(57)【要約】本発明は、概して処置、予防、および診断の分野に関する。より詳細には、本発明は、骨形態形成および骨の病変に関連する遺伝子および遺伝子産物を同定する。さらにより詳細に本発明は、骨病変の処置、予防、および診断におけるこれらの遺伝子の発現または遺伝子産物の活性の制御を企図する。細胞に基づく治療法およびインビトロ培養液中での細胞の操作も、本発明の一部を形成する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子の発現または該遺伝子によってコードされる産物の活性を調節する有効量の薬剤を被験体に投与する工程を含む、被験体の骨病変の処置もしくは予防のためまたは骨病変の発症の危険を減少させるための方法であって、該遺伝子が、GPC3、RBP4、C1QTNF3、ANXA3、WIF1、およびSHOX2からなるリスト、またはそれらの哺乳動物ホモログについて選択され、該遺伝子が、頭蓋冠の融合した縫合に対して未融合の縫合で差次的に発現する、方法。
【請求項２】
GPC3、RBP4、およびC1QTNF3が、融合した縫合と比較して、未融合の縫合でより高度に発現される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
ANXA3、WIF1、およびSHOX2が、未融合の縫合と比較して、融合したまたは融合中の縫合でより高度に発現される、請求項1記載の方法。
【請求項４】
被験体がヒトである、請求項1記載の方法。
【請求項５】
骨病変が、骨癌、骨石灰化欠陥症状（deficient bone mineralization condition）、骨損傷、縫合に基づく頭蓋障害、細胞骨格障害、および骨粗鬆症からなるリストより選択される、請求項1または2または3または4記載の方法。
【請求項６】
骨損傷が、骨折、若木骨折および剥離骨折（bone chip）からなるリストより選択される、請求項5記載の方法。
【請求項７】
縫合に基づく頭蓋障害が頭蓋骨癒合症である、請求項5記載の方法。
【請求項８】
骨石灰化欠陥症状が異形成である、請求項5記載の方法。
【請求項９】
遺伝子がGPC3である、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
遺伝子がRBP4である、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
遺伝子がC1QTNF3である、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
遺伝子がANXA3である、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
遺伝子がWIF1である、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
遺伝子がSHOX2である、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
薬剤が核酸分子である、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
薬剤が小さい化学分子である、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
薬剤がペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
遺伝子の発現または該遺伝子によってコードされる産物の活性を調節する有効量の薬剤を被験体に投与する工程を含む、被験体を処置する方法であって、該遺伝子が、GPC3、RBP4、C1QTNF3、ANXA3、WIF1、およびSHOX2からなるリスト、またはそれらの哺乳動物ホモログについて選択され、該遺伝子が、頭蓋冠の融合した縫合に対して未融合の縫合で差次的に発現し、該発現または活性の調節が、被験体の骨成長を改善する、骨成長を阻害する、および／または骨癌成長を阻害するために選択される、方法。
【請求項１９】
GPC3、RBP4、およびC1QTNF3が、融合した縫合と比較して未融合の縫合でより高度に発現される、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
ANXA3、WIF1、およびSHOX2が、未融合の縫合と比較して、融合したまたは融合中の縫合でより高度に発現される、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
被験体がヒトである、請求項18または19または20記載の方法。
【請求項２２】
遺伝子がGPC3である、請求項18記載の方法。
【請求項２３】
遺伝子がRBP4である、請求項18記載の方法。
【請求項２４】
遺伝子がC1QTNF3である、請求項18記載の方法。
【請求項２５】
遺伝子がANXA3である、請求項18記載の方法。
【請求項２６】
遺伝子がWIF1である、請求項18記載の方法。
【請求項２７】
遺伝子がSHOX2である、請求項18記載の方法。
【請求項２８】
薬剤が核酸分子である、請求項18記載の方法。
【請求項２９】
薬剤が小さい化学分子である、請求項18記載の方法。
【請求項３０】
薬剤がペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である、請求項18記載の方法。
【請求項３１】
被験体の骨病変の処置のための医薬の製造における、GPC3、RBP4、C1QTNF3、ANXA3、WIF1、およびSHOX2からなるリストより選択される遺伝子の使用。
【請求項３２】
被験体の骨病変の処置のための医薬の製造における、GPC3、RBP4、C1QTNF3、ANXA3、WIF1、およびSHOX2からなるリストより選択される遺伝子の発現産物の使用。
【請求項３３】
被験体がヒトである、請求項31または32記載の使用。
【請求項３４】
骨病変が、骨癌、骨石灰化欠陥症状、骨損傷、縫合に基づく頭蓋障害、細胞骨格障害、および骨粗鬆症からなるリストより選択される、請求項31または32または33記載の使用。
【請求項３５】
骨損傷が、骨折、若木骨折および剥離骨折からなるリストより選択される、請求項34記載の使用。
【請求項３６】
縫合に基づく障害が頭蓋骨癒合症である、請求項34記載の使用。
【請求項３７】
骨石灰化欠陥症状が異形成である、請求項34記載の使用。
【請求項３８】
遺伝子がGPC3である、請求項31または32記載の使用。
【請求項３９】
遺伝子がRPB4である、請求項31または32記載の使用。
【請求項４０】
遺伝子がC1QTNF3である、請求項31または32記載の使用。
【請求項４１】
遺伝子がANXA3である、請求項31または32記載の使用。
【請求項４２】
遺伝子がWIF1である、請求項31または32記載の使用。
【請求項４３】
遺伝子がSHOX2である、請求項31または32記載の使用。
【請求項４４】
GPC3、RBP4、C1QTNF3、ANXA3、WIF1、およびSHOX2からなるリストより選択される一つまたは複数の遺伝子の発現プロファイルを決定する工程を含む、被験体の骨病変を診断または予後予測する方法であって、未融合の組織中のGPC3、RBP4、およびC1QTNF3の発現の上昇、ならびに融合したまたは融合中の縫合でのANXA3、WIF1、およびSHOX2の発現の上昇が、骨病変の存在または骨病変の発症の素因を示す、方法。
【請求項４５】
被験体がヒトである、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
骨病変が、骨癌、骨石灰化欠陥症状、骨損傷、縫合に基づく頭蓋障害、細胞骨格障害、および骨粗鬆症からなるリストより選択される、請求項44または45記載の方法。
【請求項４７】
骨損傷が、骨折、若木骨折および剥離骨折からなるリストより選択される、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
縫合に基づく頭蓋障害が頭蓋骨癒合症である、請求項46記載の方法。
【請求項４９】
骨石灰化欠陥症状が異形成である、請求項46記載の方法。
【請求項５０】
被験体の骨病変のための診断プロトコル生成における、GPC3、RBP4、C1QTNF3、ANXA3、WIF1、およびSHOX2からなるリストより選択される遺伝子の使用。
【請求項５１】
被験体の骨病変のための診断プロトコル生成における、GPC3、RBP4、C1QTNF3、ANXA3、WIF1、およびSHOX2からなるリストより選択される遺伝子の発現産物の使用。
【請求項５２】
被験体がヒトである、請求項50または51記載の使用。
【請求項５３】
骨病変が、骨癌、骨石灰化欠陥症状、骨損傷、縫合に基づく頭蓋障害、細胞骨格障害、および骨粗鬆症からなるリストより選択される、請求項50または51または52記載の使用。
【請求項５４】
縫合に基づく頭蓋障害が頭蓋骨癒合症である、請求項53記載の使用。
【請求項５５】
骨石灰化欠陥症状が異形成である、請求項53記載の使用。
【請求項５６】
GPC3、RBP4、C1QTNF3、ANXA3、WIF1、およびSHOX2からなるリストより選択される遺伝子の発現または遺伝子発現産物を調節する薬剤、ならびに一つまたは複数の薬学的に許容される担体、希釈剤、および／または賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項５７】
GPC3、RBP4、C1QTNF3、ANXA3、WIF1、およびSHOX2より選択される遺伝子の発現、またはGPC3、RBP4、C1QTNF3、ANXA3、WIF1、およびSHOX2由来の発現産物の活性を調節する、単離された薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、概して処置、予防、および診断の分野に関する。より詳細には、本発明は、骨形態形成および骨の病変に関連する遺伝子および遺伝子産物を同定する。さらにより詳細には、本発明は、骨病変の処置、予防、および診断のための、これらの遺伝子の発現または遺伝子産物の活性の制御を意図する。細胞に基づく治療法およびインビトロ培養物中の細胞の操作もまた、本発明の一部を形成する。
【０００２】
先行技術の説明
本明細書における任意の先行技術への言及は、該先行技術が、任意の国の共通の一般知識の一部であるという承認または任意の形の示唆ではなく、またそのように受け取ってはならない。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
本明細書に引用された参照文献の書誌的詳細は、本明細書の終りに集められている。
【０００４】
骨癌、骨折、頭蓋骨癒合症、骨粗鬆症、および他の生化学的または構造的欠陥を含む骨病変は、罹患した被験体に、重篤な機能障害、生活の質の喪失および早死をもたらし得る。外科的または他の物理的処置が、これらの病変の多くに対処する主要な方法であった。医薬的治療介入により、骨に関連する障害を、処置もしくは予防できる、または回復を助けることができることが必要とされている。
【０００５】
誕生時にヒトの頭蓋骨は、縫合として知られる繊維状の継ぎ目によって分離された45個の骨要素で構成されている(Wilkie and Morriss-Kay, Nat Rev Genet 2(6):458-468, 2001(非特許文献1))。脳を囲む骨は、頭蓋冠と呼ばれ、膜内骨化により生ずる。これは、より一般的な軟骨内骨化方式によって生ずる、頭蓋基底および顔部領域を含む骨と対照的である。正常な頭蓋骨の発生のために、脳が成長を停止し、頭蓋骨の残り(特に顔部領域)が成長を止めるまで、新しい成長に合わせて骨の移動ができるように、頭蓋冠の縫合は繊維状の継ぎ目(未融合の)として残る必要がある。
【０００６】
頭蓋冠骨は、まず外間葉(一次骨化中心)の凝縮から生じ、次に骨原性細胞、前骨芽細胞へ分化し、最後にコラーゲン−プロテオグリカン細胞外マトリックス(ECM)を分泌する骨芽細胞へ分化する。ECMの石灰化が骨芽細胞を捕らえ、骨芽細胞は骨細胞に分化する。骨形成を開始する信号は不明である。いったん一次骨化中心が設定されると、骨が一次骨化中心から外に放射状に伸びて、平らな骨片を形成する。およそ妊娠18週目には、成長している骨形成前線が出会い、これらの辺縁に縫合が形成される(Dixon et al, Fundamentals of Craniofacial Growth, New York, CRC Press, 1997(非特許文献2))。
【０００７】
正常な縫合融合は、誕生後まで生じることはなく、また前頭縫合を例外として、成年期まで生じないであろう(Cohen Am J Med Genet 47(5):581-616, 1993(非特許文献3))。頭蓋骨の成長はしかし、生命の最初の6ヶ月間にほとんどの成長が起こり、4〜6歳までに終る(Enlow, Facial Growth, Philadelphia, WB Saunders Co., 1990(非特許文献4))。頭蓋冠の縫合が成長を止めて最後に融合する前に、脳は成長を停止する。したがって脳の成長が、頭蓋冠成長の原因のすべてではないように見える(Cohen 1993、前記(非特許文献3))。成長の停止が、必ずしも融合を生じさせるとは限らない(Dixon et al, 1997、前記(非特許文献2))。縫合融合の原因はまだ不明であり、ホルモン、遺伝、機械的および局所的要因を含む多くの要因を含んでいる可能性がある(Persson et al, Journal of Anatomy 125:313-321, 1978(非特許文献5))。
【０００８】
融合は、骨形成前線における増殖の停止、および前骨芽細胞の骨芽細胞への分化と共に始まる。縫合の辺縁は、介在するスペースへ徐々に侵入して、平らな縁から交互嵌合へ変化する。最終的な分化により、単純な骨小柱が、多重層ネットワークで置き換えられる結果となる(Cohen, 1993、前記(非特許文献3))。アポトーシスも、縫合の保持に役割を果たすように見える。縫合が成長中にあまりにも接近する場合は、隣接する細胞のアポトーシスが起こり、骨を分離したままに保つ。したがってアポトーシスの制御解除が、早期の融合をもたらす可能性があろう(Furtwangler et al, Acta Anat 124(1-2):74-80, 1985(非特許文献6))。
【０００９】
頭蓋骨癒合症として知られる頭蓋冠縫合の時期尚早の融合は、西欧世界で誕生する2500人の1人に生じ(Wilkie, Am J Med Genet 90(l):82-84, 2000(非特許文献7))、2番目に多い頭蓋欠陥である。融合は、並置された骨の間の時期尚早の骨架橋によるか、または極端に重なり合った骨をもたらす骨成長の増大によるかのいずれかであり得る。融合は、一つのみのまたは複数の頭蓋冠縫合で生じる場合があり、それは誕生前または誕生後に生じ、またそれは散発性または症候性である可能性があろう。頭蓋骨癒合症の研究は、それが縫合融合、骨成長および分化の原因を、したがって縫合の保持および融合を制御する因子を研究するためのモデルを提供するので、重要である。頭蓋骨癒合症の公知の原因は、遺伝子突然変異による単一遺伝子病、代謝障害、血液障害および催奇形性物質を含めて様々である。
【００１０】
少なくとも5つの遺伝子が症候性頭蓋骨癒合症を引き起こすと確認されているが、しかし散発型は、同様には理解されてはいない。頭蓋骨癒合症のなんらかの形を示す100を越える症候群が存在する。最も一般的な優性遺伝形式は、エイパー(Apert)、ベーレ-スティーブンソン(Beare-Stevenson)、ボストン(Boston)、クルゾン(Crouzon)、ジャクソン-ワイス(Jackson-Weiss)、ファイファー(Pfeiffer)、セスレ-チョーゼン(Saethre-Chotzen)およびMuenke症候群である(Muenke and Wilkie; Craniosynostosis Syndromes 3:6117-6146, 2000(非特許文献8)に概説されている)。これらの症候群の表現型は、同一の突然変異を有する患者間でさえも一致していない。しかしすべてが、複数の顔面および四肢異常に関連している。
【００１１】
頭蓋骨癒合症に起因する顔面異常を矯正するためには、組織の融合部分を再度開くことによる侵襲的手術が必要である。非症候性の患者では、融合した組織の除去により頭蓋骨が正常に再成長することができるようになり、短期間の内に骨が置き換えられる。しかし、ほとんどの症候性患者では、骨があまりにも早く再融合するので、複数の手術をして組織を絶えず再開放する必要がある。縫合の時期尚早再融合を制限する治療薬の同定、または特に遺伝的異常の存在を最初に検出したときに縫合の時期尚早融合を停止させるために用いることができる治療薬の同定が、特に望まれよう。
【００１２】
縫合間葉の培養は、インビトロで縫合間葉の分化のプロセスを研究するための一般的な方法である。したがって、骨芽細胞の分化の段階の決定に役立つバイオマーカーを同定する必要性が存在する。頭蓋冠縫合のECMは、90%の1型コラーゲン(α1(I)collおよびα2(I)coll)、細胞接着タンパク質(オステオポンチン(OP)、フィブロネクチンおよびトロンボスポンジン)、カルシウム結合タンパク質(オステオネクチン(ON)および骨シアロタンパク質(BSP))、石灰化に関与するタンパク質(オステオカルシン(OC))ならびに酵素(コラゲナーゼおよびアルカリホスファターゼ(ALP))からなる[Ducy et al, Cell 89(5);747-754, 1997(非特許文献9); Robbins, Robbins Pathologic Basis of Disease, 1999(非特許文献10)]。コラーゲンは骨原性細胞中で発現される最も初期の因子であって、その後に、増殖後骨芽細胞中のALP、ON、BSP、および最後にOCが続く。OPは、事実上すべての増殖している骨原性細胞および前骨芽細胞中で発現され、一方で低いBSP発現がまた、始原細胞中のコラーゲン発現の前に確認されている(Liu et al, J Cell Sci 116(9):1787-1796, 2003(非特許文献11))。したがって、骨芽細胞表現型の現在のマーカーは、Col1、ALP、BSP、ONおよびOCである。しかし、研究は、これらのマーカーの発現が大きく重複しており、分化の各段階から、細胞を一意的には特定しないことを示している(Liu et al, 2003、前記(非特許文献11))。
【００１３】
融合していない縫合間葉と融合した頭蓋冠縫合骨の間の遺伝子発現の差異の研究により、骨形成に関与する遺伝子が同定されるであろう。これらの遺伝子は、骨芽細胞分化および骨石灰化(融合した縫合に特異的)を促進する遺伝子に加えて、初期の骨芽細胞集団(間葉に特異的)の細胞増殖および保持の両方を促進するであろう。
【００１４】
【非特許文献１】Wilkie and Morriss-Kay, Nat Rev Genet 2(6):458-468, 2001
【非特許文献２】Dixon et al, Fundamentals of Craniofacial Growth, New York, CRC Press, 1997
【非特許文献３】Cohen Am J Med Genet 47(5):581-616, 1993
【非特許文献４】Enlow, Facial Growth, Philadelphia, WB Saunders Co., 1990
【非特許文献５】Persson et al, Journal of Anatomy 125:313-321, 1978
【非特許文献６】Furtwangler et al, Acta Anat 124(1-2):74-80, 1985
【非特許文献７】Wilkie, Am J Med Genet 90(l):82-84, 2000
【非特許文献８】Muenke and Wilkie; Craniosynostosis Syndromes 3:6117-6146, 2000
【非特許文献９】Ducy et al, Cell 89(5);747-754, 1997
【非特許文献１０】Robbins, Robbins Pathologic Basis of Disease, 1999
【非特許文献１１】Liu et al, J Cell Sci 116(9):1787-1796, 2003
【発明の開示】
【００１５】
発明の概要
文脈上他の意味に解すべき場合を除き、本明細書および特許請求の範囲の全体にわたって、「含む（comprise）」という単語、ならびに「含む（comprises）」および「含む（comprising）」などのその変化形は、述べられた整数または工程、あるいは整数または工程のグループを含むことを意味するが、しかし、いかなる他の整数または工程あるいは整数または工程のグループも排除することを意味するものではないことは当然である。
【００１６】
以下に参照するすべての科学的引用、特許、特許出願、および製造元の技術的仕様書は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【００１７】
本発明によって、骨病変に関連した差次的に発現する遺伝子が同定された。これらの遺伝子の同定によって、骨癌、骨吸収および修復、骨折、頭蓋骨癒合症を含む縫合に基づく頭蓋異常、細胞骨格障害、骨粗鬆症、石灰化欠陥、および他の生化学的または構造的欠陥を含む範囲の骨病変の処置、予防および対応における、治療、予防、診断および組織培養のプロトコルの開発が可能になる。本発明は、さらに骨成長を含む骨健康の促進を可能にする。遺伝子はまた、骨病変のバイオマーカーと考えることもでき、したがって、ある範囲の障害の診断またはそれが進行する危険性の診断、あるいは骨の健康状態の診断に役立つ可能性がある。遺伝子発現または遺伝子産物の活性の操作はまた、脂肪細胞由来の間質細胞、骨髄由来の間質細胞、破骨細胞および骨芽細胞の成長などのための、インビトロの細胞培養プロトコルにも役立つ。
【００１８】
本発明を任意の一つの理論または作用様式に限定することを望まず、同定された遺伝子は一般に、骨細胞増殖(融合していない縫合によって代表される)および骨細胞分化(融合中の縫合によって代表される)に関係していると考える。
【００１９】
したがって、本発明の一つの局面は、被験体中で骨病変が発症する危険性を減らすことを含む、骨病変の処置または予防のための方法を意図し、該方法は、該被験体に、遺伝物質の発現または遺伝物質のコード産物の活性を調節する有効量の薬剤を投与する工程を含む。この遺伝物質は、融合した頭蓋冠縫合に対して未融合の縫合で差次的に発現する。
【００２０】
本発明はさらに、被験体の融合した頭蓋冠縫合と比較して未融合の縫合で差次的に発現する一つまたは複数の遺伝子または遺伝子産物を含む一組のバイオマーカーの、骨病変のための医薬の製造または診断プロトコルの開発における使用を提供する。
【００２１】
好ましい被験体はヒトである。「バイオマーカー」への言及には、遺伝子または遺伝子産物が含まれる。「遺伝子産物」には、タンパク質またはRNAが含まれる。
【００２２】
本明細書中で用いられる略語のリストを表1に提供する。
(表１)略語のリスト
2009523739.tif 000002
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明は、被験体中の骨病変に関する治療プロトコル、予防プロトコル、および診断プロトコルの標的を規定するバイオマーカーの形態で、差次的に発現する遺伝子を提供する。バイオマーカーは、融合した縫合と比較して未融合の縫合で差次的に発現する1組の遺伝子または遺伝子産物を含む。特に、融合した縫合に対して未融合の縫合は、頭蓋骨癒合症などの(しかしそれに限定されない)縫合に基づく頭蓋の異常を有する被験体中に存在する。しかし、バイオマーカーの同定によって、骨癌、骨吸収および修復、骨折対応、縫合に基づく頭蓋の異常(頭蓋骨癒合症など)、細胞骨格障害、骨粗鬆症、および石灰化欠陥、または他の生化学的もしくは構造的欠陥を含む範囲の骨病変に対する治療、予防、および診断プロトコルを発展させることができる。バイオマーカーはまた、骨成長を促進したり、骨健康状態を維持したりするために役立つ。本明細書では、バイオマーカーを「標的遺伝子」または「標的タンパク質」、あるいは「標的遺伝子発現産物」と呼ぶ。
【００２４】
本発明を記載し特許請求する際には、以下に述べる定義にしたがって以下の用語を用いる。
【００２５】
特に明記しない限り、本発明は特定の遺伝子、分析技術、生理学的条件などに限定されず、したがって当然変更することができる。本明細書に用いられる用語は、特定の態様について記載するだけのためであり、限定を意図するものではないこともまた当然である。
【００２６】
文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単数形の「ある（a）」、「ある（an）」、および「その（the）」には、複数の場合が含まれる。したがって、例えば、「ある遺伝子」への言及には、単一の遺伝子ならびに二つまたはそれ以上の遺伝子が含まれ、「ある薬剤」への言及には、単一の薬剤または二つまたはそれ以上の薬剤への言及が含まれ、「その骨病変」への言及には、一つの骨病変または複数の骨病変が含まれるなどである。
【００２７】
用語「骨病変」には、骨癌、骨石灰化欠陥の症状、または骨折、若木骨折、もしくは剥離骨折（bone chip）の後などの骨修復が必要な場合、縫合に基づく頭蓋障害(頭蓋骨癒合症など)、細胞骨格障害、骨粗鬆症、あるいは他の生化学的または構造的欠陥を非限定的に含む、任意の骨の障害または欠陥が挙げられる。用語「骨病変」を、任意の一つの症状、疾病、または欠陥に限定して考えるべきではない。しかし、特別な一つの症状が、頭蓋骨癒合症である。用語「骨病変」はまた、骨健康レベルを指す。したがって、ある標的遺伝子または遺伝子産物が、骨健康の維持または促進に役立つ可能性がある。
【００２８】
例えば、骨ミネラル含量の損失をもたらす種々様々な症状を、本発明は考慮する。そのような症状を有する被験体を、周知の技術を利用する臨床診断により同定することができる。処置することのできる疾病の代表的な例には、軟骨異栄養症、鎖骨頭蓋骨形成不全症、軟骨腫症、線維性異形成、ゴーシェ病、低リン酸血症性くる病、マルファン症候群、多発性遺伝性外骨症、神経繊維腫症、骨形成不全症、大理石骨病、骨斑紋症、硬化障害、骨折、歯槽膿漏症、偽関節症および化膿性骨髄炎などにおけるような、骨の異常成長または異常発生が存在する異形成が含まれていた。
【００２９】
本明細書で考慮する別の症状には、骨または骨細胞が転移した他の組織に、骨細胞の異常成長が存在する骨癌が含まれる。
【００３０】
本明細書で考慮する他の症状には、骨減少症(すなわち、青年期のピークの骨格ミネラル含量のある標準偏差より大きい骨ミネラル含量または密度の低下を引き起こす症状)の種々様々な原因が含まれる。そのような症状の代表的な例には、貧血、ステロイド、ヘパリン、壊血病、栄養失調、カルシウム欠乏、特発性骨粗鬆症、先天性骨減少症または骨粗鬆症、一過性の局所的骨粗鬆症および骨軟化症によって引き起こされる症状が含まれる。
【００３１】
用語「頭蓋骨癒合症」とは、頭蓋冠縫合の時期尚早の融合を指す。その症状は、エイパー(Apert)、ベーレ-スティーブンソン(Beare-Stevenson)、ボストン(Boston)、クルゾン(Crouzon)、ジャクソン-ワイス(Jackson-Weiss)、ファイファー(Pfeiffer)、セスレ-チョーゼン(Saethre-Chotzen)およびMuenke症候群を含む、任意の数の症状から発生する可能性がある。100以上の症候群が、頭蓋骨癒合症を引き起こすことがあり得る(Muenke and Wilkie, 2000（前記）を参照のこと)。
【００３２】
先に示したように、骨の成長を助けることまたは骨の健康維持を促進することが重要な状況があるであろう。したがって用語「病変」は、必ずしも疾病状態の処置を意味しない。本バイオマーカーが非疾病状態に役立つ可能性のある状況が、老人、年少幼児、スポーツ選手、および馬などの非ヒト動物に存在する。さらに、骨成長を、成長が最適以下である被験体中で促進してもよく；骨成長を、骨成長が過度の被験体中で阻害してもよく；かつ骨癌の成長を阻害することもできる。
【００３３】
用語「化合物」、「薬剤」、「化学薬剤」、「薬理学的活性薬剤」、「医薬」、「活性剤」および「薬物」は、本明細書で交換可能に用いられ、望ましい薬理学的および／または生理学的効果を引き起こす化学化合物を指す。これらの用語はまた、塩類、エステル類、アミド類、プロドラッグ類、活性代謝物類、類似物などを非限定的に含む、具体的に本明細書で言及した活性薬剤の、薬学的に許容されかつ薬理学的活性を有する活性成分を包含する。用語「化合物」、「薬剤」、「化学薬剤」、「薬理学的活性薬剤」、「医薬」、「活性剤」および「薬物」を用いる場合、活性薬剤それ自身、ならびに薬学的に許容され薬理学的活性を有する塩類、エステル類、アミド類、プロドラッグ類、代謝物質類、類似物類などが、これに含まれることを理解するべきである。前述の化合物は、差次的に発現する一つまたは複数の遺伝子の発現を特異的に調節するか(すなわち、場合によって発現を上方制御または下方制御する)、または遺伝子産物の活性を調節するか(すなわち、遺伝子産物の活性を増大または減少させる)、あるいは効果のないまたは低レベルの遺伝子産物に置き換わってもよい。したがって、本明細書で考慮する化合物は、遺伝療法、あるいはタンパク質置換またはタンパク質阻害療法に役立つ可能性がある。化合物が遺伝的分子である場合、それは、DNA、RNA、アンチセンス分子、センス分子、二重鎖または一本鎖のRNAまたはDNA、低分子干渉RNA (siRNA)、RNA干渉(RNAi)、または核酸とリボヌクレアーゼの複合体であってよい。
【００３４】
「化合物」、「薬剤」、「化学薬剤」、「薬理学的活性薬剤」、「医薬」、「活性剤」および「薬物」への言及には、二つまたはそれ以上の活性薬剤の組み合わせが含まれる。「組み合わせ」にはまた、2部分組成物などの複数部分組成物も含まれ、薬剤は別々に提供されて、別々に与えられるか投与され、または投与に先立って混合される。例えば、複数部分の薬品パッケージが、二つまたはそれ以上の薬剤を別々に保持してもよい。
【００３５】
本明細書に用いられる用語「有効量」および「治療的有効量」の薬剤とは、所望の治療的または生理的な効果または結果をもたらすために十分な量の薬剤を意味する。そのような効果または結果には、標的遺伝子または遺伝子産物の発現または活性を調節すること、あるいは治療介入の生理的な結果において調節すること(症候の改善など)が含まれる。望ましい治療効果と共に、時々望ましくない効果(例えば副作用)が現れる；したがって、担当医は、適切な「有効量」を決める際に、予想される利益と予想されるリスクとのバランスをとる。正確な必要量は、被験体ごとに、被験体の生物種、年齢、全身状態、投与の様式その他に依存して変化するであろう。したがって、正確な「有効量」を指定することはできないかもしれない。しかし、型通りの実験作業のみを用いて、当業者は任意の個々の適切な「有効量」を決定することができよう。
【００３６】
「有効量」にはまた、骨成長または全体的健康を促進する量も含まれる。
【００３７】
「薬学的に許容される」担体、賦形剤または希釈剤とは、生物学的にまたは他の点で不適当でない物質で構成された薬学的ビヒクルを意味する。すなわちその物質は、いかなるまたは相当な有害反応を引き起こすことなく、選択された活性薬剤と共に被験体に投与することができる。担体には、賦形剤、ならびに希釈剤、界面活性剤、着色剤、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤、保存剤などの他の添加剤が含まれてもよい。
【００３８】
同様に、本明細書で提供される化合物の「薬理学的に許容される」塩、エステル、アミド、プロドラッグまたは誘導体は、生物学的にまたは他の点で不適当でない塩、エステル、アミド、プロドラッグまたは誘導体である。
【００３９】
被験体を「処置する」ことには、罹患しやすい個体における症状または他の有害な生理学的事象の予防、ならびに症状の症候を改善することによる臨床的に症候のある個体の処置が含まれる。全体的な骨健康を推進するか、骨損傷を予防する際には、用語「予防」も用いられよう。
【００４０】
本明細書に用いられる「被験体」とは、本発明の薬学的製剤および方法から利益を得ることができる動物、好ましくは哺乳動物、そしてより好ましくはヒトを指す。本明細書に記載される薬学的製剤および方法から利益を得る可能性のある動物の型には限定がない。ヒトであるか非ヒト動物であるかにかかわらず、被験体を、個体、患者、動物、宿主、または受容者と呼ぶ。本発明の化合物および方法は、ヒト医学、獣医学、ならびに、一般に家畜または野生動物の畜産学に用途を有する。
【００４１】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書で交換可能に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、アミノ酸ポリマー(その中の一つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然のアミノ酸、天然のアミノ酸ポリマー、または組換えポリマーの人工化学類似体である)に適用される。
【００４２】
用語「標的遺伝子」または「標的遺伝子産物」あるいは「標的タンパク質」には、融合した縫合に対して未融合の縫合で、上方制御または下方制御される遺伝子またはその発現産物が含まれる。用語「標的遺伝子」に包含される遺伝子のリストを、表2、3、および4に提供する。これらの遺伝子の発現産物が、「標的遺伝子産物」の例である。
【００４３】
本明細書に用いられる用語「抗体」には、修飾された抗体または改変された抗体の様々な形態、例えば、原型の免疫グロブリン、軽鎖および重鎖可変領域のみを含むFv断片、ジスルフィド結合によって連結されたFv断片(Brinkmann et al, Proc. Natl, Acad. Sci USA, 90:547-551, 1993)、可変領域および定常領域の一部を含むFabまたは(Fab)'2断片、一本鎖抗体など(Bird et al, Science 242:424-426, 1988; Huston et al, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883, 1988)が含まれる。抗体は、動物(特にマウス、ラット、ヒツジ、もしくはヤギ)起源またはヒト起源であるか、あるいはキメラ(Morrison et al, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984)、あるいはヒト化(Jones et al, Nature 321:522-525, 1986)であってよい。
【００４４】
本明細書中の用語「核酸」または「オリゴヌクレオチド」あるいは文法的等価物は、共有結合で相互に連結された少なくとも二つのヌクレオチドを指す。本発明の核酸は、好ましくは一本鎖または二本鎖であり、かつ一般にリン酸ジエステル結合を含むであろう。しかしある場合には、以下に概説されるように、例えば、ホスホルアミド(Beaucage et al, Tetrahedron 49(10):1925, 1993)およびその中の参照文献；Letsinger, J. Org. Chem. 35:3800, 1970; Sprinzl et al, Eur. J. Biochem. 81:579, 1977; Letsinger et al, Nucl. Acids Res. 14:3487, 1986; Sawai et al, Chem. Lett. 805:1984; Letsinger et al, J. Am. Chem. Soc. 110:4470, 1988およびPauwels et al, Chemica Scripta 26:1419, 1986)、ホスホロチオエート(Mag et al, Nucleic Acids Res. 19:1437, 1991; 米国特許第5,644,048号およびホスホロジチオエート(Briu et al, J. Am. Chem. Soc. 111:2321, 1989)、O-メチルホスホロアミダイト結合(Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Pressを参照のこと)を含む、代わりの主鎖を有する核酸類似体が含まれる。
【００４５】
他の核酸類似体には、正電荷を持つ主鎖(Denpcy et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6097, 1995)；非イオン性主鎖(米国特許第5,386,023号; 第5,637,684号; 第5,602,240号; 第5,216,141号、および第4,469,863号; Angew, Chem. Intl. Ed. English 30:423, 1991; Letsinger et al, 1988 前記; Letsinger et al, Nucleoside & Nucleotide 13:1597, 1994; Chapters 2 and 3, ASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Ed. YS Sanghui and P Dan Cook; Mesmaeker et al, Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4:395, 1994; Jeffs et al, J. Biomolecular NMR 34:17, 1994; Tetrahedron, Lett. 37:743, 1996)、および非リボース主鎖(米国特許第5,235,033号; 第5,034,506号、およびChapters 6 and 7, ASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Ed.YS Sanghui and P Dan Cookに記載されているものを含む)を有する核酸類似体が挙げられる。一つまたは複数の炭素環式の糖を含む核酸も、核酸の定義内に含まれる(Jenkins et al, Chem. Soc. Rev.: l69-176, 1995)。いくつかの核酸類似体について、Rawls, C & E News:35, 1997に述べられている。リボースリン酸主鎖にこれらの修飾を行い、標識などの追加部分を加えやすくするか、または生理学的環境中のそのような分子の安定性および半減期を増大させることができる。
【００４６】
用語「試験薬剤」とは、本明細書に記載される分析の一つまたは複数によってスクリーニングされるべき薬剤を指す。薬剤は、事実上任意の化学化合物であり得る。それは、単一の単離された化合物として存在してもよいし、または化学薬品(例えばコンビナトリアル)ライブラリーの構成物であってもよい。特に好ましい態様では、試験薬剤は小さな有機分子であろう。
【００４７】
再び、用語「薬剤」は、「化合物」、「分子」、「医薬」および上に挙げたその他と置き換えることができる。
【００４８】
「遺伝子」には、ゲノム遺伝子またはcDNA分子が含まれる。用語「遺伝子」、「cDNA」、「核酸分子」、および「ヌクレオチド配列」は交換可能に用いることができる。「核酸分子」はRNAまたはDNAであってよい。
【００４９】
「バイオマーカー」は、遺伝子または遺伝子産物であってよい。「遺伝子産物」はタンパク質またはRNAであってよい。
【００５０】
したがって、本発明の一つの局面は、被験体の骨病変の処置または予防のため、または骨病変発症の危険を減少させるための方法を意図する。該方法は、遺伝物質の発現または遺伝物質がコードした産物の活性を調節する薬剤の有効量を、該被験体に投与する工程を含む。この遺伝物質は、融合した頭蓋冠縫合に対して未融合の縫合で差次的に発現する。
【００５１】
本発明はさらに、被験体の骨成長または健康を促進するための方法を提供する。該方法は、遺伝物質の発現または遺伝物質がコードした産物の活性を調節する薬剤の有効量を、該被験体に投与する工程を含む。この遺伝物質は、融合した頭蓋冠縫合に対して未融合の縫合で差次的に発現する。
【００５２】
骨病変の例は上記に挙げられている。
【００５３】
したがって、本発明の特定の態様は、骨癌、骨石灰化欠陥、骨折、縫合に基づく頭蓋異常、細胞骨格異常、骨粗鬆症、あるいは他の生化学的または構造的異常または症状の一つまたは複数より選択される症状の、処置または予防のための方法を提供し、該方法は、融合した縫合と比較して未融合の縫合で上方または下方制御される遺伝子または遺伝子産物の発現レベルを調節する薬剤を、該被験体に投与する工程を含む。
【００５４】
骨癌用のバイオマーカーの例には、表5に示される発現プロファイルを有するGPC3、RBP4、C1QTNF3、FMOD、WIF1、PRELP、PTN、およびCYFIP2が非限定的に含まれる。
【００５５】
本発明は、したがって、被験体の融合した縫合と比較して未融合の縫合で差次的に発現する、一つまたは複数の遺伝子または遺伝子産物を含む1組のバイオマーカーを提供する。
【００５６】
未融合の縫合で上方制御される遺伝子の例には、以下が非限定的に含まれる：
2009523739.tif 000003
【００５７】
融合した縫合で上方制御される遺伝子の例には、以下が非限定的に含まれる：
2009523739.tif 000004
【００５８】
特に有用なバイオマーカーには、PRELP、RBP4、C1QTNF3、GPC3、CYFIP2、MFAP4、IL11RA、INHBA、WIF1，ANXA3、CASP1，SHOX2、FMOD、FBLN1、OGNおよびPTNが非限定的に含まれる。
【００５９】
よりさらに特別に有用な遺伝子には、GPC3、RBP4、C1QTNF3、ANXA3、WIF1、およびSHOX2が非限定的に含まれる。GPC3、RBP4、およびC1QTNF3は、未融合の縫合で高度に発現され、WIF1、ANXA3、およびSHOX2は、融合したおよび融合中の縫合で高度に発現される。
【００６０】
上記遺伝子への言及には、それらの多型変異突然変異およびそれらの誘導体、ならびにそれらのホモログが含まれる。
【００６１】
したがって、本発明の別の局面は、被験体の骨病変を処置するか、またはその発症の危険を減少させる方法を意図し、該方法は、
2009523739.tif 000005
を含むリストより選択される遺伝子または遺伝子産物を下方制御する薬剤、または
2009523739.tif 000006
を含むリストより選択される遺伝子または遺伝子産物の発現を上方制御する薬剤を、該被験体に投与する工程を含む。
【００６２】
上記遺伝子の上方制御は、対照より少なくとも2倍高く、および少なくとも100倍まで高く、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100倍などの上方制御である。
【００６３】
少なくとも約2倍〜少なくとも約40倍の値の上方制御が好ましく、少なくとも約10倍〜約40倍の値が特に好ましい。
【００６４】
本発明はまた、コード化核酸分子またはそのアンチセンス型を含む遺伝子コンストラクト、あるいは別の方法で、以下より選択される遺伝子など融合した縫合に対して未融合の縫合でその発現が上方制御または下方制御される核酸分子を含むリストより選択される核酸分子を標的とする遺伝子コンストラクトを提供する。
2009523739.tif 000007
2009523739.tif 000008
【００６５】
特に有用な標的遺伝子は、PRELP、RBP4、C1QTNF3、GPC3、CYFIP2、MFAP4、IL11RA、INHBA、WIF1、ANXA3、CASP1、SHOX2、FMOD、FBLN1、OGNおよびPTNである。
【００６６】
さらに特別に有用な標的遺伝子は、GPC3、RBP4、C1QTNF3、ANXA3、WIF1、およびSHOX2である。
【００６７】
骨形態関連の差次的に発現する遺伝子の同定によって、治療および診断プロトコルを発展させることが可能になる。治療プロトコルは、遺伝子発現の操作、遺伝子置換およびタンパク質活性調節またはタンパク質置換療法を包含する。診断プロトコルには、遺伝子発現または遺伝子産物のレベルおよび／または遺伝子または遺伝子産物中の任意の突然変異の存在の決定を目的とする、遺伝的およびタンパク質に基づく分析が含まれる。
【００６８】
したがって本発明はさらに、骨病変の処置のための医薬の製造における、被験体中の融合した縫合と比較して未融合の縫合で差次的に発現する一つまたは複数の遺伝子または遺伝子産物の使用を提供する。
【００６９】
差次的な発現は、頭蓋骨癒合症を有する患者において都合よく決定される。したがって本発明は、その異常発現が縫合の時期尚早の融合をもたらすが、上記に列挙した他の骨病変にも関連している遺伝子を標的とすることを意図する。
【００７０】
したがって、さらに別の態様では、本発明は、骨病変に関連した標的遺伝子または標的遺伝子産物の活性のレベルを調節する薬剤をスクリーニングするための方法を提供する。本方法は、標的遺伝子を含む試験細胞を試験薬剤と接触させる工程と、対照細胞中の標的遺伝子の発現または標的遺伝子産物の活性と比較して、試験細胞中の標的遺伝子の発現レベルまたは標的遺伝子産物の活性における変化を検出する工程とを含み、その場合、試験細胞と対照細胞における標的遺伝子の発現レベルまたは標的遺伝子産物の活性の差が、該薬剤が骨病変の症候を調節するであろうことを示す。ある態様では、対照は、試験細胞より低い濃度で試験薬剤と接触させた陰性対照細胞である。様々な態様において、該細胞中の標的遺伝子mRNAのレベルを測定することにより標的遺伝子の発現レベルを検出し、および／または生物細胞中のタンパク質レベルを決定することにより標的遺伝子産物のレベルを検出する。
【００７１】
本発明はしたがって、標的遺伝子、標的遺伝子転写物、または他の遺伝子産物(タンパク質など)と相互作用する治療薬剤を提供する。そのような治療薬剤の設計には、一般に用いられるいくつかの工程が存在する。第1に、発現または活性に決定的に重要な、標的の特定の部分を決定する。タンパク質の場合には、例えば、ペプチド中のアミノ酸残基を系統的に変えることにより、例えば順番に各残基を置換することにより、これを行うことができる。そのようなタンパク質モチーフを定めるために、例えば、タンパク質のアラニンスキャンを一般に用いる。化合物の活性領域を構成するこれらの部分または残基は、その「ファルマコフォア」として知られている。先に示したように、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、または「タンパク質」は、交換可能に用いられる。
【００７２】
一旦ファルマコフォアが見出されれば、ある範囲の供給源(例えば分光技術、X線回折データおよびNMR)からのデータを用い、その物性(例えば立体化学、結合、大きさ、および／または電荷)にしたがって、その構造をモデル化する。コンピューター分析、類似性マッピング(それは原子間の結合ではなく、ファルマコフォアの電荷および／または体積をモデル化する)、および他の技術を、このモデル化プロセスで用いることができる。
【００７３】
この手法の変形では、標的の三次元構造をモデル化する。モデル化を用いて、直鎖状配列または三次元構造と相互作用する薬剤を生成することができる。
【００７４】
次に、ファルマコフォアを模倣する化学基をその上に移植できる鋳型分子を選択する。治療薬剤が、容易に合成され、薬理学的に許容されやすく、およびインビボで分解せず、その一方でリード化合物の生物活性を保持することができるように、鋳型分子およびその上に移植される化学基を都合よく選択することができる。または、薬剤がペプチドに基づく場合には、ペプチドを環化することによりさらなる安定性が得られ、剛性を増加させることができる。次にそれらが標的特性を有するかどうか、またはそれらがどの程度まで標的タンパク質の活性を調節できるか、または標的遺伝子の発現を調節できるかを確かめるために、この手法によって見出された薬剤をスクリーニングすることができる。次に、さらなる最適化または修飾を行って、インビボのまたは臨床試験のための一つまたは複数の最終薬剤に到達することができる。
【００７５】
合理的薬物設計の最終目標は、関心対象の生物活性ポリペプチドの、あるいはそれらが相互作用する小分子(例えばアゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤または促進剤)の、構造的類似体またはアンタゴニストを製造して、例えばより活性が強いかまたは安定形のポリペプチドである薬物、あるいは例えばインビボでポリペプチドの機能を増強するか妨げる薬物を生成することである(例えばHodgson, BioTechnology 9:19-21, 1991を参照のこと)。
【００７６】
本発明は、標的遺伝子の発現を制御する薬剤もまた企図する。これには、とりわけ遺伝子療法などにおいて、細胞へ遺伝子機能を提供すること、あるいはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む遺伝子サイレンシングコンストラクトまたは発現コンストラクトを用いて、遺伝子機能を阻害することが挙げられる。
【００７７】
核酸発現を制御することができる核酸配列など、標的核酸配列または核酸配列の一部を、ベクターに入れて細胞へ移入し、該核酸配列が染色体外に残るようにすることができる。そのような状況では、該核酸配列は、細胞によって染色体外の場所から発現されるであろう。組換え用および染色体外での保持用の両方の核酸配列導入用ベクターが、当技術分野において公知であり、任意の適当なベクターを用いることができる。電気穿孔、リン酸カルシウム共沈殿、およびウイルスによる形質導入など、細胞へ核酸を導入する方法が当技術分野において公知である。
【００７８】
特に、以下のウイルスを含む多数のウイルスが、核酸移入ベクターとして、あるいは、核酸移入ベクターを調製するための基盤として用いられてきた：パポバウイルス(例えば、SV40, Madzak et al, J Gen Virol 73:1533-1536, 1992)、アデノウイルス(Berkner, Curr Top Microbiol Immunol 158:39-66, 1992; Berkner et al, BioTechniques 6:616-629, 1988; Gorziglia and Kapikian, J Virol 66:4407-4412, 1992; Quantin et al, Proc Natl Acad Sci USA 89:2581-2584, 1992; Rosenfeld et al, Cell 68:143-155, 1992; Wilkinson et al, Nucleic Acids Res 20:233-2239, 1992; Stratford-Perricaudet et al, Hum Gene Ther 1:241-256, 1990; Schneider et al, Nat Genetics 18: 180-183, 1998)、牛痘ウイルス(Moss, Curr Top Microbiol Immunol 158: 5-38, 1992; Moss, Proc Natl Acad Sci USA 93:11341-11348, 1996)、アデノ随伴ウイルス、(Muzyczka, Curr Top Microbiol Immunol 158:97-129, 1992; Ohi et al, Gene 89:279-282, 1990; Russell and Hirata, Nat Genetics 18:323-328, 1998)、HSVおよびEBVを含むヘルペスウイルス(Margolskee, Curr Top Microbiol Immunol 158:67-95, 1992; Johnson et al, J Virol 66:2952-2965, 1992; Fink et al, Hum Gene Ther 3:1-19, 1992; Breakefield and Geller, Mol Neurobiol 1:339-371, 1987; Freese et al, Biochem Pharmaco. 40:2189-2199, 1990; Fink et al, Ann Rev Neurosci 19:265-287, 1996), レンチウイルス(Naldini et al, Science 272:263-267, 1996)、シンドビスおよびセムリキ森林熱ウイルス(Berglund et al, Biotechnology 11:916-920, 1993)、およびトリ起源のレトロウイルス(Bandyopadhyay and Temin, Mol Cell Biol 4:749-754, 1984; Petropoulos et al, J Virol 66:3391-3397, 1992)、マウス起源のレトロウイルス(Miller, Curr Top Microbiol Immunol 158:1-24, 1992; Miller et al, Mol Cell Biol 5:431-437, 1985; Sorge et al, Mol Cell Biol 4:1730-1737, 1984; Mann and Baltimore, J Virol 54:401-407, 1985; Miller et al, J Virol 62:4337-4345, 1988)、およびヒト起源のレトロウイルス(Shimada et al, J Clin Invest 88:1043-1047, 1991; Helseth et al, J Virol 64:2416- 2420, 1990; Page et al, J Virol 64:5270-5276, 1990; Buchschacher and Panganiban, J Virol 66:2731-2739, 1982)。
【００７９】
リン酸カルシウム共沈殿を含む化学的技術、例えばマイクロインジェクションなどの機械的技術、リポソームによる膜融合媒介移入、および直接のDNA取込み、ならびにレセプター媒介DNA移入など、非ウイルス的核酸移入方法が当技術分野において公知である。ウイルス媒介核酸移入は、リポソーム送達を用いる直接のインビボ核酸移入と組み合わせることができ、特定の細胞にウイルスベクターを向けることを可能にする。または、特定の組織にレトロウイルスベクター産生細胞株を注入することができる。産生細胞の注入は、その後ベクター粒子の持続的な供給源を提供することになろう。
【００８０】
本発明はさらに、標的遺伝子の転写をサイレンシングするために役立つポリヌクレオチド配列など、アンチセンスおよびセンス分子の導入を意図する。リボザイム、マイクロRNA、合成RNAi、DNA由来のRNAi、および二本鎖RNAもまた導入することができる。転写前および転写後の遺伝子サイレンシングの両方を、アンチセンスサイレンシングを含めて意図する。さらに、標的遺伝子の発現産物をコードする遺伝子座のすべてまたは一部を含むポリヌクレオチドベクターを、プロモーターの制御下に、アンチセンスまたはセンス方向に置き、細胞へ導入してもよい。そのようなアンチセンスまたはセンスコンストラクトの細胞内での発現は、標的転写および／または翻訳を妨害する。
【００８１】
一つの態様では、遺伝子操作された遺伝分子が、標的遺伝子の発現を調節するために使用されるオリゴヌクレオチドおよび同様な分子種をコードする、すなわちこのオリゴヌクレオチドは、転写前または転写後の遺伝子サイレンシングを引き起こす。標的遺伝子産物をコードする一つまたは複数の標的核酸分子と特異的にハイブリダイズするか、またはそうでなければそれらを標的とするオリゴヌクレオチドを提供することにより、これは達成される。したがってコンストラクトは、とりわけ、マイクロRNA、dsRNA、ヘアピンRNA、RNAi、siRNAまたはDNAをコードしてもよい。本明細書に用いられる用語「標的遺伝子」は便宜上、標的遺伝子産物をコードするDNA、そのようなDNAから転写されたRNA(前躯体mRNA、mRNAまたはそれらの一部を含む)、およびさらにそのようなRNAに由来するcDNAを包含するように用いられる。
【００８２】
したがって別の態様で、本発明は、骨病変であることまたは骨病変を引き起こすことを特徴とする疾病または症状の処置または予防のための方法を提供し、本方法は、融合した縫合に対して融合していない縫合で差次的に発現する遺伝子の発現を制御することができる薬剤を被験体に投与する工程を含む。この方法には、骨の成長または全体的な健康を促進する工程が含まれる。先に示したように、非遺伝的治療薬剤を投与してもよい。本発明の薬剤を、一つまたは複数の薬学的に許容される担体および／または希釈剤と組み合わせて、薬理学的組成物を形成することができる。薬学的に許容される担体は、例えば、本発明の薬学的組成物の吸収速度または除去速度を安定化するかあるいは増加または減少させるように働く、生理学的に許容される化合物を含むことができる。生理学的に許容される化合物は、例えばグルコース、ショ糖、またはデキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸またはグルタチオンなどの酸化防止剤、キレート剤、低分子量タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドのクリアランスまたは加水分解を減少させる組成物、あるいは賦形剤または他の安定化剤および／または緩衝剤を含むことができる。界面活性剤を用いて、リポソーム担体を含む薬学的組成物の吸収を安定化するかあるいは増加または減少させることもできる。ペプチドおよびポリペプチド用の薬学的に許容される担体および製剤は当業者に公知であり、科学文献および特許文献に詳細に述べられている。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990 (「Remington's」)を参照のこと。
【００８３】
他の生理学的に許容される化合物には、湿潤剤、乳化剤、分散剤、あるいは微生物の成長または作用を防止するために特に役立つ保存剤が含まれる。様々な保存剤が周知であり、例えばフェノールおよびアスコルビン酸が挙げられる。生理学的に許容される化合物を含む薬学的に許容される担体の選択が、例えば本発明の調節用薬剤の投与経路およびその特定の生理化学的特性に依存することは、当業者には当然のことであろう。
【００８４】
薬学的組成物の形態の薬剤の投与は、当業者に公知の任意の便利な手段によって行ってよい。投与経路には、呼吸器内、気管内、鼻咽頭内、静脈内、腹腔内、皮下、頭蓋内、皮内、筋肉内、眼球内、髄膜下、脳内、鼻腔内、経口、直腸内、パッチ、および埋込みが非限定的に含まれる。
【００８５】
経口投与用に、化合物を、カプセル剤、丸剤、錠剤、トローチ剤、散剤、懸濁液、または乳剤など、固体または液体調製物へ製剤化することができる。組成物を経口剤形に調製する際、経口液体製剤(例えば、懸濁液、エリキシル剤、および溶液など)の場合、例えば水、グリコール、油、アルコール、香料、保存剤、着色剤、沈殿防止剤など、通常の製薬媒体の任意のもの；または経口固形製剤(例えば散剤、カプセル剤、錠剤など)の場合、デンプン、砂糖、希釈剤、粒状化剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤などの担体を使用することができる。投与が容易なことから、錠剤およびカプセル剤が最も有利な経口投薬単位形であり、その場合は、当然固体の薬学的担体を使用する。所望の場合、錠剤を、標準技術によって糖衣にしても、または腸溶性コートをしてもよい。活性薬剤をカプセル化することにより、胃腸管を安定に通過させることができて、一方で同時に血液脳関門を横切る通過を可能にする。例えば、国際特許出願公報第WO96/11698号を参照のこと。
【００８６】
本発明の薬剤を、経口投与するときに消化されないよう保護することもできる。薬剤を酸性および酵素加水分解に耐性になるよう組成物と複合体化することによって、または薬剤をリポソームのような適切な抵抗性担体で包装することによってのいずれかで、これを遂行することができる。化合物を消化から保護する手段は、当技術分野において周知である。例えば、治療薬の経口送達用脂質組成物について記載されているFix, Pharm Res 13:1760-1764, 1996; Samanen et al, J Pharm Pharmacol 48:119-135, 1996; 米国特許第5,391,377号を参照のこと。
【００８７】
注射用の使用に適した薬学的剤形は、滅菌注射溶液または分散液を調製するため、滅菌水溶液(水溶性の場合)または分散液および滅菌粉末剤を含み、あるいはクリームの形態または局所適用に適する他の形態でもよい。それは製造および貯蔵条件下で安定でなくてはならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、多価アルコール(例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール他)、それらの適当な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒であり得る。例えばレシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合の必要な粒経の保持によって、および界面活性剤の使用によって、適当な流動性を維持することができる。様々な抗細菌性および抗真菌性薬剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって、微生物作用を防止することができる。多くの場合に、等張性薬剤、例えば砂糖、塩化ナトリウムを含むことが望ましいであろう。注射用組成物の遅延吸収が、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に使用することによって可能になる。
【００８８】
無菌注射溶液は、必要量の薬剤を必要に応じて上記に列挙した様々な他の成分と共に適切な溶媒に混合し、続いて濾過滅菌を行うことにより調製される。一般に分散液は、様々な滅菌活性成分を、基礎的分散媒および上記に列挙した成分からの必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに混合することにより調製される。無菌注射溶液調製用の無菌粉末剤の場合、前もって滅菌濾過された活性成分および任意の所望の付加成分の溶液から粉末を生成する、真空乾燥および真空凍結乾燥技術が、好ましい調製法である。
【００８９】
非経口投与用には、薬剤担体中に薬剤を溶解し、溶液または懸濁液のいずれかとして投与することができる。適当な担体の例示としては、水、食塩水、デキストロース溶液、果糖溶液、エタノール、または動物、植物、もしくは合成物起源の油がある。担体はさらに他の成分、例えば保存剤、沈殿防止剤、可溶化剤、緩衝剤などを含んでもよい。薬剤を髄膜下に投与する場合は、それらを脳脊髄液に溶解してもよい。
【００９０】
経粘膜または経皮投与については、浸透させるべき障壁に適切な浸透剤を用いて、薬剤を送達することができる。そのような浸透剤は、一般に当技術分野において公知であり、例えば、経粘膜投与用には、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が公知である。さらに、浸透を促進するために界面活性剤を用いることができる。経粘膜投与は、鼻内噴霧によるか、または坐剤を用いることができる(例えば、Sayani and Chien, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 13:85-184, 1996)。局所的な経皮投与については、薬剤を、軟膏、クリーム、膏薬、粉末剤、およびゲル剤に製剤化する。経皮的送達システムは、パッチを含むこともできる。
【００９１】
吸入については、乾燥粉エアロゾル、液体配送システム、エアージェット噴霧器、噴霧剤システムなど(例えばPatton, Nat Biotech 16:141-143, 1998を参照のこと)；ポリペプチド高分子用の生成物と吸入送達システム(例えば Dura Pharmaceuticals (San Diego, CA), Aradigm (Hayward, CA), Aerogen (Santa Clara, CA), Inhale Therapeutic Systems (San Carlos, CA)その他による)を含む、任意の当技術分野で公知のシステムを用いて、本発明の薬剤を送達することができる。例えば、薬学的製剤を、エアロゾルまたは霧剤の形で投与することができる。エアロゾル投与については、界面活性剤および噴霧剤と共に製剤を微細に分割した形態で供給することができる。別の局面では、呼吸組織に製剤を送達するための装置は、その中で製剤が気化する吸入器である。他の液体送達システムには、例えば、エアージェット噴霧器が含まれる。
【００９２】
製剤を内部に送達することができる持続性送達すなわち徐放性機構により、本発明の薬剤を投与することもできる。例えば本発明の製剤に、薬剤の持続性送達が可能な生物分解性ミクロスフェアまたはカプセル、あるいは他の生分解性ポリマー構造を含めることができる(例えばPutney and Burke, Nat Biotech 16:153-157, 1998)。
【００９３】
本発明の医用薬剤を調製する際に、様々な製剤修飾を用いて処理し、薬物動態学および体内分布を変化させることができる。薬物動態学および体内分布を変化させる多くの方法が、当業者に公知である。そのような方法の例には、タンパク質、脂質(例えばリポソーム)、炭水化物、または合成ポリマーなどの物質からなる小胞中での本発明の組成物の保護が含まれる。薬物動態学の全般的な議論については、例えばRemington'sを参照のこと。
【００９４】
一つの局面では、本発明の薬剤を含む薬学的製剤を、リポソームなどの脂質単分子層または二分子層に組み込む(例えば米国特許第6,110,490号; 第6,096,716号; 第5,283,185号、および第5,279,833号を参照のこと)。本発明はまた、本発明の水溶性調節薬剤が、単分子層または二分子層の表面に接着された製剤を提供する。例えば、ペプチドを、ヒドラジド-PEG-(ジステアロイルホスファチジル)エタノールアミンを含むリポソームに接着させることができる(例えばZalipsky et al, Bioconjug Chem 6:705-708, 1995)。リポソーム、あるいは平面脂質膜または原型の細胞(例えば赤血球)の細胞膜など任意の形態の脂質膜を用いることができる。リポソーム製剤は、静脈内、経皮的(Vutla et al, J Pharm Sci 85:5-8, 1996)、経粘膜的、または経口的な投与を含む、任意の手段によって可能である。本発明はまた、ミセルおよび／またはリポソーム内に本発明の薬剤を取り込んだ薬学的調製物を提供する(Suntres and Shek, J Pharm Pharmacol 46:23-28, 1994; Woodle et al, Pharm Res 9:260-265, 1992)。リポソームおよびリポソーム製剤は、標準的な方法によって調製することができ、当技術分野において周知である(例えば Remington's; Akimaru et al, Cytokines Mol Ther 1:197-210, 1995; Alving et al, Immunol Rev 145:5-31, 1995; Szoka and Papahadjopoulos, Ann Rev Biophys Bioeng 9:467-508, 1980, 米国特許第4, 235,871号, 第4,501,728, および第4,837,028号を参照のこと)。
【００９５】
本発明の薬学的組成物を、投与方法に依存して様々な単回投与形式で投与することができる。典型的な薬学的組成物の用量は、当業者に周知である。そのような用量は、通常は本来専門家が決めるべきであり、特定の治療事情、患者の耐性などに依存して調節される。これを遂行するために十分な薬剤の量を「有効量」と定義する。これを使用するための投与計画および有効量、すなわち「投与処方計画」は、疾病または症状の病期、疾病または症状の重篤度、患者の一般的健康状態、患者の体格、年齢、薬学的製剤、および活性薬剤の濃度などを含む様々な因子に依存するであろう。患者のための投与計画を決める際に、投与様式も考慮に入れる。投与計画はまた、薬物動態学(すなわち薬学的組成物の吸収速度、バイオアベイラビリティ、代謝、クリアランスなど)を考慮に入れなければならない。例えば、Remington's; Egleton and Davis, Peptides 18:1431-1439, 1997; Langer, Science 249:1527-1533, 1990を参照のこと。
【００９６】
これらの方法にしたがって、本発明により定義される薬剤および／または薬学的組成物を、一つまたは複数の他の薬剤と共に同時投与してもよい。本明細書での「同時投与する」への言及は、同一製剤または二つの異なる製剤での、同一または異なる経路による同時の投与、あるいは同一または異なる経路による連続投与を意味する。本明細書での「連続」投与への言及は、二つの型の薬剤および／または薬学的組成物の投与の間の、秒から、分、時間、または日までの時間差を意味する。薬剤および／または薬学的組成物の同時投与は、任意の順序で行ってよい。
【００９７】
本発明はまた、疾病または症状の存在、あるいは疾病または症状を発症する傾向、あるいは疾病または症状の重篤度を決定するために役立つ、診断および／または予後分析および試薬の開発を促進する。この疾病または症状は、融合した縫合に関連する頭蓋異常などの骨病変であるという特徴を有する。
【００９８】
したがって本発明は、被験体の骨病変の発症を診断するかまたは予測する方法を意図し、本方法は、被験体由来の罹患した可能性のある骨または骨組織から、遺伝物質あるいは遺伝物質によってコードされたタンパク質またはRNAを含む試料を取り出す工程、および遺伝物質の発現パターンを決定する工程を含み、対照と比較した特定の遺伝物質の発現の上方制御または下方制御は、骨病変またはそれを発症する危険性を示す。
【００９９】
したがって分析は、遺伝またはタンパク質に基づく。特に有用な診断標的が上記に列挙されている。上方または下方制御されているとして、単一の標的を同定してもよく、あるいは一連の二つ以上の標的が、それ自体で骨病変の存在またはその発症の危険性の徴候を提供するプロファイルを提供する可能性もある。
【０１００】
特に好ましい診断用分析は、DNA中の突然変異ならびにmRNAのレベルおよび突然変異の検出など(しかしそれらに限定されない)の核酸に基づくものである。本明細書中でのDNAおよびmRNAのへの言及は、バイオマーカーに関連する核酸分子を意味する。一つの態様では、一つのバイオマーカーまたは一連のバイオマーカー中の突然変異により、頭蓋骨癒合症(しかしこれに限定されない)などの骨病変の発症の可能性が予想される。本明細書において、核酸またはタンパク質に基づく分析を行うべき試料への言及には、血清、全血、血漿、粘液、組織液、組織抽出物、骨組織生検、または骨病変に関連する遺伝子またはタンパク質の他の供給源などの生体試料が含まれる。
【０１０１】
遺伝子の発現レベルは、遺伝子産物の転写(すなわちmRNAの転写)の変化により、および／または遺伝子産物の翻訳(すなわちタンパク質の翻訳)の変化により、および／または翻訳後の修飾(例えばタンパク質の折り畳み、糖鎖形成など)により、変えることができる。発現レベルは、遺伝子中の突然変異レベルによっても影響される可能性がある。したがって本発明の好ましい分析には、転写されたmRNAのレベル、翻訳されたタンパク質のレベル、翻訳されたタンパク質の活性、および／またはDNAまたはmRNA中の多型を含む突然変異を分析することが含まれる。
【０１０２】
例えば、発現レベルの変化を、mRNAおよび／またはmRNA由来の核酸(例えば逆転写されたcDNAなど)の変化の測定により検出することができる。標的遺伝子の発現レベルを測定するためには、そのような分析用の核酸試料を提供することが望ましい。好ましい態様では、核酸は、生体試料中に見出されるかまたは生体試料に由来する。本明細書に用いられる用語「生体試料」とは、生物体または生物体の構成要素(例えば細胞)から得られる試料を指す。試料は、任意の生物組織または流体のものであってよい。生体試料には、器官、または組織学的目的のために採取された凍結切片などの組織切片も含まれる。しかし一般に、骨試料を採取してもよく、または頭蓋骨癒合症の場合には、試料は頭蓋冠の縫合に由来する。
【０１０３】
「対照」は一般に、融合した頭蓋冠の縫合に対する未融合の縫合での遺伝子発現パターンである。
【０１０４】
核酸(例えばmRNA由来のmRNA核酸)は、ある好ましい態様では、当業者に周知の多数の方法の中の任意の方法により試料から単離される。mRNAを単離する方法は、当業者に周知である。例えば、核酸の単離および精製が、Tijssen, Ed, Chapter 3 of Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Theory and Nucleic Acid Preparation, Elsevier, NY and Tijssen, Ed.に詳細に述べられている。
【０１０５】
好ましい態様では、例えば酸グアニジニウム−フェノール−クロロホルム抽出法を用いて、「全」核酸を所与の試料から単離し、オリゴdTカラムクロマトグラフイーによっ、または(dT)n磁気ビーズによって、polyA＋mRNAを単離する(Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.) 1-3:1989またはAusubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, F, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1987を参照のこと)。
【０１０６】
発現レベルを分析する前に核酸試料を増幅することが望ましい場合がしばしばある。核酸を増幅する方法は当業者に周知であり、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR、例えばInnis et al, PCR Protocols, A Guide to Methods and Application. Academic Press, Inc. San Diego, 1990)、リガーゼ連鎖反応(LCR)(Wu and Wallace, Genomics 4:560, 1989; Landegren et al, Science 241:1077, 1988 and Barringer et al, Gene 89: 117, 1990を参照のこと)、転写増幅(Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173, 1989)、自立配列複製(Guatelli et al, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87:1874, 1990)、ドットPCR、およびリンカーアダプターPCRを非限定的に含む。
【０１０７】
標的遺伝子の公知の配列を用いて、標的遺伝子転写物の検出および／または定量を、核酸ハイブリダイゼーション技術を用いて型通りに遂行することができる(Sambrook et al, 1989 前記を参照のこと)。例えば、標的遺伝子の逆転写cDNAの存在、非存在または量を評価する一つの方法には、「サザンブロット」が含まれる。サザンブロットでは典型的に、破砕して電気泳動ゲルにより分離したDNA(例えば逆転写された標的mRNA)を、標的遺伝子特異的プローブへハイブリダイズさせる。標的遺伝子プローブからのハイブリダイゼーション信号強度の「対照」プローブ(例えば「ハウスキーピング遺伝子」用プローブ)との比較により、標的核酸の相対的発現レベルの評価が与えられる。
【０１０８】
または、標的遺伝子mRNAを、ノーザン法によって直接定量することができる。簡潔に述べれば、例えば酸グアニジニウム−フェノール−クロロホルム抽出法を用いて、mRNAを所与の細胞試料から単離する。次に、mRNAを電気泳動にかけてRNA種を分離し、mRNAをゲルからニトロセルロース膜に移す。サザンブロットの場合と同様に、標識されたプローブを用いて、標的遺伝子mRNAを同定および／または定量する。適切な対照(例えばハウスキーピング遺伝子に対するプローブ)が、相対的な発現レベルを評価するための基準を提供する。
【０１０９】
標的遺伝子の発現レベルを決定するための別の手段が、インサイチューハイブリダイゼーションである。インサイチューハイブリダイゼーション分析は周知である(例えばAngerer, Meth. Enzymol 152:649, 1987)。一般に、インサイチューハイブリダイゼーションは以下の主要な工程を含む：(1) 解析するべき組織または生物学的構造の固定；(2) 標的DNAまたはRNAへのアクセスしやすさを向上させかつ非特異的結合を減少させるための、生物学的構造のハイブリダイゼーション前の処理；(3) 核酸混合物の生物学的構造または組織中の核酸へのハイブリダイゼーション；(4) ハイブリダイゼーションで結合されない核酸断片を除去するためのハイブリダイゼーション後の洗浄；および(5) ハイブリダイズされた核酸断片の検出。これらの各々の工程中で用いられる試薬および使用条件は、個々の適用例に依存して変化する。
【０１１０】
別の態様では、増幅に基づく分析を用いて、標的遺伝子発現(転写)レベルを測定することができる。そのような増幅に基づく分析では、標的核酸配列が、増幅反応(例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)または逆転写PCR (RT-PCR))において鋳型として働く。定量的増幅では、増幅産物の量は、元の試料中の鋳型の量に比例することになる。適当な対照(例えば試験薬剤に曝されていない健康な組織または細胞)との比較が、標的遺伝子転写物レベルの大きさを提供する。
【０１１１】
本発明は、アレイに基づくハイブリダイゼーション様式までに及ぶ。アレイは、一つまたは複数の表面(例えば固体、メンブレンまたはゲル)へ接着された、多数の異なる「プローブ」または「標的」核酸(あるいは他の化合物)である。好ましい態様では、多数の核酸(または他の部分)を、単一の連続した表面または多数の相互に並んだ表面へ接着させる。
【０１１２】
アレイ様式では、多数の異なるハイブリダイゼーション反応を本質的に「平行して」実行することができる。これが、単一の「実験」において、多数のハイブリダイゼーションの、迅速で、本質的に同時の評価を与える。アレイに基づく様式でハイブリダイゼーション反応を行う方法は、当業者に周知である(Pastinen, Genome Res. 7:606-6145, 1997; Jackson, Nature Biotechnology 14:1685, 1996; Chee, Science 274:610, 1995; WO 96/17958; Pinkel et al, Nature Genetics 20:207-211, 1998 を参照のこと)。
【０１１３】
アレイ、特に核酸アレイを、当業者に周知の種々様々な方法によって作製することができる。例えばある単純な態様では、固体支持体(例えばガラス面、メンブレンなど)上の種々の位置に種々の核酸をスポットする(例えば手でピペットを用いて)ことにより、「低密度」アレイを簡単に作製することができる。
【０１１４】
この単純なスポット方法を自動化し、高密度のスポットアレイが作製された(米国特許第5,807,522号を参照のこと)。この特許は、マイクロキャピラリーを表面に軽く打ち付けて小量の生体試料を沈着させる、自動化システムの使用について記載している。そのプロセスを繰り返して、高密度アレイを作製する。
【０１１５】
オリゴヌクレオチド合成技術を用いて、アレイを作製することができる。例えば米国特許第5,143,854号およびPCT特許公報番号 WO 90/15070および92./10092は、高密度オリゴヌクレオチドアレイの光配向コンビナトリアル合成法の使用を教示する。高密度アレイの合成については米国特許第5,744,305号; 第5,800,992号;および第5,445,934号にも述べられている。
【０１１６】
標的遺伝子の核酸発現レベルの検出に加えて、またはその代わりに、翻訳された標的遺伝子がコードするポリペプチドの量および／または活性を、検出および／または定量することにより、標的遺伝子発現の変化を検出および／または定量することができる。
【０１１７】
当業者に周知の多数の方法の中の任意のものにより、標的遺伝子によってコードされたポリペプチドを、検出し定量することができる。これらには、電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、薄層クロマトグラフィー(TLC)、超拡散クロマトグラフィーなどの分析生化学的方法、あるいは、流体またはゲル沈降反応、免疫拡散(単一または二重の)、免疫電気泳動法、放射免疫定量法(RIA)、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)、免疫蛍光分析、ウェスタンブロッティングなどの様々な免疫学的方法が含まれてもよい。
【０１１８】
一つの態様では、標的遺伝子発現産物(例えばタンパク質)を、電気泳動タンパク質分離法(例えば一次元または二次元電気泳動)で検出し／定量する。電気泳動技術を用いるタンパク質検出手段は、当業者に周知である(Scope, Protein Purification, Springer-Verlag, NY, 1982; Duetscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. NY, 1990を参照のこと)。
【０１１９】
別の態様では、ウエスタンブロット(免疫ブロット)分析を用いて、試料中の本発明のポリペプチドの存在を検出し定量する。この技術は一般に、ゲル電気泳動法によって、試料タンパク質を分子量に基づいて分離する工程、適当な固体支持体(ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、または誘導体化ナイロンフィルターなど)に、分離されたタンパク質を移す工程、および試料を、標的ポリペプチドを特異的に結合する抗体とインキュベートする工程を含む。
【０１２０】
したがって本発明は、標的ポリペプチドに対する抗体にまで及ぶ。ポリクローナル抗体を便利に用いてもよいが、しかし免疫分析におけるまたは捕獲のためのモノクローナル抗体の使用が、多量に産生できることおよび産生された抗体の均一性のために特に好ましい。モノクローナル抗体産生用ハイブリドーマ細胞株の調製を、不死細胞株と免疫原性試料(すなわち35-LMポリペプチドを含む)に対して感作されたリンパ球を融合させることにより行うか、または当業者に周知の技術によって遂行する(例えばDouillard and Hoffman, Basic Facts about Hybridomas, in Compendium of Immunology Vol. II, ed. by Schwartz, 1981; Kohler and Milstein, Nature 256: 495-499, 1975; Kohler and Milstein, European Journal of Immunology 6: 511-519, 1976を参照のこと)。一本鎖抗体、またはヒト化抗体を発現する遺伝子組換えマウス、あるいは他の認識タンパク質を用いてもよい。この点に関して有用なタンパク質には、二重特異性抗体、ペプチド模倣体、ならびにscFv断片およびFab断片などの抗体断片が含まれる。
【０１２１】
したがって、本発明はさらに、一つの動物または鳥類に由来する抗体が、同一または異なる種の別の動物または鳥類において実質的に非免疫原性になるようにする生化学的技術の適用法を提供する。この生化学的プロセスを、本明細書では「脱免疫化（de-immunization）」と呼ぶ。本明細書での「脱免疫化」への言及には、相補性決定領域(CDR)の移植、免疫相互作用分子のフレームワーク領域および可変(v)領域突然変異に関する「再形成」などのプロセスが含まれ、それらはすべて特定の宿主(例えば、ヒト被験体)中での免疫相互作用分子の免疫原性を減少させることを目指している。この場合には、好ましい抗体は、一つの動物または鳥類に由来するモノクローナル抗体であって、これは同一または異なる種由来の別の動物または鳥類(ヒトの治療または画像化目的で用いられる場合は、非限定的にヒトなど)の中で、低い免疫原性を示すモノクローナル抗体である。
【０１２２】
本発明は、抗体またはそれらの抗原結合断片にまで及ぶ。抗体は、ポリクローナルでもモロクローナルでもよい。
【０１２３】
標的ポリペプチドに対するポリクローナル抗体を、当業者に周知の方法により調製することができる(例えばGreen et al, Immunochemical Protocols (Manson ed):1-5, 1992; Williams et al, DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Ed., Oxford University Press 1995を参照のこと)。ポリクローナル抗体は、典型的にはラット、マウス、ウサギ、ヤギ、またはヒツジなどの動物中で産生されるが、本発明の標的ポリペプチド抗体もまた、ヒトより下等な霊長類抗体に由来するものであってよい。診断上および治療上有用な抗体をヒヒ中で生成するための一般的な技術を、例えばGoldenberg et al., 国際特許公報番号WO 91/11465, 1991およびLosman et al, Int. J. Cancer 46:310, 1990に見出すことができる。
【０１２４】
抗体は、少なくとも可変領域ドメインを含まなければならない。可変領域ドメインは任意の大きさまたはアミノ酸組成であってよく、一般に、フレームワーク配列に埋め込まれた、抗原結合に重要な少なくとも一つの超可変アミノ酸配列を含む。一般的に言って、可変(V)領域ドメインは、免疫グロブリンの重鎖(VH)および／または軽鎖(VL)可変ドメインの任意の適当な編成であってよい。したがって例えば、V領域ドメインは、モノマーであっても、VHまたはVLドメインであってよい(これらは、許容できる親和性で独立して抗原と結合することができる)。または、V領域ドメインは二量体であって、VH鎖およびVL鎖が非共有結合で結合されたVH-VH、VH-VL、またはVL-VL二量体を含んでもよい(以下でFvと略する)。しかし所望の場合は、例えば二つの可変ドメイン間のジスルフィド結合を介して直接、またはリンカー(例えばペプチドリンカー)を介してのいずれかで、鎖が共有結合されて、一本鎖ドメインを形成してもよい(以下本明細書でscFVと略する)。
【０１２５】
可変領域ドメインは、任意の天然の可変ドメイン、またはその遺伝子操作版であってよい。遺伝子操作版とは、組換えDNA工学技術を用いて作製された可変領域ドメインを意味する。そのような遺伝子操作版には、例えば自然抗体可変領域から、自然抗体のアミノ酸配列中または配列へ挿入、欠失、または変更を加えることによって作製されたものが含まれる。この型の特別な例には、抗体由来の少なくとも一つのCDRおよび任意で一つまたは複数のフレームワークアミノ酸、ならびに別の抗体由来の残りの可変領域ドメインを含む、遺伝子操作された可変領域ドメインが含まれる。
【０１２６】
可変領域ドメインを、C末端アミノ酸において少なくとも一つの他の抗体ドメインまたはその断片に共有結合してもよい。したがって例えば、VHドメインが可変領域ドメインに存在する場合に、これを免疫グロブリンCH1ドメインまたはその断片に連結してもよい。同様に、VLドメインをCKドメインまたはその断片に連結してもよい。このように、例えば抗体はFab断片であってよく、抗原結合ドメインは、接着しているVHおよびVLドメインを含み、VHおよびVLドメインは、C末端でCH1およびCKドメインにそれぞれ共有結合されている。例えば、CH1ドメインをさらにアミノ酸によって伸長して、Fab断片に見出されるようなヒンジ領域ドメインを提供するか、または抗体CH2およびCH3ドメインなど、さらなるドメインを提供してもよい。
【０１２７】
抗体断片の別の形は、単一の相補性決定領域(CDR)をコードするペプチドである。関心対象の抗体のCDRをコードする遺伝子を構築することによって、CDRペプチド(「最小の認識単位」)を得ることができる。例えばポリメラーゼ連鎖反応を用いて抗体産生細胞のRNAから可変領域を合成することにより、そのような遺伝子を調製する(例えばLarrick et al, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, 1991; Courtneay-Luck, Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al (eds), Cambridge University Press:166, 1995およびWard et al, Monoclonal Antibodies: Principles and Applications Birch et al, Wiley-Liss, Inc.:137, 1995を参照のこと)。
【０１２８】
本発明で使用する抗体は、好ましくはモロクローナル抗体(従来の免疫化および細胞融合手段によって調製される)であり、あるいは断片の場合には、還元または酵素的切断および／または消化技術(例えばペプシンによる処理)など任意の適当な標準化学を用いて、モロクローナル抗体から生じるものである。より具体的には、モロクローナル抗TGFβ結合タンパク質抗体を、様々な技術を利用して生成することができる。当業者に公知の方法によって、特定の抗原に対するげっ歯類のモノクローナル抗体を得ることができる(例えばKohler et al, 1975 上記およびColigan et al, Current Protocols in Immunology 1, John Wiley & Sons 1991; Picksley et al, DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al (eds), page 93 Oxford University Press, 1995を参照のこと)。
【０１２９】
簡潔に述べれば、モノクローナル抗体は、マウスに標的遺伝子産物を含む組成物を注入し、血清試料を取り出して抗体産生の存在を確認し、脾臓を取り出してBリンパ球を得て、Bリンパ球をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを生成し、ハイブリドーマをクローニングし、抗原に対する抗体を生成する陽性のクローンを選択し、抗原に対する抗体を生成するクローンを培養し、ハイブリドーマ培養液から抗体を単離することにより得ることができる。
【０１３０】
さらに、本発明の抗標的ポリペプチド抗体は、ヒトモノクローナル抗体由来であってよい。ヒトモノクローナル抗体は、抗原投与に応答して特異的なヒト抗体を生成するように遺伝子操作された遺伝子組換えマウスから得られる。この技術では、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座の構成要素を、標的破壊された内在的重鎖および軽鎖遺伝子座を含む胚幹細胞株由来のマウス系統へ導入する。この遺伝子組換えマウスは、ヒト抗原に対して特異的なヒト抗体を合成することができ、そのマウスを用いてヒト抗体を分泌するハイブリドーマを生成することができる。遺伝子組換えマウスからヒト抗体を得る方法について、例えばGreen et al, Nature Genet 7:1994, Lonberg et al, Nature 368:856, 1994およびTaylor et al, Int. Immun. 6:579, 1994に記載されている。
【０１３１】
十分確立した様々な技術によって、モノクローナル抗体を、ハイブリドーマ培養液から単離し精製することができる。そのような単離技術には、プロテイン-A セファロースによるアフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーが含まれる(例えば、Baines et al, Methods in Molecular Biology 10:79-104, 1992を参照のこと)。
【０１３２】
特別な使用のために、抗標的ポリペプチド抗体の断片を調製することが望ましい場合もある。そのような抗体断片を、従来方法による完全な抗体のペプシンまたはパパイン消化により得ることができる。例として、ペプシンによる抗体の酵素的切断によって抗体断片を生成し、F(ab')2と呼ばれる5S断片を提供することができる。この断片を、さらにチオール基還元剤を用いて切断し、3.5S Fab'一価断片を生成することができる。任意で、ジスルフィド結合の切断によって生じるスルフヒドリル基の封鎖基を用いて、切断反応を行うことができる。別の方法として、ペプシンを用いる酵素切断により、二つの一価Fab断片および一つのFc断片を直接生成する。これらの方法について、例えばGoldenberg 米国特許第4,331,647号; Nisonoff et al, Arch Biochem. Biophys. 89:230, 1960; Porter, Biochem J. 73:119, 1959; Edelman et al, Enzymology 1:422, 1967に記載されている。
【０１３３】
断片が原型の抗体によって認識される抗原に結合する限り、一価の軽鎖・重鎖断片を形成するための重鎖の分離、断片のさらなる切断など、抗体切断のための他の方法、または他の酵素的、化学的、または遺伝学的技術も用いてもよい。
【０１３４】
または抗体は、抗体の可変および／または定常領域をコードするDNAの操作および再発現を含む組換えDNA技術を用いて得られた、組換えのまたは遺伝子操作された抗体であってよい。そのようなDNAは、公知でありおよび／または例えばファージ抗体ライブラリー(Chiswell and McCafferty, J Tibtech 10:80-84, 1992を参照のこと)を含むDNAライブラリーから容易に入手可能であり、あるいは所望の場合には、合成することができる。標準分子生物学的および／または化学的手順を用いてDNAを配列決定し操作して、例えばシステイン残基を作製するコドンを導入したり、他のアミノ酸またはドメインを所望のように修飾するか、付加するか、または欠失させてもよい。
【０１３５】
可変および／または定常領域をコードするDNAを含む一つまたは複数の複製可能な発現ベクトルを調製し、それを用いて適当な細胞株、例えば細菌(例えば大腸菌)などの非産生ミエローマ細胞株を形質転換して、その中で抗体の産生が起こるようにしてもよい。効率的な転写および翻訳を得るために、各ベクター中のDNA配列は、適切な制御配列、特に可変ドメイン配列に機能的に連結されたプロモーターおよびリーダー配列を含むべきである。このようにして抗体を生成するための具体的な方法は一般に周知であり、日常的に用いられている。例えば、基礎的な分子生物学的手順については、Maniatis et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989に記載されており；DNA配列決定を、Sanger et al, Proc Natl. Acad Sci USA 74:5463, 1977およびthe Amersham International plc sequencing handbookに述べられているようにして行うことができ；部位特異的突然変異生成を、Kramer et al, Nucleic Acids Res. 12:9441, 1984; the Anglian Biotechnology Ltd Handbook, Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci USA 82:488-492, 1985; Kunkel et al, Methods in Enzymol. 154:367-382, 1987の方法によって実行することができる。さらに、例えばMountain A and Adair JR in Biotechnology and Genetic Engineering Reviews (ed. Tombs, M. 10, Chapter 1) Intercept, Andover, UK, 1992 および国際特許明細書番号 WO 91/09967に概説されているように、多数の刊行物が、DNAの操作、発現ベクトルの作製、および適切な細胞の形質転換による抗体の調製に適した技術を詳述している。
【０１３６】
ある態様では、本発明による抗体は、一つまたは複数のエフェクターまたはレポーター分子を接着していてもよく、本発明は、そのような修飾されたタンパク質にまで及ぶ。レポーター分子は、酵素などの検出できる部分または標識であるか、あるいは色素、放射性核種、発光基、蛍光基、またはビオチンなどを含む、他のレポーター分子であってよい。標的ポリペプチド特異的免疫グロブリンまたはその断片を、診断または治療に適用するために放射性標識してもよい。抗体を放射性標識する技術は当技術分野において公知である(Adams, In Vivo 12:11-21, 1998; Hiltunen, Acta Oncol. 32:931-939, 1993 を参照のこと)。エフェクターまたはレセプター分子を、その接着または接着プロセスが分子の結合性および有用性に悪影響を及ぼさないならば、任意の利用できるアミノ酸の側鎖、末端の酸、または、存在する場合は抗体中に位置する炭水化物官能基を介して、抗体に接着させてもよい。特定の官能基には、例えば、任意の遊離アミノ、イミノ、チオール、ヒドロキシル、カルボキシル、またはアルデヒド基が含まれる。抗体とエフェクターおよび／またはレポーター分子との接着を、そのような基とエフェクターまたはレポーター分子中の適切な官能基とを介して行うことができる。連結は、直接であっても、またはスペーシング基または架橋基を介して間接であってもよい。
【０１３７】
本発明の抗体を、治療においてタンパク質を阻害するかまたは標的とするため、あるいは診断で標的タンパク質のレベルについてスクリーニングするための両方で用いることができる。
【０１３８】
先に示した診断用分析の点から、上述の遺伝子産物または抗体あるいは核酸分子を、例えば蛍光分子、毒素および放射性核種を含む様々な化合物で標識してもよい。蛍光性分子の代表的な例には、フルオレセイン、フィコエリスリンなどのフィコビリンタンパク質、ローダミン、テキサスレッド、およびルシフェラーゼが含まれる。毒素の代表的な例には、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、トリチン、シゲラ（Shigella）毒素、およびシュードモナス(Pseudomonas)外毒素Aが含まれる。放射性核種の代表的な例には、Cu-64、Ga-67、GA-68、Zr-89、Ru-97、Tc-99m、Rh-105、Pd-109、In-11l、I-123、I-125、I-131、Re-186、Re-188、Au-198、Au-199、Pb-203、At-211、Pb-212、およびBi-212が含まれる。さらに、上述の抗体を標識しても、またはリガンド結合対の一方に接合してもよい。代表的な例には、アビジン−ビオチン、ストレプトアビジン−ビオチンおよびリボフラビン−リボフラビン結合タンパク質が含まれる。
【０１３９】
上述の代表的な標識を本明細書に記載する分子に結合するまたは分子を標識する方法を、当業者は容易に遂行できよう(トリコテセン抗体結合体については米国特許第4,744,981号；抗体結合体については米国特許第5,106,951号；蛍光発生材料および標識化技術については米国特許第4,018,884号；診断および治療用の金属放射性核種標識されたタンパク質については米国特許第4,897,255号；および改善されたキレート化速度論のための金属放射性核種キレート化合物については米国特許第4,988,496を参照のこと；さらにInman, Methods In Enzymology 34:30, 1974; Wilchek and Bayer, Anal. Biochem. 171:1-32, 1988も参照のこと)。
【０１４０】
診断および治療用キットおよび組成物もまた、本発明の一部を形成する。そのようなキットは、診断薬または治療薬を単独で、または他の薬剤と組み合わせて含むであろう。
【０１４１】
したがって、本発明の別の局面は、被験体の骨病変のための医薬または診断用薬剤の製造における、表2、3、または4に挙げられた遺伝子を上方制御または下方制御する薬剤の使用を目的とする。
【０１４２】
本発明を、さらに次の非限定的な実施例によって記載する。
【０１４３】
実施例1
骨病変に関連するバイオマーカーの同定
頭蓋骨癒合症を有する5人の患者(男児3〜7ヶ月令)の頭蓋冠縫合からRNAを抽出した。患者の未融合のおよび融合された縫合の両方から縫合組織を得た。Affymetrix U133A2.0 GeneChipを用いて、各組織内の遺伝子発現を解析した。発現パターンを、すべての未融合の縫合とすべての融合した縫合の間で比較した。バイオインフォマティクスをマイクロアレイデータに適用して、有意な発現差異を有する遺伝子を同定した。すべての縫合を組み合わせることにより、同定された遺伝子は、冠状、矢状およびラムダ縫合の各々の中で発現し、したがって縫合特異的な効果を有しないことが確かめられた。
【０１４４】
最初の試料の組のRNAおよび4人の追加の患者由来のRNAを用いて、11の遺伝子を定量的リアルタイムRT-PCRにより解析して、マイクロアレイデータを検証した。89%の相関が実現され、これはマイクロアレイデータが強固であることを示す。
【０１４５】
一次培養細胞中のバイオマーカー発現を、いくつかの継代にわたって解析した。未修飾の培養条件下では、組織によって示されるバイオマーカー発現は、細胞中のものと相関しない。これは、バイオマーカーの正確な発現を取り戻すためには、培養条件には修飾が必要であることを示している。したがってこれらのマーカーは、細胞がインビボの発現を保持していることを確証するための有用なツールである。図2は、マイクロアレイ分析によって同定された、発現差異のmRNAおよびタンパク質の確証を提供する。RBP4およびGPC3の発現パターンを図3に示す。
【０１４６】
同定された重要な遺伝子の機能の要約を、以下に示す。
【０１４７】
未融合の縫合で上方制御されるもの：
以下の遺伝子は、縫合の開存性の維持において、または初期の骨芽細胞分化の制御において、極めて重要であると予測される。
【０１４８】
RBP4はレチノール(ビタミンA)の結合材であり担体である。オールトランスレチノイン酸(RA)は、レチノールの代謝産物であり、頭蓋骨癒合症を引き起こす公知の催奇形性物質である(Gardner et al, Int. J. Epidemiol 27(l):64-67, 1998; Yip et al, Teratology 21(l):29-38, 1980)。RAは、インビトロで骨芽細胞の分化を増大させて、増殖を減少させ、骨結節形成を引き起こすことを、研究が示している(Song et al, J. Cell Physiol. 202(l):255-262, 2005; Cowan et al, Tissue Eng. 11(3-4):645-658, 2005)。縫合間葉中のRBP4の一つの有力な機能は、レチノールを捕捉して、RAのバイオアベイラビリティを制御することであろう。その発現が下方制御されると(融合段階で)、レチノールが放出されてRAに変換され、次にそれが骨芽細胞分化および過剰な骨形成を促進する。したがって、RBP4の阻害剤は骨形成を促進し、一方分泌されたそのタンパク質の送達は、初期の骨芽細胞の増殖を維持し、最終分化を制限することになろう。
【０１４９】
C1QTNF3は、TGF-β1による処理後に、最初に軟骨細胞株中で同定された。マウスにおける胚発現分析において、それは前軟骨間葉細胞中で高レベルの発現を示すが、しかし成熟した軟骨細胞では検出できない(Maeda et al, J. Biol. Chem. 276(5): 3628-3634, 2001)。それは軟骨形成前駆細胞および軟骨細胞の増殖を促進することが最近示された(Maeda et al, J. Cell Physiol. 206:537-544, 2006)。C1QTNF3を頭蓋冠縫合中の前骨芽間葉中で同定したのは、我々の研究が最初であり、その未融合の縫合での高い発現が、骨形成の制御におけるこの成長因子の新規な役割、および骨格発育中の間葉凝縮を制御する機能の可能性を示唆する。
【０１５０】
GPC3は、細胞表面のヘパラン硫酸プロテオグリカンである。GPC3の喪失はシンプソン−ゴラビベーメル(Simpson-Golabi Behmel)症候群(それは出生前および出生後の過剰成長、口蓋裂、短い広い鼻、上顎前突症、広がった鼻梁、および不釣り合いに大きな頭によって特徴付けられる)を引き起こす。BMP4およびGPC3の二重突然変異体マウスが表現型を増強させた。これはGPC3がBMPシグナル伝達に関連していることを示唆する。異所性GPC3発現は、BMP4発現を減少させ、BMP7活性を抑止し(Midorikawa et al, Int.J. Cancer 103(4):455-465, 2003; Paine-Saunders et al, Dev. Biol. 225 (1):179-187, 2000)、GPC3が、BMPによって誘起された骨芽細胞分化を制限するように作用することを示唆する。GPC3欠陥マウスはまた、頭蓋骨癒合症症候群の患者に一般的に見られる表現型である多指症を生ずる。GPC3はまたFGF2と結合し、GPC3の過剰発現が、肝細胞におけるFGF2に誘起された細胞増殖を抑制することが示された(Midorikawa et al, 2003、前記)。FGFR突然変異は複数の頭蓋骨癒合症症候群の共通の原因であるので、これは、GPC3はまたFGFシグナル伝達において骨始原細胞と相互作用することを示唆する。さらに、GPC3は非標準的Wntシグナル伝達を抑制し、かつ標準的Wnt/β-カテニンシグナル伝達を活性化し、およびそうすることにより細胞増殖を制御することが示された(Song et al, J. Biol. Chem 280(3):2116-2125, 2005; De Cat et al, J. Cell Biol. 163(3):625-635, 2003)。GPC3が骨形成性間葉内で細胞成長を管理する可能性のある複数の経路が存在するが、しかし阻害はさらなる成長をもたらし、一方、GPC3を誘起すると、FGF、BMPおよび非標準的Wntを含むシグナル伝達経路が抑制される。したがって、未融合の縫合でのGPC3の発現によって、種々のシグナル伝達経路の平衡を保ち、最適な骨成長を維持することが可能になる。
【０１５１】
MFAP4は、細胞接着または細胞間相互作用に関与するECMタンパク質であると推定されている。MFAP4の欠失は、スミス−マゲニス(Smith-Magenis)症候群(その臨床像は、短頭、顔面中央部低形成、顎前突症、および成長遅延である)を引き起こす(Zhao et al, Hum. Mol. Genet 4(4):589-597, 1995)。頭蓋奇形は、MFAP4が縫合間葉の決定的な構成要素である可能性を示唆する。ウシのMfap4は、コラーゲン結合材として同定されており、ECM組成を支援する可能性がある(Lausen et al, Biol. Chem. 274(45):32234-32240, 1999)。
【０１５２】
FMODは、小さなロイシンに富むプロテオグリカン(SLRP)であり、ECM構築に関係する。それはTGFβ 1、2および3との結合を競い、ECM中にそれらを隔離する可能性がある(Hildebrand et al, Biochem J. 302 (Pt 2):527-34.1994)。それはコラーゲン原繊維形成の制御因子であり、石灰化の開始直前にそのRNA発現が上方制御される。それはコラーゲンに結合して、原繊維形成速度を遅くして、より細い原繊維をもたらす。それは、C2C12前筋芽細胞の骨形成細胞系列へのBMP2依存性分化によって上方制御されることが確認されている。それは、細胞の成長または移動を制御しているのかもしれない。
【０１５３】
OGNは、形質転換増殖因子βと共に異所性骨形成を誘起する小さなロイシンに富むケラタン硫酸プロテオグリカンである。オステオグリシンは、その転写が成長因子および腫瘍抑制タンパク質p53によって上方制御されるので、細胞の成長を制御する可能性があると考えられる。さらに、それは多核細胞の形成を阻害し、続いて破骨細胞の形成および活性を制限することが示された。OGN欠陥マウスはまたコラーゲン繊維の直径も増加させた。これはコラーゲンの原線維形成における役割を示している。
【０１５４】
PRELPは、結合組織細胞外マトリックス中の、ヘパリン結合性の小さなロイシンに富むプロテオグリカン(SLRP)である。PRELPは、基底膜ヘパラン硫酸プロテオグリカンであるパールカンを結合する。PRELPはI型およびII型コラーゲンを結合する。PRELPは、下にある結合組織へ基底膜を繋留する分子として機能すると考えられる。
【０１５５】
INHBA、アクチビンAとしても知られるインヒビンβAは、分泌タンパク質であり、またTGF-βスーパーファミリーのメンバーである。アクチビンAは、TGF-βおよびBMPへ類似の経路によってシグナル伝達する(Lagna et al, Nature. 383:832-836, 1996)。アクチビンAは骨形成および骨の形成を刺激することができる(Sakai et al, Bone. 25:191-196, 1999)。未融合の縫合におけるINHBAのより高い発現は、骨成長の促進における役割と整合している。
【０１５６】
PTNは、ヘパリン結合性成長因子8または骨芽細胞刺激因子1としても知られ、骨成長において、濃度および一時的発現に依存して種々の機能を有する分泌タンパク質である、プレイオトロフィンをコードする(Tare et al, J Bone Miner Res. 17:2009-2020, 2002)。PTNは骨成長を刺激することができる(Li et al, Calcif Tissue Int. 76:299-306, 2005)。未融合の縫合におけるPTNのより高い発現は、骨成長の促進における役割と整合している。
【０１５７】
FBLN1、フィビュリン(fibulin)1は、分泌される細胞外マトリックスタンパク質である。それは骨髄間質中で発現され(Gu et al, Eur J Haematol. 67:176-184, 2001)、そこで、別の細胞外マトリックスタンパク質であるアグリカン(その遺伝子も、未融合の縫合でより高度に発現される)と結合することができる(表2)。未融合の縫合でのFBLN1のより高い発現は、それが細胞移動および骨形成を助ける細胞外環境を高めるであろうことを示唆する。
【０１５８】
IL11RAは、ETL2としても知られ、インターロイキン11のレセプターをコードする。IL11レセプターによるシグナル伝達が、骨再モデル化に必要である(Sims et al, J Bone Miner Res. 20:1093-1102, 2005)。IL11RAシグナル伝達はまた、骨格形成始祖細胞または他の間葉細胞の増殖および／または分化の管理に関係している可能性がある(Neuhaus et al, Dev Biol. 166:531-542, 1994)。未融合の縫合でのIL11RAのより高い発現は、骨成長の促進において予測される役割と整合している。
【０１５９】
融合した縫合で上方制御されるもの：
以下の遺伝子は、縫合の融合において役割を果たすことが予測される。
【０１６０】
WIF1はWntシグナル伝達のアンタゴニストであり、最近C2C12およびMC3T3E-1前骨芽細胞株の後期分化において、強く発現されることが示された。Wntシグナル伝達の連続的活性化は、骨芽細胞分化を減少させる。したがって、WIF1は、骨芽細胞成熟の管理に必要であろう(Vaes et al, Bone 36(5):803-811, 2005)。
【０１６１】
ANXA3は、カルシウム依存性リン脂質結合タンパク質ファミリーのメンバーである。ANXA3については、限られた情報しか公知でないが、一般的なAnxA発現が、骨関節炎の進行中に有意に増加することが同定されている。S100Aタンパク質がAnxA5およびAnxA6と相互作用することが示されており、また多くのS100Aタンパク質が、ANXA3によって上方制御されることから、それらはANXA3とも同様に相互作用する可能性がある。レチノールはAnxA6と結合することができ、AnxAのイオンチャネル活性の阻害が、RAのアポトーシス効果を覆すことが示された(Balcerzak et al, FEBS Lett. 580:3065-3069, 2006)。RAはまた、鳥類の成長板軟骨細胞の細胞分化およびAnxAの発現を刺激することが示され、これはANXA3とレチノイン酸誘起骨形成の間の関連を示唆している。
【０１６２】
CASP1は、細胞アポトーシスを引き起こすことが示されており、様々な発生段階で機能する可能性がある。この遺伝子は、インターロイキン1 (炎症、敗血症ショックおよび創傷治癒などのプロセスに関与するサイトカインである)の不活性前駆体をタンパク質分解的に切断して活性化する能力によって、同定された。
【０１６３】
SHOX2は、ホメオボックスファミリーのメンバーであり、頭蓋および顔面に発現されるホメオドメインタンパク質に特徴的な、C末端の14アミノ酸残基モチーフを有する。限定的な胚発現分析において、SHOX2が、鼻および口蓋中の凝縮しつつある軟骨間葉中で同定された。前肢芽では、転写物は、発生中の骨のまわりに凝縮しつつある未分化の間葉に限定されていた(Rudiger et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA 95(5):2406-2411, 1998)。SHOX2は、それ自体が軟骨形成および骨形成の重要な制御因子であるRunx2の制御因子として、最近同定された(Cobb et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 103:4511-4515, 2006)。融合中のおよび融合した縫合におけるSHOX2の発現の減少は、SHOX2が骨成長の制御に重要な役割を有するという我々の予測と一致する。
【０１６４】
CYFIP2、すなわち細胞質FMR1(脆弱性X精神遅滞1)相互作用タンパク質は、アクチン制御タンパク質であり、またp53依存性アポトーシスの媒介物質でもある。それは、Jurkat細胞とCD4(+)細胞のフィブロネクチンを介する結合を増加させる(Mayne et al, Eur J Immunol. 34:1217-27, 2004)。これらの研究は、過剰なCYFIP2タンパク質が、MS患者由来のT細胞の接着性増大を助長していることを示唆する。したがって、CYFIP2は、縫合融合中の免疫様応答に関与している可能性がある。
【０１６５】
未融合の縫合および融合した縫合で、少なくとも2倍の発現増加を示している遺伝子を、表2および3にそれぞれ示す。
【０１６６】
実施例2
バイオマーカーの同定
実施例1の方法を用いて、バイオマーカーの好ましいリストを特定した。表4にバイオマーカーを示す。
【０１６７】
図1は、融合したおよび未融合の縫合での実施例1に記載の10個のバイオマーカーの発現レベルを示す。
【０１６８】
表5は、ヒト骨癌細胞株におけるいくつかの好ましいバイオマーカーの発現を示す。
【０１６９】
(表２)未融合の縫合および骨細胞成長中で上方制御される、すなわち開存性を維持する遺伝子：
2009523739.tif 000009
2009523739.tif 000010
2009523739.tif 000011
2009523739.tif 000012
2009523739.tif 000013
2009523739.tif 000014
2009523739.tif 000015
2009523739.tif 000016
2009523739.tif 000017
2009523739.tif 000018
【０１７０】
(表３)融合した縫合および骨細胞分化中で上方制御される、すなわち骨芽細胞分化および石灰化を促進する遺伝子：
2009523739.tif 000019
2009523739.tif 000020
2009523739.tif 000021
2009523739.tif 000022
2009523739.tif 000023
2009523739.tif 000024
2009523739.tif 000025
2009523739.tif 000026
2009523739.tif 000027
【０１７１】
(表４)同定された好ましいバイオマーカー
2009523739.tif 000028
C＝冠状縫合；L、ラムダ縫合；S、矢状縫合；F、融合した；Fg、融合中；U、未融合
【０１７２】
一組の好ましいバイオマーカー、GPC3、RBP4、およびC1QTNF3は、未融合の縫合でより高度に発現され、一方、別の一組の好ましいバイオマーカー、ANXA3、WIF1、およびSHOX2は、融合したおよび融合中の縫合でより高度に発現される。
【０１７３】
(表５)ヒト骨癌細胞株のいくつかの好ましいバイオマーカーのプロファイル
2009523739.tif 000029
【０１７４】
リアルタイムRT-PCRにより、ヒト骨癌細胞株のいくつかの好ましいバイオマーカー遺伝子(太字で表示)、GPC3、RBP4、C1QTNF3およびWIF1 (表4を参照)、ならびに4つの他のバイオマーカー、FMOD、PRELP、PTNおよびCYFIP2 (表2および3を参照)の相対的な発現を、シクロフィリンAと比較した。「あり」は発現を示し、「なし／非常に低い」は、発現が検出できなかったことを示す。ヒト骨肉腫細胞株は、SaOS (米国培養菌保存施設[ATCC]HTB-85)、SJSA-1 (ATCC CRL-2098)、U-2 OS(ATCC HTB-96)、MG-63 (ATCC CRl-1427)、HOS (ATCC CRL-1543)およびG-292 (ATCC CRL-1423)である。
【０１７５】
当業者は、本明細書に記載された発明が、具体的に記載されたもの以外へ容易に変更および修飾できることを当然認識しているであろう。本発明がそのような変更および修飾をすべて含むことは当然である。本発明にはまた、この明細書中で個々にまたはまとめて参照されたまたは示された、すべての工程、特徴、組成物、および化合物、および該工程または特徴の任意の二つまたはそれ以上のすべての組み合わせが含まれる。
【０１７６】
引用文献
2009523739.tif 000030
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【図面の簡単な説明】
【０１７７】
いくつかの図は、カラー表示または実体を含む。カラー写真は、請求により特許権者から、または適当な特許事務所より入手可能である。特許事務所から入手する場合は料金が課されるかもしれない。
【０１７８】
【図１】融合した縫合と未融合の縫合の間で差次的に発現する上位10個の関心対象遺伝子の発現レベルのグラフ表示である。融合した組および未融合の組の中の各ヒストグラムは、それぞれ個別の縫合を表わす。
【図２】図2(a)、(b)、および(c)はそれぞれ、マイクロアレイ分析によって同定された発現差異のmRNAおよびタンパク質による確証を示す、グラフ表示および写真表示である。(a)矢状、冠状、ラムダおよび前頭縫合から単離された、未融合、融合中および融合した縫合組織についての、未融合の縫合で発現が増加した6つの遺伝子(C1QTNF3の短いアイソフォーム、RBP4、GPC3、PTN、PRELP、FMOD)、ならびに融合した縫合で発現が増加した3つの遺伝子(ANXA3、WIF1、およびCYFIP2)のリアルタイムQRT-PCR分析。平均発現＋SEMを示す。(b) (c)に見られる順序に並んだ個々のタンパク質試料の、1型コラーゲン(COL1)、GPC3、C1QTNF3およびRBP4についてのウエスタンブロット分析。(c) COL1の発現に対して規格化されたウエスタンブロットのデンシトメトリー分析。(b)および(c)中の数字は患者番号を指す。
【図３】図3(a)〜(c)は、縫合での二つの好ましい遺伝子の発現パターンを示す写真表示である。(a〜b) 頭蓋外表面骨中の骨細胞(oc)の細胞質へのRBP4の局在化(黄色からオレンジ色へ)を示す、免疫蛍光およびH&E染色(未融合の冠状縫合)。(c〜d) 石灰化組織(bn)および間葉(m)の間の領域で、細胞中に存在するRBP4を示す、連続切片の免疫蛍光(c)およびH&E染色(d)(未融合の左ラムダ縫合)。(e) RBP4は、未融合の縫合の頭蓋内表面上では検出されなかった(冠状)。(f) RBP4は、発生中の骨を裏打ちする骨芽細胞(ob)(骨芽細胞は類骨(矢頭)中に閉じ込められている)および骨細胞の細胞質中に局在していた(未融合の冠状)。(g) (f)の中央部に対応する位相差画像。(h) RBP4は、融合した縫合では検出されなかった。赤血球は弱い自己蛍光を有していた(矢状)。(i〜l) GPC3の免疫蛍光およびH&E染色によって、縫合中央部(i)の組織表面(矢頭)に近い間葉細胞中に、タンパク質が検出された。石灰化された骨(k〜l)に隣接する間葉細胞の細胞質の伸長部に、細胞膜染色が観察された。(j) 介在する間葉中へ伸び出している、骨芽細胞に裏打ちされた石灰化された骨を示す切片((k)はその深部)のH＆E染色。スケール：10μm。
【図１】
2009523739.tif 000043
【図２】
2009523739.tif 000044
【図３】
2009523739.tif 000045
【手続補正書】
【提出日】平成19年8月28日(2007.8.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子の発現または該遺伝子によってコードされる産物の活性を調節する有効量の薬剤を被験体に投与する工程を含む、被験体の骨病変の処置のためまたは骨病変の発症の危険を減少させるための方法であって、該遺伝子が、GPC3、RBP4、C1QTNF3、およびANXA3からなるリスト、またはそれらの哺乳動物ホモログについて選択される、方法。
【請求項２】
被験体の縫合に基づく頭蓋障害、骨癌、骨格障害、または骨折、若木骨折および剥離骨折（bone chip）からなるリストより選択される骨損傷の処置方法であって、該方法は、遺伝子の発現または該遺伝子によってコードされる産物の活性を調節する有効量の薬剤を被験体に投与する工程を含み、該遺伝子が、WIF1およびSHOX2からなるリスト、またはそれらの哺乳動物ホモログについて選択される、方法。
【請求項３】
被験体がヒトである、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
骨病変が、骨癌、骨石灰化欠陥症状（deficient bone mineralization condition）、骨損傷、縫合に基づく頭蓋障害、骨格障害、および骨粗鬆症からなるリストより選択される、請求項1または3記載の方法。
【請求項５】
骨損傷が、骨折、若木骨折および剥離骨折からなるリストより選択される、請求項4記載の方法。
【請求項６】
縫合に基づく頭蓋障害が頭蓋骨癒合症である、請求項2または4記載の方法。
【請求項７】
骨石灰化欠陥症状が異形成である、請求項4記載の方法。
【請求項８】
遺伝子がGPC3である、請求項1記載の方法。
【請求項９】
遺伝子がRBP4である、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
遺伝子がC1QTNF3である、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
遺伝子がANXA3である、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
遺伝子がWIF1である、請求項2記載の方法。
【請求項１３】
遺伝子がSHOX2である、請求項2記載の方法。
【請求項１４】
遺伝子の発現または該遺伝子によってコードされる産物の活性を調節する有効量の薬剤を被験体に投与する工程を含む、被験体の骨成長を改善する、骨成長を阻害する、および／または骨癌成長を阻害するために被験体を処置する方法であって、該遺伝子が、GPC3、RBP4、C1QTNF3、およびANXA3からなるリスト、またはそれらの哺乳動物ホモログから選択される、方法。
【請求項１５】
遺伝子の発現または該遺伝子によってコードされる産物の活性を調節する有効量の薬剤を被験体に投与する工程を含む、被験体の頭蓋骨癒合症を処置する方法であって、該遺伝子が、WIF1およびSHOX2からなるリスト、またはそれらの哺乳動物ホモログについて選択される、方法。
【請求項１６】
被験体がヒトである、請求項14または15記載の方法。
【請求項１７】
遺伝子がGPC3である、請求項14記載の方法。
【請求項１８】
遺伝子がRBP4である、請求項14記載の方法。
【請求項１９】
遺伝子がC1QTNF3である、請求項14記載の方法。
【請求項２０】
遺伝子がANXA3である、請求項14記載の方法。
【請求項２１】
遺伝子がWIF1である、請求項15記載の方法。
【請求項２２】
遺伝子がSHOX2である、請求項15記載の方法。
【請求項２３】
被験体の骨病変の処置のための医薬の製造における、GPC3、RBP4、C1QTNF3、およびANXA3からなるリストより選択される遺伝子の使用。
【請求項２４】
被験体の骨病変の処置のための医薬の製造における、GPC3、RBP4、C1QTNF3、およびANXA3からなるリストより選択される遺伝子の発現産物の使用。
【請求項２５】
縫合に基づく頭蓋障害、骨格障害、または骨折、若木骨折および剥離骨折からなるリストより選択される骨損傷の処置のための医薬の製造における、WIF1およびSHOX2からなるリストより選択される遺伝子の使用。
【請求項２６】
縫合に基づく頭蓋障害、骨格障害、または骨折、若木骨折および剥離骨折からなるリストより選択される骨損傷の処置のための医薬の製造における、WIF1およびSHOX2からなるリストより選択される遺伝子の発現産物の使用。
【請求項２７】
被験体がヒトである、請求項23または24または25または26記載の使用。
【請求項２８】
骨病変が、骨癌、骨石灰化欠陥症状、骨損傷、縫合に基づく頭蓋障害、骨格障害、および骨粗鬆症からなるリストより選択される、請求項23または24項記載の使用。
【請求項２９】
骨損傷が、骨折、若木骨折および剥離骨折からなるリストより選択される、請求項28記載の使用。
【請求項３０】
縫合に基づく障害が頭蓋骨癒合症である、請求項28記載の使用。
【請求項３１】
骨石灰化欠陥症状が異形成である、請求項28記載の使用。
【請求項３２】
遺伝子がGPC3である、請求項23または24記載の使用。
【請求項３３】
遺伝子がRPB4である、請求項23または24記載の使用。
【請求項３４】
遺伝子がC1QTNF3である、請求項23または24記載の使用。
【請求項３５】
遺伝子がANXA3である、請求項23または24記載の使用。
【請求項３６】
遺伝子がWIF1である、請求項25または26記載の使用。
【請求項３７】
遺伝子がSHOX2である、請求項25または26記載の使用。
【請求項３８】
GPC3、RBP4、C1QTNF3、ANXA3、WIF1、およびSHOX2からなるリストより選択される一つまたは複数の遺伝子の発現プロファイルを決定する工程を含む、被験体の骨病変を診断または予後予測する方法であって、未融合の組織中のGPC3、RBP4、およびC1QTNF3の発現の上昇、ならびに融合したまたは融合中の縫合でのANXA3、WIF1、およびSHOX2の発現の上昇が、骨病変の存在または骨病変の発症の素因を示す、方法。
【請求項３９】
被験体がヒトである、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
骨病変が、骨癌、骨石灰化欠陥症状、骨損傷、縫合に基づく頭蓋障害、骨格障害、および骨粗鬆症からなるリストより選択される、請求項38または39記載の方法。
【請求項４１】
骨損傷が、骨折、若木骨折および剥離骨折からなるリストより選択される、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
縫合に基づく頭蓋障害が頭蓋骨癒合症である、請求項40記載の方法。
【請求項４３】
骨石灰化欠陥症状が異形成である、請求項40記載の方法。
【請求項４４】
被験体の骨病変のための診断プロトコル生成における、GPC3、RBP4、C1QTNF3、ANXA3、WIF1、およびSHOX2からなるリストより選択される遺伝子の使用。
【請求項４５】
被験体の骨病変のための診断プロトコル生成における、GPC3、RBP4、C1QTNF3、ANXA3、WIF1、およびSHOX2からなるリストより選択される遺伝子の発現産物の使用。
【請求項４６】
被験体がヒトである、請求項44または45記載の使用。
【請求項４７】
骨病変が、骨癌、骨石灰化欠陥症状、骨損傷、縫合に基づく頭蓋障害、骨格障害、および骨粗鬆症からなるリストより選択される、請求項44または45または46記載の使用。
【請求項４８】
縫合に基づく頭蓋障害が頭蓋骨癒合症である、請求項47記載の使用。
【請求項４９】
骨石灰化欠陥症状が異形成である、請求項47記載の使用。
【請求項５０】
請求項1または2または14または15記載の処置方法で用いる場合、GPC3、RBP4、C1QTNF3、ANXA3、WIF1、およびSHOX2からなるリストより選択される遺伝子の発現または遺伝子発現産物を調節する薬剤、ならびに一つまたは複数の薬学的に許容される担体、希釈剤、および／または賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項５１】
請求項1または2または14または15記載の処置方法で用いる場合、GPC3、RBP4、C1QTNF3、ANXA3、WIF1、およびSHOX2より選択される遺伝子の発現、またはGPC3、RBP4、C1QTNF3、ANXA3、WIF1、およびSHOX2由来の発現産物の活性を調節する、単離された薬剤。
【国際調査報告】
2009523739.tif 000046
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2009523739.tif 000049
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