(57)【要約】  修飾された生合成ポリヌクレオチド融合阻害剤、ならびにそれの製造方法および使用を提供する。
2009514533.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項２】
上記生合成ポリペプチド融合阻害剤が、１つ以上の翻訳後修飾を含んでいる、請求項１に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項３】
上記ポリペプチドが、リンカー、ポリマー、または生物活性分子と連結している、請求項１に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項４】
上記ポリペプチドが、水溶性ポリマーと連結している、請求項３に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項５】
上記ポリペプチドが、２官能性ポリマー、２官能性リンカー、または少なくとも１つの別の生合成ポリペプチド融合阻害剤と連結している、請求項１に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項６】
上記２官能性リンカーまたはポリペプチドが、第２ポリペプチドと連結している、請求項５に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項７】
上記第２ポリペプチドが、生合成ポリペプチド融合阻害剤である、請求項６に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項８】
上記水溶性ポリマーが、ポリ（エチレングリコール）部分を含んでいる、請求項４に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項９】
上記水溶性ポリマーが、上記生合成ポリペプチド融合阻害剤に存在する非天然にコードされたアミノ酸と連結している、請求項４に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項１０】
上記非天然にコードされたアミノ酸が、リンカー、ポリマー、または生物活性分子と反応性であり、該リンカー、ポリマーまたは生物活性分子は、上記ポリペプチドにおける２０の一般アミノ酸の何れかと非反応性である、請求項１に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項１１】
上記非天然にコードされたアミノ酸が、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、セミカルバジド基、アジド基またはアルキン基を含んでいる、請求項１に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項１２】
上記非天然にコードされたアミノ酸が、カルボニル基を含んでいる、請求項１１に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項１３】
上記非天然にコードされたアミノ酸の構造が、
（ここで、ｎは０−１０であり、Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであり、Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、置換アルキル、および置換アリールであり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、Ｒ４は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である）である、請求項１２に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項１４】
上記非天然にコードされたアミノ酸が、アミノオキシ基を含んでいる、請求項１１に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項１５】
上記非天然にコードされたアミノ酸が、ヒドラジド基を含んでいる、請求項１１に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項１６】
上記非天然にコードされたアミノ酸が、ヒドラジン基を含んでいる、請求項１１に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項１７】
上記非天然にコードされたアミノ酸の残基が、セミカルバジド基を含んでいる、請求項１１に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項１８】
上記非天然にコードされたアミノ酸の残基が、アジド基を含んでいる、請求項１１に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項１９】
上記非天然にコードされたアミノ酸の構造が、
（ここで、ｎは０−１０であり、Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであるか、あるいは存在しておらず、Ｘは、Ｏ、Ｎ、またはＳであるか、あるいは存在しておらず、ｍは０−１０であり、Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である）である、請求項１８に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項２０】
上記非天然にコードされたアミノ酸が、アルキン基を含んでいる、請求項１１に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項２１】
上記非天然にコードされたアミノ酸の構造が、
（ここで、ｎは０−１０であり、Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであり、Ｘは、Ｏ、Ｎ、またはＳであるか、あるいは存在しておらず、ｍは０−１０であり、Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である）である、請求項２０に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項２２】
上記水溶性ポリマーが、約０．１ｋＤａから約１００ｋＤａまでの分子量を有している、請求項４に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項２３】
上記水溶性ポリマーが、約０．１ｋＤａから約５０ｋＤａまでの分子量を有している、請求項２２に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項２４】
カルボニル含有アミノ酸と、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基またはセミカルバジド基を含んでいる水溶性ポリマーとを反応させることによって作製された、請求項４に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項２５】
上記アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、またはセミカルバジド基が、アミド結合を介して、上記水溶性ポリマーと連結している、請求項２４に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項２６】
カルボニル基を含んでいる水溶性ポリマーと、非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるポリペプチドとの反応によって作製された請求項４に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤であって、
上記非天然にコードされたアミノ酸が、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、またはセミカルバジド基を含んでいる生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項２７】
アルキン含有アミノ酸を含んでいる生合成ポリペプチド融合阻害剤と、アジド部分を含んでいる水溶性ポリマーとの反応によって作製された、請求項４に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項２８】
アジド含有アミノ酸を含んでいる生合成ポリペプチド融合阻害剤と、アルキン部分を含んでいる水溶性ポリマーとの反応によって作製された、請求項４に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項２９】
上記アジド基またはアルキン基が、アミド結合を介して水溶性ポリマーに連結している、請求項２９に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項３０】
上記水溶性ポリマーが、分枝状ポリマーまたはマルチアームポリマーである、請求項４に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項３１】
上記水溶性ポリマーの各分枝が、約１ｋＤａから約１００ＫＤａまでの分子量を有している、請求項３０に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項３２】
上記ポリペプチドが、アンタゴニストである、請求項１に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項３３】
上記ポリペプチドが、１つ以上の翻訳後修飾、リンカー、ポリマーまたは生物活性分子を含んでいる、請求項３２に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項３４】
上記ポリマーが、水溶性ポリマーおよびポリ（エチレングリコール）から成る群から選ばれる部分を含んでいる、請求項３３に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項３５】
生合成ポリペプチド融合阻害剤をコードする核酸配列と、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドを含んでおり、該ポリヌクレオチドが少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる、単離された核酸。
【請求項３６】
上記セレクターコドンが、アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン、および４塩基コドンから成る群から選ばれる、請求項３５に記載の単離された核酸。
【請求項３７】
請求項３に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤を作製する方法であって、
非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる単離された生合成ポリペプチド融合阻害剤と、該非天然にコードされたアミノ酸と反応する部分を含んでいるリンカー、ポリマー、または生物活性分子とを接触させる工程を含んでいる、方法。
【請求項３８】
上記ポリマーが、水溶性ポリマーおよびポリ（エチレングリコール）から成る群から選ばれる部分を含んでいる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
呼吸器合胞体ウイルスに感染している患者を治療するため、または呼吸器合胞体ウイルスの感染を予防するための方法であって、治療的有効量の請求項３８に記載の組成物を、上記患者に投与する工程を含んでいる方法。
【請求項４０】
請求項３５に記載の核酸を含んでいる細胞。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔発明の分野〕
本発明は、膜融合事象を阻害し、少なくとも１つの非天然にコードされたアミノ酸を利用して作製されているか、または該アミノ酸を含んでいる、生合成ポリペプチドおよび融合タンパク質に関する。
【０００２】
〔発明の背景〕
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、パラミクソウイルス科のファミリーに属するウイルスである。ＲＳＶは、幼児、高齢者、および免疫障害者（移植患者など）における下気道感染症の主な原因であり、このウイルスに対する有効な治療やワクチンは、未だに存在しない。ＲＳＶは、１１のタンパク質をコードする一本鎖のマイナスセンスＲＮＡウイルスである。１１のタンパク質のうち９は、構造タンパク質であり、うち２つは、ウイルスの複製に関わる調節タンパク質である。ＲＳＶは、主要な２つの表面糖タンパク質、つまりウイルスを宿主の受容体に結合させる受容体結合タンパク質（Ｇ）と、ウイルスの宿主細胞内への侵入を可能にする融合（Ｆ）タンパク質とを含んでいる。中性ｐＨにおいてＲＳＶエンベロープの融合が起こると、感染された細胞と、それに隣接する非感染細胞との間において、巨大な融合細胞の形成が誘導される。上記Ｆタンパク質が切断されると、２つのジスルフィドにより連結したポリペプチドが生じる（Ｃ末端からのポリペプチドはＦ１と名付けられており、Ｎ末端からのポリペプチドはＦ２と名付けられている）。ＨＲ−ＣとＨＲ−Ｎと名付けられた７回繰り返し（ヘプタドリピート）配列の２つが、これらの２つの領域に隣接している。これら配列は、ウイルスと宿主細胞の膜とを融合させ得るヘアピン様構造の３量体を形成する。上記７回繰り返し配列の領域は、ＨＲ−Ｎに結合することから、ヘアピン構造の形成とその後の融合とを抑制するペプチド阻害剤を設計するための標的となる可能性が高い。また、このＲＳＶの融合過程は、ＨＩＶの融合機構に非常に類似している。
【０００３】
２つの独立した研究が、ＲＳＶの侵入を阻害するポリペプチドの開発に焦点を当てている。ＨＲ−Ｃ領域に由来するペプチドは、ＨＩＶの融合を妨げるＺＵＺＥＯＮ（登録商標）製品（Ｒｏｃｈｅ）と概念的に類似している。また、一般的な陰イオン性の特性を有するペプチド（GTPase RhoAに由来するペプチドなど）が、ＲＳＶに対する抗ウイルス活性を有していることが実証された。該ＲｈｏＡに由来するペプチドは、明らかに、ウイルスの細胞表面への接触を阻害する別の機構を介して作用する。
【０００４】
ペプチドは、研究および医療の現場において広く使用されている。そして、ペプチド製品の製造および性能に関する課題が取り組まれるにつれて、ペプチドの重要性が増加すると期待できる。本明細書に記載の治療用ポリペプチドのような治療用ポリペプチドのことを、生合成ポリペプチド融合阻害剤（ＢＰＦＩ）と呼ぶ。
【０００５】
未変性のポリペプチドまたはその類似体を治療に用いたとき、それらの分解および／または排除が迅速に行われることが、一般的に知られている。長期間にわたって、治療剤の血中濃度を高く維持することが望まれる場合には、治療剤の迅速な排除が不利になる。なぜなら、治療剤を繰り返し投与することが必要になるからである。いくつかの場合では、適切な薬学的組成物を適用することによって、ペプチドの放出プロフィールに影響を与えることができるが、この手法は、様々な欠点を有しており、一般に適用することができない。
【０００６】
ペプチド中のペプチド結合は、ペプチダーゼによって、ペプチド結合を横切って水分子が挿入されることによって破壊される。一般的に、ほとんどのペプチドは、体内でペプチダーゼによって数分以内に破壊される。さらに、いくつかのペプチダーゼは、特定の種類のペプチドに特異的であり、これにより、該ペプチドの分解がさらに迅速に行われる。したがって、ペプチドが治療剤として用いられる場合には、ペプチダーゼの作用によってペプチドが体内で素早く分解されるため、その活性は減少する。
【０００７】
この不利な点を克服するための１つの方法は、興味のある治療ペプチドのうちのいくつかが分解したとしても、残留物に十分な治療的効果があるように、興味のある治療ペプチドを患者に大量に投与する方法である。しかし、この方法は、患者にとって極めて心地よくないものである。というのも、ほとんどの治療用ポリペプチドは、経口で投与されることができないため、治療用ポリペプチドを定期的に注入するか、静脈注射によって頻繁に投与するか、あるいは、不便な経路である皮下注射によって頻繁に投与しなければならないからである。また、頻繁に投与しなければならないと、多くの見込みあるペプチド療法にかかる治療単位あたりの計画費用が、許容し難いほど高くなってしまう。また、分解したペプチドが多量に存在すると、望ましくない副作用が生じる虞がある。
【０００８】
親水性のポリマーであるポリ（エチレングリコール）（略してＰＥＧ）を共有結合させることは、水溶性の増加、血中半減期の増加、治療半減期の増加、免疫原性の調整、生物活性の調整、または、多くの生物活性分子（例えば、タンパク質、ペプチド、および特定の疎水性分子）の循環時間の延長を行う方法、あるいは、生物へ利用するための方法である。ＰＥＧはこれまで、医薬品、人工移植物、および生体適合性と毒性の欠如と免疫原性の欠如とが重要である他の用途に、広く用いられてきた。ＰＥＧの所望の性質を最大限に引き出すためには、ＰＥＧポリマーが結合することに一般的に関連する有利な特性が得られ、かつ親分子の生物活性（bioactivity）に悪影響を与えない程度に、生物活性分子に結合したＰＥＧポリマーの総分子量と水和状態とが十分高くなければならない。なお、ここでいう、有利な特性としては、例えば、水溶性の増加および循環半減期の増加が挙げられる。
【０００９】
ＰＥＧ誘導体は、反応性の化学官能基（リジン残基、システイン残基、ヒスチジン残基など）、Ｎ末端、および炭水化物部分を介して、生物活性分子と頻繁に連結される。多くの場合、タンパク質および他の分子では、ポリマーとの結合に利用可能な反応部位の数は限られている。ポリマーとの結合による修飾に最も適切な上記部位は、受容体結合に重要な役割を果たすとともに、上記分子の生物活性を保持するために必要であることが頻繁にある。したがって、生物活性分子における上記反応部位とポリマー鎖とが無差別的に結合すれば、ポリマーにより修飾された分子の生物活性が顕著に減少するか、または完全に失われるということが、たびたび起こる。「R. Clarkら, (1996), J. Biol. Chem.. 271:21969-21977」。所望の利点を標的分子に与えるほど十分なポリマー分子量を有する接合体を形成するために、先行技術における手法は、通常、ポリマーの数多くの腕に分子を無差別に結合させる工程を含んでいるため、親分子の生物活性が減少または完全に失われるという危険性を増加させる。
【００１０】
タンパク質にＰＥＧ誘導体を結合させる場を形成する反応部位は、タンパク質の構造によって決定される。酵素などのタンパク質は、Ｈ２Ｎ−−ＣＨＲ−−ＣＯＯＨという一般構造を有するアルファ−アミノ酸の様々な配列から構成される。あるアミノ酸のアルファアミノ部分（Ｈ２Ｎ−−）は、隣接するアミノ酸のカルボキシ部分（−−ＣＯＯＨ）と結合して、−−（ＮＨ−−ＣＨＲ−−ＣＯ）ｎ−−として表すことができるアミド結合を形成している（下付き文字の「ｎ」は、数百または数千に相当し得る）。Ｒで表される断片は、タンパク質の生物活性およびＰＥＧ誘導体の結合のための反応部位を含み得る。
【００１１】
例えば、アミノ酸がリジンである場合、アルファ位と同様にイプシロン位に−ＮＨ２部分が存在する。イプシロン位の−ＮＨ２は、基本的なｐＨという条件下において反応性である。ＰＥＧによるタンパク質の誘導体化に関する分野の技術の多くは、タンパク質に存在するリジン残基のイプシロン位の−ＮＨ２部分に結合するためのＰＥＧ誘導体を開発することに向けられていた。「“Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation”, Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003, pp. 1-17」。しかし、上記ＰＥＧ誘導体の全ては、それらを、タンパク質の表面に頻繁に多く存在するリジン残基に対して選択的に取り付ることができないという、共通の制限を有している。このことは、タンパク質の活性にとってリジン残基が重要な場合（例えばリジン残基が酵素の活性部位に存在する場合）、または、リジン残基が受容体結合部位に存在する場合のような、タンパク質と他の生体分子との相互作用の仲介に、リジン残基が関与する場合には、重大な制限になり得る。
【００１２】
タンパク質にＰＥＧを付加する既存の方法の第２問題であって、同等の重要性を有する問題は、ＰＥＧ誘導体と所望の残基以外の残基との望ましくない副反応が起こり得ることである。ヒスチジンは、−−Ｎ（Ｈ）−−という構造で表される反応性のイミノ部分を含んでいるが、イプシロン位の−−ＮＨ２と反応する多くの化学反応種は、−−Ｎ（Ｈ）−−と反応することもできる。同様に、アミノ酸のシステインの側鎖は、−ＳＨという構造で表される遊離のスルヒドリル基を生じる。いくつかの事例では、リジンのイプシロン位の−−ＮＨ２基を標的とするＰＥＧ誘導体は、システイン、ヒスチジンまたは他の残基とも反応する。このため、ＰＥＧにより誘導体化された生理活性分子の異種混合物ともいうべき複合体が生じるし、また標的とされる生理活性分子の活性が破壊される危険性が生じる。よって、１つの化学官能基をタンパク質内の１つの部位に導入することができるＰＥＧ誘導体を開発することが望ましく、これにより、該タンパク質の表面の明確に規定されかつ予測できる特定の部位において、１つ以上のＰＥＧポリマーを生理活性分子に選択的に結合させることができる。
【００１３】
リジン残基以外にも、他のアミノ酸側鎖（システイン、ヒスチジン、およびＮ−末端など）を標的とする活性型ＰＥＧ試薬の開発に、甚大な技術的努力が注ぎ込まれてきた。例えば、米国特許第６，６１０，２８１号明細書（参照によって本明細書に組み込まれる）、および「“Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation”, Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003, pp. 1-17」を参照のこと。部位特異的突然変異誘発法、および他の技術的に公知の手法を用いて、タンパク質の構造にシステイン残基を、部位特異的に導入することができる。そして、得られる遊離のスルヒドリル部分を、ＰＥＧ誘導体と反応させて、チオール反応性官能基を生じさせることができる。しかし、この手法は、遊離のスルヒドリル基の導入によって、生じるタンパク質の発現、折りたたみおよび安定性が悪化することがあるという問題を抱えている。したがって、１つ以上のＰＥＧポリマーをタンパク質に選択的に結合させることができるとともに、スルヒドリル基およびタンパク質に一般的に発見される他の化学官能基と共生できる（すなわち、そのような官能基と望ましくない副反応を起こさない）化学官能基を、生理活性分子に導入する手段を有することが望ましいと考えられる。
【００１４】
従来技術を標本調査すれば分かるように、タンパク質の側鎖（特に、リジンアミノ酸の側鎖における−−ＮＨ２部分、およびシステインの側鎖における−ＳＨ部分）に結合するために開発された上記誘導体の多くは、それらの合成および使用について問題を有していることが分かった。あるものは、加水分解されて、変質または分解する不安定な結合、あるいは水溶液の環境（血流など）において不安定である不安定な結合を、タンパク質と形成してしまう。あるものは、より安定な結合を形成するが、結合が形成される前に加水分解される。このことは、タンパク質を結合させることができる前に、ＰＥＧ誘導体における反応基が不活性化され得ることを意味している。あるものは、若干の毒性を有しているため、インビボでの使用にはあまり適さない。あるものは、反応が遅すぎるため、実際には役に立たない。あるものは、タンパク質の活性に関与する部位に結合することによって、タンパク質の活性を消失させてしまう。あるものは、それらが結合する部位に特異的ではなく、このため、所望の活性が失われることや、結果の再現性が乏しくなることがあり得る。ポリ（エチレングリコール）部分によるタンパク質の修飾に関連した課題を克服するために、より安定なＰＥＧ誘導体（参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，６０２，４９８号明細書）、または分子上および表面上のチオール部分と選択的に反応するＰＥＧ誘導体（参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，６１０，２８１号明細書）が開発された。選択的に反応して、安定な化学結合を形成するためのきっかけがあるまで、生理的環境下において化学的に不活性なＰＥＧ誘導体が、明らかに技術的に必要とされている。
【００１５】
近年、タンパク質の部位特異的修飾に関連する多くの制限を克服する見込みのある、タンパク質科学における完全に新しい技術が報告された。具体的には、原核生物であるEschrichia coli（E. coli）（例えば、「L.Wangら(2001),Science292:498-500」）、および真核生物であるSacchromyces cerevisiae（S. cerevisiae）（例えば、「J.Chinら, Science 301: 964-7(2003)」）のタンパク質生合成機構に、新規の構成要素が加えられた。これにより、インビボにおいて、タンパク質へ非遺伝的にコードされたアミノ酸を組み込むことがが可能になった。これまでにない化学的、物理的または生物学的性質を有する多数の新たなアミノ酸が、この手法によって、アンバーコドン、ＴＡＧに反応して、E.coliおよび酵母においてタンパク質へ高い忠実性で効率的に組み込まれた。例えば、「J.W.Chinら, (2002) Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027」、「J.W.Chin,& P.G.Schultz, (2002), ChemBioChem 3(11):1135-1137」、「J.W.Chinら, (2002), PNAS United States of America 99:11020-11024」、および、「L. Wang,& P.G.Schultz, (2002), Chem. Comm.,1:1-11」を参照のこと。なお、上記新たなアミノ酸としては、例えば、光親和性標識されたアミノ酸、光異性化性（photoisomerizable）アミノ酸、ケトアミノ酸、およびグリコシル化アミノ酸が挙げられる。これらの研究では、（１）タンパク質中に存在せず、（２）２０の遺伝的にコードされた一般アミノ酸において存在する全ての官能基に対して化学的に不活性であり、（３）使用したときに、選択的かつ効率よく反応して安定な共有結合を形成し得る化学官能基（ケトン基、アルキン基およびアジド部分など）を選択的且つ普通に導入できることが証明された。
【００１６】
非遺伝的にコードされた（遺伝的にコードされていないアミノ酸）を、タンパク質に組み込むことにより、天然に生じる官能基（リジンのイプシロン位の−ＮＨ２、システインのスルフィドリル（−ＳＨ）、ヒスチジンのイミノ基など）に代わる有益な化学官能基を導入することができる。２０の一般的な遺伝的にコードされたアミノ酸において見られる官能基に対して不活性であるが、非天然アミノ酸に組み込まれ得る官能基と首尾よく効率的に反応して、安定な結合を形成する特定の化学官能基が知られている。例えば、アジド基およびアセチレン基は、触媒量の銅が存在する水溶性の条件下において、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］の付加環化反応を受けることが、公知である。例えば、「Tornoeら, (2002) J. Ore. Chem. 67:3057-3064」、および「Rostovtsevら, (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41 :2596-2599」を参照のこと。アジド部分をタンパク質の構造に導入することは、例えば、タンパク質に見られるアミン、スルヒドリル、カルボン酸、ヒドロキシル基に対して化学的に不活性であるが、アセチレン部分と円滑かつ効率よく反応して付加環化産物を形成する官能基を組み込むことであるといえる。重要なことは、アセチレン部分が存在しないときには、他のタンパク質側鎖が存在する生理的条件下において、アジドは化学的に不活性でかつ非反応性であり続けるということである。
【００１７】
本発明は、取り分け、ＢＰＦＩの活性および製造に関連した問題を解決するものであり、生物学的性質、および薬理学的性質が改善された（例えば、治療半減期が改善された）ＢＰＦＩの製造を解決するものでもある。
【００１８】
〔発明の概要〕
本発明は、ＨＲ−Ｃに由来するポリペプチドの改善された螺旋傾向（helical propensity）を有するＲＳＶの侵入阻害剤を提供する。また、本発明は、融合阻害剤の活性と陰イオン性ペプチドの活性との組み合わせを有するＲＳＶ侵入阻害剤を提供する。また、本発明は、ペプチドの薬理学的性質を改善するために、部位特異的にＰＥＧが付加された（PEGylation）ＢＰＦＩを提供する。本発明は、１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる生合成ポリペプチド融合阻害剤（ＢＰＦＩ）を提供する。生合成ポリペプチド融合阻害剤としては、例えば、膜融合阻害ペプチドおよび陰イオン性ペプチドが挙げられる。本発明には、治療活性を有する任意のＢＰＦＩ、その断片、類似体またはバリアントを用いてもよい。本発明に用いてもよいＢＰＦＩの多くの例が、提供されている。しかし、提供されているリストは、包括的ではなく、本発明に用いられてもよいＢＰＦＩの数もしくは種類をまったく限定するものではない。したがって、任意のＢＰＦＩ、および／または、新規ＢＰＦＩを含む任意のＢＰＦＩから製造される断片、類似体、およびバリアントを、本発明にしたがって修飾してもよいし、治療的に使用しても良い。
【００１９】
いくつかの実施形態では、ＢＰＦＩは、１つ以上の翻訳後修飾を含んでいる。いくつかの実施形態では、ＢＰＦＩは、リンカー、ポリマー、または生物活性分子と連結している。いくつかの実施形態では、ＢＰＦＩは、２官能性ポリマー、２官能性リンカー、または少なくとも１つの別のＢＰＦＩと連結している。
【００２０】
いくつかの実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸は水溶性ポリマーと連結している。いくつかの実施形態では、該水溶性ポリマーはポリ（エチレングリコール）部分を含んでいる。いくつかの実施形態では、ポリ（エチレングリコール）分子は、２官能性ポリマーである。いくつかの実施形態では、２官能性ポリマーは、第２ポリペプチドと連結している。いくつかの実施形態では、第２ポリペプチドは、ＢＰＦＩである。
【００２１】
いくつかの実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸は、水溶性ポリマーと連結している。いくつかの実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸は、リンカーにより、水溶性ポリマーと連結しているか、もしくは水溶性ポリマーと結合している。いくつかの実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸は、生物分解性のリンカーを有する水溶性ポリマーと連結している。いくつかの実施形態では、生分解性のリンカーは、ＢＰＦＩを含んでいるプロドラッグを形成するために用いられ得る。このプロドラッグのアプローチの１例を挙げると、水溶性ポリマーは、ＢＰＦＩの活性を遮断しているが、リンカーの分解により活性型ＢＰＦＩが放出される。いくつかの実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸は、アシル部分またはアシル鎖と連結している。いくつかの実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸は、リンカーによってアシル部分またはアシル鎖と連結している。いくつかの実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸は、ポリ（エチレングリコール）リンカーまたはプロドラッグによって、アシル部分またはアシル鎖と連結している。いくつかの実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸は、血清アルブミンと連結している。いくつかの実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸は、リンカーによって血清アルブミンと連結している。いくつかの実施形態では、リンカーは、ポリ（エチレングリコール）またはプロドラッグである。いくつかの実施形態では、リンカーは、２重開裂（dual cleavage）プロドラッグである。２重開裂プロドラッグは、工程１においてアルブミンなどの分子が制御放出され、工程２においてリンカーまたはその一部を放出する第２開裂が起こるというものである。
【００２２】
いくつかの実施形態では、ＢＰＦＩは、ＢＰＦＩに存在する２つのアミノ酸の間に分子内架橋を含んでいる。いくつかの実施形態では、ＢＰＦＩは、１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる。架橋された２つの残基のうち１つは、非天然にコードされたアミノ酸または天然にコードされたアミノ酸であってもよい。非天然アミノ酸は、リンカー、ポリマー、または生物活性分子によって、接合されていてもよい。
【００２３】
いくつかの実施形態では、ＢＰＦＩは、ポリ（エチレングリコール）部分を含んでいる水溶性ポリマーと連結しているアミノ酸を少なくとも２つ含んでいる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸は、非天然にコードされたアミノ酸である。
【００２４】
いくつかの実施形態では、１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸は、ＢＰＦＩ（ＨＲ−Ｃペプチド、ＨＲ−Ｎペプチド、もしくは陰イオン性ペプチドなど）、これらペプチドの任意の１つ以上の融合体、またはこれらペプチドの任意の１つ以上の断片の任意の位置に組み込まれているか、（アミノ末端における）第１アミノ酸の前に組み込まれているか、または、カルボキシ末端において付加されているか、あるいはそれらの任意の組み合わせに組み込まれている。いくつかの実施形態では、１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸は、ＢＰＦＩのアミノ酸配列内の任意の位置に組み込まれている。
【００２５】
いくつかの実施形態では、上記位置の１つ以上における非天然に生じるアミノ酸は、水溶性ポリマーと連結している。
【００２６】
いくつかの実施形態では、本発明のＢＰＦＩポリペプチドは、１つ以上の非天然に生じるアミノ酸を、アンタゴニストを提供するＢＰＦＩ配列に隣接する１つ以上のアミノ酸の位置か、もしくは該配列内の１つ以上のアミノ酸の位置において含んでいる。
【００２７】
いくつかの実施形態では、ＢＰＦＩは、ＢＰＦＩ受容体または結合パートナーに対するＢＰＦＩの親和性を調整する置換、付加もしくは欠失を含んでいる。ここで、上記結合パートナーとしては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、低分子、脂質、または核酸などが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＢＰＦＩは、置換、付加もしくは欠失されていない対応するＢＰＦＩの安定性と比較したときに、ＢＰＦＩの安定性が増加している置換、付加もしくは欠失を含んでいる。いくつかの実施形態では、ＢＰＦＩは、置換、付加もしくは欠失されていない対応するＢＰＦＩの免疫原性と比較したときに、ＢＰＦＩの免疫原性が調整されている置換、付加もしくは欠失を含んでいる。いくつかの実施形態では、ＢＰＦＩは、置換、付加もしくは欠失されていない対応するＢＰＦＩの血中半減期もしくは循環時間と比較したときに、ＢＰＦＩの血中半減期もしくは循環時間が調整されている置換、付加もしくは欠失を含んでいる。
【００２８】
いくつかの実施形態では、ＢＰＦＩは、置換、付加もしくは欠失されていない対応するＢＰＦＩの水溶解度と比較したときに、ＢＰＦＩの水溶解度が増加している置換、付加もしくは欠失を含んでいる。いくつかの実施形態では、ＢＰＦＩは、宿主細胞において製造される置換、付加もしくは欠失されていない対応するＢＰＦＩの溶解度と比較したときに、宿主細胞において製造されるＢＰＦＩの溶解度が増加している置換、付加もしくは欠失を含んでいる。いくつかの実施形態では、ＢＰＦＩは、置換、付加もしくは欠失されていない対応するＢＰＦＩの宿主細胞における発現またはインビトロにおける合成と比較したときに、ＢＰＦＩの宿主細胞における発現またはインビトロにおける合成が増加している置換、付加もしくは欠失を含んでいる。いくつかの実施形態では、ＢＰＦＩは、置換、付加もしくは欠失されていない対応するＢＰＦＩのペプチダーゼまたはプロテアーゼ感受性と比較したときに、ＢＰＦＩのペプチダーゼまたはプロテアーゼ感受性が増加している置換、付加もしくは欠失を含んでいる。いくつかの実施形態では、ＢＰＦＩは、置換、付加もしくは欠失されていない対応するＢＰＦＩのＢＰＦＩ受容体または結合パートナーのシグナル伝達活性と比較したときに、ＢＰＦＩ受容体または結合パートナーのシグナル伝達活性が調整されている置換、付加もしくは欠失を含んでいる。いくつかの実施形態では、ＢＰＦＩは、置換、付加もしくは欠失されていない対応するＢＰＦＩの受容体などの別の分子に対する結合と比較したときに、受容体などの別の分子に対する結合が調整されている置換、付加もしくは欠失を含んでいる。ＢＰＦＩは、置換、付加もしくは欠失されていない対応するＢＰＦＩが結合した後の結合パートナーの立体構造もしくは１つ以上の生物活性と比較したときに、結合パートナーの立体構造もしくは１つ以上の生物活性が調整されている置換、付加もしくは欠失を含んでいる。
【００２９】
いくつかの実施形態では、ＢＰＦＩにおけるアミノ酸の置換は、天然に生じるアミノ酸または非天然に生じるアミノ酸によるものであってもよい。だたし、少なくとも１つの置換は、非天然にコードされたアミノ酸によるものである。
【００３０】
いくつかの実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸は、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、セミカルバジド基、アジド基またはアルキン基を含んでいる。
【００３１】
いくつかの実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸はカルボニル基を含んでいる。いくつかの実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸の構造は、
【００３２】
【化１】
2009514533.tif 000003
【００３３】
（ここで、ｎは０−１０であり、Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであり、Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、置換アルキル、および置換アリールであり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、Ｒ４は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である）である。
【００３４】
いくつかの実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸は、アミノオキシ基を含んでいる。いくつかの実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸は、ヒドラジド基を含んでいる。いくつかの実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸は、ヒドラジン基を含んでいる。いくつかの実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸の残基は、セミカルバジド基を含んでいる。
【００３５】
いくつかの実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸の残基はアジド基を含んでいる。いくつかの実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸の構造は、
【００３６】
【化２】
2009514533.tif 000004
【００３７】
（ここで、ｎは０−１０であり、Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであるか、あるいは存在しておらず、Ｘは、Ｏ、Ｎ、またはＳであるか、あるいは存在しておらず、ｍは０−１０であり、Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である）である。
【００３８】
いくつかの実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸は、アルキン基を含んでいる。いくつかの実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸の構造は、
【００３９】
【化３】
2009514533.tif 000005
【００４０】
（ここで、ｎは０−１０であり、Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであり、Ｘは、Ｏ、Ｎ、またはＳであるか、あるいは存在しておらず、ｍは０−１０であり、Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である）である。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＢＰＦＩアゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト、部分アンタゴニスト、またはインバースアゴニストである。いくつかの実施形態では、ＢＰＦＩアゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト、部分アンタゴニスト、またはインバースアゴニストは、水溶性ポリマーと連結している非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）部分を含んでいる。いくつかの実施形態では、ＢＰＦＩアゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト、部分アンタゴニスト、またはインバースアゴニストは、非天然にコードされたアミノ酸、および１つ以上の翻訳後修飾、リンカー、ポリマーまたは生物活性分子を含んでいる。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーと連結している非天然にコードされたアミノ酸は、ＢＰＦＩの受容体結合領域内に存在するか、またはＢＰＦＩの受容体結合を妨害する。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーと連結している非天然にコードされたアミノ酸は、結合パートナーに結合するＢＰＦＩの領域内に存在するか、またはＢＰＦＩと結合パートナーとの結合を妨害する。
【００４２】
また、本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列に、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドを含んでいる、単離された核酸を提供する。この単離された核酸において、該ポリヌクレオチドは、少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる。いくつかの実施形態では、セレクターコドンは、アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン、および４塩基コドンから成る群から選ばれる。
【００４３】
また、本発明は、水溶性ポリマーと連結しているＢＰＦＩを作製する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる単離されたＢＰＦＩと、該非天然にコードされたアミノ酸と反応する部分を含んでいる水溶性ポリマーとを接触させる工程を含んでいる。いくつかの実施形態では、ＢＰＦＩに組み込まれている非天然にコードされたアミノ酸は、水溶性ポリマーと反応性であり、該水溶性ポリマーは、２０の一般アミノ酸の何れかと非反応性である。いくつかの実施形態では、ＢＰＦＩに組み込まれる非天然にコードされたアミノ酸は、リンカー、ポリマー、または生物活性分子と反応性であり、該リンカー、ポリマーまたは生物活性分子は、上記ポリペプチドにおける２０の一般アミノ酸の何れかと非反応性である。
【００４４】
いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーと連結しているＢＰＦＩは、カルボニル含有アミノ酸と、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基またはセミカルバジド基を含んでいるポリ（エチレングリコール）分子とを反応させることによって作製される。いくつかの実施形態では、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、またはセミカルバジド基が、アミド結合を介して、ポリ（エチレングリコール）分子と連結している。
【００４５】
いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーと連結しているＢＰＦＩは、カルボニル基を含んでいるポリ（エチレングリコール）分子と、非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるポリペプチドとの反応によって作製されたものであって、上記非天然にコードされたアミノ酸は、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、またはセミカルバジド基を含んでいるものである。
【００４６】
いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーと連結しているＢＰＦＩは、アルキン含有アミノ酸を含んでいるＢＰＦＩと、アジド部分を含んでいるポリ（エチレングリコール）分子との反応によって作製される。いくつかの実施形態では、アジド基またはアルキン基は、アミド結合を介してポリ（エチレングリコール）分子に連結している。
【００４７】
いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーと連結しているＢＰＦＩは、アジド含有アミノ酸を含んでいるＢＰＦＩと、アルキン部分を含んでいるポリ（エチレングリコール）分子との反応によって作製される。いくつかの実施形態では、アジド基またはアルキン基は、アミド結合を介してポリ（エチレングリコール）分子に連結している。
【００４８】
いくつかの実施形態では、ポリ（エチレングリコール）分子は、約０．１ｋＤａから約１００ｋＤａまでの分子量を有している。いくつかの実施形態では、ポリ（エチレングリコール）分子は、０．１ｋＤａから５０ｋＤａまでの分子量を有している。
【００４９】
いくつかの実施形態では、ポリ（エチレングリコール）分子は、分枝状ポリマーである。いくつかの実施形態では、分枝状ポリマーであるポリ（エチレングリコール）の各分枝は、１ｋＤａから１００ＫＤａまでの分子量、または１ｋＤａから５０ｋＤａまでの分子量を有している。
【００５０】
いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーと連結しているＢＰＦＩは、ポリアルキレングリコール部分を含んでいる。いくつかの実施形態では、ＢＰＦＩに組み込まれている非天然にコードされたアミノ酸の残基は、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、ヒドラジン、セミカルバジド基、アジド基、またはアルキン基を含んでいる。いくつかの実施形態では、ＢＰＦＩに組み込まれている非天然にコードされたアミノ酸の残基は、カルボニル部分を含んでおり、水溶性ポリマーは、アミノオキシ部分、ヒドラジド部分、ヒドラジン部分、またはセミカルバジド部分を含んでいる。いくつかの実施形態では、ＢＰＦＩに組み込まれている非天然にコードされたアミノ酸の残基は、アルキン部分を含んでおり、水溶性ポリマーは、アジド部分を含んでいる。いくつかの実施形態では、ＢＰＦＩに組み込まれている非天然にコードされたアミノ酸の残基は、アジド部分を含んでおり、水溶性ポリマーはアルキン部分を含んでいる。
【００５１】
また、本発明は、非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるＢＰＦＩと、薬学的に許容可能な担体とを含有している組成物を提供する。いくつかの実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸は、水溶性ポリマーと連結している。
【００５２】
また、本発明は、セレクターコドンを含んでいるＢＰＦＩをコードするポリヌクレオチドを含有する細胞を提供する。いくつかの実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸をＢＰＦＩへ置換するために、直交化ＲＮＡシンテターゼおよび／または直交化ｔＲＮＡを含んでいる。
【００５３】
また、本発明は、非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるＢＰＦＩを作製する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＢＰＦＩをコードするポリヌクレオチド、直交化ＲＮＡシンテターゼおよび／または直交化ｔＲＮＡを含んでいる細胞を、ＢＰＦＩを発現させることができる条件下において培養する工程と、細胞および／または培地からＢＰＦＩを精製する工程とを含んでいる。
【００５４】
また、本発明は、ＢＰＦＩの治療半減期、血中半減期、または循環時間を増加させる方法を提供する。また、本発明は、ＢＰＦＩの免疫原性を調整する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、天然に生じるＢＰＦＩにおける任意の１つ以上のアミノ酸を非天然にコードされたアミノ酸で置換する工程、および／または、ＢＰＦＩをリンカー、ポリマー、水溶性ポリマーまたは生物活性分子に連結する工程を含んでいる。
【００５５】
また、本発明は、有効量の本発明のＢＰＦＩにより治療の必要な患者を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、治療的有効量の薬学的組成物を患者に投与する工程を含んでおり、該薬学的組成物は、非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるＢＰＦＩと、薬学的に許容可能な担体とを含有している、方法である。いくつかの実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸は、水溶性ポリマーと連結している。
【００５６】
本発明は、少なくとも１つのリンカー、ポリマー、または生物活性分子を含んでいるＢＰＦＩであって、該リンカー、ポリマー、または生物活性分子が、リボソームにおいてポリペプチドに組み込まれた非天然にコードされたアミノ酸の官能基を介して該ポリペプチドに結合しているＢＰＦＩを提供する。いくつかの実施形態では、ＢＰＦＩは、１つのＰＥＧが付加されている。また、本発明は、１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸が＠結合したリンカー、ポリマー、または生物活性分子を含んででいるＢＰＦＩであって、上記非天然にコードされたアミノ酸が、ポリペプチドの予め選択された部位にリボソームにおいて組み込まれたＢＰＦＩを提供する。
【００５７】
別の実施形態では、１つ以上の非天然に生じるアミノ酸を含んでいるＢＰＦＩとＰＥＧなどの別の分子との接合によって、非天然アミノ酸の接合に利用される独特な（ｕｎｉｑｕｅ）化学反応のために、実質的に精製されたＢＰＦＩが提供される。１つ以上の非天然に生じるアミノ酸を含んでいるＢＰＦＩと、ＰＥＧなどの別の分子との接合を実施するときは、接合工程の前もしくは後に、実質的に純粋なＢＰＦＩを提供する他の精製技術を行ってもよい。
【００５８】
〔図面の簡単な説明〕
図１は、Ｔ２０およびＴＥＸのクローニングを示す図である。
【００５９】
図２は、ＢＰＦＩを製造するための戦略を示す図である。
【００６０】
図３は、ＴＥＸの螺旋解析を示す図である。
【００６１】
図４は、非天然にコードされたアミノ酸を組み込むためのセレクターコドンの抑圧を示す図である。
【００６２】
図５は、ＣＮＢｒによってペプチドを切断することにより、ＢＰＦＩが得られることを示す図である。
【００６３】
図６は、ＢＰＦＩ活性のアッセイを示す図である。
【００６４】
図７Ａおよび図７Ｂは、ウイルス感染に対するＢＰＦＩの阻害を示す図である。
【００６５】
図８は、ＢＰＦＩとＰＥＧとの接合を示す図である。
【００６６】
図９において、Ａは、非天然にコードされたアミノ酸をＴ−２０およびＴＥＸに組み込むためのコンストラクトを示す図であり、Ｂは、ＣＮＢｒ切断の前後のＴ−２０ポリペプチドを示す図である。
【００６７】
図１０は、野生型のＴ−２０とＴＥＸとにおける配列の比較を示す図である。アンバーコドンで置換されたコドンによってコードされた残基を、アスタリスクで示す。
【００６８】
図１１は、Ｔ−２０とＴＥＸとの抗ウイルス活性を検査するためのインビトロの融合アッセイを示す図である。
【００６９】
図１２において、ＡおよびＢは、それぞれＴ２０  ６５１の抑圧およびＴＥＸ  ６３６の抑圧を示すクマシー染色されたポリアクリルアミドゲルの図であり、ＣおよびＤは、それぞれＡおよびＢに示された試料のウエスタンブロット（抗−Ｈｉｓ）を示す図であり、Ｅは、Ｔ−２０（Ｔ−２０−Ｍｕｔ６５１）およびＴＥＸ（ＴＥＸ−Ｍｕｔ６３６）において、ｐ−アセチル−フェニルアラニンで置換された残基をアスタリスクで示す図である。
【００７０】
図１３は、ペプチド融合阻害剤を有するＲＳＶ  Ｆタンパク質を示す図である。
【００７１】
〔定義〕
本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコール、細胞株、コンストラクト、および試薬に限定されるものではなく、変更されてもよいことを理解されたい。また、本明細書で用いられている専門用語は、特定の実施形態のみを記載するために用いられているのであって、本発明の範囲の限定を意図していないことを理解されたい。なお、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【００７２】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という単数形の形態は、内容から明らかに分かるものを除いて、複数形の形態も含んでいる。したがって、例えば、「ＢＰＦＩ」についての言及は、１つ以上のそのようなポリペプチドについての言及であるし、当業者に公知のそれらに等価なものなどを含んでいる。
【００７３】
特に定義されない限り、本明細書で用いられた全ての技術用語および科学用語は、本明細書に記載の本発明が属する技術における当業者の一人によって、一般的に理解される意味と同じ意味を有している。本明細書に記載の方法、装置、および材料と、同等または類似の任意のものを、本発明の実施または試験に用いることができるが、好ましい方法、装置、および材料を記載している。
【００７４】
本明細書に述べられている全ての出版物および特許は、記述および開示を目的として参照のために組み込まれる。例えば、出版物に記載された構造体および方法論は、目下記載される発明と関連して用いられる。本明細書において検討された出版物は、単に本出願の出願日よりも前の開示のために提供される。本明細書では、先行発明の長所または他の如何なる理由によって、本発明らが、上記開示よりも先行している資格を与えられないことを、承認していると解釈されることはない。
【００７５】
「ＢＰＦＩ」は、ペプチド結合によって共有結合しているアミノ酸残基のポリマーであり、セレクターコドンを有するｍＲＮＡから製造されるポリマーのことをいう。ＢＰＦＩには、例えば、ＨＲ−Ｃ、ＨＲ−Ｎ、および陰イオン性ペプチドが含まれる。ＢＰＦＩは、約１００アミノ酸よりも長いポリマーの断片であってもよい。また、ＢＰＦＩは、リーダー配列または分泌シグナル配列などの別のアミノ酸を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。ＢＰＦＩは、ＨＲ−Ｃ領域の断片、ＨＲ−Ｎ領域の断片、または陰イオン性ペプチドの断片、あるいはそれらの任意の組み合わせを含んでいる。また、ＢＰＦＩには、ＨＲ−Ｃに由来するペプチドおよび陰イオン性ペプチドを１つ以上含んでいる、ヘテロ２量体ペプチドまたは多量体ペプチドが含まれる。ＢＰＦＩ分子には、融合体が含まれる。該融合体としては、例えば、ＲｈｏＡペプチド−−−アミノ酸リンカー−−−ＨＲ−Ｃペプチド、ＨＲ−Ｃペプチド−−−アミノ酸リンカー−−−ＲｈｏＡペプチドが挙げられる。スペーサーの大きさは、変更可能であってもよい。スペーサーとしては、例えば、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーが挙げられる。リンカーはそれ自体、非天然にコードされたアミノ酸を含んでいてもよい。非天然にコードされたアミノ酸は、分子（ポリマー、生物活性分子、ＰＥＧ、または他の化学リンカーなど）と＠結合するために、ＲｈｏＡペプチドまたはＨＲ−Ｃペプチド中において置換されていてもよい。また、リンカーは、ＲｈｏＡペプチドとＨＲ−Ｃペプチドとを接続して、さらにポリマー、生物活性分子、ＰＥＧ、または他の化学リンカーなどのための付着点をリンカー自体に提供するようなＴ型であってもよい。
【００７６】
ポリペプチドに関する記述は、ペプチドに関する記述に、等しく適用される。また逆のことも同様である。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、天然に生じるアミノ酸ポリマー、および１つ以上のアミノ酸残基が非天然にコードされたアミノ酸であるアミノ酸ポリマーに適用される。当業者は、タンパク質に対する技術および修飾を、ポリペプチド、ペプチド、およびＢＰＦＩに適用可能であることを理解する。
【００７７】
用語「実質的に精製された」は、天然に生じている環境（すなわち、組み換えにより製造されるＢＰＦＩの場合は、自然状態の細胞または宿主細胞）において発見されるようなタンパク質を伴う構成要素、または該タンパク質と相互作用する構成要素を、実質的にもしくは本質的に有し得ないＢＰＦＩに関する。細胞内の材料を実質的に有し得ないＢＰＦＩには、例えば、タンパク質の調製物であって、該調製物に混入しているタンパク質（contaminating protein）が、乾燥重量で約３０％よりも少ない、約２５％よりも少ない、約２０％よりも少ない、約１５％よりも少ない、約１０％よりも少ない、約５％よりも少ない、約４％よりも少ない、約３％よりも少ない、約２％よりも少ない、または約１％よりも少ない調製物が挙げられる。ＢＰＦＩまたはそのバリアントが、宿主細胞によって組み換えにより製造されるとき、該タンパク質は、細胞の乾燥重量に対して約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、または約１％あるいはそれ以下の重量で存在し得る。ＢＰＦＩまたはそのバリアントが、宿主細胞によって組み換えにより製造されるとき、該タンパク質は、細胞の乾燥重量に対して約５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ、約７５０ｍｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ、約２５０ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ、または約１ｍｇ／Ｌあるいはそれ以下で培地に存在し得る。したがって、本発明の方法により製造されたときの「実質的に精製された」ＢＰＦＩの純度は、適切な方法（ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ、およびキャピラリー電気泳動など）により決定されたときに、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％であり、具体的には、上記純度は少なくとも約７５％、８０％、８５％であり、より具体的には少なくとも約９０％、純度が少なくとも約９５％、純度が少なくとも約９９％またはそれ以上である。
【００７８】
「組み換え宿主細胞」、または「宿主細胞」は、挿入方法（例えば、直接の取込、形質導入、ｆ−交配、または組み換え宿主細胞を作製する他の公知の方法）に関係無く、外因性のポリヌクレオチドを含んでいる細胞のことをいう。外因性のポリヌクレオチドを、非統合型のベクター（プラスミドなど）として維持してもよいし、あるいは、宿主のゲノムに統合してもよい。
【００７９】
本明細書で用いられるような用語「培養基」は、任意の宿主細胞を支持し得るまたは含み得る任意の培地、溶液、固体物、半固体物、または剛性の支持体を含んでいる。上記宿主細胞としては、例えば、細菌の宿主細胞、酵母の宿主細胞、昆虫の宿主細胞、植物の宿主細胞、真核生物の宿主細胞、哺乳類の宿主細胞、ＣＨＯ細胞またはE. coli、および細胞含有物が挙げられる。したがって、上記用語は、宿主細胞が成長した培養基（例えばＢＰＦＩが分泌された培養基）を包含している。さらに、そのような培養基は、増殖工程の前のものであってもよいし、後のものであってもよい。また、上記用語は、宿主細胞のライセートを含むバッファまたは試薬を包含してもよい。この場合、ＢＰＦＩが細胞内に製造されるので、ＢＰＦＩを放出させるために、宿主細胞は、溶解されるか、破壊される。
【００８０】
タンパク質のリフォールディングに関して本明細書で用いられるような「還元剤」は、還元状態においてスルヒドリル基を維持し、かつ分子内または分子間のジスルフィド結合を減少させる任意の化合物もしくは材料として定義される。適切な還元剤としては、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、ジチオエリスリトール、システイン、システアミン（２−アミノエタンチオール）、および還元型グルタチオンが挙げられる。多種多様な還元剤が、本発明の方法および組成物における使用に適切であることは、当業者に、直ちに明らかである。
【００８１】
タンパク質のリフォールディングに関して本明細書で用いられるような「酸化剤」は、酸化される化合物から電子を除去することができる、任意の化合物または材料として定義される。適切な酸化剤としては、例えば、酸化型グルタチオン、システイン、シスタミン、酸化型ジチオスレイトール、酸化型エリスリトール（oxidized erythreitol）、および酸素が挙げられる。多種多様な酸化剤が、本発明の方法における使用に適切であることは、当業者に、直ちに明らかである。
【００８２】
本明細書で用いられるような「変性剤」は、ポリペプチドの可逆的なアンホールディングを引き起こす任意の化合物または材料として定義される。変性剤の強さは、特定の変性剤の性質と濃度との両方により決定される。適切な変性剤としては、例えば、カオトロピック性物質、界面活性剤、有機溶媒、水混和性溶媒、リン脂質、またはそれらの２つ以上の組み合わせが挙げられる。適切なカオトロピック性物質としては、例えば、尿素、グアニジン、およびチオシアン酸ナトリウムが挙げられる。有用な界面活性剤としては、例えば、強界面活性剤（ドデシル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンエステル（TweenまたはTritonといった界面活性剤など）、サルコシル（Sarkosyl）など）、非イオン性の弱い界面活性剤（ジギトニンなど）、陽イオン性の弱い界面活性剤（Ｎ−＞２，３−（ジオレイオキシ）−プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムなど）、イオン性の弱い界面活性剤（コール酸ナトリウム、またはデオキシコール酸ナトリウムなど）、あるいは、両性イオン性の界面活性剤（スルホベタイン（Zwittergent）、３−（３−クロルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパンサルフェート（CHAPS）、および３−（３−クロルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（CHAPSO）など）が挙げられる。有機溶媒、水混和性溶媒（アセトニトリルなど）、低級アルカノール（特にＣ２−Ｃ４のアルカノール（エタノールまたはイソプロパノールなど））、または低級アルカンジオール（特に、Ｃ２−Ｃ４のアルカンジオール（エチレングリコールなど）を、変性剤として用いてもよい。本発明に有用なリン脂質は、天然に生じるリン脂質（ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、およびホスファチジルイノシトールなど）であってもよいし、または合成リン脂質誘導体もしくはバリアント（ジヘキサノイルホスファチジルコリンまたはジヘプタノイルホスファチジルコリンなど）であってもよい。
【００８３】
本明細書で用いられるような「リフォールディング」は、ジスルフィド結合含有ポリペプチドを、ジスルフィド結合に関して、不適切に折りたたまれた状態、あるいは折りたたまれていない状態から、未変性の立体構造もしくは適切に折りたたまれた立体構造に変形させる任意の処理、反応または方法のことである。
【００８４】
本明細書で用いられるような「コフォールディング」は、具体的には、互いに相互作用する少なくとも２つのポリペプチドを用いて、折りたたまれていないか、不適切に折りたたまれたポリペプチドを、未変性の適切に折りたたまれたポリペプチドへ変形させる、リフォールディングの処理、反応または方法のことをいう。
【００８５】
本明細書で用いられるような「ＢＰＦＩ」は、融合阻害剤、ならびにその類似体、アイソフォーム、模擬体、断片、ハイブリッドタンパク質、オリゴマーおよびマルチマー、相同物、糖鎖付加型バリアント、およびムテインの生物活性を少なくとも１つ有しているポリペプチドおよびタンパク質を含んでいるものである（なお、上記物質の生物活性は同じであかどうかは問わないし、さらに、それらを合成または製造する方法（組み換え方法（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、または他の形態の核酸から製造されるかどうかは問わない）、合成方法、トランスジェニック方法、遺伝子活性化方法）も問わない）。「Maniatis, T.ら, Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982)」に開示されているような組み換えＤＮＡ技術を使用して、ＢＰＦＩを得ることが可能である。また、当業者の一人に公知の方法によって、宿主細胞にＢＰＦＩを製造することが可能である。
【００８６】
また、ＢＰＦＩには、（１）天然に生じるＨＲ−Ｃ、ＨＲ−Ｎ、および／または陰イオン性ペプチドの、薬理学的に許容可能な塩およびプロドラッグ、該塩のプロドラッグ、多形体、水和物、溶媒和物、生物活性型断片、生物活性型バリアント、ならびに立体異性体、ならびに（２）天然に生じるＨＲ−Ｃ、ＨＲ−Ｎ、および／または陰イオン性ペプチドの、アゴニスト、模擬体、およびアンタゴニストのバリアント、ならびに（３）それらのポリペプチド融合体が含まれる。用語「ＢＰＦＩ」には、別のアミノ酸をアミノ末端、カルボキシ末端、またはその両方に含んでいる融合体が含まれる。典型的な融合体としては、例えば、ＢＰＦＩの組み換え発現により得られるメチオニルＢＰＦＩ（メチオニンがＢＰＦＩのＮ−末端に連結しているもの）、精製を目的とした融合体（例えば、ポリヒスチジンまたは親和性エピトープとの融合体）、血清アルブミン結合ペプチドとの融合体、血清アルブミンなどの血清タンパク質との融合体、免疫グロブリン分子の定常領域（Ｆｃなど）との融合体、および脂肪酸との融合体が挙げられる。天然に生じるＨＲ−Ｃ、ＨＲ−Ｎ、および陰イオン性ペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列は、１アミノ酸のバリアントまたはスプライスバリアントなどのバリアントのような、様々な形態が、知られている。
【００８７】
様々な参考文献に、ポリマー接合またはグリコシル化によるポリペプチドの修飾が開示されている。用語「ＢＰＦＩ」は、ＰＥＧなどのポリマーと接合したポリペプチドを含んでいる。また、用語「ＢＰＦＩ」は、システイン、リジン、または他の残基が１つ以上さらに誘導体化されているものを含んでいてもよい。さらに、ＢＰＦＩは、リンカーまたはポリマーを含んでいてもよい。該リンカーまたはポリマーと接合しているアミノ酸は、本発明の非天然アミノ酸であってもよい。あるいは、リジンもしくはシステインに結合させるような技術的に公知の手法を利用して、天然にコードされたアミノ酸に接合されていてもよい。
【００８８】
ポリペプチドのポリマーによる修飾は、以前から報告されている。米国特許第４，９０４，５８４号明細書には、少なくとも１つのリジン残基が削除されているか、他の任意のアミノ酸残基で置換されているという、リジンが減少したポリペプチドに、ＰＥＧを付加したものが開示されている。国際公開第９９／６７２９１号パンフレットには、タンパク質とＰＥＧとを接合する処理であって、タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸を削除して、該タンパク質をＰＥＧと、タンパク質への接合を達成するのに十分な条件下において接触させる処理が開示されている。国際公開第９９／０３８８７号パンフレットには、成長ホルモンのスーパーファミリーに属するポリペプチドのＰＥＧが付加されたバリアントであって、ポリペプチドの特定の領域に位置する非必須アミノ酸残基がシステイン残基で置換されたバリアントが開示されている。国際公開第００／２６３５４には、対応する親ポリペプチドと比較したときに少なくとも１つ追加されたグリコシル化部位を含み、アレルゲン性が減少している、グリコシル化ポリペプチドの製造方法が開示されている。米国特許第５，２１８，０９２号明細書には、未変性ポリペプチドと比較して、炭水化物鎖をさらに少なくとも１つ導入するための、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）および他のポリペプチドの修飾が開示されている。ＰＥＧが付加されたペプチドの例を挙げると、ＧＷ３９５０５８、ＰＥＧが付加されたペプチドのトロンボポエチン受容体（ＴＰＯｒ）アゴニスト（「de Serres M.ら, Stem Cells. 1999;17(4):203-9」）、および成長ホルモン放出因子のＰＥＧが付加された類似体（ＰＥＧ−ＧＲＰ、「D’Antonio Mら Growth Horm IGF Res. 2004 Jun;14(3):226-34」）である。
【００８９】
また、用語ＢＰＦＩは、グリコシル化ＢＰＦＩを含んでいる。該グリコシル化ＢＰＦＩとしては、例えば、任意のアミノ酸の位置においてグリコシル化されたＢＰＦＩ、ポリペプチドのＮ結合型グリコシル化の形態、またはＯ結合型グリコシル化の形態が挙げられる。また、１つのヌクレオチドの変更を含んでいるバリアントも、ＢＰＦＩの生物活性型バリアントであると考えられる。さらに、スプライスバリアントも含まれる。また、用語ＢＰＦＩは、１つ以上の任意のＢＰＦＩ、または任意の他のポリペプチド、タンパク質、炭水化物、ポリマー、低分子、リンカー、リガンド、もしくは他の任意の種類の生物活性分子ならびに特定の欠失または他の修飾を含んでいるが、それでも生物活性を維持しているポリペプチドの類似体が、化学的手段によって連結されているか、もしくは融合タンパク質として発現している、ＢＰＦＩのヘテロダイマー、ホモダイマー、ヘテロマルチマー、またはホモマルチマーを含んでいる。
【００９０】
用語ＢＰＦＩは、１つ以上のアミノ酸の置換、付加、または欠失を含んでいるＢＰＦＩポリペプチドを包含する。本発明のＢＰＦＩは、１つ以上の非天然アミノ酸の修飾とともに、１つ以上の天然アミノ酸による修飾を含んでいてもよい。天然に生じるＢＰＦＩの多種多様なアミノ酸の位置における置換の例が、以前から記載されているが、その例も用語ＢＰＦＩに含まれる。例えば、上記置換の例としては、ＢＰＦＩの生物活性のうち１つ以上を調整する置換などが挙げられる。また、ここでいう、ＢＰＦＩの生物活性としては、アゴニスト活性を増加させる活性、ポリペプチドの溶解度を増加させる活性、ポリペプチドをアンタゴニストに変換する活性、ペプチダーゼもしくはプロテアーゼに対する感受性を減少させる活性などである。
【００９１】
いくつかの実施形態では、ＢＰＦＩは、ＢＰＦＩの生物活性を調整する付加、置換、または欠失をさらに含んでいる。例えば、付加、置換、または欠失は、ＢＰＦＩの性質または活性を１つ以上調整するものであってもよい。例えば、付加、置換、または欠失は、ＢＰＦＩの受容体結合または結合パートナーに対する親和性（アフィニティー）の調整、受容体のダイマー化の調整（例えば、増加または減少など）、ダイマーになった受容体の安定化、結合パートナーの立体構造もしくは１つ以上の生物活性の調整、循環時間の調整、治療半減期の調整、ポリペプチドの安定性の調整、ペプチダーゼもしくはプロテアーゼによる切断の調整、容量の調整、放出もしくは生物学的利用性の調整、精製の促進、あるいは、特定の投与経路の改善もしくは変更をするものであってもよい。同様に、ＢＰＦＩは、検出（ＧＦＰなど）、精製、またはポリペプチドの他の特徴を改善する、プロテアーゼ切断配列、反応基、抗体結合ドメイン（ＦＬＡＧまたはポリＨｉｓなど）、他の親和性に基づく配列（ＦＬＡＧ、ポリＨｉｓ、ＧＳＴなど）、あるいは、連結分子（ビオチンなど）を含んでいてもよい。
【００９２】
また、用語ＢＰＦＩには、連結しているホモダイマー、ヘテロダイマー、ホモマルチマー、およびヘテロマルチマーが含まれる。これらダイマーおよびマルチマーは、例えば、非天然にコードされたアミノ酸の側鎖を介して、同じもしくは異なる非天然にコードされたアミノ酸の側鎖、または天然にコードされたアミノ酸の側鎖に直接的に連結しているもの、あるいはリンカーを介して間接的に連結しているものが挙げられる。典型的なリンカーには、例えば、低有機分子、様々な長さの水溶性ポリマー（ポリ（エチレングリコール）もしくはポリデキストランなど）、または様々な長さのポリペプチドが含まれる。
【００９３】
「非天然にコードされたアミノ酸」は、２０の一般アミノ酸のうちの１つ、セレノシステイン、もしくはピロリジンではないアミノ酸のことをいう。用語「非天然にコードされたアミノ酸」と同義として用いられてもよい別の用語は、「非天然アミノ酸」、「天然ではないアミノ酸」、「非天然に生じるアミノ酸」、ならびに、それらの様々にハイフンで繋げられたもの、およびハイフンで繋げられていないものである。また、用語「非天然にコードされたアミノ酸」としては、天然にコードされたアミノ酸（２０の一般アミノ酸、またはピロリジンおよびセレノシステインなどが含まれるが、これらに限定されない）の修飾（例えば翻訳後修飾）によって生じるが、それ自体は翻訳複合体により成長中のポリペプチド鎖に天然に組み込まれないアミノ酸が挙げられるが、これに限定されない。上記非天然に生じるアミノ酸としては、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−トレオニン、およびＯ−ホスホチロシンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９４】
「アミノ末端修飾基」は、ポリペプチドのアミノ末端に付着することができる任意の分子のことをいう。同様に、「カルボキシ末端修飾基」は、ポリペプチドのカルボキシ末端に付着することができる任意の分子のことをいう。末端修飾基には、例えば、様々な水溶性ポリマー、ペプチド、または血清アルブミンなどのタンパク質、免疫グロブリンの定常領域部分（Ｆｃなど）、あるいは、ペプチドの血清半減期を増加させる他の部分が含まれる。
【００９５】
用語「官能基」、「活性部分」、「活性化基」、「脱離基」、「反応部位」、「化学反応基」、および「化学反応部分」は、識別可能で、定義可能な分子の一部またはユニットに言及するために、本明細書および技術的に用いられる。上記用語は、化学技術的にある程度同義であり、ある機能または活性を行使するとともに、他の分子と反応する分子の一部を示すために本明細書において用いられる。
【００９６】
用語「結合」または「リンカー」は、化学反応の結果、標準的に形成される基または結合のことであり、通常、共有結合である。加水分解に安定な結合は、結合が実質的に水中において安定であり、（例えば、長期間、ことによると無期限の生理的条件下において）有用なｐＨ値において水と反応しないことを意味する。加水分解に不安定または分解性の結合は、結合が水中または水溶液中（例えば、血液）において分解可能であることを意味する。酵素に不安定または分解性の結合は、結合が１つ以上の酵素により分解され得ることを意味する。技術的に理解されるように、ＰＥＧおよびそれに関連するポリマーは、分解性の結合を、ポリマーの骨格、またはポリマーの骨格と該ポリマー分子の末端にある１つ以上の官能基との間のリンカー基に含み得る。例えば、ＰＥＧカルボン酸または活性型ＰＥＧカルボン酸と生物活性剤のアルコール基との反応によって形成されるエステル結合は、一般的に、生理条件下において加水分解され、生物活性剤を放出する。他の加水分解可能な結合としては、例えば、カーボネート結合、アミンとアルデヒドとの反応から生じるイミン結合、アルコールとリン酸基との反応により形成されるリン酸エステル結合、ヒドラジドとアルデヒドとの反応生成物であるヒドラゾン結合、アルデヒドとアルコールとの反応生成物であるアセタール結合、ギ酸塩とアルコールとの反応生成物であるオルソエステル結合、（例えば、ＰＥＧなどのポリマーの末端における）アミン基とペプチドのカルボキシル基とにより形成されるペプチド結合、および（例えばポリマーの末端における）ホスホラミジーテ（phosphoramidite）基とオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル基とにより形成されるオリゴヌクレオチド結合が挙げられる。
【００９７】
本明細書で用いられるときの用語「生物活性分子（生物学的に活性な分子）」、「生物活性部分」、または「生物活性剤（生物学的に活性な剤）」は、生物に関する生物学的な系、経路、分子、または相互作用における任意の物理性質もしくは生物化学性質に影響を与えることができる任意の物質のことを意味する。上記生物としては、例えば、ウイルス、細菌、バクテリオファージ、トランスポゾン、プリオン、昆虫、真菌、植物、動物、およびヒトが挙げられる。特に、本明細書で用いられるような生物活性分子には、ヒトまたは他の動物における疾患の診断、回復、鎮静、治療、または予防を意図される任意の物質、あるいは、ヒトまたは動物の身体的もしくは精神的な健康状態を増強するための任意の物質が含まれるが、これらに限定されない。生物活性分子としては、例えば、ペプチド、タンパク質、酵素、低分子薬物、ハードドラッグ、ソフトドラッグ、炭水化物、無機原子または分子、色素、脂質、ヌクレオシド、放射性核種、オリゴヌクレオチド、毒素、細胞、ウイルス、リポソーム、微粒子、およびミセルなどが挙げられる。本発明と一緒に使用するための適切な生物活性剤の種類としては、薬物、プロドラッグ、放射性核種、造影剤、ポリマー、抗生物質、殺菌剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、抗腫瘍剤、心・血管作動薬、抗不安剤、ホルモン、成長因子、ステロイド剤、および細菌由来の毒素などが挙げられる。
【００９８】
「２官能性ポリマー」は、他の部分（アミノ酸の側鎖など）と特異的に反応して、共有結合または非共有結合を形成することができる別々の官能基を２つ含んでいるポリマーのことをいう。２官能性リンカーでは、一方の官能基は、特定の生物活性を有する構成要素における基と反応し、もう一方の官能基は第２の生物活性を有する構成要素における基と反応する。この２官能性リンカーを用いて、第１の生物活性を有する構成要素、２官能性リンカーおよび第２の生物活性を有する構成要素を含んでいる接合体を形成してもよい。様々な化合物をペプチドに付着させるための多くの手法およびリンカー分子が公知である。例えば、欧州特許出願公開第１８８，２５６号明細書、米国特許第４，６７１，９５８号明細書、米国特許第４，６５９，８３９号明細書、米国特許第４，４１４，１４８号明細書、米国特許第４，６９９，７８４号明細書、米国特許第４，６８０，３３８号明細書、および米国特許第４，５６９，７８９号明細書、米国特許第４，５８９，０７１号明細書を参照のこと。これらは参照によって、本明細書に組み込まれる。「多官能性ポリマー」は、他の部分（アミノ酸の側鎖など）と特異的に反応して、共有結合または非共有結合を形成することができる別々の官能基を２つ以上含んでいるポリマーのことをいう。２官能性ポリマーまたは多官能性ポリマーは、任意の所望の長さ、もしくは分子量であってもよいし、さらに、ＢＰＦＩに連結する１つ以上の分子と、該ＢＰＦＩもしくはＢＰＦＩ結合パートナーとの間に特定の所望の間隔または立体構造を提供するように選ばれてもよい。
【００９９】
置換基が、左から右に書くという従来の化学式により記載されている場合、該置換基は、右から左に書かれた構造に由来する化学的に同一の置換基を同じく含んでいる。例えば、−ＣＨ２Ｏ−は−ＯＣＨ２−と同じである。
【０１００】
用語「置換基」は、特に限定されないが「不干渉性置換基」を含む。「不干渉性置換基」は、安定な化合物を産出する基である。適切な不干渉性置換基または遊離基（ｒａｄｉｃａｌ）としては、例えば、ハロ、Ｃ１−Ｃ１０のアルキル、Ｃ２−Ｃ１０のアルケニル、Ｃ２−Ｃ１０のアルキニル、Ｃ１−Ｃ１０のアルコキシ、Ｃ１−Ｃ１２のアラルキル、Ｃ１−Ｃ１２のアルカリル、Ｃ３−Ｃ１２のシクロアルキル、Ｃ３−Ｃ１２のシクロアルケニル、フェニル、置換フェニル、トルオイル、キシレニル、ビフェニル、Ｃ２−Ｃ１２のアルコキシアルキル、Ｃ２−Ｃ１２のアルコキシアリール、Ｃ７−Ｃ１２のアリールオキシアルキル、Ｃ７−Ｃ１２のオキシアリール、Ｃ１−Ｃ６のアルキルスルフィニル、Ｃ１−Ｃ１０のアルキルスルフォニル、−−（ＣＨ２）ｍ−−Ｏ−−（Ｃ１−Ｃ１０のアルキル）（ここで、ｍは１から８である）、アリール、置換アリール、置換アルコキシ、フルオロアルキル、ヘテロ環式の遊離基、置換ヘテロ環式の遊離基、ニトロアルキル、−−ＮＯ２、−−ＣＮ、−−ＮＲＣ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０のアルキル）、−−Ｃ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０のアルキル）、Ｃ２−Ｃ１０のアルキルチオアルキル、−−Ｃ（Ｏ）Ｏ−−（Ｃ１−Ｃ１０のアルキル）、−−ＯＨ、−−ＳＯ２、＝Ｓ、−−ＣＯＯＨ、−−ＮＲ２、カルボニル、−−Ｃ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０のアルキル）−ＣＦ３、Ｃ（Ｏ）−ＣＦ３、−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−−（Ｃ１−Ｃ１０のアリール）−Ｓ−−（Ｃ６−Ｃ１０のアリール）、−−Ｃ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０のアリール）、−−（ＣＨ２）ｍ−−Ｏ−−（−−（ＣＨ２）ｍ−−Ｏ−−（Ｃ１−Ｃ１０のアルキル）（ここで各ｍは１〜８である）、−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−−Ｃ（Ｓ）ＮＲ２、−−ＳＯ２ＮＲ２、−−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ２、−−ＮＲＣ（Ｓ）ＮＲ２、およびそれらの塩などが挙げられる。本明細書で用いられるような各Ｒ基は、Ｈ、アルキルもしくは置換アルキル、アリールもしくは置換アリール、アラルキルまたはアルカリルである。
【０１０１】
用語「ハロゲン」には、フッ素、塩素、ヨウ素、および臭素が含まれる。
【０１０２】
用語「アルキル」は、それ自体または別の置換基の一部として、特に断りの無い限り、炭素原子数が指定された（すなわち、Ｃ１−１０は、１から１０の炭素を意味する）、２価の遊離基および多価の遊離基を含んでいてもよいし、完全飽和、単不飽和、またはポリ不飽和であってもよい、直鎖状、分枝鎖状、または環状の炭化水素の遊離基（ラジカル）、あるいはそれらの組み合わせを意味する。飽和炭化水素の遊離基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、およびシクロプロピルメチル、ならびにｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、およびｎ−オクチルなどの同族体と異性体とが挙げられる。不飽和アルキル基は、１つ以上の２重または３重結合を有しているものである。不飽和アルキル基としては、例えば、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタンジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−および３−プロピニル、３−ブチニル、ならびに、高級同族体および異性体などが挙げられる。また、用語「アルキル」は、特に断りの無い限り、下記においてより詳細に定義されるアルキルの誘導体（ヘテロアルキルなど）を含むことを意味している。炭化水素基に限定されないアルキル基のことを、「ホモアルキル」という。
【０１０３】
用語「アルキレン」は、それ自体または別の置換基の一部として、アルカンから誘導された２価の遊離基を意味する。アルキレンとしては、例えば、−ＣＨ２ＣＨ２−および−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−という構造が挙げられる。また、アルキレンには、以下の「ヘテロアルキレン」として定義される基が含まれる。通常、アルキル（またはアルキレン）基は、１から２４までの炭素原子を有しているが、本発明では、これらの基は、１０以下の炭素原子を有していることが好ましい。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は、アルキル基またはアルキレン基における鎖がより短いもののことであり、一般的に、８以下の炭素原子を有している。
【０１０４】
用語「アルコキシ」、「アルキルアミノ」および「アルキルチオ（またはチオアルコキシ）」は、従来の意味において用いられ、酸素原子、アミノ基、または硫黄原子のそれぞれを介して、分子の残基に付着するアルキル基のことをいう。
【０１０５】
用語「ヘテロアルキル」は、それ自体または他の用語と組み合わせて、特に断りの無い限り、既定された数の炭素原子と少なくとも１つのヘテロ原子とから成る、安定な直鎖状、分枝鎖状、または環状の炭化水素の遊離基、あるいはそれらの組み合わせを意味する。上記ヘテロ原子は、Ｎ、Ｏ、ＳｉおよびＳから選択される。窒素原子および硫黄原子は、必要に応じて酸化されてもよいし、窒素のヘテロ原子は必要に応じて４級化されてもよい。Ｏ、Ｎ、およびＳ、ならびにＳｉのヘテロ原子は、ヘテロアルキル基の内部の任意の位置、または、アルキル基が分子の残部と付着する位置に配置されてもよい。例えば、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２、−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３、および−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３が挙げられるが、これらに限定されない。２以下のヘテロ原子は、隣接していてもよく、例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３、および−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３が挙げられる。同様に、用語「ヘテロアルキレン」は、それ自体または他の置換基の一部として、ヘテロアルキルに由来する２価の遊離基を意味し、例えば、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−、および−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−が挙げられる。ヘテロアルキレン基では、同種または異種のヘテロ原子を、鎖の末端の一方または両方に配置することができる（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノ、およびアミノオキシアルキレンなどが挙げられる）。さらに、アルキレンおよびヘテロアルキレンの連結基では、連結基の配向性は、連結基の一般式が書かれた方向によって示されるわけではない。例えば、一般式−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−は、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−および−Ｒ’Ｃ（Ｏ）２−の両方を表す。
【０１０６】
用語「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」は、それら自体または他の用語との組み合わせにおいて、特に断らない限りは、それぞれ「アルキル」および「ヘテロアルキル」の環化型を表す。したがって、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルには、飽和環結合、および不飽和環結合が含まれる。さらに、ヘテロシクロアルキルでは、ヘテロ原子を、ヘテロ環が分子の残部に付着する位置に配置することができる。シクロアルキルとしては、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、およびシクロヘプチルなどが挙げられる。ヘテロシクロアルキルとしては、例えば、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、および２−ピペラジニルなどが挙げられる。さらに、上記用語は、２環構造、および３環構造も含んでいる。同様に、用語「ヘテロシクロアルキレン」は、それ自体または他の置換基の一部として、ヘテロシクロアルキルに由来する２価の遊離基を意味し、用語「シクロアルキレン」は、それ自体または他の置換基の一部として、シクロアルキルに由来する２価の遊離基を意味する。
【０１０７】
本明細書で用いられるような用語「水溶性ポリマー」は、水溶液に可溶である任意のポリマーのことをいう。水溶性ポリマーとＢＰＦＩとの結合により、例えば、以下のような変化が生じる。すなわち、非修飾の形態と比べた血中半減期の増加または調節、あるいは治療半減期の増加または調節、免疫原性の調節、物理的会合特性（凝集および多量体形成など）の調節、受容体結合性の変更、１つ以上の結合パートナーに対する結合性の変更、および、受容体の２量体化および多量体化の変更など。水溶性ポリマーは、それ自体生物活性を有していてもよいし、有していなくてもよい。また、水溶性ポリマーは、ＢＰＦＩを他の物質（１つ以上のＢＰＦＩまたは１つ以上の生物活性分子など）に結合させるためのリンカーとして利用されてもよい。適切なポリマーとしては、特に限定されないが、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、またはそれらのモノＣ１−Ｃ１０アルコキシもしくはアリールオキシ誘導体（これらは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，２５２，７１４号明細書に記載されている）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸、ジビニルエーテル無水マレイン酸、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド、デキストラン、デキストラン誘導体（デキストラン  サルフェートなど）、ポリプロピレングリコール、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール、ヘパリン、ヘパリンの断片、多糖類（ポリサッカリド）、オリゴ糖（オリゴサッカリド）、グリカン、セルロースおよびセルロース誘導体（メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースなど）、デンプンおよびデンプン誘導体、ポリペプチド、ポリアルキレングリコールおよびその誘導体、ポリアルキレングリコールのコポリマーおよびその誘導体、ポリビニルエチルエーテル、およびアルファ−ベータ−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルトアミド（aspartamide）など、ならびに、それらの混合物が挙げられる。上記水溶性ポリマーとしては、例えば、ポリエチレングリコールおよび血清アルブミンが挙げられる。
【０１０８】
本明細書で用いられるような用語「ポリアルキレングリコール」または「ポリ（アルケングリコール）」は、ポリエチレングリコール（ポリ（エチレングリコール））、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、およびそれらの誘導体のことをいう。用語「ポリアルキレングリコール」は、直鎖状ポリマーおよび分枝状ポリマー、ならびに０．１ｋＤａ〜１００ｋＤａの平均分子量を含む。他の典型的な実施形態は、例えば、商業的な供給業者のカタログ（Shearwater Corporationのカタログ「“Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications”(2001)」など）に記載されている。
【０１０９】
用語「アリール」は、特に断りの無い限り、ポリ不飽和芳香族炭化水素の置換基を意味する。この置換基は、（ｉ）単環、または（ｉｉ）一緒に融合もしくは共有結合した複環であってもよく、好ましくは１から３までの環である。用語「ヘテロアリール」は、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１から４までのヘテロ原子を含んでいるアリール基（環）のことである。上記ヘテロアリールでは、窒素原子および硫黄原子が、必要に応じて酸化されたり、窒素原子が必要に応じて４級化されたりしている。ヘテロアリール基を、ヘテロ原子を介して分子の残部に付着させることができる。アリール基およびヘテロアリール基としては、例えば、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル（purinyl）、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、および６−キノリルが挙げられる。上記の各アリール環系およびヘテロアリール環系のための置換基は、以下に記載の許容可能な置換基の群から選択される。
【０１１０】
簡潔には、他の用語と組み合わせて用いたときの用語「アリール」（アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル（arylalkyl）など）は、上記において定義したようなアリール環およびヘテロアリール環の両方を含む。したがって、用語「アリールアルキル」は、アリール基がアルキル基と付着している遊離基を含むことを意味し、例えば、ベンジル、フェネチル、およびピリジルメチルなどが挙げられる。また、上記アルキル基における炭素原子（メチレン基など）が酸素原子により置換されているアルキルアリールとしては、例えば、フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、および３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなどが挙げられる。
【０１１１】
上記各用語（「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」および「ヘテロアリール」など）は、示された遊離基の置換型および非置換型の両方を含んでいることを意味する。各種類の遊離基のための典型的な置換基を以下に示す。
【０１１２】
（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルと称されることが多い基を含む）アルキル遊離基およびヘテロアルキル遊離基のための置換基は、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（０）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮ、および−ＮＯ２などから選択される様々な基の１つ以上であってもよく、また、上記置換基の数は、０から（２ｍ’＋１）までの範囲であってもよい。ｍ’は、上記遊離基における炭素原子の総数である。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’は、それぞれ独立して、水素、置換もしくは非置換へテロアルキル、非置換もしくは置換アリール（１−３のハロゲンで置換されたアリールなどを含む）、置換あるいは非置換アルキル基、アルコキシ基、もしくはチオアルキル基、またはアリールアルキル基のことである。本発明の化合物が２つ以上のＲ基を含んでいるとき、例えば、Ｒ基のそれぞれは、これらの基が２つ以上存在するとき、それぞれＲ’基、Ｒ’’基、Ｒ’’’基およびＲ’’’’基として、独立して選択される。Ｒ’およびＲ’’が同じ窒素原子に付着する場合、それらは、窒素原子と組み合わさって、５−、６−、７−員環を形成することができる。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルなどを含むことを意味する。置換基に対する上記検討によれば、当業者の一人は、用語「アルキル」は、水素基以外の基と結合した炭素原子を含む基（例えば、ハロアルキル（−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３など）、およびアシル（−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、および−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３など））を包含することを意味すると理解する。
【０１１３】
アルキル遊離基について記載された置換基と同様に、アリールおよびヘテロアリール基のための置換基には、様々なものがある。さらに、アリールおよびヘテロアリール基のための置換基は、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２、−Ｒ’、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシおよびフルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルなどから選択され、上記置換基の数は、０から芳香環系の開放原子価の総数の範囲である。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’は、それぞれ独立して、水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、およびヘテロアリールから選択される。本発明の化合物が２つ以上のＲ基を含んでいるとき、例えば、Ｒ基のそれぞれは、これらの基が２つ以上存在するとき、それぞれＲ’基、Ｒ’’基、Ｒ’’’基およびＲ’’’’基として、独立して選択される。
【０１１４】
本明細書で用いられるような用語「調節された血中半減期」は、未修飾の形態と比べたときの、修飾されたＢＰＦＩの循環半減期の正の変化または負の変化のことをいう。血中半減期は、ＢＰＦＩを投与した後の様々な時点の血液試料を採取して、各試料における該ＢＰＦＩの濃度を決定することにより測定される。血清中の濃度と時間との相互関係から、血中半減期を計算することができる。血中半減期が少なくとも約２倍に増加することが望ましいが、例えば、投与計画を満足すること、または毒性効果を避けることができる場合には、それよりも小さい方が有利である。いくつかの実施形態では、増加は、少なくとも約３倍であるか、少なくとも約５倍であるか、または少なくとも約１０倍である。
【０１１５】
本明細書で用いられるような用語「調節された治療半減期」は、未修飾の形態と比べたときの、ＢＰＦＩの治療的有効量の半減期の正の変化または負の変化のことをいう。投与後の様々な時点における、上記ＢＰＦＩの薬物動態的性質および／または薬力学的性質および／または治療効果を、測定することにより治療半減期は測定される。治療半減期が増加すると、投与計画または総用量に特定の利益をもたらすことや、あるいは、望ましくない効果を避けることができる。いくつかの実施形態では、治療半減期の増加は、効力の増加、標的に対する修飾された分子の結合の増加もしくは減少、酵素（ペプチダーゼまたはプロテアーゼなど）による分子の破壊の増加もしくは減少、あるいは未修飾の分子における作用の別のパラメーターまたは機構の増加もしくは減少に起因する。
【０１１６】
核酸またはタンパク質に適用されるときの用語「単離された」は、核酸またはタンパク質が、天然の状態において結合している細胞の他の構成要素を実質的に有しないことを示す。それは、均質な状態であってもよい。単離された物質は、乾燥状態、半乾燥状態、または溶液（水溶液など）に対して溶解した状態であってもよい。純度と均質性とは、通常、分析化学的手法（ポリアクリルアミドゲル電気泳動、または高速液体クロマトグラフィーなど）を用いて決定される。調製物の大部分を占めるタンパク質が、実質的に精製される。特に、単離される遺伝子に隣接し、興味のある遺伝子以外のタンパク質をコードする翻訳領域から、単離される遺伝子は分離される。用語「精製される」は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルにおいて実質的に１つのバンドを生じさせることを示す。特に、そのことは、核酸またはタンパク質が、少なくとも８５％の純度、少なくとも９０％の純度、少なくとも９５％の純度、少なくとも９９％の純度またはそれ以上の純度であることを意味する。
【０１１７】
用語「核酸」は、デオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、またはリボヌクレオチド、およびそれらの一本鎖または２本鎖の形態のポリマーのことを表す。具体的に限定されない限り、上記用語は、天然のヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸を含む。ここで、上記類似体は、参照核酸と同様の結合性質を有し、かつ天然に生じるヌクレオチドと同様の方法で代謝されるものである。特に具体的に他のものに限定されない限り、上記用語は、オリゴヌクレオチドの類似体（ＰＮＡ（ペプチド核酸（peptidonucleic acid））、アンチセンス技術に用いられるＤＮＡの類似体（ホスホチオエート、およびホスホロアミデートなど）など）のこともいう。他に示さない限り、特定の核酸配列は、明確に示された配列だけでなく、該核酸配列の保存的に修飾されたバリアント（縮重コドンの置換体など）および相補的配列も当然に含む。具体的には、１つ以上の選択された（または全ての）コドンの３番目の位置を、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作製することにより、縮重コドンの置換体を得ることができる（「Batzerら Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)」、「Ohtsukaら J. Biol. Chem. 260:2605- 2608 (1985)」および、「Cassolら (1992)」、「Rossoliniら, Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)」）。
【０１１８】
用語「アミノ酸」は、天然に生じるアミノ酸、および非天然に生じるアミノ酸、ならびに、天然に生じるアミノ酸と同じように機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模擬体のことをいう。天然にコードされたアミノ酸は、２０の一般アミノ酸、ピロリジン、およびセレノシステインである。上記２０の一般アミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンである。アミノ酸類似体は、天然に生じるアミノ酸と基本的な化学構造（すなわち、α炭素が、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合している構造）が同じである化合物のことをいい、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムなどが挙げられる。上記類似体では、Ｒ基が修飾されている（ノルロイシンなど）か、またはペプチド骨格が修飾されているが、天然に生じるアミノ酸と同じ基本的な化学構造が保たれている。
【０１１９】
アミノ酸が本明細書に示されるときは、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生物化学命名委員会（Biochemical Nomenclature Commission）から推薦されている公知の３文字表記、または１文字表記のどちらかが用いられてもよい。同様に、ヌクレオチドは、共通に受け入れられている１文字コードにより示されてもよい。
【０１２０】
用語「保存的に修飾されたバリアント」は、アミノ酸および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、「保存的に修飾されたバリアント」は、同一または本質的に同一なアミノ酸配列をコードする核酸配列のことか、または核酸配列が、アミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一の配列のことをいう。遺伝コードの縮重により、多くの機能的に同一の核酸が、任意の所定のタンパク質をコードしている。例えば、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵのコドンは、全てアラニンのアミノ酸をコードしている。したがって、コドンによりアラニンが特定される全ての位置では、コードされるポリペプチドを変化させることなく、対応するコドンの何れかにコドンを変化させることができる。このような核酸の変種は「サイレント変種」であり、保存的に修飾された変種の１つである。また、ポリペプチドをコードする本明細書における全ての核酸は、該核酸の可能なサイレント変種の全ても表している。当業者の一人は、機能的に同一の分子が得られるように、核酸における各コドンを修飾することができると認識している（なお、このときのコドンには、ＡＵＧ（メチオニンに対する通常唯一のコドン）およびＴＧＧ（トリプトファンに対する通常唯一のコドン）は除かれる）。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変種は、記載された各配列に潜在的に含まれる。
【０１２１】
アミノ酸配列に関して言えば、当業者の一人は、コードされた配列において１アミノ酸または数％のアミノ酸を、変更、付加、または欠失する、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の配列に対する個々の置換、欠失、または付加は、それら変更が、化学的に類似のアミノ酸による置換になる場合において、「保存的に修飾されたバリアント」であると理解する。機能的に類似のアミノ酸を示す保存的な置換の一覧は、技術的に公知である。そのような保存的に修飾されたバリアントは、本発明における多形態バリアント、種間の同族体、および対立遺伝子に加えられるとともに、それらを排除するものではない。
【０１２２】
以下の８群のそれぞれは、互いに保存的な置換となるアミノ酸を含んでいる（例えば、「Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd edition(December 1993)）」を参照のこと）：
（１）アラニン（Ａ）およびグリシン（Ｇ）；
（２）アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）；
（３）アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）；
（４）アルギニン（Ｒ）およびリジン（Ｋ）；
（５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）およびバリン（Ｖ）；
（６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）およびトリプトファン（Ｗ）；
（７）セリン（Ｓ）およびトレオニン（Ｔ）；ならびに、
（８）システイン（Ｃ）およびメチオニン（Ｍ）。
【０１２３】
２つ以上の核酸またはポリペプチドの配列に対する用語「同一」、または「同一性」の百分率は、同じである２つ以上の配列またはサブ配列に関する。（ｉ）配列を比較ウィンドウに対して最も対応するように比較および整列させたとき、あるいは、（ｉｉ）（ａ）配列を、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを用いるか、もしくは（ｂ）手動による整列と目視検査とによって、測定されるような指定領域について比較および整列させたとき、それら配列が、ある百分率で同じであるアミノ酸残基または核酸を有する場合（すなわち特定の領域に対して約６０％の同一性、必要に応じて約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％の同一性を有する場合）、配列は「実質的に同一」であるといえる。また、この定義は、試験配列の相補体にも関する。同一性は、少なくとも約５０アミノ酸またはヌクレオチドの長さである領域に対して、あるいは、７５〜１００アミノ酸またはヌクレオチドの長さである領域に対して存在することができるし、あるいは、特に指定されない場合では、同一性は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの全長の配列に渡って、存在することができるし、５０アミノ酸またはヌクレオチドの長さよりも短い領域に存在することができる。
【０１２４】
配列比較では、通常、試験配列を比較するために、１つの配列を参照配列として用いる。配列比較アルゴリズムを用いたとき、試験配列および参照配列を、コンピューターに入力し、その後、配置を指定する。また、必要に応じて、配列アルゴリズムプログラムにおけるパラメーターを指定する。初期のプログラムパラメーターを用いてもよいし、別のパラメーターを指定してもよい。それから、配列比較アルゴリズムにより、プログラムのパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性の百分率を計算する。
【０１２５】
本明細書で用いられるような「比較ウィンドウ」は、２０から６００まで、一般的には、約５０から約２００、より一般的には約１００から１５０から成る群から選択される連続した位置の数のうちの何れか１つの区分（セグメント）を参照することを含んでいる。また、このとき、２つの配列を最適に整列した後に、配列を同じ数の連続した部位の参照配列と比較してもよい。比較のために配列を整列させる方法は、公知である。比較のための配列の最適な整列を、例えば、（ｉ）「Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c」の局所的相同性アルゴリズム（local homology algorithm）、（ｉｉ）「Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443」の相同性整列アルゴリズム（homology alignment algorithm）、（ｉｉｉ）「Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444」の類似性に関する検索、（ｉｖ）これらアルゴリズムのコンピューターによる実施（「Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI」におけるTFASTA, GAP, BESTFIT, およびFASTA）、あるいは（ｖ）手動による整列と目視検査と（例えば、「Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)」を参照のこと）によって、実施することができる。
【０１２６】
配列同一性および配列類似性の百分率を決定するために適したアルゴリズムとしては、例えば、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０のアルゴリズムが挙げられる。これらは、「Altschulら (1997) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402」および「Altschulら (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410」にそれぞれ記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）を介して、公的に利用することができる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーター、Ｗ、ＴおよびＸにより、整列（アライメント）の感度と速度とが決定される。ヌクレオチド配列用のＢＬＡＳＴＮプログラムは、初期値として、１１のワード長（Ｗ）、期待値（Ｅ）または１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用している。アミノ酸配列用のＢＬＡＳＴＰプログラムは、初期値として、３のワード長、１０の期待値（Ｅ）、および５０のＢＬＯＳＵＭ６２得点集団（「Henikoff & Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915」を参照のこと）の整列（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、ならびに両方の鎖の比較を用いている。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、通常、「低い複雑性」のためのフィルタを使用することなく実施される。
【０１２７】
また、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、２つの配列間における類似性を統計解析することができる（例えば、「Karlin and Altschul, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787」を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって与えられる類似性の尺度の１つは、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間における適合が偶然に生じる可能性の指標を与える最小総和確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、参照核酸に対する試験核酸の比較において最小総和確率が、約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、または最も好ましくは約０．００１未満であるならば、核酸は、参照配列と類似していると考えられる。
【０１２８】
語句「〜に対する選択的な（または特異的な）ハイブリダイズ」は、特定のヌクレオチド配列が複合混合物（全細胞、ＤＮＡライブラリー、またはＲＮＡライブラリーなど）に存在するときに、ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件下において、特定のヌクレオチド配列にのみ、分子が結合すること、２本鎖を形成すること、またはハイブリダイズすることをいう。
【０１２９】
語句「ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件」は、技術的に公知である低イオン強度および高温度の条件をいう。通常、ストリンジェントな条件下では、プローブは、核酸の複合混合物（全細胞、ＤＮＡライブラリー、またはＲＮＡライブラリーなど）における標的のサブ配列にハイブリダイズするが、該複合混合物に存在する他の配列とはハイブリダイズしない。ストリンジェントな条件は、配列に依存する。また、環境が異なれば、ストリンジェントな条件も異なる。配列が長ければ、より高い温度において特異的にハイブリダイズする。「Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-- Hybridization with Nucleic Probes, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays” (1993)」には、核酸のハイブリダイゼーションが幅広く網羅されている。一般的に、ストリンジェントな条件は、既定のイオン強度、ｐＨにおいて、特異的な配列の熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５−１０℃低いように選択される。Ｔｍは、（既定のイオン強度、ｐＨ、および核酸の濃度において）標的に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である（標的配列は、過剰に存在するので、Ｔｍでは、プローブの５０％が平衡状態において占有される）。ストリンジェントな条件は、ｐＨが７．０−８．３において塩濃度が約１．０Ｍのナトリウムイオン濃度よりも低く、通常、約０．０１−１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、温度は、短いプローブ（１０〜５０ヌクレオチドなど）については少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（５０ヌクレオチドよりも長いものなど）については少なくとも約６０℃である。また、ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤を添加することにより達成されてもよい。選択的なまたは特異的なハイブリダイゼーションのためには、陽性シグナルが、バックグラウンドの少なくとも２倍であってもよいし、必要に応じて、バックグラウンドのハイブリダイゼーションの１０倍であってもよい。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件の典型としては、以下の条件であり得る。５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳにおいて、４２℃でインキュベーションするか、または５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳにおいて６５℃でインキュベーションし、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳにより、６５℃で洗浄する。上記洗浄を、５分、１５分、３０分、６０分、１２０分またはそれ以上実施することができる。
【０１３０】
本明細書で用いられるような用語「真核生物」は、系統発生領域（phylogenetic domain）の真核生物（Eucarya）に属する生物のことをいう。真核生物としては、例えば、動物（哺乳類、昆虫、爬虫類、鳥類など）、繊毛虫類、植物（単子葉植物、双子葉植物、藻類など）、真菌、酵母、鞭毛虫、微胞子虫目、原生生物などが挙げられる。
【０１３１】
本明細書で用いられるような用語「非真核生物」は、真核生物ではない生物のことをいう。例えば、非真核生物は、系統発生領域の真正細菌（Escherichia coli, Thermus thermophilus, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putidaなどが挙げられるが、これらに限定されない）、または、系統発生領域の古細菌（例えば、Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium(Haloferax volcaniiおよびHalobacterium種のNRC-1など), Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii, Aeuropyrum pernixなど）に属していてもよい。
【０１３２】
本明細書で用いられるような用語「被検体」は、治療、観察または実験の対象である動物のことをいい、好ましくは哺乳類であり、最も好ましくはヒトである。
【０１３３】
本明細書で用いられるような用語「有効量」は、投与される（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドの量であって、治療される疾病、病気、または疾患の１つ以上の症状をある程度軽減する量のことをいう。本明細書に記載の（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドを含んでいる組成物を、予防的治療、治療の増強、および／または、治療上の処置のために投与することができる。
【０１３４】
用語「増強する」または「増強」は、所望の効果の効力、または持続期間のどちらかを、増加または引き延ばすことを意味する。つまり、治療剤の効果を増強する事に関して、用語「増強する」は、系に対する他の治療剤の効果の効力または持続期間のどちらかを増加または引き延ばす能力のことをいう。本明細書で用いられるような「増強性有効量」は、所望の系における別の治療剤の効果を増強するのに十分な量のことをいう。患者に使用されたとき、この使用についての有効量は、疾病、病気、または疾患の重症度および治療単位（course）、薬歴、患者の健康状態、および薬物への反応性、ならびに治療を担当する医師の判断に依存する。
【０１３５】
本明細書で用いられるような用語「修飾された」は、所定のポリペプチドになされた任意の変化に関し、例えば、ポリペプチドの翻訳後修飾、共翻訳修飾、化学構造、アミノ酸の組成、アミノ酸配列、またはポリペプチドの長さの変化などが挙げられる。「（修飾された）」の形態は、検討されるポリペプチドが、必要に応じて修飾されることを意味する。すなわち、検討中のポリペプチドは、修飾され得るか、または修飾され得ない。
【０１３６】
用語「翻訳後修飾」は、天然または非天然アミノ酸の任意の修飾であって、上記アミノ酸がポリペプチド鎖に組み込まれた後に、上記アミノ酸に生じる修飾のことをいう。この用語は、例えば、インビボの共翻訳修飾、インビトロの共翻訳修飾（無細胞翻訳系など）、インビボの翻訳後修飾、およびインビトロの翻訳後修飾などを含んでいる。
【０１３７】
予防のための適用では、（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドを含んでいる組成物は、特定の疾病、疾患、または病気を発症しやすい患者、あるいは、特定の疾病、疾患、または病気の危険性のある患者に投与される。そのような量は、「予防的有効量」として定義される。この場合、正確な量は、患者の健康状態、および体重などに依存する。また、当業者の一人は、一般的な実験（例えば、用量増加臨床試験）により、上記予防的有効量を決定することが考慮される。
【０１３８】
用語「保護された」は、ある反応条件下において、化学的に反応性の官能基（化学反応官能基）の反応を防止する部分、または「保護基」が存在することに関する。保護基は、保護される化学反応基の種類に応じて変えることができる。例えば、化学反応基が、アミンまたはヒドラジドである場合、保護基を、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）から成る群から選ぶことができる。化学反応基が、チオールである場合、保護基は、オルソピリジルジスルフィドであってもよい。化学反応基が、カルボン酸（ブタン酸またはプロピオン酸など）またはヒドロキシル基である場合、保護基は、ベンジル基またはアルキル基（メチル、エチル、またはｔｅｒｔ−ブチル）であってもよい。また、技術的に公知の他の保護基も、本明細書に記載の方法および組成物と一緒に用いてもよいし、あるいは、本明細書に記載の方法および組成物に用いてもよい。
【０１３９】
一例を挙げると、封鎖基／保護基は、以下の化合物から選択されてもよい。
【０１４０】
【化４】
2009514533.tif 000006
【０１４１】
他の保護基は、「Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, NY, 1999」に記載されている。なおこの文献の全ては、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１４２】
治療への適用では、（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドを含有する組成物を、疾病、病気、または疾患の症状を回復するか、該症状の進行を少なくとも部分的に停止するのに十分な量で、疾病、病気、または疾患を既に患っている患者に投与する。そのような量は、「治療的有効量」として定義され、疾病、病気、または疾患の重症度および治療単位、薬歴、患者の健康状態、および薬物への反応性、ならびに治療を担当する医師の判断に依存する。また、当業者の一人は、一般的な実験（例えば、用量増加臨床試験）により、上記治療的有効量を決定することが考慮される。
【０１４３】
用語「治療」は予防および／または治療上の処置に関する。
【０１４４】
他に指示しない限り、当業者に公知の質量分析、ＮＭＲ、ＨＰＬＣ、タンパク質化学、生物化学、組み換えＤＮＡ技術、および薬理学の従来方法が、用いられる。
【０１４５】
〔詳細な説明〕
＜Ｉ．序論＞
本発明に有用であり得るＢＰＦＩまたはその断片の非限定的な例には、以下が含まれる。特定のＢＰＦＩまたは任意のタンパク質の活性のいくつかもしくは全てを保持している、他のバリアント、類似体、断片、および／または類似体断片も、本発明の実施形態において有用であると理解される。
【０１４６】
本発明に有用なポリペプチドの典型的な種類には、例えば、ＨＲ−Ｃ、ＨＲ−Ｎおよび陰イオン性ペプチドが含まれる。
【０１４７】
パラミクソウイルスおよびレンチウイルスは、臨床疾患および獣医学的疾患の重要な病因である。これらウイルスには、（１）呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、パラインフルエンザウイルス、はしか、おたふく風邪、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２などの重要なヒト病原体、（２）ウシのＲＳＶ、七面鳥の鼻気管炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、牛疫ウイルス、イヌジステンパーウイルス、アラザシ（ｓｅａｌ）およびウマに記載の新種の麻疹ウイルス、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）などの獣医学的病原体が含まれる。
【０１４８】
幼児および免疫抑制者における下気道疾患の主な原因は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）として知られるパラミクソウイルスである。世界中で、ＲＳＶは、年間、６５００万人に感染し、１００万人が死亡する。ＲＳＶ感染による病気の発生率が最も高いのは、６週齢から６ヶ月齢の幼児である。米国では、毎年、おおよそ９０，０００人の子どもが、ＲＳＶによる感染で入院し、そのうち４５００人が死亡する。また、幼児におけるＲＳＶの気管支梢炎の最中にＲＳＶのＩｇＥ反応が悪化することが、幼児期における再発性の喘鳴という普及した問題に関連している。
【０１４９】
ＲＳＶによる再感染は、他の呼吸器系ウイルスの大半による感染と比べて、より頻繁に起こる。深刻な疾病は、大抵、第１または第２感染と関連している。疾病の重症度は、感染が繰り返されることによって低くなるが、ＲＳＶによる前回の感染によって、その後の感染における病気は防がれない。免疫が、明らかに不完全である。生ワクチンは、一般的に、臨床的疾患を引き起こさないほど十分な程度に弱毒化された時点で、免疫原性が不十分になることが、証明されている。１９６０年代に開発された、ホルマリンにより不活性化されたワクチンは、ウイルスに対する防御反応を与えなかっただけでなく、その後の流行の間に、ワクチン接種した子どもの疾病を悪化させた。また、いくつかの弱毒化されたＲＳＶ株は、ヒトにより継代接種（human passage）された後、病原性を元に戻す可能性を有している。したがって、ワクチンの開発が慎重になされてきたが、幼児および低年齢小児においてＲＳＶ疾病を予防する努力は、不活性化ワクチン、弱毒化生ワクチン、またはサブユニットワクチンによる能動免疫化、およびヒトモノクローナル抗体であるＲＳＶ抗体、または高度免疫ＲＳＶ免疫グロブリンにより母親を能動免疫化することによる、胎児の受動免疫化を標的に続けられてきた。
【０１５０】
危険度の高い幼児は、ＲＳＶから防御するための免疫グロブリン（ＩＧ）により治療されるが、静脈注射用のＲＳＶ  ＩＧは非常に高価であり、投与は、満足しうる抗体の力価を維持するために月１回の７時間以上にも及ぶ点滴を必要とする。
【０１５１】
現在では、Synagis（シナギス（パリビツマブ（palivizumab）））またはリバビリン様の薬物が、患者集団に投与されている。
【０１５２】
参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，８１４，９６８号明細書には、インビトロとインビトロとにおいて、ＲｈｏＡタンパク質のウイルス融合タンパク質結合ドメインに結合するか、またはウイルス融合タンパク質のＲｈｏＡ結合ドメインに結合して、感受性細胞への感染を阻害する単離されたペプチド、ペプチド模擬体、および抗体が記載されている。ウイルスの中でも、パラミクソウイルスの呼吸器合胞体ウイルス、およびレンチウイルスのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）が記載されている。
【０１５３】
Ｐａｓｔｅｙらは、「Nature Medicine 2000 January; 6(l):35-40」および「J. of Virology 1999; 73(9):7262-7270」において、ＲＳＶのＦタンパク質（融合タンパク質）とＧＴＰａｓｅであるＲｈｏＡとの相互作用、およびＲＳＶとパラ−インフルエンザウイルスタイプ３とによる合胞体形成に対するＲｈｏＡペプチドの効果を調べた研究を記載している。
【０１５４】
Ｂｕｄｇｅらは、「J. of Antimicrobial Chemotherapy 2004; 54:299-302」および「J. of Virology 2004; 78(10):5015-5022」において、ＧＴＰａｓｅであるＲｈｏＡに由来するペプチド、および該ペプチドの抗ウイルス活性を記載している。ウイルスの感染とウイルスの付着との阻害は、一組の分子について測定された。特に、上記記載によれば、ＲｈｏＡのアミノ酸７７−９５に由来するペプチドの正味の負電荷、およびＲｈｏＡペプチドの切断型（アミノ酸８０−９４）の分子間ジスルフィド結合が、抗ＲＳＶ活性に極めて重要であることが示された。５ｋＤａよりも大きいポリアニオン性の分子が、エンベロープウイルスを阻害することが示された。そのような分子には、例えば、可溶性ヘパリン、デキストラン  サルフェート、負に帯電したタンパク質、および合成されたポリアニオン性のポリマーが含まれる。Ｂｕｄｇｅらは、抗ウイルス活性が、ＲＳＶ融合タンパク質−ＧＴＰａｓｅのＲｈｏＡの相互作用が阻害されることによるものではない、と示唆している。Ｌａｍｂｅｒｔらは、「PNAS 1196 93:2186-2191」において、ウイルス融合阻害剤としての、ＤＰ−１７８およびＤＰ−１０７に対する類似体であるＲＳＶ由来のペプチドの使用について記載している。
【０１５５】
Ｔ−２０は、ウイルス融合阻害剤として作用することにより、ＨＩＶが細胞に侵入するのを阻害する。ＨＩＶの融合過程は、十分特徴付けられている。ＨＩＶは、ｇｐ１２０を介して、ＣＤ４受容体に結合する。そして、この受容体への結合により、ｇｐ１２０において、一連の立体構造変化が起こると、ｇｐ１２０は、その補助受容体（コレセプター）であるＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４に結合することができる。受容体と補助受容体とに結合した後、ｇｐ１２０は、融合過程を開始するためにｇｐ４１を露出する。ｇｐ４１は、７回繰り返し（ヘプタドリピート）１および２（ＨＲ１および２）という２つの領域を有している。ＨＲ１として同定される細胞外ドメインは、ジッパードメインと提案されたアミノ末端である、αへリックスの領域である。ＨＲ１は、ｇｐ４１のＨＲ２と一緒になって、ヘアピンを形成する。このヘアピンにより形成される構造は、６つのへリックスの束である。該束により、細胞膜の近傍にＨＩＶエンベロープが配置され、２つの膜の間において融合が引き起こされる。Ｔ−２０は、ｇｐ４１の膜貫通糖タンパク質である第１ヘプタドリピート（ＨＲ１）に結合することによって、ウイルス融合に必要な立体構造変化を抑制する。つまり、Ｔ−２０がｇｐ４１のＨＲ１領域に結合することによって、６つのへリックスの束の形成が妨害される。ＨＩＶのｇｐ４１タンパク質のＤＰ１０７とＤＰ１７８とのドメイン（すなわちＨＲ１とＨＲ２とのドメイン）は、非共有結合的に互いに複合体を形成し、それらの相互作用は、ＨＩＶの正常な感染に必要である。ＤＰ１０７とＤＰ１７８との相互作用、および／またはＤＰ１０７様ペプチドとＤＰ１７８様ペプチドとの相互作用とを阻止する化合物は、抗ウイルス剤を含む抗融合剤であるといえる。
【０１５６】
ＤＰ−１７８は、ＨＩＶ−１に媒介されるＣＤ−４＋の細胞−細胞融合（すなわち合胞体形成）と、細胞に含まれないＨＩＶ−１ウイルスによるＣＤ−４＋細胞への感染とに対する強力な阻害剤として作用する。そのような抗レトロウイルス活性には、感染されていないＣＤ−４＋細胞へのＨＩＶの感染の阻害が含まれるが、これに限定されない。ＤＰ−１７８は、低濃度において作用する。さらに、ＤＰ−１７８は、インビトロの研究と動物とにおいて無害であることが示された。ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２のＤＰ１７８に対応する領域におけるアミノ酸の保存が記載されている。
【０１５７】
米国特許第５，４６４，９３３号明細書、米国特許第６，１３３，４１８号明細書、米国特許第６，７５０，００８号明細書、および米国特許第６，８２４，７８３号明細書（これら全ては参照によって本明細書に組み込まれる）には、ＨＩＶの感染に関係する融合事象の阻害に使用することに関する、ＤＰ−１７８ペプチドの使用可能性が記載されている。
【０１５８】
（１）抗ウイルス活性を示し、および／または、（２）ＨＩＶ−１以外のレトロウイルスと非レトロウイルスとにおけるコイルド−コイルペプチド構造に関する、細胞内プロセスを調整する能力、もしくは抗膜融合能を示す、ＤＰ１７８とＤＰ−１０７との部分、相同体、および類似体、ならびに、ＤＰ１７８／ＤＰ１０７、ＤＰ１７８−様ペプチド／ＤＰ１０７−様ペプチド、またはＨＲ１／ＨＲ２の相互作用の調整剤が、調べられた。そのような研究におけるウイルスには、サル免疫不全ウイルス（米国特許第６，０１７，５３６号明細書）、呼吸器合胞体ウイルス（米国特許第６，２２８，９８３号明細書、米国特許第６，４４０，６５６号明細書、米国特許第６，４７９，０５５号明細書、米国特許第６，６２３，７４１号明細書）、エプスタインバーウイルス（米国特許第６，０９３，７９４号明細書、米国特許第６，５１８，０１３号明細書）、パラインフルエンザウイルス（米国特許第６，３３３，３９５号明細書）、インフルエンザウイルス（米国特許第６，０６８，９７３号明細書、米国特許第６，０６０，０６５号明細書）、および麻疹ウイルス（米国特許第６，０１３，２６３号明細書）が含まれる。なお、上記文献の全ては、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１５９】
市販品のＤＰ−１７８は、フゼオン（Ｆｕｚｅｏｎ（登録商標）（エンフビルチド（ｅｎｆｕｖｉｒｔｉｄｅ）, Roche Laboratories Inc. and Trimeris, Inc.）である。フゼオン（Ｆｕｚｅｏｎ（登録商標））は、アセチル化されたＮ末端と、Ｃ末端としてのカルボキサミドとを有しており、以下の１次アミノ酸配列によって表される、ＣＨ３ＣＯ−ＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮＷＦ−ＮＨ２。抗レトロウイルス療法を継続しているにもかかわらず、ＨＩＶ−１の複製を示すＨＩＶ−１患者に、フゼオン（Ｆｕｚｅｏｎ（登録商標））は、他の抗ウイルス剤と組み合わされて使用される。
【０１６０】
参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，４６４，９３３号明細書および米国特許第６，８２４，７８３号明細書には、ＤＰ−１７８、ＤＰ−１７８の断片、類似体、および相同体が記載されており、例えば、アミノ末端およびカルボキシ末端に、切断、置換、挿入、欠失、付加、または巨大分子担体基を有する分子、ならびに、アミノ末端および／またはカルボキシ末端に疎水性の基などの化学基が存在するＤＰ−１７８分子が挙げられるが、これらに限定されない。さらに別のバリアントには、例えば、米国特許第６，８３０，８９３号明細書に記載のバリアント、および、米国特許第６，８６１，０５９号明細書に開示のＤＰ−１７８の誘導体が含まれる。Ｔ−２０のハイブリッドポリペプチドの一組は、米国特許第６，６５６，９０６号明細書、米国特許第６，５６２，７８７号明細書、米国特許第６，３４８，５６８号明細書、および米国特許第６，２５８，７８２号明細書に記載されており、ＤＰ−１７８の毒性融合体は、米国特許第６，６２７，１９７号明細書に記載されている。
【０１６１】
ＨＡＡＲＴ（高活性抗レトロウイルス療法）は、数種類の抗ウイルス剤からの薬物を組み合わせて、ウイルス量を減少させる標準的なＨＩＶの療法である。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，８６１，０５９号明細書には、ＤＰ−１７８もしくはＤＰ−１０７、またはそれらの誘導体と、少なくとも１つの他の抗ウイルス治療剤との組み合わせを用いた、ＨＩＶ−１複製の阻害方法とＨＩＶ−１感染の治療方法とが開示されている。上記他の抗ウイルス治療剤としては、逆転写酵素阻害剤（例えば、ＡＺＴ、ｄｄＩ、ｄｄＣ、ｄｄＡ、ｄ４Ｔ、３ＴＣ、または他のジデオキシヌクレオチドもしくはジデオキシフルオロヌクレオシド）、またはＨＩＶ−１プロテアーゼの阻害剤（例えば、インディナビル、リトナビル）が挙げられる。また、他の抗ウイルス剤としては、例えば、サイトカイン（例えば、ｒＩＦＮα、ｒＩＦＮβ、ｒＩＮＦγ）、ウイルスｍＲＮＡのキャッピングの阻害剤（例えばリバビリン）、ＨＩＶプロテアーゼの阻害剤（例えば、ＡＢＴ−５３８およびＭＫ−６３９）、抗ＨＩＶ活性を有する脂質結合分子としてのアンフォテリシンＢ、および糖タンパク質のプロセッシング阻害剤としてのカスタノスペルミン（ｃａｓｔａｎｏｓｐｅｒｍｉｎｅ）が挙げられる。他の抗ウイルス剤（逆転写酵素阻害剤、インテグラーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、サイトカインアンタゴニスト、およびケモカイン受容体の調整剤が含まれるが、これらに限定されない）とＴ−２０との組み合わせ療法として可能性のあるものは、米国特許第６，８５５，７２４号明細書、米国特許第６，８４４，３４０号明細書、米国特許第６，８４１，５５８号明細書、米国特許第６，８３３，４５７号明細書、米国特許第６，８２５，２１０号明細書、米国特許第６，８１１，７８０号明細書、米国特許第６，８０９，１０９号明細書、米国特許第６，８０６，２６５号明細書、米国特許第６，７６８，００７号明細書、米国特許第６，７５０，２３０号明細書、米国特許第６，７０６，７０６号明細書、米国特許第６，６９６，４９４号明細書、米国特許第６，６７３，８２１号明細書、米国特許第６，６７３，７９１号明細書、米国特許第６，６６７，３１４号明細書、米国特許第６，６４２，２３７号明細書、米国特許第６，５９９，９１１号明細書、米国特許第６，５９６，７２９号明細書、米国特許第６，５９３，３４６号明細書、米国特許第６，５８９，９６２号明細書、米国特許第６，５８６，４３０号明細書、米国特許第６，５４１，５１５号明細書、米国特許第６，５３８，００２号明細書、米国特許第６，５３１，４８４号明細書、米国特許第６，５１１，９９４号明細書、米国特許第６，５０６，７７７号明細書、米国特許第６，５００，８４４号明細書、米国特許第６，４９８，１６１号明細書、米国特許第６，４７２，４１０号明細書、米国特許第６，４３２，９８１号明細書、米国特許第６，４１０，７２６号明細書、米国特許第６，３９９，６１９号明細書、米国特許第６，３９５，７４３号明細書、米国特許第６，３５８，９７９号明細書、米国特許第６，２６５，４３４号明細書、米国特許第６，２４８，７５５号明細書、米国特許第６，２４５，８０６号明細書、および米国特許第６，１７２，１１０号明細書を含む多くの参考文献に記載されている。
【０１６２】
ＤＰ−１７８用の送達系として可能性のあるものは、例えば、米国特許第６，８４４，３２４号明細書、および米国特許第６，７０６，８９２号明細書に記載の送達系が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、Ｔ−２０を封入体において製造する方法は、米国特許第６，８５８，４１０号明細書に記載されている。
【０１６３】
増強された免疫反応を誘発することができる抗原性ポリペプチドは、免疫反応を増強し、ならびに、あるいは、疾病および／または疾病を引き起こす作用物質（例えば呼吸器合胞体ウイルスおよび免疫不全ウイルス（ＨＩＶ））に対する免疫的な有効反応を引き起こす。
【０１６４】
本発明は、血中半減期が短いＢＰＦＩの送達に関係する問題を解決するものである。本発明の化合物は、循環半減期が長い別のタンパク質（免疫グロブリンのＦｃ部分、またはアルブミン）に融合したＢＰＦＩを包含する。
【０１６５】
ＨＩＶの生活環のいくつかの段階が、治療的介入のための標的と考えられてきた（「Mitsuya, H.ら, 1991, FASEB J. 5:2369-2381」）。この介入にり、ＨＩＶの細胞膜への結合、ＨＩＶのＲＮＡゲノムのＤＮＡへの逆転写、またはウイルスの宿主細胞からの退出、およびウイルスの新しい標的細胞への感染を阻害することができる可能性があった。
【０１６６】
ＨＩＶ感染の最も初期の段階である、細胞へのウイルスの侵入を阻害することができる薬物の開発が、試みられている。Ｔ−２０は、他の抗ウイルス療法とは異なる機構でＨＩＶを標的とすることによって、ＨＩＶ−１のＣＤ４＋細胞への融合を阻害する阻害剤として作用する。米国特許第６，８６１，０５９号明細書には、ＤＰ−１７８もしくはＤＰ−１０７、またはそれらの誘導体と、少なくとも１つの他の抗ウイルス治療剤との組み合わせを用いた、ＨＩＶ−１複製の阻害方法とＨＩＶ−１感染の治療方法とが開示されている。上記他の抗ウイルス治療剤としては、逆転写酵素阻害剤（例えば、ＡＺＴ、ｄｄＩ、ｄｄＣ、ｄｄＡ、ｄ４Ｔ、３ＴＣ、または他のジデオキシヌクレオチドもしくはジデオキシフルオロヌクレオシド）、またはＨＩＶ−１プロテアーゼの阻害剤（例えば、インディナビル、リトナビル）が挙げられる。また、他の抗ウイルス剤としては、例えば、サイトカイン（例えば、ｒＩＦＮα、ｒＩＦＮβ、ｒＩＮＦγ）、ウイルスｍＲＮＡのキャッピングの阻害剤（例えばリバビリン）、ＨＩＶプロテアーゼの阻害剤（例えば、ＡＢＴ−５３８およびＭＫ−６３９）、抗ＨＩＶ活性を有する脂質結合分子としてのアンフォテリシンＢ、および糖タンパク質のプロセッシング阻害剤としてのカスタノスペルミンが挙げられる。
【０１６７】
本発明の化合物は、Ｎ末端とＣ末端とを有する第２ポリペプチドに融合されているＮ末端とＣ末端とを有する第１ポリペプチドを含んでいる異種融合タンパク質であって、第１ポリペプチドが、ＢＰＦＩ（陰イオン性ペプチド、ＨＲ−Ｃ、またはＨＲ−Ｎなど）であり、第２ポリペプチドが、（ａ）ヒトアルブミン、（ｂ）ヒトアルブミン類似体、および（ｃ）ヒトアルブミンの断片から成る群から選ばれ、第１ポリペプチドのＣ末端が、第２ポリペプチドのＮ末端に融合されている、異種融合タンパク質を包含する。
【０１６８】
また、本発明の化合物は、Ｎ末端とＣ末端とを有する第２ポリペプチドに融合されているＮ末端とＣ末端とを有する第１ポリペプチドを含んでいる異種融合タンパク質であって、第１ポリペプチドが、ＢＰＦＩ（陰イオン性ペプチド、ＨＲ−Ｃ、またはＨＲ−Ｎなど）であり、第２ポリペプチドが、（ａ）ヒトアルブミン、（ｂ）ヒトアルブミン類似体、および（ｃ）ヒトアルブミンの断片から成る群から選ばれ、第１ポリペプチドが、第２ポリペプチドに、リンカー、ペプチドリンカー、プロドラッグリンカーまたは水溶性ポリマーを介して、融合されている、異種融合タンパク質を包含する。ペプチドリンカーは、（ａ）グリシンリッチペプチド、（ｂ）［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］ｎ（ｎは１、２、３、４、５、６またはそれ以上）の配列を有するペプチド、および（ｃ）［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］３の配列を有するペプチドから成る群から選ばれてもよい。
【０１６９】
本発明のさらに別の化合物は、Ｎ末端とＣ末端とを有する第２ポリペプチドに融合されているＮ末端とＣ末端とを有する第１ポリペプチドを含んでいる異種融合タンパク質であって、第１ポリペプチドが、ＢＰＦＩ（陰イオン性ペプチド、ＨＲ−Ｃ、またはＨＲ−Ｎなど）であり、第２ポリペプチドが、（ａ）免疫グロブリンのＦｃ部分、（ｂ）免疫グロブリンのＦｃ部分の類似体、および（ｃ）免疫グロブリンのＦｃ部分の断片から成る群から選ばれ、第１ポリペプチドのＣ末端が、第２ポリペプチドのＮ末端に、融合されている、異種融合タンパク質を包含する。陰イオン性ペプチド、ＨＲ−Ｃ、またはＨＲ−ＮなどのＢＰＦＩは、第２ポリペプチドに、ペプチドリンカー  プロドラッグリンカー、または水溶性ポリマーを介して融合されていてもよい。ペプチドリンカーは、（ａ）グリシンリッチペプチド、（ｂ）［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］ｎ（ｎは１、２、３、４、５、６またはそれ以上）の配列を有するペプチド、および（ｃ）［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］３の配列を有するペプチドから成る群から選ばれてもよい。
【０１７０】
異種融合タンパク質の一部である、陰イオン性ペプチド、ＨＲ−Ｃ、またはＨＲ−Ｎは、複数のアミノ酸の置換を有していてもよいし、それらペプチドは、それらの天然の形態と異なるアミノ酸を、６、５、４、３、２、または１よりも多く有していてもよい。
【０１７１】
また、本発明には、本明細書に記載の異種融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含んでいるベクター、および本明細書に記載のベクターでトランスフェクションまたは形質転換された宿主細胞が含まれる。また、本発明には、異種融合タンパク質が検出可能な量で発現する条件下において、本明細書に記載のポリヌクレオチドを転写および翻訳する工程を含んでいる、異種融合タンパク質の製造方法も含まれる。
【０１７２】
少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいるＢＰＦＩ分子が、本発明に提供される。本発明の特定の実施形態では、少なくとも１つの非天然アミノ酸を有するＢＰＦＩは、少なくとも１つの翻訳後修飾を含んでいる。１実施形態では、少なくとも１つの翻訳後修飾は、当業者の一人に公知の特定の反応基に適切な化学方法論を利用した、第２反応基を含んでいる分子と、第１反応基を含んでいる非天然アミノ酸の少なくとも１つとの付着を含んでいる。ここで、該分子としては、例えば、標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋剤、放射性核種、細胞毒性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、樹脂、第２のタンパク質またはポリペプチドあるいはポリペプチド類似体、抗体または抗体断片、金属キレート剤、共同因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、阻害性リボ核酸、生体材料、ナノ粒子、スピンラベル、蛍光団、金属含有部分（ｍｏｉｅｔｙ）、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合または非共有結合で相互作用する基、光ケージド部分（a photocaged moiety）、光異性体化可能部分、ビオチン、ビオチンの誘導体、ビオチンの類似体、重原子を組み込んでいる部分、化学的に切断可能な基、光切断可能な基、伸長した側鎖、炭素結合した糖、酸化還元活性化剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識した部分、生物物理学的なプローブ、燐光性の基、化学発光性の基、電子密度の高い基、磁性基、挿入基、発色団、エネルギー伝達剤、生物活性剤、検出可能な標識、低分子、あるいは上記または他の任意の所望の化合物もしくは物質の任意の組み合わせが挙げられる。例えば、上記第１反応基は、アルキニル部分であり（例えば非天然アミノ酸であるｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンにおけるアルキニル部分であり、この場合、プロパルギル基は、ときどきアセチレン部分と呼ばれる）、第２反応基は、アジド部分であり、［３＋２］の付加環化という化学方法論が利用される。別の例を挙げると、第１反応基は、アジド部分であり（例えば、非天然アミノ酸であるｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンにおけるアジド部分）、第２反応基はアルキニル部分である。本発明の修飾されたＢＰＦＩの特定の実施形態では、少なくとも１つの翻訳後修飾を含んでいる少なくとも１つの非天然アミノ酸（ケト官能基を含んでいる非天然アミノ酸など）であって、、該少なくとも１つの翻訳後修飾がサッカライド部分を含んでいる非天然アミノ酸が、用いられる。特定の実施形態では、翻訳後修飾は、真核細胞または非真核細胞において、インビボで作製される。
【０１７３】
特定の実施形態では、上記タンパク質は、ある宿主細胞によりインビボにおいて作製された少なくとも１つの翻訳後修飾を含んでおり、該翻訳後修飾は通常、別の宿主細胞種により作製されないものである。特定の実施形態では、上記タンパク質は、真核細胞によりインビボにおいて作製された少なくとも１つの翻訳後修飾を含んでおり、該翻訳後修飾は通常、非真核細胞により作製されないものである。翻訳後修飾には、例えば、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミテートの付加、リン酸化、および糖脂質結合修飾などが含まれる。１実施形態では、翻訳後修飾は、ＧｌｃＮＡｃ−アスパラギン結合によるオリゴ糖のアスパラギンへの付着を含んでいる（例えば、上記オリゴ糖が（ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ）２−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃなどを含んでいる場合）。別の実施形態では、翻訳後修飾は、ＧａｌＮＡｃ−セリン、ＧａｌＮＡｃ−トレオニン、ＧｌｃＮＡｃ−セリン、またはＧｌｃＮＡｃ−トレオニン結合による、オリゴ糖（例えばＧａｌ−ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃなど）のセリンまたはトレオニンへの付着を含んでいる。特定の実施形態では、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、分泌または局在配列もしくはペプチド、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ、および／あるいはＧＳＴ融合などを含んでいてもよい。本発明に使用してもよいタグまたはリンカーとしては、例えば、ポリペプチド、ポリマー、親和性タグ、抗原、検出タグ、イメージングタグ、複数の要素が結合する複合体の要素の１つ、および放射性同位体タグが挙げられる。親和性タグおよび検出タグとしては、例えば、ポリＨｉｓタグ、ビオチン、アビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、および、免疫グロブリンのエピトープなどの抗原が挙げられる。イメージングタグとしては、例えば、金属、放射性核種、および磁性分子が挙げられる。複数の要素が結合する複合体タグは、例えば、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチン、プロテインＡ、およびプロテインＧが挙げられる。
【０１７４】
用語「局在ペプチド」には、例えば分泌シグナル配列などが含まれる。分泌シグナル配列としては、例えば、原核生物の分泌シグナル配列、真核生物の分泌シグナル配列、細菌での発現のために５’が最適化された真核細胞の分泌シグナル配列、新規の分泌シグナル配列、ペクチン酸リアーゼ分泌シグナル配列、ＯｍｐＡ分泌シグナル配列、およびファージ分泌シグナル配列が挙げられる。分泌シグナル配列としては、例えば、ＳＴＩＩ（原核生物）、Ｆｄ  ＧＩＩＩ、およびＭ１３（ファージ）、Ｂｇｌ２（酵母）、およびトランスポゾンに由来するシグナル配列ｂｌａが挙げられる。分泌シグナル配列としては、例えば、細菌の分泌シグナル配列、酵母の分泌シグナル配列、昆虫の分泌シグナル配列、哺乳類の分泌シグナル配列、ユニークな分泌シグナル配列が挙げられる。「局在配列」の別の例としては、例えば、ＴｒｐＬＥ配列が挙げられる。
【０１７５】
興味のあるタンパク質またはポリペプチドは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または１０以上の非天然アミノ酸を含んでいてもよい。非天然アミノ酸は、同一であっても異なっていてもよく、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なる非天然アミノ酸を含んでいる１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なる場所が、タンパク質に存在し得る。特定の実施形態では、天然発生型のタンパク質に存在する特定のアミノ酸の少なくとも１つ（ただし、全てではない）が非天然アミノ酸で置換されている。
【０１７６】
治療活性を有する任意のＢＰＦＩまたはその断片を、本発明に用いてもよい。本発明に用いられてもよいＢＰＦＩの多くの例は、提供されている。しかし、提供されている一覧は、網羅的なものではなく、また、本発明に用いられ得るＢＰＦＩの種類もしくは数を何ら限定するものではない。したがって、任意のＢＰＦＩ、および／または新規ＢＰＦＩを含む任意のＢＰＦＩから製造される断片を、本発明にしたがって修飾してもよいし、治療に用いてもよい。
【０１７７】
本発明は、少なくとも１つの非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるＢＰＦＩに基づく、方法および組成物を提供する。少なくとも１つの非天然にコードされたアミノ酸をＢＰＦＩに導入することにより、（例えば、１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸とは反応するが、一般的に生じる２０のアミノ酸とは反応しないという）特異的な化学反応を含む接合化学反応を適用することができる。いくつかの実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるＢＰＦＩ（陰イオン性ペプチド、ＨＲ−ＣまたはＨＲ−Ｎなど）は、非天然にコードされたアミノ酸の側鎖を介して、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの水溶性ポリマーと連結している。本発明は、ＰＥＧ誘導体によりタンパク質を選択的に修飾するための効率が高い方法を提供する。該方法は、非遺伝的にコードされたアミノ酸を、セレクターコドンに応じてタンパク質に選択的に組み込む工程と、その後に、適切に反応するＰＥＧ誘導体により、上記アミノ酸を修飾する工程とを含んでいる。上記非遺伝的にコードされたアミノ酸は、例えば、２０の天然に組み込まれるアミノ酸には発見されない官能基または置換基（例えば、ケトン、アジドまたはアセチレン部分）を含んでいるアミノ酸である。一旦組み込まれると、それから、天然にコードされたアミノ酸に存在する特定の置換基または官能基に適切な、当業者に公知の化学方法論を利用することにより、非遺伝的にコードされたアミノ酸の側鎖を修飾することができる。多種多様な公知の化学方法論が、水溶性ポリマーをタンパク質に組み込む本発明において、適切に使用される。上記方法論には、例えば、アセチレンまたはアジド誘導体のそれぞれとのＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］の付加環化反応などが含まれる（例えば、「Padwa, A. in Comprehensive Organic Synthesis, Vol. 4, (1991) Ed. Trost, B. M., Pergamon, Oxford, p. 1069-1109」、および「Huisgen, R. in 1.3-Dipolar Cycloaddition Chemistry. (1984) Ed. Padwa, A., Wiley, New York, p. 1-176」を参照のこと）。
【０１７８】
Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］の付加環化方法は、求核置換反応というよりは付加環化に関係するので、タンパク質を、非常に高い選択性でもって修飾することができる。触媒量のＣｕ（Ｉ）塩を反応混合物に添加することにより、非常に良好な位置選択性（１，４＞１，５）でもって、溶液の状態において室温で、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］の付加環化反応を実施することができる。例えば、「Tornoeら, (2002) J. Org. Chem. 67:3057-3064」、「Rostovtsevら, (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599」、および国際公開第０３／１０１９７２号パンフレットを参照のこと。［３＋２］付加環化を通して、本発明のタンパク質に追加することができる分子には、適切な官能基または置換基を有する実質的に任意の分子（アジドまたはアセチレン誘導体など）が含まれる。アセチレン基を有する非天然アミノ酸（ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンなど）、または、アジド基を有する非天然アミノ酸（ｐ−アジド−フェニルアラニンなど）のそれぞれに、上記分子を追加することができる。
【０１７９】
Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］の付加環化から得られる５員環は、一般的に還元環境において可逆であり、溶液環境において長期間にわたって、加水分解に対して安定である。よって、多種多様な物質の物理特性および化学特性を、本発明の活性型ＰＥＧ誘導体により、過酷な溶液条件下において修飾することができる。さらに重要なことは、アジドおよびアセチレン部分は、互いに特異的であるために（そして、例えば、２０の遺伝的にコードされた一般アミノ酸の何れとも反応しないために）、非常に高い選択性でもって、タンパク質を１つ以上の特定の部位において修飾できることである。
【０１８０】
また、本発明は、１つ以上のアセチレンまたはアジド部分を有する、ＰＥＧ誘導体およびそれに関連する親水性ポリマーの水溶性でかつ加水分解に安定な誘導体を提供する。アセチレン部分を含んでいるＰＥＧポリマー誘導体は、セレクターコドンに応じてタンパク質へ選択的に導入されたアジド部分との結合に対して、高い選択性を有する。同様に、アジド部分を含んでいるＰＥＧポリマー誘導体は、セレクターコドンに応じてタンパク質へ選択的に導入されたアセチレン部分との結合に対して、高い選択性を有する。
【０１８１】
より具体的には、アジド部分には、例えば、アルキルアジドおよびアリールアジド、ならびにこれらアジドの誘導体が含まれる。アルキルアジドおよびアリールアジドの誘導体には、アセチレンに特異的な反応性が維持されている限り、他の置換基が含まれていてもよい。アセチレン部分には、アルキルアセチレンおよびアリールアセチレン、ならびに、これらの誘導体が含まれる。アルキルアセチレンおよびアリールアセチレンの誘導体には、アジドに特異的な反応性が維持されている限り、他の置換基が含まれていてもよい。
【０１８２】
本発明は、多種多様な官能基、置換基、または部分を有する物質と、次の他の物質との接合体を提供する：標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋剤、放射性核種、細胞毒性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、樹脂、第２のタンパク質またはポリペプチドあるいはポリペプチド類似体、抗体または抗体断片、金属キレート剤、共同因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、阻害性リボ核酸、生体材料、ナノ粒子、スピンラベル、蛍光団、金属含有部分（ｍｏｉｅｔｙ）、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合または非共有結合で相互作用する基、光ケージド部分（a photocaged moiety）、光異性体化可能部分、ビオチン、ビオチンの誘導体、ビオチンの類似体、重原子を組み込んでいる部分、化学的に切断可能な基、光切断可能な基、伸長した側鎖、炭素結合した糖、酸化還元活性化剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識した部分、生物物理学的なプローブ、燐光性の基、化学発光性の基、電子密度の高い基、磁性基、挿入基、発色団、エネルギー伝達剤、生物活性剤、検出可能な標識、低分子、あるいは上記または他の任意の所望の化合物もしくは物質の任意の組み合わせ。また、本発明は、アジドまたはアセチレン部分を有する物質と、対応するアセチレンまたはアジド部分を有するＰＥＧポリマー誘導体との接合体を含んでいる。例えば、アジド部分を含んでいるＰＥＧポリマーを、タンパク質内のアセチレン機能性基（functionality）を有する非遺伝的にコードされたアミノ酸を含んでいる位置において、生物活性分子に結合することができる。ＰＥＧと生物活性分子とをつなげる結合には、例えば、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］の付加環化の産物が含まれる。
【０１８３】
ＰＥＧを用いて、生体材料の表面を修飾できることは技術的に十分確立されている（例えば、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，６１０，２８１号明細書、「Mehvar, R., J. Pharm Pharm Sci, 3(1): 125-136 (2000)」を参照のこと）。また、本発明は、１つ以上の反応性のアジドまたはアセチレン部位を有する表面と、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］の付加環化結合を介して、該表面に結合した本発明の１つ以上のアジドまたはアセチレン含有ポリマーとを含んでいる生体材料を提供する。また、カルボン酸、アミン、アルコール、またはチオール部分を含んでいる結合などのアジドまたはアセチレン結合以外の結合によって、生体材料と他の物質とを、アジドまたはアセチレン活性化ポリマーの誘導体に結合することができる。これによれば、アジドまたはアセチレン部分をその後の反応に利用することができる。
【０１８４】
本発明は、本発明のアジドおよびアセチレン含有ポリマーを合成する方法を含んでいる。アジド含有ＰＥＧ誘導体の場合、アジドを、ポリマーの炭素原子に直接結合させることができる。この代わりに、１つの末端にアジド部分を有する連結剤を、従来の活性型ポリマーに結合させることにより、アジド含有ＰＥＧ誘導体を調製することができる。これにより得られたポリマーは、その末端にアジド部分を有している。アセチレン含有ＰＥＧ誘導体の場合、アセチレンを、ポリマーの炭素原子に直接結合させることができる。この代わりに、１つの末端にアセチレン部分を有する連結剤を、従来の活性型ポリマーに結合させることにより、アセチレン含有ＰＥＧ誘導体を調製することができる。これにより得られたポリマーは、その末端にアセチレン部分を有している。
【０１８５】
より具体的には、アジド含有ＰＥＧ誘導体の場合、少なくとも１つの活性型ヒドロキシル部分を有する水溶性ポリマーに対して、より反応性のある部分（メシラート、トレシラート（tresylate）、トシレート、またはハロゲン脱離基など）を有する置換ポリマーを製造する反応を実施する。スルホニル酸ハロゲン化物、ハロゲン原子、および他の脱離期を含んでいるＰＥＧ誘導体の調製と使用とは、当業者に公知である。それから、得られた置換ポリマーに対して、該ポリマーの末端において上記のより反応性のある部分をアジド部分に置換する反応を実施する。これの代わりに、少なくとも１つの活性型の求核部分もしくは求電子部分を有する水溶性ポリマーを、１つの末端にアジドを有する連結剤と反応させる。これにより、ＰＥＧポリマーと連結剤との間に共有結合が形成され、アジド部分が、該ポリマーの末端に配置される。アミン、チオール、ヒドラジド、ヒドラジン、アルコール、カルボキシレート、アルデヒド、ケトン、およびチオエステルなどを含む求核部分および求電子部分は、当業者に公知である。
【０１８６】
より具体的には、アセチレン含有ＰＥＧ誘導体の場合、少なくとも１つの活性型ヒドロキシル部分を有する水溶性ポリマーに対して、ハロゲンまたは他の活性型脱離基をアセチレン部分を含んでいる前躯体から移動させる反応を受ける。これの代わりに、少なくとも１つの活性型の求核部分もしくは求電子部分を有する水溶性ポリマーを、１つの末端にアジドを有する連結剤と反応させる。これにより、ＰＥＧポリマーと連結剤との間に共有結合が形成され、アセチレン部分が該ポリマーの末端に配置される。有機合成におけるハロゲン部分、活性型脱離基、求核部分、および求電子部分の使用と、ＰＥＧの調製および使用とは、当業者に対して十分確立されている。
【０１８７】
また、本発明は、他の物質（例えば、アジドまたはアセチレン部分を含んでいるＰＥＧおよびＰＥＧ誘導体などの水溶性ポリマー）を修飾されたタンパク質に追加するために、タンパク質を選択的に修飾する方法を提供する。アジドおよびアセチレン含有ＰＥＧ誘導体を用いることにより、生体適合性、安定性、可溶性、免疫原性の欠失が重要である分子と表面との性質を修飾することができるとともに、技術的に以前から知られていたＰＥＧ誘導体をタンパク質に付着させる手段よりも、より選択的な手段を提供することができる。
【０１８８】
＜ＩＩ．ペプチドおよびポリペプチド＞
本発明の方法を利用して作製され得るＢＰＦＩは、任意の長さまたは配列のアミノ酸の任意の組み合わせであってもよい。また、上記アミノ酸は、天然に生じたものであってもよいし、非天然にコードされたものであってもよい。ＢＰＦＩ鎖におけるアミノ酸の少なくとも１つが、非天然にコードされたアミノ酸であることだけが、必須である。ポリペプチドが生合成により作製される場合、少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいるｍＲＮＡから翻訳されるときに、非天然にコードされたアミノ酸がペプチドに組み込まれる。化学合成により作製され得る本発明の新規ＢＰＦＩは、合成過程の間に、少なくとも１つの非天然にコードされたアミノ酸を組み込んでもよい。非天然にコードされたアミノ酸を、アミノ酸鎖の任意の位置に配置してもよいし、また、完成したＢＰＦＩの任意の部分に（例えば、生物活性ペプチド（生物学的に活性なペプチド）、リンカー、またはアルブミンもしくはＦｃなどの融合パートナーの中に）配置してもよい。
【０１８９】
本出願において陰イオン性ペプチド、ＨＲ−Ｃポリペプチド、またはＨＲ−Ｎポリペプチドに言及するときは、本発明において適切に使用されるペプチドまたはポリペプチドの例として、それらを用いることを意図している。したがって、陰イオン性ペプチド、ＨＲ−Ｃ、またはＨＲ−Ｎに関する本明細書に記載の修飾と化学反応とを、本明細書に具体的に記載されたＢＰＦＩなどを含む他の任意のＢＰＦＩに、同等に適用することができる。
【０１９０】
合成非天然アミノ酸、置換アミノ酸、または１つ以上のＤ−アミノ酸などの非天然アミノ酸を、本発明の異種融合タンパク質に組み込むことは、様々な種類の利点となり得る。Ｄ−アミノ酸含有ポリペプチドなどは、対応するＬ−アミノ酸含有ポリペプチドよりも、インビボおよびインビトロにおいてより安定である。このため、より良好な細胞内安定性が望まれるか、必要とされるときに、Ｄ−アミノ酸を組み込んでいるペプチドのコンストラクションなどは、特に有用であり得る。より具体的には、Ｄ−ペプチドなどは、内在性のペプチダーゼおよびプロテアーゼに対して耐性であるため、これにより、分子の生物学的利用性が改善されていることと、インビボにおける寿命が延長されていることとが望まれるときに、そのような性質を与えることができる。さらに、Ｄ−ペプチドなどは、Ｔヘルパー細胞への主要組織適合性複合体クラスＩＩの拘束性提示（restricted presentation）について、効率的に処理されることができない。このため、Ｄ−ペプチドなどは、全生物において体液性免疫反応を誘導する可能性が低い。
【０１９１】
＜ＩＩＩ．本発明と一緒に使用するための一般的な組み換え核酸方法＞
本発明の多くの実施形態では、興味のあるＢＰＦＩをコードする核酸が、単離およびクローニングされ、さらに、組み換え方法を用いて頻繁に変更される。そのような実施形態は、例えば、タンパク質の発現のために使用されるか、またはＢＰＦＩに由来するバリアント、誘導体、発現カセットもしくは他の配列を作製する間に、使用される。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドをコードする配列は、異種プロモーターに使用可能に連結される。宿主細胞における陰イオン性ペプチド、ＨＲ−ＣまたはＨＲ−Ｎの製造と、陰イオン性ペプチド、ＨＲ−ＣまたはＨＲ−Ｎの単離とは、例えば、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第〔〕に記載されている。
【０１９２】
非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるＢＰＦＩをコードするヌクレオチド配列を、親ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて合成してもよい。その後、関連するアミノ酸を導入するか（すなわち組み込みむか、もしくは置換する）、または除去する（すなわち欠失するか、もしくは置換する）ように、該ヌクレオチド配列を変えてもよい。従来の方法にしたがって、部位特異的変異誘発法により、ヌクレオチド配列を都合よく修飾してもよい。これの代わりに、ヌクレオチド配列を化学合成により調製してもよい。上記化学合成は、例えば、オリゴヌクレオチドが所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて設計されるオリゴヌクレオチド合成機を用いて実施される。また、上記化学合成において、組み換えポリペプチドが製造されるであろう宿主細胞に好適なコドンを選択することが好ましい。例えば、所望のポリペプチドの一部をコードする低オリゴヌクレオチドのいくつかを、ＰＣＲ、ライゲーション、またはライゲーション連鎖反応により合成および会合することができる。例えば、参照によって本明細書に組み込まれる「Baranyら, Proc. Natl. Acad. Sci 88: 189-193 (1991)」、および米国特許第６，５２１，４２７号明細書を参照のこと。
【０１９３】
本発明は、遺伝子組み換えの分野における通常の技術を利用する。本発明に使用される一般的な方法を開示する基本的なテキストとしては、「Sambrookら, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001)」、「Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)」、および「Current Protocols in Molecular Biology (Ausubelら, eds., 1994)」が挙げられる。
【０１９４】
分子生物学の技術を記載している一般的なテキストには、「Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger)」、「Sambrookら, Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 (“Sambrook”)」、および「Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubelら, eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (supplemented through 1999) (“Ausubel”)」が含まれる。これらのテキストには、突然変異誘発法、ベクターの使用、プロモーター、ならびに、例えば、直交化ｔＲＮＡ、直交化シンテターゼ、それらの対、および非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質を製造するためのセレクターコドンを含んでいる遺伝子の生成に関する他の多くの関連する題目が記載されている。プロモーターには、例えば、原核生物のプロモーター、真核生物のプロモーター、細菌のプロモーター、酵母のプロモーター、昆虫のプロモーター、哺乳類のプロモーター、ユニークなプロモーター、および誘導性プロモーターが含まれる。
【０１９５】
ｔＲＮＡのライブラリーの製造、シンテターゼのライブラリーの製造、セレクターコドンの製造、興味のあるタンパク質またはポリペプチド中の非天然アミノ酸をコードするセレクターコドンの挿入などの様々な目的のために、様々な種類の突然変異誘発法が本発明に用いられる。該突然変異誘発法には、例えば、部位特異的突然変異誘発法、ランダム点突然変異誘発法、相同性組み換え、ＤＮＡシャッフリング、または他の再帰的突然変異誘発法（recursive mutagenesis）、キメラコンストラクト、ウラシル含有テンプレートを用いた突然変異誘発法、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発法（oligonucleotide- directed mutagenesis）、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発法、ギャップ２本鎖ＤＮＡを用いた突然変異誘発法など、あるいは、それらの任意の組み合わせが含まれる。別の適切な方法には、ポイントミスマッチ修復、修復欠損宿主株を用いた突然変異誘発法、選択制限および精製制限、欠損突然変異誘発法、全遺伝子合成による突然変異誘発法、および２本鎖切断修復などが含まれる。また、キメラコンストラクト突然変異誘発法などに関する突然変異誘発法も、本発明に含まれる。１実施形態では、突然変異誘発法を、天然に生じる分子の分かっている情報（配列、配列比較、物理的性質、もしくは結晶構造など）により導くことができるし、または、天然に生じる分子を変更するか、もしくは突然変異させることにより導くことができる。
【０１９６】
これらの手法は、本明細書に見られるテキストと例とに開示されている。別の情報は、以下の刊行物および、そこで引用されている参考文献に見られる。「Lingら, Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal Biochem. 254(2): 157-178 (1997)」、「Daleら, Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, Methods Mol. Biol. 57:369-374 (1996)」、「Smith, In vitro mutagenesis, Ann. Rev. Genet. 19:423-462 (1985)」、「Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229:1193-1201 (1985)」、「Carter, Site-directed mutagenesis, Biochem. J. 237:1-7 (1986)」、「Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D.M.J. eds., Springer Verlag, Berlin) (1987)」、「Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis -without phenotypic selection, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985)」、「Kunkelら, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol. 154, 367-382 (1987)」、「Bassら, Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities, Science 242:240-245 (1988)」、「Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis using Ml3-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucleic Acids Res. 10:6487-6500 (1982)」、「Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors, Methods in Enzymol. 100:468-500 (1983)」、「Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template, Methods in Enzymol. 154:329-350 (1987)」、「Taylorら, The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764 (1985)」、「Taylorら, The rapid generation of oligonucleotide- directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8765-8785 (1985)」、「Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698 (1986)」、「Sayersら, 5’-3’ Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 16:791-802 (1988)」、「Sayersら, Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide, (1988) Nucl. Acids Res. 16: 803-814」、「Kramerら, The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456 (1984)」、「Kramer & Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA, Methods in Enzymol. 154:350-367 (1987)」、「Kramerら, Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, Nucl. Acids Res. 16: 7207 (1988)」、「Fritzら, Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999 (1988)」、「Kramerら, Different base/base mismatches are corrected with different efficiencies by the methyl-directed DNA mismatch-repair system of E. coli, Cell 38:879-887 (1984)」、「Carterら, Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using Ml3 vectors, Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443 (1985)」、「Carter, Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using Ml3 vectors, Methods in Enzymol. 154: 382-403 (1987)」、「Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, Nucl. Acids Res. 14: 5115 (1986)」、「Wellsら, Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415- 423 (1986)」、「Nambiarら, Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223: 1299-1301 (1984)」、「Sakmar and Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the alpha-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin), Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372 (1988)」、「Wellsら, Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34:315-323 (1985)」、「Grundstroemら, Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale ‘shot-gun’ gene synthesis, Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316 (1985)」、「Mandecki, Oligonucleotide-directed double- strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83:7177-7181 (1986)」、「Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinion in Biotechnology 4:450-455 (1993)」、「Sieberら, Nature Biotechnology, 19:456-460 (2001)」、「W. P. C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994)」、および「I. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res. 23, 3067-8 (1995)」。上記方法の多くについての別の詳細は、「Methods in Enzymolgy Volume 154」に見られ得る。また、「Methods in Enzymolgy Volume 154」には、様々な突然変異誘発法に関する問題をトラブルシューティングするための有益な制御が記載されている。
【０１９７】
また、本発明は、直交化ｔＲＮＡ／ＲＳの対を介してインビボにおいて非天然アミノ酸を組み込むための真核生物の宿主細胞、非真核生物の宿主細胞、および、生物に関する。宿主細胞は、一般的に本発明のポリヌクレオチド、または本発明のポリヌクレオチドを含んでいるコンストラクト（例えば、本発明のベクター）により操作されている。この操作としては、例えば、形質転換、形質導入、またはトランスフェクションなどが挙げられる。また、本発明のベクターは、例えばクローニングベクターであってもよいし、発現ベクターであってもよい。上記ベクターは、例えば、プラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド（naked polynucleotide）、または接合されたポリヌクレオチドの形態であってもよい。上記ベクターを、標準の方法によって細胞および／または微生物に導入する。標準の方法としては、例えば、エレクトロポレーション（「Frommら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5824 (1985)」、ウイルスベクターによる感染、核酸が小ビーズもしくは粒子のマトリックスの中または表面上にある小粒子による、高速弾道的浸透（「Kleinら, Nature 327, 70-73 (1987)」）が挙げられる。
【０１９８】
操作された宿主細胞を、スクリーニング工程、プロモーターの活性化、または形質転換体の選択などのような活動に適切なように修飾された従来の培養液において培養することができる。必要に応じて、上記宿主細胞を、遺伝子導入生物の中へ培養することができる。細胞の単離および培養など（例えば、その後に核酸を単離するための細胞の単離および培養）に関する他の有用な参考文献としては、例えば、以下の文献が挙げられる：「Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley- Liss, New York」およびそこで引用されている参考文献、ならびに「Payneら (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY」、「Gamborg and Phillips (eds.) (1995) Plant Cell. Tissue and Organ Culture Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York)」、および「Atlas and Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL」。
【０１９９】
標的核酸を細胞に導入する公知の方法のいくつかは利用可能であり、それらの何れかを、本発明に用いることができる。これらには、ＤＮＡを含んでいる細菌のプロトプラストと受容細胞との融合、エレクトロポレーション、発射による照射（projectile bombardment）、およびウイルスベクターによる感染（さらに以下で検討する）などが含まれる。細菌細胞を用いて、本発明のＤＮＡコンストラクトを含んでいるプラスミドの数を増幅することができる。細菌を対数増殖期まで成長させて、細菌の中のプラスミドを、技術的に公知の様々な方法により単離することができる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋを参照のこと）。さらに、細菌からプラスミドを精製するための多くのキットが、市販されている（例えば、Pharmacia Biotechから販売されているEasyPrep（登録商標）およびFlexiPrep（登録商標）、Stratageneから販売されているStrataClean（登録商標）、ならびにQiagenから販売されているQIAprep（登録商標）を参照のこと）。単離され、精製されたプラスミドを、その後にさらに操作して、細胞にトランスフェクションするために用いられるか、または生物に感染する関連ベクターに組み込むために用いられる他のプラスミドを製造する。典型的なベクターは、転写ターミネーター、翻訳ターミネーター、転写開始配列、翻訳開始配列、および特定の標的核酸の発現を調節するのに有用なプロモーターを含んでいる。必要に応じて、ベクターは、少なくとも１つの独立したターミネーター配列、真核生物もしくは原核生物またはその両方において包括的発現カセットの複製を可能にする配列を含んでいる包括的発現カセット（generic expression cassette）と、原核系および真核系のための選択マーカーとを含んでいる。また、上記包括的発現カセットが、真核生物および原核生物の両方において包括的発現カセットの複製を可能にする配列を含む場合は、そのベクターは、例えば、シャトルベクターである。ベクターは、原核生物、真核生物、好ましくはその両方において複製と組み込みとに適したものである。「Gillam & Smith, Gene 8:81 (1979)」、「Robertsら, Nature, 328:731 (1987)」、「Schneider, E.ら, Protein Expr. Purif. 6(1)10-14 (1995)」、上記「Ausubel」、上記「Sambrook」、上記「Berger」を参照のこと。クローニングに有用な細菌およびバクテリオファージのカタログは、例えば、ＡＴＣＣにより提供されており、例えば、ＡＴＣＣから出版されている、「The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage (1992) Ghernaら (eds)」が挙げられる。また、シークエンシング、クローニング、分子生物学の他の態様、および根本的な理論的考察に関する別の基本的手法が、「Watsonら (1992) Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books, NY」に見られる。さらに、本質的に任意の核酸（および実質的に任意の標識された核酸（標準的なものであっても、非標準的なものであってもよい）は、特別に作製されたものであってもよいし、様々な商業的供給者の何れかに標準的に注文されたものであってもよい。該商業的供給者は、例えば、Midland Certified reagent Company （Midland、TX、ワールドワイドウェブのmcrc.comにおいて利用可能である）、The Great American Gene Company（Ramona、CA、ワールドワイドウェブのgenco.comにおいて利用可能である）、ExpressGen Inc.（Chicago、IL、ワールドワイドウェブのexpressgen.comにおいて利用可能であ��）、Operon Technologies Inc.（Alameda，CA）、および他の多くが挙げられる。
【０２００】
（セレクターコドン）
本発明のセレクターコドンは、タンパク質の生合成機構の遺伝的コドンの枠組みを拡張するものである。例えば、セレクターコドンには、ユニークな３塩基コドン、ナンセンスコドン（アンバーコドン（ＵＡＧ）またはオパールコドン（ＵＧＡ）などの終止コドンなど）、非天然コドン、４塩基以上のコドン、またはレアコドンなどが含まれる。所望の遺伝子に導入され得るセレクターコドンの数の範囲が広いことは当業者には、直ちに明らかである。例えば、ＢＰＦＩの少なくとも一部をコードする１つのポリヌクレオチドに、１つ以上、２つ以上、３よりも多く、４よりも多く、５よりも多く、６よりも多く、７よりも多く、８よりも多く、９よりも多く、１０よりも多く、またはそれ以上のセレクターコドンを導入することができる。
【０２０１】
１実施形態では、本発明の方法は、インビボで真核細胞において非天然アミノ酸を組み込むための、終止コドンであるセレクターコドンの使用を含んでいる。例えば、終止コドン（ＵＡＧなど）を認識するＯ‐ｔＲＮＡは製造され、該Ｏ‐ｔＲＮＡが所望の非天然アミノ酸を用いてＯ‐ＲＳによりアミノアシル化される。このＯ‐ｔＲＮＡは、宿主の天然に生じるアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼにより認識されない。従来の部位特異的突然変異誘発法を用いて、終止コドン（ＴＡＧなど）を、興味のあるポリペプチドの興味のある部位に導入することができる。例えば、「Sayers, J.R.ら (1988), 5’-3’ Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res. 16:791-802」を参照のこと。Ｏ‐ＲＳ、Ｏ‐ｔＲＮＡ、および興味のあるポリペプチドをコードする核酸が、インビボにおいて組み合わされると、非天然アミノ酸が、ＵＡＧコドンに応じて組み込まれる。これにより、特定の位置において非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドが得られる。
【０２０２】
真核生物の宿主細胞をほとんど混乱させることなく、インビボにおける非天然アミノ酸の組み込みを、実施することができる。例えば、ＵＡＧコドンの抑圧効率は、Ｏ‐ｔＲＮＡ（アンバーサプレッサーｔＲＮＡなど）と真核生物の終結因子（ｅＲＦなど）とに依存するので、Ｏ‐ｔＲＮＡおよび／またはサプレッサーｔＲＮＡの発現量を増加することなどにより、抑圧効率を調整することができる。なお、終結因子は、終止コドンに結合して、成長中のペプチドのリボソームからの放出を開始するものである。
【０２０３】
また、セレクターコドンには、４塩基以上のコドン（例えば、４、５、６またはそれ以上の塩基のコドン）などの拡張されたコドン（拡張コドン）が含まれる。４塩基コドンとしては、例えば、ＡＧＧＡ、ＣＵＡＧ、ＵＡＧＡ、およびＣＣＣＵなどが挙げられる。５塩基コドンとしては、例えば、ＡＧＧＡＣ、ＣＣＣＣＵ、ＣＣＣＵＣ、ＣＵＡＧＡ、ＣＵＡＣＵ、およびＵＡＧＧＣなどが挙げられる。本発明の特徴には、フレームシフト抑圧に基づいた、拡張コドンの使用が含まれる。４塩基以上のコドンは、例えば、１つ以上の非天然アミノ酸を同じタンパク質に挿入することができる。例えば、アンチコドンループ（例えば、少なくとも８−１０ｎｔのアンチコドンループ）を有する突然変異したＯ‐ｔＲＮＡ（特別なフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡなど）の存在下において、４塩基以上のコドンが１アミノ酸として読まれる。他の実施形態では、アンチコドンループは、例えば、少なくとも４塩基コドン、少なくとも５塩基コドン、または少なくとも６塩基コドンまたはそれ以上を解読することができる。４塩基コドンには、２５６の可能性があるので、４塩基以上のコドンを用いると、同じ細胞において複数の非天然アミノ酸をコードすることができる。「Andersonら, (2002) Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size, Chemistry and Biology, 9:237-244」、「Magliery, (2001) Expanding the Genetic Code: Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of “Shifty” Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli, J. Mol. Biol. 307: 755-769」を参照のこと。
【０２０４】
例えば、以前から、４塩基コドンを用いて、インビトロの生合成方法により非天然アミノ酸をタンパク質に組み込まれている。例えば、「Maら, (1993) Biochemistry, 32:7939」、および「Hohsakaら, (1999) J. Am. Chem. Soc, 121 :34」。ＣＧＣＧおよびＡＧＧＵを用いて、２−ナフチルアラニンとリジンのＮＢＤ誘導体とが、２つの化学的にアシル化されたフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡにより、インビトロにおいてストレプトアビジンに同時に組み込まれた。例えば、「Hohsakaら, (1999) J. Am. Chem. Soc, 121: 12194」を参照のこと。インビボにおける研究では、Ｍｏｏｒらは、ＵＡＧＮコドンを抑圧するというＮＣＵＡアンチコドンを有するｔＲＮＡＬｅｕ誘導体の能力を調べた（ＮはＵ、Ａ、ＧまたはＣであり得る）。そして、ＵＣＵＡアンチコドンを有するｔＲＮＡＬｅｕにより、４塩基のＵＡＧＡが、１３〜２６％の効率でもって、０または−１フレームにおける解読がほとんどなく、解読され得ることを発見した（「Mooreら, (2000) J. Mol. Biol., 298:195」を参照のこと）。１実施形態では、レアコドンまたはナンセンスコドンに基づく拡張コドンを、本発明に用いることができる。これによれば、他の望ましくない部位におけるミスセンスのリードスルーと、フレームシフト抑圧とを減少することができる。
【０２０５】
所定の系に関して、内在性の系が天然塩基コドンを使用しない（または稀に使用する）場合、セレクターコドンには、天然の３塩基コドンの１つも含まれ得る。例えば、これには、天然３塩基コドンを認識するｔＲＮＡを欠いた系、および／または、３塩基コドンがレアコドンである系が含まれる。
【０２０６】
必要に応じて、セレクターコドンは、非天然塩基対を含んでいる。該非天然塩基対は、存在する遺伝子アルファベットをさらに拡張する。１つの付加的な塩基対により、３塩基コドンの数が、６４から１２５に増加する。３番目の塩基対の性質には、安定かつ選択的な塩基対形成、ポリメラーゼにより高い忠実度で行われる、ＤＮＡの効率の良い酵素的組み込み、および初期の非天然塩基対の合成後に、継続されるプライマーの効率の良い伸長が含まれる。方法と組成物とに適応され得る非天然塩基対は、例えば「Hiraoら, (2002) An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein, Nature Biotechnology, 20:177-182」に記載されている。また、他の関連する刊行物を以下に列挙する。
【０２０７】
インビボでの使用に関して、非天然ヌクレオシドは、膜透過性であり、リン酸化されることにより対応する３リン酸塩を形成する。さらに、増加した遺伝情報は安定であり、細胞内酵素により破壊されない。Ｂｅｎｎｅｒおよびその他によるこれまでの努力によれば、正準のワトソン−クリック対における水素結合パターンとは異なる水素結合パターンが利用された。その水素結合パターンのうち最も注目すべき例は、イソ−Ｃ：イソ−Ｇ対である。例えば、「Switzerら, (1989) J. Am. Chem. Soc. 11 1:8322」、「Piccirilliら, (1990) Nature, 343:33」、および「Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602」を参照のこと。一般的に、これら塩基は、天然塩基とある程度で誤った塩基対を形成するし、酵素により複製されることができない。Ｋｏｏｌと協働者とは、塩基間の疎水性のパッキング相互作用により、塩基対が形成されるように水素結合が置き換られ得ることを実証した。「Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602」、および「Guckian and Kool, (1998) Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 36, 2825」を参照のこと。上記必要条件の全てを満足する非天然塩基対を開発する努力において、Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ、および協働者は、一連の非天然の疎水性塩基を体系的に合成し、研究した。ＰＩＣＳ：ＰＩＣＳ自己対は、天然塩基対よりも安定であることが発見され、Escherichia coliのＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片（ＫＦ）により、効率的にＤＮＡに組み込まれることができる。例えば、「McMinnら, (1999) J. Am. Chem. Soc. 121 :11585-6」、および「Ogawaら, (2000) J. Am. Chem. Soc, 122:3274」を参照のこと。３ＭＮ：３ＭＮ自己対は、生物学的機能に十分な効率と選択性とでもって、ＫＦにより合成されることができる。例えば、「Ogawaら, (2000) J. Am. Chem. Soc. 122:8803」を参照のこと。しかし、両塩基とも、複製をさらにするときに、連鎖停止剤として作用する。ＰＩＣＳ自己対を複製するために用いることができる、突然変異のＤＮＡポリメラーゼが近年、進化された。さらに、７ＡＩ自己対を複製することができる。例えば、「Taeら, (2001) J. Am. Chem. Soc, 123:7439」を参照のこと。また、新規の金属塩基対（metallobase pair）、Ｄｉｐｉｃ：Ｐｙも開発された。このＤｉｐｉｃ：Ｐｙは、Ｃｕ（ＩＩ）の結合にしたがって、安定な対を形成する。「Meggersら, (2000) J. Am. Chem. Soc, 122:10714」を参照のこと。拡張コドンと非天然コドンとは、天然コドンに対して本質的に直交であるので、本発明の方法は、拡張コドンと非天然コドンとのための直交化ｔＲＮＡを生成するために、この性質を利用することができる。
【０２０８】
また、翻訳バイパス系を用いて、非天然アミノ酸を、所望のポリペプチドに組み込むことができる。翻訳バイパス系では、長い配列が遺伝子に挿入されるが、この配列はタンパク質に翻訳されない。該配列は、リボソームに該配列を飛び越えさせて、挿入の下流から翻訳を再開させるきっかけとなる構造を含んでいる。
【０２０９】
特定の実施形態では、本発明の方法および／または組成物における、興味のあるタンパク質もしくはポリペプチド（あるいはそれらの一部）は、核酸にコードされている。通常、該核酸は、少なくとも１つのセレクターコドン、少なくとも２つのセレクターコドン、少なくとも３つのセレクターコドン、少なくとも４つのセレクターコドン、少なくとも５つのセレクターコドン、少なくとも６つのセレクターコドン、少なくとも７つのセレクターコドン、少なくとも８つのセレクターコドン、少なくとも９つのセレクターコドン、あるいは、１０またはそれ以上のセレクターコドンを含んでいる。
【０２１０】
当業者の一人に公知の方法、および本明細書に記載の方法を用いて、興味のあるタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子を、例えば非天然アミノ酸を組み込むための１つ以上のセレクターコドンを含むように突然変異させることができる。例えば、興味のあるタンパク質に関する核酸を、１つ以上のセレクターコドンを含むように突然変異させることにより、１つ以上の非天然アミノ酸を組み込むことができる。本発明には、例えば少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいる任意のタンパク質の突然変異体、変形体などを含むそのような任意のバリアントが包含される。同様に、本発明には、対応する核酸、すなわち１つ以上の非天然アミノ酸をコードする１つ以上のセレクターコドンを有する任意の核酸も含まれる。
【０２１１】
ポリペプチドの任意の所望の位置にシステインが導入されるように、ＢＰＦＩ（陰イオン性ペプチド、ＨＲ−ＣまたはＨＲ−Ｎなど）をコードする核酸分子を、容易に突然変異させても良い。反応性分子、水溶性ポリマー、タンパク質または多種多様な他の分子を、興味のあるタンパク質へ導入するために、システインが広く用いられている。システインをポリペプチドの所望の位置に組み込むのに適した方法は、技術的に公知であり、例えば、米国特許第６，６０８，１８３号明細書に記載されている。また、該方法は、標準の突然変異誘発技術を含んでいる。
【０２１２】
＜ＩＶ．非天然にコードされたアミノ酸＞
非常に多種多様な非天然にコードされたアミノ酸が、本発明における使用に適している。任意の数の非天然にコードされたアミノ酸を、ＢＰＦＩに導入することができる。一般的に、導入された非天然にコードされたアミノ酸は、２０の遺伝的にコードされた一般アミノ酸に対して実質的に化学的に不活性である。ここで、該一般アミノ酸は、すなわちアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンである。いくつかの実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸は、２０の一般アミノ酸には発見されない官能基と効率的かつ選択的に反応して、安定な接合体を形成する官能基（例えばアジド、ケトン、アルデヒドおよびアミノオキシ基）を側鎖に含んでいる。例えば、アジド官能基を含んでいる非天然にコードされたアミノ酸を含有するＢＰＦＩを、ポリマー（例えば、ポリ（エチレングリコール）と反応させることができる。また、このＢＰＦＩを、上記ポリマー以外のものと反応させてもよく、上記ＢＰＦＩとアルキン部分を含んでいる第２ポリペプチドとを、反応させることにより、アジド官能基とアルキン官能基との選択的反応からＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化産物が形成され、これにより、安定な接合体を形成することができる。
【０２１３】
アルファ−アミノ酸の一般構造は、以下のように示される（一般式Ｉ）
【０２１４】
【化５】
2009514533.tif 000007
【０２１５】
非天然にコードされたアミノ酸は、通常、上記一般式を有する任意の構造であるが、Ｒ基は、２０の天然アミノ酸に用いられているＲ基以外の任意の置換基であるとともに、本発明における使用に適していてもよいものである。本発明の非天然にコードされたアミノ酸は、通常、側鎖の構造においてのみ天然アミノ酸と異なるので、非天然にコードされたアミノ酸は、天然もしくは非天然にコードされたアミノ酸などの他のアミノ酸と、アミド結合を天然に生じるポリペプチドに形成される様式と同じ様式で形成する。しかし、非天然にコードされたアミノ酸は、非天然にコードされたアミノ酸を天然アミノ酸から区別する側鎖を有している。例えば、必要に応じて、Ｒは、アルキル−、アリール−、アシル−、ケト−、アジド−、ヒドロキシル−、ヒドラジン、シアノ−、ハロ−、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、セレノー、スルホニル−、ボレート（ｂｏｒａｔｅ）、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、またはアミノ基など、あるいはそれらの任意の組み合わせを含んでいる。本発明の使用において適切であり得る他の興味のある非天然に生じるアミノ酸には、光活性化可能なクロスリンカーを含んでいるアミノ酸、スピンラベルアミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合アミノ酸、金属含有アミノ酸、新規官能基を有する放射性アミノ酸、他の分子と共有的または非共有的に相互作用するアミノ酸、光ケージドおよび／または光異性化可能なアミノ酸、ビオチンまたはビオチン類似体を含んでいるアミノ酸、グリコシル化アミノ酸（糖置換セリンなど）、他の炭水化物により修飾されたアミノ酸、ケト含有アミノ酸、ポリエチレングリコールまたはポリエーテルを含んでいるアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学的に切断可能および／または光切断可能なアミノ酸、天然アミノ酸と比べて伸長した側鎖（例えば約５よりも長い、もしくは約１０よりも長い炭素などを含んでいる長鎖炭化水素またはポリエーテルなど）を有するアミノ酸、炭素結合型糖アミノ酸（carbon-linked sugar-containing amino acid）、酸化還元活性を有するアミノ酸、アミノ酸を含んでいるアミノチオ酸、ならびに、１つ以上の毒性部分を含んでいるアミノ酸が含まれる。
【０２１６】
水溶性ポリマーとの反応に有用でかつ本発明における使用に適し得る、典型的な非天然にコードされたアミノ酸には、特に限定されないが、カルボニル、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド、セミカルバジド、アジド、およびアルキンの反応基を有する非天然にコードされたアミノ酸が含まれる。いくつかの実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸は、サッカライド部分を含んでいる。上記アミノ酸の例としては、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−ガラクトサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−トレオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−アスパラギン、およびＯ−マンノサミニル−Ｌ−セリンなどが挙げられる。また、上記アミノ酸の例には、例えば、アミノ酸とサッカライドとの間の天然に生じるＮ‐またはＯ−結合が、天然には通常発見されない共有結合（例えば、アルケン、オキシム、チオエーテル、およびアミドなど）により置換されている例が含まれる。また、上記アミノ酸の例は、天然に生じるタンパク質に通常発見されないサッカライド（例えば、２−デオキシ−グルコース、および２デオキシガラクトースなど）を含んでいる。
【０２１７】
本明細書に示された多くの非天然にコードされたアミノ酸は、例えば、Sigma-Aldrich（St. Louis, MO, USA）、Novabiochem (a division of EMD Biosciences, Darmstadt, Germany)、またはPeptech (Burlington, MA, USA)から市販されている。市販されていない非天然にコードされたアミノ酸は、必要に応じて、当業者に公知の標準の方法を用いるか、本明細書に示されるようにして合成される。有機合成技術に関しては、例えば、FessendonとFessendonとによる「Organic Chemistry(1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass.)」、Marchによる「Advanced Organic Chemistry(Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York)」、およびCareyとSundbergとによる「Advanced Organic Chemistry (Third Edition, Parts A and B, 1990, Plenum Press, New York)」を参照のこと。また、米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号明細書と、米国特許出願公開第２００３／０１０８８８５号明細書とを参照こと（参照によって本明細書に組み込まれる）。また、新規側鎖を含んでいる非天然アミノ酸に加えて、本発明における使用に適していてもよい非天然アミノ酸は、必要に応じて修飾された骨格構造を含んでおり、例えば、一般式ＩＩおよびＩＩＩの構造により示されるようなアミノ酸が挙げられる。
【０２１８】
【化６】
2009514533.tif 000008
【０２１９】
（式中、Ｚは、通常ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＮＨ−Ｒ’またはＳ−Ｒ’を含み、同一であっても異なっていてもよいＸおよびＹは、通常ＳまたはＯを含み、必要に応じて同一または異なっているＲおよびＲ’は、通常一般式Ｉで示される非天然アミノ酸の上記Ｒ基についての構成要素のリストと同じリスト、および水素から選ばれる）。例えば、本発明の非天然アミノ酸は、一般式ＩＩおよびＩＩＩで示されるように、アミノ基またはカルボキシル基に置換基を必要に応じて含んでいる。この種類の非天然アミノ酸には、例えば２０の一般的な天然アミノ酸の側鎖に相当する側鎖か、非天然の側鎖を有する、α−ヒドロキシ酸、α−チオ酸、α−アミノチオカルボキシレートなどが含まれる。さらに、α−炭素における置換基は、必要に応じて、例えば、Ｌアミノ酸、Ｄアミノ酸、またはα−α−２置換アミノ酸を含んでおり、例えば、Ｄ−グルタミン酸（glutamate）、Ｄ−アラニン、Ｄ−メチル−Ｏ−チロシン、およびアミノ酪酸などが挙げられる。他の構造的に異なるアミノ酸には、環状アミノ酸（プロリン類似体、ならびに、３、４、６、７、８、および９員環のプロリン類似体）、βアミノ酸、およびγアミノ酸（置換β−アラニンおよびγ−アミノ酪酸など）が含まれる。
【０２２０】
多くの非天然アミノ酸は、天然アミノ酸（チロシン、グルタミン、およびフェニルアラニンなど）に基づいていおり、本発明における使用に適している。チロシン類似体には、例えば、パラ−置換チロシン、オルソ−置換チロシン、メタ置換チロシンが含まれる。ここで、置換チロシンは、例えば、ケト基（アセチル基など）、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン基、ヒドロキシアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、Ｃ６−Ｃ２０の直鎖もしくは分枝鎖の炭化水素、飽和もしくは不飽和の炭化水素、Ｏ−メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基、またはアルキニル基などを含んでいる。さらに、アリール環が複数置換されているものも、考慮される。本発明における使用に適していてもよいグルタミン類似体には、例えば、α−ヒドロキシ誘導体、γ−置換誘導体、環状誘導体およびアミド置換グルタミン誘導体が含まれる。本発明における使用に適していてもよいフェニルアラニン類似体の例には、パラ−置換フェニルアラニン、オルソ−置換フェニルアラニン、およびメタ−置換フェニルアラニンなどが含まれ、ここで、置換体は、例えば、ヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド、アジド、イオド、ブロモ、ケト基（アセチル基など）、ベンゾイル、またはアルキニル基などを含んでいる。本発明における使用に適していてもよい非天然アミノ酸の具体的な例には、例えば、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−ドーパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−イオド−フェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、およびｐ−プロパルギルオキシ−フェニルアラニンなどが挙げられる。本発明における使用に適していてもよい様々な非天然アミノ酸の構造の例は、例えば、「In vivo incorporation of unnatural amino acids.」と題された国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレットに提供されている。また、さらなるメチオニン類似体については、「Kiickら, (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99:19-24」も参照のこと。
【０２２１】
１実施形態では、非天然アミノ酸（ｐ−（プロパルギルオキシ）−フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙａｌａｎｉｎｅ）など）を含んでいるＢＰＦＩの組成物が、提供される。また、ｐ−（プロパルギルオキシ）−フェニルアラニン（phenyalanine）を含んでおり、タンパク質および／または細胞を含有している様々な組成物が提供される。１態様では、非天然アミノ酸であるｐ−（プロパルギルオキシ）−フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙａｌａｎｉｎｅ）を含んでいる組成物は、直交化ｔＲＮＡをさらに含んでいる。非天然アミノ酸を、直交化ｔＲＮＡに、例えば共有結合させることができる。このような結合の例としては、アミノ−アシル結合を介した直交化ｔＲＮＡへの共有結合、直交化ｔＲＮＡにおける末端の糖であるリボースの３’ＯＨまたは２’ＯＨへの共有結合などが挙げられる。
【０２２２】
タンパク質へ組み込むことができる非天然アミノ酸を介した化学部分から、様々な利点が得られるとともに、タンパク質を様々に操作することができる。例えば、ケト官能基のユニークな反応性によれば、多くのヒドラジンまたはヒドロキシルアミン含有試薬の何れかを用いて、インビトロおよびインビボにおいてタンパク質を選択的に修飾することができる。例えば、重原子非天然アミノ酸は、Ｘ線構造データの位相合わせに有用であり得る。また、非天然アミノ酸を用いた重元素の部位特異的な導入は、重元素の位置を選択するときに、選択性と柔軟性とを与える。光反応性非天然アミノ酸（例えば、ベンゾフェノンおよびアリールアジド（フェニルアジドなど）の側鎖を有するアミノ酸）により、例えば、インビボおよびインビトロにおけるタンパク質の光架橋を効率的に実施することができる。光反応性非天然アミノ酸の例には、特に限定されないが、ｐ−アジド−フェニルアラニン、およびｐ−ベンゾイル−フェニルアラニンが含まれる。光反応性非天然アミノ酸を有するタンパク質を、時間的な制御を備える光反応性基の励起により、任意に架橋することができる。１例では、例えば、核磁気共鳴および振動分光法に用いる局所的構造と動態とのプローブとしての同位体標識されたメチル基などで、非天然アミノ酸のメチル基を置換することができる。アルキニルまたはアジド官能基によれば、例えば、［３＋２］付加環化反応を介して、タンパク質を分子により選択的に修飾することができる。
【０２２３】
アミノ末端においてポリペプチドに組み込まれる非天然アミノ酸を、２０の天然アミノ酸に用いられる置換基以外の任意の置換基であるＲ基と、α−アミノ酸に標準的に存在するＮＨ２（一般式Ｉを参照のこと）と異なる第２反応基とから構成することができる。同様の非天然アミノ酸を、α−アミノ酸に標準的に存在するＣＯＯＨ基（一般式Ｉを参照のこと）と異なる第２反応基により、カルボキシ末端に組み込むことができる。
【０２２４】
（非天然アミノ酸の化学合成）
本発明における使用に適した多くの非天然アミノ酸は、Sigma (USA)またはAldrich (Milwaukee, WI, USA)などから市販されている。市販されていない非天然アミノ酸は、必要に応じて、当業者に公知の標準の方法を用いるか、様々な刊行物に提供されているようにするか、または本明細書に示されるようにして合成される。有機合成技術に関しては、例えば、FessendonとFessendonとによる「Organic Chemistry(1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass.)」、Marchによる「Advanced Organic Chemistry(Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York)」、およびCareyとSundbergとによる「Advanced Organic Chemistry (Third Edition, Parts A and B, 1990, Plenum Press, New York)」を参照のこと。非天然アミノ酸の合成が記載された別の刊行物としては、例えば、「In vivo incorporation of Unnatural Amino Acids;」と題された国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレット、「Matsoukasら, (1995) J. Med. Chem., 38, 4660-4669」、「King, F.E. & Kidd, D.A.A. (1949) A New Synthesis of Glutamine and of γ-Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates. J. Chem. Soc., 3315-3319」、「Friedman, O.M. & Chatterrji, R. (1959) Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti-Tumor Agents. J. Am. Chem. Soc. 81, 3750-3752」、「 Craig, J.C.ら (1988) Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4 [[4-(diethylamino)-l- methylbutyl] amino] quinoline (Chloroquine). J. Org. Chem. 53, 1167-1 170」、「Azoulay, M., Vilmont, M. & Frappier, F. (1991) Glutamine analogues as Potential Antimalarials, Eur. J. Med. Chem. 26, 201-5」、「Koskinen, A.M.P. & Rapoport, H. (1989) Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino Acid Analogues. J. Org. Chem. 54, 1859- 1866」、「Christie, B.D. & Rapoport, H. (1985) Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L- Asparagine. Application to the Total Synthesis of (+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization. J. Org. Chem. 50:1239-1246」、「Bartonら, (1987) Synthesis of Novel alpha-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry: Synthesis of L- and D-alpha-Amino-Adipic Acids, L-alpha-aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives. Tetrahedron 43:4297-4308」、および「Subasingheら, (1992) Quisqualic acid analogues: synthesis of beta-heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualate-sensitized site. J. Med. Chem. 35:4602-7」が挙げられる。また、「Protein Arrays」と題されたシリアル番号１０／７４４，８９９の特許出願（２００３年１２月２２日出願）、シリアル番号６０／４３５，８２１の特許出願（２００２年１２月２２日出願）も参照のこと。
【０２２５】
Ａ．カルボニル反応基
カルボニル反応基を有するアミノ酸により、特に求核付加反応や、アルドール縮合反応を介して、分子（ＰＥＧ、または他の水溶性分子など）を連結させる様々な反応を実施することができる。
【０２２６】
典型的なカルボニル含有アミノ酸は、以下に示されるアミノ酸であってもよい。
【０２２７】
【化７】
2009514533.tif 000009
【０２２８】
（ここで、ｎは０−１０であり、Ｒ１はアルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであり、Ｒ２はＨ、アルキル、アリール、置換アルキル、および置換アリールであり、Ｒ３はＨ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、Ｒ４はＨ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である）。いくつかの実施形態では、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、Ｒ２は単純アルキル（すなわちメチル、エチル、またはプロピル）であり、ケトン部分がアルキル側鎖に対してパラの位置に位置している。いくつかの実施形態では、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、Ｒ２は単純アルキル（すなわちメチル、エチル、またはプロピル）であり、ケトン部分がアルキル側鎖に対してメタの位置に位置している。
【０２２９】
ｐ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニンおよびｍ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニンの合成は、「Zhang, Z.ら, Biochemistry 42: 6735-6746 (2003)」に記載されている（参照によって本明細書に組み込まれる）。他のカルボニル含有アミノ酸は、当業者によって同様に調製され得る。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるポリペプチドは、反応性のカルボニル官能基が生成されるように、化学的に修飾される。例えば、接合反応に有用なアルデヒド機能性基を、隣接するアミノ基とヒドロキシル基とを有する機能性基から生成することができる。生物活性分子が、ポリペプチドである場合、例えば、Ｎ−末端のセリンもしくはトレオニンを用いて、過ヨウ素酸塩を使った穏やかな酸化条件下においてアルデヒド機能性基を生成することができる。例えば、「Gaertnerら, Bioconjug. Chem. 3: 262-268 (1992)」、「Geoghegan, K. & Stroh, J., Bioconjug. Chem. 3:138- 146 (1992)」、「Gaertnerら, J. Biol. Chem. 269:7224-7230 (1994)」を参照のこと。また、Ｎ末端のセリンもしくはトレオニンは、標準的に存在していてもよいし、または化学的消化もしくは酵素消化により露出させられてもよい。しかし、技術的に知られている方法は、ペプチドまたはタンパク質のＮ末端のアミノ酸に制限されている。
【０２３１】
本発明では、隣接するヒドロキシル基とアミノ基を有している非天然にコードされたアミノ酸を、「マスクされた」アルデヒド機能性基として、ポリペプチドに組み込むことができる。例えば、５−ヒドロキシリジンは、イプシロン位のアミンに隣接するヒドロキシル基を有している。アルデヒドを生成する反応条件は、通常、ポリペプチド中の他の部位における酸化を避ける穏やかな条件下において、モルにして過剰量のメタリン酸ナトリウムを追加することを含んでいる。酸化反応のｐＨは、通常約７．０である。典型的な反応は、約１．５モルの過剰量のメタ過ヨウ素酸ナトリウムを、ポリペプチドの緩衝溶液に添加して、その後、暗所で約１０分間インキュベートするというものである。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，４２３，６８５号明細書を参照のこと。
【０２３２】
カルボニル機能性基を、水溶液において穏やかな条件で、ヒドラジン−、ヒドラジド−、ヒドロキシルアミン−、またはセミカルバジド−含有試薬と選択的に反応させて、生理的条件下で安定な対応するヒドラゾン、オキシム、またはセルカルバゾン結合をそれぞれ形成することができる。例えば、「Jencks, W. P., J. Am. Chem. Soc. 81, 475-481 (1959)」、「Shao, J. and Tarn, J. P., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995)」を参照のこと。さらに、カルボニル基のユニークな反応性によって、他のアミノ酸の側鎖の存在下において、選択的に修飾することができる。例えば、「Cornish, V. W.ら, J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151 (1996)」、「Geoghegan, K. F. & Stroh, J. G., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992)」、「Mahal, L. K.ら, Science 276: 1125-1128 (1997)」を参照のこと。
【０２３３】
Ｂ．ヒドラジン、ヒドラジド、またはセミカルバジド反応基
求核基（ヒドラジン、ヒドラジド、またはセミカルバジドなど）を含んでいる非天然にコードされたアミノ酸を、様々な求電子基（例えば、ＰＥＧまたは他の水溶性ポリマー）と反応させて、接合体を形成することができる。
【０２３４】
典型的なヒドラジン、ヒドラジド、またはセミカルバジド含有アミノ酸は、以下に示されているものであってもよい。
【０２３５】
【化８】
2009514533.tif 000010
【０２３６】
（ここで、ｎは０−１０であり、Ｒ１はアルキル、アリール、置換アルキルまたは置換アリールであるか、あるいは存在しておらず、ＸはＯ、ＮまたはＳであるか、あるいは存在しておらず、Ｒ２はＨ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、Ｒ３はＨ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である）。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、ｎは４であり、Ｒ１は存在しておらず、ＸはＮである。いくつかの実施形態では、Ｎは２であり、Ｒ１は存在しておらず、Ｘは存在していない。いくつかの実施形態では、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、酸素原子がアリール環の脂肪族基に対してパラに位置している。
【０２３８】
ヒドラジン含有アミノ酸、ヒドラジド含有アミノ酸、およびセミカルバジド含有アミノ酸は、商業的供給者から入手することができる。例えば、Ｌ−グルタミン−γ−ヒドラジドは、Sigma Chemical (St. Louis, MO)から入手することができる。市販されていない他のアミノ酸は、当業者によって調製することができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，２８１，２１１号明細書を参照のこと。
【０２３９】
ヒドラジン、ヒドラジド、またはセミカルバジド官能基を有する非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるポリペプチドを、アルデヒドまたは同様の化学反応性を有する他の官能基を含んでいる様々な分子と、効率的かつ選択的に反応させることができる。例えば、「Shao, J. and Tam, J., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995)」を参照のこと。ヒドラジド、ヒドラジンおよびセミカルバジド官能基は、それらのユニークな反応性により、２０の一般アミノ酸に存在する求核基（例えば、セリンもしくはトレオニンのヒドロキシル基、またはリジンおよびＮ末端のアミノ基）よりも、アルデヒド、ケトンおよび他の求電子基に対して、顕著に反応する。
【０２４０】
Ｃ．アミノオキシ含有アミノ酸
アミノオキシ（またヒドロキシルアミンとも呼ばれる）基を含んでいる非天然にコードされたアミノ酸は、様々な求電子基（ＰＥＧ、または他の水溶性ポリマーなど）と反応して、接合体を形成することができる。ヒドラジン、ヒドラジド、およびセミカルバジドのように、アミノオキシ基は、求核性が増強されているので、アルデヒドまたは同様の化学反応性を有する他の官能基を含んでいる様々な分子と、効率よく選択的に反応することができる。例えば、「Shao, J. and Tarn, J., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995)」、「H. Hang and C. Bertozzi, Acc. Chem. Res. 34: 727-736 (2001)」。ヒドラジン基との反応により、対応するヒドラゾンが得られるのに対し、アミノオキシ基とカルボニル含有基（ケトンなど）との反応からは、一般的にオキシムが得られる。
【０２４１】
アミノオキシ基を含んでいるアミノ酸の典型を、以下のように表すことができる。
【０２４２】
【化９】
2009514533.tif 000011
【０２４３】
（ここで、ｎは０−１０であり、Ｒ１はアルキル、アリール、置換アルキルまたは置換アリールであるか、あるいは存在しておらず、ＸはＯ、Ｎ、またはＳであるか、あるいは存在しておらず、ｍは０−１０であり、ＹはＣ（Ｏ）であるか、または存在しておらず、Ｒ２はＨ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、Ｒ３はＨ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である）。いくつかの実施形態では、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、ｍは１であり、Ｙは存在している。いくつかの実施形態では、ｎは２であり、Ｒ１とＸとが存在しておらず、ｍは０であり、Ｙは存在していない。
【０２４４】
アミノオキシ含有アミノ酸を、簡単に入手できるアミノ酸前躯体（ホモセリン、セリンおよびトレオニン）から調製することができる。例えば、「M. Carrasco and R. Brown, J. Org. Chem. 68: 8853-8858 (2003)」を参照のこと。また、特定のアミノオキシ含有アミノ酸（Ｌ−２−アミノ−４−（アミノオキシ）酪酸など）は、自然源から単離されている（Rosenthal, G., Life Sci. 60: 1635-1641 (1997)）。他のアミノオキシ含有アミノ酸を、当業者によって調製することができる。
【０２４５】
Ｄ．アジドおよびアルキン反応基
アジドおよびアルキン官能基は、それらのユニークな反応性により、ポリペプチドおよび他の生体分子の選択的修飾について、極めて有用なものとなっている。有機化合物のアジド（特に、脂肪族アジドおよびアルキン）は、一般的に、通常の化学反応条件に対して安定である。特に、アジドおよびアルキン官能基は、天然に生じるポリペプチドに見られる２０の一般アミノ酸の側鎖（すなわちＲ基）に対して、不活性である。しかし、それらが接近すると、アジドおよびアルキン基の「バネ仕掛けの」性質が顕になり、アジドおよびアルキン基は、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］の付加環化反応により、効率よく選択的に反応し、この結果、対応するチアゾールが生成する。例えば、「Chin J.ら, Science 301:964-7 (2003)」、「Wang, Q.ら, J. Am. Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003)」、および「Chin, J. W.ら, J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002)」を参照のこと。。
【０２４６】
Ｈｕｉｓｇｅｎの付加環化反応は、求核置換反応というよりは付加環化に関係するので（例えば、「Padwa, A., in COMPREHENSIVE ORGANIC SYNTHESIS, Vol. 4, (ed. Trost, B. M., 1991), p. 1069-1109」、および「Huisgen, R. in 1,3-DIPOLAR CYCLOADDITION CHEMISTRY, (ed. Padwa, A., 1984), p. 1-176」を参照のこと）、アジドおよびアルキン含有側鎖を有する非天然にコードされたアミノ酸を組み込むことによって、得られるポリペプチドを、該非天然にコードされたアミノ酸に位置において選択的に修飾することができる。室温で溶液条件下において、Ｃｕ（ＩＩ）から触媒量のＣｕ（Ｉ）にインサイチューで還元する還元剤が存在するときに、Ｃｕ（ＩＩ）（触媒量のＣｕＳＯ４の形態など）を添加することによって、アジドまたはアルキン含有ＢＳＰに関する付加環化反応を実施することができる（例えば、「Wang, Q.ら, J. Am. Chem. Soc. 125, 3192- 3193 (2003)」、「Tornoe, C. W.ら, J. Org. Chem. 67:3057-3064 (2002)」、および「Rostovtsevら, Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599 (2002)」を参照のこと）。典型的な還元剤としては、例えば、アスコルビン酸塩、金属銅、キニーネ、ヒドロキノン、ビタミンＫ、グルタチオン、システイン、Ｆｅ２＋、Ｃｏ２＋、および印加された電位などが挙げられる。
【０２４７】
いくつかの場合、アジドとアルキンとのＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］の付加環化反応が望ましいとき、ＢＳＰは、アルキン部分を含有する非天然にコードされたアミノ酸を含んでおり、該アミノ酸に付着する水溶性ポリマーは、アジド部分を含んでいる。また、これの代わりに、反対の反応、すなわち、アミノ酸に存在するアジド部分と、水溶性ポリマーに存在するアルキン部分との反応を行うことができる。
【０２４８】
また、アジド官能基を、アリールエステルを含んでいる水溶性ポリマーと選択的に反応させることができる。さらに、アジド官能基を、アリールホスフィン部分により適切に官能基化することによって、アミド結合を生成することができる。アリールホスフィン基は、インサイチューにおいてアジドを還元する。この結果生じたアミンは、それから、近傍のエステル結合と効率的に反応し、対応するアミドが生成する。例えば、「E. Saxon and C. Bertozzi, Science 287, 2007-2010 (2000)」を参照のこと。アジド含有アミノ酸は、アルキルアジド（例えば、２−アミノ−６−アジド−１−ヘキサン酸）であってもよいし、アリールアジド（ｐ−アジド−フェニルアラニン）であってもよい。
【０２４９】
アリールエステルとホスフィン部分とを含んでいる水溶性ポリマーの典型を、以下のように表すことができる。
【０２５０】
【化１０】
2009514533.tif 000012
【０２５１】
（ここで、ＸはＯ、Ｎ、またはＳであってもよいし、あるいは存在していなくてもよく、Ｐｈはフェニルであり、Ｗは水溶性ポリマーであり、ＲはＨ、アルキル、アリール、置換アルキル、および置換アリール基であってもよい）。典型的なＲ基は、例えば−ＣＨ２、−Ｃ（ＣＨ３）３、−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＣＮ、および−ＮＯ２である。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、およびＲ’’’’は、互いに独立して、水素、置換または非置換へテロアルキル、置換または非置換アリール（例えば、１−３のハロゲンで置換されたアリール）、置換または非置換アルキル、アルコキシまたはチオアルコキシ基、あるいは、アリールアルキル基を表す。本発明の化合物が２つ以上のＲ基を含んでいるとき、例えば、Ｒ基のそれぞれは、これらの基が２つ以上存在するとき、それぞれＲ’基、Ｒ’’基、Ｒ’’’基およびＲ’’’’基として、独立して選択される。Ｒ’およびＲ’’が同じ窒素原子に付着する場合、それらは、窒素原子と組み合わさって、５−、６−、７−員環を形成することができる。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルなどを含むことを意味する。置換基に対する上記検討によれば、当業者の一人は、用語「アルキル」は、水素基以外の基と結合した炭素原子を含む基（例えば、ハロアルキル（−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３など）、およびアシル（−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、および−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３など））を包含することを意味すると理解する。
【０２５２】
また、アジド官能基を、チオエステルを含んでいる水溶性ポリマーと選択的に反応させることができる。さらに、アジド官能基を、アリールホスフィン部分により適切に官能基化することにより、アミド結合を生成することができる。アリールホスフィン基は、インサイチューにおいてアジドを還元する。その結果生じたアミンは、それから、チオエステル結合と効率的に反応し、対応するアミドが生成する。チオエステルとホスフィン部分とを含んでいる水溶性ポリマーの典型を、以下のように表すことができる。
【０２５３】
【化１１】
2009514533.tif 000013
【０２５４】
（ここで、ｎは１−１０であり、ＸはＯ、ＮまたはＳであってよいし、あるいは存在していなくてもよく、Ｐｈはフェニルであり、Ｗは水溶性ポリマーである）。
【０２５５】
アルキン含有アミノ酸の典型を、以下のように表すことができる。
【０２５６】
【化１２】
2009514533.tif 000014
【０２５７】
（ここで、ｎは０−１０であり、Ｒ１はアルキル、アリール、置換アルキルまたは置換アリールであるか、あるいは存在しておらず、ＸはＯ、ＮまたはＳであるか、あるいは存在しておらず、ｍは０−１０であり、Ｒ２はＨ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、Ｒ３はＨ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である）。いくつかの実施形態では、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、Ｘは存在しておらず、ｍは０であり、アセチレン部分が、アルキル側鎖に対してパラの位置に位置している。いくつかの実施形態では、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、ｍは１であり、プロパルギルオキシ基が、アルキル側鎖に対してパラの位置に位置している（すなわち、Ｏ−プロパルギル−チロシン）。いくつかの実施形態では、ｎは１であり、Ｒ１とＸとが存在しておらず、ｍは０である（すなわち、プロパリルグリシン（proparylglycine））。
【０２５８】
アルキン含有アミノ酸は、市販されている。例えば、プロパルギルグリシンは、Peptech（Burlington, MA）から市販されている。代わりに、アルキン含有アミノ酸を、標準の方法にしたがって調製することができる。例えば、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンを、例えば、「Deiters, A.ら, J. Am. Chem. Soc, 125: 11782-11783 (2003)」に記載のようにして合成することができる。また、４−アルキニル−Ｌ−フェニルアラニンを、「Kayser, B.ら, Tetrahedron 53(7): 2475-2484 (1997)」に記載のようにして、合成することができる。他のアルキン含有アミノ酸は、当業者によって合成されることができる。
【０２５９】
アジド含有アミノ酸の典型を、以下のように表すことができる。
【０２６０】
【化１３】
2009514533.tif 000015
【０２６１】
（ここで、ｎは０−１０であり、Ｒ１はアルキル、アリール、置換アルキルまたは置換アリールであるか、あるいは存在しておらず、ＸはＯ、Ｎ、またはＳであるか、あるいは存在しておらず、ｍは０−１０であり、Ｒ２はＨ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、Ｒ３はＨ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である）。いくつかの実施形態では、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、Ｘは存在しておらず、ｍは０であり、アジド部分はアルキル側鎖に対してパラの位置に位置している。いくつかの実施形態ではｎは０−４であり、Ｒ１とＸとが存在しておらず、ｍは０である。いくつかの実施形態では、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、ｍは２であり、β−アジドエトキシ部分はアルキル側鎖に対してパラの位置に位置している。
【０２６２】
アジド含有アミノ酸は、市販されている。例えば、４−アジドフェニルアラニンを、Chem-Impex International, Inc. (Wood Dale, IL)から入手することができる。市販されていないアジド含有アミノ酸については、例えば、適切な脱離基（ハロゲン化物、メシラート、トシレートなど）の置換、または、適切に保護されたラクトンの開環などの当業者に公知の方法を用いることにより、アジド基を比較的容易に調製することができる。例えば、Marchによる「Advanced Organic Chemistry (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York)」を参照のこと。
【０２６３】
Ｅ．アミノチオール反応基
ベータ置換アミノチオール官能基は、そのユニークな反応性により、アルデヒドを含んでいるポリペプチドおよび他の生体分子の、チアゾリジンの形成を介した選択的修飾について、極めて有用である。例えば、「J. Shao and J. Tarn, J. Am. Chem. Soc. 1995, 117 (14) 3893-3899」を参照のこと。いくつかの実施形態では、ベータ置換アミノチオールアミノ酸を、ＢＰＳに組み込み、それから、アルデヒド機能性基を含有する水溶性ポリマーと反応させることができる。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマー、薬物接合体、または他のペイロードを、ベータ置換アミノチオールアミノ酸を含んでいるＢＰＳに、チアゾリジンの形成を介して結合させることができる。
【０２６４】
（非天然アミノ酸の細胞取り込み）
真核細胞による非天然アミノ酸の取り込みは、タンパク質への組み込み用などの非天然アミノ酸を設計および選択するときに、通常考慮される問題の１つである。例えば、α−アミノ酸の電荷密度が高いことから、これらアミノ酸が細胞透過性である可能性が低いと示唆される。天然のアミノ酸は、タンパク質に基づく輸送系の回収により、真核細胞に取り込まれる。細胞によって取り込まれた非天然アミノ酸があれば、どの非天然アミノ酸が取り込まれたかを評価する高速スクリーニングを、実施することができる。例えば、毒性試験を参照のこと（例えば、「Protein Arrays,」と題された２００３年１２月２２日付けの出願（シリアル番号１０／７４４，８９９）、および、２００２年１２月２２日付けの出願（シリアル番号６０／４３５，８２１）、ならびに、「Liu, D.R. & Schultz, P.G. (1999) Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code. PNAS United States 96:4780-4785」を参照のこと）。取り込みは様々なアッセイにより簡単に分析されるが、細胞の取り込み経路に適用される非天然アミノ酸を設計すること以外には、インビボにおいてアミノ酸を製造するための生合成経路を提供することが挙げられる。
【０２６５】
（非天然アミノ酸の生合成）
アミノ酸および他の化合物を製造する多くの生合成経路が、細胞に既に存在している。特定の非天然アミノ酸を生合成する方法は、天然（真核生物など）に存在していないかもしれないが、本発明は、そのような方法を提供する。例えば、非天然アミノ酸の生合成経路は、必要に応じて、新規酵素の追加または宿主細胞における既存の経路の修飾によって、宿主細胞に作製される。追加される新規酵素は、必要に応じて、天然発生型酵素、または人工進化型酵素である。例えば、ｐ−アミノフェニルアラニン（「In vivo incorporation of unnatural amino acids」と題された国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレットにおける実施例に示されている）の生合成は、他の生物に由来する公知の酵素の組み合わせを添加することに基づいている。上記酵素の遺伝子を含んでいるプラスミドにより真核細胞を形質転換することによって、真核細胞に該遺伝子を導入することができる。該遺伝子が真核細胞に発現するとき、該遺伝子によって、所望の化合物を合成する酵素経路が提供される。必要に応じて追加される酵素の種類の例を、以下の例に示す。また、追加される酵素の配列は、ジェンバンクなどにおいて見つかる。さらに、人工進化型酵素を、同様にして、細胞に追加してもよい。このように、細胞機構と細胞の資源とを操作することにより、非天然アミノ酸が製造される。
【０２６６】
既存の経路を進化させるため、または生合成経路に使用するための新規酵素を製造するための様々な方法を、利用することができる。例えば、Maxygen, Inc.（ワールドワイドウェブのmaxygen.comにおいて利用可能である）により開発されたような再帰的組み換えを必要に応じて用いて、新規酵素および経路を開発してもよい。例えば、「Stemmer (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370(4):389-391」、および「Stemmer, (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, Proc. Natl. Acad. Sci USA., 91:10747-10751」を参照のこと。同様に、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ（ワールドワイドウェブのgenencor.comにおいて利用可能である）により開発されたＤｅｓｉｇｎＰａｔｈ（登録商標）を、必要に応じて代謝経路を操作するために用いることにより、例えば、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシンを細胞において作製する経路が操作される。この技術は、宿主生物における既存の経路を、新規遺伝子の組み合わせを用いて、再構築するものである。新規遺伝子は、例えば、機能ゲノム科学により同定された遺伝子、ならびに、分子進化および設計によりもたらされた遺伝子が挙げられる。また、Diversa Corporation（ワールドワイドウェブのdiversa.comにおいて利用可能である）は、新規経路を作製するためなどの遺伝子経路および遺伝子のライブラリーを高速スクリーニングする技術を提供している。
【０２６７】
通常、本発明の操作された生合成経路により製造される非天然アミノ酸は、タンパク質を効率的に生合成するのに十分な濃度（例えば、天然の細胞内量）であり、他のアミノ酸の濃度に影響を与えるか、または細胞内の資源を使い果たす程度ではない濃度で製造される。このようにしてインビボにおいて製造される通常の濃度は、約１０ｍＭから約０．０５ｍＭである。特定の経路に望ましい酵素を製造するために用いられる遺伝子を含んでいるプラスミドにより、細胞を形質転換し、非天然アミノ酸を生成させた後に、必要に応じて、リボソームにおけるタンパク質の合成と細胞の成長とに関して、非天然アミノ酸の製造をさらに最適化するように、インビボにおける選択を用いる。
【０２６８】
（非天然アミノ酸を有するポリペプチド）
非天然アミノ酸の組み込みは、様々な目的のために実施され得る。その目的としては、例えば、（１）タンパク質の構造および／または機能の変化を調整すること、（２）大きさ、酸性度、求核性、水素結合、疎水性、およびプロテアーゼ標的部位の接近性を変更すること、（３）（例えば、タンパク質アレイのための）部分を標的にすること、（４）生物活性分子を追加すること、（５）ポリマーを付着させること、（６）放射性核種を付着させること、（７）血中半減期を調整すること、（８）組織（腫瘍など）への浸透性を調整すること、（９）能動輸送を調整すること、（１０）組織、細胞または臓器への特異性もしくは分布を調整すること、（１１）免疫原性を調整すること、（１２）プロテアーゼ耐性を調整することなどが挙げられる。非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質の触媒活性または生物物理的性質は、増強されているか、あるいは、完全に新規なものであり得る。例えば、非天然アミノ酸をタンパク質に含有させることによって、以下の性質が、必要に応じて修飾される：毒性、生体内分布、構造的性質、分光学的性質、化学および／または光化学的性質、触媒能、半減期（血中半減期など）、ならびに他の分子と例えば共有的または非共有的に反応する能力など。少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質を含有している組成物は、例えば、新規な治療、診断、触媒酵素、工業用酵素、および結合タンパク質（抗体など）に有用であるとともに、タンパク質の構造や機能の研究などに有用である。例えば、「Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology. 4:645-652」を参照のこと。
【０２６９】
本発明の１態様では、組成物は、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０またはそれ以上）の非天然アミノ酸を有するタンパク質を少なくとも１つ含んでいる。非天然アミノ酸は、同一であっても異なっていてもよく、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なる非天然アミノ酸を含んでいる１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なる場所がタンパク質に存在し得る。別の態様では、組成物は、タンパク質に存在する特定のアミノ酸の少なくとも１つ（ただし、全てではない）が非天然アミノ酸で置換されているタンパク質を含んでいる。２つ以上の非天然アミノ酸を有する所定のタンパク質では、該非天然アミノ酸は、同一であっても、異なっていてもよい。例えば、タンパク質は、２つ以上の異なる種類の非天然アミノ酸を含んでいてもよいし、あるいは、２つの同じ非天然アミノ酸を含んでいてもよい。３つ以上の非天然アミノ酸を有する所定のタンパク質では、非天然アミノ酸は、同一であってもよいし、異なっていてもよいし、あるいは同種類の複数の非天然アミノ酸と少なくとも１つの異なる非天然アミノ酸との組み合わせであってもよい。
【０２７０】
少なくとも１つの非天然アミノ酸を有する興味のあるタンパク質またはポリペプチドは、本発明の特徴である。また、本発明は、本発明の組成物および方法を用いて製造された、少なくとも１つの非天然アミノ酸を有するポリペプチドまたはタンパク質を含んでいる。また、薬学的に許容可能な賦形剤などの賦形剤が、上記タンパク質と一緒に存在していてもよい。
【０２７１】
少なくとも１つの非天然アミノ酸を有する興味のあるタンパク質またはポリペプチドを、真核細胞中に製造することによって、タンパク質またはポリペプチドは、通常、真核性物の翻訳後修飾を含むことになる。特定の実施形態では、タンパク質は、少なくとも１つの非天然アミノ酸と、真核細胞によりインビボにおいて作製される少なくとも１つの翻訳後修飾とを含んでいる。ここで、該翻訳後修飾は原核生物により作製されないものである。翻訳後修飾は、例えば、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミテートの付加、リン酸化、糖脂質結合修飾、およびグリコシル化などが挙げられる。１態様では、翻訳後修飾は、ＧｌｃＮＡｃ−アスパラギン結合によるオリゴ糖（（ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ）２−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃなど）のアスパラギンへの付着を含んでいる。表１を参照のこと。表１には、真核細胞のＮ結合型オリゴ糖タンパク質の例がいくつか記載されている（別の残基が存在し得るが、示されていない）。別の態様では、翻訳後修飾は、ＧａｌＮＡｃ−セリン結合、ＧａｌＮＡｃ−トレオニン結合、ＧｌｃＮＡｃ−セリン結合、またはＧｌｃＮＡｃ−トレオニン結合による、オリゴ糖（例えばＧａｌ−ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃなど）のセリンまたはトレオニンへの付着を含んでいる。
【０２７２】
さらに別の態様では、翻訳後修飾は、前躯体のタンパク質分解過程、マルチサブユニットタンパク質への会合、または高分子の会合、細胞の別の部位への移動（例えば、細胞小器官などへの移動、または分泌経路を介した細胞の別の部位への移動）を含んでいる。上記前躯体は、例えば、カルシトニン前躯体、カルシトニン遺伝子関連ペプチド前躯体、プレプロ副甲状腺ホルモン、プレプロインスリン、プロインスリン、プレプロオピオメラノコルチン、およびプロオピオメラノコルチンなどである。上記細胞小器官は、例えば小胞体、ゴルジ体、核、ライソソーム、ペルオキシソーム、ミトコンドリア、葉緑体、小胞などである。特定の実施形態では、タンパク質は、分泌または局在配列、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ、あるいはＧＳＴ融合などを含んでいる。
【０２７３】
非天然アミノ酸の１つの利点は、非天然アミノ酸が、別の分子を追加するのに用いることができる別の化学的部分を提示することである。上記修飾は、真核生物または非真核生物においてインビボで作製されてもよいし、またはインビトロで作製されてもよい。したがって、特定の実施形態では、翻訳後修飾は、非天然アミノ酸を介するものである。例えば、翻訳後修飾は、求核−求電子反応によるものであり得る。タンパク質の選択的修飾に現在用いられるほとんどの反応は、求核反応パートナーと求電子反応パートナーとの間の共有結合の形成を伴うものであり、例えば、α−ハロケトンとヒスチジンまたはシステインの側鎖との反応などが挙げられる。このような場合における選択性は、タンパク質中の求核残基の数と接近性とに決定される。本発明のタンパク質では、例えば、インビトロおよびインビボでの、非天然のケトアミノ酸とヒドラジドまたはアミノオキシ化合物との反応といった、他のより選択的な反応を用いることができる。例えば、「Cornishら, (1996) J. Am. Chem. Soc, 118:8150-8151」、「Mahalら, (1997) Science. 276:1125-1128」、「Wangら, (2001) Science 292:498-500」、「Chinら, (2002) J. Am. Chem. Soc. 124:9026- 9027」、「Chinら, (2002) Proc. Natl. Acad. Sci., 99:11020-11024」、「Wangら, (2003) Proc. Natl. Acad. Sci., 100:56-61」、「Zhangら, (2003) Biochemistry, 42:6735-6746」、および「Chinら, (2003) Science, 301:964-7」を参照のこと。これによれば、多くの試薬（蛍光団、架橋剤、サッカライド誘導体および細胞毒性分子など）により、実質的に任意のタンパク質を選択的に標識することができる。また、米国仮特許出願第６０／４１９，２６５号明細書（２００２年１０月１６日出願）、米国仮特許出願第６０／４２０，９９０号明細書（２００２年１０月２３日出願）、および米国仮特許出願第６０／４４１，４５０号明細書（２００３年１月１６日出願）に基づく、「Glycoprotein synthesis」と題された米国特許出願第１０／６８６，９４４号明細書（２００３年１０月１５日出願）も参照のこと（なお上記特許文献は、参照により本明細書に組み込まれる）。また、翻訳後修飾（アジドアミノ酸を介した翻訳後修飾など）を、シュタウディンガーライゲーションにより（例えば、トリアリールホスフィン試薬を用いて）作製することができる。例えば、「Kiickら, (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99:19-24」を参照のこと。
【０２７４】
本発明は、タンパク質を選択的に修飾する別の高効率の方法を提供する。該方法は、アジドまたはアルキニル部分などを含んでいる非天然アミノ酸を、セレクターコドンに応じてタンパク質に遺伝的に組み込む工程を含んでいる。上記アミノ酸の側鎖を、それから、例えばアルキニルまたはアジド誘導体のそれぞれを用いて、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］の付加環化反応などにより修飾することができる。Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］の付加環化反応については、「Padwa, A. in Comprehensive Organic Synthesis, Vol. 4, (1991) Ed. Trost, B. M., Pergamon, Oxford, p. 1069-1109」、および「Huisgen, R. in 1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry, (1984) Ed. Padwa, A., Wiley, New York, p. 1-176」などを参照のこと。この方法は、求核置換というよりは付加環化に関係するので、タンパク質を、非常に高い選択性でもって修飾することができる。触媒量のＣｕ（Ｉ）塩を反応混合物に添加することにより、非常に良好な位置選択性（１，４＞１，５）でもって、溶液の状態において室温で上記付加環化反応を実施することができる。例えば、「Tornoeら, (2002) J. Org. Chem. 67:3057-3064」、および「Rostovtsevら, (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599」を参照のこと。用いることができる別の方法は、テトラシステインモチーフとの二ヒ素化合物におけるリガンド交換である（「Griffinら, (1998) Science 281:269-272」などを参照のこと）。
【０２７５】
［３＋２］の付加環化によって本発明のタンパク質に追加され得る分子には、アジドまたはアルキニル誘導体を有する実質的に任意の分子が含まれる。分子は、例えば、色素、蛍光団、架橋剤、サッカライド誘導体、ポリマー（ポリエチレングリコールの誘導体など）、光架橋剤、細胞毒性化合物、親和性標識、ビオチンの誘導体、樹脂、ビーズ、第２タンパク質またはポリペプチド（あるいはそれ以上）、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）、金属キレート剤、共同因子、脂肪酸、および炭水化物などが挙げられる。上記分子を、それぞれ、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンなどのアルキニル基を有する非天然アミノ酸か、またはｐ−アジド−フェニルアラニンなどのアジド基を有する非天然アミノ酸に追加することができる。
【０２７６】
＜Ｖ．非遺伝的にコードされたアミノ酸を含んでいるＢＰＦＩのインビボでの生成＞
天然に生じる系においてコードされていないアミノ酸を追加または置換する、修飾されたｔＲＮＡとｔＲＮＡシンテターゼとを用いることによって、本発明のＢＰＦＩを、インビボにおいて生成することができる。
【０２７７】
天然に生じる系においてコードされていないアミノ酸を使用するｔＲＮＡとｔＲＮＡシンテターゼとを生成する方法は、米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号明細書（シリアル番号１０／１２６，９２７）、および米国特許出願公開第２００３／０１０８８８５号明細書（シリアル番号１０／１２６，９３１）に記載されている（なお上記特許文献は、参照により本明細書に組み込まれる）。上記の方法は、翻訳機構に内在するシンテターゼとｔＲＮＡとは独立に機能する翻訳機構を作製する工程を含んでいる。このため、上記翻訳機構は、「直交（orthogonal）」と呼ばれることもある。通常、翻訳系は、直交化ｔＲＮＡ（Ｏ‐ｔＲＮＡ）と、直交化アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ‐ＲＳ）とを含んでいる。通常、Ｏ‐ＲＳは、上記翻訳系において、少なくとも１つの非天然に生じるアミノ酸を用いて、Ｏ‐ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。Ｏ‐ｔＲＮＡは、上記翻訳系における他のｔＲＮＡには認識されないセレクターコドンを少なくとも１つ認識する。したがって、上記翻訳系によって、非天然にコードされたアミノ酸が、コードされたセレクターコドンに応じて、該翻訳系により製造されるタンパク質に挿入される。これにより、アミノ酸が、コードされたポリペプチドの位置に「置換」される。
【０２７８】
特定の合成アミノ酸をポリペプチドに挿入するための、多種多様な直交化ｔＲＮＡとアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼとが、先行技術に記載されており、それらは、一般的に本発明における使用に適している。例えば、ケト特異的Ｏ‐ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、「Wang, L.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:56-61 (2003)」、および「Zhang, Z.ら, Biochem. 42(22):6735-6746 (2003)」に記載されている。典型的なＯ‐ＲＳ、またはその一部は、ポリヌクレオチド配列によりコードされており、米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号明細書、および米国特許出願公開第２００３／０１０８８８５号明細書に開示されたアミノ酸配列を含んでいる（なお上記特許文献は、参照により本明細書に組み込まれる）。また、Ｏ‐ＲＳと共に用いられる対応するＯ‐ｔＲＮＡも、米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号明細書（シリアル番号１０／１２６，９２７）、および米国特許出願公開第２００３／０１０８８８５号明細書（シリアル番号１０／１２６，９３１）に記載されている（なお上記特許文献は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２７９】
アジド特異的Ｏ‐ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの系は、例えば、「Chin, J. W.ら, J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002)」に記載されている。ｐ−アジド−Ｌ−Ｐｈｅ用の典型的なＯ‐ＲＳ配列としては、例えば、米国特許出願公開第２００３／０１０８８８５号明細書（シリアル番号１０／１２６，９３１）に開示されているような、ヌクレオチド配列（配列番号１４−１６および２９−３２）、ならびにアミノ酸配列（配列番号４６−４８および６１−６４）が挙げられる（なお上記特許文献は、参照により本明細書に組み込まれる）。本発明における使用に適したＯ‐ｔＲＮＡ配列としては、例えば、米国特許出願公開第２００３／０１０８８８５号明細書（シリアル番号１０／１２６，９３１）に開示されているような、ヌクレオチド配列（配列番号１−３）が挙げられる（なお上記特許文献は、参照により本明細書に組み込まれる）。特定の非天然にコードされたアミノ酸に特異的な、Ｏ‐ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの対の他の例は、米国特許出願第２００３／００８２５７５号明細書（シリアル番号１０／１２６，９２７）に記載されている（なお上記特許文献は、参照により本明細書に組み込まれる）。ケト含有アミノ酸およびアジド含有アミノ酸の両方を、S. cerevisiaeにおいて組み込むＯ‐ＲＳおよびＯ‐ｔＲＮＡは、「Chin, J. W.ら, Science 301:964-967 (2003)」に記載されている。
【０２８０】
Ｏ‐ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの使用は、非天然にコードされたアミノ酸をコードする特定のコドンの選択を含んでいる。任意のコドンを用いることができるが、一般的には、Ｏ‐ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが発現する細胞において、全く使用されないか、またはめったに使用されないコドンを選択することが望ましい。例えば、典型的なコドンには、ナンセンスコドン（終止コドン（アンバー、オーカーおよびオパール）など）、４塩基以上のコドン、および用いられないか、めったに用いられない他の天然の３塩基コドンが含まれる。
【０２８１】
技術的に公知の突然変異誘発法を用いることにより、ＢＰＦＩをコードする配列の適切な位置に、特定のセレクターコドンを導入することができる。上記突然変異誘発法は、例えば、部位特異的突然変異誘発法、カセット突然変異誘発法、制限選択突然変異誘発法などが挙げられる。
【０２８２】
非天然にコードされたアミノ酸の組み込みに用いることができる、タンパク質生合成機構の構成要素（Ｏ‐ＲＳ、Ｏ‐ｔＲＮＡ、および直交化Ｏ‐ｔＲＮＡ／Ｏ‐ＲＳの対など）を生成する方法は、「Wang, L.ら, Science 292: 498-500 (2001)」、「Chin, J. W.ら, J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002)」、および「Zhang, Z.ら, Biochemistry 42: 6735-6746 (2003)」に記載されている。非天然にコードされたアミノ酸をインビボにおいて組み込むための方法と組成物とは、米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号明細書（シリアル番号１０／１２６，９２７）に記載されている（なお上記特許文献は、参照により本明細書に組み込まれる）。また、生物のインビボでの翻訳系に使用される直交化ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼの対を選択する方法も、米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号明細書（シリアル番号１０／１２６，９２７）、および米国特許出願公開第２００３／０１０８８８５号明細書（シリアル番号１０／１２６，９３１）に記載されている（なお上記特許文献は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２８３】
少なくとも１つの組み換え直交化アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ‐ＲＳ）を製造する方法は、（ａ）第１生物からの少なくとも１つのアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）に由来するＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体）のライブラリーを生成する工程、（ｂ）非天然にコードされたアミノ酸と天然アミノ酸との存在下において、直交化ｔＲＮＡ（Ｏ‐ｔＲＮＡ）をアミノアシル化するメンバーについて、ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体）のライブラリーを選択（および／またはスクリーニング）して、活性型ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体の活性型）のプールを提供する工程、および／または、（ｃ）非天然にコードされたアミノ酸の非存在下において、Ｏ‐ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性型ＲＳ（ＲＳの突然変異体の活性型など）のプールを選択して、少なくとも１つの組み換えＯ‐ＲＳを提供する工程を含んでおり、上記少なくとも１つの組み換えＯ‐ＲＳは、非天然にコードされたアミノ酸を用いてＯ‐ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する、方法である。上記第１生物は、例えば、原核生物（Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli, A. fulgidus, P. furiosus, P. horikoshii, A. pernix, またはT. thermophilusなど）、あるいは、真核生物である。上記（ｃ）工程では、必要に応じて、陰性選択により、活性型ＲＳ（ＲＳの突然変異体の活性型など）のプールを選択してもよい。
【０２８４】
１実施形態では、ＲＳは、不活性型ＲＳである。活性型ＲＳを突然変異させることにより、不活性型ＲＳを生成することができる。例えば、少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、または少なくとも約１０、あるいはそれ以上のアミノ酸を、異なるアミノ酸（アラニンなど）に突然変異させることにより、不活性型ＲＳを生成することができる。
【０２８５】
技術的に公知の様々な技術を用いて、ＲＳの突然変異体のライブラリーを生成することができる。そのような技術として、例えば、（１）ＲＳについてのタンパク質の３次元構造に基づく合理的設計、または（２）無作為的技術もしくは合理的設計技術におけるＲＳヌクレオチドの突然変異誘発法が挙げられる。例えば、部位特異的突然変異誘発法、ランダム突然変異誘発法、多様性を生成する組み換え突然変異誘発法、キメラコンストラクト、合理的設計、および本明細書に記載の方法または技術的に公知の方法によって、ＲＳの突然変異体を生成することができる。
【０２８６】
１実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸と天然アミノ酸との存在下において、活性型メンバー（例えば、直交化ｔＲＮＡ（Ｏ‐ｔＲＮＡ）をアミノアシル化する活性型メンバー）について、ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体）のライブラリーを選択（および／またはスクリーニング）する工程は、（ｉ）少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる陽性選択またはスクリーニングマーカーと、ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体）のライブラリーとを複数の細胞へ導入する段階、（ｉｉ）選択剤の存在下において、複数の細胞を成長させる段階、ならびに（ｉｉｉ）選択および／またはスクリーニング剤の存在下において、陽性選択またはスクリーニングマーカーにおける少なくとも１つのセレクターコドンを抑圧することによって、生存する（または特定の反応を示す）細胞を同定して、活性型ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体の活性型）のプールを含んでいる陽性選択された細胞の一部（ｓｕｂｓｅｔ）を提供する段階を含んでいる。上記陽性選択および／またはスクリーニングマーカーは、例えば、抗生物質耐性遺伝子である。上記セレクターコドンは、例えば、アンバーコドン、オーカーコドンまたはオパールコドンである。また、必要に応じて、選択剤および／またはスクリーニング剤の濃度を、変更することができる。
【０２８７】
１態様では、陽性選択マーカーは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子であり、セレクターコドンは、該ＣＡＴ遺伝子におけるアンバー終止コドンである。必要に応じて、陽性選択マーカーは、β−ラクタマーゼであり、セレクターコドンは、該β−ラクタマーゼ遺伝子におけるアンバー終止コドンである。別の態様では、陽性スクリーニングマーカーは、蛍光もしくは発光スクリーニングマーカー、または親和性に基づくスクリーニングマーカー（細胞表面マーカーなど）を含んでいる。
【０２８８】
１実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸の非存在下において、Ｏ‐ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性型ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体の活性型）について、上記プールを陰性選択またはスクリーニングする工程は、（ｉ）陽性選択またはスクリーニングからの活性型ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体の活性型）のプールと一緒に、少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる陰性選択またはスクリーニングマーカーを、第２生物の複数の細胞に導入する段階、ならびに（ｉｉ）非天然にコードされたアミノ酸とスクリーニングまたは選択剤とが補充された第１培養基では、生存するか、もしくは特定のスクリーニング反応を示すが、非天然にコードされたアミノ酸と選択またはスクリーニング剤とが補充されていない第２培養基では、生存しないか、もしくは特定のスクリーニング反応を示さない、細胞を同定して、少なくとも１つの組み換えＯ‐ＲＳを有する生存細胞またはスクリーニングされた細胞を提供する段階を含んでいる。上記陰性選択および／またはスクリーニングマーカーは、例えば、抗生物質耐性遺伝子（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子など）である。例えば、ＣＡＴ同定のプロトコールは、必要に応じて、適切なＯ‐ＲＳ組み換え体を決定するときの陽性選択および／または陰性スクリーニングとしての役割を果たす。例えば、必要に応じて、少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいるＣＡＴを含み、１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるか、または含んでいない成長プレート上において、クローンのプールは複製される。したがって、非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるプレートにおいて、排他的に成長するコロニーは、組み換えＯ‐ＲＳを含んでいると見なされる。１態様では、選択（および／またはスクリーニング）剤の濃度は、変更される。いくつかの態様では、第１生物と第２生物とは、異なっている。よって、第１生物および／または第２生物は、原核生物、真核生物、哺乳類、Escherichia coli、菌類、酵母、古細菌、真正細菌、植物、昆虫、原生生物などを、必要に応じて含んでいる。他の実施形態では、スクリーニングマーカーは、蛍光または発光スクリーニングマーカー、または親和性に基づくスクリーニングマーカーを含んでいる。
【０２８９】
別の実施形態では、活性型ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体の活性型）について、プールをスクリーニングまたは選択する工程（陰性選択する工程など）は、（ｉ）陽性選択の工程（ｂ）からの、ＲＳの突然変異体の活性型のプールを単離する段階、（ｉｉ）少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる陰性選択またはスクリーニングマーカーと、活性型ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体の活性型）のプールとを、第２生物の複数の細胞へ導入する段階、ならびに、（ｉｉｉ）非天然にコードされたアミノ酸が補充されていない第１培養基では、生存するか、もしくは特定のスクリーニング反応を示すが、非天然にコードされたアミノ酸が補充されている第２培養基では、生存しないか、もしくは特定のスクリーニング反応を示さない細胞を同定して、上記非天然にコードされたアミノ酸に特異的な組み換えＯ‐ＲＳを少なくとも１つ有する生存細胞またはスクリーニングされた細胞を提供する段階を含んでいる。陰性選択またはスクリーニングマーカーは、例えば、少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる毒性マーカー遺伝子（リボヌクレアーゼであるバルナーゼの遺伝子など）である。１態様では、少なくとも１つのセレクターコドンは、約２つ以上のセレクターコドンを含んでいる。そのような実施形態は、必要に応じて、少なくとも１つのセレクターコドンが２つ以上のセレクターコドンを含んでおり、第１生物と第２生物とが異なっているということを含んでいてもよい。第１生物と第２生物とは、それぞれ、原核生物、真核生物、哺乳類、Escherichia coli、菌類、酵母、古細菌、真正細菌、植物、昆虫、原生生物などを、必要に応じて含んでいる。また、いくつかの態様は、陰性選択マーカーが、リボヌクレアーゼであるバルナーゼの遺伝子（該遺伝子は少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる）を含んでいるということを包含している。他の態様では、スクリーニングマーカーは、必要に応じて蛍光または発光スクリーニングマーカー、または親和性に基づくスクリーニングマーカーを含んでいるということを包含している。本明細書における実施形態では、スクリーニングおよび／または選択は、必要に応じて、スクリーニングおよび／または選択のストリンジェンシーが変更されることを含んでいる。
【０２９０】
１実施形態では、少なくとも１つの組み換え直交化アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ‐ＲＳ）を製造する方法は、（ｄ）少なくとも１つの組み換えＯ‐ＲＳを単離する工程、（ｅ）少なくとも１つの組み換えＯ‐ＲＳに由来するＯ‐ＲＳ（必要に応じてＯ‐ＲＳの突然変異体）の第２組を生成する工程、ならびに、（ｆ）Ｏ‐ｔＲＮＡと優先的にアミノアシル化する能力を含んでいるＯ‐ＲＳの突然変異体が得られるまで、上記（ｂ）工程と（ｃ）工程とを繰り返す工程を、さらに含んでいてもよい。必要に応じて、（ｄ）工程‐（ｆ）工程は、繰り返される（例えば少なくとも約２回）。１態様では、少なくとも１つの組み換えＯ‐ＲＳに由来するＯ‐ＲＳの突然変異体の第２組は、突然変異誘発法によって生成されてもよい。該突然変異誘発法としては、例えば、ランダム突然変異誘発法、部位特異的突然変異誘発法、組み換え、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
【０２９１】
上記方法における、陽性選択／スクリーニングの（ｂ）工程、陰性選択／スクリーニングの（ｃ）工程、または陽性および陰性選択／スクリーニングの（ｂ）工程と（ｃ）工程との両方などを含んでいる選択／スクリーニング工程のストリンジェンシーは、必要に応じて、選択／スクリーニングのストリンジェンシーを変更する段階を含んでいる。別の実施形態では、陽性選択／スクリーニングの（ｂ）工程、陰性選択／スクリーニングの（ｃ）工程、または陽性および陰性選択／スクリーニングの（ｂ）工程と（ｃ）工程との両方は、レポーターを使用する段階を含んでおり、該レポーターは、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）により検出されるか、または発光により検出されるものである。必要に応じて、上記レポーターは、ファージディスプレイ、または細胞表面などに提示される。また、上記レポーターは、非天然にコードされたアミノ酸またはその類似体に関する親和性または触媒活性に基づいて選択される。１実施形態では、シンテターゼの突然変異体は、ファージディスプレイ、または細胞表面に提示される。
【０２９２】
組み換え直交化ｔＲＮＡ（Ｏ‐ｔＲＮＡ）を製造する方法は、（ａ）第１生物からの少なくとも１つのｔＲＮＡ（サプレッサーｔＲＮＡなど）に由来するｔＲＮＡの突然変異体のライブラリーを生成する工程、（ｂ）第１生物からのＲＳの非存在下において、第２生物からのアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）により、アミノアシル化されるｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）について、上記ライブラリーをスクリーニングまたは選択（陰性選択など）して、ｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）のプールを提供する工程、ならびに（ｃ）導入された直交化ＲＳ（Ｏ‐ＲＳ）によりアミノアシル化されるメンバーについて、ｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）のプールを選択またはスクリーニングして、少なくとも１つの組み換えＯ‐ｔＲＮＡを提供する工程を含んでおり、上記少なくとも１つの組み換えＯ‐ｔＲＮＡは、セレクターコドンを認識するとともに、第２生物からのＲＳにより効率的に認識されず、Ｏ‐ＲＳにより優先的にアミノアシル化される、方法である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｔＲＮＡは、サプレッサーｔＲＮＡであり、ならびに／あるいは、天然のユニークな３塩基コドン、および／もしくは非天然塩基を含んでいるか、またはナンセンスコドン、レアコドン、非天然コドン、少なくとも４塩基を含んでいるコドン、アンバーコドン、オーカーコドン、またはオパール終止コドンである。１実施形態では、組み換えＯ‐ｔＲＮＡの直交性は、改善されている。いくつかの実施形態では、Ｏ‐ｔＲＮＡが、修飾の必要なく、第２生物から第１生物へ必要に応じて移入されることが好ましい。様々な実施形態では、第１生物と第２生物とは、同じであるか、異なっている。さらに、第１生物と第２生物とは、必要に応じて、原核生物（Methanococcus jannaschii, Methanobacteium thermoautotrophicum, Escherichia coli, Halobacteriumなど）、真核生物、哺乳類、菌類、酵母、古細菌、真正細菌、植物、昆虫、原生生物などから選択される。さらに、組み換えｔＲＮＡは、必要に応じて、非天然にコードされたアミノ酸によりアミノアシル化されるものであって、該非天然にコードされたアミノ酸は、天然にまたは遺伝子操作によって、インビボにおいて生合成されるものである。非天然にコードされたアミノ酸は、少なくとも第１生物または第２生物の成長培養基に、必要に応じて加えられる。
【０２９３】
１態様では、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼによりアミノアシル化される、ｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）について、上記ライブラリーをスクリーニングまたは選択（陰性選択など）する工程（（ｂ）工程）は、（ｉ）少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる毒性マーカー遺伝子と、ｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）のライブラリーとを、第２生物からの複数の細胞へ導入する段階、ならびに、（ｉｉ）少なくとも１つの直交化ｔＲＮＡまたは非機能的なｔＲＮＡを含んでいるｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）のプールを含有している生存細胞を選択する段階を含んでいる。また、上記毒性マーカー遺伝子の代わりに、毒物もしくは静止剤の産生を引き起こす遺伝子、または生物にとって必須の遺伝子を用いてもよい（ただし、これらマーカー遺伝子は、少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる）。例えば、細胞密度比の比較アッセイを用いて、生存細胞を選択することができる。
【０２９４】
別の態様では、毒性マーカー遺伝子は、２つ以上のセレクターコドンを含んでいてもよい。上記方法の別の実施形態では、毒性マーカー遺伝子は、リボヌクレアーゼであるバルナーゼの遺伝子であり、該リボヌクレアーゼであるバルナーゼの遺伝子は、少なくとも１つのアンバーコドンを含んでいる。必要に応じて、リボヌクレアーゼであるバルナーゼの遺伝子は、２つ以上のアンバーコドンを含んでいてもよい。
【０２９５】
１実施形態では、導入された直交化ＲＳ（Ｏ‐ＲＳ）により、アミノアシル化されるメンバーについて、ｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）のプールを選択またはスクリーニングする工程は、Ｏ‐ＲＳと一緒に陽性選択またはスクリーニングマーカー遺伝子と、ｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）のプールとを、第２細胞からの複数の細胞へ導入する段階、ならびに、抗生物質などの選択またはスクリーニング剤の存在下において成長した、生存細胞またはスクリーニングされた細胞を同定して、少なくとも１つの組み換えｔＲＮＡを有する細胞のプールを提供する段階を含んでいてもよい。該少なくとも１つの組み換えｔＲＮＡは、Ｏ‐ＲＳによりアミノアシル化され、陽性マーカー遺伝子によりコードされた翻訳産物へ、少なくとも１つのセレクターコドンに応じて、アミノ酸を挿入するものである。上記陽性選択またはスクリーニングマーカー遺伝子は、薬剤耐性遺伝子、生物に必須の遺伝子、または毒物の解毒を引き起こす遺伝子を含んでいる。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、少なくとも１つのセレクターコドン（少なくとも１つのアンバー終止コドンなど）を含んでいるβ−ラクタマーゼ遺伝子が挙げられる。別の実施形態では、選択またはスクリーニング剤の濃度が、変更される。
【０２９６】
特異的なＯ‐ｔＲＮＡ／Ｏ‐ＲＳの対を生成する方法が提供される。該方法は、（ａ）第１生物からの少なくとも１つのｔＲＮＡに由来するｔＲＮＡの突然変異体のライブラリーを生成する工程、（ｂ）第１生物からのアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）の非存在下において、第２生物からのＲＳにより、アミノアシル化されるｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）について、上記ライブラリーを陰性選択またはスクリーニングして、ｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）のプールを提供する工程、ならびに（ｃ）導入された直交化ＲＳ（Ｏ‐ＲＳ）によりアミノアシル化されるメンバーについて、ｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）のプールを選択またはスクリーニングして、少なくとも１つの組み換えＯ‐ｔＲＮＡを提供する工程を含んでいる。少なくとも１つの組み換えＯ‐ｔＲＮＡは、セレクターコドンを認識し、第２生物からのＲＳにより効率的に認識されず、そして、Ｏ‐ＲＳにより優先的にアミノアシル化される。また、上記方法は、（ｄ）第３生物からの少なくとも１つのアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）に由来するＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体）のライブラリーを生成する工程、（ｅ）非天然にコードされたアミノ酸と天然アミノ酸との存在下において、少なくとも１つの組み換えＯ‐ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化するメンバーについて、ＲＳの突然変異体のライブラリーを選択またはスクリーニングして、活性型ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体の活性型）のプールを提供する工程、ならびに（ｆ）非天然にコードされたアミノ酸に非存在下において、少なくとも１つの組み換えＯ‐ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性型ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体の活性型）について、上記プールを陰性選択またはスクリーニングして、少なくとも１つの特異的Ｏ‐ｔＲＮＡ／Ｏ‐ＲＳの対を提供する工程を含んでおり、上記少なくとも１つの特異的Ｏ‐ｔＲＮＡ／Ｏ‐ＲＳの対は、非天然にコードされたアミノ酸に対して特異的な少なくとも１つの組み換えＯ‐ＲＳと、少なくとも１つの組み換えＯ‐ｔＲＮＡとを含んでいる、方法である。本発明によって製造される特異的Ｏ‐ｔＲＮＡ／Ｏ‐ＲＳの対が含まれる。特異的Ｏ‐ｔＲＮＡ／Ｏ‐ＲＳの対には、例えば、ｍｕｔＲＮＡＴｙｒ−ｍｕｔＴｙｒＲＳの対（ｍｕｔＲＮＡＴｙｒ−ＳＳ１２ＴｙｒＲＳの対など）、ｍｕｔＲＮＡＬｅｕ−ｍｕｔＬｅｕＲＳの対、ｍｕｔＲＮＡＴｈｒ−ｍｕｔＴｈｒＲＳの対、またはｍｕｔＲＮＡＧｌｕ−ｍｕｔＧｌｕＲＳの対などが含まれる。さらに、上記方法は、第１生物および第３生物が、同じであること（例えばMethanococcus jannaschiiであること）を含んでいる。
【０２９７】
また、本発明には、第２生物のインビボの翻訳系に使用するための直交化ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼの対を選択する方法が含まれる。この方法は、第１生物から単離されたか、または第１生物に由来するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）およびｔＲＮＡと、マーカー遺伝子とを、第２生物からの細胞の第１組に導入する工程、上記マーカー遺伝子とｔＲＮＡとを、第２生物からの複製した細胞の組に導入する工程、ならびに、上記複製した細胞の組では生存できないが、上記第１組では生存する細胞について選択するか、上記複製した細胞の組では特定のスクリーニング反応を示さないが、上記第１組では特定のスクリーニング反応を示す細胞をスクリーニングする工程を含んでおり、上記第１組と複製した細胞の組とは、選択またはスクリーニング剤の存在下において成長させられ、生存細胞またはスクリーニングされた細胞は、第２生物のインビボの翻訳系に使用するための直交化ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼの対を含んでいる、方法である。１実施形態では、比較および選択またはスクリーニングする工程は、インビボでの相補性試験（complementation assay）を含んでいる。選択またはスクリーニング剤の濃度は、変更可能である。
【０２９８】
本発明の生物は、様々な生物および様々な組み合わせを含んでいる。例えば、本発明の方法における第１生物および第２生物は、同一であってもよいし、異なっていてもよい。１実施形態では、上記生物は、必要に応じて、原核生物である。該原核生物としては、例えば、Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli, A. fulgidus, P. furiosus, P. horikoshii, A. pernix, またはT. thermophilusなどが挙げられる。代わりに、上記生物は、真核生物を含んでいる。該真核生物としては、例えば、植物（例えば、単子葉植物または双子葉植物などの複雑な生物）、藻類、原生生物、菌類（酵母など）、または動物（例えば哺乳類、昆虫、節足動物）などが挙げられる。別の実施形態では、第２生物は、原核生物（Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli, A. fulgidus, Halobacterium, P. furiosus, P. horikoshii, A. pernix, またはT. thermophilusなど）である。代わりに、第２生物は、真核生物（例えば、酵母、動物細胞、植物細胞、菌類、または哺乳類細胞など）であってもよい。様々な実施形態では、第１生物と第２生物とは異なっている。
【０２９９】
＜ＶＩ．ＢＰＦＩにおける非天然に生じるアミノ酸の位置＞
本発明は、ＢＰＦＩへの１つ以上の非天然に生じるアミノ酸の組み込みを意図する。１つ以上の非天然に生じるアミノ酸は、ポリペプチドの活性を破壊しない特定の位置に組み込まれ得る。これは、「保存的な」置換の実施によって達成され得る。当該「保存的な」置換の実施の例としては、疎水性アミノ酸に対する疎水性アミノ酸の置換、大きなアミノ酸（bulky amino acid）に対する大きなアミノ酸の置換、親水性アミノ酸に対する親水性アミノ酸の置換、および／または活性に必要のない位置への非天然に生じるアミノ酸の挿入が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３００】
様々な生化学的方法および構造的方法は、非天然にコードされたアミノ酸により置換される、ＢＰＦＩ内の所望の部位を選択するために採用され得る。ポリペプチド鎖のあらゆる位置が非天然に生じるアミノ酸を組み込むための選択に好適であり、選択が、任意のまたは特別ではない所望の目的のための合理的な計画に基づき得るか、または無作為な選択によるものであり得ることは、当業者にとって、直ちに明らかである。任意の所望の性質または活性を有するＢＰＦＩの産生を目的として、所望の部位を選択してもよい。そのような任意の所望の性質または活性の例としては、アゴニスト、スーパーアゴニスト、インバースアゴニスト、アンタゴニスト、受容体結合分子、受容体活性分子、パートナーとの結合に対する結合の修飾物質、結合パートナー活性分子、結合パートナー立体構造修飾分子、ダイマー形成もしくはマルチマー形成、本来の分子と比較して活性もしくは性質に対して変化がないこと、またはポリペプチドの物理的もしくは化学的な性質（例えば、可溶性、凝集、または安定性）を操作することなどが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ＢＰＦＩの生物活性に必要なポリペプチドにおける位置は、当該分野において公知の、点変異分析、アラニン走査、または相同物スキャニング法を用いて同定され得る。アラニン走査変異生成、または相同物スキャニング変異生成によって、生物活性に重要であるとして同定された残基以外の残基は、ポリペプチドに求められる所望の活性に依存する非天然にコードされたアミノ酸による置換にとって、良好な候補となり得る。また代替可能に、生物活性に重要であるとして同定された部位は、この場合もやはり、ポリペプチドに求められる所望の活性に依存する非天然にコードされたアミノ酸による置換にとって、良好な候補となり得る。他の代替可能物は、ポリペプチドの各位置において、非天然にコードされたアミノ酸による連続的な置換を簡単に作製し、かつポリペプチドの活性に関する効果を観察することである。非天然アミノ酸を用いたあらゆるポリペプチドへの置換に関する位置を選択するあらゆる手段、技術、または方法が、本発明における使用に好適であることは、当業者にとって容易に明白である。
【０３０１】
また、欠失を含むＢＰＦＩの天然に生じる突然変異体の構造および活性を調査して、非天然にコードされたアミノ酸を用いた置換に対して耐性があると思われるタンパク質の領域を決定することができる。同様に、プロテアーゼ消化およびモノクローナル抗体を使用して、ＢＰＦＩ受容体または結合パートナーとの結合を担うＢＰＦＩの領域を同定することができる。非天然にコードされたアミノ酸を用いた置換に対して耐性がないと思われる領域が排除されると、残りの位置のそれぞれにおける提案された置換の影響を、ＢＰＦＩの構造ならびにＢＰＦＩの受容体または結合パートナーから調査することができる。このようにして、当業者は、非天然にコードされたアミノ酸により置換され得るアミノ酸位置を、容易に同定可能である。
【０３０２】
いくつかの実施形態において、本発明のＢＰＦＩは、ポリペプチドのへリックス２次構造およびベータシート２次構造を破壊しないタンパク質の領域に配置された、１つ以上の非天然に生じるアミノ酸を含んでいる。
【０３０３】
いくつかの実施形態では、１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸は、ＨＲ−Ｃペプチド、ＨＲ−Ｎペプチド、もしくは陰イオン性ペプチドの任意の位置、もしくは（アミノ末端における）第１アミノ酸の前に組み込まれているか、または、カルボキシ末端において付加されているか、あるいはそれらが任意に組み合わせに組み込まれている。
【０３０４】
いくつかの実施形態では、これらの位置または他の位置における非天然に生じるアミノ酸は、水溶性分子と連結している。
【０３０５】
非天然にコードされたアミノ酸の組み込みの例示的な残基は、（１）受容体結合領域もしくは結合パートナーと結合するための領域として可能性のある領域を含んでいる残基か、もしくは当該可能性のある領域から排除される残基、（２）完全にもしくは部分的に溶媒に露出している残基、（３）近くの残基と最小限の水素結合相互作用を有する残基、もしくは該水素結合相互作用を有しない残基、（４）反応性の残基の近くに最小に露出され得る残基、（５）１つ以上のＢＰＦＩの露出した表面であり得る残基、（６）ＢＰＦＩの３次元構造、２次構造、３次構造、もしくは４次構造によって予想されるか、ＢＰＦＩの受容体または結合パートナーと結合するかもしくは結合しないか、または他のＢＰＦＩもしくは他の生物学的に活性な分子と結合するかもしくは結合しないような、柔軟性の高い領域または構造的に硬い領域にあり得る残基、あるいは（７）完全な構造の柔軟性または剛性を望み通りに変えることにより、ＢＰＦＩ自体の立体構造、１以上のＢＰＦＩを含んでいるダイマーまたはマルチマーの立体構造を修飾し得る残基、であってもよい。
【０３０６】
１実施形態では、当該方法は、第１の反応基を含んでいる非天然アミノ酸のタンパク質に組み込む工程、および該タンパク質と第２反応基を含んでいる分子とを接触させる工程を含んでいる。ここで、上記分子は、例えば、標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋剤、放射性核種、細胞毒性化合物、薬物、親和性標識物、光親和性標識物、反応性化合物、樹脂、第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体、抗体もしくは抗体断片、金属キレート剤、共同因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、水溶性デンディマー（dendimer）、シクロデキストリン、阻害性リボ核酸、生体材料、ナノ粒子、スピンラベル、蛍光団、金属含有部分、放射性部分、新規な官能基、他の分子と共有結合的もしくは非共有結合的に相互作用する基、光ケージド部分（a photocaged moiety）、光異性体化可能部分、ビオチン、ビオチン誘導体、ビオチン類似体、重原子を組み込んでいる部分、化学的切断可能な基、光切断可能な基、伸長した側鎖、炭素結合した糖、酸化還元活性化剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識された部分、生物物理学的プローブ、燐光性の基、化学発光性の基、電子密度の高い基、磁性基、挿入基、発色団、エネルギー伝達剤、生物活性剤、検出可能な標識、低分子、あるいは上記または他の任意の所望の化合物もしくは物質の任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない）とのタンパク質の接触を包含する。当該第１の反応基は、当該第２の反応基と反応して、［３＋２］付加環化を介して非天然アミノ酸に分子を付与する。１実施形態において、当該第１反応基は、アルキニル部分またはアジド部分であり、かつ当該第２反応基は、アジド部分またはアルキニル部分である。例えば、当該第１反応基は、アルキニル部分（例としては、非天然アミノ酸のｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンにおけるアルキニル部分が挙げられるが、これに限定されない）であり、当該第２反応基は、アジド部分である。他の例において、当該第１反応基は、アジド部分（例としては、非天然アミノ酸のｐ−アジドーＬ−フェニルアラニンにおけるアジド部分が挙げられるが、これに限定されない）であり、当該第２反応基は、アルキニル部分である。
【０３０７】
いくつかの場合において、非天然にコードされたアミノ酸の置換は、ＢＰＦＩの他の生物学的特徴に影響を与えるための、ＢＰＦＩ内における他の付加、置換または欠失と組み合わせられる。いくつかの場合において、上記他の付加、置換または欠失は、ＢＰＦＩの安定性（例としては、タンパク質分解に対する耐性が挙げられるが、これに限定されない）を増強し得るか、またはその受容体もしくは結合パートナーに対するＢＰＦＩの親和性を増強し得る。いくつかの場合において、上記他の付加、置換または欠失は、ＢＰＦＩの可溶性（例としては、E. coliまたは宿主細胞に発現されるときの可溶性が挙げられるが、これらに限定されない）を増強し得る。いくつかの実施形態において、付加、置換または欠失は、E. coli組み換え宿主細胞において発現した後のポリペプチドの可溶性を増強し得る。いくつかの実施形態において、E. coli組み換え宿主細胞において発現した後の、ポリペプチドの可溶性を増強させることになる非天然アミノ酸の別の組み込み部位に加えて、天然にコードされたアミノ酸または非天然にコードされたアミノ酸による置換のための部位が、選択される。いくつかの実施形態において、ＢＰＦＩは、ＢＰＦＩの受容体または結合パートナーに対する親和性の調整、受容体ダイマー化の調整（増強または低減が含まれるが、これらに限定されない）、受容体ダイマーの安定化、結合パートナーの立体構造もしくは１つ以上の生物活性の調整、循環半減期の調整、放出もしくは生物学的利用性の調整、精製の促進、または投与の特定の経路の改善もしくは変更を行う他の付加、置換または欠失を含んでいる。同様に、ＢＰＦＩは、検出（ＧＦＰなど）、精製、組織もしくは細胞膜を介する輸送、プロドラッグの放出もしくは活性化、ＢＰＦＩサイズの低下、またはポリペプチドの他の特徴を改善する連結分子（ビオチンなど）、プロテアーゼ切断配列、反応性基、抗体結合ドメイン（ＦＬＡＧまたはポリ−Ｈｉｓが含まれるが、これらに限定されない）、もしくは他の親和性に基づく配列（ＦＬＡＧ、ポリＨｉｓ、ＧＳＴなど）を含んでいてもよい。
【０３０８】
＜ＶＩＩ．非真核生物および真核生物における発現＞
クローニングされたＢＰＦＩの高レベルで発現させるために、一般的に、本発明のＢＰＦＩをコードするポリヌクレオチドを、直接転写に対する強力なプロモーター、転写／翻訳ターミネーター、さらにタンパク質をコードする核酸用であれば、翻訳開始に関するリボソーム結合部位を含む、発現ベクターにサブクローニングする。適切な細菌プロモーターは、当該分野において公知であり、かつ「Sambrookら」および「Ausubelら」に説明されている。本発明のＢＰＦＩの発現を目的とした発現ベクターの構築に好適な戦略の例としては、図２に示されている戦略が挙げられるが、これに限定されない。
【０３０９】
本発明のＢＰＦＩの発現を目的とした細菌発現系は、例えば、E. coli、Bacillus sp.、およびSalmonella（「Palvaら, Gene 22:229- 235 (1983)」、「Mosbachら, Nature 302:543-545 (1983)」）において、利用可能であるが、これらに限定されない。そのような発現系用のキットは市販されている。哺乳類細胞、酵母、および昆虫細胞にとっての真核発現系は、当該分野において公知であり、かつ市販もされている。直交化ｔＲＮＡおよびアミノアシル化ｔＲＮＡシンテターゼ（上述されている）を使用して、本発明のＢＰＦＩを発現する場合において、発現用の宿主細胞は、直交型の構成要素を使用する該宿主細胞の能力に基づいて選択される。例示的な宿主細胞としては、グラム陽性細菌（例えば、B. brevis、B. subtilis、またはStreptomycesが挙げられるが、これらに限定されない）、およびグラム陰性細菌（E. coli、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas putida）だけでなく、酵母および他の真核細胞が挙げられる。Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの対を含む細胞は、本明細書に記載されているように使用され得る。
【０３１０】
本発明の真核生物の宿主細胞、または非真核生物の宿主細胞は、有用かつ大量に非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質を合成する能力を提供する。１態様において、組成物は、例えば、必要に応じて、非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質の、少なくとも１０マイクログラム、少なくとも５０マイクログラム、少なくとも７５マイクログラム、少なくとも１００マイクログラム、少なくとも２００マイクログラム、少なくとも２５０マイクログラム、少なくとも５００マイクログラム、少なくとも１ミリグラム、少なくとも１０ミリグラム、少なくとも１００ミリグラム、少なくとも１グラム、もしくはそれ以上を含んでいるか、またはインビボタンパク質産生方法（組み換えタンパク質産生および精製についての詳細が本明細書に与えられている）を用いて達成され得る量を含んでいるが、これらに限定されない。他の態様において、タンパク質は、必要に応じて、例えば、細胞ライセート、緩衝液、薬学的緩衝液または他の液体懸濁液（例えば、１ｎｌから１００Ｌまでの任意の量などであるが、これらに限定されない）の中に、例えば、１リットルごとに少なくとも１０マイクログラムのタンパク質、１リットルごとに少なくとも５０マイクログラムのタンパク質、１リットルごとに少なくとも７５マイクログラムのタンパク質、１リットルごとに少なくとも１００マイクログラムのタンパク質、１リットルごとに少なくとも２００マイクログラムのタンパク質、１リットルごとに少なくとも２５０マイクログラムのタンパク質、１リットルごとに少なくとも５００マイクログラムのタンパク質、１リットルごとに少なくとも１ミリグラムのタンパク質、１リットルごとに少なくとも１０ミリグラムのタンパク質の濃度において、組成物に存在するが、これらに限定されない。少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む真核細胞におけるタンパク質の大量の産生は（例えば、通常に、例えば、インビボ翻訳が挙げられる他の方法を用いて可能な量よりも多いが、これに限定されない）、本発明の１つの特徴である。
【０３１１】
本発明の真核生物の宿主細胞、または非真核生物の宿主細胞は、有用かつ大量に非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質を生合成する能力を提供する。例えば、非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質は、細胞抽出物、細胞ライセート、培地、および／または緩衝液などの中に、例えば、少なくとも１０μｇ／リットル、少なくとも５０μｇ／リットル、少なくとも７５μｇ／リットル、少なくとも１００μｇ／リットル、少なくとも２００μｇ／リットル、少なくとも２５０μｇ／リットル、少なくとも５００μｇ／リットル、少なくとも１ｍｇ／リットル、少なくとも２ｍｇ／リットル、少なくとも３ｍｇ／リットル、少なくとも４ｍｇ／リットル、少なくとも５ｍｇ／リットル、少なくとも６ｍｇ／リットル、少なくとも７ｍｇ／リットル、少なくとも８ｍｇ／リットル、少なくとも９ｍｇ／リットル、少なくとも１０ｍｇ／リットル、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００ｍｇ／リットル、１ｇ／リットル、５ｇ／リットル、１０ｇ／リットル、またはそれ以上の濃度において、産生され得る。
【０３１２】
〔Ｉ．発現系、培養および単離〕
任意の数の適切な発現系において、ＢＰＦＩを発現させてもよい。該発現系としては、例えば、酵母、昆虫、哺乳類、および細菌などが挙げられる。典型的な発現系の例を以下に示す。
【０３１３】
（酵母）
本明細書で用いられるような用語「酵母」は、ＢＰＦＩをコードする遺伝子を発現可能な、任意の様々な酵母を含んでいる。そのような酵母としては、子嚢胞子を生じる酵母（ascosporogenous yeasts (Endomycetales)）、担子胞子を生じる酵母（basidiosporogenous yeasts）、および不完全真菌（Blastomycetes）の群に属する酵母などが挙げられるが、これらに限定されない。上記子嚢胞子を生じる酵母は、２のファミリー（SpermophthoraceaeおよびSaccharomycetaceae）に分けられる。後者は、４つのサブファミリー（Schizosaccharomycoideae（Schizosaccharomyces属など）、Nadsonioideae、Lipomycoideae、およびSaccharomycoideae（Pichia属、Kluyveromyces属、およびSaccharomyces属など）から構成されている。担子胞子を生じる酵母には、Leucosporidium属、Rhodosporidium属、Sporidiobolus属、Filobasidium属、およびFilobasidiella属が含まれる。不完全真菌（Blastomycetes）の群に属する酵母は、２のファミリーSporobolomycetaceae（Sporobolomyces属およびBullera属など）、およびCryptococcaceae（Candida属など）に分けられる。
【０３１４】
本発明と一緒に使用するための特に興味のあるものは、Pichia属, Kluyveromyces属, Saccharomyces属, Schizosaccharomyces属, Hansenula属, Torulopsis属, およびCandida属に含まれる種であり、例えば、P. pastoris, P. guillerimondii, S. cerevisiae, S. carlsbergensis, S. diastaticus, S. douglasii, S. kluyveri, S, norbensis, S. oviformis, K. lactis, K. fragilis, C. albicans, C. maltosa, およびH. polymorphaが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３１５】
ＢＰＦＩの発現に好適な選択は、当業者の技術範囲にある。発現用の酵母宿主の選択において、好適な宿主は、例えば、良好な分泌能、低いタンパク質分解活性、良好な可溶化タンパク質産生、および総合的な強健さを有することが示されている酵母であり得る。酵母は、一般的に様々な供給源から入手でき、例えば、Yeast Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, University of California (Berkeley, CA), and the American Type Culture Collection (「ATCC」) (Manassas, VA)などから入手できる。
【０３１６】
用語「酵母宿主」または「酵母宿主細胞」は、組み換えベクターまたは他のトランスファーＤＮＡの受容物として使用し得るか、または使用されている酵母を含む。この用語は、組み換えベクターまたは他のトランスファーＤＮＡを受け容れている元々の酵母宿主細胞の子孫を含んでいる。１つの親細胞の子孫は、形態、ゲノムＤＮＡまたは全ＤＮＡの補体（complement）において、偶発的な突然変異、または計画的な突然変異に起因して、元々の親細胞と必ずしも完全に一致しなくてもよいことを理解されたい。関連する性質（例えば、ＢＰＦＩをコードするヌクレオチド配列の存在）により特徴付けられる親細胞と十分に類似する、親細胞の子孫は、この定義により意図される子孫に含まれる。
【０３１７】
発現ベクターおよび形質転換ベクター（染色体外レプリコンまたは組み込みベクターなど）は、多くの酵母宿主を形質転換するために開発された。例えば、発現ベクターは、S. cerevisiae （「Sikorskiら, GENETICS (1989) 122:19」、「Itoら, J. BACTERIOL. (1983) 153:163」、「Hinnenら, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1978) 75:1929」）、C. albicans （「Kurtzら, MOL. CELL. BIOL. (1986) 6:142」）、C. maltosa （「Kunzeら, J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25:141」）、H. polymorpha （「Gleesonら, J. GEN. MICROBIOL. (1986) 132:3459」、「Roggenkampら, MOL. GENETICS AND GENOMICS (1986) 202:302」）、K. fragilis （「Dasら, J. BACTERIOL. (1984) 158:1165」）、K. lactis （「De Louvencourtら, J. BACTERIOL. (1983) 154:737」、「Van den Bergら, BIOTECHNOLOGY (NY) (1990) 8:135」）、 P. guillerimondii （「Kunzeら, J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25:141」）、 P. pastoris （「米国特許第５，３２４，６３９号明細書、米国特許第４，９２９，５５５号明細書、および米国特許第４，８３７，１４８号明細書、「Creggら, MOL. CELL. BIOL. (1985) 5:3376」、Schizosaccharomyces pombe （「Beachら, NATURE (1982) 300:706」）、および Y. lipolytica（「Davidowら, CURR. GENET. (1985) 10:380 (1985)」、「Gaillardinら, CURR. GENET. (1986) 10:49」）、A. nidulans （「Balanceら, BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN. (1983) 112:284-89」、「Tilburnら, GENE (1983) 26:205-221」、および「Yeltonら, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1984) 81:1470-74」）、 A. niger （「Kelly and Hynes, EMBO J. (1985) 4:475-479」）、T. reesia （欧州特許出願公開第０２４４２３４号明細書）、および糸状菌（例えば、Neurospora、Penicillium、Tolypocladium（国際公開第９１／００３５７号パンフレット）など）に対して開発された。なお、各文献は、引用によって本明細書に組み込まれる。
【０３１８】
酵母ベクターの制御配列は、当業者に公知であり、かつアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（欧州特許出願公開第０２８４０４４号明細書）、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース‐６リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド‐３‐リン酸‐デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰまたはＧＡＰＤＨ）、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３‐ホスホグリセリン酸ムターゼ、およびピルビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）（欧州特許出願公開第０３２９２０３号明細書）がなど挙げられる。また、酸性ホスファターゼをコードしている酵母のＰＨＯ５遺伝子も、有用なプロモーター配列を提供し得る（Miyanoharaら, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1983) 80:1）。酵母宿主と一緒に用いるのに適切な他のプロモーター配列には、３‐ホスホグリセリン酸キナーゼ（「Hitzemanら, J. BIOL. CHEM. (1980) 255:12073」）、および他の解糖系の酵素（例えば、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、およびホスホグルコースイソメラーゼ（例えば、「Hollandら, BIOCHEMISTRY (1978) 17:4900」、「Hessら, J. ADV. ENZYME REG. (1969) 7:149」）が含まれ得る。増殖条件によって制御される転写の付加的な利点を有する、酵母の誘導性プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド‐３‐リン酸デヒドロゲナーゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、ならびにマルトースおよびガラクトースの利用を担う酵素にとってのプロモーター領域を含んでいてもよい。酵母発現への使用に適切なベクターおよびプロモーターが、欧州特許出願公開第００７３６５７号明細書に、さらに記載されている。
【０３１９】
また、酵母エンハンサーを、酵母プロモーターと一緒に用いてもよい。さらに、合成プロモーターもまた、酵母プロモーターとして機能してもよい。例えば、酵母プロモーターの上流活性化配列（ＵＡＳ）を、別の酵母プロモーターの転写活性化領域につなぎ、合成混成プロモーターを作製してもよい。上記混成プロモーターとしては、例えば、ＧＡＰの転写活性化領域に連結されたＡＤＨ調節配列が挙げられる。米国特許第４，８８０，７３４号明細書、および米国特許第４，８７６，１９７号明細書を参照すればよく、これらの文献は引用によって本明細書に組み込まれる。混成プロモーターの他の例としては、解糖系酵素の遺伝子（例えば、ＧＡＰまたはＰｙＫ）の転写活性化領域と組み合わせたＡＤＨ２、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０、またはＰＨＯ５遺伝子の調節配列から成るプロモーターが挙げられる。欧州特許出願公開０１６４５５６号明細書を参照のこと。さらに、酵母プロモーターは、酵母のＲＮＡポリメラーゼとの結合能、および転写開始能を有する、非酵母由来の天然に存在するプロモーターを含んでいてもよい。
【０３２０】
酵母発現ベクターの一部を構成し得る他の制御要素はとしては、例えば、ＧＡＰＤＨまたはエノラーゼ遺伝子に由来するターミネーター（「Hollandら, J. BlOL. CHEM. (1981) 256:1385」）が挙げられる。さらに、２μプラスミドの起点に由来する複製起点は、酵母に適切である。酵母に使用する適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドに存在するｔｒｐ１遺伝子である。「Tschumperら, GENE (1980) 10:157」、「Kingsmanら, GENE (1979) 7:141」を参照のこと。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン存在下において増殖能を欠如している酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する。同様にＬｅｕ２欠損酵母株（ＡＴＣＣ２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する公知のプラスミドにより補完される。
【０３２１】
外因性ＤＮＡを酵母宿主に導入する方法は、当業者に公知の技術であり、かつ通常、アルカリ性陽イオンを用いて処理されたスフェロプラスト、または無傷の酵母宿主細胞のいずれかの形質転換が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、酵母の形質転換は、「Hsiaoら, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1979) 76:3829」および「Van Solingenら, J. BACT. (1977) 130:946」に記載の方法にしたがって、実施され得る。しかし、また、例えば、核注入、エレクトロポレーション、または原形質融合によってＤＮＡを細胞に導入する他の方法も、「SAMBROOKら, MOLECULAR CLONING: A LAB. MANUAL (2001)」に通常に記載されているように、使用され得る。それから、酵母宿主細胞を当業者に公知の標準技術を用いて培養してもよい。
【０３２２】
酵母宿主細胞において異種タンパク質を発現させる他の方法は、当業者に公知の技術である。一般的に、米国特許出願公開第２００２／００５５１６９号明細書、米国特許第６，３６１，９６９号明細書、米国特許第６，３１２，９２３号明細書、米国特許第６，１８３，９８５号明細書、米国特許第６，０８３，７２３号明細書、米国特許第６，０１７，７３１号明細書、米国特許第５，６７４，７０６号明細書、米国特許第５，６２９，２０３号明細書、米国特許第５，６０２，０３４号明細書、および米国特許第５，０８９，３９８号明細書、米国再発行特許発明第ＲＥ３７，３４３号明細書、および米国再発行特許発明第ＲＥ３５，７４９号明細書、国際公開第９９／０７８６２号パンフレット、国際公開第９８／３７２０８号パンフレット、および国際公開第９８／２６０８０号パンフレット、欧州特許出願公開第０９４６７３６号明細書、欧州特許出願公開第０７３２４０３号明細書、欧州特許出願公開第０４８０４８０号明細書、欧州特許出願公開第０４６００７１号明細書、欧州特許出願公開第０３４０９８６号明細書、欧州特許出願公開第０３２９２０３号明細書、欧州特許出願公開第０３２４２７４号明細書、および欧州特許出願公開第０１６４５５６明細書を参照のこと。また、「Gellissenら, ANTONIE VAN LEEUWENHOEK (1992) 62(l-2):79-93」、「Romanosら, YEAST (1992) 8(6):423-488」、「Goeddel, METHODS IN ENZYMOLOGY (1990) 185:3-7」を参照のこと。上記文献は、引用によって本明細書に組み込まれる。
【０３２３】
当業者に公知である標準の給飼バッチ発酵方法（feed batch fermentation method）を用いて、増幅段階の間に酵母宿主株を発酵槽において成長させてもよい。上記発酵方法は、特定の酵母宿主の炭素利用経路、または発現制御の様式の差異に原因して、適合されてもよい。例えば、saccharomyces酵母宿主の発酵は、１つのグルコース飼料、複合的な窒素源（カゼイン加水分解物など）、および複数のビタミン補助物を必要としてもよい。これに対し、メチロトローフ酵母であるP. pastorisは、グリセロール、メタノール、および微量の無機化合物飼料を必要としてもよく、最適な成長および発現については単純なアンモニウム（窒素）塩だけを必要とする。例えば、米国特許第５，３２４，６３９号明細書、「Elliottら, J. PROTEIN CHEM. (1990) 9:95」、および「Fieschkoら, BIOTECH. BIOENG. (1987) 29:1113」を参照のこと。なお、これら文献は、引用によって本明細書に組み込まれる。
【０３２４】
しかし、上記発酵方法は、用いられる酵母宿主株とは無関係な特定の共通の特徴を有していてもよい。例えば、成長限界栄養素（通常は炭素）を、発酵槽に増幅段階の間に添加して、最大限の成長を可能にしてもよい。さらに、発酵方法は、一般的に、十分な量の炭素、窒素、基本塩、リン、および他の微量栄養素（ビタミン、微量無機物、および塩など）を含むように調製された発酵培地を用いてもよい。Ｐｉｃｈｉａと一緒に使用するための適切な発酵培地の例が、米国特許第５，３２４，６３９号明細書、および米国特許第５，２３１，１７８号明細書に記載されている。なお、これら文献は、引用によって本明細書に組み込まれる。
【０３２５】
（バキュロウイルス感染昆虫細胞）
用語「昆虫宿主」または「昆虫宿主細胞」は、組み換えベクターまたは他のトランスファーＤＮＡの受容物として使用し得るか、または使用されている昆虫をいう。この用語は、トランスフェクトされた元々の昆虫宿主細胞の子孫を含む。１つの親細胞の子孫は、形態、ゲノムＤＮＡまたは全ＤＮＡの補体において、偶発的な突然変異、または計画的な突然変異に起因して、元々の親細胞と必ずしも完全に一致していなくてもよいことを理解されたい。関連する性質（例えば、ＢＰＦＩをコードしているヌクレオチド配列の存在）により特徴付けられる親細胞と十分に類似する、親細胞の子孫は、この定義により意図される子孫に含まれる。
【０３２６】
ＢＰＦＩの発現に好適な昆虫細胞の選択は、当業者に公知である。いくつかの昆虫種は、当該分野において十分に説明されており、かつAedes aegypti、Bombyx mori、Drosophila melanogaster、Spodoptera frugiperda、およびTrichoplusia niを含めて、市販されている。発現用の昆虫宿主の選択において、適切な宿主は、特に、良好な分泌能、低いタンパク質分解活性、および総合的な強健さを有することが示されている宿主であってもよい。昆虫は、一般的に、「Insect Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, University of California (Berkeley, CA)」、および「the American Type Culture Collection (「ATCC」) (Manassas, VA)」を含む、様々な供給源から入手することができるが、これらに限定されない。
【０３２７】
一般的に、バキュロウイルス‐感染昆虫の発現系の構成要素は、バキュロウイルスのゲノム断片、および発現される異種遺伝子の挿入に便利な制限酵素認識部位の両方を含むトランスファーベクター（普通は細菌のプラスミド）、当該トランスファーベクターにおけるバキュロウイルスに特異的な断片に対して、相同な配列を有する（これにより、バキュロウイルスゲノムに対する異種遺伝子の相同組み換えが可能になる）野生型バキュロウイルス、ならびに、適切な昆虫宿主細胞および成長培地を含んでいる。ベクターの構築、細胞のトランスフェクション、プラークの選択、または培養における細胞の成長などに用いられる材料、方法および技術は公知であり、かつこれらの技術が記載されている手引書が利用可能である。
【０３２８】
異種遺伝子をトランスファーベクターに挿入した後に、該ベクターおよび野生型ウイルスゲノムを、当該ベクターと当該ウイルスゲノムとが組み換えを起こす昆虫宿主細胞に、トランスフェクションする。パッケージングされた組み換えウイルスが発現され、かつ組み換え体プラークが同定および精製される。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系にとっての材料および方法は、例えば、Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA)が提供している、キットの様式において市販されている。これらの技術は、一般的に当業者に公知であり、かつ「SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987)」に十分に記載されている。なお、この文献は、引用によって本明細書に組み込まれる。また、「RICHARDSON, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY: BACULOVIRUS EXPRESSION PROTOCOLS (1995)」、「AUSUBELら, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 16.9-16.11 (1994)」、「KLNG AND POSSEE, THE BACULOVIRUS SYSTEM: A LABORATORY GUIDE (1992)」および「O’REILLYら, BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992)」を参照のこと。
【０３２９】
バキュロウイルス／昆虫細胞発現系を用いた、様々な異種タンパク質の製造は、実際に、当業者に公知である。例えば、米国特許第６，３６８，８２５号明細書、米国特許第６，３４２，２１６号明細書、米国特許第６，３３８，８４６号明細書、米国特許第６，２６１，８０５号明細書、米国特許第６，２４５，５２８号明細書、米国特許第６，２２５，０６０号明細書、米国特許第６，１８３，９８７号明細書、米国特許第６，１６８，９３２号明細書、米国特許第６，１２６，９４４号明細書、米国特許第６，０９６，３０４号明細書、米国特許第６，０１３，４３３号明細書、米国特許第５，９６５，３９３号明細書、米国特許第５，９３９，２８５号明細書、米国特許第５，８９１，６７６号明細書、米国特許第５，８７１，９８６号明細書、米国特許第５，８６１，２７９号明細書、米国特許第５，８５８，３６８号明細書、米国特許第５，８４３，７３３号明細書、米国特許第５，７６２，９３９号明細書、米国特許第５，７５３，２２０号明細書、米国特許第５，６０５，８２７号明細書、米国特許第５，５８３，０２３号明細書、米国特許第５，５７１，７０９号明細書、米国特許第５，５１６，６５７号明細書、米国特許第５，２９０，６８６号明細書、国際公開第０２／０６３０５号パンフレット、国際公開第０１／９０３９０号パンフレット、国際公開第０１／２７３０１号パンフレット、国際公開第０１／０５９５６号パンフレット、国際公開第００／５５３４５号パンフレット、国際公開第００／２００３２号パンフレット、国際公開第９９／５１７２１号パンフレット、国際公開第９９／４５１３０号パンフレット、国際公開第９９／３１２５７号パンフレット、国際公開第９９／１０５１５号パンフレット、国際公開第９９／０９１９３号パンフレット、国際公開第９７／２６３３２号パンフレット、国際公開第９６／２９４００号パンフレット、国際公開第９６／２５４９６号パンフレット、国際公開第９６／０６１６１号パンフレット、国際公開第９５／２０６７２号パンフレット、国際公開第９３／０３１７３号パンフレット、国際公開第９２／１６６１９号パンフレット、国際公開第９２／０３６２８号パンフレット、国際公開第９２／０１８０１号パンフレット、国際公開第９０／１４４２８号パンフレット、国際公開第９０／１００７８号パンフレット、国際公開第９０／０２５６６号パンフレット、国際公開第９０／０２１８６号パンフレット、国際公開第９０／０１５５６号パンフレット、国際公開第８９／０１０３８号パンフレット、国際公開第８９／０１０３７号パンフレット、国際公開第８８／０７０８２号パンフレットを参照のこと。なお、各文献は、引用によって本明細書に組み込まれる。
【０３３０】
バキュロウイルス／昆虫細胞発現系に有用なベクターは、公知であり、かつ例えば、バキュロウイルスのAutographacalifornica核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）に由来する、ヘルパー非依存性のウイルスベクターである昆虫の発現およびトランスファーベクターを含む。この系に由来するウイルス発現ベクターは、一般的に、異種遺伝子の発現を誘導するために、ウイルスの強力なポリへドリン遺伝子プロモーターを利用する。一般的には、「O’Reillyら, BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992)」を参照のこと。
【０３３１】
外来の遺伝子をバキュロウイルスのゲノムに挿入する前に、上記構成要素（プロモーター、リーダー（必要に応じて）、興味のあるコード配列、および転写終結配列を含んでいる）は、通常、中間置換コンストラクト（Intermediate transplacement construct）（トランスファーベクター）に集められる。中間置換コンストラクトは、細菌などの宿主において安定な維持が可能な染色体外エレメント（例えば、プラスミド）といった、レプリコンにおいてしばしば維持される。レプリコンは１つの複製系を有し、このため、クローニングおよび増幅に適切な宿主における当該レプリコンの維持を可能にする。より具体的には、プラスミドは、ポリヘドリンポリアデニル化シグナル（「Miller, ANN. REV. MICROBIOL. (1988) 42:177」）と、E.coliにおける選択および増殖に関する、原核生物のアンピシリン耐性（ａｍｐ）遺伝子と複製起点とを含有する。
【０３３２】
ＡｃＮＰＶへ外来遺伝子を導入するために一般的に使用されるトランスファーベクターの１つは、ｐＡｃ３７３である。当業者に公知である他の多くのベクターもまた設計されており、例えば、ｐＶＬ９８５が挙げられる。このベクターでは、ポリヘドリン開始コドンがＡＴＧからＡＴＴに変えられ、ＡＴＴの下流の３２塩基対にＢａｍＨＩクローニング部位が導入されている（「Luckow and Summers, VIROLOGY 170:31 (1989)」を参照のこと）。他の市販されているベクターとしては、例えば、PBlueBac4.5/V5-His、pBlueBacHis2、pMelBac、pBlueBac4.5(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)が挙げられる。
【０３３３】
異種遺伝子を挿入した後に、トランスファーベクターおよび野生型バキュロウイルスのゲノムを、昆虫細胞宿主に同時トランスフェクションする。異種ＤＮＡをバキュロウイルスの所望の部位に導入するための方法は、当該分野において公知である。例えば、「SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987)」、「Smithら, MOL. CELL. BIOL. (1983) 3:2156」、「Luckow and Summers, VIROLOGY (1989) 170:31」を参照のこと。例えば、２重交差型相同組み換えによって、ポリへドリン遺伝子などの遺伝子に、挿入してもよい。また、所望のバキュロウイルス遺伝子中に設けられた、制限酵素認識部位に挿入してもよい。例えば、「Millerら, BIOESSAYS (1989) 11(4):91」を参照のこと。
【０３３４】
トランスフェクションを、エレクトロポレーションにより達成してもよい。「TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995)」、「Mann and King, J. GEN. VIROL. (1989) 70:3501」を参照のこと。また、その代わりに、リポソームを用いて、昆虫細胞に組み換え発現ベクターとバキュロウイルスとをトランスフェクションしてもよい。例えば、「Liebmanら., BIOTECHNIQUES (1999) 26(1):36」、「Gravesら, BIOCHEMISTRY (1998) 37:6050」、「Nomuraら, J. BIOL. CHEM. (1998) 273(22): 13570」、「Schmidtら, PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1998) 12:323」、「Siffertら, NATURE GENETICS (1998) 18:45」、「TILKINSら, CELL BIOLOGY: A LABORATORY HANDBOOK 145-154 (1998) 」、「Caiら, PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1997) 10:263」、「Dolphinら, NATURE GENETICS (1997) 17:491」、「Kostら, GENE (1997) 190:139」、「Jakobssonら, J. BlOL. CHEM. (1996) 271:22203」、「Rowlesら, J. BIOL. CHEM. (1996) 271(37): 22376」、「Revereyら, J. BIOL. CHEM. (1996) 271(39) :23607- 10」、「Stanleyら, J. BlOL. CHEM. (1995) 270:4121」、「Siskら, J. VlROL. (1994) 68(2):766」、および「Pengら, BIOTECHNIQUES (1993) 14(2):274」を参照のこと。市販されているリポソームとしては、例えば、セルフェクチン（Cellfectin（登録商標））、およびリポフェクチン（Lipofectin（登録商標））（Invitrogen, Corp., Carlsbad, CA）が挙げられる。また、リン酸カルシウムトランスフェクションを用いてもよい。「TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995)」、「Kitts, NAR (1990) 18(19):5667」、および「Mann and King, J. GEN. VIROL. (1989) 70:3501」を参照のこと。
【０３３５】
バキュロウイルス発現ベクターは、たいていは、バキュロウイルスプロモーターを含んでいる。バキュロウイルスプロモーターは、バキュロウイルスのＲＮＡポリメラーゼが結合でき、コード配列（例えば、構造遺伝子）をｍＲＮＡへと下流（３’）へ転写開始する任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、たいていはコード配列の５’末端近傍に配置される転写開始領域を有している。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位と転写開始部位とを含んでいる。また、バキュロウイルスのプロモーターは、エンハンサーと呼ばれる２次ドメインを有していてもよい。この２次ドメインは、存在する場合は、構造遺伝子から遠位に存在する。また、発現は、調節されてもよいし、恒常的であってもよい。
【０３３６】
ウイルス感染サイクルの後期に多量に転写される構造遺伝子は、特に有用なプロモーター配列を提供する。有用なプロモーター配列の例としては、ウイルスポリヘドリンタンパク質をコードする遺伝子由来の配列（「FRIESENら, The Regulation of Baculovirus Gene Expression in THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES (1986)」、欧州特許出願公開第０１２７８３９号明細書、および欧州特許出願公開第０１５５４７６号明細書）、およびｐ１０タンパク質をコードする遺伝子由来の配列（「Vlakら, J. GEN. VlROL. (1988) 69:765」）が挙げられる。
【０３３７】
新しく形成されたバキュロウイルス発現ベクターは、感染性の組み換えバキュロウイルスにパッケージングされる。その後、成長したプラークが当業者に公知の方法により精製されもよい。「Millerら, BIOESSAYS (1989) 11(4):91」、「SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987)」を参照のこと。
【０３３８】
組み換えバキュロウイルス発現ベクターは、いくつかの昆虫細胞へ感染させるために開発されている。例えば、取り分け、Aedes aegypti（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１２５）、Bombyx mori（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−８９１０）、Drosophila melanogaster（ＡＴＣＣ番号１９６３）、Spodoptera frugiperda、およびTriclioplusia niのための組み換えバキュロウイルスが開発されている。国際公開第８９／０４６，６９９号パンフレット、「Wright, NATURE (1986) 321:718」、「Carbonellら, J. VlROL. (1985) 56:153」、「Smithら, MOL. CELL. BIOL. (1983) 3:2156」を参照のこと。一般的には、「Fraserら, IN VITRO CELL. DEV. BIOL (1989) 25:225」を参照のこと。より具体的には、バキュロウイルス発現ベクターの系に用いられる細胞株としては、通常、Ｓｆ９（Spodoptera frugiperda）（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１７１１）、Ｓｆ２１（Spodoptera frugiperda）（Invitrogen Corp.,カタログ番号11497-013 (Carlsbad, CA)）、Tri-368（Trichopulsia ni）、およびHigh-Five（登録商標）BTI-TN-5B1-4（Trichopulsia ni）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３３９】
バキュロウイルス／発現における異種ポリペプチドの直接発現と融合発現とのための細胞および培地は、市販されている。また、細胞培養技術は、当業者に公知である。
【０３４０】
（E. Coli、Pseudomonas species、および他の原核生物）
細菌における発現技術は、当業者に公知である。細菌宿主における使用を目的とした様々なベクターが、利用可能である。これらベクターは、１コピーベクター、またはコピー数が少ない多コピーベクター（低多コピーベクター）、もしくはコピー数が多い多コピーベクター（高多コピーベクター）であってもよい。ベクターは、クローニングおよび／または発現に役立ち得る。ベクター、多くのベクターの商業的な有効性に関する豊富な文献、ならびにベクターおよびベクターの制限酵素地図およびベクターの特徴について記載している手引書も同等に考慮して、本明細書では、これ以上論じる必要は無い。よく知られているように、ベクターは、通常は選択を可能にするマーカーを含んでいる。このマーカーは、細胞毒性剤への耐性、原栄養性、または免疫を提供し得るものである。しばしば、異なる特徴を提供する複数のマーカーが存在する。
【０３４１】
細菌プロモーターは、細菌のＲＮＡポリメラーゼが結合でき、コード配列（例えば、構造遺伝子）をｍＲＮＡへと下流（３’）へ転写開始できる任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、たいていはコード配列の５’末端近傍に配置される転写開始領域を有している。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位と転写開始部位とを含んでいる。また、細菌プロモーターは、オペレーターと呼ばれる２次ドメインを有していてもよい。この２次ドメインは、ＲＮＡ合成が始まる隣接したＲＮＡポリメラーゼ結合部位と重複してもよい。オペレーターは、負に調節される（誘導性の）転写を可能にする。すなわち、遺伝子リプレッサータンパク質が、オペレーターに結合することにより、特定の遺伝子の転写を阻害してもよい。恒常的発現は、負の調節要素（オペレーターなど）が無いときに起こり得る。さらに、正の調節が、遺伝子アクチベータータンパク質の結合配列によりもたらされてもよい。該結合配列は、存在する場合は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列よりも遠位（５’）に存在する。遺伝子アクチベータータンパク質としては、例えば、カタボライト活性化タンパク質（ＣＡＰ）が挙げられる。このＣＡＰは、Escherichia coli（E. coli）のｌａｃオペロンの転写開始を助ける（「Raibaudら, ANNU. REV. GENET. (1984) 18:173」）。したがって、制御された発現は、正または負のいずれかであってもよく、これによって転写を増強または減少させてもよい。
【０３４２】
代謝経路の酵素をコードしている配列は、特に有用なプロモーターを提供する。この配列としては、例えば、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）（「Changら, NATURE (1977) 198:1056」）、およびマルトースなどの糖代謝酵素に由来するプロモーター配列が挙げられる。別の例としては、トリプトファン（ｔｒｐ）などの生合成酵素に由来するプロモーター配列が挙げられる（「Goeddelら, Nuc. ACIDS RES. (1980) 8:4057」、「Yelvertonら, NUCL. ACIDS RES. (1981) 9:731」、米国特許第４，７３８，９２１号明細書、欧州公開第０３６７７６号明細書、欧州公開第１２１７７５号明細書）。なお、これら文献は、引用によって本明細書に組み込まれる。また、β‐ガラクトシダーゼ（ｂｌａ）のプロモーター系（「Weissmann (1981) “The cloning of interferon and other mistakes.” In Interferon 3 (Ed. I. Gresser) 」）、バクテリオファージ・ラムダのＰＬ（「Shimatakeら, NATURE (1981) 292:128」）、およびＴ５（米国特許第４，６８９，４０６号明細書）のプロモーター系も、有用なプロモーター配列を提供する（なお、これら文献は、引用によって本明細書に組み込まれる）。本発明の好ましい方法は、ＢＰＦＩを高レベルに誘導するためのＴ７プロモーターなどの強力なプロモーターを利用する。そのようなベクターの例は、当業者に公知であり、ｐＥＴ２９のシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、および国際公開第９９／０５２９７号明細書に記載のｐＰＯＰベクターなどが挙げられる（なお、上記文献は、引用によって本明細書に組み込まれる）。そのような発現系は、宿主細胞の生存能力または成長パラメーターに支障をきたすことなく、宿主において、ＢＰＦＩを高レベルに産生する。
【０３４３】
また、天然に生じない合成プロモーターも、細菌プロモーターとして機能する。例えば、１つの細菌またはバクテリオファージのプロモーターの転写活性化配列を、別の細菌またはバクテリオファージのプロモーターのオペロン配列に結合して、合成混成プロモーターを作製してもよい（米国特許第４，５５１，４３３号明細書（なお、この文献は、引用によって本明細書に組み込まれる））。例えば、ｔａｃプロモーターは、ｔｒｐプロモーター配列と、ｌａｃリプレッサーにより調節されるｌａｃオペロン配列とを含む混成ｔｒｐ‐ｌａｃプロモーターである（「Amannら, GENE (1983) 25:167」、「de Boerら, PROC. NATL. ACAD. SCI. (1983) 80:21」）。さらに、細菌プロモーターは、細菌のＲＮＡポリメラーゼとの結合能、および転写開始能を有する非細菌起源の天然に生じるプロモーターを含んでいてもよい。また、非細菌起源の天然に生じるプロモーターを、適合するＲＮＡポリメラーゼに結合させることにより、原核生物におけるいくつかの遺伝子を高レベルで発現させることができる。バクテリオファージのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系は、共役型プロモーター系の例である（「Studierら, J. MOL. BIOL. (1986) 189:113」、「Taborら, Proc Natl. Acad. Sci. (1985) 82:1074」）。さらに、混成プロモーターは、バクテリオファージプロモーターと、E. coliのオペレーター領域とを含んでいてもよい（欧州公開第２６７８５１号明細書）。
【０３４４】
また、機能性プロモーター配列に加えて、効率的なリボソーム結合部位が、外来遺伝子を原核細胞において発現させるために有効である。E. coliにおいて、リボソーム結合部位は、シャイン‐ダルガルノ（ＳＤ）配列と呼ばれ、開始コドン（ＡＴＧ）と、該開始コドンから３〜１１ヌクレオチド上流に位置した、長さ３〜９ヌクレオチドの配列とを含んでいる（「Shineら, NATURE (1975) 254:34」）。ＳＤ配列は、ＳＤ配列とE. coliの１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’との間で塩基対を形成することにより、ｍＲＮＡとリボソームとの結合を促進すると考えられている（「Steitzら “Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA”, In Biological Regulation and Development: Gene Expression (Ed. R. F. Goldberger, 1979) 」）。真核性遺伝子および原核性遺伝子を、弱いリボソーム結合部位により発現すること（「Sambrookら “Expression of cloned genes in Escherichia coli”, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989」）。
【０３４５】
用語「細菌宿主」または「細菌宿主細胞」は、組み換えベクターまたは他のトランスファーＤＮＡにとっての受容物として使用されてもよい、または使用されている細菌のことをいう。この用語は、トランスフェクションされている元々の細菌宿主細胞の子孫を含む。１つの親細胞の子孫は、形態、ゲノムＤＮＡまたは全ＤＮＡの補体において、偶発的な突然変異、または計画的な突然変異に起因して、元々の親細胞と必ずしも完全に一致していなくてもよいことを理解されたい。関連する性質（例えば、ＢＰＦＩをコードするヌクレオチド配列の存在）により特徴付けられる親細胞と十分に類似する、親細胞の子孫は、この定義により意図される子孫に含まれる。
【０３４６】
ＢＰＦＩの発現に適切な細菌宿主の選択は、当業者に公知である。発現のための細菌宿主の選択において、適切な宿主は、取り分け、良好な封入体形成能、低いタンパク質分解活性、および全体的に強健さを有することが示されている宿主であってもよい。細菌宿主は、一般的に、様々な供給源から入手することができ、例えば、「Bacterial Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, University of California (Berkeley, CA)」、および「the American Type Culture Collection (「ATCC」) (Manassas, VA)」から入手することができるが、これらに限定されない。Ｋ株に由来する細菌（Ｗ３１１０など）、またはＢ株に由来する細菌（ＢＬ２１など）が、一般的に産業的／製薬的な発酵に用いられる。これらの株は、成長パラメーターが、極めてよく知られており、強健であるから特に有用である。さらに、これらの株は非病原性であるから、安全性と環境の観点から商業的に重要である。本発明の方法の１実施形態において、E. coliは、ＢＬ２１である。本発明の方法のもう１つ別の実施形態では、E. coli宿主は、プロテアーゼが欠失した株（ＯＭＰ−、およびＬＯＮ−など）である。本発明の方法のもう１つ別の実施形態では、宿主細胞株は、Pseudomonas種(例えば、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas aeruginosa、およびPseudomonas putidaが挙げられるが、これらに限定されない)である。ＭＢ１０１株で示されるPseudomonas fluorescensの次亜種１は、組み換え体の製造に有用であることが知られており、治療用タンパク質の製造過程に利用することができる。Pseudomonasの発現系の例としては、宿主株として「The Dow Chemical Company」から入手可能な系が挙げられる（Midland, MI（ワールドワイドウェブの「dow.com」において利用できる））。米国特許第４，７５５，４６５号明細書、および米国特許第４，８５９，６００号明細書には、ｈＧＨを産生するための宿主細胞としてPseudomonas株を使用することが記載されている。なお、これら文献は、引用によって本明細書に組み込まれる。
【０３４７】
組み換え宿主細胞株が、確立されれば（すなわち、発現コンストラクトが、宿主細胞に導入され、適切な発現コンストラクトを有する宿主細胞が単離されれば）、当該組み換え宿主細胞株が、ＢＰＦＩの産生に適切な条件下において培養される。当業者には明らかなように、組み換え宿主細胞株の培養方法は、利用される発現コンストラクトの性質と、宿主細胞の個性とに依存する。組み換え宿主株は、普通は、技術的に公知の方法を用いて培養される。組み換え宿主細胞は、通常、炭素、窒素および無機塩の吸収可能な供給源を含む液体培養基にて培養される。さらに、該液体培養基は、必要に応じて、ビタミン、アミノ酸、成長因子、および技術的に公知の他のタンパク質性の培養補助物を含んでいてもよい。また、宿主細胞の培養のための液体培養基は、望ましくない微生物の成長を阻害するための抗生物質、もしくは抗真菌剤、および／または発現ベクターを含む宿主細胞を選択するための抗生物質などの化合物を、任意に含んでいてもよい。
【０３４８】
組み換え宿主細胞は、バッチ式または連続式で培養され、（ｉ）細胞を収集する（ＢＰＦＩが細胞内に蓄積する場合に）か、または、（ｉｉ）バッチ式もしくは連続式における培養液上清を収集してもよい。原核生物の宿主細胞での製造については、バッチ式培養および細胞収集が好ましい。
【０３４９】
本発明のＢＰＦＩは、普通、組み換え系における発現の後に、精製される。当該ＢＰＦＩは、技術的に公知の様々な方法によって、宿主細胞から精製され得る。普通、細菌宿主細胞において産生されたＢＰＦＩは、（封入体の形態において）可溶性に乏しくても、または不溶性であってもよい。本発明の１実施形態では、技術的に公知の方法や、本明細書に記載された方法を利用して、組み換えにより製造されたタンパク質の溶解度の増加を目的として選択されたアミノ酸の置換が、ＢＰＦＩにおいて容易に行われ得る。不溶性のタンパク質の場合、当該タンパク質は、宿主細胞ライセートから遠心分離によって回収され得、続いて、細胞のホモジナイゼーション（homogenization）が行われ得る。可溶性に乏しいタンパク質の場合、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などを含む組成物は、部分的に可溶性のタンパク質の沈殿を引き起こすために加えられ得る。それから、沈殿したタンパク質は、遠心分離によって好都合に回収され得る。当該分野において公知の様々な方法により、組み換え宿主細胞が崩壊またはホモジナイズされると、当該細胞内から封入体が放出され得る。宿主細胞の崩壊またはホモジナイゼーションは、例えば、酵素的細胞崩壊、超音波処理、ダウンス型ホモジナイゼーション（dounce homogenization）、または高圧放出崩壊を含むが、これらに限定されないよく知られる技術を用いて実施され得る。本発明の方法の１実施形態では、高圧放出技術を、E. coli宿主細胞の崩壊に使用することにより、ＢＰＦＩの封入体を放出させてもよい。ＢＰＦＩの封入体を取り扱うときに、繰り返しのホモジナイゼーション時間を最小化することが好都合である。これにより、可溶化、器械的なせん断またはタンパク質分解などの要因による損失を無くし、封入体の収量が最大になる。封入体を形成する傾向は、標的タンパク質にある種の他のタンパク質（例えば、ＴｒｐＬＥ）（「Georgiou, G. (1996) in Protein engineering: Principles and Practice (Cleland, J. L. and Craik, C. S., eds.), pp. 101-127, Wiley-Liss, New York, Ford, C. F., Suominen, I.」、および「Glatz, C. E. (1991) Protein Expression Purif. 2, 95-107」）を融合させることによって、かつ高温または７．０以外のｐＨにおいて培養することによって、向上され得る。
【０３５０】
不溶性のまたは沈殿したＢＰＦＩは、当該技術にとって公知の、適切な多くの可溶化試薬のいずれかを用いて可溶化され得る。好ましくは、ＢＰＦＩは、尿素またはグアジニン塩酸塩を用いて可溶化される。バッチの大きさが都合よく扱いやすいものを用いて、大規模なバッチが産生され得るように、可溶化されたＢＰＦＩの容積は、最小化されるべきである。組み換え宿主細胞が一度に数千リットルの容積であるバッチで成長され得るとき、この要因は、大規模な工業的設定において重要であり得る。また、特にヒトへの製薬利用のために大規模な工業的設定においてＢＰＦＩを製造するとき、機械および容器か、タンパク質産物自体かのいずれかを損傷するおそれのある過酷な化学物質の回避は、可能であれば、避けられるべきである。穏やかな変性試薬である尿素を、過酷な変性試薬であるグアニジン塩酸塩の代わりに、ＢＰＦＩ封入体の可溶化に使用できることが、本発明の方法に示されている。尿素の使用は、ＢＰＦＩの製造過程および精製過程に利用されるステンレス鋼の設備に対する損傷の危険度を有為に低減すると同時に、ＢＰＦＩ封入体を効率的に可溶化する。
【０３５１】
可溶性ＢＰＦＩの場合、ＢＰＦＩは、細胞膜周辺腔に、または培地に分泌され得る。また、可溶性ＢＰＦＩは、宿主細胞の細胞質に存在し得る。精製段階を実施する前に、可溶性ＢＰＦＩを濃縮することが望ましいことがある。当業者に公知の標準的な技術は、細胞ライセートまたは培地などからの可溶性ＢＰＦＩの濃縮に使用され得る。また、当業者に公知の標準的な技術は、宿主細胞の崩壊、および宿主細胞の細胞質もしくは細胞膜周辺腔からの可溶性ＢＰＦＩの放出に使用されてもよい。
【０３５２】
ＢＰＦＩが融合タンパク質として産生されるとき、融合配列は、好ましく除去される。融合配列の除去は、多くの異なる条件において、例えば、酵素的切断または化学的切断によって果たされ得るが、これらに限定されない。融合配列の酵素的除去は、当業者によく知られている方法を用いて果たされ得る。融合配列の除去にふさわしい酵素の選択は、融合の個性によって決定され、かつ反応条件は、当業者にとって明らかなような酵素の選択によって特定される。化学的切断は、当業者によく知られている試薬を用いて果たされ得る。そのような試薬の１つは、メチオニン残基において切断する臭化シアンである。切断されたＢＰＦＩは、よく知られた方法によって、切断された融合配列から好ましく精製される。そのような方法は、当業者にとって明らかなように、融合配列およびＢＰＦＩの個性および性質によって決定される。融合配列の除去にとってのペプチド結合は、例えば、光子エネルギーに対するばくろ、温度上昇、温度低下、ｐＨ上昇、ｐＨ低下、素粒子に対するばくろ、触媒の添加、酵素とのインキュベーション、他の化学官能基との接触、および／または他の条件において、切断され得る。これらの１つ以上の条件において切断されるペプチド結合に関して、非天然にコードされたアミノ酸は、１つ以上の特徴を有する官能基（例としては、光活性化官能基、ｐＨ活性化官能基、温度活性化官能基、触媒を要求する官能基、およびプロテアーゼ、酵素もしくは他の化学官能基によって認識される官能基が挙げられるが、これらに限定されない）を有していてもよい。精製方法の例としては、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、もしくは透析、またはこれらのあらゆる組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３５３】
また、ＢＰＦＩは、タンパク質溶液からＤＮＡを除去するために、精製されることが好ましい。ＤＮＡは、当業者に公知のあらゆる適切な方法（例えば、沈殿またはイオン交換クロマトグラフィー）によって除去さえ得るが、核酸沈殿試薬（例えば、硫酸プロタミンであるが、これに限定されない）を用いた沈殿によって好ましく除去される。ＢＰＦＩは、標準的なよく知られた方法（例としては、遠心分離またはろ過が挙げられるが、これらに限定されない）を用いて、沈殿されたＤＮＡから分離され得る。ＢＰＦＩがヒトの治療に用いられ、本発明の方法が薬学的に許容可能なレベルまで宿主細胞のＤＮＡを低減する設定において、宿主核酸分子の除去は重要な要素となる。
【０３５４】
また、小規模または大規模な発酵方法は、タンパク質発現（例としては、発酵槽、振とうフラスコ、流動床バイオリアクター、中空糸バイオリアクター、ローラーボトル培養系、および攪拌タンクバイオリアクター系が挙げられるが、これらに限定されない）に使用され得る。これらの方法のそれぞれは、バッチ処理、給飼バッチ処理、連続様式処理において実施され得る。
【０３５５】
本発明のヒトＢＰＦＩは、当該分野における標準的な方法を用いて、通常に回収され得る。例えば、培地または細胞ライセートは、細胞破片を除去するために遠心分離またはろ過され得る。上清は、濃縮され得る、またはさらなる精製用の調製物を適当な状態にする適切な緩衝液の中において、所望の容積に希釈もしくは透析され得る。本発明のＢＰＦＩのさらなる精製は、原型の形態からジアミド化され、かつ短縮されたＢＰＦＩバリアントの形態の分離を含む。
【０３５６】
以下の例示的な手法のいずれかは、本発明のＢＰＦＩの精製に採用され得る。当該手法は、アフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー（例としては、ＤＥＡＥ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥを用いたものが挙げられるが、これに限定されない）；シリカ上におけるクロマトグラフィー；逆相ＨＰＬＣ；ゲルろ過（例としては、ＳＥＰＨＡＤＥＸ  Ｇ−７５を用いたものが挙げられるが、これに限定されない）；疎水性相互作用クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー；金属キレートクロマトグラフィー；限外ろ過／ダイアフィルトレーション；エタノール沈殿；硫酸アンモニウム沈殿；等電点電気泳動（chromatofocusing）；置換クロマトグラフィー；電気泳動的手法（例としては、調製用等電点電気泳動（isoelectric focusing）が挙げられるが、これに限定されない）、差別的可溶性（differential solubility）（例としては、硫酸アンモニウム沈殿が挙げられるが、これに限定されない）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは抽出である。
【０３５７】
本発明のタンパク質（例としては、非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質、非天然アミノ酸を含んでいるペプチド、非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質に対する抗体、非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質にとってのパートナーなどが挙げられるが、これらに限定されない）は、当業者に知られ、かつ使用される標準的な手法に従って、部分的または実質的に均質に精製される。従って、本発明のポリペプチドは、当該分野においてよく知られた任意の多くの方法（例としては、硫酸アンモニウム沈殿もしくはエタノール沈殿、酸抽出もしくは塩基抽出、カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、およびゲル電気泳動などが挙げられるが、これらに限定されない）によって、回収および精製され得る。タンパク質をリフォールディング（refolding）する工程は、必要に応じて、正確に折りたたまれた成熟タンパク質を作製するときに、使用され得る。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）アフィニティークロマトグラフィー、または他の適切な方法は、高い純度が所望される最終的な精製工程において採用され得る。１実施形態において、非天然アミノ酸（または非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質もしくはペプチド）に対して作製された抗体は、１つ以上の非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質またはペプチドの親和性に基づく精製などのための精製試薬として使用され得る。所望のように、部分的にまたは均質にまで精製されると、ポリペプチドは、多種多様な有用物（例えば、アッセイの構成要素、治療学、予防法、診断学、研究試薬として、および／または抗体生成用の抗原としてであるが、これらに限定されない）に関して、必要に応じて使用される。
【０３５８】
本明細書に言及されている他の参考文献に加えて、様々な精製／タンパク質折りたたみ方法は、当該分野においてよく知られている（例えば、「R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982)」、「Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification. Academic Press, Inc. N.Y. (1990) 」、「Sandana, (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.」、「Bollagら (1996) Protein Methods, 2nd Edition Wiley-Liss, NY」、「Walker, (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris and Angal, (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England」、「Harris and Angal, Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England」、「Scopes, (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3rd Edition Springer Verlag, NY」、「Janson and Ryden, (1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, Second Edition Wiley-VCH, NY」、および「Walker (1998), Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ」ならびにこれらに引用されている参考文献に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない）。
【０３５９】
真核生物の宿主細胞または非真核生物の宿主細胞において、非天然アミノ酸を用いて興味のあるタンパク質またはポリペプチドを産生することの１つの利点は、通常、該タンパク質またはポリペプチドが、それらの本来の立体構造に折りたたまれることである。しかし、本発明のある種の実施形態において、当業者は、合成、発現および／または精製の後に、タンパク質またはポリペプチドが、関連するポリペプチドの所望の立体構造とは異なる立体構造を有することが可能であることを認識している。本発明の１態様において、発現されたタンパク質またはポリペプチドは、必要に応じて変性され、かつそれから復元される。これは、当該分野において公知の方法を利用して（例としては、興味のあるタンパク質またはポリペプチドに対するシャペロニンの添加によって、カオトロピック剤（例えば、グアニジンＨＣｌ）にタンパク質を可溶化することによって、またはタンパク質二硫化物異性化酵素を用いてなど、が挙げられるが、これらに限定されない）果たされ得る。
【０３６０】
一般的には、発現したポリペプチドを変性または還元して、その後に、当該ポリペプチドを好ましい立体構造へとリフォールディングさせることが望ましいことがある。例えば、グアニジン、尿素、ＤＴＴ、ＤＴＥ、および／またはシャペロニンは、興味のある転写産物に加えられ得る。タンパク質の還元、変性および復元の方法は、当業者によく知られている（Debinski,ら, (1993) J. Biol. Chem., 268: 14065- 14070）、「Kreitman and Pastan (1993) Bioconiug. Chem.. 4: 581-585」、および「Buchner,ら, (1992) Anal. Biochem., 205: 263-270」を参照のこと）。Debinski,らは、例えば、グアニジン−ＤＴＥにおける封入体タンパク質の変性および還元を記載している。タンパク質は、還元剤（例としては、酸化型グルタチオンおよびＬ−アルギニンを含有する還元剤が挙げられるが、これらに限定されない）においてリフォールディングされ得る。リフォールディング剤は、流されるか、またはそうでなければ、移動されて、１つ以上のポリペプチドもしくは他の発現産物と接触させられ得る。また、その逆もあり得る。
【０３６１】
ＢＰＦＩを原核生物における産生する場合、そのように産生されるＢＰＦＩは、誤って折りたたまれることがある。このため、ＢＰＦＩの生物活性が、欠如または低減されていることがあり得る。タンパク質の生物活性は、「リフォールディング」によって復帰され得る。通常、誤って折りたたまれたＢＰＦＩは、例えば、１つ以上のカオトロピック剤（例えば、尿素および／またはグアニジン）およびジスルフィド結合を還元可能な還元剤（例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、または２メルカプトエタノール（２−ＭＥ））を用いて、ポリペプチド鎖が可溶化（ＢＰＦＩも不溶性である場合に）、アンフォールディング（unfolding）および還元されることによってリフォールディングされ得る。それから、穏やかな濃度のシャペロニンにおいて、ジスルフィド結合の強化を可能にする、酸化剤（例えば、酸素、クリスチン（crystine）またはクリスタミン（crystamine））が添加される。ＢＰＦＩは、当該分野において公知の標準的な方法（例えば、米国特許第４，５１１，５０２号明細書、米国特許第４，５１１，５０３号明細書、および米国特許第４，５１２，９２２号明細書に記載の方法、これらの文献は、引用によって本明細書に組み込まれる）を用いてリフォールディングされ得る。また、ＢＰＦＩは、他のタンパク質と共同して折りたたまれて、ヘテロダイマーまたはヘテロマルチマーを形成し得る。リフォールディングまたは共同折りたたみの後に、ＢＰＦＩは、さらに精製されることが好ましい。
【０３６２】
（通常の精製方法）
様々な単離工程のいずれか１つは、ＢＰＦＩ、または任意の単離工程から得られるＢＰＦＩ混合物を含む細胞ライセート、もしくは任意のＢＰＦＩ混合物に対して実施され得る。上記任意の単離工程の例としては、アフィニティークロマトグラフィーか、イオン交換クロマトグラフィーか、疎水性相互作用クロマトグラフィーか、ゲルろ過クロマトグラフィーか、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）か、逆相クロマトグラフィー（「ＰＲ−ＨＰＬＣ」）か、発泡床吸着（expanded bed adsorption）か、それらの任意の組み合わせおよび／または繰り返し、ならびに任意の適切な順序でのそれらの任意の組み合わせおよび／または繰り返しが挙げられる。
【０３６３】
本明細書に記載されている技術の実施に使用される設備、および他の必要な材料は、市販されている。ポンプ、フラクションコレクター、モニター、記録器、および全体のシステムが、例えば、Applied Biosystems（Foster City, CA）、Bio-Rad Laboratories, Inc.（Hercules, CA）、およびAmersham Biosciences, Inc.（Piscataway, NJ）から市販されている。また、クロマトグラフィーの材料（例としては、交換基質材料、溶剤および緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない）は、そのようは企業から入手可能である。
【０３６４】
本明細書に記載されているカラムクロマトグラフィー手法における平衡および他の工程（例えば、洗浄および溶出）は、特殊な設備（例えば、ポンプ）を用いてより速く実施され得る。市販のポンプの例としては、ヒルロードポンプＰ−５０（HILOAD（登録商標） Pump P-50）、ペリスタルティックポンプＰ−１（Peristaltic Pump P-1）、ポンプＰ−９０１（Pump Ｐ-901）、およびポンプＰ−９０３（Pump P-903）（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３６５】
フラクションコレクターの例としては、レディフラック  フラクションコレクター（REDIFRAC Fraction Collector）、FRAC-100およびFRAC-200フラクションコレクター、ならびにスーパーフラック  フラクションコレクター（SUPERFRAC（登録商標） Fraction Collector）（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）が挙げられるが、これらに限定されない。また、混合物は、ｐＨ勾配および直線的な濃度勾配の形成に利用可能である。市販の混合物としては、グラジエントミキサーＧＭ−１（Gradient Mixer GM-1）およびインラインミキサーズ（In-Line Mixers）（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）が挙げられる。
【０３６６】
クロマトグラフィー過程は、あらゆる市販のモニターを用いて監視され得る。そのようなモニターは、ＵＶ、ｐＨおよび導電率のような情報の収集に使用され得る。検出器の例としては、モニターＵＶ−１（Monitor UV-1）、ユニコードＳ  ＩＩ（UVICORD（登録商標） S II）、モニターＵＶ−Ｍ  ＩＩ（Monitor  UV-M II）、モニターUV-９００（Monitor  UV-900）、モニターUPC-９００（Monitor  UPC-900）、モニターｐＨ／Ｃ−９００（Monitor pH/C-900）、およびコンダクチビティーモニター（Conductivity Monitor）（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）が挙げられる。実際に、全体のシステムは、市販されており、例えばアクタシステムズ（AKTA（登録商標） systems）などは、Amersham Biosciences（Piscataway, NJ）から市販されている。
【０３６７】
本発明の１実施形態において、例えば、ＢＰＦＩは、尿素において精製されたＢＰＦＩの第１の変性によって、還元および変性され、続いて、適切なｐＨにおいて還元剤（例えば、ＤＴＴ）を含む緩衝液に希釈され得る。他の実施形態において、ＢＰＦＩは、約２Ｍから約９Ｍの範囲にある濃度の尿素において変性され、続いて約５．０から約８．０の範囲にあるｐＨのＴＲＩＳ緩衝液に希釈される。それから、この実施形態のリフォールディング混合物は、インキュベートされる。１実施形態において、リフォールディング混合物は、室温において２０−２４時間、インキュベートされる。還元されかつ変性されたＢＰＦＩ混合物は、それからさらに単離または精製され得る。
【０３６８】
本明細書に述べられているように、第１のＢＰＦＩ混合物のｐＨは、次のあらゆる単離工程を実施する前に、調整され得る。また、第１のＢＰＦＩ混合物、またはあらゆるこれらの続きの混合物は、当該分野において公知の技術を用いて濃縮され得る。さらに、第１のＢＰＦＩ混合物、またはあらゆるこれらの続きの混合物を含む溶出緩衝液は、当業者によく知られた技術を用いて、次の単離工程に好適な緩衝液に交換され得る。
【０３６９】
（イオン交換クロマトグラフィー）
イオン交換クロマトグラフィーが、１実施形態において、そして任意の付加的な工程として、第１のＢＰＦＩ混合物について実施されてもよい。一般的に、「ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY: PRINCIPLES AND METHODS」（カタログ番号18-1114-21, Amersham Biosciences（Piscataway, NJ））を参照のこと。市販のイオン交換カラムとしては、ハイトラップ（HITRAP（登録商標））カラム、ハイプレップ（HIPREP（登録商標））カラム、およびハイロード（HILOAD（登録商標））カラム（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）が挙げられる。そのようなカラムは、強い陰イオン交換体（例えば、Ｑセファロースファーストフロウ（Q SEPHAROSE（登録商標） Fast Flow）,Ｑセファロースハイパフォーマンス（ Q SEPHAROSE（登録商標） High Performance）、およびQセファロースＸＬ（ Q SEPHAROSE（登録商標） XL））；強い陽イオン交換体（例えば、ＳＰセファロースハイパフォーマンス（SP SEPHAROSE（登録商標） High Performance）, ＳＰセファロースファーストフロウ（SP SEPHAROSE（登録商標） Fast Flow）、およびＳＰセファロースＸＬ（ SP SEPHAROSE（登録商標） XL））；弱い陰イオン交換体（例えば、デアエセファロースファーストフロウ（DEAE SEPHAROSE（登録商標） Fast Flow））；および弱い陽イオン交換体（例えば、ＣＭセファロースファーストフロウ（CM SEPHAROSE（登録商標） Fast Flow））（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）を利用している。陰イオン交換カラムクロマトグラフィーまたは陽イオン交換カラムクロマトグラフィーは、実質的に精製されたＢＰＦＩを単離するために、精製過程のあらゆる工程において、ＢＰＦＩに対して実施されてもよい。陽イオン交換クロマトグラフィー工程は、任意の適切な陽イオン交換基質を用いて実施さえれ得る。有用な陽イオン交換基質の例としては、繊維状の、多孔質の、非多孔質の、微粒子状の、ビーズ状の、または架橋された陽イオン交換基質材料が挙げられるが、これらに限定されない。そのような陽イオン交換基質材料の例としては、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリアクリレート、ポリビニル、ポリスチレン、シリカ、ポリエーテル、または上述のものの何れかの混合材料が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３７０】
陽イオン交換基質は、強いまたは弱い陽イオン交換体を含む、あらゆる適切な陽イオン交換体であり得る。強い陽イオン交換体は、広いｐＨ範囲に渡ってイオン化を維持し得、かつこのようにして、広いｐＨ範囲に渡ってＢＰＦＩと結合可能であり得る。しかし、弱い陽イオン交換体は、ｐＨに応じてイオン化を失い得る。例えば、弱い陽イオン交換体は、ｐＨが約ｐＨ４またはｐＨ５より下に低下すると、イオン化を失い得る。適切な陽イオン交換体の例としては、帯電した官能基（例えば、スルホプロピル（ＳＰ）、メチルスルホネート（Ｓ）、またはスルホエチル（ＳＥ））が挙げられるが、これに限定されない。陽イオン交換基質は、好ましくは約２．５から約６．０のＢＰＦＩ結合ｐＨ範囲を有する、強い陽イオン交換体であってもよい。代替可能に、強い陽イオン交換体は、約２．５から約５．５のＢＰＦＩ結合ｐＨ範囲を有していてもよい。陽イオン交換基質は、約３．０のＢＰＦＩ結合ｐＨを有していてもよい。代替可能に、好ましくは約６．０から約８．０のＢＰＦＩ結合ｐＨ範囲を有する、強い陽イオン交換体であってもよい。陽イオン交換基質は、好ましくは約８．０から約１２．５のＢＰＦＩ結合ｐＨ範囲を有する強い陽イオン交換体であってもよい。代替可能に、陽イオン交換体は、好ましくは約８．０から約１２．０のＢＰＦＩ結合ｐＨ範囲を有する強い陽イオン交換体であってもよい。
【０３７１】
ＢＰＦＩを装填する前に、陽イオン交換基質は、例えば、カラム容積の数倍の希釈液、弱酸（例えば、カラム容積の４倍のｐＨ３、２０ｍＭの酢酸）を用いて、平衡化され得る。平衡化に続いて、ＢＰＦＩが加えられてもよく、かつカラムは、やはり弱酸（例えば、弱い酢酸溶液またはリン酸溶液）を用いた実質的に精製されたＢＰＦＩの溶出前に、数回ほど洗浄されてもよい。例えば、カラム容積のおよそ２−４倍のｐＨ３、２０ｍＭの酢酸は、カラムの洗浄に使用され得る。また、例えば、カラム容積の２−４倍の、ｐＨ５．５、０．０５Ｍの酢酸ナトリウム、または０．１Ｍの塩化ナトリウムと混合されたｐＨ５．５、０．０５Ｍの酢酸ナトリウムを用いた付加的な洗浄が、使用され得る。代替可能に、当該分野において公知の方法を用いて、陽イオン交換基質は、カラム容積の数倍の希釈液、弱塩基を用いて平衡化され得る。
【０３７２】
代替可能に、実質的に精製されたＢＰＦＩは、基質からＢＰＦＩを移動させるほど十分に低いｐＨまたはイオン強度を有する緩衝液と、陽イオン交換基質とを接触させることによって、溶出され得る。溶出緩衝液のｐＨは、約ｐＨ２．５から約ｐＨ６．０までの範囲であり得る。より詳細には、溶出緩衝液のｐＨは、約ｐＨ２．５から約ｐＨ５．５、約ｐＨ２．５から約ｐＨ５．０までの範囲であり得る。溶出緩衝液は、約３．０のｐＨを有し得る。また、溶出緩衝液の量は、広範に変化してもよく、かつ通常、カラム容積の約２倍から約１０倍の範囲にある。
【０３７３】
陽イオン交換基質に対するＢＰＦＩの吸着に続いて、実質的に精製されたＢＰＦＩは、当該基質からＢＰＦＩを移動させるほど十分に高いｐＨまたはイオン強度を有する緩衝液と、基質とを接触させることによって溶出され得る。実質的に精製されたＢＰＦＩの高ｐＨ溶出における使用に適した緩衝液の例としては、少なくとも約５ｍＭから少なくとも約１００ｍＭの濃度範囲にある、クエン酸塩、リン酸塩、蟻酸塩、酢酸塩、ＨＥＰＥＳおよびＭＥＳ緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３７４】
（逆相クロマトグラフィー）
ＲＰ−ＨＰＬＣは、当業者に公知の適切なプロトコールに従って、タンパク質を精製するために、実施され得る。例えば、「Pearsonら, ANAL BIOCHEM. (1982) 124:217-230 (1982)」、「Rivierら, J. CHROM. (1983) 268:112-119」、「Kunitaniら, J. CHROM. (1986) 359:391-402」を参照のこと。ＲＰ−ＨＰＬＣをＢＰＦＩに対して実施して、実質的に精製されたＢＰＦＩを単離してもよい。この点に関して、多種多様な長さ（例としては、少なくともＣ３から少なくともＣ３０まで、少なくともＣ３から少なくともＣ２０まで、または少なくともＣ３から少なくともＣ１８までの長さが挙げられるが、これらに限定されない）を有するアルキル官能基を用いた、シリカ誘導体化樹脂が使用され得る。代替可能に、ポリマー化樹脂が使用され得る。例えば、スチレンポリマー樹脂である、TosoHaas Amberchrome CG1000sd樹脂が使用され得る。また、多種多様なアルキル鎖を有するシアノ樹脂またはポリマー樹脂が、使用され得る。さらに、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムは、溶媒（例えば、エタノール）を用いて洗浄され得る。ソースＲＰカラム（Source RP colum）は、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムの他の例である。
【０３７５】
イオン対化剤および有機緩和剤（例えば、メタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、またはエタノール）を含む適切な溶出緩衝液が、ＢＰＦＩをＰＲ−ＨＰＬＣカラムから溶出するために、使用され得る。最も一般的に使用されるイオン対化剤の例としては、酢酸、蟻酸、過塩素酸、リン酸、トリフルオロ酢酸、ヘプタフルオロブチル酸、トリエチルアミン、テトラメチルアンモニウム、テトラブチルアンモニウム、酢酸トリエチルアンモニウムが挙げられるが、これらに限定されない。溶出は、分離時間の短縮、およびピーク幅の縮小に好ましい勾配条件を有する、１つ以上の勾配条件または定組成条件を用いて実施され得る。他の方法は、異なる溶媒濃度範囲を有する２の勾配の使用に関する。本明細書における使用に適した溶出緩衝液の例としては、酢酸アンモニウム溶液およびアセトニトリル溶液が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３７６】
（疎水性相互作用クロマトグラフィー精製技術）
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、ＢＰＦＩに対して実施されてもよい。一般的に、「HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY HANDBOOK: PRINCIPLES AND METHODS （カタログ番号18-1020-90, Amersham Biosciences （Piscataway, NJ））」を参照すればよく、これは引用によって本明細書に組み込まれる。適切なＨＩＣ基質の例としては、アルキル置換基質もしくはアリール置換基質（例えば、ブチル置換基質、ヘキシル置換基質、オクチル置換基質、またはフェニル置換基質（例として、アガロース基質、架橋アガロース基質、セファロース基質、セルロース基質、シリカ基質、デキストラン基質、ポリスチレン基質、ポリ（メタクリレート）基質が挙げられる））、および混合形式基質（例としては、ポリエチレンアミン樹脂基質、またはブチル置換ポリ（メタクリレート）基質もしくはフェニル置換ポリ（メタクリレート）基質が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。疎水性相互作用クロマトグラフィー関する市販の原料の例としては、ハイとラップ（HITRAP（登録商標））、ハイプレップ（HIPREP（登録商標））およびハイロード（HILOAD（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３７７】
簡単に説明すると、装填の前に、ＨＩＣカラムは、当業者に公知の標準的な緩衝液（例えば、酢酸溶液／塩化ナトリウム溶液、または硫酸アンモニウムを含むＨＥＰＥＳ）を用いて、平衡化され得る。それから、ＢＰＦＩの装填の後に、カラムは、不要な物質を取り除くための標準的な緩衝液と条件とを用いて、洗浄され得るが、ＢＰＦＩはカラムに保持されている。ＢＰＦＩは、カラム容積の約３倍から約１０倍の標準的な緩衝液（例えば、とりわけ、ＥＤＴＡと平衡化緩衝液より低濃度の硫酸アンモニウムとを含むＨＥＰＥＳ緩衝液、または酢酸／塩化ナトリウム緩衝液）を用いて溶出され得る。また、例えば、リン酸カルシウムを用いた減少直線塩勾配は、ＢＰＦＩ分子の溶出に使用され得る。それから、この溶出物は、例えば、ダイアフィルトレーション、または限外ろ過といったろ過によって濃縮されてもよい。フィルトレーションは、ＢＰＦＩの溶出に使用される塩を除くために利用され得る。
【０３７８】
（他の精製技術）
ゲルろ過（引用によって本明細書に組み込まれる「GEL FILTRATION: PRINCIPLES AND METHODS」（カタログ番号18-1022-18, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ））、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（好適な基質の例としては、ＨＡウルトロゲル  ハイリソリューション（HA-Ultrogel、High Resolution（Calbiochem））、ＣＨＴセラミックヒドロキシアパタイト（CHT Ceramic Hydroxyapatite（BioRad））、バイオーゲルＨＴＰヒドロキシアパタイト（Bio-Gel HTP Hydroxyapatite（BioRad））が挙げられるが、これらに限定されない）、ＨＰＬＣ、発泡床吸着、限外ろ過、ダイアフィルトレーション、および凍結乾燥などを用いたさらに他の単離工程は、あらゆる過剰の塩を除去、および次の単離工程もしくは最終的な製剤の調合でさえ好適な緩衝液に交換するために、第１のＢＰＦＩ混合物、またはあらゆる続くこれらの混合物に対して実施され得る。
【０３７９】
実質的に精製されたＢＰＦＩを含むＢＰＦＩの収率は、当業者に公知の技術を用いて、本明細書に記載されている各工程において、監視されてもよい。また、そのような技術は、最後の単離工程の後に、実質的に精製されたＢＰＦＩの収率を評価するために使用され得る。例えば、ＢＰＦＩの収率は、様々なアルキル鎖長（例えば、シアノＰＲ−ＨＰＬＣ、Ｃ１８ＲＰ−ＨＰＬＣ）を有する様々な逆相高圧液体クロマトグラフィーだけでなく、陽イオン交換クロマトグラフィーおよびゲルろ過のいずれかを用いて、監視されてもよい。
【０３８０】
本発明の特定の実施形態において、各精製工程の後におけるＢＰＦＩの収率は、各精製工程にとっての開始物質におけるＢＰＦＩの、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．９％、または少なくとも約９９．９９％であり得る。
【０３８１】
精製は、標準的な技術（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いてか、ウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡアッセイを用いたＢＰＦＩ測定によって、判定され得る。例えば、ポリクローナル抗体は、陰性対照酵母発酵および陽イオン交換回収から単離されたタンパク質に対して生成され得る。また、抗体は、宿主細胞タンパク質の汚染の存在に対するプローブに使用され得る。
【０３８２】
ＰＲ−ＨＰＣＬ材料であるVydac C4（Vydac）は、シリカゲル粒子、Ｃ４−アルキル鎖を支持する表面からなる。タンパク質性不純物からのＢＰＦＩの分離は、疎水性相互作用の強度における差に基づいている。溶出は、希釈されたトリフルオロ酢酸におけるアセトニトリル勾配を用いて実施される。調製用ＨＰＬＣは、ステンレス鋼カラム（２．８から３．２リットルのVydac C4シリカゲルを用いて充填されている）を用いて実施される。ヒドロキシアパタイトウルトロゲル（Hydroxyapatite Ultrogel）溶出は、トリフルオロ酢酸を加えることによって酸性化され、かつVydac C４カラム上に装填される。洗浄および溶出について、希釈されたトリフルオロ酢酸におけるアセトニトリル勾配が使用される。画分は、回収され、かつただちにリン酸緩衝液を用いて中性化される。ＩＰＣ限界内にあるＢＰＦＩ画分は、プールされる。
【０３８３】
デアエセファロース（DEAE Sepharose（Pharmacia））材料は、セファロースビーズの表面と共有的に結合されるジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基からなる。ＤＥＡＥ基に対するＢＰＦＩの結合は、イオン性相互作用によって媒介される。アセトニトリルおよびトリフルオロ酢酸は、保持されることなくカラムを通過する。これらの物質が洗い流された後に、微量の不純物は、低ｐＨの酢酸緩衝液を用いてカラムを洗浄することによって除去される。それから、カラムは、中性のリン酸緩衝液を用いて洗浄され、かつＢＰＦＩは、向上されたイオン強度を有する緩衝液を用いて溶出される。カラムには、デアエセファロースファーストフロウ（DEAE Sepharose fast flow）が充填している。カラム容積は、３−１０ｍｇのＢＰＦＩ／１ｍｌのゲルの範囲におけるＢＰＦＩの装填を保障するために調節される。カラムは、水および平衡化緩衝液（リン酸ナトリウム／カリウム）を用いて洗浄される。ＨＰＬＣ溶出のプールされた画分は、装填され、かつカラムは、平衡化緩衝液を用いて洗浄される。それから、カラムは、洗浄緩衝液（酢酸ナトリウム緩衝液）により洗浄された後に、平衡化緩衝液により洗浄される。続いて、ＢＰＦＩは、溶出緩衝液（塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム／カリウム）用いてカラムから溶出され、主要な溶出プロファイルに従って、単一の画分に回収される。デアエセファロース（DEAE Sepharose）カラムの溶出物は、特定の伝導性に調節される。結果として生じる製剤原料は、テフロン（登録商標）（Teflon）ボトルの中に無菌的にろ過され、かつ７０℃において保存される。
【０３８４】
付加的な方法（例としては、エンドトキシンを除去する工程が挙げられるが、これに限定されない）が、採用され得る。エンドトキシンは、例えば、Escherichia coliといったグラム陰性の宿主細胞の外膜に見られるリポ多糖（ＬＰＳｓ）である。エンドトキシンレベルを低減する方法は、当業者に公知であり、かつ当該方法の例としては、シリカ支持体、ガラス粉末、またはヒドロキシアパタイトを用いた精製技術、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ならびにこれらの方法の組み合わせなどが挙げられるが、これらに限定されない。修飾および付加的な方法は、汚染物（例えば、興味のあるポリペプチドからの共遊走タンパク質）を除去するために要求されてもよい。
【０３８５】
多種多様な方法および手法は、１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるＢＰＦＩの収率および精製を評価するために使用されてもよく、当該方法および手法の例としては、ブラッドフォードアッセイ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、質量分析（例としては、ＭＬＤＩ−ＴＯＦが挙げられるが、これに限定されない）、および当業者に公知のタンパク質性質決定に関する他の方法が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３８６】
（本発明の異種融合タンパク質の特徴付け）
本発明の融合タンパク質を特徴づける多くの方法が存在している。これらの方法の例をいくつか挙げると、抗ＩｇＧ抗体もしくは抗ＨＳＡ抗体を用いた免疫ブロッティング、またはタンパク質染色法と一緒になったＳＤＳ−ＰＡＧＥであるが、これらに限定されない。他の方法としては、例えば、マトリックス支援レーザ脱離／イオン化−質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）、液体クロマトグラフィー／質量分析、等電点電気泳動、分析陰イオン交換、等電点電気泳動、および円偏光二色性が挙げられる。
【０３８７】
＜ＶＩＩＩ．代替系における発現＞
非組み換え宿主細胞、突然変異誘発された宿主細胞、または無細胞系においてタンパク質に非天然アミノ酸を導入するために、様々な戦略が採用される。また、これらの系は、本発明のＢＰＦＩの作製に、好適に使用される。Ｌｙｓ、ＣｙｓおよびＴｙｒなどの活性のある側鎖を有するアミノ酸の誘導体は、リジンのＮ２‐アセチル‐リジンへの転換の結果として生じた。また、化学合成は、非天然アミノ酸を組み込むために複雑ではない方法を提供する。近年に発展した、ペプチド断片の酵素的な連鎖結合、および本来の化学的な連鎖結合を用いて、より長いタンパク質を作製することが可能である。例えば、「P. E. Dawson and S. B. H. Kent, Annu. Rev. Biochem, 69:923 (2000) 」を参照のこと。一般的なインビトロの生合成方法では、所望の非天然アミノ酸により化学的にアシル化されるサプレッサーｔＲＮＡが、タンパク質の生合成を補助することができる抽出物に添加されるが、この生合成方法を使用して、１００を越える非天然アミノ酸を、ほとんどあらゆる大きさの様々なタンパク質に組み込まれてきた。例えば、「V. W. Cornish, D. Mendel and P. G. Schultz, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1995, 34:621 (1995)」、「C. J. Noren, S. J. Anthony-Cahill, M.C. Griffith, P.G. Schultz, A general method for site- specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science 244:182-188 (1989) 」、および「J. .D. Bain, C. G. Glabe, T.A. Dix, A.R. Chamberlin, E.S. Diala, Biosynthetic site-specific incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide, J. Am. Chem. Soc. 111:8013- 8014 (1989)」を参照のこと。広範囲の官能基が、タンパク質の安定性、タンパク質の折りたたみ、酵素機序、およびシグナル伝達の研究用のタンパク質に導入される。選択圧力組み込み（selective pressure incorporation）と呼ばれるインビボにおける方法は、野生型シンテターゼの無差別さを利用するために開発された。例えば、「N. Budisa, C. Minks, S. Alefelder, W. Wenger, F. M. Dong, L. Moroder and R. Huber, FASEB J.. 13:41 (1999)」を参照のこと。細胞に特定の天然アミノ酸を供給する適切な代謝経路が断たれている栄養要求性株は、制限された濃度の天然アミノ酸を含む最少培地において培養されると同時に、標的遺伝子の発現が抑制されている。安定した増殖期の開始において、天然アミノ酸が使い果たされて、非天然アミノ酸と置き換えられる。組み換えタンパク質の発現誘導は、結果として、非天然の類似体を含むタンパク質の蓄積を生じる。例えば、この戦略を用いて、ｏ、ｍおよびｐ−フルオロフェニルアラニンが、タンパク質に組み込まれ、容易に同定され得るＵＶスペクトルにおける２の特徴的な肩を示し（例えば、「C. Minks,R . Huber, L. Moroder and N. Budisa, Anal. Biochem., 284:29 (2000)」を参照のこと）、トリフルオロメチオニンが、１９Ｆ  ＮＭＲによってチトオリゴサッカリドとの相互作用を研究するためのバクテリオファージ  Ｔ４  リゾチームにおいて、メチオニンとの置き換えに使用され（例えば、「H. Duewel, E. Daub, V. Robinson and J. F. Honek, Biochemistry, 36:3404 (1997) 」を参照のこと）、トリフルオロロイシンがロイシンの代わりに組み込まれた結果として、ロイシンジッパータンパク質の向上した熱安定性および化学安定性を生じる（例えば、「Y. Tang, G. Ghirlanda, W. A. Petka, T. Nakajima, W. F. DeGrado and D. A. Tirrell, Angew. Chem. Int. Ed. Engl, 40:1494 (2001) 」を参照のこと）。さらに、セレノメチオニンお���びテルルメチオニンは、様々な組み換えタンパク質に組み込まれて、Ｘ線結晶学における相の溶解を容易にする。例えば、「W. A. Hendrickson, J. R. Horton and D. M. Lemaster, EMBO J., 9:1665 (1990) 、「J. O. Boles, K. Lewinski, M. Kunkle, J. D. Odom, B. Dunlap, L. Lebioda and M. Hatada, Nat. Struct. Biol, 1:283 (1994)」、「N. Budisa, B. Steipe, P. Demange, C. Eckerskorn, J. Kellermann and R. Huber, Eur. J. Biochem., 230:788 (1995)」、および「N. Budisa, W. Karnbrock, S. Steinbacher, A. Humm, L. Prade, T. Neuefeind, L. Moroder and R. Huber, J. Mol Biol, 270:616 (1997) 」を参照のこと。また、アルケンまたはアルキン官能基を有するメチオニン類似体は、効率的に組み込まれる。これによれば、化学的方法によりタンパク質をさらに修飾することができる。例えば、「J. C. van Hest and D. A. Tirrell, FEBS Lett., 428:68 (1998)」、「J. C. van Hest, K. L. Kiick and D. A. Tirrell, J. Am. Chem. Soc, 122:1282 (2000)」、および、「K. L. Kiick and D. A. Tirrell, Tetrahedron, 56:9487 (2000) 」、米国特許第６，５８６，２０７号明細書および米国特許出願公開第２００２／００４２０９７号明細書を参照のこと（なお、これらは引用によって本明細書に組み込まれる）。
【０３８８】
この方法の成功は、通常、タンパク質翻訳の忠実度を保障するために高い選択性を要求するアミノアシル‐ｔＲＮＡによる、非天然アミノ酸類似体の認識に依存する。この方法の範囲を拡張する１つの方法は、アミノアシル‐ｔＲＮＡシンテターゼの基質特異性を緩和することであるが、このことが達成された事例の数は限られていた。例えば、Escherichia coliのフェニルアラニル‐ｔＲＮＡシンテターゼ（ＰｈｅＲＳ）におけるＧｌｙによるＡｌａ２９４の置き換えは、基質結合ポケットの大きさを向上させ、かつｐ‐Ｃｌ‐フェニルアラニン（ｐ‐Ｃｌ‐Ｐｈｅ）により、ｔＲＮＡＰｈｅがアシル化される結果になった。「M. Ibba, P. Kast and H. Hennecke, Biochemistry, 33:7107 (1994) 」を参照のこと。この突然変異体ＰｈｅＲＳを含んでいるEscherichia coli株は、フェニルアラニンの代わりにｐ‐Ｃｌ‐フェニルアラニンまたはｐ‐Ｂｒ‐フェニルアラニンの組み込みを許容する。例えば、「M. Ibba and H. Hennecke, FEBS Lett., 364:272 (1995)」、および「N. Sharma, R. Furter, P. Kast and D. A. Tirrell, FEBS Lett., 467:37 (2000)」を参照のこと。同様に、Escherichia coliチロシル‐ｔＲＮＡシンテターゼのアミノ酸結合部位の近くにあるＰｈｅ１３０Ｓｅｒの点変異体は、アザチロシンがチロシンよりも高効率に組み込まれることを可能にする。例えば、「F. Hamano-Takaku, T. Iwama, S. Saito-Yano, K. Takaku, Y. Monden, M. Kitabatake, D. Soll and S. Nishimura, J. Biol. Chem., 275:40324 (2000) 」を参照のこと。
【０３８９】
インビボにおいてタンパク質に非天然アミノ酸を組み込む他の戦略は、校正機構を有するシンテターゼを改変することである。これらのシンテターゼは、識別が不可能なので、同種の天然アミノ酸と構造的に類似しているアミノ酸を活性化する。この誤りは、タンパク質翻訳の忠実度を維持するために、ｔＲＮＡから間違って入ったアミノ酸を脱アシル化する、別の部位において補正される。シンテターゼの校正活性が無効であれば、、間違って活性化される構造的な類似体は、校正機能を逃れて組み込まれ得る。この方法は、バリル‐ｔＲＮＡシンテターゼ（ＶａｌＲＳ）を用いて最近、証明されている。例えば、「V. Doring, H. D. Mootz, L. A. Nangle, T. L. Hendrickson, V. de Crecy-Lagard, P. Schimmel and P. Marliere, Science, 292:501 (2001) 」を参照のこと。ＶａｌＲＳは、Ｃｙｓ、Ｔｈｒまたはアミノブチレート（Ａｂｕ）を用いてｔＲＮＡＶａｌを間違ってアミノアシル化し、これらの非同種のアミノ酸は、続いて校正領域によって加水分解される。Escherichia coli染色体のランダム変異誘発の後に、ＶａｌＲＳの校正部位に突然変異を有するEscherichia coli突然変異株が、選択される。この校正に欠損のあるＶａｌＲＳは、ｔＲＮＡＶａｌにＣｙｓを間違って入れる。Ａｂｕが構造的にＣｙｓ（Ａｂｕでは、Ｃｙｓの‐ＳＨ基が‐ＣＨ３と置換されている）と似ているので、ＶａｌＲＳ突然変異体はまた、この突然変異体がＡｂｕ存在下において増殖されるとき、タンパク質にＡｂｕを組み込む。質量分析により、約２４％のバリンが本来のタンパク質におけるバリンの位置おいて、Ａｂｕによって置換されていることが示された。
【０３９０】
また、固相法および固相半合成法は、新規のアミノ酸を含む多くのタンパク質の合成を可能にする。例えば、以下の刊行物：「Crick, F.H.C., Barrett, L. Brenner, S. Watts-Tobin, R. General nature of the genetic code for proteins. Nature, 192:1227-1232 (1961)」、「Hofmann, K., Bohn, H. Studies on polypeptides. XXXVI. The effect of pyrazole-imidazole replacements on the S-protein activating potency of an S- peptide fragment, J. Am Chem, 88(24): 5914-5919 (1966) 」、「Kaiser, E.T. Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins including enyzmes, Acc Chem Res, 22:47-54 (1989) 」、「Nakatsuka, T., Sasaki, T., Kaiser, E.T. Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin, J Am Chem Soc, 109:3808-3810 (1987) 」、「Schnolzer, M., Kent, S B H. Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides: backbone- engineered HIV protease, Science, 256(5054):221-225 (1992)、「Chaiken, I.M. Semisynthetic peptides and proteins, CRC Crit Rev Biochem, 11(3):255-301 (1981)、「Offord, R.E. Protein engineering by chemical means? Protein Eng., 1(3): 151-157 (1987) 」、および「Jackson, D.Y., Burnier, J., Quan, C., Stanley, M., Tom, J., Wells, J. A. A Designed Peptide Ligase for Total Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues, Science, 266(5183):243 (1994)」、および上記刊行物で引用されている参考文献を参照のこと。
【０３９１】
化学的な修飾は、共同因子、スピンラベル、およびオリゴヌクレオチドを含む様々な非天然の側鎖を、インビトロにおいてタンパク質に導入するために使用される。例えば、「Corey, D.R., Schultz, P.G. Generation of a hybrid sequence-specific single-stranded deoxyribonuclease, Science, 238(4832): 1401-1403 (1987)」、「Kaiser, E.T., Lawrence D.S., Rokita, S.E. The chemical modification of enzymatic specificity, Annu Rev Biochem, 54:565- 595 (1985)」、「Kaiser, E.T., Lawrence, D.S. Chemical mutation of enyzme active sites, Science, 226(4674):505-511 (1984)」、「Neet, K.E., Nanci A, Koshland, D.E. Properties of thiol- subtilisin, J Biol. Chem, 243 (24): 6392-6401 (1968) 」、「Polgar, L. et M. L. Bender. A new enzyme containing a synthetically formed active site. Thiol-subtilisin. J. Am Chem Soc, 88:3153-3154 (1966) 」、および「Pollack, S. J., Nakayama, G. Schultz, P.G. Introduction of nucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites, Science, 242(4881):1038-1040 (1988)」を参照のこと。
【０３９２】
また、化学修飾されたアミノアシル‐ｔＲＮＡを用いる生物合成方法は、インビトロで合成されたタンパク質に、いくつかの生物物理的プローブを組み込むことに使用されてきた。以下の刊行物：「Brunner, J. New Photolabeling and crosslinking methods, Annu. Rev Biochem, 62:483-514 (1993)」、および「Krieg, U.C., Walter, P., Hohnson, A.E. Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin of the 54- kilodalton polypeptide of the signal recognition particle, Proc. Natl. Acad. Sci, 83(22):8604- 8608 (1986)」、および該刊行物において引用されている参考文献を参照のこと。
【０３９３】
以前から、化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡを、所望のアンバーナンセンス突然変異を含む遺伝子を用いてプログラムされたタンパク質合成反応に加えることによって、非天然アミノ酸が、インビトロにおいてタンパク質に、部位特異的に組み込まれ得ることが示されている。これらのアプローチを用いて、２０の一般アミノ酸の多くを、構造的に近縁な相同物に置換することができる（例えば、特定のアミノ酸について栄養要求性の株を用いて、フェニルアラニンをフルオロフェニルアラニンに置換することができる）。例えば、「Noren, C. J., Anthony-Cahill, Griffith, M.C., Schultz, P.G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science, 244: 182-188 (1989)」、「M.W. Nowakら, Science 268:439-42 (1995)」、「Bain, J.D., Glabe, C.G., Dix, T.A., Chamberlin, A.R., Diala, E. S. Biosynthetic site-specific Incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide, J. Am Chem Soc, 111:8013-8014 (1989) 」、「N. Budisaら, FASEB J. 13:41-51 (1999); Ellman, J.A., Mendel, D., Anthony-Cahill, S., Noren, C. J., Schultz, P.G. Biosynthetic method for introducing unnatural amino acids site-specifically into proteins. Methods in Enz., vol. 202, 301-336 (1992)」、および、「Mendel, D., Cornish, V.W. & Schultz, P.G. Site- Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code, Annu Rev Biophys. Biomol Struct. 24, 435-62 (1995)」を参照のこと。
【０３９４】
例えば、終止コドン（ＵＡＧ）を認識するサプレッサーｔＲＮＡが調製されて、該サプレッサーｔＲＮＡが、非天然アミノ酸によって化学的にアミノアシル化された。従来の部位特異的突然変異誘発法は、終止コドン（ＴＡＧ）を、タンパク質の遺伝子における興味部位に導入するために使用される。例えば、「Sayers, J.R., Schmidt, W. Eckstein, F. 5’ -3’ Exonucleases in phosphorothioate-based olignoucleotide-directed mutagensis, Nucleic Acids Res, 16(3):791- 802 (1988)」を参照のこと。アシル化されたサプレッサーｔＲＮＡと突然変異遺伝子とが、インビトロの転写／翻訳系に組み合わせられたとき、非天然アミノ酸は、特定位置にそのアミノ酸を含むタンパク質を生じさせるＵＡＧコドンに応じて組み込まれた。［３Ｈ］‐Ｐｈｅを用いた実験、およびα‐ヒドロキシ酸を用いた実験により、所望のアミノ酸だけが、ＵＡＧコドンにより特定された位置に組み込まれ、かつこのアミノ酸が、当該タンパク質の他のいかなる部位にも組み込まれないことが実証された。例えば、「上記Norenらの文献」、「Kobayashiら, (2003) Nature Structural Biology 10(6):425-432」、および「Ellman, J.A., Mendel, D., Schultz, P.G. Site-specific incorporation of novel backbone structures into proteins, Science, 255(5041):197-200 (1992)」を参照のこと。
【０３９５】
また、マイクロインジェクション技術は、タンパク質への非天然アミノ酸の組み込みに使用される。例えば、「M. W. Nowak, P. C. Kearney, J. R. Sampson, M. E. Saks, C. G. Labarca, S. K. Silverman, W. G. Zhong, J. Thorson, J. N. Abelson, N. Davidson, P. G. Schultz, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Science. 268:439 (1995)」、および「D. A. Dougherty, Curr. Opin. Chem. Biol.. 4:645 (2000)」を参照のこと。ゼノプスの卵母細胞は、インビトロにおいて作製された２のＲＮＡ種（興味のあるアミノ酸位置におけるＵＡＧ終止コドンを有する標的タンパク質をコードするｍＲＮＡ、および所望の非天然アミノ酸を有するアミノアシル化されたアンバーサプレッサーｔＲＮＡ）を用いて共注入された。その結果、卵母細胞の転写機構は、ＵＡＧによって特定される位置に非天然アミノ酸を挿入する。この方法は、インビトロ発現系において通常には受け容れられない、膜タンパク質全体のインビボにおける構造的−機能的研究を可能にする。例としては、蛍光共鳴エネルギー移動によって距離を測定するための、タキキニン  ニューロキニン−２受容体に対する蛍光アミノ酸の組み込み（例えば、「G. Turcatti, K. Nemeth, M. D. Edgerton, U. Meseth, F. Talabot, M. Peitsch, J. Knowles, H. Vogel and A. Chollet, L Biol. Chem,, 271: 19991 (1996)」を参照のこと）；イオンチャネルにおける表面露出残基を同定するための、ビオチン化アミノ酸の組み込み（例えば、「J. P. Gallivan, H. A. Lester and D. A. Dougherty, Chem. Biol., 4:739 (1997) 」を参照のこと）；実時間におけるイオンチャネルの立体構造変化を監視するための、ケージ化チロシン類似体の使用（例えば、「J. C. Miller, S. K. Silverman, P. M. England, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Neuron, 20:619 (1998) 」を参照のこと）；およびゲート開閉機序の精査のために、イオンチャネル骨格を変化させるための、アルファヒドロキシアミノ酸の使用が挙げられる。例えば、「P. M. England, Y. Zhang, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Cell, 96:89 (1999) 」、および「T. Lu, A. Y. Ting, J. Mainland, L. Y. Jan, P. G. Schultz and J. Yang, Nat. Neurosci., 4:239 (2001)」を参照のこと。
【０３９６】
インビボにおけるタンパク質に対する非天然アミノ酸の直接的な組み込み能は、高収量の変異体タンパク質、技術的な簡便性、細胞もしくはおそらく生きた組織における変異体タンパク質の研究に対する可能性、または治療的処置におけるこれらの変異体タンパク質の使用という利点を提供する。様々な大きさ、酸性度、求核性、疎水性、および他の性質を有する非天然アミノ酸をタンパク質に含める能力は、タンパク質の機能を精査し、かつ新規な性質を有する新しいタンパク質または組織を作り出すために、タンパク質の構造を合理的かつ体系的に操作する能力を、非常に拡大することができる。しかし、タンパク質の翻訳において高度な忠実性を達成するために要求されるｔＲＮＡ−シンテターゼ相互作用が、複雑な性質であるために、その過程は困難である。
【０３９７】
パラ−Ｆ−Ｐｈｅを部位特異的に組み込む１つの試みにおいて、酵母のアンバーサプレッサーｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡ／フェニルアラニル−ｔＲＮＡシンテターゼ対は、ｐ−Ｆ−Ｐｈｅ耐性の、Ｐｈｅ栄養要求株Escherichia coli株に使用された。例えば、「R. Furter, Protein Sci., 7:419 (1998) 」を参照のこと。
【０３９８】
また、無細胞（インビトロ）翻訳系を用いて、本発明のＢＰＦＩの発現を得ることが可能である。鋳型としてｍＲＮＡ（インビトロ翻訳）、または鋳型としてＤＮＡ（インビトロ転写とインビトロ翻訳との組み合わせ）のいずれかを含むことができるこれらの系において、インビトロ合成はリボソームによって管理される。相当な労力が無細胞タンパク質発現系の開発に注がれている。例えば、引用によって本明細書に組み込まれる、「Kim, D.M. and J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 74 :309-316 (2001)」、「Kim, D.M. and J.R. Swartz, Biotechnology Letters, 22, 1537-1542, (2000)」、「Kim, D.M., and J.R. Swartz, Biotechnology Progress, 16, 385-390, (2000)」、「Kim, D.M., and J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 66, 180-188, (1999)」、および「Patnaik, R. and J.R. Swartz, Biotechniques 24, 862- 868, (1998)」、米国特許第６，３３７，１９１号明細書、米国特許出願公開第２００２／００８１６６０号明細書、国際公開第００／５５３５３号パンフレット、国際公開第９０／０５７８５号明細書を参照のこと。非天然アミノ酸を含んでいるＢＰＦＩの発現に適用され得る他の方法としては、ｍＲＮＡ−ペプチド融合技術が挙げられる。例えば、「R. Roberts and J. Szostak, Proc. Natl Acad. Sci (USA) 94:12297-12302 (1997) 」、「A. Frankel,ら, Chemistry & Biology 10:1043-1050 (2003)」を参照のこと。この方法において、ピューロマイシンに連結されたｍＲＮＡの鋳型は、リボソーム上においてペプチドに翻訳される。１つ以上のｔＲＮＡ分子が修飾されているとき、非天然アミノ酸は、上手く当該ペプチドに組み込まれ得る。最後のｍＲＮＡコドンが読まれた後に、ピューロマイシンは、当該ペプチドのＣ末端を捕捉する。結果として生じるｍＲＮＡ−ペプチド接合体が、インビトロアッセイにおいて興味のある性質を有することが見られるとき、その個性は、ｍＲＮＡ配列から容易に明らかにされ得る。このようにして、所望の性質を有するポリペプチドを同定するために、１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるＢＰＦＩのライブラリーを選別し得る。つい最近、精製成分を用いたインビトロリボソーム翻訳が、非天然にコードされたアミノ酸を用いて置換されたペプチドの合成を可能にすることを報告されている。例えば、「A. Forsterら, Proc. Natl Acad. Sci. (USA) 100:6353 (2003) 」を参照のこと。
【０３９９】
＜ＩＸ．ＢＰＦＩに結合された巨大分子ポリマー＞
本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドの様々な修飾は、本明細書に記載の組成物、方法、技術および戦略を用いてもたらされ得る。これら修飾は、当該ポリペプチドの非天然アミノ酸成分に対するさらなる機能性基の組み込みを包含する。当該さらなる機能性基の例としては、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；放射性核種；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；共同因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；水溶性デンディマー（dendimer）；シクロデキストリン；阻害性リボ核酸；生体材料；ナノ粒子；スピンラベル；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規な官能基；他の分子と共有的もしくは非共有的に相互作用する基；光ケージド部分（a photocaged moiety）；光異性体化可能部分；ビオチン；ビオチンの誘導体；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素結合した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識した部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能な標識；低分子；あるいは上記または他の任意の所望の化合物もしくは物質の任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載されている組成物、方法、技術および戦略の、例証的かつ非限定的な例として、以下の記載は、非天然アミノ酸ポリペプチドに対する巨大分子の付加を中心にしている。しかし、以下に記載の組成物、方法、技術および戦略は、上記に紹介されているものなどを含む他の機能性基の付与にも（必要に応じて、当業者が本発明に開示内容を用いることができる適切な修飾を用いて）適用可能であるということを理解されたい。
【０４００】
多種多様な巨大分子ポリマーおよび他の分子を、本発明のＢＰＦＩに連結して、ＢＰＦＩの性質を調節するか、および／またはＢＰＦＩ分子に新たな生物学的性質を供給することができる。これらの巨大分子は、天然にコードされたアミノ酸、非天然にコードされたアミノ酸、または天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸のあらゆる機能的置換体、または天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸に付与されたあらゆる置換体もしくは官能基を介して、ＢＰＦＩに連結され得る。ポリマーの分子量は、広範囲（例としては、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａまたはそれ以上の間が挙げられるが、これらに限定されない）であり得る。ポリマーの分子量は、広範囲（例としては、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａまたはそれ以上の間が挙げられるが、これらに限定されない）であり得る。ポリマーの分子量は、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａの間（例としては、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ、および１００Ｄａが挙げられるが、これらに限定されない）であり得る。いくつかの実施形態において、ポリマーの分子量は、約１００Ｄａから５０，０００Ｄａの間であり得る。いくつかの実施形態において、ポリマーの分子量は、約１００Ｄａから４０，０００Ｄａの間であり得る。いくつかの実施形態において、ポリマーの分子量は、約１，０００Ｄａから４０，０００Ｄａの間であり得る。いくつかの実施形態において、ポリマーの分子量は、約５，０００Ｄａから４０，０００Ｄａの間であり得る。いくつかの実施形態において、ポリマーの分子量は、約１０，０００Ｄａから４０，０００Ｄａの間であり得る。
【０４０１】
本発明は、ポリマー：タンパク質接合体の実質的に同種の調製物を提供する。本明細書において使用されるように、「実質的に同種の」は、ポリマー：タンパク質接合体分子がタンパク質全体の半分よりも多くあると観察されることを意味する。ポリマー：タンパク質接合体は生物活性を有する。また、本明細書に提供されている本「実質的に同種の」ＰＥＧが付加されたＢＰＦＩ調製物は、同種の調製物の利点（例えば、臨床適用の際に、ロット間の薬物動態を容易に予測できること）を示すのに十分に同種である調製物である。
【０４０２】
また、ポリマー：タンパク質接合体分子の混合物を調製することを選択してもよく、かつ本明細書に与えられている利点は、モノ−ポリマー：タンパク質接合体の比率を選択して当該混合物に含めてもよいということである。従って、必要に応じて、様々な数のポリマー部分（すなわち、ジ−、トリ−、テトラ−など）が付着している様々なタンパク質の混合物を調製してもよいし、本発明の方法を用いて調製されたモノ−ポリマー：タンパク質接合体と上述の接合体とを組み合わせてもよいし、所定の比率のモノ−ポリマー：タンパク質接合体を有する混合物の状態にしてもよい。
【０４０３】
選択されたポリマーは、付着されたタンパク質が水性環境（例えば、生理学的環境）において沈殿しないように、水溶性であり得る。ポリマーは、分枝状または非分枝状であり得る。好ましくは、目的産物調製物の治療的利用では、ポリマーは、薬学的に許容可能である。
【０４０４】
反応混合物におけるタンパク質分子およびポリエチレングリコール分子の濃度が様々であるように、タンパク質分子に対するポリエチレングリコール分子の比率は、様々である。一般的に、最適な比率（未反応な余剰のタンパク質またはポリマーが最小になる反応効率の観点から）は、選択されたポリエチレングリコールの分子量によって、かつ利用可能な反応基の有効量に関して、決定され得る。分子量に関連して、一般的には、ポリマーの分子量が高ければ高いほど、タンパク質に付着し得るポリマー分子の数は少なくなる。同様に、ポリマーの分枝は、これらの要因を最適化するときに、考慮すべきである。通常、分子量が大きいほど（か、分枝が多いほど）、ポリマー：タンパク質の比率が高くなる。
【０４０５】
本明細書に使用されているように、またＰＥＧ：ＢＰＦＩ接合体を意図しているときに、用語「治療的有効量」は、患者に所望の利益をもたらす量を指している。例えば、用語「治療的有効量」は、ウイルスレベルを調節し、患者に利益もたらす量を指している。当該量は、個人によって異なり、さらに要因（患者の総合的な健康状態および治療すべき病気の根本的な原因など）の数に依存している。治療に使用されるＢＰＦＩの量は、受容可能な変化率を示し、かつ所望の応答をよい影響を及ぼすレベルにおいて維持する。本発明の組成物の治療的有効量は、公然に利用可能な材料および手法を用いて、当業者によって容易に確認され得る。
【０４０６】
水溶性ポリマーは、あらゆる構造的形態（例としては、直鎖状、分岐状または分枝状が挙げられるが、これらに限定されない）であり得る。一般的に、水溶性ポリマーは、ポリ（アルキレングリコール（例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ））であるが、他の水溶性ポリマーもまた、採用され得る。一例として、ＰＥＧが本発明のある種の実施形態を説明するために使用される。
【０４０７】
ＰＥＧは、市販されているか、当該分野においてよく知られた方法に従ってエチレングリコールの開環重合によって調製され得る、よく知られた水溶性ポリマーである（「Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, pages 138-161」）。用語「ＰＥＧ」は、大きさまたはＰＥＧの末端における修飾を考慮することなく、あらゆるポリエチレングリコールを包含して広く使用される。また、用語「ＰＥＧ」は、ＢＰＦＩと連結されたものとして以下の一般式：
ＸＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｙ
（ここで、ｎは２から１０，０００であり、ＸはＨまたは末端修飾（例としては、Ｃ１−４アルキルが挙げられるが、これらに限定されない）である）によって、表され得る。
【０４０８】
いくつかの場合において、本発明に使用されるＰＥＧは、ヒドロキシまたはメトキシ（例えば、ＸはＨまたはＣＨ３（「メトキシＰＥＧ」）を有する末端において終わっている。代替可能に、ＰＥＧは、反応基を有して終わっており、これによって２官能性ポリマーを形成可能である。一般的な反応基は、２０の一般アミノ酸に見られる官能基（例えば、マレイミド基、活性型カーボネート（ｐ−ニトロフェニルエステルなど）、活性型エステル（Ｎ−ヒドロキシスクシニミド、ｐ−ニトロフェニルエステルなど）、およびアルデヒド）だけでなく、非天然にコードされたアミノ酸に存在する存在する相補的官能基と特異的に反応するが、２０の一般アミノ酸に対して不活性な官能基（例としては、アジド基、アルキン基など）を含んでいる。上述の式においてＹによって示されるＰＥＧの他の末端が、天然に生じるアミノ酸または非天然にコードされたアミノ酸を介してＢＰＦＩに、直接にまたは非直接に付着することに留意されたい。例えば、Ｙは、ポリペプチドのアミン基（例としては、リジンのイプシロンアミン、またはＮ末端のアミン基が挙げられるが、これらに限定されない）に対するアミド、カルバミン酸塩、または尿素の結合物であり得る。代替可能に、Ｙは、チオール基（例としては、システインのチオール基が挙げられるが、これに限定されない）に対するマレイミドの結合物であり得る。代替可能に、Ｙは、２０の一般アミノ酸を介して通常に接近することができない残基に対する結合物であり得る。例えば、ＰＥＧ上におけるアジド基は、ＢＰＦＩ上におけるアルキン基と反応して、ヒュイゲン（Huisgen）［３＋２］付加環化産物を形成し得る。代替可能に、ＰＥＧ上におけるアルキン基は、非天然にコードされたアミノ酸に存在するアジド基と反応して、同様の産物を形成し得る。いくつかの実施形態において、強い求核試薬（例としては、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、セミカルバジドが挙げられるが、これらに限定されない）は、非天然にコードされたアミノ酸に存在するアルデヒド基またはケトン基と反応して、適切な還元剤を用いた処理によってさらに還元され得る場合に適用可能な、ヒドラゾン、オキシムまたはセミカルバゾンを形成し得る。代替可能に、強い求核試薬は、非天然にコードされたアミノ酸を介してＢＰＦＩに組み込まれ、かつ水溶性ポリマーに存在するケトン基またはアルデヒド基との選択的な反応に使用され得る。
【０４０９】
ＰＥＧに関しては、実際的に所望されるあらゆる分子量を使用することができ、例えば、望まれるような約１００ダルトン（Ｄａ）から１０００００Ｄａまたはそれ以上（例としては、ときに０．１−５０ｋＤａまたは１０−４０ｋＤａが挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。また、分枝鎖ＰＥＧ（各鎖の分子量の範囲が１−１００ｋＤａ（例えば、１−５０ｋＤａまたは５−２０ｋＤａなど）であるＰＥＧ分子など）が使用され得る。様々なＰＥＧ分子は、「Shearwater Polymers, Inc. catalog、Nektar Therapeutics catalog（引用によって本明細書に組み込まれる）」などに記載されている。
【０４１０】
通常、ＰＥＧ分子の少なくとも１つの末端は、非天然にコードされたアミノ酸との反応に利用可能である。例えば、アミノ酸側鎖との反応のためのアルキレン部分、およびアジド部分を有するＰＥＧ誘導体は、本明細書に記載されているような、非天然にコードされたアミノ酸にＰＥＧを付着させるために使用され得る。非天然にコードされたアミノ酸がアジドを含んでいるとき、ＰＥＧは、［３＋２］付加環化産物の形成をもたらすアルキレン部分、またはアミド結合の形成をもたらすホスフィン基を含む活性型ＰＥＧ種（例えば、エステル、カーボネート）のいずれかを、通常含んでいる。代替可能に、非天然にコードされたアミノ酸がアルキレンを含んでいるとき、ＰＥＧは、［３＋２］ヒュイゲン付加環化産物の形成をもたらすアジド部分を、通常に含んでいる。非天然にコードされたアミノ酸がカルボニル基を含んでいるとき、ＰＥＧは、対応するヒドラゾン、オキシム、およびセミカルバゾンの結合のそれぞれの形成をもたらすために、強力な求核剤（例としては、ヒドラジド機能性基、ヒドラジン機能性基、ヒドロキシルアミン機能性基またはセミカルバジド機能性基が挙げられるが、これらに限定されない）を通常に含んでいる。他の代替可能物において、上述した反応基とは逆配向の反応基（すなわち、アルキンを含んでいるＰＥＧ誘導体と反応され得る非天然にコードされたアミノ酸におけるアジド部分）が、使用され得る。
【０４１１】
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ誘導体を有するＢＰＦＩバリアントは、非天然にコードされたアミノ酸の側鎖上に存在する化学機能性基と反応する、化学機能性基を含んでいる。
【０４１２】
本発明は、いくつかの実施形態において、約８００Ｄａから約１０００００Ｄａまでの平均分子量を有する水溶性ポリマー骨格を含んでいる、アジドおよびアセチレン含有ポリマー誘導体を提供する。水溶性ポリマーの重合体骨格は、ポリ（エチレングリコール）であり得る。しかし、多種多様な水溶性ポリマー（例としては、ポリ（エチレン）グリコール、および他の関連するポリマー（例としては、ポリ（デキストラン）およびポリ（ポリプロピレングリコール）が挙げられる）が挙げられるが、これらに限定されない）が、本発明の実施に好適であり、かつ用語ＰＥＧまたはポリ（エチレングリコール）の使用は、そのような分子のすべてを包含もしくは含むことを意図していることを理解されたい。用語ＰＥＧの例としては、あらゆる形態におけるポリ（エチレングリコール）（例としては、２官能性ＰＥＧ、マルチアームＰＥＧ（multiarmed PEG）、誘導体化ＰＥＧ、分岐状ＰＥＧ、分枝状ＰＥＧ（すなわち、ポリマー骨格に張り出した１つ以上の官能基を有するＰＥＧまたは対応するポリマー）、それらに分解可能な結合を有するＰＥＧが挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４１３】
ＰＥＧは、一般的に、透明、無色、無臭、水に可溶、熱に安定、多くの化学薬品に不活性、非加水分解性もしくは非変質性、および通常に非毒性である。ポリ（エチレングリコール）は、ＰＥＧが悪影響なしに生きた組織または生体と共存在可能であることを示す、生体適合性であると考えられる。より詳細には、ＰＥＧは、ＰＥＧが体内において免疫反応を生成する傾向がないことを示す、実質的に非免疫原性である。体内においていくつかの所望の機能を有する分子（例えば、生物活性剤）に付着すると、ＰＥＧは、薬剤を被う傾向があり、かつ生体が薬剤の存在を許容可能であるように、あらゆる免疫反応を低減または排除することができる。ＰＥＧ接合体は、実質的な免疫反応を生成しないか、凝固もしくは他の好ましくない影響の原因にならないか、のいずれかの傾向がある。一般式−−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−−（ここで、ｎは約３から約４０００（一般的には約２０から約２０００）である）を有するＰＥＧは、本発明における使用に好適である。約８００Ｄａから約１０００００Ｄａの分子量を有するＰＥＧは、本発明のいくつかの実施形態において、ポリマー骨格として特に有用である。
【０４１４】
ポリマー骨格は、直鎖状または分枝状であり得る。分枝状ポリマー骨格は、通常、当該分野において公知である。一般的に、分枝状ポリマーは、中央分枝核部分および当該中央分枝核に連結された複数の直鎖状ポリマー鎖を有している。ＰＥＧは、普通、様々な多価アルコール（例えば、グリセロール、グリセロールオリゴマー、ペンタエリスリトールおよびソルビトール）にエチレンオキシドを付加することによって調製され得る分枝状形態において、使用される。また、中央分枝部分は、いくつかのアミノ酸（例えば、リジン）から誘導され得る。分枝状ポリ（エチレングリコール）は、Ｒ（−ＰＥＧ−ＯＨ）ｍ（ここで、Ｒは核部分（例えば、グリセロール、グリセロールオリゴマー、またはペンタエリスリトール）から誘導され、かつｍは腕の数を表している）のように一般形に表され得る。また、マルチアームＰＥＧ分枝（例えば、米国特許第５，９３２，４６２号明細書、米国特許第５，６４３，５７５号明細書、米国特許第５，２２９，４９０号明細書、米国特許第４，２８９，８７２号明細書、米国特許出願公開第２００３／０１４３５９６号明細書、国際公開第９６／２１４６９号パンフレットおよび国際公開第９３／２１２５９号パンフレット（これらは引用によって本明細書に組み込まれる）に記載されている分子）は、ポリマー骨格として使用され得る。
【０４１５】
また、分枝状ＰＥＧは、ＰＥＧ（−−ＹＣＨＺ２）ｎ（ここで、Ｙは連結基であり、かつＺは、規定の長さの原子鎖によってＣＨに連結される活性型末端基である）によって表される分岐状ＰＥＧの形態であり得る。
【０４１６】
張り出しＰＥＧであるさらに他の分枝状形態は、ＰＥＧ鎖の末端において、よりむしろＰＥＧ骨格に沿って、反応基（例えば、カルボキシル）を有する。
【０４１７】
これらのＰＥＧの形態に加えて、また、ポリマーは、骨格における弱いまたは分解可能な結合を用いて調製され得る。例えば、ＰＥＧは、加水分解を受けるポリマー骨格におけるエステル結合を用いて調製され得る。以下に示すように、この加水分解により、ポリマーが切断されると、より低い分子量の断片が生じる。
−ＰＥＧ−ＣＯ２−ＰＥＧ−＋Ｈ２Ｏ→ＰＥＧ−ＣＯ２Ｈ＋ＨＯ−ＰＥＧ−
用語ポリ（エチレングリコール）またはＰＥＧは、当該分野において公知のすべての形態（例としては、本明細書に開示されている形態が挙げられるが、これに限定されない）を表すか、それを含んでいるかということを、当業者は理解する。
【０４１８】
多くの他のポリマーは、本発明における使用に好適である。いくつかの実施形態において、２末端から約３００末端を有する水溶性のポリマー骨格は、本発明に特に有用である。適切なポリマーの例としては、他のポリ（アルキレングリコール）（例えば、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」））、これらのコポリマー（例としては、エチレングリコールおよびプロピレングリコールのコポリマーが挙げられるが、これらに限定されない）、これらのターポリマー、およびこれらの混合物などが挙げられるが、これらに限定されない。ポリマー骨格の各鎖の分子量は、変更可能であるが、一般的に、約８００Ｄａから約１０００００Ｄａ（しばしば、約６０００Ｄａから約８００００Ｄａ）の範囲である。
【０４１９】
当業者は、実質的に水溶性の骨格に関する上述の記載が、決して網羅的ではなく、かつ単に例示であること、さらに上述の性質を有するすべてのポリマー材料が、本発明における使用に好適であるように検討されることを、認識する。
【０４２０】
本発明のいくつかの実施形態において、ポリマー誘導体は、「多官能性」である。「多官能性」は、ポリマー誘導体が、官能基により機能性化または活性化されている、少なくとも２つの末端、ならびに、可能であれば約３００もの末端を有していることを意味する。多官能性ポリマー誘導体の例としては、同じであり得るか、異なり得る官能基とそれぞれ結合している２つの末端を有する直鎖状ポリマーが挙げられるが、これに限定されない。
【０４２１】
１つの実施形態において、ポリマー誘導体は、構造：
Ｘ−Ａ−ＰＯＬＹ−Ｂ−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
（ここで、
Ｎ＝Ｎ＝Ｎは、アジド部分であり；
Ｂは、存在してもしなくてもよい連結部分であり；
ＰＯＬＹは、水溶性の非抗原性ポリマーであり；
Ａは、存在してもしなくてもよく、かつＢと同じであり得るか、異なり得る連結部分であり；
Ｘは、第２の官能基である）を有する。ＡまたはＢに関する連結部分の例としては、１８までの炭素原子、より好ましくは１−１０の炭素原子を含む多機能化されたアルキル基が挙げられるが、これらに限定されない。異種原子（例えば、窒素、酸素または硫黄）が、アルキル鎖に含まれていてもよい。また、アルキル鎖は、異種原子において分枝されていてもよい。ＡおよびＢに関する連結部分の他の例としては、１０までの炭素原子、より好ましくは５−６の炭素原子を含む多官能性化されたアリール基が挙げられるが、これらに限定されない。アリール基は、１つ以上の炭素原子、窒素原子、酸素原子または硫黄原子で置換されていてもよい。適切な連結基の他の例としては、米国特許第５，９３２，４６２号明細書、米国特許第５，６４３，５７５号明細書および米国特許出願公開第２００３／０１４３５９６号明細書（これらは引用によって本明細書に組み込まれる）に記載された連結基が挙げられるが、これに限定されない。当業者は、連結部分に関する上述した記載が、決して網羅的ではなく、かつ単なる例示であること、さらに上述の性質を有するすべての連結部分が、本発明における使用に好適であるように検討されることを、認識する。
【０４２２】
Ｘとしての使用に好適な官能基の例としては、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、アルコキシル、活性型エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルおよび１−ベンゾトリアゾリルエステル）、活性型炭酸塩（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネートおよび１−ベンゾトリアゾリルカーボネート）、アセタール、アルデヒド、水酸化アルデヒド、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性型スルホン、アミン、アミノキシ、保護されたアミン、ヒドラジド、保護されたヒドラジド、保護されたチオール、カルボン酸、保護されたカルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレート、トレシレート、アルケン、ケトンおよびアジンが挙げられるが、これらに限定されない。当業者によって理解されるように、選択されたＸ部分は、アジド基との反応が生じないように、アジド基と適合性であるべきである。アジド含有ポリマー誘導体は、第２官能基（すなわち、Ｘ）もアジド部分であることを意味する同種２官能性（homobifunctional）であり得るか、第２官能基が異なる官能基であることを意味する異種２官能性（heterobifunctional）であり得る。
【０４２３】
用語「保護された」は、ある反応条件下において化学的に反応性の官能基の反応を防止する部分、または保護基が存在することをいう。保護基は、保護される化学的に反応性の基の種類に応じて変えられる。例えば、化学的に反応性の基が、アミンまたはヒドラジドである場合、保護基は、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）からなる群から選択され得る。化学的に反応性の基が、チオールである場合、保護基は、オルソピリジルジスルフィドであり得る。化学的に反応性の基が、カルボン酸（例えば、ブタン酸またはプロピオン酸）またはヒドロキシル基である場合、保護基は、ベンジル基またはアルキル基（例えば、メチル、エチル、またはｔｅｒｔ−ブチル）であり得る。また、当該分野において公知の他の保護基は、本発明に使用され得る。
【０４２４】
文献に記載されている末端官能基の具体的な例としては、Ｎ−スクシンイミジルカーボネート（例えば、米国特許第５，２８１，６９８号明細書、米国特許第５，４６８，４７８号明細書を参照のこと）、アミン（例えば、「Buckmannら Makromol. Chem. 182:1379 (1981) 」、「Zalipskyら Eur. Polym. J. 19:1177 (1983) 」）、ヒドラジド（「Andreszら Makromol. Chem. 179:301 (1978) 」を参照のこと）、スクシンイミジルプロピオネートおよびスクシンイミジルブタノエート（例えば、「Olsonら in Poly(ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, pp 170-181」、「Harris & Zalipsky Eds., ACS, Washington, D.C., 1997」、また、米国特許第５，６７２，６６２号明細書）を参照のこと）、スクシンイミジル琥珀酸塩（例えば、「Abuchowskiら Cancer Biochem. Biophys. 7:175 (1984)」、および「Joppichら Makrolol. Chem. 180:1381 (1979) 」を参照のこと）、スクシンイミジルエステル（例えば、米国特許第４，６７０，４１７号明細書を参照のこと）、ベンゾトリアゾールカーボネート（例えば、米国特許第５，６５０，２３４号明細書を参照のこと）、グリシジルエーテル（例えば、「Pithaら Eur. J Biochem. 94:11 (1979)」、「Ellingら, Biotech. Appl. Biochem. 13:354 (1991)」を参照のこと）、オキシカルボニルイミダゾール（例えば、「Beauchamp,ら, Anal. Biochem. 131:25 (1983)」、「Tondelliら J. Controlled Release 1 :251 (1985)」を参照のこと）、ｐ−ニトロフェニルカーボネート（例えば、「Veronese,ら, Appl. Biochem. Biotech., 11 : 141 (1985)」、および「Sartoreら, Appl. Biochem. Biotech., 27:45 (1991)」を参照のこと）、アルデヒド（例えば、「Harrisら J. Polym. Sci. Chem. Ed. 22:341 (1984) 」、米国特許第５，８２４，７８４号明細書、米国特許第５，２５２，７１４号明細書を参照のこと）、マレイミド（例えば、「Goodsonら Biotechnology (NY) 8:343 (1990) 」、「Romaniら in Chemistry of Peptides and Proteins 2:29 (1984) 」、および「Kogan, Synthetic Comm. 22:2417 (1992) 」を参照のこと）、オルトピリジル−ジスルフィド（例えば、「Woghiren,ら Bioconj. Chem. 4:314(1993) 」を参照のこと）、アクリロール（例えば、「Sawhneyら, Macromolecules, 26:581 (1993) 」を参照のこと）、ビニルスルホン（例えば、米国特許第５，９００，４６１号明細書）が挙げられるが、これらに限定されない。引用した参考文献および特許文献のすべては、引用によって本明細書に組み込まれる。
【０４２５】
本発明のある種の実施形態において、本発明のポリマー誘導体は、構造：
Ｘ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
（ここで、
Ｘは、上記において記載したような官能基であり；
ｎは、約２０から約４０００である）
を有するポリマー骨格を備える。他の実施形態において、本発明のポリマー誘導体は、構造：
Ｘ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｗ−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
（ここで、
Ｗは、１−１０の炭素原子を含んでいる脂肪族のリンカー部分または芳香族のリンカー部分であり；
ｎは、約２０から約４０００であり；
Ｘは、上記において記載したような官能基であり、ｍは、１から１０の間である。）
を有するポリマー骨格を備える。
【０４２６】
本発明のアジド含有ＰＥＧ誘導体は、様々な当該分野において公知の方法、および／または本明細書に開示されている方法によって調製され得る。以下に示されている１つの方法では、約８００Ｄａから約１０００００Ｄａまでの平均分子量を有する水溶性ポリマー骨格であって、該ポリマー骨格は、該第１官能基と結合している第１末端と、適切な脱離基と結合している第２末端とを有するポリマー骨格は、アジド陰イオン（多くの適切な対イオン（ナトリウム、カリウムおよびｔｅｒｔ−ブチルアンモニウムなど）のいずれかと一対にされていてもよい）と反応する。脱離基は、求核性置換を受け、かつアジド部分によって置き換えられる。これにより、所望のアジド含有ＰＥＧポリマーが生じる。
（Ｘ−ＰＥＧ−Ｌ＋Ｎ３−→Ｘ−ＰＥＧ−Ｎ３）。
【０４２７】
これに示されるように、本発明における使用に好適なポリマー骨格は、一般式  Ｘ−ＰＥＧ−Ｌを有する（ここで、ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）であり、Ｘはアジド基と反応しない官能基であり、Ｌは適切な官能基である）。適切な官能基の例としては、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、アセタール、アルケニル、アミン、アミノオキシ、保護されたアミン、保護されたヒドラジド、保護されたチオール、カルボン酸、保護されたカルボン酸、マレイミド、ジチオピリジン、ビニルピリジン、およびケトンが挙げられるが、これらに限定されない。適切な脱離基の例としては、塩化物、臭化物、ヨード化物、メシレート、トレシレートおよびトシレートが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４２８】
本発明のアジド含有ポリマー誘導体を調製する他の方法では、アジド機能性基を有する連結剤を、約８００Ｄａから約１０００００Ｄａまでの平均分子量を有する水溶性ポリマー骨格と接触させる。ここで、当該連結剤は、ＰＥＧポリマー上における化学機能性基と選択的に反応して、アジド含有ポリマー誘導体産物を形成する（ここで、当該アジドは、連結基によってポリマー骨格から分離されている）化学機能性基を有している。
【０４２９】
例示的な反応スキームは、以下に示される：
Ｘ−ＰＥＧ−Ｍ＋Ｎ−リンカー−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ→ＰＧ−Ｘ−ＰＥＧ−リンカー−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
（ここで、
ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）であり、Ｘはキャッピング基（capping group）（例えば、アルコキシ基または上述の官能基）であり；
Ｍは、アジド機能性基と反応しないが、Ｎ官能基と効率的かつ選択的に反応する官能基である）。
【０４３０】
適切な官能基の例としては、Ｎがアミンであるときに、Ｍはカルボン酸、カーボネート、または活性型エステルであり；Ｎがヒドラジドまたはアミノオキシ部分であるときに、Ｍはケトンであり；Ｎが求核原子であるときに、Ｍは脱離基であることが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４３１】
粗製産物の精製は、必要に応じて、公知の方法（例としては、当該産物を沈殿させて、その後にクロマトグラフィーする方法が挙げられるが、これに限定されない）によって実施され得る。
【０４３２】
より具体的な例として、ジアミンの場合を以下に示す。このジアミンでは、アミンの１つが保護基部分（例えば、ｔｅｒｔ−ブチルＢｏｃ）によって保護され、生じる保護されたモノ−ＰＥＧジアミンが、アジド機能性基を有する連結部分と反応する：
ＢｏｃＨＮ−ＰＥＧ−ＮＨ２＋ＨＯ２Ｃ−（ＣＨ２）３−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ。
【０４３３】
この場合では、様々な活性化剤（例えば、塩化チオニルもしくはカルボジイミド試薬、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドもしくはＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール）を用いて、アミン基をカルボン酸基に結合させることにより、モノアミンＰＥＧ誘導体とアジド保持リンカー部分との間にアミド結合を作製することができる。アミド結合の形成が上手く行った後に、結果として生じるＮ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｂｏｃ−保護されたアジド含有誘導体は、生理活性分子の修飾に直接に使用され得るか、他の有用な官能基を導入するためにさらに合成され得る。例えば、Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ基は、オメガ−アミノ−ＰＥＧ−アジドを生成するために強酸を用いた処理によって加水分解され得る。結果として生じるアミンは、有益な異種２官能性試薬を形成するための他の有用な機能性基（例えば、マレイミド基、活性型ジスルフィド、および活性型エステルなど）を導入するためのきっかけとなる合成物（synthetic handle）として使用され得る。
【０４３４】
異種２官能性誘導体は、ポリマーの各末端に異なる分子を結合することが望まれるときに、特に有用である。例えば、オメガ−Ｎ−アミノ−アジドＰＥＧは、ＰＥＧの１つの末端に求電子性基（例えば、アルデヒド、ケトン、活性型エステル、および活性型カーボネートなど）を有する分子を結合させることができ、さらにＰＥＧの他の末端にアセチレン基を有する分子を結合させることができる。
【０４３５】
本発明の他の実施形態において、ポリマー誘導体は、構造：
Ｘ−Ａ−ＰＯＬＹ−Ｂ−Ｃ≡Ｃ−Ｒ
（ここで、
Ｒは、Ｈ、アルキル基、アルキレン基、アルコキシ基、アリール基もしくは置換アリール基のいずれかであってもよく；
Ｂは、存在してもしなくてもよい連結部分であり；
ＰＯＬＹは、水溶性の非抗原性ポリマーであり；
Ａは、存在してもしなくてもよい、Ｂと同じまたは異なる連結部分であり；
Ｘは第２官能基である）
を有する。
【０４３６】
ＡおよびＢにふさわしい連結部分の例としては、１８までの炭素原子、そして好ましくは１−１０の間の炭素原子を含む多機能性化アルキル基が挙げられるが、これらに限定されない。異種原子（例えば、窒素、酸素または硫黄）が、アルキル鎖に含められてもよい。また、アルキル鎖は、異種原子において分枝されていてもよい。ＡおよびＢにふさわしい連結部分の例としては、１０までの炭素原子、そして好ましくは５−６の間の炭素原子を含む多機能性化アリール基が挙げられるが、これらに限定されない。アリール基は、１つ以上の炭素原子、窒素原子、酸素原子または硫黄原子で置換されてもよい。適切な連結基の他の例としては、米国特許第５，９３２，４６２号明細書、および米国特許第５，６４３，５７５号明細書、および米国特許出願公開第２００３／０１４３５９６号明細書（これらは、引用によって本明細書に組み込まれる）に記載されている連結基が挙げられる。当業者は、連結部分に関する上述の記載が、決して網羅的ではなく、かつ単に例証であること、さらに上述の性質を有する多種多様な連結部分が、本発明における使用に好適であるように検討されることを、認識する。
【０４３７】
Ｘとしての使用に好適な官能基の例としては、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、アルコキシ、活性型エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルおよび１−ベンゾトリアゾ−ルエステル）、活性型カーボネート（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネートおよび１−ベンゾトリアゾ−ルカーボネート）、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水酸化物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性型スルホン、アミン、アミノオキシ、保護されたアミン、ヒドラジド、保護されたヒドラジド、保護されたチオール、カルボン酸、保護されたカルボン酸、イソシアン酸塩、イソチオシアン酸塩、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレート、トレシレート、アルケン、ケトンおよびアセチレンが挙げられるが、これらに限定されない。理解されるであろうように、選択されたＸ部分は、アセチレン基との反応が生じないように、アセチル基と適合性であるべきである。アセチレン含有ポリマー誘導体は、第２官能基（すなわちＸ）もアセチレン部分であることを意味する同種２官能性、または第２官能基が異なる官能基であることを意味する、異種２官能性であり得る。
【０４３８】
本発明の他の実施形態において、ポリマー誘導体は、構造：
Ｘ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡ＣＨ
（ここで、
Ｘは上述のような官能基であり；
ｎは約２０から約４０００までであり；
ｍは１から１０の間である）
を有するポリマー骨格を備えている。各異種２官能性ＰＥＧポリマーの具体的な例が以下に示される。
【０４３９】
本発明のアセチレン含有ＰＥＧ誘導体は、当該分野において公知の方法および／または本明細書に開示されている方法を用いて調製され得る。１つの方法では、約８００Ｄａから約１０００００Ｄａの平均分子量を有する水溶性ポリマー骨格であって、該ポリマー骨格は、第１官能基と結合している第１末端、および適切な求核性基と結合している第２末端を有しているポリマー骨格を、ＰＥＧ上における求核性基との反応に好適なアセチレン機能性基および脱離基の両方を有する化合物と反応させる。求核性部分を有するＰＥＧポリマー、および脱離基を有する分子が、組み合わせられるとき、脱離基は、求核性置換を受け、かつ求核性部分によって置き換えられる。これにより、所望のアセチレン含有ポリマーが生じる。
（Ｘ−ＰＥＧ−Ｎｕ＋Ｌ−Ａ−Ｃ→Ｘ−ＰＥＧ−Ｎｕ−Ａ−Ｃ≡ＣＲ’）。
【０４４０】
ここに示されるように、反応における使用に好適なポリマー骨格は、一般式  Ｘ−ＰＥＧ−Ｎｕを有する（ここで、ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）であり、Ｎｕは求核性部分であり、ＸはＮｕ、Ｌまたはアセチレン機能性基と反応しない官能基である）。
【０４４１】
Ｎｕの例としては、ＳＮ２型の機序を介して主に反応するアミン基、アルコキシ基、アリールオキシ基、スルヒドリル基、イミノ基、カルボキシレート基、ヒドラジド基、アミノキシ基が挙げられるが、これらに限定されない。Ｎｕ基の付加的な他の例としては、求核付加反応を介して主に反応する官能基が挙げられる。Ｌ基の例としては、塩化物、臭化物、ヨード化物、メシレート、トレシレート、およびトシレート、ならびに求核置換を受けると予想される他の基だけでなく、ケトン、アルデヒド、チオエステル、オレフィン、アルファ−ベータ不飽和カルボニル基、カーボネート、および求核性原子によって付加を受けると予想される他の求電子性基が挙げられる。
【０４４２】
本発明の他の実施形態において、Ａは、１−１０の炭素原子の脂肪族リンカーであるか、６−１４の炭素原子の置換アリール環である。Ｘは、アジド基と反応しない官能基であり、Ｌは、適切な脱離基である。
【０４４３】
本発明のアセチレン含有ポリマーを調製する他の方法において、１つの末端に保護された官能基か、キャッピング剤かのいずれか、および他の末端に適切な脱離基を有し、約８００Ｄａから約１０００００Ｄａの平均分子量を有するＰＥＧポリマーは、アセチレン陰イオンによって接触される。
【０４４４】
例示的な反応手順は、以下：
Ｘ−ＰＥＧ−Ｌ＋−Ｃ≡ＣＲ’→Ｘ−ＰＥＧ−Ｃ≡ＣＲ’
（ここで、
ＰＥＧは、ポリ（エチレングリコール）であり、Ｘはキャッピング基（例えば、アルコキシ）または上記したような官能基であり；
Ｒ’はＨ、アルキル基、アルコキシ基、アリール基、アリールオキシ基、置換アルキル基、置換アルコキシル基、置換アリール基、または置換アリールオキシ基のいずれかである）に示される。
【０４４５】
上述の例において、脱離基Ｌは、十分な濃度のアセチレン陰イオンと接触されたときに、ＳＮ２型の置換を受けるほど、十分に反応性であるべきである。アセチレン陰イオンによる脱離基のＳＮ２置換の達成に必要な反応条件は、当該分野において公知である。
【０４４６】
粗製産物の精製は、普通、当該分野において公知の方法（例としては、必要に応じて、産物を沈殿させて、それからクロマトグラフィーを行う方法が挙げられるが、これに限定されない）によって達成され得る。
【０４４７】
水溶性ポリマーは、本発明のＢＰＦＩと連結され得る。水溶性ポリマーは、ＢＰＦＩに組み込まれている非天然にコードされたアミノ酸、天然または天然にコードされたアミノ酸の任意の官能基もしくは置換基、非天然または天然にコードされたアミノ酸に付加された任意の官能基もしくは置換基のいずれかを介して、連結され得る。代替可能に、水溶性ポリマーは、天然に生じるアミノ酸（例としては、システイン残基、リジン残基、またはＮ末端残基のアミノ基が挙げられるが、これらに限定されない）を介して、非天然にコードされたアミノ酸を組み込んでいるＢＰＦＩと連結される。いくつかの場合において、本発明のＢＰＦＩは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の非天然アミノ酸を含んでいる。ここで、１つ以上の当該非天然にコードされたアミノ酸は、水溶性ポリマー（例としては、ＰＥＧおよび／またはオリゴ糖が挙げられるが、これらに限定されない）と連結される。いくつかの場合において、本発明のＢＰＦＩは、水溶性ポリマーと結合された、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の天然にコードされたアミノ酸を、さらに含んでいる。いくつかの場合において、本発明のＢＰＦＩは、水溶性ポリマーと連結された１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸、および水溶性ポリマーと連結された１つ以上の天然に生じるアミノ酸を含んでいる。いくつかの実施形態において、本発明に使用される水溶性ポリマーの血中半減期は、非接合形態の血中半減期と比べて、増加している。
【０４４８】
本発明のＢＰＦＩと連結している水溶性ポリマーの数（すなわち、ＰＥＧ付加またはグリコシル化の程度）は、変更された（例としては、増加されたまたは減少された、が挙げられるが、これらに限定されない）薬理的、薬物動態的または薬力学的な特性（例えば、インビボにおける半減期）を提供するために調整され得る。いくつかの実施形態において、ＢＰＦＩの半減期は、非修飾ポリペプチドよりも、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０パーセント、２倍、５倍、１０倍、５０倍または少なくとも約１００倍、増加される。
【０４４９】
（強求核基（すなわち、ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、またはセミカルバジド）を含有するＰＥＧ誘導体）
本発明の１つの実施形態において、カルボニル含有非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるＢＰＦＩは、ＰＥＧの骨格と直接的に連結している末端のヒドラジン部分、ヒドロキシルアミン部分、ヒドラジド部分、またはセミカルバジド部分を含んでいるＰＥＧ誘導体により修飾される。
【０４５０】
いくつかの実施形態において、ヒドロキシルアミン末端ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２
（ここで、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、ｎは１００−１０００（すなわち、平均分子量が５−４０ｋＤａの間にある）である）を有する。
【０４５１】
いくつかの実施形態において、ヒドラジンまたはヒドラジド含有ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２
（ここで、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）、ｍは２−１０であり、ｎは１００−１０００であり、Ｘは、存在してもしなくてもよい任意のカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）である）を有する。
【０４５２】
いくつかの実施形態において、セミカルバジド含有ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２
（ここで、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）、ｍは２−１０であり、ｎは１００−１０００である）を有する。
【０４５３】
本発明の他の実施形態において、カルボニル含有アミノ酸を含んでいるＢＰＦＩは、アミド結合によりＰＥＧ骨格に連結している末端のヒドロキシルアミン部分、ヒドラジド部分、ヒドラジン部分またはセミカルバジド部分を含むＰＥＧ誘導体により修飾される。
【０４５４】
いくつかの実施形態において、ヒドロキシルアミン末端ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２
（ここで、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、ｎは１００−１０００（すなわち、平均分子量が５−４０ｋＤａの間にある）である）を有する。
【０４５５】
いくつかの実施形態において、ヒドラジンまたはヒドラジド含有ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２
（ここで、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）、ｍは２−１０であり、ｎは１００−１０００であり、かつＸは、存在してもしなくてもよい任意のカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）である）を有する。
【０４５６】
いくつかの実施形態において、セミカルバジド含有ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２
（ここで、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、ｎは１００−１０００である）を有する。
【０４５７】
本発明の他の実施形態において、カルボニル含有アミノ酸を含んでいるＢＰＦＩは、末端のヒドラジン部分、ヒドロキシルアミン部分、ヒドラジド部分、またはセミカルバジド部分を含んでいる分枝状ＰＥＧ誘導体であって、該分枝状ＰＥＧ誘導体の各鎖が１０−４０ｋＤａ、およびより好ましくは５−２０ｋＤａの範囲の分子量である分枝状ＰＥＧ誘導体によって、修飾される。
【０４５８】
本発明の他の実施形態において、非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるＢＰＦＩは、分枝状構造を有するＰＥＧ誘導体により修飾される。例えば、いくつかの実施形態において、ヒドラジンまたはヒドラジド末端ＰＥＧ誘導体は、以下の構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）］２ＣＨ（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２
（ここで、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）、ｍは２−１０であり、ｎは１００−１０００であり、Ｘは、存在してもしなくてもよい任意のカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）である）を有する。
【０４５９】
いくつかの実施形態において、セミカルバジド基を含むＰＥＧ誘導体は、構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２］２ＣＨ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２
（ここで、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）、Ｘは、任意にＮＨ、Ｏ、Ｓ、またはＣ（Ｏ）であるか、あるいは存在しておらず、ｍは２−１０であり、ｎは１００−１０００である）を有する。
【０４６０】
いくつかの実施形態において、ヒドロキシルアミン基含有ＰＥＧ誘導体は、構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２］２ＣＨ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２
（ここで、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）、Ｘは、任意にＮＨ、Ｏ、Ｓ、またはＣ（Ｏ）であるか、あるいは存在しておらず、ｍは２−１０であり、ｎは１００−１０００である）を有する。
【０４６１】
水溶性ポリマーがＢＰＦＩに連結される程度および部位によって、ＢＰＦＩ受容体またはＢＰＦＩ結合パートナーに対するＢＰＦＩの結合を調整することができる。いくつかの実施形態において、結合は、平衡結合アッセイによって測定されるような、約４００ｎＭ以下のＫｄ、１５０ｎＭ以下のＫｄ、およびいくつかの場合では１００ｎＭ以下のＫｄでもって、ＢＰＦＩがＢＰＦＩ受容体と結合するように配置される。
【０４６２】
ポリマーの活性化だけでなくペプチドの接合に関する方法および化学反応は、文献に記載され、かつ当該分野において公知である。ポリマーの活性化に通常に使用される方法の例としては、シアン、臭素、過ヨウ素酸塩、グルタルアルデヒド、バイエポキシド、エピクロロヒドリン、ジビニルスルホン、カルボジイミド、ハロゲン化スルホニル、トリクロロトリアジンなどを用いた官能基の活性化（「R. F. Taylor, (1991), PROTEIN IMMOBILISATION. FUNDAMENTAL AND APPLICATIONS, Marcel Delcker, N. Y.」、「S. S. Wong, (1992), CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING, CRC Press, Boca Raton」、「G. T. Hermansonら, (1993), IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES, Academic Press, N. Y.」、「Dunn, R.L.,ら, Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DE LIVERY SYSTE MS, AC S Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991」を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４６３】
ＰＥＧの機能性化および接合に関する総説および研究論文が、利用可能である。例えば、「Harris, Macromol. Chem. Phys. C25: 325-373 (1985) 」、「Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987) 」、「Wongら, Enzyme Microb. Technol 14: 866-874 (1992)」、「Delgadoら, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992)」、「Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165 (1995)」を参照のこと。
【０４６４】
また、ポリマーの活性化方法は、国際公開第９４／１７０３９号パンフレット、米国特許第５，３２４，８４４号明細書、国際公開第９４／１８２４７号パンフレット、国際公開第９４／０４１９３号パンフレット、米国特許第５，２１９，５６４号明細書、米国特許第５，１２２，６１４号明細書、国際公開第９０／１３５４０号パンフレット米国特許第５，２８１，６９８号明細書、および国際公開第９３／１５１８９号明細書に見られ、かつ活性化ポリマーと酵素との接合方法としては、当該酵素が凝固因子ＶＩＩＩであるときには国際公開第９４／１５６２５号パンフレット、当該酵素がヘモグロビンであるときには国際公開第９４／０９０２７号パンフレット、当該酵素が酸素運搬分子であるときには米国特許第４，４１２，９８９号明細書、当該酵素がリボヌクレアーゼおよびスパーオキシドジムスターゼであるときには「Veronese at al, App. Biochem. Biotech. 11 : 141-52 (1985)」に見られるがこれらに限定されない。すべての文献および引用特許は、引用によって本願に組み込まれる。
【０４６５】
非天然にコードされたアミノ酸（ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンなど）を含むＢＰＦＩのＰＥＧ付加（すなわち、任意の水溶性ポリマーの付加）は、あらゆる便利な方法によって実施される。例えば、ＢＰＦＩにアルキン末端化ｍＰＥＧ誘導体が付加される。要するに、過剰の固体ｍＰＥＧ（５０００）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨが、ｐ−アジド−Ｌ−Ｐｈｅ−含有ＢＰＦＩの水溶液に、室温において攪拌しながら加えられる。一般的には、上記水溶液は、反応が実施されるｐＨ（通常、約ｐＨ４−１０）に近いｐＫａを有する緩衝液を用いて、緩衝されている。ｐＨ７．５におけるＰＥＧ付加に好適な緩衝液の例としては、例えば、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩、ホウ酸塩、ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ＥＰＰＳ、およびＴＥＳが挙げられるが、これらに限定されない。ｐＨは、必要に応じて、継続的に監視され、かつ調整される。一般的に、反応は、約１−４８時間継続し得る。
【０４６６】
続いて、反応産物を、疎水性相互作用クロマトグラフィーに供して、遊離ｍＰＥＧ（５０００）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ、および、非遮断のＰＥＧが当該分子の末端の両方において活性化されることによって、ＢＰＦＩバリアントが架橋されるときに形成し得る任意のＰＥＧ化ＢＰＦＩの高分子量の複合体から、ＰＥＧが付加されたＢＰＦＩバリアントを分離する。疎水性相互作用クロマトグラフィーの間の条件は、遊離ｍＰＥＧ（５０００）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨがカラムを通って流れる、一方で、１つ以上のＰＥＧ基と接合された１つのＢＰＦＩバリアント分子を含む所望の形状が溶出された後に、あらゆるＰＥＧが付加された架橋化ＢＰＦＩバリアント複合体が、溶出されるような条件である。適切な条件は、架橋された複合体と所望の接合体との相対的な大きさに依存し、当業者によって容易に決定される。所望の接合体を含む溶出物は、限外ろ過によって濃縮され、かつダイアフィルトレーションによって脱塩される。
【０４６７】
疎水性クロマトグラフィーから得られたＰＥＧ化ＢＰＦＩは、必要に応じて、当業者に公知の１つ以上の手法（例としては、アフィニティークロマトグラフィー；陰イオン交換クロマトグラフィーもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー（例としては、デアエセファロース（DEAE SEPHAROSE）を用いたものが挙げられるが、これに限定されない）；シリカ上におけるクロマトグラフィー；逆相ＨＰＬＣ；ゲルろ過（例としては、セファデックスＧ−７５（SEPHADEX G-75）を用いたものが挙げられるが、これに限定されない）；疎水性相互作用クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー、金属キレートクロマトグラフィー；限外ろ過／ダイアフィルトレーション；エタノール沈殿；硫酸アンモニウム沈殿；等電点電気泳動（chromatofocusing）；置換クロマトグラフィー；電気泳動手法（例としては、調製用等電点電気泳動（isoelectric focusing）が挙げられるが、これに限定されない）；差別的可溶性（例としては、硫酸アンモニウム沈殿が挙げられるが、これに限定されない）、または抽出が挙げられるが、これらに限定されない）によって、さらに精製され得る。見かけの分子量は、球状タンパク質標準と比べた、ＧＰＣによって評価され得る（「Preneta, AZ in PROTEIN PURIFICATION METHODS, A PRACTICAL APPROACH (Harris & Angal, Eds.) IRL Press 1989, 293-306」）。ＢＰＦＩ−ＰＥＧ接合体の精製は、タンパク質を分解した後に（例としては、トリプシン切断が挙げられるが、これに限定されない）、質量分析をすることによって評価され得る。「Pepinsky RB.,ら, J. Pharmcol. & Exp. Ther. 297(3): 1059-66 (2001)」。
【０４６８】
本発明のＢＰＦＩのアミノ酸に連結している水溶性ポリマーは、制限なく、さらに誘導体化または置換され得る。
【０４６９】
（アジド含有ＰＥＧ誘導体）
本発明の他の実施形態において、ＢＰＦＩは、非天然にコードされたアミノ酸の側鎖上に存在するアルキン部分と反応する、アジド部分を含むＰＥＧ誘導体により修飾される。通常、ＰＥＧ誘導体は、１−１００ｋＤａ、およびいくつかの場合において１０−４０ｋＤａの範囲の平均分子量を有する。
【０４７０】
いくつかの実施形態において、アジド末端ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｎ３
（ここで、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、ｎは１００−１０００（すなわち、平均分子量が５−４０ｋＤａの間にある）である）を有する。
【０４７１】
他の実施形態において、アジド末端ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｐ−Ｎ３
（ここで、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、ｐは２−１０であり、ｎは１００−１０００（すなわち、平均分子量が５−４０ｋＤａの間にある）である）を有する。
【０４７２】
本発明の他の実施形態において、アルキン含有アミノ酸を含んでいるＢＰＦＩは、末端のアジド部分を含む分枝状ＰＥＧ誘導体であって、該分枝状ＰＥＧ誘導体の各鎖が１０−４０ｋＤａ、およびより好ましくは５−２０ｋＤａの範囲の分子量を有する分枝状ＰＥＧ誘導体により修飾される。例えば、いくつかの実施形態において、アジド末端ＰＥＧ誘導体は、以下の構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）］２ＣＨ（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−（ＣＨ２）pＮ３
（ここで、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）、ｍは２−１０であり、ｐは２−１０でり、かつｎは１００−１０００であり、かつＸは、任意にＯ、Ｎ、Ｓまたはカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）であって、いずれの場合においても存在してもしなくてもよい）を有する。
【０４７３】
（アルキン含有ＰＥＧ誘導体）
本発明の他の実施形態において、ＢＰＦＩは、非天然にコードされたアミノ酸の側鎖上に存在するアジド部分と反応する、アルキン部分を含むＰＥＧ誘導体により、修飾される。
【０４７４】
いくつかの実施形態において、アルキン末端ＰＥＧ誘導体は、以下の構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡ＣＨ
（ここで、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、ｎは１００−１０００（すなわち、平均分子量が５−４０ｋＤａの間にある）である）を有する。
【０４７５】
本発明の他の実施形態において、アルキン含有非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるＢＰＦＩは、アミド結合によってＰＥＧ骨格に連結している末端アジド部分、または末端アルキン部分を含むＰＥＧ誘導体により、修飾される。
【０４７６】
いくつかの実施形態において、アルキン末端ＰＥＧ誘導体は、以下の構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｐ−Ｃ≡ＣＨ
（ここで、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、ｐは２−１０であり、かつｎは１００−１０００である）を有する。
【０４７７】
本発明の他の実施形態において、アジド含有アミノ酸を含んでいるＢＰＦＩは、末端のアジド部分を含む分枝状ＰＥＧ誘導体であって、該分枝状ＰＥＧ誘導体の各鎖が１０−４０ｋＤａ、およびより好ましくは５−２０ｋＤａの範囲の分子量を有する分枝状ＰＥＧ誘導体により、修飾される。例えば、いくつかの実施形態において、アルキン末端ＰＥＧ誘導体は、以下の構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）］２ＣＨ（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−（ＣＨ２）ｐＣ≡ＣＨ
（ここで、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、ｐは２−１０であり、かつｎは１００−１０００であり、Ｘは、任意にＯ、Ｎ、Ｓ、またはカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）であるか、あるいは存在していない）を有する。
【０４７８】
（ホスフィン含有ＰＥＧ誘導体）
本発明の他の実施形態において、活性型官能基（例としては、エステル、カーボネートが挙げられるが、これらに限定されない）を含み、非天然にコードされたアミノ酸の側鎖上に存在するアジド部分と反応するアリールホスフィン基をさらに含んでいる、ＰＥＧ誘導体により、ＢＰＦＩは修飾される。通常、ＰＥＧ誘導体は、１−１００ｋＤａの範囲にある平均分子量を有するが、、いくつかの場合において、１０−４０ｋＤａの範囲にある平均分子量を有する。
【０４７９】
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ誘導体は、構造：
【０４８０】
【化１４】
2009514533.tif 000016
【０４８１】
（ここで、ｎは１−１０であり、ＸはＯ、Ｎ、またはＳであってもよいし、あるいは存在していなくてもよく、Ｐｈはフェニルであり、Ｗは水溶性ポリマーである）を有する。
【０４８２】
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ誘導体は、構造：
【０４８３】
【化１５】
2009514533.tif 000017
【０４８４】
（ここで、ＸはＯ、Ｎ、またはＳであってもよいし、あるいは存在していなくてもよく、Ｐｈはフェニルであり、Ｗは水溶性ポリマーであり、かつＲは、Ｈ、アルキル基、アリール基、置換アルキル基、および置換アリール基であってもよい）を有する。例示的なＲ基としては、−ＣＨ２、−Ｃ（ＣＨ３）、−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’−ハロゲン、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＣＮ、および−ＮＯ２が挙げられるが、これらに限定されない。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’およびＲ’’’’は、水素、置換もしくは非置換のヘテロアルキル基、置換もしくは非置換のアリール基（例としては、１−３のハロゲンで置換されたアリール基）、置換もしくは非置換のアルキル基、置換もしくは非置換のアルコキシ基、置換もしくは非置換のチオアルコキシ基、または置換もしくは非置換のアリールアルキル基を、それぞれ独立して指す。本発明の化合物が２つ以上のＲ基を含んでいるとき、例えば、Ｒ基のそれぞれは、これらの基が２つ以上存在するとき、それぞれＲ’基、Ｒ’’基、Ｒ’’’基およびＲ’’’’基として、独立して選択される。Ｒ’およびＲ’’が同じ窒素原子に付着しているとき、それらは、窒素原子と組み合わせて、５員環、６員環または７員環を形成し得る。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニル（例として挙げられており、これらに限定されない）を含むことを意図している。置換基の上述の議論から、当業者は、「アルキル」が、水素基以外の基と結合された炭素原子を含有する基（例えば、ハロアルキル（例としては、−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３が挙げられるが、これらに限定されない）およびアシル（例としては、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、および−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３などが挙げられるが、これらに限定されない））を包含することを意図されることを理解する。
【０４８５】
（他のＰＥＧ誘導体および通常のＰＥＧ付加技術）
ＢＰＦＩに連結され得る他の例示的なＰＥＧ分子および、ＰＥＧ化方法の例としては、米国特許出願公開第２００４／０００１８３８号明細書、米国特許出願公開第２００２／００５２００９号明細書、米国特許出願公開第２００３ ／０１６２９４９号明細書、米国特許出願公開第２００４／００１３６３７号明細書、米国特許出願公開第２００３／０２２８２７４号明細書、米国特許出願公開第２００３／０２２０４４７号明細書、米国特許出願公開第２００３／０１５８３３３号明細書、米国特許出願公開第２００３／０１４３５９６号明細書、米国特許出願公開第２００３／０１１４６４７号明細書、米国特許出願公開第２００３／０１０５２７５号明細書、米国特許出願公開第２００３／０１０５２２４号明細書、米国特許出願公開第２００３／００２３０２３号明細書、米国特許出願公開第２００２／０１５６０４７号明細書、米国特許出願公開第２００２／００９９１３３号明細書、米国特許出願公開第２００２／００８６９３９号明細書、米国特許出願公開第２００２／００８２３４５号明細書、米国特許出願公開第２００２／００７２５７３号明細書、米国特許出願公開第２００２／００５２４３０号明細書、米国特許出願公開第２００２／００４００７６号明細書、米国特許出願公開第２００２／００３７９４９号明細書、米国特許出願公開第２００２／０００２２５０号明細書、米国特許出願公開第２００１／００５６１７１号明細書、米国特許出願公開第２００１／００４４５２６号明細書、米国特許出願公開第２００１／００２７２１７号明細書、米国特許出願公開第２００１／００２１７６３号明細書、米国特許６，６４６，１１０号明細書、米国特許第５，８２４，７７８号明細書、米国特許第５，４７６，６５３号明細書、米国特許第５，２１９，５６４号明細書、米国特許第５，６２９，３８４号明細書、米国特許第５，７３６，６２５号明細書、米国特許第４，９０２，５０２号明細書、米国特許第５，２８１，６９８号明細書、米国特許第５，１２２，６１４号明細書、米国特許第５，４７３，０３４号明細書、米国特許第５，５１６，６７３号明細書、米国特許第５，３８２，６５７号明細書、米国特許第６，５５２，１６７号明細書、米国特許第６，６１０，２８１号明細書、米国特許第６，５１５，１００号明細書、米国特許第６，４６１，６０３号明細書、米国特許第６，４３６，３８６号明細書、米国特許第６，２１４，９６６号明細書、米国特許第５，９９０，２３７号明細書、米国特許第５，９００，４６１号明細書、米国特許第５，７３９，２０８号明細書、米国特許第５，６７２，６６２号明細書、米国特許第５，４４６，０９０号明細書、米国特許第５，８０８，０９６号明細書、米国特許第５，６１２，４６０号明細書、米国特許第５，３２４，８４４号明細書、米国特許第５，２５２，７１４号明細書、米国特許第６，４２０，３３９号明細書、米国特許第６，２０１，０７２号明細書、米国特許第６，４５１，３４６号明細書、米国特許第６，３０６，８２１号明細書、米国特許第５，５５９，２１３号明細書、米国特許第５，７４７，６４６号明細書、米国特許第５，８３４，５９４号明細書、米国特許第５，８４９，８６０号明細書、米国特許第５，９８０，��４８号明細書、米国特許第６，００４，５７３号明細書、米国特許第６，１２９，９１２号明細書、国際公開第９７／３２６０７号パンフレット、欧州特許第２２９，１０８号明細書、欧州特許第４０２，３７８号明細書、国際公開第９２／１６５５５号パンフレット、国際公開第９４／０４１９３号パンフレット、国際公開第９４／１４７５８号パンフレット、国際公開第９４／１７０３９号パンフレット、国際公開第９４／１８２４７号パンフレット、国際公開第９４／２８０２４号パンフレット、国際公開第９５／００１６２号パンフレット、国際公開第９５／１１９２４，国際公開第９５／１３０９０号パンフレット、国際公開第９５／３３４９０号パンフレット、国際公開第９６／０００８０号パンフレット、国際公開第９７／１８８３２号パンフレット、国際公開第９８／４１５６２号パンフレット、国際公開第９８／４８８３７号パンフレット、国際公開第９９／３２１３４号パンフレット、国際公開第９９／３２１３９号パンフレット、国際公開第９９／３２１４０号パンフレット、国際公開第９６／４０７９１号パンフレット、国際公開第９８／３２４６６号パンフレット、国際公開第９５／０６０５８号パンフレット、欧州特許第４３９  ５０８号明細書、国際公開第９７／０３１０６号パンフレット、国際公開第９６／２１４６９号パンフレット、国際公開第９５／１３３１２号パンフレット、欧州特許第９２１  １３１号明細書、国際公開第９８／０５３６３号パンフレット、欧州特許第８０９  ９９６号明細書、国際公開第９６／４１８１３号パンフレット、国際公開第９６／０７６７０号パンフレット、欧州特許第６０５  ９６３号明細書、欧州特許第５１０  ３５６号明細書、欧州特許第４００  ４７２号明細書、欧州特許第１８３  ５０３号明細書、および欧州特許第１５４  ３１６号明細書に記載されているものが挙げられる（これらは、引用によって本明細書に組み込まれる）。本明細書に記載されているＰＥＧ分子のいずれかは、あらゆる形態（例としては、単鎖、分枝鎖、マルチアーム鎖、単官能性、２官能性、多官能性またはこれらのあらゆる組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない）において使用され得る。
【０４８６】
（血清アルブミンに対する親和性の増強）
様々な分子を本発明のＢＰＦＩに融合することにより、ＢＰＦＩの血清における半減期を調製することもできる。いくつかの実施形態において、分子は、動物における内因性の血清アルブミンに対する親和性を増強するために本発明のＢＰＦＩに対して、連結または融合される。
【０４８７】
例えば、いくつかの場合において、ＢＰＦＩとアルブミン結合配列との組み換え融合体が作製される。例示的なアルブミン結合配列としては、連鎖球菌タンパク質  Ｇ由来のアルブミン結合ドメイン（例えば、「Makridesら, J. Pharmacol. Exp. Ther. 277:534-542 (1996)」、および「Sjolanderら, J, Immunol. Methods 201:115-123 (1997)」）、またはアルブミン結合ペプチド（例えば、「Dennis,ら, J. Biol. Chem. 277:35035-35043 (2002)」に記載されているようなもの）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４８８】
他の実施形態において、本発明のＢＰＦＩは、脂肪酸によりアシル化されている。いくつかの場合において、当該脂肪酸は、血清アルブミンとの結合を促進する。例えば、「Kurtzhals,ら, Biochem. J. 312:725-731 (1995) 」を参照のこと。
【０４８９】
他の実施形態において、本発明のＢＰＦＩは、血清アルブミン（例としては、ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これに限定されない）と直接的に融合されている。当業者は、多種多様な他の分子を本発明におけるＢＰＦＩに連結させることにより、血清アルブミンまたは他の血清成分との結合を調節できることも認識する。
【０４９０】
＜Ｘ．ＢＰＦＩの糖修飾＞
本発明は、サッカリド残基を有する１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸を組み込んでいるＢＰＦＩを包含する。サッカリド残基は、天然（例としては、Ｎ−アセチルグルコサミンが挙げられるが、これに限定されない）または非天然（例としては、３−フルオロガラクトースが挙げられるが、これに限定されない）のいずれかであり得る。サッカリドは、Ｎ結合型もしくはＯ結合型のグリコシド結合（例としては、Ｎ−アセチルガラクトース−Ｌ−セリンが挙げられるが、これに限定されない）、または非天然の結合（例としては、オキシム、または対応するＣ結合型もしくはＳ結合型のグリコシドが挙げられるが、これらに限定されない）によって、非天然に生じるアミノ酸に連結され得る。
【０４９１】
サッカリド（例としては、グリコシルが挙げられるが、これに限定されない）部分は、インビトロまたはインビボのいずれかにおいて、ＢＰＦＩに加えられ得る。本発明のいくつかの実施形態において、カルボニル含有非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるＢＰＦＩは、オキシム結合を介して連結された対応する糖修飾ポリペプチドを生成するために、アミノオキシ基により誘導体化されたサッカリドによって修飾される。非天然にコードされたアミノ酸に付着されると、サッカリドは、ＢＰＦＩに結合されたオリゴサッカリドを生成するために、糖転移酵素および他の酵素を用いた処理によってさらに精密化され得る。例えば、「H. Liu,ら J. Am. Chem. Soc. 125: 1702-1703 (2003) 」を参照のこと。
【０４９２】
本発明のいくつかの実施形態において、カルボニル含有非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるＢＰＦＩは、アミノオキシ誘導体として調製された明確な構造を有するグリカンによって、直接的に修飾される。当業者は、他の官能基（例としては、アジド、アルキン、ヒドラジド、ヒドラジンおよびセミカルバジド）が、非天然にコードされたアミノ酸に対する糖の連結に使用され得ることを認識する。
【０４９３】
本発明のいくつかの実施形態において、アジドまたはアルキニル含有非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるＢＰＦＩは、それから、アルキニル誘導体またはアジド誘導体（例として挙げられており、これらに限定されない）のそれぞれにより、ヒュイゲン［３＋２］付加環化反応（例として挙げられており、これらに限定されない）によって修飾され得る。この方法は、タンパク質を非常に高い選択性でもって修飾することを可能にする。
【０４９４】
＜ＸＩ．ＢＰＦＩ含有ダイマーおよびＢＰＦＩ含有マルチマー＞
また、本発明は、１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸を含む特定のＢＰＦＩが、別のＢＰＦＩ、類似体、またはそれらのバリアント、あるいは非ＢＰＦＩペプチドである他の任意のポリペプチドもしくはそのバリアントと、ポリペプチド骨格に対して直接に結合しているか、またはリンカーを介して結合しているＢＰＦＩの組み合わせ（例えば、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ホモマルチマー、またはヘテロマルチマー（すなわち、トリマー、テトラマーなど））を提供する。モノマーと比較して分子量が増大することに起因して、ＢＰＦＩダイマー接合体またはＢＰＦＩマルチマー接合体は、新たなまたは所望の性質を示し得る。そのような性質としては、例えば、モノマーのＢＰＦＩと比較して、異なる薬理学的性質、異なる薬物動態学的性質、異なる薬力学的性質、調整された治療的半減期、または調整された血しょう半減期が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明の接合体または融合体は、ＢＰＦＩとその受容体または結合パートナーとの相互作用を調整する。他の実施形態において、本発明のＢＰＦＩの接合体、融合体、ダイマーまたはマルチマーは、受容体アンタゴニスト、アゴニスト、スーパーアゴニスト（super agonist）または修飾因子として作用する。
【０４９５】
いくつかの実施形態において、ダイマーまたはマルチマーを含むＢＰＦＩに存在する１つ以上のＢＰＦＩは、受容体結合領域、または結合パートナーとの結合に関する領域に存在する、水溶性ポリマーに適合された非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる。いくつかの実施形態において、ＢＰＦＩは、Ａｓｎ−Ｌｙｓアミド結合またはＣｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合（例として挙げられるが、これらに限定されない）を介して、直接に連結される。いくつかの実施形態において、連結されたＢＰＦＩは、接合、融合、ダイマー化、マルチマー化（例としては、第１のＢＰＦＩの非天然にコードされたアミノ酸におけるアルキンと、第２非天然にコードされたアミノ酸におけるアジドとが、ヒュイゲン［３＋２］付加環化を介して接合されることが挙げられるが、これに限定されない）を容易にするために、異なる非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる。代替可能に、ケトン含有非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる、第１のＢＰＦＩおよび／または連結されたＢＰＦＩは、ヒドロキシルアミン含有非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる第２のＢＰＦＩと接合されてもよく、かつポリペプチドは、対応するオキシムの形成を介して反応する。
【０４９６】
代替可能に、２つのＢＰＦＩは、リンカーを介して連結されている。あらゆる異種または同種の２官能性リンカーは、同じまたは異なる主要な配列を有していてもよい２つのＢＰＦＩの連結に使用され得る。いくつかの場合において、複数のＢＰＦＩを一緒に繋げるために使用されるリンカーは、２官能性ＰＥＧ試薬であり得る。リンカーの分子量またはリンカーの分子の長さは、多種多様であり得る。より大きい、またはより小さい分子量のリンカーは、もしあるとすればＢＰＦＩと連結された物体との間、ＢＰＦＩとその結合パートナーとの間、または連結された物体とその結合パートナーとの間における所望の空間的関係または立体構造を提供するために、使用され得る。また、より長いまたはより短い分子長を有するリンカーは、もしあるとすればＢＰＦＩと連結された物体との間、ＢＰＦＩとその結合パートナーとの間、または連結された物体とその結合パートナーとの間における所望の空間または自由度を提供するために、使用される。同様に、特定の形状または立体構造を有するリンカーは、ＢＰＦＩがその標的に達する前または後のいずれかに、ＢＰＦＩまたは連結された物体に対して特定の形状または立体構造を与えるために利用され得る。ＢＰＦＩと連結された全体と結合パートナーとの間における空間的関係の最適化は、分子に対して新たな、調整された、または所望の性質を提供し得る。
【０４９７】
いくつかの実施形態において、本発明は、（ａ）ポリマー骨格の少なくとも第１末端上におけるアジド、アルキン、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミンまたはカルボニル含有部分；（ｂ）ポリマー骨格の第２末端上における少なくとも第２官能基を含むダンベル構造を有する、水溶性２官能性リンカーを提供する。第２官能基は、第１官能基と同じであってもよいし、異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、第２官能基は、第１官能基と反応しない。いくつかの実施形態において、本発明は、分枝状の分子構造の少なくとも１つの腕を含んでいる水溶性化合物を提供する。例えば、分枝状の分子構造は、樹脂状であり得る。
【０４９８】
いくつかの実施形態において、本発明は、構造：
Ｒ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｘ
（ここで、ｎは約５から３０００までであり、ｍは２−１０であり、Ｘは、アジド、アルキン、ヒドラジン、ヒドラジド、アミノオキシ基、ヒドロキシルアミン、アセチル、またはカルボニル含有部分であってもよく、かつＲは、Ｘと同じであってもよいか、異なってもよいキャッピング基、官能基、または脱離基である）を有する水溶性活性型ポリマーとの反応によって形成される、１つ以上のＧＨスーパーファミリーのメンバーを含んでいるマルチマーを提供する。例えば、Ｒは、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、アルコキシル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、１−ベンゾトリアゾリルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネート、１−ベンゾトリアゾリルカーボネート、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水酸化物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性型スルホン、アミン、アミノオキシ、保護されたアミン、ヒドラジド、保護されたヒドラジド、保護されたチオール、カルボン酸、保護されたカルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレート、トレシレート、アルケン、ならびにケトンからなる群から選択される官能基であり得る。
【０４９９】
＜ＸＩＩ．ＢＰＦＩ活性の測定、ならびにＢＰＦＩ受容体または結合パートナーに対するＢＰＦＩの親和性＞
ＢＰＦＩ活性は、標準的なインビトロアッセイまたはインビボアッセイを用いて決定され得る。
【０５００】
多くのアッセイが、本発明のＢＰＦＩの活性を監視するためし使用され得る。抗ウイルス活性アッセイは、Budgeら J. or Virology 2004 May; 78(10);5015-5022に記載されているように（例としては、抗原減少アッセイ、ウイルス付着の阻害アッセイ、およびウイルス感染性の付着後阻害アッセイが挙げられるが、これらに限定されない）、実施され得る。ＢＰＦＩの合胞体形成の阻害能を試験するインビトロアッセイは、Pasteyら Nature Medicine 2000; 6(l):35-40に記載されているように、使用され得る。付加的なアッセイとしては、細胞間融合アッセイ、競合的なＥＬＩＳＡアッセイが挙げられ、かつＲＳＶ用の動物モデルがまた、Pasteyら Nature Medicine 2000 Jan; 6(l):35-40に記載されているように、使用され得る。付加的なアッセイの例としては、ＲＳＶに感染した細胞における細胞病理効果（ＣＰＥ）の誘導を測定する細胞に基づくアッセイ、ＲＳＶレポーターウイルスを利用する感染アッセイ、ならびにＲＳＶのＡ株およびＢ株上におけるペプチドの効果を試験するアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。代替可能に、当業者に公知の他の多くのアッセイ（例としては、抗ウイルス活性を測定する他のアッセイ（例としては、ウイルス侵入またはウイルス融合を測定するアッセイが挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない）が、本発明のＢＰＦＩの活性の測定に使用され得る。また、別の抗ウイルス剤を用いた組み合わせ治療を試験するこれらのアッセイの改良は、当業者にとって公知である。
【０５０１】
また、当業者によく知られている標準的な方法は、非レトロウイルス活性のアッセイに利用され得る。例えば、呼吸器合胞体ウイルス活性およびパラインフルエンザウイルス活性のアッセイ技術の議論については、Pringleら（「Pringle, C. R.ら, 1985, J. Medical Virology 17:377-386」）を参照のこと。さらに、例えば、そのような技術の通常の総論については、「"Zinsser Microbiology", 1988, Joklik, W. K.ら, eds., Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 19th ed」を参照のこと。これらの参考文献は、引用によってその全体が本明細書に組み込まれる。そのような研究の例としては、毒性の研究が挙げられるが、これに限定されない。
【０５０２】
ＢＰＦＩ類似体を作り出すために使用される方法に関係なく、当該類似体は、生物活性に関するアッセイに供される。通常、生物活性に関する試験は、所望の結果（例えば、（非変更のＢＰＦＩと比較した）生物活性、（非変更のＢＰＦＩと比較した）異なる生物活性、受容体もしくは結合パートナーの親和性分析、（非変更のＢＰＦＩと比較した）ＢＰＦＩ自体もしくは結合パートナーの立体構造もしくは構造の変化、または血中半減期の分析における増加または減少）に対する分析を提供すべきである。
【０５０３】
アッセイの方法論に関する参考文献の上述した収集は、網羅的ではなく、かつ当業者は、所望の目的結果にとっての試験に有用な他のアッセイを認識する。
【０５０４】
＜ＸＩＩＩ．力価、機能的なインビボ半減期、および薬物動態的要因の測定＞
本発明の重要な態様は、水溶性ポリマー部分に対するポリペプチドの接合を用いてか、用いないかのいずれかにおけるＢＰＦＩの構築によって得られる延長された生物学的半減期である。ＢＰＦＩの血中濃度の急速な低下が、接合または非接合のＢＰＦＩ、およびそれらのバリアントを用いた処理に対する生物学的反応の評価を重要にしている。好ましくは、本発明の接合または非接合のＢＰＦＩ、およびそれらのバリアントは、静脈内投与の後にもまた、例えば、ＥＬＩＳＡ法、または主なスクリーニングアッセイによって測定を可能である、延長された血中半減期を有する。インビボにおける生物学的半減期の測定は、本明細書に記載されているように実施され得る。
【０５０５】
非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるＢＰＦＩに関する薬物動態的要因は、通常のＳＤ（Sprague-Dawley）ラットのオス（処理群ごとにＮ＝５の動物）において評価され得る。動物は、静脈内に２５μｇ／ラット、または皮下に５０μｇ／ラットの単回投与を受け、かつおよそ５−７血液サンプルが所定の時間経過（通常、水溶性ポリマーに接合されていない非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるＢＰＦＩに関して約６時間、および水溶性ポリマーに接合された非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるＢＰＦＩに関して約４日にわたって）に従って採取される。
【０５０６】
細胞に対するＲＳＶの侵入およびウイルス性融合を阻害するＢＰＦＩ能力は、インビトロにおいて（例えば、合胞体アッセイ、感染性アッセイにおいて）、またはインビボにおいて（例えば、適切な動物モデルにおいてまたはヒトにおいて）評価され得る。
【０５０７】
本発明に基づくＢＰＦＩの特異的な活性は、当該分野において公知の様々なアッセイによって決定され得る。本発明に従って得られ、そして精製された、ＢＰＦＩ変異タンパク質、またはその断片の生物活性は、本明細書に記載された、もしくは引用された、または当業者に公知の方法によって試験され得る。
【０５０８】
＜ＸＩＶ．投与および薬学的組成物＞
本発明のポリペプチドまたはタンパク質（例としては、１つ以上の非天然アミノ酸を含んでいるＢＰＦＩ、シンテターゼ、タンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない）は治療的使用（例としては、適切な薬学的担体との組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない）に任意に採用され得る。例えば、そのような組成物は、治療的有効量の化合物、および薬学的に許容可能な量の担体もしくは賦形剤を含んでいる。そのような担体または賦形剤の例としては、生理食塩水、緩衝化された生理食塩水、ぶどう糖、水、グリセロール、エタノールおよび／またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。調合物は、投与の様式に合わせて作製される。通常、タンパク質の投与法法は、当該分野において公知であり、かつ本発明のポリペプチドの投与に適用され得る。
【０５０９】
本発明の１つ以上のポリペプチドを含んでいる治療的組成物を、効率、組織代謝の確認、および用量の確立のために、当該分野においてよく知られる方法に従って、適切な１つ以上のインビトロ、および／またはインビトロの疾患モデル動物において、必要に応じて試験することができる。特に、比較アッセイにおいて、（例えば、１以上の非天然アミノ酸を含むように修飾されたＢＰＦＩと、天然アミノ酸のＢＰＦＩとの比較により）天然アミノ酸相同物に対する本明細書における非天然アミノ酸の活性、安定性、または他の適切なものを測定することにより、用量を最初に決定することができる。
【０５１０】
投与は、分子を血液または組織細胞と最終的に接触するように導入するために一般的に使用される経路のいずれかによるものである。本発明の非天然アミノ酸ポリペプチドは、あらゆる適切な様式において、必要に応じて１つ以上の薬学的に許容可能な担体とともに、投与される。本発明に照らして、患者に対してそのようなポリペプチドを投与する適切な方法は、利用可能であるが、２つ以上の経路が特定の組成物の投与に使用されてもよく、ある特定の経路は、他の経路よりも早く、かつ効果的な作用または反応をしばしば提供する。
【０５１１】
薬学的に許容可能な担体は、投与される特定の組成物によってだけでなく、当該組成物の投与に使用される特定の方法によって、部分的に決定される。従って、本発明の薬学的組成物の適切な調合物は、広範囲である。
【０５１２】
ポリペプチド組成物は、多くの経路（例としては、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮、皮下、局所、舌下、直腸の手段が挙げられるが、これらに限定されない）によって投与され得る。また、修飾または非修飾の非天然アミノ酸ポリペプチドを含んでいる組成物は、リポソームを介して投与され得る。そのような投与経路および適切な製剤は、当業者に、通常に公知である。
【０５１３】
また、非天然アミノ酸を、単独に、または他の適切な成分とともに含んでいるＢＰＦＩを、吸入を介して投与されるエアロゾル製剤（例えば、それらを「霧状化」することができる）に作製することができる。エアロゾル製剤は、加圧可能な噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、および窒素など）に入れられてもよい。
【０５１４】
非経口投与（例えば、動脈内（関節における）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、および皮下の経路といった）に好適な製剤の例としては、水性および非水性の等張性無菌注入溶液、ならびに水性および非水性の無菌懸濁液が挙げられる。上記等張性無菌注射溶液は、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤、および意図される受容物の血液と製剤を等張にする溶液を含んでいてもよい。また、上記無菌懸濁液は、懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および防腐剤を含んでいてもよい。ＢＰＦＩの製剤は、単回投与または多回投与の密閉した容器（例えば、アンプルおよびバイアル）に存在し得る。
【０５１５】
非経口的投与および静脈内投与は、好ましい投与方法である。特に、天然アミノ酸相同物治療にすでに利用している投与経路（例としては、ＧＬＰ−１、ＤＰ−１７８、ＰＹＹ、ＥＰＯ、ＧＨ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ、インターロイキン、抗体、および／またはあらゆる他の薬学的に誘導されたポリペプチドもしくはタンパク質に対して、一般的に利用される経路が挙げられるが、これに限定されない）は、現在の使用されている製剤とともに、本発明のポリペプチドにとって好ましい投与経路および製剤を提供する。
【０５１６】
本発明に照らして、患者に投与される用量は、適用に応じて、長時間にわたって患者に有益な治療反応を引き起こすのに十分な量である（例えば、病原体による感染、または他の適切な活性を阻害するのに十分な量が挙げられるが、これらに限定されない）。用量は、（ｉ）特定のベクターもしくは製剤の効率、（ｉｉ）採用される非天然アミノ酸ポリペプチドの活性、安定性、もしくは血中半減期、（ｉｉｉ）患者の状態、および（ｉｖ）治療される患者の体重または表面積によって決定される。また、用量の大きさは、特定の患者における特定のベクター、または製剤などの投与に付随するあらゆる有害な副作用の存在、性質および程度によって決定される。
【０５１７】
疾病（癌、遺伝疾病、糖尿病、またはＡＩＤＳが含まれるが、これらに限定されない）の治療または予防において投与されるベクターまたは製剤の有効量を決定するときには、医師は、循環している血漿のレベル、製剤の毒性、疾病の経過および／または関連する抗非天然アミノ酸ポリペプチド抗体の産生を評価する。
【０５１８】
例えば、７０キログラムの患者に投与される用量は、現在使用されている治療的タンパク質の用量と一般的に同等な範囲内にあるが、関連する組成物の活性または血中半減期が変更されると調節される。本発明のベクターは、あらゆる公知の従来の治療（例としては、抗体投与、ワクチン投与、細胞毒性薬剤の投与、天然アミノ酸ポリペプチドの投与、核酸の投与、ヌクレオチド類似体の投与、および生物学反応調整因子の投与などが挙げられる）による治療条件を補うことができる。
【０５１９】
投与に関して、本発明の製剤は、関連する製剤のＬＤ−５０もしくはＥＤ−５０、および／または様々な濃度における非天然アミノ酸のあらゆる副作用の観察によって決定される割合（例としては、患者の大部分のおよび総合的な健康状態に適合するような割合が挙げられるが、これに限定されない）において、投与される。投与は、単回の、または分けられた用量によって、達成され得る。
【０５２０】
製剤の注入を受ける患者が発熱、悪寒、または筋肉痛を呈したとき、彼／彼女は、適切な用量のアスピリン、イブプロフェン、アセトアミノフェンまたは他の痛覚／熱制御薬物を摂取する。注入に対する反作用（例えば、発熱、筋肉痛および悪寒）を感じる患者は、さらなる注入の３０分前に、アスピリン、アセトアミノフェン、または例えば、ジフェンヒドラミンが挙げられるが、これらに限定されないものを、前投与される。メペリジンは、解熱剤および抗ヒスタミン剤に対してすぐに反応を示さない、より重症な悪寒および筋肉痛に使用される。細胞注入は、反応の重症度に依存して、減速され、かつ中断される。
【０５２１】
本発明のヒトＢＰＦＩは、哺乳類の被検体に直接に投与され得る。投与は、被検体に対するＢＰＦＩの導入に普通に使用されるあらゆる経路による。本発明の実施形態に係るＢＰＦＩ組成物は、経口、直腸、局所、吸入（例としては、エアロゾルを介するものが挙げられるが、これに限定されない）、口腔（例としては、舌下が挙げられるが、これに限定されない）、膣、非経口（例としては、皮下、筋肉内、皮内、関節内、胸膜内、腹腔内、大脳内、動脈内がまたは静脈内挙げられるが、これらに限定されない）、局所（例えば、気道表面を含めた皮膚および粘膜表面の両方）、および経皮の投与に好適な組成物が挙げられるが、あらゆる任意の場合において、もっとも適した経路は、治療される病気の性質および重症度に依存する。投与は、局所的または全身性のいずれかであり得る。化合物の製剤は、単回投与または多回投与の密閉した容器（例えば、アンプルおよびバイアル）に存在し得る。本発明のＢＰＦＩは、薬学的に許容可能な担体を用いて、単回投与の注入可能な形態（溶液、懸濁液または乳剤が含まれるが、これらに限定されない）における混合物に調製され得る。また、本発明のＢＰＦＩは、持続的な注入（例としては、ミニポンプ（例えば、浸透圧ポンプ）が挙げられるが、これに限定されないものを用いて）単回の大量瞬時投与、または緩性放出のデポー製剤によって投与され得る。
【０５２２】
投与に好適な製剤は、水性および非水性の等張性無菌注入溶液、ならびに、水性および非水性の無菌懸濁液が挙げられる。上記等張性無菌注入溶液は、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤、および意図される受容物の血液と製剤を等張にする溶液を含んでいてよい。また、上記無菌懸濁液は、懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および防腐剤を含んでいてもよい。溶液および懸濁液は、これまでに説明した種類の無菌の粉剤、顆粒剤および錠剤から調製され得る。
【０５２３】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体を含んでいてもよい。薬学的に許容可能な担体は投与される特定の組成物によってだけでなく、当該組成物の投与に用いられる特定の方法によって、部分的に決定される。従って、本発明の薬学的組成物の適切な製剤（必要に応じて、薬学的に許容可能な担体、賦形剤または安定剤を含んでいる）は、広範囲である（例えば、「Remington 's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. 1985」を参照のこと）。
【０５２４】
適切な担体は、リン酸塩、ホウ酸塩、ＨＥＰＥＳ、クエン酸塩、および他の有機酸を含む緩衝液；酸化防止剤（例としては、アスコルビン酸が挙げられる）；低分子（約１０残基以下）ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；疎水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；単糖、２糖および他の炭水化物（例としては、グルコース、マンノースまたはデキストリンが挙げられる）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；２価の金属イオン（例えば、亜鉛、コバルト、または銅）；糖アルコール（例えば、マンニトール、またはソルビトール）；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；および／または非イオン性の界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商標）またはＰＥＧ）を含む。
【０５２５】
また、本発明のＢＰＦＩ（例としては、水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）と連結しているものが挙げられるが、これに限定されない）は、徐放性の系によって、または徐放性の系の一部として投与され得る。徐放性組成物は、例えば、造形品の形態における半透性のポリマーマトリクス（例としては、フィルムまたはマイクロカプセルが挙げられるが、これらに限定されない）を含むが、これに限定されない。徐放性マトリクスとしては、生物適合性材料（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（「Langerら, J. Biomed. Mater. Res., 15: 267-277 (1981) 」；「Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982) 」）、エチレンビニルアセテート（上述のLangerら）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシブチル酸（欧州特許第１３３，９８８号明細書）、ポリラクチド（ポリ酪酸）（米国特許第３，７７３，９１９号明細書；欧州特許第 ５８，４８１号明細書）、ポリグリコリド（polyglycolide）（グリコール酸のポリマー）、ポリラクチド  コ−グリコリド（polylactide co-glycolide）（酪酸およびグリコール酸のコポリマー）ポリ無水物、Ｌ−グルタミン酸およびガンマ−エチル−Ｌ−グルタミンのコポリマー（「Sidmanら, Biopolymers, 22, 547-556 (1983) 」）、ポリ（オルト）エステル、ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、カルボン酸、脂肪酸、リン脂質、多糖、核酸、ポリアミノ酸、アミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシン）、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドンおよびシリコン）に由来するものが挙げられる。また、徐放性組成物の例としては、リポソームに取り込まれた化合物（liposomally entrapped compound）が挙げられる。化合物を含むリポソームは、本質的に公知の方法（独国特許第３，２１８，１２１号明細書、「Eppsteinら, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 82: 3688-3692 (1985) 」、「Hwangら, Proc. Natl Acad. Sci U.S.A., 77: 4030-4034 (1980) 」、欧州特許第５２，３２２号明細書、欧州特許第３６，６７６号明細書、欧州特許第８８，０４６号明細書、欧州特許第１４３，９４９号明細書、欧州特許第１４２，６４１号明細書、日本国特許出願公開第８３−１１８００８号明細書、米国特許第４，４８５，０４５号明細書、米国特許第４，５４４，５４５号明細書、および欧州特許第１０２，３２４号明細書）によって調製される。引用した参考文献および特許のすべては、引用によって本明細書に組み込まれる。
【０５２６】
リポソームに取り込まれたＢＰＦＩは、例えば、独国特許第３，２１８，１２１号明細書、「Eppsteinら, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 82: 3688-3692 (1985) 」、「Hwangら, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 77: 4030-4034 (1980) 」、欧州特許第５２，３２２号明細書、欧州特許第３６，６７６号明細書、欧州特許第８８，０４６号明細書、欧州特許第１４３，９４９号明細書、欧州特許第１４２，６４１号明細書、日本国出願公開８３−１１８００８号明細書、米国特許第４，４８５，０４５号明細書、米国特許第４，５４４，５４５号明細書、および欧州特許第１０２，３２４号明細書に記載された方法によって調製され得る。リポソームの組成と大きさとは、当業者によって、よく知られており、かつ経験的に容易に決定され得る。リポソームのいくつかの例としては、「Park JW,ら, Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1327-1331 (1995) 」、「Lasic D and Papahadjopoulos D (eds): MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOMES (1998) 」、「Drummond DC,ら, Liposomal drug delivery systems for cancer therapy, in Teicher B (ed): CANCER DRUG DISCOVERY AND DEVELOPMENT (2002)」、「Park JW,ら, Clin. Cancer Res. 8:1172-1181 (2002) 」、「Nielsen UB,ら, Biochtm. Biophys. Acta 1591(1-3): 109-118 (2002)」、「Mamot C,ら, Cancer Res. 63: 3154-3161 (2003)」に記載の通りである。引用した参考文献および特許のすべては、引用によって本明細書に組み込まれる。
【０５２７】
本発明に照らして、患者に対して投与される用量は、長期にわたって被検体における有益な反応を引き起こすほど十分な量であるべきである。一般的に、非経口投与される本発明のＢＰＦＩの治療的有効量の一回あたりの合計は、患者の体重の、約０．０１μｇ／ｋｇ／日から約１００μｇ／ｋｇ、または約０．０５μｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇの範囲であるが、これは、治療的な自由裁量を前提にしている。また、投与の頻度は、治療的な自由裁量を前提にしており、かつヒトにおける使用に関して承認されている市販のＢＰＦＩ産物よりも、高い頻度または低い頻度であり得る。通常に、本発明のＰＥＧ化されたＢＰＦＩは、上述した投与経路のいずれかから投与され得る。
【０５２８】
＜ＸＶ．本発明のＢＰＦＩの治療的使用＞
本発明のＢＰＦＩは、多種多様な疾患の治療に有用である。
【０５２９】
本発明のＢＰＦＩ産物の投与は、ヒトにおける他のＢＰＦＩ調製物によって実証されている活性のいずれかを結果として生じる。ＢＰＦＩアゴニストまたはＢＰＦＩアンタゴニストによって影響され得る疾患を、病気もしくは疾病の一部としてまたは単独で、患っているヒトの患者に、様々な手段によって投与するのに効果的な強度になるように、ＢＰＦＩ産物を含んでいる薬学的組成物を製剤してもよい。ＢＰＦＩ産物の平均分量は、変化してもよく、かつ特に、有資格医師の提案および処方に基づくべきである。ＢＰＦＩの正確な量は、被検体よりも、治療される病気の正確な種類、治療される患者の状態だけでなく、組成物における他の成分といった要因に基づいている。また、本発明は、治療的有効量の他の活性剤の投与を提供する。投与される量は、ＢＰＦＩを用いた治療に基づいて当業者によって容易に決定され得る。
【０５３０】
ＢＰＦＩの治療的利用の例としては、ＲＳＶ感染の治療、ＲＳＶの侵入阻害、他のエンベロープウイルス（例としては、ＨＩＶが挙げられるが、これに限定されない）の侵入阻害が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のＢＰＦＩは、抗ウイルス活性を示すことが好ましい。ＢＰＦＩは、ＲＳＶに対する予防に使用される。ペプチドは、それ自体として、非感染細胞に対するヒトウイルス、非ヒトウイルスおよびレトロウイルス（特にＨＩＶ）の伝播の阻害に使用され得る。本発明のペプチドによって伝播が阻害され得るヒトレトロウイルスの例としては、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２、ならびにヒトＴリンパ球ウイルス（ＨＴＬＶ−ＩおよびＩＩ）のすべての株が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のペプチドによって伝播が阻害される非ヒトレトロウイルスの例としては、ウシ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルスおよびネコ白血病ウイルス、サル免疫不全ウイルス、サル肉腫ウイルスおよびサル白血病ウイルス、ヒツジ進行性肺炎ウイルス（sheep progress pneumonia viruses）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のペプチドによって伝播が阻害される非レトロウイルスの例としては、ヒト呼吸器合胞体ウイルスが挙げられるが、これに限定されない。本発明は、少なくとも１つの他の薬物療法学（例としては、抗ウイルス剤が挙げられるが、これに限定されない）と当該ペプチドの組み合わせ治療を用いた、上述の非レトロウイルスの治療をさらに包含する。
【０５３１】
ペプチドの他の例は、ｇｐ４１の細胞外部分のカルボキシル末端のへリックスセグメントであるＨＩＶ−１ＬＡＩの膜貫通型タンパク質（ＴＭ）  ｇｐ４１の６３８から６７３アミノ酸残基に対応するペプチドである、Ｔ−２０（ＤＰ−１７８）である。ｇｐ４１の細胞外部分は、提唱されたアミノ末端のジッパードメイン（ＤＰ１０７）である、別のαへリックス領域を有している。ＤＰ−１０７は、ウイルスの融合を阻害することによって、強力な抗ウイルス活性を示す。それは、ＨＩＶ−１ＬＡＩの膜貫通型ｇｐ４１タンパク質の５５８から５９５残基に対応する３８アミノ酸ペプチドである。ＤＰ−１０７を用いた研究から、インビトロの研究および動物のいずれにおいても、無害であることが証明されている。米国特許第５，６５６，４８０号明細書（引用によって本明細書に組みこまれる）には、ＤＰ−１０７およびその抗ウイルス活性が記載されている。
【０５３２】
Ｔ−２０は、ウイルス融合阻害剤として作用することによって、細胞へのＨＩＶの侵入を阻害する。ＨＩＶの融合過程は、十分に特徴づけられている。ＨＩＶは、ｇｐ１２０を介して、ＣＤ４受容体に結合する。そして、この受容体への結合により、ｇｐ１２０において、一連の立体構造変化が起こると、ｇｐ１２０は、その補助受容体（コレセプター）であるＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４に結合することができる。受容体と補助受容体とに結合した後、ｇｐ１２０は、融合過程を開始するためにｇｐ４１を露出する。ｇｐ４１は、７回繰り返し１および２（ＨＲ１および２）という２つの領域を有している。ＨＲ１として同定される細胞外ドメインは、ジッパードメインと提案されたアミノ末端である、αへリックスの領域である。ＨＲ１は、ｇｐ４１のＨＲ２と一緒になって、ヘアピンを形成する。このヘアピンにより形成される構造は、６つのへリックスの束である。該束により、細胞膜の近傍にＨＩＶエンベロープが配置され、２つの膜の間において融合が引き起こされる。Ｔ−２０は、ｇｐ４１の膜貫通糖タンパク質である第１ヘプタドリピート（ＨＲ１）に結合することによって、ウイルス融合に必要な立体構造変化を抑制する。つまり、Ｔ−２０がｇｐ４１のＨＲ１領域に結合することによって、６つのへリックスの束の形成が妨害される。ＨＩＶのｇｐ４１タンパク質のＤＰ１０７とＤＰ１７８とのドメイン（すなわちＨＲ１とＨＲ２とのドメイン）は、非共有結合的に互いに複合体を形成し、それらの相互作用は、ＨＩＶの正常な感染に必要である。ＤＰ１０７とＤＰ１７８との相互作用、および／またはＤＰ１０７様ペプチドとＤＰ１７８様ペプチドとの相互作用とを阻止する化合物は、抗ウイルス剤を含む抗融合剤であるといえる。
【０５３３】
ＤＰ−１７８は、ＨＩＶ−１に媒介されるＣＤ−４＋の細胞−細胞融合（すなわち合胞体形成）と、細胞に含まれないＨＩＶ−１ウイルスによるＣＤ−４＋細胞への感染とに対する強力な阻害剤として作用する。そのような抗レトロウイルス活性には、感染されていないＣＤ−４＋細胞へのＨＩＶの感染の阻害が含まれるが、これに限定されない。ＤＰ−１７８は、低濃度において作用する。さらに、ＤＰ−１７８は、インビトロの研究と動物とにおいて無害であることが示された。ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２のＤＰ１７８に対応する領域におけるアミノ酸の保存が記載されている。
【０５３４】
米国特許第５，４６４，９３３号明細書、米国特許第６，１３３，４１８号明細書、米国特許第６，７５０，００８号明細書、および米国特許第６，８２４，７８３号明細書（これら全ては参照によって本明細書に組み込まれる）には、ＨＩＶの感染に関係する融合事象の阻害に使用することに関する、ＤＰ−１７８ペプチドの使用可能性が記載されている。
【０５３５】
（１）抗ウイルス活性を示し、および／または、（２）ＨＩＶ−１以外のレトロウイルスと非レトロウイルスとにおけるコイルド−コイルペプチド構造に関する、細胞内プロセスを調整する能力、もしくは抗膜融合能を示す、ＤＰ１７８とＤＰ−１０７との部分、相同体、および類似体、ならびに、ＤＰ１７８／ＤＰ１０７、ＤＰ１７８−様ペプチド／ＤＰ１０７−様ペプチド、またはＨＲ１／ＨＲ２の相互作用の調整剤が、調べられた。そのような研究におけるウイルスには、サル免疫不全ウイルス（米国特許第６，０１７，５３６号明細書）、呼吸器合胞体ウイルス（米国特許第６，２２８，９８３号明細書、米国特許第６，４４０，６５６号明細書、米国特許第６，４７９，０５５号明細書、米国特許第６，６２３，７４１号明細書）、エプスタインバーウイルス（米国特許第６，０９３，７９４号明細書、米国特許第６，５１８，０１３号明細書）、パラインフルエンザウイルス（米国特許第６，３３３，３９５号明細書）、インフルエンザウイルス（米国特許第６，０６８，９７３号明細書、米国特許第６，０６０，０６５号明細書）、および麻疹ウイルス（米国特許第６，０１３，２６３号明細書）が含まれる。なお、上記文献の全ては、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０５３６】
市販品のＤＰ−１７８は、フゼオン（Ｆｕｚｅｏｎ（登録商標）（エンフビルチド（ｅｎｆｕｖｉｒｔｉｄｅ）, Roche Laboratories Inc. and Trimeris, Inc.）である。フゼオン（Ｆｕｚｅｏｎ（登録商標））は、アセチル化されたＮ末端と、Ｃ末端としてのカルボキサミドとを有しており、以下の１次アミノ酸配列によって表される、ＣＨ３ＣＯ−ＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮＷＦ−ＮＨ２。抗レトロウイルス療法を継続しているにもかかわらず、ＨＩＶ−１の複製を示すＨＩＶ−１患者に、フゼオン（Ｆｕｚｅｏｎ（登録商標））は、他の抗ウイルス剤と組み合わされて使用される。
【０５３７】
参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，４６４，９３３号明細書および米国特許第６，８２４，７８３号明細書には、ＤＰ−１７８、ＤＰ−１７８の断片、類似体、および相同体が記載されており、例えば、アミノ末端およびカルボキシ末端に、切断、置換、挿入、欠失、付加、または巨大分子担体基を有する分子、ならびに、アミノ末端および／またはカルボキシ末端に疎水性の基などの化学基が存在するＤＰ−１７８分子が挙げられるが、これらに限定されない。さらに別のバリアントには、例えば、米国特許第６，８３０，８９３号明細書に記載のバリアント、および、米国特許第６，８６１，０５９号明細書に開示のＤＰ−１７８の誘導体が含まれるが、これらに限定されない。Ｔ−２０のハイブリッドポリペプチドの一組は、特に限定されないが、米国特許第６，６５６，９０６号明細書、米国特許第６，５６２，７８７号明細書、米国特許第６，３４８，５６８号明細書、および米国特許第６，２５８，７８２号明細書に記載されており、ＤＰ−１７８の毒性融合体は、米国特許第６，６２７，１９７号明細書に記載されている。
【０５３８】
ＨＡＡＲＴ（高活性抗レトロウイルス療法）は、数種類の抗ウイルス剤からの薬物を組み合わせて、ウイルス量を減少させる標準的なＨＩＶの療法である。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，８６１，０５９号明細書には、ＤＰ−１７８もしくはＤＰ−１０７、またはそれらの誘導体と、少なくとも１つの他の抗ウイルス治療剤との組み合わせを用いた、ＨＩＶ−１複製の阻害方法とＨＩＶ−１感染の治療方法とが開示されている。上記他の抗ウイルス治療剤としては、逆転写酵素阻害剤（例えば、ＡＺＴ、ｄｄＩ、ｄｄＣ、ｄｄＡ、ｄ４Ｔ、３ＴＣ、または他のジデオキシヌクレオチドもしくはジデオキシフルオロヌクレオシド）、またはＨＩＶ−１プロテアーゼの阻害剤（例えば、インディナビル、リトナビル）が挙げられる。また、他の抗ウイルス剤としては、例えば、サイトカイン（例えば、ｒＩＦＮα、ｒＩＦＮβ、ｒＩＮＦγ）、ウイルスｍＲＮＡのキャッピングの阻害剤（例えばリバビリン）、ＨＩＶプロテアーゼの阻害剤（例えば、ＡＢＴ−５３８およびＭＫ−６３９）、抗ＨＩＶ活性を有する脂質結合分子としてのアンフォテリシンＢ、および糖タンパク質のプロセッシング阻害剤としてのカスタノスペルミン（ｃａｓｔａｎｏｓｐｅｒｍｉｎｅ）が挙げられる。他の抗ウイルス剤（逆転写酵素阻害剤、インテグラーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、サイトカインアンタゴニスト、およびケモカイン受容体の調整剤が含まれるが、これらに限定されない）とＴ−２０との組み合わせ療法として可能性のあるものは、米国特許第６，８５５，７２４号明細書、米国特許第６，８４４，３４０号明細書、米国特許第６，８４１，５５８号明細書、米国特許第６，８３３，４５７号明細書、米国特許第６，８２５，２１０号明細書、米国特許第６，８１１，７８０号明細書、米国特許第６，８０９，１０９号明細書、米国特許第６，８０６，２６５号明細書、米国特許第６，７６８，００７号明細書、米国特許第６，７５０，２３０号明細書、米国特許第６，７０６，７０６号明細書、米国特許第６，６９６，４９４号明細書、米国特許第６，６７３，８２１号明細書、米国特許第６，６７３，７９１号明細書、米国特許第６，６６７，３１４号明細書、米国特許第６，６４２，２３７号明細書、米国特許第６，５９９，９１１号明細書、米国特許第６，５９６，７２９号明細書、米国特許第６，５９３，３４６号明細書、米国特許第６，５８９，９６２号明細書、米国特許第６，５８６，４３０号明細書、米国特許第６，５４１，５１５号明細書、米国特許第６，５３８，００２号明細書、米国特許第６，５３１，４８４号明細書、米国特許第６，５１１，９９４号明細書、米国特許第６，５０６，７７７号明細書、米国特許第６，５００，８４４号明細書、米国特許第６，４９８，１６１号明細書、米国特許第６，４７２，４１０号明細書、米国特許第６，４３２，９８１号明細書、米国特許第６，４１０，７２６号明細書、米国特許第６，３９９，６１９号明細書、米国特許第６，３９５，７４３号明細書、米国特許第６，３５８，９７９号明細書、米国特許第６，２６５，４３４号明細書、米国特許第６，２４８，７５５号明細書、米国特許第６，２４５，８０６号明細書、および米国特許第６，１７２，１１０号明細書を含む多くの参考文献に記載されている。
【０５３９】
ＤＰ−１７８用の送達系として可能性のあるものは、例えば、米国特許第６，８４４，３２４号明細書、および米国特許第６，７０６，８９２号明細書に記載の送達系が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、Ｔ−２０を封入体において製造する方法は、米国特許第６，８５８，４１０号明細書に記載されている。
【０５４０】
また、Ｔ２０／ＤＰ１７８、Ｔ２１／ＤＰ１０７、およびこれらの断片は、Ｎ−ホルミルペプチド受容体（ＦＰＲの一員）と相互作用することが発見されている。Ｔ−２０は、ヒト食細胞に存在するＮ−ホルミルペプチド受容体（「Suら (1999) Blood 93(11):3885-3892」）を活性化し、かつ単球と好中球との化学遊走物質および活性化物質である（米国特許第６，８３０，８９３号明細書を参照のこと）。ＦＲＰ分類受容体は、Ｇ−タンパク質共役型のＳＴＭ受容体である。このＳＴＭ受容体は、化学遊走物質であるｆＭＬＰ（Ｎ−ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン）と結合し、また単球の化学走性、および病原体に対する宿主免疫応答の誘導に関与している。原型ＦＲＰ分類受容体であるＦＲＰは、高い親和性によりｆＭＬＰと結合し、低濃度のｆＭＬＰによって活性化される。ｆＭＬＰによるＦＲＰの結合は、食細胞の接着、化学走化性、酸素中間体（oxygen intermediates）の放出、ファゴサイトーシスの促進、および細菌の殺害、ならびにＭＡＰキナーゼの活性化、および遺伝子転写を導くＧタンパク質に媒介されるシグナル伝達事象のカスケードを誘導する（「Krumpら, J Biol Chem 272:937 (1997)」、「Prossnitzら, Pharmacol Ther 74:73 (1997)」、「Murphy, Annu. Rev. Immuno. 12: 593 (1994)」、および「Murphy, The N-formyl peptide chemotactic receptors, Chemoattractant ligands and their receptors. CRC Press, Boca Raton, p. 269 (1996) 」）。他のＦＰＲ分類受容体は、ＦＰＲＬ１と名付けられた（ＦＰＲＨ２およびＬＸＡ４Ｒとも呼ばれる）、ＦＲＰに対して高い相同性を有するバリアントである。ＦＰＲＬ１は、オーファン受容体としてクローニングされたが（「Murphyら, J. Biol. Chem., 267:7637-7643 (1992) 」、「Yeら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 184:582-589 (1992)」、「Baoら, Genomics, 13:437-440 (1992)」、「Gao, J. L. and P. M. Murphy, J. Biol. Chem., 268:25395-25401 (1993)」、および「Nomuraら, Int. Immunol., 5:1239-1249 (1993)」）、その後に、高濃度のｆＭＬＰに応答してＣａ２＋の流動を仲介することが発見された（「Yeら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 184:582-589 (1992)」、および「Gao, J. L. and P. M. Murphy, J. Biol. Chem., 268:25395-25401 (1993)」）。
【０５４１】
〔実施例〕
以下の実施例は、説明のために提供されており、特許請求の範囲に記載されている発明を限定するものではない。
【０５４２】
〔実施例１〕
本実施例は、ＢＰＦＩに非天然にコードされたアミノ酸を組み込む好ましい部位を選択するための多くの見込みのある一連の基準のいくつかを説明する。ＨＲ−Ｃに由来する最適なペプチド候補物が、設計される。基準（例えば、ペプチド発現、安定性、へリックスの性向、および抗ウイルス活性）は、最適なＲＳＶペプチド融合阻害剤を同定するために評価される。アミノ酸配列のコンピューターに基づく解析に従って、へリックス形成に最適なペプチドが、発現ベクターにクローニングされる。可変の長さのペプチドは、ＲＳＶ  Ｆタンパク質のＨＲ−Ｃ領域（４７４から５２３の位置）内において、生合成的に産生される。当該ペプチドの画分は、へリックス性向を増強した状態にするために、へリックスに好都合な公知の戦略（例としては、へリックス末端キャッピング、トリプトファンケージ（tryptophan cages）および塩橋が挙げられる）を用いて操作される。特異的な制限酵素部位を有している、各単一のペプチドのＤＮＡコード領域は、発現ベクターへ素早くクローニングするために、商業的に合成される。
【０５４３】
生合成的に産生されたペプチドは、生物活性に関してアッセイされる。ペプチドは、ペプチドが最良のへリックス性向を示すことを決定するために、ＣＤ（円偏光二色性）によって分析される。
【０５４４】
、部位特異的な配置と構造的な仕組みとの組み合わせを利用して、ポリエチレングリコール側鎖が共有結合した後でも、ＲＳＶ阻害効力を保持している、ＨＲ−Ｃ類似体ペプチドが開発される。ＨＲ−Ｃ類似体とＲｈｏＡに由来する陰イオン性ペプチドとの間の２官能性ヘテロダイマーペプチドが、開発される。ＨＲ−Ｃの構造データを用いて（「Zhaoら Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Dec 19;97(26): 14172-7」）、１つのペプチドまたは複数のペプチドにおけるＰＥＧ結合位置が、溶媒暴露、および暴露されたヘリックス表面に基づいて、選択される。また、突然変異体は、選択されたペプチドコード領域の各位置において、ペプチドの各位置にｐＡｃＦを組み込む可能性を提供するアンバーコドンで置換することにより、コンストラクトされる（５０までの異なる突然変異体が生成される）。抑圧効率は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、アンバーコドンで置換された突然変異体に関して評価される。上記位置のそれぞれが、抑圧効率に関して評価される。ｐＡｃＦ（パラ−アセチルフェニルアラニン）で置換されたペプチドは、生合成的に産生され、かつ３０ｋＤａのＰＥＧを用いてｐＡｃＦの上にＰＥＧ付加される。ＲＳＶペプチド類似物の抗ウイルス活性は、細胞に基づくアッセイにおいて、試験される。抗ウイルス活性および合胞体形成の阻害をさらに評価するために、初代のヒト呼吸器上皮細胞を用いた細胞−細胞融合アッセイなどのアッセイが使用されるが、これに限定されない。ＲＳＶ  Ｆタンパク質に対する候補ペプチドの結合が、実施される。ｐＡｃＦ置換され、かつＰＥＧ付加されたペプチドのへリックス性向および安定性を決定するために、該ペプチドに対して円偏光二色性（ＣＤ）および示差走査熱量測定（ＤＳＣ）が実施される。
【０５４５】
ＨＲ−Ｃ類似物ペプチドと連結、またはマルチマー化することができるＧＴＰａｓｅ  ＲｈｏＡ配列に由来する陰イオン性低ペプチド（例としては、１５ｍｅｒから１９ｍｅｒまでが挙げられるが、これに限定されない）、およびＨＲ−Ｃ由来ペプチドから構成される、ヘテロダイマーペプチド分子またはマルチマーペプチド分子が、設計される。二重特異性ペプチドが、最良のＨＲ−Ｃ候補物およびＧＴＰａｓｅ  ＲｈｏＡ由来ペプチドを用いて、作り出される。合成的に産生された長さが可変する５つの陰イオン性ＲｈｏＡペプチドは、抗ウイルスアッセイにおいて試験される。１つ以上のＲｈｏＡ由来ペプチドは、非天然アミノ酸ｐＡｃＦと接続するリンカーを介して１つ以上のＨＲ−Ｃ類似体ペプチドに連結される。結合は、最大の生物学的活性を有する分子を得るために、２つのペプチドの間において変更される。この結合（リンカーの長さは、可変し得る）から、抗ウイルス活性（例としては、特異的な細胞受容体に対するＲＳＶの付着を妨害する能力、および細胞膜に対するウイルス融合を阻害する能力が含まれるが、これらに限定されない）について試験される二重特異性ペプチドが形成される。２つの別々の阻害機序が利用されるので、この種の二重特異性ペプチド構築物は、増強された抗ウイルス性の有効性を提供し得る。二重特異性ペプチドは作製され、抗ウイルスアッセイおよび細胞融合アッセイにおいて、試験される。図１３は、ＲＳＶに対するＢＰＦＩの作用機序として可能性のあるものの概略図である。
【０５４６】
〔実施例２〕
本実施例では、E. coliにおける、非天然にコードされたアミノ酸を含むＢＰＦＩの発現が、詳しく述べられている。
【０５４７】
直交化ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）および直交化アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含んでいる、導入された翻訳系は、非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるＢＰＦＩ発現に使用される。Ｏ−ＲＳは、非天然にコードされたアミノ酸を用いてＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。次々に、翻訳系は、コードされるセレクターコドンに応じて、非天然にコードされたアミノ酸をＢＰＦＩに挿入する。
【０５４８】
【表１】
2009514533.tif 000018
【０５４９】
修飾されたＢＰＦＩ遺伝子、および（所望の非天然にコードされたアミノ酸に特異的な）直交化アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡの対を含んでいるプラスミドを用いた、E. coliの形質転換によって、ＢＰＦＩへの非天然にコードされたアミノ酸の部位特異的な組み込みが可能になる。０．０１−１００ｍＭの範囲の特定の非天然にコードされたアミノ酸を含む培養液において３７℃において成長させられた、形質転換されたE. coliは、高い忠実度および効率でもって修飾されたＢＰＦＩを発現する。
【０５５０】
〔実施例３〕
本実施例では、カルボニル含有アミノ酸の導入、およびその後のアミノオキシ含有ＰＥＧとの反応が、詳しく述べられている。
【０５５１】
本実施例では、ケトン含有非天然にコードされたアミノ酸を組み込んだ後に、およそ５０００ＭＷのアミノオキシ含有ＰＥＧと反応させられるＢＰＦＩの生成方法が実証される。例えば、ＢＰＦＩにおける残基のそれぞれは、以下の構造：
【０５５２】
【化１６】
2009514533.tif 000019
【０５５３】
を有する非天然にコードされたアミノ酸により、別々に置換される。
【０５５４】
ＢＰＦＩへのｐ−アセチルフェニルアラニンの部位特異的な組み込みに利用された配列、配列番号２（ｍｕｔｔＲＮＡ、M. jannaschii  ｍｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡ）、および配列番号１４、１５もしくは１６（ＴｙｒＲＳＬＷ１、５または６）を、上記実施例２に記載した。
【０５５５】
修飾されるとすぐに、カルボニル含有アミノ酸を含んでいるＢＰＦＩバリアントは、Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＮＨ２という形態のアミノオキシ含有ＰＥＧ誘導体と反応させられる（ここで、Ｒはメチルであり、ｎは３であり、かつＮはおよそ５０００ＭＷである）。ｐＨ６．０の２５ｍＭのＭＥＳ（Sigma Chemical, St. Louis, MO）、ｐＨ７．０の２５ｍＭのＨｅｐｅｓ（Sigma Chemical, St. Louis, MO）、またはｐＨ４．５の１０ｍＭの酢酸ナトリウム（Sigma Chemical, St. Louis, MO）に、１０ｍｇ／ｍＬになるように溶解されたｐ−アセチルフェニルアラニンを含んでいる精製ＢＰＦＩは、１０−１００倍だけ過剰のアミノオキシ含有ＰＥＧと反応させられ、それから室温において１０−１６時間、攪拌される（「Jencks, W. J. Am. Chem. Soc. 1959, 81, pp 475」）。そして、ＰＥＧ−ＢＰＦＩは、迅速な精製および分析を目的として適切な緩衝液に希釈される。
【０５５６】
〔実施例４〕
アミド結合を介してＰＥＧと連結したヒドロキシルアミン基からなるＰＥＧとの接合。
【０５５７】
以下の構造：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＮＨ２
（ここで、Ｒはメチルであり、ｎは４であり、かつＮはおよそ２００００ＭＷである）
を有するＰＥＧ試薬は、実施例３に記載された手法を用いて、ケトン含有非天然にコードされたアミノ酸と結合される。反応条件、精製条件、および分析条件は、実施例３における説明と同様である。
【０５５８】
〔実施例５〕
本実施例では、ＢＰＦＩへの２の異なる非天然にコードされたアミノ酸の導入が、詳しく述べられている。
【０５５９】
本実施例は、２つの位置にケトン機能性基を含んでいる、非天然にコードされたアミノ酸を組み込むＢＰＦＩの生成方法を実証する（ここで、Ｘ＊は非天然にコードされたアミノ酸を表す）。ＢＰＦＩは、セレクターコドンが核酸内の２の異なる部位に導入されることを除いて、実施例１および２における説明と同様に調製される。
【０５６０】
〔実施例６〕
本実施例では、ヒドラジド含有ＰＥＧに対するＢＰＦＩの接合と、その後のインサイチュ−での還元が、詳しく述べられている。
【０５６１】
カルボニル含有アミノ酸を組み込んでいるＢＰＦＩは、実施例２および３に記載された手法に従って調製される。修飾された後、以下の構造、Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２（ここで、Ｒはメチルであり、ｎは２であり、かつＮは１００００ＭＷであり、Ｘはカルボニル（Ｃ＝Ｏ）である）を有するヒドラジド含有ＰＥＧは、ＢＰＦＩと接合される。ｐ−アセチルフェニルアラニンを含んでいる精製ＢＰＦＩは、ｐＨ６．０の２５ｍＭのＭＥＳ（Sigma Chemical, St. Louis, MO）、ｐＨ７．０の２５ｍＭのＨｅｐｅｓ（Sigma Chemical, St. Louis, MO）、またはｐＨ４．５の１０ｍＭの酢酸ナトリウム（Sigma Chemical, St. Louis, MO）に、０．１−１０ｍｇ／ｍＬの間になるように溶解される。それから、１−１００倍だけ過剰のヒドラジド含有ＰＥＧと反応させられ、水に溶解された１ＭのＮａＣＮＢＨ３（Sigma Chemical, St. Louis, MO）のストック溶液を１０−５０ｍＭの最終濃度になるように添加されることによって、インサイチューで、対応するヒドラゾンが還元される。反応は、４℃から室温の暗所において、１８−２４時間、実施される。迅速に精製するために、約ｐＨ７．６の１ＭのＴＲＩＳ（Sigma Chemical, St. Louis, MO）を、Ｔｒｉｓの最終濃度が５０ｍＭになるまで添加されるか、または適切な緩衝液に希釈されることによって、反応が停止される。
【０５６２】
〔実施例７〕
本実施例では、ＢＰＦＩへのアルキン含有アミノ酸の導入、およびｍＰＥＧ−アジドを用いた誘導体化が、詳しく述べられている。
【０５６３】
ＢＰＦＩの残基のいずれかは、以下の非天然にコードされたアミノ酸：
【０５６４】
【化１７】
2009514533.tif 000020
【０５６５】
によりそれぞれ置換される。
【０５６６】
ＢＰＦＩへのｐ−プロパルギルチロシンの部位特異的な組み込みに利用された配列、配列番号２（ｍｕｔｔＲＮＡ、M. jannaschii  ｍｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡ）、および配列番号７、８もしくは９を上記実施例２に記載した。プロパルギルチロシンを含んでいるＢＰＦＩは、E. coliにおいて発現され、かつ実施例３に記載された条件を用いて精製された。
【０５６７】
プロパルギルチロシンを含んでいる精製ＢＰＦＩは、ＰＢ緩衝液（１００ｍＭのリン酸ナトリウム、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝８）に、０．１−１０ｍｇ／ｍＬの間になるように溶解され、そして、１０−１０００倍だけ過剰のアジド含有ＰＥＧが、反応混合物に加えられる。それから、触媒量のＣｕＳＯ４および銅線(Cu wire)が、反応混合物に加えられる。混合物がインキュベート（室温もしくは３７℃において４時間、または４℃において一昼夜が含まれるが、これらに限定されない）された後に、Ｈ２Ｏが加えられる。そして、混合物は、透析膜を通してろ過される。試料は、実施例３に記載された手法と同様の手法（例として挙げるがこれに限定されない）によって、付加に関して分析され得る。
【０５６８】
本実施例では、ＰＥＧは、以下の構造：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−Ｎ３
（ここで、Ｒはメチルであり、ｎは４であり、かつＮは１００００ＭＷである）を有する。
【０５６９】
〔実施例８〕
本実施例では、プロパルギルチロシンによる、ＢＰＦＩにおける大きな疎水性アミノ酸の置換が、詳しく述べられている。
【０５７０】
ＢＰＦＩ内に存在するＰｈｅ残基、Ｔｒｐ残基またはＴｙｒ残基は、実施例７に記載された以下の非天然にコードされたアミノ酸：
【０５７１】
【化１８】
2009514533.tif 000021
【０５７２】
により置換される。
【０５７３】
修飾されると、ＰＥＧは、アルキン含有アミノ酸を含んでいるＢＰＦＩバリアントと付着させられる。ＰＥＧは、以下の構造：
Ｍｅ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｎ３
を有し、結合手法は、実施例７における手法に従う。これにより、ポリペプチド内の異なる部位をＰＥＧ誘導体により修飾されており、天然に生じる大きな疎水性アミノ酸の１つとおよそ等電子配置性である非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる、ＢＰＦＩバリアントが生成する。
【０５７４】
〔実施例９〕
本実施例では、１つ以上のＰＥＧリンカーによって隔てられた、ＢＰＦＩのホモダイマー、ヘテロダイマー、ホモマルチマー、またはヘテロマルチマーの生成が、詳細に述べられている。
【０５７５】
実施例７において産生されたアルキン含有ＢＰＦＩバリアントは、以下の形態の２官能性ＰＥＧ誘導体と反応させられる：
Ｎ３−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ３；
（ここで、ｎは４であり、２つのＢＰＦＩがＰＥＧによって物理的に隔てられている対応するＢＰＦＩホモダイマーを生成するためにＰＥＧは、およそ５０００の平均ＭＷを有する）。類似の様式では、ＢＰＦＩは、ヘテロダイマー、ホモマルチマー、またはヘテロマルチマーを形成するために１つ以上の他のポリペプチドと結合され得る。結合、精製および分析は、実施例７および３の場合のように実施される。
【０５７６】
〔実施例１０〕
本実施例は、ＢＰＦＩとサッカリド部分との結合が、詳細に述べられている。
【０５７７】
ＢＰＦＩの１残基は、実施例３に記載されているように、以下の非天然にコードされたアミノ酸：
【０５７８】
【化１９】
2009514533.tif 000022
【０５７９】
により置換される。
【０５８０】
修飾されると、カルボニル含有アミノ酸を含んでいるＢＰＦＩバリアントは、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）のβ結合アミノオキシ類似体と反応させられる。ＢＰＦＩバリアント（１０ｍｇ／ｍＬ）およびアミノオキシサッカリド（２１ｍＭ）は、１００ｍＭの酢酸ナトリウム水溶液緩衝液（ｐＨ５．５）において混合され、かつ３７℃において７から２６時間インキュベートされる。第２のサッカリドは、第１のサッカリドに酵素により結合させられる。すなわち、この結合は、サッカリド結合ＢＰＦＩ（５ｍｇ／ｍＬ）、ＵＤＰ−ガラクトース（１６ｍＭ）、およびβ−１，４−ガラシトシルトランスフェラーゼ（０．４ユニット／ｍＬ）を、１５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）溶液において、環境温度で４８時間インキュベートすることによって、実施される（「Schanbacherら J. Biol. Chem. 1970, 245, 5057-5061」）。
【０５８１】
〔実施例１１〕
本実施例では、ＰＥＧ付加されたＢＰＦＩアンタゴニストの生成が、詳しく述べられている。
【０５８２】
ＢＰＦＩの１残基は、実施例３に記載されたように以下の非天然にコードされたアミノ酸：
【０５８３】
【化２０】
2009514533.tif 000023
【０５８４】
により置換される。
【０５８５】
修飾されるとすぐに、カルボニル含有アミノ酸を含んでいるＢＰＦＩは、以下の形態のアミノオキシ含有ＰＥＧ誘導体と反応させられる：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＮＨ２
（ここで、Ｒはメチルであり、ｎは４であり、ポリペプチド内の単一の部位がＰＥＧ誘導体により修飾されている、非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるＢＰＦＩアンタゴニストを生成するためにＮは２００００ＭＷである）。結合、精製、および分析は、実施例３の場合のように実施される。
【０５８６】
〔実施例１２：ＢＰＦＩ分子が直接に連結されているＢＰＦＩのホモダイマー、ホモマルチマー、またはヘテロマルチマー〕
アルキン含有アミノ酸を含んでいるＢＰＦＩバリアントは、アジド含有アミノ酸を含んでいる他のＢＰＦＩバリアントと直接に結合され得る。当該２つのＢＰＦＩバリアントのそれぞれは、非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる。類似の様式において、ＢＰＦＩは、ヘテロダイマー、ホモマルチマー、またはヘテロマルチマーを形成するために、１つ以上の他のポリペプチドと結合され得る。結合、精製および分析は、実施例３、６および７の場合のように実施される。
【０５８７】
〔実施例１３〕
ＰＥＧ−ＯＨ＋Ｂｒ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＲ’（Ａ）→ＰＥＧ−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＲ’（Ｂ）
ポリアルキレングリコール（Ｐ−ＯＨ）は、ハロゲン化アルキル（Ａ）と反応して、エーテル（Ｂ）を形成する。これらの化合物において、ｎは１から９までの整数であり、Ｒ’は、直鎖状もしくは分枝鎖状の、飽和もしくは不飽和の、Ｃ１からＣ２０のアルキル基またはヘテロアルキル基であり得る。また、Ｒ’は、飽和もしくは不飽和のＣ３からＣ７の環状アルキルもしくは環状ヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリール基もしくはヘテロアリール基、または置換もしくは非置換のアルカリル基（アルキルは置換または非置換のＣ１からＣ２０のアルキルである）もしくはヘテロアルカリル基であり得る。典型的に、ＰＥＧ−ＯＨは、８００から４００００ダルトン（Ｄａ）の分子量を有する、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）である。
【０５８８】
〔実施例１４〕
ｍＰＥＧ−ＯＨ＋Ｂｒ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ
２００００Ｄａの分子量を有するｍＰＥＧ−ＯＨ（ｍＰＥＧ−ＯＨ  ２０ｋＤａ；２．０ｇ、０．１ｍｍｏｌ、Sunbio）を、ＮａＨ（１２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３５ｍｌ）溶液を用いて処理した。それから、キシレン（０．５６ｍＬ、５ｍｍｏｌ、５０当量、Aldrich）に８０％重量溶液として溶解されたプロパルギルブロマイドの溶液、および触媒量のＫＩを、溶液に加えて、その後生じた混合液を、２時間、加熱して還流させた。それから、水（１ｍＬ）を加え、溶媒を減圧条件下において除去した。残留物にＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）を加え、有機層を分離した。それから無水Ｎａ２ＳＯ４の上において乾燥させて、容積をおよそ２ｍＬまで減少させた。このＣＨ２Ｃｌ２溶液を、ジエチルエーテル（１５０ｍＬ）に対して滴下して加えた。生じた沈殿物を回収し、冷したジエチルエーテルを用いて数回、洗浄した後、乾燥することにより、プロパルギル−Ｏ−ＰＥＧを得た。
【０５８９】
〔実施例１５〕
ｍＰＥＧ−ＯＨ＋Ｂｒ−（ＣＨ２）３−Ｃ≡ＣＨ→ｍＰＥＧ−Ｏ−（ＣＨ２）３−Ｃ≡ＣＨ
２００００Ｄａの分子量を有するｍＰＥＧ−ＯＨ（ｍＰＥＧ−ＯＨ  ２０ｋＤａ；２．０ｇ、０．１ｍｍｏｌ、Sunbio）を、ＮａＨ（１２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（３５ｍｌ）を用いて処理した。それから、１５当量の５−ブロモ−１−ペンチン（０．５３ｍｌ、５ｍｍｏｌ、Aldrich）、および触媒量のＫＩを、混合物に加えた。生じた混合物を、１６時間、加熱して還流させた。それから、水（１ｍＬ）を加え、溶媒を減圧条件下において除去した。残留物にＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）を加え、有機層を分離した。それから無水Ｎａ２ＳＯ４の上において乾燥させて、容積をおよそ２ｍＬまで減少させた。このＣＨ２Ｃｌ２溶液を、ジエチルエーテル（１５０ｍＬ）に対して滴下して加えた。生じた沈殿物を回収し、冷したジエチルエーテルを用いて数回、洗浄した後、乾燥することにより、対応するアルキンを得た。５−クロロ−１−ペンチンが同様の反応に使用されてもよい。
【０５９０】
〔実施例１６〕
（１）ｍ−ＨＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＯＨ＋ＮａＯＨ＋Ｂｒ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ→ｍ−ＨＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ
（２）ｍ−ＨＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ＋ＭｓＣｌ＋Ｎ（Ｅｔ）３→ｍ−ＭｓＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ
（３）ｍ−ＭｓＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ＋ＬｉＢｒ→ｍ−Ｂｒ−ＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ
（４）ｍＰＥＧ−ＯＨ＋ｍ−Ｂｒ−ＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２Ｃ≡ＣＨ→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ
まず、３−ヒドロキシベンジルアルコール（２．４ｇ、２０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５０ｍＬ）と水（２．５ｍＬ）との溶液に、粉末状の水酸化ナトリウム（１．５ｇ、３７．５ｍｍｏｌ）を加え、それから、キシレン（３．３６ｍＬ，３０ｍｍｏｌ）に８０％重量溶液として溶解された、プロパルギルブロマイドの溶液を加えた。反応混合物を、６時間、還流させながら加熱した。混合物に１０％クエン酸（２．５ｍＬ）を加え、溶媒を減圧条件下において除去した。残留物を、エチルアセテート（３×１５ｍＬ）を用いて抽出し、混合性の有機層を飽和ＮａＣｌ溶液（１０ｍＬ）を用いて洗浄した。それからＭｇＳＯ４上において乾燥して、濃縮することにより、３−プロパギルオキシベンジルアルコールを得た。
【０５９１】
メタンスルホニルクロライド（２．５ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）、およびトリエチルアミン（２．８ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）を、０℃において化合物３（２．０ｇ、１１．０ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２の溶液に加え、反応物を１６時間、冷却装置に置いた。メシレートが、淡黄色の油状物として、普通に徐々に生じた。この油状物（２．４ｇ、９．２ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶解し、ＬｉＢｒ（２．０ｇ、２３．０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、１時間、加熱して還流させて、それから、室温まで冷却した。混合物に対して水（２．５ｍＬ）を加え、溶媒を減圧条件下において除去した。残留物を、エチルアセテート（３×１５ｍＬ）を用いて抽出し、混合性の有機層を飽和ＮａＣｌ溶液（１０ｍＬ）を用いて洗浄した。それから無水Ｎａ２ＳＯ４上において乾燥して、濃縮することにより、所望の臭化物を生じさせた。
【０５９２】
２０ｋＤａのｍＰＥＧ（１．０ｇ、０．０５ｍｍｏｌ、Sunbio）を、ＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶解してから、溶液を氷槽において冷却した。ＮａＨ（６ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を、数分間にわたって激しく攪拌しながら加え、続いて、上述のものから得られた臭化物（２．５５ｇ、１１．４ｍｍｏｌ）と、触媒量のＫＩとを加えた。冷却槽を取り除き、生じた混合物を、１２時間、加熱して還流させた。水（１．０ｍＬ）を混合物に加えて、溶媒を減圧条件下において除去した。残留物にＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）を加え、有機層を分離した。無水Ｎａ２ＳＯ４上において乾燥し、容積をおよそ２ｍＬまで減少させた。エーテル溶液（１５０ｍＬ）に滴下しながら添加することにより、白色沈殿を生じさせた。該白色沈殿を回収して、ＰＥＧ誘導体を得た。
【０５９３】
〔実施例１７〕
ｍＰＥＧ−ＮＨ２＋Ｘ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＲ’→ｍＰＥＧ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＲ’
末端アルキン含有ポリ（エチレングリコール）ポリマーはまた、上記に示したようなアルキン機能性基を含む反応分子に、末端の官能基を含むポリ（エチレングリコール）ポリマーを結合させることによって得ることができる。ｎは１から１０の間である。Ｒ’は、ＨまたはＣ１からＣ４までの低アルキル基であり得る。
【０５９４】
〔実施例１８〕
（１）ＨＯ２Ｃ−（ＣＨ２）２−Ｃ≡ＣＨ＋ＮＨＳ＋ＤＣＣ→ＮＨＳＯ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−Ｃ≡ＣＨ
（２）ｍＰＥＧ−ＮＨ２＋ＮＨＳＯ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−Ｃ≡ＣＨ→ｍＰＥＧ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−Ｃ≡ＣＨ
４−ペンチノ酸（pentynoic acid）（２．９４３ｇ、３．０ｍｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）に溶解した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（３．８０ｇ、３．３ｍｍｏｌ）およびＤＣＣ（４．６６ｇ、３．０ｍｍｏｌ）を加え、溶液を室温において一昼夜、攪拌した。生じた粗製ＮＨＳエステル７を、以下の反応において、これ以上精製すること無く使用した。
【０５９５】
５０００Ｄａの分子量を有するｍＰＥＧ−ＮＨ２（ｍＰＥＧ−ＮＨ２、１ｇ、Sunbio）を、ＴＨＦ（５０ｍＬ）に溶解してから、混合物を４℃に冷却した。ＮＨＳエステル７（４００ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を、少量づつ激しく攪拌しながら加えた。室温まで温めながら、混合物を３時間、攪拌し続けた。それから水（２ｍＬ）を加えて、溶媒を減圧条件下において除去した。残留物にＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）を加えて、有機層を分離した。そして無水Ｎａ２ＳＯ４上において乾燥し、容積をおよそ２ｍＬまで減少させた。このＣＨ２Ｃｌ２溶液を、滴下しながらエーテル（１５０ｍＬ）に加えた。生じた沈殿物を、回収した後、減圧下で乾燥した。
【０５９６】
〔実施例１９〕
本実施例は、ポリ（エチレングリコール）のメタンスルホネートまたはメシレートとも呼ばれる、ポリ（エチレングリコール）のメタンスルホニルエステルの調製を説明する。対応するトシレートおよびハロゲン化物は、同様の手法によって調製され得る。
ｍＰＥＧ−ＯＨ＋ＣＨ３ＳＯ２Ｃｌ＋Ｎ（Ｅｔ）３→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＳＯ２ＣＨ３→ｍＰＥＧ−Ｎ３。
【０５９７】
ｍＰＥＧ−ＯＨ（ＭＷ＝３４００、２５ｇ、１０ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（１０５ｍＬ）を、窒素下において２時間、共沸蒸留して、溶液を室温まで冷却した。４０ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２およびおよび２．１ｍＬの乾燥トリエチルアミン（１５ｍｍｏｌ）を溶液に加えた。溶液を氷槽において冷却し、１．２ｍＬの蒸留メタンスルホニルクロライド（１５ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。溶液を窒素下の室温において一昼夜、攪拌した。反応を２ｍＬの無水エタノールの添加によって抑制した。混合物を減圧条件下において蒸発させて、主にトルエン以外の溶媒を除去した。さらに、混合物をろ過し、再び減圧条件下において濃縮し、それから、１００ｍＬのジエチルエーテルに沈殿させた。ろ過物を、冷やしたジエチルエーテルを用いて数回、洗浄して、減圧条件下において乾燥することにより、メシレートが得られた。
【０５９８】
メシレート（２０ｇ、８ｍｍｏｌ）を、７５ｍＬのＴＨＦに溶解してから、溶液を４℃に冷却した。冷却した溶液にアジ化ナトリウム（１．５６ｇ、２４ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を窒素条件下において２時間、加熱して還流した。それから、溶媒を蒸発させて、残留物をＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）を用いて希釈した。有機画分をＮａＣｌ溶液を用いて洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上において乾燥した。容積を２０ｍｌまで減少させて、１５０ｍＬの冷やした無水エーテルを添加することによって沈殿させた。
【０５９９】
〔実施例２０〕
（１）Ｎ３−Ｃ６Ｈ４−ＣＯ２Ｈ→Ｎ３−Ｃ６Ｈ４ＣＨ２ＯＨ
（２）Ｎ３−Ｃ６Ｈ４ＣＨ２ＯＨ→Ｂｒ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−Ｎ３
（３）ｍＰＥＧ−ＯＨ＋Ｂｒ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−Ｎ３→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−Ｎ３
４−アジドベンジルアルコールを、引用によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，９９８，５９５号明細書に記載されている方法を用いて、産生することができる。メタンスルホニルクロライド（２．５ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）およびトリエチレンアミン（２．８ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）を、０℃において４−アジドベンジルアルコール（１．７５ｇ、１１．０ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２溶液に加え、反応物を、１６時間、冷却装置に置いた。メシレートは淡黄色の油状物として通常に徐々に生じた。この油状物（９．２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶解してから、ＬｉＢｒ（２．０ｇ、２３．０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１時間、加熱して還流し、それから、室温にまで冷却した。混合物に水（２．５ｍＬ）を加え、溶媒を減圧条件下において除去した。残留物を、エチルアセテート（３×１５ｍＬ）を用いて抽出し、組み合わせた有機層を飽和ＮａＣｌ溶液（１０ｍＬ）を用いて洗浄した。無水Ｎａ２ＳＯ４上において乾燥し、濃縮することにより、所望の臭化物を生じさせた。
【０６００】
２０ｋＤａのｍＰＥＧ−ＯＨ（２．０ｇ、０．１ｍｍｏｌ、Sunbio）を、ＮａＨ（１２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３５ｍＬ）を用いて処理し、上記臭化物（３．３２ｇ、１５ｍｍｏｌ）を触媒量のＫＩとともに混合物に加えた。その結果生じた混合物を１２時間、加熱して還流した。水（１．０ｍＬ）を混合物に加え、溶媒を減圧条件下において除去した。残留物にＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）を加え、有機層を分離した。それから無水Ｎａ２ＳＯ４上において乾燥して、容積をおよそ２ｍＬまで減少させた。エーテル溶液（１５０ｍＬ）に滴下しながら添加することにより、沈殿を生じさせた。該沈殿を回収して、ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−Ｎ３を得た。
【０６０１】
〔実施例２１〕
ＮＨ２−ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ＋Ｎ３−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２−ＮＨＳ→Ｎ３−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ
ＮＨ２−ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ（３４００ＤａのＭＷ、２．０ｇ）を、ＮａＨＣＯ３の飽和水溶液（１０ｍＬ）に溶解して、溶液を０℃まで冷却した。３−アジド−１−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドプロピオネート（５当量）を激しく攪拌しながら加えた。３時間後に２０ｍＬのＨ２Ｏを加え、混合物を室温においてさらに４５分間、攪拌した。０．５ＮのＨ２ＳＯ４を用いて、ｐＨを３に調節した。そしてＮａＣｌを１５重量％の濃度になるまで加えた。ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ×３）を用いて、反応混合物を抽出してから、Ｎａ２ＳＯ４の上において乾燥し、濃縮した。冷やしたジエチルエーテルを用いて沈殿させた後に、ろ過によって産物を回収し、減圧条件下において乾燥することにより、オメガ−カルボキシ−アジドＰＥＧ誘導体が得られた。
【０６０２】
〔実施例２２〕
ｍＰＥＧ−ＯＭｓ＋ＨＣ≡ＣＬｉ→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ≡Ｃ−Ｈ
技術的に知られているように調製され、かつＴＨＦにおいて−７８℃に冷却されたリチウムアセチリドの溶液（４当量）に対して、ＴＨＦに溶解させたｍＰＥＧ−ＯＭｓの溶液を、激しく攪拌しながら滴下して加えた。３時間後に、反応は室温にまで温まり、１ｍＬのブタノールの添加とともに反応を止めた。それから、２０ｍＬのＨ２Ｏを加え、混合物を室温においてさらに４５分間、攪拌した。０．５ＮのＨ２ＳＯ４を用いてｐＨを３に調節し、１５重量％の濃度になるまでＮａＣｌを加えられた。ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ×３）を用いて反応混合物を抽出し、Ｎａ２ＳＯ４の上において乾燥し、濃縮した。冷やしたジエチルエーテルを用いて沈殿させた後に、ろ過によって産物を回収し、減圧条件下において乾燥することにより、１−（ブト−３−イニルロキシ）−メトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）（1-(but-3-ynyloxy)-methoxypolyethylene glycol）が得られた。
【０６０３】
〔実施例２３〕
「L. Wang,ら, (2001), Science 292:498-500」、「J.W. Chinら, Science 301:964-7 (2003)」、「J. W. Chinら, (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027」、「J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), Chem Bio Chem 3(11):1135-1137」、「J. W. Chin,ら, (2002), PNAS United States of America 99:11020- 11024」および「L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem. Comm., 1:1-11」に記載されている方法を用いて、アジド含有アミノ酸およびアセチレン含有アミノ酸を、タンパク質に部位選択的に組み込んだ。アミノ酸が組み込まれると、２ｍＭのＰＥＧ誘導体、１ｍＭのＣｕＳＯ４、および〜１ｍｇの銅線(Cu wire)が存在するｐＨ８のリン酸緩衝液（ＰＢ）における０．０１ｍＭのタンパク質を用いて、３７℃で４時間、付加環化反応を実施した。
【０６０４】
〔実施例２４〕
本実施例において、非天然にコードされたアミノ酸をＴ−２０に組み込む好ましい部位の選択に関して、多くの見込みのある一連の基準のいくつかを説明する。
【０６０５】
本実施例において、Ｔ−２０ポリペプチド内の好ましい部位が、非天然にコードされたアミノ酸の導入に関してどのように選択されるかを実証する。本実施例に使用される配列の番号付与は、Ｔ−２０（配列番号２２）およびＴＥＸ（配列番号２４）のアミノ酸配列に従う。ＴＥＸは、Ｔ−２０のＮ末端が延長されたポリペプチドである。引用された位置番号は、特に表示がない限り、Ｔ−２０ペプチドの６３８−６７３位およびＴＥＸペプチドの６３０−６７３位に基づいている。例えば、６３９位は、配列番号２２における２番目のアミノ酸に対応する。当業者は、配列番号２２における位置に対応するアミノ酸位置が、配列番号２４または他のＴ−２０分子において、容易に識別され得ることを十分に理解する。
【０６０６】
Ｔ−２０のアルファへリックス構造のモデリングは、「W. Shu, J. Liu, H. Ji, L. Rading, S. Jiang, M. Lu, Helical Interactions in the HIV-I gp41 Core Reveal Structural Basis for the Inhibitory Activity of gp41 Peptides (Biochemistry 39:1634 (2000)) に由来するＰＤＢ  １ＤＬＢに基づく。以下の基準を用いて、非天然にコードされたアミノ酸の導入にふさわしい、Ｔ−２０のそれぞれの位置の評価を行った。：（ａ）残基は、アラニン走査突然変異誘発法によって影響を受けるべきではないこと、（ｂ）残基は、露出された表面であり、かつモデリングに基づく周囲の残基と最小のファンデルワールス相互作用または水素結合相互作用を示すべきであること、（ｃ）残基は、Ｔ−２０バリアントにおける活性に影響を与えることなく、可変であるか、非必須であるかのいずれかであり得ること、（ｄ）残基は、非天然にコードされたアミノ酸による置換によって、保存的な置換を生じるものであること、ならびに、（ｅ）残基は、高い柔軟性を有する領域または構造的に柔軟性の低い領域のいずれかにおいて発見され得ること。また、Ｃｘプログラム（「Pintarら (2002) Bioinformatics, 18, pp 980」）を利用して、さらなる演算をＴ−２０に関して行い、ペプチドからの各タンパク質原子に対する突出の程度を評価した。非天然アミノ酸の組み込みにふさわしいＴＥＸアミノ酸位置の分析の結果を、図３に示す。
【０６０７】
いくつかの実施形態において、１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸は、（ＴＥＸを含む）Ｔ−２０の任意の位置、第１のアミノ酸の前、カルボキシ末端における付加、またはこれらの任意の組み合わせに組み込まれる。いくつかの実施形態において、１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸は、Ｔ−２０（ＴＥＸを含む）における任意の位置（例としては、以下の残基：Ｗ６３１、Ｄ６３２、Ｉ６３５、Ｎ６３６、Ｎ６３７、Ｙ６３８、Ｔ６３９、Ｓ６４０、Ｌ６４１、Ｌ６４５、Ｎ６５１またはこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これに限定されない）に組み込まれる。
【０６０８】
〔実施例２５〕
（Ｔ−２０およびＴＥＸを生合成的に産生するクローニング方法）
図９Ａは、Ｔ−２０ポリペプチドおよびＮ末端が延長しているＴ−２０のポリペプチド（ＴＥＸ）に、非天然にコードされたアミノ酸を組み込むために設計されたコンストラクトの概略図を示す。ＨＩＶプロウイルスのＤＮＡは、ペプチド産物のＮ末端にメチオニンを含むＴ−２０およびＴＥＸをコードする配列の増幅に使用された。ＨＩＶプロウイルスのＤＮＡからＴ−２０配列を増幅するために使用されたプライマーは、Ｆ−Ｔ２０  ５’ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＡＴＧ  ＴＡＣ  ＡＣＡ  ＡＧＴ  ＴＴＡ  ＡＴＡ  ＣＡＣ  ＴＣＣ３’（配列番号２６）、およびＲ−Ｔ２０  ５’ＧＣＧ  ＧＡＴ  ＣＣＣ  ＡＴＴ  ＡＡＡ  ＡＣＣ  ＡＡＴ  ＴＣＣ  ＡＣＡ  ＡＡＣ  ＴＴＧ  Ｃ３’（配列番号２７）であった。ＨＩＶプロウイルスのＤＮＡからＴＥＸ配列を増幅するために使用されたプライマーは、Ｆ−ＥＸＴ２０  ５  ’ＣＧ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＡＴＧ  ＧＡＧ  ＴＧＧ  ＧＡＴ  ＡＧＡ  ＧＡＡ  ＡＴＴ  ＡＡＣ  ＡＡＴ  ＴＡＣ  ＡＣＡ  ＡＧＴ  ＴＴＡ  ＡＴＡ  ＣＡＣ  ＴＣＣ３’（配列番号２８）、およびＲ−Ｔ２０（配列番号２７）であった。クローニング用に、Ｆ−Ｔ２０およびＦ−ＥＸＴ２０は、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位を含み、Ｒ−Ｔ２０は、ＢａｍＨＩ部位を含んでいた。
【０６０９】
Ｔ−２０およびＴＥＸ配列を、ＴｒｐＬＥ融合パートナー（ＦＰ）、および該融合パートナーのＮ末端に位置する９つのヒスチジンタグを含む発現ベクターの中にインフレーム（in frame）にクローニングした。
【０６１０】
図１０は、野生型のＴ−２０配列およびＴＥＸ配列の比較を示している。上述のプライマーを用いて、ｇｐ４１の７回繰り返し（ＨＲ２）の対応するＤＮＡ領域を増幅することにより、ペプチドＴ−２０の延長型（ＴＥＸ）を生成した（図１を参照のこと）。ＴＥＸは、Ｎ末端においてＴ−２０より８アミノ酸長く、つまり４４アミノ酸の長さのポリペプチドである。ＴＥＸは、ＨＩＶＮＬ４−３膜貫通型タンパク質（ＴＭ）のアミノ酸６３０から６７３に対応する。Ｔ−２０は、ＨＩＶＮＬ４−３膜貫通型タンパク質（ＴＭ）のアミノ酸６３８から６７３に対応する。図４は、ペプチド配列に非天然にコードされたアミノ酸を組み込んでいるＴＥＸ突然変異体の製造を示す。
【０６１１】
（生合成的に製造されたＴ２０ペプチド類似体およびＴＥＸペプチド類似体の精製）
生じた融合ペプチドを、細菌において生合成的に製造した。直交化ｔＲＮＡおよびそれに特異的な直交化アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを発現させて、Ｔ−２０コンストラクトまたはＴＥＸコンストラクトの抑圧を実施した。細菌の細胞質におけるタンパク質分解を回避するために、融合ペプチドを封入体（ＩＢ）に導くことによって、発現させた。融合ペプチドを含むＩＢを、１００μｇ／ｍｌのリゾチームおよび１０μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅを含む封入体再懸濁緩衝液（Inclusion Body Resuspension Buffer）（ＩＢＲＢ；５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、２００ｍＭのＮａＣｌ、2ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁した。懸濁液を６回、超音波処理した後に、試料を遠心分離してペレットを遠心沈殿した。１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を有する封入体洗浄緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、３０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ）を用いた超音波処理によって、ＩＢペレットを洗浄することを４回行い、洗浄間に遠心分離することによって、残りの混入物を除去した。それから、封入体洗浄緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ）を用いた超音波処理によってＩＢペレットを洗浄することを２回行い、さらに洗浄間に遠心分離した。ペレットを、ｐＨ７．８のグアニジニウム結合緩衝液（Guanidinium Binding Buffer）（６Ｍのグアニジン  ＨＣｌ、２０ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ７．８、５００ｎＭのＮａＣｌ）に可溶化し、融合ペプチドをＨｉｓタグにより精製するために、平衡化ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂に結合した。樹脂を、ｐＨ７．８のグアニジニウム結合緩衝を用いて２回、ｐＨ６．０のグアニジニウム洗浄緩衝液（６Ｍのグアニジン  ＨＣｌ、２０ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ６．０、５００ｎＭのＮａＣｌ）液を用いて２回、そしてｐＨ５．３のグアニジニウム洗浄緩衝液（６Ｍのグアニジン  ＨＣｌ、２０ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ５．３、５００ｎＭのＮａＣｌ）を用いて２回、洗浄した。Ｈｉｓタグ結合された融合ペプチドを、ｐＨ４．０のグアニジニウム溶出緩衝液（６Ｍのグアニジン  ＨＣｌ、２００ｍＭの酢酸、２０ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ４、５００ｎＭのＮａＣｌ）を用いて溶出した。
【０６１２】
試料を凍結乾燥する前に、グアニジニウム溶出緩衝液を１０％の蟻酸に変える緩衝液交換を、ＰＤ−１０脱塩カラムを用いて実施した。それから、凍結乾燥の後に、一昼夜の臭化シアン（ＣＮＢｒ）切断のために、試料を７０％の蟻酸に再懸濁した。ＣＮＢｒが、メチオニンのＣ末端側を特異的に切断するので、ＣＮＢｒを用いた切断は、Ｔ−２０またはＴＥＸをその融合パートナーから分離させることを可能にし、かつさらに抗ウイルス活性アッセイにおける試験用の純粋なペプチドを得るための精製を可能にする。図９のパネルＢの列４は、ＣＮＢｒ処理の切断産物を示す。Ｔ−２０および融合パートナー（ＦＰ）は、矢印を用いて指し示されている。他の列は、以下：列１−マーカー、列２−誘導前、列３−誘導後のように入れられた。
【０６１３】
ＣＮＢｒを用いた切断の後に、試料を凍結乾燥し、８Ｍの尿素に再懸濁して、調製用ＨＰＬＣを介して分離した。残留するＣＮＢｒを取り除くために、Ｃ８  ｐｒｅｐ  ＨＰＬＣカラムに試料を通した。産物を凍結乾燥し、それからｐＨ７．８のグアニジニウム結合緩衝液に再懸濁した。可溶化された産物を平衡化ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂に結合させて、流出したものを回収した。それから、試料をＣ８  ｐｒｅｐ  ＨＰＬＣカラムに通すことにより、Ｔ−２０またはＴＥＸを精製し、凍結乾燥した。精製したペプチドを、以下の緩衝液：２２．５ｍｇ／ｍｌのマンニトール、２．３９ｍｇ／ｍｌの炭酸ナトリウム、ｐＨ９に再懸濁した。
【０６１４】
（Ｔ２０およびＴＥＸを修飾する突然変異）
指定済みの保存された位置に非天然にコードされたアミノ酸を組み込むために、セレクターコドンをＴ−２０類似体およびＴＥＸ類似体の両方をコードするポリヌクレオチドに組み込んだ。セレクターコドンのそれぞれの位置を、ＨＩＶ融合の間における６−ヘリックス束形成の公開された結晶構造に基づいて選択した。セレクターコドンを、製品の取り扱い説明書に従ったQuickChange変異生成（Statagene）によって導入して、個々の突然変異体のそれぞれを配列決定することによって確かめた。
【０６１５】
非天然にコードされたアミノ酸による置換体をコードするセレクターコドンを有する、５の異なるＴ−２０のコンストラクトを、生成した。図１０は、アンバーコドンで置換されたコドンによってコードされるＴ−２０の５残基：Ｔ２０  ６３９として示されるスレオニン；Ｔ２０  ６４０として示されるセリン；Ｔ２０  ６４１として示されるロイシン：Ｔ２０  ６４５として示されるロイシン；およびＴ２０  ６５１として示されるアスパラギンの地図を示す。
【０６１６】
非天然にコードされたアミノ酸による置換体をコードするセレクターコドンを有する、１１の異なるＴＥＸのコンストラクトを、生成した。また、図１０は、アンバーコドンで置換されたコドンによってコードされるＴＥＸの１１残基：ＴＥＸ  ６３１として示されるトリプトファン；ＴＥＸ  ６３２として示されるアスパラギン酸；ＴＥＸ  ６３５として示されるイソロイシン；ＴＥＸ  ６３６として示されるアスパラギン；ＴＥＸ  ６３７として示されるアスパラギン；ＴＥＸ  ６３８として示されるチロシン；ＴＥＸ  ６３９として示されるトレオニン；ＴＥＸ  ６４０として示されるセリン；ＴＥＸ  ６４１として示されるロイシン；ＴＥＸ  ６４５として示されるロイシン；およびＴＥＸ  ６５１として示されるアスパラギンの地図を示す。図１２は、Ｔ２０  ６５１（パネルＡ）およびＴＥＸ  ６３６（パネルＢ）の両方において生じた抑圧を示している。ｓｕｐ．は、抑圧の略語である。図１２のパネルＣおよびＤは、図１２のパネルＡおよびパネルＢにおいて流された試料のウエスタンブロットを示している。パネルＥは、Ｔ−２０（Ｔ−２０−Ｍｕｔ６５１）およびＴＥＸ（ＴＥＸ−Ｍｕｔ６３６）において、ｐ−アセチルフェニルアラニンで置換される残基を、アスタリスクで示している。図５は、パラフェニルアラニンで置換された、ＴＥＸ−Ｗ６３１、ＴＥＸ−Ｄ６３２、ＴＥＸ−Ｎ６３６、およびＴＥＸ−Ｔ６３９を示している。
【０６１７】
〔実施例２６〕
本実施例において、非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるＴ−２０の生物学的活性を測定する方法について説明する。
【０６１８】
（Ｔ２０およびＴＥＸの抗ウイルス活性を調べるためのインビトロ融合アッセイ）
Ｔ２０またはＴＥＸの抗ウイルス活性を評価するために、単一周期感染性に基づいた融合アッセイが、使用される。アッセイの概略説明が図１１に示されている。要するに、２９３−Ｔ細胞に、２つのプラスミドをコトランスフェクションする（１つはＨＩＶエンベロープ遺伝子（ＪＲＦＬまたはＪＣ２  ｅｎｖ）のみを発現するプラスミドであり、もう１つはＨＩＶ  Ｎｅｆ遺伝子の変わりにルシフェラーゼ遺伝子を有し、かつ内因性のエンベロープ遺伝子（ｐＨＩＶ．Ｌｕｃ）を発現しない、修飾されたＨＩＶ  プロウイルスＤＮＡを発現するプラスミドである）。そのような偽型のｅｎｖ  ＨＩＶ−Ｌｕｃウイルスは、１ラウンドの感染によってのみ標的細胞に感染可能である。ＨＩＶは、感染後４８時間に産生され、トランスフェクト細胞の上清において回収される。ウイルスの定量は、ＥＬＩＳＡを用いて、ｐ２４ｇａｇを測定することによってなされる。ＨＩＶ濃度を決定すると、ヒトＣＤ４受容体、および２つのヒト補助受容体であるＣＣＲ５もしくはＣＸＣＲ４のいずれかを発現している、ヒト標的細胞に、Ｔ２０、ＴＥＸおよびそれらの対応する変異体の存在または非存在下において、異なるＭＯＩにおいて感染させる。細胞は、感染後３日に溶解され、かつ照度計によって測定されるルシフェラーゼ活性を決定するために基質を入れられる。このアッセイは、定量的であり、かつ異なるペプチドのＨＩＶ融合の阻害レベルが評価される。図６は、Ｔ２０またはＴＥＸの活性アッセイの概略を示している。Ｔ−２０、ＴＥＸ、ならびにパラ−アセチル  フェニルアラニンで置換されたＴＥＸ変異体であるＴＥＸ−Ｗ６３１、ＴＥＸ−Ｄ６３２、ＴＥＸ−Ｎ６３６およびＴＥＸ−Ｔ６３９を用いて実施したこのアッセイの結果を、FUZEONと比較しながら、図７Ａおよび図７Ｂに示す。図８は、実施例３に記載されているように接合された、５Ｋおよび３０ＫのＰＥＧを用いたＴＥＸ−Ｎ６３６のＰＥＧ付加を示している。
【０６１９】
代わりに、多くの他のアッセイ（当業者に公知の抗ウイルス活性を測定する他の方法（例えば、ウイルス侵入またはウイルス融合を測定するアッセイが挙げられるが、これに限定されない）が含まれるが、これに限定されない）を、本発明のＴ−２０ポリペプチドまたはＴＥＸポリペプチドの活性の監視に使用してもよい。また、他の抗ウイルス剤との組み合わせ治療を試験するために、これらのアッセイを改良することも、当業者に公知である。
【０６２０】
また、当業者によく知られている標準的な方法を、非レトロウイルス活性のアッセイに利用してもよい。例えば、呼吸器合胞体ウイルス、およびパラインフルエンザウイルスの活性アッセイ技術の議論については、Pringleら （「Pringle, C. R.ら, 1985, J. Medical Virology 17:377-386」）を参照のこと。さらに、そのような技術の通常の総説については、例えば、「"Zinsser Microbiology", 1988, Joklik, W. K.ら, eds., Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 19th ed」を参照のこと。これらの参考文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０６２１】
動物研究は、本発明のＴ−２０ポリペプチドを用いて実施され得る。そのような研究の例としては、毒性研究が挙げられるが、これに限定されない。
【０６２２】
本明細書に記載された実施例および実施形態が説明のみを目的としており、かつこれらの点から様々な改良および変更は、当業者に示唆されるとともに、本出願の精神および範囲、ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれることは、理解される。本明細書に引用された刊行物、特許および特許出願のすべては、参照によって、すべての目的に対してその全体が本明細書に組み込まれる。
【０６２３】
【表２】
2009514533.tif 000024
【０６２４】
2009514533.tif 000025
【０６２５】
2009514533.tif 000026
【図面の簡単な説明】
【０６２６】
【図１】Ｔ２０およびＴＥＸのクローニングを示す図である。
【図２】ＢＰＦＩを製造するための戦略を示す図である。
【図３】ＴＥＸの螺旋解析を示す図である。
【図４】非天然にコードされたアミノ酸を組み込むためのセレクターコドンの抑圧を示す図である。
【図５】ＣＮＢｒによってペプチドを切断することにより、ＢＰＦＩが得られることを示す図である。
【図６】ＢＰＦＩ活性のアッセイを示す図である。
【図７Ａ】ウイルス感染に対するＢＰＦＩの阻害を示す図である。
【図７Ｂ】ウイルス感染に対するＢＰＦＩの阻害を示す図である。
【図８】ＢＰＦＩとＰＥＧとの接合を示す図である。
【図９】Ａは、非天然にコードされたアミノ酸をＴ−２０およびＴＥＸに組み込むためのコンストラクトを示す図であり、Ｂは、ＣＮＢｒ切断の前後のＴ−２０ポリペプチドを示す図である。
【図１０】野生型のＴ−２０とＴＥＸとにおける配列の比較を示す図である。アンバーコドンで置換されたコドンによってコードされた残基を、アスタリスクで示す。
【図１１】Ｔ−２０とＴＥＸとの抗ウイルス活性を検査するためのインビトロの融合アッセイを示す図である。
【図１２】ＡおよびＢは、それぞれＴ２０  ６５１の抑圧およびＴＥＸ  ６３６の抑圧を示すクマシー染色されたポリアクリルアミドゲルの図であり、ＣおよびＤは、それぞれＡおよびＢに示された試料のウエスタンブロット（抗−Ｈｉｓ）を示す図であり、Ｅは、Ｔ−２０（Ｔ−２０−Ｍｕｔ６５１）およびＴＥＸ（ＴＥＸ−Ｍｕｔ６３６）において、ｐ−アセチル−フェニルアラニンで置換された残基をアスタリスクで示す図である。
【図１３】ペプチド融合阻害剤を有するＲＳＶ  Ｆタンパク質を示す図である。
【図１】
2009514533.tif 000027
【図２】
2009514533.tif 000028
【図３】
2009514533.tif 000029
【図４】
2009514533.tif 000030
【図５】
2009514533.tif 000031
【図６】
2009514533.tif 000032
【図７Ａ】
2009514533.tif 000033
【図７Ｂ】
2009514533.tif 000034
【図８】
2009514533.tif 000035
【図９】
2009514533.tif 000036
【図１０】
2009514533.tif 000037
【図１１】
2009514533.tif 000038
【図１２】
2009514533.tif 000039
【図１３】
2009514533.tif 000040
【配列表】
2009514533000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成20年7月2日(2008.7.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項２】
上記生合成ポリペプチド融合阻害剤が、１つ以上の翻訳後修飾を含んでいる、請求項１に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項３】
上記ポリペプチドが、リンカー、ポリマー、または生物活性分子と連結している、請求項１に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項４】
上記ポリペプチドが、水溶性ポリマーと連結している、請求項３に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項５】
上記ポリペプチドが、２官能性ポリマー、２官能性リンカー、または少なくとも１つの別の生合成ポリペプチド融合阻害剤と連結している、請求項１に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項６】
上記２官能性リンカーまたはポリペプチドが、第２ポリペプチドと連結している、請求項５に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項７】
上記第２ポリペプチドが、生合成ポリペプチド融合阻害剤である、請求項６に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項８】
上記水溶性ポリマーが、ポリ（エチレングリコール）部分を含んでいる、請求項４に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項９】
上記水溶性ポリマーが、上記生合成ポリペプチド融合阻害剤に存在する非天然にコードされたアミノ酸と連結している、請求項４に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項１０】
上記非天然にコードされたアミノ酸が、リンカー、ポリマー、または生物活性分子と反応性であり、該リンカー、ポリマーまたは生物活性分子は、上記ポリペプチドにおける２０の一般アミノ酸の何れかと非反応性である、請求項１に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項１１】
上記非天然にコードされたアミノ酸が、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、セミカルバジド基、アジド基またはアルキン基を含んでいる、請求項１に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項１２】
上記非天然にコードされたアミノ酸が、カルボニル基を含んでいる、請求項１１に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項１３】
上記非天然にコードされたアミノ酸の構造が、
【化１】
2009514533.tif 000041
（ここで、ｎは０−１０であり、Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであり、Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、置換アルキル、および置換アリールであり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、Ｒ４は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である）である、請求項１２に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項１４】
上記非天然にコードされたアミノ酸が、アミノオキシ基を含んでいる、請求項１１に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項１５】
上記非天然にコードされたアミノ酸が、ヒドラジド基を含んでいる、請求項１１に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項１６】
上記非天然にコードされたアミノ酸が、ヒドラジン基を含んでいる、請求項１１に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項１７】
上記非天然にコードされたアミノ酸の残基が、セミカルバジド基を含んでいる、請求項１１に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項１８】
上記非天然にコードされたアミノ酸の残基が、アジド基を含んでいる、請求項１１に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項１９】
上記非天然にコードされたアミノ酸の構造が、
【化２】
2009514533.tif 000042
（ここで、ｎは０−１０であり、Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであるか、あるいは存在しておらず、Ｘは、Ｏ、Ｎ、またはＳであるか、あるいは存在しておらず、ｍは０−１０であり、Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である）である、請求項１８に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項２０】
上記非天然にコードされたアミノ酸が、アルキン基を含んでいる、請求項１１に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項２１】
上記非天然にコードされたアミノ酸の構造が、
【化３】
2009514533.tif 000043
（ここで、ｎは０−１０であり、Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであり、Ｘは、Ｏ、Ｎ、またはＳであるか、あるいは存在しておらず、ｍは０−１０であり、Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である）である、請求項２０に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項２２】
上記水溶性ポリマーが、約０．１ｋＤａから約１００ｋＤａまでの分子量を有している、請求項４に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項２３】
上記水溶性ポリマーが、約０．１ｋＤａから約５０ｋＤａまでの分子量を有している、請求項２２に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項２４】
カルボニル含有アミノ酸と、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基またはセミカルバジド基を含んでいる水溶性ポリマーとを反応させることによって作製された、請求項４に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項２５】
上記アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、またはセミカルバジド基が、アミド結合を介して、上記水溶性ポリマーと連結している、請求項２４に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項２６】
カルボニル基を含んでいる水溶性ポリマーと、非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるポリペプチドとの反応によって作製された請求項４に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤であって、
上記非天然にコードされたアミノ酸が、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、またはセミカルバジド基を含んでいる生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項２７】
アルキン含有アミノ酸を含んでいる生合成ポリペプチド融合阻害剤と、アジド部分を含んでいる水溶性ポリマーとの反応によって作製された、請求項４に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項２８】
アジド含有アミノ酸を含んでいる生合成ポリペプチド融合阻害剤と、アルキン部分を含んでいる水溶性ポリマーとの反応によって作製された、請求項４に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項２９】
上記アジド基またはアルキン基が、アミド結合を介して水溶性ポリマーに連結している、請求項１１に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項３０】
上記水溶性ポリマーが、分枝状ポリマーまたはマルチアームポリマーである、請求項４に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項３１】
上記水溶性ポリマーの各分枝が、約１ｋＤａから約１００ＫＤａまでの分子量を有している、請求項３０に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項３２】
上記ポリペプチドが、アンタゴニストである、請求項１に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項３３】
上記ポリペプチドが、１つ以上の翻訳後修飾、リンカー、ポリマーまたは生物活性分子を含んでいる、請求項３２に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項３４】
上記ポリマーが、水溶性ポリマーおよびポリ（エチレングリコール）から成る群から選ばれる部分を含んでいる、請求項３３に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤。
【請求項３５】
生合成ポリペプチド融合阻害剤をコードする核酸配列と、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドを含んでおり、該ポリヌクレオチドが少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる、単離された核酸。
【請求項３６】
上記セレクターコドンが、アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン、および４塩基コドンから成る群から選ばれる、請求項３５に記載の単離された核酸。
【請求項３７】
請求項３に記載の生合成ポリペプチド融合阻害剤を作製する方法であって、
非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる単離された生合成ポリペプチド融合阻害剤と、該非天然にコードされたアミノ酸と反応する部分を含んでいるリンカー、ポリマー、または生物活性分子とを接触させる工程を含んでいる、方法。
【請求項３８】
上記ポリマーが、水溶性ポリマーおよびポリ（エチレングリコール）から成る群から選ばれる部分を含んでいる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
呼吸器合胞体ウイルスに感染している患者を治療するため、または呼吸器合胞体ウイルスの感染を予防するための方法であって、治療的有効量の請求項３８に記載の組成物を、上記患者に投与する工程を含んでいる方法。
【請求項４０】
請求項３５に記載の核酸を含んでいる細胞。
【国際調査報告】
2009514533.tif 000044
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2009514533.tif 000046