(57)【要約】本発明は、血液試料中に存在し得る微生物からデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を抽出する方法に関し、前記方法は、ｉ）０．０１μｍ〜５０μｍ、特に０．１μｍ〜１０μｍ、とりわけ０．２μｍ〜１μｍの孔径を有する濾過膜を通して血液試料を濾過する工程、ｉｉ）前記濾過膜を洗浄する工程、及び、ｉｉｉ）前記濾過膜上に存在し得る微生物からデオキシリボ核酸を抽出する工程からなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）０．０１μｍ〜５０μｍ、特に０．１μｍ〜１０μｍ、とりわけ０．２μｍ〜１μｍの孔径を有する濾過膜を通して血液試料を濾過する工程と、
ｉｉ）前記濾過膜を洗浄する工程と、
ｉｉｉ）前記濾過膜上に存在する微生物からデオキシリボ核酸を抽出する工程と
からなる血液試料中に存在する微生物からのＤＮＡの抽出方法。
【請求項２】
前記方法が、更に、
ｉｖ）前記血液試料中に存在し得る微生物、特に細菌、ウイルス、原生動物及び／又は菌類を同定する工程
からなる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程ｉｖ）が、エンドポイントポリメラーゼ連鎖反応、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応、定性ポリメラーゼ連鎖反応、半定量ポリメラーゼ連鎖反応及び定量ポリメラーゼ連鎖反応からなる群より選択されるポリメラーゼ型の活性を用いた分子生物学的技術を使用する請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記方法が、更に、
ｖ）前記血液試料中に存在し得る少なくとも一種の微生物の少なくとも一つの抗生物質耐性遺伝子を同定する工程
からなる請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記工程ｖ）が、ポリメラーゼ連鎖反応技術を用いる請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記方法が、更に、
ｖｉ）前記血液試料中に存在し得る微生物、特に細菌、ウイルス、原生動物及び／又は菌類の量を測定する工程
からなる請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記濾過膜が、フッ化ポリビニリデン製、ポリエステル製、ナイロン製、ポリプロピレン製、ポリカーボネート製及びポリエーテルスルホン製の膜からなる群より選択され、特にフッ化ポリビニリデン製である請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記濾過膜がセルロース系ではないことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記血液試料が、全血試料、及び、血液培養物試料からなる群より選択される請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記工程ｉ）の前に、
ａ）全血又は血液培養物に赤血球の凝集溶液及び／又は血小板凝集溶液を加える工程、及び、
ｂ）工程ａ）で得られた調製物を、２μｍ〜５０μｍ、特に１０μｍ〜２５μｍ、とりわけ１７μｍの孔径を有するフィルタを通して濾過する工程
を含む請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記凝集溶液が、レクチン、ポリエチレンイミン、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、デキストラン及びポリエチレングリコールからなる群より選択される少なくとも一つの凝集剤からなり、特にＬｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓレクチンであることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記血小板凝集溶液が、血小板抗原、トロンビン、トリプシン、コラーゲン、トロンボキサンＡ２、血小板活性化因子、アドレナリン、アラキドン酸、セロトニン及びエピネフリンの特異的抗体からなる群より選択される少なくとも一つの血小板凝集剤からなり、特に血小板抗原及びコラーゲンの特異的抗体であることを特徴とする請求項１０又は１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液試料中に存在する微生物の検出及び同定の分野に関する。特に、血液試料中に存在する微生物から、それらを同定する目的でデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を抽出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液試料中に存在する微生物の検出、及び／又は同定、及び／又は濃度の測定を可能にする単純かつ迅速な方法の開発は、特に健康分野において主要な課題である。
現在、分子生物学的方法、特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術が急速に発展している。
【０００３】
その理由は、これらの技術が微生物の同定及び／又は定量に対して優れた検出感度及び特異性を提供するためである。しかし、血液試料に対するこれらの分子生物学的方法、特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の適用は、特に検出感度及び実施の点で困難である。
【０００４】
その理由は、血液試料が分子生物学的技術、特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を妨げる物質からなるためである。
これらの妨害物質はＤＮＡ抽出方法を妨害し、かつ／又は細胞のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を分解し、かつ／又は、酵素、特に様々な分子生物学的技術に用いられるポリメラーゼの活性を阻害し得る。
【０００５】
特に全血に存在し、特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を妨げるそれらの物質の例には、カルシウムイオン、ヘモグロビン、ラクトフェリン、ヘミン、尿素及び血液ヘパリンが挙げられる（Ａｌ−Ｓｏｕｄ  Ｗ．Ａ．ａｎｄ  Ｒａｄｓｔｒｏｍ  Ｐ．２００１．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＣＲ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｉｎ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３９：２：４８５−４９３）。したがって、血液試料中に存在する微生物から、それらを検出及び／又は同定する目的でＤＮＡを抽出する方法が依然必要とされている。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明の発明者らは、上述の課題を完全に又は部分的に解決する特定の方法を発見した。
第１の態様によれば、本発明の目的は血液試料中に存在する微生物からＤＮＡを抽出する方法にあって、前記方法は、
ｉ）０．０１μｍ〜５０μｍ、特に０．１μｍ〜１０μｍ、とりわけ０．２μｍ〜１μｍの孔径を有する濾過膜を通して血液試料を濾過する工程、
ｉｉ）前記濾過膜を洗浄する工程、
ｉｉｉ）前記濾過膜上に存在する微生物からデオキシリボ核酸を抽出する工程
からなる。
【０００７】
本発明において「血液試料」とは、その中に存在する赤血球及び／又は血小板の量を低下かつ／又は除去する目的で処理された全血又は血液培養物試料を意味する。
血液試料中に存在する赤血球及び／又は血小板の量を低下かつ／又は除去する目的で前記試料を処理する工程は、当業者に周知の技術によって実施され得る。
【０００８】
そのような技術の例には、ＰＣＴ出願の国際公開第０３／０２５２０７号パンフレットに開示される
・血小板抗原の特異的抗体等の凝集剤を用いた血小板凝集法に続き、処理された試料の濾過を行うこと、
・レクチン等の凝集剤を用いた赤血球の凝集法に続き、処理された試料の濾過を行うこと
が挙げられる。
【０００９】
全血試料は、例えば注射器に装着された針を用い、特に個人の前腕又は肘窩の静脈に挿入する技術等の、当業者に周知の技術によって得ることができる。ヒト又は被験動物から得られ、特に抗血液凝固剤、特にＥＤＴＡ、クエン酸ナトリウム又はヘパリンの下で採取される１〜１０ｍｌの血液試料が、本発明による方法を実施するために十分である。
【００１０】
血液培養物試料は、ヒト又は被験動物から採取された全血を、微生物の成長に適した培養培地に播種した後に得られる。
本発明の方法に適用される濾過膜は、当業者の一般知識に照らして容易に特定され得る。
【００１１】
特に、本発明による濾過膜は、ポリフッ化ビニリデン製、ポリエステル製、ナイロン製、ポリプロピレン製、ポリカーボネート製、及びポリエーテルスルホン製の膜からなる群より選択され、特にポリフッ化ビニリデン製である。
【００１２】
好ましくは、前記濾過膜はセルロース系ではない。
本発明による方法の濾過工程ｉ）は、当業者に周知の装置及び濾過支持体、特に米国特許出願公開第２００４／０２０８７９６号明細書に開示されるような支持体を用いて行われ得る。
【００１３】
工程ｉｉ）において、「洗浄」とは、前記濾過膜上に溜まった不純物の量を減少させ、かつ、前記微生物の少なくともいくつかを前記膜上に保持する工程を意味する。
前記不純物は、特に分子生物学的技術を妨げる物質であり（Ｗｉｌｓｏｎ  Ｊ．Ｇ．１９９７．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６３：１０：３７４１−３７５１）、特に、
・血漿タンパク質、免疫グロブリンＧ（Ａｌ−Ｓｏｕｄ  Ｗ．Ａ．，Ｊｏｎｓｓｏｎ  Ｌ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｒａｄｓｔｒｏｍ  Ｐ．２０００．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ  ｉｎ  ｂｌｏｏｄ  ａｓ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ＰＣＲ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３８：１：３４５−３５０）、
・酵素（プロテアーゼ）、
・ポリアミン類、
・ポリアネトールスルホン酸ナトリウム（ＳＰＳ）、
・ヘパリン（Ｓａｔｓａｎｇｉ  Ｊ．，Ｊｅｗｅｌｌ  Ｄ．Ｐ．，Ｗｅｌｓｈ  Ｋ．，Ｂｕｎｃｅ  Ｍ．，ａｎｄ  Ｂｅｌｌ  Ｊ．Ｉ．１９９４．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｈｅｐａｒｉｎ  ｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｌａｎｃｅｔ  ３４３：８９１１：１５０９−１５１０）、及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（Ａｌ−Ｓｏｕｄ  Ｗ．Ａ．ａｎｄ  Ｒａｄｓｔｒｏｎ  Ｐ．２００１．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＣＲ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｉｎ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３９：２：４８５−４９３）等の抗血液凝固剤、
・ヘモグロビン、ヘミン（Ａｋａｎｅ  Ａ．，Ｍａｔｓｕｂａｒａ  Ｋ．，Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｈ．，Ｔａｈａｈａｓｈｉ  Ｓ．，ａｎｄ  Ｋｉｍｕｒａ  Ｋ．１９９４．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｍｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｃｏｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｗｉｔｈ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（ＤＮＡ）ｆｒｏｍ  ｂｌｏｏｄｓｔａｉｎｓ，ａ  ｍａｊｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｓｃｉ  ３９：２：３６２−３７２）、ビリルビン、フェノール、
・ドデシル硫酸ナトリウム又はトリトンＸ１００等の界面活性剤、及び、
・胆汁酸
である。
【００１４】
有利には、前記工程ｉｉ）はまた、特に低温ショックによって血液試料の赤血球を溶解し、かつ、それらの赤血球に含有される内容物、特にヘモグロビンを除去することができる。
【００１５】
当業者は、一般知識に照らして工程ｉｉ）で用いられる洗浄溶液量を容易に決定することができるであろう。
前記洗浄溶液量は、工程ｉ）で濾過される前記血液試料の量の４分の１〜２倍、特に２分の１〜１０倍、とりわけ１〜５倍に相当する量であってもよい。
【００１６】
例えば、工程ｉ）において濾過される前記血液試料の量が０．２〜５ｍｌ、特に０．５〜１ｍｌの範囲にある場合、工程ｉｉ）は、１〜１０ｍｌ、特に３〜５ｍｌ、とりわけ３ｍｌの洗浄溶液量で行うことができる。
【００１７】
さらなる例として、工程ｉ）で濾過される血液試料の量が、５〜１００ｍｌ、特に５〜２０ｍｌである場合、工程ｉｉ）は、５〜５０ｍｌ、特に８〜２０ｍｌ、とりわけ１０ｍｌの洗浄溶液量で行うことができる。
【００１８】
本発明による方法に適用される洗浄溶液は、当業者が一般常識に照らして容易に特定され得る。
前記洗浄溶液は、特に水性溶液から選択することができ、特に水、とりわけ濾過により滅菌されていることが好ましい透析水である。
【００１９】
濾過による水の前記滅菌は、特に濾過膜を用いて行うことができ、その孔径は約０．２２μｍであってもよい。
本発明の洗浄工程ｉｉ）に用いられ得る洗浄溶液の例には、エッペンドルフ社から入手可能な、特に参照番号００３２．００６．１５９の分子生物学用の純水、周知の精製システム、特にＥＬＧＡラボウォータ社のＰｕｒｅｌａｂ（登録商標）システム、又はミリポア社のＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）システム、又はワーナー社のＩｎｆｉｎｉｔｙ  ＵＶ／ＵＦ（登録商標）システムから得られる純水が挙げられる。
【００２０】
本発明による方法が濾過装置及び／又は支持体を用いる場合、前記洗浄工程ｉｉ）は、工程ｉ）で用いられた前記濾過装置及び／又は濾過支持体において前記濾過膜をその位置に残したまま、前記濾過膜に前記洗浄溶液を通すことによって実施され得る。
【００２１】
前記濾過膜上に存在する微生物のデオキシリボ核酸の抽出工程は、特に熱又は超音波処理による物理的溶解方法、特にＳａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ  Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．の手引書（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）に開示されている化学的溶解方法等の当業者に周知の技術によって行われ得る。
【００２２】
「微生物」とは、次の三界、すなわちのモネラ界、原生生物界、及び原生動物界のうちの一つに所属する生物を意味する。微生物は真核又は原核又は無核の細胞構造、微細又は超微細な大きさを有し、かつ単細胞である。微生物の例には以下のものが挙げられる。
・大腸菌、クレブシエラ菌、赤痢菌、連鎖球菌、ブドウ球菌、腸球菌、変形菌、腸内細菌、セラチア菌、シュードモナス菌、バチルス菌、コリネバクテリア、リステリア菌、アシネトバクター、クリプトコッカス、バルトネラ菌、及びミクロバクテリア等の細菌、及び、
・カンジダ菌及びアスペルギルス等の菌類。
【００２３】
特に、本発明による方法は更に以下の工程からなる。
ｉｖ）前記血液試料中に存在し得る微生物、特に細菌、ウイルス、原生動物及び／又は菌類を同定する工程。
【００２４】
「同定」とは、微生物種を確定することを意味する。
前記微生物の同定は、当業者に周知の分子生物学的技術によって前記微生物から抽出されるデオキシリボ核酸を用いて行われ得る。
【００２５】
特に、工程ｉｖ）はエンドポイントポリメラーゼ連鎖反応、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応、定性ポリメラーゼ連鎖反応、半定量ポリメラーゼ連鎖反応及び定量ポリメラーゼ連鎖反応からなる群より選択されるポリメラーゼ型の活性を用いる技術の使用からなる。
【００２６】
本発明による方法では、アプライド・バイオシステムズ社から「ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）」の名称で、及びロシュ・ダイアグノティクス社から「ＣＯＢＡＳ  Ａｍｐｌｉｃｏｒ（登録商標）」の名称で入手可能なエンドポイントＰＣＲ装置を使用することができる。
【００２７】
本発明による方法では、アプライド・バイオシステムズ社から「７５００  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）」の名称で、ロシュ・ダイアグノティクス社から「ＣＯＢＡＳ  Ｔａｑｍａｎ（登録商標）」の名称で、及びジーンシステムズ社から「ＧｅｎｅＤｉｓｃ  ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）」の名称で入手可能なリアルタイムＰＣＲ装置を使用することができる。
【００２８】
本発明による方法では、ロシュ社の参照番号０４４６９０４６００１又は０４４８８８１４００１の「Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ  ＳｅｐｔｉＦａｓｔ  ｋｉｔ（登録商標）」、バイオタージ社の参照番号８、７、及び１２の「ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ」キット、ＢＡＧ（Ｂｉｏｌｏｇｉｓｈ  Ａｎａｌｙｓｅｎｓｙｓｔｅｍ  ＧｍｂＨ）社の参照番号３８０１の「Ｈｙｐｌｅｘ  ＳｔａｐｈｙｌｏＲｅｓｉｓｔ（登録商標）」、参照番号３８０９の「Ｈｙｐｌｅｘ  ＳｔａｐｈｙｌｏＲｅｓｉｓｔ  Ｐｌｕｓ」、及び参照番号３８０２の「Ｈｙｐｌｅｘ  ＥｎｔｅｒｏＲｅｓｉｓｔ（登録商標）」として入手可能な、微生物に特異的なプローブ及びプライマー対を伴うリアルタイムＰＣＲキットを使用することができる。例えば、Ａｒｇｅｎｅ社から入手可能な参照番号６９−００２のリアルタイムＰＣＲキットは、血液試料中に存在するエプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）の同定及び量の測定に使用可能である。
【００２９】
特定の実施形態によれば、本発明の方法は更に以下の工程からなる。
ｖ）前記血液試料中に存在し得る少なくとも一種の微生物の少なくとも一つの抗生物質耐性遺伝子を同定する工程。
【００３０】
微生物から抽出されるデオキシリボ核酸を用いた抗生物質耐性遺伝子の同定は、当業者に周知の分子生物学的技術によって実施され得る。
特に、工程ｖ）は少なくとも一つの抗生物質耐性遺伝子に特異的なプライマー対及びプローブを用いるポリメラーゼ連鎖反応技術の使用からなる。
【００３１】
別の特定の実施形態によれば、本発明の方法は更に以下の工程からなる。
ｖｉ）前記血液試料中に存在し得る微生物、特に細菌、ウイルス、原生動物及び／又は菌類の量を測定する工程。
【００３２】
「微生物の量」とは、本発明の方法の実施を受ける血液試料中に存在する微生物の量を意味する。
前記血液試料中に存在し得る微生物の量の測定は、当業者に周知の技術によって行われ得る。
【００３３】
例として、この測定は微生物を同定する工程ｉｖ）で得られた結果を、前記微生物の所定の希釈物に相当する陽性基準から得られた結果と比較することによって行われ得る。
特に、工程ｖｉ）はリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応技術の使用からなる。
【００３４】
有利には、本発明による方法の工程ｉｖ）、ｖ）又はｖｉ）の少なくとも一つは、工程ｉｉｉ）で得られた微生物のデオキシリボ核酸の抽出物からなり、少なくとも一つの分子生物学的技術が適用される媒体において実施される。
【００３５】
「少なくとも一つの分子生物学的技術が適用される媒体」とは、これらの技術、特にポリメラーゼ連鎖反応の効率、及び／又は感度、及び／又は特異性を高めるための物質からなる媒体を意味する。
【００３６】
そのような媒体は当業者に周知であり、例えば文献（Ｗｉｌｓｏｎ  Ｊ．Ｇ．１９９７．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６３：１０：３７４１−３７５１）に開示されている。
【００３７】
ＰＣＲ技術に適用される媒体の例には、以下のもの、すなわち、特にウシ血清アルブミン（Ａｋａｎｅ  Ａ．，Ｍａｔｓｕｂａｒａ  Ｋ．，  Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｈ．，Ｔａｈａｈａｓｈｉ  Ｓ．，ａｎｄ  Ｋｉｍｕｒａ  Ｋ．１９９４．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｍｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｃｏｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｗｉｔｈ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（ＤＮＡ）ｆｒｏｍ  ｂｌｏｏｄｓｔａｉｎｓ，ａ  ｍａｊｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｓｃｉ  ３９：２：３６２−３７２）、グリセロール、マグネシウムイオン（Ｓａｔｓａｎｇｉ  Ｊ．，Ｊｅｗｅｌｌ  Ｄ．Ｐ．，Ｗｅｌｓｈ  Ｋ．，Ｂｕｎｃｅ  Ｍ．，ａｎｄ  Ｂｅｌｌ  Ｊ．Ｉ．１９９４．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｈｅｐａｒｉｎ  ｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｌａｎｃｅｔ  ３４３：８９１１：１５０９−１５１０）、トリメチルグリシン、ジメチルスルホキシド、ポリエチレングリコール、Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ４０（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標）、ＤＭＳＯ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４（登録商標）、ベタイン一水和物、ベタイントリメチルグリシン、ＰＥＧ３５０００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６０００、及びアセトアミドからなる媒体が挙げられる。
【００３８】
特定の実施形態によれば、本発明の方法は、工程ｉ）の前に、以下の工程、すなわち、
ａ）全血、又は、赤血球凝集溶液及び／又は血小板凝集溶液の血液培養物を添加する工程、及び、
ｂ）工程ａ）で得られた調製物を、２μｍ〜５０μｍ、特に１０μｍ〜２５μｍ、とりわけ１７μｍの孔径を有するフィルタを通して濾過する工程
を含む。
【００３９】
特に、前記赤血球の凝集溶液は、レクチン、ポリエチレンイミン、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、デキストラン及びポリエチレングリコールからなる群より選択される少なくとも一つの凝集剤からなり、特にレクチンである。
【００４０】
特に、前記レクチンは、ｌｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｖｉｃｉａ  ｓａｔｉｖａ、Ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ及びＥｒｙｔｈｒｉｎａ  ｃｏｒａｌｌｏｄｅｎｄｒｏｎレクチンからなる群より選択される。
【００４１】
前記凝集剤、特にレクチンは、前記凝集溶液中に１０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌ、特に１５μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、とりわけ２０μｇ／ｍｌ〜３０μｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。
【００４２】
特に、前記血小板凝集溶液は、特異的血小板抗原抗体、トロンビン、トリプシン、コラーゲン、トロンボキサンＡ２、血小板活性化因子、アドレナリン、アラキドン酸、セロトニン、及びエピネフリンからなる群より選択される少なくとも一つの血小板凝集剤からなり、特に血小板抗原及びコラーゲンの特異的抗体である。
【００４３】
前記血小板抗原の特異的抗体は、血小板凝集溶液中に、０．５μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、特に１μｇ／ｍｌ〜６０μｇ／ｍｌ、とりわけ５μｇ／ｍｌ〜４５μｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。
【００４４】
前記コラーゲンは、前記血小板凝集溶液中に、０．０５μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ、特に１μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。
本発明の他の効果及び特徴は、以下の図面及び実施例に照らして明らかになるであろう。
【００４５】
以下の図面及び実施例は、例示として提示されるものであり、限定的なものではない。
・図１（Ａ及びＢ）は、全血試料中に存在する大腸菌の同定及び定量を示す。図１Ａは、蛍光プローブ及び一対の大腸菌特異的プライマーを用いたリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応の結果を曲線で示す。図１Ｂは、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応の閾値サイクル及び増幅を表で示す。
・図２（Ａ及びＢ）は、全血試料中に存在する表皮ブドウ球菌の同定及び定量を示す。図２Ａは、蛍光プローブ及び一対の表皮ブドウ球菌特異的プライマーを用いたリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応の結果を曲線で示す。図２Ｂは、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応の閾値サイクル及び振幅を表で示す。
・図３Ａは、蛍光プローブ及び一対の大腸菌特異的プライマーを用いたエンドポイントポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び泳動後のアガロースゲルの写真を示す。
・図３Ｂは、蛍光プローブ及び一対の大腸菌特異的プライマーを用いたリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の結果を示す。
・図４は、血液培養物試料中に存在する大腸菌、表皮ブドウ球菌及びクレブシエラ・オキシトカの同定及び定量を曲線で示す。図４は、蛍光プローブ及び大腸菌、表皮ブドウ球菌、及びクレブシエラ・オキシトカ特異的プライマーを用いたリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応の結果を曲線で示す。
・図５は、ＥＤＴＡ（図５Ａ）及びクエン酸ナトリウム（図５Ｂ）の下で採取された全血試料中に存在する大腸菌の同定及び定量、及び、ヘパリン（図５Ｃ）の下で採取された全血試料中に存在する表皮ブドウ球菌の同定及び定量を曲線で示す。図５は、蛍光プローブ及び大腸菌及び表皮ブドウ球菌特異的プライマーを用いたリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応の結果を曲線で示す。
【実施例１】
【００４６】
Ｉ．血液試料の調製方法
（Ｉ．１  血液培養物試料の調製方法）
１００μｌの血液培養物試料が、滅菌注射器を用いて血液培養フラスコの隔膜を通して採取された。１ｍｌの濾過透析水（約０．２２μｍの孔径を有するフィルタを用いた）が各試料に加えられた。
【００４７】
各試料は、０．２μｍ〜１μｍの孔径を有する直径２５〜３２ｍｍのフッ化ポリビニリデン濾過膜を通して濾過された。前記濾過膜は、米国特許出願公開第２００４／０２０８７６９号明細書に開示されているような濾過支持体に包含された。
【００４８】
その後、各濾過膜は、１〜１０ｍｌの純水又は約０．２２μｍの孔径を有するフィルタを用いた濾過により透析された水で洗浄された。
濾過の後、各濾過膜は滅菌ピンセットで回収され、２００μｌ〜１ｍｌの
・エッペンドルフ社によって販売されているような、分子生物学用の純水、又は、
・ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が０．７％添加された分子生物学用の純水、又は、
・トリスＨＣｌが１２５ｍＭ、ベタインが１６０ｍＭ、及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が５％添加され、１ＭのＮａＯＨでｐＨ９．３に調整された分子生物学用の純水
を入れた滅菌マイクロチューブに挿入された。
（Ｉ．２  全血試料の調製）
抗凝集剤（ＥＤＴＡ、ヘパリン又はクエン酸ナトリウム）の下で採取された５ｍｌの全血が２０ｍｌの赤血球凝集溶液に加えられた。
【００４９】
前記凝集溶液は、７５％ブレイン・ハート・ブロス及び２５％トリプトンソイブロス（ＴＳＢ）を含む培地中２５μｇ／ｍｌのｌｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓレクチン、１％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなる。
【００５０】
室温で３０分培養後、赤血球は濃縮物となって凝集した。
１５〜２０ｍｌの赤血球凝集物の上清が取り出され、１ｍｌの血小板凝集物溶液と共に培養された。
【００５１】
前記凝集物溶液は、７５％ブレイン・ハート・ブロス及び２５％ＴＳＢを含む培地中４５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ９モノクローナル抗体からなる。
前記血小板の凝集後、調製物は約１７μｍの孔径を有するフィルタを通して濾過された。
【００５２】
この濾過工程は、フィルタ上にフィルタの孔の大きさよりも大きい血小板凝集物及び血液細胞を留めることを可能にした。
濾過物は、再度０．２μｍ〜１μｍの孔径を有する直径２５〜３２ｍｍのフッ化ポリビニリデン濾過膜を通して濾過された。前記濾過膜は米国特許出願公開第２００４／０２０８７９６号明細書に開示されるような濾過支持体に包含された。
【００５３】
前記濾過膜は、続いて８〜２０ｍｌの純水又は濾過による透析水で洗浄された。
濾過後、濾過膜は滅菌ピンセットで回収され、２００μｌ〜１ｍｌの
・エッペンドルフ社によって販売されているような、分子生物学用の純水、又は、
・ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が０．７％添加された分子生物学用の純水、又は、
・トリスＨＣｌが１２５ｍＭ、ベタインが１６０ｍＭ、及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が５％添加され、１ＭのＮａＯＨでｐＨ９．３に調整された分子生物学用の純水
のいずれかが入っている滅菌マイクロチューブに挿入された。
【実施例２】
【００５４】
ＩＩ．血液試料中に存在する微生物の同定
（ＩＩ．１  ＤＮＡ抽出方法）
実施例１に記載の方法を実施した後に得られ、滅菌マイクロチューブに入れられた濾過膜から、ＤＮＡが抽出された。
【００５５】
各マイクロチューブは、連続する加熱及び／又は超音波処理工程、及び／又はＭａｎｉａｔｉｓに開示されるような凍結工程（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ  Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．ｉｎ“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”（１９９２），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に曝された。
（ＩＩ．２  使用されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術）
ＩＩ．２．１  リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術
前の項目（ＩＩ．１）に記載の方法によって抽出された３０〜４２μｌのＤＮＡは、緩衝媒体中にＴａｑ（登録商標）ポリメラーゼ及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む混合液３０μｌに加えられた。
【００５６】
この調製物の１２μｌが、蛍光プローブ及びＰＣＴ出願の国際公開第２００４／０２４９４４号パンフレットに開示されるような検出されるべき微生物系の特異的プライマー対を含むウェルに入れられた。陰性基準は蛍光プローブを含まないウェルに相当する。
【００５７】
陽性基準は、合成したＤＮＡ配列と共に、蛍光プローブ及び前記配列の特異的プライマー対を含むウェルに相当する。
結果は、第一に、増幅サイクルの関数として蛍光強度の変化を示す増幅曲線で表示されている（図１、２及び４に示される曲線）。
【００５８】
第二に、図１及び３の表は、実施された各ポリメラーゼ連鎖反応について、
・ＤＮＡの指数増幅期に達するまでに必要な最小サイクル数に相当する閾値サイクル、すなわちＣｔ、
・得られる最大及び最小蛍光強度の間の差に相当する振幅
を示す。
ＩＩ．２．２  従来のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術及びその後のアガロースゲル泳動
前の項目（ＩＩ．１）に記載の方法によって抽出された７μｌのＤＮＡが、緩衝媒体中にＴａｑ（登録商標）ポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）及び検出されるべき微生物の特異的プライマー対を含む混合液４３μｌに加えられた。
【００５９】
４０サイクルの増幅が実施された。
その後、１５μｌの増幅ＤＮＡがピペットで採取され、そこに３μｌのブロモフェノールブルーが加えられ、この調製物はアガロースゲルのウェルに入れられた。
【００６０】
増幅ＤＮＡ断片を、それらの分子量（ＭＷ）にしたがって泳動させるため、電流が適用された。
泳動後のアガロースゲルの写真が図３Ａに示されている。
（ＩＩ．３  全血試料中に存在する大腸菌及び表皮ブドウ球菌の同定）
項目Ｉ．２に記載の、濾過膜が約０．６５μｍの孔径を有する直径２５ｍｍのフッ化ポリビニリデンから形成されているプロトコルにしたがい、５ｍｌの全血が処理された。約０．２２ｍｍの孔径を有するフィルタを用いて濾過された８ｍｌの透析水が、濾過膜の洗浄に用いられた。
【００６１】
項目ＩＩ．１に記載のプロトコルによるＤＮＡ抽出の後、項目ＩＩ．２．１に記載のプロトコルにしたがい、蛍光プローブ、及び、大腸菌及び表皮ブドウ球菌に特異的プライマー対を用いたリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が実施された。
【００６２】
図１（Ａ及びＢ）は、蛍光プローブ及び大腸菌の特異的プライマー対を用いたポリメラーゼ連鎖反応の結果を示す。
図２（Ａ及びＢ）は、蛍光プローブ及び表皮ブドウ球菌の特異的プライマー対を用いたポリメラーゼ連鎖反応の結果を示す。
【００６３】
これらの結果は、本発明による全血試料の調製方法から、ポリメラーゼ連鎖反応技術により微生物を特異的かつ再生可能な態様で同定及び定量できる試料が得られることを示している。
（ＩＩ．４  全血試料中に存在する大腸菌の同定）
項目Ｉ．２に記載の、濾過膜が約０．６５μｍの孔径を有する直径２５ｍｍのフッ化ポリビニリデンから形成されているプロトコルにしたがい、５ｍｌの全血が処理された。約０．２２ｍｍの孔径を有するフィルタによって濾過された８ｍｌの透析水が、濾過膜の洗浄に用いられた。
【００６４】
項目ＩＩ．１に記載のプロトコルによるＤＮＡ抽出の後、ＰＣＲの感度を調べるため、ＤＮＡ抽出物の分子生物学用の純水への希釈が行われた。ＤＮＡ抽出物の希釈は１００分の１〜５００００分の１で行った。
【００６５】
続いて、項目ＩＩ．２．１に記載のプロトコルによるリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び項目ＩＩ．２．２に記載のエンドポイントポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が実施された。蛍光プローブ及び大腸菌の特異的プライマー対が用いられた。
【００６６】
図３Ａは、蛍光プローブ及び大腸菌の特異的プライマー対を用いた従来のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、及び泳動後のアガロースゲルの写真を示す。
図３Ｂは、蛍光プローブ及び大腸菌の特異的プライマー対を用いたリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の結果を示す。
【００６７】
これらの結果は、本発明による全血に由来する血液試料の調製方法から、リアルタイム又はエンドポイントポリメラーゼ連鎖反応技術により微生物を特異的かつ再生可能な態様で、さらに一定の感度で同定及び定量できる試料が得られることを示している。
（ＩＩ．５  血液培養物試料中に存在する大腸菌、表皮ブドウ球菌、及びクレブシエラ・オキシトカの同定）
項目Ｉ．１に記載の、濾過膜が約０．６５μｍの孔径を有する直径２５ｍｍのフッ化ポリビニリデンから形成されているプロトコルにしたがい、血液培養物試料が調製された。３ｍｌの透析水が濾過膜の洗浄に用いられた。
【００６８】
項目ＩＩ．１に記載のプロトコルによるＤＮＡ抽出の後、項目ＩＩ．２．１に記載のプロトコルにしたがい、蛍光プローブ、及び、大腸菌、表皮ブドウ球菌及びクレブシエラ・オキシトカの特異的プライマー対を用いたリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が実施された。結果は図４に示されている。
【００６９】
これらの結果は、本発明による血液培養物に由来する血液試料の調製方法から、ポリメラーゼ連鎖反応技術により微生物を特異的かつ再生可能な態様で同定及び定量できる試料が得られることを示している。
（ＩＩ．６  異なる抗凝固剤から採取される全血試料中に存在する大腸菌及び表皮ブドウ球菌の同定）
血液抗凝固剤のＥＤＴＡ三カリウム塩、クエン酸ナトリウム又はヘパリン（ヘパリンリチウム）タイプの入ったチューブから採取された５ｍｌの全血が、項目Ｉ．２に記載の、濾過膜が約０．６５μｍの孔径を有する直径２５ｍｍのフッ化ポリビニリデンから形成されているプロトコルにしたがって処理された。約０．２２μｍの孔径を有するフィルタによって濾過された８ｍｌの透析水が、濾過膜の洗浄に用いられた。
【００７０】
項目ＩＩ．１に記載のプロトコルによるＤＮＡ抽出の後、項目ＩＩ．２．１に記載のプロトコルにしたがい、蛍光プローブ、及び、大腸菌及び表皮ブドウ球菌の特異的プライマー対を用いたリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が実施された。
【００７１】
図５Ａ及び５Ｂは、ＥＤＴＡ三カリウム塩（図５Ａ）及びクエン酸塩（図５Ｂ）の下で採取された全血に由来する微生物ＤＮＡに対し、蛍光プローブ及び大腸菌の特異的プライマー対を用いたポリメラーゼ連鎖反応の結果を示す。
【００７２】
図５Ｃは、ヘパリン（図５Ｃ）の下で採取された全血に由来する微生物ＤＮＡに対し、蛍光プローブ及び表皮ブドウ球菌の特異的プライマー対を用いたポリメラーゼ連鎖反応の結果を示す。
【００７３】
これらの結果は、本発明による異なる抗凝固剤の下で採取された全血に由来する血液試料の調製方法から、ポリメラーゼ連鎖反応技術により微生物を特異的かつ再生可能な態様で同定及び定量できる試料が得られることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１Ａ】蛍光プローブ及び一対の大腸菌特異的プライマーを用いたリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応の結果を曲線で示す。
【図１Ｂ】リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応の閾値サイクル及び振幅を表で示す。
【図２Ａ】蛍光プローブ及び一対の表皮ブドウ球菌特異的プライマーを用いたリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応の結果を曲線で示す。
【図２Ｂ】リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応の閾値サイクル及び振幅を表で示す。
【図３Ａ】蛍光プローブ及び一対の大腸菌特異的プライマーを用いたエンドポイントポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び泳動後のアガロースゲルの写真を示す。
【図３Ｂ】蛍光プローブ及び一対の大腸菌特異的プライマーを用いたリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の結果を示す。
【図４】血液培養物試料中に存在する大腸菌、表皮ブドウ球菌及びクレブシエラ・オキシトカの同定及び定量を曲線で示す。
【図５Ａ】ＥＤＴＡの下で採取された全血試料中に存在する大腸菌の同定及び定量を曲線で示す。
【図５Ｂ】クエン酸ナトリウムの下で採取された全血試料中に存在する大腸菌の同定及び定量を曲線で示す。
【図５Ｃ】ヘパリンの下で採取された全血試料中に存在する表皮ブドウ球菌の同定及び定量を曲線で示す。
【図１Ａ】
2009537167.tif 000002
【図１Ｂ】
2009537167.tif 000003
【図２Ａ】
2009537167.tif 000004
【図２Ｂ】
2009537167.tif 000005
【図３Ｂ】
2009537167.tif 000006
【図４】
2009537167.tif 000007
【図５Ａ】
2009537167.tif 000008
【図５Ｂ】
2009537167.tif 000009
【図５Ｃ】
2009537167.tif 000010
【図３Ａ】
2009537167.tif 000011
【国際調査報告】
2009537167.tif 000012
2009537167.tif 000013
2009537167.tif 000014
2009537167.tif 000015
2009537167.tif 000016
2009537167.tif 000017