(57)【要約】生体サンプル中のＣＫ−１９ｍＲＮＡ陽性細胞の定量測定についての方法が開示されている。この方法は例えば、患者の癌を検出するために末梢血を用いて使用することができる。ある態様では、この方法をアジュバント治療前に癌を検出して、それによって治療効果に関する情報を提供するために使用することができる。本発明方法の実施は、感度が高く、信頼性が高く、そして実施が容易である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのプライマーが少なくとも１つのイントロンを挟む部位を包含することを特徴とする、少なくとも１つのイントロンを包含する遺伝子の標的配列とハイブリッド形成できるプライマー対。
【請求項２】
当該プライマーが、当該遺伝子の偽遺伝子とハイブリッド形成しないことを特徴とする、請求項１に記載のプライマー対。
【請求項３】
当該プライマーの少なくとも１つが、当該偽遺伝子の３’末端にある少なくとも１つの塩基にミスマッチする、請求項２に記載のプライマー対。
【請求項４】
遺伝子が、ヒトＣＫ１９遺伝子である、請求項１、２又は３に記載のプライマー対。
【請求項５】
プライマー対の１つが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列を含んでなる、請求項４に記載のプライマー対。
【請求項６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列を有する１つのプライマー及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列を有する１つのプライマーを含んでなる、請求項５に記載のプライマー対。
【請求項７】
プライマーが、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体又は標識を含んでなる、請求項１〜６の何れか一項に記載のプライマー対。
【請求項８】
少なくとも１つのプライマーが少なくとも１つのイントロンを挟む部位を包含し、
（ｉ）核酸増幅試薬、請求項１に記載のプライマー対及びテストサンプルを包含する反応混合物を形成すること、
（ｉｉ）当該混合物を増幅条件下において、標的配列に相補的な核酸配列の少なくとも１つのコピーを生成すること、及び
（ｉｉｉ）ＰＣＲ時のリアルタイム観察を用いて、サンプル中のｍＲＮＡの量を測定すること、
の工程を含んでなる、プライマー対を用いて、少なくとも１つのイントロンを包含する遺伝子由来のｍＲＮＡの、テストサンプル中の存在を定量する方法。
【請求項９】
工程（ｉ）の反応混合物の形成前に、テストサンプルを逆転写する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
テストサンプルが、血液サンプル、骨髄からのサンプル及びリンパ節由来のサンプルから選ばれる、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
テストサンプルが、血液サンプルである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
血液サンプルが、反応混合物の形成前に遠心分離される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｉ）の反応混合物が、ハウスキーピングプライマー対を更に含んでなる、請求項８〜１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ハウスキーピングプライマー対が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５及び６を有している、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
（ｉ）患者から生体サンプルを提供すること、
（ｉｉ）生体サンプルから核酸を単離すること、
（ｉｉｉ）核酸の供給源がＲＮＡである場合、単離した核酸を任意に逆転写すること、
（ｉｖ）核酸増幅試薬、請求項４に記載のプライマー対、及び工程（ｉｉ）で単離した核酸又は工程（ｉｉｉ）の逆転写された核酸のアリコートを包含する、反応混合物を形成すること、
（ｖ）当該混合物を増幅条件下において、標的配列に相補的な核酸配列の少なくとも１つのコピーを生成すること、
（ｖｉ）ＰＣＲ時のリアルタイム観察を用いて、サンプル中のＣＫ−１９ｍＲＮＡ陽性細胞を定量すること、及び
（ｖｉｉ）サンプル中のＣＫ−１９ｍＲＮＡ陽性細胞の量に基づいて、アジュバント治療の見通しを判断すること、
の工程を含んでなる、癌を患っている患者におけるアジュバント治療の見通しを判断する診断方法。
【請求項１６】
前記癌が、乳癌、好ましくは手術可能な乳癌である、請求項１５に記載の診断方法。
【請求項１７】
前記生体サンプルが、血液サンプルである、請求項１５又は１６に記載の診断方法。
【請求項１８】
工程（ｉｉｉ）の反応混合物が、ハウスキーピングプライマー対を更に含んでなる、請求項１５〜１７の何れか一項に記載の診断方法。
【請求項１９】
ハウスキーピングプライマー対がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５及び６を有している、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
（ｉ）請求項１に記載のプライマー対、
（ｉｉ）癌細胞上に追加のマーカーと任意にハイブリッド形成する配列、及び
（ｉｉｉ）増幅試薬、
を含んでなる、ＣＫ１９標的配列を増幅するための診断キット。
【請求項２１】
前記増幅試薬が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及び４のハイブリダイゼーションプローブを含んでなる、請求項２０に記載の診断キット。
【請求項２２】
前記キットが、ハウスキーピングプライマー対、好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５及び６による配列を有するプライマー対を更に含んでなる、請求項２０又は２１に記載の診断キット。
【請求項２３】
増幅試薬及びプライマー対（複数を含む）が、凍結乾燥されている、請求項２０〜２２の何れか一項に記載の診断キット。
【請求項２４】
第１プライマーの長さが約１０〜約２０個の核酸塩基であって、更に図１で示されるＣＫ−１９ｃＤＮＡ配列と特異的にハイブリッド形成が可能である、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又は２で示される配列の少なくとも約８個の核酸塩基を有する第１プライマーを含んでなる、プライマー対。
【請求項２５】
第２プライマーの長さが約１０〜約２０個の核酸塩基であって、更に図１で示されるＣＫ−１９ｃＤＮＡ配列と特異的にハイブリッド形成が可能である、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又は２で示される配列の少なくとも約８個の核酸塩基を有する第２プライマーを更に含んでなる、請求項２４に記載のプライマー対。
【請求項２６】
第１及び第２プライマーの少なくとも１つが、修飾ヌクレオチド間架橋、修飾糖部分又は修飾核酸塩基を含んでなる、請求項２４〜２５に記載のプライマー対。
【請求項２７】
第１及び第２プライマーの少なくとも１つが、少なくとも１つの固定された核酸（locked nucleotic acid；ＬＮＡ）ユニットを含有している、請求項２６に記載のプライマー対。
【請求項２８】
少なくとも１つのプライマーが、少なくとも１つのイントロンを挟む部位を包含し、
（ｉｖ）核酸増幅試薬、請求項２４〜２７に記載のプライマー対及びテストサンプルを包含する反応混合物を形成すること、
（ｖ）当該混合物を増幅条件下において、標的配列に相補的な核酸配列の少なくとも１つのコピーを生成すること、及び
（ｖｉ）ＰＣＲ時のリアルタイム観察を用いて、サンプル中のｍＲＮＡの量を測定すること、
の工程を含んでなる、プライマーの対を用いて、少なくとも１つのイントロンを包含する遺伝子由来のｍＲＮＡの、テストサンプル中の存在を測定する方法。
【請求項２９】
ハウスキーピングプライマー対の使用を更に含んでなる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
請求項２４〜２７に記載のプライマー又はプライマー対を含んでなる、診断キット。
【請求項３１】
（ａ）生体液から何れかの単核細胞を分離すること、
（ｂ）分離した単核細胞に、単核細胞によって発現される抗原に特異的に結合する抗体（又はその抗原結合断片）を接触させること（ここにおいて、抗体（又は断片）は固体担体に結合されており、この接触は、細胞、抗体（又は断片）及び固体担体の結合複合体を形成するのに十分である）、
（ｃ）結合していない物質の何れかから、複合体を分離すること、
（ｄ）複合体に結合している内皮単核細胞から、核酸を単離すること、
（ｅ）核酸増幅試薬、請求項２４〜２７に記載のプライマー対及び核酸を包含する反応混合物を形成すること、
（ｆ）当該混合物を増幅条件下において、ＣＫ−１９標的配列に相補的な核酸配列の少なくとも１つのコピーを生成すること、及び
（ｇ）ＰＣＲを用いて、生体サンプル中のＣＫ−１９ｍＲＮＡを検出すること、
の工程を含んでなる、生体サンプル中のＣＫ−１９ｍＲＮＡの存在を確定する方法。
【請求項３２】
上皮単核細胞が、濾過又は遠心分離で分離される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
遠心分離工程が、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配法の使用を含んでなる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
抗体が、内皮単核細胞によって発現されるグリコプロテインに特異的に結合するモノクローナルである、請求項３１〜３３に記載の方法。
【請求項３５】
モノクローナル抗体が、Ｂｅｒ−ＥＰ４である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
固体担体が、免疫磁性ビーズである、請求項３１〜３５に記載の方法。
【請求項３７】
工程（ｃ）の方法が、結合複合体に磁場を掛けて、結合していない物質の全てから複合体を分離することを含んでなる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
プライマー対が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で表される、請求項３１〜３６に記載の方法。
【請求項３９】
生体液が、末梢血である、請求項３１〜３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体サンプル中のＣＫ−１９ｍＲＮＡ陽性細胞を定量するための組成物及び方法に関する。
【０００２】
特に、本発明は、癌を患っている患者からの生体サンプル中の分子マーカーＣＫ−１９の定量に基づく、循環腫瘍細胞（ＣＴＣｓ）を検出する方法に関する。本発明による方法を用いることによって、アジュバント治療の開始前に、この治療の有効性に関する情報を提供するための、検出を実施することができる。
【背景技術】
【０００３】
最近の数年間、乳癌患者の骨髄又は末梢血中の腫瘍細胞の検出及び特定化が、無病生存率及び全生存率に関して、臨床的関連性があるという一連の証拠が増えている（A.C. Lambrechts et al; 1998）。更に、微小残存病変（ＭＲＤ）の予測評価が、アジュバント治療の有効性に関する情報を与えることができる（K. Pantel et al; 2003）。従って、循環腫瘍細胞を初期に検出するための感度の高い方法は、ＭＲＤの初期診断及びより有効な治療に対して非常に重要である。
【０００４】
中間フィラメント・サイトケラチン−１９（ＣＫ−１９）は、上皮腫瘍細胞の大半で安定且つ豊富に発現され、そして乳癌患者の末梢血中の肉眼で見えない腫瘍細胞の検出のために最もよく用いられるマーカーの１つである（S. Braun et al; 2000; Y.H. Datta et al; 1994; A. Schoenfield et al; 1997）。本発明者らは最近、末梢血におけるＣＫ−１９ｍＲＮＡ陽性細胞の検出が、患者におけるアジュバント治療前の手術可能な乳癌患者の転帰の最も重要な因子の１つであることを示していること、そしてＣＫ−１９ｍＲＮＡに陰性な患者が長期の生存率及び無病生存率の十分な可能性を有していることを、明らかにした（A. Stathopoulou et al; 2002）。
【０００５】
更に、以前の検討において、本発明者らは、ＣＫ−１９ｍＲＮＡに対する蛍光標識された特異的ハイブリダイゼーションプローブのＰＣＲ時のリアルタイム観察に基づく定量方法を開発した（A. Stathopoulou et al; 2003）。この方法を乳癌患者に適用することにより、Ｉ／ＩＩ（手術可能）又はＩＶ（転移）ステージの何れかで、更に健常な血液提供者で、本発明者らは、それぞれ７０／３３７（２０．７７％）及び２／８９（２．２％）の末梢血中に陽性細胞を見出した。この場合、本発明者らは、５μｇのＲＮＡに対して０．６ＭＣＦ−７細胞当量のカットオフ値（この方法の検出限界）をセットしたときに、正常血液提供者に対して偽陽性率（２．２％）を観察した。この統計的に計算されたカットオフを用いることによって、患者及び健常な提供者の末梢血サンプルの幾つかは、非常に高い交差ポイント（Crossing point；Ｃｐｓ）でのＣＫ−１９の増幅カーブを示したにも関わらず、陰性と見なされた。これらの増幅カーブは、造血細胞からの低レベルの通常では認められない転写されたＣＫ−１９（J. A. Lopez-Guerrero et al; 1997）の増幅、ＣＫ−１９ａ及びＣＫ−１９ｂの偽遺伝子（P. Ruud et al; 1999; E. S. Savtchenko et al; 1988）又は本発明者らのサンプルから全ＲＮＡと共に抽出された夾雑ゲノムＤＮＡの増幅に起因していた。しかしながら、このカットオフ値の非常に近いところに見られるサンプルでは、この「グレーゾーン」の結果の解釈は、本発明者らの初期乳癌患者の治療に対して非常に重大な意味を持っていた（V. Bozionellou et al; in press）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、生体サンプル中のｍＲＮＡ転写物を定量測定するためのプライマー及び方法に、改善する必要性が依然として存在している。特に、従来のプライマー及び方法に比べてノイズが減少し、高い感受性及び偽陽性の低い頻度をもたらす方法であり、手術可能な癌患者の末梢血中のＣＫ−１９ｍＲＮＡ陽性細胞を測定するための改善されたプライマー及び方法が要望されている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
従って、本発明の一態様では、少なくとも１つのイントロンを包含する遺伝子の標的配列とハイブリッド形成できるプライマー対（ここにおいて、当該プライマー対の少なくとも１つは、少なくとも１つのイントロンを挟む部位を包含する）に関する。少なくとも１つのプライマーが、可能性のある偽遺伝子に対して相同性が低い配列を有していることが好ましい。
【０００８】
好ましい態様では、当該遺伝子がヒトＣＫ−１９遺伝子である。
【０００９】
本発明の別の態様では、ゲノム遺伝子及び任意に１つ又はそれ以上の偽遺伝子を包含するサンプル中で、プライマー対を用いて少なくとも１つのイントロン配列を含む遺伝子由来のｍＲＮＡを定量する改善された方法を提供する。ここにおいて、この方法は、１つ又はそれ以上の当該プライマーは、少なくとも１つのイントロンを挟む部位を包含しており、
（ｉ）核酸増幅試薬、本発明のプライマー対及びテストサンプルを包含する反応混合物を形成すること、
（ｉｉ）この混合物を増幅条件下において、標的配列に相補的な核酸配列の少なくとも１つのコピーを生成すること、及び
（ｉｉｉ）ＰＣＲ時のリアルタイム観測を用いて、サンプル中のｍＲＮＡの量を測定すること、
の工程を含んでなる。
【００１０】
遺伝子がヒトＣＫ−１９であって、サンプルが血液サンプル、骨髄由来のサンプル又はリンパ節由来のサンプルであることが好ましい。癌を患っている患者の生体サンプル中の分子マーカーＣＫ−１９の定量測定に基づく、ＣＫ−１９プライマー及び本発明の方法を用いる循環腫瘍細胞（ＣＴＣｓ）の早期検出は、従来の方法及びプライマーを用いるのに比べて、より高い精度で実施することができる。
【００１１】
更なる態様では、本発明は、癌を患っている患者におけるアジュバント治療の見通しを判断するための診断方法に関し、その方法は、
（ｉ）患者から生体サンプルを提供すること、
（ｉｉ）生体サンプルから核酸を単離すること、
（ｉｉｉ）核酸の供給源がＲＮＡである場合、単離した核酸を任意に逆転写すること、
（ｉｖ）核酸増幅試薬、本発明によるプライマー対、及び工程（ｉｉ）で単離した核酸のアリコートを包含する、反応混合物を形成すること、
（ｖ）当該混合物を増幅条件下において、標的配列に相補的な核酸配列の少なくとも１つのコピーを生成すること、
（ｖｉ）ＰＣＲ時のリアルタイム観察を用いて、サンプル中のＣＫ−１９ｍＲＮＡ陽性細胞を定量すること、及び
（ｖｉｉ）サンプル中のＣＫ−１９ｍＲＮＡ陽性細胞の量に基づいて、アジュバント治療の見通しを判断すること、
の工程を含んでなる。
【００１２】
本発明による診断方法を用いると、患者の生体サンプル中のＣＫ−１９ｍＲＮＡ陽性細胞の量のより少量での検出が可能となり、更に、偽陽性判定の頻度が非常に低くなる。このことは、疾患の進行の初期に信頼性のある判定ができ、患者の回復可能性が大いに改善されるという結果を伴うことを意味する。
【００１３】
別の態様では、本発明は、ハウスキーピングのプライマー対を提供する。このハウスキーピングのプライマー対は、特定の細胞型／臓器に偏在するハウスキーピング遺伝子とハイブリッド形成する。ハウスキーピングのプライマー対を用いると、偽陰性の出現を回避できるので、定量リアルタイムＰＣＲの適用を大きく改善できる。
【００１４】
更なる態様では、本発明は、本発明によるプライマー対、及び本発明による方法に必要な幾つかの又は全ての試薬を包含するキットに関する。
【００１５】
本発明は、血液のような生体液中のＣＫ−１９ｍＲＮＡの存在を確定する方法も提供する。この方法は次の工程の少なくとも１つ、好ましくはその全てを含む。
（ａ）生体液から上皮単核細胞を分離すること、
（ｂ）分離した単核細胞に、上皮単核細胞によって発現される抗原に結合する（好ましくは、特異的に結合する）抗体を接触させること、好ましくは、抗体は固体担体に結合されており、そしてこの接触が、細胞、抗体及び固体担体の結合複合体を形成するのに十分であること、
（ｃ）結合していない物質の何れかから、結合複合体を分離すること、
（ｄ）複合体に結合している内皮単核細胞から核酸を単離すること、
（ｅ）核酸増幅試薬、本明細書に開示されているプライマー対及び上皮単核細胞から単離された核酸を包含する反応混合物を形成すること、
（ｆ）当該混合物を増幅条件下において、ＣＫ−１９標的配列に相補的な核酸配列の少なくとも１つのコピーを生成すること、及び
（ｇ）ＰＣＲ、好ましくはリアルタイムＰＣＲを用いて生体サンプル中のＣＫ−１９ｍＲＮＡの量を測定すること。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、ＰＣＲ時のリアルタイム観察を用いる、少なくとも１つのイントロンを包含する遺伝子のｍＲＮＡを検出するためのプライマー及び方法を提供する。
【００１７】
ｍＲＮＡの定量検出は、ＰＣＲ産物の定量測定のために利用できる何れかの方法を用いて実施する。この方法はリアルタイムＰＣＲであることが好ましいが、その他の適切な方法、例えば競合ＰＣＲは本発明の範囲内である。定量化は、何れかの適切な方法で実施することができ、そして方法の選択は当該技術の範囲内である。
【００１８】
本発明は、少なくとも１つのイントロンを包含する遺伝子のｍＲＮＡの存在を検出するための診断方法及びキットを更に提供する。
【００１９】
従って、第一の態様では、少なくと１つのイントロンを包含する遺伝子の標的配列にハイブリッド形成可能なプライマー対が提供され、ここにおいて当該プライマーの少なくとも１つは、少なくとも１つのイントロンを挟む部位を含有している。
【００２０】
本明細書に記載のプライマーは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、又は国際特許出願公開ＷＯ９２／２０７０２号公報に記載されているペプチド核酸（ＰＮＡｓ）又は米国特許第５，１８５，４４４号；同第５，０３４，５０６号及び同第５，１４２，０４７号に記載されているモルホリノ類縁体を含む非荷電の核酸のような核酸類縁体を包含していてもよい。このような配列は、多種の技術を用いて規定通りに合成できる。これに代わる態様では、プライマーは、標識を包含している。
【００２１】
本明細書で用いる「標的配列」は、検出、増幅、又は増幅及び検出の両方が実施される配列であるか、又は天然状態で、すなわちゲノムＤＮＡ又は染色体外ＤＮＡとして少なくとも１つのイントロンを有している、本明細書又は別で提供される配列に相補的である配列を意味している。標的配列という用語は、時々一本鎖と言われているが、当業者は、標的配列が二本鎖であってもよいことを認識するであろう。
【００２２】
特に、標的配列は、ＣＫ１９遺伝子のｍＲＮＡ転写物である。好ましい態様では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１（５’ＣＧＧＧＡＣＡＡＧＡＴＴＣＴＴＧＧＴ−３’順方向）及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（５’ＣＧＴＴＧＡＴＧＴＣＧＧＣＣＴＣＣＡ−３’逆方向）の配列をそれぞれ有し、このプライマーは、ＣＫ１９標的配列を増幅するために用いることができる。
【００２３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列は、本発明によるプライマー対の好ましい具体例であるということを認識できるであろう。本発明によると、プライマー対の主要な特徴は、それが少なくとも１つのイントロンを挟む部位を包含することである。これは、例えばｍＲＮＡ、ｃＤＮＡからスプライシングで切り出されたイントロンの配列のみに結合できるプライマー対を提供する。この「スプライシング」は、自然に、すなわち生体サンプル中のｍＲＮＡの検出を提供するために、生じることを理解されるであろう。しかしながら、この用語は、配列、例えばｃＤＮＡの「スプライシングで切り出された」イントロンを有する遺伝子操作された配列も包含する。イントロンを挟む部位は、プライマーが採用されている条件下でイントロンのない配列のみに結合するならば、イントロンのどちらかの部位にある１個の塩基のみを含むことができる。順方向及び逆方向のプライマーのうちの片方又は両方が、１つ又はそれ以上のイントロンを挟む部位を包含することができる。好ましい態様では、プライマーの１つだけが、イントロンを挟む部位を包含し、特に好ましい態様では順方向プライマーがイントロンを挟む部位を包含する。
【００２４】
本発明の開示において、順方向のプライマーは、標的核酸のコード鎖と同じ方向に伸びるプライマーである。反対に、逆方向プライマーは、標的核酸の非コード鎖と同じ方向に伸びているプライマーである。従って、プライマーは、互いに向き合っているそれらの３’末端で直線になっている。
【００２５】
本発明によるプライマーの別な特徴は、プライマー配列が、目的の特定の遺伝子の偽遺伝子とハイブリッド形成又は結合しないことである。この第２の特徴は、偽遺伝子が存在する場合のみに必要であり、そしてこのような配列の構築には、可能性のある偽遺伝子の配列が公知であるか又は配列データベース中に見出されることが必要である。
【００２６】
本発明のこの好ましい態様では、少なくとも１つの当該プライマーが、可能性のある偽遺伝子の３’末端に少なくとも１つのミスマッチ、そして好ましくは２つ又は３つのミスマッチを包含するように、プライマー対が設計されている。本発明の特に好ましい態様では、少なくとも１つのプライマーが、ＣＫ−１９の偽遺伝子であるＣＫ−１９ａの３’末端に少なくとも１つのミスマッチを包含する。
【００２７】
本発明の第２の態様では、本発明のプライマーを用いて、テストサンプル中のｍＲＮＡの存在を検出する方法が提供される。この方法は、（ｉ）核酸増幅試薬、本発明のプライマー対及びテストサンプルを包含する反応混合物を形成すること、（ｉｉ）この混合物を増幅条件下において、標的配列に相補的な核酸配列の少なくとも１つのコピーを生成すること、及び（ｉｉｉ）リアルタイムＰＣＲ観察を用いて、サンプル中のｍＲＮＡを定量すること、の工程を含んでなる。
【００２８】
本明細書の記載において、「テストサンプル」及び「生体サンプル」は、同じ意味で用いられる。これに関連して、「テストサンプル」は、標的配列を含むと思われるものの何れかを意味する。テストサンプルは、例えば血液、骨髄、リンパ節、気管支肺胞洗浄液、唾液、咽頭拭き取り検体、接眼レンズ液、髄液、汗、喀痰、尿、乳汁、腹水症液、粘液、滑液、腹水、脳脊髄液、腹水、乳房組織等の組織のような、生体源の何れか；又は発酵濾液、細胞培養液、化学反応混合物等の由来であってもよい。肺細胞又は組織もまた、使用できる。最も一般的なテストサンプルは、末梢血、骨髄又はリンパ節のような、血液に由来する。テストサンプルは、供給源から得られたものを直接に、又は前処理してサンプルの特徴を修飾した後に使用することができる。従って、テストサンプルは、例えば、血液から血漿を調製すること、細胞を破壊すること、固体物質から液体を調製すること、粘性液体を希釈すること、液体をろ過すること、液体を蒸留すること、液体を濃縮すること、上皮細胞のような干渉する成分を不活性化すること、核酸を精製する試薬を添加すること等によって、使用前に前処理することができる。前処理の好ましい態様は、遠心分離である。
【００２９】
「生体液」は、液体形態を有する（又は有するようにした）生体サンプルである。例えば、末梢血、血漿、又は細胞若しくは組織からの抽出物を含む。
【００３０】
標的配列（すなわち、標的配列の種類がＲＮＡである場合）を増幅するために必要ならば、本発明の方法には、逆転写工程が包含されていてもよい。逆転写を意味するこの工程は、逆転写酵素と呼ばれるＲＮＡ依存性のＤＮＡポリメラーゼ酵素の影響下で起こる。この工程は更に、逆転写のために緩衝液及びｄＮＴＰｓのような試薬を必要とする。逆転写キットは、市販されており、そしてこの工程を実施することは、通常の技術範囲内である。
【００３１】
本発明で使用される核酸増幅試薬は、公知の試薬、これらに限定されないが、ポリメラーゼ活性を有する酵素、例えばＴａｑ−ポリメラーゼ（及び必要により、例えばｍＲＮＡを観察する場合に、逆転写活性を有するもの）のような熱に安定なポリメラーゼ、マグネシウム又はマンガンの塩のような酵素補助因子、及びデオキシヌクレオチド トリホスフェート（ｄＮＴＰｓ）を含む。
【００３２】
「増幅条件」という用語は一般に、プライマー配列を標的配列とのハイブリッド形成又はアニーリング、そして引き続くプライマー配列の伸長を促進する条件として定義されている。このようなアニーリングは、温度、イオン強度、配列の長さ、相補性及び配列のＧ：Ｃ含有量を含む、幾つかのパラメーターに依存していることは、当該技術分野では公知である。
【００３３】
例えば、相補的な核酸配列は、環境における温度低下でアニーリングが促進される。所定の一連の配列の溶融温度、又はＴｍは、幾つかの公知の方法によって測定することができる。通常、診断的適用では、溶融温度に近い（すなわち、１０℃以内の）ハイブリッド形成温度が用いられる。
【００３４】
イオン強度又は「塩」濃度も、小さいカチオンがホスホジエステル骨格上の負電荷を打ち消すことによって二本鎖の形成を安定化する傾向にあるので、溶融温度に影響を及ぼす。一般の塩濃度は、カチオンの性質及び価数によって決まるが、これは当業者に容易に理解されるであろう。
【００３５】
同様に、高いＧ：Ｃ含有量及び増大した配列長も、Ａ：Ｔ対が２つの水素結合であるのに対してＧ：Ｃ対が３つの水素結合を含み、そして長い配列が、配列と共により多くの水素結合を有しているので、二本鎖の形成を安定化することが知られている。従って、高いＧ：Ｃ含有量及び増大した配列長は、溶融温度を上昇させることによってハイブリッド形成条件に影響を及ぼす。特定の診断への適用に対して配列が選ばれると、Ｇ：Ｃ含有量及び配列長が分かり、そしてハイブリッド形成の条件に何が含まれるかを正確に決定し説明することができる。
【００３６】
イオン強度は一般に、酵素活性に対して最適化されるので、変更できるパラメーターは温度だけである。通常、ハイブリッド形成温度は、プライマー又はプローブの溶融温度（Ｔｍ）又はその付近で選ばれる。従って、特定のプライマー、プローブ、又はプライマーとプローブのセットについての適切なハイブリッド形成の条件を得ることは、当業者の通常の技術の範囲内である。上記の様にして産生された増幅産物は、以下に詳細に開示されている適切な方法及びプローブの何れかを用いて、標的配列の増幅時又はその後に検出することができる。
【００３７】
本発明は更に、増幅産物を検出／定量するための、ハイブリダイゼーションプローブ、Ｔａｑｍａｎプローブ又は分子ビーコンタイププローブ（molecular Beacon type probe）のような、配列特異的プローブを開示する。更に、このプローブは、特異性を保証するために使用することができる。当該プローブは、ＣＫ１９遺伝子の増幅を検出するためのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及び４による配列を有していてもよい。標的配列の増幅を検出するためのプローブの構築は、当業者の技術範囲内である。
【００３８】
プローブを標識化することが、好ましい。標識は、例えばフルオロフォア、化学発光団、蛍光粒子等のような直接検出できるものか、又は特異結合性パートナー及び核酸のような間接的に検出できるものかの何れであってもよい。好ましい標識は、直接検出できるもので、そして特に好ましい標識は、サイバーグリーンＩ（Sybr Green I）、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＶＩＣ、フルオレセインＬＣ Ｒｅｄ６１０、ＬＣ Ｒｅｄ６４０、ＬＣ Ｒｅｄ６７０、ＬＣ Ｒｅｄ７０５及び当該技術分野で公知のその他の蛍光染料のような、蛍光染料である。
【００３９】
一態様では、プローブは、最初に増幅反応混合物の一部であってもよく、この場合、プローブ配列がプライマー配列より低い溶融点を有するような条件を選ぶことが好ましい。この方法では、プローブが標的配列とハイブリッド形成しないような、すなわちプローブのＴｍを越えないように、温度を最初に選ぶことができる。この標的配列が、テストサンプル中にもともと存在していて、引き続いてこの標的配列が存在する可能性を検出できるならば、標的配列のコピーが合成された後に、プローブを新しく合成された標的配列とハイブリッド形成させるために温度を下げることができる。あるいはプローブを別々に加える。プローブが、プライマー配列に対応する配列とハイブリッド形成しないことが好ましい。
【００４０】
本発明のこの第二の態様の別の変形では、工程（ｉ）の方法が、テストサンプル中に増幅可能な物質が存在することを保証するため、そして偽陰性の結果を避けるために、ハウスキーピング遺伝子とハイブリッド形成するハウスキーピングプライマー対を更に包含することができる。当該ハウスキーピングプライマー対は、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）用の市販ハウスキーピングプライマー対（Ｒｏｃｈｅ  ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅより購入）であってよい。
【００４１】
あるいは、本発明者らによって同定されたハウスキーピングプライマー対を、本発明の方法で用いることができる。
【００４２】
従って、本発明の第三の態様では、順方向及び逆方向のプライマーに対して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５及び６による配列をそれぞれ有しているハウスキーピングプライマー対が提供される。
【００４３】
本発明との関連において、「ハウスキーピングプライマー対」及び「プライマー対」は、同一ではない。本発明との関連において、「ハウスキーピングプライマー対」という用語は、特定の細胞に偏在している遺伝子の標的配列とハイブリッド形成可能なプライマー対を意味するように意図されている。すなわち、「ハウスキーピングプライマー対」は、本発明の方法又はキットの内部標準、すなわち陰性対照として使用することができる。
【００４４】
本発明の当該ハウスキーピングプライマー対は、ハウスキーピング遺伝子ＰＢＧＤ：ヒト非赤血球形成性ポルホビリノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ；ヒドロキシメチルビランシンターゼ；受入番号；Ｘ０４８０８）であるヘム生合成経路の第３酵素とハイブリッド形成する。この酵素は、４つのポルホビリノーゲンユニットの段階的な縮合を触媒的に進めてヒドロキシメチルビラン（これは、次いでコシンテターゼによってウロポルホビリノーゲンＩＩＩに変換される）を生成する。ハウスキーピング遺伝子は、細胞にとって必須な遺伝子であるので、どんな条件下でも存在している。ＰＢＧＤ ｍＲＮＡを増幅するために本発明者らが設計したハウスキーピングプライマー対は、順方向（ＨＧＦ１）が５’−ＧＧＴＧＧＧＴＧＴＧＣＴＧＣＡＣＧＡＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）で、逆方向（ＨＧＲ）が５’−ＡＴＣＴＴＣＡＴＧＣＴＧＧＧＣＡＧＧＧＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）である。
【００４５】
当該ハウスキーピングプライマー対は、本発明の方法及びキットに適切である。しかしながら、本発明の第三の態様によるハウスキーピングプライマー対の使用は、当該方法及びキットに限定されるものではなく、テストするサンプル（細胞）が、ヒト非赤血球形成性ポルホビリノーゲンデアミナーゼをコードする遺伝子を偏在的に包含する場合はいつでも使用することができる。
【００４６】
リアルタイムＰＣＲハイブリダイゼーションプローブにおいて、Ｔａｑｍａｎプローブ又は分子ビーコンタイププローブを、ＰＣＲ産物の可視化のために請求項１のプライマー対に関連して先に記載したようにして使用することができる。１つの好ましいＴａｑｍａｎプローブは、６ＦＡＭ−ＡＴＧＡＡＧＧＡＴＧＧＧＣＡＡＣＴＧＴＡＣＣＴＧＡＣＴＧＧ−ＴＭＲである。
【００４７】
生体サンプル中で、増幅されたＰＢＧＤの標的配列又はその他の適切なハウスキーピング遺伝子を検出するために、上記のＴａｑｍａｎプローブの代わりに一連のハイブリダイゼーションプローブの何れかを使用できることは、当業者には理解されるであろう。更に、当該技術分野で公知のＰＣＲ機器（３〜６個の蛍光チャンネルを有する機器が市販されている）で利用可能な異なった蛍光チャンネルの存在を利用することにより、ハウスキーピングプライマー対は多くの異なった場合において内部標準として使用できるので、ハウスキーピング遺伝子の増幅を、ＣＫ−１９遺伝子又はその他の適当な標的遺伝子の何れかの増幅と同時に処理することができる。
【００４８】
ハウスキーピングプライマーは、サンプル中の夾雑しているゲノムＤＮＡの非特異的な増幅を避けるために、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡの増幅を避けるような方法で設計することが好ましい。これは、本発明によるＣＫ−１９プライマーを設計するために用いるのと原則的に同じ基準を用いて、ハウスホールドプライマーを設計して達成することができる。
【００４９】
本発明の第四の態様では、癌を患っている患者におけるアジュバント治療の見通しを判断する診断方法が開示される。この方法は、（ｉ）患者から生体サンプルを提供すること、（ｉｉ）生体サンプルから核酸を単離すること、（ｉｉｉ）核酸増幅試薬、請求項１のプライマー対、工程（ｉｉ）で単離した核酸のアリコートを包含する、反応混合物を形成すること、（ｉｖ）当該混合物を増幅条件下において、標的配列に相補的な核酸配列の少なくとも１つのコピーを生成すること、（ｖ）リアルタイムＰＣＲ観察を用いて、サンプル中のＣＫ−１９ｍＲＮＡ陽性細胞を定量すること、及び（ｖｉ）サンプル中のＣＫ−１９ｍＲＮＡ陽性細胞の量に基づいて、アジュバント治療の見通しを判断すること、の工程を包含する。この態様の好ましい態様では、プライマー対が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及び２による配列を有している。
【００５０】
別の好ましい態様では、生体サンプルが、血液、骨髄又はリンパ節由来であり、特に好ましい態様では、このサンプルが、血液、例えば末梢血サンプルである。
【００５１】
更に別の好ましい態様では、癌が乳癌で、好ましくは手術可能な乳癌である。
【００５２】
一般に、本発明の診断方法は、上皮性起源の癌種におけるＣＫ−１９マーカーに基づく循環腫瘍細胞（ＣＴＣｓ）の検出／定量にも使用することができる。上皮性起源は、これらに限定されないが、（扁平上皮乳頭種及び扁平上皮癌のような）扁平上皮、（移行上皮乳頭種及び移行上皮癌のような）移行上皮、（基底細胞癌のような）基底細胞、（腺腫、嚢胞腺腫及び腺癌のような）腺上皮、（腎尿細管腺腫、腎細胞癌及びグラウィッツ腫瘍（Grawitz tumor）のような）腎尿細管上皮、（肝細胞腺腫及び肝細胞癌のような）肝細胞、（胆管細胞腺腫及び胆管細胞癌のような）胆管上皮、及び（色素性母斑及び悪性黒色腫のような）メラニン細胞を含む。
【００５３】
この本発明の第四の態様では、サンプルを、先に述べた「テストサンプル」と同様に前処理することができる。従って、好ましい態様では、典型的な血液サンプルを、末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）を単離するために核酸を単離する前に遠心分離する。これはＦｉｃｏｌｌ濃縮法、ＰＡＸ遺伝子採血システム、免疫磁性分離及び濃縮法のような当該技術分野で公知の遠心分離技術の何れかを用いて行うことができ、好ましい遠心分離技術は、段階遠心分離である。本発明のこの態様に関わる「核酸増幅試薬」及び「増幅条件」は、上記と同様である。
【００５４】
本発明の第五の態様では、本発明の第四の態様の診断方法で用いるためのキットが提供される。当該キットは、本発明のプライマー対、癌細胞上のその他のマーカーとハイブリッド形成する任意の追加プライマー、及び増幅試薬を包含する。
【００５５】
当該増幅試薬及びプライマー対は、別々に、又は必要に応じて混合するかのどちらかで提供される。
【００５６】
上記の好ましい態様では、追加プライマーの配列は、ＣＫ１９とハイブリッド形成する。別の好ましい態様では、追加プライマーは、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、及び（ＣＫ２０、ＣＫ８等の）サイトケラチン、マスピン（maspin）、ＧＡＢＡ Ａｎ、Ｂ３０５Ｄ−Ｃ、ＰＩＰ、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ１４、ＰＳＡ、ムチン、癌胎児性抗原、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβ−サブユニット、マンマグロビン、上皮増殖因子、Ｅｐ−ＣＡＭ及び当該技術分野で公知の幾つかのその他のｍＲＮＡマーカー、とハイブリッド形成する。追加のマーカーの選択及び組み合わせは、当業者の技術範囲内である。プライマーの組み合わせは、癌の徴候のタイプによって自由に選択できる。特に好ましい態様では、プライマー対は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及び２による配列を有している。
【００５７】
２つ又はそれ以上のプライマーの組み合わせは、癌細胞で１つ以上のマーカーが検出されることを考えると、偽陰性の出現率が減少することを保証できる。
【００５８】
本発明の別の好ましい態様では、キットが、偽陰性を避けるために内部標準を包含しており、この内部標準としてハウスキーピングプライマー対が好ましい。このハウスキーピングプライマー対は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５及び６による配列を有していることが好ましい。
【００５９】
本発明によるキットの更なる別の好ましい態様では、全ての成分が凍結乾燥されている。更なる別の態様では、２つ又はそれ以上の、例えば全ての凍結乾燥された試薬が、混合されている。この場合、使用者、例えば臨床医は、増幅前に、単に混合物を適当な緩衝液に溶解して、テストするサンプルに加えるだけでよい。取り扱い方法の簡素化に加えて、凍結乾燥は、試薬をより安定に貯蔵できる。
【００６０】
本発明の追加のＣＫ−１９プライマー
上記から明らかなように、本発明は、ヒトＣＫ−１９遺伝子（そのＰＣＲ増幅断片を含む）を検出できる、広範囲の適切な「修飾された」プライマー（又は修飾されたプライマーの対）を包含する。好ましくは、このような修飾されたプライマー又はその対は、本明細書に開示されている特異的なプライマーのハイブリッド形成条件の１つ又は組み合わせの下で、ＣＫ−１９標的（例えば、図１に示されている配列）に特異的に結合する能力がある。
【００６１】
「特異的なハイブリッド形成」とは、特定のハイブリッド形成条件下で、対象のプライマー又はプライマー対が、ＣＫ−１９標的と結合複合体（この複合体は、ＰＣＲ増幅されて、増幅産物を産生できる）を形成できることを意味する。この増幅産物は、定量的アガロースゲル電気泳動のような標準的な方法で測定する場合、その他の増幅産物に比べて、約９０％の存在量、好ましくは９５％又はそれ以上の存在量であることが好ましい。使用して本発明の１つ又はそれ以上の目的を達成できるならば、このプライマー又はプライマー対は「適切」である。
【００６２】
具体的なプライマー修飾についての更なる考察に入る前に、本発明の目的は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される配列の少なくとも約８個の核酸塩基（すなわち、連鎖したヌクレオシド）を有しているプライマー（複数を含む）を提供することである。プライマーの一方又は両方が、好ましくはそのような核酸塩基の少なくとも約１０個又は約１２個、より好ましくはそのような核酸塩基の少なくとも約１５個〜１８個を含有している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の何れかの全配列を有しているプライマーが、本発明の多くの適用に対して好ましいであろう。
【００６３】
その他の適切なプライマーは、追加配列の約２０個〜約３０個の核酸塩基（好ましくは、配列の５’末端に配列されている）を有しているものを含む。更なるその他の本発明による適切なプライマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される配列から選ばれる、少なくとも８個の連続した核酸塩基、好ましくは少なくとも約１０個〜約１５個の核酸塩基、より好ましくは約１６個又は１７個の核酸塩基の伸展を含有する、長さが約８個〜約１８個の範囲のオリゴヌクレオチド配列のものを含む。
【００６４】
本発明による更なる具体的なプライマー対は、１つ又はそれ以上の適切なプライマーを含むが、このプライマーでは、ＤＮＡ配列（又は時にはＲＮＡ配列）が、図１（ＣＫ−１９ｃＤＮＡの約４４９〜４５５番目のヌクレオチド）に示されるようなエクソン１／２接合部のどちらかの側に、少なくとも４個の連続した核酸塩基、好ましくは５個、６個、７個、８個又は９個の連続した核酸塩基を有している。
【００６５】
更に適切なプライマーは、そのそれぞれの３’末端に、図１に示すような対応のＣＫ−１９偽遺伝子のアルファ配列とハイブリッド形成しない（すなわち、これと水素結合を形成することができない）少なくとも約１、２、３又は４個のヌクレオチドを含む。
【００６６】
好ましくは、このようなハイブリッド形成しないヌクレオチドは、ＣＫ−１９ｃＤＮＡの約５６８〜５７１番目のヌクレオチドにまたがっている。すなわち、ヌクレオチドの置換、又はある場合は削除により、プライマー対の１つ又は両方のプライマーの３”末端は、選ばれた１つ又は組み合わせたハイブリッド形成条件下で、ＣＫ−１９偽遺伝子と十分にはハイブリッド形成しないようになる。
【００６７】
本発明の範囲内の更なる適切なプライマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される配列の１つの５’末端部分からの少なくとも約１０個の追加のヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８又は９個のヌクレオチド）を有しているものを含む。多くの使用に対してあまり好ましくないが、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される配列の１つの３’末端部分からの少なくとも約５個の追加のヌクレオチド（例えば、１、２、３、４又は５個のヌクレオチド）を有している適当なプライマーも包含する。
【００６８】
当業者は、本願明細書をみて、広範囲の他のプライマー及びプライマー対が本発明の範囲内であることを認識するであろう。このような態様は、これらに限定されないが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるヌクレオチドの１個、２個又は３個が、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ又はＵで置換されている適切なプライマーを含む。また、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される配列中の１個、２個又は３個の配列（連続した又は連続していない）の適切な削除も考慮されている。
【００６９】
当然のことながら、ヌクレオシドは、塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は通常、複素環塩基である。このような複素環塩基の２つの最も一般的な種類は、プリン及びピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖の部分に共有結合するリン酸基を更に含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含有するヌクレオシドでは、リン酸基は、糖の２’、３’又は５’のヒドロキシ部分に結合することができる。オリゴヌクレオチドの形成において、リン酸基は、隣接するヌクレオシドに互いに結合して、線状の重合化合物を形成する。
【００７０】
同様に、この線状重合構造の各々の末端は、更に結合して環状構造を形成することができるが、開環した線状構造が一般に好ましい。更に、線状構造は、内部核酸塩基の相補性も有することができ、それにより二本鎖構造を形成するような方法で折り畳むことができる。オリゴヌクレオチド構造において、リン酸基は、オリゴヌクレオチドの内部ヌクレオシド骨格を形成するものと通常は見なされている。ＲＮＡ及びＤＮＡの通常の結合又は＊骨格は、３’から５’へのリン酸ジエステル結合である。
【００７１】
修飾されたＣＫ−１９プライマー：骨格
本発明の範囲内にあるプライマー及びプライマー対の更なる例は、修飾された骨格又は非天然型のヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを含む。本明細書で定義されているように、修飾された骨格を有しているオリゴヌクレオチドは、リン原子を骨格中に保持しているもの及び骨格中にリン原子を有していないものを包含する。この明細書の目的のために、そして時には技術分野内で参照されるように、そのヌクレオシド間骨格にリン原子を有していない修飾されたオリゴヌクレオチドも、オリゴヌクレオチドであると見なすことができる。
【００７２】
従って本発明は、プライマーの一方又は両方が修飾されたオリゴヌクレオチド骨格を含むプライマー及びプライマー対を包含する。このような骨格には、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、（３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含む）メチル及びその他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、（３’−アミノホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホルアミデートを含む）ホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、（通常の３’−５’結合を有する）セレノホスフェート及びボラノ−ホスフェート、これらの２’−５’結合類縁体、及び逆方向極性を有していて、１つ又はそれ以上のヌクレオチド間結合が３’−３’、５’−５’又は２’−２’結合であるものが含まれる。
【００７３】
逆方向極性を有する追加のオリゴヌクレオチドは、３’−ｍｏｓｔヌクレオチド間結合、すなわち脱塩基してもよい単一逆方向ヌクレオシド残基（核酸塩基は、欠失しているか又はその代わりに水酸基を有している）に結合する３’−３’単一結合を包含する。多種の塩、混合塩及び遊離酸形態も含まれる。
【００７４】
例えば以下の特許、第３，６８７，８０８号；第４，４６９，８６３号：第４，４７６，３０１号；第５，０２３，２４３号；第５，１７７，１９６号；第５，１８８，８９７号；第５，２６４，４２３号；第５，２７６，０１９号；第５，２７８，３０２号；第５，２８６，７１７号；第５，３２１，１３１号；第５，３９９，６７６号；第５，４０５，９３９号；第５，４５３，４９６号；第５，４５５，２３３号；第５，４６６，６７７号；第５，４７６，９２５号；第５，５１９，１２６号；第５，５３６，８２１号；第５，５４１，３０６号；第５，５５０，１１１号；第５，５６３，２５３号；第５，５７１，７９９号；第５，５８７，３６１号；第５，１９４，５９９号；第５，５６５，５５５号；第５，５２７，８９９号；第５，７２１，２１８号；第５，６７２，６９７号及び第５，６２５，０５０号、更に本明細書に開示されている引例も参照されたい。
【００７５】
本発明の更なる目的は、一方又は両方のプライマーがリン原子を含んでいない、適切なプライマー及びプライマー対を提供することである。このような態様では、骨格は、短鎖アルキル又はシクロアルキルのヌクレオシド間結合、混合のヘテロ原子及びアルキル若しくはシクロアルキルのヌクレオシド間結合、又は１つ又はそれ以上の短鎖複素原子若しくは複素環のヌクレオシド間結合によって形成される。これらは、モルホリノ結合（上記で検討のヌクレオシドの糖部分から一部が形成される）を有するもの；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート及びスルホンアミド骨格；アミド骨格；及び混合のＮ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２の構成部を有するその他のものを含む。
【００７６】
例えば以下の特許、第５，０３４，５０６号；第５，１６６，３１５号；第５，１８５，４４４号；第５，２１４，１３４号；第５，２１６，１４１号；第５，２３５，０３３号；第５，２６４，５６２号；第５，２６４，５６４号；第５，４０５，９３８号；第５，４３４，２５７号；第５，４６６，６７７号；第５，４７０，９６７号；第５，４８９，６７７号；第５，５４１，３０７号；第５，５６１，２２５号；第５，５９６，０８６号；第５，６０２，２４０号；第５，６１０，２８９号；第５，６０２，２４０号；第５，６０８，０４６号；第５，６１０，２８９号；第５，６１８，７０４号；第５，６２３，０７０号；第５，６６３，３１２号；第５，６３３，５６０号；第５，６７７，４３７号；第５，７９２，６０８号；第５，６４６，２６９号；第５，６７７，４３９号；及び本明細書に開示されている引例を参照されたい。
【００７７】
幾つかの本発明の態様では、新規な基を有する、すなわち、天然のヌクレオシドと関連していない１つ又は両方のプライマーを有していることが有用であろう。優れたハイブリッド形成特性を示しているオリゴヌクレオチド模倣体である、このようなオリゴマー化合物のあるものは、ペプチド核酸（ＰＮＡ；上記を参照されたい）と呼ばれている。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖骨格が、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格に置き換わっている。核酸塩基は保持されて、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接又は間接的に結合している。
【００７８】
ＰＮＡ化合物の製造及び使用についての更なる情報については、例えば以下の特許、第５，５３９，０８２号；第５，７１４，３３１号；及び第５，７１９，２６２号を参照されたい。
【００７９】
本発明による更なる適切なプライマー及びプライマー対は、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチド、及び複素原子骨格、特に−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−（メチレン（メチレンイミノ）又はＭＭＩ骨格として知られている）、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−及び−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−、及び−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−を有するオリゴヌクレオチドを含む。モルホリノ骨格構造を有しているオリゴヌクレオチドも好ましい。上記の検討及び米国特許第５，０３４，５０６号を参照されたい。米国特許第５，４８９，６７７及び５，６０２，２４０号も参照されたい。
【００８０】
修飾されたＣＫ−１９プライマー：糖基
幾つかの本発明の態様では、オリゴヌクレオチドが１つ又はそれ以上の置換された糖残基を有するように修飾されているプライマー及びプライマー対を有することが有用である。このように修飾された好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に、以下のもの：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルキニル；又はＯ−アルキル−Ｏ−アルキルのうちの１つを含み、ここにおけるアルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換又は非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキル、又はＣ２〜Ｃ１０アルケニル及びアルキニルである。
【００８１】
更なる修飾体は、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ]ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３]２を含有しており、ここにおいて、ｎ及びｍは、１〜約１０である。その他の典型的なオリゴヌクレオチドは、２’位に、以下のもの：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール（alkaryl）、アラルキル、Ｏ−アルカリール又はＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３，ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂基、レポーター基、又は核酸挿入剤：のうちの１つを含有する。
【００８２】
更なる修飾体は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）又は２’−ＭＯＥとしても知られている）（Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504）すなわち、アルコキシアルコキシ基を含有する。
【００８３】
更なる修飾体の実例は、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ（すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基で、以下の実施例に記載されているように、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られている）、及び２’−ジメチルアミノ−エトキシエトキシ（２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチル又は２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られている）、すなわち、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２）を含有することが好ましい。
【００８４】
その他の適切なプライマー及びプライマー対は、本発明の範囲内である。これらは、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’−アリル（２’−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む修飾を有しているプライマーを含有する。２’−修飾は、アラビノ位（上向き）又はリボ位（下向き）にあってよい。
【００８５】
２’−アラビノ修飾の例は、２’−Ｆである。同様な修飾を、オリゴヌクレオチドのその他の位置、特に３’末端ヌクレオチド又は２’−５’結合オリゴヌクレオチド上の糖の３’位、及び５’末端ヌクレオチドの５’位、で行うことができる。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分のような糖模倣体を有していてもよい。
【００８６】
例えば、以下の特許、第４，９８１，９５７号；第５，１１８，８００号；第５，３１９，０８０号；第５，３５９，０４４号；第５，３９３，８７８号；第５，４４６，１３７号；第５，４６６，７８６号；第５，５１４，７８５号；第５，５１９，１３４号；第５、５６７，８１１号；第５，５７６，４２７号；第５，５９１，７２２号；第５，５９７，９０９号；第５，６１０，３００号；第５，６２７，０５３号；第５，６３９，８７３号；第５，６４６，２６５号；第５，６５８，８７３号；第５，６７０，６３３号；第５，７９２，７４７号及び第５，７００，９２０号を参照されたい。
【００８７】
本発明による更なるプライマー対は、固定された核酸（Locked Nucleic Acid；ＬＮＡ）を有する１つ又はそれ以上のプライマーを含む。好ましいＬＮＡは、糖の環の３’又は４’炭素原子に結合している２’−ヒドロキシ基を特徴として、これにより２環性の糖部分を形成する。結合は、２’酸素原子及び４’炭素原子を繋げるメチレン（−ＣＨ２−）ｎ基が好ましく、ここにおいて、ｎは１又は２である。
【００８８】
ＬＮＡｓ及びその製造法は、国際特許出願公開第ＷＯ９８／３９３５２号及び第ＷＯ９９／１４２２６号に、更に以下の米国特許及び米国特許公開第６，７９４，４９９号；第６，６７０，４６１号；第２００３／００８２８０７（Ｘｙｌｏ−ＬＮＡ）；第２００３００８７２３０号（Ｌ−ｒｉｂｏ−ＬＮＡ）；及び第２００３／０２２４３７７号にも記載されている。
【００８９】
修飾されたＣＫ−１９プライマー：核酸塩基
明らかなように、オリゴヌクレオチドは、核酸塩基（当該技術分野では、単に「塩基」と呼ぶことが多い）の修飾及び置換も含んでいる。本明細書で用いられる「修飾されていない」又は「天然の」核酸塩基は、プリン塩基のアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、及びピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を含む。
【００９０】
修飾された核酸塩基は、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及びその他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及びその他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３）ウラシル及びシトシン、ピリミジン塩基のその他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（偽性ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−ヒドロキシル及びその他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及びその他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン、並びに３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンのような、その他の合成及び天然の核酸塩基を含む。
【００９１】
更なる修飾された核酸塩基は、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、置換フェノキサジンシチジンのようなＧ−クランプ（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４］、スピロロ（Spyrrolo）［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）のような３環性のピリミジンを含む。
【００９２】
修飾された核酸塩基は、プリン又はピリミジン塩基がその他の複素環、例えば７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン及び２−ピリドンで置換されているものも含む。
【００９３】
更なる核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、「Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering, Pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990」に開示されているもの、「Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613」によって開示されたもの、及び「Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Reserach and Applications, pages 289-302, Crooke S. T. and Lebleu, B. ed., CRC press, 1993」によって開示されたものを含む。
【００９４】
更なる修飾は、２−アミノプロピルアデニン、３−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシンを含有する、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン並びにＮ−２、Ｎ−６及びＯ−６置換プリンを含む。５−メチルシトシン置換は、核酸の二本鎖の安定性を０．６〜１．２℃で向上させることが示され（Sanghvi, Y. S.,  Crooke, S. T. and Lebleu, B. eds., Antisense Reserach and Applications, CRC press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278）、塩基置換の典型例であり、より具体的には、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせる場合がある。
【００９５】
例えば、米国特許第３，６８７，８０８号を、更に米国特許第４，８４５，２０５号；第５，１３０，３０２号；第５，１３４，０６６号；第５，１７５，２７３号；第５，３６７，０６６号；第５，４３２，２７２号；第５，４５７，１８７号；第５，４５９，２５５号；第５，４８４，９０８号；第５，５０２，１７７号；第５，５２５，７１１号；第５，５５２，５４０号；第５，５８７，４６９号；第５，５９４，１２１号；第５，５９６，０９１号；第５，６１４，６１７号；第５，６４５，９８５号；第５，８３０，６５３号；第５，７６３，５８８号；第６，００５，０９６号；及び第５，６８１，９４１号、第５，７５０，６９２号も参照されたい。
【００９６】
本発明によるプライマー又はプライマー対は、前記オリゴヌクレオチド修飾の少なくとも１つを含むならば、「修飾されて」いる。容易に理解できるように、修飾されたプライマー及びプライマー対の幾つかは、リアルタイムＰＣＲの実施のような本発明の幾つかの態様に対しては最適ではない。しかしながら、修飾されたプライマーは、例えば電気泳動のマーカーとして、及び／又は「アンチセンス」組成物として有用であり得る。
【００９７】
標的親和性及び特異性の増大が有用である、又はロバスト性の増強が役立つようなＰＣＲ適用に対しては、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される１つ又は両方の配列を、少なくとも１つのＬＮＡ、例えば、このようなＬＮＡの１つ、２つ、３つ、４つ又は５つを含むように修飾することができる。ＬＮＡオリゴヌクレオチドの製造及び使用に関する更なる開示については、例えば、「Vester, B and J. Wengel (2004) Biochemistry 43: 13233」及びそこに引用されている参考文献を参照されたい。
【００９８】
上記で検討したように、本発明は、生体液中のＣＫ−１９ｍＲＮＡの存在を測定する方法も提供する。
一態様では、この方法は、次の工程（ａ）〜（ｇ）を含む。
【００９９】
ａ）生体液から単核細胞の何れかを分離すること。
分離工程は、ろ過及び／又は遠心分離のような生体液から細胞を分離できる殆ど全ての方法を用いて実施することができる。遠心分離を選択した態様では、Ｆｉｃｏｌｌ又はその他の適切な細胞分離勾配を用いることが多くの場合好ましい。Ｆｉｃｏｌｌ  Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７システム（Sigma Aldrich, St. Louis, MO (USA)）の使用が、生体液が末梢血であるような多くの適用に対して好ましい。
【０１００】
ｂ）分離した単核細胞に、上皮単核細胞によって発現される抗原に特異的に結合するポリクローナル又はモノクローナル抗体（又はＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体などのような、それらの抗原結合断片）を接触させること。
一態様では、抗原は、細胞により、例えば細胞の表面又は細胞質で発現する糖タンパク質である。抗体の実例としては、抗原ＣＤＣ３２６、例えば、ｂｅｒ−ＥＰ４、Ｂ３０２（３２３／Ａ３）、Ｂ２９．１（ＶＵ−ＩＤ９）、ＶＵ−ＩＤ９、ＨＥＡ１２５に特異的に結合するものである。これら及び他の適切な抗体は、「Abcam plc (Cambridge, UK)」；「Dako UK LTD. (Cambridgeshire, UK)」及び「Santa Cruz Biotechnology INC (Santa Cruz, CA (USA))」のような市販の供給源から得ることができる。抗体（又は、その抗原の結合断片）は、適当な固体担体の何れか、例えばグラスファイバー濾紙、ニトロセルロース、焼結ガラス、プラスチック、合成ポリマー、酢酸セルロース、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、又はポリビニリデンフルオライドに、事前に結合させることができる。一態様では、この固体担体は、好ましくは磁性又は常磁性物質を含む、ビーズ形態である。好ましいビーズは、Ｄｙｎａｌで製造されているものである。好ましくは、この方法の接触工程は、細胞、抗体及び固体担体の間の結合複合体を形成するのに十分なものである。
【０１０１】
ｃ）結合していない物質の何れかから、結合複合体を、例えば、ろ過及び／又は遠心分離によって分離すること。
【０１０２】
ｄ）複合体に結合している内皮単核細胞から核酸（例えば、ｍＲＮＡのようなＲＮＡ）を単離すること。
通常は、そして上記のように、ｃＤＮＡは、細胞から単離されたＲＮＡから作成される。
【０１０３】
ｅ）核酸増幅試薬、本明細書で開示されるようなプライマー対、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及び２で示される配列を有しているプライマー、及び単核細胞から単離された核酸を包含する反応混合物を形成すること。
【０１０４】
ｆ）この混合物を増幅条件において、ＣＫ−１９標的配列に相補的な核酸配列の少なくとも１つのコピーを生成すること。
【０１０５】
ｇ）ＰＣＲ、好ましくはＲＴ−ＰＣＲを用いて、生体サンプル中のＣＫ−１９ｍＲＮＡを検出すること。必要により、生体液中のＣＫ−１９ｍＲＮＡの量が測定できる。
【０１０６】
「特異的に結合する」という用語又は同様の用語は、本明細書で開示されている分子が他の分子と結合し、それにより特定の結合対を形成することを意味する。しかしながら、この分子は、例えば、ウェスタンブロッティングＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、移動度シフトアッセイ、酵素免疫測定法、競合アッセイ、飽和アッセイ（saturation assay）又は当該技術分野で公知のその他のタンパク質結合試験によって測定されるような、その他の分子を認識しない又は結合しない。分子間の特異的結合を検出する方法の例については、一般に、「Harlow and Lane in, Antibodies; A Laboratory Manual (1988)」及びそこで引用されている参考文献を参照されたい。
【０１０７】
固体担体が磁性ビーズである前記方法の態様では、方法は更に、結合複合体に磁場を掛けて、結合していない物質の全てから、この複合体を分離する工程を含む。分離されたビーズ複合体を、次に標準的な方法で細胞を単離する（そして、そこから核酸を調製する）ように操作することができる。例えば、Ｄｙｎａｌ（Epitherial Enriched Dynabeads）の情報を参照されたい。
【０１０８】
方法は、本明細書に開示されているプライマー対の１つ又は組み合わせの使用に対して柔軟性及び互換性がある。特定のプライマー対の使用は、使用目的に依存する。しかしながら、多くの態様では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるプライマーで十分である。好ましい生体液は、抹消血である。
【０１０９】
必要に応じて、この方法は、実施例に記載のような１つ又はそれ以上の適切な対照のアッセイの使用を含むことにも容易に適合する。例えば、ユーザーが、特定の生体サンプル中にある単核細胞の検出のみならず定量も望む場合の態様において、ＣＫ−１９発現細胞の標準曲線を作成することがしばしば有用である。以下の実施例は、ＭＣＦ−７細胞を混合した抹消血の具体的な標準曲線の作成方法を示す。当然のことながら、標準曲線を作成するためにその他の細胞も使用できる。一度標準曲線を作成すると、その方法を実施する毎に作成を繰り返す必要がないことも当然であろう。例えば、本発明を臨床に用いる態様では、標準曲線は一度作成すればよく（又は、殆どの場合は数回）、ここでは患者から得た末梢血のような、生体サンプルの１つ又は少数のタイプがアッセイされる。
【０１１０】
必要に応じて、前記の方法を、本明細書に記載の１つ又はそれ以上のハウスキーピング遺伝子の使用を含むことに適合させることもできる。増幅されたＣＫ−１９標的配列を、本明細書に開示されているプローブを用いて検出及び任意に定量することができる。
【０１１１】
上記より明らかなように、本発明は、柔軟性があって、正常及び異常の（例えば、癌性の）組織を含む各種の生体サンプル中で発現するようなＣＫ−１９を検出又は任意に定量するために使用することができる。
【０１１２】
正常の組織に関しては、以下の例がある；毛包、汗腺の分泌細胞、メルケル細胞（Merkel cells）、乳管の管腔上皮細胞、子宮内膜及び子宮頸部の表面粘膜及び腺、子宮頸外部（exocervix）、卵巣表面中皮、ファロピウス管上皮、細胞栄養層細胞及び合胞体栄養細胞、羊膜、臍帯表面上皮、前立腺の管腔及び基底細胞、精巣網上皮、精巣輸出管、精巣上体細管、ボーマン嚢、腎臓の近位−、遠位−及び集合尿細管、尿路上皮、胆管−及び胆嚢上皮、舌の扁平上皮−、味蕾−、分泌腺細胞及び分泌腺管、食道の扁平上皮−及び小唾液腺、胃の表面粘膜−及び腺、小腸及び大腸の表面粘膜及び腺窩、膵臓管、唾液腺の分泌性−及び管細胞、甲状腺上皮、気管の表面粘膜−及び腺、気管支粘膜−及び腺、肺胞、胸膜中皮、ハッサル小体及び胸腺上皮細胞。
【０１１３】
異常な組織に関しては、以下のリストが例示される：ヒトの乳腺腫瘍、 線維腺腫、線維嚢胞性疾患、葉状嚢肉腫、浸潤性導管癌、浸潤性小葉腺癌、髄様癌及び転移、湿潤癌、管内乳頭腫、純上皮内癌（pure in situ carcinomas）、ぺージェット病を有する組織、甲状腺腫、結腸−、胃−及び肺腺腫、卵巣−及び膀胱癌、奇形腫、胎児性癌、睾丸癌、表皮性癌、扁平上皮−及び基底細胞癌、及び角化棘細胞腫。
【０１１４】
先の発明のある態様は、２００５年８月１７日出願のギリシャ国特許出願ＧＲ２００５０１００４３０号；及び２００６年４月４日出願の米国仮出願第６０／７９５，１４９号に開示されている。これらは、それぞれ本明細書に参照として組み入れられている。
【０１１５】
本明細書で引用されている全ての引例は、参照として組み入れられている。本発明はそれらの好ましい態様を、参照として詳細に記載されている。しかしながら、当然のことながら、当業者は、本開示を熟考すれば、本発明の精神及び範囲内で修飾及び改良を実施することができるであろう。
【実施例】
【０１１６】
原料及び方法
Ａ．細胞サンプル
Ｃ−１９遺伝子を発現するヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；ＡＴＣＣより入手）を、陽性対照として用い、以前に記載（A. Stathopoulou et al; 2001）のように培養した。
【０１１７】
Ｂ．臨床用サンプル
ＥＤＴＡ中の末梢血を、第Ｉ／ＩＩ病期（初期）の乳癌術後の患者１６０名及び健常な志願女性（年齢１８〜６５歳）６２名から得た。皮膚の上皮細胞による血液汚染を低減するために、血液の最初の５ｍＬを廃棄し、針を抜く前に採血管を外した。健常提供者及び患者から末梢血サンプルを集めて、同じ方法で処理した。全ての患者及び提供者からインフォームド・コンセントを得、そして検討は、参加施設の倫理科学委員会（Ethical and Scieetific Committees）によって承認された。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を静脈穿刺から１時間以内に、先に記載した（A. Stathopoulou et al; 2001）ように、Ｆｉｃｏｌｌ  Ｈｙｐａｑｕｅ−１０７７（Sigma Chemical Company, LTD, England）を用いて勾配遠心分離によって単離して、細胞ペレットを全ＲＮＡの抽出まで−８０℃に維持した。
【０１１８】
Ｃ．全ＲＮＡの単離及びｃＤＮＡの合成
Ｔｒｉｚｏｌ  ＬＳ試薬（Invitrogen, Corp., Calsbad, USA）を用い、製造会社の使用説明書に従って、全ＲＮＡの単離を行った。全てのＲＮＡの製造及び取り扱い工程を、層流フード内、ＲＮＡｓｅが無い条件下で行った。単離されたＲＮＡを、ＲＮＡ貯蔵緩衝液（Ambion, USA）に溶解して使用するまで−７０℃で保存した。ＲＮＡ濃度を、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ  ＲＮＡ 定量キット（Molecular Probes, Eugene, OR, USA）を、簡易蛍光光度計の役割をするＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Roche Diagnostics, Manheim, Germany）と一緒に用いて測定した。ＲＮＡの定量化は、次の方法で行った：５μＬのキットに付いているの濃度公知のＲＮＡ溶液若しくはその希釈液、又は未知のサンプルを、５μＬのフルオロフォアＲｉｂｏＧｒｅｅｎと共に、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒガラスキャピラリーに加えた。標準曲線を、Ｒｅａｌ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ  Ｍｏｄｅ（５〜５００ｎｇ／ｍＬの範囲）で、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ機器を用いて測定したＲＮＡ標準溶液の蛍光値を用いて作成した。サンプルの蛍光を３回測定し、標準曲線を用いてＲＮＡの濃度を計算した。
【０１１９】
ＴＨＥＲＭＯＳＣＲＩＰＴ  ＲＴ−ＰＣＲシステム（Invitorogen, USA）によりＲＮＡの逆転写を行った。ＭＣＦ−７細胞株から調製した全ＲＮＡを、陽性対照として用いた。ｃＤＮＡを、製造業者の使用説明書に従って、健常な志願者及び乳癌患者のＰＢＭＣから単離された全ＲＮＡから合成した。
【０１２０】
ＲＮＡの完全性を、製造業者の使用説明書に従って、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−ｈ−ＨＰＲＴ遺伝子セット（Roche Diagnostics）を用いて、ヒトヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）のリアルタイムＰＣＲ増幅によって、ｃＤＮＡ調製物でテストした。しかしながら、現在の科学データは、単一のハウスキーピング遺伝子への標準化は不適当であると示唆しているので［C.Tricarico et al; 2002 and K. Dheda et al; 2004］、本発明者らは、結果をＨＰＲＴ遺伝子の量に標準化せずに、以前に記載（A. Stathopoulou et al; 2003）のように、むしろｃＤＮＡの合成のために用いた全ＲＮＡ量に標準化した。
【０１２１】
Ｄ．最適化されたプロトコールＢのためのプライマーの設計
（プロトコールＢ）に使用される新規なプライマー対のＣＫ１９−ｄｏ２及びＣＫ１９−ｆｏｒ２のオリゴヌクレオチド配列は、最初に、プライマー二量体の形成、偽のプライミング位置及びヘアピン構造の形成を避けるために、プライマーＰｒｅｍｉｅｒ５ソフトウェア（Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, USA）を用いて設計して、インシリコ（コンピュータ上）で評価した。更に、順方向プライマー（ＣＫ１９−ｆｏｒ２）を、イントロン−エクソン接合上の位置に選択して、ゲノムＣＫ−１９ＤＮＡとのハイブリッド形成を完全に避けた。また、ＢＬＡＳＴ配列相同性検索ツール（NCBI, NIH）で検索して、高度の相同性を有するＣＫ−１９ａ偽遺伝子と区別するようにプライマー及びプローブを設計した（図１を参照されたい）。特に、逆方向プライマー（ＣＫ１９−ｄｏ２）は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ伸長が不可能であり、ＣＫ−１９ａ偽遺伝子の増幅から得られる偽陽性を避けるように、ＣＫ−１９ａ偽遺伝子に対してＣＫ−１９ｍＲＮＡの特定の位置、３’末端で２つのミスマッチがあるように設計された（図１）。ハイブリダイゼーションプローブ（TIBmol, Berlin, Germany）は、以前に記載（プロトコールＡ）（A. Stathopoulou et al; 2003）と同一であった。プライマーは、Ｌａｂ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（FORTH, Crete, Greece）で合成された。全てのプライマー及びハイブリダイゼーションプローブが、表１に示されている。
【０１２２】
【表１】
2009504168.tif 000003
【０１２３】
新規なプライマー対のゲノムＤＮＡに対する特異性を評価する過程において、本発明者らは、以前に用いたプライマー（ＣＫ１９−ｄｏ及びＣＫ１９−ｆｏｒ）と新たに設計したプライマー（ＣＫ１９−ｄｏ２及びＣＫ１９−ｆｏｒ２）を使用して、健常提供者の末梢血から単離したゲノムＤＮＡサンプルのリアルタイムＰＣＲ増幅を進めた。
【０１２４】
Ｄ．ＣＫ−１９  ｍＲＮＡに対する最適化されたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（プロトコールＢ）
定量化は、ＣＫ−１９に対する蛍光標識された特定のハイブリダイゼーションプローブでの、ＰＣＲ時のリアルタイムモニタリングに基づいている。蛍光がバックグラウンドのノイズより上になる時点（交差ポイント；crossing point、Ｃｐ）が、曲線の二次導関数の最大値として、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒソフトウェアによって最もよく定量化される。ＣＫ−１９ｍＲＮＡのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒシステム（Roche Daignostics）を用いて実施した。プロトコールＡについては、プライマー（ＣＫ１９−ｄｏ及びＣＫ１９−ｆｏｒ）及びハイブリダイゼーションプローブ（ＣＫ１９−ＦＬ及びＣＫ１９−ＬＣ）を以前に記載（A. Stathopoulou et al; 2003）のようにして用いた。プロトコールＢについては、本発明者らの新たに設計したプライマー、ＣＫ１９−ｄｏ２及びＣＫ１９−ｆｏｒ２を、プロトコールＡと同じハイブリダイゼーションプローブと一緒に用いた。表１を参照されたい。
【０１２５】
リアルタイムＰＣＲを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒのガラスキャピラリー中の総容量２０μＬで実施した。ＰＣＲのために２μＬのｃＤＮＡを、１８μＬの反応容量（２μＬのＭｇ２＋を抜いたＰＣＲ合成緩衝液（１０×）、１μＬのＭｇＣｌ２（５０ｍＭ）、０．４μＬのｄＮＴＰｓ（１０ｍＭ）、０．３μＬのＢＳＡ（１０μｇ／ｍＬ）、０．２μＬのプラチナＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ）（Invitrogen, USA）、１μＬのセンスプライマーＣＫ１９−ｆｏｒ２（３μＭ）、１μＬのアンチセンスプライマーＣＫ１９−ｄｏ２（３μＭ）、１μＬのハイブリダイゼーションプローブＣＫ１９−ＦＬ（３μＭ）、１μＬのハイブリダイゼーションプローブＣＫ１９−ＬＣ（３μＭ）及びＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ（最終容量になるように添加）を含む）に添加した。ＰＣＲ反応を、９５℃で１０分間変性後に開始（ホットスタートＰＣＲ）して、４０℃の３０秒間の冷却工程で終了した。繰り返しプロトコールは、１０秒間の９５℃での変性工程、２０秒間の５５℃でのアニーリング、及び２０秒間の７２℃での伸長工程からなり、そしてこれを５０回繰り返した。蛍光検出を、各アニーリング工程の最後の０秒時に実施した。
【０１２６】
定量のために外部標準ｃＤＮＡｓを用いて、外部較正曲線を得た。１×１０６個のＭＣＦ−７細胞から総ＲＮＡを調製した（血球計で確認して）。１〜１０００個のＭＣＦ−７細胞に対応する、このＲＮＡ調製物のＤＥＰＣ処理水中の連続希釈液を、ｃＤＮＡ合成に用いた。これらのｃＤＮＡを、−２０℃でアリコート保存して、本検討を通して外部標準として用いた。この較正曲線は、各外部標準に対応するＭＣＦ−７細胞の数を、その交差ポイント（Ｃｐ）の値に対してプロットして作成した。全てのテストサンプルの循環ＣＫ−１９ｍＲＮＡ陽性細胞の数は、以前に記載（A. Stathopoulou et al; 2003）のように、外部標準較正曲線による、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒソフトウェア３．１で測定された総ＲＮＡの５μｇに相当するＭＣＦ−７細胞として表した。
【０１２７】
全てのサンプルに増幅可能な物質が存在していることを保証するために、そして偽陰性の結果を避けるために、ハウスキーピング遺伝子であるヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−ｈ−ＨＰＲＴ遺伝子セット、Roche Applied Science）のリアルタイム増殖を、全てのサンプルについて実施した。
【０１２８】
ハウスキーピング遺伝子の増幅に、以下のプロトコールを用いた。リアルタイムＰＣＲを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒのガラスキャピラリー中の総容量２０μＬで実施した。ＰＣＲのために２μＬのｃＤＮＡを、１８μＬの反応容量（２μＬのＭｇ２＋を抜いたＰＣＲ合成緩衝液（１０×）、１μＬのＭｇＣｌ２（５０ｍＭ）、０．４μＬのｄＮＴＰｓ（１０ｍＭ）、０．３μＬのＢＳＡ（１０μｇ／ｍＬ）、０．２μＬのプラチナＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ）（Invitrogen, USA）、１μＬの各ハウスキーピングセンス及びアンチセンスプライマー（３μＭ）、１μＬのハイブリダイゼーションプローブＣＫ１９−ＦＬ（３μＭ）、２μＬのＴａｑｍａｎプローブ（６ＦＡＭ−ＡＴＧＡＡＧＧＡＴＧＧＧＣＡＡＣＴＧＴＡＣＣＴＧＡＣＴＧＧ−ＴＭＲ）（３μＭ）及びＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ（最終容量になるように添加）を含む）に添加した。ＰＣＲ反応を、９５℃で１０分間変性後に開始（ホットスタートＰＣＲ）して、４０℃の３０秒間の冷却工程で終了した。繰り返しプロトコールは、１０秒間の９５℃での変性工程、２０秒間の５５℃でのアニーリング、及び２０秒間の７２℃での伸長工程からなり、そしてこれを５０回繰り返した。蛍光検出を、各アニーリング工程の最後の０秒時に実施した。
【０１２９】
予防措置
汚染のリスクを低減するために、ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ工程の調製及び熱サイクルを別な部屋で実施した。ＰＣＲ混合物の調製を、フード（BioTechne Hepa, TECHNE, Cambridge, UK）中で実施し、そして全ての操作の間、それぞれの抽出及び合成に対して、本発明者らはフィルターチップを使用し、陽性及び陰性の対照サンプルを含有させた。
【０１３０】
統計
マクニマー及びフィッシャーの正確確率検定を、プライマー対の両方のセットによる同じｃＤＮＡ上のＣＫ−１９ｍＲＮＡ検出に関するリアルタイムＰＣＲの結果を比較するのに用いた。１対の非正規分布に関するウィルコクソン検定を、２つのプロトコールで測定された本発明者らのサンプルのＣＫ−１９陽性細胞のレベルを比較するために用いた（ｐ＜０．０５は、統計的に有意であると考えられる）。データ分析は、Ｓｔａｔｍｏｓｔ統計パッケージ（Statmost, DataMost Corp, USA）で実施した。
【０１３１】
結果
Ａ．プロトコールＢのＣＫ−１９及びゲノムＤＮＡに関するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
ＣＫ−１９のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲに対して最適化されたプロトコールＢの特異性を、ゲノムＤＮＡサンプル中の、プライマーの４つの組み合わせ［Ａ）ＣＫ１９−ｄｏ２／ＣＫ１９−ｆｏｒ２、Ｂ）ＣＫ１９−ｄｏ２／ＣＫ１９−ｆｏｒ、Ｃ）ＣＫ１９−ｄｏ／ＣＫ１９−ｆｏｒ、Ｄ）ＣＫ１９−ｄｏ／ＣＫ１９−ｆｏｒ２］を適用して評価した（図２を参照されたい）。プライマー対ＣＫ１９−ｄｏ２／ＣＫ１９−ｆｏｒ２は、どの産物の増幅も示さなかったのに対して、その他の３つの組み合わせは増幅を実証した。
【０１３２】
Ｂ．最適化されたプロトコールＢのＣＫ−１９に関するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
ＣＫ−１９に対して新規で特異性の高いプライマー対を設計することにより、本発明者らは先に報告したリアルタイムアッセイ（A. Stathopoulou et al; 2003）を改善した。プロトコールＢのＰＣＲ反応の条件についてほんの少しの修正が必要で、増幅温度を６０から５５℃に下げ、そして増幅時間を１０から２０秒に増やした。
【０１３３】
本発明者らは、４つの実験においてｃＤＮＡ外部標準（上記のようにして調製）を分析することにより、プロトコールＢのＣＫ−１９のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの分析感度及び線形性を評価した。これらのデータから作成された較正曲線は、全定量範囲（１〜１０００のＭＣＦ−７細胞数）にわたる直線性、及び全ての場合において正確な対数線形関係を示唆する、０．９９以上の相関関数を示した。この較正曲線の平均傾き及び切片は、それぞれ−３．２２６±０．１４（ＣＶ＝４．３％、ｎ＝４）及び３２．３０±０．２２（ＣＶ＝０．７％、ｎ＝４）であり、一方、Ｅ＝［１０−１／ｓｌｏｐｅ］−１（I.R. Peters et al; 2004）で表されるＰＣＲ効率は、１．０４±０．０６（ＣＶ＝２．９％、ｎ＝４）であった。第１外部標準（１個のＭＣＦ−７細胞当量）のＣｐの標準偏差値の３．３倍を較正曲線の平均傾きで割る値（Ｄ．Ｌ．＝３．３ＳＤ／傾き）と定義される、この方法の分析の検出限度は、０．４個のＭＣＦ−７細胞当量に相当することが見い出された。
【０１３４】
プロトコールＢの連続実験（run）内精度を測定するために、ＣＫ−１９ｍＲＮＡを、ＬＩｇｈｔＣｙｃｌｅｒで、同じ連続実験中の１、１０、１００及び１０００個のＭＣＦ−７細胞に相当する４つのＤＮＡサンプルで、６つを平行して測定し、定量した。
【０１３５】
【表２】
2009504168.tif 000004
【０１３６】
表２は、較正曲線で測定したＭＣＦ−７細胞についての連続実験内のＣＶ値が、２．９％〜２５％の範囲であるのに対し、対応するＣｐ値は０．２１％〜１．２５％であることを示している。更に、アッセイの連続実験間精度を測定するために、同じｃＤＮＡサンプルをアリコートで冷凍（−２０℃）して、１ヶ月間かけて異なった４日間に４回の別なアッセイを行った。表２は、較正曲線で測定したＭＣＦ−７細胞についての連続実験間ＣＶは６．７％〜１８．９％の範囲であるのに対し、対応するＣｐ値は０．７６％〜１．１２％の範囲であることを示している。
【０１３７】
Ｃ．末梢血サンプルにおけるＣＫ−１９ｍＲＮＡ陽性細胞の比較定量化
ＣＫ−１９に関するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲのための最適化されたプロトコールＢの特異性及び検出感度を、プロトコールＡに関連させて評価した。６２人の健常女性の血液提供者及び１６０人の手術可能な（ステージＩ／ＩＩ）乳癌患者から得た合計２２２の末梢血サンプルに、２つの定量プロトコールを適用した。これらのサンプル全てを、ＨＰＲＴハウスキーピング遺伝子の発現によって、ＲＮＡの特性及びｃＤＮＡの合成についてテストした。それぞれのサンプルの総ＲＮＡを、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎにより蛍光分析で定量した。ＲＮＡの同量を、ｃＤＮＡの合成及び本発明者らの定量的なＲＴ−ＰＣＲデータの標準化のために用いた（A. Stathopoulou et al; 2003）。
【０１３８】
新しいプライマーのセットの特異性を、本発明者らが以前にプロトコールＡで分析した（A. Stathopoulou et al; 2003）健常な志願者からの血液サンプル８９のうちの６２について再分析して、評価した。プロトコールＡを適用すると、これら８９サンプルのうちの２つがこのアッセイの分析カットオフ値（analytical cut-off）によると陽性であると思われた（Ｃｐ＝３２．１７±０．７０、ＣＶ（％）＝２．２）のに対して、６２サンプル（２つの陽性サンプルが含まれていた）の何れも、プロトコールＢで分析した場合に何ら増幅を示さなかった。最適化された方法の検出感度は、手術可能な乳癌患者の末梢血サンプル１６０を両方のプロトコールで分析して評価した。
【０１３９】
【表３】
2009504168.tif 000005
【０１４０】
表３に示すように、これらのサンプルのうちの３３（２０．６％）が、陽性であることが分かった。グレーゾーンにあってプロトコールＡで陽性と見なされていた２０サンプルが、プロトコールＢで陰性であることが分かった。一方、カットオフ値よりも大きいＣｐｓの増幅曲線を示すのでプロトコールＡで陰性と見なされていた４サンプルが、プロトコールＢで陽性であることが見い出された。テストされた全ての末梢血サンプル（健常提供者 ｎ＝６９及び乳癌患者 ｎ＝１６０）を含めると、両方のプロトコールで２９サンプルが陽性で、１６９サンプルが陰性であったので、２つのプロトコール間では８９．２％（１９８／２２２）の陽性及び陰性の一致率であった（マクニマー及びフィッシャーの正確確率検定、ｎ＝２２２、ｐ＝０．００２２）（表３）。図３に示すように、これらの２つのプロトコールで得られたＣＫ−１９ｍＲＮＡ陽性細胞レベル（ＭＣＦ−７細胞当量／５μｇＲＮＡで示した）は、非常に良く相関しており（ｒ＝０．９８６、ｎ＝２９）、２群に差異は有意になかった（対データに関するウィルコクソン検定、ｎ＝２９、ｐ＝０．１６４）。
【０１４１】
末梢細胞の免疫磁性濃縮
３つのサンプル群を新しいプロトコールの有効性を評価するために、末梢血から循環腫瘍細胞（ＣＴＣｓ）を単離してテストした。図６は、後続の操作と共にそれぞれのサンプル群を示す。
【０１４２】
第１群（図６ではグループＡとして示す）
第１群は、既知量のＭＣＦ−７細胞を混ぜた末梢血サンプルからなり、これらのサンプルをＦｉｃｏｌｌ  Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７システム（Sigma Aldrich, St. Louis, MO）に加え、１，５００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。単核細胞層を除去し、ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ／０．１％ウシ血清アルブミンで１ｍＬに希釈し、そして上皮富化ダイナビーズ（Epithelial Enriched Dynabeads；２０μＬ容量中に１×１０７ビーズ）と共に振盪しながら１時間培養した。細胞懸濁液を磁石の上に少なくとも６分間おいて、上澄液を注意深く除去した。磁性ビーズに付着した細胞を１ｍＬのＰＢＳ／０．１％ウシ血清アルブミンで３回洗浄して、キットで提供されている溶解結合緩衝液で溶解した。溶解した細胞懸濁液（及び付着したビーズ）を次の操作まで−８０℃で貯蔵した。このＭＣＦ−７上皮細胞を、モノクローナル抗体、Ｂｅｒ−ＥＰ４、及び磁性ダイナビーズ上皮富化キット（magnetic Dynabeads Epithelial Enrich kit）を用い、製造会社（Dynal）の使用説明書に従って、免疫磁性捕捉で濃縮した。製造会社は、このキットを用いると、上皮細胞の５対数の濃縮、及びビーズが付着していない生存能力のある腫瘍細胞が７０％の収率で得られることを示した。Ｂｅｒ−ＥＰ４抗体は、扁平上皮、肝細胞及び壁細胞の表層を除く、上皮細胞の表面及び細胞質にある２つの糖タンパク質を認識する。
【０１４３】
第２群（図６ではグループＢとして示す）
第２群は、ＰＢＳ中で既知量のＭＣＦ−７細胞を混ぜて調製したサンプルからなり、そして引き続いて第１群と同じ操作を行った。サンプルのこの群は、Ｆｉｃｏｌｌ単離した後のＭＣＦ−７細胞の回収で、免疫磁性濃縮する群（第１群）又は濃縮しない群（第３群）の参考として用いた。
【０１４４】
第３群（図６ではグループＣとして示す）
第３群は、既知量のＭＣＦ−７細胞を混ぜた末梢血サンプルからなり、Ｆｉｃｏｌｌ  Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７システム（Sigma Aldrich, St. Louis, MO）に加え、１，５００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。単核細胞層を除去し、ＰＢＳで２回洗浄し、そしてＰＢＭＣｓを次の操作まで−８０℃で貯蔵した。
【０１４５】
ｍＲＮＡの単離及び逆転写
総ＲＮＡの単離を、Ｔｒｉｚｏｌ ＬＳ試薬（Invitrogen）を用い、製造会社の使用説明書に従って実施した。ＲＮＡの全ての調製及び取り扱い工程を層流フード内で、ＲＮＡ分解酵素の無い条件下で行った。単離したＲＮＡを、ＲＮＡ貯蔵緩衝液（Ambion, USA）に溶解して、使用するまで−８０℃で貯蔵した。ＲＮＡの濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐスペクトロフォトメータＮＤ−１０００（NanoDrop）を用いて測定した。ＲＮＡの逆転写は、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔｗｏ Ｓｔｅｐ ｑＲＴ−ＰＣＲキット（Invitrogen）を用いて実施した。
【０１４６】
リアルタイムＰＣＲ（定量的ＰＣＲ）
ＣＫ−１９についてリアルタイムＰＣＲを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒのガラスキャピラリー中の総容量２０μＬ中で実施した。ＰＣＲのために２μＬのｃＤＮＡを、１８μＬの反応容量（２μＬのＭｇ２＋を抜いたＰＣＲ合成緩衝液（１０×）、１μＬのＭｇＣｌ２（５０ｍＭ）、０．４μＬのｄＮＴＰｓ（１０ｍＭ）、０．３μＬのＢＳＡ（１０μｇ／ｍＬ）、０．２μＬのプラチナＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ）（Invitrogen, USA）、１μＬのセンスプライマーＣＫ１９−ｆｏｒ２（３μＭ）、１μＬのアンチセンスプライマーＣＫ１９−ｄｏ２（３μＭ）、１μＬのハイブリダイゼーションプローブＣＫ１９−ＦＬ（３μＭ）、１μＬのハイブリダイゼーションプローブＣＫ１９−ＬＣ（３μＭ）、及びＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ（最終容量になるように添加）を含む）に添加した。ＰＣＲ反応を、９５℃で１０分間変性後に開始（ホットスタートＰＣＲ）して、４０℃の３０秒間の冷却工程で修了した。繰り返しプロトコールは、１０秒間の９５℃での変性工程、２０秒間の５５℃でのアニーリング、及び２０秒間の７２℃での伸長からなり、そしてこれを５０回繰り返した。蛍光検出を各アニーリング工程の最後の０秒時に実施した。
【０１４７】
ここで図８Ａ〜Ｃを参照すると、ＭＣＦ−７細胞を混ぜて末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ分離し、免疫磁性濃縮した場合、高い検出感度が得られることが分かる。これらの実験では、１個のＭＣＦ−７細胞／ｍｌＰＢまでの検出限界が得られた。図８Ａを参照されたい。
【０１４８】
本発明の更なる用途
本発明は、例えば、患者の生体サンプル中で同定される循環腫瘍細胞の定量測定方法を開示する。一例は、乳癌を患っている患者である。好ましい本発明の方法は、本発明のプライマー対を用いて特定のＣＫ−１９ｍＲＮＡ転写産物のリアルタイムＰＣＲ増幅に使用される。
【０１４９】
腫瘍中に豊富に発現される上皮マーカーであるＣＫ−１９は、子宮内膜（Ji XQ et al, Gynecol Oncol. 2006 Feb; 100(2):355-60）、結腸直腸（Yeh CS et al, Int J Oncol. 2006 Feb;28(2):411-20; Wang JY et al, World J Surg. 2006 Jun; 30(6):1007-13）、胃（Wu CS et al, Int J Cancer. Jul 15; 119(2):373-9）、頭及び頸（Tao L et al, Br J Cancer. 2006 Apr 24; 94(8):1164-9）、前立腺（O'Hara SM et al, Clin Chem. 2004 May; 50(5):826-35）及び多くの型の腫瘍が引き起される悪性胸膜滲出（Xe F et al, J Zhejiang Univ Sci. 2004 Oct; 5(10):1286-9）を含む、上皮起源の腫瘍を有する患者の生体サンプル中の循環腫瘍細胞を同定するためのマーカー（単独又はその他のマーカーと組み合わせて）でもある。このような生体サンプルは、末梢血、骨髄、リンパ節、髄液及び接眼レンズ液を含んでいてもよい。
【０１５０】
上記の腫瘍を有する患者から提供される生体サンプルからのＣＫ−１９ｍＲＮＡ陽性の循環腫瘍細胞を同定するために、本明細書に開示されている方法の１つ又は組み合わせを用いることができる。例えば、臨床サンプルを集めて、単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）を用いて総ＲＮＡが調製される。例えば、上記で概説した免疫磁性精製の方策を用いることができる。ＲＮＡを定量して、必要によって、−７０℃に長期間貯蔵する。また、ＲＮＡ（５μｇ）は、ｃＤＮＡ（標的配列）合成のための逆転写反応を行うために用いられる。健常者からのサンプルは、対照として用いられ、同一の方法で臨床サンプルと平行して処理される。当然のことながら、このような対照を、テストする対照サンプルが公知のＣＫ−１９発現プロフィールを有しているなら、実施する必要はない。合成されたｃＤＮＡは、ＣＫ−１９配列を増幅するために上記のようなプライマー対及びハイブリダイゼーションプローブ対を用いるリアルタイムＰＣＲ反応で使用される。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及び２で示されるプライマー対の使用は、多くの用途に対して好ましいであろう。
【０１５１】
定量化のために、外部較正曲線は、本願で前記したように、１×１０６個のＭＣＦ−７細胞から単離したＲＮＡから調製された外部標準ｃＤＮＡを用いることによって作成される。
【０１５２】
考察
本発明者らは、乳癌患者の末梢血サンプル中の循環ＣＫ−１９ｍＲＮＡ陽性細胞を定量する特異的且つ精度の高い方法を開発した（A. Stathpoulou et al; 2003）。このアッセイは、非常に低い偽陰性率（健常血液提供者８９名のうちの２名のみ（２．２％）がＣＫ−１９ｍＲＮＡに対して陽性であることが見い出されたので）にもかかわらず、アッセイの分析検出限界より低い、非常に高い交差ポイントで検出されたので陰性と考えられるｃＤＮＡ配列に、増幅可能なｃＤＮＡ配列を有するサンプルがあった。カットオフ値よりもやや低いＣｐに増幅曲線を示す患者サンプルの結果を評価することは、非常に困難且つ重大であることが判明した。
【０１５３】
この「グレーの判定区域」があることで、本発明者らが、新規なプライマーのセット（ＣＫ１９−ｄｏ２及びＣＫ１９−ｆｏｒ２）を設計及び評価することになった。本発明者らの主な目標は、ゲノムＤＮＡ汚染又は正当性を欠いた発現の何れかによる偽陽性、更に本発明者らのサンプル中のＣＫ−１９ｍＲＮＡの非常に低い初期濃度による偽陰性を避けることであった。新旧のＣＫ−１９プライマー対の４つの異なった組み合わせを、純粋なゲノムＤＮＡと共にテストすることにより、このハイブリダイゼーションプローブ対と組み合わせたこの新規なプライマー対が、非常に特異的であり、そして高濃度のゲノムＤＮＡ及びＣＫ−１９偽遺伝子の存在によって影響を受けないことを、本発明者らは明確に示した。以前に検討したのと同じ健常提供者のサブグループ（ｎ＝６２）からのサンプルと新しいプライマー対との再テストで、これらのサンプルの何れもＣＫ−１９ｍＲＮＡの増幅可能な産物を有していなかったことから、このアッセイの特異性において有意な改善があった。
【０１５４】
この新規で高い特異性のあるプライマー対をＣＫ−１９ｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ定量に使用することによって、本発明者らは、この方法の特異性を大幅に改善した。この方法では、陽性及び陰性のサンプルの明確な区分が達成され、そして以前のアッセイにおけるグレーゾーン結果の難しい解釈を完全に避けることができる。サンプルの大部分に対して、プライマー対の２つのセットが殆ど同じ結果をもたらし、テストした全２２９サンプルのうち、両方のプライマー対によって、２９サンプルが陽性で、１６９サンプルが陰性であることが見い出された［８９．２％の一致率（１９８／２２２）］。
【０１５５】
しかしながら、プロトコールＡの方法で、濃度が分析検出限界に非常に近くグレーゾーンとされた陽性の１０サンプルについては、プロトコールＢで４つが真の陽性であり（４０％）、一方６サンプルが偽陽性であると見い出された（６０％）。プロトコールＡで陰性であった１９サンプルの他のセットでは、分析検出限界よりやや低い濃度である２例がプロトコールＢで偽陰性であることが見い出された（１０．５％）。このように、プロトコールＡでＣＫ−１９検出の「グレーゾーン」に入っていると測定された、小さい割合の患者サンプル２９／２２２（１３％）を、プロトコールＢで陽性又は陰性としてより明確に特徴付けることができた。というのも、このプロトコールは、全ＲＮＡと一緒に抽出される微量のゲノムＤＮＡによって影響を受けないからである。
【０１５６】
以下の引例の概説は、本発明の正しい評価を高めるであろう。
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【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】図１は、ＣＫ−１９ｃＤＮＡ及びＣＫ−１９偽α遺伝子の配列アラインメント、並びにプロトコールＡ及びＢで用いられるプライマー及びプローブのハイブリッド形成部位を示している。点Ｉ及びＩＩは、それぞれエクソン１／２及びエクソン２／３の接合部を示している。
【図２】図２は、同じハイブリダイゼーションプローブとプライマーの４つの組み合わせ［Ａ）ＣＫ１９−ｄｏ２／ＣＫ１９−ｆｏｒ２、Ｂ）ＣＫ１９−ｄｏ２／ＣＫ１９−ｆｏｒ、Ｃ）ＣＫ１９−ｄｏ／ＣＫ１９−ｆｏｒ、Ｄ）ＣＫ１９−ｄｏ／ＣＫ１９−ｆｏｒ２］を用いることによる、ゲノムＤＮＡについてのリアルタイムＰＣＲである。
【図３】図３は、プロトコールＡ及びＢで得られる、ＭＣＦ−７細胞当量／５μｇＲＮＡで表したＣＫ−１９ｍＲＮＡ陽性細胞のレベルを示すグラフである。
【図４】図４は、ＰＢＧＤについての一般的なリアルタイムＰＣＲのグラフである。このグラフは、ＰＢＧＤ遺伝子を効率よく増幅する、５人の健常提供者の生体サンプル（末梢血）（正常サンプル１〜５）を用いて、本発明のハウスキーピングプライマー対を用いて生成したハウスキーピング遺伝子についての、本発明のＴａｇｍａｎプローブを用いて検出したリアルタイムＰＣＲ増幅カーブを示す。図で、ゲノムＤＮＡ（健常者から単離されたＤＮＡ）を含有している２つのサンプルでは、増幅が生じなかったことが観察される。これはゲノムＤＮＡが増幅されないようにハウスキーピングプライマーを設計した結果である。陰性対照（ネガティブコントロール；ＮＣ）は、核酸鋳型を含有していないＰＣＲ反応に対応している。
【図５】図５は、ＰＢＧＤのＰＣＲ産物についてのアガロースゲル電気泳動（２％）である。実際のＰＣＲ産物をアガロースゲル上に添加した。反応物の１０μｌ（総容量の半分）を添加して、標準的な臭化エチジウム染色を用いて検出した。サンプル１〜５は、図４の正常サンプル１〜５に対応し、一方、陰性対照は、図４の陰性対照に対応している。
【図６】図６は、末梢血（ＰＢ）から循環腫瘍細胞（ＣＴＣｓ）を単離するためのある特定の実験工程を示す概略図である。
【図７】図７は、モノクローナル抗体Ｂｅｒ−ＥＰ４及び磁性ダイナビーズ濃縮キット（magentic dynabeads epitherial enrich kit）を用いる、免疫磁性の濃縮を示す概略図である。
【図８Ａ】図８Ａ〜Ｃは、実施例で示されるサンプルの３群についての、リアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。図８Ａは、第１群＝ＰＢに既知量のＭＣＦ−７細胞を混ぜ、そして免疫磁性濃縮したサンプルを示す。
【図８Ｂ】図８Ａ〜Ｃは、実施例で示されるサンプルの３群についての、リアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。図８Ｂは、第２群＝ＰＢＳに既知量のＭＣＦ−７細胞を混ぜたサンプルを示す。
【図８Ｃ】図８Ａ〜Ｃは、実施例で示されるサンプルの３群についての、リアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。図８Ｃは、免疫磁性濃縮以外は第１群と同じ処理したサンプルを示す。
【図１】
2009504168.tif 000006
【図２】
2009504168.tif 000007
【図３】
2009504168.tif 000008
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2009504168.tif 000012
【図８Ａ】
2009504168.tif 000013
【図８Ｂ】
2009504168.tif 000014
【図８Ｃ】
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【配列表】
2009504168000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年2月12日(2007.2.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列を有する１つのプライマー及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列を有する１つのプライマーを含んでなる、プライマー対。
【請求項２】
プライマーが、ヌクレオチド、ヌクレオチドの類似体又は標識を含んでなる、請求項１に記載のプライマー対。
【請求項３】
少なくとも１つのプライマーが少なくとも１つのイントロンを挟む部位を包含し、
（ｉ）核酸増幅試薬、請求項１に記載のプライマー対及びテストサンプルを包含する反応混合物を形成すること、
（ｉｉ）当該混合物を増幅条件下において、標的配列に相補的な核酸配列の少なくとも１つのコピーを生成すること、及び
（ｉｉｉ）ＰＣＲ時のリアルタイム観察を用いて、サンプル中のｍＲＮＡの量を測定すること、
の工程を含んでなる、プライマー対を用いて、少なくとも１つのイントロンを包含する遺伝子由来のｍＲＮＡの、テストサンプル中の存在を定量する方法。
【請求項４】
工程（ｉ）の反応混合物の形成前に、テストサンプルを逆転写する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
テストサンプルが、血液サンプル、骨髄からのサンプル及びリンパ節由来のサンプルから選ばれる、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
テストサンプルが、血液サンプルである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
血液サンプルが、反応混合物の形成前に遠心分離される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｉ）の反応混合物が、ハウスキーピングプライマー対を更に含んでなる、請求項３〜７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
ハウスキーピングプライマー対が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５及び６を有している、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
（ｉ）患者から生体サンプルを提供すること、
（ｉｉ）生体試料から核酸を単離すること、
（ｉｉｉ）核酸の供給源がＲＮＡである場合、単離した核酸を任意に逆転写すること、
（ｉｖ）核酸増幅試薬、請求項１に記載のプライマー対、及び工程（ｉｉ）で単離した核酸又は工程（ｉｉｉ）の逆転写された核酸のアリコートを包含する、反応混合物を形成すること、
（ｖ）当該混合物を増幅条件下において、標的配列に相補的な核酸配列の少なくとも１つのコピーを生成すること、
（ｖｉ）ＰＣＲ時のリアルタイム観察を用いて、サンプル中のＣＫ−１９ｍＲＮＡ陽性細胞を定量すること、及び
（ｖｉｉ）サンプル中のＣＫ−１９ｍＲＮＡ陽性細胞の量に基づいて、アジュバント治療の見通しを判断すること、
の工程を含んでなる、癌を患っている患者におけるアジュバント治療の見通しを判断する診断方法。
【請求項１１】
前記癌が、乳癌、好ましくは手術可能な乳癌である、請求項１０に記載の診断方法。
【請求項１２】
生体サンプルが、血液サンプルである、請求項１０又は１１に記載の診断方法。
【請求項１３】
工程（ｉｉｉ）の反応混合物が、ハウスキーピングプライマー対を更に含んでなる、請求項１０〜１２の何れか一項に記載の診断方法。
【請求項１４】
ハウスキーピングプライマー対が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５及び６を有している、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
（ｉ）請求項１に記載のプライマー対；
（ｉｉ）癌細胞上に追加のマーカーと任意にハイブリッド形成する配列；及び
（ｉｉｉ）増幅試薬：
を含んでなる、ＣＫ１９標的配列を増幅するための診断キット。
【請求項１６】
前記増幅試薬が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及び４のハイブリダイゼーションプローブを含んでなる、請求項１５に記載の診断キット。
【請求項１７】
前記キットが、ハウスキーピングプライマー対、好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５及び６による配列を有するプライマー対を更に含んでなる、請求項１５又は１６に記載の診断キット。
【請求項１８】
増幅試薬及びプライマー対（複数を含む）が、凍結乾燥されている、請求項１５〜１７の何れか一項に記載の診断キット。
【請求項１９】
第１プライマーの長さが約１０〜約２０個の核酸塩基であって、更に図１で示されるＣＫ−１９ｃＤＮＡ配列と特異的にハイブリッド形成が可能である、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される配列の少なくとも約８個の核酸塩基を有する第１プライマー、
及び第２プライマーの長さが約１０〜約２０個の核酸塩基であって、更に図１で示されるＣＫ−１９ｃＤＮＡ配列と特異的にハイブリッド形成が可能である、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される配列の少なくとも約８個の核酸塩基を有する第２プライマーを更に含んでなる、プライマー対。
【請求項２０】
第１及び第２プライマーの少なくとも１つが、修正ヌクレオチド間架橋、修飾糖部分又は修飾核酸塩基を含んでなる、請求項１９に記載のプライマー対。
【請求項２１】
第１及び第２プライマーの少なくとも１つが、少なくとも１つの固定された核酸（locked nucleotic acid；ＬＮＡ）ユニットを含有している、請求項２６のプライマー対。
【請求項２２】
少なくとも１つのプライマーが少なくとも１つのイントロンを挟む部位を包含し、
（ｉｖ）核酸増幅試薬、請求項１９〜２１に記載のプライマー対及びテストサンプルを包含する反応混合物を形成すること、
（ｖ）当該混合物を増幅条件下において、標的配列に相補的な核酸配列の少なくとも１つのコピーを生成すること、及び
（ｖｉ）ＰＣＲ中のリアルタイム観察を用いて、サンプル中のｍＲＮＡの量を測定すること、
の工程を含んでなる、プライマーの対を用いて、少なくとも１つのイントロンを包含する遺伝子由来のｍＲＮＡの、テストサンプル中の存在を測定する方法。
【請求項２３】
ハウスキーピングプライマー対の使用を更に含んでなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１９〜２１に記載のプライマー又はプライマー対を含んでなる、診断キット。
【請求項２５】
（ａ）生体液から何れかの単核細胞を分離すること、
（ｂ）分離した単核細胞に、単核細胞によって発現される抗原に特異的に結合する抗体（又はその抗原結合断片）を接触させること（ここにおいて、抗体（又は断片）は固体担体に結合されており、この接触は、細胞、抗体（又は断片）及び固体担体の結合複合体を形成するのに十分である）、
（ｃ）結合していない物質の何れかから、複合体を分離すること、
（ｄ）複合体に結合している内皮単核細胞から、核酸を単離すること、
（ｅ）核酸増幅試薬、請求項１９〜２１に記載のプライマー対及び核酸を包含する反応混合物を形成すること、
（ｆ）当該混合物を増幅条件下において、ＣＫ−１９標的配列に相補的な核酸配列の少なくとも１つのコピーを生成すること、及び
（ｇ）ＰＣＲを用いて、生体サンプル中のＣＫ−１９ｍＲＮＡを検出すること、
の工程を含んでなる、生体サンプル中のＣＫ−１９ｍＲＮＡの存在を確定する方法。
【請求項２６】
上皮単核細胞が、濾過又は遠心分離で分離される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
遠心分離工程が、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配法の使用を含んでなる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
抗体が、内皮単核細胞によって発現されるグリコプロテインに特異的に結合するモノクローナルである、請求項２５〜２７に記載の方法。
【請求項２９】
モノクローナル抗体が、Ｂｅｒ−ＥＰ４である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
固体担体が、免疫磁性ビーズである、請求項２５〜２９に記載の方法。
【請求項３１】
方法の工程（ｃ）が、結合複合体に磁場を掛けて、結合していない物質の全てから複合体を分離することを含んでなる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
プライマー対が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で表される、請求項３１〜３６に記載の方法。
【請求項３３】
生体液が、末梢血である、請求項２５〜３２に記載の方法。
【国際調査報告】
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