(57)【要約】本発明は、タンパク質画分からα−１プロテイナーゼインヒビター（ａ１ＰＩ）を精製するための方法に関し、より具体的には、本発明は、α−１プロテイナーゼインヒビター（ａ１ＰＩ）を精製するための改善された方法に関するものであり、ａ１ＰＩの収量は、出発材料を解凍する工程とその材料を数時間インキュベートする工程の後に、洗浄する工程に供する工程により増大され得る。１つの実施形態において、タンパク質画分からａ１ＰＩを精製するための方法であって、（ａ）ａ１ＰＩを含む凍結したタンパク質画分を提供する工程、（ｂ）タンパク質画分が２〜２５℃の周囲温度に達するまで周囲温度でタンパク質画分を解凍する工程；（ｃ）２〜２５℃の周囲温度で少なくとも４時間にわたってタンパク質画分をインキュベートする工程；および（ｄ）タンパク質画分を洗浄する工程に供する工程を包含する、方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質画分からα−１プロテイナーゼインヒビター（ａ１ＰＩ）を精製するための方法であって、以下の工程、すなわち
（ａ）ａ１ＰＩを含む凍結したタンパク質画分を提供する工程、
（ｂ）該タンパク質画分が２〜２５℃の周囲温度に達するまで該周囲温度で該タンパク質画分を解凍する工程；
（ｃ）２〜２５℃の周囲温度で少なくとも４時間にわたって該タンパク質画分をインキュベートする工程；および
（ｄ）該タンパク質画分を洗浄する工程に供する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記ａ１ＰＩを含む凍結したタンパク質画分が血漿由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ａ１ＰＩを含む凍結したタンパク質画分が、コーン画分ＩＶ１、コーン画分ＩＶ４、コーン画分ＩＶ１＋ＩＶ４およびコーン画分ＩＶ１,４からなる群より選択される少なくとも１つのコーン画分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記コーン画分が、分離方法として濾過を使用することによって得られ、かつ、該コーン画分が濾過助剤を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記濾過助剤が９６〜９８％のＳｉＯ２を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ａ１ＰＩを含む凍結したタンパク質画分が、組換え法により作製されたａ１ＰＩに由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記凍結したタンパク質画分がヒト由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記凍結したタンパク質画分が粉砕されている、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記凍結したタンパク質画分が約４℃の周囲温度で解凍される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記解凍したタンパク質画分が約４℃の周囲温度でインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記解凍したタンパク質画分が少なくとも８時間にわたってインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記解凍したタンパク質画分が少なくとも１５時間にわたってインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記解凍したタンパク質画分が１６〜１９時間にわたってインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記解凍したタンパク質画分が、最高５２時間までインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法であって、前記洗浄する工程が、前記解凍してインキュベートしたタンパク質画分を水または生理食塩水中に１５℃未満の温度で少なくとも１時間にわたって懸濁して、その後、その洗浄懸濁物のｐＨを約５．５または６．０に調節し、濾過または遠心分離によりその可溶性タンパク質を不溶性タンパク質から分離することを包含する、方法。
【請求項１６】
前記可溶性タンパク質が、濾過によって前記不溶性タンパク質から分離され、該濾過のために濾過助剤が使用される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記濾過助剤が９６〜９８％のＳｉＯ２を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記洗浄する工程が少なくとも２回実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記洗浄されたタンパク質画分がウイルス不活性化のためにＳＤ処理に供される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
約１５±５％ｗｔ／ｗｔの量の糖類が、前記洗浄されたタンパク質画分に添加される、請求項５に記載の方法。
【請求項２１】
ＳＤ処理におけるａ１ＰＩの収量を増大させるために、ａ１ＰＩを含むタンパク質画分のＳＤ処理における糖類の使用。
【請求項２２】
前記収量の増大が少なくとも１０％である、請求項２１に記載される使用。
【請求項２３】
前記収量の増大が少なくとも２０％である、請求項２１に記載される使用。
【請求項２４】
前記収量の増大が少なくとも３０％である、請求項２１に記載される使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質画分からα−１プロテイナーゼインヒビター（ａ１ＰＩ）を精製するための方法に関する。より具体的には、本発明は、α−１プロテイナーゼインヒビター（ａ１ＰＩ）を精製するための改善された方法に関するものであり、ａ１ＰＩの収量は、出発材料を解凍する工程とその材料を数時間インキュベートする工程の後に、洗浄する工程に供する工程により増大され得る。
【背景技術】
【０００２】
α−１プロテイナーゼインヒビター（ａ１ＰＩ）は、α１抗トリプシン（ａｌｐｈａ−１−ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ；ＡＡＴ）とも呼ばれており、プロテアーゼの糖ペプチドインヒビターであって、ヒトの血清または生体液においてに見出される。ａ１ＰＩによるプロテアーゼ阻害は、組織タンパク質分解の調節において必須の要素であって、ａ１ＰＩが欠損することはいくつかの疾患の病態と関連する。例えば、ａ１ＰＩの欠損を遺伝的に受け継いだ個体は、重度の早発性気腫に罹患する危険性が増大し、これは、ヒト白血球エラスターゼによる肺組織の破壊が調節されない結果である。外原的なヒトａ１ＰＩの投与は、エラスターゼを阻害することが示されており、その投与は生存率の改善と関連しており、ａ１ＰＩ欠損状態にある患者の肺機能低下の速度を低減することにおいて関連する。（Ｃｒｙｓｔａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｉｎ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１５８：４９−５９（１９９８）；総説としては、Ｒ．Ｍａｈａｄｅｖａ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌｏｍａｓ，Ｔｈｏｒａｘ  ５３：５０１−５０５（１９９８）を参照のこと）。
【０００３】
その治療における有用性のために、商用のａ１ＰＩの製造が、重要な研究の対象となった。Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｒ．Ｂｉｓｃｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：３４６４−３４７２（１９９１））、酵母（Ｋ．Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４２：１９１−１９５（１９９５）；Ｂｏｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，６２９，５６７号）、および植物（Ｊ．Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１７：１２６−３３（２００１））における組換えＡＡＴの産生、さらに、トランスジェニック哺乳動物の乳汁における分泌（Ｇ．Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：８３０−８３４（１９９１）；Ａ．Ｌ．Ａｒｃｈｉｂａｌｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：５１７８−５１８２（１９９０））において、多大な進歩がなされてきた。
【０００４】
しかしながら、ヒト血漿からａ１ＰＩを単離することが、ａ１ＰＩを得るためにその量において最も効率的で実際的な方法であり、ヒト血漿がＦＤＡにより認可される唯一の供給源でもある。
【０００５】
沈降法、吸着法、抽出法、クロマトグラフィー法による工程を組み合わせたものを含む、ヒト血漿画分からａ１ＰＩを単離および精製するための数多くのプロセスが記載されてきた。
【０００６】
ａ１ＰＩを単離するための公開されているプロセスのうちの殆どが、コーン画分（Ｃｏｈｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）ＩＶ沈降物（例えば、コーン画分ＩＶ−１またはコーン画分ＩＶ１−４）として知られるヒト血漿１以上の画分から出発する。このコーン画分は、一連のエタノール沈降法およびｐＨ調節処理後のペーストとして血漿から得られる（Ｅ．Ｊ．Ｃｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，６８：４５９−４７５（１９４６））。
【０００７】
Ｍ．Ｈ．Ｃｏａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ．，４８（６）：３３３−３４２（１９８５）には、ポリエチレングリコール沈降法およびＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー法により、凍結したコーン画分ＩＶ−１ペーストからａ１ＰＩを精製した方法が記載されている。Ｒ．Ｈ．Ｈｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．Ｓｕｐｐｌ．，９：１６ｓ−２０ｓ（１９９０）では、Ｃｏａｎらの文献に記載されたものと同様のプロセスにおいてａ１ＰＩを商用に製造するための出発物質としてコーンＩＶ−１ペーストが使用されている。
【０００８】
ＷＯ９５／３５３０６では、ポリエチレングリコール／ＺｎＣｌ２沈降法に供されて、その記載に従い得られたコーン画分ＩＶ１＋ＩＶ４沈降物から出発する方法が記載されている。この沈降法では、さらに別のＺｎＣｌ２沈降法により処理され、その後、その再可溶化された沈降物が、ＱＡＥカラムに適用される。
【０００９】
ＷＯ９８／００１５４は、コーン分画法の後であってａ１ＰＩ含有材料をその後の処理工程に供する前に、洗浄する工程が取り入れられるプロセスを教示する。この方法において、そのＩＶ１＋ＩＶ４ペーストが水または生理食塩水に懸濁される。次いで、アルブミン、α１グロブリンおよびβグロブリンのようなグロブリンを含む可溶性タンパク質が、濾過法、遠心分離法などによってａ１ＰＩを含む不溶性タンパク質から分離される。その残渣を、水または生理食塩溶液で洗浄してその不溶性ペーストに物理的に捕捉されていた可溶性タンパク質をさらに取り除く。同様のものが、ＷＯ９５／３５３０６にも記載されており、次いで、その材料がＰＥＧ沈降法およびＺｎＣｌ２沈降法に供され、イオン交換クロマトグラフィー工程に適用される。
【００１０】
上述したように、ヒト血漿画分由来のａ１ＰＩのためのいくつかの他のプロセスが、当該分野において評されている。
【００１１】
しかしながら、ａ１ＰＩは、α−１抗トリプシン欠損に起因する気腫にとって有効な処置であるが、その処置は、供給源が限定されている上に製造過程が複雑であるために、非常に費用（現在のところ、１年間あたり約２５，０００ドル）がかかるものである。血漿からヒトａ１ＰＩを単離するためのより効率的で費用対効果が高い方法に対する必要性が存在するのである。本発明は、その必要性に応えるものである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、タンパク質画分からα１プロテイナーゼインヒビター（ａ１ＰＩ）を精製するための方法の改善に関するものであり、この方法において、ａ１ＰＩの収量は、周囲温度２〜２５℃でタンパク質画分を解凍してインキュベートすることにより増大され得る。タンパク質画分からα−１プロテイナーゼインヒビター（ａ１ＰＩ）を精製するための方法は、以下の工程、すなわち、ａ１ＰＩを含む凍結したタンパク質画分を提供する工程；２〜２５℃の周囲温度にそのタンパク質画分が到達するまでその周囲温度においてそのタンパク質画分を解凍する工程；および解凍したタンパク質画分を少なくとも４時間にわたって周囲温度２〜２５℃でインキュベートして、その後、タンパク質画分を洗浄する工程を包含する。本発明に従う場合、引き続く洗浄工程の間にａ１ＰＩ損失を低減することにより顕著にａ１ＰＩの収量が増大され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（本発明の詳細な説明）
本願発明は、タンパク質画分からα１プロテイナーゼインヒビター（ａ１ＰＩ）を精製する方法に関するものであり、この方法は、ａ１ＰＩを含む凍結したタンパク質画分を提供する工程、そのタンパク質画分が２〜２５℃の周囲温度に達するまで周囲温度でタンパク質画分を解凍する工程、周囲温度２〜２５℃で少なくとも４時間にわたってその解凍したタンパク質画分をインキュベートする工程；およびタンパク質画分を洗浄する工程に供する工程を包含する。
【００１４】
そのタンパク質画分は、種々の供給源に由来し得る。有用な供給源としては、血漿、組換え法により産生されたａ１ＰＩ、またはａ１ＰＩを含む他の供給源が挙げられる。
【００１５】
タンパク質を溶液から沈降させるための多くの方法（例えば、塩、アルコールおよびポリプロピレングリコールの添加による方法であり、この方法は、しばしば、冷却処理や種々のｐＨ調整などと併用される）が当該分野において公知である。そのような沈降物を溶液から分離する処理は、遠心分離法、濾過法などにより達成され得る。濾過法が分離法として使用される場合、濾過助剤が使用されてよい。有用な濾過助剤のうちの１つはＣＥＬＰＵＲＥであり、この濾過助剤は９６〜９８％のＳｉＯ２を含む。
【００１６】
本発明は、回復可能なａ１ＰＩ活性を含む殆どのａ１ＰＩ含有タンパク質沈降物に対して提供可能である。本明細書において使用される場合の用語「タンパク質画分」は、１種類以上の公知の方法により調製されたａ１ＰＩ含有タンパク質沈降物をいう。
【００１７】
本発明にとって有用なタンパク質画分としては、例えば、エタノール沈降法による血漿画分（例えば、コーン画分ＩＶ１および／またはコーン画分ＩＶ４、コーン画分ＩＶ１＋ＩＶ４およびコーン画分ＩＶ−１，４のようなコーン画分ＩＶ）が挙げられる。そのタンパク質画分は、１種より多い血漿画分を含む組成物もさらに含み得る。
【００１８】
本発明の１つの実施形態において、そのタンパク質画分は、ヒト由来のものである。
【００１９】
タンパク質画分は、−２０℃より高い（＞−２０℃）周囲温度（例えば、４〜８℃）
で凍結した状態で貯蔵して、その後の処理をしてもよい。本発明の１つの実施形態において、その凍結したタンパク質画分は、約４×４×３ｃｍ３のサイズを有するブロック状の形態にある約０．０５Ｋｇのコーンペーストの部分；約８×８×９ｃｍ３のサイズを有するブロック状の形態にある約０．６Ｋｇのコーンペーストの部分を含み得る。そのタンパク質画分は、約３２×２１×１５ｃｍ３のサイズである１０リットルプラスチック製容器に貯蔵してもよい。
【００２０】
本発明の１つの実施形態にしたがって、その凍結したタンパク質画分は、２〜２５℃の周囲温度にそのタンパク質画分が到達するまでその周囲温度において解凍される。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、「解凍された」タンパク質画分との用語は、周囲温度に到達したタンパク質画分に関する。したがって、用語「解凍する（解凍すること、解凍する工程）」は、その凍結したタンパク質画分の全体がその凍結温度（ｆｒｅｅｚｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）より高い周囲温度に到達するまでその周囲温度においてそのタンパク質画分をインキュベートするプロセスに関する。
【００２２】
そのタンパク質画分を解凍するための有用な周囲温度の例としては、１５℃を超えない温度、８℃を超えない温度、および５℃を超えない温度が挙げられる。有用な１つの周囲温度は、約４℃である。
【００２３】
本発明の１つの実施形態において、その凍結したタンパク質画分を粉砕することによって、解凍する工程が加速されてもよい。
【００２４】
タンパク質画分が周囲温度に到達するまでに必要な時間は、タンパク質画分の質量、凍結したタンパク質画分の形態、そのタンパク質画分が解凍前に貯蔵されていた温度、ならびにそのタンパク質画分が解凍される周囲温度のような数個のパラメーターに依存する。
【００２５】
解凍する工程は、タンパク質画分に温度センサを設置することによりモニターされてもよい。そのようなセンサは、そのタンパク質画分の表面ならびに内部において設置され得る。その温度センサから得られる情報は、そのタンパク質画分を解凍しそしてインキュベートするための期間を決定するために使用され得る。
【００２６】
本発明の１つの実施形態において、タンパク質画分は、そのタンパク質画分が解凍された時点から、すなわち周囲温度に達した時点から開始して少なくとも４時間にわたってインキュベートされる。本発明のさらなる実施形態において、その解凍されたタンパク質画分は、少なくとも８時間にわたってインキュベートされる。本発明の別の実施形態において、その解凍されたタンパク質画分は、少なくとも１５時間にわたってインキュベートされる。本発明の別の実施形態において、その解凍されたタンパク質画分は、１６〜１９時間にわたりインキュベートされる。本発明のさらなる実施形態において、そのインキュベート時間は、最高５２時間であり得る。
【００２７】
その後、そのタンパク質画分は、洗浄工程に供される。
【００２８】
本明細書において使用される場合、用語「洗浄する工程（洗浄すること、洗浄工程）」は、他のタンパク質（例えば、アルブミン、グロブリン）および／または他の不純物が除去されるプロセスをいう。本発明における洗浄する工程は、水または生理食塩水溶液にタンパク質画分を懸濁することも含む。洗浄する工程に使用される水は、精製水（例えば、注射用蒸留水（ＷＦＩ））を用いてもよい。生理食塩溶液は、例えば、約０．０５Ｍ〜約０．１５ＭのＮａＣｌ溶液でよい。水または生理食塩溶液の量は、タンパク質画分の１部あたり５±２部であり得る。
【００２９】
本発明の１つの実施形態では、その洗浄する工程は、１５℃未満の温度で、かつ、少なくとも１時間の期間にわたり実施される。
【００３０】
本発明の１つ実施形態では、その洗浄懸濁物のｐＨは、その後、約５．５±０．２に調整される。本発明の別の実施形態において、その洗浄懸濁物のｐＨは、その後、約６．０±０．２に調整される。
【００３１】
洗浄する工程におけるａ１ＰＩの損失が、水に懸濁する工程の後に低いレベルにまでそのｐＨを調整することによって低減され得る。凍結したペーストを解凍しインキュベートした後に、洗浄する工程に供することによって、その洗浄する工程におけるｐＨのレベルを低くする必要がなくなり、それに従い、ａ１ＰＩの損失が低減され得る。
【００３２】
本発明の実施形態のうちの１つでは、次いで、アルブミン、α−２−グロブリンおよびβ−グロブリンを含むその可溶性タンパク質は、フィルタープレス、遠心分離などによりα−１プロテイナーゼインヒビターを含む不溶性タンパク質から分離される。
【００３３】
本発明の１つの実施形態では、濾過助剤が添加されてもよい。１つの有用な濾過助剤を、ＣＥＬＰＵＲＥのような９６〜９８％ＳｉＯ２を含む高純度で高性能なケイ藻岩濾過助剤である。
【００３４】
本発明のさらなる実施形態において、その不溶性残渣に物理的に捕捉された可溶性タンパク質をさらに除去するために、上述した洗浄する工程が数回実施されてもよい。本発明の１つの実施形態に従う場合、タンパク質画分は、２回洗浄される。
【００３５】
濾過助剤が添加される場合、その濾過助剤は、濾過を始める前に、１回目の洗浄する工程の最後に添加され得る。
【００３６】
本発明の１つの実施形態に従う場合、その洗浄されたタンパク質画分は、その後の精製工程に供されて、最終的な薬学的調製物となる。
【００３７】
本発明の１つの実施形態において使用されるその後の精製工程は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈降法、それに続くＺｎＣｌ２沈降法、溶媒／界面活性剤処理によるウイルス不活性化、陰イオン交換クロマトグラフィー法、およびａ１ＰＩ含有溶出物の後処理である。
【００３８】
ＰＥＧ沈降法は、好ましくは約６時間にわたり、あるいはそれより短い時間が使用されても長い時間が使用されてもよいが、約１５°Ｃ±５°Ｃの温度にて、残渣の容量に対し不溶性タンパク質残渣を約５±２容量の水にｐＨ８．５±０．５で再懸濁することにより実施され得る。次いで、固形Ｔｒｉｓを、最終濃度１０±５ｍＭとなるまで添加して、固体ＮａＣｌを、最終濃度１５０±２０ｍＭとなるまで添加し、そしてｐＨは８．０に調整される。次いで、ポリエチレングリコール３３５０を、最終濃度１５±５％ｗｔ／ｗｔとなるまで添加して、約１５±５°Ｃで約１時間にわたり混合して、α−２−グロブリンを沈降させる。
【００３９】
形成するＰＥＧ沈降物が、フィルタープレスにより取り除かれる。このフィルタープレスは、ｐＨ８．０±０．５で１５０±２５ｍＭ  ＮａＣｌおよび１５±５％ｗｔ／ｗｔ  ＰＥＧを含む溶液で、濾過する前またその後に洗浄される。あるいは、その沈降物は、遠心分離法により取り除かれる。
【００４０】
ＺｎＣｌ２沈降法は、ＺｎＣｌ２（１００±１０ｍＭ）をＰＥＧ上清に最終濃度として６±５ｍＭまで添加することにより実施されてもよく、その溶液は、ｐＨ７．５±０．５に調整される。この溶液は、約５±５°Ｃまで冷却され、少なくとも約１時間にわたり混合される。このＺｎＣｌ２が、粗ａ１ＰＩを沈降させる。この粗ａ１ＰＩは、濾過により、例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによる「Ｐｒｏｓｔａｋ  Ｏｐｅｎ−Ｃｈａｎｎｅｌ  Ｍｏｄｕｌｅｓ」（本明細書中で参考として援用される）に記載されるようなＰｒｏｓｔａｋＴＭ濾過により、または遠心分離法により濃縮され、その濾液は、取り出される。この濃縮した懸濁物または沈降物は、その後の処理にために凍結されてもよい。
【００４１】
ウイルス不活性化のために、その粗ａ１ＰＩを、再循環によりＰｒｏｓｔａｋを介して約５０ｍＭ  ＮａＥＤＴＡに再溶解化した。約１５±５％ｗｔ／ｗｔの量のスクロースのような糖類（または約０．２５±０．０５Ｍクエン酸ナトリウム）が、ウイルス不活性化の際に安定剤として添加される。この溶液を、そのスクロースが溶解するまで１５±５℃で混合する。
【００４２】
ａ１ＰＩ含有溶液は、溶媒／界面活性剤（ＳＤ）処理によりウイルス不活性化される。１０±１％  ｗｔ／ｖポリソルビタール８０（ｐｏｌｙｓｏｒｂｉｔａｌ  ８０）および３±０．３％ｗｔ／ｗｔリン酸トリ−ｎ−ブチルの溶液を、そのａ１ＰＩ溶液に添加して、最終濃度として１．０±０．５％ｗｔ／ｖポリソルビタール８０および０．３±０．１５％ｗｔ／ｗｔリン酸トリ−ｎ−ブチルとする。次いで、その溶液は、少なくとも６時間未満に亘ってｐＨ８±０．５において２７±３℃でインキュベートされ、そのａ１ＰＩに存在し得るいずれのウイルスも不活性化する。
【００４３】
溶媒／界面活性剤処理によるウイルス不活性化の際に、例えば、スクロースのような糖類が安定剤として存在すると、コントロールと比較してａ１ＰＩ単位での収量が増大する。このコントロールは、安定化剤として糖類を用いずに溶媒／界面活性剤によりウイルス不活性化を行ったａ１ＰＩ溶液である。収量における増大は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％であり得る。
【００４４】
このインキュベーションの後で、この処理したａ１ＰＩ溶液を、０〜１０℃まで冷却して、そのｐＨを８．０±０．１に調整した。
【００４５】
陰イオン交換クロマトグラフィーを、ＳＤ処理溶液の１容量当り約１容量の水でＳＤ処理溶液を希釈することにより実施した。次いで、この希釈した溶液を、事前に平衡化してあったＱＡＥクロマトグラフィー媒体またはａ１ＰＩに結合する他に類似の陰イオン交換媒体に適用して、他のタンパク質をａ１ＰＩから分離することを可能にした。バッチクロマトグラフィーを使用してもカラムクロマトグラフィーを使用してもよい。ａ１ＰＩがその媒体に吸着した後に、それを、緩衝液を用いてｐＨ８±１で洗浄して、結合していない物質（βタンパク質を含む）を除去する。ここで、この緩衝液は、２０±１０ｍＭ  ＮａＣｌおよび２０±１０ｍＭリン酸ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）である。次いで、ａ１ＰＩを、ｐＨ８±１で溶出洗浄液を使用して陰イオン交換クロマトグラフィー媒体から溶出させる。ここで、この溶出洗浄液は、１００±５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび２０±１０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む。ａ１ＰＩを含む溶出液を、次の処理のために回収する。
【００４６】
ａ１ＰＩを取り出した後に、陰イオン交換媒体を、連続的に、次のもので洗浄することによって清浄化される。すなわち、２±０．２Ｍ  ＮａＣ１、２０±１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８±１）を含む水溶液；その後、注射用蒸留水（ＷＦＩ）；その後、５００ｍＭ  ＮａＯＨを含む水溶液；最後に、ＷＦＩで洗浄する。次いで、そのクロマトグラフィー媒体を、２±０．２Ｍ  ＮａＣｌ，２０±１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８±１）に貯蔵する。
【００４７】
ａ１ＰＩ含有溶出物の後処理は、そのａ１ＰＩ含有溶出物を合わせてそれらを０．１〜１．０％ｗｔ／ｗｔのベントナイトで約１時間またはそれ以上にわたり処理することにより実施され、アポリポタンパク質の量を低減し、例えば、アポリポプロテインＡを約０．０１ｍｇ／ｍｌ未満として、また、アポリポプロテインＢを約０．０１ｍｇ／ｍｌ未満にまで低減する。このベントナイトは、濾過により、好ましくは、例えば、Ｃｕｎｏ  Ｉｎｃによる「Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ（登録商標）Ｃ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｍｅｄｉｕｍ」（本明細書において参考として援用される）に記載されるようなＣｕｎｏ（登録商標）濾過により、取り除かれる。得られた溶液を、そのａ１ＰＩ活性が少なくとも２１．５ｍｇ活性ａ１ＰＩ／ｍｌとなるまで限外濾過により濃縮する。次いで、この濃縮した生成物は、０．４５ミクロンフィルタを通して濾過され、いずれの沈降物も取り除かれる。次いで、そのａ１ＰＩは、Ｐｌａｎｏｖａ  １５Ｎフィルタ処理されてウイルスが取り除かれ、０．２２ミクロンフィルタにより無菌濾過されてバイアルに分配され、貯蔵のために凍結乾燥される。ａ１ＰＩは、２〜８℃で貯蔵される。
【００４８】
凍結乾燥したａ１ＰＩは、患者に投与されるために滅菌水で再溶解してもよい。
【００４９】
再構成したａ１ＰＩのａ１ＰＩ活性は、色素形成アッセイ（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ａｓｓａｙ）により決定され得る。このようなアッセイは、トリプシンの存在下でｐ−ニトロアニリンを放出するトリプシン感受性色素形成性基質（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．ｏｆ  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．により供給されている）を使用する。この放出されるｐ−ニトロアニリンは、４０５ｎｍで検出される。ａ１ＰＩは、ｐ−ニトロアニリンの基質からの放出を阻害する。その生成物中におけるａ１ＰＩの活性は、ａ１ＰＩ活性の標準曲線によって決定してもよい。上述のプロセスに従って調製されて凍結乾燥したものを再構成したａ１ＰＩの色素形成アッセイは、少なくとも約１．０単位／ＯＤ２８０の比活性を示す。本発明の１つの実施形態において、そのａ１ＰＩ活性は、Ｅ．Ｈ．Ｍａｔｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ．，８１：２９−３６（２００１）に記載されるようにスクシニル−（アラニン）３−パラ−ニトロアニリド（Ｂａｃｈｅｍ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を基質として使用してブタ膵臓エラスターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の阻害を測定することによって決定される。
【００５０】
総タンパク質量は、ブラッドフォード法に従ってクマシーブルーを用いて決定され得る。
【００５１】
本発明の実施形態に従う場合、最終的な薬学的調製物は、最初の１０分間に、約０．０８ｍｌ／Ｋｇ体重／時間（分）の速度で患者に注入され得る。患者がいずれの不快感をも示さなかった場合、その速度は、耐えられる限り増大してもよい。耐えられる場合、その同一の患者に対する引き続く注入は、さらに高速で行ってもよい。有害事象が生じた場合は、その速度を低下させるべきであり、またはその症状が沈静化するまではその注入は中止されるべきである。次いで、その患者にとって耐え得る速度で注入が再開され得る。
【００５２】
投与されるべきものが大用量であるときは、いくつかの再構成したバイアルのａ１ＰＩが無菌処置技術により空の滅菌した静脈注入用容器にプールされる。
【実施例】
【００５３】
（実施例１）
分離方法として濾過を使用したコーン分画法により、そして濾過助剤としてＣＥＬＰＵＲＥを使用することにより得られたＩＶ−１ペーストの１００ｇのアリコートを、４℃で、１６時間、８時間、４時間または０時間にわたって解凍した。次いで、これらのアリコートを、５〜７℃で２４９，１ｍｌのＷＦＩを用いて並行して洗浄して、１０分間にわたって攪拌し、１Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨ６．０に調整し、さらに１０分間にわたって攪拌した。１５分間にわたり４℃にて５０００ｒｐｍで行った遠心分離の後に、その上清のサンプルを抜き、ＣＥＬＰＵＲＥを含む残りのペーストを１７．５℃で５．５倍の体積のＷＦＩで抽出して、３０分間にわたり攪拌し、ｐＨ８．８に調整して、１７．５℃でさらに１５．５時間にわたって攪拌した。ここでは、（最初のｐＨ８．８への調整の後に）１時間後、２時間後、３時間後、５時間後、７時間後および８時間後においてｐＨを調整した。１５分間にわたり４℃で５０００ｒｐｍにてさらに行った遠心分離の後に、その上清を傾瀉して、サンプルを抜いた。
【００５４】
図１は、インキュベーション期間の増大に伴った抽出物中のａ１ＰＩ収量の増大を示す。その凍結したペーストを解凍およびインキュベートをしなかった場合、８％の血漿性ａ１ＰＩがその抽出物中において回収され得たが、他方、周囲温度として４℃で４時間のインキュベーションを行った後では、その収量は２２％の血漿性ａ１ＰＩまで増大し、８時間のインキュベーション後では２４％まで増大し、１６時間のインキュベーション後では２７％まで増大した。抽出物中のａ１ＰＩ含有量は、インキュベーションがない場合の１０７ｍｇ／血漿（Ｌ）から、周囲温度で４時間のインキュベーション後では２８２ｍｇ／血漿（Ｌ）に、周囲温度で８時間のインキュベート後では３１１ｍｇ／血漿（Ｌ）に、周囲温度で１６時間のインキュベーション後では３５２ｍｇ／血漿（Ｌ）へと増大した。
【００５５】
図２は、インキュベーション時間の増大に伴う、抽出物中の０．３３から０．９５ｍｇ／ｍｌとなった総ａ１ＰＩ含有量の増大を示したものである。同様に、洗浄上清中の総ａ１ＰＩ量が０．４２ｍｇ／ｍｌから０．０９ｍｇ／ｍｌに減少した。この抽出物の比活性は、総タンパク質（ｍｇ）当りのａ１ＰＩとして０．０８４ｍｇから０．１１２ｍｇに増大した。
【００５６】
（実施例２）
分離方法として遠心分離法を使用したコーン分画法により得られたＩＶ−１ペーストの５０ｇのアリコートを、４℃で、１６時間、８時間、４時間または０時間にわたって解凍した。次いで、これらのアリコートを５〜７℃で３５０ｍｌのＷＦＩを用いて並行して洗浄して、１０分間にわたって攪拌して、１Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨ５．５またはｐＨ６．０に調整し、さらに１０分間にわたって攪拌した。２１．２ｇのＣＥＬＰＵＲＥを添加してさらに１０分間にわたって攪拌した後に、１５分間にわたる４℃で５０００ｒｐｍの遠心分離を開始した。その上清のサンプルを抜き、ＣＥＬＰＵＲＥを含む残りのペーストを１７．５℃で５．５倍の体積のＷＦＩで抽出した。ここでは、（最初のｐＨ８．８への調整の後に）１時間後、２時間後、３時間後、５時間後、７時間後および８時間後においてｐＨを調整した。１５分間にわたり４℃で５０００ｒｐｍにてさらに行った遠心分離の後に、その上清を傾瀉して、サンプルを抜いた。
【００５７】
図３は、インキュベーション時間の増大、その後のｐＨ５．５での洗浄する工程に伴った抽出物中のａ１ＰＩ収量の増大を示す。凍結したペーストを解凍およびインキュベートしなかった場合、抽出物中に３５％の血漿性ａ１ＰＩを回収し得たが、他方、周囲温度として４℃で数時間のインキュベーションを行った後では、その収量は、１９時間のインキュベーションの後までに最高で４２％の血漿性ａ１ＰＩまで増大した。その抽出物中のａ１ＰＩ含有量は、インキュベーションがない場合の４５９ｍｇ／血漿（Ｌ）から、周囲温度で４時間のインキュベーション後では５０６ｍｇ／血漿（Ｌ）に、周囲温度で８時間のインキュベート後では５３１ｍｇ／血漿（Ｌ）、周囲温度で１９時間のインキュベーション後では５７０ｍｇ／血漿（Ｌ）に増大した。
【００５８】
図４は、インキュベーション時間の増大に伴う、その抽出物中の総ａ１ＰＩ量の１．４２ｍｇ／ｍｌから１．６８ｍｇ／ｍｌへの増大を示す。同様に、洗浄した上清中の総ａ１ＰＩ含有量は、０．２７ｍｇ／ｍｌから０．０７ｍｇ／ｍｌに減少した。その抽出物の比活性は、有意な影響はなかった。
【００５９】
図５はまた、インキュベーション期間の増大、さらにその後のｐＨ６．０での洗浄する工程に伴う抽出物中におけるａ１ＰＩ収量の増大を明らかにする。その収量は、１９時間のインキュベーション後には、血漿の１９％のａ１Ｐ１から血漿の３５％のａ１Ｐ１に増大した。この抽出物のａ１Ｐｌ量は、インキュベーションがない場合の２４８ｍｇ／血漿（Ｌ）から周囲温度で１９時間インキュベーションした後の４６１ｍｇ／血漿（Ｌ）に増大した。
【００６０】
図６は、インキュベーション時間の増大に伴う抽出物における総ａ１ＰＩ量の０．７９ｍｇ／ｍｌから１．３０ｍｇ／ｍｌへの増大を示す。同様に、洗浄上清における総ａ１ＰＩ量が、０．６０ｍｇ／ｍｌから０．１８ｍｇ／ｍｌへと減少した。この抽出物の比活性は、総タンパク質（ｍｇ）当り０．１０ｍｇのａ１ＰＩから０．１８ｍｇのａ１ＰＩへと僅か変化した。
【００６１】
（実施例３）
実施例２に記載したものと同じ手順を、Ｖ−１ペーストの６００ｇアリコートを使用して実施したが、洗浄する前のペーストの分離法として遠心分離処理の代わり濾過を使用する変更をともなった。
【００６２】
図７は、１６時間のインキュベーションの後にｐＨ５．５で洗浄する工程をおこなった場合のａ１ＰＩ収量の相対的増大（総ペーストにおけるパーセンテージ（％））（左側）と、同じインキュベーション持続時間後にｐＨ６．０での洗浄する工程を行った場合のａ１ＰＩ収量の増大（右側）を比較した。インキュベーションがない場合の収量とその後のｐＨ６．０で洗浄する場合の収量は、ｐＨ５．５で洗浄する工程後の収量よりも有意に低かったが、１６時間に及ぶペーストのインキュベーションでは、その洗浄上清におけるａ１ＰＩの損失が劇的に低減されたためにその収量を同程度の値まで増大させた。
【００６３】
図８は、血漿１Ｌ当りの総ａ１ＰＩ回収量（ｍｇ）についての比較を示す。
【００６４】
図９は、総タンパク質収量について対応する比較図表を示す。
【００６５】
（実施例４）
遠心分離処理の後に得られ、１０Ｋｇプラスチック製容器（３２×２１×１５ｃｍ３）に回収され、−２０℃以下の低い温度で貯蔵された２３６ｋｇのＩＶ１ペースト（Ｖｉｅｎｎａ，ＮＧ  ｐａｔｈｗａｙ）を、解凍して、５２時間にわたり５℃でインキュベートした。２４時間後に、その１０Ｋｇ容器の芯部は、約２℃に達した（図１０）。そのペーストは、５〜７℃で７容量の水に懸濁して、１０分間にわたり勢いよく攪拌して、ｐＨ６．０に調整し、５〜７℃でさらに１０分間にわたって攪拌した。濾過助剤としてＣＥＬＰＵＲＥを添加した後に、水で洗浄したペーストをＣＵＮＯ  １０−ＣＰフィルタ層を備えるフィルタープレス上で分離した。水で洗浄したペーストを、洗浄後のフィルタープレスから得て、５．５容量の水に溶解させ、ｐＨを８．８に調整して、６時間にわたり１５〜２０℃にわたって攪拌した。塩を添加した後に、ｐＨ８．０において１５％ＰＥＧにより付随するタンパク質を沈降させて、ＣＵＮＯ  １０−ＣＰフィルタ層を備えるフィルタープレスにより取り除いた。その粗抽出ａ１ＰＩを含む濾液を、２．５ｍＭ  ＺｎＣｌ２を添加することにより沈降させ、ＰＲＯＳＴＡＫ限外濾過ユニットを使用して１０倍にまで濃縮して、最終的に、ｐＨ８．０で２〜８℃で５０ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液に溶解した。
【００６６】
ＺＮ／ＥＤＴＡ濃縮物におけるａ１ＰＩ収量は、凍結ペースト、ペースト粉砕物、およびｐＨ５．５で洗浄したそれまでの生成物と比較して約２０％増大した。
【００６７】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１は、分離方法として濾過法を使用する工程とその後のｐＨ６．０で洗浄する工程、４℃での解凍時間の影響により得たＩＶ−１ペーストの抽出物におけるａ１ＰＩ収量（ａ１ＰＩ（ｍｇ）／血漿（Ｌ））を示す。
【図２】図２は、分離方法として濾過法を使用する工程とその後のｐＨ６．０で洗浄する工程、４℃での解凍時間の影響により得たＩＶ−１ペーストの抽出物における洗浄上清のａ１ＰＩ含有量（ｍｇ／ｍｌ）と比較した抽出物中のａ１ＰＩ収量（ｍｇ／ｍｌ）と、その抽出物の比活性（ａ１ＰＩ（ｍｇ）／タンパク質（ｍｇ））を示す。
【図３】図３は、分離法として遠心分離法を使用する工程とその後のｐＨ５．５で洗浄する工程、４℃での解凍時間の影響により得たＩＶ−１ペーストの抽出物のａ１ＰＩ収量（ａ１ＰＩ（ｍｇ）／血漿（Ｌ））を示す。
【図４】図４は、分離法として遠心分離法を使用する工程とその後のｐＨ５．５にて４℃で洗浄する工程、４℃での解凍時間の影響により得たＩＶ−１ペーストの抽出物の洗浄上清のａ１ＰＩ含有量（ｍｇ／ｍｌ）と比較した抽出物中のａ１ＰＩ収量（ｍｇ／ｍｌ）と、その抽出物の比活性（ａ１ＰＩ（ｍｇ）／タンパク質（ｍｇ））を示す。
【図５】図５は、分離法として遠心分離法を使用する工程、その後のｐＨ６．０での洗浄する工程、４℃での解凍時間の影響により得たＩＶ−１ペーストの抽出物のａ１ＰＩ収量（ａ１ＰＩ（ｍｇ）／血漿（Ｌ））を示す。
【図６】図６は、分離方法として遠心分離法を使用する工程、その後のｐＨ６．０での洗浄する工程、４°Ｃでの解凍時間の影響ことにより得られたＩＶ−１ペーストの抽出物の洗浄上清のａ１ＰＩ量（ｍｇ／ｍｌ）と比較した抽出物中のａ１ＰＩ収量（ｍｇ／ｍｌ）、およびその抽出物の比活性（ａ１ＰＩ（ｍｇ）／タンパク質（ｍｇ））を示す。
【図７】図７は、分離方法として遠心分離法を使用する工程、４℃での解凍時間および洗浄する工程のｐＨの影響により得たＩＶ−１ペーストの洗浄上清のａ１ＰＩ含有量、そのペーストのＰＥＧ上清のａ１ＰＩ含有量と比較した抽出物中のａ１ＰＩ収量（総ペーストに対するパーセンテージ（％））と、そのＩＶ−１ペーストのＰＥＧ上清の比活性（ａ１ＰＩ（ｍｇ）／タンパク質（ｍｇ））を示す。
【図８】図８は、分離方法として遠心分離法を使用する工程、４℃での解凍時間および洗浄する工程のｐＨの影響により得たＩＶ−１ペーストの洗浄上清のａ１ＰＩの回収量、そのペーストのＰＥＧ上清のａ１ＰＩの回収量と比較した抽出物中のａ１ＰＩ回収量（ａ１ＰＩ（ｍｇ）／血漿（Ｌ））を示す。
【図９】図９は、分離方法として遠心分離法を使用する工程、４℃の解凍時間と洗浄する工程のｐＨの影響により得たＩＶ−１ペーストの洗浄上清の総タンパク質含有量、そのＩＶ−１ペーストのＰＥＧ上清の総タンパク質含有量と比較した抽出物中の総タンパク質収量（総ペーストにおけるパーセンテージ（％））（これは、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイにより決定される）、およびそのＩＶ−１ペーストのＰＥＧ上清の比活性（ａ１ＰＩ（ｍｇ）／タンパク質（ｍｇ））を示した。
【図１０】図１０は、コーンＩＶ−１ペーストの凍結した１０Ｋｇブロックの解凍曲線を示す。
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【国際調査報告】
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