(57)【要約】  患者におけるＨＥＲ二量体化阻害剤での治療に対する応答を予測する方法であって、患者由来の生体試料において、上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α及びＨＥＲ２マーカー遺伝子から成る群から選択されるマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせ、あるいはアンフィレグリンマーカー遺伝子、並びに上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α及びＨＥＲ２マーカー遺伝子から選択されるマーカー遺伝子を含んで成るマーカー遺伝子の組み合わせ、を評価する工程、そして最初の工程の結果を評価することにより、患者におけるＨＥＲ二量体化阻害剤による治療に対する応答を予測する工程、を含んで成る方法に関する。さらに、これらのマーカーが使用される使用及び方法も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者におけるＨＥＲ二量体化阻害剤での治療に対する応答を予測する方法であって、
ａ）患者由来の生体試料において、
−上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α及びＨＥＲ２マーカー遺伝子から成る群から選択されるマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせ、あるいは
−アンフィレグリンマーカー遺伝子、並びに上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α及びＨＥＲ２マーカー遺伝子から選択されるマーカー遺伝子を含んで成るマーカー遺伝子の組み合わせ、を評価する工程、そして
ｂ）工程ａ）の結果を評価することにより、患者におけるＨＥＲ二量体化阻害剤による治療に対する応答を予測する工程、
を含んで成る方法。
【請求項２】
前記マーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせを評価するための工程ａ）が、
ａ１）マーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルを評価する工程、
ａ２）工程ａ１）において評価された発現レベルが閾値以上であるか、又は閾値以下であるかを測定する工程、を含んで成る請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記閾値が、
１）ＨＥＲ二量体化阻害剤での治療の前に複数の患者由来の生体試料中のマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルを評価する工程、
２）ＨＥＲ二量体化阻害剤で患者を治療する工程、
３）ＨＥＲ二量体化阻害剤で治療した患者の応答と、工程ａ）において測定したマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルを相関させ、これにより閾値を決定する工程、により請求項２に記載の工程ａ１）の前に決定される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記生体試料が血清、血漿又は腫瘍組織である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＨＥＲ二量体化阻害剤が、ＨＥＲ２とＥＧＦＲ又はＨＥＲ３のヘテロ二量体形成を阻害する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＨＥＲ二量体化阻害剤が、抗体、好ましくは抗体２Ｃ４である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記患者が、癌患者、好ましくは、乳癌、卵巣癌、肺癌又は前立腺癌患者である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記マーカー遺伝子の組み合わせが：
−トランスフォーミング増殖因子α及びＨＥＲ２マーカー遺伝子、又は
−アンフィレグリンマーカー遺伝子、上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α及びＨＥＲ２マーカー遺伝子、
から成る、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
試料中のマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルが、マーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせによりコードされるマーカータンパク質又はそのフラグメント、あるいはマーカータンパク質又はそのフラグメントの組み合わせの発現レベルを検出することにより評価される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記マーカータンパク質又はそのフラグメント、あるいはマーカータンパク質又はそのフラグメントの組み合わせの発現レベルが、マーカータンパク質又はそのフラグメント、あるいはマーカータンパク質又はそのフラグメントの組み合わせと特異的に結合する試薬を使用して検出される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記試薬が、抗体、抗体のフラグメント又は抗体誘導体から成る群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記発現レベルが、プロテオミクス、フローサイトメトリー、免疫細胞化学的検査、免疫組織化学的検査、酵素結合免疫吸着測定法、マルチチャネル酵素結合免疫吸着測定法から成る群から選択される方法を使用して測定される、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記マーカータンパク質のフラグメントが、Ｈｅｒ２マーカータンパク質の細胞外ドメインである、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｈｅｒ２マーカータンパク質の細胞外ドメインが、約１０５，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記アンフィレグリンマーカータンパク質のアミノ酸配列が、アミノ酸配列番号１であるか、
前記上皮増殖因子マーカータンパク質のアミノ酸配列が、アミノ酸配列番号２であるか、
前記トランスフォーミング増殖因子αマーカータンパク質のアミノ酸配列が、アミノ酸配列番号３であるか、あるいは
前記ＨＥＲ２マーカータンパク質のアミノ酸配列が、アミノ酸配列番号４である、
請求項９〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記血清中の閾値が、
−トランスフォーミング増殖因子αマーカータンパク質について、２．０〜５．０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは約３．５ｐｇ／ｍｌであり、
−上皮増殖因子マーカータンパク質について、１００〜２５０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは約１５０ｐｇ／ｍｌであり、あるいは
−アンフィレグリンマーカータンパク質について、６〜１５ｐｇ／ｍｌ、好ましくは約１２ｐｇ／ｍｌである、
請求項９〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｈｅｒ２マーカータンパク質の細胞外ドメインについての血清中の閾値が、１２〜２２ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１８ｎｇ／ｍｌである、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記生体試料中のマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルが、該マーカー遺伝子によりコードされる転写マーカーポリヌクレオチド又は該転写マーカーポリヌクレオチドのフラグメント、あるいはマーカー遺伝子の組み合わせによりコードされる転写マーカーポリヌクレオチド群又は該転写マーカーポリヌクレオチドのフラグメント群の発現レベルを測定することにより評価される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記転写マーカーポリヌクレオチドが、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はｈｎＲＮＡであるか、あるいは該転写マーカーポリヌクレオチド群が、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はｈｎＲＮＡである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記検出工程が、さらに、転写ポリヌクレオチド又は転写ポリヌクレオチド群を増幅する工程を含んで成る、請求項１８〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記検出工程が、定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法を使用する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
−前記マーカー遺伝子の発現レベルが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において転写マーカーポリヌクレオチド又はそのフラグメントとアニーリングするプローブを伴う試料中の転写マーカーポリヌクレオチド又はそのフラグメントの存在を検出することにより評価される、あるいは
−前記マーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において転写マーカーポリヌクレオチド群又はそのフラグメント群とアニーリングするプローブ群を伴う試料中の転写マーカーポリヌクレオチド群又はそのフラグメント群の存在を検出することにより評価される、
請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記アンフィレグリンマーカーポリヌクレオチドの核酸配列が、核酸配列番号５であるか、
前記上皮増殖因子マーカーポリヌクレオチドの核酸配列が、核酸配列番号６であるか、
前記トランスフォーミング増殖因子αマーカーポリヌクレオチドの核酸配列が、核酸配列番号７であるか、あるいは
前記ＨＥＲ２マーカーポリヌクレオチドの核酸配列が、核酸配列番号８である、
請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
患者におけるＨＥＲ二量体化阻害剤による治療に対する応答を予測するための、ストリンジェントな条件下において上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α若しくはＨＥＲ２マーカーポリヌクレオチドとハイブリダイズするプローブ、又は上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α若しくはＨＥＲ２マーカータンパク質と結合する抗体の使用、あるいは患者における疾患の進行を阻害するための組成物を選択するための、ストリンジェントな条件下においてアンフィレグリン、上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α若しくはＨＥＲ２マーカーポリヌクレオチドとハイブリダイズするプローブ、又はアンフィレグリン、上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α若しくはＨＥＲ２マーカータンパク質と結合する抗体の使用。
【請求項２５】
ストリンジェントな条件下においてアンフィレグリン、上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α若しくはＨＥＲ２マーカーポリヌクレオチドとアニーリングするプローブ、又はアンフィレグリン、上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α若しくはＨＥＲ２マーカータンパク質と結合する抗体を含んで成るキット。
【請求項２６】
患者の疾患の進行を阻害するための組成物を選択する方法であって、該方法が：
ａ）複数の試験組成物の存在下で癌患者由来の生体試料の一定分量を別々に暴露する工程；
ｂ）試験組成物を接触させた生体試料の一定分量中のアンフィレグリン、上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α若しくはＨＥＲ２マーカー遺伝子から成る群から選択されるマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルと、試験組成物を接触さない生体試料の一定分量中のアンフィレグリン、上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α若しくはＨＥＲ２マーカー遺伝子から成る群から選択されるマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルを比較する工程、
ｃ）試験組成物を含有する一定分量中のマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルが、試験組成物と接触させない一定分量と比較して変化する試験組成物の１つを選択する工程であって、ここで試験組成物と接触させた生体試料の一定分量のマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルと試験組成物と接触させない生体試料の一定分量のマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルの少なくとも１０％の違いが試験組成物の選択のための指標となる工程、
を含んで成る方法。
【請求項２７】
候補薬剤を得るための方法であって、該方法が：
ａ）癌患者由来の生体試料の一定分量を候補薬剤と接触させ、そして一定分量中のアンフィレグリン、上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α若しくはＨＥＲ２マーカー遺伝子から成る群から選択されるマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルを測定する工程、
ｂ）候補薬剤と接触させない生体試料の一定分量中の対応するマーカー遺伝子又は対応するマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルを測定する工程、
ｃ）候補薬剤と接触させた生体試料の一定分量中のマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルと、候補薬剤と接触させない生体試料の一定分量中の対応するマーカー遺伝子又は対応するマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルを比較することにより候補薬剤の効果を観察する工程、
ｄ）観察された効果から該薬剤を得る工程であって、ここで候補薬剤と接触させた生体試料の一定分量中のマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルと、候補薬剤と接触させない生体試料の一定分量中の対応するマーカー遺伝子又は対応するマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルにおける少なくとも１０％の違いが候補薬剤の効果の指標となる工程、
を含んで成る方法。
【請求項２８】
前記候補薬剤が候補阻害薬剤である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記候補薬剤が候補増強薬剤である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法により得られる候補薬剤。
【請求項３１】
請求項３０に記載の薬剤を含んで成る医薬品。
【請求項３２】
癌の治療のための組成物の調製のための請求項３０に記載の薬剤の使用。
【請求項３３】
請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法の工程；及び
ｉ）治療的に有効な量において対象に前記薬物を供するために十分な量において工程（ｃ）において同定された候補薬剤又はそのアナログ若しくは誘導体を合成する工程；及び／又は
ｉｉ）工程（ｃ）において同定された該候補薬物又はそのアナログ若しくは誘導体を医薬的に許容される担体と組み合わせる工程、
を含んで成る薬物を製造する方法。
【請求項３４】
候補薬剤を得るため、あるいは患者における疾患の進行を阻害するための組成物を選択するための、アンフィレグリン、上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α若しくはＨＥＲ２マーカータンパク質又はマーカーポリヌクレオチドから成る群から選択される、マーカータンパク質又はマーカーポリヌクレオチドの使用。
【請求項３５】
癌患者を治療するための医薬の製造のためのＨＥＲ二量体化阻害剤の使用であって、該治療が患者由来の生体試料中の
−上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α及びＨＥＲ２マーカー遺伝子から成る群から選択されるマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせ、あるいは
−アンフィレグリンマーカー遺伝子、並びに上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α及びＨＥＲ２マーカー遺伝子から選択されるマーカー遺伝子を含んで成るマーカー遺伝子の組み合わせ、を評価する工程を含むことを特徴とする使用。
【請求項３６】
前記治療が、マーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせを、治療の間に少なくとも１回又は繰り返し評価することを含む、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
マーカー遺伝子の発現レベル又はマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルが評価される、請求項３５〜３６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３８】
前記ＨＥＲ二量体化阻害剤が、抗体、好ましくは抗体２Ｃ４である、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３９】
前記患者が、乳癌、卵巣癌、肺癌又は前立腺癌患者である、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、患者におけるＨＥＲ二量体化阻害剤による治療に対する応答を予測する方法であって、患者由来の生体試料中の上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α及びＨＥＲ２マーカー遺伝子から成る群から選択されるマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせ、あるいはアンフィレグリンマーカー遺伝子、並びに上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α及びＨＥＲ２マーカー遺伝子から選択されるマーカー遺伝子を含んで成るマーカー遺伝子の組み合わせを評価する工程、そして最初の工程の結果を評価することにより、患者におけるＨＥＲ二量体化阻害剤による治療に対する応答を予測する工程、を含んで成る方法に関する。更に、これらのマーカーが使用される用途及び方法も開示される。
【背景技術】
【０００２】
ヒト上皮増幅因子受容体（ＥｒｂＢ又はＨＥＲ）ファミリーは、複雑なシグナルカスケードの活性化を介する、細胞増殖及び分化の重要なメディエーターである４つのメンバー（ＨＥＲ１〜４）を含む。上皮増幅因子（ＥＧＦ）スーパーファミリー由来の少なくとも１１の異なる遺伝子産物は、これらの３つの受容体、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１又はＨＥＲ１とも称される）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）及びＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）と結合する。ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２又はｎｅｕ）と結合し、かつ活性化するリガンドは同定されていないが、ＨＥＲ２は、増幅するために他のＨＥＲ受容体に呼応して作用し、そしていくつかの場合においては、受容体−リガンドシグナリングを惹起する共受容体であることが広く知られている。同じ受容体タイプとの二量体形成（ホモ二量体形成）又はＨＥＲファミリーのほかのメンバーとの二量体形成（ヘテロ二量体形成）は、これらの活性にとって必須である。ＨＥＲ２は、他のＨＥＲメンバーにとって好ましい二量体形成パートナーである。多くの上皮腫瘍型におけるＨＥＲファミリーの役割は良く記載されており、特にＨＥＲ受容体に関する新規の癌薬剤の合理的な開発に導いている。組換えヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体（ＭＡｂ）であるトラスツズマブは、ＨＥＲ２陽性転移性乳癌（ＭＢＣ）を伴う患者における注意の標準である。２０〜３０％の乳癌ケースにおいて生じるＨＥＲ２タンパク質／遺伝子の過剰発現／増殖は、トラスツズマブによる治療のための前提条件である。
【０００３】
ペルツズマブ（ＯｍｎｉｔａｒｇTM；以前は２Ｃ４）は、ＨＥＲ二量体化阻害剤（ＨＤＩ）として知られる最初の新規なクラスの薬剤である。ペルツズマブはその二量体形成ドメインにおいてＨＥＲ２と結合し、これにより活性な二量体受容体複合体を形成するその能力を阻害し、従って最終的に細胞増殖及び分裂をもたらす下流のシグナルカスケードをブロックする。ペルツズマブは、ＨＥＲ２細胞外ドメインに対して産生した完全ヒト化組換えモノクローナル抗体である。ヒト上皮細胞におけるＨＥＲ２に対するペルツズマブの結合は、ＨＥＲ２がＨＥＲファミリーのほかのメンバー（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４を含む）と複合体を形成することを阻害し、そしておそらくＨＥＲ２ホモ二量体形成も阻害する。複合体形成をブロックすることにより、ペルツズマブは、ＨＥＲ１、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４のリガンド（例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦα、アンフィレグリン、及びヘレグリン）により活性化される成長刺激効果及び細胞生存シグナルを阻害する。ペルツズマブのほかの名称は、２Ｃ４又はＯｍｎｉｔａｒｇTMである。ペルツズマブは、ヒトＩｇＧ１（ｋ）フレームワーク配列に基づく完全ヒト化組換えモノクローナル抗体である。ペルツズマブの構造は、２本の重鎖（４４９残基）及び２本の軽鎖（２１４残基）から成る。トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））と比較して、ペルツズマブはＩｇＧ１の軽鎖中に１２個のアミノ酸の違い、そして重鎖中の２９個のアミノ酸の違いを有する。
【０００４】
ＷＯ２００４／０９２３５３及びＷＯ２００４／０９１３８４は、Ｈｅｒ２と他の受容体のヘテロ二量体の形成が、ペルツズマブの有効性又は適合性に関係することを示唆する。
【０００５】
Zabrecky, J.R. et al., J. Biol. Chem. 266 (1991) 1716-1720 は、Ｈｅｒ２の細胞外ドメインの放出が、発癌において関連性を有し、そしてその検出がガン診断において有用と成りうることを開示する。Colomer, R. et al., Clin. Cancer Res. 6 (2000) 2356-2362 は、循環Ｈｅｒ２細胞外ドメイン、及び進行した乳癌における化学療法に対する耐性を開示する。Ｈｅｒ２の細胞外ドメインの診断値及び予測値は、Hait, W.N., Clin. Cancer Res. 7 (2001) 2601-2604により概要されている。
【発明の開示】
【０００６】
ＨＥＲ二量体化阻害剤で処理した癌患者における疾患の進行を測定するための更なる方法を供することが、より必要である。
【０００７】
従って、本発明の態様において、患者におけるＨＥＲ二量体化阻害剤による処理に対する応答を予測する方法であって、
ａ）患者由来の生体試料において、
−上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α及びＨＥＲ２マーカー遺伝子から成る群から選択されるマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせ、あるいは
−アンフィレグリンマーカー遺伝子、並びに上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α及びＨＥＲ２マーカー遺伝子から選択されるマーカー遺伝子を含んで成るマーカー遺伝子の組み合わせ、を評価する工程、そして
ｂ）工程ａ）の結果を評価することにより、患者におけるＨＥＲ二量体化阻害剤による治療に対する応答を予測する工程、
を含んで成る、方法が供される。
【０００８】
本発明のほかの態様において、患者におけるＨＥＲ二量体化阻害剤による治療に対する応答を予測するために、ストリンジェントな条件下において上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α若しくはＨＥＲ２マーカーポリヌクレオチドとハイブリダイズするプローブ、又は上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α若しくはＨＥＲ２マーカータンパク質と結合する抗体が使用され、あるいは患者における疾患の進行を阻害するための組成物を選択するために、ストリンジェントな条件下においてアンフィレグリン、上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α若しくはＨＥＲ２マーカーポリヌクレオチドとハイブリダイズするプローブ、又はアンフィレグリン、上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α若しくはＨＥＲ２マーカータンパク質と結合する抗体が使用される。
【０００９】
本発明のさらにほかの態様において、ストリンジェントな条件下においてアンフィレグリン、上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α若しくはＨＥＲ２マーカーポリヌクレオチドとアニーリングするプローブ、又はアンフィレグリン、上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α若しくはＨＥＲ２マーカータンパク質と結合する抗体を含んで成るキットが供される。
【００１０】
本発明のさらにほかの態様において、患者の疾患の進行を阻害するための組成物を選択する方法であって、該方法が：
ａ）複数の試験組成物の存在下で癌患者由来の生体試料の一定分量を別々に暴露する工程；
ｂ）試験組成物を接触させた生体試料の一定分量中のアンフィレグリン、上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α若しくはＨＥＲ２マーカー遺伝子から成る群から選択されるマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルと、試験組成物を接触さない生体試料の一定分量中のアンフィレグリン、上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α若しくはＨＥＲ２マーカー遺伝子から成る群から選択されるマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルを比較する工程、
ｃ）試験組成物を含有する一定分量中のマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルが、試験組成物と接触させない一定分量と比較して変化する試験組成物の１つを選択する工程であって、ここで試験組成物と接触させた生体試料の一定分量のマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルと試験組成物と接触させない生体試料の一定分量のマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルの少なくとも１０％の違いが、試験組成物の選択のための指標となる工程、
を含んで成る方法、が供される。
【００１１】
本発明のさらにほかの方法において、候補薬剤を得るための方法であって、該方法が：
ａ）癌患者由来の生体試料の一定分量を候補薬剤と接触させ、そして一定分量中のアンフィレグリン、上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α及びＨＥＲ２マーカー遺伝子から成る群から選択されるマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルを測定する工程、
ｂ）候補薬剤と接触させない生体試料の一定分量中の対応するマーカー遺伝子又は対応するマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルを測定する工程、
ｃ）候補薬剤と接触させた生体試料の一定分量中のマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルと、候補薬剤と接触させない生体試料の一定分量中の対応するマーカー遺伝子又は対応するマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルを比較することにより候補薬剤の効果を観察する工程、
ｄ）観察された効果から該薬剤を得る工程であって、ここで候補薬剤と接触させた生体試料の一定分量中のマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルと、候補薬剤と接触させない生体試料の一定分量中の対応するマーカー遺伝子又は対応するマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルにおける少なくとも１０％の違いが候補薬剤の効果の指標となる工程、
を含んで成る方法、が供される。
【００１２】
さらにほかの態様において、本発明に従う方法により得られた候補薬剤、又は本発明に従う薬剤を含んで成る医薬品が供される。
【００１３】
本発明のさらにほかの態様において、本発明に従う薬剤は、癌の治療のための組成物の調製のために供される。
【００１４】
本発明のさらにほかの態様において、薬物を製造する方法であって、本発明の方法の工程、及び
ｉ）治療的に有効な量において対象に前記薬物を供するために十分な量において工程（ｃ）において同定された候補薬剤又はそのアナログ若しくは誘導体を合成する工程；及び／又は
ｉｉ）工程（ｃ）において同定された該候補薬物又はそのアナログ若しくは誘導体を医薬的に許容される担体と組み合わせる工程、
を含んで成る方法、が供される。
【００１５】
本発明のさらにほかの態様において、アンフィレグリン、上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α及びＨＥＲ２マーカータンパク質又はマーカーポリヌクレオチドから成る群から選択される、マーカータンパク質又はマーカーポリヌクレオチドは、候補薬剤を得るため、あるいは患者における疾患の進行を阻害するための組成物を選択するために使用される。
【００１６】
本発明のほかの態様において、ＨＥＲ二量体化阻害剤は、ヒト癌患者を治療するための医薬の製造のために使用され、該治療（treating又はtreatment)は、患者由来の生体試料において、
−上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α及びＨＥＲ２マーカー遺伝子から成る群から選択されるマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせ、あるいは
−アンフィレグリンマーカー遺伝子、並びに上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α及びＨＥＲ２マーカー遺伝子から選択されるマーカー遺伝子を含んで成るマーカー遺伝子の組み合わせ、を評価する工程を含むことを特徴とする。
【００１７】
本明細書において使用される「ａ」及び「ａｎ」は、１又は２以上（すなわち少なくとも１つ）の文法上の対象を意味する。例として「an element」は１つの因子又は複数の因子を意味する。
【００１８】
「生体試料」の用語は、個々から得られたいずれかの生体試料、体液、株化細胞、組織培養液、又は他のソースを意味する。体液は、例えば、リンパ液、血清、血漿、尿、精液、滑液及び髄液である。哺乳類から組織バイオプシー及び体液を得るための方法は、当業界に周知である。「試料」の用語が単独で使用される場合、「試料」は「生体試料」であり、すなわち該用語は互換的に使用される。
【００１９】
「ＨＥＲ二量体化阻害剤による治療に対する応答」又は「ＨＥＲ二量体化阻害剤による治療に対する患者の応答」の用語は、疾患又は症状（例えば、癌）に罹患する患者に与えられる臨床的有用性、あるいはＨＥＲ二量体化阻害剤による治療の結果を意味する。臨床的有用性は、ＨＥＲ二量体化阻害剤による治療の結果として又は該結果に由来する、完全な寛解、部分的な寛解、（進行しない）安定な疾患、無進行生存、無病生存、（疾患の）腫瘍増殖停止時間（time to progression)における改善、死亡停止時間（time to death)における改善、又は患者の全生存時間における改善を含む。治療に対する応答を測定するための基準が存在し、これらの基準は、他の治療に対する有効性の比較を許容する(Slapak and Kufe, Principles of Cancer Therapy, in Harrison's Principles of Internal Medicine, 13 th edition, eds. Isselbacher et al., McGraw-Hill, Inc., 1994)。例えば、癌の完全な応答又は完全な寛解は、全ての検出可能な悪性疾患の消失である。癌の部分的な応答又は部分的な寛解は、例えば、１又は複数の病変部の最も大きな垂直直径の産生における約５０％の減少、あるいはいずれかの病変部の大きさ又は新たな病変部の出現の増加がない場合であってよい。
【００２０】
本明細書において使用される「癌の進行」の用語は、癌の転移；再発、あるいは１つの病変部の最も大きな垂直直径の産生における少なくとも約２５％の増加、又は新たな病変部の出現を含み、そして意味することができる。癌の再発又は転位が減少し、遅行し、遅延し、あるいは予防される場合には、癌、好ましくは乳癌の進行は「阻害」される。
【００２１】
「腫瘍増殖／死亡停止時間（Time To Progression/death)（ＴＴＰ）」の用語は、「無進行生存（ＰＦＳ）」と同義である。これは、腫瘍試験において頻繁に使用される臨床的エンドポイントを記載する。ここで各患者についての測定は、試験における患者の治療の開始（試験プロトコルにおいて定義される）から悪性腫瘍の進行の検出（試験プロトコルにおいて定義される）又はいずれかの死亡の発生（いずれか最初）までの経過時間と等しい。期間後に患者の観察を停止し（例えば、実験終了時）、かつ何ら事象が観察されない場合、該観察時間ｔは「打ち切り」と称される。
【００２２】
「死亡停止時間（Time To Death)（ＴＴＤ）」の用語は、「全生存（ＯＳ）」と同義である。これは、腫瘍試験において頻繁に使用される臨床的エンドポイントを記載する。ここで各患者についての測定は、試験における患者の治療の開始（試験プロトコルにおいて定義される）からいずれかの死亡の発生までの経過時間と等しい。期間ｔ後に患者の観察を停止し、かつ該時間まで患者が生存した場合、該観察時間ｔは「打ち切り」と称される。
【００２３】
用語「共変量」は以下の意味を有する。臨床的エンドポイントは、回帰モデルにおいてよく検討され、ここで該エンドポイントは従属変数を表し、そしてバイオマーカーは主要な又は標的の独立変数（リグレッサー）を表す。該臨床データプール由来のさらなる変数が考慮される場合、これらは（臨床的）共変量として表示される。用語「臨床的共変量」は、本明細書において患者に対する全ての臨床情報を記載するために使用され、これは一般にベースラインにおいて利用できる。これらの臨床的共変量は、人口学的情報、例えば、性別、年齢等、既往情報、合併症、併用治療、理学的検査の結果、得られた一般的な実験パラメーター、標的腫瘍の既知の特性、悪性疾患の範囲を定性する情報、臨床成績スコア、例えば、ＥＣＯＧ又はカルノフスキー指数、臨床疾患ステージング、前治療及び病歴のタイミング及び結果、並びに全ての同様の情報を含んで成り、これは臨床予後診断に関係しうる。
【００２４】
用語「未加工（raw)又は未調整（unadjusted)分析」は、本明細書において検討されるバイオマーカーにおいて、更なる臨床的共変量が回帰モデルにおいて使用されず、また階層化共変量として独立因子も使用されない回帰分析を意味する。
【００２５】
「共変量により調整される」の用語は、検討されるバイオマーカーにおいて、更なる臨床的共変量が回帰モデルにおいて使用されるか、階層化共変量として独立因子が使用される回帰分析を意味する。
【００２６】
「単変量」の用語は、本明細書において、独立変数として標的バイオマーカーの１つのみがモデルの一部である回帰モデル又はグラフィカルアプローチを意味する。これらの単変量モデルは更なる臨床的共変量を伴い及び伴わずに検討することができる。
【００２７】
「多変量」の用語は、本明細書において、独立変数として複数の標的バイオマーカーがモデルの一部である回帰モデル又はグラフィカルアプローチを意味する。これらの多変量モデルは更なる臨床的共変量を伴い及び伴わずに検討することができる。
【００２８】
「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドの糖部分にさらに共有結合するリン酸基を含む「ヌクレオシド」である。ペントフラノシル糖を含むこれらの「ヌクレオシド」について、該リン酸基は糖の２’、３’又は５’ヒドロキシル部分のいずれかに結合することができる。「ヌクレオチド」は「オリゴヌクレオチド」の「モノマー単位」であり、より一般的には、本明細書において「オリゴマー化合物」又は「ポリヌクレオチド」として表され、より一般的には「ポリマー化合物」として表される。これについての他の一般的な表現は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）である。本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」は「核酸」と同義である。
【００２９】
「プローブ」の用語は、設計又は選択により合成的又は生物学的に産生された核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を意味し、規定される所定のストリンジェンシー下において、「核酸」と特異的（すなわち優先的）にハイブリダイズすることを許容する特定のヌクレオチド配列を含む。「プローブ」は、その検出がはっきりとしない所望されない物質から分離できるように核酸を「捕獲」することを意味する「捕獲プローブ」として認識することができる。分離が達成されると、適当な手順を使用して捕獲された「標的核酸」の検出を達成することができる。「捕獲プローブ」は、しばしば固相に対してすでに付着されている。本発明に従う「ストリンジェント条件」下におけるハイブリダイゼーションの用語は、Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), paragraph 1.101- 1.104)における同じ意味として与えられる。好ましくは「ストリンジェント・ハイブリダイゼーション」は、５０℃における、好ましくは５５℃における、より好ましくは６２℃における、及び最も好ましくは６８℃における１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳで１時間の洗浄、そしてより好ましくは５０℃における、好ましくは５５℃における、より好ましくは６２℃における、及び最も好ましくは６８℃における０．２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳで１時間の洗浄後にハイブリダイゼーションシグナルがなお検出可能である場合である。ＳＳＣ緩衝液の組成は、Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) に記載されている。
【００３０】
「転写ポリヌクレオチド」は、遺伝子、例えば、本発明のマーカー遺伝子の転写、及び、存在する場合には転写の通常の転写後プロセッシング（例えば、スプライシング）により作成された成熟ＲＮＡの全て又は一部と相補的又は相同的であるポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの１つのアナログ）である。「ｃＤＮＡ」の用語は、相補ＤＮＡの略語であり、ｍＲＮＡの一本鎖又は二本鎖ＤＮＡコピーである。用語「ｍＲＮＡ」は、タンパク質合成のための鋳型として働くＲＮＡの略語である。
【００３１】
「マーカー遺伝子」の用語は、患者、好ましくは乳癌患者における癌の進行を検出するための本発明に従う有用な遺伝子を含む。これはまた、癌、好ましくは乳癌マーカー遺伝子と称することができる。「マーカーポリヌクレオチド」の用語は、本発明に従うマーカー遺伝子にコードされるヌクレオチド転写物（ｈｎＲＮＡ又はｍＲＮＡ）、又は該ヌクレオチド転写物に由来するｃＤＮＡ、又は該転写物又はｃＤＮＡのセグメントを含むことを意味する。
【００３２】
「マーカータンパク質」又は「マーカーポリペプチド」の用語は、本発明に従うマーカー遺伝子によりコードされるタンパク質又はポリペプチド、あるいは該マーカータンパク質を含んで成るポリペプチド又はタンパク質フラグメントを含むことを意味する。
【００３３】
「遺伝子産物」の用語は、マーカーポリヌクレオチド及び参照遺伝子によりコードされたマーカータンパク質を含むことを意味する。
【００３４】
患者由来の試料中のマーカー遺伝子の発現レベルが、参照対象由来の試料中のレベルと、発現を評価するために用いられたアッセイの標準誤差以上の量、好ましくは少なくとも１０％、そしてより好ましくは２５％、５０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、３００％、４００％、５００％又は１，０００％の量により異なる場合、マーカー遺伝子の発現は、参照試料におけるマーカー遺伝子発現レベルと「有意に」異なる。あるいは、患者由来の発現レベルが、参照対象由来の試料中のレベルよりも発現を評価するために用いられたアッセイの標準誤差以上の量、好ましくは少なくとも１０％、そしてより好ましくは２５％、５０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、３００％、４００％、５００％又は１，０００％の量により低い場合、患者におけるマーカー遺伝子の発現は参照対象における発現レベルよりも「有意に」低いと考えてよい。
【００３５】
マーカーポリヌクレオチド又はマーカータンパク質は、他のマーカーポリヌクレオチド又はマーカータンパク質と関連する場合、特に好ましくは同一である場合、「対応する」。
【００３６】
「発現のレベル」及び「発現レベル」の用語は互換的に使用され、そして一般に試料中のポリヌクレオチド又はアミノ酸生成物若しくはタンパク質の量を意味する。「発現」は、一般に遺伝子コード情報が細胞内に存在しかつ作動する構造に変換されるプロセスを意味し、従って本発明に従う（マーカー）遺伝子の「発現」の用語は、ポリヌクレオチドへの転写、タンパク質への転写、及び該タンパク質の翻訳後修飾を含む。転写ポリヌクレオチド、翻訳タンパク質又は翻訳後修飾タンパク質のフラグメントもまた、これらが例えば、別のスプライシングから産生された転写物、分解転写物から生じるのか、あるいは例えば、タンパク質分解によるタンパク質の翻訳後プロセッシングから生じるのかが表されるように考慮すべきである。本明細書において使用される場合、「発現遺伝子」は、ｍＲＮＡとしてポリヌクレオチドに転写されたもの、及びその後タンパク質に翻訳されたものを含む。この用語はまた、ＲＮＡに転写されるが、タンパク質に翻訳されない発現遺伝子（例えば、トランスファーＲＮＡ及びリボソームＲＮＡ）も含む。「過剰発現」及び「低発現」の用語は、コントロールとして使用される試料中のベースライン発現レベルと比較した場合の、発現レベルおける上方異常性又は下方異常性をそれぞれ意味する。従ってまた、「過剰発現」は「発現増加」であり、そして「低発現」は「発現低下」でもある。
【００３７】
「アンフィレグリン」の用語は、上皮増殖因ファミリーのメンバーであるタンパク質をコードする遺伝子、及びそのタンパク質自体を意味する。これは自己分泌増殖因子であり、そしてアストロサイト、シュワン細胞、及び線維芽細胞のための分裂促進因子である。これは、上皮増殖因子（ＥＧＦ）及びトランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）と関係する。このタンパク質は、ＥＧＦ／ＴＧＦ−α受容体と相互作用し、正常な上皮細胞の成長を促進し、そして一定の侵襲性の癌細胞株の成長を阻害する。本発明に従い、アンフィレグリンのアミノ酸配列は、配列番号１に従うアミノ酸配列である。本発明に従い、「アンフィレグリン」ｃＤＮＡの核酸配列は、配列番号５に従う核酸配列であり、これは受入番号ＮＭ ００１６５７によりＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセス可能である。
【００３８】
「トランスフォーミング増殖因子α」の用語は、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）のファミリーのメンバーであるタンパク質をコードする遺伝子、及びそのタンパク質自体を意味する。これらは培養細胞において可逆的に形質転換表現型を与える生物的に活性なポリペプチドである。「トランスフォーミング増殖因子α」は、上皮細胞増殖因子と約４０％の配列相同性を示し、そしてＥＧＦ受容体と結合するＥＧＦと競合し、そのリン酸化を刺激し、そして分裂促進応答を生じる。本発明に従い、「トランスフォーミング増殖因子α」のアミノ酸配列は、配列番号３に従うアミノ酸配列である。本発明に従い、「トランスフォーミング増殖因子α」ｃＤＮＡの核酸配列は、配列番号７に従う核酸配列であり、これは受入番号ＮＭ ００３２３６によりＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセス可能である。
【００３９】
「上皮増殖因子」の用語は、増殖因子のファミリーのメンバーであるタンパク質をコードする遺伝子、及びそのタンパク質自体を意味する。「上皮増殖因子（ＥＧＦ）」は、in vivoにおいて特定の細胞の分化における顕著な効果を有し、そして外胚葉性及び中胚葉性起源の両方の多様な培養細胞のための強力な分裂促進因子である。ＥＧＦ前駆物質は、タンパク分解的に切断され、細胞分裂を刺激する５３個のアミノ酸ペプチドホルモンを産生する膜結合分子として存在するものと考えられている。本発明に従い、「上皮増殖因子」のアミノ酸配列は、配列番号２に従うアミノ酸配列である。本発明に従い、「上皮増殖因子」ｃＤＮＡの核酸配列は、配列番号６に従う核酸配列であり、これは受入番号ＮＭ ００１９６３によりＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセス可能である。「上皮増殖因子受容体」はＥＧＦＲとして省略され、１７０ｋＤの糖タンパク質であり、Ｎ−末端細胞外ドメイン、疎水性膜貫通ドメイン、及びキナーゼドメインを含むＣ−末端細胞内領域から構成される。該ｍＲＮＡは、異なる受容体タンパク質に翻訳される異なる変異体を有する。本発明に従い、「上皮増殖因子受容体」のアミノ酸配列は、配列番号１１（転写物変異体１；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ ００５２２８）、配列番号１２（転写物変異体２；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ ２０１２８２）、配列番号１３（転写物変異体３；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ ２０１２８３）、又は配列番号１４（転写物変異体４；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ ２０１２８４）に従うアミノ酸配列である。ＥＧＦＲは、ｅｒｂＢ１遺伝子によりコードされ、ヒト悪性腫瘍に因果的に関与している。特に、ＥＧＦＲの発現上昇は、乳癌、膀胱癌、肺癌、頭頚部癌及び胃癌、並びに神経膠芽腫において観察されている。ＥＧＦＲリガンド誘発性二量体形成は、内因性ＲＴＫドメイン（Ｓｒｃホモロジードメイン１、ＳＨ１）を活性化し、細胞質ドメインの非触媒性テイルにおける６つの特定のＥＧＦＲチロシン残基における自己リン酸化をもたらす。癌細胞におけるＥＧＦＲ活性化の細胞効果は、増殖増加、細胞運動性の促進、吸着、浸潤、血管新生、及びアポトーシスの阻害による細胞生存の増強を含む。活性化ＥＧＦＲは、分裂促進因子−活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケードの刺激を介して腫瘍細胞増殖を誘発する。
【００４０】
「ヒトｎｅｕ」、「ｃ−ｅｒｂＢ−２」、「ｅｒｂＢ２」、「ｅｒｂＢ−２」、「ＨＥＲ−２／ｎｅｕ」、「Ｈｅｒ２」及び「ＨＥＲ−２」の用語は、本明細書において互換的に使用される。「Ｈｅｒ２」の用語は、受容体チロシンキナーゼの上皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体ファミリーのメンバーであるタンパク質をコードする遺伝子及びそのタンパク質自体を意味する。このタンパク質はそれ自身にリガンド結合ドメインを有さず、このため増幅因子に結合することができない。しかしながら、これはヘテロ二量体を形成するために他のリガンド結合ＥＧＦ受容体ファミリーと強固に結合し、リガンド結合性を安定化し、そして、例えば、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ及びホスファチジルイノシトール−３キナーゼを含むシグナル伝達経路の下流のキナーゼ媒介活性化を増強する。アイソフォームａの６５４及び６５５番目のアミノ酸（アイソフォームｂの６２４及び６２５番目）における対立遺伝子変異が報告されており、最も一般的な対立遺伝子を伴い、本発明に従いＩｌｅ６５４／Ｉｌｅ６５５が好ましい。この遺伝子の増幅及び／又は過剰発現は、多数の癌、例えば、乳癌及び卵巣癌において報告されている。ほかのスプライシングは、数個の更なる転写物変異体、いくつかのコード相違性アイソフォーム、及び完全には特徴付けられていない他のものをもたらす。本発明に従い、Ｈｅｒ２のアミノ酸配列は、配列番号４に従うアミノ酸配列である。本発明に従い、「Ｈｅｒ２」ｃＤＮＡの核酸配列は、配列番号８に従う核酸配列であり、これは受入番号ＮＭ ００４４４８．２によりＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセス可能である。
【００４１】
「Ｈｅｒ２の細胞外ドメイン」又は「Ｈｅｒ２の脱落細胞外ドメイン」は、実質的に、ヒトＨｅｒ２遺伝子産物の細胞外ドメインに対応する９７〜１１５ｋＤａの糖タンパク質である。これはｐ１０５を意味しうる(Zabrecky, J.R. et al., J. Biol. Chem. 266 (1991) 1716-1720; US 5,401,638; US 5,604,107)。Ｈｅｒ２の細胞外ドメインの定量及び検出は、米国特許第５，４０１，６３８号及び米国特許第５，６０４，１０７号に記載されている。
【００４２】
「Ｈｅｒ３」の用語は、受容体チロシンキナーゼの上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーのほかのメンバーを表す。この膜結合タンパク質は、活性キナーゼドメインを有さない。該タンパク質は、リガンドを結合できるが、細胞内にシグナルを伝達することはできない。これは、細胞増殖又は分化に導くキナーゼ活性を有さないほかのＥＧＦ受容体ファミリーのメンバーとヘテロ二量体を形成する。この遺伝子の増幅及び／又はそのタンパク質の過剰発現は、多数の癌において発見される。本発明に従い、「Ｈｅｒ３」ｃＤＮＡのアミノ酸配列は、配列番号９に従うアミノ酸配列であり、これは受入番号ＮＭ ００１００５９１５を有するＨｅｒ３の核酸配列の翻訳からＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセス可能である。本発明に従い、「Ｈｅｒ３」ｃＤＮＡの核酸配列は、配列番号１０に従う核酸配列であり、これは受入番号ＮＭ ００１００５９１５によりＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセス可能である。
【００４３】
本明細書中の「抗体」の用語は、最も広い意味において使用され、そして所望の生物活性を示す限り、特にインタクト（intact) モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つのインタクト抗体により形成される多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体フラグメントを網羅する。
【００４４】
本明細書において使用される「モノクローナル抗体」の用語は、実質的に同種の抗体集団から得られた抗体を意味する。すなわち該集団を含んで成る個々の抗体は、僅かな量において存在可能な天然突然変異体を除いて同一である。モノクローナル抗体は、極めて特異的であり、単一の抗原部位に導かれる。さらに、異なる決定要因（エピトープ）に導かれる異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定要因に導かれる。これらの特性に加えて、モノクローナル抗体は、これらが他の抗体によって混入されずに合成できる点で有利である。改変「モノクローナル」は、実質的に同種の抗体の個体群から得られるような抗体の特徴を示し、そしていずれかの特定の方法により抗体の産生が要求されるようには解釈されない。例えば、本発明に従い使用されるモノクローナル抗体は、Kohler, G. et al., Nature 256 (1975) 495-497により最初に記載されたハイブリドーマ法により作成することができ、あるいは組換えＤＮＡ法により作成することができる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと)。「抗体フラグメント」は、インタクト抗体の一部を含んで成る。
【００４５】
本発明に従う注目の抗原に「結合する」抗体は、抗原の存在を検出するために抗体が有用であるように十分な親和性を伴い抗原と結合することができるものである。本発明に従う抗体は、ヒトＨｅｒ２と結合し、かつ他のタンパク質と（有意に）交差反応しないものである。このような態様において、他のタンパク質に対する抗体の結合性の程度は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析又は放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）により測定した場合に１０％以下である。
【００４６】
二量体形成−受容体の対合−は、全てのＨＥＲ受容体のシグナリング活性に必要である。本発明に従い、「Ｈｅｒ二量体化阻害剤」又は好ましくは「Ｈｅｒ２ヘテロ二量体化阻害剤」の用語は、Ｈｅｒ２に結合し、そしてＨｅｒ２ヘテロ二量体形成を阻害する治療薬を意味する。これらは、好ましくは、Ｈｅｒ２と結合しそしてＨｅｒ２ヘテロ二量体形成を阻害する抗体、好ましくはモノクローナル抗体、より好ましくはヒト化抗体である。ＨＥＲ２と結合する抗体の例は、４Ｄ５、７Ｃ２、７Ｆ３又は２Ｃ４、並びにこれらのヒト化変異体、例えば、米国特許第５，８２１，３３７号の表３に記載されるｈｕＭＡｂ４Ｄ５−１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−７及びｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８；及びＷＯ０１／００２４５に記載される５６０、５６１、５６２、５６８、５６９、５７０、５７１、５７４、又は５６８６９である。７Ｃ２及び７Ｆ３、並びにこれらのヒト化変異体は、ＷＯ  ９８／１７７９７に記載される。この用語は、ＨｅｒｃｅｐｔｉｎTMの名称で販売されるトラツズマブの場合、作用のメカニズムが異なる場合、そして抗体がＨｅｒ二量体形成を阻害しない場合には、モノクローナル抗体に適用するべきではない。
【００４７】
本願をとおして好ましくは、「抗体２Ｃ４」、特にそのヒト化変異体であり(WO 01/00245；ATCC HB- 12697においてAmerican Type Culture Collection, Manassass, VA, USAに寄託されたハイブリドーマ細胞株により産生された）、これはＨｅｒ２の細胞外ドメイン内領域に結合する（例えば、Ｈｅｒ２の約２２の残基〜約５８４の残基の領域内のいずれかの１又は複数の残基）。「エピトープ２Ｃ４」は、抗体２Ｃ４が結合するＥｒｂＢ２の細胞外ドメイン内の領域である。「モノクローナル抗体２Ｃ４」の表現は、ＷＯ０１／００２４５中の実施例のマウス２Ｃ４抗体の、あるいはこれに由来する抗原結合残基を有する抗体を意味する。例えば、モノクローナル抗体２Ｃ４は、マウスモノクローナル抗体２Ｃ４又はその変異体、例えば、マウスモノクローナル抗体２Ｃ４の高原結合アミノ酸残基を有するヒト化抗体２Ｃ４であってよい。ヒト化２Ｃ４抗体の例は、ＷＯ０１／００２４５の実施例３に供される。ほかに示されない限り、本明細書において使用される場合「ｒｈｕＭＡｂ  ２Ｃ４」の表現は、中国ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞により任意的に発現される、ヒト軽鎖及び重鎖ＩｇＧ１（非Ａアロタイプ）定常領域配列に融合する、配列番号３及び４の可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）配列をそれぞれ含んで成る抗体を意味する。ＷＯ０１／００２４５の好ましい態様は、本明細書においても同様に好ましい。ヒト化抗体２Ｃ４は、ペルツズマブ（ＯｍｎｉｔａｒｇTM）とも称される。
【００４８】
「キット」は、本発明のマーカー遺伝子又はタンパク質を特異的に検出するための少なくとも１つの試薬、例えば、プローブを含んで成る、いずれかの製品（例えば、パッケージ又は容器）である。該製品は、本発明の方法を行うためのユニットとして、好ましくは宣伝、流通又は販売される。
【００４９】
「決定（測定）する」及び「評価する」という動詞は、同じ意味を有し、そして本願をとおして互換的に使用される。
【００５０】
発明の詳細な説明
当業者の範囲である分子生物学及び核酸化学の慣習的な技術は、文献中に説明されている。例えば、Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; Gait, MJ. (ed.), Oligonucleotide synthesis - a practical approach, IRL Press Limited, 1984; Hames, B. D. and Higgins, SJ. (eds.), Nucleic acid hybridisation - a practical approach, IRL Press Limited, 1985; 及びa series, Methods in Enzymology, Academic Press, Incを参照のこと。これらの全ては本明細書において参考文献として組み込まれている。前後において本明細書に言及されている全ての特許、特許出願、及び刊行物は、参考文献として本明細書に組み込まれている。
【００５１】
本発明の態様において、患者におけるＨＥＲ二量体化阻害剤での治療に対する応答を予測する方法であって、
ａ）患者由来の生体試料において、
−上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α及びＨＥＲ２マーカー遺伝子から成る群から選択されるマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせ、あるいは
−アンフィレグリンマーカー遺伝子、並びに上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α及びＨＥＲ２マーカー遺伝子から選択されるマーカー遺伝子を含んで成るマーカー遺伝子の組み合わせ、を評価する工程、そして
ｂ）工程ａ）の結果を評価することにより、患者におけるＨＥＲ二量体化阻害剤による治療に対する応答を予測する工程、
を含んで成る方法、が供される。
【００５２】
好ましくは、本発明に従う方法において、マーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせを評価する工程ａ）は、
ａ１）マーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルを評価する工程、
ａ２）工程ａ１）において評価された発現レベルが閾値以上であるか、又は閾値以下であるかを測定する工程、を含んで成る。
【００５３】
閾値は、好ましくは血清又は血漿の質量／体積、又は腫瘍組織についての質量／体積において表現される値である。これは、当業者に既知の方法により測定することができ、そしてまた本発明により開示される。
【００５４】
本発明の好ましい態様において、値が閾値以上又は以下である場合、治療に対する応答を測定することができる。本発明に従う単一のマーカー遺伝子の使用に関して、転移性乳癌患者についての条件は以下のとおりである。これは支持に依存しうるが、本発明の開示に基づき測定することができる。トランスフォーミング増殖因子αマーカー遺伝子のみに関して、ＨＥＲ二量体化阻害剤による治療がＨｅｒ２低発現転移性乳癌患者について検討される場合、無進行生存（死亡又は腫瘍増殖停止時間）及び全生存（死亡停止時間）のために低発現レベルが好ましい。すなわちトランスフォーミング増幅因子αマーカー遺伝子の低発現レベルは、ＨＥＲ二量体化阻害剤による治療に対してこれらの患者における良好な応答を予測する（図７を参照のこと）。これは、臨床的共変量についての未加工（raw)又は未調整（unadjusted)の両方のケースである。従って、Ｈｅｒ２を低発現している転移性乳癌患者においてＨＥＲ二量体化阻害剤による治療に対する良好な応答を予測するためにトランスフォーミング増幅因子αマーカー遺伝子の工程ａ１）において評価された発現レベルは、閾値以下であることが好ましい。これはまた、これらの患者におけるＨｅｒ２マーカー遺伝子のみについて、特に可溶性Ｈｅｒ２細胞外ドメインについて、そしてこれらの患者における上皮増殖因子マーカー遺伝子のみについてのケースにも適用する。
【００５５】
アンフィレグリンマーカー遺伝子のみに関して、未加工分析において、ＨＥＲ二量体化阻害剤による治療がＨｅｒ２低発現転移性乳癌患者について検討される場合、無進行生存（死亡又は腫瘍増殖停止時間）及び全生存（死亡停止時間）のために低発現レベルが好ましい。すなわちアンフィレグリンマーカー遺伝子の低発現レベルは、ＨＥＲ二量体化阻害剤による治療に対してこれらの患者における良好な応答を予測する。これは、臨床的共変量のための未加工（raw)又は未調整（unadjusted)の両方のケースである。臨床的共変量について調整された分析は、これらの患者におけるＨＥＲ二量体化阻害剤による治療後の高い発現レベルが無進行生存（死亡停止時間又は腫瘍増殖停止時間）及び全生存（死亡停止時間）のために好ましいことを示す。
【００５６】
特に血清中のマーカー遺伝子群は、ほかの臨床的共変量を潜在的に含む多重マーカー予測モデルにおいて使用されうるため、このようなモデルにおける単一のマーカー遺伝子の有利な効果の傾向は単純な方法において測定できず、そして単変量分析、すなわち、単一のマーカー遺伝子の使用について記載される場合において発見された傾向と矛盾する可能性がある。
【００５７】
より好ましくは、本発明に従う方法において、閾値は、本発明の方法の工程ａ１）の前に、
１）ＨＥＲ二量体化阻害剤での治療の前に複数の患者由来の生体試料中のマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルを評価する工程、
２）ＨＥＲ二量体化阻害剤で患者を治療する工程、
３）ＨＥＲ二量体化阻害剤で治療した患者の応答と、工程ａ）において測定したマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルを相関させ、これにより閾値を決定する工程、により決定される。
【００５８】
該閾値は、好ましくは血清又は血漿の質量／体積又は腫瘍組織の質量／体積において表現される値である。
【００５９】
本発明はまた、本発明に従うマーカー遺伝子の突然変異体又は変異体も考慮し、そして本発明に従う方法において使用される。これらの突然変異体又は変異体において、マーカー遺伝子の天然配列は、置換、欠失又は挿入により変化される。「天然配列」は、マーカー遺伝子又はタンパク質の野生型又は天然型と同一のアミノ酸配列又は核酸配列を意味する。
【００６０】
本発明はまた、本発明に従うマーカー遺伝子の突然変異体又は変異体も考慮し、そして本発明に従う方法において使用される。「突然変異アミノ酸配列」、「突然変異タンパク質」又は「突然変異ポリペプチド」は、天然配列から変化したアミノ酸配列を有するポリペプチド、あるいは天然配列から意図的に製造された変異体核酸配列によりコードされるポリペプチドを意味する。「突然変異タンパク質」、「変異体タンパク質」又は「ムテイン」は、突然変異アミノ酸配列を含んで成るタンパク質を意味し、そしてアミノ酸の欠失、置換、又はその両方により本発明に従う天然タンパク質のアミノ酸配列と異なるポリペプチドを含む。
【００６１】
本発明はまた、ＨＥＲ二量体化阻害剤及び癌を治療するために使用される化学療法剤又は治療抗体として他の物質又は薬剤の組み合わせによる治療に対する応答を予測する方法を考慮する。化学療法剤は、例えば、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標）；化学名：２’，２’−ジフルオロデオキシシチジン（ｄＦｄＣ））、カルボプラチン（ジアミン−（シクロブタン−１，１−ジカルボキシレート（２−）−Ｏ，Ｏ’）−白金）、又はパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標）、化学名：β−（ベンゾイルアミノ）−α−ヒドロキシ−６，１２ｂ−ビス（アセチルオキシ）−１２−（ベンゾイルオキシ）−２ａ，３，４，４ａ，５，６，９）１０，１１，１２，１２ａ，１２ｂ−ドデカヒドロ−４，１１−ジヒドロキシ−４ａ，８，１３，１３−テトラメチル−５−オキソ−７，１１−メタノ−１Ｈ−シクロデカ（３，４）ベンズ（１，２−ｂ）オキセト−９−イルエステル、（２ａＲ−（２ａ−α，４−β，４ａ−β，６−β，９−α（α−Ｒ＊，β−Ｓ＊），１１−α，１２−α，１２ａ−α，２ｂ−α））−ベンゼンプロパン酸）であってよい。
【００６２】
本発明の好ましい態様において、生体試料は、血清、血漿又は腫瘍組織である。腫瘍組織は、ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍組織又は冷凍腫瘍細胞であってよい。
【００６３】
本発明のほかの好ましい態様において、ＨＥＲ二量体化阻害剤は、ＨＥＲ２とＥＧＦＲ又はＨＥＲ３又はＨｅｒ４とのヘテロ二量体形成を阻害する。好ましくは、該ＨＥＲ二量体化阻害剤は抗体であり、好ましくは抗体２Ｃ４である。本願をとおして、好ましくは「抗体２Ｃ４」、特にそのヒト化変異体 (WO 01/00245；ATCC HB-12697においてAmerican Type Culture Collection, Manassass, VA, USAに寄託されたハイブリドーマ細胞株により産生された）であり、これはＨｅｒ２の細胞外ドメイン内の領域に結合する（例えば、Ｈｅｒ２の約２２の残基〜約５８４の残基の領域中のいずれかの１又は複数の残基）。ヒト化２Ｃ４抗体の例は、ＷＯ０１／００２４５の実施例３に供される。ヒト化抗体２Ｃ４はまた、ＯｍｎｉｔａｒｇTM又はペルツズマブとも称される。
【００６４】
本発明のさらに他の態様において、患者は、癌患者、好ましくは乳癌、卵巣癌、肺癌又は前立腺癌患者である。乳癌患者は、好ましくは転移性乳癌患者、又はＨＥＲ２低発現性の乳癌若しくは転移性乳癌患者、又はＨｅｒ２高発現性乳癌若しくは転移性乳癌患者である。卵巣癌患者は、好ましくは転移性卵巣癌患者である。肺癌患者は、好ましくは非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者である。
【００６５】
好ましくは、２つ、３つ又は４つ全てのマーカー遺伝子、マーカーポリヌクレオチド、又はマーカータンパク質を組み合わせて使用すること、すなわち開示された本発明の全ての態様又は本発明に従う方法、使用若しくはキットにおいて使用される。好ましくは、
−上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α又はＨＥＲ２マーカー遺伝子、マーカータンパク質又はマーカーポリヌクレオチドの組み合わせ、
−アンフィレグリンマーカー遺伝子を含んで成るマーカー遺伝子、及び上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α及びＨＥＲ２マーカー遺伝子から選択されるマーカー遺伝子の組み合わせ、
−上皮増殖因子及びトランスフォーミング増殖因子α又はＨＥＲ２マーカー遺伝子、マーカータンパク質又はマーカーポリヌクレオチドの組み合わせ、あるいは
−トランスフォーミング増殖因子α及びＨＥＲ２マーカー遺伝子、マーカータンパク質又はマーカーポリヌクレオチドの組み合わせ、
の発現レベルが評価される。
【００６６】
本発明の特に好ましい態様において、マーカー遺伝子の組み合わせは：
−トランスフォーミング増殖因子α及びＨＥＲ２マーカー遺伝子、
−トランスフォーミング増殖因子α及び上皮増殖因子マーカー遺伝子、又は
−アンフィレグリン、上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α及びＨＥＲ２マーカー遺伝子、から成る。
【００６７】
本発明のほかの特に好ましい態様において、マーカー遺伝子の組み合わせは：
−上皮増殖因子及びＨＥＲ２マーカー遺伝子、
−アンフィレグリン及び上皮増殖因子マーカー遺伝子、
−アンフィレグリン及びトランスフォーミング増殖因子αマーカー遺伝子、
−アンフィレグリン及びＨＥＲ２マーカー遺伝子、
−アンフィレグリン、上皮増殖因子及びトランスフォーミング増殖因子αマーカー遺伝子、
−アンフィレグリン、上皮増殖因子及びＨＥＲ２マーカー遺伝子、
−アンフィレグリン、トランスフォーミング増殖因子α及びＨＥＲ２マーカー遺伝子、又は
−上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α及びＨＥＲ２マーカー遺伝子、
から成る。
【００６８】
本発明の好ましい態様において、試料中のマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルは、該マーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせによりコードされるマーカータンパク質若しくはそのフラグメント、又はマーカータンパク質若しくはそのフラグメントの組み合わせの発現を検出することにより評価される。好ましくは、該マーカータンパク質若しくはそのフラグメント、又はマーカータンパク質若しくはそのフラグメントの組み合わせの発現レベルは、該マーカータンパク質若しくはそのフラグメント、又はマーカータンパク質若しくはそのフラグメントの組み合わせと特異的に結合する試薬を使用して検出される。好ましくは、該試薬は、抗体、その抗体フラグメント又は抗体誘導体から成る群から選択される。
【００６９】
本発明の方法において使用することができる多くの異なる種類の免疫アッセイ、例えば、酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫吸着アッセイ（ＦＩＡ）、化学結合免疫吸着アッセイ（ＣＬＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び免疫ブロット法が存在する。使用可能な異なる免疫アッセイの概説については、Lottspeich and Zorbas (eds.), Bioanalytik, 1st edition 1998, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, Germany を参照のこと。このように、本発明のさらにほかの好ましい態様において、発現レベルは、プロテオミクス、フローサイトメトリー、免疫細胞化学測定、免疫組織化学測定、酵素結合免疫吸着測定法、マルチチャネル酵素結合免疫吸着測定法、及びこれらの方法の改変から選択される方法を使用して測定される。従って、より好ましくは、発現レベルは、プロテオミクス、フローサイトメトリー、免疫細胞化学測定、免疫組織化学測定、酵素結合免疫吸着測定法、マルチチャネル酵素結合免疫吸着測定法、及びこれらの方法の改変から成る群から選択される方法を使用して測定される。
【００７０】
本発明のほかの好ましい態様において、マーカータンパク質のフラグメントは、Ｈｅｒ２マーカータンパク質の細胞外ドメインである。好ましくは該Ｈｅｒ２マーカータンパク質の細胞外ドメインは、約１０５，０００ダルトンの分子量を有する。「ダルトン」は、水素原子の質量を同じである質量単位、又は１．６５７×１０-24グラムを表す。
【００７１】
本発明のほかの好ましい態様において、
−アンフィレグリンマーカータンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸配列番号１であり、
−上皮増殖因子マーカータンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸配列番号２であり、
−トランスフォーミング増殖因子αマーカータンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸配列番号３であり、あるいは
−ＨＥＲ２マーカータンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸配列番号４である。
【００７２】
本発明のほかの好ましい態様において、血清中の閾値は、
−トランスフォーミング増殖因子αマーカータンパク質について、２．０〜１０．０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは２．０〜５．０ｐｇ／ｍｌ、より好ましくは約３．５ｐｇ／ｍｌであり、
−上皮増殖因子マーカータンパク質について、１００〜２５０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは約１５０ｐｇ／ｍｌであり、あるいは
−アンフィレグリンマーカータンパク質について、６〜１５ｐｇ／ｍｌ、好ましくは約１２ｐｇ／ｍｌである。
【００７３】
本発明のさらに他の好ましい態様において、Ｈｅｒ２マーカータンパク質の細胞外ドメインについての血清中の閾値は、１２〜２２ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１８ｎｇ／ｍｌである。
【００７４】
本発明のさらに他の好ましい態様において、生体試料中のマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルは、該マーカー遺伝子によりコードされる転写マーカーポリヌクレオチド又は該転写マーカーポリヌクレオチドのフラグメント、あるいはマーカー遺伝子の組み合わせによりコードされる転写マーカーポリヌクレオチド群又は該転写マーカーポリヌクレオチドのフラグメント群の発現レベルを測定することにより評価される。好ましくは、該転写マーカーポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はｈｎＲＮＡであるか、あるいは該転写マーカーポリヌクレオチド群は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はｈｎＲＮＡである。
【００７５】
好ましくは、該検出工程はさらに、転写ポリヌクレオチドを増幅する工程を含んで成る。該増幅は、好ましくは、核酸を検出可能な量に特異的に増幅するポリメラーゼ連鎖反応により行われる。他の可能な増幅反応は、リガーゼ連鎖反応 (LCR; Wu D. Y. and Wallace R.B., Genomics 4 (1989) 560-569; 及び Barany F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991)189-193)；ポリメラーゼリガーゼ連鎖反応 (Barany F., PCR Methods and Applic. 1 (1991) 5-16); Gap-LCR (WO 90/01069)；リパーゼ連鎖反応(EP 0439182 A2), 3SR (Kwoh, D.Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 1173-1177; Guatelli, J.C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 1874-1878; WO 92/08808)、及びＮＡＳＢＡ(米国特許第5,130,238号)である。さらに、ストランド置換増幅法（ＳＤＡ）、転写物媒介増幅法（ＴＭＡ）、及びＱβ−増幅法が存在する (概説として、例えば、Whelen, A.C. and Persing, D.H., Annu. Rev. Microbiol. 50 (1996) 349-373; Abramson, R.D. and Myers T.W., Curr. Opin. Biotechnol. 4 (1993) 41-47を参照のこと)。より好ましくは、該検出工程は、定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法を使用する。
【００７６】
他の適当なポリヌクレオチド検出方法は、当業者に既知であり、そしてSambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989；及び Ausubel, F. et al., Current Protocols in Molecular Biology, 1987, J. Wiley and Sons, NYのような標準的な教科書において記載される。さらにまた、例えば、沈殿工程としてポリヌクレオチド検出工程の前に精製工程を行っても良い。該検出工程は、制限されることなく、二本鎖ポリヌクレオチド内に挿入され、その後これらの蛍光を変化するエチジウムブロミドとし特有の色素の結合又は挿入を含む。精製したポリヌクレオチドはまた、任意的に制限消化後の電気泳動法により分離し、これにより視覚化することができる。またさらに、特定の配列に対するオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、及びその後の該ハイブリッドの検出を利用するプローブに基づくアッセイが存在する。これはまた、当業界に既知な更なる工程の後に、ＤＮＡを配列決定することが可能である。好ましい鋳型依存ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｇポリメラーゼである。
【００７７】
本発明のさらに他の好ましい態様において、マーカー遺伝子の発現レベルは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において転写マーカーポリヌクレオチド又はそのフラグメントとアニーリングするプローブを伴う試料中の転写マーカーポリヌクレオチド又はそのフラグメントの存在を検出することにより評価され、あるいは該試料中のマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において転写マーカーポリヌクレオチド群又はそのフラグメント群とアニーリングするプローブ群を伴う試料中の転写マーカーポリヌクレオチド群又はそのフラグメント群の存在を検出することにより評価される。この方法は、好ましくはホモジニアスアッセイシステムにおいて行うことができる。「ホモジニアス」アッセイシステムの例は、米国特許第５，２１０，０１５号、米国特許第５，８０４，３７５号及び米国特許第５，４８７，９７２号に詳しい、ＴａｑＭａｎ（登録商標）システムである。端的には、該方法は、二重標識プローブ及びＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エクソヌクレアーゼ活性に基づく。該プローブは、ＰＣＲプロセスにより増幅される標的遺伝子に相補的であり、そして各ポリメリゼーションサイクル工程における２つのＰＣＲプライマー間に存在する。該プローブは、それに付着する２つの蛍光標識を有する。１つはレポーター色素、例えば、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）（これは２つめの蛍光色素の空間的接近によるエネルギー伝達によりクエンチされた発光スペクトルを有する）、６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン（ＴＡＭＲＡ）である。各増幅サイクルの経路において、プライマーＤＮＡ鎖の伸長過程におけるＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、アニーリングされたプローブを動かし、そして分解し、後者は、ポリメラーゼの内因性の５’−３’エクソヌクレアーゼ活性によるものである。該メカニズムはまた、ＴＡＭＲＡのクエンチング活性から該レポーター色素を脱する。結果として、蛍光活性はプローブの切断の増加に従い増加し、これは形成されたＰＣＲ産物の量に比例する。従って、増幅された標的配列は、放出された蛍光標識の強度を検出して測定される。「ホモジニアス」アッセイシステムのほかの例は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）機器において使用されるフォーマットにより供され（例えば、米国特許第6,174,670号を参照のこと)、これらのいくつかは、しばしば「キッシング・プローブ」フォーマットと称される。また、該原理は、２種類の相互作用色素に基づくが、これは、蛍光共鳴エネルギー移動によりドナー色素の放射波長がアクセプター色素を励起するという点で特徴付けられる。ＣＯＢＡＳ（登録商標）ＡｍｐｌｉＰｒｅｐ機器(Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany)は、ストレプトアビジンコーティングマグネット粒子と一緒にビオチン化配列特異性捕獲プローブを使用して標的配列を単離することにより、自動化を拡大するために近年導入された (Jungkind, D., J. Clin. Virol. 20 (2001) 1-6; Stelzl, E. et al., J. Clin. Microbiol. 40 (2002) 1447-1450)。これは近年、更なる多目的道具、全核酸単離（ＴＮＡＩ）キット(Roche Diagnostics)により組み合わされている。この実験室用試薬は、Boom, R. et al., J. Clin. Microbiol. 28 (1990) 495-503により開発された方法に必然的に基づき、ＣＯＢＡＳ（登録商標）ＡｍｐｌｉＰｒｅｐ機器において血漿及び血清から、一般的に、非配列特異的な核酸の単離を許容する。
【００７８】
本発明のほかの好ましい態様において、アンフィレグリンマーカーポリヌクレオチドの核酸配列は、核酸配列番号５であり、
−上皮増殖因子マーカーポリヌクレオチドの核酸配列は、核酸配列番号６であり、
−トランスフォーミング増殖因子αマーカーポリヌクレオチドの核酸配列は、核酸配列番号７であり、あるいは
−ＨＥＲ２マーカーポリヌクレオチドの核酸配列は、核酸配列番号８である。
【００７９】
本発明の他の態様において、患者におけるＨＥＲ二量体化阻害剤による治療に対する応答を予測するために、ストリンジェントな条件下において上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α若しくはＨＥＲ２マーカーポリヌクレオチドとハイブリダイズするプローブ、又は上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α若しくはＨＥＲ２マーカータンパク質と結合する抗体が使用され、あるいは患者における疾患の進行を阻害するための組成物を選択するために、ストリンジェントな条件下においてアンフィレグリン、上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α若しくはＨＥＲ２マーカーポリヌクレオチドとハイブリダイズするプローブ、又はアンフィレグリン、上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α若しくはＨＥＲ２マーカータンパク質と結合する抗体が使用される。上述のとおり、該疾患は、好ましくは癌であり、そして該患者は、好ましくは癌患者である。
【００８０】
本発明のほかの態様において、ストリンジェントな条件下においてアンフィレグリン、上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α若しくはＨＥＲ２マーカーポリヌクレオチドとアニーリングするプローブ、又はアンフィレグリン、上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α若しくはＨＥＲ２マーカータンパク質と結合する抗体を含んで成るキットが供される。このような当業者に既知なキットは、さらに増幅手順において使用することができるプラスチック製品、例えば、９６又は３８４ウェル型のマイクロタイタープレート、又は例えば、Eppendorf, Hamburg, Germanyにより製造される通常の反応チューブ、及び本発明に従う方法、好ましくは免疫アッセイ、例えば、酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫吸着アッセイ（ＦＩＡ）、化学結合免疫吸着アッセイ（ＣＬＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び免疫ブロット法を行うための全ての他の試薬を含んで成る。異なる免疫アッセイ及び使用できる試薬についての概要は、Lottspeich and Zorbas (eds.), Bioanalytik, 1st edition, 1998, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, Germanyを参照のこと。好ましくは、多様なマーカーポリヌクレオチド又はマーカータンパク質に対するプローブ又は抗体の組み合わせは、上述のとおり、好ましいマーカーポリヌクレオチド又はマーカータンパク質の組み合わせとしてキットの形態において供される。
【００８１】
本発明のほかの態様において、患者の疾患の進行を阻害するための組成物を選択する方法であって、該方法が：
ａ）複数の試験組成物の存在下で癌患者由来の生体試料の一定分量を別々に暴露する工程；
ｂ）試験組成物を接触させた生体試料の一定分量中のアンフィレグリン、上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α若しくはＨＥＲ２マーカー遺伝子から成る群から選択されるマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルと、試験組成物を接触さない生体試料の一定分量中のアンフィレグリン、上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α若しくはＨＥＲ２マーカー遺伝子から成る群から選択されるマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルを比較する工程、
ｃ）試験組成物を含有する一定分量中のマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルが、試験組成物と接触させない一定分量と比較して変化する試験組成物の１つを選択する工程であって、ここで試験組成物と接触させた生体試料の一定分量のマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルと試験組成物と接触させない生体試料の一定分量のマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルの有意な又は少なくとも１０％の違いが、試験組成物の選択のための指標となる工程、を含んで成る方法、が供される。上述のとおり、該疾患は、好ましくは癌であり、そして該患者は、好ましくは癌患者である。
【００８２】
本発明のほかの態様において、患者の疾患の進行を阻害するための組成物を選択する方法であって、該方法が：
ａ）複数の試験組成物の存在下で癌患者由来の生体試料の一定分量を別々に暴露する工程；
ｂ）試験組成物を接触させた生体試料の一定分量における、
−上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α及びＨＥＲ２マーカー遺伝子から成る群から選択されるマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせ、あるいは
−アンフィレグリンマーカー遺伝子、並びに上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α及びＨＥＲ２マーカー遺伝子から選択されるマーカー遺伝子を含んで成るマーカー遺伝子の組み合わせ、の発現レベルと、
試験組成物を接触さない生体試料の一定分量における、
−上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α及びＨＥＲ２マーカー遺伝子から成る群から選択されるマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせ、あるいは
−アンフィレグリンマーカー遺伝子、並びに上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α及びＨＥＲ２マーカー遺伝子から選択されるマーカー遺伝子を含んで成るマーカー遺伝子の組み合わせ、
の発現レベルとを比較する工程、
ｃ）試験組成物を含有する一定分量中のマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルが、試験組成物と接触させない一定分量と比較して変化する試験組成物の１つを選択する工程であって、ここで試験組成物と接触させた生体試料の一定分量のマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルと試験組成物と接触させない生体試料の一定分量の対応するマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルの有意な又は少なくとも１０％の違いが、試験組成物の選択のための指標となる工程、を含んで成る方法、が供される。上述のとおり、該疾患は、好ましくは癌であり、そして該患者は、好ましくは癌患者である。
【００８３】
発現を評価するために用いられたアッセイの標準誤差以上の量、好ましくは少なくとも１０％、そしてより好ましくは２５％、５０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、３００％、４００％、５００％又は１，０００％の量によって、患者由来の試料中のマーカー遺伝子の発現レベルが参照対象由来の試料中のレベルと異なる場合、マーカー遺伝子の発現は、参照試料におけるマーカー遺伝子発現レベルと「有意に」異なる。あるいは、発現を評価するために用いられたアッセイの標準誤差以上の量、好ましくは少なくとも１０％、そしてより好ましくは２５％、５０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、３００％、４００％、５００％又は１，０００％の量によって、患者由来の発現レベルが、コントロール対象由来の試料中のレベルよりも低い場合、患者におけるマーカー遺伝子の発現はコントロール対象における発現レベルよりも「有意に」低いと考えてよい。発現レベルの違いは、最大１０，０００又は５０，０００％である。発現レベルの違いは、好ましくは１０％〜１０，０００％であり、より好ましくは２５％〜１０，０００％、５０％〜１０，０００％であり、１００％〜１０，０００％であり、よりさらに好ましくは２５％〜５，０００％、５０％〜５，０００％、１００％〜５，０００％である。
【００８４】
本発明のほかの態様において、候補薬剤を得る（又は同定する）ための方法であって、該方法が：
ａ）癌患者由来の生体試料の一定分量を候補薬剤と接触させ、そして一定分量中のアンフィレグリン、上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α若しくはＨＥＲ２マーカー遺伝子から成る群から選択されるマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルを測定する工程、
ｂ）候補薬剤と接触させない生体試料の一定分量中の対応するマーカー遺伝子又は対応するマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルを測定する工程、
ｃ）候補薬剤と接触させた生体試料の一定分量中のマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルと、候補薬剤と接触させない生体試料の一定分量中の対応するマーカー遺伝子又は対応するマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルを比較することにより候補薬剤の効果を観察する工程、
ｄ）観察された効果から該薬剤を得る（又は同定する）工程であって、ここで候補薬剤と接触させた生体試料の一定分量中のマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルと、候補薬剤と接触させない生体試料の一定分量中の対応するマーカー遺伝子又は対応するマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルにおける少なくとも１０％の違いが候補薬剤の効果の指標となる工程、
を含んで成る方法、が供される。
【００８５】
本発明のさらに他の態様において、候補薬剤を得るための方法であって、該方法が：
ａ）癌患者由来の生体試料の一定分量を候補薬剤と接触させ、そして一定分量中の
−上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α及びＨＥＲ２マーカー遺伝子から成る群から選択されるマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせ、あるいは
−アンフィレグリンマーカー遺伝子、並びに上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α及びＨＥＲ２マーカー遺伝子から選択されるマーカー遺伝子を含んで成るマーカー遺伝子の組み合わせ、
の発現レベルを測定する工程、
ｂ）候補薬剤と接触させない生体試料の一定分量中の対応するマーカー遺伝子又は対応するマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルを測定する工程、
ｃ）候補薬剤と接触させた生体試料の一定分量中のマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルと、候補薬剤と接触させない生体試料の一定分量中の対応するマーカー遺伝子又は対応するマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルを比較することにより候補薬剤の効果を観察する工程、
ｄ）観察された効果から該薬剤を得る工程であって、ここで候補薬剤と接触させた生体試料の一定分量中のマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルと、候補薬剤と接触させない生体試料の一定分量中の対応するマーカー遺伝子又は対応するマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルにおける少なくとも１０％の違いが候補薬剤の効果の指標となる工程、
を含んで成る方法、が供される。
【００８６】
好ましくは、該候補薬剤は候補阻害剤である。好ましくは該候補薬剤は候補増強剤である。
【００８７】
本発明のほかの態様において、本発明に従う方法により得られた候補薬剤が供される。
【００８８】
本発明のほかの態様において、本発明に従う薬剤を含んで成る医薬品が供される。
【００８９】
本発明の更にほかの態様において、本発明に従う薬剤は、癌の治療のための組成物の調製のために使用される。癌の好ましい形態は、上述のとおりである。
【００９０】
本発明のほかの好ましい態様において、本発明に従う方法の工程；及び
ｉ）治療的に有効な量において対象に前記薬物を供するために十分な量において工程（ｃ）において同定された候補薬剤又はそのアナログ若しくは誘導体を合成する工程；及び／又は
ｉｉ）工程（ｃ）において同定された該候補薬物又はそのアナログ若しくは誘導体を医薬的に許容される担体と組み合わせる工程、
を含んで成る薬物を製造する方法、が供される。
【００９１】
本発明のほかの態様において、アンフィレグリン、上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α及びＨＥＲ２マーカータンパク質又はマーカーポリヌクレオチドから成る群から選択される、マーカータンパク質又はマーカーポリヌクレオチドは、候補薬剤を得るために、あるいは患者の疾患の進行を阻害するための組成物を選択するために使用される。上述のとおり、該疾患は好ましくは癌であり、そして該患者は好ましくは癌患者である。
【００９２】
本発明のほかの態様において、ＨＥＲ二量体化阻害剤は、治療する工程又は治療が、患者由来の生体試料において、
−上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α及びＨＥＲ２マーカー遺伝子から成る群から選択されるマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせ、あるいは
−アンフィレグリンマーカー遺伝子、並びに上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α及びＨＥＲ２マーカー遺伝子から選択されるマーカー遺伝子を含んで成るマーカー遺伝子の組み合わせ、
を評価する工程を含むことを特徴とする、ヒト癌患者を治療するための医薬の製造のために使用される。
【００９３】
ヒト癌患者を治療するための医薬及び特に製剤の製造は、ＷＯ０１／００２４５に記載されており、特に、抗体２Ｃ４について本明細書中に組み込まれている。
【００９４】
本発明の好ましい態様における、ヒト癌患者を治療するための医薬の製造のためのＨｅｒ二量体化阻害剤の使用において、該治療は、マーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせを、治療の間に少なくとも１回又は繰り返し評価することを含む。好ましくは、マーカー遺伝子の発現レベル又はマーカー遺伝子の組み合わせの発現レベルが評価される。好ましくは、該ＨＥＲ二量体化阻害剤は抗体であり、好ましくは抗体２Ｃ４である。好ましくは、該患者は乳癌、卵巣癌、肺癌又は前立腺癌患者である。
【００９５】
本発明のすべての態様において、上述のとおり、マーカー遺伝子、マーカーポリヌクレオチド又はマーカータンパク質の組み合わせが使用される。本発明の全ての態様において、各工程において測定された発現レベルの違いについての好ましい値もまた上述のとおりである。
【００９６】
以下の実施例、配列表及び図面は、本発明、すなわち付随の特許請求の範囲に記載される真の範囲の理解を助けるために供される。本発明の精神から離れることなく記載された手順において改変することができるものと理解される。
【実施例】
【００９７】
予測ルールに対する概論
予測ルールの一般的形態は、応答又は非応答を予測するため、より一般には、適当に規定された臨床的エンドポイントに関する利点又は利点の喪失を予測するための臨床的共変量を潜在的に含む１又は複数のバイオマーカーの機能の詳述に存する。
【００９８】
予測ルールの最も単純な形態は、共変量を伴わない単変量からなり、ここで該予測は、カットオフ又は閾値手段により決定される。これは特定のカットオフｃ及びバイオマーカー測定値ｘについてのヘビサイド関数に関して表すことができる。ここでバイナリ予測（binary prediction) Ａ又はＢが生じる。
Ｈ（ｘ−ｃ）＝０である場合、予測Ａ。
Ｈ（ｘ−ｃ）＝１である場合、予測Ｂ。
【００９９】
これは、予測ルールにおいて単変量バイオマーカー測定を使用する最も単純な方法である。このような単純なルールで十分な場合、これは該効果の予測の単純な認識、すなわち、高い発現レベルが患者のために有益なのか、あるいは低い発現レベルが患者のために有益なのかを許容する。
【０１００】
臨床的共変量を検討する必要がある場合、及び／又は複数のバイオマーカーが多変量予測ルールにおいて使用される場合には、条件はより複雑となりうる。該課題を説明するために、２つの仮説例をあげる：
【０１０１】
共変数調整（仮説例）：
バイオマーカーＸについて、高い発現レベルが悪い予後診断に関係することが、臨床試験集団において判明された（単変量分析）。より密接な分析は、該集団において２つの腫瘍タイプが存在し、その１つは他方に比べて悪い予後を有し、かつ同時にこの腫瘍グループについての該バイオマーカー発現は一般により高いことを示す。調整共変量分析は、該腫瘍タイプのそれぞれについて、臨床的有用性と予後診断の関係が裏返されること、すなわち該腫瘍タイプ中で、低い発現レベルが良い予後に関係することを明らかにする。全体的な逆効果は、共変量腫瘍タイプによって覆われ−そして予測ルールの一部としての共変量調整分析は、該方向（direction)を逆転した。
【０１０２】
多変量予測（仮説例）：
バイオマーカーＸについて、高い発現レベルが悪い予後にわずかに関係することが、臨床試験集団において判明された（単変量分析）。第２のバイオマーカーＹについて、単変量分析により同様の観察が得られた。ＸとＹの組み合わせは、両方のバイオマーカーが低い場合には、良い予後が見られることを明らかにした。これは、両方のバイオマーカーが同じカットオフ以下である場合、有用性を予測するためのルールをもたらす（ＡＮＤ−ヘビサイド予測関数の結合）。該組み合わせルールのために、単変量センスにおいて表現可能な単純なルールはもはや存在しない。例えば、Ｘにおいてより低い発現レベルを有することにより、良い予後は自動的に予測されない。
【０１０３】
これらの単純な例は、共変量を有する及び有さない予測ルールが、各バイオマーカーの単変量レベルに基づき判断できないことを示す。複数のバイオマーカーの組み合わせと共変量による潜在的な調整は、単一のバイオマーカーに対する単純な関係を割り当てることを許容しない。
【０１０４】
統計学的方法
統計タスクは以下の工程を含んで成る：
１．候補バイオマーカーの前選択
２．関連臨床予測共変量（prognostic covariate)の前選択
３．単変量レベルにおけるバイオマーカー予測関数の選択
４．単変量レベルにおける臨床的共変量を含むバイオマーカー予測関数の選択
５．多変量レベルにおけるバイオマーカー予測関数の選択
６．多変量レベルにおける臨床的共変量を含むバイオマーカー予測関数の選択
【０１０５】
以下は異なる工程を詳細に説明する：
Ａｄｌ：候補バイオマーカーの前選択：候補バイオマーカーの統計的な前選択は、臨床的有用性の尺度（meacare）に関する強度に向けられる。この目的のために、異なる臨床的エンドポイントは、得られた代用スコアに、例えば、臨床的有用性の程度の順序割り当てとして、あるいは打ち切り観察を避けるＴＴＰ又はＴＴＤに関する罹患率スコアに変換することができる。これらの代用変換尺度は、例えば、ノンパラメトリック・スピアマン順位相関法により、単純な相関分析のために簡単に使用することができる。ほかには、時間事象（Time-to-event)回帰モデルにおける測定共変量として、例えば、Ｃｏｘ比例ハザード回帰としてバイオマーカー測定が使用される。バイオマーカー値の統計分布に依存して、該工程は、例えば、分散安定化変換及び適当なスケールの使用、あるいは、例えば、そのままの測定（raw measurement)の代わりに百分率を使用する標準化工程として、いくつかの前処理を必要とし得る。さらなるアプローチは、例えば、単一の患者基準における（ｘ軸＝バイオマーカー値、ｙ軸＝臨床的有用性の測定）分布を表すことによる二変量散布図の調査である。また、例えば、平滑化スプラインにより達成されるいくつかのノンパラメトリック回帰線も、バイオマーカーと臨床的有用性の関連性を視覚化するために有用となりうる。
【０１０６】
これらの異なるアプローチの目的は、バイオマーカー共変量の前選択であり、これは少なくとも１つの用いられた有用度（benefit measure)における臨床的有用性とのいくつかの関連性を示し、一方他の基準についての結果は矛盾しない。利用可能なコントロールグループが存在する場合、異なる治療群（arms)におけるバイオマーカーと臨床的有用性の関連性における違いは、該バイオマーカーをさらなる検討にふさわしいものとする異なる予測の標識と成り得る。
【０１０７】
Ａｄ２：関連臨床予測共変量（prognostic covariate)の前選択：「臨床的共変量」の用語は、本明細書において、患者についての全てのほかの情報を記載するために使用され、これはベースラインにおいて一般に利用できる。これらの臨床的共変量は、人口学的情報、例えば、性別、年齢等、他の既存情報、合併症、併用治療、身体検査の結果、得られた一般的研究室パラメーター、標的腫瘍の既知の特性、悪性疾患の程度を定量化する情報、臨床成績スコア、例えば、ＥＣＯＧ又はカルノフスキー指数、臨床疾患病期、前処理のタイミング及び結果、病歴、並びに臨床予後診断に関係しうる同様の全ての情報を含んで成る。臨床的共変量の統計的な前選択は、バイオマーカーを前選択するためのアプローチと並行し、そして同様に臨床的有用性の尺度（measure)との関係性の強度に向けられる。従って、原則として１において考慮される同じ方法を適用する。統計基準に追加して、臨床経験からの基準及び理論的知識もまた、関連臨床的共変量を前選択するために適用することができる。
【０１０８】
臨床的共変量による予測は、バイオマーカーの予測と相互作用しうる。これらは、必要な場合には精密な予測ルールのために考慮される。
【０１０９】
Ａｄ３：単変量レベルにおけるバイオマーカー予測関数の選択：「予測関数」の用語は、標的予測を示すためにスケール化された数をもたらすバイオマーカー測定の数値関数を意味するために一般的な意味において使用される。
【０１１０】
単純な例は、特定のカットオフｃ及びバイオマーカー測定ｘについてのヘビサイド関数の選択であり、ここでバイナリ予測Ａ又はＢが生じる。
Ｈ（ｘ−ｃ）＝０である場合、予測Ａ。
Ｈ（ｘ−ｃ）＝１である場合、予測Ｂ。
【０１１１】
これはおそらく、予測ルールにおいて単変量バイオマーカー測定を使用する最も一般的な方法である。予測関数の定義は、通常、予測可能性を探索するために使用できる既存の訓練データ集合（training data set）を思い起こす。訓練集合から適当なカットオフｃを達成するために、異なる経路をとることができる。まず、１において言及した平滑化スプラインを伴う分布図は、カットオフを定義するために使用することができる。あるいは、いくつかの分布の百分率、例えば、メジアン又は四分位数を選択することができる。カットオフはまた、臨床的有用性の測定に関するこれらの予測可能性に従う全ての可能なカットオフを調査することにより体系的に抽出することができる。その後、これらの結果は、いずれかのマニュアル選択を許容するため、あるいは最適化のためのいくつかの検索アルゴリズムを利用するためにプロットすることができる。これは、各テストカットオフにおいてバイナリ共変量としてバイオマーカーを使用したＣｏｘモデルを用いるエンドポイントＴＴＰ及びＴＴＤに基づき判明した。予測基準は得られるハザード比であった。その後ＴＴＰ及びＴＴＤについての結果は、両方のエンドポイントを伴う直線における予測を示すカットオフを選択するために、一緒に考慮することができる。
【０１１２】
予測関数を選択するためのほかの非一般的なアプローチは、共変量としてバイオマーカー値（変換している可能性がある）を伴う訓練集合から得られた固定パラメーターＣｏｘ回帰モデルに基づいてよい。その後、該予測は、計算されたハザード比が１より小さいか又は大きいかに単純に依存しうる。
【０１１３】
更なる可能性は、状態予測の分離のために訓練集合において標的確立密度があらかじめ測定された、いくつかの尤度比（又はその単調変換）における決定に基づくことである。その後、バイオマーカーは密度比のいくつかの関数に当てはめられる。
【０１１４】
Ａｄ４：単変量レベルにおける臨床的共変量を含むバイオマーカー予測関数の選択：本明細書において、単変量は、１つだけのバイオマーカーを使用することを意味する−臨床的共変量に関して、これは多変量モデルとなりうる。該アプローチは、臨床的共変量を伴わない検索と並行し、該方法は、関連共変量情報を組み入れるために許容される。カットオフを選択する分布図法は、共変量の制限された使用のみを許容する。例えば、バイナリ共変量は、プロット中にコードされたカラーであってよい。該分析がいくつかの回帰アプローチに依存する場合、共変量の使用（また、同時にこれらの多く）が通常促進される。３において記載されるＣｏｘモデルに基づくカットオフ検索は、共変量の容易な取り込みを許容し、そしてこれにより共変量調整単変量カットオフ検索に導く。共変量による調整は、該モデルにおいて共変量として、あるいは層別解析における組み入れ（inclusion)を介して行うことができる。
【０１１５】
予測関数のほかの選択もまた、共変量の組み込みを許容する。
【０１１６】
これは、予測関数としてのＣｏｘモデル選択について直接的である。相互作用レベルにおける共変量の影響を推定するためのオプションが存在し、これは、例えば、異なる年齢グループのために異なるハザード比が適用されることを意味する。
【０１１７】
予測関数の尤度比タイプのために、共変量を含んで予測密度を推定しなければならない。ここで多変量パターン認識の方法を使用することができ、あるいは共変量における重回帰によりバイオマーカー値を調整することができる（密度推定前）。
【０１１８】
バイオマーカー（原測定レベル）及び応答として臨床的有用度を利用する臨床的共変量のためにＣＡＲＴ技術 (Classification And Regression Trees; Breiman L., Friedman J.H., Olshen R.A., Stone C.J., Chapman & Hall (Wadsworth, Inc.), New York, 1984) を使用することができる。このようにカットオフが検索され、そして予測のための共変量を含むデシジョン・ツリー型の関数が見出されるだろう。ＣＡＲＴにより選択されたカットオフ及びアルゴリズムは、高い頻度で最適に近づき、そして異なる臨床的有用度を検討することにより、組み合わせ、そして統一することができる。
【０１１９】
Ａｄ５：多変量レベルにおけるバイオマーカー予測関数の選択：異なる単変量予測関数選択において予測可能性を維持するいくつかのバイオマーカー候補が存在する場合、バイオマーカーの組み合わせにより、すなわち多変量予測関数を検討することにより、更なる改善を達成することができる。
【０１２０】
単純なヘビサイド関数モデルに基づき、例えば、最適カットオフが認識される場合にバイオマーカー値の二変量散布図を検討することにより、バイオマーカーの組み合わせを評価することができる。その後、改善された予測を達成するために、論理ＡＮＤ及び論理ＯＲ演算子による異なるヘビサイド関数を組み合わせることによりバイオマーカーの組み合わせを達成することができる。
【０１２１】
バイオマーカーについてのカットオフ及び予測のためのデシジョン・ツリー型の関数を達成するために、ＣＡＲＴ技術（Classification and Regression Trees）は、複数のバイオマーカー（原測定レベル）及び応答としての臨床的有用度のために使用することができる。ＣＡＲＴにより選択されたカットオフ及びアルゴリズムは、高頻度で最適に近づき、そして異なる臨床的有用度を検討することにより、組み合わせることができ、そして統一することができる。
【０１２２】
Ｃｏｘ回帰は、異なるレベルにおいて利用することができる。第一の方法は、バイナリ方法（すなわち、いくつかのカットオフを伴うヘビサイド関数に基づく）において、複数のバイオマーカーを組み込むことである。ほかの選択は、メトリック（metric) 方法（適当な変換後）、又はバイナリ及びメトリックアプローチの組み合わせにおいてバイオマーカーを利用することである。発展的な多変量予測関数は、３に記載されるとおりＣｏｘ型のものである。
【０１２３】
多変量尤度比アプローチは、認識することが難しいが、多変量予測関数ための選択もまた提供する。
【０１２４】
Ａｄ６：多変量レベルにおける臨床的共変量を含むバイオマーカー予測関数の選択：関連臨床的共変量が存在する場合、複数のバイオマーカーと複数の臨床的共変量を組み合わせることにより、さらなる改善を達成することができる。異なる予測関数の選択は、臨床的共変量を含む可能性に関して評価されるだろう。
【０１２５】
バイオマーカーについてのヘビサイド関数の単純な論理的組み合わせに基づき、更なる共変量を訓練集合において得られた論理回帰モデルに基づく予測関数に含ませることができる。
【０１２６】
ＣＡＲＴ技術及び発展的なデシジョン・ツリーは、更なる共変量とともに容易に使用することができ、これらを予測アリゴリズムに組み込む。
【０１２７】
Ｃｏｘ回帰に基づく全ての予測関数は、更なる臨床的共変量を用いることができる。相互作用レベルにおける共変量の影響を推定するためのオプションが存在する。これは、例えば、異なる年齢グループのために異なるハザード比を適用することを意味する。
【０１２８】
多変量尤度比アプローチは、さらなる共変量の使用に対して直接的に拡張可能ではない。
【０１２９】
例１
以下に記載するとおり、ペルツズマブで処理したＨＥＲ２低発現転移性乳癌患者由来のベースライン血清を、ＨＥＲリガンド及び放出したＨＥＲ２（ＨＥＲ２、ＥＣＤ）のレベルについて評価した。
【０１３０】
血清バイオマーカーの評価のために使用したキット：
【表１】
2009504142.tif 000002
【０１３１】
プロトコル：
ＨＥＲ２−ＥＣＤ：
製造業者の推奨に従い、ＨＥＲ２−ＥＣＤ  ＥＬＩＳＡを行った。
【０１３２】
アンフィレグリン：
−全ての試薬（キットにより供される）、標準希釈液（キットにより供される）及び試料を調製する。
−フレーム中にＥｖｅｎ  Ｃｏａｔ  ヤギ  抗マウス  ＩｇＧ  マイクロプレートストリップ(R&D, Cat. # CP002; not provided with the kit)を供する。該フレームは、このたびＥＬＩＳＡプレートと称する。
−必要な数（標準希釈液の数＋試料の数）のウェルを決定する。
−プレートレイアウトを決定する。
−１００μｌの希釈捕捉抗体（ＰＢＳ中１：１８０、キットにより供される）を各ウェルに添加する。
−室温で１時間インキュベートする。
−各ウェルを吸引し、そして洗浄する。該工程は、合計４回の洗浄となるように３回繰り返す。マニホールド・ディスペンサーを使用して各ウェルに４００μｌの洗浄バッファー（キットにより供されない；ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を使用した）を満たすことにより洗浄し、そして続いて吸引する。最後の洗浄後、吸引により残っている洗浄バッファーを除去する。プレートを逆さにし、そして清潔なペーパータオルにそれをブロットする。
−ウェルあたり１００μｌの標準希釈液又は希釈試料（以下を参照のこと）を添加する。全てのピペッティング工程後、チップを交換する。
−粘着ストリップ（キットにより供される）でプレートをカバーする。
−ロッキングプラットホームにおいて室温で２時間インキュベートする。
−上述の吸引／洗浄を繰り返す。
−吸引した試料及び洗浄溶液を実験室用殺菌剤で処理する。
−ウェルあたり、薬剤希釈剤（キットにより供されない；ＰＢＳ中１％ＢＳＡ(Roth; Albumin Fraction V, Cat. # T844.2)中１：１８０に希釈した１００μｌの検出抗体（キットにより供される）を添加する。
−室温で２時間インキュベートする。
−上述の吸引／洗浄を繰り返す。
−各ウェルに１００μｌのストレプトアビジン−ＧＰＲの常用希釈液（キットにより供される；試薬希釈剤中１：２００に希釈）を添加する。新たな粘着ストリップでカバーする。
−室温で２０分間インキュベートする。
−上述の吸引／洗浄を繰り返す。
−各ウェルに１００μｌの基質溶液（R&D, Cat. # DY999;キットにより供されない）を添加する。
−室温で２０分間インキュベートする。光から保護する。
−各ウェルに５０μｌの停止溶液（１．５Ｍ  Ｈ2ＳＯ4 (Schwefelsaure reinst, Merck, Cat. # 713)；キットにより供されない）を添加する。注意深く混合する。
−４５０ｎｍに設定したマイクロプレートリーダーを使用して各ウェルの光学密度を直ぐに測定する。
【０１３３】
アンフィレグリン標準曲線
４０ｎｇ／ｍｌのアンフィレグリン原液を、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ中に調製し、等分し、そして−８０℃で保存した。ＰＢＳ中２０％ＢＳＡにおけるアンフィレグリン溶液は２週間以降は安定でなかったため、使用しなかった。等分したアンフィレグリン原液から、各実験の前にＰＢＳ中２０％ＢＳＡにおいてアンフィレグリン標準曲線を新たに作成した。最も高い濃度は１０００ｐｇ／ｍｌ（アンフィレグリン原液の１：４０希釈）であった。ＥＬＩＳＡキットに供された該標準は、線形標準曲線を産生した。該カーブのエクセル解析は、全てのＥＬＩＳＡについての曲線方程式の決定を許容した。
【０１３４】
アンフィレグリン試料：
試料を試薬希釈剤に１：１に希釈すると、全ての試料はＥＬＩＳＡの直線範囲内となった。各試料を２回ずつ測定した。データの質及び十分な量の血清に依存して、必要な場合には次の実験を繰り返した。
【０１３５】
ＥＧＦ：
−全ての試薬（キットにより供される）、標準希釈液（キットにより供される）及び試料を調製する。
−フレームから過剰な抗体コーティングマイクロタイタープレートストリップを除去する。該フレームは、このたびＥＬＩＳＡプレートと称する。
−必要な数（標準希釈液の数＋試料の数）×２のウェルを決定する。
−プレートレイアウトを決定する。
−各ウェルに５０μｌの希釈ＲＤ１（キットにより供される）を添加する。
−ウェルあたり２００μｌの標準希釈液又は希釈試料（例えば、較正希釈剤  ＲＤ６Ｈ中１：２０）を添加する。全てのピペッティング工程後、チップを交換する。
−粘着ストリップ（キットにより供される）でプレートをカバーする。
−ロッキングプラットホームにおいて室温で２時間インキュベートする。
−各ウェルを吸引し、そして洗浄する。該工程は、合計４回の洗浄となるように３回繰り返す。マニホールド・ディスペンサーを使用して各ウェルに４００μｌの洗浄バッファー（キットにより供される）を満たすことにより洗浄し、そして続いて吸引する。最後の洗浄後、吸引により残っている洗浄バッファーを除去する。プレートを逆さにし、そして清潔なペーパータオルにそれをブロットする。
−吸引した試料及び洗浄溶液を実験室用殺菌剤で処理する。
−各ウェルに２００μｌのコンジュゲート（キットにより供される）を添加する。新たな粘着ストリップでカバーする。
−室温で２時間インキュベートする。
−上述の吸引／洗浄を繰り返す。
−各ウェルに２００μｌの基質溶液（キットにより供される）を添加する。
−室温で２０分間インキュベートする。光から保護する。
−各ウェルに５０μｌの停止溶液（キットにより供される）を添加する。注意深く混合する。
−４５０ｎｍに設定したマイクロプレートリーダーを使用して各ウェルの光学密度を３０分以内に測定する。
【０１３６】
ＥＧＦ標準曲線：
ＥＬＩＳＡキットで供された標準は、線形標準曲線を産生した。また極めて低濃度であっても検出可能であることが示された。
【０１３７】
ＥＧＦ試料：
該試料により合計４回のアッセイを行った。各試料は２〜５回測定し、測定の回数は、結果の質（平均値±ＳＤ）及び十分な量の血清の利用性に依存する。試料を較正希釈剤ＲＤ６Ｈ中に１：２０に希釈した場合、全ての試料はＥＬＩＳＡの線形範囲内となった。
【０１３８】
ＴＧＦ−α
−全ての試薬（キットにより供される）、標準希釈液（キットにより供される）及び試料を調製する。
−フレームから過剰な抗体コーティングマイクロタイタープレートストリップを除去する。該フレームは、このたびＥＬＩＳＡプレートと称する。
−必要な数（標準希釈液の数＋試料の数）×２のウェルを決定する。
−プレートレイアウトを決定する。
−各ウェルに１００μｌのアッセイ希釈剤ＲＤ１Ｗ（キットにより供される）を添加する。
−ウェルあたり５０μｌの標準希釈液又は希釈試料を添加する。全てのピペッティング工程後、チップを交換する。
−粘着ストリップ（キットにより供される）でプレートをカバーする。
−ロッキングプラットホームにおいて室温で２時間インキュベートする。
−各ウェルを吸引し、そして洗浄する。該工程は、合計４回の洗浄となるように３回繰り返す。マニホールド・ディスペンサーを使用して各ウェルに４００μｌの洗浄バッファー（キットにより供される）を満たすことにより洗浄し、そして続いて吸引する。最後の洗浄後、吸引により残っている洗浄バッファーを除去する。プレートを逆さにし、そして清潔なペーパータオルにそれをブロットする。
−吸引した試料及び洗浄溶液を実験室用殺菌剤で処理する。
−各ウェルに２００μｌのＴＧＦ−αコンジュゲート（キットにより供される）を添加する。新たな粘着ストリップでカバーする。
−室温で２時間インキュベートする。
−上述の吸引／洗浄を繰り返す。
−各ウェルに２００μｌの基質溶液（キットにより供される）を添加する。
−室温で３０分間インキュベートする。光から保護する。
−各ウェルに５０μｌの停止溶液（キットにより供される）を添加する。注意深く混合する。
−４５０ｎｍに設定したマイクロプレートリーダーを使用して各ウェルの光学密度を３０分以内に測定する。
【０１３９】
ＴＧＦ−α標準曲線：
ＥＬＩＳＡキットで供された標準は、線形標準曲線を産生した。また極めて低濃度であっても検出可能であることが示された。
【０１４０】
ＴＧＦ−α試料：
該試料により合計４回のアッセイを行った。試料は２〜４回の独立アッセイにおいて測定した。
【０１４１】
ペルツズマブ処理に対する応答に関連しうる血清ベースラインレベルのファクターを確認するために血清データを解析した。全てのファクターについて、分布の傾斜パターン（平均値、標準偏差、メジアン、最小値、最大値）が観察された。対数に基づき、歪度（skewness)を減少させるために、単調な変換を使用した：Ｌｏｇ（ｘ＋１）。単変量分析において、（臨床的有用性として規定されたこの例において）、応答の可能性に関係しうる該ファクターについての適当なカットポイントが規定できるかどうかを調査した。ここで、臨床的有用性を伴う患者は、部分反応（ＰＲ）を達成したもの、あるいは少なくとも６ヶ月間安定な疾患を維持したものとして定義した。該ファクター対応答カテゴリーの散布図を調査した。図１及び図２は、該アプローチを例証するため、それぞれ臨床応答カテゴリー対ＴＧＦ−α及びアンフィレグリンの血清レベルの対数変換のプロットを示す。
【０１４２】
散布図に基づき、より優れた臨床的有用性を経験した患者グループを定義するためのファクターについてカットポントを選択した。図３（ＴＧＦ−α）、図４（アンフィレグリン）、図５（ＥＧＦ）、及び図６（ＨＥＲ２−ＥＣＤ）は、オリジナルのファクター単位について計算された検索カットポイントに基づく異なるファクター分類に関係する臨床的有用性を示す。該カットポイントは、臨床的有用性を伴わない数人の患者を別とするので、より優れた臨床的有用性を伴うグループについての応答比は上昇する。
【０１４３】
例２
この例において、他の臨床的エンドポイントとして腫瘍増殖／又は死亡停止時間（ＴＴＰ）及び死亡停止時間（ＴＴＰ）を使用して、ペルツズマブの臨床的有用性の異なる測定におけるファクターグループ化の単変量効果を評価するために、例１由来の検索カットポイントを使用した。図７の概要において示されるとおり、ＴＴＰ及び／又はＴＴＤについてのカプラン・マイヤー推定値及びログランクテストにおいて、ＴＧＦ−α、アンフィレグリン、ＥＧＦ及びＨＥＲ２−ＥＣＤについての有意な効果が観察された。
【０１４４】
ハザード比を示すカプラン・マイヤープロットは、図８及び図９（ＴＧＦ−α）、図１０及び図１１（アンフィレグリン）、図１２及び図１３（ＥＧＦ）、及び図１４及び図１５（ＨＥＲ２−ＥＣＤ）において、ＴＴＰ及びＴＴＤ（最も大きな数の観察された事象）のために与えられ、ペルツズマブで処理した患者の臨床成績におけるこれらのファクターに基づくグループ化の明白な効果を示している。
【０１４５】
例３
この例において、ペルツズマブ処理から、より優れた有用性を伴う患者の同定をさらに改善するファクターの組み合わせを同定するために、多変量アプローチを使用した。ＣＡＲＴアプローチ（Classification And Regression Tree)から得られた結果が反映される。該ＣＡＲＴ分類アプローチは、有用なグループとして、０以上の臨床的有用性における全ての値を特定することが必要となる。変量として、Ｈｅｒ２−ＥＣＤ、ＴＧＦ−α、アンフィレグリン、及びＥＧＦの血清レベルを利用した。最適な結果を与えるために、血清Ｈｅｒ２−ＥＣＤと血清ＴＧＦ−αレベルの組み合わせを選択した。該ＣＡＲＴ結果から、血清Ｈｅｒ２−ＥＣＤと血清ＴＧＦ−αレベルの組み合わせについての最適化したカットポイントが得られ、実験集団における臨床的有用性の診査カテゴリー化のためのルールがもたらされた−低血清Ｈｅｒ２−ＥＣＤ値と低血清ＴＧＦ−α値の組み合わせは、実験集団において、２／２ＰＲ及び２／３ＳＤ＞６ヶ月を獲得し、かつ有意な数の急進行性患者を除外する。図１６は、診査組み合わせカットポイントに基づくＴＧＦ−α／ＨＥＲ２−ＥＣＤの組み合わせグループ化に関係する臨床的有用性を示す。図１７は、ＴＴＰ及びＴＴＤにおけるＴＧＦ−とＨＥＲ２−ＥＣＤの組み合わせの効果を概要する。図１８（ＴＴＰ）及び図１９（ＴＴＤ）において与えられるカプラン・マイヤー推定値及びハザード比は、ペルツズマブで処理した患者の臨床生成期におけるこれらのファクターの組み合わせに基づくグループ化の有意な効果を実証する。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】ＴＧＦ−α対数変換対カテゴリー化された臨床的有用性の散布図である。
【図２】アンフィレグリン対数変換対カテゴリー化された臨床的有用性の散布図である。
【図３】ＴＧＦ−αの順序的な臨床的有用性を示す。
【図４】アンフィレグリンの順序的な臨床的有用性を示す。
【図５】ＥＧＦの順序的な臨床的有用性を示す。
【図６】ＨＥＲ２−ＥＣＤの順序的な臨床的有用性を示す。
【図７】アンフィレグリン、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＨＥＲ２−ＥＣＤについてのＴＴＰ及びＴＴＤの診査カットポイント及びログランクｐ値の概要を示す。
【図８】診査単一マーカーカットポイントに基づく腫瘍増殖／死亡停止時間についてのＴＧＦ−αのカプラン・マイヤープロットである。
【図９】診査単一マーカーカットポイントに基づく死亡停止時間についてのＴＧＦ−αのカプラン・マイヤープロットである。
【図１０】診査単一マーカーカットポイントに基づく腫瘍増殖／死亡停止時間についてのアンフィレグリンのカプラン・マイヤープロットである。
【図１１】診査単一マーカーカットポイントに基づく死亡停止時間についてのアンフィレグリンのカプラン・マイヤープロットである。
【図１２】診査単一マーカーカットポイントに基づく腫瘍増殖／死亡停止時間についてのＥＧＦのカプラン・マイヤープロットである。
【図１３】診査単一マーカーカットポイントに基づく死亡停止時間についてのＥＧＦのカプラン・マイヤープロットである。
【図１４】診査単一マーカーカットポイントに基づく腫瘍増殖／死亡停止時間についてのＨＥＲ２−ＥＣＤのカプラン・マイヤープロットである。
【図１５】診査単一マーカーカットポイントに基づく死亡停止時間についてのＨＥＲ２−ＥＣＤのカプラン・マイヤープロットである。
【図１６】組み合わせスコアの例として、ＴＴＰにおける高い臨床的有用性／低い臨床的有性グループ間の分離をさらに改善させる：ＨＥＲ２−ＥＣＤとＴＧＦαの組み合わせの順序的な臨床的有用性を示す。
【図１７】ＴＧＦ−αとＨＥＲ２−ＥＣＤの組み合わせについてのＴＴＰ及びＴＴＤの診査カットポイント及びログランクｐ値の概要を示す。
【図１８】組み合わせ診査マーカーカットポイントに基づく腫瘍増殖／死亡停止時間についてのＨＥＲ２−ＥＣＤ／ＴＧＦ−αのカプラン・マイヤープロットである。
【図１９】組み合わせ診査マーカーカットポイントに基づく死亡停止時間についてのＨＥＲ２−ＥＣＤ／ＴＧＦ−αのカプラン・マイヤープロットである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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