(57)【要約】  本発明は、Ｂｅｔｕｌａ  ｖｅｒｒｕｃｏｓａ植物花粉の主要アレルゲンＢｅｔ ｖ １の低アレルギー性変種およびアレルギー性疾患の予防的または治療的処置のためのそれらの使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂｅｔｕｌａ  ｖｅｒｒｕｃｏｓａ花粉（Ｂｅｔ  ｖ１）の主要アレルゲンの低アレルギー性変種であるタンパク質であって、
ａ）野生型Ｂｅｔ  ｖ１（配列番号１）と比較してＩｇＥに対して低い反応性を示し、
ｂ）ｉ）配列番号１との同一性が少なくとも８７％、好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９７％であり、
ｉｉ）配列番号１との配列アラインメントでは、配列番号１のアミノ酸５４、１１５および／または１２３に対応する位置のＬｙｓ残基の少なくとも１個の置換または欠失が存在するアミノ酸配列を有することを特徴とするタンパク質。
【請求項２】
前記Ｌｙｓ残基が中性または極性アミノ酸で置換されている、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記中性または極性アミノ酸が、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒから選択される、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記アミノ酸が、Ａｌａ、ＳｅｒまたはＴｈｒである、請求項３に記載のタンパク質。
【請求項５】
配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５からなる群から選択される、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項６】
１５個から３５個のアミノ酸を含有し、前記で定義したような少なくとも１個のＬｙｓ置換および／または欠失を有する、請求項１から５に記載のタンパク質の免疫学的に活性のあるペプチド断片。
【請求項７】
１５個から２０個のアミノ酸を含有する、請求項６に記載のペプチド。
【請求項８】
請求項１から５に記載のタンパク質または請求項６から７に記載のペプチドをコードする核酸分子。
【請求項９】
配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０からなる群から選択される、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項１０】
請求項８から９に記載の核酸分子を含有するベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載のベクターを含有する宿主細胞。
【請求項１２】
薬学的に許容される媒体および賦形剤と一緒に、請求項１から５に記載のタンパク質または請求項６から７に記載のペプチドの有効量を含む医薬組成物。
【請求項１３】
ワクチンの形態の請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
アレルギー性疾患の予防的または治療的処置のための医薬組成物を調製するための、請求項１から５に記載のタンパク質または請求項６から７に記載のペプチドの使用。
【請求項１５】
気管支喘息、鼻炎、結膜炎およびアトピー性皮膚炎を治療するための、請求項１４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂｅｔ ｖ １タンパク質の低アレルギー性配列変種、それらをコードする核酸分子、同変種を含有する医薬組成物ならびにＢｅｔｕｌａ  ｖｅｒｒｕｃｏｓａ種の植物の花粉によって引き起こされるアレルギー性疾患の予防および治療におけるそれらの使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギーは、ＩｇＥ型抗体を産生することによって、花粉、ダニ、上皮およびある種の食品に含有される無害なタンパク質と反応する、免疫系の不全によって引き起こされる。
【０００３】
近年のデータによって、西欧諸国の人口の１０％超がこの疾患に罹患しており、その症状は時間と共に悪化し、例えば、喘息またはその他のアレルゲンに対する感作を起こさせ、適切な治療の選択がより困難になることを示している。
【０００４】
薬理学的療法とは異なり、特異的減感作免疫療法は、これらの疾患のベースとなる免疫学的パラメータを好ましい状態に変化させることができるアレルギー性疾患の唯一の病理学的処置である。
【０００５】
減感作免疫療法は、疾患の原因となる同様の物質から得られる標準抽出物（ワクチン）を漸増用量投与することにある（１）。このようにして、前記物質に対するある種の免疫学的耐性が、その後のアレルギー症状の消失を伴って、患者に徐々に誘導される。
【０００６】
しかし、重篤な副作用（２）を惹起する危険性は、徐放ワクチンまたは注射の代替となる経路によって投与されるワクチンのいずれかを使用することによって著しく低下するが、実際には、アレルギー性疾患の治療に特異的減感作免疫療法を適用することに歯止めをかけた。
【０００７】
近年、最も注目を浴びているのは効果的で安全なワクチンの開発である。特に、変異誘発された組換えタンパク質からなるワクチン、すなわち、望ましくない副作用を引き起こさずに疾患の自然な進行に好ましい影響を及ぼすことができる低アレルギー性ワクチンの開発（３）が重要な目標となっている。
【０００８】
分類学上Ｆａｇａｌｅ（カバノキ、ハンノキ、ハシバミ、オーク、シデ）として知られる植物の花粉は、温帯地方におけるアレルギー性鼻炎および喘息の最も重要な原因の１つである。カバノキ花粉の主要な２種類のアレルゲン、Ｂｅｔ ｖ １（遺伝子バンクに受入番号Ｘ１５８７７として寄託されたｃＤＮＡ）およびＢｅｔ ｖ ２（受入番号Ｍ６５１７９）は、それぞれ、分子量１７ｋＤおよび１４ｋＤのタンパク質である（４、５）。カバノキ花粉に対してアレルギーのある患者の９５％近くが、Ｂｅｔ ｖ １に対するＩｇＥ抗体を産生し、これらの患者の６０％がＢｅｔ ｖ １のみに反応性を示す（６）。
【０００９】
Ｂｅｔ ｖ １は、８４．４％と９９．４％との間を含む配列同一性を示す１０個を上回るアイソフォームとして天然に存在する（７）。このアレルゲンは、「病原性関連タンパク質」、すなわち、環境的または病理学的ストレスに応じて植物によって産生される遍在性タンパク質のファミリーに属し、その機能はステロイド輸送と関連していると考えられる（８、９）。Ｆａｇａｌｅ目のその他の植物の花粉の１群のアレルゲンとの配列相同性が高いことによって、Ｂｅｔ ｖ １に特異的なＩｇＥを有する患者がなぜ同じ分類学的目に属する異なる植物の受粉時期にアレルギー性症状を示すのかが説明される（１０）。カバノキ花粉に対するアレルギーは、新鮮な果物（例えば、サクランボ、リンゴ、ナシ）または植物（例えば、セロリおよびニンジン）の摂取によって引き起こされる有害反応を伴うことが多い。その理由は、このような食品は、Ｂｅｔ ｖ １に対する高い配列相同性および構造相同性を特徴とするタンパク質を含有しており、それがカバノキの主要なアレルゲンによって生じた特異的ＩｇＥによって認識されるからである（１１）。Ｂｅｔ ｖ １アレルゲンによる免疫療法は、カバノキ花粉アレルギーならびにＦａｇａｌｅ目のその他の植物に対する花粉症およびＢｅｔ ｖ １と交差反応するアレルゲンを含有する食品に対するアレルギーの治療に有効であり得る（１２）。
【００１０】
減感作免疫療法の有益な効果に関連する要素は、感作アレルゲンに特異的なＩｇＧ抗体の誘導である。このような（保護）抗体は、ＩｇＥが抗原、具体的にＢｅｔ ｖ １に結合するのを阻害することができ、この分子の３次元構造を変化させる（１３、１４）。アレルゲン性が少なく、免疫原特性に変わりがない組換えタンパク質からなるワクチンの開発は、アレルギー性疾患の治療を改善するだろう。
【発明の開示】
【００１１】
発明の説明
Ｂｅｔ ｖ １アレルゲンのタンパク質配列内の１個または複数のアミノ酸残基を置換または削除することによって、このアレルゲンはＩｇＥ抗体に対する反応性が少なくなることが現在では発見されている。
【００１２】
第１の態様では、本発明は、Ｂｅｔ ｖ １アレルゲンの配列変種である低アレルギー性タンパク質であって、
１）野生型Ｂｅｔ ｖ １アレルゲン（配列番号１）と比較してＩｇＥに対して低い反応性を示し、
２）ａ）配列番号１に対する同一性が少なくとも８７％、好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９７％であり、
ｂ）配列番号１との配列アラインメントでは、配列番号１のＬｙｓ残基が存在するアミノ酸５４、１１５および／または１２３に対応する残基の少なくとも１個の置換または欠失が存在するアミノ酸配列を有することを特徴とするタンパク質を提供する。
【００１３】
本発明によれば、Ｂｅｔ ｖ １アレルゲンの変種は、指示した位置で１、２または３個のＬｙｓ置換および／または欠失を示し、それぞれ一、二または三置換および／または欠失変種と称される。欠失変種よりも置換変種が好ましく、特に指示した位置での少なくとも１個のＬｙｓ残基が中性または極性アミノ酸と置換しているものが好ましい。より好ましくは、前記中性または極性アミノ酸は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅから選択され、さらにより好ましくはＡｌａ、ＴｈｒおよびＳｅｒから選択される。
【００１４】
好ましい実施形態では、低アレルギー性タンパク質は、５４、１１５および１２３位のＬｙｓ残基に前記少なくとも１個の置換または欠失を有する配列番号１からなる。
【００１５】
本発明による１個または３個の置換を有する典型的な低アレルギー性タンパク質は、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５と識別される。
【００１６】
本発明によるＢｅｔ ｖ １置換および／または欠失変種は、野生型対応アレルゲンと比較して、Ｂｅｔｕｌａ  ｖｅｒｒｕｃｏｓａ花粉アレルギー患者の血清に対するＩｇＥ反応の少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも８０％の減少を示す。
【００１７】
アレルギー患者の血清プールのタンパク質、配列番号２〜５のＩｇＥ反応性を、ＥＬＩＳＡアッセイで試験した（図１）。このようなタンパク質は、カバノキ花粉に対するアレルギー患者の血清プールの様々な希釈物（１：２から１：８）とインキュベートしたとき、ｗｔ Ｂｅｔ ｖ １アレルゲン（配列番号１）と比較して、ＩｇＥ反応性の５６％（配列番号２）、３４％（配列番号３）、２８％（配列番号４）および８０％（配列番号５）の平均的減少が認められた。
【００１８】
これらの結果は、異なるタンパク質の相同なエピトープの反応性の評価を可能にするＥＬＩＳＡ阻害実験によって確かめられた。Ｂｅｔ ｖ １ ｗｔ（配列番号１）の血清プールのＩｇＥに対する結合は、血清を同タンパク質で予備処理すると１００％阻害されるが、血清を同量の三置換変種（配列番号５）で予備処理すると、認められる阻害は４０％だけである（図２）。これらの結果は、配列番号１の５４、１１５および１２３位のアミノ酸を置換することによって、ＩｇＥによるＢｅｔ ｖ １アレルゲンの認識が低下することを明らかに示している。
【００１９】
さらに、配列番号２〜５のタンパク質のＢｅｔｕｌａ  ｖｅｒｒｕｃｏｓａ花粉に陽性の血清プールのＩｇＥに対する反応性を、ウェスタンブロッティングによって測定した。この場合も、ｗｔ Ｂｅｔ ｖ １（配列番号１）と比較して、配列番号２では８８％、配列番号３では６７％、配列番号４では４７％および配列番号５では１００％のＩｇＥ反応性の低下が分析した血清で認められた（図３）。
【００２０】
さらに、Ｂａｌｂ／ｃマウスの免疫の実験では、Ｂｅｔ ｖ １ ｗｔアレルゲンおよび低アレルギー性タンパク質配列番号５の両方がＩｇＧ特異的免疫応答を誘導できることがわかった（図４）。特に、配列番号５に対する抗体は、ｗｔに対応する配列番号１を認識することができ（図５）、５４、１１５および／または１２３位のＬｙｓ残基の置換は、タンパク質免疫原性および特にそのＩｇＧエピトープの著しい変化を決定づけないことが示唆される。対照的に、関係のない抗原で免疫されたマウスの血清に存在する抗体は、ｗｔ Ｂｅｔ ｖ １または配列番号５のいずれも認識することができなかった。
【００２１】
他の態様では、本発明は、１５個から３５個のアミノ酸残基、より好ましくは１５個から２０個のアミノ酸残基を含有し、前述の置換および／または欠失の少なくとも１個を有する、Ｂｅｔ ｖ １断片に対応する免疫学的に活性のあるペプチドを提供する。本明細書で使用したように、「免疫学的に活性のあるペプチド」という表現は、ＩｇＥとは独立した免疫応答を惹起することができるペプチドを指している。
【００２２】
本発明による置換および／または欠失は、当業者に公知の方法および技術を使用して、Ｂｅｔ ｖ １ ｃＤＮＡ配列（配列番号６）を変異誘発することによって容易に調製することができる。
【００２３】
一および三置換変種の配列番号２〜５をコードするｃＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号７〜１０と識別される。
【００２４】
他の態様では、本発明は、本明細書で開示した低アレルギー性Ｂｅｔ ｖ １タンパク質をコードする核酸分子、またはそれらから得られるペプチド、および真核細胞または原核細胞において前記タンパク質またはペプチドの発現を制御する遺伝子要素、例えば、転写プロモーター、エンハンサー、シグナル配列およびリーダー配列またはその他の転写制御に関与する配列に機能的に結合した前記核酸分子を含有する発現ベクターを提供する。ベクターの例には、プラスミド、ウイルスおよびファージが含まれるが、遺伝子操作に通常利用されるその他のいかなるベクターも同様に使用することができる。
【００２５】
本発明はさらに、前述のベクターで形質転換または形質移入された原核または真核宿主細胞を含む。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉまたはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓなどの原核細胞またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの真核細胞は一般的に、ベクタークローニングおよびｃＤＮＡ発現に使用される。
【００２６】
さらに、本発明による低アレルギー性変種は、融合タンパク質として産生することができる。
【００２７】
ＩｇＥ反応性が低下したため、本発明によるＢｅｔ ｖ １変種は、Ｂｅｔｕｌａ  ｖｅｒｒｕｃｏｓａ花粉に対してアレルギーである個体の予防的または治療的処置のための医薬組成物（例えば、錠剤およびカプセル）の調製のために都合よく使用することができる。
【００２８】
したがって、他の態様では、本発明は、任意選択的にＢｅｔｕｌａ  ｖｅｒｒｕｃｏｓａのその他のアレルゲンおよび／または薬学的に許容される媒体および賦形剤と組み合わせて、本明細書で提供したような低アレルギー性Ｂｅｔ ｖ １変種の有効量を含有する医薬組成物を対象とする。本発明の好ましい実施形態では、医薬組成物は気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎およびアレルギー性結膜炎を含むアレルギー性疾患の予防または治療に使用されるワクチンの形態である。ワクチン接種の理論および実施は、当業者にとって公知である（１５、１６）。
【００２９】
以下の実施例はさらに本発明を例証する。特に指示しなければ、実施例で使用した方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＥＴ  Ｍａｎｉａｔｉｓ「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ」２版、Ｖｏｌ．１−２−３  ＣＳＨ  Ｌａｂ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９に記載されている。
実施例１
Ｂｅｔ ｖ １アレルゲンをコードするｃＤＮＡの部位特異的変異誘発
Ｂｅｔ ｖ １アレルゲンをコードするｃＤＮＡ（配列番号６）の部位特異的変異誘発は、原核生物ベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、遺伝子バンク受入番号Ｘ５２３２７）にｃＤＮＡをクローニングし、その後ＰＣＲ増幅することによって実施した。ＰＣＲ反応におけるプライマーとして使用したオリゴヌクレオチド（表）は、適切な塩基置換を有していた。各変異誘発には、ＤＮＡ鎖の対応する領域に結合する相補的オリゴヌクレオチドを使用した（１７）。増幅後、変化していない元の鋳型を、制限酵素ＤｐｎＩによって触媒される酵素消化で選択的に分解した。次に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞を変異誘発した分子で形質転換した。１個の細菌コロニーから得られたクローンをＳａｎｇｅｒによって配列決定して、正確な塩基変異およびｃＤＮＡにおける非特異的変異が存在しないことを確認した。
【００３０】
【表１】
2009521910.tif 000002
【００３１】
実施例２
Ｂｅｔ ｖ １タンパク質およびそれらの変種の産生
６個のヒスチジンをコードする配列が隣接した、野生型（配列番号６）および変異誘発した（配列番号７〜１０）Ｂｅｔ ｖ １ ｃＤＮＡを標準的方法にしたがってクローニングし、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉで発現させた（１８、１９）。細胞を遠心によって収集し、ＮａＨ2ＰＯ4５０ｍＭ、ＮａＣｌ３００ｍＭの緩衝液、ｐＨ８に再懸濁し、超音波処理によって溶解した。組換えタンパク質を遠心によって分離した。不溶性タンパク質凝集物を含有するペレットをＮａＨ2ＰＯ4１００ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ１０ｍＭ、尿素８Ｍ（ＰＨ８）（変性緩衝液）に再懸濁して、６０分間撹拌した。可溶化した組換えタンパク質は、遠心によって不溶性の残骸から分離し、アレルゲンと融合した６個のヒスチジン部分と相互作用するニッケルイオンをキレート化するニトリロ三酢酸に結合したアガロースカラムを使用して、変性条件下でアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。精製されたタンパク質は、ＮａＣｌ０．６８％、ＮａＨＣＯ3０．２７５％溶液中で４℃で１６時間透析することによって再び折りたたまれた。
実施例３
アレルギー性対象の血清の特性
Ｂｅｔｕｌａ  ｖｅｒｒｕｃｏｓａ花粉に対する季節性アレルギーの既往歴を有し、Ｂ．ｖｅｒｒｕｃｏｓａアレルゲンに対してＲＡＳＴ４＋特異的反応性を有する個体から血清を採取し、次いでそれらを収集した。非アレルギー性患者の血清プールは、陰性対照として使用した。
実施例４
血清プールのＩｇＥに反応性のＢｅｔ ｖ １変種のＥＬＩＳＡ分析
５０ｍＭ炭酸塩／重炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６中の同量のｗｔアレルゲンおよび変異誘発変種（０．５μｇ）を、４℃で１６時間インキュベートすることによって、ＥＬＩＳＡアッセイ用ポリスチレンプレートのウェルに吸着させた。このウェルを洗浄溶液（Ｔｗｅｅｎ−２０  ０．０５％を含有する６０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．５）で洗浄して、希釈溶液（ウマ血清２５％、ＥＤＴＡ１ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０５％、チオメサール０．０１％を溶かした１５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）でブロックした。ヒト血清ＲＡＳＴ４＋のプールの連続希釈（希釈緩衝液による）の一定量１００μｌを各試料に添加し、２５℃で２時間インキュベートした。３回洗浄した後、ペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＥ血清（希釈緩衝液で１：１５００）を添加し、その後２５℃で１．５時間インキュベートした。３回洗浄後、ＴＭＢ試薬（ＢｉｏＦＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｏｗｉｎｇｓ  Ｍｉｌｌｓ、ＭＤ）１００μｌを添加し、２５℃で１５分間インキュベートすることによって比色反応を発色させた。１Ｎ  ＨＣｌ、１００μｌを添加することによって反応を停止させ、マイクロプレートリーダー分光光度計を使用して４５０ｎｍで読み取った。
実施例５
ＥＬＩＳＡ−阻害アッセイ。血清プールのＩｇＥに結合するｗｔ Ｂｅｔ ｖ １のＢｅｔ ｖ １変種による阻害
５０ｍＭ炭酸塩／重炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６中のｗｔアレルゲン１μｇを、ＥＬＩＳＡアッセイ用ポリスチレンプレートのウェルに、４℃で１６時間インキュベートすることによって吸着させた。このウェルを洗浄溶液（Ｔｗｅｅｎ−２０  ０．０５％を含有する６０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．５）で洗浄して、希釈緩衝液（ウマ血清２５％、ＥＤＴＡ１ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０５％、チオメサール０．０１％を溶かした１５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）でブロックした。希釈緩衝液で１：３に希釈したＲＡＳＴ４＋ヒト血清プールの一定量１００μｌをｗｔアレルゲンおよび変異誘発した変種の連続希釈と２５℃で２時間予めインキュベートした。得られた溶液をウェルに入れ、４℃で１６時間インキュベートした。０．０６Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．５、Ｔｗｅｅｎ−２０  ０．０５％で３回洗浄した後、ペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＥ血清を１：１５００希釈（希釈緩衝液）で添加し、その後２５℃で１．５時間インキュベートした。３回洗浄後、ＴＭＢ試薬（ＢｉｏＦＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｏｗｉｎｇｓ  Ｍｉｌｌｓ、ＭＤ）１００μｌを添加し、２５℃で１５分間インキュベートすることによって比色反応を発色させた。１Ｎ  ＨＣｌ１００μｌを添加することによって反応を停止させ、その後分光光度計で４５０ｎｍで読み取った。
【００３２】
阻害割合は、以下のように、１００×［（Ａ−Ｂ）／Ａ］で計算し、式中、Ａは阻害剤の非存在下での４５０ｎｍの吸光度であり、Ｂは阻害剤存在下での吸光度である。
実施例６
血清プールのＩｇＥに対するＢｅｔ ｖ １変種の反応性のウェスタンブロット分析
野生型アレルゲンおよび変異誘発型の同量（１．５μｇ）をポリアクリルアミドゲルで電気泳動的に分析し、その後、Ｔｏｗｂｉｎ（２０）によって記載されたように、ニトロセルロース膜にエレクトロブロッティングした。
【００３３】
この膜をまず、脱脂粉乳５％を含有するＴＢＳＴ（ＴＢＳ、Ｔｗｅｅｎ−２０  ０．０５％）（飽和緩衝液）で１時間インキュベートして、次に、ＴＢＳＴ２％脱脂粉乳で１：３に希釈した、４＋の反応性を示すＢｅｔｕｌａ  ｖｅｒｒｕｃｏｓａに対してアレルギー性の対象の血清プールで一晩インキュベートした。１時間後、この膜をＴＢＳＴで３回洗浄した。膜に結合した抗体は、ペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＥ血清と接触させて、数回洗浄後、ペルオキシダーゼ基質であるルミノールを使用して化学ルミネセンス検出系（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）で検出した。
実施例７
Ｂａｌｂ／ｃマウスの免疫方法
雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）５匹からなる２つの群を、完全フロインドアジュバント１００μｌおよび生理食塩水１００μｌ中の抗原（配列番号１および配列番号５）２０μｇを含有するエマルジョン２００μｌで皮下免疫した。完全アジュバントを不完全アジュバントに代えて、さらに３回追加免疫を１週間間隔で実施した。対照として、マウス５匹に関係のない抗原を投与した。最終免疫の７日後に、血液試料を尾から採取し、各免疫原に対する抗体応答を制御するためにＥＬＩＳＡで使用した。配列番号５で免疫したマウスでは、野生型タンパク質を認識する能力も分析した。
実施例８
免疫したマウスにおけるＩｇＧ特異的応答のＥＬＩＳＡ分析
５０ｍＭ炭酸塩／重炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６に溶かしたｗｔ Ｂｅｔ ｖ １および配列番号５変種の同量（０．２５μｇ）を、ＥＬＩＳＡアッセイ用ポリスチレンプレートのウェルに、４℃で１６時間インキュベートすることによって吸着させた。このウェルを洗浄溶液（Ｔｗｅｅｎ−２０  ０．０５％を含有する６０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．５）で洗浄して、希釈溶液（ウマ血清２５％、ＥＤＴＡ１ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０５％、チオメサール０．０１％を溶かした１５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）でブロックした。各マウスの血清の連続希釈（希釈緩衝液による）の一定量１００μｌをウェルに入れ、２５℃で２時間インキュベートした。
【００３４】
３回洗浄した後、ペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ血清を希釈緩衝液で１：２０００に希釈し、ウェルに添加し、その後２５℃で１．５時間インキュベートした。３回洗浄後、ＴＭＢ試薬（ＢｉｏＦＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｏｗｉｎｇｓ  Ｍｉｌｌｓ、ＭＤ）１００μｌを添加し、２５℃で１５分間インキュベートすることによって比色反応を発色させた。１Ｎ  ＨＣｌ１００μｌで反応を停止させ、その後分光光度計で４５０ｎｍで読み取った。図４および５は、各群のマウス５匹の血清を分析することによって得られた平均の反応性を示している。
【００３５】
参考文献
【表２】
2009521910.tif 000003
【００３６】
【表３】
2009521910.tif 000004
【００３７】
【表４】
2009521910.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、Ｂｅｔ ｖ １アレルゲンおよびＢｅｔ ｖ １低アレルギー性変種に対するＩｇＥ反応性のＥＬＩＳＡ分析を示した図である。
【図２】図２は、Ｂｅｔ ｖ １アレルゲンに対するＩｇＥ結合の阻害を示した図である。
【図３】図３は、Ｂｅｔ ｖ １アレルゲンおよびそれらの変種に対するＩｇＥ反応性のウェスタンブロッティング分析を示した図である。
【図４】図４は、各免疫原タンパク質に対するマウスＩｇＧ応答を示した図である。
【図５】図５は、配列番号５で免疫したマウスにおけるＩｇＧ応答を示した図である。
【図１】
2009521910.tif 000006
【図２】
2009521910.tif 000007
【図３】
2009521910.tif 000008
【図４】
2009521910.tif 000009
【図５】
2009521910.tif 000010
【配列表】
2009521910000001.app
【国際調査報告】
2009521910.tif 000011
2009521910.tif 000012
2009521910.tif 000013
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