(57)【要約】  本発明は、ＰＫＣ４１２のようなＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤での非小細胞性肺癌の処置法に関する。本発明はまたＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤と、ＢＡＫのアクティベーターのようなミトコンドリア外膜の透過処理のアクティベーターの医薬組み合わせにも関する。それはまた非小細胞性肺癌の処置のための、ミトコンドリア外膜の透過処理のアクティベーターとＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤の医薬組み合わせの使用、および、その処置用薬剤の製造のための、そのような医薬組成物の使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非小細胞性肺癌の処置または予防方法であって、式(II)または(III)：
【化１】
2009504608.tif 000009
【化２】
2009504608.tif 000010
(ここで、化合物(III)は化合物(II)の部分的に水素化された誘導体である)
の化合物から選択されるスタウロスポリン誘導体；または式(IV)または(Ｖ)または(VI)または(VII)：
【化３】
2009504608.tif 000011
【化４】
2009504608.tif 000012
【化５】
2009504608.tif 000013
【化６】
2009504608.tif 000014
のスタウロスポリン誘導体
〔式中、Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、非置換または置換アルキル、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、エーテル化またはエステル化ヒドロキシ、アミノ、一または二置換アミノ、シアノ、ニトロ、メルカプト、置換メルカプト、カルボキシ、エステル化カルボキシ、カルバモイル、Ｎ−モノ−またはＮ,Ｎ−ジ−置換カルバモイル、スルホ、置換スルホニル、アミノスルホニルまたはＮ−モノ−またはＮ,Ｎ−ジ−置換アミノスルホニルであり；
ｎおよびｍは、互いに独立して、０(０を含む)から４(４を含む)の数字であり；
ｎ'およびｍ'は、互いに独立して、０(０を含む)から４(４を含む)の数字であり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ８およびＲ１０は、互いに独立して、水素、−Ｏ−、３０個までの炭素原子のアシル、いずれの場合も２９個までの炭素原子の脂肪族、炭素環式、または炭素環式−脂肪族ラジカル、いずれの場合も２０個までの炭素原子およびいずれの場合も９個までのヘテロ原子のヘテロ環式またはヘテロ環式−脂肪族ラジカル、３０個までの炭素原子のアシルであり、ここでＲ４はまた存在しなくてもよく；
またはＲ３が３０個までの炭素原子のアシルならば、Ｒ４はアシルではなく；
ｐは、Ｒ４が存在しないならば０であるか、またはＲ３およびＲ４が両方とも存在し、いずれも上記ラジカルの一つであるとき１であり；
Ｒ５は水素、いずれの場合も２９個までの炭素原子の脂肪族、炭素環式、または炭素環式−脂肪族ラジカル、またはいずれの場合も２０個までの炭素原子およびいずれの場合も９個までのヘテロ原子のヘテロ環式またはヘテロ環式−脂肪族ラジカル、または３０個までの炭素原子のアシルであり；
Ｒ７、Ｒ６およびＲ９はアシルまたは−(低級アルキル)−アシル、非置換または置換アルキル、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、エーテル化またはエステル化ヒドロキシ、アミノ、一または二置換アミノ、シアノ、ニトロ、メルカプト、置換メルカプト、カルボキシ,カルボニル、カルボニルジオキシ、エステル化カルボキシ、カルバモイル、Ｎ−モノ−またはＮ,Ｎ−ジ−置換カルバモイル、スルホ、置換スルホニル、アミノスルホニルまたはＮ−モノ−またはＮ,Ｎ−ジ−置換アミノスルホニルであり；
Ｘは２個の水素原子；１個の水素原子とヒドロキシ；Ｏ；または水素および低級アルコキシであり；
Ｚは水素または低級アルキルであり；
そして環Ａ中の波線により特徴付けられる２個の結合が存在せず、４個の水素原子で置換されており、環Ｂ中の２個の波線が、各々、それぞれの平行する結合と一緒になって二重結合を意味するか；
または環Ｂ中の波線により特徴付けられる２個の結合が存在せず、４個の水素原子で置換されており、環Ａ中の２個の波線が、各々、それぞれの平行する結合と一緒になって二重結合を意味するか；
または環Ａおよび環Ｂ両方の全４個の波線が存在せず、合計８個の水素原子で置換されている。〕
または少なくとも１個の塩形成基が存在するならばそれらの塩；
を含むチロシンキナーゼ阻害剤を投与することを含み、ここで、該チロシンキナーゼ阻害剤が非小細胞性肺癌を処置または予防する、方法。
【請求項２】
非小細胞性肺癌が細胞毒性抗癌剤に感受性である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
処置がトポイソメラーゼ阻害剤を投与することをさらに含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
トポイソメラーゼ阻害剤がＶＰ１６である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
非小細胞性肺癌が細胞毒性抗癌剤に耐性を有する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
ＢＡＫ活性のモジュレーターを投与することをさらに含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
モジュレーターがＢＡＫ活性のアクティベーターである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
処置がミトコンドリア外膜透過処理を増強する組成物を投与することをさらに含む、請求項５記載の方法。
【請求項９】
非小細胞性肺癌がＦＬＴ−３変異と関連する、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
チロシンキナーゼ阻害剤が式(Ｉ)：
【化７】
2009504608.tif 000015
の化合物またはその薬学的に許容される塩である、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
非小細胞性肺癌の処置用医薬組成物の製造のための、式(Ｉ)：
【化８】
2009504608.tif 000016
の化合物または薬学的に許容される塩の使用。
【請求項１２】
非小細胞性肺癌の処置のための請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
非小細胞性肺癌を有する哺乳動物の処置方法であって、そのような処置を必要とする哺乳動物にチロシンキナーゼ阻害量の式(Ｉ)：
【化９】
2009504608.tif 000017
の化合物またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法。
【請求項１４】
哺乳動物がヒトである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
式(Ｉ)：
【化１０】
2009504608.tif 000018
の化合物またはその薬学的に許容される塩を含む、非小細胞性肺癌処置用医薬製剤。
【請求項１６】
哺乳動物における非小細胞性肺癌の処置方法であって、そのような処置を必要とする哺乳動物に薬学的に有効量の(ａ)ＦＬＴ−３阻害剤、またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグ、および(ｂ)ＢＡＫ活性のモジュレーター、またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグを同時に、一緒に、別々にまたは連続して投与することを含む、方法。
【請求項１７】
非小細胞性肺癌の処置のための、(ａ)ＦＬＴ−３阻害剤、またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグ、および(ｂ)ＢＡＫ活性のモジュレーター、またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグの組み合わせの使用。
【請求項１８】
非小細胞性肺癌(ＮＳＣＬＣ)の処置のための、請求項１７記載の使用。
【請求項１９】
ＦＬＴ−３阻害剤が式(Ｉ)：
【化１１】
2009504608.tif 000019
のＮ−[(９Ｓ,１０Ｒ,１１Ｒ,１３Ｒ)−２,３,１０,１１,１２,１３−ヘキサヒドロ−１０−メトキシ−９−メチル−１−オキソ−９,１３−エポキシ−１Ｈ,９Ｈ−ジインドロ[１,２,３−ｇｈ：３',２',１'−ｌｍ]ピロロ[３,４−ｊ][１,７]ベンゾジアゾニン−１１−イル]−Ｎ−メチルベンズアミドまたはその塩である、請求項１７記載の使用。
【請求項２０】
塩が薬学的に許容される塩である、請求項１７記載の使用。
【請求項２１】
薬剤耐性癌細胞における薬剤感受性を誘導する方法であって、癌細胞におけるアポトーシスシグナル伝達経路を誘導することを含む、方法。
【請求項２２】
少なくとも１種のＢＡＫ活性のアクティベーターを投与することを含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも１種のＢｃｌ−１／Ｂｃｌ−ＸＬ活性の阻害剤を投与することを含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
癌細胞において誘導される感受性が、スタウロスポリン誘導体を含む薬剤に対するものである、請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
薬剤耐性癌細胞の処置方法であって、癌細胞にアポトーシスの誘導剤およびスタウロスポリン誘導体を投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
導入
生存、遺伝的安定性、代謝活性および増殖を制御する細胞シグナル伝達経路の分子レベルでの理解は、過去数十年で非常に増加している。したがって、前臨床癌モデルおよび腫瘍サンプルにおいて行われる注意深い分析が、悪性形質転換および癌進行への関与因子として、または原因因子としてさえ、これらの経路の特異的脱制御の同定に至っている(１)。このバックグラウンドに反して、癌細胞をそれらの非悪性対応物から分ける特異的標的のために作られた治療の開発に向けて努力している。ＢＣＲ−ＡＢＬ陽性白血病および消化器間質腫瘍における小薬剤キナーゼ阻害剤イマチニブの臨床適用の成功がこのような概念への原理証明を印象的に提供する(２)。しかしながら、見かけ上あまり必須ではないシグナル伝達経路の薬理的阻害剤は選択していない患者集団においてわずかな臨床活性しか示さない。さらに、細胞毒性剤と非抗体阻害剤の組み合わせは、今までのところ、肺癌または結腸直腸癌において改善された臨床結果を生じていない(３−６)。
【背景技術】
【０００２】
これらの観察に基づいて、我々は、薬理的キナーゼ阻害剤により誘導される癌細胞死は、標準細胞毒性抗癌剤により引き金をひかれるものとは異なる分子経路により実質的に実行されると推論した。あるいは、両方の経路がシグナル伝達における共通段階に集束し、それが次いで薬剤耐性を破壊するための戦略的標的を構成する。
【０００３】
進行非小細胞性肺癌(ＮＳＣＬＣ)の患者の細胞毒性処置は中程度の臨床活性しか有しない。最近、上皮細胞増殖因子受容体シグナル伝達の阻害剤がＮＳＣＬＣ患者において効果を示しており、そしてさらなるシグナル伝達経路の調節がかなり見込みがある。既存の抗癌剤では現在標的とされていない分子経路を標的とする癌治療に対する要求が存在する。
【発明の開示】
【０００４】
発明の要約
我々は、ＮＳＣＬＣ細胞におけるタンパク質キナーゼＣ(ＰＫＣ)特異的阻害剤スタウロスポリンおよびＰＫＣ４１２によるアポトーシスの誘導を研究した。興味深いことに、細胞毒性抗癌剤に耐性の細胞株はまたＰＣＫ特異的阻害剤に対して保護されることを発見した。ＰＫＣ阻害剤と細胞毒性剤の組み合わせは、細胞毒性の増加または低下のような様々な結果となった。対照的に、ＢＡＫの条件的発現によるアポトーシスのミトコンドリア経路のターゲティングは、ＰＫＣ特異的阻害剤に対して薬剤耐性ＮＳＣＬＣを確実に感作した。結論として、ＰＫＣ４１２のようなＰＫＣ特異的阻害剤と組み合わせたＢＣＬ−２タンパク質ファミリーの治療的ターゲティングは、癌処置におけるキナーゼ阻害剤の効果を改善する見込みのある概念である。
【０００５】
図面の簡単な説明
図１Ａ−１Ｂは、インビトロで細胞毒性抗癌剤およびＰＫＣ特異的阻害剤で処置したＮＳＣＬＣ細胞株の耐性の類似パターンのグラフ表示である。
【０００６】
図２Ａ−２Ｅは、細胞毒性抗癌剤とＰＫＣ特異的阻害剤の組み合わせが、インビトロで予測可能な相乗的細胞毒性をもたらすことができなかったことを示すグラフ表示である。
【０００７】
図３Ａ−３Ｄは、ＰＫＣ特異的阻害剤に耐性のＮＳＣＬＣ細胞株がミトコンドリアチトクロームｃの遅い放出を示し、ΔΨｍを維持し、そしてカスパーゼの活性化ができないことを示す、グラフおよび図表示である。
【０００８】
図４Ａ−４Ｄは、ＢＡＫの条件的発現が薬剤耐性ＮＳＣＬＣ細胞株をアポトーシスに対して感受性にすることを示す、図およびグラフ表示である。
【０００９】
図５Ａ−５Ｄは、ミトコンドリアＢＡＫのターゲティングが薬剤耐性ＮＳＣＬＣ細胞株をＰＫＣ４１２誘導アポトーシスに対して感受性にすることを示すグラフ表示である。
【００１０】
詳細な記載
生存、遺伝的安定性、代謝活性および増殖を制御する細胞シグナル伝達経路の分子レベルでの理解は、過去数十年で非常に増加している。したがって、前臨床癌モデルおよび腫瘍サンプルにおいて行われる注意深い分析が、悪性形質転換および癌進行への関与因子として、または原因因子としてさえ、これらの経路の特異的脱制御の同定に至っている(１)。このバックグラウンドに反して、癌細胞をそれらの非悪性対応物から分ける特異的標的のために作られた治療の開発に向けて努力している。
【００１１】
ＢＣＬ２癌遺伝子(OMIM 151430)は、種々の条件下でアポトーシスの強力なサプレッサーとして機能する。Ｂｃｌ−２同族体であるＢｃｌ−２アンタゴニストキラー−１(“ＢＡＫ１” OMIM 600516)タンパク質はＢｃｌ−２に拮抗し、細胞死を促進し、そしてＢｃｌ−２により提供されるアポトーシスからの保護と逆反応することが発見されている。ＢＡＫの過剰発現は、血清除去線維芽細胞の急速で長いアポトーシスを誘導し、ＢＡＫが細胞死機構の活性化に直接関与することを示唆する。ＢＡＫは適当な刺激後に、最初にアポトーシス細胞死を増強する。故に、ＢＡＫモジュレーターはアポトーシスシグナル伝達経路の調節に有用である。ＢＣＲ−ＡＢＬ陽性白血病および消化器間質腫瘍における小薬剤キナーゼ阻害剤イマチニブの臨床適用の成功がこのような概念への原理証明を印象的に提供する(２)。
【００１２】
しかしながら、見かけ上あまり必須ではないシグナル伝達経路の薬理的阻害剤は選択していない患者集団においてわずかな臨床活性しか示さない。さらに、細胞毒性剤と非抗体阻害剤の組み合わせは、今までのところ、肺癌または結腸直腸癌において改善された臨床結果を生じていない(３−６)。これらの観察に基づいて、我々は、薬理的キナーゼ阻害剤により誘導される癌細胞死は、標準細胞毒性抗癌剤により引き金をひかれるものとは異なる分子経路により実質的に実行されると推論した。あるいは、両方の経路がシグナル伝達における共通段階に集束し、それが次いで薬剤耐性を破壊するための戦略的標的を構成する。
【００１３】
この目的のために、我々は、ＰＫＣ特異的阻害剤スタウロスポリン(ＳＴＳ)、その臨床的に適用される誘導体Ｎ−ベンゾイルスタウロスポリン(ＰＫＣ４１２、Novartis Pharma)、および一般的細胞毒性抗癌剤により誘導される細胞死に対する、よく特徴付けされた一連のＮＳＣＬＣ細胞株の感受性を比較した。ＰＫＣ阻害のモデルは、腫瘍増殖および生存に必須であると見なされる種々のシグナル伝達経路の中心的メディエーターとしてのＰＫＣの役割に基づいて選択した(７、８)。この広い治療スペクトルの可能性にもかかわらず、我々は、ＰＫＣ特異的阻害剤がＮＳＣＬＣ細胞においてアポトーシスを誘導できず、それはまた標準細胞毒性抗癌剤に耐性であることを発見した。分子の詳細な分析は、ＢＣＬ−２ファミリータンパク質のレベルでの機能的欠失が、これらのＮＳＣＬＣにおけるアポトーシス耐性に決定的に関与することを確認した。アポトーシスシグナル伝達におけるミトコンドリア工程の治療的ターゲティングは、ＰＫＣ阻害剤および細胞毒性剤の交差耐性を避けることが可能であった。
【００１４】
腫瘍形成および腫瘍進行中、癌細胞は、腫瘍サプレッサー経路における過剰な機能的欠損を獲得する。これはしばしば腫瘍抑制遺伝子の変異性不活性化または発現の損失により、または生存または増殖を促進する因子の遺伝子増幅および遺伝子脱制御により達成される。加えて、後成的機構が、悪性表現型において見られる異常発現パターンに関与することが示された(１)。アポトーシスは、癌性形質転換への道に打ち勝つための主要な腫瘍サプレッサー経路の一つである。したがって、アポトーシスの阻害は、種々の前臨床癌モデルにおける腫瘍発育を促進し(２０−２２)、そしてアポトーシスシグナル伝達における欠損はヒト癌においてしばしば遭遇することが示された(２３、２４)。癌進展の促進以外に、アポトーシス欠損はまた、まだ臨床腫瘍学における癌処置の大黒柱である一般的細胞毒性治療に対する耐性も扶養するように見える(２４、２５)。
【００１５】
最近、免疫仲介機構を介してまたは脱制御されたシグナル伝達経路の妨害を介して腫瘍細胞を特異的に標的とすることを目的とした新規治療が癌薬剤に導入されている。免疫仲介癌治療の成功例は、白血病のための造血幹細胞移植中または移植後のＴリンパ球のトランスファー、乳癌またはＢ細胞リンパ腫の患者へのトラスツマブまたはリツキシマブのようなモノクローナル抗体の投与、または悪性黒色腫で再発の危険性が高い患者へのインターフェロン−アルファの使用である。臨床上有効であることが証明されたシグナル伝達阻害剤は、慢性骨髄性白血病および消化器間質腫瘍の患者におけるイマチニブ、結腸直腸癌の患者におけるベバシズマブおよびセツキシマブ、再発した肺癌の患者におけるエルロチニブ、または転移性腎臓細胞癌の患者におけるソラフィニブ(sorafinib)である。これらの例は、新規化合物および処置戦略の広範囲の同定を助長し、そのいくつかは既に臨床開発に入っている。
【００１６】
これらの新規モダリティーが、実際に通常の細胞毒性治療に耐性の癌を実際にＣＨＯ性できるか否かというこの分野での未解決の疑問が残っている。同種造血幹細胞移植のモデルにおいて、最近我々は、アポトーシスシグナル伝達の遺伝的阻害剤が、癌細胞にインビトロおよびインビボで抗原特異的、細胞毒性Ｔリンパ球に対する耐性を付与できることを示している(２６)。これは、癌細胞を標準細胞毒性治療から保護する耐性因子もまた免疫仲介腫瘍抑制からの回避に至り得ることを正式に証明した。
【００１７】
本試験において、我々は“交差耐性”の概念をシグナル伝達の薬理的阻害剤に広げた。モデルとして、我々はＮＳＣＬＣおよびＰＫＣ阻害剤を使用している。
【００１８】
ＮＳＣＬＣは、非常に蔓延している悪性腫瘍であり、西洋では癌関連死の筆頭である。ほとんどのＮＳＣＬＣは進行した疾患段階と診断され、故に薬剤および放射線療法が必要である。現在の進行した切除不可能なＮＳＣＬＣのための標準治療では、臨床上意味のある腫瘍緩解は、ほんの一部の患者にしか達成されない。大規模臨床試験で処置された進行ＮＳＣＬＣ患者の中央生存は１０から１２ヶ月である。この高い医学的必要性のために、シグナル伝達経路の阻害剤を含む新規治療はＮＳＣＬＣで非常に試験されている。現在まで、上皮細胞増殖因子受容体(ＥＦＧＲ)を介したシグナル伝達の阻害剤に対して多大な努力が集中している。ゲフィチニブおよびエルロチニブのような化合物は、再幾分臨床的改善をもたらすことが示され、そして発ＮＳＣＬＣ患者の中央生存をわずかに延長さえすることが示された(２７、２８)。しかしながら、大きな患者コホートで標準細胞毒性剤レジメンとの組み合わせで第一選択薬として試験したとき、これらの化合物は全て臨床利益を導かなかった(３−５)。ＥＧＦＲのある種の活性化変異を有する患者のみが、高い確率でゲフィチニブの処置に対して応答した(２９、３０)。残念ながら、ＮＳＣＬＣ患者の大多数はこのような変異を示すことができず、これがＮＳＣＬＣにおける高度に特異的なキナーゼ阻害剤の広い臨床適用に問題を投げかける。
【００１９】
それとは反対に、ＰＫＣ酵素ファミリーは、癌進展に関与し得る数種のシグナル伝達経路に関与する。これらは血小板由来増殖因子(ＰＤＧＦ)受容体を介した分裂促進的シグナル伝達、Ｇ１およびＧ２期での細胞周期チェックポイントの制御、および内皮細胞および癌細胞上の血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)受容体を介したシグナル伝達を含む(７)。したがって、ＳＴＳまたはＰＫＣ４１２のようなＰＫＣ特異的阻害剤は、癌細胞株において細胞周期停止またはアポトーシスを誘発し、肺癌のマウス異種移植片モデルにおいて抗腫瘍性および血管新生抑制性効果を示す(８、３１、３２)。ＰＫＣ４１２の経口投与は、進行癌の患者におけるフェーズＩ治験で安全であり実現可能であることが示された(３３)。加えて、ＰＫＣ４１２とＣＤＤＰ／ゲムシタビンの標準細胞毒性レジメンの組み合わせの安全性が、進行ＮＳＣＬＣの患者におけるフェーズＩ治験で確立された(３４)。
【００２０】
このバックグラウンドに反して、我々は、ＳＴＳおよびＰＫＣ４１２のようなＰＫＣ特異的阻害剤が、標準細胞毒性抗癌剤に対する良好な応答を示すＮＳＣＬＣ細胞株に最も有効であることを発見した。対照的に、薬剤耐性ＮＳＣＬＣ細胞株はまたＰＫＣ阻害誘導アポトーシスにも感受性が低かった。残念ながら、このパターンの耐性は、細胞毒性抗癌剤とＰＫＣ阻害剤の組み合わせにより克服できなかった。限られた数のＮＳＣＬＣ細胞株において行われた他の試験と異なり(３２、３５)、我々の手にある組み合わせ治療は相乗的細胞毒性を一般にもたらさなかった。予期しないことにＰＫＣ４１２は、あるモデルにおいて細胞毒性剤の活性にさえ拮抗した。これらの結果は、ＮＳＣＬＣにおいて、およびまた他の悪性疾患において細胞毒性抗癌剤と組み合わせたＰＫＣ阻害剤の臨床効果を試験するとき考慮すべきである。今日現在、このような治験のための患者選択は、通常腫瘍の病理組織学的分類に基づく。現在の試験に使用される全細胞株はＮＳＣＬＣに由来し、また組織病理学のみでは機能的異種性を発見することが不可能であることを証明する。さらに、ＴＰ５３腫瘍サプレッサー遺伝子の機能的状態、ならびにアポトーシスの種々のレギュレーターの発現解析は、インビトロでの細胞毒性抗癌剤ならびにＰＫＣ特異的阻害剤に対する感受性の予測が不可能であった。対照的に、アポトーシスシグナル伝達経路の機能的解析は、耐性ＮＳＣＬＣ細胞株におけるＭＯＭ透過処理のレベルでの欠損を確認した。アポトーシス促進性ＢＡＫの条件的発現によるこの欠損の治療的ターゲティングはＰＫＣ阻害剤および／または標準細胞毒性剤に対する耐性に確実に打ち勝った。
【００２１】
確かに、このような徹底的な生化学的解析は癌患者から得られた腫瘍生検サンプルでは容易に実行できない。しかしながら、我々の発見は、臨床腫瘍学における新規化合物の解釈(translation)のための戦略の開発にいくつかの影響を有し得る。第一に、キナーゼ阻害剤と標準細胞毒性レジメンの組み合わせは、この組み合わせ処置の結果が病理組織学的に分類された癌患者の異種集団について予測できないため、情報価値がないかもしれない。この組み合わせの、ある患者における正の効果が、他者においては有害作用が勝るかもしれず、最良でも組み合わせ治療後の同等の正味の結果をもたらす(３−６)。第二に、新規標的薬剤は非常に類似の耐性機構により阻害され、細胞毒性抗癌剤の失敗に至り得る。現在の試験において、これはアポトーシスシグナル伝達における欠損について証明された。細胞周期制御、または代替の細胞死経路における欠損でも同様のことが当てはまる。第三に、前臨床癌モデルで行われた注意深い機能的解析は、いくつかの細胞死および生存経路の集束点に戦略的に配置された分子標的を同定できる。
【００２２】
我々の現在の試験で、ＢＡＫのレトロウイルスによる遺伝子導入および条件的発現は、このような標的のモデル治療的調節を編み出した。臨床実体への翻訳は、ＢＣＬ−２ファミリータンパク質レベルでの、アポトーシス促進性および抗アポトーシス性レオスタットの小化合物モジュレーターのような異なる薬理的戦略を必要する可能性が高い(３６,３７)。
【００２３】
本発明は、タンパク質キナーゼＣ阻害剤での例えば、結腸直腸癌(ＣＲＣ)および非小細胞性肺癌(ＮＳＣＬＣ)のような固形腫瘍の処置方法に関する。上記の疾患または悪性腫瘍の処置のためのＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤およびＢＡＫ阻害剤の医薬組み合わせの使用およびこれらの疾患または悪性腫瘍の処置用薬剤の製造のためのこのような医薬組成物の使用に関する。
【００２４】
ＢＡＫのアクティベーターのようなミトコンドリア外膜透過性のアクティベーターと組み合わせたＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤が、それらを例えば、非小細胞性肺癌(ＮＳＣＬＣ)の処置に特に有用とする治療特性を有することが、本発明により驚くべきことに判明した。
【００２５】
略語
【００２６】
ＡｃｔＤ  −  アクチノマイシンＤ、ＣＤＤＰ  −  シスプラチン、ＤＯＸ  −  ドキシサイクリン、ＤＸＲ  −  ドキソルビシン、ＥＧＦＰ  −  増強された緑色蛍光タンパク質、ＥＧＦＲ  −  上皮細胞増殖因子受容体、ＭＯＭ  −  ミトコンドリア外膜、ＮＳＣＬＣ  −  非小細胞性肺癌、ＰＤＧＦ  −  血小板由来増殖因子、ＰＫＣ  −タンパク質キナーゼＣ、ＰＫＣ４１２  −  Ｎ−ベンゾイルスタウロスポリン、ＳＴＳ  −  スタウロスポリン、ＶＥＧＦ  −  血管内皮細胞増殖因子、ＶＰ１６  −  エトポシド。
【００２７】
ＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤
【００２８】
本発明の組み合わせにおいて使用するために特に興味深いＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤はスタウロスポリン誘導体である。好ましくはＦＬＴ−３阻害剤は式Ｉ：
【化１】
2009504608.tif 000002
のＮ−[(９Ｓ,１０Ｒ,１１Ｒ,１３Ｒ)−２,３,１０,１１,１２,１３−ヘキサヒドロ−１０−メトキシ−９−メチル−１−オキソ−９,１３−エポキシ−１Ｈ,９Ｈ−ジインドロ[１,２,３−ｇｈ：３',２',１'−ｌｍ]ピロロ[３,４−ｊ][１,７]ベンゾジアゾニン−１１−イル]−Ｎ−メチルベンズアミド、またはとりわけ薬学的に許容される塩を含むその塩である。式Ｉの化合物はミドスタウリン[国際非占有名]またはＰＫＣ４１２としても既知である。ＰＫＣ４１２は天然に存在するアルカロイドスタウロスポリンの誘導体である。
【００２９】
別の態様において、適当なＦｌｔ−３阻害剤は、例えば：ＷＯ０３／０３７３４７に記載の化合物、例えば式(II)または(III)：
【化２】
2009504608.tif 000003
【化３】
2009504608.tif 000004
【００３０】
(ここで、化合物(III)は化合物(II)の部分的に水素化された誘導体である)
のスタウロスポリン誘導体；または式(IV)または(Ｖ)または(VI)または(VII)：
【化４】
2009504608.tif 000005
【化５】
2009504608.tif 000006
【化６】
2009504608.tif 000007
【化７】
2009504608.tif 000008
のスタウロスポリン誘導体
〔式中、Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、非置換または置換アルキル、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、エーテル化またはエステル化ヒドロキシ、アミノ、一または二置換アミノ、シアノ、ニトロ、メルカプト、置換メルカプト、カルボキシ、エステル化カルボキシ、カルバモイル、Ｎ−モノ−またはＮ,Ｎ−ジ−置換カルバモイル、スルホ、置換スルホニル、アミノスルホニルまたはＮ−モノ−またはＮ,Ｎ−ジ−置換アミノスルホニルであり；
ｎおよびｍは、互いに独立して、０(０を含む)から４(４を含む)の数字であり；
ｎ'およびｍ'は、互いに独立して、０(０を含む)から４(４を含む)の数字であり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ８およびＲ１０は、互いに独立して、水素、−Ｏ−、３０個までの炭素原子のアシル、いずれの場合も２９個までの炭素原子の脂肪族、炭素環式、または炭素環式−脂肪族ラジカル、いずれの場合も２０個までの炭素原子およびいずれの場合も９個までのヘテロ原子のヘテロ環式またはヘテロ環式−脂肪族ラジカル、３０個までの炭素原子のアシルであり、ここでＲ４はまた存在しなくてもよく；
またはＲ３が３０個までの炭素原子のアシルならば、Ｒ４はアシルではなく；
ｐは、Ｒ４が存在しないならば０であるか、またはＲ３およびＲ４が両方とも存在し、いずれも上記ラジカルの一つであるとき１であり；
Ｒ５は水素、いずれの場合も２９個までの炭素原子の脂肪族、炭素環式、または炭素環式−脂肪族ラジカル、またはいずれの場合も２０個までの炭素原子およびいずれの場合も９個までのヘテロ原子のヘテロ環式またはヘテロ環式−脂肪族ラジカル、または３０個までの炭素原子のアシルであり；
Ｒ７、Ｒ６およびＲ９は、アシルまたは−(低級アルキル)−アシル、非置換または置換アルキル、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、エーテル化またはエステル化ヒドロキシ、アミノ、一または二置換アミノ、シアノ、ニトロ、メルカプト、置換メルカプト、カルボキシ,カルボニル、カルボニルジオキシ、エステル化カルボキシ、カルバモイル、Ｎ−モノ−またはＮ,Ｎ−ジ−置換カルバモイル、スルホ、置換スルホニル、アミノスルホニルまたはＮ−モノ−またはＮ,Ｎ−ジ−置換アミノスルホニルであり；
Ｘは２個の水素原子；１個の水素原子とヒドロキシ；Ｏ；または水素および低級アルコキシであり；
Ｚは水素または低級アルキルであり；
そして環Ａ中の波線により特徴付けられる２個の結合が存在せず、４個の水素原子で置換されており、環Ｂ中の２個の波線が、各々、それぞれの平行する結合と一緒になって二重結合を意味するか；
または環Ｂ中の波線により特徴付けられる２個の結合が存在せず、４個の水素原子で置換されており、環Ａ中の２個の波線が、各々、それぞれの平行する結合と一緒になって二重結合を意味するか；
または環Ａおよび環Ｂ両方の全４個の波線が存在せず、合計８個の水素原子で置換されている。〕
または少なくとも１個の塩形成基が存在するならばそれらの塩を含む。
【００３１】
前記および後記で使用する一般的用語および定義は、好ましくは本明細書にその全体を引用により包含するＷＯ０３／０３７３４７に提供されるスタウロスポリン誘導体についての意味を有する。しかしながら、ＷＯ０３／０３７３４７と本明細書の間に矛盾がある場合、本明細書が優先する。
【００３２】
本質的に、本発明の化合物は薬学的に、すなわち生理学的に、許容される塩の形で存在できる(ただし、それらは塩形成基を含む)。単離および精製のために、薬学的に許容されない塩も使用できる。治療的使用のために、薬学的に許容される塩のみが使用され、これらの塩が好ましい。
【００３３】
故に、遊離酸基、例えば遊離スルホ、ホスホリルまたはカルボキシル基を有する式Ｉの化合物は、塩形成塩基成分との塩として、好ましくは生理学的に許容される塩として存在できる。これらは主に金属またはアンモニウム塩、例えばアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウムまたはカルシウム塩、またはアンモニアまたは適当な有機アミン、とりわけ３級モノアミンおよびヘテロ環式塩基、例えばトリエチルアミン、トリ−(２−ヒドロキシエチル)−アミン、Ｎ−エチルピペリジンまたはＮ,Ｎ'−ジメチルピペラジンとのアンモニウム塩であり得る。
【００３４】
塩基性特性を有する本発明の化合物は付加塩、とりわけまた無機および有機酸との酸付加塩だけでなく、また４級塩としても存在できる。故に、例えば、置換基としてアミノ基のような塩基性基を有する化合物は、一般的な酸と酸付加塩を形成できる。適当な酸は、例えば、ハロゲン化水素酸、例えば、塩酸および臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸または過塩素酸、または脂肪族、脂環式、芳香族性またはヘテロ環式カルボン酸またはスルホン酸、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、シュウ酸、ピルビン酸、フェニル酢酸、安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸、アントラニル酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、サリチル酸、ｐ−アミノサリチル酸、パモ酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ヒドロキシエタンスルホン酸、エチレンジスルホン酸、ハロベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸またはスルファニル酸、およびまたメチオニン、トリプトファン、リシンまたはアルギニン、ならびにアスコルビン酸である。
【００３５】
遊離形および、例えば新規化合物の精製または同定に中間体として使用できる塩を含む塩の形、およびその溶媒和物の形の化合物(とりわけ式Ｉの化合物)の密接な関係の観点から、前記および後記の遊離化合物に関する記載はまた適当であり、好都合である限り、対応するその塩、および溶媒和物、例えば水和物も言うことは理解すべきである。
【００３６】
スタウロスポリン誘導体およびそれらの製造法は当業者に既知の多くの先行文献に具体的に記載されている。
【００３７】
式Ｉの化合物およびそれらの製造法は、１９８８年１２月２１日に公開の欧州特許０２９６１１０、ならびに１９９２年３月３日に公開の米国特許５；０９３,３３０、および日本特許２７０８０４７に具体的に記載されており、これらの各々を引用により本明細書に包含する。
【００３８】
特にスタウロスポリン誘導体化合物について特許出願または科学文献の引用がされている各場合、最終生成物の対象、医薬製剤および特許請求の範囲は、これらの刊行物を引用することにより本明細書に包含する。
【００３９】
コード番号、一般名または商品名により同定した活性成分の構造は、標準概論“The Merck Index”の現行版またはデータベース、例えば、Patents International(例えば, IMS World Publications)から取り得る。それらの対応する内容は引用により本明細書に包含する。
【００４０】
ＢＡＫアクティベーター
【００４１】
ＢＡＫモジュレーターはアポトーシスシグナル伝達経路の調製に有用である。ＢＡＫアクティベーターはアポトーシス細胞死を増強し、ＢＣＬ２の抗アポトーシス効果と逆反応する。ＢＡＫアクティベーターはＢＣＬ−２／ＢＣＬ−ＸＬ阻害剤を含むが、これに限定されない。Ｂｃｌ−２／Ｂｃｌ−ＸＬ阻害化合物の例は、抗Ｂｃｌ−２／Ｂｃｌ−ＸＬ抗体、Ｂｃｌ−２またはＢｃｌ−ＸＬのいずれかを標的とするＲＮＡｉ構築物、炭化水素−結合した(stapled)ＢＨ３へリックスペプチドおよび化学阻害剤、例えばＮ−｛４−[４−(４'−クロロ−ビフェニル−２−イルメチル)−ピペラジン−１−イル]−ベンゾイル｝−４−(３−ジメチルアミノ−１−フェニルスルファニルメチル−プロピルアミノ)−３−ニトロ−ベンゼンスルホンアミド(Abbott化合物ＡＢＴ−７３７)を含むが、これらに限定されない(３６、３７)。さらなるＢＡＫアクティベーターを含むアポトーシス治療は最近レビューされた(４０)。
【００４２】
治療、薬剤および使用法
【００４３】
本発明は、特に非小細胞性肺癌(ＮＳＣＬＣ)の処置方法であって、このような処置を必要とする哺乳動物に治療的有効量のＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤を、遊離形または薬学的に許容される塩またはプロドラッグの形のいずれかで投与することを含む、方法を提供する。好ましいＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤はＰＫＣ４１２である。
【００４４】
好ましくは本発明は、非小細胞性肺癌(ＮＳＣＬＣ)を有する哺乳動物、とりわけヒトの処置方法であって、このような処置を必要とする哺乳動物に治療的有効量のＦＬＴ−３阻害剤、またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグを投与することを含む方法を提供する。好ましいＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤はＰＫＣ４１２である。
【００４５】
他の態様において、本発明は、ＮＳＣＬＣの処置のための遊離形または薬学的に許容される塩またはプロドラッグの形の、ＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤の使用に関する。好ましいＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤はＰＫＣ４１２である。
【００４６】
さらなる態様において、本発明は、ＮＳＣＬＣの処置用医薬組成物の製造のための、遊離形または薬学的に許容される塩またはプロドラッグの形の、ＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤の使用に関する。好ましいＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤はＰＫＣ４１２である。
【００４７】
ここに記載の疾患および状態の処置のために用いるべきＦＬＴ−３阻害剤および化合物の具体的な用量は、宿主、処置する状態の性質および重症度、投与形態を含む種々の因子に依存する。しかしながら、一般に、ＦＬＴ−３阻害剤を非経腸的に、例えば、０.１から１０mg／kg体重、好ましくは１から５mg／kg体重の１日量で腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、腫瘍内、または直腸に、または経腸的に、例えば、経口で、好ましくは静脈内または、好ましくは経口で、静脈内に投与したとき、満足いく結果が達成される。ヒト試験において２２５mg／日の総量が最大耐量(ＭＴＤ)であると最も思われた。好ましい静脈内１日量は０.１から１０mg／kg体重または、ほとんどの大型霊長類について、２００−３００mgの１日量である。典型的静脈内用量は、週に３回から５回、３から５mg／kgである。
【００４８】
最も好ましくは、ＦＬＴ−３阻害剤、とりわけミドスタウリンを、マイクロエマルジョン、軟ゲルまたは固体分散のような投与形態で、約２５０mg／日、特に２２５mg／日までの用量で経口で投与し、１日１回、２回または３回投与する。
【００４９】
通常、最初は低用量を投与し、処置下の宿主について最適用量まが決定されるまで用量を徐々に増加する。投与量の上限は、副作用により決定されるものであり、処置する宿主についての試験により決定できる。
【００５０】
組み合わせ処置
【００５１】
一つの局面において、本発明は、(ａ)ＦＬＴ−３阻害剤、とりわけ上に具体的に記載のＦＬＴ−３阻害剤、特に好ましいとして記載の阻害剤、および細胞毒性剤耐性ＮＳＣＬＣの処置において(ｂ)ミトコンドリア外膜透過処理のアクティベーター、例えばＢＡＫのアクティベーター；あるいは細胞毒性剤感受性ＮＳＣＬＣの処置において、(ｂ')トポイソメラーゼ阻害剤を含み；ここで、活性成分(ａ)および(ｂ)または(ｂ')のいずれか(以後“(ｂまたはｂ')”)はいずれの場合も遊離形または薬学的に許容される塩の形で存在する、同時に、一緒に、別々にまたは連続して使用するための、組み合わせ製剤または医薬組成物のような組み合わせにも関する。
【００５２】
用語“組み合わせ製剤”は、上記で定義の組み合わせパートナー(ａ)および(ｂまたはｂ')を独立して、または、異なる量の組み合わせパートナー(ａ)および(ｂまたはｂ')の異なる固定された組み合わせの使用により、すなわち、同時に、一緒に、別々にまたは連続して投与できる点で、とりわけ“複数パーツのキット”である。次いで、複数パーツのキットのパーツを、例えば、同時にまたは時間的にずれて、すなわち異なる時点で、および複数パーツのキットの何らかのパートと等しいまたは異なる時間間隔で投与できる。組み合わせ製剤において投与すべき組み合わせパートナー(ａ)対組み合わせパートナー(ｂまたはｂ')の総量の比率は、例えば、特定の疾患、疾患の重症度、患者の年齢、性別、体重などのために起こり得る異なる必要性の、処置すべき患者下位集団の必要性に、または単独の患者の必要性に合うために変化し得る。
【００５３】
適当な臨床試験は、例えば、増殖性疾患の患者のオープンラベル、用量漸増試験である。このような治験は、特に本発明の組み合わせの活性成分の相乗性を確認する。ＮＳＣＬＣに対する有益な効果は、直接これらの治験の結果を介して決定でき、それは当業者にはそれ自体既知である。このような治験は、特に、活性成分を使用した単剤療法および本発明の組み合わせの効果の比較に適する。好ましくは、薬剤(ａ)の用量を最大耐量に到達するまで増加させ、そして薬剤(ｂまたはｂ')を固定用量で投与する。あるいは、薬剤(ａ)を固定用量で投与し、薬剤(ｂまたはｂ')の用量を増加させる。各患者は、薬剤(ａ)の投与を毎日または間欠的に受ける。処置の効果は、このような試験において、例えば、１２週、１８週または２４週後に、６週間毎の症状スコアの評価により決定できる。
【００５４】
本発明の医薬組み合わせの投与は、本発明の組み合わせに使用した薬学的に活性成分の一方のみを適用する単剤療法と比較して、例えば、症状の軽減、進行遅延または阻止に関して有益な効果、例えば、相乗的治療効果をもたらすだけでなく、さらに驚くべき有益な効果、例えば、少ない副作用、改善された生活の質または低下した罹病率をもたらす。
【００５５】
さらなる利益は、本発明の組み合わせの活性成分の低用量を使用でき、例えば、しばしば必要な量が少ないだけでなく少ない頻度でも適用され、これは副作用の発生率または重症度を低下し得る。これは処置すべき患者の望みおよび要求に合う。
【００５６】
ここで使用する用語“併用投与”または“組み合わせ投与”などは選択した複数治療剤の単独の患者への投与を包含することを意味し、複数薬剤を必ずしも同じ経路でまたは同時に投与するものではない処置レジメンを含むことを意図する。
【００５７】
増殖性疾患のターゲティングまたは予防に併用で治療的に有効である量で本発明の組み合わせを含む医薬組成物の提供が本発明の一つの目的である。この組成物において、薬剤(ａ)および薬剤(ｂまたはｂ')を一緒に、交互にまたは別々に、一つの組み合わせ単位投与形態でまたは二つの別々の単位投与形態で投与できる。単位投与形態は固定された組み合わせでもよい。
【００５８】
本発明に従う、薬剤(ａ)および薬剤(ｂまたはｂ')の別々の投与のための、または固定された組み合わせでの、すなわち少なくとも２種の組み合わせパートナー(ａ)および(ｂまたはｂ')を含む一つのガレヌス製剤での投与のための医薬組成物は、それ自体既知の方法で製造でき、例えば、上記の通り治療的有効量の少なくとも１種の薬理学的に活性な組み合わせパートナー単独で、または、とりわけ適当な経腸または非経腸投与に適する１種以上の薬学的に許容される担体または希釈剤との組み合わせで含む、ヒトを含む哺乳動物(温血動物)への投与に適する組成物である。
【００５９】
適当な医薬組成物は、例えば、約０.１％から約９９.９％、好ましくは約１％から約６０％の活性成分(複数もある)を含む。経腸または非経腸投与のための組み合わせ治療用医薬製剤は、例えば、糖衣錠、錠剤、カプセル剤または坐薬、またはアンプルのような単位投与形態である。他に指示がない限り、これらはそれ自体既知の方法で、例えば通常の混合、造粒、糖コーティング、溶解または凍結乾燥法の手段により製造できる。各投与形態の個々の用量に含まれる組み合わせパートナーの単位含量は、必要量が複数の投与単位の投与により到達できるため、それ自体有効量を構成する必要はないことは認識される。
【００６０】
特に、本発明の組み合わせの各組み合わせパートナーの治療的有効量を、同時にまたは連続してそして任意の順番で投与してよく、複数成分を別々にまたは固定された組み合わせとして投与してよい。例えば、本発明に従う増殖性疾患の予防または処置方法は、併用で治療的有効量の、好ましくは相乗的有効量の、例えば、ここに記載の量に対応する毎日のまたは間欠的な投与量での、(ｉ)遊離または薬学的に許容される塩形の第一薬剤(ａ)の投与、および(ii)同時のまたは任意の順番での連続的な遊離または薬学的に許容される塩形の薬剤(ｂまたはｂ')の投与を含む。本発明の組み合わせの個々の苦味泡得パートナーは、治療の経過中の異なる時点で別々に、または同時に分割されたまたは単一の組み合わせ形態で投与してよい。さらに、用語投与はまたインビボで組み合わせパートナーそれ自体に変換する組み合わせパートナーのプロドラッグの使用も包含する。故に、本発明は同時または交互の処置の全てのこのようなレジメンを包含すると理解すべきであり、そしておよび用語“投与する”はそれにしたがって解釈すべきである。
【００６１】
本発明の組み合わせに用いる組み合わせパートナーの各々の有効量は、用いる具体的な化合物または医薬組成物、投与形態、処置する状態、処置する状態の重症度に依存して変化し得る。故に、本発明の組み合わせの投与レジメンは投与経路および患者の腎臓および肝臓機能を含む種々の因子に従い選択する。通常の技術の臨床医または医師は、本状態の軽減、回復または停止に必要な単一活性成分の有効量を容易に決定し、処方できる。毒性を伴わない効果を発現する活性成分濃度の範囲を達成するための最適な詳細は、標的部位の活性成分の利用能の動態に基づく投与計画を必要とする。
【００６２】
薬剤(ａ)または(ｂまたはｂ')の１日投与量は、もちろん、種々の因子、例えば選択した化合物、処置すべき特定の状態および望む効果に依存して変化する。一般に、しかしながら、薬剤(ａ)を約０.０３から５mg／kg／日、特に０.１から５mg／kg／日、例えば、０.１から２.５mg／kg／日の程度の１日投与量で、１回用量または分割用量として投与したとき、満足いく結果が達成される。薬剤(ａ)および薬剤(ｂまたはｂ')は任意の通常の経路で、特に経腸的に、例えば、経口で、例えば、錠剤、カプセル剤、飲溶液の形で、または非経腸的に、例えば、注射可能溶液または懸濁液の形で投与できる。経口投与のための適当な単位投与形態は、約０.０２から５０mgの活性成分を、通常０.１から３０mgの例えば、薬剤(ａ)または(ｂまたはｂ')を１種以上の薬学的に許容される希釈剤または担体と共に含む。
【００６３】
薬剤(ｂまたはｂ')は、ヒトに０.５から１０００mgの範囲の１日量で投与できる。経口投与のための適当な単位投与形態は、約０.１から５００mg活性成分を１種以上の薬学的に許容される希釈剤または担体と共に含む。
【００６４】
本発明の医薬組み合わせの投与は、本発明の組み合わせに使用した薬学的に活性成分の一方のみを適用する単剤療法と比較して、例えば、ＮＳＣＬＣの制御されていない増殖の阻害または進行の遅延に関して有益な効果、例えば、相乗的治療効果をもたらすだけでなく、さらに驚くべき有益な効果、例えば、少ない副作用、改善された生活の質または低下した罹病率をもたらす。
【００６５】
さらなる利益は、本発明の組み合わせの活性成分の低用量を使用でき、例えば、しばしば必要な量が少ないだけでなく少ない頻度でも適用され、これは副作用の発生率または重症度を低下し得る。これは処置すべき患者の望みおよび要求に合う。
【００６６】
(ａ)および(ｂまたはｂ')化合物は１種以上の薬学的に許容される担体と共に、および所望により１種以上の通常の医薬アジュバントと組み合わせてよく、経腸的に、例えば、経口で、錠剤、カプセル剤、カプレット剤などの形で、または非経腸的に、例えば、腹腔内または静脈内に、滅菌注射可能溶液または懸濁液の形で投与できる。経腸および非経腸組成物は通常の手段で製造できる。
【００６７】
本発明の輸液は好ましくは滅菌する。これは、例えば、滅菌濾過膜を通す濾過により容易に達成できる。液体形態の何らかの組成物の無菌製剤、バイアルの無菌充填および／または本発明の組み合わせ医薬組成物と適当な希釈剤の無菌条件下での組み合わせは、当業者には既知である。
【００６８】
ＦＬＴ−３阻害剤は、前記に記載の疾患および状態の処置に有効な量の活性成分を含む経腸および非経腸医薬組成物に製剤でき、このような組成物は単位投与形態であり、そしてこのような組成物は薬学的に許容される担体を含む。
【００６９】
記載の医薬組成物は、飽和ポリアルキレングリコールグリセリド中のミドスタウリンのような式Ｉの化合物の溶液または分散であり、ここで、グリコールグリセリドはグリセリルおよび１種以上のＣ８−Ｃ１８飽和脂肪酸のポリエチレングリコールエステルの混合物である。
【００７０】
好ましくは、少なくとも１種の有益な効果、例えば、第一および第二活性成分の効果の相互の増強、特に相乗作用、例えば、相加効果以上、さらなる有益な効果、少ない副作用、第一および第二活性成分の一方または両方の他の方法では非有効投与量での組み合わせ治療効果、およびとりわけ活性成分の強い相乗作用が存在する。
【００７１】
ＮＳＣＬＣの処置のためのＰＫＣ４１２の効果を以下の実施例の結果により説明する。これらの実施例はその範囲をいかなる方法でも限定することなく本発明を説明する。
【実施例】
【００７２】
実施例１：細胞株およびベクター
【００７３】
当分野で既知のＮＳＣＬＣ細胞株を得た。特記されない限り、ＮＳＣＬＣ細胞を組織培養皿(BD Falcon)で、１０％ウシ胎児血清、グルコース、Ｌ−グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地中、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中で増殖させる。トランスジェニックＢＡＫを条件的に発現するＮＳＣＬＣ細胞を、BD RevTet-Onベクター系(BD Clontech)を使用して得た。完全長ヒトＢＡＫ  ｃＤＮＡをコードするBamHIフラグメントをＰＣＲにより産生し、配列決定により確認し、そしてpRevTREベクターにクローン化した。レトロウイルスBCL-XL発現ベクターは以前に記載されている(２６)。複製欠損レトロウイルスビリオンをFNX amphoパッケージング細胞株において標準リン酸カルシウムトランスフェクションにより産生した(Dr G.P. Nolan, Stanfordから恵与)。トランスダクションを濾過上清を使用して行い、集団をテトラサイクリン非存在下のハイグロマイシンＢおよびピューロマイシンで選択するか、またはＥＧＦＰ陽性細胞の蛍光標示式細胞分取(Coulter)により得た。
【００７４】
実施例２：アポトーシスアッセイ
【００７５】
フラグメントＤＮＡを有する細胞の定量、活性化カスパーゼ、失われたミトコンドリア膜電位差、および細胞周期分布の測定を、以前に記載の通り(２６、３８、３９)フローサイトメトリー(Coulter)により行った。Ｎ−ベンゾイルスタウロスポリン(ＰＫＣ４１２)をNovartis Pharma, Basel, Switzerlandから得て、ｚＶＡＤ−ｆｍｋをＩＣＮから得た。全ての他の薬剤はSigmaから購入した。
【００７６】
実施例３：免疫ブロッティング
【００７７】
免疫ブロッティングおよび細胞分画を、以前に記載の通り(３８、３９)、カスパーゼ−９(Chemicon)、カスパーゼ−３、ＢＣＬ−ＸＬ、チトクロームｃ(BD Pharmingen)、ＢＡＸ、ＢＡＫ、ＰＡＲＰ(Upstate)、ＡＫＴ、ホスホ−ＡＫＴ、ＧＳＫ−３ベータ、ホスホ−ＧＳＫ３ベータ(細胞シグナル伝達)、およびアクチン(ＩＣＮ)に対する一次抗体を使用して行った。
【００７８】
実施例４：ＮＳＣＬＣ細胞株の耐性
【００７９】
図１Ａにおいて、ＴＰ５３有能(proficient)ＮＣＩ−Ｈ４６０(白四角)およびＡ５４９(黒四角)、ＴＰ５３変異ＮＣＩ−Ｈ３２２(白三角)およびＮＣＩ−Ｈ２３(黒三角)、およびＴＰ５３欠損ＮＣＩ−Ｈ１２９９(白丸)およびＣａｌｕ−６(黒丸)ＮＳＣＬＣ細胞をエトポシド(左欄)、シスプラチン(右欄、下部パネル、またはドキソルビシン(右欄、上部および中央パネル)の記載の量で処理した。４８時間後、サブディプロイドＤＮＡ内容物(ｓｕｂ−Ｇ１)を有する細胞のパーセントをアポトーシスの指標としてフローサイトメトリーで測定した。図１Ｂにおいて図１Ａと同じＮＳＣＬＣ細胞株を漸増量のＰＫＣ特異的阻害剤ＰＫＣ４１２で処理した。サブディプロイドＤＮＡ内容物を有する細胞のパーセントを処置４８時間後にフローサイトメトリーにより定量した。少なくとも３つの独立した実験の平均値±標準偏差(ＳＤ)を示す。図１Ｃおいて、薬剤感受性ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞、および薬剤耐性ＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞をＰＫＣ４１２(１から１０μM)またはＤＭＳＯで２時間前処理し、その後ＰＭＡ(１μM)で１０分刺激した。全細胞抽出物を、記載の一次抗体を使用して免疫ブロッティングにより分析した。
【００８０】
実施例５：薬剤相乗性分析
【００８１】
ＴＰ５３有能ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞(図２Ａ、黒色棒)、Ａ５４９細胞(図２Ｂ、白色棒)、およびＴＰ５３欠損ＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞(図２Ｃ、灰色棒)を２５μM  エトポシドおよび漸増用量のＰＫＣ４１２(０、５、１０、５０、１００μM)で同時に処理し、サブディプロイドＤＮＡ内容物を有する細胞を４８時間後に定量した。少なくとも３つの独立した実験の平均値＋ＳＤを示す。図２Ｄにおいて、ＤＭＳＯまたは５０μM  ＰＫＣ  ４１２で２４時間処置したＮＣＩ−Ｈ１２９９の細胞周期分布を示す。図２ＥにおいてＡ５４９およびＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞を最初に２５μM  エトポシドで２４時間処理し、その後５０μM  ＰＫＣ４１２をさらに２４時間添加した(黒色棒)。あるいは、細胞を５０μM  ＰＫＣ４１２で２４時間処理し、その後２５μM  エトポシドをさらに２４時間添加した(灰色棒)。４８時間後、サブディプロイドＤＮＡ内容物(ｓｕｂ−Ｇ１)を有する細胞フラクションのパーセントをフローサイトメトリーで定量した。ＤＭＳＯ処理細胞(白色棒)はネガティブコントロールとして作用した。少なくとも３つの独立した実験の平均値＋ＳＤを示す。
【００８２】
実施例６：ミトコンドリア機能
【００８３】
図３Ａにおいて、ＮＣＩ−Ｈ４６０(白四角)、Ａ５４９(黒四角)およびＮＣＩ−Ｈ１２９９(白丸)ＮＳＣＬＣ細胞を記載の用量のＰＫＣ４１２で処理した。４８時間後、細胞を螢光カスパーゼ基質ＦＩＴＣ−ＶＡＤ(Oncogene)で染色し、活性化カスパーゼを有する(ＦＩＴＣ＋)ＦＩＴＣ陽性細胞フラクションをフローサイトメトリーで測定した。図３Ｂにおいて、ＮＣＩ−Ｈ４６０(白四角)、Ａ５４９(黒四角)およびＮＣＩ−Ｈ１２９９(白丸)ＮＳＣＬＣ細胞を記載の用量のＰＫＣ４１２で処理した。４８時間後、細胞をミトコンドリア色素テトラメチルローダミンエチルエステル(ＴＭＲＥ、Molecular Probes)で染色し、保存されたミトコンドリア膜電位差ΔΨｍ(ＴＭＲＥ＋)を有するＴＭＲＥ陽性細胞のフラクションをフローサイトメトリーで定量した。少なくとも３つの独立した実験の平均値±ＳＤを示す。図３Ｃにおいて、ＮＣＩ−Ｈ４６０およびＡ５４９  ＮＳＣＬＣ細胞を２５μM  エトポシドで処理し、細胞質フラクションを記載の時点に得た。ミトコンドリアチトクロームｃの細胞質への放出を、チトクロームｃ特異的一次抗体を使用した免疫ブロッティングにより検出した。図３Ｄにおいて、全細胞抽出物をＴＰ５３有能Ａ５４９およびＮＣＩ−Ｈ４６０、ＴＰ５３変異ＮＣＩ−Ｈ２３およびＮＣＩ−Ｈ３２２、およびＴＰ５３欠損Ｃａｌｕ−６およびＮＣＩ−Ｈ１２９９  ＮＳＣＬＣ細胞から調製した。ＢＡＸ、ＢＡＫおよびＢＣＬ−ＸＬの構成的発現を免疫ブロッティングにより検出した。
【００８４】
実施例７：条件的ＢＡＫ発現
【００８５】
図４Ａにおいて、テトラサイクリン制御プロモーターの制御制御下にＢＡＫを発現するＡ５４９細胞を、ドキシサイクリン(ＤＯＸ)非存在下(−)または存在下(＋)で増殖させた。全細胞抽出物を、ＤＯＸ誘導２４時間後に調製し、免疫ブロッティングによりＢＡＫ発現について分析した。ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞からの細胞抽出物は、ＢＡＫの内因性発現レベルのコントロールとして働いた。図４Ｂにおいてテトラサイクリン制御プロモーター制御下にＢＡＫを発現するＮＣＩ−Ｈ４６０、Ａ５４９およびＮＣＩ−Ｈ１２９９  ＮＳＣＬＣ細胞を、ＤＯＸ非存在下(白色棒)または存在下(黒色棒)で増殖させ、サブディプロイドＤＮＡ内容物(ｓｕｂ−Ｇ１)を有する細胞を２４時間後にフローサイトメトリーで定量した。少なくとも３つの独立した実験の平均値＋ＳＤを示す。図４Ｃにおいて、テトラサイクリン制御プロモーターの制御下にＢＡＫを発現するＡ５４９細胞をＤＯＸ存在下２５μM  エトポシドで処理し、全細胞抽出物を記載の時点で得た。ＢＡＫの発現、およびカスパーゼ−９、カスパーゼ−３の開裂、およびカスパーゼ基質ＰＡＲＰを免疫ブロッティングにより検出した。図４Ｄにおいて、テトラサイクリン制御プロモーター制御下にＢＡＫを発現するＡ５４９細胞を、ＥＧＦＰに関連してＢＣＬ−ＸＬ(黒色棒)またはコントロールベクター(白色棒)を発現するように形質導入し、ＥＧＦＰ陽性集団を蛍光標示式細胞分取により選択した。ＢＡＫ発現をＤＯＸの添加により誘導し、サブディプロイドＤＮＡ内容物を有する細胞のフラクションを、４８時間後フローサイトメトリーで定量した。少なくとも３つの独立した実験の平均値＋ＳＤを示す。
【００８６】
実施例８：ミトコンドリアＢＡＫのターゲティング
【００８７】
テトラサイクリン制御プロモーターの制御下にＢＡＫを発現する薬剤耐性Ａ５４９(図５Ａ)および薬剤感受性ＮＣＩ−Ｈ４６０(図５Ｂ)細胞を、漸増用量のＰＫＣ４１２でＤＯＸの非存在下(白色棒)または存在下(黒色棒)処理し、ＢＡＫ発現を誘導した。サブディプロイドＤＮＡ内容物(ｓｕｂ−Ｇ１)を有する細胞を、４８時間後フローサイトメトリーで定量した。少なくとも３つの独立した実験の平均値＋ＳＤを示す。図５Ｃにおいて、テトラサイクリン制御プロモーターの制御下にＢＡＫを発現する薬剤耐性ＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞を、漸増用量のＰＫＣ４１２でＤＯＸの非存在下(白色棒)または存在下(黒色棒)処理し、ＢＡＫ発現を誘導した。ΔΨｍ(ＴＭＲＥ＋)を維持した細胞を４８時間後ＴＭＲＥ染色およびフローサイトメトリーにより定量した。少なくとも３つの独立した実験の平均値±ＳＤを示す。図５Ｄにおいて、テトラサイクリン制御プロモーターの制御下にＢＡＫを発現するＡ５４９細胞を漸増量のＰＫＣ４１２(１から１０μM)でＤＯＸの非存在下または存在下処理し、ＢＡＫ発現を誘導した。全細胞抽出物２４時間目に得て、カスパーゼ−９、カスパーゼ−３の開裂およびカスパーゼ基質ＰＡＲＰを免疫ブロッティングにより検出した。
【００８８】
実施例９：ＮＳＣＬＣにおけるタンパク質キナーゼＣ特異的阻害剤および細胞毒性抗癌剤に対する耐性の類似パターン
【００８９】
ＮＳＣＬＣの薬剤耐性に対する核となるアポトーシス機構の欠損の関与の可能性を試験するために、ＴＰ５３腫瘍サプレッサー遺伝子について有能(Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ４６０)、欠損(ＮＣＩ−Ｈ１２９９、Ｃａｌｕ−６)、または変異(ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ３２２)いずれかの３種の細胞株を分析した。ドキソルビシン(ＤＸＲ)、シスプラチン(ＣＤＤＰ)、パクリタキセル、アクチノマイシンＤ(ａｃｔＤ)およびエトポシド(ＶＰ１６)を含む一連の臨床上適応される細胞毒性抗癌剤を使用して、我々は、各細胞毒性剤と無関係のこれらの細胞の耐性の類似パターンを発見した(図１Ａ、および示していない)。これらの結果は、ｐ５３状態が、ＮＳＣＬＣにおける細胞毒性治療の感受性の悪い予測因子であることを確認する。
【００９０】
増殖因子剥奪がＤＮＡ損傷誘引細胞死と異なる機構によりアポトーシスを誘発できるため、我々は、増殖因子シグナル伝達の阻害剤が、このような細胞毒性治療に対する癌細胞耐性を除くことができると推論した。この目的のために、ＮＳＣＬＣ細胞株をＰＫＣ特異的阻害剤スタウロスポリンおよびその臨床的に適用される誘導体ＰＫＣ４１２で処理した。興味深いことに、細胞毒性剤によるアポトーシスに対して保護された細胞株はまたＰＫＣ特異的阻害剤に低下した感受性を示した(図１Ｂおよび示していない)。これは、ＰＫＣ４１２が薬剤耐性および薬剤感受性細胞株においてタンパク質キナーゼＢ／ＡＫＴおよびグリコーゲンシンターゼキナーゼ３−ベータのようなＰＫＣシグナル伝達のリン酸化の下流標的(９)を効率的に低下させるため、標的分子阻害の差異により説明されなかった(図１Ｃおよび示していない)。故に、細胞毒性抗癌剤およびＰＫＣ阻害剤により誘導されるアポトーシスに対する耐性は、アポトーシスシグナル伝達経路における共通の欠損により決定されると考えた。
【００９１】
実施例１０：ＮＳＣＬＣにおけるＰＫＣ４１２と細胞毒性抗癌剤の組み合わせは様々な結果をもたらした
【００９２】
ＰＫＣ４１２および細胞毒性抗癌剤の組み合わせ処置の相乗的または相加的効果がＮＳＣＬＣにおける薬剤耐性に打ち勝つことができるか否かを調べるために、我々は最初に、固定された用量のトポイソメラーゼ阻害剤ＶＰ１６および漸増量のＰＫＣ４１２の同時インキュベーション後に誘導されたアポトーシスを測定した。ＮＣＩ−Ｈ４６０のような
感受性癌細胞株において、ＰＫＣ４１２はＶＰ１６単独と比較してアポトーシスのさらなる増加をもたらさなかった(図２Ａ)。興味深いことに、薬剤耐性ＮＳＣＬＣ細胞株で一貫しない結果が得られた。ＰＫＣ４１２およびＶＰ１６での組み合わせ処置はＡ５４９細胞において相加的細胞毒性をもたらすが(図２Ｂ)、ＰＫＣ４１２での処置は、ＶＰ１６誘導アポトーシスに対して実際にＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞を保護した(図２Ｃ)。ＰＫＣ４１２およびＶＰ１６の適用の時期および順番の影響をさらに区別するために、細胞をＶＰ１６またはＰＫＣ４１２いずれか一方で２４時間前処理し、続いて他方の薬剤をさらに２４時間添加した。ＰＫＣ４１２での前処置は、Ｇ２／Ｍ期での細胞周期停止をもたらし、それはＣＤＫ１活性の阻害により説明できる可能性が高い(１０)(図２Ｄ)。興味深いことに、ＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞において、このＧ２／Ｍ停止はＰＫＣ４１２の後に与えたＶＰ１６により誘導されたアポトーシスの量を低下させた(図２Ｅ)。対照的に、ＰＫＣ４１２で前処理したＡ５４９で見られたアポトーシスの量は、ＶＰ１６での前処理後に見られたものと有意には異ならなかった(図２Ｅ)。
【００９３】
実施例１１：ＰＫＣ４１２に耐性のＮＳＣＬＣ細胞におけるカスパーゼ活性化のミトコンドリア経路の欠損
【００９４】
ＤＮＡ傷害剤および増殖因子離脱により誘導されるアポトーシスは、主にカスパーゼ活性化のミトコンドリア経路を介して進む(１１、１２)。ＮＳＣＬＣ細胞株におけるＰＫＣ特異的阻害剤の機構をさらに詳細に調べるために、我々はこのアポトーシスシグナル伝達経路の数工程を分析した。耐性ＮＳＣＬＣ細胞株は、ＰＫＣ特異的阻害剤または細胞毒性抗癌剤での処置後、一貫してカスパーゼ活性化および保存されたミトコンドリア膜電位差(“ΔΨｍ”)を示した(図３Ａ、Ｂおよび示していない)。また薬剤耐性ＮＳＣＬＣ細胞株においてミトコンドリアチトクロームｃの細胞質への放出は遅れ、低下した(図３Ｃ)。これらの結果は、ＢＣＬ−２ファミリータンパク質のレベルでのアポトーシスシグナル伝達における遮断を示した。この目的のために、我々は、ＮＳＣＬＣ細胞株における必須アポトーシス促進性ＢＨ１−２−３タンパク質ＢＡＸおよびＢＡＫ、および抗アポトーシスタンパク質ＢＣＬ−ＸＬの構成的発現を試験した。ＢＡＸは全６細胞株で構成的に発現されていたが、ＢＡＫおよびＢＣＬ−ＸＬのタンパク質レベルは幾分変動していた(図３Ｄ)。しかしながら、これらの因子のいずれもＮＳＣＬＣ細胞株で観察される端正のパターンを納得がいくように説明しなかった。
【００９５】
実施例１２：ＰＫＣ４１２仲介アポトーシスへのＢＡＫ感作耐性ＮＳＣＬＣ細胞の誘導性発現
【００９６】
先の結果に基づき、我々は、アポトーシス促進性ＢＣＬ−２ファミリータンパク質の治療的ターゲティングが薬剤耐性ＮＳＣＬＣ細胞株で見られるカスパーゼ活性化の機能的遮断に打ち勝つことができると推論した。この経路の中枢工程は、ミトコンドリア外膜(ＭＯＭ)の透過処理であり、これはアポトーシス促進性ＢＣＬ−２タンパク質ＢＡＸおよびＢＡＫにより実行される(１３)。過剰発現試験は、両方の分子が直接ＭＯＭ透過処理およびアポトーシスを誘導できることを示している(１４−１７)。生理学的状況で、ＢＡＸおよびＢＡＫはＢＣＬ−ＸＬ、ＭＣＬ−１またはＢＣＬ−２のような抗アポトーシスＢＣＬ−２タンパク質により負に制御される。ＢＡＸおよびＢＡＫの直接的または間接的な正の制御は、ＢＩＤおよびＢＩＭ、またはＰＵＭＡ、ＮＯＸＡ、ＢＡＤおよびその他を含むが、これらに限定されないＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質のグループにより達成される(１８、１９)。
【００９７】
ミトコンドリアに構成的に標的化されているＢＡＫの薬理学的調節を試験するために、我々は、ヒトＢＡＫ  ｃＤＮＡの条件的発現を可能にするレトロウイルスベクターを産生した。この系で、トランスジェニックＢＡＫの発現は、ドキシサイクリン(ＤＯＸ)添加により転写レベルで誘導される。このレトロウイルスベクター系で達成される高い形質導入効率により、我々はＮＳＣＬＣ細胞株の集団の評価が可能となった。これは、一細胞クローンの試験よりも、腫瘍の薬理的処置を良好に反映する。さらに、これらの集団中のトランスジェニックＢＡＫの発現レベルは、いくつかのＮＳＣＬＣ細胞株で観察された内因性ＢＡＫのレベルを超えなかった(図４Ａ)。
【００９８】
トランスジェニックＢＡＫの発現の誘発は、薬剤耐性ＮＳＣＬＣ細胞株においてある程度のアポトーシスをもたらした(図４Ｂ)。トランスジェニックＢＡＫにより促進されたアポトーシスはカスパーゼおよびカスパーゼ基質の開裂および活性化(図４Ｃ)、ΔΨｍの損失を伴い、ＢＣＬ−ＸＬの発現また抗スペクトルカスパーゼ阻害剤ＶＡＤ−ｆｍｋにより阻害された(図４Ｄおよび示していない)。これらの結果は、トランスジェニックＢＡＫがこの実験系ではその生理学的カウンターパートのように働くことを核にする。
【００９９】
興味深いことに、条件的に発現されたＢＡＫは、ＰＫＣ特異的阻害剤または細胞毒性抗癌剤により誘導されたアポトーシスに対して薬剤耐性ＮＳＣＬＣ細胞株を効率的に感受性にした(図５Ａ、Ｃおよび示していない)。これは、これらの細胞株において、ＤＯＸの非存在下ではなく、存在下のみでのＰＫＣ特異的阻害剤での処置後のカスパーゼ活性化により説明された(図５Ｄ)。対照的に、薬剤感受性ＮＳＣＬＣ細胞におけるＢＡＫ発現の誘導は、ＰＫＣ特異的阻害剤で処置後に観察されるアポトーシスの量をわずかに増加させるのみであった(図５Ｂ)。
【０１００】
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【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１Ａ−１Ｂ】インビトロで細胞毒性抗癌剤およびＰＫＣ特異的阻害剤で処置したＮＳＣＬＣ細胞株の耐性の類似パターンのグラフ表示である。
【図２Ａ−２Ｅ】細胞毒性抗癌剤とＰＫＣ特異的阻害剤の組み合わせが、インビトロで予測可能な相乗的細胞毒性をもたらすことができなかったことを示すグラフ表示である。
【図３Ａ−３Ｄ】ＰＫＣ特異的阻害剤に耐性のＮＳＣＬＣ細胞株がミトコンドリアチトクロームｃの遅い放出を示し、ΔΨｍを維持し、そしてカスパーゼの活性化ができないことを示す、グラフおよび図表示である。
【図４Ａ−４Ｄ】ＡＫの条件的発現が薬剤耐性ＮＳＣＬＣ細胞株をアポトーシスに対して感受性にすることを示す、図およびグラフ表示である。
【図５Ａ−５Ｄ】ミトコンドリアＢＡＫのターゲティングが薬剤耐性ＮＳＣＬＣ細胞株をＰＫＣ４１２誘導アポトーシスに対して感受性にすることを示すグラフ表示である。
【図１Ａ】
2009504608.tif 000020
【図１Ｂ】
2009504608.tif 000021
【図１Ｃ】
2009504608.tif 000022
【図２Ａ−２Ｃ】
2009504608.tif 000023
【図２Ｄ−２Ｅ】
2009504608.tif 000024
【図３】
2009504608.tif 000025
【図４】
2009504608.tif 000026
【図５】
2009504608.tif 000027
【国際調査報告】
2009504608.tif 000028
2009504608.tif 000029
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