(57)【要約】本発明は、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の生合成の分野に属する。本発明は、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の代謝、好ましくは産生に関与する遺伝子の少なくとも１つを有する、遺伝子組み換え微生物に関する。この微生物は、ポリヒドロキシアルカノエートを工業的に生産することに有用である。本発明は、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を産生する方法に、さらに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の代謝に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子、またはＰＨＡの産生とともに微生物の代謝に干渉するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子に、中程度のまたは長い鎖を有するポリヒドロキシアルカノエート  ＰＨＡの堆積および／または過剰産生を引き起こす少なくとも１つの改変を有する遺伝子組み換え微生物。
【請求項２】
上記少なくとも１つの遺伝子が、ＰＨＡの産生とともに微生物の代謝に干渉し、かつＰＨＡ合成経路の酵素と競合する、ＰＨＡ合成経路における中間体にとっての酵素であるタンパク質をコードする請求項１に記載の遺伝子組み換え微生物。
【請求項３】
上記酵素がチオエステル化酵素である請求項２に記載の遺伝子組み換え微生物。
【請求項４】
上記チオエステル化酵素が、基質としての（Ｒ）−３−ＯＨ−アシル−ＣｏＡに作用する請求項２または３に記載の遺伝子組み換え微生物。
【請求項５】
上記チオエステル化酵素が、アシル−ＣｏＡチオエステル化酵素ｔｅｓＢ類似物である請求項２または３に記載の遺伝子組み換え微生物。
【請求項６】
上記酵素が、図１１または１２に示されている（改変された）核酸配列あるいはそれらの相同物を含む核酸配列によってコードされている請求項２〜５のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え微生物。
【請求項７】
上記酵素は、図１４、１６および１８〜２５のいずれか１つに示されている（天然の）核酸配列が少なくとも１つの改変によって改変された核酸配列あるいはその相同物を含む核酸配列によってコードされている請求項２に記載の遺伝子組み換え微生物。
【請求項８】
上記少なくとも１つの改変が、改変された遺伝子の完全なまたは部分的な不活性化を引き起こす請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え微生物。
【請求項９】
上記少なくとも１つの改変が、Ｔｎ５トランスポゾンおよびＴｎ１０トランスポゾンからなる群から選択されたトランスポゾンの挿入によって、好ましくはＴｎ５の挿入によって、より好ましくは改変された遺伝子における下流側に、もたらされる請求項１〜８のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え微生物。
【請求項１０】
上記少なくとも１つの改変が、好ましくはｍｉｎｉＴｎ５  Ｋｍ  エレメント、より好ましくはｍｉｎｉＴｎ５  Ｓｔｒ／Ｓｐ  エレメントに基づくトランスポゾン変異生成によってもたらされる請求項１〜９のいずれか１項に遺伝子組み換え微生物。
【請求項１１】
上記遺伝子が上記微生物の染色体に組み込まれている請求項１〜１０のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え微生物。
【請求項１２】
上記少なくとも１つの遺伝子が、ＰＨＡ合成酵素、ＰＨＢ合成酵素、アシル−ＣｏＡ転移酵素、エニオル−ＣｏＡ加水分解酵素またはエニオル−ＣｏＡ還元酵素からなる群から選択されたタンパク質をコードする請求項１に記載の遺伝子組み換え微生物。
【請求項１３】
上記少なくとも１つの改変が、微生物によって産生されたポリヒドロキシアルカノエート  ＰＨＡ、好ましくは中程度のまたは長い鎖を有するポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の細胞外の堆積または過剰産生を引き起こす請求項１に記載の遺伝子組み換え微生物。
【請求項１４】
ポリヒドロキシアルカノエート  ＰＨＡの細胞外の上記堆積または上記過剰産生が、対応する野生型の微生物のＰＨＡ産生よりも、少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも１５倍、より好ましくは少なくとも２５倍、さらに好ましくは少なくとも４０倍、さらに好ましくは少なくとも５０倍、最も好ましくは少なくとも６０倍、最も好ましくは少なくとも８０倍、さらに最も好ましくは少なくとも１００倍、である請求項１３に記載の遺伝子組み換え微生物。
【請求項１５】
Ａｌｋａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｃｉｔｏｐｈｉｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖａｒａｎｓ、Ｉｄｉｏｍａｒｉｎａ  ｌｏｉｈｉｅｎｓｉｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｌａｎｄｉｉ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍおよびＣｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｖｉｎｏｓｕｍからなる群から選択されている請求項１〜１４のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え微生物。
【請求項１６】
Ａｌｋａｎｉｖｏｒａｘ、好ましくはＡｌｋａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ、より好ましくはＡｌｋａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ  ＳＫ２からなる群から選択されている請求項１〜１５のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え微生物。
【請求項１７】
ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の代謝に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を構成する、またはＰＨＡの産生とともに微生物の代謝に干渉するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子にある核酸配列。
【請求項１８】
上記遺伝子がＰＨＡ合成酵素、ＰＨＢ合成酵素、アシル−ＣｏＡ転移酵素、エニオル−ＣｏＡである請求項１７に記載の核酸配列。
【請求項１９】
上記遺伝子が、アシル−ＣｏＡチオエステル化酵素ｔｅｓＢ類似物、好ましくはＡｌｋａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｃｉｔｏｐｈｉｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖａｒａｎｓ、Ｉｄｉｏｍａｒｉｎａ  ｌｏｉｈｉｅｎｓｉｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｌａｎｄｉｉ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍおよびＣｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｖｉｎｏｓｕｍのアシル−ＣｏＡチオエステル化酵素ｔｅｓＢ類似物である請求項１７に記載の核酸配列。
【請求項２０】
上記遺伝子が、アシル−ＣｏＡチオエステル化酵素ｔｅｓＢ類似物、好ましくはＡｌｋａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓのアシル−ＣｏＡチオエステル化酵素ｔｅｓＢ類似物、より好ましくはＡｌｋａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ  ＳＫ２のアシル−ＣｏＡチオエステル化酵素ｔｅｓＢ類似物である請求項１７に記載の核酸配列。
【請求項２１】
上記少なくとも１つの改変が、トランスポゾン変異生成、好ましくはＴｎ−５の挿入によって改変された遺伝子の下流側にもたらされる請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の核酸配列。
【請求項２２】
上記少なくとも１つの改変が、好ましくはｍｉｎｉＴｎ５  Ｋｍエレメント、より好ましくはｍｉｎｉＴｎ５  Ｓｔｒ／Ｓｒエレメント、トランスポゾン変異生成によってもたらされる請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の核酸配列。
【請求項２３】
図１１または１２に示される（改変された）核酸配列あるいはそれらの相同物を含む請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の核酸配列。
【請求項２４】
図１４、１６および１８〜２５のいずれか１つに示されている（天然の）核酸配列が少なくとも１つの改変によって改変された核酸配列あるいはこれらの相同物を含む請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の核酸配列。
【請求項２５】
請求項１７〜２４のいずれか１項に記載の核酸配列によってコードされるポリペプチド。
【請求項２６】
図１１または１２に示されるアミノ酸配列を含む請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
請求項１７〜２４のいずれか１項に記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項２８】
ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の代謝に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子またはＰＨＡ産生とともに請求項１〜１６のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え微生物の代謝に干渉するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子に、中程度のまたは長い鎖を有するポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）細胞外の堆積を引き起こす少なくとも１つの改変を有するＰＨＡ産生遺伝子群を含むベクター。
【請求項２９】
請求項２７もしくは２８に記載のベクターおよび／または請求項１７〜２４のいずれか１項に記載の核酸配列を備える細胞。
【請求項３０】
以下の工程：
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の微生物または請求項２９に記載の細胞を培養する工程；ならびに
培養液からポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を回収する工程
を包含するポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を産生する方法。
【請求項３１】
中程度のまたは長い鎖を有するポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の産生および堆積への、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の微生物、請求項１７〜２４のいずれか１項に記載の核酸配列、請求項２６もしくは２７および／または請求項２９に記載の細胞の利用。
【請求項３２】
中程度のまたは長い鎖を有するポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の過剰産生への、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の微生物、請求項１７〜２４のいずれか１項に記載の核酸配列、請求項２６もしくは２７および／または請求項２９に記載の細胞の利用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の生合成の分野に属する。本発明は、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の代謝、好ましくは産生に関与する少なくとも１つの遺伝子を有する遺伝子組み換え微生物に関する。この微生物は、ポリヒドロアルカノエートの工業用な生産に有用である。本発明は、ポリヒドロアルカノエートの産生方法に、さらに関する。
【０００２】
ポリヒドロアルカノエート（ＰＨＡ）は、工業的および生物医学的な幅広い用途を有する、再生可能な資源から生産された生分解性のおよび生物学的適合性の熱可塑性材料（３−ヒドロキシ脂肪酸のポリエステル）である、重合体である。ポリヒドロアルカノエート（ＰＨＡ）は、幅広い範囲の細菌によって合成され、かつプラスティック廃棄物の有害な影響から、従来の石油化学的なプラスティックに代わる潜在的な用途のために広く研究されている。
【０００３】
ＰＨＡは、側鎖の長さおよび生合成の経路に応じて、２つの群に分けることができる。（Ｒ）−３−ヒドロブチル酸単位のホモ重合体であるＰＨＢのような、短い側鎖を有するＰＨＢは、結晶性の熱可塑性物質である。一方、長い側鎖を有するＰＨＡは、より弾性に富んでいる。前者は、約７０年前から知られており（ＬｅｍｏｉｇｎｅおよびＲｏｕｋｈｅｌｍａｎ，  １９２５）、一方、後者は、比較的に最近になって発見された（ｄｅＳｍｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １５４：８７０−７８）。しかし、この指摘よりも前に、５〜１６の炭素原子の（Ｒ）−３−ヒドロキシブチル酸単位および（Ｒ）−３−ヒドロキシ酸単位の両方を含んでいる細菌由来のＰＨＡが同定されている（Ｗａｌｌｅｎ，  Ｒｏｈｗｅｄｅｒ，  １９７４，  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ８：５７６−７９）。（Ｒ）−３−ヒドロキシブチル酸ならびに５〜１６の炭素原子から構成されている１つまたそれ以上の長い側鎖を有するヒドロキシ酸の共重合体を産生する多くの細菌が同定されている（Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ，  Ｗｉｅｓｅ，  １９９２，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３７：  ６９１  ９７；  Ｖａｌｅｎｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３６：  ５０７−１４；  Ｖａｌｅｎｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９９４，  ４０：  ７１０−１６；  Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌ．  １６：  １１５−１９；  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ４２：  ９０１−０９；  Ｋａｔｏ  ｅｔ ａｌ．，  １９９６，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ４５：  ３６３−７０；  Ｖａｌｅｎｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ４６：  ２６１−６７；  ＵＳ  ＰＡＴＥＮＴ  Ｎｏ．  ４，８７６，３３１）。これらの共重合体は、ＰＨＢ−ｃｏ−ＨＸ（ここで、Ｘは３−ヒドロキシアルカノエートまたはアルカノエート、あるいは６以上の炭素のアルカノエートである）と呼ばれうる。特定の２つの構成要素からなる共重合体の内、有用な例は、ＰＨＢ−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサノエート（ＰＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）である（Ｂｒａｎｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌ．  １１：  ４９−５５；  Ａｍｏｓ  ＆  ＭｃＩｎｅｒｅｙ，  １９９１，  Ａｒｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １５５：  １０３−０６；  ＵＳ  ＰＡＴＥＮＴ  Ｎｏ．  ５，２９２，８６０）。
【０００４】
しかし、ＰＨＡは、（上述のように、）生分解性の熱可塑性物質および生物高分子である再生可能な資源として潜在的な用途のために広く研究され、工業的に開発および販売されている（Ｈｒａｂａｋ，  Ｏ．  １９９２）ものの、これらの製品コストは、従来の石油化学に基づくプラスティックよりもはるかに高いために、これらのより幅広い利用に対する大きな障害になっている（Ｃｈｏｉ  および  Ｌｅｅ  １９９７）。上述のように、多くの細菌（例えば、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ，  Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ，  Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｌａｎｄｉｉ，  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｃｉｔｏｐｈｉｌａ，  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖａｒａｎｓ，  Escherichia  ｃｏｌｉ，  Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｕｔｒｏｐｈａ，  Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ，  Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｖｉｎｏｓｕｍ，  Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓなど）がＰＨＡを産生する。当該技術において周知のＰＨＡを産生する細菌のすべては、細胞内ＰＨＡを産生し、産生したＰＨＡをＰＨＡ小粒として蓄積する（Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ，  １９９１）。ＰＨＡ生産が高価になることによって、石油化学に基づくプラスティックと比べて不利であるという主要な側面は、ＰＨＡが蓄積している細菌細胞内から産生されたＰＨＡを回収する困難さである。ＰＨＡの総生産コストを低減するには、効率的な回収手法の開発が、
（１）適切な溶解剤、
（２）ＰＨＡの次亜塩素酸塩抽出法および／または
（３）非ＰＨＡの細胞性物質の消化
によって通常、細胞の崩壊を目指す必要がある（Ｌｅｅ  １９９６）と考えられる。
【０００５】
しかし、工業規模において、当該技術における周知の方法のすべては、回収コストの低減の障害である、大量の化学薬品および／または酵素を必要とする。ＰＨＡを回収する代わりの方策が差し迫って求められている。
【０００６】
本発明の目的は、産生されたＰＨＡを回収するコストを低減しつつ、工業的に大きな水準のＰＨＡの生産を可能にするシステムを提供することである。
【０００７】
この技術的な問題点は、本発明、特に上述のような要求に応じて、上記システムに適用可能な微生物の提供によって解決される。
【０００８】
本発明の第１の実施形態は、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の代謝に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子に、または好ましくは、ＰＨＡを産生する微生物の代謝に干渉するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子に、上記微生物によって産生されたポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、好ましくは中程度の、または長い鎖状のポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の細胞外の堆積（例えば、排出）を、好ましくは培養液中において引き起こす少なくとも１つの改変を有する組み換え微生物に関する。好ましくは、上記微生物が、図１１、１２、１４、１６および１８〜２５に示される核酸配列、あるいはこれらの機能的断片または異形の内の１つを含む。より好ましくは、上記微生物が、図１１、１２、１４、１６および１８〜２５に示される核酸配列の１つに係る１８０番目〜６８０番目、好ましくは２３０番目〜６４０番目、より好ましくは３１０番目〜５５０番目、最も好ましくは３５０番目〜５１０番目の核酸、あるいはこれらの機能的断片または異形を含む。
【０００９】
本発明に係る組み換え微生物が、培養液中における（細胞内において産生された）ＰＨＡの細胞外の堆積（例えば、排出）によって細胞外のＰＨＡを産生することは、本発明者らによって見出された。微生物によるＰＨＡの堆積（例えば、排出）は、当該技術においてこれまでに記述されていない。本発明の微生物は、当該技術において周知の微生物とは異なり、大量のＰＨＡを産生し、好ましくは過剰のＰＨＡを産生し、かつＰＨＡ産物の大部分を細胞外の培養液に堆積することが好ましい。培養液中に大量のＰＨＡを細胞外に堆積（例えば、排出）すること、および過剰産生することは、ＰＨＡの代謝に関与するポリペプチドをコードする遺伝子の少なくとも１つを改変すること、好ましくはＰＨＡの産生に干渉するポリペプチド（酵素）をコードする遺伝子において少なくとも１つの改変を導入することによって達成される。また、本発明に係る“ポリペプチド”という用語は、“ペプチド”、“タンパク質”または“酵素”を含んでいる。
【００１０】
ポリペプチドをコードする種々の遺伝子がＰＨＡの代謝に関与している。種々のこれらの遺伝子は、図５によって示されるような表１に明記されている。従って、本発明に係る遺伝子は、ＰＨＡ代謝、好ましくはＰＨＡ産生に関与するポリペプチドをコードする遺伝子を含む。上述のような遺伝子は、ＰＨＡ合成酵素、（これらに限定される訳ではないが、）ポリ（３−ヒドロキシアルカノエート）合成酵素、エニオル−ＣｏＡ加水分解酵素、およびＰＨＢ合成酵素をコードしている。
【００１１】
同様に、脂肪酸代謝、例えば、脂肪酸合成またはベータ酸化に関与する他の酵素（ポリ（３−ヒドロキシアルカノエート）解重合酵素、還元酵素またはチオール化酵素）もまた、改変されていてもよい。しかし、これらの酵素は、ＰＨＡ合成に特異的に影響しないので、ＰＨＡ合成が増加させる改変としてあまり好ましくない。
【００１２】
ＰＨＡ産生に必要な遺伝子の一揃えは、本発明の微生物において損なわれていないことが好ましい。あるゆるＰＨＡ産生遺伝子（上述の記載を参照のこと）に導入されているあらゆる改変は、酵素活性を低減させるのではなく、増強させることを意味することが好ましい。従って、本発明に係る微生物は、当該技術において周知の微生物よりも高いＰＨＡの産生量を提供することができる。
【００１３】
これに対して、本発明に係る微生物は、ＰＨＡの産生を損なうポリペプチドをコードするあらゆる遺伝子に改変を含むことが最も好ましい。特に、本発明に係る微生物は、チオエステル化酵素の働き、例えば、アシル−ＣｏＡチオエステル化酵素によってアシル−ＣｏＡ分子を切断する酵素をコードする遺伝子に改変が加えられている。特定の微生物によれば、１つ以上のアシル−ＣｏＡチオエステル化酵素は、脂肪酸代謝に機能している。アシル−ＣｏＡチオエステル化酵素は、アシル−ＣｏＡチオエステル化酵素Ｉ（ｔｅｓＡ遺伝子にコードされる）およびアシル−ＣｏＡチオエステル化酵素ＩＩ（ｔｅｓＢ遺伝子にコードされる）と呼ばれる２つの酵素を保有する、特にＥ．ｃｏｌｉにおいて研究されている。チオエステル化酵素Ｉは、Ｃ１２〜Ｃ１８のアシル−ＣｏＡエステルに対して特異性を示し（Ｂｏｎｎｅｒ，  ＷＭ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７２，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２４７，  ３１２３−３１３３）、一方においてチオエステル化酵素ＩＩは、Ｃ１２〜Ｃ１８の鎖長を有するβ−ヒドロキシアシル−ＣｏＡエステルだけでなく、Ｃ６〜Ｃ１８のアシル−ＣｏＡエステルを切断する（Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７０，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ｖｏｌ．  ２４５，  Ｎｏ．  １２，  ｉｓｓｕｅ  ｏｆ  Ｊｕｎｅ  ２５，  ３１２２−３１２８）。ｔｅｓＡは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、脂肪酸の新規生合成の連鎖停止に関与し、かつ脂肪酸の新規生合成から脂肪酸のβ−酸化まで、アシルＡＣＰ中間体を媒介する（Ｋｌｉｎｋｅ，  ＳＱ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６５：  ５４０−５４８）。これまでのところ、細菌の代謝におけるｔｅｓＢの生理学的役割はほとんど分かっていなかった。
【００１４】
非常に最近の報告において、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡチオエステルの結合を切断してこれらを遊離３−ＨＡＡに変化させることによって、チオエステル化酵素ＩＩが３−ヒドロキシアルカノ酸（３−ＨＡＡ）の産生に重要な役割を果たしていることが記載されている（Ｚｗｅｎｇ，  Ｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ７０（７）：  ３８０７−３８１３）。本発明によれば、種々の微生物が、ＰＨＡ合成に欠かせない要素を成している３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡの切断に対して高い特異性を有する活性を用いて作用する、チオエステル化酵素を発現するということが見出された。これらのチオエステル化酵素は、遊離３−ＨＡＡの放出を可能にする。しかし、３−ＨＡＡへの変化は、同様の細胞性中間体（３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡと呼ばれる）に作用するＰＨＡ合成酵素によるＰＨＡ合成と競合する反応である。本発明によれば、（ｉ）遊離３−ＨＡＡの放出およびＰＨＡ合成が代謝経路に干渉していること、（ｉｉ）特定のチオエステル化酵素、本明細書中においてはｔｅｓＢ類似チオエステル化酵素と呼ぶ、の機能的な破壊は、細胞外の培養液におけるＰＨＡの堆積を提供することが見出された。ｔｅｓＢ類似遺伝子における機能破壊的な変異（詳細については後述する）が、多くの微生物において、細胞内の３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡの量を増加させ、これによって（ＰＨＡ前駆体としての）３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡの代謝をＰＨＡ合成に導くことが同定された（図８を参照のこと）。
【００１５】
上述のように、本発明は、基質として（Ｒ）−３−ＯＨ−アシル−ＣｏＡを用いるチオエステル化酵素の（破壊的な）改変がＰＨＡ産生微生物に細胞外の培養液にＰＨＡを蓄積させることを可能にするという普遍的な知見に基づいている。例えば、Ａｌｋａｎｉｖｏｒａｘ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．およびＣａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓにおいて、（Ｒ）−３−ＯＨ−アシル−ＣｏＡに対して特異的に作用すると見られるチオエステル化酵素は、アシル−ＣｏＡチオエステル化酵素であり、同時にわずかに異なる代謝に基づいている他のＰＨＡ産生微生物は、他のチオエステル化酵素、例えばアシル−ＣｏＡチオエステル化酵素ｔｅｓＢまたはｔｅｓＡを用いて３−ＨＡＡを産生する。
【００１６】
あらゆる場合において、３−ＨＡＡ産生に（Ｒ）−３−ＯＨ−アシル−ＣｏＡを特異的に用いるチオエステル化酵素の改変は、例えばアシル−ＣｏＡチオエステル化酵素ｔｅｓＢ類似物のチオエステル化酵素活性を相当に、例えば少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、その上さらに好ましくは少なくとも９０％だけ低下させることが最も好ましく見込まれる。特に好ましい実施形態において、チオエステル化酵素、例えばアシル−ＣｏＡチオエステル化酵素ｔｅｓＢ類似物の機能機能が完全に停止した状態になっている。
【００１７】
また、本発明は、本明細書に開示されているようなタンパク質（およびこれらをコードしている核酸）、特にチオエステル化酵素のｔｅｓＢ類似相同物を含む。本発明の説明において、本明細書に開示されているようなタンパク質のｔｅｓＢ類似相同物は、本明細書に開示されているようなタンパク質のｔｅｓＢ類似相同物以外にも、異なる微生物において生じている、好ましくは、このｔｅｓＢ類似タンパク質と（有為な）相同性を示し、かつ類似または全く同一の生物学的な機能を示す、あらゆるタンパク質またはペプチド配列を含むことを意味している。ここに示されているようなｔｅｓＢ類似タンパク質に対する（有為な）相同性は、当該技術において周知の方法、例えば本明細書に開示されている配列同定決定法または活性検定を用いて、当業者によって容易に決定される。
【００１８】
本発明の知見によれば、Ａｌｋａｎｉｖｏｒａｘは、（Ｒ）−３−ＯＨ−アシル−ＣｏＡに特異的に作用して３−ＨＡＡを産生するアシル−ＣｏＡチオエステル化酵素ｔｅｓＢ類似物、および脂肪酸の産生に関与するアシル−ＣｏＡチオエステル化酵素ｔｅｓＢと名付けられた２つのｔｅｓＢチオエステル化酵素によって特徴付けられる。種々のＰＨＡ産生細菌において相同性検索（ＢＬＡＳＴ検索）を実施することによって、本発明者らは、（高い特異性を有するアシル−ＣｏＡチオエステル化酵素ｔｅｓＢ類似物および他のチオエステル化酵素（ｔｅｓＢ）を用いて）Ａｌｋａｎｉｖｏｒａｘと同じまたは同様の代謝構造物を示す他の微生物を選別した。
【００１９】
また、Ａｌｋａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ  ＳＫ２に存在するチオエステル化酵素の両方の形態は、多くの近縁種であるＰＨＡ産生γプロテオバクテリア（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｐ．  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐ．  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐ．  ｓｙｒｉｎｇａｅ、Ｐ．  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｉｄｉｏｍａｒｉｎａ  ｌｏｉｈｉｅｎｓｉｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．およびＣａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）において発現されている。ＡｌｋａｎｉｖｏｒａｘｔｅｓＢ類似タンパク質の相同物は、他の微生物において、例えば、ｔｅｓＢ類似チオエステル化酵素、推定されるアシル−ＣｏＡチオエステル化酵素ＩＩまたは仮定されるタンパク質のように異なる名前が付けられている。しかし、“ｔｅｓＢ類似”という用語は、ずれのある名称を用いた上述した微生物が有するこれらのチオエステル化酵素のすべてを包含することを意味している。Ａｌｋａｎｉｖｏｒａｘ  ｔｅｓＢ類似チオエステル化酵素のこれらの相同物は、表４に示されている（図１０の表４を参照のこと）。ｔｅｓＢおよびｔｅｓＢ類似タンパク質と名付けられた、Ａｌｋａｎｉｖｏｒａｘおよび他の微生物における２つのチオエステル化酵素の存在は、ｔｅｓＢおよびｔｅｓＢ類似タンパク質の異なる機能によって本発明者らによって、明らかにされている。おそらく、ｔｅｓＢ類似タンパク質は、Ｃ６〜Ｃ１８のアシル−ＣｏＡ誘導体に対して専門的に作用し、同時に、ヒドロキシアシル−ＣｏＡを専門的に切断する。この推論は、ｔｅｓＢタンパク質のこれまでの研究によって支持されている。Ｅ．ｃｏｌｉにおける類似のチオエステル化酵素ＩＩ（Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ｓｕｐｒａ）とは異なって、ＰＨＡ産生Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｉｄｅｓのｔｅｓＢタンパク質（Ｗｉｅｃｚｏｒｅｋ，  ＲＡ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １３５：  ２３−３０）が３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ基質を加水分解することができない（Ｓｅａｙ，  Ｔ ｅｔ ａｌ．，  １９８２，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｍａｙ  ６，  ２５（９）：  ２４８０−２４８５）。
【００２０】
好ましい実施形態において、本発明の微生物は、通常、概略を述べたように、少なくとも１つの改変を有する、染色体に取り込まれている遺伝子を含む。
【００２１】
ＰＨＡ代謝、および／または好ましくは（Ｒ）−３−ＯＨ−アシル−ＣｏＡの分解に関与するタンパク質をコードする上述の遺伝子における少なくとも１つの改変は、遺伝工学的な技術を用いて当該遺伝子の核酸配列に改変を挿入することによって達成される。“遺伝子組み換えの（遺伝子改変された）”という用語は、本発明の微生物の人工的な操作、遺伝子および／または遺伝子産物（ポリペプチド）を意味している。従って、改変（変異）は、配列分析によって確認される（例えば、実施例とともに図１１〜１４および１５〜３３の核酸配列およびアミノ酸配列を参照のこと）。
【００２２】
“改変”という用語は、特に本発明の上述した微生物における少なくとも１つの遺伝子に対する、本発明の微生物のあらゆる操作および変異を意味している。上記改変が、好ましくは、少なくとも１つの遺伝子の核酸配列における変化を生じて、通常、これによりアミノ酸配列レベルにおいて発現される、または調節領域、例えば、遺伝子のプロモータ領域における変異の原因であってもよい。上述した核酸配列の変化の結果として生じる改変は、１つ以上のヌクレオチドの付加、置換、削除または挿入によって達成されることが好ましい。さらに、改変は、微生物における遺伝子の１つ以上の付加的な複製、および／または遺伝子の（完全な）欠失であってもよい。また、欠失は、組み換えまたは挿入（例えば、トランスポゾン）による遺伝子の破壊が原因であってもよい。好ましい実施形態において、本発明に係る微生物内部の改変は、ＰＨＡ、より好ましくはチオエステル化酵素、さらに好ましくはＰＨＡ合成経路の中間体を分解するチオエステル化酵素、最も好ましくは（特に）（Ｒ）−３−ＯＨ−アシル−ＣｏＡを変化させるチオエステル化酵素の産生に干渉する（例えば、ＰＨＡ生合成経路において生化学的に中間体を変化させることによって）代謝に関与する、タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の完全なまたは部分的な不活性化を引き起こす。本発明の最も好ましい実施形態において、微生物は、（Ａｌｋａｎｉｖｏｒａｘにおける）ｔｅｓＢ類似チオエステル化酵素または（微生物における）それらの相同物に関して、欠損している。欠損している性質は、遺伝子レベルにおける種々の改変、あるいは転写後修飾の低減または関連するチオエステル化酵素の酵素活性を破壊することが原因であってもよい。
【００２３】
さらに、ＰＨＡ産生に関与する遺伝子の１以上に改変が、本発明に係る微生物において生じていてもよい。これらの改変は、ＰＨＡ合成酵素、ポリ（３−ヒドロキシアルカノエート）合成酵素、エニオルＣｏＡ加水分解酵素、および／またはＰＨＢ合成酵素ならびに／あるいは脂肪酸代謝に関与する他の酵素に連結されていてもよい。ＡｌｋａｎｉｖｏｒａｘにおけるエニオルＣｏＡ加水分解酵素をコードする遺伝子は、たとえば、ＡＢＯ＿２２４０、ＡＢＯ＿０５２６、ＡＢＯ＿１２３８、ＡＢＯ＿０９８７、ＡＢＯ＿０１４８、ＡＢＯ＿１６４５である。エニオルＣｏＡ加水分解酵素は、β酸化の中間体であるエニオルＣｏＡからの３−ヒドロキシ−アシル−ＣｏＡの産生を触媒するＰＨＡ生合成とともにβ酸化に関与する。３−ヒドロキシ−アシル−ＣｏＡは、ＰＨＡの前駆体であり、かつｐｈａＣによってＰＨＡに取り込まれる。Ａｌｋａｎｉｖｏｒａｘには、ＡＢＯ＿２２１４およびＡＢＯ＿１４１８という、ＰＨＡ合成酵素をコードする２つの遺伝子がある。ＰＨＡ合成酵素は、ＰＨＡ合成における決定的な最終段階を触媒する。これらの酵素の酵素活性は、導入された変異によって増強される。
【００２４】
本発明によれば、遺伝子組み換えの微生物は、ＰＨＡ産生を妨げる代謝に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子に少なくとも１つの改変および付加的にＰＨＡの代謝に関与する遺伝子に少なくとも１つの改変を有している。上記微生物は、ＰＨＡの産生を妨げる代謝に関与するタンパク質をコードする１つの遺伝子に１つの改変だけを有していてもよい。しかし、上記微生物は、本発明に係る微生物の関連する代謝に関与する、同じ遺伝子または２つ以上の異なる遺伝子に１つ以上の（２つ以上の）改変を有していてもよい。この場合において、１つ以上の改変が異なる結果または表現型を生じてもよい。例えば、これらの改変の１つがＰＨＡの排出を生じ、同時に他の改変がＰＨＡの過剰産生を生じる（後述されている）。
【００２５】
さらにまた、本発明に係る微生物は、異なる機能を有する異なる遺伝子に１つ以上の改変を有していてもよい。すなわち、（少なくとも）１つの改変がＰＨＡの産生を妨げる代謝に関与するタンパク質をコードする（少なくとも）１つの遺伝子に生じ、同時に（少なくとも）１つの他の改変がＰＨＡ代謝に関与する（少なくとも）１つの遺伝子に生じている。また、更なる遺伝子、例えば、分泌機序に関与するタンパク質をコードする遺伝子が改変されていてもよい。このような場合、これら（少なくとも）１つの改変が、（増加された）ＰＨＡの排出を生じ、同時に（少なくとも）他の１つの改変がＰＨＡ過剰産生を生じてもよい（後述されている）。
【００２６】
当該技術において周知の種々の好適な遺伝子組み換え技術が、本発明の微生物を作製するために使用されてもよい。通常、あらゆる起源からの遺伝子が、微生物ならびに分子ツールとしてそれらの酵素または転移因子を用いて、種々の方法において断片にされ、かつ改変されてもよい。本発明によれば、遺伝子組み換え技術を用いて、本発明の微生物によるＰＨＡの産生に関与する（例えば、ＰＨＡの産生量を増大させる）および／または例えば、３−ＨＡＡ産生の阻害に関与する少なくとも１つの完全に人工的な遺伝子を構築することもできる。所望の遺伝子が選択され、かつ作製されると、当該遺伝子は、本発明の微生物において発現して所望の遺伝子産物を産生可能に、本発明の微生物に挿入される。例えば、広範囲の遺伝子組み換え手法は、分子クローニングに基づいている。分子クローニングにおいて、２本鎖ＤＮＡを構成する必須の遺伝要素のあらゆる種類に由来するＤＮＡ断片は、ベクターと組み換えられ、かつ適切な宿主に導入される。通常に採用されるクローニングベクターは、例えば、プラスミドおよびバクテリオファージ（例えば、プラスミド  ｐＢＲ３２２、バクテリオファージラムダ、または以下を参照のこと）を含む。分子クローニングは、以下の個々の工程：
原料ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、または合成ＤＮＡなど）の単離および断片化；
ＤＮＡリガーゼを用いたクローニングベクターに対するＤＮＡ断片の接合；ならびに
例えば、形質転換による宿主生物（微生物）における導入および維持
に分割されてもよい。
【００２７】
従って、本発明の微生物は、例えば、ＰＨＡ合成経路に関するタンパク質を過剰に発現してＰＨＡ経路の中間物の量を増大させる、（強力なプロモータに作用可能に連結された）人工のまたは天然の遺伝子を含んでいてもよい。結果として、ＰＨＡが天然の状態よりも大量に産生される。付加的な遺伝子は、細胞に挿入され、別個のＤＮＡ分子、例えばベクター（例えば、プラスミド）上に配置される、または細胞の染色体に組み込まれてもよい。
【００２８】
核酸配列を変える他の好ましい技術は、遺伝子における特定の塩基対を他の塩基対に変えることができる、オリゴヌクレオチドの部位直接的な変異生成に関する（例えば、Ｃｏｍａｃｋ  Ｂ，  ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，  ８．０１−８．５．９，  Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ，  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．  １９９１を参照のこと）。この技術において、所望の変異を含む配列のオリゴヌクレオチドは、上述のように合成される。それから、このオリゴヌクレオチドは、野生型の核酸配列を含む鋳型に対合される。この技術の好ましい実施形態において、鋳型は、１本鎖の鋳型である。ｆ１遺伝子間領域を含むプラスミドであることが特に好ましい。この領域は、ヘルパーファージがファージミドを保持する培養細胞に加えられると、１本鎖の鋳型を生成することができる。鋳型に対するオリゴヌクレオチドのアニーリングの後に、ＤＮＡ依存性ＤＮＡ重合酵素が、当該オリゴヌクレオチドからの鋳型ＤＮＡに相補的な第２の鎖を合成するために使用される。宿主細胞による複製の後には、野生型および新しく構築された変異体という２種類のプラスミドの混合物が存在する。この技術は、核酸のコード配列がすぐ隣にある、実施者によって採用された転写または翻訳調節要素と置き換えられるように、従来の制限酵素切断部位の挿入を可能にする。必要に応じて、単に当業者にとって周知の技術を用いる適切な調節要素に代えることによって、Ｅ．ｃｏｌｉ用に利用されている構築プロトコルに従って、他の生体に用いる類似のベクターの構築に利用されてもよい。
【００２９】
本発明に係る特に好ましい技術は、ランダムリコンビネーションの一種である、トランスポゾン変異生成に関する。この手法は、通常、染色体に組み込まれている移動性のＤＮＡの末端における切断反応および多くの異なる非相同的なＤＮＡ部位の１つにおけるこれらの末端の接触を含む。それは、ヘテロ２本鎖ＤＮＡの形成を含んでいない。トランスポゾンは、化学的なまたは物理的な試薬を用いることなく、変異を導入する試薬として使用することができる。トランスポゾン（転移因子とも呼ばれる）は、（例えば、細菌の）染色体における種々の領域に組み込まれて、変異（変異は、核酸の塩基配列および／またはペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列における遺伝的または人工的な変化として定義される）を引き起こす。ここで、遺伝子内への挿入は、通常、遺伝子の機能を消失させる。従って、これらは、染色体を通じて変異を生成する手軽な手法である。それから、トランスポゾンを含むクローンは、抗生物質耐性のコロニーの単離によって選択されてもよい。変異生成に広く用いられる２つのトランスポゾンは、テトラサイクリン耐性をマーカーとして含むＴｎ１０ならびにネオマイシン耐性およびカナマイシン耐性を与えるＴｎ５である。従って、好ましい実施形態は、好ましくはｍｉｎｉＴｎ５カナマイシンエレメント（ｍｉｎｉＴｎ５  Ｋｍエレメント）に基づいて（図１４および１５を参照のこと）、さらに好ましくはｍｉｎｉＴｎ５ストレプトマイシンエレメント（ｍｉｎｉＴｎ５Ｓｔｒ／Ｓｐエレメント）に基づいて（図１を参照のこと）、少なくとも１つの改変がトランスポゾン変異生成によって行われる本発明の微生物に関する。
【００３０】
本発明の好ましい実施形態において、微生物は、改変された遺伝子の下流側におけるトランスポゾンの挿入、好ましくはＴｎ−５挿入に続いて起こる極性効果を引き起こす改変を含む。
【００３１】
他の有用な技術は、非常に短いヘテロ２本鎖接合の生成を含み、かつこれによって供与ＤＮＡ分子および受容ＤＮＡ分子の両方において同じである短いＤＮＡ配列を要する、保存された部位特異的な組み換えに関する。この方法において、ＤＮＡの切断および接合は、互いに関与するＤＮＡ分子のそれぞれに１つある、２つの特定の部位において生じる。得られた２本鎖分子は、形質転換によってクローニングの宿主に挿入され、変異が選択される。２つの組み換え部位の方向によって、ＤＮＡ組み込み、ＤＮＡ切り取りまたはＤＮＡ反転が生じえる。保存された部位特異的な組み換えは、特に、遺伝子をオンまたはオフに切替えることに有効である。
【００３２】
上述のように、ＰＨＡの産生を妨げる代謝に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子、および／またはＰＨＡの代謝に関与するタンパク質をコードする遺伝子における少なくとも１つの改変は、微生物によって産生されたポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、好ましくは中程度のまたは長い鎖を有するポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の細胞外への、好ましくは周囲の培養液への堆積（例えば、排出）を導く。従って、本発明の微生物は、通常、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、好ましくは中程度のまたは長い鎖を有するポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を、好ましくは周囲の天然培地または培養液の中に堆積、例えば排出する。本発明によれば、“堆積”または“堆積した”という用語は、微生物が（細胞内において）産生されたＰＨＡを、好ましくは微生物の生存および増殖に必須な成分および好適な条件のすべて（栄養素、緩衝液、ｐＨおよび温度）を含む培養液である周囲の培養液に放出することを意味する。堆積は、生細胞の動的な過程（“排出”）および／またはＰＨＡの（過剰な）産生の結果として微生物が死亡したことに由来するＰＨＡの放出が原因であってもよい。ヒドロキシ酸を構成単位とする通常のポリエステル（ＰＨＡ）は、５〜１６の炭素原子からなる側鎖を有するヒドロキシ酸構成単位（［（Ｒ）−３−ヒドロキシ酸構成単位］）を含む。“長い鎖を有するＰＨＡ”は、単量体（分子）ごとに少なくとも１２、好ましくは１４の炭素原子を有するＰＨＡを含むことを意味し、一方において、“中程度の鎖を有するＰＨＡ”は、５〜１４の炭素原子を有するＰＨＡを含むことを意味している。
【００３３】
本発明によれば、本発明の微生物によるＰＨＡの過剰産生が示される（図１、４、６および７を参照のこと）。従って、ＰＨＡの産生を妨げる代謝に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子に少なくとも１つの改変、特に（部分的に）欠損したチオエステル化酵素、さらに特に高い特異性を有する基質として（Ｒ）−３−ＯＨ−アシル−ＣｏＡに導く改変を有している微生物は、通常、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、好ましくは中程度のおよび／または長い鎖を有するポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の過剰産生（に加えて培養液におけるＰＨＡの堆積）を示す。“過剰産生”という用語は、本発明の微生物によるＰＨＡ産生量が、野生体の微生物のＰＨＡ産生量と比較して、少なくとも５倍、好ましくは１０倍、より好ましくは１５倍、さらに好ましくは２５倍、さらに好ましくは４０倍、さらに好ましくは５０倍、最も好ましくは６０倍、さらに最も好ましくは８０倍、さらに最も好ましくは１００倍、であることを意味している。野生型の微生物とは、遺伝子組み換えされておらず、かつ人工的に改変（変異）されていないＰＨＡ産生微生物を意味している。野生型の微生物は、通常のレベルのＰＨＡを産生するが、堆積するという性質を示さない。さらに、本発明に係る微生物は、ＰＨＡ合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子に少なくとも１つの改変を含んでいてもよい。この改変は、例えば、ＰＨＡ合成遺伝子の改変されたプロモータもしくは他の改変された調節因子またはＰＨＡ合成遺伝子の複製数の追加（例えば、微生物の形質転換によって達成される）、あるいはＰＨＡ合成酵素の活性および／または特異性を増加させる遺伝子のコーディング領域内の変異によるタンパク質の過剰発現のためであってもよい。
【００３４】
通常、“微生物”という用語は、原核生物の単細胞または細胞集合（例えば、細菌または藍色細菌）ならびに真核生物（例えば、原虫または菌類）として存在している、顕微鏡的な生物の大きな、かつ種々の群を意味する。本発明に係る好ましい微生物は、ＰＨＡ産生細菌である。本発明に従って使用される発明となる微生物は、ＰＨＡ産生細菌である、Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｉｄｉｏｍａｒｉｎａ  ｌｏｉｈｉｅｎｓｉｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．およびＣａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓの群から選択されることが好ましい。しかし、例えば、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｌａｎｄｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｃｉｔｏｐｈｉｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖａｒａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍまたはＣｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｖｉｎｏｓｕｍなどのあらゆる他のＰＨＡ産生微生物が同様に使用されてもよい。さらに、ＰＨＡ産生に必要な酵素を発現可能にし、かつ上述のように少なくとも１つの改変を含む遺伝子群または対応する発現カセット、特に、ＰＨＡ合成酵素、ポリ（３−ヒドロキシアルカノエート）合成酵素、エニオルＣｏＡ加水分解酵素および／またはＰＨＢ合成酵素を含む発現ベクターを備える微生物であれば、天然にはＰＨＡを産生しないあらゆる微生物が、本発明に従って使用されてもよい。上述のような発現ベクターが微生物、特に、上述のような微生物の細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにあらゆる好適な手法、例えば、トランスフェクション、形質導入または形質転換などによって導入されてもよい（これ以降の記載を参照のこと）。
【００３５】
本発明に係る微生物として、特に、好ましくは低栄養細菌であり、より好ましくは好塩性の低栄養細菌であり、さらに好ましくは油分解性の海洋細菌であり、特に、この内のＡｌｋａｎｉｖｏｒａｘ株であり、より好ましくはＡｌｋａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ株であり、さらに好ましくはＡｌｋａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ株  ＳＫ２である。Ａ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓは、水性環境に広く分布している油分解性の海洋細菌である。Ａ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓは、炭素源およびエネルギー源として、石油炭化水素のみを必須に使用することができる中程度の好塩性を有する低栄養細菌である。Ａ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓは、油によって汚染された海水において優勢な種として、ほとんど発見されており（Ｈａｒａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９、Ｋａｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１および２００２ならびにＳｙｕｔｓｕｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）、従って微生物による環境浄化の目的にとって、重要な用途を有していることから、Ａ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓは、特に興味深い。Ａｌｋａｎｉｖｏｒａｘを含む低栄養性の海洋細菌にとって、油による汚染は、高いＣ／Ｎ比によって特徴付けられる、一時的に栄養物が豊富な条件になる。そのような条件下において、上記微生物は、窒素の欠乏が制限要因にならない限り、エネルギー源として使用するために過剰の炭素を蓄積する。高いＣ／Ｎ比というこれらの条件は、実際に微生物の細胞内における含有物の蓄積を助ける。過剰の炭素がＰＨＡ産生細菌の種によるポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）小粒の形態において蓄積されることを可能にする（Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ  １９９１）。以前に、Ａ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓがＰＨＡを産生することができないという記載があった（Ｙａｋｉｍｏｖ  ｅｔ  ａｌｌ．  １９９８）。しかし、培養液における比較的に高い窒素条件（５ｇ／ｌ）が原因で、培養条件がＰＨＡの蓄積に好ましくなかった。本発明によれば、Ａ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓの完全なゲノムが配列決定された。（他の微生物を用いた相同性に関する研究によって示されているように、）Ａ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓゲノムの機能解析が、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生のためのタンパク質をコードする遺伝子の存在を明らかにした。従って、本発明によれば、Ａ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓがＰＨＡ産生微生物であることが示された。さらに、タンパク質のアミノ酸配列の整列は、Ａ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓにおけるＰＨＡ産生の特徴的な代謝の基礎を示唆する、他の細菌種におけるＰＨＡ合成代謝に関与するタンパク質と低い配列相同性を示した（図５の表１を参照のこと）。
【００３６】
上述のように、本発明の微生物は、通常、ＰＨＡ産生を妨げるタンパク質、好ましくはチオエステル化酵素、より好ましくはＰＨＡ合成の代謝に関与するタンパク質をコードする３−ＨＡＡを合成するチオエステル化酵素をコードする少なくとも１つの改変された遺伝子を含んでいてもよい。しかし、本発明はまた、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の代謝に関与するタンパク質をコードする遺伝子を構成する核酸配列を提供する。当該遺伝子は、好ましくは本発明の微生物によって産生された長鎖のポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）をＰＨＡの排出の原因になる少なくとも１つの改変を有している。
【００３７】
本発明の改変された核酸配列は、ＰＨＡ合成酵素、ＰＨＢ合成酵素、アシル−ＣｏＡ転移酵素、エニオル−ＣｏＡ加水分解酵素、エニオル−ＣｏＡ還元酵素、チオール化酵素、およびアシル−ＣｏＡチオエステル化酵素の群から選択された野生型の遺伝子に基づくことが好ましい。一方において、本発明は、好ましくはコードされる酵素の酵素活性を欠損させる、少なくとも１つの改変によって改変された遺伝子を提供する。ここで、上記遺伝子は、アシル−ＣｏＡチオエステル化酵素ｔｅｓＢ類似物、好ましくはＡｌｋａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓのアシル−ＣｏＡチオエステル化酵素ｔｅｓＢ類似物、より好ましくはＡｌｋａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ  ＳＫ２のアシル−ＣｏＡチオエステル化酵素ｔｅｓＢ類似物または特に、表４（図１０）に示されているような他の微生物における当該酵素の相同物である。
【００３８】
本発明の特に好ましい微生物は、特許手続き上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約に従って、独国ブラウンシュヴァイク３８１２４マッシュローダー通り１ｂのドイチュ  サムルンク  フォン  ミクロオーガニスメン  ウント  ツェルクルツレン株式会社（ＤＳＭＺ：Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）に識別名ＳＫ２  Ｃ９  変異体および受入番号ＤＳＭ１７４８３として寄託されている。
【００３９】
特に好ましい実施形態は、図１１、１２、１６および１８〜２５に示される核酸配列の１つあるいはこれらの機能的な断片またはこれらの異形を含むまたはからなる核酸配列に関する。
【００４０】
本発明の核酸配列は、コード配列および最終的なさらなる配列を含んでいるＤＮＡであってもよい。核酸分子は、２本鎖および１本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡがコード（センス）鎖または非コード（アンチセンス）鎖のいずれかである１本鎖であってもよい。必要に応じて、核酸配列は、非コード配列である（例えば、調節配列含んでいる）３’−および５’−配列のような付加的な非コード配列を含むことができる。特に指定はされていないが、すべての核酸配列は、５’末端から３’末端の方向に記載されている。“核酸配列”という用語はまた、後述するように、これらの断片または異形を含む。さらに、本発明の核酸配列は、例えば、マーカー配列、リーダー配列、あるいはポリペプチドの単離または純化などを補助するポリペプチドをコードする核酸配列を含む、または当該核酸配列からなる核酸配列と融合されていてもよい。以下のものに限られるわけではないが、代表的な配列は、例えば、グルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ）融合タンパク質、ポリヒスチジン（例えば、Ｈｉｓ６）ヘマグルチンまたはＨＳＶタグをコードする核酸配列を含む。
【００４１】
核酸配列の“機能的な”断片または異形という用語は、ＰＨＡの代謝に関与するタンパク質をコードする通常に改変された遺伝子、あるいは後述するような、本発明の、ＰＨＡの産生とともに微生物の代謝に干渉するタンパク質、および／または生物学的に活性な（例えば、ＰＨＡの代謝に関与するタンパク質、またはＰＨＡの産生とともに微生物の代謝に干渉するタンパク質）ポリペプチドをコードする遺伝子を構成することができる、本発明の核酸配列に関する。
【００４２】
また、本発明に関して、核酸配列は、本明細書において、微生物においてＰＨＡ合成酵素によってＰＨＡの合成と競合するタンパク質をコードし、細胞外の培養液にＰＨＡの堆積を供給するものとして使用されてもよい。従って、これらの核酸配列は、本明細書において“機能不全の”核酸配列と称してもよい。本発明に係る“機能不全の”核酸配列は、図１６および１８〜２５に係る天然の核酸配列を含んでいてもよく、または図１７および２６〜３３に係る天然のポリペプチド配列をコードしていてもよい。なお、ここまでに核酸配列および対応する遺伝子について開示したように、これらの配列はトランスポゾンの挿入によって妨げられている（例えば、図１４および１５に例示されている）。さらに、本発明に係る“機能不全の”核酸配列は、トランスポゾンの挿入によって妨げられている図１１および１２に係る核酸配列を含んでいてもよい。
【００４３】
核酸配列の“断片”という用語は、連続する少なくとも約２５のヌクレオチド、連続する少なくとも約５０のヌクレオチド、好ましくは連続する少なくとも約６０のヌクレオチド、より好ましくは連続する少なくとも約１２０のヌクレオチド、より好ましくは連続する少なくとも約１８０のヌクレオチド、より好ましくは連続する少なくとも約２５０のヌクレオチド、より好ましくは連続する少なくとも約４１０のヌクレオチド、またはそれ以上の長さからなる本明細書に記載された核酸配列の一部を含むことを意味している。これに関して、本発明に係るより短い断片は、プローブとして有用であり、またプライマーとして有用である。特に好ましいプライマーおよびプローブは、本明細書に記載されたポリペプチドをコードする核酸配列と選択的に対合する。プライマーは、酵素のまたは合成的な伸張にとって開始基質として機能する、核酸配列の断片である。プローブは、本発明の核酸配列、これらの断片またはこれらの相補的な核酸配列と対合する。上述のような機能を保有する本発明に係るポリペプチドをコードする断片は、特に有用である。
【００４４】
対合は、得られた断片または遺伝子が本発明の微生物と合致するか否かを分析するために用いられてもよく、従って、本発明の範囲に含まれる。対合とは、核酸配列の鎖が塩基を介して相補鎖と合わさる過程を説明している。非同一であるが、非常に似ている相補的な核酸に利用される条件は、２つの鎖の相補性および鎖の長さにともなって、変化する。このような条件および対合技術は、当該分野の当業者にとって周知であり、標準的な対合検定（例えば、上述のＳａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ  （２００１）を参照のこと）に従って実行されればよい。結果として、本発明に係る核酸あるいはこれらの断片または異形と対合する核酸は、本発明に包含される。
【００４５】
核酸配列の異形とは、上述のような核酸配列の機能を維持したまま、１つ以上の核酸の付加、置換、削除または挿入によって本発明の核酸配列から誘導された核酸配列を意味する。上述の核酸配列は、いくつかの特定の局面（例えば、増加したまたは減少した発現率）において変化した性質を示すことができる。その上、遺伝暗号の縮重のせいで、アミノ酸のほとんどが１つ以上の核酸トリプレットによってコードされているという理由から、当業者であれば、以下に説明するような本発明のポリペプチドのアミノ酸配列が、異なる核酸のトリプレットによってコードされ得ることを認識する。これらの選択的な核酸配列が同じアミノ酸配列をコードしているので、本発明はまた、これらの選択的な核酸配列を含む。
【００４６】
本発明に係る核酸配列の異形は、本明細書中に記載されている核酸配列と実質的に同一である。特に好ましくは、本明細書中に記載されている核酸配列と、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは６０％、その上さらに好ましくは８０％、その上さらに好ましくは９０％、およびその上さらに好ましくは９５％の同一性を有している核酸配列である。
【００４７】
これまでに記載における、２つの核酸配列の同一性のパーセントを決定するために、核酸配列は、最適な比較を目的として並べられてもよい（例えば、第１の核酸配列の配列に隙間が導入されてもよい）。それから、対応するヌクレオチド位置におけるヌクレオチドが比較されてもよい。第１の配列における位置が、第２の配列において対応している位置と同じヌクレオチドによって占められているとき、その位置における分子は同一である。２つの配列間の同一性のパーセントは、配列によって共有されている同一な位置の数の相関関係である。従って、２つの配列の同一性のパーセントは、数学的な演算手順を用いて決定してもよい。これに限定されるわけではないが、２つの配列の比較に利用される数学的な演算の一例として、Ｋａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３），  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，  ９０：５８７３−５８７７の演算が好ましい。上述の演算は、本発明の核酸配列に対して所望の同一性を有する配列を同定するために用いられる、ＮＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。比較を目的とした隙間が設けられた整列を得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）およびＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  ２５：３３８９−３４０２に記載されているようなＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用してもよい。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用するとき、それぞれのプログラム（例えば、ＮＢＬＡＳＴ）の初期設定の変数が使用されてもよい。上述した２つの核酸配列の同一性のパーセントを決定する方法は、アミノ酸配列に適用してもよい。
【００４８】
本発明の核酸配列の断片または異形の生成は、当該分野における当業者に周知の標準的な方法に従って行なわれてもよい（上述のＳａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ  （２００１）を参照のこと）。核酸配列の機能的な断片または異形の調製は、通常、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を改変（変更）し、適切な方法（例えば、ＰＣＲ技術）を用いてＤＮＡ配列を増幅することによって達成されうる。核酸配列のこれらの改変（変異）は、上述のような遺伝子組み換え技術によって生成されてもよい。核酸配列の機能的な断片または機能的な異形の単離は、スクリーニング法（例えば、ゲノムＤＮＡライブラリのスクリーニング）のような標準的な方法の後に（例えば、標的とする核酸の所望の配列を有するオリゴヌクレオチドを生成することによって誘導された好適なプローブを用いて）配列決定または対合を利用して行なえばよい。
【００４９】
本発明はまた、本発明の核酸配列の遺伝子産物を含む。本発明に係る遺伝子産物は、特に純化された形態における、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡに対応する転写物だけでなく、対立遺伝子、ポリペプチドあるいはタンパク質または酵素に関する。遺伝子産物は、本発明の核酸によってコードされるポリペプチドであることが好ましい。本発明のポリペプチドは、図１３、１７および２６〜３３に示されるアミノ酸配列の１つを含むことが好ましい。
【００５０】
本発明に係る“機能的な”ポリペプチドは、ポリペプチドが堆積された、例えば、好ましくはＰＨＡの代謝に関与するたのポリペプチドと組み合わせて、排出されたＰＨＡを産生するために使用されることを意味している。ＰＨＡの過剰産生はまた、ＰＨＡ合成経路の機能的なポリペプチドによって達成されることが好ましい、物質の産生、排出および／または過剰産生を測定および分析する方法は、当該技術において周知であり（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ  （２００１）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｂｏｒ，  ＮＹを参照のこと）、本発明によってもまた説明されている（例えば、実施例２〜８、図１、３、および４〜６）。これらに限定されるわけではないが、本発明に係る“機能的な”ポリペプチドは、図１７および２６〜３３に係る天然のポリペプチド配列を含む。
【００５１】
また、本発明の説明において、特に、微生物におけるＰＨＡ合成酵素によるＰＨＡ合成との競合することによって細胞外の培養液におけるＰＨＡの堆積を提供する、ポリペプチドがここに使用されてもよい。従って、本明細書において定義されているように、当該ポリペプチドは、“機能不全の”ポリペプチド、例えば、ｔｅｓＢ類似タンパク質と名づけてもよい。ここまでに説明したように、上述の競合物は、ＰＨＡ合成の基礎をなす３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡの切断に関して、高い特異的な活性を用いて作用するチオエステル化酵素によって生じてもよい。これらのチオエステル化酵素は、遊離３−ＨＡＡの放出を可能にする。しかし、３−ＨＡＡへの変化は、同じ細胞性中間体（すなわち、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ）に作用するＰＨＡ合成酵素によって、ＰＨＡの合成と競合する反応である。ここまでに説明したように、本発明によれば、（ｉ）遊離３−ＨＡＡの放出およびＰＨＡの合成が、干渉し合っている代謝経路であること、ならびに（ｉｉ）特定のチオエステル化酵素、ここではｔｅｓＢ類似チオエステル化酵素の機能的な破壊が、細胞外の培養液におけるＰＨＡの堆積を提供するということが見出された。本発明に係る“機能不全の”ポリペプチドは、図１７および２６〜３３に係る天然のポリペプチド配列あるいは図１６および１８〜２５に係る核酸配列によってコードされるような天然のポリペプチド配列を含んでもよい。ここでこれらの配列は、ここまで開示されたように、核酸配列および対応する遺伝子に対する、トランスポゾンの挿入によって妨げられている（例えば、図１４および１５に例示されている）。さらに、本発明に係るポリペプチドは、トランスポゾンの挿入によって妨げられている図１１および１２に係る核酸配列によってコードされるような、ポリペプチド配列を含んでいてもよい。
【００５２】
本発明のポリペプチドの産生は、周知であり、当該技術における当業者によって周知である多くの異なる標準的な手法（上述のＳａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ  （２００１）を参照のこと）、例えば、固相ペプチド合成法または組み換え法に従って実施されてもよい。両方の方法は、米国出願４，６１７，１４９号に記載されており、上記文献の全体は、引用することによって本明細書に包含される。ポリペプチドの固相化学合成は、当該技術において周知であり、例えば、Ｄｕｇａｓ  Ｈ．  ａｎｄ  Ｐｅｎｎｅｙ  Ｃ．  （１９８１），  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ｐａｇｅｓ  ５４−９２に記載されている。例えば、ペプチドは、アプライドバイオシステム  ４３０Ａ  ペプチド合成機（フォスターシティーのアプライドバイオシステム社から購入可能である）およびアプライドバイオシステム社から提供された合成サイクルを利用して、固相法の方法論によって合成されてもよい。ｔ−ブトキシカルボニルの保護基がついたアミノ酸のような必須の保護基がついたアミノ酸、および他の試薬は、多くの化学的な生産財の卸売商から購入可能である。本発明のポリペプチドの単離は、遠心分離、フィルタろ過あるいはクロマトグラフィーおよび沈降による培養液からの分離ような標準の方法を用いて行われてもよい（上述のＳａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ  （２００１）を参照のこと）。
【００５３】
本発明のポリペプチドはまた、少なくとも１つの第２の部分と融合されてもよい。少なくとも１つの第２の部分は、アミノ酸、オリゴペプチド、またはポリペプチドであり、かつ適切な位置、例えば、Ｎ末端、Ｃ末端または内部において本発明のポリペプチドと連結されている。リンカー配列が、少なくとも１つの他の部分と本発明のポリペプチドとの融合に用いられてもよい。本発明の１つの実施形態によれば、リンカー配列は、５〜５０残基の適応性のある配列、より好ましくは５〜１５残基の適応性のある配列を形成していることが好ましい。好ましい実施形態において、リンカー配列は、少なくとも２０％、より好ましくは４０％、さらに好ましくは５０％のＧｌｙ残基を含んでいる。適切なリンカー配列は、当業者によって容易に選択され、かつ調製される。付加的な部分は、必要に応じて、本発明の配列と結合されていてもよい。ポリペプチドが融合タンパク質として産生されるのであれば、融合の相手（例えば、ＨＡ、ＨＳＶタグまたはＨｉｓ６）を使用して純化／単離を容易にしてもよい。それから、必要に応じて、融合の相手は、産生過程の最後に（例えば、タンパク質分解性の切断または当該技術において周知の他の方法によって）本発明のポリペプチドから取り除かれてもよい。
【００５４】
本発明はまた、本発明の核酸配列を含むベクターを提供する。“構築物”“組み換え構築物”および“ベクター”という用語は、同じ意味を有しており、他の核酸配列の近くに１つ以上の核酸配列を含むヌクレオチド配列を決めている。適切な細胞（宿主細胞）への形質転換に、核酸の発現を起こすベクターが使用されてもよい。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子または単なる潜在的なあるゲノムの挿入であってもよい。好適な宿主に形質転換されると、ベクターは、複製されて宿主ゲノムとは独立して機能する、または好適な条件において、ゲノムに組み込まれてもよい。
【００５５】
ベクターの“他の配列”という上述の用語は、以下に示す配列に関する。通常、好適なベクターは、複製開始点（例えば、Ｏｒｉ  ｐおよびｃｏｌＥｌ  Ｏｒｉのような挿入された核酸配列の発現を可能にする配列）および／または選択的な遺伝子マーカー（例えば、ＧＦＰのような蛍光タンパク質をコードする遺伝子、またはＴｎ３由来のｐ−ラクタマーゼ、Ｔｎ９０３由来のカナマイシン耐性遺伝子またはＴｎ９由来のクロラムフェニコール耐性の抗生物質耐性を示す遺伝子）を含んでいる。
【００５６】
“プラスミド”という用語は、染色体外において通常に自己複製する遺伝子要素を意味しいている。プラスミドは、通常、文字および数字の前および／または後に置かれた小文字の“ｐ”によって示される。最初のプラスミドは、ここでは、市販のもの、制限されない基準に基づいて公然に一般に利用可能なもの、または公開された手法に従って利用可能なプラスミドから構築されるもののいずれかである。これらに記載されたプラスミドの等価物は、当該技術の当業者に周知である。本発明のベクターを調製するために採用された最初のプラスミドは、例えば、セシウムクロライドＤＮＡ単離のような標準的な手法を用いたこれらのプラスミドを含んでいる適切なＥ．  ｃｏｌｉから単離されてもよい。本発明に係るベクターは、（組み換え）発現ベクターと同様に（組み換え）ＤＮＡクローニングベクターを含む。本発明に係る好ましいベクターは、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ｐＢＲ３２２、ＸＬ−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ‘およびｐＢＫ−ＣＭＶ、ならびにバクテリオファージラムダなどである。ＤＮＡクローニングベクターは、これに限定されるわけではないが、１つ以上の本発明の付加的な核酸が付加されているＤＮＡ分子を構成するプラスミドおよびファージを含む、自発的に複製する試薬を指す。発現ベクターは、好適な宿主において、発現効率を向上可能であり、かつ挿入された本発明の核酸配列の転写を制御可能である好適な制御配列に作動可能に連結されている本発明の核酸配列を含む、あらゆるＤＮＡクローニングベクター組み換え構築物を指す。作動可能に連結されている、とは、核酸配列が、核酸配列の発現可能な方法において制御配列に連結されていることを意味する。転写とは、ＤＮＡの核酸配列に含まれる情報が相補的なＲＮＡ配列に転写される過程を意味する。
【００５７】
上述の制御配列は、当該技術において周知であり、本発明の核酸を発現および転写の制御のために選択される。上述の制御配列は、これに限定されるわけではないが、ポリアデニル化シグナル、転写の効率を上げるプロモータ（例えば、天然のまたは合成のプロモータ）あるいはエンハンサ、転写を制御する付加的なオペレータ配列、組織特異的な転写を可能にする部位制御領域、ｍＲＮＡ上の適切なリボソ−ム結合部位をコードする配列、ｍＲＮＡの安定化を可能にする配列ならびに転写および翻訳の終了を制御する配列を含む。これらの制御配列は、制御機能を維持したままで、１つ以上の核酸が削除、付加、挿入、または置換によって改変されていてもよい。他の好適な制御配列は、当該技術において周知であり、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ  （１９９０），  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡに記載されている。
【００５８】
細菌の系に使用するプロモータはまた、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結されたシャイン−ダルガノ配列を含んでいてもよい。
【００５９】
例えば、有効な発現ベクターは、ＳＶ４０の種々の周知の異形および周知の細菌プラスミド（例えば、ｃｏｌ  Ｅ１、ｐＢＫ、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭｂ９、ｐＵＣ  １９およびこれらの異形を含むＥ．  ｃｏｌｉ由来のプラスミド、宿主範囲の広いプラスミド（例えば、ＰＲ４、ファージＤＮＡ（例えば、ファージラムダの多数の異形（例えば、ＮＭ９８９））および他のＤＮＡファージ（例えば、Ｍ１３および１本鎖ＤＮＡの糸状ファージ）、ならびにファージＤＮＡまたは他の発現制御配列を用いて改変されているプラスミドのようなプラスミドＤＮＡとファージＤＮＡとの組み合わせに由来するベクター）のように、染色体部分、非染色体部分および合成ＤＮＡ配列からなっていてもよい。本発明の発現ベクターを用いた発現技術は、当該技術において周知であり、通常に例えば、上述のＳａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ  （２００１）に記載されている。
【００６０】
本発明のベクター、特に発現ベクターは、ここまでに定義されているように、改変された遺伝子を含む遺伝子群を含んでいる。当該改変された遺伝子とは、例えば、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の代謝に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子、好ましくはＰＨＡの産生とともに微生物の代謝に干渉するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子に少なくとも１つの改変を有する遺伝子であり、当該改変は、微生物によって産生されたＰＨＡ、好ましくは中程度のまたは長い鎖を有するＰＨＡの、好ましくは培養液における細胞外の堆積（例えば、排出）を引き起こす。このような発現ベクターが、上述のように、あらゆる好適な微生物に導入されて、ＰＨＡを産生し、かつ排出する発明の微生物を生成する。このような遺伝子群は、通常、ＰＨＡの代謝に必要かつ適切な遺伝子のすべてを含んでいる。従って、上述の遺伝子群を含む上述の（発現）ベクターを含む発明の微生物はまた、本願に包含される。
【００６１】
また、本発明は、本発明に係るベクターまたは核酸（あるいはこれらの機能的な断片または機能的な異形）を備える細胞（また、宿主細胞）を提供する。細胞（宿主細胞）はとは、本発明にとって有用な、本明細書に記載されたあらゆる微生物の細胞を意味する。さらに、細胞または宿主細胞とは、本発明に係る核酸またはベクターにとって、宿主および発現の媒介物として作用できる細胞を意味する。上記細胞は、原核生物であることが好ましい。本明細書に記載したように、（例えば、形質転換、トランスフェクションまたは形質導入の結果として、）ベクターまたは核酸を備えている細胞は、これに限定されるわけではないが、細菌細胞である（例えば、Ａ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓまたはＥ．  ｃｏｌｉ）。特定の細胞の選択は、本発明の核酸を発現させるために使用される特定の発現ベクターに関するおよその範囲に依存する。
【００６２】
ベクターは、あらゆる好適な方法（例えば、形質転換、電気穿孔、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストランまたは他の物質を用いたトランスフェクション、微粒子銃、リポフェクション、感染あるいは形質導入）を用いて細胞（）に導入されてもよい。形質転換は、ＤＮＡが染色体外エレメントとして、または染色体への組み込みによって複製可能なように、生体へのＤＮＡ（核酸配列）の導入に関する。細菌の宿主を形質転換する方法は、当該技術において周知である。核内注入または原形質融合のような多数の方法が、上述のＳａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ  （２００１）にまとめられている。トランスフェクションは、あらゆるコード配列が実際に発現されているか否かを、細胞（宿主細胞）によるベクターの取り込みを参考にする。あらゆる指標または作用あるいはこのベクターが細胞内において生じているとき、通常、トランスフェクションの成功が認識される。
【００６３】
本発明の他の局面は、以下の工程：
本発明の微生物または細胞を培養する工程；および
培養液からポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を回収する工程
を包含するポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の産生方法に関する。
【００６４】
好適な条件における微生物または細胞を培養する標準的な方法は、当該技術において周知である。下記〔実施例〕の下にある（材料）の記載および上述のＳａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ  （２００１）を参照すればよい。
【００６５】
ＰＨＡは、遠心分離またはフィルタろ過による培養液からの細胞の分離、上清における組成物（ＰＨＡ）の沈降またはろ過とそれに続くクロマトグラフなどの手法（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー）による純化あるいは同様の技術と認められる手法を含む従来の手法によって培養液から単離されてもよい（実施例４も参照のこと）。
【００６６】
本発明の他の局面は、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、特に中程度のおよび／または長い鎖のポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を堆積（排出）および／または過剰産生する、微生物、ポリペプチド、核酸、ベクターおよび／または細胞の利用に関する。
【００６７】
まとめると、本発明は、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の代謝に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子において、または、好ましくは、ＰＨＡを産生する微生物の代謝に干渉するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子において、上記微生物によって産生されたポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、好ましくは中程度の、または長い鎖状のポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の細胞外の堆積（例えば、排出）を、好ましくは培養液中において引き起こす少なくとも１つの改変を有する組み換え微生物に関する。ｍｉｎｉＴｎ５Ｋｍエレメントと同様に、ｍｉｎｉＴｎ５  Ｓｔｒ／Ｓｐエレメント（実施例１を参照のこと）に基づくトランスポゾン変異生成は、ＰＨＡの産生とともに微生物の代謝に干渉するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の中に少なくとも１つの改変を導入するために使用された。従って、プラスティック表面に対する変異体細胞の接触の欠損によって測定されるような、生物膜形成に欠陥のあるｍｉｎｉＴｎ５変異体のスクリーニングが実施された（実施例２を参照のこと）。後ほどＰＨＡとして同定される（実施例４を参照のこと）分泌された重合性物質が原因となって、生物膜の形成に明らかな欠陥を示している変異体（以下において“Ｃ９”または“Ｃ９変異体”と示す）が単離された。
【００６８】
本発明によれば、これらの微生物、特に、Ａ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓによる顆粒の形態における細胞内のＰＨＡ蓄積と同様に、例えば、Ａ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓから由来する発明の遺伝子組み換え微生物の適用による、ＰＨＡの産生および堆積（例えば、排出）は、化学分析によって確認された。例えば、Ｎに対するＣの高い比率の条件において培養されたこれらの遺伝子組み換え微生物、特に、Ａ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓの利用によって、異なるＰＨＡ（ヒドロキシアルカノエート、ヒドロキシオクタノエート、ヒドロキシデカノエートおよびヒドロキシドデカノエート）の混合物が蓄積物質として細胞内の顆粒の形態において産生され得ることが分析された。その上、特に、ＰＨＡの産生とともに微生物の代謝に干渉するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子における、少なくとも１つの改変を有する遺伝子組み換え微生物の単離と特徴付けが達成された。本発明は、細胞内に産生されたＰＨＡの回収に費用がかかるという問題を回避し、かつＰＨＡより高い生産量を導く。
【００６９】
以下の図面および実施例は、本発明を説明すると考えられる。それらは、それらに関して本発明の範囲に限定を設けるものではない。本明細書の開示内容によって参照される参考文献のすべては、ここに言及することによって、その全体が本明細書に組み込まれる。
【００７０】
他の実施形態において、ここまでに定義されたように、３−ＨＡＡの産生をもたらす酵素が提供される。上述の酵素は、これらに限定されるわけではないが、Ａｌｋａｎｉｖｏｒａｘ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．およびＣａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓのチオエステル化酵素に由来するあらゆる酵素ならびに３−ＨＡＡ産生を可能にするあらゆる酵素を含む。
【００７１】
さらに、本発明は、ここまでに定義されたような３−ＨＡＡの産生をもたらす、これらの酵素および／またはＰＨＡ、好ましくは中程度のもしくは長い鎖を有するポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を産生するためのこれらをコードしている核酸配列の利用を提供する。上述の酵素は、これまでに概略を説明したように、例えば、ベクターまたは（むき出しの）核酸として、あるいは例えば、当該技術において周知の方法を用いた細胞貫通ペプチドとの融合体としてのタンパク質の形態において、微生物にトランスフェクトされてもよい。
【００７２】
図１は、炭素源としての２％ピルビン酸塩または１．５％のオクタデカンの条件にある、野生型のＡ．  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ  ＳＫ２（以下において、“ＳＫ２”または“ＳＫ２野生型”と記載する）および変異体のＡ．  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ  ＳＫ２（以下において、“Ｃ９変異体”と記載する）における、ＰＨＡ産生を示している。細胞およびこれに対応する上清が、ｇ／ｌにおいて示されるＰＨＡ含有量について確認された。ＰＨＡの産生は、以下の順序：
Ｃ９変異体の上清  ピルビン酸塩＞Ｃ９変異体の上清  オクタデカン＞ＳＫ２野生型の細胞＋上清  オクタデカン＞ＳＫ２野生型の細胞＋上清  ピルビン酸塩
であった。ピルビン酸塩またはオクタデカンのいずれかの上において培養されたＣ９変異体細胞から単離されたＰＨＡの量は、非常に低く定量化された（図における３番目および５番目のプローブ）。ピルビン酸塩上において培養されたＣ９変異体は、ピルビン酸塩上において培養されたＳＫ２野生型のほぼ１０倍のＰＨＡを産生した。さらに、オクタデカン上において培養されたＣ９変異体は、オクタデカン上において培養されたＳＫ２野生型のほぼ１０倍のＰＨＡを産生した。従って、本発明によれば、ＰＨＡを堆積（例えば、分泌）および過剰産生する遺伝子組換えの微生物が、提供される。
【００７３】
図２は、Ａ．  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ  ＳＫ２株の電子顕微鏡画像を示している。細胞は、１．５％（重量／堆積）のオクタデカンおよび０．２７ｇ／ｌのＮＨ４Ｃｌ（保存条件）を含むＯＮＲ７ａにおいて培養され、定常期に回収された。上記細胞から準備されたこれらの超薄切片について、細胞内の小粒の存在を確かめた。
【００７４】
図３は、オクタデカンを用いて覆われたパーマノクス（Ｐｅｒｍａｎｏｘ）疎水性スライドガラス上において培養されたＳＫ２野生型細胞およびＣ９変異体細胞の走査型電子顕微鏡画像（図３Ａおよび図３Ｂ）ならびに電子顕微鏡画像（図３Ｃおよび図３Ｄ）を示している。図３Ａおよび３Ｃは、ＳＫ２野生型細胞の結果を示している。図３Ｂおよび３Ｄは、それぞれ、周囲の培養液中における細胞外ＰＨＡの産生およびＰＨＡの排出を確かめているＣ９変異体細胞の結果を示している。両方の画像は桿状の細胞を含んでいるが、Ｃ９変異体細胞が堆積、例えば排出された物質の細胞外の網目状組織に組み込まれており、一方において、ＳＫ２野生型細胞には見られないことは、明らかである。これらの結果は、Ｃ９変異体株が化学分析によってＰＨＡであると証明された重合性の細胞外物質の産生に関与しているという仮説を支持している。さらに、保存条件におけるオクタデカンの上で培養されたＳＫ２野生型細胞およびＣ９変異体細胞の陰付け技術の電子顕微鏡画像は、Ｃ９変異株によって産生されたＰＨＡが培養液に堆積、例えば、排出されるという上記仮説に対する付加的な支持を与えた。Ｃ９変異株の陰付き細胞の電子顕微鏡画像は、細胞内において産生されたＰＨＡの排出におそらく関与している、するＣ９変異体細胞表面上に穴があることを明らかにした。
【００７５】
図４は、Ｃ９変異体およびＳＫ２野生型の増殖特性を比較する図を示している。図に示すように、炭素源としてピルビン酸塩が使用されたとき、Ｃ９変異体は、ＳＫ２野生型に匹敵する増殖特性を有していた。オクタデカンを使用した場合には、さらに、Ｃ９変異体は、ＳＫ２野生型と比較してより良好な増殖を示した。ＳＫ２野生型は、Ｃ９変異体と比較して、これらの条件におけるオクタデカン上の増殖においていくらか不足していた。これに対して、細胞内における高いＰＨＡの含有量がＳＫ２野生型の細胞分裂を抑制しているという説明が可能である。また、細胞のカウント数は、高いＣ／Ｎ比の条件下において培養液に合成されたＰＨＡを放出し、まだ細胞分裂することができるＣ９変異体にとってのオクタデカン上の増殖において優位性を示している（データは示さず）。結論として、本発明に係る微生物は、生物工学的、商業的および工業的な目的に実に有用である。
【００７６】
図５は、Ａ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓにおいてポリヒドロキシアルカノエートを産生および動態化する遺伝子の配列データのコンピュータ上における解析の結果を示す表１を示している。
【００７７】
図６は、ＰＨＡの解析およびその組成を表す表２を示している。野生型のＡ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ  ＳＫ２（以下において、“ＳＫ２”または“ＳＫ２野生型”と記載する）および変異体のＡ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ  ＳＫ２（以下において、“Ｃ９変異体”と記載する）によって堆積、例えば排出された物質が、実際にＰＨＡであるのかを確かめるために、さらなる化学分析が実施され、ＰＨＡの存在を明らかにした。細胞は、炭素源としてピルビン酸塩またはオクタデカン上において、およびＰＨＡ堆積条件（ＰＨＡ蓄積条件）、例えば、高いＣ／Ｎ比（Ｃ：Ｎ比１００：１）におけるエネルギー供給条件において、培養され、培養液から分離された。細胞およびこれに対応する上清は、次亜塩素酸ナトリウム消化およびアセトン／ジエチルエーテルを用いた次の溶媒抽出によって純化された（Ｓｏｌａｉｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。ＰＨＡの産生は、以下の順序：
Ｃ９変異体の上清  オクタデカン＞Ｃ９変異体の細胞  ピルビン酸塩＞ＳＫ２野生型の細胞＋上清  オクタデカン＞ＳＫ２野生型の細胞＋上清  ピルビン酸塩
であった。
【００７８】
ピルビン酸塩またはオクタデカンのいずれかにおいて培養されたＣ９変異体の細胞から単離されたＰＨＡの量は、定量化には少なすぎた（図１も参照のこと）。オクタデカンにおいて培養されたＳＫ２野生型の細胞は、ピルビン酸塩において培養された細胞に比べてほぼ３倍も多いＰＨＡを産生した（１８ｍｋ／ｌに対して６．５ｍｇ／ｌ）。オクタデカンにおいて培養されたＣ９変異体の上清から単離されたＰＨＡの量は、ピルビン酸塩において培養された細胞と比較してほぼ２２倍のＰＨＡを産生した（２９６０ｍｇ／ｌに対して１３４ｍｇ／ｌ）。
【００７９】
表２に示すように、ＳＫ２野生型によって産生されるＰＨＡの量は、むしろ低く（ピルビン酸塩において６．５ｍｇ／ｌおよびオクタデカンにおいて１６ｍｇ／ｌ）、アルカンにおいてよりＰＨＡが産生されるように、炭素源に依存していた。ＳＫ２野生型によって産生されたＰＨＡは、主な単量体の化合物としてヒドロキシデカノエートを有する、ヒドロキシヘキサノエート（Ｃ６）、ヒドロキシオクタノエート（Ｃ８）、ヒドロキシデカノエート（Ｃ１０）およびヒドロキシドデカノエート（Ｃ１２）から構成されていた。こように、以前の発見（Ｙａｋｉｍｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）にもかかわらず、高いＣ／Ｎ比の条件にあるＡｌｃａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ  ＳＫ２株は、アルカンから主にポリヒドロキシアルカノエートの混合物を生成するということが示された。さらに、高いＣ／Ｎ比の条件におけるＡ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ  ＳＫ２の遅い増殖は、実際に光学顕微鏡下において見えるＰＨＡからなる顆粒を示した（図２も参照のこと）。
【００８０】
また、表２は、ＳＫ２野生型のＰＨＡが細胞の内側に蓄積され（細胞外の産生はなし）、一方において、Ｃ９変異体によって産生されたＰＨＡのすべては、細胞培養液に堆積、例えば、排出された（細胞外の産生）ことを示している。単量体の繰り返し単位の組成および重合体の分子量が、気相クロマトグラフィー／質量分析およびゲル透過クロマトグラフィーによって、それぞれ決定された。
【００８１】
図７は、Ａ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ由来のＰＨＡの分子量を表す表３を示している。ピルビン酸塩において培養されたＣ９変異体の上清およびオクタデカンにおいて培養されたＣ９変異体の上清、ならびにピルビン酸塩において培養されたＳＫ２野生型およびオクタデカンにおいて培養されたＳＫ２野生型の上清にとっての結果が示されている。Ａ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ  ＳＫ２重合体は、Ｃ６からＣ１２までの繰返しの範囲の単量体を有していた。上記重合体の分子量は、１８００００から５４００００Ｄａまで（１分子あたり）変化した。これは、重合体によって、１０２７かた２２４６の単量体の繰り返しに対応する。同様の単量体の繰り返しおよび／または分子量は、Ｃ９変異体に観察されたが、構成要素のＰＨＡ分子量は、ＳＫ２野生型細胞においてわずかに低かった。また、単量体の分子量は、炭素源に依存していなかった。これらのデータは、変異が、ＰＨＡ産生の様式に影響するのであって、産生されたＰＨＡの組成には影響しないことを強く示唆している。
【００８２】
図８は、炭化水素／ピルビン酸塩上において培養されたＡ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ  ＳＫ２におけるＰＨＡ生合成の仮説的な経路の模式図を示している（Ｋｌｉｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  グルコン酸塩上において培養されたＥ．  ｃｏｌｉに含まれているＰＨＡポリメラーゼおよびＰＨＡチオエステル化酵素ＩのＭＣＬ  ＰＨＡ生合成の仮説的な経路の修正版）。炭化水素は、アシル−ＣｏＡ合成酵素によって活性化され、アシル−ＣｏＡの形態においてｂ−酸化に入る結果として遊離脂肪酸を生じる、モノオキシゲナーゼ、アルコール脱水酵素およびアルデヒド脱水酵素の必然の作用による末端酸化段階を介して分解される。ベータ酸化において産生された（Ｓ）−３−ＯＨ−アシル−ＣｏＡは、異性化酵素の作用によって（Ｒ）−３−ＯＨ−アシル−ＣｏＡに異性化される。ピルビン酸塩は、アセチル−ＣｏＡの形態において脂肪酸生合成に入る。脂肪酸生合成において産生されたアシル−ＡＣＰは、ｔｅｓＡおよびｔｅｓＢの作用によって遊離脂肪酸に転換される。脂肪酸生合成において産生された遊離脂肪酸は、アシルＣｏＡ合成酵素によって活性化されえｔ、ベータ酸化環に入れられる。ベータ酸化において産生された（Ｒ）−３−ＯＨ−アシル−ＣｏＡは、ｔｅｓＢ類似アシル−ＣｏＡチオエステル化酵素の作用を介する３−ヒドロキシアルカノ酸（３−ＨＡＡ）および／またはｐｈａＣ合成酵素の作用を介するポリヒドロキシアルカノエート酸（ＰＨＡ）のいずれかの生合成に使用される。ｔｅｓＢ類似アシル−ＣｏＡチオエステル化酵素における変異は、３−ＨＡＡの酸性を破壊し、結果として制御されないＰＨＡの産生を生じる。
【００８３】
言い換えると、本発明によれば、このようにして、３−ＨＡＡ−ＣＡＡから遊離３−ＨＡＡを放出するｔｅｓＢ類似遺伝子の破壊の変異は、制御されないＰＨＡ産生およびＰＨＡの排出を誘導するＰＨＡ前駆体３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡの貯蔵の増加に寄与するのであろう。
【００８４】
図９は、単一のオペロンを構成している２つの遺伝子、ｔｅｓＢ類似遺伝子および推定されるアセチル基転移酵素のオペロン構造を示している。
【００８５】
トランスポゾンの挿入部位の決定（実施例１を参照のこと）は、ＰＨＡの代謝／産生／合成を妨げることによってｔｅｓＢ類似遺伝子の機能を破壊し、この遺伝子を不活性化するタンパク質をコードする遺伝子の１つである、ｍｉｎｉ−Ｔｎ５がアシル−ＣｏＡチオエステル化酵素ｔｅｓＢ類似遺伝子（Ａｂｏ＿１０４４）に挿入されることを明らかにした。ｔｅｓＢ類似遺伝子の下流には、１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスフェートアセチル基転移酵素である、推定されるアセチル基転移酵素の遺伝子（Ａｂｏ＿１０４５）が続いている。推定されるアセチル基転移酵素遺伝子のオープンリーディングフレームは、前にあるｔｅｓＢ類似遺伝子の最後のコドンと３塩基対の重複がある６４５塩基対を含み、２３．７ｋＤａの推定分子量を有する２１４アミノ酸のタンパク質をコードすると予想されている。ｔｅｓＢ類似遺伝子および推定されるアセチル基転移酵素遺伝子は、図９に示されるように、１つのオペロンに配置されている。
【００８６】
本明細書において説明するような、ＰＨＡの排出および過剰生産の表現系がＰＨＡの代謝／産生／合成を妨げるタンパク質をコードしている遺伝子、特にｔｅｓＢ類似遺伝子における修飾（変異）の結果であるかを評価するために、および下流遺伝子上にあるトランスポゾン変異の極性効果の可能性を評価するために、下流遺伝子の部位直接的な変異体が構築されて、その表現型が、Ｃ９変異体と比較された（実施例３を参照のこと）。破壊変異体の構築のために、この遺伝子の野生型の複製が、増幅され、Ａ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓにおいて複製されないベクターにクローン化された。ストレプトマイシン（Ｓｔｒ）耐性カセットが、この遺伝子独自の部位の内部に挿入され、結果として生じた構築物がこの遺伝子の野生型の複製を置き換えて用いられた。この結果は、培養液の光学顕微鏡法および化学分析によって確かめられた（データは示さず）。これらの結果は、ｍｉｎｉ−Ｔｎ５の挿入が推定されるアセチル基転移酵素遺伝子に対する極性効果を有しているということを意味している、破壊変異体が、培養液にＰＨＡを堆積、例えば、排出されたことを示した。従って、ＰＨＡ産生に対するｔｅｓＢ類似物の積極的な周知の寄与を考慮すると、ＰＨＡ排出および過剰生産という表現型はまた、ｔｅｓＢ類似物の不活性化に加えて、下流の推定されるアセチル基転移酵素遺伝子に対するＴｎ−５挿入の極性効果によって生じうる。
【００８７】
図１０は、Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ  ＳＫ２（Ａｂｏ＿１０４４）のｔｅｓＢ類似遺伝子の相同的な遺伝子によってコードされる、近縁のグラム陰性菌が有する種々のアシル−ＣｏＡチオエステル化酵素タンパク質を示す、表４を示している。これらのデータは、推定されるアシル−ＣｏＡチオエステル化酵素タンパク質の対応する相同性検索（ＢＬＡＳＴ検索）の結果である。図４から明らかなように、ｔｅｓＢ類似タンパク質は、それぞれ、推定されるアシル−ＣｏＡチオエステル化酵素ＩＩ、仮定されるタンパク質またはｔｅｓＢ類似チオエステル化酵素と名付けられたものを指定した。これらの検索の細菌は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡ０１、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ  Ｂ７２８ａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＰｆＯ−１、Ｉｄｉｏｍａｒｉｎａ  ｌｏｉｈｉｅｎｓｉｓ  Ｌ２ＴＲ、Acinetobacter  ｓｐ．  ＡＤＰ１およびＣａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ  ＣＢ１５という種であった。しかし、“ｔｅｓＢ類似物”“ｔｅｓＢ類似遺伝子”および／または“ｔｅｓＢ類似タンパク質”という用語、ならびにこれらの記述が、上述のこれらの異なる指定物のすべてに関することが意図されていることは、理解される。表４に示されたタンパク質は、Ａ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ  ＳＫ２（Ａｂｏ＿１０４４）のｔｅｓＢ類似遺伝子と高い相同性を示している。
【００８８】
図１１は、単一のオペロンを形成している２つの遺伝子、ｔｅｓＢ類似遺伝子（Ａｂｏ＿１０４４）（下線部）および推定されるアセチル基転移酵素遺伝子（Ａｂｏ＿１０４５）の核酸配列を示している。第１行目は、ｔｅｓＢ類似遺伝子から上流の領域である。ｔｅｓＢ類似遺伝子の開始コドンは、ａｔｇであり、かつ太字で印が付けられている。Ｔｎ５挿入は、ｔｅｓＢ類似遺伝子内の５２７番目の位置に生じており、“／／”を用いて印をつけた。ｔｅｓＢ類似遺伝子からの下流は、推定されるアセチル基転移酵素遺伝子である。ｔｅｓＢ類似遺伝子（Ａｂｏ＿１０４４）の終端および推定されるアセチル基転移酵素（Ａｂｏ＿１０４５）の開始部位に３塩基対の重複がある。
【００８９】
図１２は、Ａ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓのｔｅｓＢ類似物の核酸配列を示している。Ｔｎ５挿入は、Ｔｎ５挿入は、５５７番目の位置に生じている。開始コドンおよび終止コドンは、太字で印が付けられている。
【００９０】
図１３は、Ａ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓのｔｅｓＢ類似物のアミノ酸配列を示している。
【００９１】
図１４は、ｍｉｎｉＴｎ５  Ｋｍエレメントの核酸配列を示している。
【００９２】
図１５は、ネオマイシン耐性およびカナマイシン耐性を担う、ネオマイシンリン酸基転移酵素のアミノ酸配列を示している。
【００９３】
図１６は、Ａ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓの推定されるアセチル基転移酵素の核酸配列を示している。開始コドンおよび終止コドンは、太字で印が付けられている。
【００９４】
図１７は、Ａ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓの推定されるアセチル基転移酵素のアミノ酸配列を示している。
【００９５】
図１８は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０の推定されるアシルＣｏＡチオエステル化酵素ＩＩの核酸配列を示している。
【００９６】
図１９は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡ０１の仮定のタンパク質  ＰＡ２８７１の核酸配列を示している。
【００９７】
図２０は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ  Ｂ７２８ａの推定される、アシルＣｏＡチオエステル化酵素ＩＩの核酸配列を示している。
【００９８】
図２１は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＰｆＯ−１のアシルＣｏＡチオエステル化酵素の核酸配列を示している。
【００９９】
図２２は、Ｉｄｉｏｍａｒｉｎａ  ｌｏｉｈｉｅｎｓｉｓ  Ｌ２ＴＲのｔｅｓＢ類似アシルＣｏＡチオエステル化酵素の核酸配列を示している。
【０１００】
図２３は、Acinetobacter  ｓｐ．  ＡＤＰ１の推定されるアシルＣｏＡチオエステル化酵素ＩＩの核酸配列を示している。
【０１０１】
図２４は、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ  ＣＢ１５の仮定されるタンパク質ＣＣ２４７２の核酸配列を示している。
【０１０２】
図２５は、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＨＴＣＣ２５９４の仮定されるタンパク質ＥＬＩ０９９２の核酸配列を示している。
【０１０３】
図２６は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０の推定されるアシルＣｏＡチオエステル化酵素ＩＩのアミノ酸配列を示している。
【０１０４】
図２７は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡ０１の仮定されるタンパク質  ＰＡ２８７１のアミノ酸配列を示している。
【０１０５】
図２８は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ  Ｂ７２８ａの推定される、アシルＣｏＡチオエステル化酵素ＩＩのアミノ酸配列を示している。
【０１０６】
図２９は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＰｆＯ−１のアシルＣｏＡチオエステル化酵素のアミノ酸配列を示している。
【０１０７】
図３０は、Ｉｄｉｏｍａｒｉｎａ  ｌｏｉｈｉｅｎｓｉｓ  Ｌ２ＴＲのｔｅｓＢ類似アシルＣｏＡチオエステル化酵素の核酸配列を示している。
【０１０８】
図３１は、Acinetobacter  ｓｐ．  ＡＤＰ１の推定されるアシルＣｏＡチオエステル化酵素ＩＩのアミノ酸配列を示している。
【０１０９】
図３２は、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ  ＣＢ１５の仮定されるタンパク質ＣＣ２４７２のアミノ酸配列を示している。
【０１１０】
図３３は、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＨＴＣＣ２５９４の仮定されるタンパク質ＥＬＩ０９９２のアミノ酸配列を示している。
【０１１１】
〔実施例〕
（材料：細菌株、培地および培養条件）
Ａ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ  ＳＫ２は、すべての実験において野生型として使用された。上記細菌は、ＫＮＯ３の代わりに窒素源として０．２７ｇ／ｌのＮＨ４Ｃｌが使用された、改変されたＯＮＲ７ａ培地（Ｙａｋｉｍｏｖ  ｅｔ  ａｌ  １９９８）において３０℃で培養された。ピルビン酸塩（２％）またはオクタデカン（１．５％）は、炭素ｐ源およびエネルギー源として使用された。
【０１１２】
Ｅ．ｃｏｌｉは、必要に応じて、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（１２．５μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、ナリジキシン酸（１０μｇ／ｍｌ）を補ったＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地において３７℃で培養された。プラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｓ１７−１を用いた接合によってＡ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓに導入された。
【０１１３】
（実施例１：ｍｉｎｉ−Ｔｎ５  突然変異生成）
トランスポゾン変異生成は、ｄｅ  Ｌｏｒｅｚｏ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）によって開発されたｍｉｎｉＴｎ５  Ｓｔｒ／Ｓｐエレメント（およびｍｉｎｉＴｎ５  Ｋｍエレメント）に準拠した。Ａ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ  ＳＫ２は、増殖の定常期までＯＮＲ７ａ培地において３０℃で培養され、細胞は遠心分離された。Ｅ．ｃｏｌｉの供与体およびヘルパー菌株は、ストレプトマイシンまたはクロラムフェニコールのいずれかを有するＬＢ培地のそれぞれにおいて３７℃で培養され、新しいＬＢ培地を用いて洗浄された後に遠心分離された。Ａ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓならびにＥ．ｃｏｌｉの供与体およびヘルパーのペレットは、４：１：１の割合において混合され、ＬＢアガロースおよび塩（０．４５ｇ／ｌのＮａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、２．５ｇ／ｌのＮａＮＯ３、１１．５ｇ／ｌのＮａＣｌ、０．３８ｇ／ｌのＫＣｌ、および０．７ｇ／ｌのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）、ならびに炭素源およびエネルギー源として２％のピルビン酸塩を用いたプレート上の薄膜フィルタ上に置かれた。プレートは、３０℃において２４時間、インキュベートされた。細胞は、１０ｍＭのＭｇＳＯ４を用いて洗浄され、転移接合体がナリジキシン酸およびストレプトマイシンを有するＯＮＲ７ａにおいて選択された。
【０１１４】
上記株のｍｉｎｉＴｎ５挿入部位は、上述のような反転ＰＣＲ（Ｏｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ  １９８８）によって決定された。まもなく、変異体のＤＮＡのすべてが、単離され、ｍｉｎｉ−Ｔｎ５エレメントを切断しないＣｌａＩを用いて消化された。結果として得られたＤＮＡ断片が環状にされ、かつ挿入されたｍｉｎｉ−Ｔｎ５隣接領域が２つのプライマー、ＯＴＲ末端（ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＡＣＴ  ＴＧＴ  ＧＴＡ  ＴＡＡ  ＧＡＧ  ＴＣＡ  Ｇ）および１ＴＲ末端（ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＧＡＴ  ＣＡＡ  ＧＡＧ  ＡＣＡ  Ｇ）を用いて増幅された。ＰＣＲは、９４℃において１．５分間、４８℃において１分間、および７０℃において４分間を３０サイクルの条件において行った。ＰＣＲ産物は、ゲル純化され、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７７  シークエンサ（ＡＰ  バイオシステム）において、Ｂｉｇ  Ｄｙｅターミネータを用いて自動ＤＮＡシークエンスに使用された。ｔｅｓＢ類似物の変異に関するトランスポゾン変異の正確な部位を決定するために、破壊された遺伝子の隣接領域を読むプライマー、１０８６Ｆ（ＴＴＡ  ＣＴＧ  ＧＣＴ  ＴＣＧ  ＣＡＧ  ＧＡＡ  ＴＧＧ）およびＩｎｔＳＭ１６０（ＣＴＴ  ＧＧＣ  ＡＣＣ  ＣＡＧ  ＣＡＴ  ＧＣＧ  ＣＧＡ  ＧＣＡ  ＧＧ９）を設計した。
【０１１５】
（実施例２：生物膜形成検定）
生物膜形成に欠陥を有するｍｉｎｉ−Ｔｎ５変異体を選別するために、Ｏ‘’ＴｏｏｌｅおよびＫｏｌｔｅｒ（１９９８）によって説明された検定が採用された。この検定は、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）プラスティックから成る９６穴のマイクロタイター用のディッシュに細胞が接着する能力を評価する。ＯＮＲ７ａ培地（１００μｌ／ウェル）が、レプリケータ装置を用いて接種された。接種後、プレート３０℃において４８時間インキュベートされ、それから、クリスタルバイオレット（ＣＶ）の１％溶液が、各ウェルに加えられた（この染料は、ＰＶＣを染めずに、細胞を染める）。そして、このプレートは、室温において約１５分間、インキュベートされ、水を用いて完全に、かつ繰り返してすすぎ洗いをして、生物膜の形成を評価した。
【０１１６】
生物膜形成は、ＣＶ染色したマイクロタイターディッシュのウェルのそれぞれに２μｌの９５％エタノールを２回加えて定量化された。ＣＶ染色された生物膜は、２００μの９５％エタノールにおいて可溶化され、そのうちの１２５ｍｌが新しいポリスチレンのマイクロタイターディッシュに移された。そして、吸光度が６００ｎｍにおいてプレートリーダを用いて決定された（シリーズ７００  マイクロプレートリーダ  ケンブリッジ  テクノロジー）。
【０１１７】
（実施例３：推定されるアセチル基転移酵素遺伝子の部位直接的な突然変異生成）
Ｃ９株において観察された表現型が、ｔｅｓＢ類似物の不活性化または下流遺伝子におけるｍｉｎｉ−トランスポゾン変異の極性効果の結果であるのか否かを分析するために、標的にされる推定されるアセチル基転移酵素の変異体が構築された。下流にあるアセチル基転移酵素遺伝子の７６９塩基対の断片は、プライマー１０８７Ｆ（ＣＡＧＴＧＡＴＧＧＣＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＧ）およびプライマー１０８７Ｒ（ＣＴＴＴＧＡＴＣＡＧＴＣＣＧＧＣＡＡＡＡＣ）を用いて、Ａ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ  ＳＫ２  ＤＮＡから増幅され、抵抗選択用のアンピシリン耐性遺伝子を含むｐＣＲ  ２．１  ＴＯＰＯ  Ｃｌｏｎｉｎｇベクター（インビトロジェン）にクローン化された。ストレプトマイシン耐性カセットが、Ｔｎ５  Ｓｔｒ／Ｓｐプラスミド（ｄｅ  Ｌｏｒｅｎｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）が切り出されて、アセチル基転移酵素遺伝子の独自の部位に挿入された。それから、非機能的な推定されるアセチル基転移酵素遺伝子は、接合を介した相同性組換えによって、Ａ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ  ＳＫ２ゲノムに再導入された。それから、ＤＮＡ  ＳｔｒＲを有するベクターの消失を確認するために、コロニーは、ストレプトマイシン、ナリジキシン酸を含むＯＮＰ７Ａアガロース上に蒔かれ、かつ平行してＴｏｐｏＣｌｏｎｉｎｇベクターに含まれるＡｍｐＲマーカー消失したものを同定するために、アンピシリンを含むＯＮＴ７Ａアガロースに蒔かれた。破壊変異体の増殖特性およびＰＨＡ蓄積が測定され、ｍｉｎｉ−Ｔｎ５変異体と野生型との間において比較された。
【０１１８】
（実施例４：ＰＨＡの化学分析）
野生型のＡ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ  ＳＫ２およびその変異体株によって培養液中に放出されたＰＨＡを分析するために、２つの上記最近は、炭素源として２％のピルビン酸塩または１．５％のオクタデカン（蓄積条件）を含むＯＮＲ７ａにおいて培養された。２つの上記細菌は、増殖の定常期の後期まで３０℃において回転振とう機（１００ｒｐｍ）において培養された。２つの上記細菌は、遠心分離（６０分間、１２０００ｒｐｍ）によって回収され、上清およびペレットが別々に回収された後、凍結乾燥されて次のＰＨＡの化学分析に使用された。
【０１１９】
（実施例５：ＰＨＡの定量化）
細胞および上清の分取物は、氷冷した水を用いて洗浄され、引圧条件下において８０℃で一晩中乾燥された。ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）は、次亜塩素酸ナトリウムと次のアセトン／ジエチルエーテルを用いた溶媒抽出（Ｓｏｌａｍａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ９９９）によって、細胞から純化された。
【０１２０】
（実施例６：気相クロマトグラフィー／質量分析）
ＰＨＡの組成を決定するために、約２ｍｇのＰＨＡを、１：０．８５：０．１５ｍｌの比においてクロロフォルム、メタノールおよび硫酸を含む混合物が入った小フラスコに入れて、低温制御槽の中において１００℃で２時間、反応させた。この方法は、メタノリシスによって、ＰＨＡを成分のβ−ヒドロキシカルボキシ酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）に分解する。この反応の後に、０．５ｍｌの蒸留水が加えられ、そのチューブが１時間、振とうされた。相分離の後に、有機物層が取り除かれてバイアルに移され、分析に用いられた。ＦＡＭＥは、３０ｍ×０．２５ｍｍ  ＨＰ−５（５％のジフェニルポリシロキサンおよび９５％のジメチルポリシロキサン）ヒューズ付きのシリカキャピラリーカラム、１ｍｌ／分の流量率、８℃／分の割合において２３０までの試料入力温度、２５０℃の界面温度、１７５℃のイオン流出温度、７０ｅＶの電子衝撃モード、および０．５秒／走査において４５から４５０ａｍｕの走査が備えられた、気相ガスクロマトグラフ質量分析計（ＧＣ／ＭＳ、モデルＶａｒｉａｎ  ３４００ＣＸ、Ｖａｒｉａｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｕｇａｒ  Ｌａｎｄ、ＴＸ、およびＶＧ  Ａｕｔｏｓｐｅｃ  分析計）を用いて分析された。微量のタンパク質、炭化水素および脂質が、これらにおいて記録されなかった。表１におけるデータを参照すればよい。
【０１２１】
（実施例７：ゲル透過クロマトグラフィー）
実施例６の試料は、Ｓｐｅｃｔｒａ−ＰｈｙｓｉｃｓポンプおよびＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈカラム（バイオラッド、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）を用いて、以下の条件：５０℃のカラム温度；定組成の勾配；移動相として５ｍＭの硫酸；０．５ｍｌ／分の流量率；および検出器として光散乱、の下においてＨＰＬＣシステムにおいて分析された。表２のデータを参照すればよい。
【０１２２】
（実施例８：電子顕微鏡法）
細胞は、１．５％のオクタデカンおよびＮＨ４Ｃｌ（蓄積条件）を含むＯＮＲ７ａにおいて培養され、増殖の定常期に回収された。走査型電子顕微鏡法用の細胞は、オクタデカンがパーマノクス細胞培養スライドガラス（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ）上に埋め込まれているという点を除いて、同じ条件において培養された。Ｇｏｌｙｓｈｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）に従って、細胞は陰付けがなされ、包埋および超薄切片は、Ｙａｋｉｍｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）に記載されたように行われ、走査型電子顕微鏡法はＬｕｎｓｄｏｒｆ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）に記載されているように実施された。
【０１２３】
〔参考文献〕
Abe et al., 1994. Int. J. Biol. Macromol, 16: 115-19;
Amos & McInerey, 1991, Arch. Microbiol. 155: 103-06
Bagdasarian, M., R. Lurz, B. Ruckert, F. C. H. Franklin, M. M. Bagdasarian,J. Frey, and K. N. Timmis. 1981. Gene 16:237-247
Brandl et al., 1989, Int. J. Biol. Macromol. 11: 49-55
Cho, H., and J. E. Cronan, Jr. 1995. J. Biol. Chem. 270:4216-4219
Choi J., Lee., S.Y. 1997. Bioprocess Eng. 17: 335-342
Cooper, C.L., Jackowski, S., and Rock C.O. 1987. J.Bacteriology, Feb., p. 605-611
Cronan, J. E., Jr. 1968. J. Bacteriol. 95:2054-2061
de Lorenzo V, Herrero M, Jakubzik U, Timmis KN. 1990. J Bacteriology Nov; 172(11):6568-72
deSmet et al., 1983. J. Bacteriol. 154: 870-78
Harayama, S., Kishira, H., Kasai, Y., and Shutsubo, K. 1999. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 1°: 63-70
Hocking, P. J. & Marchessault, R. H. 1994. Biopolyesters. Regulation of phasin and granule formation Chemistry and Technology of Biodegradable Polymers, pp. 48-96. Edited by G. J. L. Griffin. London: Chapman & Hall
Holmes, P.A., Lim, G.B. 1990. Separation process. US patent 4,910,145
Hrabak, O. 1992. FEMS Microbiol. Rev. 103:251-256
Huijberts, G. N. M., T. C. de Rijk, P. de Waard, and G. Eggink. 1995. J. Bacteriol. 176: 1661-1666
Huijberts, G. N. M., G. Eggink, P. de Waard, G. W. Huisman, and B. Witholt. 1992. Appl. Environ. Microbiol. 58:536-544
Golyshina, O.V., Pivovarova, T.A., Karavaiko, G-I., Kondrat’eva, T.F., Moore, E.R.B., Abraham, W.-R., Lunsdorf, H., Timmis, K.N., Yakimov, M.M., Golyshin, P.N. 2000. Int. J. System. Evol. Microbiol. 50: 997-1006
Kasai, Y., Kishira, H., Syutsubo, K., and Harayama, S. 2001. Environ. Microbiol. 3: 246-255
Kasai, Y., Kishira, H., Sasaki, T., Syutsubo, K., Watanabe, K., and Harayama, S. 2002. Environ. Microbiol.4:141-147
Kato et al., 1996, Appl. Microbiol. Biotechnol. 45: 363-70
Klinke, S., Q. Ren, B. Witholt, and B. Kessler. 1999. Appl. Environ. Microbiol. 65:540-548
Lai, JS., W.M.Philbrick, and H.C.Wu. 1980. J.Biol.Chem. 255:5384-5387
Lai, J.S., and H.C. Wu. 1980. J.Bacteriology 144:451-453
Lee et al., 1995, Appl. Microbiol. Biotechnol. 42: 901-09
Lee, S.Y. 1996. Biotechnol. Bioeng. 49: 1-14
Lunsdorf, H., Strompl, C., Osborn, A.M., Moore, E.R.B., Abraham, W.-R., Timmis, K.N. 2001. Methods Enzymol., 336: 317-331
Madison, L.L., and Huisman, G.W. 1999. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63:21-53
Ochman H., Gerber AS, Hartl DL. 1988. Genetics. Nov, 120 (3):621-3
Poirrier, Y., Ventre, G., Caldelari, D. 1999. Plant Physiology, December, Vol. 121, pp. 1359-1366
O’Toole, R. Kolter. 1999. Molecular Microbiology. Volume 28, Issue 3, page 449-461
Rock, C.O., Goelz, S.E., and Cronan, J.E., Jr. 1981. J. Biol. Chem. 256, 736-742
Rock, C.O., and S.Jackowski. 1982. J.Biol. Chem. 257: 10759-10765
Steinbuchel, A. ‘‘Polyhydroxyalkanoic acids’’, in: Biomaterials, D. Byrom, Ed., MacMillan Publishers, Basingstoke 1991, p. 123 ff
Steinbuchel and Wiese. 1992. Appl. Microbiol. Biotechnol. 37: 691 97
Steinbuchel and Valentin. 1995. FEMS Microbiol. Lett. 28: 219-28)
Syutsubo, K., Kishira, H., and Harayama, S. 2001. Environ. Microbiol. 3: 371-379
Valentin et al.. 1992. Appl. Microbiol. Biotechnol, 36: 507-14.
Valentin et al.. 1994. Appl. Microbiol. Biotechnol, 40: 710-16;
Valentin et al., 1996, Appl. Microbiol. Biotechnol. 46: 261-67
Wallen and Rohweder. 1974. Environ. Sci. Technol, 8: 576-79
Williams and Peoples. 1996. Chemtech26, 38-44
Yakimov MM, Golyshin PN, Lang S, Moore ER, Abraham WR, Lunsdorf H, Timmis KN. 1998.  Int. J. Syst. Bacteriol. Apr°; 48:339-48
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】炭素源としての２％ピルビン酸塩または１．５％のオクタデカンの条件にある、野生型のＡ．  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ  ＳＫ２（以下において、“ＳＫ２”または“ＳＫ２野生型”と記載する）および変異体のＡ．  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ  ＳＫ２（以下において、“Ｃ９変異体”と記載する）における、ＰＨＡ産生を示している。
【図２】Ａ．  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ  ＳＫ２株の電子顕微鏡画像を示している。
【図３】オクタデカンを用いて覆われたパーマノクス（Ｐｅｒｍａｎｏｘ）疎水性スライドガラス上において培養されたＳＫ２野生型細胞およびＣ９変異体細胞の走査型電子顕微鏡画像（図３Ａおよび図３Ｂ）ならびに電子顕微鏡画像（図３Ｃおよび図３Ｄ）を示している。
【図４】Ｃ９変異体およびＳＫ２野生型の増殖特性を比較する図を示している。
【図５】Ａ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓにおいてポリヒドロキシアルカノエートを産生および動態化する遺伝子の配列データのコンピュータ上における解析の結果を示す表１を示している。
【図６】ＰＨＡの解析およびその組成を表す表２を示している。
【図７】Ａ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ由来のＰＨＡの分子量を表す表３を示している。
【図８】炭化水素／ピルビン酸塩上において培養されたＡ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ  ＳＫ２におけるＰＨＡ生合成の仮説的な経路の模式図を示している（Ｋｌｉｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  グルコン酸塩上において培養されたＥ．  ｃｏｌｉに含まれているＰＨＡポリメラーゼおよびＰＨＡチオエステル化酵素ＩのＭＣＬ  ＰＨＡ生合成の仮説的な経路の修正版）。
【図９】単一のオペロンを構成している２つの遺伝子、ｔｅｓＢ類似遺伝子および推定されるアセチル基転移酵素のオペロン構造を示している。
【図１０】Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ  ＳＫ２（Ａｂｏ＿１０４４）のｔｅｓＢ類似遺伝子の相同的な遺伝子によってコードされる、近縁のグラム陰性菌が有する種々のアシル−ＣｏＡチオエステル化酵素タンパク質を示す、表４を示している。
【図１１】単一のオペロンを形成している２つの遺伝子、ｔｅｓＢ類似遺伝子（Ａｂｏ＿１０４４）（下線部）および推定されるアセチル基転移酵素遺伝子（Ａｂｏ＿１０４５）の核酸配列を示している。
【図１２】Ａ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓのｔｅｓＢ類似物の核酸配列を示している。
【図１３】Ａ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓのｔｅｓＢ類似物のアミノ酸配列を示している。
【図１４】ｍｉｎｉＴｎ５  Ｋｍエレメントの核酸配列を示している。
【図１５】ネオマイシン耐性およびカナマイシン耐性を担う、ネオマイシンリン酸基転移酵素のアミノ酸配列を示している。
【図１６】Ａ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓの推定されるアセチル基転移酵素の核酸配列を示している。
【図１７】Ａ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓの推定されるアセチル基転移酵素のアミノ酸配列を示している。
【図１８】Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０の推定されるアシルＣｏＡチオエステル化酵素ＩＩの核酸配列を示している。
【図１９】Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡ０１の仮定のタンパク質  ＰＡ２８７１の核酸配列を示している。
【図２０】Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ  Ｂ７２８ａの推定される、アシルＣｏＡチオエステル化酵素ＩＩの核酸配列を示している。
【図２１】Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＰｆＯ−１のアシルＣｏＡチオエステル化酵素の核酸配列を示している。
【図２２】Ｉｄｉｏｍａｒｉｎａ  ｌｏｉｈｉｅｎｓｉｓ  Ｌ２ＴＲのｔｅｓＢ類似アシルＣｏＡチオエステル化酵素の核酸配列を示している。
【図２３】Acinetobacter  ｓｐ．  ＡＤＰ１の推定されるアシルＣｏＡチオエステル化酵素ＩＩの核酸配列を示している。
【図２４】Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ  ＣＢ１５の仮定されるタンパク質ＣＣ２４７２の核酸配列を示している。
【図２５】Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＨＴＣＣ２５９４の仮定されるタンパク質ＥＬＩ０９９２の核酸配列を示している。
【図２６】Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０の推定されるアシルＣｏＡチオエステル化酵素ＩＩのアミノ酸配列を示している。
【図２７】Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡ０１の仮定されるタンパク質  ＰＡ２８７１のアミノ酸配列を示している。
【図２８】Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ  Ｂ７２８ａの推定される、アシルＣｏＡチオエステル化酵素ＩＩのアミノ酸配列を示している。
【図２９】Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＰｆＯ−１のアシルＣｏＡチオエステル化酵素のアミノ酸配列を示している。
【図３０】Ｉｄｉｏｍａｒｉｎａ  ｌｏｉｈｉｅｎｓｉｓ  Ｌ２ＴＲのｔｅｓＢ類似アシルＣｏＡチオエステル化酵素の核酸配列を示している。
【図３１】Acinetobacter  ｓｐ．  ＡＤＰ１の推定されるアシルＣｏＡチオエステル化酵素ＩＩのアミノ酸配列を示している。
【図３２】Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ  ＣＢ１５の仮定されるタンパク質ＣＣ２４７２のアミノ酸配列を示している。
【図３３】Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＨＴＣＣ２５９４の仮定されるタンパク質ＥＬＩ０９９２のアミノ酸配列を示している。
【図１】
2009504146.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
2009504146.tif 000023
【図２３】
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【図２４】
2009504146.tif 000025
【図２５】
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【図２６】
2009504146.tif 000027
【図２７】
2009504146.tif 000028
【図２８】
2009504146.tif 000029
【図２９】
2009504146.tif 000030
【図３０】
2009504146.tif 000031
【図３１】
2009504146.tif 000032
【図３２】
2009504146.tif 000033
【図３３】
2009504146.tif 000034
【配列表】
2009504146000001.app
【国際調査報告】
2009504146.tif 000035
2009504146.tif 000036
2009504146.tif 000037
2009504146.tif 000038
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2009504146.tif 000040
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