(57)【要約】  本発明は、ＩＬ−１、またはＮＡＬＰ３インフラマソームによるその成熟を遮断する阻害剤の有効量を投与することを含んでなる、痛風または偽痛風の治療のための新規な方法、および薬剤の製造方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
痛風または偽痛風の治療に用いられる薬剤の製造のための、ＩＬ−Ｉ、またはＮＡＬＰ３インフラマソームによるその成熟を遮断する阻害剤の使用。
【請求項２】
ＩＬ−Ｉが、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βからなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ＮＡＬＰ３インフラマソームによるＩＬ−１の成熟を遮断する阻害剤が、ＮＡＬＰ３インフラマソーム形成の阻害剤およびＮＡＬＰ３インフラマソーム活性の阻害剤からなる群から選択される、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
ＮＡＬＰ３インフラマソーム形成の阻害剤が、ＨＳＰ９０の阻害剤である、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
ＨＳＰ９０の阻害剤が、ゲルダナマイシン、１７−ＡＡＧ（１７−（アリルアミノ）−１７−デメトキシゲルダナマイシン）および１７−ＤＭＡＧ（１７−（ジメチルアミノエチルアミノ）−１７−デメトキシゲルダナマイシン）からなる群から選択される、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
ＩＬ−１を遮断する阻害剤が、ＩＬ−１の活性を阻害する抗体から選択される、請求項１または２に記載の使用。
【請求項７】
抗ＩＬ−１抗体が、モノクローナル抗体である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
ＩＬ−１を遮断する阻害剤が、ＩＬ−１とその受容体（ＩＬ−１Ｒ  Ｉ型）との結合を阻害する抗体から選択される、請求項１または２に記載の使用。
【請求項９】
抗体が、抗ＩＬ−１ＲＩ抗体である、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
抗ＩＬ−１ＲＩ抗体が、モノクローナル抗体である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
ＩＬ−１を遮断する阻害剤が、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１  Ｒａ）である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項１２】
ＩＬ−１Ｒａが、アナキンラである、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
ＩＬ−１、またはＮＡＬＰ３インフラマソームによるその成熟を遮断する阻害剤が、１日１回、ＩＬ−１活性を阻害するのに十分な用量で投与される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
ＩＬ−１、またはＮＡＬＰ３インフラマソームによるその成熟を遮断する阻害剤が、１週間に１回、ＩＬ−１活性を阻害するのに十分な用量で投与される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
ＩＬ−１、またはＮＡＬＰ３インフラマソームによるその成熟を遮断する阻害剤が、１か月に１回、ＩＬ−１活性を阻害するのに十分な用量で投与される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
アナキンラが、１日１回、１００ｍｇ／日の用量で１、２または３日間投与される、請求項１２に記載の使用。
【請求項１７】
ＩＬ−１、またはＮＡＬＰ３によるその成熟を遮断する阻害剤が、少なくとも１種の第二の抗痛風化合物と併用される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
第二の抗痛風化合物が、コルヒチン、アロプリノールおよびウリカーゼからなる群から選択される、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
ＩＬ−１、またはＮＡＬＰ３インフラマソームによるその成熟を遮断する阻害剤が、少なくとも１種の抗炎症性化合物または組成物と併用される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２０】
抗炎症性化合物または組成物が、プレドニゾン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、コルチバゾール、ヒドロコルチゾン、トリアムシノロン、インドメタシン、スリンダック、チアプロフェン酸、アルミノプロフェン、ジクロフェナク、エトドラック、フルルビプロフェン、イブプロフェン、ケトプロフェン、ナブメトン、ナプロキセン、メロキシカム、ピロキシカム、テノキシカム、セレコキシブおよびレフェコキシブからなる群から選択される、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
炎症性障害の治療に用いられる薬剤の製造のための、ＨＳＰ９０の阻害剤の使用。
【請求項２２】
ＨＳＰ９０の阻害剤が、ゲルダナマイシン、１７−ＡＡＧ（１７−（アリルアミノ）−１７−デメトキシゲルダナマイシン）および１７−ＤＭＡＧ（１７−（ジメチルアミノエチルアミノ）−１７−デメトキシゲルダナマイシン）からなる群から選択される、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
炎症性障害が、痛風、偽痛風、マックル・ウェルズ症候群、遺伝性周期性発熱、家族性地中海熱、家族性寒冷誘導自己炎症症候群、ブラウ症候群、関節リウマチ、変形性関節症、全身型若年性特発性関節炎、乾癬、狼瘡、多発性硬化症、喘息、慢性閉塞性肺疾患、炎症性腸疾患、クローン病、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病などの自己免疫および自己炎症性疾患からなる群から選択される、請求項２１または２２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＬ−１、またはＮＡＬＰ３インフラマソーム（inflammasome）によるその成熟を遮断する阻害剤の有効量を投与することを含む、痛風または偽痛風の治療のための新規な方法、および薬剤の製造方法に関する。
【発明の背景】
【０００２】
痛風および偽痛風として知られる急性および慢性炎症性応答の発症はそれぞれ関節および関節周囲の組織における尿酸一ナトリウム（ＭＳＵ）またはピロリン酸カルシウム二水和物（ＣＰＰＤ）結晶の沈着に関連している。ＭＳＵ結晶はまず１８世紀に痛風の病因因子として確認され１、最近では、死にかけている（dying）細胞から放出される「危険シグナル」であることも確認された２が、ＭＳＵまたはＣＰＰＤにより誘発される炎症の基礎をなす分子機構についてはほとんど知られていない。
【０００３】
痛風または偽痛風の症状に苦しむ患者にとって、痛風または偽痛風の治療のために今日利用できる療法は少ない。これらの治療は一般にコルヒチンおよび他の化合物を用いる。しかしながら、このような治療は満足のいくものではない。一例として、経口コルヒチンの使用は吐き気や腹痛などの副作用により制限される。通常の痛風治療と副作用に関する情報は、Cannella & Mikuls (The American Journal of Managed Care, Nov. 2005, Vol. 11, NO. 15, SUP., S541-S458)およびウェブサイトhttp://www.arthritis.ca/tvpes%20of%20arthritis/gout/default.asp?s=1に示されている。
【０００４】
痛風は「自己炎症性疾患」と総称される病態群である。これらには、感染または自己免疫的原因が存在しない自発的周期的炎症と発熱を特徴とする不均質な病態群を含む３。そのような炎症性疾患として、遺伝性周期性発熱（ＨＰＦ）、マックル・ウェルズ症候群、家族性地中海熱（ＦＭＦ）、家族性寒冷誘導自己炎症症候群（ＦＣＡＳ）および代謝症候群障害である痛風や偽痛風などが挙げられる。痛風と、関節リウマチ、変形性関節症または全身型若年性特発性関節炎（ＳｏＪＩＡ）のような自己免疫疾患との間には違いがある。実際、自己免疫疾患は、再配列され、クローン的に選択される受容体（抗体およびＴ細胞受容体）による自己成分の認識を担う適応免疫成分（Ｂ細胞およびＴ細胞）を含むと考えられている。それは感染により誘発される場合があり、自己の抗原と交差反応をもたらす。あるいは、遺伝的素因のバックグラウンドがこれらの病態をもたらす場合もある。これに対し、痛風は生得的免疫系成分、特にＮＯＤ様受容体が関与するだけで、適応免疫成分は関与しない。痛風は病原体により誘発されないと思われる。むしろ、痛風は代謝不全、すなわち、体内のある領域でのＭＳＵ結晶の増加から起こる(Choi, HK et al. 2005. Pathogenesis of gout. Ann. Intern. Med. 143:499)。
【０００５】
内因性発熱物質として知られるＩＬ−１βは炎症性の高いサイトカインであり、その産生は少なくとも３つの異なる段階で厳格に制御されている９。
【０００６】
第一段階はプロＩＬ−１βタンパク質（ｐ３５）の産生を含む。第二段階は前駆体プロＩＬ−１βの切断による活性型ＩＬ−１βタンパク質（ｐ１７）の産生を含む。この反応はカスパーゼ−１活性化複合体の活性化によるものであり、最も特徴的なのはインフラマソームである１０，１１。第三段階で、ＩＬ−１βは細胞外環境へ放出される。
【０００７】
活性化すると、ＮＡＬＰ１、ＮＡＬＰ２、ＮＡＬＰ３／ＣｒｙｏｐｙｒｉｎまたはＩｐａｆなどのＮＯＤ−ＬＲＲ（ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン−ロイシンリッチリピート）タンパク質ファミリーのいくつかのものと、そのＮＯＤ−ＬＲＲタンパク質とカスパーゼ−１とをつなぐアダプタータンパク質ＡＳＣによりインフラマソームが形成される１２。インフラマソームの活性化をもたらすシグナルおよび機構はまだあまり理解されていない。最近、細菌の細胞壁成分であるペプチドグリカンの分解産物であるムラミルジペプチド（ＭＤＰ）および粗ＬＰＳの夾雑物が、ＮＡＬＰ３のＬＲＲドメインを介してＮＡＬＰ３インフラマソームを活性化することが示され１３、このことはトル様（Toll-like）受容体（ＴＬＲ）のようにＮＡＬＰが微生物検出の基礎であることを示唆する。しかしながら、インフラマソームはまた、細胞外ＡＴＰもしくは低張ストレスなどのストレスまたは内因性の「危険シグナル」の検知にも長けている１０,１１，１５。最近、ＭＳＵ結晶が死にかけている細胞からの尿酸の放出後に形成される「危険シグナル」として特定された。
【０００８】
発明者らは、ＭＳＵおよびＣＰＰＤがＮＡＬＰ３インフラマソームと関与し、活性型ＩＬ−１α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１８の産生をもたらすことを示した。
【０００９】
カスパーゼ−１、ＡＳＣおよびＮＡＬＰ３など、インフラマソームの種々の成分を欠いたマウスのマクロファージは結晶により誘発されるＩＬ−１の活性化および次の好中球の流入に欠陥がある。同様に、ＩＬ−１受容体Ｉ型（ＩＬ−１ＲＩ）が欠損すると、ＭＳＵまたはＣＰＰＤにより誘発される炎症で好中球の動員が上手くいかない。同系列の証拠で、同じことで、ＩＬ−１受容体Ｉ型に対する遮断型モノクローナル抗体またはアナキンラ（Kineret，ＩＬ−１Ｒａ）を投与すると、ＴＮＦに対する遮断型モノクローナル抗体を投与する場合と違い、マウスにおいてＭＳＵにより誘発される好中球の動員が排除される。同様に、ＨＳＰ９０シャペロンの阻害剤はＮＡＬＰ３インフラマソームの形成を阻害する。これらの阻害剤はまた、ヒト単球およびマウスマクロファージによるＩＬ−１分泌も遮断し、マウスにおいてＭＳＵにより誘発される好中球動員も阻害する。
【００１０】
これらの知見は痛風および偽痛風の炎症症状の基礎にある分子プロセスに洞察をもたらし、このような症状の治療に好適な新たな薬剤および医薬を特定する。
【発明の簡単な説明】
【００１１】
本発明は、痛風または偽痛風の治療のための新規な方法であって、ＩＬ−１、またはＮＡＬＰ３インフラマソームによるその成熟を遮断する阻害剤の有効量を投与することを含んでなる方法に関する。
【００１２】
ＮＡＬＰ３インフラマソームはカスパーゼ−１、ＡＳＣおよびＮＡＬＰ３の結合体（conjugate）である。
【００１３】
本発明によれば、ＮＡＬＰ３インフラマソームによるＩＬ−１成熟を遮断する阻害剤は、ＮＡＬＰ３インフラマソームの形成の阻害剤および／またはＮＡＬＰ３インフラマソームの活性の阻害剤を含む。
【００１４】
ＮＡＬＰ３インフラマソームの形成の阻害剤としては、特に、カスパーゼ−１および／またはＡＳＣおよび／またはＮＡＬＰ３の発現および／または活性の阻害剤がある。
【００１５】
さらに、本発明者らは、ＮＡＬＰ３インフラマソームの集合にはＮＡＬＰ３と熱ショックタンパク質ＨＳＰ９０、さらにはクライアントタンパク質Ｓｇｔ１との一時的会合を必要とすることを見出した。従って、ＮＡＬＰ３インフラマソームの形成の阻害剤はまた、ＨＳＰ９０および／またはＳｇｔ１の発現および／または活性の阻害剤、より詳しくは、ＨＳＰ９０の阻害剤を含む。
【００１６】
本発明によれば、ＮＡＬＰ３インフラマソームの活性の阻害剤は、ＮＡＬＰ３インフラマソームによるプロＩＬ−１βのＩＬ−１βへのプロセシングを阻害してもよい。
【００１７】
ＩＬ−１を遮断する阻害剤は好ましくはＩＬ−１αおよび／またはＩＬ−１βを遮断する阻害剤である。
【００１８】
これらの阻害剤は好ましくは、ＩＬ−１の活性の阻害剤、ＩＬ−１受容体の阻害剤およびＩＬ−１受容体アンタゴニストから選択される。
【発明の詳細な説明】
【００１９】
ＩＬ−１、またはＮＡＬＰ３インフラマソームによるその成熟を遮断する阻害剤は、小分子、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列、タンパク質、抗体など、その作用がＩＬ−１の形成、および／または同ＩＬ−１の活性、および／またはＮＡＬＰ３インフラマソームによるＩＬ−１の成熟、を阻害する物質の組成物である。
【００２０】
小分子量化合物は約５００Ｄａ未満の分子量の化学化合物である。これらの化学化合物は天然源のもの、修飾天然化合物または完全合成化合物由来である。天然化合物は植物、植物抽出物または生体材料を含むその他媒体など、生体材料の抽出により得ることができる。それらはまた、完全または部分的合成によって得ることもできる。それらは単独で用いることもできるし、既知の薬学上許容される塩を含む生理食塩水形態で使用することもできる。
【００２１】
例えば、ＮＡＬＰ３のＡＴＰ結合部位に適合する小分子量化合物は、ＮＡＬＰ３インフラマソームの阻害剤として用いることができる。ＮＡＬＰ３の配列解析によれば、推定ＡＴＰ結合部位の存在が明らかになっている。関連のＡＴＰ結合部位を有する他のタンパク質（すなわち、キナーゼ、ホスファターゼおよびホスホジエステラーゼ）に関して小分子量化合物阻害剤の開発に成功しているが、このようなＮＡＬＰ３の阻害剤の特定が合理的に推定できることが示唆される。
【００２２】
ゲルダナマイシンなどのＨＳＰ９０を特異的に遮断する小分子量化合物、または１７−ＡＡＧ（１７−（アリルアミノ）−１７−デメトキシゲルダナマイシン）もしくは１７−ＤＭＡＧ（１７−（ジメチルアミノエチルアミノ）−１７−デメトキシゲルダナマイシン）およびそれらの薬学上許容される塩などの毒性の低い誘導体の開発に成功している。これらの化合物は癌の治療に関して評価されている。これらの阻害剤はまた、ＨＳＰ９０依存型のＮＡＬＰ３インフラマソームの集合にも有効であり、痛風または偽痛風を治療するための薬剤を製造するのに有効な量で使用することができる。
【００２３】
他のゲルダナマイシン誘導体は、その内容が引用することにより本明細書の一部とされる米国特許第４，２６１，９８９号、ＵＳ２００４−０２３５８１３、ＷＯ０２／３６５７４、ＷＯ０２／０７９１６７、ＷＯ０３／０２６７１およびＷＯ２００５／０９５３４７に開示されている化合物など、当技術分野で公知である。
【００２４】
ＨＳＰ９０の他の阻害剤も、その内容が引用することにより本明細書の一部とされるＷＯ２００６／０９５７８３、ＷＯ２００６／０９２２０２、ＷＯ２００６／０９００９４、ＷＯ２００６／０８７０７７、ＷＯ２００６／０８４０３０、ＷＯ２００５／０２８４３４、ＷＯ２００４／０７２０５１、ＷＯ２００６／０７９７８９、ＵＳ２００６−０１６７０７０、ＷＯ２００６／０７５０９５、ＵＳ２００６−０１４８８１７、ＷＯ２００６／０５７３９６、ＷＯ２００６／０５５７６０、ＷＯ０２／０６９９００、ＷＯ２００６／０５２７９５、ＷＯ２００６／０５０３７３、ＷＯ２００６／０５１８０８、ＷＯ２００６／０３９９７７、ＵＳ２００６−００７３１５１、ＥＰ１６４２８８０、ＥＰ１６３１２６７、ＥＰ１６２８６６７、ＵＳ２００６−００３５８３７、ＷＯ２００６／００８５０３、ＷＯ２００６／０１０５９５、ＷＯ２００６／０１０５９４、ＷＯ２００６／００３３８４、ＷＯ２００５／１１５４３１、ＥＰ１６２００９０、ＷＯ２００５／０６１４６１、ＷＯ２００５／０６３２２２、ＵＳ２００５−００４９２６３、ＷＯ２００４／０５００８７、ＷＯ２００４／０２４１４２、ＷＯ２００４／０２４１４１、ＷＯ０３／０６７２６２、ＷＯ０３／０５５８６０、ＷＯ０３／０４１６４３、ＷＯ０３／０３７８６０に開示されている化合物など、当技術分野で開示されている。
【００２５】
インターロイキン−１阻害剤は、ＷＯ８９／１１５４０、またはNishiharaら(Infect Immun. 1988 November; 56(11): 2801-2807)もしくはPeledら(blood, Volume 79, Issue 5, pp. 1172-1177)などの多くの科学文献に開示されている阻害剤など、当技術分野で公知である。他のインターロイキンアンタゴニストも、米国特許第６，４１７，２０２号に開示されている小分子など、当技術分野で公知である。上記公報の内容は引用することにより本明細書の一部とされる。
【００２６】
本発明によれば、ＩＬ−１の阻害剤は好ましくは、ＩＬ−１αを遮断する阻害剤およびＩＬ−１βを遮断する阻害剤からなる群から選択される。
【００２７】
好ましい実施形態では、ＩＬ−１の阻害剤はＩＬ−１受容体Ｉ型（ＩＬ−１ＲＩ）アンタゴニスト（天然または合成）、特に、Ｋｉｎｅｒｅｔ（登録商標）の名称で市販されているアナキンラとしても知られるＩＬ−１Ｒａである。
【００２８】
別の好ましい実施形態では、ＩＬ−１の阻害剤はＩＬ−１αおよび／またはＩＬ−１βの活性を阻害する抗体から選択される。このような抗ＩＬ−１αおよび／またはβ抗体はポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり、好ましくはモノクローナル抗体である。
【００２９】
別の好ましい実施形態では、ＩＬ−１の阻害剤はＩＬ−１αまたはＩＬ−１βとその受容体との結合を妨げる抗体から選択される。このような抗ＩＬ−１ＲＩ抗体はポリクローナルまたはモノクローナル抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。
【００３０】
このような抗体は当技術分野で公知であり、関節リウマチおよび変形性関節症などの他の疾病の治療にための療法での使用が開示されているものものある（例えば、引用することにより本明細書の一部とされるＷＯ０３／０７３９８２参照）。
【００３１】
さらに、当業者ならば、標準的な技術により新たな抗体を同定および作製することができる。
【００３２】
好ましい実施形態では、抗体はヒト化抗体、すなわち、完全にまたは部分的に、ヒト抗体生殖系に由来するアミノ酸配列または再配列配列からなり、非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する抗体の配列を変更することにより製造される抗体である。
【００３３】
可変領域のフレームワーク領域は対応するヒトフレームワーク領域により置換され、非ヒトＣＤＲは実質的にそのまま残る。このフレームワーク領域は完全にヒトであってもよいし、あるいは抗体と標的抗原との結合に影響を及ぼす領域に置換を含んでもよい。これらの領域は対応する非ヒトアミノ酸で置換されていてもよい。
【００３４】
ヒト化抗体は、ヒトの療法における使用に、より詳しくはヒト免疫系により認識されないこと、また、非ヒト抗体よりも循環中での半減期が長いことから、いくつかの潜在的な利点を有する。
【００３５】
ＩＬ−１、またはＮＡＬＰ３インフラマソームによるその成熟を遮断する阻害剤は、標準的な手順に従い、標準的な医薬組成物を用いて投与される。
【００３６】
ＩＬ−１、またはＮＡＬＰ３インフラマソームによるその成熟を遮断する阻害剤は、標準的な投与技術を用い、好ましくは、注射もしくは注入、静脈投与、腹腔内投与、筋肉内投与または皮下投与による末梢投与により、また、肺投与、鼻腔投与、口内投与、舌下投与、経皮投与、経口投与または坐薬投与などの他の経路により投与される。
【００３７】
ＩＬ−１、またはＮＡＬＰ３インフラマソームによるその成熟を遮断する阻害剤としての医薬組成物は当技術分野で公知であり、選択された投与様式に適するように設計される。薬学上許容される担体、賦形剤ならびにバッファー、界面活性剤、保存剤、可溶化剤、安定剤は既知の実務に従って用いられる。
【００３８】
好ましい実施形態では、好ましいＩＬ−１Ｒａまたは抗ＩＬ−１αおよびβまたは抗ＩＬ−１ＲＩ抗体は１日１回、好ましくは１週間に１回、いっそうより好ましくは１か月に１回、ＩＬ−１αおよびβ活性を阻害するのに十分な用量で投与される。
【００３９】
当業者、より詳しくは痛風または偽痛風の治療を指示する医師であれば、とりわけ、疾病の病期、患者の年齢、体重および健康状態を考慮に入れてこの用量を決定することができる。
【００４０】
抗ＩＬ−１αおよびβ抗体の推奨用量は１〜２０ｍｇ／ｋｇの間、好ましくは２〜１０ｍｇ／ｋｇの間、より好ましくは３〜５ｍｇ／ｋｇの間からなる。好ましい投与経路は静脈注入である。
【００４１】
注入は医師が決定する特定の投与プログラムで投与される。このようなプログラムは最初の注入後、１または２および５または６週目に追加注入し、その後、８〜１０週ごとにさらなる注入を行うことを含んでもよい。
【００４２】
ＩＬ−１Ｒａの推奨用量は５０〜１５０ｍｇ／日の間の１日投与量を含む。好ましい投与経路は皮下注射である。
【００４３】
本発明の方法では、ＮＡＬＰ３インフラマソーム阻害剤は、既知の抗痛風化合物または組成物および既知の抗炎症性化合物または組成物などの他の治療薬と併用してもよい。
【００４４】
既知の抗痛風化合物および組成物はコルヒチン、またはアロプリノールもしくはウリカーゼなどの、尿酸の蓄積を防ぐ組成物から選択される。
【００４５】
既知の抗炎症性化合物および組成物はプレドニゾン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、コルチバゾール、ヒドロコルチゾン、トリアムシノロンなどのコルチコイド類、ならびにインドメタシン、スリンダック、チアプロフェン酸、アルミノプロフェン、ジクロフェナク、エトドラック、フルルビプロフェン、イブプロフェン、ケトプロフェン、ナブメトン、ナプロキセン、メロキシカム、ピロキシカム、テノキシカム、セレコキシブ、レフェコキシブなどの非ステロイド類、および薬局方に挙げられている他の抗炎症性化合物から選択される。
【００４６】
本発明はまた、上記に開示される痛風または偽痛風の治療に用いられる薬剤の製造のための、ＩＬ−１、またはＮＡＬＰ３インフラマソームによるその成熟を遮断する阻害剤の使用に関する。
【００４７】
本発明はまた、哺乳類における炎症性障害の治療、特に、インフラマソームの形成に関連する炎症性障害、より詳しくはＮＡＬＰ３インフラマソーム形成に関連する障害の治療のための、１７−ＡＡＧまたは１７−ＤＭＡＧをはじめとする、上記に開示されるようなＨＳＰ９０阻害剤の使用に関する。
【００４８】
本発明はまた、哺乳類における炎症性障害の治療、特に、インフラマソームの形成に関連する炎症性障害、より詳しくはＮＡＬＰ３インフラマソーム形成に関連する障害の治療に用いられる薬剤の製造のための、１７−ＡＡＧまたは１７−ＤＭＡＧをはじめとする、上記に開示されるようなＨＳＰ９０阻害剤の使用に関する。
【００４９】
このような炎症性障害はより詳しくは、痛風、偽痛風、マックル−ウェルズ症候群、遺伝性周期性発熱、家族性地中海熱、家族性寒冷誘導自己炎症症候群、ブラウ症候群、関節リウマチ、変形性関節症、全身型若年性特発性関節炎、乾癬、狼瘡、多発性硬化症、喘息、慢性閉塞性肺疾患、炎症性腸疾患、クローン病、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病などの自己免疫および自己炎症性疾患から選択される。
【００５０】
このようなＨＳＰ９０の阻害剤は全く単独で用いてもよいし、あるいは上記に開示される他の抗炎症性化合物および組成物と併用してもよい。
【００５１】
材料および方法
結晶の作製
ＭＳＵ結晶を記載のようにして作製した３１。要すると、０．０１Ｍ  ＮａＯＨ中、１．６８ｇの尿酸を７０℃まで加熱した。必要に応じてＮａＯＨを加え、ｐＨを７．１〜７．２の間に維持し、溶液を濾過し、室温でゆっくり弱い攪拌をしながら連続的に２４時間インキュベートした。硝酸カルシウム溶液（終濃度０．１Ｍ）とピロリン酸ナトリウムの酸性溶液（終濃度，２５ｍＭ  Ｎａ２Ｐ２Ｏ７および３０ｍＭ  ＨＮＯ３）を混合することによりＣＰＰＤを得た。この乳白色沈殿は、濾過し、５０〜６０℃で２４時間インキュベーションした後、ＣＰＰＤ結晶を形成した３２。アロプリノール結晶は従前に記載されているように作製した２。ダイアモンド結晶（１〜３ミクロン）はmicrodiamant AG, Lengwil (Switzerland)から厚意により提供されたものである。結晶は総て無菌状態で維持し、エタノールで洗浄し、乾燥させ、オートクレーブにかけ、音波処理によりＰＢＳ中に再懸濁させ、位相差偏光顕微鏡で観察した。
【００５２】
一次ヒト単球およびＴＨＰ１の調製および刺激
ＴＨＰ１を記載のように１０、刺激の前日に０．５μＭのＰＭＡで３時間刺激した。この処理により細胞の食作用が高まり、プロＩＬ−１βの構成的産生が誘導された３３。ヒト単球を従前に記載されているように精製した３０。総ての細胞を示されているようにＯｐｔｉＭＥＭ培地で刺激した。ヒト成熟ＩＬ−１βを、Cell Signallingからの切断型エピトープ（Ｄ１１６）に対する特異的抗体で、またはBD bioscienceからの酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）で検出した。ＴＮＦおよびＩＬ−６はImmunoToolsからのＥＬＩＳＡにより、カスパーゼ−１はAlexisのＥＬＩＳＡにより検出した。ＩＬ−１８はＭＢＬからの抗体（Ｄ０４４−３）で、カスパーゼ−１はSanta Cruz Biotechnologyからの抗体（ｓｃ−６２２）で検出した。ヒトＩＬ−１βに対する抗体はRoberto Solari, Glaxからの譲渡品であり、ｚ−ＹＶＡＤ−ｆｍｋはAlexis Biochemicalsから購入した。ＩＬ−１ｒａ（アナキンラ，Kineret）はAmgen (thousand Oaks, USA)から入手した。
【００５３】
マウス
ＮＡＬＰ３ターゲティングベクター（図５）をＣ５７ＢＬ／６ＥＳ細胞(Ozgene)にエレクトロポレーションした。相同組換えＥＳ細胞をサザンブロット分析により同定し、Ｃ５７ＢＬ／６胚盤胞にマイクロインジェクションした。後代をＣ５７ＢＬ／６マウスと戻し交配し、生殖細胞系の伝達をテールゲノムＤＮＡのＰＣＲにより確認した（図５ｂ）。テールゲノムＤＮＡ上の次のプライマー：５’ＧＣＴＣＡＧＧＡＣＡＴＡＣＧＴＣＴＧＧＡ（フォワード、イントロン１）、５’ＴＧＡＧＧＴＣＣＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＧＧ（リバース、エキソン２）および５’ＴＴＧＴＡＧＴＴＧＣＣＧＴＣＧＴＣＣＴＴ（リバース、ＥＧＦＰカセット）を用い、ＰＣＲジェノタイピングにより、ＮＡＬＰ３欠損マウスのスクリーニングを行った。ＮＡＬＰ３＋／＋およびＮＡＬＰ３−／−マクロファージから単離されたｃＤＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析により、ＮＡＬＰ３が存在しないことを確認した。ＡＳＣ欠損マウスはVishva Dixit (Genentech, San Francisco)の厚意による譲渡品であり、従前に記載の通りである１１。カスパーゼ−１−欠損マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）はRichard Flavell (Yale University, School of Medecine)の厚意による譲渡品であり、ＭｙＤ８８欠損マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）はShizuo Akira (Research Institute of Microbial Diseases, Osaka University)から入手し、ＩＬ−１Ｒ（ＢＡＬＢ／Ｃ）欠損マウスはManfred Kopf (ETH, Zurich)から入手した。本試験に用いる手順は米国ガイドラインに従った。
【００５４】
マウスマクロファージの調製
示された遺伝子型の８〜１２週齢マウスに４％チオグリコレート溶液を腹腔内注射し、３〜６日後に腹腔洗浄によりマクロファージを採取した。細胞を１２穴ディッシュに７×１０５細胞の密度でプレーティングし、３時間後に非接着細胞を除去した。細胞を、１０％ＦＣＳ、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン／ストレプトマイシンおよびＬ−グルタミンを添加したＲＰＭＩで培養した。総ての細胞を上記のようにＯｐｔｉＭＥＭ培地で刺激した。カスパーゼ−１はSanta Cruz Biotechnologyからの抗体（ｓｃ−５１４）を用い、ＡＳＣは従前に記載されている３４ような抗体を用いて分析した。マウスＩＬ−１βに対する抗体はRoberto Solari, Glaxoからの譲渡品であった。次のマウスＥＬＩＳＡキットを用いた：ＴＮＦおよびＩＬ−１βはR&D systems、ＩＬ−６はBD biosciences。
【００５５】
in vivoマウス腹膜炎モデル
０．５ｍｌ無菌ＰＢＳ中、ＭＳＵ結晶またはチモサン（zymosan）を注射することにより腹膜炎を誘発した。６時間後、マウスをＣＯ２曝露により安楽死させ、腹腔を１０ｍｌのＰＢＳで洗浄した。洗液を、好中球マーカー  Ｌｙ−６ＧおよびＣＤ１１ｂ(BD Pharmingen)を用いるＦＡＣＳにより、ＰＭＮ動員に関して分析した。
【実施例】
【００５６】
以下の実施例は特定の実施形態を示すことを意図するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００５７】
実施例１
本実施例はＭＳＵまたはＣＰＰＤ結晶に応答したヒト起源（ＴＨＰ１）細胞の単球細胞系統による、および、ヒト単球による成熟ＩＬ−１βの産生について記載する。ＴＨＰ１細胞をＭＳＵ結晶とともにインキュベートし、１０μｇ／ｍｌといった少ない結晶で刺激した後にＩＬ−１βの成熟を実際に検出した（図１ａ）。カスパーゼ−１活性化の既知の阻害剤であるｚＹＶＡＤ−ｆｍｋを添加すると、ＭＳＵによる誘発されるＩＬ−１βの活性化が完全に遮断されたが、このことはプロＩＬ−１β切断がカスパーゼ−１に依存することを示唆する（図１ａ）。偽痛風としても知られるピロリン酸カルシウム沈着疾患に関与する別の種類の病原結晶ＣＰＰＤはＭＳＵと同様の活性であった（図１ｂ）。非炎症性アロプリノールまたはダイアモンド結晶およびチモサンやアルミニウム粉末などの特定の要素は、同様の大きさおよび／または化学組成であるにもかかわらず、プロＩＬ−１βプロセシングを誘発することができない（図１ｃ）ので、結晶により誘発されるＩＬ−１βプロセシングはこれらの構造に特異的であった。インフラマソームの既知のアクチベーターに比べ、粗ＬＰＳおよびＡＴＰ、ＭＳＵおよびＣＰＰＤはより活性が高かった１１，１３（図１ｃ）。この優れた能力は、カスパーゼ−１の第二の既知基質であるプロＩＬ−１８のプロセシングを分析する場合に特に明白であった（図１ｃ）。従前に本発明者らは、インフラマソームの活性化の後、炎症性カスパーゼが切断され、活性なＩＬ−１βとともに放出されることを実証している１３。このことは細胞をＭＳＵおよびＣＰＰＤで処理した場合にも見られた（図１ｃ，ｄ）。結晶が介在するカスパーゼ−１の活性化はＴＨＰ１細胞系統の独特な特性であるということを排除するため、ＭＳＵおよびＣＰＰＤを精製ヒト単球に加えた。図１ｄに示されるように、一次細胞では両病原結晶に対する強い応答も惹起された。
【００５８】
実施例２
本実施例は結晶により誘発される炎症におけるＮＡＬＰ３インフラマソームの直接的関与を示す。本発明者らは、インフラマソーム複合体または他のプロ炎症性経路の種々の鍵タンパク質を欠損したマウスに由来する腹腔マクロファージ（ＰＭΦ）を分析した。ex vivoではＰＭΦ中のプロＩＬ−１βは存在しない、かつ／または急速に分解されることを考えると、また、本発明者らはＭＳＵまたはＣＰＰＤによりプロＩＬ−１βの転写または翻訳の直接的誘発を認めることはできなかったので、サイトカインの合成を誘導するためＰＭΦ中のＴＬＲ４を純粋なＬＰＳで刺激した１１，１３。ヒト単球における本発明者らのこれまでの知見と一致し、ＭＳＵまたはＣＰＰＤで刺激されたマウスＰＭΦはカスパーゼ−１を活性化し、成熟ＩＬ−１βを分泌した（図２ａ）。成熟はカスパーゼ−１欠損マウス由来のＰＭΦでは無効であり、この活性化の特異性が確認された。予測されたように、ＭｙＤ８８欠損ＰＭΦは、それらのＴＬＲシグナル伝達欠陥のために成熟ＩＬ−１βを産生せず、その結果、ＬＰＳ予備刺激後にプロＩＬ−１βを産生することができなかった（図２ａ）。それでもなお、ＭｙＤ８８−／−ＰＭΦはカスパーゼ−１を活性化した（図２ａ）ので、さらに、この活性化はＴＬＲに依存せず、インフラマソームの関与の可能性と一致することが示唆される１３，１５。ＡＳＣはＮＡＬＰインフラマソーム複合体へのカスパーゼ−１の動員に必要とされる重要なアダプタータンパク質である１２。ＡＳＣ欠損ＰＭΦは、ＭＳＵ結晶およびＣＰＰＤ結晶による刺激後に成熟ＩＬ−１βを産生しなかった（図２ｂ）。
【００５９】
ヒトゲノムは１４種類のＮＡＬＰのレパートリーを持っている。そのうちいくつがインフラマソームを形成するのかは現在のところ明らかでない。ＮＡＬＰ３は単球とマクロファージの双方で発現し、ヒトおよびマウスでよく保存されている。本発明者らは、ＮＡＬＰ３インフラマソームが結晶により誘発されるカスパーゼ−１の活性化に関与している可能性があると考えたことから、ＮＡＬＰ３欠損マウスを作出した（図３）。ＡＳＣ−／−マウス由来のＰＭΦと同様、ＭＳＵおよびＣＰＰＤ曝露時にＮＡＬＰ３欠損ＰＭΦではＩＬ−１βの放出が損なわれた（図２ｃ）。同様に、ＭＳＵ曝露時のＮＡＬＰ３欠損マウスマクロファージではＩＬ−１αの放出が損なわれたが、ＴＮＦαは損なわれなかった（図２ｄ）。インフラマソームの他の既知の非微生物刺激であるＡＴＰによるＩＬ−１βの誘導もＮＡＬＰ３に依存していた（図２ｃ）。ＡＴＰ受容体Ｐ２Ｘ７の遮断はＡＴＰにより駆動されるインフラマソームの活性化を阻害したが、それはＭＳＵにより誘発される活性化には効果が無く、このことはこの２つのインフラマソーム活性化経路が独立に働いていることを示す（図４）。
【００６０】
実施例３
本実施例は、ＭＳＵまたはＣＰＰＤ結晶に応答したＴＮＦの産生が、ＩＬ−１の分泌に依存することを示す。その活性がカスパーゼ−１の活性化に依存するサイトカインの他、ＭＳＵおよびＣＰＰＤもＴＮＦ−αなどの他のサイトカインを誘導することが知られており１７，１８、さらに、結晶のインフラマソームに依存しない活性が示唆されている。ＴＮＦ−αの放出をアッセイした際、本発明者らは、ＴＮＦ−αの産生が比較的緩慢で、ＩＬ−１βの放出が先行したことを認めた１９（図５ａ）。従って、ＴＮＦ−αの分泌は少なくとも部分的に、放出された成熟ＩＬ−１βにより開始される可能性があった。実際に、ＩＬ−１βの成熟をｚＹＶＡＤ−ｆｍｋで遮断したところ、ＴＬＲ２アゴニストのチモサンによるＴＮＦ−α産生に影響を及ぼさずに、ＭＳＵおよびＣＰＰＤにより誘導されるＴＮＦ−αの産生が５０％を超えて低下した（図５ａ）。同様に、ＩＬ−１シグナル伝達の天然阻害剤であるＩＬ−１Ｒａは、ヒト単球によるＴＮＦ−αおよびＩＬ−６産生に有意に影響を及ぼした（図５ｂ）。
【００６１】
実施例４
本実施例は、ＭＳＵ結晶またはＣＰＰＤ結晶の接種によるＩＬ−１β放出には無傷な細胞骨格が必要であること、およびコルヒチン（微小管の適正な集合を妨げる薬剤）はＮＡＬＰ３インフラマソームの活性化を阻害することを示す。関節内ＭＳＵ注射前にコルヒチンで静脈内処理すると炎症が著しく低減するが２３、このことはコルヒチンが炎症の初期段階を標的とすることを示唆している。従って、本発明者らは、結晶により誘発されるＩＬ−１βの成熟にけるコルヒチンの役割を調べた。図６に示されるように、コルヒチン（その溶媒エタノールではない）で前処理すると、ＩＬ−１βのプロセシングが完全に遮断された。これに対し、コルヒチンは細胞外ＡＴＰによるＩＬ−１βの活性化には影響を及ぼさず、この薬剤がインフラマソームの活性化の上流で働くことが示唆される。
【００６２】
実施例５
本実施例は、痛風または偽痛風の治療のためのＮＡＬＰ３インフラマソームの形成を阻害する小分子化合物について記載する。多くの場合、多タンパク質構造の集合は、最終的なタンパク質多量体の個々の成分と熱ショックタンパク質などのシャペロンタンパク質との間の複合体の形成による。植物で行われている研究からも、ＮＡＬＰタンパク質と構造的に関連のある植物病害耐性タンパク質（Ｒタンパク質）の活性がＨＳＰ９０クライアントタンパク質Ｓｇｔ１により制御されることが知られている。この実験では、尿酸一ナトリウム（ＭＳＵ）結晶で刺激されたヒト単球による成熟ＩＬ−１βの産生が培養培地に既知のＨＳＰ９０阻害剤であるゲルダナマイシンを添加することにより排除されることが示された。また、ゲルダナマイシンはＰＧＮおよびＡＴＰなどの他の刺激によって誘導されるＩＬ−１βの産生も阻害した（図７）。同様に、ゲルダナマイシンの低毒性誘導体である１７−ＡＡＧも、ＡＴＰ（図８ｂ）またはＭＳＵ結晶（図８ｃ）により刺激されたマウスマクロファージによるＩＬ−１βの産生をほぼ完全に阻害したが、ＴＮＦα産生の低下は５０％未満であった（図８ａ）。また同様に、ゲルダナマイシンの水溶性誘導体である１７−ＤＭＡＧも、ＭＳＵ結晶により刺激されたマウスマクロファージ（図８ｄ）またはヒト血液単球（図８ｅ）によるＩＬ−１βの産生を阻害した。
【００６３】
ゲルダナマイシンによるこの成熟ＩＬ−１β分泌の低下は、ＩＬ−１の転写レベル、インフラマソームの集合、インフラマソームの活性または成熟ＩＬ−１βの分泌における阻害作用によるものである可能性がある。ゲルダナマイシンがＭＳＵ刺激単球による成熟ＩＬ−１βの分泌をどのように妨げるかを解明するため（上記図７参照）、ゲルダナマイシン処理の後にＮＡＬＰ３の発現が損なわれたかどうか検討した。Ｓｇｔ１発現はＳｇｔ１特異的ｓｉＲＮＡ処理により排除され、ＮＡＬＰ３発現は維持されたことから、ＮＡＬＰ３発現はＳｇｔ１の存在に依存しないことが示された。培養培地にゲルダナマイシンを添加すると、Ｓｇｔ１の存在または不在にかかわらずにＮＡＬＰ３発現が排除された（図９）。これらの結果は、成熟ＩＬ−１βの分泌に対するゲルダナマイシンの阻害作用を説明する。
【００６４】
これらの結果を合わせると、ＮＡＬＰ３インフラマソームの集合に対する、それゆえ成熟ＩＬ−１βの分泌に対するゲルダナマイシンまたはその誘導体１７−ＡＡＧおよび１７−ＤＭＡＧの作用が示される。これらの結果は、ＮＡＬＰ３インフラマソームの形成を阻害する分子が痛風または偽痛風に治療に使用可能であるという考えを裏付けるものである。
【００６５】
実施例６
本実施例は、インフラマソーム成分に欠損があるマウスにおける、ＭＳＵ結晶に応答するin vivo炎症性浸潤物の減少について記載する。臨床上、痛風および偽痛風は、関節内および関節周囲の空間における好中球の著しい浸潤を伴う症状である関節の浮腫および紅斑に関連し、結果として激しい痛みを伴う。この顕著な好中球流入は、結晶の腹腔内注射によりマウスで実験的に再現することができる２４。本発明者らは、結晶により誘発される炎症におけるインフラマソームのin vivoでの役割を検討するため、この十分確立されたモデルを用いた。ＭＳＵ、ＣＰＰＤまたはアロプリノール結晶を注射し、６時間後に好中球の腹腔動員を分析した。ＭＳＵおよびＣＰＰＤは双方とも、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに注射した場合、ＰＢＳまたはアロプリノールに比べて好中球の動員の顕著な増加を誘発した（図１０ａ）。重要なこととしては、病原結晶をカスパーゼ−１またはＡＳＣ欠損マウスに注射した場合には好中球流入が６０％低下したことであり（図１０ｂおよびｃ）、このことはこのプロセスにおけるインフラマソームおよびＩＬ−１βの主要な役割を示唆している。特に、ＡＳＣ欠損マウスでは、チモサンにより誘発される好中球流入は影響を受けなかった（図１０ｃ）。
【００６６】
実施例７
本実施例は、マウスモデルにおいてＩＬ−１Ｒの関与／誘発が痛風症状に決定的な役割を果たしていることを示す。ＷＴまたはＩＬ−１ＲＩ欠損マウスの腹腔にＭＳＵ結晶、またはＩＬ−１ＲＩに対する遮断型モノクローナル抗体と、もしくはＩＬ−１Ｒａ（アナキンラ，Kineret）と組み合わせて、またはＩＬ−１αおよびＩＬ−１βに対する遮断型モノクローナル抗体と組み合わせて注射することにより、無菌性腹膜炎を誘発した。注射６時間後に炎症性細胞の動員を測定した。ＩＬ−１Ｒ欠損マウスは、ＭＳＵおよびＣＰＰＤは後の好中球の動員の完全な低下を示した（図１１）。同系列の証拠として、ＫｉｎｅｒｅｔまたはＩＬ−１ＲＩに対するモノクローナル抗体またはＩＬ−１αおよびＩＬ−１βに対するモノクローナル抗体を投与すると、好中球流入がほぼ完全に妨げられた（図１２）。これに対し、ＩＬ−１Ｒ欠損マウスでは、チモサンにより誘発される好中球流入は影響を受けなかった（図１１）。
【００６７】
実施例８
この実施例は、マウスモデルにおいて、ＴＮＦの遮断は痛風の臨床症状を緩和しないことを示す。マウスの腹腔にＭＳＵ結晶を、ＴＮＦαに対する遮断型モノクローナル抗体とともに、または伴わずに、あるいはＩＬ−Ｒａ（アナキンラ，Kineret）とともに注射することにより無菌性腹膜炎を誘発した。注射６時間後に炎症性細胞の動員を測定した。図１３に示されるように、ＴＮＦαに対する遮断型モノクローナル抗体を投与しても好中球流入は低下せず、Ｋｉｎｅｒｅｔの場合は低下した。
【００６８】
実施例９
本実施例は、マウスモデルにおいて、水溶性で経口投与可能なＨＳＰ９０阻害剤である１７−ＤＭＡＧを投与すると、痛風の臨床症状が緩和されることを示す。ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔にＭＳＵ結晶を単独または２５ｍｇ／ｋｇの１７−ＤＭＡＧと組み合わせて注射することにより無菌性腹膜炎を誘発した。注射６時間後に炎症性細胞の動員を測定した。図１４に示されるように、１７−ＤＭＡＧを投与すると、ＭＳＵに応答する好中球流入が低下した。
【００６９】
実施例１０
本実施例は、急性痛風患者においてＩＬ−１の阻害により痛風の臨床症状が改善されることを示す。痛風であることが分かっている４名の患者をアナキンラ(Kineret)で処置した。
【００７０】
症例１
慢性結節性痛風病歴１３年の７２歳の女性に対し、組換えウリカーゼによる治療の評価を行った。これまでにこの患者はアロプリノールに対して重篤な皮膚反応を示し、ベンズブロマゾンによる尿酸排泄処置は腎臓結石を招いた。これまでの痛風発作の際には、医学的治療は満足のいくものではなかった。高用量では胃腸管出血事例１回を含む胃腸管副作用が引き起こされたため、この患者には低用量のジクロフェナク（５０〜１００ｍｇ／日）にしか耐性がない可能性があった。コルヒチン１ｍｇ／日では耐え難い下痢が起こり、経口コルチコステロイドでは激しい腹痛が生じた。ウリカーゼ治療（５日間、毎日１４ｍｇ  ｉｖ）を開始すると尿酸レベルの急速な低下が見られた。治療４日目、手足の関節に関節炎が発症した。過去の発作時にジクロフェナクで処置しても症状の緩和に１週間以上かかったことから、アナキンラ治療が提案された。アナキンラを２日間、１日１００ｍｇ投与した。患者の関節炎はすぐに応答し、４８時間で関節痛は急速に軽減された。この患者はウリカーゼの方針を継続することができた。その後２か月は急な発作は見られなかった。
【００７１】
症例２
慢性結節性痛風病歴８年の７０歳の男性に対し、尿酸値低下治療を評価した。過去の病歴としては、うっ血性心不全、重篤な虚血性心疾患、高血圧症および腎不全（血清クレアチニン２０２μｍｏｌ／Ｌ、正常範囲４４〜８０μｍｏｌ／Ｌ）があった。それまでのアロプリノール治療の試みは、初回投与後に急性痛風が発症し、これは低用量ＮＳＡＩＤに応答しなかったことから棄却された。高用量ＮＳＡＩＤは腎不全のために禁忌であった。低用量コルヒチン（＜１ｍｇ／日）はすぐに下痢を引き起こした。この患者に再び低用量アロプリノール（１００ｍｇ）を開始したが、初回の投与後に右足および足首に急性関節炎が発症した。アナキンラ１日１００ｍｇを３日間投与したところ、関節炎の徴候および症状が急速に軽減された。この患者のアロプリノール１日１００ｍｇを続け、１か月後の追跡調査時には、同じ用量のアロプリノールを続けているにもかかわらず、さらなる発作は見られなかった。
【００７２】
症例３
糖尿病、高血圧症、腎不全および虚血性心疾患の病歴を持つ７２歳の男性は多関節性痛風を呈していた。関節炎は膝、右足首および右足根骨関節を含んでいた。膝関節穿刺液にはＭＳＵ結晶が検出され、この液体は炎症性であった（白血球総数２２．５Ｇ／Ｌ、９８％多形核）。腎不全とコルヒチンによる直腸出血歴のため、経口プレドニゾン１日３０ｍｇによる治療を７日間漸減用量で開始した。ステロイドであるにもかかわらず、関節炎は続き、患者は歩行できなかった。ステロイドを中断した後、アナキンラの３日コースを患者に行ったところ、２日までに関節炎の完全緩解が見られた。１か月後の追跡調査時には関節炎の再発は見られなかった。
【００７３】
症例４
主として右足首と親指を含む多関節性痛風病歴２０年の５０歳の男性は、ますます頻発する痛風発作のために医学的助言を求めていた。この患者はアロプリノールを始めていたが、それが関節炎の発作を誘発するために治療の継続はできなかった。ＮＳＡＩＤは重篤な胃腸管疼痛を引き起こし、コルヒチン１日１ｍｇは効果がなかった。高用量コルヒチンは下痢を起こした。診察時、この患者には右足首の関節に関節炎を有し、関節穿刺液でＭＳＵ結晶が確認された。アロプリノール（３００ｍｇ／日）の開始と同時にアナキンラの試みを開始した。この患者の関節炎は急速に応答し、アロプリノールを継続した。この患者は２か月後、無症候であった。
【参照文献】
【００７４】
2009522339.tif 000002
2009522339.tif 000003
2009522339.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】尿酸一ナトリウム結晶（ＭＳＵ）およびピロリン酸カルシウム二水和物（ＣＰＰＤ）はＩＬ−１βの切断および放出を活性化する。  ａ−ｃ，ＴＨＰ１細胞を示された量／ｍｌのＭＳＵ結晶（ａ）、ＣＰＰＤ（ｂ）または示されるように５０μｇ／ｍｌの純粋なＬＰＳ、ＭＳＵ、アロプリノール結晶、ＣＰＰＤ結晶、ダイアモンド結晶、アルミニウム粒子、チモサン、ＬＰＳの粗調製物、または５ｍＭの細胞外ＡＴＰ（ｃ）で６時間刺激した。上清（ＳＮ）を成熟ＩＬ−１β、ＩＬ−１８またはカスパーゼ−１の存在に関して分析し、細胞抽出物（Cell）をプロＩＬ−１βおよびプロＩＬ−１８の存在に関して分析した。ｄ，ヒト単球を５０μｇ／ｍｌの示された結晶で６時間刺激し、ウエスタンブロットでＩＬ−１β活性化に関して、またはＥＬＩＳＡで放出されたカスパーゼ−１およびＩＬ−１βに関して分析した。
【図２】ＮＡＬＰ３インフラマソームはＩＬ−１αおよびβの成熟に必要である。  前駆体プロＩＬ−１βの合成を誘導するために、野生型（＋／＋）、カスパーゼ−１（Ｃａｓｐ１）またはＭｙＤ８８欠損マウス（ａ）、ＡＳＣ欠損マウスまたは同腹子対照（ｂ）、およびＮＡＬＰ３欠損マウスまたは同腹子対照（ｃ）由来のマウスマクロファージを示されたように超純粋ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ，AlexisまたはInvivogen）の存在下を刺激した。（ｃ）では、超純粋ＬＰＳを刺激の１時間前に加えた。上清（ＳＮ）または細胞抽出物（Cell）を示されたようにウエスタンブロットで分析し、（ｄ）ＷＴまたはＮＡＬＰ３  ＫＯ由来のマクロファージをＬＰＳでプライミングした後、ＭＳＵ結晶で活性化した。ＳＮをＩＬ１に関して試験し、ＥＬＩＳＡでＴＮＦ含量を調べた。
【図３】マウスＮＡＬＰ３遺伝子の破壊のための遺伝子ターゲティング戦略  ａ，ＥＧＦＰカセットをエキソン２のＡＴＧと同一フレーム内に挿入した。このＥＧＦＰカセットの後にＳＶ４０ポリ（Ａ）テールを続けると、ＮＡＬＰ３遺伝子が破壊された。２つのｌｏｘＰ部位によりフランキングされた選択カセットＰＧＫ−ｎｅｏをイントロン２に挿入した。このｎｅｏカセットを、このマウスとＣｒｅ発現欠失系統（Ｃ５７ＢＬ／６）と戻し交雑することにより欠失させた。ｂ，ＫＯ、ＷＴおよびヘテロ接合マウスのＰＣＲジェノタイピング。
【図４】尿酸一ナトリウム結晶（ＭＳＵ）が媒介するＩＬ−１βの活性化はＡＴＰ−受容体Ｐ２Ｘ７と独立に起こる。  ＴＨＰ１細胞をＰ２Ｘアンタゴニストであるピリドキサール−ホスフェート−６−アゾフェニル−２’，４’−ジスルホン酸（ＰＰＡＤＳ，Alexis）で３０分間前処理した後、ＭＳＵ結晶（５０μｇ／ｍｌ）で６時間刺激した。上清（ＳＮ）を成熟ＩＬ−１βの存在に関して分析し、細胞抽出物（Cell）をプロＩＬ−１βの存在に関して分析した。
【図５】ＩＬ−１βの成熟はＭＳＵおよびＣＰＰＤ刺激後すぐに起こる事象である。  ａ，ＴＨＰ１細胞をカスパーゼ−１阻害剤ｚＹＶＡＤ−ｆｍｋの存在下または不在下で示された時間、ＭＳＵ、ＣＰＰＤまたはチモサン（Ｚｙｍ）で刺激した。上清をＥＬＩＳＡによりＴＮＦ−α（グレーのバー）およびＩＬ−１β（黒いバー）産生に関して分析した。ｂ，ヒト単球を２種類の濃度のＩＬ−１Ｒａの存在下でＭＳＵまたはＣＰＰＤとともにインキュベートした。ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の産生をＥＬＩＳＡでモニタリングした。
【図６】ＩＬ−１βの成熟はコルヒチンにより遮断される。  ＴＨＰ１細胞をコルヒチン（ｃｏｌｃｈ）の存在下または不在下で、ＭＳＵ、ＣＰＰＤまたはＡＴＰで刺激した。ＩＬ−１βの成熟をウエスタンブロットで分析した。
【図７】一次マクロファージにおけるＩＬ−１βの成熟はゲルダナマイシンにより遮断される。  ヒト一次単球を一晩２００ｎＭゲルダナマイシン（ＧＡ）で処理した後、ＭＳＵ（１００μｇ／ｍｌ）、ＰＧＮ（５０μｇ／ｍｌ）または５ｍＭ（ＡＴＰ）で６時間刺激した。上清を採取し、ＩＬ−１βプロセシングに関して評価した。
【図８】尿酸一ナトリウム結晶で刺激したマウス腹腔浸出細胞およびヒト血液単球によるＩＬ−１β産生に対する１７−ＡＡＧおよび１７−ＤＭＡＧの作用  ＢＡＬＢ／Ｃマウスにチオグリコレート４％溶液を腹膜内注射した。６日後、腹腔をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄することにより腹腔浸出細胞（ＰＥＣ）を採取した。細胞を組織培養１２穴プレートの穴に分注した（１０６細胞／穴）。非接着細胞を洗浄し、接着細胞を２００ｎＭの１７−ＡＡＧ(Invivogen)の存在下または不在下、１μｇ／ｍｌのＵｌｔｒａｐｕｒｅ  ＬＰＳ(Invivogen)で処理した。（ａ）一晩培養した後、上清を採取し、ＥＬＩＳＡによるＴＮＦの測定に用いた。（ｂ，ｃ）新鮮培地を２ｍＭのＡＴＰまたは１００μｇ／ｍｌ  ＭＳＵの存在下または不在下の細胞に加えた。５時間後、上清を採取し、ＩＬ−１βをＥＬＩＳＡにより測定した。（ｄ）マウス腹腔マクロファージを５０ｎＭの１７−ＤＭＡＧ(Invivogen)の存在下または不在下、５００ｎｇ／ｍｌのＵｌｔｒａｐｕｒｅ  ＬＰＳ(Invivogen)で処理した。２時間後、細胞を５００μｇ／ｍｌ  ＭＳＵで刺激した。４時間後、上清を採取し、ＩＬ−１βをＥＬＩＳＡにより測定した。（ｅ）ヒト血液単球を段階的用量の１７−ＤＭＡＧ(Invivogen)の存在下または不在下、１μｇ／ｍｌのＵｌｔｒａｐｕｒｅ  ＬＰＳ(Invivogen)で処理した。一晩培養した後、細胞を１００μｇ／ｍｌ  ＭＳＵで刺激した。６時間後、上清を採取し、ＩＬ−１βをＥＬＩＳＡにより測定した。
【図９】ゲルダナマイシン処理時のＮＡＬＰ３の分解  Ｆｌａｇタグの付いたＮＡＬＰ３  Ｔ−ｒｅｘ細胞をＳｇｔ１に対するｓｉＲＮＡまたはスクランブルｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後、ＮＡＬＰ３をドキシサイクリンで誘導した。細胞をゲルダナマイシン１μＭで８時間処理した。細胞溶解液中のＮＡＬＰ３の分解をウエスタンブロットで分析した。
【図１０】結晶により媒介される腹膜炎のマウスモデルにおけるインフラマソームの役割  （ａ−ｃ）示された野生型または変異型マウスに０．５ｍｌ  ｉ．ｐ．の無菌ＰＢＳ単独、または１ｍｇの示された結晶もしくは０．２ｍｇのチモサンを添加したものを投与した。６時間後に好中球流入を定量した（値は各群ｎ＝４〜６マウスの±Ｓ．Ｅ．Ｍである）。片側スチューデントのｔ検定を用いてｐ値を算出した。
【図１１】マウスモデルにおいてＩＬ−１Ｒ結合／惹起は痛風症状に決定的役割を果たす。  示された野生型または変異型マウスに０．５ｍｌ  ｉ．ｐ．の無菌ＰＢＳ単独、または１ｍｇの示された結晶もしくは０．２ｍｇのチモサンを添加したものを投与した。６時間後に好中球流入を定量した（値は各群ｎ＝４〜６マウスの±Ｓ．Ｅ．Ｍである）。片側スチューデントのｔ検定を用いてｐ値を算出した。
【図１２】マウスにおける尿酸一ナトリウム結晶により誘発される炎症に対するアナキンラ(Kineret)および抗ＩＬ−１受容体１型（ＩＬ−１ＲＩ）モノクローナル抗体の作用  雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５００μｇ尿酸一ナトリウム結晶（ＭＳＵ）とＰＢＳ、２００μｇアナキンラ(Kineret, Amgen Inc., Thousand Oaks, USA)、２００μｇ抗ＩＬ−１  ＲＩモノクローナル抗体(BD Pharmingen, San Jose, USA)、２００μg抗ＩＬ−１αモノクローナル抗体(Biolegend, San Diego, USA)、２００μｇ抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体(Biolegend, San Diego, USA)、または２００μｇ抗ＩＬ−１αモノクローナル抗体と２００μｇ抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体の組合せを注射することにより無菌性腹膜炎を誘発した。６時間後、マウスを屠殺し、腹腔を１０ｍｌの冷ＰＢＳで洗浄した。好中球マーカーＣＤ１１ｂおよびＧｒ１（Ｌｙ−６Ｇ）を用いるＦＡＣＳにより、この洗液を好中球動員に関して分析した。値は各群４〜５匹の好中球総数の±ｓ．ｅ．ｍ．である。片側スチューデントのｔ検定を用いてｐ値を算出した。
【図１３】抗ＴＮＦαモノクローナル抗体による、ＭＳＵにより誘発される好中球動員の阻害は見られない。  雌ＢＡＬＢ／Ｃマウスに、５００μｇ尿酸一ナトリウム結晶（ＭＳＵ）とＰＢＳ、２００μｇアナキンラ(Kineret, Amgen Inc., Thousand Oaks, USA)または２００μｇ抗ＴＮＦαモノクローナル抗体(BD Pharmingen, San Jose, USA)を注射することにより無菌性腹膜炎を誘発した。６時間後、マウスを屠殺し、腹腔を１０ｍｌの冷ＰＢＳで洗浄した。好中球マーカーＣＤ１１ｂおよびＧｒ１（Ｌｙ−６Ｇ）を用いるＦＡＣＳにより、この洗液を好中球動員に関して分析した。値は各群４〜５匹の好中球総数の±ｓ．ｅ．ｍ．である。片側スチューデントのｔ検定を用いてｐ値を算出した。
【図１４】マウスにおける尿酸一ナトリウム結晶により誘発される炎症に対するゲルダナマイシンの水溶性類似体である１７−ＤＭＡＧの作用  雌ＢＡＬＢ／ＣマウスをＮａＣｌ  ０．９％または２５ｍｇ／ｋｇ  １７−ＤＭＡＧで腹膜内処理した。１時間後、５００μｇ尿酸一ナトリウム結晶（ＭＳＵ）を注射することにより無菌性腹膜炎を誘発した。５時間後、マウスを屠殺し、腹腔を１０ｍｌの冷ＰＢＳで洗浄した。好中球マーカーＣＤ１１ｂおよびＧｒ１（Ｌｙ−６Ｇ）を用いるＦＡＣＳにより、この洗液を好中球動員に関して分析した。値は各群５匹の好中球総数の±ｓ．ｅ．ｍ．である。片側スチューデントのｔ検定を用いてｐ値を算出した。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図８ｄ】
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【図８ｅ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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