(57)【要約】  本発明は、ポリヌクレオチドアジュバント（ＰＩＣＫＣａ）組成物、および、免疫応答、特に粘膜免疫応答を引き起こす際の使用方法を提供する。ポリヌクレオチドアジュバント組成物は、ポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸（ＰＩＣ）、少なくとも１種類の抗生物質および少なくとも１種の陽イオンを含んでいる。本発明はまた、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、寄生生物抗原および／またはがん抗原から選択される抗原（例えば、ワクチンに見られるようなもの）などの他の免疫原性組成物と共にポリヌクレオチドアジュバント組成物が含まれている免疫原性組成物を提供する。本発明はさらに、このようなアジュバント組成物の使用方法、特に免疫応答、とりわけ抗原性化合物に対する粘膜免疫応答を引き起こす際の使用方法を意図している。
2009523721.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸（ＰＩＣ）、少なくとも１種類の抗生物質および少なくとも１種類の陽イオンを含むポリヌクレオチドアジュバントと、
（ｂ）少なくとも１種類の抗原とを含む免疫原性組成物であって、
持続放出するように剤形化されていることを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項２】
（ａ）ポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸（ＰＩＣ）、少なくとも１種類の抗生物質および少なくとも１種類の陽イオンを含むポリヌクレオチドアジュバントと、
（ｂ）少なくとも１種類のウイルス抗原とを含む免疫原性組成物であって、
上記抗原が、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アストロウイルス科、ブニヤウイルス科、カリシウイルス科、フラビウイルス科、デルタ肝炎ウイルス科、ヘペウイルス科、モノネガウイルス目、ニドウイルス目、ピコルナウイルス科、オルトミクソウイルス科、パピローマウイルス科、パルボウイルス科、ポリオーマウイルス科、ポックスウイルス科、レオウイルス科、レトロウイルス科またはトガウイルス科の抗原であることを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項３】
（ａ）ポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸（ＰＩＣ）、少なくとも１種類の抗生物質および少なくとも１種類の陽イオンを含むポリヌクレオチドアジュバントと、
（ｂ）少なくとも１種類の細菌性抗原とを含み、
上記抗原が、放線菌門、クラミジア門、グラム陽性細菌門、プロテオバクテリア門またはスピロケータ門の抗原であることを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項４】
（ａ）ポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸（ＰＩＣ）、少なくとも１種類の抗生物質および少なくとも１種類の陽イオンを含むポリヌクレオチドアジュバントと、
（ｂ）少なくとも１種類の真菌抗原とを含み、
上記抗原が、子嚢菌門または担子菌門の抗原であることを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項５】
（ａ）ポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸（ＰＩＣ）、少なくとも１種類の抗生物質および少なくとも１種類の陽イオンを含むポリヌクレオチドアジュバントと、
（ｂ）少なくとも１種類の寄生生物抗原とを含み、
上記抗原が、肉質鞭毛虫門、アピコンプレクサ門、有毛虫門、扁形動物門、線形動物門または節足動物門の抗原であることを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項６】
（ａ）ポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸（ＰＩＣ）、少なくとも１種類の抗生物質および少なくとも１種類の陽イオンを含むポリヌクレオチドアジュバントと、
（ｂ）少なくとも１種類のがん抗原とを含み、
上記抗原が、骨肉腫、脳腫瘍、乳がん、消化管／胃腸がん、内分泌腺がん、眼がん、泌尿生殖器がん、生殖細胞腫瘍、婦人科がん、頭頚部がん、液／血液腫、肺がん、筋骨格腫瘍、神経がん、呼吸器／胸部がんまたは皮膚がんのがん抗原であることを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項７】
（ａ）ポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸（ＰＩＣ）、少なくとも１種類の抗生物質および少なくとも１種類の陽イオンを含むポリヌクレオチドアジュバントと、
（ｂ）２種類以上の抗原を組み合わせたものとを含み含み、
上記抗原が、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アストロウイルス科、ブニヤウイルス科、カリシウイルス科、フラビウイルス科、デルタ肝炎ウイルス科、ヘペウイルス科、モノネガウイルス目、ニドウイルス目、ピコルナウイルス科、オルトミクソウイルス科、パピローマウイルス科、パルボウイルス科、ポリオーマウイルス科、ポックスウイルス科、レオウイルス科、レトロウイルス科、トガウイルス科、放線菌門、クラミジア門、グラム陽性細菌門、プロテオバクテリア門またはスピロケータ門、子嚢菌門または担子菌門、肉質鞭毛虫門、アピコンプレクサ門、有毛虫門、扁形動物門、線形動物門および／または節足動物門の抗原であることを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項８】
分子量が不均一なポリヌクレオチドアジュバント組成物分子を含んでおり、該分子量は少なくとも６６，０００ダルトンであることを特徴とする請求項１から７の何れか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
分子量が不均一なポリヌクレオチドアジュバント組成物分子を含んでおり、該分子量は約６６，０００から１，２００，０００ダルトンであることを特徴とする請求項１から８の何れか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
分子量が不均一なポリヌクレオチドアジュバント組成物分子を含んでおり、該分子量は少なくとも１５０，０００ダルトンであることを特徴とする請求項１から９の何れか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
少なくとも１種類の免疫賦活剤をさらに含んでいることを特徴とする請求項１から１０の何れか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
上記抗原は、不活化微生物、弱毒化微生物、組み換えポリペプチドおよび／または合成ポリペプチドであることを特徴とする請求項１から１１の何れか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
請求項１から１２の何れか１項に記載の免疫原性組成物であって、該免疫原性組成物または該免疫原性組成物に含まれるＰＩＫＡアジュバントが、液体、溶液、液滴、固形物、カプセル、乳液、懸濁物、エリキシル剤、クリーム、坐薬、ゲル、ソフトカプセル、スプレー、吸入抗原、エアロゾル、錠剤、被覆錠剤、マイクロカプセル、坐薬、糖衣錠、シロップ剤、スラリー、浣腸剤、顆粒、粉末、錠剤またはトローチ剤の形態であることを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項１４】
請求項１から１２の何れか１項に記載の免疫原性組成物であって、上記アジュバント組成物の少なくとも１種または該免疫原性組成物が凍結乾燥されていることを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項１５】
請求項１から１４の何れか１項に記載の免疫原性組成物を備えているキット。
【請求項１６】
抗原に対する宿主の免疫応答を亢進させる方法であって、
請求項１から１４の何れか１項に記載の免疫原性組成物を宿主に投与することを特徴とする方法。
【請求項１７】
上記宿主は感染症に罹患しており、上記抗原性化合物の投与により、該感染症の原因となっている病原体に対する免疫応答を引き起こすことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
上記投与が、非経口注射、筋肉注射、腹腔内注射、静脈注射、皮下注射、局所送達、経皮送達または皮内送達によるものであることを特徴とする請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
上記抗原に対する宿主における免疫応答を亢進させるための薬剤を調製するための、請求項１から１４の何れか１項に記載の免疫原性組成物の利用。
【請求項２０】
上記宿主は感染症に罹患しており、上記宿主に対する上記抗原の投与により、該感染症の原因となっている病原体に対する免疫応答を引き起こすことを特徴とする請求項１９に記載の利用。
【請求項２１】
上記投与が、非経口注射、筋肉注射、腹腔内注射、静脈注射、皮下注射、局所送達、経皮送達または皮内送達によるものであることを特徴とする請求項２０に記載の利用。
【請求項２２】
上記宿主がヒトであることを特徴とする請求項１６から１８の何れか１項に記載の方法および請求項１９から２１の何れか１項に記載の利用。
【請求項２３】
上記宿主が非ヒト動物であることを特徴とする請求項１６から１８の何れか１項に記載の方法および請求項１９から２１の何れか１項に記載の利用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔発明の分野〕
本発明は、概して、免疫原性組成物およびこれを用いた方法に関する。より詳細には、本発明は、宿主において疾患に特異的な免疫応答を引き起こすのに使用される、一つ以上の抗原性物質を組み合わせたポリヌクレオチドアジュバントを含む免疫原性組成物に関する。
【０００２】
〔発明の背景〕
免疫システムは、特異免疫および非特異免疫のいずれも示す。非特異免疫は、いろいろある中で、例えば、マクロファージまたは顆粒球によるファゴサイトーシス（外来微粒子または抗原の取り込み）、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性など、様々な細胞およびメカニズムを含んでいる。非特異免疫は、進化があまり進んでいないメカニズムに依存しており、特異免疫応答の典型的な特徴である、特異性および記憶の獲得性質を示さない。特異免疫と非特異免疫との主要な違いは、Ｂ細胞およびＴ細胞特異性に基づくものである。これらの細胞は、主に、特定の抗原による活性化の後にそれらの応答性を獲得し、この抗体にさらにさらされることがあったときに、記憶を提示するメカニズムを有している。その結果、ワクチン接種（特異性および記憶を含む）は、有害な病原体に対する防御のための有効なプロトコールとなる。
【０００３】
通常、Ｂリンパ球およびＴリンパ球は、特定の抗原に特異的なレセプターを細胞表面に提示しており、特異免疫を生み出している。特異免疫システムは、２つの手段により、異なる抗原に応答できる：１）Ｂ細胞刺激およびＢ細胞による抗体もしくは免疫グロブリンの産生、抗原ならびにヘルパーＴ細胞（主に、Ｔｈ２）を含む、液性免疫、および２）細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）を包含するＴ細胞を通常含み、ＣＴＬ応答の産生に関与する他の細胞（例えば、抗原提示細胞およびＴｈ１細胞）もまた含む、細胞性免疫。
【０００４】
より安全で、より有効なワクチンを求めた継続的な研究において、組み換え、精製および合成方法を含む新しい技術が、質および用いられる抗原に対する特異性を向上させるために用いられている。精製した抗原、サブユニット化された抗原および合成抗原は、安全性の向上を示したが、有効なアジュバントを同定するための一つの要因（driver）である免疫原性が減少していた。したがって、有効なアジュバントは、ますます、最近のワクチンの必須成分となっている。アジュバントは、概して、抗原と共に（抗原の投与と同時に、もしくは抗原の投与よりも所定の時間で先に）投与したときに、その特定の抗原に対する免疫応答を亢進させ、および／または修正する組成物である。
【０００５】
免疫応答を亢進させるために用いられている典型的なアジュバントとしては、アルミニウム組成物（全て、一般的に“ミョウバン”と称されている）、水中油型（oil-in-water）エマルジョン（フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）は、乾燥し熱殺菌した結核菌（Mycobacterium  tuberculosis）生物を含む水中油型エマルジョンである）、サポニン（キラヤ・サポナリア（Quillaja  Saponoria）の樹皮から単離したものであり、Ｑｕｉｌｅ  Ａとして知られているアジュバント活性成分である）、ＣｐＧ  ＯＤＮ（非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む、合成オリゴデオキシヌクレオチド）、サルモネラ・ミネソタ（Salmonella  minnesota）Ｒｅ５９５のリポ多糖類由来のモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、リポソーム（通常、リン脂質などの生分解性物質により作り出されている）、および生分解性ポリマーミクロスフィア（ポリホスファゼンおよびポリ無水物などの様々なポリマーにより作られている）がある。これら化合物のアジュバントの特性は、それぞれのアジュバントが長所および短所を示すものとして評価されてきている。
【０００６】
ポリヌクレオチド複合体は、アジュバントとしての作用を含め様々な応用について調べられてきている。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡｓ）は、ナノモルの濃度で細胞に対して深い影響を及ぼすことができる、非常に強力な生物学的修飾因子である。ｄｓＲＮＡによる調節効果は、分子レベルおよび細胞レベルにおいて、広範な範囲の作用に及ぶ。
【０００７】
分子レベルにおいて、ｄｓＲＮＡｓは、インターフェロン合成、プロテインキナーゼの誘導、組織適合抗原の亢進および代謝阻害などの生物学的効果を引き起こすことができる。また、細胞レベルにおいて、ｄｓＲＮＡは、発熱性（pyrogenicity）、有糸分裂生起（mitogenicity）、マクロファージの活性化、液性免疫の活性化、細胞性免疫の活性化および抗ウイルス状態の誘導などの生物学的効果を引き起こすことができる。ｄｓＲＮＡｓの免疫調節効果はすでに開示されている。米国特許第４，１２４，７０２号には、生きている動物の細胞において二本鎖ポリヌクレオチドがインターフェロン誘導を引き起こすことが、開示されている。米国特許第３，９０６，０９２号には、アジュバント型ワクチンに対する抗体応答がポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド複合体のワクチンと結合することにより増大することが、開示されている。Ｈｏｕｓｔｏｎらは、新たなアジュバントを追加することなく一次抗体反応を増加させることにより、強力なアジュバントとしてＰＩＣＬＣ（ポリイノシン酸ポリシチジル酸ポリ−Ｌ−リジンカルボキシ−メチルセルロース複合体）を構築した。
【０００８】
ポリイノシン酸−ポリシチジル酸（ＰＩＣ）は、最もよく研究されているポリヌクレオチド複合体の一つであるが、サルおよびヒトに用いた場合には、投与後、体内において不安定であるため、効果的ではなかった。そのため、一つまたは他の欠陥を克服するために、様々な手法によるＰＩＣの修飾がなされてきている。例えば、ポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸とポリ−Ｌ−リジン臭化水素酸塩との複合体は、もとのＰＩＣと比較して、膵臓リボヌクレアーゼによる加水分解に対して、およそ５から１５倍の耐性がある。
【０００９】
Ｌｉｎらは、ポリイノシンポリシチジル酸、カナマイシンおよびカルシウムを含む抗ウイルス薬はアジュバントとして用い得ることを報告している（Lin, et al., A new immunostimulatory complex（PICKCa） in experimental rabies: antiviral and adjuvant effects, Arch Virol, 131:307-19, 1993;および中国特許第９３１０５８６２．７号）。中国特許第９３１０５８６２．７号では、ヒトおよび哺乳動物への利用のためのワクチンにおけるアジュバントとして、ポリＩ：Ｃ、カナマイシンおよびカルシウム（ＰＩＣＫＣａ）の一般組成物の利用を提供している。しかしながら、当初同定されたＰＩＣＫＣａの形態は、アジュバントの利用として最適な効率／安全性に関する特徴点をもたらさず、また、特定の状況下においては、許容できない意に沿わない副作用をも含んでいることをＬｉｎは見出していた。
【００１０】
本発明は、安全性および効率の特徴点が向上している新規な免疫原性組成物；およびこの組成物の利用方法を提供する。主たる免疫原性組成物は、ポリヌクレオチドアジュバントおよび抗原を含んでいる。
【００１１】
[文献]
以下の参考文献が着目される。
・日本国特開平０１−９３５４０号
・米国特許第４，１２４，７０２号
・米国特許第３，６９２，８９９号
・米国特許第３，９０６，０９２号
・米国特許第４，３８９，３９５号
・米国特許第４，３４９，５３８号
・米国特許第４，０２４，２４１号
・米国特許第３，９５２，０９７号
・Houston et al., Infection and Immunity, 14:318-9, 1976C
・Wright and Adler-Moore, Biochemical and Biophysical Research Communications, 131:949-45, 1985
・Lin, et al., A new immunostimulatory complex(PICKCa) in experimental rabies; antiviral and adjuvant effects, Arch Virol, 131:307-19, 1993
・中国特許第９３１０５８６２．７号
・Gupta R.K. et al., Adjuvants - a balance between toxicity and adjuvanticity, Vaccine, 11:293-306, 1993
・Arnon, R. (Ed.) Synthetic Vaccines 1:83-92, CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla., 1987
・Sela, M., Science 166:1365-1374 (1969)
・米国特許第６，００８，２００号
・Ellouz et al., Biochem. & Biophy. Res. Comm., 59:1317, 1974
・米国特許第４，０９４，９７１号
・米国特許第４，１０１，５３６号
・米国特許第４，１５３，６８４号
・米国特許第４，２３５，７７１号
・米国特許第４，３２３，５５９号
・米国特許第４，３２７，０８５号
・米国特許第４，１８５，０８９号
・米国特許第４，０８２，７３６号
・米国特許第４，３６９，１７８号
・米国特許第４，３１４，９９８号
・米国特許第４，０８２，７３５号
・米国特許第４，１８６，１９４号
・米国特許第６，４６８，５５８号
・New Trends and Development in Vaccines, edited by Voller et al., University Park Press, Baltimore, Md., USA, 1978
・Klein, J., et al., Immunology(2nd), Blackwell Science Inc., Boston (1997)
・Gupa R.K. and Siber G.R., Adjuvants for human vaccines - current status, problems and future prospects, Vaccine, 13 (14):1263-1276, 1995
・Richard T Kenney et al. Meeting Report - 2nd meeting on novel adjuvants currently in/close to human clinical testing, Vaccine 20 2155-2163, 2002
・Laboratory Techniques in Rabies Edited by F X Meslin, M M Kaplan, H Koprowski 4th, 1996, Edition ISBN 92 4 1544 1
【００１２】
〔発明の概要〕
概して、本発明は、免疫原性または抗原性物質と共にポリヌクレオチドアジュバントを含む新規な免疫原性組成物、および免疫応答を引き起こす利用方法に関する。
【００１３】
したがって、（ａ）ポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸（ＰＩＣ）、少なくとも１種類の抗生物質および少なくとも１種類の陽イオンを含むポリヌクレオチドアジュバントと、（ｂ）少なくとも１種類の抗原とを含む免疫原性組成物であって、持続放出投与するように剤形化されていることを特徴とする免疫原性組成物が提供される。
【００１４】
本発明に係る免疫原性組成物は、分子量が不均一なポリヌクレオチドアジュバント組成物分子を含んでおり、該分子量は少なくとも６６，０００ダルトンである。
【００１５】
〔図面の簡単な説明〕
図１−ＰＩＫＡおよび／またはＨＢｓ抗原ａｄｗ型を含むワクチンによる免疫化後の、インターフェロン−γを生産したマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴ検出。
図２−ＰＩＫＡおよび／またはＨＢｓ抗原ａｄｗ型を含むワクチンによる免疫化後の、ＩＬ−２を生産したマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴ検出。
図３−ＰＩＫＡおよび／またはＨＢｓ抗原ａｄｗ型を含むワクチンによる免疫化後のマウス脾細胞により生産されたＩＬ−４のＥＬＩＳＰＯＴ検出。
図４−ＰＩＫＡおよび／またはＨＢｓ抗原ａｄｗ型を含むワクチンによる免疫化後のマウス血清（４００×希釈）に由来する特定のＩｇＧの力価のＥＬＩＳＡ検出。
図５−ＰＩＫＡおよび／または不活化され分割されたインフルエンザ抗原を含むワクチンによる免疫化後の、インターフェロン−ガンマ（γ）を生産したマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴ検出。
図６−ＰＩＫＡおよび／または不活化され分割されたインフルエンザ抗原を含むワクチンによる免疫化後の、ＩＬ−２を生産したマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴ検出。
図７−ＰＩＫＡおよび／または不活化され分割されたインフルエンザ抗原を含むワクチンによる免疫化後の、ＩＬ−４を生産したマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴ検出。
図８−ＰＩＫＡおよび／または不活化され分割されたインフルエンザ抗原を含むワクチンによる免疫化後のマウス血清（９００×希釈）に由来する特定のＩｇＧの力価のＥＬＩＳＡ検出。
図９−ＰＩＫＡおよび／またはＨＩＶ  ｇｐ１２０抗原を含むワクチンによる免疫化後の、インターフェロン−γを生産したマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴ検出。
図１０−ＰＩＫＡおよび／またはＨＩＶ  ｇｐ１２０抗原を含むワクチンによる免疫化後の、ＩＬ−２を生産したマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴ検出。
図１１−ＰＩＫＡおよび／またはＨＩＶ  ｇｐ１２０抗原を含むワクチンによる免疫化後の、ＩＬ−４を生産したマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴ検出。
図１２−ＰＩＫＡおよび／またはＨＩＶ  ｇｐ１２０抗原を含むワクチンによる免疫化後の、マウスの脾細胞におけるＦＡＣＳ解析であり、インターフェロン−γを発現しているＣＤ４＋細胞の割合。
図１３−ＰＩＫＡおよび／または炭疽菌ｒＰＡ抗原を含むワクチンによる免疫化後の、インターフェロン−γを生産したマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴ検出。
図１４−ＰＩＫＡおよび／または炭疽菌ｒＰＡ抗原を含むワクチンによる免疫化後の、ＩＬ−２を生産したマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴ検出。
図１５−ＰＩＫＡおよび／または炭疽菌ｒＰＡ抗原を含むワクチンによる免疫化後の、ＩＬ−４を生産したマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴ検出。
図１６−ＰＩＫＡおよび／または炭疽菌ｒＰＡ抗原を含むワクチンによる免疫化後の、マウスの脾細胞におけるＦＡＣＳ解析であり、インターフェロン−γを発現しているＣＤ４＋細胞の割合。
図１７−ＰＩＫＡおよび／または炭疽菌ｒＰＡ抗原を含むワクチンによる免疫化後のマウス血清（４００×希釈）に由来する特定のＩｇＧの力価のＥＬＩＳＡ検出。
図１８−ＰＩＫＡおよび／または炭疽菌ｒＰＡ抗原を含むワクチンによる免疫化１６週間後のマウス血清に由来する特定のＩｇＧの力価のＥＬＩＳＡ検出。
図１９−ＰＩＫＡおよび／またはＨＳＶ２−ｇＤ抗原を含むワクチンによる免疫化後の、インターフェロン−γを生産したマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴ検出。
図２０−ＰＩＫＡおよび／またはＨＳＶ２−ｇＤ抗原を含むワクチンによる免疫化後の、ＩＬ−２を生産したマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴ検出。
図２１−ＰＩＫＡおよび／またはＨＳＶ２−ｇＤ抗原を含むワクチンによる免疫化後の、ＩＬ−４を生産したマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴ検出。
図２２−ＰＩＫＡおよび／またはＨＳＶ  ２ｇＤ抗原を含むワクチンによる免疫化後の、マウスの脾細胞におけるＦＡＣＳ解析であり、インターフェロン−γを発現しているＣＤ４＋細胞の割合。
図２３−ＰＩＫＡおよび／またはＨＳＶ２−ｇＤ抗原を含むワクチンによる免疫化後のマウス血清（２，７００×希釈）に由来する特定のＩｇＧの力価のＥＬＩＳＡ検出。
図２４−ＰＩＫＡおよび／または不活化Ｈ５Ｎ１抗原を含むワクチンによる免疫化後の、インターフェロン−γを生産したマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴ検出。
図２５−ＰＩＫＡおよび／または不活化Ｈ５Ｎ１抗原を含むワクチンによる免疫化後の、ＩＬ−２を生産したマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴ検出。
図２６−ＰＩＫＡおよび／または不活化Ｈ５Ｎ１抗原を含むワクチンによる免疫化後の、ＩＬ−４を生産したマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴ検出。
図２７−ＰＩＫＡおよび／または不活化Ｈ５Ｎ１抗原を含むワクチンによる免疫化後の、マウスの脾細胞におけるＦＡＣＳ解析であり、インターフェロン−γを発現しているＣＤ４＋ｖｅ細胞の割合。
図２８−ＰＩＫＡおよび／または不活化Ｈ５Ｎ１抗原を含むワクチンによる免疫化後のマウス血清（９００×希釈）に由来する特定のＩｇＧの力価のＥＬＩＳＡ検出。
図２９−ＰＩＫＡおよび／または不活化ＳＡＲＳ抗原の全体を含むワクチンによる免疫化後のマウス血清（１６，０００希釈）に由来する特定のＩｇＧの力価のＥＬＩＳＡ検出。
図３０−ＰＩＫＡおよび／または不活化Ｈ５Ｎ１抗原を含むワクチンによる免疫化後のニワトリ血清に由来する特定の抗体Ｈ５の力価のＥＬＩＳＡ検出。
図３１−ＰＩＫＡおよび／または不活化Ｈ９Ｎ２抗原を含むワクチンによる免疫化後のニワトリ血清に由来する特定のＨ９抗体の力価のＥＬＩＳＡ検出。
図３２−野生の狂犬病ウイルスにさらされた後に狂犬病ワクチンを処方されたマウスの生存率。
図３３−ＰＩＫＡおよび／またはＨＢｓ抗原ａｄｗを含むワクチンによる免疫化後のマウス血清に由来する特定の抗体の力価のＥＬＩＳＡ検出。
図３４−ＰＩＫＡおよび／または不活化され分割されたインフルエンザ抗原を含むワクチンによる免疫化後のマウス血清に由来する特定の抗体の力価のＥＬＩＳＡ検出。
図３５−ＰＩＫＡおよび／またはＨＢｓ抗原を含むワクチンによる免疫化後のマウス血清に由来する特定のＩｇＧ１の力価のＥＬＩＳＡ検出。
図３６−ＰＩＫＡおよび／またはＨＢｓ抗原を含むワクチンによる免疫化後のマウス血清に由来する特定のＩｇＧ２の力価のＥＬＩＳＡ検出。
図３７−ＰＩＫＡおよび／またはＨＢｓ抗原を含むワクチンによる免疫化後の、インターフェロン−γを生産したマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴ検出。
図３８−ＰＩＫＡおよび／またはＨＢｓ抗原を含むワクチンによる免疫化後の、インターフェロン−γを生産したマウス脾細胞（２ｕｇ／ｍｌのＩＰＱペプチドを用いて６日間再刺激した後）のＥＬＩＳＰＯＴ検出。
表１は、抗原源としての役割を果たし得る典型的なウイルス病原体およびこれらの有機体に関連する疾患の表である。
表２は、抗原源としての役割を果たし得る典型的な細菌性病原体およびこれらの生物に関連する疾患の表である。
表３は、抗原源としての役割を果たし得る典型的な真菌性病原体およびこれらの生物に関連する疾患の表である。
表４は、抗原源としての役割を果たし得る典型的な寄生生物およびこれらの生物に関連する疾患の表である。
表５は、抗原源としての役割を果たし得る典型的ながん（例えば、組織別によるもの）の表である。
【００１６】
〔本発明を例示する実施形態の詳細な説明〕
本発明は、以下の本発明の特定の実施形態の詳細な説明および本明細書に記載の実施例を参照することにより、より容易に理解されるだろう。
【００１７】
本出願は参考文献を載せており、これらの文献の開示内容は、本発明の属する分野の技術水準をより十分に説明するために、そのまま、本出願に参考として援用される。
【００１８】
本発明についてさらに説明する前に、本発明が、説明に用いられる特定の実施形態に限定されるものではなく、当然、変化したものであってもよいことは、理解されるべきである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるため、本明細書において用いられる用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図していないこともまた理解されるべきである。
【００１９】
別の定義をしていない限り、本明細書における技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の通常の当業者のひとりによって一般的に理解される意味と同じ意味で用いられる。本明細書において記載されているものと同様または等価な任意の方法および材料を、本発明の実施および評価にも用いることができるものの、好ましい方法および材料がここに記載されている。本明細書において記載されている全ての文献は、方法および／または材料を開示し、説明するために、当該文献に挙げられている方法および／または材料と併せて、本明細書に参考として援用される。
【００２０】
本明細書および特許請求の範囲に用いているように、単数形である「一」、「および」および「その」は、前後関係から別のことであることが明確に指示されていない限り、複数形の対象を含むものである点、留意しなければならない。したがって、例えば、「一免疫原性組成物」というときは、このような組成物の複数を含み、また、「その抗原」というときは、一つ以上の抗原をいうこと、および当業者において公知の、その他それらと同等のものを含む。特許請求の範囲は任意の構成要素を考慮しないで作成してもよいことは、さらに留意すべきである。そのようなものとして、この明細書は、請求項の構成要素の列挙と共に、「一つだけ」および「のみ」など排他的な用語を使用するための、または「消極的」な限定を使用するための根拠としての役割を果たすことが意図されている。
【００２１】
＜用語の定義＞
本発明の詳細について記載する前に、本明細書に用いられるいくつかの用語の定義を記載することは、本発明を理解するために有用であろう。
【００２２】
本明細書において用いる場合、用語「アジュバント」は、抗原性化合物に対する宿主の免疫応答を増大または多様化させる任意の物質または物質の混合物をいう。
特に：
１．用語「ＰＩＣＫＣａ」は、特定の物理的特性および免疫原性特性に関わりなく、概して、ポリＩ：Ｃ、カナマイシンおよびカルシウムを含む組成物を指す。
２．「Ａｖ−ＰＩＣＫＣａ」は、抗ウイルス剤として商業的に用いられているＰＩＣＫＣａの形態を指す。
３．「ＰＩＫＡ」は、ポリＩ：Ｃ、抗生物質（例えば、カナマイシン）、陽イオン（例えば、カルシウム）を含む本発明の組成物を指し、ＰＩＫＡは投与におけるような物質特性（例えば、分子量、サイズなど）により特徴付けられ、ＰＩＫＡは、例えばＰＩＣＫＣａよりも意に沿わない副作用が低減しており（例えば、毒性の低下）、また例えばＡｖ−ＰＩＣＫＣａよりも有効性が優れている（例えば、亢進した免疫応答を刺激する）というアジュバントの特徴を示す。
【００２３】
用語「ポリＩ：Ｃ」または「ＰＩＣ」は、ポリリボイノシン核酸およびポリリボシチジル核酸（これらは、それぞれ、ポリイノシン酸−ポリシチジル酸ともいう）を含む組成物を指す。
【００２４】
「ＰＩＣ含有分子」または「ＰＩＣ含有化合物」は、特に制限なく、ＰＩＣを指し、ＰＩＣ含有分子を含む組成物中に存在する抗生物質（例えば、カナマイシン）および陽イオン（例えば、カルシウム）の少なくとも一つまたは両方と、状況に応じて複合し、または別の方法で組み合わされている。一実施形態において、ＰＩＣ含有分子は、複合体中に、ポリ−Ｌ−リジンまたはその誘導体を含んでいない。
【００２５】
本明細書において、本発明のアジュバント組成物との関連で用いられる場合、「不均一」は、例えばＰＩＣ含有分子などの組成物の構成物質が、分子量、サイズまたはその両方の物理的特性に関して均一ではないことを指す。組成物が所定の物理的特性において不均一であるとして記載されている場合、またさらに組成物がその物理的特性において一定の値の範囲であるとして記載されている場合、列挙された範囲にわたる、および範囲を超えた物理的特性を有する分子により特徴付けられる分子から実質的に構成されていると考えられている。組成物は、列挙された範囲の上限と下限との間の全ての物理的特性値に対応する分子は含んでいないものの、組成物は、概して、上限値および下限値の物理的特性を有する分子を少なくとも一つは含んでいるだろう。特定の実施形態における組成物は、組成物を説明するために用いられる物理的特性の規定の範囲からはずれた分子を含んでいてもよい。組成物中にある、規定した範囲からはずれた分子は、組成物の基本特性および新規特性に実質的に影響を与えない。
【００２６】
用語「個体」は、本明細書において、「宿主」、「被験体」および「動物」と交換可能に用いられ、ヒト、ならびに家畜およびペットなど全ての家畜化された哺乳動物および野生の哺乳動物、ならびに家禽が含まれ、畜牛、ウマ、乳牛、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、シカ、ミンク、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウおよびゲームヘンなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
用語「抗体」は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含んでおり、同様に、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｄおよびＦｖ断片を含むような抗体の抗原性物質結合断片、ならびにそれらの一本鎖誘導体を含んでいる。さらに、用語「抗体」は、自然に生じる抗体および自然には生じない抗体を含み、例えば、キメラ抗体、二官能性抗体およびヒト化抗体ならびに関連した合成アイソフォームが含まれる。用語「抗体」は、「免疫グロブリン」と交換可能に用いられる。
【００２８】
本明細書で用いられる場合、「抗原性化合物」は、適当な条件下において免疫システムに認識され得る（例えば、抗体が結合する、または細胞内免疫応答を引き起こすために加工される）任意の物質を指す。
【００２９】
本明細書で用いられる場合、「抗原」は、細胞、細胞抽出物、タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質、核タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖、多糖複合体、ペプチドによる多糖模倣物、脂質、糖脂質、炭水化物、ウイルス、ウイルス抽出物、細菌、細菌抽出物、真菌、真菌抽出物、寄生生物などの多細胞生物、およびアレルゲンを含むが、これらに限定されるものではない。抗原は、外来性（例えば、抗原が投与される個体以外に由来するもの、例えば、異なる種に由来するもの）、または内因性（例えば、宿主内に由来するもの、例えば、身体の罹患成分、がん抗原、および抗原を生産するウイルス感染細胞など）のものであってよい。抗原は、天然のもの（例えば、自然に生じるもの）、合成したもの、または組み換えたものであってよい。抗原は、粗抽出物、全細胞、および精製抗原を含む。ここで「精製」とは、抗原が通常生じる環境および／または例えば抗原の培養状態などの粗抽出物と比較して濃縮されている状態の抗原を指す。
【００３０】
本明細書で用いられる場合、「免疫原性組成物」は、宿主に投与したときに免疫応答を共に引き起こす２以上の物質（例えば、抗原およびアジュバント）を組み合わせたものを指す。
【００３１】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において交換可能に使用され、アミノ酸の任意の長さの重合形態を指し、コードしているアミノ酸およびコードしていないアミノ酸、化学修飾もしくは生化学修飾アミノ酸または誘導アミノ酸、ならびに修飾されたペプチドバックボーンを有するポリペプチドを含み得る。
【００３２】
「抗原性化合物の有効量」は、任意的にアジュバントを組み合わせたときに、抗原性化合物に対する特異免疫応答を対象に引き起こさせるであろう抗原性化合物の量を指す。
【００３３】
用語「免疫応答」は、脊椎動物被験体の免疫システムによる、抗原性または免疫原性化合物に対する任意の応答を指す。典型的な免疫応答は、ＣＤ８＋  細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）の抗原特異的誘導を含むＣＴＬ応答、Ｔ細胞の増殖反応およびサイトカイン放出を含むヘルパーＴ細胞応答ならびに抗体反応を含むＢ細胞応答などの、局所および全身性細胞性免疫および液性免疫であるが、これらに限定されるものではない。
【００３４】
用語「免疫応答を引き起こすこと」は、主に、免疫応答の誘導および／または増強作用を包含するために本明細書において用いられる。
【００３５】
用語「免疫応答を誘導すること」は、刺激された、引き起こされた、または誘導された免疫応答を指す。
【００３６】
用語「免疫応答を増強すること」は、向上した、促進された、補われた、増幅された、亢進した、増大した、または引き延ばされた既存の免疫応答を指す。
【００３７】
「亢進した免疫応答」という表現または類似の表現は、事前の免疫応答の状態、例えば本発明の免疫原性組成物の投与の前の状態と比較して、宿主に対する免疫応答の利点が高まり、向上し、亢進していることを意味する。
【００３８】
用語「液性免疫」および「液性免疫応答」は、抗原刺激に応答して抗体分子が産生される免疫の形態を指す。
【００３９】
用語「細胞性免疫」および「細胞性免疫応答」は、例えば、Ｔ細胞リンパ球が被害細胞に近接したときにＴ細胞リンパ球によりもたらされる免疫防御など、リンパ球によりもたらされる免疫防御を指すことを意味する。細胞性免疫応答は、通常、リンパ球の増殖を含む。「リンパ球増殖」が測定されるとき、特定の抗原に応答したリンパ球の増殖能力が測定される。リンパ球増殖は、Ｂ細胞、Ｔヘルパー細胞、または細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）細胞増殖を指すことを意味する。
【００４０】
用語「免疫原性量」は、主たる免疫原性組成物を投与したときに、ポリヌクレオチドアジュバントの非存在下で抗原により引き起こされる免疫応答と比較して、免疫応答を刺激するのに十分な抗原性化合物の量を指す。
【００４１】
用語「免疫増強量」は、本発明の組成物における抗原性化合物を投与したときに、ポリヌクレオチドアジュバントの非存在下で観察される抗体および／または細胞性免疫レベルの増加と比較して、抗体力価および／または細胞性免疫の増加をもたらすのに必要なアジュバントの量を指す。
【００４２】
用語「処理」、「処理すること」および「処理する」などは、概して、所望の薬理効果および／または生理学的効果を獲得することを指すために本明細書において用いられる。この効果は、疾患または疾患の症状を完全にまたは部分的に抑えるという観点から予防の効果であってよく、および／または、疾患および／または疾患に起因する副作用を部分的にまたは完全に安定化する、または治癒するという観点から治療の効果であってよい。本明細書において用いる場合、「処理」は、被験体の、特に哺乳動物被験体の、より特にはヒトの疾患に対する任意の処理に及び、以下のものを含む：（ａ）疾患または症状にかかりやすいが未だかかっているとは診断されていない被験体において、疾患または症状が生じるのを抑えること、（ｂ）疾患の症状を防ぐこと、例えば、その発達を阻むこと、または疾患の症状を軽減させること、すなわち、疾患または症状の退行を引き起こすこと、（ｃ）疾患を引き起こす病原体により産出される産物（例えば、毒素および抗原など）の水準の低減、および（ｄ）疾患を引き起こす病原体に対する、好ましくない生理反応（例えば、発熱および組織浮腫など）を減少させること。
【００４３】
本明細書において用いる場合、用語「混合すること」は、組成物の構成成分を混ぜ合わせる任意の方法を含むものである。このような方法としては、組成物の構成成分の混和、分配、溶解、乳化、凝固もしくは懸濁、または組成物の構成成分を物理的に混ぜ合わせる別の方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４４】
化合物の「薬剤として許容される塩」は、薬剤として許容され、もととなる化合物の所望の薬理活性を保持している塩を意味する。このような塩としては以下のものが含まれる：（１）酸を添加した塩であり、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸およびリン酸などの無機酸により形成されているもの、または、酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、琥珀酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２−エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−クロロベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、４−トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、グルコヘプトン酸、４，４’−メチレンビス−（３−ヒドロキシ−２−エン−１−カルボン酸）、３−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、ｔｅｒｔ−ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸およびムコン酸などの有機酸により形成されているもの、または（２）もととなる化合物にある酸性プロトンを、例えばアルカリ金属イオン、アルカリ土類イオンまたはアルミニウムイオンなどの金属イオンにより置換するか、または、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミンおよびＮ−メチルグルカミンなどの有機塩基を用いて調整するかの何れかにより形成された塩。
【００４５】
本明細書において用いられる場合、用語「単位剤形」は、ヒトおよび動物被験体に対する単一の投薬量として適している物理的に分離した一構成単位を指し、各構成単位は、薬事的／生理学的に許容し得る希釈剤、キャリヤまたは賦形剤と共に、所望の効果を産み出すのに十分な量に計算された本発明の化合物の規定量を含んでいる。
【００４６】
＜本発明の例示となる実施形態＞
本発明は、免疫原性組成物、ならびに免疫応答の誘導および／または亢進に有用な方法に向けられており、この免疫応答は、ヒト、非ヒト動物もしくは細胞培養における液性および／または細胞性免疫応答であってよい。概して、主たる免疫原性組成物は、抗原（「抗原性組成物」）およびアジュバントを含んでいる。アジュバントが存在することにより、抗原に対する免疫応答が亢進され、修飾される。アジュバントは、産生される免疫グロブリン、ケモカインおよび／またはサイトカインのサブクラス（アイソタイプ）に影響を与えることにより、免疫応答の質を変化させてもよい。結果として、先天性免疫、液性および／または細胞性免疫応答は、アジュバントの存在により、より有効となる。
【００４７】
際立った利点は、特定の液性免疫応答を誘導し、それにより防御免疫を亢進させる際の、抗原性物質と組み合わせたＰＩＫＡアジュバントの効果である。
【００４８】
さらなる重要な利点は、抗原と組み合わせたＰＩＫＡアジュバントが、ウイルス、細菌および寄生生物の細胞内感染を制限し、治療するための治療ワクチンに必須である特異的な細胞性免疫応答、およびがんまたは自己免疫疾患の治療などの疾患の治療に必須である特異的な細胞性免疫応答を誘導できることである。
【００４９】
したがって、本発明には、動物および／またはヒトに投与するためのワクチンとしての利用に最も適したものとする独特の産物特性を有し、有益な免疫応答を引き起こす、安全なアジュバントの必要性に対応する組成物が含まれる。
【００５０】
したがって、本発明は、ヒトおよび動物において安全に利用し得るアジュバントおよび免疫原性組成物を提供する。
【００５１】
したがって、（ａ）ポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸（ＰＩＣ）、少なくとも１種類の抗生物質および少なくとも１種類の陽イオンを含むポリヌクレオチドアジュバントと、（ｂ）少なくとも１種類の抗原とを含む免疫原性組成物であって、持続放出投与するように剤形化されていることを特徴とする免疫原性組成物が提供される。
【００５２】
本発明に係る免疫原性組成物は、分子量が不均一なポリヌクレオチドアジュバント組成物分子を含んでいることができ、この分子量は少なくとも６６，０００ダルトンである。６６，０００ダルトンという値は、約６．４スベドベリの大きさに対応する。したがって、６６，０００から１，２００，０００ダルトンの範囲の分子量は、約６．４から２４．０スベドベリの大きさに対応する。
【００５３】
いくつかの実施形態において、ＰＩＫＡアジュバント組成物は、ポリヌクレオチド、抗生物質および陽イオンを含み、ここで、ポリヌクレオチドはポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸（ＰＩＣ）であってよく、抗生物質はカナマイシンであってよく、イオンはカルシウムであってよい。
【００５４】
特に着目される一態様において、本発明は、抗原特異的細胞性免疫応答を引き起こすことができるポリヌクレオチドアジュバント組成物を含む、抗原性化合物の抗原性を亢進させるための免疫原性組成物を提供する。
【００５５】
特に着目される一態様において、本発明は、抗原特異的液性免疫応答を引き起こすことができるポリヌクレオチドアジュバント組成物を含む、抗原性化合物の抗原性を亢進させるための免疫原性組成物を提供する。
【００５６】
特に着目される一態様において、本発明は、特定の細胞性免疫応答と液性免疫応答とが結合した応答を引き起こすことができるポリヌクレオチドアジュバント組成物を含む、抗原性化合物の抗原性を亢進させるための免疫原性組成物を提供する。
【００５７】
特に着目される一態様において、本発明は、凍結乾燥されているアジュバント組成物またはアジュバント組成物を含む凍結乾燥されている免疫原性組成物を提供する。
【００５８】
特に着目される一態様において、本発明は、宿主における免疫応答を亢進させるための薬剤を調製するための、ポリヌクレオチドアジュバント組成物の利用を提供する。
【００５９】
＜ポリヌクレオチドアジュバント＞
対象免疫原性組成物は、ＰＩＣ含有ポリヌクレオチドアジュバントを含む。例えば、ＰＩＫＡ組成物は、概して、ポリイノシン酸、ポリシチジル酸、抗生物質（例えば、カナマイシン）、および２価の陽イオン（例えば、カルシウム）を含んで構成されている。そのようなＰＩＣ含有アジュバントの中でも典型的な例として、本明細書において、ＰＩＫＡを参照する。
【００６０】
着目されるＰＩＣ含有アジュバントは、技術的に利用可能な方法を用いて製造することができる。ＰＩＣ含有アジュバント組成物は、任意の適当な工程で製造することができる。例えば、ポリヌクレオチドアジュバント組成物は、ポリイノシン酸、ポシシチジル酸、抗生物質、およびｐＨ６〜８の塩化ナトリウム／リン酸緩衝液中の陽イオン源を混合することにより製造することができる。ポリイノシン酸およびポリシチジル酸は、一般に０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ、通常は０．５〜５ｍｇ／ｍｌ、より通常には０．５〜２．５ｍｇ／ｍｌの濃度で提供される。濃色効果値（hyperchromicity value）は１０％より大きい値、１５％より大きい値、２０％より大きい値、または５０％より大きい値であるべきである。ＰＩＣの調製、および抗生物質（例えば、カナマイシン）と陽イオン（例えば、カルシウム）との組み合わせは、一般に、国際適正製造基準（Good Manufacturing Process）と一致する品質基準のもとで実施される。
【００６１】
本発明のある実施形態では、アジュバントの抗生物質成分はカナマイシンである。抗生物質がカナマイシンであるいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドアジュバント組成物中のカナマイシンは、１つ以上の抗生物質と共に用いる、または、１つ以上の抗生物質で代用される。１つ以上の抗生物質は、トブラマイシン）、アントラサイクリン、ブチロシンサルフェート（butirosin sulfate）、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、アミカシン、ジベカシン、ネブラマイシン、メタズアミド（metrzamide）、ネオマイシン、ピューロマイシン、ストレプトマイシンおよびストレプトゾシンを含む群から選択される。本発明のポリヌクレオチドアジュバント組成物中の抗生物質（例えば、カナマイシンまたは同種のもの）は、一般に、約１０〜１００，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、約１００〜１０，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、または約５００〜５，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌの濃度で提供される。
【００６２】
本発明のある実施形態では、ポリヌクレオチドアジュバント組成物は、さらに、陽イオン（カチオン）、通常は２価の陽イオン、普通はアルカリ金属の陽イオンを含む。陽イオンは、一般に、塩または複合体のような陽イオン源として本発明の組成物中に供給される。塩または複合体の例としては、有機塩もしくは無機塩または有機複合体もしくは無機複合体であり、通常は、無機塩または無機複合体である。典型的な陽イオンは、カルシウム、カドミウム、リチウム、マグネシウム、セリウム、セシウム、クロム、コバルト、重水素、ガリウム、ヨウ素、鉄、または亜鉛を含むが、必ずしもこれらに限定されない。
【００６３】
陽イオンは、任意の適切な塩または有機複合体の形で供給することができる。任意の適切な塩もしくは有機複合体は、塩化物、フッ化塩、水酸化物塩、リン酸塩、または硫酸塩を含むが、必ずしもこれらに限定されない。例えば、陽イオンがカルシウムである場合、イオンは、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、フッ化カルシウム、水酸化カルシウム、リン酸カルシウム、または硫酸カルシウムの形で供給することができる。
【００６４】
陽イオン（例えば、カルシウム）は、約１０ｕｍｏｌ／ｍｌ〜１０ｍｍｏｌ／ｍｌ、通常は約５０ｕｍｏｌ／ｍｌ〜５ｍｍｏｌ／ｍｌ、より通常には約１００ｕｍｏｌ／ｍｌ〜１ｍｍｏｌ／ｍｌの範囲の濃度で、本発明の組成物中に供給することができる。用語「ｕｍｏｌ」は、マイクロモルを表すために文中で用いられる。
【００６５】
本発明のアジュバント組成物中の陽イオンがカルシウムである場合、カルシウムイオンは、その他の陽イオンと組み合わせること、またはその他の陽イオンで代用することができる。その他の陽イオンとは、カドミウム、リチウム、マグネシウム、セリウム、セシウム、クロム、コバルト、重水素、ガリウム、ヨウ素、鉄および亜鉛を含み、これらのイオンは、無機塩または有機複合体の形で存在することができる。
【００６６】
上記の結果生じる組成物は、抗生物質および陽イオンをさらに含むＰＩＣ含有アジュバントである。抗生物質はカナマイシンであり、イオンはカルシウムである、ある実施形態では、産物は、ＰＩＣＫＣａとして記載してもよい。関連の実施形態では、異なる物理的性質の制限なしに、ＰＩＣＫＣａ組成物は分子を含むことができる。
【００６７】
＜ＰＩＫＡアジュバント組成物＞
特定の典型的な実施形態では、ＰＩＣ含有アジュバントは、ＰＩＫＡである。ＰＩＫＡは、特に着目すべきＰＩＣＫＣａから生産されると同時に、様々な方法で生産されてもよい。ＰＩＫＡは、分子の大きさおよび／または分子量が明確な分子の単離および／または濃縮を含む付加的な製造工程を通して、ＰＩＣＫＣａから生産することができる。特定の性質のポリヌクレオチド分子の分離および濃縮は、ろ過、クロマトグラフィー、熱処理、遠心分離、電気泳動、および当業者に公知の標準的な工程の同様の方法を用いて行われる。
【００６８】
着目される特定の実施形態では、本発明は、一般にＰＩＫＡとして引用されるアジュバントを特徴とする。ＰＩＫＡは、ポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸（ＰＩＣ）、抗生物質（例えば、カナマイシン）、および正電気を帯びたイオン（例えば、カルシウムイオン）を含んでおり、組成物は、約６６，０００〜１，２００，０００ダルトンの不均一な分子量のアジュバント分子を含む。すなわち、アジュバント組成物は、約６６，０００〜１，２００，０００ダルトンの範囲の重量分布を有する分子を含む。
【００６９】
関連の実施形態では、組成物中のＰＩＫＡポリヌクレオチドアジュバント組成物分子は、不均一である。すなわち、アジュバント分子の重量は、約３００，０００〜１，２００，０００ダルトン、または約６６，０００〜６６０，０００ダルトン、または約３００，０００〜６６０，０００ダルトン、または約３００，０００〜２，０００，０００ダルトン、または約６６，０００〜１００，０００ダルトン、または１００，０００〜２００，０００ダルトン、約３００，０００〜４，０００，０００ダルトン、または約５００，０００〜１，０００，０００ダルトン、または約１，０００，０００〜１，５００，０００ダルトン、または約１，５００，０００〜２，０００，０００ダルトン、または約２，０００，０００〜２，５００，０００ダルトン、または約２，５００，０００〜３，０００，０００ダルトン、または約３，０００，０００〜３，５００，０００ダルトン、または約３，５００，０００〜４，０００，０００ダルトン、または約４，０００，０００〜４，５００，０００ダルトン、または約４，５００，０００〜５，０００，０００ダルトンの範囲に分布する。
【００７０】
関連の実施形態では、組成物中のＰＩＫＡポリヌクレオチドアジュバント組成物分子は、６６，０００ダルトンと等しいもしくは等しいもしくはそれより大きい平均分子量、１５０，０００ダルトンより大きい平均分子量、または２５０，０００ダルトンと等しいもしくはそれより大きい平均分子量、または３５０，０００ダルトンと等しいもしくはそれより大きい平均分子量、または５００，０００ダルトンと等しいもしくはそれより大きい平均分子量、または６５０，０００ダルトンと等しいもしくはそれより大きい平均分子量、または７５０，０００ダルトンと等しいもしくはそれより大きい平均分子量、または１，０００，０００ダルトンと等しいもしくはそれより大きい平均分子量、または１，２００，０００ダルトンと等しいもしくはそれより大きい平均分子量、または１，５００，０００ダルトンと等しいもしくはそれより大きい平均分子量、または２，０００，０００ダルトンと等しいもしくはそれより大きい平均分子量を有する。
【００７１】
特に着目される実施形態では、本発明は、一般にＰＩＫＡとして引用されるアジュバントを特徴とする。ＰＩＫＡは、ポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸（ＰＩＣ）、抗生物質（例えば、カナマイシン）、および正電気を帯びたイオン（例えば、カルシウムイオン）を含んでおり、組成物は、不均一なアジュバント分子を含む。すなわち、アジュバント分子の大きさは、約６．４３Ｓ〜２４．０３Ｓの沈降係数スベドベリ（Svedbergs）（Ｓ）を有する分子の大きさの範囲に分布する。
【００７２】
関連の実施形態では、組成物中のＰＩＫＡポリヌクレオチドアジュバント組成物分子は不均一である。すなわち、アジュバント分子の大きさは、約１２．８Ｓ〜２４．０３Ｓ、または約３Ｓ〜１２Ｓ、または約６．４３Ｓ〜１８．３１Ｓ、または約１２．８Ｓ〜１８．３１Ｓ、または約１２．８Ｓ〜３０．３１Ｓ、または約１２．８Ｓ〜４１．５４Ｓ、または約１３．５Ｓ〜１８．３１Ｓ、または約１３．５Ｓ〜２４．０３Ｓ、または約１６．１４Ｓ〜２２．１２Ｓ、または約２２．１２Ｓ〜２６．６Ｓ、または約２６．６Ｓ〜３０．３１Ｓ、または約３０．３１Ｓ〜３３．５５Ｓ、または約３３．５５Ｓ〜３６．４５Ｓ、または約３６．４５Ｓ〜３９．１Ｓ、または約３９．１Ｓ〜４１．５４Ｓ、または約４１．５４Ｓ〜４３．８３Ｓ、または約４３．８３Ｓ〜４５．９５Ｓの範囲内に分布する。
【００７３】
さらに関連の実施形態では、ＰＩＫＡポリヌクレオチドアジュバント組成物は、９より大きい平均沈降係数（スベドベリ）、または１２より大きい平均沈降係数、または１３．５より大きい平均沈降係数、または１５より大きい平均沈降係数、または１６より大きい平均沈降係数、または１７より大きい平均沈降係数、または１８より大きい平均沈降係数、または１９より大きい平均沈降係数、または２０より大きい平均沈降係数、または２１より大きい平均沈降係数、または２２より大きい平均沈降係数、または２５より大きい平均沈降係数、または３０より大きい平均沈降係数を有している。
【００７４】
＜免疫原性特性＞
ＰＩＫＡと抗原とを含む免疫原性組成物は、一般に、少なくとも２つの方法で抗原特異的免疫応答を誘導する事ができる。つまり、ｉ）液性免疫、および、ｉｉ）細胞性免疫である。液性免疫は、Ｂ細胞刺激、および抗体もしくは免疫グロブリンの産生を含む（その他の細胞も抗体応答の発生に関与する。例えば、マクロファージおよびヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１およびＴｈ２）を含む抗原提示細胞）。細胞性免疫は、一般に、細胞傷害性Ｔリンパ球を含むＴ細胞が関与する。しかし、その他の細胞も細胞傷害性Ｔリンパ球応答の発生に関与する（例えば、Ｔｈ１および／またはＴｈ２細胞、ならびに抗原提示細胞）
さらに、ポリヌクレオチドアジュバント組成物は、免疫グロブリンの親和性と同様に、産生される免疫グロブリンのサブクラス（アイソタイプ）に影響を与える事で、免疫応答の質を変えることができる。
【００７５】
それ故に、対象免疫原性組成物により誘導される免疫グロブリン応答の程度および性質は、免疫系の細胞によって産生されるサイトカイン、ケモカイン、および抗体を含む分子の存在を測定することにより評価することができる。
【００７６】
インターロイキン−４は、主として、活性化Ｔｈ２細胞によって産生される。上記インターロイキン−４（ＩＬ−４）の産生は、Ｂ細胞の活性化を誘導し、その結果、ＩｇＧ１およびＩｇＥ免疫グロブリン（抗体）の産生を誘導する。免疫グロブリンは、血清のサンプル中で測定することができる。ＩＬ−４は、Ｔｈ２免疫応答の指標（indictor）および典型的なサイトカインと考えられる。Ｔｈ２細胞は、抗体応答を促進する傾向がある。
【００７７】
インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、ＮＫ細胞およびリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞と同様に、主として、活性化Ｔｈ１細胞によって産生される。ＩＬ−２は、効果的な細胞性適応的免疫応答において必須段階であるＴ細胞の増殖および成熟に関与する。
【００７８】
インターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）は、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋ Ｔ細胞と同様、ナチュラルキラー細胞を含む様々な細胞によって産生され、マクロファージを活性化し高殺菌性にすることを含む適応的免疫応答において必須の部分を担う。さらに、ＩＮＦ−γは、特にＴｈ１ Ｔ細胞の発生を方向付け、その結果、細胞性適応的免疫応答を上昇制御（up-regulating）するよう作用する因子である。
【００７９】
本発明は、例えば、抗原特異的液性応答および／または特異的細胞性応答（例えば、Ｔ細胞）を被験体中で誘発するために、本発明のポリヌクレオチドアジュバントと抗原との使用方法を意図している。誘発される免疫応答は、未免疫被験体では、抗原への応答であってもよいし、または、現在の免疫応答を亢進させる役割を果たしてもよい（例えば、追加免疫により）。本発明に記載のＰＩＫＡを含む免疫原性組成物は、本明細書において記述するように、特に有利な特性を有している。
【００８０】
様々な異なる抗原は、ＰＩＫＡの有無により、免疫応答を誘導する能力をｉｎ  ｖｉｖｏで試された。試験抗原は、Ｂ型肝炎表面抗原ａｄｗ型の組み換えタンパク質、不活化分割インフルエンザワクチン（サノフィパスツール製ＶＡＸＩＧＲＩＰ）、合成ＨＩＶペプチド抗原、単純ヘルペスウイルス２型ｇＤ抗原の組み換えタンパク質、組み換え防御炭疽菌タンパク質抗原、トリインフルエンザ抗原Ｈ５Ｎ１株の不活化全ウイルス、および、抗原不活化重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）の不活化全ウイルスを含む。
【００８１】
それぞれの場合で、抗原のみまたはＰＩＫＡのみの場合と比較して、抗原と共にＰＩＫＡアジュバントが存在することによりサイトカインの発現が亢進した。特に、サイトカインＩＮＦ−γ、ＩＬ−２、およびＩＬ−４の発現亢進（実施例１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、および１．６を参照）は、ＰＩＫＡアジュバントの存在により、特異的適応的免疫の刺激がより亢進したことを示唆している。より具体的には、サイトカインＩＮＦ−γおよびＩＬ−２の発現亢進は、ＰＩＫＡアジュバントの存在により、主要Ｔｈ１細胞免疫が有意に改善されたことを示唆している。細胞性免疫応答の活性は、細胞内のウイルス、細菌、および寄生生物感染症を治療するために必須の主要な特徴であり、特に、治療用ワクチンの開発にとって重要な因子である。
【００８２】
さらに、ＰＩＫＡを含む組成物は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＮＦ−γ産生を刺激した（実施例１．３、１．４、１．５、および１．６）。この特徴は、ＰＩＫＡが宿主の適応的免疫応答を亢進させることを立証する。
【００８３】
観察された血清中の抗体の増加は、ＰＩＫＡアジュバントが効果的な液性応答を誘導することを示している。ＰＩＫＡを免疫原性組成物に加えることにより、特異的抗体であるＩｇＧ力価の上昇が観察された（実施例１．１、１．２、１．４、１．５、１．６、２、３、５、および６を参照）。
【００８４】
ＰＩＫＡアジュバントは、不活化抗原（実施例１．２、１．６、２、３、４、および６）、ペプチド抗原（実施例１．３）、および組み換え抗原（実施例１．１、１．４、１．５、５、および７）と組み合わせたときに、宿主における免疫応答を亢進させる。
【００８５】
ＰＩＫＡアジュバントの特定の特徴は、宿主における感染を抑えるおよび／または感染を根絶するための適切な防御をもたらすこと、および／または、病原体による感染の結果生じる疾病の症状の危険性を減らすことである。実施例１．２および６で抗原として用いられたＶＡＸＩＧＲＩＰ（サノフィパスツール社製）は、それ自身がヒトインフルエンザワクチンであり、急性インフルエンザ感染に対する防御を提供するのに十分であると考えられる程度の免疫活性を誘発する。免疫系により発現する有益なサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＮＦ−γ、および、ＩＬ−４）および特異的ＩｇＧの程度によって実証されるように、ＰＩＫＡをＶＡＸＩＧＲＩＰに添加すると免疫応答がさらに亢進した。
【００８６】
ＰＩＫＡの防御特性のさらなる実証では、２４羽の１０日齢のニワトリに、ＰＩＫＡと、Ｈ５Ｎ１株およびＨ９Ｎ２株を含む不活化トリインフルエンザ抗原とを含む組成物を接種した（実施例３）。続いて、これらのニワトリに、Ｈ５Ｎ１生ウイルスを病原体接種し、２週間の期間観察した。この計画の終わりの時点において、ＰＩＫＡ／抗原組成物を事前に接種せず、生ウイルスを病原体接種した対照群２４羽のニワトリの生存率がたった１７％であったのに比べ、ＰＩＫＡ／抗原組成物を接種したニワトリの生存率は８３％であった。
【００８７】
ＰＩＫＡアジュバントの治療亢進特性を実証する為の関連の実験では、Ｂａｌｂ／ｃマウスに、狂犬病ウイルスの野性株を病原体接種した（実施例４）。感染後、３つの異なる動物群は、異なる狂犬病ワクチンでの治療レジュメ（regime）を接種された。ハムスター腎臓細胞から精製された不活化狂犬病抗原とＰＩＫＡとの組み合わせを接種された上記マウス群の生存率は、８０％に達した。ハムスター腎臓細胞から精製された狂犬病抗原とミョウバンアジュバントとを接種された第二群のマウスの生存率は、１５％であった。さらに、サノフィ‐アベンティス製の「ベロラブ（Verorab）」を投与された第三群のマウスは、２０％の生存率を有していた。ベロラブとはベロ細胞由来の不活化狂犬病ワクチンである。
【００８８】
ＰＩＫＡアジュバントの特性のさらなる実証では、実施例７で、ＨＢｓＡｇ ａｄｗ型と同時にＰＩＫＡが存在することによりマウス血清中の特異的ＩｇＧの産生が亢進すること（表２６図３５）、およびＩｇＧ２ａの力価がより有意に亢進すること（表２７図３６）が実証されている。この観察からの結論は、ＰＩＫＡが治療免疫応答、特に、Ｔｈ１に偏った免疫応答を亢進させることである。
【００８９】
関連の実験（実施例７）では、ＨＢｓＡＧ ａｄｗ型を含むワクチン製剤中にＰＩＫＡが存在することにより、ＣＤ８ Ｔ細胞ペプチドエピトープで刺激された脾細胞によるインターフェロン−γの産生が亢進することが示された。この結果は、ＰＩＫＡがＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を誘導することを実証する（表２８図３７）。
【００９０】
さらに、（実施例７）ＨＢｓＡｇを含むワクチン製剤中にＰＩＫＡが存在することにより、２ｕｇ／ｍｌのＣＤ８ Ｔ細胞ペプチドエピトープと共に６日間生体外で培養した脾細胞によるインターフェロン−γの産生が亢進することが示された。この結果は、ＰＩＫＡは中枢メモリーＴ細胞応答を誘導することを実証する。
【００９１】
＜追加の特徴＞
さらなる実施形態では、対象免疫原性組成物は、ＰＩＫＡアジュバントおよび抗原または複数抗原の相対的存在によってさらに特徴付けられる。この場合、上記存在は量、濃度、容量、分子数、またはその他の認定された測定基準の中の１つ以上の特徴に関して測定される。
【００９２】
関連の実施形態では、対象免疫原性組成物は、ポリヌクレオチドアジュバント組成物および１つの抗原または複数抗原を含み、分子量もしくは分子数に関するアジュバントと抗原との存在は、１：１０００より低い比、１：９００より低い比、１：８００より低い比、１：７００より低い比、１：５００より低い比、１：４００より低い比、１：３００より低い比、１：２００より低い比、１：１００より低い比、１：５０より低い比、１：１０より低い比、１：５より低い比、１：２より低い比、約１：１、２：１より高い比、５：１より高い比、１０：１より高い比、５０：１より高い比、１００：１より高い比、２００：１より高い比、３００：１より高い比、４００：１より高い比、５００：１より高い比、６００：１より高い比、７００：１より高い比、８００：１より高い比、９００：１より高い比、１０００：１より高い比である。
【００９３】
さらに関連する実施形態では、対象免疫原性組成物は投与量の点で特徴付けられる。投与量とは、つまり、適切で有益な免疫応答を誘導するために投与されるワクチンの量、または、免疫応答を誘発するための必要最低投与量から意に沿わない副作用を誘導する可能性との関連で追加の有益な応答が医学的に立証されない最大投与量までの、投与できる投与量の範囲である。
【００９４】
特に着目される実施形態では、免疫原性組成物は、ポリヌクレオチドアジュバント組成物と抗原とを含み、単位投与量中の抗原の存在は、以下の量で供給される。つまり、０．１ｕｇより多い量、０．５ｕｇより多い量、０．００１ｍｇより多い量、０．００５ｍｇより多い量、０．０１ｍｇより多い量、０．０２５ｍｇより多い量、０．０５ｍｇより多い量、０．０７５ｍｇより多い量、０．１ｍｇ、０．２５ｍｇより多い量、０．５ｍｇより多い量、１．２ｍｇより多い量、１．４ｍｇより多い量、１．６ｍｇより多い量、１．８ｍｇより多い量、２．０ｍｇより多い量、２．５ｍｇより多い量、３ｍｇより多い量、３．５ｍｇより多い量、４ｍｇより多い量、５ｍｇより多い量、６ｍｇより多い量、７ｍｇより多い量、８ｍｇより多い量、９ｍｇより多い量、１０ｍｇより多い量、１５ｍｇより多い量、２０ｍｇより多い量、２５ｍｇより多い量、または５０ｍｇより多い量である。
【００９５】
適切な抗原量およびＰＩＫＡアジュバントに対する抗原の適切な比率は、宿主における抗体の力価とその他の免疫原性応答との観察を含む標準的な研究により究明することができる。
【００９６】
＜抗原＞
特に着目される実施形態では、本発明は、抗原またはワクチンと共にポリヌクレオチドアジュバント組成物を提供する。この場合、抗原の元は、ヒト抗原、動物抗原、植物抗原、あらゆるウイルス、マイコバクテリアを含む細菌、真菌、もしくは、寄生生物由来の感染性物質からの１つ以上の物質、がん抗原、アレルギー性物質、および自己免疫疾患を発症するようなその他の抗原である。
【００９７】
ある実施形態において、抗原は粗製または精製した自然源に由来してもよいし、抗原の元の生存型、または殺傷後抗原、または不活型抗原、または短縮型抗原、または弱毒型抗原、または非可逆型への形質転換型抗原、または解毒型抗原、または無毒型への変異型抗原、またはフィルター処理した抗原、または精製した抗原を用いてもよい。
【００９８】
いくつかの実施形態では、抗原は、例えば、ウイルス性抗原、細菌性抗原、真菌性抗原、アレルギー性抗原、がん抗原、または自己免疫抗原のような単離された微小有機体抗原である。その他の実施形態では、抗原は、不活化完全抗原である。完全抗原を不活化する方法は、周知技術である。つまり、いくつかの既知の方法は、抗原を不活化するために用いることができ、抗原の種類に応じて適切に選択することができる。そのような抗原不活化法は、例えば、光反応性化合物；酸化剤；照射（例えば、紫外線、γ線照射のような放射照射）；リボフラビンと紫外線照射との組み合わせ；溶剤−界面活性剤処理（例えば、有機溶媒であるトリ−Ｎ−ブチル−ホスフェートとＴｗｅｅｎ ８０のような界面活性剤との処理）；ポリエチレングリコール処理；低温殺菌（熱処理）；および低ｐＨ処理；ペプシンまたはトリプシンでの緩やかな酵素処理；メチレンブルー（ＭＢ）光処理；ジメチルメチレンブルー（ＤＭＭＢ）と可視光との処理；ソラレン誘導体Ｓ‐５９と紫外線Ａ照射との処理；および同類のものの使用を含む。
【００９９】
着目される関連の実施形態では、抗原は、固相合成法により合成されてもよいし、または、遺伝子組み換え法により得てもよいし、または、病原体の免疫原性の特徴を模倣するように別の方法で人工的に製造してもよい。
【０１００】
ポリペプチド抗原は、公知技術である標準的なタンパク質精製法を用いて自然源から単離してもよい。タンパク質精製法は、液体クロマトグラフィー（例えば、高速液体クロマトグラフィー、高速タンパク質液体クロマトグラフィー等）、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動（一次元ゲル電気泳動、二次元ゲル電気泳動を含む）、親和性クロマトグラフィー、または、その他の精製技術を含むが、これらに限定されない。固相ペプチド合成技術を採用してもよく、そのような技術は当業者において公知である。ジョーンズ、「The Chemical Synthesis of Petides」(Clarendon Press, Oxford)(1994)を参照のこと。一般に、そのような方法では、ペプチドは、活性型モノマー単位を固相結合伸長ペプチド鎖に逐次的に付加することで産生される。十分に確立された組み換えＤＮＡ技術をポリペプチドの産生のために採用してもよい。そのような組み換えＤＮＡ技術は、例えば、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクトを適切な宿主細胞（例えば、単細胞性の存在としてｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養中で成長する真核生物宿主細胞、例えば、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞等）、または、原核細胞（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養中で成長する）に導入し、遺伝子操作により改変された宿主細胞を作り出す方法を含むが、これらに限定されない。つまり、適切な培養条件下で、タンパク質は、遺伝子操作により改変された宿主細胞により産生される。
【０１０１】
いくつかの実施例では、抗原は、例えば、約２５％〜５０％純度、約５０％〜約７５％純度、約７５％〜約８５％純度、約８５％〜約９０％純度、約９０％〜約９５％純度、約９５％〜約９８％純度、約９８％〜約９９％純度、９９％純度より高純度の精製抗原である。
【０１０２】
抗原は、無細胞性、カプセル状、感染性クローン、レプリコン、ベクター化、マイクロカプセル化、１価、２価、または多価であってもよい。
【０１０３】
本発明のポリヌクレオチドアジュバント組成物は、ＤＮＡワクチンにより産生される抗原、および／または、ＤＮＡ発現タンパク質に対する免疫応答を亢進させるために用いることもできる。これらのワクチン中の抗原をコードするＤＮＡ配列は、そのままでもよいし、または、リポソームのような運搬システム中に収容することができる。
【０１０４】
特に着目される一態様では、対象免疫原性組成物は、ＰＩＫＡアジュバントとの組み合わせで用いられる抗原または複数抗原の選択により特徴付けることができる。
【０１０５】
より具体的には、上記本発明は、免疫原性組成物、および使用方法を提供する。この場合、免疫原性組成物はウイルス性抗原と共にＰＩＫＡアジュバントを含む。典型的な抗原は、表１に記載の一つ以上のウイルスの抗原を含むが、これらに限定されない。
【０１０６】
【表１】
2009523721.tif 000003
【０１０７】
2009523721.tif 000004
【０１０８】
2009523721.tif 000005
【０１０９】
2009523721.tif 000006
【０１１０】
2009523721.tif 000007
【０１１１】
より具体的には、本発明は、免疫原性組成物、および使用法を提供する。この場合、免疫原性組成物は細菌性抗原と共にＰＩＫＡアジュバントを含む。典型的な抗原は、表２に記載の一つ以上の細菌の抗原を含むが、これらに限定されない。
【０１１２】
【表２】
2009523721.tif 000008
【０１１３】
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【０１１４】
2009523721.tif 000010
【０１１５】
2009523721.tif 000011
【０１１６】
より具体的には、本発明は、免疫原性組成物、および使用法を提供する。この場合、免疫原性組成物は真菌性抗原と共にＰＩＫＡアジュバントを含む。典型的な抗原は、表３に記載の一つ以上の真菌の抗原を含むが、これらに限定されない。
【０１１７】
【表３】
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【０１１８】
2009523721.tif 000013
【０１１９】
より具体的には、本発明は、免疫原性組成物、および使用法を提供する。この場合、免疫原性組成物は、寄生生物性抗原と共にＰＩＫＡアジュバントを含む。典型的な抗原は、表４に記載の一つ以上の寄生生物の抗原を含むが、これらに限定されない。
【０１２０】
【表４】
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【０１２１】
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【０１２２】
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【０１２３】
関連の実施形態では、本発明は、免疫原性組成物、および使用法を提供する。この場合、免疫原性組成物はアレルギー性抗原（いわゆるアレルゲン）またはワクチンと共にＰＩＫＡアジュバントを含み、抗原もしくはワクチンの元は、ヒトもしくは動物のアレルギー源に由来する、または、これらのアレルギー源からの病原体を模倣して生産される。動物のアレルギー源は、植物、動物、真菌、昆虫、穀物、薬物、埃、およびダニ等を含む。
【０１２４】
アレルゲンは、周囲の空気アレルゲン；ブタクサ／花粉症のような植物の花粉；雑草花粉アレルゲン；牧草花粉アレルゲン；ジョンソン草；樹木花粉アレルゲン；ライグラス；イエダニアレルゲンのようなクモ形類動物アレルゲン（例えば、Ｄｅｒ ｐ Ｉ、Ｄｅｒ ｆ Ｉ等）；倉庫ダニアレルゲン；杉花粉／花粉症；カビ胞子アレルゲン；動物アレルゲン（例えば、イヌ、テンジクネズミ、ハムスター、アレチネズミ、ラット、ハツカネズミ等のアレルゲン）；食物アレルゲン（例えば、甲殻類のアレルゲン；ピーナッツのような木の実のアレルゲン；柑橘類の果物のアレルゲン）；昆虫アレルゲン；毒物：（膜翅目、スズメバチ、ミツバチ、カリバチ、スズメバチ、カミアリ）；ゴキブリ、ノミ、蚊等からのその他の周囲の昆虫アレルゲン；連鎖球菌（streptococcal）抗原のような細菌アレルゲン；回虫（Ascaris）抗原のような寄生生物アレルゲン；ウイルス抗原；真菌胞子；薬物アレルゲン；抗生物質；ペニシリンおよび関連化合物；その他の抗生物質；ホルモン（インスリン）、酵素（ストレプトキナーゼ）のような完全タンパク質；不完全抗原もしくはハプテンのように働くことができるすべての薬物およびそれらの代謝産物；ハプテンのように働きアレルゲンとして機能することができる産業用化学物質および代謝産物（例えば、酸無水物（無水トリメリット酸など）およびイソシアネート（トルエンジイソシアネートなど））；小麦粉（例えば、パン屋喘息の原因となるアレルゲン）、トウゴマの実、コーヒー豆、および、上記に記載の産業用化学物質のような職業性アレルゲン；ノミアレルゲン；および、非ヒト動物におけるヒトタンパク質を含むが、これらに限定されない。
【０１２５】
アレルゲンは、細胞、細胞抽出物、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖類、多糖類複合体、多糖類およびその他の分子のペプチドおよび非ペプチド模倣体、低分子、脂質、糖脂質、および、炭水化物を含むが、これらに限定されない。
【０１２６】
天然アレルゲン、動物アレルゲン、および植物アレルゲンの例としては、以下の属に特異的なタンパク質、つまり：イヌ属（Canine）（イヌ（Canis familiaris））；ヒョウダニ属（Dermatophagoides）（例えば、コナヒョウダニ（Dermatophagoides farinae））；ネコ属（Felis）（イエネコ（Felis domesticus））；ブタタサ属（Ambrosia）（ブタクサ（Ambrosia artemiisfolia））；ドクムギ属（Lolium）（例えば、ホソムギ（Lolium perenne）またはネズミムギ（Lolium multiflorum））；スギ属（Cryptomeria）（スギ（Cryptomeria japonica））；アルテルナリア属（Alternaria）（アルテルナリア・アルテルナタ（Alternaria alternata））；ハンノキ属（Alder）；ハンノキ属（Alnus）（アルヌス・グルティノサ（Alnus gultinosa））；カバノキ属（Betula）（カバ（Betula verrucosa））；コナラ属（Quercus）（クウェルクス・アルバ（Quercus alba））；オリーブ属（Olea）（オリーブ（Olea europa））；ヨモギ属（Artemisia）（ヨモギ（Artemisia vulgaris））；オオバコ属（Plantago）（例えば、ヘラオオバコ（Plantago lanceolata））；ヒカゲミズ属（Parietaria）（例えばパリエタリア・オフィチナリス（Parietaria officinalis）またはタチヒカゲミズ（Parietaria judaica））；チャバネゴキブリ属（Blattella）（例えば、チャバネゴキブリ（Blattella germanica））；ミツバチ属（Apis）（例えば、アピス・ムルティフロルム（Apis multiflorum））；イトスギ属（Cupressus）（例えば、クプレスス・セムペルビレンス（Cupressus sempervirens）、クプレスス・アリゾニカ（Cupressus arizonica）、および、クプレスス・マクロカルパ（Cupressus macrocarpa））；ビャクシン属（Juniperus）（例えば、ユニペルス・サビオノイデス（Juniperus sabinoides）、ユニペルス・ビルギニアナ（Juniperus virginiana）、ユニペルス・コムニス（Juniperus communis）、および、ユニペルス・アシェイ（Juniperus ashei））；クロベ属（Thuya）（例えば、ツヤ・オリエンタリス（Thuya orientalis））；ヒノキ属（Chamaecyparis）（例えば、ヒノキ（Chamaecyparis obtusa））；ゴキブリ属（Periplaneta）（例えば、ワモンゴキブリ（Periplaneta americana））；カモジグサ属（Agropyron）（例えば、アグロピロン・レペンス（Agropyron repens））；ライムギ属（Secale）（例えば、ライムギ（Secale cereale））；コムギ属（Triticum）（例えば、コムギ（Triticum aestivum））；カモガヤ属（Dactylis）（例えば、カモガヤ（Dactylis glomerata））；ウシノケグサ属（Festuca）（例えば、ヒロハノウシノケグサ（Festuca elatior））；イチゴツナギ属（Poa）（例えば、ナガハグサ（Poapratensis）またはポア・コンプレサ（Poa compressa））；カラスムギ属（Avena）（例えば、マカラスムギ（Avena sativa））；シラゲガヤ属（Holcus）（例えば、シラゲガヤ（Holcus lanatus））；ハルガヤ属（Anthoxanthum）（例えば、ハルガヤ（Anthoxanthum odoratum））；オオカニツリ属（Arrhenatherum）（例えば、オオカニツリ（Arrhenatherum elatius））；ヌカボ属（Agrostis）（例えば、コヌカグサ（Agrostis alba））；アワガエリ属（Phleum）（例えば、オオアワガエリ（Phleum pratense））；クサヨシ属（Phalaris）（例えば、クサヨシ（Phalaris arundinacea））；スズメノヒエ属（Paspalum）（例えば、パスパルム・ノタツム（Paspalum notatum））；モロコシ属（Sorghum）（例えば、ソルグム・ハレペンシス（Sorghum halepensis））；および、スズメノチャヒキ属（Bromus）（例えば、コスズメノチャヒキ（Bromus inermis））を含むが、これら��限定されない。
【０１２７】
関連の実施形態では、本発明は、ポリヌクレオチドアジュバント組成物、および免疫原性組成物が自己免疫抗原もしくはワクチンと共にＰＩＫＡアジュバントを含む場合の使用方法を提供する。
【０１２８】
関連の実施形態では、本発明は、免疫原性組成物、および、使用方法を提供する。この場合、上記免疫原性組成物は、ＰＩＫＡアジュバントのみを含む、または、がん抗原を併せて含む。典型的な抗原は、表５に記載の一つ以上のがんの抗原を含むが、これらに限定されない。
【０１２９】
【表５】
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【０１３０】
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【０１３１】
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【０１３２】
関連の実施形態では、がん抗原の起源は以下のようであってもよい。つまり、１）ウイルス性タンパク質、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、エプスタイン‐バーウイルス（ＥＢＶ）、および、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）は、それぞれが、肝細胞がん、リンパ腫、および、子宮頸がんの発症に重要である。；２）．全がん細胞（不活化されてもよい）、および／または、これらの細胞の未精製および／または半精製抽出物；３）．腫瘍特異的発がんタンパク質、糖鎖付加タンパク質、ガングリオシド、糖脂質、ムチン、ペプチド、炭水化物および抗イディオタイプモノクローナル抗体のような腫瘍関連抗原（ＴＡＡｓ）。
【０１３３】
関連の実施形態では、ポリヌクレオチドアジュバントを含む免疫源組成物は、現存するがんのさらなる成長の防止、処置したがんの再発防止、または先の治療により殺されなかったがん細胞の除去を通じてがん腫瘍を治療するために使用されてもよい。この治療は、個体に提供されるその他の治療に先立って、その他の治療と併せて、またはその他の治療の後に行ってもよい。それゆえに、がんを治療するための総合的な併用治療の一環をなしてもよい。
【０１３４】
関連の実施形態では、がんワクチンは、初期腫瘍および転移腫瘍の両方に対する腫瘍特異的免疫応答を誘導することができる治療を提供する。加えて、強力な免疫の誘導により、免疫記憶の確立をもたらすことができる。その結果、腫瘍の再発を減らすまたは阻止することができる。がんワクチンは、腫瘍関連表面抗原に対する特異的抗体を誘導してもよいし、なるべくＴｈ１免疫応答に偏った細胞性免疫応答を誘導することがより好ましい。
【０１３５】
様々な既知の腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）のいずれのものも、対象免疫原性組成物中に含むことができる。全部のＴＡＡは、必ずしも必要ではないが用いてもよい。代わりに、ＴＡＡの一部分、例えばエピトープを用いてもよい。腫瘍関連抗原（または、腫瘍関連抗原の中のエピトープを含む断片）は、ＹＦＶに用いてもよく、腫瘍関連抗原は、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、ＨＥＲ−２、高分子量メラノーマ関連抗原ＭＡＡ、ＧＤ２、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＴＡＧ‐７２、卵巣関連抗原ＯＶ‐ＴＬ３およびＭＯＶ１８、ＴＵＡＮ、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＯＦＰ、ＣＡ−１２５、ＣＡ−５０、ＣＡ−１９−９、腎腫瘍関連抗原Ｇ２５０、ＥＧＰ‐４０（ＥｐＣＡＭとしても知られる）、Ｓ１００（悪性黒色腫関連抗原）、ｐ５３、およびｐ２１ｒａｓを含むが、これらに限定されない。前述の任意のＴＡＡを含む任意のＴＡＡ（または、それらのエピトープ）の合成類似体を用いてもよい。さらに、一つ以上のＴＡＡ（または、それらのエピトープ）の組み合わせを組成物中に含んでもよい。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、対象免疫原性組成物は、ポリヌクレオチドアジュバントと少なくとも２つの異なる抗原とを含む。例えば、いくつかの実施形態では、対象免疫原性組成物は、２つの抗原、３つの抗原、４つの抗原、５つの抗原、または５つより多い抗原を含む。
【０１３７】
＜付加的な物質＞
いくつかの実施形態では、対象免疫原性組成物は、ＰＩＫＡアジュバントおよび抗原に加えて、一つ以上の付加的な物質、例えば、免疫賦活剤、担体等を含む。
【０１３８】
特に着目される実施形態では、本発明は、免疫原性組成物およびその使用方法を提供する。この場合、免疫原性組成物は、アジュバントを含むその他の免疫賦活物質と共に、ＰＩＫＡアジュバント、抗原またはワクチンを含んでおり、適切な免疫賦活物質は、水酸化アルミニウムのようなアルミニウム組成物；水中油型乳剤（oil-in-water emulsion）組成物、または、フロイント完全アジュバントを含む免疫原性物質を含む乳剤；乾燥、熱殺傷ヒト結核菌（Mycobacterium tuberculosis）有機体を含む水中油型乳剤；フロイント不完全アジュバント；マイコバクテリアの細胞壁を含む乳剤組成物；スクアレン（ＭＦ−５９）を含む乳剤；モノホスホリル脂質Ａ微生物（ＭＰＬ）を含む無毒化エンドトキシンである脂質Ａ誘導体；ハプテン；ニトロセルロース−吸収タンパク質；キラヤ・サポナリアの皮から単離された粒子状免疫賦活剤、例えばＱＳ２１を含むサポニン；内因性ヒト免疫賦活剤；非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む微生物由来アジュバント；非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含むオリゴデオキシヌクレオチド（例えば、合成オリゴヌクレオチド）；リポソーム（例えば、リン脂質のような生体分解性物質から作ったリポソーム）；生体分解性重合体ミクロスフィア（例えば、ポリ乳酸−コ−グリコール酸（polylactic-co-glycolic acid）（ＰＬＧＡ）、ポリホスファゼン、および、ポリ無水物のような様々なポリマーから作られるミクロスフィア）；インターロイキン−２；カルメット・ゲラン桿菌（Bacille Calmette Guerin）；顆粒球単球−コロニー刺激因子；モンタナイド（Montanide） ＩＳＡ−５１；キーホールリンペットヘモシアニン；ＤＮＡ；タンパク質；カプセル型抗原；免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ’ｓ）；コレラ毒素、コレラ毒素誘導体；閉鎖帯毒素；大腸菌昜熱性エンテロトキシン；不安定毒素、不安定毒素誘導体；百日咳毒素、百日咳毒素誘導体；ムラミールジペプチド誘導体；セピック社シリーズのモノタニドアジュバント(seppic series of monotanide adjubant)；ポリ−ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン（poly-di(carboxylatophenoky)phosphazene）、および、リーシュマニア伸長因子を含むが、これらに限定されない。
【０１３９】
対象免疫原性組成物がその他のアジュバントと併せて投与されるとき、ポリヌクレオチドアジュバントは、その他のアジュバントの投与前に、および／または、その他のアジュバントの投与後に、および／または、その他のアジュバントの投与と同時に投与することができる。例えば、ポリヌクレオチドアジュバントは、抗原の初回投与に併せて投与し、続いてアジュバントの一方または両方を含む追加免疫ワクチンを投与してもよい。代わりに、初回ワクチンは、ポリヌクレオチドアジュバントを除いてもよいが、ポリヌクレオチドアジュバントを含む免疫原性物質は、その後患者に投与される。
【０１４０】
ある実施形態では、対象免疫原性組成物は、サイトカインまたはその他の共刺激分子、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、と共に投与されてもよい。
【０１４１】
関連の実施形態では、本発明は、ＰＩＫＡアジュバント、１つの抗原性物質もしくは複数の抗原性物質に加えて、適切な担体を含む免疫原性物質を提供する。担体は、例えば、水中油型乳剤、懸濁液、脂質小胞、アルミニウム塩、コクリエート（cochleate）、ＩＳＣＯＭｓ、リポソーム、生細菌ベクター（live bacterial vector）、生ウイルスベクター（live viral vector）、ミクロスフィア、核酸ワクチン、ポリマー、ポリマー環、フッ化ナトリウム、遺伝子組み換え植物、ビロソーム（virosome）、ウイルス様微粒子、および公知技術であるその他の運搬小胞でよい。
【０１４２】
ポリヌクレオチドアジュバントは、被験体に直接投与してもよいし、または、運搬複合体と組み合わせて投与してもよい。この場合、運搬複合体は、標的手段に関連する物質、例えば、樹上細胞表面のような標的細胞への高親和性結合をもたらす分子、および／または標的細胞による細胞内取り込みを増加するような分子である。典型的な運搬複合体は、ステロール（例えば、コレステロール）、脂質（例えば、陽イオン性脂質、ビロソーム、または、リポソーム）、または標的細胞特異的結合剤（例えば、標的細胞特異的受容体により認識されるリガンド）に関連する核酸運搬酸を含むが、これらに限定されない。好ましい複合体は、生体内で十分に安定であるため、標的細胞によって取り込まれるより前の著しい脱共役を防ぐことができる。しかし、複合体は、細胞内の適切な条件下では開裂可能であってもよい。
【０１４３】
着目される一実施形態では、ＰＩＫＡアジュバントを含む組成物は、ポリ−Ｌ−リジンまたはそれらの誘導体を含まない。
【０１４４】
＜キット＞
ある実施形態では、本発明は、対象免疫原性組成物を含むキットを提供する。ある実施形態では、本発明は、別々の製剤中にＰＩＫＡアジュバントおよび抗原を含むキットを提供する。
【０１４５】
関連の実施形態では、本発明は、ポリヌクレオチドアジュバントおよび免疫原性化合物を含むキットを提供する。この場合、免疫原性物質は抗原である。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、対象キットは、無菌液製剤（例えば、水性製剤）中に対象免疫原性組成物を含む。この場合、上記製剤は無菌であり、無菌容器、無菌バイアル、または無菌注射器に入れて提供される。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、対象キットは、注射用に製剤された対象免疫原性組成物を含んでいる。いくつかの実施形態では、対象キットは、無菌注射器内に入れられた無菌液製剤中の対象免疫原性組成物；および、注射針を含む。いくつかの実施例では、対象キットは、無菌注射器内に入れられた単位投薬量（例えば、一回の投与量）の無菌液製剤中の対象免疫原性組成物；および注射針を含んでいる。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、対象キットは、無菌容器中の凍結乾燥された対象免疫原性組成物；および凍結乾燥された組成物を再構成するための無菌液を含む容器を含む。いくつかの実施形態では、キットは、さらに、上記凍結乾燥された組成物を再構成するための使用説明書を含む。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、対象キットは、直腸投与、経膣投与、経鼻投与、経口投与（吸入を含む）、オプサマリカリーな（opthamalically）投与、局所投与、肺投与、眼球投与、または皮膚投与のために製剤された免疫原性組成物、および、適切な運搬デバイス、例えば、吸引器、坐薬、塗布器またはそれと同等のものを含む。
【０１５０】
いくつかの実施形態における対象キットは、例えば、投与量および投与頻度を含む使用のための使用説明書をさらに含むだろう。いくつかの実施形態では、使用説明書は、キットに直接印刷されている。その他の実施形態では、使用説明書は能書として提供される印刷物である。使用説明書は、その他の媒体、例えば、音声カセット、音声テープ、コンパクトディスク、デジタル多用途ディスク等に、例えば、デジタル形式またはアナログ形式で電子的に提供することもできる。
【０１５１】
＜製剤＞
対象免疫原性組成物は、様々な製剤のいずれかで提供される。例えば、対象免疫原性組成物は、注射物質、乾燥粉末、溶液（例えば、水溶液または生理食塩水）として、または、懸濁液、クリーム、乳剤、錠剤、被覆錠剤、マイクロカプセル、坐薬、点滴剤、丸薬、顆粒、糖衣錠、カプセル、ゲル、シロップ、または、スラリーとして調製してもよい。所望の免疫原性組成物製剤の調製は、概して、Vaccine 4th Edition（Stanley A Plotkin et al., W.B. Saunders Company;4th edition 2003）に記載されている。適切な製剤は、「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」（(2000) A.Gennaro, 20th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins）；Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems（(1999) H.C. Ansel et al., eds., 7th ed., Lippincott, Williams, & Wilkins）;および、Handbook of Pharmaceutical Excipients（(2000) A.H. Kibbe et al., eds., 3rd ed. Amer. Pharmaceutical Assoc.）；Methods in Molecular Medicine, Vol.87: Vaccine Protocols, 2nd edition（(2003), Humana Press）；Mucosal Vaccines（(1996), Kiyono et al., eds., Academic Press）;および、Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols（(2000) D.T. O’Hagan, Humana Press）にも記載されている。
【０１５２】
対象免疫原性組成物は、マイクロカプセル内に入れられてもよいし、コクリエートに入れられてもよいし、極小の金粒子上に被覆されてもよいし、リポソーム内に入れられてもよいし、噴霧エアロゾルでもよいし、皮下に埋め込む丸薬でもよいし、または、皮膚に傷をつけるための鋭利なもの（例えば、注射針）の上で乾燥させてもよい。
【０１５３】
さらなる実施形態では、対象免疫原性物質は、単独で運搬されてもよいし、分散系と組み合わせて運搬されてもよい。いくつかの実施形態では、分散系は、例えば、高分子複合体に基づく系、ナノカプセルに基づく系、ミクロスフィアに基づく系、ビーズに基づく系および脂質に基づく系からなる群より選択される。脂質に基づく系は、水中油型乳剤、ミセル、混合ミセル、または、リポソームを任意に含む。
【０１５４】
ある実施形態では、ＰＩＫＡアジュバントを含む対象免疫原性組成物は、薬事上許容される溶液の形であり、通常、薬事上許容される濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、適合性のある担体、アジュバント、および任意にその他の治療用成分を含んでいてもよい。組成物は、添加剤、例えば、錠剤分解物質、結合剤、被覆剤、膨張剤、潤滑剤、香味料、甘味料、または可溶化剤等を含んでいてもよい。
【０１５５】
ある実施形態では、ＰＩＫＡアジュバントを含む対象免疫原性組成物は、薬事上許容されるそのままの形で、または、薬事上許容される塩の形で投与される。
【０１５６】
本発明の免疫原性組成物は、カプセル、溶液、液滴、乳液、懸濁液、エリキシル剤、クリーム、坐薬、ゲル、ソフトカプセル、スプレー、吸入抗原、エアロゾル、粉末、錠剤、被覆錠剤、トローチ剤、ミクロカプセル、坐薬、糖衣錠、シロップ、スラリー、顆粒、浣腸剤、または丸薬として、無菌的および非無菌的両方の形態で用いてもよい。いずれの不活性な担体を用いてもよい。例えば、ゼラチンカプセルもしくはミクロカプセルで覆われた生理食塩水もしくはリン酸緩衝生理食塩水、防腐剤、高圧ガス、または投与を助ける媒体、または任意の担体中で本発明の方法で用いられる化合物が本発明の方法での使用に適した溶解特性を有するような担体を用いることができる。
【０１５７】
ある実施形態では、ＰＩＫＡアジュバント組成物、および、ＰＩＫＡアジュバントと抗原性化合物とを含む免疫原性組成物は、長期間の安定性のために凍結乾燥され、固形で貯蔵される。凍結乾燥法は、当業者に公知である。
【０１５８】
着目される一態様では、本発明は、アジュバント組成物または免疫原性組成物を提供し、免疫原性組成物または免疫原性組成物に含まれるアジュバント組成物は、固体もしくは液体であり、または、溶液中もしくは懸濁液中もしくは乳剤中に存在する。
【０１５９】
対象免疫原性組成物は、吸入投与法（経口投与、気管内投与、経鼻投与）のための薬剤運搬系法により個体に投与される。そのため、対象免疫原性組成物は、吸引による投与に適切な形に製剤してもよい。薬剤運搬系は、気管支の粘膜内層へ対象細菌性組成物を局所投与することによる呼吸器系の治療に適した運搬系である。この発明は、容器から細菌を発射するために圧縮ガスの粉に依存した系を利用することができる。エアロゾルまたは加圧型容器を、この目的に用いることができる。
【０１６０】
本明細書において用いられる場合、用語「エアロゾル」は、加圧下の高圧ガスにより治療適用場所へ運ぶ、非常に微細な液体粒子もしくは固体粒子を表す従来の意味で用いられる。エアロゾル式医薬品が、本発明で用いられる場合、エアロゾルは、免疫原性組成物を含んでおり、この免疫原性組成物は、流動性担体および高圧ガスの混合物中に溶解、懸濁、または、乳化することができる。エアロゾルは、溶液、懸濁液、乳剤、粉末、または半固体の形に調製できる。本発明で用いられるエアロゾルは、被験体の気道経由で微細な固体粒子または液体蒸気としての投与を対象としている。当業者に公知の様々な種類の高圧ガスを利用することができる。適切な高圧ガスの例として、炭化水素もしくはその他の適切なガスを含むが、これらに限定されない。加圧型エアロゾルの場合、定量を運搬するための値を規定することにより、投薬量単位を決定することができる。
【０１６１】
いくつかの異なる種類の吸入方法があり、本発明と組み合わせて用いることができる。対象免疫原性組成物は、基本的に３つの異なる種類の吸入用製剤中に製剤することができる。まず、対象免疫原性組成物は、低沸点高圧ガスと共に製剤することができる。そのような製剤は、一般に、従来の定量吸入器（ＭＤＩ’ｓ）により投与される。しかし、米国特許第５，４０４，８７１号および第５，５４２，４１０号において論じられているように、従来のＭＤＩ’ｓは、被験体の吸入量および流速を測定する技術を用いることにより、再現性のある投薬を達成する能力を高めるように改良できる。
【０１６２】
あるいは、対象免疫原性組成物は、水溶液またはエタノール溶液中に製剤し、従来の噴霧器により運搬することができる。いくつかの実施形態では、そのような溶液製剤は、米国特許第５，４９７，７６３号；第５，５４４，６４６号；第５，７１８，２２２号；および、第５，６６０，１６６号に開示されているような装置および系を用いてエアロゾル化される。
【０１６３】
さらに、対象免疫原性組成物は、乾燥粉末製剤に製剤される。そのような製剤は、粉末のエアロゾル蒸気を作り出した後、乾燥粉末製剤を単純吸引することにより投与することができる。上記を実施するための技術は、米国特許第５，７７５，３２０号および米国特許第５，７４０，７４９号に記載されている。鼻内投与に適した製剤は、鼻腔用スプレー、鼻腔用点滴剤およびエアロゾル製剤等を含む。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、対象免疫原性組成物は、持続放出（例えば、制御された放出製剤）するように製剤される。例えば、いくつかの実施形態では、対象免疫原性組成物は、丸薬またはシリンダー内に製剤され、貯蓄注射もしくはインプラントとして、筋肉内もしくは皮下に埋め込まれる。そのようなインプラントは、一般に、生体分解性ポリマーのような既知の不活性材料が用いられる。注射用デポー剤形は、対象免疫原性組成物のマイクロカプセル化マトリクスをポリラクチド−ポリグリコリドのような生体分解性ポリマー中に形成することにより作られる。その他の適した生体分解性ポリマーの例として、ポリオルトエステルおよびポリ無水物が含まれる。貯蓄注射製剤は、組成物を生体組織に適合するリポソームもしくはマイクロエマルジョン中に封入することによっても調製される。運搬放出系は、下記の例、つまり、ポリマーに基づく系、マイクロカプセル、脂質、ヒドロゲル放出系、シラスティック系（sylastic system）、ペプチド系、ペプチドに基づく系、ワックス加工、圧縮錠、部分融合インプラント、当業者に公知のその他の持続放出の形も含む。
【０１６５】
＜方法＞
特に着目される一態様では、本発明は、抗原性化合物への免疫応答を誘発するおよび／または亢進させる方法を提供する。この方法は、宿主への対象免疫原性組成物の投与を含む。いくつかの実施形態では、宿主はヒトである。その他の実施形態では、宿主は非ヒト動物、例えば、非ヒト哺乳類、鳥類等である。
【０１６６】
ある実施形態では、ポリヌクレオチドアジュバント組成物は、ワクチンとの関連で用いることができる。任意に、ワクチン組成物は付加的なアジュバントを含む。含まれるワクチンの種類は、抗感染症、抗がん、抗アレルギー、および抗自己免疫疾患である。
【０１６７】
さらに、本発明は、宿主に対象免疫原性組成物を投与することにより、抗原性化合物への免疫応答を亢進させる方法を提供する。宿主をヒトまたは非ヒト動物とすることができる。
【０１６８】
ある実施形態では、アジュバントは抗原と共に投与される。さらなる実施形態では、アジュバントは、抗原の投与前、または、投与後に投与される。
【０１６９】
対象免疫原性組成物は、いくつかの実施形態では、筋肉内注射、腹腔内注射、静脈注射、または皮内注射のような注射により非経口で運搬される。その他の実施形態では、免疫原性組成物は、注射以外の方法、例えば、機械的な手法により上皮バリアーを傷つけない方法により経皮投与される。その他の実施形態では、免疫原性組成物は、直腸から、膣から、鼻から、口から（吸入を含む）、オプサマリカリーに、眼球から、局所的に、肺から、または皮膚から運搬される。
【０１７０】
被験体は、環境接触により抗原に曝され、その結果、例えば、アレルギー反応、感染症、自己免疫疾患、またはがんを発症する危険性があってもよい。その他の実施形態では、被験体は、環境接触を通して抗原に前もって曝された結果、例えば、感染症、自己免疫疾患、がん、またはアレルギーになる。
【０１７１】
ある実施形態では、ポリヌクレオチドアジュバントを含む免疫原性組成物の投与方法ががん腫瘍の治療のためである場合、運搬は、腫瘍に直接注射する方法、または腫瘍の近くに注射する方法である。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、生体内分布を向上させて治療効果を高めるために、均一に腫瘍の全体または至る所に運搬される。
【０１７２】
水溶液での非経口投与のために、例えば、この溶液は、必要であれば適切に緩衝化されるべきであり、液体希釈剤は、まず、十分な生理食塩水もしくはグルコースで等張にされるべきである。これらの特殊な水溶液は、特に、静脈投与および腹腔内投与に適している。このことに関しては、本発明の開示内容に照らせば、用いることができる無菌的水性溶剤は、当業者にわかるだろう。本発明で用いられる典型的な注射溶剤は、分散剤および／または防腐剤、および、食用油、ミネラルオイル、タラの肝油、スクアレン、モノグリセロール、ジグリセロール、トリグリセロール、およびそれらの混合物を添加したまたは添加していない緩衝剤を含む。
【０１７３】
対象免疫原性組成物は、「効果的な量」で投与される。効果的な量とは、選択された投与経路で免疫応答を誘発し、誘導し、または亢進させるのに効果的な対象免疫原性組成物量である。いくつかの実施形態では、免疫応答は、病原微生物により産生される抗原に対して誘発される。いくつかの実施形態では、対象免疫原性組成物の量は、病原有機体による感染を制限すること、および／または感染を根絶すること、および／または感染に関連する症状を減らすことに効果がある。
【０１７４】
例えば、いくつかの実施形態では、個体への対象免疫原性組成物の投与は、感染症の治療に効果がある。この場合、感染症の治療とは、個体における病原体の数を減らすこと（例えば、ウイルス量を減らすこと、細菌量を減らすこと、原虫量を減らすこと、蠕虫量を減らすこと）、および／または感染症関連のパラメーターを減らすことの内、一つ以上を含む。感染症関連のパラメーターとは、病原体により産生される産物（例えば、毒素、抗原等）の量の減少、および病原体への望まない生理応答（例えば、発熱、組織浮腫等）の減少を含むが、これらに限定されない。
【０１７５】
必要とされるそのような組成物の正確な量は、被験体間で異なり、被験体の種、年齢、体重および全身状態、治療もしくは予防する疾病、感染または病気の重症度、用いる詳細な化合物、ならびにその投与方法等による。本明細書において指示される所定の実験のみを用いて、技術的にありふれた技術の一つにより適切な量を決定することができる。初回投与に続いて、被験体は、十分に期間をあけて、１回または数回の追加免疫を受けてもよい。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、対象免疫原性組成物は連続投与される。これらの実施形態では、ワクチン投与の結果を受けて、第一回目の投与量の対象免疫原性組成物を投与してもよい。第一回目の投与量に曝され、個体が免疫学的に準備が整った後、第二回目の投与量の対象免疫原性組成物が上記個体に投与される。追加抗原投与量は、患者の反応および状態により、初回投与量のから数日後、数週間後、または数ヶ月後に投与されてもよい。例えば、追加免疫投与量は、初回から、約２日後から約１２ヶ月後、例えば、約２日後から約７日後、約１週間後から約２週間後、約２週間後から約４週間後、約４週間後から約８週間後、約８週間後から約６ヶ月後、約６ヶ月後から約１２ヶ月後に投与される。本発明は、例えば、第三回目、第四回目、第五回目、第六回目、またはそれに続く投与量を用いての、第三回目、第四回目、第五回目、第六回目、またはそれに続く追加免疫の使用を、さらに意図している。
【０１７７】
ある実施形態では、投与方法は、代わりの経路の組み合わせを含んでもよい。例えば、全身的な投与（例えば、腹膜投与、筋肉内投与、皮下投与、または皮内投与）の後には、粘膜的運搬投与（例えば、経鼻投与、吸入）が続いてもよい。または、逆の場合も同じである。
【０１７８】
ある実施形態では、ポリヌクレオチドアジュバントは、投与される抗原の初回用量もしくは後続の投与用量のいずれかと一緒に投与してもよいし、または患者へ投与されるすべての用量と共に投与してもよい。全体の手順の一環として投与される用量の内、少なくとも一つは、ＰＩＫＡアジュバントを含むだろう。
【０１７９】
ある実施形態では、投与された免疫原性組成物の組成物は、初回投与と追加免疫との間、および／または追加免疫の投与量間で異なっていてもよい。一例として、最初の投与用量は、ＤＮＡワクチンを含んでいるが、追加免疫投与量は組み換えタンパク質ワクチンの形であってもよい。全体の手順の一環として投与される用量の内、少なくとも一つは、ＰＩＫＡアジュバントを含むだろう。
【０１８０】
抗原に対する抗体応答が個体内で誘導される、または、亢進されるかどうかは、標準的試験を用いて容易に実証される。例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫沈降試験、およびタンパク質ブロット試験（“ウエスタン”ブロット）のような免疫学的試験；および、中和試験（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでのウイルスの感染力の中和）；であり、これらの試験は、体液もしくはその他の生体試料、例えば、個体の血清、分泌物、またはその他の液体中の細菌抗原に特異的な抗体の存在を検出するために用いることができる。
【０１８１】
抗原に対するＣＤ４免疫応答が個体中に誘導されたかどうかは、標準的な試験を用いて容易に実証される。例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）（例えば、Waldrop et al. (1997) J. Clin. Invest. 99:1739-1750参照）；抗原刺激後のサイトカインの産生を検出する細胞内サイトカイン試験（例えば、Suni et al. (1998) J. Immunol. Methods 212:89-98；Nomura et al. (2000) Cytometry 40:60-68；Ghanekar et al. (2001) Clin. Diagnostics Lab Immunol. 8:628-631を参照）；ＭＨＣ−ペプチドマルチマー染色試験、例えば、検出可能な標識（例えば、蛍光標識）を付けた可溶性ＭＨＣ Ｃｌａｓｓ ＩＩ／ペプチドマルチマーの使用（例えば、Bill and Kotzin (2002) Arthritis Res. 4:261-265；Altman et al. (1996) Science 274:94-96；および、Murali-Krishna et al. (1998) Immunity 8:177-187を参照）；エリスポット（enzyme-linked immunospot）（ELISPOT）試験（例えば、Hutchings et al. (1989) J. Immunol. Methods 120:1-8；および、Czerkinsky et al. (1983) J.Immunol. Methods 65:109-121を参照）等である。細胞内サイトカイン試験の一つの限定されない例として、全血液は抗原、および、共刺激抗体（例えば、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ４９ｄ）で２時間以上刺激され；ブレフェルジンＡはサイトカインの分泌を阻害するために加えられ；そして、細胞は、ＣＤ４対する蛍光標識抗体と、ＴＮＦ−ａ、ＩＮＦ−γおよびＩＬ−２のようなサイトカインに対する蛍光標識抗体とを用いてＦＡＣＳ解析される。
【０１８２】
抗原特異的ＣＤ８（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞；いわゆる、ＣＴＬ）応答が抗原（例えば、病原体）に対して誘導されるかどうかは、公知技術である多くの試験のうちいずれかを用いて実証することができる。試験は、細胞表面に抗原を発現する標的細胞におけるＣＴＬによる特異的溶解の測定を含むが、これに限定されない。標的細胞は、溶解により標的細胞から放出される検出可能な標識を取り込んでおり、例えば、５１Ｃｒ−放出試験；ランタニド蛍光に基づくサイトカイン試験等を用いて測定することができる。
【０１８３】
＜治療に適した被験体＞
細菌性病原体への免疫応答を誘導する対象方法、および細菌性病原体の感染を治療するまたは防ぐ方法を用いた治療に適した被験体は、病原微生物に感染した個体；病原微生物により感染しやすいが、まだ感染していない個体；および、病原微生物に感染する危険性があるが、まだ感染していない個体を含む。適した被験体は、乳児、子供、若者、および成人を含む。
【０１８４】
細菌性病原体に対する免疫応答を誘導する対象方法、および細菌性病原体の感染を治療または制限する方法を用いた治療に適した被験体は、小児科が対象とする集団を含む。例えば、約１歳から約１７歳の間の個体で、乳児（例えば、約１ヶ月齢から約１歳）；子供（例えば、約１歳から約１２歳）；および、若者（例えば、約１３歳から約１７歳）である。
【０１８５】
細菌性病原体に対する免疫応答を誘導する対象方法、および細菌性病原体の感染を治療または制限する方法を用いた治療に適した被験体は、新生児を含む。例えば、１日齢から約１４日齢の個体（例えば、ヒトの新生児）で、例えば、約１日齢から約２日齢、約２日齢から約１０日齢、約１０日齢から約１４日齢の個体である。
【０１８６】
特定の実施形態では、被験体は、約１０歳またはそれより若い、例えば、約５歳またはそれより若いヒトの子供である。そして、免疫原性組成物は、以下の時期の内いずれか１つまたはそれ以上で投与される。具体的には、生後２週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１５ヶ月、１８ヶ月もしくは２１ヶ月、または２歳時、３歳時、４歳時、５歳時、６歳時、７歳時、８歳時、９歳時もしくは１０歳時である。いくつかの実施形態では、対象免疫原性組成物は約６ヶ月齢から約６歳の範囲の個体に投与される。この場合、個体は、約６ヶ月齢で初回投与量を受け、続く追加免疫投与量、例えば、２回から３回の続く追加免疫投与量を、例えば、２歳、４歳および６歳で受ける。
【０１８７】
特定の実施形態では、被験体は、約１７歳から４９歳のヒトの成人である。いくつかの実施形態では、被験体は、５０歳から６５歳、６５歳から７５歳、７５歳から８５歳、８５歳以上のヒトの高齢者である。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、対象免疫原性組成物は、実際の細菌性病原体源または細菌性病原体源の可能性があるものに接触して間もなく（例えば、接触が認められた、または接触が疑われてから間もなく）の個体、例えば、細菌性病原体に感染した、または感染したことが疑われるとわかった個体に投与される。例えば、いくつかの実施形態では、対象免疫原性組成物は、細菌性病原体に感染したまたは感染したことが疑われるとわかった個体との接触後約１時間以内、約２時間以内、約５時間以内、約８時間以内、約１２時間以内、約１８時間以内、約２４時間以内、約２日以内、約４日以内、約７日以内、約２週間以内または約１ヶ月以内に個体に投与される。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、対象免疫原性組成物は、個体が感染の症状を示しているいないを問わず、保菌者もしくは細菌性病原体であることがわかっている、または疑うことのできる個体に投与される。
【０１９０】
細菌性病原体に対する免疫応答を誘導する対象方法、および細菌性病原体の感染を治療するもしくは制限する方法を用いた治療に適した被験体は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を欠損する個体（“ＣＤ４＋−欠損”個体）、例えば、機能性ＣＤ４＋ Ｔリンパ球の数が正常より低い個体を含む。本明細書において用いられる場合、用語「正常個体」は、集団内で正常範囲内のＣＤ４＋Ｔリンパ球の水準と機能を有する個体を表す。ヒトでは、通常は、１ｍｍ３の血液あたり６００〜１５００個のＣＤ４＋ Ｔリンパ球が範囲内である。ＣＤ４＋−欠損個体は、後天的免疫不全、または一次免疫不全の個体を含む。後天的一次免疫不全は、放射線療法または化学療法による一時的なＣＤ４＋欠損でもよい。
【０１９１】
健康で、免疫系が損なわれていないが、ＣＤ４＋欠損になる危険性がある個体（“危険な状態にある”個体）も本発明の方法を用いた治療に最適である。危険な状態にある個体とは、ＣＤ４＋欠損になる可能性が、一般的な集団よりも高い個体を含むが、これらに限定されない。ＣＤ４＋欠損になる危険な状態にある個体とは、ＨＩＶに感染した個体との性行為が原因でＨＩＶに感染する危険性がある個体；静脈注射用薬物使用者；ＨＩＶに感染した血液、血液製剤またはその他のＨＩＶに汚染された体液に曝された可能性のある個体；ＨＩＶ感染個体の産道を通った新生児；ＨＩＶ感染している母親より授乳されている新生児等を含むが、これらに限定されない。
【０１９２】
がん治療のために対象方法を用いる治療に適した被験体は、発がん物質に感染した個体、がんになりやすいが、まだがんと診断されていない個体；およびがんになる危険性があるが、まだがんと診断されていない個体を含む。適した被験体は、乳児、子供、若者、および成人を含む。
【０１９３】
がん治療のために対象方法を用いる治療に適した被験体は、がんと診断された個体；例えば化学療法もしくは放射線療法により、以前、がんの治療をした個体、および、以前治療したがんの再発を観察されている個体；および、骨髄移植またはその他の臓器移植を経験した個体を含む。
【０１９４】
アレルギー治療のために本発明の製剤および方法を用いる治療に適した被験体は、アレルギーを有すると診断されたあらゆる個体をも含む。本明細書に記載された方法および薬剤を用いた治療の影響を受けやすい被験体は、一つ以上のアレルゲンに対しアレルギー性過敏症を有することがわかっている個体を含む。治療の影響を受けやすい被験体は、上述したアレルギー性疾患のいずれかを有する個体を含む。一つ以上のアレルゲンに対しアレルギー反応を有する危険性のある被験体も治療の影響を受けやすい。一つ以上のアレルギー性疾患治療のための標準的な療法を用いた治療が失敗した個体も最適である。
【０１９５】
治療に適した被験体は、先進工業国に住んでいる個体；発展途上国に住んでいる個体；農村部に住んでいる個体；比較的隔離された地域に住んでいる個体等を含む。
【０１９６】
対象免疫原性組成物の標的集団は、細菌性病原体によって変わるだろう。
【０１９７】
上記の開示は、主に、本発明について記載している。以下の実施例は、本発明の理解に役立つだろう。これらの実施例は、説明の目的のためだけに記載され、本発明の範囲を限定するものではない。周囲の環境により方法が示唆または提供されている場合には、形態の変更および均等物への置換が予期される。本明細書においては、特殊な用語が用いられているが、そのような用語は、説明的な意味で表されたのであって、限定目的ではない。
【０１９８】
〔実施例〕
[実施例１：ＰＩＫＡは種々の抗原とともに特定の免疫応答を誘導する]
本実施例は、生体内において種々の抗原とともに特定の免疫応答を誘発するＰＩＫＡの使用に関する。本研究は、毎回異なる抗原を使用しているが、共通のプロトコルによる一連の独立の実験において実施された。検証された抗原は、以下のものを含む：Ｂ型肝炎表面抗原ａｄｗ型の組換えタンパク質、不活化され分割されたインフルエンザワクチン（サノフィパスツール社が提供するＶＡＸＩＧＲＩＰ）、合成ＨＩＶペプチド抗原、単純ヘルペスウイルス２型のｇＤ抗原の組換えタンパク質、組み換え型の炭疽菌タンパク質防御抗原、不活化されたトリインフルエンザウイルス全体の抗原Ｈ５Ｎ１株、および不活化された重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス全体の不活化抗原。
【０１９９】
個々の実験におけるプロトコルでは、抗原のみを含む組成物、抗原およびＰＩＫＡアジュバント（主に約６６ｋＤａ〜１，２００ｋＤａの重量分布範囲内であるＰＩＫＡ分子の不均一な組成物）を含む組成物、ＰＩＫＡのみを含む組成物、またはリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を含むコントロールを、Ｂａｌｂ／ｃマウスのグループ（グループにつき３匹のマウス）へ接種することを伴う。
【０２００】
実際の投与量は、使用される抗原ごとに規定される。マウスは、最初の注射の１０〜１４日後に、また同一の追加免疫ワクチンを与えられた。追加免疫注射の１０〜１４日後に血液試料を採取し、その後マウスを屠殺して、脾臓から組織試料を採取した。示された結果は、各グループ内における個々のマウスの試験結果の平均である。
【０２０１】
脾臓細胞の懸濁液を調製した後、各マウスからの細胞懸濁液試料を、ＥＬＩＳＰＯＴプレートの６−１２ウェルの中に入れ、培養した。ＥＬＩＳＰＯＴプレートの各ウェルは、２００ｕｌの脾細胞懸濁液（約２×１０５〜１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を含んでいた（詳細は下記の表を参照）。培養する各マウスの脾細胞試料について、脾細胞を含むウェルのうちの半分のウェルは、培養液とともに培養し、残りの半分のウェルには、評価中の特定の抗原についての２つの異なる濃度のうち１つを用いて刺激を与えた。最後の調製および標準的なＥＬＩＳＰＯＴプレート読取り装置を用いた読取りの前に、環境的に制御される条件において、プレートを３７℃で２０時間インキュベートする。
【０２０２】
サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−２、およびＩＮＦ−γを生産する細胞の数を検出するために、当業者に知られる標準的なＥＬＩＳＰＯＴ試験を用いた。
【０２０３】
ＣＤ４＋Ｔ細胞により生産されるＩＮＦ−γを検出するために、フローサイトメトリー解析を用いた。蛍光発色セルソーター（ＦＡＣＳ）の使用方法は、当業者において周知である。簡単にいえば、２．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度の脾細胞懸濁液を調製し、試料につき２ｍｌを個々のチューブに分配した。次に抗原により刺激された試料を調製した後、環境的に制御された条件において３７℃で５時間培養した。その後、標準的なＦＡＣＳ読取り装置における読取りの前に、試料を洗浄および染色した。
【０２０４】
屠殺前の動物から採取された血清における特定の抗体の力価を検出するために、当業者に公知の標準的なＥＬＩＳＡ試験を用いた。
【０２０５】
[実施例１．１：組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）ａｄｗ]
下記の表６における結果は、ＨＢｓ抗原ａｄｗ型の組換えタンパク質を用いてＩＮＦ−γ、ＩＬ−２およびＩＬ−４を生産した細胞の存在数を検出したＥＬＩＳＰＯＴ試験の結果である。表６におけるデータ（図１、２および３もまた参照）は、ＥＬＩＳＰＯＴの読取り、つまりスポットを形成した細胞の数を表しており、すなわちサイトカインを生産した細胞の数の直接的な測定を表している。
【０２０６】
スポットを形成した細胞の数がＰＩＫＡアジュバントの添加により明らかに増加したこと（抗原のみと比べて）は、培養脾臓細胞によるサイトカインＩＮＦ−γ、ＩＬ−２およびＩＬ−４の発現がＰＩＫＡアジュバントを組換えＢ型肝炎表面抗原に添加することにより亢進したことを示している。サイトカインの発現が観察されたことは、ＰＩＫＡアジュバントの存在により、液性および細胞性免疫の両方におけるより一層の適応的免疫反応が誘導されたことを示す。
【０２０７】
【表６】
2009523721.tif 000020
【０２０８】
屠殺前に採取された血液試料におけるＥＬＩＳＡ試験の結果（下記の表７、および図４）は、ＰＩＫＡの存在が著しく免疫応答を亢進させ、かつ血清中に検出された特定の抗体の力価により示されたことを明らかにする。
【０２０９】
【表７】
2009523721.tif 000021
【０２１０】
導き出される結論は、ＰＩＫＡアジュバントの添加により、ＨＢｓ抗原への免疫応答全般、特には特定の免疫応答、より特には適応的免疫、またより明確にはＴｈ１に顕著に偏った免疫応答が亢進し、細胞性免疫応答が促進されることである。
【０２１１】
[実施例１．２：Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２様菌株およびｂ／Ｓｈａｎｇｈａｉ５／３６１／２００２菌株を含む、不活化および精製されたインフルエンザ抗原、ＶＡＸＩＧＲＩＰ（サノフィパスツール社）]
下記の表８における結果は、サノフィパスツール社により製造された、不活化され分割されたヒトインフルエンザワクチンである、ＶＡＸＩＧＲＩＰワクチンを用いて、ＩＮＦ−γ、ＩＬ−２およびＩＬ−４を生産した細胞の存在数を検出したＥＬＩＳＰＯＴ試験の結果である。表８におけるデータ（図５、６および７もまた参照）は、ＥＬＩＳＰＯＴの読取り、つまりスポットを形成した細胞の数を表しており、すなわちサイトカインを生産した細胞の数の直接的な測定を表している。
【０２１２】
スポットを形成した細胞の数がＰＩＫＡアジュバントの添加により明らかに増加したこと（抗原のみと比べて）は、培養脾臓細胞によるサイトカインＩＮＦ−γ、ＩＬ−２およびＩＬ−４の発現がＰＩＫＡアジュバントをインフルエンザ抗原に添加することにより亢進したことを示している。サイトカインの発現が観察されたことは、ＰＩＫＡアジュバントの存在により、液性および細胞性免疫の両方におけるより一層の適応的免疫反応が誘導されたことを示す。
【０２１３】
【表８】
2009523721.tif 000022
【０２１４】
屠殺前に採取された血液試料におけるＥＬＩＳＡ試験の結果（下記の表９、および図８）は、ＰＩＫＡの存在が著しく免疫応答を亢進させ、かつ血清中に検出された特定の抗体の力価により示されたことを明らかにする。
【０２１５】
【表９】
2009523721.tif 000023
【０２１６】
導き出される結論は、ＰＩＫＡアジュバントの添加により、インフルエンザ抗原への免疫応答全般、特には特定の免疫応答、より特には適応的免疫、またより明確には細胞性免疫応答が亢進することである。
【０２１７】
ＶＡＸＩＧＲＩＰは、インフルエンザに感染する危険性を著しく減少させることが認められている、認可されたインフルエンザワクチンである。ＰＩＫＡの添加によりサイトカインの生産量が亢進することは、ＶＡＸＩＧＲＩＰおよびＰＩＫＡを含むワクチンが、インフルエンザに感染する危険性を著しく減少させる免疫応答をさらに誘発することを示す。
【０２１８】
[実施例１．３：合成ＨＩＶペプチド抗原]
下記の表１０における結果は、ＨＩＶペプチド抗原を用いてＩＮＦ−γ、ＩＬ−２およびＩＬ−４を生産した細胞の存在数を検出したＥＬＩＳＰＯＴ試験の結果である。表１０におけるデータ（図９、１０および１１もまた参照）は、ＥＬＩＳＰＯＴの読取り、つまりスポットを形成した細胞の数を表しており、すなわちサイトカインを生産した細胞の数の直接的な測定を表している。
【０２１９】
スポットを形成した細胞の数がＰＩＫＡアジュバントの添加により明らかに増加したこと（抗原のみと比べて）は、培養脾臓細胞によるサイトカインＩＮＦ−γ、ＩＬ−２およびＩＬ−４の発現が、ＰＩＫＡアジュバントをＨＩＶ抗原に添加することにより亢進したことを明らかにする。サイトカインの発現が観察されたことは、ＰＩＫＡアジュバントの存在により、液性および細胞性免疫の両方におけるより一層の適応的免疫反応が誘導されたことを示す。
【０２２０】
【表１０】
2009523721.tif 000024
【０２２１】
ＦＡＣＳ解析の結果を、下記の表１１に示す（図１２もまた参照）。ＩＮＦ−γを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞がＰＩＫＡおよびＨＩＶ抗原の両方を含む処方においてのみ存在したことは、適応的免疫反応が成熟段階に達していたこと、およびＰＩＫＡがこの過程に有益であることについての所見を確かにする。
【０２２２】
【表１１】
2009523721.tif 000025
【０２２３】
導き出される結論は、ＨＩＶ抗原へのＰＩＫＡアジュバントの添加により、免疫応答全般、特には特定の免疫応答、より特には適応的免疫、またより明確には細胞性免疫応答が亢進することである。
【０２２４】
[実施例１．４：バチルス・アントラシスからの、組み換え型炭疽菌の防御抗原（ｒＰＡ）]
下記の表１２における結果は、組み換え型炭疽菌を用いてＩＮＦ−γ、ＩＬ−２およびＩＬ−４の存在を検出したＥＬＩＳＰＯＴ試験の結果である。表１２におけるデータ（図１３、１４および１５もまた参照）は、ＥＬＩＳＰＯＴの読取り、つまりスポットを形成した細胞の数を表しており、すなわちサイトカインを生産した細胞の数の直接的な測定を表している。
【０２２５】
スポットを形成した細胞の数がＰＩＫＡアジュバントの添加により明らかに増加したこと（抗原のみと比べて）は、培養される脾臓細胞によるサイトカインＩＮＦ−γ、ＩＬ−２およびＩＬ−４の発現が、ＰＩＫＡアジュバントを炭疽菌抗原へ添加することにより亢進されたことを明らかにする。サイトカインの発現が観察されたことは、ＰＩＫＡアジュバントの存在により、液性および細胞性免疫の両方におけるより一層の適応的免疫反応が誘導されたことを示す。
【０２２６】
【表１２】
2009523721.tif 000026
【０２２７】
ＦＡＣＳ解析の結果を、下記の表１３に表す（図１６もまた参照）。ＩＮＦ−γを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞がＰＩＫＡおよびｒＰＡ抗原の両方を含む処方においてのみ存在したことは、適応的免疫反応が成熟段階に達していたこと、およびＰＩＫＡがこの過程に有益であることについての所見を確かにする。
【０２２８】
【表１３】
2009523721.tif 000027
【０２２９】
屠殺前に採取された血液試料におけるＥＬＩＳＡ試験の結果（下記の表１４、ならびに図１６および１７）は、ＰＩＫＡの存在が著しく免疫応答を亢進させ、かつ血清中に検出された特定の抗体の力価により示されたことを明らかにする。
【０２３０】
標準的なＥＬＩＳＡ試験を用いて、当初のグループＡおよびＢのマウスからの血液試料における特定の抗体の存在量について調べたところ、最初のワクチン注射の１６週間後において一貫性のある結果が観察された。炭疽菌抗原とともにＰＩＫＡが存在することにより、血清中の特定の抗体の力価により示されるような、著しくより高い免疫応答が再び誘導された。
【０２３１】
【表１４】
2009523721.tif 000028
【０２３２】
導き出される結論は、ＰＩＫＡアジュバントの添加により、ｒＰＡへの免疫応答全般、特には特定の免疫応答、より特には適応的免疫、またより明確には細胞性免疫応答が亢進することである。
【０２３３】
[実施例１．５：組換え型単純ヘルペスウイルス２型のｇＤ抗原]
下記の表１５における結果は、組み換え型単純ヘルペスウイルス抗原を用いてＩＮＦ−γ、ＩＬ−２およびＩＬ−４の存在を検出したＥＬＩＳＰＯＴ試験の結果である。表１５におけるデータ（図１９、２０および２１もまた参照）は、ＥＬＩＳＰＯＴの読取り、つまりスポットを形成した細胞の数を表しており、すなわちサイトカインを生産した細胞の数の直接的な測定を表している。
【０２３４】
スポットを形成した細胞の数がＰＩＫＡアジュバントの添加により明らかに増加したこと（抗原のみと比べて）は、培養される脾臓細胞によるサイトカインＩＮＦ−γ、ＩＬ−２およびＩＬ−４の発現が、ＰＩＫＡアジュバントを単純ヘルペスウイルス抗原へ添加することにより亢進したことを明らかにする。サイトカインの発現が観察されたことは、ＰＩＫＡアジュバントの存在により、液性および細胞性免疫の両方におけるより一層の適応的免疫反応が誘導されたことを示す。
【０２３５】
【表１５】
2009523721.tif 000029
【０２３６】
ＦＡＣＳ解析の結果を、下記の表１６に表す（図２２もまた参照）。ＩＮＦ−γを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞がＰＩＫＡおよびＨＳＶ抗原の両方を含む処方においてのみ存在したことは、適応的免疫反応が成熟段階に達していたこと、およびＰＩＫＡがこの過程に有益であることについての所見を確かにする。
【０２３７】
【表１６】
2009523721.tif 000030
【０２３８】
屠殺前に採取された血液試料におけるＥＬＩＳＡ試験の結果（下記の表１７、および図２３）は、ＰＩＫＡの存在が著しく免疫応答を亢進させ、かつ血清中に検出された特定の抗体の力価により示されたことを明らかにする。
【０２３９】
【表１７】
2009523721.tif 000031
【０２４０】
導き出される結論は、ＰＩＫＡアジュバントの添加により、ＨＳＶ抗原への免疫応答全般、特には特定の免疫応答、より特には適応的免疫、またより明確には細胞性免疫応答が亢進することである。
【０２４１】
[実施例１．６：不活化Ｈ５Ｎ１のウイルス（トリインフルエンザ）全体の抗原]
下記の表１８における結果は、不活化された未精製のＨ５Ｎ１抗原を用いてＩＮＦ−γ、ＩＬ−２およびＩＬ−４の存在を検出したＥＬＩＳＰＯＴ試験の結果である。表１８におけるデータ（図２４、２５および２６もまた参照）は、ＥＬＩＳＰＯＴの読取り、つまりスポットを形成した細胞の数を表しており、すなわちサイトカインを生産した細胞の数の直接的な測定を表す。
【０２４２】
スポットを形成した細胞の数がＰＩＫＡアジュバントの添加により明らかに増加したこと（抗原のみと比べて）は、培養される脾臓細胞によるサイトカインＩＮＦ−γ、ＩＬ−２およびＩＬ−４の発現が、ＰＩＫＡアジュバントをＨ５Ｎ１抗原へ添加することにより亢進したことを明らかにする。サイトカインの発現が観察されたことは、ＰＩＫＡアジュバントの存在により、液性および細胞性免疫の両方におけるより一層の適応的免疫反応が誘導されたことを示す。
【０２４３】
【表１８】
2009523721.tif 000032
【０２４４】
ＦＡＣＳ解析の結果を、下記の表１９に表す（図２７もまた参照）。ＩＮＦ−γを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞がＰＩＫＡおよびＨ５Ｎ１抗原の両方を含む処方においてのみ存在したことは、適応的免疫反応が成熟段階に達していたこと、およびＰＩＫＡがこの過程に有益であることについての所見を確かにする。
【０２４５】
【表１９】
2009523721.tif 000033
【０２４６】
屠殺前に採取された血液試料におけるＥＬＩＳＡ試験の結果（下記の表２０、および図２８）は、ＰＩＫＡの存在が著しく免疫応答を亢進させ、かつ血清中に検出された特定の抗体の力価により示されたことを明らかにする。
【０２４７】
【表２０】
2009523721.tif 000034
【０２４８】
導き出される結論は、ＰＩＫＡアジュバントの添加により、Ｈ５Ｎ１抗原への免疫応答全般、特には特定の免疫応答、より特には適応的免疫、またより明確には細胞性免疫応答が亢進することである。
【０２４９】
[実施例２：不活化されたウイルス全体のＳＡＲＳ抗原]
本実験の目的は、ＳＡＲＳ抗原にＰＩＫＡを添加することが免疫応答を亢進させ、かつＳＡＲＳ特異的な防御抗体を生産するために宿主の免疫システムを刺激することを明らかにすることである。
【０２５０】
本調査計画においては、それぞれ４匹のＢａｌｂ／ｃマウスを含む６つのグループに対して、ＳＡＲＳ抗原、抗体にＰＩＫＡ（主に６６ｋＤａ〜１，２００ｋＤａの重量分布範囲内であるＰＩＫＡ分子による不均一な組成物）を加えたもの、ＰＩＫＡのみ、またはコントロールの組み合わせについて接種（腹膜注射）した（下記の表２１、および図２９もまた参照）。
【０２５１】
各グループに対して、０日目、１４日目および２８日目に同一の投与量を投与した。６週間目に血液試料を抽出し、そしてその血清における、病気特異的な抗体の存在の指標であるＩｇＧの存在量について検査した。血清を１６，０００倍の係数により希釈し、その後当業者によく知られている方法でＥＬＩＳＡ読取り装置を用いてＩｇＧの存在量を測定した。出力は吸光度（Ｏ．Ｄ．）であり、値が大きいほどＩｇＧの存在量が多いことを示す。
【０２５２】
表２１に示される、各グループの平均の結果は、ＰＩＫＡアジュバントの存在とＩｇＧ発現の増加との関係を明らかにする。
【０２５３】
【表２１】
2009523721.tif 000035
【０２５４】
結論は、ＳＡＲＳ抗原とともにＰＩＫＡが存在することにより、投与量依存的にＩｇＧ発現が増加し、それにより宿主の免疫応答が亢進することである。
【０２５５】
[実施例３：ＰＩＫＡワクチンはＨ５Ｎ１およびＨ９Ｎ２感染に対して免疫防御を与える]
本実験の目的は、ＰＩＫＡアジュバントを含むトリインフルエンザワクチンが、生きているトリインフルエンザウイルスの感染からニワトリを保護し得ることを明らかにすることである。
【０２５６】
調査は、２つのグループにおける２４羽の特定病原体除去（ＳＰＦ）のニワトリそれぞれに対して行われた。ＰＩＫＡ（主に６６ｋＤａ〜６６０ｋＤａの重量分布範囲内であるＰＩＫＡ分子の不均一な組成物）と、トリインフルエンザ（Ｈ５Ｎ１およびＨ９Ｎ２）の２つの株とを含むワクチンの投与量７００ｕｌを、１０日目のニワトリの頚部の皮下に接種した。組成物は、抗原とＰＩＫＡアジュバントとを、約２：１（抗原対ＰＩＫＡアジュバント）の割合で含んでいた。
【０２５７】
７、１４および２１日目に、羽の下から血液試料を採取した。それぞれのニワトリからの血清に対して、特定のＨ５およびＨ９抗体の存在について検査した。
【０２５８】
２１日目に、ニワトリに、Ｈ５Ｎ１の生きているウイルスを病原体接種し、その後さらに１４日間観察した。生きているＨ５Ｎ１にさらされてから１４日後のニワトリの生存率を記録した。
【０２５９】
各グループの平均の結果（表２２、図３０および３１もまた参照）から、ＰＩＫＡの存在により特定の抗原の抗体の生産が誘導されることが明らかである。
【０２６０】
【表２２】
2009523721.tif 000036
【０２６１】
生きているＨ５Ｎ１ウイルスにさらされてから１４日後に生存していたのは、抗原／ＰＩＫＡ組成物をワクチン接種された２４羽のニワトリのうち２１羽（８３％）であった。全くワクチンを受けずに、しかし生きているＨ５Ｎ１ウイルスにさらされたコントロールグループにおける２４羽のニワトリのうち、１４日後に生存していたのはたった４羽（１７％）であった。
【０２６２】
導き出される結論は、ＰＩＫＡワクチンが、Ｈ５Ｎ１ウイルスに対する有効なレベルの免疫防御を与えることである。
【０２６３】
[実施例４：ＰＩＫＡワクチンは狂犬病感染に対して免疫防御を与える]
本調査の目的は、ＰＩＫＡアジュバントを含む狂犬病ワクチンが、狂犬病感染に対する防御を与え得ることを明らかにすることである。
【０２６４】
各グループの平均の結果（表２２、図３０および３１もまた参照）から、ＰＩＫＡの存在が特定の抗原の抗体の生産を誘導したことが明らかである。
【０２６５】
【表２３】
2009523721.tif 000037
【０２６６】
生きているＨ５Ｎ１ウイルスにさらされてから１４日後に生存していたのは、抗原／ＰＩＫＡ組成物をワクチン接種された２４羽のニワトリのうち２１羽（８３％）であった。全くワクチンを受けずに、しかし生きているＨ５Ｎ１ウイルスにさらされたコントロールグループにおける２４羽のニワトリのうち、１４日後に生存していたのはたった４羽（１７％）であった。
【０２６７】
導き出される結論は、ＰＩＫＡワクチンが、Ｈ５Ｎ１ウイルスに対する有効なレベルの免疫防御を与えることである。
【０２６８】
[実施例４：ＰＩＫＡワクチンは狂犬病感染に対して免疫防御を与える]
本調査の目的は、ＰＩＫＡアジュバントを含む狂犬病ワクチンが、狂犬病感染に対する防御を与え得ることを明らかにすることである。
【０２６９】
２０匹のＢａｌｂ／ｃのＳＰＦクンミンマウスを含む４つのグループ（ｉ、ｉｉ、ｉｉｉおよびｉｖと表される）に対して、野生の狂犬病ウイルスＣＱ９２株を含む１００ｕｌをそれぞれ病原体接種した。各グループは、異なるタイプのワクチンを接種される；ｉ）ＰＩＫＡ（主に６６ｋＤａ〜６６０ｋＤａの重量分布範囲内であるＰＩＫＡ分子の不均一な組成物）と、不活化され精製されたハムスターの腎臓細胞による狂犬病抗原とを１：４の体積比で含む組成物、ｉｉ）ベロ細胞による不活化された狂犬病ワクチンである、サノフィ・アベンティス社のＶｅｒｏａｂ、ｉｉｉ）ミョウバンアジュバントを含む、不活化され精製されたハムスター腎臓細胞による狂犬病ワクチン、およびｉｖ）コントロールのリン酸緩衝液。大腿への皮下注射による感染の３０〜４０分後、３日後、６日後および９日後に、投与量６０ｕｌのワクチンが投与された。
【０２７０】
各グループの生存率を、表２３に示す（図３２もまた参照）。
【０２７１】
【表２４】
2009523721.tif 000038
【０２７２】
導き出される結論は、ＰＩＫＡの存在により、不活化され精製されたハムスター腎臓細胞による狂犬病抗原により与えられる免疫防御が著しく亢進することである。
【０２７３】
[実施例５：ＰＩＫＡ  Ｂ型肝炎ワクチンは血清において特定の抗体の生産を誘導する]
本実験のプロトコルでは、Ｂａｌｂ／ｃマウスの３つのグループ（グループあたり３匹のマウス）について、グループＡには４ｕｇのＨＢｓ抗原ａｄｗのみを含む組成物、グループＢには７５ｕｇのＰＩＫＡアジュバント（主に６６ｋＤａ〜１，２００ｋＤａの重量分布範囲内であるＰＩＫＡ分子の不均一な組成物）を含む４ｕｇの当該抗原を含む組成物、およびグループＣには１００ｕｇのＰＩＫＡのみを含む組成物を皮下注射することによりワクチン接種した。
【０２７４】
最初の注射の１０〜１４日後に、マウスに、同一の追加免疫ワクチンを皮下注射により与えた。追加免疫注射の１０〜１４日後に血液試料を採取し、特定の抗体の力価について、当業者に公知の標準的なＥＬＩＳＡ試験により検査した。
【０２７５】
下記の表２４（および図３３）に示される各グループの平均の結果は、血清試料において観察される特定の抗体の力価により示されるように、Ｂ型肝炎抗原への免疫応答がＰＩＫＡの存在により亢進することを明らかにする。
【０２７６】
【表２５】
2009523721.tif 000039
【０２７７】
上記の例から導き出される結論は、血清中の特定の抗体の力価により示されるように、ＰＩＫＡおよびＢ型肝炎抗原を含む免疫原性の物質が、著しい免疫応答の産生を誘導することである。
【０２７８】
[実施例６：ＰＩＫＡ  インフルエンザワクチンは血清中における特定の抗体の生産を誘導する]
本実験のプロトコルでは、Ｂａｌｂ／ｃマウスの２つのグループ（グループあたり３匹のマウス）に、グループＡには４ｕｇのサノフィ社のＶＡＸＩＧＲＩＰインフルエンザワクチンのみを含む組成物、およびグループＢには１００ｕｇのＰＩＫＡアジュバント（主に６６ｋＤａ〜１，２００ｋＤａの重量分布範囲内であるＰＩＫＡ分子の不均一な組成物）を含む４ｕｇの抗原を含む組成物を皮下注射することによりワクチン接種した。
【０２７９】
最初の注射の２０日後に、マウスに、同一の追加免疫ワクチンを皮下注射により与えた。最初のワクチン接種の３５日後に血液試料を採取し、特定の抗体の力価について、当業者に公知の標準的なＥＬＩＳＡ試験により検査した。
【０２８０】
下記の表２５（および図３４）に示される各グループの平均の結果は、血清試料において観察される特定の抗体の力価により示されるように、ＰＩＫＡの存在によりインフルエンザワクチン抗原への免疫応答が亢進することを明らかにする。
【０２８１】
【表２６】
2009523721.tif 000040
【０２８２】
上記の例から導き出される結論は、血清中の特定の抗体の力価により示されるように、ＰＩＫＡおよびインフルエンザ抗原を含む免疫原性の物質が、著しい免疫応答の産生を誘導することである。
【０２８３】
[実施例７：ＰＩＫＡ  Ｂ型抗原（表面抗原ａｄｗ型）ワクチンは治療的な免疫応答を誘導する]
本実験のプロトコルでは、６〜１０週間の４匹のＢａｌｂ／ｃマウスのグループに、ＰＩＫＡアジュバント（主に６６ｋＤａ〜１，２００ｋＤａの重量分布範囲内であるＰＩＫＡ分子の不均一な組成物）を含む市販のＨＢｓ抗原ａｄｗ型を含む組成物、ＰＩＫＡアジュバントを含まない抗原を含む組成物、ＰＩＫＡのみを含む組成物、またはリン酸緩衝液を含むコントロールを接種することを必要とする。
【０２８４】
マウスに対して、背中の両側のそれぞれに１００ｕｌずつの第一の皮下注射を施した。実際の投与量は、下記の結果の表において与えられる。最初の注射の２１日後に、マウスに、同一の追加免疫ワクチンを与えた。４２日目に血液試料を採取し、その後マウスを屠殺して、検査のために脾臓から組織試料を採取した。
【０２８５】
抗原特異的なインターフェロン−γを分泌するＴ細胞の数を計測するために、ＥＬＩＳＰＯＴ解析を実施した。ＨＢｓ抗原由来のペプチドエピトープ（ＩＰＱＳＬＤＳＷＷＴＳＬ）特異的なＣＤ８＋細胞の存在を測定するために、各マウスからの脾細胞試料を、５ｕｇ／ｍｌの濃度の、どちらか一方のＣＤ８  Ｔ細胞のペプチドエピトープ（ＩＰＱＳＬＤＳＷＷＴＳＬ）を用いて、生体外において刺激した。
【０２８６】
第二の脾細胞試料に対して、生体外において６日間、２ｕｇ／ｍｌのＨＢｓ抗原ペプチドＩＰＱＳＬＤＳＷＷＴＳＬを用いて再度刺激した。インターフェロン−γを検出するために、５ｕｇ／ｍｌのＨＢｓ抗原ペプチドＩＰＱＳＬＤＳＷＷＴＳＬを生体外の刺激物として用いたＥＬＩＳＰＯＴ解析を実施した。この解析は、免疫化に続く中枢の記憶細胞応答を評価し、同定するために実施された。
【０２８７】
血清中のＨＢＶ抗原特異的な抗体、特にＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体の存在を測定するために、ＥＬＩＳＡ解析を用いた。Ｎｕｎｃ  Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを、ＨＢｓ抗原（ＰＢＳ／０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０において６ｕｇ／ｍｌ）により摂氏４度において一晩コーティングした。プレートを、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、５％ＦＣＳを含むＰＢＳにより２時間ブロッキングした。洗浄後、血清のＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎによる希釈液を２時間加えた。洗浄後、ビオチンが結合したラットの抗マウスＩｇＧ１モノクローナル抗体の１／３０００希釈液、またはビオチンが結合したラットの抗マウスＩｇＧ２ａモノクローナル抗体の１／１５００希釈液のいずれかを加えた。洗浄後、ストレプトアビジンＨＲＰ（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎによる１／１０，０００希釈液）を１時間加えた。洗浄後、ＡＢＴＳ基質を過酸化水素（１０００：１）とともに２０分間加えた。その後４０５ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を測定し、示された結果は各グループにおける平均である。
【０２８８】
ＰＩＫＡアジュバントを用いて処方されたＨＢｓ抗原によって免疫化されたマウスにおけるＩｇＧ１応答は、ＨＢｓ抗原のみによって免疫化されたマウスにおける応答より約５倍高かった。ＩｇＧ１の力価は、投与量依存的に増加した（表２６、図３５）。
【０２８９】
【表２７】
2009523721.tif 000041
【０２９０】
ＰＩＫＡアジュバントを用いて処方されたＨＢｓ抗原によって免疫化されたマウスにおけるＩｇＧ２ａ応答は、ＨＢｓ抗原のみによって免疫化されたマウスにおける応答よりも著しく増加した。ＩｇＧ２ａの力価は投与量依存的に増加し、Ｔｈ１に偏った免疫応答が増加したことを示す（表２７、図３６）。
【０２９１】
【表２８】
2009523721.tif 000042
【０２９２】
ＣＤ８ペプチドエピトープ特異的な生体外の刺激におけるＥＬＩＳＰＯＴ解析は、ＨＢｓ抗原のみにより免疫化されたマウスによる応答が検出できなかったことを示した。それに比べて、ＰＩＫＡを用いて処方されたＨＢｓ抗原による免疫化後には、投与量依存的にインターフェロン−γを発現する細胞が容易に検出されたことは、ＰＩＫＡにより治療的な免疫応答が亢進することを示している（表２８、図３７）。
【０２９３】
【表２９】
2009523721.tif 000043
【０２９４】
脾細胞を６日間培養した後さらに実施したＥＬＩＳＰＯＴ解析によって、ＨＢｓ抗原およびＰＩＫＡアジュバントを含む製剤により免疫化されたマウスにおけるインターフェロン−γを生産する脾細胞の数が、ＨＢｓ抗原のみを投与されたマウスにおける脾細胞の数の２倍であったことが明らかになった。上記の結果は、ＰＩＫＡの存在により中枢の記憶細胞の活性化が亢進することを確かにする（表２８、図３８）。
【図面の簡単な説明】
【０２９５】
【図１】ＰＩＫＡおよび／またはＨＢｓ抗原ａｄｗ型を含むワクチンによる免疫化後の、インターフェロン−γを生産したマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴ検出の図である。
【図２】ＰＩＫＡおよび／またはＨＢｓ抗原ａｄｗ型を含むワクチンによる免疫化後の、ＩＬ−２を生産したマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴ検出の図である。
【図３】ＰＩＫＡおよび／またはＨＢｓ抗原ａｄｗ型を含むワクチンによる免疫化後のマウス脾細胞により生産されたＩＬ−４のＥＬＩＳＰＯＴ検出の図である。
【図４】ＰＩＫＡおよび／またはＨＢｓ抗原ａｄｗ型を含むワクチンによる免疫化後のマウス血清（４００×希釈）に由来する特定のＩｇＧの力価のＥＬＩＳＰＯＴ検出の図である。
【図５】ＰＩＫＡおよび／または不活化され分割されたインフルエンザ抗原を含むワクチンによる免疫化後の、インターフェロン−ガンマ（γ）を生産したマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴ検出の図である。
【図６】ＰＩＫＡおよび／または不活化され分割されたインフルエンザ抗原を含むワクチンによる免疫化後の、ＩＬ−２を生産したマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴ検出の図である。
【図７】ＰＩＫＡおよび／または不活化され分割されたインフルエンザ抗原を含むワクチンによる免疫化後の、ＩＬ−４を生産したマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴ検出の図である。
【図８】ＰＩＫＡおよび／または不活化され分割されたインフルエンザ抗原を含むワクチンによる免疫化後のマウス血清（９００×希釈）に由来する特定のＩｇＧの力価のＥＬＩＳＡ検出の図である。
【図９】ＰＩＫＡおよび／またはＨＩＶ  ｇｐ１２０抗原を含むワクチンによる免疫化後の、インターフェロン−γを生産したマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴ検出の図である。
【図１０】ＰＩＫＡおよび／またはＨＩＶ  ｇｐ１２０抗原を含むワクチンによる免疫化後の、ＩＬ−２を生産したマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴ検出の図である。
【図１１】ＰＩＫＡおよび／またはＨＩＶ  ｇｐ１２０抗原を含むワクチンによる免疫化後の、ＩＬ−４を生産したマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴ検出の図である。
【図１２】ＰＩＫＡおよび／またはＨＩＶ  ｇｐ１２０抗原を含むワクチンによる免疫化後の、マウスの脾細胞におけるＦＡＣＳ解析の図であり、インターフェロン−γを発現しているＣＤ４＋細胞の割合を示す。
【図１３】ＰＩＫＡおよび／または炭疽菌ｒＰＡ抗原を含むワクチンによる免疫化後の、インターフェロン−γを生産したマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴ検出の図である。
【図１４】ＰＩＫＡおよび／または炭疽菌ｒＰＡ抗原を含むワクチンによる免疫化後の、ＩＬ−２を生産したマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴ検出の図である。
【図１５】ＰＩＫＡおよび／または炭疽菌ｒＰＡ抗原を含むワクチンによる免疫化後の、ＩＬ−４を生産したマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴ検出の図である。
【図１６】ＰＩＫＡおよび／または炭疽菌ｒＰＡ抗原を含むワクチンによる免疫化後の、マウスの脾細胞におけるＦＡＣＳ解析の図であり、インターフェロン−γを発現しているＣＤ４＋細胞の割合を示す。
【図１７】ＰＩＫＡおよび／または炭疽菌ｒＰＡ抗原を含むワクチンによる免疫化後のマウス血清（４００×希釈）に由来する特定のＩｇＧの力価のＥＬＩＳＡ検出の図である。
【図１８】ＰＩＫＡおよび／または炭疽菌ｒＰＡ抗原を含むワクチンによる免疫化１６週間後のマウス血清に由来する特定のＩｇＧの力価のＥＬＩＳＡ検出の図である。
【図１９】ＰＩＫＡおよび／またはＨＳＶ２−ｇＤ抗原を含むワクチンによる免疫化後の、インターフェロン−γを生産したマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴ検出の図である。
【図２０】ＰＩＫＡおよび／またはＨＳＶ２−ｇＤ抗原を含むワクチンによる免疫化後の、ＩＬ−２を生産したマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴ検出の図である。
【図２１】ＰＩＫＡおよび／またはＨＳＶ２−ｇＤ抗原を含むワクチンによる免疫化後の、ＩＬ−４を生産したマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴ検出の図である。
【図２２】ＰＩＫＡおよび／またはＨＳＶ  ２ｇＤ抗原を含むワクチンによる免疫化後の、マウスの脾細胞におけるＦＡＣＳ解析の図であり、インターフェロン−γを発現しているＣＤ４＋細胞の割合を示す。
【図２３】ＰＩＫＡおよび／またはＨＳＶ２−ｇＤ抗原を含むワクチンによる免疫化後のマウス血清（２，７００×希釈）に由来する特定のＩｇＧの力価のＥＬＩＳＡ検出の図である。
【図２４】ＰＩＫＡおよび／または不活化Ｈ５Ｎ１抗原を含むワクチンによる免疫化後の、インターフェロン−γを生産したマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴ検出の図である。
【図２５】ＰＩＫＡおよび／または不活化Ｈ５Ｎ１抗原を含むワクチンによる免疫化後の、ＩＬ−２を生産したマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴ検出の図である。
【図２６】ＰＩＫＡおよび／または不活化Ｈ５Ｎ１抗原を含むワクチンによる免疫化後の、ＩＬ−４を生産したマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴ検出の図である。
【図２７】ＰＩＫＡおよび／または不活化Ｈ５Ｎ１抗原を含むワクチンによる免疫化後の、マウスの脾細胞におけるＦＡＣＳ解析の図であり、インターフェロン−γを発現しているＣＤ４＋ｖｅ細胞の割合を示す。
【図２８】ＰＩＫＡおよび／または不活化Ｈ５Ｎ１抗原を含むワクチンによる免疫化後のマウス血清（９００×希釈）に由来する特定のＩｇＧの力価のＥＬＩＳＡ検出の図である。
【図２９】ＰＩＫＡおよび／または不活化ＳＡＲＳ抗原の全体を含むワクチンによる免疫化後のマウス血清（１６，０００希釈）に由来する特定のＩｇＧの力価のＥＬＩＳＡ検出の図である。
【図３０】ＰＩＫＡおよび／または不活化Ｈ５Ｎ１抗原を含むワクチンによる免疫化後のニワトリ血清に由来する特定の抗体Ｈ５の力価のＥＬＩＳＡ検出の図である。
【図３１】ＰＩＫＡおよび／または不活化Ｈ９Ｎ２抗原を含むワクチンによる免疫化後のニワトリ血清に由来する特定のＨ９抗体の力価のＥＬＩＳＡ検出の図である。
【図３２】野生の狂犬病ウイルスにさらされた後に狂犬病ワクチンを処方されたマウスの生存率の図である。
【図３３】ＰＩＫＡおよび／またはＨＢｓ抗原ａｄｗを含むワクチンによる免疫化後のマウス血清に由来する特定の抗体の力価のＥＬＩＳＡ検出の図である。
【図３４】ＰＩＫＡおよび／または不活化され分割されたインフルエンザ抗原を含むワクチンによる免疫化後のマウス血清に由来する特定の抗体の力価のＥＬＩＳＡ検出の図である。
【図３５】ＰＩＫＡおよび／またはＨＢｓ抗原を含むワクチンによる免疫化後のマウス血清に由来する特定のＩｇＧ１の力価のＥＬＩＳＡ検出の図である。
【図３６】ＰＩＫＡおよび／またはＨＢｓ抗原を含むワクチンによる免疫化後のマウス血清に由来する特定のＩｇＧ２の力価のＥＬＩＳＡ検出の図である。
【図３７】ＰＩＫＡおよび／またはＨＢｓ抗原を含むワクチンによる免疫化後の、インターフェロン−γを生産したマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴ検出の図である。
【図３８】ＰＩＫＡおよび／またはＨＢｓ抗原を含むワクチンによる免疫化後の、インターフェロン−γを生産したマウス脾細胞（２ｕｇ／ｍｌのＩＰＱペプチドを用いて６日間再刺激した後）のＥＬＩＳＰＯＴ検出の図である。
【図１】
2009523721.tif 000044
【図２】
2009523721.tif 000045
【図３】
2009523721.tif 000046
【図４】
2009523721.tif 000047
【図５】
2009523721.tif 000048
【図６】
2009523721.tif 000049
【図７】
2009523721.tif 000050
【図８】
2009523721.tif 000051
【図９】
2009523721.tif 000052
【図１０】
2009523721.tif 000053
【図１１】
2009523721.tif 000054
【図１２】
2009523721.tif 000055
【図１３】
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【図１４】
2009523721.tif 000057
【図１５】
2009523721.tif 000058
【図１６】
2009523721.tif 000059
【図１７】
2009523721.tif 000060
【図１８】
2009523721.tif 000061
【図１９】
2009523721.tif 000062
【図２０】
2009523721.tif 000063
【図２１】
2009523721.tif 000064
【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
2009523721.tif 000067
【図２５】
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【図２６】
2009523721.tif 000069
【図２７】
2009523721.tif 000070
【図２８】
2009523721.tif 000071
【図２９】
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【図３０】
2009523721.tif 000073
【図３１】
2009523721.tif 000074
【図３２】
2009523721.tif 000075
【図３３】
2009523721.tif 000076
【図３４】
2009523721.tif 000077
【図３５】
2009523721.tif 000078
【図３６】
2009523721.tif 000079
【図３７】
2009523721.tif 000080
【図３８】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年7月15日(2008.7.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸（ＰＩＣ）、少なくとも１種類の抗生物質および少なくとも１種類の陽イオンを含むポリヌクレオチドアジュバントと、
（ｂ）少なくとも１種類の抗原とを含む免疫原性組成物であって、
持続放出するように剤形化されていることを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項２】
（ａ）ポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸（ＰＩＣ）、少なくとも１種類の抗生物質および少なくとも１種類の陽イオンを含むポリヌクレオチドアジュバントと、
（ｂ）少なくとも１種類のウイルス抗原とを含む免疫原性組成物であって、
上記抗原が、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アストロウイルス科、ブニヤウイルス科、カリシウイルス科、フラビウイルス科、デルタ肝炎ウイルス科、ヘペウイルス科、ヘルペスウイルス科、モノネガウイルス目、ニドウイルス目、ピコルナウイルス科、オルトミクソウイルス科、パピローマウイルス科、パルボウイルス科、ポリオーマウイルス科、ポックスウイルス科、レオウイルス科、レトロウイルス科またはトガウイルス科の抗原であることを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項３】
（ａ）ポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸（ＰＩＣ）、少なくとも１種類の抗生物質および少なくとも１種類の陽イオンを含むポリヌクレオチドアジュバントと、
（ｂ）少なくとも１種類の細菌性抗原とを含み、
上記抗原が、放線菌門、クラミジア門、グラム陽性細菌門、プロテオバクテリア門またはスピロケータ門の抗原であることを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項４】
（ａ）ポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸（ＰＩＣ）、少なくとも１種類の抗生物質および少なくとも１種類の陽イオンを含むポリヌクレオチドアジュバントと、
（ｂ）少なくとも１種類の真菌抗原とを含み、
上記抗原が、子嚢菌門または担子菌門の抗原であることを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項５】
（ａ）ポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸（ＰＩＣ）、少なくとも１種類の抗生物質および少なくとも１種類の陽イオンを含むポリヌクレオチドアジュバントと、
（ｂ）少なくとも１種類の寄生生物抗原とを含み、
上記抗原が、肉質鞭毛虫門、アピコンプレクサ門、有毛虫門、扁形動物門、線形動物門または節足動物門の抗原であることを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項６】
（ａ）ポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸（ＰＩＣ）、少なくとも１種類の抗生物質および少なくとも１種類の陽イオンを含むポリヌクレオチドアジュバントと、
（ｂ）少なくとも１種類のがん抗原とを含み、
上記抗原が、骨肉腫、脳腫瘍、乳がん、消化管／胃腸がん、内分泌腺がん、眼がん、泌尿生殖器がん、生殖細胞腫瘍、婦人科がん、頭頚部がん、液／血液腫、肺がん、筋骨格腫瘍、神経がん、呼吸器／胸部がんまたは皮膚がんのがん抗原であることを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項７】
（ａ）ポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸（ＰＩＣ）、少なくとも１種類の抗生物質および少なくとも１種類の陽イオンを含むポリヌクレオチドアジュバントと、
（ｂ）２種類以上の抗原を組み合わせたものとを含み含み、
上記抗原が、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アストロウイルス科、ブニヤウイルス科、カリシウイルス科、フラビウイルス科、デルタ肝炎ウイルス科、ヘペウイルス科、モノネガウイルス目、ニドウイルス目、ピコルナウイルス科、オルトミクソウイルス科、パピローマウイルス科、パルボウイルス科、ポリオーマウイルス科、ポックスウイルス科、レオウイルス科、レトロウイルス科、トガウイルス科、放線菌門、クラミジア門、グラム陽性細菌門、プロテオバクテリア門またはスピロケータ門、子嚢菌門または担子菌門、肉質鞭毛虫門、アピコンプレクサ門、有毛虫門、扁形動物門、線形動物門および／または節足動物門の抗原であることを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項８】
分子量が不均一なポリヌクレオチドアジュバント組成物分子を含んでおり、該分子量は少なくとも６６，０００ダルトンであることを特徴とする請求項１から７の何れか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
分子量が不均一なポリヌクレオチドアジュバント組成物分子を含んでおり、該分子量は約６６，０００から１，２００，０００ダルトンであることを特徴とする請求項１から８の何れか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
分子量が不均一なポリヌクレオチドアジュバント組成物分子を含んでおり、該分子量は少なくとも１５０，０００ダルトンであることを特徴とする請求項１から９の何れか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
少なくとも１種類の免疫賦活剤をさらに含んでいることを特徴とする請求項１から１０の何れか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
上記抗原は、不活化微生物、弱毒化微生物、組み換えポリペプチドおよび／または合成ポリペプチドであることを特徴とする請求項１から１１の何れか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
請求項１から１２の何れか１項に記載の免疫原性組成物であって、該免疫原性組成物または該免疫原性組成物に含まれるＰＩＫＡアジュバントが、液体、溶液、液滴、固形物、カプセル、乳液、懸濁物、エリキシル剤、クリーム、坐薬、ゲル、ソフトカプセル、スプレー、吸入抗原、エアロゾル、錠剤、被覆錠剤、マイクロカプセル、坐薬、糖衣錠、シロップ剤、スラリー、浣腸剤、顆粒、粉末、錠剤またはトローチ剤の形態であることを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項１４】
請求項１から１２の何れか１項に記載の免疫原性組成物であって、上記アジュバント組成物の少なくとも１種または該免疫原性組成物が凍結乾燥されていることを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項１５】
請求項１から１４の何れか１項に記載の免疫原性組成物を備えているキット。
【請求項１６】
抗原に対する宿主の免疫応答を亢進させる方法であって、
請求項１から１４の何れか１項に記載の免疫原性組成物を宿主に投与することを特徴とする方法。
【請求項１７】
上記宿主は感染症に罹患しており、上記抗原性化合物の投与により、該感染症の原因となっている病原体に対する免疫応答を引き起こすことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
上記投与が、非経口注射、筋肉注射、腹腔内注射、静脈注射、皮下注射、局所送達、経皮送達または皮内送達によるものであることを特徴とする請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
上記抗原に対する宿主における免疫応答を亢進させるための薬剤を調製するための、請求項１から１４の何れか１項に記載の免疫原性組成物の利用。
【請求項２０】
上記宿主は感染症に罹患しており、上記宿主に対する上記抗原の投与により、該感染症の原因となっている病原体に対する免疫応答を引き起こすことを特徴とする請求項１９に記載の利用。
【請求項２１】
上記投与が、非経口注射、筋肉注射、腹腔内注射、静脈注射、皮下注射、局所送達、経皮送達または皮内送達によるものであることを特徴とする請求項２０に記載の利用。
【請求項２２】
上記宿主がヒトであることを特徴とする請求項１６から１８の何れか１項に記載の方法および請求項１９から２１の何れか１項に記載の利用。
【請求項２３】
上記宿主が非ヒト動物であることを特徴とする請求項１６から１８の何れか１項に記載の方法および請求項１９から２１の何れか１項に記載の利用。
【国際調査報告】
2009523721.tif 000082
2009523721.tif 000083