(57)【要約】  水溶性蛍光粒子は簡単な方法で形成される。溶媒と、水と、溶媒中に溶解した蛍光ポリマーと、両親媒性分子とを含んだ混合物が提供される。蛍光ポリマーは疎水性セグメントを含む。両親媒性分子は親水性および疎水性セグメントを含む。混合物から溶媒を除去して蛍光ポリマーと両親媒性分子とを水の存在下で絡み合わせ、こうして水溶性蛍光粒子を形成する。形成された粒子中で、両親媒性分子の親水性セグメントは互いに絡み合い、蛍光ポリマーおよび両親媒性分子の疎水性セグメントが互いに絡み合う。両親媒性分子は蛍光ポリマーを包み、親水性セグメントの少なくともいくらかは露出して粒子を水に可溶化させる。
2009506188.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
疎水性セグメントを含む蛍光ポリマーと、
親水性セグメントおよび疎水性セグメントを含む両親媒性分子と
を含む水溶性蛍光粒子であって、前記両親媒性分子の親水性セグメントは互いに絡み合い、前記蛍光ポリマーおよび前記両親媒性分子の前記疎水性セグメントは互いに絡み合い、
前記両親媒性分子は前記蛍光ポリマーを包み、前記親水性セグメントの少なくともいくらかは露出して前記粒子を水に可溶化させる水溶性蛍光粒子。
【請求項２】
前記蛍光ポリマーはアリーレン、ヘテロアリーレン、アリーレンビニレン、ヘテロアリーレンビニレン、アリーレンエチレン、またはヘテロアリーレンエチレンの少なくとも１つを含む請求項１の水溶性蛍光粒子。
【請求項３】
前記アリーレン、ヘテロアリーレン、アリーレンビニレン、ヘテロアリーレンビニレン、アリーレンエチレン、またはヘテロアリーレンエチレンの少なくとも１つは置換されている請求項２の水溶性蛍光粒子。
【請求項４】
前記アリーレン、ヘテロアリーレン、アリーレンビニレン、ヘテロアリーレンビニレン、アリーレンエチレン、またはヘテロアリーレンエチレンの少なくとも１つは置換されていない請求項２の水溶性蛍光粒子。
【請求項５】
前記アリーレン基がＯ，Ｓ，Ｎ，Ｓｉ、およびＰ原子の１つ以上を持つ請求項２ないし４のいずれか１項の水溶性蛍光粒子。
【請求項６】
前記アリーレン基は他のアリーレン基と単結合によって結合されるか、または他のアリーレン基と接続基によって接続され、前記接続基はＯ，Ｓ，Ｎ，Ｓｉ，Ｐ、および置換もしくは無置換アルキレンの１つである請求項２ないし５のいずれか１項の水溶性蛍光粒子。
【請求項７】
前記蛍光ポリマーはフェニレン、チエニレン、フルオレニレン、スピロビフルオレニレン、インデノフルオレニレン、ピリジレン、ビピリジレン、カルバゾイレン、インデノカルバゾリレン、ベンゾチアゾリレン、オキサジアゾリレン、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アルキルチオ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリール基を含むアミノ基、アリールエーテル、ヘテロアリールエーテル、アリールチオエーテル、ヘテロアリールチオエーテル、水素、ハロゲン、シアノ、ニトロ、カルボニル、チオニル、スルホニル、および過フッ化アルキルの少なくとも１つを含む請求項１ないし６のいずれか１項の水溶性蛍光粒子。
【請求項８】
前記蛍光ポリマーはポリ（２，５−ビスジメチルデシルシリル）−１，４−フェニレンビニレン、ポリ（２−メトキシ−５−２’−エチル−ヘキシルオキシ−１，４−フェニレンビニレン）、ポリ（９，９−ジヘキシル−フルオレン−２，７−ジル）、およびポリ（２−（２’−フェニル−４’，５’−ジ（３’’−メチル−ブチル）−フェニル−１，４−フェニレンビニレン））の１つ
以上を含む請求項１ないし７のいずれか１項の水溶性蛍光粒子。
【請求項９】
前記両親媒性分子が１つ以上の脂質およびポリマーを含む請求項１ないし８のいずれか１項の水溶性蛍光粒子。
【請求項１０】
前記両親媒性分子が、
（ａ）骨格を有し、前記骨格は疎水性ブロックを含むコポリマー、または、
（ｂ）骨格と、前記骨格に接続されるグラフトセグメントとを持つコポリマーであって、
（i）前記骨格は親水性セグメントを含み、前記グラフトセグメントは疎水性セグメントを含むか、もしくは
（ii）前記骨格は疎水性セグメントを含み、前記グラフトセグメントは親水性セグメントを含むか、もしくは
（iii）前記骨格および前記グラフトセグメントの各々は、親水性セグメントおよび疎水性セグメントの両方を含むコポリマー、または
（ｃ）親水性セグメントおよび疎水性セグメントを含む高分岐ポリマー、または
（ｄ）親水性セグメントおよび疎水性セグメントを含む樹状ポリマー
を含む請求項１ないし９のいずれか１項の水溶性蛍光粒子。
【請求項１１】
前記両親媒性分子はポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）修飾ポリマーを含む請求項１ないし１０のいずれか１項の水溶性蛍光粒子。
【請求項１２】
前記ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）修飾ポリマーは、ポリヘドラルオリゴシルセスキオキサン−ＰＥＯ（ＰＯＳＳ−ＰＥＯ）、ＰＥＯ−ポリヒドロキシブチレート−ＰＥＯ（ＰＥＯ−ＰＨＢ−ＰＥＯ）、ポリ乳酸−ＰＥＯ（ＰＬＡ−ＰＥＯ）、ＰＥＯ−ＰＬＡ−ＰＥＯ、ＰＥＯ−ポリプロピレンオキシド−ＰＥＯ（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）、ポリジメチルシロキサン−グラフト−ＰＥＯ（ＰＤＭＳ−グラフト−ＰＥＯ）、ポリスチレン−ＰＥＯ（ＰＳ−ＰＥＯ）の１つ以上を含む請求項１１の水溶性蛍光粒子。
【請求項１３】
前記両親媒性分子は複数の蛍光ポリマーを包み、前記ポリマーの各々は蛍光粒子が別個の蛍光応答性を持つ請求項１ないし１２のいずれか１項の水溶性蛍光粒子。
【請求項１４】
前記蛍光ポリマーの各々が別個の蛍光発光スペクトルを持つ請求項１３の水溶性蛍光粒子。
【請求項１５】
前記蛍光ポリマーの各々が別個の蛍光吸収スペクトルを持つ請求項１３または１４の水溶性蛍光粒子。
【請求項１６】
およそ１０ナノメートルないしおよそ１０マイクロメートルの粒径を持つ、請求項１ないし１５のいずれか１項の水溶性蛍光粒子。
【請求項１７】
前記粒子を標的に接続するリガンドを含む、請求項１ないし１６のいずれか１項の水溶性蛍光粒子。
【請求項１８】
前記リガンドが、ヌクレオチド、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ペプチド、タンパク、ホルモン、抗体、受容体、抗原、エピトープ、核酸結合タンパク、分子、酵素基質またはその類縁体、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、モノサッカリド、およびポリサッカリドの少なくとも１つを含む請求項１７の水溶性蛍光粒子。
【請求項１９】
前記標的が分子、細胞、および生物のうちの少なくとも１つを含む請求項１７または１８の水溶性蛍光粒子。
【請求項２０】
請求項１ないし１９のいずれか１項の水溶性蛍光粒子を含む蛍光プローブ。
【請求項２１】
複数の水溶性蛍光粒子を含み、各々が別個の蛍光反応を持つ請求項２０の蛍光プローブ。
【請求項２２】
蛍光プローブであって、前記水溶性蛍光粒子の各々が別個の蛍光発光スペクトルを持つ請求項２１の蛍光プローブ。
【請求項２３】
前記水溶性蛍光粒子の各々は別個の蛍光吸収スペクトルを持つ請求項２１または２２の蛍光プローブ。
【請求項２４】
水に溶解した請求項１ないし１９のいずれか１項の水溶性蛍光粒子を含む溶液。
【請求項２５】
複数の水溶性蛍光粒子を含み、各々が別個の蛍光応答性を持つ請求項２４の溶液。
【請求項２６】
水溶性蛍光粒子の各々は別個の蛍光発光スペクトルを持つ請求項２５の溶液。
【請求項２７】
前記水溶性蛍光粒子の各々が別個の蛍光吸収スペクトルを持つ請求項２４または２５の溶液。
【請求項２８】
請求項１ないし１９のいずれか１項の水溶性蛍光粒子を調製する方法であって、
溶媒と、水と、前記溶媒に溶解した前記蛍光ポリマーと、前記両親媒性分子とを含む混合物を提供し、
前記混合物から前記溶媒を除去して、前記水の存在下で前記蛍光ポリマーと前記両親媒性分子とを絡み合わせ、こうして前記水溶性蛍光粒子を形成する
ことを含む方法。
【請求項２９】
前記溶液を、前記水を含んだ水性液体と混合することによって前記混合物を調製し、前記溶液は前記溶媒と、前記蛍光ポリマーおよび前記両親媒性分子の前駆体とを含む請求項２８の方法。
【請求項３０】
第１の溶液と第２の溶液とを混合することによって前記混合物を調製し、前記第１の溶液は前記溶媒に溶解した前記蛍光ポリマーの前駆体を含み、前記第２の溶液は水に溶解した前記両親媒性分子の前駆体を含む請求項２８の方法。
【請求項３１】
第１の溶液、第２の溶液および水性液体を混合することによって前記混合物を調製し、前記第１の溶液は前記溶媒に溶解した前記蛍光ポリマーの前駆体を含み、前記第２の溶液は他の溶媒に溶解した前記両親媒性分子の前駆体を含み、前記水性液体は水を含む請求項２８の方法。
【請求項３２】
前記溶液を前記水性液体と混合する前に、前記溶液を超音波処理する請求項２９の方法。
【請求項３３】
前記溶媒が有機溶媒である請求項２８ないし３２のいずれか１項の方法。
【請求項３４】
前記有機溶媒がテトラヒドロフラン、クロロホルム、およぶジクロロメタンの少なくとも１つを含む請求項３３の方法。
【請求項３５】
前記混合物を攪拌することを含む、請求項２８ないし３４のいずれか１項の方法。
【請求項３６】
前記前駆体が前記蛍光ポリマーと前記両親媒性分子とを含む請求項２８ないし３５のいずれか１項の方法。
【請求項３７】
前記蛍光ポリマーの重量が、前記蛍光ポリマーおよび前記両親媒性分子の総重量のおよそ０．００１％ないしおよそ９５％である請求項２８ないし３６のいずれか１項の方法。
【請求項３８】
プローブとしての、請求項１ないし１９のいずれか１項の水溶性蛍光粒子の使用方法。
【請求項３９】
標的の検出、画像化、および追跡のためのプローブとしての、請求項１ないし１９のいずれか１項の水溶性蛍光粒子の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は２００５年８月３０日に出願された米国仮出願第６０／７１２，１０３号に関する利益を主張し、その内容はここで参照によって組入れられる。  
発明の分野
本発明は蛍光粒子に関する。  
発明の背景
蛍光粒子は種々の応用に有用である。例えば薬および遺伝子の研究、細胞／微生物イメージング、疾病診断、検体検出などの多くの生化学分野において、蛍光色素分子は例えばラベルまたはタグのような蛍光プローブとして有用である。通常の蛍光色素分子は有機染料、緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）およびそれらの変種、水溶性共役蛍光ポリマー、量子ドット（ＱＤ）などを含む。
【０００２】
しかしながら、通常の蛍光色素分子はいくつかの欠点を持つ。例えば、多色有機染料およびＧＦＰの製造工程は複雑である。さらに、これらの蛍光色素分子の性能はしばしば周囲環境に依存し、したがってそれらを不安定かつ信頼できないものにさせ、或る環境においては不適切にさえさせる。さらに、ＧＦＰは特に青色および赤色スペクトル領域において発光が低い。有機染料およびＧＦＰのような水溶性共役蛍光ポリマーは、ｐＨ値および周囲溶液のイオン強度のような外部環境の条件に敏感である。他の問題は、蛍光ポリマーを含む多くの蛍光色素分子は、水中に溶解して安定かつ均一な溶液を形成できないことである。水環境は自然界で最も一般的な環境なので、このことはそれらの応用を著しく制限してしまう。
【０００３】
疎水性蛍光ナノ結晶を水性溶液中に可溶化する既知の技術は、ナノ結晶を架橋両親媒性ポリマーで包み、水溶性ＱＤを形成することである。しかしながら、両親媒性ポリマーはナノ結晶コアの周りにシェルを形成しなければならないだけでなく、それらがシェルを形成した後に両親媒性ポリマーを架橋させなければならないので、このアプローチは複雑な製造工程を必要とする欠点がある。さらに、ＱＤは他の短所を持つ。ＱＤの形成方法は典型的に高温を必要とし、高発光および狭い発光スペクトルの両方を持つＱＤを作るのは難しい。さらに、ＱＤは典型的に光退色または蛍光明滅を伴う生細胞中での単分子イメージングのような、或る分野においては限定的な応用しかない。ＱＤは高い光安定性を持つので、それらは光退色するには難しい。ＱＤは長い明滅間隔を持つので、それらは蛍光明滅過程における使用には不適切である。  
発明の概要
本発明の最初の態様に従えば、水溶性蛍光粒子が提供される。粒子は疎水性セグメントを含んだ蛍光ポリマーと、親水性セグメントおよび疎水性セグメントを含んだ両親媒性分子とを含み、両親媒性分子の親水性セグメントは互いに絡み合っており、蛍光ポリマーおよび両親媒性分子の疎水性セグメントは互いに絡み合っていて、両親媒性分子は蛍光ポリマーを包み、親水性セグメントの少なくともいくらかは露出し、粒子を水中に可溶化させる。蛍光粒子を例えば標的の検出、画像化、追跡のためのプローブとして使用してもよく、粒子を標的に接続するリガンドを含んでいてもよい。
【０００４】
本発明の他の態様によれば、先述した水溶性蛍光粒子を調製する方法が提供される。この方法は、溶媒と、水と、溶媒中に溶解された蛍光ポリマーと、両親媒性分子とを含んだ混合物を提供し、混合物から溶媒を除去して蛍光ポリマーおよび両親媒性分子を水の存在下で絡み合わせ、こうして水溶性蛍光粒子を形成することを含む。溶液を、水を含んだ水性液体と混合することによって混合物を調製してもよい。溶液は、溶媒と、蛍光ポリマーおよび両親媒性分子の前駆体とを含む。
【０００５】
本発明のさらなる態様に従えば、先述の粒子を含んだ蛍光プローブが提供される。
【０００６】
本発明のさらなる態様に従えば、水中に溶解した先述の粒子を含んだ溶液が提供される。
【０００７】
本発明の他の態様および特徴は、添付図と関連した本発明の具体的な実施態様の以下の記述を参照する際に、当業者に明らかとなるであろう。  
図中では、単に例として本発明の実施態様を説明する。
【０００８】
詳細な説明
概観して、図１中に模式的に示した粒子１０のような水溶性蛍光粒子を、以下に記述するような比較的簡単な手順で形成することができる。図示するように、粒子１０は蛍光ポリマー１２（太線）と、蛍光ポリマー１２を包む１つ以上の両親媒性分子１４（細線）とを持つ。蛍光ポリマー１２は１つ以上の疎水性セグメントを持つ。両親媒性分子１４は、疎水性ブロック１６（大きな黒いブロック）のような疎水性セグメントおよび親水性骨格のような親水性セグメントの両方を持つ。蛍光ポリマー１２の疎水性セグメントと両親媒性分子１４の疎水性セグメントとは互いに絡み合っている。両親媒性分子１４の親水性セグメントも互いに絡み合っている。両親媒性分子１４の親水性セグメントの少なくともいくらかは露出しており、粒子１０を水中に可溶化させる。点線１８は、粒子１０を主に疎水性コア領域と主に親水性シェル領域とに分ける境界を示す。分子の絡み合いは、粒子１０が水性溶液中に溶解された場合にさえ、粒子１０の物理構造を安定にすると信じられている。
【０００９】
蛍光ポリマー１２は、任意の適当な蛍光性のポリマー分子を含み、１つ以上の疎水性セグメントを含むので、蛍光ポリマー分子は水中に十分に溶解せず、安定かつ均一な溶液を形成しないであろう。蛍光粒子は、疎水性セグメントのみか、または疎水性および親水性セグメントの両方を持つ、包まれた蛍光ポリマーを含んでもよい。蛍光ポリマーの親水性セグメントが存在する場合は、両親媒性分子の親水性セグメントと絡み合うであろう。任意のケースで、蛍光ポリマー中の疎水性セグメントの量は、粒子形成の際にポリマーの蛍光色素分子が主に疎水性コア領域中に存在し、したがって主に親水性シェル領域に包まれ、蛍光粒子が水中に溶解して安定かつ均一な溶液を形成できることを保証するのに十分なはずである。
【００１０】
異なるポリマーを、得られる粒子の所望の蛍光粒子に依存して選択してもよい。例えば、粒子がオレンジ色の光を放出することが望ましい場合は、好適なポリマーは、ポリ（２−メトキシ−５−２’−エチル−ヘキシルオキシ−１，４−フェニレンビニレン）（ＭＥＨ−ＰＰＶ）のような、一般に励起時にオレンジ色の蛍光を放出できるポリマーを含むであろうということが、当業者にはわかるであろう。いくつかの応用においては、蛍光ポリマーが強い蛍光を示すことが望ましいであろう。粒子１０は、任意の数のいくつかの蛍光ポリマーの分子を含んでいてもよい。異なる実施態様において、単一の粒子は別個の蛍光発光スペクトルまたは別個の蛍光吸収（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）スペクトル、またはその両方のような、別個の蛍光応答性を示す２つ以上の異なる蛍光ポリマーを含んでいてもよい。
【００１１】
蛍光ポリマー１２は１つ以上の成分基（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｇｒｏｕｐ）を持っていてもよい。各々の成分基はアリーレン、ヘテロアリーレン、アリーレンビニレン、ヘテロアリーレンビニレン、アリーレンエチレン、ヘテロアリーレンエチレンなどでもよく、それらの各々は置換または無置換基でもよい。アリーレン基はＯ，Ｓ，Ｎ，Ｓｉ、およびＰ原子の１つ以上を持っていてもよい。アリーレン基は、単結合または接続基によって互いに接続されてもよい。接続基はＯ，Ｓ，Ｎ，Ｓｉ，Ｐ、および置換もしくは無置換アルキレンの１つでもよい。例えば、成分基はフェニレン、チエニレン、フルオレニレン、スピロビフルオレニレン、インデノフルオレニレン、ピリジレン、ビピリジレン、カルバゾイレン（ｃａｒｂａｚｏｙｌｅｎｅ）、インデノカルバゾリレン、ベンゾチアゾリレン、オキサジアゾリレンなどの１つでもよい。成分基は、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アルキルチオ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリール基を含むアミノ基、アリールエーテル、ヘテロアリールエーテル、アリールチオエーテル、ヘテロアリールチオエーテル、水素、ハロゲン、シアノ、ニトロ、カルボニル、チオニル、スルホニル、およびその置換体を含んだ過フッ化アルキル、の１つでもよい。
【００１２】
例えば、ポリフルオレン（ＰＦ）、ポリチオフェン（ＰＴｈ）、ポリフェニレンビニレン（ＰＰＶ）、ポリフェニレン−エーテル（ＰＰＥ）、ポリアリーレンビニレン、ポリアリーレンエチニレンおよびそれらの誘導体またはコポリマーは、異なる実施態様において好適な蛍光ポリマーであろう。
【００１３】
図２は、ＰＦ、ＰＰＥ、ＰＴｈ、ＰＰＶならびにポリ（９，９−ジヘキシルフルオレニル−２，７−ジル）（Ｃ６ＰＦ）、ポリ（２−（２’−フェニル−４’，５’−ジ（３’’−メチル−ブチル）−フェニル−１，４−フェニレンビニレン））（ＢＰ−ＰＰＶ）、ＭＥＨ−ＰＰＶおよびポリ（２，５−ビスジメチルデシルシリル）−１，４−フェニレンビニレン（Ｓｉ−ＰＰＶ）のようなそれらの誘導体を含む、いくつかの典型的な蛍光ポリマーの化学構造を示す。図２において、「ｎ」は３〜３０００、例えば３〜１０００の値を持ってもよい。Ｒ、Ｒ１およびＲ２各々は、水素、ハロゲン、およびシアノ基から独立に選択されてもよい。Ｒ、Ｒ１およびＲ２各々は、アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、アラアルキル、ヘテロアラアルキル、アルキルシリル、およびアルキルゲルミル基から独立に選択されてもよく、各々の基は置換されても無置換でもよい。各々のアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、およびヘテロアルキル基は１ないし３０個の炭素原子、例えば１ないし１８個の炭素原子を持ってもよい。アルケニルおよびアルキニル基各々は２ないし３０個の炭素原子の鎖長、例えば２ないし１８個の炭素原子を持ってもよい。アリール、アリールチオ、およびアルコキシ基各々は６ないし６０個、例えば６ないし３０個の炭素原子を持っていてもよい。アリールアミノ基は６ないし１８０個の炭素原子、例えば６ないし１２０個の炭素原子を持っていてもよい。ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、およびヘテロアリールチオ基は３ないし１２０個、例えば３ないし６０個の炭素原子を持っていてもよい。ヘテロアリールアミノ基は３ないし１８０個の炭素原子、例えば３ないし１２０個の炭素原子を持っていてもよい。
【００１４】
用途によっては、赤、オレンジ、黄、緑、または青色の蛍光ポリマーを選択してもよい。例えば、ＭＥＨ−ＰＰＶ、Ｃ６ＰＦもしくはＢＰ−ＰＰＶなど、またはそれらの任意の組み合わせを、粒子１０中の蛍光色素分子として使用してもよい。
【００１５】
両親媒性分子１４は疎水性および親水性成分を含んだ任意の適当な両親媒性分子でもよい。両親媒性分子１４は生体適合性があってもよい。例えば、適当な両親媒性分子は脂質と、コポリマー、高分岐ポリマーまたは樹状ポリマーのようなポリマーとを含んでいてもよい。両親媒性分子１４は１つ以上の親水性セグメントと、１つ以上の疎水性セグメントとを持っていてもよい。親水性および疎水性セグメントはブロックコポリマーを形成するであろう。コポリマーは、疎水性セグメントから形成される骨格と共に、様々な箇所で疎水性骨格に接続される任意の親水性セグメントを持っていてもよい。コポリマーは、親水性セグメントから形成される骨格と共に、親水性骨格に接続される疎水性セグメントを持っていてもよい。骨格は疎水性および親水性セグメント両方から、それらに接続される親水性および疎水性グラフトセグメントの１つまたは両方と共に形成されてもよい。認識されるように、親水性骨格と疎水性側鎖とを含むグラフトポリマーは好適であろう。なぜならば、水性溶液中でこのようなポリマー分子はその立体配置を変えることができるので、グラフトポリマーの疎水性側鎖はコアの方に縮み上がるかまたは絡み合い、ポリマーの親水性セグメントは水相の方に伸びてコアを覆い、親水性セグメントを水に対して露出してポリマーを可溶化させるからである。
【００１６】
好適な両親媒性ポリマーの例は、ポリヘドラルオリゴシルセスキオキサン−ＰＥＯ（ＰＯＳＳ−ＰＥＯ）、ＰＥＯ−ポリヒドロキシブチレート−ＰＥＯ（ＰＥＯ−ＰＨＢ−ＰＥＯ）、ポリ乳酸ＰＥＯ（ＰＬＡ−ＰＥＯ）、ＰＥＯ−ＰＬＡ−ＰＥＯ、ＰＥＯ−ポリプロピレンオキシド−ＰＥＯ（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）、ポリジメチルシロキサン−グラフト−ＰＥＯ（ＰＤＭＳ−グラフト−ＰＥＯ）、ポリスチレン−ＰＥＯ（ＰＳ−ＰＥＯ）のようなポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）修飾ポリマーを含む。それらの化学構造を図３Ａおよび３Ｂに示す。ここで、それぞれの「ｍ」および「ｎ」は３〜５０００の値を持っていてもよい。
【００１７】
認識されるように、先述した蛍光ポリマーおよび両親媒性分子各々は、適当な液体中に
分散された場合は絡み合うであろう。認識されるように、結晶とは異なり、ポリマーは典型的に柔軟性があるので、比較的容易に絡み合うことができる。したがって、これらのポリマーは粒子中に有利に使用されるであろう。
【００１８】
都合のよいことには、粒子１０のような蛍光粒子は水性溶液中に可溶であり、生体イメージングおよび生体検出のような広範囲の環境および応用に使用することができる。例えば蛍光粒子を、さらに以下で示すラベルおよびタグを含む蛍光プローブとして使用するか、またはそれに組入れてもよい。粒子を１つ以上の標的の画像化、追跡または検出に使用してもよい。標的は分子、細胞または生物でもよい。例えば、特異的に認識、結合、相互作用または標的分子、細胞または生物に取り込まれるリガンドもしくは捕捉分子である分子に組入れられるか、接続されるかまたは結合されてもよい。代替的に、粒子が標的分子、細胞または生物とそのような方法で結合、粘着、相互作用または取り込まれて、粒子したがって標的分子、細胞または生物の可視化ができるならば、粒子自身はプローブとして働くであろう。
【００１９】
分子の絡み合いは、内部の蛍光コアを保護する安定な外部シェルも提供する。結果として、蛍光色素分子、すなわち粒子のコア内の蛍光ポリマーの蛍光特性および性能は、周囲環境に著しく影響を受けるわけではないので、粒子を広範な環境および応用に使用してもよい。
【００２０】
構造体の径および蛍光特性は変動してもよく、以下でさらに記述するように、形成方法の間に都合よく制御または調節できる。異なる実施態様において、粒径はおよそ１０ナノメートル〜１０マイクロメートル、例えば数十ナノメートルないし数マイクロメートルで変動してもよい。シェル領域の厚さは、粒子半径のおよそ５％ないし９５％の範囲であろう。理解されるように、粒子はナノメートル範囲の径を持つナノ粒子でもよい。
【００２１】
都合のよいことには、粒子が水中に可溶かつ安定であるので、粒子を含んだ透明な水性溶液が得られるであろう。このような溶液は、当業者に理解され得るような種々の応用に有用であろう。
【００２２】
また認識されるように、蛍光ポリマーは、量子ドットまたは有機染料と比較すると非常に短い寿命を持つであろう。したがって、蛍光ポリマーを含んだ粒子は蛍光明滅過程、例えば生細胞中での単分子の追跡に都合よく使用されるであろう。いくつかの実施態様において、粒子中の蛍光ポリマーは光照射に感受性があってもよく、したがって光退色の応用に使用されてもよい。
【００２３】
多色発光も、このような粒子を使用して得られる。先に理解および議論されたように、異なる発光／吸収スペクトルの蛍光ポリマーを単一の粒子中に包み込んでもよい。１つの実施態様において、異なるタイプの蛍光ポリマーは異なる吸収スペクトルを持つであろう。したがって、粒子からの異なる色の発光は、異なる外部励起光源を使用することによって得られるであろう。他の実施態様において、一方のポリマー分子からの放出光が同じ粒子中の他方のポリマー分子によって吸収され、異なるポリマー分子から異なる波長でさらなる蛍光を生じるであろう。同じ粒子中の異なるポリマーの間でエネルギーが移動するので、粒子の蛍光スペクトルは、それらが同じ光源によって励起される場合でさえも広範囲に渡って調節可能であろう。例えば、同じ粒子が青色および緑色両方の蛍光色素分子を含み、緑色蛍光色素分子の吸収スペクトルが青色蛍光色素分子の発光スペクトルと実質的に重なっている場合には、発光と吸収スペクトルとの重なりおよび粒子中の各々の蛍光分子のタイプの相対量に依存した部分吸収から完全吸収の程度で、青色蛍光色素分子からの発光は緑色蛍光色素分子によって吸収され得る。粒子からの総発光の色は、粒子内エネルギー移動の程度に依存し、紫、青、緑、赤から白または他の色まで変化してもよい。したがって異なる発光色は、単一のＵＶ光源のような或る外部励起光源を使用して得られるであろう。
【００２４】
粒子中の両親媒性分子は、或る細胞または組織中で特定の分子と結合できる特定のリガンドと接続されてもよい。例えば両親媒性分子の親水性セグメントは、リガンドと結合されてもよい。
【００２５】
リガンドは、リガンド（およびそれゆえに接続される粒子）および標的の結合をもたらす所望の標的分子、細胞または生物と相互作用可能な任意の検出分子である。リガンドは、例えば注入および摂取によって多細胞生物中に吸収される場合も含んで、特定の細胞表面マーカーまたは特定の細胞受容体のような細胞表面上に表れた分子を含む分子と特異的に結合するであろう。このような結合は、ある状況において細胞内へのリガンドおよび付着粒子の取り込みをもたらすであろう。
【００２６】
リガンドは、例えばヌクレオチド、一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡを含む核酸分子、ペプチドまたはホルモン、ペプチドリガンド、抗体、受容体、抗原、エピトープもしくは核酸結合タンパクを含むタンパク、酵素基質もしくはそれらの類縁体、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチンを含む小分子、モノサッカリドもしくはポリサッカリドを含むサッカリドでもよい。
【００２７】
先述したように、標的は分子、細胞または生物でもよい。標的が分子の場合、分子はリガンドに結合するか、特異的にリガンドを識別する分子である。分子は核酸、細胞表面受容体、酵素、抗体、抗原、核酸結合タンパクを含む受容体のようなタンパクでもよい。
【００２８】
リガンドの粒子への接続は例えば静電的な非共有結合でもよく、または共有結合的な接続でもよい。共有結合的な接続は、粒子の両親媒性分子とリガンドとの間に共有結合が存在することを意味する直接型、または例えば二官能性スペーサーまたはリンカー基または粒子の両親媒性分子およびリガンドの両方と共有結合する分子による間接型でもよい。
【００２９】
リガンドを、既知の方法を用いて粒子と共有結合的に接続してもよい。例えば、２つの相補的な官能基の間の共有結合の形成をもたらす条件下で、他方の粒子またはリガンドの相補的な官能基と反応する反応性の官能基を持った、或る粒子またはリガンドが調製されてもよい。例えば、ビオチン−アビジン、抗体−抗原などである。二官能性の架橋剤またはスペーサーが使用された場合は、リンカーまたはスペーサーは、リガンド上で相補的な官能基と反応する１つめの官能基と、粒子上で相補的な官能基と反応する２つめの反応性官能基とを持つように選択されるか、または調製されるであろう。リンカーまたはスペーサーと、リガンドまたは粒子との間に共有結合を形成する条件下で、リンカーまたはスペーサーは最初にリガンドおよび粒子の１つと反応するであろう。反応の生成物は次に精製されるか、または他方のリガンドおよび粒子に直接加えられ、スペーサーまたはリンカーを介した粒子へのリガンドの接続を可能にする条件下で反応させられるであろう。
【００３０】
２官能性スペーサーまたはリンカーは、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、カルボニル基、アルデヒド基を含む、リガンドおよび粒子中に存在する官能基に依存して選択されるであろうことがわかるだろう。スペーサーまたはリンカー中の反応性官能基は光反応性でもよく、またはＮＨＳ−エステル、マレイミド基、フェニルアジン基、ヒドラジン基またはイソシアネート基でもよい。同様に、選択されるスペーサーまたはリンカーは、反応の結果として粒子中の蛍光色素分子が意図した目的で機能しないような方法では、粒子と反応させるべきではない。
【００３１】
したがって、粒子は細胞の可視化、細胞の追跡、または細胞もしくは組織中の特定の分子の検出に使用してもよい。
【００３２】
異なるリガンドを粒子に接続してもよい。異なる蛍光反応特性を持つ異なるタイプの粒子が異なるタイプの特定のリガンドと結合される場合、例えば異なる波長の光で試料を励起するか、または異なる発光波長を検出することによって、異なるタイプの標的を同時に追跡または検出してもよい。
【００３３】
有機溶媒のような非水性溶媒中で蛍光ポリマーおよび両親媒性分子の両方についての前駆体を溶解して溶液を形成し、水のような水性液体と溶液を混合することによって、粒子を形成してもよい。非水系溶媒を次に混合物から除去してもよい。粒子は混合物中で例えば分子の自己凝集によって形成される。
【００３４】
あらゆる特定の理論に限定されないが、水分子に包囲された場合は、親水性セグメントは周囲の水分子の方に動く傾向があろうし、水分子と水素結合すら形成するであろうということが予期されるであろう。この過程において、両親媒性分子の親水性セグメントは互いにもつれるであろう。対照的に、疎水性セグメントは水分子からは離れる方に動くが、互いに近づく傾向がある。この過程において、蛍光ポリマーおよび両親媒性分子の両方の疎水性セグメントは互いにもつれるであろう。結果として、疎水性セグメントは粒子のコア領域に濃縮され、親水性セグメントは粒子のシェル領域に濃縮され、蛍光ポリマーは両親媒性分子に包まれる。
【００３５】
典型的な実施態様において、蛍光ポリマーおよび両親媒性分子についての前駆体は、最初に適当な方法で調製されるであろう。種々の蛍光ポリマーおよび両親媒性ポリマーのような両親媒性分子を調製する多くの通常の方法が当業者に周知であり、この方法で容易に実施することができる。ポリマーまたは分子についての前駆体は、内部で反応して所望の分子を形成する１つ以上の異なる分子を含んでもよいか、または調製される同じ分子でもよいことは注目される。
【００３６】
前駆体分子を溶媒中に溶解してもよく、したがって調製される粒子を形成する蛍光ポリマーと両親媒性分子とを含む前駆体溶液を形成する。蛍光ポリマーの両親媒性分子に対する重量比は、およそ１：１０００００ないしおよそ９５：５でもよい。換言すれば、蛍光ポリマーの重量は、蛍光ポリマーおよび両親媒性分子の総重量のおよそ０．００１％ないしおよそ９５％でもよい。理解されるように、得られる粒子中の蛍光ポリマーに対する両親媒性分子の重量比は、溶液中の比率と同様であろう。認識されるように、前駆体または蛍光ポリマーが疎水性かつ水中に不溶な分子を含む場合は、有機溶媒のような適当な非水性溶媒が都合よく使用されるであろう。選択した分子を溶解できる任意の適当な有機溶媒を使用してもよい。典型的な有機溶媒はテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、クロロホルム、ジクロロメタンなどを含む。選択した分子を溶解できる他のタイプの溶媒も使用されるであろう。それぞれの特定の応用において適当な溶媒は、特定の応用に伴った特定の分子および前駆体に依存して変わってもよい。溶媒は、水と比較したような場合に室温で比較的高い蒸気圧を持っていてもよい。この利点は以下で明らかになるであろう。分子の溶解および均一な分布を容易にし、溶液を超音波処理または攪拌などによってかき混ぜてもよい。
【００３７】
前駆体溶液を精製水のような水性液体と混合して液体混合物を形成してもよい。
【００３８】
水性液体は塩、塩基、または酸のような溶質を含んでいてもよい。塩は異なるイオン強度を持っていてもよい。塩基または酸を、水性溶液のｐＨを調節するために加えてもよい。水性液体はアルコールのような有機溶媒を含んでいてもよい。当業者に理解されるように、水性液体の組成は、形成される粒子の特性に影響を与えるであろう。例えば、水性液体を選択して粒径または粒径分布、または両方の調節を向上させてもよい。応用に依存して、追加の添加剤を溶液に加えてもよい。
【００３９】
異なる実施態様において、他の全ての材料が加えられる前に、水性液体を加えてもよい。さらに、両親媒性分子の前駆体を、次に前駆体ポリマー溶液と混合される水性液体中に溶解してもよい。他の実施態様において、両親媒性分子および蛍光ポリマーについての前駆体を最初に異なる溶媒中に溶解して、次に水性液体と混合される２つの別個の溶液を形成してもよい。先述した一続きの工程または前駆体溶液が調製される方法を変えることは、最終的な粒径または粒径分布に影響を与えるであろうことは注目されるべきである。
【００４０】
１つの実施態様において、前駆体溶液を水性流体に加えてもよい。例えば滴状で前駆体溶液をゆっくり加えることは有利であろう。例えば、前駆体溶液をゆっくり加えることは、粒子の均一性を向上するであろう。粒子の均一性とは、粒径および粒子の化学的および物理的構造の一様な分布といってもよい。
【００４１】
都合のよいことには、分子自己凝集過程は、水性液体混合物中で自動的に起こり、図１に示すような絡み合った構造を室温下の自己凝集によって形成するであろう。先に議論したように、自己凝集は少なくとも或る程度、分子の疎水性および親水性特性によって推進されるであろう。
【００４２】
具体的な例において、蛍光ポリマーはＭＥＨ−ＰＰＶを含んでもよく、両親媒性分子はＰＯＳＳ−ＰＥＯを含んでもよい。この場合、ＭＥＨ−ＰＰＶ分子は粒子のコア領域において濃縮され、ＰＯＳＳ−ＰＥＯ分子のＰＥＰ基は粒子のシェル領域において濃縮されるであろう。ＰＯＳＳ−ＰＥＯ分子のＰＥＰ基は互いに絡み合い、ならびにＭＥＨ−ＰＰＶ分子と絡み合うであろう。ＰＥＯ基は互いに絡み合い、したがってＭＥＨ−ＰＰＶを包む安定なシェルを形成するであろう。
【００４３】
水性液体混合物を攪拌あるいはかき混ぜて十分な混合および分子の一様な分布、および分子の絡み合いを容易にしてもよい。
【００４４】
粒子の平均径および径分布を、形成方法の間に制御してもよい。粒子の径に影響を与える要素は、それらの化学構造または分子量のような使用される前駆体分子のタイプ、使用される溶液中の種々の成分の濃度または比率、溶媒の性質、操作温度、例えば攪拌および攪拌速度のようなかき混ぜの程度によって溶液がかき混ぜられるか否かなどを含む。実行される種々の工程のシーケンスおよび順序を含んだ調製手順も、形成される粒子の径に影響を与えるであろう。他の要素もまた、任意の与えられた応用において粒子の径に影響を与えるであろうことが、当業者に理解されるであろう。粒径における特定の要素の効果は、当業者に既知の簡単な試験手順を使用した試験をすることによって決定されるであろう。例えば、異なるバッチの試験試料を異なる条件のもとで、または異なる原料または手順を使用して調製してもよい。例えばここで説明するような、試験試料を画像化し、粒子画像の径を測定する適当な技術を使用することによってそれぞれのバッチについての粒径および粒径分布を決定してもよい。
【００４５】
理解されるように、粒子の蛍光スペクトルは、粒径または粒子の密度に依存して変化するであろう。粒子の蛍光スペクトルは主として粒子中の蛍光ポリマーの特性によって決定されるが、それらは分子間相互作用によっても影響を受けるであろう。したがって、適当な他の分子を粒子中、例えば粒子のコア領域中に加えることによって、または異なる疎水性成分を持つような異なる両親媒性分子を選択することによってスペクトルを微調整してもよい。
【００４６】
混合物が十分に混合された後に、最初の有機溶媒のような非水性溶媒を混合物から除去してもよい。溶媒を、任意の適当な手法で除去してもよい。簡単な技術は、溶媒を蒸発によって除去することである。蒸発技術は、溶媒が水と比べて蒸発温度において比較的高い蒸気圧を持つ場合に使用されるであろう。高い蒸気圧は少なくとも２つの理由で有利であろう。一方は混合物からの水の蒸発を制限し、他方は溶媒を十分に速い速度で蒸発させることであり、したがって溶媒の除去に必要な時間を削減する。例えば、ＴＨＦのような多くの有機溶媒について、蒸発は室温にて十分な速度で実行されるであろう。いくつかの実施態様において、所望され、かつ適当な場合は、混合物を加熱して蒸発過程を加速してもよい。蒸発温度は水の蒸発を制限するのに十分な程に低い方がよいことに注意すべきである。
【００４７】
蒸発過程をスピードアップするために、蒸発の間に混合物を連続的にかき混ぜるか、または攪拌してもよい。さらに、蒸発する溶媒蒸気を液体混合物の表面から吸引排出することによって、蒸発を加速してもよい。いくつかの実施態様において、攪拌も、形成される粒子の均一性を向上させるであろう。例えば、いくつかの実施態様において、攪拌は大きな凝集体の形成または粒子の凝固を防ぐであろう。有機溶媒の蒸発速度も、粒子の均一性に影響を与えることがわかっている。いくつかの実施態様において、緩徐な蒸発速度は、粒子の均一性を向上させるであろう。或る実施態様において、非水性溶媒は１ないし２日の期間のうちに完全に蒸発するであろう。
【００４８】
蒸発後に残った液体は、濾過、希釈、乾燥などのような当業者に理解可能なさらなる処理を受けるであろう。
【００４９】
有利には、先述の過程は、絡み合いが生じるような条件で、以下でさらに説明するような溶液または混合液体を加熱する必要が無いような、室温または異なる温度で実施されてもよい。
【００５０】
水溶性蛍光粒子を含んだ得られる溶液は、蛍光感知、検出、ラベリングまたはタギング（ｔａｇｇｉｎｇ）、および他の類似の目的に使用してもよい。有機溶媒を使用した場合、有機溶媒によって生じるあらゆる望ましくない影響を避けるために、溶媒を使用の前に実質的に完全に、混合物から除去してもよい。
【００５１】
得られる粒子の蛍光特性を、例えば前駆体溶液中の前駆体溶液の比率を調節することによって形成過程の間に制御してもよい。前駆体溶液中の前駆体の比率の変化は、得られる粒子中の両親媒性分子に対する蛍光分子の比率の変化をもたらす。例えば、先に議論したように、蛍光分子の重量パーセントはおよそ０．００１ｗｔ％ないしおよそ９５ｗｔ％で変動してもよい。理解されるように、得られる粒子の蛍光強度はこの比率に依存する。したがって、この比率を調節することによって粒子の蛍光強度を調節してもよい。
【００５２】
形成される蛍光粒子は、例えば乾燥させることによって最終液体から抽出し、さらなる使用のために貯蔵してもよい。しかしながら、認識されるように、蛍光色素分子は典型的に液体環境中で使用され、生物学または生物化学の応用においては、しばしば水環境で使用される。したがって使用の前に、乾燥された粒子は水性溶液中に再び溶解されるであろう。乾燥された粒子が凝固していても、一旦再溶解されれば、凝固粒子はばらばらになり、再び比較的一様な径の粒子を形成するであろう。認識されるように、いくつかの実施態様において、蛍光粒子が一様な径であることが望ましい。
【００５３】
異なる発光スペクトルを持つ粒子を含んだ溶液は、精製水のような同じ水性流体中に異なるタイプの粒子を溶解することによって得ることができ、各々のタイプの粒子は本発明の実施態様に関連して調製されるが、別個の発光スペクトルを持つ。例えば、それぞれのタイプの粒子は単色発光を示してもよいが、異なるタイプの粒子は異なる色の光を放出してもよい。したがって、溶液は多色蛍光放出特性を持ってもよく、多標的プロ−ビングに使用してもよい。
【００５４】
ここで認識されるように、先述した典型的な方法による水溶性蛍光粒子の形成については、蛍光ポリマーと両親媒性分子との間に必ずしも任意の安定な化学結合を形成しなくともよい。必ずしも両親媒性分子を架橋させなくともよい。理解されるように、分子の絡み合いは、ランダムな分子間相互作用点を持ったランダム配置、絡み合った分子の捻れまたは巻きつきを伴う。或る絡み合った分子の原子またはセグメントは、他の絡み合った分子のそれらに関してランダムに配置され、２つの絡み合った分子間に強い化学結合すなわちイオン結合および共有結合は存在しないが、異なる分子のセグメント間に弱い結合が形成されるであろう。分子の絡み合いは、絡み合った分子の間に強い化学結合が存在しなくとも、粒子構造に十分な安定性を与えると信じられている。結果として、方法の間に高温での化学反応を伴う複雑な単数または複数の処理工程を避けることができるであろう。したがって、室温かつ常圧、かつ少数の簡単な工程で処理が実行されるであろう。
【００５５】
分子の間に絡み合いが存在するか否かは、応用に依存した当業者に既知の通常の技術を含む、種々の適当な技術に基づいて決定されるであろう。粒子中の分子構造を画像化すること、および分子間にイオン結合もしくは共有結合が形成されているか否かを決定することが可能なので、絡み合いの存在は、直接的または間接的のいずれでもアクセスされるであろう。分子の絡み合いの存在または程度にアクセスすることが可能である（例えば、分子動力学シミュレーションに基づいて（Ｚ．Ｑ．Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｘ．Ｚ．Ｙａｎｇ，”Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｈａｉｎ  ｉｎｔｅｒｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ｏｎ  ａｎ  ｏｒｄｅｒｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅａｒｌｙ  ｓｔａｇｅ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ”，Ｐｏｌｙｍｅｒ，２００６，ｖｏｌ．４７，ｎｏ．１４，ｐｐ．５２１３−５２１９を参照のこと）、例えば示差走査熱量測定（ＤＳＣ）に基づいて（Ｊ．Ｊ．  Ｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｈｙｐｅｒｂｒａｎｃｈｅｄ  ａｒｏｍａｔｉｃ  ｐｏｌｙｉｍｉｄｅｓ  ｈａｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ  ｒｅｐｅａｔｉｎｇ  ｕｎｉｔ  ｂｙ  ＡＢ（２）  ｓｅｌｆ−ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａ（２）＋Ｂ−３  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ”,  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００３，ｖｏｌ．３６，  ｎｏ．１０，ｐｐ．３５１９−３５２８を参照のこと）、例えば流体力学的特性に基づいて（Ｒ．Ｎ．  Ｓｈｒｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈ．  Ｍａｖｒｉｄｉｓ  ”Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ＮＭＲ  ａｎｄ  ｒｈｅｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＬＣＢ  ｉｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｌｉｎｅａｒ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｓ”，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００１，
ｖｏｌ．３４，ｎｏ．２１，ｐｐ．７３６２−７３６７を参照のこと）、または例えばＮＭＲ測定に基づいて（Ａ．Ｃｈａｒｌｅｓｂｙ，”Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｏｆ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  Ｂｙ  Ｐｕｌｓｅｄ  ＮＭＲ”，Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９２，ｖｏｌ.３９，ｎｏ．１，ｐｐ．４５−５１を参照のこと））。
【００５６】
認識されるように、ここに記載した典型的な方法は実行が容易で、強加熱、高価な施設、または厳密もしくは困難な操作手順を必要としない。
【００５７】
粒子の径および粒子のシェルの厚さを、調製方法の間の調節して制御することができるので、粒子は、一方の粒子から他方へのエネルギー移動を減じるように選択された粒径およびシェルの厚さを持つであろう。例えば、粒子間エネルギー移動は、相互作用する粒子の蛍光スペクトルおよびそれらの間の距離に依存するであろう。したがって、溶液中の粒子の濃度およびシェルの厚さを調節することによって、粒子間エネルギー移動を制御してもよい。
【００５８】
例
例１
試料１を以下のように調製した。
【００５９】
ＴＨＦ溶媒中でＭＥＨ−ＰＰＶの溶液を調製した。溶液中のＭＥＨ−ＰＰＶの濃度は１ｍｇ／ｇであった。
【００６０】
２０ｍｇのＰＯＳＳ−ＰＥＯを２０ｍｇのＭＥＨ−ＰＰＶ溶液に加えた。ＴＨＦを加えて溶液を１ｍｌに希釈し、前駆体溶液を形成した。
【００６１】
前駆体溶液を２０ｍｌのガラスボトル中で１０ｇの脱イオン水と混合した。ボトル中の水に前駆体溶液を２分間かけて滴状で添加し、その時間のあいだ、ボトルを超音波処理した。混合後、ボトルの内容物をさらに５分強、超音波処理した。
【００６２】
混合液体を室温でマグネティックスターラーを用いて２日間攪拌し、蒸発によってＴＨＦを除去した。
【００６３】
得られた溶液を１μｍのフィルターで濾過し、凝集した粒子を除去した。濾過された溶液を、蛍光ナノ粒子を含んだ試料I溶液とした。ナノ粒子中で、ＭＥＨ−ＰＰＶ分子は、ＰＯＳＳ−ＰＥＯ分子に包まれていた。
【００６４】
前駆体溶液中のＰＯＳＳ−ＰＥＯに対するＭＥＨ-ＰＰＶの比は、およそ０．１ｗｔ％であった。混合液体中のＰＯＳＳ−ＰＥＯの濃度は、およそ０．２ｗｔ％であった。
【００６５】
図４Ａおよび４Ｂそれぞれは、ＬＥＩＣＡ  ＤＭ  ＩＲＥ２ＴＭＩｎｖｅｒｔｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅで測定された試料I溶液中の粒子の共焦点画像を示す。図４Ａは蛍光画像を示し、図４Ｂは透過光画像を示す。明るい点は粒子の画像である。図に示すように、これらの点の径、形、および明るさは比較的一様であり、画像化された粒子の径、形および輝度は完全に一様なことを示す。これらの画像は、試料I溶液中の平均粒径はおよそ２００ｎｍであることを示す。
【００６６】
例２
試料II溶液は、前駆体溶液の形成に使用するＭＥＨ−ＰＰＶのＴＨＦ溶液の量が１０ｍｇであるという以外は、試料I溶液と同様に調製した。結果として、前駆体溶液中のＰＯＳＳ−ＰＥＯに対するＭＥＨ−ＰＰＶの比はおよそ０．０５ｗｔ％であった。
【００６７】
図５Ａは、試料II溶液から撮影したＴＥＭ画像を示す。暗い点は粒子の画像である。画像から判断すると、粒径はおよそ１４０ｎｍないしおよそ１６５ｎｍで変動する。
【００６８】
例３
試料III溶液は、ＭＥＨ−ＰＰＶのＴＨＦ溶液の量が３０ｍｇであるという以外は、試料I溶液と同様に調製した。結果として、前駆体溶液中のＰＯＳＳ−ＰＥＯに対するＭＥＨ−ＰＰＶの比は０．１５ｗｔ％であった。
【００６９】
図５Ｂは、試料III溶液から撮影したＴＥＭ画像を示す。暗い点は粒子の画像である。図５Ａおよび５Ｂの画像は、試料II溶液および試料III溶液中の粒径は同じであることを示す。
【００７０】
例４ないし６
試料IV、V、およびVI溶液は、ＭＥＨ−ＰＰＶポリマーをＣ６ＰＦポリマーで置換えて、試料溶液中のナノ粒子がＨＥＨ−ＰＰＶの代わりに蛍光色素分子としてＣ６ＰＦを持つという以外は、それぞれ試料I、IIおよびIII溶液と同様に調製した。
【００７１】
例７ないし９
試料VII、VIII、およびIX溶液は、ＭＥＨ−ＰＰＶポリマーをＢＰ−ＰＰＶポリマーで置換えて、試料溶液中のナノ粒子がＨＥＨ−ＰＰＶの代わりに蛍光色素分子としてＢＰ−ＰＰＶを持つという以外は、それぞれ試料I、IIおよびIII溶液と同様に調製した。
【００７２】
例１０ないし１８
試料XないしXVIII溶液は、ＰＯＳＳ−ＰＥＯポリマーをＰＥＯ−ＰＨＢ−ＰＥＯポリマーで置換えて、試料溶液中のナノ粒子がＨＥＨ−ＰＰＶの代わりに封入分子としてＰＥＯ−ＰＨＢ−ＰＥＯを持つという以外は、それぞれ試料IないしIX溶液と同様に調製した。
【００７３】
例１９
試料XIX溶液を以下のように調製した。
【００７４】
Ｃ６ＰＦ溶液は、ＴＨＦ溶媒中にＣ６ＰＦを溶解することによって調製した。Ｃ６ＰＦ溶液中のＣ６ＰＦの濃度は１ｍｇ／ｇであった。
【００７５】
ＢＰ−ＰＰＶ溶液は、ＴＨＦ溶媒中にＢＰ−ＰＰＶを溶解することによって調製した。ＢＰ−ＰＰＶ溶液中のＢＰ−ＰＰＶの濃度は１ｍｇ／ｇであった。
【００７６】
２０ｍｇのＰＯＳＳ−ＰＥＯ、２０ｍｇのＣ６ＰＦ溶液、および２０ｍｇのＢＰ−ＰＰＶ溶液を一緒に混合した。混合された溶液を、ＴＨＦを加えることによって１ｍｌに希釈し、前駆体溶液を形成した。
【００７７】
前駆体溶液を、２０ｍｌ入りガラスボトル中の、１０ｇの脱イオン水に加えた。前駆体溶液を２分間かけて滴状で添加し、その時間のあいだ、ボトルの内容物を超音波処理した。混合後、ボトルの内容物をさらに５分間強、超音波処理した。
【００７８】
ボトル中の混合液体を室温でマグネティックスターラーを用いて２日間攪拌し、蒸発によってＴＨＦを除去した。
【００７９】
得られた溶液を１μｍのフィルターで濾過し、凝集した粒子を除去した。濾過された溶液を、蛍光ナノ粒子を含んだ試料XIX溶液とした。ナノ粒子は、コア領域中にＣ６ＰＦおよびＢＰ−ＰＰＶポリマーの両方を持ち、ＰＯＳＳ−ＰＥＯポリマーに包まれていた。
【００８０】
前駆体溶液中のＰＯＳＳ−ＰＥＯに対するＣ６ＰＦおよびＢＰ−ＰＰＶそれぞれの比は、およそ０．１ｗｔ％であった。
【００８１】
例２０
試料VII溶液に少量の１ＭのＨＣｌまたは１ＭのＮａＯＨを加えてそのｐＨ値を中性からおよそ３ないしはおよそ１０に調節した。
【００８２】
異なるｐＨの溶液中の、蛍光粒子のＰＬ発光強度を測定し、図６に示した。正方形は測定された点であり、線は点のフィット（ｆｉｔ）である。図に示すように、発光強度は広いｐＨ範囲に渡って実質的に一定である。ｐＨがおよそ３と低くとも、ＰＬ強度は中性溶液における値からわずかおよそ８％しか低下しない。高い蛍光安定性は、蛍光ポリマーが周囲の水相から孤立した疎水性環境中に存在しているという事実のためと思われる。したがって、ＰＥＯ基に影響を与える溶液中の条件、例えばそのｐＨ値は、粒子のコア中の蛍光ポリマーに比較的小さな影響しか与えないであろう。したがって、試験結果は、蛍光ポリマーが実際に包まれているということを示す。
【００８３】
例２１
蛍光ナノ粒子を含んだ試験溶液は、例１に記載したものと同様の手順で調製したが、粒子の形成に使用した混合液体は５０ｍｇのＰＯＳＳ−ＰＥＯ、０．１ｍｇのＭＥＨ−ＰＰＶおよび１０ｍｌの脱イオン水を含む。
【００８４】
細胞培養液を調製した。１ｍｌの細胞培養液を２００μｌの試験溶液と混合した。小膠細胞を得られた混合物中に分散させ、共焦点顕微鏡を用いてその後それぞれ２、６、１２および２４時間において画像化した。２４時間後、培養された小膠細胞を、一般的な手順によりホルマリンで２時間固定した。２６時間おいた時点で、混合物を再度画像化した。
【００８５】
異なる時点で得られたいくつかの試料画像を図７Ａないし７Ｏに示す。簡潔には、図７Ａ〜７Ｃは、２時間の時点で撮影された混合物の画像を示す。；図７Ｄ〜７Ｆは、６時間の時点で撮影された混合物の画像を示す。；図７Ｇ〜７Iは、１２時間の時点で撮影された混合物の画像を示す。；図７Ｊ〜７Ｌは、２４時間の時点で撮影された混合物の画像を示す。；図７Ｍ〜７Ｏは、細胞を２４時間培養した後、次にホルマリンで２時間固定した後に撮影された混合物の画像を示す。図７Ａ、７Ｄ、７Ｇ、７Ｊおよび７Ｍは、明るい点が蛍光粒子の位置を表す混合物の蛍光画像を示す。図７Ｂ、７Ｅ、７Ｈ、７Ｋおよび７Ｎは、細胞の位置を表す混合物の顕微鏡画像である。図７Ｃ、７Ｆ、７Ｉ、７Ｌおよび７Ｏは、その左のもの２つの画像の重ね合わせである。それは同時点で同地点にて撮影された混合物の蛍光画像および顕微鏡画像である。
【００８６】
図７Ｏからわかるように、細胞と蛍光粒子との位置が一致するので、殆ど全ての小膠細胞が蛍光ナノ粒子を取り込んでいる。蛍光ナノ粒子は、細胞によるピノサイトーシス過程によって取り込まれることが予期される。
【００８７】
得られた細胞画像は、混合物中の生細胞濃度は、２４時間の観察期間に渡って一定であることを示す。なぜならば、同領域中の細胞数は、これらの画像中で大きくは変化していないからである。この結果は、蛍光ナノ粒子は細胞に対して毒性が無いことを示す。
【００８８】
画像はさらに、細胞のホルマリン固定は、培養細胞中のナノ粒子の蛍光特性に著しい影響を与えないことを示す。
【００８９】
認識されるように、試験結果はバイオイメージングまたは免疫測定についての検出、または薬、遺伝子もしくは細胞などのトレーサーとしてデリバリーシステムにおけるこれらのナノ粒子の潜在的な応用を例示する。
【００９０】
さらに、光吸収分光および蛍光分光を用いて、試料粒子の光学特性を測定した。図８Ａ〜８Ｅはそれぞれ、試料溶液および対照試料から測定されたＵＶおよびＰＬスペクトルを示す。
【００９１】
図８は、異なる環境中のＭＥＨ−ＰＰＶポリマーについての測定結果を示す。スペクトル線は以下のように標識される。
【００９２】
（ａ）ＴＨＦ溶媒中に溶解したＭＥＨ−ＰＰＶポリマーのＵＶスペクトル  
（ｂ）ＭＥＨ−ＰＰＶフィルムのＵＶスペクトル  
（ｃ）試料I溶液中の蛍光粒子のＵＶスペクトル  
（ｄ）ＴＨＦ溶媒中のＭＥＨ−ＰＰＶポリマーのＰＬスペクトル  
（ｅ）ＭＥＨ−ＰＰＶフィルムのＰＬスペクトル（ＰＬ）  
（ｆ）試料I溶液中の蛍光粒子のＰＬスペクトル
ＭＥＨ−ＰＰＶフィルムは、ＭＥＨ−ＰＰＶ−ＴＨＦ溶液を石英プレート上にスピニングすることによって調製した。
【００９３】
結果は、粒子、フィルムまたは溶液中の蛍光ポリマーは類似の構造を持っていることを示す。しかしながら認識されるように、試料I溶液中の蛍光粒子（「ｃ」）の極大吸収波長は、ＴＨＦ溶媒中のＭＥＨ−ＰＰＶ（「ａ」）および試料フィルム（「ｂ」）の吸収スペクトルに比べてブルーシフトしている。試料I溶液のＰＬ強度ピーク（「ｆ」）は、ＴＨＦ溶液（「ｄ」）とフィルム（「ｅ」）との間に位置するが、フィルムについてのピークと非常に近い。試料I溶液中の粒子の相対量子収率はおよそ５％ないし１０％である（標準とする０．１ＭのＨ２ＳＯ４中の１０-５硫酸キニーネに基づく）。
【００９４】
図８Ｂは、試料I溶液（Ｒ）、試料IV溶液（Ｂ）、および試料VII溶液（Ｇ）中の蛍光粒子のＵＶ（実線）およびＰＬ（破線）スペクトルを示す。それらはそれぞれ励起時に、赤、青、または緑の一般的な色の光を放出する。図に示すように、異なる蛍光ポリマーを持つ粒子は、異なる励起波長下で異なる色の光を放出する。試料IV、試料VII溶液、およびＳｉ−ＰＰＶ／ＰＯＳＳ（０．１％）−ＰＥＯの相対量子収率は、それぞれ３０％、６２％、および９０％であった。
【００９５】
図８Ｃは、下部の線が純粋な試料I溶液から測定された下部の線を除いては、試料I溶液と試料IV溶液との、異なる混合比における混合物中の蛍光粒子の、測定されたＰＬスペクトルを示す。混合物中の試料IV溶液／試料I溶液の比はそれぞれ、図８Ｃ中で最上部の線から続いて下の線の順に２０％、１０％、４％、２％、および１％である。図に示すように、発光強度は、試料II溶液の割合の増加につれて減少する。
【００９６】
図８Ｃは、２つ以上のタイプの蛍光粒子を或る混合比で溶液中に混合した場合、混合溶液の蛍光は異なる粒子個々の蛍光の和となることを示す。図に示すように、青色発光の強度は、試料IV溶液（Ｃ６ＰＦ／ＰＯＳＳ−ＰＥＯ粒子）の割合の増加に伴って次第に増加する。Ｃ６ＰＦ／ＰＯＳＳ−ＰＥＯ試料の割合が１０％に増加する場合、その強い蛍光により、Ｃ６ＰＦ／ＰＯＳＳ−ＰＥＯ試料からの発光が支配的になる。Ｃ６ＰＦ／ＰＯＳＳ−ＰＥＯ粒子からＭＥＨ−ＰＰＶ／ＰＯＳＳ−ＰＥＯ粒子へのエネルギー移動が無いことは明白である。特殊な理論に限定されなくとも、エネルギー移動が無いことは２つの理由を持つことが予期される。：（１）粒径はフェルスターエネルギー移動範囲を超える１００ないし２００ｎｍの範囲である。：（２）顕著なエネルギー移動のためにはＣ６ＰＦ／ＰＯＳＳ−ＰＥＯ粒子の割合が低すぎる。
【００９７】
上記の結果は、粒子の蛍光スペクトルを、それらの波長範囲および強度だけでなくそれらの形状をも制御可能なことを示唆する。
【００９８】
混合された蛍光粒子のほかの利点は、異なる励起波長の光が混合された粒子の励起に用いられる場合、粒子は全く異なった発光スペクトルを示すかもしれないということである。例えば、Ｃ６ＰＦ／ＰＯＳＳ−ＰＥＯおよびＭＥＨ−ＰＰＶ／ＰＯＳＳ−ＰＥＯ粒子を含んだ混合物が３９０ｎｍで励起された場合、Ｃ６ＰＦ／ＰＯＳＳ−ＰＥＯおよびＭＥＨ−ＰＰＶ／ＰＯＳＳ−ＰＥＯ粒子の両方が光を放出するであろう。しかしながら、混合物が４９０ｎｍで励起された場合は、ＭＥＨ−ＰＰＶ／ＰＯＳＳ−ＰＥＯ粒子だけしか光を放出しないであろう。
【００９９】
図８Ｄは、試料IV溶液（左側の線）、試料VII溶液（細い線）、および２つの溶液の混合比１：１の混合物（太い線）についてのＰＬスペクトルを示す。
【０１００】
図は、青色発色団と緑色発色団との間のエネルギー移動挙動を説明する。２つの溶液の混合物から形成された粒子中では、各々の粒子が青色発色団と緑色発色団との両方を持つ。これらの粒子が短波長の光を照射された場合、青色および緑色発色団の両方が光を放出する。しかしながら、図に示すように、励起された青色発色団の大抵のエネルギーは緑色発色団に輸送され、粒子からの発光は主として緑色発色団からのものになる。この結果は、緑色発色団（長波長光を用いて）、または青色および緑色発色団の両方のいずれかを選択的に励起できることを証明する。
【０１０１】
ここで記載する上記で特に言及しなかった本発明の他の特徴、利益および利点は、この記載および図から当業者に理解されるであろう。
【０１０２】
先に引用された各々の参照の内容は、この結果ここで参照によって組入れられる。
【０１０３】
もちろん、先述の実施態様は説明のみであって、決して限定を意図していない。記載した実施態様は、多くの形状、パーツ、細部および操作の順序の配置の変形が可能である。本発明はむしろ、請求項によって規定されるようなその範囲内の、このような全ての変更を包含することを意図している。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】図１は、本発明の実施態様の典型的な蛍光粒子の模式図である。
【図２】図２は、典型的な蛍光ポリマーの化学構造を示す。
【図３Ａ】図３Ａおよび３Ｂは、典型的な両親媒性分子の化学構造を示す。
【図３Ｂ】図３Ａおよび３Ｂは、典型的な両親媒性分子の化学構造を示す。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、水性溶液中の典型的な蛍光粒子の、共焦点顕微鏡画像である。
【図５】図５Ａないし５Ｃは、水性溶液中の典型的な蛍光粒子の、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像である。
【図６】図６は、溶液のｐＨ値の関数としての水性溶液中の典型的な蛍光粒子の発光（ＰＬ）放出強度を示す線グラフである。
【図７−１】図８Ａないし８Ｏは、典型的な蛍光粒子を含む水性溶液中で培養された小膠細胞の共焦点顕微鏡画像である。
【図７−２】図８Ａないし８Ｏは、典型的な蛍光粒子を含む水性溶液中で培養された小膠細胞の共焦点顕微鏡画像である。
【図８−１】図８Ａないし８Ｄは、異なる環境中の蛍光ポリマーの紫外（ＵＶ）およびＰＬスペクトルを示す線グラフである。
【図８−２】図８Ａないし８Ｄは、異なる環境中の蛍光ポリマーの紫外（ＵＶ）およびＰＬスペクトルを示す線グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【国際調査報告】
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