(57)【要約】  本発明は、核酸分子のプールから複数の選択された核酸分子を増幅する、及び任意選択で、定量化する、及び／又は同定する改善された方法に関する。多重反応が、反応成分を求めるアンプリコン間での有意な競合が起きる前のポイントまで進行できる場合に使用される第１ラウンドの多重増幅。この後に、第２ラウンドの増幅が続き、この第２ラウンドの増幅は、一般的に、選択された核酸分子のそれぞれを定量化させるために蛍光レポーターを含む。前記方法は、遺伝子発現産物等の種々の供給源からの核酸の増幅及び定量化に有用であり、それによって、多数のそのような産物を、非常に限られたサンプル及び分解された保存記録のサンプルから増幅及び定量化できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子のプールから複数の選択された核酸分子を増幅する方法であって：
（ａ）複数の外側のプライマー対を含む第１ラウンド多重増幅反応において、複数の選択された核酸分子を増幅するステップであって、各対が選択された核酸配列に特異的であり、前記増幅反応が、反応成分を求めるアンプリコン間での有意な競合が起きる前のポイントまで進行できる、ステップ；及び、
（ｂ）前記完了した多重反応の一部を鋳型として、及び、内側のプライマーの対を少なくとも１つそれぞれ含む複数の第２ラウンド増幅反応において、前記選択された核酸分子をさらに増幅するステップであって、各第２ラウンド反応が前記複数の選択された核酸分子のサブセットをそれぞれさらに増幅するように各対が前記選択された核酸配列の１つに特異的である、ステップ；
を含む方法。
【請求項２】
核酸分子のプールから複数の選択された核酸分子を増幅する方法であって：
（ａ）複数の外側のプライマー対を含む第１ラウンド多重増幅反応において、複数の選択された核酸分子を増幅するステップであって、各対が選択された核酸配列に特異的であり、前記増幅反応が、反応成分を求めるアンプリコン間での有意な競合が起きる前のポイントまで進行できる、ステップ；並びに、
（ｂ）前記完了した多重反応の一部を鋳型として、及び、プライマーの対を少なくとも１つそれぞれ含む複数の第２ラウンド増幅反応において、前記選択された核酸分子をさらに増幅するステップであって、各第２ラウンド反応が前記複数の選択された核酸分子のサブセットをそれぞれさらに増幅するように、各対が、内側のプライマー及び前記外側のプライマーの１つを含み、さらに、前記選択された核酸配列の１つに特異的である、ステップ；
を含む方法。
【請求項３】
核酸分子のプールから選択された核酸分子の数を見積もる方法であって：
（ａ）複数の外側のプライマー対を含む第１ラウンド多重増幅反応において、複数の選択された核酸分子を増幅するステップであって、各対が選択された核酸配列に特異的であり、前記増幅反応が、反応成分を求めるアンプリコン間での有意な競合が起きる前のポイントまで進行できる、ステップ；
（ｂ）検出可能なレポーター、前記完了した多重反応の一部を鋳型として、及び、内側のプライマーの対を少なくとも１つそれぞれ含む複数の第２ラウンド増幅反応において、前記選択された核酸分子をさらに増幅するステップであって、各対が前記選択された核酸配列の１つに特異的であり、それによって各第２ラウンド反応が前記複数の選択された核酸分子のサブセットをそれぞれさらに増幅する、ステップ；並びに、
（ｃ）各選択された配列の選択された核酸分子の数が見積もられるように、各第２ラウンド増幅反応を前記検出可能なレポーターによりモニターする、ステップ；
を含む方法。
【請求項４】
核酸分子のプールから選択された核酸分子の数を見積もる方法であって：
（ａ）複数の外側のプライマー対を含む第１ラウンド多重増幅反応において、複数の選択された核酸分子を増幅するステップであって、各対が選択された核酸配列に特異的であり、前記増幅反応が、反応成分を求めるアンプリコン間での有意な競合が起きる前のポイントまで進行できる、ステップ；並びに、
（ｂ）検出可能なレポーター、前記完了した多重反応の一部を鋳型として、及び、プライマーの対を少なくとも１つそれぞれ含む複数の第２ラウンド増幅反応において、前記選択された核酸分子をさらに増幅するステップであって、各第２ラウンド反応が前記複数の選択された核酸分子のサブセットをそれぞれさらに増幅するように、各対が、内側のプライマー及び前記外側のプライマーの１つを含み、さらに、前記選択された核酸配列の１つに特異的である、ステップ；並びに、
（ｃ）各選択された配列の選択された核酸分子の数が見積もられるように、各第２ラウンド増幅反応を前記検出可能なレポーターによりモニターする、ステップ；
を含む方法。
【請求項５】
請求項３又は請求項４に記載された、核酸分子のプールから選択された核酸分子の数を見積もる方法であって、前記蛍光発生レポーターが、二本鎖ＤＮＡの間に介入する色素である方法。
【請求項６】
請求項３又は請求項４に記載された、核酸分子のプールから選択された核酸分子の数を見積もる方法であって、前記蛍光発生レポーターが、一本鎖ＤＮＡと相互作用する蛍光発生プローブである方法。
【請求項７】
請求項３又は請求項４に記載された、核酸分子のプールから選択された核酸分子の数を見積もる方法であって、前記第２ラウンド増幅反応が、各選択された配列の複数の選択された核酸分子が増幅及び定量化されるように、複数のプライマー対及び複数の蛍光発生プローブを含む方法。
【請求項８】
前記核酸分子がＤＮＡ分子を含む、上記請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９】
上記請求項のいずれか１つに記載された、複数の選択された核酸分子を増幅する方法であって、前記第２ラウンド増幅反応に含まれた前記プライマーが、前記第１ラウンド増幅反応に含まれた前記外側のプライマーのうち少なくとも１つよりも高いＴｍを有し、前記第２ラウンド増幅反応における前記オリゴヌクレオチドプライミングが、前記のより高いＴｍを有する前記プライマーを好んで実質的に偏っているようになっている、方法。
【請求項１０】
上記請求項のいずれか１つに記載された、複数の選択された核酸分子を増幅する方法であって、前記外側のプライマーのうち少なくとも１つが、ＵＴＰヌクレオチドを含み、それによって、前記プライマーは、ＵＮＧ酵素による消化を受け入れられる、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載された、複数の選択された核酸分子を増幅する方法であって、前記外側のプライマーは、ＵＮＧ酵素を用いた消化により前記第１ラウンドの増幅の終わりで除去され、その結果、前記第１ラウンドのプライマーによる前記第２ラウンド増幅反応の汚染を実質的に防いでいる、方法。
【請求項１２】
前記第１ラウンド多重増幅反応が、約１乃至３０サイクルで進行できる、上記請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１３】
前記第１ラウンド多重増幅反応が、約５乃至２５サイクルで進行できる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１ラウンド多重増幅反応が、約５乃至２０サイクルで進行できる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１ラウンド多重増幅反応が、約１０乃至２０サイクルで進行できる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記多重増幅反応が、約４個を超える選択された核酸分子を増幅する、上記請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１７】
前記多重増幅反応が、約４乃至１５０個の選択された核酸分子を増幅する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記多重増幅反応が、約１０乃至１５０個の選択された核酸分子を増幅する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記多重増幅反応が、約２０乃至１００個の選択された核酸分子を増幅する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
上記請求項のいずれか１つに記載された、複数の選択された核酸分子を増幅する方法であって、遺伝子多型、突然変異、挿入、及び遺伝子欠失を検出する方法に使用される方法。
【請求項２１】
上記請求項のいずれか１つに記載された、複数の選択された核酸分子を増幅する方法であって、疾患及び障害を診断する方法に使用される方法。
【請求項２２】
腫瘍の診断に使用される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記腫瘍が乳癌である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記腫瘍が結腸直腸癌である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１乃至２１のいずれか１つに記載された、複数の選択された核酸分子を増幅する方法であって、選択された生物の検出及び同定に使用される方法。
【請求項２６】
前記生物が、前記核酸産物の配列により検出及び同定される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記生物が、細菌、ウイルス、真菌、マイコプラズマ、及び寄生虫、若しくはその組合せの群から選択される、請求項２５又は請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記方法が融解曲線分析を含む、請求項２０乃至２７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２９】
前記融解曲線が、約０．０５℃から約０．０２℃の範囲の分解能をもって作成される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記融解曲線が、約０．０２℃未満の分解能をもって作成される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記増幅反応が、熱サイクル装置において自動的に進行される、上記請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３２】
前記熱サイクル装置が、複数の穴を持つリアルタイム熱サイクル装置である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記熱サイクル装置が、連続流れＰＣＲ装置である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記熱サイクル装置が、回転式の熱サイクル装置である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも１つの選択された核酸配列を同定及び／又は定量化する方法であって：
１又は複数の選択された核酸配列を、１又は複数の検出可能なレポーターと混合するステップ；
前記１又は複数の検出可能なレポーターにより発生した信号を測定することによって、融解曲線を作成するステップ；
前記融解曲線から前記１又は複数の選択された核酸配列を同定及び／又は定量化するステップ；
を含む方法。
【請求項３６】
前記融解曲線が、約０．０５℃から約０．０２℃の範囲の分解能をもって作成される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記融解曲線が、約０．０２℃未満の分解能をもって作成される、請求項３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の増幅、同定、及び定量化の方法に関し、特に、診断学的、法医学的、及び研究的な使用のために複数の遺伝子若しくは遺伝子発現産物を増幅及び定量化、又は同定する改善された方法に関する。本発明は、核酸の小さく及び分解されたサンプルから、複数の核酸配列をより正確に増幅、同定、及び定量化する方法にも関する。
【０００２】
特に、本発明は、複数の核酸分子の同時の増幅及び定量化に関し、本出願に関しては以下に記述される。しかし、本発明は、この特定分野での使用に限定されないことが理解される。
【背景技術】
【０００３】
本明細書を通じて従来技術のいかなる考察も、そのような従来技術が広く知られている、又は、当分野の一般的な共通の知識の一部を形成するという承認として決して考慮されるべきではない。
【０００４】
遺伝子発現を分析する既知の方法は、選択されたｃＤＮＡ配列を増幅するＰＣＲ又はネステッドＰＣＲの使用を含む。選択されたｃＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡ分子のプールからの単一遺伝子の発現産物を表し、ｃＤＮＡ分子のプールは、多くの異なる遺伝子を表している。単一遺伝子ＰＣＲ反応では、単一遺伝子からの遺伝子発現産物は、一般的に、１ラウンドのＰＣＲにおいて一対のプライマーを用いて増幅される。典型的なネステッドＰＣＲ増幅反応において、１つの非常に希少な配列が、２つの連続的なＰＣＲ反応により増幅される。その連続的な反応は、それぞれ、１つのネステッドプライマーの組合せを使用した３０〜４０サイクルからなっている。ネステッドＰＣＲは、通常、希少な配列のクローンを得るために使用され、遺伝子発現の定量化又は遺伝子の同定には通常考慮されない。ＰＣＲを用いて遺伝子発現のレベルを定量化するために、各関心のあるＰＣＲ産物の量が、従来のリアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて一般的に測定され、各サイクルの増幅後、リアルタイムでのＰＣＲ産物の累積を測定する。これには、本出願に援用されている米国特許第６，７１３，２９７号に開示されているように、挿入色素、副溝結合色素、又は蛍光発生プローブ等の検出可能なレポーターが一般的に利用され、それによって、光の施用がレポーターに蛍光を発するよう刺激し、結果として生じる蛍光は、ＣＣＤカメラ又は光電子倍増管検知システムを用いて一般的に検知される。単一遺伝子分析方法が、現在、日常的ではあるけれども、複数の遺伝子発現産物が多重ＰＣＲにおいて同じＰＣＲ反応内で増幅されなければならない場合に、障害が生じる。多重増幅反応において、個々の遺伝子発現産物はそれぞれ、ＰＣＲ反応の開始時に高コピー数で存在する高発現遺伝子の産物が、重要な反応成分を隔離することにより、低コピー数の遺伝子産物の増幅を効果的に防ぐように、ＰＣＲ中に反応成分を求めて競合しなければならない。これにより、少数の高発現遺伝子のみを表す増加された遺伝子産物のプールが生じる。これらの産物の分析は、反復実験間で起こる大きな差異によりさらに複雑になり、その大きな差異は、遺伝子発現の正確な定量化を非常に難しくしている。プライマー及び反応成分の最適化がこの問題をある程度にまで軽減するけれども、これは、一般的に大規模な実験を必要とし、多重反応において分析される遺伝子の数が増加するに従い、さらに難しくなる。それによって、４種類の遺伝子が、一般的に、大規模に最適化されたシステムにおいて、信頼して分析できる最大数である。遺伝子発現分析には、一般的に、各遺伝子発現の量が見積もられることが必要とされ、その見積は多重ＰＣＲにおいてさらに複雑になっている。
多重ＰＣＲへの現代のアプローチ
この問題への現代のアプローチは、Ｔａｑｍａｎ（Ｒ）プローブ等の蛍光発生検知システムの使用を含み、各遺伝子発現産物に結合して特定の検知可能な蛍光を放出することにより、これらの遺伝子発現産物を個々に検知する（Ｅｘｎｅｒ  Ｍ．Ｍ．，ａｎｄＬｅｗｉｎｓｋｉ．Ｍ．Ａ．（２００２））。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ及びＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使用した多重リアルタイムＰＣＲ反応の感受性は、ＤＮＡポリメラーゼの濃度に依拠している（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ．２００２  Ｏｃｔ；１６（５）：３５１−７）。これらのプローブ及びその使用は、米国特許第５，２１０，０１５号；５，４８７，９７２号；５，８０４，３７５号；５，９９４，０５６号；５，５３８，８４８号、及び６，０３０，７８７号において記載されており、本出願に援用される。これは、異なる波長で蛍光を検知するための複数のチャンネルを有するリアルタイム熱サイクル装置を必要とする。さらに、Ｔａｑｍａｎ（Ｒ）プローブは、購入するには高価で、プローブ結合のための特異的配列の必要性により分析できる特定領域の配列を限定する恐れもある。
【０００５】
他の蛍光発生方法は、本出願に援用されている米国特許第５，４３６，１３４号及び５，６５８，７５１号において開示されているように、いかなる遺伝子産物からの増幅したＤＮＡにも挿入された場合に蛍光を発するＳＹＢＲ−グリーン色素等の一般的な検知システムの使用を含む。ＳＹＢＲ−グリーン色素は、使用するのに安価で優れた蛍光発生性質を有しているが、各遺伝子産物に関して、蛍光の供給源として多重ＰＣＲにおける遺伝子発現のレベルを見積もるためには、通常、適切ではなく、その遺伝子発現のレベルは信頼して決定できない。
【０００６】
検知システムとしての蛍光発生プローブ又はＳＹＢＲ−グリーン色素の使用には関係なく、それでも多重ＰＣＲは、遺伝子発現産物が反応成分を求めて競合するという同じ問題を被っており、その結果、複数の遺伝子からの遺伝子発現の正確な定量化を妨げている。
ハイスループット方法
多重遺伝子発現測定への別のアプローチは、マイクロアレイの使用を含む。マイクロアレイを使用して、何千という遺伝子の発現を同時に定量化することができる。しかし、マイクロアレイには、一般的に、大規模な操作訓練、多量のサンプルＲＮＡ、及び大規模な設備が必要とされる。さらに、分析できる遺伝子の数は多いけれども、結果として生じる遺伝子発現の定量化は、精度においてはるかに劣っており、擬陽性を生じることが多い。
【０００７】
このように、複数の遺伝子の発現の正確な定量化が必要とされる、又は、特定の核酸の検知が必要とされる、又は、複数の核酸産物の作製が必要とされる等、いかなる設定における使用にも適切な簡単で安価な方法の必要性がある。本発明は、血斑、レーザーダイセクション顕微鏡サンプル、単細胞、並びに、年数を経たサンプル及びホルマリン固定したパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）切片から得られた核酸のように部分的に分解した核酸を含有するサンプル等の非常に小さいサンプルからの核酸の増幅及び検知に特に適している。しかし、本発明の方法は、大きなサンプル及び高品質のサンプルにも等しく応用可能である。本発明が有用でありうる設定の例は、それだけに限らないが：診断学；予後徴候；法医学；環境並びに製品試験及びモニター；生物兵器検出；研究等を含む。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明の目的は、従来技術の欠点のうち少なくとも１つを克服若しくは改善する、又は、有用な代案を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、核酸増幅及び定量化の方法に関し、特に、診断的、法医学的、及び研究的な使用のための複数の遺伝子発現産物を増幅及び定量化、又は同定する改善された方法に関する。本発明は、少量の開始材料を用いた多くの遺伝子からの遺伝子発現の定量化又は同定に特に応用可能であり、文書館資料又は法医学的な材料から得られたサンプル等の分解されたサンプルにも使用できる。当業者は、本発明の方法は、ゲノムＤＮＡ又はウイルスＤＮＡ等の他の供給源からの核酸の増幅に等しく応用可能であることを理解するであろう。本発明は、第１ラウンド多重増幅反応を含めた２ラウンドのタンデム型増幅手順を使用する。第１ラウンド多重増幅反応は、複数の選択された核酸配列を増幅し、その後、複数の第２ラウンド増幅反応が続き、どちらも、一般的に、その選択された核酸配列の１つをさらに増幅する。
【００１０】
本発明の第１の態様によると、核酸分子のプールから複数の選択された核酸分子を増幅する方法が提供されており、その方法は：
（ａ）外側のプライマー対を複数含む第１ラウンド多重増幅反応において、複数の選択された核酸分子を増幅するステップであって、各プライマー対が選択された核酸配列に特異的であり、前記増幅反応が、反応成分を求めるアンプリコン間での有意な競合が起きる前のポイントまで進行できるステップ；及び、
（ｂ）前記完了した多重反応の一部を鋳型として、及び、内側のプライマーの対を少なくとも１つそれぞれ含む複数の第２ラウンド増幅反応において、前記選択された核酸分子をさらに増幅するステップであって、各第２ラウンド反応が複数の選択された核酸分子のサブセットをそれぞれさらに増幅するように各プライマーの対が前記選択された核酸配列の１つに特異的である、ステップ；
を含む。
【００１１】
本発明の第２の態様によると、核酸分子のプールから複数の選択された核酸分子を増幅する方法が提供されており、その方法は：
（ａ）外側のプライマー対を複数含む第１ラウンド多重増幅反応において、複数の選択された核酸分子を増幅するステップであって、各プライマー対が選択された核酸配列に特異的であり、前記増幅反応が、反応成分を求めるアンプリコン間での有意な競合が起きる前のポイントまで進行できるステップ；並びに、
（ｂ）前記完了した多重反応の一部を鋳型として、及び、プライマーの対を少なくとも１つそれぞれ含む複数の第２ラウンド増幅反応において、前記選択された核酸分子をさらに増幅するステップであって、各第２ラウンド反応が複数の選択された核酸分子のサブセットをそれぞれさらに増幅するように、各プライマーの対が、内側のプライマー及び外側のプライマーの１つを含み、さらに、前記選択された核酸配列の１つに特異的である、ステップ；
を含む。
【００１２】
本発明の第３の態様によると、核酸分子のプールから選択された核酸分子の数を見積もる方法が提供されており、その方法は：
（ａ）外側のプライマー対を複数含む第１ラウンド多重増幅反応において、複数の選択された核酸分子を増幅するステップであって、各プライマー対が選択された核酸配列に特異的であり、前記増幅反応が、反応成分を求めるアンプリコン間での有意な競合が起きる前のポイントまで進行できるステップ；
（ｂ）検出可能なレポーター、前記完了した多重反応の一部を鋳型として、及び、内側のプライマーの対を少なくとも１つそれぞれ含む複数の第２ラウンド増幅反応において、前記選択された核酸分子をさらに増幅するステップであって、各プライマーの対が前記選択された核酸配列の１つに特異的であり、それによって各第２ラウンド反応が複数の選択された核酸分子のサブセットをそれぞれさらに増幅する、ステップ；並びに、
（ｃ）各選択された配列の選択された核酸分子の数が見積もられるように、各第２ラウンド増幅反応を前記検出可能なレポーターによりモニターするステップ；
を含む。
【００１３】
本発明の第４の態様によると、核酸分子のプールから選択された核酸分子の数を見積もる方法が提供されており、その方法は：
（ａ）外側のプライマー対を複数含む第１ラウンド多重増幅反応において、複数の選択された核酸分子を増幅するステップであって、各プライマー対が選択された核酸配列に特異的であり、前記増幅反応が、反応成分を求めるアンプリコン間での有意な競合が起きる前のポイントまで進行できるステップ；並びに、
（ｂ）検出可能なレポーター、前記完了した多重反応の一部を鋳型として、及び、プライマーの対を少なくとも１つそれぞれ含む複数の第２ラウンド増幅反応において、前記選択された核酸分子をさらに増幅するステップであって、各第２ラウンド反応が複数の選択された核酸分子のサブセットをそれぞれさらに増幅するように、各プライマーの対が、内側のプライマー及び外側のプライマーの１つを含み、さらに、前記選択された核酸配列の１つに特異的である、ステップ；並びに、
（ｃ）各選択された配列の選択された核酸分子の数が見積もられるように、各第２ラウンド増幅反応を前記検出可能なレポーターによりモニターするステップ；
を含む。
【００１４】
本発明の一実施形態において、完全にネステッド型の多重タンデム型ポリメラーゼ連鎖反応（ＭＴ−ＰＣＲ）法が、第１及び第３の態様において使用され、それによって、第１ラウンドの増幅には外側のプライマーを、第２ラウンドの増幅には内側のプライマーを２個使用して、各選択された核酸分子は増幅される。
【００１５】
本発明の別の実施形態において、ヘミネステッドな（ｈｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄ）ＭＴ−ＰＣＲ法が第２及び第４の態様に従い使用され、それによって、各選択された核酸分子が、第１ラウンドの増幅において外側のプライマーの対を使用して増幅され、選択された核酸配列が、前記第１ラウンドの増幅で使用された前記外側のプライマーの１つを内側のプライマー１個と対にして含むプライマーの対を使用して第２ラウンドの増幅においてさらに増幅される。
【００１６】
好ましくは、蛍光発生レポーターはＳＹＢＲ−グリーン又はＳＹＴＯ−９色素である。
【００１７】
当業者は、他の蛍光発生色素も熟慮されることを理解するであろう。
【００１８】
いくつかの実施形態において、前記蛍光発生レポーターは蛍光発生プローブである。
【００１９】
いくつかの実施形態において、前記第２ラウンド増幅反応は、各選択された配列の複数の選択された核酸分子が、それぞれが選択された核酸配列に特異的である蛍光プローブにより増幅及び定量化されるように、複数のプライマー対及び複数の蛍光プローブを含む。
【００２０】
当業者は、第２ラウンド増幅反応を同時に又は順次に実行できることを認識するであろう。
【００２１】
好ましくは、前記核酸分子はＤＮＡ分子を含む。
【００２２】
好ましくは、前記第２ラウンド増幅反応における前記オリゴヌクレオチドプライミングが、より高いＴｍを有するプライマーを好んで実質的に偏っているように、前記第２ラウンド増幅反応に含まれた前記プライマーは、前記第１ラウンド増幅反応に含まれた前記外側のプライマーのうち少なくとも１つよりも高いＴｍを有している。
【００２３】
いくつかの実施形態において、前記外側のプライマーのうち少なくとも１つが、ＵＴＰヌクレオチドを含み、それによって、前記プライマーは、ＵＮＧ酵素による消化を受け入れられ、前記外側のプライマーは、ＵＮＧ酵素を用いた消化により前記第１ラウンドの増幅の終わりで除去される。その結果、前記第１ラウンドのプライマーによる前記第２ラウンド増幅反応の汚染を実質的に防いでいる。
【００２４】
好ましくは、使用される多重増幅サイクルの数は、各選択された核酸配列の特異的増幅を提供する一方で、反応成分を求めるアンプリコン間での有意な競合が起きる前のポイントまでアンプリコンを増幅することにより、増幅中のこれらの反応成分を求めるアンプリコン間でのいかなる競合の影響も最小化するため、反応の開始に使用される核酸の量に留意して選択される。例えば、約５０ｎｇから約５００ｎｇまでの核酸が使用される場合、約１０サイクルの多重増幅が好ましい。約０．５から約５０ｎｇまでの核酸が使用される場合は、約１５サイクルの多重増幅が好ましい。約０．０１から約０．５ｎｇまでの核酸が使用される場合は、約２０サイクルの多重増幅が好ましい。より少量の核酸が投入された場合に、多数の多重増幅サイクルを使用できることは、本明細書に提供されている教示から、当業者には明らかである。
【００２５】
好ましくは、前記第１ラウンド多重増幅反応は、約１乃至３０サイクルで進行できる。より好ましくは、前記第１ラウンド多重増幅反応は、約５乃至２５サイクルで進行でき、さらに好ましくは、前記第１ラウンド多重増幅反応は、約５乃至２０サイクルで進行でき、最も好ましくは、前記第１ラウンド多重増幅反応は、約１０乃至２０サイクルで進行できる。
【００２６】
標準的な多重ＰＣＲ反応を使用して、一般的に、限られた数の異なる配列のみ（４配列等）増幅、定量化、及び同定することができるけれども、驚いたことに、本発明の方法を使用すると、１５０を超える選択された配列を増幅、定量化、及び／又は同定できることが発見されている。好ましくは、本発明の多重増幅反応により、約４を超える選択された核酸分子が増幅される。より好ましくは、前記多重増幅反応により、約４乃至１５０個の選択された核酸分子が増幅される。さらに好ましくは、前記多重増幅反応により、約１０乃至１５０個の選択された核酸分子が増幅され、最も好ましくは、前記多重増幅反応により、約２０乃至１００個の選択された核酸分子が増幅される。
【００２７】
当業者は、所与のサンプルのために第１ラウンド多重増幅反応において効果的に増幅できる選択された核酸分子及びプライマーの群の最大数は、必要とされる増幅のレベル、及び、第２ラウンドの増幅において結果として生じる定量化の精度を留意してそれぞれのケースにおいて決定されなければならないことを理解するであろう。
【００２８】
好ましくは、前記方法は、遺伝子多型、突然変異、挿入、及び遺伝子欠失を検出する方法に使用される。
【００２９】
一実施形態において、蛍光発生プローブが、遺伝子多型、突然変異、ＳＮＰ、メチル化（亜硫酸水素塩処理後）、挿入、及び遺伝子欠失等の核酸変異体を検出するために、第２ラウンドの増幅に使用されている。
【００３０】
いくつかの実施形態において、前記方法が、疾患及び障害の診断に使用されている。
【００３１】
いくつかの実施形態において、前記方法が、腫瘍の診断に使用されている。
【００３２】
いくつかの実施形態において、前記腫瘍は、乳癌である。
【００３３】
いくつかの実施形態において、前記腫瘍は、結腸直腸癌である。
【００３４】
当業者は、本発明の方法は、いかなる核酸配列の増幅及び／又は定量化によっても検出できるいかなる疾患又は障害に対する診断検査において有用であると認識するであろう。
【００３５】
いくつかの実施形態において、前記方法は、選択された生物の検出及び同定に使用できる。
【００３６】
いくつかの実施形態において、前記生物は、高分解能融解分析により検出及び同定される。
【００３７】
好ましくは、前記生物は、細菌、ウイルス、真菌、マイコプラズマ、及び寄生虫の群から選択される。
【００３８】
好ましくは、前記方法は高分解能融解曲線分析を含み、前記融解曲線は、約０．０５℃から約０．０２℃の範囲の分解能をもって作成されるのが好ましく、０．０２℃未満の分解能で作成されることがさらに好ましい。
【００３９】
当業者は、本発明の方法は、増幅可能ないかなる遺伝子材料にも応用でき、この材料はいかなる生物からも由来できることを理解するであろう。
【００４０】
好ましくは、前記増幅反応は、熱サイクル装置において自動的に進行する。
【００４１】
好ましくは、前記熱サイクル装置は、複数の穴を持つリアルタイム熱サイクル装置（ｍｕｌｔｉ−ｗｅｌｌ  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｉｎｇ  ａｐｐａｒａｔｕｓ）である。
【００４２】
いくつかの実施形態において、前記熱サイクル装置は、連続流れＰＣＲ装置である。
【００４３】
いくつかの実施形態において、前記熱サイクル装置は、回転式の熱サイクル装置である。
【００４４】
本発明の第５の態様によると、少なくとも１つの選択された核酸配列を同定及び／又は定量化する方法が提供されており、その方法は：
（ｉ）１又は複数の選択された核酸配列を、１又は複数の検出可能なレポーターと混合するステップ；
（ｉｉ）前記１又は複数の検出可能なレポーターにより発生した信号を測定することによって、融解曲線を作成するステップ；
（ｉｉｉ）前記融解曲線から前記１又は複数の選択された核酸配列を同定及び／又は定量化するステップ；
を含む。
前記融解曲線は、約０．０５℃から約０．０２℃の範囲の分解能をもって作成されるのが好ましく、０．０２℃未満の分解能で作成されることがさらに好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
多重タンデム型ポリメラーゼ連鎖反応（ＭＴ−ＰＣＲ）と呼ばれる２ラウンドのタンデム型ＰＣＲ手順を、比較的小さなサンプルの核酸からの大きなグループの遺伝子の発現を、削減された費用にて少ない時間で正確に測定するために設計した。多くの遺伝子発現産物が反応成分を求めて競合する多重ＰＣＲに伴う問題は、アンプリコン間での競合が最小化されるように、多重増幅が予め選択された数のサイクルに限定される本発明により克服される。感受性は、２ラウンド増幅を使用することにより改善される。その２ラウンド増幅は、一般的に遺伝子の群からの発現産物である選択された核酸配列の全てを、以前は単一遺伝子の発現産物等の単一の選択された配列からの産物を定量化するためのみに十分であったある量のサンプルを用いて測定することを可能にする。第２ラウンドの核酸増幅が急速なサイクルパラメータを使用できるため、全体の処理時間は減少する。
【００４６】
好ましい実施形態において、多重反応から複数の配列を検出するために以前は必要とされた高価なラベルされたオリゴヌクレオチドプローブを使用するのではなく、ＳＹＢＲ−グリーンＤＮＡ測定を使用することにより費用は削減される。
【００４７】
別の実施形態において、Ｔａｑｍａｎ（Ｒ）プローブ等の蛍光発生プローブも、第２ラウンド増幅反応において、単一の選択された核酸又は複数の選択された核酸の増幅された産物を検出及び定量化するために使用できる。
【００４８】
臨床サンプルからの遺伝子発現レベルを分析するために、ＲＮＡが、初めに、一般的にはホルムアルデヒドにおいて保存された生検組織からの適切な組織、血液サンプル、又は他の組織から抽出される。次に、ｃＤＮＡがＲＮＡサンプルから逆転写により調製される。逆転写は、発現された配列の大部分からｃＤＮＡを調製するために（ランダムプライミングのための）ランダム六量体を使用して、より好ましくは遺伝子特異的な方法により行うことができる。
【００４９】
好ましい実施形態において、逆転写反応（ＲＴ反応）は、関心のある選択された核酸に特異的な外側のプライマーの各対を使用した複数遺伝子に特異的なプライミング法を用いて実行される。これらの同じ外側のプライマーが、第１ラウンド多重増幅において関心のある特異的遺伝子発現産物を増幅するために後に使用される。その方法は以下に記述される。逆転写及び第１ラウンドの増幅に同じプライマーを使用することにより、反応混合物に使用されるオリゴヌクレオチドの数が減少される。遺伝子特異的プライミングにより、何年も保存してきたホルマリン固定したパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料から抽出されたＲＮＡをＭＴ−ＰＣＲに使用させてしまうＲＮＡ分解に伴う問題も低減される。ＲＴ反応は、約１分間実行され、それは、後の増幅のために必要とされたｃＤＮＡを作成するのに十分な時間である。多重増幅のアンプリコンは、一般的に、約１５０ｂｐ未満の長さであり、能率的な逆転写も後の増幅も促進する。改善された結果も、反応において少量のＲＴ酵素を使用して得られ、さらに、好ましい実施形態において、約１ユニット／μlのＭＭＬＶ又はＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ酵素がＲＴ反応において使用される。
【００５０】
逆転写酵素は、ＰＣＲ反応の抑制物質であり、多重増幅に先だってその酵素を除去又は変性させるのに有用である。好ましい実施形態において、逆転写酵素は、多重増幅ステップに先立ち、約９５℃の加熱ステップにより変性される。この逆転写酵素は、ｃＤＮＡを変性するためにも働き、そのｃＤＮＡを多重第１ラウンドの増幅のために準備させる。
【００５１】
好ましくは、第１ラウンド反応において、キャリア蛋白質が添加され、酵素を安定化する。ＢＳＡ、クリスタリン、及び他の蛋白質又は安定剤も、使用可能である適切な代替物であるけれども、ゼラチンが、安価且つ約９５℃で安定であるため、キャリア蛋白質に良好である。
【００５２】
第１ラウンド多重増幅は、一般的に、多重増幅において多数の発現された遺伝子又は配列産物の共増幅を可能にするために必要とされる外側のプライマー及び成分を含む。
【００５３】
反応の形式は使用される設備に留意して選択できることが、当業者には明らかになる。例えば、７２の増幅反応を作動するために使用できる「Ｇｅｎｅ−Ｄｉｓｃ」（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いた場合、そのようなディスクを１枚若しくは７２の個々の遺伝子を使用して約２４の遺伝子の発現産物を３回定量化できる、又は、９６穴プレートの形式を使用して約３２の遺伝子発現産物を３回定量化することができる、又は、必要とされる統計学的な妥当性に留意して数を選択することもできる。
【００５４】
当業者は、便宜上、３８４穴プレート、９６穴プレート、又は連続流れ装置等のいかなる他の適切な形式も使用できることを理解するけれども、以下の記述された形式は、Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社「Ｇｅｎｅ−Ｄｉｓｃ」の使用に関する。
【００５５】
好ましくは、各第１ラウンド多重増幅において、約７２対の外側のプライマーが、約７２の配列を同時に増幅するために使用され、その約７２の配列それぞれが、遺伝子の発現産物又は他の発現された配列を表している。
【００５６】
好ましくは、外側のプライマーは、完全にネステッドなＭＴ−ＰＣＲでは、約２５０ｂｐ以下、ヘミネステッドなＭＴ−ＰＣＲでは、約１５０ｂｐ以下のＤＮＡのアンプリコンからなるＤＮＡ断片を各遺伝子発現産物から増幅するよう設計される。
【００５７】
当業者は、標準的な実験経験を用いて、本発明をより長い長さの選択された核酸配列にも応用でき、適切なｃＤＮＡ合成及び増幅を成し遂げるために、ＲＴ反応に使用される時間の長さ及び増幅中に使用される延長時間等の条件の変更も増加できることを認識するであろう。
【００５８】
多重増幅中の反応成分を求めるアンプリコン間での競合という問題を克服するために、増幅反応が、使用されるＲＮＡの投入レベルに応じて比較的低いサイクル数に操作される。自動化された器具において、多重増幅反応における全ＤＮＡ合成のレベルを、ＳＹＢＲ−グリーン色素等の挿入蛍光発生色素で測定することができ、このポイントが越えられないことを確実にしている。第１ラウンド多重増幅に使用されるサイクルの数を、選択された核酸及び入手可能なサンプルの大きさの相対的存在量に留意して最適化することができ、多重第１ラウンドの増幅におけるこれらのアンプリコンの増幅により、全ポリヌクレオチド量の約５％を超えるアンプリコンを作製しないようになっている。全ポリヌクレオチド量の約５％を超えるアンプリコンは、さらなる増幅がもはや成し遂げられないポイントを越えるサイクル数で進行できる反応において作製されてしまう。方法におけるこの変形により、選択された核酸配列（遺伝子発現産物等）のプールが、反応成分を求める有意な競合が多重増幅中にそのそれぞれのアンプリコン間で起こるレベルまで増幅しないよう防がれる。合成された核酸の総量はそれでも比較的少ないため、常に試薬の過剰量が大きく、従って、多重増幅反応におけるアンプリコン間の競合は実質的に最小化される。
【００５９】
多重増幅サイクルの数は、検出反応における所望の感受性に従い選択される。好ましくは、約１０サイクルの多重増幅が、約５０〜５００ｎｇのＲＮＡサンプルからの遺伝子発現の検出に使用される。好ましくは、約１５サイクルが、約０．５〜５０ｎｇのＲＮＡからの遺伝子発現の検出に使用され、さらに、好ましくは、約２０サイクルが、約０．０１〜０．５ｎｇのＲＮＡからの検出に使用される。当業者は、より少ない量のＲＮＡが投入された場合に、より多くの数の多重増幅サイクルを使用できることを認識するであろう。
【００６０】
実行において、同じ種類で同じ量のサンプルが使用された場合、遺伝子発現の比較が、同じ数の多重増幅サイクルを使用してＭＴ−ＰＣＲアッセイ間で行われる。
【００６１】
好ましい実施形態において、この第１ラウンドの増幅は、１０ｎｇのＲＮＡ又はＤＮＡを投入して１５サイクル作動され、アンプリコン間の競合の可能性をさらに減少するために、高レベルのヌクレオチド三リン酸（約０．３ｍＭ）が反応混合物に含められる。第１ラウンド多重増幅における外側のプライマーの濃度も、反応産物が第２ラウンド増幅反応に移送された場合にこれらのプライマーの濃度をさらに減少し、その結果、第２ラウンド増幅反応に対するこれらのプライマーの影響を減少するために、約０．１μＭまで減少される。
【００６２】
これにより、多重増幅におけるアンプリコン間での競合という重大な問題が低減されるけれども、そのような少ない数の増幅サイクルを用いて得られた増幅は、発現された核酸分子の正確な検出又は定量化を可能にするのに十分な増幅を提供せず、完了した多重増幅反応混合物は、多数の発現された核酸配列由来の増幅された産物のプールをなおも含んでいる。このプールからの特異的な選択された配列の別々の第２ラウンド増幅反応におけるさらなる増幅により、各遺伝子又は発現された配列からの増幅産物が、分析のために十分に増幅できるようになる。その分析は、実質的に個々に基づき行われ、その結果、本来の核酸配列のプールから各選択された核酸配列を正確に検出及び定量化できる。
【００６３】
第２ラウンドのＰＣＲに使用される減少された量のプライマー及びＴａｑポリメラーゼ酵素は、二量体化されたプライマーの形成等、非特異的な産物形成の可能性をさらに減少する。いくつかの実施形態において、約０．５ユニットのＴａｑが、２０μlの第２ラウンド増幅反応それぞれに使用され、プライマー濃度が約０．２μＭまで減少される。好ましくは、これらの条件下でのＧＣが豊富なアンプリコンの増幅を促進するために、約２％ＤＭＳＯが添加される。
【００６４】
好ましい実施形態において、約３５サイクルの第２ステージ増幅が、一般的に、不十分に発現された遺伝子からの遺伝子発現産物の正確な定量化を可能にするのに十分である。第１及び第２ラウンドの増幅におけるサイクルの数は、第１ラウンド多重増幅反応に先立ち異なる量の開始材料からこれらの核酸が増幅されている場合にも核酸の定量化を可能にするよう変更でき、それによって、使用する開始材料の量が少ないと、より多くの数の第１及び第２ラウンド増幅サイクルが一般的に必要とされることが当業者により認識される。
【００６５】
一実施形態において、完了した第１ラウンド多重増幅反応から一定分量が採取され、個々の第２ラウンド増幅反応混合物をそれぞれ含有する、いくつかの独立したチューブに添加される。この一定分量において適切なレベルの希釈度が第２ラウンド増幅反応混合物への添加で起こるように、この一定分量を第２ラウンド反応混合物への添加に先立ち希釈する、又は、少量の第１ラウンド産物を移送することができる。
【００６６】
好ましくは、２５ｘの希釈度の第１ラウンド多重増幅産物が、各第２ラウンド反応チューブへのその添加に先立ち作製され、その一定分量が第２ラウンド増幅反応内で希釈される場合には、約１００ｘのレベルまでのさらなる希釈が得られる。当業者は、希釈のレベルは変更できるが、これは、一般的に、剰余の第１ラウンド外側プライマーが第２ラウンドの増幅における各選択された核酸配列の定量化の精度に影響を与えるのを防ぐために、十分高くあるべきだということを認識するであろう。
【００６７】
この希釈ステップにより、第１ラウンド多重増幅から第２ラウンドの増幅まで通過する第１ラウンド外側プライマーの量は、取るに足らないことが確実にされ、第２ラウンドの増幅におけるさらなるプライミングが、第２ラウンドプライマーにより実質的に導かれるようになっており、その結果、選ばれた第２ラウンドプライマーにより刺激されたそれらの選択された分子のみを実質的に増幅するようになっている。
【００６８】
好ましくは、個々の第２ラウンド増幅反応はそれぞれ、内側のプライマーの対を含み、そのプライマーは、第１ラウンドの多重増幅で増幅された発現された配列、又は、選択された遺伝子の１つのアンプリコンの１つにある小領域に相補的であるよう選択されている。各内側のプライマーの対は、より短いアンプリコンを増幅し、好ましい実施形態において、これらの短いアンプリコンは約７０〜９０ｂｐ又はそれ以下である。
【００６９】
別の実施形態では、アンプリコンが約１５０ｂｐ以下であることが好ましいヘミネステッドなＭＴ−ＰＣＲにおいて、選択された核酸配列をさらに増幅するために、追加量の第１ラウンド外側プライマーの１つが、対応する内側のプライマーの１つと組合せで、第２ラウンド増幅反応に追加される。
【００７０】
このように、大部分の増幅が起こる第２ラウンドの増幅において、各関心のある遺伝子又は発現された配列の増幅反応を分離することにより、各アンプリコンは、さらなる分析を促進する独立した状態で、他の配列からの競合も無く増幅される。
【００７１】
好ましい実施形態において、凍結乾燥した形状の第２ラウンドプライマーを第２ラウンドＰＣＲ反応容器内に包含することにより、処理時間は減少される。適切な反応容器の例として、「Ｇｅｎｅ−Ｄｉｓｃ」（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）、９６穴ＰＣＲプレート、又は３８４穴ＰＣＲプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、ＵＳＡ）が挙げられる。次に、第１ラウンド増幅産物／反応成分混合物が、第２ラウンドの増幅に先立って反応容器に添加される。
【００７２】
好ましくは、第２ラウンド増幅反応も、偽プライミングの発生及び処理時間を減少するために、高速サイクルの条件を用いて作動される。
【００７３】
好都合なことに、本発明の一実施形態において、第１ステージの多重増幅は、７２穴の「Ｇｅｎｅ−Ｄｉｓｃ」形式に基づいて約３６個の遺伝子のための外側プライマーを含み、各増幅を、総量約１０ｎｇのＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡを用いて２回実行させている。第１ラウンド増幅反応は、約２％ＤＭＳＯの存在下で、それぞれ約０．１μＭの濃度の外側プライマーを含む。約１０増幅サイクルの第１ラウンドの終わりで、反応産物は約２５ｘに希釈され、約５μlのこれらの希釈された産物が、第２ラウンドの増幅内に導入される。第２ラウンドの増幅では、関心のある遺伝子はすでに鋳型に濃縮されているため、高速サイクルが使用される。さらに、内側にプライマーは、多重増幅から作製された選択されたアンプリコン内で結合するように設計される。これらの内側プライマーは、約７０〜９０ｂｐという短いアンプリコンの増幅を可能にするので、第２ラウンドの増幅においては短い延長時間が使用される。一般的に、第２ラウンド増幅サイクル条件は、９５℃で１ｓ、６０℃で１０ｓ、及び７２℃で１０ｓである。
【００７４】
当業者は、さらなる第１ラウンド外側プライマーの対の包含が、不必要な追加の産物を第２ラウンドの増幅において生じない、又は、選択されたアンプリコンの定量化の精度に第２ラウンド中影響しない限り、第１ラウンド多重反応において共増幅できる配列の数は変更できることを認識するであろう。
【００７５】
第２ラウンドの増幅に導入された反応産物は、関心のある選択された核酸配列に濃縮されているため、第２ステージは、高速サイクルの条件を使用することができ、限界濃度のプライマー、及び、第２ラウンドの増幅において独特で正しいアンプリコン産物の形成に貢献する酵素を含むことができる。これによって、非特異的なＤＮＡ分子又は二量体化されたプライマーにより実質的に汚染されていない第２ラウンド増幅産物が生じる。さもなければ、汚染された産物により、分析は複雑になる、又は、阻止されてしまう。
【００７６】
第２ラウンドの増幅に使用される反応混合物は、Ｔａｑｍａｎ（Ｒ）プローブ等のフルオロフォア含有プローブ、又は、蛍光色素等、検出可能なレポーター成分を含むことが好ましく、当業者は、特定のアニーリング温度が、そのようなプローブの使用において必要とされることを認識するであろう。
【００７７】
好ましい実施形態において、レポーター成分は、増幅されたＤＮＡの存在に応じて非特異的な方法で蛍光を発するＳＹＢＲ−グリーン色素であり、それによって、蛍光のレベルは、第２ラウンド増幅反応に存在する増幅されたＤＮＡの量に比例している。この蛍光の発達がモニターされ、各反応において存在する発現された配列又は遺伝子産物の量が定量化されるように、第２ラウンド増幅反応は、増幅中にリアルタイムＰＣＲマシン内でモニターされるのが好ましい。
【００７８】
別の実施形態において、第２ラウンド増幅反応は、複数の選択された核酸配列のためのプライマーを含むことができ、それによって、選択された核酸配列の検出及び定量化が、Ｔａｑｍａｎ（Ｒ）プローブ、又は、他の適切にラベルされたオリゴヌクレオチドプローブ等の蛍光発生プローブを用いて行われる。
【００７９】
さらなる実施形態において、本発明の方法はＤＮＡの分析に応用され、種々の形質（哺乳動物において需要の多い形質及び疾病素因）、ＳＮＰ、（亜硫酸水素塩反応後の）メチル化、遺伝性障害等に付随した特異的な配列を検出する。
【００８０】
当業者は、本発明が、それだけに限らないが、生物兵器検出を含めた、寄生虫、ウイルス、真菌、細菌、及びマイコプラズマ、食物、組織、水、土壌、空気等の汚染の検出、並びに、法医学的な分析に有用になるように、本発明により小さなサンプルの分析が可能になっていることを認識するであろう。
【００８１】
さらなる実施形態において、ＰＣＲに先立つ核酸の処理及びＰＣＲ反応の調製は、ＣＡＳ１２００ロボット（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）、ＭｕｌｔｉＰＲＯＢＥ（Ｒ）ＩＩＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ワークステーション（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、及びｅｐＭｏｔｉｏｎＴＭ５０７５ワークステーション（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（Ｒ））等の適切な装置、又は、当分野において周知である他の装置を用いて自動化される。
【００８２】
好ましくは、核酸増幅システムは、本出願に援用されている米国特許第４，６８３，２０２号、米国特許第４，６８３，１９５号、及び、米国特許第４，９６５，１８８号に記載されているＰＣＲシステムである。
【００８３】
好ましくは、核酸の増幅、検出、及び定量化は、Ｒｏｔｏｒ  Ｇｅｎｅ  ＲＧ６０００（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製７９００ＨＴ、又は、他の適切な器具等の自動化された定量的ＰＣＲの熱サイクル装置における反応の操作及びモニターにより達成される。他の適切な器具の例は、本出願に援用されている欧州特許第１１５７７４４号及び米国特許第６，７１３，２９７号に開示されている。
【００８４】
好ましくは、遺伝子発現測定は、同じバッチのＭＴ−ＰＣＲで実行される比較基準の遺伝子（ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ  ｇｅｎｅ）に相関して表され、実質的に類似した条件のもと行われた遺伝子発現測定のみと比較された。
【００８５】
他の実施形態において、増幅反応は、リガーゼ連鎖反応、自立性配列複製、ローリングサークル型増幅、鎖置換増幅、等温ＤＮＡ増幅等であってもよい。
【００８６】
当業者は、本発明の方法をいかなる生細胞、又は、それだけに限らないが、哺乳動物（ヒトを含める）；鳥類、魚類、植物；爬虫類；節足動物；腹足類；細菌；ウイルス；真菌；及びマイコプラズマを含めた生物にも応用できることも認識するであろう。
【００８７】
当業者は、本発明の方法を使用して、約０．０１ｎｇのＲＮＡが入手可能である単一の哺乳動物細胞等のサンプルから、及び、約１０ｎｇのＲＮＡが得られる単一のＦＦＰＥ組織切片から選択された核酸のレベルを検出できることも認識するであろう。
【００８８】
好ましくは、増幅反応は、複数の穴を持つリアルタイム熱サイクル装置又は連続流れＰＣＲ装置におけるフルイディックス（ｆｌｕｉｄｉｃｓ）ロボットにより自動的に進行する。
【００８９】
別の実施形態において、第２ラウンドの増幅は、（Ｔｍより高い）高温で外側のプライマーに対してアニールする内側のプライマーを含み、その内側のプライマーを用いて第２ラウンドの増幅を特異的にプライムするために、第２ラウンドの増幅におけるアニーリングステップが高温で作動され、その結果、第２ラウンド増幅反応中の外側のプライマーによるプライミングを実質的に防ぐようになっている。
【００９０】
さらなる実施形態において、１又は複数のＵＴＰヌクレオチドが１又は複数の外側プライマーに取り込まれており、これらのプライマーがＵＮＧ酵素による消化を受け入れ、それによって、外側のプライマーを第１ラウンドの増幅の終わりで除去でき、その結果、第１ラウンドのプライマーによる第２ラウンド増幅反応の汚染を実質的に防ぐようになっている。
【００９１】
別の実施形態において、本発明の方法が、良性及び悪性両方の種々の固形腫瘍、並びに、白血病等の形状から選択された腫瘍の診断において等、診断の方法に使用される。
【００９２】
記述されている核酸分子は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及びｃＤＮＡ分子を含む。しかし、関連する変異体も、増幅できる限り熟慮されることが理解される。
【００９３】
オリゴヌクレオチドプローブ内に取り込むことができる蛍光部分の例として、それだけに限らないが、以下の例が挙げられる：カルボキシ−Ｘ−ローダミン、フルオレセイン、６−テトラメチルローダミン−５（６）−カルボキサミド、ＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３ＴＭ、ＢＯＤＩＰＹ−Ｆ１−ＸＴＭ、（４，６−ジクロロトリアジニル）アミノフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、６−（（５−ジメチルアミノナフタレン−１−スルホニル）アミノ）ヘキサン酸、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ５００ＴＭ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ４８８ＴＭ、Ｒｈｏｄｏｌ  ＧｒｅｅｎＴＭ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ５１４ＴＭ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ−ＸＴＭ、ＮＢＤ−Ｘ、テトラクロロフルオレセイン、２’，４’，５’，７’−テトラブロモスルホンフルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ−Ｆ１  ＢＲ２ＴＭ、ＢＯＤＹＰＹ−Ｒ６ＧＴＭ、６−カルボキシ−４’−５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ−５３０／５５０ＴＭ、ヘキサクロロフルオレセイン、Ｃａｒｂｏｘｙｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ６ＧＴＭ、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８ＴＭ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ−ＸＴＭ、１−（３−カルボキシベンジル）−４−（５−（４−メトキシフェニル）オキサゾル−２−イル）ピリジニウムブロミド、ＢＯＤＩＰＹ−５６４／５７０ＴＭ、Ｃｙ３ＴＭ、６−（テトラメチルローダミン−５（６）−カルボキサミド）ヘキサン酸、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅｄ−ＸＴＭ、ＢＯＤＩＰＹ−５７６／５８９ＴＭ、ＢＯＤＩＰＹ−５８１／５９１ＴＭ、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ−ＸＴＭ、Ｃｙ３．５ＴＭ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲ−ＸＴＭ、ＣＹ５ＴＭ、カルボキシナフトフルオレセイン、Ｃｙ５．５ＴＭ。
〔定義〕
本明細書の文脈において、「検出可能なレポーター」という用語は、核酸の量を測定する検出可能な手段を提供する成分を意味し、放射標識された成分、並びに、蛍光部分等を取り込んでいるプローブ（Ｔａｑｍａｎ  ｐｒｏｂｅｓ（Ｒ）等）及び色素等の蛍光レポーターを含む。
【００９４】
本明細書の文脈において、「蛍光レポーター」という用語は、検出可能なレポーターを意味し、（１）蛍光の能力があるヌクレオチド塩基を取り込んでおり、特異的な標的ＤＮＡ配列に結合し、その核酸の量を定量化させる方法で特異的検出可能なレポーターを放出するオリゴヌクレオチド配列（プローブ又は蛍光発生プローブとしても既知である）、又は、（２）ＤＮＡに結合し、その配列の検出及び／又は定量化及び／又は同定を可能にする方法で蛍光を放出する（ＳＹＢＲ−グリーン色素等の）色素である。
【００９５】
本明細書の文脈において、「プローブ」又は「蛍光発生プローブ」という用語は、蛍光の能力があるヌクレオチド塩基を取り込んでいるオリゴヌクレオチド配列を意味し、特異的な標的ＤＮＡ配列に結合し、その核酸の量を定量化させる方法で特異的検出可能なレポーターを放出する。これは、「検出可能なレポーター」及び「蛍光レポーター」の定義内にも分類される。
【００９６】
本明細書の文脈において、「ポリメラーゼ連鎖反応」という用語及びその頭字語「ＰＣＲ」は、当業者により理解されるようにその通常の意味に従い使用される。ＰＣＲ法の例は、当分野で使用されている一般的な分子生物学のテキスト及び解説書で見ることができる。例えば、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（１９８９）Ｅｄ  Ｈ  Ａ  Ｅｒｌｉｃｈ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ。ＰＣＲの例は、一般的に、熱安定性のポリメラーゼ、いくつかの試薬、及び、２種類の短いプライマーを用いて選択された核酸配列を増幅するために使用され、それによって、増幅される配列が、その配列に結合するプライマーの包含により「選択される」。１種類のプライマーが、相補的な塩基対により配列の一末端の（＋）鎖に結合して増幅し、さらに、もう１種類のプライマーが、もう一方の末端の（−）鎖に結合する。新たに合成されるＤＮＡ鎖（アンプリコン）は、後に同じプライマー配列の追加の鋳型として働くことができるため、プライマーアニーリング、鎖伸長、及び解離の連続するラウンドにより、選択された配列の迅速で非常に特異的な増幅が得られる。
【００９７】
本明細書の文脈において、「アンプリコン」という用語は、ＰＣＲなどの核酸増幅工程により作製された、新たに合成されたＤＮＡ鎖を意味する。
【００９８】
本明細書の文脈において、「プライマー」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、（一般的にはＰＣＲ反応での）核酸増幅における増幅（コピー）工程又は逆転写反応を開始するために使用される短い長さのポリヌクレオチド鎖ＤＮＡを意味する。
【００９９】
本明細書の文脈において、「外側のプライマー（又は外側プライマー）」という用語は、図１に示されているように、１又は複数の対応する内側のプライマーにより結合される領域に対して外側の位置で、選択された核酸配列又はアンプリコンに結合するプライマーを意味する。
【０１００】
本明細書の文脈において、「内側のプライマー（又は内側プライマー）」という用語は、図１に示されているように、外側のプライマーの結合位置に対して内側の位置で、選択されたアンプリコンに結合するプライマーを意味する。
【０１０１】
本明細書の文脈において、「ネステッドＰＣＲ」、「完全にネステッドなＰＣＲ」、又は「タンデム型ＰＣＲ」という用語は、２つ以上のラウンド（ステップ）の核酸増幅を意味し、一般的に、２ラウンドのＰＣＲからなり、第１ラウンドのＰＣＲは、外側のプライマーの対を使用して選択された核酸分子を増幅し、さらに、第２ラウンドの増幅が、その増幅された選択された核酸分子由来のアンプリコンを、外側のプライマーの結合位置に対して内側の位置でアンプリコンに結合する内側のプライマーの対を用いてさらに増幅する。
【０１０２】
本明細書の文脈において、「ヘミネステッドなＰＣＲ」又は「ヘミタンデム型（ｈｅｍｉ−ｔａｎｄｅｍ）ＰＣＲ」という用語は、ＰＣＲ反応の形状を意味し、第１ラウンド外側プライマーの１つが第２ラウンド増幅反応にも含まれ、対応する内側のプライマーと協力して選択されたアンプリコンの増幅をプライムする。その対応する内側のプライマーは、もう一方の第１ラウンド外側プライマーの結合位置に対して内側の位置で同じアンプリコンに結合している。
【０１０３】
本明細書の文脈において、「多重ＰＣＲ」、「多重核酸増幅」、又は「多重増幅」という用語は、１対を超えるプライマーの対を含む核酸増幅反応（一般的にはＰＣＲ）を意味し、図１に示されているように単一の反応容器において、２種類以上の異なる選択された核酸配列がその反応により増幅されるようになっている。
【０１０４】
本明細書の文脈において、「選択された核酸分子」又は「選択された核酸配列」という用語は、特定の核酸配列の核酸分子を意味している。例えば、遺伝子発現分析の状況において、１つの選択された核酸配列は、特定の核酸配列の産物である、特定遺伝子の遺伝子発現産物を意味し、複数の選択された核酸配列は、複数の特定遺伝子の遺伝子発現産物を意味する。
【０１０５】
本明細書の文脈において、「核酸」という用語は、ヌクレオチドサブユニットからなる複雑な有機酸分子を意味する。２種類の主な核酸はＤＮＡ及びＲＮＡである。この核酸は、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ，ｃＤＮＡ等、全ての核酸のサブタイプを含む。これは、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ等、種々の形状のＲＮＡも意味する。
【０１０６】
本明細書の文脈において、「ｃＤＮＡ」という用語は、逆転写によりｍＲＮＡから作製されたＤＮＡ配列を意味する。ｃＤＮＡは、その配列が本来のｍＲＮＡ配列の補体であるため、そう呼ばれている。
【０１０７】
本明細書の文脈において、「哺乳動物」という用語は、ヒト、猫や犬等の伴侶動物、馬、牛、豚、羊等の家畜動物を含む。
【０１０８】
本明細書の文脈において、「凍結乾燥した」という用語は、結晶化又は粉末化される場合が多い、乾燥した形状の物質を意味する。
【０１０９】
本明細書の文脈において、「生物」という用語は、いかなる種の植物、動物、細菌、真菌、ウイルス、マイコプラズマ、又は、遺伝子改変された生物も意味し、さらに、寄生性のＤＮＡ配列等にまで及ぶ。
【０１１０】
本明細書の文脈において、「Ｔｍ」という用語は、オリゴヌクレオチドプライマーに使用された場合に、一般的に、オリゴヌクレオチドがその相補的な核酸配列に二本鎖で結合される確率が５０％である温度を意味する。
【０１１１】
本明細書の文脈において、「ＵＴＰ」という用語は、ウリジン三リン酸を意味する。
【０１１２】
本明細書の文脈において、「ウラシルＮ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）」という用語は、デオキシウリジンを含有するＤＮＡにおけるデオキシリボースの糖とウラシルの間にあるＮ−グリコシド結合を加水分解する能力がある酵素を意味する。
【０１１３】
本明細書の文脈において、「反応成分を求めるアンプリコン間での有意な競合が起きる前のポイント」という表現は、選択された核酸配列のさらなる増幅が、第２ラウンドの増幅において得られた定量化の精度に有害になるところ越えた（ｐａｓｔ）増幅反応内のサイクル又はステージを意味する。いかなる特定の機構又は理論により限定されることを望むことなく、言及された定量化の精度に対する害は、ｄＮＴＰ及びプライマー等の反応成分を求める増幅している配列（アンプリコン）間での競合のためであると考慮される。サイクルの数が増加するに従い、これらの成分は次第により不足し、その結果、反応において低濃度になる。入手可能な反応成分がより制限されるに従い、より豊富な核酸種の増幅が有利になり、これにより、第２ラウンド増幅反応における定量化の精度がそこなわれる。従って、各選択された核酸配列の特定の増幅を提供する一方で、増幅中の反応成分を求めるアンプリコン間でのいかなる競合の影響も最小化するために、最適な多重増幅のサイクル数は、投入される核酸の量に留意して選択される。実行において、例えば、５０〜５００ｎｇの核酸が使用される場合、約１０サイクルの多重増幅が、反応成分を求めるアンプリコン間での有意な競合が起きる前のポイントまで選択された核酸分子を増幅するのに十分である。同様に、０．５〜５０ｎｇの核酸が使用される場合、約１５サイクルの多重増幅が好まれる。０．０１〜０．５ｎｇの核酸が使用される場合、約２０サイクルの多重増幅が好まれる。投入された核酸の量が少ないほど、より多くの数の多重増幅サイクルを使用することができる。本発明の方法に使用される多重増幅反応サイクルの数は、一般的に、第２ラウンドの増幅で見積もられる時に、定量化の精度に不利に影響するような大量の選択された核酸配列産物を作製しない。
【０１１４】
次に、本発明は、制限しない実施例を参考にしてより詳しく記述される。
〔実施例〕
実施例１  単一のサンプルからの多重増幅、及び、第２ラウンドの増幅におけるＳＹＢＲ−グリーン検出システムの取り込みを用いて多数の異なる遺伝子の発現を測定するために、ＭＴ−ＰＣＲを使用することができる。
【０１１５】
ＳＹＢＲ−グリーンレポーター色素等の一般的なレポーターを用いた複数の遺伝子発現産物の多重増幅及び測定は、現在可能ではない。しかし、ＭＴ−ＰＣＲ法は、多くの遺伝子の発現産物を同時に増幅する能力を有する。ＭＴ−ＰＣＲ法は、図１において、ＭＴ−ＰＣＲにおけるプライマーの配置を示す概略図として概説されおり、その概略図は、タンデム型及びヘミタンデム型両方の実施形態を示している。「ＲＴ」と示されている、外側のリバースプライマーは、一般的に、ｃＤＮＡの合成をプライムするために使用され、示されている増幅反応に先立つ逆転写反応中、各遺伝子に特異的である。実行においては、７２個の異なる遺伝子の発現産物を増幅するのが一般的であるが、どちらの方法も、４個の異なる遺伝子（１〜４）の遺伝子発現産物増幅及び定量化する工程に示されている。タンデム型ＭＴ−ＰＣＲにおいて、外側のプライマーは多重プライマーとして使用され、核酸種の定量化が行われる場合に、内側のプライマーが第２ラウンド増幅反応において使用される。ヘミタンデム型ＭＴ−ＰＣＲにおいては、内側のプライマーの１つが、第１ラウンド多重増幅反応と第２ラウンド増幅反応の双方の間で共通である。
【０１１６】
ＭＴ−ＰＣＲ法が、複数の遺伝子からの発現産物を定量化することにおいて特に効果的であることを実証するために、５０ｎｇのＲＮＡをＭＣＦ７ヒト上皮細胞から抽出し、７２穴「Ｇｅｎｅ−Ｄｉｓｃ」形式におけるヘミタンデム型ＭＴ−ＰＣＲアッセイに使用して、７２個の異なる遺伝子から発現産物をＳＹＢＲ−グリーン検出を用いて同時に定量化した。工程の第１ステージにおいて、７２個のオリゴヌクレオチドプライマー対を使用した。そのうち２４個が表１及び２に示されている。各プライマー対は、所与の遺伝子発現産物に特異的であり、これらのプライマーを逆転写酵素及びＴａｑポリメラーゼと共に５０ｎｇのＲＮＡに添加した。逆遺伝子特異的ＰＣＲプライマーが逆転写のプライマーとして働く５５℃での逆転写反応を１分行った後、逆転写酵素を９５℃で５分間変性し、７２個の遺伝子を１０サイクル共増幅した。各サイクルは、９５℃の温度を５ｓ、６０℃を２０ｓ、及び７２℃を２０ｓ維持した。この時点で、７２個の遺伝子に対応するアンプリコンに濃縮された結果として生じた産物を、次に、一定分量に分けた。多重増幅に使用した外側のプライマーの１つ、及び、その選択されたアンプリコンに特異的な対応する内側のプライマーを用い、図１に示されているヘミタンデム型ＭＴ−ＰＣＲ法を使用して、各一定分量をさらに３回増幅及び定量化した。このステージでは、９５℃で１ｓ、６０℃で１０ｓ、及び７２℃で１０ｓというサイクルを使用した。アッセイのどちらのステージも、いかなる数値の維持温度及びサイクル条件も組み合わせることができるＲＧ３０００Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）で行った。７２増幅反応の結果は、図２Ａに示されており、３回の２４個の遺伝子発現測定を表している。この結果は、個々の３回の遺伝子測定に対応している各組の３本線が、ほぼ同一の曲線を有しているため、再現できる方法で各遺伝子発現産物を増幅したことを示している。重要なことに、図２Ｂに示されている対応する融解曲線、及び、図２Ｃに示されているＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  “ｇｅｌ”  ｉｍａｇｅにより実証されているように、第２の増幅産物がこれらの反応において検出可能ではなかったため、これらの産物を高い特異性でも増幅した。図２Ｃは、各反応により１つの増幅産物が生じたことを各ケースにおいて示している。
【０１１７】
【表１】
2009506759.tif 000002
【０１１８】
【表２】
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実施例２  保存記録のＦＦＰＥ組織サンプルに存在する核酸等、断片化された核酸の小さなサンプルから、遺伝子発現産物等の核酸を定量化するために、ＭＴＲ−ＰＣＲを使用することができる。
【０１１９】
保存記録のホルマリン固定されたパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）サンプルからの遺伝子発現の定量化は、非常に所望されるが、これらの試料からのＲＮＡの低い回収率（１０μｍ切片あたり約１０ｎｇ）により、及び、回収された分子の高い断片化される性質により制限されている。いかなるＲＮＡ断片も、ＲＮＡの３’末端、及び、測定されるアンプリコン両方を含むことはあり得ないため、オリゴ−ｄＴプライマーを使用して逆転写又は直線的なＲＮＡ増幅を行うことは可能ではない。従って、本発明の手順は、遺伝子特異的又はランダムプライムされた逆転写を用いて、各サンプルからの非常に少ない数の遺伝子における発現の定量化を可能にするだけである。
【０１２０】
ＭＴ−ＰＣＲ法が、非常に断片化され分解された核酸から多数の遺伝子を同時に増幅することにおいて特に効果的であることを実証するために、初めに、ＲＮＡ抽出に先立ち１０年間保存されてきたＦＦＰＥ異種移植切片の１スライスからＲＮＡを抽出した。プロテイナーゼＫ消化及びシリカカラム精製（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いて、直径が約４ｍｍで、厚さが約１０μｍの切片からＲＮＡを抽出した。約３ｎｇを含むと測定された、ＦＦＰＥスライスから抽出した全ＲＮＡの３分の１を、１５サイクルの多重増幅を使用した、表１及び２に示されている外側及び内側のプライマーを用いた実施例１に記述されているヘミタンデム型ＭＴ−ＰＣＲ法において後に使用した。３回増幅した２４個の遺伝子からの遺伝子発現特性は、図３Ａに示されている。これは、増幅曲線の高い再現性により実証されているように、その方法を使用して、非常に少量の断片化されたＲＮＡから遺伝子発現産物を能率的に再現性よく増幅及び定量化できることを示している。重要なことに、図３Ｂに示されている対応する融解曲線により実証されているように、第２の増幅産物がこれらの反応において検出可能ではなかったため、これらの産物を高い特異性でも増幅した。図３Ｂは、１つのピークにより表された１つの増幅産物が、各反応により生じたことを各ケースにおいて示している。この結果は、その方法を効果的に使用して、単一細胞、レーザーで解剖された生検組織、法医学的なサンプル等から得られた核酸鋳型等、非常に少量の核酸鋳型から多数の異なる核酸配列を増幅できることを示している。
実施例３  単一細胞及びレーザーダイセクションから得られた顕微試料からの核酸の増幅及び定量化に対するＭＴ−ＰＣＲの使用
１０ｐｇだけしかないＲＮＡのサンプルを用いて、２４個の遺伝子の発現産物を増幅及び定量化するために、２０サイクルの多重増幅を含んだＭＴ−ＰＣＲ法を使用した。そのＲＮＡの量は、一般的に単一の哺乳動物細胞から得られる全ＲＮＡ鋳型の概算量に等しい。図４Ａは、１０ｐｇのＭＣＦ７ＲＮＡからの２４個の遺伝子の定量化を示し、図４Ｂは、各増幅産物の対応する融解曲線を示している。２４個の遺伝子発現産物のうち２０個が、不必要な第２の増幅産物なしで検出され、さらに定量化した。この結果は、その方法を効果的に使用して、単一細胞、レーザーで解剖された生検組織、法医学的なサンプル等から得られた核酸鋳型等、非常に少量の核酸鋳型から多数の異なる核酸配列を増幅できることを示している。示されているように、そのような少量のサンプルから核酸を十分に増幅するためには、多重増幅ステップにおいて比較的多くの数のサイクルを使用することが必要であり、この場合２０サイクルが十分である。その方法は、サンプルが頻繁にその大きさにおいて非常に限られており、且つ、核酸が非常に分解／断片化された構造のものである法医学的使用等に特に有用である。
実施例４  ＭＴ−ＰＣＲに対する適切な反応条件及びパラメータの確立
所与の多重反応システムに対して適切な数の多重増幅サイクルを確立するために、適切なサイクル数が、所与のサンプル／プライマーシステムに対して経験的に決定されなければならない。理想的には、十分なレベルの増幅を提供し、第２ラウンドの増幅における各選択された核酸配列の正確な定量化を促進するために、多重増幅ステップは、十分な数のサイクルで作動されるべきである。しかし、多重増幅サイクルの数は、選択された核酸配列のさらなる増幅が、第２ラウンドの増幅において得られた定量化の精度に有害になるところを越えないように、制限もされなければならない。言及された定量化の精度に対する害は、ｄＮＴＰ及びプライマー等の反応成分を求める増幅している配列（アンプリコン）間での競合のためであると考慮される。サイクルの数が増加するに従い、これらの成分は次第により不足し、その結果、反応において低濃度になる。
【０１２１】
所与の第１ラウンド多重増幅反応に使用する適切な数のサイクルを確立するガイドとして、最も豊富なｍＲＮＡ種又は核酸配列の指数関数的な増幅は、第１ラウンドの増幅中に有意に増加されてはならない。異なる量のＲＮＡ投入をそれぞれ含む個々のＲＴ反応を使用し、次に、反応をモニターするためのＳＹＢＲ−グリーン色素の包含により第１ラウンドの増幅中に作製された核酸の量を調べるために、有意な増加をチェックすることができる。この場合、増幅反応は、最も豊富なＲＮＡ種が選ばれ、その１つの選択された核酸配列に特異的なプライマーのみを含む。その結果、この反応は多重増幅反応ではなく、代わりにユニプレックス（ｕｎｉｐｌｅｘ）である。図５に示されているように、５０〜５００ｎｇのＲＮＡの投入により、少量の核酸のみが最初の１０サイクルの反応内で豊富なＲＮＡ種から作製されており、この範囲の投入ＲＮＡと共に使用するのにこれは適切な数のサイクルであることを示している。使用する多重増幅サイクルの適切な数を確立する通則として、サイクルがもはやさらなる増幅をもたらさないポイントである十分な数のサイクルで反応が進めたれた場合に一般的に作製されるポリヌクレオチドの総量に対する割合として、５％を超えるポリヌクレオチドが合成されるポイントを越えて多重増幅が進行するのを防ぐべきである。
【０１２２】
従って、１０サイクルの多重ＰＣＲが、日常的な研究使用に推奨される。これを、１つの遺伝子の遺伝子発現産物を分析するために約５０ｎｇのＲＮＡが通常使用される従来のｑＰＣＲと比較することができる。
【０１２３】
図５に示されているように、５〜５０ｎｇのＲＮＡの投入では、最初の１５サイクルの反応により、最も豊富なＲＮＡに対しては少量の核酸のみが作製されている。従って、１５サイクルの多重ＰＣＲが、ＦＦＰＥ切片からのＲＮＡサンプルの分析を含めた、この規模のサンプルに推奨される。
【０１２４】
図５に示されているように、０．０１〜５ｎｇのＲＮＡの投入では、豊富なＲＮＡ種の有意な増幅が起こる前に、２０サイクルの多重増幅が可能であった。したがって、２０サイクルの多重ＰＣＲが、法医学的サンプル、微生物的サンプル、及びレーザーダイセクション顕微鏡サンプルに推奨される。当業者は、２５を超える多重ＰＣＲのサイクルを使用することは、いくつかのケースにおいて実用的であることを認識するけれども、実行にあたり、多重増幅ステップにおいて、２５以上の増幅のサイクルを使用して非常に少量のサンプルを分析する場合、この高いサイクル数は、プライマー二量体及び第２の産物の形成を好んでしまう。類似の範囲の感受性が、ＲＮＡに関してＤＮＡの分析にあてはまる。
【０１２５】
投入するＲＮＡ鋳型の量又は多重増幅サイクルの数を変更した際の定量化の精度を直接比較するために、これらのパラメータを変更して２４個の遺伝子発現産物を増幅及び定量化した。３５サイクルの第２ラウンド増幅中に行われた結果として生じる定量化を、０．１ｎｇ又は１．０ｎｇのＲＮＡを使用して比較し（図６Ａ）、さらに、１０又は１５サイクルの多重増幅を使用した場合の定量化を比較した（図６Ｂ）。それぞれのケースにおいて、２３個の遺伝子の発現を定量化し、データを規格化するために同じタンデム型ＭＴ−ＰＣＲアッセイにおける比較基準の遺伝子に対する比率として比較した。図６Ａは、０．１又は１ｎｇのＲＮＡを使用した場合に類似の測定値を得たことを示し、０．９６の相関係数を生じ、使用したＲＮＡの量における倍率変化により類似の相関的定量化値が生じたことを実証している。異なる数の多重増幅サイクルを使用して、同じ量のＲＮＡを測定した場合、相関係数はそれでも０．９６よりも高かったが、予測されたように、完全な倍率の相違において系統誤差が現れる（図６Ｂ）。これにより、遺伝子発現の定量化等、核酸の量を定量化する場合に、各反復実験は同じ数の多重増幅サイクルを使用する場合のみ比較されるべきであることが実証されている。
実施例５  タンデム型ＰＣＲに使用する、プライマー二量体の形成を最小化するための適切なＴａｑポリメラーゼ、プライマー濃度、及び逆転写酵素の確立
不十分に発現された遺伝子から遺伝子発現産物を定量化するために、一般的には、より多くの数の増幅サイクルを使用して、分析のために産物を十分に増幅しなければならない。これらのケースの場合、従来の方法により効果的な定量化を複雑に又は妨げる恐れがあるプライマー二量体が形成されてしまうのが一般的である。本発明の方法を用いてこの問題を最小化するために、第２ラウンド増幅反応に含まれるべきであるＴａｑポリメラーゼのレベルを実験において最適化し、希少な遺伝子の群（ＥＲＢＢ２、ＥＳＲ１、ＴＰ５３、ＭＹＣ、及びＧＥＭ）の遺伝子発現産物を増幅及び定量化した。約０．２μＭプライマー及び２％ＤＭＳＯを有する２０μlの反応に約０．５ユニットのＴａｑを組み入れた場合に、最適性能を得て、図７Ａに示されているようにきれいな融解曲線を生じた。第２ラウンド増幅反応における０．５Ｕ又は１．０ＵのＴａｑの使用間での比較が、図７Ａ及び７Ｂにそれぞれ示されている結果として生じる融解曲線により例示されている。その融解曲線により、プライマー二量体は高いレベルのＴａｑ（１．０Ｕ等）が使用される場合に発生しうることが実証されている。
【０１２６】
次に、後の増幅に先立つＲＮＡ鋳型からのｃＤＮＡの合成の間に、逆転写酵素（ＭＭＬＶ）の量を変更して類似の実験を行った。前記の方法を引き続き使用して、十分に発現される遺伝子の抜粋（ＴＯＰ２Ａ、ＢＴＦ３、ＭＤＭ２、ＲＰＬ３５）、及び、不十分に発現される遺伝子（ＥＳＲ１）を増幅し、後の第２ラウンド増幅反応の質に対する逆転写（ＲＴ）反応でのＭＭＬＶの変更した量の効果が、図７Ｃ及び７Ｄに示されている結果として生じる融解曲線により例示されている。図７Ｃの融解曲線により、約２０ＵのＭＭＬＶを前のＲＴ反応に使用した場合に、有意な第２増幅産物を得なかったことが示されている。しかし、約２００Ｕというより高いレベルのＭＭＬＶを使用した場合、図７Ｄに示された結果として生じる融解曲線において見られる複数のピークにより例示されているように、非特異的産物の後の増幅を生じた。ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ  逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用しても類似の結果を得た。このように、約２０Ｕの逆転写酵素を一般的な２０μＬのＲＴ反応に使用することが推奨される。
実施例６  複数の実験に関する定量化見積の再現性の比較
５０ｎｇの同じバッチのＲＮＡから、１０の別々のＭＴ−ＰＣＲ反応を、異なる日に４日行った。タンデム型ＭＴ−ＰＣＲを、第１ラウンドに１０サイクルの多重ＰＣＲを用いて実施例１に記述されているように行った。１回の実行で、２０μlＲＴ混合物を３ｘ６μl一定分量に分け、３セットの２４個の遺伝子測定に使用した。次に、その測定を平均し、表３に示されているデータを作成した。これらの測定値の平均を、１０回行われた実行間で比較した。１個の遺伝子（Ｎａｔ１）がそのＲＮＡにはなく、起伏のないサイクル曲線を生じた。Ｃｔ値における変動係数は、２３個の検出された遺伝子全てに対しては０．０３という平均値で、０．０１から０．０５に変化し、ＭＴ−ＰＣＲ実験間で特に高いレベルの精度を実証している。
【０１２７】
【表３】
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実施例７  細胞株モデルを用いた診断における癌関連遺伝子発現の定量化へのＭＴ−ＰＣＲの使用
７．１  腫瘍由来細胞株における遺伝子発現の測定
腫瘍由来のヒト乳癌細胞株は、その細胞株が由来する腫瘍細胞の遺伝的構造及び生理的特徴の多くを保存すると信じられている。本発明では、２４個の遺伝子の発現レベルを、１５個のヒト乳癌細胞株においてヘミネステッドなＭＴ−ＰＣＲにより３回測定した。
７．２  材料
外側のプライマーの混合物を、表４に列挙されている２４対のプライマーをそれぞれ２μl混合することにより、４μlの水と共に１００μＭの濃度で作製した。
凍結乾燥したプライマーを用いたＣｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製「Ｇｅｎｅ−Ｄｉｓｃ」の調製
表５に示されているプライマーの対をそれぞれが含む遺伝子特異的プライマー混合物を、１０μlの順方向プライマー貯蔵液を１００μＭで、１０μlの対応する逆方向プライマー貯蔵液を１００μＭで、及び、６０５μlの水を０．２ｍlチューブに含むよう調製した。次に、ＣＡＳ１２００ロボット（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を使用して、各プライマー混合物の５μlをＣｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製のｇｅｎｅ  ｄｉｓｋに３回で分注した。次に、これらの一定分量を、ＳｐｅｅｄＶａｃ凍結乾燥器を用いて、加熱しながら、ｇｅｎｅ  ｄｉｓｋにおいて１５分間凍結乾燥した後、ｇｅｎｅ  ｄｉｓｋヒートシーラーを用いて１６０℃でｇｅｎｅ  ｄｉｓｋを密封した。次に、各ｇｅｎｅ  ｄｉｓｋを、使用する前に４℃で保存した。
ＲＴ−ＰＣＲ及びＰＣＲ貯蔵液
〔ゼラチン−リボヌクレアーゼフリー（５ｍl）〕
５０ｍｇのゼラチン（Ｓｉｇｍａ社製Ｇ−２６２５）を５．０ｍlの水及び５μlのＤＥＰＣに添加した後、時々かき混ぜながら１時間６０℃で培養し、使用する前に２０℃で保存した。
〔１０ｘＲＴ緩衝液（１０ｍl）〕
３０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３００ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、及び０．１ｍｇ／ｍlのゼラチンを含有する５００ｍＭ  塩酸トリス（ｐＨ８．５）を、使用する前に０．５ｍlの一定分量で２０℃にて保存した。
〔１０ｘＰＣＲ緩衝液（１０ｍl）〕
５００ｍＭ  ＫＣｌ、３０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、及び１μｇ／ｍlのゼラチンを含有する２００ｍＭ  塩酸トリス（ｐＨ８．５）を、使用する前に０．５ｍlの一定分量で２０℃にて保存した。
７．３  方法
手短に言えば、ＲＮｅａｓｙ法（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、ＲＮＡを各細胞株の培地から抽出し、５０ｎｇを各ＭＴ−ＰＣＲ反応で使用するように、希釈した。全５０ｎｇのＲＮＡ、各プライマーの最終濃度を０．１μＭとした外側のプライマーの混合物、０．３ｍＭ  ｄＮＴＰ（Ｒｏｃｈｅ社）、ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液、２％ＤＭＳＯ、０．５μlのＲＮＡｓｉｎ、２０ユニットのＭＭＬＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、１ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含んだＲＴ−ＰＣＲ反応混合物を０．２ｍlの薄壁ＰＣＲチューブ内で調製した。
第１ラウンド多重増幅
各チューブをＲＧ３０００（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）に配置し、以下の通りに熱処理した：５５℃で１分（逆転写）、９５℃で５分（ＲＴ変性）、その後、１サイクル９５℃で１０ｓ、６０℃で２０ｓ、７２℃で２０ｓを１０サイクル続けた。これにより、多重ＰＣＲステップは完了し、産物を水において１：５０に希釈した。
第２ラウンド増幅反応混合物
５００μlの多重増幅産物を１．５ｍlのＰＣＲ反応混合物それぞれに添加し、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、２％ＤＭＳＯ、２５Ｕ／ｍlのＴａｑ、ＰＣＲ緩衝液、ＳＹＢＲ−グリーン１：２０，０００希釈度という最終濃度にした。次に、２０μlのＰＣＲ反応混合物をｇｅｎｅ  ｄｉｓｋ（凍結乾燥した内側のプライマーを含有）内の各位置に添加し、ＰＣＲを、１サイクル９５℃で１ｓ、６０℃で１０ｓ、及び７２℃で１０ｓとして３５サイクル行った。７２℃の延長ステップの終わりに蛍光を測定した。この手順を、タンデム型及びヘミタンデム型ＭＴ−ＰＣＲ両方を使用して応用するのに成功したことが注目されるべきである。
７．４結果
各細胞株における上皮増殖因子受容体遺伝子（ＥＧＦＲ）の発現を、タンデム型ＭＴ−ＰＣＲを用いて定量化した。各細胞株から得られたデータを、体内の比較基準の遺伝子の使用により規格化し、１５個の細胞株のそれぞれにおけるＥＧＦＲ発現の相関的定量化を提供した。次に、これらのデータを、図８に示されているように、並べて比較した。ＥＧＦＲは、ＢＴ２０及びＳＫＢＲ３という、１５個の細胞株のうち２個のみにおいて十分に発現しているのを見ることができる。ＢＴ２０もＳＫＢＲ３もこの遺伝子を過剰発現することは既知であり、この結果は、図８の並んだ定量的比較におけるＭＴ−ＰＣＲ定量化結果により正確に反映されている。この種の情報は、癌を有する患者の治療において価値があり、いくつかのケースにおいて、適切な薬物療法の決定に必要な情報を提供する。
【０１２８】
【表４】
2009506759.tif 000005
【０１２９】
【表５】
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実施例８  ＭＴ−ＰＣＲは、ＰＣＲにより測定することができるいかなる遺伝子にも広範な応用性を有している：内皮細胞における炎症性の遺伝子発現産物の定量化
他の臨床的に関連性のある領域におけるＭＴ−ＰＣＲのさらなる応用を実証するために、１７個の炎症性の遺伝子発現を、ヒト皮膚生検組織から単離した１００ｎｇのＲＮＡから、第１ラウンドにおいて１０サイクルの多重増幅後、３５サイクルの第２ラウンド増幅を用いて定量化及び分析した。図９Ａに示されているように、全１７遺伝子が３回能率的及び正確に増幅した。３回測定により、各遺伝子発現産物が高い再現性で測定されたことが示されていることに注目されるであろう。図９Ｂに示されている対応する融解曲線も、第２ラウンドにおける３５サイクルの増幅後でさえも、全ての第２ラウンド増幅反応が、非特異的産物、プライマー二量体等による汚染を欠いて１つの産物を生じたことを示している。図９Ｃに示されているように、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いた分析により、１つのＰＣＲ産物が各反応に存在したことが明白に示され、増幅の特異性をさらに確証した。このＭＴ−ＰＣＲアッセイに使用した遺伝子を、標準的なＰＣＲ反応においてその遺伝子自体を分析した場合に、その遺伝子が１つの産物を産生したことを実証することにより確証した。次に、さらなる最適化がないよう一組の癌関連遺伝子のために予め最適化された十分に多重化されたＭＴ−ＰＣＲ反応において、その遺伝子を共に使用した。この例により、それ自体が分析された場合に良く機能するいかなるＰＣＲ反応も、さらなる最適化のない十分に多重化されたＭＴ−ＰＣＲ反応に組み込まれた場合に、実質的に類似した方法で機能するであろうということが実証されている。
実施例９  標的配列の同定のために高分解能融解分析と組み合わされたＭＴ−ＰＣＲ
標的ＤＮＡ配列の同定、異種起源のサンプルにおける種々のウイルス又は細菌の菌株の検出、ＳＮＰの検出及び定量化、ＤＮＡメチル化（亜硫酸水素塩処理後）、及び遺伝子型同定等、広範な種々の応用のために、ＭＴ−ＰＣＲ法を高分解能融解曲線分析と組み合わせることもできる。ＳＹＴＯ９、ＥｖａＧｒｅｅｎ、又はＬＣＧｒｅｅｎ等の二本鎖アンプリコンＤＮＡを飽和させる挿入色素を利用することが好ましい融解曲線分析の例として、複数のウイルス菌株の検出（Ｖａｒｇａ，Ａ  ａｎｄ  Ｊａｍｅｓ，Ｄ（２００６）Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３２：１４６−１５３）、種々の細菌種（Ｂｅｌｌ  ＣＡ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｌ  Ｒ．（２００５）Ｄｉａｇｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．５３（４）：３０１−６）、ＤＮＡメチル化分析（Ｗｏｒｍ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４７：１１８３−１１８９）、並びに、癌診断学のための突然変異及び遺伝子型同定分析（Ｂｅｒｎａｒｄ，Ｐ．Ｓ．ａｎｄ  Ｗｉｔｔｗｅｒ，Ｃ．Ｔ（２００２）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４８（８）：１１７８−１１８５；Ｐｏｗｅｌｌ  Ｂ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２３（２）：３１１−３１５）が挙げられる。高分解能融解分析は、ＰＣＲにより測定できるいかなる遺伝子に対しても広範な応用性を明らかに有している。
【０１３０】
１又は複数のＭＴ−ＰＣＲ産物を含むことができる増幅反応から融解曲線の特性を得るために、産物は約６０℃から約９５℃まで徐々に加熱され、ＳＹＴＯ−９色素等の蛍光レポーターは、ＤＮＡが二本鎖の形状から１本鎖の形状に変わる温度で、増幅された産物から急速に解離する。その解離により、特有の温度での放出される蛍光の低下が生じる。この蛍光における変化は、温度勾配にわたって連続的に又は定期的にモニターされ、次に、融解曲線の特性を得るために、蛍光における変化は、温度勾配の軸に沿ってプロットされる。各特異的な標的ＰＣＲ産物は特異的な融解温度（Ｔｍ）を有しているため、図１０Ａ及び１０Ｂに実証されているように、その異なる融解温度により同定される。Ｒｏｔｏｒ−ｇｅｎｅ６０００（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）の正確な温度調節により、融解温度を０．０２℃未満の精度で決定することができる。これは、ＭＴ−ＰＣＲにより増幅された標的におけるわずかな突然変異を識別するのに、又は、正しい標的がその反応で増幅されたことを確証するのに十分である。図１０Ａでは、２個のヒト乳癌細胞株から選択された８個のサンプルから、ＴＰ５３遺伝子のうち、突然変異しやすい領域をＭＴ−ＰＣＲにより増幅し、Ｒｏｔｏｒ−ｇｅｎｅ６０００の高分解能融解により分析した。ＳＫＢＲ３細胞株からの増幅産物が、変異ＴＰ５３遺伝子領域を示し（８６．４６℃の融解温度を有する）、これは、野生型ＴＰ５３遺伝子領域を有するＭＣＦ７細胞株の増幅産物（８７．１６℃の融解温度を有する）から容易に識別できることがわかる。パウエル（Ｐｏｗｅｌｌ）等（ｓｕｐｒａ社）にも説明されているように、ＴＰ５３遺伝子におけるいくつかの高頻度可変性モチーフは、治療学的意義を有していることが既知であるため、この分析及びこの分析に類似するものを、予測医学において使用することができる。図１０Ｂは、ＴＰ５３遺伝子のうち、そのような変異を示さない領域に対する比較試験を示している。この領域も、２個の細胞株から採取したサンプルにＭＴ−ＰＣＲを用いて増幅した。このケースでは、曲線により、ＳＫＢＲ３及びＭＣＦ７からのＭＴ−ＰＣＲ増幅産物はどちらも同じであり、８４．９０℃という同じ融解温度を有していることが示されている。第２ラウンド増幅反応成分を最適化し、融解曲線特性の精度及び信頼性を改善することは有利であり、これに関して、ＤＭＳＯが第２ラウンド増幅混合物に含まれない場合にしばしば有利であることがさらに注目されるべきである。
実施例１０  細菌の同定のために高分解能融解分析と組み合わされたＭＴ−ＰＣＲ
実施例９に記述されているように、高分解能融解曲線分析法を再度使用したが、融解曲線の規格化後に、テストＤＮＡを比較基準のＤＮＡと比較し、同定の非常に鋭敏な測定又はその比較基準のＤＮＡとの相違点を得ることができるように、比較基準のＤＮＡサンプルを提供した。図１１Ａ及び１１Ｂでは、いくつかの細菌ＤＮＡ抽出物の、腸球菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に特異的なプライマーを用いた増幅後の融解曲線が示されている。他の細菌の１６Ｓ配列との類似性により、これらの抽出物も、ＭＴ−ＰＣＲによるネステッドな増幅後でもＰＣＲ産物を生じることが意味されている。図１１Ａに示されている領域間の融解曲線の規格化後、１つの融解曲線を本物の腸球菌融解曲線として同定し、他の融解曲線全てをその曲線と比較した（図１１Ｂ）。この図において、横線は比較基準の腸球菌、及び、９８％の信頼度で同定された腸球菌のもう１つのサンプルからである。その他の融解曲線は、腸球菌でありうる信頼度が非常に低いレベルであるため、異なる細菌であると示されている（表６）。ＭＴ−ＰＣＲは、その産物の純度が結果の信頼性を改善するため、高分解能融解分析に特に適している。さらに、法医学的分析において、ＭＴ−ＰＣＲの感受性はヒト組織をトレースする分析にかなり適しており、さらに、組織の分類においては、同時に決定できる多数の標的により、その方法は非常に正確になっている。
【０１３１】
【表６】
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ＭＴ−ＰＣＲ法、並びに、高分解能融解曲線分析を含む又は組み合わせたＭＴ−ＰＣＲ法を、広範囲のサーモサイクラープラットフォーム、及び、広範囲の蛍光レポーターを含めた検出システムを用いて行えることは当業者により理解される。例えば、Ｒｏｔｏｒ−ｇｅｎｅ６０００を用いて増幅反応及び融解曲線分析を実行できるけれども、Ｌｉｇｈｔ  ｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）（Ｒｏｃｈｅ社）、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（Ｒ）７０００、７７００、及び７９００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒ）（Ｃｅｐｈｅｉｄ社）、ｉＣｙｃｌｅｒＴＭ（ＢｉｏＲａｄ社）、並びに、当業者には既知である他のそのようなプラットフォーム等の他のシステムを用いて達成することもできる。従って、ＭＴ−ＰＣＲ法、並びに、融解曲線分析を含む又は組み合わせたＭＴ−ＰＣＲ法を、ＳＹＢＲ−グリーンＩ、ＳＹＴＯ９、ＬＣ  Ｇｒｅｅｎ、ＥｖａＧｒｅｅｎ、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）プローブ、ＬＵＸＴＭｆｌｕｏｇｅｎｉｃ  Ｐｒｉｍｅｒｓ、及び当業者には明白であるもの等の広範囲の蛍光レポーターを用いて実行できる。
【０１３２】
本発明は、いくつかの好ましい実施形態を参考にして記述されているが、当業者は、多数の変更及び改変が、本発明の範囲を逸脱することなく可能であることを認識するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】ＭＴ−ＰＣＲにおけるプライマーの配置を示す概略図であり、タンデム型実施形態もヘミタンデム型実施形態も示し（それぞれＡ及びＢ）、４個の異なる遺伝子（１〜４）の遺伝子発現産物を増幅及び定量化する工程において示されている。
【図２Ａ】表１及び２のプライマー、並びに、記述されている方法を用いて、１つのＲＮＡサンプルからヘミタンデム型ＭＴ−ＰＣＲにより行われ、Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製ＲＧ３０００上にて３回測定されている２４の遺伝子発現３回測定である。
【図２Ｂ】図２Ａに示されている２４の遺伝子測定に関連する融解曲線である。
【図２Ｃ】図２Ａに示されている２４個の遺伝子のＭＴ−ＰＣＲにより形成され、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて分析されている産物である。
【図３Ａ】１切片のＦＦＰＥ材料由来のｃＤＮＡを用いた２４の遺伝子発現産物増幅曲線（それぞれ３回測定）であり、ｃＤＮＡは、初めに１５サイクルの多重ＰＣＲを使用して、７２個の選択された遺伝子発現産物のプールとして増幅され、そのうち２４個が、その後、第２ラウンドのＰＣＲにおいて定量化された。
【図３Ｂ】図３Ａに示されている２４の遺伝子測定に対する融解曲線である。
【図４Ａ】最初の２０サイクルの多重増幅に続く第２ラウンドのＰＣＲで示されている、１０ｐｇの投入ＲＮＡからの２４の遺伝子発現産物増幅曲線（それぞれ３回測定）である。
【図４Ｂ】図４Ａに示されている２４の遺伝子測定に対する融解曲線である。
【図５】増幅中の反応成分を求めるアンプリコン間での競合を回避するための、多重増幅サイクルの適切な数の決定である。多重ＰＣＲステップの条件のもと、本発明の遺伝子セットに使用されている最も豊富な遺伝子（ＢＴＦ３）のＰＣＲである。５ｎｇ、５０ｎｇ、及び５００ｎｇの投入ＲＮＡ由来のｃＤＮＡを用いて各増幅が開始された場合の増幅曲線が示されている。
【図６Ａ】比較基準の遺伝子に相関的な遺伝子発現の定量化が、異なる投入ＲＮＡ量で維持されている。
【図６Ｂ】多重増幅サイクルの数の変更、及び、遺伝子発現の定量化に対して結果として生じる影響である。
【図７Ａ】タンデム型ＭＴ−ＰＣＲの第２ラウンド増幅反応において１反応あたり０．５ユニットのＴａｑを使用することの影響を調査するために、第２ラウンドの増幅後に得られた融解曲線である。
【図７Ｂ】図７Ａに示されているものと同一の実験であり、１．０ユニットのＴａｑが使用されている。
【図７Ｃ】タンデム型ＭＴ−ＰＣＲにおける多重増幅ステップに先立ち、２０ユニットの逆転写酵素を逆転写に使用することの影響を調査するために、第２ラウンドの増幅後に得られた融解曲線である。
【図７Ｄ】図７Ｃに示されているものと同一の実験であり、２００ユニットの逆転写酵素が使用されている。
【図８】ＭＴ−ＰＣＲのさらなる診断学的可能性：１５個の細胞株におけるＥＧＦＲ遺伝子の発現であり、その細胞株のうちＢＴ２０及びＳＫＢＲ３は、ＥＧＦＲを過剰発現することが既知である。
【図９Ａ】ＭＴ−ＰＣＲによる炎症性の遺伝子の定量化であり、ヒト皮膚生検組織からの１７個の炎症性遺伝子の発現を３回示している。
【図９Ｂ】図９Ａの増幅産物に対応する融解曲線である。
【図９Ｃ】図９Ａの増幅産物のＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ分析である。
【図１０Ａ】ヒト乳癌細胞株におけるＴＰ５３の高頻度可変性領域の高分解能融解による分析である。
【図１０Ｂ】ヒト乳癌細胞株におけるＴＰ５３のうち、突然変異を有していない領域の高分解能融解を用いた分析である。
【図１１Ａ】種々の菌種における１６ＳＲＮＡアンプリコンの高分解能融解による分析である。
【図１１Ｂ】図１１Ａに示されている規格化された融解曲線の異なるプロットである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【国際調査報告】
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