(57)【要約】患者は、代表的にはワクチン接種センターへの異なる診察の間に、粘膜インフルエンザワクチンを受容し、次いで非経口インフルエンザワクチンを受容する。本発明は、患者をインフルエンザウイルス感染に対して免疫感作するための方法を提供し、ここで第１のインフルエンザワクチンが、上記患者に投与され、次いで第２のインフルエンザワクチンが、上記患者に投与され、上記第１のワクチンが、粘膜経路によって投与され、かつ上記第２のワクチンが、非経口経路によって投与される。
2009514840.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者をインフルエンザウイルス感染に対して免疫感作するための方法であって、第１のインフルエンザワクチンが、該患者に投与され、次いで第２のインフルエンザワクチンが、該患者に投与され、ここで該第１のワクチンが、粘膜経路によって投与され、かつ該第２のワクチンが、非経口経路によって投与される、方法。
【請求項２】
前記粘膜用量の投与と前記非経口用量の投与との間の時間が、少なくとも１４日間である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記粘膜用量の投与と前記非経口用量の投与との間の時間が、６ヶ月間以下である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
粘膜経路によって第１のインフルエンザワクチンを以前に受容した患者に、第２のインフルエンザワクチンを投与するための方法であって、該第２のワクチンは、非経口経路によって該患者に投与される、方法。
【請求項５】
前記以前の粘膜インフルエンザワクチンが、前記非経口投与の少なくとも１４日前に受容された、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記以前の粘膜インフルエンザワクチンが、前記非経口投与の前、６ヶ月以内に受容された、請求項４または請求項５に記載の方法。
【請求項７】
（ｉ）粘膜経路による患者への投与のために包装された第１のインフルエンザワクチン；および（ｉｉ）非経口経路による患者への投与のために包装された第２のインフルエンザワクチンを備えるキットであって、該キットはまた、粘膜経路によって該第１のワクチンを投与し、かつ非経口経路によって該第２のワクチンを投与するための指示書を備え得る、キット。
【請求項８】
前記非経口投与経路は、筋肉内注射である、請求項１〜７のいずれかに記載のキットまたは方法。
【請求項９】
前記粘膜投与経路は、鼻腔内である、請求項１〜８のいずれかに記載のキットまたは方法。
【請求項１０】
前記粘膜ワクチンは、アジュバント添加される、請求項１〜９のいずれかに記載のキットまたは方法。
【請求項１１】
前記非経口ワクチンは、アジュバント添加される、請求項１〜１０のいずれかに記載のキットまたは方法。
【請求項１２】
前記粘膜ワクチンおよび非経口ワクチンは、両方ともアジュバント添加される、請求項１〜１１のいずれかに記載のキットまたは方法。
【請求項１３】
前記非経口ワクチンは、アジュバント添加されない、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のキットまたは方法。
【請求項１４】
前記粘膜ワクチンは、細菌ＡＤＰリボシル化毒素の無毒化された形態を用いてアジュバント添加される、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のキットまたは方法。
【請求項１５】
前記粘膜ワクチンは、弱毒生インフルエンザウイルスを含む、請求項１〜１４のいずれかに記載のキットまたは方法。
【請求項１６】
前記粘膜ワクチンは、生ワクチンであるか、または不活化ワクチンである、請求項１〜１５のいずれかに記載のキットまたは方法。
【請求項１７】
前記粘膜ワクチンは、弱毒生インフルエンザウイルスを含む、請求項１〜１６のいずれかに記載のキットまたは方法。
【請求項１８】
前記非経口ワクチンは、不活化ウイルスである、請求項１〜１７のいずれかに記載のキットまたは方法。
【請求項１９】
前記非経口ワクチンは、注射のためのスプリットインフルエンザワクチンである、請求項１〜１８のいずれかに記載のキットまたは方法。
【請求項２０】
前記非経口ワクチンは、注射のための精製された表面抗原インフルエンザワクチンである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のキットまたは方法。
【請求項２１】
前記粘膜ワクチンは、細胞培養物において増殖されたウイルスから調製される、請求項１〜２０のいずれかに記載のキットまたは方法。
【請求項２２】
前記非経口ワクチンは、細胞培養物において増殖されたウイルスから調製される、請求項１〜２１のいずれかに記載のキットまたは方法。
【請求項２３】
前記粘膜ワクチンおよび非経口ワクチンは、両方とも細胞培養物において増殖されたウイルスから調製される、請求項１〜２２のいずれかに記載のキットまたは方法。
【請求項２４】
インフルエンザウイルス感染に対して免疫感作するための複数回用量ワクチンの製造におけるインフルエンザ抗原の使用であって、該複数回用量ワクチンは、処置レジメンによって患者に投与され、該処置レジメンにおいて、第１のインフルエンザワクチンが、該患者に投与され、次いで第２のインフルエンザワクチンが、該患者に投与され、ここで該第１のワクチンは、粘膜経路によって投与され、かつ該第２のワクチンは、非経口経路によって投与される、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中に引用される全ての文書は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、患者に対するインフルエンザワクチンの投与の分野にある。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
現在、一般的使用におけるインフルエンザワクチンは、参考文献１の第１７章および第１８章においてさらに詳細に記載される。それらのワクチンは、生ウイルス（ｌｉｖｅ  ｖｉｒｕｓ）または不活化ウイルスに基づき、そして不活化ワクチンは、全ウイルス（ｗｈｏｌｅ  ｖｉｒｕｓ）、「スプリット」ウイルス（「ｓｐｌｉｔ」ｖｉｒｕｓ）または精製された表面抗原（赤血球凝集素およびノイラミニダーゼを含む）に基づき得る。赤血球凝集素（ＨＡ）は、不活化インフルエンザワクチンにおける主要な免疫原であり、そしてワクチン用量は、ＨＡレベルへの参照によって標準化され、そのワクチンは、代表的に、１株あたり約１５μｇのＨＡを含む。
【０００４】
最新のワクチンは、患者に筋肉内注射によって非経口的に投与される。しかし、ＦＬＵＭＩＳＴＴＭ製品は、粘膜免疫系にアクセス（ａｃｃｅｓｓ）する鼻腔内に投与される弱毒生ワクチンである。この経鼻ワクチンは、最初に０．５ｍＬ用量が投与され、次いで第２の０．５ｍＬ用量が、少なくとも６週間後に投与される投薬スケジュールによって投与される。
【０００５】
したがって、非経口経路および粘膜経路は、それぞれ、インフルエンザワクチンの投与のために、一般的に使用される。
【０００６】
これらの経路の両方によって患者にワクチンを投与することが、提案されている。例えば、特許文献１は、患者が（筋肉内に局所的に）非経口用量を受容し、そして（鼻腔内に局所的に）粘膜用量を受容するインフルエンザワクチン接種のための２用量レジメンを開示する。これらの２つのワクチンは、好ましくは、医師による単回の診察の間に患者に対して投与される。上記２用量レジメンに粘膜用量を含むことは、上記ワクチンによって達成される防御免疫応答を増強し、そして特に、ＩｇＡ抗体応答を増強すると考えられる。非特許文献１は、皮下注射による２用量のアジュバント添加（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）された一価ワクチンを受容し、次いで鼻腔内経路によるアジュバント添加されていないブースター（ｂｏｏｓｔｅｒ）を受容するマウスを用いた３用量レジメンを開示する。
【０００７】
インフルエンザウイルスの自然な感染経路は、上気道および下気道を介するものである。ヒトおよび動物の両方において、上気道は、主に、局所的に産生されたＩｇＡによって防御され、下気道は、主に、血清または局所的に産生されたＩｇＧによって防御される。したがって、ＩｇＡ応答およびＩｇＧ応答の両方を誘導する方法は、これらの２つの応答のうちの１つだけを提供する方法よりも良好な防御を提供する。
【特許文献１】国際公開第０１／２２９９２号パンフレット
【非特許文献１】Ｇｕｙら、Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９８年、第５巻、ｐ．７３２〜７３６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
インフルエンザワクチンの投与のためのさらなる複数回用量レジメンおよび改良された複数回用量レジメンを提供することが、本発明の目的である。特に、ＩｇＡ応答およびＩｇＧ応答が誘発され得るようなレジメンを提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の開示）
本発明に従って、患者は、粘膜インフルエンザワクチンを受容し、次いで非経口インフルエンザワクチンを受容する。上記２つのワクチンは、この順序（すなわち、最初に粘膜ワクチン）で与えられる。上記２つのワクチンは、一般に、実質的に同時に与えられない（すなわち、それらのワクチンは、ワクチン接種センターによる同じ診察の間に投与されない）。むしろ、それらのワクチンは、互いに少なくとも１日の間隔（例えば、数週間の間隔）を空けて与えられる。この方法における投薬の分離は、最良の免疫応答を与えることが見出されている。
【００１０】
したがって、本発明は、患者をインフルエンザウイルス感染に対して免疫感作するための方法を提供し、ここで第１のインフルエンザワクチンが、上記患者に投与され、次いで第２のインフルエンザワクチンが、上記患者に投与され、上記第１のワクチンが、粘膜経路によって投与され、かつ上記第２のワクチンが、非経口経路によって投与される。粘膜に投与されたワクチンおよび非経口的に投与されたワクチンは、通常、抗原的には互いと同一であるが、それらは、抗原的に異なり得る（以下を参照のこと）。上記粘膜に投与されたワクチンおよび上記非経口的に投与されたワクチンは、通常、非抗原性成分に関して異なる（例えば、それらのワクチンは、異なるキャリア、送達系、アジュバントなどを含み得る）。
【００１１】
本発明はまた、インフルエンザウイルス感染に対して免疫感作するための複数回用量ワクチンの製造におけるインフルエンザ抗原の使用を提供し、上記複数回用量ワクチンは、処置レジメンによって患者に投与され、その処置レジメンにおいて、第１のインフルエンザワクチンが、上記患者に投与され、次いで第２のインフルエンザワクチンが、上記患者に投与され、ここで上記第１のワクチンは、粘膜経路によって投与され、かつ上記第２のワクチンは、非経口経路によって投与される。
【００１２】
本発明はまた、粘膜経路によって第１のインフルエンザワクチンを以前に受容した患者に、第２のインフルエンザワクチンを投与するための方法を提供し、上記第２のワクチンは、非経口経路によって上記患者に投与される。
【００１３】
本発明はまた、インフルエンザウイルス感染に対して免疫感作するためのワクチンの製造における、インフルエンザ抗原の使用を提供し、（ｉ）上記ワクチンは、非経口経路による患者への投与のためであり、そして（ｉｉ）上記患者は、粘膜経路によるインフルエンザワクチンを以前に受容した。
【００１４】
最初の粘膜用量とその後の非経口用量の投与との間の時間は、代表的に、少なくともｎ日間であり、ここでｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４２、４９、５６またはそれ以上から選択される。上記時間は、代表的に、６ヶ月以内である。上記用量は、互いから約４週間の間隔を空けて（例えば、０日目とその後の約２８日目において）与えられ得る。
【００１５】
好ましい非経口投与経路は、注射（代表的に、筋肉内注射）である。
【００１６】
好ましい粘膜投与経路は、経口であり、そしてより好ましくは、鼻腔内である。
【００１７】
上記粘膜ワクチンおよび／または上記非経口ワクチンは、アジュバント添加され得る。その代わりとして、それらのワクチンのいずれかまたは両方が、アジュバント添加され得る。両方がアジュバント添加される場合、それらのワクチンは、同じアジュバントを使用し得るか、またはより代表的には、それらのワクチンは、異なるワクチンを使用する。
【００１８】
現在のワクチンにおけるインフルエンザ抗原の形態は、生ウイルスまたは不活化ウイルスのいずれかであり、および不活化ワクチン中の抗原は、全ウイルス、「スプリット」ウイルスまたは精製された表面抗原の形態をとり得る。上記粘膜ワクチンおよび／または上記非経口ワクチンは、異なる形態の抗原を使用し得るが、それらのワクチンは、代表的に、両方とも同じ形態の抗原を使用する。
【００１９】
本発明はまた、（ｉ）粘膜経路による患者への投与のために包装された第１のインフルエンザワクチン；および（ｉｉ）非経口経路による患者への投与のために包装された第２のインフルエンザワクチンを備えるキットを提供する。上記キットはまた、粘膜経路による第１のワクチンおよび非経口経路による第２のワクチンを投与するための指示書を含み得る。
【００２０】
（インフルエンザウイルス抗原）
本発明は、以下の２つの別個のインフルエンザワクチンの使用を包含する：第１の粘膜ワクチンおよび第２の非経口ワクチン。これらの２つのワクチンの各々は、インフルエンザウイルス抗原を含む。各々のワクチン中の抗原は、代表的に、インフルエンザビリオンから調製されるが、その代わりとして、赤血球凝集素などの抗原が、組換え宿主（例えば、プラスミド発現系を使用した酵母、またはバキュロウイルスベクターを使用した昆虫細胞株）において発現され、そして精製された形態で使用され得る［３、４］。しかし、一般に、抗原は、ビリオン由来である。
【００２１】
上記抗原は、生ウイルスの形態、または不活化ウイルスの形態をとり得る。ウイルスを不活化するための化学的手段としては、以下の因子の１種以上の有効量による処理が挙げられる：洗浄剤、ホルムアルデヒド、ホルマリン、β−プロピオラクトン、またはＵＶ光。不活化のためのさらなる化学的手段としては、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）または任意のその組合せによる処理が挙げられる。ウイルス不活化の他の方法は、当該分野において公知である（例えば、第二級エチルアミン、アセチルエチレンイミン、またはγ線照射）。ＩＮＦＬＥＸＡＬＴＭ製品は、全ビリオン不活化ワクチンである。
【００２２】
不活化ウイルスが使用される場合、上記ワクチンは、全ウイルス、スプリットウイルス、または精製された表面抗原（赤血球凝集素を含み、そして通常は、ノイラミニダーゼをまた含む）を含み得る。
【００２３】
ビリオンは、種々の方法によってウイルス含有流体から回収され得る。例えば、精製プロセスは、ビリオンを破壊するための洗浄剤を含む直線ショ糖勾配溶液を使用したゾーン遠心分離を含み得る。次いで、抗原は、必要に応じた希釈後に、透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって精製され得る。
【００２４】
スプリットビリオン（ｓｐｌｉｔ  ｖｉｒｉｏｎ）は、ビリオンを洗浄剤（例えば、エチルエーテル、ポリソルベート８０、デオキシコール酸塩、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ１０１、臭化セチルトリメチルアンモニウムなど）により処理（「Ｔｗｅｅｎ−エーテル」分解（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ）プロセスを含む）してサブビリオン調製物を産生することによって得られる。インフルエンザウイルスを分解する方法は、当該分野において周知である（例えば、参考文献５〜１０などを参照のこと）。ウイルスの分解は、代表的に、破壊する濃度の分解剤（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）によって全ウイルスを破壊または断片化する（感染性であっても非感染性であってもよい）ことによって行われる。上記破壊は、ウイルスタンパク質の完全または部分的な可溶化をもたらし、ウイルスの完全性を変化させる。好ましい分解剤は、非イオン性界面活性剤およびイオン性（例えば、カチオン性）界面活性剤（例えば、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖（ａｃｙｌ  ｓｕｇａｒ）、スルホベタイン、ベタイン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド（Ｇｌｕｃａｍｉｄｅ）、Ｈｅｃａｍｅｇ、アルキルフェノキシポリエトキシエタノール、第四級アンモニウム化合物、サルコシル、ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、Ｃｅｔａｖｌｏｎ、ミリストイルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）、リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、およびＤＯＴ−ＭＡ、オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはＴｒｉｔｏｎ  Ｎ１０１などのＴｒｉｔｏｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステルなどである。１つの有用な分解手順は、デオキシコール酸ナトリウムおよびホルムアルデヒドの継続的な効果を使用し、そして分解は、（例えば、ショ糖密度勾配溶液における）最初のビリオン精製の間に行われ得る。スプリットビリオンは、通常、リン酸ナトリウムによって緩衝化された等張塩化ナトリウム溶液に再懸濁され得る。ＢＥＧＲＩＶＡＣＴＭ製品、ＦＬＵＡＲＩＸＴＭ製品、ＦＬＵＺＯＮＥＴＭ製品およびＦＬＵＳＨＩＥＬＤＴＭ製品は、スプリットワクチン（ｓｐｌｉｔ  ｖａｃｃｉｎｅ）である。
【００２５】
精製された表面抗原ワクチンは、インフルエンザ表面抗原の赤血球凝集素、および代表的には、ノイラミニダーゼをまた含む。精製された形態でこれらのタンパク質を調製するためのプロセスは、当該分野において周知である。ＦＬＵＶＩＲＩＮＴＭ製品、ＡＧＲＩＰＰＡＬＴＭ製品およびＩＮＦＬＵＶＡＣＴＭ製品は、サブユニットワクチンである。
【００２６】
インフルエンザ抗原はまた、ＩＮＦＬＥＸＡＬ  ＶＴＭ製品およびＩＮＶＡＶＡＣＴＭ製品のように、ビロソーム［１１］（核酸を含まないウイルス様リポソーム粒子）の形態で提供され得る。ウイルス様粒子（ＶＬＰ）もまた、使用され得る。
【００２７】
上記インフルエンザウイルスは、弱毒化され得る。上記インフルエンザウイルスは、温度感受性であり得る。上記インフルエンザウイルスは、低温適応性であり得る。これらの３つの可能性は、特に、生ウイルスに適合する。
【００２８】
ワクチンに使用するためのインフルエンザウイルス株は、季節により変化する。最近の大流行間期において、ワクチンは、代表的に、２種のインフルエンザＡ型株（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）および１種のインフルエンザＢ型株を含み、そして三価ワクチンが、代表的である。本発明はまた、（特に、インフルエンザＡ型ウイルスの）Ｈ２サブタイプ株、Ｈ５サブタイプ株、Ｈ７サブタイプ株またはＨ９サブタイプ株などの流行株（すなわちワクチンのレシピエントおよび一般的なヒト集団が免疫学的にナイーブである株）に由来するウイルスを使用し得、そして流行株に対するインフルエンザワクチンは、一価であっても、流行株によって補充された通常の三価ワクチンに基づいてもよい。しかし、季節および上記ワクチンに含まれる抗原の性質に依存して、本発明は、ＨＡサブタイプであるＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５またはＨ１６の１種以上を防御し得る。本発明は、インフルエンザＡ型ウイルスのＮＡサブタイプであるＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８またはＮ９の１種以上を防御し得る。
【００２９】
上記組成物に通常含まれ得る他の株は、抗ウイルス療法に対して抵抗性（例えば、オセルタミビル［１２］および／またはザナミビルに対して抵抗性）の株であり得、その株は、抵抗性の流行株を含む［１３］。
【００３０】
本発明のアジュバント添加組成物は、流行株に対して免疫感作するために特に有用である。流行の発生を引き起こす可能性をインフルエンザ株に与えるインフルエンザ株の特性は、以下である：（ａ）そのインフルエンザ株が、最近広まっているヒト株における赤血球凝集素と比較して新規の赤血球凝集素（すなわち、１０年以上にわたってヒト集団において顕性でない赤血球凝集素（例えばＨ２））を含むか、またはヒト集団において以前に全く見出されていない（例えば、一般には鳥類集団においてのみ見出されているＨ５、Ｈ６またはＨ９）ことにより、ヒト集団がその株の赤血球凝集素に対して免疫学的にナイーブであること；（ｂ）そのインフルエンザ株が、ヒト集団において水平伝播し得ること；および（ｃ）そのインフルエンザ株が、ヒトに対して流行性であること。Ｈ５型赤血球凝集素を有するウイルスは、流行性インフルエンザ（例えば、Ｈ５Ｎ１株）に対する免疫感作のために好ましい。他の可能性のある株としては、Ｈ５Ｎ３、Ｈ９Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ１およびＨ７Ｎ７、および任意の他の顕在する潜在的な流行株が挙げられる。Ｈ５サブタイプにおいて、ウイルスは、ＨＡクレード１、ＨＡクレード１’、ＨＡクレード２またはＨＡクレード３に分類され得［１４］、クレード１およびクレード３は、特に、関連性がある。
【００３１】
本発明の組成物は、インフルエンザＡ型ウイルスおよび／またはインフルエンザＢ型ウイルスを含む１種以上（例えば１種、２種、３種、４種またはそれ以上）のインフルエンザウイルス株由来の抗原を含み得る。ワクチンが、１種より多い株のインフルエンザを含む場合、それらの異なる株は、代表的に、別個に増殖され、かつそれらのウイルスが回収された後に混合され、そして抗原が、調製される。したがって、本発明のプロセスは、１種より多いインフルエンザ株由来の抗原を混合する工程を含み得る。２種のインフルエンザＡ型ウイルス株および１種のインフルエンザＢ型ウイルス株由来の抗原を含む三価ワクチンが、好ましいが、一価ワクチンもまた、（例えば、流行株に対して）有用である。本発明に従って使用される２種のワクチンについて、それらのワクチンは少なくとも１種のウイルス株を共通して有することが、好ましく、そして両方のワクチン中の株は同一であることが、より好ましい。
【００３２】
上記インフルエンザウイルスは、リアソータント（ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ）株であり得、そして逆方向遺伝学技術によって得ることができた。逆方向遺伝学技術［例えば、１５〜１９］は、プラスミドを使用してインビトロで調製される所望のゲノムセグメントを有するインフルエンザウイルスを可能にする。代表的に、それは、（ａ）例えば、ｐｏｌＩプロモーターにより、所望のウイルスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を発現すること、および（ｂ）例えば、ｐｏｌＩＩプロモーターにより、ウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ分子を発現することを含むことで、細胞における両方の型のＤＮＡの発現が、完全なインタクト感染性ビリオンの構築を生じる。上記ＤＮＡは、好ましくは、全ての上記ウイルスＲＮＡおよびウイルスタンパク質の全てを提供するが、そのＲＮＡおよびタンパク質のいくつかを提供するためにヘルパーウイルスを使用することもまた、可能である。各ウイルスＲＮＡを産生するために別個のプラスミドを使用するプラスミドベースの方法が、好ましく［２０〜２２］、そしてこれらの方法はまた、上記ウイルスタンパク質の全てまたはいくつか（例えば、ＰＢ１タンパク質、ＰＢ２タンパク質、ＰＡタンパク質およびＮＰタンパク質だけ）を発現するためのプラスミドの使用を包含し、１２種のプラスミドが、いくつかの方法において使用される。
【００３３】
必要とされるプラスミドの数を減少させるために、最近のアプローチ［２３］は、（ウイルスＲＮＡ合成のための）同じプラスミド上の複数のＲＮＡポリメラーゼＩ転写カセット（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種または８種全てのインフルエンザＡ型ｖＲＮＡセグメントをコードする配列）と、別のプラスミド上のＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを有する複数のタンパク質コード領域（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種または８種全てのインフルエンザＡ型ｍＲＮＡ転写物をコードする配列）を合わせる。参考文献２３の方法の好ましい局面は、以下を含む：（ａ）単一プラスミド上のＰＢ１  ｍＲＮＡコード領域、ＰＢ２  ｍＲＮＡコード領域およびＰＡ  ｍＲＮＡコード領域；および（ｂ）単一プラスミド上の全８種のｖＲＮＡコードセグメント。１つのプラスミド上にＮＡセグメントおよびＨＡセグメントを含み、そして別のプラスミド上に６種の他のセグメントを含むこともまた、問題を容易にし得る。
【００３４】
上記ウイルスＲＮＡセグメントをコードするためにｐｏｌＩプロモーターを使用する代わりに、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターを使用することが、可能である［２４］。例えば、ＳＰ６ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼまたはＴ７ポリメラーゼのためのプロモーターが、慣用的に使用され得る。ｐｏｌＩプロモーターの種特異性に起因して、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターは、多くの細胞型（例えばＭＤＣＫ）に関してより慣用的であり得るが、細胞はまた、外因性ポリメラーゼ酵素をコードするプラスミドによってトランスフェクトされる必要がある。
【００３５】
他の技術において、単一の鋳型に由来して上記ウイルスＲＮＡおよび発現可能なｍＲＮＡを同時にコードするために二重のｐｏｌＩプロモーターおよびｐｏｌＩＩプロモーターを使用することが、可能である［２５、２６］。
【００３６】
したがって、インフルエンザＡ型ウイルスは、特に、そのウイルスが卵において増殖される場合、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルス由来の１種以上のＲＮＡセグメント（代表的に、６セグメントは、Ａ／ＰＲ／８／３４に由来し、上記ＨＡセグメントおよびＮセグメントは、ワクチン株に由来する、すなわち、６：２リアソータント）を含み得る。それはまた、ワクチン調製物のためのリアソータントウイルスを産生するために、Ａ／ＷＳＮ／３３ウイルス由来の１種以上のＲＮＡセグメント、または有用な任意の他のウイルス株の１種以上のＲＮＡセグメントを含み得る。代表的に、上記株のゲノムは、通常、哺乳動物（例えば、ヒト）インフルエンザウイルスに由来する少なくとも１種のＲＮＡセグメントを含むので、本発明は、ヒト同士の伝染が可能である株から防御する。それは、鳥インフルエンザウイルスに由来するＮＳセグメントを含み得る。
【００３７】
上記抗原の供給源として使用されるウイルスは、卵または細胞培養物のいずれかにおいて増殖され得る。インフルエンザウイルス増殖についての現在の標準的な方法は、有胚の特定病原体除去（ＳＰＦ）鶏卵を使用し、そのウイルスは、その卵の内容物（尿膜腔液）から精製される。しかし、さらに最近、ウイルスは、動物細胞培養物において増殖され、そして速さおよび患者のアレルギーの理由に起因して、この増殖方法が、好ましい。卵ベースのウイルス増殖が使用される場合、１種以上のアミノ酸がウイルスと一緒に卵の尿膜の流体中に導入され得る［１０］。
【００３８】
細胞培養が使用される場合、ウイルス増殖培養基は、代表的に、哺乳動物起源の細胞株である。適切な哺乳動物細胞の起源としては、ハムスター細胞、ウシ細胞、霊長類細胞（ヒト細胞およびサル細胞を含む）およびイヌ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。腎細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞などのような種々の細胞型が、使用され得る。適切なハムスター細胞の例は、ＢＨＫ２１またはＨＫＣＣの名前を有する細胞株である。適切なサル細胞は、例えば、アフリカミドリザル細胞（例えば、Ｖｅｒｏ細胞株のような腎細胞）である。適切なイヌ細胞は、例えば、ＭＤＣＫ細胞株のような腎細胞株である。したがって、適切な細胞株としては、ＭＤＣＫ；ＣＨＯ；２９３Ｔ；ＢＨＫ；Ｖｅｒｏ；ＭＲＣ−５；ＰＥＲ．Ｃ６；ＷＩ−３８；などが挙げられるが、これらに限定されない。インフルエンザウイルスを増殖させるために好ましい哺乳動物細胞株としては、以下が挙げられる：Ｍａｄｉｎ  Ｄａｒｂｙイヌ腎臓に由来するＭＤＣＫ細胞［２７〜３０］；アフリカミドリザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｅｔｈｉｏｐｓ）腎臓に由来するＶｅｒｏ細胞［３１〜３３］；またはヒト胚性網膜芽細胞に由来するＰＥＲ．Ｃ６細胞［３４］。これらの細胞株は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ）コレクション［３５］、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ［３６］、またはＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から広範に入手可能である。例えば、ＡＴＣＣは、カタログ番号ＣＣＬ−８１、ＣＣＬ−８１．２、ＣＲＬ−１５８６およびＣＲＬ−１５８７の種々の異なるＶｅｒｏ細胞を提供し、そしてＡＴＣＣは、カタログ番号ＣＣＬ−３４のＭＤＣＫ細胞を提供する。ＰＥＲ．Ｃ６は、寄託番号９６０２２９４０においてＥＣＡＣＣから入手可能である。哺乳動物細胞株のあまり好ましくない代替物として、ウイルスは、鳥類細胞株［例えば、参考文献３７〜３９］（鳥類胚性幹細胞［３７、４０］、およびアヒル（例えば、アヒル網膜）または雌鶏に由来する細胞株を含む）において増殖され得る。適切な鳥類胚性幹細胞としては、ニワトリ胚性幹細胞、ＥＢ４５、ＥＢ１４、およびＥＢ１４−０７４に由来するＥＢｘ細胞株［４１］が挙げられる。ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）などもまた、使用され得る。
【００３９】
インフルエンザウイルスを増殖させるために最も好ましい細胞株は、ＭＤＣＫ細胞株である。元のＭＤＣＫ細胞株は、ＣＣＬ−３４としてＡＴＣＣから入手可能であるが、この細胞株の派生物もまた、使用され得る。例えば、参考文献２７は、懸濁培養物における増殖に適合したＭＤＣＫ細胞株（ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９として寄託された「ＭＤＣＫ  ３３０１６」）を開示する。同様に、参考文献４２は、無血清培養の懸濁物において増殖するＭＤＣＫ由来細胞株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４４９として寄託された「Ｂ−７０２」）を開示する。参考文献４３は、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞（「ＭＤＣＫ−Ｓ」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５００）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０１」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０１）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０２」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０２）および「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０３」（ＰＴＡ−６５０３）を含む）を開示する。参考文献４４は、感染に対して高い感受性を有するＭＤＣＫ細胞株（「ＭＤＣＫ．５Ｆ１」細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２０４２）を含む）を開示する。任意のこれらのＭＤＣＫ細胞株が、使用され得る。
【００４０】
ウイルスが哺乳動物細胞株において増殖された場合、上記組成物は、有益に、卵タンパク質（例えばオボアルブミンおよびオボムコイド）およびニワトリＤＮＡを含まず、それによってアレルゲン性を減少させる。
【００４１】
ウイルスが細胞株において増殖された場合、増殖のための培養物、およびまた、培養を開始するために使用されるウイルス接種物は、好ましくは、単純ヘルペスウイルス、ＲＳウイルス、パラインフルエンザウイルス３型、ＳＡＲＳコロナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、ビルナウイルス、サーコウイルス、および／またはパルボウイルスを含まない［４５］（すなわち、それらの培養物および接種物は、これらのウイルスについて試験され、そしてこれらのウイルスによる汚染についてネガティブな結果を得る）。単純ヘルペスウイルスが無いことは、特に好ましい。
【００４２】
ウイルスが細胞株において増殖された場合、上記組成物は、好ましくは、１用量あたり１０ｎｇ未満（好ましくは、１ｎｇ未満、およびより好ましくは、１００ｐｇ未満）の残留宿主細胞ＤＮＡを含むが、微量の宿主細胞ＤＮＡが、存在し得る。一般に、上記宿主細胞ＤＮＡ（それは、本発明の組成物から取り除くことが望ましい）は、１００ｂｐよりも長いＤＮＡである。
【００４３】
残留宿主細胞ＤＮＡの測定は、現在、生物製剤についての慣用的な管理要件（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ）であり、そして当業者の通常の能力の範囲内である。ＤＮＡを測定するために使用されるアッセイは、代表的に、確認されたアッセイである［４６、４７］。確認されたアッセイの性能の特徴は、数学的項目および定量可能な項目において記載され得、そしてその考えられる誤差の供給源は、同定されている。上記アッセイは、一般に、正確度、精度、特異性などの特徴について試験された。一旦アッセイが、（例えば、宿主細胞ＤＮＡの既知の標準量に対して）較正され、そして試験された場合、定量的ＤＮＡ測定は、慣用的に行われ得る。ＤＮＡ定量についての以下の３つの主要な技術が、使用され得る：サザンブロットまたはスロットブロットなどのハイブリダイゼーション法［４８］；ＴｈｒｅｓｈｏｌｄＴＭ  Ｓｙｓｔｅｍなどのイムノアッセイ法［４９］；および定量的ＰＣＲ［５０］。これらの方法は全て、当業者によく知られているが、各方法の正確な特徴は、目的とする宿主細胞に依存し得る（例えば、ハイブリダイゼーションのためのプローブの選択、増幅のためのプライマーおよび／またはプローブの選択など）。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ製のＴｈｒｅｓｈｏｌｄＴＭシステムは、ピコグラムレベルの全ＤＮＡについての定量的アッセイであり、そして生物製剤中の混入したＤＮＡのレベルをモニタリングするために使用されている［４９］。代表的なアッセイは、ビオチン化ｓｓＤＮＡ結合タンパク質と、ウレアーゼ結合体化抗ｓｓＤＮＡ抗体と、ＤＮＡとの間における反応複合体の配列非特異的形成を包含する。全てのアッセイ成分は、上記製造業者から入手可能である完全なＴｏｔａｌ  ＤＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔに含まれる。種々の商業的な製造業者は、残留宿主細胞ＤＮＡを検出するための定量的ＰＣＲアッセイを提供する（例えば、ＡｐｐＴｅｃＴＭ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅＴＭ、Ａｌｔｈｅａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓなど）。ヒトウイルスワクチンの宿主細胞ＤＮＡの混入を測定することについての化学発光ハイブリダイゼーションアッセイと全ＤＮＡ  ＴｈｒｅｓｈｏｌｄＴＭシステムとの比較は、参考文献５１に見出され得る。
【００４４】
混入したＤＮＡは、標準的な精製手順（例えば、クロマトグラフィーなど）を使用して、ワクチン調製の間に除去され得る。残留宿主細胞ＤＮＡの除去は、例えば、ＤＮａｓｅを使用することによるヌクレアーゼ処理によって増強され得る。宿主細胞ＤＮＡの混入を減少させるために好都合な方法は、参考文献５２および５３に開示され、その方法は、最初に、ウイルス増殖の間に使用され得るＤＮａｓｅ（例えば、ベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ））を使用し、次いで、ビリオンの破壊の間に使用され得るカチオン性洗浄剤（例えばＣＴＡＢ）を使用する、２工程の処理を含む。アルキル化剤（例えば、β−プロピオラクトン）による処理がまた、宿主細胞ＤＮＡを除去するために使用され得、そしてまた、有益に、ビリオンを不活化するために使用され得る［５４］。
【００４５】
０．２５ｍｌ容量あたり＜１０ｎｇ（例えば＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンであるような、１５μｇの赤血球凝集素あたり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンが、好ましい。０．５ｍｌ容量あたり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンであるような、５０μｇの赤血球凝集素あたり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンが、より好ましい。
【００４６】
任意の残留宿主細胞ＤＮＡの平均の長さは５００ｂｐ未満（例えば、４００ｂｐ未満、３００ｂｐ未満、２００ｂｐ未満、１００ｂｐ未満など）であることが、好ましい。
【００４７】
細胞株（例えば、ＭＤＣＫ細胞）における増殖について、ウイルスは、懸濁物における細胞［２７、５５、５６］または付着培養（ａｄｈｅｒｅｎｔ  ｃｕｌｔｕｒｅ）中の細胞において増殖され得る。懸濁培養のための１つの適切なＭＤＣＫ細胞株は、ＭＤＣＫ  ３３０１６（ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９として寄託された）である。代替物として、マイクロキャリア培養（ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ  ｃｕｌｔｕｒｅ）が、使用され得る。
【００４８】
インフルエンザウイルス複製を補助する細胞株は、好ましくは、無血清培地および／またはタンパク質を含まない培地において増殖される。培地は、ヒト起源または動物起源の血清に由来する添加物が存在しない本発明の文脈において、無血清培地と称される。タンパク質を含まないことは、上記細胞の増殖がタンパク質、成長因子、他のタンパク質添加物および非血清タンパク質の排除して生じる培養を意味すると理解されるが、ウイルス増殖に必要であり得るトリプシンまたは他のプロテアーゼなどのタンパク質を必要に応じて含み得る。そのような培養物において増殖する細胞は、細胞自体のタンパク質をもちろん含む。
【００４９】
インフルエンザウイルス複製を補助する細胞株は、好ましくは、例えば、ウイルス複製の間に、３７℃未満（例えば、３０〜３６℃、または約３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃）で増殖される［５７］。
【００５０】
培養された細胞においてウイルスを増殖させるための方法は、一般に、その培養された細胞に培養されるべき株を接種する工程、ウイルス増殖（例えば、ウイルス力価または抗原発現によって決定される）のために所望の期間（例えば、接種の２４時間後と１６８時間後との間）にわたって、感染された細胞を培養する工程、および増殖されたウイルスを回収する工程を包含する。上記培養された細胞は、１：５００〜１：１、好ましくは、１：１００〜１：５、より好ましくは、１：５０〜１：１０の細胞比まで、ウイルス（ＰＦＵまたはＴＣＩＤ５０によって測定される）を接種される。上記ウイルスは、上記細胞の懸濁物に添加されるか、または上記細胞の単一層に適用され、そしてそのウイルスは、２５℃〜４０℃（好ましくは、２８℃〜３７℃）にて、少なくとも６０分間（しかし通常は、３００分未満（好ましくは、９０分間と２４０分間との間））にわたってその細胞上に吸着される。上記感染された細胞の培養物（例えば、単一層）は、回収される培養上清のウイルス含量を増大させるために、凍結解凍または酵素作用のいずれかによって除去され得る。次いで、上記回収された流体は、凍結されて不活化または保存のいずれかが行われる。培養された細胞は、約０．０００１〜１０、好ましくは、０．００２〜５、より好ましくは、０．００１〜２の感染多重度（「ｍ．ｏ．ｉ．」）にて感染され得る。よりさらに好ましくは、上記細胞は、約０．０１のｍ．ｏ．ｉにて感染される。感染された細胞は、感染後３０時間〜６０時間で回収され得る。好ましくは、上記細胞は、感染後３４時間〜４８時間で回収される。よりさらに好ましくは、上記細胞は、感染後３８時間〜４０時間で回収される。プロテアーゼ（代表的に、トリプシン）は、一般に、ウイルスの放出を可能にするために細胞培養の間に添加され、そしてそのプロテアーゼは、その培養の間の任意の適切な段階において添加され得る。
【００５１】
赤血球凝集素（ＨＡ）は、不活化インフルエンザワクチン中の主要な免疫原であり、そしてワクチン用量は、代表的に、一次元放射状免疫拡散（ＳＲＩＤ）アッセイによって測定されるようなＨＡレベルを参照することによって標準化される。ワクチンは、代表的に、１株あたり約１５μｇのＨＡを含むが、より低い用量がまた、例えば、小児のためかまたは流行性の状況において使用される。１／２（すなわち、１株あたり７．５μｇのＨＡ）、１／４および１／８のような分割量が、より高い用量（例えば、３×用量または９×用量［６０、６１］）を有する場合に使用されている［５８、５９］。したがって、ワクチンは、１つのインフルエンザ株あたり０．１μｇと１５０μｇとの間のＨＡ、好ましくは、０．１μｇと５０μｇとの間（例えば、０．１μｇ〜２０μｇ、０．１μｇ〜１５μｇ、０．１μｇ〜１０μｇ、０．１μｇ〜７．５μｇ、０．５μｇ〜５μｇなど）のＨＡを含み得る。特定の用量は、例えば、１株あたり約４５、約３０、約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約１．９、約１．５などを含む。これらのより低い用量は、本発明のようにアジュバントがワクチン中に存在する場合、最も有用である。本発明のワクチン、キットおよび方法の成分（例えば、それらの容量および濃度）は、最終的な産物においてこれらの抗原用量を提供するために選択され得る。
【００５２】
生ワクチンについて、投薬量は、ＨＡ含量よりもむしろ５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）によって測定され、そして１株あたり１０６と１０８との間（好ましくは、１０６．５〜１０７．５）のＴＣＩＤ５０が、代表的である。
【００５３】
本発明で使用されるＨＡは、ウイルスにおいて見出されるような天然のＨＡであっても、改変されていてもよい。例えば、ウイルスを鳥類種において非常に病原性にする決定因子（例えば、ＨＡ１とＨＡ２との切断部位周辺の超塩基性領域（ｈｙｐｅｒ−ｂａｓｉｃ  ｒｅｇｉｏｎ））を除去するためにＨＡを改変することが、公知である。なぜならば、これらの決定因子は、そうでなければウイルスが卵において増殖されることを妨げ得るからである。
【００５４】
本発明の組成物は、特に、スプリットワクチンまたは表面抗原ワクチンのために、洗浄剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（「Ｔｗｅｅｎｓ」として公知である）、オクトキシノール（例えば、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（「ＣＴＡＢ」）、またはデオキシコール酸ナトリウム）を含み得る。上記洗浄剤は、微量でのみ存在し得る。したがって、上記ワクチンは、各々１ｍｇ／ｍｌ未満のオクトキシノール−１０、α−コハク酸水素トコフェロールおよびポリソルベート８０を含み得る。残りの他の微量成分は、抗生物質（例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンＢ）であり得る。
【００５５】
不活化されている非全細胞ワクチン（例えば、ウイルス成分ワクチンまたは精製された表面抗原ワクチン）は、この抗原内に位置するさらなるＴ細胞エピトープからの利益を受けるために、マトリックスタンパク質を含み得る。したがって、赤血球凝集素およびノイラミニダーゼを含む非全細胞ワクチン（特に、スプリットワクチン）は、Ｍ１および／またはＭ２マトリックスタンパク質をさらに含み得る。マトリックスタンパク質が存在する場合、検出可能なレベルのＭ１マトリックスタンパク質を含むことが、好ましい。核タンパク質もまた、存在し得る。
【００５６】
（薬学的組成物）
本発明で使用されるワクチンは、薬学的に受容可能である。それらのワクチンは、抗原、およびアジュバントに加えて、成分を含み得る（例えば、それらのワクチンは、代表的に、１つ以上の薬学的キャリアおよび／または賦形剤を含有する）。そのような成分の徹底的な考察は、参考文献６２において入手可能である。粘膜ワクチンにおいて使用されるキャリア／賦形剤は、非経口ワクチンにおいて使用されるものと同じでも異なっていてもよい。
【００５７】
組成物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールなどの保存剤を含み得る。しかし、上記ワクチンは実質的に水銀物質を含まない（すなわち、５μｇ／ｍｌ未満）（例えば、チオメルサールを含まない）べき［９、６３］であることが、好ましい。水銀を含まないワクチンが、より好ましい。
【００５８】
特に、注射可能なワクチンにおいて張度を制御するために、生理的塩（例えば、ナトリウム塩）を含有することが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、その塩化ナトリウムは、１ｍｇ／ｍｌと２０ｍｇ／ｍｌとの間で存在し得る。存在し得る他の塩としては、塩化カリウム、二水素リン酸カリウム、無水二ナトリウムリン酸塩、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが挙げられる。
【００５９】
組成物は、一般に２００ｍＯｓｍ／ｋｇと４００ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、好ましくは２４０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間の浸透圧モル濃度を有し、より好ましくは２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内となる。浸透圧モル濃度は、ワクチン接種により引き起こされる痛みに対して影響を有しないことが以前に報告されている［６４］が、この範囲に浸透圧モル濃度を維持することが、やはり好ましい。
【００６０】
組成物は、１つ以上の緩衝剤を含有し得る。代表的な緩衝剤としては、以下が挙げられる：リン酸緩衝剤；Ｔｒｉｓ緩衝剤；ホウ酸緩衝剤；コハク酸緩衝剤；ヒスチジン緩衝剤；またはクエン酸緩衝剤。緩衝剤は、代表的に５〜２０ｍＭの範囲で含有される。
【００６１】
組成物のｐＨは、一般に、５．０と８．１との間、より代表的には６．０と８．０との間、例えば、６．５と７．５との間、または７．０と７．８との間である。したがって、本発明の方法は、包装前にバルクワクチンのｐＨを調整する工程を包含し得る。
【００６２】
上記組成物は、好ましくは、無菌である。上記組成物は、好ましくは、非発熱性である（例えば、１用量あたり＜１ＥＵ（エンドトキシン単位、標準的な測定単位）、そして好ましくは１用量あたり＜０．１ＥＵを含む）。上記組成物は、好ましくは、グルテンを含まない。
【００６３】
上記組成物は、単回免疫感作のための物質を含んでも、複数回免疫感作（すなわち、「複数回用量」キット）のための物質を含んでもよい。保存剤を含むことが、複数回用量の準備において好ましい。複数回用量組成物中に保存剤を含むことの代わりとして（またはそれに加えて）、その組成物は、物質を除去するための無菌のアダプターを有する容器中に含まれ得る。
【００６４】
インフルエンザワクチンは、代表的に、約０．５ｍｌの投薬容量で投与されるが、半用量（すなわち、約０．２５ｍｌ）が、小児に投与され得る。鼻腔内投与について、この総投薬容量は、外鼻孔の間で分割され得る（例えば、各外鼻孔において１／２）。
【００６５】
（組成物またはキット成分の包装）
本発明の組成物（またはキット成分）に適した容器としては、バイアル、注射器（例えば、使い捨て可能な注射器）、点鼻スプレーなどが挙げられる。これらの容器は、無菌であるべきである。
【００６６】
組成物／成分が、バイアル中におかれる場合、そのバイアルは、好ましくは、ガラス材料またはプラスチック材料から作製される。上記バイアルは、好ましくは、上記組成物がそのバイアルに添加される前に滅菌される。ラテックス感受性患者に関する懸案事項を回避するために、バイアルは、好ましくは、ラテックスを含まないストッパーによって密封され、そして全ての包装用物質中にラテックスが存在しないことが、好ましい。上記バイアルは、単回用量のワクチンを含み得るか、またはそのバイアルは、１つよりも多い用量（例えば１０用量）を含み得る（「複数回用量」バイアル）。好ましいバイアルは、無色のガラスから作製される。
【００６７】
バイアルは、予め充填された注射器がそのキャップ中に挿入され得るように適合したキャップ（例えば、Ｌｕｅｒロック）を有し得、その注射器の内容物は、（例えば、その中の凍結乾燥された物質を再構成するために）そのバイアル中に排出され得、そしてそのバイアルの内容物は、その注射器中に戻され得る。上記バイアルから上記注射器を取り外した後、次いで針が、接続され得、そして組成物が、患者に投与され得る。上記キャップが、好ましくは、シールまたはカバーの内側に配置されて、そのシールまたはカバーは、そのキャップが接触され得る前に取り外される必要がある。バイアルは、特に、複数回用量バイアルに関して、その内容物の無菌的な取り出しを可能にするキャップを有し得る。
【００６８】
組成物／成分が、注射器中に包装される場合、その注射器は、それに接続された針を有さない可能性があるが、別個の針が、組み立ておよび使用のために注射器とともに提供され得る。安全針が、好ましい。１インチ２３ゲージの針、１インチ２５ゲージの針および５／８インチ２５ゲージの針が、代表的である。注射器には、その上に内容物のロット番号、インフルエンザの時期および使用期限日がプリントされ得る剥ぎ取りラベルが提供され得、記録維持を容易にする。上記注射器中のプランジャーは、好ましくは、ストッパーを有し、プランジャーが吸引の間に偶発的に外れることを防ぐ。上記注射器は、ラテックスゴムキャップおよび／またはプランジャーを有し得る。使い捨て可能な注射器は、単回用量のワクチンを含む。上記注射器は、一般に、針の接続前に先端を密封するために先端キャップを有し、そしてその先端キャップは、好ましくは、ブチルゴムから作製される。上記注射器と針とが別個に包装される場合、その針は、好ましくは、ブチルゴムシールドが取り付けられる。好ましい注射器は、商標名「Ｔｉｐ−Ｌｏｋ」ＴＭで市販されるものである。
【００６９】
容器は、半用量の容量を示して小児に対する半用量の送達を容易にするために、標識され得る。例えば、０．５ｍｌ用量を含む注射器は、０．２５ｍｌ容量を示す標識を有し得る。
【００７０】
ガラス容器（例えば、注射器またはバイアル）が使用される場合、ソーダ石灰ガラス製の容器よりもホウケイ酸ガラス製の容器を用いることが好ましい。
【００７１】
キットまたは組成物は、上記ワクチンの詳細（例えば、投与のための指示書、ワクチン内の抗原の詳細など）を含む印刷物と一緒に（例えば、同じ箱中に）含まれ得る。その指示書はまた、警告、例えば、ワクチン接種の後のアナフィラキシー反応の場合、直ちに利用できるようにアドレナリンの溶液を準備しておくことなどを含み得る。
【００７２】
（処置およびワクチンの投与の方法）
本発明の方法および使用によって惹起された免疫応答は、一般に、抗体応答（好ましくは、防御的な抗体応答）を含む。インフルエンザウイルスワクチン接種後の抗体応答、中和能力および防御を評価するための方法は、当該分野において周知である。ヒト研究は、ヒトインフルエンザウイルスの赤血球凝集素に対する抗体力価が防御と相関することを示している（約３０〜４０の血清サンプル赤血球凝集−抑制力価は、同種のウイルスによる感染に対する約５０％の防御を与える）［６５］。抗体応答は、代表的に、赤血球凝集抑制、マイクロ中和、一次元放射状免疫拡散（ＳＲＩＤ）、および／または単純放射溶血（ｓｉｎｇｌｅ  ｒａｄｉａｌ  ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ）（ＳＲＨ）によって測定される。これらのアッセイ技術は、当該分野において周知である。
【００７３】
ワクチンの粘膜投与について、使用され得る経路としては、直腸、経口（例えば、錠剤、スプレー）、咽頭、口腔粘膜（ｂｕｃｃａｌ）、膣、局所、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）または経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、鼻腔内、眼、肺などが挙げられるが、これらに限定されない。上述のように、好ましい粘膜投与経路は、鼻腔内注入によるものである。鼻腔内投与は、例えば、スプレー、点滴、エーロゾルなどによるものであり得る。
【００７４】
ワクチンの非経口投与について、使用され得る経路としては、筋肉内注射、皮下注射、静脈内注射、腹腔内注射（利用可能な場合）、皮内注射など、および他の全身経路が挙げられるが、これらに限定されない。上述のように、好ましい非経口投与経路は、筋肉内注射（例えば、腕または脚への）によるものである。
【００７５】
本発明に従って調製されるワクチンは、小児および成人の両方を処置するために使用され得る。インフルエンザワクチンは、最近、小児および成人の免疫感作における６月齢からの使用について推奨される。したがって、上記患者は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、または少なくとも５５歳であり得る。上記ワクチンを受容するための好ましい患者は、高齢者（例えば、５０歳以上、６０歳以上、および好ましくは６５歳以上）、若年者（例えば５歳以下）、入院患者、医療従事者、国軍および軍人、妊婦、慢性疾患患者、免疫不全患者、そのワクチンを受容する前の７日間において抗ウイルス化合物（例えば、リン酸オセルタミビルなどのオセルタミビルまたはザナミビル化合物；以下を参照のこと）を摂取している患者、卵アレルギーを有する患者、および海外渡航者である。上記ワクチンは、これらの群に対してのみ適しているわけではないが、より一般的には集団において使用され得る。流行株に関して、全ての年齢群に対する投与が、好ましい。
【００７６】
本発明の好ましい組成物は、効力に関してＣＰＭＰ判定基準の１、２または３を満たす。成人（１８〜６０歳）において、これらの基準は、（１）７０％以上のセロプロテクション（ｓｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）；（２）４０％以上のセロコンバージョン；および／または（３）２．５倍以上のＧＭＴ増加である。高齢者（＞６０歳）において、これらの判定基準は、（１）６０％以上のセロプロテクション；（２）３０％以上のセロコンバージョン；および／または（３）２倍以上のＧＭＴ増加である。これらの判定基準は、少なくとも５０人の患者による非盲検研究に基づく。
【００７７】
本発明によって産生されるワクチンは、他のワクチン（麻疹ワクチン、流行耳下腺炎ワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、結合体化ｂ型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅワクチン、不活性化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌結合体ワクチン（例えば、四価Ａ−Ｃ−Ｗ１３５−Ｙワクチン）、ＲＳウイルスワクチン、肺炎球菌結合体ワクチンなど）と実質的に同時（例えば、医療専門家またはワクチン接種センターへの同一の医学的な対診または診察の間）に患者に対して投与され得る。肺炎球菌ワクチンおよび／または髄膜炎菌ワクチンと実質的に同時の投与は、特に、高齢患者において有用である。
【００７８】
同様に、本発明のワクチンは、抗ウイルス化合物、および特に、インフルエンザウイルスに対して活性な抗ウイルス化合物（例えば、オセルタミビルおよび／またはザナミビル）と実質的に同時（例えば、医療専門家による同一の医学的な対診または診察の間）に患者に対して投与され得る。これらの抗ウイルス剤としては、ノイラミニダーゼインヒビター（例えば、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸、または５−（アセチルアミノ）−４−［（アミノイミノメチル）−アミノ］−２，６−アンヒドロ−３，４，５−トリデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノン−２−エノン酸（そのエステル（例えば、エチルエステル）およびその塩（例えば、リン酸塩）を含む））が挙げられる。好ましい抗ウイルス剤は、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸，エチルエステル，ホスフェート（１：１）（リン酸オセルタミビル（ＴＡＭＩＦＬＵＴＭ）としても公知である）である。
【００７９】
（アジュバント）
上記粘膜ワクチンおよび／または上記非経口ワクチンは、アジュバント添加されなくても、それらのワクチンは、アジュバントと一緒に投与されてもよい。上記アジュバントは、上記組成物を受容する患者において誘発された免疫応答（体液性および／または細胞性）を増強するように機能し得る。いくつかのアジュバントは、非経口投与について有効であるが、粘膜投与については有効ではなく（例えば、アルミニウム塩）、そしてその逆も同じであるが、いくつかのアジュバントは、両方の経路について有効である。アジュバントが使用される場合、それらは、適宜選択される。
【００８０】
本発明で使用され得るアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
−無機質含有組成物（カルシウム塩およびアルミニウム塩（またはそれらの混合物）を含む）。カルシウム塩としては、リン酸カルシウムが挙げられる（例えば、参考文献６６に開示される「ＣＡＰ」粒子）。アルミニウム塩としては、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩などが挙げられ、それらの塩は、任意の適切な形態（例えば、ゲル、結晶、非結晶など）をとる。これらの塩への吸着が、好ましい。無機質含有組成物はまた、金属塩の粒子として処方され得る［６７］。アルミニウム塩アジュバントは、以下でより詳細に記載される。
−以下でより詳細に記載されるような水中油型エマルション。
−以下でより詳細に記載されるような免疫刺激性オリゴヌクレオチド。
−以下でより詳細に記載されるような３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（「ＭＰＬＴＭ」としても公知である「３ｄＭＰＬ」）。
−イミダゾキノリン化合物（例えば、イミキモッド（Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）（「Ｒ８３７」）［６８、６９］、レシキモッド（Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）（「Ｒ−８４８」）［７０］、およびそれらのアナログ；ならびにそれらの塩（例えば、塩酸塩）。免疫刺激性イミダゾキノリンについてのさらなる詳細は、参考文献７１〜７５に見出され得る。
−チオセミカルバゾン化合物（例えば、参考文献７６に開示されるもの）。活性化合物についての処方、製造、およびスクリーニングの方法はまた、参考文献７６に記載される。上記チオセミカルバゾンは、特に、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α）の産生のためのヒト末梢血単核細胞の刺激に有効である。
−トリプタントリン化合物（例えば、参考文献７７に開示されるもの）。活性化合物についての処方、製造、およびスクリーニングの方法はまた、参考文献７７に記載される。上記チオセミカルバゾンは、特に、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α）の産生のためのヒト末梢血単核細胞の刺激に有効である。
−（ａ）イサトラビン（Ｉｓａｔｏｒａｂｉｎｅ）（ＡＮＡ−２４５；７−チア−８−オキソグアノシン）：
【００８１】
【化１】
2009514840.tif 000003
などのヌクレオシドアナログ、およびそのプロドラッグ；（ｂ）ＡＮＡ９７５；（ｃ）ＡＮＡ−０２５−１；（ｄ）ＡＮＡ３８０；（ｅ）参考文献７８〜８０に開示される化合物；（ｆ）式：
【００８２】
【化２】
2009514840.tif 000004
を有する化合物（ここで、
Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｈ、ハロ、−ＮＲａＲｂ、−ＯＨ、Ｃ１−６アルコキシ、置換Ｃ１−６アルコキシ、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、Ｃ６−１０アリール、置換Ｃ６−１０アリール、Ｃ１−６アルキル、または置換Ｃ１−６アルキルであり；
Ｒ３は、存在しないか、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、Ｃ６−１０アリール、置換Ｃ６−１０アリール、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり；
Ｒ４およびＲ５は、各々独立して、Ｈ、ハロ、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、−Ｃ（Ｏ）−Ｒｄ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキルであるか、または一緒に結合されてＲ４−５：
【００８３】
【化３】
2009514840.tif 000005
のような５員環を形成し、この結合は、
【００８４】
【化４】
2009514840.tif 000006
によって示される結合において達成され、Ｘ１およびＸ２は、各々独立して、Ｎ、Ｃ、Ｏ、またはＳであり；
Ｒ８は、Ｈ、ハロ、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、−ＯＨ、−ＮＲａＲｂ、−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−Ｒｃ、−Ｏ−（Ｃ１−６アルキル）、−Ｓ（Ｏ）ｐＲｅ、または−Ｃ（Ｏ）−Ｒｄであり；
Ｒ９は、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリルまたはＲ９ａであり、Ｒ９ａは、
【００８５】
【化５】
2009514840.tif 000007
であり、この結合は、
【００８６】
【化６】
2009514840.tif 000008
によって示される結合において達成され；
Ｒ１０およびＲ１１は、各々独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１−６アルコキシ、置換Ｃ１−６アルコキシ、−ＮＲａＲｂ、または−ＯＨであり；
各々のＲａおよびＲｂは、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｄ、Ｃ６−１０アリールであり；
各Ｒｃは、独立して、Ｈ、ホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、Ｃ１−６アルキル、または置換Ｃ１−６アルキルであり；
各Ｒｄは、独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、置換Ｃ１−６アルコキシ、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）、−ＮＨ（置換Ｃ１−６アルキル）、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）２、−Ｎ（置換Ｃ１−６アルキル）２、Ｃ６−Ｉ０アリール、またはヘテロシクリルであり；
各Ｒｅは、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、Ｃ６−１０アリール、置換Ｃ６−１０アリール、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり；
各Ｒｆは、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｄ、ホスフェート、ジホスフェート、またはトリホスフェートであり；
各ｎは、独立して、０、１、２、または３であり；
各ｐは、独立して、０、１、または２である）；あるいは（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のいずれかの薬学的に受容可能な塩、（ａ）〜（ｆ）のいずれかの互変異性体、またはその互変異性体の薬学的に受容可能な塩。
−ロキソリビン（Ｌｏｘｏｒｉｂｉｎｅ）（７−アリル−８−オキソグアノシン）［８１］。
−参考文献８２に開示される化合物（アシルピペラジン化合物、インドールジオン化合物、テトラヒドライソキノリン（ＴＨＩＱ）化合物、ベンゾシクロジオン化合物、アミノアザビニル化合物、アミノベンゾイミダゾールキノリノン（ＡＢＩＱ）化合物［８３、８４］、ヒドラフタラミド化合物、ベンゾフェノン化合物、イソキサゾール化合物、ステロール化合物、キナジリノン化合物、ピロール化合物［８５］、アントラキノン化合物、キノキサリン化合物、トリアジン化合物、ピラゾロピリミジン（Ｐｙｒａｚａｌｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）化合物、およびベンザゾール（Ｂｅｎｚａｚｏｌｅ）化合物［８６］を含む）。
−ポリオキシドニウム（ｐｏｌｙｏｘｉｄｏｎｉｕｍ）ポリマー［８７、８８］または他のＮ−酸化ポリエチレン−ピペラジン誘導体。
−参考文献８９に開示される化合物（３，４−ジ（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン、スタウロスポリンアナログ、誘導体化ピリダジン、クロメン−４−オン、インドリノン、キナゾリンおよびヌクレオシドアナログを含む）。
−アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体（例えば、ＲＣ−５２９）［９０、９１］。
−ＣＤ１ｄリガンド（例えば、α−グリコシルセラミド［９２〜９９］（例えば、α−ガラクトシルセラミド）、フィトスフィンゴシン含有α−グリコシルセラミド、ＯＣＨ、ＫＲＮ７０００［（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−（Ｎ−ヘキサコサノイルアミノ）−１，３，４−オクタデカントリオール］、ＣＲＯＮＹ−１０１、３’’−Ｏ−スルホ−ガラクトシルセラミドなど）。
−例えば、参考文献１００および１０１に記載されるようなポリ［ジ（カルボキシレートフェノキシ（ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｏｐｈｅｎｏｘｙ））ホスファゼン］（「ＰＣＰＰ」）などのホスファゼン。
−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２−エチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２−ブチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２−ブチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−ペンチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロプ−２−エニル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
１−（２−メチルプロピル）−２−［（フェニルメチル）チオ］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン；
１−（２−メチルプロピル）−２−（プロピルチオ）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン；
２−［［４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−イル］（メチル）アミノ］エタノール；
２−［［４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−イル］（メチル）アミノ］エチルアセテート；
４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−ｌ，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン；
Ｎ２−ブチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２−ブチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
１−｛４−アミノ−２−［メチル（プロピル）アミノ］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル｝−２−メチルプロパン−２−オール；
１−［４−アミノ−２−（プロピルアミノ）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−２−メチルプロパン−２−オール；
Ｎ４，Ｎ４−ジベンジル−１−（２−メトキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
などの低分子免疫増強物質（ＳＭＩＰ）。
−広範な植物種の樹皮、葉、茎、根および花においてさえも見出されるステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種群であるサポニン［参考文献１２９の第２２章］。Ｑｕｉｌｌａｉａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ  ｔｒｅｅの樹皮由来のサポニンは、アジュバントとして広範に研究されている。サポニンはまた、Ｓｍｉｌａｘ  ｏｒｎａｔａ（サルサパリラ）、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ブライダルベール）、およびＳａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（サボンソウ根（ｓｏａｐ  ｒｏｏｔ））から商業的に得られ得る。サポニンアジュバント処方物としては、精製された処方物（例えば、ＱＳ２１）、および脂質処方物（例えば、ＩＳＣＯＭ）が挙げられる。ＱＳ２１は、ＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭとして市販されている。サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを使用して精製されている。これらの技術を使用した特定の精製された分画が、同定されており、それとしては、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃが挙げられる。好ましくは、上記サポニンは、ＱＳ２１である。ＱＳ２１の産生の方法は、参考文献１０２に開示される。サポニン処方物はまた、ステロール（例えば、コレステロール）を含み得る［１０３］。サポニンとコレステロールとの組み合わせは、免疫刺激性複合体（ＩＳＣＯＭ）と称される固有の粒子を形成するために使用され得る［参考文献１２９の第２３章］。ＩＳＣＯＭはまた、代表的に、リン脂質（例えば、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリン）を含む。任意の公知のサポニンは、ＩＳＣＯＭにおいて使用され得る。好ましくは、ＩＳＣＯＭは、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡおよびＱＨＣのうちの１つ以上を含む。ＩＳＣＯＭは、参考文献１０３〜１０５にさらに記載される。必要に応じて、ＩＳＣＯＭＳは、さらなる洗浄剤を欠き得る［１０６］。サポニンベースのアジュバントの開発の概説は、参考文献１０７および１０８において見出され得る。
−細菌ＡＤＰリボシル化毒素（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ」、コレラ毒素「ＣＴ」、または百日咳毒素「ＰＴ」）およびその無毒化された誘導体（例えば、ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２として公知である変異体毒素［１０９］）。無毒化されたＡＤＰリボシル化毒素の粘膜アジュバントとしての使用は、参考文献１１０に記載され、そして非経口アジュバントとしての使用は、参考文献１１１に記載される。
−エステル化ヒアルロン酸マイクロスフェア［１１２］またはキトサンおよびその誘導体［１１３］などの生体付着物質（ｂｉｏａｄｈｅｓｉｖｅｓ）および粘膜付着物質（ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｖｅｓ）。
−生分解性かつ非毒性である材料（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど（ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコシド）が好ましい））から形成された微粒子（すなわち、約１００ｎｍ〜約１５０μｍの直径（より好ましくは、約２００ｎｍ〜約３０μｍの直径、または約５００ｎｍ〜約１０μｍの直径）の粒子）（負に荷電した表面（例えば、ＳＤＳを用いる）または正に荷電した表面（例えば、カチオン性洗浄剤（例えば、ＣＴＡＢ）を用いる）を有するように必要に応じて処理される）。
−リポソーム（参考文献１２９の第１３章および第１４章）。アジュバントとして使用するために適したリポソーム処方物の例は、参考文献１１４〜１１６に記載される。
−ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル［１１７］。そのような処方物としては、オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤［１１８］、ならびに少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤（例えば、オクトキシノール）と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤またはポリオキシエチレンアルキルエステル界面活性剤［１１９］がさらに挙げられる。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、ポリオキシエチレン−９−ステアロイル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル，ポリオキシエチレン−８−ステアロイルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
−ムラミルペプチド（例えば、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（「ｔｈｒ−ＭＤＰ」）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−イソグル−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシ（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｘｙ）プロピルアミド（「ＤＴＰ−ＤＰＰ」、または「ＴｈｅｒａｍｉｄｅＴＭ」）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（「ＭＴＰ−ＰＥ」）。
−第２のグラム陰性菌に由来するリポ多糖（ＬＰＳ）調製物と組み合わせた第１のグラム陰性菌から調製される外膜タンパク質プロテオソーム調製物（その外膜タンパク質プロテオソーム調製物およびＬＰＳ調製物は、安定な非共有結合性アジュバント複合体を形成する）。そのような複合体としては、「ＩＶＸ−９０８」（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜およびＬＰＳから構成される複合体）が挙げられる。
−メチルイノシン５’−モノホスフェート（「ＭＩＭＰ」）［１２０］。
−式：
【００８７】
【化７】
2009514840.tif 000009
を有するもの（Ｒは、水素、直鎖または分枝鎖であり、非置換または置換であり、不飽和または飽和である、アシル基、アルキル基（例えば、シクロアルキル基）、アルケニル基、アルキニル基およびアリール基、あるいはそれらの薬学的に受容可能な塩または誘導体からなる群より選択される）などのポリヒドロキシル化ピロリジン化合物［１２１］。例としては、カスアリン（ｃａｓｕａｒｉｎｅ）、カスアリン−６−α−Ｄ−グルコピラノース、３−エピ−カスアリン、７−エピ−カスアリン、３，７−ジエピ−カスアリンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
−γイヌリン［１２２］またはその誘導体（例えば、アルガムリン（ａｌｇａｍｍｕｌｉｎ））。
−参考文献１２３に規定されるような、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ：
【００８８】
【化８】
2009514840.tif 000010
の化合物、あるいはその塩、例えば、「ＥＲ  ８０３０５８」、「ＥＲ  ８０３７３２」、「ＥＲ  ８０４０５３」、「ＥＲ  ８０４０５８」、「ＥＲ  ８０４０５９」、「ＥＲ  ８０４４４２」、「ＥＲ  ８０４６８０」、「ＥＲ  ８０４７６４」、「ＥＲ  ８０３０２２」、または「ＥＲ  ８０４０５７」、例えば：
【００８９】
【化９】
2009514840.tif 000011
−ＯＭ−１７４などのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来のリピドＡの誘導体（参考文献１２４および１２５に記載される）。
−カチオン性脂質および（通常は、中性の）共脂質（ｃｏ−ｌｉｐｉｄ）の処方物（例えば、アミノプロピル−ジメチル−ミリストレイルオキシ（ｍｙｒｉｓｔｏｌｅｙｌｏｘｙ）−プロパンアンモニウムブロミド−ジフィタノイルホスファチジル−エタノールアミン（「ＶａｘｆｅｃｔｉｎＴＭ」）またはアミノプロピル−ジメチル−ビス−ドデシルオキシ−プロパンアミニウムブロミド−ジオレオイルホスファチジル−エタノールアミン（「ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ：ＤＯＰＥ」）。（±）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（ｓｙｎ−９−テトラデセニルオキシ（ｔｅｔｒａｄｅｃｅｎｅｙｌｏｘｙ））−１−プロパンアンモニウム塩を含む処方物が、好ましい［１２６］。
−ＴＬＲ４アンタゴニストＥ５５６４［１２７、１２８］：
【００９０】
【化１０】
2009514840.tif 000012
などの、ホスフェート含有非環式骨格に結合された脂質を含む化合物。
【００９１】
これらアジュバント活性物質および他のアジュバント活性物質は、参考文献１２９および１３３においてより詳細に考察される。
【００９２】
本発明において使用するためのアジュバントは、Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）のモジュレーターおよび／またはアゴニストであり得る。例えば、それらは、ヒトＴＬＲ１タンパク質、ヒトＴＬＲ２タンパク質、ヒトＴＬＲ３タンパク質、ヒトＴＬＲ４タンパク質、ヒトＴＬＲ７タンパク質、ヒトＴＬＲ８タンパク質、および／またはヒトＴＬＲ９タンパク質のうちの１つ以上のアゴニストであり得る。好ましい薬剤は、ＴＬＲ７のアゴニスト  （例えば、イミダゾキノリン）および／またはＴＬＲ９のアゴニスト（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）である。これらの薬剤は、先天免疫経路を活性化するために有用である。
【００９３】
単一のワクチンは、上記アジュバントの２種以上を含み得る。
【００９４】
組成物中の抗原およびアジュバントは、代表的に、混合物中にある。
【００９５】
（アルミニウム塩アジュバント）
水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムとして公知であるアジュバントが、使用され得る。これらの名前は、慣習的であるが、便宜上のみに使用され、いずれも存在している実際の化合物の正確な説明でもない［例えば、参考文献１２９の第９章を参照のこと］。本発明は、アジュバントとして一般的に使用される任意の「水酸化物」アジュバントまたは「リン酸塩」アジュバントを使用し得る。
【００９６】
「水酸化アルミニウム」として公知であるアジュバントは、代表的に、オキシ水酸化アルミニウム塩であり、それは、通常、少なくとも部分的に結晶性である。式ＡｌＯ（ＯＨ）によって表され得るオキシ水酸化アルミニウムは、赤外（ＩＲ）分光学によって、特に、１０７０ｃｍ−１における吸収帯および３０９０〜３１００ｃｍ−１における強力なショルダーの存在によって水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）３のようなその他のアルミニウム化合物と区別され得る［参考文献１２９の第９章］）。水酸化アルミニウムアジュバントの結晶化度の程度は、回折バンドの半価幅（ＷＨＨ）に反映され、結晶性の低い粒子は、同様の微結晶サイズに起因して、より大きい線幅拡大を示す。ＷＨＨが増大する場合、表面積は、増大し、そしてより高いＷＨＨ値を有するアジュバントは、抗原吸着についてのより大きい能力を有することが見出されている。繊維状の形態学（例えば、透過型電子顕微鏡写真において見られるような）は、水酸化アルミニウムアジュバントに関して代表的である。水酸化アルミニウムアジュバントのｐＩは、代表的に、約１１である（すなわち、そのアジュバント自体は、生理学的ｐＨにて正の表面電荷を有する）。ｐＨ７．４において１ｍｇのＡｌ＋＋＋あたり１．８ｍｇ〜２．６ｍｇの間の吸着力が、水酸化アルミニウムアジュバントについて報告されている。
【００９７】
「リン酸アルミニウム」として公知であるアジュバントは、代表的に、ヒドロキシリン酸アルミニウムであり、それはまた、しばしば少量の硫酸塩（すなわち、ヒドロキシリン酸アルミニウムサルフェート）を含む。それらのアジュバントは、沈殿によって得られ得、そして沈殿の間の反応条件および濃度は、上記塩におけるヒドロキシルに対するリン酸の置換の程度に影響を及ぼす。ヒドロキシリン酸塩は、一般に、０．３と１．２との間のＰＯ４／Ａｌモル比を有する。ヒドロキシリン酸塩は、厳密なＡｌＰＯ４からヒドロキシル基の存在によって区別され得る。例えば、３１６４ｃｍ−１におけるＩＲスペクトルバンド（例えば、２００℃まで加熱される場合）は、構造的なヒドロキシルの存在を示す［参照番号１２９の第９章］。
【００９８】
リン酸アルミニウムアジュバントのＰＯ４／Ａｌ３＋モル比は、一般に、０．３と１．２との間、好ましくは、０．８と１．２との間、そしてより好ましくは、０．９５±０．１である。上記リン酸アルミニウムは、一般に、特にヒドロキシリン酸塩については一般に非晶質である。代表的なアジュバントは、０．８４と０．９２との間のＰＯ４／Ａｌモル比を有する非晶質のヒドロキシリン酸アルミニウムを有し、１ｍｌあたり０．６ｍｇのＡｌ３＋で含む。上記リン酸アルミニウムは、一般に、粒子状（例えば、透過型電子顕微鏡写真において見られるような板状の形態学）である。その粒子の代表的な直径は、任意の抗原吸着の後において０．５μｍ〜２０μｍ（例えば、約５μｍ〜１０μｍ）の範囲である。ｐＨ７．４において１ｍｇのＡｌ＋＋＋あたり０．７ｍｇ〜１．５ｍｇの間のタンパク質を吸着する能力が、リン酸アルミニウムアジュバントについて報告されている。
【００９９】
リン酸アルミニウムの荷電ゼロ点（ＰＺＣ）は、ヒドロキシルに対するリン酸の置換の程度に逆に相関し、そしてこの置換の程度は、沈殿によって上記塩を調製するために使用される反応条件および濃度に依存して変動し得る。ＰＺＣはまた、溶液中の遊離リン酸イオンの濃度（より多いリン酸塩＝より酸性のＰＺＣ）を変化させること、またはヒスチジン緩衝剤（ＰＺＣをより塩基性にする）などの緩衝剤を添加することによって変えられる。本発明に従って使用されるリン酸アルミニウムは、一般に、４．０と７．０との間、より好ましくは５．０と６．５との間（例えば、約５．７）のＰＺＣを有する。
【０１００】
本発明の組成物を調製するために使用されるアルミニウム塩の懸濁物は、緩衝剤（例えば、リン酸緩衝剤またはヒスチジン緩衝剤またはＴｒｉｓ緩衝剤）を含み得るが、これは、常に必要であるとは限らない。上記懸濁物は、好ましくは、無菌であり、かつ発熱物質を含まない。懸濁物は、例えば、１．０ｍＭと２０ｍＭとの間、好ましくは５ｍＭと１５ｍＭとの間、そしてより好ましくは約１０ｍＭの濃度で存在する、遊離型の水性リン酸イオンを含み得る。上記懸濁物はまた、塩化ナトリウムを含み得る。
【０１０１】
本発明は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの両方の混合物を使用し得る。この場合において、水酸化アルミニウムよりも多いリン酸アルミニウム（例えば、少なくとも２：１（例えば、≧５：１、≧６：１、≧７：１、≧８：１、≧９：１など）の重量比）が、存在し得る。
【０１０２】
患者に対する投与のための組成物におけるＡｌ＋＋＋の濃度は、好ましくは、１０ｍｇ／ｍｌ未満（例えば、≦５ｍｇ／ｍｌ、≦４ｍｇ／ｍｌ、≦３ｍｇ／ｍｌ、≦２ｍｇ／ｍｌ、≦１ｍｇ／ｍｌなど）である。好ましい範囲は、０．３ｍｇ／ｍｌと１ｍｇ／ｍｌとの間である。０．８５ｍｇ／用量未満の最大量が、好ましい。
【０１０３】
（水中油型エマルションアジュバント）
水中油型エマルションは、インフルエンザウイルスワクチンにアジュバント添加する（ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ）のに使用するために特に適切であることが見出されている。種々のそのようなエマルションは、公知であり、そしてそれらは、代表的に、少なくとも１種の油および少なくとも１種の界面活性剤を含み、その油および界面活性剤は、生分解性（代謝可能）かつ生体適合性である。上記エマルション中の油滴は、一般に、５μｍ未満の直径であり、そしてサブミクロンの直径でさえも有し得、これらの小さいサイズは、安定なエマルションを提供するために、マイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅｒ）を用いて達成される。２２０ｎｍ未満のサイズを有する小滴は、それらが濾過滅菌に供され得る場合に好ましい。
【０１０４】
本発明は、油（例えば、動物（例えば、魚）または植物供給源由来の油）と一緒に使用され得る。植物油についての供給源としては、ナッツ類、種子類および穀物類が挙げられる。ピーナッツ油、ダイズ油、ココナッツ油およびオリーブ油が最も一般的に入手可能な代表的なナッツ油である。例えば、ホホバ豆から得られるホホバ油が使用され得る。種子油として、ベニバナ油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ油などが挙げられる。穀物群において、トウモロコシ油が最も容易に入手可能であるが、小麦、燕麦、ライ麦、イネ、テフ、トリチカレなどの他のシリアル穀物類の油もまた使用され得る。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０炭素の脂肪酸エステルは、種子油内には天然に存在しないが、ナッツ油および種子油から出発した適切な物質の加水分解、分離およびエステル化により調製され得る。哺乳動物のミルク由来の脂肪および油は代謝可能であり、従って、本発明の実施において使用され得る。動物供給源から純粋な油を得るために必要な分離、精製、けん化および他の方法に関する手順は、当該分野において周知である。ほとんどの魚は、容易に回収され得る代謝可能な油を含む。例えば、タラの肝油、サメの肝油、および鯨ろうのようなクジラ油が代表的な種々の魚油であり、本明細書中において使用され得る。いくつかの分枝鎖油は、５炭素イソプレン単位で生化学的に合成され、一般的にテルペノイドといわれる。サメの肝油は、スクアレン、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサンとして公知の分枝、不飽和テルペノイドを含み、本明細書において特に好ましい。スクアレンの飽和アナログであるスクアランもまた好ましい油である。スクアレンおよびスクアランを含む魚油は、市販の供給源から容易に入手可能であるか、または当該分野において公知の方法により得られ得る。他の好ましい油は、トコフェロール（以下参照）である。油の混合物が使用され得る。
【０１０５】
界面活性剤は、それらの「ＨＬＢ」（親水性／親油性バランス）により分類され得る。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、そしてより好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般的にＴｗｅｅｎといわれる）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０；エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー（例えば、ＤＯＷＦＡＸＴＭ商標名で販売される直線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー）；エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の繰返し数が変動し得るオクトキシノール、特にオクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）に関心がある；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ホスファチジルコリン（レシチン）のようなリン脂質；ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコール由来のポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知）（例えば、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ  ３０））；およびソルビタンエステル（一般的にＳＰＡＮとして公知）（例えば、ソルビタントリオレアート（Ｓｐａｎ  ８５）およびソルビタンモノラウレート）を含む界面活性剤を用いて使用され得るが、これらに限定されない。非イオン性界面活性剤が、好ましい。エマルション中に含む好ましい界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ  ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）、Ｓｐａｎ  ８５（ソルビタントリオレアート）、レシチンおよびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。
【０１０６】
界面活性剤の混合物は、例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０／Ｓｐａｎ  ８５混合物が使用され得る。ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ  ８０））とオクトキシノール（例えば、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００））との組合せもまた、適切である。別の有用な組合せは、ラウレス９にポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを加えたものを含む。
【０１０７】
界面活性剤の好ましい量（重量％）は、以下である：ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０）の０．０１〜１％（特に、約０．１％）；オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、またはＴｒｉｔｏｎシリーズにおける他の洗浄剤）の０．００１〜０．１％（特に、０．００５〜０．０２％）；ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ラウレス９）の０．１〜２０％（好ましくは、０．１〜１０％、そして特に、０．１〜１％または約０．５％）。
【０１０８】
本発明に有用な特定の水中油型エマルションアジュバントとしては、以下が挙げられる
：
−スクアレン、Ｔｗｅｅｎ  ８０、およびＳｐａｎ  ８５のサブミクロンエマルション。容量によるエマルションの組成は、約５％のスクアレン、約０．５％のポリソルベート８０および約０．５％のＳｐａｎ  ８５であり得る。重量の項目（ｔｅｒｍ）に関して、これらの比は、４．３％のスクアレン、０．５％のポリソルベート８０および０．４８％のＳｐａｎ  ８５になる。このアジュバントは、参考文献の第１０章および参考文献１３３の第１２章により詳細に記載されるように、「ＭＦ５９」［１３０〜１３２］として公知である。上記ＭＦ５９エマルションは、有益に、クエン酸イオン（例えば、１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝剤）を含む。
−スクアレン、トコフェロールおよびＴｗｅｅｎ  ８０のエマルション。このエマルションは、リン酸緩衝化生理食塩水を含み得る。またＳｐａｎ  ８５（例えば、１％で）および／またはレシチンも含み得る。これらのエマルションは、２〜１０％スクアレン、２〜１０％トコフェロールおよび０．３〜３％Ｔｗｅｅｎ  ８０を有し得、より安定なエマルションを提供する場合、スクアレン：トコフェロールの重量比は、１以下が好ましい。スクアレンおよびＴｗｅｅｎ  ８０は、約５：２の容量比で存在し得る。そのようなエマルションの１つは、２％溶液を与えるためにＰＢＳ中にＴｗｅｅｎ  ８０を溶解し、次いでこの溶液９０ｍｌを（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍＬのスクアレンの）混合物とともに混合し、次いでこの混合物を微細流動化することにより作製され得る。この生じたエマルションは、サブミクロンの油滴（例えば、平均直径が１００ｎｍと２５０ｎｍの間、好ましくは約１８０ｎｍ）を有し得る。
−スクアレン、トコフェロールおよびＴｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）のエマルション。そのエマルションはまた、３ｄ−ＭＰＬ（以下参照）を含み得る。そのエマルションは、リン酸緩衝剤を含み得る。
−ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）およびトコフェロール（例えば、コハク酸α−トコフェロール）を含むエマルション。そのエマルションは、約７５：１１：１０（例えば、７５０μｇ／ｍｌのポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および１００μｇ／ｍｌのコハク酸α−トコフェロール）の質量比でこれら３つの成分を含み得、そしてこれらの濃度は、抗原由来のこれらの成分の任意の寄与を含むべきである。そのエマルションはまた、スクアレンを含み得る。そのエマルションはまた、３ｄ−ＭＰＬ（以下参照）を含み得る。その水相は、リン酸緩衝剤を含み得る。
−スクアレン、ポリソルベート８０およびポロクサマー４０１（「ＰｌｕｒｏｎｉｃＴＭＬ１２１」）のエマルション。このエマルションは、リン酸緩衝化生理食塩水、ｐＨ７．４で処方され得る。このエマルションは、ムラミルジペプチドに有用な送達ビヒクルであり、「ＳＡＦ−１」アジュバントにおいてトレオニル−ＭＤＰとともに使用される［１３４］（０．０５〜１％  Ｔｈｒ−ＭＤＰ、５％スクアレン、２．５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１および０．２％ポリソルベート８０）。「ＡＦ」アジュバントの場合、Ｔｈｒ−ＭＤＰなしでもまた使用され得る［１３５］（５％スクアレン、１．２５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１および０．２％ポリソルベート８０）。微細流動化が好ましい。
−０．５〜５０％油、０．１〜１０％リン脂質、および０．０５〜５％非イオン性界面活性剤を有するエマルション。参考文献１３６に記載されるように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカルジオリピンである。サブミクロンの小滴サイズが有利である。
−代謝不可能な油（例えば、軽油）および少なくとも一種の界面活性剤（例えば、レシチン、Ｔｗｅｅｎ  ８０またはＳｐａｎ  ８０）のサブミクロン水中油型エマルション。添加物としては、ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン−親油性物結合体（例えば、参考文献１３７に記載される、グルクロン酸のカルボキシル基を介して脱アシルサポニンに脂肪族アミンを付加することにより産生されるＧＰＩ−０１００）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミドおよび／またはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンが挙げられ得る。
−サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）およびステロール（例えば、コレステロール）がらせん状のミセルとして会合されるエマルション［１３８］。
−鉱油、非イオン性の脂肪親和性エトキシル化脂肪アルコール、および非イオン性の親水性界面活性剤（例えば、エトキシル化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルション［１３９］。
−鉱油、非イオン性の親水性エトキシル化脂肪アルコール、および非イオン性の脂肪親和性界面活性剤（例えば、エトキシル化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルション［１３９］。
【０１０９】
上記エマルションは、送達時において即時に抗原と混合される。従って、アジュバントおよび抗原は、代表的に包装されたワクチンまたは配布されたワクチンに別個に保たれ、使用時に最終処方物に準備される。この抗原は一般的に水性の形態であり、このワクチンは最終的に２つの液体の混合により調製される。混合のための２つの液体の容量比は、変更し得る（例えば、５：１と１：５の間で）が、一般的に約１：１である。
【０１１０】
上記抗原およびアジュバントが混合された後、赤血球凝集素抗原は、一般に、水溶液中に残るが、その赤血球凝集素抗原は、それ自体、油／水界面付近に分布し得る。一般に、任意の赤血球凝集素が上記エマルションの油相に進入することは、ほとんどない。
【０１１１】
組成物がトコフェロールを含む場合、α、β、γ、δ、εまたはζトコフェロールのいずれかが使用され得るが、α−トコフェロールが好ましい。このトコフェロールは、いくつかの形態をとり得る（例えば、異なる塩および／または異性体）。塩として、有機塩（例えば、コハク酸塩、酢酸塩、ニコチン酸塩など）が挙げられる。Ｄ−α−トコフェロールおよびＤＬ−α−トコフェロールの両方が使用され得る。トコフェロールは、有益に、高齢患者（例えば、６０歳以上）において使用するためのワクチンに含まれる。なぜならば、ビタミンＥは、この患者群における免疫応答に対するポジティブな効果［１４０］、およびＴｈ１／Ｔｈ２バランスに関与する遺伝子の発現に対する顕著な影響［１４１］を有することが報告されているからである。それらはまた、上記エマルションを安定化するために役立ち得る抗酸化剤特性を有する［１４１］。好ましいα−トコフェロールはＤＬ−α−トコフェロールであり、このトコフェロールの好ましい塩は、コハク酸塩である。そのコハク酸塩は、インビボでＴＮＦ関連リガンドと協同することが見出されている。さらに、コハク酸α−トコフェロールは、インフルエンザワクチンと適合性であり、そして水銀化合物に代わるものとして有用な保存剤であることが公知である［９］。保存剤を含まないワクチンが、特に好ましい。
【０１１２】
（免疫刺激性オリゴヌクレオチド）
免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド改変／アナログ（例えば、ホスホロチオエート改変）を含み得、そして二本鎖であっても（ｄｓＲＮＡを除いて）一本鎖であってもよい。参考文献１４２、１４３および１４４は、可能なアナログ置換（例えば、２’−デオキシ−７−デアザグアノシンによるグアノシンの置換）を開示する。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、参考文献１４５〜１５０においてさらに考察される。上記ＣｐＧ配列は、ＴＬＲ９に関し得る（例えば、モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴ）［１５１］。上記ＣｐＧ配列は、Ｔｈ１免疫応答の誘導について特異的であり得る（例えば、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮ（オリゴデオキシヌクレオチド））か、またはその配列は、Ｂ細胞応答の誘導について、より特異的であり得る（例えば、ＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮ）。ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮは、参考文献１５２〜１５４において考察される。好ましくは、上記ＣｐＧは、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮである。好ましくは、上記ＣｐＧ  オリゴヌクレオチドは、その５’末端がレセプター認識を達成可能であるように構築される。必要に応じて、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列は、「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成するようにそれらの３’末端において結合され得る。例えば、参考文献１５１および参考文献１５５〜１５７を参照のこと。有用なＣｐＧアジュバントは、ＰｒｏＭｕｎｅＴＭ（Ｃｏｌｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）としても公知であるＣｐＧ７９０９である。
【０１１３】
ＣｐＧ配列を使用する代わりか、またはそれに加えて、ＴｐＧ配列が、使用され得る［１５８］。これらのオリゴヌクレオチドは、非メチル化ＣｐＧモチーフを含まない可能性がある。
【０１１４】
上記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ピリミジンが豊富であり得る。例えば、その免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、１個より多くの連続したチミジンヌクレオチド（例えば、参考文献１５８に開示されるようなＴＴＴＴ）を含み得るか、そして／または免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、＞２５％（例えば、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）のチミジンを含むヌクレオチド組成を有し得る。例えば、その免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、１個より多くの連続したシトシンヌクレオチド（例えば、参考文献１５８に開示されるようなＣＣＣＣ）を含み得るか、そして／またはその免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、＞２５％（例えば、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）のシトシンを含むヌクレオチド組成を有し得る。これらのオリゴヌクレオチドは、非メチル化ＣｐＧモチーフを含まない可能性がある。
【０１１５】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、代表的に、少なくとも２０個のヌクレオチドを含む。それらは、１００個よりも少ないヌクレオチドを含み得る。
【０１１６】
（３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ）
３ｄＭＰＬ（３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡまたは３−Ｏ−脱アシル−４’−モノホスホリルリピドＡとしても公知である）は、モノホスホリルリピドＡ中の還元末端グルコサミンの３位が脱アシル化されるアジュバントである。３ｄＭＰＬは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔａのヘプトース欠損（ｈｅｐｔｏｓｅｌｅｓｓ）変異体から調製され、そして化学的にリピドＡに類似しているが、酸に不安定なホスホリル基および塩基に不安定なアシル基を欠いている。それは、単球／マクロファージ系統の細胞を活性化し、そしてＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦを含む数種のサイトカインの放出を刺激する（参考文献１５９も参照のこと）。３ｄＭＰＬの調製は、最初に、参考文献１６０に記載された。
【０１１７】
３ｄＭＰＬは、それらのアシル化によって変動する（例えば、異なる長さであり得る３、４、５または６のアシル鎖を有する）関連分子の混合物の形態をとり得る。２つのグルコサミン（２−デオキシ−２−アミノ−グルコースとしても公知の）単糖は、それらの２位の炭素（すなわち、２位および２’位）でＮ−アシル化され、そしてまた３’位でＯ−アシル化されている。炭素２に結合する基は、式−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ１Ｒ１’を有する。炭素２’に結合する基は、式−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ２Ｒ２’を有する。炭素３’に結合する基は、式−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ３Ｒ３’を有する。代表的な構造は以下：
【０１１８】
【化１１】
2009514840.tif 000013
である。
【０１１９】
基Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、各々独立して−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３である。ｎの値は、好ましくは、８〜１６の間であり、より好ましくは、９〜１２の間であり、そして最も好ましくは、１０である。
【０１２０】
基Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’は、各々独立して、（ａ）−Ｈ；（ｂ）−ＯＨ；または（ｃ）−Ｏ−ＣＯ−Ｒ４；であり得、ここでＲ４は−Ｈまたは−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３のいずれかであり、ここでｍの値は、好ましくは、８〜１６の間であり、そしてより好ましくは、１０、１２または１４である。２位では、ｍは、好ましくは、１４である。２’位では、ｍは、好ましくは、１０である。３’位では、ｍは、好ましくは、１２である。したがって、基Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’は、好ましくは、ドデカン酸、テトラデカン酸またはヘキサデカン酸由来の−Ｏ−アシル基である。
【０１２１】
Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のすべてが−Ｈである場合、上記３ｄＭＰＬは３つのアシル鎖のみを有する（２位、２’位および３’位の各々に１つ）。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のうち２つのみが−Ｈである場合、上記３ｄＭＰＬは４つのアシル鎖を有し得る。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のうち１つのみが−Ｈである場合、上記３ｄＭＰＬは５つのアシル鎖を有し得る。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のいずれもが−Ｈではない場合、上記３ｄＭＰＬは、６つのアシル鎖を有し得る。本発明に従って用いられる３ｄＭＰＬアジュバントは、３〜６つのアシル鎖を備えたこれらの形態の混合物であり得るが、この混合物中に６つのアシル鎖をもつ３ｄＭＰＬを含むことが好ましく、そして特に６つのアシル鎖形態が総３ｄＭＰＬの少なくとも１０重量％、例えば、２０重量％以上、３０重量％以上、４０重量％以上、５０重量％以上またはさらに多くを占めることが好ましい。６つのアシル鎖を備えた３ｄＭＰＬは、最もアジュバント活性な形態であることが見出された。
【０１２２】
従って、本発明の組成物に含めるために３ｄＭＰＬの最も好ましい形態は、
【０１２３】
【化１２】
2009514840.tif 000014
である。
【０１２４】
３ｄＭＰＬが混合物の形態で使用される場合、本発明の組成物中の３ｄＭＰＬの量または濃度に関する言及は、混合物中の合わせた３ｄＭＰＬ種をいう。
【０１２５】
水性条件では、３ｄＭＰＬは、異なるサイズを備えた（例えば、直径＜１５０ｎｍまたは＞５００ｎｍを備えた）ミセル凝集体または粒子を形成し得る。これらのいずれか、または両方は、本発明とともに使用され得、そしてより良好な粒子が通常のアッセイによって選択され得る。より小さな粒子（例えば、３ｄＭＰＬの透明な水性懸濁物を与えるに十分小さい）が、より優れた活性［１６１］に起因して、本発明に従う使用に好ましい。好ましい粒子は、２２０ｎｍより小さいか、より好ましくは２００ｎｍより小さいか、１５０ｎｍより小さいか、あるいは１２０ｎｍより小さい平均直径を有し、１００ｎｍより小さい平均直径を有しさえし得る。しかしながら、大部分の場合において、この平均直径は、５０ｎｍより小さくはない。これらの粒子は、濾過滅菌に適するほどに十分小さい。粒子直径は、通常の動的光散乱法の技法によって評価され得、平均粒子直径が明らかとなる。粒子がｘｎｍの直径を有するといわれる場合、一般的にはおおよそこの平均の粒子の分布が存在するが、粒子の数で少なくとも５０％（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、またはそれより多く）がｘ±２５％の範囲内の直径を有する。
【０１２６】
３ｄＭＰＬは、有益に、水中油型エマルションと組み合わせて使用され得る。実質的に全ての３ｄＭＰＬは、好ましくは、上記エマルションの水相に位置する。
【０１２７】
ワクチン中の３ｄＭＰＬの代表的な量は、１０〜１００μｇ／用量（例えば、約２５μｇまたは約５０μｇ）である。
【０１２８】
３ｄＭＰＬはそれ自体でアジュバントとして使用され得るか、またはさらに１つ以上のアジュバント化合物と組み合わせて使用され得る。例えば、ＱＳ２１サポニン［１６２］（水中油型エマルション［１６３］を含む）、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ＱＳ２１および免疫刺激性オリゴヌクレオチドの両方、リン酸アルミニウム［１６４］、水酸化アルミニウム［１６５］またはリン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムの両方と組み合わせて３ｄＭＰＬを使用することが公知である。
【０１２９】
（一般）
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含有する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる」を包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、専らＸからなり得るか、またはさらなる何かを含有し得る（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【０１３０】
語「実質的に」は、「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくても良い。必要である場合、語「実質的に」は、本発明の定義から省略され得る。
【０１３１】
数値ｘに関する用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１３２】
詳細に述べられていなければ、２つ以上の成分を混合する工程を含むプロセスは、混合の任意の特定の順序を要求しない。したがって、成分は任意の順序で混合され得る。３つの成分が存在するとき、そのときは、２つの成分が互いと組み合わされ得、そして次にこの組み合わせが、第３の成分と組み合わされ得るなどである。
【０１３３】
動物（および特にウシ）材料が細胞の培養に使用される場合、それらを、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）のない、および特にウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）のない供給源から取得しなければならない。総合的に、動物に由来する材料の完全な非存在下で細胞を培養することが、好ましい。
【０１３４】
化合物が、組成物の部分として投与される場合、その化合物は、代替的に、適切なプロドラッグによって置換され得る。
【０１３５】
細胞基質が、リアソータント手順または逆方向遺伝学手順のために使用される場合、それは、好ましくは、例えば、Ｐｈ  Ｅｕｒ総論（ｇｅｎｅｒａｌ  ｃｈａｐｔｅｒ）５．２．３にあるようなヒトワクチン生産における使用について承認されているものである。
【実施例】
【０１３６】
（本発明を実施するための様式）
三価インフルエンザサブユニットワクチンを、ＭＤＣＫ細胞培養物において増殖させたウイルスから調製した。株は、（ｉ）Ａ／Ｗｙｏｍｉｎｇ  Ｈ３Ｎ２；（ｉｉ）Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ  Ｈ１Ｎ１；および（ｉｉｉ）Ｂ／Ｊｉａｎｇｓｕであった。これらのワクチンを使用して、用量が０日目および２８日目に与えられる以下の種々の２用量レジメンによって雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫感作した：（ａ）２×筋肉内注射；（ｂ）２×鼻腔内噴霧；（ｃ）鼻腔内噴霧、その後の筋肉内注射；（ｄ）筋肉内注射、その後の鼻腔内噴霧；（ｅ）２×同時の筋肉内注射および鼻腔内噴霧。第６の群（ｆ）は、単一の同時の筋肉内注射および鼻腔内噴霧を受容した。鼻腔内処方物は、５μｇのＬＴ−Ｋ６３アジュバントを含んだ。１ワクチン用量につき１株あたりのＨＡ用量は、１μｇであった。血清サンプル、鼻洗浄液および気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）を、４２日目に採取し、そして血清ＩｇＧ（ＥＬＩＳＡ）、粘膜ＩｇＡ（ＥＬＩＳＡ）および赤血球凝集抑制についてアッセイした。
【０１３７】
総体的に、レジメン（ｃ）（すなわち、鼻腔内投与後の筋肉内注射）は、一貫して最も高い血清ＨＩ力価を誘導した。このレジメンは、他の全ての免疫感作の経路よりも１０倍以上高いＨＩ力価を誘導し（図１）、そして他の全ての群と比較して統計学的有意性（ｐ＜０．００２、ステューデントｔ検定（両側、２つのサンプルが等分散であると仮定する）、９５％信頼区間）を達成した。
【０１３８】
対照的に、逆の２用量（すなわち、レジメン（ｄ））は、最も低い応答を与えた。その次に低いものは、（ｂ）であり、次いで（ａ）であった。したがって、粘膜用量が最初に投与される別個の粘膜用量および非経口用量を含むレジメンが、最適であると考えられる。同日に２つの用量を与えることよりもむしろ２つの用量を分離することが、より強力な応答を与える。
【０１３９】
さらなる実験において、筋肉内注射が１／１０のＨＡ用量（１株あたり０．１μｇのＨＡ）を含む場合、同じ様式の血清ＨＩ力価が見られた。しかし、抗原用量（筋肉内用量および鼻腔内用量の両方において１株あたり１μｇのＨＡ）が維持された一方で、鼻腔内用量におけるＬＴ−Ｋ６３の量が１０分の１に減らした（０．５μｇ）場合、その様式は、変化した。レジメン（ｃ）が、依然としてレジメン（ｄ）より優れていた一方で、レジメン（ｅ）は、最良の総合力価を与えた。対照的に、これらの１０分の１の減少が両方とも使用された（すなわち、筋肉内注射における０．１μｇのＨＡおよび鼻腔内用量における０．５μｇのＬＴ−Ｋ６３）場合、レジメン（ｃ）は、最良の結果を与えた。したがって、アジュバントが使用される場合、その量は、また投与される抗原の量に対して十分であるべきである。
【０１４０】
図２に示す通り、抗ＨＡ  ＩｇＧ抗体分泌細胞および抗ＨＡ  ＩｇＡ抗体分泌細胞は、レジメン（ｂ）の後に頸部リンパ節（ＣＬＮ）において局所的に検出された。レジメン（ｃ）および（ｄ）は、ＣＬＮ中のＩｇＧ抗体分泌細胞のみを誘導した。予期した通り、レジメン（ａ）は、ＣＬＮにおいていかなるＩｇＧ抗体分泌細胞もＩｇＡ抗体分泌細胞も誘導しなかった。ＥＬＩＳＰＯＴの結果は、ＨＡによるＣＬＮ細胞の一晩の刺激に由来する上清に対するＥＬＩＳＡによって確認された。
【０１４１】
重要なことに、粘膜エフェクター部位（鼻洗浄液中のＩｇＡとして直接測定される）と粘膜感応部位（ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ）（ＣＬＮ）との間の抗体応答に相関関係が、存在した。なぜならば鼻洗浄液における抗ＨＡ  ＩｇＡ応答は、図３に見られる通り、レジメン（ｂ）において最も高かった。レジメン（ｃ）は、レジメン（ａ）、次いでレジメン（ｄ）よりも有意に高い（ｐ＜０．０２）、鼻洗浄液における２番目に高い抗ＨＡ  ＩｇＡ応答を誘導したからである。これらのデータは、レジメン（ｂ）および（ｃ）におけるような最初の粘膜用量が最も高いレベルの抗ＨＡ  ＩｇＧ局所（ＣＬＮ）応答および抗ＨＡ  ＩｇＡ局所（ＣＬＮ）応答ならびに抗ＨＡ  ＩｇＧ粘膜（鼻洗浄液）応答および抗ＨＡ  ＩｇＡ粘膜（鼻洗浄液）応答を誘導したことを示す。したがって、粘膜免疫感作およびその後の非経口免疫感作は、多くのエフェクター機能を伴う局所ＩｇＡを誘導するために有用である。
【０１４２】
異なるレジメンがまたサイトカイン応答の増大をもたらすか否かを決定するために、本発明者らはまた、最終的な免疫感作の１週間後にＣＬＮおよび脾臓の培養上清におけるＩＦＮγ、ＩＬ−１３およびＩＬ−５を測定した。レジメン（ｃ）は、最も高い量のＩＦＮγ、ＩＬ−１３およびＩＬ−５を、ＣＬＮにおいて局所的に誘導し、そして脾臓において全身的に誘導した（図４および図５）。重要なことに、そのサイトカイン応答は、一般に、脾臓（図５）と比較してＣＬＮ（図４）においてより高かった。また、これらのデータは、レジメン（ｃ）が有益であることを示す。
【０１４３】
インフルエンザに対する免疫性におけるサイトカインの役割は、動物モデルにおいて良好に研究されており、そしてここでそのデータは、独占的なＴＨ１型応答またはＴＨ２型応答よりも病的でないこと証明し得るバランスのとれたＴＨ１応答およびＴＨ２応答が達成され得ることを示唆する。
【０１４４】
非経口免疫感作を介した不活化ポリオウイルスワクチンによる粘膜免疫の誘導は、生ウイルスとの以前の粘膜接触に依存する［１６６］。また、インフルエンザに対してプライム（ｐｒｉｍｅ）された小児は、プライムされていない小児よりも顕著に高いＩｇＧ応答およびＩｇＡ応答を示した［１６７］。本発明者らのデータは、非経口免疫感作後の粘膜応答および全身応答の誘導が交差反応性のウイルス株によって粘膜を介して事前にプライムすることに起因し得ることを示唆する。したがって、レジメン（ｃ）は、新規インフルエンザ株に対して予め存在する免疫をナイーブな集団において誘導するのに特に有効であることを証明し得る。
【０１４５】
本発明は例示のみによって記載され、そして改変は本発明の範囲および精神の中にあるままでもなされ得ることが、理解される。
【０１４６】
（参考文献（その内容は、本明細書によって参考として援用される））
【０１４７】
【化１３】
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【０１４８】
【化１４−１】
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［７４］米国特許第４６８９３３８号、同第４９２９６２４号、同第５２３８９４４号、同第５２６６５７５号、同第５２６８３７６号、同第５３４６９０５号、同第５３５２７８４号、同第５３８９６４０号、同第５３９５９３７号、同第５４８２９３６号、同第５４９４９１６号、同第５５２５６１２号、同第６０８３５０５号、同第６４４０９９２号、同第６６２７６４０号、同第６６５６９３８号、同第６６６０７３５号、同第６６６０７４７号、同第６６６４２６０号、同第６６６４２６４号、同第６６６４２６５号、同第６６６７３１２号、同第６６７０３７２号、同第６６７７３４７号、同第６６７７３４８号、同第６６７７３４９号、同第６６８３０８８号、同第６７０３４０２号、同第６７４３９２０号、同第６８００６２４号、同第６８０９２０３号、同第６８８８０００号および同第６９２４２９３号．
【０１４９】
【化１４−２】
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【０１５０】
【化１５】
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【０１５１】
【化１６】
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【図面の簡単な説明】
【０１５２】
【図１】図１は、レジメン（ａ）〜（ｆ）によって免疫感作されたマウスにおける血清ＨＩ力価を示す。６個の群の各々において、３つのバーは、左から右に、Ａ／Ｗｙｏｍｉｎｇ；Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ；Ｂ／Ｊｉａｎｇｓｕである。
【図２】図２は、レジメン（ａ）〜（ｅ）についてのＣＬＮ  ＥＬＩＳＰＯＴの結果（１００万個の細胞あたりの抗体分泌細胞を示す）を示す。白色のバーは、ＩｇＡであり、灰色のバーは、ＩｇＧである。
【図３】図３は、レジメン（ａ）〜（ｅ）についての鼻洗浄液のＩｇＡ価を示す。
【図４】図４および図５は、レジメン（ａ）〜（ｄ）を使用した、頸部リンパ節（図４）または脾臓（図５）におけるサイトカインレベル（ｐｇ／ｍｌ）を示す。その４つのレジメンの各々について、３つのバーは、左から右に、ＩＦＮγ；ＩＬ−１３；およびＩＬ−５である。
【図５】図４および図５は、レジメン（ａ）〜（ｄ）を使用した、頸部リンパ節（図４）または脾臓（図５）におけるサイトカインレベル（ｐｇ／ｍｌ）を示す。その４つのレジメンの各々について、３つのバーは、左から右に、ＩＦＮγ；ＩＬ−１３；およびＩＬ−５である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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