(57)【要約】  本発明は免疫療法、ならびに免疫療法で使用するための分子と細胞に関する。特に、本発明は、癌の免疫療法に関する。本発明はさらに、抗腫瘍免疫応答を刺激するワクチン組成物の活性製薬成分として作用する腫瘍関連Tヘルパー細胞ペプチドエピトープ単独、あるいはそれらとその他の腫瘍関連ペプチドとの組み合わせに関する。特に、本発明は、抗腫瘍免疫応答を誘発するワクチン組成物に使用可能な、ヒトの腫瘍細胞株のHLAクラスII分子由来の2つの新規なペプチド配列に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID No. 1またはSEQ ID No. 2またはそれらの多型による配列の少なくとも1を含むペプチドの群から選択されるが、完全なヒト腫瘍関連ポリペプチドではない、腫瘍関連ペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドが、SEQ ID No. 1またはSEQ ID No. 2またはそれらの多型によるアミノ酸配列を含むか、あるいは該アミノ酸配列から本質的になることを特徴とする、請求項1に記載の腫瘍関連ペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドが、9から100、好ましくは9から30、さらに好ましくは9から16アミノ酸の全長を呈することを特徴とする、請求項1または2のいずれかに記載の腫瘍関連ペプチド。
【請求項４】
ヒト主要組織適合抗原複合体（MHC）クラスIまたはIIの分子に結合する能力を有することを特徴とする、請求項1から4のいずれかに記載の腫瘍関連ペプチド。
【請求項５】
ヒト主要組織適合抗原複合体（MHC）クラスIIの少なくとも1つのさらなる分子に結合する能力を有することを特徴とする、請求項5に記載の腫瘍関連ペプチド。
【請求項６】
前記ペプチドが非ペプチド結合を含むことを特徴とする、請求項1から6のいずれかに記載の腫瘍関連ペプチド。
【請求項７】
前記ペプチドが、特に、HLA-DR抗原関連インバリアント鎖（Ii）のN末端アミノ酸を含む融合タンパクであることを特徴とする、請求項1から6のいずれかに記載の腫瘍関連ペプチド。
【請求項８】
請求項1から7のいずれかに記載の前記ペプチドをエンコードする核酸。
【請求項９】
前記核酸が、DNA, cDNA, PNA, CNA, RNAまたはそれらの組み合わせであることを特徴とする、請求項8に記載の核酸。
【請求項１０】
請求項8または9のいずれかに記載の核酸を発現可能な発現ベクター。
【請求項１１】
請求項1から7のいずれかに記載の腫瘍関連ペプチド、請求項8または9のいずれかに記載の核酸、あるいは請求項10に記載の発現ベクターの医薬における使用。
【請求項１２】
請求項8または9のいずれかに記載の核酸、または請求項10に記載の発現ベクターを含むホスト細胞。
【請求項１３】
組み換えRCCまたはAwells細胞であることを特徴とする、請求項12に記載のホスト細胞。
【請求項１４】
請求項1から7のいずれかに記載の少なくとも1つの腫瘍関連ペプチド、請求項8または9のいずれかに記載の核酸、あるいは請求項10に記載の発現ベクター、および薬理学的に許容可能な担体を含んでなることを特徴とする、薬剤組成物。
【請求項１５】
SEQ ID No. 3からSEQ ID No .11のいずれかによる配列を含む少なくとも1つの追加のペプチドをさらに含むことを特徴とする、請求項14に記載の薬剤組成物。
【請求項１６】
前記ペプチドが、9から100、好ましくは9から30、さらに好ましくは9から16アミノ酸の全長を呈することを特徴とする、請求項14または15のいずれかに記載の薬剤組成物。
【請求項１７】
前記少なくとも１つのペプチドが非ペプチド結合を含むことを特徴とする、請求項14から16のいずれかに記載の薬剤組成物。
【請求項１８】
SEQ ID No. 1および／またはSEQ ID No. 2およびSEQ ID No. 3からSEQ ID No. 11によるアミノ酸配列からなるペプチドを含んでなることを特徴とする、請求項14から17のいずれかに記載の薬剤組成物。
【請求項１９】
前記組成物中に存在する前記（複数の）腫瘍関連ペプチドの量が、組織、癌および／または患者に特異的であることを特徴とする、請求項14から18のいずれかに記載の薬剤組成物。
【請求項２０】
少なくとも1つの適当なアジュバントをさらに含むことを特徴とする、請求項14から19のいずれかに記載の薬剤組成物。
【請求項２１】
前記アジュバントが、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）などのコロニー刺激因子のグループから選択されることを特徴とする、請求項20に記載の薬剤組成物。
【請求項２２】
請求項14から21のいずれかに記載の薬剤組成物の抗癌ワクチンとしての使用。
【請求項２３】
請求項1から7のいずれかに記載の腫瘍関連ペプチドの作製方法であって、該方法は、請求項12に記載の前記ホスト細胞を培養するステップと、前記ペプチドを前記ホスト細胞またはその培地から単離するステップとを含んでなることを特徴とする、方法。
【請求項２４】
請求項1から7のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを異常に発現する、患者内の標的細胞を死滅させる方法であって、該方法は、有効量の請求項1から7のいずれかに記載のペプチド、請求項8または9のいずれかに記載の核酸、あるいは請求項10に記載の発現ベクターを、前記患者に投与することからなり、前記ペプチドの量、前記核酸の量、または前記発現ベクターの量は、前記患者内で抗標的細胞免疫応答を誘発するのに有効であることを特徴とする、方法。
【請求項２５】
請求項1から7のいずれかに記載の腫瘍関連ペプチド、請求項8または9のいずれかに記載の核酸、あるいは請求項10に記載の発現ベクターの、請求項1から6のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを異常に発現する、患者内の標的細胞を死滅させるための薬物製造における使用。
【請求項２６】
活性化細胞傷害性Tリンパ球（CTL）を作製するためのin vitro方法であって、該方法は、in vitroでCTLを、抗原に特異的な方法で該CTLを活性化させるのに十分な期間、適当な抗原提示細胞の表面上で発現させたヒトクラスIまたはIIMHC分子を負荷した抗原に接触させるステップを含み、該抗原は請求項1から7のいずれかに記載のペプチドであることを特徴とする、方法。
【請求項２７】
前記抗原が、十分量の抗原を抗原提示細胞に接触させることにより、適当な抗原提示細胞の表面上に発現させたクラスIまたはクラスIIMHC分子上に負荷されることを特徴とする、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗原提示細胞が、請求項10に記載の発現ベクターを含むことを特徴とする、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
請求項26から28のいずれかに記載の方法によって作製された活性化細胞傷害性Tリンパ球（CTL）であって、請求項1から5または7のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを異常に発現する細胞を選択的に認識する、活性化細胞傷害性Tリンパ球。
【請求項３０】
請求項1から7のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを異常に発現する細胞を認識するT細胞レセプター（TCR）であって、該TCRは、請求項29に記載の細胞傷害性Tリンパ球（CTL）からか、あるいは該TCRと機能的に同等な分子から得られることを特徴とする、T細胞レセプター。
【請求項３１】
請求項30に記載のT細胞レセプター（TCR）をエンコードする核酸。
【請求項３２】
請求項30に記載のT細胞レセプター（TCR）を発現可能な発現ベクター。
【請求項３３】
請求項1から5または7のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを異常に発現する、患者内の標的細胞を死滅させる方法であって、該方法は、有効数の請求項29で定義される細胞傷害性Tリンパ球（CTL）を患者に投与するステップを含むことを特徴とする、方法。
【請求項３４】
請求項1から5または7のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを異常に発現する、患者内の標的細胞を死滅させる方法であって、該方法は、
(1)前記患者から細胞傷害性Tリンパ球（CTL）を採取するステップと、
(2)前記細胞に、請求項30で定義される核酸エンコードT細胞レセプター（TCR）または機能的に同等な分子を導入するステップと、
(3)前記ステップ(2)で作製された前記細胞を前記患者内に導入するステップと、
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項３５】
請求項1から7のいずれかに記載の腫瘍関連ペプチドか、請求項8または9のいずれかに記載の核酸か、請求項10に記載の発現ベクター、あるいは請求項14から21のいずれかに記載の薬剤組成物の、患者内の癌細胞を死滅させるための薬物の製造における使用。
【請求項３６】
前記癌細胞が腎癌細胞である、請求項35に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫療法、ならびに免疫療法に用いる分子および細胞に関する。より詳細には、本発明は、癌、特に腎癌の免疫療法に関する。本発明はさらに、単独またはそれらとその他の腫瘍関連ペプチドと組み合わさって、抗腫瘍免疫応答を刺激するワクチン組成物の活性製薬成分として機能する、腫瘍関連Ｔヘルパー細胞ペプチドエピトープに関する。特に、本発明は、抗腫瘍免疫応答を誘発するワクチン組成物に使用可能な、ヒトの腫瘍細胞株のHLAクラスIおよびII分子由来の2つの新規なペプチド配列に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫応答の刺激は、ホストの免疫系により異物として認識される抗原の存在に左右される。腫瘍関連抗原の存在の発見により、腫瘍の成長に介入するのにホストの免疫系を用いる可能性が生じた。体液性免疫と細胞性免疫の両方を利用する様々な機構が、癌免疫療法のために現在調査されている。
【０００３】
細胞性免疫応答の特定の要素は、腫瘍細胞を特異的に認識して破壊可能である。細胞傷害性T細胞（CTL）の腫瘍浸潤性細胞集団からあるいは末梢血からの単離は、そのような細胞が、癌に対する自然な免疫防御において重要な役割を果たすことを示唆している（Cheever等Annals N.Y. Acad. Sci. 1993 690:101-112（非特許文献１））。特に、細胞質ゾル内に存在するタンパク質由来の、通常８〜１０残基の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）関連ペプチドのクラスI分子を認識するCD８陽性T細胞（TCD8＋）は、この応答において重要な役割を果たす。ヒトのMHC分子はまた、ヒト白血球抗原（HLA）として定義される。
【０００４】
MHC分子の分類は２つある：MHCクラスI分子は、内因性タンパク質および大型のペプチドのタンパク分解によって得られたペプチドを提示し、核を有するほとんどの細胞上に見られる。MHCクラスII分子は、プロフェッショナル抗原提示細胞（APC）上にのみ見いだされ、エンドサイトーシスの過程中にAPCにより取り込まれて続いてプロセッシングされる外因性タンパク質のペプチドを提示する。ペプチドとMHCクラスIの複合体は、CD8陽性細胞傷害性Tリンパ球によって認識され、ペプチドとMHCクラスIIの複合体は、CD4陽性ヘルパーT細胞によって認識される。
【０００５】
CD-4陽性ヘルパーT細胞は、抗腫瘍T細胞応答のエフェクター機能を統制することにおいて重要な役割を果たし、このため、腫瘍関連抗原（TAA）由来のCD4陽性T細胞エピトープの同定は、抗腫瘍免疫応答を誘発するための薬剤生成物の開発に非常に重要であり得る（Kobayashi,H.,R.Omiya,M. Ruiz、E. Huarte、P. Sarobe、J. J. Lasarte、M. Herraiz、B. Sangro、J. Prieto、F. Borras-CuestaとE. Celisの2002年、癌胎児抗原由来のヘルパーT細胞のための抗原エピトープの同定：Clin. Cancer Res. 8:3219-3225（非特許文献２）、Gnjatic, S., D. Atanackovic, E. Jager, M. Matsuo, A. Selvakumar, N.K. Altorki, R.G. Maki, B. Dupont, G. Ritter, Y.T. Chen, A. KnuthとL.J. Oldの、2003年、癌患者におけるNY-ESO-1に対する自然発生的CD4陽性T細胞応答の調査、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A . 100(15):8862-7（非特許文献３））。
【０００６】
例えばネズミなどのモデル哺乳動物において、細胞傷害性Tリンパ球（CTL）エフェクター細胞（すなわち、CD8陽性Tリンパ球）が存在しない場合でさえも、CD4陽性T細胞が、インターフェロンγ（IFNγ）の分泌による血管形成の阻害を介して腫瘍の顕在化を阻害するのに十分であることが示された（Qin, Z.とT. Blankenstein、2000年、CD4+T細胞介在腫瘍拒絶反応が、非造血細胞によるIFNγレセプターの発現に依存する血管形成の阻害に関連する。Immunity. 12:677-686（非特許文献４））。さらに、HLAクラスII分子によって提示される腫瘍関連抗原由来のペプチドを認識するCD4陽性T細胞が、抗体（Ab）応答の誘導を介して腫瘍の進行に対抗可能であることが示された（Kennedy, R.C., M.H. Shearer, A.M. WattsとR.K. Bright、2003年、CD4+ Tリンパ細胞は、抗体生成並びにサルウイルス40の大型腫瘍抗原に対する腫瘍免疫において決定的な役割を果たす（Cancer Res. 63:1040-1045（非特許文献５））。HLAクラスI分子に結合する腫瘍関連ペプチドとは対照的に、これまで少数のTAAのクラスIIリガンドだけが説明されている（www.cancerimmunity.org、www.syfpeithi.de）。HLAクラスII分子の構成的発現が、通常、免疫系の細胞に限定されるため（Mach, B., V. Steimle, E. Martinez-SoriaとW. Reith、1996年、MHCクラスII遺伝子の調節：病気から学ぶ、Annu. Rev. Immunol. 14:301-331（非特許文献６））、原発腫瘍からクラスIIペプチドが直接単離される可能性はないと考えられた。そのため、抗原提示細胞（APC）のクラスIIのプロセッシング経路内へのターゲット抗原に対する多数の戦略が開示されており、例えば、それを可能にするべく目標とする抗原でAPCの培養が採用され、プロセスされ、提示されるか（Chaux, P., V. Vantomme, V. Stroobant, K. Thielemans, J. Corthals, R. Luiten, A.M. Eggermont, T. BoonとB.P. van der Bruggen、1999年、CD4(+)Tリンパ球に対するHLA-DR分子によって提示されるMAGE-3エピトープの同定、J. Exp. Med. 189:767-778（非特許文献７））、あるいは、対象とする抗原をエンコードする遺伝子またはミニ遺伝子で細胞のトランスフェクションがされ、及び不変鎖に融合され、抗原をリソソームのMHCクラスII処理及び構築分画（MIIC）への移動を仲介する。
【０００７】
ペプチドに細胞性免疫応答を誘発させるために、MHC分子に結合させなければならない。このプロセスは、MHC分子の対立遺伝子と、ペプチドのアミノ酸配列の特定の多形に依存する。MHCクラスI結合ペプチドは、通常、8-10残基の長さであり、2つの保存残基（"アンカー"）を、MHC分子の対応する結合溝と相互作用するそれらの一次アミノ酸配列中に有する。
【０００８】
炎症がない場合、MHCクラスII分子の発現は、主として免疫系の細胞、特に、プロフェッショナル抗原提示細胞（APC）、例えば、単球、単球誘導細胞、マクロファージ、樹状細胞などに限定される。
【０００９】
腫瘍特定細胞傷害性Tリンパ球によって認識される抗原、すなわち、それらのエピトープは、酵素、レセプター、転写ファクターなどの全てのタンパク質クラスから誘導される分子である場合が多い。さらに、例えば、腫瘍関連抗原は、変異遺伝子の生成物として腫瘍細胞内にのみ存在し得る。腫瘍関連抗原の他の重要なクラスは、異なる種類の腫瘍かつ精巣の健康組織内で発現されたCT（"精巣癌"）抗原などの組織特定構造体である。
【００１０】
様々な腫瘍関連抗原が同定されている。さらに、さらなる腫瘍関連抗原を同定するために、多大な鋭意研究が行われている。腫瘍関連抗原のいくつかのグループは、当業界において組織特異的なものとしても称されている。それらに限定されるものではないが、それらの例には、メラノーマのチロシナーゼ、前立腺癌のPSAおよびPSMA、並びにリンパ腫におけるbcr/ablなどの染色体の交差が包含される。しかしながら、同定される多くの腫瘍関連抗原は、多数の腫瘍型において生じるため、実際に形質転換を引き起こすある種の腫瘍遺伝子タンパク質および／または腫瘍抑制遺伝子（腫瘍抑制遺伝子は、例えば、Linehan WM, Walther MM, Zbar B、腎臓癌の遺伝学的原理、J Urol. 2003 Dec;170(6 Pt 1):2163-72（非特許文献８）における腎臓部の癌に概説されている。）は、ほぼ全ての腫瘍型で生じる。例えば、細胞の成長と分化を制御する、p53（腫瘍抑制遺伝子の例）、ras、c-met、myc、pRB、VHLおよびHER-2/neuなどの正常な細胞タンパク質は、これら遺伝子生成物の発現を増加した結果、変異を次第に増やすことができるため、それらを癌化する（McCartey等の癌研究、1998年、15:58 2601-5（非特許文献９）；Disis等の Ciba Found. Symp、1994年、187:198-211（非特許文献１０））。
【００１１】
ムチン-1（MUC1）は、多くのヒト腺癌様の乳ガンおよび卵巣癌の細胞上に異常に過剰発現する、高度にグリコシル化されたタイプIの膜貫通型糖タンパク質である。悪性腫瘍における異常な脱グリコシル化は、正常な細胞上には存在することのない腫瘍細胞における共通の露出したエピトープである。さらに、MUC1の発現は、多くの骨髄腫ならびに、いくつかのB細胞非ホジキン型リンパ腫により（Gendler S, Taylor-Papadimitriou J, Duhig T, Rothbard J, and Burchell J. A highly immunogenic region of a human polymorphic epithelial mucin expressed by carcinomas is made up of tandem repeats. J. Biol. Chem. 263:12820-12823 (1988)（非特許文献１１）; Siddiqui J, Abe M, Hayes D, Shani E, Yunis E, and Kufe D. Isolation and Sequencing of a cDNA Coding for the Human DF3 Breast Carcinoma-Associated Antigen. PNAS 85:2320-2323 (1988)（非特許文献１２）; Girling A, Bartkova J, Burchell J, Gendler S, Gillett C, and Taylor-Papadimitriou J. A core protein epitope of the polymorphic epithelial mucin detected by the monoclonal antibody SM-3 is selectively exposed in a range of primary carcinomas. Int. J. Cancer 43:1072-1076 (1989)（非特許文献１３）; Brossart P, Heinrich KS, Stuhler G, Behnke L, Reichardt VL, Stevanovic S, Muhm A, Rammensee HG, Kanz L, and Brugger W. Identification of HLA-A2-restricted T-cell epitopes derived from the MUC1 tumor antigen for broadly applicable vaccine therapies. Blood 93:4309-4317 (1999)（非特許文献１４）; Duperray C, Klein B, Durie BG, Zhang X, Jourdan M, Poncelet P, Favier F, Vincent C, Brochier J, Lenoir G, and . Phenotypic analysis of human myeloma cell lines. Blood 73:566-572 (1989)（非特許文献１５）; Mark AS and Mangkornkanok M. B-cell lymphoma marking only with anti-epithelial membrane antigen. Cancer 63:2152-2155 (1989)（非特許文献１６）; Delsol G, Al ST, Gatter KC, Gerdes J, Schwarting R, Caveriviere P, Rigal-Huguet F, Robert A, Stein H, and Mason DY. Coexpression of epithelial membrane antigen (EMA), Ki-1, and interleukin-2 receptor by anaplastic large cell lymphomas. Diagnostic value in so-called malignant histiocytosis. Am. J. Pathol. 130:59-70 (1988)（非特許文献１７）; Apostolopoulos V and McKenzie IF. Cellular mucins: targets for immunotherapy. Crit Rev. Immunol. 14:293-309 (1994)（非特許文献１８）; Finn OJ, Jerome KR, Henderson RA, Pecher G, Domenech N, Magarian-Blander J, and Barratt-Boyes SM. MUC-1 epithelial tumor mucin-based immunity and cancer vaccines. Immunol. Rev. 145:61-89 (1995)（非特許文献１９））において立証されている。近年、いくつかの報告（Apostolopoulos V and McKenzie IF. Cellular mucins: targets for immunotherapy. Crit Rev. Immunol. 14:293-309 (1994)（非特許文献１８）; Finn OJ, Jerome KR, Henderson RA, Pecher G, Domenech N, Magarian-Blander J, and Barratt-Boyes SM. MUC-1 epithelial tumor mucin-based immunity and cancer vaccines. Immunol. Rev. 145:61-89 (1995)（非特許文献１９）; Barnd DL, Lan MS, Metzgar RS, and Finn OJ. Specific, Major Histocompatibility Complex-Unrestricted Recognition of Tumor-Associated Mucins by Human Cytotoxic T-cells. PNAS 86:7159-7163 (1989)（非特許文献２０）; Takahashi T, Makiguchi Y, Hinoda Y, Kakiuchi H, Nakagawa N, Imai K, and Yachi A. Expression of MUC1 on myeloma cells and induction of HLA-unrestricted CTL against MUC1 from a multiple myeloma patient. J. Immunol. 153:2102-2109 (1994)（非特許文献２１）;Noto H, Takahashi T, Makiguchi Y, Hayashi T, Hinoda Y, and Imai K. Cytotoxic T lymphocytes derived from bone marrow mononuclear cells of multiple myeloma patients recognize an underglycosylated form of MUC1 mucin. Int. Immunol. 9:791-798 (1997)（非特許文献２２））、子宮、乳房、膵臓、および多数の骨髄腫瘍由来の細胞傷害性MHC非制限T細胞が、タンデム反復配列に位置するMUC1タンパク質コアのエピトープを認識可能であることを示している。MUC1タンパク質由来の2つのHLA-A2制限T細胞エピトープが同定されている（Brossartの欧州特許第1484397号公報（1999年）（特許文献１））。第1のペプチドはMUC1タンパク質のタンデム反復領域由来である。第2のペプチドは、MUC1のシグナル配列内に位置する。それらペプチドを用いた乳癌または卵巣癌の患者におけるペプチドを負荷した樹状細胞でのワクチン接種後における、生体内での細胞傷害性Tリンパ球応答の誘発が成功している（Brossart P, Wirths S, Stuhler G, Reichardt VL, Kanz L, and Brugger W. Induction of cytotoxic T-lymphocyte responses in vivo after vaccinations with peptide-pulsed dendritic cells. Blood 96:3102-3108 (2000)（非特許文献２３）;Wierecky J, M?ller M, Horger M, Brugger W, Kanz L, Brossart P. Induction of clinical and immunological responses in patients with metastatic renal cell carcinoma after vaccinations with peptide pulsed dendritic cells. Abstract No. 2507 presented at the Annual Meeting of the American Society of Clinical Oncology ASCO (2005)（非特許文献２４）;Wierecky J, Muller MR, Horger MS, Brugger W, Kanz L, and Brossart P. Induction of clinical and immunological responses in patients with metastatic renal cell carcinoma after vaccinations with peptide pulsed dendritic cells. J Clin Oncol (Meeting Abstracts) 23:2507 (2005)（非特許文献２５））。腎細胞癌に関して、MUC1の発現は通常の腫瘍において共通しており、腫瘍のグレードならびにステージに関連すると報告されている（Fujita K, Denda K, Yamamoto M, Matsumoto T, Fujime M, and Irimura T. Expression of MUC1 mucins inversely correlated with post-surgical survival of renal cell carcinoma patients. Br. J. Cancer 80:301-308 (1999)（非特許文献２６）; Kraus S, Abel PD, Nachtmann C, Linsenmann HJ, Weidner W, Stamp GW, Chaudhary KS, Mitchell SE, Franke FE, and Lalani e. MUC1 mucin and trefoil factor 1 protein expression in renal cell carcinoma: correlation with prognosis. Hum. Pathol. 33:60-67 (2002)（非特許文献２７）; Leroy X, Copin MC, Devisme L, Buisine MP, Aubert JP, Gosselin B, and Porchet N. Expression of human mucin genes in normal kidney and renal cell carcinoma. Histopathology 40:450-457 (2002)（非特許文献２８）; Bamias A, Chorti M, Deliveliotis C, Trakas N, Skolarikos A, Protogerou B, Legaki S, Tsakalou G, Tamvakis N, and Dimopoulos MA. Prognostic significance of CA 125, CD44, and epithelial membrane antigen in renal cell carcinoma. Urology 62:368-373 (2003)（非特許文献２９）; Cao Y, Karsten U, Zerban H, and Bannasch P. Expression of MUC1, Thomsen-Friedenreich-related antigens, and cytokeratin 19 in human renal cell carcinomas and tubular clear cell lesions. Virchows Arch. 436:119-126 (2000)（非特許文献３０））。MUC1に関しては、タンパク質の過剰発現はmRNAの過剰発現とは相関関係はない。
【００１２】
アジポフィリンは、脂質の小滴を含む特異的に分化した細胞、かつ、脂肪蓄積細胞に関連する病気に対するマーカーである（Heid HW, Moll R, Schwetlick I, Rackwitz HR, and Keenan TW. Adipophilin is a specific marker of lipid accumulation in diverse cell types and diseases. Cell Tissue Res. 294:309-321 (1998)（非特許文献３１））。アジポフィリンは、繊維芽細胞および内皮・外皮細胞を含む広範囲にわたる培養された細胞株で生じる。しかしながら、組織においては、アジポフィリンの発現はある種の細胞型、授乳中の乳腺外皮細胞、副腎皮質細胞、男性の生殖器系のセルトリ細胞およびライディッヒ細胞、およびアルコール依存症による肝硬変における脂肪肝細胞などのある種の細胞型に限定される（Heid HW, Moll R, Schwetlick I, Rackwitz HR, and Keenan TW. Adipophilin is a specific marker of lipid accumulation in diverse cell types and diseases. Cell Tissue Res. 294:309-321 (1998)（非特許文献３１））。アジポフィリンは、結腸直腸癌（Saha S, Bardelli A, Buckhaults P, Velculescu VE, Rago C, St CB, Romans KE, Choti MA, Lengauer C, Kinzler KW, and Vogelstein B. A phosphatase associated with metastasis of colorectal cancer. Science 294:1343-1346 (2001)（非特許文献３２））、肝細胞癌（Kurokawa Y, Matoba R, Nakamori S, Takemasa I, Nagano H, Dono K, Umeshita K, Sakon M, Monden M, and Kato K. PCR-array gene expression profiling of hepatocellular carcinoma. J. Exp. Clin. Cancer Res. 23:135-141 (2004)（非特許文献３３））、および腎細胞癌（Young AN, Amin MB, Moreno CS, Lim SD, Cohen C, Petros JA, Marshall FF, and Neish AS. Expression profiling of renal epithelial neoplasms: a method for tumor classification and discovery of diagnostic molecular markers. Am. J. Pathol. 158:1639-1651 (2001)（非特許文献３４））において過剰発現することが報告されている。
【００１３】
c-Metは、βサブユニットにジスルフィド結合するα鎖からなるチロシンキナーゼ活性を有するヘテロ二量体である膜貫通型レセプターをエンコードする（Bottaro DP, Rubin JS, Faletto DL, Chan AM, Kmiecik TE, Vande Woude GF, and Aaronson SA. Identification of the hepatocyte growth factor receptor as the c-met proto-oncogene product. Science 251:802-804 (1991)（非特許文献３５）；Rubin JS, Bottaro DP, and Aaronson SA. Hepatocyte growth factor/scatter factor and its receptor, the c-met proto-oncogene product. Biochim. Biophys. Acta 1155:357-371 (1993)（非特許文献３６））。いずれのサブユニットも、その表面上で発現し、重鎖のβサブユニットはリガンドである肝細胞増殖因子（HGF）の結合部分であり、αサブユニットは、異なるシグナル導入経路の活性化を介在する細胞内ドメインを含む。c-Metのシグナル化は、肝臓ならびに腎臓、胚発生、造血、筋肉の発達、正常な活性化B細胞および単核球の移入ならびに接着について明示されるように臓器の再生に関連する（Zarnegar R and Michalopoulos GK. The many faces of hepatocyte growth factor: from hepatopoiesis to hematopoiesis. J. Cell Biol. 129:1177-1180 (1995)（非特許文献３７）; Naldini L, Vigna E, Narsimhan RP, Gaudino G, Zarnegar R, Michalopoulos GK, and Comoglio PM. Hepatocyte growth factor (HGF) stimulates the tyrosine kinase activity of the receptor encoded by the proto-oncogene c-MET. Oncogene 6:501-504 (1991)（非特許文献３８）; Montesano R, Soriano JV, Malinda KM, Ponce ML, Bafico A, Kleinman HK, Bottaro DP, and Aaronson SA. Differential effects of hepatocyte growth factor isoforms on epithelial and endothelial tubulogenesis. Cell Growth Differ. 9:355-365 (1998)（非特許文献３９）; Schmidt C, Bladt F, Goedecke S, Brinkmann V, Zschiesche W, Sharpe M, Gherardi E, and Birchmeier C. Scatter factor/hepatocyte growth factor is essential for liver development. Nature 373:699-702 (1995)（非特許文献４０）; Uehara Y, Minowa O, Mori C, Shiota K, Kuno J, Noda T, and Kitamura N. Placental defect and embryonic lethality in mice lacking hepatocyte growth factor/scatter factor. Nature 373:702-705 (1995)（非特許文献４１）; Bladt F, Riethmacher D, Isenmann S, Aguzzi A, and Birchmeier C. Essential role for the c-met receptor in the migration of myogenic precursor cells into the limb bud. Nature 376:768-771 (1995)（非特許文献４２）Takayama H, LaRochelle WJ, Anver M, Bockman DE, and Merlino G. Scatter factor/hepatocyte growth factor as a regulator of skeletal muscle and neural crest development. PNAS 93:5866-5871 (1996)（非特許文献４３）; Mizuno K, Higuchi O, Ihle JN, and Nakamura T. Hepatocyte growth factor stimulates growth of hematopoietic progenitor cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 194:178-186 (1993)（非特許文献４４）; van d, V, Taher TE, Keehnen RM, Smit L, Groenink M, and Pals ST. Paracrine regulation of germinal center B cell adhesion through the c-met-hepatocyte growth factor/scatter factor pathway. J. Exp. Med. 185:2121-2131 (1997)（非特許文献４５）; Beilmann M, Vande Woude GF, Dienes HP, and Schirmacher P. Hepatocyte growth factor-stimulated invasiveness of monocytes. Blood 95:3964-3969 (2000)（非特許文献４６））。さらに、多数の研究により悪性化および悪性細胞の侵襲性におけるc-Metの過剰発現の関連性が示された。
【００１４】
c-Metは、細胞成長の促進、運動性、生存、細胞外基質の溶解、血管形成を含む、HGF/散乱係数の多機能でかつ潜在的腫瘍活性を介在する（Bottaro DP, Rubin JS, Faletto DL, Chan AM, Kmiecik TE, Vande Woude GF, and Aaronson SA. Identification of the hepatocyte growth factor receptor as the c-met proto-oncogene product. Science 251:802-804 (1991)（非特許文献３５）；Rubin JS, Bottaro DP, and Aaronson SA. Hepatocyte growth factor/scatter factor and its receptor, the c-met proto-oncogene product. Biochim. Biophys. Acta 1155:357-371 (1993)（非特許文献３６）；Zarnegar R and Michalopoulos GK. The many faces of hepatocyte growth factor: from hepatopoiesis to hematopoiesis. J. Cell Biol. 129:1177-1180 (1995)（非特許文献４７））。HGFのレセプターへの結合により、c-Metの自己リン酸化を誘引し、ras、ホスファチジルイノシトール3'キナーゼ、ホスホリパーゼCγ、およびマイトゲン活性化プロテインキナーゼ関連経路を含む下流シグナル伝達系が活性化する（Naldini L, Vigna E, Narsimhan RP, Gaudino G, Zarnegar R, Michalopoulos GK, and Comoglio PM. Hepatocyte growth factor (HGF) stimulates the tyrosine kinase activity of the receptor encoded by the proto-oncogene c-MET. Oncogene 6:501-504 (1991)（非特許文献４８）; Montesano R, Soriano JV, Malinda KM, Ponce ML, Bafico A, Kleinman HK, Bottaro DP, and Aaronson SA. Differential effects of hepatocyte growth factor isoforms on epithelial and endothelial tubulogenesis. Cell Growth Differ. 9:355-365 (1998)（非特許文献４９）; Furge KA, Zhang YW, and Vande Woude GF. Met receptor tyrosine kinase: enhanced signaling through adapter proteins. Oncogene 19:5582-5589 (2000)（非特許文献５０）; Ponzetto C, Bardelli A, Maina F, Longati P, Panayotou G, Dhand R, Waterfield MD, and Comoglio PM. A novel recognition motif for phosphatidylinositol 3-kinase binding mediates its association with the hepatocyte growth factor/scatter factor receptor. Mol. Cell Biol. 13:4600-4608 (1993)（非特許文献５１）; Dong G, Chen Z, Li ZY, Yeh NT, Bancroft CC, and Van WC. Hepatocyte growth factor/scatter factor-induced activation of MEK and PI3K signal pathways contributes to expression of proangiogenic cytokines interleukin-8 and vascular endothelial growth factor in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Res. 61:5911-5918 (2001)（非特許文献５２）; Furge KA, Kiewlich D, Le P, Vo MN, Faure M, Howlett AR, Lipson KE, Woude GFV, and Webb CP. Suppression of Ras-mediated tumorigenicity and metastasis through inhibition of the Met receptor tyrosine kinase. PNAS 98:10722-10727 (2001)（非特許文献５３））。c-Met遺伝子は、主として上皮細胞で発現し、いくつかの悪性組織および悪性細胞株で過剰に発現する（Di Renzo MF, Olivero M, Giacomini A, Porte H, Chastre E, Mirossay L, Nordlinger B, Bretti S, Bottardi S, Giordano S, and . Overexpression and amplification of the met/HGF receptor gene during the progression of colorectal cancer. Clin. Cancer Res. 1:147-154 (1995)（非特許文献５４）; Ferracini R, Di Renzo MF, Scotlandi K, Baldini N, Olivero M, Lollini P, Cremona O, Campanacci M, and Comoglio PM. The Met/HGF receptor is over-expressed in human osteosarcomas and is activated by either a paracrine or an autocrine circuit. Oncogene 10:739-749 (1995)（非特許文献５５）; Tuck AB, Park M, Sterns EE, Boag A, and Elliott BE. Coexpression of hepatocyte growth factor and receptor (Met) in human breast carcinoma. Am. J. Pathol. 148:225-232 (1996)（非特許文献５６）; Koochekpour S, Jeffers M, Rulong S, Taylor G, Klineberg E, Hudson EA, Resau JH, and Vande Woude GF. Met and hepatocyte growth factor/scatter factor expression in human gliomas. Cancer Res. 57:5391-5398 (1997)（非特許文献５７）;Li G, Schaider H, Satyamoorthy K, Hanakawa Y, Hashimoto K, and Herlyn M. Downregulation of E-cadherin and Desmoglein 1 by autocrine hepatocyte growth factor during melanoma development. Oncogene 20:8125-8135 (2001)（非特許文献５８）; Fischer J, Palmedo G, von KR, Bugert P, Prayer-Galetti T, Pagano F, and Kovacs G. Duplication and overexpression of the mutant allele of the MET proto-oncogene in multiple hereditary papillary renal cell tumours. Oncogene 17:733-739 (1998)（非特許文献５９）; Maulik G, Kijima T, Ma PC, Ghosh SK, Lin J, Shapiro GI, Schaefer E, Tibaldi E, Johnson BE, and Salgia R. Modulation of the c-Met/hepatocyte growth factor pathway in small cell lung cancer. Clin. Cancer Res. 8:620-627 (2002)（非特許文献６０）; Qian CN, Guo X, Cao B, Kort EJ, Lee CC, Chen J, Wang LM, Mai WY, Min HQ, Hong MH, Vande Woude GF, Resau JH, and Teh BT. Met protein expression level correlates with survival in patients with late-stage nasopharyngeal carcinoma. Cancer Res. 62:589-596 (2002)（非特許文献６１）; Ramirez R, Hsu D, Patel A, Fenton C, Dinauer C, Tuttle RM, and Francis GL. Over-expression of hepatocyte growth factor/scatter factor (HGF/SF) and the HGF/SF receptor (cMET) are associated with a high risk of metastasis and recurrence for children and young adults with papillary thyroid carcinoma. Clin Endocrinol. (Oxf) 53:635-644 (2000)（非特許文献６２））。造血細胞、神経細胞および骨格細胞などの非上皮細胞がHGFや、c-Metタンパク質を発現する造血悪性腫瘍様多発性骨髄腫、ホジキン病、白血病、リンパ種に応答することを示す報告の数がますます増加している（Gherardi E and Stoker M. Hepatocyte growth factor--scatter factor: mitogen, motogen, and met. Cancer Cells 3:227-232 (1991)（非特許文献６３）; Teofili L, Di Febo AL, Pierconti F, Maggiano N, Bendandi M, Rutella S, Cingolani A, Di RN, Musto P, Pileri S, Leone G, and Larocca LM. Expression of the c-met proto-oncogene and its ligand, hepatocyte growth factor, in Hodgkin disease. Blood 97:1063-1069 (2001)（非特許文献６４）; Borset M, Seidel C, Hjorth-Hansen H, Waage A, and Sundan A. The role of hepatocyte growth factor and its receptor c-Met in multiple myeloma and other blood malignancies. Leuk. Lymphoma 32:249-256 (1999)（非特許文献６５）; Jucker M, Gunther A, Gradl G, Fonatsch C, Krueger G, Diehl V, and Tesch H. The Met/hepatocyte growth factor receptor (HGFR) gene is overexpressed in some cases of human leukemia and lymphoma. Leuk. Res. 18:7-16 (1994)（非特許文献６６）; Pons E, Uphoff CC, and Drexler HG. Expression of hepatocyte growth factor and its receptor c-met in human leukemia-lymphoma cell lines. Leuk. Res. 22:797-804 (1998)（非特許文献６７））。浸潤性成長表現型の、c-Met活性突然変異、c-Met増幅／過剰発現、およびHGF/c-Met自己分泌ループの取得により誘発された腫瘍活性化c-Metによりコントロールが外れると、悪性腫瘍細胞に浸潤性および転移特性が与えられる。特に、HGFを過剰発現する遺伝子導入マウスにおけるc-Metの構成的活性化により、広範な腫瘍形成を促進する（Wang R, Ferrell LD, Faouzi S, Maher JJ, and Bishop JM. Activation of the Met receptor by cell attachment induces and sustains hepatocellular carcinomas in transgenic mice. J. Cell Biol. 153:1023-1034 (2001)（非特許文献６８）；Takayama H, Larochelle WJ, Sharp R, Otsuka T, Kriebel P, Anver M, Aaronson SA, and Merlino G. Diverse tumorigenesis associated with aberrant development in mice overexpressing hepatocyte growth factor/scatter factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 94:701-706 (1997)（非特許文献６９））。
【００１５】
Gタンパク質シグナル伝達調節因子5（RGS5）は、ヘテロ三量体のGタンパク質シグナル伝達経路の陰性調節因子であるが、in vivoでのその機能は慢性的に残存する。RGSタンパク質は、統一触媒機能を有するが、組織分布を変える分子のファミリーからなる。それらは、活性化Gαサブユニットの固有のグアノシントリホスファターゼ（GTPアーゼ）活性を刺激するため、Gタンパク質の不活性化を促進する。そのため、RGS分子は、Gタンパク質結合レセプターの下流シグナル伝達を阻害する（De VL, Zheng B, Fischer T, Elenko E, and Farquhar MG. The regulator of G protein signaling family. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 40:235-271 (2000)（非特許文献７０））。近年、Gタンパク質シグナル伝達調節因子5の調節因子の周皮細胞への誘導が、腫瘍の血管新生中の活発な血管再構築と同時に起こることが示されている。膵臓のランゲルハンス島の癌化細胞、ならびに、高度な血管新生星状細胞腫のマウスモデルにおいて、RGS5の過剰発現が、活発な血管再構築を伴う血管新生の転換の間、周皮細胞に見られていた。過剰発現は、正常な膵臓のランゲルハンス島と比較して腫瘍血管に限定された。しかしながら、RGS5はまた、創傷治癒および排卵中に増加する（Berger M, Bergers G, Arnold B, Hammerling GJ, and Ganss R. Regulator of G-protein signaling-5 induction in pericytes coincides with active vessel remodeling during neovascularization. Blood 105:1094-1101 (2005)（非特許文献７１））。
【００１６】
RGS5の発現はRCC中で増加する（Rae FK, Stephenson SA, Nicol DL, and Clements JA. Novel association of a diverse range of genes with renal cell carcinoma as identified by differential display. Int. J. Cancer 88:726-732 (2000)（非特許文献７２））。その他の研究において、RT-PCRにより、調べた全てのRCCでRGS5の強力な発現が示され、正常な腎臓においては、発現は、非常に弱いか検知できなかった（6.6:1、リアルタイムPCR）。腫瘍の内皮細胞は、RCCのRGS5の主な発現場所であった（Furuya M, Nishiyama M, Kimura S, Suyama T, Naya Y, Ito H, Nikaido T, and Ishikura H. Expression of regulator of G protein signalling protein 5 (RGS5) in the tumour vasculature of human renal cell carcinoma. J. Pathol. 203:551-558 (2004)（非特許文献７３））。さらに、肝細胞腫瘍でのRGS5はシヌソイド内皮細胞マーカーであることが報告された（Chen X, Higgins J, Cheung ST, Li R, Mason V, Montgomery K, Fan ST, van de RM, and So S. Novel endothelial cell markers in hepatocellular carcinoma. Mod. Pathol. 17:1198-1210 (2004)（非特許文献７４））。
【００１７】
アポリポタンパク質L1（APOL1）は、アポリポタンパク質A-Iに結合する分泌された高密度脂質タンパク質である。アポリポタンパク質A-Iは、比較的豊富な血漿タンパク質であり、HDLの主要アポタンパク質である。それは、ほとんどの血漿中のコレステロールエステル形成に関与しており、細胞からのコレステロールの流出を促進する。アポリポタンパク質L1は脂質交換および身体全体への輸送、さらには逆に、コレステロールの末梢細胞から肝臓への輸送において役割を果たす。血漿タンパク質は、見かけ分子量約40kDaの単鎖ポリペプチドである（Duchateau PN, Pullinger CR, Orellana RE, Kunitake ST, Naya-Vigne J, O'Connor PM, Malloy MJ, and Kane JP. Apolipoprotein L, a new human high density lipoprotein apolipoprotein expressed by the pancreas. Identification, cloning, characterization, and plasma distribution of apolipoprotein L. J. Biol. Chem. 272:25576-25582 (1997)（非特許文献７５）；Duchateau PN, Pullinger CR, Cho MH, Eng C, and Kane JP. Apolipoprotein L gene family: tissue-specific expression, splicing, promoter regions; discovery of a new gene. J. Lipid Res. 42:620-630 (2001)（非特許文献７６））。APOL1 cDNAを活性化内皮細胞cDNAライブラリーから単離し、TNF-αにより増加調節されることが示され、これは強力な炎症誘発性のサイトカインである（Monajemi H, Fontijn RD, Pannekoek H, and Horrevoets AJ. The apolipoprotein L gene cluster has emerged recently in evolution and is expressed in human vascular tissue. Genomics 79:539-546 (2002)（非特許文献７７））。
【００１８】
KIAA0367は、推定タンパク質をエンコードする未知の長いヒト転写物の同定を目的としたKazusa cDNAプロジェクトで同定された（Ohara O, Nagase T, Ishikawa K, Nakajima D, Ohira M, Seki N, and Nomura N. Construction and characterization of human brain cDNA libraries suitable for analysis of cDNA clones encoding relatively large proteins. DNA Res. 4:53-59 (1997)（非特許文献７８））。KIAA0367の生成物である推定820アミノ酸長のタンパク質の作用は未知であるが、C末端においてCRAL-TRIO脂質結合ドメイン特性を含み、これは小型の疎水性分子に結合し、いくつかのヌクレオチド交換因子とBCL2/アデノウイルスE1B 19-kDaタンパク質相互作用タンパク質2（BNIP-2）に存在する。BNIP-2は、細胞形態学、移入、エンドサイトーシス、および細胞周期進行を含む、様々な細胞機能の制御に関与する（Zhou YT, Guy GR, and Low BC. BNIP-2 induces cell elongation and membrane protrusions by interacting with Cdc42 via a unique Cdc42-binding motif within its BNIP-2 and Cdc42GAP homology domain. Exp. Cell Res. 303:263-274 (2005)（非特許文献７９））。KIAA0367は、染色体の9q21領域上に位置する。この領域は、多くの腫瘍におけるホモ接合型欠失またはヘテロ接合性欠失の共通の標的（Gursky S, Olopade OI, and Rowley JD. Identification of a 1.2 Kb cDNA fragment from a region on 9p21 commonly deleted in multiple tumor types. Cancer Genet. Cytogenet. 129:93-101 (2001)（非特許文献８０）；Weber RG, Rieger J, Naumann U, Lichter P, and Weller M. Chromosomal imbalances associated with response to chemotherapy and cytotoxic cytokines in human malignant glioma cell lines. Int. J. Cancer 91:213-218 (2001)（非特許文献８１）；Louhelainen J, Wijkstrom H, and Hemminki K. Initiation-development modelling of allelic losses on chromosome 9 in multifocal bladder cancer. Eur. J. Cancer 36:1441-1451 (2000)（非特許文献８２）；Tripathi A, Dasgupta S, Roy A, Sengupta A, Roy B, Roychowdhury S, and Panda CK. Sequential deletions in both arms of chromosome 9 are associated with the development of head and neck squamous cell carcinoma in Indian patients. J. Exp. Clin. Cancer Res. 22:289-297 (2003)（非特許文献８３））として説明される。
【００１９】
可溶性グアニル酸シクラーゼ（sGC）、すなわち、αとβサブユニット（1ヘムグループ）からなるヘテロ二量体タンパク質は、GTPのセカンドメッセンジャーcGMPへの転換に触媒作用を及ぼし、一酸化窒素とニトロ血管拡張剤の主要レセプターとして機能する。GUCYa3，b3は、ヒトの神経膠腫で過剰発現する。アンチセンスGUCY1A3またはGUCY1B3のトランスフェクションは、ヌードマウスの血管新生と腫瘍の成長を低減させた。これは、VEGFがcGMPによって誘導されるという事実に起因すると思われた（Saino M, Maruyama T, Sekiya T, Kayama T, and Murakami Y. Inhibition of angiogenesis in human glioma cell lines by antisense RNA from the soluble guanylate cyclase genes, GUCY1A3 and GUCY1B3. Oncol. Rep. 12:47-52 (2004)（非特許文献８４））。GUCY1A3は、マウスの乳癌細胞株の腫瘍細胞の移入を促進する（Jadeski LC, Chakraborty C, and Lala PK. Nitric oxide-mediated promotion of mammary tumour cell migration requires sequential activation of nitric oxide synthase, guanylate cyclase and mitogen-activated protein kinase. Int. J. Cancer 106:496-504 (2003)（非特許文献８５） ）。
【００２０】
サイクリンD1は、高度に保存されたサイクリンファミリー、より具体的にはサイクリンDサブファミリーに属する（Xiong Y, Connolly T, Futcher B, and Beach D. Human D-type cyclin. Cell 65:691-699 (1991)（非特許文献８６）；Lew DJ, Dulic V, and Reed SI. Isolation of three novel human cyclins by rescue of G1 cyclin (Cln) function in yeast. Cell 66:1197-1206 (1991)（非特許文献８７））。サイクリンのCDK（cyclin-dependent kinases）の調節因子として機能する。別のサイクリンは、各有糸分裂の時間的協調に寄与する異なる発現および分解パターンを呈する（Deshpande A, Sicinski P, and Hinds PW. Cyclins and cdks in development and cancer: a perspective. Oncogene 24:2909-2915 (2005)（非特許文献８８））。サイクリンD1は、CDK4またはCDK6と複合体を形成して、その調節サブユニットとして作用し、その活性は、細胞周期G1/S移行に必要である。CCND1は、CDK4およびCDK6とともにセリン／スレオニンキナーゼホロ酵素複合体を形成し、基質にその複合体に対する特異性を分け与える（Bates S, Bonetta L, MacAllan D, Parry D, Holder A, Dickson C, and Peters G. CDK6 (PLSTIRE) and CDK4 (PSK-J3) are a distinct subset of the cyclin-dependent kinases that associate with cyclin D1. Oncogene 9:71-79 (1994)（非特許文献８９））。このタンパク質は、腫瘍抑制タンパク質Rbと相互作用することが示されており（Loden M, Stighall M, Nielsen NH, Roos G, Emdin SO, Ostlund H, and Landberg G. The cyclin D1 high and cyclin E high subgroups of breast cancer: separate pathways in tumorogenesis based on pattern of genetic aberrations and inactivation of the pRb node. Oncogene 21:4680-4690 (2002)（非特許文献９０））、この遺伝子の発現は、Rbによって陽性に調節される（Halaban R. Melanoma cell autonomous growth: the Rb/E2F pathway. Cancer Metastasis Rev. 18:333-343 (1999)（非特許文献９１））。この遺伝子の突然変異、増幅および過剰発現は、細胞周期進行を変え、様々な腫瘍で頻繁に観察され、腫瘍形成に寄与し得る（Hedberg Y, Davoodi E, Roos G, Ljungberg B, and Landberg G. Cyclin-D1 expression in human renal-cell carcinoma. Int. J. Cancer 84:268-272 (1999)（非特許文献９２）；Vasef MA, Brynes RK, Sturm M, Bromley C, and Robinson RA. Expression of cyclin D1 in parathyroid carcinomas, adenomas, and hyperplasias: a paraffin immunohistochemical study. Mod. Pathol. 12:412-416 (1999)（非特許文献９３）；Troussard X, vet-Loiseau H, Macro M, Mellerin MP, Malet M, Roussel M, and Sola B. Cyclin D1 expression in patients with multiple myeloma. Hematol. J. 1:181-185 (2000)（非特許文献９４））。
【００２１】
マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）ファミリーのタンパク質は、胚の発生、複製、組織の再生などの正常な生理的プロセスにおける細胞外基質の分解、ならびに、関節炎や転移などの病気のプロセスに関与する（Mott JD and Werb Z. Regulation of matrix biology by matrix metalloproteinases. Curr. Opin. Cell Biol. 16:558-564 (2004)（非特許文献９５）。Matrix metalloproteinase 7（MMP7）は、29.6kDaの不活性なタンパク質として分泌され、これは細胞外タンパク質分解酵素によって分解されると活性化される。活性酵素は分子量19.1kDaであり、サブユニットごとに2つの亜鉛イオンと2つのカルシウムイオンに結合する（Miyazaki K, Hattori Y, Umenishi F, Yasumitsu H, and Umeda M. Purification and characterization of extracellular matrix-degrading metalloproteinase, matrin (pump-1), secreted from human rectal carcinoma cell line. Cancer Res. 50:7758-7764 (1990)（非特許文献９６）；Browner MF, Smith WW, and Castelhano AL. Matrilysin-inhibitor complexes: common themes among metalloproteases. Biochemistry 34:6602-6610 (1995)（非特許文献９７））。MMP7は、ゼラチン、フィブロネクチンおよびカゼインを分解し（Miyazaki K, Hattori Y, Umenishi F, Yasumitsu H, and Umeda M. Purification and characterization of extracellular matrix-degrading metalloproteinase, matrin (pump-1), secreted from human rectal carcinoma cell line. Cancer Res. 50:7758-7764 (1990)（非特許文献９６）；Quantin B, Murphy G, and Breathnach R. Pump-1 cDNA codes for a protein with characteristics similar to those of classical collagenase family members. Biochemistry 28:5327-5334 (1989)（非特許文献９８））、他のMMPファミリーとは異なり、保存されたC末端タンパク質ドメインが欠失している（Gaire M, Magbanua Z, McDonnell S, McNeil L, Lovett DH, and Matrisian LM. Structure and expression of the human gene for the matrix metalloproteinase matrilysin. J Biol. Chem. 269:2032-2040 (1994)（非特許文献９９））。MMP7は、悪性腫瘍組織中で過剰発現していることしばしば見つかっており（Lin TS, Chiou SH, Wang LS, Huang HH, Chiang SF, Shih AY, Chen YL, Chen CY, Hsu CP, Hsu NY, Chou MC, Kuo SJ, and Chow KC. Expression spectra of matrix metalloproteinases in metastatic non-small cell lung cancer. Oncol Rep. 12:717-723 (2004)（非特許文献１００）；Bramhall SR, Neoptolemos JP, Stamp GW, and Lemoine NR. Imbalance of expression of matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of the matrix metalloproteinases (TIMPs) in human pancreatic carcinoma. J Pathol. 182:347-355 (1997)（非特許文献１０１）；Denys H, De Wever O, Nusgens B, Kong Y, Sciot R, Le AT, Van Dam K, Jadidizadeh A, Tejpar S, Mareel M, Alman B, and Cassiman JJ. Invasion and MMP expression profile in desmoid tumours. Br. J Cancer 90:1443-1449 (2004)（非特許文献１０２））、腫瘍細胞のin vivo侵入を促進することが示唆されている（Wang FQ, So J, Reierstad S, and Fishman DA. Matrilysin (MMP-7) promotes invasion of ovarian cancer cells by activation of progelatinase. Int. J Cancer 114:19-31 (2005)（非特許文献１０３））。これらのタンパク質は、様々な型の癌において腫瘍特異的免疫応答の標的となり得る。
【００２２】
B型肝炎ウイルスコア抗原ペプチドHBV-001は、ヒトの内因性腫瘍関連抗原由来ではなく、B型肝炎ウイルスコア抗原由来である。第一に、これはTUMAPによって誘発されるT細胞応答の程度を定量的に比較するのを可能にするため、抗腫瘍応答を誘起する能力の重要な推論を可能にする。第二に、これは、患者のT-細胞応答が欠如する場合における重要な陽性コントロールとして作用する。そして第三に、これはその患者の免疫能の状態の結論付けを可能にする。
【００２３】
B型肝炎ウイルス（HBV）感染は、肝臓病を誘発する原因としてよく知られており、世界中でおおよそ350,000,000万人の人々が感染している（Rehermann B and Nascimbeni M. Immunology of hepatitis B virus and hepatitis C virus infection. Nat. Rev. Immunol. 5:215-229 (2005)（非特許文献１０４））。全般的に伝染することおよび肝硬変および肝細胞癌を誘引し得る潜在的に慢性疾患であるのに起因して、HBVは、世界中の多くの国々の公衆衛生システムに対して大きな影響を及ぼしている。HBVゲノムは、部分的に二本鎖環状DNAからなる（Previsani N and Lavanchy D. Hepatitis B. World Health Organization Department of Communicable Diseases Surveillance and Response. 2002 WHO/CDS/CSR/LYO/2002. 2:Hepatitis B. (2002)（非特許文献１０５））。HBVウイルス粒子には、コアタンパク質HBcとその他のタンパク質と一緒に詰め込まれており、ヌクレオカプシドを形成しており、これは脂質と表面タンパク質ファミリーHBs（エンベロープタンパク質とも呼ばれる）を含む外側のエンベロープで取り囲まれている。HBcとHBsに関連する抗原決定基は、それぞれHBcAgとHBsAgとして示される。これらの抗原は、血清学的な、すなわち、患者の血液で見られる抗体応答に関連し、HBV感染診断の臨床的に最も有用な抗原-抗体系の1つである。HBcは、HBV感染の前歴を用いることなく、全ての個体に対する新規な外的抗原を提示する。この抗原について免疫原性ペプチドが既知であるため（Bertoletti A, Chisari FV, Penna A, Guilhot S, Galati L, Missale G, Fowler P, Schlicht HJ, Vitiello A, Chesnut RC, and . Definition of a minimal optimal cytotoxic T-cell epitope within the hepatitis B virus nucleocapsid protein. J Virol. 67:2376-2380 (1993)（非特許文献１０６）；Livingston BD, Crimi C, Grey H, Ishioka G, Chisari FV, Fikes J, Grey H, Chesnut RW, and Sette A. The hepatitis B virus-specific CTL responses induced in humans by lipopeptide vaccination are comparable to those elicited by acute viral infection. J Immunol. 159:1383-1392 (1997)（非特許文献１０７））、HBcAg由来の1つの10アミノ酸からなるペプチドが、IMA内の陽性コントロール抗原として選択された。そのため、患者の免疫能と有効なワクチン治療のマーカーとして、HBcペプチド特異的CTLの導入が用いられるであろう。
【００２４】
癌患者における免疫療法は、腫瘍細胞には対抗するが、健康な組織には対抗しない、免疫系細胞、具体的には、特に細胞傷害性T細胞（CTL、"キラー細胞"とも知られ、また、CD8陽性T細胞とも知られる）と呼ばれる細胞の活性化を目的とする。腫瘍細胞は腫瘍関連タンパク質の発現により健康な細胞とは異なる。該細胞表面上のHLA分子は、細胞内容物を外部に提示することにより、細胞傷害性T細胞が健康な細胞と腫瘍細胞との間を区別することを可能にする。このことは細胞内の全てのタンパク質を短いペプチドに分解することによって実現され、該ペプチドは次いでHLA分子に付着して細胞表面上で提示される（Rammensee,H.G., Bachmann,J., and Stevanovic,S. (1997). MHC Ligands and Peptide Motifs. Springer-Verlag, Heidelberg, Germany)（非特許文献１０８））。腫瘍細胞上に提示されるが身体の健康な細胞上では提示されないか、わずかしか提示されないペプチドは腫瘍関連ペプチド（TUMAP）と呼ばれる。
【００２５】
腫瘍関連ペプチドを用いた最初の臨床実験は、Boon等によって1990年代中頃に開始され、主としてメラノーマを検出するものであった。最良の実験における臨床的な応答は10％-30％の範囲であった。深刻な副作用や深刻な自己免疫は、ペプチドをベースとするワクチンの単独療法を用いた臨床実験では報告されなかった。軽度の白斑形成が、メラノーマ関連ペプチドで治療を行った何人かの患者で報告されている。
【００２６】
しかしながら、1種のCTLの刺激は全ての腫瘍細胞を排除するのには通常不十分である。腫瘍は非常に変異原性であるため、それらのタンパク質パターンをCTLによる認識を逃れるように変えることによりCTLの攻撃に迅速に応答可能である。その腫瘍の回避メカニズムをカウンター攻撃するため、様々な特異的ペプチドがワクチン療法に用いられる。このように、腫瘍に対抗する広範な同時攻撃をいくつかのCTLクローンにより同時に用いることができる。これにより、腫瘍が免疫応答を回避する機会を減少させることができる。この説は近年、後期のメラノーマ患者を治療する臨床試験で確認された。いくつかの例外を除いて、少なくとも3種の異なるT細胞応答を有した患者は、目的とする臨床的応答または安定した病態を示し、さらに生存率が上昇したが、一方で3種のT細胞応答より少ない大多数の患者が進行性の病気と診断された。
【００２７】
これまでに、クラス1、クラスIIプロセッシング経路への標的抗原に対する多数の戦略が開示されている。取り出して処理するために、抗原提示細胞（APC）を対象とする抗原で培養することができる（Chaux, P., Vantomme, V., Stroobant, V., Thielemans, K., Corthals, J., Luiten, R., Eggermont, A. M., Boon, T. & van der, B. P. (1999年) J. Exp. Med. 189, 767-778（非特許文献１０９））。その他の戦略は、リソソームの標的配列を含む融合タンパク質を用いるものである。APC中で発現したそのような融合タンパク質は、抗原をクラスIIのプロセッシング分画へ運ぶ（Marks, M. S., Roche, P. A., van Donselaar, E., Woodruff, L., Peters, P. J. & Bonifacino, J. S. (1995年) J. Cell Biol. 131, 351-369（非特許文献１１０）; Rodriguez, F., Harkins, S., Redwine, J. M., de Pereda, J. M. & Whitton, J. L. (2001年) J. Virol. 75, 10421-10430（非特許文献１１１））。 
【００２８】
細胞傷害性Tリンパ球によってタンパク質を腫瘍特異的抗原として認識し、治療において用いるためには特定の前提条件が満たされていなければならない。抗原は、主として腫瘍細胞によって発現されなければならず、正常で健康な組織によって発現されてはならず、あるいは正常で健康な組織では発現されてもごく少量でなければならない。さらに、各抗原が1種類の腫瘍に存在するだけでなく高濃度（例えば、細胞ごとに複製数）であることが望ましい。腫瘍関連抗原に由来するようなペプチド（"免疫原性ペプチド"）が、in vitroまたはin vivoでT細胞応答を誘導すべきであるため、抗原のアミノ酸配列中のエピトープの存在が重要である。
【００２９】
現在、おおよそ30％の患者が転移性疾患を患っており、他の25％の患者は限局的に進行する腫瘍を患っている。外科的切除を受ける40％の人は、最終的に転移する。転移性疾患の人のうち、おおよそ75％は肺の転移を呈し、36％はリンパ節および／または軟組織に、20％は骨に、18％は肝臓に併発する。5年生存率は、Robsonのステージ分類によって変化する。すべて合わせて、RCCは患者の80％近くにおいて致命的なままである（Senn HJ, Drings P, Glaus A, Jungi WF, Pralle HB, Sauer R,およびSchlag PM. Checkliste Onkologie、第5版、Georg Thieme Verlag、シュトゥットガルト/ニューヨーク(2001年)（非特許文献１１２）； Vokes EEおよびGolomb HM. Oncologic Therapies、第2版、Springer-Verlag、ベルリン/ハイデルベルク(2003年)（非特許文献１１３））。
【００３０】
腎細胞癌の分類は、TNMによってなされた（Guinan P. TNM Staging of Renal Cell carcinoma. Presented at 'Diagnosis and prognosis of Renal Cell Carcinoma: 1997年 Workshop', Rochester, Minnesota, March21-22, Communication of the UICC - Union Internationale Contre le Cancer, and AJCC - American Joint Committee on Cancer, published by ASC - American Society Cancer (1997年), Communication of the UICC（非特許文献１１４））。以下の表Ａと表Ｂを参照されたい。
【００３１】
（表Ａ）：腎細胞癌のTNM分類
【表Ａ】
2009506762.tif 000002
【００３２】
（表Ｂ）：腎細胞癌のRobsonのステージ分類と5年生存率
【表Ｂ】
2009506762.tif 000003
* 米国泌尿器疾患財団
【００３３】
RCCの標準的な治療は、根治的腎摘除である（全てのステージに対して）。放射線治療は、癌の広がりを減少させるのに用いられるが、腎細胞癌は放射線に耐性を有する場合が多い。ホルモン治療はいくつかのケースで腫瘍の成長を低減し得る（10％未満）。今日まで化学療法は、この病気では顕著な作用を示していない。ビンブラスチン、5-FU（5-フルオロウラシル）およびフルオロウラシル（FUDR）は、最も研究された化学療法薬であるが、5-FUとその代謝産物であるFUDRのみが10-12％活性率を示した（Vokes EEおよびGolomb HM. Oncologic Therapies, 第2版、Springer-Verlag, ベルリン／ハイデルベルグ (2003年)（非特許文献１１３））。ゲムシタビンと5-FUとの組み合わせにより、17％の応答率が得られた。
【００３４】
進行したRCCの治療に関して、インターフェロンα（IFNα）やインターロイキン-2（IL-2）などの免疫学的治療法が、米国ならびに欧州の規定の委任機関により近年評価された。最新の高い投与量のIL-2での治療は、未だFDAの認可を受けているたった1つの免疫学的治療法である。IFNα単独療法は、当初25-30％の応答率を有すると報告されたが、さらなる試験により、真の応答率はわずか約1％に過ぎないことが報告された（Vokes EEおよびGolomb HM. Oncologic Therapies、第2版、Springer-Verlag、ベルリン/ハイデルベルク(2003年)（非特許文献１１３））。IL-2は、おおよそ5％の耐久性のある完全な寛解に達する患者での、IFNαと比較して、同様の全応答率を有することを示す。進行したRCCの6,000人の患者を超える最近のメタアナリシスは、サイトカイン治療、例えば、IFNα、大量のIL-2迅速投与、あるいはIL-2吸入などにより、平均して、わずか12.9％の臨床的応答率しか得られないという結果となった。同様の分析により、プラセボでは4.3％の応答を示し、非免疫学療法コントロールアームにおいては2.5％の応答を示した（Coppin C, Porzsolt F, Awa A, Kumpf J, Coldman A, Wilt T. Cochrane Database Syst Rev. 2000年;(3):CD001425、進行腎細胞癌の免疫療法（非特許文献１１５））。
【００３５】
多くの腫瘍実体において新しい治療法が臨床効果を示し、近年認可を受けたが、腎細胞癌の生存率はこの10年間でほとんど変化していない。現在利用可能な全身的な治療選択である化学療法ならびに免疫学的治療は、比較的乏しい有効性しか得られないことが示されており、より重要なことに、顕著な全身毒性により制限される。結果的に、腎細胞癌における新たな治療選択の医学的要求は実質的に満たされていない。
【００３６】
Tヘルパー細胞は、抗腫瘍免疫においてCTLのエフェクター機能を調整することにおいて重要な役割を果たす。TH1型のTヘルパー細胞応答を誘発するTヘルパー細胞エピトープは、それらの細胞表層上で腫瘍関連ペプチド／MHC複合体を提示する腫瘍細胞に運ばれる細胞傷害性能を含むCD8陽性キラーT細胞のエフェクター機能を支持する。このようにして、腫瘍関連Tヘルパー細胞ペプチドエピトープは、単独またはその他の腫瘍関連ペプチドと組み合わさって、抗腫瘍免疫応答を刺激するワクチン組成物の活性製薬成分として作用し得る。
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【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３７】
本発明の腫瘍ワクチンの開発における、主要な課題とは、新規な腫瘍関連抗原、および、CD8陽性T細胞またはCD4陽性T細胞、特に、T H1型のCD4陽性T細胞によって認識可能なそれらに由来する免疫性Tヘルパーエピトープの同定並びに特徴付けである。それゆえ、本発明の主要な目的は、ヒト主要組織適合抗原複合体（MHC）クラスI（HLAクラスI）またはII（HLAクラスII）への結合能を有するペプチドのような新規なアミノ酸配列を提供することである。本発明のさらなる目的は、上記新規なペプチドをベースとする、少なくとも部分的には、有効な抗癌ワクチンを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００３８】
本発明によれば、第一の目的は、添付の配列表のSEQ ID No.1またはSEQ ID No.2のいずれかよる配列を少なくとも1つ含むペプチドの群から選択される腫瘍関連ペプチドを提供することによって達成され、ここで、一方のペプチドは、ヒト主要組織適合抗原複合体（MHC）クラス2（HLAクラス2）への結合能を有し、他方は、ヒト主要組織適合抗原複合体（MHC）クラス1（HLAクラス1）への結合能を有するが、完全なヒト腫瘍関連ポリペプチドではない。
【００３９】
本発明において、本発明者等は、哺乳類の腫瘍、特にヒトの腫瘍、好ましくは腎臓細胞癌から直接由来するHLAクラスIまたはII分子に結合するペプチドを単離して特徴付けることが可能であることを示す。
【００４０】
本発明は、腫瘍化に関連する抗原由来の、ヒト白血球の免疫応答、特にリンパ球、特にTリンパ球、特にCD4陽性Tリンパ球、特にCD4陽性Tリンパ球介在TH1型の免疫応答を誘発するための、HLAクラス2分子への十分な結合能を有するペプチドを提供する。
本発明はまた、腫瘍化に関連する抗原由来の、ヒト白血球の免疫応答、特にリンパ中、特にTリンパ球、特にCD8陽性細胞傷害性Tリンパ球の免疫応答を誘発するべく、HLAクラスI分子への十分な結合能を有するペプチドを提供する。
【００４１】
ペプチドは、腫瘍関連抗原、特に、例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼ7（MMP7；SEQ ID No.1）と、アポリポタンパク質L1（APOL1；SEQ ID No.4）由来の腫瘍関連ペプチドを含む、例えば、タンパク質加水分解、血管形成、細胞成長、細胞周期調節、細胞分裂、転写の調節、翻訳の調節、組織侵入における機能を有する腫瘍関連抗原に由来する。
本発明において、本発明者等はまた、HLAクラスII分子、ヒトゲノムのHLA DR遺伝子座によって遺伝的にエンコードされるHLAクラスII対立遺伝子に十分に無差別に結合する腫瘍関連ペプチドが、ヒトCD4陽性T細胞によって介在された免疫応答を誘引することが可能であるという決定的な証拠を提供する。CD4陽性T細胞は、ヒトの末梢血液から単離されたものであり、クレームのペプチドが、ヒト腫瘍細胞ペプチドームの選択されたペプチドに対するヒト免疫系のT細胞応答を誘発するのに適していることを示すことができる。以下にMMP7由来のペプチド（SEQ ID No. 1）とともに例示するように、これらのHLA-DRに対して無差別的に結合する腫瘍関連ペプチドは、CD4陽性T細胞によって認識されることが見いだされた。
【００４２】
同様に、HLAクラスI分子に十分に結合する腫瘍関連ペプチドが、ヒトのCD8陽性細胞傷害性Tリンパ球により免疫応答を誘引することが可能であることを見いだし、また、クレームのペプチドが、ヒト腫瘍細胞ペプチドームの選択されたペプチドに対するヒト免疫系のT細胞応答を誘発するのに適していることを立証した。
【００４３】
ペプチドは化学的に合成でき、製薬的調合物の活性製薬成分として用いることができるため、本発明者等の発明によって提供されるペプチドは、免疫療法、好ましくは癌の免疫療法に使用することができる。
【００４４】
ペプチドをベースとする免疫療法を開発するべくTAA由来のHLAクラスIIリガンドを同定するために、本発明者等は、特定の腎細胞癌（RCC）から切り出した充実性腫瘍から直接HLA-DR-提示ペプチドを単離することを試みた（以下を参照されたい）。
【００４５】
技術的な実証実験を証明するためにRCCに着目する理由を後述する：
新たに150,000人程度の世界中の人々が、毎年RCCであると診断され、この疾患は致死率が高く、毎年およそ78,000人が死亡している（Pavlovich, C.P.とL.S. Schmidt、2004年；腎細胞癌の遺伝的原因に関する調査、Nat. Rev. Cancer 4:381-393）。転移が診断された場合、１年の生存率は約60％に低下するため（Jemal, A., R.C. Tiwari, T. Murray, A. Ghafoor, A. Samuels, E. Ward, E.J. FeuerとM.J. Thun、2004年；癌戦略、2004年CA Cancer J. Clin. 54:8-29）、この指標には高度なまだ対処されていない医療が必要なことが強調される。RCCは、免疫原性腫瘍であると思われるため（Oliver RTD, Mehta A, Barnett M；転移性腎細胞癌の患者における2相試験の調査ならびにそのような患者の進行に対する反応の評価、Mol Biother. 1988;1:14-20. Gleave M, Elhilali M, Frodet Y等、転移性腎細胞癌におけるインターフェロンγ-1bのプラセボとの比較、N Engl J Med. 1998年;338:1265）、腫瘍反応性および腫瘍浸潤性CTLの存在によって同定されるとき（Finke, J.H., P. Rayman, J. Alexander, M. Edinger, R.R. Tubbs, R. Connelly, E. PontesとR. Bukowski、1990年；ヒトの腎細胞癌におけるCD4陽性およびCD8陽性腫瘍浸潤性リンパ細胞の細胞傷害活性の特徴付け、Cancer Res. 50:2363-2370）、ペプチドをベースとする抗腫瘍ワクチン摂取を開発するための臨床試験が開始された（Wierecky J, Mueller M, Brossart P.；MUC-1を標的とする樹状細胞ベースの癌免疫療法、Cancer Immunol Immunother. 2005年4月28日）。しかしながら、TAA由来のヘルパーT細胞エピトープの欠乏により、分子的に画定されたワクチンは、通常、クラスIリガンドとしてのみ機能するペプチドからなる。
【００４６】
本発明の第二の目的は、癌細胞、特に充実性腫瘍の細胞に対して有効な、本発明のペプチドを有効量含むか、あるいはそのようなペプチドをエンコードする核酸を含んでなる製薬的調合物を、好ましくはワクチンの形態で提供することによって達成される。該ワクチンは、以下により説明するように、さらに有効となるよう、別のペプチドおよび／または賦形剤をさらに含むことができる。
【００４７】
ペプチドまたはペプチドをエンコードする核酸はまた、腫瘍または癌のワクチンを構成することができる。該ワクチンは、直接患者に、または患部臓器にまたは全身的に投与され、または、患者由来の細胞またはその後患者に投与されるヒト細胞株由来の細胞に生体外で適用され、または患者由来の免疫細胞から副次集団を選択するようin vitroで用いられ、次いで、それらは再び患者に投与される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
本発明の第1の態様は、SEQ ID No. 1 (SQDDIKGIQKLYGKRS)またはSEQ ID No. 2 (VMAGDIYSV)あるいはそれらの多型ので構成されるペプチドであって、該アミノ酸配列が誘導される完全なヒトのポリペプチド（すなわち、遺伝子座のリンクIDにあげたような全長配列のうちの1つ）ではないペプチドを提供する（Accession番号、以下に添付の表1参照）。
【００４９】
以下に開示するように、本発明の基礎を形成するペプチドは、MHCクラスII担持細胞（RCC）で提示されたものとして全て同定された。そのため、これらの特定のペプチド、さらには、該配列を含むその他のペプチド（即ち、誘導されたペプチド）は、ほぼまちがいなく特定のT細胞応答を全て誘発すると思われるが、そのような応答が誘発される範囲は、個々のペプチドによって変わる可能性がある。例えば、差異は、該ペプチドにおける変異に起因して生じ得る（以下を参照のこと）。当業者であれば、特に、本明細書の例ならびにそれぞれの文献を参照することにより、個々のペプチドによって誘発される応答の及ぶ範囲を決定するための方法は充分に承知している。
【００５０】
好ましくは、本発明によるペプチドは、本質的にSEQ ID No. 1またはSEQ ID No. 2またはそれらの多型のうちの1つによるアミノ酸配列からなるものである。
【００５１】
「本質的に〜からなる」とは、本発明によるペプチドが、SEQ ID No. 1からSEQ ID No. 11、またはそれらの多型のいずれかに基づく配列に加えて、結合モチーフからなるペプチドのコア配列として、かつ、免疫原性Tヘルパーエピトープとして機能するペプチド部分を形成する必要のないN-および／またはC末端に位置するアミノ酸残基をさらに含むことを意味する。
【００５２】
それにもかかわらず、これら残基は、本発明のペプチドを細胞内に効率的に誘導するために重要である場合がある。本発明の一実施態様において、本発明のペプチドは、NCBI、GenBankのAccession番号X00497からなる、HLA-DR抗原関連不変鎖（p33、以下における"Ii"）の80個のN末端アミノ酸を含んでいる（Strubin, M., Mach, B.とLong, E.O.、HLA-DR関連不変鎖のｍRNAの完全な配列は、独特な膜透過極性を有するポリペプチドを示す。EMBO J. 3 (4), 869-872 (1984年)）。
【００５３】
所与のアミノ酸配列の「変形」により、本発明者等は、例えば、アミノ酸残基の1つまたは2つの側鎖を、所与のアミノ酸配列からなるペプチドと実質的に同じようにペプチドがHLA分子への結合能をそれにもかかわらず有するよう変更する（例えば、別の自然発生的アミノ酸残基またはその他の側鎖と置換することなどにより）ことを意図するものである。例えば、ペプチドは、改善しない場合に、少なくともHLAクラスII分子の場合のHLA-DRB1やクラスI分子の場合のHLA-A2などの適当なMHC分子との相互作用能および結合能を維持ように、かつ、改善しない場合に、本発明の態様において定義されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを異常に発現する細胞を認識して殺すことが可能な活性化されたCTLの生成能、あるいは、CD8陽性T細胞を助けるかまたはサイトカインを分泌させて直接標的細胞を攻撃できるヘルパーT細胞への刺激能を少なくとも維持するよう、改変することができる。以下の開示するようなデータベースから誘導可能なため、HLA-DR結合性ペプチドの特定の位置は、通常、コア配列に適合するHLA結合溝の結合モチーフを形成する残基を固定する。HLA-DRの結合に関与するこれらおよびその他の残基は、CTL認識を変更することなく結合を増強することができる。
【００５４】
T細胞レセプターと相互作用する必須ではないそれらのアミノ酸残基は、その導入は、実質的にT細胞反応性に影響を与えず、関連MHCへの結合を排除しない、別のアミノ酸と置換することによって改変することができる。そのため、所与の条件とは別に、本発明のペプチドは、提示したようなアミノ酸配列または部分またはそれらの変形を含むいずれのペプチドであってもよい（本発明者等は該用語によりオリゴペプチドまたはポリペプチドが包含する）。
【００５５】
さらに、MHCクラスII提示ペプチドに関して知られていることとは、これらペプチドは、あるHLA特異的アミノ酸モチーフと、任意に、コア配列の機能とは干渉しない（すなわち、ペプチドとT細胞の相互作用に関係ないと思われる）N-および／またはC末端延長を有する「コア配列」からなることである。N-および／またはC末端延長は、それぞれが1〜10アミノ酸長であり得る。したがって、本発明の好ましいペプチドは、全長9〜100、好ましくは9〜30、さらに好ましくは9〜16のアミノ酸を呈する。これらペプチドはMHCクラスII分子を直接負荷するために用いられるか、あるいは、該配列が以下で説明のベクター中にクローン可能であることができるかのいずれかである。これらのペプチドが、細胞内で大型のペプチドのプロセッシングの最終生成物を形成するため、より長いペプチドを用いることもできる。本発明のペプチドは、いずれのサイズのものであってよいが、通常は分子量で100,000分子量以下、好ましくは50,000分子量以下、さらに好ましくは10,000分子量以下であり、典型的には約5,000分子量である。アミノ酸残基の数について、本発明のペプチドは、1,000残基より少なく、好ましくは500残基より少なく、より好ましくは100残基より少ない。
【００５６】
本発明の他の態様において、MHCクラスII分子について上記で説明した状況と同様に、本発明のペプチドは、HLAクラス1分子のコアまたは部分的な配列を同時に提示するペプチドとして、MHCクラスI特異的応答を誘発するのに用いることができる。本発明の好ましいMHCクラスI特異的ペプチドは、全長9〜16、好ましくは9〜12アミノ酸を呈する。これらのペプチドは、MHCクラスIIペプチドと同様に、（例えばワクチン内で）より長いペプチドとして用いられ得ることは理解すべきである。HLAクラスI分子に対するある一定のHLA特異的アミノ酸モチーフを有するMHCクラスI特異的"コア配列"の同定方法は当業者には周知であるため、例えば、コンピュータプログラムPAProC（http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/）およびSYFPEITHI（http://www.syfpeithi.de）により予測可能である。
【００５７】
本発明のペプチドは、本発明の発現ペプチドの基礎を形成するポリペプチドを異常に発現させる細胞をT細胞に認識させることを可能にする免疫療法において特に有用である。所与のアミノ酸配列からなるこれら特定のペプチドはHLAクラスIまたはHLAクラスII分子に結合するため、本発明のペプチドがHLAクラスIまたはHLAクラスII分子に結合し、適当な抗原提示細胞の表層上に存在する場合、そのように結合したHLAペプチド複合体が、所与のアミノ酸配列を含むポリペプチドを異常に発現する細胞を認識するT細胞の刺激を誘発可能であるものであることが好ましい。
【００５８】
約12アミノ酸残基より大きいペプチドがMHC分子に直接結合させるのに用いられる場合、コアHLA結合領域に隣接する残基が、ペプチドの、MHC分子の結合溝に特異的に結合する能力またはペプチドをT細胞に提示する能力に実質的に影響を与えないものであることが好ましい。しかしながら、上記ですでに示したように、特に、ポリヌクレオチドによってエンコードされる場合、大型のペプチドが、適当な抗原提示細胞によって断片化され得るため、大型のペプチドを用いることができることは理解されるであろう。
【００５９】
MHCリガンドのペプチド、モチーフ、多型の例、並びにN末端および／またはC末端伸張部のある例は、例えば、http://syfpeithi.bmi-heidelberg.com/のデータベースSYFPEITHIから得られ（Rammensee H, Bachmann J, Emmerich NP, Bachor OA, Stevanovic S. SYFPEITHI: MHCリガンドとペプチドモチーフのデータベース；Immunogenetics、1999年11月; 50(3-4):213-9.）、本明細書中で参照として引用される。
【００６０】
非限定的な例として、データベース中のHLA-DRに対するペプチドは、Igκ鎖188-203由来のK H K V Y A C E V T H Q G L S S（Kovats等のEur J Immunol.1997年4月;27(4):1014-21）、Igκ鎖145-159由来のK V Q W K V D N A L Q S G N S（Kovats等のEur J Immunol.1997年4月;27(4):1014-21）、GAD65 270-283由来のL P R L I A F T S E H S H F（Endl等のJ Clin Invest.1997年5月15日;99(10):2405-15）またはGAD65 556-575 由来のF F R M V I S N P A A T H Q D I D F L I（Endl等のJ Clin Invest.1997年5月15日；99(10):2405-15）である。さらに、ペプチドはまた、bcr-abl 210 kD融合タンパク質由来のA T G F K Q S S K A L Q R P V A S（ten Bosch等のBlood.1996年11月1日;88(9):3522-7）、HCV-1 NS3 28-41由来のG Y K V L V L N P S V A A T（Diepolder等のJ Virol.1997年8月;71(8):6011-9）、または、HIV-1 (HXB2) RT 326-345由来のF R K Q N P D I V I Q Y M D D L Y V G（van der Burg等のJ Immunol.1999年1月1日;162(1):152-60）の場合など、変異配列の抗原からも誘導することができる。全ての「アンカー」アミノ酸（HLA-DR4の例として、Friede 等のBiochim Biophys Acta.1996年6月7日;1316(2):85-101、Sette等のJ Immunol.1993年9月15日;151(6):3163-70、Hammer等のCell.1993年7月16日;74(1):197-203およびHammer等のJ Exp Med.1995年5月1日;181(5):1847-55を参照のこと）は、太字で示されており（下表Ｃ参照）、コア配列は下線部であると見なされている。
【００６１】
【表Ｃ】
2009506762.tif 000004
【００６２】
上記ペプチドの全ては、所与のアミノ酸配列の「多型」という用語に包含される。「ペプチド」という語により、本発明者等は、アミノ酸残基がペプチド（-CO-NH-）結合で結合される分子だけでなく、ペプチド結合が保存される分子をも含むことを意図するものである。そのようなRetro-inverso型ペプチド模倣は、当業界で既知の方法、例えば、参照としてここに記載するMeziere等の（1997年）のJ. Immunol. 159, 3230-3237に開示されるような方法を用いて作製することができる。このアプローチは、側鎖の配向ではなく、バックボーンに関連する変化を含む偽ペプチドを作製することを包含する。Meziere等（1997年）は、少なくともMHCクラスIIとTヘルパー細胞応答のために、これら偽ペプチドが有用であることを示している。Retro-inverse型ペプチドは、CO-NHペプチド結合の代わりにNH-CO結合を有し、タンパク質加水分解に対してより抵抗性を有する。
【００６３】
通常、本発明のペプチドは、抗原提示細胞中で発現した場合、フラグメントが生成されるようにプロセッシングすることができるものであり、適切なMHC分子への結合能を有し、かつ、適当な細胞で提示することができ、それにより適当なT細胞応答を誘引する。ペプチドから生成されたフラグメントもまた、本発明のペプチドであることは理解されるであろう。好都合なことに、本発明のペプチドは、所与のアミノ酸配列を含む部分またはそれらの多型の部分、さらには、望ましい特徴を与えるさらなる部分を含む。例えば、そのさらなる部分は、別のT細胞エピトープ（第1のT細胞エピトープ含有部分として同じポリペプチドから誘導されたかまたはそうでないかのいずれか）を含むか、あるいは、キャリアタンパク質またはペプチドを含み得る。そのため、一実施態様において、本発明のペプチドは、一部欠失ヒトタンパク質か、あるいはタンパク質フラグメントと別のポリペプチド部分の融合タンパク質であるが、ただし、ヒトの部分は１つまたはより多くの本発明のアミノ酸配列を有する。
【００６４】
特に好ましい実施態様において、本発明のペプチドは、本発明のアミノ酸配列と、少なくとも1つのさらなるT細胞エピトープとを含み、該さらなるT細胞エピトープは、腫瘍関連抗原を異常に発現する腫瘍の型に向けたT細胞応答の生成を促進することができる。したがって、本発明のペプチドは、これもワクチンとして使用可能な「ストリング上のビーズ」と呼ばれるポリペプチドを含む。そのようなペプチドは、化学リンカーによって離間させることができ、それらにはアミノ酸（G-stretchなど）を含み得るが、さらにまたは任意に化学結合基（すなわち、特定の間隔を提供する以外の機能を有する）を含むことができる。
【００６５】
「異常に発現した」という語により、本発明者等は、ポリペプチドが、正常なレベルの発現と比較して過剰に発現しているか、あるいは、遺伝子が、腫瘍が誘導される組織内で沈黙しているが、腫瘍内で発現するという意味を含むことを意図するものである。「過剰に発現した」という語により、本発明者等は、ポリペプチドが、正常な組織に存在する場合よりも少なくとも1.2倍、好ましくは少なくとも2倍、より好ましくは正常な組織に存在するレベルの少なくとも5倍または10倍のレベルで存在することを意図するものである。
【００６６】
ペプチド（少なくとも、アミノ酸残基間にペプチド結合を有するペプチド）は、Lu等の（1981年）、J. Org. Chem. 46,3433および本明細書における参考文献に開示されるような、固相ペプチド合成のFmoc法によるポリアミド型によって合成することができる。一時的なN-アミノ基の保護は、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc法）基によって与えられる。この高度に塩基不安定な保護基の反復切断は、N,N-ジメチルフォルムアルデヒド中の20%ピペリジンを用いることで影響を受ける。側鎖の官能性は、それらのブチルエーテルとして（セリンスレオニンおよびチロシンの場合）、ブチルエステルとして（グルタミン酸およびアスパラギン酸の場合）、ブチルオキシカルボニル誘導体として（リシンおよびヒスチジンの場合）、トリチル誘導体として（システインの場合）、4-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルフォニル誘導体として（アルギニンの場合）保護することができる。グルタミンまたはアスパラギンがC末端残基である場合、側鎖アミド官能性の保護のため、4,4'-ジメトキシベンズヒドリル基の作製を利用する。固相支持体は、3つのモノマージメチルアクリルアミド（バックボーンモノマー）、ビスアクリロイルエチレンジアミン（クロスリンカー）、およびアクリオリルサルコジンメチルエステル（機能化剤）からなるポリジメチル-アクリルアミドポリマーに基づいている。用いられたペプチド-樹脂の切断可能に結合された試薬は、酸不安定な4-ヒドロキシメチル-フェノキシ酢酸誘導体である。全てのアミノ酸誘導体は、アスパラギンとグルタミンを除いて、それらのプリフォームされた対称的な無水物誘導体として、逆転N,N-ジシクロヘキシル-カルボジイミド／1-ヒドロキシベンゾトリアゾール介在カップリング方法を用いて添加される。全てのカップリングと脱保護反応は、ニンヒドリン、トリニトロベンゼンスルホン酸、すなわち、isotin試験法を用いて監視する。合成が完了すると、ペプチドは、50%スカベンジャー混合物を含む95％のトリフルオロ酢酸で処理することにより、側鎖保護基の除去に伴って樹脂支持体から切断される。共通して用いられるスカベンジャーは、エタンジチオール、フェノール、アニソール、および水であり、正確な選択は、合成されたペプチドのアミノ酸の構成に依存する。また、ペプチド合成のための固相と液相方法論の組み合わせも可能である（例えば、Bruckdorfer T, Marder O, Albericio Fの、研究のためのミリグラム単位から未来の薬剤のための数トン単位のでのペプチドの生成、Curr Pharm Biotechnol. 2004年2月、5(1):29-43ならびにここで引用の参考文献を参照）。
【００６７】
トリフルオロ酢酸は、真空中での蒸発によって除去し、その後、ジエチルエーテルで粉砕することにより、粗ペプチドを得ることができる。スカベンジャーの存在は、水性相の凍結乾燥がスカベンジャーの粗ペプチドフリーを与える簡単な抽出法で除去される。ペプチド合成の試薬は、通常、英国ノッティンガムNG7 2QJのCalbiochem-Novabiochem社（英国）から入手可能である。
【００６８】
アセトニトリル／水勾配分離を用いるサイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび（通常の）逆相高速液体クロマトグラフィーなどの技術のうちの1つまたはそれらの組み合わせによって精製を達成することができる。
【００６９】
ペプチドの分析は、薄層クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、酸分解後のアミノ酸分析および高速原子衝撃（FAB）質量スペクトル分析ならびにMALDIおよびESI-Q-TOF質量スペクトル分析を用いて実行することができる。
【００７０】
本発明のさらなる態様によれば、本発明のペプチドをエンコードする核酸（例えば、ポリヌクレオチド）が提供される。ポリヌクレオチドは、DNA、cDNA、PNA、CAN、RNAまたはそれらの組み合わせであってよく、本発明のペプチドをコードする限り、イントロンを含んでも含まなくてもよい。当然のことながら、ポリヌクレオチドによってエンコード可能な自然発生的ペプチド結合によって結合される自然発生的アミノ酸残基を含む単なるペプチドである。本発明のさらに別の態様によれば、本発明のポリペプチドを発現可能な発現ベクターが提供される。
【００７１】
例えば、相補型付着末端を介して、ポリヌクレオチド、特にDNAをベクターに操作可能に結合させる様々な方法が開発されている。例えば、相補型ホモポリマートラクトは、ベクターDNAに挿入されるDNAセグメントに加えることができる。ベクターとDNAセグメントは、次いで、相補型ホモポリマー尾部間の水素結合によって接合され、組み換えDNA分子を形成する。
【００７２】
1つまたはより多くの制限酵素切断部位を含む合成リンカーは、DNAセグメントをベクターに接合する別の方法を提供する。上述のように制限エンドヌクレアーゼ制限分解によって生成されるDNAセグメントは、バクテリオファージT4DNAポリメラーゼまたは大腸菌DNAポリメラーゼI、それらの3'-5'-エクソヌクレアーゼ活性を有する突出3'-単鎖末端を排除し、重合活性を有するそれらの陥凹3'-末端を満たす酵素で処理される。
【００７３】
そのため、これら活性の組み合わせは、平滑末端化DNAセグメントを生成する。平滑末端化セグメントは、次いで、バクテリオファージT4DNAリガーゼなどの、平滑化末端DNA分子の連結を触媒可能な酵素の存在下で大過剰モルのリンカー分子で培養される。そのため、反応生成物は、高分子リンカー配列を少なくともそれらの末端で担持するDNAセグメントである。これらDNAセグメントは、次いで、適当な制限酵素によって切断され、これらDNAセグメントとの親和性を有する末端を生成する酵素によってすでに切断された発現ベクターに連結される。
【００７４】
様々な制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーは、米国コネチカット州ニューヘブンのInternational Biotechnologies社を含む数社から商業的に入手可能である。
【００７５】
本発明のポリペプチドをエンコードするDNAを改質する望ましい方法は、Saiki等の（1988年）Science 239,487-491に開示されるようなポリメラーゼ鎖反応を使用することである。この方法は、例えば、遺伝子操作によって、適当な制限部位における、適当なベクター中にDNAを導入するのに用いることができ、あるいは、DNAを当業界で既知のその他の有用な方法で改質するのに用いることができる。この方法において、酵素によって増幅されるDNAは、それ自体が増幅DNA中に導入される2つの特定プライマーで両脇を固められる。該特定プライマーは、当業界で既知の方法を用いて発現ベクター中にクローニングするのに使用可能な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含み得る。
【００７６】
DNA（または、レトロウイルスベクターの場合にはRNA）は、次いで、本発明の化合物からなるポリペプチドを生成するよう適当なホスト中で発現される。そのため、本発明の化合物を構成するポリペプチドをエンコードするDNAは、既知の技術に従って使用することができ、発現ベクターを構築するよう、本明細書中の教示に鑑みて適切に改質され、次いで、本発明のポリペプチドを発現して生成するために適当なホスト細胞に形質転換するのに用いられる。そのような技術には、1984年4月3日発効のRutter等の米国特許第4,440,859号明細書、1985年7月23日発効のWeissmanの第4,530,901号明細書、1986年4月15日発効のCrowlの第4,582,800号明細書、1987年6月30日発効のMark等の第4,677,063号明細書、1987年7月7日発効のGoeddelの第4,678,751号明細書、1987年11月3日発効のItakura等の第4,704,362号明細書、1987年12月1日発効のMurrayの第4,710,463号明細書、1988年7月12日発効のToole, Jr.等の第4,757,006号明細書、1988年8月23日発効のGoeddel等の第4,766,075号明細書および1989年3月7日発効のStalkerの第4,810,648号明細書に開示されるような技術が包含され、これらは全て参照としてここに組み入れられる。
【００７７】
本発明の化合物を構成するポリペプチドをエンコードするDNA（レトロウイルスベクターの場合はRNA）は、適当なホストに導入するために、広範なその他のDNA配列に接合することができる。随伴DNAは、ホストの性質、DNAのホストへの導入法に依存し、およびエピソームの維持または組込みのいずれかが望ましい。
【００７８】
概して、DNAはプラスミドなどの発現ベクター中に、発現のため、適当な配向で正しい読み枠で挿入される。必要に応じて、所望のホストで認識される適当な転写および翻訳調節制御ヌクレオチド配列に連結することができるが、そのような制御は、概して発現ベクター中で利用可能である。ベクターは、次いで、標準的な技術によってホスト中に導入される。概して、全てのホストがベクターによって形質転換されるわけではない。そのため、形質転換されたホスト細胞を選択する必要がある。一選択技術には、必要な制御因子とともに、抗生物質抵抗性などの、形質転換した細胞中に選択可能な形質をコードするDNA配列を発現ベクター中に導入することが包含される。
【００７９】
あるいはまた、そのような選択可能な形質の遺伝子は、その他のベクター上にある場合があり、所望のホスト細胞を共転換するのに用いられる。
【００８０】
本発明の組み換えDNAによって形質転換されたホスト細胞は、次いで、ポリペプチドの発現を可能にする本明細書で開示の技術を考慮し、当業者等に既知の十分な時間、適当な条件下で培養され、その後回収することができる。
【００８１】
バクテリア（例えば、or example E. coli and Bacillus subtilis）、イースト菌（例えば、Saccharomyces cerevisiae）、糸状菌（例えば、Aspergillu）、植物細胞、動物細胞、昆虫細胞を含む多くの発現系が知られている。好ましくは、そのような系はRCCまたはAwells細胞であってよい。
【００８２】
プロモーターは、RNAポリメラーゼの結合を可能にするDNA配列で形成される発現制御因子であり、転写を引き起こす。代表的なバクテリアホストとの親和性を有するプロモータ配列は、通常、本発明のDNAセグメントの導入のための好都合な制限部位を有するプラスミドベクター中に提供される。典型的な原核細胞ベクタープラスミドは、Biorad研究所（米国カリフォルニア州リッチモンド）から入手可能なpUC18、pUC19、pBR322および米国ニュージャージー州ピスカタウェイのPharmacia社から入手可能なpBR329、pTrc99AおよびpKK223-3である。
【００８３】
典型的なほ乳類の細胞ベクタープラスミドは、米国ニュージャージー州ピスカタウェイのPharmacia社から入手可能なpSVLである。このベクターは、クローン遺伝子の発現を発動するのにSV40後期プロモータを用い、発現の最高レベルはCOS-1細胞などのT抗原産生細胞中で見られる。誘導可能なほ乳類発現ベクターの例はpMSGであり、これもまた、Pharmaciaから入手可能である。このベクターは、クローン化された遺伝子の発現を発動するためにマウスの乳癌ウイルスの長い末端反復配列のグルココルチコイド誘導プロモータを用いる。有用なイースト菌プラスミドベクターは、PRS403-406とpRS413-416であり、概して、米国カリフォルニア州92037ラ・ホーヤのStratagene Cloning Systemsから入手可能である。プラスミドpRS403、pRS404、pRS404、pRS405およびpRS406はイーストintegrateプラスミド（Yips）であり、イースト選択可能なマーカーHIS3、TRP1、LEU2およびURA3を導入する。プラスミドpRS413-416は、イーストセントロメアプラスミド（Ycps）である。様々なホスト細胞とともに用いるその他のベクターと発現系は当業界で既知である。
【００８４】
本発明はまた、本発明からなるポリヌクレオチドベクターで形質転換したホスト細胞に関する。ホスト細胞は、原核細胞または真核細胞のいずれかであってよい。バクテリア細胞は、ある環境においては好ましい原核ホスト細胞であり、通常、例えば、米国メリーランド州ベセスダのBethesda Research Laboratories Inc.から入手可能な大腸菌株DH5および米国メリーランド州ロックヴィルのAmerican Type Culture Collection （ATCC）から入手可能なRR1（No ATCC 31343）などの大腸菌株である。好ましい真核ホスト細胞は、イースト菌、昆虫およびほ乳類の細胞を含み、マウス、ラット、サルあるいはヒトの線維芽細胞株および腎臓細胞株由来などの脊椎動物の細胞が好ましい。イースト菌ホスト細胞には、米国カリフォルニア州92037ラ・ホーヤのStratagene Cloning Systemsから入手可能なYPH499、YPH500およびYPH501が包含される。好ましいほ乳類ホスト細胞には、CCL61としてATCCから入手可能なチャイニーズハムスターの卵巣（CHO）細胞、CRL 1658として入手可能なNIHスイスマウス胎芽細胞NIH/3T3、CL 1650としてATCCから入手可能なサルの腎臓由来COS-1細胞、およびヒト胎児腎臓細胞である293細胞が包含される。好ましい昆虫細胞は、Sf9細胞であり、バキュロウイルス発現ベクターでトランスフェクトすることができる。
【００８５】
本発明のDNAを有する適当な細胞ホストの形質転換は、通常使用するベクターの種類に応じた既知の方法で達成される。原核ホスト細胞の形質転換については、例えば、Cohen等の（1972年）、Proc. Natl. Acad. Sci.米国69,2110およびSambrook等の（1989年）分子のクローニング、A Laboratory Manual、米国ニューヨーク州コールドスプリングのCold Spring Harbor Laboratoryを参照されたい。イースト細胞の形質転換については、Sherman等の（1986年）、研究所の手引き、イースト菌遺伝子学における方法、米国ニューヨーク州のCold Spring Harborに開示されている。Beggsの方法（1978年）、Nature 275,104-109もまた有用である。脊椎動物の細胞については、そのような細胞をトランスフェクトするのに有用な試薬は、例えば、Stratagene Cloning Systemsまたは米国メリーランド州20877ガイザーブルクのLife Technologies Incから入手可能な、リン酸カルシウムとDEAEデキストランまたはリポソーム形成因子である。細胞を形質転換および／または遺伝子導入するのに電気穿孔法もまた有用であり、イースト菌細胞、バクテリア細胞、昆虫細胞および脊椎動物細胞を形質転換する技術において当業界において周知である。
【００８６】
うまく形質転換された細胞、すなわち、本発明のDNA構成を含む細胞は、周知の技術によって同定することができる。例えば、本発明の発現構成体を導入して得られた細胞は、本発明のポリペプチドを産生するよう成長させることができる。細胞は回収して溶解させることができ、Southernの（1975年）、J. Mol. Biol. 98,503またはBerent等の（1985年）、Biotech. 3,208に開示されるような方法を用いて、DNAの存在についてそれらのDNA含有量を検査することができる。あるいはまた、以下で説明する抗体を用いて上清中のタンパク質の存在を検出することができる。
【００８７】
組み合えDNAの存在を直接アッセイすることに加えて、形質転換の成功は、組み換えDNAがタンパク質の発現を誘導可能であるとき、既知の免疫学的方法によって確認することができる。例えば、発現ベクターで形質転換が成功した細胞により、適切な抗原性を呈するタンパク質が生成される。形質転換されると推測される細胞の検体を回収し、適当な抗体を用いてタンパク質について分析する。したがって、形質転換したホスト細胞自体に加えて、本発明はまた、それら細胞の培養、好ましくは、栄養培地における単クローン性（クローン的に均質な）培養かあるいは単クローン性培養から得られた培養を意図するものである。
【００８８】
本発明の一定のホスト細胞、例えば、イースト菌と昆虫細胞が、本発明のペプチドを調製するのに有用であることは理解されるであろう。しかしながら、その他のホスト細胞は、ある種の治療法においては有用であろう。例えば、樹状細胞などの抗原提示細胞は、適当なMHC分子中に負荷されるよう本発明のペプチドを発現させるのに有効に用いることができる。
【００８９】
好ましいホスト細胞は、組み換えRCCまたはAwells細胞である。好ましくは、本発明の腫瘍関連ペプチドを作製する方法は、本発明のホスト細胞を培養するステップと、標準的な方法に従ってホスト細胞またはその培地からペプチドを単離するステップとを含む。
【００９０】
本発明のさらなる態様は、静脈内（i. v.）注射、皮下（s. c.）注射、皮内（i. d.）注射、腹腔内（i. p）注射、筋肉内（i. m.）注射のためのペプチドを作製する方法が提供される。ペプチド注射の好ましい方法は、s. c.、i. d.、i. p.、i. m.、およびi. v.である。DNA注射の好ましい方法は、i. d.、i. m.、s. c.、i. p.、およびi. v.である。ペプチドまたはDNAの投与量は、以下に概略するように1〜500 mgであってよい。
【００９１】
本発明のさらなる態様は、本発明による腫瘍関連ペプチド、本発明による核酸または本発明による発現ベクターの医療における使用に関するものである。
【００９２】
さらなる態様において、本発明の目的は、本発明のSEQ ID No. 1またはSEQ ID No. 2による腫瘍関連ペプチド、本発明の核酸、または本発明の発現ベクターを少なくとも1つと、薬理学的に許容可能な担体とを含む薬剤組成物によって達成される。この組成物は、皮下的、皮内的、腹腔内的、静脈内的などの非経口的投与、あるいは経口的投与などに用いられる。このため、ペプチドは薬理学的に許容可能な、好ましくは水溶性担体に溶解または懸濁する。さらに、該組成物は、緩衝剤、結合剤、爆破剤、希釈剤、香料、潤滑剤などの賦形剤を含んでもよい。ペプチドはまた、サイトカインなどの免疫刺激物質とともに投与することができる。そのような組成物で使用可能な賦形剤の指示リストは、例えば、A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 第3版、2000年（American Pharmaceutical Association and pharmaceutical press）から得ることができる。組成物は、腺腫性疾患または癌疾患の防止、予防および／または治療に用いることができる。
【００９３】
SEQ ID No. 1および／またはSEQ ID No. 2からなるペプチド、本発明の核酸、または本発明の発現ベクターのうちの少なくとも1つを含む製薬調合物は、それぞれのペプチドまたは抗原に関連する腺腫性疾患または癌疾患を患う患者に投与される。これにより、T細胞介在免疫応答を誘発することができる。本発明の薬剤組成物は、好ましくは、SEQ ID No. 3からSEQ ID No. 10のいずれかの配列によるさらなる腫瘍関連ペプチド、それぞれの核酸、またはそれぞれの発現ベクターを少なくとも1つ、さらに含む。
【００９４】
概して、本発明の薬剤組成物中に存在するペプチドは、SEQ ID No. 1および／またはSEQ ID No. 2を含む本発明のペプチドに関して上述したような同様の特徴を有する。したがって、これらは全長9〜100、好ましくは9〜30、さらに好ましくは9〜16のアミノ酸を呈する。さらに、SEQ ID No. 1からSEQ ID No .11のいずれかによる少なくとも1つのペプチドは、非ペプチド結合を有し得る。また、それぞれの核酸は、9〜100、好ましくは9〜30、さらに好ましくは9〜16のアミノ酸をエンコードすることができる。
【００９５】
SEQ ID No. 1および／またはSEQ ID No. 2およびSEQ ID No. 3 to SEQ ID No. 11のアミノ酸配列からなる（特に腫瘍関連）ペプチドからなる本発明の薬剤組成物であることが好ましい。
【００９６】
本発明の薬剤組成物は、該組成物中に存在する際、（複数の）（特に腫瘍関連）ペプチド、本発明の（複数の）核酸、または本発明による（複数の）発現ベクターの量は組織、癌および／または患者に特異的であることが好ましい。
【００９７】
ペプチドはまた、タグを付けることができるか、融合タンパク質か、またはハイブリッド分子であってよい。
【００９８】
ペプチドは、実質的に純粋であるか、または免疫刺激アジュバントと組み合わせたものであってよいか、あるいは免疫刺激性サイトカインとともに用いるか、例えばリポソームのような適当なデリバリーシステムにより投与することができる。その他の適当なアジュバントには、サポニン、マイコバクテリア抽出物および合成バクテリア細胞壁ミミックから誘導されるAquila's QS21 stimulon（Aquila Biotech, 米国メリーランド州ウースター）、および、Ribi's Detox. Quil A、その他のサポニン誘導アジュバント（デンマークSuperfos）などの特許アジュバントもまた用いることができる。フロイントのアジュバントなどのその他のアジュバントもまた使用可能である。これは、スカシ貝ヘモシアニン（KLH）またはマンナン複合ペプチドを得るのに有用でもある（WO 95/18145号公報およびLongenecker等の(1993年) Ann. NY Acad. Sci. 690,276-291参照）。アジュバントが、抗原に対する免疫応答を増強する物質であると定義されるため（MedlinePlus（登録商標）Medical Dictionary, NIH）、それらに限定されるものではないが、toll-like receptorアゴニスト（TLRアゴニスト）を含むこの機能を有するその他の物質も用いることができ、好ましい物質は、TLR3,7,8および9、より好ましくはTLR9とアゴニスト様に相互作用し、例えば、プロタミン安定化RNA、CpGオリゴヌクレオチド、CpRオリゴヌクレオチド、バクテリアDNA、イミダゾキノリンなどである。
【００９９】
免疫応答を増強するのに適した当業界において既知のその他物質には、それらに限定されるものではないが、誘導型一酸化窒素合成酵素（iNOS）、アルギナーゼ（ARG1）、インドールアミン-2,3-ジオキシゲナーゼ（IDO）、血管内皮増殖因子レセプター1（VEGFR-1）、血管内皮増殖因子（VEGF）、シクロオキシゲナーゼ-2（COX-2）、TGF-βレセプターI（TGF-β-RI）の阻害剤が包含される。そのような阻害剤は、例えば、上記分子または小さい分子に対するモノクローナル抗体であってよい。上述の因子に対して阻害作用を有することが従来から知られている小さい分子とモノクローナル抗体、すなわち免疫応答増強作用は、例えば、1-MT, NCX-4016, rofecoxib, celebrex, BEC, ABH, nor-NOHA, SB-505124, SD-208, LY580276, AMD3100, axitinib, bevacizumab, JSI-124, CPA-7, XL-999, ZD2171, pazopanib, CP-547632およびVEGF Trapである。
【０１００】
また、調節T細胞（CD 4+, CD25+, FoxP3+）の数を減少させる物質はアジュバントとして適している。これらには、それらに限定されるものではないが、例えば、cyclophosphamide（Cytoxan）、ONTAK（denileukin diftitox）、Sunitinib、抗CTLA-4（MDX-010, CP-675206）、抗CD25、抗CCL-22および抗GITRが包含される。
【０１０１】
その他の好ましい実施態様において、ワクチンは核酸ワクチンである。DNAワクチンなどのポリペプチドをエンコードする核酸ワクチンの摂取が、T細胞応答を導くことが知られている。該ワクチンは、直接患者に、または患部臓器にまたは全身的に投与され、または、患者由来の細胞またはその後患者に投与されるヒト細胞株由来の細胞に生体外で適用され、または患者由来の免疫細胞から副次集団を選択するようin vitroで用いられ、次いで、それらは再び患者に投与される。核酸がin vitroで細胞に投与される場合、インターロイキン-2またはGM-CSFなどの免疫刺激サイトカインを共発現するよう細胞を形質移入させることが有用であろう。
【０１０２】
核酸ワクチンはまた、BCGやミョウバンなどのアジュバントとともに投与することができる。しかしながら、核酸ワクチンはアジュバントなしに投与する場合も好ましい。
【０１０３】
ポリヌクレオチドは実質的に純粋であるか、適当なベクターまたはデリバリーシステムに含まれ得る。適当なベクターおよびデリバリーシステムには、アデノウイルス、ワクチンウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ関連ウイルスまたは1種類以上のウイルス成分を含むハイブリッドなどをベースとするウイルスシステムが包含される。非ウイルス性デリバリーシステムは、カチオン性脂質および当業界において周知のDNAデリバリーのカチオン性ポリマーを包含する。「遺伝子銃（gene-gun）」などを介した物理的なデリバリーもまた用いることができる。ペプチドまたは核酸によってエンコード化されたペプチドは、例えばCD4陽性T細胞を刺激するエピトープを有する融合タンパク質であってよい。
【０１０４】
適当に、患者に投与した核酸は滅菌されてパイロージェンフリーにする。裸のDNAは、筋肉内か皮内か皮下的に与えることができる。ペプチドは、筋肉内または皮内または皮下に与えることができる。
【０１０５】
好都合なことに、核酸ワクチンは、適当な核酸デリバリー手段を含み得る。核酸、好ましくはDNA、裸の（すなわち、実質的にその他の成分は投与されない）であるか、または、リポソーム中またはウイルス性ベクターデリバリーシステムでデリバリーすることができる。
【０１０６】
核酸の摂取および樹状細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞によってエンコード化されたポリペプチドの発現が、免疫応答の刺激のメカニズムであると考えられているが、樹状細胞はトランスフェクトされることはなく、しかし、組織中でトランスフェクトされた細胞から発現したペプチドを採取するために重要である（"クロスプライミング"、例えば、Thomas AM, Santarsiero LM, Lutz ER, Armstrong TD, Chen YC, Huang LQ, Laheru DA, Goggins M, Hruban RH, Jaffee EM.、Mesothelin特異的CD8(+)T細胞応答は、ワクチン摂取した膵臓癌患者における抗原提示細胞によりin vivoクロスプライミングの証拠をもたらす、J Exp Med. 2004年8月2;200(3):297-306）。
【０１０７】
DNAワクチンなどのワクチンを、筋肉中に投与することが好ましい。ワクチンを皮膚に投与することもまた好ましい。核酸ワクチンはアジュバントを用いず投与する。核酸ワクチンはまた、BCGまたはミョウバンなどのアジュバントとともに投与することができる。その他の適当なアジュバントには、サポニン、マイコバクテリア抽出物および合成バクテリア細胞壁ミミックから誘導されるAquila's QS21 stimulon（Aquila Biotech, 米国メリーランド州ウースター）、および、Ribi's Detox. Quil A、その他のサポニン誘導アジュバント（デンマークSuperfos）などの特許アジュバントもまた用いることができる。核酸ワクチンを、アジュバントを用いずに投与することが好ましい。フロイントのアジュバントなどのその他のアジュバントもまた有用である。ペプチドを、好ましくはアジュバントとともにスカシ貝ヘモシアニンに接合することもまた有用である。
【０１０８】
癌のポリヌクレオチド介在免疫治療は、Conry等の（1996年）腫瘍学セミナー23,135-147；Condon等の（1996年）Nature Medicine 2,1122-1127；Gong等の（1997年）Nature Medicine 3,558-561；Zhai等の（1996年）J. Immunol. 156,700-710；Graham等の（1996年）Int J. Cancer 65,664-670およびBurchell等の（1996年）pp 309-313 In: 乳ガン、生物学における進歩および治療、Calvo等 (eds), John Libbey Eurotextに開示されており、これらは全て参照のため全体としてここに組み入れられる。
【０１０９】
ワクチンは、注入する部位、標的ベクターとデリバリーシステム、または患者由来の細胞種の選択的精製、ペプチドまたは核酸のex vivo投与、のいずれにより、例えば、抗原提示細胞などの特異的な細胞種を標的にすることが有用であろう（例えば、樹状細胞は、Zhou等の（1995年）Blood 86,3295-3301; Roth等の（1996年）Scand. J. Immunology 43,646-651に開示されるように分類することができる）。例えば、標的ベクターは、適切な場所で抗原を発現させる組織または腫瘍特異的プロモーターからなるものであってよい。
【０１１０】
本発明は、さらなる態様において製薬組成物に関し、該組成物は、1つまたはより多くの本発明の上記ペプチドを含む。この組成物は、皮下、皮内、筋肉内などの非経口投与や経口投与に用いることができる。このため、ペプチドは、薬理学的に許容可能な好ましい水性担体中に溶解または懸濁される。さらに、組成物は、緩衝剤、結合剤、爆破剤、希釈剤、香料、潤滑剤などの賦形剤を含んでもよい。ペプチドはまた、サイトカインなどの免疫刺激物質と一緒に投与することができる。そのような組成物に使用可能な賦形剤の指示リストは、例えば、A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 第3版、2000年（American Pharmaceutical Association and pharmaceutical press）から得ることができる。組成物は、腺腫性疾患または癌疾患の防止、予防および／または治療に用いることができる。
【０１１１】
SEQ ID No. 1および／またはSEQ ID No. 2の少なくとも1つを含む本発明のペプチドを含む製薬調合物は、それぞれのペプチドまたは抗原に関連する腺腫性疾患または癌疾患を患う患者に投与される。これにより、CTL特異的免疫応答を誘発させることができる。
【０１１２】
本発明の別の態様において、本発明による2つまたはいくつかのペプチドの組み合わせをワクチンとして、直接的な組み合わせか、該治療法において用いることができる。さらには、その他のペプチド、例えばMHCクラスIまたはII特異的ペプチドとの組み合わせが使用可能である。当業者は、例えば、T細胞のin vitro産生ならびにそれらの有効率および全存在、特定のペプチドに対するある種のT細胞の増殖、親和性および発現、およびT細胞の機能、例えばIFN-γ生成（以下の例も参照）を分析することによる試験によって、免疫原性ペプチドの好ましい組み合わせを選択することができるであろう。通常、最も効果的なペプチドは、上述の目的でワクチンとして組み合わせたものである。
【０１１３】
適当なワクチンは、1から20のペプチド、好ましくは2,3,4,5,6,7,8,9,10または11の異なるペプチド、さらに好ましくは6,7,8,9,10または11の異なるペプチド、もっと好ましくは11の異なるペプチドを含むことが好ましい。癌ワクチンに用いられるペプチドの長さは適当なペプチドのいずれかであってよい。特に、適当な9アミノ酸長のペプチドまたは適当な7アミノ酸長または8アミノ酸長、10アミノ酸長、11アミノ酸長のペプチド、あるいは12アミノ酸長であってよい。さらに長いペプチドもまた適当であり、MHCクラスIペプチドとしては添付の表1に開示したような9アミノ酸長または10アミノ酸長のペプチドが好ましい。
【０１１４】
ペプチドは、腫瘍または癌のワクチンを構成する。ワクチンは、直接患者に、または患部臓器にまたは全身的に投与され、または、患者由来の細胞またはその後患者に投与されるヒト細胞株由来の細胞に生体外で適用され、または患者由来の免疫細胞から副次集団を選択するようin vitroで用いられ、次いで、それらは再び患者に投与される。ペプチドはまた、スカシ貝ヘモシアニン（KLH）またはマンナンなどの適当な担体に接合させることもできる（WO 95/18145号公報およびLongenecker等の(1993年) Ann. NY Acad. Sci. 690,276-291参照）。ペプチドワクチンはアジュバントを用いずに投与することができる。ペプチドワクチンはBCGやミョウバンなどのアジュバントとともに投与することができる。その他の適当なアジュバントには、サポニン、マイコバクテリア抽出物および合成バクテリア細胞壁ミミックから誘導されるAquila's QS21 stimulon（Aquila Biotech, 米国メリーランド州ウースター）、および、Ribi's Detox. Quil Aなどの特許アジュバントが包含され、その他のサポニン誘導アジュバント（デンマークSuperfos）もまた用いることができる。フロイントのアジュバントなどのその他のアジュバントもまた使用可能である。これはまた、ペプチドをスカシ貝ヘモシアニン（KLH）に、好ましくはアジュバントとともに接合するのに有用である。上述したようなその他のアジュバントは使用することができる。ペプチドはまた標識化することができるか、あるいは融合タンパク質であるか、ハイブリッド分子であり得る。その配列が本発明で与えられるペプチドは、CD8陽性CTLを刺激することが予測される。しかしながら、刺激性はCD4陽性T細胞による協力の存在によってより効率的になる。そのため、ハイブリッド分子の融合相手または断片はCD4陽性T細胞を刺激するエピトープを提供するのに適している。CD4陽性刺激性エピトープは当業界において既知であり、破傷風トキソイドにおいて同定されるものを含む。
【０１１５】
本発明のペプチドワクチンの特に好ましい実施態様は、腎細胞癌の治療のための該ワクチンは多型ペプチド腫瘍ワクチンである。好ましくは、上記ワクチンは、一次腎癌細胞上に位置し同定されるSEQ ID No. 1から10による一組の腫瘍関連ペプチドを含んでなる。この組には、HLAクラスIとクラスIIペプチドが含まれる。該ペプチドの組はまた、皮内投与の有効性をテストする免疫マーカーとして作用する陽性コントロールペプチドとして用いられるHBVコア抗原由来などの少なくとも1つのペプチドを含み得る。特定の一態様において、ワクチンは11の個別のペプチド（SEQ ID No. 1から11による）を含み、各ペプチドは約1500μg〜約75μg、好ましくは約1000μg〜約750μg、さらに好ましくは500μg〜約600μg、もっと好ましくは約578μgであり、それら全てはHPLCとイオン交換クロマトグラフィーで精製することができ、白色からオフホワイトの粉末を呈する。凍結乾燥物を炭酸水素ナトリウム中に溶解し、室温で再構成後30分以内に皮内注射に用いるのが好ましい。本発明によれば、ペプチドの好ましい量は、500μl溶液当たり、約0.1〜100mg、好ましくは約0.1〜1mg、より好ましくは約300μg〜800μgの範囲で変更可能である。ここで、「約」という語は別途示さない限り、所与の値の+／-10％であることを意味する。当業者であれば、例えば、個々の患者の免疫ステータスおよび／または特定の型の癌で提示するTUMAPの量などのいくつかの要素に基づいて用いるよう正確なペプチドの量を調節することができるであろう。本発明のペプチドは、凍結乾燥物質の代わりにその他の形態（無菌液など）で提供することも可能である。
【０１１６】
その配列が本発明で与えられるペプチドのいくつかは、CD8陽性T細胞（CTL）を刺激すると予想されている。しかしながら、刺激性はCD4陽性T細胞による協力の存在によって、より効率的になる。そのため、ハイブリッド分子の融合相手または断片は、CD4陽性T細胞を刺激するエピトープを提供するのに適している。CD4陽性刺激性エピトープは当業界で既知であり、破傷風トキソイドにおいて同定されるもの、または本発明で提供されるMMP7由来のペプチドを含む。
【０１１７】
最終的に、本発明のワクチンは、治療すべき患者が患う癌の特定の型、並びに病気のステータス、初期の治療法、患者の免疫状態、そして当然のことながら、患者のHLAハロタイプに依存させることができる。さらに、本発明のワクチンは、特定の患者の個人の要求によって、個別の成分を含んでよい。例としては、そのような特定の患者における関連TAAの発現によって異なる量のペプチド、個々のアレルギーやその他の治療に起因する望ましくない副作用、および最初の治療過程または計画後の二次的治療の調節に応じるものである。
【０１１８】
本発明のさらなる態様は、本発明のペプチド、またはそのようなペプチドをエンコードするポリヌクレオチドや発現ベクターの、本発明のアミノ酸配列を含むポリペプチドを異常に発現する患者の標的細胞を死滅させるための医薬の製造における使用に関する。抗癌ワクチンである薬剤組成物としての使用が好ましい。
【０１１９】
本発明のさらなる態様は、本発明のペプチド、またはそのようなペプチドをエンコードするポリヌクレオチドや発現ベクターの、ヒトのクラスIまたはIIMHC分子をそれらの表面上で発現させて本発明のアミノ酸配列を含むポリヌクレオチドを提示する、充実性腫瘍の細胞に対抗する免疫応答、特に細胞性免疫応答、より好ましくはＴ細胞介在免疫応答を誘起するための医薬の製造における使用に関する。
【０１２０】
本発明に関連して、充実性腫瘍の腫瘍細胞が、同じ組織の健康な細胞とは対照的に、ヒトのHLAクラスII分子をその表面に発現することが意外にも判明した。この事実は、Brasanac等においてのみ開示されており（Brasanac D, Markovic-Lipkovski J, Hadzi-Djokic J, Muller GA, Muller CA、HLAクラスII抗原と腫瘍浸潤性腎細胞癌の単核細胞の免疫組織学的分析：臨床的ならびに組織病理学的データとの相関関係、Neoplasma. 1999年;46(3):173-8）、ここで、37個の腎細胞癌（RCC）の凍結切片（25個は明細胞型、10個は顆粒細胞型、2個は嫌色素性型）が、HLAクラスII抗原の分析のために、ならびに腫瘍浸潤単核細胞（TIM）に関しては抗CD14、抗CD3、抗CD4および抗CD8MoAbの分析のために、モノクローナル抗体（MoAb）をHLA-DR、HLA-DPおよびHLA-DQ抗原に適用する間接的な免疫ペルオキシダーゼ法で研究された。陽性細胞の数は、半定量的に見積もり、免疫組織化学的調査の結果は、RCCの臨床的特徴（患者の年齢ならびに性別、腫瘍のサイズおよびTNMステージ）と組織病理学的（細胞学的、組織学的、等級的）特徴と相関関係を有していた。全てのRCCはHLA-DR抗原、92％HLA-DQ抗原および73％HLA-DP抗原を発現し、その発現レベルはDR>DQ>DPの順であったが、分析した組織病理学的パラメータや臨床的パラメータでは統計的に重要な相関関係は得られなかった。単核球は、Tリンパ球よりも多く、また、CD4陽性T細胞はCD8陽性T細胞より多く、そのため、Tリンパ球優勢であり、CD4陽性T細胞とCD8陽性T細胞がほぼ同数の腫瘍は、最大平均径を有していた。Tリンパ球の腫瘍細胞による不適切な活性化（抗原提示能にもかかわらず）は、RCC上での異常性HLAクラスII抗原の発現を伴う、より攻撃的な腫瘍行動を示すパラメータの関連に対する理由となり得た。
【０１２１】
本発明のさらなる態様は、本発明のペプチド、またはそのようなペプチドをエンコードするポリヌクレオチドや発現ベクターの、患者で標的細胞を死滅させるための医薬の製造における使用に関し、該標的細胞はSEQ ID No. 1から10のいずれかで与えられるアミノ酸配列を含むポリペプチドを異常に発現する。
【０１２２】
したがって、本発明のさらなる態様は、in vivoまたはinvitro活性化Tリンパ球を作製するための方法を提供するものであり、それにより、第1の方法は、in vitroでT細胞を、適当な抗原提示細胞の表面上で発現させた、抗原を負荷させたヒトクラスIまたはIIMHC分子に該T細胞を活性化するのに十分な時間、抗原に特異的な方法で接触せさせるステップを含んでなり、該抗原は本発明によるペプチドである。第2の方法は、より好ましいものであり、Walter等（Walter S, Herrgen L, Schoor O, Jung G, Wernet D, Buhring HJ, Rammensee HG, Stevanovic S. Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T-cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres. J Immunol. 2003年 11月15日;171(10):4974-8）によって開示されている。
【０１２３】
MHCクラスII分子は、適当な細胞の表層上で発現させることができ、細胞は自然にMHCクラスII分子を発現しないものであるか（この場合、細胞はそのような分子を発現するようトランスフェクトされる）、あるいは、そうでない場合、抗原プロセッシングまたは抗原提示経路中で機能しないものであることが好ましい。このように、MHCクラスII分子を発現する細胞は、実質的に、CTLを活性化させる前に選択したペプチド抗原によって完全に刺激することが可能である。
【０１２４】
抗原提示細胞（または刺激細胞）は、通常MHCクラスIまたはII分子をその表層上に有し、好ましくは、実質的にそれ自体は、MHCクラスIまたはII分子を選択した抗原で負荷することができない。以下でより詳細に説明するように、MHCクラスIまたはII分子は、in vitroで選択した抗原を容易に負荷させることができる。
【０１２５】
ほ乳類の細胞は、TAPペプチドトランスポーターの機能が欠如しているか、低減したレベルの該作用を有するか、該作用が低減されていることが好ましい。TAPペプチドトランスポーターが欠如している適当な細胞はT2、RMA-Sおよびショウジョウバエの細胞が含まれる。TAPとはTransporter Associated with antigen Processingである。
【０１２６】
ヒトのペプチド負荷欠損細胞株T2は、米国メリーランド州20852ロックヴィルパークローンドライブのAmerican Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USAから、カタログNo. CRL1992で入手可能あり、ショウジョウバエの細胞株Schneider line 2は、カタログNo.CRL19863としてATCCから入手可能であり、マウスRMA-S細胞株は、KarreとLjunggren (1985年) J. Exp. Med. 162,1745に開示されている。
【０１２７】
好都合なことに、トランスフェクトされる前の該ホスト細胞は、実質的にMHCクラスII分子を発現しない。また、好ましいことに、刺激細胞は、T細胞を共に刺激するのに重要な分子を発現し、B7.1、B7.2、ICAM-1およびLFA 3のいずれかなどである。
【０１２８】
さらなる実施態様において、HLA分子の組み合わせを用いることも可能である。
【０１２９】
組み換えポリペプチドワクチンの、多数のCD8陽性CTLエピトープのデリバリーのための使用は、Thomson等（1996年）J. Immunol. 157, 822-826およびWO 96/03144号公報に開示されており、いずれも参照としてここに記載する。本発明に関連して、単一のワクチン中に、本発明のアミノ酸配列とその他のCD4陽性T細胞刺激性エピトープ（MMP-7由来などの）とを含むペプチド（またはペプチドをエンコードする核酸）を含むことが望ましく、有利である。そのようなワクチンは、癌を治療するのに特に有用である。
【０１３０】
CTLをin vitroで生成するのにその他多数の方法を用いることができる。例えば、Peoples等の（1995年）Proc. Natl. Acad. Sci.米国92,432-436およびKawakami等の（1992年）J. Immunol. 148,638643に開示の方法は、自己腫瘍浸潤リンパ球をCTL作製に用いる。Plebanski等（1995年）Eur. J. Immunol. 25,1783-1787は、自己末梢血リンパ球（PLB）をCTLの作製に利用する。Jochmus等の（1997年）J. Gen. Virol. 78,1689-1695は、ペプチドまたはポリペプチドとともにパルス標識する樹状細胞を利用することまたは組み換えウイルスの感染によって自己CTLの作製を開示している。Hill等の（1995年）J. Exp. Med. 181,2221-2228とJerome等の（1993年）J. Immunol. 151,1654-1662は、自己CTLの生成にB細胞を利用している。さらに、ペプチドまたはポリペプチドでパルス標識した、または組み換えウイルスで感染したマクロファージを、自己CTLの作製に用いることができる。
【０１３１】
同種の細胞もまたCTLの作製に用いることができ、この方法はWO 97/26328号公報で詳細に開示されており、ここに参照として記載する。例えば、ショウジョウバエ細胞とT2細胞に加えて、CHO細胞、バキュロウイルス感染昆虫細胞、バクテリア、イースト菌、ワクチン感染標的細胞などのその他の細胞も抗原を提示するのに用いることができる。さらに、植物ウイルスも使用可能である（例えば、外部ペプチドの提示のための高効率システムとしてのササゲモザイクウイルスの開発を開示するPorta等の（1994年）Virology 202, 449-955を参照）。
【０１３２】
好ましくは、本発明の方法においては抗原提示細胞は上述の発現ベクターからなる。
【０１３３】
本発明のペプチドに直接対抗する活性化T細胞は治療において有用である。そのため、本発明のさらなる態様は、前述の本発明の方法により得られた活性化T細胞を提供する。
【０１３４】
本発明のさらなる態様によれば、本発明のアミノ酸からなるポリペプチドを異常に発現する細胞を選択的に認識する活性化T細胞が提供される。好ましくは、T細胞は該細胞を、HLA/ペプチド複合体と相互作用することによって認識する（例えば結合）。T細胞は、本発明のアミノ酸配列からなるポリペプチドを異常に発現する患者の標的細胞を死滅させる方法において有用であり、該患者は有効数の活性化T細胞を投与される。患者に投与されるT細胞は、患者由来のものであってよく、かつ、上述したように活性化することができる（すなわち、自己T細胞である）。あるいはまた、T細胞は、患者由来ではなく別の個体由来のものである。当然のことながら、該個体は健常個体であることが好ましい。「健常個体」という語により、本発明者等は、おおむね健康であり、好ましくは適当な免疫系を有し、より好ましくは、容易にテストでき、検出できるいずれの病気でもないことを意図する。
【０１３５】
活性化T細胞は、ポリペプチドを異常に発現する細胞の認識に関連するT細胞レセプター（TCR）を発現する。TCRをエンコードするcDNAが、活性化T細胞からクローニングしたものであり、かつ、発現のために別のT細胞中に移動させることが有用である。
【０１３６】
本発明の実施態様によるCD4陽性T細胞の標的細胞は、生体内で腫瘍（ときにはMHCクラスIIを発現する）細胞および／または腫瘍（腫瘍細胞）を取り巻く間質細胞（MHCクラスIIを発現する場合もある）である。
【０１３７】
本発明のペプチド特異的な本発明のT細胞クローンのTCRはクローニングされる。T細胞クローン中でのTCRの用法は、(i)TCRの異なる領域特異的モノクローナル抗体と、(ii)VaとVp遺伝子ファミリーに特異的なプライマーを用いたRT-PCRを用いるものと定義される。cDNAライブラリは、T細胞クローンから抽出されたポリAｍRNAから作製される。TプライマーにはTCR a鎖のC末端部分とP鎖および同定されたVaセグメントとPセグメントのN末端部分に対する特異性が用いられる。TCR a鎖とp鎖の完全なcDNAは、高度に正確なDNAポリメラーゼで増幅され、増幅された生成物は適当なクローニングベクター中にクローンされる。クローンされたa鎖とP鎖遺伝子は、Chung等の（1994年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91,12654-12658に開示される方法によって、一本鎖TCRに集合させることができる。この一本鎖構成において、VaJセグメントはV DJセグメントから生じ、続いて、Cpセグメントは膜透過とCD3鎖の細胞質セグメントによって生じる。この一本鎖TCRは、次いで、レトロウイルス発現ベクター中に挿入される（ベクターのパネルは、成熟CD8陽性Tリンパ球に感染させ、遺伝子発現を媒介する能力を基礎とする。レトロウイルスベクターシステムキットは好ましい一例である（Finer等の（1994年）Blood 83,43を参照））。高タイター両性レトロウイルスは、腫瘍の患者の末梢血から分離した、精製されたCD8陽性またはCD4陽性Tリンパ球に感染させるのに用いられる（Roberts等の(1994年) Blood 84,2878-2889によって公開されたプロトコルに従う（参照としてここに組み入れる））。精製されたCD8陽性T細胞の増殖を引き起こすのに抗CD3抗体が用いられ、これにより、レトロウイルスの集積と一本鎖TCRの安定な発現を促進する。レトロウイルス形質導入の効率は、一本鎖TCRに特異的な抗体を感染させたCD8陽性T細胞によって決定される。形質導入されたCD8陽性T細胞のin vitro分析は、それらからTCR鎖が最初にクローン化される同種異系制限されたT細胞クローンで見られるように、同じ腫瘍特異的致死性を呈するのを確立する。特異性を期待される形質転換されたCD8陽性T細胞の個体群は、腫瘍患者の養子免疫療法に用いることができる。患者は、108〜1011の自己、形質転換T細胞で治療することができる。CD8陽性と類似に、関連構成体を担持する、導入CD4陽性Tヘルパー細胞を生成することができる。
【０１３８】
T細胞に遺伝子を導入するためのその他の適当な系は、Moritz等の(1994年)、Proc. Natl. Acad. Sci.米国、91,4318-4322に開示されており、参照としてここに組み入れられる。Eshhar等の(1993年)、Proc. Natl. Acad. Sci.米国、90,720-724およびHwu等の(1993年)J. Exp. Med. 178, 361-366もまたCTLのトランスフェクションを開示している。したがって、本発明のさらなる態様によれば、本発明のアミノ酸配列を含むポリペプチドを異常に発現する細胞を認識するTCRが提供され、該TCRは活性化T細胞から得られる。
【０１３９】
本発明には、TCRに加え、TCRと機能的に同等な分子も本発明に包含される。これらには、TCRとして同様に役割を果たすことが可能な、TCRと機能的に同等な分子のいずれも含まれる。特に、そのような分子には、概して、参照としてここに組み入れられ、上記で参照したChung等の（1994年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91,12654-12658に開示される方法によって得られるような遺伝子操作した3ドメインの一本鎖TCRが包含される。本発明はまた、TCRをまたは機能的に同等な分子をエンコードするポリヌクレオチドと、TCRまたは機能的に同等な分子をエンコードする発現ベクターとを含む。本発明のTCRを発現するのに適した発現ベクターには、上記で本発明のペプチドの発現に関して説明したものが包含される。
【０１４０】
しかしながら、発現ベクターは、トランスフェクト後のT細胞中でTCRを発現可能なものであることが好ましい。
【０１４１】
本発明のさらに別の態様によれば、患者の標的細胞を死滅させる方法が提供され、該標的細胞は、本発明のアミノ酸配列からなるポリペプチドを異常に発現し、該方法は、有効量の本発明のペプチドか、有効量のポリヌクレオチドまたは該ペプチドをエンコードする発現ベクターか、あるいは有効数の上述のTリンパ球を患者に投与するステップを含み、前記ペプチドの量、または前記ポリヌクレオチドまたは発現ベクターまたはT細胞の量は、前記患者における抗標的細胞免疫応答を誘発するのに有効である。標的細胞は、通常腫瘍または癌細胞であり、特に、ヒトのMHCクラスIまたはII分子をそれらの表面で発現し、上記アミノ酸配列からなるポリペプチドを提示する充実性腫瘍である。
【０１４２】
本発明のさらなる態様によれば、患者の標的細胞を死滅させる方法が提供され、該標的細胞は本発明のアミノ酸配列からなるポリペプチドを異常に発現し、該方法は、(1)患者由来のT細胞を得るステップと、(2) 該細胞に、TCRまたは上記で定義したように機能的に同等な分子をエンコードするポリヌクレオチドを導入するステップと、(3)ステップ(2)で作製された細胞を患者に導入するステップ、とを含んでなる。
【０１４３】
本発明のさらなる態様によれば、患者の標的細胞を死滅させる方法が提供され、該標的細胞は上記で定義したアミノ酸配列からなるポリペプチドを異常に発現し、該方法は、(1)該患者由来の樹状細胞などの抗原提示細胞を得るステップと、(2)該抗原提示細胞を、本発明の第一、第二または第三の態様で定義したペプチド、またはそのようなペプチドをエンコードするポリヌクレオチドにex vivoで接触させるステップと、(3)そのように処理した抗原提示細胞を患者に再導入するステップ、とを含む。
【０１４４】
該抗原提示細胞は樹状細胞であることが好ましい。該樹状細胞は、抗原性ペプチドでパルス化した自己樹状細胞であることが適している。抗原性ペプチドは、適当なT細胞応答を引き起こす抗原性ペプチドのいずれかであってよい。腫瘍関連抗原由来のペプチドでパルス化した自己樹状細胞を用いるT細胞治療は、Murphy等の(1996年)The Prostate 29, 371-380およびTjua等の(1997年)The Prostate 32, 272-278に開示されている。
【０１４５】
さらなる実施態様において、樹状細胞などの抗原提示細胞は、本発明のペプチドをエンコードするポリヌクレオチドに接触させる。ポリヌクレオチドは、いずれの適当なポリヌクレオチドであってよく、樹状細胞を形質転換可能であることにより、ペプチドを提示して免疫性を呈する結果となる。
【０１４６】
好都合なことにポリヌクレオチドは、ウイルス性ポリヌクレオチドまたはウイルスに含まれ得る。例えば、アデノウイルス形質転換樹状細胞は、MUC1に関連して抗原特異的抗腫瘍免疫を誘発することが示されている（Gong等の(1997年)Gene Ther. 4,1023-1028）参照）。同様に、アデノウイルスベース系を用いることができ（Wan等の(1997年)Hum. Gene Ther. 8, 1355-1363参照）、レトロウイルス系を用いることができ（Specht等の(1997年)、J. Exp. Med. 186, 1213-1221およびSzabolcs等の(1997年)樹状細胞への血液粒子介在移転もまた使用可能であり（Tuting等の(1997年)、Eur. J. Immunol. 27, 2702-2707）、さらには、RNAも用いることができる（Ashley等の(1997年)、J. Exp. Med. 186, 1177 1182）。
【０１４７】
患者の標的細胞を死滅させる方法に関連して、標的細胞が癌細胞であること、より好ましくは腎癌細胞または結腸癌細胞であることが好ましいことは理解されるであろう。
【０１４８】
好ましい実施態様において、治療前に患者のHLAハロタイプを確認する。HLAハプロタイプ決定は適当な方法で行うことができ、そのような方法は当業界で周知である。
【０１４９】
本発明は、in vivoでのアクティブなワクチン接種のためと、in vitroでの自己樹状細胞の操作と、そのように操作された樹状細胞のin vivoでの、T細胞応答を活性化するための導入のためと、自己T細胞をin vitroで活性化させ、養子免疫治療する（すなわち、そのように操作したCTLは患者に導入される）ためと、健常ドナー（MHCが適合する、あるいは適合しない）由来T細胞をin vitroで活性化して養子免疫療法するために、特に、本発明のペプチド（またはそれらをエンコードするポリヌクレオチド）の使用を包含する。
【０１５０】
好ましい実施態様において、本発明のワクチンは、単独または、腫瘍の形成を阻害または抑制するために別の癌治療と組み合わせてホストに投与される。
【０１５１】
ペプチドワクチンは、アジュバントを用いずに投与してもよい。ペプチドワクチンはまた、BCGやミョウバンなどのアジュバントとともに投与してもよい。その他の適当なアジュバントもまた上記で説明する。
【０１５２】
本発明のペプチドはまた、診断薬として用いることもできる。ペプチドを用いることにより、T細胞群おいて、T細胞をペプチドに直接特異的に提示するか、あるいは治療により誘発させるかを分析することができる。さらに、前駆体T細胞の増大を、定義されたペプチドに対する反応性を有するそれらペプチドでテストすることができる。また、ペプチドは、ペプチドが誘導される抗原を発現する腫瘍の病態の進行を監視するためのマーカーとして使用することができる。
【０１５３】
添付の表1において、同定されたペプチドを挙げる。さらに、この表では、ペプチドから誘導されるタンパク質が設計されており、それぞれのタンパク質におけるペプチドのそれぞれの部分を示す。さらに、それぞれのAcc番号を提供し、それらは国立健康研究所（National Institute of Health(http: www.ncbi.nlm.nih.gov参照)）の「バイオテクノロジーインフォメーションナショナルセンター（National Centre for Biotechnology Information）」のGenbankに関連する。
【０１５４】
他の好ましい実施態様において、ペプチドは、白血球、特にTリンパ球を染色するのに用いられる。ペプチドに対するCTL種特性CTLが存在するか否かが証明されれば、この使用は特に利点を有するものである。さらには、ペプチドは、腫瘍または疾患における治療の進行を確認するマーカーとして使用可能である。
【０１５５】
さらに好ましい実施態様において、ペプチドは、抗体の作製に用いられる。ポリクローナル抗体を、ペプチドを注射し、続いて免疫グロブリンを精製することによる動物免疫法によって標準的な方法で得ることができる。モノクローナル抗体は、例えば、Methods Enzymol、(1986年)、121、ハイブリドーマ技術とモノクローナル抗体に開示されるような方法などの標準的なプロトコルによって作製できる。
【０１５６】
TAAのヘルパーT細胞エピトープの同定は、抗腫瘍免疫療法において重要な作業を残している。現在までに、TAA由来のクラスIまたはIIペプチドを同定するための様々な戦略が実施されており、採用かつプロセスすべき対象の抗原でのAPCの培養から（Chaux, P., V. Vantomme, V. Stroobant, K. Thielemans, J. Corthals, R. Luiten, A.M. Eggermont, T. BoonおよびB.P. van der Bruggen、1999年、CD4陽性Tリンパ球に対するHLA-DR分子によるMAGE-3エピトープの同定J. Exp. Med. 189:767-778）、融合タンパク質による様々なトランスフェクション戦略まで範囲が及び得る（Dengjel,J., P.Decker, O. Schoor, F. Altenberend, T. Weinschenk, H.G. RammenseeおよびS. Stevanovicの、2004年、HLAクラスIIターゲッティングと示差質量分析との新規な組み合わせによる、自然にプロセスされたサイクリンD1Tヘルパーエピトープの同定、Eur.J.Immunol. 34:3644-3651）。これら全ての方法は、非常に時間を要するものであるため、同定されたHLAリガンドが、ヒトの組織によってin vivoで実際に提示される場合、不明確なままであることが多々ある。
【０１５７】
本発明者等は、MMP7由来の1つのコア配列を占めるリガンドを同定した。本発明者等は、腎細胞癌において過剰発現するこれらのタンパク質を発見し、さらには、腫瘍関連として説明した（Miyamoto, S., K. Yano, S. Sugimoto, G. Ishii, T. Hasebe, Y. Endoh, K. Kodama, M. Goya, T. ChibaとA. Ochiai、2004年、マトリックスメタロプロテイナーゼ7はインスリン様成長因子結合タンパク質3に対するそのプロテナーゼ活性によりインスリン様成長因子の生物学的利用率を促進する、Cancer Res. 64:665-671; Sumi, T., T. Nakatani, H. Yoshida, Y. Hyun, T. Yasui, Y. Matsumoto, E. Nakagawa, K. Sugimura, H. KawashimaおよびO. Ishikoの2003年、ヒトの腎細胞癌におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ７と２の発現；Oncol. Rep. 10:567-570；Cheung, C.W., D.A. Vesey, D.L. NicolおよびD.W. Johnson、2004年、近位尿細管の調節におけるIGF-IとIGFBP-3の役割、および腎細胞癌の細胞増殖；Kidney Int. 65:1272-1279）。これらのタンパク質はHLAクラスII分子に無差別に結合し、異なる健康なドナー由来のCD4陽性T細胞を活性化させることができた。したがって、本発明者等のアプローチは、TAA由来の新たなクラスIIペプチド候補の同定において医療的なワクチン接種プロトコルの使用において有用となるであろう。
【０１５８】
本明細書で開示かつ説明する本発明の特徴が、示したようなそれぞれの組み合わせのみならず、本発明の意図する範囲から逸脱することなく、特異な方法で用いることは理解されるべきである。
【０１５９】
本発明を図面、配列表および実施例を参照しながら以下でより詳細に説明する。以下の実施例は例示目的でのみ与えられるものであり、本発明を限定することを意図するものではない。
【０１６０】
SEQ ID No 1からSEQ ID No 2は、本発明によるMHCクラスIまたはIIによって提示されるペプチドを含むT細胞エピトープのペプチド配列を示している。
【０１６１】
SEQ ID No 3からSEQ ID No 11は、本発明のワクチンで用いられるペプチドのペプチド配列を示しており、以降、"IMA"と称す。
【０１６２】
図１は、一次腫瘍検体RCC013におけるc-Met癌原遺伝子由来ペプチドIMA-MET-001を示している。ナノキャピラリー高速液体クロマトグラフィーESM MSを、RCC013から溶離したペプチドに対して行った。1006.54 ±0.5 Daのマスクロマトグラムは、保持時間47.8分でピークを示している。所与の保持時間における二次LC-MSで記録された挿入図で示された、m/z 1006.54からの衝撃により誘発された質量スペクトルにより、IMA-MET-001の存在が確認された（Weinschenk T, Gouttefangeas C, Schirle M, Obermayr F, Walter S, Schoor O, Kurek R, Loeser W, Bichler KH, Wernet D, Stevanovic S, and Rammensee HG. Integrated functional genomics approach for the design of patient-individual antitumor vaccines. Cancer Res. 62:5818-5827 (2002)）。
【０１６３】
図２は、c-Met癌原遺伝子（MET）の組織の発現を示している。発現を、オリゴヌクレオチドマイクロアッセイによって分析した。複製数は腎臓に関連し、1.0にセットされている。"P"は遺伝子が存在することを意味し、"A"は不存在を、"M"はアルゴリズムと呼ばれる統計学的絶対に基づく限界を意味する。"I"は、遺伝子の発現が腎臓と比較して顕著に増大していることを意味し、"D"は発現の減少を示し、"NC"は発現において変化のないことを意味する。腎臓と比較した発現の値は、シグナルlog比から計算し、縦棒グラフの上に示す。横波線は、正常な組織（このケースでは肺）における最も高い発現を示している。
【０１６４】
図３は、IMA-MET-001で刺激したCTLによる、ペプチド負荷標的細胞の死滅を示している。
【０１６５】
図４は、IMA-MET-001で刺激したCTLによる、悪性腫瘍細胞の死滅を示している。
【０１６６】
図５は、低温標的阻害アッセイ（cold target inhibition assay）を示している。
【０１６７】
図６は、微粒子主導拡張の四量体的分析を示している。
【０１６８】
図７は、IMA-MMP-001のin vitro免疫原性を示している。4人の健康なドナーの代表的な細胞内IFNγ対CD4染色であり、ドナー1、ドナー2およびドナー3は、3回目および4回目の刺激後にIMA-MMP-001に対するCD4陽性T細胞反応性を示した。ドナー4は常に陰性であった。
【０１６９】
図８は、腫瘍と健康な組織上での異なるペプチドの提示を示している。
(A)それぞれ正常な腎臓と患者RCC100の腎細胞癌組織由来の、2つのペプチド種m/z 739.96と741.95の質量スペクトル。質量スペクトルは、腎細胞癌組織上のアジポフィリンが、対応する自己の正常な組織と比較して約4倍の過剰提示であることを示す。
(B) m/z 741.95（腫瘍）の衝突解離質量分析法により、ペプチド配列IMA-ADF-003、アジポフィリン由来のペプチド配列を示した。
【０１７０】
図９は、IMA-ADF-001に対するin vivo免疫、MUC由来の2つのTUMAPでパルス化した自己由来の樹状細胞をワクチン接種した患者における、非ワクチン化ペプチドに対する2人のRCC患者におけるT細胞免疫性を示している。IMA-ADF-001（"アジポフィリン"）に特異的なT細胞は、ワクチン接種前には存在せず、6回のワクチン接種後に患者#3（パネル上方）で検知され、8回のワクチン接種後に患者#8（パネル下方）で検知された。
【０１７１】
図１０は、同じ患者と抗原について増幅ELISPOTアッセイで同定された、IMA誘発T細胞応答のそれぞれの例を示している。上方および下方のカラムは、読み取りに用いた、陰性コントロール抗原HIV-001と単独TUMAPIMA-CCN-01をそれぞれ示している。左側のカラムは、スクリーニング2日目（S2）のワクチン接種前で、最初の接種(V1)の直前に採取された、プールされた検体のELISPOTを示している。右側のカラムは、ワクチン接種プロトコル22日目(V6)と36日目(V7)中に採取された、プールされた検体のELOSPOTを示している。陽性細胞の数をそれぞれの実験について与える。
【０１７２】
図１１は、増幅四量体（amplified tetramer）染色アッセイで同定された、IMA誘発T細胞応答の代表例である。上方および中間のパネルは、CD3陽性リンパ球に対してゲート化した二次元のドットプロットを示しており、下方のパネルは、CD3陽性、CD8陽性リンパ球に対してゲート化したものを示している。患者、時点、および染色は各カラムに示した通りである。
S1+V1：ワクチン接種前に採取；V4+V5：8日目と15日目に採取；V6+V7：22日目と36日目に採取；V8+FU：64日目（最後のワクチン接種）と85日目-92日目（実験の最後）に採取。
A：図10に、IMA-CCN-01に対する免疫学的応答を確認する患者03-004のデータを示す。CD3+とIMA-CCN-01四量体に対して陽性の細胞群は、リンパ球の0.78％を占める（V6+V7；下方パネル）4回目と5回目のIMA（V6+V7；中間パネル）接種後に同定可能である。K67-001四量体（下方パネル）には陽性群は見られなかった。
B：IMA-RGS-001ペプチドに対する免疫学的応答を示さないが（上方パネル）、ワクチン接種プロトコルのコース時間中にIMA-CCN-01四量体陽性応答を生じ（中間パネル、カラム3とカラム4）、リンパ球の0.8％までを占める（下方パネル；カラム3）、患者03-003のデータである。
【０１７３】
図１２は、増幅四量体分析における1つの時点のT細胞動作の程度を観察した図である。プールされた検体による通常の増幅四量体分析でワクチン誘発T細胞応答が検知された患者05-001の、1つの時点での読み取りに関する結果を示している。IMA（TUMAPプール）に存在する全ての腫瘍関連抗原、特にIMA-CCN-001ペプチドについての結果を提供する。さらに、同じ1時点におけるHIV-001とIMA-HBV-001のコントロールも示す。
【実施例】
【０１７４】
（表Ｄ）：用語解説
【表Ｄ】
2009506762.tif 000005
【０１７５】
I.  本発明のペプチドの特徴付け
IMAペプチドが誘導される遺伝子産生物の発現に関するデータ
一次RCC組織から同定されたペプチドを、遺伝子発現分析、文献ならびに同定されたペプチドが派生される既知の抗原の特徴を検索するためのデータベースに、主として基づく内部ランキングシステムによるワクチンIMA（以下を参照）内への包含物として選択した。自然に提示されたペプチドの全ては、正常な腎臓組織ならびにその他の生存臓器および組織と比較して、腎細胞癌組織では非常に過剰発現された。そのような選択は、(1)IMAのワクチン接種により誘発される自己免疫の可能性を最小限にするため、その他の組織ではなく、腫瘍の認識に対して高度に特異的なT細胞を誘導可能なペプチドを選択するために、かつ、(2)患者群の腫瘍の多数を誘導されたT細胞によって確実に認識するために、必要である
【０１７６】
IMAに含有されるペプチドが誘導される抗原の平均有病率は68％であり（RCCにおける過剰発現対n=24RCC検体における生存臓器と組織）、単一の抗原では54-96％の範囲内である。これは、Her-2/neu（有病率：25-30％）などの標準腫瘍抗原と比較して非常に高い。
【０１７７】
市販から入手可能な高濃度マイクロアレイシステム（Affymetrix）を用いて、網羅的遺伝子発現プロファイルを実行した。高濃度オリゴヌクレオチドマイクロアレイのためにRNAを組織から分離し、プロセスしてハイブリッド化した。染色して洗浄した後、アレイをスキャンしたところ、アレイ上の各スポットの蛍光強度は、オリゴヌクレオチドのDNA配列に一致した遺伝子のある種の発現レベルを示した。アレイ上のいくつかのオリゴヌクレオチドは、各遺伝子の配列を網羅する。統計ソフトによる分析後、2つの検体間の対的な相対発現値が各遺伝子について得られる。１つの一定な検体を基準として用いた異なる検体からの全データの規準化により、全検体間における発現レベルの相対的定量が可能である。
【０１７８】
RNAソース：ヒトの組織由来の総RNAは、市販されているものから得られる（Ambion, 英国ハンティントン；Clontech,独国ハイデルベルク；Stratagene,オランダ、アムステルダム；BioChain,独国ハイデルベルク）。いくつかの個体由来の総RNAは、各個体由来のRNAが等しい重量になるよう混合した。品質と量は、Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent、独国ヴァルトブロン）でRNA6000 Nano LabChip Kit（Agilent）を用いて確認した。
【０１７９】
高濃度オリゴヌクレオチドマイクロアレイ分析：Affymetrixマニュアルとして与えられるような、SuperScript RTII（Life Technologies, Inc.、独国カールスルーエ）とプライマー（Eurogentec、ベルギー、セラン）を用いて5-8μgの総RNAから二重鎖DNAを合成した。BioArray（商標）High Yield（商標） RNA Transcript Labelling Kit (ENZO Diagnostics, Inc.、米国ニューヨーク州ファーミングデール)を用いたin vitro転写、フラグメント化、AffymetrixU133AまたはU133 Plus 2.0 GeneChips（Affymetrix、米国カリフォルニア州サンタクララ）に基づくハイブリダイゼーション、ならびにストレプトアビジン-フィコエリトリンとビオチン化抗ストレプトアビジン抗体（Molecular Probes、オランダ、ライデン）による染色は製造業者のプロトコルに従った（Affymetrix）。Affymetrix GeneArray Scannerを用い、データをMicroarray Analysis Suite 5.0ソフトウェアまたはGeneChip（登録商標）Operating Software (GCOS)で解析した。規準化にはAffymetrixが提供する100のハウスキーピング遺伝子を用いた。対的な比較を、基準としての腎臓における発現値を用いて計算した。従って、シグナルlog比から罫線された全ての発現値は、1に設定された腎臓に相対している。発現差の有意性は、ソフトウェアに実行された統計アルゴリズムで与えられる"変化"値によって判定した。発現の絶対的な検知のため、統計アルゴリズムを用いてデータを再度解析した。遺伝子発現の存在または欠失は、アルゴリズムと呼ばれる絶対値によって確認した。
【０１８０】
c-Met原癌遺伝子（MET）の遺伝子発現の例示的組織発現パネルを図2に示す。METは、分析した腎細胞癌（n=24、右手側）の96％において過剰発現したが、選択された生体の健康な組織と臓器ならびに免疫学的に重要な組織および細胞（図2の左手側）のいくつかには発現しないか、非常に狭い範囲の発現だった。
【０１８１】
表1は、本発明のIMAワクチンに含有されるペプチドの概要であり、本発明のペプチドも含む。
（表１）：本発明のペプチド
【表１】
2009506762.tif 000006
【０１８２】
表2は、本発明のIMAワクチンに含有されるペプチドならびに本発明のペプチドをコード化する全抗原の発現結果の概要である。
（表２）：RCC（n=24）における抗原の過剰発現の頻度
【表２】
2009506762.tif 000007
1：ソフトウェアに実行された統計アルゴリズムによって与えられる"変化"値に従う（"I"の数）
2：全ての正常な組織のうち、最も高い発現を有する正常な組織と比較した場合、それより高い発現を有するRCCの数
3：脳は免疫特権的であるため、この理由により考慮しなかった。
【０１８３】
RCC対全正常組織における最小の過剰発現は54％であり、最大は96％である。これは、Her-2/neuなどの標準腫瘍抗原における場合（有病率：25-30％）と比較して非常に高い。
【０１８４】
例外はMUCであり、MUC mRNAについては過剰発現は検知できなかった。しかしながら、以下の公表された報告は考慮しなければならない。
【０１８５】
1.悪性腫瘍における異常な脱グリコシレーションは共通であり、正常な細胞上で提示されない腫瘍細胞における非暴露エピトープである。そのようなメカニズムはRCCでも高度に起こりえる。これは、MUCを発現する腫瘍細胞株の特異的な死滅を説明する（Brossart P, Heinrich KS, Stuhler G, Behnke L, Reichardt VL, Stevanovic S, Muhm A, Rammensee HG, Kanz L, and Brugger W. Identification of HLA-A2-restricted T-cell epitopes derived from the MUC1 tumor antigen for broadly applicable vaccine therapies. Blood 93:4309-4317 (1999)）。MUCの特性に関する第4.1.5章もまた参照されたい。
【０１８６】
2.IMA-MUC-001を、チュービンゲン大学における研究者主導実験において自己樹状細胞と組み合わせて投与した。ASCO2003（Mueller MRWJ, Brugger W, Gouttefangeas.C., Kanz L, and Brossart P. Vaccinations with peptide pulsed dendritic cells induces clinical and immunological responses in patients with metastatic renal cell carcinoma. Proc Am Soc Clin Oncol 22, 168. 1-6-2003. Ref Type: Abstract）で近年提示されたこの実験と自己免疫作用に関するASCO2005（Wierecky J, M?ller M, Horger M, Brugger W, Kanz L, Brossart P. Induction of clinical and immunological responses in patients with metastatic renal cell carcinoma after vaccinations with peptide pulsed dendritic cells. Abstract No. 2507 presented at the Annual Meeting of the American Society of Clinical Oncology ASCO (2005)）ミーティングにおけるフォローアップデータが報告された。
【０１８７】
3.臨床実験からのその他の報告は、IMA-MUC-001に特異的な細胞傷害性T細胞が、乳癌（Rentzsch C, Kayser S, Stumm S, Watermann I, Walter S, Stevanovic S, Wallwiener D, and Guckel B. Evaluation of pre-existent immunity in patients with primary breast cancer: molecular and cellular assays to quantify antigen-specific T lymphocytes in peripheral blood mononuclear cells. Clin Cancer Res. 9:4376-4386 (2003).）と結腸腺癌（Dittmann J, Keller-Matschke K, Weinschenk T, Kratt T, Heck T, Becker HD, Stevanovic S, Rammensee HG, and Gouttefangeas C. CD8(+) T-cell response against MUC1-derived peptides in gastrointestinal cancer survivors. Cancer Immunol Immunother. (2004)）患者において自然に生じることを報告している。これらの患者においては自己免疫作用は報告されなかった。これはIMA-MUC-001特異的T細胞の自然な役割を強調するものである。
【０１８８】
この支持するデータに基づき、IMA-CCN-001の投与は安全であると考えられるが、mRNAレベル単独に対するMUC抗原については過剰発現を検知することはできない。
【０１８９】
IMA-MUC-001のいくつかのHLA-DRアレルに対する無差別的な結合
IMA-MUC-001は、HLA-DR、HLAクラスII分子に結合するペプチドである。クラスIIのTUMAPは、クラスIIのTUMAPで活性化された細胞傷害性T細胞の機能を助ける重要な役割を果たすT細胞を活性化する。HLA-DRペプチドの無差別的な結合は、IMAで治療したほとんど（>50％）のHLA-A*02陽性の患者がIMA-MMP-001へのT細胞応答を確実に誘発可能にするのに重要である。IMA-MMP-001の結合のin silico分析は、IMA-MMP-001がいくつかのHLA-DRアレル(DRB1*0101, *0301, *0401, *1101 and *1501)に対して無差別的に結合することを示しており、これは総計でHLA-A2陽性の白人群の少なくとも69.6％を網羅する。IMA-MMP-001の無差別的な結合は、in vitro免疫原性データによって実験的に確認されている。
【０１９０】
試験の原理
チュービンゲン大学において開発されたSYFPEITHIアルゴリズム（Rammensee,H.G., Bachmann,J., and Stevanovic,S. (1997). MHC Ligands and Peptide Motifs. Springer-Verlag, Heidelberg, Germany)；Rammensee H, Bachmann J, Emmerich NP, Bachor OA, and Stevanovic S. SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs. Immunogenetics 50:213-219 (1999)）を用いることにより、IMA-MMP-001のいくつかの共通HLA-DRアレルに対する結合を分類した。アルゴリズムは、広範囲な抗原、例えばヒトのTAA TRP2（クラスI）（Sun Y, Song M, Stevanovic S, Jankowiak C, Paschen A, Rammensee HG, and Schadendorf D. Identification of a new HLA-A(*)0201-restricted T-cell epitope from the tyrosinase-related protein 2 (TRP2) melanoma antigen. Int. J. Cancer 87:399-404 (2000)）とSSX2（クラスII）（Neumann F, Wagner C, Stevanovic S, Kubuschok B, Schormann C, Mischo A, Ertan K, Schmidt W, and Pfreundschuh M. Identification of an HLA-DR-restricted peptide epitope with a promiscuous binding pattern derived from the cancer testis antigen HOM-MEL-40/SSX2. Int. J. Cancer 112:661-668 (2004)）由来のクラスIとクラスIIエピトープを同定するのに有効に用いられている。分析したHLA-DRアレルは、HLA-A2陽性の白人群の少なくとも69.9％を網羅する（Mori M, Beatty PG, Graves M, Boucher KM, and Milford EL. HLA gene and haplotype frequencies in the North American population: the National Marrow Donor Program Donor Registry. Transplantation 64:1017-1027 (1997)）。結合の閾値は、既知の刊行物の無差別HLA-DRリガンドの結合スコアの分析に基づく18のスコアで定義した。無差別的結合は、HLA-DRペプチドの、白人群の少なくとも50％で発現したいくつかのHLA-DRアレルに対する結合として定義される。
【０１９１】
HLA-AとHLA-DRの遺伝子座は、他と比べると好ましいHLA-A2と特異的HLA-DRとの組み合わせを産生する結合不均衡の状態にある（表3）。
【０１９２】
（表３）：北米白人のハロタイプ頻度
【表３】
2009506762.tif 000008
血清学的ハロタイプを示している。N.a.は、割り当てなし(not assigned)を意味する（Mori M, Beatty PG, Graves M, Boucher KM, and Milford EL. HLA gene and haplotype frequencies in the North American population: the National Marrow Donor Program Donor Registry. Transplantation 64:1017-1027 (1997)）。
【０１９３】
特定のMHC分子のリガンドは、それらの一次配列の特定の位置にあるアミノ酸に関連した化学物質を担持し、全てのMHCアレルに関するペプチドモチーフの定義を可能にする（Falk K, Rotzschke O, Stevanovic S, Jung G, and Rammensee HG. Allele-specific motifs revealed by sequencing of self-peptides eluted from MHC molecules. Nature 351:290-296 (1991)）。SYFPEITHIは、エドマン分解と質量分析法による自然なリガンド分析に排他的に基づく精製モチーフから推測されるモチーフマトリックスを用いる（Schirle M, Weinschenk T, and Stevanovic S. Combining computer algorithms with experimental approaches permits the rapid and accurate identification of T-cell epitopes from defined antigens. J. Immunol. Methods 257:1-16 (2001)）。これらのマトリックスにより、MHCクラスIまたはII分子上に提示される所与のタンパク質配列由来のペプチドの正確な予測が可能となる（Rotzschke O, Falk K, Stevanovic S, Jung G, Walden P, and Rammensee HG. Exact prediction of a natural T-cell epitope. Eur. J. Immunol. 21:2891-2894 (1991)）。
【０１９４】
（表４）：IMA-MMP-001の共通HLA-DRアレルに対する結合スコア
【表４】
2009506762.tif 000009
【０１９５】
白人群における最も共通するHLA-DRB1アレルに関するIMA-MMP-001 SYFPEITHI結合スコアを示す。HLA-A2陽性の白人の対応血清学的ハロタイプの頻度をかっこ内に示す。ペプチドは、スコアが18に等しいかまたは18より高い場合のHLA分子への結合するものと考えられた。
【０１９６】
SYFPEITHIアルゴリズムによる予測に基づいて、IMA-MMP-001は、HLA-A2陽性の白人群の少なくとも69.6％に及ぶいくつかのHLA-DRアレル（DRB1*0101, *0301, *0401, *1101および*1501）に結合すると思われる。HLA-DR15の頻度データを入手できないため、このアレルは計算で省いた。したがって、該群の有効範囲は69.9％よりずっと高いと考えられる。IMA-MMP-001の無差別的な結合についての実験的確認は、in vitro免疫原性データから得られる（以下を参照）。
【０１９７】
腫瘍と自己由来正常組織における抗原の発現と誘導されたペプチドの提示の比較
過剰発現した抗原は、細胞表面上のHLA分子上で過剰提示すると過程される。例として、アジポフィリン由来のHLA-A*03ペプチド、いずれもIMAに含まれるHLA-A*02ペプチドであるIMA-ADF-001とIMA-ADF-002が誘導される過剰発現した抗原は、QUALITEA戦略を採用した患者RCC100由来の自己正常組織と比較して、腎細胞癌組織上で高度に過剰提示することが示された。この実験例においてこれは、抗原の過剰発現（この場合はアジポフィリン）が、同じ抗原の誘導ペプチドの過剰発現に関連することを示している。
【０１９８】
この方法は（Lemmel C, Weik S, Eberle U, Dengjel J, Kratt T, Becker HD, Rammensee HG, and Stevanovic S. Differential quantitative analysis of MHC ligands by mass spectrometry using stable isotope labeling. Nat. Biotechnol. 22:450-454 (2004)）により詳細に開示されている。QUALITEAは、腫瘍と正常組織由来のHLA溶離ペプチドの差定量に関する戦略を代表する。2つの異なるソース由来のHLAリガンドは、1Hx-試薬または2Dx -試薬のいずれかまたは組み合わせによりN末端から派生したものである。高速液体クロマトグラフィーによるペプチドの複雑性の減少後、ESI-MS分析によりペプチドをそのピーク領域に基づいて定量する。一対の派生したペプチド（1Hx-派生と2Dx-派生）は、クロマトグラフ系で本質的に共溶離するため、物理化学的に同一であり、容易に検知可能である。さらに、質量分析スキャンで一定の質量差を有する。この差は、派生物中の安定な同位体の数に依存する。リガンドの配列の同定は、ESI-MSMS分析と、記録されたスペクトルのコンピュータ支援データベース検索によって明らかとなる。そのため、この分析により、腫瘍と正常な組織上のペプチド提示の定性的かつ定量的側面についての情報が得られる。
【０１９９】
過剰発現した抗原の腫瘍と正常な組織上の異なるHLAペプチド提示の例を図8に示す。患者RCC100由来の健康な腎臓組織に対して4倍、腫瘍組織上で過剰提示したペプチドIMA-ADF-003を、多数の同等に提示したペプチドにおける衝突解離質量分析により同定した。腫瘍組織上で過剰提示したこのペプチドはアジポフィリン由来であった。同じ患者RCC100の遺伝子発現分析はまた、この腫瘍組織において、健康な腎臓と比較して2.64倍のアジポフィリンの過剰発現を示した（データは示さない）。この特定のケースにおけるこのデータは、腫瘍組織において遺伝子レベルに対する過剰発現により、該腫瘍細胞表面上でペプチドを過剰提示させることを確認するものである。
【０２００】
IMA-ADF-001に対するIn vivo免疫原性
RCC患者から産生された自己樹状細胞（DC）を、これらIMA-MUC-001のうちのMUC由来の2つのTUMAPでパルス化した。IMA-ADF-001はワクチン化しなかった。ワクチン接種は、2週間ごとに4回皮下的に行い、腫瘍進行まで毎月繰り返した。5回目のDC接種後、患者はさらに低用量IL-2（1Mio IE/m2）の3回の皮下接種／週を受けた。T細胞前駆体の活性化を、IFNγELISPOTを用いて監視した。2種のワクチン化ペプチドに対するT細胞の導入に加えて、いくつかのその他既知のTUMAPのうちIMA-ADF-001に対するT細胞活性を試験した。
【０２０１】
結果は、近年、Dr. Peter Brossart（チュービンゲン大学）により、米国臨床腫瘍学会（ASCO）の2005年の年次学会発表で示され、発表の全てはASCOのウェブサイトで公開されている。自己DC上にパルス化した2種のMUCペプチドをワクチン接種した2人の患者（pt #8とpt#13）において、T細胞のワクチン化したペプチド以外のペプチドに対する免疫性を、ワクチン接種後に検出した（図9）。ワクチン接種前には免疫性は存在しなかったため、そのようなT細胞がエピトープの拡散により誘発されたと考えられる。エピトープの拡散は、腫瘍細胞が破壊されるときに生じ（例えば、壊死、ワクチン誘導T細胞などによる溶解）、抗原を放出し、該抗原は抗原提示細胞（APC、例えばDC）に取り込まれ得る。これらAPCは、次いで、細胞内で抗原をプロセスし、T細胞エピトープ（すなわち、TUMAP）を刺激T細胞応答に提示する。このデータは、自然に生じるT細胞抗原としてのIMA-ADF-001の強力な潜在的役割を強調する。
【０２０２】
II. 本発明によるワクチン"IMA"の生成と使用
IMAは、一次腎癌細胞上に位置し同定された一組の腫瘍関連ペプチドを含むワクチンである。この組は、HLAクラスIとクラスIIペプチドを含む。ペプチドの組はまた、皮内投与の有効性を試験する免疫マーカーとして作用する陽性コントロールペプチドとして使用されるHBVコア抗原由来の1つのペプチドも含む。ペプチドのワクチン接種には、概してアジュバント化が必要であり、GM-CSFがこのワクチン接種スケジュールにおいてアジュバントとして利用される（ヒトのGM-CSFはSargramositim、Leukine（登録商標）、Berlexとして市販から入手可能である）。
【０２０３】
IMAに含まれる10個の腫瘍関連ペプチドのうちの8個を、以下に説明するXPRESIDENT技術で同定した。腫瘍によって発現されるHLA分子構成上に自然に提示されるこれらのペプチドに関しては、それゆえ直接的な証拠により示される。ペプチドIMA-MUC-001とIMA-CCN-001を、その他の技術を用いて同定した。後者のペプチドの両方に関して、腫瘍細胞株によるこれらペプチドの自然な提示を、in vitro免疫原性アッセイにおける非直接的な証拠に基づいて示す（以下を参照）。
【０２０４】
試験の原理
衝撃凍結処理した一次腎細胞癌組織由来のHLA分子を精製し、HLA関連ペプチドを単離する。これらペプチドを、HPLCによりオフラインで分離し、画分を分析するか、質量分析による配列解析を、オンラインHPLC-MSMS実験により行う。得られた配列を、同定したペプチドの合成と、同定したペプチドと合成したペプチドのフラグメントスペクトルの比較により評価する。同定したペプチドが、一次腫瘍のHLA分子から直接派生したものであるため、これらの結果は、一次腎細胞癌組織上における同定したペプチドの自然なプロセッシングおよび提示に対する直接的な証拠である。
【０２０５】
方法
方法は、（Weinschenk T, Gouttefangeas C, Schirle M, Obermayr F, Walter S, Schoor O, Kurek R, Loeser W, Bichler KH, Wernet D, Stevanovic S, and Rammensee HG. Integrated functional genomics approach for the design of patient-individual antitumor vaccines. Cancer Res. 62:5818-5827 (2002)）により詳細に開示されている。要約すると、チュービンゲン大学の泌尿器科から得たshock-凍結した患者の検体（現地の倫理委員会の許可を受けている）を解凍し、HLA分子を、HLAクラスI特異的抗原W6/32またはHLA-A*02特異的抗原BB7.2、または（IMA-MMP-001の場合）HLA-DR特異的抗原L243を用いた親和クロマトグラフィーで精製した。HLA関連ペプチドを、酸処理によって溶離し、限外ろ過によりMHCα鎖タンパク質から単離した。単離したペプチドを逆相高速液体クロマトグラフィーによりオフラインで分離し、画分をハイブリッド4重極子直交加速飛行時間型質量分析計（Q-TOF IまたはQ-TOF Ultima, Waters）におけるナノESI MSによって分析するか、あるいは、同じ装置によりオンラインLC-MSMS分析を行った。システムがペプチドのない状態であることを確実にするためにブランクを常に設けた。システムの最適なパフォーマンスを確実にするため、1日に少なくとも1回校正を行い、適当な間隔で標準化合物に対する分析を行った。フラグメントのスペクトルの解釈は手動で行った。分析の検証は、データベース検索、推定ペプチド配列の固相合成、同定したペプチドと合成したペプチドのフラグメントスペクトルの比較によって得た。IMA-MUC-001とIMA-CCN-001を除くIMAに含まれる全ペプチド（データは示さず）を、一次腎細胞癌組織上のこれらペプチドの自然な提示を確認する同じ方法で同定した。
【０２０６】
IMAの成分
この臨床的開発のためのペプチドを、標準的かつ十分に確立されたFmoc化学法で合成する。分取高速液体クロマトグラフィーとイオン交換により精製を行う。重要なのは、ペプチドの同一性と精製度とを、質量分析と高速液体クロマトグラフィーで容易にかつ高精度で確認できることである。IMAの製剤は、以下でより詳細に説明する11個の別個の薬剤物質を含む。
【０２０７】
（表５）：IMA中の抗原
【表５】
2009506762.tif 000010
全ペプチドを、Fmoc固相化学法により合成し、HPLCとイオン交換クロマトグラフィーによって>95％まで精製する。正しい構造は、アミノ酸解析と質量分析によって確認する。
【０２０８】
（表６）：IMA中のペプチドの物理化学的特性
【表６】
2009506762.tif 000011
薬剤生成物であるIMAは、11個のペプチドを、それらの塩（アセテート）の形態で各ペプチドにつき578μgずつ含む皮内適用のための凍結乾燥物として提供される。臨床試験処方箋の患者への適用に関して、各ペプチドについて578μg含む注射用粉末は、700μl炭酸水素ナトリウム（4.2％）中に溶解される。溶液500μl（1回分の注射につき各ペプチド413μgである1用量、かつ1回分の注射につき4.5mg IMAである総1用量に等しい）を再構成した後、皮内注射する。
【０２０９】
（表７）：IMA中のその他の成分
【表７】
2009506762.tif 000012
*製造工程中に除去
IMAの品質は、Ph. Eur.の用件を満たす活性物質と賦形剤の両方の使用によって保障する。
【０２１０】
IMA中に含まれるペプチドのIn vitro免疫原性
IMAは、9つのHLAクラスI腫瘍関連ペプチドと、1つのHLAクラスII腫瘍関連ペプチドと、1つのHLAクラスIウイルスコントロールペプチドとを含む。In vitro免疫原性によりIMAに含まれる非常に多数のペプチドを説明することができた。
【０２１１】
In vitro免疫原性は、主として2つのT細胞アッセイである、A.クロム放出アッセイにおける細胞傷害性による標的細胞の死滅、および／またはB.HLA四量体によるT細胞の検出を用いて、IMA中に含まれる10個のHLAクラスI配列のうちの8個について説明した。これらのアッセイにより、HLA-A*02陽性のドナー血中の特異的な前駆細胞の存在ならびにそのような特異的T細胞が標的細胞を死滅させる能力が立証される。後者の場合のように、抗原を内因的に発現するいくつかの腫瘍細胞株もまた認識される。これにより、腫瘍細胞上で使用したペプチドの自然な提示にさらなる（間接的な）指標が提供され、これらペプチドを用いて産生された細胞傷害性T細胞が腫瘍細胞の認識に対して大きな親和性を有することが示される。In vitro免疫原性により、フローサイトメトリーにおける細胞内サイトカイン染色を用いて、IMA中に含まれるHLAクラスIIペプチドIMA-MMP-001を立証した（以下を参照）。
【０２１２】
（表８）：IMA中に含まれるペプチドのin vitro免疫原性データの概要
【表８】
2009506762.tif 000013
キラーアッセイ：クロム release assayにより測定した標的の細胞傷害性による死滅；サイトカイン放出：ELISAで測定したT細胞によるサイトカインの放出；サイトカイン染色：細胞内フローサイトメトリーにより測定されたT細胞によるサイトカインの合成；四量体検出：HLA四量体によるペプチド特異的T細胞の検出
【０２１３】
IMA中に含まれるHLAクラスIペプチドのin vitro免疫原性
IMAは、10個のHLAクラスI結合ペプチドを含む。それらのin vitro免疫原性に関してペプチドをテストするため、CD8陽性細胞傷害性T細胞を、IMA中に含まれる単一のペプチドを用いて健康なドナーから得た同種末梢血単核球細胞（PBMC）から産生し、それら細胞傷害性T細胞の活性を、クロム release assayとフローサイトメトリーによるHLA四量体を用いたT細胞の検出により試験した。両方の方法のための代表的なペプチド（IMA-MET-001）について詳細なデータを示す。その他のペプチドのデータは上記表8に要約する。
【０２１４】
第一のステップにおいて、細胞傷害性T細胞を、テストするため、健康なHLA-A*02陽性ドナーから得た末梢血単核球細胞（PBMC）を特異的なペプチドで反復刺激することにより、in vitroで産生（刺激）する。プライミングは、該ドナーの血液単球由来の同種樹状細胞か、HLA四量体負荷ビーズのいずれかを用いて行うことができる。
A.標的の細胞傷害性による死滅：第二のステップにおいて、そのように刺激した細胞傷害性T細胞（CTL）の細胞傷害性を、標的細胞に上澄み中に放出された放射性クロムで標識を付し、産生したCTLで標的細胞を培養することによって試験する。上澄み中に放出された放射性クロムの量は、死滅した標的細胞に直接比例させることができる。
B.HLA四量体によるT細胞の検出：代替的に、第二のステップにおいて、所与のペプチドに対して特異的に刺激したCTLを、HLA四量体を用いて検出する。四量体は、相互に結合した4つのペプチド負荷HLA-A*02分子からなる。これらの構成体により、四量体中のHLAペプチド複合体を認識する同源のT細胞レセプターの特異的な標識化と、フルオロクロムによる四量体の標識化、その後のフローサイトメトリー（FACS）における分析が可能となる。
【０２１５】
樹状細胞による細胞傷害性T細胞のプライミング 
CTLの誘導について、5×105DCを50 g/mlの合成ペプチドIMA-MET-001で2時間パルス化し、洗浄し、2.5×106の自己由来PBMNCによりRP10培地で培養した。7日間の培養後、細胞を自己ペプチドでパルス化したPBMNCで再刺激し、1ng/mlのヒト組み換えIL-2（R&D Systems）を1日目と3日目と5日目に加えた。最後の再刺激後、誘導したCTLの細胞傷害性活性を5日目に標準51Cr-release assay (Brossart P, Heinrich KS, Stuhler G, Behnke L, Reichardt VL, Stevanovic S, Muhm A, Rammensee HG, Kanz L, and Brugger W. Identification of HLA-A2-restricted T-cell epitopes derived from the MUC1 tumor antigen for broadly applicable vaccine therapies. Blood 93:4309-4317 (1999))で分析した（以下を参照）。
【０２１６】
四量体負荷ビーズによる細胞傷害性T細胞のin vitroプライミング
若干の変更前またはそれとともにin vitroプライミングを実施した（Walter S, Herrgen L, Schoor O, Jung G, Wernet D, Buhring HJ, Rammensee HG, and Stevanovic S. Cutting Edge: Predetermined Avidity of Human CD8 T-cells Expanded on Calibrated MHC/Anti-CD28-Coated Microspheres. J Immunol 171:4974-4978 (2003)）。すなわち、膜透過性ドメインのない、重鎖のカルボキシ末端でビオチン化した、ビオチン化組み換えHLA-A*0201分子を前述のように産生した（Altman JD, Moss PA, Goulder PJ, Barouch DH, McHeyzer-Williams MG, Bell JI, McMichael AJ, and Davis MM. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science 274:94-96 (1996)）。精製したマウスの共刺激性IgG2a抗ヒトCD28Ab9.3（Jung G, Ledbetter JA, and Muller-Eberhard HJ. Induction of cytotoxicity in resting human T lymphocytes bound to tumor cells by antibody heteroconjugates. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 84:4611-4615 (1987)）を、Sulfo-N-hydroxysuccinimidobiotinを用いて、製造業者（Perbio Science、独国ボン）推奨の条件下で化学的にビオチン化した。使用した微小球は、おおよそ0.06μgのビオチン-FITC/mg微小球である結合能を有する径5.60μmのストレプトアビジン被覆のポリスチレン粒子であった（Bangs Laboratories、米国イリノイ州フィッシャー）。微小球の取り扱いの際、滅菌PBS/BSA/EDTAバッファーを用いた。ビオチン化した分子の共役のため、微小球を洗浄し、様々な濃度の、ビオチン化MHCおよび／または抗体を含むバッファー中で2×106粒子／mlに再懸濁した。室温で30分間撹拌しながら結合させた。被覆ビーズを3回洗浄し、上述のバッファー中で再懸濁し、使用前まで4週間を限度に4℃で保存した。
【０２１７】
PBMCは、標準勾配分離培養液（Linaris、独国ヴェルトハイム-ベッチンゲンまたはPAA Laboratories、オーストリア国リンツ）を用いて新鮮なバフィーコートから単離した。表示する際、未処理のCD8T細胞を陰性ディプリーションによりCD8T細胞分離キット（Miltenyi Biotec、独国グラドバッファー、ベルギッシュ）を用いて、製造業者の条件に従い、磁気的に濃縮し、80％以上の精製度のCD8陽性TCR陽性細胞を得た。5×106の応答細胞と1×106 のAPCまたはウェルごとに1.5mlのT細胞培地中の微小球を用いた24穴のプレートでin vitro刺激を開始した。別途説明しない限り、5ng/mlのヒトIL-12p70（R&D）をAPCまたは微小球とともに加えた。37℃で3-4日の共培養後、新鮮な培地と20U/mlのヒトIL-2（R&D）を加え、細胞をさらに37℃で3-4日間培養した。この刺激サイクルを2回繰り返した。
【０２１８】
chromium-release assayを用いたCTLによる標的細胞の死滅 
標準的な51Cr-release assayを説明したように実施した（Brossart P, Schneider A, Dill P, Schammann T, Grunebach F, Wirths S, Kanz L, Buhring HJ, and Brugger W. The epithelial tumor antigen MUC1 is expressed in hematological malignancies and is recognized by MUC1-specific cytotoxic T-lymphocytes. Cancer Res. 61:6846-6850 (2001)）。標的細胞を、50μg/mlペプチドで2時間パルス化し、RP10中で51Cr-sodium chromateで、37℃で1時間かけて標識化した。104個の細胞を丸底の96穴プレートのウェルに移入した。様々な数のCTLを加えて最終的な容量が200μlになるようにし、37℃で4時間培養した。アッセイの最後に、上澄み液（50μl/ウェル）を回収し、ベータプレートカウンターでカウントした。特異的溶解の割合を計算した：100×（実験による放出-自然放出）／最大放出-自然放出）。自然放出と最大放出は、培地または2%トリトンX-100のいずれかの存在下で、それぞれ測定した。さらに腫瘍細胞溶解の抗原特異性を低温標的阻害アッセイにおいて、ペプチドパルス化非標識化T2細胞が20:1の割合で（阻害因子：標的の比）腫瘍細胞の溶解を阻害する能力を分析することにより測定した。
【０２１９】
HLA四量体による細胞傷害性T細胞の検出
四量体の染色を上記で示したように（Walter S, Herrgen L, Schoor O, Jung G, Wernet D, Buhring HJ, Rammensee HG, and Stevanovic S. Cutting Edge: Predetermined Avidity of Human CD8 T-cells Expanded on Calibrated MHC/Anti-CD28-Coated Microspheres. J Immunol 171:4974-4978 (2003)）あるいは若干変更して実施した。すなわち、膜透過性ドメインのない、重鎖のカルボキシ末端でビオチン化した、ビオチン化組み換えHLA-A*0201分子を前述のように産生した（Altman JD, Moss PA, Goulder PJ, Barouch DH, McHeyzer-Williams MG, Bell JI, McMichael AJ, and Davis MM. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science 274:94-96 (1996)）。ストレプトアビジン-PEまたはストレプトアビジン-APCを（Molecular Probes、オランダ国ライデン）4:1のモル比でビオチン化HLA-A*0201と共培養することにより蛍光四量体を生成した。四量体分析に関して、細胞を10mg/mlのアジ化ナトリウムを含むPBS/BSA/EDTA（Merck、独国ダルムシュタット）中で洗浄し、AbsCD4-FITCとCD8-PerCPクローンSK1（いずれもBecton Dickinson）を含む同じバッファー中で、4℃で20分間染色した。微小球の刺激実験後、100μg/mlの非標識化ストレプトアビジン（Sigma）を含有させた。2％加熱不活性化FCS（PAN Biotech、独国アイデンバッファー）と、2mMのEDTAナトリウムと、10mg/mlアジ化ナトリウムを含むPBS中で細胞を洗浄し、四量体を4℃で30分間、50％FCSを含むPBS/FCS/EDTA/Azidで染色した。四量体試薬は、常に5μg/mlのMHC濃度で用いた。染色細胞は、PBS/FCS/EDTA/Azid中で広範に洗浄し、1％ホルムアルデヒド（Merck）で固定した。4-colour FACSCalibur（Becton Dickinson）で細胞を分析した。例として、詳細に方法Aおよび方法BのIMA-MMP-001について結果を示す。その他のHLAクラスIペプチドについては結果を表8に要約する。
【０２２０】
A. 標的の細胞傷害による死滅
結果は（Schag K, Schmidt SM, Muller MR, Weinschenk T, Appel S, Weck MM, Grunebach F, Stevanovic S, Rammensee HG, and Brossart P. Identification of C-met oncogene as a broadly expressed tumor-associated antigen recognized by cytotoxic T-lymphocytes. Clin Cancer Res. 10:3658-3666 (2004)）により公表された。関連情報を以下に要約する。
【０２２１】
第一のステップにおいて、誘導CTLの細胞傷害性を、ペプチド負荷T2細胞と自己DCを、標的として用いて標準的51Cr-release assayで分析した。図3に示すように、2週間の再刺激後、CTL株は、抗原特異的な死滅を呈した。T細胞は、T2細胞または同源ペプチドで被覆したDCのみを認識したが、survivinタンパク質由来の無関係のHLA-A2結合ペプチドまたはHIV-1逆転写酵素でパルス化した標的細胞を溶解しなかったため、細胞傷害活性の特異性を確認した。
【０２２２】
第二のステップにおいて、in vitro誘導CTLがc-Metタンパク質を内因的に発現する腫瘍細胞を溶解する機能を、標準51Cr-release assay中で、c-Metを標的として発現するHLA-A*02陽性細胞株HCT116（結腸癌）、A498、MZ1257（腎細胞癌、RCC）、MCF-7（乳癌）、Mel1479（悪性メラノーマ）、およびU266（多発性骨髄腫）を用いて分析した。EBV形質転換B細胞株Croft（HLA-2+/c-Met-）と卵巣癌細胞株SK-OV-3（HLA-A3+/c-Met+）を、特異性とCTLのHLA拘束性を決定するために含んだ。図4で示すように、ｃ-Metペプチド特異的CTLは、HLA-A2とc-Metの両方を発現する悪性腫瘍細胞を効果的に溶解することができた。卵巣癌細胞SK-OV-3またはCroft細胞は認識されなかったため、HLA-A2分子の構成上、c-Metペプチドの腫瘍細胞上での提示が、標的細胞の有効な溶解に必要であり、抗原特異性とCTLのMHC拘束性とを確認することが立証できた。In vitro誘導T細胞はK562細胞を認識しなかったため、細胞傷害活性がNK細胞介在ではないことを示すことができた。
【０２２３】
抗原特異性とIn vitro誘導CTL株のMHC拘束性をさらに確認するため、本発明者等は低温標的阻害アッセイを実施した。標的細胞（U266とA498）の溶解は、低温標的阻害アッセイで阻害することができた。同種ペプチドでパルス化した低温（51Crで標識していない）T2細胞の添加により、腫瘍細胞の溶解が減少したため、無関係なペプチドでパルス化したT2細胞は効果を示さなかった（図5）。
【０２２４】
B. HLA四量体でのT細胞の検出
1人のA*02+健康なドナーの濃縮したCD8T細胞を、10nMCD28Abと、10nMの無関係なA*02複合体（左側パネル）または指し示した抗原で再折りたたみしたA*02（中央と右側パネル）のいずれかとの存在下で、被覆したビーズで3回刺激した。指し示した抗原は、CMVpp65由来のペプチドNLVPMVATV（Wills MR, Carmichael AJ, Mynard K, Jin X, Weekes MP, Plachter B, and Sissons JG. The human cytotoxic T-lymphocyte (CTL) response to cytomegalovirus is dominated by structural protein pp65: frequency, specificity, and T-cell receptor usage of pp65-specific CTL. J Virol. 70:7569-7579 (1996)）、Melan-A/Mart-1由来の修飾ペプチドELAGIGILTV（Kawakami Y, Eliyahu S, Sakaguchi K, Robbins PF, Rivoltini L, Yannelli JR, Appella E, and Rosenberg SA. Identification of the immunodominant peptides of the MART-1 human melanoma antigen recognized by the majority of HLA-A2-restricted tumor infiltrating lymphocytes. J Exp. Med. 180:347-352 (1994)）、そしてペプチドIMA-MET-001であった。全T細胞株は、CD8-PerCPAbと、同種四量体-PE（図6の左側と中央パネル）と、無関係なA*02/ILKEPVHGV四量体-APC（右側パネル）とで、表面を染色した。CD8陽性リンパ球のうち、四量体+細胞の割合を各プロットに示す。
【０２２５】
IMA中に含まれるHLAクラスIIペプチドIMA-MMP-001のin vitro免疫原性
IMAは、マトリックスメタロプロテイナーゼ7由来の1つのHLAクラスIIペプチド、IM-MMP-001を含む。ペプチドをそのin vitro免疫原性とその無差別的結合特性とに関してテストするため、CD4陽性T細胞を、異なるHLA遺伝子型を有する健康なドナーの自己末梢血単核球細胞（PBMC）から、IMA-MMP-001ペプチドを用いて産生し、これらヘルパーT細胞の活性を、フローサイトメトリーにおける細胞内サイトカインの染色によりテストした。
最初に、CD4陽性T細胞を、IL-12の存在下で、テストするために、特異的ペプチドで健康なドナー由来の末梢血単核球細胞（PBMC）を反復刺激することにより、in vitroで産生（刺激）した。プライミングは、ドナーの血中単球から産生した自己樹状細胞を用いて実施した。第二ステップにおいて、所与のペプチドに特異的な刺激したCD4陽性T細胞の活性を、蛍光標識した抗体を用いて、細胞内IFNγを染色することによって、IFNγ産生物の測定によってテストした。解析はフローサイトメトリー（FACS）によって行った。
【０２２６】
樹状細胞（DC）の産生
ヒトのDCを、健康なドナーの新たに採取した血液由来のPBMCから調製した。PMBCを、Ficoll密度勾配法（Lymphocyte Separation Medium, PAA Laboratories GmbH、オーストリア国パッシング）を用いて単離した。得られた細胞を洗浄し、50U/mlペニシリンと、50μg/mlストレプトマイシンと、2mMのLグルタミンとで補ったX-Vivo15培地（Bio Whittaker、ベルギー国ヴァーヴィエ）中で再懸濁し、密度7×106細胞／mlでプレートに蒔いた。37℃で2時間後、接着性の単核球を、100ng/ml GM-CSFと40ng/ml IL-4を含むX-Vivo培地（AL-ImmunoTools、独国フライスオイテ）中で6日間培養した。7日目に、未成熟DCを、10ng/ml TNF-α（R&D System、独国ワイスバーデン）と20μg/mlポリ（IC）（Sigma Aldrich、独国シュタインハイム）で3日間活性化した。DCの分化状態を、フローサイトメトリーで検査し、成熟DCは、主として、CD14陽性、CD40陽性、CD80陽性、CD83陽性、CD86陽性、かつHLA-DR+であった（データは示さず）。
【０２２７】
抗原特異的CD4陽性T細胞の産生
CD4陽性T細胞を産生するために、106個のPMBCを2×105個の自己DCで刺激した。刺激後、凍結保存した自己PMBCで6?8日ごとに再刺激した。刺激について、細胞は、5μg/mlペプチドで、90分間37℃においてパルス化し、照射した（60Gy；Gammacell 1000 Elite, Nordion International Inc.、カナダ国オンタリオ）。細胞を96穴プレート中（各ドナー、各ペプチドにつき7ウエル）で、T細胞培地（：HEPESとLグルタミンを含むRPMI1640（Gibco、英国ペイズリー）を用いて）、10％加熱不活性化したヒト血清（PAA、独国コルベ）と、50U/mlペニシリンと、50μg/mlストレプトマイシンと、20μg/mlゲンタマイシン（Bio Whittaker）で補い、10ng/mlIL-12（Promocell、独国ハイデルベルグ）の存在下で培養した。37℃で3?4日間共培養した後、80U/ml IL-2（Proleukin、Chiron Corporation、米国カリフォルニア州エメリーヴィル）と5ng/ml IL-7（Promocell）を用いた新しい培地を加えた。3回目と4回目の刺激後に細胞内IFNγ染色による解析を行った。
【０２２８】
細胞内IFNγ染色
凍結乾燥したPMBCを解凍し、X-Vivo15培地中で2回洗浄し、T細胞培地中で107細胞/mlに再懸濁し、非特異的IFNγの産生を低減させるため、一晩培養した。翌日、PMBCを5μg/mlペプチドで2時間パルス化し、X-Vivo 15培地で3回洗浄し、1:1の比でエフェクター細胞と共に6時間培養した。Golgi-Stop液（Becton Dickinson、独国ハイデルベルグ）を、培養最後の4時間で加えた。Cytofix/Cytoperm Plus kit (Becton Dickinson)とCD4-FITC（免疫学的ツール）、IFNγ-PEとCD8-PerCPクローンSK1抗体（Becton Dickinson）を用いて細胞を分析した。染色後、three-color FACSCalibur (Becton Dickinson)で細胞を解析した。
【０２２９】
抗原特異的CD4陽性T細胞を産生し、無差別的結合についてペプチドをテストするために、異なるHLA-DRアレルを有する4人の健康なドナーのPBMC（図7）を、ペプチドパルス化自己DCを用いて刺激した。抗原特異的CD4陽性T細胞の産生のための読み出しシステムに際し、IFNγ生成をフローサイトメトリーにより評価した。T細胞を3回目と4回目の刺激後、細胞内IFNγ染色と、CD4-FITCとCD8-PerCP染色により、特異的T細胞サブ集団におけるIFNγ生成細胞の割合を決定するため、解析した。全実験において、無関係なペプチドによる、及びペプチドを用いない刺激を陰性コントロールとして実施した。IFNγ応答は、IFNγ生成CD4陽性T細胞の検出が、陰性コントロールと比較して2倍以上高かった場合に陽性であるとした（Horton H, Russell N, Moore E, Frank I, Baydo R, Havenar-Daughton C, Lee D, Deers M, Hudgens M, Weinhold K, and McElrath MJ. Correlation between interferon- gamma secretion and cytotoxicity, in virus-specific memory T-cells. J. Infect. Dis. 190:1692-1696 (2004)）。4人のうち3人のドナーにおいて、対象とするペプチドに特異的に反応するCD4陽性T細胞を産生することができた（図7）。ドナー4では、3回目の刺激後でも4回目の刺激後でもT細胞応答は観察できなかった。IMA-MMP-001に対して特異的なIFNγ生成CD4陽性T細胞の最も高い頻度は、ドナー1とドナー2のそれぞれで見られた。
【０２３０】
したがって、IMA-MMP-001は無差別的なバインダーであり、異なるHLAアレルを有する4人の健康なドナーのうちの3人においてCD4陽性T細胞応答を誘発可能である。結合予測と得られた結果により、ペプチドはHLA-DRB1*0101, HLA-DRB1*0401/*0408 およびHLA-DRB1*1101により提示されると思われる。4つのアレルの全ては、それらβ鎖の86位にグリシン残基と、57位にアスパラギン酸残基とを有する（データは示さず）。そのため、それらアレルは、それらの結合ポケットP1とP4に対する結合特性を共有する、非常に似た結合モチーフを有する（Rammensee,H.G., Bachmann,J., and Stevanovic,S. (1997). MHC Ligands and Peptide Motifs. Springer-Verlag, Heidelberg, Germany)；Hammer J, Valsasnini P, Tolba K, Bolin D, Higelin J, Takacs B, and Sinigaglia F. Promiscuous and allele-specific anchors in HLA-DR-binding peptides. Cell 74:197-203 (1993)；Marshall KW, Liu AF, Canales J, Perahia B, Jorgensen B, Gantzos RD, Aguilar B, Devaux B, and Rothbard JB. Role of the polymorphic residues in HLA-DR molecules in allele-specific binding of peptide ligands. J. Immunol. 152:4946-4957 (1994)）。ドナー4は、非常に異なる結合モチーフを有するHLA-DRB1*0318アレルとDRB1*1401アレルを担持する。これは、このドナー由来の細胞で上述のペプチドを用いたT細胞応答を誘発できなかった理由を説明するものであろう。
【０２３１】
ヒトにおける効果
長さとアミノ酸分布において類似する上述の短いペプチドに、1996年からの様々なフェーズ1-3の臨床試験で何千人もの患者において免疫性を与えた。これらの研究では、深刻な有害事象は報告されなかった。さらに、IMAに含有されるペプチドIMA-MUC-001は、独国のチュービンゲン大学での研究者主導実験において樹状細胞を負荷させたワクチンとしてすでに用いられており、非常に良好に受け入れられた（Wierecky J, M?ller M, Horger M, Brugger W, Kanz L, Brossart P. Induction of clinical and immunological responses in patients with metastatic renal cell carcinoma after vaccinations with peptide pulsed dendritic cells. Abstract No. 2507 presented at the Annual Meeting of the American Society of Clinical Oncology ASCO (2005)）。
【０２３２】
SEQ-ID-Nr. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10のペプチドを、30人の患者でテストし、そのうち26人は、10週間のワクチン接種コースを完全に終えた。高い割合の患者のうち、74％が、ワクチンに含まれるペプチド配列に対する特異的免疫応答を示した。この小さいフェーズIのコホートにおいてすでに、9個のペプチドのうちMHCクラスI（アレルHLA-A*02）に結合する8個（SEQ-ID-Nr. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9）のin vivo生物学的機能は、以下に説明するように実施した増幅ELISPOTおよび／または四量体染色アッセイの結果によって確認できた。異なる読み出しが必要なSEQ-ID-No. 1 (IMA-MMP-001)のペプチドは、患者の血液から入手できるPBMCに限界があったため、テストできなかった。
【０２３３】
特異的免疫学的パラメーター（免疫学的モニタリング）
今日まで、免疫学的モニタリングは、多数の治療ワクチン研究における何千もの患者での共通するプラクティスであった（Romero P, Cerottini JC, Speiser DE. Monitoring tumor antigen specific T-cell responses in cancer patients and phase I clinical trials of peptide-based vaccination. Cancer Immunol Immunother. 2004 Mar;53(3):249-55）。多数の異なる免疫学的モニタリング法がこれまでに報告されており、それらには機能的および特異的アッセイが含まれる。治療ワクチンIMAの免疫原性成分は、特異的Tリンパ球をin vivoで誘導すると思われるHLA結合ペプチドである。この活性化により、それらは増殖し、抗原と接触した際にサイトカインを分泌する能力を含むエフェクター機能を獲得する。
【０２３４】
T細胞活性化の代理マーカーとして、血液中の特異的サイトカイン分泌単核細胞の頻度は、ELISPOTアッセイを用いてテストすることができる。そのようなアッセイは、それらが単一の細胞をベースとしており、血液検体中のサイトカイン分泌抗原特異的Tリンパ球の真の頻度に直接関連すると期待されるパラメーター（すなわち、単核細胞中でスポット形成細胞の数）が得られるため、この目的に特に適している。そのため、アッセイはまた、比較的多数の検体とペプチドを並行してプロセッシングすることができ、これらは、これまでのところ多数の臨床的研究における免疫学的モニタリング研究にすでに広く用いられている（Schmittel A, Keilholz U, Thiel E, Scheibenbogen C. Quantification of tumor-specific T lymphocytes with the ELISPOT assay. J Immunother. 2000 May-Jun;23(3):289-95）。
【０２３５】
免疫応答
免疫学的活性／有効性は、T細胞応答分析によって説明できる。様々な療法のために、免疫応答に関する異なる臨床研究に基づく経験と結果を文献で見いだすことができる。Disis等は、1999年、卵巣癌と乳癌患者における、100％までのT細胞応答を説明している。卵巣癌、乳癌、非小細胞肺癌の患者での、Her2/neu抗原とGM-CFSを用いた3-arm研究において患者（n=64）の84％に拡散性のエピトープが、2002年にDisis等によって報告された。その他の著者が、メラノーマ患者における33％-83％のT細胞応答に関する結果を公表している（Slingluff, C. L., Jr., G. R. Petroni, G. V. Yamshchikov, D. L. Barnd, S. Eastham, H. Galavotti, J. W. Patterson, D. H. Deacon, S. Hibbitts, D. Teates, P. Y. Neese, W. W. Grosh, K. A. Chianese-Bullock, E. M. Woodson, C. J. Wiernasz, P. Merrill, J. Gibson, M. Ross, and V. H. Engelhard. Clinical and immunologic results of a randomized phase II trial of vaccination using four melanoma peptides either administered in granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in adjuvant or pulsed on dendritic cells. J. Clin. Oncol. 21:4016. (2003)）。Gaudernack/Gjertsenは、2003年に、この研究で用いる抗原に特異的ないくつかのCD4陽性T細胞クローンとCD8陽性T細胞クローンの免疫応答について報告した。
【０２３６】
また、Wierecky等により提供されたのが（Wierecky J, M?ller M, Horger M, Brugger W, Kanz L, Brossart P. Induction of clinical and immunological responses in patients with metastatic renal cell carcinoma after vaccinations with peptide pulsed dendritic cells. Abstract No. 2507 presented at the Annual Meeting of the American Society of Clinical Oncology ASCO (2005)）次の通りである。自己成熟単核球由来樹状細胞（DC）を、MUC1ペプチドから推定される2つのHLA-A2結合ペプチドでパルス化した。CD4陽性T細胞の補充と活性化のために、DCをさらにPAN-DR結合ペプチドPADREで培養した。ワクチン接種を2週間ごとに4回皮下に行い、この治療アプローチにおける、腫瘍の進行までこれを月毎に反復した。5回目のDC接種後、患者に追加的に、低用量のIL-2（1Mio IE/m2）の接種を3回／週受けさせた。T細胞の前駆体の増強を、IFNγELISPOTと51Cr-release assayを用いてモニターした。さらに、ワクチン関連エピトープの誘発に応答して、サイトカインを産生するPBMCの能力を定量的リアルタイムPCRでテストした。
【０２３７】
Wierecky等によるこの研究において、in vivoでMUC1ペプチド特異的T細胞応答を、ORの全患者のPBMC中で検出した。これらin vivoの誘導T細胞は、in vivoでの再刺激後に続いて、抗原とHLA拘束法においてMUC1を構成的に発現する、同源ペプチドまたは一致する同種腫瘍細胞（A498）でパルス化した標的細胞を認識することができた。治療に反応する患者において、アジポフィリン、テロメラーゼ、OFAなどのワクチンに用いられない抗原に対して応答するT細胞は検出できなかったため、エピトープの拡散が生じ得ることが示された。PADREペプチドに対する増殖的応答は、11/16の患者で検出可能であり、何人かの患者では2回目のワクチン接種後にすでに検出可能であった。結論：ワクチン接種した患者におけるエピトープ拡散の解析は、臨床的かつ免疫学的応答に関連した有用なパラメーターとなり得る。
【０２３８】
IN VIVO免疫応答
臨床実験のための調製
IMAの臨床実験のための調製物は以下を含む。
- 3mlの試験管に11のペプチドを含む凍結乾燥物
- 希釈剤（炭酸水素ナトリウム4.2％）
【０２３９】
IMAの投与形態
3mlのガラス製試験管中に注射用粉末。パッケージ内容：4本の試験管を箱に詰める。希釈剤は、700μlの炭酸水素ナトリウムを含み、250mlのびんに詰める。IMAの1つの試験管を、さらに700μlの4.2％炭酸水素ナトリウム溶液（希釈剤）で再構成する。IMAを溶解するために、バイアルと希釈剤を3分間勢いよく振り、超音波で1分間処理する。その後、試験管を再び1分間振る。500μlのこの溶液を、再構成後30分以内に投与する。
【０２４０】
ワクチン接種
この研究では、進行した腎細胞癌患者に、10週間かけて8回のワクチン接種をした。全体で、総計24人のHLA-A*02陽性HLA型の患者が含まれていた。皮内ワクチン接種（GM-CSFとIMA）を、1日目、2日目、3日目、8日目、15日目、22日目、36日目および64日目に行った。研究中に血液検体を異なる時点で採取し、その患者の末梢血単核球細胞（PBMC）に含まれるT細胞を、密度勾配遠心分離法によりヘパリン血液から単離し、血球計数器を用いて計測し、アッセイに供するまで凍結温度で貯蔵できるよう保存した。2つの異なる通常のELISPOTアッセイと、1つの通常の四量体アッセイとを、次いで本発明者等は実施した。
【０２４１】
増幅ELISPOTアッセイ
"ex vivo ELISPOT"アッセイにおいて、細胞を異なる時点で解凍し、生存する細胞の数を計測し、検体を3組のウェル中で異なるペプチドまたはコントロールで1日間培養することにより評価する。ex vivo ELISPOTアッセイにより、以下のその他のアッセイと比較してずっと速く定量データを得ることができる。さらに、これは、IMA中に含まれる1つのHLAクラスIIペプチド（IMA-MMP-001）の測定が可能なたった1つのアッセイである。しかしながら、このアッセイは、感応性が制限されたものであり、陽性データは、ウイルスに対する記憶された（リコール）免疫応答と比べて非常に強力なT細胞応答の場合でのみ期待される。
【０２４２】
"増幅ELISPOT"アッセイにおいて、異なる時点の細胞をプールし、計数し、おおよそ2週間抗原で予め刺激し、特異的細胞を分割させた。次いで、細胞を培地から回収し、再計測し、抗原で1日間再刺激した際のIFNγスポット産生について上述のように測定した。そのような条件下で活性化させた細胞は、酵素結合サンドイッチ抗体法で検出されるIFNγを分泌する。スポットを色形成反応によって視覚化し、自動高解像度デジタルカメラ（本明細書において"ELISPOT"リーダーと称す）で計数した。検体中で活性化した抗原特異的Tリンパ球の真の頻度と相互に関連したスポットの数を、ELISPOTリーダーで撮影した画像から、ソフトウェアアルゴリズムによって測定した。このアッセイは、様々な第三者による臨床試験でワクチン処理した腫瘍抗原に対するT細胞応答を検出するのに用いられることが多々あった。T細胞の"in vivoプライミング"に起因する擬陽性データの可能性は、このアッセイにおいて様々なコントロールを用いることによって排除される。以下の四量体アッセイと比較して、このアッセイはさらなる機能的情報、すなわちIFNγサイトカイン放出を提供する。
【０２４３】
増幅ELISPOTアッセイを、ワクチン接種プロトコルの前またはその間の異なる時点における、この研究の28人の患者に対して、かつIMA中に存在する全抗原について実施した。図10は、同じ患者と抗原に対する増幅ELISPOTアッセイにより同定したIMA誘導T細胞応答の代表例を示す。上方と下方のカラムはそれぞれ、読み出しに用いた陰性コントロール抗原HIV-001と、単一のTUAPIMA-CCN-001とを示している。各実験の陽性細胞の数を示す。左側のカラムは、ワクチン接種前に採取したプール検体のELISPOTを示し、一方、右側のカラムは、ワクチンプロトコル中に採取したプール検体のELISPOTを示している。コントロール抗原は、免疫応答を誘発させた後のスポットの数を増大させなかったが、IMAの注射により、IMA-CCN-001についてはスポット数が増大した。陽性の数、すなわちIFNγ分泌細胞の数は、ワクチン接種前の27-34から、4回目と5回目の注射後に100-141に増大した。IMAでの処理により、この患者のIMA-CCN-001抗原に特異的な活性化Tリンパ球の頻度は増大した。
【０２４４】
増幅四量体アッセイ
"増幅四量体"アッセイにおいて、異なる時点の細胞を解凍し、計数し、およそ2週間、抗原で予め刺激することにより、抗原特異的T細胞を分割させることができた。次いで、細胞を培地から回収し、再計数し、PE-およびAPC蛍光クロムで標識したMHC多量体と抗体で染色し、CD8陽性T細胞（1回の染色＆時点ごとに1ウェル）を画定する。MHC多量体は、多量体化され、蛍光染料と共役した組み換えペプチドMHC複合体である。その元来導入された分野（Altman JD, Moss PA, Goulder PJ, Barouch DH, McHeyzer-Williams MG, Bell JI, McMichael AJ, and Davis MM. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science 274:94-96 (1996)）と完全に当量の四量体のHLA-A*0201多量体のみを用いた。これを本明細書では簡単に四量体と称す。染色し、固定した検体を当業界で既知の標準的な手順を用いてフローサイトメトリーで解析した結果、各検体について単一の細胞ベースのデータセットが得られた。この"増幅四量体"アッセイは、非常に高感応性なものであるが、ex vivoアッセイと比較してそれほど定量的ではない。
【０２４５】
四量体データの一次分析について、検体ごとの、総合的に評価したCD8陽性T細胞と、単一の四量体陽性細胞と、二重の四量体陽性細胞の数を、市販のソフトウェアを用いてサイトメトリーリストモードファイルから電子的に計測した。CD8陽性T細胞を、生きているリンパ球での前方および側方散乱ゲーティングならびに、蛍光抗体に基づくCD8陽性CD3陽性事象でのサブゲーティングにより同定した。リンパ球ゲートとCD3/CD8ゲートの解像度は、アッセイにおける1人の患者の全染色と同一であった。四量体陽性群は、quadrantかgateを用いたダブル四量体のドットプロットを解析することによってCD8陽性T細胞から同定した。四量体陽性細胞の解像度は、アッセイにおける所与の患者の各染色条件に一致し、認識可能な細胞群に基づくものであった。増幅四量体アッセイを、ワクチンプロトコル前あるいはその間の異なる時点において、この研究における28人の患者に対してかつIMA中に存在する全抗原について実施した。
【０２４６】
図11は、増幅四量体染色アッセイによって同定されたIMA誘導T細胞応答の代表的な2例を示す。上方および中央のパネルは、CD3陽性リンパ球にゲートされた二次元のドットプロットを示し、下方パネルは、CD3陽性、CD8陽性リンパ球にゲートされたものを示す。患者、時点、および染色を各カラムについて示した。図11Aにおいて、ELISPOTアッセイですでに示した（図10）IMA-CCN-001に対する患者03-004の免疫学的応答を、四量体アッセイにより確認した。CD3陽性とIMA-CCN-001に対して陽性の細胞群を、IMA（V6+V7；中央のパネル）の4回目と5回目の接種後に同定し、一方、非陽性群はK67-001四量体（上方のパネル）で見られた。IMA-CCN-001陽性細胞は、ワクチン接種前の0.03％から、3回のうちの1回目の接種後の0.78％のリンパ球（V6+V7；下方のパネル）まで増大した。
【０２４７】
患者03-003は、RGS-001ペプチドに対して免疫学的応答を示さなかった（図11B；上方のパネル）が、ワクチンプロトコルのコース中にIMA-CCN-001四量体陽性応答を発現した（S1+V1：ワクチン接種前に採取した検体；V4+V5：8日目と15日目に採取した検体；V6+V7：22日目と36日目に採取した検体；V8+FU：64日目（最後のワクチン接種）と85日?92日後（研究の最後）に採取した検体）。中央のパネルにおいて、カラム3とカラム4は、CNN-001とCD3陽性に対して異なる陽性樹状細胞群を示す。ワクチン接種のコース中、これら細胞の量は、ワクチン接種前の0.02％から3回のうちの1回目の接種後の0.8％のリンパ球（下方パネル；カラム3）に増大し、64日目以降に0.31％に減少した（下方パネル；カラム4；V8+FU）。
【０２４８】
選択した患者について、1つの時点、すなわち血液検体がプールされなかった時点に対して増幅四量体アッセイを実施することにより、T細胞の動態をより正確に評価することができた。その例を図12に示す。増幅四量体アッセイの1つの時点における観察したT細胞の動態の程度を、患者05-001について示す。IMA（TUMAPプール）中に存在する腫瘍関連抗原は、22日目、36日目および64日目に最も高かった（V6、V7、V8）一方で、IMA-CCN-001ペプチドに対する応答は、もっと速く、22日目でピークを示した（V6）。HBV-001陽性のコントロールは、もっと速く応答を示し、15日目で最大に達した（V5）。
【０２４９】
IMA-CCN-001に対して非常に高い応答を有する2人の患者を選択して、非増幅実験における増幅四量体アッセイの結果を確認した。これらのex vivo四量体アッセイを、細胞培養を行うことなく2週間実施した。
【０２５０】
以下の表9に結果を要約する。ex vivo四量体および増幅アッセイでワクチン誘導応答が検出された患者／抗原に整合する増幅四量体アッセイの評価可能な結果を全て示す。"ex vivo"法に関連して、全CD8陽性T細胞のうちの四量体＋の割合（％）を示す。"増幅した、ルーチン"評価法に関して、CD8陽性Tリンパ球のサブ群を解析することができ、全CD8陽性Tリンパ球に基づく計算により、ルーチンデータの第2の再評価を示す（"増幅した、定量的"）。ex vivoにおいておよび増幅四量体アッセイにおいて、分散した四量体＋群が見られた場合に、"増幅ファクター"を算出した。
結果は、増幅四量体アッセイによって測定された免疫学的応答は、2週間の培養中の細胞の増殖に起因しないが、患者の血液中に存在する前述の"ex vivo"リンパ球に基づくものであることを明確に示している。
【０２５１】
（表９）：ex vivoおよび増幅四量体アッセイから計算したT細胞応答の程度の比較
【表９】
2009506762.tif 000014
*:分散した四量体+群の検出
#: 分離アッセイは、TUMAPプール応答が、rCCN-001にだけ寄与可能である明確な証拠を示した。
【０２５２】
総合的な患者の応答性
IMAに含まれる全てのペプチドに対して、28人の患者のこの研究の異なる時点における上述のアッセイで測定したT細胞応答を評価した。患者は、"応答性を有する"とのスコアが付けられ、i.d.はワクチン接種後の時点で採取した血液検体の1つが、四量体陽性リンパ球またはある1つのペプチドで刺激した際の分泌されたIFNγを含んだ場合に、ワクチン誘導免疫応答を示した。
【０２５３】
予想されるように、患者はIMAに含まれる異なるペプチドに対して個別に反応した。少数の患者を考慮した場合、患者の多数（評価可能な患者27人のうちの23人）が、ペプチドのうち少なくとも1つに対して免疫応答を現したため、驚くほど良好な応答性が得られた。評価可能な患者27人のうちの8人（30％）は、多数のTUMAPに対してさえT細胞応答を示した。
【図面の簡単な説明】
【０２５４】
【図１】一次腫瘍検体RCC013におけるc-Met癌原遺伝子由来ペプチドIMA-MET-001を示した図である。
【図２】c-Met癌原遺伝子（MET）の組織の発現を示した図である。
【図３】IMA-MET-001で刺激したCTLによる、ペプチド負荷標的細胞の死滅を示した図である。
【図４】IMA-MET-001で刺激したCTLによる、悪性腫瘍細胞の死滅を示した図である。
【図５】低温標的阻害アッセイ（cold target inhibition assay）を示した図である。
【図６】微粒子主導拡張の四量体的分析を示した図である。
【図７】IMA-MMP-001のin vitro免疫原性を示した図である。
【図８】腫瘍と健康な組織上での異なるペプチドの提示を示した図である。
【図８Ａ】正常な腎臓と患者RCC100の腎細胞癌組織由来の、2つのペプチド種m/z 739.96と741.95の質量スペクトル。
【図８Ｂ】m/z 741.95（腫瘍）の衝突解離質量分析法により、ペプチド配列IMA-ADF-003、アジポフィリン由来のペプチド配列を示した。
【図９】IMA-ADF-001に対するin vivo免疫、MUC由来の2つのTUMAPでパルス化した自己由来の樹状細胞をワクチン接種した患者における、非ワクチン化ペプチドに対する2人のRCC患者におけるT細胞免疫性を示した図である。
【図１０】同じ患者と抗原について増幅ELISPOTアッセイで同定された、IMA誘発T細胞応答のそれぞれの例を示した図である。
【図１１】図１１は、増幅四量体（amplified tetramer）染色アッセイで同定された、IMA誘発T細胞応答の代表例を示した図である。
【図１１Ａ】IMA-CCN-01に対する免疫学的応答を確認する患者03-004のデータを示した図である。
【図１１Ｂ】IMA-RGS-001ペプチドに対する免疫学的応答を示さないが、ワクチン接種プロトコルのコース時間中にIMA-CCN-01四量体陽性応答を生じ、リンパ球の0.8％までを占める患者03-003のデータを示した図である。
【図１２】増幅四量体分析における1つの時点のT細胞動作の程度を観察した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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