(57)【要約】  本発明は、粗製タクロリムスを、水／有機溶媒混合物に溶解した銀塩と植物由来の担体とに接触させるステップ、この担体から混合物を分離するステップ、および精製されたタクロリムスを回収するステップを含む、タクロリムスを精製するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．粗製タクロリムスを、
水−有機溶媒混合物中に溶解した銀塩と、
セルロース、変性セルロース、デンプン、化工デンプン、モノマーとして単純な炭水化物を有する天然ポリマー、および炭素から選択された植物由来の担体と、
に接触させるステップ；
ｂ．担体から水／有機溶媒混合物を分離するステップ；
ｃ．水相からタクロリムスを回収するステップ
を含む、タクロリムス（Ｉ）を精製するための方法。
【化１】
2009502993.tif 000006
【請求項２】
水相からタクロリムスを回収するステップが：
ｃ１．有機溶媒の除去；
ｃ２．タクロリムスが可溶な有機溶媒による水相の抽出；
ｃ３．水相からの有機相の分離、および溶媒の蒸発による精製されたタクロリムスの回収
により実現される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｄ．精製されたタクロリムスを、銀塩を含有する水／溶媒混合物で処理し、ステップａ〜ｃを繰り返す工程をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
担体がセルロースである、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
担体が炭素である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップａ）が、１回目は炭素を用いて、２回目はセルロースを用いて実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
ステップａ）が、１回目はセルロースを用いて、２回目は炭素を用いて実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
溶媒がアルコールまたはケトンである、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
溶媒がメタノールまたはアセトンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
有機溶媒が脂肪族化合物または脂環式炭化水素である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
溶媒がｎ−ヘキサンまたはシクロヘキサンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
タクロリムスが可溶な有機溶媒が酢酸エチルである、請求項２または３に記載の方法。
【請求項１３】
ステップｄ）の抽出から得られた水溶液をステップａ）に再生利用する、請求項２または３に記載の方法。
【請求項１４】
非イオン性樹脂上でのタクロリムスのクロマトグラフィー精製をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般に、免疫抑制剤および抗菌三環系マクロライドに関し、詳細には、タクロリムス（Ｉ）を回収し精製するための方法に関する。
【０００２】
【化１】
2009502993.tif 000002
【背景技術】
【０００３】
技術的背景
タクロリムス（Ｉ）（１７−アリル−１，１４−ジヒドロキシ−１２−［２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシシクロヘキシル）−１−メチルビニル］−２３，２５−ジメトキシ−１３，１９，２１，２７−テトラメチル−１１，２８−ジオキシ−４−アザトリシクロ−［２２．３．１．０4,9］オクタコス−１８−エン−２，３，１０，１６−テトラオン）は、ストレプトマイセス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）の発酵を通して生成された三環系マクロライドである。タクロリムスは、移植拒絶反応、自己免疫疾患、および感染症などの治療で使用される。
【０００４】
ＥＰ０１８４１６２は、発酵および化学合成を通して、タクロリムスおよびその誘導体を調製するための方法を開示する。特に、ストレプトマイセス種による発酵は、タクロリムスの他に、一般にＦＫ５２０として知られている１７−エチル誘導体（ＩＩ）（１７−エチル−１，１４−ジヒドロキシ−１２−［２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシシクロヘキシル）−１−メチルビニル］−２３，２５−ジメトキシ−１３，１９，２１，２７−テトラメチル−１１，２８−ジオキシ−４−アザトリシクロ−［２２．３．１．０4,9］オクタコス−１８−エン−２，３，１０，１６−テトラオン）、
【０００５】
【化２】
2009502993.tif 000003
【０００６】
および１７−プロピル誘導体（ＩＩＩ）（１７−プロピル−１，１４−ジヒドロキシ−１２−［２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシシクロヘキシル）−１−メチルビニル］−２３，２５−ジメトキシ−１３，１９，２１，２７−テトラメチル−１１，２８−ジオキシ−４−アザトリシクロ−［２２．３．１．０4,9］オクタコス−１８−エン−２，３，１０，１６−テトラオン）
【０００７】
【化３】
2009502993.tif 000004
【０００８】
も生成する。
【０００９】
タクロリムスおよび関連する副産物の物理化学的な特徴付けに加え、ＥＰ０１８４１６２では、抽出、精製および回収方法も開示されている。特に、発酵培養液（ｂｒｏｔｈｓ）からの回収は、ブロスまたは菌糸体から活性を抽出するのに適した溶媒の使用；陰イオンおよび陽イオン交換樹脂、または非イオン性吸収樹脂による吸着／溶離；シリカゲルやアルミナ、セルロースなど、従来のクロマトグラフィー担体上での精製；活性炭による脱色、結晶化、および再結晶などの、公知の抽出技法を用いて実現される。
【００１０】
ＥＰ０１８４１６２によれば、発酵ブロスからタクロリムスおよび関連する副産物を抽出し回収するための方法は、下記のステップ、即ち：
−  溶媒（例えばアセトンおよびメタノール）で、菌糸体および／または発酵培養液を抽出するステップ；
−  非イオン性吸収樹脂（特にＨＰ−２０）上で精製するステップ；
−  精製された溶液を蒸発させて油にするステップ；
−  シリカゲル（特に、グレード１２のシリカゲル、Ｆｕｊｉ−Ｄｅｖｉｓｏｎ  Ｃｏ．）上での精製を２回または３回繰り返して、生成物を粉末の形で得るステップ；
−  上述の不純物を分離するために、分取ＨＰＬＣ（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  ＨＰＬＣ）によって精製するステップ
を含む。
【００１１】
非イオン性吸収樹脂上での精製ステップおよびシリカゲル上での精製ステップは、発酵培養液から得られるほとんどの化合物（発酵中に微生物によって生成された物質）、無機塩、および出発材料から得られた物質を除去することが目的であるのに対し、不純物（ＩＩ）および（ＩＩＩ）は、分取ＨＰＬＣ上での精製を用いて分離されるが、この生産性および適用性は、工業規模では不十分である。
【００１２】
米国特許第６４９２５１３号は、銀塩（特に硝酸銀）で前処理した陽イオン交換樹脂による、不純物（ＩＩ）および（ＩＩＩ）からのタクロリムスの精製を開示する。炭素原子の数が同じである不飽和脂肪酸のシス−トランス異性体を、分離する際の銀塩の使用が、文献において知られている（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、１４９（１９７８）４１７〜４３０）。銀塩は、その立体配座に応じてこのように分離された不飽和化合物と、π錯体を形成する。米国特許第６４９２５１３号の方法によれば、タクロリムスは銀錯体を形成するため、２種の不純物よりも陽イオン交換樹脂に緊密に保持されるので、タクロリムス（不飽和１７−アリル側鎖を有する）は１７−飽和側鎖を有する２種の不純物から分離される。
【００１３】
最後に、米国特許第６５７６１３５号は、非イオン性吸収樹脂を用いた不純物（ＩＩ）および（ＩＩＩ）からのタクロリムスの分離を開示する。
【発明の開示】
【００１４】
発明の詳細な開示
タクロリムスは、植物由来の担体の使用を通して、銀イオンとのπ錯体（ＩＶ）として不純物（ＩＩ）および（ＩＩＩ）から都合良く精製できることを、ついに見出した。
【００１５】
【化４】
2009502993.tif 000005
【００１６】
したがって本発明は、粗製タクロリムスを、
水−有機溶媒混合物に溶解した銀塩と、
セルロース（ＡＲＢＯＣＥＬＬ  ＢＣ  ２００、Ｊ．Ｒｅｔｔｅｎｍａｉｅｒ  ＆  Ｓｏｈｎ、またはＳＯＬＫＡ  ＦＬＯＣ、Ｄｉｃａｌｉｔｅなど）、変性セルロース（Ｍｅｔｈｏｃｅｌ、Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌなど）、デンプン、化工デンプン、モノマーとして単純な炭水化物を有する天然ポリマー、および炭素から選択された植物由来の担体とに接触させるステップを含む、
タクロリムスを精製するための方法に関する。このように、不純物は植物由来の担体上に保持されるのに対し、錯体のタクロリムス−銀イオンは水相に溶離される。担体から溶媒混合物を溶離した後、タクロリムスが可溶な有機溶媒で水相を処理することにより、タクロリムスを回収することができる。
【００１７】
したがって、第１の実施形態によれば、本発明の方法は：
ａ．粗製タクロリムスを、
水−有機溶媒混合物中に溶解した銀塩と、
セルロース、変性セルロース、デンプン、化工デンプン、モノマーとして単純な炭水化物を有する天然ポリマー、および炭素から選択された植物由来の担体とに接触させるステップ；
ｂ．担体から水／有機溶媒混合物を分離するステップ；
ｃ．水相からタクロリムスを回収するステップ
とを含む。
【００１８】
特に、水相からタクロリムスを回収するステップは：
ｃ１．有機溶媒の除去；
ｃ２．タクロリムスが可溶な有機溶媒による水相の抽出；
ｃ３．水相からの有機相の分離、および溶媒の蒸発による精製されたタクロリムスの回収
を用いて実現することができる。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態によれば、第１の精製ステップと同じか、または異なる植物由来の担体を使用して、このように精製されたタクロリムスを、この方法に再び適用することができる。例えば第１の精製ステップ中、セルロースを使用できるのに対し、第２の精製ステップ中は炭素を使用することができ、またはこの逆も同様である（ｖｉｃｅ−ｖｅｒｓａ）。
【００２０】
本発明の記述において、「有機溶媒」という表現は、ケトン、アルコール、脂肪族および脂環式炭化水素から選択された、水混和性または非混和性の溶媒を意味し；好ましい溶媒は、アセトン、メタノール、ｎ−ヘキサン、およびシクロヘキサンである。
【００２１】
タクロリムスが可溶であり、水相からのタクロリムスの回収（ステップｃ２）に使用される有機溶媒は、非水混和性の有機溶媒であり、例えば酢酸エチル、メチル−エチル−ケトン、エチルエーテル、ジクロロメタンであり、好ましくは酢酸エチルである。より詳細には、ステップｃは、下記の通り実施される：タクロリムス−銀のπ錯体を含有する混合物を真空濃縮して、有機溶媒を除去し（ステップｃ１）、その後、タクロリムスが可溶な０．５〜３体積の有機溶媒で抽出する（ステップｃ２）。有機相を、１体積の脱イオン水で２〜３回洗浄し、その後、小体積に濃縮する（ステップｃ３）。
【００２２】
銀塩を含有する、ステップｃ３で得られた水相は、タクロリムス−銀イオン錯体を調製するために回収し再生利用することができる。
【００２３】
植物由来の担体の重量は、タクロリムスの重量と比較した場合に３÷１００倍であり、好ましくは１５÷２５倍である。植物由来の担体が炭素である場合は、タクロリムスの重量と比較して３÷５０倍、好ましくは５÷１５倍の量で使用される。この場合、水−有機溶媒混合物中の、タクロリムス−銀イオン錯体は、炭素が入っているカラムに投入され、水と、錯体を含有する混合物と同じ有機溶媒とからなる混合物と、平衡になる。溶離流量は、使用される炭素の体積に応じて０．５÷１０体積／時であり、好ましくは３．０÷５体積／時である。洗浄溶液の体積は、炭素の体積と比較して２÷１０倍であり、好ましくは３÷８倍である。次いで溶離液を回収し、上述のステップａ〜ｄを適用する。
【００２４】
精製された錯体を形成する銀イオンは、銀塩から、好ましくは硝酸銀または過塩素酸銀から解放される。銀イオンの濃度は、好ましくは０．０５から１．３０モル／ｌであり、最も好ましくは０．２０から０．３０モル／ｌである。第１の精製サイクルにかけられるタクロリムス−イオン銀錯体は、ストレプトマイセス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ）からの発酵生成物を、好ましくは酢酸エチル、メタノール、およびアセトニトリルから選択されたタクロリムスが可溶な有機溶媒に溶解することによって調製する。炭素以外の担体を溶液に添加し、その後、有機溶媒を蒸発させ、得られた固体を、銀塩を含有する水−有機溶媒混合物で抽出する。抽出混合物中の有機溶媒の量は、水溶液の体積に対して０から６０％であり、好ましくは０から２０％である。抽出混合物の重量は、タクロリムスの重量と比較した場合に５０÷５００倍である。固液抽出は、９０％よりも高い精製されたタクロリムスの抽出のモル収率が得られるように、５回まで繰り返すことができる。
【００２５】
その一方で、担体が炭素である場合、発酵生成物を、銀塩を含有する水−有機溶媒混合物で直接処理し、次いでカラムに投入する。
【００２６】
別の実施形態によれば、本発明の方法は、例えばＥＰ０１８４１６２に記載されるような、非イオン性樹脂上でのクロマトグラフィー精製も含むことができる。樹脂は、通常、市販されている吸収樹脂から選択され、好ましくは三菱化学（株）（ＳＰ２００またはＳＰ８００）またはＲｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ（シリーズＸＡＤ）製の吸収樹脂である。この追加のステップは、植物由来の担体で精製する前または後に行うことができる。特に好ましい実施形態によれば、この追加のステップは、以下により詳細に述べるように、先に行われる。
【００２７】
適切に濾過された、発酵培養液または菌糸体を、タクロリムスが可溶な有機溶媒で、好ましくはケトンまたはアルコール、より好ましくはアセトンまたはメタノールで抽出し、この抽出生成物を、非イオン性吸収樹脂上での吸収クロマトグラフィーにかけて、タクロリムスと、発酵ブロス中に含有されるその他の化合物からの不純物（ＩＩ）および（ＩＩＩ）、例えば発酵中に微生物によって放出された物質、無機塩、および出発材料から得られた物質などを精製する。
【００２８】
得られた生成物を、本発明の方法にかけられる銀塩を含有する水−有機溶媒混合物に溶解する。好ましくは、タクロリムス−銀イオン錯体を含有する混合物を、最初に上述のように炭素上で精製し、次いでこの精製プロセスを、別の植物由来の担体、好ましくはセルロースを使用して繰り返す。
【００２９】
本発明の方法により得られた純粋なタクロリムスを、公知の方法で結晶化させ；通常はこの生成物を、有機溶媒に、好ましくはアセトニトリルに溶解し、脱イオン水を添加することによって一水和物結晶として沈殿させる。得られた結晶は、高純度であることを特徴とする（ＨＰＬＣ％面積＞９９％、Ｙ．Ｎａｍｉｋｉ他、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ  Ｖｏｌ．４０、Ｎ°５／６  １９９５年３月に報告されたＨＰＬＣ法による）。
【００３０】
本発明の方法は、生産性および最終生成物のコストの両方の観点から、公知の方法と比較した場合に特に有利である。
【００３１】
生産性に関しては、本発明の方法は、順相シリカゲル上でクロマトグラフィー精製を繰り返す必要がない。文献に開示された抽出／精製手順により必要とされる前記精製では、並外れた量の溶媒およびシリカゲルの使用と、長い時間を要する。
【００３２】
最終生成物のコストは、公知の方法で得ることが可能な生成物の場合よりも確かに安いが、この理由は、本発明の方法が、文献に開示された手順で使用されるクロマトグラフィー担体よりも、非常に安いコストで市販されている植物由来の担体の使用を含むからである。さらに、本発明の方法によれば、銀イオンを含有する水溶液を、完全に再生利用することができ、したがって、環境への影響を低く保ち、銀塩のコストが最終生成物のコストに占める率を抑えることが可能になる。
【００３３】
次に本発明について、いくつかの実施例を用いてより詳細に例示する。
【実施例】
【００３４】
実施例１−抽出および吸収樹脂上での精製
発酵ブロス５０リットルに、アセトン５０リットルおよび濾過助剤（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ａｄｊｕｖａｎｔ）（Ｄｉｃａｌｉｔｅ）１ｋｇを添加する。室温で１時間攪拌した後、スラリーを濾過する。得られた精製溶液を、吸収樹脂ＸＡＤ１６（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ）２リットルに吸収させる。活性を、水／アセトン  ２５／７５  ６リットルで溶離する。得られた溶液を濃縮して、アセトンを除去する。水相（１．５リットル）を酢酸エチル１．５リットルで抽出する。相を分離し、有機相を濃縮して油にする。
【００３５】
実施例２−顆粒状炭素上での精製
油相に、ＡｇＮＯ3  １３．５ｇを含有する、５０／５０の水／アセトン溶液１８０ｍｌを添加する。ＡｇＮＯ3  １１．２５ｇを含有する５０／５０の水／アセトン溶液１５０ｍｌで事前に調整された、顆粒状炭素ＧＡＣ  １２４０  ＰＬＵＳ（ＣＥＣＡ  ＩＴＡＬＩＡＮＡ）１００ｍｌを含有するカラム中に、得られた溶液を浸透させた（ｐｅｒｃｏｌａｔｅｄ）。その後、ＡｇＮＯ3  ３０ｇを含有する５０／５０の水／アセトン溶液４００ｍｌを、カラムに通して溶離する。得られた溶液を蒸発させて、３５０ｍｌの体積にする。酢酸エチル３５０ｍｌを添加し、相を分離し、水相を再生利用するのに対し、有機相を実施例３にしたがって処理する。
【００３６】
実施例３−セルロース上での精製
実施例２からの有機相に、セルロースＳＯＬＫＡ  ＦＬＯＣ（ＤＩＣＡＬＩＴＥ）１６０ｇを添加する。懸濁液を、有機相が完全に除去されるまで蒸発させる。得られた固体に、ＡｇＮＯ3  １１１．５ｇを含有する７５／２５の水／ｎ−ヘキサン溶液２リットルを添加し、室温で３０分間攪拌し、その後、固体を濾過する。抽出および濾過を４回繰り返し、相を分離する。水相に、酢酸エチル１リットルを添加し、相を分離する。水相を再生利用するのに対し、有機相は、この有機層の体積に対して１体積の脱イオン水で３回洗浄し、その後に濃縮することにより、白色固体（９．２ｇ）が得られる。
【００３７】
実施例４−タクロリムス一水和物の結晶化
固体生成物（９．２ｇ、タクロリムス８．５ｇを含有する）を、アセトニトリル７００ｍｌに溶解する。脱イオン水１２００ｍｌを、２５℃でゆっくりと（１〜２時間）添加し、この溶液を５℃に冷却し、５℃で１２〜１４時間静置し、次いで濾過する。高純度タクロリムス（ＨＰＬＣ％面積＞９９％）７．０ｇが得られる。
【００３８】
実施例５−ＡｇＮＯ3水溶液の再生利用による顆粒状炭素上での精製
残留有機溶媒を、実施例２の水相から除去して２９０ｍｌの溶液にし、次いでこの溶液にアセトン２９０ｍｌを添加する。
【００３９】
実施例１で述べた手順により得られた油相に、再生利用した水／アセトン溶液１８０ｍｌを添加する。ＡｇＮＯ3  １１．２５ｇを含有する５０／５０の水／アセトン溶液１５０ｍｌで事前に調整された、顆粒状炭素ＧＡＣ  １２４０  ＰＬＵＳ（ＣＥＣＡ  ＩＴＡＬＩＡＮＡ製）１００ｍｌを含有するカラムに、得られた溶液を投入する。その後、再生利用した水／アセトン溶液４００ｍｌを溶離する。得られた溶液を蒸発させて３５０ｍｌにし、酢酸エチル３５０ｍｌを添加し、次いで相を分離し、水相を再生利用するのに対し、有機相は実施例６で報告される内容にしたがって後処理する。
【００４０】
実施例６−水性ＡｇＮＯ3溶液の再生利用によるセルロース上での精製
残留有機溶媒を、実施例３により得られた再生利用された水相から除去して、ｎ−ヘキサン２リットルが添加された溶液６リットルが得られる。
【００４１】
実施例５の有機相に、セルロース  ＳＯＬＫＡ  ＦＬＯＣ（ＤＩＣＡＬＩＴＥ）１６０ｇを添加する。懸濁液を、有機相が除去されるまで蒸発させる。得られた固体に、再生利用によって得られた水／ｎ−ヘキサン溶液２リットルを添加し、室温で３０分間攪拌し、次いで固体を濾過する。抽出および濾過を４回繰り返し、相を分離する。水相に酢酸エチル１リットルを添加し、相を分離する。水相を再生利用するのに対し、有機相は、この有機層の体積に対して１体積の脱イオン水で３回洗浄し、その後に濃縮することにより、白色固体生成物（９．２ｇ）が得られる。
【００４２】
実施例７−タクロリムス一水和物の結晶化
固体生成物（９．２ｇ、タクロリムス８．５ｇを含有する）を、アセトニトリル７００ｍｌに溶解する。２５℃の脱イオン水１２００ｍｌをゆっくりと（１〜２時間）添加し、この溶液を５℃に冷却し、次いで５℃で１２〜１４時間静置させ、濾過する。高純度のタクロリムス（ＨＰＬＣ％面積＞９９％）７．０ｇが得られる。
【国際調査報告】
2009502993.tif 000007
2009502993.tif 000008
2009502993.tif 000009
2009502993.tif 000010