(57)【要約】【化１】2009523760.tif 000043  本発明は、ヒストンデアセチラーゼ阻害酵素活性をもつ、式（Ｉ）［式中、Ｒ１、Ｒ２Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｘ及びＹは定義された意味をもつ］の新化合物、それらの製造、それらを含有する組成物１５並びに医薬としてのそれらの使用を含んでなる。
2009523760.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
2009523760.tif 000040
［式中、
ｎは値０、１又は２をもつ整数であり、そしてｎが０である時は直接結合が意図されており、
ｍは値１又は２をもつ整数であり、
ＸはＮ又はＣＨであり、
ＹはＯ、Ｓ又はＮＲ８であり、ここで
Ｒ８は水素、Ｃ１−６アルキル，Ｃ１−６アルキルオキシＣ１−６アルキル、Ｃ３−６シクロアルキル、Ｃ３−６シクロアルキルメチル、フェニルＣ１−６アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨＲ９Ｒ１０又は−Ｓ（＝Ｏ）２−Ｎ（ＣＨ３）２であり、ここで
Ｒ９及びＲ１０はそれぞれ独立して水素、アミノ、Ｃ１−６アルキル又はアミノＣ１−６アルキルであり、そして
ＹがＮＲ８でありそしてＲ２がインドリルの７位上にある時は、Ｒ２及びＲ８が一緒になって２価の基
−（ＣＨ２）２−        （ａ−１）又は
−（ＣＨ２）３−        （ａ−２）
を形成してもよく、
Ｒ１は水素、Ｃ１−６アルキル、ヒドロキシＣ１−６アルキル、シアノＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、Ｃ１−６アルキルカルボニル又はモノ−もしくはジ（Ｃ１−６アルキル）アミノスルホニルであり、
Ｒ２は水素、ヒドロキシ、アミノ、ハロ、Ｃ１−６アルキル、シアノ、Ｃ２−６アルケニル、ポリハロＣ１−６アルキル、ニトロ、フェニル、Ｃ１−６アルキルカルボニル、ヒドロキシカルボニル、Ｃ１−６アルキルカルボニルアミノ、Ｃ１−６アルキルオキシ又はモノ−もしくはジ（Ｃ１−６アルキル）アミノであり、
Ｒ３はヒドロキシ又はアミノであり、
Ｒ４は水素、チエニル、フラニル又はフェニルであり、そしてチエニル、フラニル又はフェニルはそれぞれ場合により、ハロ、アミノ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、フェニル、Ｃ１−６アルキル、（ジＣ１−６アルキル）アミノ、Ｃ１−６アルキルオキシ、フェニルＣ１−６アルキルオキシ、ヒドロキシＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルオキシカルボニル、ヒドロキシカルボニル、Ｃ１−６アルキルカルボニル、ポリハロＣ１−６アルキルオキシ、ポリハロＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、ヒドロキシカルボニルＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルカルボニルアミノ、アミノスルホニル、アミノスルホニルＣ１−６アルキル，イソオキサゾリル、アミノカルボニル、フェニルＣ２−６アルケニル、フェニルＣ３−６アルキニル又はピリジニルＣ３−６アルキニルで置換されていてもよく、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７はそれぞれ独立して水素、アミノ、ニトロ、フラニル、ハロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルオキシ、トリフルオロメチル、チエニル、フェニル、Ｃ１−６アルキルカルボニルアミノ、アミノカルボニルＣ１−６アルキル又は−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｒ１１である］
の化合物、そのＮ−オキシド、製薬学的に許容される付加塩及び立体化学的異性体。
【請求項２】
ａ）ｎが０又は１であり、
ｂ）ｍが１又は２であり、
ｃ）ＸがＮ又はＣＨであり、
ｄ）ＹがＮＲ８であり、ここでＲ８が水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−６シクロアルキル又はＣ３−６シクロアルキルメチルであり、
ｅ）Ｒ１が水素、Ｃ１−６アルキル、ヒドロキシＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルカルボニル又はＣ１−６アルキルスルホニルであり、
ｆ）Ｒ２が水素又はハロであり、
ｇ）Ｒ３がアミノであり、
ｈ）Ｒ４が水素又はチエニルであり、そして
ｉ）Ｒ５、Ｒ６及びＲ７がそれぞれ水素である、
請求項１記載の化合物。
【請求項３】
ａ）ｎが１であり、
ｂ）ｍが１であり、
ｃ）ＸがＮであり、
ｄ）ＹがＮＲ８であり、ここでＲ８がメチルであり、
ｅ）Ｒ１が水素であり、
ｆ）Ｒ２が水素又はハロであり、
ｇ）Ｒ３がアミノであり、
ｈ）Ｒ４が水素又は２−チエニルであり、そして
ｉ）Ｒ５、Ｒ６及びＲ７がそれぞれ水素である、
請求項１記載の化合物。
【請求項４】
化合物が化合物Ｎｏ．２、すなわち式
【化２】
2009523760.tif 000041
の化合物である請求項１記載の化合物。
【請求項５】
製薬学的に許容される担体及び、有効成分として、治療的有効量の、請求項１〜４のいずれかに記載の化合物を含んでなる製薬学的組成物。
【請求項６】
製薬学的に許容される担体及び請求項１〜４のいずれかに記載の化合物が密接に混合される、請求項５に請求の製薬学的組成物の調製方法。
【請求項７】
医薬としての使用のための請求項１〜４のいずれかに記載の化合物。
【請求項８】
増殖性疾患の処置のための医薬の調製のための、請求項１〜４のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項９】
抗癌剤及び請求項１〜４のいずれかに記載のＨＤＡＣインヒビターの組み合わせ物。
【請求項１０】
ａ）塩基の存在下で、そのＭが水素又はアルカリ金属を表す式（ＩＩ）の中間体を、式（ＩＩＩ）の化合物と反応させる方法を特徴とする、請求項１記載の化合物の製造方法：
【化３】
2009523760.tif 000042
。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害酵素活性を有する化合物を対象にする。それは更に、それらの調製法、それらを含んでなる組成物並びに、ＨＤＡＣを阻害するための、そして医薬としての、例えば、癌及び乾癬のような増殖性状態を抑制するための医薬としての、インビトロ及びインビボ双方のそれらの使用を対象にする。
【背景技術】
【０００２】
核のヒストンは、遺伝子の転写並びに、複製、修復、組み換え及び染色体分離のような他のＤＮＡテンプレート過程を制御する役目をもつ機構の不可欠な、動的成分として知られる。それらはアセチル化、リン酸化、メチル化、ユビキチン化及びＡＤＰ−リボシル化を包含する翻訳後修飾の対象である。
【０００３】
本明細書で「ＨＤＡＣ」と呼ばれる１種又は複数のヒストンデアセチラーゼは、核のヌクレオソームのヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３及びＨ４を包含する、タンパク質のリシン残基上のアセチル修飾物の除去を触媒する酵素である。ＨＤＡＣは、本明細書で「ＨＡＴ」と呼ばれる１種又は複数のヒストン・アセチルトランスフェラーゼと一緒に、ヒストンのアセチル化レベルを制御する。ヌクレオソームのヒストンのアセチル化の平衡は多数の遺伝子の転写に重要な役割を果たす。ヒストンのアセチル化低下は遺伝子転写の後退をもたらす凝縮されたクロマチン構造を伴ない、他方アセチル化されたヒストンは、より開放されたクロマチン構造及び転写の活性化を伴なう。
【０００４】
１１種の、構造的に関連したＨＤＡＣが記載されており、２群に分類される。第Ｉ群のＨＤＡＣはＨＤＡＣ１、２、３、８及び１１よりなり、他方第ＩＩ群のＨＤＡＣはＨＤＡＣ４、５、６、７、９及び１０よりなる。第３群のＨＤＡＣのメンバーは第Ｉ群及び第ＩＩ群のＨＤＡＣと構造的には関連していない。第Ｉ／ＩＩ群のＨＤＡＣは亜鉛依存性機序により作動し、他方第ＩＩＩ群のＨＤＡＣはＮＡＤ依存性である。
【０００５】
ヒストンに加えて、その他のタンパク質、とりわけｐ５３、ＧＡＴＡ−１及びＥ２Ｆのような転写因子；グルココルチコイド受容体、甲状腺ホルモン受容体、エストローゲン受容体のような核受容体；並びにｐＲｂのような細胞周期制御タンパク質もまた、アセチル化のための基質であった。タンパク質のアセチル化は、ｐ５３の安定化、コファクターの採用及び増加したＤＮＡ結合のようなタンパク質の安定化と関連付けられてきた。ｐ５３は、ＤＮＡ損傷のような種々のストレス信号に反応して細胞周期の停止又はアポトーシスを誘導する可能性がある腫瘍サプレッサーである。ｐ５３誘導の細胞周期停止の主要標的はｐ２１遺伝子であるように見える。ｐ５３によるその活性化の次に、ｐ２１は、Ｇ１及びＧ２相の両方における細胞周期停止、老衰期間中のその調節過剰及び増殖している細胞核の抗原とのその相互反応をもたらすサイクリン／サイクリン−依存性キナーゼ複合物とのその関連により特定されてきた。
【０００６】
ＨＤＡＣのインヒビターの研究により、それらが細胞周期停止、細胞分化、アポトーシス及び形質転換された表現型の逆転において重要な役割を果たすことが示される。
【０００７】
例えば、インヒビターのトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）はＧ１及びＧ２相の両方において細胞周期停止を誘導し、異なる細胞系列の形質転換表現型を逆転し、そしてフレンド白血病細胞及び他の細胞の分化を誘導する。ＴＳＡ（及びスベロイルアニリドヒドロキサム酸ＳＡＨＡ）はマウスにおいて、細胞増殖を阻害し、末端の分化（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｉ
ｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を誘導し、そして腫瘍の形成を抑制することが報告された（非特許文献１参照）。
【０００８】
トリコスタチンＡはまた、繊維症、例えば肝繊維症及び肝硬変の処置に有用であることが報告された（特許文献１参照）。
【０００９】
ＨＤＡＣインヒビターの薬作用発生団は、ＨＤＡＣの亜鉛含有活性部位と相互反応する金属結合領域、リンカー領域及び、活性部位の縁上の残基と相互反応する表面認識領域又はキャッピング領域よりなる。
【００１０】
ＨＤＡＣのインヒビターはまた、ｐ２１遺伝子の発現を誘導することが報告されている。これらのインヒビターによるｐ２１遺伝子の転写活性化は、ｐ２１プロモーター領域における、ヒストンＨ３及びＨ４のアセチル化の後のクロマチン再形成により促進される。ｐ２１のこの活性化はｐ５３−非依存性の様態で起り、従ってＨＤＡＣインヒビターは多数の腫瘍の証明の、突然変異ｐ５３遺伝子をもつ細胞中で作用する。
【００１１】
更にＨＤＡＣインヒビターは宿主の免疫反応の増強及び腫瘍脈管形成の抑制のような間接的作用をもつことができ、従って原発腫瘍の増殖を抑制し、転移を妨げることができる（非特許文献２参照）。
【００１２】
以上を考察すると、ＨＤＡＣインヒビターは、突然変異ｐ５３遺伝子をもつ腫瘍を包含する細胞増殖疾患又は状態の処置に大きな可能性をもつことができる。
【００１３】
２００３年８月１４日公開の特許文献２はヒストンデアセチラーゼのインヒビターとしての２環式ヒドロキサメートを開示している（特許文献２参照）。
【００１４】
なかでも２００３年９月１８日に公開された特許文献３、４、５、６、７、８、９、１０はヒストンデアセチラーゼのインヒビターとしての置換ピペラジニルピリミジニルヒドロキサム酸を開示しており、特許文献８は更にＲ３０６４６５を開示している（特許文献３〜１０参照）。
【００１５】
２００３年１０月９日公開の特許文献１１はＨＤＡＣインヒビターとしての、ピペラジン結合を含んでなるカルバミン酸化合物を開示している（特許文献１１参照）。
【００１６】
２００３年１０月２３日公開の特許文献１２はヒストンデアセチラーゼインヒビターとしての置換ピペラジニルフェニルベンズアミド化合物を開示している（特許文献１２参照）。
【００１７】
２００３年１１月１３日公開の特許文献１３はヒストンデアセチラーゼインヒビターとしてのベンズアミドを開示している（特許文献１３参照）。
【００１８】
２００４年１月２９日に公開の特許文献１４はヒストンデアセチラーゼインヒビターとしてのアリール基とヒドロキサメート間にアルキルリンカーを含有する誘導体を開示している（特許文献１４参照）。
【００１９】
２００４年２月１２日公開の特許文献１５はヒストンデアセチラーゼインヒビターとしての、（ヘテロ）アリールアルケニル置換２環式ヒドロキサメートを開示している（特許文献１５参照）。
【００２０】
２００４年６月２４日公開の特許文献１６は薬理学的物質としてのアリーレン−カルボ
ン酸（２−アミノ−フェニル）−アミド誘導体を開示している（特許文献１６参照）。
【００２１】
２００４年７月２９に公開の特許文献１７は抗炎症及び抗腫瘍作用をもつＮ−ヒドロキシ−ベンズアミドの誘導体を開示している（特許文献１７参照）。
【００２２】
２００４年７月２９日公開の特許文献１８はヒストンデアセチラーゼインヒビターとしての、置換アリールヒドロキサメート誘導体を開示している（特許文献１８参照）。
【００２３】
２００４年、８月１９日に公開の特許文献１９は薬理学的物質としてのモノ−アシル化Ｏ−フェニレンジアミン誘導体を開示している（特許文献１９参照）。
【００２４】
２００４年８月１９日公開の特許文献２０はヒストンデアセチラーゼインヒビターとしてのジアミノフェニレン誘導体を開示している（特許文献２０参照）。
【００２５】
２００４年８月２６日公開の特許文献２１はヒストンデアセチラーゼインヒビターとしてのベンズアミド誘導体を開示している（特許文献２１参照）。
【００２６】
２００４年８月２６に公開の特許文献２２はヒストンデアセチラーゼインヒビターとしてのインドール、ベンズイミダゾール及びナフトイミダゾールを開示している（特許文献２２参照）。
【００２７】
２００４年９月３０日に公開の特許文献２３はヒストンデアセチラーゼインヒビターとしての非芳香族複素環式環系に結合されたヒドロキサメートを開示している（特許文献２３参照）。
【００２８】
２００４年１０月１４日公開の特許文献２４はヒストンデアセチラーゼインヒビターとしてのオキシム誘導体を開示している（特許文献２４参照）。
【００２９】
２００４年１０月２８日に公開の特許文献２５はヒストンデアセチラーゼインヒビターとしてのヒドロキサメート誘導体を開示している（特許文献２５参照）。
【００３０】
２００５年、３月３１に公開の特許文献２６はヒストンデアセチラーゼインヒビターとしてのベンズイミダゾールを開示している（特許文献２６参照）。
【００３１】
２００５年、４月７日に公開の特許文献２７及び２８はヒストンデアセチラーゼインヒビターとしてのベンズアミドを開示している（特許文献２７、２８参照）。
【００３２】
２００５年５月６日に公開された特許文献２９はヒストンデアセチラーゼインヒビターとしてのアシル尿素に結合された及びスルホニル尿素に結合されたヒドロキサメートを開示している（特許文献２９参照）。
【００３３】
２００５年５月６日に公開の特許文献３０はまた、ヒストンデアセチラーゼインヒビターとしての二アリール結合ヒドロキサメートを開示している（特許文献３０参照）。
【００３４】
２００５年８月１８日に公開の特許文献３１は、ヒストンデアセチラーゼインヒビターとしてのチアゾリルヒドロキサム酸及びチアジアゾリルヒドロキサム酸を開示している（特許文献３１参照）。
【００３５】
２００５年９月２２日に公開の特許文献３２は、ヒストンデアセチラーゼインヒビターとしてのヘテロ五環式ヒドロキサム酸を開示している（特許文献３２参照）。
【００３６】
２００５年１０月６日に公開の特許文献３３は、ヒストンデアセチラーゼとしてのアルケニルベンズアミドを開示している（特許文献３３参照）。
【００３７】
本発明の化合物は構造、それらの薬理作用及び／又は薬理学的効力において先行技術と異なる。
【００３８】
解決するべき問題は、増加した生体利用能及び／又はインビボの効力を有する、高い酵素活性及び細胞活性をもつヒストンデアセチラーゼインヒビターを提供することである。
【００３９】
本発明の新化合物は前記の問題を解決する。本発明の化合物は優れたヒストンデアセチラーゼ阻害酵素活性及び細胞活性を示す。それらはｐ２１遺伝子を活性化する高い能力を有する。それらは望ましい薬物動態学的プロファイル及びＰ４５０酵素に対する低い親和性をもつことができ、それがより広い安全範囲をも許容する、不都合な薬物−薬物相互作用の危険性を軽減する。本発明の化合物の有利な特徴は代謝安定性、溶解度及び／又はｐ２１誘導能である。更にとりわけ本発明の化合物は水溶液中の増加した安定性を有しそして／又はインビボのｐ２１プロモーター誘導能を高めた。
【特許文献１】Ｇｅｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，欧州特許第０  ８２７  ７４２号明細書、１９９８年３月１１日公開
【特許文献２】欧州特許第１４７２２１６号明細書
【特許文献３】欧州特許第１４８５０９９号明細書
【特許文献４】欧州特許第１４８５３４８号明細書
【特許文献５】欧州特許第１４８５３５３号明細書
【特許文献６】欧州特許第１４８５３５４号明細書
【特許文献７】欧州特許第１４８５３６４号明細書
【特許文献８】欧州特許第１４８５３６５号明細書
【特許文献９】欧州特許第１４８５３７０号明細書
【特許文献１０】欧州特許第１４８５３７８号明細書
【特許文献１１】欧州特許第１４９２５３４号明細書
【特許文献１２】欧州特許第１４９５００２号明細書
【特許文献１３】欧州特許第１５０１５０８号明細書
【特許文献１４】国際公開出願第０４／００９５３６号パンフレット
【特許文献１５】欧州特許第１５２５１９９号明細書
【特許文献１６】欧州特許第１５７２６２６号明細書
【特許文献１７】欧州特許第１５８１４８４号明細書
【特許文献１８】欧州特許第１５８５７３５号明細書
【特許文献１９】欧州特許第１５９２６６７号明細書
【特許文献２０】欧州特許第１５９０３４０号明細書
【特許文献２１】欧州特許第１５９２６６５号明細書
【特許文献２２】国際公開出願第０４／０７２０４７号パンフレット
【特許文献２３】欧州特許第１６０８６２８号明細書
【特許文献２４】欧州特許第１６１３６２２号明細書
【特許文献２５】欧州特許第１６１１０８８号明細書
【特許文献２６】国際公開出願第０５／０２８４４７号パンフレット
【特許文献２７】国際公開出願第０５／０３０７０４号パンフレット
【特許文献２８】国際公開出願第０５／０３０７０５号パンフレット
【特許文献２９】国際公開出願第０５／０４０１０１号パンフレット
【特許文献３０】国際公開出願第０５／０４０１６１号パンフレット
【特許文献３１】国際公開出願第０５／０７５４６９号パンフレット
【特許文献３２】国際公開出願第０５／０８６８９８号パンフレット
【特許文献３３】国際公開出願第０５／０９２８９９号パンフレット
【非特許文献１】Ｆｉｎｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４０１：１８８−１９３．１９９９
【非特許文献２】Ｍａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２５：２６１−３０９，２００５
【発明の開示】
【００４０】
本発明は式（Ｉ）
【００４１】
【化１】
2009523760.tif 000003
【００４２】
［式中、
ｎは値０、１又は２をもつ整数であり、そしてｎが０である時は直接結合が意図されており、
ｍは値１又は２をもつ整数であり、
ＸはＮ又はＣＨであり、
ＹはＯ、Ｓ又はＮＲ８であり、ここで
Ｒ８は水素、Ｃ１−６アルキル，Ｃ１−６アルキルオキシＣ１−６アルキル、Ｃ３−６シクロアルキル、Ｃ３−６シクロアルキルメチル、フェニルＣ１−６アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨＲ９Ｒ１０又は−Ｓ（＝Ｏ）２−Ｎ（ＣＨ３）２であり、ここで
Ｒ９及びＲ１０はそれぞれ独立して水素、アミノ、Ｃ１−６アルキル又はアミノＣ１−６アルキルであり、そして
ＹがＮＲ８でありそしてＲ２がインドリルの７−位上にある時は、Ｒ２及びＲ８が一緒になって２価の基
−（ＣＨ２）２−        （ａ−１）又は
−（ＣＨ２）３−        （ａ−２）
を形成してもよく、
Ｒ１は水素、Ｃ１−６アルキル、ヒドロキシＣ１−６アルキル、シアノＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、Ｃ１−６アルキルカルボニル又はモノ−もしくはジ（Ｃ１−６アルキル）アミノスルホニルであり、
Ｒ２は水素、ヒドロキシ、アミノ、ハロ、Ｃ１−６アルキル、シアノ、Ｃ２−６アルケニル、ポリハロＣ１−６アルキル、ニトロ、フェニル、Ｃ１−６アルキルカルボニル、ヒドロキシカルボニル、Ｃ１−６アルキルカルボニルアミノ、Ｃ１−６アルキルオキシ又はモノ−もしくはジ（Ｃ１−６アルキル）アミノであり、
Ｒ３はヒドロキシ又はアミノであり、
Ｒ４は水素、チエニル、フラニル又はフェニルであり、そしてチエニル、フラニル又はフェニルはそれぞれ場合により、ハロ、アミノ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、フェニル、Ｃ１−６アルキル、（ジＣ１−６アルキル）アミノ、Ｃ１−６アルキルオキシ、フェニルＣ１−６アルキルオキシ、ヒドロキシＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルオキシカルボニル、ヒドロキシカルボニル、Ｃ１−６アルキルカルボニル、ポリハロＣ１−６アルキルオキシ、ポリハロＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、ヒドロキシカルボニルＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルカルボニルアミノ、アミノスルホニル、アミノ
スルホニルＣ１−６アルキル，イソオキサゾリル、アミノカルボニル、フェニルＣ２−６アルケニル、フェニルＣ３−６アルキニル又はピリジニルＣ３−６アルキニルで置換されていてもよく、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７はそれぞれ独立して水素、アミノ、ニトロ、フラニル、ハロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルオキシ、トリフルオロメチル、チエニル、フェニル、Ｃ１−６アルキルカルボニルアミノ、アミノカルボニルＣ１−６アルキル又は−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｒ１１である］
の化合物、それらのＮ−オキシド、製薬学的に許容される付加塩及び立体化学的異性体を対象とする。
【００４３】
用語「ヒストンデアセチラーゼインヒビター」又は「ヒストンデアセチラーゼのインヒビター」は、ヒストンデアセチラーゼと相互反応することができ、その活性、より具体的にはその酵素活性を阻害することができる化合物を特定するために使用される。ヒストンデアセチラーゼ酵素活性を阻害する方法は、ヒストンからアセチル基を除去するヒストンデアセチラーゼの能力を減少させる方法を意味する。このような阻害は好ましくは特異的である、すなわちヒストンデアセチラーゼインヒビターが何か他の、無関係の生物学的効果をもたらすために要するインヒビターの濃度より低い濃度で、ヒストンからアセチル基を除去するためのヒストンデアセチラーゼの能力を低下させる。
【００４４】
以上の定義及び以後に使用される、ハロはフルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードを包含し、Ｃ１−２アルキルは例えばメチル又はエチルのような１又は２個の炭素原子を有する直鎖飽和炭化水素基を定義し、Ｃ１−６アルキルはＣ１−２アルキル及び、例えばプロピル、ブチル、１−メチルエチル、２−メチルプロピル、ペンチル、２−メチルーブチル、ヘキシル、２−メチルペンチル等のような、３〜６個の炭素原子を有する直鎖及び分枝鎖飽和炭化水素基を定義し、ポリハロＣ１−６アルキニルは３個の同一の又は異なるハロ置換基を含有するＣ１−６アルキル、例えばトリフルオロメチルを定義し、Ｃ２−６アルケニルは、例えば、エテニル、２−プロペニル、３−ブテニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、３−メチル−２−ブテニル、等のような、１個の二重結合を含有し、そして２〜６個の炭素原子を有する直鎖及び分枝鎖炭化水素基を定義し、Ｃ３−６アルキニルは例えば２−プロピニル、３−ブチニル、２−ブチニル、２−ペンチニル、３−ペンチニル、３−ヘキシニル、等のような、１個の三重結合を含有し、そして３〜６個の炭素原子を有する直鎖及び分枝鎖の炭化水素基を定義し、Ｃ３−７シクロアルキルはシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル等のような３〜７個の炭素を有する環式炭化水素基を包含する。
【００４５】
製薬学的に許容される付加塩は、製薬学的に許容される酸付加塩及び製薬学的に許容される塩基の付加塩を包含する。前記の製薬学的に許容される酸付加塩は、式（Ｉ）の化合物が形成することができる治療的に有効な無毒の酸付加塩形態を含んでなることを意味する。塩基性を有する式（Ｉ）の化合物は、前記の塩基形態を適当な酸で処理することにより、それらの製薬学的に許容される酸付加塩に転化させることができる。適当な酸は例えば、ハロゲン化水素酸（例えば塩酸又は臭化水素酸）、硫酸、硝酸、リン酸等の酸のような無機酸、あるいは例えば酢酸、トリフルオロ酢酸、プロパン酸、ヒドロキシ酢酸、乳酸、ピルビン酸、蓚酸、マロン酸、琥珀酸（すなわちブタンジオン酸）、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シクラミン酸、サリチル酸、ｐ−アミノ−サリチル酸、パモエ酸等の酸のような有機酸を含んでなる。
【００４６】
酸性を有する式（Ｉ）の化合物は、前記の酸形態を適当な有機又は無機塩基で処理することにより、それらの製薬学的に許容される塩基付加塩に転化させることができる。適当な塩基塩形態は例えば、アンモニウム塩、アルカリ及びアルカリ土類金属塩（例えばリチ
ウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム塩等）、有機塩基との塩（例えばベンザチン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、ヒドラバミン塩）及び、例えばアルギニン、リシン等のようなアミノ酸との塩を含んでなる。
【００４７】
用語の「酸又は塩基付加塩」はまた、式（Ｉ）の化合物が形成することができる水和物及び溶媒付加形態物を含んでなる。このような形態物の例は例えば、水和物、アルコラート等である。
【００４８】
本明細書で使用される用語「式（Ｉ）の化合物の立体化学的異性体」は、式（Ｉ）の化合物が所有することができる、同一配列の結合により結合された同一原子よりなるが、互換性でない異なる三次元構造を有するすべての可能な化合物を定義する。別に言及され又は示されない限り、化合物の化学名は、該化合物が所有することができるすべての可能な立体化学的異性体形態の混合物を包含する。該混合物は該化合物の基礎分子構造のすべてのジアステレオマー及び／又はエナンチオマーを含有することができる。純粋な形態又は相互に混合された、双方の、式（Ｉ）の化合物のすべての立体化学的異性体形態が本発明の範囲内に包含されることが意図される。
【００４９】
式（Ｉ）の化合物のＮ−オキシドはそこで、１個又は複数の窒素原子がいわゆるＮ−オキシド、特にその１個又は複数のピペリジン−、ピペラジン又はピリダジニル−窒素がＮ−酸化されているＮ−オキシドに酸化されている、式（Ｉ）化合物を含んでなることを意味する。
【００５０】
幾つかの式（Ｉ）化合物はまた、それらの互変異性体で存在することができる。前記の式中には明白に記載されていないが、このような形態は本発明の範囲内に包含されることが意図される。
【００５１】
用語「式（Ｉ）の化合物」はまた、以後使用される時はいつも、製薬学的に許容される付加塩及びすべての立体異性体をも包含することを意味する。
【００５２】
本明細書で使用される用語「ヒストンデアセチラーゼ」及び［ＨＤＡＣ］は、ヒストンのＮ−末端のリシン残基のε−アミノ基からアセチル基を除去する酵素の１族のいずれか１個を表すことが意図される。文脈により別に示されない限り、用語「ヒストン」はあらゆる種からのＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４及びＨ５を包含するいずれかのヒストンタンパク質を表すことを意味する。ヒトのＨＤＡＣタンパク質又は遺伝子生産物はそれらに限定せずに、ＨＤＡＣ−１、ＨＤＡＣ−２、ＨＤＡＣ−３、ＨＤＡＣ−４、ＨＤＡＣ−５、ＨＤＡＣ−６、ＨＤＡＣ−７、ＨＤＡＣ−８、ＨＤＡＣ−９、ＨＤＡＣ−１０及びＨＤＡＣ−１１を包含する。ヒストンデアセチラーゼはまた、原生動物又はカビ・真菌源から誘導することができる。
【００５３】
興味深い化合物の第１の群は、そのＲ４が水素以外である式（Ｉ）の化合物よりなる。
【００５４】
興味深い化合物の第２の群は、１項又は複数の以下の制約が適用される式（Ｉ）の化合物よりなる：
ａ）ｎが０又は１であり、
ｂ）ｍが１又は２であり、
ｃ）ＸがＮ又はＣＨであり、
ｄ）ＹがＮＲ８であり、ここでＲ８が水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−６シクロアルキル又はＣ３−６シクロアルキルメチルであり、
ｅ）Ｒ１が水素、Ｃ１−６アルキル、ヒドロキシＣ１−６アルキル又はＣ１−６アルキルスルホニルであり、
ｆ）Ｒ２が水素又はハロであり、
ｇ）Ｒ３がアミノであり、
ｈ）Ｒ４が水素又はチエニルであり、そして
ｉ）Ｒ５、Ｒ６及びＲ７がそれぞれ水素である。
【００５５】
興味深い化合物の第３の群は、１項又は複数の以下の制約が適用される式（Ｉ）の化合物よりなる：
ａ）ｎが０又は１であり、
ｂ）ｍが１又は２であり、
ｃ）ＸがＮ又はＣＨであり、
ｄ）ＹがＮＲ８であり、ここでＲ８が水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−６シクロアルキル又はＣ３−６シクロアルキルメチルであり、
ｅ）Ｒ１が水素、Ｃ１−６アルキル、ヒドロキシＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルカルボニル又はＣ１−６アルキルスルホニルであり、
ｆ）Ｒ２が水素又はハロであり、
ｇ）Ｒ３がアミノであり、
ｈ）Ｒ４が水素であり、そして
ｉ）Ｒ５、Ｒ６及びＲ７がそれぞれ水素である。
【００５６】
興味深い化合物の第４の群は、１項又は複数の以下の制約が適用される式（Ｉ）の化合物よりなる：
ａ）ｎが０又は１であり、
ｂ）ｍが１又は２であり、
ｃ）ＸがＮ又はＣＨであり、
ｄ）ＹがＮＲ８であり、ここでＲ８が水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−６シクロアルキル又はＣ３−６シクロアルキルメチルであり、
ｅ）Ｒ１が水素、Ｃ１−６アルキル、ヒドロキシＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルカルボニル又はＣ１−６アルキルスルホニルであり、
ｆ）Ｒ２が水素又はハロであり、
ｇ）Ｒ３がアミノであり、
ｈ）Ｒ４が水素又はチエニルであり、そして
ｉ）Ｒ５、Ｒ６及びＲ７がそれぞれ水素である。
【００５７】
興味深い化合物の第５群は、１項又は複数の以下の制約が適用される式（Ｉ）の化合物よりなる：
ａ）ｎが１であり、
ｂ）ｍが１又は２であり、
ｃ）ＸがＮ又はＣＨであり、
ｄ）ＹがＮＲ８であり、ここでＲ８がＣ１−６アルキル、例えばメチル又はエチルであり、
ｅ）Ｒ１が水素、ヒドロキシＣ１−６アルキル又はＣ１−６アルキルスルホニルであり、ｆ）Ｒ２が水素あるいはハロ、例えば特に４−、５−又は７−位のフルオロ又はクロロであり、
ｇ）Ｒ３がアミノであり、
ｈ）Ｒ４が水素又はチエニルであり、そして
ｉ）Ｒ５、Ｒ６及びＲ７がそれぞれ水素である。
【００５８】
もっとも好ましい化合物の群は、１項又は複数の以下の制約が適用される式（Ｉ）の化合物よりなる：
ａ）ｎが１であり、
ｂ）ｍが１であり、
ｃ）ＸがＮであり、
ｄ）ＹがＮＲ８であり、ここでＲ８がメチルであり、
ｅ）Ｒ１が水素であり、
ｆ）Ｒ２が水素あるいはハロ、例えば特に４−、５−又は７−位のフルオロ又はクロロであり、
ｇ）Ｒ３が−ＮＨ２であり、
ｈ）Ｒ４が水素又は２−チエニルであり、そして
ｉ）Ｒ５、Ｒ６及びＲ７がそれぞれ水素である。
【００５９】
特に好ましい式（Ｉ）の化合物は化合物Ｎｏ．２、すなわち式
【００６０】
【化２】
2009523760.tif 000004
【００６１】
の化合物である。
【００６２】
式（Ｉ）の化合物、それらの製薬学的に許容される塩及びＮ−オキシド及び立体化学的異性体は、従来の方法で製造することができる。出発原料及び幾つかの中間体は知られた化合物であり、そして市場で入手することができるか又は当該技術分野で一般に知られた従来の反応方法に従って又は欧州特許出願第１４８５０９９号、第１４８５３４８号、第１４８５３５３号、第１４８５３５４号、第１４８５３６４号、第１４８５３６５号、第１４８５３７０号及び第１４８５３７８号明細書中に記載されたように製造することができる。式（Ｉ）の最終化合物を取得する他の方法は実施例中に説明される。
【００６３】
式（Ｉ）の化合物は、例えばトリエチルアミン及びベンゾトリアゾル−１−イルオキシトリピロリジノ−ホスホニウム・ヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）のような塩基の存在下で、そのＭが水素あるいはアルカリ金属、例えばナトリウム又はリチウムを表す式（ＩＩ）の中間体を式（ＩＩＩ）の化合物と反応させることにより製造することができる。前記反応は例えばテトラヒドロフラン又はジクロロメタン又はそれらの混合物のような適当な溶媒中で実施される。
【００６４】
【化３】
2009523760.tif 000005
【００６５】
あるいはまた、式（Ｉ）の化合物は、例えば、ジクロロメタンのような適当な溶媒中でスルホニルクロリド（ＳＯＣｌ２）との処理により式（ＩＩ）の化合物を酸塩化物に転化させ、次にジクロロメタン又はＴＨＦのような適当な溶媒中でピリジンのような塩基の存在下で、生成される酸塩化物化合物を式（ＩＩＩ）の化合物と反応させることにより製造することができる。
【００６６】
式（Ｉ）の化合物はまた、分子中の他の基の感受性に応じて、当該技術分野で知られた反応又は官能基転化により相互に転化させることができ、例えばカルボン酸エステルの対応するカルボン酸又はアルコールへの加水分解；アミドの対応するカルボン酸又はアミンへの加水分解；ニトリルの対応するアミドへの加水分解；フェニル上のアミノ基を当該技術分野で知られたジアゾ化反応及び次の、水素によるジアゾ基の置換により水素により置換することができ；アルコールをエステル及びエーテルに転化させることができ；第一級アミンを第二級又は第三級アミンに転化させることができ；二重結合を対応する単結合に水素化することができ；フェニル基上のヨード基を適当なパラジウム触媒の存在下で一酸化炭素の挿入によりエステル基に転化させることができる。
【００６７】
式（ＩＩ）の中間体は、一般に還流下で、エタノールのような適当な溶媒中で、式（ＩＩＩ）の中間体を適当な酸性溶液、例えば塩酸又は適当なアルカリ金属塩基、例えば水酸化ナトリウムと反応させることにより製造することができる。
【００６８】
【化４】
2009523760.tif 000006
【００６９】
式（ＩＩＩ）の中間体は、アルコール、例えばメタノールのような適当な溶媒中で、ホウ水素化ナトリウム、例えばテトラヒドロホウ酸ナトリウムのような適当な試薬の存在下で、式（ＩＶ）のカルボン酸エチルエステルを、そのｔが０又は１である式（Ｖ）の適当なカルボキシアルデヒドと反応させることにより製造することができる。
【００７０】
【化５】
2009523760.tif 000007
【００７１】
同様な方法で、式（ＩＩＩ）の中間体は、式（ＩＶａ）の中間体を前記の式（Ｖａ）の中間体と反応させることにより製造することができる。
【００７２】
【化６】
2009523760.tif 000008
【００７３】
式（ＩＩＩ）の中間体はまた、式（ＩＶ）の中間体を、そのＷが例えばハロ（例えばフ
ルオロ、クロロ、ブロモ又はヨード）あるいはメチルスルホニルオキシ、４−メチルフェニルスルホニルオキシ等のようなスルホニルオキシ基のような適当な離脱基である、式（ＶＩ）の中間体と反応させることにより製造することができる。その反応は、例えばアルコール（例えばメタノール、エタノール、２−メトキシ−エタノール、プロパノール、ブタノール等）；エーテル（例えば４，４−ジオキサン、１，１’−オキシビスプロパン等）；ケトン（例えば４−メチル−２−ペンタノン又はＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ニトロベンゼン、アセトニトリル等）のような反応不活性溶媒中で実施することができる。例えばアルカリ又はアルカリ土類金属炭酸塩又は炭酸水素塩（例えばトリエチルアミン又は炭酸ナトリウム）のような適当な塩基の添加は反応経過中に放出される酸を除去するために利用することができる。反応を促進するために少量の適当な金属ヨウ化物、例えばヨウ化ナトリウム又はカリウムを添加することができる。撹拌は反応速度を促進することができる。反応は好都合には、室温と反応混合物の還流温度の範囲内の温度で実施され、そして所望される場合は反応は高圧下で実施することができる。
【００７４】
【化７】
2009523760.tif 000009
【００７５】
同様な方法で、式（ＩＩＩ）の中間体は、式（ＶＩＩ）の中間体を、そのＷが前記のような適当な離脱基である式（ＶＩＩＩ）の中間体と反応させることにより製造することができる。
【００７６】
【化８】
2009523760.tif 000010
【００７７】
式（Ｉ）の化合物及び幾つかの中間体はそれらの構造中に少なくとも１個のステレオジェン中心をもつかも知れない。このステレオジェン中心はＲ又はＳ配置で存在することができる。
【００７８】
前述の方法で製造される式（Ｉ）の化合物は一般に、エナンチオマーのラセミ混合物であり、それらは当該技術分野で知られた分割法に従って相互から分割することができる。
式（Ｉ）のラセミ化合物は適当なキラル酸との反応により、対応するジアステレオマー塩形態に転化させることができる。該ジアステレオマー塩形態を次に、例えば選択的又は分別結晶化により分離して、エナンチオマーをアルカリによりそれらから遊離させる。式（Ｉ）の化合物のエナンチオマー形態を分離する代りの方法は、キラル固定相を使用する液体クロマトグラフィーを伴なう。該純粋な立体化学異性体形態はまた、その反応が立体特異的に起る場合は、適当な出発材料の、対応する純粋な立体化学的異性体形態から誘導することができる。特定の立体異性体が所望される場合は、該化合物は好ましくは立体特異的製造法により合成されるであろう。これらの方法は有利にはエナンチオマーとして純粋な出発材料を使用するであろう。
【００７９】
式（Ｉ）の化合物、それらの製薬学的に許容される酸付加塩及び立体異性体形態は、それらがヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害効果を有するという貴重な薬理学的特性を有する。
【００８０】
本発明は、有効量の本発明の化合物を投与することにより、形質転換細胞を包含する細胞の異常増殖を抑制する方法を提供する。細胞の異常増殖は正常な制御機構と独立した細胞増殖（例えば接触阻止の喪失）を表す。これは直接には癌細胞の増殖の停止、末端分化及び／又はアポトーシスを誘導することによる、そして間接的には、腫瘍の新生血管形成を抑制する双方による、腫瘍増殖の抑制を包含する。
【００８１】
本発明はまた、有効量の本発明の化合物をこのような処置を要する被験体、例えば哺乳動物（そしてより具体的にはヒト）に投与する方法による、腫瘍の増殖を抑制する方法を提供する。とりわけ本発明は、有効量の本発明の化合物の投与による腫瘍の増殖を抑制する方法を提供する。抑制することができる腫瘍の例は、限定せずに、肺癌（例えば腺癌及び非小細胞肺癌を包含する）、膵臓癌（例えば外分泌膵癌のような膵癌）、結腸癌（例えば結腸腺癌及び結腸腺腫のような、例えば結腸直腸癌）、進行疾患を包含する前立腺癌、リンパ系の造血器官腫瘍（例えば急性リンパ性白血病、Ｂ−細胞リンパ腫、ブルキットリンパ腫）、骨髄性白血病（例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ））、甲状腺濾胞腺癌、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、間葉細胞源の腫瘍（例えば繊維肉腫及び横紋筋肉腫）、メラノーマ、奇形癌、神経芽細胞腫、神経膠腫、皮膚の良性腫瘍（例えば、角化棘細胞腫）、乳癌（例えば進行乳癌）、腎臓癌、卵巣癌、膀胱癌及び表皮癌である。
【００８２】
本発明に従う化合物は、他の治療目的、例えば、
ａ）癌を処置するための腫瘍の放射線照射前、その間又はその後に本発明に従う化合物を投与することにより放射線治療に対して腫瘍を感受性化させる、
ｂ）関節リューマチ、変形性関節炎、若年性関節炎、痛風、多発性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎及び全身性エリテマドーデスのような関節症及び骨病理状態を処置する、ｃ）血管増殖障害、アテローム性動脈硬化症及び再狭窄を包含する平滑筋細胞増殖を抑制する、
ｄ）潰瘍性大腸炎、クローン病、アレルギー性鼻炎、移植片対宿主病、結膜炎、喘息、ＡＲＤＳ、ベーチェット病、移植拒絶、蕁麻疹、アレルギー性皮膚炎、円形脱毛症、強皮症、発疹、湿疹、皮膚筋炎、ニキビ、糖尿病、全身性エリテマドーデス、川崎病、多発性硬化症、気腫、嚢胞性繊維症及び慢性気管支炎のような炎症状態及び皮膚状態を処置する、ｅ）子宮内膜症、子宮筋腫、不正子宮出血及び子宮内膜増殖症を処置する、
ｆ）網膜及び脈絡膜血管に影響する血管疾患を包含する眼科血管形成を処置する、
ｇ）心機能不全を処置する、
ｈ）ＨＩＶ感染症の処置のような免疫抑制状態を抑制する、
ｉ）腎機能不全を処置する、
ｊ）内分泌障害を抑制する、
ｋ）糖新生の機能不全を抑制する、
ｌ）神経病理、例えばパーキンソン病あるいは、認識障害、例えばアルツハイマー病又はポリグルタミン関連神経疾患をもたらす神経病理を処置する、
ｍ）精神障害、例えば精神分裂病、双極性障害、鬱病、心配症及び精神病を処置する、
ｎ）神経筋肉病理、例えば筋萎縮性側索硬化症を抑制する、
ｏ）脊髄筋萎縮症を処置する、
ｐ）遺伝子の発現を強化することにより、処置に敏感な他の病理学的状態を処置する、
ｑ）遺伝子治療を高める、
ｒ）脂質生成を抑制する、
ｓ）マラリアのような寄生虫症を処置する、
のために、使用することができる。
【００８３】
従って、本発明は、医薬としての使用のための式（Ｉ）の化合物並びに、１種又は複数の前記の状態を処置するための医薬の製造のための、式（Ｉ）のこれらの化合物の使用を開示する。
【００８４】
式（Ｉ）の化合物、それらの製薬学的に許容される酸付加塩及び立体異性体形態は、それらを、標識化合物とＨＤＡＣ間の複合体の形成を検出又は測定する方法を含んでなる、生体サンプル中のＨＤＡＣを検出又は特定するために使用することができるという貴重な診断的特性を有することができる。
【００８５】
検出又は特定法は、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質、等のような標識物質で標識される化合物を使用することができる。放射性同位元素の例は１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈ及び１４Ｃを包含する。酵素は通常、順次検出可能な反応を触媒する適当な基質の共役により検出可能にさせられる。それらの例は、例えばベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ及びマレートデヒドロゲナーゼ、好ましくはホースラディッシュのペルオキシダーゼを包含する。発光物質は例えばルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、エクオリン及びルシフェラーゼを包含する。
【００８６】
生体サンプルは体組織又は体液と定義することができる。体液の例は脳脊髄液、血液、血漿、血清、尿、喀痰、唾液等である。
【００８７】
それらの有用な薬理学的特性を考慮すると、主題化合物は投与目的のための種々の製薬学的剤形に調合することができる。
【００８８】
本発明の製薬学的組成物を製造するためには、有効成分として、有効量の塩基又は酸付加塩形態の特定の化合物を、投与に所望される製造物の形態に応じて広範な形態を採ることができる、製薬学的に許容される担体と密接な混合物に組み合わせる。これらの製薬学的組成物は望ましくは、好ましくは経口、直腸内、経皮的又は非経口注射による投与に適した単一の投与剤形にある。例えば、経口投与剤形の組成物を製造する際には、懸濁物、シロップ、エリキシル及び液剤のような経口液体製造物の場合には、例えば水、グリコール、油、アルコール、等のようないずれかの通常の製薬学的媒質、あるいは散剤、ピル、カプセル及び錠剤の場合にはデンプン、糖、カオリン、滑沢剤、結合剤、崩壊剤等のような固形担体を使用することができる。
【００８９】
それらの投与の容易さのために錠剤及びカプセルがもっとも有利な経口投与単位剤形を表し、その場合には明らかに固形の製薬学的担体が使用される。非経口組成物のための担体は、例えば溶解性を補助するための他の成分を包含することはできるが、通常は、少なくとも大部分は滅菌水を含んでなるであろう。例えば、その担体が生理食塩水、ブドウ糖液又は生理食塩水とブドウ糖液の混合物を含んでなる注射液を製造することができる。適
当な液体担体、懸濁剤等を使用することができる注射用懸濁液もまた製造することができる。経皮的投与に適した組成物中では、担体は、場合により、皮膚に対して有意な有害効果を誘導しない、少量の、あらゆる性状の適当な添加剤と組み合わせてもよい浸透促進剤及び／又は適当な湿潤化剤を場合により含んでなる。該添加剤は皮膚に対する投与を容易にし、そして／又は所望の組成物を製造する補助になることができる。これらの組成物は種々の方法で、例えば経皮的パッチとして、スポットオン剤として又は軟膏として投与することができる。
【００９０】
投与の容易さ及び用量の均一性のために、前記の製薬学的組成物を投与単位剤形に調合することは特に有益である。本明細書及び請求項に使用される投与単位剤形は、各単位が、必要な製薬学的担体と一緒に、所望の治療効果をもたらすように計算された、前以て決定された量の有効成分を含有する、単一投与物として適した物理的に分割された単位を表す。このような投与単位剤形の例は錠剤（刻み目付き錠剤又はコート錠）、カプセル、ピル、散剤分包、ウエファー、注射液又は懸濁物、小匙１杯、大匙１杯等並びにそれらの分離された複数物である。
【００９１】
当業者は、以後に提示される試験結果から、有効量を容易に決定することができるであろう。概括的に治療的有効量は０．００５ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、そしてとりわけ０．００５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重であろうと推測される。必要量を１日に適当な間隔を空けて２、３、４又は５回以上の分割量として投与することが適当かも知れない。該分割量は例えば、単位投与剤形当たり０．５〜５００ｍｇ、そしてとりわけ１０ｍｇ〜５００ｍｇの有効成分を含有する単位投与剤形として調合することができる。
【００９２】
本発明のもう１つのアスペクトとして、特に医薬としての使用のための、より具体的には癌又は関連疾患の処置における、もう１種の抗癌剤とのＨＤＡＣ−インヒビターの組み合わせ物が想定される。
【００９３】
前記の状態の処置のために、本発明の化合物を有利には、１種又は複数の他の医薬、より具体的には他の抗癌剤と組み合わせて使用することができる。抗癌剤の例は、
−白金配位化合物、例えばシスプラチン、カルボプラチン又はオキサリプラチン、
−タキサン化合物、例えばパクリタキセル又はドセタキセル、
−カンプトテシン化合物のようなトポイソメラーゼＩインヒビター、例えばイリノテカン又はトポテカン、
−抗癌性ポドフィロトキシン誘導体のようなトポイソメラーゼＩＩインヒビター、例えばエトポシド又はテニポシド、
−抗腫瘍ビンカアルカロイド、例えばビンブラスチン、ビンクリスチン又はビノレルビン−抗腫瘍ヌクレオシド誘導体、例えば５−フルオロウラシル、ゲンシタビン又はカペシタビン、
−ナイトロジェン・マスタード又はニトロソ尿素のようなアルキル化剤、例えばシクロホスホアミド、クロランブシル、カルムスチン又はロムスチン、
−抗腫瘍、アントラサイクリン誘導体、例えばダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン又はミトキサントロン、
−ＨＥＲ２抗体、例えばトラストズマブ、
−エストロゲン受容体アンタゴニスト又は選択的エストロゲン受容体モジュレーター、例えばタモキシフェン、トレミレン、ドロルオキシフェン、ファスロデックス又はラルオキシフェン、
−エキセメスタン、アナストロゾール、レトラゾール及びボロゾールのようなアロマターゼインヒビター、
−レチノイド、ビタミンＤ及びレチノイン酸代謝阻害剤（ＲＡＭＢＡ）のような分化剤、例えばアキュタン、
−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼインヒビター、例えばアザシチジン、
−キナーゼインヒビター、例えばフラボペリドール、イマチニブメシレート又はゲフィチニブ、
−ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、
−他のＨＤＡＣインヒビター、
−ユビキチン−プロテアソム経路のインヒビター、例えばＶｅｌｃａｄｅ、あるいは
−Ｙｏｎｄｅｌｉｓ、
である。
【００９４】
用語「白金配位化合物」は本明細書では、イオンの形態の白金を提供するいずれかの腫瘍細胞増殖阻害白金配位化合物を表すために使用される。
【００９５】
用語［タキサン化合物］はタキサン環系を有し、特定の種のイチイの木（Ｔａｘｕｓ）からの抽出物に関連した又はそれから誘導される化合物の１クラスを示す。
【００９６】
用語「トポイソメラーゼインヒビター」は真核細胞中のＤＮＡ位相を変えることができる酵素を示すために使用される。それらは重要な細胞機能及び細胞増殖に必須である。真核細胞には２種のトポイソメラーゼ、すなわちＩ型及びＩＩ型がある。トポイソメラーゼＩは約１００，０００の分子量のモノマー酵素である。この酵素はＤＮＡに結合して、一時的な単鎖分解を誘導し、二重らせんを解き（又は解かせ）、そして次にＤＮＡ鎖から解離する前にその分解を再シールする。トポイソメラーゼＩＩはＤＮＡ鎖分解物の導入又は遊離ラジカルの形成に関与する、同様な作用機序を有する。
【００９７】
用語「カンプトテシン化合物」は中国茶のカンプトテシン・アクミナタ（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ  ａｃｕｍｉｎａｔａ）及びインドの木のノタポヂテ・フェチダ（Ｎｏｔｈａｐｏｄｙｔｅｓ  ｆｏｅｔｉｄａ）から誘導される非水溶性アルカロイドである親カンプトテシン化合物に関連した、又はそれから誘導される化合物を表すために使用される。
【００９８】
用語［ポドフィロトキシン化合物］はマンドレークの植物から抽出される、親ポドフィロトキシンに関連した、又はそれから誘導される化合物を示すために使用される。
【００９９】
用語「抗腫瘍ビンカアルカロイド」はツルニチソウ（Ｖｉｎｃａ  ｒｏｓｅａ）の抽出物に関連した、又はそれから誘導される化合物を示すために使用される。
【０１００】
用語「アルキル化剤」は生理学的条件下で、ＤＮＡのような生物学的に必須の高分子にアルキル基を与える能力を有するという共通の特徴をもつ広範な化学薬品の群を包含する。大部分はナイトロジェンマスタード及びニトロソ尿素のような、より重要な物質であるが、有効なアルキル化部分は、複雑な分解反応（その幾つかは酵素による）後にインビボで生成される。アルキル化剤のもっとも重要な薬理学的作用は、細胞増殖、とりわけＤＮＡ合成及び細胞分裂に関与する基本的機序を乱すものである。急速に増殖している組織中のＤＮＡ機能及び結合性を阻害するアルキル化剤の能力が、それらの治療的適用及び多数のそれらの毒性の基礎を提供する。
【０１０１】
用語「抗腫瘍アントラサイクリン誘導体」は、グリコシド結合により結合された稀有な糖のダウノスアミンをもつテトラサイクリン環構造をもつことを特徴とする、カビ・真菌のＳｔｒｅｐ．ｐｅｕｔｉｃｕｓ  ｖａｒ．ｃａｅｓｉｕｓから得られる抗生物質及びそれらの誘導体を含んでなる。
【０１０２】
原発性乳癌におけるヒト表皮増殖因子受容体２タンパク質（ＨＥＲ２）の増殖は、特定の患者に対する低い臨床予後と関連することが示された。トラストズマブはＨＥＲ２受容
体の細胞外領域に高い親和性及び特異性をもって結合する、著しく精製された組み換えＤＮＡ−誘導ヒト化モノクローナルＩｇＧ１カッパ抗体である。
【０１０３】
多数の乳癌はエストロゲン受容体を有し、これらの腫瘍の増殖はエストロゲンにより刺激され得る。用語「エストロゲン受容体アンタゴニスト」及び「選択的エストロゲン受容体モジュレーター」は、エストロゲン受容体（ＥＲ）に結合するエストラジオールの競合的インヒビターを示すために使用される。選択的エストロゲン受容体モジュレーターはＥＲに結合されると、受容体の三次元形態に変化を誘導し、ＤＮＡ上のエストロゲン反応性要素（ＥＲＥ）に対するその結合を変化させる。
【０１０４】
閉経後の女性においては、循環エストロゲンの主要な生成源は、末梢組織におけるアロマターゼ酵素による、副腎及び卵巣のアンドローゲン（アンドロステンジオン及びテストステロン）のエストロゲン（エストロン及びエストラジオール）への転化からである。アロマターゼ阻害又は不活性化によるエストロゲンの剥奪はホルモン依存性乳癌をもつ何人かの閉経後患者に対する有効な選択的処置である。
【０１０５】
用語「抗エストロゲン剤」は本明細書では、エストロゲン受容体アンタゴニスト及び選択的エストロゲン受容体モジュレーターのみならずまた、前記のようなアロマターゼインヒビターを包含するために使用される。
【０１０６】
用語「分化剤」は種々の方法で、細胞増殖を阻害し、分化を誘導することができる化合物を包含する。ビタミンＤ及びレチノイドは、広範な正常及び悪性の細胞タイプの増殖及び分化を制御するのに重要な役割を果たすことが知られている。レチノイン酸代謝阻害剤（ＲＡＭＢＡ）は、レチノイン酸のチトクロームＰ４５０−媒介異化作用を阻害することにより内在レチノイン酸のレベルを増加する。
【０１０７】
ＤＮＡメチル化の変化はヒト新生物におけるもっとも一般的な異常の１つである。選択される遺伝子のプロモーター内のメチル化亢進は通常、関与する遺伝子の不活性化を伴なう。用語「ＤＮＡメチルトランスフェラーゼインヒビター」は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの薬理学的阻害及び腫瘍サプレッサーの遺伝子発現の再活性化により作用する化合物を示すために使用される。
【０１０８】
用語「キナーゼインヒビター」は細胞周期の進行及びプログラムされたアポトーシス（アポトーシス）に関与するキナーゼの強力なインヒビターを含んでなる。
【０１０９】
用語「ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター」はＲａｓ及び他の細胞内タンパク質のファルネシル化を抑制するようにされた化合物を示すために使用される。それらは悪性細胞の増殖及び生存に影響をもつことが示されている。
【０１１０】
用語「他のＨＤＡＣインヒビター」は、限定せずに、
−カルボキシレート、例えばブチレート、桂皮酸、４−フェニルブチレート又はバルプロ酸、
−ヒドロキサム酸、例えばスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、ピペラジン含有ＳＡＨＡ類似体、二アリールヒドロキサメートＡ−１６１９０６及びそのカルボゾリルエーテル−、テトラヒドロピリジン−及びテトラロン−類似体、二環式アリール−Ｎ−ヒドロキシカルボキシアミド、ピロキシアミド、ＣＧ−１５２１、ＰＸＤ−１０１、スルホンアミドヒドロキサム酸、ＬＡＱ−８２４、ＬＢＨ−５８９、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、オキサムフラチン、スクリプタイド、スクリプタイド関連三環式分子、ｍ−カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサム酸（ＣＢＨＡ）、ＣＢＨＡ−様ヒドロキサム酸、トラポキシン−ヒドロキサム酸類似体、ＣＲＡ−０２４７８１、Ｒ３０６４６５及び関連ベンゾイル
−及びヘテロアリール−ヒドロキサム酸、アミノスベレート及びマロニルジアミド、
−環式テトラペプチド、例えばトラポキシン、アピジシン、デプシペプチド、スピルコスタチン−関連化合物、ＲｅｄＦＫ−２２８、スルフヒドリル−含有環式テトラペプチド（ＳＣＯＰ）、ヒドロキサム酸含有環式テトラペプチド（ＣＨＡＰ）、ＴＡＮ−１７４及びアズムアミド、
−ベンズアミド、例えばＭＳ−２７５又はＣＩ−９９４、あるいは
−デプデシン
を含んでなる。
【０１１１】
用語「ユビキチン−プロテアソム経路のインヒビター」は細胞周期の制御タンパク質を包含するプロテアソム中の細胞タンパク質の標的とされた破壊を阻害する化合物を特定するために使用される。
【０１１２】
癌の処置のためには、本発明に従う化合物を、放射線照射と一緒に前記のような患者に投与することができる。放射線照射はイオン化光線、そしてとりわけガンマ光線、特に線形加速器により又は今日一般に使用されている放射性核種により放出されるものを意味する。放射性核種による腫瘍の照射は外部からでも内部からでもよい。
【０１１３】
本発明はまた、抗癌剤及び本発明に従うＨＤＡＣインヒビターの本発明に従う組み合わせ物を対象にする。
【０１１４】
本発明はまた、例えば腫瘍細胞の増殖を抑制するための医学的治療における使用のための本発明に従う組み合わせ物を対象とする。
【０１１５】
本発明はまた、腫瘍細胞の増殖を抑制するための本発明に従う組み合わせ物を対象とする。
【０１１６】
本発明はまた、有効量の本発明に従う組み合わせ物を被験体に投与する方法を含んでなる、ヒトの被験者における腫瘍細胞の増殖を抑制する方法を対象とする。
【０１１７】
本発明は更に、有効量の本発明に従う組み合わせ物を投与する方法により、形質転換細胞を包含する細胞の異常増殖を抑制する方法を提供する。
【０１１８】
他の医薬及びＨＤＡＣインヒビターは同時に（例えば別の組成物又は単一組成物中で）又はどんな順序でも連続的に投与することができる。後者の場合には、２種の化合物は有益な又は相乗的効果が確実に達成されるのに十分な期間内そして量及び方法で投与されるであろう。投与の好ましい方法及び順序並びに組み合わせ物の各成分それぞれの投与量及び計画は、投与される特定のその他の医薬及びＨＤＡＣインヒビター、それらの投与経路、処置される特定の腫瘍及び処置される特定の宿主に左右されるであろう。投与の最適な方法及び順序並びに投与量及び計画は、従来の方法を使用し、そして本明細書に提示された情報を考慮して当業者により容易に決定されることができる。
【０１１９】
白金配位化合物は有利には、１コースの処置当たり、体表面積１平方メーターにつき１〜５００ｍｇ（ｍｇ／ｍ２）、例えば５０〜４００ｍｇ／ｍ２、特にシスプラチンに対しては約７５ｍｇ／ｍ２、そしてカルボプラチンに対しては約３００ｍｇ／ｍ２の用量で投与される。
【０１２０】
タキサン化合物は有利には、１コースの処置当たり、体表面積１平方メーターにつき５０〜４００ｍｇ（ｍｇ／ｍ２）、例えば７５〜２５０ｍｇ／ｍ２、特にパクリタキセルに対しては約１７５〜２５０ｍｇ／ｍ２、そしてドセタキセルに対しては約７５〜１５０ｍ
ｇ／ｍ２の用量で投与される。
【０１２１】
カンプトテシン化合物は有利には、１コースの処置当たり、体表面積１平方メーターにつき０．１〜４００ｍｇ（ｍｇ／ｍ２）、例えば１〜３００ｍｇ／ｍ２、特にイリノテカンに対しては約１００〜３５０ｍｇ／ｍ２、そしてトポテカンに対しては約１〜２ｍｇ／ｍ２の用量で投与される。
【０１２２】
抗腫瘍ポドフィロトキシン誘導体は有利には、１コースの処置当たり、体表面積１平方メーターにつき３０〜３００ｍｇ（ｍｇ／ｍ２）、例えば５０〜２５０ｍｇ／ｍ２、特にエトポシドに対しては約３５〜１００ｍｇ／ｍ２、そしてテニポシドに対しては約５０〜２５０ｍｇ／ｍ２の用量で投与される。
【０１２３】
抗腫瘍ビンカアルカロイドは有利には、１コースの処置当たり、体表面積１平方メーターにつき２〜３０ｍｇ（ｍｇ／ｍ２）、特にビンブラスチンに対しては約３〜１２ｍｇ／ｍ２、ビンクリスチンに対しては約１〜２ｍｇ／ｍ２、そしてビノレルビンに対しては約１０〜３０ｍｇ／ｍ２の用量で投与される。
【０１２４】
抗腫瘍ヌクレオシド誘導体は有利には、１コースの処置当たり、体表面積１平方メーターにつき２００〜２５００ｍｇ（ｍｇ／ｍ２）、例えば７００〜１５００ｍｇ／ｍ２、特に５−ＦＵに対しては約２００〜５００ｍｇ／ｍ２、ゲムシタビンに対しては約８００〜１２００ｍｇ／ｍ２、そしてカペシタビンに対しては約１０００〜２５００ｍｇ／ｍ２の用量で投与される。
【０１２５】
ナイトロジェンマスタード又はニトロソ尿素のようなアルキル化剤は有利には、１コースの処置当たり、体表面積１平方メーターにつき１００〜５００ｍｇ（ｍｇ／ｍ２）、例えば１２０〜２００ｍｇ／ｍ２、特にシクロホスホアミドに対しては約１００〜５００ｍｇ／ｍ２、クロランブシルに対しては約０．１〜０．２ｍｇ／ｍ２、カルムスチンに対しては約１５０〜２００ｍｇ／ｍ２、そしてロムスチンに対しては約１００〜１５０ｍｇ／ｍ２の用量で投与される。
【０１２６】
抗腫瘍アントラサイクリン誘導体は有利には、１コースの処置当たり、体表面積１平方メーターにつき１０〜７５ｍｇ（ｍｇ／ｍ２）、例えば１５〜６０ｍｇ／ｍ２、特にドキソルビシンに対しては約４０〜７５ｍｇ／ｍ２、ダウノルビシンに対しては約２５〜４５ｍｇ／ｍ２、そしてイダルビシンに対しては約１０〜１５ｍｇ／ｍ２の用量で投与される。
【０１２７】
トラストズマブは有利には、１コースの処置当たり、体表面積１平方メーターにつき１〜５ｍｇ（ｍｇ／ｍ２）、特に２〜４ｍｇ／ｍ２の用量で投与される。
【０１２８】
抗エストロゲン剤は有利には、特定の薬剤及び処置される状態に応じて１日に約１〜１００ｍｇの用量で投与される。タモキシフェンは有利には５〜５０ｍｇ、好ましくは１０〜２０ｍｇを１日２回の用量で経口投与され、治療効果を達成し、維持するために十分な期間、治療を継続する。トレミフェンは有利には１日１回約６０ｍｇの用量で経口投与され、治療効果を達成し、維持するために十分な期間治療を継続する。アナストロゾールは有利には１日１回約１ｍｇの用量で経口投与される。ドロロキシフェンは有利には１日１回約２０〜１００ｍｇの用量で経口投与される。ラロキシフェンは有利には１日１回約６０ｍｇの用量で経口投与される。エキセメスタンは有利には１日１回約２５ｍｇの用量で経口投与される。
【０１２９】
これらの用量は１コースの処置当たり例えば１回、２回又は３回以上投与することがで
き、それを例えば７、１４、２１又は２８日毎に反復することができる。
【０１３０】
それらの有用な薬理学的特性を考慮すると、本発明に従う組み合わせ物の成分、すなわち他の医薬及びＨＤＡＣインヒビターは、投与目的のための種々の製薬学的剤形に調合することができる。成分は個々の製薬学的組成物中に別々に又は両成分を含有する単一の製薬学的組成物中に調合することができる。
【０１３１】
従って、本発明はまた１種又は複数の製薬学的担体と一緒に、他の医薬及びＨＤＡＣインヒビターを含んでなる製薬学的組成物を対象とする。
【０１３２】
本発明はまた、１種又は複数の製薬学的担体と一緒に、抗癌剤及び本発明に従うＨＤＡＣインヒビターを含んでなる製薬学的組成物の形態の本発明に従う組み合わせ物を対象とする。
【０１３３】
本発明は更に、腫瘍細胞の増殖を抑制するための製薬学的組成物の製造における本発明に従う組み合わせ物の使用を対象とする。
【０１３４】
本発明は更に、癌を罹患する患者の処置における、同時の、別々の又は連続的使用のための組み合わせ製造物としての、第１の有効成分としての本発明に従うＨＤＡＣインヒビター及び第２の有効成分としての抗癌剤を含有する製品を対象とする。
【０１３５】
実験部門
以後、「Ｋ２ＣＯ３」は炭酸カリウム、「ＣＨ２Ｃｌ２」はジクロロメタン、「ＭｇＳＯ４」は硫酸マグネシウム、「ＤＩＰＥ」はジイソプロピルエーテル、「ＴＨＦ」はテトラヒドロフラン、「ＥｔＯＡｃ」は酢酸エチル、「ＤＭＦ」はＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシド、「Ｅｔ３Ｎ」はトリエチルアミン、「ＮａＢＨ４」はナトリウムテトラヒドロボレート（−１）、「ＮａＢＨ３ＣＮ」はシアノホウ水素化ナトリウム、「ＰｙＢＯＰ」はベンゾトリアゾル−１−イルオキシ−トリスピロリジノ−ホスホニウム・ヘキサフルオロホスフェート、「ＤＩＰＥＡ」はＮ−エチル−Ｎ−（１−メチルエチル）−２−プロパンアミン、「ＮＨ４ＯＨ」は水酸化アンモニウム、「ＣＨ３ＯＨ」はメタノール、「ＮＨ４ＨＣＯ３」は炭酸水素アンモニウム、そして「Ｍ．Ｐ．」は融点を意味する。
【０１３６】
Ａ．中間体の製造
〈実施例Ａ１〉
ａ）中間体１の製造
【０１３７】
【化９】
2009523760.tif 000011
【０１３８】
２−［２−（５−クロロ−１Ｈ−インドル−３−イル）エチル］−１Ｈ−イソインドール−１，３（２Ｈ）−ジオン（０．０１７モル）の溶液（１７ｍｌのＤＭＦ中）を水素化ナトリウム（０．０３４モル）の懸濁物（１１ｍｌのＤＭＦ中）に室温、Ｎ２流下で添加した。混合物を室温で１時間撹拌した。１−ヨードプロパン（０．０３４モル）を滴下し
た。混合物を室温で２時間撹拌し、Ｈ２Ｏ及びＮａＣｌ中に注入し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をＨ２Ｏで洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、溶媒を蒸発させると、７．７７ｇの中間体１を取得した。
ｂ）中間体２の製造
【０１３９】
【化１０】
2009523760.tif 000012
【０１４０】
中間体１（０．０２１モル）及びヒドラジン／Ｈ２Ｏ（０．１０６モル）の混合物（１００ｍｌのエタノール中）を２時間撹拌還流し、次に室温に冷却し、Ｈ２Ｏ中に注入し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、溶媒を蒸発させると、５ｇ（１００％）の中間体２を取得した。
【０１４１】
〈実施例Ａ２〉
ａ）中間体３の製造
【０１４２】
【化１１】
2009523760.tif 000013
【０１４３】
２−（メチルスルホニル）−５−ピリミジンカルボン酸エチルエステル（０．０９４モル）の溶液（４０ｍｌのアセトニトリル中）を４−ピペリジンメタノール（０．０８６モル）及びＫ２ＣＯ３（０．１７２モル）の懸濁物（２００ｍｌのアセトニトリル中）に１０℃、Ｎ２流下で添加した。混合物を室温に戻し、次に４時間撹拌し、Ｈ２Ｏ中に注入し、そしてＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、溶媒を蒸発させた。残渣（２３ｇ）をアセトニトリル／ジエチルエーテルから結晶化させた。母層を蒸発させ、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ／ＮＨ４ＯＨ  ９７／３／０．１；２０〜４５μｍ）により精製した。純粋な画分を回収し、溶媒を蒸発させると４．６ｇ（２０％）（Ｍ．Ｐ．：１２９℃）の中間体３を取得した。
ｂ）中間体４の製造
【０１４４】
【化１２】
2009523760.tif 000014
【０１４５】
ＤＭＳＯ（０．１２７モル）をエタンジオイル・ジクロリド（０．０６１モル）の溶液（１１０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２中）に−７８℃、Ｎ２流下で添加した。混合物を１５分間撹拌した。中間体３（０．０５１モル）の溶液（２００ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２中）を添加した。混合物を−７８℃で１時間３０分間撹拌した。Ｅｔ３Ｎ（０．２６モル）を滴下した。混合物を−７８℃で１５分間撹拌し、次に室温に２時間３０分間かけて冷却した。Ｈ２Ｏを添加した。混合物をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、溶媒を蒸発させた。残渣（１４ｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離剤：シクロヘキサン／ＥｔＯＡｃ  ７０／３０；２０〜４５μｍ）により精製した。純粋な画分を回収し、溶媒を蒸発させると７．６ｇ（５７％）の中間体４を取得した。
ｃ）中間体５の製造
【０１４６】
【化１３】
2009523760.tif 000015
【０１４７】
ＮａＢＨ３ＣＮ（０．０３４モル）及び酢酸（０．０２３モル）を中間体２（０．０２１モル）及び中間体４（０．０２１モル）の溶液（５００ｍｌのＣＨ３ＯＨ中）にＮ２流下で添加した。混合物を７２時間撹拌し、１０％Ｋ２ＣＯ３溶液中に注入し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、溶媒を蒸発させた。残渣（１０．４ｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ／ＮＨ４ＯＨ  ９７／３／０．１；１５〜４０μｍ）により精製した。純粋な画分を回収し、溶媒を蒸発させると５．５ｇ（５４％）の中間体５を取得した。
ｄ）中間体６の製造
【０１４８】
【化１４】
2009523760.tif 000016
【０１４９】
中間体５（０．００１モル）及び水酸化ナトリウム（０．００４モル）の混合物（５０ｍｌのエタノール中）を５時間撹拌還流し、次に室温に冷却し、蒸発乾燥させた。残渣をジエチルエーテル中に取った。沈殿物を濾取し、乾燥すると、０．４０７ｇ（８５％）（Ｍ．Ｐ．：＞２６０℃）の中間体６をナトリウム塩（．Ｎａ）として取得した。
【０１５０】
〈実施例Ａ３〉
ａ）中間体７の製造
【０１５１】
【化１５】
2009523760.tif 000017
【０１５２】
２−［４−（アミノメチル）−１−ピペリジニル］−５−ピリミジンカルボン酸エチルエステル（０．００７６モル）及び１−メチル−１Ｈ−インドール−３−カルボキシアルデヒド（０．０１１４モル）の混合物（８０ｍｌのＣＨ３ＯＨ中）を１５時間撹拌還流し、次に室温に冷却した。ＮａＢＨ４（０．０１２モル）を滴下した。混合物を室温で１晩撹拌し、Ｈ２Ｏ中に注入し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、溶媒を蒸発させた。残渣（３．２ｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ／ＮＨ４ＯＨ  ９５／６／０．５；１５〜４０μｍ）により精製した。純粋な画分を回収し、溶媒を蒸発させると、１．６ｇ（５３％）の中間体７を取得した。
ｂ）中間体８の製造
【０１５３】
【化１６】
2009523760.tif 000018
【０１５４】
中間体７（０．００３７モル）及び水酸化ナトリウム（０．００７４モル）の混合物（６０ｍｌのエタノール中）を５０℃で１５時間撹拌し、次に室温に冷却し、溶媒を蒸発乾燥すると、１．５ｇ（１００％）の中間体８をナトリウム塩（．Ｎａ）として取得した。
【０１５５】
〈実施例Ａ４〉
ａ）中間体９の製造
【０１５６】
【化１７】
2009523760.tif 000019
【０１５７】
水素化ナトリウム（０．００２６モル、油中６０％）を５−フルオロ−１Ｈ−インドール−３−カルボキシアルデヒド（０．００２４モル）の溶液（８ｍｌのＤＭＦ中）にＮ２流下で分割添加した。混合物を室温で３０分間撹拌した。１−ヨードプロパン（０．００２９モル）を滴下した。混合物を室温で２時間撹拌し、氷水上に注入した。沈殿物を濾取し、Ｈ２Ｏで洗浄し、乾燥すると、０．４４ｇ（８８％）の中間体９を取得した。
【０１５８】
〈実施例Ａ５〉
ａ）中間体１０の製造
【０１５９】
【化１８】
2009523760.tif 000020
【０１６０】
２−［４−（アミノメチル）−１−ピペリジニル］−５−ピリミジンカルボン酸エチルエステル（０．００５３モル）、中間体９（０．００８モル）及びＭｇＳＯ４（１．５ｇ）の混合物（１００ｍｌのＣＨ３ＯＨ中）をＮ２流下で１晩撹拌還流し、次に５℃に冷却した。ＮａＢＨ４（０．００９１モル）を添加した。混合物を室温で４時間撹拌し、Ｈ２Ｏ中に注入し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、溶媒を蒸発させた。残渣（３．４ｇ）をシリカゲル上カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ／ＮＨ４ＯＨ  ９７／３／０．５；１５〜４０μｍ）により精製した。純粋な画分を回収し、溶媒を蒸発させると、１．３ｇ（５４％）の中間体１０を取得した。
ｂ）中間体１１の製造
【０１６１】
【化１９】
2009523760.tif 000021
【０１６２】
中間体１０（０．００２９モル）及び水酸化ナトリウム（０．００５７モル）の混合物（５０ｍｌのエタノール中）を６０℃で１晩撹拌し、次に室温に冷却し、溶媒を蒸発させると０．８ｇ（５４％）の中間体１１をナトリウム塩（．Ｎａ）として取得した。
【０１６３】
〈実施例Ａ６〉
ａ）中間体１２の製造
【０１６４】
【化２０】
2009523760.tif 000022
【０１６５】
４−ピペリジンメタノール（０．０３３モル）の溶液（８０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２中）を２−クロロ−５−ピリミジンカルボン酸メチルエステル（０．０６６モル）及びＤＩＰＥＡ（０．０８３モル）の溶液（１００ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２中）に室温、Ｎ２流下で添加した。混合物を室温で３時間３０分間撹拌し、氷水上に注入し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、溶媒を蒸発させた。残渣をペンタン中に取った。沈殿物を濾取し、乾燥すると７．８８ｇ（９５％）の中間体１２を取得した。ｂ）中間体１３の製造
【０１６６】
【化２１】
2009523760.tif 000023
【０１６７】
ＤＭＳＯ（０．０５８モル）をエタンジオイル・ジクロリド（０．０２７８モル）の溶液（５０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２中）に−７８℃、Ｎ２流下で滴下した。混合物を１５分間撹拌した。中間体１２（０．０２３モル）の溶液（２００ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２中）を滴下した。混合物を−７８℃で１時間３０分間撹拌した。Ｅｔ３Ｎ（０．１１８モル）を滴下した。混合物を−７８℃で１時間撹拌し、Ｈ２Ｏ中に注入し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、溶媒を蒸発させた。残渣をジエチルエーテルから結晶化した。沈殿物を濾取し、乾燥すると、３．０６ｇ（５４％）の中間体１３を取得した。
ｃ）中間体１４の製造
【０１６８】
【化２２】
2009523760.tif 000024
【０１６９】
ＮａＢＨ３ＣＮ（０．０１９モル）を中間体１３（０．０１２５モル）及び１Ｈ−インドール−３−エタンアミン（０．０１２５モル）の溶液（２５０ｍｌのＣＨ３ＯＨ中）に５℃、Ｎ２流下で滴下した。酢酸（１ｍｌ）を添加した。混合物を室温で４８時間撹拌した。Ｋ２ＣＯ３１０％を添加した。混合物をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、溶媒を蒸発させた。残渣（５ｇ）をシリカゲル上カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ／ＮＨ４ＯＨ  ９６／４／０．３；１５〜４０μｍ）により精製した。純粋な画分を回収し、溶媒を蒸発させると、３ｇ（６０％）の中間体１４を取得した。
ｄ）中間体１５の製造
【０１７０】
【化２３】
2009523760.tif 000025
【０１７１】
中間体１４（０．００６４モル）及び水酸化ナトリウム（０．０２５モル）の混合物（８０ｍｌのエタノール中）を８０℃で１晩撹拌し、次に室温に冷却し、蒸発させた。残渣をジエチルエーテル中に取った。沈殿物を濾取し、乾燥すると、２ｇ（７８％）の中間体１５をナトリウム塩（．Ｎａ）として取得した。
【０１７２】
〈実施例Ａ７〉
ａ）中間体１６の製造
【０１７３】
【化２４】
2009523760.tif 000026
【０１７４】
２−［４−（アミノメチル）−１−ピペリジニル］−５−ピリミジンカルボン酸エチルエステル（０．００４９モル）、１Ｈ−インドール−３−エタノール・メタンスルホネート（０．００５４モル）及びＫ２ＣＯ３（０．０１モル）の混合物（２０ｍｌのアセトニトリル中）を１晩撹拌還流し、次に冷却し、氷水上に注入し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、溶媒を蒸発させた。残渣（２．２ｇ）をシリカゲル上カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ／ＮＨ４ＯＨ  ９６／４／０．２；１５〜４０μｍ）により精製した。純粋な画分を回収し、溶媒を蒸発させると、０．４４２ｇ（２２％）の中間体１６を取得した。
ｂ）中間体１７の製造
【０１７５】
【化２５】
2009523760.tif 000027
【０１７６】
メタンスルホニルクロリド（０．００１８モル）を中間体１６（０．００１２モル）及びＥｔ３Ｎ（０．００３６モル）の溶液（１５ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２中）に室温で滴下した。混合物を室温で１晩撹拌し、Ｈ２Ｏ中に注入し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、溶媒を蒸発させると、０．６ｇ（１００％）の中間体１７を取得した。
ｃ）中間体１８の製造
【０１７７】
【化２６】
2009523760.tif 000028
【０１７８】
中間体１７（０．０１２モル）及び水酸化ナトリウム（０．０３６モル）の混合物（４０ｍｌのエタノール中）を６０℃で５時間撹拌し、次に蒸発乾燥させた。残渣をジエチルエーテル中に取った。混合物を蒸発乾燥させると０．６ｇ（１００％）の中間体１８をナトリウム塩（．Ｎａ）として取得した。
【０１７９】
〈実施例Ａ８〉
ａ）中間体１９の製造
【０１８０】
【化２７】
2009523760.tif 000029
【０１８１】
プロパノイルクロリド（０．００１８モル）を中間体１６（０．００１２モル）の溶液（０．５ｍｌのＥｔ３Ｎ及び１５ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２中）に０℃で添加した。混合物を室温で１晩撹拌し、氷水中に注入し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を水で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、溶媒を蒸発させると、０．５６ｇ（１００％）の中間体１９を取得した。この生成物を次の反応工程に直接使用した。
ｂ）中間体２０の製造
【０１８２】
【化２８】
2009523760.tif 000030
【０１８３】
中間体１９（０．００１２モル）及び水酸化ナトリウム（０．１５モル）の混合物（５０ｍｌのエタノール中）を６０℃で６時間撹拌し、次に室温に冷却し、蒸発させた。残渣をジエチルエーテル中に取った。混合物を蒸発乾燥させると、０．５５ｇ（１００％）の中間体２０をナトリウム塩（．Ｎａ）として取得した。この生成物を次の反応工程に直接使用した。
【０１８４】
Ｂ．化合物の製造
〈実施例Ｂ１〉化合物１の製造
【０１８５】
【化２９】
2009523760.tif 000031
【０１８６】
Ｅｔ３Ｎ（０．００３７モル）を中間体６（０．０００８モル）、１，２−ベンゼンジアミン一塩酸（０．００１９モル）及びＰｙＢＯＰ（０．００１７モル）の溶液（４０ｍ
ｌのＴＨＦ及び４０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２中）に室温で添加した。混合物を室温で２日間撹拌し、氷水上に注入し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、溶媒を蒸発させた。残渣（１．２ｇ）をシリカゲル上カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ／ＮＨ４ＯＨ  ９４／６／０．５；１５〜４０μｍ）により精製した。純粋な画分を回収し、溶媒を蒸発させた。得られた残渣（０．０７８ｇ）をシリカゲル上カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ／ＮＨ４ＯＨ  ９８／２／０．２〜９０／１０／１；３．５μｍ）により精製した。純粋な画分を回収し、溶媒を蒸発させると、０．０４９ｇ（１１％）（Ｍ．Ｐ．：８０℃）の化合物１を取得した。
【０１８７】
〈実施例Ｂ２〉化合物２の製造
【０１８８】
【化３０】
2009523760.tif 000032
【０１８９】
Ｅｔ３Ｎ（０．０１０８モル）を中間体８（０．００２５モル）及び１，２−ベンゼンジアミン一塩酸（０．００５８モル）及びＰｙＢＯＰ（０．００５モル）の溶液（５０ｍｌのＤＭＦ／タミ中）に室温で添加した。混合物を室温で４８時間撹拌し、Ｈ２Ｏ中に注入し、濾過した。濾液をＥｔＯＡｃで抽出し、次にＨ２Ｏで３回洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、溶媒を蒸発させた。残渣（１．８ｇ）をシリカゲル上カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ／ＮＨ４ＯＨ  ９５／５／０．５；１５〜４０μｍ）により精製した。純粋な画分を回収し、溶媒を蒸発させた。得られた残渣（０．２６２ｇ、２２％）をアセトニトリル／ＤＩＰＥから結晶化した。沈殿物を濾取し、乾燥すると、０．１０６ｇ（Ｍ．Ｐ．：１４２℃）の化合物２を取得した。
【０１９０】
〈実施例Ｂ３〉化合物３の製造
【０１９１】
【化３１】
2009523760.tif 000033
【０１９２】
Ｅｔ３Ｎ（０．００７２モル）を中間体１１（０．００１８モル）、１，２−ベンゼンジアミン一塩酸（０．００４５モル）及びＰｙＢＯＰ（０．００３６モル）の溶液（２０ｍｌのＴＨＦ及び２０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２中）に添加した。混合物を室温で７２時間撹拌し、Ｈ２Ｏ中に注入し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層をＨ２Ｏで洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、溶媒を蒸発させた。残渣（３ｇ）をシリカゲル上カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ／ＮＨ４ＯＨ  ９３／７／０．５；１５〜４０μｍ）により精製した。純粋な画分を回収し、溶媒を蒸発させると、０．１３ｇ（１４％）（Ｍ．Ｐ．：８５℃）の化合物３を取得した。
【０１９３】
〈実施例Ｂ４〉化合物４の製造
【０１９４】
【化３２】
2009523760.tif 000034
【０１９５】
Ｅｔ３Ｎ（０．０１モル）を中間体１５（０．００２５モル）、１，２−ベンゼンジアミン一塩酸（０．００５７モル）及びＰｙＢＯＰ（０．００５モル）の溶液（１５ｍｌのＴＨＦ及び１５ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２中）に室温で添加した。混合物を室温で４８時間撹拌し、Ｈ２Ｏ中に注入し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、溶媒を蒸発させた。残渣（０．１３ｇ）をシリカゲル上カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ／ＮＨ４ＯＨ  ９２／８／０．５；１５〜４０μｍ）により精製した。純粋な画分を回収し、溶媒を蒸発させた。この画分（０．１３ｇ）をシリカゲル上逆相クロマトグラフィー（溶離剤：ＣＨ３ＯＨ／ＮＨ４ＨＣＯ３  ６０／４０；５μｍ）により精製した。純粋な画分を回収し、溶媒を蒸発させると、０．０７ｇ（Ｍ．Ｐ．：９５℃）の化合物４を取得した。
【０１９６】
〈実施例Ｂ５〉化合物５の製造
【０１９７】
【化３３】
2009523760.tif 000035
【０１９８】
Ｅｔ３Ｎ（０．６ｍｌ）を中間体１８（０．００１モル）、１，２−ベンゼンジアミン一塩酸（０．００２４モル）及びＰｙＢＯＰ（０．００２モル）の溶液（５ｍｌのＴＨＦ及び５ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２中）に添加した。混合物を室温で７２時間撹拌し、Ｈ２Ｏ中に注入し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、溶媒を蒸発させた。残渣（１．５ｇ）をシリカゲル上カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ／ＮＨ４ＯＨ  ９８／２／０．２；１５〜４０μｍ）により精製した。純粋な画分を回収し、溶媒を蒸発させると、０．０２７ｇ（５％）（Ｍ．Ｐ．：１０５℃）の化合物５を取得した。
【０１９９】
〈実施例Ｂ６〉化合物６の製造
【０２００】
【化３４】
2009523760.tif 000036
【０２０１】
Ｅｔ３Ｎ（０．００４８モル）を中間体２０（０．００１２モル）、１，２−ベンゼンジアミン一塩酸（０．００２７モル）及びＰｙＢＯＰ（０．００２４モル）の溶液（５ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２及び５ｍｌのＴＨＦ中）に添加した。混合物を室温で４８時間撹拌し、水中に注入し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、溶媒を蒸発させた。残渣（１．５ｇ）をシリカゲル上カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＥｔＯＡｃ／ＣＨ３ＯＨ／ＮＨ４ＯＨ  ９３／７／０．５；１５〜４０μｍ）により精製した。純粋な画分を回収し、溶媒を蒸発させると、０．１６ｇ（２５％）の化合物６を取得した。
【０２０２】
表Ｆ−１は前記の実施例の１つに従って製造された化合物を記載する。
【０２０３】
【表１】
2009523760.tif 000037
【０２０４】
Ｃ．薬理学的実施例
ヒストンデアセチラーゼの阻害のインビトロアッセイ（実施例Ｃ．１参照）は、式（Ｉ）の化合物により得られるＨＤＡＣ酵素活性の阻害を測定する。
【０２０５】
式（Ｉ）の化合物の細胞活性は、細胞毒性又は生存に対し、比色アッセイを使用して、Ａ２７８０腫瘍細胞について測定した（Ｍｏｓｍａｎｎ  Ｔｉｍ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６５：５５−６３，１９８３）（実施例Ｃ．２参照）。
【０２０６】
化合物の溶解度は溶液中に滞留する化合物の能力を測定する。第１の方法において、希釈時に水溶液中に滞留する化合物の能力を測定する（実施例Ｃ．３．ａ参照）。ＤＭＳＯ
−ストック溶液を異なる連続工程で単一のバッファー水性溶媒で希釈する。次にこの方法で混合物をＢＤ  Ｇｅｎｔｅｓｔ  Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ中で沈殿物の存在についてスキャンする。第２の方法において、異なるｐＨにおける化合物の溶解度を化学発光窒素検出計の使用により測定することができる（実施例Ｃ．３．ｂ参照）。
【０２０７】
薬剤の透過性は１つの媒質からもう１つの媒質中へ又はそれを通って移動するその能力を表す。特に、腸膜を通って血流中へそして／又は血流から標的中へ移動するその能力を表す。透過性（実施例Ｃ．４参照）はフィルター固定された人工膜のリン脂質の２層の形成により測定することができる。フィルター固定人工膜アッセイにおいては、システムがバッファー水溶液と接触する時に、多層状の２層がフィルターチャンネルの内側に形成する条件下で、各複合体のウェルが、ジオレオイルホスファチジル−コリンの２％（ｗｔ／ｖ）のドデカン溶液でコートされた、１２５μｍの微細フィルターディスク（０．４５μｍの孔）により分離された、底部に供与体溶液そして上部に受容体溶液を含む２室に分けられるように、９６−ウェルの微量滴定プレート及び９６−ウェルフィルタープレートにより「サンドイッチ」が形成される。この人工膜を通る化合物の透過性はｃｍ／秒で測定される。その目的は２種の異なるｐＨ、４．０と７．４における平行な人工膜を通る薬剤の透過性を求めることである。化合物の検定は２５０と５００ｎｍ間の最適な波長でＵＶ−分光分析により実施される。
【０２０８】
薬剤の代謝は、脂溶性の生体異物又は生物体内生化合物が１種又は複数の極性の、水溶性の、そして排泄可能な代謝物に酵素により転化されることを意味する。薬剤代謝の主要器官は肝臓である。代謝生成物はしばしば、親薬剤より活性が低いか又は不活性である。しかし、いくつかの代謝物は高められた活性又は毒性効果を有することがある。従って薬剤代謝は「解毒」及び「中毒」双方の過程を包含する可能性がある。薬剤及び化学薬品を処理する生物の能力を決定する主要な酵素系の１つは、ＮＡＤＰＨ依存性酵素であるチトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼにより代表される。化合物の代謝安定性は細胞以下のヒト組織の使用によりインビトロで決定することができる（実施例Ｃ．５．ａ．参照）。ここで化合物の代謝安定性はミクロソームとのこれらの化合物の１５分間のインキュベート後に代謝された薬剤の％として表される。化合物の定量はＬＣ−ＭＳ分析により決定された。
【０２０９】
ＤＮＡ損傷剤及びヒストンデアセチラーゼインヒビターを包含する広範な抗腫瘍剤がｐ２１タンパク質を活性化することが示された。ＤＮＡ損傷剤は腫瘍サプレッサーｐ５３によりｐ２１遺伝子を活性化し、他方ヒストンデアセチラーゼインヒビターは転写因子Ｓｐ１によりｐ２１遺伝子を転写により活性化する。従って、ＤＮＡ損傷剤はｐ５３反応性要素によりｐ２１プロモーターを活性化し、他方、ヒストンデアセチラーゼインヒビターはｓｐ１部位（ＴＡＴＡボックスに対して−６０ｂｐ〜＋４０ｂｐ領域に位置する）によりｐ２１プロモーターを活性化し、両者がｐ２１タンパク質の増加した発現をもたらす。細胞中のｐ２１プロモーターがｐ５３反応性要素を含まないｐ２１の１３００ｂｐプロモーターフラグメントよりなる時は、それに従ってＤＮＡ損傷剤に非反応性である。
【０２１０】
ｐ２１を誘導する化合物の能力は、細胞レベルのＨＤＡＣ阻害の結果としてのｐ２１を誘導する化合物の能力を試験することにより評価することができる。細胞はｐ５３反応性要素を含有しないｐ２１の１３００ｂｐプロモーターフラグメントを含有する発現ベクトルで安定にトランスフェクションすることができ、そこで対照レベルに比較して、リポーター遺伝子発現の増加が化合物をｐ２１誘導能をもつものと特定する。リポーター遺伝子は蛍光タンパク質であり、リポーター遺伝子の発現は発光される蛍光の量として測定される（実施例Ｃ．６．参照）。
【０２１１】
特異的ＨＤＡＣインヒビターは豊富なＣＹＰ  Ｐ４５０タンパク質のような他の酵素を
阻害しないにちがいない。ＣＹＰ  Ｐ４５０（大腸菌発現）タンパク質３Ａ４、２Ｄ６及び２Ｃ９はそれらの特異的基質を蛍光分子に転化させる。ＣＹＰ３Ａ４タンパク質は７−ベンジルオキシ−トリフルオロメチルクマリン（ＢＦＣ）を７−ヒドロキシ−トリフルオロメチルクマリンに転化させる。ＣＹＰ２Ｄ６タンパク質は３−［２−（Ｎ，Ｎ−ジエチル−Ｎ−メチルアミノ）エチル］−７−メトキシ−４−メチルクマリン（ＡＭＭＣ）を３−［２−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）エチル］−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン塩酸に転化し、そしてＣＹＰ２Ｃ９タンパク質は７−メトキシ−４−トリフルオロメチルクマリン（ＭＦＣ）を７−ヒドロキシ−トリフルオロメチルクマリンに転化させる。酵素反応を阻害する化合物は蛍光信号の減少をもたらすであろう。
【０２１２】
〈実施例Ｃ．１．〉蛍光標識基質によるヒストンデアセチラーゼの阻害に対するインビトロアッセイ
ＢｉｏｍｏｌのＨＤＡＣ蛍光活性アッセイ／薬剤発見キット（カタログ番号：ＡＫ−５００−０００１）を使用した。ＨＤＡＣ蛍光活性アッセイはＦｌｕｏｒ  ｄｅ  Ｌｙｓ（Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ  Ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅＡｃｅｔｙｌａｓｅ  Ｌｙｓｙｌ（蛍光発生ヒストンデアセチラーゼリシル））基質及び発色剤の組み合わせ物に基づく。Ｆｌｕｏｒ  ｄｅ  Ｌｙｓ基質はアセチル化リシン側鎖を含んでなる。その基質の脱アセチル化は、第２工程において、Ｆｌｕｏｒ  ｄｅ  Ｌｙｓ発色剤による処理が発蛍光団を生成するように基質を感受性にさせる。
【０２１３】
ＨｅＬａ核抽出物（供給会社：Ｂｉｏｍｏｌ）を７５μＭの基質とともに６０μｇ／ｍｌでインキュベートした。Ｆｌｕｏｒ  ｄｅ  Ｌｙｓ基質を２５ｍＭのトリス、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ及び１ｍＭのＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏを含有するバッファー（ｐＨ７．４）中に添加した。３０分後、１容量の発色剤を添加した。発蛍光団を３５５ｎｍ光線で励起し、発光（４５０ｎｍ）を蛍光プレート読み取り装置上で検定した。
【０２１４】
各実験につき、対照（ＨｅＬａ核抽出物及びバッファーを含有）、ブランクインキュベート（バッファーを含有するが、ＨｅＬａ核抽出物を含まない）及びサンプル（ＤＭＳＯに溶解され、更にバッファー中に希釈された化合物及びＨｅＬａ核抽出物を含有）を平行して実施した。第１に、化合物を１０−５Ｍの濃度で試験した。化合物が１０−５Ｍで活性を示した時に、そこで化合物が１０−５Ｍと１０−９Ｍの間の濃度で試験される濃度−反応曲線を作成した。すべてのサンプルを４回試験した。各試験において、ブランク値を対照及びサンプル値の両方から差し引いた。対照サンプルは１００％の基質の脱アセチル化を表した。各サンプルに対する蛍光は対照の平均値の百分率として表した。適当なＩＣ５０−値（代謝物の量を対照の５０％に減少させるために要する薬剤濃度）を漸増データに対するｐｒｏｂｉｔ分析を使用して計算した。ここで試験化合物の効果はｐＩＣ５０（ＩＣ５０−値のマイナス対数値）として表される（表Ｆ−２参照）。
【０２１５】
〈実施例Ｃ．２．〉Ａ２７８０細胞に対する抗増殖作用の測定
試験されるすべての化合物をＤＭＳＯに溶解し、更に培養培地中に希釈した。細胞増殖アッセイにおける最終ＤＭＳＯ濃度は０．１％（ｖ／ｖ）を決して超えなかった。対照は化合物を含まずにＡ２７８０細胞及びＤＭＳＯを含有し、そしてブランクはＤＭＳＯを含有したが、細胞を含まなかった。ＭＴＴをＰＢＳ中５ｍｇ／ｍｌに溶解した。ＮａＯＨ（１Ｎ）でｐＨ１０．５にバッファーされた、０．１Ｍのグリシン及び０．１ＭのＮａＣｌよりなるグリシンバッファーを製造した（すべての試薬はＭｅｒｃｋから購入した）。
【０２１６】
ヒトＡ２７８０卵巣ガン細胞（Ｔ．Ｃ．Ｈａｍｉｌｔｏｎ博士［Ｆｏｘ  Ｃｈａｓｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡ］からの提供品）を、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン及び１０％のウシ胎仔血清を添加されたＲＰＭＩ  １６４０培地中で培養した。細胞を３７℃の湿潤化５％ＣＯ２雰囲気
内で単層培養物として定常的に維持した。細胞は１：４０の分離比率のトリプシン／ＥＤＴＡ溶液を使用して、毎週１回処理した（ｐａｓｓａｇｅｄ）。すべての培地及び補助物はＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。細胞はＧｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  マイコプラズマ組織培養キット（供給会社：ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）を使用して決定されるようにマイコプラズマ汚染はなかった。
【０２１７】
細胞をＮＵＮＣＴＭ９６−ウェル培養プレート（供給会社：Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に播種し、１晩プラスチックに付着させた。プレート付着に使用された密度は，２００μｌの培地総量でウェル当たり１５００の細胞であった。プレートに対する細胞付着後に、培地を変え、薬剤及び／又は溶媒を２００μｌの最終容量まで添加した。４日間のインキュベート後、培地を２００μｌの新鮮な培地と交換し、細胞密度及び生存性をＭＴＴ−基質のアッセイを使用して測定した。各ウェルに対し、２５μｌのＭＴＴ溶液を添加し、細胞を更に３７℃で２時間インキュベートした。次いで培地を注意して吸引し、青色のＭＴＴ−フォルマザン生成物を、２５μｌのグリシンバッファー、次いで１００μｌのＤＭＳＯの添加により可溶化させた。微量試験プレートを微量プレートシェーカー上で１０分間震盪し、５４０ｎｍにおける吸収をＥｍａｘ  ９６−ウェル分光比色計（供給会社：Ｓｏｐａｃｈｅｍ）を使用して測定した。１回の実験中、各実験条件に対する結果は３回の重複ウェルの平均である。最初のスクリーニングの目的のためには、化合物を１０−６Ｍの単一の固定濃度で試験した。有効化合物に対しては実験を反復して、完全な濃度−反応曲線を確立した。各実験に対し、対照（薬剤を含まない）及びブランクインキュベート（細胞も薬剤も含まない）を平行して実施した。ブランク値をすべての対照及びサンプル値から差し引いた。各サンプルに対し、細胞増殖に対する平均値（吸収単位における）は対照の細胞増殖の平均値の百分率として表された。適当な場合には、ＩＣ５０−値（対照の５０％まで細胞増殖を減少させるために要する薬剤の濃度）を漸増データに対するｐｒｏｂｉｔ分析を使用して計算した（Ｆｉｎｎｅｙ，Ｄ．Ｊ．，Ｐｒｏｂｉｔ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，２ｎｄ  Ｅｄ．Ｃｈａｐｔｅｒ  １０，Ｇｒａｄｅｄ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  １９６２）。ここで試験化合物の効果はｐＩＣ５０（ＩＣ５０−値のマイナス対数値）として表される（表Ｆ−２参照）。
【０２１８】
〈実施例Ｃ．３．〉溶解度
Ｃ．３．ａ．水性媒質中の動力学的溶解度
５０００−９．８μＭ（１／２希釈物）からのＤＭＳＯ−ストック溶液を９６ウェルストック溶液プレート中でＤＭＳＯ中に製造する（２００μｌ／ウェル）。各希釈後、サンプルを混合する。次にこれらのＤＭＳＯ溶液のアリコート（２μｌ）を、２００μｌ／ウェルの水性バッファーを含有する２個の他の９６ウェルバッファープレートに移す。各バッファープレートは水性バッファー（ｐＨ７．４）又は水性バッファー（ｐＨ４．０）のいずれかを含有する。最後の希釈後、バッファープレートを混合し、サンプルを１／２時間室温で安定化する。偶発的誤差を排除するために各化合物に対して希釈を二重に実施する。次に混合物を沈殿の発生に対してＢＤ  Ｇｅｎｔｅｓｔ  Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  Ｓｃａｎｎｅｒにおいてスキャンする。混合物中の沈殿物の不在／存在に基づき、動力学的溶解度を外挿により計算する。３クラスへの評価を実施する。
【０２１９】
高い溶解度をもつ化合物は３の評価を与えられ、そして５０μＭ以上の溶解度を有する。中程度の溶解度をもつ化合物は２の評価を与えられ、１０μＭを超え、５０μＭ未満の溶解度を有する。低い溶解度をもつ化合物は１の評価を与えられ、これらの化合物に対して、溶解度は１０μＭ以下である。
【０２２０】
３種の化合物が試験され、アッセイにおける両方のｐＨにおいて１の評価を得た。
【０２２１】
Ｃ．３．ｂ．ｐＨ２．３における溶解度
ｐＨ２．３における化合物の溶解度はまた、化学発光窒素検出計の使用により測定することができる（表Ｆ−２を参照）。
【０２２２】
〈実施例Ｃ．４〉平行な人口膜の透過性の分析
ストックサンプル（１００％ＤＭＳＯ中５ｍＭのストック溶液の１０μｌのアリコート）をｐＨ４又はｐＨ７．４の水性バッファー系の２ｍｌ含有ディープウェルプレート又はプレミックスプレート中に希釈した（ＰＳＲ４  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（ｐＩＯＮ））。
【０２２３】
サンプルを対照プレートに添加する前に、１５０μｌのバッファーをウェルに添加し、ブランクのＵＶ−測定を実施した。その後、バッファーを廃棄し、そのプレートを対照プレートとして使用した。すべての測定をＵＶ−抵抗性プレート（供給会社：Ｃｏｓｔａｒ又はＧｒｅｉｎｅｒ）において実施した。
【０２２４】
対照プレートのブランク測定後、１５０μｌの希釈サンプルを対照プレートに添加し、２００μｌの希釈サンプルを供与体プレート１に添加した。受容体フィルタープレート（供給会社：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，タイプ：ＭＡＩＰ  Ｎ４５）を４μｌの人口膜形成溶液（０．１％の２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノールを含有するドデカン中１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセル−３−ホスホコリン）でコートしそして供与体プレート１の上部に配置して、「サンドイッチ」を形成した。バッファー（２００μｌ）を上部の受容体ウェル中に分配した。サンドイッチを蓋でカバーし、暗所、室温で１８時間保存した。
【０２２５】
受容体プレート２のブランク測定を、ウェルに１５０μｌのバッファーを添加し、次にＵＶ−測定により実施した。受容体プレート２のブランク測定後、バッファーを廃棄し、１５０μｌの受容体溶液を受容体フィルタープレート１から受容体プレート２に移した。次に受容体フィルタープレート１をサンドイッチから外した。供与体プレート２のブランク測定後（前記参照）、１５０μｌの供与体溶液を供与体プレート１から供与体プレート２に移した。供与体プレート２、受容体プレート２及び対照プレートウェルのＵＶスペクトルをスキャンした（ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ  １９０）。すべてのスペクトルをＰＳＲ４ｐ  Ｃｏｍｍａｎｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅにより処理して、透過性を計算した。すべての化合物を三重測定した。カルバマゼピン、グリセオフルビン、アシクログアニシン、アテノロール、フロセミド及びクロロチアジドを各実験の標準物として使用した。化合物を低い透過性（平均効果＜０．５×１０−６ｃｍ／秒；評価１）、中程度の透過性（１×１０−６ｃｍ／秒＞平均効果≧０．５×１０−６ｃｍ／秒；評価２）又は高い透過性（≧１×１０−６ｃｍ／秒；評価３）をもつ３分類に評価した。
【０２２６】
〈実施例Ｃ．５〉代謝の安定性
細胞以下の組織製造物をＧｏｒｒｏｄ等（Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ  ５：４５３−４６２．１９７５）に従って、組織の機械的ホモジネート化後の遠心分離により製造した。肝組織を氷冷した０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）バッファー中ですすいで、過剰な血液を洗浄した。次に組織をブロット乾燥し、秤量し、外科用はさみを使用して粗く刻んだ。組織片を、Ｔｅｆｒｏｎ乳棒の付いたＰｏｔｔｅｒ−Ｓ（Ｂｒａｕｎ，Ｉｔａｌｙ）又はＳｏｒｖａｌｌ  Ｏｍｎｉ−Ｍｉｘホモジナイザーのいずれかを使用して、７×１０秒間、３容量の氷冷０．１Ｍのリン酸バッファー（ｐＨ７．４）中にホモジナイズした。双方の場合に、容器はホモジナイズ工程中氷中／上に維持された。
【０２２７】
組織ホモジネートをＳｏｒｖａｌｌ遠心分離装置又はＢｅｃｋｍａｎ  Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅを使用して４℃で２０分間９０００×ｇで遠心分離した。生成された上
澄みを−８０℃で保存し、「Ｓ９」と記号を付けた。
【０２２８】
Ｓ９画分を更に、Ｂｅｃｋｍａｎ超遠心分離装置を使用して６０分間（４℃）１００．０００×ｇで遠心分離することができる。生成された上澄みを注意して吸引し、アリコートし、「シトソール」と記号を付けた。ペレットを０．１Ｍのリン酸バッファー（ｐＨ７．４）中に再懸濁させて、０．５ｇの最初の組織重量に対して１ｍｌの最終容量にし、「ミクロソーム」と記号を付けた。
【０２２９】
すべての細胞以下の画分をアリコートし、液体窒素中で瞬間凍結し、使用まで−８０℃で保存した。
【０２３０】
試験されるサンプルとして、インキュベート混合物はＰＢＳ（０．１Ｍ）、化合物（５μＭ）、ミクロソーム（１ｍｇ／ｍｌ）及びＮＡＤＰＨ−生成系（０．８ｍＭのグルコース−６−リン酸、０．８ｍＭの塩化マグネシウム及び０．８単位のグルコース−６−リン酸脱水素酵素）を含有した。対照サンプルは同様な物質を含有したが、ミクロソームは熱不活性化（９５℃で１０分間）ミクロソームで置き換えられた。対照サンプル中の化合物の回収は常に１００％であった。
【０２３１】
混合物を３７℃で５分間プレインキュベートした。反応は０．８ｍＭのＮＡＤＰの添加により時点ゼロ（ｔ＝０）で開始し、サンプルを１５分間（ｔ＝１５）インキュベートした。反応を２容量のＤＭＳＯの添加により終結した。次にサンプルを９００×ｇで１０分間遠心分離し、上澄みを分析まで２４時間を超えないように室温で保存した。すべてのインキュベートを二重に実施した。上澄みの分析をＬＣ−ＭＳ分析により実施した。サンプルの溶離をＸｔｅｒｒａ  ＭＳ  Ｃ１８（５０×４．６ｍｍ、５μｍ、Ｗａｔｅｒｓ，ＵＳ）上で実施した。Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２７９０（供給会社：Ｗａｔｅｒｓ，ＵＳ）ＨＰＬＣシステムを使用した。溶離は２．４ｍｌ／分の流速で、バッファーＡ（Ｈ２Ｏ／アセトニトリル（９５／５）中２５ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ５．２））、アセトニトリルの溶媒Ｂ及びメタノールの溶媒Ｃにより実施された。使用した勾配は、有機相濃度を、５分間にわたり０％から５０％のＢ及び５０％のＣに、１分間にわたり１００％Ｂまで直線状に増加し、有機相濃度は更に１．５分間一定に維持された。サンプルの総注入容量は２５μｌであった。
【０２３２】
検出計として、ＥＳＩ源を備えたＱｕａｔｔｒｏ（供給会社：Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）トリプル四極子質量分析装置を使用した。エネルギー源及び脱溶媒和温度はそれぞれ１２０及び３５０℃に設定され、ネブライザー及び乾燥ガスとして窒素を使用した。データをポジティブスキャンモード（単一イオン反応）で獲得した。コーン電圧を１０Ｖに設定し、滞留時間は１秒であった。
【０２３３】
代謝安定性は活性ミクロソーム（Ｅ（ａｃｔ））の存在下で１５分間のインキュベート後の化合物の代謝％として表した、
【０２３４】
【数１】
2009523760.tif 000038
【０２３５】
２０％未満の代謝率を有する化合物は著しく代謝的に安定であるものと定義され、３の評価を与えられた。２０〜７０％の間の代謝を有する化合物は中程度に安定であると定義され、２の評価を与えられ、そして７０％を超える代謝率を示す化合物は低い代謝安定と定義され、１の評価を与えられた。代謝安定性のスクリーニングが実施される時は３種の対
照化合物が常に包含された。べラパミルは低い代謝安定性（代謝％＝７３％）をもつ化合物として包含された。シサプリドは中程度の代謝安定性（代謝％＝４５％）をもつ化合物として包含され、そしてプロパノールは中程度から高い代謝安定性（２５％の代謝）をもつ化合物として包含された。これらの対照化合物は代謝安定性アッセイの有効性を証明するために使用された。２種の化合物が試験され、それぞれ３の評価及び２の評価を得た。
【０２３６】
〈実施例Ｃ．６〉ｐ２１誘導能
Ａ２７８０細胞（ＡＴＣＣ）を３７℃の、５％ＣＯ２を含む湿潤化インキュベーター内の、１０％ＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン及びゲンタマイシンを添加されたＲＰＭＩ  １６４０培地中で培養した。すべての細胞培養液はＧｉｂｃｏ−ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）により提供される。他の材料はＮｕｎｃにより提供される。
【０２３７】
ゲノムＤＮＡを、増殖しているＡ２７８０細胞から抽出し、ｐ２１プロモーターのネスト化されたＰＣＲ単離物のテンプレートとして使用した。第１の増殖を、テンプレートとしてゲノムＤＮＡを含むオリゴヌクレオチド対ＧＡＧＧＧＣＧＣＧＧＴＧＣＴＴＧＧ及びＴＧＣＣＧＣＣＧＣＴＣＴＣＴＣＡＣＣを使用して５５℃のアニーリング温度で２０周期につき実施した。ＴＡＴＡボックスに対して−４５５１〜＋８８フラグメントを含有する生成された４．５ｋｂのフラグメントを、８８℃のアニーリングにより２０周期につき、オリゴヌクレオチドＴＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＧＧＧＣＧＣＧＧＴＧＣＴＴＧＧ及びＡＴＡＣＴＣＧＡＧＴＧＣＣＧＣＣＧＣＴＣＴＣＴＣＡＣＣで再増殖させて４．５ｋｂフラグメントを生成し、次いで８８℃のアニーリングにより２０周期につき、オリゴヌクレオチド対ＴＣＧＧＧＴＡＣＣＧＧＴＡＧＡＴＧＧＧＡＧＣＧＧＡＴＡＧＡＣＡＣＡＴＣ及びＡＴＡＣＴＣＧＡＧＴＧＣＣＧＣＣＧＣＴＣＴＣＴＣＡＣＣにより再増殖させて、ＴＡＴＡボックスに対して−１３００〜＋８８フラグメントを含有する１．３ｋｂフラグメントをもたらした。オリゴヌクレオチド中に存在する制限部位ＸｈｏＩ及びＫｐｎＩ（下線配列）をサブクローン生成に使用した。
【０２３８】
ルシフェラーゼリポーターをＫｐｎＩ及びＸｂａＩ制限部位においてｐＧＬ３−塩基性から除去し、ＺｓＧｒｅｅｎリポーター（ｐＺｓＧｒｅｅｎ１−Ｎ１プラスミドから）により置き換えた。ＸｈｏＩ及びＫｐｎＩ部位のｐＧＬ３−塩基性−ＺｓＧｒｅｅｎ中へのヒトｐ２１プロモーター領域の前記の１．３ｋｂフラグメントの挿入により、ｐＧＬ３−塩基性−ＺｓＧｒｅｅｎ−１３００を構成した。すべての制限酵素はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｍ（ドイツ）により提供される。Ａ２７８０細胞を２×１０５細胞の密度で６−ウェルのプレートに添加し、２４時間インキュベートし、製造業者により説明されるようにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，ベルギー）を使用することにより、２μｇのｐＧＬ３−塩基性−ＺｓＧｒｅｅｎ−１３００及び０．２μｇのｐＳＶ２ｎｅｏベクトルによりトランスフェクションさせた。トランスフェクション細胞はＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）により１０日間選択し、単一の細胞懸濁物を増殖させた。３週後、単一のクローンを得た。
【０２３９】
Ａ２７８０の選択されたクローンを増量させ（ｅｘｐａｎｄｅｄ）、９６−ウェルのプレート中にウェル当たり１００００細胞で播種した。播種の２４時間後に、細胞を化合物（近位のｐ２１プロモーター領域中のｓｐ１部位に影響する）とともに更に２４時間処理した。次いで、細胞を３０’間、４％のＰＦＡで固定し、Ｈｏｅｃｈｓｔの染料により対比染色した。ＺｓＧｒｅｅｎ生産及び従って蛍光をもたらすｐ２１プロモーターの活性化をＡｓｃｅｎｔ  Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，ベルギー）によりモニターした。
【０２４０】
各実験につき、対照（薬剤を含まない）及びブランクインキュベート（細胞も薬剤も含
まない）を平行して実施した。ブランク値をすべての対照及びサンプル値から差し引いた。各サンプルにつき、ｐ２１誘導の値は、対照中に存在するｐ２１の値の百分率として表した。１３０％を超える誘導百分率を有意な誘導と定義した。
【０２４１】
〈実施例Ｃ．７〉Ｐ４５０阻害能
試験されたすべての化合物をＤＭＳＯ（５ｍＭ）に溶解し、アセトニトリル中に５  １０−４Ｍに更に希釈した。アッセイバッファー（０．１ＭのＮａＫリン酸バッファー、ｐＨ７．４）中に更に希釈し、最終溶媒濃度は２％を決して超えなかった。
【０２４２】
ＣＹＰ３Ａ４タンパク質のアッセイは、１００μｌの総アッセイ容量中に、ウェル当たり１５ｐモルのＰ４５０／１ｍｇのタンパク質（０．０１ＭのＮａＫリン酸バッファー＋１．１５％のＫＣｌ中）、ＮＡＤＰＨ生成系（アッセイバッファー中、３．３ｍＭのグルコース−６−リン酸、０．４Ｕ／ｍｌのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、１．３ｍＭのＮＡＤＰ及び３．３ｍＭのＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ）及び化合物を含んでなる。３７℃で５分間のプレインキュベート後に、アッセイバッファー中に１５０μＭの蛍光プローブ基質ＢＦＣの添加により酵素反応を開始した。室温で３０分間のインキュベート後に、２容量のアセトニトリルの添加後に反応は終結した。４０５ｎｍの励起波長及び５３５ｎｍの発光波長で蛍光の測定を実施した。本実験における対照化合物としてケトコナゾール（ＩＣ５０−値＝３×１０−８Ｍ）を包含した。
【０２４３】
ＣＹＰ２Ｄ６タンパク質のアッセイは、１００μｌの総アッセイ容量において、ウェル当たり、６ｐモルのＰ４５０／１ｍｇのタンパク質（０．０１ＭのＮａＫリン酸バッファー＋１．１５％のＫＣｌ中）、ＮＡＤＰＨ生成系（アッセイバッファー中、０．４１ｍＭのグルコース−６−リン酸、０．４Ｕ／ｍｌのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、０．００８２ｍＭのＮＡＤＰ及び０．４１ｍＭのＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ）及び化合物を含んでなる。３７℃で５分間のプレインキュベート後に、アッセイバッファー中に３μＭの蛍光プローブ基質ＡＭＭＣの添加により酵素反応を開始した。室温で４５分間のインキュベート後、２容量のアセトニトリルの添加後に反応を終結した。４０５ｎｍの励起波長及び４６０ｎｍの発光波長で蛍光の測定を実施した。本実験の対照化合物としてキニジン（ＩＣ５０−値＜５×１０−８Ｍ）を包含した。
【０２４４】
ＣＹＰ２Ｃ９タンパク質のアッセイは、１００μｌの総アッセイ容量において、ウェル当たり、１５ｐモルのＰ４５０／１ｍｇのタンパク質（０．０１ＭのＮａＫリン酸バッファー＋１．１５％のＫＣｌ中）、ＮＡＤＰＨ生成系（アッセイバッファー中、３．３ｍＭのグルコース−６−リン酸、０．４Ｕ／ｍｌのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、１．３ｍＭのＮＡＤＰ及び３．３ｍＭのＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ）及び化合物を含んでなる。３７℃で５分間のプレインキュベート後、アッセイバッファー中に２００μＭの蛍光プローブ基質ＭＦＣの添加により酵素反応を開始した。室温で３０分間のインキュベート後、２容量のアセトニトリルの添加後に反応は終結した。４０５ｎｍの励起波長及び５３５ｎｍの発光波長で蛍光の測定を実施した。本実験の対照化合物としてスルファフェナゾール（ＩＣ５０−値＝６．８×１０−７Ｍ）を包含した。
【０２４５】
最初のスクリーニングの目的のためには、化合物は１×１０−５Ｍの単一の固定濃度で試験された。有効な化合物に対しては、全体の濃度−反応曲線を確立するために実験を反復した。各実験につき、対照（薬剤を含まない）及びブランクインキュベート（酵素も薬剤も含まない）を平行して実施した。すべての化合物を４重実験で測定した。ブランク値をすべての対照及びサンプル値から引いた。各サンプルにつき、サンプルのＰ４５０活性の平均値（相対的蛍光単位で）を対照のＰ４５０活性の平均値の百分率として表した。抑制百分率は１００％引く、サンプルのＰ４５０活性の平均値として表した。適当な場合には、ＩＣ５０−値（対照の５０％までＰ４５０活性を減少させるために要する薬剤の濃度
）を計算した。
【０２４６】
表Ｆ−２は実施例Ｃ．１、Ｃ．２及びＣ．３．ｂ．に従って試験された化合物の結果を示す（ブランクは関連化合物に対して利用可能な値がないことを示す）。
【０２４７】
【表２】
2009523760.tif 000039
【０２４８】
Ｄ．組成物実施例：フィルムコート錠
錠剤コアの製造
１００ｇの式（Ｉ）の化合物、５７０ｇのラクトース及び２００のデンプンの混合物を十分混合し、その後、５ｇのナトリウムドデシルスルフェート及び１０ｇのポリビニル−ピロリドンの溶液（約２００ｍｌの水中）で湿潤化する。湿った粉末混合物をふるい、乾燥し、再度ふるう。次いで１００ｇの微細結晶セルロース及び１５ｇの水素化植物油を添加する。全体を十分に混合し、打錠すると、各１０ｍｇの式（Ｉ）の化合物を含んでなる１０．０００錠を与える。
【０２４９】
コーティング
１０ｇのメチルセルロースの溶液（７５ｍｌの変性エタノール中）に５ｇのエチルセルロースの溶液（１５０ｍｌのジクロロメタン中）を添加する。次いで７５ｍｌのジクロロメタン及び２．５ｍｌの１，２，３−プロパントリオールを添加する。１０ｇのポリエチレングリコールを融解し、７５ｍｌのジクロロメタン中に溶解する。後者の溶液を前者に添加し、次に２．５ｇのマグネシウムオクタデカノエート、５ｇのポリビニルピロリドン及び３０ｍｌの濃厚色素懸濁液を添加し、全体をホモジネート化する。コーティング装置内で、錠剤のコアをこのように得た混合物でコートする。
【国際調査報告】
2009523760.tif 000044
2009523760.tif 000045