(57)【要約】  ビデオカメラ等を用いて流液（２１４）を撮像することによって、流動（層）液体中の蛍光粒子（２１０）の濃度を測定する発明が開示される。照明ビームは、対象粒子を照明するのに使用される。撮像オプティクス（４０８、４１２）は、流液ストリーム中の複数蛍光試料粒子の画像を形成するために焦点面を観測するように配置される。カメラは撮像オプティクスによって形成された画像を記録し、計数アルゴリズム（８１２）は粒子を計数する。粒子密度（８２８）の初期推定値、例えば、流量（８２４ａ）、露出時間（８２４）およびサンプリング間隔（８２４ａ）に応じて、システムの動作パラメータが調整される（８２４）。さらに、推定粒子密度によって、計数アルゴリズムが選択される。
2009522586.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流液（３１４）中の粒子を計数する方法であって、前記流液は、前記流液の照明断面を撮像する焦点面を有する撮像装置を含む撮像システム（４０８、４１２）によってモニタされ、
前記方法は、
（ａ）前記撮像装置（４０８）によって１つ以上のフレームを撮像するステップ（４０４、４０８）と、
（ｂ）既定の計数アルゴリズムを使用して、撮像されたフレームに基づいて粒子密度の予備的推定を行なうステップ（８２８）と、
（ｃ）撮像された前記フレームの粒子密度が収まる２つ以上の所定の密度カテゴリを判定するステップ（８１０）と、
（ｄ）判定された前記密度カテゴリに応じて、
−前記計数アルゴリズム（８１２）、
−前記撮像システム（８２４ｂ）のパラメータ、および／または
−流速（８２４ａ）
の少なくとも１つを調整するステップと、
（ｅ）前記ステップ（ｃ）の調整をした後に、前記溶液中の粒子を計数するステップ（８１４）と
を備えることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記調整するステップは、露光時間または照明強度を含む前記撮像システムのパラメータを調整することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記調整するステップは、異なる粒子密度カテゴリで動作するように設計された複数の計数アルゴリズムから選択することによって、前記計数アルゴリズムを調整することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記計数アルゴリズムは、低位粒子密度アルゴリズム（８０８Ａ、８０８Ｂ）および高粒子密度アルゴリズム（８０８Ｃ）を含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記低位粒子密度アルゴリズムは、
２つの連続した画像フレーム（９０８、１００８）の差分を取るステップと、
所定の閾値強度（９１０、１０１０）を越えたピクセルのグループをフラグ付けするステップと、
フラグ付けされたグループを粒子（９１８、１０１８）として計数するステップと、
空間的な錯誤（９２０、１０２０）に対して計数を修正するステップと
を含むことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
粒子を計数する前記ステップは、フラグ付けされたグループのサイズを利用して粒子を識別するステップをさらに含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
空間的な錯誤（９２０、１０２０）に対して計数を修正する前記ステップは、計数された粒子間の距離に基づいて所定の評価基準に応じて前記計数を減らすことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記低位粒子密度アルゴリズムは、低粒子密度アルゴリズム（８０８Ａ）および中間粒子密度アルゴリズム（８０８Ｂ）に分類されており、前記中間粒子密度アルゴリズムは、どの計数された粒子が先のフレーム（１０２０）内で計数されていたかを判定するステップと、それに応じて前記計数を判定するステップ（１０２１）とをさらに含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記調整するステップは、
前記低粒子密度アルゴリズムにおいては、前記調整するステップは前記ポンプスピードを高く設定しかつ前記露光時間を長く設定し、
前記中間粒子密度アルゴリズムにおいては、前記調整するステップは前記ポンプスピードを中位に設定しかつ前記露光時間を中位に設定し、
前記高粒子密度アルゴリズムにおいては、前記調整するステップは前記ポンプスピードを低く設定しかつ前記露光時間を速く設定して、
前記撮像システムの露光時間およびサンプリング時間を調整することを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記中間粒子密度アルゴリズムは、連続したフレーム内で検出された運動粒子を１つの粒子（１０２１）として計数するために、連続した画像のｘ、ｙ座標を追跡するステップを含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記高粒子密度アルゴリズムは、
所定の閾値強度（１１１０、１１１２）を越えたピクセルのグループをフラグ付けするステップと、
フラグ付けされた粒子（ｌ１１８）を計数するステップと、
前記計数（１１２０、１１２８）に基づいた数式によって、空間的な錯誤訂正因子を前記計数に対して適用するステップとを含むことを特徴とする請求項４の方法。
【請求項１２】
前記フラグ付けするステップ（１１０８）に先立って、前記フレームに高域通過フィルタをかけるステップをさらに含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記撮像システムはレンズ（４１２）を含み、前記撮像装置はＣＣＤ画像要素、ＣＭＯＳ撮像要素またはビデオカメラのうちいずれか１つを含むことを特徴とする請求項１の方法。
【請求項１４】
前記撮像システムはレーザまたはＬＥＤのうちいずれか１つを含む照明要素を含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記流液は、フローサイトメータ内で生ずることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記焦点面（２３４）は、前記流液の方向に対して実質的に垂直であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記焦点面は、前記流液の方向に対して実質的に水平であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記流速が、前記流液の所定の体積内の前記粒子の全てが実質的に１つの画像内で検出されるように調節される（８２４ａ）ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
一連のフレーム群内において対象粒子を追跡するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記フレームを撮像するステップは、２色（４０８、４０８ｂ）のフレームを撮像し、および前記２色の各々の強度に対して対象粒子の各々を測定するステップをさらに備えることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
撮像されたフレームの明度を既定の状態で測定するステップと、
前記測定された明度に応じて照明または撮像システム露出時間（８２４ｂ）を調整するステップと
をさらに備えることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記計数するステップは、前記計数アルゴリズムを決定する前記画像からのデータを用いて、撮像が完了した後に、一組の撮像されたフレームにおいて実行されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
粒子の強度分布を測定するステップと、
前記強度分布に応じて照明強度、露出時間およびポンプ速度を調整するステップと
をさらに備えることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記流速は、制御可能な流量でシリンジ・ポンプ（４６０）または蠕動ポンプによって保たれることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
複数のフレーム内で検出された１つの粒子の明度が、最大測定明度となるように設定されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項２６】
流液中の粒子を計数する装置であって、
１つ以上の画像フレームを記録しおよび照明された前記流液（３１４）の断面を撮像する焦点面を有する撮像装置を含み、前記流液をモニタする撮像システム（４１２、４０８）、
プロセッサ内に記憶された既定の計数アルゴリズムを使用して、前記撮像システムからの撮像されたフレーム（４０４）に基づいて、粒子密度を推定する予備的推定モジュール（８０６）、
推定された前記粒子密度に基づいて、撮像された前記フレームの前記粒子密度が収まる２つ以上の所定の密度カテゴリを判定する密度カテゴリ化モジュール（８１０）、
判定された前記密度カテゴリに応じて、前記プロセッサ内に記憶された計数アルゴリズム、撮像システムのパラメータおよび／または流速の中から選択された１つ以上の要素を調整する制御信号（８２４）を生成する制御システムモジュール（８１０）および
前記要素が調整された後に、計数アルゴリズムに応じて前記流液中の粒子を計数する計数モジュール（８１４）
を実装するプロセッサと、
前記制御信号に応じて、選択された要素を調整する調整ユニット（８１２、４０８、４６０）と
を備えたことを特徴とする装置。
【請求項２７】
前記プロセッサは制御信号（８２４ｂ）を生成して、前記撮像システムのパラメータを調整し、前記調整ユニット（８１２）は前記制御信号に応じて前記撮像システムの前記露出時間または照明強度を変えることを特徴とする請求項２６に記載の装置。
【請求項２８】
前記プロセッサは制御信号（８２４ｃ）を生成して前記計数アルゴリズムを調整し、前記調整ユニット（８１２）は前記制御信号に応じて前記計数モジュールにより用いられた前記計数アルゴリズムを変えることを特徴とする請求項２６に記載の装置。
【請求項２９】
前記撮像システムはレンズ（４１２）を含み、前記撮像装置はＣＣＤ画像要素、ＣＭＯＳ画像要素またはビデオカメラのうちいずれか１つを含むことを特徴とする請求項２６の装置。
【請求項３０】
前記流液は、フローサイトメータ内で生ずることを特徴とする請求項２６に記載の装置。
【請求項３１】
前記焦点面は、前記流液の方向に対して実質的に垂直であることを特徴とする請求項３０に記載の装置。
【請求項３２】
前記焦点面は、前記流液の方向に対して実質的に平行であることを特徴とする請求項３０に記載の装置。
【請求項３３】
前記流速が、前記流液の所定体積内の前記粒子の全てが実質的に１つの画像内で検出されるように調節される（８２４ａ）ことを特徴とする請求項２６に記載の装置。
【請求項３４】
制御可能な流量で前記流速を決定するシリンジ・ポンプ（４６０）または蠕動ポンプのうちいずれか一方をさらに備えたことを特徴とする請求項２６に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、半透明または透明な流動液体中の特定対象粒子を計数する装置ならびに方法に関する。特に、本発明は画像化された粒子を計数することに関し、流液中において推定された粒子密度に応じて、装置パラメータおよび信号処理が調整される。
【背景技術】
【０００２】
体積の大きい流体中において、密度の低い選択された対象粒子、特に細胞を撮像しおよび分類することに関する出願は多くある。このような出願には、１．）バイオテロと生物戦争防御、２．）食物と水質保全、３．）癌細胞の臨床的検出、および４．）環境監視を含む。これまで開発された細胞撮像計数システムにおいては、１．）高コスト、２．）不十分な感度、３．）遅い、４．）大きいサイズ、５．）不十分なスペクトルおよび／もしくは空間的分解能、並びに／または、６．）労働集約的な準備ステップの問題を通常抱えている。
【０００３】
従来のフローサイトメトリを使用して、細胞を直接的に計数しても良い。フローサイトメトリは一般的に使用されている技術であり、細胞の化学的または物理的な性質を測定することができる。細胞は、流体中、大抵は空気または水中において浮遊されたまま、測定装置によって一列となって流動する。免疫蛍光フローサイトメトリにおいては、各細胞に蛍光抗体を付着させることによって、以下のように、細胞を特定することができる。
・蛍光性分子または蛍光光色素を用いて対象となる細胞に対して特定の抗体をラベルする。
・対象となる細胞と共に、ラベルされた抗体を溶液中で混ぜる。抗体が（抗原と称される）細胞の特定のサイトに付着する。
・細胞を（複数の）レーザ付近の溶液流中に一列で通過させ、レーザは蛍光色素を照明して、細胞は異なる波長で蛍光する。
・光電子増倍管またはフォトダイオードを用いて、マークされた細胞が検出装置の前を通る毎に蛍光放射散乱が検出される。
・マークされた細胞の数を計数することができる。対象となる細胞に特有の抗体を選択することができる。
【０００４】
流動細胞計測は、現在、種々のアプリケーションに使用されており、ＨＩＶ治療をモニタするためのヘルパーＴリンパ球数を測定するアプリケーションや、癌治療の判定において腫瘍細胞ＤＮＡ含有量を測定するアプリケーションや、動物育種のＸとＹ染色体ベアリング精液を分離するアプリケーションに使用されている。
【０００５】
図１（先行技術）は、典型的なフローサイトメトリシステム（非特許文献１）を示している。サイトメトリを実行に移すことは、２つの同心円筒の流液を用いることを含む。内部流または中心流液は、サンプリングされるべき細胞を含んでいる。外側のストリームまたはシース流液を用いる目的は、中心流の直径を小さくすることである。中心およびシース流体が流液のテーパ状の領域に達するので、中心流の断面面積は小さくなる。小口径の中心流（約２０ミクロン）によって、小さい直径のレーザ光線により照明された流液中の細胞が光学的に精度良く測定される。すなわち、細胞のすべてが、ビームのほとんど同一の部分を通り抜けて、均一に照明されるだろう。なぜ、細胞は小口径透明チューブを通過しないか？一般に、小さい直径の孔は機能しない。なぜならば、頻繁に目詰まりするからである。市販のフローサイトメータの全てが現在、シース／中心流配置を採用している。
【０００６】
フローサイトメータ内の蛍光ラベルのレーザ励起蛍光は、食物が媒介する病原体等の特定の微生物を、迅速、確実でかつ比較的明確に検知する唯一の強力な方法である。数点の研究論文がローサイトメータの方法およびアプリケーションについて説明している（例えば、Ａ．Ｌ．ＧｉｖａｎによるＦｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：Ｆｉｒｓｔ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、１９９２年、参照文献）。
【０００７】
歴史的には、フローサイトメータは非常に大きくて、高価な実験室ベースの器具である。フローサイトメータは、大電力を消費して、複雑なエレクトロニクスを採用している。フローサイトメータは、携帯型装置の分野内では通常考慮されていない。従来のフローサイトメータのサイズ（最小でもデスクトップサイズ）、所要電力量、および目詰まりのしやすさの故に、水の生物汚染のフィールドモニタリング等の多くのアプリケーションに利用することはできない。
【０００８】
特許文献１においては、ボイラー中の発光粒子を計数する撮像手段が開示されているものの、
・一般のフローサイトメータまたは特に噴水流フローサイトメータには適用しておらず、
・粒子を取り込むための流路を含んでおらず、
・対象粒子中の蛍光を励起するための照明装置を含んでおらず、
・ポンピング機構およびポンプ率を制御する手段を含んでおらず、
・粒子が１以上の回数で計数されないことを保証する方法を含んでおらず、
・システム操作パラメータを急いで最適化するのに使用されるべき測定計数をなす手段に備えておらず、
・空間的な錯誤に対する計数を修正することによって、正確に粒子を計数する方法を含んでおらず、
・計数評価基準として、粒子サイズを含んでおらず、
・粒子密度に基づいて複数の計数アルゴリズムを使用する手段を含んでいない。
【０００９】
特許文献４においては、透明媒体中の蛍光ラベルされたＤＮＡを高スループットで分析する発明が開示されている。この発明は、流液中で撮像装置に近づく細胞を検出するデバイスである。流液は、非常に細長いビームを伴うレーザによって側面から焦点面に照明された透明チューブ内にある。
【００１０】
この発明は代替技術として上に示された欠点を有していないものの、流液媒体が透明でないアプリケーションには適していない。また、それは撮像技術ではなく、むしろ単一ポイントの測光的な検出および解析に適した技術である。
【００１１】
特許文献５および特許文献６には、細胞を計数する発明が開示されており、その計数は、比較的平坦な透明チャンバに細胞を流し、それらの蛍光を励起させ、カメラを用いて単一画像でチャンバを撮像することによってなされる。カメラの画像はデジタル化され、チャンバ内の細胞数が計数される。
【００１２】
特許文献３においては、特許文献５と同様に細胞を撮像するための発明が開示されており、試料がフローチャンバに流れて、撮像される。
【００１３】
特許文献２においては、所望の不確実性が得られるまで、一定の不確実性に定量化されるべき細胞を含む液体サンプルは、一度に測定される１個のサブサンプルである発明が開示されている。
【００１４】
図２（従来技術）は、本願の発明者による特許文献７に詳細に開示されている（そして本願明細書に参照として組み入れられた）噴水フローサイトメータと称されるシステムの概略を示している。手短に説明すれば、以下のとおりである。
−蛍光ラベル細胞（２１０）のサンプルは、ＣＣＤ／ＣＭＯＳカメラおよび前部オプティクス（２０８）に向かってチューブ（２０６）の上方に流れる。
−細胞は、レーザ（２２８）により焦点面内で照明される。
−細胞が、ＣＣＤ／ＣＭＯＳカメラ焦点面（２３４）を通り抜けるとき、透明窓を介するＣＣＤ／ＣＭＯＳカメラ（２１８）およびレンズアセンブリ（２１２）、並びに蛍光発光の波長を分離するフィルタ（２１４）によって撮像される。
−細胞が浮遊している流体は窓のそばを通過し、排液管（２３０）から出る。
【００１５】
通常、サンプルは垂直に上向きに流れる。（１実施例では、サンプルは水平な排液管（２３０）から流れ、ガラスカバースリップ（２２０）下の流路（２２２）から流れるだろう）。体積（ｖｏｌｕｍｅ）２２６は、我々の発明においては、空気または透明な液体で満たされる。これにより、溶媒を介在せず、介在する流体の光学的深度を０付近まで低減させずに、照明された体積（２２４）を見ることができる。照明された体積（２２４）は、薄い必要ではなく（すなわち、リボンとして形成されず）、またレーザを通して照明される必要はない。発光ダイオード等のインコヒーレント光を介した照明は、使用可能であるだけでなく、いくつかの点においては好ましい。照明された体積における照明の不均一性を増大させる際の干渉の効果を最小にするからである。
【００１６】
サンプル（２０６）の列は、エンドオンで観察されおよび照明される（これを実行する１つの方法としては、観察路と照明路の両方をフロー軸と一致させ、反対方向においては、エピ蛍光顕微鏡と同様の二色性ミラーを用いる方法がある）。撮像された体積は、カメラ前部オプティクスの被写界深度によって制御されて、通常、結果のデジタル画像を縮小する逆効果を防ぐために小さく維持されるであろう。理想的な状況は、流管に流れる粒子が少数ピクセルで撮像されるところにある。
【００１７】
利便性良く撮像される流管の断面は、サンプル流体の不透明度に依存しておらず、非常に大きく（３ｍｍ×３ｍｍ平方）することができるので、サンプルの流出量を高くすることができる。我々は、直径８ｍｍの噴水流口を使用して、１００ｍｌ／分より大きい流量で、ＬＥＤによって照明したアメーバを検知した。
【００１８】
チューブ壁付近の粒子の流れが遅いので、壁付近の粒子がより低速で移動し、その結果、複数の画像中に現れる。デバイスを較正するときには、この効果を考慮しなければならない。
【００１９】
選択的に微生物にタグ付けをする蛍光抗体の使用に組み合わされる場合、この発明により、２つの応用例を例示すれば、食物および水中の病原微生物の検出が可能となる。サイズ判定に基づく選別を可能にして、高解像度の画像により、蛍光タグ付けされた粒子のサイズを測定することができる。リアルタイムでの検出、計数およびサイズ判定を実行することができる。
【００２０】
【特許文献１】米国特許第４８１４８６８号明細書  １９８９年３月  James
【特許文献２】米国特許第５９７８４３５号明細書  １９９９年１１月  Christensen他
【特許文献３】米国特許第６１１５１１９号明細書  ２０００年９月  Sieracki他
【特許文献４】米国特許第６３０９８８６号明細書  ２００１年１０月  Ambrose他
【特許文献５】米国特許第６７１０８７９号明細書  ２００４年３月  Hansen他
【特許文献６】米国特許第６７３１１００号明細書  ２００４年５月  Hansen他
【特許文献７】米国特許第６７６５６５６号明細書  ２００４年７月  Johnson
【特許文献８】米国特許出願公開１０／８４９，４７７号明細書
【非特許文献１】Shapiro著、Practical Flow Cytometry、第２版
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
しかしながら、粒子密度の大きいダイナミックレンジに渡って対象粒子密度を正確に測定するために、この技術を実用化するためには、画像処理手段および計数手段において、以下に示す点を改良しなければならない。
・ビデオ画像から、ゆっくり変化するものの比較的強度の高いバックグラウンドを低減させて、バックグラウンドと対象粒子とを識別できるようにする。
・ノイズを減らす。
・候補粒子のサイズおよび測光的強度を含み、感度ならびに客観的基準に基づいて、粒子を検出する。
・ソース錯誤の効果を減らす、すなわち、２つの粒子が１つの粒子として計数される１つのフレーム内に十分近接して共に出現する統計的確率を訂正する。
・１つ以上の画像に現れていたとしても、その粒子を１回だけ計数する。
・検出装置の焦点面を通り抜けるとき、対象粒子の各々の測光的強度およびそのサイズを正確に測定する。
・システムの操作パラメータを変えて、対象粒子密度に迅速に適応し、粒子密度を測定するシステムのダイナミックレンジを拡張する。これらの操作パラメータは、流速、露光時間、照明の明度、並びに画像の処理および計数に用いられるアルゴリズムを含んでいる。
【００２２】
半透明な流動液体中の特定粒子を高スループット画像ベースで計数する改善された装置および方法の必要性が、当技術分野にある。流液中の算出された粒子密度に応じて、装置パラメータおよび信号処理が調整される必要性もある。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明の目的は、半透明または透明な流動液体中における特定粒子の高スループットイメージングベースの計数のための改良された装置と方法を提供することにある。流液中の推定された粒子密度に応じて、装置パラメータおよび信号処理が調整される。
【００２４】
この技術の1つの好適な実施例は、特許文献７の噴水流発明を利用するフローサイトメトリに関連している。しかし、この実施例に制限されず、流液の断面を抽出する焦点面を有する撮像装置によってモニタされるいかなる流液においても、対象粒子の計数に使用される。これは、従来のフローサイトメトリおよび特許文献４による発明を含んでいる。
【００２５】
本明細書において説明する発明は、新規な統合されたシステムであり、撮像装置と、照明器と、流液路と、バックグラウンドおよびノイズを低減させるイメージプロセッシング手段と、粒子を計数する計数手段と、計数値を修正して正確に粒子密度を測定する分析手段と、システムパラメータを調整して短い時間間隔で正確な測定を最適化する制御手段とを含む。
【００２６】
本発明のいくつかの実施例は、半透明または透明な流動液体中のサンプルの高スループット、高感度検出および識別をする装置ならびに方法を提供する。これは、比較的大きい断面図の軸流を与えることによって達成され、軸流中においては、流液中に浮遊する細胞または対象粒子は、撮像装置の焦点面を通して流れるときに、観測される。広いダイナミックレンジに亘る対象粒子密度の測定は、対象粒子密度の迅速な測定に基づいて、リアルタイムでシステムの動作パラメータを調整することによって、達成される。
【００２７】
本発明には、固相サイトメトリ（Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｑｕａｔ．  Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｅｃｏｌ．，  ２５：  ３０１−３０９，  ２００）が可能であるという利点があり、はるかに低いコスト（＜１万ドル）で個々の微生物を検出できるという利点も含まれる。本発明は、免疫蛍光色素を含む蛍光色素を使用した分類学的識別に基づいている。検出ステップは、以下のステップを含む。すなわち、
・対象細胞種に特有の抗体が、蛍光分子または蛍光色素によってラベル付けされる。
・ラベル付けされた抗体は、対象細胞種と共に溶液中で混ぜられる。抗体が細胞（抗原）上の特定位置に付着する。
・細胞の液体浮遊液はレーザまたはＬＥＤに向かう流路内に送り込まれ、レーザまたはＬＥＤは蛍光色素を照明し、これにより、細胞が長波長で蛍光を発する。対象細胞に対して、極めて特有の抗体を選択することができる。
・低コストＣＣＤ（電荷撮像素子）またはＣＭＯＳ二次元検出装置が流路を撮像し、マークされたセルが検出装置の焦点面を通り抜ける間において、そのセルがレーザーダイオードによって照明される度に蛍光放射のフラッシュが撮像される。
・マークされた細胞の数がコンピュータを介して計数され、その結果は、測定される対象粒子の密度用にシステムのパラメータを最適化するのに用いられる。
【００２８】
本発明は、流路を通り抜けるサンプル中の複数の蛍光粒子を撮像する装置および方法を含む。１つの好適な実施例では、流路は、フローストリーム中のサンプルに対して流れ方向を定義し、流液を分岐する観測面を有する。照明ビームは、流液中の画像焦点面において、対象粒子からの蛍光を励起するのに用いられる。撮像オプティクスは、フローストリーム中の複数の蛍光サンプル粒子の画像を形成するために焦点面を観測するように配置されている。カメラは、撮像オプティクスによって形成された画像を記録する。コンピュータは、カメラによって記録されたデジタル画像上において、粒子検出、計数、システム制御およびデータ解析を実行する。
【００２９】
撮像要素は、カラーフィルタと、オプティクスと、ＣＣＤまたはＣＭＯＳカメラ等の撮像要素とを含んでも良い。サンプルの流量を維持するポンプ要素は、シリンジ・ポンプ、ぜん動ポンプ、または他のコンピュータの制御可能なポンプから成っても良い。レーザまたはＬＥＤにより照明される。
【００３０】
本発明は流液中の粒子を計数する方法を提供し、流液は、照明された流液の断面を撮像する焦点面を有する撮像装置を含む撮像システムによってモニタされる。その方法は、
（ａ）撮像装置を用いて１つ以上のフレームを撮像するステップと、
（ｂ）既定の計数アルゴリズムを使用して、撮像されたフレームに基づいて粒子密度の予備的推定を行なうステップと、
（ｃ）撮像されたフレームの密度が収まる２以上の密度カテゴリを決定するステップと、
（ｄ）決定された密度カテゴリに応じて、
−計数アルゴリズム、
−撮像システムのパラメータ、
−流速
のうち少なくとも１つの要素を調整するステップと、
（ｅ）ステップ（ｃ）の調整をした後に、流液中の粒子を計数するステップとを含む。
【００３１】
上記の調整ステップは、露光時間または照明強度を含む撮像システムのパラメータを調整しても良い。また、上記の調整するステップは、異なる粒子密度カテゴリで動作するように設計された複数の計数アルゴリズムから選択することによって、計数アルゴリズムを調整しても良い。上述の方法は、粒子の強度分布を測定し、測定された強度分布に応じて照明強度、露光時間およびポンプスピードを調整する。
【００３２】
計数アルゴリズムが修正されるケースでは、計数アルゴリズムは少なくとも低位粒子密度アルゴリズムおよび高粒子密度アルゴリズムを含む。低位粒子密度アルゴリズムは、２つの連続した画像レームの差分を取るステップと、所定の閾値強度を超えたピクセルのグループをフラグ付け（ｆｌａｇｇｉｎｇ）ステップと、フラグ付けされたグループを粒子として計数するステップと、空間的な錯誤に対して計数を訂正するステップとを実行する。一般に、粒子計数ステップは、粒子を選別するためにフラグ付けされたグループのサイズを利用している。空間的な錯誤に対して計数を訂正するステップは、一般に、計数された粒子間の距離に基づいて、所定の評価基準に応じて計数を減らすことになる。
【００３３】
好適な実施例では、高粒子密度アルゴリズムは、所定の閾値強度を超えたピクセルのグループをフラグ付けするステップと、フラグ付けされたグループを粒子として計数するステップと、計数に基づく数式に応じて計数に空間的な錯誤補正因子を適用するステップとを含む。一般に、フラグ付けするステップに先立って、その処理はフレームに高域通過フィルタをかける。
【００３４】
好適な実施例では、低位粒子密度アルゴリズムは、低粒子密度アルゴリズムおよび中間粒子密度アルゴリズムにさらに分類される。この場合、中間粒子密度アルゴリズムは、計数された粒子が先のフレーム内で計数されているかを判定するステップと、それに応じて計数を減らすステップとを含む。また、中間粒子密度アルゴリズムは、連続したフレーム内に検出された運動粒子を１つの粒子として計数するために、連続した画像内のｘ、ｙ座標を追跡するステップを含んでも良い。複数のフレーム内で検出された粒子の明度が最大測定明度となるようにとられる。
【００３５】
調整するステップは、以下の様に撮像システムの露光時間およびサンプリング時間を調整しても良い。
−低粒子密度アルゴリズムにおいては、調整ステップはポンプスピードを高い値に設定しおよび露光時間を長い時間に設定する。
−中間粒子密度アルゴリズムにおいては、調整ステップはポンプスピードを中位に設定しおよび露光時間を中位に設定する。
−高粒子密度アルゴリズムにおいては、調整ステップはポンプスピードを低い値に設定しおよび露光時間を短い時間に設定する。
【００３６】
場合によっては、上述の流速が、流液の所定の体積内の粒子の全てが実質的に１つの画像内で検出されるように調節される。いくつかの実施例においては、フレーム撮像ステップは、２色のフレームを撮像し、および２色の各々の強度に対して対象粒子の各々を測定するステップをさらに含む。この方法は、撮像されたフレームの明度を既定の状態で測定するステップと、測定された明度に応じて照明または撮像システム露出時間を調整するステップとをさらに含む。都合がよければ、計数ステップは、計数アルゴリズムを決定する画像からのデータを用いて、撮像が完了した後に、一組の撮像されたフレームにおいて実行される。
【００３７】
本発明に係る流液中の粒子を計数する装置は、以下の（１）−（３）を含む。
（１）１つ以上の画像フレームを記録しおよび照明された流液の断面を撮像する焦点面を有する撮像装置を含み、流液をモニタする撮像システム。
（２）以下のモジュールを実装するプロセッサであって、そのモジュールは、以下のとおりある。
−プロセッサ内に記憶された既定の計数アルゴリズムを使用して、撮像システムからの撮像されたフレームに基づいて、粒子密度を推定する予備的推定モジュールと、
−推定された粒子密度に基づいて、撮像された前記フレームの粒子密度が収まる２つ以上の所定の密度カテゴリを判定する密度カテゴリ化モジュール
−判定された密度カテゴリに応じて、
−プロセッサ内に記憶された計数アルゴリズム、
−撮像システムのパラメータ、および／または、
−流速
の中から選択された１つ以上の要素を調整する制御信号を生成する制御システムモジュール
−要素が調整された後に、計数アルゴリズムに応じて流液中の粒子を計数する計数モジュール
（３）前記制御信号に応じて、選択された要素を調整する調整ユニット。
【００３８】
上述のプロセッサは制御信号を生成して、撮像システムのパラメータを調整し、その場合、調整ユニットが制御信号に応じて撮像システムの露出時間または照明強度を変えても良い。または、プロセッサは、制御信号を生成して計数アルゴリズムを調整し、その場合、調整ユニットは制御信号に応じて計数モジュールにより用いられた計数アルゴリズムを変更する。
【００３９】
上述の撮像システムはレンズを含み、撮像装置はＣＣＤ画像要素、ＣＭＯＳ画像要素またはビデオカメラのうちいずれか１つを含んでも良い。流液はフローサイトメータ内で生じても良い。焦点面は前記流液の方向に対して実質的に垂直であり、実質的に平行であり、またはその他の構成であっても良い。流速が、流液の所定体積内の粒子の全てが実質的に１つの画像内で検出されるように調節されても良い。制御可能な流量で流速を決定するシリンジ・ポンプまたは蠕動ポンプのうちいずれか一方をさらに含んでも良い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
本発明は、流動液体中の粒子を計数する装置および方法を含む。流動液体中の粒子の濃度に応じて、装置パラメータおよび信号処理パラメータの両方が調整される。
【００４１】
図３Ａおよび図３Ｂは、本発明に係る噴水流サイトメータから得られた一連の画像である。図３Ｃは、２つの画像の差分を示してある。一連の画像の差分を取ることが図９と図１０とともに以下に説明するように利用される。したがって、図３Ｃは、（低粒子密度に対する）アルゴリズム８０８Ａまたは（中間の粒子密度に対する）アルゴリズム８０８Ｂから生じ得る図を示している。
【００４２】
図４、図５および図６は、流液中の粒子濃度に応じて、粒子検出がどのように変わるかを示している。低濃度では、各々の粒子が計数され得る。高濃度では、検出粒子の低い数から実際の粒子の数を推定しなければならない。
【００４３】
図４は、実際の粒子密度と、条件１と称する低濃度、高流量速度条件下で測定された粒子密度との関係を示すプロットである。予測された細胞計数と測定された細胞計数との間には、強い線形相関があり、傾きは約１／２である。
【００４４】
条件１は流量が十分に高い条件であるので、カメラが１つの画像を表示するのにかかる時間、すなわち４４０ミリ秒よりもはるかに短時間内に、粒子が照明された焦点面内に留まる。例えば、細胞が＜＜４４０ミリ秒で焦点面を通過する場合、細胞が検出される見込みは約露光時間４４０ミリ秒である。焦点面内のセル残留時間は、検出には十分長いと想定される。これらの条件下では、個々の細胞は複数のフレームには検出されないだろう。この条件では、焦点面を通して流れる細胞の実際の数値に検出（ｐ）確率を掛けることによって計数されている。いくつかのカメラ／条件に対して、サイクルタイムは露光時間に等しく、検出確率は１（ｕｎｉｔｙ）である(その場合は、連続した読み出しを可能にするＣＭＯＳイメージャを用いた場合である。)。確率が１であるとき、条件１および条件２は同一となる。
【００４５】
図５は、実際の粒子密度と、中濃度、低流量速度条件（条件２）下で測定された粒子密度との関係を示すプロット図である。
【００４６】
条件２下では、予測された細胞計数と測定された細胞計数とには、ほぼ線形的な関係があり、傾きは約１である。ソース錯誤が高濃度で効いてくるまで、条件２では、照明された焦点面における細胞残留時間がカメラのサイクルタイムより大であるかまたは等しく、画像面を通過するあらゆる細胞が、少なくとも一度撮像される。この条件では、複数フレーム（フレーム間において空間的に同時発生：ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃｅ）内で撮像された細胞に対して、訂正（ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）をしなければならない。さらに、個々の画像内の細胞濃度は十分低いと想定されるので、１つのフレーム内の空間的な同時発生、すなわち、ソース錯誤は顕著ではない。条件２の下では、(引き続くフレーム内のほぼ同一の座標で見られる１つのフレーム内にあるいかなる細胞をも、１つの検出として、計数して)フレーム間の空間的な同時発生を訂正することによって、焦点面を通して流れる粒子の実際の数値を測定することができる。
【００４７】
図６は、実際の粒子密度と、高濃度、低流量速度条件（条件３）において測定された粒子密度との関係を示すプロット図である。
【００４８】
条件３では、１つのフレーム内の細胞濃度が十分高いので、ソース錯誤が顕著となる。フレーム間の空間的な同時発生が非常に大きいので、それらは無視されている。これは、条件１下のように焦点面を通して流れる細胞の実際の数値をもはや測定していないことを意味している。しかし、実際の細胞数と計数された細胞数との間における経験的な関係が判定されている。この判定は、所定の対象粒子密度の静的な較正液体（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｌｉｑｕｉｄ）を連続的にスナップショットすることによってなされる。言い換えれば、高濃度な静的サンプルのスナップショットによって、焦点面内の何百もの細胞を検知することができる。異なった濃度のサンプルをスナップショットすることによって、計数と実際の濃度との間において経験的な関係を得ることができる。ソース錯誤はこの関係に影響するであろう。
【００４９】
条件３の下では、ソース錯誤を示すほど高くない濃度においてのみ、測定された計数と実際の計数との間には、線形的な相関がある。ソース錯誤が顕著になるにつれ、測定された計数は飽和し始める。
【００５０】
図７は、本発明に係る粒子計数装置の１つの実施例の構成要素を示すブロックダイアグラムである。図８は、粒子計数プロセスで実行される基本ステップを示すフロー図である。２つの図の間には密接な関係があるので、これらの２つの図を一緒に議論する。
【００５１】
図７は、本発明に係る粒子計数装置の実施例を示すブロックダイアグラムである。この実施例は、フローセル配列、２つの照明要素および２つの撮像要素を含んでいるが、他の多くの構成も可能である。図７に示す好適な実施例は、（本明細書に参考として共に援用されている）特許文献７および特許文献８の噴水流の発明を利用するフローサイトメトリに関連している。しかし、この実施例に制限されることはなく、いなかる流液中にある対象粒子の計数に使用することができる。流液の断面は流液の断面をサンプリングする焦点面を有する撮像装置によってモニタされる。これは、従来のフローサイトメトリおよび特許文献４の発明を含んでいても良い。
【００５２】
図７の実施例では、ポンプ４６０によって、流体はフローセル３００内を流れる。流体は、光学要素４５２、４５４、４４２および４４４を介して、レーザ４４８、４５０によって照明される。流液から放射された光４３４は、光学要素４４４、４４２、および４１２を介してＣＣＤ４０８、４０８ｂに進み、ビームスプリッタ４５６によって分岐される。
【００５３】
ＣＣＤ４０８およびＣＣＤ４０８ｂは装置の画像処理部に画像データを与え、画像処理部は、図８に示されているようにデータを処理する。処理部によって決定された粒子密度に応じて、処理部は、順番に、露光時間、サンプリング時間およびポンプスピード等の装置パラメータを調整する。
【００５４】
エシュリキア属大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）は、以下のパラメータを使用して、本発明に係る噴水流システムによって検出される。大腸菌は、水溶液中で浮遊している間、SYBRゴールド染色液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｅｕｇｅｎｅ，  Ｏｒｅｇｏｎ）を使用して検出される。２mmの開口部は、２２ミリワット電力のアルゴンイオンレーザによってフロー開口部において照明された。画像は、Omega XF3105フィルタを介したElectrim 1000L CCDカメラによって撮られた。
【００５５】
これらのパラメータにおける低密度とは、８．３３ｘ１０−３ｍｌ／ｓの流量と１００ｍｓの露光時間において、１ｍｌあたり１万未満の細胞が存在する密度であった。これらのパラメータにおける中間密度とは、１．１７ｘ１０−３ｍｌ／ｓの流量と１００ｍｓの露光時間において、１ｍｌあたり１万〜１０万の細胞が存在する密度であった。これらのパラメータにおける高密度とは、５．８３ｘ１０−４ｍｌ／ｓの流量、２５〜１００  ｍｓの露光時間において、１ｍｌあたり１０万より多い細胞が存在する密度であった。
【００５６】
当業者であれば、特定の構成および条件に応じて、特定の粒子密度、流量および露光時間は変動することを理解するであろう。本発明は、おおよその粒子密度を決定し、システムのシステムパラメータを変えて、その密度における粒子を最善に計数する。
【００５７】
図８は、粒子計数の全体的なプロセスを示すフローチャートである。このプロセスは、ステップ８０２で開始する。ステップ８０４において、ＣＣＤ４０８（図７を参照）から得られた初期画像４０４が与えられる。初期信号処理ステップ８０６は、初期画像中の粒子密度を推定する。サブプロセス８０８は、推定された粒子密度に応じて変わるステップ８１０、８１２および８１４を含んでいる。図９−図１１を参照されたい。
【００５８】
一般的に説明すると、ステップ８１０は、流速および露光時間等の装置パラメータを選択して、これらのパラメータをフロー−撮像機器に与える（図７を参照されたい）。ステップ８１２は、粒子密度環境に対して、正しい画像プロセッシング／粒子計数アルゴリズムを選択する（図９−１１を参照されたい）。ステップ８１４は、選択されたアルゴリズムに応じて、ＣＣＤ４０８からの画像４０４に対して全ての画像処理および粒子計数を遂行する。その結果８２６がステップ８１６に与えられ、ステップ８１６においては、ステップ８０６で推定された粒子密度が、ステップ８１４で検出されたより正確な粒子密度に対して十分に近接しているかどうかが判定される。近接している場合（８１８）、粒子データはステップ８２２において利用するために出力される。近接していない場合、フィードバックループ８２０において、新たな粒子密度計数がステップ８１０に与えられ、より正確な結果が求められる。
【００５９】
本発明の好適な実施例では、自動化されたバクテリア認識および計数コンピュータプログラムが、例えば、ＣＣＤ／ＣＭＯＳカメラ画像のバクテリアを計数する。
【００６０】
画像内で検出された粒子密度に応じて、プログラムによって適用されたアルゴリズムが選択される。低粒子密度が検出される場合、図９に示されたアルゴリズム８０８Ａが使用される。中間の粒子密度が検出される場合、図１０に示されたアルゴリズム８０８Ｂが使用される。高粒子密度が検出される場合、アルゴリズム８０８Ｃが使用される。低密度および中間の密度アルゴリズムによって、２つの連続した画像の差分を取りおよび負ピクセルをゼロに設定することによって、バックグラウンドが除去される。
【００６１】
噴水流焦点面の照明の不均一性が原因で、ＣＣＤ画像の光度測定のバックグラウンドは不均一なため、２つの連続する画像の差分を取りおよび差分における負ピクセルをゼロに設定することによって、バックグラウンドは、プログラム（図３）内で排除される。対象粒子(例えば、バクテリア)およびノイズだけが、差分画像に残っている。対象粒子が１つの画像からその次の画像まで横方向に動くので、高濃度のバクテリア以外においては、１つのフレーム内の粒子は連続したフレーム内の粒子からは、通常差し引かれない。
【００６２】
例として、アルゴリズム８０８Ａおよびアルゴリズム８０８Ｂの画像差分ステップは、表１中に示された３つのパラメータについてユーザに問い合わせを行う。（ＣＣＤ検出器がコラムからコラムへの固定したパターンオフセットを示すように、）プログラムは、画像内の各コラムに対する中央値および標準偏差を測定する。次に、プログラムは、ノイズを超過したそれらの信号強度に基づいて、バクテリアと思われるピクセルを識別する。次に、プログラムは、バクテリアの候補を識別しおよび計数する。その識別および計数は、１つの連続したグループ内で検出された候補バクテリアピクセルの数と、そのグループの中心点の特定半径内の全積分光度測定強度とに基づいている。そのようなプログラムは多くのＣＣＤ画像でテストされており、目によって識別されたバクテリアの数はプログラムによって計数されたバクテリアの数とほぼ等しい。最終的に、プログラムは複数の連続する画像内で検出されたバクテリアの座標を比較して、複数の連続する画像内で検出された明度の高いスポットのどれが、(所定の距離内にそれらの座標があるので)同一のバクテリアであるのかを判定する。
【００６３】
画像の差分を取ることは、バクテリアの濃度が高い画像に対しては上手く機能しない。第１に、バクテリア密度が高い場合、複数の連続する画像内における同様のx、y座標で定義される粒子が同一のバクテリアを示しているのかどうか、または同一の座標を一致して共有する２つのバクテリアを示しているのかを、正確に判定することはできない。この効果は、ソース錯誤と呼ばれている。第２に、１つのフレームをその次のフレームから差し引くことによって、１つのバクテリアを連続する画像内における別のバクテリアから差し引いてしまう可能性がある。バクテリアの密度が高い場合にあっては、連続する画像の差分を取ることは実行されない。代わりに、アルゴリズム８０８Ｃは、座標のフレーム内の空間的な同時存在（ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃｅ）を無視して、これらに対して修正はしない。アルゴリズム８０８Ｃは、測定された噴水流計数と較正サンプルの計数との間における経験的な関係を構築することに依存している。アルゴリズム８０８Ｃは、バックグラウンドを差し引くのに連続する画像の差分を使用していない。代わりに、メジアンフィルタリングが、画像内の点放射源(バクテリア)から生ずる広範のバックグラウンドを取り除くのに使用される。言い換えれば、メジアン（ｍｅｄｉａｎ）フィルタ(１つの実施例では１０×１０ピクセル平方)を適用して、データから低空間周波数が取り除かれる。
【００６４】
【表１】
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【００６５】
このように、粒子を含む画像内の粒子密度に応じて、本発明は異なったアルゴリズムを粒子計数に使用している。理想的には、流速および画像露光時間等の装置パラメータも、粒子計数を最適化するように調整される。図８は、本発明の全体的な粒子計数アルゴリズムを例示しており、図９−図１１は、異なった粒子密度条件における粒子計手法の変形例を例示している。
【００６６】
流動内の対象粒子の密度測定タスクの手順が、以下に与えられている。以下に与えられた画像処理、粒子検出および計数ステップと同時に、撮像（データ取得）手順が実行されるの。したがって、画像収集中に、すなわちリアルタイムで計数を表示することができる。好適な実施例は、特許文献７に記載されているような噴水流サイトメトリの使用を想定している。
【００６７】
ステップ８０６において、予備的な粒子計数が実行される。例として、このプロセスは以下のステップを含んでも良い。
【００６８】
１．低速で(または定常流で)送り込み、流液の「スナップショット」(１つの画像)を取る。
【００６９】
２．画像または画像中の列または行に対して平均値(または、中央値)および標準偏差を測定する。後者は、列から列へまたは行から行へと変動する画像内の固定されたパターンオフセットを取り扱うときに役立つ。
【００７０】
３．画像にメジアンフィルタをかける。
【００７１】
４．隣接ピクセルの最小数で構成された画像内の明るいスポットまたは縞の数を計数する。隣接ピクセルの各々は、平均値(または、中間値)を超えた標準偏差の選択数よりも大きい強度を有する。
【００７２】
５．明るいスポットを含む明るいピクセルのすべての強度を加算することによって、明るいスポット(または縞)の各々の概ねの強度を計算する。
【００７３】
６．画像中の対象粒子の密度(撮像された体積によって割られた計数値であり、体積＝領域の深さ×照明されおよび撮像された焦点面の面積)を計算する。
【００７４】
７．対象粒子の密度および強度分布を使用して、画像処理、計数、分析並びに最適な流量、露光時間および照明強度の設定のために使用されるフローおよびアルゴリズムの適切な条件番号（ｎｕｍｂｅｒ）を見つける。
【００７５】
８．粒子密度に応じて、操作パラメータを変える。
【００７６】
９．適切なアルゴリズム８Ａ、Ｂ、またはＣを使用して、最終的な測定をする。
【００７７】
図９は、低粒子密度条件下における図８のアルゴリズムで利用された特定のアルゴリズムを示すフローチャートである。図１０は、中間的な粒子密度条件下における図８のアルゴリズムで利用された特定のアルゴリズムを示すフローチャートである。これらアルゴリズムの両方が、流液中の個別粒子の大部分またはすべてを検出するのに画像差分を利用している。
【００７８】
図９に図示したアルゴリズム８０８Ａは、以下のステップを含んでいる。
【００７９】
ステップ９０２は、制御信号８２４ａを介してポンプスピードを高い（Ｈｉｇｈ）に設定する。
【００８０】
ステップ９０４は、制御信号８２４ｂを介して露光時間およびサンプリング時間を長い（ｌｏｎｇ）設定する。
【００８１】
ステップ９０６は、データストリーム４０４を介してＣＣＤ４０８からの画像を取得する。対象粒子密度の定量を所望の精度にするために、一連の画像が撮られる。
【００８２】
ステップ９０８は、前の画像を差し引くことによって各画像の差分をとり、バックグラウンドが差し引かれた一連の画像を生成する。負ピクセルがゼロに設定され、差し引かれた画像から対象粒子の影響が取り除かれる。
【００８３】
ステップ９１０は、「ホット」ピクセルにフラグ付け（ｆｌａｇ）をする。ここで、「ホット」ピクセルとは、ある明度閾値を超えたピクセルと定義される。ステップ９１２は、ピクセルのグループを見つける。このピクセルのグループは、先に選択された最小数隣接ホットピクセル（以下、スポットまたは明るいスポットと称する）を含み、検出されたスポット群の重心におけるｘ、ｙ画像座標を決定する。
【００８４】
ステップ９１６は、開口測光（ａｐｅｒｔｕｒｅ  ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ）を使用することによって各スポットの明度を測定する。
【００８５】
ステップ９１８は、粒子を計数する。これは、予め選択された閾値より大きい強度を有する画像内の明るいスポット数である。明るいスポットの各々のおよその強度は、そのスポットを含むホットピクセルのすべての強度を加算することによって、計算される。開口測光を使用して、強度についてより正確な測定をすることができる。（すなわち、２以上のスポットを１つの粒子として計数することによって、所定半径内で検出された同一粒子から生ずる同じ粒子を二度計数することを訂正する）。一般に、粒子座標、粒子強度および粒子サイズが取得され、そして当初の画像は消去される。
【００８６】
ステップ９２２は、全画像が収集されたかどうかを判定する。収集された場合（９２６）、データ９３２はブロック８２２で出力される（図８）。粒子密度９３０がステップ９２８において計算され、およびブロック８１６に出力される。画像収集が完了していない場合（９２４）、処理はステップ９０６に戻る。
【００８７】
図１０に示すアルゴリズム８０８Ｂは、以下のステップを含んでいる。
【００８８】
ステップ１００２は、制御信号８２４ａを介してポンプスピードを中間に設定する。ステップ１００４は、露光時間およびサンプリング時間を制御信号８２４ｂを介して設定する。ポンプ４６０は、カメラサイクル時間に合致する率で動作される。粒子の各々は撮像された体積内に残留しているので、粒子の各々は、少なくとも１つのカメラ露光時間中に検出される。同時に、対象粒子の運動は、２つの連続した画像の差分において識別できる程度に十分に検出されるであろう。
【００８９】
ステップ１００６は、データストリーム４０４を介してＣＣＤ４０８から一連の画像を取得する。ステップ１００８は、前の画像を差し引くことによって、各画像の差分を取り、バックグランドが差し引かれた一連の画像を生成する。負ピクセルがゼロに設定され、差し引かれた画像から対象粒子の影響が取り除かれる。
【００９０】
ステップ１０１０はホットピクセルをフラグ付けし、ステップ１０１２は隣接ホットピクセルのグループを検出し、検出された全スポットの重心に関するｘ、ｙ画像座標を決定する。
【００９１】
ステップ１０１６は、開口測光を使用することによって、各スポットの明度を測定する。ステップ１０１８は、強度および／またはサイズ評価基準を使用して、粒子を計数する。ステップ１０２０は、フレーム内における空間的な同時存在を訂正する。
【００９２】
ステップ１０２１は、前のフレーム内に検出された粒子に対する粒子数を減らす。粒子が複数のフレーム内に検出される場合、最大明度がその粒子の明度として記録される。
【００９３】
ステップ１０２２は、全画像が収集されたかどうか判定する。収集されている場合（１０２６）、データ１０３０はブロック８２２（図８）で出力される。粒子密度１０３２はステップ１０２８において計算され、ブロック８１６に出力される。画像収集が完了していない場合（１０２４）、処理はステップ１００６へ戻る。
【００９４】
図１１は、高粒子密度条件における図８のアルゴリズムで利用された特定のアルゴリズムを示すフローチャートである。このアルゴリズムは、低い密度および中間的な密度に対するアルゴリズムとは全く異なっている。なぜならば、画像について差分を取ることができないからである。処理は、以下の通りである。
【００９５】
ステップ１１０２は、制御信号８２４ａを介してポンプスピードを低く設定する。ステップ１１０４は、制御信号８２４ｂを介して露光時間を速い（ｆａｓｔ）に設定しおよびサンプリング時間（ポンプスピードおよびサンプリング時間に合致した露光時間）を短い（ｓｈｏｒｔ）に設定する。
【００９６】
高濃度においては、低ポンプ率が使用されて、焦点面は少数の独立画像を用いてサンプリングされる(すなわち、被写界深度を横切って粒子を運ぶ流速に対して、露出間で十分な時間が与えられる)。
【００９７】
ステップ１１０６は、データストリーム４０４を介してＣＣＤ４０８から一連の画像を取得する。
【００９８】
ステップ１１０８は、画像にメジアンフィルタをかけ、画像中の低空的周波数バックグラウンドが取り除かれる。
【００９９】
ステップ１１１０はホットピクセルをフラグ付けし、ステップ１１１２は、隣接ホットピクセルのグループを検出しおよび検出されたスポットの重心に関してｘ、ｙ画像座標を測定する。ステップ１１１８は、強度および／またはサイズ評価基準を使用して、粒子を計数する。ステップ１１２０は、フレーム間における空間的な同時存在を訂正する。
【０１００】
データ１１３２は、ブロック８２２（図８）での出力である。粒子密度１１３０はステップ１１２８で計算され、ブロック８１６に出力される。
【０１０１】
粒子密度は、撮像された体積によって割られた計数として、１１２８において計算される。ここで、撮像された体積＝被写界深度×照明されおよび撮像された焦点面の面積、である。ソース錯誤に対して、測定された粒子密度が訂正される（以下の数式１）。
【０１０２】
１０×１０スーパーピクセルに分割されるような６００×５００の画像を見る場合を想定する。このとき、１つのこの画像内に３０００スーパーピクセルが含まれることになる。同一のスーパーピクセル内で検出された２つの細胞について混同が生じる場合、すなわち、２つの細胞が１つの細胞として認識される程度に密接している場合を想定する。この画像が１５００の細胞画像を含むとき、細胞数が１つだけ増えることは、この細胞がソース錯誤が原因で検出されないだろうという〜５０％の可能性を意味する。細胞計数が増えると、更に、細胞濃度に対する非線形な応答が生じる。検出装置のサイズを６００×５００から１２００×１０００まで増やすと、ダイナミックレンジが４倍に増大するのは明らかである。
【０１０３】
この状況は、放射能測定器にける不感時間統計と類似している。ここで、検知されたn'ピクセル(見かけのカウント)を計数した６０×５０のスーパーピクセルアレイ内を想定する。n'、「充満」、または「デッド」ピクセル(検出されたピクセル)がある。計数の真の数はnであるべきとする。デッドピクセルの割合はn'/3000である。同時存在（ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃｅ）の数または同一のスーパーピクセル内でなされた２つの検知のものでないカウント数は、およそn*n'/3000であるだろう。真の計数と見かけの計数との差は、 n-n'= n*n'/3000、またはn = n'/(1-n'/3000)によって与えられる。これは、まさに不感時間の式と同一である。より一般には、以下の通りとなる。
数式  １）  n = n'／(1−n'／(α／ΔxΔy))
ここで、αは撮像された体積上で撮像された検出ピクセルの数であり、ΔxおよびΔyはそれぞれx-とy-方向におけるピクセルにおける「識別距離」(２つの粒子として識別するために画像内の２つの粒子の中心間の最小離間距離)である。画像における見かけ計数と真の計数との関係が、図６に示されている。測定される溶液中の真の細胞密度をより良く近似するのに、この関係を使用することができる。真の計数と見かけ計数との関係は非線形であるので、条件３の下での粒子計数は装置のダイナミックレンジを拡大させることに注意すべきである。
【０１０４】
データ解析（条件番号）のアルゴリズムの選択は、数式  ２）−数式  ４）で以下に与えるように、流速、被写界深度、露光時間、孔のサイズ、検出形式および粒子密度に依存している。α／ΔxΔy（数式１）と比べて、撮像された体積中の粒子数が小である場合、フレーム間におけるソース錯誤は無視できる。撮像された体積中の粒子数は、粒子密度の撮像された体積倍に等しい。無視できるソース錯誤に対する評価基準（条件１または条件２の適切な使用)は、「静止した」流液に対しては数式２によって与えられる。すなわち、撮像されたボリュームを通過する粒子に対する時間は、露光時間よりはるかに短い。どのアルゴリズム(条件)を用いるべきかを判定するため、流液の「スナップショット」がｎを推定するのに使用されるときに、数式２が用いられる。
数式  ２）  n =ρAd << (α／ΔxΔy)    静止流液中の無視可能なソース錯誤
ここで、nは1つのフレーム中の真の計数であり、ρは粒子密度であり、Aは孔の断面積であり、dは被写界深度である。数式２の不等式が満たされていない場合、条件３を適用でき、そうでなければ、条件１または条件２が適している。時間内にいかなる間隔で撮像された体積中の粒子数が、露光時間の間に撮像されたボリュームを通過する粒子数よりはるかに小である場合、数式２ａの「動的流液」近似を適用できる。これは、一般に条件1および条件２の流液のケースである。さらに、n＜＜（α／ΔxΔy）である場合にのみ、n＝n'であり、さもなければ、数式１を使用して訂正をしなければならない。
数式  ２ａ）  n =ρAυΔtexp (n＜＜α／ΔxΔy)    運動流液
ここで、υは流速であり、Δtexpはカメラサイクル時間である。カメラサイクル時間Δtは、露光の長さΔtexpと露光間の不感時間の長さΔtdtとを加えたものに等しい。条件1または条件２が測定に適切であるかどうかが、粒子検出に必要な最小露光時間によって判定される。焦点面(被写界深度／流れ速度)内の粒子の滞在時間がカメラサイクル時間以下である場合、条件1を適用できる。すなわち、
数式  ３）Δtexp＋Δtdt≦d／2υ            条件１
となる。
【０１０５】
数式３中の１／２の因子は、粒子が絶え間なく焦点面を通して移動しているという事実から生じる。検出において最悪の場合では、２つの連続したフレーム内に、１つの粒子が同じ期間、観察されるであろう。全粒子が露光時間の最小期間に露出されることを確実とするために、粒子がカメラサイクル時間内で移動する距離は、被写界深度の半分未満でなければならない。
【０１０６】
１つの目的は、サンプリング時間を最小とすることである。露光時間を、対象粒子の検出のための最小許容時間Δtminに設定する場合、粒子検出においては、粒子が≧２（Δtmin＋Δtdt）の撮像された体積中に残存しなければならないことが必要である。
この要件は、（条件１および２に対して）流液中の粒子検出を許容する最大流速度υｍａｘを順番に決定する。
数式  ３ａ）υｍａｘ＝d／2（Δtmin＋Δtdt）  条件１および２に対する最大流速
一般に、粒子が検出される回数はkであり、ここで、
数式  ４）  k＝d／υ（Δtmin＋Δtdt）      １つの粒子の検知回数
である。k＞１である場合、条件２を適用できる、そうでなければ、条件１が当てはまる。
【０１０７】
粒子計数の当業者であれば、好適な実施例の図面および説明が本発明を示すのに有用であるが、多くの他の構成が本発明の精神の範囲内にあるものであることも理解できるだろう。本発明の核心は、画像データを保存し、既定のアルゴリズムに基づいて画像内の粒子密度を推定し、装置パラメータおよび／または計数アルゴリズムを調整して、より正確に計数するという概念にある。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】典型的な流動細胞計測システムを示す概略図である。
【図２】噴水流血球計算システムを示す概略図である。
【図３】Ａは、本発明に係る、フロー中に混入された蛍光対象粒子を有するフローサイトメータから得られた一連の画像である。Ｂは、本発明に係る、フロー中に混入された蛍光対象粒子を有するフローサイトメータから得られた一連の画像である。Ｃは、対応する２つの画像間の差分を示す図である。
【図４】低濃度、高流量速度条件における測定された粒子密度に対する実際の粒子密度を示したプロット図である。
【図５】中濃度、低流量スピード条件における測定された粒子密度に対して実際の粒子密度を示したプロット図である。
【図６】高濃縮、低流量スピード条件における測定された粒子密度に対して実際の粒子密度を示したプロット図である。
【図７】本発明に係る粒子計数装置を示すブロック図である。
【図８】本発明に係る粒子計数の全体プロセスを示すフロー図である。
【図９】低粒子密度条件における図８のアルゴリズムで利用された特定のアルゴリズムを示すフロー図である。
【図１０】中間的な粒子密度条件における図８のアルゴリズムで利用された特定のアルゴリズムを示すフロー図である。
【図１１】高粒子密度条件における図８のアルゴリズムで利用された特定のアルゴリズムを示すフロー図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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