(57)【要約】  本発明によれば、ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ミッドカイン、プレイオトロフィン及びチモシンβ１０から選ばれた少なくとも一種を効果的要素として含有する瘢痕形成促進剤を投与して、繊維化を伴うことなく且つ弾性を維持しつつ瘢痕形成を促進することによって心機能を改善する、虚血性心疾患の治療方法が提供される。前記瘢痕形成促進剤は、好ましくは、薬剤担体（ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｈｉｃｌｅｓ）に挿入された、ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ミッドカイン、プレイオトロフィン及びチモシンβ１０から選ばれた少なくとも一種を含有する。
2009514787.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ミッドカイン、プレイオトロフィン及びチモシンβ１０から選ばれた少なくとも一種を効果的要素として含有する瘢痕形成促進剤を投与して、瘢痕形成を促進することにより損傷した心筋組織を修復する、虚血性心疾患の治療方法。
【請求項２】
前記瘢痕形成促進剤が、薬剤担体（ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｈｉｃｌｅｓ）に挿入された、ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ミッドカイン、プレイオトロフィン及びチモシンβ１０から選ばれた少なくとも一種を含有する請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記瘢痕形成促進剤が、シートに支持され及び／又は固定された薬剤担体に挿入された、ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ミッドカイン、プレイオトロフィン及びチモシンβ１０から選ばれた少なくとも一種を含有する請求項２記載の方法。
【請求項４】
瘢痕形成を促進することによって損傷した心筋組織を修復する、虚血性心筋障害の治療用薬物を調製するための、ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ミッドカイン、プレイオトロフィン及びチモシンβ１０から選ばれた少なくとも一種の使用。
【請求項５】
前記薬物が、薬剤担体に挿入された、ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ミッドカイン、プレイオトロフィン及びチモシンβ１０から選ばれた少なくとも一種を含有する請求項４記載の使用。
【請求項６】
前記薬物が、シートに支持され及び／又は固定された薬剤担体に挿入された、ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ミッドカイン、プレイオトロフィン及びチモシンβ１０から選ばれた少なくとも一種を含有する請求項５記載の使用。
【請求項７】
ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ミッドカイン、プレイオトロフィン及びチモシンβ１０から選ばれた少なくとも一種を、損傷した心筋組織を修復するために使用する効果的要素として含有する瘢痕形成促進剤。
【請求項８】
ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ミッドカイン、プレイオトロフィン及びチモシンβ１０から選ばれた少なくとも一種を、瘢痕形成を促進することができ且つそれにより損傷した心筋組織を修復することができる効果的要素として含有する虚血性心筋障害に対する治療薬剤。
【請求項９】
薬剤担体に挿入された、ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ミッドカイン、プレイオトロフィン及びチモシンβ１０から選ばれた少なくとも一種を含有する請求項８記載の薬物。
【請求項１０】
シートに支持され及び／又は固定された薬剤担体に挿入された、ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ミッドカイン、プレイオトロフィン及びチモシンβ１０から選ばれた少なくとも一種を含有する請求項９記載の薬物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、損傷した心筋を回復させて心機能を改善する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
心筋梗塞とは、長期虚血に起因する心筋の不可逆的な壊死状態である。損傷した心筋組織からなる梗塞巣は、非収縮性スカベンジャー細胞で浸潤され、最終的には瘢痕組織に取って代わられる。この繊維性瘢痕は、心臓の収縮にあまり寄与しない。心細胞が分裂して損傷した領域に再定着することはなく、前記損傷領域は、浸潤性線維芽細胞が産生した結合組織によって満たされる。線維芽細胞は、コラーゲンを主体とした細胞外基質成分を産生する。線維芽細胞自体及び結合組織のいずれも収縮能を有する組織を形成しない。そこで、心筋壊死の問題に直接取り組むため、分子・細胞レベルの心筋形成術の研究が発展してきた。
【０００３】
従来、細胞レベルの心筋形成術においては、その収縮機能を回復させる目的で、損傷した心筋に細胞を移植する。これらの方法においては、損傷した心筋を回復させるための移植細胞として、筋芽細胞及び造血幹細胞を用いる場合が多い。筋芽細胞は樹立細胞系を誘導することによって調製されるが、このような細胞では、通常移植患者による拒絶反応が起きる。
【０００４】
例えば、Nature, 428, 668-673（2004年4月）には、梗塞モデルにおける造血幹細胞の心筋再生能に関する研究に基づき、造血幹細胞は、通常の造血細胞としての運命を専ら辿ることが報告されている。また、Cell, 119巻, 4号, 543?554頁（2004年11月12日）には、骨髄性及び／又は循環血中から筋肉に移植された細胞は、筋衛星細胞と解剖学的に同一の区画に局在するが、それらの細胞は内因性の筋原性を示さなかったことが報告されている。また、成体機能性筋前駆細胞は、造血性又はその他の骨髄性若しくは循環血中の前駆細胞からは生じないことが報告されている。
【０００５】
さらに、線維芽細胞の遺伝子操作が可能であることから、分子レベルの心筋形成術が開発された。例えば、Tamらは、J. Thoracic and Cardiovascular Surgery, 918-924(1995)において、レトロウィルスを発現する筋決定遺伝子の一つであるＭｙｏＤを、インビトロでの線維芽細胞から筋芽細胞への変換に用いた。しかし、そのインビボ（生体内）での生存能力は示されていない。
【０００６】
一方、分泌性Frizzled関連タンパク質（secreted frizzled-related protein；ＳＦＲＰ)ファミリーは、Frizzledタンパク質における推定Wnt結合部位に類似している、システインに富むドメインを有し、Wntシグナル伝達における可溶性修飾因子として作用することが知られている。このＳＦＲＰファミリーのうち、ＳＦＲＰ２及びＳＦＲＰ４がアポトーシスにおけるシグナル伝達カスケードに関与することが、Cancer Res. 65(3), 743-748(2005)及びJ. Biol. Chem. 279(15), 14602-14609(2004)に報告されている。さらに、アポトーシスに関与する分子には、ミッドカイン（ＭＤＫ）、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）及びチモシンβ１０（ＴＢ１０）が含まれる（J Med Dent Sci. 46(1):45-51 (1999)、及びJ Biol Chem. 277(39), 35862-8 (2002), J. Biol. Chem. 280(40), 340003-34007 (2005))。
【０００７】
プレイオトロフィン（ＰＴＮ）及びミッドカイン（ＭＤＫ）は、発生を制御するサイトカインに属するものであり、非常によく似た三次元構造を持ち、約５０％のアミノ酸配列同一性を示す。それらの遺伝子は、ショウジョウバエからヒトに至るまでよく保存されており、本来、神経発生、神経変性疾患やある種の癌に関与している。ＰＴＮ及びＭＤＫは胎生期脳のradial glial processに局在し、それに従って神経幹細胞が移動し分化する（Cancer Letter. 2004;204:127-143及びDevelopment. 1995;121:37-51）。
【０００８】
興味深いことに、これらのタンパク質はともに有糸分裂活性、抗アポトーシス活性、及び血管新生活性を示すが、これらの活性は、発達段階の神経組織だけでなく成体の脳においても、損傷組織の再生に必要な基本的な性質である（Cancer Letter. 2004;204:127-143, Development. 1995;121:37-51及びGene Therapy. 2005;12:487-493）。さらに、損傷した神経以外の臓器、例えば肝臓や心臓などにおける前記タンパク質の発現とその修復能力を示唆する報告がある（Liver Int. 2004;24:484-491, Biochem Biophys Res Commun. 2005;332:1146-1152及びAnticancer res. 1998;18:145-152）。また、Anticancer res. 1998;18:145-152及びJ. Immunol. 2001;167:3463-3469には、発生を制御するサイトカインであるＰＴＮ及びＭＤＫが、ストレスを受けた成体の組織、例えば虚血性の心臓や腎臓において誘導されることが報告されている。
しかし、これらの分子、即ちＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ＭＤＫ、ＰＴＮ及びＴＢ１０の、損傷した心筋における役割、およびそれらの虚血性心筋症に対する治療応用可能性に関してはあまり知られていない。
【０００９】
【非特許文献１】Nature, 428, 668-673（2004年4月）
【非特許文献２】Cell, 119巻, 4号, 543?554頁（2004年11月12日）
【非特許文献３】J. Thoracic and Cardiovascular Surgery, 918-924(1995)
【非特許文献４】Cancer Res. 65(3), 743-748(2005)
【非特許文献５】J. Biol. Chem. 279(15), 14602-14609(2004)
【非特許文献６】J. Med Dent Sci. 46(1):45-51 (1999)
【非特許文献７】J. Biol Chem. 277(39), 35862-8 (2002)
【非特許文献８】J. Biol. Chem. 280(40), 34003-34007 (2005)
【非特許文献９】Cancer Letter. 2004;204:127-143
【非特許文献１０】Development. 1995;121:37-51
【非特許文献１１】Gene Therapy. 2005;12:487-493
【非特許文献１２】Liver Int. 2004;24:484-491
【非特許文献１３】Biochem Biophys Res Commun. 2005;332:1146-1152
【非特許文献１４】Anticancer res. 1998;18:145-152
【非特許文献１５】J. Immunol. 2001;167:3463-3469
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、宿主細胞に由来する線維化を伴うことなく瘢痕形成を促進し、弾性を有する組織を形成することによって、虚血性心疾患を治療する方法、及び前記方法に用いられる瘢痕形成促進剤並びに虚血性心筋障害に対する治療薬剤を提供することにある。
【００１１】
本発明の他の目的は、長期間にわたって瘢痕形成を促進することにより組織形成を助け、加えて、瘢痕形成促進剤及び虚血性心筋障害に対する治療薬剤の取扱い性を改善できる、虚血性心疾患の治療方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、前記課題を達成するため鋭意検討した結果、ある種の分子が、宿主細胞に由来する瘢痕形成及び肉芽形成を促進して、弾性を有する組織を形成することが可能であり、それにより損傷した心筋組織が修復され、心筋機能が回復することを見出し、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち、本発明は、ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ミッドカイン（ＭＤＫ）、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）及びチモシンβ１０（ＴＢ１０）から選ばれた少なくとも一種を効果的要素として含有する、繊維化を惹起することのない瘢痕形成促進剤を投与して瘢痕形成を促進することにより、損傷した心筋組織を修復する、虚血性心疾患の治療方法を提供する。前記瘢痕形成促進剤は、薬剤担体(delivery vehicles)、特にシートに支持され及び／又は固定された薬剤担体に挿入された、ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ＭＤＫ、ＰＴＮ、及びＴＢ１０から選ばれた少なくとも一種を含有していてもよい。
【００１４】
本発明はさらに、瘢痕形成を促進することによって損傷した心筋組織を修復する、虚血性心筋障害の治療用薬物を調製するための、ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ＭＤＫ、ＰＴＮ、及びＴＢ１０から選ばれた少なくとも一種の使用を提供する。前記薬物は、薬剤担体中、特にシートに支持され及び／又は固定された薬剤担体に挿入された、ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ＭＤＫ、ＰＴＮ、及びＴＢ１０から選ばれた少なくとも一種を含有していてもよい。
【００１５】
また、本発明は、損傷した心筋組織を修復するために用いられる瘢痕形成促進剤であって、ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ＭＤＫ、ＰＴＮ、及びＴＢ１０から選ばれた少なくとも一種を効果的要素として含有する瘢痕形成促進剤を提供する。
【００１６】
本発明はさらに、ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ＭＤＫ、ＰＴＮ、及びＴＢ１０から選ばれた少なくとも一種を、瘢痕形成を促進することにより損傷した心筋組織を修復する作用を有する効果的要素として含有する、虚血性心筋障害に対する治療薬剤を提供する。前記薬物は、薬剤担体中、特にシートに支持され及び／又は固定された薬剤担体に挿入された、ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ＭＤＫ、ＰＴＮ、及びＴＢ１０から選ばれた少なくとも一種を含有していてもよい。
【００１７】
本明細書において、「梗塞巣」（即ち、心筋の損傷した領域）とは、当業者が特定できるものをさす。「梗塞巣近傍」とは、心筋が壊死する程の損傷が認められる部位に十分近いことを意味し、例えば、梗塞巣の端から約１ｃｍ以内を意味する。
【００１８】
本発明の、上記以外の目的、特徴及び効果は、下記の好ましい態様の説明から明らかになる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ＭＤＫ、ＰＴＮ、及びＴＢ１０はそれぞれ梗塞巣内及び／又は梗塞巣近傍において宿主細胞に作用し、作用を受けた宿主細胞は、独力で弾性組織の形成に寄与する。従って、ドナー細胞や移植組織を用いる必要がなく、拒絶反応を起こすこともない。特に、薬剤担体、またはシートに支持され及び／又は固定された薬剤担体に挿入された前記効果的要素を投与した場合は、前記効果的要素は、梗塞巣内及び／又は梗塞巣近傍の細胞に、弾性を有する瘢痕の形成に十分なほど長期間にわたりゆっくりと作用し、心筋機能を改善することが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は虚血性心疾患の治療方法に関するものであり、前記方法は、ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ＭＤＫ、ＰＴＮ及びＴＢ１０から選ばれた少なくとも一種を効果的要素として含有する瘢痕形成促進剤を投与することを特徴とする。
【００２１】
本発明における虚血性心疾患には、例えば、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、心筋梗塞（ＭＩ）、重症狭心症（ＡＰ）などの、長期虚血に起因して心筋壊死を引き起こす疾患が含まれる。心筋壊死の進行に伴い、損傷した心筋組織が繊維組織に取って代わられ、梗塞巣の厚みが薄くなり、心内腔が拡張し、収縮能などの心機能が悪化し、心不全に陥る。
【００２２】
本発明者らは、ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ＭＤＫ、ＰＴＮ及びＴＢ１０から選ばれた少なくとも一種は、瘢痕形成を促進し、それにより損傷した心筋組織を修復する効果を有することを見出した。修復された組織は収縮能を有する組織を含むので、心機能が改善される。
【００２３】
前記瘢痕形成促進剤は、ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ＭＤＫ、ＰＴＮ及びＴＢ１０から選ばれた少なくとも一種を効果的要素として含有する。
【００２４】
本発明者らは、成体ラットの梗塞後心筋において、ＭＤＫ及びＰＴＮ遺伝子の発現が速やかに誘導されることを見出した。この誘導は強力だが一過性のものである。というのは、前記発現は梗塞後１週間でピークになり、左室リモデリングが進行し始める梗塞後２週間という短期間で正常レベル近くまで回復したからである。驚くべきことに、ＬＡＤ結紮後に組換えＭＤＫを注入することによって、それに続く左室リモデリング及び心筋繊維化が有意に減弱した。ＭＤＫを注入した心臓においては、非梗塞性心筋は拡張したが、心筋細胞の肥大は減少した。
【００２５】
本発明者らはまた、ＬＡＤ結紮後に組換えＳＦＲＰ４又はＴＢ１０を注入することによって、それに続く左室リモデリング及び心筋繊維化が有意に減少することを見出した。
【００２６】
以下、ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ＭＤＫ、ＰＴＮ、ＴＢ１０及びそれらの組み合わせを総称して「効果的要素」という。前記効果的要素は、医薬品用に精製可能な限り、種々の方法で調製できる。
【００２７】
前記効果的要素は天然型、組換え型の何れであってもよく、患者に投与される前後において機能を有している限り何れであってもよい（以下、「活性のある効果的要素」という場合がある）。例えば、核酸；及び、少なくとも一つ以上のアミノ酸が置換や欠失などの修飾を受けていてもよい、タンパク質、ポリペプチド及びペプチドなどが含まれる。中でも、可溶性のタンパク質及びポリペプチドが好ましい。前記効果的要素、即ちＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ＭＤＫ、ＰＴＮ及びＴＢ１０は、それぞれ単独で又は二種以上を組み合わせて用いることができる。前記効果的要素は、公知の方法に従い、化学的合成または生物学的合成のいずれかで調製できる。例えば、効果的要素に用いる組換えタンパク質は、インビボ又はインビトロで調製された、効果的要素を安定して又は一時的に発現可能な細胞を用いる方法で調製できる。このような組換えタンパク質は、市販品として得ることができる。
【００２８】
さらに、前記核酸、例えば前記活性のある効果的要素をコードする核酸など、の遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（ロスアラモス国立研究所、米国ニューメキシコ州ロスアラモス）などの各種情報源から得ることができる。前記核酸は、エンドヌクレアーゼ制限酵素による切断及び遺伝子断片の単離によって、又は、前記効果的要素の遺伝子を発現する細胞から得られたｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅することによって得ることができる。前記核酸は通常、患者体内で機能する組換え核酸を得るために、調節要素と共に、例えば、プラスミドＤＮＡベクターなどの組換えベクター、ｃＤＮＡ含有リポソーム、修飾ウイルス、又はナノ粒子中に、当業者に周知の標準的な方法で挿入される。前記調節要素には、心組織特異的プロモーター／エンハンサーなどのプロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーなどが含まれる。
【００２９】
前記瘢痕形成促進剤は、従来医薬品に用いられている、上記以外の成分を含有していてもよい。このような成分には、例えば、薬剤担体、キャリア、賦形剤、キレート化剤、非イオン性界面活性剤、緩衝剤、安定剤などの、医薬用に用いられる成分であって、その成分に曝露した細胞又は哺乳類に対して、用いられる用量及び濃度において毒性を示さないものが含まれる。
【００３０】
例えば、本発明の瘢痕形成促進剤は、前記活性のある効果的要素を緩衝液に溶解した水溶液であってもよい。このような液剤は、静脈内注射や梗塞巣への局所注射によって投与できる。
【００３１】
前記瘢痕形成促進剤は、液体や、粉末、顆粒、カプセル、タブレット、丸薬や他の成形体として供してもよい。これらの成形体は、さらに酢酸フタル酸セルロースなどによる腸溶性コーティングが施されていてもよい。
【００３２】
本発明の瘢痕形成促進剤の代表例には、薬剤担体に挿入された、ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ＭＤＫ、ＰＴＮ、及びＴＢ１０から選ばれた少なくとも一種が含まれる。前記薬剤担体は、効果的要素を送達できる限り特に限定されず、組換え核酸で形質転換された細胞やウイルスの他、高分子マトリックスやリポソーム（脂質二重層など）などが含まれる。前記高分子マトリックスは、一種以上の合成又は天然高分子を含み、生体内安定性高分子若しくは生体吸収性高分子であってもよい。前記生体吸収性高分子は、天然又は合成高分子の何れであってもよく、例えば、コラーゲン、ハイドロゲル（寒天、ゼラチンなど）、フィブリン、アルブミン、セルロース、デンプン、キチン、キトサン、ヒアルロン酸や他のタンパク質や多糖類；ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、ポリシアノアクリレートや他の合成高分子又はポリペプチド類；そのほか、例えば、埋込（移植）可能なメディカルデバイス若しくは送達用メディカルデバイスとしての使用が例示された広範囲の各種のものが含まれる。中でも、コラーゲンなどの、生体適合性及び取扱い性に優れた物質が好ましい。本明細書において、「生体吸収性高分子」とは、生分解性高分子などの高分子を含む意味に用いる。
【００３３】
前記効果的要素は、ハイドロゲルやコラーゲンなどの親水性高分子に封入若しくはカプセル化されているのが好ましい。このようにカプセル化すると、効果的要素の放出速度及び放出期間を容易に制御できるからである。具体的には、ゼラチン内に封入又はコラーゲンと混合した効果的要素が、徐放性薬剤として長期間使用できる。
【００３４】
瘢痕形成促進剤は、単独で、又は医薬組成物（又は医薬）の一部として投与できる。前記医薬組成物（又は医薬）は、さらに、球状粒子、フィルム、及びシートなどの一種以上のキャリア、希釈剤、湿潤剤又は懸濁剤、アジュバント、活性要素、及び他の医薬分野で用いられる成分を含有する。前記瘢痕形成促進剤を併用療法の一部として投与する場合、併用する他の薬剤もまた、前記瘢痕形成促進剤と同一の医薬組成物に含有されていてもよく、あるいは異なる医薬組成物の一部として含有されていてもよく、またその双方に含有されていてもよい。
【００３５】
本発明において、前記瘢痕形成促進剤は、ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ＭＤＫ、ＰＴＮ及びＴＢ１０から、好ましくはＳＦＲＰ４、ＭＤＫ及びＴＢ１０から選ばれた少なくとも一種の、組換えタンパク質により構成することができる。このような薬剤は梗塞巣に直接注入でき、用量依存的にリモデリングの進行を阻害する。
【００３６】
本発明の瘢痕形成促進剤の代表例には、さらに、シートに支持され及び／又は固定された薬剤担体に挿入された、ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ＭＤＫ、ＰＴＮ、及びＴＢ１０から選ばれた少なくとも一種が含まれる。このようなシートは、梗塞巣内及び／又は梗塞巣近傍の細胞が集合し組織を形成する際の足場の役割を果たす。また、前記シートを用いた薬剤は取扱いしやすいので、投与がより容易になる。
【００３７】
前記シートは、上記のような生体吸収性（生分解性）高分子からなってもよい。前記生体吸収性高分子は、所望の高分子安定性に応じて選択できる。中でも、生体適合性が良好で幅広い生分解性を有することから、ＰＬＡ、ＰＧＡ、及びＰＬＧＡが好ましい。ＰＬＡ、ＰＧＡ、及びＰＬＧＡの主な分解産物である乳酸とグリコール酸は、ヒト体内で速やかに消失する。さらに、これらの高分子の分解に要する時間は、その分子量及び組成に応じて、数ヶ月から数年まで調整可能である。本明細書における前記ＰＬＡ、ＰＧＡ、及びＰＬＧＡは、主に、乳酸及び／又はグリコール酸に対応する単量体単位を有しているが、所望の吸収性（分解性）を有する限り、他の単量体単位を含んでいてもよい。
【００３８】
投与ルートは、公知の方法に従い、例えば、静脈内、筋肉内、動脈内又は病巣内ルートによる注射若しくは輸液、局所投与、又は徐放性（持続放出性）システムが挙げられる。特に、徐放性システムを用いた病巣内ルートが好ましい。一方、静脈内連続投与は、より容易及び／又は安全であるため、これも好ましい。徐放性システムの典型的な例では、１μｇの効果的要素タンパク質が１日間より長い期間であって通常１週間までの期間、持続的に放出可能である。
【００３９】
本発明の瘢痕形成促進剤における用量及び所望の効果的要素濃度は、想定している用途によって異なる。適当な用量又は投与ルートの決定は、通常の医師の技術範囲内で良い。注射によって局所投与する場合の前記活性のある効果的要素の量は、例えば、０．１〜１００μｇ／ｃｍ2程度、好ましくは０．５〜５０μｇ／ｃｍ2程度である。シートに支持され及び／又は固定した活性のある効果的要素を用いて局所投与する場合の前記活性のある効果的要素の量は、前記シートの面積に対して、例えば、１〜５００ｎｇ／ｃｍ2程度、好ましくは５〜２００ｎｇ／ｃｍ2程度である。
【００４０】
投与の時期は、効果的要素の種類及びその役割に応じて適宜選択できる。例えば、心筋細胞が完全に死滅する前などの、心筋梗塞後早期にＭＤＫを投与すると、より顕著な効果が得られる。
【００４１】
さらに、本発明において、前記効果的要素は、瘢痕形成を促進し、損傷した心筋組織を修復して虚血性心筋障害治療用の薬物を調製するために用いることができる。前記虚血性心筋障害に対する治療薬剤は、ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ＭＤＫ、ＰＴＮ、及びＴＢ１０から選ばれた少なくとも一種を効果的要素として含有することができ、その組成、形状、投与方法、他の材料及び方法は上記と同様である。
【００４２】
本発明の好ましい態様の方法は、シートを梗塞巣へ移植することを含む。ここで、該シートは、ゼラチン内に封入された、ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ＭＤＫ、ＰＴＮ、及びＴＢ１０から選ばれた少なくとも一種のタンパク質を含み、さらに、５０ｎｇ／ｃｍ2の量で、生分解性ＰＬＧＡシートに支持され及び／又は固定されている。
【００４３】
本発明の他の好ましい態様の方法は、薬剤を注射によって梗塞巣に投与することを含む。ここで、該薬剤は、ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ＭＤＫ、ＰＴＮ、及びＴＢ１０から選ばれた少なくとも一種に由来する組換えタンパク質をコラーゲンゲル中に含み、例えば、各タンパク質２５μｇをコラーゲン２００μｌ中に含有する。
【００４４】
本発明によれば、梗塞巣内及び／又は梗塞巣近傍において、効果的要素の効果により瘢痕形成が促進され、梗塞巣の厚みが約２〜３週間にわたり増加し、心内腔の拡張が生じない。瘢痕は、繊維組織ではなく収縮能を有する細胞を含み、その結果、収縮能などの心機能が改善され、心不全が予防できる。
【００４５】
心筋梗塞後の心臓のリモデリングは、臨床的に左心室の大きさ、形状及び機能の変化によって定義されるが、初期には代償性を示すが、一般的に逆であり心不全の進行につながる。組織学的には、リモデリングされた心臓には、通常、心筋細胞の肥大と間質の繊維化が認められ、心室拡張の程度は、冠動脈疾患に罹患した患者の予後不良と相関している（Circulation. 1990;81:1161-72, Am J Cardiol. 2003;93(suppl):17B-20B, Lancet. 2006;367:356-367）。従って、心室リモデリングは、心筋梗塞患者における重要な治療対象であると今日では広く考えられている。
【００４６】
心臓リモデリングは、下記の左室リモデリング及び心筋繊維化の減少として認められる。即ち、非梗塞性の心筋は拡張したが、心筋細胞の肥大の減少が認められた。
【００４７】
繊維化を伴わない瘢痕形成能は、超音波を用いて梗塞巣の厚みを測定することによっても求められる。例えば、５０ｎｇ／ｃｍ2の前記効果的要素を固定したシートを連続的に４週間梗塞巣に接触させた場合、梗塞巣の厚みは、正常な厚みに対し、例えば、少なくとも半分まで、好ましくは７０％を超える値まで回復する。
【００４８】
本発明者らは、梗塞巣内に新生した組織を構成する細胞の遺伝子発現様式を調べた。その結果、ＭｙｏＤ、ｍｙｆ５及びミオゲニンなどの筋原性遺伝子、並びに、ＧＡＴＡ４、Ｎｋｘ２?５及びｃＴｎ-Ｔなどの心特異的遺伝子のいずれにおいても、顕著な発現の増加は認められなかった。即ち、効果的要素が梗塞巣における骨格筋組織や心筋組織の産生を促進するものではないと思われる。ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ＭＤＫ、ＰＴＮ及び／又はＴＢ１０を含む効果的要素の投与によって心機能が改善される機構は不明であるが、前記効果的要素が、未分化の間葉細胞を、梗塞巣及び／又は梗塞巣近傍へ補給し、分化し、弾性を有する組織を形成すると考えられる。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例及び比較例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５０】
参考例１
（心筋梗塞モデルラットの作成）
本実験では、Wistar-Lewisラット［180-220ｇ；6?10週齡；セアック吉富（株）、福岡（ＳＤラット、日本クレア、日本）］を用いた。全てのラットは、「"Principles of Laboratory Animal Care", National Society for Medical Research」及び「"Guide for the Care and Use of Laboratory Animals", National Institutes of Health, NIH Publication. No. 85-23, 1996」に従って人道的に扱われた。ＳＤラットは、ペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ体重）の腹膜内注射により麻酔した。麻酔下のラットに挿管し、人工呼吸器（ＳＮ?４８０?７型、株式会社シナノ製作所、東京）を用いて陽圧換気を維持した。左胸部を横に２．５ｃｍ開胸して、心臓を露出させた。左冠動脈主幹部（Left Anterior Descendant main branch）を、７番（segment 7)において６．０プロリン手術用縫合糸で結紮（ＬＡＤ結紮）し、心筋梗塞モデルとした。以下、ＬＡＤ結紮２週間後のラットを「モデルラット」ということがある。
【００５１】
参考例２
（心筋梗塞モデルラットの作成）
雄の８週齡Lewisラット（220?225g；セアック吉富（株）、福岡）を用いた。全てのラットは、大阪大学大学院医学系研究科が定めた動物実験ガイドライン及び動物の愛護及び管理に関する法律に従って適切に扱われた。本実験のプロトコルは、大阪大学動物実験委員会によって検討・承認された。ケタミン（９０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）を用いてラットを麻酔し、文献記載の方法（Circulation. 1988;78:186-201)に従い、人工呼吸（機械換気）下に冠動脈左前下行枝（ＬＡＤ）を結紮することにより心筋梗塞を引き起こした。以下、これらのラットを「ＬＡＤ結紮ラット」ということがある。また、ＬＡＤ結紮２週間後のラットを「モデルラット」ということがある。
【００５２】
参考例３
（筋芽細胞注入モデル）
ＳＤラットの後肢骨格筋から筋芽細胞を単離した。ラットを安楽死させ、筋肉を切り出してリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。非筋組織を注意深く除去した後、筋肉を細かく刻み、５ｍｇ／ｍＬのコラーゲナーゼ（ギブコＢＲＬ、米国メリーランド州ロックヴィル）酵素により３７SYMBOL 176 \f "Symbol" \s 10.5Ｃで４０分間消化した。処理後、細胞を回収し、２０％ウシ胎児血清及び１％ペニシリン＿ストレプトマイシン添加ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ギブコＢＲＬ）に再懸濁した。まず、細胞を１００−ｍｍコラーゲン被覆培養皿（岩城硝子、東京）に植え、５％ＣＯ2含有湿潤雰囲気下３７度で培養した。翌日、培養基を替えることにより非付着細胞を除去し、残りの付着細胞を約７０％の集密度になるまで培養した。５日間の培養後、細胞を集め、ＤＭＥＭで洗浄し、移植まで氷上に保存した。通常、一匹のラットから２０×１０6個の筋芽細胞が得られ、培養細胞は約５０％のデスミン陽性細胞を含有していた。得られた筋芽細胞を参考例４の筋芽細胞シートの形成に用いた。
【００５３】
参考例１で得られたモデルラット６匹のそれぞれに、筋芽細胞懸濁液（５×１０6個の培養細胞を含有）０．２ｍＬを、右心室に１箇所及び左心室壁に３箇所（前遊離壁、心尖及び後壁）、３０ゲージツベルクリン注射器で注入した。投与１週間後にラットを屠殺し、ジーンチップ（Ｇｅｎｅ  Ｃｈｉｐ）分析用の心臓サンプル（以下、Ｄ群という場合がある）を得た。
【００５４】
参考例４
（筋芽細胞シートモデル）
参考例１で単離された筋芽細胞を、温度応答性高分子であるポリＮ-イソプロピルアクリルアミド（ＰＩＰＡＡｍ）で被覆された組織培養皿（プロセル、株式会社セルシード、東京）上で培養し、筋芽細胞シートを調製した。なお、これらの培養皿の表面は、３７℃においては疎水性であるが、２０℃未満の温度になると親水性に変化する。６ｃｍ皿内の細胞密度５×１０6の細胞懸濁液を、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＤＭＥＭ中、５％ＣＯ2雰囲気下３７℃で１〜２日間培養した。６ｃｍ皿で培養した集密細胞（コンフルエント細胞）は、２０℃の温度に１時間保持することによって自発的に剥離し、１．５ｃｍ×２．０ｃｍの大きさの筋芽細胞シートが得られた。
【００５５】
得られた筋芽細胞シートを、参考例１で得られたモデルラット６匹の梗塞巣の表面にそれぞれ移植した。移植１週間後に処置したラットを屠殺し、ジーンチップ分析用の心臓サンプル（以下、Ｅ群という場合がある）を得た。
【００５６】
参考例５
（ジーンチップ分析）
ラット６匹［Wistar?Lewisラット（180?220g；6?10週齡：セアック吉富（株）、福岡（ＳＤラット、日本クレア、日本）］を屠殺し、非処置心臓サンプルを対照として得た（以下、Ａ群という）。
【００５７】
同様に、参考例１で得られたモデルラット６匹（ＬＡＤ結紮２週間後）を屠殺し、心臓サンプルを得た（以下、Ｂ群という）。
【００５８】
参考例１で得られたモデルラット６匹の梗塞巣の表面に、１．５×２．０ｃｍコラーゲンシート（直径３３ｍｍ、高研セルゲン、東京）をそれぞれ移植した。移植１週間後、処置したラットを屠殺し、心臓サンプルを得た（以下、Ｃ群という）。
【００５９】
各群（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ群）につき、心臓の非虚血部から１サンプルと、虚血部又は処置部から１サンプルの合計２サンプルを採取し、ＲＮＡを抽出してラット用ジーンチップ（アフィメトリクス社、米国カリフォルニア州）を用いた遺伝子発現分析を行った。さらに、Ｅ群の虚血部における遺伝子発現が他の群よりも高いという前提のもとに、ジーンスプリング７ソフトウェアを用いてデータマイニングを行い、最終的に、ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ミッドカイン、プレイオトロフィン及びチモシンβ１０を見出した。
【００６０】
参考例６
参考例２で得られたモデルラットから、結紮から４、７、１４又は５６日後に梗塞及び非梗塞左心室（ＬＶ）心筋を採取し、使用するまでの間、直ちにＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）溶液（ＱＩＡＧＥＮ、ドイツ国ヒルデン）中に保存した（各時点につきｎ＝５）。正常ラット１５匹から無処置の心筋を同様に採取し、参照試料として用いた。ＲＮｅａｓｙミニキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて全ＲＮＡを抽出し、ＰＴＮ又はＭＤＫ遺伝子の転写物の相対的レベルを、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００配列決定システム（J Heart Lung Transplant. 2002;21:1090?1100）を用いた定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ?ＰＣＲ）により測定した。用いたforwardプライマー、reverseプライマー及びTaqManプローブ（登録商標）の塩基配列は下記の通りである：
ラットＭＤＫ；
CGG ATG GTC TCC TGG CAC （配列番号１）、
AGC AAG GAC TGC GGC ATG （配列番号２）、
GCC ACA CGC CCC CCA GCT （配列番号３）、
ラットＰＴＮ；
GCA AAT ACC AGT TCC AGG CTT G （配列番号４）、
TTC TTG CCT TCC TTT TTC TTC TTC T （配列番号５）、
GAA CTC ACC AGC CCA AGC CTC AAG C （配列番号６）。
【００６１】
各サンプルにおける遺伝子転写の平均コピー数を、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）基準に換算し、遺伝子の発現誘導比(fold induction)を下記式に従って算出した：発現誘導比＝（心筋梗塞後のサンプルにおける規準化値）／（前記正常ＬＥＷラットから得られた参照心筋における基準化値の平均値）。
【００６２】
その結果、低値ではあるが検出可能なレベルのＰＴＮ又はＭＤＫのｍＲＮＡが正常ラット心筋において発現していた（ＰＴＮ／ＧＡＰＤＨ：0.0021SYMBOL 177 \f "Symbol" \s 10.50.00028、ＭＤＫ／ＧＡＰＤＨ：0.00083SYMBOL 177 \f "Symbol" \s 10.50.000080、n=15）、また、両方の遺伝子の発現が心筋梗塞後に誘導された（図１Ａ、Ｂ）。ＰＴＮ又はＭＤＫ遺伝子発現の誘導は、ＬＡＤ結紮後それぞれ４又は７日後に最大になり、共に結紮１４日後には速やかに減少した。強い誘導が梗塞心筋に認められたが非梗塞心筋には認められなかった。無処置ＬＥＷラットにおける前記規準化値の平均値に比較して、虚血部におけるＰＴＮ又はＭＤＫのｍＲＮＡは、およそ５４倍又は１８倍増加していた。免疫組織化学的分析の結果、ＭＤＫの発現は、境界部及び梗塞巣に生き残った心筋細胞において認められたが、非梗塞部では認められなかった（データ不示）。この結果は、心筋梗塞後のより早い時点における実験結果と一致していた（Anticancer res. 1998;18:145-152）。ＭＤＫタンパク質の免疫組織化学的染色において、ＭＤＫは、心筋梗塞後の心臓の境界部及び梗塞巣に生き残った心筋細胞において発現していたが、非梗塞部では発現していなかった。
【００６３】
実施例１
Ｒ＆Ｄシステム製ＳＦＲＰ２（１μｇ）をゼラチン（新田ゼラチン、日本）１０ｍｇと混合し、直径１００〜１５０μｍの徐放性ゲル微粒子（マイクロスフェア）を調製した。前記微粒子を、２ｃｍ×２ｃｍサイズの生分解性ＰＬＧＡシート（足場用シート；ベーリンガーインゲルハイム製「Ｒｅｓｏｍｅｒ  ＲＧ８５８」、「Ｒｅｓｏｍｅｒ７６８」）に設置し、ＬＡＤ結紮２週間後のラット虚血心の表面に移植した。
【００６４】
実施例２〜５
ＳＦＲＰ２に代えて、ＳＦＲＰ４を１μｇ（実施例２）、ミッドカインを１μｇ（実施例３）、プレイオトロフィンを２μｇ（実施例４）、以上いずれもＲ＆Ｄシステム製、又はチモシンβ１０、シグマ製、を１μｇ（実施例５）用いた以外は、実施例１と同様の操作を行った。得られたゲル微粒子を、２ｃｍ×２ｃｍサイズの生分解性ＰＬＧＡシート（実施例１に同じ）に設置し、ＬＡＤ結紮２週間後のラット虚血心の表面に移植した。
【００６５】
比較例１
ＳＦＲＰ２を用いずに直径１００〜１５０μｍのゲル微粒子を調製する以外は、実施例１と同様の操作を行った。得られたゲル微粒子を、２ｃｍ×２ｃｍサイズの生分解性ＰＬＧＡシート（実施例１に同じ）に設置し、ＬＡＤ結紮２週間後のラット虚血心の表面に移植した。
【００６６】
実施例６（直接注入療法）
２μｇのＳＦＲＰ２（Ｒ＆Ｄシステム製）をＰＢＳ中に溶解したＳＦＲＰ２溶液を、ＬＡＤ結紮２週間後のラット虚血心に投与した。投与は、３０ゲージ注射針（テルモ、東京）を用いた左側開胸術下６箇所への注入、又は、腹腔内への単回投与により行った。
【００６７】
実施例７〜１０
ＳＦＲＰ２に代えて、ＳＦＲＰ４を１μｇ（実施例７）、ミッドカインを１μｇ（実施例８）、プレイオトロフィンを２μｇ（実施例９）、以上いずれもＲ＆Ｄシステム製、又はチモシンβ１０、シグマ製、を１μｇ（実施例１０）用いた以外は、実施例６と同様の操作を行った。
【００６８】
実施例１１
ＳＦＲＰ２に代えて、ＳＦＲＰ２を２μｇ、ＳＦＲＰ４を２μｇ、ミッドカインを１μｇ、プレイオトロフィンを４μｇ、以上いずれもＲ＆Ｄシステム製、及びチモシンβ１０、シグマ製、を１μｇ（実施例１０）含有する混合物を用いた以外は、実施例６と同様の操作を行った。
【００６９】
比較例２
ＳＦＲＰ２溶液に代えて、ＰＢＳをＬＡＤ結紮２週間後のラット虚血心に投与した以外は、実施例３と同様の操作を行った。
【００７０】
実施例１２、１３、１４及び比較例３
前記参考例２で得られた、ＬＡＤ結紮２週間後のモデルラットを用いて、心機能のベースラインを測定した。そして、前記梗塞ラットの境界部心筋４箇所に、種々の量の組換えヒトＰＴＮ又はＭＤＫ（Ｒ＆Ｄシステム社、米国ミネソタ州ミネアポリス）を注入した（各亜群につきｎ＝１０）。注入は、前記と同様の麻酔下にラットの左胸部を再開胸して行った。サイトカインは、コラーゲン２００μｌ中に１、５又は２５μｇの各タンパク質を含有したものを、それぞれ実施例１２、１３及び１４として、３０ゲージ注射針を用いてＮａｔｕｒｅ．２００５；４３２：４６６−４７２に記載のように投与した。比較例３として、コラーゲンゲルのみを対照ラットに投与した。
【００７１】
実施例１５、１６及び比較例４
前記参考例１で得られた、ＬＡＤ結紮２週間後のモデルラットを用いて、心機能のベースラインを測定した。そして、前記梗塞ラットの境界部心筋４箇所に、種々の量の組換えヒトＳＦＲＰ２又はＳＦＲＰ４（Ｒ＆Ｄシステム社、米国ミネソタ州ミネアポリス）を注入した（各亜群につきn=10）。注入は、前記と同様の麻酔下にラットの左胸部を再開胸して行った。サイトカインは、コラーゲン２００μｌ中に４又は２０μｇの各タンパク質を含有したものを、それぞれ実施例１５及び１６として、３０ゲージ注射針を用いて上記（Ｎａｔｕｒｅ．２００５；４３２：４６６−４７２）のように投与した。比較例４として、ＰＢＳを含有するコラーゲンを対照ラットに投与した。
【００７２】
実施例１７及び比較例５
前記参考例１で得られた、ＬＡＤ結紮２週間後のモデルラットを用いて、心機能のベースラインを測定した。そして、前記梗塞ラットの境界部心筋４箇所に、種々の量の組換えヒトチモシンβ１０（Ｒ＆Ｄシステム社、米国ミネソタ州ミネアポリス）を注入した（各亜群につきｎ＝１０）。注入は、前記と同様の麻酔下にラットの左胸部を再開胸して行った。サイトカインは、コラーゲン２００μｌ中に４又は２０μｇのチモシンβ１０を含有したものを、実施例１７として、３０ゲージ注射針を用いて上記（Ｎａｔｕｒｅ．  ２００５；４３２：４６６−４７２）のように投与した。比較例５として、ＰＢＳを含有するコラーゲンを対照ラットに投与した。
【００７３】
評価
組織学的検査
実施例１〜１０及び比較例１及び２において移植若しくは注入したラットから心臓を回収し、前記心臓の横断切片（厚み２μｍ）を１０％緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、ヘマトキシリン・エオジン（H.E.)染色及びマッソントリクローム染色を行った。
【００７４】
ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗第VIII因子関連抗原（ＥＰＯＳ抗ヒトフォン・ウィルブランド因子／ＨＲＰ、ＤＡＫＯ社、米国カリフォルニア州カーピンテリア）を用いて、取扱説明書に従って血管内皮細胞の検出を行った。梗塞巣の細胞を染色するために、ブロック状の検体を薄切し、下記の抗体を用いて免疫染色した：骨格筋の速筋型ミオシン重鎖に対するモノクローナル抗骨格筋ミオシン抗体（ＭＨＣ、ＭＹ?３２、シグマ、米国）；骨格筋の遅筋型ミオシン重鎖アイソフォームに対するモノクローナル抗ミオシン抗体（骨格筋、遅筋型）（ＮＯＱ７．５．４Ｄ、シグマ、米国ミシガン州）。免疫染色した各スライドを蛍光顕微鏡（ＩＸ?７１、オリンパス、日本）で観察した。
【００７５】
各検体につき５枚以上の切片を作成した。マッソントリクローム染色を行い、ウィンドウズ・メタモルフ（Ｗｉｎｄｏｗｓ  ＭｅｔａＭｏｒｐｈ）ソフトウェア（ユニバーサル・イメージング・コーポレーション、米国ペンシルバニア州ダウニングタウン）を用いた面積測定法を用いて前記切片の画像解析をすることによって、繊維化率（％）を算出した。
【００７６】
第VIII因子陽性動脈と直径１００μｍ未満の毛細血管の本数を、顕微鏡（ＩＸ?７１、オリンパス、日本）を用いて倍率１００倍で数えた。
【００７７】
実施例１〜１０の好転した心臓では繊維化部は殆ど認められない。これに対して、比較例１及び２の梗塞巣では、繊維化が広い範囲で認められる。
【００７８】
組織学的検査２
実施例１２〜１４及び比較例３のラットについて、注入から６週間後に、冷却心筋保護液（２４ｍＥｑ／Ｌカリウム含有５％グルコース溶液）を注入することにより、全ての処置心臓を拡張期で停止させ、取り出した。前記心臓を梗塞巣中心部において水平方向に薄切した。サンプルは全て１０％緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋した。前記特定処置を行った群について、通常のヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色及びマッソントリクローム染色を常法に従って行った。また、心筋繊維化の評価のためにピクロシリウス赤染色を、又は心筋細胞肥大の評価のために過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色を、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．  ２００５；４６：４１２−４１８，  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．  ２００２；９０：ｄ６４１−６４８に記載のように行った。各染色について、ＭａｃＳｃｏｐｅソフトウェア（三谷商事（株）、東京）を用いた定量的形態計測解析を行った。
【００７９】
非梗塞部における心筋繊維化の割合を繊維化率（％）で表した。前記繊維化率は、コラーゲンリッチな赤く染色された部分の心筋全体における分率を意味し、一匹当たり、一切片につき１０視野から得られた値である。心筋細胞の細胞サイズに関しては、４００倍の倍率で、各心室につき１０視野を無作為に選び、各視野につき５個の心筋細胞を無作為に選んだ。各群につき、１０個の心臓から得られた値の平均値を示した。さらに、注入６週間後の心臓から２μｍ厚みの切片を作成し、脱パラフィンした。そして、フォン・ウィルブランド因子用に該切片の染色を行い、各処置群の血管密度を測定した。染色には抗フォン・ウィルブランド因子一次抗体（Ａ００８２、ＤＡＫＯ社、デンマーク国グルストルップ）を用いた。
【００８０】
図１に示すＭＤＫ発現の評価
参考例６で得られたラットの心臓を、ＬＡＤ結紮から１週間後に取り出し、?８０SYMBOL 176 \f "Symbol" \s 10.5Ｃで保存した（ｎ＝５）。厚み５μｍの凍結切片を、ポリクローナル山羊抗ラットＭＤＫ血清（ｓｃ−１３９８、サンタ・クルーズ・バイオテクノロジー社、米国カリフォルニア州サンタクルーズ）と共に温置し、ＡＢＣキット（ＡＢＣ  ＫＩＴ、ベクターラボラトリー社、米国カリフォルニア州バーリンゲーム）を用いて可視化した（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００２  （ｓｕｐｐｌ  Ｉ）；１０６：Ｉ−２６４−Ｉ−２６９）。
【００８１】
図３に示す左室リモデリングの評価
結果として、ゲル単独又は組換えＭＤＫ２５μｇで処置した心臓の全体の様子が得られた（データ不示）。心筋梗塞の中心部における短軸切片において、青色染料で染色された梗塞瘢痕部は、ゲル単独投与群の方が、左心室腔の拡張のため、より細く且つ長かった。しかし、算出された心筋梗塞巣の総面積については、何れの用量のＭＤＫ注入についてもあまり影響がなかった（図３Ａ）。一方、ＭＤＫ２５μｇを注入した心臓の非梗塞心筋は厚みが増していた。事実、ＭＤＫ注入心臓における非梗塞部面積は、ゲル注入心臓の非梗塞部面積よりも有意に大きかった（図３Ｂ）。ＭＤＫ投与心臓における非梗塞部の増加は、ＭＤＫの用量に依存していた。このような非梗塞部の拡張の用量依存性は、図２Ｄに示す心エコー法による知見と一致した。
【００８２】
図４に示す心筋繊維化の評価
ピクロシリウス赤染色による顕微鏡観察での評価（データ不示）において、ゲル投与対照群において非梗塞心筋の繊維化について強い変化が認められた。これは、おそらく、梗塞後の左室リモデリングの不適応反応を反映しているものと考えられる。心筋繊維化は、ＭＤＫ投与群の心臓においても認められるが、ゲル投与対照群の心臓に比べると、その程度は有意に低い（図４）。
【００８３】
図５に示す血管密度の評価
さらに、ＭＤＫが血管新生能を有することが既に報告されているため、ゲル単独投与群及びＭＤＫ２５μｇ投与群の心臓の血管密度を評価した（データ不示）。心筋梗塞後、ゲル又はＭＤＫ投与群の心臓の梗塞性瘢痕部及び境界部において、フォン・ウィルブランド因子陽性血管が優勢に認められた。前記境界部及び梗塞性瘢痕の血管密度は、ＭＤＫ投与群心臓の方が、ゲル投与群心臓よりも有意に高かった（図５）。非梗塞部の血管数は比較的少なく、ゲル投与群心臓とＭＤＫ投与群心臓の間で信頼性の高い血管数の比較を行うことは困難であった。
【００８４】
心臓壁厚
上記作成した組織切片の肉眼的評価によると、実施例１〜１０における梗塞巣の壁厚は改善したが、比較例１及び２においては、前記壁厚が薄くなり、心内腔が拡張していた。特に、前記壁厚の改善に関しては、実施例１〜５の方が実施例６〜１０よりもさらに厚みが改善されていた。
【００８５】
心機能
実施例１〜１０並びに比較例１及び２の移植又は注入されたラットについて、イソフルラン麻酔下、１２ＭＨｚ環状配列変換素子を備えた市販の心エコー検査装置ＳＯＮＯ  ５５００（アジレント・テクノロジー社、米国）を用いて、心エコー測定を下記の方法で行った。
【００８６】
体重測定後、ラットに麻酔を施し、続いて、検査前に２０分間その状態を維持して血行動態を安定化させた。Ｍモードの心エコー図を記録し、心拍数（ＨＲ）、左心室収縮終期寸法（Ｄｓ）、左心室拡張終期寸法（Ｄｄ）及び短縮率（ＦＳ）を１０分以内に測定した。心エコー図の読像者は、被測定群の区別を知らされていない。
上記の方法により、６週間後まで毎週心エコー図を記録した。
【００８７】
その結果、実施例１〜１０における心収縮能は改善したが、比較例１及び２における心収縮能は異常であった。
【００８８】
表１及び図２に示す心エコー図モニタリング
一方、実施例１２〜１４及び比較例３における投与後ラットの左心室機能を、サイトカイン注入から２、４、及び６週間後に、安定した血行動態条件下に心エコー図上でモニターし、注入前（ベースライン）と比較した（表１）。前記心エコー図は、ジエチルエーテル麻酔下、１２ＭＨｚ環状配列変換素子を備えた心エコー検査装置ＳＯＮＯＳ  ５５００（アジレント・テクノロジー社、米国カリフォルニア州パロアルト）を用いて記録した。心臓を乳頭筋のレベルで短軸２D画像化し、左心室収縮終期面積（ＬＶＥＳＡ）、左心室拡張終期面積（ＬＶＥＤＡ）、並びに収縮終期及び拡張終期における左心室寸法（ＬＶＤｓ及びＬＶＤｄ）を測定した。駆出率（ＥＦ）は、Ｐｏｍｂｏ法により下記式に従い算出した：ＥＦ（％）＝｛（ＬＶＤｄ3−ＬＶＤｓ3）／ＬＶＤｄ3｝×１００。間接ｔａｉｌ−ｃｕｆｆ方式を採用したＭＫ−２０００型血圧モニター装置（室町機械株式会社、東京）を用いて、ラットの心拍数（ＨＲ）及び血圧（ＢＰ）を測定中連続的に記録した。ベースラインにおける前記ＬＶＥＤＡ、ＬＶＥＳＡ、ＥＦ、ＨＲ及び平均ＢＰに関して、７群間に有意差は見られなかった。
【００８９】
ゲル単独投与対照群において、ＬＶＥＤＡ及びＬＶＥＳＡが共に徐々に増加し、６週目にベースラインとの差が有意に達した（表１、図２Ａ、Ｂ）。対照群心臓のＥＦは投与後２週から６週にかけて一定の割合で減少した（図２Ｃ）。これに対して、ＭＤＫ２５μｇ投与群心臓におけるＬＶＥＤＡ及びＬＶＥＳＡの増加は最小であり、対照群心臓におけるものと比較した場合有意に小さかった（図２Ａ、Ｂ）。さらに、ＭＤＫ投与群心臓の４週目又は６週目のＥＦは、対照群心臓におけるものに比べて有意に良好であった。この心筋梗塞後の左室リモデリングを抑制する効果は、注入されたＭＤＫの量に依存するが、ＰＴＮ注入については、少なくとも一心臓当たり２５μｇの用量までは同様の効果は認められなかった（図２Ｄ、表１）。
【００９０】
統計解析
データは全て平均値±標準誤差（ＳＥ）で表される。心機能の経時的解析データを、ＳｔａｔＶｉｅｗ  ５．０（Ａｂａｃｕｓ  Ｃｏｎｃｅｐｔ社、米国カリフォルニア州バークリー）を用いた二元配置多重比較反復測定分散分析（ＡＮＯＶＡ）に供した。それぞれの群間の有意差検定には、独立スチューデントｔ−検定を用いた。その他の項目の比較は、ボンフェローニの事後検定又は独立スチューデントｔ−検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによって行った。Ｐ値が０．０５より小さければ有意であるとみなした。
【００９１】
著者らは、前記データを制限なく利用すると共に、責任をもってデータの保全を行った。全ての著者らは書かれた原稿を読み、承諾した。
【００９２】
図６に示す心筋細胞リモデリングの評価
非梗塞心筋部面積の増大を細胞レベルで解明するために、ゲル単独投与又はＭＤＫ２５μｇ投与群の心臓を処置から６週間後に取り出し、ＰＡＳ染色を行った（データ不示）。ゲル単独投与群の心筋細胞は、有意にその直径がより大きく（図６Ａ）、長さがより長く（図６Ｂ）、細胞サイズがより大きかった（図６Ｃ）。これは、心筋梗塞後の体積及び圧力の過負荷を反映している。これに対して、ＭＤＫ投与群心臓の心筋細胞は、非梗塞正常心臓の心筋細胞よりも若干大きいものの、その増加は、ゲル投与対照群心臓の心筋細胞よりも有意に小さかった。この結果は驚くべきものである。何故なら、ＭＤＫ投与群心臓は、ゲル投与群心臓に比べ筋体積が増加しており、このことは、ＭＤＫ投与群心臓の心筋細胞数が、ゲル投与対照群心臓の心筋細胞数よりも多いにちがいないことを強く示唆するからである。
【００９３】
【表１】
2009514787.tif 000003
【００９４】
実施例１５〜１７及び比較例４〜５において、種々の量のＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４及びＴＢ１０を結紮１週間後に注入した。処置したラットについて、サイトカイン投与から１、２、３、４、及び５週間後に、左心室機能を心エコー法によりモニターし、ＰＢＳ投与群と比較した。前記心機能の測定は、ジエチルエーテル麻酔下、１２ＭＨｚ環状配列変換素子を備えた超音波診断装置Ｍ２４２４Ａ  ソノス  ７５００  Ｒｅｖ．Ｄ．２（フィリップス、フィリップスメディカルシステム大阪、日本）を用いて行った。心臓を乳頭筋のレベルで短軸２Ｄ画像化し、左心室収縮終期面積（ＬＶＥＳＡ）、左心室拡張終期面積（ＬＶＥＤＡ）、収縮終期及び拡張終期における左心室寸法（ＬＶＤｓ及びＬＶＤｄ）を測定した。駆出率（ＥＦ）は、Ｐｏｍｂｏ法により下記式に従い算出した：ＥＦ（％）＝｛（ＬＶＤｄ3−ＬＶＤｓ3）／ＬＶＤｄ3｝×１００。短縮率（ＦＳ）又はパーセンテージＦＳは、下記式に従い算出した：ＦＳ（％）＝ＬＶＤｄ-ＬＶＤｓ／ＬＶＤｄ×１００。
【００９５】
対照群心臓のＥＦ及びＦＳは、投与後コンスタントに減少した。これに対して、ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４又はＴＢ１０投与群の心臓のＥＦ及びＦＳは次第に改善し、４又は５週間後には対照群心臓の値より有意に改善した（図７〜１０）。ＳＦＲＰ２の効果は、ＳＦＲＰ４の効果より小さかった。これらの結果より、ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４及びＴＢ１０を心臓内に投与すると、ＭＤＫ投与の場合と同様に、虚血性心疾患後の損傷した心筋の機能が改善されることが示唆される（実施例１２〜１４参照）。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
本発明によれば、宿主細胞由来の繊維化を伴うことなく瘢痕形成を促進することによって、虚血性心疾患を治療する方法；並びに前記方法に用いられる、血管新生活性、抗アポトーシス活性及び成長促進活性などを有し、有効な治療法となる可能性のある虚血性心筋障害に対する治療薬剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】図１は、参考例６で得られた、ラットのＬＡＤ結紮ＬＥＷ心の左心室（ＬＶ）心筋における、プレイオトロフィン（Ａ）、ミッドカイン（Ｂ）のｍＲＮＡ発現を示す折れ線グラフである。白印が梗塞性心筋におけるデータ、黒印が非梗塞性心筋におけるデータである。
【図２】図２は、（Ａ）が左室拡張終期面積（ＬＶＥＤＡ）、（Ｂ）が左室収縮終期面積（ＬＶＥＳＡ）、（Ｃ）が駆出率（ＥＦ）のそれぞれベースラインに対する増加分を示す折れ線グラフであり、白印が比較例３におけるゲル単独投与ラットのデータ、黒印が実施例１４におけるＭＤＫ投与ラットのデータである。また、（Ｄ）は、心エコー法に基づき評価したＬＶＥＤＡのベースラインに対する増加分を示す棒グラフであり、ゲル単独、ＭＤＫ、又はＰＴＮ投与ラットの投与６週間後のデータである。
【図３】図３は、実施例１２〜１４及び比較例３で得られた、ゲル投与群又はＭＤＫ投与群ラット心における、梗塞性瘢痕面積（Ａ）及び非梗塞性筋面積（Ｂ）を示す棒グラフである。これらはコンピュータ補助による形態計測分析によるデータである。
【図４】図４は、ラット心臓の繊維化面積率（％）を示す棒グラフであり、実施例１４及び比較例３で得られた、ゲル投与梗塞心（ｇｅｌ）又はＭＤＫ投与梗塞心（ＭＤＫ）及び非梗塞性正常心（ｎｏｒｍａｌ）におけるデータを示す。
【図５】図５は、ラットの梗塞性瘢痕及び境界領域における血管密度を示す棒グラフであり、実施例１４及び比較例３で得られたデータである。
【図６】図６は、ラット心筋細胞の、幅（Ａ）、長さ（Ｂ）及び細胞サイズ（Ｃ）を示す棒グラフである。それぞれ、比較例３で得られたゲル投与梗塞心（ｇｅｌ）、実施例１４で得られたＭＤＫ投与梗塞心（ＭＤＫ）、及び非梗塞性正常心（ｎｏｒｍａｌ）のデータを示す。
【図７】図７は、心エコー法で測定された、駆出率（Ａ）及び短縮率（Ｂ）を示す点図である。それぞれ実施例１５及び１６、並びに比較例４で得られた、ラット梗塞心に対するｓｆｒｐ２、ｓｆｒｐ４及びＰＢＳの心臓内投与のデータを示す。
【図８】図８は、図７を書き直したグラフであり、心エコー法で測定された駆出率（Ａ）及び短縮率（Ｂ）を示す折れ線グラフである。それぞれ実施例１５及び１６、並びに比較例４で得られた、ラット梗塞心に対するｓｆｒｐ２、ｓｆｒｐ４及びＰＢＳの心臓内投与のデータを示す。
【図９】図９は、心エコー法で測定された駆出率（Ａ）及び短縮率（Ｂ）を示す点図であり、それぞれ実施例１７及び比較例５で得られた、ラット梗塞心に対するチモシンβ１０及びＰＢＳの心臓内投与のデータを示す。
【図１０】図１０は、図９を書き直したグラフであり、心エコー法で測定された駆出率（Ａ）及び短縮率（Ｂ）を示す折れ線グラフである。それぞれ実施例１７及び比較例５で得られた、ラット梗塞心に対するチモシンβ１０及びＰＢＳの心臓内投与のデータを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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