(57)【要約】  ５−リポキシゲナーゼ、１５−リポキシゲナーゼ、ＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２、インターロイキン−１β、インターロイキン−６、α、ＨＬＥ３、及びｉＮＯＳを阻害するための方法及び組成物。炎症性疾患及び皮膚癌を含む疾病を、治療及び予防するための方法及び組成物。加工されたモリンダ・シトリフォリア（Ｍｏｒｉｎｄａ  ｃｉｔｒｉｆｏｌｉａ）成分を含んでなる組成物、そのあるものは葉抽出物、葉ジュース、及び／又は種子抽出物を包含する。
2009521476.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５−リポキシゲナーゼ及び１５−リポキシゲナーゼを阻害するための方法であって、
モリンダ・シトリフォリア（Ｍｏｒｉｎｄａ  ｃｉｔｒｉｆｏｌｉａ）の種子を収集すること；
種子を粉砕すること；
加工されたモリンダ・シトリフォリア種子を、アルコール系溶液に添加すること；
加工されたモリンダ・シトリフォリア種子から、溶液中に成分を抽出して画分を得ること；
抽出された成分を哺乳類に導入することにより、５−リポキシゲナーゼ及び１５−リポキシゲナーゼを阻害すること、
の各工程を含んでなる方法。
【請求項２】
粉砕された後の種子を有機溶媒と混合して種子を脱脂すること、及び、加工された種子をアルコール系溶液に添加する前に過剰の有機溶媒を除去すること、の各工程をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
有機溶媒がヘキサンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
種子が、最初に、有機溶媒中で、室温において約１時間脱脂される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
脱脂する工程及び過剰の溶媒を除去する工程が、アルコール系溶液により画分を抽出する前に１回繰返される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
アルコール系溶液が、約３０〜９６体積％の量で存在するエタノールである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
アルコール系溶液が、約８０％エタノールである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
炎症を低減する工程をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
アルコール系溶液が、メタノール、エタノール、及び酢酸エチルからなる群より選択される成分を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
リポキシゲナーゼの阻害が、胃粘膜の完全性を保持しながら達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
５−リポキシゲナーゼ及び１５−リポキシゲナーゼを阻害するための組成物であって、モリンダ・シトリフォリア種子からの抽出物、モリンダ・シトリフォリア種子、脱脂され粉砕されたモリンダ・シトリフォリア種子粉末からなる群より選択される、加工されたモリンダ・シトリフォリア成分を含んでなる組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組成物であって、
モリンダ・シトリフォリアの種子を収集すること；
種子を粉砕すること；
加工されたモリンダ・シトリフォリア種子を、アルコール系溶液に添加すること；
加工されたモリンダ・シトリフォリア種子から、溶液中に成分を抽出して画分を得ること；
の各工程を含んでなる方法により製造される組成物。
【請求項１３】
粉砕された後の種子を有機溶媒と混合して種子を脱脂すること、及び、加工された種子をアルコール系溶液に添加する前に過剰の有機溶媒を除去すること、の各工程をさらに含んでなる、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
組成物が、１以上のリポキシゲナーゼ酵素の阻害を含む、アラキドン酸からのロイコトリエンの合成を阻害する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
組成物が、アラキドン酸の、その中間体成分への酸素化を阻害する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１６】
加工されたモリンダ・シトリフォリア製品中の活性成分を単離し、及び前記活性成分を使用してリポキシゲナーゼを阻害するための方法であって、
種子をモリンダ・シトリフォリア植物から取得すること；
種子を有機溶媒と混合すること；
過剰の有機溶媒を除去すること；
脱脂された種子を、のアルコール系溶液と混合すること；
アルコール可溶性画分を収集すること；
アルコール可溶性画分から残留アルコールを除去してアルコール可溶性画分活性成分を得ること；
活性成分を、栄養補助薬製剤中に混合すること、
の各工程を含んでなる方法。
【請求項１７】
ＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２、インターロイキン−１β、インターロイキン−６、ＴＮＦ−α、ＨＬＥ、及びｉＮＯＳを阻害するための方法であって、
モリンダ・シトリフォリアの種子を収集すること；
種子を粉砕すること；
加工されたモリンダ・シトリフォリア種子を、アルコール系溶液に添加すること；
加工されたモリンダ・シトリフォリア種子から、溶液中に成分を抽出して画分を得ること；
抽出された成分を哺乳類に導入することにより、ＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２、インターロイキン−１β、インターロイキン−６、ＴＮＦ−α、ＨＬＥ、及びｉＮＯＳを阻害すること、
の各工程を含んでなる方法。
【請求項１８】
粉砕された後の種子を有機溶媒と混合して種子を脱脂すること、及び、加工された種子をアルコール系溶液に添加する前に過剰の有機溶媒を除去すること、の各工程をさらに含んでなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
有機溶媒がヘキサンである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
種子が、最初に、有機溶媒中で、室温において約１時間脱脂される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
脱脂する工程及び過剰の溶媒を除去する工程が、アルコール系溶液により画分を抽出する前に１回繰返される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
アルコール系溶液が、約３０〜９６体積％の量で存在するエタノールである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
アルコール系溶液が、約８０％エタノールである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
炎症を低減する工程をさらに含んでなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
アルコール系溶液が、メタノール、エタノール、及び酢酸エチルからなる群より選択される成分を含んでなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
ＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２、インターロイキン−１β、インターロイキン−６、ＴＮＦ−α、ＨＬＥ、及びｉＮＯＳの阻害が、胃粘膜の完全性を保持しながら達成される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２７】
ＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２、インターロイキン−１β、インターロイキン−６、ＴＮＦ−α、ＨＬＥ、及びｉＮＯＳを阻害するための組成物であって、モリンダ・シトリフォリア種子からの抽出物、モリンダ・シトリフォリア種子、脱脂され粉砕されたモリンダ・シトリフォリア種子粉末からなる群より選択される、加工されたモリンダ・シトリフォリア成分を含んでなる組成物。
【請求項２８】
請求項２６に記載の組成物であって、
モリンダ・シトリフォリアの種子を収集すること；
種子を粉砕すること；
加工されたモリンダ・シトリフォリア種子を、アルコール系溶液に添加すること；
工されたモリンダ・シトリフォリア種子から、溶液中に成分を抽出して画分を得ること；
の各工程を含んでなる方法により製造される組成物。
【請求項２９】
粉砕された後の種子を有機溶媒と混合して種子を脱脂すること、及び、加工された種子をアルコール系溶液に添加する前に過剰の有機溶媒を除去すること、の各工程をさらに含んでなる、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３０】
組成物が、１以上のリポキシゲナーゼ酵素の阻害を含む、アラキドン酸からのロイコトリエンの合成を阻害する、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３１】
組成物が、アラキドン酸の、その中間体成分への酸素化を阻害する、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３２】
加工されたモリンダ・シトリフォリア製品中の活性成分を単離し、及び前記活性成分を使用してＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２、インターロイキン−１β、インターロイキン−６、ＴＮＦ−α、ＨＬＥ、及びｉＮＯＳを阻害するための方法であって、
種子をモリンダ・シトリフォリア植物から取得すること；
種子を有機溶媒と混合すること；
過剰の有機溶媒を除去すること；
脱脂された種子を、アルコール系溶液と混合すること；
アルコール可溶性画分を収集すること；
アルコール可溶性画分から残留アルコールを除去してアルコール可溶性画分活性成分を得ること；
活性成分を、栄養補助薬製剤中に混合すること、
の各工程を含んでなる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モリンダ・シトリフォリア（Ｍｏｒｉｎｄａ  ｃｉｔｒｉｆｏｌｉａ（ヤエヤマアオキ））を含んでなる組成物及び取得法、及び、５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯＸ）及び１５−リポキシゲナーゼ（１５−ＬＯＸ）、ＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２、インターロイキン−１β、インターロイキン−６、ＴＮＦ−α、ＨＬＥ、及びｉＮＯＳ、炎症性疾患、及び／又は癌を阻害するための、その使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
エイコサノイドは、膜において、少なくとも３つの二重結合を含有する２０炭素脂肪酸鎖から連続的に合成される。エイコサノイドには、４つの主要なクラス、すなわち、プロスタグランジン、プロスタサイクリン、トロンボキサン、及びロイコトリエンがあり、それらは全て、主としてアラキドン酸から作られる。ロイコトリエンを除く全ての合成には、酵素シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）が関与している：ロイコトリエンの合成には、酵素リポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）が関与している。エイコサノイドは、疼痛、発熱、及び炎症において重要な役割を果たしていることから、これらの合成経路は、数多くの治療薬の標的である。例えば、コルチゾンのようなコルチコステロイドホルモンは、明らかにされたエイコサノイド合成経路の第１段階においてホスホリパーゼの活性を阻害し、非感染性炎症疾患、例えばある型の関節炎を治療するべく、臨床的に広く使用されている。非ステロイド抗炎症薬、例えばアスピリン及びイブプロフェンは、対照的に、シクロオキシゲナーゼにより触媒される第１の酸化段階を阻止する。出産時、子宮において大量に産生され、子宮平滑筋の収縮を刺激するいくつかのプロスタグランジンは、流産を誘導するための薬物として広く使用されている。
【０００３】
ＣＯＸに加えて、サイトカイン、特にインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、及び腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）の阻害は、多くの臨床的有用性があることが立証されてきた。一般に、サイトカインは細胞内調節タンパク質であって、多くの免疫学的生物学的機能を仲介し、いくつかの病理学的状況、特に自己免疫疾患、慢性炎症性疾患、及びある白血病においては、サイトカインの産生は調節されていない。ＩＬ−１β、ＩＬ−６、及びＴＮＦ−αの臨床的利益は次に議論される。
【０００４】
ＩＬ−１は、局所及び全身の炎症反応のメディエーターであり、敗血症性ショック及びリウマチ様関節炎において病原性の役割を果たす。リウマチ様関節炎における強い一時性の滑膜炎により引き起こされる、骨及び軟骨に対する損傷は、ＩＬ−１、並びに他の前炎症性メディエーター、例えば、他のサイトカインの中でもＴＮＦ−α及びＩＬ−６に起因すると考えられる。注目すべきことに、ＩＬ−１及びＴＮＦ−αは、関節の滑膜ライニングのサイトカインプロファイルにおいて特に豊富である。ＩＬ−１の阻止は、他の疾病、例えば血管炎、播種性血管内凝固症候群、骨粗鬆症、神経変性疾患、例えばアルツハイマー病、糖尿病、ループス腎炎、免疫複合体糸球体腎炎、及び自己免疫疾患に対しても、一般に有益であることが示されている。
【０００５】
血清中で増加したＩＬ−６は、多様な外傷又は炎症性症状において、例えば外傷／外科手術の患者の血清中、及びＣＮＳ感染症患者の脳脊髄液中において、或いはＣＮＳが関与する血管炎において検出されてきた。さらに、ＩＬ−６のレベルは、クーロン病、全身性エリテマトーデス、アルコール肝硬変、及びキャッスルマン病の患者の血清中で増加する。ＩＬ−６は、リウマチ様関節炎の滑液中にで有意に増大している。ＩＬ−６はまた、多発性骨髄腫においても検出され、ここではそれは腫瘍細胞又は間質細胞により発現され；腎細胞癌では腫瘍細胞により発現され；心臓粘液腫患者では腫瘍細胞により発現されかつ血清中にも検出される。
【０００６】
ＴＮＦの主要な生理学的役割は、疑いもなく、微生物性、寄生生物性、ウイルス性、又は機械的ストレスに対する生体の第一線の反応の活性化である。それは、抗細菌抵抗性において重要な役割をもち、かつリーシュマニア症に対する宿主抵抗性において重要でありうる。マラリア原虫感染症のようなプラスモディウム感染症は、結果として循環ＴＮＦレベルを増大させ、抗ＴＮＦ抗体が脳への影響に対し防御することが見出されている。寄生生物性、細菌性、及びある種のウイルス性感染症は、循環中のＴＮＦのため、より病原性又は致命的となっている。例えば、ＨＩＶにより潜伏感染されたＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＴＮＦにより刺激されて、ウイルス複製が活発となりうる。さらなる研究により、移植片対宿主病が、抗ＴＮＦ療法により、或いは内在性ＴＮＦの合成を妨げる治療により、防止または減少可能であることが見出された。リウマチ様関節炎においては、ＴＮＦはしばしば炎症部位に存在する。
【０００７】
ヒト白血球エラスターゼ（ＨＬＥ）を阻害することにも、多くの臨床上の利益がある。ＨＬＥは、ＰＭＮＬにより産生及び放出されるセリンプロテアーゼであり、その攻撃的な破壊性の故に、ある研究者達は、ＨＬＥがいくつかの疾病、例えば肺気腫、嚢胞性線維症、慢性気管支炎、急性呼吸窮迫症候群、糸球体腎炎、及びリウマチ様関節炎において、役割を果たしうることを見出した。気腫、嚢胞性線維症、及びリウマチ様関節炎においては、未結合のＨＬＥが結合組織の破壊を引き起こすと考えられており、それ故ＨＬＥの阻害が望まれる。
【０００８】
酸化窒素の誘導型アイソフォーム（ｉＮＯＳ）を阻害することもまた、臨床上の利益を示す。一酸化窒素（ＮＯ）は、脳虚血の間に重要な役割を果たす。ＮＯは、Ｌ−アルギニン及び酸素から、ＮＯシンターゼ（ＮＯＳ）により合成される。構成型ＮＯＳにより合成される少量のＮＯは、広く多様な生理学的機能、例えば血圧、血管緊張、透過性、及び神経伝達を調節する。ｉＮＯＳは、ミクログリア、星状細胞、内皮、及び血管平滑筋において誘導可能である。ひとたび発現されれば、それは、細胞内カルシウムレベルに関係なく連続して活性があり、細胞毒性及び炎症性作用をもたらす高いＮＯ合成をもたらす。
【０００９】
多数の分子的及び生物学的機構が炎症介在性の細胞損傷に寄与する。脳微小循環は、小血管の白血球性栓形成により激しく悪化される。ニューロン及びマクロファージは、毒性酵素、例えばｉＮＯＳ及びＣＯＸを誘導しうる。ｉＮＯＳは、浸潤性好中球により産生され、そのことが、増大されたＮＯ産生をもたらしうる。薬理学的阻害の使用により、ｉＮＯＳが脳虚血の間に神経毒性効果を及ぼすことが明確に証明されてきた。
【００１０】
ｉＮＯＳの過剰産生はまた、敗血症ショックにも寄与しており、それは、輸液蘇生法及び昇圧療法に対して充分に反応しない激しい低血圧により特徴づけられる。加えて、ＮＯはまた心筋の機能不全及び心拍出量の減損にも寄与している。炎症及び感染においては、ＮＯは、ＴＮＦ−αのようなサイトカイン放出、及びプロスタグランジンの形成の増加を伴うＣＯＸの活性化を増強することにより、炎症性応答を促進する。
【００１１】
５−ＬＯＸ及び１５−ＬＯＸ経路の酵素は、アラキドン酸から、炎症を引き起こす活性代謝産物を産生する。このことは、ロイコトリエンが細胞培養に添加されたときの炎症の一次徴候の証拠と結び付けられる、急性及び慢性の双方の炎症性損傷における高レベルのロイコトリエンの同定により示されてきた。ロイコトリエンは、急性及び慢性炎症、及びアレルギー性応答疾患に関与する脂質メディエーターのファミリーである。それらは、アラキドン酸の生物活性代謝産物であり、喘息、関節炎、乾癬、及び炎症性腸疾患を含む炎症性疾患の病的発現に関係づけられてきた。ロイコトリエン（ＬＴ又はＬＴ’ｓ）の生合成は、５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯＸ）がアラキドン酸を酸素化して、ＬＴＡ４（ロイコトリエンの形成の主要な（中心的な）中間体）として知られる不安定なエポキシドとすることにより始まる。ＬＴＡ４はさらに、酵素ＬＴＡ４ヒドロラーゼにより、強力な化学誘引物質であるＬＴＢ４へ転換されることができ、或いは、グルタチオン（ＧＳＨ）と一緒になって、ＬＴＣ４シンテターゼ（ＬＴＣ４Ｓ）として知られる特異的ミクロソームＧＳＨ  Ｓ−トランスフェラーゼ（ＭＧＳＴ）により、ＬＴＣ４を産生する。ＬＴＣ４は、ＬＴＣ４、ＬＴＤ４、及びＬＴＥ４を包含するロイコトリエン（ｃｙｓ−ＬＴｓ）の親化合物である。これら３つのシステイニルロイコトリエンは、特に呼吸系及び循環系における強力な平滑筋収縮剤である。これらは、少なくとも２つの細胞受容体、ＣｙｓＬＴ１及びＣｙｓＬＴ２によって仲介される。ＣｙｓＬＴ１受容体は、７つの膜貫通領域をもつＧ−タンパク質共役受容体である。ＣｙｓＬＴが、炎症及びアレルギー性応答疾患、特に喘息において、中枢的な役割を果たしていることを明確に証明する、多量のデータが収集されてきた。
【００１２】
これらの脂質メディエーターは、強い血行力学的効果を有しており、冠血管を収縮させ、結果として心拍出量の効率に減少を生じることもまた立証されてきた。さらにＣｙｓＬＴは、培養ＨＵＶＥＣにおいて、フォン・ウィルブランド因子の分泌、及びＰ−セレクチンの表面発現を誘導することが示されている。フォン・ウィルブランド病は、遺伝的障害である。最も一般的なタイプでありかつ最も知られているものは、血友病である。５−ＬＯＸ経路のこれらの酵素は、アラキドン酸から炎症を引き起こす活性代謝産物を産生する。このことは、ロイコトリエンが細胞培養に添加されたときの炎症の一次徴候の証拠と結び付けられる、急性及び慢性の双方の炎症性損傷における高レベルのロイコトリエンの同定により示されてきた。
【００１３】
加えて、システイニルＬＴは、主として好酸球、肥満細胞、及びマクロファージにより分泌され、そのことが血管拡張を引き起し、後毛細管小静脈透過性を増大し、かつ気管支収縮及び粘液分泌を刺激する。さらに、高いロイコトリエンＬＴＣ４シンターゼ活性が、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）患者からの末梢血顆粒球懸濁物、及びヒト骨髄由来の骨髄前駆細胞において見られたことが観察されている。喘息においては、システイニルロイコトリエンが患者の肺胞洗浄液中に存在する。それゆえ、５−ＬＯＸ及びロイコトリエンシンターゼの存在は、気管支喘息患者の診断において臨床的に重要である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の実施態様は、インディアンマルベリー（Ｉｎｄｉａｎ  Ｍｕｌｂｅｒｒｙ）又はモリンダ・シトリフォリアＬ（Ｍｏｒｉｎｄａ  ｃｉｔｒｉｆｏｌｉａ  Ｌ．）植物の、特別に加工された成分の種々の使用法であって、炎症性疾患、すなわち喘息、関節炎、乾癬、及び炎症性腸疾患の病的発現に寄与する、５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯＸ）、１５−リポキシゲナーゼ（１５−ＬＯＸ）、及びロイコトリエンとして既知の脂質メディエーターを阻害することにより、アラキドン酸の酸素化と、そのロイコトリエン合成中間体への代謝とを、阻害するための方法、並びにこれらの疾病の治療及び予防に関する。
【００１５】
本発明のいくつかの実施態様は、１以上の加工されたモリンダ・シトリフォリア成分、例えばモリンダ・シトリフォリアの葉からの抽出物、葉の熱水抽出物、加工モリンダ・シトリフォリア葉エタノール抽出物、加工モリンダ・シトリフォリア葉水蒸気蒸留抽出物、モリンダ・シトリフォリア果汁、モリンダ・シトリフォリア抽出物、モリンダ・シトリフォリア食物繊維、モリンダ・シトリフォリアピューレジュース、モリンダ・シトリフォリアピューレ、モリンダ・シトリフォリア果汁濃縮物、モリンダ・シトリフォリアピューレジュース濃縮物、凍結濃縮モリンダ・シトリフォリア果汁、及びモリンダ・シトリフォリア果汁の蒸発濃縮物、モリンダ・シトリフォリアの新鮮な全果実、モリンダ・シトリフォリア乾燥全果実、粉末又は溶媒抽出物の形状並びに酵素処理されたモリンダ・シトリフォリア種子、或いは任意の他の加工されたモリンダ・シトリフォリア種子（すなわち、ロースティング、ブランチング、マイクロ波処理、熱処理、水又は、種々の塩又は化合物の水溶液中のソーキング）、花（ブロッサム又はフラワー）付きモリンダ・シトリフォリア全果実、葉抽出物、葉ジュース、及び、脱脂処理及び未処理の種子抽出物を包含する。これらの方法のいくつかは、炎症性疾患又は癌を、阻害、防止、又は治療するべく、モリンダ・シトリフォリア組成物を哺乳類へ投与する工程を含む。
【００１６】
本発明のこれらの、及び他の特徴及び利点は、以下の記載及び添付の特許請求の範囲において示されるか、或いはさらに充分に明らかとなるであろう。特徴及び利点は、添付の特許請求の範囲において特に示された装置及び組合せにより、実現及び取得することができる。さらに、本発明の特徴及び利点は、本発明の実施により学習することができ、或いは、以下に示される記載から明らかとなるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
図面の簡単な説明
本発明の、上記に列挙された、及び他の利点及び特徴を理解するために、上記に簡単に記載された本発明のさらに詳細な記載を、添付の図面に例示されているその具体的な実施態様を参照することにより説明する。これらの図面は、本発明の典型的な実施態様を描いているにすぎず、故にその範囲を制限するものとみなされるべきでないことが理解され、本発明は、添付の図面を用いて、さらなる具体性及び詳細をもって記載され説明される。
【００１８】
図１Ａ及び１Ｂは、モリンダ・シトリフォリア種子抽出物による、５−ＬＯＸ活性の阻害を例示する図であり、特に図１Ａは、未処理（Ｖｉｐ＿Ｅ＿Ｍｏｃｉ’０５＿８７とラベルされた試料）の種子抽出物による阻害の実施態様を例示する図であり、図１Ｂは、脱脂された種子抽出物（Ｖｉｐ＿Ｅ＿Ｍｏｃｉ’０５＿８８とラベルされた試料）による阻害を例示する図である。
【００１９】
図２Ａ乃至２Ｆは、抽出プロセスの間に使用されるエタノール濃度を変えたモリンダ・シトリフォリア種子抽出物による、５−ＬＯＸの阻害を例示する図である。図２Ａは、Ｖｉｐ＿Ｅ＿Ｍｏｃｉ’０５＿９０とラベルされた試料による阻害を例示し、図２Ｂは、Ｖｉｐ＿Ｅ＿Ｍｏｃｉ’０５＿９１とラベルされた試料による阻害を例示し、図２Ｃは、Ｖｉｐ＿Ｅ＿Ｍｏｃｉ’０５＿９２とラベルされた試料による阻害を例示し、図２Ｄは、Ｖｉｐ＿Ｅ＿Ｍｏｃｉ’０５＿１００とラベルされた試料による阻害を例示し、図２Ｅは、Ｖｉｐ＿Ｅ＿Ｍｏｃｉ’０５＿９３とラベルされた試料による阻害を例示し、図２Ｆは、Ｖｉｐ＿Ｅ＿Ｍｏｃｉ’０５＿１０１とラベルされた試料による阻害を例示する図である。
【００２０】
図３Ａ及び３Ｂは、モリンダ・シトリフォリア種子抽出物による、ＣＯＸ−１の阻害を例示する図である。図３Ａは、Ｖｉｐ＿Ｅ＿Ｍｏｃｉ’０５＿１００とラベルされた試料による阻害を例示し、図３Ｂは、Ｖｉｐ＿Ｅ＿Ｍｏｃｉ’０５＿１００．１とラベルされた試料による阻害を例示する図である。
【００２１】
図４Ａ及び４Ｂは、モリンダ・シトリフォリア抽出物による、ＣＯＸ−１の阻害を例示する図である。図４Ａは、Ｖｉｐ＿Ｅ＿Ｍｏｃｉ’０５＿１００とラベルされた試料による阻害を例示し、図４Ｂは、Ｖｉｐ＿Ｅ＿Ｍｏｃｉ’０５＿１００．１とラベルされた試料による阻害を例示する図である。
【００２２】
図５Ａ及び５Ｂは、モリンダ・シトリフォリア抽出物による、ＴＮＦ−αの阻害を例示する図である。図５Ａは、Ｖｉｐ＿Ｅ＿Ｍｏｃｉ’０５＿１００とラベルされた試料による阻害を例示し、図５Ｂは、Ｖｉｐ＿Ｅ＿Ｍｏｃｉ’０５＿１００．１とラベルされた試料による阻害を例示する図である。
【００２３】
図６Ａ及び６Ｂは、モリンダ・シトリフォリア種子抽出物による、ＩＬ−６の阻害を例示する図である。図６Ａは、Ｖｉｐ＿Ｅ＿Ｍｏｃｉ’０５＿１００とラベルされた試料による阻害を例示し、図６Ｂは、Ｖｉｐ＿Ｅ＿Ｍｏｃｉ’０５＿１００．１とラベルされた試料による阻害を例示する図である。
【００２４】
図７Ａ及び７Ｂは、モリンダ・シトリフォリア種子抽出物による、ＨＬＥの阻害を例示する図である。図７Ａは、Ｖｉｐ＿Ｅ＿Ｍｏｃｉ’０５＿１００とラベルされた試料による阻害を例示し、図７Ｂは、Ｖｉｐ＿Ｅ＿Ｍｏｃｉ’０５＿１００．１とラベルされた試料による阻害を例示する図である。
【００２５】
図８Ａ及び８Ｂは、モリンダ・シトリフォリア種子抽出物による、ｉＮＯＳの阻害を例示する図である。図８Ａは、Ｖｉｐ＿Ｅ＿Ｍｏｃｉ’０５＿１００とラベルされた試料による阻害を例示し、図８Ｂは、Ｖｉｐ＿Ｅ＿Ｍｏｃｉ’０５＿１００．１とラベルされた試料による阻害を例示する図である。
【００２６】
図９は、モリンダ・シトリフォリア種子抽出物による、ｉＮＯＸの阻害を例示する図である。
【００２７】
図１０は、薬物−溶媒比に対する収量を例示する図である。
【００２８】
本明細書において全般的に記載されるように、本発明の成分が、広く多様な異なる形態において、組み合わせ、設計することができることが容易に理解されよう。したがって、本発明の組成物及び方法の実施態様についての以下のより詳細な記載は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を制限することを意図したものではなく、本発明の現在の好ましい実施態様を代表するものにすぎない。本発明の範囲は、それゆえ、上記記載ではなく添付の特許請求の範囲により示される。特許請求の範囲の意味及び同等の範囲内に入る全ての変更は、本発明の範囲内に含まれる。
【００２９】
本発明の実施態様は、インディアンマルベリー又はモリンダ・シトリフォリアＬ植物の成分を含んでなる組成物の投与による、哺乳類の炎症性疾患及び皮膚癌を阻害するため、及び治療及び予防するための、方法及び組成物を特徴とする。
【００３０】
１．  モリンダ・シトリフォリアＬ植物の全般的な記載
インディアンマルベリー又はモリンダ・シトリフォリア植物は、科学的にはＭｏｒｉｎｄａ  ｃｉｔｒｉｆｏｌｉａ  Ｌ．（「モリンダ・シトリフォリア」）として知られる、高さ１０ｍまでの灌木又は低木である。葉は、楕円形から卵形で、対生に配置される。小型の白色の花は、多肉質の、球形の、頭状の集合果中に含まれる。果実は、大型で、多肉質、かつ卵型である。成熟時は、それらはクリーミーホワイトで可食であるが、不快な味及び匂いがある。該植物は東南アジア原産であり、古代にインドから東ポリネシアまでの広大な地域に広がった。野生ではランダムに育ち、プランテーション及び個人の育成用小区画で栽培されてきた。モリンダ・シトリフォリアの花は、小型で、白色で、３−５裂の、筒状で、香りがあり、かつ約１．２５ｃｍの長さである。花は、卵形、楕円、又は丸みのある、でこぼこの本体へ融合し、蝋質の、白色か、又は緑色がかった白又は黄色の、半透明の果皮をもつ、多数の核果からなる複合果へ発達する。果実は、その表面にジャガイモに類似の「目」を含有する。果実は多肉で苦味があり、穏黄又は黄白色で、それぞれが４個の種子を含有する、多数の赤褐色の、硬い、長楕円−三角形の、二子房室の石果を含有する。果実は完熟すると、酸敗チーズ臭のような顕著なにおいをもつ。果実は、いくつかの民族により食物として食されてきたが、モリンダ・シトリフォリア植物の最も一般的な用途は、伝統的に、赤及び黄色の染料の供給源としてであった。
【００３１】
２．  モリンダ・シトリフォリア葉の加工
モリンダ・シトリフォリア植物の葉は、本発明の組成物中に含ませることができる、モリンダ・シトリフォリア植物の１つの可能な成分である。例えば、いくつかの組成物は、本明細書においてさらに記載される、葉抽出物及び／又は葉汁を含んでなる。いくつかの組成物は、モリンダ・シトリフォリア植物から得られた、葉抽出物及び果汁の双方を含んでなるリーフシーラムを含んでなる。本発明のいくつかの組成物は、栄養補助薬製品（本明細書の「栄養補助薬」は、ヒト又は哺乳類のような生体の健康を改善するべく設計された、任意の薬物又は製品を指す）に組み込まれた、リーフシーラム及び／又は種々の葉抽出物を含んでなる。
【００３２】
本発明のいくつかの実施態様においては、モリンダ・シトリフォリア葉抽出物は、以下のプロセスを用いて取得される。まず、モリンダ・シトリフォリアＬ植物から比較的乾燥した葉が収集され、小片に切断され、粉砕装置、好ましくは水圧プレス、へ入れられ、そこで葉の小片は粉砕される。ある実施態様においては、粉砕された葉片は、次にアルコール、例えばエタノール、メタノール、酢酸エチル、又は他のアルコール系の誘導体により、当該技術分野において公知の方法を用いて漉される。次に、いくつかの実施態様では、アルコール及び全てのアルコール可溶性成分は、粉砕された葉片から抽出され、葉抽出物を与え、それは次に加熱により煮詰められ、全ての液体をそこから除去する。得られる葉の乾燥エキスは、本明細書では「一次葉抽出物」と呼ばれる。
【００３３】
本発明のいくつかの実施態様においては、一次葉抽出物は、少なくとも部分的に抽出物を滅菌しかつ好ましくない微生物を破壊するべく殺菌される。一次葉抽出物は、好ましくは摂氏７０度から８０度の範囲の温度において、抽出物の主要な化学物質を変えることなしに好ましくない微生物を破壊するべく充分な時間をかけて殺菌される。殺菌はまた、種々の照射技術又は方法により遂行されてもよい。
【００３４】
本発明のいくつかの実施態様においては、殺菌された一次葉抽出物は、遠心分離デカンタに入れられ、そこで遠心分離されて、その中に残留する葉汁を、クロロフィルを含む他の物質から除去または分離する。ひとたび遠心分離サイクルが完了すれば、葉抽出物は比較的純粋な状態である。この純粋な葉抽出物は、次に前文に議論された同様の方法で再度殺菌され、純粋な一次葉抽出物を得る。
【００３５】
好ましくは、一次葉抽出物は、殺菌及び／又は精製されていてもいなくても、さらに２つの別個の画分、すなわち、ドライヘキサン画分及び水性メタノールに分画される。これは、好ましくは、二酸化ケイ素及びＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ成分を含有するガスクロマトグラフィーにより、当該技術分野における周知の方法を用いて遂行される。本発明のいくつかの実施態様においては、メタノール画分はさらに分画され、２次メタノール画分を得る。本発明のいくつかの実施態様においては、ヘキサン画分はさらに分画され、２次ヘキサン画分を得る。
【００３６】
一次葉抽出物、ヘキサン画分、メタノール画分、又は２次ヘキサン又はメタノール画分のいずれかを含む１以上の葉抽出物は、モリンダ・シトリフォリア植物の果実の果実ジュースと一緒にされ、リーフシーラムを得ることができる（果実ジュースを得るプロセスは、本明細書においてさらに記載される）。いくつかの実施態様においては、リーフシーラムは、出荷に対する準備のため、パッケージされ凍結される；別の態様においては、それはさらに、本明細書に説明されるような栄養補助薬製品に組み込まれる。
【００３７】
３．  モリンダ・シトリフォリア果実の加工
本発明のいくつかの実施態様は、モリンダ・シトリフォリア植物の果汁を含んでなる組成物を包含する。モリンダ・シトリフォリア果実は、すべて非食用の実用的な目的向きであることから、人間の消費に向けて美味にするため、また本発明の組成物中に含まれるためには、加工しなければならない。加工モリンダ・シトリフォリア果実ジュースは、熟したモリンダ・シトリフォリア果実のジュース及びパルプから種子及び皮を分離すること；ジュースからパルプを濾過すること；及びジュースをパッケージすることにより調製可能である。別法として、ジュースは、パッケージングせず、直ちに別の製品中に成分として含めてもよく、凍結してもよく、又は殺菌してもよい。本発明のいくつかの実施態様においては、ジュース及びパルプは、均一なブレンドにピューレして、他の成分と混合することが可能である。他のプロセスは、果実及びジュースを凍結乾燥することを包含する。果実及びジュースは、最終的なジュース製品の製造の過程で再構成されることが可能である。さらに別のプロセスは、果実及びジュースは、こねる前に自然乾燥することを包含してもよい。
【００３８】
モリンダ・シトリフォリア果汁を製造するための現在好ましいプロセスにおいては、果実は手もぎされるか、又は機械装置により摘果される。果実は、少なくとも直径１インチ（２−３ｃｍ）、及び１２インチ（２４−３６ｃｍ）までのとき、収穫可能である。果実は、好ましくは、暗緑色から、黄緑色を経て、白色までの範囲の色、及び間には色のグラデーションを有する。果実は、収穫後、及び任意の加工が行われる前に、完全に浄化される。
【００３９】
果実は、０から１４日間、しかし好ましくは２−３日間、熟されるか又は熟成される。果実は、果実が地面に接触しないようにする装置上に置かれることにより、熟されるか又は熟成される。果実は、好ましくは、熟成の間、布又は網状物質によりカバーされるが、果実はカバーされることなく熟成可能である。さらなる加工のため準備される場合、果実は色が薄く、例えば薄緑色、薄黄色、白色、又は半透明の色である。果実は、腐敗について、又は、過度の緑色及び堅さについて検査される。腐敗した、及び堅い緑色の果実は、許容される果実から区別される。
【００４０】
熟した、及び熟成された果実は、さらなる加工及び輸送に向け、好ましくは整列されたプラスチック容器内に置かれる。熟成された果実の容器は、０から３０日間保持可能であるが、好ましくは果実の容器は、加工前、７−１４日間保持される。容器は、さらなる加工に先立ち、冷蔵条件下に任意に貯蔵可能である。果実は、貯蔵容器から取出され、手作業又は機械的な分離器により加工される。種子及び皮は、ジュース及びパルプから分離される。
【００４１】
ジュース及びパルプは、貯蔵及び輸送に向け、容器にパッケージ可能である。別法として、ジュース及びパルプは直ちに、完成したジュース製品へ加工可能である。容器は、冷蔵、凍結、又は室温条件において貯蔵可能である。モリンダ・シトリフォリアのジュース及びパルプは、好ましくは均一なブレンドに混合され、その後に、他の成分、例えば着香料、甘味料、栄養成分、植物性薬品、及び着色料と混合されてもよい。完成したジュース製品は、好ましくは、最低温度１８１°Ｆ（８３℃）又は、より高い２１２°Ｆ（１００℃）までの温度において加熱殺菌される。製造される別の製品は、濃縮又は希釈された形状の、モリンダ・シトリフォリアピューレ又はピューレジュースである。ピューレは本質的に、種子から分離されたパルプであり、本明細書に記載される果汁製品とは異なる。
【００４２】
製品は、プラスチック、ガラス、又は加工温度に耐えることが可能な他の適当な材料からなる最終容器中に充填され、密閉される。容器は充填温度において維持されるか、又は迅速に冷却されてもよく、次いで輸送容器中に置かれる。輸送容器は、好ましくは、最終容器中の製品の温度を維持又は制御するための材料及び方法により包装される。
【００４３】
ジュース及びパルプは、濾過装置を通してジュースからパルプを分離することにより、さらに加工されてもよい。濾過装置は、好ましくは、限定されないが、遠心分離デカンタ、１ミクロンから２０００ミクロンまで、さらに好ましくは５００ミクロン未満のサイズをもつスクリーンフィルタ、フィルタプレス、逆浸透濾過装置、及び任意の他の標準的な市販の濾過装置から構成される。操作する濾過圧は、好ましくは、０．１ｐｓｉｇから約１０００ｐｓｉｇまでの範囲である。流速は、好ましくは、０．１ｇ．ｐ．ｍ．から１０００ｇ．ｐ．ｍ．まで、さらに好ましくは、５と５０ｇ．ｐ．ｍ．の間の範囲である。ウェットパルプは洗浄され、少なくとも1回、及び１０回まで濾過され、パルプから全てのジュースを除去する。得られたパルプ抽出物は、典型的には１０−４０重量パーセントの線維含量を有する。得られたパルプ抽出物は、好ましくは、最低１８１°Ｆ（８３℃）の温度で殺菌され、次に、さらなる加工に向けてドラムへ詰められるか、又は高繊維製品とする。
【００４４】
４．  モリンダ・シトリフォリア種子の加工
本発明のいくつかのモリンダ・シトリフォリア組成物は、モリンダ・シトリフォリア植物からの種子を包含する。本発明のいくつかの実施態様においては、モリンダ・シトリフォリア種子は、ラボラトリーミルにおいて、それらを種子粉末へ粉砕することにより加工される。ある実施態様においては、種子粉末は未処理のままである。ある実施態様においては、種子粉末はさらに、粉末をヘキサン中に、好ましくは1時間、室温で浸漬及び攪拌することにより脱脂される（薬物：ヘキサン比、１：１０）。ある実施態様では、残渣は、次に真空下で濾過され、再度脱脂され（好ましくは、同条件下で３０分間）、かつ真空下で再度濾過される。粉末は、残留するヘキサンを除去するべく、ヒュームフード内に一晩保持されてもよい。
【００４５】
さらに、本発明のある実施態様においては、脱脂粉末及び／又は未処理粉末は、好ましくは５０％（ｍ／ｍ）エタノールを用いて、薬物溶媒比１：２において、室温で２４時間抽出される。
【００４６】
５．  モリンダ・シトリフォリア油の加工
本発明のいくつかの実施態様は、モリンダ・シトリフォリア植物からの油抽出物を含んでいてもよい。油を抽出及び加工するための方法は、１９９９年８月２７日に出願され、かつ２００１年４月１０日に特許第６，２１４，３５１号として発行された、米国特許出願第０９／３８４，７８５号に記載されており、これは参考として本明細書に含まれる。モリンダ・シトリフォリア油は、典型的には、いくつかの異なる脂肪酸の混合物、例えばパルミチン、ステアリン、オレイン、及びリノール脂肪酸、及び、少量存在する他の脂肪酸をトリグリセリドとして包含する。加えて、油は、好ましくは油の腐敗を阻害するための酸化防止剤を包含する。好ましくは、通常の食品グレードの酸化防止剤が使用される。
【００４７】
６．  組成物及びその用途
本発明は、５−ＬＯＸ、１５−ＬＯＸ、及び／又は皮膚癌を阻害するための、組成物及び方法を特徴とする。本発明はまた、炎症性疾患を治療及び予防する目的のための、アラキドン酸の、そのロイコトリエン中間体成分への酸素化を阻害するための、組成物及び方法も特徴とする。本発明の実施態様はまた、モリンダ・シトリフォリア組成物を哺乳類の体内へ内部導入するための方法も含んでなる。モリンダ・シトリフォリア組成物のいくつかの実施態様は、種々の異なる成分を含んでなり、各々の実施態様は、本明細書に教示及び説明された１以上の形状の加工モリンダ・シトリフォリア成分を含んでなる。
【００４８】
本発明の組成物は、多数のモリンダ・シトリフォリア成分：例えば、葉抽出物、葉ジュース、リーフシーラム、果汁、果実パルプ、パルプ抽出物、ピューレ、種子（脱脂又は未処理）、及び油の任意のものを含んでいてもよい。本発明の組成物はまた、種々の他の成分を含んでいてもよい。他の成分の例としては、限定されないが、人工着香料、他の天然の果汁又は果汁濃縮物、例えば天然のブドウジュース濃縮物又は天然のブルーベリージュース濃縮物；担体成分；及び他のものが挙げられ、本明細書においてさらに説明される。
【００４９】
モリンダ・シトリフォリア葉からの葉抽出物を有する組成物は、１以上の以下のもの：一次葉抽出物、ヘキサン画分、メタノール画分、２次ヘキサン及びメタノール画分、リーフシーラム、又は栄養補助薬葉製品を含んでいてもよい。
【００５０】
本発明のいくつかの実施態様においては、モリンダ・シトリフォリア成分の活性成分又は化合物は、当該技術分野において周知の、種々の手順及びプロセスを用いて抽出することができる。例えば、活性成分は、アルコール又はアルコール系の溶液、例えばメタノール、エタノール、及び酢酸エチル、及び他のアルコール系の誘導体を用いて、当該技術分野において公知の方法を用いて単離及び抽出することができる。これらの活性成分又は化合物は、単離され、かつさらに分画されるか、又はそれらの構成部分へ互いに分離されてもよい。好ましくは、化合物は、疾病を予防するか、健康を増進するか、又は他の類似の機能を実行するための助けとなるかもしれない任意の活性成分を同定及び分離するべく、分離又は分画される。さらに、化合物は、今述べたものと同様の健康に有益な機能を提供するかもしれない任意の重要な又は依存性の相互作用を同定又は分離するべく、それらの構成部分へ分画又は分離されてもよい。
【００５１】
さらに、モリンダ・シトリフォリアの任意の成分及び組成物は、栄養補助薬製品に組み込むことができる（再度、本明細書の「栄養補助薬」は、ヒト又は哺乳類のような生体の健康を改善するべく設計された、任意の薬物又は製品を指す）。栄養補助薬製品の例としては、限定されないが、輸液製品、局所経皮製品、損傷治癒製品、スキンケア製品、ヘアケア製品、化粧用及び美容用製品（例えば、メイクアップ、ローション、その他）、火傷治癒及び治療用製品、応急手当製品、抗菌製品、リップバーム及び軟膏、骨治癒及び治療用製品、肉軟化製品、抗炎症製品、点眼薬、脱臭剤、抗真菌製品、関節炎治療製品、筋肉リラクサー、練り歯磨き、及び、本明細書においてさらに議論される種々の栄養補助薬及び他の製品が挙げられる。
【００５２】
本発明の組成物は、製剤して、経口組成物、局所経皮溶液、輸液、及び他の製品及び組成物を含む、多様な実施態様の任意のものとすることができる。
【００５３】
経口組成物は、例えば、タブレット、ロゼンジ、水性又は油性懸濁液、分散性粉末又は顆粒、エマルジョン、シロップ、又はエリキシルの形状を取ってもよい。経口使用に意図された組成物は、当該技術分野において公知の任意の方法に従って調製することができ、かかる組成物は１以上の薬剤、例えば甘味剤、着香剤、着色剤、及び保存剤を含有してもよい。それらはまた、１以上の付加的な成分、例えば、ビタミン及びミネラルなどを含有してもよい。タブレットは、１以上のモリンダ・シトリフォリア成分を、タブレットの製造に好適な、非毒性の医薬的に許容される賦形剤との混合物中に含有するべく製造することができる。これらの賦形剤は、例えば、不活性な希釈剤、造粒及び崩壊剤、結合剤、及び潤滑剤でよい。タブレットは、未コートであってもよく、或いは、胃腸管内での崩壊及び吸収を遅らせるための既知の技術によりコートされ、それにより、長期にわたる持続作用を提供するようにしてもよい。例えば、グリセリルモノステアレート又はグリセリルジステアレートのような遅延物質が使用されてもよい。
【００５４】
水性懸濁液は、モリンダ・シトリフォリア成分を、水性懸濁液の製造に適した賦形剤との混合物中に含有するべく製造することができる。かかる賦形剤の例としては、限定されないが、懸濁化剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム、及びアラビアガム；分散又は湿潤剤、例えば、レシチンのような天然産ホスファチド、又はアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合物、例えばステアリン酸ポリオキシエチレン、又はエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合物、例えばヘプタデカエチレン−オキシセタノール、又はエチレンオキシドと、脂肪酸及びヘキシトールから誘導される部分エステルとの縮合物、例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール、又はエチレンオキシドと、脂肪酸及びヘキシトール無水物から誘導される部分エステルとの縮合物、例えばモノオレイン酸ポリエチレンソルビタンが挙げられる。
【００５５】
典型的な甘味剤としては、限定されないが、トウモロコシ、テンサイ、サトウキビ、ジャガイモ、タピオカ、又は、他の化学的又は酵素的に、結晶状のチャンク、粉末、及び／又はシロップへ転換可能なデンプン含有性供給源から誘導される天然の糖が挙げられる。また、甘味料は、人工の又は高甘味度の甘味料を含んでいてもよく、いくつかの例としては、アスパルテーム、スクラロース、ステビア、サッカリン、その他が挙げられる。甘味料の濃度は、モリンダ・シトリフォリア組成物の０から５０重量パーセントまでの間でよく、さらに好ましくは約１と５重量パーセントとの間である。
【００５６】
典型的な着香剤としては、限定されないが、嗜好性に寄与する人工及び／又は天然の着香成分が挙げられる。着香剤の濃度は、例えば、モリンダ・シトリフォリア組成物の０から１５重量パーセントまでの範囲でよい。着色剤は、食品グレードの、人工又は天然の着色剤を包含してよく、モリンダ・シトリフォリア組成物の０から１０重量パーセントまでの範囲の濃度を有する。
【００５７】
典型的な栄養成分は、ビタミン、ミネラル、微量元素、ハーブ、植物抽出物、生物活性化学物質、及び化合物を、モリンダ・シトリフォリア組成物の０から１０重量パーセントまでの濃度において包含してもよい。ビタミンの例としては、限定されないが、Ａ、Ｂ１からＢ１２まで、Ｃ、Ｄ、Ｅ、葉酸、パントテン酸、ビオチン、その他が挙げられる。ミネラル及び微量元素の例としては、限定されないが、カルシウム、クロム、銅、コバルト、ホウ素、マグネシウム、鉄、セレン、マンガン、モリブデン、カリウム、ヨウ素、亜鉛、リン、その他が挙げられる。ハーブ及び植物抽出物としては、限定されないが、アルファルファグラス、ビーポーレン、クロレラ粉末、ドンクアイ粉末、エキナセア根、イチョウ抽出物、ホーステールハーブ、インディアンマルベリー、シイタケマッシュルーム、スピルリナーシーウィード、グレープシード抽出物などが挙げられる。典型的な生物活性化学物質としては、限定されないが、カフェイン、エフェドリン、Ｌ−カルニチン、クレアチン、リコペン、その他が挙げられる。
【００５８】
局所経皮製品において利用される成分としては、哺乳類の体内への内部移行について安全な任意のものが挙げられ、ゲル、ローション、クリーム、軟膏、その他の種々の形状で存在してもよく、これらは１以上の担体を含んでなる。全身的に（例えば、静脈内に）投与される組成物中に組み込まれる成分又は担体はまた、当該技術分野において公知の任意のものを含んでいてもよい。
【００５９】
１つの代表的な実施態様においては、本発明のモリンダ・シトリフォリア組成物は、約０．０１と１００重量パーセントとの間、及び好ましくは０．０１と９５重量パーセントとの間の重量で存在する、１以上の加工されたモリンダ・シトリフォリア成分を含んでなる。製剤のいくつかの実施態様は、２００１年４月１０日発行の米国特許第６，２１４，３５１号に包含されている。しかしながら、これらの組成物は代表的であることを意図したものにすぎず、当業者は、加工されたモリンダ・シトリフォリア製品を含む他の製剤または組成物を理解することができる。
【００６０】
別の代表的な実施態様においては、内服用の組成物は、０．１−８０重量パーセントの量で存在する、加工モリンダ・シトリフォリア果汁又はピューレジュース；０．１−２０重量パーセントの量で存在する、加工モリンダ・シトリフォリア油；及び２０−９０重量パーセントの量で存在する担体媒体、の各成分を含む。モリンダ・シトリフォリアピューレジュース又は果汁はまた、同様の濃度で存在する加工モリンダ・シトリフォリア食物繊維と共に製剤されてもよい。
【００６１】
７．  実施例
以下の実施例は、本発明のいくつかのモリンダ・シトリフォリア組成物の、５−ＬＯＸ、１５−ＬＯＸ、ＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２、インターロイキン１β、インターロイキン−６、ＴＮＦ−α、ＨＬＥ、ｉＮＯＳ、炎症性疾患、及び／又は癌に対する、予防及び治療効果を例証する。これらの実施例は、制限となることが意図されたものではなく、単に、本発明のモリンダ・シトリフォリア組成物のいくつかの実施態様の、恩恵、利点、及び治療効果を例示するものにすぎない。
【実施例１】
【００６２】
研究は、未処理及び脱脂モリンダ・シトリフォリア種子抽出物の、ヒト５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯＸ）の活性に対する潜在的阻害効果を測定するべく行われた。モリンダ・シトリフォリア種子は、ラボラトリーミルで粉砕された。得られた種子粉末の半分は、未処理のまま残され、他の半分は、粉末をヘキサン中に、室温で１時間浸漬及び攪拌することにより脱脂された（薬物：ヘキサン比、１：１０）。真空下での濾過の後、残渣は同じ条件下で３０分間再度脱脂され、真空下で再び濾過された。残留するヘキサンを除去するため、粉末はヒュームフード内に一晩保持された。
【００６３】
脱脂粉末並びに未処理粉末は、１：２の薬物溶媒比において、５０％（ｍ／ｍ）エタノールにより、室温で２４時間抽出された。液体抽出物は、濾過の後、さらなる濃縮工程なしに、バイオアッセイに直接使用された。５０％エタノール中１５ｍｇ／ｍｌのストック溶液が、５−ＬＯＸアッセイ用に調製された。
【００６４】
次に、ヒトＨＬ−６０細胞におけるリポキシゲナーゼアッセイ（１，２）は、以下のように行われた。ヒトＨＬ−６０細胞（骨髄性白血病、ＤＳＭＺ  Ｎｏ  ＡＣＣ３）は、５％ＣＯ２を加えた加湿雰囲気中で３７℃に保持され、１０％ウシ胎児血清及び１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン溶液を補充された完全ＲＰＭＩ１６４０培地中で培養された。細胞は、ＤＭＳＯ（１．２％ｖ／ｖ）を用いて、６−８日間にわたり分化された。５−ＬＯＸ活性アッセイは、ベネット（Ｃ．Ｆ．Ｂｅｎｎｅｔ）、チャング（Ｍ．Ｙ．Ｃｈｉａｎｇ）、モニア（Ｂ．Ｐ．Ｍｏｎｉａ）、及びクルック（Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ）により、「ＨＬ−６０細胞における５−リポキシゲナーゼ活性化タンパク質発現の調節（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ５−ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ＨＬ−６０  ｃｅｌｌｓ）」、「ザ・バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｃｈｅｍ．Ｊ．）」、第２８９巻、ｐ．３３−３９に記載されたように行われた。簡単にいえば、分化された細胞は回収され、Ｃａ２＋（１ｍＭ）及びグルコース（１ｍＭ）を含有するＰＢＳ中に懸濁され、９６穴マイクロタイタープレート中に分配された（１ｘ１０６細胞／ウェル）。
【００６５】
適当な溶媒中の試験化合物のストック溶液は、ＰＢＳで希釈された。試料又はビヒクルとの、室温で１５分間のプレインキュベーションの後、反応は、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７（５μＭ）及びアラキドン酸（１０μＭ）の添加により開始された。取得された全ての値は、溶媒濃度についての最終値を表す。陰性対照は、カルシウムイオノフォア刺激なしに行われた。アッセイ混合物（１００μｌ）は、３７℃で１５分間インキュベートされ、１００μｌの、ＨＣｌ（１Ｍ、３％ｖ／ｖ）を含有するメタノールを添加すること、及びマイクロタイタープレートを氷上に置くことにより停止された。１０分間の遠心分離（３４０ｘｇ）の後、上清中のＬＴＢ４濃度が測定された。
【００６６】
５−ＬＯＸの活性に対する試料及び参照化合物の効果は、アッセイ条件下で産生されるロイコトリエンＢ４の量を定量することにより測定された。ロイコトリエンＢ４の定量化は、ケイマン（Ｃａｙｍａｎ）からの、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）キット、Ｎｏ  ５２０１１１（ＬＴＢ４）を用いて行われた。光学密度は、λ＝４１５ｎｍにおいて測定された。量は、少なくとも５つの異なる濃度からなる標準曲線を用いて計算された。サンプルポイントは、二重に測定された。用量関連阻害値は、陽性対照値の百分率として表された。以下の表及び図表、及び図１Ａ及び１Ｂは、アッセイ及び結果を要約している。
【００６７】
【表１】
2009521476.tif 000003
【００６８】
【表２】
2009521476.tif 000004
【００６９】
【表３】
2009521476.tif 000005
【００７０】
【表４】
2009521476.tif 000006
【００７１】
要約すれば、試験されたモリンダ・シトリフォリアの種子抽出物は、両方とも、インビトロで５−ＬＯＸ活性を明らかに阻害した。未処理抽出物と脱脂抽出物との間には、有意な差異は観察されなかった。未処理抽出物、Ｖｉｐ＿Ｅ＿Ｍｏｃｉ’０５＿８７は、５−ＬＯＸ活性を、５０μｇ／ｍｌのＩＣ５０値で阻害し、脱脂抽出物、Ｖｉｐ＿Ｅ＿Ｍｏｃｉ’０５＿８８は、５−ＬＯＸ活性を、６０μｇ／ｍｌのＩＣ５０値で阻害した。
【実施例２】
【００７２】
別の実施態様においては、モリンダ・シトリフォリアの、インビトロの薬理学的スクリーニング研究が行われた。この研究の目的は、ヒト５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯＸ）活性に対する、モリンダ・シトリフォリア種子の、異なるエタノール抽出物の潜在的阻害効果を測定することであった。
【００７３】
モリンダ・シトリフォリア種子は、ラボラトリーミルで粉砕された。得られた種子粉末の半分は、未処理のまま残され、他の半分は、粉末をヘキサン中に、室温で１時間浸漬及び攪拌することにより脱脂された（薬物：ヘキサン−比、１：１０）。真空下での濾過の後、残渣は同じ条件下で３０分間再度脱脂され、真空下で再び濾過された。残留するヘキサンを除去するため、粉末はヒュームフード内に一晩保持された。
【００７４】
脱脂粉末は、異なるエタノール濃度を用いて、１：２の薬物溶媒比で、室温で２４時間抽出された。液体抽出物は、濾過の後、さらなる濃縮工程なしに、バイオアッセイに直接使用された。
【００７５】
次に、ヒトＨＬ−６０細胞におけるリポキシゲナーゼアッセイ（１，２）が、以下のように行われた。ヒトＨＬ−６０細胞（骨髄性白血病、ＤＳＭＺ  Ｎｏ  ＡＣＣ３）は、５％ＣＯ２を加えた加湿雰囲気中で３７℃に保持され、１０％ウシ胎児血清及び１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン溶液を補充された完全ＲＰＭＩ１６４０培地中で培養された。細胞は、ＤＭＳＯ（１．２％ｖ／ｖ）を用いて、６−８日間にわたり分化された。５−ＬＯＸ活性アッセイは、ベネット（Ｃ．Ｆ．Ｂｅｎｎｅｔ）、チャング（Ｍ．Ｙ．Ｃｈｉａｎｇ）、モニア（Ｂ．Ｐ．Ｍｏｎｉａ）、及びクルック（Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ）により、「ＨＬ−６０細胞における５−リポキシゲナーゼ活性化タンパク質発現の調節」、「ザ・バイオケミカル・ジャーナル」、第２８９巻、ｐ．３３−３９に記載されたように行われた。簡単にいえば、分化された細胞は回収され、Ｃａ２＋（１ｍＭ）及びグルコース（１ｍＭ）を含有するＰＢＳ中に懸濁され、９６穴マイクロタイタープレート中に分配された（１ｘ１０６細胞／ウェル）。
【００７６】
適当な溶媒中の試験化合物のストック溶液は、ＰＢＳで希釈された。試料又はビヒクルとの、室温で１５分間のプレインキュベーションの後、反応は、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７（５μＭ）及びアラキドン酸（１０μＭ）の添加により開始された。取得された全ての値は、溶媒濃度についての最終値を表す。陰性対照は、カルシウムイオノフォア刺激なしに行われた。アッセイ混合物（１００μｌ）は、３７℃で１５分間インキュベートされ、１００μｌの、ＨＣｌ（１Ｍ、３％  ｖ／ｖ）を含有するメタノールを添加すること、及びマイクロタイタープレートを氷上に置くことにより停止された。１０分間の遠心分離（３４０ｘｇ）の後、上清中のＬＴＢ４濃度が測定された。
【００７７】
５−ＬＯＸの活性に対する試料及び参照化合物の効果は、アッセイ条件下で産生されるロイコトリエンＢ４の量を定量することにより測定された。ロイコトリエンＢ４の定量化は、ケイマン（Ｃａｙｍａｎ）からの、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）キット、Ｎｏ  ５２０１１１（ＬＴＢ４）を用いて行われた。光学密度は、λ＝４１５ｎｍにおいて測定された。量は、少なくとも５つの異なる濃度からなる標準曲線を用いて計算された。サンプルポイントは、二重に測定された。用量関連阻害値は、陽性対照値の百分率として表された。以下の表及び図表、及び図２Ａ−２Ｆは、アッセイ及び結果を要約している。
【００７８】
【表５】
2009521476.tif 000007
【００７９】
【表６】
2009521476.tif 000008
【００８０】
【表７】
2009521476.tif 000009
【００８１】
要約すれば、全てのモリンダ・シトリフォリア種子抽出物は、インビトロで５−ＬＯＸ活性を明らかに阻害した。５−ＬＯＸ活性の阻害の程度は、抽出溶液のエタノール含量によって変化した。抽出溶液のエタノール含量を８０％のＥｔＯＨ含量まで増すにつれ、抽出物は、増大する阻害効果を示した。８０％ＥｔＯＨ含量では、抽出物Ｖｉｐ＿Ｅ＿Ｍｏｃｉ’０５＿１００は、５−ＬＯＸ活性を、１０μｇ／ｍｌのＩＣ５０値で阻害した。抽出溶液中の、より低い、又はより高いエタノール含量は、より高いＩＣ５０値によって示されるように、抽出物の阻害効果を低減させた。
【００８２】
薬理学的スクリーニング研究は、モリンダ・シトリフォリア種子の活性スペクトルを測定し、延長された貯蔵が抽出物の生物活性に影響を及ぼすかどうかを測定するべく行われた。この目的のためには、シクロオキシゲナーゼ−１（ＣＯＸ−１）及びシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）の活性に対する、２つの抽出物の潜在的阻害効果が測定された。特に、ＩＣ５０値は、ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２について、単離された酵素で測定された。
【００８３】
モリンダ・シトリフォリア種子は、ラボラトリーミルで粉砕された。得られた種子粉末の半分は、未処理のまま残され、他の半分は、粉末をヘキサン中に、室温で１時間浸漬及び攪拌することにより脱脂された（薬物：ヘキサン−比、１：１０）。真空下での濾過の後、残渣は同じ条件下で３０分間再度脱脂され、真空下で再び濾過された。残留するヘキサンを除去するため、粉末はヒュームフード内に一晩保持された。
【００８４】
脱脂粉末並びに未処理粉末は、５０％（ｍ／ｍ）エタノールを用いて、１：２の薬物溶媒比で、室温で２４時間抽出された。液体抽出物は、濾過の後、さらなる濃縮工程なしに、バイオアッセイに直接使用された。５０％エタノール中１５ｍｇ／ｍｌのストック溶液が、５−ＬＯＸアッセイ用に調製された。
【００８５】
アッセイは、次に、ＣＯＸ−１（雄ヒツジ精嚢）及びＣＯＸ−２（ヒツジ胎盤）について、以下のように行われた。試料とアッセイ混合物との、室温で１５分間のプレインキュベーションの後、反応は、アラキドン酸（１０μＭ）の添加により開始された。インキュベーション時間は３分間であった。対照［ｔ（０）］は、熱不活性化された酵素により行われた。
【００８６】
いくつかの濃度の試料及び参照化合物の、ＣＯＸの活性に対する効果は、アッセイ条件下で産生されるプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の量を定量することにより測定された。
【００８７】
ＰＧＥ２の定量化は、ケイマン（Ｃａｙｍａｎ）からの、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）キット、Ｎｏ  ５１４０１０を用いて行われた。光学密度は、λ＝４１５ｎｍにおいて測定された。量は、少なくとも５つの異なる濃度からなる標準曲線を用いて計算された。
【００８８】
各サンプルポイントは、二重に測定された。用量関連阻害値は、陽性対照値の百分率として表された。ＩＣ５０値（阻害レベルが５０％であるときの試料濃度に対応する）は、図表により測定された。以下の表、図表、及び図３Ａ、３Ｂ、４Ａ、及び４Ｂは、アッセイ及び結果を要約している。
【００８９】
【表８】
2009521476.tif 000010
【００９０】
【表９】
2009521476.tif 000011
【００９１】
【表１０】
2009521476.tif 000012
【００９２】
【表１１】
2009521476.tif 000013
【００９３】
【表１２】
2009521476.tif 000014
【００９４】
要約すれば、モリンダ・シトリフォリア種子抽出物は、インビトロのＣＯＸ−１活性を明らかに阻害した。ＣＯＸ−１活性の阻害の程度には変動があり、ＩＣ５０値は、Ｖｉｐ＿Ｅ＿Ｍｏｃｉ’０５＿１００についての５０μｇ／ｍｌから、Ｖｉｐ＿Ｅ＿Ｍｏｃｉ’０５＿１００．１についての８０μｇ／ｍｌであった。ＣＯＸ−２に関しては、２５μｇ／ｍｌのＩＣ５０値をもつＶｉｐ＿Ｅ＿Ｍｏｃｉ’０５＿１００．１が、８０μｇ／ｍｌだけのＩＣ５０値をもつＶｉｐ＿Ｅ＿Ｍｏｃｉ’０５＿１００よりも強い阻害を示した。
【実施例３】
【００９５】
別の実施態様においては、薬理学的スクリーニング研究は、モリンダ・シトリフォリア種子の活性スペクトルを測定するため、また、延長された貯蔵が抽出物の生物活性に影響を及ぼすかどうかを測定するために行われた。この研究は、サイトカイン類、インターロイキン−１β、インターロイキン−６、及びＴＮＦ−αの活性に対する、２つのモリンダ・シトリフォリア抽出物の潜在的阻害効果を測定した。特に、ＩＣ５０値は、ヒトの単球（分化されたＴＨＰ−１細胞）で、当該サイトカイン類について測定された。
【００９６】
モリンダ・シトリフォリア種子は、ラボラトリーミルで粉砕された。得られた種子粉末の半分は、未処理のまま残され、他の半分は、粉末をヘキサン中に、室温で１時間浸漬及び攪拌することにより脱脂された（薬物：ヘキサン−比、１：１０）。真空下での濾過の後、残渣は同じ条件下で３０分間再度脱脂され、真空下で再び濾過された。残留するヘキサンを除去するため、粉末はヒュームフード内に一晩保持された。
【００９７】
脱脂粉末は、異なるエタノール濃度により、１：２の薬物溶媒比で、室温で２４時間抽出された。液体抽出物は、濾過の後、さらなる濃縮工程なしに、バイオアッセイに直接使用された。
【００９８】
次に、ヒトＴＨＰ−１細胞におけるサイトカインアッセイ（α、ＩＬ−１β、及びＩＬ−６）は、以下のように行われた。試料は、予めＰＭＡで分化された細胞（ヒトＴＨＰ−１）と、３７℃で３０分間プレインキュベートされた（αについては５ｘ１０４細胞／ｍｌ、ＩＬ−１βについては１０４細胞／ｍｌ、ＩＬ−６については５ｘ１０５細胞／ｍｌ）。反応はＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）により開始され、インキュベーションは３７℃で２４時間行われた。陰性対照［ｔ（０）］は、ＬＰＳ刺激なしにアッセイ混合物を用いて行われた。
【００９９】
ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、及びＩＬ−６の定量は、ケイマン（Ｃａｙｍａｎ）からの、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）キット、Ｎｏ  ５８９２０１（ＴＮＦ−α）、Ｎｏ：５８３３１１（ＩＬ−１β）、及びＮｏ：５８３３６１（ＩＬ−６）を用いて行われた。光学密度は、λ＝４１５ｎｍにおいて測定された。量は、少なくとも５つの異なる濃度からなる標準曲線を用いて計算された。
【０１００】
各サンプルポイントは、二重に測定された。用量関連阻害値は、陽性対照値の百分率として表された。ＩＣ５０値（阻害レベルが５０％であるときの試料濃度に対応する）は、図表により測定された。以下の表、図表、及び図５Ａ、５Ｂ、６Ａ、６Ｂ、７Ａ、及び７Ｂは、アッセイ及び結果を要約している。
【０１０１】
【表１３】
2009521476.tif 000015
【０１０２】
【表１４】
2009521476.tif 000016
【０１０３】
【表１５】
2009521476.tif 000017
【０１０４】
【表１６】
2009521476.tif 000018
【０１０５】
【表１７】
2009521476.tif 000019
【０１０６】
【表１８】
2009521476.tif 000020
【０１０７】
【表１９】
2009521476.tif 000021
【０１０８】
【表２０】
2009521476.tif 000022
【０１０９】
要約すれば、双方の抽出物は、上記に例示のように、濃度依存性のＴＮＦ−α阻害を誘導した。１００μｇ／ｍｌの抽出物濃度において、ＴＮＦ−α産生の５０％阻害が観察された。ＬＰＳ誘導性のサイトカインＩＬ−６は、Ｖｉｐ＿Ｅ＿Ｍｏｃｉ’０５＿１００及びＶｉｐ＿Ｅ＿Ｍｏｃｉ’０５＿１００．１により、それぞれ８０μｇ／ｍｌ及び６０μｇ／ｍｌのＩＣ５０値で、明らかに阻害された。ＩＬ−１βの明らかな阻害もまた、Ｖｉｐ＿Ｅ＿Ｍｏｃｉ’０５＿１００について９０μｇ／ｍｌの、またＶｉｐ＿Ｅ＿Ｍｏｃｉ’０５＿１００．１について６０μｇ／ｍｌのＩＣ５０値により観察された。
【実施例４】
【０１１０】
別の実施態様においては、モリンダ・シトリフォリア種子抽出物の活性スペクトルを測定するため、別の薬理学的スクリーニング研究が行われた。この研究は、ヒト白血球エラスターゼ（ＨＬＥ）の活性に対する、２つの抽出物の潜在的阻害効果を測定した。特に、ＩＣ５０値は、ＨＬＥについて、単離された酵素で測定された。
【０１１１】
種子抽出物を調製するために利用された方法は、上述する実施例に記載されている。
【０１１２】
白血球エラスターゼアッセイは、以下のように行われた。試料を酵素ＨＬＥ（２０ｎＭ）と、室温で１０分間プレインキュベートした後、反応は酵素基質（５ｍＭ）により開始された。反応時間は室温で１５分間であった。対照［ｔ（０）］は、酵素なしで行われた。いくつかの濃度の試料及び参照化合物の、ＨＬＥの活性に対する効果は、アッセイ条件下でｐ−ニトロアニリンの量を定量することにより測定された。ｐ−ニトロアニリンの定量は、直接的な光度測定により行われた。光学密度は、λ＝４１５ｎｍにおいて測定された。量は、少なくとも５つの異なる濃度からなる標準曲線を用いて計算された。
【０１１３】
全てのサンプルポイントは、二重に測定された。用量関連阻害値は、陽性対照値の百分率として表された。ＩＣ５０値（阻害レベルが５０％であるときの試料濃度に対応する）は、図表により測定された。以下の表、図表、及び図８Ａ及び８Ｂは、アッセイ及び結果を要約している。
【０１１４】
【表２１】
2009521476.tif 000023
【０１１５】
【表２２】
2009521476.tif 000024
【０１１６】
【表２３】
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【０１１７】
【表２４】
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【０１１８】
要約すれば、モリンダ・シトリフォリアの２つの抽出物は、ＨＬＥの活性を様々な程度に阻害した。Ｖｉｐ＿Ｅ＿Ｍｏｃｉ’０５＿１００は、ＨＬＥ活性を７μｇ／ｍｌのＩＣ５０値で阻害し、Ｖｉｐ＿Ｅ＿Ｍｏｃｉ’０５＿１００．１は、５０μｇ／ｍｌの値を示した。
【実施例５】
【０１１９】
本実施例においては、モリンダ・シトリフォリア種子抽出物の活性スペクトルを測定するため、別の薬理学的スクリーニング研究が行われた。この研究は、ニトライト（Ｎｉｔｒｉｔｅ）・オキシドシンターゼ（ｉＮＯＳ）の活性に対する、抽出物の潜在的阻害効果を測定した。特に、ＩＣ５０値は、ｉＮＯＳについてネズミマクロファージ（Ｊ７７７４Ａ．１）で測定された。
【０１２０】
種子抽出物を調製するためのプロセスは、上述の実施例に記載されている。ｉＮＯＳアッセイは、以下のように行われた。ネズミマクロファージ（１．５ｘ１０５細胞／ウェル）は、２４時間播種された。試料を細胞とともに室温で１０分間プレインキュベートした後、反応は１μｇ／ｍｌのＬＰＳ（大腸菌  ０５５：Ｂ５）により開始された。インキュベーション時間は、３７℃及び５％ＣＯ２において２４時間であった。対照［ｔ（０）］は、ＬＰＳ刺激なしに行われた。
【０１２１】
一酸化窒素の定量は、バイオビジョン（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）からの一酸窒素比色アッセイキット（Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ）（商品番号：＃Ｋ２６２−２００）を用いて行われた。光学密度は、λ＝５７０ｎｍにおいて測定された。量は、少なくとも７つの異なる濃度からなる標準曲線を用いて計算された。サンプルポイントは、三重に測定された。
【０１２２】
用量関連阻害値は、陽性対照値の百分率として表された。適用可能であれば、ＩＣ５０値（阻害レベルが５０％であるときの試料濃度に対応する）は、図表により測定された。以下の表、図表、及び図９は、アッセイ及び結果を要約している。
【０１２３】
【表２５】
2009521476.tif 000027
【０１２４】
【表２６】
2009521476.tif 000028
【０１２５】
【表２７】
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【０１２６】
要約すれば、一酸化窒素の産生はＮＯ−シンターゼ酵素ファミリー（ＮＯＳ）により触媒され、ＮＯＳ−シンターゼの、構成的に産生されるのアイソエンザイムと、誘導可能なアイソエンザイムとは、識別可能である。構成型−ｅＮＯＳ−は、心臓血管系の細胞タイプに発生する。誘導型−ｉＮＯＳ−は、基底状態では産生されない。産生は、炎症性疾患の間に、例えばマクロファージ又は内皮細胞において、細菌リポ多糖又は他の感染性の刺激により誘発されうる。試験されたモリンダ・シトリフォリア抽出物、Ｖｉｐ＿Ｅ＿Ｍｏｃｉ’０５＿１００は、２５μｇ／ｍｌのＩＣ５０値により、ｉＮＯＳの明らかな阻害を示した。
【０１２７】
本発明は、その本質的な特徴の精神から離れることなく、他の特定の形状において具現化されてもよい。記載された実施態様は、全ての点において、単なる例証としてみなされるべきであり、制限するものではない。本発明の範囲は、それ故、上記の記載ではなく、添付の特許請求の範囲によって示される。特許請求の範囲の同等物の意味及び範囲内に入る全ての変更は、本発明の範囲内に包含される。
【実施例６】
【０１２８】
別の実施態様においては、試験は、抽出プロセスに対する溶媒、すなわち、８０％ｗ／ｗ及び９０％ｗ／ｗエタノールの影響を測定するために行われた。様々なプロセス段階が検討され、調整された。必要な助剤の量が評価及び規定された。次に続くプロセス段階に対する、脱脂プロセスの影響が試験された。脱脂プロセスが必要か否かも調べられた。さらに、さらさらした粉末を得るための乾燥プロセスが研究された。すべてのプロセス段階は、薬理試験を伴った。
【０１２９】
全ての抽出は、遠心ミル中で２ｍｍサイズに粉砕されたモリンダ・シトリフォリア種子から行われた。粉砕された種子は、３重量部（ｗ／ｗ）のｎ−ヘキサンと混合され、６０分間攪拌され、次いで深層濾過された。濾過後の薬物残渣は、２重量部（ｗ／ｗ）のｎ−ヘキサンと混合され、３０分間攪拌された。薬物残渣は次に、深層濾過によりヘキサンから分離された。得られたこの残渣は、残留ヘキサンの除去のため、エアフローフード内で一晩保持された。この脱脂された薬物が、１セットの実験の出発物質であった。
【０１３０】
抽出物は、脱脂及び非脱脂薬物から製造された。使用された溶媒は、８０％ｗ／ｗ及び９０％ｗ／ｗエタノールであった。全ての抽出は、加熱及び攪拌装置を具備したコニカルフラスコ内で、以下の固定されたパラメータのもとに行われた。
温度：        ４０℃
抽出時間：    １２０分間
薬物−溶媒比：１／６
薬物量        １００ｇ
溶媒量        ６００ｇ
【０１３１】
抽出後、薬物残渣は深層濾過により除去された。そのようにして得られた濾液（ミセラ）は、容易に濃縮されて軟エキスとした。
【０１３２】
濾液を濃縮するため、アラビアガムの溶液、水中の３０％ｗ／ｗ（最終的な乾燥エキス量に対して）が調製され、次いで、液体抽出物は、４０℃、減圧下（２００−１００ミリバール）の同時蒸発プロセスの間に、この溶液中に導入された。蒸発プロセスは、約３０％ｗ／ｗの乾燥重量（ＤＣ）の軟エキスが得られたとき停止された。
【０１３３】
蒸発後に得られた全ての軟エキスは、二分割された。一方は、１７０℃の吸入温度をもつ、ラボスケールの噴霧乾燥ユニットにおいて乾燥された。他方は、真空オーブン中で、減圧下（６０−３０ミリバール）に４０℃で乾燥された。
【０１３４】
脱脂プロセスが行われ、残留ヘキサンの除去の後、薬物は抽出に使用された。
【０１３５】
抽出及び濾過の後、濁った濾液が得られた。脱脂及び非脱脂薬物の間には、顕著な差異はなかった。
【０１３６】
【表２８】
2009521476.tif 000030
【０１３７】
ミセラの乾燥含量（ＤＣ）は、４つの抽出物全てについて、約１％ｗ／ｗであった。
【０１３８】
アラビアガムの溶液を用いた、減圧下の同時蒸発プロセスにより、均一な軟エキスが形成した。沈澱は見られなかった。抽出物Ｖｉｐ−Ｅ−Ｍｏｃｉ０６−１２０は、蒸発プロセスの間に、「油脂滴」の形成を示した。この問題は、アラビアガムの量を４０％ｗ／ｗ（最終的な乾燥エキス量に対して）に増やすことにより解決された。
【０１３９】
【表２９】
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【０１４０】
軟エキスは、１７０℃の入口温度を用いて噴霧乾燥された。各抽出物につき、ノズルの閉塞はなかった。粉末の自由排出は得られなかった。生成物は、噴霧乾燥塔の内側へ完全に戻された。ほとんどの遊離粉末は、サイクロン内に到達しなかった。用いたパラメータによる噴霧乾燥は、また一般的に、乾燥のための好適な方法ではないようである。
【０１４１】
軟エキスの真空オーブン乾燥は、わずかに粘着性の乾燥ケークを生じ、それはラボスケールミルにおいて粉砕され、さらさらした粉末を得た。抽出物番号Ｖｉｐ−Ｅ−Ｍｏｃｉ’０６−１２０については、１％ｗ／ｗの親水コロイド状シリカが添加され、さらさらした粉末を得た。真空オーブン乾燥は、さらさらした粉末を得るための実行可能な方法であると考えられる。
【０１４２】
表では、各抽出のミセラ（液体抽出物）及び乾燥エキスについての薬理結果が表されている。
【０１４３】
【表３０】
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【０１４４】
非脱脂薬物の、８０％ｗ／ｗエタノールによる抽出（Ｖｉｐ−Ｅ−Ｍｏｃｉ’０６−１２２）により、最良の薬理活性が得られた。ミセラ（液体抽出物）と最終乾燥エキスとを比較して、活性の劣化はなかった。
【０１４５】
抽出物Ｖｉｐ−Ｅ−Ｍｏｃｉ’０６−１１９及びＶｉｐ−Ｅ−Ｍｏｃｉ’０６−１２２は、他の双方の抽出物の２倍の効力がある。
【０１４６】
抽出及び濃縮プロセスについては、脱脂及び非脱脂薬物の間で、有意差はなかった。抽出溶媒としての８０％ｗ／ｗ及び９０％ｗ／ｗエタノールの間にも、差異はなかった。９０％ｗ／ｗエタノールによる抽出及び非脱脂薬物のみ、濃縮工程においてより多くの助剤を必要とした。用いたパラメータによる噴霧乾燥は、生成物の自由排出がないことから、適用不能と考えられる。真空オーブン乾燥法により、さらさらした粉末が生じる。８０％ｗ／ｗエタノールによる抽出及び非脱脂薬物（Ｗｉｐ−Ｅ−Ｍｏｃｉ０６−１１９）、並びに９０％ｗ／ｗエタノール及び脱脂薬物（Ｗｉｐ−Ｅ−Ｍｏｃｉ０６−１２２）は、最も高い薬理活性を示していた。これらの結果により、８０％ｗ／ｗエタノールによる非脱脂薬物の抽出が、経済及び技術的原理から、最良の抽出法として評価されるであろう。
【実施例７】
【０１４７】
別の実施例においては、実験は、部分実験により、最適加工パラメータを決定するべく行われた。基本の技術的パラメータが、後の経済的な大規模製造が技術的な問題なしに実行され得ることを確認するために試験された。
【０１４８】
第１の実験においては、抽出収率に最良の割合を決定する目的で、脱脂され、粉砕されたモリンダ・シトリフォリア種子を出発物質として用い、種々の薬物−溶媒比（ＤＳＲ）が調べられた。さらに、種々の助剤が、蒸発及び乾燥のプロセスを改善するそれらの能力について調べられた。
【０１４９】
全ての実際の抽出は、遠心ミルにおいて２ｍｍサイズに粉砕され、脱脂されたモリンダ・シトリフォリア（Ｍｏｒｉｎｄａｅ  ｃｉｔｒｉｆｏｌｉａｅ）種子の１試料（Ｖｉｐ−Ｍｏｃｉ’０６−３６；ブラット・ローソン（Ｂｒａｔｔ  Ｒａｗｓｏｎ）より供給、５ｋｇ、２００６年、春）から行われた。
【０１５０】
粉砕された種子の一部は、３重量部（ｗ／ｗ）のヘキサン中で、１時間、浸漬及び攪拌され、次いで深層濾過された。薬物残渣は、再度、２重量部（ｗ／ｗ）のヘキサン中で３０分間浸漬及び攪拌され、続いて深層濾過され、脱脂された薬物は、残留ヘキサンの除去のため、エアフローフード内に一晩保持された。濾液は、脂肪化合物（ヘキサン可溶性）の実際の量を測定するべく濃縮された。脱脂された薬物試料は、抽出実験に使用された。
【０１５１】
全ての抽出は、４０℃において１２０分間、攪拌下に行われた。全ての抽出に使用された抽出溶媒は、８０％ｗ／ｗエタノールであった。
【０１５２】
１／３、１／６、１／９、１／１２、及び１／１５の薬物−溶媒比（ＤＲＳ）が調べられたが、他の抽出パラメータは一定に維持された。５０．０ｇの、脱脂され、粉砕された種子が、ＤＳＲ１／３−１／１５の抽出に使用された。
【０１５３】
抽出は、マグネチックスタラー及び加熱を具備したコニカルフラスコ内で行われた。より大きいバッチ（より高いＤＳＲ）用には、抽出は、加熱及び攪拌装置を具備した２Ｌのリアクタ内で行われた。抽出後、液体抽出物（ミセラ）は深層濾過され、溶媒は減圧下で４０℃で蒸発された。
【０１５４】
アラビアガムは、蒸発プロセスの間、及び後に、均一な抽出物を得るための、準エマルジョン（ｑｕａｓｉ−ｅｍｕｌｓｉｏｎ）を形成するその態度について試験された。それ故、液体抽出物は、最終的な軟エキスが受け取られるまで、アラビアガム（水中、１０％ｗ／ｗ）の溶液中へ連続的に添加された。蒸発は、減圧下で４０℃で行われた。
【０１５５】
アラビアガムは、蒸発プロセスの間、及び後に、均一な抽出物を得るための、準エマルジョン（ｑｕａｓｉ−ｅｍｕｌｓｉｏｎ）を形成するその振る舞いについて試験された。それ故、液体抽出物は、最終的な軟エキスが受け取られるまで、アラビアガム（水中、１０％ｗ／ｗ）の溶液中へ連続的に添加された。蒸発は、減圧下で４０℃で行われた。
【０１５６】
さらに、クエン酸ナトリウム（三塩基性無水物；推定される最終抽出物の０．５％ｗ／ｗ）は、蒸発プロセスの間の生物活性の可能な損失を防止する目的で、アラビアガムを含有する液体抽出物の一部へ、重金属キレート剤として添加された。蒸発は、減圧下で４０℃で行われた。
【０１５７】
親水コロイド状シリカ（エアロシル（Ａｅｒｏｓｉｌ））は、ケーク形成を防止するため、及びさらさらした粉末を得るために、粉砕プロセスの間に乾燥エキスに添加された。
【０１５８】
全ての軟エキスは、その後真空オーブン内で、４０℃及び１００−３０ｍｂａｒにおいて、乾燥され、乾燥エキスを得た。
【０１５９】
脱脂プロセスは問題なく行われた。約６％ｗ／ｗの脂肪化合物（ヘキサン可溶性画分）が、脱脂プロセスにより種子から除去された。
【０１６０】
液体抽出物の抽出及び濾過は、問題を示さなかった。しかしながら、液体抽出物の蒸発の間に、均一な軟エキスの形成を妨害する凝集及び沈澱が発生し、物理化学的反応の可能性を示唆していた。
【０１６１】
様々な収量が、以下の表に示されている。
【０１６２】
【表３１】
2009521476.tif 000033
【０１６３】
図１０は、ＤＳＲ１／３から１／１２までの、収量の増加を示す。１／１２及び１／１５のＤＳＲで、プラトーに達する。１／１２及び１／１５のＤＳＲの間には、これ以上の関連する差異はない。
【０１６４】
溶媒の量を考慮すれば、１／１２のＤＳＲは、一次抽出段階のための技術的及び経済的観点の下で最良の抽出法として評価することができる。さらに実験は、標準的な蒸発法が軟エキス（乾燥エキスを製造するために不可欠な中間体である）の製造に適さないことを示した。
【０１６５】
水を用いたアラビアガム１０％ｗ／ｗ溶液（最終抽出物について、濃度は２０％ｗ／ｗ）への液体抽出物の添加と、それに続く同時蒸発は、均一な軟エキスを生じた。最初の実験において見られた沈澱は、観察されなかった。
【０１６６】
クエン酸ナトリウム（三塩基性無水物）の添加は、蒸発及び乾燥プロセスにおいて、影響を示さなかった。クエン酸ナトリウムの最終的な値は、未処理及び処理試料の生物活性について測定されるであろう。
【０１６７】
軟エキスは、真空オーブン内で４０℃において、問題なく乾燥された。しかしながら、乾燥エキスは粘着性であり、さらさらの粉末に粉砕されず、吸湿性又は熱可塑性を示唆していた。この問題は、粉砕プロセスの間の親水コロイド状シリカの添加により解決可能であった。さらさらした粉末が得られた。
【０１６８】
これまで行われた実験に基づき、脱脂された２ｍｍサイズのラグ、抽出溶媒８０％ｗ／ｗエタノール、４０℃で２時間、及び１／１２のＤＳＲの使用は、一次プロセスのための予備的パラメータとして設定可能であった。軟エキスのさらなる加工用には、アラビアガムは、蒸発プロセスを通じて凝集及び沈澱の形成を防止することから、好適な添加剤であると見られる。
【０１６９】
いくつかの実施態様においては、加工段階は、増大された活性をもつ抽出物を製造するべく操作することができる。特に、一次抽出用のエタノール濃度は、劇的な活性の増加又は減少を生じることがある。例えば、３０％ｍ／ｍエタノールによる抽出は、１００μｇ／ｍｌのＩＣ５０を生じたのに対し、８０％ｍ／ｍエタノールによる抽出は、１０μｇ／ｍｌのＩＣ５０を生じた。したがって、ある実施態様においては、プロセス段階は、阻害効果に影響を及ぼすべく変更することができ、また効力の高い生物活性乾燥粉末エキスの製造を可能にするべく変更することができる。
【０１７０】
本発明は、その本質的な特徴の精神から離れることなく、他の特定の形状において具現化することができる。記載された実施態様は、全ての点において、単なる例証としてみなされるべきであり、制限するものではない。本発明の範囲は、それ故、上記の記載ではなく添付の特許請求の範囲によって示される。特許請求の範囲の意味及び同等物の範囲内に入る全ての変更は、本発明の範囲内に包含される。
【図面の簡単な説明】
【０１７１】
【図１】モリンダ・シトリフォリア種子抽出物による、５−ＬＯＸ活性の阻害を例示する図である。
【図２Ａ】モリンダ・シトリフォリア種子抽出物による、５−ＬＯＸの阻害を例示する図である。
【図２Ｂ】モリンダ・シトリフォリア種子抽出物による、５−ＬＯＸの阻害を例示する図である。
【図２Ｃ】モリンダ・シトリフォリア種子抽出物による、５−ＬＯＸの阻害を例示する図である。
【図２Ｄ】モリンダ・シトリフォリア種子抽出物による、５−ＬＯＸの阻害を例示する図である。
【図２Ｅ】モリンダ・シトリフォリア種子抽出物による、５−ＬＯＸの阻害を例示する図である。
【図２Ｆ】モリンダ・シトリフォリア種子抽出物による、５−ＬＯＸの阻害を例示する図である。
【図３】モリンダ・シトリフォリア種子抽出物による、ＣＯＸ−１の阻害を例示する図である。
【図４】モリンダ・シトリフォリア抽出物による、ＣＯＸ−１の阻害を例示する図である。
【図５】モリンダ・シトリフォリア抽出物による、ＴＮＦ−αの阻害を例示する図である。
【図６】モリンダ・シトリフォリア種子抽出物による、ＩＬ−６の阻害を例示する図である。
【図７】モリンダ・シトリフォリア種子抽出物による、ＨＬＥの阻害を例示する図である。
【図８】モリンダ・シトリフォリア種子抽出物による、ｉＮＯＳの阻害を例示する図である。
【図９】モリンダ・シトリフォリア種子抽出物による、ｉＮＯＸの阻害を例示する図である。
【図１０】薬物−溶媒比に対する収量を例示する図である。
【図１】
2009521476.tif 000034
【図２Ａ】
2009521476.tif 000035
【図２Ｂ】
2009521476.tif 000036
【図２Ｃ】
2009521476.tif 000037
【図２Ｄ】
2009521476.tif 000038
【図２Ｅ】
2009521476.tif 000039
【図２Ｆ】
2009521476.tif 000040
【図３】
2009521476.tif 000041
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年8月18日(2008.8.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２、インターロイキン−１β、インターロイキン−６、ＴＮＦ−α、ＨＬＥ、ｉＮＯＳ、５−リポキシゲナーゼ、又は１５−リポキシゲナーゼを阻害するための方法であって、
モリンダ・シトリフォリア（Ｍｏｒｉｎｄａ  ｃｉｔｒｉｆｏｌｉａ）の種子を収集すること；
種子を粉砕すること；
粉砕された後の種子を有機溶媒と混合して種子を脱脂すること；
過剰の有機溶媒を除去すること；
加工され脱脂されたモリンダ・シトリフォリアの種子を、アルコール系溶液に添加すること；
アルコール可溶性画分を収集すること；
前記アルコール可溶性画分から残留アルコールを除去してアルコール可溶性画分活性成分を得ること；
前記抽出された成分を哺乳類に導入することにより、５−リポキシゲナーゼ、及び１５−リポキシゲナーゼを阻害すること、
の各工程を含んでなる方法。
【請求項２】
有機溶媒がヘキサンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
種子が、最初に、有機溶媒中で、室温において約１時間脱脂される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
脱脂する工程及び過剰の溶媒を除去する工程が、アルコール系溶液により画分を抽出する前に１回繰返される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
アルコール系溶液が、約３０〜９６体積％の量で存在するエタノールである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
アルコール系溶液が、約８０％エタノールである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記アルコール系溶液が、メタノール、エタノール、及び酢酸エチルからなる群より選択される成分を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２、インターロイキン−１β、インターロイキン−６、ＴＮＦ−α、ＨＬＥ、ｉＮＯＳ、５−リポキシゲナーゼ、又は１５−リポキシゲナーゼを阻害するための組成物であって、モリンダ・シトリフォリア種子からの抽出物、モリンダ・シトリフォリア種子、脱脂され粉砕されたモリンダ・シトリフォリア種子粉末からなる群より選択される加工されたモリンダ・シトリフォリア成分を含んでなる組成物。
【請求項９】
請求項８に記載の組成物であって、
モリンダ・シトリフォリアの種子を収集すること；
種子を粉砕すること；
加工されたモリンダ・シトリフォリア種子を、アルコール系溶液に添加すること；
加工されたモリンダ・シトリフォリア種子から、溶液中に成分を抽出して画分を得ること；
の各工程を含んでなる方法により製造される組成物。
【請求項１０】
粉砕された後の種子を有機溶媒と混合して種子を脱脂すること、及び、加工された種子をアルコール系溶液に添加する前に過剰の有機溶媒を除去すること、の各工程をさらに含んでなる、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
組成物が、アラキドン酸のその中間体成分への酸素化を阻害する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１２】
ＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２、インターロイキン−１β、インターロイキン−６、ＴＮＦ−α、ＨＬＥ、ｉＮＯＳ、５−リポキシゲナーゼ、又は１５−リポキシゲナーゼを阻害するための製剤を製造する方法であって、
モリンダ・シトリフォリアの種子を収集すること；
種子を粉砕すること；
加工されたモリンダ・シトリフォリア種子を、アルコール系溶液に添加すること；
前記加工されたモリンダ・シトリフォリア種子から、溶液中に成分を抽出して画分を得ること；
の各工程を含んでなる方法。
【請求項１３】
粉砕された後の種子を有機溶媒と混合して種子を脱脂すること、及び、加工された種子をアルコール系溶液に添加する前に過剰の有機溶媒を除去すること、の各工程をさらに含んでなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
有機溶媒がヘキサンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
種子が、最初に、有機溶媒中で、室温において約１時間脱脂される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
脱脂する工程及び過剰の溶媒を除去する工程が、アルコール系溶液により画分を抽出する前に１回繰返される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
アルコール系溶液が、約３０〜９６体積％の量で存在するエタノールである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
アルコール系溶液が、約８０％エタノールである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記アルコール系溶液が、メタノール、エタノール、及び酢酸エチルからなる群より選択される成分を含んでなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
加工されたモリンダ・シトリフォリア製品中の活性成分を単離し、及び前記活性成分を使用してＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２、インターロイキン−１β、インターロイキン−６、ＴＮＦ−α、ＨＬＥ、ｉＮＯＳ、５−リポキシゲナーゼ、又は１５−リポキシゲナーゼを阻害するための方法であって、
モリンダ・シトリフォリア植物から種子を取得すること；
種子を有機溶媒と混合すること；
過剰の有機溶媒を除去すること；
脱脂された種子を、アルコール系溶液と混合すること；
アルコール可溶性画分を収集すること；
前記アルコール可溶性画分から残留アルコールを除去してアルコール可溶性画分活性成分を得ること；
前記活性成分を、栄養補助薬製剤中に混合すること、
の各工程を含んでなる方法。
【国際調査報告】
2009521476.tif 000049