(57)【要約】  多能性の療法的にプログラミングされた細胞、およびこうした細胞を作製するための方法を提供する。多能性の療法的にプログラミングされた細胞は、出生後幹細胞であり、これらは、刺激因子に接触した後、より分化した状態、またはより分化していない状態のいずれかに相当するように、成熟している細胞である。多能性の療法的に再プログラミングされた細胞は、細胞再生療法に適しており、そしてより拘束された細胞系譜に分化する潜在能力を有する。出生後幹細胞を療法的に再プログラミングするための培地もまた、開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト出生後幹細胞を単離し；
療法的に再プログラミングされた細胞への前記ヒト出生後幹細胞の発生を誘導する刺激因子を含む培地と、前記ヒト出生後幹細胞を接触させる、ここで前記ヒト出生後幹細胞は、多能性ヒト幹細胞に療法的に再プログラミングされる
工程を含む、療法的再プログラミング方法。
【請求項２】
前記多能性ヒト幹細胞を分化させて、組織特異的細胞を生じる工程をさらに含む、請求項１の療法的再プログラミング方法。
【請求項３】
前記ヒト出生後幹細胞が始原性細胞である、請求項１の療法的再プログラミング方法。
【請求項４】
前記始原性細胞が、男性または女性出生後供給源から単離された二倍体生殖細胞である、請求項３の療法的再プログラミング方法。
【請求項５】
前記始原性細胞が精原幹細胞である、請求項３の療法的再プログラミング方法。
【請求項６】
前記培地がＰＭ−１０培地を含む、請求項１の療法的再プログラミング方法。
【請求項７】
前記組織特異的細胞が、心筋細胞、グリア、ニューロン、肝細胞、骨細胞および軟骨細胞からなる群より選択される、請求項１の療法的再プログラミング方法。
【請求項８】
細胞培養増殖培地基剤；
複数のビタミン類およびミネラル類；ならびに
複数の細胞増殖および成熟因子
を含む、出生後幹細胞を療法的に再プログラミングするための細胞培地。
【請求項９】
前記出生後幹細胞がヒト幹細胞である、請求項８の細胞培地。
【請求項１０】
前記培地が血清を含有しない、請求項８の細胞培地。
【請求項１１】
前記複数の細胞増殖および成熟因子が、組換えヒト上皮増殖因子（ｒｈＥＧＦ）、組換えヒト線維芽細胞増殖因子２（ｒｈＦＧＦ−２）、組換えヒト・グリア細胞由来神経栄養因子（ｒｈＧＤＮＦ）およびヒト白血病阻害因子（ＬＩＦ）、血小板由来増殖因子ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、トランスフォーミング増殖因子−β３（ＴＧＦ−β３）、線維芽細胞増殖因子８（ＦＧＦ−８）ならびにソニック・ヘッジホッグ（ＳＨＨ）からなる群より選択される因子を含む、請求項８の細胞培地。
【請求項１２】
前記組換えヒト上皮増殖因子が、１０ｎｇ／ｍｌ〜４０ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在する、請求項１１の細胞培地。
【請求項１３】
前記組換えヒト上皮増殖因子が、２０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１２の細胞培地。
【請求項１４】
前記組換えヒト線維芽細胞増殖因子２が、１ｎｇ／ｍｌ〜１２０ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在する、請求項１１の細胞培地。
【請求項１５】
前記組換えヒト線維芽細胞増殖因子２が、１ｎｇ／ｍｌ〜２ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在する、請求項１４の細胞培地。
【請求項１６】
前記組換えヒト線維芽細胞増殖因子２が、１０ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在する、請求項１４の細胞培地。
【請求項１７】
前記組換えヒト線維芽細胞増殖因子２が、１１０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１４の細胞培地。
【請求項１８】
前記組換えヒト・グリア細胞由来神経栄養因子が、２ｎｇ／ｍｌ〜４０ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在する、請求項１１の細胞培地。
【請求項１９】
前記組換えヒト・グリア細胞由来神経栄養因子が、２ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１８の細胞培地。
【請求項２０】
前記組換えヒト・グリア細胞由来神経栄養因子が、１０ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在する、請求項１８の細胞培地。
【請求項２１】
前記ヒト白血病阻害因子が、１，０００単位／ｍｌ〜１０，０００単位／ｍｌの間の濃度で存在する、請求項１１の細胞培地。
【請求項２２】
前記ヒト白血病阻害因子が、１，０００単位／ｍｌの濃度で存在する、請求項２１の細胞培地。
【請求項２３】
幹細胞基礎培地、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ＭＥＭビタミン溶液、０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、１０−４Ｍアスコルビン酸、１０μｇ／ｍｌ  ｄ−ビオチン、８０ｎｇ／ｍｌ  β−エストラジオール、６０ｎｇ／ｍｌプロゲステロン、５ｍｇ／ｍｌウシ・アルブミン、１μｌ／ｍｌ  ＤＬ−乳酸、３０μｇ／ｍｌピルビン酸、６ｍｇ／ｍｌ  Ｄ−（＋）−グルコース、３０ｎＭ亜セレン酸ナトリウム、６０μＭプトレシン、１００μｇ／ｍｌトランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ）、２５μｇ／ｍｌインスリン、１ｘペニシリン／ストレプトマイシン、１０ｘ１０−５Ｍ  β−メルカプトエタノール、１％ウシ胎児血清、２０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＥＧＦ、１ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＦＧＦ−２、１０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＧＤＮＦおよび１，０００単位のヒトＬＩＦを含む改善剤（ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ）から本質的になる、ＰＭ−１０と称される、ヒト出生後幹細胞の療法的再プログラミング用の細胞培地。
【請求項２４】
幹細胞基礎培地、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ＭＥＭビタミン溶液、０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、１０−４Ｍアスコルビン酸、１０μｇ／ｍｌ  ｄ−ビオチン、８０ｎｇ／ｍｌ  β−エストラジオール、６０ｎｇ／ｍｌプロゲステロン、５ｍｇ／ｍｌウシ・アルブミン、１μｌ／ｍｌ  ＤＬ−乳酸、３０μｇ／ｍｌピルビン酸、６ｍｇ／ｍｌ  Ｄ−（＋）−グルコース、３０ｎＭ亜セレン酸ナトリウム、６０μＭプトレシン、１００μｇ／ｍｌトランスフェリン、２５μｇ／ｍｌインスリン、１ｘペニシリン／ストレプトマイシン、１０ｘ１０−５Ｍ  β−メルカプトエタノール、１％ウシ胎児血清、２０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＥＧＦ、１ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＦＧＦ−２、２０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＧＤＮＦおよび１，０００単位のヒトＬＩＦを含む改善剤から本質的になる、ＰＭ−２０と称される、ヒト出生後幹細胞の療法的再プログラミング用の細胞培地。
【請求項２５】
幹細胞基礎培地、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ＭＥＭビタミン溶液、０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、１０−４Ｍアスコルビン酸、１０μｇ／ｍｌ  ｄ−ビオチン、８０ｎｇ／ｍｌ  β−エストラジオール、６０ｎｇ／ｍｌプロゲステロン、５ｍｇ／ｍｌウシ・アルブミン、１μｌ／ｍｌ  ＤＬ−乳酸、３０μｇ／ｍｌピルビン酸、６ｍｇ／ｍｌ  Ｄ−（＋）−グルコース、３０ｎＭ亜セレン酸ナトリウム、６０μＭプトレシン、１００μｇ／ｍｌトランスフェリン、２５μｇ／ｍｌインスリン、１ｘペニシリン／ストレプトマイシン、１０ｘ１０−５Ｍ  β−メルカプトエタノール、１％ウシ胎児血清、２０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＥＧＦ、１１０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＦＧＦ−２、１０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＧＤＮＦおよび１，０００単位のヒトＬＩＦを含む改善剤から本質的になる、ＰＭ−１００と称される、ヒト出生後幹細胞の療法的再プログラミング用の細胞培地。
【請求項２６】
幹細胞基礎培地、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ＭＥＭビタミン溶液、０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、１０−４Ｍアスコルビン酸、１０μｇ／ｍｌ  ｄ−ビオチン、８０ｎｇ／ｍｌ  β−エストラジオール、６０ｎｇ／ｍｌプロゲステロン、５ｍｇ／ｍｌウシ・アルブミン、１μｌ／ｍｌ  ＤＬ−乳酸、３０μｇ／ｍｌピルビン酸、６ｍｇ／ｍｌ  Ｄ−（＋）−グルコース、３０ｎＭ亜セレン酸ナトリウム、６０μＭプトレシン、１００μｇ／ｍｌトランスフェリン、２５μｇ／ｍｌインスリン、１ｘペニシリン／ストレプトマイシン、１０ｘ１０−５Ｍ  β−メルカプトエタノール、１％ウシ胎児血清、２０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＦＧＦ−２、２ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＧＤＮＦおよび１，０００単位のヒトＬＩＦを含む改善剤から本質的になる、ＰＭ−１と称される、ヒト出生後幹細胞の療法的再プログラミング用の細胞培地。
【請求項２７】
幹細胞基礎培地、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ＭＥＭビタミン溶液、０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、１０−４Ｍアスコルビン酸、１０μｇ／ｍｌ  ｄ−ビオチン、８０ｎｇ／ｍｌ  β−エストラジオール、６０ｎｇ／ｍｌプロゲステロン、５ｍｇ／ｍｌウシ・アルブミン、１μｌ／ｍｌ  ＤＬ−乳酸、３０μｇ／ｍｌピルビン酸、６ｍｇ／ｍｌ  Ｄ−（＋）−グルコース、３０ｎＭ亜セレン酸ナトリウム、６０μＭプトレシン、１００μｇ／ｍｌトランスフェリン、２５μｇ／ｍｌインスリン、１ｘペニシリン／ストレプトマイシン、１０ｘ１０−５Ｍ  β−メルカプトエタノール、１２％ウシ胎児血清、２０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＦＧＦ−２、２ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＧＤＮＦおよび１，０００単位のヒトＬＩＦを含む改善剤から本質的になる、ＰＭ−３と称される、ヒト出生後幹細胞の療法的再プログラミング用の細胞培地。
【請求項２８】
幹細胞基礎培地、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ＭＥＭビタミン溶液、０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、１０−４Ｍアスコルビン酸、１０μｇ／ｍｌ  ｄ−ビオチン、８０ｎｇ／ｍｌ  β−エストラジオール、６０ｎｇ／ｍｌプロゲステロン、５ｍｇ／ｍｌウシ・アルブミン、１μｌ／ｍｌ  ＤＬ−乳酸、３０μｇ／ｍｌピルビン酸、６ｍｇ／ｍｌ  Ｄ−（＋）−グルコース、３０ｎＭ亜セレン酸ナトリウム、６０μＭプトレシン、１００μｇ／ｍｌトランスフェリン、２５μｇ／ｍｌインスリン、１ｘペニシリン／ストレプトマイシン、１０ｘ１０−５Ｍ  β−メルカプトエタノール、１％ウシ胎児血清、２０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＥＧＦ、２ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＦＧＦ−２、２０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＧＤＮＦおよび１，０００単位のヒトＬＩＦを含む改善剤から本質的になる、ＰＭ−５と称される、ヒト出生後幹細胞の療法的再プログラミング用の細胞培地。
【請求項２９】
幹細胞基礎培地、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ＭＥＭビタミン溶液、０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、１０−４Ｍアスコルビン酸、１０μｇ／ｍｌ  ｄ−ビオチン、８０ｎｇ／ｍｌ  β−エストラジオール、６０ｎｇ／ｍｌプロゲステロン、５ｍｇ／ｍｌウシ・アルブミン、１μｌ／ｍｌ  ＤＬ−乳酸、３０μｇ／ｍｌピルビン酸、６ｍｇ／ｍｌ  Ｄ−（＋）−グルコース、３０ｎＭ亜セレン酸ナトリウム、６０μＭプトレシン、１００μｇ／ｍｌトランスフェリン、２５μｇ／ｍｌインスリン、１ｘペニシリン／ストレプトマイシン、１０ｘ１０−５Ｍ  β−メルカプトエタノール、１％ウシ胎児血清、２０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＦＧＦ−２、１０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＧＤＮＦおよび１，０００単位のヒトＬＩＦを含む改善剤から本質的になる、ＰＭ−１０１と称される、ヒト出生後幹細胞の療法的再プログラミング用の細胞培地。
【請求項３０】
療法的に再プログラミングされたヒト出生後幹細胞を含む、多能性療法組成物。
【請求項３１】
前記ヒト出生後幹細胞が始原性細胞である、請求項３０の多能性療法組成物。
【請求項３２】
前記始原性細胞が、男性または女性出生後供給源から単離された二倍体生殖細胞である、請求項３１の療法的再プログラミング法。
【請求項３３】
前記始原性細胞が精原幹細胞である、請求項３１の多能性療法組成物。
【請求項３４】
前記の療法的に再プログラミングされたヒト出生後幹細胞が、請求項１の療法的再プログラミング法にしたがって産生される、請求項３０の多能性療法組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対するクロス・リファレンス
［０００１］本出願は、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づいて、２００５年７月１５日出願の米国仮特許出願第６０／６９９，６８０号に優先権を請求し、そして２００６年４月１３日出願の米国特許出願第１１／２７９，６１１号の一部継続出願であり、該出願は、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づいて、２００５年４月１５日出願の仮特許出願第６０／６７１，８２６号に優先権を請求する。本出願はまた、２００５年２月１６日出願の米国特許出願第１１／０６０，１３１号の一部継続出願でもあり、該出願は、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づいて、２００４年７月１５日出願の仮特許出願第６０／５８８，１４６号に優先権を請求する。上に言及する出願はすべて、その全体が本明細書に援用される。
【０００２】
発明の分野
［０００２］本発明は、療法的に再プログラミングされた細胞の分野に関する。具体的には、加齢プロセスによって損なわれておらず、免疫適合性であり、そして適切な出生後細胞環境において機能して、移植後に機能する細胞を生じるであろう、療法的に再プログラミングされた細胞を提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
［０００３］幹細胞は、他の種類の細胞を生じさせる未分化細胞である。前駆細胞とも称される、いくつかの種類の幹細胞がある。全能性細胞は、ヒト胚に栄養を与える胎盤を加えて、体のすべての細胞を生成するのに必要な遺伝子情報をすべて含有するため、体の「マスター」細胞と見なされる。ヒト細胞は、受精卵の最初の数回の分裂の間のみ、この全能性を有する。全能性細胞が３〜４回分裂した後、細胞が次第に特殊化する、一連の段階が続く。分裂の次の段階は、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）細胞を生じ、これらの細胞は非常に万能であり、そして胎盤または子宮の他の支持組織の細胞を除いて、いかなる細胞種も生じさせうる。次の段階で、細胞は多分化性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）となり、これは、これらの細胞が、いくつかの他の細胞種を生じさせうるが、これらの種類の数が限定されることを意味する。多分化性細胞の例は、造血細胞−いくつかの種類の血液細胞に発生可能であるが、脳細胞には発生不能である血液細胞−である。胚を作り上げる、細胞分裂の長い連鎖の最後は、「最終的に分化した」細胞−特定の機能に永久に拘束されたと見なされる細胞−である。
【０００４】
［０００４］科学者らは、分化した細胞が天然に拘束されている方法以外のいずれかの方法で、こうした細胞が振舞うように改変することも、またそうした振舞いを引き起こすことも不可能であるという意見を、長年持っていた。しかし、最近の幹細胞実験において、科学者らは、ニューロンのように振舞うように血液幹細胞を促すことが可能になった。したがって、研究はまた、多分化性細胞を多能性種にする方法にも重点を置くようになってきている（Ｋａｎａｔｓｕ−Ｓｈｉｎｏｈａｒａ  Ｍ．ら  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｍｏｕｓｅ  ｔｅｓｔｉｓ．  Ｃｅｌｌ  １１９：１００１−１２，  ２００４）。
【０００５】
［０００５］幹細胞は、臓器維持および機能に必要な広い範囲の細胞組織種を生じさせうる稀な細胞集団である。これらの細胞は、２つの基本的な特性；（ｉ）自己再性能を有し、（ｉｉ）成熟表現型を持つ１以上の特殊化細胞種に分化する能力も有する特性を有する、未分化細胞と定義される。幹細胞には３つの主な群；（ｉ）すべての出生後生物に存在する成体または体性（出生後）、（ｉｉ）前胚性（ｐｒｅ−ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ）または胚性発生段階に由来してもよい胚性、および（ｉｉｉ）発生中の胎児から単離可能な胎児幹細胞（出生前）がある。幹細胞の各群は、細胞再生療法に関して、特に分化潜在能力および適切なまたはターゲットとされる細胞環境において新たに移植されそして機能する能力において、それ自体の利点および不都合な点を有する。
【０００６】
［０００６］出生後の動物においては、細胞系譜に拘束された前駆幹細胞および細胞系譜に拘束されていない多能性幹細胞である細胞があり、これらは結合組織中に住して、連続する臓器または臓器系維持および修復に必要な細胞を、出生後生物に提供する。これらの細胞は、体性または成体幹細胞と呼ばれ、そして休止していることもまたは休止していないこともありうる。典型的な成体幹細胞は、２つの特性：（ｉ）長期間に渡ってそれ自体の同一コピーを作製可能であり（長期自己複製）；そして（ｉｉ）特徴的な形態および特殊化された機能を有する成熟細胞種を生じさせうる特性を共有する。
【０００７】
［０００７］幹細胞生物学の理解の多くは、造血幹細胞、および骨髄移植後のその振舞いから得られている。骨髄ニッチ内には、いくつかの種類の成体幹細胞があり、これらは各々、その細胞環境に関連して、ユニークな特性および可変性の分化能を有する。免疫前ヒツジ胎児中に子宮内移植された、ヒト骨髄から単離された体性幹細胞は、多数の組織内に異種移植する能力を有する。やはり骨髄ニッチ内にあるのは間充織幹細胞であり、この細胞は、骨、軟骨、脂肪、腱、肺、筋肉、骨髄間質、および脳組織を含む、広範囲の非造血分化能を有する。さらに、神経幹細胞、膵臓、筋肉、脂肪、卵巣および精原幹細胞が発見されてきている。骨髄移植の使用を通じて、体性または出生後幹細胞の療法的有用性が立証されてきており、そして理解されてきている。しかし、成体体性幹細胞は、加齢および細胞分裂によって改変されているゲノムを有する。加齢は、フリーラジカル損傷、または酸化損傷の集積を生じ、こうした損傷は、細胞に新生物を形成させる傾向があるか、細胞分化能を減少させるか、またはアポトーシスを誘導する可能性もある。細胞分裂の反復は、細胞の機能上の寿命を決定する究極の細胞時計であるテロメア短縮に直接関連する。その結果、成体体性幹細胞は、胚性および出生前幹細胞に見られる生理学的に最高の状態とは十分に異なったゲノムを有する。
【０００８】
［０００８］不運なことに、成体動物の体内の実質的にすべての体細胞は、幹細胞を含めて、時間および細胞分裂反復によって破壊されたゲノムを所持する。したがって、今日まで、損傷を受けていないか、または最高の状態の生理学的ゲノムを有する幹細胞を得るための唯一の手段は、中絶された胚またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精技術を用いて形成された胚から幹細胞を回収することであった。しかし、科学的および倫理的懸念から、胚性幹細胞を用いた幹細胞研究の進行は遅れてきた。胚性幹細胞株の生成は、研究および療法の両方のための胚性幹細胞の再生可能供給源を提供すると考えられてきたが、最近の報告によって、現存する細胞株には、免疫原性の動物分子が混入していることが示されている（Ｍａｒｔｉｎ  Ｍ．ら，  Ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １１：２２８−３２，  ２００５）。
【０００９】
［０００９］成体幹細胞を用いることに関連する別の問題は、これらの細胞が免疫学的に特権を与えられていないか、または移植後にその免疫学的特権を失いうることである。（用語「免疫学的に特権を与えられている」は、レシピエントの免疫系がその細胞を異質（ｆｏｒｅｉｇｎ）と認識しない状態を称するように用いられる）。したがって、成体幹細胞を用いる場合はほとんど、自己移植のみが可能である。したがって、幹細胞療法の大部分の現在想定される形は、本質的にカスタマイズされた医学的方法であり、そしてしたがって、こうした方法に付随する経済的要因によって、その広い範囲の潜在能力が限定される。現在入手可能なものの使用に対するさらなる障壁。
【００１０】
［００１０］さらに、幹細胞は、療法剤として有用となるために、望ましい臓器または細胞種に成熟するよう誘導されなければならない。ｉｎ  ｖｉｖｏの幹細胞成熟に影響を及ぼす要因は、ほとんど理解されておらず、そしてｅｘ  ｖｉｖｏではさらにより理解されていない。したがって、現在の成熟技術は、管理する科学者またはレシピエントの制御を超えて、ほとんど、幸運および生物学的プロセスに頼る。
【００１１】
［００１１］現在の研究は、細胞再生療法における使用のため、全能性または多能性の免疫学的に特権を与えられた細胞の供給源として、発生中の胚性幹細胞に重点を置く。しかし、胚性幹細胞は、移植後に奇形腫を形成するため、それ自体、直接移植に適していない可能性もあるため、移植に適した、カスタマイズされた多能性、多分化性または拘束細胞に分化することも可能な「普遍的ドナー」として提唱されている。さらに、ヒト胚からの胚性幹細胞の単離と関連する道徳的および倫理的問題がある。
【００１２】
［００１２］再生医学において安全に使用可能である多能性細胞株の生成は、バイオテクノロジーに大きな影響を有する。これに関連して、胚性幹（ＥＳ）細胞は、無制限に増殖可能であり、そして３つの胚葉すべての表現型に分化可能であるため、細胞置換療法の潜在的な細胞供給源となりうる。しかし、ＥＳ細胞適用が実現可能となりうる前に、倫理的問題を解決しなければならず、そしてＥＳ細胞またはその派生物の移植後の奇形腫の形成を克服しなければならない。多様な組織から生じる成体幹細胞は、移植後に奇形腫を形成せず、そして同じ系譜の表現型に分化する柔軟性を維持するため、細胞に基づく療法の代替供給源と見なされる。これらは、異なる系譜の細胞種にトランス分化するように誘導されるか、または臨床適用のため、多能性幹細胞になるよう再プログラミングされることさえ可能である。すべての成体幹細胞の中で、生殖系列幹細胞（ＧＳＣ）のみが、遺伝情報を子孫に伝える能力を保持する。ＧＳＣが正常発生中の再プログラミング・プロセスを通じて、多能可能性を獲得することを示唆するいくつかの系列の証拠もある。したがって、ＧＳＣは、療法目的のために多能性細胞株を生成するための優れた成体幹細胞モデルとして見なされる。最近、ＥＳ細胞様細胞が新生マウス精巣から生成された。これらの細胞は、ＥＳ細胞と類似の分子特性および機能特性を示し、そして免疫低下マウスの精巣に注入すると奇形腫を生じる。しかし、これらのＥＳ様細胞は、成体精巣からは生成不能であり、療法目的に関する価値が減少する。
【００１３】
［００１３］したがって、生理学的にほぼ最高の状態であるゲノムを有する、生物学的に有用な多能性幹細胞の供給源に対する必要性がある。さらに、療法的に有用であるために十分な期間に渡って、レシピエントにおいて、免疫学的特権を維持する、生理学的にほぼ最高の状態であるゲノムを有する、生物学的に有用な多能性幹細胞の供給源に対する必要性がある。さらに、移植された幹細胞が、意図される組織へと成熟する潜在能力を最大にするため、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏのいずれかで幹細胞移植片を適切な状態にする必要がある。
【発明の開示】
【００１４】
発明の概要
［００１４］本発明は、ヒト出生後幹細胞から生じ、最小限の酸化損傷、および損傷を受けていない出生前または胚性幹細胞のテロメア長と好適に匹敵するテロメア長を有する、生物学的に有用な多能性の療法的に再プログラミングされたヒト細胞を提供する（すなわち本発明の療法的に再プログラミングされたヒト細胞は、ほぼ最高の生理学的状態のゲノムを所持する）。さらに、本発明の療法的に再プログラミングされたヒト細胞は、免疫学的に特権を与えられており、そしてしたがって、療法的適用に適している。さらに、本発明には、本発明の解説にしたがって作製されたヒト出生後幹細胞を、特定の宿主組織へと成熟させるための関連方法も含まれる。
【００１５】
［００１５］本発明の態様において、ヒト幹細胞を療法的に再プログラミングするための細胞培地であって、細胞培養増殖培地基剤；複数のビタミン類およびミネラル類、ならびに複数の細胞増殖および成熟因子を含む、前記培地を提供する。
【００１６】
［００１６］本発明の別の態様において、細胞培地は血清不含であり、そしてＰＭ−１０、ＰＭ−２０またはＰＭ−１００と称され；複数の細胞増殖および成熟因子は、組換えヒト上皮増殖因子、組換えヒト線維芽細胞増殖因子２、組換えヒト・グリア細胞由来神経栄養因子およびヒト白血病阻害因子からなる群より選択される因子を含む。組換えヒト上皮増殖因子は、およそ１０ｎｇ／ｍｌ〜およそ４０ｎｇ／ｍｌの間、好ましくはおよそ２０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する。組換えヒト線維芽細胞増殖因子２は、およそ１ｎｇ／ｍｌ〜およそ１２０ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在する。組換えヒト・グリア細胞由来神経栄養因子は、およそ２ｎｇ／ｍｌ〜およそ４０ｎｇ／ｍｌの間、好ましくはおよそ１０ｎｇ／ｍｌ（ＰＭ−１０およびＰＭ−１００）〜およそ２０ｎｇ／ｍｌ（ＰＭ−２０）の間の濃度で存在する。ヒト白血病阻害因子は、およそ１，０００単位／ｍｌ〜およそ１０，０００単位／ｍｌの間、好ましくはおよそ１，０００単位／ｍｌの濃度で存在する。
【００１７】
［００１７］本発明の別の態様において、細胞培地は低濃度の血清または血清代替物を含有し、そしてＰＭ−１、ＰＭ−５またはＰＭ−１０１と称され；血清構成要素は、およそ１％〜およそ５％の間、好ましくはおよそ１％の濃度のヒト血清またはウシ胎児血清である。複数の細胞増殖および成熟因子は、組換えヒト上皮増殖因子、組換えヒト線維芽細胞増殖因子２、組換えヒト・グリア細胞由来神経栄養因子およびネズミ白血病阻害因子からなる群より選択される因子を含む。組換えヒト上皮増殖因子は、およそ１０ｎｇ／ｍｌ〜およそ４０ｎｇ／ｍｌの間、好ましくはおよそ２０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する。組換えヒト線維芽細胞増殖因子２は、およそ１０ｎｇ／ｍｌ〜およそ１２０ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在する。組換えヒト・グリア細胞由来神経栄養因子は、およそ２ｎｇ／ｍｌ〜およそ４０ｎｇ／ｍｌの間、好ましくはおよそ２ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する。ネズミ白血病阻害因子は、およそ１，０００単位／ｍｌ〜およそ１０，０００単位／ｍｌの間、好ましくはおよそ１，０００単位／ｍｌの濃度で存在する。
【００１８】
［００１８］本発明の態様において、細胞培地は、高濃度の血清または血清代替物を含有し、そしてＰＭ−３と称され；血清構成要素は、およそ１０％〜およそ１５％の間、好ましくはおよそ１２％の濃度のヒト血清またはウシ胎児血清である。複数の細胞増殖および成熟因子は、組換えヒト上皮増殖因子、組換えヒト線維芽細胞増殖因子２、組換えヒト・グリア細胞由来神経栄養因子およびネズミ白血病阻害因子からなる群より選択される因子を含む。組換えヒト上皮増殖因子は、およそ１０ｎｇ／ｍｌ〜およそ４０ｎｇ／ｍｌの間、好ましくはおよそ２０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する。組換えヒト線維芽細胞増殖因子２は、およそ１０ｎｇ／ｍｌ〜およそ４０ｎｇ／ｍｌの間、好ましくはおよそ１０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する。組換えヒト・グリア細胞由来神経栄養因子は、およそ２ｎｇ／ｍｌ〜およそ４０ｎｇ／ｍｌの間、好ましくはおよそ２ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する。ネズミ白血病阻害因子は、およそ１，０００単位／ｍｌ〜およそ１０，０００単位／ｍｌの間、好ましくはおよそ１，０００単位／ｍｌの濃度で存在する。
【００１９】
［００１９］本発明の別の態様において、細胞培地は拡大培地と称され；血清構成要素はおよそ１２％〜およそ１７％の間、好ましくはおよそ１５％の濃度のヒト血清またはウシ胎児血清または血清代替物である。複数の細胞増殖および成熟因子は、組換えヒト上皮増殖因子、組換えヒト線維芽細胞増殖因子２、組換えヒト・グリア細胞由来神経栄養因子およびネズミ白血病阻害因子からなる群より選択される因子を含む。ネズミ白血病阻害因子は、およそ１，０００単位／ｍｌ〜およそ１０，０００単位／ｍｌの間、好ましくはおよそ１，０００単位／ｍｌの濃度で存在する。
【００２０】
［００２０］本発明の態様において：幹細胞を単離し；療法的に再プログラミングされた細胞への該幹細胞の発生を誘導する刺激因子を含む培地と、該幹細胞を接触させ；療法的に再プログラミングされた細胞を培地から回収し；そして療法的に再プログラミングされた細胞、またはそこから成熟した細胞を、療法的に再プログラミングされた細胞を必要とする宿主内に移植する工程を含む、療法的再プログラミング方法を提供する。
【００２１】
［００２１］本発明の療法的再プログラミング法の態様において、幹細胞は、始原性細胞、例えば精原幹細胞である。
［００２２］本発明の療法的再プログラミング方法の態様において、幹細胞は、始原性細胞などのヒト出生後幹細胞である。別の態様において、始原性細胞は、男性または女性出生後供給源から単離された二倍体生殖細胞である。別の態様において、始原性細胞は精原幹細胞である。
【００２２】
［００２３］本発明の療法的再プログラミング方法の別の態様において、培地は、ＰＭ−１、ＰＭ−３、ＰＭ−５またはＰＭ−１０１培地または拡大培地を含む。
［００２４］本発明の療法的再プログラミング方法の別の態様において、培地は、ＰＭ−１０、ＰＭ−２０またはＰＭ−１００培地を含む。
【００２３】
［００２５］本発明の療法的再プログラミング方法の態様において、療法的に再プログラミングされたヒト細胞から成熟する細胞は、心筋細胞である。
［００２６］本発明の療法的再プログラミング方法の別の態様において、療法的に再プログラミングされたヒト細胞から成熟する細胞は、グリア細胞である。
【００２４】
［００２７］本発明の別の態様において、幹細胞基礎培地、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ＭＥＭビタミン溶液、０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、１０−４Ｍアスコルビン酸、１０μｇ／ｍｌ  ｄ−ビオチン、８０ｎｇ／ｍｌ  β−エストラジオール、６０ｎｇ／ｍｌプロゲステロン、５ｍｇ／ｍｌウシ・アルブミン、１μｌ／ｍｌ  ＤＬ−乳酸、３０μｇ／ｍｌピルビン酸、６ｍｇ／ｍｌ  Ｄ−（＋）−グルコース、３０ｎＭ亜セレン酸ナトリウム、６０μＭプトレシン、１００μｇ／ｍｌトランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ）、２５μｇ／ｍｌインスリン、１ｘペニシリン／ストレプトマイシン、１０ｘ１０−５Ｍ  β−メルカプトエタノール、１％ウシ胎児血清、２０ｎｇ／ｍｌ組換えヒト上皮増殖因子、１０ｎｇ／ｍｌ組換えヒト線維芽細胞増殖因子２、２ｎｇ／ｍｌ組換えヒト・グリア細胞由来神経栄養因子および１，０００単位のネズミ白血病阻害因子を含む改善剤（ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ）から本質的になる、ＰＭ−１と称される、幹細胞の療法的再プログラミング用の細胞培地を提供する。
【００２５】
［００２８］本発明のさらに別の態様において、ダルベッコの修飾イーグル培地、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、１ｘペニシリン／ストレプトマイシン、０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノール、１２％ウシ胎児血清、２０ｎｇ／ｍｌ組換えヒト上皮増殖因子、１０ｎｇ／ｍｌ組換えヒト線維芽細胞増殖因子２、２ｎｇ／ｍｌ組換えヒト・グリア細胞由来神経栄養因子および１，０００単位のネズミ白血病阻害因子を含む改善剤から本質的になる、ＰＭ−３と称される、幹細胞の療法的再プログラミング用の細胞培地を提供する。
【００２６】
［００２９］本発明の別の態様において、ダルベッコの修飾イーグル培地、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、１ｘペニシリン／ストレプトマイシン、０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノール、１５％ウシ胎児血清および１，０００単位のネズミ白血病阻害因子を含む改善剤から本質的になる、拡大培地と称される、幹細胞の療法的再プログラミング用の細胞培地を提供する。
【００２７】
［００３０］本発明の別の態様において、幹細胞基礎培地、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ＭＥＭビタミン溶液、０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、１０−４Ｍアスコルビン酸、１０μｇ／ｍｌ  ｄ−ビオチン、８０ｎｇ／ｍｌ  β−エストラジオール、６０ｎｇ／ｍｌプロゲステロン、５ｍｇ／ｍｌウシ・アルブミン、１μｌ／ｍｌ  ＤＬ−乳酸、３０μｇ／ｍｌピルビン酸、６ｍｇ／ｍｌ  Ｄ−（＋）−グルコース、３０ｎＭ亜セレン酸ナトリウム、６０μＭプトレシン、１００μｇ／ｍｌトランスフェリン、２５μｇ／ｍｌインスリン、１ｘペニシリン／ストレプトマイシン、１０ｘ１０−５Ｍ  β−メルカプトエタノール、２０ｎｇ／ｍｌ組換えヒト上皮増殖因子、１ｎｇ／ｍｌ組換えヒト線維芽細胞増殖因子２、１０ｎｇ／ｍｌ組換えヒト・グリア細胞由来神経栄養因子および１，０００単位／ｍｌのヒト白血病阻害因子を含む改善剤から本質的になる、ＰＭ−１０と称される、幹細胞の療法的再プログラミング用の細胞培地を提供する。
【００２８】
［００３１］本発明の別の態様において、幹細胞基礎培地、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ＭＥＭビタミン溶液、０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、１０−４Ｍアスコルビン酸、１０μｇ／ｍｌ  ｄ−ビオチン、８０ｎｇ／ｍｌ  β−エストラジオール、６０ｎｇ／ｍｌプロゲステロン、５ｍｇ／ｍｌウシ・アルブミン、１μｌ／ｍｌ  ＤＬ−乳酸、３０μｇ／ｍｌピルビン酸、６ｍｇ／ｍｌ  Ｄ−（＋）−グルコース、３０ｎＭ亜セレン酸ナトリウム、６０μＭプトレシン、１００μｇ／ｍｌトランスフェリン、２５μｇ／ｍｌインスリン、１ｘペニシリン／ストレプトマイシン、１０ｘ１０−５Ｍ  β−メルカプトエタノール、１％ウシ胎児血清、２０ｎｇ／ｍｌ組換えヒト上皮増殖因子、１ｎｇ／ｍｌ組換えヒト線維芽細胞増殖因子２、２０ｎｇ／ｍｌ組換えヒト・グリア細胞由来神経栄養因子および１，０００単位のヒト白血病阻害因子を含む改善剤から本質的になる、ＰＭ−２０と称される、ヒト出生後幹細胞の療法的再プログラミング用の細胞培地を提供する。
【００２９】
［００３２］本発明の別の態様において、幹細胞基礎培地、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ＭＥＭビタミン溶液、０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、１０−４Ｍアスコルビン酸、１０μｇ／ｍｌ  ｄ−ビオチン、８０ｎｇ／ｍｌ  β−エストラジオール、６０ｎｇ／ｍｌプロゲステロン、５ｍｇ／ｍｌウシ・アルブミン、１μｌ／ｍｌ  ＤＬ−乳酸、３０μｇ／ｍｌピルビン酸、６ｍｇ／ｍｌ  Ｄ−（＋）−グルコース、３０ｎＭ亜セレン酸ナトリウム、６０μＭプトレシン、１００μｇ／ｍｌトランスフェリン、２５μｇ／ｍｌインスリン、１ｘペニシリン／ストレプトマイシン、１０ｘ１０−５Ｍ  β−メルカプトエタノール、２０ｎｇ／ｍｌ組換えヒト上皮増殖因子、１１０ｎｇ／ｍｌ組換えヒト線維芽細胞増殖因子２、１０ｎｇ／ｍｌ組換えヒト・グリア細胞由来神経栄養因子および１，０００単位／ｍｌのヒト白血病阻害因子を含む改善剤から本質的になる、ＰＭ−１００と称される、幹細胞の療法的再プログラミング用の細胞培地を提供する。
【００３０】
［００３３］本発明の別の態様において、幹細胞基礎培地、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ＭＥＭビタミン溶液、０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、１０−４Ｍアスコルビン酸、１０μｇ／ｍｌ  ｄ−ビオチン、８０ｎｇ／ｍｌ  β−エストラジオール、６０ｎｇ／ｍｌプロゲステロン、５ｍｇ／ｍｌウシ・アルブミン、１μｌ／ｍｌ  ＤＬ−乳酸、３０μｇ／ｍｌピルビン酸、６ｍｇ／ｍｌ  Ｄ−（＋）−グルコース、３０ｎＭ亜セレン酸ナトリウム、６０μＭプトレシン、１００μｇ／ｍｌトランスフェリン、２５μｇ／ｍｌインスリン、１ｘペニシリン／ストレプトマイシン、１０ｘ１０−５Ｍ  β−メルカプトエタノール、１％ウシ胎児血清、２０ｎｇ／ｍｌ組換えヒト上皮増殖因子、２ｎｇ／ｍｌ組換えヒト線維芽細胞増殖因子２、２０ｎｇ／ｍｌ組換えヒト・グリア細胞由来神経栄養因子および１，０００単位のヒト白血病阻害因子を含む改善剤から本質的になる、ＰＭ−５と称される、ヒト出生後幹細胞の療法的再プログラミング用の細胞培地を提供する。
【００３１】
［００３４］本発明の別の態様において、幹細胞基礎培地、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ＭＥＭビタミン溶液、０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、１０−４Ｍアスコルビン酸、１０μｇ／ｍｌ  ｄ−ビオチン、８０ｎｇ／ｍｌ  β−エストラジオール、６０ｎｇ／ｍｌプロゲステロン、５ｍｇ／ｍｌウシ・アルブミン、１μｌ／ｍｌ  ＤＬ−乳酸、３０μｇ／ｍｌピルビン酸、６ｍｇ／ｍｌ  Ｄ−（＋）−グルコース、３０ｎＭ亜セレン酸ナトリウム、６０μＭプトレシン、１００μｇ／ｍｌトランスフェリン、２５μｇ／ｍｌインスリン、１ｘペニシリン／ストレプトマイシン、１０ｘ１０−５Ｍ  β−メルカプトエタノール、１％ウシ胎児血清、２０ｎｇ／ｍｌ組換えヒト上皮増殖因子、１０ｎｇ／ｍｌ組換えヒト線維芽細胞増殖因子２、１０ｎｇ／ｍｌ組換えヒト・グリア細胞由来神経栄養因子および１，０００単位のヒト白血病阻害因子を含む改善剤から本質的になる、ＰＭ−１０１と称される、ヒト出生後幹細胞の療法的再プログラミング用の細胞培地を提供する。
【００３２】
［００３５］本発明の１つの態様において、幹細胞を単離し；療法的に再プログラミングされた細胞への該幹細胞の発生を誘導する刺激因子を含む培地と、該幹細胞を接触させ；そして療法的に再プログラミングされた細胞を培地から回収する工程を含む、療法的再プログラミング方法を提供する。
【００３３】
［００３６］本発明の療法的再プログラミング方法の別の態様において、幹細胞は始原性細胞である。さらに別の態様において、始原性細胞は精原幹細胞である。
［００３７］本発明の療法的再プログラミング方法のさらに別の態様において、培地はＰＭ−１培地を含む。別の態様において、培地はＰＭ−３培地を含む。別の態様において、培地は拡大培地を含む。
【００３４】
［００３８］本発明の療法的再プログラミング方法の別の態様において、療法的に再プログラミングされた細胞は、多能性生殖幹細胞である。別の態様において、療法的に再プログラミングされた細胞から成熟する細胞は、心筋細胞である。
【００３５】
［００３９］本発明の療法的再プログラミング方法の別の態様において、幹細胞はｃ−ｋｉｔを発現する。
［００４０］本発明の療法的再プログラミング方法の別の態様において、方法は、前記多能性生殖幹細胞を培養する工程をさらに含む。
【００３６】
［００４１］本発明の療法的再プログラミング方法のさらに別の態様において、方法は、療法的に再プログラミングされた細胞、またはそこから成熟した細胞を、療法的に再プログラミングされた細胞を必要とする宿主内に移植する工程をさらに含む。
【００３７】
［００４２］本発明の態様において、療法的に再プログラミングされたヒト出生後幹細胞を含む多能性療法組成物を提供する。別の態様において、ヒト出生後幹細胞は始原性細胞である。別の態様において、始原性細胞は、男性または女性出生後供給源から単離された二倍体生殖細胞である。さらに別の態様において、始原性細胞は精原幹細胞である。
【００３８】
［００４３］本発明の別の態様において、療法的に再プログラミングされたヒト出生後幹細胞を含み、そして療法的に再プログラミングされたヒト出生後幹細胞が、本発明の療法的再プログラミング方法にしたがって産生される、多能性療法組成物を提供する。
用語の定義
［００７２］用語の以下の定義を、読者に役立つ参考として提供する。本特許に用いる用語は、本発明に関連した際の特定の意味を有する。用語の通常のそして一般的な意味にしたがって、用語を用いる、あらゆる努力を行った。しかし、一般的な通常の意味および以下の定義の間に矛盾が存在する場合は、これらの定義が一般的な用法に優先する。
【００３９】
［００７３］拘束された：本明細書において、「拘束された（committed）」は、特定の機能に永久に拘束されたと見なされる細胞を指す。拘束された細胞はまた、「最終的に分化した細胞」とも称される。
【００４０】
［００７４］脱分化：本明細書において、「脱分化」は、形状または機能における特殊化の喪失を指す。細胞において、脱分化は、より拘束されていない細胞を導く。
［００７５］分化：本明細書において、「分化」は、特定の形状または機能に対する細胞の適応を指す。細胞において、分化は、より拘束された細胞を導く。
【００４１】
［００７６］胚：本明細書において、「胚」は、成長および分化の初期段階にある動物を指し、これらの段階は、３つの胚葉が定義され、そして確立される、着床および原腸形成によって、そしてそれぞれの臓器および臓器系への胚葉の分化によって、特徴付けられる。３つの胚葉は、内胚葉、外胚葉および中胚葉である。
【００４２】
［００７７］胚性幹細胞：本明細書において、「胚性幹細胞」は、全能性であり、そして子宮壁に付着する発生段階に到達した、発生中の胚に由来する、いかなる細胞も指す。これに関連して、胚性幹細胞および前胚性幹細胞は同等の用語である。胚性幹細胞様（ＥＳＣ様）細胞は、胚から直接単離されたのではない、全能性または多能性細胞である。ＥＳＣ様細胞は、本発明の解説にしたがって脱分化した、始原性細胞に由来してもよい。
【００４３】
［００７８］胎児幹細胞：本明細書において、「胎児幹細胞」は、多分化性であり、そしてもはや初期または中期臓器形成中ではない、発生中の多細胞胎児に由来する細胞を指す。
【００４４】
［００７９］生殖（ｇｅｒｍ）細胞：本明細書において、「生殖細胞」は、精母細胞または卵母細胞などの繁殖（ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ）細胞、あるいは繁殖細胞へと分化するであろう細胞を指す。
【００４５】
［００８０］成熟：本明細書において、「成熟」は、分化経路における順方向または逆方向いずれかの協調した段階のプロセスを指し、そして分化および脱分化の両方を指してもよい。本明細書において、成熟は、本明細書記載のプロセスに適用された場合、用語、発生する、または発生と同義である。
【００４６】
［００８１］多分化性：本明細書において、「多分化性」は、いくつかの他の細胞種を生じうるが、こうした細胞種の数が限定されている細胞を指す。多分化性細胞の例は、造血細胞−いくつかの種類の血液細胞に発生可能であるが、脳細胞には発生不能である血液細胞−である。
【００４７】
［００８２］多分化性成体前駆細胞：本明細書において、「多分化性成体前駆細胞」は、間充織、内皮および内胚葉系譜細胞に分化する潜在能力を有する、骨髄から単離される多分化性細胞を指す。
【００４８】
［００８３］多能性：本明細書において、「多能性」は、胎盤の細胞または子宮の他の支持細胞を除いて、いかなる細胞種も生じさせうる細胞を指す。
［００８４］多能性生殖幹細胞：本明細書において、「多能性生殖幹細胞」または「ＰＧＳ」は、多能性であるように療法的に再プログラミングされ、そして培養中で維持可能な始原性細胞を指す。
【００４９】
［００８５］出生後幹細胞：本明細書において、「出生後幹細胞」は、多分化性であり、そして誕生後の多細胞生物に由来する、いかなる細胞も指す。
［００８６］前胚：本明細書において、「前胚」は、細胞分裂前の発生初期段階中の受精卵を指す。前胚段階中、卵割の最初の段階が起こる。
【００５０】
［００８７］前胚性幹細胞：上記の「胚性幹細胞」を参照されたい。
［００８８］始原性細胞：本明細書において、「始原性細胞」は、雄性または雌性成熟または発生中の性腺に由来し、種を増殖させる細胞を生じることが可能であり、そして二倍体ゲノム状態を含有する、いかなる二倍体細胞も指す。始原性細胞は、休止していてもまたは能動的に分裂していてもよい。これらの細胞には、雄性原生殖細胞、雌性原生殖細胞、精原幹細胞、卵巣幹細胞、卵原細胞、Ａ型精原細胞、Ｂ型精原細胞が含まれる。始原性細胞はまた、生殖系列幹細胞（ＧＳＣ）としても知られる。
【００５１】
［００８９］始原生殖細胞：本明細書において、「始原生殖細胞」は、生殖細胞になることが運命付けられている、初期胚形成中に存在する細胞を指す。
［００９０］再プログラミング：本明細書において、「再プログラミング」は、細胞が多能性を示し、そして完全に発生した生物を産生する潜在能力を有するように、細胞の遺伝的プログラムをリセットすることを指す。
【００５２】
［００９１］応答性である：本明細書において、「応答性である」は、細胞環境内で、適宜、感受性であり、そして機能しうる、細胞または細胞群の状態を指す。応答性細胞は、特定の細胞環境、組織、臓器および／または臓器系において、応答し、そして機能することが可能である。
【００５３】
［００９２］体性幹細胞：本明細書において、「体性幹細胞」は、二倍体多分化性または多能性幹細胞を指す。体性幹細胞は、全能性幹細胞ではない。
［００９３］療法的クローニング：本明細書において、「療法的クローニング」は、卵の核を、別の細胞および内部細胞塊由来の幹細胞の核と交換することを含む、核トランスファー法を用いた細胞のクローニングを指す。
【００５４】
［００９４］療法的再プログラミング：本明細書において、「療法的再プログラミング」は、本発明の解説にしたがって、幹細胞を刺激因子に曝露して、多能性、多分化性または組織特異的拘束細胞を得る、成熟プロセスを指す。療法的に再プログラミングされた細胞は、病気の、損傷を受けた、欠陥がある、または遺伝的に損傷がある組織を置換するかまたは修復するため、宿主内に移植するのに有用である。本発明の療法的に再プログラミングされた細胞は、非ヒト・シアル酸残基を所持しない。
【００５５】
［００９５］全能性：本明細書において、「全能性」は、胎盤を加えて、体のすべての細胞を生成するのに必要な遺伝子情報をすべて含有する細胞を指す。ヒト細胞は、受精卵の最初の数回の分裂中にのみ、全能性である能力を有する。
発明の詳細な説明
［００９６］本発明は、出生後幹細胞から生じ、最小限の酸化損傷、および損傷を受けていない出生前または胚性幹細胞のテロメア長と好適に匹敵するテロメア長を有する、生物学的に有用な多能性の療法的に再プログラミングされた細胞を提供する（すなわち本発明の療法的に再プログラミングされた細胞は、ほぼ最高の生理学的状態のゲノムを所持する）。さらに、本発明の療法的に再プログラミングされた細胞は、免疫学的に特権を与えられており、そしてしたがって、療法的適用に適している。
【００５６】
［００９７］幹細胞は、他の種類の細胞を生じさせる未分化細胞である。前駆細胞とも称される、いくつかの種類の幹細胞がある。全能性細胞は、ヒト胚に栄養を与える胎盤を加えて、体のすべての細胞を生成するのに必要な遺伝子情報をすべて含有するため、体の「マスター」細胞と見なされる。ヒト細胞は、受精卵の最初の数回の分裂の間のみ、この全能性を有する。全能性細胞が３〜４回分裂した後、細胞が次第に特殊化する、一連の段階が続く。分裂の次の段階は、多能性細胞を生じ、これらの細胞は非常に万能であり、そして胎盤または子宮の他の支持組織の細胞を除いて、いかなる細胞種も生じさせうる。次の段階で、細胞は多分化性となり、これは、これらの細胞が、いくつかの他の細胞種を生じさせうるが、これらの種類の数が限定されることを意味する。多分化性細胞の例は、造血細胞−いくつかの種類の血液細胞に発生可能であるが、脳細胞には発生不能である血液細胞−である。胚を作り上げる、細胞分裂の長い連鎖の最後は、「最終的に分化した」細胞−特定の機能に永久に拘束されたと見なされる細胞−である。
【００５７】
［００９８］科学者らは、分化した細胞が天然に拘束されている方法以外のいずれかの方法で、こうした細胞が振舞うように改変することも、またそうした振舞いを引き起こすことも不可能であるという意見を、長年持っていた。しかし、最近の幹細胞実験において、科学者らは、ニューロンのように振舞うように血液幹細胞を促すことが可能になった。したがって、研究はまた、多分化性細胞を多能性種にする方法にも重点を置くようになってきている（Ｋａｎａｔｓｕ−Ｓｈｉｎｏｈａｒａ  Ｍ．ら  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｍｏｕｓｅ  ｔｅｓｔｉｓ．  Ｃｅｌｌ  １１９：１００１−１２，  ２００４）。
【００５８】
［００９９］哺乳動物発生の個体発生は、幹細胞に中心的な役割を提供する。胚形成初期、生殖細胞になることが運命付けられている近位胚盤葉上層由来の細胞（始原生殖細胞）は、生殖隆起に沿って移動する。これらの細胞は、高レベルのアルカリホスファターゼを発現するとともに、転写因子Ｏｃｔ−４を発現する。生殖隆起での移動およびコロニー形成に際して、始原生殖細胞は、雄性または雌性生殖細胞前駆体（始原性細胞）への分化を経る。本開示の目的のため、雄性始原性細胞（ＰＳＣ）のみを論じるが、雄性および雌性始原性細胞の性質および特性は同等であり、そしていかなる制限も示されない。雄性始原性細胞発生中、始原幹細胞は、前駆体セルトリ細胞と緊密に関連するようになり、輸精索の形成開始を導く。始原生殖細胞は、輸精索に囲い込まれると、有糸分裂が休止した原生殖細胞に分化する。これらの原生殖細胞は、数日間分裂した後、細胞周期のＧ０／Ｇ１期で抑止される。マウスおよびラットでは、これらの原生殖細胞は、誕生後、数日以内に分裂を再開して、精原幹細胞を生じ、そして最終的に精子形成に関連する分化および減数分裂を経る。
【００５９】
［０１００］始原性細胞は、受精に必要な細胞の生成に、そして最終的には、新たな生物を生成する新たなラウンドの胚形成に直接関与する。始原性細胞は、死ぬようにプログラムはされず、そして胚性状態のものに匹敵する性質を持つ。
【００６０】
［０１０１］胚性幹細胞は、着床前の胚盤胞段階の胚の内部細胞塊に由来する細胞であり、そして最大の分化潜在能力を有し、胚の３つの胚葉すべてに見られる細胞を適切に生じさせることが可能である。現実的な観点から、胚性幹細胞は、天然の胚盤葉上層環境において、胚形成中に一過性にしか存在しないため、細胞培養のアーチファクトである。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの胚性幹細胞の操作によって、心筋細胞、造血細胞、内皮細胞、神経、骨格筋、軟骨細胞、脂肪細胞、肝臓および膵臓島を含む、広範囲の細胞種の生成および分化が導かれてきた。成熟細胞と共培養中の増殖しつつある胚性幹細胞は、胚性幹細胞の特定の系譜への分化に影響を及ぼし、そしてこうした分化を開始することも可能である。
【００６１】
［０１０２］この議論の目的のため、臓器形成に関連した発生段階に基づいて、胚および胎児を区別する。前胚段階は、前胚が、卵割の最初の段階を経ている期間を指す。初期胚形成は、３つの胚葉が定義され、そして確立される、着床および原腸形成によって特徴付けられる。後期胚形成は、それぞれの臓器および臓器系の形成への胚葉派生物の分化によって定義される。胚から胎児への移行は、大部分の重要な臓器および臓器系の発生、その後の迅速な胎児成長によって定義される。
【００６２】
［０１０３］胚形成は、精子によって受精した卵母細胞が分裂し始め、そして卵割および胞胚形成が起こる胚形成の第一ラウンドを経る、発生プロセスである。第二ラウンド中、着床、原腸形成および初期臓器形成が起こる。第三ラウンドは、臓器形成によって特徴付けられ、そして胚がもはや胚とは呼ばれず、胎児と呼ばれる、胚形成の最終ラウンドでは、胎児成長および発生が起こる。
【００６３】
［０１０４］胚形成中、桑実胚卵割後およびコンパクションから生じる、最初の２つの組織系譜は、栄養外胚葉および未分化内胚葉であり、これらは胎盤および胚体外卵黄嚢に大きく寄与する。コンパクション後、まもなく、そして着床前に、胚盤葉上層または未分化内胚葉が発生し始める。
【００６４】
［０１０５］胚盤葉上層は、胚を適切に生じさせる細胞を提供する。多能性細胞が住し、そして発生中に、多様な発生上の仕事を行うように指示される、胚盤葉上層幹細胞ニッチが発生すると、胞胚形成は完了し、この時点で、胚は透明体から現れ、そして子宮壁に着床する。
【００６５】
［０１０６］着床後、原腸形成および初期臓器形成が続く。臓器形成の第一ラウンド終了までに、３つの胚葉はすべて、形成されているであろうし；外胚葉、中胚葉および明確な内胚葉、ならびに基本的なボディープランおよび臓器原基が確立される。初期臓器形成後、胚形成は、大規模な臓器発生によって特徴付けられ、これが完了した時点が、発生中の胚から発生中の胎児への転換の印であり、胎児は、胎児成長および臓器発生の最終ラウンドによって特徴付けられる。胚形成が完了したならば、妊娠期間は誕生によって終了し、この時点で、生物は、正常に機能し、そして出生後に生存するために必要な臓器、組織および細胞ニッチをすべて有する。
【００６６】
［０１０７］胚形成プロセスは、胚発生が起こる際のその広範囲なプロセスを記載するよう用いられるが、細胞レベルでは、胚形成を細胞成熟によって記載し、そして／または立証してもよい。
【００６７】
［０１０８］胎児幹細胞は、胎児骨髄（造血幹細胞）、胎児脳（神経幹細胞）および羊水（多能性羊水幹細胞）から単離されてきている。さらに、幹細胞は、成体雄性および雌性組織の両方で記載されてきている。胎児幹細胞は、臓器形成および胎児発生のプロセス中に多数の役割を果たし、そして最終的には体性幹細胞予備の一部になる。
【００６８】
［０１０９］成熟は、分化経路において順方向または逆方向いずれかの協調した段階のプロセスであり、そして分化および／または脱分化の両方を指してもよい。成熟プロセスの１つの例において、細胞または細胞群が、胚形成および臓器形成中に、その細胞環境と相互作用する。成熟が進行するにつれて、細胞はニッチを形成し、そしてこれらのニッチまたは微小環境には、臓器形成を導きそして制御する幹細胞が住する。誕生時に、生物が出生後に機能し、そして生存するための、細胞および適切な細胞ニッチが存在するように、成熟が進行する。発生プロセスは、異なる種間で非常に保存されており、実験室において、１つの哺乳動物種由来の成熟または分化系を、他の哺乳動物種に拡張することが可能である。
【００６９】
［０１１０］生物の一生の間、臓器および臓器系の細胞組成物は、細胞またはゲノム損傷を誘導する、広範囲の内因性および外因性因子に曝露される。紫外光は、正常の皮膚細胞に影響を及ぼすだけでなく、皮膚幹細胞集団にも影響を及ぼす。癌を治療するのに用いる化学療法薬剤は、造血幹細胞に壊滅的な影響を及ぼす。細胞代謝の副産物である反応性酸素種は、細胞のゲノム完全性を損なう内因性因子である。すべての臓器または臓器系において、細胞は絶え間なく幹細胞集団で交換されている。しかし、生物が加齢するにつれて、これらの幹細胞集団において、細胞の損傷が集積する。ゲノム突然変異のように、損傷が遺伝性であれば、すべての子孫が影響を受け、そしてしたがって損なわれる。単一の幹細胞クローンは、１年より長く、リンパおよび骨髄細胞などの系譜の生成に寄与し、そしてしたがって、幹細胞が損傷を受けているならば、幹細胞は、突然変異を伝播させる可能性を有する。体は、アポトーシスを誘導し、それによって損なわれた幹細胞をプールから除去し、そして潜在的に機能不全であるかまたは腫瘍原性である特性を防止することによって、損なわれた幹細胞に応答する。アポトーシスは、損なわれた細胞を集団から取り除くが、また、将来的に利用可能である幹細胞の数を減少させる。したがって、生物が加齢するにつれて、幹細胞の数が減少する。幹細胞プールの損失に加えて、加齢が幹細胞のホーミング機構の効率を減少させる証拠がある。テロメアは、非常に保存された、タンデムに反復されるＤＮＡ配列を含有する染色体の物理的末端である。テロメアは、直鎖ＤＮＡ分子の複製および安定性に関与し、そして細胞における計数機構として働く；細胞分裂の各ラウンドとともに、テロメアの長さが短くなり、そしてあらかじめ決定された閾値で、シグナルが活性化されて、細胞老化が開始する。幹細胞および体細胞はテロメラーゼを産生し、これがテロメアの短縮を阻害するが、加齢および細胞ストレスの間、テロメアはなお次第に短縮される。
【００７０】
［０１１１］多様な疾患の治療のための細胞療法の歴史があるが、使用の大部分は、悪性腫瘍を含む、造血障害に対する骨髄移植におけるものである。骨髄移植において、個体の免疫系は、別の個体から移植された骨髄で回復される。この回復は、骨髄における造血幹細胞の作用に長く寄与してきた。
【００７１】
［０１１２］幹細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏで特定の細胞種に分化可能であり、そして多様な組織内に移植されることによって多分化性である潜在能力を有し、そして胚葉を渡って移動することを示しうる証拠が増加しており、そしてこうしたものとして、幹細胞は細胞療法の多くの研究の対象であり続けている。移植の慣用的な種類と同様、免疫拒絶は、細胞療法の制限要因である。レシピエント個体の表現型およびドナーの表現型は、細胞または臓器移植片が免疫系によって寛容されるかまたは拒絶されるかを決定するであろう。
【００７２】
［０１１３］したがって、本発明は、細胞再生／修復療法のため、機能する免疫適合幹細胞を提供するための方法および組成物を提供する。
［０１１４］本発明の態様において、出生後幹細胞を療法的に再プログラミングするための方法および組成物を提供する。療法的再プログラミングは、本発明の解説にしたがって幹細胞が刺激因子に曝露され、多能性、多分化性または組織特異的拘束細胞を生じる、成熟プロセスを指す。限定されるわけではないが、療法的にクローニングされた細胞、ハイブリッド幹細胞、胚性幹細胞、胎児幹細胞、多分化性出生後幹細胞（成体前駆細胞）、脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）および始原性細胞を含む多様な幹細胞を用いて、療法的再プログラミングのプロセスを行ってもよい。
【００７３】
［０１１５］本発明の療法的再プログラミング方法は、限定されるわけではないが、霊長類、げっ歯類、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ、ウマ等を含む多様な動物由来の細胞を再プログラミングするのに適している。１つの態様において、霊長類はヒトである。
【００７４】
［０１１６］療法的再プログラミングは、精原幹細胞および脂肪由来幹細胞のような特定の幹細胞が比較的容易に得られるという事実を利用して、そしてこれらの細胞を刺激因子に曝露することによって後成的に再プログラミングする。これらの療法的に再プログラミングされた細胞は、成熟状態をより拘束された細胞系譜またはより拘束されていない細胞系譜のいずれかに変化させる。したがって、療法的に再プログラミングされた細胞は、病気の、損傷を受けた、欠陥がある、または遺伝的に損傷がある組織を修復するかまたは再生することが可能である。
【００７５】
［０１１７］療法的再プログラミングは、限定なしに、化学薬品、生物化学薬品および細胞抽出物を含む刺激因子を用いて、細胞の後成的なプログラミングを変化させる。これらの刺激因子は、他の結果の中でも、ドナーＤＮＡにおけるゲノムメチル化および／またはアセチル化変化を誘導する。
【００７６】
［０１１８］本発明の１つの特定の態様において、始原性細胞（ＰＳＣ）を、療法的に再プログラミングする。始原性細胞は、精巣の精細管の裏打ちおよび卵巣の裏打ちに住し（それぞれ、精原細胞および卵原細胞）、加齢および細胞分裂の影響によって、著しくは損傷を受けない二倍体（２Ｎ）ゲノムを所持すると決定された。したがって、ＰＳＣは、生理学的にほぼ最高の状態のゲノムを所持する。本発明の態様で特に有用なＰＳＣの限定されない例は、精原幹細胞である。本明細書の解説にしたがって、胚形成および臓器形成中に、発生中の胚および胎児に存在する幹細胞によって経験されるものと類似の手段を用いて、成熟プロセスのために、療法的に再プログラミングされたＰＳＣ細胞を調製する。
【００７７】
［０１１９］本発明の態様において、精原幹細胞を、フィーダー細胞の非存在下、ＰＭ−１培地中、細胞増殖促進および維持および成熟因子の存在下での培養によって、療法的に再プログラミングする（実施例３）。ＰＭ−１培地は、精原幹細胞が、多能性胚性幹細胞様細胞に療法的に再プログラミングされるのに必要なシグナルを含有する。低血清環境において、ＰＭ−１培地を用いて、ＰＳＣを療法的に再プログラミングするのに有用な細胞増殖および成熟因子には、限定されるわけではないが、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）および白血病阻害因子（ＬＩＦ）が含まれる。さらに、増殖因子、ならびに他の細胞増殖促進および維持因子を含有する拡大培地を実施例３に開示する（表４）。拡大培地は、療法的に再プログラミングされた多能性胚性幹細胞様細胞を培養するのに適している。
【００７８】
［０１２０］本発明の態様において、標準的な去勢外科手術を受け、そして長期ホルモン（エストロゲン）治療を受けているヒト男性から単離された精原幹細胞を、フィーダー細胞および血清の非存在下、ＰＭ−１０、ＰＭ−２０またはＰＭ−１００培地中、細胞増殖促進および維持および成熟因子の存在下での培養によって療法的に再プログラミングする（実施例８）。ＰＭ−１０およびＰＭ−２０培地は、ヒト精原幹細胞が、多能性胚性幹細胞様細胞に療法的に再プログラミングされるのに必要なシグナルを含有する。血清不含環境において、ＰＭ−１０およびＰＭ−２０またはＰＭ−１００培地を用いて、ＰＳＣを療法的に再プログラミングするのに有用な細胞増殖および成熟因子には、限定されるわけではないが、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）および白血病阻害因子（ＬＩＦ）が含まれる。
【００７９】
［０１２１］本発明の態様は、療法的に再プログラミングされたヒト細胞、幹細胞および始原性細胞を、出生後環境において、より拘束された細胞系譜に、さらに成熟させるかまたは分化させて、細胞再生／修復療法において使用するためのより拘束された細胞を提供するための方法を提供する。さらに、成熟および分化プロセスは、出生前および出生後臓器において損傷を受けた細胞を、治療するかまたは置換するのに使用可能な療法細胞を提供する。
【００８０】
［０１２２］本発明の１つの態様において、ＰＭ−３培地は、療法的に再プログラミングされたＰＳＣを、拍動する心筋細胞に分化させるために用いられてきている。ＰＭ−３培地を用いて、療法的に再プログラミングされたＰＳＣを、限定されるわけではないが、神経細胞、造血細胞、骨細胞、および他の細胞に分化させることが、本発明の範囲内である。ＰＭ−３培地を用いた、ＰＳＣおよび療法的に再プログラミングされたＰＳＣの成熟および分化に有用な細胞増殖および成熟因子には、限定されるわけではないが、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）および白血病阻害因子（ＬＩＦ）が含まれる。
【００８１】
［０１２３］別の態様において、ＰＭ−１−ＡＺＡ培地は、療法的に再プログラミングされたヒトＰＳＣを、拍動する心筋細胞に分化させるために用いられてきている。療法的に再プログラミングされたヒトＰＳＣを、限定されるわけではないが、神経細胞、造血細胞、骨細胞、および他の細胞に分化させることが、本発明の範囲内である。ヒトＰＳＣおよび療法的に再プログラミングされたヒトＰＳＣの療法的再プログラミングおよび成熟および分化に有用な細胞増殖および成熟因子には、限定されるわけではないが、ＥＧＦ、ＦＧＦ−２、ＧＤＮＦ、ＬＩＦ、血小板由来増殖因子ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、トランスフォーミング増殖因子−β３（ＴＧＦ−β３）、線維芽細胞増殖因子８（ＦＧＦ−８）およびソニック・ヘッジホッグ（ＳＨＨ）が含まれる。
【００８２】
［０１２４］始原性細胞から産生される、療法的に再プログラミングされた細胞は、多能性生殖系列幹（ＰＧＳ）細胞と称されている。出生後マウス精巣から単離された精原幹細胞（ＳＳＣ）が、胚盤胞注入後に、正常な胚発生に寄与することから、これらが再プログラミングのための柔軟性を保持し、そして多能性幹細胞になることが、本発明の解説にしたがって作製されたこれらのＰＧＳ細胞によって立証される。これらはまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで異なる細胞系譜に分化するように指示されることも可能である。
【００８３】
［０１２５］第一に、出生後マウス精巣におけるＳＳＣの中のどの下位集団（単数または複数）が、ＰＧＳ細胞形成に寄与するかに関連して、ＰＧＳ細胞に再プログラミングさせるためには、ｃ−ｋｉｔ陽性細胞集団が好ましい。ｃ−ｋｉｔ陰性細胞は、やはり多能性マーカーおよび高いテロメラーゼ活性を示すものの、性腺系譜に拘束されている。驚くべきことに、ｃ−ｋｉｔ陽性細胞も、またｃ−ｋｉｔ陰性細胞も、免疫低下マウスに移植した後、奇形腫形成を誘導しなかった。胚性幹（ＥＳ）細胞様多分化性幹細胞が奇形腫を形成するため、ＰＧＳ細胞の奇形非形成性は、予期せぬものである。生殖系列幹細胞は、インプリンティングに続いて、１３．５ｄｐｃ（受精後の日数）後に奇形非形成性であることが見出されているため、ＰＧＳ細胞は、発生段階および潜在能力の観点で、報告されるＥＳ細胞様細胞とは異なる。再プログラミングされたＰＧＳ細胞は、多能性であるが、ＥＳ細胞のレベルではない初期発生段階に達する。したがって、ＰＧＳ細胞は、ＥＳおよび成体幹細胞の限界を持たないが、利点を保持する、細胞置換療法のための優れた細胞供給源である。
【００８４】
［０１２６］インプリンティングは、ドナー細胞の遺伝的特質を保持するかまたは除去するため、細胞置換療法用の細胞の重要な特徴である。雄性生殖細胞において、ゲノム・インプリンティングは、胎児段階中に消去され、そして誕生前後に、プロ精原細胞において、雄性特異的インプリンティングが獲得され始める；このプロセスは誕生後に完了する。インプリンティング・プロセスに関与する分子事象は、再プログラミング中に生じるものに似ていると考えられる。始原生殖細胞（ＰＧＣ）の胚性生殖細胞への変換は、幹細胞因子、ＬＩＦおよびｂＦＧＦを含むポリペプチド増殖因子に応じることが示されてきている。ｂＦＧＦ、ＬＩＦ、ＧＤＮＦおよびＥＧＦなどの増殖因子は、ＳＳＣを多能性生殖細胞に変換するために重要な因子である。レポーター遺伝子追跡系を用いることによって明らかになったこのプロセスは、培養開始後のＯｃｔ−４の迅速な下方制御に続く、ＰＧＳコロニー形成中のＯｃｔ−４の上方制御を伴う。
【００８５】
［０１２７］ＰＧＳ細胞は、ＥＳ細胞およびＥＳ様細胞に比較してＳＳＥＡ−１のより低い発現を有する。ＳＳＥＡ−１は、炭水化物の段階特異的胚性抗原ファミリーのメンバーであり、そして腫瘍浸潤および転位に関与することが示されてきている。例えば、ＳＳＥＡ−１によるヒト療法ＰＧＳ細胞の選択および濃縮は、移植可能なＰＧＳ集団の性質を改善しうる。ｉｎ  ｖｉｖｏで機能する表現型に分化することが可能な、出生後および成体ヒト精巣から単離された奇形非形成性ＰＧＳ細胞の派生およびスケールアップした産生は、幹細胞生物学および適用に、直ちに影響を有するであろう。
【００８６】
［０１２８］本発明の解説にしたがって作製された、療法的に再プログラミングされたヒト細胞は、細胞再生／修復療法のための広範囲の療法的適用において、有用である。例えば、そして限定として意図されずに、本発明の療法的に再プログラミングされたヒト細胞を用いて、年齢、または癌放射療法および化学療法などの除去療法のために、天然幹細胞が枯渇している哺乳動物において、幹細胞を補充してもよい。別の限定されない実施例において、本発明の療法的に再プログラミングされたヒト細胞は、臓器再生および組織修復に有用である。本発明の１つの態様において、療法的に再プログラミングされたヒト細胞を用いて、ジストロフィー筋および心筋梗塞などの虚血事象によって損傷を受けた筋肉を含む、損傷を受けた筋肉組織を再活性化させてもよい。本発明の別の態様において、本明細書に開示する、療法的に再プログラミングされたヒト細胞を用いて、外傷的傷害または手術後、ヒトを含む動物における瘢痕を改善してもよい。この態様において、本発明の療法的に再プログラミングされたヒト細胞を、静脈内などで全身投与し、そしてこうした細胞は、損傷を受けた細胞によって分泌される循環サイトカインによって補充されて、新たに外傷を負わされた組織部位に移動する。本発明の別の態様において、療法的に再プログラミングされたヒト細胞を、修復または再生が必要な治療部位に、局所投与してもよい。
【００８７】
［０１２９］幹細胞は、本発明の成熟プロセスに普遍的に感受性であるわけではない。したがって、本発明者らは、出生後ヒト幹細胞が、成熟因子に感受性である状態になるように誘導される、療法的再プログラミング・プロセスを開発した。ドナー細胞を成熟のために感受性にするのに適した条件下で、そしてそれに十分な時間、刺激因子とインキュベーションすることによって、この療法的再プログラミング・プロセスを達成してもよい。
【００８８】
［０１３０］以下の実施例は、本発明の１以上の態様を例示することを意味し、そして以下に記載するものに本発明を限定することを意味しない。
【実施例】
【００８９】
実施例１
ネズミ精巣からの始原性細胞の単離
［０１３１］以下の方法および一般の当業者に知られるさらなる方法を用いて、出生前、胚性、出生後および成体精巣から、精巣を単離してもよい。
【００９０】
［０１３２］０〜３日齢ＯＧ２の雄の性腺から、雄性生殖幹細胞を単離した。トランスジェニックＯＧ２マウスは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する。各試験（全部で２５回の試験）において、およそ３０匹の仔を用いた。細かく刻んだ後、コラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）、ＤＮアーゼ−１（１μｇ／ｍｌ）およびＥＤＴＡ（５ｍＭ）を含有するＤＰＢＳ中で、精巣を消化した。当業者に周知の方法にしたがって、精巣細胞培養を行った。簡潔には、ゼラチンでコーティングした（０．１％）培養プレート中に細胞を配分した。翌日、浮遊細胞を収集し、そしてマウスＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス）、ヒトｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ）、ＥＳＧＲＯ（ネズミ白血病阻害因子、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）および組換えＧＤＮＦ（Ｒ＆Ｄ）を含有するＰＭ−１培地中、二次培養プレートに継代した（１．２ｃｍ２あたり１ｘ１０５細胞）。培養２〜４週後、ＧＦＰ陽性コロニーを、マイトマイシンＣで処理したネズミ胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダーに機械的に移した。新たなＭＥＦに機械的に移しつつ、３〜４回増殖させた後、コロニーが確立され、そして、さらなる拡大および保存のため、このコロニーは培養プレートから酵素的に除去可能であった。新生非トランスジェニックＩＣＲマウスからもまた、精巣細胞を単離し、そして新生ＯＧ２マウス精巣幹細胞におけるように培養した。さらに、４〜６週齢の成体ＯＧ２マウス（ｎ＝４）から精巣細胞を単離し、その精巣を外科的に手術して、そして精子形成３０を抑止しつつ、２〜３ヶ月間、停留睾丸になるまで、腹壁に固定した。さらに、非停留睾丸成体ＯＧ２マウスを、細胞単離に用いた。また、成体マウスから単離した精巣細胞を、上述のように、ＰＭ−１培地中、ＭＥＦフィーダー上で培養する前に、ＧＦＰに関して選別した。
【００９１】
［０１３３］１２．５ｄｐｃ  ＣＤ−１マウス胚を用いた標準法を用いて、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダーを調製した。トリプシン処理する前に胚を取り出し、そしてプレートあたり〜１．５個の胚のプレーティング密度で、解離した細胞を１５０ｍｍプレート上にプレーティングした。最初のプレーティング後、ＭＥＦを１：５にスプリットし、そして次いで凍結した（継代１）。マイトマイシンＣ処理前に、融解したＭＥＦ（Ｐ１）を、拡大目的のため、一度だけ継代した。ｃｍ２あたり５０〜６０ｘ１０３の密度で、ＭＥＦフィーダーをプレーティングした。ＰＧＳ細胞誘導のため、７〜１０日ごとに、新鮮なＭＥＦフィーダーを用いた。
実施例２
卵巣からの始原性細胞の単離
［０１３４］動物に麻酔し、そして卵巣を取り除く。あるいは、卵巣のパンチ生検から、始原性細胞（ＰＳＣ）を単離してもよい。次いで、顕微鏡の補助で、ＰＳＣを単離する。始原性細胞は、幹細胞形態（すなわち大きく、丸く、そして平滑である）を有し、そして卵巣から機械的に回収される。
実施例３
生殖系列幹細胞の療法細胞への療法的再プログラミング
［０１３５］実施例１に記載するように、始原性細胞を単離した。次いで、ＰＭ−１培地中、２００，０００細胞／３．８ｃｍ２の密度で、細胞をプレーティングし、そして次いで、生殖系列幹細胞、精原幹細胞および／または始原性細胞（懸濁）から体細胞（付着）を分離する、示差接着のため、３７℃で一晩インキュベーションした。この日を第０日と称した。
【００９２】
［０１３６］ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）−３４完全培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールスバッド）は、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）−３４血清不含培地（ＳＦＭ）およびＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）−３４栄養補助剤で構成され、そして米国特許第６，７３３，７４６  Ｂ２号に開示され、該特許の内容は、その全体、特に第１７〜１８欄の表１、２および３が本明細書に援用される。この開示の目的のため、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）−３４完全培地は、幹細胞基礎培地と称される。本発明の細胞培地に用いるＳｔｅｍＰｒｏ−３４完全培地の構成要素を列挙する表２および３を、‘７４６特許に見られるとおりに、正確に以下に再現する。
表１
【００９３】
【表１】
2009502124.tif 000002
【００９４】
表２
【００９５】
【表２】
2009502124.tif 000003
【００９６】
表３
【００９７】
【表３−１】
2009502124.tif 000004
【００９８】
【表３−２】
2009502124.tif 000005
【００９９】
［０１３７］ＰＭ−１培地は、始原性細胞（ＰＳＣ）の培養および維持、ならびに多能性生殖系列幹（ＰＧＳ）細胞へのＰＧＳ細胞の最初の再プログラミングのために特別に設計されている。上述のＰＭ−１培地は、本発明の療法的再プログラミング法の例示的な態様である。当業者には、ＰＭ−１の構成要素の濃度が多様であることも可能であり、そしてなお意図する結果を達成しうることが理解されるであろう。本発明の態様において、ｒｈＥＧＦの濃度は、およそ１０ｎｇ／ｍｌ〜およそ４０ｎｇ／ｍｌの範囲であることも可能であり、ｒｈＦＧＦ２の濃度は、およそ１０ｎｇ／ｍｌ〜およそ４０ｎｇ／ｍｌの範囲であることも可能であり、ｒｈＧＤＮＦの濃度は、およそ２ｎｇ／ｍｌ〜およそ４０ｎｇ／ｍｌの範囲であることも可能であり、そしてＥＳＧＲＯ（登録商標）マウスＬＩＦの濃度は、およそ１，０００単位／ｍｌ〜およそ１０，０００単位／ｍｌの範囲であることも可能である。
【０１００】
［０１３８］翌日（第１日）、浮遊細胞を収集し、そして０．１％ゼラチン化プレート上にプレーティングして、そしてＰＭ−１中で培養する。この段階で、細胞のサイズは８〜１０ミクロンであり、丸く、仮足の外見を持ち、そして非接着性であった（図１Ａ）。ＰＭ−１中で培養した細胞は、第３日〜第１５日の間に形態学的変化を示した（第３日〜第７日の細胞を図１Ｂに示し、そして第７日〜第１５日の細胞を図１Ｃに示す）。療法的再プログラミングのこの段階の間、細胞は分裂して目立つコロニーになり、そしてサイズはおよそ１０〜１５ミクロンであり、そして接着性である。コロニーのサイズは細胞総数５０未満であった。
【０１０１】
［０１３９］療法的再プログラミングの次の段階において、ほぼ第１７日から始まって（図１Ｄ）、コロニーサイズは５０〜２００細胞に増加し、そして細胞は互いに緊密に接着して増殖する。療法的再プログラミングのこの段階中、細胞形態もまた異なる。細胞は丸みを失うようであり、そして１０ミクロン以下の細胞しか生き残らない。
【０１０２】
［０１４０］ほぼ第２６日（図１Ｅ）、コロニーサイズは２００細胞を超えて大きくなる。この時点の細胞のサイズはおよそ１０ミクロンであり、そして多能性幹細胞マーカーＯｃｔ−４を高レベルで発現した（図１Ｆ）。
【０１０３】
［０１４１］次いで、療法的に再プログラミングされた細胞を摘み取り、そして不活化初代マウス胚性線維芽細胞を含有するプレート上にプレーティングした。この時点で、療法的再プログラミングは完了し、そして再プログラミングされた細胞を拡大培地（表４）中で拡大するか、またはＰＭ−１（表１）、ＰＭ−１０、ＰＭ２０またはＰＭ−１０１中で培養し続け、そして分化させることも可能である。
表４
【０１０４】
【表４】
2009502124.tif 000006
【０１０５】
［０１４２］拡大培地は、多能性の療法的に再プログラミングされた細胞の培養および維持のために特別に設計されている。上述の拡大培地は、本発明の療法的再プログラミング法の例示的な態様である。当業者には、拡大培地の構成要素の濃度が多様であることも可能であり、そしてなお意図する結果を達成しうることが理解されるであろう。本発明の態様において、ＥＳＧＲＯ（登録商標）マウスＬＩＦの濃度は、およそ１，０００単位／ｍｌ〜およそ１０，０００単位／ｍｌの範囲であることも可能である。
実施例４
療法的再プログラミングによるネズミ多能性細胞株の評価
［０１４３］Ｏｃｔ−４ゲノム断片の遠位制御要素内に挿入されたレポーター遺伝子を用いて、マウスにおける多能性生殖系列細胞発生を視覚化した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するトランスジェニックＯＧ２マウスを、生殖系列幹細胞の単離および再プログラミングに用いた。再プログラミングのため、ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ならびにＧＤＮＦ、ｂＦＧＦ、ＬＩＦおよびＥＧＦを含む増殖因子を含有するＰＭ−１培地（実施例３）中、ゼラチンでコーティングしたプレート上で、単離した精巣細胞を培養した。培養後、まもなく、ＧＦＰ陽性シグナルは有意に減少し、そして数日後には消失した（図１Ａ〜Ｂ）。その後、細胞は、鎖様構造およびコロニーを含む、目立つ形態学的変化を示した（図１Ｃ〜Ｅ）。
【０１０６】
［０１４４］培養３〜４週間後（図１Ｆ）、コロニー内のＧＦＰ陽性細胞の外見は、再プログラミング・プロセスが起きたことを示唆した。ＧＦＰ陽性コロニーが形成されたら直ちに、これらをマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダーに移し、そして拡大培地（実施例３）中で培養した。多能性生殖系列幹細胞（ＰＧＳ）形成のためのこのプロトコルは、再現可能であり、誘導効率は〜３０％であった（１０回の試験から３つの細胞株が得られた；（図１Ｇ〜Ｉ））。単離および示差接着直後に、ＦＡＣＳによってＧＦＰ陽性単細胞を選別し、そしてＭＥＦフィーダー細胞上で直接培養して、ＰＧＳコロニー形成をおよそ２週間前倒しすることも可能である。Ｏｃｔ−４−ＧＦＰシグナルは数日以内に消失するが、２週間で再出現した。
【０１０７】
［０１４５］ＰＧＳ細胞の性質決定には、以下の抗体および方法を用いた。以下の一次抗体をＣｈｅｍｉｃｏｎ、カリフォルニア州テメキュラから得た：マウス抗ＳＳＥＡ−１、ヤギ抗マウス心筋トロポニン−１、マウス抗ミオシン重鎖、ウサギ抗グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、マウス抗神経フィラメント、およびマウス抗ネスチン。用いた他の抗体は：マウス抗ｎａｎｏｇ（ｂｅｔｈｙｌ、テキサス州モンゴメリー）、ＡＰＣコンジュゲート化抗ｃ−ｋｉｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）、ヤギ抗マウスＩｇＭ−ＦＩＴＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８コンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カリフォルニア州カールスバッド）およびヤギ抗マウス・テキサスレッド（Ａｂｃａｍ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）。製造者のプロトコルにしたがって、ＳｔｅｍＴＡＧキット（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて、アルカリホスファターゼ染色を行った。ＰＢＳ中で緩衝された２％パラホルムアルデヒド中、培養細胞を室温で３０分間固定し、そしてＰＢＳ中、４℃で保存した。免疫細胞化学のため、細胞を１ｘＣｙｔｏｐｅｒｍ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）で１５分間透過処理し、そして続いて、２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）、２％（ｖ／ｖ）正常ヤギ血清／１ｘＣｙｔｏｐｅｒｍ−ＰＢＳ中で、どちらも室温で３０分間、続けてインキュベーションした。一次抗体を２％ＢＳＡ  ２％ＧＳ／１ｘＣｙｔｏｐｅｒｍ−ＰＢＳ中で希釈し、そして４℃で１〜３時間インキュベーションした。２回の洗浄後、蛍光二次抗体を２％ＢＳＡ  ２％ＧＳ／１ｘＣｙｔｏｐｅｒｍ−ＰＢＳ中で希釈し、そして暗所中、４℃で１時間インキュベーションした。細胞を２回洗浄し、ホイルに巻いて、そして顕微鏡分析まで４℃で保存した。
【０１０８】
［０１４６］Ｉｎｆｌｕｘ細胞選別装置（Ｃｙｔｏｐｅｉａ、ワシントン州シアトル）上で細胞を選別した。Ｏｃｔ−４−ＧＦＰ構築物を含有する細胞をＣＤ１１７  ＡＰＣ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）で染色した。４８８ｎｍ固相状態Ｃｏｈｅｒｅｎｔレーザー（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ、カリフォルニア州サンタクララ）でＧＦＰ励起を達成して、そして５３０−４０二色ミラーを通じて発光を収集した。６３８ｎｍ固相状態ＣｏｈｅｒｅｎｔレーザーでＡＰＣ励起を達成して、そして７１０−４０二色ミラーを通じて発光を収集した。
【０１０９】
［０１４７］生殖系列発生に関与する多くの因子の中で、幹細胞因子の受容体であるｃ−ｋｉｔは、生殖細胞発生の運命において非常に重要な役割を果たす。マウス胚において、ｃ−ｋｉｔは始原生殖細胞（ＰＧＣ）で高発現され、そしてＰＧＣが原生殖細胞および精原幹細胞に分化すると、その発現が下方制御される。したがって、ｃ−ｋｉｔ発現に基づいて、Ｏｃｔ−４−ＧＦＰ陽性ＰＧＳ細胞を選別し（図２Ａ〜Ｄ）、そしてｃ−ｋｉｔ陽性およびｃ−ｋｉｔ陰性細胞の両方を、ＭＥＦフィーダー細胞上で直接培養した。
【０１１０】
［０１４８］いくつかの実験のため、新鮮なＰＧＳコロニーを解離させ、そして抗ＳＳＥＡ−１抗体で、その後、ＰＥ−Ｃｙ７とコンジュゲート化したヤギ抗マウスＩｇＭ（ＢＤ，  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）で、細胞を染色した。
【０１１１】
［０１４９］ＰＳＣの異なる供給源から、３つのＰＧＳ細胞株：ＰＧ−ｍＧＳＣ−１（新生マウスＰＳＣから）、ＰＧ−ｍＧＳＣ−２およびＰＧ−ｍＧＳＣ−３（成体マウスＰＳＣから）を生成した。成体ＯＧ２および野生型ＩＣＲマウスからもまた、ＰＧＳ細胞株を生成して、成体および非トランスジェニック動物のどちらに関しても、療法的再プログラミング法の再現性を立証した。ｃ−ｋｉｔ陽性細胞（４／４）からのみＰＧＳコロニーが生成され、ｃ−ｋｉｔ陰性細胞からは生成されなかった（０／４）。
【０１１２】
［０１５０］Ｏｃｔ−４（ＧＦＰ＋）以外の多能性マーカーに関するＰＧＳ細胞株の性質決定によって、これらがＳＳＥＡ−１およびＮａｎｏｇ（ＥＳ細胞特異的）ならびにアルカリホスファターゼを同時発現していることが示された（図３）。さらに、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって、ＰＧＳ細胞はまた、Ｏｃｔ−４およびＮａｎｏｇに加えて、２つのさらなる多能性マーカーであるＲｅｘ−１およびＤｐｐａ５も発現していることが確認された。すべてのＰＧＳ細胞は、生殖細胞特異的マーカーであるＤＡＺＬを発現した（図４）。フローサイトメトリーによる分析によって、ＰＧＳ細胞の約２０％が、低いＳＳＥＡ−１発現を有することが示された（図５）。対照的に、調べたＥＳ細胞の約６０％がＳＳＥＡ−１を発現した（図５）。
【０１１３】
［０１５１］さらに、テロメラーゼ活性および核型に関して、ＰＧＳ細胞株を評価した。テロメラーゼ活性決定のため、１５０Ｕ／ｍｌ  ＲＮアーゼを含有するＣＨＡＰＳ溶解緩衝液を用いて、ＰＧＳ細胞株（１０回以上の継代）、新鮮に単離したＯｃｔ−４＋／ｃｋｉｔ＋選別細胞およびＯｃｔ−４＋／ｃｋｉｔ−選別細胞から細胞抽出物を単離した。細胞溶解物を１２，０００ｘｇ、４℃で２０分間遠心分離し、そして上清を−８０℃で保存した。標準としてＢＳＡを用い、Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬でタンパク質濃度をアッセイし、そして分光光度計で定量化した。ＰＣＲに基づくアッセイ、ＴＲＡＰＥＺＥ検出キット（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）によって、テロメラーゼ活性を検出した。ＴＲＡＰ反応緩衝液、ｄＮＴＰ、基質オリゴヌクレオチド、テロメラーゼ・プライマー、内部標準プライマー、およびＴａｑポリメラーゼを含有する総体積５０μｌのＰＣＲ反応混合物に、７５０μｇ／μｌの細胞抽出物２マイクロリットルを添加した。各実験試料に関して、陽性対照として、２μｌのネズミ胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）抽出物を反応混合物に添加し、そしてＣＨＡＰＳ溶解緩衝液のみおよび熱不活化テロメラーゼを陰性対照として用いた。各試料を、テロメラーゼ伸長のため３０℃で３０分間インキュベーションし、その後、ＰＣＲ増幅した。核型決定のため、増殖中の細胞を、０．１μｇ／ｍｌ  ＫａｒｙｏＭＡＸ  Ｃｏｌｃｅｍｉｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む培養中で３〜４時間インキュベーションした後、低張溶液（０．０７５Ｍ  ＫＣｌ）中に再懸濁し、そして室温で１０分間インキュベーションした。次いで、細胞を冷固定液（３：１メタノール：酢酸）中に再懸濁し、そして４℃で少なくとも３０分間保存した。固定液で洗浄した後、細胞を清浄ガラススライドに適用し、そして風乾した。分裂中期染色体を調製し、そしてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｂａｎｄ  Ｖｉｅｗデジタル画像化系を用いて、核型を生じた。１５回の継代後、細胞遺伝学的分析によって決定されるように、ＰＧＳ細胞は、高いテロメラーゼ活性（図６）および正常の核型（４０、ＸＹ）（図７）を示した。
【０１１４】
［０１５２］多能性を定義するため、ＰＧＳ細胞がｉｎ  ｖｉｖｏでキメラを形成する能力を調べた。３つのＰＧＳ細胞株すべてから単離した未分化Ｏｃｔ−４−ＧＦＰ陽性細胞を、アルビノＣＤ−１マウスから生成した胚内にマイクロインジェクション（各１５〜２０細胞）した。ＰＧＳ細胞を注入した胚盤胞の大部分の内部細胞塊で、ＧＦＰ陽性細胞の取り込みが観察された（図９）。続いて、偽妊娠里親マウスの子宮内に胚を移植した（総数２３４の移植）。妊娠後１２．５日（ｄｐｃ）でレシピエント動物の何匹かを屠殺し、発生中の胚を回収し、そしてキメラ形成の指標として、ＧＦＰ  ＤＮＡの存在を決定するため、３つの胚葉に相当する脳、心臓および肝臓を含む胚性組織を単離した。大部分のレシピエント・マウスには、出産まで妊娠を続けさせ、そしてＰＣＲ増幅を用いて、異なる新生組織において、ＧＦＰ  ＤＮＡを測定した。ＧＦＰ  ＤＮＡは、キメラ仔の脳（２２％）、心臓（３６．４％）および肝臓（２５％）で観察された（図８）。ＧＦＰ  ＤＮＡはまた、キメラ仔の４７％の精巣でも見られ、ＰＧＳ細胞が、生殖系列伝達可能であることが示唆された（表５）。
表５
【０１１５】
【表５】
2009502124.tif 000007
【０１１６】
［０１５３］ヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ  ＵＳＡ）における、皮下、筋内または輸精管注入によって、ｉｎ  ｖｉｖｏで奇形腫を形成する能力に関して、ＰＧＳ細胞を調べた。奇形腫形成の陽性対照として、何匹かのマウスにＥＳ細胞を注入した。皮下または筋内注入では、およそ１ｘ１０６細胞を注入した。輸精管マイクロインジェクションでは、輸出管を通じて、およそ２ｘ１０５細胞を注入した。６週間後、マウスを屠殺し、そして形態学的および組織学的分析のため、組織を採取した。結果によって、ＰＧＳ細胞が、移植後６週間、精巣において奇形腫を形成しないことが示された（０／２０）。対照的に、未分化ＥＳ細胞移植を受けたレシピエント・マウスすべてで、奇形腫の形成が観察された（６／６）（図１０Ｅ〜Ｆ）。
【０１１７】
［０１５４］ＰＧＳ細胞は、精巣から生じているため、生殖系列細胞に分化する能力を、精原細胞移植によって、さらに調べた。この方法によって、精原幹細胞が、不妊動物の空の精細管に再コロニー形成して、そして成熟精子に分化することが可能になる。新鮮に単離した細胞を、ｃ−ｋｉｔに関して選別し、そして樹立されたＰＧＳ株由来の細胞を、ブスルファン処理したヌードマウス精巣内に移植した。移植後６週間、新鮮に単離したｃ−ｋｉｔ陰性細胞のみがレシピエント・マウスにおいて精子形成を開始し（図１０Ｂ、Ｄ）；ｃ−ｋｉｔ陽性細胞または未選別ＰＧＳ細胞の移植後には精子形成はまったく観察されなかった（図１０Ｃ、Ｅ）。
実施例５
ＰＭ−３培地を用いた、ネズミ生殖系列幹細胞の心臓細胞への療法的再プログラミング
［０１５５］実施例１および２に記載するように、ネズミ始原性細胞を単離した。次いで、細胞を、ＰＭ−３培地（表６）中、２００，０００細胞／３．８ｃｍ２の密度でプレーティングし、そして一晩インキュベーションした。この日を第０日と称する。
表６
【０１１８】
【表６】
2009502124.tif 000008
【０１１９】
［０１５６］ＰＭ−３培地は、特定の系譜細胞へのＰＳＣおよび療法的に再プログラミングされたＰＳＣの分化および拡大のために特別に設計されている。上述のＰＭ−３培地は、本発明の療法的再プログラミング法の例示的な態様である。当業者には、ＰＭ−３の構成要素の濃度が多様であることも可能であり、そしてなお意図する結果を達成しうることが理解されるであろう。本発明の態様において、ｒｈＥＧＦの濃度は、およそ１０ｎｇ／ｍｌ〜およそ４０ｎｇ／ｍｌの範囲であることも可能であり、ｒｈＦＧＦ２の濃度は、およそ１０ｎｇ／ｍｌ〜およそ４０ｎｇ／ｍｌの範囲であることも可能であり、ｒｈＧＤＮＦの濃度は、およそ２ｎｇ／ｍｌ〜およそ４０ｎｇ／ｍｌの範囲であることも可能であり、そしてＥＳＧＲＯ（登録商標）マウスＬＩＦの濃度は、およそ１，０００単位／ｍｌ〜およそ１０，０００単位／ｍｌの範囲であることも可能である。
【０１２０】
［０１５７］翌日（第１日）、浮遊細胞を収集し、そして０．１％ゼラチン化プレート上にプレーティングして、そして適切な培地（ＰＭ−３）中で培養する。細胞のサイズは８〜１０ミクロンであり、丸く、仮足の外見を持ち、そして非接着性である。
【０１２１】
［０１５８］ＰＭ−３中で培養した細胞は、ほぼ第８日に、形態変化し始める。これは、療法的再プログラミングの第１段階であり、この間、細胞は分裂して目立つコロニーになり、そしてサイズはおよそ１０〜１５ミクロンであり、そして接着性である。さらに、細胞はより長くなり始め、そして先細になり、サイズは１５〜２０ミクロンであった。第８日までに、療法的再プログラミング段階１〜４がすでに起きており、培地ＰＭ−３中では、生殖系列幹細胞の分化可能な療法細胞への療法的再プログラミングが、ＰＭ−１中よりはるかに迅速に起こる。
実施例６
療法的に再プログラミングされた多能性生殖幹細胞の分化
［０１５９］ＰＧＳ細胞が他の表現型に分化可能であるかどうかを決定するため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＥＳ細胞の分化を誘導する方法を用いた。胚様体（ＥＢ）を生成するため、ＰＧＳコロニーをコラゲナーゼで解離させ、そして１５％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含有するＰＭ−１培地中、非接着性培養プレートに４日間プレーティングした。いくつかの実験において、ＥＢは懸滴中で形成された。次いで、これらを神経選択のため、血清不含Ｎ１培地：ＩＴＳ（インスリン、１０ｍｇ／ｌ；トランスフェリン、６．７ｎｇ／ｌ；セレン、５．５ｍｇ／ｌ）およびフィブロネクチン（５０μｇ／ｍｌ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）中で培養した。５〜７日後、神経前駆細胞の拡大のため、Ｎ２培地（ＩＴＳを含み、そして１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２）中、ゼラチンでコーティングした培養プレートにＥＢを移した。心筋細胞に分化させるには、ＥＢを形成し、そしてＤＭＳＯ（０．０６Ｍ）、５’−アザ−２’−デオキシ−シチジン（ＡＺＡ、５ｍＭ）およびカルジオジェノール−Ｃ（２５〜５０μＭ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カリフォルニア州サンディエゴ）を含む異なる心臓形成化合物の存在下で、２週間培養した。分化プロセス中、細胞形態を分析し、そしてＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現分析および免疫組織化学染色の両方のため、試料を採取した。
【０１２２】
［０１６０］未分化ＰＧＳ細胞を維持し、そして２０回を超える継代のため、培養中で維持し、そして増殖させる間、自発的な分化が起こる。図１１は、初期心臓形成中に発現される心臓系譜マーカーである、トロポニン−１の発現によって決定されるような、心筋細胞に分化したＰＧＳ細胞培養における２つの集団を示す（図１１Ａ〜ＢおよびＤ〜Ｅ）。同じ培養中、いくつかの集団が、最長数日間続く、律動収縮を示した（図１１Ｃ）。心臓特異的遺伝子Ｎｋｘ２．５およびＧＡＴＡ−４の発現もまた提示する（図１１Ｇ）。さらに、数は少ないが、多くの培養で、脂肪細胞へのＰＧＳ細胞の自発的分化が観察された（図１１Ｆ）。
【０１２３】
［０１６１］まず、細胞凝集後の胚様体（ＥＢ）形成によって、ＰＧＳ細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏで多数の系譜に分化する能力を評価した。ＰＧＳ細胞は凝集して、そして懸濁中および懸滴中の両方でＥＢを形成することが可能であった。凝集後数日だけ、ＧＦＰシグナルが観察され、ＥＢにおけるＯｃｔ−４および細胞分化の下方制御が示された（図１２Ａ、Ｃ）。ＥＢを、Ｎ１神経培地による神経選択に供し、その後、ｂＦＧＦを含有するＮ２培地中で神経前駆細胞を拡大すると、ＥＢから解離した細胞は、神経前駆細胞マーカー、ネスチンを発現した（図１２Ｃ）。いくつかの細胞はまた、アストロサイト・マーカー、ＧＦＡＰ（図１２Ｄ）、ならびに神経マーカー、神経フィラメント（図１２Ｅ）に関しても陽性に染色された。図１３Ａに示すように、これらの神経遺伝子マーカーの発現をＲＴ−ＰＣＲによって確認した。５−アザ−２−デオキシ−シチジン（ＡＺＡ）またはカルジオジェノール−Ｃで処理した後、ＰＧＳ細胞由来ＥＢを誘導して、心筋細胞に分化させることもまた、可能である。これらの表現型は、トロポニン−１（図１２Ｃ）および心臓ミオシン重鎖（図１２Ｇ）、ならびに図１３Ｂに示すように、心臓特異的遺伝子マーカー、Ｎｋｘ２．５を示した。
実施例７
ヒト精巣からの始原性細胞の単離
［０１６２］長期ホルモン（エストロゲン）治療下にあった男性被験体から、標準的な去勢外科手術法のもとで、精巣を得た。切除し、そして被膜を取り除く（ｄｅｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）前に、３％過酸化水素で５分間、精巣を消毒した。細いはさみを用いて、精巣組織を細かく刻み、そして「１酵素１工程」解離法に供した。この方法は、実施例１に詳述するようなマウス・プロトコルから変更したものであった。１ｍｇ／ｍｌの１型コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）および０．５ｍｇ／ｍｌ  ＤＮアーゼ（Ｓｉｇｍａ）を含有する培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）に、細かく刻んだ精巣組織を移した。１５０サイクル／分で作動する振盪水槽中、組織サイズに応じて、３７℃で３０〜６０分間、消化を行った。ＦＢＳ（最終濃度１０％）で酵素活性を中和した後、調製物を１００ミクロン細胞ろ過器（Ｂ−Ｄ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）に通過させることによって、解離した細胞を未消化組織から単離した。細胞懸濁物を４００ｘｇ、室温で１０分間遠心分離し、そして２４〜７２時間、好ましくは４８時間の示差接着のため、１％ＦＢＳを含有するＰＭ−１０培地中で、ペレットを再構成した（図１５Ａ）。
【０１２４】
［０１６３］さらに、精巣組織を「２酵素２工程」解離法に供してもよい。１ｍｇ／ｍｌのＩ型コラゲナーゼおよび０．５ｍｇ／ｍｌ  ＤＮアーゼを含有する培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）中に精巣組織を移した。１１０サイクル／分で作動する振盪水槽中、３７℃で１０分間、消化を行った。単位重力で１０分間沈降させることによって、間質細胞を分離し、そしてＤＭＥＭ／Ｆ１２中で洗浄した。最初の消化工程に関するものと同じ条件下で、Ｉ型コラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）、ＤＮアーゼ（０．５ｍｇ／ｍｌ）、およびヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ；０．５ｍｇ／ｍｌ）の混合物中、精巣組織の基底膜構成要素の最終消化を行った。得た単細胞懸濁物を、培地、ならびに１ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）および０．５％ウシ胎児血清を含有するＰＢＳで、連続して洗浄した。５０μｍナイロンメッシュを通じて細胞懸濁物をろ過することによって、白膜の未消化の残りを取り除いた。方法全体で、すべての細胞を５℃に維持した。
【０１２５】
［０１６４］さらに、精巣組織を「３酵素２工程」解離法に供してもよい。１．５ｍｇ／ｍｌの１型コラゲナーゼおよび０．５ｍｇ／ｍｌ  ＤＮアーゼを含有する培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）に、細かく刻んだ精巣組織を移した。１５０サイクル／分で作動する振盪水槽中、３７℃で１５分間、消化を行った。ＦＢＳ（最終濃度１０％）で酵素活性を中和した後、調製物を１００ミクロン細胞ろ過器に通過させることによって、解離した細胞を未消化組織から単離した。細胞懸濁物を４００ｘｇ、室温で１０分間遠心分離し、そして２４〜７２時間、好ましくは４８時間の示差接着のため、１％ＦＢＳを含有するＰＭ−１０培地中で、ペレットを再構成した（図１５Ｂ）。主に、精原幹細胞を含む精細管である、未消化組織を、３つの酵素：１．５ｍｇ／ｍｌ  １型コラゲナーゼ、１．５ｍｇ／ｍｌヒアルロニダーゼおよび０．５ｍｇ／ｍｌトリプシン（Ｓｉｇｍａ）の組み合わせによって、再び解離させた。１５０サイクル／分で作動する振盪水槽中、３７℃で３０〜４５分間、消化を行った。ＦＢＳ（最終濃度１０％）で酵素活性を中和した後、調製物をまず１００ミクロン細胞ろ過器に、そして次いで４０ミクロン細胞ろ過器に通過させることによって、解離した細胞を未消化組織から単離した。細胞懸濁物を４００ｘｇ、室温で１０分間遠心分離し、そして５００〜５０００万細胞／ｍｌ、好ましくは１０００万細胞／ｍｌの濃度で、１〜１０ｍｌのＰＭ−１００培地中で、ペレットを再構成した。漏斗上部を用いて、クロマトグラフィー・ガラスカラム（４５ｘ４５０ｍｍ、ＣｈｅｍＧｌａｓｓ、ニュージャージー州バインランド）上に細胞懸濁物を装填する。２〜４％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）−ＰＢＳ溶液上、４℃で２．５時間の重力沈降によって細胞分画を達成した。流速およそ１〜３ｍｌ／分で、分画した細胞を溶出させ、そしてカラムが空になるまで、１４ｍｌ分画を収集した。まず位相差で、そして次いでホフマン対物下で、各分画の細胞形態を顕微鏡的に調べて、培養のため、濃縮された精原幹細胞を含有する分画を同定した。
【０１２６】
［０１６５］あるいは、性腺から精細管を切断し、１０ｍｌの１ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＤＰＢＳ（−）を含有するプレートにこれらをプレーティングし、そして室温で１５分間インキュベーションすることによって、精巣から始原性細胞を単離してもよい。白膜を精細管から注意深く切断する。次いで、精細管を、ＤＰＢＳ（−）／コラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）／１００単位のＤＮアーゼＩに入れ、そして穏やかに振盪しながら３７℃の水槽中で２０〜３０分間インキュベーションする。次いで、等体積の２０％ＦＢＳ／ＤＰＢＳ（−）で消化反応を停止する。次いで、２０％ＦＢＳ／ＤＰＢＳ（−）で細胞を２回洗浄した。
【０１２７】
［０１６６］上述の方法のいずれかによって単離した精巣細胞を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によってさらに分画してもよい。０．５％ＦＢＳを含有するＰＢＳ（ＰＢＳ／ＦＢＳ）中に、解離した精巣細胞を再懸濁した（５ｘ１０６細胞／ｍｌ）。次いで、細胞を一次抗体と氷上で２０分間インキュベーションし、過剰なＰＢＳ／ＦＢＳで２回洗浄し、そしてＦＡＣＳ分析に用いた。一次抗体には、Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート化抗α６−インテグリン、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲート化抗ｃ−ｋｉｔ、およびビオチン化抗αｖ−インテグリンおよびヤギＩｇＧ抗ＧＤＮＦ受容体が含まれる。二次試薬を用いた実験のため、細胞をＡＰＣコンジュゲート化ストレプトアビジンとさらに２０分間インキュベーションして、ビオチン化抗体を検出した。すべての抗体または二次試薬を、５μｇ／ｍｌで用いた。対照細胞は、抗体で処理されない。最終洗浄後、１μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ）を含有する２ｍｌ  ＰＢＳ／ＦＢＳ中に細胞を再懸濁し（１０７細胞／ｍｌ）、３５μｍ孔サイズのナイロンスクリーンを通じてろ過して、試験管に入れ、そして分析まで、暗所で氷上に維持した。抗体染色、およびその相対的粒度、または内部の複雑さ（側方散乱、ＳＳＣ）に基づいて、細胞を選別した。４８８ｎｍアルゴン（２００ｍＷ）および６３３ｎｍヘリウムネオン（３５ｍＷ）レーザーを備えた、二重レーザーＦＡＣＳｔａｒ  Ｐｌｕｓ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって、細胞選別を行った。アルゴンレーザーを用いて、ＰＥおよびヨウ化プロピジウムを励起し、そしてＰＥには５７５  ＤＦ  ２６フィルター、そしてヨウ化プロピジウムには６１０  ＤＦ  ２０フィルターを用いて、発光を収集した。ネオンレーザーを用いてＡＰＣを励起し、そして６７５  ＤＦ  ２０フィルターで発光を検出した。データ収集時、ヨウ化プロピジウム陽性事象を排除することによって、死んだ細胞を排除した。１０％ＦＢＳを補充した氷冷ＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ／ＦＢＳ）２ｍｌを含有する５ｍｌポリスチレン試験管中に、細胞を選別して入れた。α６−インテグリン高／ＳＳＣ低／ｃ−ｋｉｔ（−）集団を療法的再プログラミングにさらに用いる。
実施例８
ヒト生殖系列幹細胞の療法細胞への療法的再プログラミング
［０１６７］始原性細胞を実施例７に記載するように単離した。次いで、単離したヒト生殖系列幹細胞を、組織培養プレートにプレーティングし、そして必要であれば、表７または８に開示するような培地中で、３７℃で一晩インキュベーションして、接着細胞をさらに取り除いた。
表７
【０１２８】
【表７】
2009502124.tif 000009
【０１２９】
表８
【０１３０】
【表８】
2009502124.tif 000010
【０１３１】
［０１６８］ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）−３４完全培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｒｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールスバッド）は、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）−３４血清不含培地（ＳＦＭ）およびＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）−３４栄養補助剤で構成され、そして米国特許第６，７３３，７４６  Ｂ２号に開示され、該特許の内容は、その全体、特に第１７〜１８欄の表１、２および３が本明細書に援用される。この開示の目的のため、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）−３４完全培地は、幹細胞基礎培地と称される。本発明の細胞培地に用いるＳｔｅｍＰｒｏ−３４完全培地の構成要素を列挙する表２および３を、‘７４６特許に見られるとおりに、正確に以下に再現する。
【０１３２】
［０１６９］ＰＭ−１０、ＰＭ−２０およびＰＭ−１００培地は、血清不含環境における、ヒト始原性細胞（ｈＰＳＣ）の培養および維持、ならびに多能性胚性幹細胞様細胞への最初の再プログラミングのために特別に設計された。上述のＰＭ−１０、ＰＭ−２０およびＰＭ−１００培地は、本発明の療法的再プログラミング法の例示的な態様である。当業者には、ＰＭ−１０、ＰＭ−２０およびＰＭ−１００培地の構成要素の濃度が多様であることも可能であり、そしてなお意図する結果を達成しうることが理解されるであろう。本発明の態様において、ｒｈＥＧＦの濃度は、およそ１０ｎｇ／ｍｌ〜およそ４０ｎｇ／ｍｌの範囲であることも可能であり、ｒｈＦＧＦ２の濃度は、およそ１ｎｇ／ｍｌ〜およそ１２０ｎｇ／ｍｌの範囲であることも可能であり、ｒｈＧＤＮＦの濃度は、およそ２ｎｇ／ｍｌ〜およそ４０ｎｇ／ｍｌの範囲であることも可能であり、そしてヒトＬＩＦの濃度は、およそ１，０００単位／ｍｌ〜およそ１０，０００単位／ｍｌの範囲であることも可能である。
【０１３３】
［０１７０］２４〜７２時間、示差接着させるか、幹細胞特異的抗体によって細胞選別するか、または沈降分画した後、単離精巣細胞を、０．１％〜０．２％ゼラチンおよび／またはフィーダー細胞（マウスまたはヒト線維芽細胞）でコーティングした新鮮な組織培養プレート上に再プレーティングし、そしてＰＭ−１０、ＰＭ−２０またはＰＭ−１００培地中で培養した。この段階で、細胞サイズはおよそ８〜１０ミクロンであり、そして非接着性であった（図１５ＡおよびＢ）。続ける前に、全部で３〜１７日間、細胞を培養した。
【０１３４】
［０１７１］非接着性生殖系列幹細胞は、次に、接着し（図１６）そして「卵様」構造に変形する（図１７）。ヒト生殖系列幹細胞をさらに３〜１７日間培養し、この時点で、細胞の「グレープ様」クラスターが培地中に現れる（図１８）。これらのグレープ様クラスターの外見はまた、細胞をヒト胚培地（ＳＳＳを含む完全胚盤胞培地、Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号９９３０）中で培養することによっても誘導されうる。細胞が、緊密に詰まったコロニーを形成し始めるまで、ＰＭ−１０、ＰＭ−２０またはヒト胚培地中で、細胞を培養し続ける（図１９）。
【０１３５】
［０１７２］次いで、細胞に基づく再生療法で使用するのに適した多能性生殖系列幹（ＰＧＳ）細胞へのヒト生殖系列幹細胞の変換経路の最終段階において、コロニーを収集し、そしてマイトマイシンＣで不活化した初代胚性線維芽細胞（ヒトまたはマウス）を場合によって含有する６ｃｍ組織培養プレート内で解離させた。胚性幹細胞によって形成されるコロニーに似た、非常に目立つ詰まったコロニー（図２０）を形成することによって、生じたＰＧＳ細胞が特徴付けられた。これらの細胞は、ヒト特異的マーカー（抗ヒト・ミトコンドリア抗体［Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ＭＡＢ  １２７３］、図２１）、Ｏｃｔ−４（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ＭＡＢ  ４３０５、図２２Ａ）およびＮａｎｏｇ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ａ３００−３９８Ａ、図２２Ｂ）の発現によってもまた特徴付けられた。再プログラミングは、多能性幹細胞で発現されるサイン遺伝子であるＯｃｔ−４の発現を伴う、制御されたプロセスである。Ｏｃｔ−４は、多能性細胞が分化するにつれて下方制御され、そして分化した細胞が多能性潜在能力を回復するにつれて上方制御される。マウス精巣幹細胞を多能性ＰＧＳコロニーになるように再プログラミングすると、Ｏｃｔ−４の発現が再出現した（実施例４）。したがって、Ｏｃｔ−４発現の動態の追跡をヒト精巣幹細胞培養における再プログラミングの指標として用いる。成体ヒト精巣がＯｃｔ−４を発現しないことがよく立証されてきている（図２３、レーン３）。精巣組織から単離し、そして酵素解離、示差接着または分画を通じてプロセシングした細胞もまた、Ｏｃｔ−４を発現しない（図２３、レーン４）。対照的に、Ｏｃｔ−４発現は、培養第９〜３５日の間に上方制御された（図２３、レーン５〜８）。この証拠によって、成体ヒト精巣幹細胞が療法的に再プログラミングされており、血清不含培地（ＰＭ−１０、ＰＭ−２０またはＰＭ−１００培地）中での培養中に、Ｏｃｔ−４の発現によって証拠付けられるように、多能性を回復したことが立証される。Ｎａｎｏｇ（図２３）、Ｄｐｐａ５、Ｓｏｘ２、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１を含む、いくつかの多能性マーカーもまた、再プログラミング後に発現されていることが見出された。生殖系列特異的マーカーＤＡＺＬに対する抗体で細胞を染色することによって、ヒト生殖系列細胞の同一性を確認した（図２３）。
【０１３６】
［０１７３］３つのプロトコル：二次元血清不含プロトコル、二次元血清含有プロトコルおよび三次元血清不含プロトコルによって、再プログラミングされた多能性ヒト幹細胞を拡大した。二次元血清不含プロトコルにおいて、単離し、そして再プログラミングした精巣幹細胞を、１型コラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）またはトリプシン（１ｍｇ／ｍｌ）によって解離させ、そしてゼラチン（０．１〜０．２％）でコーティングした表面またはフィーダー細胞（不活化マウスまたはヒト胚性線維芽細胞）上に再プレーティングした。ＰＭ−１０、ＰＭ−２０またはＰＭ−１００培地中で細胞を培養し、そして拡大した（図２０）。拡大した細胞コロニーを増殖させるか、凍結するか、または特定の表現型に分化させた。
【０１３７】
［０１７４］二次元血清含有プロトコルにおいて、１５〜２０％ＦＢＳを含有しているＰＭ−１０において、あるいはＰＭ−５またはＰＭ−１０１培地において、細胞を培養し、そして拡大した。拡大した細胞コロニーを手で摘み取るか、あるいは１型コラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）またはトリプシン（１ｍｇ／ｍｌ）によって解離させ、ゼラチンでコーティングしたプレート（０．１〜０．２％）上、プラスチック培養フラスコ、ＭＥＦフィーダー、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）マトリックス、またはフィブロネクチンでコーティングしたプレートまたはカバースリップにプレーティングした。拡大した細胞コロニーを増殖させるか、凍結するか、または特定の表現型に分化させた。
【０１３８】
［０１７５］三次元血清不含プロトコルにおいて、単離、示差接着、および／またはＢＳＡ分画後の細胞を、回転培養しながら、バイオリアクター中、懸濁中でＰＭ−１００培地において培養した。細胞を５００ｍｌまたは２５０ｍｌ  ＣｙｔｏＳｐｉｎフラスコ（ＶＷＲ）中に入れ、そしてそれぞれ、４００ｍｌまたは２００ｍｌのＰＭ−１００培地中で培養した。フラスコを、インキュベーター中、３４〜３７℃で、５０〜７０ｃｐｍに設定した回転速度のスターラー上に置くことによって、回転を達成した。頻繁な間隔で試料を収集して、細胞生存度、細胞数、Ｏｃｔ−４およびＮａｎｏｇ発現などの多能性マーカー、ならびに細胞拡大を評価した。遠心分離および新鮮な培地中での再構成によって、バイオリアクター中の培地を５〜７日ごとに交換した。拡大した細胞コロニーを増殖させるか、凍結するか、または特定の表現型に分化させた。
実施例９
療法的に再プログラミングされたヒト多能性生殖系列幹細胞の心臓細胞への分化
［０１７６］実施例８由来の療法的に再プログラミングされたヒト出生後幹細胞をいくつかの異なる細胞種に分化させてもよい。実施例７に記載するように、始原性細胞を単離した。次いで、あらかじめ０．１％ゼラチンで処理した６ｃｍ組織培養プレート上に細胞をプレーティングし、そしてアザ−２’−デオキシシジチンを含有する培地中、３４℃〜４２℃の温度範囲で、標準的ＣＯ２細胞培養インキュベーター中、３０日間培養し、培地を３０日間、１日おきに交換した。
【０１３９】
［０１７７］およそ０．１μＭ〜９．０μＭの濃度で、アザ−２’−デオキシシチジンをＰＭ−１、ＰＭ−３、ＰＭ−１０またはＰＭ−２０培地に添加した。ＰＭ−１培地は実施例３に記載され、ＰＭ−３培地は実施例６に記載され、そしてＰＭ−１０およびＰＭ−２０培地は実施例８に記載される。本明細書に記載するアザ−２’−デオキシシチジン含有培地は、本発明の療法的再プログラミング法の例示的な態様である。アザ−２’−デオキシシチジン含有培地の構成要素の濃度が多様であることも可能であり、そしてなお意図する結果を達成しうることが、当業者には理解されるであろう。本実施例の目的のため、アザ−２’−デオキシシチジン含有培地はＰＭ−１−ＡＺＡである。
【０１４０】
［０１７８］ＰＭ−１−ＡＺＡ培地中でほぼ１１日後、懸濁生殖系列幹細胞は、療法的再プログラミングを経て、そしてプレートに付着し、そしてコロニーを形成する（図２４Ａ）。ＰＭ−１−ＡＺＡ培地中でほぼ２２日後、細胞は目立つコロニーを形成した（図２４Ｂ）。
【０１４１】
［０１７９］ＰＭ−１−ＡＺＡ培地を用いた培養中でほぼ３５日後、懸濁生殖系列幹細胞は、分化し、そして心臓マーカー心筋トロポニン１（図２５Ａ〜Ｃ）、心臓アルファ・アクチン（図２５Ｄ）、デスミン（図２５Ｅ）および心臓ミオシン（図２５Ｆ）に関して陽性に染色され、そしてＮｋｘ２．５およびＧＡＴＡ−４を含む心筋細胞特異的遺伝子を発現した（図２５Ｇ）。
実施例１０
療法的に再プログラミングされたヒト多能性生殖系列幹細胞の組織特異的細胞への分化
［０１８０］実施例８由来の、療法的に再プログラミングされた単離ヒト生殖系列幹細胞を、モノクローナル抗ＧＦＡＰ抗体（Ｂ−Ｄ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅカタログ番号５５６３２９）を用いた蛍光免疫細胞化学によって、グリア細胞マーカー、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の発現に関して同定する前に、ＰＭ−ＳＨＨ培地（表９）中、３４℃で２４日間培養した。全培養期間中に、異質な細胞は導入されなかった。培地を１日おきに新しくした。
表９
【０１４２】
【表９】
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【０１４３】
［０１８１］染色された細胞集団において、ＧＦＡＰ＋細胞は、ＰＭ−ＳＨＨ培地中で培養した集団においてのみ観察され（図２６Ａ）、ＰＭ−１培地中では観察されなかった（図２６Ｂ）。これらの結果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、単離したヒト性腺幹細胞がＧＦＡＰ＋グリア細胞を含む神経細胞に分化するよう、指示可能であるという証拠を提供する。成体精巣において、グリア細胞が存在するという既知の証拠はないため、上に示すＧＦＡＰグリア細胞は、療法的再プログラミングを介して、性腺幹細胞（多能性細胞）から分化した。
【０１４４】
［０１８２］アストログリア分化に加えて、再プログラミングされた多能性精巣幹細胞はまた、ＭＡＰ−２、ＮＦ−６８、およびＧＡＤ−６７を含むニューロン特異的マーカーの発現によって立証されるように、ＰＭ−ＳＨＨ培地中で、神経細胞にも分化可能である（図２６Ｃ）。再プログラミングおよび拡大中、精巣幹細胞と胚性マウス・プレ脂肪細胞（頭蓋骨骨髄から単離された、マウスＰＡ  ６細胞；ＰＡ６細胞は、理研（Ｒｉｋｉｎｓ）、日本から購入される）との共培養は、精巣幹細胞のニューロンならびにアストログリア細胞への分化を生じる。特定の神経細胞種が、分化後に同定され、これらには、ＧＡＢＡ作動性ニューロン（ＧＡＤ−６７発現）およびドーパミン作動性ニューロン（チロシン・ヒドロキシラーゼに対する抗体によって、陽性に染色される）が含まれた。
【０１４５】
［０１８３］オリゴデンドログリア細胞は、以下のように、再プログラミングされた多能性精巣幹細胞から分化した。ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）発現（図２６Ｄ）に関しては、二次元血清含有法によって単離し、そして増殖させた精巣幹細胞を、１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦおよび１ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦを含むＮ２培地中、フィブロネクチンでコーティングしたカバースリップ上にプレーティングした。２％ＦＢＳを含み、増殖因子を含まないＰＭ−１０培地中、０．２％ゼラチンでコーティングしたカバースリップ上で、対照細胞を培養した。ガラクトセレブロシド−Ｃ（Ｇａｌ−Ｃ）およびプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）発現を決定するため（図２６Ｅ）、二次元血清含有法によって単離し、そして増殖させた精巣幹細胞を、ＧｌｕｔａＭａｘを含み、４０％  ＭＣＤＢ−２０１培地（Ｓｉｇｍａ）を含み、そしてＩＴＳ＋ＬＡ−ＢＳＡ（ウシ膵臓由来の１０μｇ／ｍｌインスリン、５．５μｇ／ｍｌヒト・トランスフェリン（実質的に鉄不含）、５ｎｇ／ｍｌ亜セレン酸ナトリウム、０．５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンおよび４．７μｇ／ｍｌリノレン酸）、１ｎＭデキサメタゾン、１００μＭアスコルビン酸を補充したＤＭＥＭ低グルコース中、フィブロネクチンでコーティングしたカバースリップ上にプレーティングし、そして２００ｎｇ／ｍｌ  ＳＨＨおよび１００ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−８で３日間処理し、そして次いで、２０ｎｇ／ｍｌ  ＢＤＮＦを含むＮ２補助剤に交換した。ＧｌｕｔａＭａｘを含み、２％ＦＢＳ、ＭＣＤＢ−２０１  ４０％を含み、そしてＩＴＳ＋ＬＡ−ＢＳＡ、１ｎＭデキサメタゾンおよび１００μＭアスコルビン酸を補充したＤＭＥＭ低グルコース中、０．２％ゼラチンでコーティングしたカバースリップ上、ＳＨＨおよびＦＧＦ−８を添加せずに、対照細胞を培養した。
【０１４６】
［０１８４］心臓および神経分化に加えて、再プログラミングされた多能性精巣幹細胞はまた、軟骨細胞（図２７Ａ〜Ｂ）、骨細胞（図２７Ｃ〜Ｄ）および肝細胞（図２７Ｅ〜Ｆ）にも分化可能である。
【０１４７】
［０１８５］軟骨細胞分化のため、二次元血清含有法によって単離し、そして増殖させた精巣幹細胞を、２０％ＦＢＳ、および培地交換直前に培地に添加する１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−３βを含む、ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ（登録商標）培地（Ｃａｍｂｒｅｘ  ＰＴ４１２４）中、０．２％ゼラチンでコーティングしたプレート上にプレーティングした。Ｌ−グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含み、２０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ低グルコース中で、対照細胞を培養した。
【０１４８】
［０１８６］骨細胞分化のため、二次元血清含有法によって単離し、そして増殖させた精巣幹細胞を、Ｌ−グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含み、２０％ＦＢＳを補充し、そして１００ｎＭデキサメタゾン、０．２５ｍＭアスコルビン酸および１０ｍＭ  Ｂ−グリセロホスフェートを添加したＤＭＥＭ低グルコース中、０．２％ゼラチンでコーティングしたプレート上にプレーティングした。培地交換は２〜３日ごとであった。Ｌ−グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含み、２０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ低グルコース中、０．２％ゼラチンでコーティングしたプレート上で、対照細胞を培養した。
【０１４９】
［０１８７］肝細胞分化のため、二次元血清含有法によって単離し、そして増殖させた精巣幹細胞を、ＧｌｕｔａＭａｘを含み、５％ＦＢＳ、４０％  ＭＣＤＢ−２０１を含み、そしてＩＴＳ＋ＬＡ−ＢＳＡ、１ｎＭデキサメタゾン、１００μＭアスコルビン酸、１０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−４および２０ｖｎｇ／ｍｌ  ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）を補充したＤＭＥＭ低グルコース中、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）でコーティングしたプレート上にプレーティングした。２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中、０．２％ゼラチンでコーティングしたプレート上で、対照細胞を維持した。
【０１５０】
［０１８８］別に示さない限り、明細書および請求項で用いる、分子量、反応条件等の特性である、成分の量を表すすべての数字は、すべての場合で、用語「約」によって修飾されると理解されるものとする。したがって、逆に示されない限り、明細書および付随する請求項に示す数字のパラメータは、本発明によって得ようとする所望の特性に応じて、多様であってもよい近似値である。最低限でも、そして請求項の範囲に同等である原理の適用を制限する試みとしてではなく、数字のパラメータ各々は、少なくとも、報告される有効数字の数の観点で、そして通常の丸め技術を適用することによって、解釈されなければならない。本発明の広い範囲を示す数値域およびパラメータが、近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に示す数値は、可能な限り正確であるように報告される。しかし、いかなる数値も、生得的に、それぞれの試験測定値で見られる標準偏差から必然的に生じる、ある程度の誤差を含有する。
【０１５１】
［０１８９］本発明を記載する文脈で（特に請求項の文脈で）用いる用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」、ならびに類似の指示語は、本明細書に別に示されるかまたは文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を含むと見なされるものとする。本明細書における値の範囲の列挙は、範囲内に属する別個の値各々に個々に言及する簡単な方法として働くよう意図される。本明細書に別に示さない限り、各個々の値は、本明細書に個々に列挙されたかのように、本明細書に援用される。本明細書記載の方法はすべて、本明細書に別に示されるかまたは文脈によって明らかに矛盾しない限り、いかなる適切な順序で行ってもよい。本明細書で提供する、あらゆる例、または例示的な言葉遣い（例えば「など」）の使用は、本発明をよりよく解明することを単に意図し、そして別に請求する本発明の範囲に限定を課さない。明細書中の言葉遣いは、本発明の実施に本質的ないかなる非請求要素も示すと見なされるべきである。
【０１５２】
［０１９０］本明細書に開示する、本発明の代替要素または態様のグループ分けは、限定として見なされないものとする。各グループメンバーを、個々に、またはグループの他のメンバーもしくは本明細書に見られる他の要素と任意に組み合わせて、称し、そして請求してもよい。便宜上および／または特許性の理由のため、グループの１以上のメンバーをグループに含めても、またはグループから除去してもよいと予期される。こうした包含または除去のいずれが起こる場合も、本明細書は、修飾されるような、したがって付随する請求項に用いられる、マーカシュ・グループの書面による記載を満たすグループを含有すると見なされる。
【０１５３】
［０１９１］本発明を実行するため、本発明者に知られる最適の様式を含めて、本発明の好ましい態様を本明細書に記載する。もちろん、前述の説明を読むと、一般の当業者には、これらの好ましい態様に関する変形が明らかになるであろう。本発明者らは、当業者がこうした変形を適切に使用することを期待し、そして本発明者らは、本明細書に具体的に記載するのと別の方式で本発明が実施されることを意図する。したがって、本発明には、適用可能な法律によって許されるような、本明細書に付随する請求項に列挙する主題のすべての修飾および同等物が含まれる。さらに、すべてのありうる変形での上述の要素のいかなる組み合わせも、本明細書に別に示さない限り、または文脈によって明らかに否定されない限り、本発明に含まれる。
【０１５４】
［０１９２］さらに、本明細書全体で、特許および印刷された刊行物に多くの言及がなされている。上に引用する参考文献および印刷された刊行物の各々は、その全体が個々に、本明細書に援用される。
【０１５５】
［０１９３］締めくくりに、本明細書に開示する本発明の態様は、本発明の原理の例示であると理解されるものとする。使用可能な他の修飾が、本発明の範囲内である。したがって、例であるが、限定ではなく、本明細書の解説にしたがって、本発明の代替形態を利用してもよい。したがって、本発明は、まさに示され、そして記載されるとおりのものに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】［００４４］図１は、本発明の解説にしたがった、多能性生殖幹（ＰＧＳ）細胞へのＳＳＣの療法的再プログラミングを示す。培養後、まもなく、Ｏｃｔ−４の下方制御が観察された（Ａ〜Ｂ）。培養第２週に細胞が付着した後、明らかな形態学的変化が生じた（Ｃ〜Ｄ）。培養およそ３週間後、小さい丸い細胞を含有するコロニーが形成された（Ｅ）。培養約１ヵ月後、ＧＦＰの発現によって示されるようなＯｃｔ−４の上方制御が観察された（Ｆ）。３つの異なるＰＧＳ細胞株（ＰＧ−ｍＧＳＣ１−２、新生ＯＧ２およびＰＧ−ｍＧＳＣ−３成体ＯＧ２）の画像をパネルＧ〜Ｉに提示する。スケールバー：７０μｍ。
【図２】［００４５］図２は、本発明の解説にしたがってフローサイトメトリーを用いた、マウス精巣幹細胞からのｃ−ｋｉｔ陽性およびｃ−ｋｉｔ陰性下位集団の単離を示す。ＧＦＰ発現によって検出した際、Ｏｃｔ−４陽性細胞は、野生型精巣細胞に比較して目立つ細胞集団として見出された（Ａ〜Ｂ）。Ｏｃｔ−４陽性細胞の中で、ｃ−ｋｉｔ陽性細胞（Ｒ５）およびｃ−ｋｉｔ陰性細胞（Ｒ２）からなる２つの下位集団が見出された（Ｃ〜Ｄ）。５８０チャネル（ＡｕｔｏＦＩ）を用いて、自己蛍光細胞をゲート・アウトした。
【図３】［００４６］図３は、本発明の解説にしたがった、ＰＧＳコロニー中の多能性マーカーの免疫位置決定を示す。Ａ：Ｏｃｔ−４；Ｂ：Ｎａｎｏｇ；Ｃ：ＳＳＥＡ−１；Ｄ：アルカリホスファターゼ。スケールバー：Ａ：２０μｍ；ＢおよびＤ：１００μｍ；Ｃ：１０μｍ。
【図４】［００４７］図４は、ＲＴ−ＰＣＲによって検出した際の、本発明の解説にしたがって作製したＰＧＳコロニー中の多能性マーカー遺伝子の発現を示す。レーン１：水、レーン２：マウス精巣、レーン３：マウスＥＳ細胞、レーン４〜６：ＰＧＳ株１〜３。
【図５】［００４８］図５は、フローサイトメトリーを用いた、本発明の解説にしたがって作製したＰＧＳ細胞およびＥＳ細胞間のＳＳＥＡ−１発現の比較を示す。ＳＳＥＡ−１陽性細胞の割合およびＳＳＥＡ−１染色強度の両方が、ＥＳ細胞よりもＰＧＳ細胞でより低い。
【図６】［００４９］図６は、成体脂肪幹細胞およびマウスＥＳ細胞に比較した際の、本発明の解説にしたがって作製したＰＧＳ細胞株のテロメラーゼ活性を示す。レーン１：熱不活化マウス脂肪由来幹細胞（ｍＡＤＳＣ）；２：損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）ｍＡＤＳＣ；３：熱不活化し、そして選別したマウスＥＳＣ；４：選別したマウスＥＳ細胞；５：選別したｃ−ｋｉｔ陽性細胞、熱不活化；６：選別したｃ−ｋｉｔ陽性細胞；７：選別したｃ−ｋｉｔ陰性細胞、熱不活化；８：選別したｃ−ｋｉｔ陰性細胞；９：ＰＧＳ細胞（継代数１０）、熱不活化；１０：ＰＧＳ細胞（継代数１０）：１１：細胞抽出溶解緩衝液のみ；１２：低分子量ラダー。
【図７】［００５０］図７は、本発明の解説にしたがって作製したＰＧＳ細胞株の核型を示す。核型は、分析した８０の分裂中期スプレッドの典型である。１５回の継代後、細胞は正常な核型を示す。
【図８】［００５１］図８は、本発明の解説にしたがって作製したＰＧＳ細胞から生じたキメラ仔の組織における、ＰＣＲを用いたＧＦＰ  ＤＮＡの増幅を示す。テンプレートＤＮＡを欠く反応、ならびに陰性対照として用いたＣＤ１マウスから収集したＤＮＡでは、ＧＦＰはまったく観察されなかった。ＧＦＰ陽性ＥＳ細胞から生じたキメラ仔由来の組織試料を陽性対照として用いた。
【図９】［００５２］図９は、本発明の解説にしたがって作製したＰＧＳ細胞の、胚盤胞注入後の内部細胞塊への取り込みを示す。ＣＤ−１レシピエント胚盤胞内への注入の２４時間後、ＧＦＰシグナルを示す画像を撮影した。スケールバー：２５μｍ。
【図１０】［００５３］図１０は、本発明の解説にしたがった、新鮮に単離したＧＦＰ陽性細胞（Ｂ）、選別したｃ−ｋｉｔ陽性細胞（Ｃ）、選別したｃ−ｋｉｔ陰性細胞（Ｄ）、ＰＧＳ細胞株（Ｅ）およびマウスＥＳ細胞（Ｆ）の精巣移植後の奇形腫の形成および精子形成の再生を示す。Ａは；ブスルファン処置２．５ヵ月後の対照精巣の組織学を示す。精細管の大部分は、内因性精子形成から欠失している。移植した細胞の中で、ＥＳ細胞のみが奇形腫を形成し（Ｆ）、そして移植６週間後に評価すると、新鮮に単離したＧＦＰ陽性細胞およびｃ−ｋｉｔ陰性細胞のみが精子形成を再生した（Ｂ、Ｄ）。スケールバー：Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ：３００μｍ；ＢおよびＤ：１７５μｍ。
【図１１】［００５４］図１１は、本発明の解説にしたがった、心筋細胞および脂肪細胞へのＰＧＳ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化を示す。いくつかの培養条件下で、生殖系列幹細胞は凝集体を形成した（Ａ）。１〜２日以内に、これらの凝集体は、細胞層へと分化し続けた（Ｂ）。凝集体および細胞層はどちらも、心筋細胞マーカー、トロポニン−１を発現した（ＤおよびＥ）。さらに、いくつかの凝集体は、律動収縮を示した（Ｃ）。生殖系列幹細胞はまた、オイルレッド染色で示されるように、脂肪細胞へと自発的に分化した（Ｆ）。ＲＴ−ＰＣＲ分析によって、心筋細胞へと自発的に分化した後のＰＧＳ細胞において、心臓特異的遺伝子ＮＫｘ−２．５、およびＧＡＴＡ−４の発現が示された。スケールバー：Ａ、Ｃ、Ｄ：６０μｍ；ＢおよびＥ：９０μｍ；Ｆ：１２μｍ。
【図１２】［００５５］図１２は、本発明の解説にしたがった、ニューロンおよび心筋細胞へのＰＧＳ細胞の分化誘導を示す。ＰＧＳ細胞は、非接着性培養プレート中での培養の４８時間後、胚様体（ＥＢ）を形成した。凝集体内の細胞は、なおＧＦＰ陽性であり、Ｏｃｔ−４が発現していることが示された（Ａ）。凝集第４日、すべてのＥＢがＧＦＰ発現を失い、分化したことが示された（Ｂ）。分化誘導２週間後、ネスチン陽性神経前駆細胞（Ｃ）、ＧＦＡＰ陽性アストロサイト（Ｄ）および神経フィラメント陽性細胞（Ｅ）が見出された。ＡＺＡおよびカルジオジェノール（Ｃａｒｉｏｇｅｎｏｌ）−Ｃを用いて、凝集したＰＧＳ細胞を心筋細胞に向けた（Ｆ〜Ｇ）。誘導後、間もなく、心筋細胞特異的トロポニンを発現する細胞が形成された（Ｆ）。分化したＰＧＳ細胞の単層において、心臓特異的ミオシン重鎖陽性細胞が示される（Ｇ）。スケールバー：Ａ、Ｂ、Ｆ、Ｇ：４５μｍ；Ｃ〜Ｅ：２５μｍ。
【図１３】［００５６］図１３は、本発明の解説にしたがった分化誘導後の神経および心臓遺伝子マーカーの発現を示す（Ａ、Ｂ）。同じ分化プロトコルを経て分化したＰＧＳ細胞、ならびにＥＳ細胞における、神経前駆細胞マーカー、ネスチンの存在、ならびにニューロン・マーカー、ＭＡＰ−２およびＧＦＡＰの発現に注目されたい（Ａ）。アザ、カルジオジェノール−Ｃまたは組み合わせを用いた分化後の、ＰＧＳ細胞における心臓特異的遺伝子ＮＫｘ−２．５の発現（Ｂ）。
【図１４】［００５７］図１４は、幹細胞マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−８１およびＴｒａ−１−６０に対する抗体を用いた、ヒト生殖系列幹細胞の濃縮のための蛍光活性化細胞選別を示す。
【図１５】［００５８］図１５は、本発明の療法的再プログラミング法の接着工程後、１酵素（図１５Ａ）または３酵素（図１５Ｂ）法によって単離したヒト生殖系列幹細胞を示す。
【図１６】［００５９］図１６は、本発明の療法的再プログラミング法におけるヒト生殖系列幹細胞の付着を示す。
【図１７】［００６０］図１７は、本発明の療法的再プログラミング法における「卵様」構造中のヒト生殖系列幹細胞を示す。
【図１８】［００６１］図１８は、本発明の療法的再プログラミング法の間の「グレープ様」クラスター中のヒト生殖系列幹細胞を示す。
【図１９】［００６２］図１９は、本発明のＰＭ−１０／ＰＭ−２０療法的再プログラミング法の工程３におけるヒト生殖系列幹細胞のコロニーを示す。
【図２０】［００６３］図２０は、本発明の療法的再プログラミング法の解説にしたがった、ヒト生殖系列幹細胞のコロニーを示す。
【図２１】［００６４］図２１は、抗ヒト・ミトコンドリア抗体で染色した、本発明の解説にしたがって療法的に再プログラミングされた多能性ヒト生殖系列幹（ＰＧＳ）細胞を示す。
【図２２】［００６５］図２２は、抗ヒトＯｃｔ−４（図２２Ａ）または抗ヒトＮａｎｏｇ（図２２Ｂ）抗体で染色した、本発明の解説にしたがって療法的に再プログラミングされた多能性ヒト幹細胞を示す。
【図２３】［００６６］図２３は、ＰＭ−１０培地中での再プログラミング９日後、上方制御されたＯｃｔ−４およびＮａｎｏｇを有する、本発明の解説にしたがって療法的に再プログラミングされた多能性ヒト幹細胞を示す。成体ヒト精巣組織（レーン３）および単離精巣幹細胞（第０日、レーン４）は、多能性遺伝子、特にＯｃｔ−４を発現しない。精巣幹細胞は、生殖系列特異的マーカーＤＡＺＬを発現する。
【図２４】［００６７］図２４Ａ〜Ｂは、本発明の解説にしたがった心臓分化プロセスの第１１日（図２４Ａ）および第２２日（図２４Ｂ）の療法的に再プログラミングされた多能性ヒト幹細胞を示す。
【図２５Ａ】［００６８］図２５Ａ〜Ｇは、心臓細胞マーカー心筋トロポニン（図２５Ａ〜Ｃ）、アルファ・アクチン（図２５Ｄ）、デスミン（図２５Ｅ）、心筋ミオシン（図２５Ｆ）に対する抗体での染色によって、そしてＮｋｘ２．５、ＧＡＴＡ−４およびアルファ・アクチンを含む心臓特異的遺伝子マーカーの発現（図２５Ｇ）によって立証される、本発明の解説にしたがって心臓細胞に分化した、療法的に再プログラミングされた多能性ヒト幹細胞を示す。
【図２５Ｂ】心臓細胞マーカー心筋トロポニン（図２５Ａ〜Ｃ）。
【図２５Ｃ】心臓細胞マーカー心筋トロポニン（図２５Ａ〜Ｃ）。
【図２５Ｄ】アルファ・アクチン。
【図２５Ｅ】デスミン。
【図２５Ｆ】心筋ミオシン。
【図２５Ｇ】Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ−４およびアルファ・アクチンを含む心臓特異的遺伝子マーカー。
【図２６Ａ】［００６９］図２６Ａ〜Ｅは、本発明の解説にしたがった異なる培養プロトコルにより、神経細胞に分化した、療法的に再プログラミングされた多能性ヒト幹細胞を示す。グリア細胞マーカー、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）に対する抗体での染色によって立証されるように、神経分化増殖因子、ソニック・ヘッジホッグ（ＳＨＨ）を含有する培地（ＰＭ−１またはＰＭ−１０のいずれかに基づく、ＰＭ−ＳＨＨ）によって、アストログリア細胞が誘導された（図２６Ａ）。
【図２６Ｂ】ＳＨＨを添加しない対照培地（ＰＭ−１）は、グリア細胞分化を誘導しなかった。
【図２６Ｃ】ニューロン遺伝子マーカー、神経フィラメント−６８およびＧＡＤ−６７の発現によって立証されるように、ＰＭ−ＳＨＨによって、神経細胞もまた、誘導された。
【図２６Ｄ】ＰＭ−１０培地を、ＳＨＨ、ＦＧＦ８およびＢＤＮＦを含む分化因子を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２に基づく培地と交換することによって、オリゴデンドログリア細胞が誘導され、そしてこれはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、図２６Ｄ）およびガラクトセレブロシド−Ｃ（Ｇａｌ−Ｃ、図２６Ｅ）に対する抗体で染色することによって立証された。
【図２６Ｅ】ＰＭ−１０培地を、ＳＨＨ、ＦＧＦ８およびＢＤＮＦを含む分化因子を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２に基づく培地と交換することによって、オリゴデンドログリア細胞が誘導され、そしてこれはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、図２６Ｄ）およびガラクトセレブロシド−Ｃ（Ｇａｌ−Ｃ、図２６Ｅ）に対する抗体で染色することによって立証された。
【図２７Ａ】［００７０］図２７Ａ〜Ｆは、アルシアンブルーでの染色（図２７Ａ）、軟骨細胞マーカーの発現（図２７Ｂ）によって立証されるように、ＴＧＦ−３βを含有する軟骨形成性ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ（登録商標）培地中で培養することによって、本発明の解説にしたがって軟骨細胞に分化した、療法的に再プログラミングされた多能性ヒト幹細胞を示す。さらに、アリザリンレッドでの染色（図２７Ｃ）および骨細胞マーカーの発現（図２７Ｄ）によって立証されるように、デキサメタゾン、アスコルビン酸およびＢ−グリセロホスフェートを含有するＤＭＥＭ−ＬＧ／ＧＬ培地中で培養されることによって、本発明の解説にしたがって、療法的に再プログラミングされた多能性ヒト幹細胞は、骨細胞に分化した。さらに、療法的に再プログラミングされた多能性ヒト幹細胞は、形態（図２７Ｅ）および肝細胞−内胚葉遺伝子マーカーの発現（図２７Ｅ）によって立証されるように、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）およびＦＧＦ−４を含有するｈＭＡＳＣ培地中で培養されることによって、本発明の解説にしたがって、療法的に再プログラミングされた多能性ヒト幹細胞は、肝細胞に分化した。
【図２７Ｂ】軟骨細胞マーカーの発現（図２７Ｂ）。
【図２７Ｃ】アリザリンレッドでの染色（図２７Ｃ）。
【図２７Ｄ】骨細胞マーカーの発現（図２７Ｄ）。
【図２７Ｅ】形態（図２７Ｅ）。
【図２７Ｆ】肝細胞−内胚葉遺伝子マーカーの発現（図２７Ｅ）。
【図２８】［００７１］図２８は、本発明の解説にしたがって作製されたヒトＰＧＳ細胞株の核型を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２５Ｅ】
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【図２５Ｆ】
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【図２５Ｇ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２６Ｅ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２７Ｅ】
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【図２７Ｆ】
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【図２８】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年6月18日(2008.6.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト生殖系列幹細胞培養物を作製する方法であって：
出生後のヒト由来の生殖細胞サンプルを用意し；
前記生殖細胞サンプルからｃ−ｋｉｔ陰性且つα6インテグリン陽性の細胞を単離し；
単離されたｃ−ｋｉｔ陰性且つα6インテグリン陽性の細胞を、生育と増殖に有効な条件下で培養することにより、生殖系列幹細胞培養物を作製する工程を含み、
ここで、該生殖系列幹細胞培養物は、自己再生と、外胚葉細胞型、中胚葉細胞型及び内胚葉細胞型の全てに分化する能力を有するものである、前記方法。
【請求項２】
生殖系列幹細胞培養物中の単離されたｃ−ｋｉｔ陰性且つα6インテグリン陽性の細胞が、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、Ｄｐｐａ５、Ｓｏｘ２、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１からなる群から選択される少なくとも一つの多能性幹細胞マーカーを発現する、請求項１の方法。
【請求項３】
生殖系列幹細胞培養物中の単離されたｃ−ｋｉｔ陰性且つα6インテグリン陽性の細胞が、さらに、テロメラーゼを胚性幹細胞にほぼ等しいレベルで発現する、請求項２の方法。
【請求項４】
生殖系列幹細胞培養物中の単離されたｃ−ｋｉｔ陰性且つα6インテグリン陽性の細胞が、さらに、少なくとも一つの生殖系列特異的マーカーを発現する、請求項３の方法。
【請求項５】
生殖系列特異的マーカーがＤＡＺＬを含む、請求項４の方法。
【請求項６】
前記培養工程が、前記単離されたｃ−ｋｉｔ陰性且つα6インテグリン陽性の細胞を、該細胞の、療法的に再プログラミングされた細胞への発達を誘導する刺激因子を含む培地と接触させることを含む、請求項１の方法。
【請求項７】
前記生殖細胞が精巣細胞又は卵巣細胞である、請求項１の方法。
【請求項８】
前記培地が：
細胞培養増殖培地基剤；
複数のビタミン類およびミネラル類；ならびに
複数の細胞増殖および成熟因子
を含む、請求項６の方法。
【請求項９】
前記培地が血清を含有しない、請求項８の方法。
【請求項１０】
前記複数の細胞増殖および成熟因子が、組換えヒト上皮増殖因子（ｒｈＥＧＦ）、組換えヒト線維芽細胞増殖因子２（ｒｈＦＧＦ−２）、組換えヒト・グリア細胞由来神経栄養因子（ｒｈＧＤＮＦ）およびヒト白血病阻害因子（ＬＩＦ）、血小板由来増殖因子ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、トランスフォーミング増殖因子−β３（ＴＧＦ−β３）、線維芽細胞増殖因子８（ＦＧＦ−８）ならびにソニック・ヘッジホッグ（ＳＨＨ）からなる群より選択される因子を含む、請求項８の方法。
【請求項１１】
請求項１の方法により作製される生殖系列幹細胞培養物。
【請求項１２】
ｃ−ｋｉｔ陰性且つα6インテグリン陽性の細胞を含む、生殖系列幹細胞培養物であって：
前記ｃ−ｋｉｔ陰性且つα6インテグリン陽性の細胞は、少なくとも一つの多能性幹細胞マーカーを発現し、テロメラーゼを胚性幹細胞にほぼ等しいレベルで発現し、そして少なくとも一つの生殖系列特異的マーカーを発現し、
該生殖系列幹細胞培養物は、自己再生能力、及び外胚葉細胞型と中胚葉細胞型と内胚葉細胞型の全てに分化する能力を有する、前記生殖系列幹細胞培養物。
【国際調査報告】
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