(57)【要約】  多剤耐性(MDR)は、癌の化学療法において大きな課題である。最も良く確認された耐性機序は、細胞の外に種々の抗癌剤をポンプで送る、薬剤排出輸送体、浸透性-糖タンパク(P-gp)の過剰発現によって仲介されるものであり、細胞内薬剤蓄積が低下することになる。本発明において一連のフラボノイド二量体が開発され、種々の長さのリンカー基が共に結合されている。これらのフラボノイド二量体は、試験管内で抗癌剤の細胞毒性を増強するとともに細胞内薬剤蓄積を劇的に高める効率的なP-gpモジュレータであることことがわかる。本発明のフラボノイド二量体は、また、寄生虫症を治療する際に薬剤耐性を低下させるのに有効である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Iの化合物:
フラボノイド-リンカー-フラボノイド          I
(式中、
・フラボノイドは、カルコン、フラボン、フラボノール、フラバノン、アントシアニン、及びイソフラボノイドからなる群より選ばれ;
・リンカーは、少なくとも一つの炭素原子を有する基である)。
【請求項２】
リンカーが、アルキレン基、複数のエチレングリコール単位を有する基、複数のプロピレングリコール単位を有する基、複数のo-フェニレンジオキシ単位、m-フェニレンジオキシ単位又はp-フェニレンジオキシ単位を有する基、もしくはこれらの組み合わせからなる群より選ばれる、請求項1に記載の化合物。
【請求項３】
リンカーが、複数のエチレングリコール単位を有する基である、請求項2に記載の化合物。
【請求項４】
リンカーが、エチレングリコール単位1〜13個を有する、請求項3に記載の化合物。
【請求項５】
リンカーが、エチレングリコール単位2〜6個を有する、請求項4に記載の化合物。
【請求項６】
リンカーが、エチレングリコール単位2〜4個を有する、請求項5に記載の化合物。
【請求項７】
リンカーが、エチレングリコール単位4個を有する、請求項6に記載の化合物。
【請求項８】
フラボノイドが、フラバノンである、請求項1に記載の化合物。
【請求項９】
フラバノンが、アピゲニンである、請求項1に記載の化合物。
【請求項１０】
式Iの化合物:
フラボノイド-リンカー-フラボノイド          I
(式中、
・フラボノイドは、フラバノンであり;
・リンカーは、複数のエチレングリコール単位を有する基である)
を合成する方法であって:
a) p-ヒドロキシベンズアルデヒドと式IIの化合物とを反応させて、式IIIの化合物を形成する工程
【化１】
2009537630.tif 000020
(式中、R1は、-H、-トシレート、及び-メシレートより選ばれる); 及び
b) 式IIIの化合物と式IVの化合物とを反応させて、
【化２】
2009537630.tif 000021
式Iの化合物(式中、R2は、-H、ベンジル及びメトキシメチルからなる群より選ばれる)を形成する工程を含む、前記方法。
【請求項１１】
式Iの化合物:
フラボノイド-リンカー-フラボノイド          I
(式中、
・フラボノイドは、フラバノンであり;
・リンカーは、複数のエチレングリコール単位を有する基である)
を合成する方法であって:
a) p-ヒドロキシベンズアルデヒドと式IVの化合物とを反応させて、式Vの化合物を形成する工程
【化３】
2009537630.tif 000022
(式中、R2は、-H、ベンジル及びメトキシメチルからなる群より選ばれる); 及び
b) 式Vの化合物と式IIの化合物とを反応させて、式Iの化合物を形成する工程
【化４】
2009537630.tif 000023
(式中、R1は、-H、-トシレート、及び-メシレートより選ばれる)
を含む、前記方法。
【請求項１２】
P糖タンパクベースの多剤耐性を低下させる方法であって、式Iの化合物:
フラボノイド-リンカー-フラボノイド          I
(式中、
・フラボノイドは、カルコン、フラボン、フラボノール、フラバノン、アントシアニン、及びイソフラボノイドからなる群より選ばれ;
・リンカーは、少なくとも一つの炭素原子を有する基である)
の有効な量を投与する段階を含む、前記方法。
【請求項１３】
リンカーが、アルキレン基、複数のエチレングリコール単位を有する基、複数のプロピレングリコール単位を有する基、複数のo-フェニレンジオキシ単位、m-フェニレンジオキシ単位又はp-フェニレンジオキシ単位を有する基、もしくはこれらの組み合わせからなる群より選ばれる、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
リンカーが、複数のエチレングリコール単位を有する基である、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
リンカーが、エチレングリコール単位1〜13個を有する、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
リンカーが、エチレングリコール単位2〜6個を有する、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
リンカーが、エチレングリコール単位2〜4個を有する、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
リンカーが、エチレングリコール単位4個を有する、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
フラボノイドが、フラバノンである、請求項12に記載の方法。
【請求項２０】
フラバノンが、アピゲニンである、請求項12に記載の方法。
【請求項２１】
式Iの化合物の濃度が、5〜30μMである、請求項12に記載の方法。
【請求項２２】
寄生虫症において薬剤耐性を低下させる方法であって、式Iの化合物:
フラボノイド-リンカー-フラボノイド          I
(式中、
・フラボノイドは、カルコン、フラボン、フラボノール、フラバノン、アントシアニン、及びイソフラボノイドからなる群より選ばれ;
・リンカーは、少なくとも一つの炭素原子を有する基である)
の有効な量を投与する段階を含む、前記方法。
【請求項２３】
リンカーが、アルキレン基、複数のエチレングリコール単位を有する基、複数のプロピレングリコール単位を有する基、複数のo-フェニレンジオキシ単位、m-フェニレンジオキシ単位又はp-フェニレンジオキシ単位を有する基、もしくはこれらの組み合わせからなる群より選ばれる、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
リンカーが、複数のエチレングリコール単位を有する基である、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
リンカーが、エチレングリコール単位1〜13個を有する、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
リンカーが、エチレングリコール単位2〜6個を有する、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
リンカーが、エチレングリコール単位2〜4個を有する、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
リンカーが、エチレングリコール単位4個を有する、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
フラボノイドが、フラバノンである、請求項22に記載の方法。
【請求項３０】
フラバノンが、アピゲニンである、請求項22に記載の方法。
【請求項３１】
式Iの化合物の濃度が、4〜60μMである、請求項22に記載の方法。
【請求項３２】
寄生虫症が、リーシュマニア属によって引き起こされる、請求項22に記載の方法。
【請求項３３】
寄生虫症が、L.ドノバニ、L.アマゾネンシス、L.タレントレ、L.トロピカ、L.エンリエッティイ、L.メキシカーナ、及びL.メジャーからなる群より選ばれる寄生虫の一つによって引き起こされる、請求項29に記載の方法。
【請求項３４】
薬剤が、スチボグルコン酸ナトリウム及びペンタミジンからなる基より選ばれる、請求項22に記載の方法。
【請求項３５】
薬剤が、1〜6.4mg/mLの濃度である、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
P糖タンパクベースの多剤耐性を低下させる薬剤の製造における式Iの化合物の有効な量の使用:
フラボニド-リンカー-フラボノイド          I
(式中、
・フラボノイドは、カルコン、フラボン、フラボノール、フラバノン、アントシアニン、及びイソフラボノイドからなる群より選ばれ;
・リンカーは、少なくとも一つの炭素原子を有する基である)。
【請求項３７】
寄生虫症における薬剤耐性を低下させる薬剤の製造における式Iの化合物の有効な量の使用:
フラボニド-リンカー-フラボノイド          I
(式中、
・フラボノイドは、カルコン、フラボン、フラボノール、フラバノン、アントシアニン、及びイソフラボノイドからなる群より選ばれ;
・リンカーは、少なくとも一つの炭素原子を有する基である)。
【請求項３８】
P糖タンパクベースの多剤耐性を低下させるか又は寄生虫症における薬剤耐性を低下させる薬剤であって、前記薬剤が請求項1〜8のいずれか1項に記載の化合物を含む、前記薬剤。
【請求項３９】
薬剤が、癌を治療するために用いられる、請求項38に記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明はP糖タンパクベースの多剤耐性を低下させる化合物及び方法並びにこれらの化合物の合成に関する。
【０００２】
背景技術
癌化学療法の薬剤耐性
多剤耐性(MDR)は、癌の化学療法において大きな課題である。最も良く確認された耐性機序は、細胞の外に種々の抗癌剤をポンプで送る、薬剤排出輸送体、浸透性-糖タンパク(P-gp)の過剰発現によって仲介されるものであり、細胞内薬剤蓄積が低下することになる。P-gpによる薬剤の排出は配座の変化によって仲介されると考えられる。P-gpに対する克服剤又は調節剤の開発は、学界と業界双方が関心をひくものである。Tsuruo et al(ベラパミルによって高められたビンクリスチン及びビンブラスチンの細胞毒性による生体内及び生体外P388白血病のビンクリスチン耐性の克服。Cancer Res 1981, 41, 1967-1972)は、最初に、ベラパミル、カルシウムチャンネル遮断薬がP-gp-仲介薬剤排出を阻害することによって耐性を逆転させることができることを報告した。それ以来、P-gpによるMDRは、デクスベラパミル21、デクスニグルジピン22、PSC 833(PSC-833、新規な非免疫抑制剤シクロスポリンによる耐性修飾。Eur J Cancer 1991, 27, 1639-1642)及びVX-710 (BIRICODAR(VX-710; Incel): 神経芽細胞腫における有効な化学増感剤。Br J Cancer 1999, 80, 1190-1196)を含むある範囲の化合物によって効果的に調節され得ることを示すかなりの試験管内データがある。これらのいわゆる第二世代のMDRモジュレータが一部の奨励している結果を示したが、それらの使用は、抗癌剤とのそれらの予測できない薬物動態学的相互作用によって制限される(正常組織におけるMDR発現。P糖タンパクインヒビターの臨床使用への薬理学的影響。Hematol Oncol Clin North Am 1995, 9, 319-336)。構造活性相関及びコンビナトリアルケミストリー方法によって開発された第三世代のMDRモジュレータとしては、ゾスキダルLY335979、タリキダルXR9576、ラニキダルR101933、アクリドンカルボキサミドGF120918及び置換ジアリールイミダゾールONT-090が挙げられ、現在、臨床試験によって評価されている。
MDRモジュレータとして有望な化合物ファミリは、フラボノイドの毒性が通常は低いことからフラボノイドである。フラボノイドは、ヒト食品の通常の成分を構成する、果実と野菜の中に天然に存在する化合物である。また、細胞のタイプや用いられる薬剤によってはMDRに対して種々の効果を示す。クリシン(1)、ケルセチン(2)、ケンフェロール(3)、デヒドロシリビン(dehydrosilybin)(4)(図1a)がマウスP-gpのNBD2細胞質ドメインに直接結合することが報告された(P糖タンパク及び関連ABC輸送体によって仲介される細胞多剤耐性のフラボノイドによる調節。CMLS, Cell. Mol. Life Sci. 2002, 59, 307 - 322.)。プレニル基又は他のアルキル基のフラボノイド構造への導入による疎水性増大によって、より効率的なインヒビターがしばしば得られた。8-又は6-プレニルクリシン(5又は6)(図1a)は、白血病K562/R7細胞内でP-gp仲介薬剤排出を阻害し、8-ジメチルアリルケンフェリド(7)は、Ltrmdr1の阻害においてシクロスポリンA又はベラパミルより良好なモジュレータであった。
毒性が低くても、現世代のフラボノイドモジュレータは制限がある。第一は、活性が中程度である傾向があることである。第二に、抗エストロゲンや他のATPアーゼの阻害を含む広域スペクトルの生物活性を有することである。MDRモジュレータとしてのフラボノイドの高用量適用は、副作用につながりやすい。
【０００３】
寄生虫症を治療する際の薬剤耐性
リーシュマニア症（世界保健機構(WHO)によって目標とされる6つの主要な寄生虫症のうちの1つ）は、世界中の88カ国に特有のものである。ほとんどのリーシュマニア症は、北アフリカ、アジア、ラテンアメリカ及び中東で生じる。350,000,000人が感染の危険にさらされ、毎年2,000,000の症例が報告されている。これらの症例の約1/4は内臓リーシュマニア症であり、死に至るものである。リーシュマニア症の一次治療は、五価のアンチモン化合物(ペントスタムやグルカンタイム)の投与による。二次治療としては、ペンタミジンやアンホテリシンBが挙げられる。これらの治療は多くの副作用があり、抗リーシュマニア薬の一部に対する臨床耐性の出現によって効力が更に妨げられている(ヒトリーシュマニア症: ここ10年間における臨床、診断、及び化学療法の開発。Clin. Infect. Dis. 1997, 24, 684-703)。インドでの50%を超える内臓リーシュマニア症の症例がアンチモン化合物に耐性であることが報告された(インドの内臓リーシュマニア症患者における循環するTヘルパー1(Th1)細胞結合サイトカインとTh2細胞結合サイトカイン。Am. J. Trop. Med. Hyg. 1997, 56, 522-5)。WHOは、リーシュマニア症における五価のアンチモン化合物耐性を最優先の一つとして定めた。ミルテフォシン、ヘキサデシルホスホコリンのようなより新たな治療も、大きな期待が示された。しかしながら、血中半減期が長いために、ミルテフォシンによる治療は薬剤耐性に容易につながり得る。それ故、多剤耐性を示す寄生虫症を治療し得る新薬を開発することが求められている。
【０００４】
発明の目的
それ故、本発明の目的は、フラボノイドより活性及び/又は選択性が改善されたフラボノイド誘導体を開発して、従来技術において示された課題の少なくとも一つを解決することである。最低限として、本発明の目的は、有用な選択を提供することである。
【０００５】
発明の概要
従って、本発明は、式Iの化合物を提供する:
フラボノイド-リンカー-フラボノイド          I
(式中、
・フラボノイドは、カルコン、フラボン、フラボノール、フラバノン、アントシアニン及びイソフラボノイドからなる群より選ばれ;
・リンカーは、少なくとも一つの炭素原子を有する基である)。
好ましくは、リンカーは、アルキレン基、複数のエチレングリコール単位を有する基、複数のプロピレングリコール単位を有する基、複数のo-フェニレンジオキシ単位、m-フェニレンジオキシ単位又はp-フェニレンジオキシ単位を有する基、もしくはこれらの組み合わせからなる群より選ばれる。
より好ましくは、リンカーは、複数のエチレングリコール単位を有する基であり、エチレングリコール単位1〜13個を有してもよい。有利には、リンカーは、エチレングリコール単位2〜4個又は6個、より好ましくはエチレングリコール単位4個を有する。
式Iのフラボノイドは、フラバノンであってもよく、より好ましくはアピゲニンであってもよい。
本発明の他の態様は、上記式Iの化合物
(式中、
・フラボノイドは、フラバノンであり;
・リンカーは、複数のエチレングリコール単位を有する基である)
を合成する方法を提供することである。
まず、p-ヒドロキシベンズアルデヒドと式IIの化合物とを反応させて、式IIIの化合物を形成する
【０００６】
【化１】
2009537630.tif 000002
【０００７】
(式中、R1は、-H、-トシレート、及び-メシレートより選ばれる)。
次に、式IIIの化合物と式IVの化合物
【０００８】
【化２】
2009537630.tif 000003
【０００９】
とを反応させて、式Iの化合物(式中、R2は、-H、ベンジル及びメトキシメチルからなる群より選ばれる)を形成する。
本発明は、また、式Iの化合物
(式中、
・フラボノイドは、フラバノンであり;
・リンカーは、複数のエチレングリコール単位を有する基である)
を合成する代替的方法を提供する。
まず、p-ヒドロキシベンズアルデヒドと式IVの化合物とを反応させて、式Vの化合物を形成する
【００１０】
【化３】
2009537630.tif 000004
【００１１】
(式中、R2は、-H、ベンジル及びメトキシメチルからなる群より選ばれる)。
次に、式Vの化合物と式IIの化合物とを反応させて、式Iの化合物を形成する
【００１２】
【化４】
2009537630.tif 000005
【００１３】
(式中、R1は、-H、-トシレート、及び-メシレートより選ばれる)。
本発明の更に他の態様は、式Iの化合物の有効な量を投与する段階を含むP糖タンパクベースの多剤耐性を低下させる方法を提供することである:
フラボノイド-リンカー-フラボノイド          I
(式中、
・フラボノイドは、カルコン、フラボン、フラボノール、フラバノン、アントシアニン、及びイソフラボノイドからなる群より選ばれ;
・リンカーは、少なくとも一つの炭素原子を有する基である)。
本発明の態様は、更に、式Iの化合物の有効な量を、好ましくは4〜60Mの濃度で投与する段階を含む寄生虫症において薬剤の耐性を低下させる方法を提供することである:
フラボノイド-リンカー-フラボノイド          I
(式中、
・フラボノイドは、カルコン、フラボン、フラボノール、フラバノン、アントシアニン、及びイソフラボノイドからなる群より選ばれ;
・リンカーは、少なくとも一つの炭素原子を有する基である)。
好ましくは、寄生虫症は、リーシュマニア(Leishmania)属によって引き起こされる。より好ましくは、寄生虫症は、リーシュマニア・ドノバニ(L. donovani)、リーシュマニア・アマゾネンシス(L. amazonensis)、L.タレントレ(L. tarentolae)、リーシュマニア・トロピカ(L. tropica)、L.エンリエッティイ(L. enriettii)、リーシュマニア・メキシカーナ(L. mexicana)及びリーシュマニア・メジャー(L. major)からなる群より選ばれる寄生虫の一つによって引き起こされる。
有利には、薬剤は、好ましくは1〜6.4mg/mLの濃度で、スチボグルコン酸ナトリウム及びペンタミジンからなる基より選ばれる。
本発明の他の態様は、P糖タンパクベースの多剤耐性を低下させるか又は癌又は寄生虫症において薬剤の耐性を低下させる上述のフラボノイド二量体のいずれか一つを含む薬剤を提供することである。
ここで、本発明の好ましい実施態様を、一例として、添付の図面によって説明する。
【００１４】
好ましい態様の詳細な説明
ここで、本発明を、以下の段落において図面による一例として記載する。
本発明の目的、特徴、及び態様は、以下の説明の中に開示されるか又は以下の説明から明らかである。本説明は、単に例示的実施形態の説明であり、本発明のより幅広い態様を制限するものとして意味することなく、より幅広い態様が例示的な構成において具体化されることは当業者によって理解されるべきである。
本発明のフラボノイドの効力と選択性を改善する方法は、擬二量体の種類及び多価相互作用を用いることによるP-gpの複数の結合部位を利用することである。生物系の多価相互作用は、一つの生物学的実体について複数のリガンドの同時結合によって確認される。“多価性”は、一つの生物学的実体に同時に結合することができる一つ以上の“リガンド”を有する単一分子を意味する。正しい条件下、多価相互作用は、典型的には、第二結合事象のより有利なエントロピーのために対応する一価の相互作用より非常に強い。この方法は、比較的安全なP-gp克服剤であるフラボノイドの利点とモノマーの親和性を増大させるのに多価性の能力を組み合わせることを目指すものである。
本発明の幅広い意味において、式Iの化合物を合成する:
フラボノイド-リンカー-フラボノイド          I
(式中、
・フラボノイドは、カルコン、フラボン、フラボノール、フラバノン、アントシアニン及びイソフラボノイドからなる群より選ばれ;
・リンカーは、少なくとも一つの炭素原子を有する基である)。
用語“フラボノイド”は、クロマン環が位置2、3又は4に第二芳香環Bを持つC15骨格に基づく化合物を意味する。
【００１５】
【化５】
2009537630.tif 000006
【００１６】
フラボノイドの種々のサブグループは、環Cの置換パターンに従って分類される。複素環の酸化状態と環Bの位置は共に分類において重要である。
六つの主要なサブグループの例は、以下の通りである:
1. カルコン
【００１７】
【化６】
2009537630.tif 000007
【００１８】
2. フラボン(一般的には草本科、例えば、シソ科(Labiatae)、セリ科(Umbelliferae)、キク科(Compositae)におけるもの)。
アピゲニン(アピウム・グラベオレンス(Apium graveolens)、ペトロセリヌム・クリスプム(Petroselinum crispum))。
ルテオリン(エキセツム・アルベンス(Equisetum arvense))
【００１９】
【化７】
2009537630.tif 000008
【００２０】
3. フラボノール(一般的には木の被子植物におけるもの)
クエルシトール(ルタ・グラベオレンス(Ruta graveolens)、ファゴピルム・エスクレンツム(Fagopyrum esculentum)、サムブクス・ニグラ(Sambucus nigra))
ケンフェロール(サムブクス・ニグラ(Sambucus nigra、カッシア・センナ(Cassia senna)、エキセツム・アルベンス(Equisetum arvense)、ラミウム・アルブム(Lamium album)、ポリゴヌム・ビストルタ(Polygonum bistorta))。
ミリセチン。
【００２１】
【化８】
2009537630.tif 000009
【００２２】
4. フラバノン 
【００２３】
【化９】
2009537630.tif 000010
【００２４】
5. アントシアニン
【００２５】
【化１０】
2009537630.tif 000011
【００２６】
6. イソフラボノイド
【００２７】
【化１１】
2009537630.tif 000012
【００２８】
上記化合物の全てが、本発明に関連した“フラボノイド”として使用し得る。フラボノイドのベンゼン環又は6員環について-H又は-OHの種々の置換が可能である。例えば、-H又は-OHは、以下の基によって置換されてもよい:
ハロゲン: フッ素、塩素、臭素、ヨウ素;
C1-C10アルキル: 炭素原子1〜10個を有する直鎖又は分枝鎖アルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、1-メチルエチル、ブチル、1-メチルプロピル、2-メチルプロピル、1,1-ジメチルエチル、ペンチル、2-メチルブチル;
C1-C10ハロアルキル: 炭素原子1〜10個を有する直鎖又は分枝鎖アルキル基、これらの基の水素原子の一部又は全てが上述したハロゲン原子によって置き換えられてもよい、例えば、クロロメチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、クロロフルオロメチル、ジクロロフルオロメチル、クロロジフルオロメチル、1-フルオロエチル、2-フルオロエチル、2,2-ジフルオロエチル、2,2,2-トリフルオロエチル、2-クロロ-2-フルオロエチル、2-クロロ-2,2-ジフルオロエチル、2,2-ジクロロ-2-フルオロエチル、2,2,2-トリクロロエチル、ペンタフルオロエチルのようなC1-C10-ハロアルキル;
C1-C10アルコキシ: 酸素原子(--O--)を介して骨格に結合される上述の炭素原子1〜10個を有する直鎖又は分枝鎖アルキル基、例えば、メチルオキシ、エチルオキシ、プロピルオキシ、1-メチルエチルオキシ、ブチルオキシ、1-メチルプロピルオキシ、2-メチルプロピルオキシ、1,1-ジメチルエチルオキシのようなC1-C10アルコキシ;
C2-C10ハロアルコキシ: 炭素原子2〜10個を有する直鎖アルキル基、これらの基の水素原子の一部又は全てが上述したハロゲン原子によって置き換えられてもよく、これらの基は酸素原子を介して骨格に結合されている、例えば、2-フルオロエチルオキシ、2,2-ジフルオロエチルオキシ、2,2,2-トリフルオロエチルキシ、2-クロロ-2-フルオロエチルオキシ、2-クロロ-2,2-ジフルオロエチルオキシ、2,2-ジクロロ-2-フルオロエチルオキシ、2,2,2-トリクロロエチルオキシ。
用語“部分的に又は完全にハロゲン化される”は、このように確認される基において水素原子が上述された同一か又は異なるハロゲン原子によって部分的に又は完全に置き換えられてもよいことを表すことを意味する。
フラボノイドのベンゼン環又は6員環についての水素原子又は-OH基は、上記のように置換が異なるアルキル基やアリール基を持つアミノ基、ニトロ基、チオエーテル基、スルホキシド基又はスルホン基によって部分的に又は完全に置き換えられてもよい。
更にまた、フラボノイドのベンゼン環又は6員環についての-OH基は、所望により、適切なエステル基によって保護されてもよく、例えば、-OH基のHは、構造-(CO)-Rを有するC1-C6アシルによって置き換えられてもよく、ここで、Rは、水素又は炭素原子1〜5個を有する直鎖又は分枝鎖アルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、1-メチルエチル、ブチル、1-メチルプロピル、2-メチルプロピル、1,1-ジメチルエチル、ペンチル、2-メチルブチルである。アルキル基Rは、部分的に又は完全にハロゲン化されることが可能である。
【００２９】
用語“部分的に又は完全にハロゲン化される”は、このように確認される基において水素原子が同一か又は異なるハロゲン原子によって部分的に又は完全に置き換えられてもよいことを表すこと、例えば、クロロメチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、クロロフルオロメチル、ジクロロフルオロメチル、クロロジフルオロメチル、1-フルオロエチル、2-フルオロエチル、2,2-ジフルオロエチル、2,2,2-トリフルオロエチル、2-クロロ-2-フルオロエチル、2-クロロ-2,2-ジフルオロエチル、2,2-ジクロロ-2-フルオロエチル、2,2,2-トリクロロエチル及びペンタフルオロエチルを意味する。
本発明において種々のリンカー基が用いられてもよい。リンカーが二つ末端を有しなければならず、それぞれの末端がフラボノイドの一方に結合することは明らかである。リンカーは、アルキレン基(-CH2-)n; 一般式-O[-(-CH2)m-(O)]n-を有する基、例えば、複数のエチレングリコール単位-O-(-CH2-CH2-O)n-を有する基、複数のプロピレングリコール単位-O-(CH2-CH2-CH2-O)n-を有する基; o-フェニレンジオキシ、m-フェニレンジオキシ又はp-フェニレンジオキシ単位を有する基; もしくは化学結合によって共にフラボノイドを結合してもよいこれらの基又は他の基の組み合わせを含む少なくとも一つの炭素原子を有しなければならない。これらの基の各々は、更にまた“部分的に又は完全にハロゲン化される”ことが可能である。リンカー基が種々の長さを持ち得ることは後に示される。即ち、“m”及び/又は“n”は、1以上のいかなる整数でもよい。
式Iにおいて二つのフラボノイドが異なってもよいことは留意すべきである。例えば、一方がフラバノンであってもよく、もう一方がフラボンであってもよく、他の種々の組み合わせも可能である。
更に、結合の位置は、フラボノイドの種々の位置にあってもよい。このことは、化合物の合成で設計選択の問題であり、当業者によって決定される。
驚くべきことに、本発明のフラボノイド二量体が生体外で高度に有効な化学増感剤であることがわかる。化合物の一部は、薬剤耐性細胞内で薬剤蓄積を増大することができるが薬剤感受性細胞内では増大せず、生体外で薬剤耐性乳癌や白血病の細胞における抗癌剤(タキソール、ドキソルビシン、ダウノマイシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン)の細胞毒性を5-50倍だけ増強する。
一般構造9のフラボノイドが種々の長さのアピゲニン(8)ポリエチレングリコール(PEG)鎖である一連のフラボノイド二量体を合成した(図1)。アピゲニン(8)は、結腸HCT-15の癌細胞におけるMDRのモジュレータであることが報告されていることから、親モノリガンドに選ばれる。C'4位置は、この位置の置換が分子の活性に対してほとんど効果がないことが知られていることから、リンカーの結合点に選ばれた。異なるMDR癌細胞を増感する際にエチレングリコール単位1〜13個と結合した一連のアピゲニン二量体の効力を調べる。これらの活性を、アピゲニン自体だけでなくモノマー10a及び10bと比較する。我々は、また、P-gpが仲介する薬剤排出を逆転させる能力を評価した。
【００３０】
ポリエチレングリコール結合アピゲニン二量体の合成
化学
図2に示されるようにポリエチレングリコール(PEG)結合フラボノイド9の合成を達成するために利用され得る二つ合成経路がある。第一方法(経路A)は、“カルコン光付加環化によるシクロブタンリングに基づくジダイトピックシクロファンの合成。Tetrahedron 2003, 59, 3455 - 3459”に従ってアルデヒド15と対応するエチレングリコールジトシレート13a又はジメシレート13bから合成した一連のPEG結合ビスアルデヒド11の使用を含む。次に、ビスアルデヒド11とトリヒドロキシアセトフェノン14とのアルドール縮合に続いて、ビスカルコンをフラボンに酸化的環化して、9を得なければならない。その他の経路(経路B)は、選択的に保護されたフラボノイド12の合成を含み、次に、活性化PEG鎖13a又は13bとカップリングする。フラボノイド12は、トリヒドロキシアセトフェノン14とベンズアルデヒド15から誘導され得る。
PEG鎖13は、n = 6まで市販されている。nが6より大きいPEGは、市販されていないので、合成する必要があった。nが6より大きいPEGは、“単分散オリゴ(エチレングリコール)の適切な合成。Synthesis 2004, 7, 1007 - 1010”に記載される方法によって得ることができる。エチレングリコールジトシレート13a(n = 2、3)及びジメシレート13b(n = 1、4〜9)は、“所定の長さの直交する末端官能性オリゴエチレングリコールの合成。Tetrahedron Lett. 2004, 45, 4285 - 4288”に記載される方法に従って、ジクロロメタン中氷浴温度で対応するPEG鎖13、塩化トシル又は塩化メタンスルホニル及びトリエチルアミンから調製した。いずれの化合物トリヒドロキシアセトフェノン14もベンズアルデヒド15も市販されている。保護2-ヒドロキシアセトフェノン14a(エピガロカテキン-3-ガレート(EGCG)の3,4,5-トリメトキシベンゾイルエステル類似体の合成: 天然産物緑茶カテキンへの潜在的経路、EGCG. Org. Lett. 2001, 3, 843 - 846)及び14b(イソオリエンチンの有効な合成: 6-C-グルコシルフラボンの位置選択的合成。Carbohydrate Research 2000, 329, 507 - 513)をそれぞれの参考文献に記載される方法に従って調製することができる。他の目標化合物の合成を試みる前に、合成に最適な条件を確認するモデル研究としてフラボノイド9a(n = 1)を選択した。
【００３１】
9a(n = 1)の経路Aによる合成
9aの合成を経路Aに従って調製した。結果をスキーム1にまとめる。p-ヒドロキシベンズアルデヒド(15)を、還流温度で、50%アセトニトリル(ACN)/水の炭酸カリウムの存在下にエチレングリコールジメシレート(13b)とカップリングして、ビスアルデヒド11aを高収率で得た。次に、塩基性媒体下でビスアルデヒド11aとジベンジル保護アセトフェノン14aとのアルドール縮合からビスカルコン16を調製した。ビスカルコン16を合成する最初の試みは、生成物の低い変換、緩慢な反応速度及び問題がある分離によって挫折した。我々は、問題点を反応媒体におけるアルデヒドの難溶解性によるものと考えた。多くの実験後、ビスアルデヒド11aをTHFに溶解し、これを60%KOH水溶液中のアセトフェノン14aの溶液に添加することによって、所望のビスカルコンに近い定量的変換を達成されることができることがわかった。ビスカルコン16は、特徴的な鮮黄色を有する。オレフィンプロトン(J = 16Hz)の大きな結合定数は、炭素-炭素二重結合がトランス型であることを示した。ビスカルコン16のビス-フラボノイド17への環化は、熱条件下でジメチルスルホキシド(DMSO)中触媒量のヨウ素を用いて環化-脱離経路によってワンポットで順調に進行した。触媒量を超えるヨウ素を存在させることによってベンジル基の切断だけでなくフェニル環のヨウ素化が生じることは強調されなければならない。100mgを超える出発ビスカルコンが反応に用いられる場合に最良の結果が得られた。特に、17におけるベンジル基の脱保護に用いられる方法は、水素転移水素化分解、及び水素雰囲気下での触媒量のPd(OH)2/木炭又はPd/Cである。しかしながら、これらは成功せず、出発物質だけが回収された。反応条件の多くの態様後、最後に、多量のTHF/水混合液中10%Pd/Cを使うことによってフラボノイド9aが非常に低い収量で得られた。従って、ベンジル基の保護基としての使用は問題があるようであり、全収率はわるかった。従って、ベンジル基を置き換えるためにメトキシメチル(MOM)基を選択し、全合成経路をビスアルデヒド11aから繰り返した(スキーム1)。
ビスカルコン16aは、3M KOH/EtOH溶液を用いたビスアルデヒド11aとジMOM保護アセトフェノン14bとのアルドール縮合によって高収率で得た。触媒量のヨウ素/DMSOを用いたビスカルコン16aのフラボンへの環化は失敗であった。一方、熱条件下の2,3-ジクロロ-5,6-ジアノ-1,4-ベンゾキノン(DDQ)仲介酸化的環化を進行させて、一つのMOM基が切断した17aを得た。反応混合物の面倒なクロマトグラフィの精製によって低収量の17aが得られた。17aのフラボノイド9aへの変換は、MOM基の酸性媒体脱保護によって達成された。これらの結果は、MOM基が穏やかな条件下で容易に切断され得るので、保護のためのMOM基の使用がベンジル基より優れていることを示した。しかしながら、15の9aへの全体の変換の収率は、まだ低かった。全体合成スキームの再最適化が必要であった。
【００３２】
【化１２】
2009537630.tif 000013
【００３３】
スキーム1. (a) K2CO3, ACN/H2O, 還流, 14 h; (b) 16の場合, 14a, 60% KOH, r.t., 14 h; 16aの場合, 14b, 3M KOH / EtOH, r.t., 14 h; (c) 17の場合, cat. I2, DMSO, 還流, 14 h; 17aの場合, DDQ, PhMe/ジオキサン, 還流, 14 h; (d) 17から, H2, Pd/C, THF/H2O, r.t., 14 h; 17aから, 80% AcOH, 還流, 14 h.
9a(n = 1)の経路Bによる合成
経路Bに従って9aの合成を調べた。結果をスキーム2にまとめる。アセトフェノン14bとp-アリルオキシベンズアルデヒドとを塩基性媒体下で縮合して、カルコン18を高収量で得た。18のDDQ仲介酸化的環化を進行させて、一つのMOM基が切断した19を得た。DMF中炭酸カリウムを用いて19におけるヒドロキシ基を臭化ベンジルで保護して、20を良好な収率で得た。触媒量のPd(PPh3)4とメタノール中の炭酸カリウムを用いて20のアリル保護基を切断して、12aを高収率で得た。塩基性条件下でジメシレート13b(n = 1)を12aのパラフェノキシ部分によって分子間求核置換して、21aを得た。21aの二量体の種類は、高解像質量スペクトルから明らかであった。ベンジル基のパラジウム触媒脱保護に続いてMOM基を酸性脱保護して、フラバノイド9aを高収率で得た。
【００３４】
【化１３】
2009537630.tif 000014
【００３５】
スキーム2. (a) 3M KOH / EtOH, r.t., 16 h; (b) DDQ, PhMe/ジオキサン, 還流, 7 h; (c) K2CO3, BnBr, DMF, 還流, 2 h; (d) cat. Pd(PPh3)4, K2CO3, MeOH, 還流, 2 h; (e) K2CO3, DMF, 還流, 2 h; (f) H2, Pd/C, CHCl3, r.t., 12 h; (g) 80% AcOH, 還流, 14 h.
フラボン二量体9b〜9iの経路Bによる合成
経路Bによる9aの合成に最適な条件を確立したことにより、異なるPEG鎖を有する他のフラボノイド二量体も同様にして合成した。結果をスキーム3にまとめる。より短い鎖(n=2、3)の場合、PEGジトシレート(13a)を用いたが、より長い鎖(n=4-9)の場合、PEGジメシレート(13b)と用いた。すべての場合において、フラボノイド二量体9a〜9iを適度な全収率で12aに基づき30-50%の範囲で調製した。概して、より長いPEG鎖(n=5以上)を有するフラボノイド二量体を油として得た。より短いPEG鎖長(n=4以下)を有するフラボノイド二量体の場合には、固体として得、融点は、352oC(n=1)から131oC(n=4)に低下した。
一価のフラボノイド10a及び10bの合成
続いての生物学的実験の過程で、一価のフラボノイド10が制御実験のために必要であることが明らかになった。偶然に、12aとジトシレート13a(n=3)又はジメシレート13b(n=4)とのカップリングにおいて、おそらく反応の間にトシレート基又はメシレート基の一つが加水分解することから、モノカップリング生成物23a(n=3)又は23b(n=4)を副作用の少ないものとして得た。23a及び23bのモノマーの種類は、高解像質量スペクトルから明らかであった。その後のベンジル基のパラジウム触媒脱保護に続いてMOM基を酸脱保護して、一価のフラボノイド10a及び10b(スキーム3)を示した。
【００３６】
【化１４】
2009537630.tif 000015
【００３７】
スキーム3. (a) K2CO3, DMF, 還流; (b) H2, Pd/C, CHCl3, r.t.; (c) n = 2, 3の場合; 80% AcOH, 還流; n = 4〜9の場合; 6 M HCl, THF, r.t.
ポリエチレングリコール結合アピゲニン類似体二量体の合成
経路Bによって開発された一般的な方法を用いて、スキーム4に従って種々の置換ヒドロキシアセトフェノン(31a-l)から出発して多くのアピゲニン類似体二量体(35a-l)を調製することができる。モノマー類似体34a-lの一つと一価のアピゲニン24のメシレートとのカップリングに続いて脱保護することによって非対称のアピゲニン二量体を調製することもできる。
【００３８】
【化１５】
2009537630.tif 000016
【００３９】
スキーム4
二つ合成経路によって種々の長さのポリエチレングリコール鎖で共に結合された、一連のアピゲニンベースのフラボノイド二量体を本発明において合成した。MOM基が穏やかな条件下で容易に切断することができるので、保護のためのMOM基の使用はベンジル基より優れていることがわかった。このことは、他のフラボノイド化合物の合成においても有用に適用することができる。
実験データ
概要. 全てのNMRスペクトルを、Bruker MHz DPX400分光計により1Hについては400.13MHz、13Cについては100.62MHzで記録した。全てのNMR測定を室温で行い、化学シフトをCDCl3の共鳴と相対するδ単位の100万分の1(ppm)として報告する(それぞれ1Hモードにおいては7.26ppm、13Cモードにおいては三重項の中心線の77.0ppm)。電子噴霧イオン化(ESI)方式によるMicromassQ-TOF-2又は電子イオン化(EI)方式によるFinnigan MAT95 STによって低解像質量スペクトルや高解像質量スペクトルを得た。Electrothermal IA9100デジタル融点装置を用いて融点を測定したが、補正しなかった。全ての試薬及び溶媒は、試薬用であり、特に明記しない限り精製せずに用いた。薄層クロマトグラフィ(TLC)に用いられるプレートは、E.Merckシリカゲル60F254(0.25mmの厚さ)であり、短い(254nm)紫外線によって視覚化した。クロマトグラフィの精製は、MNシリカゲル60(230−400メッシュ)を用いて行った。
トランス-(4-アリルオキシフェニル)-1-[2,4-ビス(メトキシメトキシ)-6-ヒドロキシフェニル]プロペノン(18): 丸底フラスコに2-ヒドロキシ-4,6-ビス(メトキシメトキシ)アセトフェノン14b(4.39g、17.1ミリモル)、4-アリルオキシベンズアルデヒド(2.90g、17.9ミリモル)及びKOH溶液(3M 96% EtOH溶液、30mL)を充填した。この溶液は直ちに褐色に変わり、室温で16時間撹拌した。TLCがアセトフェノンの完全な消費を示したときに、反応混合液を、0.5M HCl溶液(180mL)を含有する分液漏斗に注入した。混合液をCH2Cl2(40mL×3)で抽出した。合わせた有機層をMgSO4で乾燥し、ろ過し、蒸発させて、粗褐色油状物を得、これをシリカゲル(70g)によりフラッシュカラムクロマトグラフィ(20% EtOAc/ヘキサン)に供して、カルコン18(6.53g、95%)を黄色固形物として得た: m.p.: 70−71oC; 1H NMR (CDCl3) 3.48 (s, 3H), 3.53 (s, 3H), 4.57 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 5.18 (s, 2H), 5.28 (s, 2H), 5.31 (d, J = 10.4 Hz, 1H), 5.42 (dd, J = 1.2, 17.2 Hz, 1H), 6.02 - 6.04 (m, 1H), 6.24 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.31 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.93 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.76 (ABのA, J = 15.4 Hz, 1H), 7.83 (ABのB, J = 15.4 Hz, 1H), 13.9 (s, 1H); 13C NMR (CDCl3) 56.4, 56.8, 68.8, 94.0, 94.7, 95.1, 97.5, 107.5, 115.1, 118.0, 125.0, 128.3, 130.0, 132.7, 142.6, 159.8, 160.4, 163.2, 167.2, 192.8; LRMS (ESI) m/z 401 (M+ + H, 100), 423 (M+ + Na, 22); HRMS (ESI) C22H25O7の計算値 (M+ + H) 401.1600, 実測値 401.1604.
【００４０】
5-ヒドロキシ-7-メトキシメトキシ-2-(4'-アリルオキシフェニル)-4H-クロメン-4-オン(19): 丸底フラスコに、カルコン18(6.53g、16.3ミリモル)、DDQ(5.56g、24.5ミリモル)及び25%ジオキサン/トルエン(100mL)の乾燥溶媒を充填した。この溶液は直ちに濃い褐色に変わり、窒素雰囲気下還流温度で7時間撹拌した。TLCがカルコン18の完全な消費を示したときに、反応混合液を室温に冷却し、溶媒を蒸発乾固した。CH2Cl2(150mL)の添加後、不溶性褐色固形物を吸引濾過によって除去した。濃い褐色ろ液を飽和NaHCO3で洗浄し、MgSO4で乾燥し、ろ過し、蒸発させ、シリカゲル(130g)によるフラッシュカラムクロマトグラフィ(ヘキサン中15%EtOAc)に供して、化合物19(2.10g、36%)を淡黄色の固体として得た:m.p.: 100 - 101 oC; 1H NMR (CDCl3) 3.49 (s, 3H), 4.59 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 5.22 (s, 2H), 5.32 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 5.43 (d, J = 17.2 Hz, 1H), 6.00 - 6.09 (m, 1H), 6.44 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 6.54 (s, 1H), 6.25 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 6.99 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.79 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 12.74 (s, 1H); 13C NMR (CDCl3) 56.4, 68.9, 94.2, 94.2, 100.0, 104.2, 106.1, 115.1, 118.2, 123.5, 127.9, 132.4, 157.5, 161.6, 161.9, 162.8, 163.9, 182.4; LRMS (ESI) m/z 355 (M+ + H, 36); HRMS (ESI) C20H19O6の計算値 (M+ + H) 355.1182, 実測値 355.1164.
5-ベンジルオキシ-7-メトキシメトキシ-2-(4'-アリルオキシフェニル)-4H-クロメン-4-オン(20): 丸底フラスコに、化合物19(2.24g、6.3ミリモル)、臭化ベンジル(1.70g、9.9ミリモル)、K2CO3(1.80g、13.0ミリモル)及びDMF(15mL)を充填した。反応混合液を、還流温度で2時間撹拌した。TLCが19の完全な消費を示したときに、反応混合液を水(200mL)を含有する分液漏斗に注入した。混合液を、CH2Cl2(30mL×3)で抽出した。合わせた有機層を、MgSO4で乾燥し、ろ過し、蒸発させて、褐色油状物を得、シリカゲル(50g)による勾配溶離(30% EtOAc/ヘキサン〜60% EtOAc/ヘキサン)でフラッシュカラムクロマトグラフィに供して、オフホワイトの固形物として化合物20(2.01g、72%)を得た:m.p.: 120 - 122 oC; 1H NMR (CDCl3) 3.68 (s, 3H), 4.78 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 5.41 (s, 2H), 5.43 (s, 2H), 5.51 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 5.62 (d, J = 17.2 Hz, 1H), 6.21 - 6.26 (m, 1H), 6.69 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.77 (s, 1H), 6.94 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.18 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.45 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.58 (dd, J = 7.2, 7.6 Hz, 2H), 7.82 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.99 (d, J = 8.6 Hz, 2H); 13C NMR (CDCl3) 56.4, 68.9, 7.07, 94.3, 96.0, 98.7, 107.6, 110.2, 115.0, 118.1, 123.9, 126.6, 127.6, 128.5, 128.7, 132.6, 136.4, 159.4, 159.6, 160.7, 161.0, 161.2, 177.4; LRMS (ESI) m/z 445 (M+ + H, 100), 467 (M+ + Na, 15); HRMS (ESI) C27H25O6の計算値 (M+ + H) 445.1651, 実測値 445.1641.
【００４１】
5-ベンジルオキシ-7-メトキシメトキシ-2-(4'-ヒドロキシフェニル)-4H-クロメン-4-オン(12a): 丸底フラスコに、化合物20(2.01g、4.5ミリモル)、触媒量のPd(PPh3)4(0.1g)、K2CO3(2.50g、18.1ミリモル)及びMeOH(80mL)を充填した。反応混合液を、還流温度で2時間撹拌した。TLCが20の完全な消費を示したときに、反応混合液を水(200mL)を含有するビーカーに注入した。この溶液を、1M HCl溶液を用いてpH 4の酸性にし、多くのオフホワイト固形物を形成し、これを吸引濾過によって集めた。集めた固形物を50% EtOAc/MeOHに溶解し、不溶性の暗色の木炭状物をろ過によって除去した。褐色のろ液を減圧下で蒸発させ、化合物12a(1.42 g、78%)が白色固形物として徐々に析出した: m.p.: 202 - 204 oC; 1H NMR (d6-DMSO) 3.59 (s, 3H), 5.40 (s, 2H), 5.51 (s, 2H), 6.77 (s, 1H), 6.85 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.07 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.09 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.49 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.58 (dd, J =7.2, 7.6 Hz, 2H), 7.79 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 8.06 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 10.41 (s, 1H); 13C NMR (d6-DMSO) 56.5, 70.3, 94.4, 96.2, 99.1, 106.6, 109.6, 116.3, 121.7, 127.3, 127.9, 128.3, 128.7, 137.3, 159.2, 159.4, 160.7, 161.0, 161.2, 176.1; LRMS (ESI) m/z 405 (M+ + H, 100), 427 (M+ + Na, 19); HRMS (ESI) C24H21O6の計算値 (M+ + H) 405.1338, 実測値 405.1336.
12aからフラボノイド二量体21a-iの合成のための一般手順:丸底フラスコに、化合物12a(1.6当量)、ジメシレート13b(n = 1の場合、4〜9)又はジトシレート13a(n = 2、3)(1当量)、K2CO3(8当量)及びDMFを充填した。反応混合液を還流温度で2〜3時間撹拌した。加熱中に混合液が色が薄茶色から乳白色に徐々に変わった。TLCが12aの完全な消費を示したときに、反応混合液を水(200mL)を含有する分液漏斗に注入した。この混合液をCH2Cl2(20mL×3)で抽出した。混合物を二層に分離することができない場合には、1M HCl(20mL)を添加した。合わせた有機層を、MgSO4で乾燥し、ろ過し、蒸発させて、粗反応混合液を得た。フラボノイド二量体の精製を、以下に示される結晶化又はフラッシュカラムクロマトグラフィによって行った。
1,4-ビス[4'-((5-ベンジルオキシ-7-メトキシメトキシ)-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-1,4-ジオキサブタン(21a): 上記フラボノイド二量体の合成のための一般手順のように、12a(230mg、0.57ミリモル)、エチレングリコールジメシレート(75mg、0.34ミリモル)、K2CO3(380mg)及びDMF(8mL)からこの化合物を調製した。EtOAcから結晶化後、標記化合物(150mg、63%)を白色固体として得た: m.p.: 173 - 175 oC; 1H NMR (CDCl3) 3.50 (s, 6H), 4.40 (s, 4H), 5.23 (s, 4H), 5.25 (s, 4H), 6.51 (d, J = 1.6 Hz, 2H), 6.57 (s, 2H), 6.77 (d, J = 1.6 Hz, 2H), 7.04 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 7.30 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 7.39 (dd, J = 7.2, 7.6 Hz, 4H), 7.63 (d, J = 7.6 Hz, 4H), 7.83 (d, J = 8.8 Hz, 4H); 13C NMR (CDCl3) 56.4, 66.5, 70.7, 94.3, 96.0, 98.8, 107.7, 110.2, 114.9, 124.3, 126.6, 127.6, 127.7, 128.5, 136.4, 159.4, 159.6, 160.6, 160.9, 161.3, 177.4; LRMS (ESI) m/z 835 (M+ + H, 100), 857 (M+ + Na, 68); HRMS (ESI) C50H42O12Naの計算値 (M+ + Na) 857.2574, 実測値 857.2571.
【００４２】
1,7-ビス[4'-((5-ベンジルオキシ-7-メトキシメトキシ)-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-1,4,7-トリオキサヘプタン(21b): 上記フラボノイド二量体の合成のための一般手順のように、12a(200mg、0.50ミリモル)、ジエチレングリコールジトシレート(130mg、0.31ミリモル)、K2CO3(360mg)及びDMF(8mL)からこの化合物を調製した。EtOAcから結晶化後、標記化合物(88mg、40%)を白色固体として得た: m.p.: 110 - 111 oC; 1H NMR (CDCl3) 3.48 (s, 6H), 3.96 (t, J = 4.6 Hz, 4H), 4.22 (t, J = 4.6 Hz, 4H), 5.26 (s, 8H), 6.47 (d, J = 1.8 Hz, 2H), 6.58 (s, 2H), 6.73 (d, J = 1.8 Hz, 2H), 6.99 (d, J = 8.6 Hz, 4H), 7.30 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.40 (dd, J = 7.2, 7.6 Hz, 4H), 7.62 (d, J = 7.2 Hz, 4H), 7.78 (d, J = 8.6 Hz, 4H); 13C NMR (CDCl3) 56.4, 67.6, 69.8, 70.7, 94.3, 95.9, 98.7, 107.5, 110.1,114.9, 123.9, 126.6, 127.6, 128.5, 136.4, 159.4, 159.5, 160.7, 161.1, 161.3, 177.4; LRMS (ESI) m/z 879 (M+ + H, 7); HRMS (ESI) C52H47O13の計算値 (M+ + H) 879.3017, 実測値 879.3032.
1,10-ビス[4'-((5-ベンジルオキシ-7-メトキシメトキシ)-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-1,4,7,10-テトラオキサデカン(21c)及び9-[4'-((5-ベンジルｌオキシ-7-メトキシメトキシ)-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-3,6,9-トリオキサノナン-1-オール(23a): 上記フラボノイド二量体の合成のための一般手順のように、12a(200mg、0.50ミリモル)、トリエチレングリコールジトシラート(140mg、0.33ミリモル)、K2CO3(380mg)及びDMF(8mL)からこの化合物を調製した。EtOAcから結晶化後、化合物21c(96mg、42%)を白色固体として得た: m.p.: 78 - 80 oC; 1H NMR (CDCl3) 3.48 (s, 6H), 3.77 (s, 4), 3.89 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 4.17 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 5.20 (s, 8H), 6.46 (d, J = 1.6 Hz, 2H), 6.56 (s, 2H), 6.72 (d, J = 1.6 Hz, 2H), 6.97 (d, J = 8.6 Hz, 4H), 7.30 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 7.39 (t, J = 7.2 Hz, 4H), 7.62 (d, J = 7.2 Hz, 4H), 7.76 (d, J = 8.6 Hz, 4H); 13C NMR (CDCl3) 56.4, 67.5, 69.6, 70.6, 70.9, 94.3, 95.9, 98.7, 107.4, 110.1, 114.9, 123.8, 126.6, 127.5, 128.5, 136.4, 159.4, 159.5, 160.7, 161.2, 161.2, 177.3; LRMS (ESI) m/z 923 (M+ + H, 18), 946 (M+ + Na, 50); HRMS (ESI) C54H50O14Naの計算値 (M+ + Na) 945.3098, 実測値 945.3103. 次に、母液を更に蒸発させ、シリカゲル(20g)による勾配溶離(20%〜50%アセトン/CH2Cl2)でフラッシュカラムクロマトグラフィに供して、化合物23a(56mg、21%)を淡黄色油として得た: 1H NMR (CDCl3) 2.64 (br, 1H), 3.47 (s, 3H), 3.60 (t, J = 4.2 Hz, 2H), 3.67 - 3.73 (m, 6H), 3.86 (t, J = 4.7 Hz, 2H), 4.16 (t, J = 4.7 Hz, 2H), 5.20 (s, 2H), 5.22 (s, 2H), 6.48 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.57 (s, 1H), 6.73 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.97 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.28 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.37 (dd, J = 7.4, 7.8 Hz, 2H), 7.61 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.77 (d, J = 8.8 Hz, 2H); 13C NMR (CDCl3) 56.3, 61.6, 67.4, 69.4, 70.2, 70.6, 70.7, 72.4, 94.2, 95.9, 98.6, 107.4, 110.0, 114.8, 123.8, 126.5, 127.5, 127.5, 128.4, 136.3, 159.3, 159.5, 160.7, 161.1, 161.2, 177.3.
【００４３】
1,13-ビス[4'-((5-ベンジルオキシ-7-メトキシメトキシ)-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-1,4,7,10,13-ペンタオキサトリデカン(21d)及び12-[4'-((5-ベンジルｌオキシ-7-メトキシメトキシ)-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-3,6,9,12-テトラオキサドデカン-1-オル(23b): 上記フラボノイド二量体の合成のための一般手順のように、12a(1.33g、3.3ミリモル)、テトラエチレングリコールジメシレート(0.72g、2.1ミリモル)、K2CO3(2.27g)及びDMF(30mL)からこれらの化合物を調製した。シリカゲル(40g)によるフラッシュカラムクロマトグラフィ(2% MeOH/CH2Cl2)処理後、標記化合物21d(0.93g、58%)を白色泡状物として得た:1H NMR (CDCl3) 3.44 (s, 6H), 3.67 (t, J = 1.6 Hz, 4H), 3.69 (t, J = 1.6 Hz, 4H), 3.83 (t, J = 4.4 Hz, 4H), 4.09 (t, J = 4.0 Hz, 4H), 5.15 (s, 8H), 6.42 (d, J = 1.8 Hz, 2H), 6.49 (s, 2H), 6.67 (d, J = 1.8 Hz, 2H), 6.92 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 7.25 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 7.36 (dd, J = 7.2, 7.6 Hz, 4H), 7.60 (d, J = 7.6 Hz, 4H), 7.71 (d, J = 8.8 Hz, 4H); 13C NMR (CDCl3) 56.4, 67.5, 69.5, 70.6, 70.6, 70.8, 94.3, 95.9, 98.6, 107.4, 110.0, 114.8, 123.7, 126.6, 127.5, 127.5, 128.5, 136.5, 159.3, 159.5, 160.6, 161.2, 177.2; LRMS (ESI) m/z 967 (M+ + H, 18), 989 (M+ + H, 100); HRMS (ESI) C56H55O15の計算値 (M+ + H) 967.3541, 実測値 967.3568. 標記化合物23b(0.27g、14%)を淡黄色の油として得た: 1H NMR (CDCl3) 3.00 (br, 1H), 3.44 (s, 3H), 3.56 (t, J = 4.2 Hz, 2H), 3.62 - 3.69 (m, 10H), 3.82 (t, J = 4.5 Hz, 2H), 4.13 (t, J = 4.5 Hz, 2H), 5.17 (s, 2H), 5.18 (s, 2H), 6.44 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 6.53 (s, 1H), 6.70 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 6.94 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.25 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.35 (dd, J = 7.4, 7.6 Hz, 2H), 7.59 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.74 (d, J = 8.8 Hz, 2H); 13C NMR (CDCl3) 56.2, 61.4, 67.3, 69.3, 70.0, 70.3, 70.4, 70.4, 70.6, 72.4, 94.1, 95.8, 98.5, 107.2, 109.9, 114.7, 123.6, 126.4, 127.4, 128.3, 136.2, 159.2, 159.3, 160.6, 161.0, 161.1, 177.2.
【００４４】
1,16-ビス[4'-((5-ベンジルオキシ-7-メトキシメトキシ)-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-1,4,7,10,13,16-ヘキサオキサヘキサデカン(21e): 上記フラボノイド二量体の合成のための一般手順のように、12a(300mg、0.74ミリモル)、ペンタエチレングリコールジメシレート(170mg、0.43ミリモル)、K2CO3(480mg)及びDMF(10mL)からこの化合物を調製した。シリカゲル(15g)によるフラッシュカラムクロマトグラフィ(2% MeOH/CH2Cl2)処理後、標記化合物(160mg、43%)を白色の泡状物として得た: 1H NMR (CDCl3) 3.44 (s, 6H), 3.63 - 3.68 (m, 12H), 3.81 (t, J = 4.2 Hz, 4H), 4.09 (t, J = 4.2 Hz, 4H), 5.15 (s, 8H), 6.42 (d, J = 1.6 Hz, 2H), 6.49 (s, 2H), 6.67 (d, J = 1.6 Hz, 2H), 6.93 (d, J = 8.6 Hz, 4H), 7.26 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 7.36 (dd, J = 6.8, 7.4 Hz, 4H), 7.59 (d, J = 7.4 Hz, 4H), 7.71 (d, J = 8.6 Hz, 4H); 13C NMR (CDCl3) 56.4, 67.5, 69.5, 70.5, 70.8, 94.3, 95.9, 98.6, 107.4, 110.0, 114.8, 123.7, 126.6, 127.5, 127.5, 128.5, 128.6, 136.4, 159.3, 159.5, 160.6, 161.2, 177.3; LRMS (ESI) m/z 1011 (M+ + H, 4), 1033 (M+ + Na, 26); HRMS (ESI) C58H59O16の計算値 (M+ + H) 1011.3803, 実測値 1011.3793.
1,19-ビス[4'-((5-ベンジルオキシ-7-メトキシメトキシ)-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-1,4,7,10,13,16,19-ヘプタオキサノナデカン(21f): 上記フラボノイド二量体の合成のための一般手順のように、12a(230mg、0.57ミリモル)、ヘキサエチレングリコールジメシレート(160mg、0.37ミリモル)、K2CO3(400mg)及びDMF(10mL)からこの化合物を調製した。シリカゲル(15g)によるフラッシュカラムクロマトグラフィ(2%のMeOH/CH2Cl2)処理後、標記化合物(160mg、53%)を白色の泡状物として得た: 1H NMR (CDCl3) 3.47 (s, 6H), 3.64 - 3.71 (m, 16H), 3.85 (t, J = 4.4 Hz, 4H), 4.15 (t, J = 4.4 Hz, 4H), 5.19 (s, 4H), 5.21 (s, 4H), 6.47 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 6.54 (s, 2H), 6.72 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 6.97 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 7.27 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 7.38 (dd, J = 7.2, 7.6 Hz, 4H), 7.61 (d, J = 7.6 Hz, 4H), 7.76 (d, J = 8.8 Hz, 4H); 13C NMR (CDCl3) 56.4, 67.5, 69.5, 70.5, 70.6, 70.6, 70.8, 94.3, 95.9, 98.7, 107.5, 110.1, 114.9, 123.8, 126.6, 127.5, 128.5, 136.4, 159.4, 159.5, 160.6, 161.2, 177.3; LRMS (ESI) m/z 1055 (M+ + H, 11), 1077 (M+ + Na, 47); HRMS (ESI) C60H62O17Naの計算値 (M+ + Na) 1077.3885, 実測値 1077.3883.
【００４５】
1,22-ビス[4'-((5-ベンジルオキシ-7-メトキシメトキシ)-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-1,4,7,10,13,16,19,22-オクタオキサドコサン(21g): 上記フラボノイド二量体の合成のための一般手順のように、12a(220mg、0.54ミリモル)、ヘプタエチレングリコールジメシレート(160mg、0.33ミリモル)、K2CO3(370mg)及びDMF(10mL)からこの化合物を調製した。シリカゲル(15g)によるフラッシュカラムクロマトグラフィ(4% MeOH/CH2Cl2)処理後、標記化合物(160mg、54%)を白色の泡状物として得た: 1H NMR (CDCl3) 3.44 (s, 6H), 3.61 - 3.69 (m, 20H), 3.82 (t, J = 4.2 Hz, 4H), 4.12 (t, J = 4.2 Hz, 4H), 5.17 (s, 4H), 5.18 (s, 4H), 6.44 (d, J = 1.6 Hz, 2H), 6.51 (s, 2H), 6.69 (d, J = 1.6 Hz, 2H), 6.94 (d, J = 8.6 Hz, 4H), 7.25 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 7.36 (dd, J = 6.8, 7.0 Hz, 4H), 7.60 (d, J = 7.0 Hz, 4H), 7.34 (d, J = 8.6 Hz, 4H); 13C NMR (CDCl3) 56.4, 67.5, 69.5, 70.5, 70.5, 70.8, 94.3, 95.9, 98.6, 107.4, 110.1, 114.8, 123.7, 126.6, 127.5, 128.5, 128.7, 136.4, 159.3, 159.5, 160.6, 161.2, 177.3; LRMS (ESI) m/z 1099 (M+ + H, 7), 1121 (M+ + Na, 31); HRMS (ESI) C62H66O18Naの計算値 (M+ + Na) 1121.4147, 実測値 1121.4132.
1,25-ビス[4'-((5-ベンジルオキシ-7-メトキシメトキシ)-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-1,4,7,10,13,16,19,22,25-ノナオキサペンタコサン(21h): 上記フラボノイド二量体の合成のための一般手順のように、12a(250mg、0.62ミリモル)、オクタエチレングリコールジメシレート(200mg、0.38ミリモル)、K2CO3(420mg)及びDMF(10mL)からこの化合物を調製した。シリカゲル(15g)によるフラッシュカラムクロマトグラフィ(4% MeOH/CH2Cl2)処理後、標記化合物(170mg、48%)を白色の泡状物として得た: 1H NMR (CDCl3) 3.43 (s, 6H), 3.59 - 3.67 (m, 24 H), 3.80 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 4.10 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 5.15 (s, 4H), 5.16 (s, 4H), 6.43 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 6.50 (s, 2H), 6.68 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 6.92 (d, J = 9.2 Hz, 4H), 7.25 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.34 (dd, J = 7.6, 7.2 Hz, 4H), 7.59 (d, J = 7.2 Hz, 4H), 7.72 (d, J = 9.2 Hz, 4H); 13C NMR (CDCl3) 56.4, 67.5, 69.4, 70.5, 70.5, 70.8, 94.3, 95.9, 98.6, 107.4, 110.1, 114.8, 123.7, 126.5, 127.5, 128.5, 136.4, 159.3, 159.5, 160.6, 161.2, 161.2, 177.2; LRMS (ESI) m/z 1144 (M+ + H, 3), 1166 (M+ + Na, 21); HRMS (ESI) C64H70O19Naの計算値 (M+ + Na) 1165.4409, 実測値 1165.4424.
【００４６】
1,28-ビス[4'-((5-ベンジルオキシ-7-メトキシメトキシ)-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28-デカオキサオクタコサン(21i): 上記フラボノイド二量体の合成のための一般手順のように、12a(240mg、0.59ミリモル)、ノナエチレングリコールジメシレート(210mg、0.37ミリモル)、K2CO3(410mg)及びDMF(10mL)からこの化合物を調製した。シリカゲル(15g)によるフラッシュカラムクロマトグラフィ(4% MeOH/CH2Cl2)処理後、標記化合物(180mg、51%)を白色の泡状物として得た:1H NMR (CDCl3) 3.42 (s, 6H), 3.58 - 3.66 (m, 28H), 3.80 (t, J = 4.6 Hz, 4H), 4.10 (t, J = 4.6 Hz, 4H), 5.14 (s, 4H), 5.15 (s, 4H), 6.42 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 6.48 (s, 2H), 6.67 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 6.91 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 7.23 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.33 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 7.59 (d, J = 7.6 Hz, 4H), 7.71 (d, J = 8.8 Hz, 4H); 13C NMR (CDCl3) 56.3, 67.5, 69.4, 70.5, 70.5, 70.8, 94.2, 95.9, 98.6, 107.4, 110.1, 114.8, 123.7, 126.5, 127.5, 128.5, 136.4, 159.3, 159.5, 160.6, 161.2, 161.2, 177.2; LRMS (ESI) m/z 1188 (M+ + H, 3), 1210 (M+ + Na, 23); HRMS (ESI) C66H75O20の計算値 (M+ + H) 1187.4852, 実測値 1187.4825.
化合物21a-i及び23a-bの水素化分解のための一般手順: 丸底フラスコに化合物21又は23、触媒量の10% Pd/活性炭及びクロロホルムを充填した。反応混合液を、水素雰囲気下にバルーン圧力と室温で12時間活発に撹拌した。TLCが出発物質の完全な消費を示したときに、木炭を吸引濾過によって除去した。淡黄色のろ液をシリカゲルの短いパッドを通過させることによって精製して、脱保護生成物を得た。
1,4-ビス[4'-((5-ヒドロキシ-7-メトキシメトキシ)-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-1,4-ジオキサブタン(22a): 上記水素化分解のための一般手順のように、21a(64mg、0.08ミリモル)、10% Pd/木炭(15mg)及びクロロホルム(10mL)からこの化合物を調製した。標記化合物(43mg、86%)を白色固体として得た: m.p.: 206 - 207 oC; 1H NMR (CDCl3) 3.51 (s, 6H), 4.44 (s, 4H), 5.24 (s, 4H), 6.47 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 6.59 (s, 2H), 6.66 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 7.07 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 7.86 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 12.73 (s, 2H); 13C NMR (CDCl3) 56.4, 66.5, 94.2, 94.3, 100.1, 104.5, 106.2, 115.1, 124.0, 128.1, 157.5, 161.5, 162.0, 162.9, 163.9, 182.5; LRMS (ESI) m/z 655 (M+ + H, 14), 677 (M+ + Na, 8); HRMS (ESI) C36H31O12の計算値 (M+ + H) 655.1816, 実測値 655.1845.
【００４７】
1,7-ビス[4'-((5-ヒドロキシ-7-メトキシメトキシ)-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-1,4,7-トリオキサヘプタン(22b): 上記水素化分解のための一般手順のように、21b(88mg、0.10ミリモル)、10% Pd/木炭(18mg)及びクロロホルム(10mL)からこの化合物を調製した。標記化合物(60mg、86%)を白色固体として得た: m.p.: 171 - 172 oC; 1H NMR (CDCl3) 3.50 (s, 6H), 3.98 (t, J = 4.4 Hz, 4H), 4.24 (t, J = 4.4 Hz, 4H), 5.23 (s, 4H), 6.44 (d, J = 1.6 Hz, 2H), 6.55 (s, 2H), 6.62 (d, J = 1.6 Hz, 2H), 7.00 (d, J = 9.0 Hz, 4H), 7.79 (d, J =9.0 Hz, 4H), 12.63 (s, 2H); 13C NMR (d6-DMSO) 56.5, 68.0, 69.3, 94.3, 94.9, 99.8, 104.1, 105.6, 115.5, 123.0, 128.8, 157.4, 161.5, 162.1, 162.9, 164.1, 182.4; LRMS (ESI) m/z 699 (M+ + H, 5), 721 (M+ + Na, 3); HRMS (ESI) C38H35O13の計算値 (M+ + H) 699.2078, 実測値 699.2079.
1,10-ビス[4'-((5-ヒドロキシ-7-メトキシメトキシ)-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-1,4,7,10-テトラオキサデカン(22c): 上記水素化分解のための一般手順のように、21c(96mg、0.10ミリモル)、10% Pd/木炭(15mg)及びクロロホルム(10mL)からこの化合物を調製した。標記化合物(62mg、80%)を淡黄色の固形物として得た: m.p.: 159 - 160 oC; 1H NMR (CDCl3) 3.39 (s, 6H), 3.62 (d, J = 4.0 Hz, 4H), 3.76 (t, J = 4.6 Hz, 4H), 4.17 (t, J = 4.6 Hz, 4H), 5.28 (s, 4H), 6.37 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 6.76 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 6.87 (s, 2H), 7.06 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 7.96 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 12.85 (s, 2H); 13C NMR (d6-DMSO) 56.3, 67.8, 69.0, 70.3, 94.2, 94.7, 99.6, 103.9, 105.4, 115.2, 122.8, 128.6, 157.2, 161.4, 161.9, 162.7, 163.8, 182.2; LRMS (ESI) m/z 743 (M+ + H, 9); HRMS (ESI) C40H39O14の計算値 (M+ + H) 743.2340, 実測値 743.2343.
1,13-ビス[4'-((5-ヒドロキシ-7-メトキシメトキシ)-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-1,4,7,10,13-ペンタオキサトリデカン(22d): 上記水素化分解のための一般手順のように、21d(930mg、0.96ミリモル)、10% Pd/木炭(88mg)及びクロロホルム(20mL)からこの化合物を調製した。標記化合物(710mg、94%)を白色の泡状物として得た: 1H NMR (CDCl3) 3.39 (s, 6H), 3.55 - 3.59 (m, 8H), 3.76 (t, J = 4.6 Hz, 4H), 4.13 (d, J = 4.6 Hz, 4H), 5.28 (s, 4H), 6.37 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 6.75 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 6.85 (s, 2H), 7.04 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 7.95 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 12.84 (s, 2H); 13C NMR (d6-DMSO) 56.3, 56.3, 67.8, 69.0, 70.2, 94.2, 94.7, 99.6, 103.9, 105.4, 115.2, 122.8, 128.6, 157.1, 161.4, 161.9, 162.7, 163.8, 182.2; LRMS (ESI) m/z 787 (M+ + H, 57), 809 (M+ + Na, 60); HRMS (ESI)  C42H43O15の計算値 (M+ + H) 787.2602, 実測値 787.2591.
【００４８】
1,16-ビス[4'-((5-ヒドロキシ-7-メトキシメトキシ)-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-1,4,7,10,13,16-ヘキサオキサヘキサデカン(22e): 上記水素化分解のための一般手順のように、21e(75mg、0.07ミリモル)、10% Pd/木炭(12mg)及びクロロホルム(10mL)からこの化合物を調製した。標記化合物(52mg、84%)を白色の泡状物として得た: 1H NMR (CDCl3) 3.48 (s, 6H), 3.66 - 3.73 (m, 12H), 3.87 (t, J = 4.6 Hz, 4H), 4.17 (t, J =4.6 Hz, 4H), 5.22 (s, 4H), 6.42 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 6.52 (s, 2H), 6.61 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 6.97 (d, J = 9.0 Hz, 4H), 7.77 (d, J = 9.0 Hz, 4H), 12.72 (s, 2H); 13C NMR (CDCl3) 56.4, 67.0, 67.6, 69.5, 70.6, 70.8, 94.1, 94.2, 100.0, 104.2, 106.1, 115.0, 123.4, 127.9, 157.4, 161.7, 161.9, 162.8, 163.9, 182.4; LRMS (ESI) m/z 831 (M+ + H, 35), 853 (M+ + Na, 100); HRMS (ESI) C44H46O16Naの計算値 (M+ + Na) 853.2684, 実測値 853.2677.
1,19-ビス[4'-((5-ヒドロキシ-7-メトキシメトキシ)-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-1,4,7,10,13,16,19-ヘプタオキサノナデカン(22f): 上記水素化分解のための一般手順のように、21f(76mg、0.07ミリモル)、10% Pd/木炭(19mg)及びクロロホルム(10mL)からこの化合物を調製した。標記化合物(52mg、83%)を白色の泡状物として得た: 1H NMR (CDCl3) 3.47 (s, 6H), 3.64 - 3.72 (m, 16H), 3.85 (t, J = 4.6 Hz, 4H), 4.15 (t, J =4.6 Hz, 4H), 5.20 (s, 4H), 6.40 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 6.49 (s, 2H), 6.58 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 6.95 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 7.74 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 12.70 (s, 2H); 13C NMR (CDCl3) 56.3, 66.9, 67.5, 69.4, 70.4, 70.5, 70.7, 94.1, 94.1, 99.9, 104.1, 106.0, 114.9, 123.3, 127.8, 157.3, 161.7, 161.8, 162.7, 163.8, 182.3; LRMS (ESI) m/z 875 (M+ + H, 28), 897 (M+ + Na, 100); HRMS (ESI) C46H50O17Naの計算値 (M+ + Na) 897.2946, 実測値 897.2936.
1,22-ビス[4'-((5-ヒドロキシ-7-メトキシメトキシ)-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-1,4,7,10,13,16,19,22-オクタオキサドコサン(22g): 上記水素化分解のための一般手順のように、21g(102mg、0.09ミリモル)、10% Pd/木炭(21mg)及びクロロホルム(10mL)からこの化合物を調製した。標記化合物(78mg、91%)を白色の泡状物として得た: 1H NMR (CDCl3) 3.45 (s, 6H), 3.61 - 3.70 (m, 20H), 3.84 (t, J = 4.6 Hz, 4H), 4.12 (t, J =4.6 Hz, 4H), 5.18 (s, 4H), 6.38 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 6.47 (s, 2H), 6.56 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 6.93 (d, J = 9.0 Hz, 4H), 7.72 (d, J = 9.0 Hz, 4H), 12.70 (s, 2H); 13C NMR (CDCl3) 56.3, 67.6, 69.4, 70.5, 70.5, 70.8, 94.1, 94.2, 99.9, 104.1, 106.0, 114.9, 123.3, 127.9, 157.4, 161.8, 161.8, 162.8, 163.9, 182.3; LRMS (ESI) m/z 919 (M+ + H, 5), 941 (M+ + Na, 100); HRMS (ESI) C48H54O18Naの計算値 (M+ + Na) 941.3208, 実測値 941.3188.
【００４９】
1,25-ビス[4'-((5-ヒドロキシ-7-メトキシメトキシ)-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-1,4,7,10,13,16,19,22,25-ノナオキサペンタコサン(22h):  上記水素化分解のための一般手順のように、21h(89mg、0.08ミリモル)、10% Pd/木炭(16mg)及びクロロホルム(10mL)からこの化合物を調製した。標記化合物(62mg、83%)を白色の泡状物として得た: 1H NMR (CDCl3) 3.50 (s, 6H), 3.68 - 3.75 (m, 24H), 3.87 (t, J = 4.6 Hz, 4H), 4.18 (t, J =4.6 Hz, 4H), 5.23 (s, 4H), 6.44 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 6.54 (s, 2H), 6.62 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 6.98 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 7.78 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 12.72 (s, 2H); 13C NMR (CDCl3) 56.4, 56.4, 67.6, 69.5, 70.2, 70.3, 70.4, 70.7, 94.2, 94.3, 100.0, 104.3, 106.1, 115.0, 123.5, 128.0, 157.4, 161.7, 161.9, 162.9, 163.9, 182.4; LRMS (ESI) m/z 963 (M+ + H, 50), 985 (M+ + Na, 100); HRMS (ESI) C50H59O19の計算値 (M+ + H) 963.3651, 実測値 963.3637.
1,28-ビス[4'-((5-ヒドロキシ-7-メトキシメトキシ)-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28-デカオキサオクタコサン(22i): 上記水素化分解のための一般手順のように、フラボン21i(120mg、0.10ミリモル)、10% Pd/木炭(28mg)及びクロロホルム(10mL)からこの化合物を調製した。標記化合物(92mg、90%)を白色の泡状物として得た: 1H NMR (CDCl3) 3.39 (s, 6H), 3.53 - 3.63 (m, 28H), 3.77 (t, J = 4.6 Hz, 4H), 4.04 (t, J =4.6 Hz, 4H), 5.11 (s, 4H), 6.28 (d, J = 1.8 Hz, 2H), 6.37 (s, 2H), 6.47 (d, J = 1.8 Hz, 2H), 6.84 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 7.62 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 12.63 (s, 2H); 13C NMR (CDCl3) 56.0, 57.2, 69.1, 70.1, 70.2, 70.4, 93.8, 93.8, 99.5, 103.6, 105.6, 114.6, 122.8, 127.5, 156.9, 161.4, 161.5, 162.4, 163.5, 181.9; LRMS (ESI) m/z 1007 (M+ + H, 10), 1029 (M+ + Na, 58); HRMS (ESI) C52H62O20Naの計算値 (M+ + Na) 1029.3732, 実測値 1029.3696.
9-[4'-((5-ヒドロキシ-7-メトキシメトキシ)-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-3,6,9-トリオキサノナン-1-オール(24a): 上記水素化分解のための一般手順のように、23a(48mg、0.09ミリモル)、10% Pd/木炭(8mg)及びクロロホルム(10mL)からこの化合物を調製した。標記化合物(32mg、80%)を淡黄色の固形物として得た: m.p.: 57 - 59 oC; 1H NMR (CDCl3) 3.49 (s, 3H), 3.62 (t, J = 4.2 Hz, 2H), 3.70 - 3.75 (m, 6H), 3.89 (t, J = 4.7 Hz, 2H), 4.20 (t, J = 4.7 Hz, 2H), 5.23 (s, 2H), 6.45 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.56 (s, 1H), 6.64 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.00 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.81 (d, J = 8.8 Hz, 2H); 13C NMR (CDCl3) 56.2, 61.5, 67.4, 69.3, 70.1, 70.7, 72.3, 94.0, 94.1, 99.9, 104.1, 106.0, 114.8, 123.4, 127.8, 157.3, 161.6, 161.8, 162.3, 163.9, 182.3; LRMS (EI) m/z 446 (M+, 100); HRMS (EI) C23H26O9の計算値 (M+ ) 446.1577, 実測値 446.1570.
【００５０】
12-[4'-((5-ヒドロキシ-7-メトキシメトキシ)-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-3,6,9,12-テトラオキサドデカン-1-オール(24b):上記水素化分解のための一般手順のように、23b(150mg、0.26ミリモル)、10% Pd/木炭(22mg)及びクロロホルム(20mL)からこの化合物を調製した。標記化合物(122mg、96%)を淡黄色の油状物として得た: 1H NMR (CDCl3) 3.44 (s, 3H), 3.56 (t, J = 4.2 Hz, 2H), 3.62 - 3.69 (m, 10H), 3.82 (t, J = 4.5 Hz, 2H), 4.13 (t, J = 4.5 Hz, 2H), 5.18 (s, 2H), 6.44 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 6.53 (s, 1H), 6.70 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 6.94 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.74 (d, J = 8.8 Hz, 2H); 13C NMR (CDCl3) 56.2, 61.4, 67.3, 69.3, 70.0, 70.3, 70.4, 70.4, 70.6, 72.4, 94.1, 95.8, 98.5, 107.2, 109.9, 114.7, 123.6, 126.4, 127.4, 128.3, 136.2, 159.2, 159.3, 160.6, 161.0, 161.1, 177.2; LRMS (EI) m/z 490 (M+, 100); HRMS (EI) C25H30O10の計算値 (M+) 490.1839, 実測値 490.1828.
22a-iのMOM基の脱保護のための一般手順: 方法A: 丸底フラスコに、化合物22及び75% AcOHを充填した。反応混合液を、還流温度で14時間撹拌した。TLCが22の完全な消費を示したときに、反応混合液を0oCに冷却し、氷水を添加した。形成されたオフホワイトの固形物を吸引濾過によって集めた。方法B:丸底フラスコに、化合物22、6M HCl溶液及びTHFを充填した。反応混合液を、室温で15分間撹拌した。TLCが22の完全な消費を示したときに、反応混合液を、水を含有する分液漏斗に注入した。混合液を、EtOAc(20mL×3)で抽出した。合わせた有機層を、MgSO4で乾燥し、ろ過し、蒸発させて、粗混合物を得た。シリカゲルの短いパッドを通過させることにより粗混合液を精製して、所望の生成物を得た。
1,4-ビス[4'-((5,7-ジヒドロキシ)-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-1,4-ジオキサブタン(9a): 上記方法Aのように、化合物22a(43mg、0.07ミリモル)及び75%酢酸(20mL)からこの化合物を調製した。標記化合物(26mg、70%)を淡緑色の固形物として得た: m.p.: 352 - 355 oC; 1H NMR (d6-DMSO) 4.46 (s, 4H), 6.19 (d, J = 1.6 Hz, 2H), 6.50 (d, J = 1.6 Hz, 2H), 6.88 (s, 2H), 7.17 (d, J = 8.4 Hz, 4H), 8.04 (d, J = 8.4 Hz, 4H), 10.85 (s, 2H), 12.90 (s, 2H); 13C NMR (CDCl3) 67.0, 94.5, 99.3, 104.1, 104.2, 115.5, 123.4, 128.8, 157.8, 161.7, 161.9, 163.6, 164.7, 182.2; LRMS (EI) m/z 566 (M+, 11); HRMS (ESI) C32H23O10の計算値 (M+ + H) 567.1291, 実測値 567.1268.
【００５１】
1,7-ビス[4'-((5,7-ジヒドロキシ)-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-1,4,7-トリオキサヘプタン(9b): 上記方法Aのように、化合物22b(57mg、0.08ミリモル)及び75%酢酸(25mL)からこの化合物を調製した。標記化合物(42mg、84%)をオフホワイトの固形物として得た: m.p.: 268 - 270 oC; 1H NMR (d6-DMSO) 3.85 (s, 4H), 4.22 (s, 4H), 6.16 (d, J = 1.8 Hz, 2H), 6.46 (d, J = 1.8 Hz, 2H), 6.84 (s, 2H), 7.09 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 7.98 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 10.82 (s, 2H), 12.98 (s, 2H); 13C NMR (d6-DMSO) 68.0, 69.3, 94.4, 99.3, 103.9, 104.2, 115.4, 123.3, 128.7, 157.7, 161.9, 161.9, 163.6, 164.6, 182.2; LRMS m/z 611 (M+ + H, 8), 633 (M+ + Na, 3); HRMS C34H27O11の計算値 (M+ + H) 611.1553, 実測値 611.1542.
1,10-ビス[4'-((5,7-ジヒドロキシ)-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-1,4,7,10-テトラオキサデカン(9c): 上記方法Aのように、化合物22c(62mg、0.08ミリモル)及び75%酢酸(25mL)からこの化合物を調製した。標記化合物(43mg、79%)を淡黄色の固形物として得た: m.p.: 143 - 145 oC; 1H NMR (d6-DMSO) 3.81 (s, 4H), 3.95 (s, 4H), 4.36 (s, 4H), 6.35 (d, J = 1.0 Hz, 2H), 6.64 (d, J = 1.0 Hz, 2H), 7.01 (s, 2H), 7.27 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 8.16 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 11.00 (s, 2H), 13.08 (s, 2H); 13C NMR (d6-DMSO) 67.8, 69.0, 70.2, 94.2, 99.1, 103.7, 104.0, 115.2, 123.0, 128.5, 157.5, 161.7, 161.8, 163.4, 164.4, 182.0; LRMS (ESI) m/z 655 (M+ + H, 15); HRMS (ESI) C36H31O12計算値 (M+ + H) 655.1816, 実測値 655.1816.
1,13-ビス[4'-((5,7-ジヒドロキシ)-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-1,4,7,10,13-ペンタオキサトリデカン(9d): 上記方法Bのように、化合物22d(720mg、0.92ミリモル)、6M HCl溶液(70mL)及びTHF(50mL)からこの化合物を調製した。標記化合物(620mg、97%)を淡黄色の固形物として得た: m.p.: 131 - 133 oC; 1H NMR (d6-DMSO) 3.54 - 3.58 (m, 8H), 3.75 (t, J = 4.4 Hz, 4H), 4.15 (t, J = 4.4 Hz, 4H), 6.16 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 6.45 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 6.81 (s, 2H), 7.07 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 7.96 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 10.81 (s, 2H), 12.88 (s, 2H); 13C NMR (d6-DMSO) 68.0, 69.2, 70.3, 70.4, 94.4, 99.3, 103.9, 104.2, 115.4, 123.2, 128.7, 157.7, 161.8, 161.9, 163.6, 164.6, 182.2; LRMS (ESI) m/z 699 (M+ + H, 33), 721 (M+ + Na, 58); HRMS (ESI) C38H35O13Naの計算値 (M+ + Na) 721.1897, 実測値 721.1896.
【００５２】
1,16-ビス[4'-((5,7-ジヒドロキシ)-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-1,4,7,10,13,16-ヘキサオキサヘキサデカン(9e):  上記方法Bのように、化合物22e(48mg、0.06ミリモル)、6M HCl溶液(20mL)及びTHF(20mL)からこの化合物を調製した。標記化合物(37mg、86%)を淡黄色の泡状物として得た: 1H NMR (d6-アセトン) 3.59 - 3.65 (m, 12H), 3.83 (t, J = 4.6 Hz, 4H), 4.20 (t, J = 4.6 Hz, 4H), 6.22 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 6.51 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 6.63 (s, 2H), 7.09 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 7.95 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 12.90 (s, 2H); 13C NMR (d6-アセトン) 67.8, 69.2, 70.4, 70.5, 93.8, 98.8, 103.6, 104.4, 115.0, 123.4, 128.1, 157.8, 162.0, 164.0, 164.6, 182.2; LRMS (ESI) m/z 743 (M+ + H, 34), 765 (M+ + Na, 100); HRMS (ESI) C40H38O14Naの計算値 (M+ + Na) 765.2159, 実測値 765.2164.
1,19-ビス[4'-((5,7-ジヒドロキシ)-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-1,4,7,10,13,16,19-ヘプタオキサノナデカン(9f): 上記方法Bのように、化合物22f(45mg、0.05ミリモル)、6M HCl溶液(20mL)及びTHF(20mL)からこの化合物を調製した。標記化合物(36mg、89%)を淡黄色の泡状物として得た: 1H NMR (d6-アセトン) 3.56 - 3.65 (m, 16H), 3.81 (t, J = 4.6 Hz, 4H), 4.17 (t, J = 4.6 Hz, 4H), 6.22 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 6.48 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 6.57 (s, 2H), 7.02 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 7.88 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 12.88 (s, 2H); 13C NMR (d6-アセトン) 67.7, 69.2, 70.3, 70.3, 70.5, 93.9, 98.8, 103.5, 104.4, 114.9, 123.3, 128.0, 157.6, 162.0, 162.3, 163.6, 163.9, 182.0; LRMS (ESI) m/z 809 (M+ + Na, 15); HRMS (ESI) C42H43O15の計算値 (M+ + H) 787.2602, 実測値 787.2614.
1,22-ビス[4'-((5,7-ジヒドロキシ)-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-1,4,7,10,13,16,19,22-オクタオキサドコサン(9g): 上記方法Bのように、化合物22g(65mg、0.07ミリモル)、6M HCl溶液(20mL)及びTHF(20mL)からこの化合物を調製した。標記化合物(58mg、99%)を淡黄色の泡状物として得た: 1H NMR (d6-アセトン) 3.54 - 3.65 (m, 20H), 3.81 (t, J = 4.6 Hz, 4H), 4.18 (t, J = 4.6 Hz, 4H), 6.23 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 6.49 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 6.59 (s, 2H), 7.04 (d, J = 9.0 Hz, 4H), 7.90 (d, J = 9.0 Hz, 4H), 12.90 (s, 2H); 13C NMR (d6-アセトン) 67.7, 69.2, 70.3, 70.3, 70.5, 93.9, 98.8, 103.6, 104.4, 114.9, 123.3, 128.0, 157.8, 162.0, 162.0, 163.6, 163.9, 182.0; LRMS (ESI) m/z 853 (M+ + Na, 36); HRMS (ESI) C44H47O16の計算値 (M+ + H) 831.2864, 実測値 831.2889.
【００５３】
1,25-ビス[4'-((5,7-ジヒドロキシ)-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-1,4,7,10,13,16,19,22,25-ノナオキサペンタコサン(9h): 上記方法Bのように、化合物22h(50mg、0.05ミリモル)、6M HCl溶液(20mL)及びTHF(20mL)からこの化合物を調製した。標記化合物(42mg、92%)を淡黄色の泡状物として得た: 1H NMR (d6-アセトン) 3.53 - 3.65 (m, 24H), 3.83 (t, J = 4.6 Hz, 4H), 4.19 (t, J = 4.6 Hz, 4H), 6.23 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 6.51 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 6.62 (s, 2H), 7.07 (d, J = 9.0 Hz, 4H), 7.94 (d, J = 9.0 Hz, 4H), 12.88 (s, 2H); 13C NMR (d6-アセトン) 67.8, 69.2, 70.3, 70.3, 70.5, 93.9, 98.8, 103.6, 104.4, 115.0, 123.3, 128.0, 157.6, 162.0, 162.3, 163.7, 163.9, 182.0; LRMS (ESI) m/z 875 (M+ + H, 3), 897 (M+ + Na, 100); HRMS (ESI) C46H51O17の計算値 (M+ + H) 875.3126, 実測値 875.3145.
1,28-ビス[4'-((5,7-ジヒドロキシ)-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28-デカオキサオクタコサン(9i): 上記方法Bのように、化合物22i(78mg、0.08ミリモル)、6M HCl溶液(20mL)及びTHF(20mL)からこの化合物を調製した。標記化合物(69mg、97%)を淡黄色の油状物として得た: 1H NMR (d6-アセトン) 3.53 - 3.64 (m, 28H), 3.80 (t, J = 4.6 Hz, 4H), 4.15 (t, J = 4.6 Hz, 4H), 6.23 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 6.48 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 6.57 (s, 2H), 7.02 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 7.88 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 12.94 (s, 2H); 13C NMR (d6-アセトン) 67.7, 69.2, 70.3, 70.3, 70.5, 93.9, 98.9, 103.5, 104.4, 114.9, 123.2, 128.0, 157.7, 162.0, 162.3, 163.6, 164.0, 182.0; LRMS (ESI) m/z 919 (M+ + H, 4), 941 (M+ + Na, 100); HRMS (ESI) C48H55O18の計算値 (M+ + H) 919.3388, 実測値 919.3399.
9-[4'-((5,7-ジヒドロキシ)-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-3,6,9-トリオキサノナン-1-オール(10a): 上記方法Bのように、化合物24a(28mg、0.06ミリモル)、6M HCl溶液(10mL)及びTHF(10mL)からこの化合物を調製した。標記化合物(19mg、75%)を淡黄色の固形物として得た: m.p.: 135 - 137 oC; 1H NMR (d6-DMSO) 3.40 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 3.45 - 3.59 (m, 6H), 3.75 (t, J = 4.4 Hz, 2H), 4.18 (t, J = 4.4 Hz, 2H), 4.57 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 6.18 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.48 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.86 (s, 1H), 7.10 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 8.00 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 10.85 (br, 1H), 12.91 (s, 1H); 13C NMR (d6-DMSO) 60.6, 68.0, 69.2, 70.2, 70.4, 72.8, 94.4, 99.3, 103.9, 104.2, 115.4, 123.2, 128.7, 157.7, 161.8, 162.0, 163.7, 164.6, 182.2; LRMS (EI) m/z 402 (M+, 100); HRMS (EI) C21H22O8の計算値 (M+) 402.1315, 実測値 402.1297.
【００５４】
12-[4'-((5,7-ジヒドロキシ)-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-3,6,9,12-テトラオキサドデカン-1-オール(10b): 上記方法Bのように、化合物24b(80mg、0.16ミリモル)、6M HCl溶液(10mL)及びTHF(10mL)からこの化合物を調製した。標記化合物(65mg、89%)を淡黄色の油状物として得た: 1H NMR (CDCl3) 3.61 (t, J = 4.1 Hz, 2H), 3.68 - 3.75 (m, 10H), 3.84 (t, J = 4.4 Hz, 2H), 4.05 (t, J = 4.4 Hz, 2H), 6.21 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.28 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.35 (s, 1H), 6.74 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.52 (d, J = 8.8 Hz, 2H); 13C NMR (CDCl3) 61.4, 67.2, 69.4, 69.8, 70.4, 70.4, 70.4, 72.2, 94.2, 99.4, 103.1, 104.4, 114.4, 122.7, 127.3, 157.3, 161.2, 161.5, 163.3, 181.9; LRMS (EI) m/z 446 (M+, 97); HRMS (EI) C23H26O9の計算値 (M+) 446.1577, 実測値 446.1574.
化合物9j(n=10)を、経路Aによって調製した: アセトニトリル(5mL/ミリモル)中のビスメシレート13b(n=10)(1ミリモル)の撹拌溶液に、固体炭酸カリウム(6ミリモル)及び4-ヒドロキシベンズアルデヒド(2.2ミリモル)を添加し、得られた反応混合液を80oCで16時間加熱した。この後に、反応をろ過し、固形物をジクロロメタンで洗浄した。ジクロロメタン/アセトニトリル母液を減圧下で蒸発させ、フラッシュカラムクロマトグラフィ(EtOAc)(61%)により精製した後、ビスアルデヒド11j(n=10)を無色の油状物として得た。1H NMR (CDCl3, 400 MHz): 3.6 - 3.75 (m, 32H), 3.87 (m, 4H), 4.20 (m, 4H), 7.01 (d, J = 8.5 Hz, 4H), 7.81 (d, J = 8.5 Hz, 4H), 9.87 (s, 2H); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz): 67.68, 69.40, 70.47, 70.52, 70.81, 114.83, 130.0, 131.92, 163.82, 190.82; ES-MS C34H51O13の計算値 (MH+) 667.3330 実測値 667.3345.
THF(0.25mL/ミリモル)中のビスアルデヒド11j(n=10)(1ミリモル)及び2,4-ジベンジルオキシ-5-ヒドロキシアセトフェノン(2.1ミリモル)の撹拌溶液に、60%(w/v)KOH(0.25mL/ミリモル)の溶液を添加した。得られた溶液を室温で16時間撹拌した。この後に、反応混合液を水に注入し、有機層が無色になるまで酢酸エチルで繰り返し洗浄した(典型的には3回)。合わせた有機層を、乾燥(MgSO4)し、ろ過し、減圧下で蒸発し、EtOAcに抽出し、減圧下で濃縮して、カルコン16j(n=10)を黄色の油状物として得た(収率>95%)。これを精製せずただちに次の工程に用いた。1H NMR (CDCl3, 400 MHz): 3.60-3.75 (m, 36H), 3.78 (m, 4H), 4.13 (m, 4H), 5.06 (s, 4H), 5.10 (s, 4H), 6.16 (d, J = 2 Hz, 2H), 6.21 (d, J = 2 Hz, 2H), 6.70 (d, J = 8.5 Hz, 4H), 6.99 (d, J = 8.5 Hz, 4H), 7.27- 7.5 (m, 20H), 7.68 (d, J = 16 Hz, 2H), 7.77 (d, J = 16 Hz, 2H), 14.76 (s, 2H).
【００５５】
150oCにおけるDMSO(最低容積)中のカルコン16jの撹拌溶液に、少量のヨウ素を添加した(典型的には一つの結晶)。得られた反応混合液を、更に16時間又は小さいアリコートの1H NMR分光分析を用いて反応が完全であることがわかるまで、一定温度で撹拌した。反応の完了後、混合液を水(10mL/mLの使用DMSO)に注入し、得られた黄色の懸濁液を酢酸エチルで洗浄した。有機層が透明になるまで、洗浄を続けた(典型的には3-4回)。次に、合わせた有機層を5%チオ硫酸ナトリウム液、水で洗浄した後、乾燥し(MgSO4)、ろ過し、減圧下で蒸発させ、フラッシュカラムクロマトグラフィ(勾配1:5〜1:3のアセトン/DCM)(16%)による精製後、フラボノイド二量体17j(n=10)を薄い橙色/褐色の油状物として得た。1H NMR (CDCl3, 400 MHz): 3.6-3.75 (m, 32H), 3.87 (m, 4H), 4.19 (m, 4H), 5.10 (s, 4H), 5.20 (s, 4H), 6.44 (d, J = 2 Hz, 2H), 6.58 (s, 2H), 6.62 (d, J = 2 Hz, 2H), 7.01 (d, J = 8.5 Hz, 4H), 7.27- 7.40 (m, 16H), 7.61 (d, J = 8.5 Hz, 4H), 7.79 (d, J = 8.5 Hz, 4H).
THF中の保護ビスフラボノイド17jの溶液を含有するフラスコに、混合液がちょうど濁り始めるまで水を滴下した。この点で、全ての材料が可溶になるまでTHFを滴下した。10%パラジウム/炭素(典型的には1当量/質量)を添加し、得られた黒色の懸濁液を脱ガスし、水素ガスを充填した。1H NMR分光法による分析がベンジル保護基の完全な除去を示すまで得られた反応混合液を室温で急速に撹拌した。反応の終了時に、溶媒を減圧下で除去して、化合物9j(n=10)を橙色/褐色の油状物として得た。1H NMR (d6-アセトン, 400 MHz): 3.54-3.64 (m, 32H), 3.88 (m, 4H), 4.26 (m, 4H), 6.27 (d, J = 2 Hz, 2H), 6.56 (d, J = 2 Hz, 2H), 6.67 (s, 2H), 7.14 (d, J = 8 Hz, 4H), 8.02 (d, J = 8 Hz, 4H), 13.01 (s, 2H).
9jのために記載された同じ手順を用いて化合物9k(平均n=13)を調製したが、ジメシレート13b(平均n=13)は市販の13(平均n=13)から調製した。フラッシュカラムクロマトグラフィ(EtOAc)(61%)により精製した後、化合物11k(平均n=13)を無色の油状物として得た。1H NMR (CDCl3, 400 MHz) 3.6 - 3.75 (m, 〜44H), 3.88 (m, 4H), 4.22 (m, 4H), 7.00 (d, J = 8.5 Hz, 4H), 7.81 (d, J = 8.5 Hz, 4H), 9.88 (s, 2H). EtOAcで抽出し、減圧下で濃縮(収率>95%)した後、化合物16k(平均n=13)を黄色の油状物として得た。これを精製せずにただちに次の工程に用いた。1H NMR (CDCl3, 400 MHz): 3.60-3.75 (m,〜44H), 3.80 (m, 4H), 4.14 (m, 4H), 5.07 (s, 4H), 5.10 (s, 4H), 6.18 (d, J = 2 Hz, 2H), 6.23 (d, J = 2 Hz, 2H), 6.73 (d, J = 8.5 Hz, 4H), 7.03 (d, J = 8.5 Hz, 4H), 7.27- 7.5 (m, 20H), 7.69 (d, J = 16 Hz, 2H), 7.77 (d, J = 16 Hz, 2H), 14.76 (s, 2H). フラッシュカラムクロマトグラフィ(勾配1:5〜1:3アセトン/DCM)(28%)により精製した後、化合物17k(平均n=13)を薄い橙色/褐色の油状物として分離した。1H NMR (CDCl3, 400 MHz): 3.6-3.75 (m, 〜44H), 3.89 (m, 4H), 4.20 (m, 4H), 5.13 (s, 4H), 5.23 (s, 4H), 6.47 (bs 2H), 6.56 (bs, 2H), 6.62 (bs, 2H), 7.00 (m, 4H), 7.27- 7.40 (m, 16H), 7.61 (m 4H), 7.78 (m, 4H). 化合物9k(平均n=13)を橙色/褐色の油状物として得た。1H NMR (d6-アセトン, 400 MHz): 3.54-3.64 (m, 〜44H), 3.87 (m, 4H), 4.26 (m, 4H), 6.27 (br, 2H), 6.55 (br, 2H), 6.70 (br, 2H), 7.1 (m, 4H), 8.0 (m, 4H).
【００５６】
ポリエチレングリコール結合アピゲニン類似体二量体の合成
カルコン32a-lの合成のための一般手順: 丸底フラスコに、2'-ヒドロキシアセトフェノン31(1.0当量)、4-アリルオキシベンズアルデヒド(1.0当量)及び過剰量の水酸化カリウム溶液(96% 3MEtOH溶液)を充填した。混合液を室温で16時間撹拌した。TLCが2'-ヒドロキシアセトフェノンの完全な消費を示した時に、反応混合液を氷浴温度において1M HCl溶液でpH 5の酸性にした。混合液をCH2Cl2(30mL×3)で連続して抽出した。合わせた有機層を、MgSO4で乾燥し、ろ過し、減圧下で蒸発させて、粗混合液を得、これを5%酢酸エチル/ヘキサンで洗浄して、所望のカルコンを得た。
フラボン33a-lの合成のための一般手順: 50oCにおけるジメチルスルホキシド中のカルコン32のよく撹拌された溶液に、触媒量のヨウ素(4モル%)を一度に添加した。次に、反応混合液を130oCで12時間撹拌した。加熱中に、反応混合液が薄茶色から暗褐色に徐々に変わった。TLCがカルコン32の完全な消費を示したときに、反応混合液を水(200mL)を含有する分液漏斗に注入した。混合液をCH2Cl2(30mL×3)で抽出した。混合液が二層に分離することができない場合には、1M HCl(20mL)を添加した。合わせた有機層を、0.5%チオ硫酸ナトリウム液で洗浄し、MgSO4で乾燥し、ろ過し、蒸発して、粗反応混合液を得、これを結晶化して、所望のフラボン33を得た。
フラボン33a-lのアリル基の脱保護による34a-lの合成のための一般手順: 還流温度におけるフラボン33(1当量)、K2CO3(6当量)及びMeOHを充填した丸底フラスコに、触媒量のPd(PPh3)4(2モル%)を一度に添加した。反応混合液を還流温度で2時間撹拌した。TLCが33の完全な消費を示したときに、反応混合液を水(200mL)を含有するビーカーに注入した。この溶液を1M HCl溶液を用いてpH 4の酸性にし、非常に多くのオフホワイトの固形物を形成し、これを吸引濾過によって集めた。集めた固形物をアセトンに溶解し、不溶性の暗色の木炭状物をろ過によって除去した。得られた褐色のろ液を減圧下で蒸発させて、標記化合物34を得た。これらのフラボンの一部は、以前に文献に報告されている[Cpd 33a-Huang, X.; Tang, E.; Xu, W.-M.; Cao, J. J. Comb. Chem. 2005, 7, 802 − 805. Cpd 34a-Miyake, H.; Takizawa, E.; Sasaki, M.; Bull. Chem. Soc. Jpn., 2003, 76, 835 − 836. Cpd 34d-Jesthi, P. K.; Sabat, B. K.; Rout, M. K. J. Indian Chem. Soc. 1965, 42, 105 − 108. Cpd 34e-Ono, M.; Yoshida, N.; Ishibashi, K.; Haratake, M.; Arano, Y.; Mori, H.; Nakayama, M. J. Med. Chem., 2005, 48, 7253 − 7260. Cpd 34f-Jha, B. C.; Amin, G. C. Tetrahedron 1958, 2, 241 − 245. Cpd 34i-Pelter, A.; Bradshaw, J.; Warren, R. Phytochemistry 1971, 10, 835 − 850. Cpd 34i-Pelter, A.; Ward, R. S.; Balasubramanian, M. Chem. Comm. 1976, 4, 151 − 152. Cpd 34j and Cpd 34k-Prendergast, Patrick T. Use of flavones, coumarins and related compounds to treat infections. PCT Int. Appl. (2001), 70 pp. Cpd 34l- Bargellini, G.; Grippa, A. Gazzetta Chimica Italiana 1927, 57, 605 − 609.]。
【００５７】
フラボン二量体35a-lの合成のための一般手順: 丸底フラスコに、フラボン34(1.6当量)、テトラエチレングリコールジメシレート(1.0当量)、K2CO3(4当量)及びDMFを充填した。反応混合液を還流温度で2〜3時間撹拌した。加熱中に、反応混合液を濃い茶色から乳白色に徐々に変わった。TLCがフラボン34の完全な消費を示したときに、反応混合液を水(200mL)を含有する分液漏斗に注入した。混合液をCH2Cl2(20mL×3)で連続して抽出した。混合液を二層に分離することができない場合には、1M HCl(20mL)を添加した。合わせた有機層を、MgSO4で乾燥し、ろ過し、蒸発させて、粗反応混合液を得た。フラボン二量体35の精製は、アセトンから結晶化又は下で示されるシリカゲル(溶離剤として20%アセトン/CH2Cl2)によるフラッシュカラムクロマトグラフィによって行った。
1,13-ビス[4'-(4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-1,4,7,10,13-ペンタオキサトリデカン(35a) シリカゲルによるフラッシュカラムクロマトグラフィ処理後に、標記化合物(0.98g、37%)を淡黄色の固形物として得た: 1H NMR (CDCl3) 3.63 − 3.67 (m, 8H), 3.79 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 4.06 (t, J = 4.4 Hz, 4H), 6.57 (s, 2H), 6.87 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 7.25 (dd, J = 7.6, 7.6 Hz, 2H), 7.37 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.53 (ddd, J = 1.2, 7.6, 7.6 Hz, 2H), 7.68 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 8.06 (dd, J = 0.8, 7.6 Hz, 2H); 13C NMR (CDCl3) 67.3, 69.2, 70.4, 70.5, 105.6, 114.6, 117.6, 123.5, 123.5, 124.7, 125.1, 127.5, 133.3, 155.7, 161.3, 162.8, 177.9.
1,13-ビス[4'-(7-フルオロ-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-1,4,7,10,13-ペンタオキサトリデカン(35b) シリカゲルによるフラッシュカラムクロマトグラフィ処理後に、標記化合物(0.15g、54%)を淡黄色の固形物として得た: 1H NMR (CDCl3) 3.68 − 3.74 (m, 8H), 3.87 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 4.16 (t, J = 4.4 Hz, 4H), 6.65 (s, 2H), 6.98 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 7.08 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.16 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.77 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 8.17 (dd, J = 6.4, 8.8 Hz, 2H); 13C NMR (CDCl3) 67.6, 69.5, 70.6, 70.8, 104.5, 104.7, 106.0, 113.6, 113.8, 115.0, 120.6, 123.6, 127.9, 156.9, 157.1, 161.7, 163.5, 164.2, 166.8, 177.3.
1,13-ビス[4'-(6-フルオロ-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-1,4,7,10,13-ペンタオキサトリデカン(35c) シリカゲルによるフラッシュカラムクロマトグラフィ処理後に、標記化合物(0.13g、55%)を白色固形物として得た: m.p.: 147 − 149 oC; 1H NMR (CDCl3) 3.66 − 3.75 (m, 8H), 3.88 (t, J = 4.4 Hz, 4H), 4.17 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 6.68 (s, 2H), 6.98 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 7.36 (dt, J = 0.4, 6.0 Hz, 2H), 7.49 (dd, J = 4.0, 8.8 Hz, 2H), 7.80 (d, J = 8.0 Hz, 6H); 13C NMR (CDCl3) 67.6, 69.5, 70.6, 70.8, 105.3, 110.4, 110.6, 115.0, 120.0, 121.5, 121.8, 123.7, 124.9, 127.9, 152.2, 158.2, 160.7, 161.7, 163.5, 177.4.
【００５８】
1,13-ビス[4'-(6-クロロ-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-1,4,7,10,13-ペンタオキサトリデカン(35d) アセトンから結晶化した後、標記化合物(48mg、31%)を黄色の固形物として得た: m.p.: 180 − 182 oC; 1H NMR (CDCl3) 3.70 − 3.76 (m, 8H), 3.90 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 4.18 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 6.70 (s, 2H), 7.00 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 7.47 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.60 (dd, J = 2.8, 8.8 Hz, 2H), 7.81 (d, J = 8.8 Hz, 4H) 8.14 (d, J = 2.4 Hz, 2H); 13C NMR (CDCl3) 67.6, 69.5, 70.7, 70.8, 105.9, 115.0, 119.6, 123.6, 124.8, 125.1, 127.9, 131.0, 133.7, 154.4, 161.8, 163.5, 177.0; LRMS (ESI) m/z 703 (M+ + H, 10), 725 (M+ + Na, 37); HRMS (ESI) C38H33O9Cl2の計算値 (M+ + H) 703.1502, 実測値 703.1505.
1,13-ビス[4'-(6-ブロモ-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-1,4,7,10,13-ペンタオキサトリデカン(35e) シリカゲルによるフラッシュカラムクロマトグラフィ処理後に、標記化合物(43mg、34%)を黄色の固形物として得た: m.p.: 184 − 186 oC; 1H NMR (CDCl3) 3.69 − 3.75 (m, 8H), 3.88 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 4.17 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 6.68 (s, 2H), 6.98 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 7.38 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 7.71 (dd, J = 2.4, 8.8 Hz, 2H), 7.78 (d, J = 8.8 Hz, 4H) 8.27 (d, J = 2.0 Hz, 2H); 13C NMR (CDCl3) 67.6, 69.5, 70.6, 70.8, 106.0, 115.0, 119.8, 123.6, 125.1, 127.9, 128.2, 136.5, 154.8, 161.8, 163.5, 176.9; LRMS (ESI) m/z 793 (M+ + H, 8), 815 (M+ + Na, 20); HRMS (ESI) C38H33O9Br2の計算値 (M+ + H) 791.0491, 実測値 791.0506.
1,13-ビス[4'-(6,8-ジクロロ-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-1,4,7,10,13-ペンタオキサトリデカン(35f) シリカゲルによるフラッシュカラムクロマトグラフィ処理後に、標記化合物(45mg、28%)を白色固形物を得た: m.p.: 147 − 148 oC; 1H NMR (CDCl3) 3.70 − 3.76 (m, 8H), 3.90 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 4.18 (t, J = 4.4 Hz, 4H), 6.71 (s, 2H), 7.00 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 7.67 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 7.85 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 8.03 (d, J = 2.8 Hz, 2H); 13C NMR (CDCl3) 67.7, 69.5, 70.7, 70.8, 105.6, 115.1, 123.1, 123.8, 124.2, 125.6, 128.1, 130.7, 133.5, 150.2, 162.0, 163.3, 176.2; LRMS (ESI) m/z 773 (M+ + H, 29), 795 (M+ + Na, 100); HRMS (ESI) C38H31O9Cl4の計算値 (M+ + H) 771.0722, 実測値 771.0730.
【００５９】
1,13-ビス[4'-(7-メチル-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-1,4,7,10,13-ペンタオキサトリデカン(35g) シリカゲルによるフラッシュカラムクロマトグラフィ処理後に、標記化合物(0.12g、33%)を白色固形物として得た: m.p.: 128 − 129 oC; 1H NMR (CDCl3) 2.45 (s, 6H), 3.68 − 3.75 (m, 8H), 3.87 (t, J = 4.4 Hz, 4H), 4.16 (t, J = 4.4 Hz, 4H), 6.66 (s, 2H), 6.98 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 7.16 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.28 (s, 2H), 7.79 (d, J = 8.4 Hz, 4H), 8.03 (d, J = 8.0 Hz, 2H); 13C NMR (CDCl3) 21.8, 67.6, 69.5, 70.7, 70.8, 105.9, 114.9, 117.7, 121.5, 124.1, 125.2, 126.5, 127.8, 144.9, 156.2, 161.5, 163.0, 178.3; LRMS (ESI) m/z 663 (M+ + H, 97), 685 (M+ + Na, 100); HRMS (ESI) C40H39O9の計算値 (M+ + H) 663.2594, 実測値 663.2588.
1,13-ビス[4'-(6-メチル-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-1,4,7,10,13-ペンタオキサトリデカン(35h) シリカゲルによるフラッシュカラムクロマトグラフィ処理後に、標記化合物(47mg、36%)を白色固形物として得た: m.p.: 139 − 140 oC; 1H NMR (CDCl3) 2.42 (s, 6H), 3.69 − 3.75 (m, 8H), 3.88 (t, J = 4.4 Hz, 4H), 4.16 (t, J = 4.4 Hz, 4H), 6.69 (s, 2H), 6.98 (d, J = 8.4 Hz, 4H), 7.38 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.44 (dd, J = 1.6, 8.4 Hz, 2H), 7.80 (d, J = 8.4 Hz, 4H), 7.94 (s, 2H); 13C NMR (CDCl3) 20.9, 67.6, 69.5, 70.6, 70.8, 105.9, 114.9, 117.6, 123.4, 124.1, 124.9, 127.8, 134.8, 135.0, 154.3, 161.5, 163.1, 178.4; LRMS (ESI) m/z 663 (M+ + H, 79), 685 (M+ + Na, 100); HRMS (ESI) C40H39O9の計算値 (M+ + H) 663.2594, 実測値 663.2586.
1,13-ビス[4'-(7-メトキシ-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-1,4,7,10,13-ペンタオキサトリデカン(35i) シリカゲルによるフラッシュカラムクロマトグラフィ処理後に、標記化合物(95mg、33%)を淡黄色の固形物として得た: m.p.: 128 − 130 oC; 1H NMR (CDCl3) 3.69 − 3.75 (m, 8H), 3.88 (t, J = 4.4 Hz, 4H), 3.90 (s, 6H), 4.17 (t, J = 4.4 Hz, 4H), 6.65 (s, 2H), 6.89 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 6.93 (dd, J = 2.0, 8.4 Hz, 2H), 6.99 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 7.79 (d, J = 8.4 Hz, 4H), 8.07 (d, J = 8.8 Hz, 2H); 13C NMR (CDCl3) 55.8, 67.6, 69.5, 70.7, 70.8, 100.3, 105.9, 114.2, 114.9, 117.6, 124.1, 126.9, 127.7, 157.8, 161.4, 162.9, 164.0, 177.8; LRMS (ESI) m/z 695 (M+ + H, 63), 717 (M+ + Na, 100); HRMS (ESI) C40H39O11の計算値 (M+ + H) 695.2492, 実測値 695.2495.
【００６０】
1,13-ビス[4'-(6-メトキシ-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-1,4,7,10,13-ペンタオキサトリデカン(35j) アセトンから結晶化した後、標記化合物(0.17g、45%)を白色固体として得た: m.p.: 129 − 130 oC; 1H NMR (CDCl3) 3.70 − 3.74 (m, 8H), 3.87 (s, 6H), 3.88 (t, J = 4.4 Hz, 4H), 4.16 (t, J = 4.4 Hz, 4H) 6.70 (s, 2H), 6.98 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 7.24 (dd, J = 2.8, 8.8 Hz, 2H), 7.43 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 7.53 (d, J = 2.8 Hz, 2H), 7.80 (d, J = 8.8 Hz, 4H); 13C NMR (CDCl3) 55.9, 67.6, 69.5, 70.7, 70.8, 104.7, 105.3, 114.9, 119.3, 123.5, 124.3, 127.8, 150.9, 156.8, 161.5, 163.1, 178.1; LRMS (ESI) m/z 695 (M+ + H, 47), 717 (M+ + Na, 100); HRMS (ESI) C40H39O11の計算値 (M+ + H) 695.2492, 実測値 695.2493.
1,13-ビス[4'-(5-メトキシ-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-1,4,7,10,13-ペンタオキサトリデカン(35k) シリカゲルによるフラッシュカラムクロマトグラフィ処理後に、標記化合物(0.11g、39%)を白色固形物として得た: m.p.: 60 − 61 oC; 1H NMR (CDCl3) 3.68 − 3.72 (m, 8H), 3.86 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 3.95 (s, 6H), 4.14 (t, J = 4.4 Hz, 4H), 6.61 (s, 2H), 6.77 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.96 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 7.05 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.51 (dd, J = 8.0, 8.0 Hz, 2H), 7.77 (d, J = 8.8 Hz, 2H); 13C NMR (CDCl3) 56.4, 67.5, 69.5, 70.6, 70.8, 106.3, 107.5, 110.0, 114.8, 123.6, 127.6, 133.5, 158.1, 159.6, 161.0, 161.3, 178.2.
1,13-ビス[4'-(6,7-ジメトキシ-4H-クロメン-4-オン-2-イル)フェニル]-1,4,7,10,13-ペンタオキサトリデカン(35l) アセトンから結晶化した後、標記化合物(0.11g、39%)を白色固形物として得た: m.p.: 71 − 72 oC; 1H NMR (CDCl3) 3.67 − 3.71 (m, 8H), 3.85 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 3.89 (s, 6H), 3.95 (s, 6H), 4.12 (t, J = 4.4 Hz, 4H), 6.60 (s, 2H), 6.85 (s, 2H), 6.92 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 7.40 (s, 2H), 7.71 (d, J = 8.8 Hz, 4H); 13C NMR (CDCl3) 56.1, 56.3, 67.5, 69.4, 70.6, 70.7, 99.5, 104.0, 105.3, 114.8, 116.9, 124.0, 127.5, 147.3, 151.9, 154.1, 161.2, 162.5, 177.3; LRMS (ESI) m/z 755 (M+ + H, 48), 777 (M+ + Na, 100); HRMS (ESI) C42H42O13Na計算値 (M+ + Na) 777.2523, 実測値 777.2512.
【００６１】
ポリエチレングリコール結合アピゲニン二量体の効力
1〜13のエチレングリコール単位に結合した一連のアピゲニン二量体9a-9kの効力を、異なるMDR癌細胞を増感する際に評価する。これらの活性を、アピゲニン自体だけでなくモノマー10a及び10bと比較する。P-gpによって仲介される薬剤排出を逆転させる能力も評価した。
一部のP-gpとMRP輸送体が寄生原虫類リーシュマニア属の薬剤耐性に関与することが最近証明された(原虫耐性に関与する薬剤輸送機序における化学増感剤。Curr. Drug Targets Infect. Disord. 2005, 5, 411-31)。L.タレントレにおける五価のアンチモン化合物スチボグルコン酸ナトリウム(SSG)に対する耐性は、MRP部材(LtPGPA)によるものである。ペンタミジン耐性が標的、ミトコンドリアからペンタミジンを排除することによるものであることが報告された(リーシュマニア・ドノバニ及びリーシュマニア・アマゾネンシス前鞭毛期及び無菌無鞭毛型におけるペンタミジン取り込み。Biochem. J. 1996, 315 (Pt 2), 631-4)。一部のフラボノイドが癌におけるP-gpタイプのMDRの調節に検討されるとともに種々のATP-結合タンパク質、例えば、細胞質膜ATPアーゼ、環状AMP依存性タンパク質キナーゼやタンパク質キナーゼCを阻害することができたので、本発明のフラボノイド二量体がNBDに結合するのにアピゲニンの効力を増大させ、それによってP-gpを不活性化し、それによってペンタミジンやSSGに耐性であるリーシュマニア細胞のMDR活性を調節することが本発明において検討される。
材料及び方法
材料. DMSO、ベラパミル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、パクリタキセル(タキソール)及びミトキサントロンをSigma-Aldrichから購入した。Dulbecco変法Eagle培地(DMEM)、RPMI 1640培地、トリプシン-EDTA及びペニシリン/ストレプトマイシンをGibco BRLからのものとした。ウシ胎仔血清(FBS)は、HyClone Laboratoriesからのものとした。MTS、フェナジンメトスルフェート(PMS)及びP糖タンパク質によるPgp-GloTMアッセイシステムをPromegaから購入した。ヒト乳がん細胞系MDA435/LCC6及びMDA435/LCC6 MDRは、Dr. Robert Clarke(ジョージタウン大学、ワシントン、DC)から恵贈されたものである。マウス白血病細胞系P388及びP388/ADRは、国立癌研究所(メリーランド、米国)から入手した。
【００６２】
癌化学療法における薬剤耐性
細胞培養.
MDA435/LCC6及びP388(親株もMDRサブタイプも)を、それぞれ、10% FBSで補足したDMEM及びRPMI 1640の培養液中で維持した。RPMI 1640培養液は、100単位/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシンを含有した。細胞を、5% CO2を有する加湿された雰囲気中37oCで培養した。0.05%トリプシン-EDTA溶液を用いて、MDA435/LCC6(野生型もMDRサブタイプも)細胞を分離した。
細胞増殖分析. MDA435/LCC6及びP388(親株もMDRサブタイプも)細胞を、それぞれ、96穴プレートにおいて2000細胞と5000細胞/ウェルに播種した。フラボノイド二量体を含む又は含まない種々の濃度の抗癌剤(ドキソルビシン、ダウノルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソール、ミトキサントロン)を200μlの最終の容積に添加し、細胞を、それぞれ、MDA435/LCC6及びP388(親株もMDRサブタイプも)細胞について4日間及び3日間増殖した。MDA435/LCC6(親株もMDRサブタイプも)については、対応する薬剤を、細胞付着(24時間インキュベーション)後に添加した。細胞増殖を測定するために、cell Titer 96(登録商標) Aqueous Assay(Promega)を製造業者の説明書に従って用いた。手短に言うと、MTS(2mg/ml)及びPMS(0.92mg/ml)を、20:1の比で混合した。30μlのMTS/PMS混合液を、それぞれのウェルに添加し、37°Cで2時間インキューベートした。次に、ELISAマイクロタイタープレートリーダー(Bio-Rad)を用いて490nmの光学吸光度を記録した。それぞれの実験を、少なくとも三回ずつ行い、二回繰り返した。抗癌剤の細胞毒性を、未処理DMSO(0.05%)溶媒対照と相対して生存した細胞の画分として表わした。抗癌剤のIC50又はIC60を、それぞれ、50%又は60%だけ細胞増殖を阻害する薬剤の濃度として表わした。
ドキソルビシンの蓄積. 2.5ml(105細胞/ml)、MDA435/LCC6(親株もMDRサブタイプも)細胞を、6ウェルプレートのそれぞれのウェルに播種した。集密点で、培養液を除去した。2mlの新たなDMEMをモジュレータとともに添加し、細胞を37oCで30分間インキューベートした。次に、ドキソルビシン(最終濃度20μM)を添加し、37oCで2時間インキューベートした。次に、細胞をトリプシン処理によって収集した。
【００６３】
P388(親株もMDRサブタイプも)細胞については、1ml(105細胞)の集密的細胞は、エッペンドルフチューブへのアリコートとし、フラボン二量体と37oCで30分間プレインキュベートした。次に、ドキソルビシン(最終濃度10μM)を添加し、10μMの最終濃度で37oCにおいて2時間インキューベートした。細胞ペレットを、微小遠心管を用いて冷PBSで3回洗浄し、50%エタノール中0.3N HCLで溶解し、30秒間超音波で破壊した。10000rpm/分で3分間遠心分離した後、上清を保存した。ドキソルビシンの蛍光を、分光蛍光計(λexcite = 470nm、λemit = 585nm)を用いて測定した。
ATPアーゼ分析. P-gp ATPアーゼ活性を、製造業者の説明書に従うことによってヒトP-gp膜を有するPgp-GloTM分析システムを用いて測定した。分析は、ホタルルシフェラーゼの光生成反応のATP依存性による。簡単に言えば、25μg P-gp膜を、Na3VO4(100μM)、溶媒対照(0.1% DMSO)、9d(100μM)、ベラパミル(100μM)と又はベラパミル(100μM)＋9d(100μM)と37oCでインキューベートした。ATPアーゼ反応を、添加する5mM MgATPによって開始し、37oCで40分間インキュベートした。反応を停止し、ATP検出試薬の添加によってルシフェラーゼ生成ルミネセンスシグナルとして残存する代謝されていないATPを検出した。20分間の室温シグナル安定化後、BMG Fluostarプレート照度計でルミネセンスを読み取った。P-gp ATPアーゼ活性を、Na3VO4で処理したものと比較した試料のルミネセンスの低下として示した。
結果
アピゲニン二量体9a〜9k単独は、5μM未満だけでなく、モノマー10a及び10bについての10μMの濃度でも試験されたMDR細胞系に対して抗癌作用を有しない。それ故、5μMアピゲニン二量体と10μMモノマーを選択して、以下の分析において化学増感効果を評価した。
【００６４】
MDA435/LCC6MDR細胞におけるタキソール耐性の逆転に対するフラボノイド二量体の効果
MDA435/LCC6は、エストロゲン独立ヒト乳がん細胞系である。古典的MDR1耐性パターンを有する細胞系を生じる、ヒトMDR1 cDNAの構成的発現を特定するレトロウイルスのベクターを形質導入することによってMDRサブタイプ(MDA435/LCC6 MDR)を生成した(MDA435/LCC6及びMDA435/LCC6MDR1: ヒト乳癌の腹水モデル。Br J Cancer 1996, 73, 154-161)。MDA435/LCC6 MDR細胞におけるタキソール耐性を逆転させる本発明のアピゲニン二量体の能力を試験した。タキソールは、乳癌を治療する選択の第一選択薬の一つであり、タキソール耐性がP-gpによって仲介されることは知られている。5μMのベラパミルを正の対照として用いた。10μMのアピゲニンモノマー10a及び10bを負の対照として用いた。図3Aに示されるように、異なる二量体は、異なる程度だけタキソールの毒性を強化した。スペーサの長さが4つのPEGsの化合物9dは、115nMから4.4nMに約26相対倍率(RF)だけタキソールのIC50を低下させることによって最も劇的な逆転活性を示した。効力は、ベラパミル(IC50 = 5.2nM)に匹敵した。スペーサの長さが2つと3つのPEGの化合物9b及び9cも、それぞれ、19.9nMと21.5nMに対して5.8RFと5.4RFだけIC50を低下させることによってタキソール耐性を著しく逆転させた。しかしながら、スペーサが2つのPEGs(9a)より短い又は5つのPEGより長い(9e、9f、9h、9j、9k)二量体は、5μMでほとんど或いは全く逆転効果を示さなかった。抗癌耐性逆転活性が単独で合成モジュレータの二量体の種類によるものかを求めるために、これらの実験において負の対照として3つ及び4つのPEG(10a及び10b)を有するアピゲニンモノマーを用い、同数のエチレングリコール単位を有する二量体9c及び9d(5μM)として二倍で濃度(10μM)を使用した場合でさえ、ほとんど逆転させる効果がないことがわかった。これらの結果は、9d、9c及び9bの調節する活性がそれらの二価の構造によるものであり、アピゲニン部分の数の簡単な増加によるものでないことを示す。
MDA435/LCC6 MDR細胞において9dによるタキソール耐性の逆転は、濃度依存性であった(図3B)。1μM 9dの濃度は、IC50を約1.9RF低下させることができた。9dの濃度を増大することにより、更に逆転させる活性が増大し、5μMがプラトーに達する。
【００６５】
MDA435/LCC6 MDR細胞における他の抗癌剤に対する耐性を逆転させることに対するアピゲニン二量体の効果
ビンブラスチン耐性における異なるアピゲニン二量体による化学増感効果の同様の傾向が認められた(図4A)。図4Aは、9dがビンブラスチンの細胞毒性を強化するのに最も大きい効力を示し、4.8nMから0.36nMに約13RFだけIC50値を低下させたことを示す。9dの効力は、ベラパミルのそれと同様であった(IC50=0.25 nM)。化合物9b及び9cは、9dと比較して、それぞれ、IC50を低下させる活性が0.61nM及び0.87nMに7.9RF及び5.5RFだけより低いがなお非常に高い。スペーサがより短い(9a)又はより長い(9e、9f、9h、9j、9k)他の二量体の活性は、ほとんどないか或いは全くない。モノマー10a及び10bは、用いられる濃度が二倍でも(10M)効果がなかった。化合物9dは、また、ビンブラスチン細胞毒性を強化するのに用量依存効果を示した(図4B)。同様に、9dは、ドキソルビシン細胞毒性を強化するのに他のものより有効であり、4.7μMから0.73μMに約6RFだけIC60を低下させた(図5)。化合物9c(IC60 =1.3μM)及び9b(IC60 =1.3μM)は、それぞれ、約3.6RF及び3.1RFだけIC60を低下させるのに高い効力を示した。PEGがより短い(9a)又はより長い(9e、9f、9h、9j、9k)アピゲニン二量体は、ドキソルビシン増感をほとんど或いは全く示さなかった。モノマー(10a及び10b)は、同様に無効な逆転剤であった。
化合物1dは、MDA435/LCC6 MDRのMDRをほぼ親レベルまで逆転させることができる
化合物9dが一貫してタキソール、ビンブラスチン及びドキソルビシンに対して最も高い調節活性を示したので、我々は、9dがMDA435/LCC6 MDRの耐性を親のレベル(MDA435/LCC6)に逆転させることができるかを調べることに集中した。図6A〜6Eは、9dの5μMがビンブラスチン、タキソール、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ダウノルビシンに対するMDA435/LCC6 MDRの耐性を親の(MDA435/LCC6)レベルに近いレベルに逆転させることができることを示した。ミトキサントロン(図6F)には効果が認められなかった。9dを含む又は含まない薬剤のIC50の相対倍率変化によって求められる逆転能力を表1にまとめる。それは、7.6〜41RFの範囲にある。IC50が感受性対応物とほとんど同じレベルに低下し得るのでビンブラスチン及びタキソールに対する逆転活性が特に印象的である。
【００６６】
MDA435/LCC6及びMDA435/LCC6 MDR細胞のドキソルビシンの細胞蓄積に対するアピゲニン二量体の効果
異なる二量体による種々の抗癌剤に対する調節活性がP-gp仲介薬剤排出を調節する異なる能力によるものであるかを理解するために、MDA435/LCC6感受性細胞及び耐性細胞双方におけるドキソルビシンの蓄積に対する効果を調べた。ドキソルビシンはP-gpの蛍光薬剤基質であり、この実験においてP-gp仲介薬剤排出をモニタするために用いた。これらの細胞におけるドキソルビシンの蓄積を、アピゲニン二量体(10μM)及びモノマー(20μM)の存在下又は不在下で求めた。ベラパミルを正の対照として用いた。
結果を図7Aに示す。P-gp発現の基礎レベルによるLCC6におけるドキソルビシンの蓄積は、溶媒対照(DMSO)又は種々のアピゲニンモノマー、二量体又はベラパミルによる処理によって影響を受けない。LCC6 MDR細胞については、DMSO対照で処理した場合、ドキソルビシンの蓄積レベルは、LCC6の20%程度であることがわかった。このことは、LCC6 MDR細胞において見られるP-gpによる仲介ドキソルビシン排出によるものである。しかしながら、このような低レベルの蓄積は、9dによる同時処理によって完全に逆転した。10μMにおいて、9dは、5.8倍だけLCC6 MDR細胞のドキソルビシン蓄積を増強した。ここで、ドキソルビシンの蓄積は、9d処理LCC6細胞とほとんど同じ(97%)である。この効力は、ベラパミル(6.2倍)に匹敵する。LCC6 MDRにおいてタキソール、ビンブラスチン及びドキソルビシンに対して薬剤耐性逆転活性を有する化合物9c及び9dは、それぞれ、対照の4.5及び4だけドキソルビシン蓄積増強した。一般に、ドキソルビシン蓄積のモジュレータの逆転効力は、LCC6 MDRにおいてドキソルビシン耐性を逆転させるのにそれらの効力によって密接に実行されている。
【００６７】
表1. MDR細胞における化学療法剤の細胞毒性に対する9dの効果。材料及び方法において記載されるように、5μM 9dを含む/含まない一連の薬剤濃度にさらした後にそれぞれの細胞系についてIC50値を求めた。RFは、薬剤感受性の倍率変化を表す。VP=ベラパミル。
2009537630.tif 000017
a R.F.相対倍率 = (モジュレータを含まないIC50)と(モジュレータを含むIC50)との比率。これは、モジュレータの逆転活性の強度の指標として用いられる。b N.D. 実施せず。
【００６８】
次に、P-gp正細胞や負細胞におけるドキソルビシンの蓄積に対する9dの用量依存効果を調べ、図7Bに示す。9dは、MDA435/LCC6 MDR細胞におけるドキソルビシン蓄積を用量依存的方法でかなり増大するが、MDA435/LCC6感受性細胞においては増大しないことがわかった。9dの濃度を0〜10μMに増大した場合、細胞内ドキソルビシン濃度がLCC6の17%から88%まで徐々に増大された。
P388/ADR細胞における抗癌毒性を逆転させることに対するアピゲニン二量体の効果
上記のデータは、アピゲニン二量体、特に9dがヒト乳がん細胞における薬剤耐性を逆転させるのに有望であることを示す。これらのアピゲニン二量体がP-gp排出を阻害することによってMDRを調節することができる場合には、他のMDR癌も同様に調節することができるにちがいない。これを証明するために、ADR(アドリアマイシン、ドキソルビシンのブランド名)に耐性である他のよく確認された癌MDR系P388/ADR-マウス白血病細胞系を試験する。P388/ADRは、MDRモジュレータの臨床前の評価のための基準として広く使われている。
前の所見と一致して、スペーサの長さが異なるアピゲニン二量体は、P388/ADR細胞において異なる調節活性を示した(図8A及び図9A)。更にまた、9dは、最も強力なモジュレータであり、ドキソルビシン及びダウノルビシンIC50を、それぞれ、1.5μM及び2.1μMから0.15μM及び0.10μMに約10R及び21RFだけ低下させる(図8A及び図9A)。化合物9dは、また、約5μMの飽和濃度で、ドキソルビシン(図8B)及びダウノルビシン(図9B)に対する耐性を逆転させることに対して用量依存効果を示した。スペーサ長さがより短い9c及び9bで適度な阻害が認められ、それぞれ、ドキソルビシンのIC50を約3RF及び2RFに及びダウノルビシンのIC50を約4.6RF及び2.5RFに低下させた。スペーサが9dより長い又は9bより短いモジュレータは、P388/ADR細胞におけるドキソルビシン及びダウノルビシン細胞毒性を強化することに対してほとんど或いは全く効果がない。モノマー10a及び10bはいずれも、9c及び9dに用いた濃度を二倍で添加された場合でさえ、ほとんど調節活性を示さなかった。しかし、MDA435/LCC6 MDR細胞と異なり、9dの逆転活性は、P388/ADR細胞においてドキソルビシン及びダウノルビシン耐性をほぼ完全に逆転させた、ベラパミルほど良好でなかった(それぞれ、IC50 = 0.06μM 及び0.04μM)。上記の結果は、アピゲニン二量体がLCC6 MDR及びP388/ADR細胞双方のP-gpを阻害することを示している。薬剤耐性逆転活性とアピゲニン二量体のスペーサ長さとの間の相関は、これらの二つ細胞系においてほぼ同じである。
化合物9dは、P388/ADR細胞の薬剤耐性を感受性がある親細胞系P388のほとんどのレベルに逆転させることができる
【００６９】
化合物9dは、また、他のP-gp基質のドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、ビンクリスチン及びビンブラスチンを含むP388/ADR細胞に及ぼす作用を異なる程度に強化した(図10A〜10E)。タキソール、ビンクリスチン及びビンブラスチンの場合には、5μMの9dは、P388/ADRの耐性をほとんど感受性があるレベルに完全に逆転させ(図10C、図10D及び図10E)、9dによる抗癌剤の排出の完全な阻害が示される。ミトキサントロン耐性には効果がなかった。これは、P388/ADRが9dに感受性がないミトキサントロンの追加のMDR機序を収容していることを示している。IC50における相対倍率変化によって決定される逆転させる能力を表1にまとめる。それは、14〜66RFに変動する。
P388細胞及びP388/ADR細胞におけるドキソルビシンの細胞蓄積に対するアピゲニン二量体の効果
P388細胞及びP388/ADR細胞双方におけるドキソルビシン蓄積に影響を及ぼすアピゲニン二量体の能力を調べた。DMSO処理対照において、P388/ADR細胞におけるドキソルビシンの蓄積はP388細胞の約33%であり、ドキソルビシンの排出が示された(図11A)。異なるアピゲニン二量体の添加は、MDR細胞におけるドキソルビシンのP-gp排出を異なる程度に阻害した。前の結果と一致して、9dは、対照の約2倍までドキソルビシン蓄積の増加を引き起こす最高効力を示した。化合物9b及び9cも、9dに匹敵する活性を示した。一方、モノマー10b(二量体の二倍の濃度による)又はスペーサがより長い(9e、9k)又はより短い(9a)アピゲニン二量体は、活性をほとんど或いは全く示さなかった。P388/ADRにおける薬剤耐性逆転活性とアピゲニン二量体のスペーサ長さとの間の相関は、我々がLCC6 MDR細胞において認めたものと同様である。対照的に、親P388感受性細胞におけるドキソルビシン蓄積は、いかなるアピゲニン二量体、モノマー又はベラパミルによってもほとんど影響を受けなかった。細胞が種々の濃度の9dと30分間プレインキュベートされた場合、9dは、P388/ADR細胞におけるドキソルビシン蓄積を用量依存的方法で著しく増大するが、P388感受性細胞においては増大しない(図11B)。9dが最良の活性を示したが、それは感受性細胞に耐性P388/ADR細胞の細胞ドキソルビシンレベルを回復させることができないが、ベラパミルは回復させることができる(図11A)。これは、9dがP388/ADRにおいてドキソルビシンのP-gp排出を完全には阻害しないことを示すものである。このことは、ベラパミルと同じ程度の細胞毒性を調節する効果と一致していない(図10A)。
【００７０】
P-gp ATPアーゼ活性に対する9dの効果
9dとP-gp間の相互作用を更に調べるために、P-gp ATPアーゼ活性及びベラパミル誘導ATPアーゼ活性双方に対する9d(100μM)の効果を調べた。興味深いことに、9d(100μM)は、3.3倍(P<0.0001)だけ基礎レベルよりP-gp ATPアーゼ活性を増大させることができる(図12)。予想通りに、ベラパミル(基質結合部位に結合することによる周知のP-gp ATPアーゼ刺激物質)は、7.4倍(P<0.0001)だけ基礎レベルよりP-gp ATPアーゼ活性を増大させることができる。9dが存在する場合、このようなベラパミル誘導P-gpATPアーゼ活性は7.4倍から6.1倍に低下した(P<0.0001)。この結果は、ベラパミルのような9dがP-gp ATPアーゼ活性を刺激することができ、おそらく、ベラパミルが行うのと同じP-gp部位に結合することによって作用することを示した。ベラパミル及び9d(100M)は共に、非P-gp ATPアーゼ活性に対してほとんど効果がなかった(データは示されていない)。
ポリエチレングリコール(n=4)結合アピゲニン類似体二量体の生物活性:
化合物9dがMDR細胞に対して良好な逆転活性を示したので、同じポリエチレングリコール(n=4)リンカーを有する種々のアピゲニン類似体二量体の生物活性を調べた。種々の合成フラボノイド類似二量体35a-lの5μM濃度の存在下にLCC6MDRに対するタキソールのIC50を調べ、表2にまとめた。多くのこれらの類似二量体(35a、35b、35f、35g、35h)は、ベラパミルより強い逆転活性を示した。
結論として、上記の結果は、異なるスペーサ長さによって結合されるフラボノイド二量体が癌の化学療法の治療のための同時薬剤として作用することができることを明らかに実証した。生体外で乳腺細胞と白血病MDR細胞双方の抗癌剤の細胞毒性の6-50RFの増大を示し、また、それらの細胞内薬剤蓄積を劇的に増強することによるスペーサ長さが最適なアピゲニン二量体が同定される(9d)。フラボノイド二量体の類似体も、抗癌剤の細胞毒性の著しい増加を示す。
【００７１】
表2. LCC6MDR細胞に対するタキソールの細胞毒性に関するアナログ二量体35a〜35lの効果. 材料及び方法に記載された5μMの化合物との一連のタキソール濃度にさらした後にIC50値を求めた。
5μM濃度の種々の合成フラボノイド二量体類似体の存在下のLCC6MDRに対するタキソールのIC50:
添加した類似体               タキソールの平均IC50 (nM)
なし(対照)                   128.2
ベラパミル(正の対照)         8.1
35a (全てH)                  2.7
35b (7-F)                    3.1
35c (6-F)                    12.2
35d (6-Cl)                   32.8
35e (6-Br)                   20.9
35f (6,8-Di-Cl)              3.4
35g (7-Me)                   2.4
35h (6-Me)                   3.3
35i (7-MeO)                  32.0
35j (6-MeO)                  37.7
35k (5-MeO)                  7.4
35l (6,7-Di-MeO)             16.4
【００７２】
フラボノイド二量体による寄生虫症を治療する際の薬剤耐性の低下
細胞系及び細胞培養. リーシュマニア・エンリエッティイ(LePentR50、Le野生型、LeMDR1-/-及びLeMDR1過剰発現LeV160突然変異体)及びリーシュマニア・ドノバニ(LdAG83、Ld2001及びLd39)の前鞭毛期をこの実験に使った。前者はモルモットの天然の感染株であり、後者は臨床株であり、ヒトにおいて内臓リーシュマニア症を引き起こすことができるものである。いずれの細胞株も、10%(v/v)加熱不活性ウシ胎仔血清(Hyclone)で補足したシュナイダーのショウジョウバエ培地(Invitrogen)、pH 6.9中で4mMグルタミン(Sigma)と25g/mLゲンタマイシン溶液(Invitrogen)と共に27oCで4日間培養した(リーシュマニア・エンリエッティイにおける外部染色体的に増幅された多種薬剤耐性のような遺伝子のクローニング及び機能解析。Mol. Biochem. Parasitol 1993, 60, 195-208)。
LePentR50(ペンタミジン耐性、ペンタミジンのIC50 = 117g/mL)、Ld2001(スチボグルコン酸ナトリウム耐性、SSGのIC50 = 4.1mg/mL)及びLd39(スチボグルコン酸ナトリウム耐性、SSGのIC50 = 6.4mg/mL)の前鞭毛期を、それぞれ、50g/mLのペンタミジン(Sigma)及び3.5mg/mLのスチボグルコン酸ナトリウム(SSG)の存在下に培養した。L.ドノバニ野生型(LdAG83、SSGのIC50 = 1.5mg/mL)にはスチボグルコン酸ナトリウムを添加しなかった。LeV160の前鞭毛期を160g/mLビンブラスチンの存在下に培養した。Le野生型及びLeMDR1-/-突然変異体にはペンタミジン及びビンブラスチン(Sigma)を添加しなかった。
L.ドノバニの無鞭毛型を、50mLの4日令の前鞭毛期(後期対数期)を沈降させることによって調製し、M199培養液(Gibco)、0.5% Tryptoカゼイン大豆、3mM L-システイン、15mM D‐グルコース、5mM L-グルタミン、4mM NaHCO3、25mM HEPES、0.01mM バソクプロイン二スルホン酸及び0.023mMヘミンを含有する純粋培養液に移した。次に、細胞を時間の間の37oCで24時間インキューベートした。無鞭毛型は、形状が卵形体になり、薬剤蓄積分析の準備ができていた。
【００７３】
細胞生存率分析
テトラゾリウム化合物(MTS)及び電子カップリング試薬、フェナジンメトスルフェート(PMS)を使うCell Titer 96(登録商標)Aqueous Assay(Promega)によって前鞭毛期の生存率を求めた。最終容積の100L培養液中に1×105細胞/ウェルで、96ウェル平底マイクロタイタープレートに前鞭毛期を播種した。フラボノイド二量体の寄生虫への細胞毒性効果を求めるために、種々の濃度のフラボノイド二量体を前鞭毛期に添加した。スペーサ長さが異なるフラボノイド二量体の逆転効果を求めるために、種々の濃度の抗リーシュマニア薬、ペンタミジン又はSSG、ビンブラスチン及びピューロマイシンの一つをフラボノイド二量体を含む又は含まないウェルに添加した。寄生虫を27oCで72時間インキューベートした。フラボノイド二量体を含む又は含まないそれぞれの濃度の抗リーシュマニア薬を、それぞれの実験で三回ずつ試験した。2mg/mLのMTS及び0.92mg/mL PMSを、20:1(MTS: PMS)の割合で混合した。72時間のインキュベーション後、10LのMTS: PMS混合液をマイクロタイタープレートのそれぞれのウェルに添加した。その後、プレートを着色のために27oCで4時間インキューベートした。4時間のインキュベーション後、自動マイクロタイタープレートリーダー(Bio-Rad)を用いて490nmでOD値を求めた。結果を、生存%として示した(試験化合物による各ウェルのOD値を、未処理対照ウェルで割る)。
HPLCによるペンタミジン蓄積分析
ペンタミジンの蓄積に対するフラボノイド二量体の効果を調べた。1mLの4日令の前鞭毛期(約2×108細胞/mLの細胞密度を有する後期対数期)を0.84mMペンタミジン及び0M、15M、30M及び60Mを含む種々の濃度のフラボノイド二量体(9d)と27oCで3時間インキューベートした。それぞれの濃度の9dを三回ずつ試験し、個別実験で二回繰り返した。3時間のインキュベーション後、寄生虫を冷PBS、pH 7.4で三回洗浄した。次に、細胞ペレットを350Lの75%アセトニトリルに溶解し、反復凍結融解サイクルによって溶解した。溶解後、溶解した細胞懸濁液を14,000gで4oCにおいて10分間遠心分離した。上清を収集し、HPLC(Agilent 1100 Series)を用いてペンタミジン濃度を決定する準備ができた。ペンタミジンプールを、40oCで保持したZorbax ODS C18カラム(4.6mm×25cm、5ミクロン)で分析した。移動相は、ポンプAについては水(10mM塩化テトラメチルアンモニウム(TMAC)、10mMヘプタンスルホン酸ナトリウム(SHS)、4.2mMリン酸(PA)、ポンプBについては水(10mM TMAC、10mM SHS、4.2mM PA)中75%アセトニトリル(ACN)からなった。カラムは、分析の前に一晩40oCで平衡化した。1.0mL/分の流量及び265nmのシグナルを用いて、58%のポンプAと42%のポンプBで分析を行った。ペンタミジンの保持時間は、3.2分である。化合物9dは、これらの条件で溶離されなかった。標準曲線を作成するために、2.5mgペンタミジンイセチオネート塩を21mLの75%ACN(10mM TMAC、10mM SHS、4.2mM PA)に溶解することによって200μMペンタミジンイセチオネート塩保存溶液を調製した。次に、連続希釈によって100μM、50μM、25μM及び13μMの濃度にし、標準曲線の作成を可能にした。
【００７４】
ICP-MSを用いる全アンチモン[Sb(III)及びSb(V)]蓄積分析
スチボグルコン酸アンチモンナトリウム(SSG)の蓄積に対するフラボノイド二量体の効果を調べた。無鞭毛型は、SSGにより感受性であるので、前鞭毛期と比較してよりSSGを蓄積する。それ故、Sb蓄積分析を研究するために無鞭毛型を選択した。1mLの4日令無鞭毛型(2×108細胞/mL)を0.05mM SSG及び0μM、30μM及び60μMを含むフラボノイド二量体(9d)の異なる濃度と37oCで3時間インキューベートした。各濃度の9dを、三回ずつの実験で試験し、個別実験で二回繰り返した。3時間のインキュベーション後、寄生虫を冷PBS、pH 7.4で三回洗浄した。細胞ペレットを、200Lの濃硝酸に室温で24時間溶解した。試料を蒸留水で3mLに希釈し、約5ppbの最終濃度の全Sb溶液になった。次に、定量化のためにICP-MS(Perkin-Elmer)に注入した。内部標準としてインジウム(In、m/z= 115)により121及び123のm/z比率でアンチモンを測定した。試料の前処理に用いられる全ての薬品は、少なくとも分析グレードであり、蒸留水は、容認されているように精製せずに直接用いた。
結果
ペンタミジン耐性のL.エンリエッティイ(LePentR50)及びSSG耐性のL.ドノバニ(Ld39及びLd2001)
3つの薬剤耐性リーシュマニア細胞系（即ち、LePentR50(ペンタミジン耐性のL.エンリエッティイ)、Ld39及びLd2001(SSG耐性のL.ドノバニ)を本発明の合成フラボノイド二量体の薬剤耐性調節活性を実験するために用いた。LePentR50は、我々の研究室において段階的選択によって得られたペンタミジン耐性のL.エンリエッティイ細胞系である(未発表)。それを50μg/mlペンタミジンの存在下に維持し、IC50は約117μg/mlであるが、野生型L.エンリエッティイ(Le)のIC50は8.7μg/mlである(図13A)。Ld39及びLd2001は、五価のアンチモン化合物スチボグルコン酸ナトリウム(SSG)(2)に耐性である二つのL.ドノバニ細胞系である。Ld39及びLd2001を3.5mg/mlのSSGの存在下に維持し、IC50は、それぞれ6.1及び4.1mg/mlであるが、野生型L.ドノバニ(LdAG83)のIC50は、約2.4mg/mlである(図13B)。
リーシュマニア寄生虫に対する合成フラボノイド二量体の生体外細胞毒性
それぞれのリーシュマニア細胞系における本発明のフラボノイド二量体の細胞毒性を、MTSベースの細胞増殖法で測定した。表3は、LePentR50、LdAG83及びL39に対するそれぞれの合成モジュレータのIC50値をまとめたものである。ペンタミジン耐性のLePentR50は、フラボノイド二量体(9a〜9f、10a及び10b)の一部に比較的耐性であり、IC50は40μMから200μMを超えるまでの範囲にある。合成フラボノイド二量体に対するL.ドノバニ、LdAG83及びLd39の感受性は、9c及び9dを除いてL.エンリエッティイに匹敵した。LdAG83(9cのIC50 =8±0.3μM及び9dのIC50=7±0.4μM)及びLd39(9cのIC50 =11±0.7μM及び9dのIC50=10±0.9μM)は、LePentR50より9c及び9dにより感受性であることがわかった。L.エンリエッティイとL.ドノバニとの間の種差は、アピゲニン二量体9c及び9dだけに限られた。これらの二つ種は、アピゲニンモノマー及び3つ(10a)又は4つの(10b)エチレングリコール単位を有するアピゲニンに等しく感受性があった(表3)。9c及び9dに対するL.ドノバニ、LdAG83及びLd39双方の過感受性は、これらの二つアピゲニン二量体が抗L.ドノバニ剤として有効なものであることを意味することができる。
【００７５】
表3. 9c及び9dに対するL.ドノバニ、LdAG83及びLd39双方の過感受性は、これらの二つアピゲニン二量体が抗L.ドノバニ剤として有効なものであり得ることを意味するものである。
表3. リーシュマニア寄生虫に対する合成フラボノイドのIC50
2009537630.tif 000018
MTSベースの増殖分析によってそれぞれの合成フラボンのIC50値を求めた。それぞれのIC50値は、それぞれの実験において三回ずつによる少なくとも二つの独立した実験から得た。
a これらのモジュレータは、試験した最高濃度(200μM)で細胞毒性効果がなかったことからIC50を求めることができない。
ND: これらのモジュレータについてはIC50値を求めなかったが、薬剤耐性調節活性を実験するために用いられる濃度の二倍である、12μMで細胞毒性効果は認められなかった。
【００７６】
LePentR50のペンタミジン耐性の調節に対する合成フラボノイド二量体の効果
DMSO処理LePentR50は、約117.0±3.0μg/mlのペンタミジンのIC50を有する(図14A)。6μMの化合物9c(n=3)(IC50=40.0 2.7g/mL、P<0.01)及び9d(n=4)(IC50=39.2 2.1g/mL、P<0.01)は、LePentR50のIC50を約3倍だけ著しく低下させた(図14A)。いずれもリンカー長さがより短い(9a(IC50=90 4.88g/mL)及び9b(IC50=89.2 8.92g/mL))又はリンカー長さがより長い(9e(IC50=90 7.88g/mL)、9f(IC50=75 10.99g/mL)、9h-1(IC50=106 2.7g/mL)、9i(IC50=73 3.54g/mL)、9j(IC50=134 5.4g/mL)及び9k-1(IC50=130 6.1g/mL))他のフラボノイド二量体は、半分未満の調節活性を示すか或いは全く示さなかった(図14A)。フラボノイド二量体のリンカー長さと調節活性との間の“U”型の関係は、アピゲニン部分の標的が比較的限定された距離によって分けられることを示すものである。三つ又は四つのエチレングリコール単位を有するアピゲニンモノマーの対照化合物(10a及び10b)は、濃度を二倍で用いた場合でさえ(12μM)、調節活性を示さなかった(図14A; それぞれ、IC50 = 100.0±5.0μg/ml及び98.5±8.5μg/ml)。このことは、9c及び9dの調節活性が実際にそれらの二量体の種類によるものであることを示すものである。アピゲニン部分の数の簡単なモル増加は、ほとんど調節活性を生じなかった。対照として、n = 3及び4(トリPEG-リンカー及びテトラPEGリンカー)を有するリンカーは、逆転効果を有しなかった(図14A)。
Ld39及びLd2001のSSG耐性の調節に対する合成フラボノイド二量体の効果
Ld39及びLd2001前鞭毛期のSSG耐性の調節に対する本発明のフラボノイド二量体の効果を調べた。フラボノイド二量体の中で(6μMで用いる)、9c及び9dは、L.ドノバニLd39前鞭毛期のSSG耐性を調節するのに最も有効であった。Ld39のSSGのIC50は、6.4±0.7mg/ml(DMSO処理)から2.3±0.2mg/ml(9c処理)及び2.3±0.3mg/ml(9d処理)に低下した(図14B)。LePentR50のペンタミジン耐性と同様に、リンカーがより短い(9a及び9b)又はリンカーがより長い(9e〜9j)化合物は、ほとんどSSG耐性調節活性を示さなかった(図14B)。アピゲニン、10a及び10bは、12μMで用いられた場合でさえ、ほとんど調節活性を示さなかった(図14B)。n =3(トリPEG-リンカー)又はn = 4(テトラPEG-リンカー)を有する対照リンカーは、いずれも効果を示さなかった(図14B)。
【００７７】
その他のSSG耐性のL.ドノバニLd2001が実験された場合、本質的に同様のパターンが見られた(図14C)。化合物9c及び9dが最も有効であり、Ld2001のSSGのIC50を6.6mg/ml(DMSO対照)からそれぞれ1.5mg/ml(9c)及び1.0mg/ml(9d)に低下させることができる(図14C)。
しかしながら、9c及び9dを含む全ての合成フラボノイドモジュレータは、SSG感受性野生型L.ドノバニLdAG83に対して調節効果がなかった。IC50値は、モジュレータの有無にかかわらずほとんど同じままであった(図14D)。このことは、9c及び9がSSG耐性寄生虫にユニークに又は充分に存在するが、SSG感受性寄生虫に存在しないか又はめったに発現しないタンパク質を特に標的にすることを示すことができる。
合成フラボノイド二量体9c及び9dはLePentR50においてペンタミジン耐性及び蓄積に対する用量依存性調節活性を示す
上記の結果による二つの最も有効なモジュレータ、即ち、9c(3つのエチレングリコール単位を含有する)及び9d(4つのエチレングリコール単位を含有する)のLePentR50のペンタミジン耐性の調節に対する量的効果。60μg/mlペンタミジン単独で処理した場合、LePentR50の生存は、わずかだけ低下した(未処理の94.0±2.3%)。しかしながら、60μg/mlペンタミジンを9cの増加濃度で同時処理すると、LePentR50の生存が段階的に減少し、9cが用量依存的方法でLePentR50のペンタミジン耐性を調節し得ることを示した(図15A)。9cのEC50(60μg/mlペンタミジンにおいてLePentR50の50%生存をもたらす9cの有効濃度)は、約1.85μMである。同様の所見が化合物9dについてもなされた(図15B)。毒性は、6μMの濃度まで、9dには見られなかった。9dについてのEC50は、約0.94μMである。それ故、化合物9dは、LePentR50のペンタミジン耐性の調節に9cのほぼ2倍有効であった。
LePentR50のペンタミジン蓄積に対する9dの効果も実験した。より高濃度の9d(15M、30M及び60M)を、より短いインキュベーション時間(3時間)と共に用いてペンタミジン蓄積を測定する。化合物9dは、用量依存的方法でLePentR50のペンタミジン蓄積を増大させることができる(図16)。9dの濃度が0から15μM、30μM及び60μMに増大した場合、LePentR50の細胞内ペンタミジン濃度が、それぞれ、2.0±0.2μMから2.95±0.01μM、4.69±0.51μM及び26.6±0.6μMペンタジミン/mgタンパク質に徐々に増大した(図16)。このことは、9dがペンタミジン蓄積を増大させることによってLePentR40のペンタミジン耐性を調節することを示す。LePentR50と60Mの9dを3時間インキュベートすることにより、細胞毒性が生じなかった(データは示されない)。それ故、ペンタミジン蓄積の用量依存性増加は、9dの調節効果によるものであり、LePentR50に対する細胞毒性効果によるものではないと考えられる。
【００７８】
合成フラボノイド二量体9c及び9dはLd39細胞におけるSSG耐性及び蓄積に対する用量依存性調節活性を示す
LePentR50と同様に、9c及び9dはいずれも、Ld39前鞭毛期のSSG耐性に対する用量依存性調節効果を示した(図17A及び図17B)。4μMの9c又は9dは、Ld39のSSG耐性レベルをまたLdAG83の感受性株のレベルに低下させることができる(図17A及び図17B)。9dの調節効果は、9dが6μMまで用いられる場合でさえ、LdAG83のSSG感受性に対する調節効果がないことから、Ld39だけに存在する標的タンパク質に特異的であると考えられる(図17C)。
L.ドノバニ無鞭毛型のSSG蓄積に対する9dの効果を調べた。寄生虫を37oCで24時間適合させることによって無菌無鞭毛型を得た。光学顕微鏡検査は、細胞が集合したことを示した(データは示されていない)。
SSG蓄積実験において、より高濃度の9d(30μM及び60μM)をより短いインキュベーション時間(3時間)と共に用いて、SSG蓄積を測定した。9dの不在下で、Ld39及びLd2001のSSGの蓄積は、それぞれ、LdAG83の28%及び15%であった(図17D)。30μMの9dで処理した場合、Ld39及びLd2001のSSG蓄積は、それぞれ、LdAG83の74%及び83%に増大した(図17D)。9dの濃度を60μMまで更に増大させた場合、Ld39及びLd2001のSSG蓄積は、それぞれ、LdAG83の90%及び69%であった(図17D)。対照的に、9d(30μM又は60μM)で処理したSSG感受性LdAG83におけるSSGの蓄積は、処理をしない細胞における蓄積とほとんど異なることなく、二量体9dが、SSG耐性株にだけ存在するABC輸送体の機能を特に阻害することができると思われることを示した(図17D)。化合物9dは、60μMにおいて3時間処理した場合にL.ドノバニに対して細胞毒性がなく(データは示されていない)、SSG蓄積の増加が9dの調節効果によるものであり、細胞毒性効果によるものでないことが確認された。
9c及び9dと他の従来のMDRモジュレータとの調節活性の比較
9c及び9dとベラパミル、レセルピン、キニン、キナクリン及びキニジンとの調節活性を比較した。LePentR50の場合、9c(IC50=47±1.2g/mL)及び9d(IC50=35±2.3g/mL)のモジュレータの調節活性は、レセルピン(IC50=40±1.3g/mL)及びキナクリン(IC50=28.7±1.3g/mL)と同様であり、ペンタミジン増感がそれぞれ約2.7倍、3.7倍、3.2倍及び4.5倍であった(図18A)。対照的に、ベラパミル、キニン及びキニジンを用いる場合、1/2倍未満の増感しか実証されなかった(図18A)。Ld39におけるSSG耐性の調節活性に関して、9c及び9dだけが有効であり(それぞれ、IC50=2.3±0.1mg/mL及び1.8±0.05mg/mL)、3.1倍及び3.9倍のSSG増感が示された(図18B)。他の従来のMDR化学増感剤のいずれも調節効果を示さなかった(ベラパミル、レセルピン、キニン、キナクリン及びキニジンに対して、それぞれ、IC50=7.2±0.54mg/mL、7.2±0.3mg/mL、7.0±0.21mg/mL、6.7±0.11mg/mL及び7.2±0.04mg/mL)(図18B)。
【００７９】
本発明のフラボノイド二量体の標的はLeMDR1でない
本発明のフラボノイド二量体が二つのNBDによってABC輸送体に結合することは可能である。L.エンリエッティイにおけるABC輸送体、LeMDR1が、合成フラボノイド二量体の標的であるかどうかの可能性を、三つのL.エンリエッティイ細胞系、即ち、野生型Le、LeMDR1ノックアウト(LeMDR1-/-)及び過剰発現LeMDR1(LeV160)に対する合成フラボノイド二量体の調節効果を実験することによって調べた。ペンタミジン耐性がLeMDR1のコピー数に逆に関係することがわかった。LeMDR1-/-、Le及びLeV160のペンタミジンのIC50は、それぞれ、18.9±0.8g/ml、12.0±0.8g/ml及び9.0±0.1g/mlである(表4)。合成フラボノイド二量体のパネルについてLeMDR1-/-のペンタミジン耐性に対する調節活性を試験した場合、9c及び9dがペンタミジンのIC50を、それぞれ、5±0.3 g/mL及び4.6±0.4 g/mLに低下させるのに有効であり、3.8倍及び4.1倍の増感を示すことがわかった(表4)。化合物9b(IC50=9.4±0.4g/mL)及び9h-1(IC50=8.2±0.5g/mL)は、それぞれ、2.0倍及び2.3倍の増感を示した。しかしながら、9a(IC50=18±1.0 g/mL)、9e(IC50=12.5±0.1 g/mL)、9f(IC50=12.5±0.8 g/mL)、9i(IC50=13.8±0.7 g/mL)、9j(IC50=20.9±1.3 g/mL)及び9k-1(IC50=20.9±3 g/mL)は、半分未満の増感効果を示すか又はほとんど示さなかった(表4)。全てのフラボノイド二量体を分析した場合、エチレングリコールリンカー長さとペンタミジン耐性調節活性との間に“U”型関係が見い出された。このことは、我々がLePentR50において見い出したものと同じである(図14A)。
Le野生型細胞において、9d(IC50=4±0.3g/mL)は、ペンタミジンのIC50を12.0±0.8g/mLから4.0±0.8g/mLに著しく低下させた(約1/3倍に低下する)(表4)。LeMDR1過剰発現LeV160において、9c(IC50=5.0±0.4g/mL)及び9d(IC50=4.7±0.1 g/mL)は、ペンタミジンのIC50を、それぞれ、9.0±0.1g/mLから5.0±0.4g/mL及び4.7±0.1g/mLにわずかに低下させた(約0.55倍及び0.52倍に低下する)(表4)。しかしながら、化合物9e(IC50=7.5±0.3g/mL)、9f(IC50=7.2±0.3g/mL)及び9i(IC50=6.8±0.2g/mL)は、増感効果を示さなかった。
【００８０】
表4 LeMDR1突然変異体のペンタミジン耐性に対する合成フラボノイド二量体の効果
2009537630.tif 000019
それぞれの薬剤のIC50はMTSベースの増殖活性によって求めた。
それぞれのIC50はそれぞれの実験において三回ずつ少なくとも三回の独立した実験から得られた。
- 測定せず
【００８１】
本発明のフラボノイド二量体がLeMDR1のコピー数にかかわりなくペンタミジン耐性を調節することができるという所見は、LeMDR1が合成フラボノイド二量体の標的でないことを示すが、L.エンリエッティイにおいてビンブラスチンやピューロマイシン耐性に関与することは既知であった(マウスP糖タンパク質のC末端ヌクレオチド結合ドメイン内のATP-結合部位の配列要求性:フラボノイド結合のための構造-活性相関。Biochemistry 2001, 40, 10382-91)。フラボノイド二量体のいずれもがほとんど調節活性がなく(表4)、合成フラボノイド二量体がLeMDR1を標的としていないことを更に示すことがわかった。
考察
リーシュマニア属における種々のABC輸送体は、薬剤耐性を仲介することに関係がある(原虫耐性に関与する薬剤輸送機序における化学増感剤。Curr. Drug Targets Infect Disord 2005, 5, 411-31)。これらには、L.ドノバニのLdmdr1、L.アマゾネンシスのLamdr1及びLamdr2、L.タレントレのLtpgpA、L.トロピカのLtmdr1、L.エンリエッティイのLemdr1、L.メキシカーナのLmepgpA、L.メジャーのLmpgpA、L.メジャーのPENrが挙げられる。構造的には、ABCB(Ldmdr1、Lamdr1、Lamdr2、Ltrmdr1、Lemdr1及びPENr)及びABCCタイプ(LtpgpA、LmepgpA及びLmpgpA)に分類することができる。ABCB及びABCCの両輸送体は、二つのNBDを有するので、フラボノイドの潜在的標的である。
MDRを克服することにおける成功は、ABC輸送体の薬剤結合部位のためのMDRモジュレータの特異性の欠如と低親和性によって制限されてきた。
【００８２】
上記の結果において、本発明のフラボノイド二量体が、それを阻害することができ且つ寄生虫症、特にリーシュマニア属によって引き起こされるもののペンタミジン耐性を逆転させることができることが示された。二つのアピゲニンが三つ又は四つのエチレングリコール単位によって結合された化合物9c又は9dがペンタミジンとSSG双方の耐性の最高調節活性を示し、IC50が約1/3倍に低下した。リンカー長さがより長い又はより短い本発明の他のフラボノイド二量体は、より低い調節活性を示すか或いは全く示さなかった。リンカーのエチレングリコール数が同じであるアピゲニンモノマー(10a及び10b)は、二倍の濃度が用いられた場合でさえ(12μM)、調節活性を有しなかった。このことは、本発明のフラボノイド二量体、特に9c及び9dの調節活性が、ABC輸送体に対するフラボノイド結合の二倍の濃度によるものでなく、むしろ二つのアピゲニン間のエチレングリコール単位の鎖長効果によるものであることを実証する。ペンタミジン及びSSG耐性を逆転させるのに最良の性能を有する鎖長は、3〜4つのエチレングリコール単位である。9c及び9dによる処理は、ペンタミジン及びSSGの蓄積の用量依存性増加を生じる。この結果は、排出輸送体が薬剤蓄積を低下させることによってペンタミジン及びSSG耐性を仲介することを間接的に示すものである。
他の従来のMDRモジュレータと比較すると、9c及び9dは、レセルピンやキナクリンに匹敵するペンタミジン耐性逆転活性を示した。SSG耐性の場合には、9c及び9dは、著しい調節活性を有するが、従来のMDRモジュレータのいずれもが作用しない。
本発明の好ましい実施態様を実施例によって詳述してきたが、本発明の変更と改作が当業者に生じることは明らかである。更にまた、本発明の実施態様は、実施例又は図だけによって限定されるように解釈されない。しかしながら、このような変更と改作が、以下の特許請求の範囲に示されるように、本発明の範囲内であることは明白に理解されるべきである。例えば、一実施態様の一部として図示されるか又は記載される特徴を他の実施態様に用いて、なお更に実施態様を得ることができる。従って、本発明は、特許請求の範囲及びそれらの等価物の範囲内に入るこのような変更及び態様を包含することを意図する。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１ａ】図1aは、既知のフラボノイドを示す構造である。
【図１ｂ】図1bは、本発明二量化されたフラボノイドを示す構造である。
【図２】図2は、二つの経路を経るアピゲニン二量体の合成の逆合成分析を示す図である。
【図３Ａ】図3Aは、MDA435LCC6 MDR細胞におけるタキソール細胞毒性に対するアピゲニンモノマー及び二量体の効果を示すグラフである。
【図３Ｂ】図3Bは、MDA435LCC6 MDR細胞におけるタキソール細胞毒性に対する9dの効果を示すグラフである。
【図４Ａ】図4Aは、MDA435LCC6 MDR細胞におけるビンブラスチン細胞毒性に対するアピゲニンモノマー及び二量体の効果を示すグラフである。
【図４Ｂ】図4Bは、MDA435LCC6 MDR細胞におけるビンブラスチン細胞毒性に対する9dの効果を示すグラフである。
【図５】図5は、MDA435LCC6 MDR細胞におけるドキソルビシン細胞毒性に対するアピゲニンモノマー及び二量体の効果を示すグラフである。
【図６Ａ】図6Aは、5μM 9dを含む又は含まない抗癌剤(A)ビンブラスチンの存在下のMDA435LCC6 MDR細胞及びMDA435LCC6細胞の増殖を示すグラフである。
【図６Ｂ】図6Bは、5μM 9dを含む又は含まない抗癌剤(B)タキソールの存在下のMDA435LCC6 MDR細胞及びMDA435LCC6細胞の増殖を示すグラフである。
【図６Ｃ】図6Cは、5μM 9dを含む又は含まない抗癌剤(C)ドキソルビシンの存在下のMDA435LCC6 MDR細胞及びMDA435LCC6細胞の増殖を示すグラフである。
【図６Ｄ】図6Dは、5μM 9dを含む又は含まない抗癌剤(D)ビンクリスチンの存在下のMDA435LCC6 MDR細胞及びMDA435LCC6細胞の増殖を示すグラフである。
【図６Ｅ】図6Eは、5μM 9dを含む又は含まない抗癌剤(E)ダウノルビシンの存在下のMDA435LCC6 MDR細胞及びMDA435LCC6細胞の増殖を示すグラフである。
【図６Ｆ】図6Fは、5μM 9dを含む又は含まない抗癌剤(F)ミトキサントロンの存在下のMDA435LCC6 MDR細胞及びMDA435LCC6細胞の増殖を示すグラフである。
【図７Ａ】図7Aは、(A)異なるモジュレータで治療したMDA435LCC6 MDR細胞及びMDA435LCC6細胞におけるドキソルビシンの細胞内蓄積を示すグラフである。
【図７Ｂ】図7Bは、(B)異なる濃度の9d(0-20μM)で治療したMDA435LCC6 MDR細胞及びMDA435LCC6細胞におけるドキソルビシンの細胞内蓄積を示すグラフである。
【図８Ａ】図8Aは、P388/ADR細胞におけるドキソルビシン細胞毒性に対するアピゲニンモノマー及び二量体の効果を示すグラフである。
【図８Ｂ】図8Bは、異なる濃度の9d(0-10μM)の存在下にMTS細胞毒性分析の用量反応曲線から算出したIC50値として示される、P388/ADR細胞におけるドキソルビシン細胞毒性に対する9dの濃度依存効果を示すグラフである。
【図９Ａ】図9Aは、P388/ADR細胞におけるダウノルビシン細胞毒性に対するアピゲニンモノマー及び二量体の効果を示すグラフである。
【図９Ｂ】図9Bは、P388/ADR細胞におけるダウノルビシン細胞毒性に対する濃度依存効果を示すグラフである。結果は、異なる濃度の9d(0-10μM)の存在下にMTS細胞毒性分析の用量反応曲線から算出したIC50値として示される。
【図１０Ａ】図10Aは、5μM 9dを含む又は含まない抗癌剤(A)ビンブラスチンの存在下のP388/ADR細胞及びP388細胞の増殖を示すグラフである。
【図１０Ｂ】図10Bは、5μM 9dを含む又は含まない抗癌剤(B)タキソールの存在下のP388/ADR細胞及びP388細胞の増殖を示すグラフである。
【図１０Ｃ】図10Cは、5μM 9dを含む又は含まない抗癌剤(C)ドキソルビシンの存在下のP388/ADR細胞及びP388細胞の増殖を示すグラフである。
【図１０Ｄ】図10Dは、5μM 9dを含む又は含まない抗癌剤(D)ビンクリスチンの存在下のP388/ADR細胞及びP388細胞の増殖を示すグラフである。
【図１０Ｅ】図10Eは、5μM 9dを含む又は含まない抗癌剤(E)ダウノルビシンの存在下のP388/ADR細胞及びP388細胞の増殖を示すグラフである。
【図１０Ｆ】図10Fは、5μM 9dを含む又は含まない抗癌剤(F)ミトキサントロンの存在下のP388/ADR細胞及びP388細胞の増殖を示すグラフである。
【図１１Ａ】図11Aは、9d(0-20μM)の(A)異なるモジュレータ及び(B)異なる濃度によるP388/ADR細胞及びP388細胞におけるドキソルビシンの細胞内蓄積を示すグラフである。
【図１１Ｂ】図11Bは、(B)異なる濃度の9d(0-20μM)によるP388/ADR細胞及びP388細胞におけるドキソルビシンの細胞内蓄積を示すグラフである。
【図１２】図12は、P-gp ATPアーゼ活性に対する9dの効果を示すグラフである。
【図１３Ａ】図13Aは、リーシュマニアの薬剤耐性: (A)ペンタミジン耐性のL.エンリエッティイ(LePentR50)を示すグラフである。
【図１３Ｂ】図13bは、リーシュマニアの薬剤耐性: (B)スチボグルコン酸ナトリウム(SSG)耐性のL.ドノバニ(Ld39及びLd2001)を示すグラフである。
【図１４Ａ】図14Aは、ペンタミジン耐性のL.エンリエッティイ LePentR50(A)の耐性に対する異なる長さのエチレングリコール単位(1〜13単位)による本発明のフラボノイド二量体の調節活性を示すグラフである。
【図１４Ｂ】図14Bは、SSG耐性のL.ドノバニLd39(B)のSSG耐性に対する異なる長さのエチレングリコール単位(1〜13単位)による本発明のフラボノイド二量体の調節活性を示すグラフである。
【図１４Ｃ】図14Cは、SSG耐性のLd2001(C)のSSG耐性に対する異なる長さのエチレングリコール単位(1〜13単位)による本発明のフラボノイド二量体の調節活性を示すグラフである。
【図１４Ｄ】図14Dは、野生型L.ドノバニLdAG83(D)に対する異なる長さのエチレングリコール単位(1〜13単位)による本発明のフラボノイド二量体の調節活性を示すグラフである。
【図１５Ａ】図15Aは、LePentR50のペンタミジン耐性に対するフラボノイド二量体9cの用量依存性調節活性を示すグラフである。
【図１５Ｂ】図15Bは、LePentR50のペンタミジン耐性に対するフラボノイド二量体9dの用量依存性調節活性を示すグラフである。
【図１６】図16は、LePentR50のペンタミジン蓄積に対するフラボノイド二量体9dの効果を示すグラフである。
【図１７Ａ】図17Aは、Ld39のSSG耐性に対する9c(A)の用量依存性調節活性を示すグラフである。
【図１７Ｂ】図17Bは、Ld39のSSG耐性に対する9d(B)の用量依存性調節活性を示すグラフである。
【図１７Ｃ】図17Cは、LdAG83(C)に対する9dの用量依存性調節活性を示すグラフである。
【図１７Ｄ】図17dは、LdAG83及びLd2001(D)の全アンチモン蓄積に対する9dの効果を示すグラフである。
【図１８Ａ】図18Aは、9c及び9dの調節活性とLePentR50(A)のペンタミジン耐性に対する他のMDRモジュレータとの比較を示すグラフである。
【図１８Ｂ】図18Bは、9c及び9dの調節活性とLd39(B)のSSG耐性に対する他のMDRモジュレータとの比較を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【国際調査報告】
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