(57)【要約】本発明の様々な実施形態は、一般的に、プラスミドＤＮＡ調製物ならびにこのような調製物の作製方法および使用方法に関する。一実施形態では、本発明はプラスミドＤＮＡ調製物を提供する。他の実施形態では、プラスミドＤＮＡは、低下した内毒素レベルを含む。このようなプラスミドＤＮＡ調製物の作製方法および使用方法も提供する。一実施形態では、プラスミドＤＮＡは、ａ）多重欠失株細菌においてプラスミドＤＮＡを増殖させるステップと、ｂ）多重欠失株細菌を溶解して溶解物を生成するステップと、ｃ）溶解物からプラスミドＤＮＡの少なくとも一部を単離し、単離プラスミドＤＮＡを精製するステップとを含む方法によって調製される。リポ多糖および／または腸内共通抗原の産生に関与する遺伝子を欠如している多重欠失株細菌も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
内毒素レベルの低下したプラスミドＤＮＡの作製方法であって、
ａ）多重欠失株細菌において前記プラスミドＤＮＡを増殖させるステップと、
ｂ）前記多重欠失株細菌を溶解して溶解物を生成するステップと、
ｃ）前記溶解物から前記プラスミドＤＮＡを単離して、単離プラスミドＤＮＡを形成するステップと、
ｄ）前記単離プラスミドＤＮＡを精製するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記多重欠失株細菌が大腸菌多重欠失株である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記大腸菌多重欠失株が機能的ｍｓｂＢ遺伝子を欠如している、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記大腸菌株が最小培地中で原栄養性である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記多重欠失株が、リポ多糖の産生に関与する１種または複数種の遺伝子を欠如している、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記大腸菌多重欠失株が、腸内共通抗原の産生に関与する１種または複数種の遺伝子を欠如している、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記プラスミドＤＮＡが、内毒素除去剤でプラスミドＤＮＡを精製する前に、内毒素を２００ＥＵ／ｍｇＤＮＡ未満含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記プラスミドＤＮＡが、内毒素除去剤で前記プラスミドＤＮＡを精製する前に、内毒素を５０ＥＵ／ｍｇＤＮＡ未満含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記プラスミドＤＮＡが、内毒素除去剤でプラスミドＤＮＡを精製する前に、内毒素を０．１ＥＵ／ｍｇＤＮＡ未満含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
リポ多糖の産生に関連した１種または複数種の遺伝子を欠如している大腸菌多重欠失株。
【請求項１１】
腸内共通抗原の産生に関与する１種または複数種の遺伝子を欠如している大腸菌多重欠失株。
【請求項１２】
機能的ｍｓｂＢ遺伝子を欠如している大腸菌多重欠失株。
【請求項１３】
リポ多糖の産生に必要な１種または複数種の遺伝子を欠如している大腸菌。
【請求項１４】
腸内共通抗原の産生に必要な１種または複数種の遺伝子を欠如している大腸菌。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法によって調製されたプラスミドＤＮＡ。
【請求項１６】
前記プラスミドＤＮＡが、前記多重欠失株細菌と同種の非多重欠失株細菌で増殖させた、その他の点では類似しているプラスミドＤＮＡと比較して、少なくとも５％低下した内毒素レベルを含有する、請求項１５に記載のプラスミドＤＮＡ。
【請求項１７】
前記プラスミドＤＮＡが、前記多重欠失株細菌と同種の非多重欠失株細菌で増殖させた、その他の点では類似しているプラスミドＤＮＡと比較して、少なくとも５０％低下した内毒素レベルを含有する、請求項１５に記載のプラスミドＤＮＡ。
【請求項１８】
前記プラスミドＤＮＡが、前記多重欠失株細菌と同種の非多重欠失株細菌で増殖させた、その他の点では類似しているプラスミドＤＮＡと比較して、少なくとも９５％低下した内毒素レベルを含有する、請求項１５に記載のプラスミドＤＮＡ。
【請求項１９】
プラスミドＤＮＡと任意の内毒素除去剤との任意の接触の前に、内毒素濃度が約１００Ｕ／ｍｇ未満である細菌産生プラスミドＤＮＡ。
【請求項２０】
プラスミドＤＮＡと任意の内毒素除去剤との任意の接触の前に、内毒素濃度が約５ＥＵ／ｍｇ未満である、請求項１９に記載の細菌産生プラスミドＤＮＡ。
【請求項２１】
プラスミドＤＮＡと任意の内毒素除去剤との任意の接触の前に、内毒素濃度が約０．２ＥＵ／ｍｇ未満である、請求項１９に記載の細菌産生プラスミドＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００６年５月２４日に出願された米国仮特許出願第６０／８０８，５００号の利益を請求する。米国仮特許出願第６０／８０８，５００号は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明の様々な実施形態は、一般的に、プラスミドＤＮＡ調製物ならびにそれらの作製方法および使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
プラスミドＤＮＡは、ヒトおよび動物の多くの疾患に有望な治療薬である。これらのプラスミドＤＮＡの多くは、化学合成によって作製するには大きすぎ、したがって、宿主細胞において増殖させることによって最も効率よく産生され、この宿主は栄養培地上で高密度になるまで増殖する。このＤＮＡは、その後宿主細胞から回収される。複雑な混合物からのプラスミドＤＮＡの単離および精製には、多数の精製段階が関与する。最初の段階は、消費されなかった栄養分ならびに細胞老廃物から構成される発酵培地からの細胞の濃縮を含む。次の段階には、細胞を溶解または破壊することが必要であり、これによって対象のプラスミドＤＮＡを含む細胞構成物の複雑な生化学的混合物が生じる。これらは通常、プラスミドＤＮＡを分解し得る酵素活性を最小限に抑えるため、カオトロピック塩の存在下で行うか、またはＤＮＡ分解を最小限にする酵素阻害剤と併用した圧力セル、超音波処理器、流体力学的剪断装置、もしくはビーズビーターなどを用いた機械的手段によって実現することができる。プラスミド調製の次の段階では、遠心、示差的沈殿（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）もしくは濾過によって膜、変性タンパク質および大きな染色体ＤＮＡ断片などの不溶性物質から可溶性プラスミドＤＮＡを物理的に分離する。これによってプラスミドＤＮＡを含有する透明な溶解物が生じ、これはさらに、直接沈殿、相分配または様々な樹脂にイオン交換もしくは疎水性相互作用法およびそれらの組合せによって吸着させることによって精製することができ、その後プラスミドＤＮＡを沈殿もしくは相分配することができる。クロマトグラフィー精製は、バッチもしくはカラムクロマトグラフィー法によって実施することができ、適合イオンによる間接的、または直接的吸着法が関与し得る。これらの方法は全て、当業者には公知であり、各段階は不純物およびプラスミドＤＮＡから混入物を除去するように設計される。精製法は全て、プラスミドＤＮＡを単離する材料の量および複雑さを低下させることによって改善することができる。これには、培地中の潜在的な混入物および宿主細胞によって産生された物質が含まれる。
【０００４】
細菌細胞から得られた細胞調製物中に存在する重大な不純物の１つは内毒素で、一部には細菌の外膜に存在するリポ多糖（ＬＰＳ）から生じる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などのグラム陰性菌には、生存するために少なくともＬＰＳの最小限の構造成分が必要で、これらの構造の生合成に必要な経路をコードする遺伝子が大幅に欠如すると死に至る。しかし、ＬＰＳ合成に関与するいくつかの遺伝子は必須ではなく、これらの特定の遺伝子の機能が欠如または欠失しても細胞は許容できる。細菌の内毒素プロファイルを改善するために、このような遺伝子を操作する多くの試みがなされてきたが明らかな成功は得られていない。１つの著しい例外は、ミリストイルアシルトランスフェラーゼをコードするｍｓｂＢが欠如するとヒト組織培養細胞によるＴＮＦα誘発能力が１０００〜１００００倍減少した細胞を産生するという発見である（非特許文献１）。内毒素レベルが低いＤＮＡを生成することができるＬＰＳ欠損細胞を生じるｍｓｂＢ変異体を使用し、腫瘍標的ベクターとしてのこのような細胞を使用することは、いくつかの米国特許（例えば、特許文献１、特許文献２および特許文献３）に開示されている。
【０００５】
大腸菌の染色体は、多くの不顕性プロファージおよび時間と共に大腸菌内に移動する水平伝播遺伝子を表す挿入配列（ＩＳ）因子を含有している。これらの水平伝播配列およびその他の非必須遺伝子を除去すると、Ｂｌａｔｔｎｅｒおよび共同研究者によって報告されたもの（いずれも本明細書に全体を参考として援用した、非特許文献２、特許文献４および特許文献５として公開されたＰＣＴ／ＵＳ０３／０１８００）などの多重欠失株（ＭＤＳ）が生じる。これらの細胞は、プラスミドＤＮＡの産生で通常使用するその他の大腸菌株と比較して多数の遺伝子を欠如していることが特有である。しかし、これらの株は、完全に原栄養性を維持しており、合成最小培地で着実に増殖することができる。大腸菌の合成最小培地は通常、以下のもの（ｇ／ｌ）を含む：グルコース５ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４６ｇ、ＫＨ２ＰＯ４３ｇ、ＮＨ４Ｃｌ１ｇ、ＮａＣｌ０．５ｇ、ＭｇＳＯ４０．１２ｇおよびＣａＣｌ２０．０１ｇ。
【０００６】
合成最小培地で増殖した細胞から得られたプラスミドＤＮＡ調製物は、プラスミドＤＮＡを生成するために通常使用する栄養要求性細菌細胞系の効率のよい増殖に必要な栄養豊富な培地の未確認成分から混入する未確認成分の多くを含んでいない。プラスミドを含有する細菌細胞を増殖させるために、化学的に知られている栄養源の数を制限した合成最小培地を使用すると、培地由来の混入物の数が低下し、その後プラスミドＤＮＡを精製しなければならない細胞組成物はより均一となるだろう。さらに、不顕性プロファージ溶解機能が全て除去されており、ＭＤＳ株発酵中に無制御な溶解はおこらず、染色体から多くの遺伝子が除去されており、ＭＤＳ細胞の生化学的複雑さが減少しているため、溶解物中のタンパク質およびその他の生物学的成分の数も減少する。実際に、ＬＰＳ産生能力が完全に維持されており、ＬＰＳ合成に影響を及ぼすことが知られている遺伝子を全て保持したＭＤＳ株から作製されたプラスミドＤＮＡは、栄養豊富な培地で増殖させたときでも、その他の通常使用する細菌細胞系と比べて、ＬＡＬアッセイによる内毒素レベルが著しく減少していた。
【０００７】
ヒト治療薬として使用するためのプラスミドＤＮＡの産生には、精製されたＤＮＡ産物中に残存する細菌性内毒素の量を最小限に抑えることが必要である。細菌宿主におけるプラスミドＤＮＡの生物学的産生は、大量のプラスミドを生成する効率のよい、測定可能な方法を提供する。しかし、細菌宿主からのプラスミドＤＮＡの精製では、現在実施されている方法のどんな組合せによっても調製ＤＮＡから完全に内毒素が除去されない。現在の方法によって入手できるよりも内毒素のレベルが低いプラスミドＤＮＡが産生できるならば、当技術分野における著しい進歩となる。
【特許文献１】米国特許第６，５４８，２８７号明細書
【特許文献２】米国特許第６，０８０，８４９号明細書
【特許文献３】米国特許第５，９９７，８８１号明細書
【特許文献４】米国特許第６，９８９，２６５号明細書
【特許文献５】国際公開第０３／０７０８８０号パンフレット
【非特許文献１】Ｓｏｍｍｅｒｖｉｌｌｅら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １９９６年９７巻：３５９頁
【非特許文献２】Ｐｏｓｆａｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００６年  ３１２巻：１０４４頁
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要旨
一実施形態では、本発明はプラスミドＤＮＡ調製物を提供する。他の実施形態では、プラスミドＤＮＡは、低下した内毒素レベルを含む。このようなプラスミドＤＮＡ調製物の作製方法および使用方法も提供する。一実施形態では、プラスミドＤＮＡは、ａ）多重欠失株細菌においてプラスミドＤＮＡを増殖させるステップと、ｂ）多重欠失株細菌を溶解して溶解物を生成するステップと、ｃ）溶解物からプラスミドＤＮＡの少なくとも一部を単離し、単離プラスミドＤＮＡを精製するステップとを含む方法によって調製される。リポ多糖および／または腸内共通抗原の産生に関与する遺伝子を欠如している多重欠失株細菌も提供する。
【０００９】
本発明のこれらおよび他の実施形態を、本明細書の下記にさらに詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明は、様々な形態で実施することができるが、本発明の開示は本発明の例としてみなすべきものであって、例示した特定の実施形態に本発明を限定するものではないことを理解して、以下にいくつかの実施形態を説明する。表題は、都合上付けられているだけであって、本発明をどのような方法によっても制限するものではない。表題の下に例示した実施形態は、その他の表題の下に例示した実施形態と一緒にすることができる。
【００１１】
本出願で詳述した様々な範囲における数値の使用は、特記しない限り、記載した範囲内の最小値と最大値の両方に前に「約」という語がついているかのように、近似値として記載されている。このように、記載した範囲の前後のわずかな変動は、範囲内の値と同様の結果を実質的に実現するために使用することができる。本明細書で使用したように、数値に関して「約」および「およそ」という用語は、問題の関連技術における当業者にとって平明で通常の意味を有する。また、範囲の開示は、引用した最小値と最大値の間の全値を含む連続した範囲ならびにこのような値によって形成され得る任意の範囲を意図する。これには、限定された上限および／または下限を含む、または含まないで形成され得る範囲が含まれる。これにはまた、別の開示された数を所与の開示された数で除することによって導き出される比が含まれる。したがって、当業者は、多くのこのような比、範囲および比の範囲が本明細書で表したデータおよび数から明白に得ることができ、いずれも本発明の様々な実施形態を表すことを理解するであろう。
【００１２】
様々な実施形態では、本発明はプラスミドＤＮＡの作製方法を提供する。一実施形態では、プラスミドＤＮＡは、内毒素レベルが低下している。別の実施形態では、この方法は、ａ）多重欠失株細菌においてプラスミドＤＮＡを増殖させるステップと、ｂ）多重欠失株細菌を溶解して溶解物を生成するステップと、ｃ）溶解物からプラスミドＤＮＡの少なくとも一部を単離し、単離プラスミドＤＮＡを精製するステップとを含む。
【００１３】
本明細書では「多重欠失株（ＭＤＳ）細菌」という用語は、そのタンパク質をコードする遺伝子の約１％から約７５％が欠失した、例えば、そのタンパク質をコードする遺伝子の約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％または約６０％が欠失した細菌を意味する。一実施形態では、「ＭＤＳ細菌」という用語は、前記量のタンパク質コード領域の除去が生物の最小培地で増殖する能力に許容できない影響を及ぼさない細菌を意味する。本文脈において二種類以上の遺伝子の欠失が最小培地で生物が増殖する能力に「許容できない影響を及ぼす」かどうかは、特定の適用に左右される。例えば、増殖率の３０％の減少は、一適用では許容され得るが、別の適用では許容できない。さらに、ゲノムからのＤＮＡ配列削除の有害作用は、培養条件の変化などの措置によって抑えることができる。このような措置は、普通ならば許容できない有害作用を許容できる作用に転換することができる。一実施形態では、増殖率は、親株とほぼ同様である。しかし、親株の増殖率よりも約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％から約５０％の範囲まで低い増殖率は本発明の範囲内である。より具体的には、本発明の細菌の倍加時間は、約５分から約３時間の範囲であってよい。適切なＭＤＳ細菌の非限定的例は、それぞれ本明細書に参考として援用した米国特許第６９８９２６５号および米国特許公報第２００６０２７００４３号および第２００６／０１９９２５７号に開示されている。
【００１４】
限定はしないが、大腸菌、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）およびその他のグラム陰性菌を含む様々な細菌株を、本発明の実施形態で使用することができる。
【００１５】
ＭＤＳ細菌を形成するために、様々なタンパク質コード遺伝子を欠失させることができる。大腸菌およびその他の細菌ならびに高等生物において、欠失させることができるＤＮＡ配列の種類には、一般的に生物またはその生物の遺伝子産物の安定性に悪影響を及ぼすものが含まれる。不安定性を上昇させるこのような要素には、限定はしないが、転位因子、挿入配列およびゲノム不安定性に役割を担う可能性があるその他の「自己ＤＮＡ」因子が含まれる。例えば、挿入配列（ＩＳ）因子およびそれらの関連転位酵素は、細菌ゲノムに見出されることが多く、したがって欠失の標的である。ＩＳ配列は、大腸菌において一般的であり、それらの全ては欠失させることができる。この書類では明らかにするために、ＩＳ因子および転位可能な要素という用語は一般的に、完全であっても、欠損があっても、ゲノムのある点から別の点に移動できるＤＮＡ因子を意味するために使用する。科学技術におけるＩＳ因子の有害な効果の一例は、配列決定のために増殖させている最中に、それらが宿主大腸菌のゲノムからＢＡＣプラスミドに移動してしまうという事実である。この人為的現象は、宿主細胞から全ＩＳ因子を欠失させることによって防ぐことができた。特定の適用では、ゲノム不安定性に関連したその他の特定の遺伝子も欠失させることもできる。
【００１６】
一実施形態では、ＭＤＳ細菌は、機能的ｍｓｂＢ遺伝子を欠如している。別の実施形態では、ＭＤＳ細菌は、リポ多糖の産生に関与する、または必要な１種または複数種の遺伝子を欠如している。本明細書では、「リポ多糖」という用語は一般的に、共有結合によって一緒になった脂質および多糖（炭水化物）を含む高分子であることを意味する。リポ多糖は一般的に、コアオリゴ糖、リピドＡおよび多糖類（Ｏ）側鎖を含む。
【００１７】
リポ多糖の産生に関与し、かつ／または必要な遺伝子は当技術分野では公知であり、例えば、それぞれ本明細書に参考として援用しているＲｅｅｖｅｓ  Ｐ、Ｗａｎｇ  Ｌ（２００２年）、「Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＬＰＳ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｏｃｉ」Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２６４巻（１）：  １０９〜３５頁およびＰａｔｉｌ  Ｐら、（２００４年）「Ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｓｕｇｇｅｓｔｉｖｅ  ｏｆ  ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｔ  ａ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  （ｌｐｓ）  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｌｏｃｕｓ  ｉｎ  Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚａｅ  ｐｖ，  ｏｒｙｚａｅ，  ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｌｅａｆ  ｂｌｉｇｈｔ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｏｆ  ｒｉｃｅ」ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４巻（１）：４０頁に開示されている。一実施形態では、欠失の候補となる遺伝子には、ｍｓｂＢならびに大腸菌染色体のヌクレオチド３７９２０１０と３８０６１２１の間のｒｆａ遺伝子群に生じるその他のＬＰＳ生合成遺伝子が含まれる。リポ多糖の産生に関与するか、または必要な他の遺伝子の例には、ｒｆａＩ、ｒｆａＪ、ｒｆｅ遺伝子（リポ多糖のＯ側鎖の生合成に必要）が含まれる。
【００１８】
内毒素レベルをさらに低下させる他の欠失には、腸内共通抗原（ＥＣＡ）、すなわち、いずれも内毒素の変種を構成し得る、免疫糖脂質との関連を含む様々な形態で生じる反復三糖炭水化物部分および環状多量体の産生に関連する遺伝子が含まれる。ＥＣＡ遺伝子は一般的に、大腸菌染色体のヌクレオチド３９６５９３９と３９８０２９５との間に密集している。
【００１９】
一実施形態では、本発明の方法に従って調製されたプラスミドＤＮＡは、多重欠失株細菌と同一の細菌中で増殖した、多重欠失は含有していないが、その他の点では類似している比較用プラスミドＤＮＡと比較して、内毒素レベルが減少していた。様々な実施形態では、本発明の方法に従って調製されたプラスミドＤＮＡは、多重欠失株細菌と同一の株の細菌で増殖した、多重削除は含有していないが、その他の点では類似しているプラスミドＤＮＡと比較して約１％から約９５％、例えば、少なくとも７５％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも２０％、少なくとも５％または少なくとも２．５％減少した内毒素を含む。
【００２０】
内毒素の正確な化学的性質は曖昧だが、この名称は一般的に、通常、糖類、脂肪酸および様々なその他の置換基から構成される一連の分子を含むと理解されている。内毒素は、カブトガニ血液産物から得られ、当業者に周知のリムルスアメーバ様細胞溶解物（ＬＡＬ）を含む様々なアッセイをベースにしたＦＤＡ承認の方法を使用して定量されることが多い。リムルスアメーバ様細胞溶解物法は、それぞれ本明細書に参考として援用したＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２８９巻、１８号、９３１〜９３４頁（１９７３年）および米国特許第４，１０７，００７号に記載されている。リムルスアメーバ様溶解物は、カブトガニ、Ｌｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓの血液細胞（アメーバ様細胞）の水抽出物である。内毒素は、リムルスアメーバ様細胞溶解物中の酵素を活性化し、その後低分子凝固タンパク質と反応してゲルを形成する。通常、Ｐｙｒｏｔｅｌｌ（登録商標）の商標で市販されている凍結乾燥リムルス溶解調製物の溶液０．１ｍｌを試験試料０．１ｍｌと混合して、その後３７℃で１時間静置してインキュベートする。試験管を１８０度反転させて破壊しないゲルが形成されることによって陽性試験の印となる。体液中の内毒素の量を定量するために、試験試料の連続希釈を実施して、前述の陽性の結果が得られる最低希釈度を決定する。試料は、本明細書に参考として援用した米国特許第４，２７６，０５０号に開示された方法に従って検出のために調製することができる。内毒素はまた、当技術分野で周知のＬＡＬ発色動態アッセイ（Ｅｎｄｏｃｈｒｏｍｅ−Ｋ（商標）に従って定量することができる。
【００２１】
別の実施形態では、本発明は、内毒素除去剤での任意の処理の前に、約２００ＥＵ／ｍｇＤＮＡ、約１５０ＥＵ／ｍｇＤＮＡ、約１００ＥＵ／ｍｇＤＮＡ、約５０ＥＵ／ｍｇＤＮＡ、約２０ＥＵ／ｍｇＤＮＡ、約１０ＥＵ／ｍｇＤＮＡ、約９ＥＵ／ｍｇＤＮＡ、約８ＥＵ／ｍｇＤＮＡ、約７ＥＵ／ｍｇＤＮＡ、約６ＥＵ／ｍｇＤＮＡ、約５ＥＵ／ｍｇＤＮＡ、約４ＥＵ／ｍｇＤＮＡ、約３ＥＵ／ｍｇＤＮＡ、約２ＥＵ／ｍｇＤＮＡ、約１ＥＵ／ｍｇＤＮＡ、約０．５ＥＵ／ｍｇＤＮＡ、約０．２５ＥＵ／ｍｇＤＮＡ、約０．２ＥＵ／ｍｇＤＮＡ、約０．１５ＥＵ／ｍｇＤＮＡ、約０．０５ＥＵ／ｍｇＤＮＡ未満の内毒素濃度を有するプラスミドＤＮＡを提供する。本明細書では「内毒素除去剤」という用語は一般的に、内毒素に関連した糖部分と相互作用するホウ酸をベースにした、またはホウ酸を含有する化合物を意味する。内毒素除去剤を含む精製キットおよび組成物の例は、Ｐｒｏｍｅｇａ社製Ｗｉｚａｒｄ  ＭａｇｎｅＳｉｌ  Ｔｆｘ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ、Ｑｉａｇｅｎ社製ＥｎｄｏＦｒｅｅ（登録商標）およびＭｉｒｕｓ社製ＭｉｒａＣＬＥＡＮ（登録商標）である。一実施形態では、プラスミドＤＮＡは、前述の内毒素の少ないプラスミドＤＮＡの作製方法を実施する際には内毒素除去剤と接触しない。別のこのような実施形態では、プラスミドＤＮＡは細菌によって産生される。
【００２２】
本発明の様々な実施形態によるプラスミドＤＮＡは、広範な用途を有する。このようなプラスミドＤＮＡは、例として、感染疾患を予防するためのワクチン、様々なタンパク質産物をコードする遺伝子を発現するクローニングベクターなどとして使用することができる。
【００２３】
リポ多糖または腸内共通抗原の産生に関与する、または必要な１種または複数種の遺伝子を欠如しているＭＤＳ細菌は、本発明のさらなる実施形態となる。
【実施例】
【００２４】
（実施例１）
細胞は、１リットル振盪フラスコ内で酵母抽出物、トリプトンをベースにした培地中で３７℃で増殖させた。精製されたスーパーコイルプラスミドは、当技術分野で周知の方法を使用して、低速遠心、細胞溶解および不溶性残渣の除去によって調製した（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、２００１年を参照のこと）。プラスミドＤＮＡは、イオン交換クロマトグラフィー、次いで疎水性樹脂による適合イオン分離によってさらに精製した。得られたプラスミドＤＮＡ中の内毒素のレベルは、表１に示した様に、ＬＡＬ色素発色速度アッセイ（Ｅｎｄｏｃｈｒｏｍｅ−Ｋ（商標）、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって試験した。
【００２５】
【表１】
2009538147.tif 000002
表１からわかるように、多重欠失株細菌から調製されたプラスミドＤＮＡはＤＨ１０Ｂ株と比較して内毒素濃度および有効内毒素レベルが非常に低い。
【００２６】
（実施例２）
ＣＭＶプロモーターおよびアミノグリコシドＧ４１８に対する耐性をコードする遺伝子に転写的に結合させた緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子を含有するプラスミドを、吸着精製段階でシリカゲル膜を使用する市販のプラスミド単離キット（ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）によって様々な細菌宿主株から単離した。これらのプラスミド調製物の毒性をＣＯＳ１サル腎細胞形質移入アッセイで試験した。このアッセイでは、ＣＯＳ１細胞２．５×１０４個に添加したプラスミドＤＮＡ４μｇのリポソーム媒介形質移入、その後選択培地での２４時間増殖を行う。リポソーム媒介形質移入反応は、当技術分野では周知で、多くの資料、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、２００１年）に記載されている。各培養皿から顕微鏡の視野を無作為に１０カ所選択して、各視野内の全細胞数を計数した。ＦＩＴＣフィルター（４８８ｎｍカットオフ）を使用して各視野内のＧＦＰを発現する細胞を識別し、ＧＦＰ発現細胞の数を細胞の全数で除することによって全形質転換効果を算出した。試験を２回行い、結果を表２に示す。
【００２７】
【表２】
2009538147.tif 000003
表２からわかるように、形質転換効率は、変異ｍｓｂＢ遺伝子を有するＭＧ１６５５を含む対照株と比較して、多重欠失株細菌において高かった。
【００２８】
（実施例３）
内毒素に関連した毒性について、実施例２で説明したのと同じプラスミドおよび組織培養系でさらに試験を実施した。この場合、ＣＯＳ１細胞１．０×１０５個にリポフェクション試薬に溶かしたプラスミドＤＮＡ４μｇを添加して、その後非選択培地で２４時間増殖させることによって形質移入を実施した。培養物を０．３％トリパンブルー色素で染色し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄して死細胞を除去した。各培養皿から顕微鏡の視野を無作為に１０カ所選択して、各視野内の全細胞数を計数した。試験を２回実施し、結果を表３に示す。
【００２９】
【表３】
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ＬＰＳ関連遺伝子を欠失させると、このような株から回収されたプラスミドＤＮＡ中の内毒素レベルをさらに低下させることができる。
【００３０】
実施例で示したように、本発明の方法はＥＣＡ遺伝子を欠如した細菌株から単離されたプラスミドＤＮＡをもたらす。このプラスミドＤＮＡの内毒素は非常に少なく、したがってＥＣＡ遺伝子群を保持している細胞の細菌培養物から単離したプラスミドＤＮＡよりも高い効率で、かつ低い細胞傷害性で、組織培養細胞に形質移入することができる。ＥＣＡ遺伝子群の欠失をｍｓｂＢ変異と組み合わせると、細胞傷害性は最も効率よく低下するものと考えられる。組織培養細胞にその後形質移入するためにプラスミドを使用するとき、そのプラスミドを産生するためにＥＣＡ、ｍｓｂＢ欠失株を使用することにより、ＥＣＡ、ｍｓｂＢ株では遺伝的手段によって回収ＤＮＡ中の内毒素が本質的に減少しているので、研究者は、より高価な内毒素減少キット（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎおよびＱｉａｇｅｎから市販されているキット）ではなく、標準的なプラスミド回収キットで作業することが可能になる。
【国際調査報告】
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