(57)【要約】  本発明は、一般的には、siRNAに関し、特定的には、siRNAの標的化送達を行う方法およびそのような方法に使用するのに好適な化合物に関する。【選択図】  図1A
2009538626.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸ターゲッティング部分とRNAサイレンシング部分とを含むキメラ分子であって、Dicerの基質であることを特徴とする、上記分子。
【請求項２】
前記ターゲッティング部分がアプタマーである、請求項1に記載の分子。
【請求項３】
前記ターゲッティング部分が細胞表面レセプターを標的にする、請求項1に記載の分子。
【請求項４】
そのようなターゲッティング部分がPSMA、Plk1、またはBcl2を標的にする、請求項1に記載の分子。
【請求項５】
前記分子がRNA分子である、請求項1に記載の分子。
【請求項６】
前記分子が、アプタマーとpre-siRNA、アプタマーとshRNA、アプタマーとpre-miRNA、またはアプタマーとpri-miRNAを含む、請求項1に記載の分子。
【請求項７】
請求項1に記載の分子と担体とを含む組成物。
【請求項８】
細胞へのRNAサイレンシング部分の標的化送達を行う方法であって、ターゲッティング部分により認識される標的を含む細胞を、請求項1に記載のキメラ分子に、該細胞が該分子を内部移行させかつ該細胞内に存在するDicerが該分子をプロセシングすることにより該サイレンシングが行われるような条件下で、接触させることを含む、上記方法。
【請求項９】
前記細胞がin vivoの細胞である、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞がヒト細胞である、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が癌細胞である、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞が前立腺癌細胞である、請求項11に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2006年6月1日出願の米国仮出願第60／809,842号（その全内容は参照により本明細書に組み入れられるものとする）に基づく優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所（The National Institutes of Health）により与えられた助成金番号R01HL079051に基づいて政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明に関する一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、一般的には、干渉RNA（RNAi）（たとえばsiRNA）に関し、特定的には、RNAiの標的化送達を行う方法およびそのような方法に使用するのに好適な化合物に関する。
【背景技術】
【０００４】
RNA干渉（RNAi）とは、21〜23ntのRNA二本鎖がコグネイトmRNAの分解を引き起こす細胞機序のことであり、1998年にファイア（Fire）らによりC.エレガンス（C. elegans）で初めて報告された（非特許文献1）。外因性の低分子干渉RNA（siRNA）が哺乳動物細胞においてこの経路を介して遺伝子発現をサイレンシングしうることが初めて実証されて以来、RNAiの治療的用途の有望性が明らかになっている（非特許文献2）。治療剤として魅力的なRNAiの性質としては、1）ストリンジェントな標的遺伝子特異性、2）siRNAの比較的低い免疫原性、ならびに3）siRNAのデザインおよび検査の単純性が挙げられる。
【０００５】
RNAiに基づく臨床的用途に重要な技術的ハードルは、in vivoで細胞の形質膜を横切ってsiRNAを送達することである。この問題に対して、カチオン性脂質（非特許文献3）、ウイルスベクター（非特許文献4,非特許文献5,非特許文献6）、高圧注射（非特許文献7）、およびsiRNAの修飾（たとえば、化学修飾、脂質修飾、ステロイド修飾、タンパク質修飾）（非特許文献8,非特許文献9,非特許文献10,非特許文献11,非特許文献12,非特許文献13）をはじめとするいくつかの解決策が報告されている。しかしながら、これまでに報告されている手段のほとんどは、細胞タイプに関係なく非特異的にsiRNAを細胞に送達するという欠点を有する。
【０００６】
in vivoで使用する場合、治療用siRNA試薬を特定の細胞タイプ（たとえば癌細胞）にターゲッティングすることが重要であり、それにより、非特異的送達の結果として生じる副作用が制限されるとともに、重要な経費要件である治療に必要なsiRNA量が削減される。最近の研究の１つでは、siRNAを標的化送達する有望な方法が報告された。この方法では、細胞タイプ特異的細胞表面レセプターに結合する抗体がプロタミンに融合され、エンドサイトーシスを介してsiRNAを細胞に送達するために使用された（非特許文献14）。
【０００７】
本発明は、siRNAの特異的送達のためのきわめて単純な手段、少なくとも一実施形態では単にRNAの性質を使用するだけである手段に関する。SELEX（試験管内進化法）を用いることにより、高い親和性および特異性を有してさまざまなタンパク質に結合可能な構造RNAを同定しうることが実証されている。本発明に係る送達方法では、特定の細胞表面レセプターひいては特定の細胞タイプにsiRNAをターゲッティングするために核酸（たとえばRNA）の構造上の能力を活用する。したがって、本発明は、ターゲッティング部分（たとえばアプタマー）と、マイクロRNAのプロセシングに類似した方法でDicerにより認識されてプロセシングを受けるRNAサイレンシング部分（たとえばsiRNA）と、の両方を含む核酸を特異的に送達する方法を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Fire et al, Nature 391(6669):806-811 (1998)
【非特許文献２】Elbashir et al, Nature 411(6836):494-8 (2001)
【非特許文献３】Yano et al, Clin Cancer Res. 10(22):7721-6 (2004)）
【非特許文献４】Fountaine et al, Curr Gene Ther. 5(4):399-410 (2005)
【非特許文献５】Devroe and Silver, Expert Opin Biol Ther. 4(3):319-27 (2004)
【非特許文献６】Anderson et al, AIDS Res Hum Retroviruses. 19(8):699-706 (2003)
【非特許文献７】Lewis and Wolff, Methods Enzymol. 392:336-50 (2005)
【非特許文献８】Schiffelers et al. Nucleic Acids Res. 32(19):e149 (2004)
【非特許文献９】Urban-Klein et al, Gene Ther. 12(5):461-6 (2005)
【非特許文献１０】Soutschek et al, Nature 432(7014):173-8 (2004)
【非特許文献１１】Lorenz et al, Bioorg Med Chem Lett. 14(19):4975-7 (2004)
【非特許文献１２】Minakuchi et al, Nucleic Acids Res. 32(13):e109 (2004)
【非特許文献１３】Takeshita et al, Proc Natl Acad Sci USA. 102(34):12177-82 (2005)
【非特許文献１４】Song et al, Nat. Biotechnol. 23(6):709-17 (2005)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、一般的には、干渉RNA（RNAi）およびその送達方法に関する。より特定的には、本発明は、送達されるsiRNAとターゲッティング部分（ただしターゲッティング部分はアプタマーである）とを含む核酸の使用を伴うsiRNAの標的化送達を行う方法に関する。
【００１０】
本発明の目的および利点は、以下の説明から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】アプタマー−siRNAキメラの模式的な提案された作用機序。（図1A）アプタマー−siRNAキメラは、細胞表面レセプター（薄緑色長方形）に結合し、エンドサイトーシスにより取り込まれ、続いてエンドソームから放出されてRNAi経路を入る。比較のために細胞内サイレンシング経路が示されている。プレマイクロRNA（pre-miRNA）は、Droshaによる切断を受けて核から送出され、エンドヌクレアーゼDicerにより認識される。Dicerは、pre-miRNAをプロセシングして21ntの成熟miRNAを与える。続いて、成熟miRNAは、サイレンシング複合体（RISC）中に組み込まれ、それにより標的化mRNA分解を媒介する。
【図１Ｂ】PSMA特異的アプタマーA10およびA10アプタマー−siRNAキメラ誘導体の予測RNA構造。PSMAへの結合に関与するA10アプタマーの領域は、マゼンタ色で輪郭が示されている。この領域は、突然変異型A10アプタマー、mutA10−Plk1中で突然変異を受けた（突然変異塩基は青色で示されている）。（アプタマーA10の二次構造が示されている。）
【図１Ｃ】A10アプタマー−siRNAキメラの細胞タイプ特異的結合。蛍光標識化アプタマー−siRNAキメラの細胞表面結合（緑色で示される）をフローサイトメトリー分析により評価したところ、PSMAを発現するLNCaP細胞に制限されることが判明した。非染色細胞は紫色で示される。
【図１Ｄ】アプタマー−siRNAキメラの細胞表面結合は、PSMA表面レセプターへの結合に関与するA10のインタクトな領域を必要とする。
【図２Ａ】A10アプタマー−siRNAキメラは、細胞表面抗原PSMAに特異的に結合する。（図２Ａ）蛍光標識化A10アプタマー−siRNAキメラの結合は、過剰のA10アプタマーと効果的に競合させうる。結合は、G1内のカウント数％として表される。
【図２Ｂ】LNCaP細胞へのA10アプタマーおよびA10アプタマー−siRNAキメラの細胞表面結合は、ヒトPSMAに特異的な抗体により破壊される。蛍光標識化されたA10アプタマーおよびA10アプタマー−siRNAキメラの細胞表面結合をフローサイトメトリー分析により評価した。これは、平均蛍光強度（MFI）として示される。競合物質の有無におけるMFI値を用いて競合％を計算した。
【図２Ｃ】LNCaP細胞へのA10アプタマーおよびA10アプタマー−siRNAキメラの細胞表面結合は、5−α−ジヒドロテストステロン（2nM DHT）処理を行うとPSMA細胞表面発現の減少の結果として低減される。結合は、G1（ゲート1）内のカウント数％として表される。
【図３Ａ】アプタマー−siRNAキメラによる遺伝子の細胞タイプ特異的サイレンシング。（図３Ａ）A10−Plk1型のアプタマー−siRNAキメラは、PC−3細胞内ではなくLNCaP細胞内のPlk1発現をサイレンシングする（上側パネル）。サイレンシングは、フローサイトメトリー分析により測定したときのFITC標識化A10−Plk1によるLNCaP細胞の効率的標識化と相関する（下側パネル）。
【図３Ｂ】A10−Bcl−2型のアプタマー−siRNAキメラは、PC−3細胞内ではなくLNCaP細胞内のBcl−2発現をサイレンシングする（上側パネル）。サイレンシングは、FITC標識化A10−Bcl−2によるLNCaP細胞の標識化と相関する（下側パネル）。
【図３Ｃ】Plk1のA10−Plk1媒介サイレンシングは、LNCaP細胞を5−α−ジヒドロテストステロン（2nM DHT）処理すると低減される。
【図４Ａ】Plk1遺伝子およびBcl−2遺伝子のアプタマー−siRNAキメラ媒介サイレンシングの結果として、増殖およびアポトーシスに対する細胞タイプ特異的効果が得られる。（図４Ａ）Plk1 siRNAもしくは対照siRNAのいずれかでトランスフェクト（＋カチオン性脂質）されたかまたはA10アプタマーもしくはA10アプタマー−siRNAキメラ（A10−CONおよびA10−Plk1）で処理（−カチオン性脂質）されたPC−3細胞およびLNCaP細胞の増殖を、3H−チミジンの取込みにより測定した。
【図４Ｂ】シスプラチン、A10アプタマー、もしくはA10アプタマー−siRNAキメラ（A10−CONおよびA10−Plk1）で処理されたかまたはPlk1 siRNAもしくは対照siRNAでトランスフェクトされたPC−3細胞およびLNCaP細胞のアポトーシスを、活性カスパーゼ３に特異的なＰＥコンジュゲート化抗体を用いてフローサイトメトリー分析により評価した。
【図４Ｃ】シスプラチン、A10アプタマー、もしくはA10アプタマー−siRNAキメラ（A10−CONおよびA10−Bcl2）で処理されたかまたはBcl2 siRNAもしくは対照siRNAでトランスフェクトされたPC−3細胞およびLNCaP細胞のアポトーシスを、以上に記載したように評価した。
【図５Ａ】アプタマー−siRNAキメラ媒介遺伝子サイレンシングは、RNAi経路を介して行われる。（図5A）Dicerに対するsiRNAの存在下または不在下でsiRNA、A10アプタマー、またはA10アプタマー−siRNAキメラ（A10−CONおよびA10−Plk1）のいずれかでトランスフェクトされたLNCaP細胞。
【図５Ｂ】in vitro Dicerアッセイ。Dicerを併用してまたは併用せずに処理されたRNAを非変性ポリアクリルアミドゲル上で分離し、エチジウムブロミドで染色した。一本鎖キメラのｓｓA10−Plk1およびｓｓA10−CON（アンチセンスsiRNAを含まない）。
【図５Ｃ】in vitro Dicerアッセイ。32Pで標識された相補的アンチセンスsiRNA鎖にアニールされたアプタマー−siRNAキメラを、Dicerを併用してまたは併用せずにインキュベートし、続いて、切断産物を非変性ポリアクリルアミドゲル上で分離した。アンチセンスsiRNAは、A10に相補的ではなかったので、A10にはアニールしなかった。
【図６Ａ】前立腺癌のマウスモデルにおけるA10−Plk1型のアプタマー−siRNAキメラの抗腫瘍活性。（図6A）ヌードマウスの後部側腹中に左右相称に埋植されたPSMA陰性前立腺癌細胞PC−3（左側パネル）またはPSMA陽性前立腺癌細胞LNCaP（右側パネル）のいずれかを有するマウスモデルでキメラRNAを腫瘍内投与した。一元配置ANOVAを用いて平均腫瘍体積を分析した。＊＊＊、P＜0.0001；＊＊、P＜0.001；＊、P＜0.01。（n＝腫瘍数6〜8）。
【図６Ｂ】個別のLNCaP細胞由来腫瘍に対する腫瘍曲線は、A10−Plk1処理の後では腫瘍増殖の退縮を示すが、DPBS、A10−CON、またはmutA10−Plk1による処理の後では退縮を示さない。
【図７Ａ】PSMAの細胞タイプ特異的発現。ヒトPSMAに特異的な抗体を用いて（図7A）フローサイトメトリー分析および（図7B）イムノブロッティングにより、PSMAの発現を評価した。PSMAは、LNCaP前立腺癌細胞の表面上では発現されるが、PC−3前立腺癌細胞やHeLa細胞（非前立腺由来の癌細胞系）の表面上では発現されない。
【図７Ｂ】PSMAの細胞タイプ特異的発現。ヒトPSMAに特異的な抗体を用いて（図7A）フローサイトメトリー分析および（図7B）イムノブロッティングにより、PSMAの発現を評価した。PSMAは、LNCaP前立腺癌細胞の表面上では発現されるが、PC−3前立腺癌細胞やHeLa細胞（非前立腺由来の癌細胞系）の表面上では発現されない。
【図８Ａ】A10およびA10アプタマー−siRNAキメラ誘導体の相対親和性の測定。（図8A）蛍光標識化RNA（A10、A10−CON、およびA10−Plk1）の細胞表面結合親和性をフローサイトメトリー分析により評価した。（図8B）一部のデータ（図8A）についてG1内のMFI％（平均蛍光強度）を示した図。漸増量の蛍光標識化されたA10 RNA、A10−CON RNA、またはA10−Plk1 RNAをLNCaP細胞と共にインキュベートすることにより、LNCaP細胞表面に対するA10およびアプタマー−siRNAキメラの相対親和性を測定した。細胞蛍光をフローサイトメトリーにより測定した。アプタマー−siRNAキメラおよびA10は、LNCaP細胞表面に対して同等の親和性を有することが判明した。
【図８Ｂ】A10およびA10アプタマー−siRNAキメラ誘導体の相対親和性の測定。（図8A）蛍光標識化RNA（A10、A10−CON、およびA10−Plk1）の細胞表面結合親和性をフローサイトメトリー分析により評価した。（図8B）一部のデータ（図8A）についてG1内のMFI％（平均蛍光強度）を示した図。漸増量の蛍光標識化されたA10 RNA、A10−CON RNA、またはA10−Plk1 RNAをLNCaP細胞と共にインキュベートすることにより、LNCaP細胞表面に対するA10およびアプタマー−siRNAキメラの相対親和性を測定した。細胞蛍光をフローサイトメトリーにより測定した。アプタマー−siRNAキメラおよびA10は、LNCaP細胞表面に対して同等の親和性を有することが判明した。
【図９Ａ】Ｐｏｌｏ様キナーゼ１（Plk1）およびBcl2に対する機能性siRNAにより媒介された遺伝子サイレンシング。（図9A）ヒトPlk1または（図9B）ヒトBcl−2のいずれかに特異的なsiRNAをPC−3細胞およびLNCaP細胞にカチオン性脂質媒介送達することにより、遺伝子サイレンシングを達成した。フローサイトメトリー分析（上側パネル）およびイムノブロッティング（下側パネル）により、サイレンシングを評価した。
【図９Ｂ】Polo様キナーゼ１（Plk1）およびBcl2に対する機能性siRNAにより媒介された遺伝子サイレンシング。（図9A）ヒトPlk1または（図9B）ヒトBcl−2のいずれかに特異的なsiRNAをPC−3細胞およびLNCaP細胞にカチオン性脂質媒介送達することにより、遺伝子サイレンシングを達成した。フローサイトメトリー分析（上側パネル）およびイムノブロッティング（下側パネル）により、サイレンシングを評価した。
【図１０Ａ】DicerのsiRNA媒介サイレンシング。ヒトDicerに特異的な抗体を用いて（図10A）フローサイトメトリーによりおよび（図10B）酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）により、Dicer遺伝子発現のサイレンシングを評価した。対照の非サイレンシングsiRNAまたはヒトDicerに対するsiRNAでHeLa細胞をトランスフェクトした。Dicer siRNAによるサイレンシングは特異的であり、Dicer遺伝子発現の80％超の減少を引き起こした。
【図１０Ｂ】DicerのsiRNA媒介サイレンシング。ヒトDicerに特異的な抗体を用いて（図10A）フローサイトメトリーによりおよび（図10B）酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）により、Dicer遺伝子発現のサイレンシングを評価した。対照の非サイレンシングsiRNAまたはヒトDicerに対するsiRNAでHeLa細胞をトランスフェクトした。Dicer siRNAによるサイレンシングは特異的であり、Dicer遺伝子発現の80％超の減少を引き起こした。
【図１１Ａ】アプタマー−siRNAキメラは、インターフェロン応答を引き起こさない。INF−βに特異的な抗体を用いた酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）により、インターフェロン−β（INF−Ｂ）の産生に関して、siRNA（CON、Plk1、もしくはBcl−2）、A10アプタマー、またはアプタマー−siRNAキメラ（A10−CON、A10−Plk1、もしくはA10−Bcl2）で処理された（図11A）PC−3細胞および（図11B）LNCaP細胞を評価した。この実験ではインターフェロンインデューサーのポリ（I：C）で処理された細胞を陽性対照として使用した。
【図１１Ｂ】アプタマー−siRNAキメラは、インターフェロン応答を引き起こさない。INF−βに特異的な抗体を用いた酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）により、インターフェロン−β（INF−Ｂ）の産生に関して、siRNA（CON、Plk1、もしくはBcl−2）、A10アプタマー、またはアプタマー−siRNAキメラ（A10−CON、A10−Plk1、もしくはA10−Bcl2）で処理された（図11A）PC−3細胞および（図11B）LNCaP細胞を評価した。この実験ではインターフェロンインデューサーのポリ（I：C）で処理された細胞を陽性対照として使用した。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、RNAi（たとえばsiRNAおよびショートヘアピンRNA（shRNA））の標的化送達を行う方法に関する。この方法は、たとえば、特定の細胞タイプ（たとえば、特定のタンパク質、炭水化物、または脂質（たとえば、特定の細胞表面レセプター）を有する細胞）にsiRNAの送達を標的化するために使用可能である。これまでに報告されているほとんどの送達方法とは対照的に、本明細書に開示された方法は、RNAだけを含む化合物を用いて実施可能である。使用される分子は、RNAサイレンシング部分（たとえばsiRNA（修飾型もしくは非修飾型のRNAを含む））に連結された核酸ターゲッティング部分（たとえばアプタマー）を含むキメラ分子である。（本発明によれば、ターゲッティング部分（たとえばアプタマー）は、RNA、DNA、または任意の修飾型核酸に基づくオリゴヌクレオチドを含みうる。）
アプタマー−siRNA型のキメラRNAに関して本発明を以下で例示する。このキメラRNAは、ｉ）前立腺癌細胞（および細胞表面レセプターPSMAを発現するほとんどの固形腫瘍の血管内皮）に特異的に結合し（ヒトPSMA（A10）に対して選択されたRNAアプタマーの使用に基づく（Lupold et al, Cancer Res. 62(14):4029-33 (2002)）、かつｉｉ）polo様キナーゼ１（Plk1）（Reagan-Shaw and Ahmad, FASEB J. 19(6):611-3 (2005))およびBcl2(Yang et al, Clin Cancer Res. 10(22):7721-6 (2004)）を標的にする治療用siRNAを送達する（２種の生存遺伝子は、ほとんどのヒト腫瘍で過剰発現される（Takai et al, Oncogene 24(2):287-291 (2005), Eckerdt et al, Oncogene 24(2):267-76 (2005), Cory and Adans, Cancer Cell 8(1):5-6 (2005)）。これらのキメラRNAは、Dicerに対する基質として作用し、したがって、siRNAをRNAi経路に入るように誘導し、それらのコグネイトmRNAをサイレンシングする（図１Ａ）。（したがって、Dicer媒介切断によりsiRNAを生じるので、キメラ型のアプタマー−siRNAは、実際上、アプタマー−pre siRNAとみなしうる。）以下の実施例に記載の特定の試薬は、前立腺癌および他の癌の治療に利用することが期待される。
【００１３】
しかしながら、本発明は、PSMAに特異的なキメラに限定されるものではない。そうではなく、本手段は、癌以外の多種多様な疾患を治療するための治療剤の創製にも適用可能である。所与の疾患に対してこの手段に必要とされる２つの要件は、既定の細胞集団の特定の遺伝子をサイレンシングすることにより治療効果が得られることおよびRNAリガンドを細胞内に送達可能な対象の細胞集団で表面レセプターが特異的に発現されることである。多くの疾患は、これらの要件の両方を満たす（例としては、HIV阻害のためのCD4＋ T細胞、インスリンレセプターおよび糖尿病、肝臓レセプター細胞および肝炎遺伝子などが挙げられる）。
【００１４】
適切なターゲッティング部分およびサイレンシング部分は、ターゲッティングの対象となる分子およびサイレンシングの対象となる遺伝子の性質に基づいて当技術分野で公知の方法を用いてデザイン／選択が可能である（Nimjee et al, Annu. Rev. Med. 56:555-83 (2005) and U.S. Publication Appln. 20060105975を参照されたい）。キメラは、当技術分野で公知のRNA合成方法を用いて（たとえば、化学合成によりまたはRNAポリメラーゼにより）合成可能である。高い親和性を有して種々の標的に結合する短いRNAアプタマー（25〜35塩基）が報告されている（Pestourie et al, Biochimie (2005), Nimjee et al, Annu. Rev. Med. 56:555-83 (2005)）。そのような短いアプタマーを用いてデザインされたキメラは、約45〜55塩基の長い鎖を有する。化学合成されたRNAは、そのin vivo半減期および生物学的利用能の改変に使用可能な種々の修飾たとえばペグ化を行うのに適している。（たとえば、U.S. Application Nos. 20020086356, 20020177570, 20060105975, and 20020055162, and USPs 6,197,944, 6,590,093, 6,399,307, 6,057,134, 5,939,262, and 5,256,555も参照されたい。そのほかに、Manoharan, Biochem. Biophys. Acta 1489:117 (1999); Herdewijn, Antisense Nucleic Acid Drug Development 10:297 (2000); Maier et al, Organic Letters 2:1819 (2000)およびそこに引用されている参考文献も参照されたい。）
本発明に係るキメラは、キメラのほかに製薬上許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含みうる医薬組成物の形態に製剤化可能である。組成物の正確な性質は、少なくともある程度は、キメラの性質および投与経路に依存するであろう。最適な投与レジメンは、当業者であれば容易に確定可能であり、キメラ、患者、および要求される効果に応じて変更可能である。一般的には、キメラは、適宜、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与、または局所投与が可能である。
【００１５】
実際上、本発明に係る標的化送達方法では、非標的化細胞へのsiRNAの送達に伴う有害な副作用を回避することが可能である。たとえば、siRNAは、形質細胞様樹状細胞内のtoll様レセプターを活性化させてインターフェロン分泌を引き起こし種々の有害な症状をもたらす可能性があることが知られている（Sledz et al, Nat. Cell Biol. 5(9):834-9 (2003), Kariko et al, J. Immunol. 172(11):6545-9 (2004)）。アポトーシスを引き起こすsiRNAを送達する場合、本手段の使用により回避される他の危険性は、健常細胞の死滅である。本発明に係るキメラの全身送達を含む治療は、非標的化細胞による取込みが低減されるので、実質的により少量（非標的化試薬と比較して）の標的化試薬（たとえばsiRNA）を必要とすることが期待されうる。したがって、記載の方法は、治療の経費を実質的に削減しうる。
【００１６】
RNAはタンパク質よりも免疫原性が低いと考えられるので、本発明に係るキメラRNAを用いれば、タンパク質媒介送達手段を用いるよりも免疫系の非特異的活性化が少なくなることが期待されうる。治療剤として現在使用されているいくつかのタンパク質は、とくに反復投与の後で危険なアレルギー反応をときどき引き起こすことが知られているので、これは重要な差異である可能性がある（Park, Int. Anesthesiol. Cl9in. 42(3):135-45 (2004), Shepherd, Mt. Sinai J. Med. 70(2):113-25 (2003)）。
【００１７】
キム（Kim）らの提案によれば、RNAのDicer媒介プロセシングでは、生じたsiRNAがRISC複合体中により効率的に取り込まれる可能性がある（Kim et al, Nat. Biotechnol. 23(2):222-6 (2005)）。この示唆は、Dicerによりプロセシングされるより長い二本鎖RNA（約29bp）がDicerによりプロセシングされないsiRNA（19〜21bp）よりも低い濃度でそのコグネイトmRNAを枯渇させるという観測結果に基づく。したがって、理論に拘束されることを望むものではないが、本発明に係るキメラは、Dicerによりプロセシングされるので、プロセシングされない19〜21bpのdsRNAよりも遺伝子サイレンシング能力が強力でありうると推測される。
【００１８】
有利には、本発明に係るキメラは、
ｉ）細胞表面レセプターを認識し、
ｉｉ）レセプターを発現する細胞内に移行し、かつ
ｉｉｉ）miRNAまたはsiRNAプロセシング機構（たとえばDicer）により認識される。さらに、切断siRNA産物は、RNAiまたはmiRNAサイレンシング複合体（たとえばRISC）に組み込まれうる。したがって、少なくとも好ましい実施形態では、本発明に係るキメラのプロセシングは、細胞がmiRNAを認識しプロセシングする方法を模倣する（たとえば、本キメラRNAはDicerの基質でありうる）。（McNamara et al, Nature Biotechnology 24:1005-1015 (2006)も参照されたい。）
本発明の特定の態様は、以下の実施例によりさらに詳細に説明可能であるが、これに限定されるものではない。
【００１９】
（実施例）
実験の詳細
とくに記載がないかぎり、化学物質はすべて、シグマ・アルドリッチ社（Sigma−Aldrich Co．）から購入し、制限酵素はすべて、ニュー・イングランド・バイオラボ社（New England BioLabs Inc．）（NEB）から入手し、そして細胞培養物はすべて、インビトロジェン社（Invitrogen Corp．）の一部門であるギブコＢＲＬ／ライフ・テクノロジーズ（Gibco BRL／Life Technologies）から購入した。
【００２０】
siRNA
CON siRNA標的配列：  AATTCTCCGAACGTGTCACGT
Plk1 siRNA標的配列：  AAGGGCGGCTTTGCCAAGTGC
Bcl−2 siRNA標的配列：  NNGTGAAGTCAACATGCCTGC
Dicer siRNA標的配列  NNCCTCACCAATGGGTCCTTT
（ただし、「N」は、A、T、G、またはC）のいずれかである）
アンチセンス鎖の5’末端がFITCで標識された蛍光siRNAは、ダーマコン（DharmaCON）社から購入した。
【００２１】
アプタマー−siRNAキメラ
A10：  5’GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCUUGUCAAUCCUCAUCGGCAGACGACUCGCCCGA3’
A10−CONセンス鎖：  5’GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCUUGUCAAUCCUCAUCGGCAGACGACUCGCCCGAAAUUCUCCGAACGUGUCACGU3’
A10−CONアンチセンスsiRNA：  5’ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT3’
A10−Plk1センス鎖：  5’GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCUUGUCAAUCCUCAUCGGCAGACGACUCGCCCGAAAGGGCGGCUUUGCCAAGUGC3’
A10−Plk1アンチセンスsiRNA：  5’GCACUUGGCAAAGCCGCCCdTdT3’
A10−Bcl−2センス鎖：  5’GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCUUGUCAAUCCUCAUCGGCAGACGACUCGCCCGAAAGUGAAGUCAACAUGCCUGC3’
A10−Bcl−2アンチセンスsiRNA：  5’GCAGGCAUGUUGACUUCACUU-3’
mutA10−Plk1センス鎖：  5’GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUCCUUACGUCACUCCUUGUCAAUCCUCAUCGGCAGACGACUCGCCCGAAAGGGCGGCUUUGCCAAGUGC3’
A10−Plk1アンチセンスsiRNA：  5’GCACUUGGCAAAGCCGCCCdTdT3’
A10 5’プライマー：  5’TAATACGACTCACTATAGGGAGGACGATGCGG3’
A10 3’プライマー：  5’TCGGGCGAGTCGTCTG3’
A10鋳型プライマー：  5’GGGAGGACGATGCGGATCAGCCATGTTTACGTCACTCCTTGTCAATCCTCATCGGCAGACGACTCGCCCGA3’
対照siRNA 3’プライマー：  5’ACGTGACACGTTCGGAGAATTTCGGGCGAGTCGTCTG3’
Plk1 siRNA 3’プライマー：  5’GCACTTGGCAAAGCCGCCCTTTCGGGCGAGTCGTCTG3’
Bcl−2 siRNA 3’プライマー：  5’GCAGGCATGTTGACTTCACTTTCGGGCGAGTCGTCTG3’
A10突然変異型プライマー：  5’AGGACGATGCGGATCAGCCATCCTTACGTCA3’
次のようにPCRにより二本鎖DNA鋳型を作製した。A10鋳型プライマーをPCR用の鋳型として使用するとともに、A10 5’プライマーと、次の3’プライマー：A10 3’プライマー（A10アプタマー用）、対照siRNA 3’プライマー（A10−CONキメラ用）、Plk1 siRNA 3’プライマー（A10−Plk1キメラ用）、またはBcl−2 siRNA 3’プライマー（A10−Bcl−2キメラ用）のうちの１つと、を使用した。このようにして、またはこれらのPCR産物をＴ−Ａクローニングベクター（プロメガ（Promega）（Madison, WI）社製のpGem−tRNA−easy）中にクローニングしクローンをPCR用の鋳型として使用するとともに適切なプライマーを使用することにより、転写用の鋳型を作製した。
【００２２】
mutA10−Plk1キメラをコードするDNAを逐次的PCRにより調製した。第１の反応では、A10鋳型プライマーを鋳型として使用するとともに、A10突然変異型プライマーを5’プライマーとしてかつPlk1 siRNA 3’プライマーを3’プライマーとして使用した。この反応の産物を精製し、A10 5’プライマーとPlk1 siRNA 3’プライマーとを用いた第２の反応用の鋳型として使用した。得られたPCR産物をpGem−tRNA−easy中にクローニングし、そして配列決定を行った。このクローンをA10 5’プライマーとPlk−1 3’プライマーとを用いたPCRで鋳型として使用し、転写用の鋳型を作製した。以下に記載されるように5’−（FAM）（スペーサー9）−G−3’（FAM標識化G）（トライリンク（TriLink）社製）の存在下で蛍光アプタマーおよび蛍光アプタマー−siRNAキメラをin vitroで転写した。
【００２３】
in vitro転写
4ｍＭ FAM標識化Gを併用してまたは併用せずに転写を開始した。250μL転写反応のために、2’Ｆ転写用に最適化された50μL 5×T7 RNAＰ緩衝液（20%w/v PEG8000、200mM Tris-HCl pH8.0、60mM MgCl2、5mMスペルミジンHCl、0.01%w/v トリトンX-100,25mM DTT)、25μL 10×2’F-dNTP(30mM 2’F-CTP、30mM 2’F-UTP、10mM 2’OH-ATP、10mM 2’OH-GTP)、2μL IPPI(ロシュ(Roche)社製)、300ピコモル アプタマー-siRNAキメラPCR鋳型、3μL T7(Y639F)ポリメラーゼ(Padilla and Sousa, Nucleic Acids Res. 27(6):1561-3 (1999))を、ミリQ H2Oで250μLにする。
RNAの二次構造の予測
RNA構造プログラムのバージョン4.1（rna.chem.rochester.edu/RNAstructure）を用いて、A10アプタマー、A10−3、およびA10アプタマー−siRNAキメラ誘導体の二次構造を予測した。各RNAオリゴについて最小自由エネルギーを有する最も安定な構造を比較した。
【００２４】
細胞培養
10％ウシ胎仔血清が添加されたDMEM中37℃かつ5％CO2でHeLa細胞を保持した。前立腺癌細胞系のLNCaP（ATCC＃ CRL−1740）およびPC−3（ATCC＃ CRL−1435）を、それぞれ、10％ウシ胎仔血清（FBS）が添加されたRPMI1640中およびハム（Ham）F12−K培地中で増殖させた。
【００２５】
PSMAの細胞表面発現
ヒトPSMAに特異的な抗体を用いてフローサイトメトリーおよび/またはイムノブロッティングにより、PSMAの細胞表面発現を測定した。フローサイトメトリー:HeLa細胞、PC-3細胞、およびLNCaP細胞をトリプシン処理し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄し、そして血球計数器を用いて計数した。200,000細胞(1×106細胞/mL)を500μlのPBS+4%ウシ胎仔血清(FBS)中に再懸濁させて、室温(RT)で20分間インキュベートした。次に、細胞をペレット化し、PSMAに対する一次抗体(抗PSMA 3C6:ノースウエスト・バイオセラピューティクス(Northwest Biotherapeutics)社製)20μg/mLまたはアイソタイプ特異的対照抗体20μg/mLを含有する100μLのPBS+4%FBS中に再懸濁させた。室温で40分間インキュベートした後、細胞を500μLのPBS+4%FBSで3回洗浄し、そしてPBS+4%FBS中で1:500希釈の二次抗体(抗マウスIgG-APC)と共に室温で30分間インキュベートした。以上に詳述したように細胞を洗浄し、400μLのPBS+1%ホルムアルデヒドで固定し、そしてフローサイトメトリーにより分析した。イムノブロッティング:HeLa細胞、PC-3細胞、およびLNCaP細胞を以上に記載したように採取した。1×プロテアーゼ・ホスファターゼ阻害剤カクテル(シグマ(Sigma)社製)を含有する1×RIPA緩衝液(150mM NaCl、50mM Tris-HCl pH8.0、1mM EDTA、1% NP-40)中に細胞ペレットを再懸濁させて、氷上で20分間インキュベートした。次に、細胞をペレット化し、上清に由来する25μgの全タンパク質を7.5%SDS-PAGEゲル上で分離した。ヒトPSMAに特異的な抗体(抗PSMA 1D11;ノースウエスト・バイオセラピューティクス(Northwest Biotherapeutics)社製)を用いて、PSMAを検出した。
アプタマー-siRNAキメラの細胞表面結合
PC-3細胞またはLNCaP細胞をトリプシン処理し、500μLのPBSで2回洗浄し、そして400μLの固定溶液(PBS+1%ホルムアルデヒド)中、室温で20分間固定した。細胞を洗浄して残存する痕跡量のホルムアルデヒドを完全に除去した後、細胞ペレットを1×結合緩衝液(1×BB)(20mM HEPES pH7.4、150mM NaCl、2mM CaCl2、0.01% BSA)中に再懸濁させて、37℃で20分間インキュベートした。次に、細胞をペレット化し、400nM FAM-G標識化A10アプタマーまたは400nM FAM-G標識化アプタマー-siRNAキメラのいずれかを含有する50μLの1×BB(37℃で予備加温)中に再懸濁させた。転写反応時のFAM-Gの取込み効率が低いので、A10-Plk1およびmutA10-Plk1の細胞表面結合を比較するために、10μMまでのFAM-G標識化アプタマーキメラを使用した。相対親和性を測定するためのFAM-G標識化アプタマーおよびFAM-G標識化アプタマー-siRNAキメラの濃度を0から4μMまで変化させた。細胞をRNAと共に37℃で40分間インキュベートし、37℃で予備加温された500μLの1×BBで3回洗浄し、最後に、37℃で予備加温された400μLの固定溶液中に再懸濁させた。次に、以上に詳述したようにフローサイトメトリーを用いて細胞をアッセイし、そしてA10アプタマーおよびA10アプタマー-siRNAキメラ誘導体の相対的細胞表面結合親和性を測定した。
細胞表面結合競合アッセイ
細胞表面結合実験のためにLNCaP細胞を以上に詳述したように調製した。4μMのFAM-G標識化A10アプタマーまたはFAM-G標識化A10アプタマー-siRNAキメラ誘導体を、37℃で予備加温された1×BB中の非標識化A10アプタマー(濃度を0から4μMまで変化させた)またはPBS+4%FBS中の2μgの抗PSMA 3C6抗体のいずれかと競合させた。細胞を以上に詳述したように3回洗浄し、400μLの固定液(PBS+1%ホルムアルデヒド)で固定し、そしてフローサイトメトリーにより分析した。
5-α-ジヒドロテストステロン(DHT)処理
5%活性炭処理済血清を含有するRPMI1640培地中でLNCaP細胞を24時間増殖させた後、5%活性炭処理済FBSを含有するRPMI1640培地中に2nM 5-α-ジヒドロテストステロン(DHT)(シグマ(Sigma)社製)を添加して48時間増殖させた。以上に詳述したようにイムノブロッティングによりPSMA発現を評価した。以上に詳述したようにフローサイトメトリーによりPSMAの細胞表面発現を分析した。FAM-G標識化A10アプタマーならびにFAM-G標識化A10-CON型、FAM-G標識化A10-Plk1型、およびFAM-G標識化mutA10-Plk1型アプタマーキメラの細胞表面結合を、40μMのFAM-G標識化RNAを用いて以上に詳述したように行った。
遺伝子サイレンシングアッセイ
siRNA:(1日目)PC-3細胞およびLNCaP細胞を60%のコンフルエントで6ウェルプレート中に播種した。製造業者の推奨基準に従ってスーパーフェクト(Superfect)試薬(キアゲン(Qiagen)社製)を用いて、2日目および4日目に200nM siRNAまたは400nM siRNAのいずれかで細胞をトランスフェクトした。分析のために5日目に細胞を採取した。A10アプタマーおよびA10アプタマー-siRNAキメラ:(1日目)PC-3細胞およびLNCaP細胞を60%のコンフルエントで6ウェルプレート中に播種した。2日目および4日目に400nM A10アプタマーまたは400nM A10アプタマー-siRNAキメラで細胞を処理した。分析のために5日目に細胞を採取した。
それぞれヒトPlk1に特異的な抗体(ザイメッド(Zymed)社製)およびヒトBcl-2に特異的な抗体(ザイメッド(Zymed)社製)を用いてフローサイトメトリーまたはイムノブロッティングにより、遺伝子サイレンシングを評価した。フローサイトメトリー:PC-3細胞およびLNCaP細胞をトリプシン処理し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄し、そして血球計数器を用いて計数した。200,000細胞(5×105細胞/mL)を400μlのPERM/FIX緩衝液(ファーミンジェン(Pharmingen)社製)中に再懸濁させて、室温(RT)で20分間インキュベートした。次に、細胞をペレット化して、1×PERM/WASH緩衝液(ファーミンジェン(Pharmingen)社製)で3回洗浄した。次に、ヒトPlk1もしくはヒトBcl-2のいずれかに対する一次抗体20μg/mLまたはアイソタイプ特異的対照抗体20μg/mLを含有する50μLの1×PERM/WASH緩衝液中に細胞を再懸濁させた。室温で40分間インキュベートした後、細胞を500μLの1×PERM/WASH緩衝液で3回洗浄し、そして1×PERM/WASH液中で1:500希釈の二次抗体(抗マウスIgG-APC)と共に室温で30分間インキュベートした。細胞を以上に詳述したように洗浄し、そしてフローサイトメトリーにより分析した。イムノブロッティング:以上に記載したように対照siRNAまたはPlk1もしくはBcl-2のいずれかに対するsiRNAでLNCaP細胞をトランスフェクトした。細胞をトリプシン処理し、PBSで洗浄し、そして細胞ペレットを1×RIPA緩衝液中に再懸濁させて、氷上で20分間インキュベートした。次に、細胞をペレット化し、上清に由来する50μgの全タンパク質をPlk1用の8.5% SDS-PAGEゲルまたはBcl-2用の15% SDS-PAGEゲルのいずれかで分離した。ヒトPlk1に特異的な抗体(ザイメッド(Zymed)社製)を用いてPlk1を検出した。ヒトBcl-2に特異的な抗体(ダコサイトメーション(Dykocytomation)社製)を用いてBcl-2を検出した。
増殖(DNA合成)アッセイ
以上に詳述したようにsiRNAまたはアプタマー-siRNAキメラであらかじめ処理されたPC-3細胞およびLNCaP細胞をトリプシン処理し、約20,000細胞/ウェルで12ウェルプレート中に播種した。次に、0.5μMヒドロキシウレア(HU)を添加することにより、細胞をG1/S期で停止させた。21時間後、HUの欠如した培地を添加することにより、細胞をHU媒介停止から解放し、そして3H-チミジンを含有する培地(1μCi/mLの培地)でインキュベートしてDNA合成をモニターした。3H-チミジンを含有する培地の存在下で24時間インキュベートした後、細胞をPBSで2回洗浄し、5%w/vトリクロロ酢酸(TCA)(VWR社製)で1回洗浄し、0.5mLの0.5N NaOH(VWR社製)中に採取し、そして3H-チミジン取込みの測定に供すべくシンチレーションバイアル中に入れた。
活性カスパーゼ3アッセイ
PC-3細胞またはLNCaP細胞をPlk1もしくはBcl-2に対するsiRNAでトランスフェクトするかまたは以上に記載したようにA10アプタマー-siRNAキメラで処理した。また、アポトーシスの陽性対照として100μM(1×)または200μM(2×)のシスプラチンを含有する培地で細胞を30時間処理した。次に、細胞を固定し、そして製造業者のプロトコル(ファーミンジェン(Pharmingen)社)に規定されるように切断カスパーゼ3に特異的なPEコンジュゲート化抗体を用いて活性カスパーゼ3を染色した。フローサイトメトリー分析を用いてアポトーシスの尺度としてPE陽性細胞%を定量化した。
Dicer siRNA
HeLa細胞を1ウェルあたり200,000細胞で6ウェルプレート中に播種した。24時間後、以上に記載したようにスーパーフェクト(Superfect)試薬を用いて、細胞を400nMの対照siRNAまたはヒトDicerに対するsiRNAのいずれかでトランスフェクトした。次に、細胞を採取し、そしてフローによるPlk1およびBcl-2の分析に関連して以上に記載したように、ヒトDicerに特異的な抗体(IMX-5162;イムゲネックス(IMGENEX)社製)を用いてフローサイトメトリー分析の処理を行った。
酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)
HeLa細胞を1ウェルあたり200,000細胞で6ウェルプレート中に播種した。24時間後、以上に記載したようにスーパーフェクト(Superfect)試薬を用いて、細胞を400nMの対照非サイレンシングsiRNAまたはヒトDicerに対するsiRNAのいずれかでトランスフェクトした。次に、細胞を採取し、そして1×プロテアーゼ・ホスファターゼ阻害剤カクテル(シグマ(Sigma)社製)を含有する1×RIPA緩衝液中、氷上で20分間溶解させた。次に、100μLの細胞溶解物を各ELISA用96ウェルプレートに添加して、室温で24時間インキュベートした。ウェルを300μLの1×RIPAで3回洗浄し、そして1×RIPA中のヒトDicerに対する一次抗体の1:200希釈液100μLと共に2時間インキュベートした。ウェルを以上のように洗浄し、そして1×RIPA中の抗ウサギIgG-HRP二次抗体の1:200希釈液100μLと共に1時間インキュベートした。ウェルを以上のように洗浄した後、100μLのTMB基質溶液(PBLバイオメディカル・ラボラトリーズ(PBL Biomedical Laboratories)社製)を添加した。20分後、50μLの1M H2SO4(停止液)を各ウェルに添加して、プレートリーダーを用いてOD450〜OD540を測定した。
in vivo Dicerアッセイ
LNCaP細胞を1ウェルあたり200,000細胞で6ウェルプレート中に播種した。24時間後、以上に記載したようにスーパーフェクト(Superfect)トランスフェクション試薬を用いて、400nMの対照siRNA、400nMのPlk1 siRNA、400nMのA10アプタマー、もしくは400nMのA10アプタマー-siRNAキメラのいずれかを単独でまたはヒトDicerに対するsiRNAと共に、細胞を共トランスフェクトした。次に、細胞を採取し、そして以上に記載したようにヒトPlk1に特異的な抗体を用いてフローサイトメトリー分析の処理を行った。
in vitro Dicerアッセイ
製造業者の推奨基準に従って組換えDicer酵素(組換えヒトターボDicerキット;GTS社製)を用いて、1〜2μgのA10アプタマーまたはA10アプタマー-siRNAキメラを消化した(Myers et al, Nat. Biotechnol. 21(3):324-8 (2003))。ssA10-CONおよびssA10-Plk1は、相補的アンチセンスsiRNA鎖を含まないアプタマー-siRNAキメラに対応する。次に、消化物を15%非変性PAGEゲル上で分離して、エチジウムブロミドで染色した後、GEL.DOCXR(バイオラッド(BioRad)社製)ゲルカメラを用いて映像化した。他の選択肢として、1〜2μgのA10アプタマーまたはA10アプタマー-siRNAキメラセンス鎖を32P末端標識化相補的アンチセンスsiRNA(プローブ)にアニールした。製造業者の推奨基準に従ってT4ポリヌクレオチドキナーゼ(NEB社製)を用いてsiRNAを末端標識化した。アンチセンスsiRNAは、A10アプタマーには相補的でなかった。Dicer酵素を併用してまたは併用せずにA10またはアニール化キメラ(A10-CONもしくはA10-Plk1)をインキュベートし、続いて、以上に記載したように15%非変性PAGEゲル上で分離した。ゲルを乾燥させて、バイオマックスMR(BioMAX MR)フィルム(コダック(Kodak)社製)を5分間感光させた。
インターフェロンアッセイ
製造業者の推奨基準に従ってヒトインターフェロンβ用ELISAキット(PBLバイオメディカル・ラボラトリーズ(PBL Biomedical Laboratories)社製)を用いて、処理済みおよび未処理のPC-3細胞およびLNCaP細胞から分泌されたIFN-βを検出した。簡潔に述べると、6ウェルプレート中に200,000細胞/ウェルで細胞を播種した。24時間後、スーパーフェクト(Superfect)のトランスフェクション試薬(キアゲン(Qiagen)社製)とインターフェロンβに対する陽性対照としてのさまざまな量のポリ(I:C)(2.5、5、10、15μg/ml)との混合物あるいはスーパーフェクト(Superfect)トランスフェクション試薬とCON siRNAまたはPlk1もしくはBcl2に対するsiRNAのいずれか(200nmまたは400nm)との混合物のいずれかで、細胞をトランスフェクトした。そのほかに、以上に記載したように各400nMのA10アプタマーおよびA10アプタマー-siRNAキメラで細胞を処理した。種々の処理の48時間後、各処理グループに由来する100μLの上清を96ウェルプレートの1つのウェルに添加して、室温で24時間インキュベートした。製造業者の推奨基準に従ってヒトINF-βに特異的な抗体を用いて、上清中のINF-βの存在を検出した。
in vivo実験
デューク大学(Duke University)の癌センター隔離施設(The Cancer Center Isolation Facility)(CCIF)から胸腺欠損ヌードマウス(nu/nu)を入手し、米国農務省(The US Department of Agriculture)および米国実験動物管理公認協会(The American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care)(AAALAC)により作成されたガイドラインに従って無菌環境中に保持した。このプロジェクトは、デューク大学(Duke University)の施設内動物管理利用委員会(The Institutional Animal Care and Utilization Committee)(IAUCUC)により承認された。5×106個(100μlの50%マトリゲル中)のin vitro増殖されたPC-3細胞またはLNCaP細胞を各側腹に皮下注射して胸腺欠損マウスに接種した。各腫瘍タイプごとに直径1cmを超える約32個の非壊死性腫瘍を、次のように一処理グループあたり8匹のマウスよりなる4つのグループにランダムに分けた:グループ1、処理なし(DPBS);グループ2、A10-CONキメラ(200pmol/注射×10)で処理;グループ3、A10-Plk1キメラ(200pmol/注射×10)で処理;グループ4、mut-A10-Plk1キメラ(200pmol/注射×10)で処理。合計20日間にわたり1日おきに75μLの体積で化合物を腫瘍内注射した。0日目は、注射の初日を表す。少量注射は、非特異的な高圧注射に起因して細胞内に化合物が圧入されるのを防止するのに十分な程度に少量である。3日間ごとにカリパスを用いて三つの寸法で腫瘍を測定した。次式を用いて腫瘍体積を計算した:VT=(W×L×H)×0.5236(W、最短寸法;L、最長寸法)。増殖曲線は、腫瘍体積の平均値±SEMとしてプロットされる。免疫組織化学的特性を調べるために腫瘍を切除してホルマリン固定した最後の処理の3日後に安楽死させて実験を終了した。
統計解析
一元配置ANOVAを用いて統計解析を行った。P値が0.05以下のとき、有意差があるとみなした。一元配置ANOVAのほかに、対応のない両側t検定を行って各処理グループをすべての他のグループと比較した。PSMAを発現する腫瘍では、グループ3(A10-Plk1)は、12、15、18、および21日目、グループ1(DPBS)、グループ2(A10-CON)、およびグループ4(mutA10-Plk1)と有意差があった(P<0.01)。グループ2(A10-CON)およびグループ4(mutA10-Plk1)は、処理期間中のいずれの時点においてもDPBS対照グループと有意差がなかった(P>0.05)。PSMA陰性腫瘍では、グループ間に有意差がなかった。
結果
A10アプタマー-siRNAキメラ
細胞表面レセプターPSMAを発現する細胞にsiRNAを特異的にターゲッティングするために、アプタマー-siRNA型のキメラRNAを作製した。キメラのアプタマー部分(A10)は、PSMAへの結合を媒介する。siRNA部分は、Plk1(A10-Plk1)およびBcl2(A10-Bcl2)のような生存遺伝子の発現を標的にする。非サイレンシングsiRNAを対照(A10-CON)として使用した。RNA構造プログラム(バージョン4.1)を用いて、A10およびA10アプタマー-siRNAキメラ誘導体の二次構造を予測した(図1B)。PSMAへの結合に関与するA10の領域を予測するために、A10の予測二次構造とトランケート型A10アプタマーA10-3の予測二次構造(データは示されていない)(Lupold et al, Cancer Res. 62(14):4029-33 (2002))との比較を行った。A10-3もまたPSMAに結合するので、A10-3中に保持された構造要素は、PSMAへの結合に必要なものであろう(図1B中でマゼンタ色の四角で囲まれている)。アプタマー-siRNAの予測構造は、この予測PSMA結合要素を保持していることから、PSMA結合をも保持することが示唆される(A10-Plk1について示された図1B)。対照として、A10アプタマーの推定PSMA結合部分の二次構造を破壊すると予測される二点突然変異をこの領域内で行った(mutA10-Plk1)(図1B中に青色で示される)。
A10アプタマー-siRNAキメラはPSMA発現細胞に特異的に結合する
最初に、PSMAを発現する細胞の表面に結合するA10アプタマー-siRNAキメラの能力を試験した。すでに、PSMAは、LNCaP細胞の表面上では発現されるがPC-3細胞(異なる前立腺癌細胞)の表面上では発現されないことが明らかにされている。この知見は、フローサイトメトリーおよびイムノブロッティングにより確認された(図7)。A10アプタマー-siRNAキメラが、PSMAを発現する細胞の表面に結合するかどうかを調べるために、蛍光標識化されたA10、A10-CON、またはA10-Plk1を、LNCaP細胞またはPC-3細胞と共にインキュベートした(図1C)。A10およびA10アプタマー-siRNAキメラの結合は、LNCaP細胞に特異的であり、mutA10-Plk1が結合不可能であったのでPSMAに結合すると予測されたA10アプタマーの領域に依存した(図1D)。さらに、アプタマー-siRNAキメラおよびA10アプタマーは、同等の親和性を有してLNCaP細胞の表面に結合することが判明した(図8)。
A10アプタマー-siRNAキメラがPSMAに実際に結合していることを確認するために、LNCaP細胞を(1μM)の蛍光標識化されたA10 RNA、A10-CON RNA、またはA10-Plk1 RNAのいずれかと共にインキュベートし、漸増量(0μMから4μMまで)の非標識化A10アプタマー(図2A)またはヒトPSMAに特異的な抗体(図2B)と競合させた。漸増量の競合物質の存在下で結合された蛍光標識化RNAをフローサイトメトリーにより評価した。LNCaP細胞への標識化A10アプタマーおよび標識化A10アプタマー-siRNAキメラ(A10-CONおよびA10-Plk1)の結合は、非標識化A10または抗PSMA抗体のいずれとも同等に競合したことから、これらのRNAはLNCaP細胞の表面上のPSMAに結合していることが示唆される。アプタマー-siRNAキメラの標的が実際にPSMAであることをさらに確認するために、5-α-ジヒドロテストステロン(DHT)で予備処理されたLNCaP細胞へのキメラの結合を試験した(なぜなら、DHTは、PSMAの発現を低下させることが明らかにされているからである)(Israeli et al, Cancer Res. 54(7):1807-11 (1994))。PSMA遺伝子発現のDHT媒介阻害をフローサイトメトリーおよびイムノブロッティングにより評価した(図2Cの上側パネル)。48時間にわたりLNCaP細胞を2nM DHTで処理したところ、PSMAの発現は大幅に低減された。PSMAの細胞表面発現は、フローサイトメトリーにより測定した場合、73.2%から13.4%に低減され、LNCaP細胞へのA10ならびにA10アプタマー-siRNAキメラ(A10-CONおよびA10-Plk1)の結合の減少と相関した(図2C)。予想どおり、mutA10-Plk1は、DHT処理の有無にかかわらずLNCaP細胞の表面に結合しなかった(図2C)。
アプタマー-siRNAキメラは遺伝子発現を特異的にサイレンシングする
アプタマー-siRNAキメラが標的遺伝子発現をサイレンシングしうるかどうかを調べるために、A10アプタマー-siRNAキメラを用いて、PSMAを発現する細胞にPlk1に対するsiRNA(Reagan-Shaw and Ahmad, FASEB J. 19(6):611-3 (2005))またはBcl2に対するsiRNA(Yano et al, Clin. Cancer Res. 10(22):7721-6 (2004))を送達した(図3)。PC-3細胞およびLNCaP細胞をトランスフェクション試薬の不在下でアプタマー-siRNAキメラのA10-Plk1(図3A)またはA10-Bcl-2(図3B)で処理した。Plk1遺伝子およびBcl-2遺伝子のサイレンシングをフローサイトメトリーおよび/またはイムノブロッティングにより評価した。非標的化siRNAのトランスフェクション(図9)とは対照的に、A10-Plk1およびA10-Bcl-2によるサイレンシングは、PSMAを発現するLNCaP細胞に特異的であり、LNCaP細胞内への蛍光標識化アプタマー-siRNAキメラの取込みと相関する(図3Aおよび3B)。Plk1タンパク質およびBcl-2タンパク質が細胞タイプ特異的に低減されることから、siRNAはキメラのアプタマー部分を介してPSMA発現細胞に特異的に送達されることが示唆される。A10アプタマー-siRNAキメラによるサイレンシングがPSMAに実際に依存することをさらに確認するために、2nM DHTを併用してまたは併用せずにLNCaP細胞を48時間インキュベートした後、A10-Plk1を添加した(図3C)。細胞内へのA10-Plk1の取込みおよびPlk1遺伝子発現のサイレンシングは、DHTで処理された細胞内では実質的に低減された。これらのデータを細胞表面結合データと合わせると、細胞タイプ特異的サイレンシングはPSMAの細胞表面発現に依存することが示唆される。
アプタマー-siRNAキメラは細胞増殖を阻害してPSMAを発現する細胞のアポトーシスを誘導する
オンコジーンおよび抗アポトーシス遺伝子を標的にするアプタマー-siRNAキメラにより細胞増殖の低減およびアポトーシスの誘導という目的を達成しうるかどうかを調べるために、キメラで処理された細胞でこれらの細胞過程を測定した。PC-3細胞およびLNCaP細胞をA10-CON型またはA10-Plk1型のアプタマー-siRNAキメラで処理し(図4A)、細胞増殖を3H-チミジン取込みにより測定した。LNCaP細胞の場合、増殖は、A10-Plk1キメラにより効果的に低減されたが、対照A10-CONキメラでは低減されなかった。この効果は、PC-3細胞の場合には見られなかったのでPSMAを発現する細胞に特異的であった。アプタマー-siRNA送達ではトランスフェクション試薬を利用しなかったにもかかわらず、カチオン性脂質を利用してPlk1 siRNAをトランスフェクトした時に観測されたのとほぼ同程度に増殖が低減された(図4A)。
次に、PSMAを発現する前立腺癌細胞のアポトーシスを誘導するA10-Plk1キメラおよびA10-Bcl-2キメラの能力を評価した(図4Bおよび4C)。PC-3細胞およびLNCaP細胞を、培地へのA10、A10-CON、A10-Plk1、もしくはA10-Bcl2の添加により処理するか、またはカチオン性脂質を用いてPlk1もしくはBcl2に対するsiRNAでトランスフェクトするか、のいずれかを行った。フローサイトメトリーにより活性カスパーゼ3(Casp3)の産生を測定することにより、アポトーシスを評価した。Plk1およびBcl-2に対するsiRNAをトランスフェクトすることによりPC-3細胞およびLNCaP細胞の両方のアポトーシスが誘導されたが、アプタマー-siRNAキメラにより誘導されたアポトーシスは、LNCaP細胞に特異的であり、かつトランスフェクション試薬を必要としなかった。シスプラチンによるPC-3細胞およびLNCaP細胞の処理をアポトーシスに対する陽性対照として使用した。
アプタマー-siRNA媒介遺伝子サイレンシングはRNAi経路を介して行われる
次に、アプタマー-siRNAキメラにより遺伝子発現をサイレンシングする機序がDicer活性に依存するかどうかに関する測定を行った。したがって、ヒトDicerに対するsiRNAでその発現を標的にすることにより、Dicerタンパク質レベルを低減させた(Doi et al, Curr. Biol. 13(1):41-6 (2003))(図10)。次に、A10-Plk1キメラ媒介遺伝子サイレンシングをDicer発現へのその依存性に関して試験した。A10アプタマーまたはアプタマー-siRNAキメラ(A10-CONもしくはA10-Plk1)を単独であるいはDicer siRNAと組み合わせて、LNCaP細胞を共トランスフェクトした(図5A)。A10-Plk1キメラによるPlk1遺伝子発現のサイレンシングはDicer siRNAの共トランスフェクションにより阻害されたことから(図5Aの上側パネル)、アプタマー-siRNAキメラ媒介遺伝子サイレンシングはDicerに依存しかつRNAi経路を介して行われることが示唆される。これとは対照的に、予想どおり、Dicerの阻害は、21〜23ntの長さのsiRNAがDicer段階をバイパスすることが明らかにされているので(Murchison et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102(34):12135-40 (2005), Kim et al, Nat. Biotechnol. 23(2):222-6 (2005))、Plk1 siRNA媒介サイレンシングに影響を及ぼさなかった(図5Aの下側パネル)。
キメラ構築物中に作製されたsiRNA配列に対応する21〜23ntのsiRNA断片を産生するようにアプタマー-siRNAキメラがDicerにより直接切断されるかどうかを試験するために、RNAをin vitroで組換えDicer酵素で消化し、得られた断片を非変性PAGEで分離した(図5Bおよび5C)。図5Bに示されるように、アプタマー-siRNAキメラ(A10-CONまたはA10-Plk1)は、21〜23ntの長さの断片を放出するようにDicer酵素により消化されたが、A10またはアプタマー-siRNAキメラのより長い一本鎖センス鎖(ssA10-CONもしくはssA10-Plk1)はいずれも、消化されなかった。これらの21〜23ntの長さのDicer媒介切断断片が対照siRNAおよびPlk1 siRNAに対応するかどうかを確認するために、siRNAの相補的32P末端標識化アンチセンス鎖をアニールすることによりA10アプタマー-siRNAキメラを標識化し、組換えDicerを併用してまたは併用せずにインキュベートした(図5C)。組換えDicerによる標識化A10-CONまたは標識化A10-Plk1の消化により、32P末端標識化アンチセンス鎖を保持した21〜23ntの長さの断片が放出されたことから、これらの断片は実際にアプタマー-siRNAキメラのsiRNA部分であることが示唆される。
アプタマー-siRNAキメラはインターフェロン応答を引き起こさない
送達されたsiRNAは、潜在的に非特異的炎症反応を活性化させる可能性があり、結果的に細胞毒性を引き起こす可能性があると、種々のグループにより報告されている(Sledz et al, Nat. Cell Biol. 5(9):834-9 (2003), Kariko et al, J. Immunol. 172(11):6545-9 (2004))。したがって、未処理のもの、Plk1もしくはBcl-2に対するsiRNAでトランスフェクトされたもの、またはアプタマー-siRNAキメラで処理されたもののいずれかであるPC-3細胞およびLNCaP細胞により産生されるINF-βの量の測定を酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)により行った(図11)。siRNAまたはアプタマー-siRNAキメラのいずれで処理しても、これらの実験条件下でINF-βの産生は誘導されなかったことから、細胞へのアプタマー-siRNAキメラの送達は実質的なインターフェロン応答を引き起こさないことが示唆される。
A10-Plk1は前立腺癌のマウスモデルで腫瘍退縮を媒介する
次に、PSMA陽性ヒト前立腺癌細胞(LNCaP)またはPSMA陰性ヒト前立腺癌細胞(PC-3)のいずれかに由来する腫瘍を有する胸腺欠損マウスにおけるA10-Plk1キメラの効率および特異性に焦点をあてた(図6)。胸腺欠損マウスにLNCaP細胞またはPC-3細胞のいずれかを接種し、最長寸法の直径が1cmに達するまで腫瘍を増殖させた。次に、1日おきに合計10回の注射を行って、DPBSを単独でまたはキメラRNA(A10-CON、A10-Plk1、もしくはmutA10-Plk1)との併用で腫瘍に注射した(0日目)。3日ごとに腫瘍を測定した。PC-3腫瘍では、異なる処理のいずれを用いた場合にも腫瘍体積の差は観測されなかったことから、キメラRNAは非特異的な細胞死滅効果を有していないことが示唆される。これとは対照的に、A10-Plk1キメラで処理されたLNCaP腫瘍では、腫瘍体積の顕著な減少が観測された。実際に、6日目から21日目までに、種々の対照処理腫瘍は、体積が3.63倍に増大し(n=22)、一方、A10-Plk1処理腫瘍は、体積が1/2.21に減少した(n=8)。LNCaP腫瘍体積の退縮は、A10-Plk1に特異的であり、DPBS処理またはA10-CON型もしくはmutA10-Plk1型のキメラRNAによる処理ではいずれも観測されなかった。重要なこととして、キメラRNAによる20日間の処理の後、罹患も死亡も観測されなかったことから、これらの化合物はこれらの実験の条件下で動物に対して毒性を示さないことが示唆される。
要約すると、特定の細胞タイプを標的にしかつDicerに対する基質として作用することにより細胞タイプ特異的遺伝子サイレンシングを引き起こすアプタマー-siRNAキメラを開発し特徴付けた。以上に記載した試験では、とくに、細胞表面レセプターPSMAを発現する癌細胞において、抗アポトーシス遺伝子をRNAiの標的にした。標的化遺伝子産物の枯渇により、培養下で標的化細胞の増殖が減少し、アポトーシスが増大した(図4)。キメラRNAの細胞標的化は、キメラのアプタマー部分と細胞表面上のPSMAとの相互作用により媒介された。意義深いことに、PSMAへの結合に関与するアプタマーの領域内に二点突然変異を有する突然変異型キメラRNAは、結合活性の消失を引き起こした(図1D)。PSMAを発現しないPC-3細胞および5-α-ジヒドロテストステロンで処理することによりPSMAが枯渇したLNCaP細胞はキメラの標的にならないがPSMAを発現する未処理のLNCaP細胞は標的になることを実証することにより、結合特異性をさらに確認した(図2C)。このほかに、PSMAに特異的な抗体は、LNCaP細胞表面へのキメラの結合と競合した(図2B)。
キメラRNAによる遺伝子サイレンシングは、RISC複合体の集合前にdsRNAをプロセシングするエンドヌクレアーゼDicerを必要とするので、RNAi経路に依存することが明らかになった(図5A)。Dicerはまた、キメラの二本鎖遺伝子標的化部分をアプタマー部分から切断することも判明した。この段階は、RISC複合体中へのこの試薬のより短い鎖の取込みに先行することが予想される(図5Bおよび5C)。
重要なこととして、このsiRNA送達手段は、前立腺癌のマウスモデルで腫瘍退縮を効果的に媒介した。したがって、RNAキメラは、作製された形態でin vivoでマウスの腫瘍を標的にするのに好適であり、将来的には、ヒト前立腺癌の有用な治療剤であることが明らかになるであろう。この試薬は、PSMA陰性PC-3腫瘍が処理時に退縮しなかったので、PSMA発現に対してin vivoでもin vitroのときと同一の特異性を呈した。キメラの作製に使用されるRNAは、アプタマーセンス鎖中のピリミジンの2’-フルオロ修飾により細胞外RNAseによる急速分解から保護されることは注目に値する。このことは、おそらく、in vivoでの(同様に血清の存在下でin vitroでも)その性能に不可欠であろう(Allerson et al, J. Med. Chem. 48(4):901-4 (2005), Layzer et al, RNA 10(5):766-71 (2004), Cui et al, J. Membr. Biol. 202(3):137-49 (2004))。
siRNAを細胞に送達するための種々の方法が報告されているが、これらの方法のほとんどは、非特異的に送達を達成する(Yano et al, Clin Cancer Res. 10(22):7721-6 (2004), Fountaine et al, Curr Gene Ther. 5(4):399-410 (2005), Devroe and Silver, Expert Opin Biol Ther. 4(3):319-27 (2004), Anderson et al, AIDS Res Hum Retroviruses. 19(8):699-706 (2003), Lewis and Wolff, Methods Enzymol. 392:336-50 (2005), Schiffelers et al. Nucleic Acids Res. 32(19):e149 (2004), Urban-Klein et al, Gene Ther. 12(5):461-6 (2005), Soutschek et al, Nature 432(7014):173-8 (2004), Lorenz et al, Bioorg Med Chem Lett. 14(19):4975-7 (2004), Minakuchi et al, Nucleic Acids Res. 32(13):e109 (2004), Takeshita et al, Proc Natl Acad Sci USA. 102(34):12177-82 (2005))。したがって、siRNAの細胞タイプ特異的送達は、安全および経費の両方の要件に基づいて、治療におけるこの技術の広範にわたる適用可能性に重要な目標となる。
以上で引用した文献および他の情報源はすべて、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年1月29日(2009.1.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
【図１Ａ】アプタマー−siRNAキメラの模式的な提案された作用機序。（図1A）アプタマー−siRNAキメラは、細胞表面レセプター（薄緑色長方形）に結合し、エンドサイトーシスにより取り込まれ、続いてエンドソームから放出されてRNAi経路を入る。比較のために細胞内サイレンシング経路が示されている。プレマイクロRNA（pre-miRNA）は、Droshaによる切断を受けて核から送出され、エンドヌクレアーゼDicerにより認識される。Dicerは、pre-miRNAをプロセシングして21ntの成熟miRNAを与える。続いて、成熟miRNAは、サイレンシング複合体（RISC）中に組み込まれ、それにより標的化mRNA分解を媒介する。
【図１Ｂ】PSMA特異的アプタマーA10（配列番号５）およびA10アプタマー−siRNAキメラ誘導体の予測RNA構造。PSMAへの結合に関与するA10アプタマーの領域は、マゼンタ色で輪郭が示されている。この領域は、突然変異型A10アプタマー、mutA10−Plk1（配列番号８および９）中で突然変異を受けた（突然変異塩基は青色で示されている）。（アプタマーA10の二次構造が示されている。）
【図１Ｃ】A10アプタマー−siRNAキメラの細胞タイプ特異的結合。蛍光標識化アプタマー−siRNAキメラの細胞表面結合（緑色で示される）をフローサイトメトリー分析により評価したところ、PSMAを発現するLNCaP細胞に制限されることが判明した。非染色細胞は紫色で示される。
【図１Ｄ】アプタマー−siRNAキメラの細胞表面結合は、PSMA表面レセプターへの結合に関与するA10のインタクトな領域を必要とする。
【図２Ａ】A10アプタマー−siRNAキメラは、細胞表面抗原PSMAに特異的に結合する。（図２Ａ）蛍光標識化A10アプタマー−siRNAキメラの結合は、過剰のA10アプタマーと効果的に競合させうる。結合は、G1内のカウント数％として表される。
【図２Ｂ】LNCaP細胞へのA10アプタマーおよびA10アプタマー−siRNAキメラの細胞表面結合は、ヒトPSMAに特異的な抗体により破壊される。蛍光標識化されたA10アプタマーおよびA10アプタマー−siRNAキメラの細胞表面結合をフローサイトメトリー分析により評価した。これは、平均蛍光強度（MFI）として示される。競合物質の有無におけるMFI値を用いて競合％を計算した。
【図２Ｃ】LNCaP細胞へのA10アプタマーおよびA10アプタマー−siRNAキメラの細胞表面結合は、5−α−ジヒドロテストステロン（2nM DHT）処理を行うとPSMA細胞表面発現の減少の結果として低減される。結合は、G1（ゲート1）内のカウント数％として表される。
【図３Ａ】アプタマー−siRNAキメラによる遺伝子の細胞タイプ特異的サイレンシング。（図３Ａ）A10−Plk1型のアプタマー−siRNAキメラは、PC−3細胞内ではなくLNCaP細胞内のPlk1発現をサイレンシングする（上側パネル）。サイレンシングは、フローサイトメトリー分析により測定したときのFITC標識化A10−Plk1によるLNCaP細胞の効率的標識化と相関する（下側パネル）。
【図３Ｂ】A10−Bcl−2型のアプタマー−siRNAキメラは、PC−3細胞内ではなくLNCaP細胞内のBcl−2発現をサイレンシングする（上側パネル）。サイレンシングは、FITC標識化A10−Bcl−2によるLNCaP細胞の標識化と相関する（下側パネル）。
【図３Ｃ】Plk1のA10−Plk1媒介サイレンシングは、LNCaP細胞を5−α−ジヒドロテストステロン（2nM DHT）処理すると低減される。
【図４Ａ】Plk1遺伝子およびBcl−2遺伝子のアプタマー−siRNAキメラ媒介サイレンシングの結果として、増殖およびアポトーシスに対する細胞タイプ特異的効果が得られる。（図４Ａ）Plk1 siRNAもしくは対照siRNAのいずれかでトランスフェクト（＋カチオン性脂質）されたかまたはA10アプタマーもしくはA10アプタマー−siRNAキメラ（A10−CONおよびA10−Plk1）で処理（−カチオン性脂質）されたPC−3細胞およびLNCaP細胞の増殖を、3H−チミジンの取込みにより測定した。
【図４Ｂ】シスプラチン、A10アプタマー、もしくはA10アプタマー−siRNAキメラ（A10−CONおよびA10−Plk1）で処理されたかまたはPlk1 siRNAもしくは対照siRNAでトランスフェクトされたPC−3細胞およびLNCaP細胞のアポトーシスを、活性カスパーゼ３に特異的なＰＥコンジュゲート化抗体を用いてフローサイトメトリー分析により評価した。
【図４Ｃ】シスプラチン、A10アプタマー、もしくはA10アプタマー−siRNAキメラ（A10−CONおよびA10−Bcl2）で処理されたかまたはBcl2 siRNAもしくは対照siRNAでトランスフェクトされたPC−3細胞およびLNCaP細胞のアポトーシスを、以上に記載したように評価した。
【図５Ａ】アプタマー−siRNAキメラ媒介遺伝子サイレンシングは、RNAi経路を介して行われる。（図5A）Dicerに対するsiRNAの存在下または不在下でsiRNA、A10アプタマー、またはA10アプタマー−siRNAキメラ（A10−CONおよびA10−Plk1）のいずれかでトランスフェクトされたLNCaP細胞。
【図５Ｂ】in vitro Dicerアッセイ。Dicerを併用してまたは併用せずに処理されたRNAを非変性ポリアクリルアミドゲル上で分離し、エチジウムブロミドで染色した。一本鎖キメラのｓｓA10−Plk1およびｓｓA10−CON（アンチセンスsiRNAを含まない）。
【図５Ｃ】in vitro Dicerアッセイ。32Pで標識された相補的アンチセンスsiRNA鎖にアニールされたアプタマー−siRNAキメラを、Dicerを併用してまたは併用せずにインキュベートし、続いて、切断産物を非変性ポリアクリルアミドゲル上で分離した。アンチセンスsiRNAは、A10に相補的ではなかったので、A10にはアニールしなかった。
【図６Ａ】前立腺癌のマウスモデルにおけるA10−Plk1型のアプタマー−siRNAキメラの抗腫瘍活性。（図6A）ヌードマウスの後部側腹中に左右相称に埋植されたPSMA陰性前立腺癌細胞PC−3（左側パネル）またはPSMA陽性前立腺癌細胞LNCaP（右側パネル）のいずれかを有するマウスモデルでキメラRNAを腫瘍内投与した。一元配置ANOVAを用いて平均腫瘍体積を分析した。＊＊＊、P＜0.0001；＊＊、P＜0.001；＊、P＜0.01。（n＝腫瘍数6〜8）。
【図６Ｂ】個別のLNCaP細胞由来腫瘍に対する腫瘍曲線は、A10−Plk1処理の後では腫瘍増殖の退縮を示すが、DPBS、A10−CON、またはmutA10−Plk1による処理の後では退縮を示さない。
【図７Ａ】PSMAの細胞タイプ特異的発現。ヒトPSMAに特異的な抗体を用いて（図7A）フローサイトメトリー分析および（図7B）イムノブロッティングにより、PSMAの発現を評価した。PSMAは、LNCaP前立腺癌細胞の表面上では発現されるが、PC−3前立腺癌細胞やHeLa細胞（非前立腺由来の癌細胞系）の表面上では発現されない。
【図７Ｂ】PSMAの細胞タイプ特異的発現。ヒトPSMAに特異的な抗体を用いて（図7A）フローサイトメトリー分析および（図7B）イムノブロッティングにより、PSMAの発現を評価した。PSMAは、LNCaP前立腺癌細胞の表面上では発現されるが、PC−3前立腺癌細胞やHeLa細胞（非前立腺由来の癌細胞系）の表面上では発現されない。
【図８Ａ】A10およびA10アプタマー−siRNAキメラ誘導体の相対親和性の測定。（図8A）蛍光標識化RNA（A10、A10−CON、およびA10−Plk1）の細胞表面結合親和性をフローサイトメトリー分析により評価した。（図8B）一部のデータ（図8A）についてG1内のMFI％（平均蛍光強度）を示した図。漸増量の蛍光標識化されたA10 RNA、A10−CON RNA、またはA10−Plk1 RNAをLNCaP細胞と共にインキュベートすることにより、LNCaP細胞表面に対するA10およびアプタマー−siRNAキメラの相対親和性を測定した。細胞蛍光をフローサイトメトリーにより測定した。アプタマー−siRNAキメラおよびA10は、LNCaP細胞表面に対して同等の親和性を有することが判明した。
【図８Ｂ】A10およびA10アプタマー−siRNAキメラ誘導体の相対親和性の測定。（図8A）蛍光標識化RNA（A10、A10−CON、およびA10−Plk1）の細胞表面結合親和性をフローサイトメトリー分析により評価した。（図8B）一部のデータ（図8A）についてG1内のMFI％（平均蛍光強度）を示した図。漸増量の蛍光標識化されたA10 RNA、A10−CON RNA、またはA10−Plk1 RNAをLNCaP細胞と共にインキュベートすることにより、LNCaP細胞表面に対するA10およびアプタマー−siRNAキメラの相対親和性を測定した。細胞蛍光をフローサイトメトリーにより測定した。アプタマー−siRNAキメラおよびA10は、LNCaP細胞表面に対して同等の親和性を有することが判明した。
【図９Ａ】Ｐｏｌｏ様キナーゼ１（Plk1）およびBcl2に対する機能性siRNAにより媒介された遺伝子サイレンシング。（図9A）ヒトPlk1または（図9B）ヒトBcl−2のいずれかに特異的なsiRNAをPC−3細胞およびLNCaP細胞にカチオン性脂質媒介送達することにより、遺伝子サイレンシングを達成した。フローサイトメトリー分析（上側パネル）およびイムノブロッティング（下側パネル）により、サイレンシングを評価した。
【図９Ｂ】Polo様キナーゼ１（Plk1）およびBcl2に対する機能性siRNAにより媒介された遺伝子サイレンシング。（図9A）ヒトPlk1または（図9B）ヒトBcl−2のいずれかに特異的なsiRNAをPC−3細胞およびLNCaP細胞にカチオン性脂質媒介送達することにより、遺伝子サイレンシングを達成した。フローサイトメトリー分析（上側パネル）およびイムノブロッティング（下側パネル）により、サイレンシングを評価した。
【図１０Ａ】DicerのsiRNA媒介サイレンシング。ヒトDicerに特異的な抗体を用いて（図10A）フローサイトメトリーによりおよび（図10B）酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）により、Dicer遺伝子発現のサイレンシングを評価した。対照の非サイレンシングsiRNAまたはヒトDicerに対するsiRNAでHeLa細胞をトランスフェクトした。Dicer siRNAによるサイレンシングは特異的であり、Dicer遺伝子発現の80％超の減少を引き起こした。
【図１０Ｂ】DicerのsiRNA媒介サイレンシング。ヒトDicerに特異的な抗体を用いて（図10A）フローサイトメトリーによりおよび（図10B）酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）により、Dicer遺伝子発現のサイレンシングを評価した。対照の非サイレンシングsiRNAまたはヒトDicerに対するsiRNAでHeLa細胞をトランスフェクトした。Dicer siRNAによるサイレンシングは特異的であり、Dicer遺伝子発現の80％超の減少を引き起こした。
【図１１Ａ】アプタマー−siRNAキメラは、インターフェロン応答を引き起こさない。INF−βに特異的な抗体を用いた酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）により、インターフェロン−β（INF−Ｂ）の産生に関して、siRNA（CON、Plk1、もしくはBcl−2）、A10アプタマー、またはアプタマー−siRNAキメラ（A10−CON、A10−Plk1、もしくはA10−Bcl2）で処理された（図11A）PC−3細胞および（図11B）LNCaP細胞を評価した。この実験ではインターフェロンインデューサーのポリ（I：C）で処理された細胞を陽性対照として使用した。
【図１１Ｂ】アプタマー−siRNAキメラは、インターフェロン応答を引き起こさない。INF−βに特異的な抗体を用いた酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）により、インターフェロン−β（INF−Ｂ）の産生に関して、siRNA（CON、Plk1、もしくはBcl−2）、A10アプタマー、またはアプタマー−siRNAキメラ（A10−CON、A10−Plk1、もしくはA10−Bcl2）で処理された（図11A）PC−3細胞および（図11B）LNCaP細胞を評価した。この実験ではインターフェロンインデューサーのポリ（I：C）で処理された細胞を陽性対照として使用した。
【発明を実施するための形態】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
siRNA
CON siRNA標的配列：  AATTCTCCGAACGTGTCACGT（配列番号１）
Plk1 siRNA標的配列：  AAGGGCGGCTTTGCCAAGTGC（配列番号２）
Bcl−2 siRNA標的配列：  NNGTGAAGTCAACATGCCTGC（配列番号３）
Dicer siRNA標的配列  NNCCTCACCAATGGGTCCTTT（配列番号４）
（ただし、「N」は、A、T、G、またはC）のいずれかである）
アンチセンス鎖の5’末端がFITCで標識された蛍光siRNAは、ダーマコン（DharmaCON）社から購入した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
アプタマー−siRNAキメラ
A10：  5’GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCUUGUCAAUCCUCAUCGGCAGACGACUCGCCCGA3’ （配列番号５）
A10−CONセンス鎖：  5’GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCUUGUCAAUCCUCAUCGGCAGACGACUCGCCCGAAAUUCUCCGAACGUGUCACGU3’ （配列番号６）
A10−CONアンチセンスsiRNA：  5’ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT3’ （配列番号７）
A10−Plk1センス鎖：  5’GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCUUGUCAAUCCUCAUCGGCAGACGACUCGCCCGAAAGGGCGGCUUUGCCAAGUGC3’ （配列番号８）
A10−Plk1アンチセンスsiRNA：  5’GCACUUGGCAAAGCCGCCCdTdT3’ （配列番号９）
A10−Bcl−2センス鎖：  5’GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCUUGUCAAUCCUCAUCGGCAGACGACUCGCCCGAAAGUGAAGUCAACAUGCCUGC3’ （配列番号１０）
A10−Bcl−2アンチセンスsiRNA：  5’GCAGGCAUGUUGACUUCACUU-3’ （配列番号１１）
mutA10−Plk1センス鎖：  5’GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUCCUUACGUCACUCCUUGUCAAUCCUCAUCGGCAGACGACUCGCCCGAAAGGGCGGCUUUGCCAAGUGC3’ （配列番号１２）
A10−Plk1アンチセンスsiRNA：  5’GCACUUGGCAAAGCCGCCCdTdT3’ （配列番号１３）
A10 5’プライマー：  5’TAATACGACTCACTATAGGGAGGACGATGCGG3’ （配列番号１４）
A10 3’プライマー：  5’TCGGGCGAGTCGTCTG3’ （配列番号１５）
A10鋳型プライマー：  5’GGGAGGACGATGCGGATCAGCCATGTTTACGTCACTCCTTGTCAATCCTCATCGGCAGACGACTCGCCCGA3’ （配列番号１６）
対照siRNA 3’プライマー：  5’ACGTGACACGTTCGGAGAATTTCGGGCGAGTCGTCTG3’ （配列番号１７）
Plk1 siRNA 3’プライマー：  5’GCACTTGGCAAAGCCGCCCTTTCGGGCGAGTCGTCTG3’ （配列番号１８）
Bcl−2 siRNA 3’プライマー：  5’GCAGGCATGTTGACTTCACTTTCGGGCGAGTCGTCTG3’ （配列番号１９）
A10突然変異型プライマー：  5’AGGACGATGCGGATCAGCCATCCTTACGTCA3’ （配列番号２０）
次のようにPCRにより二本鎖DNA鋳型を作製した。A10鋳型プライマーをPCR用の鋳型として使用するとともに、A10 5’プライマーと、次の3’プライマー：A10 3’プライマー（A10アプタマー用）、対照siRNA 3’プライマー（A10−CONキメラ用）、Plk1 siRNA 3’プライマー（A10−Plk1キメラ用）、またはBcl−2 siRNA 3’プライマー（A10−Bcl−2キメラ用）のうちの１つと、を使用した。このようにして、またはこれらのPCR産物をＴ−Ａクローニングベクター（プロメガ（Promega）（Madison, WI）社製のpGem−tRNA−easy）中にクローニングしクローンをPCR用の鋳型として使用するとともに適切なプライマーを使用することにより、転写用の鋳型を作製した。
【国際調査報告】
2009538626.tif 000031