(57)【要約】式ＣＮＮのヌクレオチド配列に結合するジンクフィンガーとヌクレオチドの結合領域を含有するポリペプチドが提供される。又、複数のポリペプチドを含有する組成物、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びにこのようなポリペプチド、組成物及びポリヌクレオチドで遺伝子発現を調節する方法も提供される。本発明は、本明細書に開示した複数又は好ましくは約２〜約１２個のジンクフィンガーヌクレオチド結合領域を含有するポリペプチド組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式ＣＮＮ（式中、ＮはＡ、Ｃ、Ｇ又はＴである）の標的ヌクレオチドに優先的に結合する、５〜１０個のアミノ酸残基のヌクレオチド結合領域を含む、単離精製ジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチド。
【請求項２】
前記標的ヌクレオチドが、式ＣＡＮ、ＣＣＮ、ＣＧＮ、ＣＴＮ、ＣＮＡ、ＣＮＣ、ＣＮＧ又はＣＮＴを有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記標的ヌクレオチドが、式ＣＡＡ、ＣＡＣ、ＣＡＧ、ＣＡＴ、ＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＣＴ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＴ、ＣＴＡ、ＣＴＣ、ＣＴＧ又はＣＴＴを有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記結合領域が、配列番号１〜２８、３５〜４５、４８、５４、５７〜８２、８５〜１３０及び１３４〜１５７の何れかと同じヌクレオチド結合特性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記結合領域が、配列番号１〜２８、３５〜４５、４８、５４、５７〜８２、８５〜１３０及び１３４〜１５７の何れかをその中に含むポリペプチドと結合について競合する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記結合領域が、配列番号１〜２８、３５〜４５、４８、５４、５７〜８２、８５〜１３０及び１３４〜１５７の何れかのアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記結合領域が、配列番号５４、５７〜８２、８５〜１３０及び１３４〜１５７の何れかのアミノ酸配列を有する、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記結合領域が、配列番号２、１４、１８、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７５、７７、７８、７９、８０、８１、８２、１３４及び１５３の何れかのアミノ酸配列を有する、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記結合領域が、配列番号２、１４、１８、６３、６６、７１、７２、７３、７５、７７、７８、７９、８０、８１及び８２の何れかのアミノ酸配列を有する、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記ヌクレオチド結合領域が７個の残基であり、αヘリカル構造を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記結合領域が、
（ａ）配列番号２、１４、１８、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７５、７７、７８、７９、８０、８１、８２、１３４及び１５３の何れかのアミノ酸配列の結合領域；並びに
（ｂ）配列番号２、１４、１８、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７５、７７、７８、７９、８０、８１、８２、１３４及び１５３の何れかのアミノ酸配列と、２個以下の保存的アミノ酸置換でしか異ならない結合領域であって、解離定数が該置換前のポリペプチドの解離定数の１２５％以下であり、且つ保存的アミノ酸置換が、以下の置換：Ａｌａ／Ｇｌｙ又はＳｅｒ；Ａｒｇ／Ｌｙｓ；Ａｓｎ／Ｇｌｎ又はＨｉｓ；Ａｓｐ／Ｇｌｕ；Ｃｙｓ／Ｓｅｒ；Ｇｌｎ／Ａｓｎ；Ｇｌｙ／Ａｓｐ；Ｇｌｙ／Ａｌａ又はＰｒｏ；Ｈｉｓ／Ａｓｎ又はＧｌｎ；Ｉｌｅ／Ｌｅｕ又はＶａｌ；Ｌｅｕ／Ｉｌｅ又はＶａｌ；Ｌｙｓ／Ａｒｇ又はＧｌｎ又はＧｌｕ；Ｍｅｔ／Ｌｅｕ又はＴｙｒ又はＩｌｅ；Ｐｈｅ／Ｍｅｔ又はＬｅｕ又はＴｙｒ；Ｓｅｒ／Ｔｈｒ；Ｔｈｒ／Ｓｅｒ；Ｔｒｐ／Ｔｙｒ；Ｔｙｒ／Ｔｒｐ又はＰｈｅ；Ｖａｌ／Ｉｌｅ又はＬｅｕの１つである、結合領域、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドが、天然に存在するジンクフィンガータンパク質の誘導体又は変異体である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記天然に存在するジンクフィンガータンパク質が、ＳＰ１Ｃ、ＴＦＩＩＩＡ及びＺｉｆ２６８からなる群から選択される、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１に記載のポリペプチドを複数含むポリペプチド組成物であって、該ポリペプチドが互いに作動可能に結合している、ポリペプチド組成物。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが、５〜１５個のアミノ酸残基のフレキシブルペプチドリンカーを介して作動可能に結合する、請求項１４に記載のポリペプチド組成物。
【請求項１６】
前記リンカーが配列番号３０及び配列番号１３３からなる群から選択される配列を有する、請求項１５に記載のポリペプチド組成物。
【請求項１７】
前記組成物が２〜１２個のポリペプチドを含む、請求項１４に記載のポリペプチド組成物。
【請求項１８】
前記組成物が２〜６個のポリペプチドを含む、請求項１７に記載のポリペプチド組成物。
【請求項１９】
前記ポリペプチド組成物が、天然に存在するジンクフィンガータンパク質の誘導体又は変異体である、請求項１５に記載のポリペプチド組成物。
【請求項２０】
前記天然に存在するジンクフィンガータンパク質が、ＳＰ１Ｃ、ＴＦＩＩＩＡ及びＺｉｆ２６８からなる群から選択される、請求項１９に記載のポリペプチド組成物。
【請求項２１】
αヘリカル構造を有し、式ＣＮＮ（式中、ＮはＡ、Ｃ、Ｇ又はＴである）の標的ヌクレオチドに優先的に結合する、単離ヘプタペプチド。
【請求項２２】
前記標的ヌクレオチドが、式ＣＡＮ、ＣＣＮ、ＣＧＮ、ＣＴＮ、ＣＮＡ、ＣＮＣ、ＣＮＧ又はＣＮＴを有する、請求項２１に記載の単離ヘプタペプチド。
【請求項２３】
前記標的ヌクレオチドが、式ＣＡＡ、ＣＡＣ、ＣＡＧ、ＣＡＴ、ＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＣＴ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＴ、ＣＴＡ、ＣＴＣ、ＣＴＧ又はＣＴＴを有する、請求項２２に記載の単離ヘプタペプチド。
【請求項２４】
前記ヘプタペプチドが、配列番号１〜２８、３５〜４５、４８、５４、５７〜８２、８５〜１３０及び１３４〜１５７の何れかのアミノ酸配列を有する、請求項２１に記載の単離ヘプタペプチド。
【請求項２５】
前記ヘプタペプチドが、配列番号２、１４、１８、６３、６６、７１、７２、７３、７５、７７、７８、７９、８０、８１、８２、１３４及び１５３の何れかのアミノ酸配列を有する、請求項２４に記載の単離ヘプタペプチド。
【請求項２６】
前記ヘプタペプチドが、配列番号２、１４、１８、６３、６６、７１、７２、７３、７５、７７、７８、７９、８０、８１及び８２の何れかのアミノ酸配列を有する、単離ヘプタペプチド。
【請求項２７】
前記ヘプタペプチドが、
（ａ）配列番号２、１４、１８、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７５、７７、７８、７９、８０、８１、８２、１３４及び１５３の何れかのアミノ酸配列；並びに
（ｂ）配列番号２、１４、１８、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７５、７７、７８、７９、８０、８１、８２、１３４及び１５３の何れかのアミノ酸配列と、２個以下の保存的アミノ酸置換でしか異ならないアミノ酸配列であって、解離定数が該置換前の該ポリペプチドの解離定数の１２５％以下であり、且つ保存的アミノ酸置換が、以下の置換：即ち、Ａｌａ／Ｇｌｙ又はＳｅｒ；Ａｒｇ／Ｌｙｓ；Ａｓｎ／Ｇｌｎ又はＨｉｓ；Ａｓｐ／Ｇｌｕ；Ｃｙｓ／Ｓｅｒ；Ｇｌｎ／Ａｓｎ；Ｇｌｙ／Ａｓｐ；Ｇｌｙ／Ａｌａ又はＰｒｏ；Ｈｉｓ／Ａｓｎ又はＧｌｎ；Ｉｌｅ／Ｌｅｕ又はＶａｌ；Ｌｅｕ／Ｉｌｅ又はＶａｌ；Ｌｙｓ／Ａｒｇ又はＧｌｎ又はＧｌｕ；Ｍｅｔ／Ｌｅｕ又はＴｙｒ又はＩｌｅ；Ｐｈｅ／Ｍｅｔ又はＬｅｕ又はＴｙｒ；Ｓｅｒ／Ｔｈｒ；Ｔｈｒ／Ｓｅｒ；Ｔｒｐ／Ｔｙｒ；Ｔｙｒ／Ｔｒｐ又はＰｈｅ；Ｖａｌ／Ｉｌｅ又はＬｅｕの１つである、アミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項２１に記載の単離ヘプタペプチド。
【請求項２８】
１個以上の転写調節因子と作動可能に結合されている、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
前記転写調節因子が転写のレプレッサーである、請求項２８に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
前記転写調節因子が転写のアクチベーターである、請求項２８に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
１個以上の転写調節因子と作動可能に結合されている、請求項１４に記載のポリペプチド組成物。
【請求項３２】
前記転写調節因子が転写のレプレッサーである、請求項３１に記載のポリペプチド組成物。
【請求項３３】
前記転写調節因子が転写のアクチベーターである、請求項３２に記載のポリペプチド組成物。
【請求項３４】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする、単離精製ポリヌクレオチド。
【請求項３５】
請求項１４に記載のポリペプチド組成物をコードする、単離精製ポリヌクレオチド。
【請求項３６】
請求項２１に記載の単離ヘプタペプチドをコードする、単離精製ポリヌクレオチド。
【請求項３７】
請求項３４に記載の単離精製ポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３８】
請求項３５に記載の単離精製ポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３９】
請求項３６に記載の単離精製ポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４０】
請求項３７に記載のベクターで形質転換又は形質導入した宿主細胞。
【請求項４１】
真核生物である、請求項４０に記載の宿主細胞。
【請求項４２】
原核細胞である、請求項４０に記載の宿主細胞。
【請求項４３】
請求項３８に記載のベクターで形質転換又は形質導入した宿主細胞。
【請求項４４】
真核生物である、請求項４３に記載の宿主細胞。
【請求項４５】
原核細胞である、請求項４５に記載の宿主細胞。
【請求項４６】
請求項３９に記載のベクターで形質転換又は形質導入した宿主細胞。
【請求項４７】
真核生物である、請求項４６に記載の宿主細胞。
【請求項４８】
原核細胞である、請求項４６に記載の宿主細胞。
【請求項４９】
請求項３４に記載のポリヌクレオチドで形質転換又は形質導入した宿主細胞。
【請求項５０】
真核生物である、請求項４９に記載の宿主細胞。
【請求項５１】
原核細胞である、請求項４９に記載の宿主細胞。
【請求項５２】
請求項３５に記載のポリヌクレオチドで形質転換又は形質導入した宿主細胞。
【請求項５３】
真核生物である、請求項５２に記載の宿主細胞。
【請求項５４】
原核細胞である、請求項５２に記載の宿主細胞。
【請求項５５】
請求項３６に記載のポリヌクレオチドで形質転換又は形質導入した宿主細胞。
【請求項５６】
真核生物である、請求項５５に記載の宿主細胞。
【請求項５７】
原核細胞である、請求項５５に記載の宿主細胞。
【請求項５８】
（ａ）請求項１のポリペプチドをコードする単離精製ポリヌクレオチド；及び
（ｂ）（ａ）の配列と少なくとも９５％相同であるが、但し、特異的核酸結合活性を含む請求項１に記載のポリペプチドの活性を有するポリペプチドに翻訳されることを条件とする、核酸配列
からなる群から選択される、単離精製ポリヌクレオチド。
【請求項５９】
（ａ）請求項１４に記載のポリペプチド組成物をコードする単離精製ポリヌクレオチド；並びに
（ｂ）（ａ）の配列と少なくとも９５％相同であるが、但し、特異的核酸結合活性を含む請求項１０に記載のポリペプチドの活性を有するポリペプチドに翻訳されることを条件とする、核酸配列
からなる群から選択される、単離精製ポリヌクレオチド。
【請求項６０】
（ａ）請求項２１に記載のヘプタペプチドをコードする単離精製ポリヌクレオチド；並びに
（ｂ）（ａ）の配列と少なくとも９５％相同であるが、但し、特異的核酸結合活性を含む請求項１７に記載のポリペプチドの活性を有するポリペプチドに翻訳されることを条件とする、核酸配列
からなる群から選択される、単離精製ポリヌクレオチド。
【請求項６１】
配列５’−（ＣＮＮ）ｎ−３’（式中、ｎは２〜１２である）を含有するヌクレオチド配列の発現を調節するプロセスであって、該ヌクレオチド配列を請求項１４に記載のポリペプチド組成物の有効量に曝露することを含む、プロセス。
【請求項６２】
前記配列５’−（ＣＮＮ）−３’が５’−（ＣＮＮ）ｎ−３’配列内に位置する、請求項６１に記載のプロセス。
【請求項６３】
前記配列５’−（ＣＮＮ）ｎ−３’が前記ヌクレオチド配列の転写領域に位置する、請求項６１に記載のプロセス。
【請求項６４】
前記配列５’−（ＣＮＮ）ｎ−３’が前記ヌクレオチド配列のプロモーター領域に位置する、請求項６１に記載のプロセス。
【請求項６５】
前記配列５’−（ＣＮＮ）ｎ−３’が発現配列タグ内に位置する、請求項６１に記載のプロセス。
【請求項６６】
前記ポリペプチド組成物が１個以上の転写調節因子に作動可能に結合する、請求項６１に記載のプロセス。
【請求項６７】
前記転写調節因子が転写のレプレッサーである、請求項６６に記載のプロセス。
【請求項６８】
前記転写調節因子が転写のアクチベーターである、請求項６６に記載のプロセス。
【請求項６９】
前記ヌクレオチド配列が遺伝子である、請求項６１に記載のプロセス。
【請求項７０】
前記遺伝子が真核細胞遺伝子である、請求項６９に記載のプロセス。
【請求項７１】
前記遺伝子が原核細胞遺伝子である、請求項６９に記載のプロセス。
【請求項７２】
前記遺伝子がウイルス遺伝子である、請求項６９に記載のプロセス。
【請求項７３】
前記真核細胞遺伝子が哺乳動物遺伝子である、請求項７０に記載のプロセス。
【請求項７４】
前記哺乳動物遺伝子がヒト遺伝子である、請求項７３に記載のプロセス。
【請求項７５】
前記真核細胞遺伝子が植物遺伝子である、請求項７０に記載のプロセス。
【請求項７６】
前記原核細胞遺伝子が細菌遺伝子である、請求項７１に記載のプロセス。
【請求項７７】
（ａ）治療有効量の請求項１に記載のポリペプチド；及び
（ｂ）薬学的に許容される担体
を含む、薬学的組成物。
【請求項７８】
（ａ）治療有効量の請求項１４に記載のポリペプチド組成物；及び
（ｂ）薬学的に許容される担体
を含む、薬学的組成物。
【請求項７９】
（ａ）治療有効量の請求項２１に記載のヘプタペプチド；及び
（ｂ）薬学的に許容される担体
を含む、薬学的組成物。
【請求項８０】
（ａ）治療有効量の請求項３４に記載のポリヌクレオチド；及び
（ｂ）薬学的に許容される担体
を含む、薬学的組成物。
【請求項８１】
（ａ）治療有効量の請求項３５に記載のポリヌクレオチド；及び
（ｂ）薬学的に許容される担体
を含む、薬学的組成物。
【請求項８２】
（ａ）治療有効量の請求項３６に記載のポリヌクレオチド；及び
（ｂ）薬学的に許容される担体
を含む、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、先の特許出願である、Ｂａｒｂａｓらによる「Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎｓ  ｆｏｒ  ＣＮＮ」という名称の２００４年６月１８日に出願された、米国特許出願第１０／４８７，２６８号に関する。米国特許出願第１０／４８７，２６８号は、２００２年８月２０日に出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／２６３８８号の米国国内段階であり、これは次いで、２００１年８月２０日に出願された米国仮特許出願第６０／３１３，８６４号および同第６０／３１３，６９３号から優先権を主張する。これらの開示は、全て、本明細書中に参考として援用される。本願はまた、Ｂａｒｂａｓらによる「Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎｓ  ｆｏｒ  ＣＮＮ」という名称の、２００５年８月１１日に出願された米国仮特許出願第６０／７０７，８３９号から優先権を主張する。
【０００２】
政府の権利
本明細書に報告する試験の幾つかを支援するために使用される基金は、国立衛生研究所（ＮＩＨ  ＧＭ  ５３９１０）によって提供されたものである。従って、連邦政府は本発明における特定の権利を有する。
【０００３】
発明の技術分野
本発明の分野は、標的ヌクレオチドへのジンクフィンガータンパク質の結合である。より具体的には、本発明は、式５’−（ＣＮＮ）−３’の標的ヌクレオチドに特異的に結合するジンクフィンガーのαヘリカルドメイン内のアミノ酸残基配列に関する。
【背景技術】
【０００４】
人工転写因子の構築は、過去数年の間に多大な注目を集めてきた。遺伝子発現は、調節ドメインに融合する多指のジンクフィンガータンパク質によって特異的に調節することができる。Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２ファミリーのジンクフィンガードメインは、モジュール構造を有することから、人工転写因子の構築に最も有望であるとされてきた。各ドメインは約３０個のアミノ酸からなり、疎水性相互作用及び保存されたＣｙｓ２−Ｈｉｓ２残基による亜鉛イオンのキレート化により安定化したαヘリカル構造へと折り畳まれる。現在のところ、このジンクフィンガータンパク質ファミリーの最も特徴の優れたタンパク質は、マウスの転写因子Ｚｉｆ  ２６８である（Ｐａｖｌｅｔｉｃｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２  （５００７），  ８０９−８１７；  Ｅｌｒｏｄ−Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４（１０），  １１７１−１１８０）。Ｚｉｆ  ２６８／ＤＮＡ複合体の分析により、ＤＮＡ結合が、主に１位、３位及び６位のαヘリックスのアミノ酸残基と、３ｂｐのＤＮＡサブサイトの３’末端、中央及び５’末端のヌクレオチドとの相互作用によって達成されることが示唆された。１位、２位及び５位は、ＤＮＡのリン酸骨格と直接又は水を介して接触することが明らかにされている。ロイシンは通常４位に認められ、ドメインの疎水性コアに詰め込まれる。αヘリックスの２位は、その他のヘリックス残基と相互作用する他にも、３ｂｐサブサイトの外側のヌクレオチドとも接触できることが明らかにされている（Ｐａｖｌｅｔｉｃｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２  （５００７），  ８０９−８１７；  Ｅｌｒｏｄ−Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４（１０），  １１７１−１１８０；  Ｉｓａｌａｎ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４（１１），  ５６１７−５６２１）。
【０００５】
５’−（ＧＮＮ）−３’ＤＮＡサブサイトのそれぞれを高い特異性と親和性で認識するモジュールジンクフィンガードメインの選択及びその部位特異的変異処理の洗練化が明らかにされてきた（開示内容が参考として本明細書で援用される、米国特許６，１４０，０８１号）。これらのモジュールドメインが集合して、ヒトゲノム又は他のあらゆるゲノム内で唯一である長さ１８ｂｐのＤＮＡ配列を認識するジンクフィンガータンパク質を形成することができる。更に、これらのタンパク質は転写因子として機能し、調節ドメインに融合して遺伝子発現を変化させることができ、核内ホルモン受容体のリガンド結合ドメインに融合してホルモン依存性になることさえできる。あらゆるＤＮＡ配列に結合するジンクフィンガーを主成分とする転写因子を迅速に構築するには、モジュールジンクフィンガードメインの既存のセットを伸長させ、タンパク質を終結させる３個のトリプレットを含めた、遺伝コードにおいて意味が割り当てられる６４個の考え得るＤＮＡトリプレットの一つ一つを認識させることが重要である。この目的は、ファージディスプレイの選択及び／又は合理的なデザインによって達成することができる。ジンクフィンガーとＤＮＡとの相互作用に関する構造的なデータが限られているため、亜鉛タンパク質の合理的なデザインには極めて時間がかかる上に、多くの場合不可能であることもある。更に、大部分の天然に存在するジンクフィンガータンパク質は、５’−（ＧＮＮ）−３’のＤＮＡ配列を認識するドメインから構成される。５’−（ＮＮＮ）−３’のＤＮＡ標的配列に結合する新規のジンクフィンガードメインを同定するために最も有望な手法は、ファージディスプレイを介した選択である。この手法で限定される手順とは、各モジュールで認識されるサブサイト内の５’アデニン、シトシン又はチミンの特定を可能にするライブラリーの構築である。ファージディスプレイの選択は、このタンパク質の種々のフィンガーが無作為化されたＺｉｆ２６８に基づいて行われてきた（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。５’−（ＧＮＮ）−３’のＤＮＡ配列を認識する１組の１６からなるドメインは、Ｚｉｆ２６８の誘導体（非特許文献４）であるＣ７のフィンガー２が無作為化されたライブラリーから以前に報告されている（非特許文献７）。このような戦略においては、フィンガー３のＡｓｐ２がフィンガー２サブサイトで５’グアニン又はチミンの相補的塩基と接触するため、選択は５’−（ＧＮＮ）−３’又は５’−（ＴＮＮ）−３’を認識するドメインに限定される（非特許文献８；非特許文献９）。
【０００６】
本発明の手法は、科学界を挙げてのジンクフィンガータンパク質の迅速な構築を可能にし、サブサイト間の相互作用による制限に関する懸念が限定された場合にしか起こらない、ジンクフィンガードメインのモジュール性に基づくものである。本開示内容は、５’−（ＣＮＮ）−３’のＤＮＡ配列を特異的に認識するジンクフィンガードメインの選択において新しい戦略を導入するものである。これらのドメインの特異的なＤＮＡ結合特性を、１６個の５’−（ＣＮＮ）−３’のトリプレット全てについてマルチターゲットＥＬＩＳＡで評価した。これらのドメインは、一つ一つが延長１８ｂｐ配列を特異的に認識する種々の数の５’−（ＣＮＮ）−３’ドメインを含有する多指のタンパク質に容易に組み入れることができる。更に、これらのドメインは、調節ドメインに融合すると遺伝子発現を特異的に変化させることができる。このような結果は、所定の構成ブロックから多指のタンパク質を構築することの実行可能性を強調するものである。更に、本明細書で特徴付けられるドメインは、人工の転写因子の標的になりうるＤＮＡ配列の数を著明に増加させる。
【非特許文献１】Ｃｈｏｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９１（２３），  １１１６８−７２
【非特許文献２】Ｒｅｂａｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．，  １８８３−）  ２６３（５１４７），  ６７１−３
【非特許文献３】Ｊａｍｉｅｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３，  ５６８９−５６９５
【非特許文献４】Ｗｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）  ＰＮＡＳ  ９２，  ３４４−３４８
【非特許文献５】Ｊａｍｉｅｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３，  １２８３４−１２８３９
【非特許文献６】Ｇｒｅｉｓｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５  （５３００），  ６５７−６６１
【非特許文献７】Ｓｅｇａｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６（６），  ２７５８−２７６３
【非特許文献８】Ｐａｖｌｅｔｉｃｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２（５００７），  ８０９−８１７
【非特許文献９】Ｅｌｒｏｄ−Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４（１０），  １１７１−１１８０
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様において、本発明は、式ＣＮＮ（式中、ＮはＡ、Ｃ、Ｇ又はＴである）を有する標的ヌクレオチドに優先的に結合する、５〜１０個のアミノ酸残基からなるヌクレオチド結合領域を含有する、単離精製ジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドを提供する。好ましくは、標的ヌクレオチドは、式ＣＡＡ、ＣＡＣ、ＣＡＧ、ＣＡＴ、ＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＣＴ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＴ、ＣＴＡ、ＣＴＣ、ＣＴＧ又はＣＴＴを有するのがよい。一実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１〜２８、３５〜４５、４８、５４、５７〜８２、８５〜１３０及び１３４〜１５７の何れかと同じヌクレオチド結合特性を有するアミノ酸配列を有する結合領域を含有する。このようなポリペプチドは、配列番号１〜２８、３５〜４５、４８、５４、５７〜８２、８５〜１３０及び１３４〜１５７の何れかと競合して標的ヌクレオチドと結合する。即ち、好ましいポリペプチドは、配列番号１〜２８、３５〜４５、４８、５４、５７〜８２、８５〜１３０及び１３４〜１５７の何れかによる結合を、競合によって取って代わる結合領域を含有するのがよい。競合的結合を判定する手段は、当該技術分野で周知である。好ましくは、結合領域は配列番号１〜２８、３５〜４５、４８、５４、５７〜８２、８５〜１３０及び１３４〜１５７の何れかのアミノ酸配列を有するのがよい。より好ましくは、結合領域は配列番号５４、５７〜８２、８５〜１３０及び１３４〜１５７の何れかのアミノ酸配列を有するのがよい。尚より好ましくは、結合領域は配列番号２、１４、１８、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７５、７７、７８、７９、８０、８１、８２、１３４及び１５３の何れかのアミノ酸配列を有するのがよい。更により好ましくは、結合領域は配列番号２、１４、１８、６３、６６、７１、７２、７３、７５、７７、７８、７９、８０、８１、８２、１３４及び１５３の何れかのアミノ酸配列を有するのがよい。尚更に好ましくは、結合領域は配列番号２、１４、１８、６３、６６、７１、７２、７３、７５、７７、７８、７９、８０、８１及び８２の何れかのアミノ酸配列を有するのがよい。
【０００８】
別の態様において、本発明は、本明細書に開示した複数又は好ましくは約２〜約１２個のジンクフィンガーヌクレオチド結合領域を含有するポリペプチド組成物を提供する。これらのドメインを、５〜１５個のアミノ酸残基からなるフレキシブルペプチドリンカー等によって作動可能に結合させる。操作的な結合は、好ましくは配列番号３０に示すようなフレキシブルペプチドリンカーを介して行われるのがよい。このような組成物は、式５’−（ＣＮＮ）ｎ−３’の配列（式中、ＮはＡ、Ｃ、Ｇ又はＴであり、ｎが２〜１２である）を含有するヌクレオチド配列に結合する。好ましくは、このポリペプチド組成物は、約２〜約６個のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインを含有し、式５’−（ＣＮＮ）ｎ−３’の配列（式中、ｎは２〜６である）を含有するヌクレオチド配列に結合する。結合は解離定数（ＫＤ）が１μＭ〜１０μＭの場合に行われる。好ましくは、結合はＫＤが１０μＭ〜１μＭ、１０ｐＭ〜１００ｎＭ、１００ｐＭ〜１０ｎＭでる場合に行われるのがよく、より好ましくはＫＤが１ｎＭ〜１０ｎＭである場合に行われるのがよい。好ましい実施形態において、本発明のポリペプチド及びポリペプチド組成物は何れも、転写のレプレッサー又は転写のアクチベーター等の１つ以上の転写調節因子に作動可能に結合させるのがよい。
【０００９】
又別の態様において、本発明は更に、αヘリカル構造を有し、式ＣＮＮ（式中、ＮはＡ、Ｃ、Ｇ又はＴである）の標的ヌクレオチドに優先的に結合する単離ヘプタペプチドを提供する。好ましい標的ヌクレオチドは上に記載の通りである。
【００１０】
好ましくは、このヘプタペプチドは、配列番号１〜２８、３５〜４５、４８、５４、５７〜８２、８５〜１３０及び１３４〜１５７の何れかのアミノ酸配列を有するのがよい。より好ましくは、ヘプタペプチドは、配列番号５４、５７〜８２、８５〜１３０及び１３４〜１５７の何れかのアミノ酸配列を有するのがよい。尚より好ましくは、ヘプタペプチドは、配列番号２、１４、１８、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７５、７７、７８、７９、８０、８１、８２、１３４及び１５３の何れかのアミノ酸配列を有するのがよい。更により好ましくは、ヘプタペプチドは、配列番号２、１４、１８、６３、６６、７１、７２、７３、７５、７７、７８、７９、８０、８１、８２、１３４及び１５３の何れかのアミノ酸配列を有するのがよい。尚更に好ましくは、ヘプタペプチドは、配列番号２、１４、１８、６３、６６、７１、７２、７３、７５、７７、７８、７９、８０、８１及び８２の何れかのアミノ酸配列を有するのがよい。
【００１１】
本発明は更に、本発明のポリペプチド又は組成物をコードするポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドを含有する発現ベクター及びポリヌクレオチド又は発現ベクターと共に形質転換する宿主細胞を提供する。
【００１２】
本発明は更に、標的ヌクレオチド配列５’−（ＣＮＮ）−３’を含有するヌクレオチド配列の発現を調節するプロセスを提供する。標的ヌクレオチド配列は、長い５’−（ＮＮＮ）−３’配列内のどこにでも位置することができる。このプロセスは、ヌクレオチド配列を有効量のジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチド又は本明細書に記載した組成物に曝露する手順を含む。一実施形態においては、あるプロセスで、５’−（ＣＮＮ）ｎ−３’配列（式中、ｎは２〜１２である）を含有するヌクレオチド配列の発現が調節される。このプロセスは、そのヌクレオチド配列を有効量の本発明の組成物に曝露する手順を含む。配列５’−（ＣＮＮ）ｎ−３’は、ヌクレオチド配列の転写領域に位置しても、ヌクレオチド配列の転写プロモーター領域に位置しても、発現配列タグ内に位置してもよい。組成物は好ましくは、転写のレプレッサー又は転写のアクチベーター等の１つ以上の転写調節因子に作動可能に結合させるのがよい。一実施形態において、ヌクレオチド配列は、真核細胞遺伝子、原核細胞遺伝子又はウイルス遺伝子等の遺伝子である。真核細胞遺伝子は、ヒト遺伝子等の哺乳動物遺伝子であっても、植物遺伝子であってもよい。原核細胞遺伝子は細菌遺伝子であってもよい。
【００１３】
又別の実施形態において、本発明は、
（１）上記の本発明に従った治療有効量のポリペプチド、ポリペプチド組成物又は単離ヘプタペプチド；及び
（２）薬学的に許容される担体、
を含む薬学的組成物を提供する。
【００１４】
又別の実施形態において、本発明は、
（１）上記の本発明に従ったポリペプチド、ポリペプチド組成物又は単離ヘプタペプチドをコードする治療有効量のヌクレオチド配列；及び
（２）薬学的に許容される担体、
を含む薬学的組成物を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
定義
特に記載がない限り、本明細書で使用する技術的及び科学的用語は全て、本発明が属する業界の当業者に共通して理解される同じ意味を有する。
【００１６】
本明細書で使用される「核酸」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」という用語又は同様の用語は、一本鎖又は二本鎖であって、コード又は非コード（例えば、アンチセンス）形態を含む、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを指す。この用語は、天然のヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸も包含する。この用語は又、相補的ヌクレオチドのワトソン・クリック結合又はヌクレオチド配列の結合が、ジンクフィンガータンパク質等の特異的に結合するタンパク質で干渉される限り、修飾又は置換塩基が含まれる核酸を包含する。この用語は又、合成骨格を有する核酸様の構造も包含する。本発明が提供するＤＮＡ骨格類似体には、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホラミデート、アルキルホスホトリエステル、スルファメート、３’−チオアセタール、メチレン（メチルイミノ）、３’−Ｎ−カルバメート、モルフォリノカルバメート及びペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれる；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，  ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｆ．  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９１）；  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ６００，  Ｅｄｓ．  Ｂａｓｅｒｇａ  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ  （ＮＹＡＳ  １９９２）；  Ｍｉｌｌｉｇａｎ  （１９９３）  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３６：  １９２３−１９３７；  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  （１９９３，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい。ＰＮＡは、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン単位等の非イオン性骨格を含有する。ホスホロチオエート結合は、例えば米国特許第６，０３１，０９２号、第６，００１，９８２号、第５，６８４，１４８号に記載されており；又、国際特許第ＷＯ  ９７／０３２１１号、第ＷＯ  ９６／３９１５４号、Ｍａｔａ  （１９９７）  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １４４：１８９−１９７も参照されたい。本用語で包含される他の合成骨格には、メチルホスホネート結合又は代替のメチルホスホネート及びホスホジエステル結合（例えば米国特許第５，９６２，６７４号；Ｓｔｒａｕｓｓ−Ｓｏｕｋｕｐ  （１９９７）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：８６９２−８６９８を参照）及びベンジルホスホネート結合（例えば米国特許第５，５３２，２２６号；Ｓａｍｓｔａｇ  （１９９６）  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  ６：１５３−１５６を参照）が含まれる。
【００１７】
本明細書で使用される「転写調節ドメイン又は因子」という用語は、遺伝子転写を調節するべく機能する、本明細書で提供される融合ポリペプチドの該当部分を指す。例示的及び好ましい転写レプレッサードメインは、ＥＲＤ、ＫＲＡＢ、ＳＩＤ、デアセチラーゼ及び誘導体、多量体及び、ＫＲＡＢ−ＥＲＤ、ＳＩＤ−ＥＲＤ、（ＫＲＡＢ）２、（ＫＲＡＢ）３、ＫＲＡＢ−Ａ、（ＫＲＡＢ−Ａ）２、（ＳＩＤ）２、（ＫＲＡＢ−Ａ）−ＳＩＤ及びＳＩＤ−（ＫＲＡＢ−Ａ）といったその組み合わせである。その他の転写調節ドメインには、参考として本明細書で援用される、Ｂａｒｂａｓが発明した”Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒｓ”という表題のＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ０３／１０４４１４号に開示されるものがある。本明細書で使用される「ヌクレオチド結合ドメイン又は領域」という用語は、特異的な核酸結合能力を提供する、本明細書によって提供されるポリペプチドの該当部分又は組成物を指す。このヌクレオチド結合領域は、特異的な遺伝子に結合するｓｕｂｊｅｃｔポリペプチドを標的にするべく機能する。本明細書で使用される「操作的結合」という用語は、例えばポリペプチドの要素が結合して、それぞれが意図すべく役割を果たすか機能することを意味する。例えば、レプレッサーが結合ドメインに結合して、標的ヌクレオチドにその結合ドメインを介して結合する場合、そのレプレッサーは転写を阻害又は予防するべく働く。要素間の結合は、直接的な場合もあれば、リンカーを介する等、間接的な場合もある。要素は必ずしも隣接していなくてもよい。このため、レプレッサードメインは、当該技術分野で周知のあらゆる結合手段を使用してヌクレオチド結合ドメインに結合させることができる。２つのドメイン間にリンカー部分を含めることが必要になることもある。このようなリンカー部分は一般的に、ドメイン間にスペースを作るアミノ酸残基の短い配列である。リンカーが結合又はレプレッサードメインのあらゆる機能に干渉しない限り、あらゆる配列を使用することができる。例示的なリンカーを以下に挙げる。
【００１８】
本明細書で使用される「修飾」という用語は、ジンクフィンガーヌクレオチド結合モチーフが過剰に活性化した場合にそれを含有するプロモーターからの発現を阻害又は抑制すること、又はそうしたプロモーターの活性化が低下した場合にそこからの発現を増加又は促進させることを意味する。
【００１９】
本明細書で使用する、本明細書に記載のさまざまなアミノ酸配列から生じるアミノ酸は、周知の３文字又は１文字の略号に従って記載される。種々のＤＮＡ断片で生じるヌクレオチドは、当該技術分野で通常使用される標準的な１文字表記によって表記される。
【００２０】
ペプチド又はタンパク質において、好適なアミノ酸の保存的置換は、当業者に周知であり、結果として得られる分子の生物学的活性を変化させることなく一般的には行うことができる。当業者は一般的に、ポリペプチド内の重要でない領域における単一アミノ酸置換は、生物学的活性を実質的に変化させないことを認識している（例えば、Ｗａｔｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，  ４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９８７，  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，  ｐ．２２４を参照）。特に、このような保存的変異体は、その変化がそのタンパク質（その保存的変異体）の構造及び／又は活性、例えば核酸結合活性、抗体活性、酵素活性又は受容体活性等を実質的に変化させないような修飾アミノ酸配列を有する。これらは、保存的に修飾されたアミノ酸配列の変異体を含む。即ち、タンパク質の活性に重要ではない残基のアミノ酸が置換、追加又は欠失されるか、同様の特性（例えば、酸性、塩基性、陽性帯電又は陰性帯電、極性又は非極性等）を有する残基のアミノ酸が置換されて、それよりも更に重要なアミノ酸の置換が構造及び／又は活性を実質的に変化しないようにする。機能的に同様のアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当該技術分野で周知である。例えば、保存的置換を選択するためのガイドラインの例は（元々の残基の後に置換例を表記）：Ａｌａ／Ｇｌｙ又はＳｅｒ；Ａｒｇ／Ｌｙｓ；Ａｓｎ／Ｇｌｎ又はＨｉｓ；Ａｓｐ／Ｇｌｕ；Ｃｙｓ／Ｓｅｒ；Ｇｌｎ／Ａｓｎ；Ｇｌｙ／Ａｓｐ；Ｇｌｙ／Ａｌａ又はＰｒｏ；Ｈｉｓ／Ａｓｎ又はＧｌｎ；Ｉｌｅ／Ｌｅｕ又はＶａｌ；Ｌｅｕ／Ｉｌｅ又はＶａｌ；Ｌｙｓ／Ａｒｇ又はＧｌｎ又はＧｌｕ；Ｍｅｔ／Ｌｅｕ又はＴｙｒ又はＩｌｅ；Ｐｈｅ／Ｍｅｔ又はＬｅｕ又はＴｙｒ；Ｓｅｒ／Ｔｈｒ；Ｔｈｒ／Ｓｅｒ；Ｔｒｐ／Ｔｙｒ；Ｔｙｒ／Ｔｒｐ又はＰｈｅ；Ｖａｌ／Ｉｌｅ又はＬｅｕ。代替のガイドラインの例は、以下の６つの群を使用したもので、それぞれが互いに保存的置換であるアミノ酸を含むものである；（１）アラニン（Ａ又はＡｌａ）、セリン（Ｓ又はＳｅｒ）、スレオニン（Ｔ又はＴｈｒ）；（２）アスパラギン酸（Ｄ又はＡｓｐ）、グルタミン酸（Ｅ又はＧｌｕ）；（３）アスパラギン（Ｎ又はＡｓｎ）、グルタミン（Ｑ又はＧｌｎ）；（４）アルギニン（Ｒ又はＡｒｇ）、リジン（Ｋ又はＬｙｓ）；（５）イソロイシン（Ｉ又はＩｌｅ）、ロイシン（Ｌ又はＬｅｕ）、メチオニン（Ｍ又はＭｅｔ）、バリン（Ｖ又はＶａｌ）及び（６）フェニルアラニン（Ｆ又はＰｈｅ）、チロシン（Ｙ又はＴｙｒ）、トリプトファン（Ｗ又はＴｒｐ）；（又、例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ  （１９８４）  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ；  Ｓｃｈｕｌｚ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｍｅｒ  （１９７９）  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇを参照）。当業者は、上記の置換のみが考え得る保存的置換ではないことを理解している。例えば、ある目的のために全ての荷電したアミノ酸をそれが陽性であろうと陰性であろうと、互いにとっての保存的置換としてみなすことができる。更に、コードされた配列において単一のアミノ酸又は低率のアミノ酸を変化、添加又は欠失させる個々の置換、欠失又は添加も、送達されるタンパク質の３次元構造及び機能がこのような変異によっても保存される場合は、「保存的に修飾した変異体」とみなすことができる。
【００２１】
本明細書で使用される「発現ベクター」という用語は、本明細書に記載の融合タンパク質又は本明細書に示す発現カセットをコードする核酸等の異種ＤＮＡの挿入又は組入れにより操作された、当該技術分野で既知のプラスミド、ウイルス、ファージミド又はその他のビヒクルを指す。このような発現ベクターは一般的に、細胞内に挿入された核酸を効率よく転写するためのプロモーター配列を含有する。発現ベクターは一般的に、複製起点、プロモーター並びに形質転換細胞の表現型選択を可能にする特異的な遺伝子が含まれる。
【００２２】
本明細書で使用される「宿主細胞」という用語は、ベクターがその中で増殖し、そのＤＮＡが発現することのできる細胞を指す。この用語は又、ｓｕｂｊｅｃｔ宿主細胞のあらゆる子孫細胞を含む。複製中に変異が起こることもあるため、全ての子孫細胞が親細胞と同一であるとは限らないことは理解されるはずである。このような子孫細胞も、「宿主細胞」という用語が使用される場合には含まれる。外来ＤＮＡが宿主の中に持続的に保存されるための安定した転移方法は、当該技術分野で既知である。
【００２３】
本明細書で使用される遺伝子治療は、このような治療が求められる疾患又は病態を来した哺乳動物、特にヒトの特定の細胞、標的細胞に異種ＤＮＡを導入することを伴う。ＤＮＡは、その異種ＤＮＡが発現し、それによりコードされた治療的生成物が産生されるように、選択した標的細胞に導入する。或いは、異種ＤＮＡは何らかの方法で治療的生成物をコードするＤＮＡの発現を媒介することができるか、治療的生成物の発現を直接的又は間接的に何らかの方法で媒介するペプチドやＲＮＡといった生成物をコードすることができる。遺伝子治療は又、欠損のある遺伝子に取って代わるか、それが導入された哺乳動物又は細胞が産出する遺伝子生成物を補給する遺伝子生成物をコードする核酸を送達するのに使用されることもある。導入された核酸は、通常は哺乳動物の宿主内では産生されないか、治療有効量が産出されないか、治療上有用な時期に産出されない、増殖因子阻害剤等の治療的化合物又はその受容体等の腫瘍壊死因子又は阻害剤をコードすることができる。治療的生成物をコードする異種ＤＮＡは、罹患宿主の細胞に導入する前に修飾して、その生成物又は発現を促進するか、別の方法で変化させることができる。遺伝子治療は又、遺伝子発現の阻害剤又はレプレッサー又はその他の修飾物質の送達を伴う。
【００２４】
本明細書で使用される異種ＤＮＡとは、それが発現する細胞によってｉｎ  ｖｉｖｏでは通常産生されないか、内在性ＤＮＡの発現を転写、翻訳又はその他の調節可能な生化学的プロセスに作用することによって変化させる媒介物質を媒介するかコードするＲＮＡ及びタンパク質をコードするＤＮＡである。異種ＤＮＡは外来ＤＮＡと呼ばれることもある。当業者が、それが発現する細胞に対して異種又は外来と認識又はみなすあらゆるＤＮＡを、本明細書では異種ＤＮＡに含める。異種ＤＮＡの例には、薬物耐性を付与するタンパク質等の追跡マーカータンパク質をコードするＤＮＡ、抗がん剤、酵素及びホルモン等の治療上有効な物質をコードするＤＮＡ及び抗体等の他の種類のタンパク質をコードするＤＮＡが含まれるが、これらに限定されない。異種ＤＮＡによりコードされる抗体は、異種ＤＮＡが導入された細胞の表面に分泌されるか発現する。
【００２５】
このため、本明細書における異種ＤＮＡ又は外来ＤＮＡは、ゲノム内に認められる対のＤＮＡ分子と全く同じ方向及び位置に存在しないＤＮＡ分子を含む。又、その他の生体又は種由来（即ち、外因性）のＤＮＡ分子のことも指す場合がある。
【００２６】
本明細書で使用される治療上有効な生成物とは、異種核酸、一般的にはＤＮＡがコードする生成物であって、その核酸が宿主に導入された場合に発現する、先天性又は後天性疾患の症状や徴候を改善するか除去するか、疾患を治癒する生成物である。一般的には、所望の遺伝子生成物をコードするＤＮＡは、プラスミドベクター内にクローン化し、リン酸カルシウムによるＤＮＡ取り込み（（１９８１）  Ｓｏｍａｔ．  Ｃｅｌｌ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ７：６０３−６１６を参照）又はμインジェクション等の通常の方法で、パッケージング細胞等のプロデューサー細胞に導入する。プロデューサー細胞で増幅した後、異種ＤＮＡを含有するベクターを選択した標的細胞に導入する。
【００２７】
本明細書で使用される発現又は送達ベクターとは、好適な宿主細胞での発現のためその中に外来又は異種ＤＮＡが挿入されたあらゆるプラスミド又はウイルスを指す。即ち、ＤＮＡでコードされるタンパク質又はポリペプチドは、宿主細胞系で合成される。１つ以上のタンパク質をコードするＤＮＡセグメント（遺伝子）の発現を制御することのできるベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。又、逆転写酵素を使用して産生したｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）のクローニングを可能にするベクターも含まれる。
【００２８】
本明細書で使用される遺伝子とは、そのヌクレオチド配列がＲＮＡ又はポリペプチドをコードする核酸分子を指す。遺伝子は、ＲＮＡ又はＤＮＡの何れかであってもよい。遺伝子は、コード領域の前後の領域（リーダー領域及びトレーラー領域）並びに個々のコードセグメント（エクソン）間に介在する配列（イントロン）を含む。
【００２９】
本明細書で使用される、核酸分子又はポリペプチド又はその他の生体分子に関する「単離された」という用語は、その核酸又はポリペプチドが、そのポリペプチド又は核酸が得られた遺伝環境から分離されていることを意味する。又、その生体分子が天然の状態から変化させられていることを意味する場合もある。例えば、生きている動物に天然のポリヌクレオチド又はポリペプチドは「単離され」ていないが、天然状態の共存物質から分離されている同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは、本明細書でその用語が使用されている場合は「単離されて」いる。このため、遺伝子組換え宿主細胞内で産生及び／又は含有されるポリペプチド又はポリヌクレオチドは、単離されているとみなされる。又、「単離ポリペプチド」又は「単離ポリヌクレオチド」の意図するところは、遺伝子組換え宿主細胞又は生来の源から、部分的又は実質的に精製されているポリペプチド又はポリヌクレオチドである。例えば、遺伝子組換えによって産生された化合物は、Ｓｍｉｔｈ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｇｅｎｅ  ６７：３１４０に記載の一段法により実質的に精製することができる。「単離」及び「精製」という用語は、時に同義に使用される。
【００３０】
このため、「単離」という用語は、当該の核酸をコードする遺伝子がすぐ近傍に存在する天然のゲノムの中で、その核酸がそれらの遺伝子のコード配列を有さないことを意味する。単離ＤＮＡは、一本鎖又は二本鎖であることができ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、遺伝子組換えハイブリッドＤＮＡ又は合成ＤＮＡであることもできる。天然のＤＮＡ配列と同一であることもできるが、１個以上のヌクレオチドの欠失、追加又は置換によってこのような配列と異なっていることもできる。
【００３１】
生物学的細胞又は宿主から作製された調製物を指すのに使用される「単離された」又は「精製された」という用語は、当該ＤＮＡ又はタンパク質の粗抽出物を含む所定のＤＮＡ又はタンパク質を含有するあらゆる細胞抽出物を意味する。例えば、タンパク質の場合、精製された調製物は、個々の技法又は一連の調製法又は生化学的技法に従って得ることができ、所定のＤＮＡ又はタンパク質は種々の純度でこれらの調製物中に存在することができる。特にタンパク質の場合、この手順には、例えば硫酸アンモニウム分画法、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離法、等電点分画電気泳動法、クロマトフォーカシング及び電気泳動が含まれるが、これらに限定はされない。
【００３２】
「実質的に純粋な」又は「単離された」ＤＮＡ又はタンパク質の調製物は、このようなＤＮＡ又はタンパク質が通常天然に関連する天然物質を含まない調製物を意味することは理解されなければならない。「本質的に純粋な」は、所定のＤＮＡ又はタンパク質を少なくとも９５％含有する「高度に」精製された調製物を意味することを理解されなければならない。
【００３３】
所定のＤＮＡ又はタンパク質を含有する細胞抽出物は、所定のタンパク質を発現しているか、所定のＤＮＡを含有している細胞から入手した均質な調製物又は細胞を含まない調製を意味することを理解されなければならない。「細胞抽出物」という用語は、培地、特に細胞が取り除かれた後の消費された培地を含むことを意図する。
【００３４】
本明細書で使用される「修飾」とは、ある機能の抑制、促進又は誘導を指す。例えば、ジンクフィンガー核酸結合ドメイン及びその変異体は、プロモーター内のモチーフに結合することによりプロモーター配列を修飾し、それによってプロモーター細胞ヌクレオチド配列に作動可能に結合する遺伝子の転写を促進するか抑制する。或いは、修飾は、ジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドの変異体が構造遺伝子に結合し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによるその遺伝子の読み取りを遮断し、それによってその遺伝子の転写を阻害する場合には、遺伝子の転写の阻害を含む。構造遺伝子は、通常の細胞遺伝子であっても、例えば腫瘍遺伝子であってもよい。或いは、修飾は転写生成物の翻訳の阻害を含むことができる。
【００３５】
本明細書で使用される「阻害」という用語は、あるプロモーターに作動可能に結合した構造遺伝子の転写の活性化レベルの抑制を指す。例えば、本明細書に記載の方法においては、遺伝子はジンクフィンガーヌクレオチド結合モチーフを含む。
【００３６】
本明細書で使用される「転写調節ドメイン」という用語は、標的細胞内で遺伝子を発現させる領域を指す。本明細書で使用するのに好適な転写調節ドメインには、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー／プロモーター、ＳＶ４０初期エンハンサー／プロモーター、ＪＣポリオーマウイルスプロモーター、アルブミンプロモーター、ＣＭＶエンハンサーに結合したＰＧＫ及びαアクチンプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。その他の転写調節ドメインも、当該技術分野で既知である。
【００３７】
本明細書で使用される、ある遺伝子のプロモーター領域は、調節要素又は、５’から構造遺伝子に一般的に又がる要素を含み、複数の調節要素が存在し、介在するヌクレオチド配列によって分離されることができる。遺伝子を活性化させる必要がある場合は、転写因子と呼ばれるタンパク質がその遺伝子のプロモーター領域に結合する。この結合したアセンブリは、ある酵素の第二の遺伝セグメントをＤＮＡからＲＮＡに転写することを可能にすることによって「スイッチオン」に似た状態にする。殆どの場合、結果生じるＲＮＡ分子は、特異的なタンパク質を合成するテンプレートの役割を果たすが、場合によってはＲＮＡそれ自体が最終生成物になることもある。プロモーター領域は、通常の細胞プロモーターであることもあれば、例えば、腫瘍プロモーターであることもある。腫瘍プロモーターは一般的にウイルス由来プロモーターである。ジンクフィンガー結合ポリペプチドが標的となるウイルスプロモーターには、レトロウイルスの長末端反復配列（ＬＴＲ）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）１及び２及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１又は２由来のプロモーターといったレンチウイルスプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。
【００３８】
本明細書で使用される「有効量」という用語は、以前に活性化したプロモーターの非活性化を引き起こす量又は、ジンクフィンガーヌクレオチド結合モチーフを含有するプロモーターの不活性化を引き起こす量又は、構造遺伝子の転写又はＲＮＡの翻訳を遮断する量を含む。ジンクフィンガー由来のヌクレオチド結合ポリペプチドの必要量は、既存のタンパク質／プロモーター複合体における天然に存在するジンクフィンガーヌクレオチド結合タンパク質に取って代わるのに必要な量又は、天然に存在するジンクフィンガーヌクレオチド結合タンパク質と競合してプロモーターそれ自体と複合体を形成するのに必要な量の何れかである。同様に、構造遺伝子又はＲＮＡを遮断するのに必要な量は、それぞれ、ＲＮＡポリメラーゼに結合してそれによる遺伝子の読み取りを遮断する量又は、翻訳を阻害する量である。好ましくは、この方法は細胞内で実施されるのがよい。機能的にプロモーター又は構造遺伝子を不活性化することによって、転写又は翻訳が抑制される。ジンクフィンガーヌクレオチド結合タンパク質モチーフを含有する細胞ヌクレオチド配列に結合又は「接触」するのに有効な量の阻害タンパク質の送達、レトロウイルスベクター又はリポソーム等の本明細書に記載の機序の一つにより、又は当該技術分野で周知のその他の方法により達成することができる。
【００３９】
本明細書で使用される「短縮された（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）」という用語は、天然に存在するジンクフィンガー結合タンパク質で認められる総数のジンクフィンガーの数が足らないか、非所望の配列が欠失したジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチド誘導体を指す。例えば、９個のジンクフィンガーを天然の状態では含有するジンクフィンガーヌクレオチド結合タンパク質ＴＦＩＩＩＡは短縮により、１〜３個のみのジンクフィンガーを含むポリペプチドとなる。「拡大（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）」という用語は、追加のジンクフィンガーモジュールが追加されたジンクフィンガーポリペプチドを指す。例えば、ＴＦＩＩＩＡは３個のジンクフィンガードメインを追加することにより、１２フィンガーまで拡大することができる。更に、短縮されたジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドは、１個以上の野生型ポリペプチドのジンクフィンガーモジュールを含み、「ハイブリッド」ジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドとなる。
【００４０】
本明細書で使用される「突然変異した」という用語は、タンパク質をコードするＤＮＡの無作為又は部位特異的な突然変異を達成する既知の方法の何れかを実施することによって得られた、ジンクフィンガー由来ヌクレオチド結合ポリペプチドを指す。例えば、ＴＦＩＩＩでは、突然変異を実施して、１個以上のコンセンサス配列の反復において保存されていない残基に取って代わることができる。短縮又は拡大したジンクフィンガーヌクレオチド結合タンパク質も、突然変異させることができる。
【００４１】
本明細書で使用される、ポリペプチドの「変異体」又は「誘導体」は、ポリペプチド又は遺伝子組換えによって産生されたポリペプチドの突然変異形態であるが、リガンド又は核酸分子に結合する能力や転写を修飾する能力といった所望の活性を依然として有する突然変異体のポリペプチドを指す。
【００４２】
本明細書で使用される、ジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドの「変異体」又は「誘導体」は、ジンクフィンガータンパク質の突然変異体、又は遺伝子組換えにより産生されたジンクフィンガータンパク質の突然変異体であるポリペプチドを指す。変異体は、例えば、あるタンパク質が第二のタンパク質のジンクフィンガードメインに結合した、ジンクフィンガードメインを含有するハイブリッドであってもよい。ドメインは野生型であっても突然変異体であってもよい。「変異体」又は「誘導体」は、野生型タンパク質の元来のフィンガー数よりも少ないフィンガーを含有する、野生型ジンクフィンガータンパク質の短縮型を含むことができる。誘導体又は変異体をそこから産生することのできるジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドの例には、ＳＰ１Ｃ、ＴＦＩＩＩＡ及びＺｉｆ２６８が含まれる。同じ用語は、「変異体」又は「誘導体」の核内ホルモン受容体及び「変異体」又は「誘導体」の転写エフェクタードメインを指すためにも使用される。
【００４３】
本明細書で使用される「ジンクフィンガーヌクレオチド結合ターゲット又はモチーフ」は、ジンクフィンガーヌクレオチド結合誘導体ポリペプチドが特異的に結合するヌクレオチドセグメントのあらゆる２次元又は３次元特性を指す。この定義に含まれるのは、一般的には５個以下のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列並びにヘリックスの主溝及び副溝及び面等であるがこれらに限定されないＤＮＡ二重らせんの３次元的側面である。モチーフは一般的に、ジンクフィンガーポリペプチドが結合することのできる好適な長さのあらゆる配列である。例えば、３フィンガーポリペプチドは、一般的には約９〜約１４個の塩基対を有するモチーフに結合する。好ましくは、認識配列は少なくとも約１６個の塩基対であって、ゲノム内での特異性を確実にするのがよい。このため、あらゆる特異性を有するジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドが提供される。ジンクフィンガー結合モチーフは、先験的にデザインされたか、ジンクフィンガータンパク質が結合するあらゆる配列であってもよい。モチーフは、調節配列、エクソン、イントロン又はあらゆる非コード配列を含め、あらゆるＤＮＡ又はＲＮＡ配列に認めることができる。
【００４４】
本明細書で使用される「薬学的に許容される」、「生理学的に許容される」という用語、及びその文法的変異体は、組成物、担体、希釈剤及び試薬を指す場合は、同義に使用され、その材料がその組成物の投与を不可能にする程度までの悪心、眩暈、胃蠕動異常亢進等の望ましくない生理学的作用を生じさせることなく、ヒトに投与することができることを意味する。
【００４５】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、異なる遺伝環境の間を、それが作動可能に結合した別の核酸へ運搬することのできる核酸分子を指す。好ましいベクターは、自己複製ができ、それが作動可能に結合したＤＮＡセグメント中に存在する構造遺伝子生成物を発現することのできるものである。このため、ベクターは、好ましくはレプリコン及び前述の選択可能なマーカーを含有するのがよい。ベクターには発現ベクターが含まれるが、必ずしもこれに限定されない。
【００４６】
ＤＮＡ断片を含む核酸分子について本明細書で使用される「作動可能に結合した」という用語は、配列又はセグメントが好ましくは従来のホスホジエステル結合により、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡの１本鎖に共有結合して、作動可能に結合した部分が意図した通りに機能することを意味する。本明細書で提供される転写ユニット又はカセットが作動可能に結合するベクターの選択は、当該技術分野で周知の通り、ベクター複製及びタンパク質発現といった所望の機能特性及び形質導入する宿主細胞に直接依存し、これらは遺伝子組換えＤＮＡ分子を構築する技術が元来有する制限事項である。
【００４７】
本明細書で使用される、治療的組成物の投与は、あらゆる手段によって実行することができ、経口、皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内、注入法、腹腔内投与及び非経口投与を含むが、これらに限定されない。
Ｉ．  本発明
本発明は、ジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチド、１個以上の前記ポリペプチドを含有する組成物、前記ポリペプチド及び組成物をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含有する発現ベクター、前記ポリヌクレオチド又は発現ベクターが形質導入された細胞及び、ヌクレオチドの構造及び／又は機能を修飾するためのポリペプチド、組成物、ポリヌクレオチド及び発現ベクターの使用を提供する。
ＩＩ．  ポリペプチド
本発明は、単離精製ジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドを提供する。ポリペプチドは、５〜１０個のアミノ酸残基、及び好ましくは約７個のアミノ酸残基からなるヌクレオチド結合領域を含有する。ヌクレオチド結合領域は、式ＣＮＮ（式中、ＮはＡ、Ｃ、Ｇ又はＴである）の標的ヌクレオチドに優先的に結合する。好ましくは、標的ヌクレオチドは式ＣＡＡ、ＣＡＣ、ＣＡＧ、ＣＡＴ、ＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＣＴ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＴ、ＣＴＡ、ＣＴＣ、ＣＴＧ又はＣＴＴを有する。
【００４８】
本発明のポリペプチドは、非天然の変異体である。本明細書で使用される「非天然の」という用語は、例えば以下の１つ以上を意味する：（ａ）非天然のアミノ酸配列から構成されるポリペプチド；（ｂ）天然のポリペプチドを伴わない非天然の二次構造を有するポリペプチド；（ｃ）ポリペプチドが天然に生じる生体種では通常伴わない１個以上のアミノ酸を含むポリペプチド；（ｄ）ポリペプチドを含む１個以上のアミノ酸の立体異性体を含むポリペプチドで、その立体異性体が天然に発生する状態のポリペプチドを伴わない；（ｅ）天然のアミノ酸の一つ以外の１個以上の化学成分を含むポリペプチド；又は（ｆ）天然のアミノ酸配列の単離部分（短縮された配列）。本発明のポリペプチドは単離された形態で存在し、実質的に汚染物質を含まないように精製される。ポリペプチドは天然資源から単離し精製することができる。或いは、ポリペプチドは、遺伝子工学又は固相ペプチド合成といった当該技術分野で周知の技法を使用して新規に作製することもできる。ジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドは、ポリペプチド、即ち、好ましくはジンクフィンガータンパク質の突然変異体、又は遺伝子組換えにより産生されたものであるのがよい。ポリペプチドは、例えば、あるタンパク質が第二のタンパク質のジンクフィンガードメインに結合した、ジンクフィンガードメインを含有するハイブリッドであってもよい。ドメインは野生型であっても突然変異体であってもよい。ポリペプチドは、野生型のジンクフィンガータンパク質の短縮型を含むことができる。ポリペプチドを産生することができるジンクフィンガータンパク質の例には、ＳＰ１Ｃ、ＴＦＩＩＩＡ及びＺｉｆ２６８、並びにＣ７（Ｚｉｆ２６８の誘導体）及び当該技術分野で既知のその他のジンクフィンガータンパク質が含まれる。その他のジンクフィンガータンパク質が誘導されるこれらのジンクフィンガータンパク質は、本明細書において「骨格」と呼ばれる。
【００４９】
本発明のジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドは、ポリペプチドのαヘリックスドメイン内に独自の七量体（７個のアミノ酸残基からなる隣接配列）を包含し、その七量体の配列が標的ヌクレオチドへの結合特異性を決定する。この七量体配列は、αヘリックスドメイン内のどこにでも位置することができるが、残基が従来から当該技術分野で番号付けられているように、七量体が−１位から６位に位置するのが好ましい。本発明のポリペプチドは、ジンクフィンガータンパク質の一部として機能するために、当該技術分野で既知のあらゆるβシート及びフレームワーク配列を含むことができる。多くのジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドが作製され、ＣＮＮトリプレットを含有する標的ヌクレオチドに対する結合特異性を試験した。
【００５０】
ジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチド誘導体は、短縮又は拡大によって野生型のジンクフィンガータンパク質から、又は部位特異的突然変異のプロセス又は手順の組み合わせによって野生型由来ポリペプチドの変異体として、誘導又は産生することができる。更に、短縮されたジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドは、１個以上の野生型ポリペプチドからなるジンクフィンガーモジュールを含み、それによって「ハイブリッド」ジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドとなる場合がある。
【００５１】
「突然変異した」という用語は、タンパク質をコードするＤＮＡの無作為又は部位特異的な突然変異を達成する既知の方法の何れかを実施することによって得られた、ジンクフィンガー由来のヌクレオチド結合ポリペプチドを指す。例えば、ＴＦＩＩＩＡでは、突然変異を実施して、１個以上のコンセンサス配列の反復において保存されていない残基に取って代わることができる。短縮されたジンクフィンガーヌクレオチド結合タンパク質も、突然変異させることができる。本発明に従って短縮、拡大及び／又は突然変異させて、ジンクフィンガーヌクレオチド結合モチーフを含有するヌクレオチド配列の機能を阻害することのできる既知のジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドの例には、ＳＰ１Ｃ、ＴＦＩＩＩＡ及びＺｉｆ２６８が含まれる。その他のジンクフィンガーヌクレオチド結合タンパク質も、当業者に既知である。
【００５２】
一実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１〜２８、３５〜４５、４８、５４、５７〜８２、８５〜１３０及び１３４〜１５７の何れかと同じヌクレオチド結合特性を有するアミノ酸配列を有する結合領域を含有する。どのようにしてこれらの結合特性が決定されるかについての詳細な説明は、本明細書に後述する実施例に認めることができる。このようなポリペプチドは、配列番号１〜２８、３５〜４５、４８、５４、５７〜８２、８５〜１３０及び１３４〜１５７の何れかと、標的ヌクレオチドへの結合において競合する。即ち、好ましいポリペプチドは、配列番号１〜２８、３５〜４５、４８、５４、５７〜８２、８５〜１３０及び１３４〜１５７の何れかの結合に、競合的に取って代わる結合領域を含有する。競合する結合を決定する手段は、当該技術分野で周知である。好ましくは、結合領域は、配列番号１〜２８、３５〜４５、４８、５４、５７〜８２、８５〜１３０及び１３４〜１５７の何れかのアミノ酸配列を有するのがよい。より好ましくは、結合領域は、配列番号５４、５７〜８２、８５〜１３０及び１３４〜１５７の何れかのアミノ酸配列を有するのがよい。尚より好ましくは、結合領域は、配列番号２、１４、１８、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７５、７７、７８、７９、８０、８１、８２、１３４及び１５３の何れかのアミノ酸配列を有するのがよい。更により好ましくは、結合領域は、配列番号２、１４、１８、６３、６６、７１、７２、７３、７５、７７、７８、７９、８０、８１、８２、１３４及び１５３の何れかのアミノ酸配列を有するのがよい。尚更により好ましくは、結合領域は、配列番号２、１４、１８、６３、６６、７１、７２、７３、７５、７７、７８、７９、８０、８１及び８２の何れかのアミノ酸配列を有するのがよい。
【００５３】
一般的には、結合領域は７個のアミノ酸残基を有し、αヘリックス構造を有する。
【００５４】
本発明の適用範囲内には、上に開示したポリペプチドと、置換を行う前のポリペプチドに比べて所望のサブサイト又は標的領域への結合親和性が少なくとも８０％にもなる、２個以下の保存的アミノ酸置換又は２個以下の保存的アミノ酸置換の点で異なるポリペプチドも含まれる。解離定数の点からは、これは置換を行う前のポリペプチドの解離定数の１２５％以下に相当する。この文脈において、「保存的アミノ酸置換」という用語は、以下の置換の一つとして定義される：Ａｌａ／Ｇｌｙ又はＳｅｒ；Ａｒｇ／Ｌｙｓ；Ａｓｎ／Ｇｌｎ又はＨｉｓ；Ａｓｐ／Ｇｌｕ；Ｃｙｓ／Ｓｅｒ；Ｇｌｎ／Ａｓｎ；Ｇｌｙ／Ａｓｐ；Ｇｌｙ／Ａｌａ又はＰｒｏ；Ｈｉｓ／Ａｓｎ又はＧｌｎ；Ｉｌｅ／Ｌｅｕ又はＶａｌ；Ｌｅｕ／Ｉｌｅ又はＶａｌ；Ｌｙｓ／Ａｒｇ又はＧｌｎ又はＧｌｕ；Ｍｅｔ／Ｌｅｕ又はＴｙｒ又はＩｌｅ；Ｐｈｅ／Ｍｅｔ又はＬｅｕ又はＴｙｒ；Ｓｅｒ／Ｔｈｒ；Ｔｈｒ／Ｓｅｒ；Ｔｒｐ／Ｔｙｒ；Ｔｙｒ／Ｔｒｐ又はＰｈｅ；Ｖａｌ／Ｉｌｅ又はＬｅｕ。好ましくは、ポリペプチドは上述のポリペプチドと１個以下の保存的アミノ酸置換の点で異なるのがよい。
【００５５】
又、本発明のポリペプチドは、長いポリペプチドに組み込むことができる。この例を幾つか、ポリペプチドを使用して人工転写因子を作製する場合のものとして以下に記載する。一般的に、ポリペプチドは長い融合タンパク質に組み入れられても、その特異的なＤＮＡ結合活性は保持する。これらの融合タンパク質は、精製タグ、酵素ドメイン又はその他のドメイン等、当該技術分野で既知の種々の追加のドメインを、ジンクフィンガーとポリペプチドの特異的ＤＮＡ結合活性を著明に変化させることなく、含むことができる。一例では、ポリペプチドは、βラクタマーゼ等の分断酵素の２個の半分に組み込んで、細胞内又はｉｎ  ｖｉｖｏで配列を方向付けることができる。このような分断酵素の２個の半分の結合により、分断酵素のアセンブリが完成する（Ｊ．Ｍ．  Ｓｐｏｔｔｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｔｉｍｅ−Ｌａｐｓｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ａ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ”，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９９：１５１４２−１５１４７  （２００２））。別の例では、本発明に基づく複数のジンクフィンガードメインを連結的に結合して、長いＤＮＡ配列に対する特異的結合親和性を有するポリペプチドを形成することができる。これは下に更に記載する。
【００５６】
本発明のポリペプチドは、当該技術分野で周知の種々の標準的な技法を使用して作製することができる。本明細書の実施例で後に更に詳細に開示する通り、ジンクフィンガータンパク質のファージディスプレイライブラリーを作製し、配列特異的なタンパク質を豊富にするのに好条件下で選択した。多くの配列を認識するジンクフィンガードメインは、ファージ選択データ及び構造情報の両方によって導かれる部位特異的突然変異による洗練化を必要とする。
【００５７】
従って、本発明に基づくジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質の誘導体又は変異体であってもよい。天然に存在するジンクフィンガータンパク質は、限定ではないが例えば、ＳＰ１Ｃ、ＴＦＩＩＩＡ又はＺｉｆ２６８であってもよい。その他の天然に存在するジンクフィンガータンパク質、特にＣｙｓ２−Ｈｉｓ２に分類されるものは、本発明に基づくジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドを形成するのに使用することができる。この天然に存在するジンクフィンガータンパク質は、本明細書において「骨格」と呼ばれる。天然に存在するジンクフィンガータンパク質を骨格と呼ぶことは、この天然ジンクフィンガータンパク質内での他の残基の突然変異を阻むものではない。これは、結合親和性、結合特異性、タンパク質の安定性を高めるため又は他の理由のために行うことができる。
【００５８】
マウスの転写因子Ｚｉｆ２６８の変異体であるＣ７に基づくファージディスプレイの選択によって単離され、部位特異的突然変異によって精製された、５’−（ＧＮＮ）−３’のＤＮＡ配列をそれぞれ特異的に認識する１６個のジンクフィンガードメインの特徴を以前に報告した（開示内容が参考として本明細書で援用される、Ｓｅｇａｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６（６），  ２７５８−２７６３；  Ｄｒｅｉｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３０３，  ４８９−５０２；及び米国特許第６，１４０，０８１号）。一般的に、Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２型のジンクフィンガードメインの特異的なＤＮＡ認識は、各αヘリックスのアミノ酸残基−１、３及び６を介してなされるが、必ずしも常にこの３つの残基がＤＮＡ塩基と接触するわけではない。優性の架橋−サブサイトの相互作用が、認識ヘリックスの２位から認められている。Ａｓｐ２は、それに続く３ｂｐのサブサイトの５’末端チミン又はグアニンに対するそれぞれ相補的アデニン又はシトシンと直接接触することによって、ジンクフィンガードメインの結合を安定化することが明らかにされている。これらの非モジュール相互作用は、標的部位の重複として記載されてきた。更に、アミノ酸と３ｂｐサブサイトの外側のヌクレオチドとの他の相互作用が、結合部位を伸長させることも報告されている（Ｐａｖｌｅｔｉｃｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２  （５００７），  ８０９−８１７；  Ｅｌｒｏｄ−Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４（１０），  １１７１−１１８０；  Ｉｓａｌａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４（１１），  ５６１７−５６２１）。
【００５９】
グアニン又はチミン以外の５’末端のヌクレオチドに結合するジンクフィンガードメインの、以前に報告されたファージディスプレイライブラリーの選択は、フィンガー３認識ヘリックスＲＳＤ−Ｅ−ＬＫＲ（配列番号２６）の２位のアスパラギン酸塩からの架橋−サブサイト相互作用のため奏功しなかった。人工転写因子の構築のため、ジンクフィンガードメインの利用可能性を広げるために、５’−（ＡＮＮ）−３’型のＤＮＡ配列を特異的に認識するドメインを選択した（開示内容が参考として本明細書で援用される、２００１年２月出願の米国特許出願第０９／７９１，１０６）。その他の研究チームは、４つの５’−（ＡＮＮ）−３’サブサイト、即ち５’−（ＡＡＡ）−３’、５’−（ＡＡＧ）−３’、５’−（ＡＣＡ）−３’及び５’−（ＡＴＡ）−３’を認識するドメインの特徴付けが行える連続選択法を記載している（Ｇｒｅｉｓｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５  （５３００），  ６５７−６６１；  Ｗｏｌｆｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２８５（５），  １９１７−１９３４）。本開示内容は、標的部位の重複を除去することによってＣＮＮ部位を認識するジンクフィンガードメインを選択するための手法を使用する。第一に、サブサイト５’−（ＧＣＧ）−３’に結合するＣ７（ＲＳＤ−Ｅ−ＲＫＲ）（配列番号２７）のフィンガー３を、２位にアスパラギン酸塩を含有しないドメインと交換した（図１）。以前にトリプレット５’−（ＧＡＴ）−３’に高い特異性で結合する位置にあるフィンガー２を特徴とするヘリックスＴＳＧ−Ｎ−ＬＶＲ（配列番号２８）は、良好な候補であるように思われた。Ｃ７のフィンガー１及び２及び５’−（ＧＡＴ）−３’認識ヘリックスをフィンガー３の位置に含有するこの３フィンガータンパク質（Ｃ７．ＧＡＴ；図１Ａ下）の、異なるフィンガー２サブサイトを有する標的に対するＤＮＡ結合特異性を、マルチターゲットＥＬＩＳＡで分析し、元々のＣ７タンパク質（Ｃ７．ＧＣＧ；図１Ｂ）と比較した。何れのタンパク質も５’−（ＴＧＧ）−３’サブサイトに結合した（Ｃ７．ＧＣＧは、以前に報告されているフィンガー３のＡｓｐ２によってチミン又はグアニンの５’規格のため、５’−（ＧＧＧ）−３’にも結合することに留意されたい）。フィンガー２サブサイトの５’ヌクレオチドの認識を、１６個全ての５’−（ＸＮＮ）−３’標的部位（Ｘはアデニン、グアニン、シトシン又はチミンを表す）の混合物を使用して評価した。事実、元々のＣ７．ＧＣＧタンパク質が、フィンガー２の５位におけるグアニン又はチミンを特定したのに対し、Ｃ７．ＧＡＴは塩基を特定せず、５’チミンに対して相補的なアデニンへの架橋−サブサイト相互作用が消失していることを示した。同様の作用は、Ａｓｐ２が部位特異的突然変異によってＡｌａ２に取って代わられたＺｉｆ２６８の変異体でも報告されている（Ｉｓａｌａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４（１１），  ５６１７−５６２１；  Ｄｒｅｉｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３０３，  ４８９−５０２）。ゲル運動性シフト分析によって測定したＣ７��ＧＡＴの親和性は、Ｃ７．ＧＣＧの０．５ｎＭに比べて、約４００ｎＭと比較的低いことが明らかになり（Ｓｅｇａｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６（６），  ２７５８−２７６３）、それは部分的にはフィンガー３のＡｓｐ２が欠けているためと考えられる。
【００６０】
３フィンガータンパク質Ｃ７．ＧＡＴに基づき、ファージディスプレイベクターｐＣｏｍｂ３Ｈでライブラリーを構築した（Ｂａｒｂａｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８，  ７９７８−７９８２；  Ｒａｄｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ８（４），  ５０３−５０８）。無作為化には、ＶＮＳコドンドーピング戦略（Ｖ＝アデニン、シトシン又はグアニン、Ｎ＝アデニン、シトシン、グアニン又はチミン、Ｓ＝シトシン又はグアニン）を使用して、フィンガー２のαヘリックスの−１位、１位、２位、３位、５位及び６位を含めた。これにより、各無作為化したアミノ酸の位置に２４つの可能性が生じたが、芳香族のアミノ酸、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ及びＴｙｒ並びに終止コドンはこの戦略から除外した。Ｌｅｕは主に、Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２のジンクフィンガードメインの認識ヘリックスの４位に認められるため、この部分は無作為化しなかった。ライブラリーをＥＲ２５３７細胞（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に形質導入した後、ライブラリーは１．５×１０９のメンバーを含有した。これは必要なライブラリーサイズを６０倍ほど超えており、全てのアミノ酸の組み合わせを含有するのに十分であった。
【００６１】
ジンクフィンガーディスプレイファージを６回選択し、非ビオチン化競合ＤＮＡの存在下で、それぞれ１６個の５’−ＧＡＴ−ＣＮＮ−ＧＣＧ−３’（配列番号２９）ビオチン化ヘアピン標的オリゴヌクレオチドと結合させた。選択の厳密性は回を重ねるごとに、ビオチン化標的オリゴヌクレオチドの量が減少し、競合オリゴヌクレオチド混合物の量が増加することから、高まった。６回目において、標的の濃度は通常は１８ｎＭであり、５’−（ＡＮＮ）−３’、５’−（ＧＮＮ）−３’及び５’−（ＴＮＮ）−３’競合混合物は、各オリゴヌクレオチドプールでそれぞれ５倍過剰となり、特異的５’−（ＣＮＮ）−３’混合物（標的配列を除外）は１０倍過剰となった。ビオチン化標的オリゴヌクレオチドに結合したファージを、ストレプトアビジンでコーティングした磁性ビーズへの捕捉により回収した。クローンは通常、６回の選択が終了した後に解析した。
【００６２】
これらの結果は、本発明における配列を決定するための多くの指針を当業者に提供するものである。これらの指針とは以下のものである。（１）５’ヌクレオチドがアデニンである場合、Ｇｌｎは−１位にあるのが好ましい。（２）サブサイトが５’−ＣＡＡ−３’である場合、Ｇｌｎ、Ａｓｎ又はＳｅｒは−１位にあるのが好ましい。（３）サブサイトが５’−ＣＣＡ−３’である場合、Ｓｅｒは−１位にあるのが好ましい。（４）標的サブサイトが３’グアニンを有する場合、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＩｌｅは−１位にあるのが一般的に好ましく、Ａｒｇについては特に好ましい。（５）５’−ＣＮＧ−３’サブサイトに結合させるには、Ａｓｐが２位にあるのが一般的に好ましい。（６）サブサイト５’−ＣＮＴ−３’に結合させるには、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ及びＣｙｓは−１位にあるのが一般的に好ましい。（７）３’シトシンを含有するサブサイトの場合、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ又はＡｓｐは一般的には−１位にあるのが好ましい。（８）５’−ＣＡＮ−３’を認識させるには、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ及びＬｙｓは一般的に３位にあるのが好ましく、Ａｓｎについては極めて好ましい。（９）５’−ＧＣＮ−３’サブサイトを認識するヘリックスの３位にはＴｈｒ又はＡｓｐが特に好ましいが、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＡｓｎも適応させることができる。（１０）標的部位５’−ＣＣＣ−３’の場合、３位は好ましくはＡｓｎ又はＨｉｓであるのがよい。（１１）標的部位５’−ＣＣＧ−３’の場合、３位は好ましくはＴｈｒ又はＨｉｓの何れかであるのがよい。（１２）標的部位５’−ＧＧＮ−３’の場合、Ｈｉｓは３位にあるのがよい。（１３）標的部位５’−ＣＧ（Ｇ／Ｔ）−３’の場合、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ及びＧｌｙは３位にあるのが好ましい。Ｈｉｓも可能である。（１４）標的部位５’−ＣＧＣ−３’の場合、Ｔｒｐ及びＴｈｒは一般的には３位にあるのが好ましい。Ｈｉｓも可能である。（１５）一般的に、５’−ＣＧＮ−３’の中央のグアニンは、Ｈｉｓによって認識されることができる。（１６）標的部位５’−ＣＴＮ−３’の場合、３位は好ましくはＳｅｒ又はＡｌａの何れかであるが、Ｈｉｓが好ましい５’−ＣＴＣ−３’及び５’−ＣＴＴ−３’については例外である。（１７）６位には、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｓｅｒ又はＶａｌが好ましい。Ｇｌｕが特に好ましい。隣接するアミノ酸がこの相互作用に影響を与えることがある。（１８）１位、２位及び５位は幅広く異なることができる。（１９）３’アデニンを認識するには、Ｇｌｎは一般的には−１位にあるのが好ましい。（２０）３’グアニンを認識するには、Ａｒｇは一般的には−１位にあるのが好ましい。（２１）３’チミンを認識するには、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＨｉｓは一般的には−１位にあるのが好ましい。（２２）５’シトシンを認識するには、４位、５位及び６位のモチーフＬｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕが一般的には好ましい。これらは単なる指針であり、本発明に基づくジンクフィンガー部分を組み込んだタンパク質又はポリペプチドの二次又は三次構造は、特定のサブサイト、又はこのようなサブサイトの所定の位置における特定のヌクレオチドを認識するのに種々のアミノ酸が好ましくなる可能性がある。更に、複数のジンクフィンガー部分を有するタンパク質内での、特殊なジンクフィンガー部分の配座は、結合を妨げることがある。
【００６３】
更に、ジンクフィンガーを組み込んだタンパク質又はポリペプチドは、詳細を実施例１３に記載の通りに、分子レベルでモデル化することができる。分子モデリングに好適なコンピュータプログラムの一つは、Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩである。分子モデリングを使用して、本明細書に記載され、本発明の適用範囲内のジンクフィンガー部分の変異に基づいた他のジンクフィンガー部分を産生することができる。このような変異が、本発明の適用範囲内のジンクフィンガー部分のそれと実質的に類似し、モデリングの基礎として使用した、水素結合パターンを有するようなモデリングが確立されれば、その変異も本発明の適用範囲内に含まれる。本明細書で使用される、水素結合パターンに関する「実質的に類似する」という用語は、同じ数の水素結合が存在し、各水素結合の結合角度が約１０度以下しか異ならず、各水素結合の結合長が約０．２オングストローム以下しか異ならないことを意味する。
【００６４】
ＩＩＩ．  ポリペプチド組成物
別の態様において、本発明は、上述のように作動可能に結合されて、５’−（ＣＮＮ）ｎ−３’（式中、ｎは１を超える整数である）として示されるヌクレオチド標的モチーフに特異的に結合する、本発明に基づく複数のジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドを含むポリペプチド組成物を提供する。この標的モチーフはあらゆる長さのヌクレオチド配列内（例えば、３〜１３個以上のＴＮＮ、ＧＮＮ、ＡＮＮ又はＮＮＮ配列）に位置することができる。好ましくは、ｎは２〜約１２の整数であり、より好ましくは２〜６の整数である。個々のポリペプチドは、好ましくはオリゴペプチドリンカーと結合する。このようなリンカーは好ましくは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質に認められるリンカーと類似するのがよい。本発明で使用するのに好ましいリンカーは、アミノ酸残基配列ＴＧＥＫＰ（配列番号３０）である。本発明で使用するのに好ましい別のリンカーには、アミノ酸残基配列ＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＴＧＥＫＰ（配列番号１３３）がある。より長い複数のジンクフィンガー結合ポリペプチドの２個の半分を実質的に独立した方法で操作したい場合は、より長いリンカーを使用することができる。グリシン又はセリン反復配列等の他のリンカーは、ペプチド（例えば、一本鎖抗体領域）に結合させるものとして当該技術分野で周知であり、本発明の組成物に使用することができる。更に別のリンカーが当該技術分野で既知であり、参考として本明細書で援用される、Ｓ．  Ａｌｗｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｃｕｓｔｏｍ  Ｚｉｎｃ−Ｆｉｎｇｅｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌｓ，”  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  １２：６１０−６１７  （２００５）に記載されるような、ＡＡＡＲＡリンカー（配列番号１５８）等を使用することができる。リンカーの使用は全ての目的において必要とされるわけではなく、任意には省くこともできる。本発明に基づくポリペプチド組成物の、その特異的核酸配列に対する好ましい結合は、ＫＤが１０μＭ〜１μＭ、１０ｐＭ〜１００ｎＭ、１００ｐＭ〜１０ｎＭ、及びより好ましくは１ｎＭ〜１０ｎＭで起こるのがよい。
【００６５】
本発明に基づくポリペプチド組成物は、天然したジンクフィンガータンパク質の誘導体又は変異体であってもよい。天然したジンクフィンガータンパク質は、上述のようなＳＰ１Ｃ、ＴＦＩＩＩＡ又はＺｉｆ２６８であることができるが、これらに限定はされない。使用される天然に存在するジンクフィンガータンパク質は、本明細書では上述の通り「骨格」と呼ばれる。
【００６６】
本発明のポリペプチド又はポリペプチド組成物は、１個以上の機能ポリペプチドに作動可能に結合させることができる。このような機能ポリペプチドは、所定の機能を有するタンパク質の競合配列であることができるか、所定の機能を有するタンパク質内で発生する単一又は複数のドメインから派生することができる。このような機能ポリペプチドは、当該技術分野で周知であり、レプレッサー又は活性化ドメイン又は他の機能を有するペプチド等の転写調節因子であってもよい。このような機能ポリペプチドの例及び好ましい形は、ヌクレアーゼ、メチラーゼ、核局在ドメイン及びエンド−又はエクソヌクレアーゼ等の制限酵素である（例えば、Ｃｈａｎｄｒａｓｅｇａｒａｎ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ３８０：８４１−８４８，  １９９９を参照）。
【００６７】
抑制ドメインポリペプチドの一例は、ｅｔｓ２抑制因子（ＥＲＦ）のアミノ酸４７３〜５３０によって規定されるＥＲＦレプレッサードメイン（ＥＲＤ）である（Ｓｇｏｕｒａｓ，  Ｄ．Ｎ．，  Ａｔｈａｎａｓｉｏｕ，  Ｍ．Ａ．，  Ｂｅａｌ，  Ｇ．Ｊ．，  Ｊｒ．，  Ｆｉｓｈｅｒ，  Ｒ．Ｊ．，  Ｂｌａｉｒ，  Ｄ．Ｇ．  ＆  Ｍａｖｒｏｔｈａｌａｓｓｉｔｉｓ，  Ｇ．Ｊ．  （１９９５）  ＥＭＢＯ  Ｊ．１４，  ４７８１−４７９３）。このドメインは、ｅｔｓファミリーの転写因子の活性に対するＥＲＦの拮抗作用を媒介する。合成レプレッサーは、このドメインをジンクフィンガータンパク質のＮ−又はＣ−末端に融合させることによって構築される。第二の抑制タンパク質は、Ｋｒｕｐｐｅｌ結合ボックス（ＫＲＡＢ）ドメインを使用して調製される（Ｍａｒｇｏｌｉｎ，  Ｊ．Ｆ．，  Ｆｒｉｅｄｍａｎ，  Ｊ．Ｒ．，  Ｍｅｙｅｒ，  Ｗ．，  Ｋ．−Ｈ．，  Ｖｉｓｓｉｎｇ，  Ｈ．，  Ｔｈｉｅｓｅｎ，  Ｈ．−Ｊ．  ＆  Ｒａｕｓｃｈｅｒ  ＩＩＩ，  Ｆ．Ｊ．  （１９９４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１，  ４５０９−４５１３）。このレプレッサードメインはジンクフィンガータンパク質のＮ末端に通常は認められ、おそらくは、ＲＩＮＧフィンガータンパク質ＫＡＰ−１と相互作用することによって（Ｆｒｉｅｄｍａｎ，  Ｊ．Ｒ．，  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓ，  Ｗ．Ｊ．，  Ｊｅｎｓｅｎ，  Ｄ．Ｅ．，  Ｓｐｅｉｃｈｅｒ，  Ｄ．Ｗ．，  Ｈｕａｎｇ，  Ｘ．−Ｐ．，  Ｎｅｉｌｓｏｎ，  Ｅ．Ｇ．  ＆  Ｒａｕｓｃｈｅｒ  ＩＩＩ，  Ｆ．Ｊ．  （１９９６）  Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．  １０，  ２０６７−２０７８）、距離及び方向に非依存的な方法で、ＴＡＴＡ−依存性転写に対する抑制活性を発揮する（Ｐｅｎｇｕｅ，  Ｇ．  ＆  Ｌａｎｉａ，  Ｌ．  （１９９６）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３，  １０１５−１０２０）。本発明者等はジンクフィンガータンパク質ＫＯＸ１のアミノ酸１〜９７の間に認められるＫＲＡＢドメインを使用した（Ｍａｒｇｏｌｉｎ，  Ｊ．Ｆ．，  Ｆｒｉｅｄｍａｎ，  Ｊ．Ｒ．，  Ｍｅｙｅｒ，  Ｗ．，  Ｋ．−Ｈ．，  Ｖｉｓｓｉｎｇ，  Ｈ．，  Ｔｈｉｅｓｅｎ，  Ｈ．−Ｊ．  ＆  Ｒａｕｓｃｈｅｒ  ＩＩＩ，  Ｆ．Ｊ．  （１９９４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１，  ４５０９−４５１３）。この場合、Ｎ末端融合のジンクフィンガーポリペプチドが構築される。最後に、ヒストン脱アセチル化が抑制に果たす有用性を確認するため、Ｍａｄ  ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）のアミノ酸１〜３６を、ジンクフィンガータンパク質のＮ末端に融合する（Ａｙｅｒ，  Ｄ．Ｅ．，  Ｌａｈｅｒｔｙ，  Ｃ．Ｄ．，  Ｌａｗｒｅｎｃｅ，  Ｑ．Ａ．，  Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，  Ａ．Ｐ．  ＆  Ｅｉｓｅｎｍａｎ，  Ｒ．Ｎ．  （１９９６）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １６，  ５７７２−５７８１）。この小さなドメインは転写因子ＭａｄのＮ末端に認められ、ｍＳＩＮ３と相互作用することによってその転写抑制を媒介する役割を担っており、ｍＳＩＮ３は、今度コレプレッサーＮ−ＣＯＲ及びヒストン脱アセチル化酵素ｍＲＰＤ１と相互作用する（Ｈｅｉｎｚｅｌ，  Ｔ．，  Ｌａｖｉｎ��ｋｙ，  Ｒ．Ｍ．，  Ｍｕｌｌｅｎ，  Ｔ．−Ｍ．，  Ｓｏｄｅｒｓｔｒｏｍ，  Ｍ．，  Ｌａｈｅｒｔｙ，  Ｃ．Ｄ．，  Ｔｏｒｃｈｉａ，  Ｊ．，  Ｙａｎｇ，  Ｗ．−Ｍ．，  Ｂｒａｒｄ，  Ｇ．，  ＆  Ｎｇｏ，  Ｓ．Ｄ．  （１９９７）  Ｎａｔｕｒｅ  ３８７，  ４３−４６）。遺伝子特異的活性化を確認するため、ジンクフィンガーポリペプチドを単純ヘルペスウイルスＶＰ１６タンパク質のアミノ酸４１３〜４８９（Ｓａｄｏｗｓｋｉ，  Ｉ．，  Ｍａ，  Ｊ．，  Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇ，  Ｓ．  ＆  Ｐｔａｓｈｎｅ，  Ｍ．  （１９８８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３３５，  ５６３−５６４）又はＶＰ１６の最小活性化ドメインの人工四量体反復であるＶＰ６４（Ｓｅｉｐｅｌ，  Ｋ．，  Ｇｅｏｒｇｉｅｖ，  Ｏ．  ＆  Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ，  Ｗ．  （１９９２）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １１，  ４９６１−４９６８）に融合させることにより、転写アクチベーターを産生する。
【００６８】
上述のような本発明のポリペプチド組成物は、１個以上の転写修飾又は調節因子に作動可能に結合させることができる。転写アクチベーター又は転写サプレッサー又はレプレッサーといった修飾因子は、当該技術分野で周知である。ポリペプチドをこのような因子に作動可能に結合させる方法も、当該技術分野で周知である。遺伝子発現を修飾するためのこのような因子の例及び好ましい例及びその使用については、本明細書で後に詳述する。
【００６９】
遺伝子特異的転写調節因子としてジンクフィンガータンパク質を使用するという考え方を検証するため、６フィンガータンパク質を多くのエフェクタードメインに融合させる。３個のヒト由来レプレッサードメインの何れかをジンクフィンガータンパク質に結合させることによって、転写レプレッサーを産生する。最初のレプレッサータンパク質は、ｅｔｓ２抑制因子（ＥＲＦ）のアミノ酸４７３〜５３０によって規定されるＥＲＦレプレッサードメイン（ＥＲＤ）（Ｓｇｏｕｒａｓ，  Ｄ．Ｎ．，  Ａｔｈａｎａｓｉｏｕ，  Ｍ．Ａ．，  Ｂｅａｌ，  Ｇ．Ｊ．，  Ｊｒ．，  Ｆｉｓｈｅｒ，  Ｒ．Ｊ．，  Ｂｌａｉｒ，  Ｄ．Ｇ．  ＆  Ｍａｖｒｏｔｈａｌａｓｓｉｔｉｓ，  Ｇ．Ｊ．  （１９９５）  ＥＭＢＯ  Ｊ．１４，  ４７８１−４７９３）を使用して調製される。このドメインは、ｅｔｓファミリーの転写因子の活性に対するＥＲＦの拮抗作用を媒介する。合成レプレッサーは、このドメインをジンクフィンガータンパク質のＣ−末端に融合させることによって構築される。第二の抑制タンパク質は、Ｋｒｕｐｐｅｌ結合ボックス（ＫＲＡＢ）ドメインを使用して調製される（Ｍａｒｇｏｌｉｎ，  Ｊ．Ｆ．，  Ｆｒｉｅｄｍａｎ，  Ｊ．Ｒ．，  Ｍｅｙｅｒ，  Ｗ．，  Ｋ．−Ｈ．，  Ｖｉｓｓｉｎｇ，  Ｈ．，  Ｔｈｉｅｓｅｎ，  Ｈ．−Ｊ．  ＆  Ｒａｕｓｃｈｅｒ  ＩＩＩ，  Ｆ．Ｊ．  （１９９４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１，  ４５０９−４５１３）。このレプレッサードメインはジンクフィンガータンパク質のＮ末端に通常は認められ、おそらくは、ＲＩＮＧフィンガータンパク質ＫＡＰ−１と相互作用することによって（Ｆｒｉｅｄｍａｎ，  Ｊ．Ｒ．，  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓ，  Ｗ．Ｊ．，  Ｊｅｎｓｅｎ，  Ｄ．Ｅ．，  Ｓｐｅｉｃｈｅｒ，  Ｄ．Ｗ．，  Ｈｕａｎｇ，  Ｘ．−Ｐ．，  Ｎｅｉｌｓｏｎ，  Ｅ．Ｇ．  ＆  Ｒａｕｓｃｈｅｒ  ＩＩＩ，  Ｆ．Ｊ．  （１９９６）  Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．  １０，  ２０６７−２０７８）、距離及び方向に非依存的な方法で、ＴＡＴＡ−依存性転写に対する抑制活性を発揮する（Ｐｅｎｇｕｅ，  Ｇ．  ＆  Ｌａｎｉａ，  Ｌ．  （１９９６）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３，  １０１５−１０２０）。本発明者等はジンクフィンガータンパク質ＫＯＸ１のアミノ酸１〜９７の間に認められるＫＲＡＢドメインを使用した（Ｍａｒｇｏｌｉｎ，  Ｊ．Ｆ．，  Ｆｒｉｅｄｍａｎ，  Ｊ．Ｒ．，  Ｍｅｙｅｒ，  Ｗ．，  Ｋ．−Ｈ．，  Ｖｉｓｓｉｎｇ，  Ｈ．，  Ｔｈｉｅｓｅｎ，  Ｈ．−Ｊ．  ＆  Ｒａｕｓｃｈｅｒ  ＩＩＩ，  Ｆ．Ｊ．  （１９９４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１，  ４５０９−４５１３）。この場合、６フィンガータンパク質によるＮ−末端融合が構築される。最後に、ヒストン脱アセチル化が抑制に果たす有用性を確認するため、Ｍａｄ  ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）のアミノ酸１〜３６を、ジンクフィンガータンパク質のＮ末端に融合する（Ａｙｅｒ，  Ｄ．Ｅ．，  Ｌａｈｅｒｔｙ，  Ｃ．Ｄ．，  Ｌａｗｒｅｎｃｅ，  Ｑ．Ａ．，  Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，  Ａ．Ｐ．  ＆  Ｅｉｓｅｎｍａｎ，  Ｒ．Ｎ．  （１９９６）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １６��  ５７７２−５７８１）。この小さなドメインは転写因子ＭａｄのＮ末端に認められ、ｍＳＩＮ３と相互作用することによってその転写抑制を媒介する役割を担っており、ｍＳＩＮ３は、今度コレプレッサーＮ−ＣＯＲ及びヒストン脱アセチル化酵素ｍＲＰＤ１と相互作用する（Ｈｅｉｎｚｅｌ，  Ｔ．，  Ｌａｖｉｎｓｋｙ，  Ｒ．Ｍ．，  Ｍｕｌｌｅｎ，  Ｔ．−Ｍ．，  Ｓｏｄｅｒｓｔｒｏｍ，  Ｍ．，  Ｌａｈｅｒｔｙ，  Ｃ．Ｄ．，  Ｔｏｒｃｈｉａ，  Ｊ．，  Ｙａｎｇ，  Ｗ．−Ｍ．，  Ｂｒａｒｄ，  Ｇ．，  ＆  Ｎｇｏ，  Ｓ．Ｄ．  （１９９７）  Ｎａｔｕｒｅ  ３８７，  ４３−４６）。人工転写因子を産生するためにエフェクタードメインに融合させる６フィンガーのジンクフィンガータンパク質のこの他の例は、参考として本明細書で援用される、Ｐ．  Ｂｌａｎｃａｆｏｒｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒｓ”，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０２：  １１７１６−１１７２１  （２００５）に記載されており、薬物耐性、細胞骨格リモデリング、基質依存性細胞移動及びｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける腫瘍細胞浸潤を誘導することのできるＶＰ６４アクチベータードメインを含有する６ジンクフィンガー人工転写因子の選択及び特徴も記載されている。又、合成６及び１２フィンガー合成ジンクフィンガータンパク質からなる合成転写因子は、類表皮扁平上皮癌細胞系のＥｒｂＢ２及びＥｒｂＢ３受容体のレベルを変化させることが明らかになった（参考として本明細書で援用される、Ｃ．Ｖ．  Ｌｕｎｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒｓ  Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｆｏｒ  Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｃｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＥｒｂＢ２  ａｎｄ  ＥｒｂＢ３  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：  Ｉｎｓｉｇｎｔ  ｉｎｔｏ  ＥｒｂＢ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２５：  ９０８２−９０９１  （２００５））。
【００７０】
遺伝子特異的活性化を確認するため、ジンクフィンガータンパク質を単純ヘルペスウイルスＶＰ１６タンパク質のアミノ酸４１３〜４８９（Ｓａｄｏｗｓｋｉ，  Ｉ．，  Ｍａ，  Ｊ．，  Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇ，  Ｓ．  ＆  Ｐｔａｓｈｎｅ，  Ｍ．  （１９８８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３３５，  ５６３−５６４）又はＶＰ１６の最小活性化ドメインの人工四量体反復、ＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬ（配列番号３６）であるＶＰ６４（Ｓｅｉｐｅｌ，  Ｋ．，  Ｇｅｏｒｇｉｅｖ，  Ｏ．  ＆  Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ，  Ｗ．  （１９９２）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １１，  ４９６１−４９６８）に融合させることにより、転写アクチベーターを産生する。
【００７１】
本発明者等の設計した転写調節因子の特異的活性を確認するため、ルシフェラーゼレポーター遺伝子に結合させたｅｒｂＢ−２プロモーターの断片を含有するレポーター構築物を産生する。標的レポータープラスミドは、ＡＴＧ開始コドンに関するヌクレオチド−７５８〜−１を含有する。プロモーター断片は、ＨｅＬａ細胞に一過性に形質導入させた場合に同様の活性を示し、過去の知見と合致することが明らかになった（Ｈｕｄｓｏｎ，  Ｌ．Ｇ．，  Ｅｒｔｌ，  Ａ．Ｐ．  ＆  Ｇｉｌｌ，  Ｇ．Ｎ．  （１９９０）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５，  ４３８９−４３９３）。ジンクフィンガーとレプレッサードメインの融合構築物が、ｅｒｂＢ−２プロモーターの活性に与える作用を確認するため、ＨｅＬａ細胞に一過性にジンクフィンガー発現ベクター及びルシフェラーゼレポーター構築物を同時に形質導入する。各構築物で著明な抑制が認められる。転写の活性化を媒介させる場合の遺伝子特異的な多指の（ｐｏｌｙｄａｃｔｙｌ）タンパク質の有用性を、同じ２個のレポーター構築物を使用して試験する。
【００７２】
本明細書のデータは、新規の９−及び１８−ｂｐのＤＮＡ標的部位に結合することのできるジンクフィンガータンパク質が、５’−（ＣＮＮ）−３’部位を認識する予め規定したドメインを使用することによって迅速に調製できることを示している。この情報は、ＤＮＡ配列の１８ｂｐにそれぞれ結合することのできる１６６又は１７００万個の新規の６フィンガータンパク質を調製するのに十分なものである。この新規のジンクフィンガータンパク質を構築する迅速な方法論は、その他の研究者らが提案したジンクフィンガードメインの連続的産生及び選択（Ｇｒｅｉｓｍａｎ，  Ｈ．Ａ．  ＆  Ｐａｂｏ，  Ｃ．Ｏ．  （１９９７）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５，  ６５７−６６１）よりも有益であり、上述のような標的の重複の問題が５’−（ＣＮＮ）−３’部位を標的とするタンパク質内で回避されうることを示唆する構造的情報を利用する。複雑且つよく研究されたｅｒｂＢ−２プロモーター及び生存ヒト細胞を使用して、このデータはこれらのタンパク質が、適切なエフェクタードメインと共に提供された場合、発現を惹起又は活性化し、これらの実験の背景レベルまでの段階的なレベルの抑制を実現するのに使用することができることを明らかにしている。
【００７３】
上述のような本発明に基づくポリペプチド組成物は、酵素活性等の他の活性を有する融合タンパク質分子に組み込むこともできる。融合タンパク質分子に組み込むことのできる酵素活性の中には、インテグラーゼがある。一例は、参考として本明細書で援用される、Ｗ．  Ｔａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ  Ｔｙｐｅ  １  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｇｒａｓｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  Ｐｏｌｙｄａｃｔｙｌ  Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ２Ｃ  Ｃａｎ  Ｂｉａｓ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ  ｉｎｔｏ  ａ  Ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  Ｒｅｇｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌｓ”，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８０：  １９３９−１９４８  （２００６）に記載されている。同様に、本発明に基づく融合タンパク質は、ヒト細胞を含めた哺乳類細胞における相同遺伝子組換えを刺激する標的ＤＮＡ二重鎖切断を触媒するヌクレアーゼの産生を記載した、参考として本明細書で援用される、Ｓ．  Ａｌｗｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｃｕｓｔｏｍ  Ｚｉｎｃ−Ｆｉｎｇｅｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌｓ”，  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  １２：６１０−６１７  （２００５）に記載のような、ヌクレアーゼ活性を含むこともできる。これらの融合タンパク質はＦｏｋｌ触媒ドメインをその中に組み込む。このような融合タンパク質は、矯正した細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた後に患者に再導入するといった、ヒト幹細胞の遺伝子修復に使用することができる。
【００７４】
更に、本発明に基づくポリペプチド又はポリペプチド組成物のジンクフィンガーヌクレオチド結合活性特性の他に、２つ以上の活性を有するドメインをその中に含む融合タンパク質をはじめとして、その他の融合タンパク質も可能である。このような融合タンパク質も本発明の適用範囲内に含まれる。
【００７５】
ＩＶ．  単離ヘプタペプチド
本発明の別の態様は、αヘリックス構造を有し、式ＣＮＮ（式中、ＮはＡ、Ｃ、Ｇ又はＴである）の標的ヌクレオチドに優先的に結合する単離ヘプタペプチドである。好ましい標的ヌクレオチドは、上述の通りである。
【００７６】
好ましくは、ヘプタペプチドは、配列番号１〜２８、３５〜４５、４８、５４、５７〜８２、８５〜１３０及び１３４〜１５７の何れかのアミノ酸配列を有するのがよい。より好ましくは、ヘプタペプチドは、配列番号５４、５７〜８２、８５〜１３０及び１３４〜１５７の何れかのアミノ酸配列を有するのがよい。尚より好ましくは、ヘプタペプチドは、配列番号２、１４、１８、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７５、７７、７８、７９、８０、８１、８２、１３４及び１５３の何れかのアミノ酸配列を有するのがよい。更により好ましくは、ヘプタペプチドは、配列番号２、１４、１８、６３、６６、７１、７２、７３、７５、７７、７８、７９、８０、８１、８２、１３４及び１５３の何れかのアミノ酸配列を有するのがよい。尚更により好ましくは、ヘプタペプチドは、配列番号２、１４、１８、６３、６６、７１、７２、７３、７５、７７、７８、７９、８０、８１及び８２の何れかのアミノ酸配列を有するのがよい。
【００７７】
或いは、ヘプタペプチドは、
（ａ）配列番号２、１４、１８、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７５、７７、７８、７９、８０、８１、８２、１３４及び１５３の何れかのアミノ酸配列；並びに
（ｂ）配列番号２、１４、１８、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７５、７７、７８、７９、８０、８１、８２、１３４及び１５３の何れかのアミノ酸配列と、２個以下の保存的アミノ酸置換でしか異ならないアミノ酸配列であって、解離定数が置換前のポリペプチドのそれの１２５％以下であり、且つ保存的アミノ酸置換が、以下の置換：即ち、Ａｌａ／Ｇｌｙ又はＳｅｒ；Ａｒｇ／Ｌｙｓ；Ａｓｎ／Ｇｌｎ又はＨｉｓ；Ａｓｐ／Ｇｌｕ；Ｃｙｓ／Ｓｅｒ；Ｇｌｎ／Ａｓｎ；Ｇｌｙ／Ａｓｐ；Ｇｌｙ／Ａｌａ又はＰｒｏ；Ｈｉｓ／Ａｓｎ又はＧｌｎ；Ｉｌｅ／Ｌｅｕ又はＶａｌ；Ｌｅｕ／Ｉｌｅ又はＶａｌ；Ｌｙｓ／Ａｒｇ又はＧｌｎ又はＧｌｕ；Ｍｅｔ／Ｌｅｕ又はＴｙｒ又はＩｌｅ；Ｐｈｅ／Ｍｅｔ又はＬｅｕ又はＴｙｒ；Ｓｅｒ／Ｔｈｒ；Ｔｈｒ／Ｓｅｒ；Ｔｒｐ／Ｔｙｒ；Ｔｙｒ／Ｔｒｐ又はＰｈｅ；Ｖａｌ／Ｉｌｅ又はＬｅｕの１つである、アミノ酸配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。好ましくは、このアミノ酸配列は、配列番号２、１４、１８、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７５、７７、７８、７９、８０、８１、８２、１３４及び１５３の何れかのアミノ酸配列と、１個以下の保存的アミノ酸置換でしか異ならないのがよい。
【００７８】
Ｖ．  ポリヌクレオチド、発現ベクター及び形質導入細胞
本発明は、ポリペプチド、ポリペプチド組成物及び上述のような単離ヘプタペプチドを含めた、ジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。天然、短縮及び拡大ポリペプチドを含む、本発明のジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、幾つかの方法で得ることができる。例えば、ＤＮＡは、当該技術分野で周知のハイブリダイゼーション手順を使用して単離することができる。これらには、（１）共有のヌクレオチド配列を検出するためのプローブとゲノム、又はｃＤＮＡライブラリーとのハイブリダイゼーション；（２）共有の構造特性を検出するための発現ライブラリーの抗体スクリーニング及び（３）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による合成が含まれるが、これらに限定されない。本発明のＲＮＡ配列は、当該技術分野で既知の方法によって得ることができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ａｕｓｕｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｄｓ．，  １９８９を参照）。
【００７９】
本発明のジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドをコードする特異的なＤＮＡ配列を開発するには、（１）ゲノムＤＮＡからの二重鎖ＤＮＡ配列の単離；（２）当該ポリペプチドに必要なコドンを提供するためのＤＮＡ配列の化学的製造及び（３）真核ドナー細胞から単離したｍＲＮＡの逆転写による二重鎖ＤＮＡ配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの合成を行う。（３）の場合、ｍＲＮＡの二重鎖ＤＮＡ補体が最終的には形成され、これを一般的にはｃＤＮＡと呼ぶ。遺伝子組換えの手順に使用する特異的ＤＮＡ配列を作製するためのこれら３つの方法の内、ゲノムＤＮＡの単離は最もまれである。哺乳動物ポリペプチドの細菌を使用した発現が望まれる場合は特に、イントロンの存在のために行われることは稀である。ジンクフィンガー由来のＤＮＡ結合ポリペプチドを得るには、所望のポリペプチド生成物のアミノ酸残基の全配列が既知である場合は、ＤＮＡ配列の合成が第一選択の方法となることが多い。所望のポリペプチドのアミノ酸残基の全配列が未知である場合、ＤＮＡ配列の直接的な合成は不可能であり、第一選択の方法はｃＤＮＡ配列の形成となる。当該ｃＤＮＡ配列を単離するための標準的手順には、高レベルの遺伝子発現が認められるドナー細胞に豊富に含まれるｍＲＮＡの逆転写に由来するプラスミド保有ｃＤＮＡライブラリーの形成がある。ポリメラーゼ連鎖反応技術と共に使用した場合、極めて少量の発現生成物であってもクローン化することができる。ポリペプチドのアミノ酸配列の大部分が既知である場合は、一本鎖に変性したｃＤＮＡのクローン複製を対象に実施されるＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション手順において、標的ｃＤＮＡに存在することが推定される配列を複製する、標識された一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡプローブ配列の産生を行うことができる（Ｊａｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１：  ２３２５，  １９８３）。
【００８０】
本発明の適用範囲内に含まれるヌクレオチド配列に関しては、記載された本発明の実施形態であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は全て、本発明の適用範囲内のヌクレオチド配列に含まれる。これは更に、上述のような保存的アミノ酸置換が組み込まれた本発明に基づくポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を全て含む。これは更に、融合タンパク質をはじめとして、ジンクフィンガードメインを組み込んだより大きなタンパク質及び、ジンクフィンガードメインに作動可能に結合した転写修飾因子を組み込んだタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。これらの目的のため、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｓ．Ｂ．  Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｃ．Ｄ．  Ｗｕｎｓｃｈ，  ”Ａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｔｗｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３−４５３  （１９７０））に従って、「同一性」を定義する。
【００８１】
本発明に包含されるヌクレオチド配列は、当該技術分野で周知の通り、発現ベクターを含むがこれに限定されないベクターに組み込まれることができ、好適な宿主細胞に感染又は形質導入するのに使用することができる。この本発明に包含されるヌクレオチド配列を組み込んだベクターも、本発明の適用範囲内に含まれる。ベクター又は本発明のポリヌクレオチド又はヌクレオチド配列で形質導入又は感染させた宿主細胞も、本発明の適用範囲内に含まれる。宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞であることができ、真核細胞であれば、宿主細胞は哺乳動物細胞、昆虫細胞又は酵母細胞であってもよい。原核細胞であれば、宿主細胞は一般的には細菌細胞である。
【００８２】
遺伝子組換えＤＮＡの宿主細胞への形質導入は、当業者に周知の従来の技法によって実施することができる。宿主が大腸菌等の原核細胞である場合、ＤＮＡ取り込みが可能な競合細胞は、当該技術分野で周知の手順によって、指数増殖期の後に回収し、その後ＣａＣｌ２法で処理することによって調製することができる。或いは、ＭｇＣｌ２又はＲｂＣｌを使用することもできる。形質導入は、宿主細胞のプロトプラストを形成した後、又はエレクトロポレーションによって実施することもできる。
【００８３】
宿主が真核細胞である場合、リン酸カルシウム共沈法或いは、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソームに包埋したプラスミドの挿入又はウイルスベクター等の従来の機械的手順等のＤＮＡトランスフェクション法を使用することができる。
【００８４】
ジンクフィンガー由来のヌクレオチド結合コード配列を発現させるため、種々の宿主−発現ベクター系を使用することができる。これらには、ジンクフィンガー由来ヌクレオチド結合ポリペプチドコード配列を含有する遺伝子組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡ発現ベクターを導入した細菌等の微生物；ジンクフィンガーヌクレオチド結合コード配列を含有する遺伝子組換え酵母発現ベクターを導入した酵母；ジンクフィンガー由来ＤＮＡ結合コード配列を含有する遺伝子組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染させるか、当該配列を含有する遺伝子組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）を導入した植物細胞系；ジンクフィンガーヌクレオチド結合コード配列を含有する遺伝子組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；又はジンクフィンガー由来ヌクレオチド結合コード配列を含有する遺伝子組換えウイルス発現ベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス）に感染させた動物細胞系又は安定した発現を行わせるべく工学的処理を行った形質導入した動物細胞系が含まれるが、これらに限定されない。糖化が重要になるこのような場合においては、哺乳動物、昆虫、酵母又は植物発現系等の、翻訳修飾及び翻訳後修飾に備えた発現系を使用することができる。
【００８５】
使用する宿主／ベクター系によって、構成及び誘導プロモーター、転写エンハンサー要素、転写ターミネーター等を含めた多くの好適な転写及び翻訳要素の何れかを、発現ベクター内で使用することができる（例えば、Ｂｉｔｔｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １５３：  ５１６−５４４，  １９８７を参照）。例えば、細菌系におけるクローニングの場合、バクテリオファージλのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター）等の誘導プロモーターを使用することができる。哺乳動物細胞系におけるクローニングの場合は、哺乳動物のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）又は哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、レトロウイルス末端反復配列；アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を使用することができる。遺伝子組換えＤＮＡ又は合成法によって産生したプロモーターも、挿入されたジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドコード配列の転写のために使用することができる。
【００８６】
細菌系では、発現させるジンクフィンガー由来ヌクレオチド結合ポリペプチドの使用意図に応じて、多くの発現ベクターを有益に選択することができる。例えば、大量に産生する必要がある場合、容易に精製できる高レベルの融合タンパク質生成物の発現を誘導するベクターが望ましい場合がある。当該タンパク質を回収する助けとなる切断部位を含有するべく工学的に処理されたベクターが好ましい。このようなベクターには、ジンクフィンガーヌクレオチド結合タンパク質コード配列がｌａｃＺコード領域を有するフレーム内でベクターに結合するために、ジンクフィンガーとｌａｃＺのハイブリッドタンパク質が産生される大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ２：１７９１，  １９８３）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ  ＆  Ｉｎｏｕｙｅ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １３：３１０１−３１０９，  １９８５；  Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ＆  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２６４：５５０３−５５０９，  １９８９）等が含まれるが、これらに限定はされない。
【００８７】
酵母では、構成又は誘導プロモーターを含有する多くのベクターを使用することができる。レビューについては、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．２，  １９８８，  Ｅｄ．  Ａｕｓｕｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈ．  Ａｓｓｏｃ．  ＆  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｃｈ．  １３；  Ｇｒａｎｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７，  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｙｅａｓｔ，  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｅｄｓ．  Ｗｕ  ＆  Ｇｒｏｓｓｍａｎ，  ３１９８７，  Ａｃａｄ．  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎ．Ｙ．，  Ｖｏｌ．  １５３，  ｐｐ．５１６−５４４；  Ｇｌｏｖｅｒ，  １９８６，  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｖｏｌ．  ＩＩ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｗａｓｈ．，  Ｄ．Ｃ．，  Ｃｈ．３；  及びＢｉｔｔｅｒ，  １９８７，  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｅｄｓ．  Ｂｅｒｇｅｒ  ＆  Ｋｉｍｍｅｌ，  Ａｃａｄ．  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎ．Ｙ．，  Ｖｏｌ．１５２，  ｐｐ．６７３−６８４；及びＴｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，  １９８２，  Ｅｄｓ．  Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｖｏｌｓ．  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩを参照されたい。ＡＤＨ又はＬＥＵ２等の構成酵母プロモーター又はＧＡＬ等の誘導プロモーターを使用することができる（Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ，  Ｃｈ．３，  Ｒ．  Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ  Ｉｎ：  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｏｌ．１１，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｅｄ．  ＤＭ  Ｇｌｏｖｅｒ，  １９８６，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｗａｓｈ．，  Ｄ．Ｃ．）。或いは、外来ＤＮＡ配列の酵母の染色体への組み込みを促進するベクターを使用することができる。
【００８８】
植物発現ベクターを使用する場合、ジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドコード配列の発現は、多くのプロモーターの何れかによってなされる。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ  ＲＮＡ及び１９Ｓ  ＲＮＡプロモーター等のウイルスプロモーター（Ｂｒｉｓｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３１０：５１１−５１４，  １９８４）又はＴＭＶに対するコートタンパク質プロモーター（Ｔａｋａｍａｔｓｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ６：３０７−３１１，  １９８７）を使用することができる。或いは、ＲＵＢＩＳＣＯの小さなサブユニット等の植物プロモーター（Ｃｏｒｕｚｚｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ３：１６７１−１６８０，  １９８４；  Ｂｒｏｇｌｉｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：８３８−８４３，  １９８４）又はダイズｈｓｐ１７．５−Ｅ又はｈｓｐ１７．３−Ｂ等の熱ショックプロモーター（Ｇｕｒｌｅｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ６：５５９−５６５，  １９８６）を使用することができる。これらの構築物は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接的ＤＮＡ形質導入、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等を使用して植物細胞に導入することができる。このような技法のレビューについては、例えば、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ  ＆  Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ，  Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＶＩＩＩ，  ｐｐ．４２１−４６３，  １９８８及びＧｒｉｅｒｓｏｎ  ＆  Ｃｏｒｅｙ，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２ｄ  ｅｄ．，  Ｂｌａｃｋｉｅ，  Ｌｏｎｄｏｎ，  Ｃｈ．７−９，  １９８８を参照されたい。
【００８９】
本発明のタンパク質を発現させるのに使用することのできる又別の発現系は、昆虫系である。このような系の一つとして、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして使用して、外来遺伝子を発現させることができる。このウイルスはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞において増殖する。ジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドコード配列を、当該ウイルスの非主要領域（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａにポリヘドリン遺伝子を）にクローン化し、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下におくことができる。ジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドコード配列の挿入に成功すれば、ポリヘドリン遺伝子を不活化し、非包埋の遺伝子組換えウイルス（即ち、ポリヘドリン遺伝子によってコードされるタンパク質からなる外殻を持たないウイルス）を産生することができる。次に、これらの遺伝子組換えウイルスを使用して、挿入した遺伝子を発現させる細胞に感染させる（例えば、Ｓｍｉｔｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  ４６：５８４，  １９８３；  Ｓｍｉｔｈ，  米国特許第４，２１５，０５１号を参照）。
【００９０】
真核細胞系、及び好ましくは哺乳動物発現系は、発現させた哺乳動物のタンパク質を適切に翻訳後修飾させることを可能にする。このため、一次転写生成物の適切な処理、糖化、リン化及び有益には遺伝子生成物の分泌等を行う細胞内機械を有する哺乳動物細胞等の真核細胞は、ジンクフィンガー由来ヌクレオチド結合ポリペプチドを発現させるのに好ましい宿主細胞である。このような宿主細胞系は、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、−２９３及びＷＩ３８を含むが、これらに限定されない。
【００９１】
発現を制御するのに遺伝子組換えウイルス又はウイルス要素を使用する哺乳動物細胞系は、工学的に処理することができる。例えば、アデノウイルス発現ベクターを使用する場合、ジンクフィンガー由来ポリペプチドのコード配列を、例えば後期プロモーター及び三単位（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列等のアデノウイルス転写／翻訳制御複合体に結合させることができる。次にこのキメラ遺伝子を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏの遺伝子組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非主要領域（例えば、領域Ｅ１又はＥ３）への挿入により、感染宿主の中で生存が可能で、ジンクフィンガーポリペプチドを発現することのできる遺伝子組換えウイルスを得ることができる（例えば、Ｌｏｇａｎ  ＆  Ｓｈｅｎｋ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１：３６５５−３６５９，  １９８４を参照）。或いは、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーターを使用することもできる（例えば、Ｍａｃｋｅｔｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７９：７４１５−７４１９，  １９８２；Ｍａｃｋｅｔｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ４９：８５７−８６４，  １９８４；  Ｐａｎｉｃａｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７９：４９２７−４９３１，  １９８２を参照）。特に注目されるのは、染色体外要素として複製する能力を有するウシパピローマウイルスに基づくベクターである（Ｓａｒｖｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １：４８６，  １９８１）。このＤＮＡをマウス細胞に導入してまもなく、プラスミドは細胞当たり約１００〜２００のコピーを複製する。挿入されたｃＤＮＡが転写されるのに、プラスミドが宿主の染色体に組み込まれる必要がなく、そのため高レベルでの発現が得られる。これらのベクターを使用して、プラスミドにｎｅｏ遺伝子等の選択可能なマーカーを含めることによって、安定した発現を得ることができる。或いは、レトロウイルスゲノムを、ジンクフィンガーヌクレオチド結合タンパク質遺伝子を宿主細胞へ導入しその発現を制御することのできるベクターとして使用するために修飾することができる（Ｃｏｎｅ  ＆  Ｍｕｌｌｉｇａｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１：６３４９−６３５３，  １９８４）。メタロチオネインＩＩＡプロモーター及び熱ショックプロモーターを含むがこれらに限定されない誘導プロモーターを使用することによっても、高レベルの発現が可能になる。
【００９２】
長期にわたる高レベルでの遺伝子組換えタンパク質の産生には、安定した発現が望まれる。複製の元となるウイルスを含有する発現ベクターを使用するよりも、宿主細胞に、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）で制御されるｃＤＮＡ及び選択マーカーを導入することができる。遺伝子組換えプラスミド内の選択マーカーはその選択肢に耐性を付与し、細胞がその染色体にプラスミドを安定的に組み込み、細胞巣を形成してそれがクローン化され細胞系にまで増殖することを可能にする。例えば、外来ＤＮＡの導入後に、工学的処理を行った細胞は、栄養豊富な培地で１〜２日間増殖させ、その後選択的培地に切り替えることができる。多くの選択系を使用することができ、それには、それぞれｔｋ．ｓｕｐ．−、ｈｇｐｒｔ．ｓｕｐ．−又はａｐｒｔ．ｓｕｐ．−細胞で使用することのできる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １１：２２３，  １９７７）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ＆  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ４８：２０２６，  １９６２）及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｌｏｗｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，  ２２：８１７，  １９８０）が含まれるが、これらに限定はされない。又、抗代謝物耐性付与遺伝子を選択の基礎として使用することもできる。例えば、メトトレキセートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７７：３５６７，  １９８０；  Ｏ’Ｈａｒｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７８：  １５２７，  １９８１）、ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ遺伝子（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｂｅｒｇ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７８：２０７２，  １９８１）、アミノグリコシドＧ４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ遺伝子（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １５０：１，  １９８１）及びハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ遺伝子（Ｓａｎｔｅｒｒｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  ３０：１４７，  １９８４）等である。近年、この他の選択遺伝子も報告されている。細胞に対してトリプトファンの代わりにインドールを使用することを可能にさせるｔｒｐＢ遺伝子、細胞に対してヒスチジンの代わりにヒスチノールを使用することを可能にさせるｈｉｓＤ遺伝子（Ｈａｒｔｍａｎ  ＆  Ｍｕｌｌｉｇａｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８５：８０４，  １９８８）及びオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン、ＤＦＭＯに対する耐性を付与するＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）遺伝子（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ  Ｌ．，  Ｉｎ：  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｅｄ．，  １９８７）等である。
【００９３】
本発明が提供する細菌を介して発現させたタンパク質又はその断片の単離及び精製は、分取クロマトグラフィー及びモノクローナル又はポリクローナル抗体に関わる免疫学的分離を含めた従来の方法によって実施することができる。本発明で提供される抗体は、本発明のジンクフィンガーヌクレオチド結合タンパク質に対して免疫反応性を有する。種々のエピトープ特異性を有するモノクローナル抗体のプールから主になる抗体並びに独特のモノクローナル抗体調製物が提供される。モノクローナル抗体は、当該技術分野で周知の方法により、タンパク質の断片を含有する抗原から作製される（Ｋｏｈｌｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６：４９５，  １９７５；  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ａｕｓｕｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄ．，  １９８９）。
【００９４】
ＶＩ．  薬学的組成物
別の態様において、本発明は、（１）上述の本発明に基づく治療有効量のポリペプチド、ポリペプチド組成物又は単離ヘプタペプチド；及び（２）薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。或いは、本発明は、（１）上述の本発明に基づくポリペプチド、ポリペプチド組成物又は単離ヘプタペプチドをコードする治療有効量のヌクレオチド配列；及び（２）薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。
【００９５】
本明細書で使用される、治療量のヌクレオチド配列を含む本発明に基づく薬理学的組成物の説明において、ヌクレオチド配列は更に上述のようなベクターに組み込むこともできる。
【００９６】
その中に溶解又は分散させた活性成分を含有する薬理学的組成物の調製方法は業界で理解されている。一般的に、このような組成物は、水性又は非水性の液体溶液又は懸濁液の何れかの滅菌注射剤として調製されるが、溶液又は懸濁液に好適な固体であって使用前に液体にするものとしても調整することができる。調製物は乳化させることもできる。活性成分は、薬学的に許容され、活性成分に適合する賦形剤と、本明細書に記載の治療方法で使用するのに好適な量だけ混合することができる。好適な調剤は、例えば、水、生食水、ブドウ糖、グリセロール、エタノール等及びその組み合わせである。更に、必要に応じて、組成物は、湿潤剤又は乳化剤並びにｐＨ緩衝剤等活性成分の有効性を高める副次的物質を少量含有することができる。キレート化剤、保存剤、抗菌剤、抗酸化剤、着色剤、矯味剤等の、製薬業界で慣習とされている更に他の成分も、組成物の特徴及び組成物の予定投与経路に応じて使用することができる。
【００９７】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される構成要素の塩を含むことができる。薬学的に許容される塩には、例えば塩酸又はリン酸等の無機酸又は、酢酸、酒石酸、マンデル酸等の有機酸と形成される酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基と形成）が含まれる。遊離カルボキシル基と形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は水酸化第二鉄等の無機塩基及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基に由来することができる。生理学的に許容される担体は、当該技術分野で周知である。液体担体の例は、活性成分及び水の他に物質を全く含有しない滅菌水溶液又はリン酸緩衝生食水等の生理学的ｐＨ値でリン酸ナトリウム等の緩衝剤、生理学的生食水又はその両方を含有する滅菌水溶液である。更に、水性担体は、１つ以上の緩衝塩並びに塩化ナトリウム及びカリウム等の塩、ブドウ糖、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール及び他の溶質を含有することができる。液体組成物は、水と共に及び水を除外して、液相を含有することができる。このような追加の液相の例は、グリセリン、綿実油等の植物油、オレイン酸エチル等の有機エステル及び水−油エマルジョンである。
【００９８】
ＶＩ．  使用
一実施形態において、本発明の方法は、ＣＮＮ標的配列を含有するヌクレオチド配列の発現を修飾する（阻害する又は抑制する）プロセスを含む。この方法は、当該ヌクレオチドを、当該モチーフに結合した本発明の有効量のジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドに接触させる手順を含む。ヌクレオチド配列がプロモーターである場合、この方法はジンクフィンガーＤＮＡ結合モチーフを含有するプロモーターの転写活性化の阻害を含む。「阻害」という用語は、例えばジンクフィンガーヌクレオチド結合モチーフを含有する等、プロモーターと作動可能に結合させた構造遺伝子の転写の活性化レベルの抑制を指す。更に、ジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドは、構造遺伝子又はＲＮＡ配列内の標的に結合することができる。
【００９９】
「有効量」という用語は、既に活性化されたプロモーターを不活化させる量又は標的ヌクレオチドを含有するプロモーターを不活化させる量又は構造遺伝子の転写又はＲＮＡの翻訳を遮断する量を含む。必要とされるジンクフィンガー由来ヌクレオチド結合ポリペプチドの量は、既存のタンパク質／プロモーター複合体内の天然に存在するジンクフィンガーヌクレオチド結合タンパク質に取って代わるのに必要な量又は、プロモーターそれ自体と複合体を形成するのに天然に存在するジンクフィンガーヌクレオチド結合タンパク質と競合するのに必要な量である。同様に、構造遺伝子又はＲＮＡを遮断するのに必要な量は、それぞれ、ＲＮＡポリメラーゼに結合して遺伝子の読み取りを遮断する量、又は翻訳を阻害する量である。好ましくは、この方法は細胞内で実施されるのがよい。プロモーター又は構造遺伝子を機能的に不活化することにより、転写又は翻訳は抑制される。標的配列を含有する細胞内ヌクレオチド配列と結合するか「接触する」阻害タンパク質の有効量の送達は、レトロウイルスベクター又はリポソーム等本明細書に記載した機序の一つ、又は当該技術分野で周知のその他の方法によって達成することができる。「修飾」という用語は、ある機能の抑制、促進又は誘導を指す。例えば、本発明のジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドは、プロモーター内の標的配列に結合することによってプロモーター配列を修飾し、それによってプロモーターヌクレオチド配列に作動可能に結合した遺伝子の転写を促進又は抑制することができる。或いは、修飾は、ジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドが構造遺伝子に結合し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによる遺伝子の読み取りを遮断して、その遺伝子の転写を阻害する場合、遺伝子の転写の阻害を含む。構造遺伝子は通常の細胞遺伝子又は例えば腫瘍遺伝子であってもよい。或いは、修飾は、転写生成物の翻訳の阻害を含むことができる。
【０１００】
遺伝子のプロモーター領域は一般的に、５’から構造遺伝子の間に存在する調節要素を含む。或いは、複数の調節要素が、仲介するヌクレオチド配列によって隔てられて存在することができる。遺伝子を活性化させる必要がある場合、転写因子と呼ばれるタンパク質がその遺伝子のプロモーター領域に結合する。このアセンブリは、ある酵素の第二の遺伝セグメントをＤＮＡからＲＮＡに転写することを可能にすることによって「スイッチオン」に似た状態にする。殆どの場合、結果生じるＲＮＡ分子は、特異的なタンパク質を合成するためのテンプレートとして働くが、場合によってはＲＮＡそれ自体が最終生成物になることもある。
【０１０１】
プロモーター領域は、通常の細胞のプロモーター又は例えば腫瘍プロモーターであってもよい。腫瘍プロモーターは一般的にウイルス由来プロモーターである。例えば、レトロウイルスの長末端反復配列（ＬＴＲ）は、本発明のジンクフィンガー結合ポリペプチド変異体の標的となるプロモーター領域である。このようなヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）１及び２又はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１又は２等の病原体を含むレンチウイルス群のメンバー由来のプロモーターは、本発明のジンクフィンガー結合ポリペプチドにより転写修飾の標的となるウイルスプロモーター領域の例である。
【０１０２】
標的ＣＮＮヌクレオチド配列は、遺伝子の転写領域又は発現配列タグ内に位置させることができる。標的配列を含有する遺伝子は、植物遺伝子、動物遺伝子又はウイルス遺伝子であってもよい。遺伝子は、真核細胞遺伝子又は細菌遺伝子等の原核細胞遺伝子であってもよい。動物遺伝子は、ヒト遺伝子を含めた哺乳動物遺伝子であってもよい。好ましい実施形態において、ヌクレオチド発現を修飾する方法は、標的ヌクレオチド配列を含有する細胞に本発明のポリペプチド又は組成物をコードするポリヌクレオチドを導入することによって達成される。好ましくは、このコードを行うポリヌクレオチドは、標的細胞で使用するのに好適な発現ベクター内に含有されるのがよい。好適な発現ベクターは、当該技術分野で周知である。
【０１０３】
ＣＮＮ標的は、その他の標的トリプレット配列とのあらゆる組み合わせで存在することができる。即ち、特殊なＣＮＮ標的は、伸長ＣＮＮ配列（［ＣＮＮ］２−１２）の一部として、又は（ＧＮＮ）１−１２、（ＡＮＮ）１−１２、（ＴＮＮ）１−１２又は（ＮＮＮ）１−１２等のあらゆる他の伸長配列の一部として存在することができる。
【０１０４】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を説明するもので、本明細書及び特許請求の範囲を如何なる方法でも制限するものではない。これらの実施例、特に実施例１３については、参考として本明細書で援用される、Ｂ．  Ｄｒｅｉｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｄｏｍａｉｎｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ５’−ＣＮＮ−３’  Ｆａｍｉｌｙ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒｓ，”  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８０：３５５８８−３５５９７  （２００５）に詳述されている。
【実施例】
【０１０５】
実施例１
ジンクフィンガーライブラリーの構築及びファージディスプレイを介した選択
ジンクフィンガーライブラリーの構築を前述のＣ７タンパク質に基づき行った（［Ｗｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５）  ＰＮＡＳ  ９２，  ３４４−３４８］；図１Ａ上）。フィンガー３をコードするプライマー（５’−ＧＡＧＧＡＡＧＴＴＴＧＣＣＡＣＣＡＧＴＧＧＣＡＡＣＣＴＧ  ＧＴＧＡＧＧＣＡＴＡＣＣＡＡＡＡＴＣ−３’）（配列番号３１）及びｐＭａｌ特異的プライマー（５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ  ＴＧＣＣＡＡＧＣ−３’）（配列番号３２）を使用した重複ＰＣＲ法を介して、５’−（ＧＣＧ）−３’サブサイトを認識するフィンガー３を、５’−（ＧＡＴ）−３’サブサイト［Ｓｅｇａｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６（６），  ２７５８−２７６３］に結合するドメインで置換した。ジンクフィンガーライブラリーの重複伸長ＰＣＲによる無作為化を、主に記載の通りに行った［Ｗｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）  ＰＮＡＳ  ９２，  ３４４−３４８；  Ｓｅｇａｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６（６），  ２７５８−２７６３］。ライブラリーをファージミドベクターｐＣｏｍｂ３Ｈに連結した［Ｒａｄｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ８（４），  ５０３−５０８］。文献に記載の通り、ファージの増殖及び沈殿を実施した［Ｂａｒｂａｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｍｅｔｈｏｄｓ：  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２（２），  １１９−１２４；  Ｂａｒｂａｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８，  ７９７８−７９８２；  Ｓｅｇａｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６（６），  ２７５８−２７６３］。５００μＬの亜鉛緩衝液Ａ（ＺＢＡ：  １０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，  ｐＨ７．５／９０ｍＭ  ＫＣｌ／１ｍＭ  ＭｇＣｌ２／９０ｍＭ  ＺｎＣｌ２）／０．２％  ＢＳＡ／５ｍＭ  ＤＴＴ／１％  Ｂｌｏｔｔｏ  （Ｂｉｏｒａｄ）／二本鎖の剪断処理したニシン精子ＤＮＡ２０ｍｇを含有する１００μＬの沈殿ファージ（１０１３コロニー形成単位）中で結合反応を実施した。ファージを非ビオチン化競合オリゴヌクレオチドに４℃にて１時間結合させた後に、ビオチン化した標的オリゴヌクレオチドを添加した。結合を４℃にて一晩持続した。５０μＬのストレプトアビジンでコーティングした磁性ビーズ（Ｄｙｎａｌ；  ＺＢＡ中の５％  Ｂｌｏｔｔｏで遮断）で１時間培養した後、ビーズを５００μＬのＺＢＡ／２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０／５ｍＭ  ＤＴＴで１０回、Ｔｗｅｅｎを含有しない緩衝液で１回洗浄した。ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ緩衝生食水）中の２５μＬのトリプシン（１０μｇ／μＬ）中で室温にて３０分間培養することによって、結合ファージを溶出した。ヘアピン競合オリゴヌクレオチドは、ＮＮＮがフィンガー２サブサイトオリゴヌクレオチドを、Ｎ’Ｎ’Ｎ’がその相補的塩基を示す、配列５’−ＧＧＣＣＧＣＮ’Ｎ’Ｎ’ＡＴＣＧＡＧＴＴＴＴＣＴＣＧＡＴＮＮ  ＮＧＣＧＧＣＣ−３’（配列番号３３）（標的オリゴヌクレオチドはビオチン化した）を有した。通常、標的オ���ゴヌクレオチドは、最初の３回の選択で７２ｎＭを添加し、６回目で３６ｎＭに、最終回では１８ｎＭにして添加した。競合として、５’−（ＴＧＧ）−３’フィンガー２サブサイトオリゴヌクレオチドを使用して、親クローンと競合させた。１５個の標的部位を除くフィンガー２  ５’−（ＣＮＮ）−３’サブサイトの等モル混合物及び５’−（ＡＮＮ）−３’、５’−（ＧＮＮ）−３’及び５’−（ＴＮＮ）−３’型の各フィンガー２サブサイトの競合混合物を、それぞれ選択の回を重ねるごとに量を増やして添加した。通常、特異的５’−（ＣＮＮ）−３’競合混合物は、初回には添加しなかった。
【０１０６】
実施例２
マルチターゲット特異性検定及びゲル運動性シフト分析
ジンクフィンガーコード配列を、ｐＣｏｍｂ３Ｈから修飾細菌発現ベクターｐＭａｌ−ｃ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）にサブクローニングした。ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した後、ジンクフィンガー−マルトース−結合タンパク質（ＭＢＰ）融合体を、１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加した後に発現させた。これらの細菌培養物の凍結／融解抽出物を、１：２で希釈して、ストレプトアビジンでコーティングした９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ）に注入し、１６個の５’−（ＧＡＴ  ＣＮＮ  ＧＣＧ）−３’（配列番号３４）標的部位のそれぞれに対するＤＮＡ結合特異性を試験した。主に記載の通りに、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫検定法）を実施した［Ｓｅｇａｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６（６），  ２７５８−２７６３；  Ｄｒｅｉｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３０３，  ４８９−５０２］。マウス抗ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）抗体（Ｓｉｇｍａ、１：１０００）と培養した後、アルカリホスファターゼに結合させたヤギ抗マウス抗体（Ｓｉｇｍａ、１：１０００）を添加した。検出の後にアルカリホスファターゼ基質（Ｓｉｇｍａ）を添加し、ＯＤ４０５をＳＯＦＴＭＡＸ２．３５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定した。
【０１０７】
ゲルシフト分析を、主に記載の通りに、精製タンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で実施した。
【０１０８】
実施例３
フィンガー２の部位特異的突然変異
文献に記載の通り、ＰＣＲによってフィンガー２突然変異体を構築した［Ｓｅｇａｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６（６），  ２７５８−２７６３；  Ｄｒｅｉｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３０３，  ４８９−５０２］。ＰＣＲテンプレートとして、５’−ＴＧＧ−３’フィンガー２及び５’−ＧＡＴ−３’フィンガー３を含有するライブラリークローンを使用した。突然変異したフィンガー２及び５’−ＧＡＴ−３’フィンガー３を含有するＰＣＲ生成物を、Ｃ７のフィンガー１を有するフレーム内のＮｓｉｌ及びＳｐｅｌ制限部位を介して、修飾ｐＭａｌ−ｃ２ベクター（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）にサブクローニングした。３フィンガータンパク質を、記載のようなＳＰ１Ｃフレームワークを使用して、フィンガー２縫取り法により構築した［Ｂｅｅｒｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５（２５），  １４６２８−１４６３３］。この作業で産生されたタンパク質は、５’−ＧＮＮ−３’  ＤＮＡ配列を認識するヘリックス［Ｓｅｇａｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６（６），  ２７５８−２７６３］並びに本明細書に記載の５’−ＡＮＮ−３’及び５’−ＴＡＧ−３’ヘリックスを含有した。６フィンガータンパク質を、適合可能なＸｍａｌ及びＢｓｒＦｌ制限部位を介して組み立てた。ＤＮＡ結合特性の分析を、ＩＰＴＧ誘導凍結／融解細菌抽出物から実施した。
【０１０９】
実施例４
一般的方法
形質導入及びルシフェラーゼ検定
ＨｅＬａ細胞を集密度４０〜６０％で使用した。２４ウェルプレートで、細胞に１６０ｎｇのレポータープラスミド（ｐＧＬ３−プロモーター構築物）及び４０ｎｇのエフェクタープラスミド（ｐｃＤＮＡ３中のジンクフィンガー−エフェクタードメイン融合体）を形質導入した。形質導入から４８時間後に細胞抽出物を調製し、ＭｉｃｒｏＬｕｍａｔ  ＬＢ９６Ｐ照度計（ＥＧ  ＆  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  Ｍｄ．）を使用して、ルシフェラーゼ検定試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）で測定した。
【０１１０】
レトロウイルスによる遺伝子ターゲティング及びフローサイトメトリー分析
これらの検定を文献に記載の通りに実施した［Ｂｅｅｒｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７（４），  １４９５−１５００；  Ｂｅｅｒｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５（４２），  ３２６１７−３２６２７］。一次抗体として、ＥｒｂＢ−１−特異的ｍＡｂ  ＥＧＦＲ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ＥｒｂＢ−２−特異的ｍＡｂ  ＦＳＰ７７（Ｎａｎｃｙ  Ｅ．  Ｈｙｎｅｓから寄贈；Ｈａｒｗｅｒｔｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２）及びＥｒｂＢ−３−特異的ｍＡｂ  ＳＧＰ１（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を使用した。二次抗体としては、蛍光標識したロバＦ（ａｂ’）２抗マウスＩｇＧを使用した（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ）。
【０１１１】
実施例５
ＥＬＩＳＡ検定のためのｐＭａｌ融合タンパク質の細菌抽出物
選択したジンクフィンガータンパク質を、発現させるためｐＭａｌベクター（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）にクローニングした。構築物をエレクトロポレーションによって大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅに導入し、５０μｇ／ｍＬのカルベネシリンを含有するＬＢプレート上に画線塗抹した。各突然変異体の４つの単独コロニーを、５０μｇ／ｍＬのカルベネシリン及び１％グルコースを含有するＳＢ培地３ｍＬ中に接種した。培養物を３７℃にて一晩増殖させた。培養物１．２ｍＬを、５０μｇ／ｍＬのカルベネシリン、０．２％グルコース、９０μｇ／ｍＬのＺｎＣｌ２を含有する新鮮ＳＢ培地２０ｍＬに形質転換させ、３７℃にて更に２時間増殖させた。ＩＰＴＧを終濃度０．３ｍＭまで添加した。培養を２時間続けた。Ｂｅｃｋｍａｎ  ＧＰＲ遠心分離器を使用して、培養物を４℃にて５分間、３５００ｒｐｍで遠心分離した。細菌のペレットを、５ｍＭの新鮮ＤＴＴを含有するＺｉｎｃ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ  １．２ｍＬ内で再懸濁した。タンパク質抽出物を、ドライアイス／エタノール及び温水を使用して、凍結／融解手順により単離した。この手順を６回繰り返した。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離器を使用して、試料を４℃にて５分間遠心分離した。上澄液を清潔な１．５ｍＬ入り遠心分離チューブに移し、ＥＬＩＳＡ検定に使用した。
【０１１２】
ＥＬＩＳＡ検定：Ｃ７．ＧＡＴのフィンガー２変異体を、マルトース−結合タンパク質（ＭＢＰ）との融合体として細菌発現ベクターにサブクローニングし、タンパク質を１ｍＭのＩＰＴＧによる誘導により発現させた（タンパク質（ｐ）には選択されたフィンガー２サブサイトの名前を付けた）。タンパク質は、５’−（ＧＡＴ  ＣＮＮ  ＧＣＧ）−３’（配列番号３４）の１６個のフィンガー２サブサイトのそれぞれに対して酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）を行い、そのＤＮＡ結合特異性を試験した。
【０１１３】
又、５’−ヌクレオチドの認識を、ジンクフィンガータンパク質を特異的標的オリゴヌクレオチド及び、中央のトリプレットの５’−ヌクレオチドのみが異なる３個のサブサイトに曝露することによって分析した。例えば、ｐＣＡＡは、５’−ＡＡＡ−３’、５’−ＣＡＡ−３’、５’−ＧＡＡ−３’及び５’−ＴＡＡ−３’サブサイトについて」試験を行った。試験を受けた３フィンガータンパク質の多くは、選択されたフィンガー２サブサイトに対して著明なＤＮＡ結合特異性を示した（表１）。
【０１１４】
【表１−１】
2009504156.tif 000002
【０１１５】
【表１−２】
2009504156.tif 000003
実施例６
ゲル運動性シフト分析
転写調節因子に結合したジンクフィンガーポリペプチドを、ＺＢＡ／５ｍＭ  ＤＴＴをカラム緩衝液として使用することを除いては、タンパク質融合及び精製系（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、９０％未満の均質性まで精製する。タンパク質の純度及び濃度を、クマシーブルー染色１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをもとに、ＢＳＡ標準品との比較によって測定する。標的オリゴヌクレオチドをその５’又は３’末端において［３２Ｐ］及び精製ゲルで標識する。１１個のタンパク質の３倍連続希釈物を、２０μＬの結合反応物（１×結合緩衝液／１０％グリセロール／＞＞１ｐＭ標的オリゴヌクレオチド）中で、室温にて３時間培養し、０．５×ＴＢＥ緩衝液中の５％ポリアクリルアミドゲル上で溶解する。乾燥ゲルの定量化をＰｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ及びＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用して実施し、ＫＤをＳｃａｔｃｈａｒｄ解析により測定した。
【０１１６】
実施例７
ジンクフィンガー−エフェクタードメイン融合タンパク質の構築
ジンクフィンガー−エフェクタードメイン融合タンパク質を構築するため、ｅｔｓレプレッサー因子（ＥＲＦ）レプレッサードメイン（ＥＲＤ）のアミノ酸４７３〜５３０（Ｓｇｏｕｒａｓ，  Ｄ．Ｎ．，  Ａｔｈａｎａｓｉｏｕ，  Ｍ．Ａ．，  Ｂｅａｌ，  Ｇ．Ｊ．，  Ｊｒ．，  Ｆｉｓｈｅｒ，  Ｒ．Ｊ．，  Ｂｌａｉｒ，  Ｄ．Ｇ．  ＆  Ｍａｖｒｏｔｈａｌａｓｓｉｔｉｓ，  Ｇ．Ｊ．  （１９９５）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １４，  ４７８１−４７９３）、ＫＯＸ１のＫＲＡＢドメインのアミノ酸１〜９７（Ｍａｒｇｏｌｉｎ，  Ｊ．Ｆ．，  Ｆｒｉｅｄｍａｎ，  Ｊ．Ｒ．，  Ｍｅｙｅｒ，  Ｗ．，  Ｋ．−Ｈ．，  Ｖｉｓｓｉｎｇ，  Ｈ．，  Ｔｈｉｅｓｅｎ，  Ｈ．−Ｊ．  ＆  Ｒａｕｓｃｈｅｒ  ＩＩＩ，  Ｆ．Ｊ．  （１９９４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１，  ４５０９−４５１３）又はＭａｄ  ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）のアミノ酸１〜３６（Ａｙｅｒ，  Ｄ．Ｅ．，  Ｌａｈｅｒｔｙ，  Ｃ．Ｄ．，  Ｌａｗｒｅｎｃｅ，  Ｑ．Ａ．，  Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，  Ａ．Ｐ．  ＆  Ｅｉｓｅｎｍａｎ，  Ｒ．Ｎ．  （１９９６）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １６，  ５７７２−５７８１）をコードするＤＮＡを重複するオリゴヌクレオチドからＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して組み立てる。ＶＰ１６転写活性化ドメインのアミノ酸４１３〜４８９のコード領域（Ｓａｄｏｗｓｋｉ，  Ｉ．，  Ｍａ，  Ｊ．，  Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇ，  Ｓ．  ＆  Ｐｔａｓｈｎｅ，  Ｍ．  （１９８８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３３５，  ５６３−５６４）を、ｐｃＤＮＡ３／Ｃ７−Ｃ７−ＶＰ１６（１０）からＰＣＲ増幅した。ＶＰ１６の最小活性化ドメインの四量体反復をコードし、アミノ酸４３７〜４４７を含むＶＰ６４  ＤＮＡ（Ｓｅｉｐｅｌ，  Ｋ．，  Ｇｅｏｒｇｉｅｖ，  Ｏ．  ＆  Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ，  Ｗ．  （１９９２）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １１，  ４９６１−４９６８）を、相補的オリゴヌクレオチドの二対から産生する。結果得られた断片を標準的なクローニング手順によりジンクフィンガーコード領域に融合し、結果得られた各構築物が内部ＳＶ４０核局在化シグナル並びにＣ末端ＨＡデカペプチドタグを含有するようにした。融合構築物を真核細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングする。
【０１１７】
実施例８
ルシフェラーゼレポータープラスミドの構築
ＡＴＧ開始コドンに対するヌクレオチド−７５８〜−１を含むｅｒｂＢ−２プロモーター断片を、ＴａｑＥｘｐａｎｄ  ＤＮＡポリメラーゼミックス（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して、ヒト骨髄ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流に位置するｐＧＬ３ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングする。ヌクレオチド−１５７１〜−２４を包含するヒトｅｒｂＢ−２プロモーター断片を、Ｈｉｎｄ３による消化により、ｐＳＶＯＡＬＤ５’／ｅｒｂＢ−２  （Ｎ−−Ｎ）（Ｈｕｄｓｏｎ，  Ｌ．Ｇ．，  Ｅｒｔｌ，  Ａ．Ｐ．  ＆  Ｇｉｌｌ，  Ｇ．Ｎ．  （１９９０）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５，  ４３８９−４３９３）から切断し、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流に位置するｐＧＬ３ｂａｓｉｃにサブクローニングする。
【０１１８】
実施例９
ルシフェラーゼの検定
全ての形質導入に、ＨｅＬａ細胞を集密度４０〜６０％で使用する。一般的には、細胞に４００ｎｇのレポータープラスミド（ｐＧＬ３−プロモーター構築物又は陰性対照としてｐＧＬ３ｂａｓｉｃ）、５０ｎｇのエフェクタープラスミド（ｐｃＤＮＡ３内のジンクフィンガー構築物又は陰性対照として空のｐｃＤＮＡ３）及び２００ｎｇの内部標準プラスミド（ｐｈｒＡｃｔ−ｂＧａｌ）を、リポフェクタミン試薬（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を使用して、６ウェルディッシュのウェルで導入する。形質導入から約４８時間後に細胞抽出物を調製する。ＭｉｃｒｏＬｕｍａｔ  ＬＢ  ９６Ｐ照度計（ＥＧ＆Ｇ  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）を使用して、ルシフェラーゼ活性をルシフェラーゼ検定試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）で、βＧａｌ活性をＧａｌａｃｔｏ−Ｌｉｇｈｔ（Ｔｒｏｐｉｘ）で測定する。ルシフェラーゼ活性をβＧａｌ活性で正規化する。
【０１１９】
実施例１０
Ｈｅｌａ細胞内のｅｒｂＢ−２遺伝子の調節
ｅｒｂＢ−２遺伝子を調節の標的とする。天然のｅｒｂＢ−２遺伝子を調節するには、合成レプレッサータンパク質及びトランス活性化因子タンパク質を使用する（Ｒ．Ｒ．  Ｂｅｅｒｌｉ，  Ｄ．Ｊ．  Ｓｅｇａｌ，  Ｂ．  Ｄｒｅｉｅｒ，  Ｃ．Ｆ．  Ｂａｒｂａｓ，  ＩＩＩ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５，  １４６２８  （１９９８））を使用する。このＤＮＡ結合タンパク質を、６個の予め規定したモジュールジンクフィンガードメインから構築する（Ｄ．Ｊ．  Ｓｅｇａｌ，  Ｂ．  Ｄｒｅｉｅｒ，  Ｒ．Ｒ．  Ｂｅｅｒｌｉ，  Ｃ．Ｆ．  Ｂａｒｂａｓ，  ＩＩＩ，  ＩＩＩ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５，２７５８  （１９９９））。レプレッサータンパク質がＫｏｘ−１  ＫＲＡＢドメインを含有するのに対し（Ｊ．Ｆ．  Ｍａｒｇｏｌｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１，  ４５０９  （１９９４））、トランス活性化因子ＶＰ６４は単純ヘルペスウイルスタンパク質ＶＰ１６に由来する最小活性化ドメインの四量体反復を含有する（Ｋ．  Ｓｅｉｐｅｌ，  Ｏ．  Ｇｅｏｒｇｉｅｖ，  Ｗ．  Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １１，  ４９６１  （１９９２））。
【０１２０】
ヒト子宮頚癌細胞系ＨｅＬａであるＨｅＬａ／ｔｅｔ−ｏｆｆの誘導体を使用する（Ｍ．  Ｇｏｓｓｅｎ  ａｎｄ  Ｈ．  Ｂｕｊａｒｄ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９，  ５５４７  （１９９２））。ＨｅＬａ細胞は上皮細胞由来であるため、ＥｒｂＢ−２を発現し、ｅｒｂＢ−２遺伝子ターゲティングの試験によく適合する。ＨｅＬａ／ｔｅｔ−ｏｆｆ細胞はテトラサイクリン制御性トランス活性化因子を産生し、増殖培地からテトラサイクリン又はその誘導体のドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を除外することにより、所定の遺伝子をテトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ）の制御下に誘導することができる。本発明者等はこの系を使用して、転写因子を化学的制御下におく。こうして、レプレッサー又はアクチベータープラスミドを構築し、ＢａｍＨｌ及びＣｌａｌ制限部位を使用してｐＲｅｖＴＲＥ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に、ＢａｍＨｌ及びＮｏｔｌ制限部位を使用してＰＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ［Ｘ．  Ｌｉｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９４，  １０６６９  （１９９７）］にサブクローニングする。ＰＣＲ増幅の忠実性を配列決定により確認し、ＨｅＬａ／ｔｅｔ−ｏｆｆ細胞に形質導入し、２０個の安定したクローンをそれぞれ単離して、Ｄｏｘ依存性標的遺伝子の調節について解析する。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ試薬（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を使用して、構築物をＨｅＬａ／ｔｅｔ−ｏｆｆ細胞系に形質導入する（Ｍ．  Ｇｏｓｓｅｎ  ａｎｄ  Ｈ．  Ｂｕｊａｒｄ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９，  ５５４７  （１９９２））。２ｍｇ／ｍＬのＤｏｘの存在下で、ハイグロマイシン含有培地で２週間選択した後、安定したクローンを単離し、ＥｒｂＢ−２発現のＤｏｘ依存性調節について解析する。主に文献に記載の通り、ウェスタンブロット、免疫沈澱、ノーザンブロット及びフローサイトメトリー解析を実施する［Ｄ．  Ｇｒａｕｓ−Ｐｏｒｔａ，  Ｒ．Ｒ．  Ｂｅｅｒｌｉ，  Ｎ．Ｅ．  Ｈｙｎｅｓ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５，  １１８２  （１９９５）］。ｅｒｂＢ−２プロモーター活性の読み出しとして、ＥｒｂＢ−２タンパク質のレベルを最初にウェスタンブロッティングで解析する。これらのクローンの著明な分画が、Ｄｏｘの４日間の除去によるＥｒｂＢ−２発現量の調節、即ち、レプレッサーのクローンにおけるＥｒｂＢ−２のダウンレギュレーション及びアクチベーターのクローンにおけるアップレギュレーションを示すはずである。ＥｒｂＢ−２タンパク質のレベルは、その特異的ｍＲＮＡのレベルの変化に相関し、ＥｒｂＢ−２の発現の調節が転写の抑制又は活性化の結果であることを示している。
【０１２１】
実施例１１
Ｅ２Ｓ−ＫＲＡＢ、Ｅ２Ｓ−ＶＰ６４、Ｅ３Ｆ−ＫＲＡＢ及びＥ３Ｆ−ＶＰ６４タンパク質のコード領域のレトロウイルスベクターｐＭ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰへの導入
幾つかの細胞系でＥ２Ｓ−ＫＲＡＢ、Ｅ２Ｓ−ＶＰ６４、Ｅ３Ｆ−ＫＲＡＢ及びＥ３Ｆ−ＶＰ６４タンパク質（下の表２を参照）を発現させるため、そのコード領域をレトロウイルスベクターｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰに導入した。
【０１２２】
これらの構築物の配列を選択して、ＥｒｂＢ−２又はＥｒｂＢ−３プロモーターの特異的領域に結合させた（表２を参照）。コード領域をｐｃＤＮＡ３に基づく発現プラスミドからＰＣＲ増幅し（Ｒ．Ｒ．  Ｂｅｅｒｌｉ，  Ｄ．Ｊ．  Ｓｅｇａｌ，  Ｂ．  Ｄｒｅｉｅｒ，  Ｃ．Ｆ．  Ｂａｒｂａｓ，  ＩＩＩ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５，  １４６２８  （１９９８））、ＢａｍＨｌ及びＣｌａｌ制限部位を使用してｐＲｅｖＴＲＥ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に、ＢａｍＨｌ及びＮｏｔｌ制限部位を使用してｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ［Ｘ．  Ｌｉｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９４，  １０６６９  （１９９７）］にサブクローニングした。ＰＣＲ増幅の忠実性を配列決定により確認した。このベクターはジンクフィンガータンパク質を翻訳するための単一の２シストロン性（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）メッセージを発現し、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）からは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する。両方のコード領域が同じｍＲＮＡを共有しているため、その発現は互いに物理的に関連しあい、ＧＦＰの発現はジンクフィンガーの発現の指標となる。その後、これらのプラスミドから調製したウイルスを使用して、ヒト癌細胞系Ａ４３１に感染させた。
【０１２３】
【表２】
2009504156.tif 000004
実施例１２
ＥｒｂＢ−２及びＥｒｂＢ−３遺伝子発現の調節
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を使用して、両指向性（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）パッケージング細胞系であるＰｈｏｅｎｉｘ  Ａｍｐｈｏに実施例１１のプラスミドを一過的に形質導入し、２日後に、培養物上澄液を使用して、８ｍｇ／ｍＬのポリブレンの存在下で標的細胞への感染を行った。感染から３日後、細胞を回収して解析した。感染から３日後、ＥｒｂＢ−２及びＥｒｂＢ−３の発現をフローサイトメトリーで測定した。結果は、Ｅ２Ｓ−ＫＲＡＢ及びＥ２Ｓ−ＶＰ６４組成物がＥｒｂＢ−２遺伝子発現をそれぞれ抑制及び促進させたことを示した。データは又、Ｅ３Ｆ−ＫＲＡＢ及びＥ３Ｆ−ＶＰ６４組成物が、ＥｒＢ−２遺伝子発現をそれぞれ抑制及び促進させたことも示している。
【０１２４】
ジンクフィンガーに基づく転写スイッチの開発のため、標的モデルとしてヒトｅｒｂＢ−２及びｅｒｂＢ−３遺伝子を選択した。ＥｒｂＢ受容体ファミリーのメンバーは、ヒト悪性腫瘍の発現に重要な役割を果たす。特に、乳房、卵巣、肺、胃及び唾液腺を含めた多くの部位に生じるヒト腺癌の高レベルにおいて、遺伝子の増幅及び／又は転写の脱調節（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）の結果としてｅｒｂＢ−２が過剰発現する（Ｈｙｎｅｓ，  Ｎ．Ｅ．  ＆  Ｓｔｅｍ，  Ｄ．Ｆ．  （１９９４）  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １１９８，  １６５−１８４）。ＥｒｂＢ−２の発現の亢進は、その内在性チロシンキナーゼの構成的な活性化につながり、培養細胞の形質転換を引き起こすことが明らかにされている。多くの臨床試験により、ＥｒｂＢ−２発現レベルが上昇した腫瘍患者の予後が不良であることが明らかにされている（Ｈｙｎｅｓ，  Ｎ．Ｅ．  ＆  Ｓｔｅｍ，  Ｄ．Ｆ．  （１９９４）  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １１９８，  １６５−１８４）。ヒト癌への関与に加えて、ｅｒｂＢ−２は哺乳動物の成熟期及び胚発生時期の両方において重要な生物学的役割を果たす（Ｈｙｎｅｓ，  Ｎ．Ｅ．  ＆  Ｓｔｅｍ，  Ｄ．Ｆ．  （１９９４）  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １１９８，  １６５−１８４，  Ａｌｔｉｏｋ，  Ｎ．，  Ｂｅｓｓｅｒｅａｕ，  Ｊ．−Ｌ．  ＆  Ｃｈａｎｇｅｕｘ，  Ｊ．−Ｐ．  （１９９５）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １４，  ４２５８−４２６６，  Ｌｅｅ，  Ｋ．−Ｆ．，  Ｓｉｍｏｎ，  Ｈ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｈ．，  Ｂａｔｅｓ，  Ｂ．，  Ｈｕｎｇ，  Ｍ．−Ｃ．  ＆  Ｈａｕｓｅｒ，  Ｃ．  （１９９５）  Ｎａｔｕｒｅ  ３７８，  ３９４−３９８）。
【０１２５】
このため、ｅｒｂＢ−２プロモーターは、人工転写調節因子の開発には興味深い試験例となる。このプロモーターは詳細まで特徴が明らかになっており、ＴＡＴＡ依存性及びＴＡＴＡ非依存性転写開始部位の両方を含有するという比較的複雑なものであることが明らかにされている（Ｉｓｈｉｉ，  Ｓ．，  Ｉｍａｍｏｔｏ，  Ｆ．，  Ｙａｍａｎａｓｈｉ，  Ｙ．，  Ｔｏｙｏｓｈｉｍａ，  Ｋ．  ＆  Ｙａｍａｍｏｔｏ，  Ｔ．  （１９８７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４，  ４３７４−４３７８）。初期の試験では多指タンパク質は転写を特異的に活性化又は抑制する転写調節因子として働くことを示したが、これらのタンパク質は人工プロモーターの上流でタンパク質結合部位の６連結反復に結合した（Ｌｉｕ，  Ｑ．，  Ｓｅｇａｌ，  Ｄ．Ｊ．，  Ｇｈｉａｒａ，  Ｊ．Ｂ．  ＆  Ｂａｒｂａｓ，  Ｃ．Ｆ．  （１９９７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９４，  ５５２５−５５３０）。更に、この試験は、その結合特異性が修飾されていない多指タンパク質を使用していた。本明細書で本発明者等は、予め規定された構成ブロックから組み立てた多指タンパク質が天然のｅｒｂＢ−２及びｅｒｂＢ−３プロモーターの単一の部位に結合する場合の有効性を試験した。
【０１２６】
所望のＤＮＡ結合特異性を有する多指タンパク質を産生するため、本試験はＧｒｅｉｓｍａｎとＰａｂｏ（Ｇｒｅｉｓｍａｎ，  Ｈ．Ａ．  ＆  Ｐａｂｏ，  Ｃ．Ｏ．  （１９９７）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５，  ６５７−６６１）が提唱した連続的選択法とは異なり、予め規定したジンクフィンガードメインのアセンブリに焦点を当てた。何故なら、そうした選択法では、必要とされる各タンパク質に対して６個のジンクフィンガーライブラリーを連続的に産生し選択する必要が生じ、この実験法が殆どの研究室にとって手の届かないものになり、皆にとって極めて時間のかかるものになるからである。更に、この方法では、代替となる結合配列に対して特異的な陰性選択を適用するのは困難であるため、最近報告された通りに結果として得られるタンパク質が比較的非特異的なものになると考えられる（Ｋｉｍ，  Ｊ．−Ｓ．  ＆  Ｐａｂｏ，  Ｃ．Ｏ．  （１９９７）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２，  ２９７９５−２９８００）。
【０１２７】
１８ｂｐのＤＮＡ配列を認識する３フィンガータンパク質を産生するために２種類の方法の一般的有用性を検討した。各方法はジンクフィンガードメインのモジュール的性質に基づくものであり、５’−（ＮＮＮ）−３’のトリプレットを認識するジンクフィンガードメインのファミリーを利用するものである。第一の方法では、ｅｒｂＢ−２又はｅｒｂＢ−３標的部位のｈａｌｆ−ｓｉｔｅを認識する３個の６フィンガータンパク質を、ＰＣＲアセンブリ方法を使用して、予め規定されたフィンガー２（Ｆ２）ドメイン変異体を共に融合させることによって産生した。
【０１２８】
その標的に対する各タンパク質の親和性を、電気泳動運動性シフト検定により測定した。これらの試験により、ジンクフィンガーペプチドがＺｉｆ２６８及びその他の天然の転写因子と同等の親和性を有することが明らかになった。
【０１２９】
ＤＮＡ標的部位に対する各タンパク質の親和性をゲルシフト解析により測定する。
【０１３０】
実施例１３
更なるジンクフィンガードメイン特異的結合（ＣＮＮ）配列の開発
ＤＮＡ配列に予め規定された特異性を有するタンパク質を迅速に調製することができれば、多岐にわたるテクノロジーが可能になり、例えば遺伝子の発現を制御したり、遺伝子及びゲノムを物理的に修飾するために使用することができる。普遍的な遺伝子調節系を開発するために、多指のジンクフィンガータンパク質に基づく人工転写因子の開発に多大な努力が払われてきた［１〜３］。このような系は生物学及び生物工学に多大な影響を与えることが考えられ、制御された遺伝子調節に基づく疾患の処置のため新しい手法を提供する。現在、遺伝子発現は、１８塩基対（ｂｐ）の標的部位に結合する多指のジンクフィンガータンパク質に基づく人工転写因子を使用して特異的に変化させることができることが明らかにされている［１、２］。９ｂｐといった小さな部位のターゲティングによっても、おそらくはクロマチン凝集（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）を介して、調節の特異性がある程度までは提供される［４〜６］。転写調節に加え、新規のジンクフィンガーＤＮＡ結合の特異性は、Ｆｏｋ  Ｉヌクレアーゼドメインと融合させることにより相同遺伝子組換えを制御するのに極めて有望である［７、８］。
【０１３１】
Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２のジンクフィンガードメインは独特であり、そのモジュール的性質のため、伸長ＤＮＡ配列を認識する有望なタンパク質である。各ドメインはββα構造へと折り畳まれた約３０個のアミノ酸からなり、この構造は疎水性相互作用及び保存されたＣｙｓ２−Ｈｉｓ２残基による亜鉛イオンのキレート化により安定化される［９、１０］。現在まで、ジンクフィンガータンパク質ファミリーの中で最も特徴が明らかにされているタンパク質は、マウス転写因子Ｚｉｆ２６８である。Ｚｉｆ２６８の３個のジンクフィンガードメインはそれぞれ、α認識ヘリックスのＤＮＡ２重ヘリックスの主溝への挿入により、３ｂｐのサブサイトに結合する［１１、１２］。ＤＮＡ結合タンパク質の迅速な構築を容易化し、タンパク質とＤＮＡの相互作用を研究するため、本発明者等は以前にＤＮＡ配列の５’−ＧＮＮ−３’及び５’−ＡＮＮ−３’ファミリーに結合するドメインを作製していた［１３〜１５］。本発明者等は、これらのドメインが、９〜１８ｂｐの標的部位を特異的に認識する多指のジンクフィンガータンパク質を組み立てることのできるモジュール認識単位として機能することを明らかにした。特に、１８ｂｐ部位はヒト又は他のあらゆるゲノムにおいて独自であることができるのに十分なだけ長く、このようなタンパク質の転写特異性は形質転換植物及びヒト細胞においてアレイ解析を使用することで明らかにされてきた［１６、１７］。構成的調節に加えて、核内ホルモン受容体のリガンド結合ドメインの特異的結合ドメインとの融合は、この種の転写因子による遺伝子調節の誘導を可能にする［１８］。ＤＮＡターゲティングにおいて究極的な自由を提供するには、考え得る３ｂｐサブサイトをターゲティングするのに必要な６４個のＤＮＡ結合ドメインを同定することが重要である。
【０１３２】
ジンクフィンガー／ＤＮＡ相互作用に関する構造的データが限られているため［１９〜２４］、高度の特異性で新規の配列と結合する亜鉛タンパク質の新規の設計はある程度までしか成功していない［２５］。特に、本明細書に報告する試験では、天然に存在するジンクフィンガードメインと５’−ＣＮＮ−３’サブサイトとの相互作用に関する構造的情報は全く得られていない。ＤＮＡ認識ヘリックスを、全長タンパク質を条件としてＤＮＡサブサイト５’−ＣＡＡ−３’に結合する配列ＱＳＴ−Ｎ−ＬＫＳ（配列番号５４）（配列はタンパク質のαヘリックスのＮ末端近位の最初の残基（−１）から開始する）を含有するＹＹ１のフィンガー４は、５’シトシンと直接相互作用せず、この部位に特異的に結合しない［２２］。Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２ファミリーのジンクフィンガードメインの作用様式に関する結晶学的データ及び突然変異試験により、多くのＤＮＡサブサイトを認識するドメインを選択するためのファージディスプレイライブラリーの構築に関する指針が得られた［１５］。Ｚｉｆ２６８／ＤＮＡ複合体の解析により、ＤＮＡ結合が主に、αヘリックスの−１位、３位及び６位のアミノ酸残基と、ＤＮＡサブサイトの３ｂｐのそれぞれ３’、中央及び５’のヌクレオチドと相互作用して達成されることが示唆されている［１１、１２］。αヘリックスの１位、２位及び５位はＤＮＡのリン酸骨格と直接又は水を介して接触し、タンパク質の究極の特異性に重要な寄与因子である。ロイシンは通常４位に認められ、ドメインの疎水性コアに詰め込まれる。αヘリックスの２位は他のヘリックス残基と相互作用する他、３ｂｐサブサイトの外側のヌクレオチドと接触することができ、標的部位の重複を起こす［１３、１５、２６〜２８］。
【０１３３】
Ｚｉｆ２６８に基づくファージディスプレイライブラリーは、５’−ＧＮＮ−３’モチーフに結合するドメインの選択に好適であった。幾つかのジンクフィンガードメインが伸長認識接触部と相互作用してしまう標的部位の重複の問題のため、５’−ＡＮＮ−３’の選択はファージディスプレイライブラリーの洗練を必要とした。これは、Ａｓｐをαヘリックスの２位に有するＺｉｆ２６８のフィンガー３が、ドメイン間認識を媒介する残基を持たないドメインに置換されることによって達成された。本発明者等はこのライブラリーから、５’−ＡＮＮ−３’サブサイトのドメインを選択し、更に部位特異的突然変異を介して新規のドメインの洗練又は設計に取り組んだ［１５］。その他の研究チームは、ＤＮＡ結合特異性が変化したジンクフィンガードメインの開発に、異なる選択方法を適用した［１−３］。
【０１３４】
ここでは、予め規定されたドメインの既存のセットを５’−ＣＮＮ−３’標的配列に特異的なドメインへと伸長させるための、ジンクフィンガードメインのモジュラー性に基づく選択法について報告する。ファージディスプレイライブラリーから、５’−ＣＮＮ−３’標的部位を特異的に認識する８個のジンクフィンガードメインを選択した。部位特異的突然変異により、４個のドメインのＤＮＡ結合特異性を改善した。６個の５’−ＣＮＮ−３’標的部位の場合は、特異的ドメインをｄ新規の設計で産生した。結果得られたタンパク質のＤＮＡ結合特異性を解析した。更に、これらのドメインが、１８ｂｐ標的部位へのＤＮＡ結合特異性を有する人工転写因子を構築するモジュールとして使用することができることを示す。ＶＰ６４活性化ドメイン又はＫＲＡＢ抑制ドメインに融合されると、ヒトＥＲＢＢ−２遺伝子の５’ＵＴＲを標的とする６フィンガータンパク質Ｅ２Ｓは、その内在遺伝子の発現を変化させることができる。同様に、ｇｇ１−ＶＰ６４と呼ばれる転写アクチベーターを構築し、ヒトγ−グロブリンの内在性発現を調節することを示した。本明細書に報告する結果は、５’−ＣＮＮ−３’サブサイトのジンクフィンガー／ＤＮＡによる認識に関する新しい知見を提供し、設計された転写因子及びヌクレアーゼで標的とすることのできるＤＮＡ配列の種類を格段に増加させるものである。
【０１３５】
材料及び方法
ジンクフィンガーライブラリーの構築及びファージディスプレイを介する選択
ジンクフィンガーライブラリーの構築は、前述のＣ７タンパク質に基づいた［２９］。５’−ＧＣＧ−３’サブサイトを認識するフィンガー３を、前述の通り、フィンガー３（５’−ＧＡＧＧＡＡＧＴＴＴＧＣＣＡＣＣＡＧＴＧＧＣＡＡＣＣＴＧＧＴＧＡＧＧＣＡＴＡ  ＣＣＡＡＡＡＴＣ−３’）（配列番号３１）をコードするプライマー及びｐＭａｌ特異的プライマー（５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣ−３’）（配列番号３２）を使用して、重複ＰＣＲ法を介して、５’−ＧＡＴ−３’サブサイト（１３）に結合することが知られているドメインで置換した［１５］。ＰＣＲ重複伸長によるジンクフィンガーライブラリーの無作為化は主に文献に記載の通りに実施した［１３、２９］。ライブラリーはファージミドベクターｐＣｏｍｂ３Ｈに結合させた［３０］。既述の通り、ファージを増殖して沈殿させた［１３、３１、３２］。容量５００μＬの亜鉛緩衝液Ａ（ＺＢＡ：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５／９０ｍＭ  Ｋｃｌ／１ｍＭ  ＭｇＣｌ２／９０ｍＭ  ＺｎＣｌ２）／０．２％  ＢＳＡ／５ｍＭ  ＤＴＴ／１％  Ｂｌｏｔｔｏ  （Ｂｉｏｒａｄ）／二本鎖の剪断処理したニシン精子ＤＮＡ２０ｍｇを含有する１００μＬの沈殿ファージ（１０１３コロニー形成単位）中で結合反応を実施した。ファージを非ビオチン化競合オリゴヌクレオチドに４℃にて１時間結合させた後に、ビオチン化した標的オリゴヌクレオチドを添加した。結合を４℃にて３時間又は一晩持続した。５０μＬのストレプトアビジンでコーティングした磁性ビーズ（Ｄｙｎａｌ；  ＺＢＡ中の５％  Ｂｌｏｔｔｏで遮断）で１時間培養した後、ビーズを５００μＬのＺＢＡ／２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０／５ｍＭ  ＤＴＴで１０回、Ｔｗｅｅｎを含有しない緩衝液で１回洗浄した。ＴＢＳ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中の２５μＬのトリプシン（１０μｇ／μＬ）中で室温にて３０分間培養することによって、結合ファージを溶出した。
【０１３６】
標的及び競合オリゴヌクレオチドをヘアピンを形成するように設計して、ＮＮＮがフィンガー２サブサイトを、Ｎ’Ｎ’Ｎ’がその相補的塩基を示す、配列５’−ＧＧＣＣＧＣＮ’Ｎ’Ｎ’ＡＴＣＧＡＧＴＴＴＴＣＴＣＧＡＴＮＮＮＧＣＧＧＣＣ−３’（配列番号３３）（標的オリゴヌクレオチドは５’末端でビオチン化した）を有するようにした。通常、標的オリゴヌクレオチドは、最初の３回の選択で７２ｎＭを添加し、５回目で３６ｎＭに、６回目では１８ｎＭにして添加した。選択の第１回における野生型の競合ヘアピンは、濃度１０８ｎＭで、ＮＮＮにおいて５’−ＴＧＧ−３’と同じ配列を有し、回を重ねるごとに増加して６回目では最大４６０ｎＭとした。続く選択においては、１５個の標的配列を除くフィンガー２  ５’−ＣＮＮ−３’サブサイトの等モル混合物を増量し、標的よりも５モル多いように第１回に添加した。５’−ＡＮＮ−３’、５’−ＧＮＮ−３’及び５’−ＴＮＮ−３’の各フィンガー２サブサイトの混合物を、標的よりも１．２５モル多いように第１回で添加し、実験に応じて標的配列よりも１０倍又は場合によっては４０倍多くなるように増量した。更に、５’−ＣＧＡ−３’、５’−ＣＡＧ−３’、５’−ＣＧＧ−３’及び／又は５’−ＣＴＧ−３’（これらが標的部位ではない場合）のＮＮＮとの競合物を濃度１８０ｎＭまで含めて、特定の標的部位の特異的認識のために選択を強化した。
【０１３７】
マルチターゲット特異性ＥＬＩＳＡ
ジンクフィンガーをコードする配列を、ｐＣｏｍｂ３Ｈ  ［３０，３１］から修飾細菌発現ベクターｐＭａｌ−ｃ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）にサブクローニングした。ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した後、ジンクフィンガー−マルトース−結合タンパク質（ＭＢＰ）融合体を、１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加した後に発現させた。これらの細菌培養物又は精製タンパク質の凍結／融解抽出物を、１：２で希釈して、ストレプトアビジンでコーティングした９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ）に注入し、上述のヘアピンオリゴヌクレオチドを使用して、１６個の５’−ＧＡＴ  ＣＮＮ  ＧＣＧ−３’（配列番号２９）標的部位のそれぞれに対するＤＮＡ結合特異性を試験した。主に記載の通りに、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫検定法）を実施した［１３，１４］。マウス抗ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）抗体（Ｓｉｇｍａ、１：１０００）と培養した後、アルカリホスファターゼに結合させたヤギ抗マウス抗体（Ｓｉｇｍａ、１：１０００）を添加した。アルカリホスファターゼ基質（Ｓｉｇｍａ）を添加し、４０５ｎＭにおける光学密度（ＯＤ４０５）をＳＯＦＴＭＡＸ２．３５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定した。
【０１３８】
ゲル運動性シフト及びＤＮａｓｅ  Ｉフットプリント解析
ｐＥ２Ｓのコード配列を修飾ｐＭＡＬ−ｃ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）細菌発現ベクターにサブクローニングし、大腸菌株ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した。タンパク質を、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で、カラム緩衝液としてＺｉｎｃ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ／５  ｍＭ  ＤＴＴを使用して精製した。タンパク質の純度を、クマシーブルー染色４〜１２％Ｎｏｖｅｘゲルで評価した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）標準品を使用して、Ｂｒａｄｆｏｒｄ検定により濃度を測定した。精製タンパク質を使用して、ＤＮａｓｅ  Ｉフットプリント及びゲル運動性シフト検定を実施し、ＤＮＡ結合部位及び親和性を決定した。
【０１３９】
ＤＮａｓｅ／フットプリントのため、ヒトＥＲＢＢ−２プロモーターのＤＮＡ断片を、５’−３２Ｐ標識Ｅ２ＳＦ（５’−ＧＧＣ  ＴＧＣ  ＴＴＧ  ＡＧＧ  ＡＡＧ  ＴＡＴ  ＡＡＧ  ＡＡＴ  ＧＡＡ  ＧＴＴ  ＧＴＧ  ＡＡＧ  Ｃ−３’）（配列番号５５）及び、ｐＧＬ３に挿入したゲノム断片由来のｐＧＬＰ２（５’−ＣＴＴ  ＴＡＴ  ＧＴＴ  ＴＴＴ  ＧＧＣ  ＧＴＣ  ＴＴＣ  ＣＡ−３’）（配列番号５６）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）プライマーを使用して、ＰＣＲで産生した［３３］。このＤＮＡ断片は２６７ｂｐを含有し、ＥＲＢＢ−２プロモーターの領域−２０９〜＋３を含んでいた。反応緩衝液の内容は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０μＭ  ＺｎＣｌ２、ｐＨ７．０であった。結合反応物は、１５ｋｃｐｍの３２Ｐ末端標識ＥＲＢＢ−２プロモーター断片及び５ｍＭ  ＤＴＴを含有し、タンパク質の濃度は０．１〜１００ｎＭであった。反応物を４℃にて１２〜１８時間培養した。ＤＮＡの分解を、既述の通り、ＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して実施した［３４］。試料を６％アクリルアミド／８Ｍ尿素ゲル上で分離し、ＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒプレートで曝露し、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ  ＳＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙａｎａｍｉｃｓ）で記録した。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）及びＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈソフトウェア（Ｓｙｎｅｒｇｙ［米国ペンシルバニア州レディング］）を使用して解析を行い、Ｋｄ値を得た。
【０１４０】
ゲル運動性シフト解析を、主に記載の通り精製タンパク質を使用して実施した［１３］。
【０１４１】
フィンガー２の部位特異的突然変異
既述の通り、ＰＣＲによってフィンガー２突然変異体を構築した［１３，１４］。ＰＣＲテンプレートとして、５’−ＴＧＧ−３’フィンガー２及び５’−ＧＡＴ−３’フィンガー３を含有するライブラリークローンを使用した。突然変異したフィンガー２及び５’−ＧＡＴ−３’フィンガー３を含有するＰＣＲ生成物を、Ｃ７のフィンガー１を有するフレーム内のＮｓｉ  Ｉ及びＳｐｅ  Ｉ制限部位を介して、修飾ｐＭａｌ−ｃ２ベクター（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）にサブクローニングした。
【０１４２】
多指ジンクフィンガータンパク質の構築
３フィンガータンパク質を、記載のようなＳＰ１Ｃフレームワークを使用して、フィンガー２縫取り法により構築した［３３］。６フィンガータンパク質を、適合可能なＸｍａ  Ｉ及びＢｓｒＦ  Ｉ制限部位を介して組み立てた。ＤＮＡ結合特性の分析を、ＩＰＴＧ誘導凍結／融解細菌抽出物から実施した。これらのタンパク質の遺伝子発現の調節能力を分析するため、文献に記載の通り［３３，３５］、活性化ドメインＶＰ６４（単純ヘルペスウイルスのＶＰ１６最小活性化ドメインの４量体反復）又はＫｏｘ−１の抑制ドメインＫＲＡＢに融合させ、レトロウイルスｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクター［３５、３６］（ＩＲＥＳは内部リボソーム侵入部位；ＧＦＰは緑色蛍光タンパク質）にサブクローニングした。
【０１４３】
レトロウイルス遺伝子ターゲティング及びフローサイトメトリー解析
これらの検定を主に既述の通りに実施した［３５］。遺伝子組換えレトロウイルスを産生するため、３．５×１０６  ２９３ＧａｇＰｏｌ細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＰＬＵＳ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、調節ドメインに融合したジンクフィンガータンパク質のそれぞれをコードするｐＭＸ−ＩＲＥＳ  ３．７５μｇ及びｐＭＤＧ−ＶＳＶプラスミド１．２５μｇを同時に形質導入した。形質導入から２日後にウイルス上澄液を回収し、これを使用して１×１０５  Ａ４３１細胞を感染させた。感染から２日後、Ａ４３１細胞をＥＲＢＢ２特異的抗体（５μｇ／ｍＬ）で染色し、フローサイトメトリーで解析した。一次抗体として、ＥＲＢＢ２−特異的ｍＡｂ  ＦＳＰ７７（Ｎａｎｃｙ  Ｅ．  Ｈｙｎｅｓから寄贈；［３７］）を使用した。二次抗体としては、フィコエリトリンで標識したロバＦ（ａｂ’）２抗マウスＩｇＧを使用した（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ）。
【０１４４】
コンピュータモデリング
Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，  Ｉｎｃ．）を使用してコンピュータモデルを産生した。モデルは、Ｚｉｆ２６８−ＤＮＡの共結晶構造の配位に基づいた（ＰＤＢ委託１ＡＡＹ）。構造のエネルギー最小化は行わず、可能な相互作用を示唆するためのみに示す。重原子間の距離が３（±０．３）オングストロームであり、重原子と水素によって形成される角度が１２０°を超える場合には、水素結合が適切とみなした。
【０１４５】
結果
ライブラリーの構築及び選択
以前に本発明者等は、ファージディスプレイの選択による単離及びそれぞれ特異的に５’−ＧＮＮ−３’型ＤＮＡ配列を認識する１６個のジンクフィンガードメインの同定を報告した。選択に使用したライブラリーは、マウス転写因子Ｚｉｆ２６８の高親和性変異体であるＣ７に基づくものであった［２９］。Ｚｉｆ２６８のフィンガー１は、アミノ酸配列ＲＳＤ−Ｅ−ＬＴＲ（配列番号１５）（−１位〜６位）を有し、Ｃ７は配列ＫＳＡ−Ｄ−ＬＫＲ（配列番号４４）を有する。何れのタンパク質も、フィンガー２は配列ＲＳＤ−Ｈ−ＬＴＴ（配列番号４５）（−１位〜６位）を有し、フィンガー３は配列ＲＡＤ−Ｅ−ＲＫＲ（−１位〜６位）（配列番号５７）を有する。何れのタンパク質も、ＤＮＡ標的部位５’−ＧＣＧ−ＴＧＧ−ＧＣＧ−３’（配列番号４６）に結合する。この５’−Ａ／ＣＮＮ−３’サブサイトに結合するこのライブラリーからジンクフィンガードメインを選択する試みは、認識ヘリックスの２位のＡｓｐが、続く３ｂｐサブサイトの反対側の鎖にあるアデニン又はシトシンの何れかと優勢なサブサイト間相互作用を起こすため、成功をみなかった［１１、１２］。このドメイン間の接触は、標的部位重複と呼ばれてきた［１３、２６〜２８］。
【０１４６】
５’−ＣＮＮ−３’サブサイトと結合するジンクフィンガードメインを選択するため、既述の通り［１５］、フィンガー交換（ｆｉｎｇｅｒ−ｓｗａｐｐｉｎｇ）によりファージディスプレイライブラリーを構築した。サブサイト５’−ＧＣＧ−３’に特異性を有するＣ７（ＲＳＤ−Ｅ−ＲＫＲ、−１位〜６位）（配列番号２７）のフィンガー３を、５’−ＧＡＴ−３’サブサイトと結合することが以前に特徴付けられているドメイン［１３］と交換して、３フィンガータンパク質Ｃ７．ＧＡＴを産生した。この認識ヘリックス（ＴＳＧ−Ｎ−ＬＶＲ）（配列番号５８）は２位にＡｓｐを有さないため、５’−ＡＮＮ−３’又は５’−ＣＮＮ−３’  ＤＮＡサブサイトと結合するジンクフィンガードメインを選択することができた。本発明者等は以前に、２個の標的部位、５’−ＡＣＧ−３’及び５’−ＡＣＴ−３’の認識には芳香族アミノ酸残基が必要であることを主張していたため、追加のファージディスプレイライブラリーをＮＮＫコドンドーピング法を使用して構築した（Ｎ＝アデニン、シトシン、グアニン又はチミン；Ｋ＝グアニン又はチミン）。このライブラリーは芳香族アミノ酸残基を含んでいたが、終止コドンを含んでいなかった。無作為化にはフィンガー２のαヘリックスの−１位、１位、２位、３位、５位及び６位を含めて、各アミノ酸の配位に３２通りの可能性を提供した。ライブラリーには２．４×１０９のメンバーが含まれ、殆ど全てのアミノ酸の組み合わせが保証された。
【０１４７】
所望の９個のｂｐ結合部位を含有するビオチン化したヘアピンオリゴヌクレオチドを使用して、ジンクフィンガーディスプレイファージの選択を実施した。通常、非ビオチン化競合ＤＮＡの存在下で、１６個の５’−ＧＡＴ−ＣＮＮ−ＧＣＧ−３’（配列番号２９）標的オリゴヌクレオチドのそれぞれでパンニングを６回実施した。回を重ねるごとにビオチン化標的オリゴヌクレオチドを減量し、競合オリゴヌクレオチド混合物を増量することにより、選択の厳密性を高めた。６回目で標的濃度は一般的に１８ｎＭであった。５’−ＡＮＮ−３’、５’−ＧＮＮ−３’及び５’−ＴＮＮ−３’フィンガー２サブサイトの競合混合物は、各オリゴヌクレオチドプールの５倍超とし、特異的５’−ＣＮＮ−３’混合物（標的配列を除く）は標的の１０倍超で存在するようにした。幾つかの特異的競合物を、標的部位に応じて２０倍量まで添加した。競合の５’−ＴＧＧ−３’を使用して、野生型タンパク質の選択を抑制した。競合の５’−ＣＡＧ−３’、５’−ＣＧＧ−３’及び５’−ＣＧＡ−３’を添加して、全ての５’−ＣＮＮ−３’標的部位に非特異的に結合するタンパク質の選択を抑制した（下記参照）。ビオチン化標的オリゴヌクレオチドに結合するファージを、ストレプトアビジンでコーティングした磁性ビーズによる捕捉により回収した。
【０１４８】
第６回の選択の後、又は修飾大腸菌発現ベクターｐＭａｌ−ｃ２へのサブクローニングの後、クローンを直接配列した。選択したフィンガー２ヘリックスのアミノ酸配列を、配列解析によって決定した（図２）。図２では、通常は各標的部位に対して幾つかのクローンを第６回のパンニングの後に配列した。各クローンのアミノ酸配列を決定した。フィンガー２サブサイトを左側に示し、認識ヘリックス内の配位を各セットの上に示す。ＤＮＡと直接接触すると思われるアミノ酸を太字で示す。囲み線で示した配列は、最上の親和性及び特異性を有して結合するクローンである。これらの３フィンガータンパク質のＤＮＡ結合特異性を図２の上の図に示す。決定された各ヘリックスの右側の番号は、特定の配列の発現数である。＊印は、修飾ｐＭａｌ−ｃ２発現ベクターへのサブクローニングの後に同定されたクローンを示す。＃印はＮＮＫライブラリーから選択されたクローンを示す。タンパク質は一般的にＺｉｆ２６８骨格の中でクローン化して解析した。幾つかのタンパク質はＳＰ１の添加が示す通り、Ｓｐ−１骨格の中でクローン化した。１６個の５’−ＣＮＮ−３’標的部位の内の８個に妥当な親和性及び特異性で結合するタンパク質を選択した（図２及び３）。Ｃ７．ＧＡＴ  ＮＫＫライブラリーを使用したパンニング又は特異的競合物の添加により、その他の７個のサブサイトのジンクフィンガーを選択する試みは成功しなかった。
【０１４９】
５’−ＣＮＮ−３’標的部位のファージディスプレイから選択したフィンガー２のヘリカル認識ドメインを含むアミノ酸を図２に示す。良好な特異性を有するアミノ酸配列を図２の枠内に示す。選択したヘリックスの５０％超がＨｉｓを３位に有した。標的部位５’−ＣＮＡ−３’及び５’−ＣＮＧ−３’のために選択したヘリックスは、一般的に−１位に良好に保存されており、これらの配位のアミノ酸残基で以前に認められている知見と合致した［１３〜１５］。３’ヌクレオチドがアデニンである場合（５’−ＣＧＡ−３’及び５’−ＣＴＡ−３’）、−１位はＧｌｎであった。５’−ＣＡＡ−３’では、Ｇｌｎ、Ａｓｎ又はＳｅｒは好ましくは−１位にあるのがよいが、５’−ＣＡＡ−３’ではＳｅｒが選択された。−１位にあるＳｅｒの３’アデニンとの相互作用は、以前に５’−ＡＣＡ−３’（ＳＰＡ−Ｄ−ＬＴＮ）（配列番号５９）に結合するドメインで認められていた［１５］。３’グアニンを含有するフィンガー２標的部位に対するパンニングでは、−１位のＡｒｇが強度に選択されたが、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＩｌｅも認められた。５’−ＣＮＧ−３’サブサイトに結合するドメインは、２位にＡｓｐを有することが多かった。Ａｓｐはおそらくは、フィンガー１の５’グアニンと対をなすシトシン塩基に接触することにより、３フィンガータンパク質の相互作用を安定化させるものと思われる。標的部位５’−ＣＮＴ−３’では、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ及びＣｙｓが認識ヘリックスの−１位に認められた。３’シトシンを含有するフィンガー２サブサイトでは、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ又はＡｓｐが−１位に選択された。
【０１５０】
５’−ＣＡＮ−３’の認識では、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ及びＬｙｓが認識ヘリックスの３位に選択された。以前に、５’−ＧＣＮ−３’を認識したヘリックスの３位にＴｈｒ又はＡｓｐが認められている［１３、１５］。ここでは、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ並びにＡｓｐ及びＴｈｒを選択した。標的部位５’−ＣＣＣ−３’では、３位はＡｓｎ又はＨｉｓであった。５’−ＣＣＧ−３’では、３位はＴｈｒ又はＨｉｓの何れかであった（図２）。５’−ＧＧＮ−３’では、Ｈｉｓが３位に強度に選択され、以前に認められた所見と合致した［１３〜１５］。標的部位５’−ＣＧＧ−３’及び５’−ＣＧＴ−３’では、３位にＳｅｒ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ及びＧｌｙが選択された。５’−ＣＧＣ−３’では、場合によってＴｒｐ及びＴｈｒが選択された。５’−ＣＴＮ−３’に結合するヘリックスでは、３位はＳｅｒ又はＡｌａの何れかであった。例外はＨｉｓが選択された５’−ＣＴＣ−３’及び５’−ＣＴＴ−３’であった。α認識ヘリックスの１位、２位及び５位は変動可能であった。これらの残基は通常ＤＮＡと接触する直接塩基に関与しないため、これは驚くべきことではない［１１、１２］。４位は無作為化しなかったが、天然の突然変異により、５’−ＣＧＴ−３’に結合する４位においてＬｅｕからＣｙｓへの変化を有するヘリックスが産生された（図２）。この種の天然の突然変異は、５’−ＡＴＣ−３’及び５’−ＧＣＣ−３’標的部位に結合するタンパク質の選択において稀に認められた［１３、１５］。
【０１５１】
Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２ジンクフィンガードメインによる５’シトシンの認識に関しては殆ど知られていない。５’グアニンの認識については詳細に特徴付けられており、ヘリックスの６位のＡｒｇ又はＬｙｓの何れかによって達成される［１２、１３、１９〜２４］。部位特異的突然変異の選択も、認識が６位のアミノ酸によって達成されることを示唆した。例えば、５’アデニンの認識では、アミノ酸はＡｓｎ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、Ａｒｇ又はＧｌｕであることができる［１５］。これから類推するに、５’シトシンの認識はα認識ヘリックスの６位におけるアミノ酸残基によって達成されることが考えられる。５’−ＣＮＮ−３’フィンガー２サブサイトに結合するドメインのファージディスプレイの選択の結果、６位のＧｌｕ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｓｅｒ及びＶａｌが選択された。驚くべきことに、配列したタンパク質の６５％（１２７中８２）において、６位にＧｌｕが存在した（図２）。
【０１５２】
５’−ＣＮＮ−３’標的部位を認識する選択ドメインのＤＮＡ結合特異性
ファージディスプレイにより選択されるジンクフィンガードメインのＤＮＡ結合特異性を評価するため、１６部位全ての５’−ＧＡＴ−ＣＮＮ−ＧＣＧ−３’（配列番号２９）に対してマルチターゲット特異性ＥＬＩＳＡを使用してそれぞれを試験した（図３、黒色のバー）。更に、５’−ＡＮＮ−３’、５’−ＣＮＮ−３’、５’−ＧＮＮ−３’及び５’−ＴＮＮ−３’標的部位のそれぞれに対する１６個のオリゴヌクレオチドの等モル混合物への結合を評価することにより、５’特異性を解析した（図３、白色のバー）。図３の、各グラフの上に示すのは、認識されたオリゴヌクレオチド配列（ｐＮＮＮ）及び分析した３フィンガータンパク質のフィンガー２ドメイン（ヘリックス開始部に対する−１〜６位）のアミノ酸配列である。黒色のバーは、種々のフィンガー２サブサイト：５’−ＣＡＡ−３’、５’−ＣＡＣ−３’、５’−ＣＡＧ−３’、５’−ＣＡＴ−３’、５’−ＣＣＡ−３’、５’−ＣＣＣ−３’、５’−ＣＣＧ−３’、５’−ＣＣＴ−３’、５’−ＣＧＡ−３’、５’−ＣＧＣ−３’、５’−ＣＧＧ−３’、５’−ＣＧＴ−３’、５’−ＣＴＡ−３’、５’−ＣＴＣ−３’、５’−ＣＴＧ−３’と標的オリゴヌクレオチドへの結合を示す。白色のバーは、５’認識を評価するためのサブサイト５’−ＡＮＮ−３’、５’−ＣＮＮ−３’、５’−ＧＮＮ−３’及び５’−ＴＮＮ−３’のぞれぞれの１６個のオリゴヌクレオチドの混合物への結合を示す。各バーの高さは、各標的へのタンパク質の相対的親和性を示すもので、２回の独立した実験結果を平均し、黒色又は白色のバーでの最強シグナルに補正したものである。エラーバーはこの平均値からの偏差を示す。上図：パンニングで得られた図１の枠内のヘリックス配列に対応して解析したタンパク質。下図：解析したタンパク質は部位特異的突然変異から派生したものであった（ｐｍ）。一般的に、タンパク質はＺｉｆ２６８骨格の中でクローン化して解析した。幾つかのタンパク質はＳＰ１の添加が示す通り、Ｓｐ−１骨格の中でクローン化した。パンニングから派生したクローンの結果を図３の上の図に示す。一般的に、選択されたヘリックスは、認識ヘリックスの６位がＧｌｕである場合は、５’シトシンに対する著明なＤＮＡ結合特異性を示した。唯一の例外は、５’アデニンとオリゴヌクレオチドの結合がより強度であった標的部位５’−ＣＧＧ−３’（タンパク質配列ＲＳＤ−Ｈ−ＬＴＥ）（配列番号１４）であった（図３ｇ）。６位にＩｌｅ（ＲＡＤ−Ｈ−ＬＡＩ：図３ａ）（配列番号６０）又はＡｓｐ（ＲＳＤ−Ｈ−ＬＴＤ）（配列番号６１；図示なし）を有するクローンを、それぞれ優先的に５’グアニンに結合する５’−ＣＡＧ−３’及び５’−ＣＣＧ−３’への結合のために選択した。これらのヘリックスの２個は６位にＡｌａを有した。５’−ＣＣＧ−３’への結合のために選択された配列ＲＮＤ−Ｔ−ＬＱＡ（配列番号６２）を有するジンクフィンガーは、５’グアニンに優先的に結合したが（図３ｄ）、５’−ＣＧＴ−３’への結合のために選択された配列ＳＲＲ−Ｔ−ＣＲＡ（配列番号１８）を有するタンパク質は高度の特異性で５’シトシンに結合した（図３ｈ）。以前に、６位のＡｌａは、５’アデニンの認識を媒介することが明らかにされている［１５］。これらの結果は、トリプレットの５’ヌクレオチドの認識が、α−ヘリックスの６位にあるアミノ酸残基にのみ依存するのではなく、おそらくは配位による相互作用を介して、隣接するアミノ酸にも依存することを示すものと考えられる。
【０１５３】
中央のアデニン（５’−ＣＡＮ−３’）の認識は、ヘリックスが３位にＡｓｎを含む場合に、ＲＡＤ−Ｎ−ＬＡＩ（配列番号５）による５’−ＣＡＧ−３’の結合として認められ（図３ａ）、以前の報告結果と合致した［１３〜１５］。中央のシトシン（５’−ＣＣＮ−３’）は、ヘリックスの３位がＨｉｓである場合に、ＳＫＫ−Ｈ−ＬＡＥ（配列番号６３）の場合として特異的に認識された（図３ｂ）。Ａｓｎも極めて特異的に中央のシトシンを認識した（ＳＶＲ−Ｎ−ＬＲＥ）（配列番号６４）（図３ｃ）。これも以前の知見と合致したのは、３位にＴｈｒがある場合の、ＲＮＤ−Ｔ−ＬＱＡ（配列番号６５）による５’−ＣＣＧ−３’の認識（図３ｄ）であった［１３〜１５］。中央のグアニン、５’−ＣＧＮ−３’は、以前に報告された通り、３位のＨｉｓによって認識された［１３〜１５］。ＨＴＧ−Ｈ−ＬＬＥ（配列番号６６）（図３ｆ）が５’−ＣＧＣ−３’に対する優れたＤＮＡ結合特異性を示したのに対し、５’−ＣＧＮ−３’を認識する他のタンパク質（ＱＬＡ−Ｈ−ＬＫＥ（配列番号１１）（図３ｅ）、ＲＳＤ−Ｈ−ＬＴＥ（配列番号６７）（図３ｇ）及びＱＬＲ−Ｈ−ＬＲＥ（配列番号６８）（図３ｉ））は他の部位との若干の交差反応性を示した。ＱＬＡ−Ｈ−ＬＫＥ（配列番号１１）（図３ｅ）が親和性及び特異性の低いクローンの代表である。ヘリックスＳＲＲ−Ｔ−ＣＲＡ（配列番号６９）（図２ｈ）は、３位にＴｈｒがあるにもかかわらず、５’−ＣＧＴ−３’の中央のグアニンに特異的に結合した。中央のチミンは、３位にＳｅｒ又はＡｌａの何れかを有するヘリックスＱＲＨ−Ｓ−ＬＴＥ（配列番号７０）（図３ｊ）及びＲＮＤ−Ａ−ＬＴＥ（配列番号７１）（図３ｋ）によって特異的に認識され、過去の知見と合致した［１３〜１５］。
【０１５４】
−１位にＧｌｎを有するヘリックス（ＱＬＡ−Ｈ−ＬＫＥ（配列番号１１）（図３ｅ）；ＱＲＨ−Ｓ−ＬＴＥ（配列番号７０）（図３ｊ））では、過去に報告されている通り［１３〜１５］、３’アデニンの認識が認められた。３’シトシンの認識においては、−１位にＳｅｒ及びＨｉｓが認められた（ＨＴＧ−Ｈ−ＬＬＥ（配列番号６６）（図２ｆ）；ＳＫＫ−Ｈ−ＬＡＥ（配列番号６３）（図３ｂ）；及びＳＶＲ−Ｎ−ＬＲＥ（配列番号６４）（図３ｃ））。３’グアニンの認識は、−１位のＡｒｇによってなされた（図３ａ、３ｄ、３ｇ及び３ｋ）。このデータは過去の報告と合致する［１３〜１５］。３’チミンの認識は、−１位のＳｅｒ、Ｔｈｒ又はＨｉｓによって媒介されることが報告されている［１３〜１５］。本試験では、３’チミンを認識するヘリックスは、−１位にＳｅｒ（ＳＲＲ−Ｔ−ＣＲＡ（配列番号６９）（図３ｈ））又はＧｌｎ（ＱＬＲ−Ｈ−ＬＲＥ（配列番号６８）（図２ｉ））を有した。
【０１５５】
要約すれば、ファージディスプレイの選択により、８個の５’−ＣＮＮ−３’標的部位：５’−ＣＡＧ−３’、５’−ＣＣＣ−３’、５’−ＣＣＧ−３’、５’−ＣＧＣ−３’、５’−ＣＧＧ−３’、５’−ＣＧＴ−３’、５’−ＣＴＡ−３’及び５’−ＣＴＧ−３’のドメインが得られた。その他の標的部位においては、パンニングの結果妥当な特異性を有するドメインが得られなかった。５’−ＣＡＧ−３’（図２ａ）及び５’−ＣＣＧ−３’（図２ｄ）では、５’シトシンの結合における特異性を改善する必要があった。５’−ＣＧＡ−３’に結合するヘリックス（図２ｅ）は、殆ど特異性を示さず、部位特異的突然変異による改良を必要とした。５’−ＣＮＧ−３’型のＤＮＡ配列に結合するドメインの場合は、中央のヌクレオチドに対する特異性が不足していることが通常であった。この現象は、５’−ＧＮＧ−３’及び５’−ＡＮＧ−３’型のＤＮＡ配列に結合するドメインについても、以前に報告されているものでもあった［１３〜１５］。
【０１５６】
部位特異的突然変異及び新規の設計による、５’−ＣＮＮ−３’配列ファミリーに結合するドメインの特異性の改良
ファージディスプレイの選択では、５’−ＣＡＡ−３’、５’−ＣＡＣ−３’、５’−ＣＡＴ−３’、５’−ＣＣＡ−３’、５’−ＣＣＴ−３’、５’−ＣＧＡ−３’、５’−ＣＴＣ−３’又は５’−ＣＴＴ−３’に特異的に結合するジンクフィンガードメインが産生されなかった。場合によっては選択されたヘリックスがそのコグネート標的部位に結合したが、その他の部位との若干の交差反応性が認められた（例えば５’−ＣＡＧ−３’、図３ａ；５’−ＣＣＧ−３’、図３ｄ；５’−ＣＧＡ−３’、図３ｅ；５’−ＣＧＧ−３’、図３ｇ）。部位特異的突然変異を使用して、ＤＮＡ結合特異性を改良した。結果を図３の下の図に示す。α−ヘリックスの４位、５位及び６位のＤＮＡ結合モチーフＬｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕが、５’シトシンの認識を媒介するためのパンニング中に選択された多くの配列で認められた。５’−ＣＡＧ−３’（ＲＡＤ−Ｎ−ＬＡＩ（配列番号６０）（図３ａ））を認識するために選択されたヘリックスを、このコンセンサス配列（ＲＡＤ−Ｎ−ＬＴＥ）（配列番号７２）に変更した。ＤＮＡ結合特異性は５’シトシンだけでなく中央のアデニンについても格段に改良された（図３ｎ）。Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕモチーフの使用は、５’−ＣＣＧ−３’への結合も改良した（ＲＮＤ−Ｔ−ＬＱＡ（配列番号６２）（図３ｄ）をＲＮＤ−Ｔ−ＬＴＥ（配列番号７３）（図３ｑ）と比較した場合）。標的部位５’−ＣＧＧ−３’で５’シトシンの認識を改良するために、３位のＨｉｓをＬｙｓで置換した（ＲＳＤ−Ｋ−ＬＴＥ（配列番号７４）（図３ｔ）に対するＲＳＤ−Ｈ−ＬＴＥ（配列番号１４）（図３ｇ））。これは５’シトシンの認識を改良しなかったが、中央のグアニンの排他的認識をもたらした。５’−ＣＧＡ−３’の認識のために選択されたアミノ酸配列を、Ｓｅｇａｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９の配列（ＱＳＧ−Ｄ−ＬＲＲ）（配列番号７６）に基づき、ＱＬＡ−Ｈ−ＬＫＥ（配列番号１１）（図３ｅ）からＱＳＧ−Ｈ−ＬＴＥ（配列番号７５）へと変更した。これにより、ＤＮＡ結合特異性及び親和性が改良されたが、正味の特異性はその他殆どのドメインに比べて低いままであった（図３ｓ）。
【０１５７】
５’−ＣＡＡ−３’を認識するドメインの産生にも、理論設計を適用した。フィンガー２ヘリックスＱＳＧ−Ｎ−ＬＴＥ（配列番号２）（５’−ＧＣＡ−３’を認識するジンクフィンガーＱＳＧ−Ｄ−ＬＲＲ（配列番号７６）から派生）［１３］は、その標的部位に良好な特異性で結合した（図３ｌ）。ヘリックスＳＫＫ−Ａ−ＬＴＥ（配列番号７７）は、その標的部位５’−ＣＡＣ−３’に、優れた５’シトシン認識で優先的に結合したが（図３ｍ）、中央の塩基の特異性は低かった。５’−ＣＡＴ−３’の認識のため、５’−ＧＡＴ−３’（ＴＳＧ−Ｎ−ＬＶＲ）（配列番号２８）を認識するヘリックスに基づいて、ヘリックスＴＳＧ−Ｎ−ＬＴＥ（配列番号７８）を産生した［１３］。マルチターゲットＥＬＩＳＡにより、このヘリックスがその標的Ｖに優れた５’シトシン認識で、優先的に結合することが明らかになった（図３ｏ）。ＱＲＨ−Ｓ−ＬＴＥ（図３ｊ）（配列番号７０）の５’−ＣＴＡ−３’ヘリックスをＱＮＳ−Ｔ−ＬＴＥ（配列番号７９）（図３ｕ）に変更することにより、その他の標的に対する非特異的な結合が抑制された。５’−ＣＣＣ−３’を除き（図２ｂ）、ピリミジンヌクレオチドのみを含有する部位を標的とする特異的ヘリックスは、ファージディスプレイから産生されなかった。ヘリックスＴＳＨ−Ｓ−ＬＴＥ（配列番号８０）は、サブサイト５’−ＣＴＣ−３’に結合すべく設計されたが、驚くべきことに優れた５’シトシン認識で５’−ＣＣＡ−３’に優先的に結合した（図３ｐ）。その後このデータは、５’−ＣＣＴ−３’を極めて特異的に認識するドメイン、ＴＫＮ−Ｓ−ＬＴＥ（配列番号８１）（図３ｒ）及び５’−ＣＴＴ−３’に対するＴＴＧ−Ａ−ＬＴＥ（配列番号８２）（図３ｖ）を設計することを可能にした。サブサイト５’−ＣＴＣ−３’の場合は、複数のヘリックスを試験した後も、特異的に結合するものは全く同定できなかった。
【０１５８】
５’−ＣＮＮ−３’ドメインを含有する多指ジンクフィンガータンパク質の産生
本発明者等は以前に、外在及び内在遺伝子が、５’−（ＧＮＮ）６−３’  ＤＮＡ配列を特異的に認識するジンクフィンガードメインを含む６フィンガータンパク質によって調節することができることを明らかにしている［３３、３５、３６］。更に、本発明者等は、５’−ＧＮＮ−３’、５’−ＡＮＮ−３’及び５’−ＴＮＮ−３’を認識する種々の数のドメインを含む５フィンガータンパク質が、内在遺伝子を調節することができることを明らかにした［１５］。ＤＮＡ配列の５’−ＣＮＮ−３’ファミリーを認識する本明細書に記載のドメインが、人工転写因子の構築に好適であるかどうかを確認するため、６フィンガータンパク質ｐＥ２Ｓを構築した。本発明者等は以前に、ＥＲＢＢ−２遺伝子の５’ＵＴＲを標的とする６フィンガータンパク質Ｅ２Ｃ及びＥ２Ｘによる特異的な遺伝子調節を報告しているため［１５、３５］、モデル系としてはヒトＥＲＢＢ−２遺伝子を選択した。６フィンガーｐＥ２Ｓは、５’ＵＴＲ内の−１３７〜−１５４位の標的部位５’−ＣＧＧ−ＧＧＧ−ＧＣＴ−ＣＣＣ−ＣＴＧ−ＧＴＴ−３’（配列番号８３）に結合するべく設計された［３８］。この標的部位は、過去に同定された３個の５’−ＧＮＮ−３’領域［１３］の認識部位及び、本明細書に記載の３個の５’−ＣＮＮ−３’領域（下線で示す）を含有した。
【０１５９】
迅速ＰＣＲ重複伸長法及びＳｐ１Ｃフレームワークを使用して、２個の３フィンガーコード領域を産生した［３３］。次に、これらの３フィンガータンパク質を融合して６フィンガータンパク質を作製し、それを細菌発現ベクターｐＭａｌ−ｃ２にクローニングした。この６フィンガータンパク質を大腸菌内にＭＰＢ融合タンパク質として発現させ、精製した。精製ｐＥ２Ｓの親和性を、電気泳動運動性シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を使用して測定し、３．２５ｎＭにおける解離定数を決定した。ｐＥ２Ｓ結合部位を含有するＥＲＢＢ−２プロモーターの２６７ｂｐ断片内での６フィンガータンパク質Ｅ２ＳのそのＤＮＡ標的部位に対する結合特異性の特徴を、ＤＮａｓｅ  Ｉフットプリント法を使用して測定した（図４）。Ｅ２Ｓタンパク質を１００ｎＭ〜０．１ｎＭの範囲で滴定し、解離定数を得た。図４では、６フィンガータンパク質ｐＥ２ＳをＳＰ１Ｃフレームワークを使用して構築した。細菌内での発現及び精製の後、ｐＥ２Ｓを、ＥＲＲＢ−２プロモーターの−２０９〜＋３領域を含有する２６７ｂｐの放射線標識したＤＮＡ断片と共に培養した。ＤＮａｓｅ  Ｉによる分解の後、試料を６％アクリルアミド／８Ｍ尿素ゲル上で分離した。対照：分解していないＤＮＡ断片；Ｇ＋Ａラダー：２６７ｂｐ  ＤＮＡ断片の配列ラダー；ＤＮａｓｅ  Ｉ：Ｅ２Ｓタンパク質を有さない標識断片の分解；レーン４〜１３は、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．２ｎＭ及び０．１ｎＭのＥ２Ｓタンパク質を含有。Ｅ２Ｓ結合部位の位置を示す。３個の独立した実験結果を平均するとＫｄ値は１４±４ｎＭとなり、ＥＭＳＡで求められた親和性データと合致した。ｐＥ２ＳのＤＮＡ結合は、正確に１８ｂｐの標的部位５’−ＣＧＧ−ＧＧＧ−ＧＣＴ−ＣＣＣ−ＣＴＧ−ＧＴＴ−３’（配列番号８３）で認められた。この結果は、ここで特徴付けた５’−ＣＮＮ−３’ドメインが、６フィンガータンパク質の枠内においても極めて特異的な結合も促進することを示すものである。
【０１６０】
６フィンガータンパク質ｐＥ２Ｓの内在ＥｒｂＢ−２遺伝子の発現を変化させる能力を確認するため、そのコード領域をレトロウイルスベクターｐＭＸ−ＩＲＥＳにサブクローニングし、ＶＰ６４活性化ドメイン又はＫｏｘ−１のＫＲＡＢレプレッサードメインの何れかと融合させた［３３、３９］。ヒト癌細胞系Ａ４３１を遺伝子組換えレトロウイルスに感染させた。感染から２日後、細胞をＥＲＢＢ２特異的抗体を使用してフローサイトメトリーで解析した（図５）。図５で、Ａ４３１細胞に、活性化ドメインＶＰ６４に融合させたｐＥ２Ｓ又は抑制ドメインＫＲＡＢに融合させたｐＥ２Ｓの何れかからなる転写因子をコードするレトロウイルスを形質導入した。３日後、フィコエリトリンで標識した二次抗体と組み合わせたＥｒｂＢ２−特異的ｍＡｂ  ＦＳＰ７７で無傷の細胞を染色し、フローサイトメトリーで解析した。細線、二次抗体単独で染色；点線、ｍｏｃｋ導入細胞の特異的染色；実線、転写因子Ｅ２Ｓ−ＶＰ６４（Ａ）又はＥ２Ｓ−ＫＲＡＢ（Ｂ）を発現させるための導入を行った細胞の特異的染色。ＶＰ６４活性化ドメインに融合したｐＥ２Ｓでは内在ＥＲＢＢ−２遺伝子の強度のアップレギュレーションが認められ（図５Ａ）、ＫＲＡＢ抑制ドメインに融合したｐＥ２Ｓを発現させた場合はダウンレギュレーションが認められた（図５Ｂ）。ｐＥ２Ｓの結果は、本明細書に記載の５’−ＣＮＮ−３’ドメインが、設計した転写調節因子を構築するモジュール構成ブロックとして働くことができることを明確に示している。
【０１６１】
同様に、本発明者等は最近、解離定数０．７ｎＭで配列５’−ＧＴＣ  ＡＡＧ  ＧＣＡ  ＡＧＧ  ＣＴＧ  ＧＣＣ−３’（配列番号８４）に結合するγ−グロブリンを標的とするタンパク質ｇｇ１の構築を報告した［４０］。このタンパク質はＤＮａｓｅ  Ｉフットプリント法及びクロマチン免疫沈殿法により、標的とする配列にｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで結合することが明らかにされており、このタンパク質に基づく転写因子は内在遺伝子の強力な調節因子であった。これらの２例は、ここで選択されたドメインが、本発明者等が報告してきた種々の他のドメインと容易に結合することを示している。
【０１６２】
考察
Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２のジンクフィンガードメインは、内在遺伝子を標的により調節する用途の広いツールであることが明らかになっており、より近年では、相同遺伝子組換えを介する遺伝子修復を容易にするヌクレアーゼ標的ドメインとして知られている。ジンクフィンガーによる３ｂｐのＤＮＡ配列の認識は、α−ヘリックスの−１位、３位及び６位のアミノ酸残基と、３’、中央及び５’ヌクレオチドとのそれぞれの相互作用により主に達成されるが、ヘリックス内の他の部位におけるアミノ酸は微細な特異性の要素を提供する鍵を握っている。α−ヘリックスの２位は他のヘリックス残基と相互作用し、更に３ｂｐサブサイトの外側のヌクレオチドと接触することができる［１１、１２、４１］。この標的部位の重複は、転写因子を作製するモジュール法の限界であるが、α認識ヘリックスの２位がＡｓｐである場合、この影響はドメイン間の相互作用に対してのみに制限されると考えられる［４１、４２］。
【０１６３】
本試験で本発明者等は、３フィンガータンパク質Ｃ７．ＧＡＴに基づくファージディスプレイライブラリーからの選択による、５’−ＣＮＮ−３’サブサイトに結合するジンクフィンガードメインの産生並びに、理論設計による洗練化及び／又は作製を説明する。このＣ７．ＧＡＴライブラリーは、２位にＡｓｐを含有しないフィンガー３で構築して、５’アデニン又は５’シトシンを含有するフィンガー２サブサイトを認識するジンクフィンガードメインの選択を可能にした。このライブラリーからの５’−ＣＮＮ−３’型ＤＮＡ配列に結合するドメインのファージディスプレイの選択は、５’−ＡＮＮ−３’ドメインの選択ほど成功しなかった［１５］。５’ピリミジン（シトシン又はチミン）を含有する標的部位の選択は、ピリミジンが認識ヘリックスの側鎖に到達しにくく、水素結合の機会をそれほど提供しないことから、より困難であると考えられる。
【０１６４】
１６個の考え得る５’−ＣＮＮ−３’標的部位の内の８個を特異的に認識するジンクフィンガードメインを、ファージディスプレイから選択した（図２）。これらは、標的部位５’−ＣＣＣ−３’、５’−ＣＧＣ−３’、５’−ＣＧＴ−３’、５’−ＣＴＡ−３’、及び５’−ＣＴＧ−３’（図３ｂ、ｆ、ｈ、ｊ及びｋ）との優れたＤＮＡ結合特異性を有する５個のドメイン及び、５’−ＣＡＧ−３’、５’−ＣＣＧ−３’及び５’−ＣＧＧ−３’（図３ａ、ｄ及びｇ）と良好な特異性で結合する３個のドメインを含んでいた。標的部位５’−ＣＡＧ−３’、５’−ＣＣＧ−３’、５’−ＣＧＡ−３’及び５’−ＣＴＡ−３’に対するＤＮＡ結合特異性は、ファージディスプレイで得られたアミノ酸配列に理論設計を適用することによって改良された（図３ｎ、ｑ、ｓ及びｕ）。標的部位５’−ＣＡＡ−３’、５’−ＣＡＣ−３’、５’−ＣＡＴ−３’、５’−ＣＣＡ−３’、５’−ＣＣＴ−３’及び５’−ＣＴＴ−３’の場合は、妥当から優れたＤＮＡ結合特異性を有するジンクフィンガードメインが、新規の設計により得られた（図３ｌ、ｍ、ｏ、ｐ、ｒ及びｖ）。広範な解析を行ったが、特異性をもって５’−ＣＴＣ−３’を認識するジンクフィンガードメインを同定することはできなかった。最も適当なジンクフィンガードメイン及びその認識部位を表３に要約する。
【０１６５】
【表３】
2009504156.tif 000005
本発明者等の選択の中には非特異的なジンクフィンガーも認められた。多くの標的部位５’−ＣＡＡ−３’、５’−ＣＡＣ−３’、５’−ＣＡＴ−３’、５’−ＣＣＡ−３’、５’−ＣＣＴ−３’、５’−ＣＴＣ−３’及び５’−ＣＴＴ−３’に対する選択の中で同じ３個のヘリックスＱＲＨ−Ｈ−ＬＶＥ（配列番号８５）、ＳＰＧ−Ｈ−ＬＩＥ（配列番号８６）及びＳＣＳ−Ｈ−ＬＡＥ（配列番号８７）が得られた（図２）。これらのヘリックスにおいては、特異的な標的部位が全く同定されなかった。この３個のヘリックスは、親和性は高いが特異性は低い状態でＤＮＡと結合すると考えられる。
【０１６６】
一般的に、ジンクフィンガードメインによる５’−ＣＮＮ−３’サブサイトの中央及び３’のヌクレオチドの認識に関しては、過去の知見と合致した［１３−１５］。中央のアデニン（５’−ＣＡＮ−３’）は、主に３位のＡｓｎによって認識されるが、例外は５’−ＣＡＣ−３’（ＳＫＫ−Ａ−ＬＴＥ（配列番号７７）（図３ｍ））であった。中央のグアニンは３位のＨｉｓによって認識されるが、例外は５’−ＣＧＴ−３’（ＳＲＲ−Ｔ−ＣＲＡ（配列番号１８）（図３ｈ））であり、中央のチミンは３位のＳｅｒ又はＡｌａの何れかによって認識された。興味深いことに、中央のシトシンの認識は、過去に報告されたように３位のＴｈｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕによっては達成されず、Ｓｅｒ又はＨｉｓによって達成された（例外は５’−ＣＣＧ−３’、ＲＮＤ−Ｔ−ＬＴＥ（配列番号７３）（図３ｑ））。標的の３’ヌクレオチドの認識は、−１位のアミノ酸によって媒介された：３’アデニンはＧｌｎによって（例外は５’−ＣＣＡ−３’、ＴＳＨ−Ｓ−ＬＴＥ（配列番号８０）（図３ｐ））、３’グアニンはＡｒｇによって、及び３’チミンはＴｈｒ又はＳｅｒによって認識された。３’シトシンを認識するドメインでは、−１位に稀なアミノ酸残基、例えばＡｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＨｉｓが認められた。以前には、Ａｓｐ及びＧｌｕのみが３’シトシンの特異的な認識を媒介するとされていた［１３〜１５］。
【０１６７】
選択されたジンクフィンガードメインの多くが、α認識ヘリックスの６位にＧｌｕを有していた（図２）。このＧｌｕが５’シトシンの認識を媒介すると仮定したいところであるが、選択されたヘリックスのＤＮＡ結合特異性の解析により、シトシンの認識はより複雑で、ヘリックスの他の配位に依存することが明らかとなった。６位にＧｌｕを有する８個のドメインにおいては５’シトシンの優れた識別力が認められたが（図３ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、ｈ、ｉ、ｊ及びｋ）、ＲＳＤ−Ｈ−ＬＴＥ（配列番号１４）（図３ｇ）は例外であった。５位及び６位で最も多く選択されたモチーフは、ＴＥであった。このモチーフをジンクフィンガードメインの理論設計に使用した場合、そのドメインは５’シトシンの優れた識別力を示したが（図３ｌ−ｖ）、例外はＱＳＧ−Ｎ−ＬＴＥ（配列番号２）及びＲＳＤ−Ｋ−ＬＴＥ（配列番号７４）（図３ｓ、ｔ）であった。
【０１６８】
分子モデリングを実施して、ジンクフィンガー認識ヘリックスにおける変化がどのようにして観察されたＤＮＡ結合特異性を生じさせるのかについての知見を深めた。主要な興味は、６位のＧｌｕがどのようにして５’シトシンの認識を媒介するのかであった。５’−ＣＧＧ−３’（図３ｇ）を認識したへリックスＲＳＤ−Ｈ−ＬＴＥ（配列番号１４）を、その特徴が明らかにされているＺｉｆ２６８タンパク質ＲＳＤ−Ｈ−ＬＴＴ（配列番号４５）（図６Ａ）のフィンガー２の配列の相似性を利用して、モデル化した（図６Ｂ）。そのオペレーターＤＮＡに結合したＺｉｆ２６８の構造［１１］は、本試験に関連した幾つかのアミノ酸と塩基との相互作用を明らかにした。Ｚｉｆ２６８構造におけるフィンガー２サブサイトは５’−ＴＧＧ−３’である。３’グアニンの認識は、−１位のＡｒｇからの２個の水素結合によって達成された。Ａｒｇ側鎖は、２位のＡｓｐへの２個のつっかい効果を有する（ｂｕｔｔｒｅｓｓｉｎｇ）水素結合によって、構造的に束縛された。中央グアニンの認識は、３位のＨｉｓからの１個の水素結合によって達成された。このＨｉｓは５’チミンに連結し、この相互作用がＨｉｓの構造的フレキシビリティーを制限し、それによって中央グアニンに対する特異性が高まるものと考えられた。６位のＴｈｒは５チミンと水素結合をなさなかった。５’チミンへの特異性は、３位のＨｉｓとチミンとの連結による相互作用及び反対側の鎖のアデニンと隣接するフィンガー３認識ヘリックスの２位のＡｓｐとの水素結合によって達成された（図６Ａには示さず）。この標的部位の重複については上で考察した。図６では、選択された酸素（赤色）、窒素（青色）及びリン（紫色）原子を明晰性のためカラーで示す。緑色の点線は、示唆される水素結合を示す。各ヘリックスの配列、ＤＮＡサブサイト及び考え得る相互作用を各モデルの下に要約する。緑色の線は水素結合を示す。矢印は水素受容体を示す。Ａ、Ｚｉｆ２６８のフィンガー２；Ｂ、ｐＣＧＧ（図３ｇ）；Ｃ、ｐｍＣＡＧ（図３ｎ）。
【０１６９】
フィンガー２ヘリックスＲＳＤ−Ｈ−ＬＴＥ（配列番号１４）が、Ｚｉｆ２６８フィンガー２ヘリックスＲＳＤ−Ｈ−ＬＴＴ（配列番号４５）が５’−ＴＧＧ−３’に結合するのとほぼ同じ方法で５’−ＣＧＧ−３’に結合すると予測するのは、先験的には妥当であると考えられる。Ｚｉｆ２６８の配位上で適切なアミノ酸及び塩基を置換することにより、図６Ｂに示すＲＳＤ−Ｈ−ＬＴＥ（配列番号１４）のモデルが得られた。このモデルは、５’シトシンのＮ４の水素結合距離（３±０．５Å）内の６位でＧｌｕのε酸素を有し、この塩基へのＧｌｕの特異性についての妥当な説明を提供する。但し、マルチターゲットＥＬＩＳＡデータは、ＲＳＤ−Ｈ−ＬＴＥ（配列番号１４）が実際には５’シトシンよりも５’アデニンに優先的に結合することを示した（図３ｇ）。ＲＳＤ−Ｈ−ＬＴＥ（配列番号１４）による５’シトシンへの特異性の低さの理由として考えられるのは、Ｚｉｆ２６８のフィンガー２で認められるＨｉｓ−５’チミンの相互作用に類似した、３位のＨｉｓと５’シトシンとの連結による相互作用である。このような相互作用により、５’シトシンは６位のＧｌｕと水素結合しにくいように位置付けられると思われる。ファージ選択データも、Ｈｉｓと５’シトシンとの間に相互作用が存在する可能性を支持している（図２）。Ｈｉｓは、５’−ＣＧＮ−３’を標的とする選択されたジンクフィンガードメインの５６％において３位に現れ、これは中央グアニンの認識におけるその確立された役割によるものと考えられた。但し、Ｈｉｓは、５’−ＣＮＡ−３’（５’−ＣＴＡ−３’を除く）、５’−ＣＮＣ−３’及び５’−ＣＮＴ−３’に結合するドメインの大半を含めた、全体例の５１％（８２配列中４２配列）にも現れた（図２）。このため、標的部位における５’シトシンの存在は、３位の残基としてのＨｉｓの選択を偏らせてきた可能性がある。認識ヘリックスの他の配位も、５’ヌクレオチドへの特異性に影響を与えている可能性がある。ＱＳＧ−Ｈ−ＬＴＥ（配列番号７５）は低い５’特異性を示したが（図３ｓ）、ＳＫＫ−Ｈ−ＬＡＥ（配列番号６３）及びＨＴＧ−Ｈ−ＬＬＥ（配列番号６６）は何れも５’シトシンに強い特異性を示した（図３ｂ及び３ｆ）。残念なことに、このようなヘリックスに基づくモデルは何れも、関連配列の構造データが十分ではないため、極めて推測的なものにとどまる。
【０１７０】
検討すべき第二の興味深い事例は、５’−ＣＡＧ−３’を認識するＲＡＤ−Ｎ−ＬＴＥ（配列番号７２）である（図６Ｃ）。このヘリックスとＲＳＤ−Ｈ−ＬＴＥ（配列番号１４）との主要な差は、３位のＡｓｎである。このヘリックスは５’シトシンに対する優れた特異性を示す（図３ｎ）。５’特異性の根拠を調べるため、適切なアミノ酸及び塩基を、Ｚｉｆ２６８のフィンガー２の構造の配位に置換した。これらの単純な置換により、３位ＡｓｎのδＯ及びδＮは、アデニンのＮ６及びＮ７を遥かに超える水素結合距離（≫４．５Å）を持つに至った。しかし、過去の構造データ並びにこのドメインの中央アデニンに対する優れた特異性は、水素結合が存在しなくてはならないことを示唆している。原則として、これはアデニンの再配置又はＡｓｐをＤＮＡに近付けるα認識ヘリックスの回転によって達成される。何れの構造的変化も、５’−ＡＡＧ−３’に結合するタンパク質Ｔｒａｍｔｒａｋ、ＲＫＤ−Ｎ−ＭＴＡ（配列番号８８）のフィンガー２の構造において認められる［２１］。この構造的変化は又、６位のＧｌｎを５’シトシンに近付け、観察された５’シトシンへの優れた特異性を生じさせる相互作用を容易にしている可能性がある。但し、Ｔｒａｍｔｒａｋタンパク質のフィンガー２の６位のＡｌａが標的の５’塩基と接触することはなく、Ｔｒａｍｔｒａｋヘリックスの配位上でのモデル化ＲＡＤ−Ｎ−ＬＴＥ（配列番号７２）は更なる知見を殆ど提供するものではなかったことには留意する必要がある（データなし）。
【０１７１】
既存の構造データが不足していることから、本試験で説明したジンクフィンガーヘリックスの多くによる５’シトシンの特異性は、コンピュータモデリングによって容易に解釈することはできない。５’アデニン、チミン又はシトシンの認識が合理的に解釈できる構造においては、特異性は標的部位の重複の結果生じるものであった［１１，４２］。本試験では全てのタンパク質に共通のフィンガー３が存在していたが、５’シトシン認識は変化しやすいことから、本発明者等は本試験で使用したフィンガー３ヘリックスから標的部位重複による相互作用が生じることはないと考える。ＤＮＡ塩基の配置に関与するパラメータ及びα−ヘリックスのＤＮＡに対する連結方向を理解するには、より多くの構造試験が必要であることは明らかである。
【０１７２】
本明細書に記載のジンクフィンガードメインの５’−ＣＮＮ−３’標的部位に対する特異性を生じさせる分子的相互作用をより詳しく理解するには至っていないものの、人工転写因子におけるその利用を示してきた。本発明者等は、ＥＲＢＢ−２遺伝子の５’ＵＴＲ内の１８ｂｐ配列５’−ＣＧＧ−ＧＧＧ−ＧＣＴ−ＣＣＣ−ＣＴＧ−ＧＴＴ−３’（配列番号８３）を標的とする、３個の５’−ＣＮＮ−３’認識ヘリックスを含有する６フィンガータンパク質ｐＥ２Ｓを構築した。ＤＮａｓｅ  Ｉフットプリント解析結果が示す通り、この１８ｂｐ認識部位へのｐＥ２Ｓの結合は特異的であった（図４）。更に、本発明者等は、ｐＥ２Ｓが、活性化領域ＶＰ６４又は抑制領域ＫＲＡＢに融合すると、内在ＥＲＢＢ−２遺伝子をそれぞれアップ及びダウンレギュレートすることができることを明らかにした（図５）。また最近、本発明者等は、鎌状赤血球貧血を処置することを目的とした戦略における、γ−グロブリン遺伝子をアップレギュレートするべく設計された転写因子を報告した［４０］。この報告では、５’−ＣＴＧ−３’ドメインが５’−ＡＮＮ−３’及び５’−ＧＮＮ−３’と共に組み込まれた配列５’−ＧＴＣ  ＡＡＧ  ＧＣＡ  ＡＧＧ  ＣＴＧ  ＧＣＣ−３’（配列番号８４）に結合すべく、転写因子ｇｇ１を設計した。この転写因子は又、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで高い親和性及び特異性でその標的部位に結合し、内在遺伝子を調節することが明らかになった。
【０１７３】
要約すれば、本明細書に記載の５’−ＣＮＮ−３’  ＤＮＡサブサイトを認識するジンクフィンガードメインは、人工転写因子を迅速に構築するのに好適である。これらの１５個の５’−ＣＮＮ−３’ジンクフィンガードメインが、本発明者等が過去に開発した１６個の５’−ＧＮＮ−３’、１４個の５’−ＡＮＮ−３’及び２個の５’−ＴＮＮ−３’ドメインを増大させ、５’−［（Ｇ／Ａ／Ｃ）ＮＮ］６−３’に結合する１００億を超えるタンパク質の迅速な構築を共に可能にする。この種の部位は、ランダム配列において約６ヌクレオチドに１回の頻度で出現する。このため、本明細書に開示する予め規定したドメインは、人工転写因子及びヌクレアーゼによって迅速に標的されることのできるＤＮＡ配列の数を著明に増加させる。
【０１７４】
実施例１３の参照文献
便宜上、実施例１３の参照文献を示し、番号順に列挙する。これらの参照文献は、参考として本明細書で援用される。
参考文献
【０１７５】
【数１】
2009504156.tif 000006
【０１７６】
【数２】
2009504156.tif 000007
【０１７７】
【数３】
2009504156.tif 000008
実施例１４
更なるジンクフィンガーの構築
種々の骨格を使用して、実施例１３の通り、更なるジンクフィンガーを構築した。
【０１７８】
１．  ＴＳＧ−Ｎ−ＬＴＥ（配列番号７８）
ＴＳＧ−Ｎ−ＬＴＥ（配列番号７８）を使用したジンクフィンガーをＺｉｆ２６８骨格で構築した。その結合能を、実施例１３の通り、ＥＬＩＳＡによる粗融解生成物を使用して解析した。このジンクフィンガーはＣＡＴ及びＣＴＴに結合し、親和性はＣＡＴの方が高かった。
【０１７９】
又、ＴＳＧ−Ｎ−ＬＴＥ（配列番号７８）を使用したジンクフィンガーをＳＰ１Ｃ骨格で構築した。その結合能を、ＥＬＩＳＡによる粗融解生成物を使用して解析した。このジンクフィンガーはＣＡＴと結合した。
【０１８０】
２．  ＴＫＮ−Ｓ−ＬＴＥ（配列番号８１）
ＴＫＮ−Ｓ−ＬＴＥ（配列番号８１）を使用した別のジンクフィンガーをＳＰ１Ｃ骨格で構築した。その結合能を、ＥＬＩＳＡによる粗融解生成物を使用して解析した。このジンクフィンガーはＣＣＴと結合した。
【０１８１】
３．  ＱＮＳ−Ｔ−ＬＴＥ（配列番号７９）
ＱＮＳ−Ｔ−ＬＴＥ（配列番号７９）を使用したジンクフィンガーをＺｉｆ２６８骨格で構築した。その結合能を、ＥＬＩＳＡによる粗融解生成物を使用して解析した。このジンクフィンガーは高い特異性でＣＴＡに結合した。
【０１８２】
４．  ＮＬＱ−Ｈ−ＬＧＥ（配列番号３）
ＮＬＱ−Ｈ−ＬＧＥ（配列番号３）を使用したジンクフィンガーをＺｉｆ２６８骨格で構築した。その結合能を、ＥＬＩＳＡによる粗融解生成物を使用して解析した。このジンクフィンガーはＣＡＣ及びＣＡＴと結合し、若干の交差反応性が認められた。
【０１８３】
５．  ＱＳＧ−Ｎ−ＬＴＥ（配列番号２）
ＱＳＧ−Ｎ−ＬＴＥ（配列番号２）を使用したジンクフィンガーをＺｉｆ２６８骨格で構築した。その結合能を、ＥＬＩＳＡによる粗融解生成物を使用して解析した。このジンクフィンガーはＣＡＣ及びＣＡＴと結合し、若干の交差反応性が認められた。
【０１８４】
６．  ＱＲＨ−Ｎ−ＬＴＥ（配列番号１）
ＱＲＨ−Ｎ−ＬＴＥ（配列番号１）を使用したジンクフィンガーをＺｉｆ２６８骨格で構築した。その結合能を、ＥＬＩＳＡによる粗融解生成物を使用して解析した。このジンクフィンガーは可能なＣＮＮトリプレットの１４個と結合したが、ＣＴＧ及びＣＴＴには殆ど結合しなかった。
【０１８５】
７．  ＲＮＤ−Ｔ−ＬＴＥ（配列番号８）
ＲＮＤ−Ｔ−ＬＴＥ（配列番号８）を使用したジンクフィンガーをＺｉｆ２６８骨格で構築した。その結合能を、ＥＬＩＳＡによる粗融解生成物を使用して解析した。このジンクフィンガーはＣＡＧ、ＣＣＧ、ＣＧＧ及びＣＴＧと結合した。
【０１８６】
８．  ＲＮＤ−Ｔ−ＬＱＡ（配列番号６２）
ＲＮＤ−Ｔ−ＬＱＡ（配列番号６２）を使用したジンクフィンガーをＺｉｆ２６８骨格で構築した。その結合能を、ＥＬＩＳＡによる粗融解生成物を使用して解析した。このジンクフィンガーはＣＣＧと高い特異性で結合した。
【０１８７】
９．  ＱＬＡ−Ｈ−ＬＫＥ（配列番号１１）
ＱＬＡ−Ｈ−ＬＫＥ（配列番号１１）を使用したジンクフィンガーをＺｉｆ２６８骨格で構築した。その結合能を、ＥＬＩＳＡによる粗融解生成物を使用して解析した。このジンクフィンガーはＣＡＴ及びＣＧＡと結合したが、ＣＴＴを除く他のトリプレットの大半と交叉反応を起こした。
【０１８８】
１０．  ＱＳＧ−Ｈ−ＬＴＥ（配列番号１０）
ＱＳＧ−Ｈ−ＬＴＥ（配列番号１０）を使用したジンクフィンガーをＺｉｆ２６８骨格で構築した。その結合能を、ＥＬＩＳＡによる粗融解生成物を使用して解析した。このジンクフィンガーはＣＡＧ及びＣＧＡと結合したが、その他のトリプレットの大半と交叉反応を起こした。
【０１８９】
ＱＳＧ−Ｈ−ＬＴＥ（配列番号１０）を使用した別のジンクフィンガーをＳＰ１Ｃ骨格で構築した。その結合能を、ＥＬＩＳＡによる粗融解生成物を使用して解析した。このジンクフィンガーはＣＧＴを除くトリプレットの大半と結合した。
【０１９０】
１１．  ＲＡＤ−Ｎ−ＬＴＥ（配列番号４）
ＲＡＤ−Ｎ−ＬＴＥ（配列番号４）を使用したジンクフィンガーをＺｉｆ２６８骨格で構築した。その結合能を、ＥＬＩＳＡによる粗融解生成物を使用して解析した。このジンクフィンガーは高い特異性でＣＡＧと結合した。
【０１９１】
ＲＡＤ−Ｎ−ＬＴＥ（配列番号４）を使用した別のジンクフィンガーをＳＰ１Ｃ骨格で構築した。その結合能を、ＥＬＩＳＡによる粗融解生成物を使用して解析した。このジンクフィンガーはＣＡＧ、ＣＧＧ及びＣＧＧと結合した。
【０１９２】
１２．  ＴＳＨ−Ｓ−ＴＬＥ（配列番号８０）
ＴＳＨ−Ｓ−ＴＬＥ（配列番号８０）を使用したジンクフィンガーをＺｉｆ２６８骨格で構築した。その結合能を、ＥＬＩＳＡによる粗融解生成物を使用して解析した。このジンクフィンガーはＣＴＡと結合したが、若干の交差反応性が認められた。
【０１９３】
ＴＳＨ−Ｓ−ＴＬＥ（配列番号８０）を使用した別のジンクフィンガーをＳＰ１Ｃ骨格で構築した。その結合能を、ＥＬＩＳＡによる粗融解生成物を使用して解析した。このジンクフィンガーは極めて高い特異性でＣＣＡと結合した。
【０１９４】
１３．  ＮＬＱ−Ｎ−ＬＧＥ（配列番号１３４）
ＮＬＱ−Ｎ−ＬＧＥ（配列番号１３４）を使用したジンクフィンガーをＳＰ１Ｃ骨格で構築した。その結合能を、ＥＬＩＳＡによる粗融解生成物を使用して解析した。このジンクフィンガーは極めて高い特異性でＣＣＴと結合した。
【０１９５】
１４．  ＱＳＧ−Ｈ−ＣＲＡ（配列番号１３５）
ＱＳＧ−Ｈ−ＣＲＡ（配列番号１３５）を使用したジンクフィンガーをＳＰ１Ｃ骨格で構築した。その結合能を、ＥＬＩＳＡによる粗融解生成物を使用して解析した。このジンクフィンガーは極めて高い交差反応性と共にＣＧＡと結合した。即ち、５’ヌクレオチドの認識は不良であった。
【０１９６】
１５．  ＲＳＤ−Ｋ−ＣＲＡ（配列番号１３６）
ＲＳＤ−Ｋ−ＣＲＡ（配列番号１３６）を使用したジンクフィンガーをＳＰ１Ｃ骨格で構築した。その結合能を、ＥＬＩＳＡによる粗融解生成物を使用して解析した。このジンクフィンガーはＣＧＧと結合した。即ち、５’ヌクレオチドの認識は不良であった。
【０１９７】
１６．  ＨＫＮ−Ａ−ＣＲＡ（配列番号１３７）
ＨＫＮ−Ａ−ＣＲＡ（配列番号１３７）を使用したジンクフィンガーをＳＰ１Ｃ骨格で構築した。その結合能を、ＥＬＩＳＡによる粗融解生成物を使用して解析した。このジンクフィンガーは１６個のトリプレット全てと結合した。
【０１９８】
１７．  ＴＳＧ−Ａ−ＬＴＥ（配列番号１３８）
ＴＳＧ−Ａ−ＬＴＥ（配列番号１３８）を使用したジンクフィンガーをＳＰ１Ｃ骨格で構築した。その結合能を、ＥＬＩＳＡによる部分的に精製した融解生成物（１：８）を使用して解析した。このジンクフィンガーはＣＴＴと結合したが、若干の交差反応性が認められた。
【０１９９】
１８．  ＴＳＧ−Ｔ−ＬＴＥ（配列番号１３９）
ＴＳＧ−Ｔ−ＬＴＥ（配列番号１３９）を使用したジンクフィンガーをＳＰ１Ｃ骨格で構築した。その結合能を、ＥＬＩＳＡによる部分的に精製した融解生成物（１：８）を使用して解析した。このジンクフィンガーはＣＡＣ、ＣＴＣ及びＣＴＴと結合した。
【０２００】
１９．  ＴＴＧ−Ａ−ＬＴＥ（配列番号８２）
ＴＴＧ−Ａ−ＬＴＥ（配列番号８２）を使用したジンクフィンガーをＳＰ１Ｃ骨格で構築した。その結合能を、ＥＬＩＳＡによる部分的に精製した融解生成物（１：８）を使用して解析した。このジンクフィンガーはＣＴＴと結合したが、若干の交差反応性が認められた。
【０２０１】
２０．  ＴＴＧ−Ｇ−ＬＴＥ（配列番号１４０）
ＴＴＧ−Ｇ−ＬＴＥ（配列番号１４０）を使用したジンクフィンガーをＳＰ１Ｃ骨格で構築した。その結合能を、ＥＬＩＳＡによる部分的に精製した融解生成物（１：８）を使用して解析した。このジンクフィンガーはＣＡＣ、ＣＴＣ及びＣＴＴを除くトリプレットの大半と結合した。
【０２０２】
２１．  ＤＣＲ−Ｔ−ＬＡＥ（配列番号１４１）
ＤＣＲ−Ｔ−ＬＡＥ（配列番号１４１）を使用したジンクフィンガーをＳＰ１Ｃ骨格で構築した。その結合能を、ＥＬＩＳＡによる部分的に精製した融解生成物（１：８）を使用して解析した。このジンクフィンガーはＣＴＴと結合した。
【０２０３】
２２．  ＤＣＲ−Ａ−ＬＴＥ（配列番号１４２）
ＤＣＲ−Ａ−ＬＴＥ（配列番号１４２）を使用したジンクフィンガーをＳＰ１Ｃ骨格で構築した。その結合能を、ＥＬＩＳＡによる部分的に精製した融解生成物（１：８）を使用して解析した。このジンクフィンガーはＣＡＣ、ＣＴＣ及びＣＴＴを除くトリプレットの大半と結合した。
【０２０４】
２３．  ＤＣＲ−Ｔ−ＬＴＥ（配列番号１４３）
ＤＣＲ−Ｔ−ＬＴＥ（配列番号１４３）を使用したジンクフィンガーをＳＰ１Ｃ骨格で構築した。その結合能を、ＥＬＩＳＡによる部分的に精製した融解生成物（１：８）を使用して解析した。このジンクフィンガーはＣＡＣ、ＣＴＣ及びＣＴＴを除くトリプレットの大半と結合した。
【０２０５】
２４．  ＳＣＲ−Ｔ−ＬＡＥ（配列番号１４４）
ＳＣＲ−Ｔ−ＬＡＥ（配列番号１４４）を使用したジンクフィンガーをＳＰ１Ｃ骨格で構築した。その結合能を、ＥＬＩＳＡによる部分的に精製した融解生成物（１：８）を使用して解析した。このジンクフィンガーはＣＡＣ、ＣＴＣ及びＣＴＴを除くトリプレットの大半と結合した。
【０２０６】
２５．  ＳＣＲ−Ａ−ＬＴＥ（配列番号１４５）
ＳＣＲ−Ａ−ＬＴＥ（配列番号１４５）を使用したジンクフィンガーをＳＰ１Ｃ骨格で構築した。その結合能を、ＥＬＩＳＡによる部分的に精製した融解生成物（１：８）を使用して解析した。このジンクフィンガーはＣＡＣ、ＣＴＣ及びＣＴＴを除くトリプレットの大半と結合した。但し、ＣＣＴ及びＣＧＣに対しては若干の特異性が認められた。
【０２０７】
２６．  ＳＣＲ−Ｔ−ＬＴＥ（配列番号１４６）
ＳＣＲ−Ｔ−ＬＴＥ（配列番号１４６）を使用したジンクフィンガーをＳＰ１Ｃ骨格で構築した。その結合能を、ＥＬＩＳＡによる部分的に精製した融解生成物（１：８）を使用して解析した。このジンクフィンガーはＣＣＴと結合したが、若干の交差反応性が認められた。
【０２０８】
２７．  ＤＫＫ−Ａ−ＬＡＥ（配列番号１４７）
ＤＫＫ−Ａ−ＬＡＥ（配列番号１４７）を使用したジンクフィンガーをＳＰ１Ｃ骨格で構築した。その結合能を、ＥＬＩＳＡによる部分的に精製した融解生成物（１：８）を使用して解析した。このジンクフィンガーはＣＡＣ、ＣＴＣ及びＣＴＴを除くトリプレットの大半と結合した。
【０２０９】
２８．  ＤＫＫ−Ｔ−ＬＡＥ（配列番号１４８）
ＤＫＫ−Ｔ−ＬＡＥ（配列番号１４８）を使用したジンクフィンガーをＳＰ１Ｃ骨格で構築した。その結合能を、ＥＬＩＳＡによる部分的に精製した融解生成物（１：８）を使用して解析した。このジンクフィンガーはＣＡＣ、ＣＴＣ及びＣＴＴを除くトリプレットの大半と結合した。
【０２１０】
２９．  ＤＫＫ−Ａ−ＬＴＥ（配列番号１４９）
ＤＫＫ−Ａ−ＬＴＥ（配列番号１４９）を使用したジンクフィンガーをＳＰ１Ｃ骨格で構築した。その結合能を、ＥＬＩＳＡによる部分的に精製した融解生成物（１：８）を使用して解析した。このジンクフィンガーはＣＡＣ、ＣＴＣ及びＣＴＴを除くトリプレットの大半と結合した。
【０２１１】
３０．  ＤＫＫ−Ｔ−ＬＴＥ（配列番号１５０）
ＤＫＫ−Ｔ−ＬＴＥ（配列番号１５０）を使用したジンクフィンガーをＳＰ１Ｃ骨格で構築した。その結合能を、ＥＬＩＳＡによる部分的に精製した融解生成物（１：８）を使用して解析した。このジンクフィンガーはＣＡＣ及びＣＣＣと結合したが、若干の交差反応性が認められた。
【０２１２】
３１．  ＳＫＫ−Ａ−ＬＡＥ（配列番号１５１）
ＳＫＫ−Ａ−ＬＡＥ（配列番号１５１）を使用したジンクフィンガーをＳＰ１Ｃ骨格で構築した。その結合能を、ＥＬＩＳＡによる部分的に精製した融解生成物（１：８）を使用して解析した。このジンクフィンガーはＣＡＣ、ＣＴＣ及びＣＴＴを除くトリプレットの大半と結合した。
【０２１３】
３２．  ＳＫＫ−Ｔ−ＬＡＥ（配列番号１５２）
ＳＫＫ−Ｔ−ＬＡＥ（配列番号１５２）を使用したジンクフィンガーをＳＰ１Ｃ骨格で構築した。その結合能を、ＥＬＩＳＡによる部分的に精製した融解生成物（１：８）を使用して解析した。このジンクフィンガーはＣＡＣ、ＣＴＣ及びＣＴＴを除くトリプレットの大半と結合した。
【０２１４】
３３．  ＳＫＫ−Ａ−ＬＴＥ（配列番号７７）
ＳＫＫ−Ａ−ＬＴＥ（配列番号７７）を使用したジンクフィンガーをＳＰ１Ｃ骨格で構築した。その結合能を、ＥＬＩＳＡによる部分的に精製した融解生成物（１：８）を使用して解析した。このジンクフィンガーはＣＡＣと結合した。
【０２１５】
３４．  ＳＫＫ−Ｔ−ＬＴＥ（配列番号１５３）
ＳＫＫ−Ｔ−ＬＴＥ（配列番号１５３）を使用したジンクフィンガーをＳＰ１Ｃ骨格で構築した。その結合能を、ＥＬＩＳＡによる部分的に精製した融解生成物（１：８）を使用して解析した。このジンクフィンガーはＣＡＣと結合した。
【０２１６】
３５．  ＨＴＧ−Ａ−ＬＬＥ（配列番号１５４）
ＨＴＧ−Ａ−ＬＬＥ（配列番号１５４）を使用したジンクフィンガーをＳＰ１Ｃ骨格で構築した。その結合能を、ＥＬＩＳＡによる部分的に精製した融解生成物（１：８）を使用して解析した。このジンクフィンガーはＣＡＣ、ＣＴＣ及びＣＴＴを除くトリプレットの大半と結合した。
【０２１７】
３６．  ＨＴＧ−Ｎ−ＬＬＥ（配列番号１５５）
ＨＴＧ−Ｎ−ＬＬＥ（配列番号１５５）を使用したジンクフィンガーをＳＰ１Ｃ骨格で構築した。その結合能を、ＥＬＩＳＡによる部分的に精製した融解生成物（１：８）を使用して解析した。このジンクフィンガーはＣＡＣ、ＣＴＣ及びＣＴＴを除くトリプレットの大半と結合した。
【０２１８】
３７．  ＳＫＫ−Ｈ−ＬＡＥ（配列番号７）
ＳＫＫ−Ｈ−ＬＡＥ（配列番号７）を使用したジンクフィンガーをＺｉｆ２６８骨格で構築した。その結合能を、ＥＬＩＳＡによる粗融解生成物を使用して解析した。このジンクフィンガーはＣＣＣと結合した。
【０２１９】
３８．  ＤＰＧ−Ｎ−ＬＶＲ（配列番号１５６）
ＤＰＧ−Ｎ−ＬＶＲ（配列番号１５６）を使用したジンクフィンガーをＳＰ１Ｃ骨格で構築した。その結合能を、ＥＬＩＳＡによる部分的に精製した融解生成物（１：８）を使用して解析した。このジンクフィンガーはＧＡＣと結合した。
【０２２０】
３９．  ＤＳＧ−Ｎ−ＬＶＲ（配列番号１５７）
ＤＳＧ−Ｎ−ＬＶＲ（配列番号１５７）を使用したジンクフィンガーをＳＰ１Ｃ骨格で構築した。その結合能を、ＥＬＩＳＡによる部分的に精製した融解生成物（１：８）を使用して解析した。このジンクフィンガーはＣＡＣ及びＣＡＴと結合した。当初はＡＡＣに対する特異性を有するとされていた。
【０２２１】
【表４】
2009504156.tif 000009
2009504156.tif 000010
2009504156.tif 000011
2009504156.tif 000012
核酸配列のフットプリント
１  ＮはＡ、Ｃ、Ｇ又はＴの何れかである。
２  塩基２６〜２８に相補的な塩基７〜９；塩基２６〜２８はＡ、Ｃ、Ｇ又はＴの何れかである。
３  ＣＮＮヌクレオチドモチーフ（式中、ＮはＡ、Ｃ、Ｇ又はＴである）の２〜１２回の反復を包含する。
４  ＧＮＮヌクレオチドモチーフ（式中、ＮはＡ、Ｃ、Ｇ又はＴである）の２〜６回の反復を包含する。
５  ＡＮＮヌクレオチドモチーフ（式中、ＮはＡ、Ｃ、Ｇ又はＴである）の２〜１２回の反復を包含する。
６  ＴＮＮヌクレオチドモチーフ（式中、ＮはＡ、Ｃ、Ｇ又はＴである）の２〜１２回の反復を包含する。
７  ＴＮＮヌクレオチドモチーフ（式中、ＮはＡ、Ｃ、Ｇ又はＴである）の２〜１２回の反復を包含する。
【０２２２】
発明の利点
本発明は、核酸配列、特にＤＮＡ配列に対して多岐にたって結合するタンパク質を提供する。これらの結合タンパク質は転写修飾因子と結合させることができ、そのため特定の遺伝子を特異的な方法でアップレギュレート又はダウンレギュレートさせるのに使用することができる。このため、これらの結合タンパク質は、癌、自己免疫疾患、代謝性疾患、発達障害及び遺伝子発現の調節異常に起因する他の疾患又は病態を処置する遺伝子療法又はタンパク質療法に使用することができる。
【０２２３】
核酸配列への結合タンパク質、その結合タンパク質をコードする核酸配列、その核酸配列を組み込んだベクター及びそのベクターで形質転換又は形質導入した宿主細胞は、転写の調節異常又は異常な転写パターンの存在を特徴とする疾患又は病態を処置する医薬品の調製のための産業的適用可能性を有する。これらの結合タンパク質、核酸配列、ベクター及び宿主細胞は又、更なるジンクフィンガータンパク質を開発及び単離するためのタンパク質、核酸及び核酸配列の細胞をスクリーニングするための産業的適用可能性を有する。
【０２２４】
値の範囲に関しては、特に明確な記載がない限り、本発明はその範囲の上限及び下限の間の下限の１０分の１単位までの全ての介在値を包含する。更に、本発明は、指定した範囲から特に除外されない限り、その範囲の上限及び下限の何れか又は両方を含むあらゆる他の指定した介在値及び範囲を包含する。
【０２２５】
特に記載のない限り、本明細書で使用した全ての技術的及び化学的用語の意味は、本発明が帰属する業界の当業者によって広く理解されているものとする。当業者は又、本明細書に記載のそれと類似又は等価のあらゆる方法及び材料が本発明を実践又は試験するのに使用することができることを理解する必要がある。
【０２２６】
本明細書で考察した刊行物及び特許は、本出願の出願日以前の開示内容のためにのみ提供される。本発明が先行特許のためにこのような刊行物に先立つ権利が与えられないことに対する許可として解釈されるものは本明細書には何一つない。更に、記載の出版日は実際の出版日と異なることがあり、それらは独自に確認する必要がある。
【０２２７】
引用した刊行物は全て、公開された全ての特許、特許出願、参照文献、並びにこれらの出版文書で援用される刊行物を含め、全体が参考として本明細書で援用される。但し、参考として本明細書で援用された何らかの刊行物で、公開する情報について言及する限り、本出願者等は、本出願の出願日後に公開された何れの当該情報も従来技術であることを認めない。
【０２２８】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される単数形は、複数形を包含する。例えば、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という冠詞は、特に明確な記載がない限り、複数の指示物を包含する。更に、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、その一連の要素全てを指すものとして理解されなければならない。本明細書で例示的に記載された本発明は、本明細書に特に開示されていない何れかの要素、限度がなくても好適に実施することができる。このため、例えば、「含む」「含めた」「含有する」等の用語は、広範に制限なく解釈されるものとする。更に、本明細書で使用される用語及び表現は、制限のためではなく例示のために使用されており、このような用語及び表現を使用するのに、今後示され記載されるあらゆる等価物又はそのあらゆる部分を除外する意図は全くなく、種々の改変は権利請求する本発明の適用範囲内で可能であることが認識される。このため、本発明は望ましい実施例及び至適な特性により特異的に開示されているが、本明細書に開示する本発明の改変及び変更は当業者によって行われることができ、このような改変及び変更は本明細書に開示の本発明の適用範囲内に含まれるとみなされることが理解されるべきである。本発明を本明細書で広汎且つ包括的に説明してきた。その包括的開示内容の適用範囲内に含まれるより狭義の種類及び亜属的集合も、これらの発明の一部を形成する。削除された内容が特異的に本明細書にとどまるかどうかに関係なく、あらゆる内容をこの属から除去するという条件又は否定的限定付きで、これは各発明の包括的説明を含む。更に、発明の特性又は側面をマルクーシュ構造の用語で説明する場合、当業者は本発明もそれによりあらゆる個々のメンバー又はマルクーシュ構造のメンバーの亜群に関して記載されることを認識する必要がある。又、上記の説明は例示を目的とするものであって制限を目的とするものでないことを理解する必要がある。上の記載をレビューする当業者にとっては多くの実施形態が明らかであるはずである。従って、本発明の適用範囲は上の記載を参照して決定されるのでなく、添付の特許請求の範囲、並びにこのような特許請求の範囲に権利が付与される等価物の全範囲によって決定されるべきである。当業者は、通常の実験のみを使用して、記載された本発明の特異的な実施形態との多くの等価物を認識することができ、確認することができるはずである。このような等価物も以下の特許請求の範囲によって網羅される。
【図面の簡単な説明】
【０２２９】
本発明は、明細書、添付の特許請求の範囲及び添付の図面を参照することによってより詳しく理解されるであろう。
【図１−１】図１は、１Ａ及び１Ｂの２つの図で、ジンクフィンガーファージディスプレイライブラリー（Ａ）及びＣ７タンパク質のマルチターゲット特異的ＥＬＩＳＡ（Ｂ）の構築を図式的に示す：（１）５’−（ＣＡＡ）−３’；（２）５’−（ＣＡＣ）−３’；（３）５’−（ＣＡＧ）−３’；（４）５’−（ＣＡＴ）−３’；（５）５’−（ＣＣＡ）−３’；（６）５’−（ＣＣＣ）−３’；（７）５’−（ＣＣＧ）−３’；（８）５’−（ＣＣＴ）−３’；（９）５’−（ＣＧＡ）−３’；（１０）５’−（ＣＧＣ）−３’；（１１）５’−（ＣＧＧ）−３’；（１２）５’−（ＣＧＴ）−３’；（１３）５’−（ＣＴＡ）−３’；（１４）５’−（ＣＴＣ）−３’；（１５）５’−（ＣＴＧ）−３’；（１６）５’−（ＣＴＴ）−３’。
【図１−２】図１は、１Ａ及び１Ｂの２つの図で、ジンクフィンガーファージディスプレイライブラリー（Ａ）及びＣ７タンパク質のマルチターゲット特異的ＥＬＩＳＡ（Ｂ）の構築を図式的に示す。
【図１−３】図１は、１Ａ及び１Ｂの２つの図で、ジンクフィンガーファージディスプレイライブラリー（Ａ）及びＣ７タンパク質のマルチターゲット特異的ＥＬＩＳＡ（Ｂ）の構築を図式的に示す。
【図１−４】図１は、１Ａ及び１Ｂの２つの図で、ジンクフィンガーファージディスプレイライブラリー（Ａ）及びＣ７タンパク質のマルチターゲット特異的ＥＬＩＳＡ（Ｂ）の構築を図式的に示す。
【図１−５】図１は、１Ａ及び１Ｂの２つの図で、ジンクフィンガーファージディスプレイライブラリー（Ａ）及びＣ７タンパク質のマルチターゲット特異的ＥＬＩＳＡ（Ｂ）の構築を図式的に示す。
【図１−６】図１は、１Ａ及び１Ｂの２つの図で、ジンクフィンガーファージディスプレイライブラリー（Ａ）及びＣ７タンパク質のマルチターゲット特異的ＥＬＩＳＡ（Ｂ）の構築を図式的に示す。
【図１−７】図１は、１Ａ及び１Ｂの２つの図で、ジンクフィンガーファージディスプレイライブラリー（Ａ）及びＣ７タンパク質のマルチターゲット特異的ＥＬＩＳＡ（Ｂ）の構築を図式的に示す。
【図１−８】図１は、１Ａ及び１Ｂの２つの図で、ジンクフィンガーファージディスプレイライブラリー（Ａ）及びＣ７タンパク質のマルチターゲット特異的ＥＬＩＳＡ（Ｂ）の構築を図式的に示す。
【図１−９】図１は、１Ａ及び１Ｂの２つの図で、ジンクフィンガーファージディスプレイライブラリー（Ａ）及びＣ７タンパク質のマルチターゲット特異的ＥＬＩＳＡ（Ｂ）の構築を図式的に示す。
【図１−１０】図１は、１Ａ及び１Ｂの２つの図で、ジンクフィンガーファージディスプレイライブラリー（Ａ）及びＣ７タンパク質のマルチターゲット特異的ＥＬＩＳＡ（Ｂ）の構築を図式的に示す。
【図１−１１】図１は、１Ａ及び１Ｂの２つの図で、ジンクフィンガーファージディスプレイライブラリー（Ａ）及びＣ７タンパク質のマルチターゲット特異的ＥＬＩＳＡ（Ｂ）の構築を図式的に示す。
【図１−１２】図１は、１Ａ及び１Ｂの２つの図で、ジンクフィンガーファージディスプレイライブラリー（Ａ）及びＣ７タンパク質のマルチターゲット特異的ＥＬＩＳＡ（Ｂ）の構築を図式的に示す。
【図１−１３】図１は、１Ａ及び１Ｂの２つの図で、ジンクフィンガーファージディスプレイライブラリー（Ａ）及びＣ７タンパク質のマルチターゲット特異的ＥＬＩＳＡ（Ｂ）の構築を図式的に示す。
【図１−１４】図１は、１Ａ及び１Ｂの２つの図で、ジンクフィンガーファージディスプレイライブラリー（Ａ）及びＣ７タンパク質のマルチターゲット特異的ＥＬＩＳＡ（Ｂ）の構築を図式的に示す。
【図１−１５】図１は、１Ａ及び１Ｂの２つの図で、ジンクフィンガーファージディスプレイライブラリー（Ａ）及びＣ７タンパク質のマルチターゲット特異的ＥＬＩＳＡ（Ｂ）の構築を図式的に示す。
【図１−１６】図１は、１Ａ及び１Ｂの２つの図で、ジンクフィンガーファージディスプレイライブラリー（Ａ）及びＣ７タンパク質のマルチターゲット特異的ＥＬＩＳＡ（Ｂ）の構築を図式的に示す。
【図１−１７】図１は、１Ａ及び１Ｂの２つの図で、ジンクフィンガーファージディスプレイライブラリー（Ａ）及びＣ７タンパク質のマルチターゲット特異的ＥＬＩＳＡ（Ｂ）の構築を図式的に示す。
【図２】図２は、選択クローンからのフィンガー２認識ヘリックスのアミノ酸配列を示す。
【図３】図３は、選択されたドメイン及び下記の部位特異的変異から派生したドメインのＤＮＡ結合特性を確認するためのマルチターゲット特異性検定を示すグラフである：（ａ）ＲＡＤ−Ｎ−ＬＡＩ（配列番号５）；（ｂ）ＳＫＫ−Ｈ−ＬＡＥ（配列番号６３）；（ｃ）ＳＶＲ−Ｎ−ＬＲＥ（配列番号６４）；（ｄ）ＲＮＤ−Ｔ−ＬＱＡ（配列番号６２）；（ｅ）ＱＬＡ−Ｈ−ＬＫＥ（配列番号１１）；（ｆ）ＨＴＧ−Ｈ−ＬＬＥ（配列番号６６）；（ｇ）ＲＳＤ−Ｈ−ＬＴＥ（配列番号１４）；（ｈ）ＳＲＲ−Ｔ−ＣＲＡ（配列番号１８）；（ｉ）ＱＬＲ−Ｈ−ＬＲＥ（配列番号６８）；（ｊ）ＱＲＨ−Ｓ−ＬＴＥ（配列番号７０）；（ｋ）ＲＮＤ−Ａ−ＬＴＥ（配列番号７１）；（ｌ）ＱＳＧ−Ｎ−ＬＴＥ（配列番号２）；（ｍ）ＳＫＫ−Ａ−ＬＴＥ（配列番号７７）；（ｎ）ＲＡＤ−Ｎ−ＬＴＥ（配列番号７２）；（ｏ）ＴＳＧ−Ｎ−ＬＴＥ（配列番号７８）；（ｐ）ＴＳＨ−Ｓ−ＬＴＥ（配列番号８０）；（ｑ）ＲＮＤ−Ｔ−ＬＴＥ（配列番号７３）；（ｒ）ＴＫＮ−Ｓ−ＬＴＥ（配列番号８１）；（ｓ）ＱＳＧ−Ｈ−ＬＴＥ（配列番号７５）；（ｔ）ＲＳＤ−Ｋ−ＬＴＥ（配列番号７４）；（ｕ）ＱＮＳ−Ｔ−ＬＴＥ（配列番号７９）；（ｖ）ＴＴＧ−Ａ−ＬＴＥ（配列番号８２）。
【図４】図４は、５’−ＣＮＮ−３’ＤＮＡ配列を認識するドメインを含有する６フィンガータンパク質ｐＥ２ＳのＤＮａｓｅ  Ｉの足跡を示す放射能写真である。
【図５】図５は、内在性遺伝子の発現を調節する本発明に基づく人工転写因子の作用を試験するための、レトロウイルスを使用した遺伝子ターゲティングの結果を示すフローサイトメトリーで得られた一連のグラフである：細線は二次抗体単独での染色を、点線はｍｏｃｋ導入細胞の特異的な染色を、実線は転写因子Ｅ２Ｓ−ＶＰ６４（Ａ）又はＥ２Ｓ−ＫＲＡＢ（Ｂ）を発現する形質導入細胞の特異的な染色を示す。
【図６】図６は、５’−シトシンの認識を示唆するフィンガー２ドメインのコンピュータモデルを示すグラフである。選択された酸素（赤）、窒素（青）及びリン（紫）原子をわかりやすく着色して示す。緑色の点線は、示唆される水素結合を示す。各ヘリックスの配列、ＤＮＡサブサイト及び考え得る相互作用を各モデルの下に要約する。緑色の線は、水素結合を示す。矢印は、水素受容体を示す。Ａ：Ｚｉｆ２６８のフィンガー２；Ｂ：ｐＣＧＧ（図３ｇ）；Ｃ：ｐｍＣＡＧ（図３ｎ）。
【図１Ａ】
2009504156.tif 000013
【図１−２】
2009504156.tif 000014
【図１−３】
2009504156.tif 000015
【図１−４】
2009504156.tif 000016
【図１−５】
2009504156.tif 000017
【図１−６】
2009504156.tif 000018
【図１−７】
2009504156.tif 000019
【図１−８】
2009504156.tif 000020
【図１−９】
2009504156.tif 000021
【図１−１０】
2009504156.tif 000022
【図１−１１】
2009504156.tif 000023
【図１−１２】
2009504156.tif 000024
【図１−１３】
2009504156.tif 000025
【図１−１４】
2009504156.tif 000026
【図１−１５】
2009504156.tif 000027
【図１−１６】
2009504156.tif 000028
【図１−１７】
2009504156.tif 000029
【図２】
2009504156.tif 000030
【図３】
2009504156.tif 000031
【図４】
2009504156.tif 000032
【図５】
2009504156.tif 000033
【図６】
2009504156.tif 000034
【配列表】
2009504156000001.app
【国際調査報告】
2009504156.tif 000035
2009504156.tif 000036
2009504156.tif 000037
2009504156.tif 000038