, 236:1532- 1539」、「McCorkleら, 1987, Concepts Biochem. 64:221-226」）は、天然に生じるＲＮＡが、触媒として作用することを実証した（リボザイム）。しかし、これらの天然のＲＮＡ触媒は、リボ核酸基質に対して切断およびスプライシングの作用をすることが示されただけであったが、リボザイムの人工進化に対する最近の発展により、触媒のレパートリーが、様々な化学反応に拡張されている。研究により、アミノアシル‐ＲＮＡ結合を、自身の（２’）３’‐末端上に触媒することができるＲＮＡ分子（Illangakekareら, 1995 Science 267:643-647）、および１つのＲＮＡ分子からもう１つ別のＲＮＡ分子にアミノ酸を転移することができるＲＮＡ分子が同定された（Lohseら, 1996, Nature 381:442-444）。
【００６７】
米国特許出願公開２００３／０２２８５９３号明細書には、リボザイムをコンストラクトする方法、および、天然にコードされたアミノ酸、または非天然にコードされるアミノ酸を用いたｔＲＮＡのアミノアシル化におけるその使用が開示されている（なお、上記文献は、参照により本明細書に組み込まれる）。ｔＲＮＡをアミノアシル化することができる酵素分子（リボザイムなど）を基板に固相化することにより、アミノアシル化された産物を効率的に親和性精製することができる。適切な基板としては、例えば、アガロース、セファロース、および磁気ビーズが挙げられる。アミノアシル化するための基板に固相化された形体のリボザイムの製造、および使用は、「Chemistry and Biology 2003, 10:1077-1084」、および米国特許出願公開第２００３／０２２８５９３号明細書に記載されている（なお、これら文献は参照により本明細書に組み込まれる）。
【００６８】
シンテターゼを用いることなく、アミノアシル化する化学的アミノアシル化の方法には、特に限定されないが、以下の方法が含まれる。（１）Hechtおよびその同僚により導入された方法（「Hecht, S. M. Acc. Chem. Res. 1992, 25, 545」、「Heckler, T. G.; Roesser, J. R.; Xu, C.; Chang, P.; Hecht, S. M. Biochemistry 1988, 27, 7254」、「Hecht, S. M.; Alford, B. L.; Kuroda, Y.; Kitano, S. J. Biol. Chem. 1978, 253, 4517」）、ならびに（２）Schultz, Chamberlin, Dougherty、および（２）他の研究者により導入された方法（「Cornish, V. W.; Mendel, D.; Schultz, P. G. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995, 34, 621」、「Robertson, S. A.; Ellman, J. A.; Schultz, P. G. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 2722」、「Noren, C. J.; Anthony-Cahill, S. J.; Griffith, M. C.; Schultz, P. G. Science 1989, 244, 182」、「Bain, J. D.; Glabe, C. G.; Dix, T. A.; Chamberlin, A. R. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 8013」、「Bain, J. D.ら Nature 1992, 356, 537」、「Gallivan, J. P.; Lester, H. A.; Dougherty, D. A. Chem. Biol. 1997, 4, 740」、「Turcattiら, J. Biol. Chem. 1996, 271, 19991」、「Nowak, M. W.ら Science, 1995, 268, 439」、「Saks, M. E.ら J. Biol. Chem. 1996, 271, 23169」、「Hohsaka, T.ら J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 34」）。上記方法または他の化学的アミノアシル化方法を用いて、本発明のｔＲＮＡをアミノアシル化してもよい。
【００６９】
化学修飾されたアミノアシル‐ｔＲＮＡを用いる生物合成方法を用いて、インビトロにおいて合成されたタンパク質に、いくつかの生物物理的プローブが組み込まれてきた。以下の刊行物、および、該刊行物において引用されている参考文献を参照のこと。「Brunner, J. New Photolabeling and crosslinking methods, Annu. Rev Biochem, 62:483-514 (1993)」、および「Krieg, U.C., Walter, P., Hohnson, A.E. Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin of the 54- kilodalton polypeptide of the signal recognition particle, Proc. Natl. Acad. Sci, 83(22):8604- 8608 (1986)」。
【００７０】
以前から、非天然アミノ酸を、インビトロにおいてタンパク質に、部位特異的に組み込めることが示されている。これは、化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡを、所望のアンバーナンセンス突然変異を含んでいる遺伝子を用いてプログラムされたタンパク質合成反応に加えることにより実施されている。これらのアプローチを特定のアミノ酸について栄養要求性の株に対して用いることにより、２０の共通アミノ酸の多くを、構造的に近縁な相同物に置換することができる（例えば、フルオロフェニルアラニンをフェニルアラニンと置換することができる）。例えば、「Noren, C. J., Anthony-Cahill, Griffith, M.C., Schultz, P.G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science, 244: 182-188 (1989)」、「M.W. Nowakら, Science 268:439-42 (1995)」、「Bain, J.D., Glabe, C.G., Dix, T.A., Chamberlin, A.R., Diala, E. S. Biosynthetic site-specific Incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide, J. Am Chem Soc, 111:8013-8014 (1989)」、「N. Budisaら, FASEB J. 13:41-51 (1999); Ellman, J.A., Mendel, D., Anthony-Cahill, S., Noren, C. J., Schultz, P.G. Biosynthetic method for introducing unnatural amino acids site-specifically into proteins. Methods in Enz., vol. 202, 301-336 (1992)」、および、「Mendel, D., Cornish, V.W. & Schultz, P.G. Site- Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code, Annu Rev Biophys. Biomol Struct. 24, 435-62 (1995)」を参照のこと。
【００７１】
例えば、終止コドン（ＵＡＧ）を認識するサプレッサーｔＲＮＡが調製されて、該サプレッサーｔＲＮＡが、非天然アミノ酸を用いて化学的にアミノアシル化された。従来の部位特異的突然変異誘発法を用いて、終止コドン（ＴＡＧ）が、タンパク質の遺伝子における興味のある部位に導入された（例えば、「Sayers, J.R., Schmidt, W. Eckstein, F. 5’ -3’ Exonucleases in phosphorothioate-based olignoucleotide-directed mutagensis, Nucleic Acids Res, 16(3):791- 802 (1988)」を参照のこと）。アシル化されたサプレッサーｔＲＮＡと突然変異遺伝子とが、インビトロの転写／翻訳系において組み合わされたとき、非天然アミノ酸が、ＵＡＧコドンに応じて組み込まれた。これにより、アミノ酸を特定の位置に含んでいるタンパク質が得られた。［３Ｈ］‐Ｐｈｅを用いた実験、およびα‐ヒドロキシ酸を用いた実験により、所望のアミノ酸だけが、ＵＡＧコドンにより特定された位置に組み込まれること、ならびに、このアミノ酸は、タンパク質の他のどのような部位に組み込まれないことが実証された（例えば、「上記Ｎｏｒｅｎらの文献」、「Kobayashiら, (2003) Nature Structural Biology 10(6):425-432」、および「Ellman, J.A., Mendel, D., Schultz, P.G. Site-specific incorporation of novel backbone structures into proteins, Science, 255(5041):197-200 (1992)」を参照のこと）。
【００７２】
触媒ＲＮＡを作製するための方法は、無作為化されたリボザイム配列の別々になったプールを作製する工程、該プールに対して定方向進化（directed evolution）を実施する工程、所望のアミノアシル化活性をスクリーニングする工程、および、所望のアミノアシル化活性を示すリボザイムの配列を選抜する工程を含んでいてもよい。
【００７３】
リボザイムは、アシル化活性を促進するモチーフおよび／または領域（ＧＧＵモチーフおよびＵに富む領域（U-rich region）など）を含んでいてもよい。例えば、Ｕに富む領域は、アミノ酸基質の認識を促進できることや、ＧＧＵモチーフは、ｔＲＮＡの３’末端と塩基対を形成できることが報告されている。そこで、これらを組み合わせることにより、ＧＧＵモチーフおよびＵに富む領域は、アミノ酸とｔＲＮＡとの両方を同時に認識することが、同時に促進される。これにより、ｔＲＮＡの３’末端のアミノアシル化が促進される。
【００７４】
ｔＲＮＡＡｓｎＣＣＣＧと接合している部分的に無作為化されたｒ２４ｍｉｎｉを用いたインビトロの選抜を行い、その後、活性クローンに見出されるコンセンサス配列を体系的に操作することによって、リボザイムを作製することができる。この方法により得られる典型的なリボザイムは、「Ｆｘ３リボザイム」と呼ばれ（米国特許出願公開第２００３／０２２８５９３号明細書に記載されている（この文献の内容は、参照によって本明細書に組み込まれる））、同種の非天然アミノ酸により作用を受ける様々なアミノアシル‐ｔＲＮＡを合成するための多目的酵素としてはたらく。
【００７５】
基板上への固相化を用いて、アミノアシル化されたｔＲＮＡの親和性精製を効率的に実施することができる。適切な基板としては、例えば、アガロース、セファロース、および磁気ビーズが挙げられるが、これらに限定されない。リボザイムを、ＲＮＡの化学的構造の長所を活かして、樹脂に固相化することができる。例えば、ＲＮＡのリボースにおける３’‐シス‐ジオールを、過ヨウ素酸塩により酸化して、対応するジアルデヒドを作製することにより、樹脂上へのＲＮＡの固相化が促進される。様々な種類の樹脂（安価なヒドラジド樹脂など）を用いることができる。還元アミノ化により、樹脂とリボザイムとの間の相互作用を、不可逆結合にすることができる。アミノアシル‐ｔＲＮＡの合成を、このオン‐カラムアミノアシル化（on-column aminoacylation）により著しく促進することができる。Kourouklisら（Methods 2005; 36:239-4）は、カラムに基づくアミノアシル化の系を開示している。
【００７６】
アミノアシル化ｔＲＮＡの単離は、様々な方法により実施することができる。適切な方法の１つは、カラムから緩衝液によりアミノアシル化ｔＲＮＡを溶出することである。該緩衝液としては、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む酢酸ナトリウム溶液、５０ｍＭ  Ｎ‐（２‐ヒドロキシエチル）ピペラジン‐Ｎ’‐（３‐プロパンスルホン酸）、１２．５ｍＭ  ＫＣｌを含む緩衝液（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡあるいは、（ｉｉｉ）単純にＥＤＴＡにより緩衝化された水（ｐＨ７．０）などが挙げられる。
【００７７】
本発明のアミノアシル化ｔＲＮＡを翻訳反応に添加することにより、ｔＲＮＡのアミノアシル化に用いたアミノ酸を、上記翻訳反応により作製されるポリペプチドの所望の位置に組み込むことができる。本発明のアミノアシル化ｔＲＮＡは、翻訳系において使用してもよい。この翻訳系としては、例えば細胞ライセートが挙げられるが、これに限定されない。細胞ライセートには、投入したｍＲＮＡからポリペプチドをインビトロにおいて翻訳するのに必要な反応要素が含まれている。上記反応要素としては、例えば、リボソームタンパク質、ｒRNA、アミノ酸、ｔＲＮＡ、ＧＴＰ、ＡＴＰ、翻訳開始因子、翻訳伸長因子、および翻訳に関わる他の因子が挙げられるが、これらに限定されない。また、翻訳系は、バッチ翻訳または区画化翻訳であってもよい。バッチ翻訳系では、反応要素が１つの区画において混合される。これに対し、区画化翻訳系では、翻訳効率を阻害し得る反応産物から翻訳反応要素が分離される。上記翻訳系は、市販されている。
【００７８】
また、共役型転写／翻訳系を用いてもよい。共役型転写／翻訳系により、投入ＤＮＡから対応するｍＲＮＡへの転写と、反応要素によるその後の翻訳とを実施することができる。市販されている共役型転写／翻訳系としては、例えば、迅速翻訳系（Rapid Translation System (RTS, Roche Inc.)）が挙げられる。この系には、翻訳要素（リボソームおよび翻訳因子など）を提供するE. coliライセートを含有する混合物が含まれている。また、翻訳に用いられるｍＲＮＡの鋳型を、投入ＤＮＡから転写するためのＲＮＡポリメラーゼが含まれている。ＲＴＳでは、各反応区画（供給／消費区画、および転写／翻訳区画など）の間に設けられた膜により反応要素を区画化することができる。
【００７９】
ｔＲＮＡのアミノアシル化を、他の作用物質（トランスフェラーゼ、ポリメラーゼ、触媒抗体、多機能タンパク質など）により実施してもよい。
【００８０】
‐直交化アミノアシル‐ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ‐ＲＳ）‐
Ｏ‐ＲＳは、本発明のＯ‐ｔＲＮＡを、選択アミノ酸を用いてインビトロまたはインビボにおいて、選択的にアミノアシル化するものである。本発明のＯ‐ＲＳを、Ｏ‐ＲＳを含んでいるポリペプチド、および／またはＯ‐ＲＳもしくはその一部をコードしているポリヌクレオチドにより、翻訳系（インビトロの翻訳要素または細胞など）に提供することができる。Ｏ‐ＲＳまたはその一部は、ポリヌクレオチド配列、またはそれに相補的な配列、もしくはそれの保存的変種によりコードされている。本発明のＯ‐ｔＲＮＡは、多種多様なＯ‐ＲＳ分子（本明細書に開示のＯ‐ＲＳなど）によりアミノアシル化され得る。
【００８１】
また、Ｏ‐ｔＲＮＡ（Ｏ‐ｔＲＮＡなど）と一緒に用いるための直交化アミノアシル‐ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ‐ＲＳ）（Ｏ‐ＲＳなど）を同定する方法も、本発明の特徴である。例えば、本発明の方法は、第１種細胞集団を陽性選抜する工程を含んでおり、該細胞は、それぞれ（１）複数のアミノアシル‐ｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）のうちの１つ（該複数のＲＳは、突然変異ＲＳを含み、ＲＳは第１種以外の種に由来するか、または突然変異ＲＳおよびＲＳの両方は第１種以外に由来する）、（２）第２種に由来する直交化ｔＲＮＡ（Ｏ‐ｔＲＮＡ）、および（３）陽性選抜マーカーをコードし、かつ少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいるポリヌクレオチドを含んでいる方法である。複数のＲＳのうちの１つの量が減少しているか、またはこの１つを欠く細胞と比べて、抑制効率が増加している細胞を、選抜またはスクリーニングする。抑制効率が増加した細胞は、Ｏ‐ｔＲＮＡをアミノアシル化する活性型ＲＳを含んでいる。第１種に由来するｔＲＮＡの第１組が、活性型ＲＳによりインビトロまたはインビボにおいて、アミノアシル化されるときのレベルと、第２種に由来するｔＲＮＡの第２組が活性型ＲＳによりインビトロまたはインビボにおいて、アミノアシル化されるときのレベルとを比較する。アミノアシル化のレベルを、検出物質（標識アミノ酸、または標識非天然アミノ酸など）によって決定することができる。ｔＲＮＡの第１組と比べて、ｔＲＮＡの第２組をより効率的にアミノアシル化する活性型ＲＳを選抜することにより、Ｏ‐ｔＲＮＡと一緒に用いるための直交化アミノアシル‐ｔＲＮＡシンテターゼが提供される。上記方法により同定された、Ｏ‐ＲＳ（例えばＯ‐ＲＳ）も本発明の特徴である。
【００８２】
多くのアッセイの何れかを用いて、アミノアシル化を決定することができる。これらのアッセイは、インビトロまたはインビボにおいて実施してもよい。例えば、インビトロでのアミノアシル化アッセイは、例えば、「Hoben, P., and Soll, D. (1985) Methods Enzymol. 113:55-59」および、米国特許出願公開第２００３／０２２８５９３号明細書に記載されている。また、直交化翻訳要素と一緒にレポーターを用いて、タンパク質をコードしている少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいるポリヌクレオチドを発現する細胞における上記レポーターを検出することにより、アミノアシル化を決定することができる。また、「IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS」と題された米国特許出願第１０／１２６，９２７号明細書、および「EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE.」と題された米国特許出願第１０／８２５，８６７号明細書を参照のこと。
【００８３】
さらに、同定されたＯ‐ＲＳを操作して、シンテターゼの基質特異性を変更することができ、これにより、所望の非天然アミノ酸のみ（２０の共通アミノ酸ではない）をＯ‐ｔＲＮＡに作用させることができる。非天然アミノ酸に対する基質特異性を有する直交化アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを作製する方法は、（ａ）シンテターゼを突然変異させる工程、および（ｂ）選抜処理を実施する工程を含んでいる。上記（ａ）工程では、例えば、該シンテターゼの活性部位、該シンテターゼにおける編集機構の部位、または該シンテターゼの異なるドメインの組み合わせによる異なる部位などにおいて突然変異が誘発される。陽性選抜と陰性選抜とを組み合わせに基づく戦略を用いられ、この戦略では、陽性選抜の後に陰性選抜が実施される。陽性選抜では、陽性マーカーの重要ではない位置に導入されたセレクターコドンの抑制により、細胞は陽性の淘汰圧下において生存することができる。したがって、天然アミノ酸および非天然アミノ酸の両方の存在下において、生存物は、天然アミノ酸または非天然アミノ酸のどちらかを用いて、直交化サプレッサーｔＲＮＡに作用する活性型シンテターゼをコードしている。陰性選抜では、陰性マーカーの重要ではない位置に導入されたセレクターコドンの抑制により、天然アミノ酸への特異性を有しているシンテターゼが除去される。陰性選抜および陽性選抜の生存物は、非天然アミノ酸だけを用いて直交化サプレッサーｔＲＮＡをアミノアシル化（作用）するシンテターゼをコードしている。それから、上記シンテターゼに突然変異を誘発してもよい。突然変異を誘発する方法としては、例えば、ＤＮＡシャッフリング、または他の反復的な突然変異誘発法が挙げられる。
【００８４】
突然変異Ｏ‐ＲＳのライブラリーを、公知の様々な突然変異誘発技術を用いて作製することができる。例えば、部位特異的突然変異法、ランダム点変異法、相同組み換え法、ＤＮＡシャッフリング法、または他の反復的な突然変異誘発法、キメラ体のコンストラクト、あるいは、それらの組み合わせにより作製することができる。例えば、突然変異ＲＳのライブラリーを、２以上の他のライブラリー（規模がより小さく、多様性も低い「サブ‐ライブラリー」）から製造することができる。また、ＲＳのキメラライブラリーも本発明に含まれる。なお、様々な生物（例えば、微生物（真正細菌または古細菌など））からのｔＲＮＡシンテターゼのライブラリーを、必要に応じて、コンストラクトし、直交化の対をスクリーニングしてもよい。上記ライブラリーとしては、例えば、自然多様性を含んでいるライブラリーが挙げられる（例えば、米国特許第６，２３８，８８４号明細書（Shortら）；米国特許第５，７５６，３１６号明細書（Schallenbergerら）；米国特許第５，７８３，４３１号明細書（Petersenら）；米国特許第５，８２４，４８５号明細書（Thompsonら）；米国特許第５，９５８，６７２号明細書（Shortら）を参照のこと）。
【００８５】
シンテターゼを、陽性および陰性選抜／スクリーニング戦略に適用した後、これらのシンテターゼを、さらに突然変異誘発法に適用することができる。例えば、Ｏ‐ＲＳをコードしている核酸を単離することができる。突然変異したＯ‐ＲＳをコードしているポリヌクレオチドの組を、（ランダム点変異誘発法、部位特異的突然変異誘発法、相同組み換え、あるいは、それらの組み合わせなどにより）核酸から作製することができる。さらに、非天然アミノ酸を用いてＯ‐ｔＲＮＡを選択的にアミノアシル化する突然変異したＯ‐ＲＳが得られるまで、これらの個々の工程またはこれらの工程の組み合わせを、繰り返してもよい。本発明の１態様では、上記工程を、複数回（例えば、少なくとも２回）実施してもよい。
【００８６】
また、別のレベルの選抜／スクリーニングのストリンジェンシーを、Ｏ‐ｔＲＮＡ、Ｏ‐ＲＳまたはそれらの対を製造するための本発明の方法に用いることができる。選抜またはスクリーニングのストリンジェンシーを、上記方法における工程のうちの１つまたは両方において変更して、Ｏ‐ＲＳを製造することができる。このことは、例えば、用いられる選抜／スクリーニング剤の量を変更する工程などを含んでいる。また、陽性および／または陰性選抜を、さらに実施することができる。また、選抜またはスクリーニングは、アミノ酸の透過性の変更、翻訳効率の変更、翻訳忠実度の変更などを含む１以上の陽性または陰性選抜もしくはスクリーニングを含んでいてもよい。通常、１以上の変更は、生物中の１以上の遺伝子に誘発された突然変異に基づいている。上記生物では、直交化ｔＲＮＡ‐ｔＲＮＡシンテターゼの対により、タンパク質が製造される。
【００８７】
Ｏ‐ＲＳ、Ｏ‐ｔＲＮＡおよびＯ‐ｔＲＮＡ／Ｏ‐ＲＳの対のための他の種類の選抜を、本発明に用いることができる。陽性選抜マーカーは、分子（例えば、成長のための栄養補助物質を提供する産物など）のいずれかであり得る。そして、選抜は、上記栄養補助物質を欠く培養液において実施される。陽性選抜マーカーをコードしているポリヌクレオチドとしては、例えば、細胞のアミノ酸要求性の補充に基づくレポーター遺伝子、ｈｉｓ３遺伝子（例えば、ｈｉｓ３遺伝子は、イミダゾールグリセロールリン酸デヒドラターゼをコードしているので、３‐アミノトリアゾール（３‐ＡＴ）の提供により検出される）、ｕｒａ３遺伝子、Ｉｅｕ２遺伝子、Ｉｙｓ２遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ａｄｈ遺伝子などが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、「G. M. Kishore, & D. M. Shah, (1988), Amino acid biosynthesis inhibitors as herbicides, Annual Review of Biochemistry 57:627-663」を参照のこと。１実施の形態では、ｌａｃＺの産物は、オルソ‐ニトロフェニル‐β‐Ｄ‐ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）の加水分解により検出される。例えば、「I. G. Serebriiskii, & E. A. Golemis, (2000), Uses of lacZ to study gene function: evaluation of beta-galactosidase assays employed in the yeast two-hybrid system, Analytical Biochemistry 285:1-15」を参照のこと。また、別の陽性選抜マーカーとしては、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＥＧＦＰ、ＲＦＰ、抗生物質耐性遺伝子の産物（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ））、転写調節タンパク質（ＧＡＬ４など）などが挙げられる。また、必要に応じて、陽性選抜マーカーをコードしているポリヌクレオチドは、セレクターコドンを含んでいてもよい。
【００８８】
陽性選抜マーカーをコードしているポリヌクレオチドを、応答要素に機能的に連結することができる。また、応答要素からの転写を調節する転写調節タンパク質をコードし、かつ少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる別のポリヌクレオチドが、存在してもよい。非天然アミノ酸を転写調節タンパク質に、該非天然アミノ酸によりアミノアシル化されたＯ‐ｔＲＮＡによって組み込むことにより、陽性選抜マーカーをコードしているポリヌクレオチド（レポーター遺伝子など）を転写することができる。必要に応じて、セレクターコドンを、転写調節タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードしているポリヌクレオチドの一部、または該一部に十分近い位置に設けてもよい。
【００８９】
また、陰性選抜マーカーをコードしているポリヌクレオチドを、応答要素に機能的に連結することができる。これにより、この応答要素から、転写が転写調節タンパク質により媒介される。例えば、「A. J. DeMaggioら, (2000), The yeast split-hybrid system, Method Enzymol. 328:128-137」、「H. M. Shihら, (1996), A positive genetic selection for disrupting protein-protein interactions: identification of CREB mutations that prevent association with the coactivator CBP, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93:13896-13901」、「M. Vidalら, (1996), Genetic characterization of a mammalian protein-protein interaction domain by using a yeast reverse two-hybrid system, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93:10321- 10326」、および「Vidalら, (1996), Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detect dissociation of protein-protein and DNA-protein interactions (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93:10315-10320)」を参照のこと。天然アミノ酸を転写調節タンパク質に、該天然アミノ酸によりアミノアシル化されたＯ‐ｔＲＮＡによって組み込むことにより、陰性選抜マーカーを転写することができる。必要に応じて、陰性選抜マーカーは、セレクターコドンを含んでいてもよい。本発明の陽性選抜マーカーおよび／または陰性選抜マーカーは、少なくとも２つのセレクターコドンを含んでいてもよい。上記マーカーのそれぞれまたは両方は、少なくとも２つの異なるセレクターコドン、または少なくとも２つの同じセレクターコドンを含んでいてもよい。
【００９０】
転写調節タンパク質は、核酸配列（応答要素など）に直接的にまたは間接的に結合するとともに、上記応答要素に機能的に連結された配列の転写を調節する分子である。転写調節タンパク質は、転写活性化タンパク質（例えば、ＧＡＬ４、核ホルモン受容体、ＡＰＩ、ＣＲＥＢ、ＬＥＦ／ｔｃｆファミリーのメンバー、ＳＭＡＤ、ＶＰ１６、ＳＰｌなど）、転写抑制タンパク質（例えば、核ホルモン受容体、グロウチョ／ｔｌｅ（Groucho/tle）ファミリー、エングレイルド（Engrailed）ファミリーなど）、または、環境に依存して両方の活性を示すタンパク質（例えば、ＬＥＦ／ｔｃｆ、ホモボックスタンパク質など）であり得る。応答要素は、通常、転写調節タンパク質により認識される核酸配列、または転写調節タンパク質と強調して作用する別の作用物質である。
【００９１】
転写調節タンパク質の別の例は、転写活性化タンパク質であるＧＡＬ４である。例えば、「A. Laughonら, (1984), Identification of two proteins encoded by the Saccharomyces cerevisiae GAL4 gene, Molecular & Cellular Biology 4:268- 275」、「A. Laughon, & R. F. Gesteland, (1984), Primary structure of the Saccharomyces cerevisiae GAL4 gene, Molecular & Cellular Biology 4:260-267」、「L. Keeganら, (1986), Separation of DNA binding from the transcription-activating function of a eukaryotic regulatory protein, Science 231:699-704」、および、「M. Ptashne, (1988), How eukaryotic transcriptional activators work, Nature 335:683-689」を参照のこと。この８８１アミノ酸のタンパク質におけるＮ末端の１４７アミノ酸は、ＤＮＡ配列に特異的に結合するＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を形成する。例えば、「M. Careyら, (1989), An amino-terminal fragment of GAL4 binds DNA as a dimer, J. Mol. Biol. 209:423-432」、および「E. Giniger, ら, (1985), Specific DNA binding of GAL4, a positive regulatory protein of yeast, Cell 40:767-774」を参照のこと。上記ＤＢＤは、介在タンパク質配列を介して、活性化ドメイン（ＡＤ、Ｃ末端の１１３アミノ酸）に連結している。この活性化ドメインは、ＤＮＡに結合したときに転写を活性化できるドメインである。例えば、「J. Ma, & M. Ptashne, (1987), Deletion analysis of GAL4 defines two transcriptional activating segments, Cell 48:847-853」、および「J. Ma, & M. Ptashne, (1987), The carboxy-terminal 30 amino acids of GAL4 are recognized by GAL80, Cell 50:137-142」を参照のこと。ＧＡＬ４のＮ末端のＤＢＤとＣ末端のＡＤとを含んでいる１ポリペプチドのＮ末端のＤＢＤの近くなどに、アンバーコドンを配置することにより、Ｏ‐ｔＲＮＡ／Ｏ‐ＲＳの対によるアンバー抑制を、ＧＡＬ４による転写活性化と関連付けることができる。ＧＡＬ４により活性化されたレポーター遺伝子を用いて、該遺伝子による陽性および陰性選抜を実施することができる。
【００９２】
陰性選抜に用いられる培養液は、陰性選抜マーカーにより検出物質へと変換される選抜剤またはスクリーニング剤を含んでいてもよい。本発明の１態様では、検出物質は、毒性物質である。陰性選抜マーカーをコードしているポリヌクレオチドは、ｕｒａ３遺伝子などであり得る。例えば、ＵＲＡ３レポーターを、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合部位を含んでいるプロモーターの制御下に配置することができる。陰性選抜マーカーが、セレクターコドンを用いて、ＧＡＬ４をコードしているポリヌクレオチドの翻訳により製造されるとき、ＧＡＬ４はＵＲＡ３の転写を活性化する。陰性選抜は、５‐フルブロオロト酸（5-flubroorotic acid（５‐ＦＯＡ））を含む培養液において実施される。このとき、５‐ＦＯＡは、ｕｒａ３遺伝子の遺伝子産物により検出物質（例えば細胞を殺す毒性物質）へと変換される。例えば、「J. D. Boekeら, (1984), A positive selection for mutants lacking orotidme-5’-phosphate decarboxylase activity in yeast」、「5-fluoroorotic acid resistance, Molecular & General Genetics 197:(345-346)」、「M. Vidalら, (1996), Genetic characterization of a mammalian protein-protein interaction domain by using a yeast reverse two-hybrid system., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93:10321-10326」、および、「M. Vidalら, (1996), Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detect dissociation of protein- protein and DNA-protein interactions., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93:10315-10320」を参照のこと。
【００９３】
陽性選抜マーカーと同様に、陰性選抜マーカーも、様々な分子のうちの何れかであり得る。陽性選抜マーカーおよび／または陰性選抜マーカーは、適切な反応物質の存在下において発光反応を触媒するか、または蛍光を発するポリペプチドであってもよい。例えば、陰性選抜マーカーは、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＥＧＦＰ、ＲＦＰ、抗生物質耐性遺伝子の産物（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ））、ｌａｃＺ遺伝子の産物、転写調節タンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない。陽性選抜マーカーおよび／または陰性選抜マーカーは、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）または発光により検出されてもよい。陽性選抜マーカーおよび／または陰性選抜マーカーは、親和性に基づくスクリーニングマーカーを含んでいてもよい。同じポリヌクレオチドが、陽性選抜マーカーと陰性選抜マーカーとをコードしてもよい。例えば、陽性選抜工程、陰性選抜工程、またはそれらの工程の両方は、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）により検出されるレポーターを用いる工程を含んでいてもよい。例えば、陽性選抜を、陽性選抜マーカーを用いて最初に実施し、その後、陰性選抜スクリーニングを実施することができる。ここで、該陽性選抜マーカーが、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）である場合、ＣＡＴ遺伝子は、該遺伝子中にセレクターコドン（アンバー終止コドン）を含んでいる。また、陰性選抜スクリーニングは、陰性マーカー（例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子）内の位置のセレクターコドン（例えば２以上）を抑制できないことに基づいている。陽性選抜マーカーおよび陰性選抜マーカーを、同じベクター（プラスミドなど）に組み込むことができる。陰性マーカーの発現により、レポーター（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）など）が発現される。選抜およびスクリーニングのストリンジェンシーを、変えることができる。例えば、蛍光に必要な光の強度を変えることができる。陽性選抜を、ＦＡＣＳによりスクリーニングされる陽性選抜マーカーとしてのレポーターを用いて実施し、その後、陰性選抜スクリーニングを実施することができる。陰性選抜スクリーニングは、陰性マーカー（バルナーゼなど）内のある位置のセレクターコドン（例えば２以上）を抑制できないことに基づいている。
【００９４】
必要に応じて、上記レポーターは、細胞表面に展示される（ファージディスプレイなど）。細胞表面への展示（ＯｍｐＡに基づく細胞表面への展示系（OmpA-based cell-surface display system））は、特定のエピトープの発現に依存する。エピトープとしては、例えば、Escherichia coli細胞の表面における外膜のポーリンのＯｍｐＡに融合されるポリオウィルスＣ３のペプチドが挙げられる。タンパク質のメッセージにおけるセレクターコドンが、翻訳の間に抑制されるときのみに、上記エピトープは、細胞表面に展示される。その後、展示されたペプチドは、ライブラリーおける突然変異アミノアシル‐ｔＲＮＡシンテターゼの１つにより認識されるアミノ酸を含むので、対応するシンテターゼ遺伝子を含んでいる細胞を、特定の非天然アミノ酸を含むペプチドに対する抗体を用いて単離することができる。ＯｍｐＡに基づく細胞表面への展示系は、ファージディスプレイに代わるものとして、Georgiouらにより開発され、最適化された。例えば、「Francisco, J. A., Campbell, R., Iverson, B. L. & Georgoiu, G. Production and fluorescence-activated cell sorting of Escherichia coli expressing a functional antibody fragment on the external surface. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 90:10444-8 (1993) 」を参照のこと。
【００９５】
本発明の他の実施の形態は、インビトロにおける１以上の選抜段階を実行する工程を含んでいる。それから、選抜された要素（例えばシンテターゼおよび／またはｔＲＮＡ）を、インビボでの非天然アミノ酸の組み込みに用いる細胞に導入することができる。
【００９６】
Ｏ‐ＲＳの製造、およびシンテターゼの基質特異性の変更に関するさらに詳細な説明は、「Methods and Compositions for the Production of Orthogonal tRNA-Aminoacyl tRNA Synthetase Pairs」と題された米国特許出願第１０／１２６，９３１号明細書、および、「EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE,」と題された米国特許出願第１０／８２５，８６７号明細書に記載されている。なお、これら文献は参照により本明細書に組み込まれる。Ｏ‐ＲＳの製造に関するさらに詳細な説明は、「Hamano-Takakuら, (2000) A mutant Escherichia coli Tyrosyl-tRNA Synthetase Utilizes the Unnatural Amino Acid Azatyrosine More Efficiently than Tyrosine, Journal of Biological Chemistry, 275(51):40324-40328」、「Kigaら (2002), An engineered Escherichia coli tyrosyl-tRNA synthetase for site-specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in eukaryotic translation and its application in a wheat germ cell-free system, PNAS 99(15): 9715-9723」、および、「Francklynら, (2002), Aminoacyl-tRNA synthetases: Versatile players in the changing theater of translation; RNA, 8:1363-1372」に記載されている。なお、これら文献のそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９７】
‐供給源および宿主生物‐
本発明の翻訳要素は、通常、非真核生物に由来するものである。例えば、直交化Ｏ‐ｔＲＮＡは、例えば、非真核生物（古細菌（Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium(Haloferax volcaniiおよびHalobacterium種のNRC-1など)、Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii, またはAeuropyrum pernixなど）、あるいは、真正細菌（Escherichia coli, Thermus thermophilics, またはBacillus stearothermphilusなど）に由来し得る。一方、直交化Ｏ‐ＲＳは、非真核生物（例えば、Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium(Haloferax volcaniiおよびHalobacterium種のNRC-1など)、Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii, またはAeuropyrum pernixなど）、あるいは、真正細菌（Escherichia coli, Thermus thermophilus, またはBacillus stearothermphilusなど）に由来し得る。１実施の形態では、真核生物の供給源を用いることができ、例えば、植物、藻類、原生生物、真菌、酵母、動物（例えば、哺乳類、昆虫、節足動物など）、または同様のものなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９８】
Ｏ‐ｔＲＮＡ／Ｏ‐ＲＳの対の個々の要素は、同じ生物または異なる生物に由来し得る。１実施の形態では、Ｏ‐ｔＲＮＡ／Ｏ‐ＲＳの対は、同じ生物に由来している。別の実施の形態では、Ｏ‐ｔＲＮＡ／Ｏ‐ＲＳのＯ‐ｔＲＮＡとＯ‐ＲＳとは、異なる生物に由来している。例えば、Ｏ‐ｔＲＮＡは、Halobacterium sp NRC-Iなどに由来し得、Ｏ‐ＲＳは、Methanobacterium thermoautrophicumなどに由来し得る。
【００９９】
Ｏ‐ｔＲＮＡ、Ｏ‐ＲＳまたはＯ‐ｔＲＮＡ／Ｏ‐ＲＳの対を、インビボまたはインビトロにおいて選抜もしくはスクリーニングすることができるし、および／ならびに、細胞（非真核細胞（E. coli細胞など）または真核細胞など）に用いて、選択アミノ酸（非天然アミノ酸など）によりポリペプチドを製造することができる。非真核細胞は、例えば、様々な供給源（例えば、古細菌の系統発生領域（Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium(Haloferax volcaniiおよびHalobacterium種のNRC-1など), Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii,またはAeuropyrum pernixなど）に由来してもよいし、あるいは、真正細菌系統発生領域（Escherichia coli、Thermus thermophilus、Bacillus stearothermophilus、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas aeruginosa、またはPseudomonas putidaなど）に属してもよい。真核生物は、様々な供給源（植物（単子葉植物または双子葉植物などの複合植物）、藻類、原生生物、真菌、酵母（Saccharomyces cerevisiaeなど）、動物（哺乳類、昆虫、節足動物など）、または同様のものなどに由来してもよい。また、本発明の翻訳要素を有している細胞の組成物も本発明の特徴である。ある種におけるＯ‐ｔＲＮＡおよび／またはＯ‐ＲＳを、他の種に使用するためにスクリーニングすることについては、「Expanding the Eukaryotic Genetic Code」と題された、米国特許出願第１０／８２５，８６７号明細書を参照のこと。
【０１００】
興味のあるポリペプチドを、選択アミノ酸を用いて宿主細胞において発現させるために、興味のあるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、発現ベクターにサブクローンしてもよい。該発現ベクターは、転写を導くプロモーター、転写／翻訳ターミネーター、および核酸がタンパク質をコードしている場合は、翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含んでいる。適切な細菌のプロモーターは、公知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋらおよびＡｕｓｕｂｅｌらに記載されている。
【０１０１】
興味のあるポリペプチドを発現させるための細菌発現系は、例えば、特に限定されないが、E. coli, Bacillus sp., Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, およびSalmonella（「Palvaら, Gene 22:229-235 (1983)」、「Mosbachら, Nature 302:543-545 (1983)」）において利用可能である。上記発現系のためのキットも、市販されている。哺乳類細胞、酵母、および昆虫細胞に関する真核生物を利用した発現系も、公知であり、市販されている。
【０１０２】
本発明のｔＲＮＡおよび／またはＲＳ、ならびに／あるいは興味のあるポリペプチドを、適切な発現系に利用してもよいし、および／または該発現系において発現させてもよい。上記発現系としては、例えば、酵母、昆虫細胞、および細菌が挙げられる。典型的な発現系を以下に示す。
【０１０３】
（酵母）
本明細書で用いられるような用語「酵母」は、興味のあるポリペプチドを発現させることができる様々な酵母のうちの何れかを含んでいる。そのような酵母としては、子嚢胞子を生じる酵母（ascosporogenous yeasts (Endomycetales)）、担子胞子を生じる酵母（basidiosporogenous yeasts）、および不完全真菌（Blastomycetes）の群に属する酵母などが挙げられるが、これらに限定されない。上記子嚢胞子を生じる酵母は、２つのファミリー（SpermophthoraceaeおよびSaccharomycetaceae）に分けられる。後者は、４つのサブファミリー（Schizosaccharomycoideae（Schizosaccharomyces属など）, Nadsonioideae, Lipomycoideae, およびSaccharomycoideae（Pichia属、Kluyveromyces属、およびSaccharomyces属など））から構成されている。担子胞子を生じる酵母には、Leucosporidium属、Rhodosporidium属、Sporidiobolus属、Filobasidium属、およびFilobasidiella属が含まれる。不完全真菌（Blastomycetes）の群に属する酵母は、２つのファミリーSporobolomycetaceae（Sporobolomyces属およびBullera属など）、およびCryptococcaceae（Candida属など）に分けられる。
【０１０４】
本発明と一緒に使用するための特に興味のあるものは、Pichia属, Kluyveromyces属, Saccharomyces属, Schizosaccharomyces属, Hansenula属, Torulopsis属, およびCandida属に含まれる種であり、例えば、P. pastoris, P. guillerimondii, S. cerevisiae, S. carlsbergensis, S. diastaticus, S. douglasii, S. kluyveri, S, norbensis, S. oviformis, K. lactis, K. fragilis, C. albicans, C. maltosa, およびH. polymorphaが挙げられるが、これらに限定されない。酵母は、一般的に様々な供給源から入手でき、例えば、Yeast Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, University of California (Berkeley, CA), and the American Type Culture Collection (「ATCC」) (Manassas, VA）などから入手できる。
【０１０５】
用語「酵母宿主」または「酵母宿主細胞」は、組み換えベクターまたは他のトランスファーＤＮＡを受け入れることができるか、またはできた酵母を含んでいる。この用語は、組み換えベクターまたは他のトランスファーＤＮＡを受け入れた元々の酵母宿主細胞の子孫を含んでいる。１つの親細胞の子孫は、元々の親細胞と、形態、ゲノムＤＮＡまたは全ＤＮＡの補体（complement）において、必ずしも完全に一致していなくてもよいことを理解されたい。これは、偶発的な突然変異、または計画的な突然変異が発生するからである。親細胞の子孫は、関連する特性（興味のあるポリペプチドをコードしているポリペプチドが存在しているなど）により特徴付けられる親細胞と十分に類似しており、このような子孫は、ここの定義により意図される子孫に含まれる。
【０１０６】
発現ベクターおよび形質転換ベクター（染色体外レプリコンまたは組み込みベクターなど）は、多くの酵母宿主を形質転換するために開発された。例えば、発現ベクターは、S. cerevisiae （「Sikorskiら, GENETICS (1989) 122:19」、「Itoら, J. BACTERIOL. (1983) 153:163」、「Hinnenら, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1978) 75:1929」）、C. albicans （「Kurtzら, MOL. CELL. BIOL. (1986) 6:142」）、C. maltosa （「Kunzeら, J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25:141」）、H. polymorpha （「Gleesonら, J. GEN. MICROBIOL. (1986) 132:3459」、「Roggenkampら, MOL. GENETICS AND GENOMICS (1986) 202:302」）、K. fragilis （「Dasら, J. BACTERIOL. (1984) 158:1165」）、K. lactis （「De Louvencourtら, J. BACTERIOL. (1983) 154:737」、「Van den Bergら, BIOTECHNOLOGY (NY) (1990) 8:135」）、 P. guillerimondii （「Kunzeら, J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25:141」）、 P. pastoris （「米国特許第５，３２４，６３９号明細書、米国特許第４，９２９，５５５号明細書、および米国特許第４，８３７，１４８号明細書、「Creggら, MOL. CELL. BIOL. (1985) 5:3376」、Schizosaccharomyces pombe （「Beachら, NATURE (1982) 300:706」）、および Y. lipolytica; A. nidulans （「Balanceら, BlOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN. (1983) 112:284-89」、「Tilburnら, GENE (1983) 26:205-221」、および「Yeltonら, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1984) 81:1470-74」）、 A. niger （「Kelly and Hynes, EMBO J. (1985) 4:475-479」）、T. reesia （欧州特許出願公開第０２４４２３４号明細書）、および、糸状菌（例えばNeurospora、Penicillium、Tolypocladium（国際公開第９１／００３５７号パンフレット）など）のために開発された。なお、各文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０７】
酵母ベクターの制御配列は、当業者に公知であり、例えば、以下に列挙した遺伝子のプロモーター領域が挙げられるが、これらに限定されない。すなわち、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（欧州特許出願公開第０２８４０４４号明細書）、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース‐６リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド‐３‐リン酸‐デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰまたはＧＡＰＤＨ）、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３‐ホスホグリセリン酸ムターゼ、およびピルビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）（欧州特許出願公開第０３２９２０３号明細書）がなど挙げられる。また、ホスファターゼをコードしている酵母のＰＨＯ５遺伝子も、有用なプロモーター配列を提供し得る（Miyanoharaら, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1983) 80:1）。酵母宿主と一緒に使用するための他の適切なプロモーター配列には、３‐ホスホグリセリン酸キナーゼ（「Hitzemanら, J. BIOL. CHEM. (1980) 255:12073」）、および他の解糖系の酵素（ピルビン酸デカルボキシラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、およびホスホグルコースイソメラーゼ（「Hollandら, BIOCHEMISTRY (1978) 17:4900」、「Hessら, J. ADV. ENZYME REG. (1969) 7:149」）が含まれてもよい。成長条件により転写を制御できるという利点をさらに有する酵母の誘導性プロモーターは、以下に列挙するタンパク質のプロモーター領域を含んでいてもよい。すなわち、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド‐３‐リン酸デヒドロゲナーゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、および、マルトースとガラクトースの利用に関与する酵素である。また、酵母発現に使用するための適切なベクターおよびプロモーターは、欧州特許出願公開第００７３６５７号明細書に記載されている。
【０１０８】
また、酵母エンハンサーを、酵母プロモーターと一緒に用いてもよい。さらに、合成プロモーターを、酵母プロモーターとして機能させてもよい。例えば、酵母プロモーターの上流活性化配列（ＵＡＳ）を、別の酵母プロモーターの転写活性化領域に連結させて、合成混成プロモーターを作製してもよい。上記混成プロモーターとしては、例えば、ＧＡＰの転写活性化領域に連結されたＡＤＨ調節配列が挙げられる。米国特許第４，８８０，７３４号明細書、および米国特許第４，８７６，１９７号明細書を参照のこと。なお、この文献は参照により本明細書に組み込まれる。混成プロモーターの他の例としては、ＡＤＨ２、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０、またはＰＨＯ５遺伝子の調節配列と、解糖系酵素の遺伝子（ＧＡＰまたはＰｙＫなど）の転写活性化領域との組み合わせから成るプロモーターが挙げられる。欧州特許出願公開０１６４５５６号明細書を参照のこと。さらに、酵母プロモーターは、天然に存在するものであって、酵母のＲＮＡポリメラーゼに結合し、転写を開始させることができる酵母を起源としないプロモーターを含んでいてもよい。
【０１０９】
酵母発現ベクターの一部を構成してもよい他の制御要素はとしては、ターミネーター（例えば、ＧＡＰＤＨまたはエノラーゼ遺伝子に由来するもの（「Hollandら, J. BlOL. CHEM. (1981) 256:1385」））が挙げられる。さらに、２μプラスミドの起点に由来する複製起点は、酵母に適切である。酵母に用いるための適切な選抜遺伝子は、酵母プラスミドに存在するｔｒｐ１遺伝子である。「Tschumperら, GENE (1980) 10:157」、「Kingsmanら, GENE (1979) 7:141」を参照のこと。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファンにおいて成長することができない酵母の突然変異株についての選抜マーカーを提供する。同様にＬｅｕ２欠損酵母株（ＡＴＣＣ２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を生じる公知のプラスミドにより補完される。
【０１１０】
外因性ＤＮＡを酵母宿主に導入する方法は、当業者に公知である。該方法は、通常、アルカリ性陽イオンを用いて処理されたスフェロプラストまたは無傷の酵母宿主細胞を形質転換する工程を含んでいるが、これに限定されない。例えば、酵母の形質転換を、「Hsiaoら, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1979) 76:3829」および「Van Solingenら, J. BACT. (1977) 130:946」に記載の方法にしたがって、実施することができる。しかし、他の方法（核注入、エレクトロポレーション、または原形質融合などによってＤＮＡを細胞に導入する方法）も用いることができる。この方法は、例えば「SAMBROOKら, MOLECULAR CLONING: A LAB. MANUAL (2001)」に記載されている。それから、酵母縮主意細胞を、当業者に公知の標準技術を用いて培養してもよい。
【０１１１】
酵母宿主細胞における異種タンパク質を発現させる他の方法は、当業者に公知である。一般的に、以下の文献を参照のこと、米国特許出願公開第２００２／００５５１６９号明細書、米国特許第６，３６１，９６９号明細書、米国特許第６，３１２，９２３号明細書、米国特許第６，１８３，９８５号明細書、米国特許第６，０８３，７２３号明細書、米国特許第６，０１７，７３１号明細書、米国特許第５，６７４，７０６号明細書、米国特許第５，６２９，２０３号明細書、米国特許第５，６０２，０３４号明細書、および米国特許第５，０８９，３９８号明細書、米国再発行特許発明第ＲＥ３７，３４３号明細書、および米国再発行特許発明第ＲＥ３５，７４９号明細書、国際公開第９９／０７８６２号パンフレット、国際公開第９８／３７２０８号パンフレット、および国際公開第９８／２６０８０号パンフレット、欧州特許出願公開第０９４６７３６号明細書、欧州特許出願公開第０７３２４０３号明細書、欧州特許出願公開第０４８０４８０号明細書、国際公開第９０／１０２７７号明細書、欧州特許出願公開第０３４０９８６号明細書、欧州特許出願公開第０３２９２０３号明細書、欧州特許出願公開第０３２４２７４号明細書、および欧州特許出願公開第０１６４５５６明細書。また、「Gellissenら, ANTONIE VAN LEEUWENHOEK (1992) 62(l-2):79-93」、「Romanosら, YEAST (1992) 8(6):423-488」、「Goeddel, METHODS IN ENZYMOLOGY (1990) 185:3-7」を参照のこと。上記文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１２】
当業者に公知である標準の給飼バッチ発酵方法（feed batch fermentation method）を用いた増殖段階の間に、酵母宿主株を発酵槽において成長させてもよい。上記発酵方法を、特定の酵母宿主の炭素利用経路、または発現制御の様式の違いを説明するために適用してもよい。例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ酵母宿主の発酵は、１つのグルコース飼料、窒素源の複合体（カゼイン加水分解物など）、および複合ビタミン栄養補助物を必要としてもよい。これに対し、メチロトローフ酵母であるP. pastorisは、グリセロール、メタノール、および微量の無機化合物飼料を要求してもよく、最適な成長および発現については単純なアンモニウム（窒素）塩だけを要求する。例えば、米国特許第５，３２４，６３９号明細書、「Elliottら, J. PROTEIN CHEM. (1990) 9:95」、および「Fieschkoら, BIOTECH. BIOENG. (1987) 29:1113」を参照のこと。なお、これら文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１３】
しかし、上記発酵方法は、用いられる酵母宿主株とは無関係な特定の共通の特徴を有していてもよい。例えば、成長制限栄養素（通常は炭素）を、発酵槽に増幅段階の間に添加して、最大限の成長を引き出してもよい。さらに、発酵方法は、一般的に、十分な量の炭素、窒素、基本塩、リン、および他の微量栄養素（ビタミン、微量無機物、および塩など）を含むように調製された発酵培養液を用いてもよい。Ｐｉｃｈｉａに用いるのに適切な発酵培養液としては、例えば、米国特許第５，３２４，６３９号明細書、および米国特許第５，２３１，１７８号明細書に記載の発酵培養液を用いることができる。なお、これら文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１４】
（バキュロウィルス感染昆虫細胞）
用語「昆虫宿主」または「昆虫宿主細胞」は、組み換えベクターまたは他のトランスファーＤＮＡを受け入れることができるか、またはできた昆虫のことをいう。この用語は、形質転換された元々の昆虫宿主細胞の子孫も含む。１つの親細胞の子孫は、元々の親細胞と、形態、ゲノムＤＮＡまたは全ＤＮＡの補体において、必ずしも完全に一致していなくてもよいことを理解されたい。これは、偶発的な突然変異、または計画的な突然変異が発生するからである。親細胞の子孫は、関連する特性（興味のあるポリペプチドをコードしているポリペプチドが存在しているなど）により特徴付けられる親細胞と十分に類似しており、このような子孫は、ここの定義により意図される子孫に含まれる。
【０１１５】
興味のあるポリペプチドの発現のための適切な昆虫細胞の選抜は、当業者に公知である。また、いくつかの昆虫種は、公知であり、市販されている。そのような昆虫種としては、例えば、Aedes aegypti、Bombyx mori、Drosophila melanogaster、Spodoptera frugiperda、およびTrichoplusia niが挙げられる。発現のための昆虫宿主の選抜において、適切な宿主は、取り分け、分泌能力に優れ、タンパク質分解活性が低く、そして全体的に強健である宿主であってもよい。昆虫は、一般的に、様々な供給源から入手することができ、例えば、「Insect Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, University of California (Berkeley, CA)」、および「the American Type Culture Collection (「ATCC」) (Manassas, VA)」から入手することができるが、これらに限定されない。
【０１１６】
一般的に、バキュロウィルス‐感染昆虫の発現系の要素には、トランスファーベクター、野生型バキュロウィルス、適切な昆虫宿主細胞、および成長培養液が含まれる。上記トランスファーベクターは、通例、細菌のプラスミドであり、このプラスミドは、バキュロウィルスのゲノムの断片と、発現される異種遺伝子の挿入に便利な制限酵素認識部位とを含んでいる。また、上記野生型バキュロウィルスは、トランスファーベクター中のバキュロウィルスに特異的な断片に相同な配列を有しており、これにより、異種遺伝子のバキュロウィルスゲノムへの相同組み換えが可能になる。ベクター、細胞へのトランスフェクション、プラークの採集、または培養液中での細胞の成長などに用いられる材料、方法および技術は公知であり、記載されているこれらの技術を利用することができる。
【０１１７】
異種遺伝子を、トランスファーベクターに挿入した後、該ベクターおよび野生型ウィルスゲノムを、昆虫宿主細胞にトランスフェクションする。この昆虫宿主細胞において、ベクターとウィルスゲノムとが、組み換えを起こす。パッケージングされた組み換えウィルスを発現させる。そして組み換えプラークを同定して精製する。バキュロウィルス／昆虫細胞発現系のための材料と方法とは、キットの様式で、例えばInvitrogen Corp. (Carlsbad, CA)から市販されている。これらの技術は、一般的に当業者に公知であり、「SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987)」に十分記載されている。なお、この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。また、「RICHARDSON, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY: BACULOVIRUS EXPRESSION PROTOCOLS (1995)」、「AUSUBELら, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 16.9-16.11 (1994)」、「KLNG AND POSSEE, THE BACULOVIRUS SYSTEM: A LABORATORY GUIDE (1992)」および「O’REILLYら, BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992)」を参照のこと。
【０１１８】
バキュロウィルス／昆虫細胞発現系を用いた、様々な異種タンパク質の製造は、実際に、当業者に公知である。例えば、米国特許第６，３６８，８２５号明細書、米国特許第６，３４２，２１６号明細書、米国特許第６，３３８，８４６号明細書、米国特許第６，２６１，８０５号明細書、米国特許第６，２４５，５２８号明細書、米国特許第６，２２５，０６０号明細書、米国特許第６，１８３，９８７号明細書、米国特許第６，１６８，９３２号明細書、米国特許第６，１２６，９４４号明細書、米国特許第６，０９６，３０４号明細書、米国特許第６，０１３，４３３号明細書、米国特許第５，９６５，３９３号明細書、米国特許第５，９３９，２８５号明細書、米国特許第５，８９１，６７６号明細書、米国特許第５，８７１，９８６号明細書、米国特許第５，８６１，２７９号明細書、米国特許第５，８５８，３６８号明細書、米国特許第５，８４３，７３３号明細書、米国特許第５，７６２，９３９号明細書、米国特許第５，７５３，２２０号明細書、米国特許第５，６０５，８２７号明細書、米国特許第５，５８３，０２３号明細書、米国特許第５，５７１，７０９号明細書、米国特許第５，５１６，６５７号明細書、米国特許第５，２９０，６８６号明細書、国際公開第０２／０６３０５号パンフレット、国際公開第０１／９０３９０号パンフレット、国際公開第０１／２７３０１号パンフレット、国際公開第０１／０５９５６号パンフレット、国際公開第００／５５３４５号パンフレット、国際公開第００／２００３２号パンフレット、国際公開第９９／５１７２１号パンフレット、国際公開第９９／４５１３０号パンフレット、国際公開第９９／３１２５７号パンフレット、国際公開第９９／１０５１５号パンフレット、国際公開第９９／０９１９３号パンフレット、国際公開第９７／２６３３２号パンフレット、国際公開第９６／２９４００号パンフレット、国際公開第９６／２５４９６号パンフレット、国際公開第９６／０６１６１号パンフレット、国際公開第９５／２０６７２号パンフレット、国際公開第９３／０３１７３号パンフレット、国際公開第９２／１６６１９号パンフレット、国際公開第９２／０２６２８号パンフレット、国際公開第９２／０１８０１号パンフレット、国際公開第９０／１４４２８号パンフレット、国際公開第９０／１００７８号パンフレット、国際公開第９０／０２５６６号パンフレット、国際公開第９０／０２１８６号パンフレット、国際公開第９０／０１５５６号パンフレット、国際公開第８９／０１０３８号パンフレット、国際公開第８９／０１０３７号パンフレット、国際公開第８８／０７０８２号パンフレットを参照のこと。なお、各文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１９】
バキュロウィルス／昆虫細胞発現系に有用なベクターは、公知であり、例えば、バキュロウィルスのAutographacalifornica核多角体ウィルス（ＡｃＮＰＶ）に由来する昆虫の発現およびトランスファーベクターが挙げられる（なお、この例示したベクターは、ヘルパー非依存性のウィルスベクターである）。この系に由来するウィルス発現ベクターでは、異種遺伝子の発現を誘導するために、ウィルスの強力なポリへドリン遺伝子プロモーターが用いられる。一般的には、「O’Reillyら, BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992)」を参照のこと。
【０１２０】
外来の遺伝子をバキュロウィルスのゲノムに挿入する前に、上記要素（プロモーター、リーダー（必要に応じて）、興味のあるコード配列、および転写終結配列を含んでいる）を、通常は中間置換コンストラクト（Intermediate transplacement construct）（トランスファーベクター）に組み立てる。中間置換コンストラクトはしばしば、細菌のような宿主中で安定して維持され得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のような、レプリコン中に維持される。レプリコンは１つの複製系を有し、このため、クローニングおよび増幅に適切な宿主中に維持され得る。より具体的には、プラスミドは、ポリヘドリンポリアデニル化シグナル（「Miller, ANN. REV. MICROBIOL. (1988) 42:177」）、および、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて選抜および増殖されるための原核生物のアンピシリン耐性（ａｍｐ）遺伝子と複製起点とを含有する。
【０１２１】
ＡｃＮＰＶへ外来遺伝子を導入するために一般的に使用されるトランスファーベクターの１つは、ｐＡｃ３７３である。当業者に公知のその他の多くのベクターもまた設計されており、例えば、ｐＶＬ９８５が挙げられる。このベクターでは、ポリヘドリン開始コドンがＡＴＧからＡＴＴに変えられ、ＡＴＴの下流の３２塩基対にＢａｍＨＩクローニング部位が導入されている（「Luckow and Summers, VIROLOGY 170:31 (1989)」を参照のこと）。他の市販されているベクターとしては、例えば、PBlueBac4.5/V5-His, pBlueBacHis2, pMelBac, pBlueBac4.5 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)が挙げられる。
【０１２２】
異種遺伝子を挿入した後、トランスファーベクターおよび野生型バキュロウィルスのゲノムを、昆虫細胞宿主に共トランスフェクションする。異種ＤＮＡをバキュロウィルスの所望の部位に導入するための方法は、公知である。例えば、「SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987)」、「Smithら, MOL. CELL. BIOL. (1983) 3:2156」、「Luckow and Summers, VIROLOGY (1989) 170:31」を参照のこと。例えば、２重交差型相同組み換えによって、ポリへドリン遺伝子などの遺伝子に、挿入してもよい。また、所望のバキュロウィルス遺伝子中に設けられた、制限酵素認識部位に挿入してもよい。例えば、「Millerら, BIOESSAYS (1989) 11(4):91」を参照のこと。
【０１２３】
トランスフェクションを、エレクトロポレーションにより達成してもよい。「TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995)」、「Mann and King, J. GEN. VIROL. (1989) 70:3501」を参照のこと。また、その代わりに、リポソームを用いて、昆虫細胞に組み換え発現ベクターとバキュロウィルスとをトランスフェクションしてもよい。例えば、「Liebmanら., BIOTECHNIQUES (1999) 26(1):36」、「Gravesら, BIOCHEMISTRY (1998) 37:6050」、「Nomuraら, J. BIOL. CHEM. (1998) 273(22):13570」、「Schmidtら, PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1998) 12:323」、「Siffertら, NATURE GENETICS (1998) 18:45」、「TILKINSら, CELL BIOLOGY: A LABORATORY HANDBOOK 145-154 (1998)」、「Caiら, PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1997) 10:263」、「Dolphinら, NATURE GENETICS (1997) 17:491」、「Kostら, GENE (1997) 190:139」、「Jakobssonら, J. BlOL. CHEM. (1996) 271:22203」、「Rowlesら, J. BIOL. CHEM. (1996) 271(37):22376」、「Revereyら, J. BIOL. CHEM. (1996) 271(39) :23607- 10」、「Stanleyら, J. BlOL. CHEM. (1995) 270:4121」、「Siskら, J. VlROL. (1994) 68(2):766」、および「Pengら, BIOTECHNIQUES (1993) 14(2):274」を参照のこと。市販されているリポソームとしては、例えば、セルフェクチン（Cellfectin（登録商標））、およびリポフェクチン（Lipofectin（登録商標））（Invitrogen, Corp., Carlsbad, CA）が挙げられる。また、リン酸カルシウムトランスフェクションを用いてもよい。「TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995)」、「Kitts, NAR (1990) 18(19):5667」、および「Mann and King, J. GEN. VIROL. (1989) 70:3501」を参照のこと。
【０１２４】
バキュロウィルス発現ベクターは、たいていは、バキュロウィルスプロモーターを含んでいる。バキュロウィルスプロモーターは、バキュロウィルスのＲＮＡポリメラーゼが結合でき、コード配列（例えば、構造遺伝子）をｍＲＮＡへと下流（３’）へ転写開始する任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、たいていはコード配列の５’末端近傍に配置される転写開始領域を有している。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位と転写開始部位とを含んでいる。また、バキュロウィルスのプロモーターは、エンハンサーと呼ばれる２次ドメインを有していてもよい。この２次ドメインは、存在する場合は、上記構造遺伝子から遠位に存在する。また、発現は、調節されてもよいし、恒常的であってもよい。
【０１２５】
ウィルス感染サイクルの後期に多量に転写される構造遺伝子は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例えば、ウィルスポリヘドリンタンパク質をコードしている遺伝子由来の配列（「FRIESENら, The Regulation of Baculovirus Gene Expression in THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES (1986)」、欧州特許出願公開第０１２７８３９号明細書、および欧州特許出願公開第０１５５４７６号明細書）、およびｐ１０タンパク質をコードしている遺伝子由来の配列（「Vlakら, J. GEN. VlROL. (1988) 69:765」）が含まれる。
【０１２６】
新しく形成されたバキュロウィルス発現ベクターは、感染性の組み換えバキュロウィルスへとパッケージングされる。その後、成長したプラークを当業者に公知の方法により精製してもよい。「Millerら, BIOESSAYS (1989) 11(4):91」、「SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987)」を参照のこと。
【０１２７】
組み換えバキュロウィルス発現ベクターは、いくつかの昆虫細胞へ感染させるために開発された。例えば、取り分け、Aedes aegypti（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１２５）、Bombyx mori（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−８９１０）、Drosophila melanogaster（ＡＴＣＣ番号１９６３）、Spodoptera frugiperda、およびTriclioplusia niのための組み換えバキュロウィルスが開発された。「Wright, NATURE (1986) 321:718」、「Carbonellら, J. VlROL. (1985) 56:153」、「Smithら, MOL. CELL. BIOL. (1983) 3:2156」を参照のこと。一般的には、「Fraserら, IN VITRO CELL. DEV. BIOL (1989) 25:225」を参照のこと。より具体的には、バキュロウィルス発現ベクターの系に用いられる細胞株としては、通常、Ｓｆ９（Spodoptera frugiperda）（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１７１１）、Ｓｆ２１（Spodoptera frugiperda）（Invitrogen Corp.,カタログ番号11497-013 (Carlsbad, CA)）、Tri-368（Trichopulsia ni）、およびHigh-Five（登録商標）BTI-TN-5B1-4（Trichopulsia ni）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２８】
バキュロウィルス／発現における異種ポリペプチドの直接発現と融合発現とのための細胞および培養液は、市販されている。また、細胞培養技術は、当業者に公知である。
【０１２９】
（E.Coli、Pseudomonas種、および他の原核生物）
細菌における発現技術は、当業者に公知である。細菌宿主において使用するための多種多様なベクターが、利用可能である。これらベクターは、１コピーベクターであってもよいし、または、多コピーベクターであってもよい。多コピーベクターは、コピー数が少なくてもよい（低多コピーベクター）し、多くてもよい（高多コピーベクター）。クローニングベクターおよび／または発現ベクターが、提供されてもよい。ベクター、多くの市販のベクター、ベクターの手引書、ベクターの制限酵素地図、および特徴に関する文献が多く発行されているので、本明細書では、これ以上論じる必要は無い。よく知られているように、ベクターは、通常は選抜を可能にするマーカーを含んでいる。このマーカーにより、細胞毒性剤への耐性、原栄養性、または免疫が提供され得る。また、ベクターの多くは、異なる特徴を提供するマーカーを複数有している。
【０１３０】
細菌プロモーターは、細菌のＲＮＡポリメラーゼが結合でき、コード配列（例えば、構造遺伝子）をｍＲＮＡへと下流（３’）へ転写開始できる任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、たいていはコード配列の５’末端近傍に配置される転写開始領域を有している。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位と転写開始部位とを含んでいる。また、細菌のプロモーターは、オペレーターと呼ばれる２次ドメインを有していてもよい。この２次ドメインは、ＲＮＡ合成が開始される隣接したＲＮＡポリメラーゼ結合部位に重複してもよい。オペレーターにより、負に調節される（誘導性の）転写を実施することができる。すなわち、遺伝子リプレッサータンパク質が、オペレーターに結合することにより、特定の遺伝子の転写を阻害してもよい。恒常的発現は、負の調節要素（オペレーターなど）が無いときに起こり得る。さらに、正の調節が、遺伝子アクチベータータンパク質の結合配列によりもたらされてもよい。該結合配列は、存在する場合は、通常ＲＮＡポリメラーゼ結合配列よりも遠位（５’）に存在する。遺伝子アクチベータータンパク質としては、例えば、カタボライト活性化タンパク質（ＣＡＰ）が挙げられる。このＣＡＰにより、Escherichia coli（E. coli）のｌａｃオペロンの転写開始が促進される（「Raibaudら, ANNU. REV. GENET. (1984) 18:173」）。したがって、発現を、正または負のどちらかに調節することにより、転写を増強または減少させてもよい。
【０１３１】
代謝経路の酵素をコードしている配列は、特に有用なプロモーターを提供する。この配列としては、例えば、ガラクトース、ラクトース（lac）（「Changら, NATURE (1977) 198:1056」）、およびマルトースなどの糖代謝酵素に由来するプロモーター配列が挙げられる。別の例としては、トリプトファン（trp）などの生合成酵素に由来するプロモーター配列が挙げられる（「Goeddelら, Nuc. ACIDS RES. (1980) 8:4057」、「Yelvertonら, NUCL. ACIDS RES. (1981) 9:731」、米国特許第４，７３８，９２１号明細書、欧州公開第０３６７７６号明細書、欧州公開第１２１７７５号明細書）。なお、これら文献は、参照により本明細書に組み込まれる。また、β‐ガラクトシダーゼ（ｂｌａ）のプロモーター系（「Weissmann (1981) “The cloning of interferon and other mistakes.” In Interferon 3 (Ed. I. Gresser)」）、バクテリオファージ・ラムダのＰＬ（「Shimatakeら, NATURE (1981) 292:128」）、およびＴ５（米国特許第４，６８９，４０６号明細書）のプロモーター系も、有用なプロモーター配列を提供する（なお、これら文献は、参照により本明細書に組み込まれる）。強力なプロモーター（Ｔ７プロモーターなど）を用いて、興味のあるポリペプチドを高レベルに誘導してもよい。そのようなベクターの例は、当業者に公知であり、ｐＥＴ２９のシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、および国際公開９９／０５２９７号明細書に記載のｐＰＯＰベクターなどが挙げられる（なお、上記文献は、参照により本明細書に組み込まれる）。これら発現系により、宿主細胞の生存能力または成長パラメーターに支障をきたすことなく、宿主において、ポリペプチドを高レベルで発現させることができる。ｐＥＴ１９（Ｎｏｖａｇｅｎ）は、公知の別のベクターである。
【０１３２】
また、天然に生じない合成プロモーターも、細菌プロモーターとして機能する。例えば、１つの細菌またはバクテリオファージのプロモーターの転写活性化配列を、別の細菌またはバクテリオファージのプロモーターのオペロン配列に連結して、合成混成プロモーターを作製してもよい（米国特許第４，５５１，４３３号明細書（なお、この文献は、参照により本明細書に組み込まれる））。例えば、ｔａｃプロモーターは、ｔｒｐプロモーター配列と、ｌａｃリプレッサーにより調節されるｌａｃオペロン配列とを含む混成ｔｒｐ‐ｌａｃプロモーターである（「Amannら, GENE (1983) 25:167」、「de Boerら, PROC. NATL. ACAD. SCI. (1983) 80:21」）。さらに、細菌プロモーターは、細菌のＲＮＡポリメラーゼに結合し、転写を開始することができる非細菌起源の天然に生じるプロモーターを含んでいてもよい。また、非細菌起源の天然に生じるプロモーターを、適合するＲＮＡポリメラーゼに結合させて、原核生物においていくつかの遺伝子を高レベルで発現させることができる。バクテリオファージのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系は、共役型プロモーター系の例である（「Studierら, J. MOL. BIOL. (1986) 189:113」、「Taborら, Proc Natl. Acad. Sci. (1985) 82:1074」）。さらに、混成プロモーターは、バクテリオファージプロモーターと、E. coliのオペレーター領域とを含んでいてもよい（欧州公開第２６７８５１号明細書）。
【０１３３】
また、機能性プロモーター配列に加えて、効率的なリボソーム結合部位が、外来遺伝子を原核細胞において発現させるために有効である。E. coliでは、リボソーム結合部位は、シャイン‐ダルガルノ（ＳＤ）配列と呼ばれ、開始コドン（ＡＴＧ）と、該開始コドンから３〜１１ヌクレオチド上流に位置した、長さ３〜９ヌクレオチドの配列とを含んでいる（「Shineら, NATURE (1975) 254:34」）。ＳＤ配列は、ＳＤ配列とE. coliの１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’との間で塩基対を形成することにより、ｍＲＮＡとリボソームとの結合を促進すると考えられる（「Steitzら “Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA”, In Biological Regulation and Development: Gene Expression (Ed. R. F. Goldberger, 1979)」）。真核性遺伝子および原核性遺伝子を、弱いリボソーム結合部位により発現すること（Sambrookら 「Expression of cloned genes in Escherichia coli」, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989）。
【０１３４】
用語「細菌宿主」または「細菌宿主細胞」は、組み換えベクターまたは他のトランスファーＤＮＡを受け入れることができるか、またはできた細菌のことをいう。この用語は、トランスフェクションされた元々の細菌宿主細胞の子孫を含む。１つの親細胞の子孫は、元々の親細胞と、形態、ゲノムＤＮＡまたは全ＤＮＡの補体において、必ずしも完全に一致していなくてもよいことを理解されたい。これは、偶発的な突然変異、または計画的な突然変異が発生するからである。親細胞の子孫は、関連する特性（興味のあるポリペプチドをコードしているポリペプチドが存在しているなど）により特徴付けられる親細胞と十分に類似しており、このような子孫は、ここの定義により意図される子孫に含まれる。
【０１３５】
ポリペプチドの発現に適切な細菌宿主の選抜は、当業者に公知である。発現のための細菌宿主の選抜において、適切な宿主は、取り分け、封入体形成能力に優れ、タンパク質分解活性が低く、そして、全体的に強健である宿主であってもよい。細菌宿主は、一般的に、様々な供給源から入手することができ、例えば、「Bacterial Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, University of California (Berkeley, CA)」、および「the American Type Culture Collection (「ATCC」) (Manassas, VA)」から入手することができるが、これらに限定されない。Ｋ株に由来する細菌（Ｗ３１１０など）、またはＢ株に由来する細菌（ＢＬ２１など）が、一般的に産業的／製薬的な発酵に用いられる。これらの株は、成長パラメーターが、極めてよく知られており、強健であるから特に有用である。さらに、これらの株は非病原菌性であるから、安全性と環境の観点から商業的に重要である。他の適切なE. coli宿主の例としては、ＢＬ２１，ＤＨ１０Ｂまたはそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法のもう１つ別の実施の形態では、E. coli宿主は、プロテアーゼが欠失した株（ＯＭＰ−、およびＬＯＮ−など）である。宿主細胞株は、Pseudomonas種(Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, およびPseudomonas putidaなど)であってもよい。ＭＢ１０１株で示されるPseudomonas fluorescensの次亜種１、は、組み換え体の製造に有用であることが知られており、治療用タンパク質の製造過程に利用することができる。Pseudomonasの発現系の例は、宿主株として「The Dow Chemical Company」から入手することができる（（Midland, MI（ワールドワイドウェブの「dow.com」において利用できる））。米国特許第４，７５５，４６５号明細書と米国特許第４，８５９，６００号明細書には、ｈＧＨを産生するための宿主細胞としてPseudomonas株を使用することが記載されている。なお、これら文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３６】
組み換え宿主細胞株が、確立されれば（すなわち、発現コンストラクトが、宿主細胞に導入され、適切な発現コンストラクトを有する宿主細胞が単離されれば）、組み換え宿主細胞株を、興味のあるポリペプチドの産生に適切な条件下において培養する。当業者には明らかなように、組み換え宿主細胞株の培養方法は、利用される発現コンストラクトの性質と、宿主細胞の個性とに依存する。組み換え宿主株は、普通は、公知の方法を用いて培養される。組み換え宿主細胞は、通常、炭素、窒素および無機塩の吸収可能な供給源を含む液体培養液にて培養される。さらに、該液体培養液は、必要に応じて、ビタミン、アミノ酸、成長因子、および当業者に公知の他のタンパク質性の培養補助物を含んでいてもよい。また、宿主細胞の培養のための液体培養液は、望ましくない微生物の成長を阻害するための抗生物質、または抗真菌剤、ならびに／あるいは、発現ベクターを含む宿主細胞を選抜するための抗生物質などの化合物を含んでいてもよい。
【０１３７】
組み換え宿主細胞は、バッチ式または連続式で培養し、（ｉ）細胞を収集するか、または、（ｉｉ）バッチ式もしくは連続式における培養液上清を収集してもよい。細胞を収集する場合、興味のあるポリペプチドは、細胞内に蓄積する。原核性の宿主細胞での製造については、バッチ式培養および細胞収集が好ましい。
【０１３８】
‐セレクターコドン‐
本発明のセレクターコドンは、タンパク質の生合成機構における遺伝暗号の枠組みを拡張するものである。例えば、セレクターコドンとしては、独特の３塩基コドン、ナンセンスコドン（例えば終止コドン（アンバーコドン（ＵＡＧ）、オーカーコドンまたはオパールコドン（ＵＧＡ）など））、非天然コドン、４（またはそれ以上の）塩基コドン、またはレアコドンなどが挙げられる。多くのセレクターコドン（１以上、２以上、３以上など）を、所望の遺伝子またはポリヌクレオチドに導入することができる。
【０１３９】
１実施の形態では、本発明の方法は、選択アミノ酸（非天然アミノ酸など）をインビボにおいて組み込むための終止コドンであるセレクターコドンの使用を含んでいる。例えば、終止コドンを認識し、選択アミノ酸を用いてＯ‐ＲＳによってアミノアシル化されるＯ‐ｔＲＮＡが製造される。このＯ‐ｔＲＮＡは、天然に生じる宿主のアミノアシル‐ｔＲＮＡシンテターゼには認識されない。従来の部位特異的突然変異誘発法を用いて、興味のあるポリペプチドにおける興味のある部位に、終止コドンを導入することができる。例えば、「Sayers, J.R.ら (1988), 5’-3’ Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res, 16:791-802」を参照のこと。Ｏ‐ＲＳ、Ｏ‐ｔＲＮＡ、および興味のあるポリペプチドをコードしている核酸が、インビボなどにおいて組み合わされるときに、選択アミノ酸は、終止コドンに応じて組み込まれ、選択アミノ酸（非天然アミノ酸など）を、特定の位置に含むポリペプチドが得られる。本発明の１実施の形態では、セレクターコドンとして用いられる終止コドンは、アンバーコドン（ＵＡＧ）、および／または、オパールコドン（ＵＧＡ）である。例えば、アンバーコドンを認識するＯ‐ｔＲＮＡの例については、配列番号６を参照のこと。また、オパールコドンを認識するＯ‐ｔＲＮＡの例については、配列番号７を参照のこと。ＵＡＧおよびＵＧＡがセレクターコドンとして用いられる遺伝暗号は、２２アミノ酸をコードしている。一方、最も豊富な終結シグナルであるオーカーコドン（ＵＡＡ）は、ナンセンスコドンとして保存されている。
【０１４０】
選択アミノ酸（非天然アミノ酸など）のインビボでの組み込みを、宿主細胞にあまり支障をきたすことなく実施することができる。例えば、非真核細胞（Escherichia coliなど）では、ＵＡＧコドンの抑制効率は、Ｏ‐ｔＲＮＡ（アンバーサプレッサーｔＲＮＡなど）と終結因子１（ＲＦ１）との間の競合に依存するので、抑制効率を、Ｏ‐ｔＲＮＡ（サプレッサーｔＲＮＡなど）の発現レベルを増加させるか、ＲＦ１欠損株を用いるかによって調整することができる。ここで、ＲＦ１は、ＵＡＧコドンに結合し、成長中のペプチドのリボソームからの放出を開始するものである。真核細胞では、ＵＡＧコドンについての抑制効率は、Ｏ‐ｔＲＮＡ（アンバーサプレッサーｔＲＮＡなど）と、真核細胞の終結因子（ｅＲＦなど）との間の競合に依存するので、抑制効率を、Ｏ‐ｔＲＮＡ（サプレッサーｔＲＮＡなど）の発現レベルを増加させることなどにより調整することができる。ここで、ｅＲＦは、終止コドンに結合し、成長中のペプチドのリボソームからの放出を開始するものである。
【０１４１】
また、非天然アミノ酸は、レアコドンにコードされていてもよい。例えば、インビトロでのタンパク質合成反応においてアルギニンの濃度が減少するとき、アルギニンのレアコドン（ＡＧＧ）は、アラニンを用いてアシル化される合成ｔＲＮＡによるＡｌａの挿入について効率的であると判明した。例えば、「Maら, Biochemistry, 32:7939 (1993)」を参照のこと。この場合、合成ｔＲＮＡは、天然に生じるｔＲＮＡＡｒｇ（Escherichia coliにおいて存在量が少ない種である）と競合する。いくつかの生物は、全ての３重コドンを使用しない。Micrococcus luteusにおいて、割り当てられていないコドン（ＡＧＡ）は、インビトロでの転写／翻訳抽出物において、アミノ酸を挿入するために利用されてきた。例えば、「Kowal and Oliver, Nucl. Acid. Res., 25:4685 (1997)」を参照のこと。これらのレアコドンを、インビボにおいて使用するために、本発明の要素を作製することができる。
【０１４２】
また、セレクターコドンは、拡張コドン（例えば４以上の塩基のコドン（４塩基コドン、５塩基コドン、６塩基コドンまたはそれ以上の塩基コドンなど））を含んでいる。４塩基コドンとしては、例えば、ＡＧＧＡ、ＣＵＡＧ、ＵＡＧＡ、およびＣＣＣＵなどが挙げられるが、これらに限定されない。５塩基コドンとしては、ＡＧＧＡＣ、ＣＣＣＣＵ、ＣＣＣＵＣ、ＣＵＡＧＡ、ＣＵＡＣＵ、およびＵＡＧＧＣなどが挙げられるが、これらに限定されない。また、フレームシフトの抑制に基づく拡張コドンを使用することなどの特徴が挙げられる。４塩基以上のコドンにより、１以上の選択アミノ酸（非天然アミノ酸など）を、同じタンパク質へ挿入することができる。例えば、アンチコドンループ（例えば、ＣＵ（Ｘ）ｎＸＸＸＡＡ配列（ｎ＝１））を有している突然変異Ｏ‐ｔＲＮＡ（特別なフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡなど）の存在下において、４塩基以上のコドンは、１つのアミノ酸として読み取られる。例えば、４塩基コドンを認識するＯ‐ｔＲＮＡについては、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／２２０６１号パンフレットに示された配列番号６、１２を参照のこと。他の実施の形態では、アンチコドンループは、少なくとも４塩基コドン、少なくとも５塩基コドン、または少なくとも６塩基コドン、あるいはそれ以上を解読（デコード）することができる。４塩基コドンには、２５６通りの可能性があるので、４塩基以上のコドンを用いて、同じ細胞において複数の非天然アミノ酸をコードすることができる。「Andersonら, (2002) Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size, Chemistry and Biology, 9:237-244」、および「Magliery, (2001) Expanding the Genetic Code: Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of “Shifty” Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli, J. MoI. Biol. 307: 755-769」を参照のこと。
【０１４３】
例えば、４塩基コドンを用いて、インビトロの生合成方法により非天然アミノ酸をタンパク質へ組み込まれてきた。例えば、「Maら, (1993) Biochemistry, 32:7939」、および「Hohsakaら, (1999) J. Am. Chem. Soc, 121:34」を参照のこと。ＣＧＧＧおよびＡＧＧＵを用いて、２‐ナフチルアラニンとリジンのＮＢＤ誘導体とをストレプトアビジンへ、インビトロにおいて、２つの化学的にアミノアシル化されたフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡを用いて、同時に組み込まれていた。例えば、「Hohsakaら, (1999) J. Am. Chem. Soc, 121:12194」を参照のこと。インビボの研究では、Mooreらは、ＮＣＵＡのアンチコドンを有するｔＲＮＡＬｅｕの誘導体が、ＵＡＧＮコドンを抑制できることを調べた（Ｎは、Ｕ、Ａ、ＧまたはＣであってもよい）。そして、４つ組のＵＡＧＡが、ＵＣＵＡのアンチコドンを有するｔＲＮＡＬｅｕにより、０または−１フレームでほとんど解読されることなく、１３〜２６％の効率で解読されることを発見した。「Mooreら, (2000) J. Mol. Biol, 298:195」を参照のこと。１実施の形態では、レアコドンまたはナンセンスコドンに基づく拡張コドンを、本発明に用いることができ、これにより、他の好ましからざる部位においてミスセンスを読み通すこと（ミスセンスのリードスルー）と、フレームシフト抑制とを減らすことができる。
【０１４４】
所定の系（天然の３塩基のコドンを用いないか、あるいは稀に用いる内因性の系）に付いて言えば、セレクターコドンは、天然の３塩基コドンのうちの１つを含んでいてもよい。例えば、この系は、天然の３塩基のコドンを認識するｔＲＮＡを欠損している系、および／または、天然の３塩基のコドンがレアコドンである系を含んでいる。
【０１４５】
セレクターコドンは、必要に応じて、非天然塩基対を含んでいる。また、該天然塩基対は、存在する遺伝子アルファベットを拡張している。１つの余分な塩基対は、３重コドンの数を、６４から１２５に増やす。第３塩基対には、塩基対が安定で選択的に形成されること、ポリメラーゼにより高い忠実度でもって、ＤＮＡに酵素的に組み込まれる効率が良いこと、および、新生非天然塩基対の合成後に、継続されるプライマー伸長の効率が良いことなどの特性がある。方法および組成物に適用可能な非人工塩基対は、例えば、「Hiraoら, (2002) An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein, Nature Biotechnology, 20:177-182」に記載されている。また、「Wu, Y.ら, (2002) J. Am. Chem. Soc. 124:14626-14630」も参照のこと。他の関連性のある刊行物を以下に、記載する。
【０１４６】
インビボでの使用について言えば、非天然のヌクレオシドは膜透過性であり、リン酸化されて対応する３リン酸塩を形成する。さらに、増加した遺伝情報は安定であり、細胞内の酵素により破壊されない。Bennerなどによるこれまでの努力により、標準のワトソン‐クリック対における水素結合パターンとは異なる水素結合パターンが利用されている。これについて、最も注目すべきは、例えば、イソ‐Ｃ：イソ‐Ｇの対である。例えば、「Switzerら, (1989) J. Am. Chem. Soc, 111:8322」、「Piccirilliら, (1990) Nature, 343:33」、および、「Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602」を参照のこと。一般的に言って、これらの塩基は、天然の塩基と、ある程度の割合で誤対合を起こし、酵素的に置換されることはできない。Koolとその同僚は、塩基対が形成されるように、塩基間の疎水的なパッキング相互作用により、水素結合が交換され得ることを実証した。「Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol, 4:602」、および「Guckian and Kool, (1998) Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 36, 2825」を参照のこと。上記必要条件の全ての満足する非天然塩基対を開発する目的で、Schultz, Romesbergとその同僚は、一連の非天然の疎水性塩基を、体系的に合成して研究した。その結果、ＰＩＣＳ：ＰＩＣＳの自己対は、天然塩基対よりも安定であり、Escherichia coliのＤＮＡポリメラーゼＩであるクレノウフラグメント（ＫＦ）によりＤＮＡに効率よく組み込まれ得ることが発見された。例えば、「McMinnら, (1999) J. Am. Chem. Soc, 121: 11585-6」、および「Ogawaら, (2000) J. Am. Chem. Soc, 122:3274」を参照のこと。３ＭＩＮ：３ＭＩＮの自己対は、生物的機能に十分な効率と選択性とでもって、ＫＦにより合成されることができる。例えば、「Ogawaら, (2000) J. Am. Chem. Soc., 122:8803」を参照のこと。しかし、それら両塩基は、さらなる複製について連鎖停止の原因になる。ＰＩＣＳの自己対を複製するのに用いることができる突然変異ＤＮＡポリメラーゼが、最近開発された。さらに、７ＡＩの自己対を複製することができる。例えば、「Taeら, (2001) J. Am. Chem. Soc, 123:7439」を参照のこと。また、新規の金属塩基対（Ｄｉｐｉｃ：Ｐｙ）も開発された。この塩基対は、ＣＵ（ＩＩ）の結合により安定な対を形成する。「Meggersら, (2000) J. Am. Chem. Soc., 122:10714」を参照のこと。拡張コドンおよび非天然コドンは、本質的に天然コドンに対して直交であるので、本発明の方法は、この特性を利用して、該拡張コドンおよび非天然コドンについての直交化ｔＲＮＡを作製することができる。
【０１４７】
また、翻訳バイパス系を用いて、選択アミノ酸（非天然アミノ酸など）を、所望のポリペプチドに組み込むことができる。翻訳バイパス系では、長い配列が遺伝子に挿入されるが、この配列はタンパク質に翻訳されない。該配列は、リボソームに該配列を飛び越えさせて、挿入の下流から翻訳を再開させるきっかけとなる構造を含んでいる。
【０１４８】
‐非天然選択アミノ酸‐
本明細書で使用されているように、選択アミノ酸は、所望のあらゆる天然に生じるアミノ酸または非天然アミノ酸を意味している。天然に生じるアミノ酸は、遺伝的にコードされる２０のアルファアミノ酸：アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンのうちのいずれか１つを含む。１つの実施形態において、選択アミノ酸は、高い忠実度でもって（例えば、所定の選択コドンに対する約７０％以上の有効性において、所定の選択コドンに対する約７５％以上の有効性において、所定の選択コドンに対する約８０％以上の有効性において、所定の選択コドンに対する約８５％以上の有効性において、所定の選択コドンに対する約９０％以上の有効性において、所定の選択コドンに対する約９５％以上の有効性において、または所定の選択コドンに対する約９９％以上の有効性において、もしくは所定の選択コドンに対するさらに高い有効性において）、伸張しているポリペプチド鎖に組み込まれる。
【０１４９】
本明細書で使用されているように、非天然アミノ酸は、セレノシステインおよび／またはピロリジン、ならびに遺伝的にコードされる以下の２０のアルファアミノ酸：アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリン以外のあらゆるアミノ酸、修飾されたアミノ酸、またはアミノ酸の類似体を意味している。アルファアミノ酸の一般的な構造は、式Ｉによって説明されている。
【０１５０】
【化１】
2009504182.tif 000002
【０１５１】
非天然アミノ酸は、通常、一般式Ｉで示される任意の構造体（Ｒ基は２０の天然アミノ酸に使用される置換基以外のあらゆる置換基である）である。例えば、２０の天然アミノ酸の構造について、L. Stryerによる「Biochemistry 3rded. 1988, Freeman and Company, New York」を参照のこと。ここで、留意すべきことは、本発明の非天然アミノ酸が上述した２０のアルファアミノ酸以外の天然に生じる化合物であり得るということである。
【０１５２】
本発明の非天然アミノ酸は、通常側鎖の構造のみにおいて天然アミノ酸と異なっているので、当該非天然アミノ酸は、他のアミノ酸（以下に限定されないが、天然または非天然を含む）と、天然に生じるタンパク質に形成されているアミノ結合と同じ様式において、アミノ結合を形成する。しかし、当該非天然アミノ酸は、上記天然アミノ酸から当該非天然アミノ酸を区別する側鎖基を有する。例えば、式ＩにおけるＲは、アルキル基、アリール基、アシル基、ケト基、アジル基、ヒドロキシル基、ヒドラジン、シアン基、ハロ基、ヒドラジド、アルケニル、アルキンル（ａｌｋｙｎｌ）、エーテル、チオール、セレン置換、スルホニル基、ホウ酸塩、リン酸、リン化水素、複素環、エノン（ｅｎｏｎｅ）、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、および他の同種のもの、あるいはこれらのあらゆる組み合わせを包含し得る。他の非天然に生じるアミノ酸は、以下に限定されないが、光活性化する架橋剤を備えるアミノ酸、スピン標識したアミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、新規な官能基を有するアミノ酸、他の分子と共有的または非共有的に相互作用するアミノ酸、光を閉じ込める（ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ）および／または光異性化するアミノ酸、ビオチンまたはビオチン類似体を備えるアミノ酸、糖置換されたセリンまたは他の炭水化物によって修飾されたアミノ酸のようなグリコシル化されたアミノ酸、ケト基を含んでいるアミノ酸、ポリエチレングリコールまたはポリエーテルを備えるアミノ酸、重原子に置換されたアミノ酸、化学的に開裂可能なまたは光開裂可能なアミノ酸、以下に限定されないが、ポリエーテル、または（以下に限定されないが、５または１０以上の炭素原子を含む）長鎖炭化水素を含む、天然アミノ酸と比べて延長された側鎖を有するアミノ酸、炭素が連結された糖を含むアミノ酸、酸化還元活性を有するアミノ酸、アミノ酸を含むアミノチオ酸、ならびに１つ以上の毒性を有する部分を備えるアミノ酸を包含する。また、米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号明細書および米国特許出願公開第２００３／０１０８８８５号明細書を参照のこと（なお、これらは参照によって本明細書に組み込まれる）。非天然アミノ酸は、例えば、固体の支持体にタンパク質を連結するために使用される光活性化する架橋剤を有していてもよい。非天然アミノ酸は、アミノ酸側鎖に付随する単糖類を有していてもよい。
【０１５３】
新規な側鎖を含む非天然アミノ酸のほかに、非天然アミノ酸はまた、例えば、式ＩＩおよびＩＩＩ：
【０１５４】
【化２】
2009504182.tif 000003
【０１５５】
（ここで、Ｚは、通常、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＮＨ‐Ｒ’、またはＳ‐Ｒ’を含み、同一であり得るまたは異なり得るＸおよびＹは、通常、ＳまたはＯを含み、ならびに付加的に同一のまたは異なるＲおよびＲ’は、通常、水素だけでなく式Ｉを有する非天然アミノ酸について上述したＲ基について紹介した構成要素と同じものから選択される）の構造によって示されるような修飾された骨格構造を付加的に備えている。例えば、非天然アミノ酸は、式ＩＩおよびＩＩＩによって示されるようなアミノ基またはカルボキシル基における置換体を備えていてもよい。この種類の非天然アミノ酸は、以下に限定されないが、例えば、通常の２０の天然アミノ酸と一致する側鎖または非天然の側鎖を有する、α‐ヒドロキシ酸、α‐チオ酸およびα‐アミノチオカルボキシ酸塩を含む。また、α‐炭素における置換は、Ｄ‐グルタミン酸塩、Ｄ‐アラニン、Ｄ‐メチル‐Ｏ‐チロシン、アミノブチル酸および他の同種のものといったＬ、Ｄ、またはα‐α‐２基置換のアミノ酸を付加的に包含する。他の構造的な代替物は、プロリン類似体と同様に３、４、６、７、８および９員環のプロリン類似体のような環状のアミノ酸、ならびに置換されたβ‐アラニンおよびγ‐アミノブチル酸のようなβおよびγアミノ酸を包含する。
【０１５６】
多くの非天然アミノ酸は、チロシンおよびグルタミンなどのような天然アミノ酸を基にしている。チロシン類似体は、パラ置換されたチロシン、オルト置換されたチロシン、およびメタ置換されたチロシンを含み、ここで、置換されたチロシンは、ケト基（以下に限定されないが、メチル基を含む）、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシアミン、チオール基、カルボキシル基、イソプロピル基、メチル基、Ｃ６‐Ｃ２０の直鎖のもしくは枝分かれした炭化水素、飽和炭化水素もしくは不飽和炭化水素、オルト位にあるメチル基、ポリエーテル基、およびニトロ基などを備えている。また、多重に置換されたアリール環もまた、考慮される。また、グルタミン類似体は、以下に限定されないが、α‐ヒドロキシ誘導体、γ‐置換された誘導体、環状の誘導体、およびアミド置換されたグルタミン誘導体を含む。フェニルアラニン類似体は、一例として、以下に限定されないが、パラ置換されたフェニルアラニン、オルト置換されたフェニルアラニン、およびメタ置換されたフェニルアラニンを含み、ここで、置換体は、ヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド、ヨード、臭素、またはケト基（以下に限定されないが、メチル基を含む）などを含む。非天然アミノ酸の特定の例としては、以下に限定されないが、ｐ‐アセチル‐Ｌ‐フェニルアラニン、ｐ‐プロパルギル‐フェニルアラニン、Ｏ‐メチル‐Ｌ‐チロシン、Ｌ‐３‐（２‐ナフチル）アラニン、３‐メチル‐フェニルアラニンＯ‐４‐アリル‐Ｌ‐チロシン、トリ‐Ｏ‐アセチル‐ＧｌｃＮＡｃβ‐セリン、Ｌ‐ドーパ、フッ化フェニルアラニン、イソプロピル‐Ｌ‐フェニルアラニン、ｐ‐アジド‐Ｌ‐フェニル‐アラニン、ｐ‐アシル‐Ｌ‐フェニルアラニン、ｐ‐ベンゾイル‐Ｌ‐フェニルアラニン、Ｌ‐ホスホセリン、ホスホセリン、ホスホノチロシン、ｐ‐ヨード‐フェニルアラニン、ｐ‐臭化フェニルアラニン、ｐ‐アミノ‐Ｌ‐フェニルアラニン、イソプロピル‐Ｌ‐フェニルアラニンおよびｐ‐プロパルギルオキシ‐フェニルアラニンなどを含む。種々の非天然アミノ酸の構造は、一例として、例えば、「In vivo incorporation of unnatural amino acids」と題された国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレットに与えられている（なお、これは参照によって本明細書に組み込まれる）。付加的なメチオニン類似体については、「Kiickら, (2002) Incorporation ofazides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99:19-24」を参照のこと（これは参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０１５７】
アミノ末端におけるポリペプチドに組み込まれた非天然アミノ酸は、２０の天延アミノ酸に用いられている置換体以外のあらゆる置換体であるＲ基から構成され得、かつＭＨ２基とは異なる第２反応基が、通常、天然のα‐アミノ酸に存在している（図１を参照のこと）。類似の非天然アミノ酸は、通常、α‐アミノ酸に存在するＣＯＯＨ基とは異なる第２反応基を用いてカルボキシル末端に組み込まれ得る（式Ｉを参照のこと）。
【０１５８】
本発明の非天然アミノ酸は、２０の天然アミノ酸において得られない付加的な特性を提供するために選択または設計されてもよい。例えば、非天然アミノ酸は、タンパク質の生物学的性質を修飾する、例えば、それらが組み込まれるために、付加的に設計または選択されてもよい。例えば、以下の性質：毒性、体内分布、可溶性、安定性（例えば、熱安定性、加水分解安定性、酸化安定性および酵素分解耐性など）、精製および処理の容易さ、構造的な性質、分光性質、化学的および／または光化学的な性質、触媒活性、酸化還元電位、半減期、ならびに他の分子との（例えば、共有的または非共有的な）反応性などが、タンパク質における非天然アミノ酸の含有によって任意に修飾されてもよい。
【０１５９】
種々の非天然アミノ酸の構造は、例えば、「In vivo incorporation of unnatural amino acids」と題された国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレットの図１６、１７、１８、１９、２６および２９に与えられている（なお、これは参照によって本明細書に組み込まれる）。例としては、以下に限定されないが、本発明のｔＲＮＡに伴われるアミノ酸のあらゆる様式がある。
【０１６０】
非天然アミノ酸の利点の１つは、付加的な分子を加えるために使用可能である、付加的な化学的な成分を提供することである。これらの修飾は、真核細胞もしくは非真核細胞のインビボ、またはインビトロにおいてなされてもよい。従って、ある実施形態において、非天然アミノ酸は、転写後修飾を受ける。ポリペプチドにおける非天然アミノ酸は、当該ポリペプチドに他の分子を付着させるために使用されてもよい。他の分子は、以下に限定されないが、特定の反応基として好適であると通常の当業者に周知であり、かつ化学的な方法論を利用する第１の反応基を備える非天然アミノ酸の内の、少なくとも１つに対する第２反応基を備える、標識物、染料、高分子、水溶性の高分子、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋剤、放射性核種、細胞毒性化合物、薬物、親和性標識物、光親和性標識物、反応性化合物、樹脂、第２タンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体、抗体もしくは抗体断片、金属キレート剤、補足因子、脂肪酸、炭化水素、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、単糖類、デンドリマー、シクロデキストリン、抑制性のリボ核酸、生体材料ナノ粒子、スピン標識物、蛍光団、金属含有成分、放射性成分、新規な官能基、他の分子と共有的もしくは非共有的に反応する化学基、光を閉じ込める成分、光活性の放射線励起成分、光異性化成分、ビオチン、ビオチンの誘導体、ビオチンの類似体、重元素を取り込んでいる成分、化学的に開裂可能な化学基、光開裂可能な化学基、延長された側鎖、炭素と連結された糖、酸化還元反応活性剤、アミノチオ酸、毒性成分、同位体的に標識された成分、生物物理的なプローブ、燐光性の化学基、化学発光化学基、高電子密度の化学基、磁性のある化学基、挿入化学基、発色団、エネルギー転移剤、生物学的に活性な試薬、検出標識物、小分子、量子小点、ナノ伝達物質、または上述のものもしくはあらゆる所望する他の化合物もしくは所望する他の物質のあらゆる組み合わせを含んでいる。
【０１６１】
例えば、転写後修飾は、求核‐求電子反応を介してもよい。現在のところタンパク質の選択的な修飾に使用される、以下に限定されないがヒスチジン側鎖またはシステイン側鎖を有するα‐ハロケトンの反応を含む、反応のほとんどは、求核反応の相手と求電子反応の相手との間における共有結合形成に関与する。これらの場合における選択性は、タンパク質における求核性の残基の数および近づき易さによって決定される。本発明のタンパク質において、他のさらなる選択的な反応は、ヒドラジド化合物またはアミノオキシ化合物を有する非天然ケト‐アミノ酸の反応などを、インビボまたはインビトロにおいて用いられてもよい。例えば、「Cornishら, (1996) J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151」、「Mahalら, (1997) Science, 276:1125-1128」、「Wangら, (2001) Science 292:498-500」、「Chinら, (2002) J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027」、「Chinら., (2002) Proc. Natl. Acad. Sci 99:11020-11024」、「Wangら, (2003) Proc. Natl. Acad. Sci 100:56-61」、「Zhangら, (2003) Biochemistry. 42:6735-6746」、および「Chinら, (2003) Science, 301:964-7」を参照のこと（なお、これらのすべては、参照によって本明細書に組み込まれる）。これによって、蛍光団、架橋剤、単糖の誘導体および細胞毒性分子を含む多くの試薬を用いて実際にあらゆるタンパク質の選択的な標識を可能にする。また、「Glycoprotein synthesis」と題された米国特許６．９２７．０４２号を参照のこと（これは参照によって本明細書に組み込まれる）。以下に限定されないがアジドアミノ酸を介する転写後修飾はまた、（以下に限定されないが、トリアリルホスフィンを用いた）シュタウディンガー連結反応を介してなされ得る。例えば、「Kiickら., (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemos elective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99:19-24」を参照のこと。
【０１６２】
（非天然アミノ酸の化学合成）
多くの非天然アミノ酸は、市販（例えば、Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)、Novabiochem(a division of EMD Biosciences, Darmstadt, Germany)、またはPeptech(Burlington, MA, USA)）されている。市販されていない非天然アミノ酸は、本明細書示されているように、または通常の当業者に周知の標準的な方法を用いて付加的に合成される。有機合成技術については、例えば、「Organic Chemistry by Fessendon and Fessendon, (1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass.)」、「Advanced organic Chemistry by March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York)、および「Advanced organic Chemistry by Carey and Sundberg (Third Edition, Parts A and B, 1990, Plenum Press, New York)」を参照のこと。非天然アミノ酸の合成を説明している付加的な出版物は、「In vivo incorporation of Unnatural Amino Acids」と題された国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレット、「Matsoukasら, (1995) J. Med. Chem., 38, 4660-4669」、「King, F.E. & Kidd, D. A. A. (1949) A New Synthesis of Glutamine and of γ-Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates. J. Chem. Soc. 3315-3319」、「Friedman, O.M. & Chatterrji, R. (1959) Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti-Tumor Agents. J. Am. Chem. Soc. 81, 3750-3752」、「Craig, J.C.ら (1988)“Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4 [[4-(diethylamino)-1-methylbutyl] amino] quinoline (Chloroquine). J. Org. Chem. 53, 1167-1170」、「Azoulay, M., Vilmont, M. & Frappier, F. (1991) Glutamine analogues as Potential Antimalarials, Eur. J. Med. Chem. 26, 201-5」、「Koskinen, A.M.P. & Rapoport, H. (1989) Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino Acid Analogues. J. Org. Chem. 54, 1859-1866」、「Christie, B.D. & Rapoport, H. (1985) Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L- Asparagine. Application to the Total Synthesis of (+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization. J. Org. Chem. 50:1239-1246」、「Bartonら, (1987) Synthesis of Novel alpha-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry: Synthesis of L- and D-alpha-Amino-Adipic Acids, L-alpha-aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives. Tetrahedron 43:4297-4308」、および、「Subasingheら, (1992) Quisqualic acid analogues: synthesis of beta-heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualate-sensitized site. J. Med. Chem. 35:4602- 7」を含む。また、「Protein Arrays」と題された米国特許出願２００４／０１９８６３７号明細書を参照のこと（これは参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０１６３】
（非天然アミノ酸の細胞の取込み）
細胞による非天然アミノ酸の取り込みは、例えば、タンパク質に組み込むために、非天然アミノ酸を設計および選択するときに、通常に考慮される１つの問題である。例えば、αアミノ酸の高い荷電密度は、これらの化合物が細胞透過性に見込みがないことを示唆している。天然アミノ酸は、タンパク質に基づく輸送系の選択を介して取り込まれる。非天然アミノ酸が少しでも細胞によって取り込まれることを評価することは、急速なふるいによってなされてもよい。例えば、引用によって包含される「Protein Arrays」と題された米国特許出願公開第２００４／０１９８６３７号明細書、および「Liu, D.R. & Schultz, P. G. (1999) Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code. PNAS United States 96:4780-4785」を参照のこと。取り込みは種々の方法を用いて容易に分析されるので、細胞性の取り込み経路に影響され易い非天然アミノ酸を設計する代替案は、インビボにおいてアミノ酸を作り出す生合成経路を提供することである。
【０１６４】
（非天然アミノ酸の生合成）
多くの生合成経路は、すでにアミノ酸および他の化合物を産生するために細胞に存在している。一方において、特定の非天然アミノ酸に関する方法は、天然には（以下に限定されないが、そのような方法を提供する細胞および発明には）存在していない。例えば、非天然アミノ酸用の生合成経路は、新しい酵素の添加、または存在する宿主細胞経路の修飾によって宿主細胞において任意に生成される。付加的な新しい酵素は、任意に、天然に生じる酵素または人工的に導き出された酵素である。例えば、ｐ‐アミノフェニルアラニンの生合成（“Invivo incorporation of unnatural amino acids”と名づけられた国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレットに１例が示されるように）は、他の生物に由来する周知の酵素を組み合わせたものの添加に頼っている。これらの酵素に関する遺伝子は、当該遺伝子を備えるプラスミドを用いた細胞の形質転換によって細胞に導入され得る。当該細胞において発現される当該遺伝子は、所望の化合物を合成する酵素経路を提供する。任意に添加されるこの種の酵素の例は、以下の例に示される。付加的な酵素の配列は、例えば、ジーンバンクに見られる。また、人工的に導き出された酵素は、同様の方法において細胞に対して任意に添加される。この方法において、細胞の機序、および細胞の資源は、非天然アミノ酸を産生するために操作される。
【０１６５】
種々の方法が、生合成経路に使用する、または存在する経路を発展させる新規な酵素の生成に利用可能である。例えば、繰り返し使用できる組み換え（例えば、Maxygen, Inc.（maxigen.comにおけるワールドワイドウェブ上において購入可能な）によって開発されたような）は、新規の酵素および経路の開発に任意に使用される。例えば、「Stemmer (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370(4):389- 391」、および、「Stemmer, (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91:10747-10751」を参照のこと。同様に、Genencor（genencor.comにおけるワールドワイドウェブ上において購入可能な）によって開発されたDesignPath（登録商標）は、代謝経路設計（例えば、細胞においてＯ‐メチル‐Ｌ‐チロシンを作り出す経路の設計）に任意に使用される。この技術は、新しい遺伝子の組み合わせ（以下に限定されないが、機能的なゲノミクスを介して同定された遺伝子を含む）、ならびに分子進化および設計を用いて宿主生物に存在する経路を再構築する。また、Diversa Corporation（diversa.comにおけるワールドワイドウェブ上において購入可能な）は、以下に限定されないが、新しい経路を作り出すことを含む、遺伝子および遺伝子経路のライブラリーを急速にスクリーニングする技術を提供する。
【０１６６】
通常、本発明の設計された生合成経路を用いて生成された非天然アミノ酸は、有効なタンパク質の生合成に十分な濃度（例えば、天然の細胞における量であるが、他のアミノ酸の濃度に影響するまたは細胞資源を排出するような程度ではない）に産生される。
この方法におけるインビボにおいて生成される通常の濃度は、約１０ｍＭから０．０５ｍＭである。細胞が、特定の経路に関して所望される酵素の生成に使用される遺伝子を備えるプラスミドを用いて、形質転換され、かつ非天然アミノ酸が生成されると、インビボにおける選択は、リボソームのタンパク質合成および細胞増殖の両方に関して、非天然アミノ酸の産生をさらに最適化するために任意に使用される。
【０１６７】
‐核酸配列およびアミノ酸配列ならびにバリアント‐
上述のように、および以下に述べるように、本発明は、核酸ポリヌクレオチド配列およびポリペプチドアミノ酸配列（例えば、ｔＲＮＡおよびＲＳ）、ならびに当該配列を包含する組成物および方法を提供する。上記配列の例としては（例えば、ｔＲＮＡおよびＲＳ）、本明細書に開示されている。しかし、本発明が、本明細書に（例えば、実施例）開示されているこれらの配列に限定されないことは、当該分野における当業者にとって明らかであろう。本発明がまた、本明細書に開示された機能を有する（例えば、Ｏ‐ｔＲＮＡまたはＯ‐ＲＳをコードしている）、関連するおよび関連しない多くの配列を提供することは、当業者にとって明らかであろう。
【０１６８】
本発明は、ポリペプチド（Ｏ‐ＲＳ）およびポリヌクレオチド（例えば、Ｏ‐ｔＲＮＡ、Ｏ‐ＲＳまたはそれらのタンパク質をコードしているポリヌクレオチド、およびアミノアシル‐ｔＲＮＡシンテターゼクローンを単離するために使用されるオリゴヌクレオチドなど）を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、１つ以上の選択コドンを有する本発明の興味のあるタンパク質またはポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む。また、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１、２および３に記載のヌクレオチド配列、これらに相補的なポリヌクレオチド、あるいは保存的変種な変種を備えるポリヌクレオチドを含む。同様に、核酸配列の実質的に全長にわたって高いストリンジェンシーの条件の下に指し示されるポリヌクレオチドと対合する核酸は、本発明のポリヌクレオチドである。
【０１６９】
ある実施形態において、ベクター（例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、細菌、ウィルス、裸のポリヌクレオチド、接合されたポリヌクレオチドなど）は、本発明のポリヌクレオチドを備えている。１つの実施形態において、上記ベクターは、発現ベクターである。他の実施形態において、上記発現ベクターは、１つ以上の本発明のポリヌクレオチドと作動可能に連結されたプロモーターを含んでいる。他の実施形態において、細胞は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを、備えている。
【０１７０】
また、当業者にとって、開示された配列の多くのバリアントが本発明に含まれることが明らかであろう。例えば、機能的に同一な配列を生じる開示された配列の保存的変種は、本発明に含まれる。開示された配列の少なくとも１つと対合する核酸配列のバリアントは、本発明に含まれること看做される。また、例えば、標準的な配列比較技術によって決定されたような本明細書に開示された配列の独特の部分配列は、本発明に含まれる。
【０１７１】
（保存的変種）
遺伝コードの縮重のせいで、“サイレント置換”（結果としてコードされるポリペプチドに変化を生じる例えば、核酸配列における置換）は、アミノ酸をコードしている核酸のすべてに含まれる特徴である。同様に、高い類似性の性質を有し、かつ異なるアミノ酸配列に置換されたアミノ酸配列において、１つまたは少数のアミノ酸における“保存的なアミノ酸置換”はまた、開示された構造物に対して高い類似性であるとして容易に同定される。このような、開示された配列のそれぞれに対する保存的変種は、本発明の一部である。
【０１７２】
特定の核酸配列の“保存的変種”は、同一なもしくは本質的に同一なアミノ酸配列コードしているこれらの核酸を、または核酸がアミノ酸配列をコードしていないときには実質的に同一の配列を意味する。当該分野における通常の当業者は、コードされる配列における単一のアミノ酸または小さい割合のアミノ酸を、変える、付加するまたは削除する個々の置換、欠損、または付加が、欠損、１アミノ酸の付加、または化学的に類似のアミノ酸を用いた１ミノ酸の置換の結果として変化を生じる“保存的に修飾された変種”または“保存的に修飾されたバリアント”であることを認識する。従って、本発明の記載されたポリペプチド配列の“保存的変種”は、当該ポリペプチド配列のアミノ酸における小さな割合の、代表的には５％以下の、さらに代表的には４、２または１％以下の、同じ保存的な置換基の保存的に選択アミノ酸を用いた置換を含む。非機能的な配列の付加のように、核酸分子のコードされた活性を変えない配列の付加は、もとの核酸の保存的変種である。
【０１７３】
機能的に類似のアミノ酸を示す保存的な置換の一覧は、当該分野における通常の当業者にとって周知である。以下の８つの群：
（１）アラニン（Ａ）およびグリシン（Ｇ）；
（２）アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）；
（３）アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）；
（４）アルギニン（Ｒ）およびリジン（Ｋ）；
（５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）およびバリン（Ｖ）；
（６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）およびトリプトファン（Ｗ）；
（７）セリン（Ｓ）およびスレオニン（Ｔ）；ならびに、
（８）システイン（Ｃ）およびメチオニン（Ｍ）
のそれぞれは、互いに保存的な置換であるアミノ酸を含む（例えば、「Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 第2版 (12月 1993))」を参照のこと）。
【０１７４】
‐核酸対合（ハイブリダイゼーション）‐
比較対合は、本発明の保存的変種を含む、配列番号１〜３のような本発明の核酸の同定に使用されてもよく、この比較対合法は、本発明の核酸を識別する好ましい方法である。また、高い、極端に高いおよび／またはさらに極端に高いストリンジェンシーの条件において、配列番号１〜３によって表される核酸と対合する標的の核酸は、本発明の一部である。そのような核酸の例には、所定の核酸配列と比較して、１つまたは少数の、サイレントなまたは保存的な核酸置換を有する核酸が含まれる。
【０１７５】
完全に適合する相補標的の少なくとも２分の１だけプローブと対合するときに（例えば、あらゆる適合しない標的核酸との対合において観察される約５〜１０倍の高さのノイズ対シグナル比を有して、完全に適合するプローブが完全に適合する相補標的と結合する条件において、標的に対するプローブの対合性の少なくとも２分の１のノイズ対シグナル比の高さを有して）、試験核酸は、プローブ核酸と特異的に対合すると言われている。
【０１７６】
核酸は、代表的に溶液において、それらが会合しているときに“対合する”。核酸は、水素結合、溶質排斥、および塩基スタッキングなどのような、種々のよく性質決定された物理化学的な力によって対合する。“厳密な対合条件”という表現は、当該分野において知られているような、低いイオン強度および高い温度という条件を当該分野において知られているような、低いイオン強度および高い温度という条件を意味する。代表的に、ストリンジェントな条件において、プローブは、核酸の複雑な混合物（以下に限定されないが、細胞全体のまたはライブラリーの、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む）における標的配列と対合するが、その複雑な混合物における他の配列と対合しない。核酸の対合についての多数の手引きが、「Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology (1995)」と同様に、「Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays,”（Elsevier, New York）」に見られる。「Hames and Higgins (1995) Gene Probes 1 IRL Press at Oxford University Press, Oxford, England, (Hames and Higgins 1)」、および「Hames and Higgins (1995) Gene Probes 2 IRL Press at Oxford University Press, Oxford, England (Hames and Higgins 2)」は、オリゴヌクレオチドを含むＤＮＡおよびＲＮＡの合成、標識、検出、および定量化について詳細に示している。通常、ストリンジェントな条件は、明確なイオン強度ｐＨにおける特異的な配列に対する熱融点（Ｔｍ）より約５〜１０℃低く選択される。Ｔｍは、標的に対して相補的なプローブの５０％が平衡点において標的配列と対合する温度（規定されたイオン強度、ｐＨ、および核の濃度）である。ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０から８．３において塩濃度が約１．０Ｍ以下のナトリウムイオン濃度、代表的には約０．０１から０．１Ｍ以下のナトリウムイオン（または他の塩）濃度であり、温度が、短いプローブ（以下に限定されないが、１０から５０のヌクレオチドを含む）について少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（以下に限定されないが、５０以上のヌクレオチドを含む）について少なくとも約６０℃である条件であってもよい。また、ストリンジェントな条件は、ホルムアミドのような不安定化剤を添加して達成されてもよい。選択的なまたは特異的な対合に関して、正のシグナルは、バックグラウンドの少なくとも２倍、任意にバックグラウンドの１０倍であってもよい。ストリンジェントな対合条件の一例としては、６５℃において０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳにおける洗浄とともに、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳを用いて４２℃においてインキュベートすること、あるいは５×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳを用いて６５℃においてインキュベートすること、である。このような洗浄は、５分、１５分、３０分、６０分、１２０分またはそれ以上の間、実施される。
【０１７７】
サザンブロットまたはノザンブロットにおけるフィルタ上において１００以上の相補的な残基を有する相補的な核酸の対合に関するストリンジェントな対合条件の一例としては、一昼夜実行される対合を用いた、４２℃における１ｍｇのヘパリンを有する５０ホルマリンである。ストリンジェントな洗浄条件の一例としては、１５分間および６５℃における０．２×ＳＳＣ洗浄である（例えば、「Sambrookら, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001)」のＳＳＣ緩衝液の記載を参照のこと）。多くの場合において、低いストリンジェンシー洗浄は、バックグラウンドのプローブシグナルを除去するために、高いストリンジェンシー洗浄に先行する。低いストリンジェンシー洗浄の一例としては、１５分間、４０度における２×ＳＳＣである。特定の対合検定において関連のないプローブに見られるものに対して５倍（またはそれ以上）のノイズ対シグナル比は、特異的な対合の検出を表している。
【０１７８】
サザンブロットおよびノザンブロットのような核酸対合実験に関する記載において、“ストリンジェントな対合洗浄条件”は、配列依存的であり、かつ異なる実験要因に基づいて異なる。より長い配列は、より高い温度において特異的に対合する。核酸の対合についての多数の手引きが、上述のTijssen(1993)ならびに上述のHames and Higginsの１および２に見られる。ストリンジェントな対合条件および洗浄条件は、あらゆる試験核酸について経験的に容易に決定されてもよい。例えば、高いストリンジェントな対合条件および洗浄条件の決定において、当該対合条件および洗浄条件は、選択された基準の一揃えが要求を満たされている限りにおいて、（例えば、対合または洗浄における温度の上昇、塩濃度の低下、界面活性剤濃度の上昇、および／またはホルマリンのような有機溶媒の濃度の上昇によって、）徐々に上昇する。例えば、上記対合条件および洗浄条件は、不適合な標的に対するプローブの対合に見られるよりも少なくとも５倍のノイズ対シグナル比とともに、プローブが完全に適合する相補的な標的と結合する限りにおいて、徐々に上昇する。
【０１７９】
“非常にストリンジェントな”条件は、特定のプローブに関して熱融点と等しく選択される。上記Ｔｍは、（規定されたイオン強度およびｐＨに基づいて）試験配列の５０％が完全に適合するプローブと対合する温度である。本発明のために、通常、“高いストリンジェントな”対合条件および洗浄条件は、規定されたイオン強度において、特定の配列に関するＴｍよりも約５℃低く選択される。
【０１８０】
“極端に高いストリンジェンシー”の対合条件および洗浄条件は、完全に適合する相補的な標的核酸に対するプローブの結合によるノイズ対シグナル比が、あらゆる不適合な標的核酸との対合にみられるときよりも少なくとも１０倍である限りにおいて、対合条件および洗浄条件のストリンジェンシーが、上昇される条件である。完全に適合する標的核酸の場合の少なくとも２分の１のノイズ対シグナル比を有して、そのような条件においてプローブと対合する標的核酸は、極端に高いストリンジェンシーの条件においてプローブと結合すると言える。
【０１８１】
同様に、ストリンジェンシーのさらに高いレベルでさえ、関連した対合検定の対合条件および／または洗浄条件を徐々に上昇させることによって決定される。例えば、完全に適合する標的核酸とプローブとの結合における、ノイズ対シグナル比が、あらゆる不適合な標的核酸との対合に関して見られるときの、少なくとも１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、もしくは５００倍またはそれ以上である限りにおいて、対合条件および洗浄条件のストリンジェンシーが上昇される条件。完全に適合する標的核酸の少なくとも２分の１のノイズ対シグナル比を有して、そのような条件においてプローブと対合する標的核酸は、さらに極端に高いストリンジェンシーの条件においてプローブと結合すると言える。
【０１８２】
ストリンジェントな条件において、互いに対合しない核酸は、コードしているポリペプチドが実質的に同一であれば、やはり実質的に同一である。これは、例えば、核酸の複製が、遺伝コードに許容される最大のコドン縮重を用いて作り出されたときに、生じる。
【０１８３】
（独特の部分配列）
１つの態様において、本発明は、本明細書に開示されたＯ‐ｔＲＮＡおよびＯ‐ＲＳの配列から選択された核酸において独特の部分配列を備える核酸を提供する。当該独特の部分配列は、あらゆる周知のＯ‐ｔＲＮＡまたはＯ‐ＲＳの核酸配列と対応する核酸と比較して独特である。位置合わせは、例えば、初期値の変数に設定されたＢＬＡＳＴを用いて実施されてもよい。あらゆる独特の配列は、例えば、本発明の核酸を同定するプローブとして有用である。
【０１８４】
同様に、本発明は、本明細書に開示されたＯ‐ＲＳの配列から選択されたポリペプチドにおける独特の配列を備えるポリペプチドを含む。ここで、当該独特の配列は、あらゆる周知のポリペプチドと対応するポリペプチドと比較して独特である。
【０１８５】
また、本発明は、ストリンジェントな条件において、Ｏ‐ＲＳの配列から選択されたポリペプチドにおける独特の部分配列をコードしている独特のコーディングオリゴヌクレオチドと対合する、標的核酸を提供する。ここで、独特の部分配列があらゆる制御ポリペプチド（例えば、本発明のシンテターゼが、例えば、突然変異によって生成された親配列）と対応するポリペプチドと比較して独特である。独特の配列は、上述のように決定される。
【０１８６】
（配列の比較、同一性、および相同性）
１つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の記載において、“同一の”または“同一性の”割合という用語は、以下に記載する配列比較の算法（もしくは当該分野における通常の当業者に利用可能な他の算法）の１つを用いて、または手動の整列と目視検査とによって評価されるように、比較領域または所定の領域に渡って対応を最大化するために比較および整列されたときに、同じである、またはアミノ酸残基もしくはヌクレオチドが同じである特定の割合を有する、２つ以上の配列または部分配列を意味する。
【０１８７】
２つの核酸配列またはポリペプチド配列（例えば、Ｏ‐ｔＲＮＡもしくはＯ‐ＲＳをコードしているＤＮＡまたはＯ‐ＲＳのアミノ酸配列）の記載において、“実質的に同一な”という表現は、配列比較の算法（もしくは当該分野における通常の当業者に利用可能な他の算法）の１つを用いて、または手動の整列と目視検査とによって評価されるように、比較領域または所定の領域に渡って対応を最大化するために比較および整列されたときに、少なくとも約６０％、約８０％、約９０〜９５％、約９８％、約９９％またはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有する、２つ以上の配列または部分配列を意味する。そのような“実質的に同一な”配列は、実際の系統を基準にすることなく、“相同物”であると標準的に看做される。“実質的な同一性”は、比較される２つの配列の、長さにして少なくとも約５０残基である配列の領域、約１００残基の領域、もしくは約１５０残基の領域に渡って、または全長に渡って、存在していてもよい。
【０１８８】
配列の比較および相同性評価に関して、標準的に１つの配列が、試験配列が比較される参照配列の役割を果たす。配列比較算法を用いるとき、試験配列および参照配列がコンピュータに入力され、部分配列の調整が指示され、かつ必要に応じて、配列算法プログラムの変数が指示される。それから、配列比較算法は、指示されたプログラム変数に基づいて、参照配列と比較した（複数の）試験配列に関する配列同一性の割合を算出する。
【０１８９】
比較する配列の整列方法は、当該分野における通常の当業者にとって周知である。比較する配列の最適な整列は、例えば、「Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482c (1981)」の相同性整列算法によって、「Needleman & Wunsch, J. MoI. Biol. 48:443 (1970)」の相同性整列算法によって、「Pearson & Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)」の類似度法に関する検索によって、これらの算法（Wisconsin Genetics Software Package(Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ化された装置によって、または手動の整列と視覚検査とによって（例えば、「Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)」を参照のこと）、実施されてもよい。
【０１９０】
配列同一性および配列類似性の割合の決定に適している算法の一例は、「Altschulら, (1997) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402」、および「Altschulら, J. Mol. Biol, 215:403-410 (1990)」に記載されている、ＢＬＡＳＴ算法およびＢＬＡＳＴ２．０算法である。ＢＬＡＳＴ解析を実施するソフトウェアは、ｎｃｂｉ．ｎｈｎ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおけるワールドワイドウェブ上において、全米バイオテクノロジー情報センターを通して公に利用可能である。この算法は、まず、データベース配列における同じ長さのワードを用いて整列されたときに、ある正の評価された閾値の点数と適合する、またはこれを満たす、照会配列における長さＷの短いワードを同定することによって高い点数の配列対（ＨＳＰｓ：high scoring sequence pairs）を同定することを含む。Ｔは、近傍にあるワード点数閾値として参照される（上述のAltschulら,）。これらの最初の近傍にあるワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰｓを見つける開始検索用の核の役割を果たす。それから、ワードヒットは、累積の整列点数が増加される限りにおいて、各配列に沿って両方向に広げられる。累積の点数は、核酸配列について、変数Ｍ（一致する残基対に対する報酬点数、常に＞０である）およびＮ（不一致の残基に対する罰則点数、常に＜０である）を用いて算出される。アミノ酸配列について、点数の集団が累積の点数の算出に使用される。各方向におけるワードヒットの継続は、以下の場合：累積の整列点数が獲得した最大値から量Ｘだけ低下する場合；累積の点数が１つ以上の負の得点残基整列の蓄積によって０以下になる場合；または各配列の末端に到達する場合に停止される。ＢＬＡＳＴ算法の変数Ｗ、ＴおよびＸは、整列の感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（核酸配列用）は、初期値として、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値、１００の切捨て、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両方の鎖の比較を使用している。アミノ酸配列用のＢＬＡＳＴＰプログラムは、初期値として、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、および５０のＢＬＯＳＵＭ６２得点集団（「Henikoff & Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915」を参照のこと）の整列（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４および両方の鎖の比較を用いている。ＢＬＡＳＴ算法は、“低い複雑さ”の切られたフィルタを用いて、標準的に実施される。
【０１９１】
配列同一性の割合を算出することに加えて、ＢＬＡＳＴ算法はまた、２つの配列間における類似性の統計解析（例えば、「Karlin & Altschul, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)」を参照のこと）を実施する。ＢＬＡＳＴ算法によって与えられる類似性の測定の１つは、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間における適合が偶然に生じる可能性の指標を与える最小の総和確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、参照核酸に対する試験核酸の比較において最小の総和確率が約０．２以下、約０．０１以下または約０．００１以下であるならば、核酸は、参照配列と類似していると看做されてもよい。
【０１９２】
（突然変異誘発および他の分子生物学技術）
本発明のおよび本発明に使用されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、分子生物学的技術を用いて作製されてもよい。ヌクレオチド配列は、従来の方法に従って部位特異的突然変異誘発法によって簡便に改変されてもよい。代わりに、ヌクレオチド配列は、これに限定されないがオリゴヌクレオチド合成剤を用いることを含む、化学合成によって調整されてもよい。ここで、オリゴヌクレオチドは、所望するポリペプチドのアミノ酸配列、およびに組み換えポリペプチドが産生される宿主細胞において有利に働く、好ましく選択されるこれらのコドン基づいて設計される。例えば、所望するポリペプチドの部分をコードしている種々の小さなオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ、核酸連結、または核酸連結連鎖反応によって合成およびコンストラクトされてもよい。例えば、「Baranyら, Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 189-193(1991)」および米国特許６，５２１，４２７を参照のこと（なお、これらは参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０１９３】
本発明は、組み換え遺伝学の分野において、日常的な技術を利用する。本発明で使用する通常の方法を開示している基本的な文献は、「Sambrookら, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001)」、「Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)」、および「Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et at, eds., 1994)」を含む。
【０１９４】
分子生物学的な技術について記載している通常の文献は、「Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger)」、「Sambrookら, Molecular Cloning-A Laboratory Manual(2nd Ed.), Vol.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 (“Sambrook”)」、および「Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubelら, eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (supplemented through 1999) (“Ausubel”)」を含む。これらの文献は、例えば、選択アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸）、直交化ｔＲＮＡ、直交化シンテターゼ、およびこれらの対を含むタンパク質を産生する選択コドンを含む、遺伝子またはポリヌクレオチドの生成に関する、突然変異誘発、ベクターの使用、プロモーター、および多くの他の関連する話題について記載している。
【０１９５】
以下に限定されないが、新規なシンテターゼまたはｔＲＮＡの産生、ｔＲＮＡ分子の突然変異誘発、ｔＲＮＡライブラリーの産生、ＲＳ分子の突然変異誘発、シンテターゼライブラリーの産生、選択コドンの産生、ならびに所望のタンパク質またはポリペプチドにおける選択アミノ酸をコードしている選択コドンの挿入を含む、様々な目的について、様々な種類の突然変異誘発が本発明に使用される。それらは、以下に限定されないが、部位特異的突然変異誘発法、ランダム点変異誘発法、相同性組み換え、ＤＮＡシャッフリングもしくは他の反復的な突然変異誘発法、キメラコンストラクト、鋳型を含むウラシルを用いた突然変異誘発、オリゴヌクレオチド直接的な突然変異誘発、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発、ギャップドデュプレックス（gapped duplex）ＤＮＡまたはこれらのあるゆる組み合わせなどを含む。付加的な好ましい方法は、点不一致対、修復欠損宿主株、制限選択および制限精製、欠損変異誘発、全体の遺伝子合成による突然変異精製、ならびに２重鎖破壊修復などを含む。また、以下に限定されないが、キメラコンストラクトを伴うことを含む、突然変異誘発は、本発明に含まれる。１つの実施形態において、以下に限定されないが、配列、配列比較、物理的性質、２次の、３次のもしくは４次の構造、または結晶構造などを含む、突然変異誘発は、天然に生じる分子、または変更もしくは変異誘発された天然に生じる分子の周知の情報によって導かれてもよい。
【０１９６】
本明細書に挙げられた文献および例は、これらの手法について記載している。付加的な情報は、以下に列挙する公開物および参考文献：「Lingら, Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal Biochem. 254(2): 157-178 (1997)」、「Daleら, Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, Methods Mol. Biol. 57:369-374 (1996)」、「Smith, In vitro mutagenesis, Ann. Rev. Genet. 19:423-462 (1985)」、「Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229:1193-1201 (1985)」、「Carter, Site-directed mutagenesis, Biochem. J. 237:1-7 (1986)」、「Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D.M.J, eds., Springer Verlag, Berlin) (1987)」、「Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985)」、「Kunkelら, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol. 154, 367-382 (1987)」、「Bass ら, Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities, Science 242:240-245 (1988)」、「Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis using Ml3-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucleic Acids Res. 10:6487-6500 (1982)」、「Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into Ml3 vectors, Methods in Enzymol. 100:468-500 (1983)」、「Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template, Methods in Enzymol. 154:329- 350 (1987)」、「Taylor ら, The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764 (1985)」、「Taylor ら, The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8765-8785 (1985)」、「Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698 (1986)」、「Sayers ら, 5’-3’ Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 16:791-802 (1988)」、「Sayers ら, Strand specific cleavage of phosphorothioate-contaming DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide, (1988) Nucl. Acids Res. 16: 803-814」、「Kramer ら, The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456 (1984)」、「Kramer & Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA, Methods in Enzvtnol. 154:350-367 (1987)」、「Kramer ら, Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, Nucl. Acids Res. 16: 7207 (1988)」、「Fritz ら, Oligonucleotide- directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999 (1988)」、「Kramer ら, Different base/base mismatches are corrected with different efficiencies by the methyl-directed DNA mismatch- repair system of E. coli, Cell 38:879-887 (1984)」、「Carter ら, Improved oligonucleotide site- directed mutagenesis using M13 vectors, Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443 (1985)」、「Carter, Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors, Methods in Enzymol. 154: 382-403 (1987)」、「Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, Nucl. Acids Res. 14: 5115 (1986)」、「Wells ら, Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423 (1986)」、「Nambiar ら, Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223: 1299-1301 (1984)」、「Sakmar and Kliorana, Total synthesis and expression of a gene for the alpha-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin) , Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372 (1988)」、「Wells ら, Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34:315-323 (1985)」、「Grundstroem ら, Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale ‘shot-gun’ gene synthesis, Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316 (1985)」、「Mandecki, Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7177-7181 (1986)」、「Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinion in Biotechnology 4:450-455 (1993)」、「Sieber, ら, Nature Biotechnology, 19:456-460 (2001); W. P. C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994)」、および 「I. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res. 23, 3067-8 (1995)」に見られる。上述の方法の多くに関する付加的な詳細は、種々の突然変異誘発法に伴う問題を解決する有用な調整についても記載されている「Enzymology Volume 154」に見られる。
【０１９７】
例えば、本発明の突然変異誘発（例えば、シンテターゼのライブラリーの突然変異誘発またはｔＲＮＡの変化）に使用するオリゴヌクレオチドは、「Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letts. 22(20): 1859-1862, (1981)」によって記載されている固相ホスホラミダイトエステル法（例えば、「Needham-VanDevanter ら, Nucleic Acids Res., 12:6159-6168 (1984)」に記載されているような自動化された合成機を用いる）に従って標準的に化学合成される。
【０１９８】
また、基本的にあらゆる核酸は、「The Midland Certified Reagent Company (mcrc@oligos.com)」、「The Great American Gene Company (www.genco.com)」、「ExpressGen Inc. (www.expressgen.com)」、および「Operon Technologies Inc. (Alameda, Calif.)」などのような、種々の商業的な資源から特別に注文または標準的に注文されてもよい。
【０１９９】
また、本発明は、直交化ｔＲＮＡ／ＲＳ対により非天然アミノ酸をインビボにおいて組み込むための生物、真核性宿主細胞、および非真核性宿主細胞に関する。宿主細胞は、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターである（これに限定されないが、）本発明のベクターを含んでいる、本発明のポリヌクレオチド、または本発明のポリヌクレオチドを含むコンストラクトを用いて、遺伝子操作（以下に限定されないが、形質転換、形質導入またはトランスフェクトを含む）される。例えば、生成される直交化ｔＲＮＡ、直交化ｔＲＮＡのシンテターゼおよびタンパク質に対するコード領域は、所望の宿主細胞において機能的である遺伝子発現制御要素と作動可能に連結されている。上記ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、細菌、ウィルス、裸のポリヌクレオチドまたは接合されたポリヌクレオチドの形態であってもよい。上記ベクターは、電気穿孔法（「Fromm ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5824 (1985)」）、ウィルスベクターによる感染、および／または、微小なビーズもしくは粒子の基質内、またはその表面のいずれかにある核酸を有する微小粒子による高速弾道貫通（「Klein ら, Nature 327, 70-73 (1987)」）などを含む、標準的な方法によって細胞および／または微生物に導入される。
【０２００】
細胞に標的の核酸を導入する種々の周知の方法は、利用可能であり、本発明に使用され得るあらゆる方法である。これらは、上記ＤＮＡを含む細菌性の原形質体と受容者細胞の融合、電気穿孔法、粒子衝撃法（projectile bombardment）、およびウィルスベクターを用いた感染（以下にさらに述べる）などを含む。細菌細胞は、本発明のＤＮＡコンストラクトを含むプラスミド数の増幅に使用されてもよい。上記細菌は、対数期に増殖され、当該細菌内の上記プラスミドは、当該分野における種々の方法によって単離されてもよい（例えば、Sambrookを参照のこと）。また、キットは、細菌に由来するプラスミドの精製用として市販されている（例えば、EasyPrep（登録商標）、FLEXIPREP（登録商標）（いずれもPharmacia Biotech）、StrataClean（登録商標）（STRATAGENE）およびQIAprep（登録商標）（Qiagen））。それから、単離および精製されたプラスミドは、他のプラスミドを作製するためにさらに操作される、細胞のトランスフェクトに使用される、または感染生物に関連するベクターに組み込まれる。代表的なベクターは、特定の標的核酸の発現制御に有用な、転写終了因子および翻訳ターミネーター、転写ターミネーターおよび翻訳開始配列、ならびにプロモーターを含む。上記ベクターは、少なくとも１つの独立したターミネーター配列、（以下に限定されないが、シャトルベクターを含む）真核生物、原核生物もしくは両方において上記発現カセット複製を可能にする配列、ならびに原核生物系と真核生物系との両方に対する選択マーカを含む、遺伝子発現カセットを付加的に備えている。ベクターは、原核生物、真核生物もしくはその両方における複製および／または組み込みに好適である。例えば、「Gillam & Smith, Gene 8:81 (1979)」、「Robertsら, Nature. 328:731 (1987) 」、「Schneider, E.ら, protein Expr. Purif. 6(1)10-14 (1995)」、「Ausubel, Sambrook, Berger」(すべて上述している) を参照のこと。クローン化に有用な細菌および細菌ファージの一覧は、例えば、ＡＴＣＣによって示されている（例えば、ＡＴＣＣによって公開された「The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage (1992) Gherna ら (eds)」）。また、配列決定、クローン化および分子生物学の局面、ならびに基礎をなす論理的な事柄に関する付加的な基礎的手法は、「Watson ら (1992) Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books, NY」に見られる。また、実質的にあらゆる核酸（および標準であろう非標準であろうが事実上すべての標識された核酸）は、Midland Certified Reagent Company (mcrc.comにおけるワールドワイドウェブ上において購入可能なMidland, TX, The Great American Gene Company (genco.comにおけるワールドワイドウェブ上において購入可能なRamona, CA)、 ExpressGen Inc. (expressgen.comにおけるワールドワイドウェブ上において購入可能なChicago, IL), Operon Technologies Inc. (Alameda, CA)および他の多くのような、種々の商業的な資源から特別に注文または標準的に注文されてもよい。
【０２０１】
遺伝工学的に作製された宿主細胞は、例えば、スクリーニング段階、活性プロモーター、または選択形質転換体のような活性に対して好適なように、改変された従来の栄養培地において培養されてもよい。これらの細胞は、任意に形質転換動物内において培養されてもよい。例えば、細胞の単離および培養について（例えば、部分配列核酸の単離について）他の有用な参考文献には、「Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley- Liss, New York and the references cited therein」、「Payne ら (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY」、「Gamborg and Phillips (eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture」、「Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York)」、および「Atlas and Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL」が含まれる。
【０２０２】
インビボにおいてタンパク質に直接に非天然アミノ酸を組み込む能力は、以下に限定されないが、突然変異タンパク質の高い収率、技術的な容易さ、細胞もしくはおそらく生きた組織における突然変異タンパク質を研究する将来性、ならびに治療的な処置および診断利用におけるこれらの突然変異タンパク質の利用を含む、広く多様な利点を提供する。タンパク質の中に種々の大きさ、酸性度、求核性、疎水性および他の性質を有する非天然アミノ酸を含ませる能力は、タンパク質の機能を調べるために、および新規な性質を有する新しいタンパク質もしくは生物を作り出すための、タンパク質の構造を合理的および体系的に操作するわれわれの能力を、大きく拡大することができる。
【０２０３】
‐興味のあるタンパク質およびポリペプチド‐
非天然アミノ酸の組み込みは、以下に限定されないが、タンパク質の構造および／または機能を目的に合わせた変更、大きさの変更、酸性度、求核性、水素結合、疎水性、プロテアーゼ標的部位の可触性、成分（以下に限定されないがタンパク質アレイ用を含む）に対する標的化、生物学的に活性な分子の付加、重合体の付着、放射性核種の付着、血清半減期の調節、組織浸潤性（例えば、腫瘍）の調節、活性な輸送の調節、組織、細胞もしくは器官の特異性もしくは分布の調節、免疫原性の調節、あるいはプロテアーゼ体性の調節などを含む、種々の目的に対して使用されてもよい。非天然アミノ酸を含むタンパク質は、増強された、またはさらに完全に新しい、触媒のもしくは生物物理的な性質を有していてもよい。例えば、以下の性質：毒性、体内分布、構造的な性質、分光性質、化学的および／または光化学的な性質、触媒活性、半減期（以下に限定されないが、血清半減期を含む）、ならびに他の分子との（例えば、共有的または非共有的な）反応性などが、タンパク質における非天然アミノ酸の含有によって任意に修飾されてもよい。非天然アミノ酸を少なくとも１つ含むタンパク質を含んでいる、組成物は、以下に限定されないが、治療薬、診断や区、触媒酵素、産業的な酵素、結合タンパク質（これに限定されないが、抗体を含む）、ならびに以下に限定されないがタンパク質の構造および機能の研究にとって有用である。例えば、「Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology, 4:645-652」を参照のこと。
【０２０４】
タンパク質は、少なくとも１つの、以下に限定されないが、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、少なくとも７つの、少なくとも８つの、少なくとも９つの、少なくとも１０この、またはそれ以上の非天然アミノ酸を含んでいてもよい。非天然アミノ酸は、同一であってもまたは異なっていてもよく、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０またはそれ以上の異なる非天然アミノ酸を備える、タンパク質における１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０またはそれ以上の異なる部位にあってもよい。タンパク質は、当該タンパク質に存在する、すべてではないが少なくとも１つの、非天然アミノ酸を用いて置換された特定のアミノ酸を有していてもよい。１つ以上の非天然アミノ酸を有する興味のあるタンパク質について、非天然アミノ酸は、同一であっても、異なっていてもよい（以下に限定されないが、当該タンパク質は、２つ以上の異なる非天然アミノ酸を含んでいてもよく、または２つの同じ非天然アミノ酸を含んでいてもよい）。２つ以上の非天然アミノ酸を有する所定のタンパク質について、非天然アミノ酸は、同一の、異なるまたは組み合わせの、少なくとも１つの異なる多数の非天然アミノ酸を有する、同種の非天然アミノ酸であってもよい。
【０２０５】
少なくとも１つの非天然アミノ酸を有する興味のあるタンパク質またはポリペプチドを真核細胞において生成することによって、タンパク質またはポリペプチドは、通常、真核生物の転写後修飾を含んでいる。ある実施形態において、タンパク質は、少なくとも１つの非天然アミノ酸、および真核細胞によってインビボにおいて作り出される少なくとも１つの転写後修飾を含んでいる。ここで、転写後修飾は原核細胞によって作り出されない。例えば、転写後修飾は、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミチン酸塩付加、リン酸化、糖脂質連結修飾、および糖化などを含む。さらに他の態様において、転写後修飾は、前駆体（以下に限定されないが、カルシトニン前駆体、カルシトニン遺伝子関連ペプチド前駆体、プレプロ甲状腺ホルモン、プレプロインスリン、プロインスリン、プレプロオピオメラノコルチンおよびプロオピオメラノコルチンなどを含む）のタンパク分解過程、多サブユニットタンパク質の集合または巨大分子集合、細胞における他の部位（以下に限定されないが、ゴルジ体、核、リソソーム、ペルオキシソーム、もしくは葉緑体などのような細胞小器官または分泌経路を介することを含む）への転換を含む。ある実施形態において、タンパク質は、分泌配列もしくは局在化配列、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ、またはＧＳＴ融合などを備えている。
【０２０６】
また、特定の位置に選択アミノ酸を有するタンパク質を細胞において生成する方法は、本発明の特徴である。例えば、方法は、好適な培地において、少なくとも１つの選択コドンを備え、かつタンパク質をコードしている核酸を備える細胞を増殖させること、および選択アミノ酸を供給することを含み、当該細胞は、細胞において機能し、かつ選択コドンを認識する直交化ｔＲＮＡ（Ｏ‐ｔＲＮＡ）、および選択アミノ酸を用いて上記Ｏ‐ｔＲＮＡを好適にアミノアシル化する直交化アミノアシル‐ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ‐ＲＳ）をさらに備えている。通常、上記Ｏ‐ｔＲＮＡ選択コドンに応答して同種のシンテターゼの存在について、抑制活性を備えている。また、この方法によって生成されたタンパク質は、本発明の特徴である。
【０２０７】
本発明の組成物および本発明の方法によって作製された組成物は、任意に細胞内にある。それから、Ｏ‐ｔＲＮＡ／Ｏ‐ＲＳの対または本発明の個々の組成物は、タンパク質に組み込まれる選択アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸）を結果として生じる、宿主体系の転写機序に使用されてもよい。「Expanding the Eukaryotic Genetic Code」と題された米国特許出願第１０／８２５，８６７号明細書、および、「IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS」と題された米国特許出願第１０／１２６，９２７号明細書において、この過程が記載されている（なお、これらは参照によって本明細書に組み込まれる）。例えば、Ｏ‐ｔＲＮＡ／Ｏ‐ＲＳの対は、宿主（例えば、Escherichia coli）に導入されると、当該対は、ロイシンアミノ酸の誘導体のような非天然アミノ酸（例えば、合成アミノ酸）のような、選択アミノ酸を、インビボにおいて選択コドンに対応したタンパク質への組み込ませる。当該アミノ酸は、増殖培地に対して外来性に添加されてもよい。本発明の組成物は、インビトロでの翻訳系またはインビボでの翻訳系にあり得る。
【０２０８】
選択アミノ酸、例えば、非天然アミノ酸（およびあらゆる対応する核酸（例えば、１つ以上の選択コドンを含む）をコードしている）を含むあらゆるタンパク質（またはそれらの部分）は、本明細書に説明されている上記組成物および方法を用いて生成されてもよい。１つ以上の非天然アミノ酸を含むために（例えば、適切な転写系において１つ以上の適当な選択コドンを含むために）、あらゆる利用可能な突然変異誘発法を調整することによって、修飾され得るあらゆる、数十万もの周知のタンパク質を同定する試みは、なされていない。周知のタンパク質に関する通常配列の集積場所としては、ＧｅｎＢａｎｋ  ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪおよびＮＣＢＩが挙げられる。他の集積場所は、インターネットを検索することによって簡単に発見できる。
【０２０９】
通常、上記タンパク質は、あらゆる利用可能なタンパク質（例えば、治療的なタンパク質、診断的なタンパク質、産業的な酵素またはこれらの一部など）に対して、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％またはそれ以上の同一性であり、当該タンパク質は、１つ以上の選択されらアミノ酸を備えている。治療的な、診断的なおよび他のタンパク質は、米国特許出願第１０／８２５，８６７号明細書（「Expanding the Eukaryotic Genetic Code」と名づけられている）および米国特許出願第１０／１２６，９２７号明細書（「IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS.」と名づけられている）に見られる。
【０２１０】
ある実施形態において、本発明の方法および／または組成物における、興味のあるタンパク質またはポリペプチド（またはこれらの一部）は、核酸にコードされている。通常、上記核酸は、１つの選択コドン、２つの選択コドン、３つの選択コドン、４つの選択コドン、５つの選択コドン、６つの選択コドン、７つの選択コドン、８つの選択コドン、９つの選択コドン、または１０以上の選択コドンを備えている。
【０２１１】
興味のあるタンパク質またはポリペプチドをコードしている遺伝子は、当該分野における当業者に周知の、および本明細書にある“突然変異誘発および他の分子生物学技術”に記載されている方法を用いて突然変異を誘発して、例えば、選択アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸）を組み込むための選択コドンを含められてもよい。例えば、興味のあるタンパク質についての核酸は、突然変異が誘発されて、１つ以上の選択アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸）の挿入を与える１つ以上の選択コドンを含められる。本発明は、そのような任意のバリアント（（例えば、少なくとも１つの選択アミノ酸を含んでいる）任意のタンパク質の突然変異体、変種）を含む。また、同様に、本発明は、対応する核酸（例えば、１つ以上の選択アミノ酸をコードしている１つ以上の選択コドンを有するあらゆる核酸）を含む。
【０２１２】
選択アミノ酸を含むタンパク質を作製するために、直交化Ｏ‐ｔＲＮＡ／Ｏ‐ＲＳの対を介した選択アミノ酸のインビボにおける組み込みに適応された宿主細胞および生物を使用可能である。宿主細胞は、直交化ｔＲＮＡまたは直交化ｔＲＮＡシンテターゼを発現する１つ以上のベクター、ならびに生成されるべきタンパク質をコードしているベクターを用いて、遺伝的に改変（例えば、形質転換、形質導入またはトランスフェクト）されている。これらの構成要素のそれぞれは、同じベクター上にあってもよく、または別のベクター上にあってもよく、２つの構成要素は１つのベクター上にあり、かつ第３構成要素が第２ベクター上にあってもよい。上記ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、細菌、ウィルス、裸のポリヌクレオチドまたは接合されたポリヌクレオチドの形態であってもよい。
【０２１３】
（選択可能な系）
非組み換え宿主細胞、突然変異誘発された宿主細胞または細胞を使用しない系においてタンパク質に非天然アミノ酸を導入するために、種々の戦略が採用される。Ｌｙｓ、ＣｙｓおよびＴｙｒのような活性のある側鎖を有するアミノ酸の誘導体は、リジンのＮ２‐アセチル‐リジンへの転換の結果として生じた。また、化学合成は、非天然アミノ酸を組み込むために複雑ではない方法を提供する。近年に発展した、ペプチド断片の酵素的な連鎖結合、および本来の化学的な連鎖結合を用いて、より長いタンパク質を作製することがかのうである。例えば、「P. E. Dawson and S. B. H. Kent, Annu. Rev. Biochem, 69:923 (2000)」を参照のこと。化学的なペプチド合成および本来の化学的な連鎖結合は、米国特許第６，１８４，３４４号明細書、米国特許出願公開第２００４／０１３８４１２号明細書、米国特許出願公開第２００３／０２０８０４６号明細書、国際公開第０２／０９８９０２号パンフレットおよび国際公開第０３／０４２２３５号パンフレットに記載されている（なお、これらは参照によって本明細書に組み込まれる）。一般的な、インビトロの生合成方法では、所望の非天然アミノ酸を用いて化学的にアシル化されるサプレッサーｔＲＮＡが、タンパク質の生合成を抑制することが可能な抽出物に添加される。この方法を用いて、１００を越える非天然アミノ酸を、事実上任意の大きさの様々なタンパク質に組み込まれた。例えば、「V. W. Cornish, D. Mendel and P. G. Schultz, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1995, 34:621 (1995)」、「C. J. Noren, S. J. Anthony-Cahill, M.C. Griffith, P.G. Schultz, A general method for site- specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science 244:182-188 (1989)」、および「J. .D. Bain, C. G. Glabe, T.A. Dix, A.R. Chamberlin, E.S. Diala, Biosynthetic site-specific incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide, J. Am. Chem. Soc. 111:8013- 8014 (1989)」を参照のこと。広い範囲の官能基が、タンパク質の安定性、タンパク質の折りたたみ、酵素機序、およびシグナル伝達の研究用のタンパク質に導入される。
【０２１４】
選択圧力組み込み（selective pressure incorporation）と呼ばれるインビボにおける方法は、野生型シンテターゼの乱雑さを利用するために開発された。例えば、「N. Budisa, C. Minks, S. Alefelder, W. Wenger, F. M. Dong, L. Moroder and R. Huber, FASEB J.. 13:41 (1999)」を参照のこと。細胞に特定の天然アミノ酸を供給する適切な代謝経路が断たれている栄養要求性株は、制限された濃度の天然アミノ酸を含む最少培地において培養されると同時に標的遺伝子の発現が抑制されている。安定した増殖期において、天然アミノ酸が使い果たされて、非天然アミノ酸と置き換えられる。組み換えタンパク質の発現誘導は、結果として、非天然の類似体を含むタンパク質の蓄積を生じる。例えば、この戦略を用いて、ｏ、ｍおよびｏ−フルオロフェニルアラニンが、タンパク質に組み込まれ、容易に同定され得るＵＶスペクトルにおける２つの特徴的な肩を示し（例えば、「C. Minks,R . Huber, L. Moroder and N. Budisa, Anal. Biochem., 284:29 (2000)」を参照のこと）、トリフルオロメチオニンが、１９Ｆ  ＮＭＲによってチトオリゴサッカライドとの相互作用を研究するためのバクテリオファージ  Ｔ４  リゾチームにおいて、メチオニンとの置き換えに使用され（例えば、「H. Duewel, E. Daub, V. Robinson and J. F. Honek, Biochemistry, 36:3404 (1997)」を参照のこと）、トリフルオロロイシンがロイシンの代わりに組み込まれた結果として、ロイシンジッパータンパク質の向上した熱安定性および化学安定性を生じる（例えば、「Y. Tang, G. Ghirlanda, W. A. Petka, T. Nakajima, W. F. DeGrado and D. A. Tirrell, Angew. Chem. Int. Ed. Engl, 40:1494 (2001)」を参照のこと）。さらに、セレノメチオニンおよびテルルメチオニンは、種々の組み換えタンパク質に組み込まれて、Ｘ線結晶学における相の溶解を容易にする。例えば、「W. A. Hendrickson, J. R. Horton and D. M. Lemaster, EMBO J., 9:1665 (1990)、「J. O. Boles, K. Lewinski, M. Kunkle, J. D. Odom, B. Dunlap, L. Lebioda and M. Hatada, Nat. Struct. Biol, 1:283 (1994)」、「N. Budisa, B. Steipe, P. Demange, C. Eckerskorn, J. Kellermann and R. Huber, Eur. J. Biochem., 230:788 (1995)」、および「N. Budisa, W. Karnbrock, S. Steinbacher, A. Humm, L. Prade, T. Neuefeind, L. Moroder and R. Huber, J. Mol Biol, 270:616 (1997)」を参照のこと。また、アルケンまたはアルキン作用性を有するメチオニン類似体は、効率的に組み込まれて、化学的方法によるタンパク質の付加的な修飾を可能にする。例えば、「J. C. van Hest and D. A. Tirrell, FEBS Lett., 428:68 (1998)」、「J. C.. van Hest, K. L. Kiick and D. A. Tirrell, J. Am. Chem. Soc, 122:1282 (2000)」、および、「K. L. Kiick and D. A. Tirrell, Tetrahedron, 56:9487 (2000)」、米国特許第６，５８６，２０７号明細書および米国特許出願公開第２００２／００４２０９７号明細書を参照のこと（なお、これらは参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０２１５】
この方法の成功は、通常、タンパク質翻訳の忠実度を保障するために高い感度を要求するアミノアシル‐ｔＲＮＡによる、非天然アミノ酸類似体の認識に依存している。この方法の範囲を拡張する１つの方法としては、限られた数の場合における実現をもたらすアミノアシル‐ｔＲＮＡシンテターゼの基質特異性を、緩和することである。例えば、Escherichia coliのフェニルアラニル‐ｔＲＮＡシンテターゼ（ＰｈｅＲＳ）におけるＧｌｙによるＡｌａ２９４の置き換えは、基質結合ポケットの大きさを向上させ、かつｐ‐Ｃｌ‐フェニルアラニン（ｐ‐Ｃｌ‐Ｐｈｅ）によるｔＲＮＡのアシル化を生じる。「M. Ibba, P. Kast and H. Hennecke, Biochemistry, 33:7107 (1994)」を参照のこと。この突然変異体ＰｈｅＲＳを含んでいるEscherichia coli株は、フェニルアラニンの代わりにｐ‐Ｃｌ‐フェニルアラニンまたはｐ‐Ｂｒ‐フェニルアラニンの取り込みを許容する。例えば、「M. Ibba and H. Hennecke, FEBS Lett., 364:272 (1995)」、および「N. Sharma, R. Furter, P. Kast and D. A. Tirrell, FEBS Lett., 467:37 (2000)」を参照のこと。同様に、Escherichia coliチロシル‐ｔＲＮＡシンテターゼのアミノ酸結合部位の近くにあるＰｈｅ１３０Ｓｅｒの点変異体は、アザチロシンがチロシンよりも高効率に組み込まれることを可能にする。例えば、「F. Hamano-Takaku, T. Iwama, S. Saito-Yano, K. Takaku, Y. Monden, M. Kitabatake, D. Soil and S. Nishimura, J. Biol. Chem., 275:40324 (2000)」を参照のこと。
【０２１６】
インビボにおいてタンパク質に非天然アミノ酸を組み込む他の戦略は、校正機構を有するシンテターゼを改変することである。これらのシンテターゼは、識別が不可能なので、同種の天然アミノ酸と構造的に類似しているアミノ酸を活性化する。この誤りは、タンパク質翻訳の忠実度を維持するために、ｔＲＮＡから間違って入ったアミノ酸を脱アシル化する、別の部位において補正される。シンテターゼの校正活性は、校正機能を逃れて組み込まれるかもしれない、間違って活性化される構造的な類似体を無効にする。この提案は、バリル‐ｔＲＮＡシンテターゼ（ＶａｌＲＳ）を用いて最近、証明されている。例えば、「V. Doling, H. D. Mootz, L. A. Nangle, T. L. Hendrickson, V. de Crecy-Lagard, P. Schimmel and P. Marliere, Science, 292:501 (2001)」を参照のこと。ＶａｌＲＳは、Ｃｙｓ、Ｔｈｒまたはアミノブチレート（Ａｂｕ）を用いてｔＲＮＡＶａｌを間違ってアミノアシル化し、これらの非同種のアミノ酸は、続いて構成領域によって加水分解される。Escherichia coli染色体のランダム変異誘発の後に、ＶａｌＲＳの校正部位に突然変異を有するEscherichia coli突然変異株が、選択される。この校正に欠損のあるＶａｌＲＳは、ｔＲＮＡにＣｙｓを間違って入れる。Ａｂｕが構造的にＣｙｓ（Ｃｙｓの‐ＳＨ基は、Ａｂｕにおける‐ＣＨ３と置換されている）と似ているので、ＶａｌＲＳ突然変異体はまた、この突然変異体がＡｂｕ存在下において増殖されるとき、タンパク質にＡｂｕを組み込む。質量分析解析は、バ２４％のバリンが通常のタンパク質におけるバリンの位置おいてＡｂｕによって置換されている。
【０２１７】
また、成法および固相半合成法は、新規のアミノ酸を含む多くのタンパク質の合成を可能にする。例えば、以下の公開文献および引用文献：「Crick, F.H.C., Barrett, L. Brenner, S. Watts-Tobin, R. General nature of the genetic code for proteins. Nature, 192:1227-1232 (1961)」、「Hofmann, K., Bohn, H. Studies on polypeptides. XXXVI. The effect of pyrazole-imidazole replacements on the S-protein activating potency of an S- peptide fragment, J. Am Chem, 88(24): 5914-5919 (1966)」、「Kaiser, E.T. Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins including enyzmes, Acc Chem Res, 22:47-54 (1989)」、「Nakatsuka, T., Sasaki, T., Kaiser, E.T. Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin, J Am Chem Soc, 109:3808-3810 (1987)」、「Schnolzer, M., Kent, S B H. Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides: backbone- engineered HIV protease, Science, 256(5054):221-225 (1992)、「Chaiken, I.M. Semisynthetic peptides and proteins, CRC Crit Rev Biochem, 11(3):255-301 (1981)、「Offord, R.E. Protein engineering by chemical means? Protein Eng., 1(3):151-157 (1987)」、および「Jackson, D.Y., Burnier, J., Quan, C., Stanley, M., Tom, J., Wells, J. A. A Designed Peptide Ligasefor Total Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues, Science, 266(5183):243 (1994)」を参照のこと。
【０２１８】
化学的な修飾は、補足因子、スピン標識、およびオリゴヌクレオチドを含む種々の非天然の側鎖を、インビトロにおいてタンパク質に導入するために使用される。例えば、「Corey, D.R., Schultz, P.G. Generation of a hybrid sequence-specific single-stranded deoxyribonuclease, Science, 238(4832): 1401-1403 (1987)」、「Kaiser, E.T., Lawrence D.S., Rokita, S.E. The chemical modification of enzymatic specificity, Annu Rev Biochem, 54:565- 595 (1985)」、「Kaiser, E.T., Lawrence, D.S. Chemical mutation of enyzme active sites, Science, 226(4674):505-511 (1984)」、「Neet, K.E., Nanci A, Koshland, D.E. Properties of thiol- subtilisin, J Biol. Chem, 243 (24): 6392-6401 (1968)」、「Polgar, L. et M. L. Bender. A new enzyme containing a synthetically formed active site. Thiol-subtilisin. J. Am Chem Soc, 88:3153-3154 (1966)」、および「Pollack, S. J., Nakayama, G. Schultz, P.G. Introduction of nucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites, Science, 242(4881):1038-1040 (1988)」を参照のこと。
【０２１９】
（免疫反応活性によるポリペプチドの特徴付け）
本発明のポリペプチドは、種々の新しいポリペプチド配列（例えば、本明細書における翻訳系において合成されるタンパク質の場合、または例えば、標準的なアミノ酸の新規なシンテターゼ、新規な配列において選択アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸）を備える）を提供し、また、当該ポリペプチドは、例えば、免疫学的検定において認識され得る新しい構造的な特徴を提供する。本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗血清の産生および当該抗血清によって結合されるポリペプチドは、本発明の一部である。ここで使用されているように、“抗体”という用語は、以下に限定されないが、分析物（抗原）と結合し、かつ認識する、１つの免疫グロブリン遺伝子もしくは複数の免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされるポリペプチド、またはこれらの断片を含む。例としては、他クローン性の、単クローン性の、キメラの、および単鎖の抗体などが挙げられる。また、Ｆａｂ断片、およびファージディスプレイを含む発現ライブラリーによって生成される断片を含む、免疫グロブリンの断片は、ここで使用されているように、“抗体”という用語に含まれる。例えば、「Paul, Fundamental Immunology, 4th Ed., 1999, Raven Press, New York, for antibody structure and terminology」を参照のこと。
【０２２０】
例えば、本発明は、アミノ酸配列を備える免疫原に対して産生された抗体もしくは抗血清と、特異的に結合するおよび／または特異的に免疫反応する、本発明のｔＲＮＡおよび／またはＲＳを利用して作製されるタンパク質を含む。他の相同物と交差反応することを排除するために、上記抗体または抗血清は、野生型ポリペプチド（例えば、“対照の”ポリペプチド）のような利用可能なタンパク質を用いて減じられてもよい。上記野生型ポリペプチドがある核酸に対応する場合に、当該核酸によってコードされるポリペプチドが抗原／抗血清を減じる目的に産生され、かつ使用される。
【０２２１】
１つの通常の形態において、免疫検定は、１つ以上のポリペプチドまたはこれらの実質的な配列（例えば、規定の全長配列の約３０％）に対して発生される他クローン性の抗血清を使用する。上記タンパク質から生じた潜在的なポリペプチド免疫原の一揃えは、以下において、まとめて“免疫原性ポリペプチド”と呼ばれる。結果物としての項血清は、対照のシンテターゼ相同物に対して低い交差反応性を有するように任意に選択され、あらゆる当該交差反応は、免疫検定における他クローン性の抗血清の利用に先立って、例えば、免疫吸着によって、１つ以上の対照相同物を用いて除去される。
【０２２２】
免疫検定に使用する抗血清を生成するために、１つ以上の免疫原性ポリペプチドは、本明細書に記載されているように生成され、かつ精製される。例えば、組み換えタンパク質が、組み換え砂防において生成されてもよい。マウスの同形交配種（マウスにおける実際の遺伝的な同一性が原因でより高い再現性が生じるので、この検定に使用される）は、フロインド補助液のような標準的な補助剤と組み合わせた上記免疫原性ポリペプチド、および標準的なマウス免疫手順（例えば、特異的な免疫反応性を決定するために使用され得る抗体産生、免疫検定の形態、および条件の標準的な説明に関して、「Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York」を参照のこと）を用いて免疫される。
【０２２３】
また、抗体の付加的な参考文献および考察は、本明細書に見られ、かつ免疫活性によってポリペプチドを規定するためにここに適用されてもよい。変更可能に、本明細書に開示された配列から生じた１つ以上の合成ポリペプチドまたは組み替えポリペプチドは、担体のタンパク質と接合され、かつ免疫原として使用される。
【０２２４】
他クローン性の血清は、回収され、かつ免疫検定（例えば、固体支持体上に固定された１つ以上の免疫原性タンパク質を用いる固相免疫検定）における免疫原性ポリペプチドに対する力価評価される。減じられ、貯められた、かつ力価評価された他クローン性抗血清を生成するために、１０６の力価を有する他クローン性抗血清が、対照のシンテターゼポリペプチドを用いて、選択され、貯められ、かつ減じられる。
【０２２５】
上述の減じられ、貯められた、かつ力価評価された他クローン性抗血清は、比較による免疫検定において、対照の相同物に対する交差反応について試験される。この比較の検定において、識別できる結合条件は、免疫原性タンパク質に対する力価評価された他クローン性の抗血清の結合に関するノイズに対するシグナルの割合が、対照のシンテターゼ相同物に対する結合と比較して、少なくとも約５〜１０倍を生じる、減じられ、かつ力価評価された他クローン性の抗血清について、試験された。それは、結合反応の厳密さが、アルブミンもしくは脱脂粉乳のような非特異的な競合物の添加、および／または、塩条件および／または温度の調整などによって調整されるということである。これらの結合条件は、試験ポリペプチド（免疫原性ポリペプチドおよび／または対象のポリペプチドと比較されるポリペプチド）が、貯められ、かつ減じられた他クローン性の抗血清によって特異的に結合されるか否かを決定する、次の検定に使用される。
【０２２６】
他の実験において、競合的な結合形式における免疫検定は、試験ポリペプチドの検出に使用される。例えば、交差反応抗体は、上述のように、対照ポリペプチドを用いた免疫吸着によって貯められた抗血清混合物から除去されている。それから、免疫原性ポリペプチドは、上述の減じられ、かつ貯められた抗血清にさらされる固体支持体に不動化される。試験タンパク質は、貯められ、かつ減じられた抗血清との結合を競合するために上記検定に加えられる。試験タンパク質が、上述の減じられ、かつ貯められた抗血清との結合を、上述の不動化されたタンパク質に対する結合と比較して、競合する能力は、結合について競合する検定に加えられる免疫原性ポリペプチドの能力である（当該免疫原性ポリペプチドは、上述の貯められた抗血清との結合について不動化された免疫原性ポリペプチドを用いて効果的に競合する）。試験タンパク質に関する交差反応性の割合は、標準的な計算を用いて、計算される。
【０２２７】
平行する検定において、貯められ、かつ減じられた抗血清との結合について競合する対照タンパク質の能力は、当該抗血清との結合について競合する免疫原性ポリペプチドの能力と比較して、任意に決定される。この場合もやはり、対照ポリペプチドに関する交差反応性の割合は、標準的な計算を用いて計算される。交差反応性の割合が、対照ポリペプチド比較して試験ポリペプチドに対して少なくとも５〜１０倍である場合、または試験ポリペプチドの結合が、おおよそ免疫原性ポリペプチドの結合の範囲内である場合において、試験ポリペプチドは、貯められ、かつ減じられた抗血清と特異的に結合すると言える。
【０２２８】
通常、免疫吸着され、かつ貯められた抗血清は、本明細書に記載されているように、免疫原性のおよび／または対象のポリペプチドに対して、あらゆる試験ポリペプチドを比較するために、競合的な結合免疫検定に使用されてもよい。この比較を実施するために、免疫原性のある試験ポリペプチドおよび対照ポリペプチドは、例えば、標準的な技術を用いて決定される不動化された対象の、試験のまたは免疫原性のタンパク質に対する減じられた抗血清の結合を５０％阻害するために必要な、各ポリペプチドの濃度の広い範囲および量において、それぞれ評価される。競合的な検定において結合に必要な試験ポリペプチドの量が、免疫原性ポリペプチドの必要な量の２倍未満であり、試験ポリペプチドの量が対照ポリペプチドに対してよりも少なくとも５倍であるこのときに、試験ポリペプチドは、免疫原性タンパク質に対して生じた抗体と特異的に結合すると言える。
【０２２９】
特異性の付加的な決定として、貯められた抗血清は、（対照ポリペプチドよりむしろ、）免疫原性ポリペプチドを用いて十分に、免疫吸着に使用される免疫原性ポリペプチドに対する、結果として生じる免疫原性ポリペプチドを用いて減じられ、かつ貯められたポリペプチドの結合がほとんどまたは完全に検出されなくなるまで、任意に免疫吸着される。それから、この十分に免疫吸着された抗血清は、試験ポリペプチドとの反応性について試験される。反応性がほとんど、またはまったく観察されないとき（例えば、免疫原性ポリペプチドに対する十分に免疫吸着された抗血清の結合について、２倍以上のノイズに対するシグナルの割合が観察されたとき）、それから上記試験ポリペプチドは免疫原性タンパク質によって導き出された上記抗血清によって、特異的に結合される。
【０２３０】
タンパク質、抗体および抗血清などに関する付加的な詳細は、“真核生物の遺伝コードの拡張”と名づけられた米国特許出願第１０／８２５，８６７号明細書、“IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS”と題された国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレット、“Glycoprotein synthesis”と題された米国特許６，９２７，０４２号明細書、および“Protein Arrays”と題された米国特許出願公開第２００４／０１９８６３７号明細書（これらは参照によって本明細書に組み込まれる）に見られてもよい。
【０２３１】
‐キット‐
また、キットは、本発明の一部である。例えば、少なくとも１つの選択アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸）を備えるタンパク質を細胞において生成するキットが提供される。ここで、当該キットは、Ｏ‐ｔＲＮＡをコードしているポリヌクレオチドおよび／またはＯ‐ｔＲＮＡ、および／または、Ｏ‐ＲＳをコードしているポリヌクレオチドおよび／またはＯ‐ＲＳを含む容器を含む。１つの実施形態において、上記キットは、少なくとも選択アミノ酸を含む。他の実施形態において、キットは、本発明アミノアシルｔＲＮＡを含む。他の実施形態において、キットは、タンパク質を産生する取扱説明書をさらに含む。
【０２３２】
付加的な例として、少なくとも１つの選択アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸）を備えるタンパク質を、細胞を使用しない系において産生する、キットが挙げられる。ここで、当該キットは、Ｏ‐ｔＲＮＡをコードしているポリヌクレオチドおよび／またはＯ‐ｔＲＮＡ、および／または、Ｏ‐ＲＳをコードしているポリヌクレオチドおよび／またはＯ‐ＲＳを含む容器を含む。１つの実施形態において、キットは、選択アミノ酸をさらに含む。他の実施形態において、キットは、本発明のアミノアシルｔＲＮＡを含む。他の実施形態において、キットは、タンパク質を産生する取扱説明書をさらに含む。
【０２３３】
〔実施例〕
以下の実施例は、特許請求の範囲に記載された発明を説明するために提供されるが、該発明を限定するものではない。当業者は、特許請求の範囲に記載された発明から逸脱せずに変更され得る種々の必須の要因を認識するだろう。
【０２３４】
〔実施例１：パラ‐アセチルフェニルアラニンに対するアミノアシル‐ｔＲＮＡシンテターゼの選択〕
２つのＤＮＡライブラリーは、非天然にコードされるアミノ酸であるパラアセチルフェニルアラニンを対照としてアミノアシルｔＲＮＡについてスクリーニングされた。これらのライブラリーは、ｐＢＫプラスミドにおけるMethanococcous janneschiiに由来するチロシルｔＲＮＡシンテターゼ遺伝子における、６つの突然変異から構成された。
【０２３５】
５回の変化する選択、３回の陽性、および２回の陰性から構成された選択手法が実施された。上記ライブラリーは、１：１の比率において混合され、かつ陽性の選択細胞株（陽性の選択プラスミドであるｐＲＥＰを用いたＧｅｎｅＨｏｇ）に電気穿孔され、適切な抗生物質および非天然にコードされるアミノ酸であるパラアセチルフェニルアラニン（ｐＡＦ）を用いて最小培地プレート（ＧＭＭＬ）上において培養された。上記プレートは、３７℃において掻き取りによって細胞が回収された時間である約４０時間、インキュベートされた。上記ＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｎｉ‐Ｐｒｅｐ法を用いて抽出され、それからライブラリープラスミドＤＮＡを単離するためにアガロースゲル精製された。
【０２３６】
それから、このＤＮＡは、陰性の選択細胞株（陰性の選択プラスミドであるｐＢＡＤ誘導体を用いたＧｅｎｅＨｏｇ）に電気穿孔された。これらの形質転換体は、上述の非天然にコードされるアミノ酸（ｐＡＦ）なしで適切な抗生物質を用いたＬＢプレート上において培養された。１７時間後にこれらの細胞は、掻き取りによって回収され、かつプラスミドＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｎｉ‐Ｐｒｅｐ法およびアガロースゲル精製法を用いて精製された。
【０２３７】
続く回の選択は、電気穿孔、培養、回収およびＤＮＡ精製の同じ方法を利用して行われた。最後（５回目）の選択において、希釈系列が、最小培地の上において培養された、形質転換されたよう性の選択細胞から作られた。それから個々のコロニーが、拾い上げられ、９６ウェル区画において１晩中、培養された。それから、この区画は、非天然アミノ酸  ｐＡＦを用いて、および用いずに、クロラムフェニコール（陽性の選択抗生物質）の濃度を変化させた最小培地プレート上においてレプリカ培養された。３７℃において約４０時間、培養した後に、上記プレートは、可視的に比較して、最もクロラムフェニコール濃度の高い条件においてコロニー成長したが、非天然にコードされるアミノ酸  ｐＡＦの非存在において成長しない、またはほとんど成長しないことを評価した。これらの基準に適合したコロニーは、１晩中、培養された。上記ＤＮＡは、Ｍｉｎｉ‐Ｐｒｅｐおよびアガロースゲル精製によって培地から単離され、かつ配列決定された。
【０２３８】
ｐＡＦに関するこの選択から、１３のコロニーは、独特のアミノ酸配列を有することが分かり、かつｐＡＦ‐ｔＲＮＡシンテターゼの忠実度およびプロセス度を決定するためにさらに性質決定を実施される。
【０２３９】
これらのシンテターゼを性質決定するため、少量のアンバー抑制が実施され、非天然にコードされるアミノ酸  ｐＡＦがポリペプチドに組み込まれることを示し、かつその結果は、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって可視化された。単一のコロニーが拾い上げられ、かつＬＢ培養液において、１晩中培養され、それから、５０ｍｌのＬＢへの接種に使用された。細胞は、１．５ｍＬの分取液が誘導前の点として取られた時点において０．３〜０．４のＯＤになるまで培養され、培養液は、２つのフラスコに分けられた。１ｍＭのｐＡＦが分けた内の１つに加えられ、かつ両方が３０分間、培養された。３０分間の培養に続いて、両方の培養液（＋／−  ｐＡＦ）は、０．２％Ｌ‐アラビノースを用いて誘導され、かつ４．５時間培養され、ＯＤ６００が記録された。それから、１．５ｍＬの分取液がＳＤＳ‐ＰＡＧＥ解析用の＋／−  ｐＡＦフラスコから取られた。
【０２４０】
１．５ｍＬの分取液（誘導前、＋ｐＡＦおよび−ｐＡＦ）は、上記細胞をペレットにするために、１００００ｇにおいて遠心分離された。それから、上記細胞は、回収の時点であるＯＤ６００のときに対応する量の、均整の取れたBacterial Protein Extraction Reagent(BPER、Pierce)に懸濁された。溶解（ライシス）された細胞にＤＮａｓｅ  Ｉが加えられて、４℃において２０分間インキュベートされた。それから、試料は、還元剤および負荷染料を用いて混合され、ＭＥＳ緩衝液における４〜１２％のビス‐ＴＲＩＳゲル上に３０分間流された。ゲルは、蒸留Ｈ２Ｏにおいて２回洗浄され、クーマシーブルー染料を用いて染められた。＋／−ｐＡＦのバンドは、ｐＡＦ‐ｔＲＮＡ  ＲＳの忠実度について比較され、ｐＡＦの組み込みを生じ、＋ｐＡＦのバンドは、前に選択されたｐＡＦ‐ｔＲＮＡ  ＲＳと比較された。
【０２４１】
ＲＳのプロセス度を確認するために、同じ手法が、C-H6 S4am myoglobin (S4am-Myo)を用いて実施された。それから、Ｓ４ａｍ‐Ｍｙｏは、ＩＭＡＣに精製され、ｐＡＦの組み込み量を決定するために、タンパク質配列けっていに送られた。
【０２４２】
この選択から同定されたｐＡＦ‐ｔＲＮＡ  ＲＳの内、１つのシンテターゼ（Ｅ９）は、Ｓ４ａｍ‐ＭｙｏにｐＡＦが９５％以上の効率性を有する、効率的なｐＡＦの組み込みが見られた。組み込みは、アミノ酸配列決定によって決定され、かつプロセス度は、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲル上におけるタンパク質バンドを比較することによって示された。Ｅ９に関する核酸配列は、配列番号９に示され、Ｅ９のアミノ酸配列は、配列番号５に示されている。
【０２４３】
Ｅ９と類似の活性を有する付加的な突然変異体が同定され、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有している。
【０２４４】
〔実施例２：ｔＲＮＡ突然変異誘発〕
３つの突然変異体がｔＲＮＡ  Ｊ１７から生成された。野生型のＪ１７のＤＮＡ配列は、配列番号８として、米国特許出願公開第２００３／０１０８８８５号明細書における配列番号１として、および米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号明細書における配列番号１として示されている（それぞれ米国特許出願第１０／１２６，９３１号明細書および米国特許出願第１０／１２６，９２７号明細書）。なお、上記文献は参照によって本明細書に組み込まれる。Ｊ１７  ｔＲＮＡは、図１に示すようにＴΨＣステムにおいて、Ｕ５１：Ｇ６３の揺らぎ対を有している。
【０２４５】
３つのＪ１７突然変異体（Ｆ１２、Ｆ１３およびＦ１４）が、ＴΨＣステムの５１位および６３位におけるワトソンクリック塩基対を産生するために生成された。突然変異誘発は、重複ＰＣＲによって実施され、最終コンストラクトは、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼをコードしているポリヌクレオチド配列（配列番号４）、およびアンバーコドン置換を有するヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）（配列番号１６）をコードしているポリヌクレオチド配列を備える、ｐＥＴプラスミドのＥｃｏＲＩおよびＮｄｅＩ部位にクローン化された。ｈＧＨの発現は、Ｔ７プロモーターの制御下であった。
【０２４６】
２つの断片が重複ＰＣＲ用に生成された。第１断片は、プライマー伸張によって得られた。３つの突然変異体のそれぞれを生成するために用いられた前方のプライマーは、
ＧＴＡＡＣＧＣＴＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＣＧＧＴＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＧＣＡＧＡＡＣＧＧＣＧＧＡＣＴＣＴＡＡＡＴＣＣＧＣＡＴＧＧＣＧＣ  （ＦＴａｍｌｌ、配列番号９）
であった。
【０２４７】
Ｆ１２突然変異体（５１Ｃ：６３Ｇ）を生成するために、以下の逆向きのプライマー：
ＧＡＴＣＴＧＣＡＧＴＧＧＴＣＣＧＧＣＧＧＧＣＣＧＧＡＴＴＴＧＡＡＣＣＧＧＣＧＣＣＡＴＧＣＧＧＡＴＴＴＡＧＡＧＴＣＣＧＣＣＧＴＴＣＴＧＣ  （ＦＴａｍｌ２、配列番号１０）
が使用された。
【０２４８】
Ｆ１２突然変異体（５１Ｕ：６３Ａ）を生成するために、以下の逆向きのプライマー：
ＧＡＴＣＴＧＣＡＧＴＧＧＴＣＣＧＧＣＧＧＧＣＴＧＧＡＴＴＴＧＡＡＣＣＡＧＣＧＣＣＡＴＧＣＧＧＡＴＴＴＡＧＡＧＴＣＣＧＣＣＧＴＴＣＴＧＣ  （ＦＴａｍｌ３、配列番号１１）
が使用された。
【０２４９】
Ｆ１２突然変異体（５１Ａ：６３Ｕ）を生成するために、以下の逆向きのプライマー：
ＧＡＴＣＴＧＣＡＧＴＧＧＴＣＣＧＧＣＧＧＧＣＡＧＧＡＴＴＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＣＣＡＴＧＣＧＧＡＴＴＴＡＧＡＧＴＣＣＧＣＣＧＴＴＣＴＧＣ  （ＦＴａｍｌ４、配列番号１２）
が使用された。
【０２５０】
第２断片である、Ｊ１７  ｔＲＮＡ用の核酸配列（配列番号８）を備えるプラスミド  ｐＥＴ１９  Ｊ１７  Ｅ９  ｈＧＨを生成するために、ｔＲＮＡシンテターゼ  Ｅ９（配列番号４）をコードしているポリヌクレオチド、およびアンバーコドン置換を有するヒト成長ホルモン（配列番号１６）をコードしているポリヌクレオチド配列が、以下の一揃いのプライマー：
ＣＧＣＣＧＧＡＣＣＡＣＴＧＣＡＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣＧＡＡＡＧＣＴＡＡＧＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＧＣ  （前方のプライマー、ＦＴａｍｌ５、配列番号１３）、およびＣＡＡＡＴＴＣＧＴＣＣＡＴＡＴＧＧＧＡＴＴＣＣ  （ＦＴａｍ  １６、配列番号１４）
が増幅の鋳型として使用された。前方のプライマーは、ｔＲＮＡの３’末端から上記プラスミドのＮｄｅＩ部位までの配列を伸張するために使用された。結果産物は、ゲル精製された。
【０２５１】
重複ＰＣＲの最終段階は、前方のプライマーＧＴＡＡＣＧＣＴＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＣＧ  （ＦＴａｍｌ７、配列番号１５）、逆向きプライマー  ＦＴａｍｌ６（配列番号１４）、第１断片および第２断片を必要とした。コンストラクトされた産物は、ＥｃｏＲＩおよびＮｄｅＩを用いて消化され、かつＥｃｏＲＩおよびＮｄｅＩを用いて消化されたプラスミド  ｐＥＴ１９  Ｊ１７  Ｅ９  ｈＧＨの中に連結された。各コンストラクトの配列は、配列決定によって確かめられ、Ｊ１７突然変異体ｔＲＮＡのそれぞれに対するＤＮＡ配列は、配列番号１（Ｆ１２）、配列番号２（Ｆ１３）および配列番号３（Ｆ）１４として示されている。ｔＲＮＡは、これらの対応する逆向きプライマーの後に命名された。
【０２５２】
（タンパク質発現）
ｔＲＮＡ（Ｊ１７、Ｆ１２、Ｆ１３またはＦ１４）をコードしているプラスミドは、細菌宿主細胞E. coli菌株１および菌株２に化学的方法によってそれぞれ形質導入され、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを有するＬＢアガープレート上において培養された。上記プレートは、３７℃において１晩中インキュベートされた。各ｔＲＮＡについて、単一のコロニーが、拾い上げられ、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを有する１ｍｌの２ｘＹＴにおいて１晩の培養を始めた。この１ｍｌの培養は、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを有する３７℃における１０ｍｌの２ｘＹＴ培養液の２つに接種するために使用された。１つの１０ｍｌの培養液は、４ｍＭのパラアセチルフェニルアラニンを追加された。ＯＤ６００＝０．７において、ｈＧＨ発現は、０．４ｍＭＩＰＴＧを用いて誘導された。２５０ｒｐｍを用いた３７℃における４時間の細胞培養の後に、細胞は、５０００ｇにおいて５分間の遠心分離によって回収された。細胞は、５μｇ／ｍｌのＤＮＡｓｅＩを追加されたB-PER Reagent(Pierce、Rockford、IL)を用いて溶解された。すべての細胞ライセートが、４〜１２％のＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分析された。
【０２５３】
図２は、E. coli菌株１のすべての細胞ライセートのＳＤＳ  ＰＡＧＥによる分析を示している。ヒト成長因子における選択コドンの抑制は、Ｊ１７またはＪ１７突然変異体（Ｆ１２、Ｆ１３およびＦ１４）  ｔＲＮＡならびにアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ  Ｅ９を用いて実施された。Ｊ１７突然変異体を含む細胞は、Ｊ１７を含む細胞よりもわずかにゆっくりと増殖した。全長のｈＧＨ産物は、４ｍＭのパラアセチルフェニルアラニンの非存在におけるｔＲＮＡ突然変異体に関するＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって観察されなかった。４ｍＭのパラアセチルフェニルアラニンの存在において、全長の産物は、ｔＲＮＡ突然変異体のそれぞれとともに産生され、これらのｔＲＮＡ突然変異体‐ＲＳ  Ｅ９の対が、E. coliの機序に対して直交であることを示している。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥに基づいて、Ｊ１７突然変異体の抑制されたｈＧＨの産生は、E. coli菌株１におけるＪ１７よりも約１．５〜２倍高かった。
【０２５４】
１つのＪ１７突然変異体であるＦ１３は、図３に示すように、アンバー抑制についてE. coli菌株２  細菌株においてさらに試験された。E. coli菌株２において、アンバー抑制の産生だけでなく、発現は、E. coli菌株１に対して相対的に低下された。パラアセチルフェニルアラニンの非存在において、全長のｈＧＨ産物は、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって観察されなかった。４ｍＭのパラアセチルフェニルアラニンの存在において、全長のｈＧＨは、両方のｔＲＮＡについて観察された。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥに基づいて、Ｆ１３のｈＧＨ産生の抑制は、Ｊ１７よりも約３倍大きかった。
【０２５５】
Ｊ１７およびＦ１３を比較する発酵工程が、１Ｌの最終体積を用いて実施された。Ｊ１７  ｔＲＮＡをコードしているプラスミドおよびＦ１３  ｔＲＮＡをコードしているプラスミドのそれぞれは、E. coli菌株１に形質導入された。それぞれについて最終の細胞密度は、約１９０ｇ湿細胞／ｌであった。ｈＧＨの力価は、Ｊ１７クローンについて３４７ｍｇ／ＬおよびＦ１３クローンについて５４２ｍｇ／Ｌであった。
【０２５６】
上述の発明は、明確さ、および理解を目的としていくらかの詳細について説明されているが、形式および詳細における種々の変更が、真の本発明の範囲から逸脱しない限り可能であるというこの開示の解釈は、当該分野における当業者にとって明らかなことである。例えば、上述したすべての技術および装置は、種々の組み合わせにおいて使用されてもよい。個々の公開、特許、特許出願および／または他の文献のそれぞれが、すべての目的に対して引用によって組み込まれると個々に示されているかのように、この出願におけるすべての公開、特許、特許出願、および／または他の引用文献は、ある範囲に対するすべての目的のために、それらの全体について引用されることによって組み込まれる。
【０２５７】
【表１】
2009504182.tif 000004
2009504182.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【０２５８】
【図１】ＴΨＣＪ１７ステムの突然変異部位を有するｔＲＮＡのクローバー型構造を示す図である。
【図２】ヒト成長ホルモンにおけるアンバー変異の抑制を、Ｊ１７またはＪ１７突然変異体（Ｆ１２、Ｆ１３、Ｆ１４）を用いて示す図である。
【図３】Ｆ１３を用いたヒト成長ホルモンにおけるアンバー変異の抑制を、異なる細胞株において示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年4月24日(2008.4.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、２、３、それらに相補的なポリヌクレオチド配列、およびそれらの保存的変種からなる群から選ばれる核酸配列を有しているｔＲＮＡを、含んでいる組成物。
【請求項２】
上記ｔＲＮＡが、アミノアシル化される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
上記ｔＲＮＡが、非天然にコードされるアミノ酸によりアミノアシル化される、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
上記非天然にコードされるアミノ酸が、パラ‐アセチルフェニルアラニンである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
上記ｔＲＮＡが化学的にアミノアシル化される、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
上記ｔＲＮＡが酵素的にアミノアシル化される、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
上記ｔＲＮＡが、ＲＳによって酵素的にアミノアシル化される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
上記ｔＲＮＡが、リボザイムによって酵素的にアミノアシル化される、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
ＲＳをさらに含んでおり、上記ｔＲＮＡが、アミノ酸によりアミノアシル化される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
上記アミノ酸が、非天然にコードされるアミノ酸である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
上記非天然にコードされるアミノ酸が、パラ‐アセチルフェニルアラニンである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
上記ｔＲＮＡが古細菌に由来する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
上記ｔＲＮＡがM. janneschiiに由来する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
翻訳系をさらに含んでいる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
上記翻訳系が無細胞翻訳系である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
上記翻訳系が細胞ライセートである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
上記翻訳系が再構成系である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
上記翻訳系が細胞翻訳系である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１９】
翻訳系を含んでいる細胞であって、該翻訳系が、請求項１に記載のｔＲＮＡを含んでいる細胞。
【請求項２０】
上記細胞が真核細胞である、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２１】
上記真核細胞が酵母細胞である、請求項２０に記載の細胞。
【請求項２２】
上記真核細胞が真菌細胞である、請求項２０に記載の細胞。
【請求項２３】
上記真核細胞が哺乳類細胞である、請求項２０に記載の細胞。
【請求項２４】
上記真核細胞が昆虫細胞である、請求項２０に記載の細胞。
【請求項２５】
上記真核細胞が植物細胞である、請求項２０に記載の細胞。
【請求項２６】
上記細胞が非真核細胞である、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２７】
上記非真核細胞がE. coli細胞である、請求項２６に記載の細胞。
【請求項２８】
興味のあるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドをさらに含んでおり、該ポリヌクレオチドは、ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含んでいる、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２９】
上記興味のあるポリペプチドが、ヒト成長ホルモンである、請求項２８に記載の細胞。
【請求項３０】
請求項１に記載のｔＲＮＡを含んでいるE. coli細胞。
【請求項３１】
請求項１に記載のｔＲＮＡを含んでいる酵母細胞。
【請求項３２】
請求項１に記載のｔＲＮＡを含んでいる真菌細胞。
【請求項３３】
請求項１に記載のｔＲＮＡを含んでいる哺乳類細胞。
【請求項３４】
請求項１に記載のｔＲＮＡを含んでいる昆虫細胞。
【請求項３５】
請求項１に記載のｔＲＮＡを含んでいる植物細胞。
【請求項３６】
配列番号１、２、３、それらに相補的なポリヌクレオチド配列、およびそれらの保存的変種からなる群から選ばれる核酸配列を有しているｔＲＮＡを、コードしているポリヌクレオチドを、含んでいるベクター。
【請求項３７】
上記ベクターが、プラスミド、コスミド、ファージ、またはウィルスを含んでいる、請求項３６に記載のベクター。
【請求項３８】
上記ベクターが発現ベクターである、請求項３６に記載のベクター。
【請求項３９】
請求項３６に記載のベクターを含んでいる細胞。
【請求項４０】
特定の位置に選択アミノ酸を有するポリペプチドを、細胞中において製造する方法であって、
適切な培養液中において細胞を成長させる工程と、選択アミノ酸を提供する工程とを含んでおり、
該細胞は、（ｉ）少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいるとともに、タンパク質をコードしている核酸、（ｉｉ）、細胞中において機能し、セレクターコドンを認識する直交化ｔＲＮＡ（Ｏ‐ｔＲＮＡ）、および（ｉｉｉ）直交化アミノアシル‐ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ‐ＲＳ）を含んでおり、
上記Ｏ‐ｔＲＮＡは、配列番号１、２、３、それらに相補的なポリヌクレオチド配列、およびそれらの保存的変種からなる群から選ばれる核酸配列を有しており、上記Ｏ‐ＲＳは、上記選択アミノ酸を用いて上記Ｏ‐ｔＲＮＡをアミノアシル化する、方法。
【請求項４１】
上記選択アミノ酸が、パラ‐アセチルフェニルアラニンである請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
請求項４０に記載の方法により製造されるポリペプチド。
【請求項４３】
上記選択アミノ酸がパラ‐アセチルフェニルアラニンである、請求項４２に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
上記ポリペプチドが、ヒト成長ホルモンである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
配列番号１、２、３、それらに相補的なポリヌクレオチド配列、およびそれらの保存的変種からなる群から選ばれる核酸配列を有しているポリヌクレオチド。
【国際調査報告】
2009504182.tif 000009
2009504182.tif 000010
2009504182.tif 000011