(57)【要約】本発明は、自己免疫障害を処置するための薬学的製剤および方法に関する。本製剤および方法は、障害を有するかまたは障害を有する素因がある患者に2つの別々の物質を投与する併用療法レジメンを提供する。2つの成分は、少なくとも1つの免疫調節ペプチドおよびクロロキン誘導体を含む。2つの成分の組み合わせを一緒にまたは別々に投与することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫調節ポリペプチドおよびクロロキン分子を含む組成物。
【請求項２】
ポリペプチドが約10〜100 mgの濃度を有し、かつクロロキン分子が約200および400 mgの濃度を有する、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
ポリペプチドが配列番号：1〜配列番号：57からなる群より選択される、請求項1記載の組成物。
【請求項４】
クロロキン分子が、ヒドロキシクロロキン、硫酸ヒドロキシクロロキン、およびクロロキンからなる群より選択される、請求項1記載の組成物。
【請求項５】
自己免疫障害を処置する方法であって、その必要がある対象に治療的有効量の免疫調節ポリペプチドおよびクロロキン分子を投与し、それによって自己免疫障害を処置する工程を含む、方法。
【請求項６】
対象がヒトまたは動物である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
投与が、経口投与、粘膜投与、摂取、経鼻投与、気管支投与、および結腸投与からなる群より選択される経路によって行われる、請求項5記載の方法。
【請求項８】
約2.5〜100 mgの免疫調節ポリペプチドが投与される、請求項5記載の方法。
【請求項９】
約10〜50 mgの免疫調節ポリペプチドが投与される、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
約10、15、20、25、30、35、40、または50 mgの免疫調節ポリペプチドが投与される、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
免疫調節ポリペプチドが1日に少なくとも1回投与される、請求項5記載の方法。
【請求項１２】
免疫調節ポリペプチドが1日に少なくとも2回投与される、請求項5記載の方法。
【請求項１３】
約150〜500 mgのクロロキン分子が投与される、請求項5記載の方法。
【請求項１４】
約190〜450 mgのクロロキン分子が投与される、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
約200〜400 mgのクロロキン分子が投与される、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
クロロキン分子が1日に少なくとも2回投与される、請求項13記載の方法。
【請求項１７】
免疫調節ポリペプチドが配列番号：1〜57のいずれか1つから選択される、請求項5記載の方法。
【請求項１８】
クロロキン分子が、ヒドロキシクロロキン、硫酸ヒドロキシクロロキン、およびクロロキンからなる群より選択される、請求項5記載の方法。
【請求項１９】
自己免疫障害が、関節炎、関節リウマチ、若年性突発性関節炎、乾癬性関節炎、および乾癬からなる群より選択される、請求項5記載の方法。
【請求項２０】
自己免疫障害が、多発性硬化症、炎症性腸疾患、およびクローン病からなる群より選択される、請求項5記載の方法。
【請求項２１】
免疫調節ポリペプチドおよびクロロキン分子が対象に同時に投与される、請求項5記載の方法。
【請求項２２】
免疫調節ポリペプチドおよびクロロキン分子が対象に連続的に投与される、請求項5記載の方法。
【請求項２３】
免疫調節ポリペプチドがクロロキン分子の投与後に投与される、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
免疫調節ポリペプチドがクロロキン分子の投与前に投与される、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
自己免疫障害を処置する方法であって、その必要がある対象に免疫調節ポリペプチドおよびクロロキン誘導体を含む薬学的組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項２６】
ポリペプチドとクロロキン分子の組み合わせを投与した後に自己免疫状態が改善されるということを特徴とする、自己免疫状態を処置するための医用薬剤の製造における、免疫調節ポリペプチドおよびクロロキン分子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、自己免疫障害を処置するための免疫調節を標的とした治療に関し、より具体的には、免疫介在性疾患における自己免疫毒性を改善するための組み合わせ処置治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景情報
以下の説明は、本発明を理解する際に有用となる可能性のある情報を含む。これは、任意のそのような情報が、特許請求される本発明にとって先行技術である、または任意のそのような情報が、特許請求される本発明と関連している、または具体的にもしくは暗黙的に参照される任意の刊行物が、先行技術であると認めるものではない。
【０００３】
関節リウマチおよびその他のヒト自己免疫疾患を処置するための最近の治療は、免疫系の非特異的な抑制に基づいている。そのように基づいている処置レジメンでは、炎症性免疫経路が標的とされ、結果として、非特異性によって引き起こされる毒性と、意図される疾患寛解の恩恵の感知とのバランスを取ることに取り組む必要がある。
【０００４】
例えば、関節リウマチに関して、第一世代の生物学的薬剤には、1つまたは別の構成要素、例えば、TNFαなどの炎症性サイトカインを遮断することによって炎症カスケードに干渉する薬剤が含まれている。病原性経路とのそのような直接的な生物学的干渉は、増え続ける数の分子、主としてサイトカインに対して考慮され、一般化された薬理学的免疫抑制が、より個々の必要性に応じた処置経路に置き替えられる。
【０００５】
自己の認識が生理的かつ必須の現象であるというさらなる理解、ならびに自己の認識による損傷を起こさないことを確実なものとし、かつ感染などの感知された「危険」を取り除くことを目的とした必須の炎症応答を、その「危険」が排除されれば直ちに下方制御することを確実なものとする複雑な機構によって、免疫応答の「質」および「強度」が制御されるというさらなる理解を考慮すると、組織損傷を防ぐために免疫応答の質的および量的な制御に寄与する一連の複雑な相補的かつ相互作用的な経路を考慮に入れた処置レジメンに対する必要性が当技術分野にある。この文脈において、寛容を得るために免疫系に影響を与えることは、調光スイッチを利用することと似通っており；すなわち、経路の完全なオン／オフ切替えを引き起こすよりもむしろ、反応性を軽減する。したがって、寛容経路に焦点を合わせたさらなる処置レジメンは、毒性のある免疫反応性をもたらさないように、この複雑性を考慮すべきである。
【０００６】
関節リウマチに対する治療などにおける、幾つかの寛容経路に焦点を合わせた処置レジメンは、抗原特異的ではない。免疫応答を非特異的な様式で鈍らせるか、または減弱させることが、個々の治療およびレジメンによって明らかに変化する出来事の頻度および重大性に関して望ましくない効果をもたらし得るということをデータは示唆している。したがって、免疫処置の技術分野を前進させるための処置法ならびに治療的製剤および組成物に対する必要性が当技術分野に今なお存在する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、関節リウマチならびにその他のヒト自己免疫疾患および障害などの、炎症性自己免疫障害に関連し、かつ免疫調節ペプチドおよびクロロキン誘導体の組み合わせの投与を含むその処置に関連する。
【０００８】
1つの態様において、本発明は、患者における自己免疫毒性を改善させるための1つまたは複数の免疫調節ペプチドおよびクロロキン誘導体の治療量の組み合わせを、その必要がある患者に投与することによって自己免疫障害を処置する方法を提供する。1つの態様において、免疫調節ペプチドは、表Iに開示した配列の群より選択される。
【０００９】
別の態様において、本発明は、免疫調節ペプチドおよびクロロキン誘導体の組み合わせの粘膜投与による、関節リウマチ（RA）、若年性突発性関節炎（JIA）、乾癬性関節炎（PA）、および乾癬を含むがこれらに限定されない、関節リウマチならびにその他のヒト自己免疫疾患および障害などの、炎症性自己免疫障害の処置のための方法を提供する。免疫調節ペプチドとは、任意の順序のアミノ酸を含むポリペプチド、またはMHCクラスII分子に結合しかつ疾患と関連性のある様式で免疫経路に影響を与えることができる模倣ペプチド分子を意味する。
【００１０】
別の態様において、本発明は、熱ショックタンパク質由来のポリペプチドまたはその模倣物を含む少なくとも1つの免疫調節ペプチドおよび少なくとも1つのクロロキン誘導体の粘膜投与を含む、RA、JIA、PA、および乾癬を処置する方法を提供する。
【００１１】
別の態様において、本発明は、少なくとも1つの免疫調節熱ショックポリペプチドおよび少なくとも1つのクロロキン誘導体の組み合わせを含む薬学的組成物を提供する。組成物は、固相、コロイド相、液相、蒸気相、または気相中にあってもよい。関連する態様において、製剤は、当業者に周知であるような薬学的に許容される塩および／またはその他の物質をさらに含むことができる。さらに関連する態様において、製剤は、患者に対する有益な結果のための処置レジメンにおいて使用するための、その必要がある患者への投与のための1つの処方混合物、または別々に、連続的に、もしくは同時に投与されることが意図された別々に製剤化された組成物、またはその任意の組み合わせを含むことができる。
【００１２】
別の態様において、本発明は、ペプチドおよびクロロキン誘導体を投与するための処置レジメンを含む。通常、ペプチドおよびクロロキンの両方を、その必要がある患者の粘膜に吸収可能な形態で一緒に投与することができる。あるいは、ペプチドおよびクロロキン成分を、同様に患者への粘膜送達によって任意の順序で互いに別々に投与することができる。
【００１３】
別の局面において、本発明は、ペプチド模倣物またはペプチド誘導体、ならびに天然の熱ショックタンパク質由来のポリペプチド配列の分子構造を模倣しおよび／またはMHCクラスII分子に結合して疾患に関連性のある様式で免疫経路の調節に影響する能力を保有する、その他の分子構造の使用を提供する。このように、本発明は、自己免疫障害を処置するのに有用な薬剤を同定する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図1A〜1Cは、免疫調節ペプチドおよび(ヒドロキシ)クロロキンによる処置に対する応答のレベルを示すグラフである。図1Aで示すように、ACR20によるdnaJP1およびHCQのレシピエントは、驚くべきかつ予期しない明白で相乗的な応答を示す。図1BはACR50応答の結果を示し、一方で図1CはACR70の結果を示す。
【図２】図2A〜2Cは、図1と同じ基準による検討における全ての患者の結果を示し、すなわち、図2AはACR20応答パーセンテージを示し、図2BはACR50応答の結果を示し、一方で図2CはACR70の結果を示す。
【図３】図3A〜3Cは、検討における(ヒドロキシ)クロロキンを受けなかった全ての患者についての結果を示す。図3AはACR20応答パーセンテージを示し、図3BはACR50応答の結果を示し、一方で図3CはACR70の結果を示す。
【図４】図4A〜4Cは、検討におけるdnaJP1単独かまたは(ヒドロキシ)クロロキンかのいずれかを受けた全ての患者についての結果を示す。図4AはACR20応答パーセンテージを示し、図4BはACR50応答の結果を示し、一方で図4CはACR70の結果を示す。
【図５】プラセボについて観察されたほとんどない効果とdnaJP1刺激によるTNFαの減少の相関を示す棒グラフである。
【図６】図6Aおよび6Bは、処置後のIL-10の増加への移行を示すプロットである。示されたように、dnaJP1群は増加と相関したが、プラセボ群は相関しなかった。
【図７】図7A〜7Cは、プラセボ（n=79）およびdnaJP1（n=81）を用いた検討で処置された全ての患者由来のT細胞によるIFN-γおよびIL-10の産生を示す。結果を、168日目から0日目の間の差としてIFN-γを産生するCD3+ T細胞のパーセントで表す（図7A）。図7Bおよび7Cは、IL-10産生の相関を示す。IFN-γおよびIL-10両方とも、168日目のHCQ-dnaJP1の組み合わせ群で増加している。
【図８】図8A〜8Cは、データがHCQを受けている全ての患者についてのものであるということを除き、図7A〜7Cと同じ様式でのIFN-γおよびIL-10の産生を示す。
【図９】図9A〜9Dは、dnaJP1特異的なT細胞の数の比較をdnaJP1による粘膜寛容化の前後の全体のT細胞のパーセンテージとして示す細胞分離解析である。
【図１０】免疫調節処置がFox P3発現の増加と関連することを示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、種々の自己免疫障害、例えば、関節リウマチ、若年性突発性関節炎、炎症性腸疾患、クローン病、ならびに多発性硬化症、乾癬性関節炎、および乾癬を処置する製剤および方法を提供する。
【００１６】
本発明の組成物および方法を記載する前に、本発明は、記載した特定の組成物、方法、および実験条件に限定されず、したがって、組成物、方法、および条件は変化し得るということが理解されるべきである。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で用いる専門用語は、特定の態様のみを記載する目的のためのものであり、限定的であるとは意図されないということが理解されるべきである。
【００１７】
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いる場合、文脈上明確に別途指示されない限り、単数形の「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」には、複数のものに関する言及が含まれる。したがって、例えば、「その方法」という言及には、本開示などを読めば当業者に明白になると考えられる本明細書で記載した種類の1つもしくは複数の方法および／または工程が含まれる。
【００１８】
別途定義されない限り、本明細書で用いた全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で記載したものと同様または同等の任意の方法および材料を本発明の実施または検討に用いることができるが、好ましい方法および材料をこれから記載する。
【００１９】
本明細書で用いる場合の「タンパク質」または「ペプチド」という用語は、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、およびペプチドを含む、少なくとも2つの共有結合的に付着したアミノ酸を指す。タンパク質は、天然のアミノ酸およびペプチド結合、または合成ペプチド模倣構造から構成されていてもよい。したがって、本明細書で用いる場合の「アミノ酸」または「ペプチド残基」は、天然のアミノ酸および合成アミノ酸の両方を意味する。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリン、およびノルロイシンは、本発明の目的のためのアミノ酸と見なされる。「アミノ酸」には、プロリンおよびヒドロキシプロリンなどのイミノ酸残基も含まれる。側鎖は、(R)立体配置かまたは(S)立体配置かのいずれかであってもよい。
【００２０】
「サイトカイン」という用語は、免疫系の細胞によって放出されかつ特異的受容体を通じて非酵素的に作用して免疫応答を制御する可溶性糖タンパク質を指すように本明細書で幅広く用いられる。したがって、本明細書で用いる場合の「サイトカイン」という用語には、ケモカイン、インターロイキン、リンホカイン、モノカイン、インターフェロン、コロニー刺激因子、血小板活性化因子、腫瘍壊死因子-α、および受容体関連タンパク質、ならびにそれらの機能的断片も含まれる。
【００２１】
本明細書で用いる場合、「機能的断片」という用語は、本来のタンパク質の生物学的機能または活性特徴を保有する、タンパク質のペプチド部分またはポリペプチド部分を指す。例えば、IFNγまたはTNFαの機能的断片は、例えば、それぞれ、天然かまたは組換えによって産生されたIFNγまたはTNFαと実質的に同じ炎症促進性活性を有する。
【００２２】
本発明で用いる場合の「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の無傷の分子だけでなく、エピトープ決定基に結合することができるFabおよびF(ab')2、Fv、ならびにSCA断片などの、その断片も含むことが意味される。
【００２３】
本明細書で用いる場合の「対象」という用語は、本発明の方法が行なわれる任意の個体または患者を指す。例えば、対象は、サイトメガロウイルス感染を有するかまたはサイトメガロウイルス感染を有する危険性のある任意の対象であってもよい。通常、対象はヒトであるが、当業者によって正しく理解されると考えられるように、対象は動物であってもよい。
【００２４】
本明細書で用いる場合の「試料」および「生物学的試料」という用語は、本発明によって提供される方法に好適な任意の試料を指す。1つの態様において、本発明の生物学的試料は、組織試料、例えば、針生検に由来する試料などの生検標本である。その他の態様において、本発明の生物学的試料は、体液、例えば、血清、血漿、唾液、尿、および精液である。
【００２５】
本明細書で用いる場合、「免疫化状態」という用語は、本発明のペプチドがその免疫原性活性をもたらすように、本発明のペプチドを細胞に接触させるかまたは対象に投与することを意味する。したがって、T細胞免疫原であるペプチドは通常、免疫原性の量で、典型的にはプライミング用量として、次いでしばらく後に1回または複数回のブースター用量として、皮内に、皮下に、または筋肉内に、および望ましい場合には、フロイントの完全アジュバントまたは不完全アジュバントなどの免疫アジュバントを含む組成物中に製剤化されて、投与されると考えられる。
【００２６】
本明細書で用いる場合、「寛容化状態」という用語は、本発明のペプチドが、他の場合ならば免疫原性がある活性に対して寛容化を誘導するように、本発明のペプチドを細胞に接触させるかまたは対象に投与することを意味する。結果として、本発明のペプチドが対象によって「自己」と認識されかつ免疫応答をもたらし得ないように、対象を、例えば、ペプチドに対して寛容化する。寛容化量のペプチドを、通常は少量をある期間にわたって、皮内に、皮下に、筋肉内に、または好ましくは、粘膜に、例えば、鼻スプレーを通してかもしくは摂食によって、投与することによって、ペプチドを寛容化条件下で投与することができる。
【００２７】
本明細書で用いる場合、「対応する正常細胞」とは、検査される障害または疾患と同じ器官由来である細胞および検討された障害または疾患と同じ種類である細胞を意味する。1つの局面において、対応する正常細胞は、健康な個体から得られた細胞の試料を含む。そのような対応する正常細胞は、検査される細胞を含む試料を提供する個体と年齢が一致する個体、および／または検査される細胞を含む試料を提供する個体と同じ性別である個体に由来し得るが、そうである必要はない。
【００２８】
本明細書で用いる場合、「改善する」または「処置する」という用語は、自己免疫障害（例えば、RA）と関連する臨床兆候および／または症状が、行なわれた行為の結果として軽減されるということを意味する。モニタリングされるべき兆候または症状は、自己免疫障害の特徴であると考えられ、かつ兆候および状態をモニタリングするための方法と同様に、当業者に周知であると考えられる。さらに、「低下させる」または「阻害する」という用語は、場合によっては、例えば、自己免疫障害と関連する兆候または症状の減少を特定のアッセイの検出のレベルより下に低下させることができるということが認めらるので、一緒に用いられる。したがって、活性がアッセイの検出のレベルより下に「低下する」のか、または完全に「阻害される」のかは必ずしも明確ではない場合がある。それでもやはり、本発明による処置の後、自己免疫障害と関連する兆候または症状が少なくとも処置前のレベルから低下するということが明確に確定できると考えられる。
【００２９】
今日までに、寛容誘導のための3つの形態の抗原非依存的アプローチが、自己免疫障害の処置、すなわち、細胞およびサイトカインに基づく介入、ならびに幹細胞治療に利用されている。
【００３０】
RAにおける、細胞に基づく生物学的介入および免疫寛容
免疫寛容は、潜在的に自己に反応する細胞の単なる排除によっては確立することができない活性過程である。これは、反応性T細胞を枯渇させようとする初期の試みで関節リウマチ（RA）を処置することができなかったことによって強調された。そのようなアプローチの潜在的で深刻な副作用に加えて、CAMPATHおよびCD-4に対する枯渇抗体を用いた治療的介入は、RAにおける炎症をコントロールすることに成功しなかった。これにより、T細胞を枯渇させないが、その代わりにT細胞機能を潜在的に調節することができる、細胞に基づく治療へと注目が移行した。実際、単にCD4細胞を枯渇させる代わりにCD4分子をコーティングすることは、枯渇よりも有益であるように思われる。
【００３１】
T細胞活性化を調節するためのその他の手段には、T細胞共刺激のレベルでの介入が含まれる。この文脈において、最も研究された化合物は細胞毒性Tリンパ球関連抗原4（CTLA-4）である。最適なT細胞活性化のために、T細胞は、そのT細胞受容体（TCR）を通じたシグナル（シグナル1）だけではなく、抗原特異的でない共刺激、最も顕著にはCD28を通じたシグナルも受容する。T細胞上に構成的に発現されるCD28は、抗原提示細胞上のCD80およびCD86と相互作用してシグナル2を発生させる。CTLA-4は活性化T細胞上に発現しかつ高い親和性で抗原提示細胞上のCD80およびCD86に結合する。したがって、それはCD28を通じた共刺激シグナルの最適な送達を阻止しかつ活性化T細胞の自然な下方制御に寄与する。CTLA-4はまた、IL-2産生およびIL-2受容体発現を低下させかつT細胞を細胞周期のG1相に止めることによってT細胞活性化を直接阻害することができるが、その他の作用の様式も示唆されている。
【００３２】
ヒトIgG1の重鎖とCTLA-4の外部ドメインとの融合タンパク質（CTLA-4Ig）は、抗原提示細胞上のCD80およびCD86に結合し、したがってCD28を通じた共刺激シグナルを遮断し、T細胞活性化の自然な下方制御を模倣する。結果として、自己反応性T細胞は静止したシグナル1を受容することができるが、結果的にこれらの細胞を機能的にアネルギー性にするCD28を通じた共刺激シグナル2を受容することができない。したがって、十分に考慮されたレジメンはまだ臨床的に用いるのに十分でない。
【００３３】
自己免疫疾患の様々な動物モデルにより、自己免疫のコントロールに対するCTLA4-Igの臨床的有効性も示されている。さらに、メトトレキサートを受けたRA患者におけるプラセボ対照試験により、CTLA4Igで処置した患者における疾患活動性の改善が示された。CTLA-4 Igは、RAにおけるその他のセッティングでおよびSLEなどのその他の自己免疫疾患のために現在研究されているところでもある。明らかなことに、処置は一般のT細胞活性化を遮断することを目指しているので、それは特異性に欠ける。共刺激のレベルでの介入の危険性は、CD28を通じた介入を目指した臨床試験における劇的な副作用によって、つい最近浮き彫りになった。
【００３４】
RAにおけるその他の細胞に基づく介入にはB細胞枯渇が含まれる。本格的な（full-blown）RAは成熟B細胞の非存在下でも発症し得るが、RAの発病におけるB細胞および自己抗体の役割について十分な証拠が入手可能である。様々な研究により、キメラ抗CD20モノクローナル抗体（リツキシマブ）を用いたB細胞枯渇は実際に、RAにおける有益な効果を有するということが示されている。リツキシマブによる処置は、重篤な感染症の危険性増加の犠牲が明らかに生じる末梢B細胞のほぼ完全な枯渇をもたらす。B細胞枯渇がT細胞寛容に有益に影響し得る可能性は高くないように思われるが、この問題はこれまでの研究で対処されていない。
【００３５】
RAにおける、サイトカインに基づく介入および免疫寛容
抗原非依存的介入に関して、サイトカインに基づく介入、とりわけTNF-a経路の遮断に基づく介入が利用されている。TNF-aはRAにおける炎症および関節損傷の重要なメディエーターである。TNF-a遮断の主要な臨床効果は、TNF-aおよび下流のサイトカインの効果の直接的阻害に寄与する。しかしながら、RAおよび若年性突発性関節炎において、いわゆる天然のCD4+CD25+ 制御性T細胞は、数ではなく、むしろ制御機能が欠損している。RAにおけるCD4+CD25+制御性細胞は、活性化されたT細胞および単球による炎症促進性サイトカインの産生を抑制することができない。さらに、それらはエフェクターCD4+CD25- T細胞における制御性の表現型を誘導することができない。インフリキシマブによる処置の後、末梢血中の制御性T細胞の数は著しく上昇する。際立つことに、これらの前もって欠損している制御性T細胞の制御機能も回復する。これらの変化は抗TNFa治療に有利に応答する患者で特に顕著であり、したがってT制御機能および免疫寛容の回復は、この治療の臨床的有効性の因子となり得るということを示唆する。可溶性のTNF-a受容体であるエタネルセプトが、T制御機能に対する同様の効果を有するかどうかは未だに明らかにされていない。長期の抗TNFa治療の間にこの寛容の状態が維持されるかまたはより著明な免疫抑制によって徐々に取って代わられるかということがやはり明らかにされなければならない。不幸なことに、処置の撤回によって数か月以内での疾患の再発が引き起こされるので、抗TNFa治療下でのT制御機能の回復は不十分である。
【００３６】
IL-1、IL-6、IL-15、IL-17、およびIL-18による介入を含む、その他のサイトカインに基づく介入が開発されているところであるが、RAの処置におけるそれらの役目がやはり明らかにされなければならない。
【００３７】
幹細胞移植および免疫寛容
約十年間、自己幹細胞移植（ASCT）が重度の難治性自己免疫疾患に対する処置として用いられてきた。関節炎において、この種の処置は、若年性突発性関節炎（JIA）で特に効き目がある。際立つことに、ASCTを受けている患者の大部分が、継続的な免疫抑制処置がなくても、何年間も彼らの深刻な疾患の無病寛解にある。したがって、ASCT後に、免疫寛容が、処置の直接的効果が消え去ったずっと後でも誘導されかつ維持されるということが明白であると考えられる。
【００３８】
ASCTを受けているJIAの子供における最近の研究により、免疫寛容の回復は、2つの別々の機構を通じたT制御性コンパートメントの回復に基づくということが明らかにされた。ASCT後に、免疫再構成のリンパ球減少期の間のCD4+CD25+ 制御性T細胞の優先的なホメオスタシスによる拡大が原因で、およびナイーブなFoxP3 mRNAを発現するCD4+CD25+ 制御性T細胞の新たな胸腺細胞増殖が原因で、FoxP3を発現するCD4+CD25bright制御性T細胞の回復が見出される。これらの「自然な」制御性T細胞の回復の次に、ASCTはまた、自己の熱ショックタンパク質特異的なT細胞を誘導して、炎症促進性の表現型からIL-10およびGATA-3を発現する、より寛容原性の表現型へと逸脱させる。制御性T細胞レパートリーにおけるこれらの深遠な変化および診療におけるそれらの明白な結果により、ヒト自己免疫疾患における寛容誘導の治療的可能性が強調される。明らかに、ASCTなどのスケールが大きい治療に対する必要性を迂回しかつ免疫バランスを等しく有効に回復することができる異なるアプローチを同定することが必要である。
【００３９】
したがって、1つの局面において、本発明は、治療的有効量の免疫調節ポリペプチドを投与することによって自己免疫障害について対象を処置する方法を提供する。疾患関連ポリペプチド、または免疫調節特性を有するその模倣物を用いて、免疫経路に影響を与える。したがって、1つの態様において、本発明のポリペプチドの投与は、自然部門および獲得部門両方の免疫応答の変化を相乗的な様式で誘導すること、特に制御性T細胞および／またはエフェクターT細胞の機能ならびに寛容原性の表現型を指向するレパートリーの変化を誘導することによって、対象における免疫系の制御応答を誘発する。
【００４０】
別の態様において、抗原特異的ペプチドに加えて、本方法は、抗炎症活性を有するクロロキン誘導体の投与を含む。この態様において、クロロキン誘導体の投与は、例えばエフェクターT細胞受容体に結合しかつ活性化することができるプロセッシングされたペプチド、すなわち、細胞内でプロセッシングされたペプチドが、最終的により少なくなるように、疾患関連ペプチドモチーフのプロセッシングを場合によっては低下させることを含む幾つかの起こり得る機構によって、反応性T細胞集団に対する非特異的な効果を提供する。クロロキン誘導体の作用の特異的機構は十分には理解されていないが、エフェクターT細胞リソソーム内のpHの変化の誘導を含むと考えられ、その変化は自己のペプチドモチーフのプロセッシングを軽減するかまたは防止し、次にはT細胞受容体によって結合される機会を有する疾患関連ペプチドをより少なくする。ペプチドプロセッシングのそのような低下の結果は、表Iに列挙したようなそれらのペプチドなどの非自己のペプチドモチーフで循環T細胞/受容体を標的することができるということである。
【００４１】
（表Ｉ）
2009538922.tif 000002
2009538922.tif 000003
【００４２】
このように、本発明の方法は、対象に免疫調節活性を有する少なくとも1つのペプチドを投与する工程を含む。免疫調節活性を有するペプチドは、免疫関連タンパク質、特に熱ショックタンパク質の幾つかのファミリーに由来するペプチドを含むことができる。1つの態様において、ペプチドは、配列番号：8のアミノ酸配列を有する。dnaJP1（配列番号：8）は、関節リウマチの発病と関連性のある経路で特異的に認められる。熱ショックタンパク質由来の免疫関連ペプチドの一般的なクラスに入るその他のペプチドには、表Iに列挙したペプチドが含まれるが、これらに限定されない。1つの態様において、本方法には、クロロキン分子またはその誘導体と組み合わせたdnaJP1などの免疫調節ペプチド、またはその他の熱ショックタンパク質誘導体の投与が含まれる。例示的なクロロキン分子には、（ヒドロキシル）クロロキン、硫酸ヒドロキシクロロキン、または置換クロロキンが含まれるが、これらに限定されない。
【００４３】
dnaJP1として同定されたペプチドは、熱ショックタンパク質（hsp）dnaJに由来する。それは細菌のdnaJから派生したが、そのヒト同等物との相同性を共有するので、このペプチドは自己／非自己ペプチドである。さらに、dnaJP1は、RAと関連するHLAクラスIIアレルの多くに存在する5つのアミノ酸カセットを含む。前臨床研究において、最も関連性のあるエピトープがマッピングされ、かつ活動性の関節リウマチ（RA）を持つ患者におけるインビトロでの炎症促進性T細胞応答に対するその寄与が示された。この臨床プログラムの根底にある仮説は、dnaJP1に対する粘膜寛容化が、活性化された炎症促進性エフェクターT細胞の免疫逸脱を決定し得るということ、およびそのような逸脱を臨床的利益に転換し得るということである。概念的には、以前の粘膜寛容化の試みとの主な違いは、dnaJP1応答が独立にその誘因からの自己免疫炎症の増幅に作用しているように見え、それゆえに免疫寛容化に好適な標的であるという事実である。ペプチド投与と一致して、クロロキン誘導体の同時投与は、臨床転帰に関して明白でかつ全く予期しないかつ驚くべき相乗効果を提供するということが示された。
【００４４】
クロロキン誘導体とは、(ヒドロキシ)クロロキンであり、免疫障害およびその他の障害を処置するためにクロロキン誘導体を用いる技術分野の当業者に一般に公知であるような、炭素、酸素、水素、窒素、塩素、および硫黄の原子の任意の組み合わせを含む任意の数の分子構造を含むR'基を含んでもよくまたは含まなくてもよい。より具体的には、(ヒドロキシ)クロロキンは、以下の式
C18H26ClN3
を有し、319.877の分子量および以下のような構造
2009538922.tif 000004
を有する。あるいは、(ヒドロキシ)クロロキンは、以下の分子式
C18H26ClN3O-H2SO4
を有し、433.96の分子量および以下のような構造
2009538922.tif 000005
を有する硫酸誘導体をさらに含んでもよい。別の態様において、クロロキン誘導体は、任意の数の化学的側基を含むR'基がコアのクロロキン分子に付着していてもよい置換クロロキンを含むことができる。
【００４５】
クロロキン誘導体(ヒドロキシ)クロロキン（HCQ）であるDMARDは、マラリアおよびRAなどのある種の自己免疫障害を処置するために半世紀にもわたって用いられているが、それがその効果を達成する機構は依然としてはっきりしていない。抗炎症薬剤としてのその相対的な有効性はその他の現在入手可能な抗リウマチ薬剤よりも小さい。結果として、HCQは、早期のリウマチを持つ患者に対するおよびあまり攻撃的でない疾患発現がある患者における抗炎症薬剤として用いられる傾向にある。HCQなどの抗マラリア薬はリソソーム指向性であり、かつリソソームのpHを変化させるので、それらは、MHC分子の同化および輸送などの、抗原提示細胞における様々なリソソーム依存的機能に影響を及ぼす可能性があるということが示唆されている。これは同様に、T細胞の活性化を変化させるなどの、さらなる効果を有する可能性がある。HCQは、T細胞に対する直接的な阻害効果を有することも示されている。HCQによる単核細胞の処置は、炎症性サイトカインの分泌の阻害を結果的にもたらすことが示されている。したがって、本ペプチド/HCQの組み合わせの相乗効果は、RAの特徴であるような免疫駆動性の炎症において、種々の特異的で複雑な変化をもたらす。
【００４６】
別の態様において、本発明は、本発明の少なくとも1つの免疫調節ペプチドおよびクロロキン誘導体の組み合わせを含む薬学的製剤を含む。あるいは、本発明の製剤は、併用療法形式で投与されることが意図された別々の免疫調節ペプチドおよびクロロキン誘導体の製剤を含むことができる。「併用療法形式」とは、免疫調節ペプチドおよびクロロキン誘導体の組み合わせが投与されている患者に対して有益な結果が達成されるように、免疫調節ペプチドおよびクロロキン誘導体を投与する治療レジメンを意味する。
【００４７】
近年、分子免疫学によって、関節リウマチ（RA）を含むがこれに限定されない、自己免疫障害の発病に寄与する機構について、より良い見識を得るための重要なツールが提供されている。この疾患の慢性炎症性の性質は、現在より良く理解され、炎症過程を増幅しかつ組織損傷をもたらすメディエーターおよび経路の多くが同定されている。この進歩は、その重要な構成要素の1つ、例えばTNF-αなどの炎症性サイトカインを遮断することによって炎症カスケードを効果的に干渉する第一世代の生物学的薬剤の導入を伴って、臨床的な実施に至っている。
【００４８】
免疫応答の制御の理解の前進により、自己免疫疾患の根底にある基本的な過程についての我々の見識は変化した。自己の認識は生理的でかつ必要な現象であるということが現在十分に理解されている。免疫応答の質および強度は、自己の認識が損傷を引き起こさないということと、感染などの認知された「危険」を排除することを目的とした必要な炎症応答が、「危険」が除かれれば直ちに下方制御されるということとを保証する複雑な機構によって制御される。それゆえに、免疫寛容は、組織損傷を防ぐために免疫応答の質的および量的な制御に寄与する一連の複雑な相補的かつ相互作用的な経路である。この文脈において、免疫寛容は、特異的な免疫関連経路を完全にオンまたはオフに切替えることよりもむしろ、軽減することを伴う。この論理と一貫して、自己免疫は、これらの寛容の機構が損なわれている状況と定義されると考えられる。概念的には、1つのサイトカイン経路に作用することによって炎症をコントロールしようと試みる工程ではなく、本発明は、免疫寛容の誘導を介して炎症の生理的調節を回復する工程を含む。
【００４９】
1つの局面において、本発明は、本発明の免疫調節ペプチドによるT細胞免疫寛容を誘導する方法を提供し、投与の用量および経路ならびに抗原の親和性および生体利用可能性などの極めて重要な因子に依存する。適当な抗原との接触後の、T細胞応答は、無視〜反応性〜寛容／アネルギーまでの範囲に及び、かつそのような応答は典型的には、T細胞によって受容されるシグナルのレベルに対する応答の強度と比較した場合、U型曲線に従う。この文脈におけるシグナルは、一次刺激（MHC／ペプチド）ならびに二次刺激（例えば、共刺激分子、および例えば、クロロキン誘導体などの抗炎症性分子の存在を含む微小環境因子）の総和である。免疫調節ペプチドの投与に関して、抗原特異的なT細胞応答の質および強度は、投与の経路、使用される抗原の頻度および濃度によって大きく影響を受ける。例えば、過剰な濃度の反応性ペプチドなどの免疫原は、アネルギーによる応答の欠如を引き起こす可能性がある一方で、低い濃度は、活性化の閾値に到達しないので有効でない。寛容原性または炎症促進性の環境の存在によりエフェクターT細胞の応答の質が強く条件付けられるため、微小環境も免疫結果に影響を与え得る。この効果は、粘膜経路の投与が用いられる場合に特に明白である。
【００５０】
本明細書で用いる場合、「粘膜寛容誘導」という用語は、粘膜免疫系の特有の微小環境における抗原提示を指す。寛容原性刺激の文脈において、粘膜寛容誘導には、TGF-βおよびIL-10などの可溶性のメディエーターならびに関連樹状細胞（DC）の「免疫原性表現型」の両方が含まれる。したがって、特異的なT細胞による抗原の認識の能力は無傷のままであるが、応答の質は変化し、多くの場合、炎症性型から免疫原性型への免疫逸脱を誘導する。
【００５１】
ヒトの自己免疫において、抗原特異的な病原性経路は間違いなく複数であり、したがって1つの個別経路に影響を与えることは治療的に見当違いである可能性がある。しかしながら、本発明において、抗原特異的なT細胞による制御が異なる特異性を持つエフェクター機構に影響を及ぼし得る限り、粘膜寛容化は「感染性」として特徴付けすることが可能である。それゆえに、抗原特異的な粘膜寛容は、無関係な病原性経路に影響を及ぼす可能性を有し、したがって、治療的影響を与える可能性を有する。帰納的に、本発明において、免疫寛容化のために選ばれる抗原は、炎症の調節に誘因依存的な様式で関与し、より良い治療的可能性を達成する抗原を反映することが意図される。そのような抗原は容易に利用可能であり、かつ場合によって炎症部位で過剰発現しているはずである。表Iに示したペプチドを含む、そのような抗原に向けた免疫応答は、臨床的な疾患活動性と相関する。抗原特異的な応答についての臨床的炎症と免疫学的炎症の間の相関は、選ばれる抗原が免疫認識および応答の調節の機構に関与しているということを示す。
【００５２】
したがって、hspに対する免疫応答は、免疫系が「危険」の感知に反応する強力な手段として認識される。具体的に、hspの認識は、感染の存在を示し、かつ次にはより洗練されたT細胞依存的でエピトープ特異的な調節と協調して自然免疫応答経路の機構を惹起する強力な炎症性応答を通じてそれを排除する必要性を示す。hspに対する免疫応答は、炎症が起こる部位で発生し、それゆえに調節される必要がある初期増幅効果を有する可能性がある。本発明は、組織損傷を防ぐために炎症応答の漸進的な下方制御をもたらすそのような調節を提供する。この制御の機構は、hsp由来の抗原に特異的である制御機能を持つT細胞を伴う可能性が最も高い。この制御機能は、分子レベルで1つの構成要素であり、「分子調光器（molecular dimmer）」を創り出し、その分子調光器の生理的機能は、その誘因から独立に炎症を調節することである。自己免疫では、この調節機能は損なわれるが、治療目的のために回復し得る。重要なことに、表Iに開示したようなペプチドなどの免疫調節ペプチドは、必要不可欠な調節のための免疫応答を提供する。
【００５３】
本発明の別の局面において、自己免疫障害（例えば、RA）を処置するために有用な薬剤を同定するための方法を提供する。本発明の方法のいずれかにおいて有用な薬剤は、任意の種類の分子、例えば、ポリヌクレオチド、ペプチド、ペプチド模倣物、ビニル性ペプトイドなどのペプトイド、有機小分子などであってよく、かつ様々な方法のうちのいずれかで作用して自己免疫障害を改善することができる。特定の種類の自己免疫障害を処置するのに用いられる薬剤にとって典型的な任意の方法で、または薬剤の標的細胞との接触、および適切な場合、細胞内への侵入を容易にする条件下で、薬剤を投与することができる。ポリヌクレオチド薬剤の細胞内への侵入を、例えば、細胞に感染することができるウイルスベクターの中にポリヌクレオチドを組み入れることによって容易にすることができる。細胞の種類に特異的なウイルスベクターが利用可能でない場合、ベクターを、標的細胞上に発現されるリガンド（もしくは受容体）に特異的な受容体（もしくはリガンド）を発現するように改変してもよく、またはリポソーム内にカプセル化して、そのようなリガンド（もしくは受容体）を含むように同様に改変してもよい。例えば、ヒト免疫不全ウイルスTATタンパク質形質導入ドメインなどのタンパク質形質導入ドメインを含むようにペプチドを人為的に改変することを含む様々な方法で、ペプチド薬剤を細胞内に導入することができ、ペプチドの細胞内への移動を容易にすることができる。
【００５４】
候補薬剤は、数多くの化学的なクラスを包含するが、典型的にそれらは有機分子、好ましくは100ダルトンを上回りかつ約2,500ダルトンに満たない分子量を有する小有機化合物（すなわち、小分子）である。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、好ましくは水素結合に必要な官能基を含み、典型的には少なくとも1つのアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基、好ましくは官能性のある化学基の少なくとも2つを含む。候補薬剤は多くの場合、上記の官能基の1つまたは複数で置換された環状炭素構造もしくは複素環構造および／または芳香族構造もしくは多環芳香族構造を含む。候補薬剤は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体、またはそれらの組み合わせを含む生体分子の中にも見出される。
【００５５】
候補薬剤を、合成または天然の化合物のライブラリーを含む多種多様な供給源から得てもよい。例えば、数多くの手段が、ランダム化されたオリゴヌクレオチドの発現を含む、多種多様な有機化合物および生体分子のランダム合成および指定（directed）合成に利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物、および動物の抽出物の形状での天然化合物のライブラリーが利用可能でありかつ容易に生成される。さらに、天然かまたは合成で生成されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的、および生化学的手段を通じて容易に修飾される。公知の薬理学的薬剤を、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などの指定化学修飾またはランダム化学修飾に供して構造類似体を生成してもよい。
【００５６】
別の局面において、本発明の方法は、個別化医療を実施するための手段を提供するのに有用であり、処置は、対象における自己免疫障害（例えば、RA）の特定の特徴に基づいて対象に合わせられる。本方法は、例えば、クロロキン分子と組み合わせた本発明の免疫調節ペプチドと対象由来の細胞の試料とを接触させることによって実施することができ、免疫調節ペプチドおよびクロロキン分子の非存在下での自己免疫疾患と関連する兆候および／または症状と比較した場合の、免疫調節ペプチドおよびクロロキン分子の存在下での自己免疫疾患と関連する兆候および／または症状の減少によって、前記ペプチドを、疾患を処置するのに有用であると同定する。本発明の方法によって検討される細胞の試料は、処置されるべき対象から得るてもよく、または対象の種類と同じ種類の樹立された細胞株の細胞であってもよい。1つの局面において、樹立された細胞株は、そのような細胞株の一団のうちの1つであることができ、一団は、同じ種類の疾患の異なる細胞株および／または異なる自己免疫障害の異なる細胞株を含むことができる。そのような細胞株の一団は、例えば、処置されるべき対象からごくわずかの数の細胞しか得られず、したがって対象の細胞の代替試料を提供する場合に、本発明の方法を実施するのに有用である可能性があり、かつ本方法を実施する際の対照試料として含めるのに有用である可能性もある。
【００５７】
ひとたび疾患を確定しかつ処置プロトコルを開始すれば、本発明の方法を定期的に繰り返し、対象における自己免疫障害に関する症状のレベルまたは強度が正常対象で観察されるものに接近し始めるかどうかを評価してもよい。連続的なアッセイから得られる結果を用いて、数日〜数か月の範囲に及ぶ期間にわたる処置の有効性を示してもよい。したがって、本発明は、自己免疫障害を有する対象を処置するための治療レジメンをモニタリングするための方法にも向けられている。治療の前および治療の間の自己免疫障害に関連する兆候および症状のレベルの比較によって治療の有効性が示される。それゆえに、当業者は、必要とされるような治療的アプローチを認識しかつ調節することができると考えられる。
【００５８】
対象への投与のために、ペプチド、またはコードするポリヌクレオチドを通常、組成物として製剤化する。したがって、本発明は、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドに加えて、ペプチドまたはポリヌクレオチドを投与のために都合よく製剤化することができる担体を通常含む組成物を提供する。例えば、担体は、生理緩衝食塩水などの水性溶液またはグリコール、グリセロールなどのその他の溶媒もしくはビヒクル、オリーブ油もしくは注射可能な有機エステルなどの油であることができる。担体は、作用して、例えば、ペプチドまたはコードするポリヌクレオチドを安定化するかまたはその吸収を増加させる生理的に許容される化合物を含むこともできる。生理学的に許容される化合物には、例えば、グルコース、スクロース、もしくはデキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸もしくはグルタチオンなどの酸化防止剤、キレート化薬剤、低分子量タンパク質、またはその他の安定化剤もしくは賦形剤が含まれる。同様に、細胞を対象に投与したい場合、本発明の方法を実施する目的のために、培養下で処置された細胞、例えば、滑液の単核細胞、樹状細胞なども組成物中に製剤化することができる。
【００５９】
薬学的組成物は、医療技術分野で周知でありかつ経口投与されるべき錠剤などの固体形態の製剤を含むことができる。本発明の製剤は、口、鼻、気管支、小腸、または結腸（肛門および肛門周囲）への送達が可能である液体、ゲル、半固体、コロイド、蒸気、および気相の製剤を含むことができる。1つの態様において、本発明の組成物を粘膜に（すなわち、対象の粘膜に）投与する。粘膜とは、口、鼻、気管支、食道、および肛門または肛門周囲を含む任意の体粘膜を意味する。
【００６０】
生理学的に許容される化合物を含む担体の選別は、例えば、ペプチドまたはコードするポリヌクレオチドを投与する方式だけでなく、組成物の投与の経路にも依存するということが当業者に認識されると考えられる。組成物を免疫化条件下で、すなわち、ワクチンとして投与する場合、それを通常、筋肉内に、皮内に、または皮下に投与するが、静脈内のように非経口的に投与することもでき、かつ注射、挿管、または当技術分野で公知のその他のそのような方法で投与することができる。免疫系の所望の調節が寛容化である場合、好ましくは組成物を経口投与するか、または上記のように投与することができる。
【００６１】
「治療的有効量」または「有効量」という用語は、研究者、獣医、医師、またはその他の臨床医によって求められている組織、システム、動物、またはヒトの生物学的または医学的な応答を誘発すると考えられる化合物または薬学的組成物の量を意味する。したがって、本発明の方法を実施する際に投与されるべき組成物の総量を、比較的短い期間にわたってボーラスとしてかまたは注入によってかのいずれかで、単一用量として対象に投与することができ、かつある期間にわたって1回または複数回のブースター投薬を引き続き行なうことができる。対象において免疫応答を刺激するための組成物の量は、対象の年齢および全般的な健康だけでなく、投与の経路および投与されるべき処置の数も含む様々な因子に依存する。これらの因子を考慮して、熟練臨床医は、必要に応じて特定の投薬量を加減することを知っていると考えられる。一般に、組成物の製剤化ならびに投与の経路および頻度を、第I相および第II相臨床試験を用いて、最初に決定する。
【００６２】
本発明の方法を実施する際に投与されるべき化合物または組成物の総量を、比較的短い期間にわたってボーラスとしてかまたは注入によってかのいずれかで、単一用量として対象に投与してもよく、または複数の用量を長期間にわたって投与する分割処置プロトコルを用いて投与してもよい。当業者は、対象において自己免疫障害を処置するための本発明の組成物の量が、対象の年齢および全般的な健康だけでなく、投与の経路および投与されるべき処置の数も含む多くの因子に依存するということを知っていると考えられる。これらの因子を考慮して、当業者は、必要に応じて特定の用量を加減することを知っていると考えられる。一般に、薬学的組成物の製剤化ならびに投与の経路および頻度を、第I相および第II相臨床試験を用いて、最初に決定する。
【００６３】
通常、ペプチド性成分およびクロロキン成分の両方を含む処置製剤、またはペプチド性成分がクロロキンとは異なる別の製剤中にある製剤を、臨床転帰が疾患状態に関して免疫系に影響を及ぼすことを目標とするように、一緒に、別々に、任意の順序で投薬時に投与することができる。例えば、慢性疾患状態は、発生期の疾患状態と異なった形で個々の必要性に応じた各成分の投薬レジメンを要求し得る。通常、本発明のペプチド（例えば、dnaJP1）の単一用量は、2.5〜100ミリグラム、通例10〜70 mg、およびさらにより典型的には、20〜50 mgであり得る。1つの態様において、単一用量は、10、15、20、25、30、35、40、または50 mgでさえも含むことができる。クロロキン誘導体に関して、単一用量は、通常150〜500 mgのクロロキン誘導体、通例 190〜450 mg、およびさらにより典型的には、200〜400 mgを含むことができる。免疫調節ペプチドおよびクロロキン誘導体の各々に関し、1つの態様において、ペプチド成分は、1日に少なくとも1回投与されることが意図され、かつクロロキン成分は、1日に少なくとも2回送達されることが意図される。別の態様において、ペプチド成分を1日に2回投与することができる一方で、クロロキン成分を1日に少なくとも2回投与することができる。
【００６４】
「投与」または「投与する」という用語は、処置を必要とする対象に本発明の化合物または薬学的組成物を提供する行為を含むと定義される。本明細書で用いた場合の「非経口投与」および「非経口投与された」という語句は、通常注射による、腸内および局所投与以外の投与の様式を意味し、かつ静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、胸骨内の注射および注入を含むが、これらに限定されるわけではない。本明細書で用いた場合の「全身投与」、「全身投与された」、「末梢投与」、および「末梢投与された」という語句は、それが対象のシステムに侵入し、したがって代謝およびその他の同様の過程に供されるように、中枢神経系に直接入り込むもの以外の化合物、薬物、またはその他の材料の投与、例えば、皮下投与を意味する。
【００６５】
経時的な本発明の治療法の有効性を、障害の素因はあるが、治療の開始の時点で障害の兆候または症状をまだ示していない対象における免疫学的障害の症状または臨床的兆候の不在によって同定することができる。免疫学的障害、または免疫応答を調節することが望ましいその他の状態を有すると診断された対象において、本発明の方法の有効性を、対象における兆候もしくは症状の重症度の軽減を測定することによって、または障害についての代替エンドポイントの存在によって評価することができる。当業者は、必要とされるような治療的アプローチを認識しかつ適合させることができる。したがって、本発明は、自己免疫障害を有する対象を処置するための治療レジメンをモニタリングするための方法にも向けられている。
【００６６】
以下の実施例は、本発明の有利性および特色をさらに例証するために提供されるが、本発明の範囲を限定することは意図されない。それらは使用し得るものの典型であるが、当業者に公知のその他の手順、方法論、または技術を代わりに用いてもよい。
【００６７】
実施例1
HCQおよびdnaJP1を用いた併用療法
本実施例は、本発明の製剤の有効性、および関節リウマチを処置するための投与レジメンを示す。
【００６８】
二重盲式の、プラセボを対照としたITT試験を立案し、試験で観察されるdnaJP1に対する免疫寛容化が、疾患の臨床的改善に転換されるかどうかを初めて検証した。dnaJP1を早期のRAを持つ患者における寛解の最重要の誘導剤として検証した。厳密な成功に焦点を合わせるよりもむしろ経時的に寛容化事象を捉えることに焦点を合わせることによって、より従来的な最後の観測点よりもむしろ従来的でないエンドポイント（開始から112、140、および168日の時点についてのAUC）の選択が決定された。dnaJP1は、安全でかつ十分に寛容的であることが分かり、有害事象の割合は、プラセボおよびdnaJP1群の両方で同様であった。表IIは、研究についての全体的なパラメータを示す。
【００６９】
（表ＩＩ）RAにおけるdnaJP1を用いた第II相臨床試験の方法
2009538922.tif 000006
RAにおいてdnaJP1を用いた第II相臨床試験に用いられた方法の概要。NSAIDS=非ステロイド系抗炎症薬物、MHAQ=改変した健康評価アンケート、VAS=苦痛および疾患活動性についての視覚的アナログ尺度。* リウマチ因子、ESRおよびCRP、分画を含むCBC、ALT、クレアチニン、アルブミン、および総タンパク質、ならびにさらなる免疫学的検討のための採血。
【００７０】
dnaJP1処置の臨床効果が、HCQを用いた患者の2つの群（プラセボ+HCQ n=46、dnaJP1 n=45）でプラセボよりも優れている限りにおいて、(ヒドロキシ)クロロキンはdnaJP1処置との相乗的な相互作用を示した。それらの疾患活動性ならびにその他の臨床的および人口統計学的な特徴が完全に比較した場合、これら2つの群は均質であった。これらの結果に対する併用医薬剤の効果はなかった。それゆえに、エピトープ特異的な免疫治療は、HCQと組み合わせて採用された場合に真に増強された効果を有することが本明細書により開示される。
【００７１】
作用の機構は相乗効果を示す。全体にわたって、dnaJP1は、プラセボよりも優れている持続的な臨床効果を示す。経時的なACR結果もこの優位性を示す。dnaJP1の臨床効果は、(ヒドロキシ)クロロキンを用いた患者で最も高い。dnaJP1群およびプラセボ群における臨床転帰を、寛解のAmerican College for Rheumatology（ACR）基準に従って評価した。特に興味深いものとして、ACR20、ACR50、およびACR70基準を用いた臨床転帰を示す。ACR20、ACR50、およびACR70の各々は、プラセボと被検薬物間の有意な差を測定することを示しかつ本基準によりそれぞれ、処置に対する20％、50％、または70％の応答を達成する複合応答-基準を意味する。関節リウマチにおける改善のACR予備定義、すなわち、圧痛関節数における20％、50％、もしくは70％を超えるかまたは20％、50％、もしくは70％と等しい改善、腫膨関節数における20％、50％、または70％の改善、および以下の5項目：1）患者による疼痛評価；2）患者による全般評価；3）医師による全般評価；4）患者が（MHAQを用いて）自己評価した機能状況；5）急性期の反応物（ESRまたはCRP）のうちの3項目における20％、50％、または70％の改善が適用された。意味のある改善を、エンドポイントで上記の基準のいずれかを満たしたことと定義する。彼らが検討の間の任意の時点で応答基準を満たす場合、患者を「反応者」と定義する。
【００７２】
表III、IV、VおよびVIの各々において、以下を適用する：左の列は、最初の投与後の日数、すなわち、112、140、168日目、およびFU（最後の投薬である168日目の1か月後のサンプリング時間を意味する「追跡調査」）であり； 2つの患者群の各々における、2番目および3番目の列は、ACR20反応者、対象の数、および反応者のパーセンテージ；ならびにACR50反応者、対象の数、および反応者のパーセンテージである。112日〜168日の間および112日〜FUの間の曲線下面積（AUC）についてのP値を示す。各表（III、IV、V、およびVI）中のデータは、それぞれ、図1〜4に示したデータに対応する。データは、検討の間の異なる訪問日の各処置群におけるACR反応者を示す。それらが導き出された検定にP値を付す：££=コクラン-マンテル-ヘンツェル検定（CMH）（Biochem J. 2006 April, V48(2) pp 319-326）、黒い菱形=一般化推定方程式の方法論（GEE）（J. Biopharm Stat. 2005 V1 5(6) pp.993-1007）。
【００７３】
処置群は、1）全ての(ヒドロキシ)クロロキンの使用者、プラセボ 対 dnaJP1（図1A〜C）；2）検討における全ての患者、(ヒドロキシ)クロロキンを受けているまたは受けていないにかかわらない（図2A〜C）；3）全ての(ヒドロキシ)クロロキンの非使用者、プラセボ 対 dnaJP1（図3A〜C）；および4）dnaJP1単独 対 プラセボ：(ヒドロキシ)クロロキン単独（図4A〜C）。
【００７４】
注記：図1A〜C および2A〜Cは、ベースライン特徴の差を示さなかった群の比較を表し、dnaJP1およびクロロキン誘導体の組み合わせ投与の応答が、どちらか単独の投与では近寄れない驚くべきかつ予期しない相乗的な結果を提供するということを示している。しかしながら、図4A〜Cは、プラセボ群における(ヒドロキシ)クロロキンの使用者をdnaJP1群における(ヒドロキシ)クロロキンの非使用者と比較している。これらの群はベースラインで異なるので、直接比較は一般に、転帰に関して意義がある。
【００７５】
表IIIにdnaJP1およびクロロキン誘導体を受けた患者に関する検討の結果を示す。
【００７６】
（表ＩＩＩ）dnaJP1およびクロロキン誘導体を受けた患者
2009538922.tif 000007
* 0.05未満のp値であり、有意である値を表す。
【００７７】
具体的に、表III中のデータは、ペプチドならびに／またはペプチドおよびHCQの組み合わせが効果を発揮するのに必要とされる時間が引き起こすであろう結果である、140日目以後に明白なACR20およびACR50に関する処置群とプラセボ群の間の明確な二分を示す。ACR20プラセボおよびdnaJP1、ならびにACR50プラセボおよびdnaJP1と本明細書で定義した、亜群におけるACR反応者のパーセンテージを示し、データは、検討の間の異なる訪問日の、プラセボまたはdnaJP1処置および(ヒドロキシ)クロロキンの同時使用を反映している。P値はカイ二乗検定で導き出す。
【００７８】
図1Aで示したように、グラフは、関節リウマチの影響に苦しんでいる患者の、dnaJP1および(ヒドロキシ)クロロキンの両方による、組み合わせた所定の投薬間の、自明でなく、実に予期しないかつ驚くべき、相乗作用を示し、この極めて重要な試験における反応者は50％に迫る。図1Bで示したように、ACR50基準は、20％未満の応答があるプラセボに対して30％を超える応答を示す。図1Cは、疾患状況の70％の改善というずっとより厳しい基準についてさえも、dnaJP1ペプチドが意味のある結果を示したということを示すACR70基準応答を示す。
【００７９】
試験における全ての患者を含む、第二の群の患者からのデータを表IVに示す。
【００８０】
（表ＩＶ）全ての患者
2009538922.tif 000008
* 0.05未満のp値であり、有意である値を表す。
【００８１】
表IVにおいて、112、140、および168日目のACR20応答率の曲線下面積（AUC）の主要有効性エンドポインドは、CMHで0.09およびGEEで0.02のp値に達し、それは施設間のばらつきを考慮している。ACR50 AUCもまた、GEEで陽性であった（p=0.02）。欠けているデータを失敗とみなすことによって事後分析を行なった。個々の時点での群間の有効性を比較し、同様にACR50についての最後の時点を含む、幾つかの時点について統計的有意性を見出した。文献中の既往データと比較した場合、プラセボ効果はACR50およびACR70について異常に高かった。196日目の追跡調査訪問でのRAの兆候および症状の特に有意な改善は、薬物の持続的効果、したがって患者のための有益な結果を示している。有意な相乗作用が見られるように、HCQを用いない患者をデータに含めたとしても。対応する図2A〜2Cで示したように、dnaJP1群およびプラセボ群の各々についてHCQを受けた患者およびHCQを受けていない患者について、データ中のHCQ使用者の存在が原因で上昇したように見える20％のプラセボ率と比較した場合、ACR20応答は40％超である。図2Aで示したような全体の応答率は、dnaJP1投与単独のデータにおける影響が原因で、図1Aで示したような応答率よりも低い可能性が高い。図2BがACR50応答を示す一方、図2CはACR70応答を示し、その両方ともが図1A〜Cで示した結果と一致する。
【００８２】
全ての(ヒドロキシ)クロロキンの非使用者を含む第三の群は、表Vで示す結果を示した。
【００８３】
（表Ｖ）(ヒドロキシ)クロロキンの非使用者全て
2009538922.tif 000009
【００８４】
対応する図3A〜3Cで示したように、dnaJP1群およびプラセボ群の各々を比較する。dnaJP1かまたはプラセボかのいずれかのACR20応答は類似しているが、dnaJP1が有利性を提供する。図2BがACR50応答を示す一方、図2CはACR70応答を示す。
【００８５】
(ヒドロキシ)クロロキン単独 対 dnaJP1単独を含む第四の群は、表VIで示すデータを示した。
【００８６】
（表ＶＩ） 全ての患者 (ヒドロキシ)クロロキン単独 対 dnaJP1単独
2009538922.tif 000010
【００８７】
対応する図4A〜4Cで示したように、dnaJP1単独群およびプラセボ単独群の各々を比較する。dnaJP1のACR20応答は、dnaJP1が有利性を提供するということを示す。図4BがACR50応答を示す一方、図4CはACR70応答を示し、各々は、事例的には、それらが経時的な効果を有するということを示している。
【００８８】
ここで示した一組のデータは、上で示した臨床的および免疫学的な結果を補完する。具体的には、i）HCQ/dnaJP1併用療法の免疫学的効果の特徴付け；ii）dnaJP1で処置されたRA患者におけるTreg機能の特徴付け、およびiii）T細胞捕捉（TCC）によるdnaJP1特異的なT細胞の検出についての本発明者らの研究に関し、予備的データをここで提供する。
【００８９】
処置の間の臨床的改善は、免疫逸脱を示唆する有意な負の相関を伴って、とりわけ、20％の下落またはそれより大きい下落という副次的エンドポイントとして当初予想したものと一致しかつIL-10の対応する増加によるdnaJP1に応答したTNFαの産生の付随する減少（41.8％の下落）を含む。これらの観察に基づいて、炎症性の免疫から制御性の機能プロファイルを持つ免疫への免疫逸脱が生じたと仮定された。具体的には、図5で示したように、dnaJP1に応答してTNFαを産生するCD3+ T細胞のパーセンテージは、168日目にdnaJP1処置した群でプラセボ群よりも有意に多く減少した。（dnaJP1群におけるp値は0.03と等しい）。図6Aおよび6Bでさらに示したように、このTNFαの減少はdnaJP1処置群におけるIL-10の増加と相関する（dnaJP1群におけるP値は0.04と等しい）。
【００９０】
dnaJP1による処置で誘導された変化の免疫学的解析は、免疫細胞に対する処置の効果の多重度を明確に示している。この多様性は、HCQ/dnaJP1併用療法群について特に明白である。これは2つの薬物の相乗効果が原因である可能性が最も高い。以下に叙述する、本発明者らの予備的データは、直接的な細胞毒性または寛容原性サイトカインの放出に基づく制御の機構が、HCQ処置患者で顕著である可能性があるということを実際に示している。2つの傾向がこの仮説を正当化しかつ以下に叙述される：i）IFN-γおよびIL-10の産生は、HCQ-dnaJP1の組み合わせで処置された患者で上向きである。図7A〜7Cおよび図8A〜8Cで示したように、0日目と168日目の間のT細胞によってIFN-γおよびIL-10を産生するCD3+ T細胞のパーセントの差として結果を表す。結果は、HCQ-dnaJP1で処置した患者の群でより高いdnaJP1による刺激に対する応答を示している。
【００９１】
このデータは、観察された免疫逸脱に関与する1つまたは幾つかの制御経路を示唆し、dnaJP1がクラスII制限ペプチドであるので、それはおそらくCD4+クラスII制限ペプチド特異的なT細胞に頼っている。細胞内の細胞毒性機構に関連した遺伝子の過剰発現は、病原性T細胞を直接的に排除する際のdnaJP1特異的なT細胞の追加の機能を示唆している。CD244などの、IFN-γ分泌経路に関与する遺伝子の増加発現、およびIFN-γそれ自体の著しい増加は、この仮説にさらなる裏付けを提供する。これは、本研究で見られたように、免疫炎症をコントロールしかつ臨床症状を改善するための幾つかの相補的な機構のうちの1つである可能性がある。
【００９２】
T細胞捕捉（TCC）を用いて結果をさらに検討し、dnaJP1特異的なT細胞のさらなる特徴付けを可能にした。処置の開始後の制御性サイトカインの産生で示されるような、処置患者におけるdnaJP1のT細胞認識の持続性により、ペプチド特異的なT細胞のクローンの枯渇ではなく、免疫逸脱が生じるということが示唆された。この問題に対処するために、直接dnaJP1特異的なT細胞をTCCで数え上げた（例えば、米国特許第7,022,483号参照）。フルオロクロム標識した人工的なAPC（aAPC）を組み入れた、dnaJP1または適当な対照ペプチド（PADRE-）を取り込んだHLA DRB1*0401分子からなるaAPCを人為的に作製した。aAPC上のラフトもまた、抗CD28抗体および抗LFA1抗体を含んだ。試験からの代表的RA患者でテトラマーおよびTCCで測定されたCD4 dnaJP1特異的T細胞の特徴付けのための比較としてテトラマー染色を用いた。dnaJP1ペプチドによる処置中のHLA-DR4 RA患者由来のPBMCを、10 μg/mlのdnaJP1ペプチドで48時間培養下に置いた。インビトロ刺激後、抗CD4（PE）抗体で染色したPBMCを、テトラマー（FITC）またはdnaJP1もしくは陰性対照ペプチド（PADRE-）を取り込んだaAPC（FITC）とインキュベートした。図9A〜9Dで示したように、全体のT細胞のパーセンテージとしてのdnaJP1特異的なT細胞の数を、dnaJP1による粘膜寛容化の前後で比較した。この図は、抗原特異的T細胞を検出する別の方法である、テトラマー使用とTCCを比較し、TCCの優位性を示している。図9AはdnaJP1特異的T細胞を示し、図9Bは陰性ペプチド対照によるバックグラウンドの非特異的染色を示す。このように、テトラマーは染色するのに効率的ではないように見える。図9Cは、dnaJP1特異的T細胞を検出するTCCの能力を示している。図9Dは、陰性対照についてTCCで得られた結果を描写している。このように、時間0から処置の終わりまでの抗原特異的T細胞の全体数を比較した場合、数は、処置後に有意には変化しなかった（前6.5％±2.5 対 後8.0％±2.5、P=0.3、n=6）。これらの実験により、dnaJP1による処置が、抗原によって誘導される炎症促進性サイトカインの産生およびT細胞増殖能力の有意な減少をもたらすものの、これは、抗原特異的T細胞の全体数における損失が原因ではないということを証明された。
【００９３】
さらなる検討において、dnaJP1に対する寛容化が、IFN-γおよびIL-10の同時産生、ならびにdnaJP1特異的T細胞による増加したFOXP3発現と関連するということが観察された。幾つかの機構が、IFN-γを産生するdnaJP1特異的T細胞の持続性を説明し得る。最も可能性が高いのは、dnaJP1特異的T細胞の異なる集団が、処置によって影響を受けるということである。これらの中で、IFN-γおよびIL-10両方を産生する、Treg細胞が重要である可能性がある。この仮説を調べるために、（TCCで同定される）dnaJP1特異的T細胞を、時間0および7の時点の選択された試料（n=4）から分取した。mRNAを抽出しかつIFN-γおよびIL-10の同時発現についてTaqmanで解析した。IFN-γおよびIL-10を同時に産生する、dnaJP1特異的T細胞が、処置期間の終わりにということが見出された（IFN-γ：0.081±0.0054、IL-10：0.07±0.0131/CTプロバンド（proband）* 100/CT GAPDH、n=4）。
【００９４】
dnaJP1に対する寛容化は、dnaJP1特異的T細胞の全体数ではなく、むしろ機能を変化させるという概念をさらに確証するために、本発明者らはフォークヘッド転写因子FOXP3の発現を検討した。FOXP3発現は、Tregの発生および機能に影響を及ぼす。それゆえに、それは、これらの制御性細胞の機能的マーカーとして提案されている。本発明者らは、dnaJP1に対する寛容化が、回復したTreg機能の徴候としてのFOXP3発現を誘導するかどうかを試験した。2人の患者からの寛容化前後の試料をdnaJP1と培養した。CD25+細胞を分取しかつTaqManでFOXP3発現について評価した。CD4+/CD25+細胞によるFOXP3発現は、寛容化後に増加した。RA患者をFOXP3転写因子発現について解析した。dnaJP1によるインビトロ刺激の48時間前および48時間後に、CD4+/CD25+細胞を得るためにPBMCを分取した。トータルRNAを抽出し、遺伝子発現プロファイルをTaqManで解析した。GAPDHの発現によって正規化したCt値として結果を表す。誘導指数は、正規化過程（AU）の結果でありかつ刺激されていないものと比較して遺伝子発現が何倍であるかということを指す。図10で示したように、Fox P3発現は増加した。
【００９５】
本発明者らのアプローチの幾つかの利点のうちの1つは、その特異性および安全性である。実際、処置は、炎症促進性の病理学的経路に絶妙に影響を及ぼし、免疫系が、感染などの、刺激に反応する能力を無傷のままにしておく。これは、処置した患者において、リコール抗原である破傷風トキソイドに応答するT細胞の能力が、自己免疫炎症の特異的な制御の存在下で無傷のままであったという事実によって証明されている。これにより、処置の免疫学的安全性および特異性（データは示さない）が示されている。したがって、本明細書で記載したように、クロロキン誘導体、本実施例では、HCQを含む製剤の粘膜投与による併用療法、および/または患者に各成分を同時にかもしくは別々にかのいずれかで投薬するためのレジメンで免疫原性ペプチドを用いるエピトープ特異的な免疫治療は、免疫系の両方の部門に作用する制御機構を生み出すことによって自己免疫炎症のコントロールを容易にする可能性がある。
【００９６】
本明細書で開示のおよび特許請求の全ての組成物および方法を、本開示に照らして過度の実験を伴わずに作製および実行することができる。本発明の組成物および方法を好ましい態様の点から記載しているが、変形を、組成物および方法にまたは本明細書で記載した方法の工程もしくは一連の工程で本発明の精神および範囲から逸脱することなく適用し得るということが当業者に明白であると考えられる。より具体的には、記載した態様は、全ての点で単に例証的とみなされかつ制限的ではないとみなされるべきである。当業者にとって明白な全ての同様の置換および修飾は、添付の特許請求の範囲によって定義されるような本発明の精神および範囲の範囲内であるとみなされる。
【００９７】
本明細書で言及した全ての特許、特許出願、および刊行物は、本発明が属する技術分野の当業者のレベルを示している。優先権または別の恩典が主張されるものを含む、全ての特許、特許出願、および刊行物は、各々の個々の刊行物が具体的にかつ個々に参照により組み入れられることが示されるのと同じ程度まで参照により本明細書に組み入れられる。
【００９８】
本明細書で例証的に記載された本発明を好適に、本明細書で具体的に開示されていない任意の要素の非存在下で実施してもよい。したがって、例えば、本明細書中の各々の例において、「含む」、「から本質的になる」、および「からなる」という用語のいずれかを、その他の2つの用語のどちらかと置き替えてもよい。利用されている用語および表現は、説明の用語として用いられかつ限定の用語としては用いられず、そのような用語および表現の使用は、全体でまたはその一部で示されかつ記載された特色の任意の同等物を排除することを意味する意図はないが、様々な修正が、特許請求される本発明の範囲内であり得るということが認識される。したがって、本発明は、好ましい態様および任意の特色によって具体的に開示されているが、本明細書で開示された概念の修正および変形が当業者によって用いられ得るということ、ならびにそのような修正および変形が、添付の特許請求の範囲によって定義されるような本発明の範囲内であるとみなされるということが理解されるべきである。
【００９９】
本発明は上の実施例に関して記載されているが、修正および変形が本発明の精神および範囲の範囲内に包含されるということが理解されると考えられる。したがって、本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１】
2009538922.tif 000011
【図２】
2009538922.tif 000012
【図３】
2009538922.tif 000013
【図４】
2009538922.tif 000014
【図５】
2009538922.tif 000015
【図６】
2009538922.tif 000016
【図７】
2009538922.tif 000017
【図８】
2009538922.tif 000018
【図９】
2009538922.tif 000019
【図１０】
2009538922.tif 000020
【配列表】
2009538922000001.app
【国際調査報告】
2009538922.tif 000021