(57)【要約】  本発明は、新規クラスの化合物、このような化合物を含む医薬組成物およびこのような化合物の、異常なまたは脱制御されたキナーゼ活性が関連する疾患または障害、特にＡｂｌ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、Ａｕｒｏｒａ−Ａ、ＳＧＫ、Ｔｉｅ−２、Ｔｒｋ−Ｂ、ＦＧＦＲ３、ｃ−ｋｉｔ、ｂ−ＲＡＦ、ｃ−ＲＡＦ、ＤＹＲＫ２、Ｆｍｓ、ＦｙｎおよびＰＤＧＦＲαおよびＰＤＧＦＲβキナーゼの異常な活性化が関与する疾患または障害の処置または予防における使用を提供する。
2009504757.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
2009504757.tif 000024
〔式中、
Ｘ１はＣＨおよびＮから選択され；
ＹはＳおよびＮＲ５から選択され；ここで、Ｒ５は水素およびＣ１−６アルキルから選択され；
ＺはＣおよびＳ(Ｏ)から選択され；
Ｒ１は水素およびＣ１−６アルキルから選択され；
Ｒ２はＣ６−１２アリールおよび−ＮＲ３Ｒ４から選択され；
Ｒ３は水素およびＣ１−６アルキルから選択され；
Ｒ４は−ＸＲ５であり；ここで、Ｘは結合、Ｃ１−６アルキレンおよびＣ１−１０ヘテロアリーレンから選択され；ここで、Ｒ５はＣ６−１０アリールおよびＣ１−１０ヘテロアリールから選択され；
ここで、Ｒ５の該アリールまたはヘテロアリールは、Ｃ１−６アルキル、ハロ−置換−Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−８ヘテロシクロアルキル、−Ｃ(Ｏ)ＮＲ６Ｒ７および−ＮＲ６Ｃ(Ｏ)Ｒ７から独立して選択される１〜３個のラジカルで所望により置換されていてよく；ここで、Ｒ６は水素およびＣ１−６アルキルから選択され、そしてＲ７はＣ６−１０アリールおよびＣ１−１０ヘテロアリールから選択され；
ここで、Ｒ７の該アリールまたはヘテロアリールは、−Ｒ８および−ＯＲ８から独立して選択される１〜３個のラジカルで所望により置換されていてよく；ここで、Ｒ８はＣ１−６アルキル、ハロ−置換−Ｃ１−６アルキル、Ｃ６−１２アリール、Ｃ１−１０ヘテロアリールおよびＣ３−８ヘテロシクロアルキル−Ｃ０−４アルキルから選択され；ここで、Ｒ８の該アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクロアルキル置換基はＣ１−６アルキルで所望により置換されていてよく；
またはＲ３およびＲ４は、Ｒ３およびＲ４が結合している原子と一緒になって、−Ｃ(Ｏ)ＮＲ６Ｒ９で所望により置換されていてよいＣ３−８ヘテロシクロアルキルを形成し；ここで、Ｒ６は水素およびＣ１−６アルキルから選択され、そしてＲ９はＣ６−１０アリールおよびＣ１−１０ヘテロアリールから選択される。〕
の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
式Ｉａ：
【化２】
2009504757.tif 000025
〔式中、
Ｘ１がＣＨおよびＮから選択され；
ＹがＳおよびＮＲ５から選択されここで、Ｒ５は水素およびＣ１−６アルキルから選択され；
ｎが０、１および２から選択され；
Ｒ１は水素およびＣ１−６アルキルから選択され；
そして
Ｒ１２が水素、Ｃ１−６アルキル、ハロ−置換−Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−８ヘテロシクロアルキル、−Ｃ(Ｏ)ＮＲ６Ｒ７および−ＮＲ６Ｃ(Ｏ)Ｒ７から選択され；ここで、Ｒ６が水素およびＣ１−６アルキルから選択され、そしてＲ７がＣ６−１０アリールおよびＣ１−１０ヘテロアリールから選択され；
ここで、Ｒ７の該アリールまたはヘテロアリールが、−Ｒ８および−ＯＲ８から独立して選択される１〜３個のラジカルで所望により置換されていてよく；ここで、Ｒ８がＣ１−６アルキル、ハロ−置換−Ｃ１−６アルキル、Ｃ６−１２アリール、Ｃ１−１０ヘテロアリールおよびＣ３−８ヘテロシクロアルキル−Ｃ０−４アルキルから選択され；ここで、Ｒ８の該アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクロアルキル置換基はＣ１−６アルキルで所望により置換されていてよい。〕
の化合物である、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ｘ１がＣＨおよびＮから選択され；ＹがＳおよびＮ(ＣＨ３)から選択され；そしてＲ１が水素である、請求項２記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ１２が水素、メチル、−Ｃ(Ｏ)ＮＨＲ７、−ＮＨＣ(Ｏ)Ｒ７、−Ｎ(ＣＨ３)Ｃ(Ｏ)Ｒ７またはモルホリノであり；ここで、Ｒ７がフェニルおよびイソオキサゾリルから選択され；ここで、Ｒ７の該フェニルまたはオキサゾリルは、イソブチル、トリフルオロメチル、フェノキシ、エチル−ピペラジニル−メチル、メチル−ピペラジニル−メチル、メチル−イミダゾリルおよびモルホリノ−メチルから選択される１〜２個のラジカルで所望により置換されていてよい、請求項３記載の化合物。
【請求項５】
６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸[３−(３−トリフルオロメチル−フェニルカルバモイル)−フェニル]−アミド；１−メチル−１,６−ジヒドロ−１,５,６−トリアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸[３−(３−トリフルオロメチル−ベンゾイルアミノ)−フェニル]−アミド；６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸(４−モルホリン−４−イル−フェニル)−アミド；６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸フェニルアミド；６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸３−トリフルオロメチル−ベンジルアミド；モルホリン−４−イル−(６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−イル)−メタノン；２−ベンゼンスルホニル−１−メチル−１,６−ジヒドロ−１,５,６−トリアザ−ａｓ−インダセン；６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸[３−(３−トリフルオロメチル−ベンゾイルアミノ)−フェニル]−アミド；６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸[３−(３−トリフルオロメチル−フェニルカルバモイル)−フェニル]−アミド；６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸[２−メチル−５−(３−トリフルオロメチル−ベンゾイルアミノ)−フェニル]−アミド；６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸[２−メチル−５−(３−トリフルオロメチル−フェニルカルバモイル)−フェニル]−アミド；６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸{２−メチル−５−[メチル−(３−トリフルオロメチル−ベンゾイル)−アミノ]−フェニル}−アミド；６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸{５−[４−(４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル)−３−トリフルオロメチル−フェニルカルバモイル]−２−メチル−フェニル}−アミド；６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸{２−メチル−５−[３−(４−メチル−イミダゾル−１−イル)−５−トリフルオロメチル−ベンゾイルアミノ]−フェニル}−アミド；６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸[２−メチル−５−(３−モルホリン−４−イルメチル−５−トリフルオロメチル−フェニルカルバモイル)−フェニル]−アミド；６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸{２−メチル−５−[４−(２−メチル−イミダゾル−１−イル)−３−トリフルオロメチル−ベンゾイルアミノ]−フェニル}−アミド；６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸{２−メチル−５−[４−(４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル)−３−トリフルオロメチル−フェニルカルバモイル]−フェニル}−アミド；６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸[５−(５−ｔｅｒｔ−ブチル−イソキサゾル−３−イルカルバモイル)−２−メチル−フェニル]−アミド；４−(６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボニル)−ピペラジン−１−カルボン酸(４−フェノキシ−フェニル)−アミド；６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸{１−[３−(３−トリフルオロメチル−ベンゾイルアミノ)−フェニル]−１Ｈ−イミダゾル−２−イル}−アミド；１−メチル−１,６−ジヒドロ−１,５,６−トリアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸[２−メチル−５−(３−トリフルオロメチル−ベンゾイルアミノ)−フェニル]−アミド；１−メチル−１,６−ジヒドロ−１,５,６−トリアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸[３−(３−トリフルオロメチル−ベンゾイルアミノ)−フェニル]−アミド；１−メチル−１,６−ジヒドロ−１,５,６−トリアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸[３−(３−トリフルオロメチル−フェニルカルバモイル)−フェニル]−アミド；６Ｈ−１−チア−５,６,７−トリアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸[３−(３−トリフルオロメチル−ベンゾイルアミノ)−フェニル]−アミド；６Ｈ−１−チア−５,６,７−トリアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸[２−メチル−５−(３−トリフルオロメチル−ベンゾイルアミノ)−フェニル]−アミド；６Ｈ−１−チア−５,６,７−トリアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸[２−メチル−５−(４−モルホリン−４−イルメチル−３−トリフルオロメチル−フェニルカルバモイル)−フェニル]−アミド；６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸[３−メトキシ−５−(３−トリフルオロメチル−ベンゾイルアミノ)−フェニル]−アミド；６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸[３−メトキシ−５−(３−トリフルオロメチル−フェニルカルバモイル)−フェニル]−アミド；６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸[３−メトキシ−５−(４−モルホリン−４−イルメチル−３−トリフルオロメチル−フェニルカルバモイル)−フェニル]−アミド；６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸{３−メトキシ−５−[３−(４−メチル−イミダゾル−１−イル)−５−トリフルオロメチル−フェニルカルバモイル]−フェニル}−アミド；６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸{３−[４−(４−エチル−ピペラジン−１−イル)−３−トリフルオロメチル−フェニルカルバモイル]−５−メトキシ−フェニル}−アミド；および６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸[２−メチル−５−(５−トリフルオロメチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾル−２−イル)−フェニル]−アミド：から選択される、請求項１記載の化合物。
【請求項６】
治療的有効量の請求項１記載の化合物を、薬学的に許容される賦形剤と共に含む、医薬組成物。
【請求項７】
動物におけるキナーゼ活性の阻害が疾患の病状および／または症状を予防、阻止または軽減できる疾患の処置方法であって、該動物に治療的有効量の請求項１記載の化合物を投与することを含む、方法。
【請求項８】
キナーゼがＡｂｌ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、Ａｕｒｏｒａ−Ａ、ＳＧＫ、Ｔｉｅ−２、Ｔｒｋ−Ｂ、ＦＧＦＲ３、ｃ−ｋｉｔ、ｂ−ＲＡＦ、ｃ−ＲＡＦ、ＤＹＲＫ２、Ｆｍｓ、ＦｙｎおよびＰＤＧＦＲαおよびＰＤＧＦＲβから選択される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
動物におけるＡｂｌ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、Ａｕｒｏｒａ−Ａ、ＳＧＫ、Ｔｉｅ−２、Ｔｒｋ−Ｂ、ＦＧＦＲ３、ｃ−ｋｉｔ、ｂ−ＲＡＦ、ｃ−ＲＡＦ、ＤＹＲＫ２、Ｆｍｓ、Ｆｙｎおよび／またはＰＤＧＦＲαおよびＰＤＧＦＲβのキナーゼ活性が疾患の病状および／または症状に関与する疾患の処置用薬剤の製造のための、請求項１記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本発明は、３５  Ｕ.Ｓ.Ｃ. §１１９(ｅ)の下、２００５年８月１６日出願の米国仮出願６０／７０８,９１５に対する優先権を主張する。優先権出願の記載は、引用により、その全体として、かつすべての目的に関して、本明細書に包含される。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は新規クラスの化合物、そのような化合物を含む医薬組成物、および異常なまたは脱制御されたキナーゼ活性に関連する疾患または障害、特にＡｂｌ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、Ａｕｒｏｒａ−Ａ、ＳＧＫ、Ｔｉｅ−２、Ｔｒｋ−Ｂ、ＦＧＦＲ３、ｃ−ｋｉｔ、ｂ−ＲＡＦ、ｃ−ＲＡＦ、ＤＹＲＫ２、Ｆｍｓ、ＦｙｎおよびＰＤＧＦＲαおよびＰＤＧＦＲβキナーゼの異常な活性化が関与する疾患または障害の処置または予防のためのそのような化合物の使用を提供する。
【背景技術】
【０００３】
背景
タンパク質キナーゼはタンパク質の大きなクラスを表しそれは種々の細胞過程の制御および細胞機能の制御の維持において中心的役割を有する。これらのキナーゼの部分的、非限定的例は以下を含む：受容体チロシンキナーゼ、例えば血小板由来増殖因子受容体キナーゼ(ＰＤＧＦ−Ｒ)、神経増殖因子受容体、ｔｒｋＢ、Ｍｅｔ、および線維芽細胞増殖因子受容体、ＦＧＦＲ３；非受容体チロシンキナーゼ、例えばＡｂｌおよび融合キナーゼＢＣＲ−Ａｂｌ、Ｌｃｋ、Ｃｓｋ、Ｆｅｓ、Ｂｍｘおよびｃ−ｓｒｃ；およびセリン／スレオニンキナーゼ、例えばｂ−ＲＡＦ、ｃ−ＲＡＦ、ｓｇｋ、ＭＡＰキナーゼ(例えば、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、など)およびＳＡＰＫ２α、ＳＡＰＫ２βおよびＳＡＰＫ３。異常なキナーゼ活性は、良性および悪性増殖性障害ならびに免疫系および神経系の不適切な活性化に起因する疾患を含む、多くの疾患状態で観察されている。
【０００４】
本発明の新規化合物は１種以上のタンパク質キナーゼを阻害し、故に、キナーゼ関連疾患の処置に有用であることが期待される。
【発明の開示】
【０００５】
発明の要約
一つの局面において、本発明は式Ｉ：
【化１】
2009504757.tif 000003
〔式中、
Ｘ１はＣＨおよびＮから選択され；
ＹはＳおよびＮＲ５から選択されここで、Ｒ５は水素およびＣ１−６アルキルから選択され；
ＺはＣおよびＳ(Ｏ)から選択され；
Ｒ１は水素およびＣ１−６アルキルから選択され；
Ｒ２はＣ６−１２アリールおよび−ＮＲ３Ｒ４から選択され；
Ｒ３は水素およびＣ１−６アルキルから選択され；
Ｒ４は−ＸＲ５であり；ここで、Ｘは結合、Ｃ１−６アルキレンおよびＣ１−１０ヘテロアリーレンから選択され；ここで、Ｒ５はＣ６−１０アリールおよびＣ１−１０ヘテロアリールから選択され；
ここで、Ｒ５の該アリールまたはヘテロアリールは、Ｃ１−６アルキル、ハロ−置換−Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−８ヘテロシクロアルキル、−Ｃ(Ｏ)ＮＲ６Ｒ７および−ＮＲ６Ｃ(Ｏ)Ｒ７から独立して選択される１〜３個のラジカルで所望により置換されていてよく；ここで、Ｒ６は水素およびＣ１−６アルキルから選択され、そしてＲ７はＣ６−１０アリールおよびＣ１−１０ヘテロアリールから選択され；
ここで、Ｒ７の該アリールまたはヘテロアリールは、−Ｒ８および−ＯＲ８から独立して選択される１〜３個のラジカルで所望により置換されていてよく；ここで、Ｒ８はＣ１−６アルキル、ハロ−置換−Ｃ１−６アルキル、Ｃ６−１２アリール、Ｃ１−１０ヘテロアリールおよびＣ３−８ヘテロシクロアルキル−Ｃ０−４アルキルから選択され；ここで、Ｒ８の該アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクロアルキル置換基はＣ１−６アルキルで所望により置換されていてよく；
または、−Ｃ(Ｏ)ＮＲ６Ｒ９で所望により置換されていてよいＣ３−８ヘテロシクロアルキルを形成し；ここで、Ｒ６は水素およびＣ１−６アルキルから選択され、そしてＲ９はＣ６−１０アリールおよびＣ１−１０ヘテロアリールから選択される。〕
の化合物、およびそのＮ−オキシド誘導体、プロドラッグ誘導体、被保護誘導体、個々の異性体および異性体混合物；およびそのような化合物の薬学的に許容される塩および溶媒和物(例えば水和物)を提供する。
【０００６】
第二の局面において、本発明は、式Ｉの化合物またはそのＮ−オキシド誘導体、個々の異性体および異性体混合物；またはその薬学的に許容される塩を、１種以上の安定な賦形剤と混合して含む、医薬組成物を提供する。
【０００７】
第三の局面において、本発明は、動物におけるキナーゼ活性、特にＡｂｌ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、Ａｕｒｏｒａ−Ａ、ＳＧＫ、Ｔｉｅ−２、Ｔｒｋ−Ｂ、ＦＧＦＲ３、ｃ−ｋｉｔ、ｂ−ＲＡＦ、ｃ−ＲＡＦ、ＤＹＲＫ２、Ｆｍｓ、ＦｙｎおよびＰＤＧＦＲαおよび／またはＰＤＧＦＲβ活性の阻害が疾患の病状および／または症状を予防、阻止または軽減できる疾患の処置方法であって、該動物に治療的有効量の式Ｉの化合物またはそのＮ−オキシド誘導体、個々の異性体および異性体混合物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む方法を提供する。
【０００８】
第四の局面において、本発明は、動物におけるキナーゼ活性、特にＡｂｌ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、Ａｕｒｏｒａ−Ａ、ＳＧＫ、Ｔｉｅ−２、Ｔｒｋ−Ｂ、ＦＧＦＲ３、ｃ−ｋｉｔ、ｂ−ＲＡＦ、ｃ−ＲＡＦ、ＤＹＲＫ２、Ｆｍｓ、ＦｙｎおよびＰＤＧＦＲαおよび／またはＰＤＧＦＲβ活性が疾患の病状および／または症状に関与する疾患の処置用薬剤の製造のための式Ｉの化合物の使用を提供する。
【０００９】
第五の局面において、本発明は、式Ｉの化合物およびそのＮ−オキシド誘導体、プロドラッグ誘導体、被保護誘導体、個々の異性体および異性体混合物、およびその薬学的に許容される塩の製造方法を提供する。
【００１０】
発明の詳細な記載
定義
基および例えばハロ−置換−アルキルおよびアルコキシのような他の基の構造要素としての“アルキル”は、直鎖でも分枝鎖でもよい。Ｃ１−４−アルコキシは、メトキシ、エトキシ、などを含む。ハロ−置換アルキルはトリフルオロメチル、ペンタフルオロエチル、などを含む。
【００１１】
“アリール”は、６〜１０個の環炭素原子を含む単環式または縮合二環式芳香環集合体を意味する。例えば、アリールはフェニルまたはナフチル、好ましくはフェニルであり得る。“アリーレン”はアリール基由来の２価ラジカルを意味する。
【００１２】
“ヘテロアリール”は、上記でアリールについて定義の通りであり、ここで環炭素員の１個以上がヘテロ原子で置換され得る。例えば、Ｃ１−１０ヘテロアリールはモルホリノ、ピリジル、インドリル、インダゾリル、キノキサリニル、キノリニル、ベンゾフラニル、ベンゾピラニル、ベンゾチオピラニル、ベンゾ[１,３]ジオキソール、イミダゾリル、ベンゾ−イミダゾリル、ピリミジニル、フラニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピラゾリル、チエニル、などを含む。
【００１３】
“シクロアルキル”は、記載の環原子数を含む飽和または部分的不飽和、単環式、縮合二環式または架橋多環式環集合体を意味する。例えば、Ｃ３−１０シクロアルキルはシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、などを含む。
【００１４】
“ヘテロシクロアルキル”は、本明細書で定義のシクロアルキルを意味する。ただし、記載の環炭素の１個以上が、−Ｏ−、−Ｎ＝、−ＮＲ−、−Ｃ(Ｏ)−、−Ｓ−、−Ｓ(Ｏ)−または−Ｓ(Ｏ)２−（式中、Ｒは水素、Ｃ１−４アルキルまたは窒素保護基である）で置換されている。例えば、本発明の化合物を記載するために本明細書で使用するＣ３−８ヘテロシクロアルキルは、モルホリノ、ピロリジニル、ピロリジニル−２−オン、ピペラジニル、ピペリジニル、ピペリジニロン、１,４−ジオキサ−８−アザ−スピロ[４.５]デク−８−イル、などを含む。
【００１５】
“ハロゲン”(またはハロ)は、好ましくはクロロまたはフルオロであるが、またブロモまたはヨードでもあり得る。
【００１６】
“キナーゼ・パネル”は、Ａｂｌ(ヒト)、Ａｂｌ(Ｔ３１５Ｉ)、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＡＬＫ、ＪＮＫ１α１、ＡＬＫ４、ＫＤＲ、Ａｕｒｏｒａ−Ａ、Ｌｃｋ、Ｂｌｋ、ＭＡＰＫ１、Ｂｍｘ、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２、ＢＲＫ、ＭＥＫ１、ＣａＭＫＩＩ(ラット)、Ｍｅｔ、ＣＤＫ１／サイクリンＢ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＣＨＫ２、ＰＡＫ２、ＣＫ１、ＰＤＧＦＲα、ＣＫ２、ＰＤＫ１、ｃ−ｋｉｔ、Ｐｉｍ−２、ｃ−ＲＡＦ、ＰＫＡ(ｈ)、ＣＳＫ、ＰＫＢα、ｃＳｒｃ、ＰＫＣα、ＤＹＲＫ２、Ｐｌｋ３、ＥＧＦＲ、ＲＯＣＫ−Ｉ、Ｆｅｓ、Ｒｏｎ、ＦＧＦＲ３、Ｒｏｓ、Ｆｌｔ３、ＳＡＰＫ２α、Ｆｍｓ、ＳＧＫ、Ｆｙｎ、ＳＩＫ、ＧＳＫ３β、Ｓｙｋ、ＩＧＦ−１Ｒ、Ｔｉｅ−２、ＩＫＫβ、ＴｒＫＢ、ＩＲ、ＷＮＫ３、ＩＲＡＫ４、ＺＡＰ−７０、ＩＴＫ、ＡＭＰＫ(ラット)、ＬＩＭＫ１、Ｒｓｋ２、Ａｘｌ、ＬＫＢ１、ＳＡＰＫ２β、ＢｒＳＫ２、Ｌｙｎ(ｈ)、ＳＡＰＫ３、ＢＴＫ、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ３、ＳＡＰＫ４、ＣａＭＫＩＶ、ＭＡＲＫ１、Ｓｎｋ、ＣＤＫ２／サイクリンＡ、ＭＩＮＫ、ＳＲＰＫ１、ＣＤＫ３／サイクリンＥ、ＭＫＫ４(ｍ)、ＴＡＫ１、ＣＤＫ５／ｐ２５、ＭＫＫ６(ｈ)、ＴＢＫ１、ＣＤＫ６／サイクリンＤ３、ＭＬＣＫ、ＴｒｋＡ、ＣＤＫ７／サイクリンＨ／ＭＡＴ１、ＭＲＣＫβ、ＴＳＳＫ１、ＣＨＫ１、ＭＳＫ１、Ｙｅｓ、ＣＫ１ｄ、ＭＳＴ２、ＺＩＰＫ、ｃ−Ｋｉｔ(Ｄ８１６Ｖ)、ＭｕＳＫ、ＤＡＰＫ２、ＮＥＫ２、ＤＤＲ２、ＮＥＫ６、ＤＭＰＫ、ＰＡＫ４、ＤＲＡＫ１、ＰＡＲ−１Ｂα、ＥｐｈＡ１、ＰＤＧＦＲβ、ＥｐｈＡ２、Ｐｉｍ−１、ＥｐｈＡ５、ＰＫＢβ、ＥｐｈＢ２、ＰＫＣβＩ、ＥｐｈＢ４、ＰＫＣδ、ＦＧＦＲ１、ＰＫＣη、ＦＧＦＲ２、ＰＫＣθ、ＦＧＦＲ４、ＰＫＤ２、Ｆｇｒ、ＰＫＧ１β、Ｆｌｔ１、ＰＲＫ２、Ｈｃｋ、ＰＹＫ２、ＨＩＰＫ２、Ｒｅｔ、ＩＫＫα、ＲＩＰＫ２、ＩＲＲ、ＲＯＣＫ−ＩＩ(ヒト)、ＪＮＫ２α２、Ｒｓｅ、ＪＮＫ３、Ｒｓｋ１(ｈ)、ＰＩ３  Ｋγ、ＰＩ３  ＫδおよびＰＩ３−Ｋβを含むキナーゼのリストである。本発明の化合物はキナーゼ・パネル(野生型および／またはその変異)に対してスクリーニングされ、該パネルメンバーの少なくとも１種の活性を阻害する。
【００１７】
“ＢＣＲ−Ａｂｌの変異型”は、野生型配列からの１個または複数個のアミノ酸の変化を意味する。ＢＣＲ−ＡＢＬにおける変異はタンパク質と阻害剤(例えば、Gleevec、など)の重要な接触点を、よりしばしば、不活性型から活性型への、すなわちＢＣＲ−ＡＢＬおよびGleevecが結合できない形態への変化の誘導により破壊することにより作用する。臨床サンプルの分析から、耐性に関連して見られる変異のレパートリーは、長期間にわたりゆっくりではあるが、容赦なく増え続けている。変異は４つの種領域に群発するように見える。変異の一つの群(Ｇ２５０Ｅ、Ｑ２５２Ｒ、Ｙ２５３Ｆ／Ｈ、Ｅ２５５Ｋ／Ｖ)は、ＡＴＰのためのリン酸結合ループ(Ｐ−ループとしても既知)を形成するアミノ酸を含む。第二の群(Ｖ２８９Ａ、Ｆ３１１Ｌ、Ｔ３１５Ｉ、Ｆ３１７Ｌ)はGleevec結合部位に見られ、本阻害剤と水素結合またはファン・デル・ワールス相互作用を介して直接相互作用する。変異の第三の群(Ｍ３５１Ｔ、Ｅ３５５Ｇ)は触媒ドメインの近位に群発する。変異の第四の群(Ｈ３９６Ｒ／Ｐ)は活性化ループに位置し、その立体配置がキナーゼ活性化／不活性化の分子スイッチである。ＣＭＬおよびＡＬＬ患者において検出されるGleevec耐性と関連するＢＣＲ−ＡＢＬ点変異は：Ｍ２２４Ｖ、Ｌ２４８Ｖ、Ｇ２５０Ｅ、Ｇ２５０Ｒ、Ｑ２５２Ｒ、Ｑ２５２Ｈ、Ｙ２５３Ｈ、Ｙ２５３Ｆ、Ｅ２５５Ｋ、Ｅ２５５Ｖ、Ｄ２７６Ｇ、Ｔ２７７Ａ、Ｖ２８９Ａ、Ｆ３１１Ｌ、Ｔ３１５Ｉ、Ｔ３１５Ｎ、Ｆ３１７Ｌ、Ｍ３４３Ｔ、Ｍ３１５Ｔ、Ｅ３５５Ｇ、Ｆ３５９Ｖ、Ｆ３５９Ａ、Ｖ３７９Ｉ、Ｆ３８２Ｌ、Ｌ３８７Ｍ、Ｌ３８７Ｆ、Ｈ３９６Ｐ、Ｈ３９６Ｒ、Ａ３９７Ｐ、Ｓ４１７Ｙ、Ｅ４５９Ｋ、およびＦ４８６Ｓを含む(一文字表記により示すアミノ酸位置はGenBank配列, accession number AAB60394についてであり、ABL type 1a;Martinelli et al., Haematologica/The Hematology Journal, 2005, April;90-4に対応する)。本発明について特記しない限り、Ｂｃｒ−Ａｂｌは、本酵素の野生型および変異形態を含む。
【００１８】
“処置”、“処置する”および“処置し”は、疾患および／またはその付随症状の軽減または寛解を意味する。
【００１９】
好ましい態様の記載
融合タンパク質ＢＣＲ−Ａｂｌは、Ａｂｌ癌原遺伝子とＢｃｒ遺伝子を融合する相互転座の結果である。次いで、ＢＣＲ−Ａｂｌは、分裂促進的活性を介してＢ細胞をトランスフォーミング可能となる。この増加はアポトーシスに対する感受性の減少、ならびにＣＭＬ前駆細胞の接着および帰巣の変換をもたらす。本発明は、キナーゼ関連疾患、特にＡｂｌ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、Ａｕｒｏｒａ−Ａ、ＳＧＫ、Ｔｉｅ−２、Ｔｒｋ−Ｂ、ＦＧＦＲ３、ｃ−ｋｉｔ、ｂ−ＲＡＦ、ｃ−ＲＡＦ、ＤＹＲＫ２、Ｆｍｓ、ＦｙｎおよびＰＤＧＦＲαおよびＰＤＧＦＲβキナーゼ関連疾患の処置のための化合物、組成物および方法を提供する。例えば、白血病およびＢＣＲ−Ａｂｌに関連する他の増殖障害はＢｃｒ−Ａｂｌの野生型および変異形態の阻害により処置できる。
【００２０】
一つの態様において、式Ｉの化合物を参照して、式Ｉａの化合物：
【化２】
2009504757.tif 000004
〔式中、
Ｘ１はＣＨおよびＮから選択され；
ＹはＳおよびＮＲ５から選択されここで、Ｒ５は水素およびＣ１−６アルキルから選択され；
ｎが０、１および２から選択され；
Ｒ１は水素およびＣ１−６アルキルから選択され；そして
Ｒ１２が水素、Ｃ１−６アルキル、ハロ−置換−Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−８ヘテロシクロアルキル、−Ｃ(Ｏ)ＮＲ６Ｒ７および−ＮＲ６Ｃ(Ｏ)Ｒ７から選択され；ここで、Ｒ６は水素およびＣ１−６アルキルから選択され、そしてＲ７はＣ６−１０アリールおよびＣ１−１０ヘテロアリールから選択され；
ここで、Ｒ７の該アリールまたはヘテロアリールは、−Ｒ８および−ＯＲ８から独立して選択される１〜３個のラジカルで所望により置換されていてよく；ここで、Ｒ８はＣ１−６アルキル、ハロ−置換−Ｃ１−６アルキル、Ｃ６−１２アリール、Ｃ１−１０ヘテロアリールおよびＣ３−８ヘテロシクロアルキル−Ｃ０−４アルキルから選択され；ここで、Ｒ８の該アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクロアルキル置換基はＣ１−６アルキルで所望により置換されていてよい。〕
の化合物である。
【００２１】
他の態様において、Ｘ１がＣＨおよびＮから選択され；ＹがＳおよびＮ(ＣＨ３)から選択され；そしてＲ１が水素である。
【００２２】
さらなる態様において、Ｒ１２が水素、メチル、−Ｃ(Ｏ)ＮＨＲ７、−ＮＨＣ(Ｏ)Ｒ７、−Ｎ(ＣＨ３)Ｃ(Ｏ)Ｒ７およびモルホリノであり；ここで、Ｒ７がフェニルおよびイソオキサゾリルから選択され；ここで、Ｒ７の該フェニルまたはオキサゾリルは、イソブチル、トリフルオロメチル、フェノキシ、エチル−ピペラジニル−メチル、メチル−ピペラジニル−メチル、メチル−イミダゾリルおよびモルホリノ−メチルから選択される１〜２個のラジカルで所望により置換されていてよい。
【００２３】
好ましい本発明の化合物は：６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸[３−(３−トリフルオロメチル−フェニルカルバモイル)−フェニル]−アミド；１−メチル−１,６−ジヒドロ−１,５,６−トリアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸[３−(３−トリフルオロメチル−ベンゾイルアミノ)−フェニル]−アミド；６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸(４−モルホリン−４−イル−フェニル)−アミド；６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸フェニルアミド；６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸３−トリフルオロメチル−ベンジルアミド；モルホリン−４−イル−(６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−イル)−メタノン；２−ベンゼンスルホニル−１−メチル−１,６−ジヒドロ−１,５,６−トリアザ−ａｓ−インダセン；６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸[３−(３−トリフルオロメチル−ベンゾイルアミノ)−フェニル]−アミド；６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸[３−(３−トリフルオロメチル−フェニルカルバモイル)−フェニル]−アミド；６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸[２−メチル−５−(３−トリフルオロメチル−ベンゾイルアミノ)−フェニル]−アミド；６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸[２−メチル−５−(３−トリフルオロメチル−フェニルカルバモイル)−フェニル]−アミド；６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸{２−メチル−５−[メチル−(３−トリフルオロメチル−ベンゾイル)−アミノ]−フェニル}−アミド；６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸{５−[４−(４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル)−３−トリフルオロメチル−フェニルカルバモイル]−２−メチル−フェニル}−アミド；６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸{２−メチル−５−[３−(４−メチル−イミダゾル−１−イル)−５−トリフルオロメチル−ベンゾイルアミノ]−フェニル}−アミド；６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸[２−メチル−５−(３−モルホリン−４−イルメチル−５−トリフルオロメチル−フェニルカルバモイル)−フェニル]−アミド；６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸{２−メチル−５−[４−(２−メチル−イミダゾル−１−イル)−３−トリフルオロメチル−ベンゾイルアミノ]−フェニル}−アミド；６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸{２−メチル−５−[４−(４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル)−３−トリフルオロメチル−フェニルカルバモイル]−フェニル}−アミド；６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸[５−(５−ｔｅｒｔ−ブチル−イソキサゾル−３−イルカルバモイル)−２−メチル−フェニル]−アミド；４−(６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボニル)−ピペラジン−１−カルボン酸(４−フェノキシ−フェニル)−アミド；６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−イン��セン−２−カルボン酸{１−[３−(３−トリフルオロメチル−ベンゾイルアミノ)−フェニル]−１Ｈ−イミダゾル−２−イル}−アミド；１−メチル−１,６−ジヒドロ−１,５,６−トリアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸[２−メチル−５−(３−トリフルオロメチル−ベンゾイルアミノ)−フェニル]−アミド；１−メチル−１,６−ジヒドロ−１,５,６−トリアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸[３−(３−トリフルオロメチル−ベンゾイルアミノ)−フェニル]−アミド；１−メチル−１,６−ジヒドロ−１,５,６−トリアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸[３−(３−トリフルオロメチル−フェニルカルバモイル)−フェニル]−アミド；６Ｈ−１−チア−５,６,７−トリアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸[３−(３−トリフルオロメチル−ベンゾイルアミノ)−フェニル]−アミド；６Ｈ−１−チア−５,６,７−トリアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸[２−メチル−５−(３−トリフルオロメチル−ベンゾイルアミノ)−フェニル]−アミド；６Ｈ−１−チア−５,６,７−トリアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸[２−メチル−５−(４−モルホリン−４−イルメチル−３−トリフルオロメチル−フェニルカルバモイル)−フェニル]−アミド；６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸[３−メトキシ−５−(３−トリフルオロメチル−ベンゾイルアミノ)−フェニル]−アミド；６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸[３−メトキシ−５−(３−トリフルオロメチル−フェニルカルバモイル)−フェニル]−アミド；６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸[３−メトキシ−５−(４−モルホリン−４−イルメチル−３−トリフルオロメチル−フェニルカルバモイル)−フェニル]−アミド；６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸{３−メトキシ−５−[３−(４−メチル−イミダゾル−１−イル)−５−トリフルオロメチル−フェニルカルバモイル]−フェニル}−アミド；６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸{３−[４−(４−エチル−ピペラジン−１−イル)−３−トリフルオロメチル−フェニルカルバモイル]−５−メトキシ−フェニル}−アミド；および６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸[２−メチル−５−(５−トリフルオロメチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾル−２−イル)−フェニル]−アミドから選択される。
【００２４】
さらに好ましい本発明の化合物は、以下の実施例および表Ｉに記載する。
【００２５】
薬理学および有用性
本発明の化合物はキナーゼの活性を調節し、そして、それ自体、キナーゼが疾患の病状および／または症状に関与する疾患または障害の処置のために有用である。ここに記載の化合物および組成物により阻害されるおよびそれに対してここに記載の方法が有用なキナーゼは、Ａｂｌ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ(野生型および変異形態)、Ａｕｒｏｒａ−Ａ、ＳＧＫ、Ｔｉｅ−２、Ｔｒｋ−Ｂ、ＦＧＦＲ３、ｃ−ｋｉｔ、ｂ−ＲＡＦ、ｃ−ＲＡＦ、ＤＹＲＫ２、Ｆｍｓ、ＦｙｎおよびＰＤＧＦＲαおよびＰＤＧＦＲβを含むが、これらに限定されない。
【００２６】
Ａｕｒｏｒａ有糸分裂タンパク質キナーゼ(Ａ、ＢおよびＣ)は、種々の腫瘍タイプで頻繁に過剰発現しているセリン／スレオニンキナーゼである。Ａｕｒｏｒａ−Ａは、ｐ５３を含む種々の細胞サイクルレギュレーターとの相互作用を介して中心体機能をＭ期に制御する。また、ａｕｒｏｒａ−Ａにおける共通コード領域多形は乳癌または食道癌の危険性に影響する。
【００２７】
アベルソンチロシンキナーゼ(すなわちＡｂｌ、ｃ−Ａｂｌ)は細胞周期の制御、遺伝毒性ストレスに対する応答、およびインテグリンシグナル伝達を介した細胞環境に関する情報の伝達に関与する。全体として、Ａｂｌタンパク質は、種々の細胞外および細胞内供給源からのシグナルを統合する、および細胞周期およびアポトーシスに関する決定に影響する細胞モジュールとしての複雑な役割を果たすように見える。アベルソンチロシンキナーゼは、チロシンキナーゼ活性の脱制御を伴うキメラ融合物(腫瘍性タンパク質)ＢＣＲ−Ａｂｌまたはｖ−Ａｂｌのようなサブタイプ誘導体を含む。ＢＣＲ−Ａｂｌは、９５％の慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)および１０％の急性リンパ性白血病の病因として重要である。ＳＴＩ−５７１(Gleevec)は、発癌性ＢＣＲ−Ａｂｌチロシンキナーゼの阻害剤であり、慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)の処置に使用されている。しかしながら、ＣＭＬの急性転化段階のある患者は、ＢＣＲ−Ａｂｌキナーゼ変異のためにＳＴＩ−５７１に耐性である。今日までに２２種を超える変異が報告されており、最も一般的なものはＧ２５０Ｅ、Ｅ２５５Ｖ、Ｔ３１５Ｉ、Ｆ３１７ＬおよびＭ３５１Ｔである。
【００２８】
本発明の化合物は、ａｂｌキナーゼ、とりわけｖ−ａｂｌキナーゼを阻害する。本発明の化合物はまた野生型ＢＣＲ−ＡｂｌキナーゼおよびＢＣＲ−Ａｂｌキナーゼの変異体も阻害し、故に白血病(とりわけとりわけアポトーシス機能の作用がみられる場所である慢性骨髄性白血病および急性リンパ芽球性白血病)のようなＢｃｒ−ａｂｌ陽性癌および腫瘍疾患の処置に適当であり、また白血病性幹細胞のサブグループに対して効果を示し、これらの細胞の、該細胞除去(例えば、骨髄除去)後のインビトロでの精製および癌細胞を浄化した後の該細胞の再移植(例えば、精製骨髄細胞の再移植)のために可能性がある。
【００２９】
Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫシグナル伝達経路は、増殖シグナルに対する細胞応答を介在する。Ｒａｓは、〜１５％のヒト癌で発癌性形態に変異する。Ｒａｆファミリーはセリン／スレオニンタンパク質キナーゼに属し、３種のメンバー、Ａ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆおよびｃ−Ｒａｆ(またはＲａｆ−１)を含む。医薬標的としてのＲａｆへの焦点は、Ｒａｓの下流エフェクターとしてのＲａｆの関係に絞られている。しかしながら、近年のデータは、Ｂ−Ｒａｆが、Ｒａｓ対立遺伝子の活性化の必要なくある種の腫瘍の形成において顕著な役割を有し得ることを示唆する(Nature 417, 949- 954(01 Jul 2002))。特に、Ｂ−Ｒａｆ変異は、悪性黒色腫の大部分で検出されている。
【００３０】
黒色腫に対する現在存在する医薬処置は、とりわけ後期黒色腫に対する、それらの効果により制限されている。本発明の化合物はまたｂ−Ｒａｆキナーゼが関与する細胞過程を阻害し、ヒト癌、とりわけ黒色腫に対する新しい治療の機会を提供する。
【００３１】
本発明の化合物はまたｃ−Ｒａｆキナーゼが関与する細胞過程を阻害する。ｃ−Ｒａｆはｒａｓ発癌遺伝子により活性化され、それは多数のヒト癌で変異している。故にｃ−Ｒａｆのキナーゼ活性の阻害はｒａｓ介在腫瘍増殖を予防する方法を提供し得る[Campbell, S. L., Oncogene, 17, 1395(1998)]。
【００３２】
ＰＤＧＦ(血小板由来増殖因子)は非常に一般的に存在する増殖因子であり、それは正常な増殖およびまた発癌および血管平滑筋細胞の疾患、例えばアテローム性動脈硬化症および血栓症においてみられるような病的細胞増殖の両方に重要な役割を有する。本発明の化合物はＰＤＧＦ受容体(ＰＤＧＦＲ)活性を阻害でき、故に、神経膠腫、肉腫、前立腺腫瘍、ならびに結腸、乳房、および卵巣腫瘍のような腫瘍疾患の処置に適当である。
【００３３】
本発明の化合物は、例えば小細胞肺癌における腫瘍阻害物質としてだけでなく、アテローム性動脈硬化症、血栓症、乾癬、強皮症および線維症のような非悪性増殖性障害の処置剤として、ならびに、例えば５−フルオロウラシルのような化学療法剤の血液毒性と戦うための幹細胞の保護のために、および喘息において使用できる。本発明の化合物は、とりわけＰＤＧＦ受容体キナーゼの阻害に応答する疾患の処置に使用できる。
【００３４】
本発明の化合物は、移植、例えば、同種移植の結果として起こる障害、とりわけ組織拒絶反応、例えばとりわけ閉塞性細気管支炎(ＯＢ)、すなわち同種肺移植の慢性拒絶の処置において有効な効果を示す。ＯＢのない患者と比較して、ＯＢを有するものは、しばしば気管支肺胞洗浄液中の上昇したＰＤＧＦ濃度を示す。
【００３５】
本発明の化合物はまた、再狭窄およびアテローム性動脈硬化症のような、血管平滑筋細胞遊走および増殖(そこで、ＰＤＧＦおよびＰＤＧＦ−Ｒがまたしばしば役割を有する)が関連する疾患においても有効である。血管平滑筋細胞増殖または遊走に対するインビトロおよびインビボでのこれらの効果およびその結果は、本発明の化合物の投与により、およびまたインビボでの機械的傷害後の血管内膜の肥厚に対するその効果の調査により証明できる。
【００３６】
ニューロトロフィン受容体のｔｒｋファミリー(ｔｒｋＡ、ｔｒｋＢ、ｔｒｋＣ)は、神経および非神経組織の生存、増殖および分化を促進する。ＴｒｋＢタンパク質は小腸および結腸における神経内分泌型細胞、膵臓のアルファ細胞、リンパ節および脾臓の単球およびマクロファージ、および表皮の顆粒層で発現される(Shibayama and Koizumi, 1996)。ＴｒｋＢタンパク質の発現は、ウィルムス腫瘍および神経芽腫の望ましくない進行と関連している。ＴｋｒＢは、さらに、癌性前立腺細胞で発現されるが、正常細胞ではされない。ｔｒｋ受容体の下流のシグナル伝達経路はＳｈｃ、活性化Ｒａｓ、ＥＲＫ−１およびＥＲＫ−２遺伝子、およびＰＬＣ−ガンマ伝達経路を介したＭＡＰＫ活性化のカスケードに関与する(Sugimoto et al., 2001)。
【００３７】
キナーゼ、ｃ−Ｓｒｃは多くの受容体の発癌性シグナルを伝達する。例えば、腫瘍におけるＥＧＦＲまたはＨＥＲ２／ｎｅｕの過剰発現はｃ−ｓｒｃの構成的活性化に至り、これは悪性細胞に特徴的であるが、正常細胞では存在しない。他方、ｃ−ｓｒｃ発現を欠くマウスは、大理石骨病表現型を示し、ｃ−ｓｒｃの破骨細胞機能への重要な参加および関連障害への関与の可能性を示す。
【００３８】
Ｔｅｃファミリーキナーゼ、Ｂｍｘ、非受容体タンパク質−チロシンキナーゼは乳房上皮性癌細胞の増殖を制御する。
【００３９】
線維芽細胞増殖因子受容体３は骨成長に対する負の制御効果および軟骨細胞増殖阻害を発揮することが示された。致死性骨異形成症は、線維芽細胞増殖因子受容体３における異なる変異により特徴付けられ、１個の変異、ＴＤII  ＦＧＦＲ３は構成的チロシンキナーゼ活性を有し、それは転写因子ｔａｔ１を活性化し、細胞周期阻害因子の発現、増殖停止および異常骨発育に至る(Su et al., Nature, 1997, 386, 288-292)。ＦＧＦＲ３はまた多発性骨髄腫タイプの癌においてしばしば発現される。ＦＧＦＲ３活性の阻害剤は、リウマチ性関節炎(ＲＡ)、コラーゲンII関節炎、多発性硬化症(ＭＳ)、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、乾癬、若年発症糖尿病、シェーグレン病、甲状腺疾患、サルコイドーシス、自己免疫性ブドウ膜炎、炎症性腸疾患(クローン病および潰瘍性大腸炎)、セリアック病および重症筋無力症を含むがこれらに限定されない、Ｔ細胞介在炎症性または自己免疫性疾患の処置において有用である。
【００４０】
消化器間質腫瘍(ＧＩＳＴ)は、ヒト胃腸管の最も一般的な間葉性腫瘍である。癌原遺伝子ｃ−ｋｉｔによりコードされる受容体チロシンキナーゼであるＫｉｔは、実質的に全てのＧＩＳＴで発現される。
【００４１】
ＤＹＲＫ２(２重特異的チロシンリン酸化および制御タンパク質キナーゼ２)過剰発現は、食道および肺腺癌の両方において遺伝子増幅よりも頻繁に起こる。
【００４２】
血清およびグルココルチコイド制御キナーゼ(ＳＧＫ)の活性は、イオンチャネル活性の混乱、特に、ナトリウムおよび／またはカリウムチャネル活性の混乱と関連し、本発明の化合物は高血圧の処置に有用であり得る。
【００４３】
Lin et al(1997)J. Clin. Invest. 100, 8: 2072-2078およびP. Lin(1998)PNAS 95, 8829-8834は、乳房腫瘍および黒色腫異種移植片モデルにおいてアデノウイルス感染中またはＴｉｅ−２の細胞外ドメイン(Ｔｅｋ)の注入中に腫瘍増殖および血管新生が阻害されおよびまた肺転移が減少することを示している。Ｔｉｅ２阻害剤は新血管新生が不適切に行われる状況(すなわち糖尿病性網膜症、慢性炎症、乾癬、カポジ肉腫、黄斑変性症による慢性新血管新生、リウマチ性関節炎、小児血管腫および癌)において使用できる。
【００４４】
ＬｃｋはＴ細胞シグナル伝達において役割を有する。Ｌｃｋ遺伝子を欠くマウスは、胸腺細胞を発育させる能力が乏しい。Ｔ細胞シグナル伝達の正のアクティベーターとしてのＬｃｋの機能は、Ｌｃｋ阻害剤がリウマチ性関節炎のような自己免疫性疾患の処置に有用であり得ることを示唆する。
【００４５】
ＪＮＫは他のＭＡＰＫと同様、癌、トロンビン誘発血小板凝集、免疫不全障害、自己免疫性疾患、細胞死、アレルギー、骨粗鬆症および心臓疾患に対する細胞応答に介在において役割を有すると見なされる。ＪＮＫ経路活性化に関連する治療標的は、慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、リウマチ性関節炎、喘息、骨関節症、虚血、癌および神経変性疾患を含む。肝臓疾患または肝虚血の事象と関連するＪＮＫ活性化の重要性の結果、本発明の化合物はまた種々の肝障害の処置にも有用であり得る。心筋梗塞または鬱血性心不全のような心臓血管疾患におけるＪＮＫの役割も、ＪＮＫが心臓ストレスの種々の形態に対する肥大性応答を介在するとして報告されている。ＪＮＫカスケードはまたＩＬ−２プロモーターの活性化を含むＴ細胞活性化において役割を有することが証明されている。故に、ＪＮＫの阻害剤は、病的免疫応答の変更に治療的価値を有し得る。種々の癌におけるＪＮＫ活性化の役割は確立されており、癌におけるＪＮＫ阻害剤の使用の可能性を示唆する。例えば、構成的に活性化されたＪＮＫはＨＴＬＶ−１介在腫瘍形成と関連する[Oncogene 13: 135-42(1996)]。ＪＮＫはカポジ肉腫(ＫＳ)において役割を有し得る。血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)、ＩＬ−６およびＴＮＦαのような、ＫＳ増殖に関与する他のサイトカインの他の増殖性効果もまたＪＮＫが介在し得る。加えて、ｐ２１０  ＢＣＲ−ＡＢＬ形質転換細胞におけるｃ−ｊｕｎ遺伝子の制御はＪＮＫ活性と一致し、慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)の処置におけるＪＮＫ阻害剤の役割を示唆する[Blood 92: 2450-60(1998)]。
【００４６】
ある種の異常増殖状態はｒａｆ発現と関連すると考えられており、故に、ｒａｆ発現の阻害に応答すると考えられる。ｒａｆタンパク質の異常に高レベルの発現は形質転換および異常細胞増殖に関与する。これらの異常増殖状態もまたｒａｆ発現の阻害に応答すると考えられる。例えば、ｃ−ｒａｆタンパク質の発現は、全肺癌腫細胞系の６０％が異常に高レベルのｃ−ｒａｆ  ｍＲＮＡおよびタンパク質と報告されているため、異常細胞増殖において役割を有すると考えられる。異常増殖状態のさらなる例は、癌、腫瘍、過形成、肺線維症、血管形成、乾癬、アテローム性動脈硬化症ならびに狭窄または血管形成術術後の再狭窄のような血管における平滑筋細胞増殖のような、過増殖性障害である。ｒａｆが一部である細胞シグナル伝達経路はまた、例えば組織移植片拒絶、エンドドキシンショック、および糸球体腎炎のようなＴ細胞増殖(Ｔ細胞活性化および増殖)により特徴付けられる炎症性障害に関与している。
【００４７】
ストレス活性化タンパク質キナーゼ(ＳＡＰＫ)は、ｃ−ｊｕｎ転写因子の活性化およびｃ−ｊｕｎにより制御される遺伝子の発現をもたらすシグナル伝達経路の最後から２番目の工程を代表する、タンパク質キナーゼのファミリーである。特に、ｃ−ｊｕｎは、遺伝毒性傷害により損傷したＤＮＡの修復に関与するタンパク質をコードする遺伝子の転写に関与する。故に、細胞におけるＳＡＰＫ活性を阻害する薬剤は、ＤＮＡ修復を妨げ、細胞を、ＤＮＡ損傷を誘発するかＤＮＡ合成を阻害して細胞のアポトーシスを誘発する、または細胞増殖を阻害する薬剤に感受性とする。
【００４８】
マイトージェン−活性タンパク質キナーゼ(ＭＡＰＫ)は、種々の細胞外シグナルに応答して、転写因子、翻訳因子および他の標的分子を活性化する保存されたシグナル伝達経路のメンバーである。ＭＡＰＫは配列Ｔｈｒ−Ｘ−Ｔｙｒを有するデュアルリン酸化モチーフの、マイトージェン−活性タンパク質キナーゼキナーゼ(ＭＫＫ)によるリン酸化により活性化される。高等真核細胞において、ＭＡＰＫシグナル伝達の生理学的役割は、増殖、発癌、発育および分化のような細胞事象と相関している。したがって、シグナル伝達をこれらの経路を介して(特にＭＫＫ４およびＭＫＫ６を介して)制御する能力は、炎症性疾患、自己免疫性疾患および癌のようなＭＡＰＫシグナル伝達と関連するヒト疾患の処置および予防的治療の発展に至る。
【００４９】
ヒトリボソームＳ６タンパク質キナーゼのファミリーは少なくとも８種のメンバー(ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＲＳＫ４、ＭＳＫ１、ＭＳＫ２、ｐ７０Ｓ６Ｋおよびｐ７０Ｓ６  Ｋｂ)から成る。リボソームタンパク質Ｓ６タンパク質キナーゼは、重要な多面的な(pleotropic)機能を有し、とりわけ、タンパク質生合成中のｍＲＮＡ翻訳に重要な役割を有する(Eur. J. Biochem 2000 November; 267(21): 6321-30, Exp Cell Res. Nov. 25, 1999; 253(1): 100-9, Mol Cell Endocrinol. May 25, 1999; 151(1-2): 65-77)。Ｓ６リボソームタンパク質のｐ７０Ｓ６によるリン酸化はまた、細胞運動性(Immunol. Cell Biol. 2000 August; 78(4): 447-51)および細胞増殖(Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol., 2000; 65: 101-27)の制御に関与しており、故に腫瘍転移、免疫応答および組織修復ならびに他の疾患状態に重要であり得る。
【００５０】
ＳＡＰＫ(“ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ”または“ＪＮＫ’ｓ”とも呼ばれる)は、ｃ−ｊｕｎ転写因子の活性化およびｃ−ｊｕｎにより制御される遺伝子の発現をもたらすシグナル伝達経路の最後から２番目の工程を代表する、タンパク質キナーゼのファミリーである。特に、ｃ−ｊｕｎは、遺伝毒性傷害により損傷したＤＮＡの修復に関与するタンパク質をコードする遺伝子の転写に関与する。細胞におけるＳＡＰＫ活性を阻害する薬剤は、ＤＮＡ修復を妨げ、細胞を、ＤＮＡ損傷を誘発により作用する癌治療モダリティーに感受性とする。
【００５１】
ＢＴＫは全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、リウマチ性関節炎、多発性脈管炎、特発性血小板減少性紫斑病(ＩＴＰ)、重症筋無力症、および喘息のような自己免疫性および／または炎症性疾患において役割を有する。Ｂ細胞におけるＢＴＫの役割が活性化であるため、ＢＴＫの阻害剤は、自己抗体産生のようなＢ細胞介在病原性活性の阻害剤として有用であり、Ｂ細胞リンパ腫および白血病の処置に有用である。
【００５２】
ＣＨＫ２はセリン／スレオニンタンパク質キナーゼのチェックポイントキナーゼファミリーであり、環境変異源および内因性活性酸素種により引き起こされる損傷のようなＤＮＡ損傷の監視に使用される機構に含まれる。結果として、それは腫瘍サプレッサーおよび癌治療の標的として関与する。
【００５３】
ＣＳＫは癌細胞、特に結腸癌の転移能に影響する。
【００５４】
Ｆｅｓは種々のサイトカインシグナル伝達経路ならびに骨髄性細胞の分化に関与している非受容体タンパク質チロシンキナーゼである。Ｆｅｓはまた顆粒球分化機構の重要な要素である。
【００５５】
Ｆｌｔ３受容体チロシンキナーゼ活性は白血病および骨髄異形成症候群に関与する。約２５％のＡＭＬにおいて、白血病細胞は、細胞表面上に、自己リン酸化(ｐ)ＦＬＴ３チロシンキナーゼの構成的に活性な形態を発現する。ｐ−ＦＬＴ３活性は、白血病性細胞に増殖および生存優位性を付与する。白血病細胞がｐ−ＦＬＴ３キナーゼ活性を示す急性白血病の患者は、全体的臨床成績が悪い。ｐ−ＦＬＴ３キナーゼ活性の阻害は白血病性細胞のアポトーシス(計画細胞死)を誘発する。
【００５６】
ＩＫＫαおよびＩＫＫβ(１＆２)の阻害剤は、リウマチ性関節炎、移植片拒絶反応、炎症性腸疾患、骨関節症、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アテローム性動脈硬化症、乾癬、多発性硬化症、卒中、全身性エリテマトーデス、アルツハイマー病、脳虚血、外傷性脳傷害、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、くも膜下出血または脳および中枢神経系における炎症性メディエーターの過剰産生と関連する他の疾患または障害を含む、疾患の治療剤である。
【００５７】
Ｍｅｔは主要なヒト癌のほとんどのタイプの関連し、発現はしばしば悪い予後および転移と相関する。Ｍｅｔの阻害剤は、肺癌、ＮＳＣＬＣ(非小細胞肺癌)、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頚部癌、皮膚または眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、結腸癌、乳癌、婦人科腫瘍(例えば、子宮肉腫、輸卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頚の癌腫、膣の癌腫または外陰の癌腫)、ホジキン病、食道の癌、小腸の癌、内分泌系の癌(例えば、甲状腺、副甲状腺または副腎の癌)、軟組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、前立腺癌、慢性または急性白血病、小児の固形腫瘍、リンパ球性脈リンパ腫、膀胱の癌、腎臓または輸尿管の癌(例えば、腎臓細胞癌腫、腎盂の癌腫)、小児科悪性腫瘍、中枢神経系の新生物(例えば、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄の軸の腫瘍、脳幹神経膠腫または下垂体腺腫)、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病のような血液の癌などを含む癌、バレット食道(前悪性症候群)、新生物皮膚疾患、乾癬、菌状息肉腫(mycoses fungoides)および良性前立腺肥大、糖尿病性網膜症のような糖尿病合併症、網膜虚血および網膜新血管新生、肝硬変、アテローム性動脈硬化症のような心臓血管疾患、自己免疫性疾患および腎臓疾患のような免疫学的疾患を含む、疾患の治療剤である。好ましくは、本疾患は、急性骨髄性白血病および結腸直腸癌のような癌である。
【００５８】
Ｎｉｍａ関連キナーゼ２(Ｎｅｋ２)は、中心体に局在化する有糸分裂の開始時に最大活性を有する、細胞周期制御タンパク質キナーゼである。機能的試験から、Ｎｅｋ２は中心体分離および紡錘体形成の制御に関連している。Ｎｅｋ２タンパク質は子宮頚、卵巣、前立腺、および特に乳房のものを含む広範のヒト腫瘍由来の細胞系において、２〜５倍上昇している。
【００５９】
ｐ７０Ｓ６Ｋ介在疾患または状態は、癌および結節性硬化症のような増殖性障害を含むが、これらに限定されない。
【００６０】
前記によって、本発明はさらに処置を必要とする対象における上記のいずれかの疾患または障害の処置法であって、該対象に式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩の治療的有効量(下記“投与および医薬組成物”参照)を投与することを含む、方法を提供する。上記の全ての使用に関して、必要な投与量は、投与の形態、処置すべき特定の状態および望む効果に依存して変化する。
【００６１】
投与および医薬組成物
一般に、本発明の化合物は、治療的有効量で、当分野で既知の任意の通常のおよび許容される形態で、単独でまたは１種以上の治療剤と組み合わせて投与される。治療的有効量は疾患の重症度、対象の年齢および相対的健康状態、使用する化合物の効力および他の因子に依存して広範囲に変化し得る。一般に、満足な結果が、約０.０３から２.５mg／体重kgの一日量で全身的に得られることが示される。大型哺乳動物、例えばヒトにおける指示される一日量は、約０.５mgから約１００mgの範囲であり、簡便には、例えば１日４回までの分割量でまたは徐放形態で投与する。経口投与のための適当な単位投与形態は約１から５０mg活性成分を含む。
【００６２】
本発明の化合物は医薬組成物として、任意の慣用の経路により、特に経腸的に、例えば、経口で、例えば、錠剤またはカプセルの形で、または非経腸的に、例えば、注射可能溶液または懸濁液の形で、局所的に、例えば、ローション、ゲル、軟膏またはクリームの形で、または鼻腔内にまたは坐薬形態で投与できる。遊離形または薬学的に許容される塩形の本発明の化合物を少なくとも１個の薬学的に許容される担体または希釈剤と共に含む医薬組成物は、混合、造粒またはコーティング法による慣用法で製造できる。例えば、経口組成物は、活性成分をａ)希釈剤、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロースおよび／またはグリシン；ｂ)滑剤、例えば、シリカ、タルク、ステアリン酸、そのマグネシウムまたはカルシウム塩および／またはポリエチレングリコール；錠剤についてはまたｃ)結合剤、例えば、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、デンプンペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースおよび／またはポリビニルピロリドン；望むならばｄ)崩壊剤、例えば、デンプン、寒天、アルギン酸またはそのナトリウム塩、または起沸性混合物；および／またはｅ)吸収剤、着色剤、香味剤および甘味剤と共に含む、錠剤またはゼラチンカプセルである。注射可能組成物は、水性等張性溶液または懸濁液であってよく、そして坐薬は脂肪エマルジョンまたは懸濁液から製造できる。本組成物は滅菌してよくおよび／またはアジュバント、例えば防腐剤、安定化剤、湿潤剤または乳化剤、溶解促進剤、浸透圧調整用塩および／または緩衝剤を含んでよい。加えて、それらはまた他の治療的に価値ある物質を含んでよい。経皮適用に適当な製剤は、有効量の本発明の化合物と担体を含む。担体は、宿主の皮膚を介した通過を助けるための吸収可能な薬理学的に許容される溶媒を含む。例えば、経皮デバイスは裏打ち部材、化合物を所望により担体と共に含む貯蔵部、所望により化合物を宿主の皮膚へ長時間にわたり制御されかつ予定された速度で送達するための速度制御バリア、および該デバイスを皮膚に固定する手段を含む、バンデージの形である。マトリックス経皮製剤も使用できる。例えば、皮膚および眼への局所投与に適当な製剤は、好ましくは当分野で既知の水性溶液、軟膏、クリームまたはゲルである。これらは可溶化剤、安定化剤、張性増強剤(tonisity enhancing agent)、緩衝剤および防腐剤を含み得る。
【００６３】
本発明の化合物は、治療的有効量で、１個以上の治療剤と組み合わせて投与できる(医薬組合せ剤)。例えば、相乗効果が他の免疫抑制剤または抗炎症剤、例えばシクロスポリン、ラパマイシン、またはアスコマイシン、またはそれらの免疫抑制類似体、例えばシクロスポリンＡ(ＣｓＡ)、シクロスポリンＧ、ＦＫ−５０６、ラパマイシン、または同等な化合物、コルチコステロイド、シクロホスファミド、アザチオプリン、メトトレキサート、ブレキナール、レフルノミド、ミゾルビン、ミコフェノール酸、ミコフェノール酸モフェチル、１５−デオキシスペルグアリン、免疫抑制性抗体、とりわけ白血球受容体、例えばＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ２５、ＣＤ２８、Ｂ７、ＣＤ４５、ＣＤ５８またはそれらのリガンドに対するモノクローナル抗体、またはＣＴＬＡ４１ｇのような他の免疫抑制性化合物と組み合わせて使用したとき起こり得る。本発明の化合物を他の治療剤と組み合わせて投与するとき、併用投与化合物の投与量は、用いる併用剤のタイプ、用いる具体的薬剤、処置する状態などに依存して変化する。
【００６４】
本発明はまたａ)ここに記載の通りの遊離形または薬学的に許容される塩形の本発明の化合物である第一剤、およびｂ)少なくとも１個の併用剤を含む、医薬組合せ剤、例えばキットを提供する。本キットは、その投与のための指示書を含み得る。
【００６５】
ここで使用する用語“併用投与”または“組合せ投与”などは、単独の患者への選択した治療剤の投与を包含することを意味し、複数薬剤を必ずしも同じ投与経路でまたは同時に投与するものではない処置レジメンを包含することを意図する。
【００６６】
ここで使用する用語“医薬組合せ剤”は、２種以上の活性成分の混合または組合せに由来する製品を意味し、活性成分の固定されたおよび固定されていない組合せ剤の両方を含む。用語“固定された組合せ剤”は、活性成分、例えば式Ｉの化合物および併用剤が、両方とも患者に単一の物または投与量の形で投与されることを意味する。用語“固定されていない組合せ剤”は、活性成分、例えば式Ｉの化合物および併用剤が、両方とも患者に別々の物として、同時に、一緒にまたは特別な時間制限なく連続的に投与されることを意味し、ここで、このような投与は患者体内において２種の化合物の治療的有効レベルを提供する。後者はまたカクテル療法、例えば３種以上の活性成分の投与に適用される。
【００６７】
本発明の化合物の製造法
本発明はまた本発明の化合物の製造法も含む。記載の反応において、反応性官能基、例えばヒドロキシ、アミノ、イミノ、チオまたはカルボキシ基を、これらが最終生成物において望まれるとき、これらの反応への望まない参加を避けるために、保護する必要があるかもしれない。慣用の保護基を標準実務に従い使用でき、例えば、T.W. Greene and P. G. M. Wuts in “Protective Groups in Organic Chemistry”, John Wiley and Sons, 1991を参照のこと。
【００６８】
式Ｉａの化合物は以下の反応スキームＩの通りに進行して製造できる：
【化３】
2009504757.tif 000005
【００６９】
式中、ｎ、Ｘ１、Ｒ１およびＲ１２は発明の要約で定義の通りである。式Ｉの化合物を、式２の化合物を適当な溶媒(例えば、ＤＭＦ、など)、適当なカップリング剤(例えば、ＨＡＴＵ、など)および適当な塩基(例えば、ＤＩＥＡ、など)の存在下、反応させることにより製造できる。本反応は、０℃から約４０℃の温度で進行し、完了まで約１０時間かかり得る。
【００７０】
式Ｉの化合物の合成の詳細な例は、以下の実施例に見ることができる。
【００７１】
本発明の化合物の製造のさらなる工程
本発明の化合物は、遊離形態の化合物と、薬学的に許容される無機または有機酸の反応により、薬学的に許容される酸付加塩として製造できる。あるいは、本発明の化合物の薬学的に許容される塩基付加塩を、本化合物の遊離酸形態と、薬学的に許容される無機または有機塩基の反応により製造できる。
【００７２】
あるいは、本発明の化合物の塩形態は、出発物質または中間体の塩の使用により製造できる。
【００７３】
本発明の化合物の遊離酸または遊離塩基形態は、各々対応する塩基付加塩または酸付加塩形態から製造できる。例えば酸付加塩形態の本発明の化合物を、適当な塩基(例えば、水酸化アンモニウム溶液、水酸化ナトリウムなど)との反応により対応する遊離塩基に変換できる。塩基付加塩形態の本発明の化合物を、適当な酸(例えば、塩酸など)で処理することにより、対応する遊離酸に変換できる。
【００７４】
酸化されていない形の本発明の化合物を、本発明の化合物のＮ−オキシドから、還元剤(例えば、硫黄、二酸化硫黄、トリフェニルホスフィン、リチウムボロハイドライド、水素化ホウ素ナトリウム、リン三塩化物、三臭化物など)で、適当な不活性有機溶媒(例えばアセトニトリル、エタノール、水性ジオキサンなど)中、０〜８０℃で処理することにより製造できる。
【００７５】
本発明の化合物のプロドラッグ誘導体は、当業者に既知の方法により製造できる(例えば、さらなる詳細は、Saulnier et al., (1994), Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, Vol. 4, p. 1985参照)。例えば、適当なプロドラッグは、誘導体化されていない本発明の化合物と、適当なカルバミル化剤(例えば、１,１−アシルオキシアルキルカルバノクロリデート、パラ−ニトロフェニルカーボネートなど)の反応により製造できる。
【００７６】
本発明の化合物の被保護誘導体は、当業者に既知の手段により製造できる。保護基の創成およびそれらの除去に適応できる技術の詳細な記載は、T. W. Greene, “Protecting Groups in Organic Chemistry”, 3rd edition, John Wiley and Sons, Inc., 1999に見ることができる。
【００７７】
本発明の化合物は、溶媒和物(例えば、水和物)として簡便に製造でき、または本発明の工程中に形成される。本発明の化合物の水和物は、簡便にはジオキシン、テトラヒドロフランまたはメタノールのような有機溶媒を使用した、水性／有機溶媒混合物からの再結晶により製造できる。
【００７８】
本発明の化合物は、化合物のラセミ混合物を、光学活性な分離剤と反応させて、ジアステレオ異性体化合物の混合物を形成させ、ジアステレオマーを分離し、光学的に純粋なエナンチオマーを回収することにより、その個々の立体異性体として製造できる。エナンチオマーの解離は、本発明の化合物の二価ジアステレオマー誘導体を使用して行い得るが、分離可能な複合体(例えば、結晶性ジアステレオマー塩)が好ましい。ジアステレオマーは異なる物理特性(例えば、融点、沸点、溶解度、反応性など)を有し、これらの差異を利用して容易に分離できる。ジアステレオマーはクロマトグラフィーにより、または好ましくは、溶解度の差異を利用した分離／分解技術により分離できる。光学的に純粋なエナンチオマーを、次いで分離剤と共に、ラセミ化をもたらさない任意の実際的手段により回収する。化合物の立体異性体の、そのラセミ混合物からの分離に適用可能な技術のより詳細な記載は、Jean Jacques, Andre Collet, Samuel H. Wilen, “Enantiomers, Racemates and Resolution”, John Wiley and Sons, Inc., 1981に見ることができる。
【００７９】
要約すると、式Ｉの化合物は下記を含む方法により製造できる：
(ａ)反応スキームＩのもの；そして
(ｂ)所望により本発明の化合物の薬学的に許容される塩への変換；
(ｃ)所望により塩形の本発明の化合物の非塩形への変換；
(ｄ)所望により酸化されていない形の本発明の化合物の薬学的に許容されるＮ−オキシドへの変換；
(ｅ)所望によりＮ−オキシド形の本発明の化合物のその酸化されていない形への変換；
(ｆ)所望により異性体混合物からの本発明の化合物の個々の異性体の分離；
(ｇ)所望により誘導体化されていない本発明の化合物の、薬学的に許容されるプロドラッグ誘導体への変換；および
(ｈ)所望により、本発明の化合物のプロドラッグ誘導体の、その非誘導体化形への変換。
【００８０】
出発物質の製造が特に記載されていない限り、該化合物は既知であるか、または当分野で既知の方法に従い、もしくは下記実施例に記載の通りに製造できる。
【００８１】
当業者は、上記の変換は本発明の化合物の製造の単なる代表例であり、他の既知の方法を同様に使用できることを認識するであろう。
【実施例】
【００８２】
本発明は、本発明の式Ｉの化合物の製造を説明する下記実施例によりさらに例証するが、限定しない。
【００８３】
実施例１
６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸[３−(３−トリフルオロメチル−フェニルカルバモイル)−フェニル]−アミド
【化４】
2009504757.tif 000006
【００８４】
４−クロロ−１−トリイソプロピルシラニル−１Ｈ−ピロロ[２,３−ｂ]ピリジンの合成：
【化５】
2009504757.tif 000007
−７８℃に冷却した４−クロロ−１Ｈ−ピロロ[２,３−ｂ]ピリジン(３.２１ｇ、２１mmol)のＴＨＦ(６０mL)溶液に、ｎ−ＢｕＬｉ(ヘキサン中１.６Ｍ、１３.８mL、２２mmol)をゆっくり添加する。３０分撹拌後、ＴＩＰＳＯＴｆ(５.７７mL、２１.４mmol)を添加する。混合物を室温に温め、水でクエンチする。混合物をヘキサン(２００mL)および塩水に分配する。有機抽出物を塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮する。残渣をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル、ヘキサンで溶出)で精製し、表題化合物を得る：1H NMR 600 MHz(アセトン-d6)δ 8.19(d, 1H, J = 5.4 Hz), 7.57(d, 1H, J = 3.0 Hz), 7.18(d, 1H, J = 5.4 Hz), 6.69(d, 1H, J = 3.0 Hz), 1.92(sept, 3H, J = 7.2 Hz ), 1.12(d, 18H, J = 7.2 Hz);MS m/z 309.2(M + 1)。
【００８５】
４−クロロ−１−トリイソプロピルシラニル−１Ｈ−ピロロ[２,３−ｂ]ピリジン−５−カルボアルデヒドの合成：
【化６】
2009504757.tif 000008
−７８℃に冷却した４−クロロ−１−トリイソプロピルシラニル−１Ｈ−ピロロ[２,３−ｂ]ピリジン(０.９０ｇ、２.９１mmol)のＴＨＦ(８mL)溶液に、ｓｅｃ−ＢｕＬｉ(ヘキサン中１.４Ｍ、４.１６mL、５.８２mmol)をゆっくり添加する。４５分撹拌後、ＤＭＦ(０.６８mL、８.７４mmol)を−７８℃で添加する。混合物を１時間撹拌し、ＨＣｌのエーテル溶液(１Ｍ、８.７３mL、８.７３mmol)でクエンチする。混合物を室温に温める。反応混合物を飽和重炭酸ナトリウム溶液でｐＨ８に塩基性化し、酢酸エチルで抽出する。有機抽出物を塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮して、表題化合物の混合物を得て、それを次反応にさらに精製することなく使用する：MS m/z 337.2(M + 1)。
【００８６】
４−メチルアミノ−１Ｈ−ピロロ[２,３−ｂ]ピリジン−５−カルボアルデヒドの合成：
【化７】
2009504757.tif 000009
４−クロロ−１Ｈ−ピロロ[２,３−ｂ]ピリジン−５−カルボアルデヒドおよび４−クロロ−１−トリイソプロピルシラニル−１Ｈ−ピロロ[２,３−ｂ]ピリジン−５−カルボアルデヒド(２.０ｇ、上記工程から)、メチルアミン(４０％水溶液、１６mL、１００mmol)の混合物のメトキシ−エタノール(４mL)溶液を１１０℃で密封チューブ中一晩加熱する。反応混合物を室温に冷却し、濃縮する。残渣をＨＣｌ溶液(１Ｎ、２０mL)に溶解し、５０℃で加熱する。１.５時間、５０℃で撹拌後、反応混合物を飽和重炭酸ナトリウム溶液でｐＨ８まで中和する。固体を濾過により回収し、水、次いでヘキサンで洗浄し、乾燥させて、表題化合物を明黄色固体として得る：MS m/z 176.1(M + 1)。
【００８７】
６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸メチルエステルの合成：
【化８】
2009504757.tif 000010
４−クロロ−１−トリイソプロピルシラニル−１Ｈ−ピロロ[２,３−ｂ]ピリジン(９００mg、２.１４mmol)をＤＭＦに溶解する。Ｋ２ＣＯ３(５９０mg、４.２８mmol)、続いてチオグリシドール(０.２mL、２.３５mmol)の添加後、反応混合物を６５℃で３.５時間撹拌する。反応混合物を次いで冷却し、氷冷水に注ぐ。残渣を濾過により回収し、乾燥させる。粗生成物を次いでシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、オフホワイト色無定形化合物を得る：1H NMR 400 MHz(DMSO-d6)δ 12.21(s, 1H), 8.90(s, 1H), 8.40(s, 1H), 7.59(d, 1H, J = 3.0 Hz), 6.79(d, 1H, J = 3.1 Hz), 3.91(s, 3H);MS m/z 233.1(M + 1)。
【００８８】
６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸の合成：
【化９】
2009504757.tif 000011
６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸メチルエステル(１００mg、０.４３mmol)、ＬｉＯＨ(２５.５mg、１.０７mmol)の混合物をＴＨＦ(４ml)およびＨ２Ｏ(１mL)に溶解する。混合物を６０℃で３時間撹拌する。酢酸での酸性化により褐色固体がもたらされ、それを濾過により回収する。次いでそれを真空で乾燥させ、なんらさらに精製することなく次工程に使用する。
【００８９】
６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸[３−(３−トリフルオロメチル−フェニルカルバモイル)−フェニル]−アミドの合成
６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸(３０mg、０.１３８mmol)をＤＩＥＡ(０.０３０ml、０.１７２mmol)およびＨＡＴＵ(５７.７１mg、０.１５１mmol)と２ml  ＤＭＦ中、室温で混合する。３−アミノ−Ｎ−(３−トリフルオロメチル−フェニル)−ベンズアミド(３８.６mg、０.１３８mmol)を反応混合物に０.５時間後に添加する。室温で２時間撹拌後、反応混合物を濃縮し、Ｐｒｅｐ−ＨＰＬＣで精製して、表題化合物をＴＦＡ塩として得る：1H NMR 400 MHz(DMSO-d6)δ 12.09(s, 1H), 10.70, (s, 1H), 10.55(s, 1H), 8.84(s, 1H), 8.29(s, 1H), 8.19(s, 1H), 8.03-7.97 9(m, 2H), 7.69(d, 1H, J = 7.6 Hz), 7.57-7.49(m, 3H), 7.40(d, 1H, J = 7.6 Hz), 6.72(dd, 1H, J = 3.2, 1.6 Hz;MS m/z 481.1(M + 1)。
【００９０】
実施例２
１−メチル−１,６−ジヒドロ−１,５,６−トリアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸[３−(３−トリフルオロメチル−ベンゾイルアミノ)−フェニル]−アミド
【化１０】
2009504757.tif 000012
【００９１】
１−メチル−１,６−ジヒドロ−１,５,６−トリアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸エチルエステルの合成：
【化１１】
2009504757.tif 000013
４−クロロ−１−トリイソプロピルシラニル−１Ｈ−ピロロ[２,３−ｂ]ピリジン(７００mg、２.０８mmol)をＤＭＦに溶解する。Ｋ２ＣＯ３(５７３mg、４.１６mmol)、続いてサルコシンエチルエステルヒドロクロライド(３８３.３mg、２.４９mmol)の添加後、反応混合物を６５℃で３６時間撹拌する。反応混合物を次いで冷却し、氷冷水に注ぐ。残渣を濾過により回収し、乾燥させて粗生成物を得て、次いでそれをシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、所望の化合物を得る：1H NMR 400 MHz(DMSO-d6)δ 12.41(s, 1H), 8.68(s, 1H), 8.57(s, 1H), 7.75(d, 1H, J = 3.0 Hz), 6.73(d, 1H, J = 3.1 Hz), 4.32(q, 2H, J = 6.8 Hz), 4.28(s, 3H), 1.35(t, 3H, J = 6.8 Hz);MS m/z 244.1(M + 1)。
【００９２】
１−メチル−１,６−ジヒドロ−１,５,６−トリアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸の合成
【化１２】
2009504757.tif 000014
６Ｈ−１−チア−５,６−ジアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸メチルエステル(１００mg、０.４６４mmol)、ＬｉＯＨ(２５.５mg、１.０７mmol)の混合物をＴＨＦ(４ml)およびＨ２Ｏ(１mL)に溶解する。混合物を６０℃で３時間撹拌する。酢酸での酸性化により褐色固体がもたらされ、それを濾過により回収する。次いでそれを真空で乾燥させ、なんらさらに精製することなく次工程に使用する。
【００９３】
１−メチル−１,６−ジヒドロ−１,５,６−トリアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸[３−(３−トリフルオロメチル−ベンゾイルアミノ)−フェニル]−アミドの合成
【化１３】
2009504757.tif 000015
１−メチル−１,６−ジヒドロ−１,５,６−トリアザ−ａｓ−インダセン−２−カルボン酸(３５mg、０.１６２mmol)をＤＩＥＡ(０.０３０ml、０.１７２mmol)およびＨＡＴＵ(６７.８mg、０.１７８mmol)と２ml  ＤＭＦ中、室温で混合する。Ｎ−(３−アミノ−フェニル)−３−トリフルオロメチル−ベンズアミド(４５.５３mg、０.１６２mmol)を反応混合物に０.５時間後に添加する。室温で２時間撹拌後、反応混合物を濃縮し、Ｐｒｅｐ−ＨＰＬＣで精製して、表題化合物をＴＦＡ塩として得る：1H NMR 400 MHz(DMSO-d6)δ 12.37(s, 1H), 10.56, (s, 2H), 8.87(s, 1H), 8.40(s, 1H), 8.33(s, 1H), 8.29(d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.98(d, 1H, J = 7.6 Hz), 7.84(t, 1H, J = 8.0 Hz), 7.68(s, 1H), 7.57-7.54(m, 3H), 7.37(t, 1H, J = 8.0 Hz), 7.09-7.07(m, 1H), 4.32(s, 3H)Hz;MS m/z 481.1(M + 1)。
【００９４】
適当な出発物質を使用して上記実施例の方法を繰り返すことにより、表Ｉに同定する以下の式Ｉの化合物を得る。
【表１】
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【００９５】
【表２】
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【００９６】
【表３】
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【００９７】
【表４】
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【００９８】
【表５】
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【００９９】
【表６】
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【０１００】
【表７】
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【０１０１】
【表８】
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【０１０２】
アッセイ
本発明の化合物を、ＢＣＲ−Ａｂｌを発現する３２Ｄ細胞(３２Ｄ−ｐ２１０)の細胞増殖を親３２Ｄ細胞と比較して特異的に阻害する能力を測定するためにアッセイする。ＢＣＲ−Ａｂｌ形質転換細胞の増殖を選択的に阻害する化合物を、Ｂｃｒ−ａｂｌの野生型または変異形態のいずれかを発現するＢａ／Ｆ３細胞に対する抗増殖性活性について試験する。加えて、化合物を、Ａｂｌ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、Ａｕｒｏｒａ−Ａ、ＳＧＫ、Ｔｉｅ−２、Ｔｒｋ−Ｂ、ＦＧＦＲ３、ｃ−ｋｉｔ、ｂ−ＲＡＦ、ｃ−ＲＡＦ、ＤＹＲＫ２、Ｆｍｓ、ＦｙｎおよびＰＤＧＦＲαおよびＰＤＧＦＲβキナーゼを阻害する能力についてアッセイする。
【０１０３】
細胞性ＢＣＲ−Ａｂｌ依存性増殖の阻害(ハイスループット法)
使用するマウス細胞系は、ＢＣＲ−Ａｂｌ  ｃＤＮＡ(３２Ｄ−ｐ２１０)で形質転換した３２Ｄ造血前駆細胞系である。これらの細胞をペニシリン５０μg／mL、ストレプトマイシン５０μg／mLおよびＬ−グルタミン２００mM添加ＲＰＭＩ／１０％ウシ胎児血清(ＲＰＭＩ／ＦＣＳ)に維持する。非形質転換３２Ｄ細胞を、ＩＬ３供給源として１５％のＷＥＨＩ馴化培地を添加して、同様に維持する。
【０１０４】
５０μlの３２Ｄまたは３２Ｄ−ｐ２１０細胞懸濁液をGreiner  ３８４ウェルマイクロプレート(黒色)に５０００細胞／ウェルの密度で播く。５０nlの試験化合物(ＤＭＳＯ貯蔵溶液中１mM)を各ウェルに添加する(ＳＴＩ５７１をポジティブコントロールとして包含させる)。細胞を７２時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。１０μlの６０％Alamar Blue溶液(Tek diagnostics)を各ウェルに添加し、細胞をさらに２４時間インキュベートする。蛍光強度(励起５３０nm、放出５８０nm)を、AcquestＴＭシステム(Molecular Devices)を使用して定量する。
【０１０５】
細胞性ＢＣＲ−Ａｂｌ依存性増殖の阻害
３２Ｄ−ｐ２１０細胞を９６ウェルＴＣプレートに１５,０００細胞／ウェルの密度で播く。５０μLの試験化合物の２倍連続希釈(Ｃｍａｘは４０μM)を各ウェルに添加する(ＳＴＩ５７１をポジティブコントロールとして包含させる)。細胞を４８時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした後、１５μLのＭＴＴ(Promega)を各ウェルに添加し、細胞をさらに５時間インキュベートする。５７０nmでの光学密度を分光光度法で測定し、５０％阻害に必要な化合物濃度であるＩＣ５０値を用量応答曲線から決定する。
【０１０６】
細胞周期分布に対する効果
３２Ｄおよび３２Ｄ−ｐ２１０細胞を６ウェルＴＣプレートに５mlの培地中２.５×１０６細胞／ウェルで播き、１または１０μMの試験化合物を添加する(ＳＴＩ５７１をコントロールとして包含させる)。細胞を次いで２４時間または４８時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。２mlの細胞懸濁液をＰＢＳで洗浄し、７０％ＥｔＯＨに１時間固定させ、ＰＢＳ／ＥＤＴＡ／ＲＮａｓｅ  Ａで３０分処理する。ヨウ化プロピジウム(Ｃｆ＝１０μg／ml)を添加し、蛍光強度をFACScaliburＴＭシステム(BD Biosciences)上でのフローサイトメトリーにより定量する。本発明の試験化合物は、３２Ｄ−ｐ２１０細胞に対してアポトーシス効果を示すが、３２Ｄ親細胞にはアポトーシスを誘発しない。
【０１０７】
細胞性ＢＣＲ−Ａｂｌ自己リン酸化に対する効果
ＢＣＲ−Ａｂｌ自己リン酸化を、ｃ−ａｂｌ特異的捕捉抗体および抗ホスホチロシン抗体を使用した捕捉Ｅｌｉｓａで定量する。３２Ｄ−ｐ２１０細胞を９６ウェルＴＣプレートに５０μLの培地中２×１０５細胞／ウェルで播く。５０μLの試験化合物の２倍連続希釈(Ｃｍａｘは１０μM)を各ウェルに添加する(ＳＴＩ５７１をポジティブコントロールとして包含させる)。細胞を９０分、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。細胞を次いで１時間、氷上で、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む１５０μLの溶解緩衝液(５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.４、１５０mMＮａＣｌ、５mM  ＥＤＴＡ、１mM  ＥＧＴＡおよび１％ＮＰ−４０)で処理する。５０μLの細胞溶解物を、予め抗ａｂｌ特異的抗体でコートし、遮断した９６ウェルoptiplateに添加する。プレートを４時間、４℃でインキュベートする。ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０緩衝液で洗浄後、５０μLのアルカリホスファターゼ結合抗ホスホチロシン抗体を添加し、さらに一晩、４℃でインキュベートする。ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０緩衝液で洗浄後、９０μLの発光基質を添加し、発光をAcquestＴＭシステム(Molecular Devices)を使用して定量する。ＢＣＲ−Ａｂｌ発現細胞の増殖を阻害する本発明の試験化合物は、用量依存的方法で細胞性ＢＣＲ−Ａｂｌ自己リン酸化を阻害する。
【０１０８】
Ｂｃｒ−ａｂｌの変異形態を発現する細胞の増殖に対する効果
本発明の化合物は、ＢＣＲ−Ａｂｌの野生型または、ＳＴＩ５７１に対する耐性もしくは減少した感受性を付与する変異形態(Ｇ２５０Ｅ、Ｅ２５５Ｖ、Ｔ３１５Ｉ、Ｆ３１７Ｌ、Ｍ３５１Ｔ)のいずれかを発現するＢａ／Ｆ３細胞に対する、その抗増殖効果について試験する。変異−ＢＣＲ−Ａｂｌ発現細胞および非形質転換細胞に対するこれらの化合物の抗増殖効果を、上記の通り１０、３.３、１.１および０.３７μMで試験した(ＩＬ３欠損培地で)。非形質転換細胞に毒性のない化合物のＩＣ５０値を、上記の通りに得た用量応答曲線から決定した。
【０１０９】
ＦＧＦＲ３(酵素アッセイ)
精製ＦＧＦＲ３(Upstate)でのキナーゼ活性アッセイを、キナーゼ緩衝液(３０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７.５、１５mM  ＭｇＣｌ２、４.５mM  ＭｎＣｌ２、１５μMＮａ３ＶＯ４および５０μg／mL  ＢＳＡ)中の０.２５μg／mLの酵素、および基質(５μg／mL  ビオチン−ポリ−ＥＹ(Ｇｌｕ、Ｔｙｒ)(CIS-US, Inc.)および３μM  ＡＴＰ)を含む、最終容量１０μL中で行う。２種の溶液を製造する：キナーゼ緩衝液中にＦＧＦＲ３酵素を含む５μlの第一の溶液を、最初に３８４形式のProxiPlate(登録商標)(Perkin-Elmer)に分配し、その後ＤＭＳＯに溶解した５０nLの化合物を添加し、次いでキナーゼ緩衝液中に基質(ポリ−ＥＹ)およびＡＴＰを含む５μlの第二の溶液を各ウェルに添加した。反応物を室温で１時間インキュベートし、１０μLのＨＴＲＦ検出混合物(それは、３０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７.５、０.５Ｍ  ＫＦ、５０mM  ＥＴＤＡ、０.２mg／mL  ＢＳＡ、１５μg／mL  ストレプトアビジン−ＸＬ６６５(CIS-US, Inc.)および１５０ng／mL  クリプタート結合抗ホスホチロシン抗体(CIS-US, Inc.)を含む)の添加により、停止させる。ストレプトアビジン−ビオチン相互作用をさせるために１時間、室温でインキュベート後、時間分解蛍光シグナルをAnalyst GT(Molecular Devices Corp.)で読む。ＩＣ５０値を、各化合物の１２濃度(５０μMから０.２８nMまでの１：３希釈)での阻害パーセントの直線回帰分析により計算する。このアッセイにおいて、本発明の化合物は１０nMから２μMの範囲のＩＣ５０を有する。
【０１１０】
ＦＧＦＲ３(細胞性アッセイ)
本発明の化合物を、ＦＧＦＲ３細胞キナーゼ活性に依存する形質転換Ｂａ／Ｆ３−ＴＥＬ−ＦＧＦＲ３細胞の増殖を阻害する能力について試験する。Ｂａ／Ｆ３−ＴＥＬ−ＦＧＦＲ３を、培養培地として１０％ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ  １６４０で、懸濁液中８００,０００細胞／mLまで培養する。細胞を３８４ウェル形式のプレートに５０μL  培養培地中５０００細胞／ウェルで分配する。本発明の化合物をジメチルスルフオキシド(ＤＭＳＯ)に溶解し、希釈する。１２点の１：３連続希釈をＤＭＳＯ中に調製し、典型的に１０mMから０.０５μMの範囲の濃度勾配を作る。細胞を５０nLの希釈した化合物と共に添加し、４８時間、細胞培養インキュベーター中でインキュベートする。増殖している細胞により作られる還元環境をモニターするために使用できるAlamarBlue(登録商標)(TREK Diagnostic Systems)を細胞に、１０％の最終濃度で添加する。さらに４時間、３７℃細胞培養インキュベーター中でのインキュベート後、還元されたAlamarBlue(登録商標)からの蛍光シグナル(励起５３０nm、放出５８０nm)を、Analyst GT(Molecular Devices Corp.)で定量する。ＩＣ５０値を、各化合物の１２濃度での阻害パーセントの直線回帰分析により計算する。
【０１１１】
ＦＬＴ３およびＰＤＧＦＲβ(細胞性アッセイ)
本発明の化合物のＦＬＴ３およびＰＤＧＦＲβの細胞性活性に対する効果を、Ｂａ／Ｆ３−ＴＥＬ−ＦＧＦＲ３の代わりにＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤおよびＢａ／Ｆ３−Ｔｅｌ−ＰＤＧＦＲβを各々使用する以外、ＦＧＦＲ３細胞性活性について上記したのと同じ方法を使用して行う。
【０１１２】
ｂ−Ｒａｆ−酵素アッセイ
本発明の化合物をｂ−Ｒａｆの活性を阻害する能力について試験する。アッセイを黒色壁および透明底の３８４ウェルMaxiSorpプレート(NUNC)で行う。基質、ＩκＢαをＤＰＢＳ(１：７５０)中で希釈し、１５μlを各ウェルに添加する。プレートを４℃で一晩インキュベートし、３回ＴＢＳＴ(２５mM  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８.０、１５０mMＮａＣｌおよび０.０５％Ｔｗｅｅｎ−２０)でＥＭＢＬＡプレート洗浄機を使用して洗浄する。プレートをSuperblock(１５μl／ウェル)で３時間、室温でブロックし、３回ＴＢＳＴで洗浄し、軽打乾燥させる。２０μM  ＡＴＰ(１０μl)含有アッセイ緩衝液、その後１００nlまたは５００nlの化合物を各ウェルに添加する。Ｂ−Ｒａｆをアッセイ緩衝液で希釈し(２５μl中１μl)、１０μlの希釈ｂ−Ｒａｆを各ウェルに添加する(０.４μg／ウェル)。プレートを室温で２.５時間インキュベートする。キナーゼ反応を、プレートを６回ＴＢＳＴで洗浄することにより停止させる。ホスホ−ＩκＢαＳｅｒ３２／３６)抗体をSuperblock(１：１０,０００)で希釈し、１５μlを各ウェルに添加する。プレートを４℃で一晩インキュベートし、６回ＴＢＳＴで洗浄する。ＡＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧをSuperblock(１：１,５００)で希釈し、１５μlを各ウェルに添加する。プレートを室温で１時間インキュベートし、６回ＴＢＳＴで洗浄する。１５μlの蛍光Attophos AP基質(Promega)を各ウェルに添加し、プレートを室温で１５分インキュベートする。プレートを蛍光強度プログラム(励起４５５nm、放出５８０nm)を使用してAcquestまたはAnalyst GTで読む。
【０１１３】
ｂ−Ｒａｆ−細胞性アッセイ
本発明の化合物を、Ａ３７５細胞でＭＥＫのリン酸化を阻害する能力について試験する。Ａ３７５細胞系(ＡＴＣＣ)はヒト黒色腫患者由来であり、それはＢ−Ｒａｆ遺伝子にＶ５９９Ｅ変異を有する。リン酸化ＭＥＫのレベルは、Ｂ−Ｒａｆの変異により上昇する。サブコンフルエントからコンフルエントのＡ３７５細胞を化合物と２時間、３７℃で無血清培地中でインキュベートする。細胞を次いで１回冷ＰＢＳで洗浄し、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００含有溶解緩衝液で溶解させる。遠心分離後、上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、次いでニトロセルロース膜に移す。膜を次いで抗ホスホ−ＭＥＫ抗体(ｓｅｒ２１７／２２１)(細胞シグナル伝達)とウェスタン・ブロット法に付す。リン酸化ＭＥＫの量を、ニトロセルロース膜上のホスホ−ＭＥＫバンドの密度によりモニターする。
【０１１４】
Upstate Kinase ProfilerＴＭ−放射性−酵素フィルター結合アッセイ
本発明の化合物を、キナーゼ・パネルの個々のメンバーを阻害する能力について評価する。化合物を１０μMの最終濃度で、デュプリケートでこの一般的プロトコールに従い試験する。キナーゼ緩衝液組成および基質は、“Upstate Kinase ProfilerＴＭ”パネルに含まれる異なるキナーゼに関して変化することは注意すべきである。キナーゼ緩衝液(２.５μL、１０倍−  必要なときＭｎＣｌ２含有)、活性キナーゼ(０.００１−０.０１単位；２.５μL)、キナーゼ緩衝液中の特異的またはポリ(Ｇｌｕ４−Ｔｙｒ)ペプチド(５−５００μMまたは.０１mg／ml)およびキナーゼ緩衝液(５０μM；５μL)を、氷上でエッペンドルフ中混合する。Ｍｇ／ＡＴＰ混合物(１０μL；６７.５(または３３.７５)mM  ＭｇＣｌ２、４５０(または２２５)μM  ＡＴＰおよび１μCi／μl  [γ−３２Ｐ]−ＡＴＰ(３０００Ci／mmol))を添加し、反応物を約３０℃で約１０分インキュベートする。反応混合物を反応混合物を２cm×２cm  Ｐ８１(ホスホセルロース、正荷電ペプチド基質について)またはWhatman No. 1(ポリ(Ｇｌｕ４−Ｔｙｒ)ペプチド基質について)試験紙切片(square)上にスポットする(２０μL)。アッセイ切片を４回、各５分、０.７５％リン酸で洗浄し、１回アセトンで５分洗浄する。アッセイ切片をシンチレーションバイアルに移し、５mlシンチレーションカクテルを添加し、ペプチド基質への３２Ｐ取り込み(cpm)をBeckmanシンチレーションカウンターで定量する。阻害パーセントを各反応について計算する。
【０１１５】
遊離形または薬学的に許容される塩形の式Ｉの化合物は、例えば、本明細書に記載のインビトロ試験において示される通り、価値ある薬理学的特性を示す。例えば、式Ｉの化合物は、好ましくは野生型ＢＣＲ−ＡｂｌおよびＧ２５０Ｅ、Ｅ２５５Ｖ、Ｔ３１５Ｉ、Ｆ３１７ＬおよびＭ３５１Ｔ  ＢＣＲ−Ａｂｌ変異体に対して１×１０−１０から１×１０−５Ｍ、好ましくは５００nM未満、２５０nM未満、１００nM未満および５０nM未満の範囲のＩＣ５０を示す。式Ｉの化合物は、好ましくは、１０μMの濃度で、好ましくはＡｂｌ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、Ａｕｒｏｒａ−Ａ、ＳＧＫ、Ｔｉｅ−２、Ｔｒｋ−Ｂ、ＦＧＦＲ３、ｃ−ｋｉｔ、ｂ−ＲＡＦ、ｃ−ＲＡＦ、ＤＹＲＫ２、Ｆｍｓ、ＦｙｎおよびＰＤＧＦＲαおよび／またはＰＤＧＦＲβキナーゼに対して５０％を越える、好ましくは約７０％を越える阻害パーセントを示す。
【０１１６】
ここに記載の実施例および態様は説明の目的のためのみであり、それに照らした種々の修飾および変化が、当業者には示唆させ、本明細書および添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に含まれることは理解される。ここに引用する全ての刊行物、特許および特許出願は、全ての目的のために引用により本明細書に包含する。
【国際調査報告】
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