(57)【要約】【解決手段】  本発明は、葉酸受容体アルファ（ＦＲＡ）を発現する細胞に特異的に結合し、二者択一でこの細胞に内部移行し、抗体依存性細胞傷害作用などの免疫エフェクター活性を誘導する能力を有するモノクローナルおよびポリクローナル抗体の利用に関する。前記抗体は、薬物をＦＲＡ発現細胞に特異的に送達し、特に腫瘍細胞および前駆体で免疫エフェクター活性を誘発する際に有用である。また本発明は、本発明の抗体をコードするヌクレオチド、前記抗体を発現する細胞、癌細胞を検出する方法、および前記抗体を用いて癌を治療する方法に関する。【選択図】      図２
2009521206.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）葉酸受容体アルファ（ＦＲＡ）に特異的に結合し、さらに（ｂ）選択的に免疫エフェクター活性を誘発するか、或いはＦＲＡ提示細胞に内部移行する、インアウト抗葉酸受容体アルファ抗体。
【請求項２】
請求項１記載の抗体において、前記抗体は少なくとも約１×１０−７Ｍの親和性でＦＲＡに結合するものである。
【請求項３】
請求項１記載の抗体において、前記抗体は少なくとも約１×１０−８Ｍの親和性でＦＲＡに結合するものである。
【請求項４】
請求項１記載の抗体において、前記抗体は少なくとも約１×１０−９Ｍの親和性でＦＲＡに結合するものである。
【請求項５】
請求項１記載の抗体において、前記抗体は少なくとも約１×１０−１０Ｍの親和性でＦＲＡに結合するものである。
【請求項６】
請求項１記載の抗体において、前記抗体はキメラ抗体である。
【請求項７】
請求項６記載の抗体において、前記キメラ抗体はヒト−マウスキメラ抗体である。
【請求項８】
請求項１記載の抗体において、前記抗体はヒト化抗体である。
【請求項９】
請求項１記載の抗体において、前記抗体は完全ヒト抗体である。
【請求項１０】
請求項１記載の抗体において、前記抗体は化学治療物質に結合される。
【請求項１１】
請求項１０記載の抗体において、前記化学治療物質は放射性核種である。
【請求項１２】
請求項１記載の抗体において、ＦＲＡは配列ＩＤ番号２のアミノ酸配列を有するものである。
【請求項１３】
請求項１記載の抗体において、ＦＲＡは配列ＩＤ番号１の前記ヌクレオチド配列によってコードされるものである。
【請求項１４】
請求項１記載の抗体において、前記免疫エフェクター活性は抗体依存性細胞傷害作用である。
【請求項１５】
請求項１記載の抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１記載の抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１記載の抗体の重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項１記載の抗体を有する薬学的組成物。
【請求項１９】
請求項１８記載の医薬品において、前記抗体は化学治療物質と結合される。
【請求項２０】
請求項１９記載の医薬品において、前記化学治療物質は放射性核種である。
【請求項２１】
請求項１記載の抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドを有するベクター。
【請求項２２】
請求項１記載の抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを有するベクター。
【請求項２３】
請求項１記載の抗体の重鎖と請求項１記載の抗体の軽鎖とをコードするポリヌクレオチドを有するベクター。
【請求項２４】
請求項１記載の抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドと、請求項１記載の抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチドとを有する発現細胞。
【請求項２５】
請求項２３記載の前記ベクターを有する発現細胞。
【請求項２６】
請求項２５記載の発現細胞において、前記細胞は哺乳類細胞である。
【請求項２７】
請求項２４記載の発現細胞において、前記細胞は哺乳類細胞である。
【請求項２８】
請求項１記載の抗体を産生する細胞。
【請求項２９】
請求項２８記載の細胞において、前記細胞はハイブリドーマである。
【請求項３０】
ＦＲＡに特異的に結合するインアウト抗体を作製する方法であって、請求項２８記載の細胞を培養する工程と、成長培地から前記抗体を回収する工程とを有する方法。
【請求項３１】
ＦＲＡ陽性細胞の成長を阻害する方法であって、前記細胞を有する対象にインアウト抗ＦＲＡ抗体を投与する工程を有する方法。
【請求項３２】
請求項３１記載の方法において、前記インアウト抗ＦＲＡ抗体は生体分子に結合されるものである。
【請求項３３】
請求項３１記載の方法において、前記ＦＲＡ陽性細胞は異型細胞である。
【請求項３４】
請求項３１記載の方法において、前記対象はヒトである。
【請求項３５】
請求項３１記載の方法において、前記抗体は化学治療物質と結合される。
【請求項３６】
請求項３５記載の方法において、前記化学治療物質は放射性核種である。
【請求項３７】
請求項３１記載の方法において、この方法は、さらに、
細胞傷害性薬を前記被験者に投与する工程を有するものである。
【請求項３８】
請求項３１記載の方法において、この方法は、さらに、
細胞増殖抑制物質を前記被験者に投与する工程を有するものである。
【請求項３９】
請求項３１記載の方法において、この方法は、さらに、
化学治療物質を前記被験者に投与する工程を有するものである。
【請求項４０】
請求項３１記載の方法において、前記抗体は非複合型抗体として投与されるものである。
【請求項４１】
請求項３１記載の方法において、前記抗体は非複合型抗体と化学治療物質に結合した抗体との混合物として投与されるものである。
【請求項４２】
キットであって、ＦＲＡに特異的に結合する抗体において、この抗体は選択的に免疫エフェクター活性を誘発するか、或いはＦＲＡ提示細胞に内部移行するものである前記抗体と、対象のＦＲＡ提示細胞の成長を阻害する方法において前記キットを使用するための使用説明書とを有する、キット。
【請求項４３】
請求項４２のキットにおいて、このキットは、さらに、
少なくとも１つの化学治療物質を有するものである。
【請求項４４】
請求項４２のキットにおいて、このキットは、さらに、
少なくとも１つの診断薬を有するものである。
【請求項４５】
請求項４２のキットにおいて、このキットは、さらに、
前記抗体を前記被験者に投与する方法と使用説明書を有するものである。
【請求項４６】
キットであって、インアウト抗ＦＲＡ抗体と、インビトロまたはインビボでＦＲＡ提示細胞の有無を同定する方法において前記キットを使用するための使用説明書とを有する、キット。
【請求項４７】
請求項４６のキットにおいて、このキットは、さらに、
少なくとも１つの診断薬を有するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は２００５年４月２２日付け出願の米国特許仮出願第６０／６７４，１８５号に対して優先権を主張するものであり、その開示はこの参照によって本明細書に完全に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、葉酸受容体アルファ（ｆｏｌａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ：ＦＲＡ）を発現または提示する細胞（「ＦＲＡ陽性細胞」）に特異的に結合し、前記細胞に選択的に内部移行し、抗体依存性細胞傷害作用などの免疫エフェクター活性を誘導する、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の使用に関する。前記抗体は、薬物をＦＲＡ陽性細胞に特異的に送達し、特に腫瘍細胞および異型細胞で免疫エフェクター活性を誘発させる際に有用である。また本発明は、前記モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体などの抗体誘導体、抗体フラグメントを発現した細胞、ＦＲＡ陽性細胞の検出法、および本発明の抗体を用いた癌の治療法に関連する。
【背景技術】
【０００３】
ヒト膜葉酸結合タンパク質には、α、β、およびγの主に３種類の異性体が存在する。  αおよびβ異性体は約７０％のアミノ酸配列相同性を有し、一部の葉酸では、その立体特異性が著しく異なる。両異性体とも、胎児および成人の両方の組織で発現するが、正常組織では一般に少量から中程度の量のＦＲ−βを発現する。しかし、ＦＲ−αはあるサブセットの正常上皮細胞にて発現されており、様々な癌腫で著しく上昇することが多い（Ｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ  ７３（９）：２４３２−２４４３；Ｒｅｔｔｉｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：３１１０−３１１４；Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：５３２９−５３３８；Ｃｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：６１２５−６１３２；Ｗｅｉｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：３３９６−３４０１；Ｇａｒｉｎ−Ｃｈｅｓａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４２：５５７−５６７；Ｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）ＡＰＭＩＳ  １０２：４１３−４１９；Ｆｒａｎｋｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８（Ｓｕｐｐｌ．）：８９−９５；Ｍｉｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３９：２９７−３０３；およびＶｅｇｇｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｔｕｍｏｒｉ  ７５：５１０−５１３）。ＦＲ−αは９０％を超える卵巣癌で過剰発現されている（Ｓｕｄｉｍａｃｋ  ａｎｄ  Ｌｅｅ（２０００）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．４１（２）：１４７−６２）。さらに、ＦＲ−αは、乳癌、結腸直腸癌、腎臓癌、および肺癌など（これに限定されるものではないが）、他の多数の癌でも過剰発現されている。  
１９８７年、Ｍｉｏｔｔｉらは、ヒト卵巣癌細胞の抗原を認識する、３種類の新しいモノクローナル抗体について報告した（Ｍｉｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３９（３）：２９７−３０３）。このうちの１つがＭＯｖ１８と命名されており、これは絨毛癌細胞表面の３８ｋＤａタンパク質を認識する。ＭＯｖ１８はマウスＩｇＧ１κ抗体であり、卵巣癌細胞株ＩＧＲＯＶ１の特異的細胞溶解を媒介する。Ａｌｂｅｒｔｉら（（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７１（３）：１０５１−１０５５）は、ＭＯｖ１８により認識される抗原はＧＰＩ結合タンパク質であることを示した。その後、これはヒト葉酸結合タンパク質として特定された（Ｃｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１（２２）：６１２５−６１３２）。Ｔｏｍａｓｓｅｔｔｉらは、ＭＯｖ１８が、ＩＧＲＯＶ１細胞にある前記葉酸結合タンパク質の可溶型とＧＰＩアンカー型を認識することを示した（Ｔｏｍａｓｓｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３１７（１−２）：１４３−１４６）。その後の研究では、マウスＭＯｖ１８の可変領域をヒトＩｇＧ１（κ）の定常領域と結合させ、キメラ化ＭＯｖ１８抗体を作製した。前記キメラ化抗体は、１０〜１００倍低い抗体濃度で、ＩＧＲＯＶ１細胞のより多く、より特異的な溶解を媒介した（Ｃｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４（９）：２４４８−２４５５）。
【０００４】
米国特許第５，９５２，４８４号明細書では、３８ｋＤａタンパク質（ＦＲ−α）に結合するヒト化抗体について報告している。前記抗体は、同名の抗原にちなんでＬＫ２６と名付けられた。元のマウスモノクローナル抗体は、欧州特許出願第８６１０４１７０．５号明細書（ＥＰ０１９７４３５として公表され、米国では米国特許出願番号４，８５１，３３２号明細書として発行されている）でＲｅｔｔｉｇによって報告された。
【０００５】
卵巣癌は、婦人科悪性腫瘍による死亡の主な原因である。化学療法が推奨される治療であり、いくらか成功を収めてきたが、その５年生存期間はまだ４０％未満である。
【０００６】
細胞傷害性薬を用いた卵巣癌および他の癌の治療において困難な問題は、細胞毒が癌組織だけではなく、正常組織にも毒性を示すことが多い点である。癌を治療するためにより良い特異性得るためのアプローチは、癌細胞には発現されているが、正常細胞には発現されていないか、低レベルで発現する特異的抗原を標的にすることが可能な抗体を使用することである。前記抗原の生物活性を阻害し、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）および／または抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）による免疫エフェクター機能を誘発することにより、または抗原提示細胞に送達されたときに前記標的細胞を特異的に死滅させる免疫複合体または放射性複合体（ｒａｄｉｏ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を送達することにより、抗原提示細胞を死滅させる抗体を利用にこれらの抗体を用いることが可能となる。抗原提示腫瘍細胞に特異的に結合して効率的に死滅させることが可能な抗体を見つけることは、多くの癌で困難であることが証明されてきた。このことは、免疫エフェクター機能の欠如、または免疫毒素を運ぶ抗体が効率的に内部移行しないため、確実に死滅させることができないことが部分的にその原因となっている。ＦＲＡは、卵巣癌、腎臓癌、結腸直腸癌、および肺癌を含むいくつかの種類の癌に対して、腫瘍特異的な標的化を得るための機会を提示している。
【０００７】
本明細書において、例えば、ＦＲＡ陽性細胞に毒素複合体を送達するため、選択的に（つまり、両方の能力を有するが、一度に１つの能力しか発揮できない）ＦＲＡ陽性細胞で確実な免疫エフェクター機能を誘発し、ＦＲＡ陽性細胞に内部移行することが可能なインアウト抗ＦＲＡ抗体が提供される。本発明の抗体は、卵巣癌、腎臓癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌など（これに限定されるものではないが）ＦＲＡを提示する癌に対し、効果的な治療法である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書において、選択的に、強力な免疫エフェクター機能を誘発し、さらにＦＲＡ陽性細胞に内部移行することが可能なＦＲＡ特異的抗体が提供され、これを本明細書ではインアウト（インアウト）抗ＦＲＡ抗体と称する。本明細書に用いられる「インアウト抗体」（「インアウト  Ａｂｓ」）は、選択的に、免疫エフェクター活性を誘発し、標的抗原に結合して抗原提示細胞に内部移行することが可能な抗体を指す。特定の理論に縛られることなく、インアウト抗体は、抗原−抗体提示細胞に補充される免疫エフェクター細胞または生化学物質によって結合されない限り、坑原提示細胞の細胞表面に結合し、一定期間後内部移行すると考えられている。ＡＤＣＣまたはＣＤＣなどの免疫エフェクター作用を誘発し、内部移行する抗体は以前に報告されているが（Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｓ：ｅｎｈａｎｃｅｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｎｕｄｅ  ｍｉｃｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９３  Ｊｕｎ  １；５３：２５６０−５）、任意の抗原またはエピトープに対してインアウト抗体を発展させることができるかは明らかではない（Ｋｕｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｏｎ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９３  Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；１３（６Ａ）：２２０７−１２）。ＦＲＡを標的とするインアウト抗体についてはこれまでに報告されていない。ＦＲＡ特異的抗体は以前に報告されているが、そのような抗体が前記抗原に結合して内部移行することは知られていない（Ｃｏｇｌｉａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ｒｉｃｉｎ  ａｎｄ  ａ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｏｎ−ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ  ＭＡｂ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１１：４１７−２１，１９９１）。細胞表面の抗原を標的にすることができる抗体は、前記細胞表面の抗原に結合したときに、必ずしも免疫エフェクター機能を誘発するものではない（Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉ−ＣＣ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４  ＩｇＧ１  ｗｉｔｈ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｓｈｏｗｓ  ｐｏｔｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ａｎｄ  ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４：２１２７−３３，２００４；Ｋｉｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ＣＤ４７  ｓｈｏｗｅｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ．Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．２９：４４５−５０，２００５；Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃ��ｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉ−ＧＤ３  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＫＭ８７１  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎ．Ｆｅｂ  ２２；５：３，２００５）。本明細書において、前記細胞表面の抗原ＦＲＡに結合し、選択的に（例えばＡＤＣＣまたはＣＤＣなどの）免疫エフェクター活性を誘発し、抗原陽性細胞に内部移行する抗体が提供される。これらの抗体およびその誘導体は、癌治療に有用である。
【０００９】
本発明において、ＦＲＡに特異的に結合するインアウト（インアウト）抗体が提供される。一部の実施形態において、前記抗体はＬＫ２６およびＭＯｖ１８よりも親和性および／または結合活性が高い抗原に結合する。一部の実施形態において、本発明のインアウト抗体は、例えば立体構造エピトープなど、ＬＫ２６またはＭＯｖ１８によって結合するエピトープと同じエピトープに結合する。一部の実施形態において、本発明のインアウト抗体はＬＫ２６またはＭＯｖ１８によって結合するエピトープとは異なるエピトープに結合する。
【００１０】
本発明の抗体は、ヒト−マウスキメラ抗体を含む（これに限定されるものではないが）キメラ抗体であっても良い。本発明の抗体はヒト化されていても良い。本発明の抗体は完全にヒト化されていても良い。本発明の抗体を発現したハイブリドーマ細胞、本発明の抗体をコードしたポリヌクレオチド、本発明の抗体をコードしたポリヌクレオチドを有するベクター、およびトランスフェクトーマと呼ばれる本発明のポリヌクレオチドを有する発現細胞もまた、本発明において提供される。
【００１１】
本発明はまた、本発明のインアウト抗体を産生する方法も提供する。一部の方法には、本発明の抗体を発現したトランスフェクトーマまたはハイブリドーマを培養する工程が含まれる。本発明の抗体産生細胞は、細菌、酵母、昆虫細胞、および動物細胞であり、好ましくは哺乳類細胞である。
【００１２】
本発明はさらに、ＦＲＡの発現亢進と関連する、異型細胞または腫瘍細胞などのＦＲＡ陽性細胞の成長を阻害する方法を提供する。一部の実施形態において、そのような方法は、ＦＲＡ陽性細胞を有する患者に本発明のインアウト抗体を有する組成物を投与する工程を有する。前記方法は、これらに限定されるものではないが、卵巣癌、乳癌、結腸直腸癌、腎臓癌、および肺癌など、様々な異形成疾患の治療に用いることが可能である。好ましい実施形態において、前記患者はヒトである。一部の実施形態において、前記抗体は、これに限定されるものではないが放射性核種、毒素、および細胞傷害性薬または細胞増殖抑制物質など、１若しくはそれ以上の化学療法剤と結合する。他の実施形態において、前記抗体は、１若しくはそれ以上の化学療法剤または生体分子と併用される。さらに他の実施形態において、前記抗体は、抗葉酸化合物と併用される。インアウト抗体は、複合型または非複合型抗体として単独で、または前記複合型または非複合型形態物または別の治療薬と併用して投与することが可能である。
【００１３】
特異的にＦＲＡを標的とする治療用抗体を開発するこれまでの試みは、ＭＯｖ１８抗体などのように内部移行が少なく、および／または親和性が低いためにほとんど成功しなかった（Ｃｏｇｌｉａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ｒｉｃｉｎ  ａｎｄ  ａ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｏｎ−ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ  ＭＡｂ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１１：４１７−２１，１９９１）。このように内部移行しなかったのは、抗体組成および／またはエピトープの結合のため、親和性が低いか、内部移行が少ないことが原因であった可能性がある。さらに、前記ＭＯｖ１８抗体は、その非複合型は細胞傷害作用自体がないため、免疫複合体として試された。本明細書では、選択的にＦＲＡ陽性細胞に内部移行し、免疫エフェクター活性により細胞傷害作用を誘発するインアウト抗体が提供される。
【００１４】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および実施例から明らかとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本明細書において引用したＧｅｎＢａｎｋデータベースの配列の受入番号を含む参照研究、特許、特許出願書類、および科学文献は、当業者の知識を確立するものであり、各資料が具体的かつ個別に参照によって組み込まれるように、これらの資料は、この参照によってその全体が本明細書に完全に組み込まれるものである。本明細書において引用された参照と本明細書の特定の教示の間に不一致があった場合、本明細書の特定の教示を優先することにより解決されるものとする。同様に、当業者に理解される単語または表現の定義と、本明細書で具体的に教示されている単語または表現の定義との間に不一致があった場合、本明細書の単語または表現を優先して解決されるものとする。
【００１６】
当業者に周知の組み換えＤＮＡ技術に関する一般的原理を示した標準的な参照研究には、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  &  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，２Ｄ  ＥＤ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＡＮＤ  ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ（１９９５）；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｅｄ．，ＤＩＲＥＣＴＥＤ  ＭＵＴＡＧＥＮＥＳＩＳ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９１）が含まれる。
【００１７】
本発明は特定の方法、試薬、化合物、組成物、または生物系に制限されることはなく、当然ながら変更されることは理解されるものとする。また、本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態のみを説明する目的で使用されるものであり、限定する意図はないこともまた理解される。本明細書および添付の請求項に用いられる、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その内容が明らかに別のことを示していない限り、複数の言及を含む。従って、例えば「ａ  ｃｅｌｌ（細胞）」の言及は２若しくはそれ以上の細胞の組み合わせなどを含む。
【００１８】
本明細書に列挙した各範囲は、本明細書に含まれる特定の数字だけでなく、範囲内のすべての組み合わせおよびサブコンビネーションを含む。
【００１９】
本明細書に用いられる「約」という用語は、量、一時的な期間など、測定可能な値を指す場合、特定の値からの±２０％または±１０％、より好ましくは±５％、さらに好ましくは±１％、まださらに好ましくは±０．１％のばらつきを含むことを意味し、そのようなばらつきは開示された方法を実施する上で適当である。
【００２０】
本発明は、これに限定されるものではないが癌細胞などのＦＲＡ陽性細胞の成長を阻害する方法を提供する。そのような方法を利用し、ＦＲＡ、好ましくは哺乳類ＦＲＡ、より好ましくはヒトＦＲＡ（配列ＩＤ番号１（ヌクレオチド）および２（アミノ酸））に特異的に結合するインアウト抗体を用いて腫瘍性疾患の進行を抑制することができる。本発明の方法は、例えば、ヒトを含む哺乳類の癌を治療するなど、ＦＲＡ陽性細胞の成長を調整するために使用することが可能である。抑制される癌細胞には、正常ヒト組織に関連してＦＲＡの発現が亢進しているすべての癌細胞、特に卵巣癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌細胞を含む。
【００２１】
特定の操作理論にしばられることなく、癌細胞においてＦＲＡの発現が増強されると、前記細胞表面における膜結合型の細胞表面発現が亢進する。従って、一部の癌細胞では、正常組織と比べてＦＲＡの発現が亢進している。従って、前記膜結合型ＦＲＡは癌の抗体療法には理想的な標的である。
【００２２】
本明細書において用いられる「エピトープ」という用語は、抗体が特異的に結合する抗原の一部を指す。
【００２３】
本明細書で用いられる「立体構造エピトープ」という用語は、連続したアミノ酸以外の抗原のアミノ酸同士の空間関係によって形成される不連続エピトープを指す。
【００２４】
本明細書に用いられる「免疫エフェクター活性」、「免疫エフェクター作用」、および「免疫エフェクター機能」という用語は、抗体依存性細胞傷害作用（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害作用（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＣＤＣ）による抗体の殺細胞力を指す。
【００２５】
本明細書に用いられる「インアウト抗体」という用語は、抗原提示細胞に内部移行し、内部移行しない場合は免疫エフェクター活性を誘発することができる抗体を指す。
【００２６】
本明細書に用いられる「選択的」という表現は、内部移行または免疫エフェクター活性を誘発する抗体の能力を指す場合、前記抗体が内部移行能力と免疫エフェクター活性誘発能力の両方を有するが、同時に両方を行うことはできないことを意味する。
【００２７】
本明細書に用いられる「インビトロでの異型細胞の成長抑制」という用語は、培養中、細胞数が約５％、好ましくは約１０％、より好ましくは約２０％、より好ましくは約３０％、より好ましくは約４０％、より好ましくは約５０％、より好ましくは約６０％、より好ましくは約７０％、より好ましくは約８０％、より好ましくは約９０％、最も好ましくは約１００％減少することを意味する。インビトロでの腫瘍細胞の成長抑制は、当該分野で既知のアッセイにより測定される。
【００２８】
本明細書において用いられる「インビボでの異型細胞の成長抑制」という用語は、微生物の細胞数が約５％、好ましくは約１０％、より好ましくは約２０％、より好ましくは約３０％、より好ましくは約４０％、より好ましくは約５０％、より好ましくは約６０％、より好ましくは約７０％、より好ましくは約８０％、より好ましくは約９０％、最も好ましくは約１００％減少することを意味する。インビボでの細胞成長の調節は、当該分野で既知のアッセイにより測定することができる。
【００２９】
本明細書に用いられる「異型細胞」は異常な成長を示す細胞を指す。異常な成長特性の例には、これに限定されるものではないが、軟寒天中での増殖、接触阻害の欠如、無血清状態で細胞周期停止の拒否、および免疫力低下マウスに注入したときの腫瘍形成などが含まれる。異型細胞には、これに限定されるものではないが、腫瘍、過形成などが含まれる。
【００３０】
「予防する」という用語は、微生物が感染するか、異形成など異常な状態を発生させる可能性を低下させることを指す。
【００３１】
「治療する」という用語は、治療効果を有し、生物体の異常状態を少なくとも部分的に軽減または抑止することを指す。治療とは、抑制された腫瘍成長の維持および寛解の誘発を含む。
【００３２】
「治療効果」は対象者における疾患または異常な状態、その症状、またはその副作用の軽減、除去、または予防を指す。「有効量」は、所望の効果を生じさせるために必要な量を指す。「治療的有効量」は、疾患、状態、または障害を治療するために対象者に投与する場合、その疾患に対する治療効果をもたらすのに十分な量を指す。治療効果は、前記異常な状態の１若しくはそれ以上の症状を、ある程度軽減する。前記異常な状態の治療に関して、治療効果は、（ａ）細胞の増殖、成長、および／または分化の増加または減少、（ｂ）インビボにおける腫瘍細胞の成長の阻害（つまり遅延化または停止）、（ｃ）細胞死の促進、（ｄ）変性の抑制、（ｅ）前記異常な状態に関連した１若しくはそれ以上の症状のある程度の軽減、および（ｆ）細胞集団の機能強化、の１若しくはそれ以上を指す可能性がある。本明細書に説明した抗体およびその誘導体は、単独、または本発明の組成物の複合体または更なる組成物の併用して前記治療効果を達成する。
【００３３】
本明細書において用いられる「癌または腫瘍性疾患の進行を阻害する」という用語は、未治療癌細胞が末期疾患に向かうのを調節することと関連し、腫瘍性疾患の末期癌へ向かうのを調節して遅延させる治療活動を指す。
【００３４】
本明細書に用いられる「腫瘍性疾患」という用語は、組織細胞の異常な増殖によって特徴付けられる状態を指す。
【００３５】
本明細書に用いられる「生体分子」という用語は、複合体を形成し、同時投与され、本発明の抗体投与前後に投与され、またはそれ以外で本発明の抗体と関連して使用することができるすべての分子を指す。生体分子には、これらに限定されるものではないが酵素、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、脂質、炭水化物、およびフラグメント、相同体、類似体、または誘導体、およびその組み合わせを含む。生体分子の例には、これらに限定されるものではないが、インターロイキン−２、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、リツキサン、ゼバリン、ハーセプチン、エルビタックス、およびアバスチンを含む。前記生体分子は、天然型、組み換え型、または合成とすることができ、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化、ミリスチル化などにより、その天然型から修飾することもできる。本明細書に用いられる生体分子という用語は、天然型の分子に限定されず、生物由来ではない合成分子を含む。
【００３６】
本明細書に用いられる「細胞傷害性」または「細胞増殖抑制」物質という用語は、細胞の生存率または増殖する可能性を低下させる物質を指す。細胞傷害性薬または細胞増殖抑制物質は、例えば、これに限定されるものではないがＤＮＡの障害を誘導、細胞周期停止を誘導、ＤＮＡ合成を阻害、転写を阻害、翻訳またはタンパク質合成を阻害、細胞分裂を阻害、またはアポトーシスを誘導することにより、細胞の生存可能性または増殖を抑制する様々な方法で作用することができる。本明細書に用いられる「化学治療物質」という用語は、腫瘍細胞を選択的に死滅、その成長を抑制、またはその転移を抑制するか、急速に増殖する細胞の細胞周期を混乱させる細胞傷害性物質、細胞増殖抑制物質、および抗腫瘍性物質を指す。化学治療物質の具体的な例には、これらに限定されるものではないが、放射性核種、ヤマゴボウ抗ウイルス性タンパク質、アブリン、リシン、およびそのＡ鎖、アルトレタミン、アクチノマイシンＤ、プリカマイシン、プロマイシン、グラミシジンＤ、ドキソルビシン、コルヒチン、サイトカラシンＢ、シクロホスファミド、エメチン、マイタンシン、アムサクリン、シスプラチン、エトポシド、エトポシドオルトキノン、テニポシド、ダウノルビシン、ゲムシタビン、ドキソルビシン、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒａｏｎｅ）、ビサントレン、ブレオマイシン、メトトレキセート、ビンデシン、アドリアマイシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ＢＣＮＵ、タキソール、タルセバ、アバスチン、マイトマイシン、修飾シュードモナスエンテロトキシンＡ、カリチェアミシン、５−フルオロウラシル、シクロホスファミド、およびＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βなどの特定サイトカインが含まれる。
【００３７】
「保存的修飾変異体」はアミノ酸および核酸配列の両方に当てはまる。特定の核酸配列に関して、保存的修飾変異体とは、同一或いは基本的に同一であるアミノ酸配列をコードする核酸を指し、または前記核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、基本的に同一の配列を指す。遺伝暗号の縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が特定タンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべてアミノ酸のアラニンをコードする。従って、アラニンがコドンで特定されるすべての位置で、コードされるポリペプチドを変化させることなく、前記コドンを前述の対応するコドンのいずれかと変更することができる。そのような核酸変異は「サイレント変異」であり、保存的修飾変異体の一種である。ポリヌクレオチドをコードする本明細書のすべての核酸配列は、前記核酸の考えられるすべてのサイレント変異も描写する。当業者であれば、核酸の各コドン（通常メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧと、通常トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を修飾し、機能的に同一な分子を生じることができることが理解される。従って、ポリヌクレオチドをコードする核酸の各サイレント変異は、発現生成物について描写された各配列で絶対的であるが、実際のプローブ配列については絶対的ではない。
【００３８】
例えば、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターに関連して用いられる場合の「組み換え型」は、前記細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが異種核酸またはタンパク質の導入、または天然型核酸またはタンパク質の変更により修飾されたか、前記細胞がそのように修飾された細胞に由来することを示す。従って、例えば、組み換え型細胞は前記細胞の天然型（非組み換え型）には見られない遺伝子を発現しているか、そうでなければ異常に発現されるか、発現が少ないか、全く発現されていない天然型遺伝子を発現している。
【００３９】
「核酸」または「ポリヌクレオチド配列」という用語は、５’から３’末端に向かって読み取ったデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖重合体を指す。核酸には、ポリメラーゼにより読み取りを補正することができ、例えば保存的修飾変異体を含む核酸でコードされるポリペプチドの発現を変化させない、修飾ヌクレオチドも含むことができる。
【００４０】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は本明細書で同義的に使用され、アミノ酸残基の重合体を指す。前記用語は、１若しくはそれ以上のアミノ酸残基が対応する天然型アミノ酸の人工化学的ミメティックであるアミノ酸重合体、および天然型アミノ酸重合体および非天然型アミノ酸重合体にも当てはまる。本発明の抗体を含む本発明のポリペプチドには、保存的修飾変異体を含む。当業者であれば、コード化配列中の単一アミノ酸または少ない割合のアミノ酸を変更、付加、または欠失させる核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列の置換、欠失、または付加は「保存的修飾変異体」であり、前記変化により、アミノ酸が化学的に類似のアミノ酸と置換されることが認識される。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は当該分野で周知である。そのような保存的修飾変異体は、本発明の多型変異体、種間相同体、および対立遺伝子に追加され、これらを除外しない。以下の８群はそれぞれ互いに保存的置換のあるアミノ酸を含み、それは１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）である（３３）。「保存的置換」という用語は、非置換親アミノ酸に代わり置換アミノ酸を使用することも含むが、ただしそのようなポリペプチドは必須の結合活性も示す。
【００４１】
「アミノ酸」は、天然型および合成アミノ酸、および前記天然型アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸ミメティックを指す。天然型アミノ酸は、遺伝暗号でコードされたアミノ酸、および後で修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリンである。「アミノ酸類似体」は、天然型アミノ酸と同じ基本的化学構造、つまり、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ群、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムに結合するα炭素を有する化合物を指す。そのような類似体は、修飾されたＲ群（例えばノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然型アミノ酸と同じ基本的化学構造を保持している。「アミノ酸ミメティック」は、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然型アミノ酸と同様に機能する化学化合物を指す。
【００４２】
本明細書において、アミノ酸は一般的に知られる３文字記号またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎが推奨する１文字記号で称することができる（以下の表１を参照）。同様に、ヌクレオチドは一般的に受け入れられている１文字コードによって称される。
【００４３】
【表１】
2009521206.tif 000003
【００４４】
本明細書において、すべてのアミノ酸配列は、左から右の方向が従来のアミノ末端からカルボキシ末端の方向である式で表されていることに留意すべきである。
【００４５】
本明細書に用いられる「インビトロ」または「生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）」という用語は、人工環境、およびこれらに限定されるものではないが、例えば試験管および細胞培養などの人工的な環境で発生する工程または反応を指す。前記「インビボ」という用語は、自然環境（例えば、動物または細胞）および自然環境で発生する工程または反応を指す。
【００４６】
「薬学的に許容される」、「生理学的に忍容性の」、およびその文法的変形形態は、組成、担体、希釈剤、試薬を指す場合は同義的に用いられ、前記組成の投与を阻害する程度の好ましくない生理学的効果を発生させずに、前記物質を人に投与できることを示す。
【００４７】
「薬学的に許容される担体」という用語は、適切な医学的判断の範囲内で、妥当な利益／リスク比と釣り合い、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の合併症を生じずに、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適した、試薬、添加物、細胞、成分、物質、組成物、および／または投与形態を指す。本明細書でさらに詳細に説明するとおり、本発明での使用に適した薬学的に許容される担体には、気体、液体、および半固体および固体物質が含まれる。
【００４８】
特別な記載がない限り、「対象」または「患者」は同義的に用いられ、ヒト患者およびヒト以外の霊長類などの哺乳類、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、およびその他の動物などの実験動物を指す。従って、本明細書に用いられる「対象」または「患者」は、本発明の組成物を投与することが可能なすべての哺乳類患者または被験者を意味する。本発明の一部の実施形態において、前記患者は感染症または炎症性疾患に罹患する。本発明の一部の実施形態において、前記患者は癌と診断される。本発明の典型的な実施形態において、本発明に沿った治療の候補患者を特定するため、一般に認められたスクリーニング方法を採用し、被験者の既存の疾患または状態の状況、または標的となるか疑わしい疾患または状態と関連したリスクファクターを決定する。これらのスクリーニング方法には、例えば、被験者が感染症、炎症性疾患、または癌に罹患しているか否かを決定する検査を含む。このようなルーティンな方法により、臨床医は治療が必要な被験者を選択することができる。
【００４９】
本明細書に用いられる「治療用化合物」は癌などの疾患または状態の予防または治療に有用な化合物を指す。
【００５０】
本明細書に用いられる「併用投与」、「同時投与」、または「併用」には、同時にまたは併用して、一緒に、または互いに前後して活性薬物（例えば、ＭＡｂｓ、化学治療物質、生体分子）を投与することを含む。前記複数の薬物は、すべての薬物が作用部位で十分有効濃度を達成することができる方法で投与される限り、同じ経路または異なる経路で、同時にまたは順次投与することができる。当業者であれば、特定の薬物と本発明の組成を投与する適切なタイミング、順序、および用量を決定することは困難なことではない。
【００５１】
「免疫グロブリン」または「抗体」は広義に用いられ、抗体分子と様々な抗体由来分子の両方を指し、前記免疫系の主要成分である、高等哺乳動物で生成する一連の糖タンパク質の一員を含む。前記「抗体」という用語は広義の意味で用いられ、望みの生物活性を示す限り、具体的にはモノクローナル抗体、多エピトープ特異性を持つ抗体組成、二重特異性抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、および単鎖分子、また抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ）を網羅する。免疫グロブリン分子には抗原結合ドメインを含み、それぞれが軽鎖と、重鎖の末端タンパク質、および補体との結合など様々な機能に必要なＦｃ領域を含む。免疫グロブリンには５種類のクラスがあり、前記Ｆｃ領域の重鎖の主要構造が前記免疫グロブリンのクラスを決める。具体的には、α、δ、ε、γ、およびμ鎖がそれぞれＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭに対応する。本明細書に用いられる「免疫グロブリン」または「抗体」にはα、δ、ε、γ、およびμのすべてのサブクラスを含み、４鎖の免疫グロブリン構造の天然（例えば、ＩｇＡおよびＩｇＭ）または合成多量体も指す。抗体は、非共有結合的に、特異的に、および可逆的に抗原と結合する。本明細書に用いるとおり、前記「モノクローナル抗体」という用語は、かなり均質な抗体集団から得られる抗体を指し、つまり、少量で存在することができ、自然に発生した可能性のある変異を除き、前記集団を有する個々の抗体は同一である。例えば、モノクローナル抗体は抗体産生細胞の単一クローンにより作製することができる。ポリクローナル抗体と異なり、モノクローナル抗体は単一特異的である（例えば、単一抗原の単一エピトープに対して特異的である）。前記「モノクローナル」という修飾語は、かなり均質な抗体集団から得られる抗体の特徴を示し、いかなる特定の方法でも前記抗体の作製が必要であるとは解釈されない。例えば、本発明に従って使用される前記モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５，１９７５で最初に報告されたハイブリドーマ法により作製することができるか、組み換えＤＮＡ法により作製することができる。前記「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７，１９９１に報告されている技術を利用し、ファージ抗体ライブラリから単離することもできる。
【００５２】
抗体由来分子は、抗原結合特異性を保持し、例えば、少なくとも１つの可変領域（重鎖または軽鎖可変領域）を有する完全な抗体の一部を有する。抗体由来分子には、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆ（ｖ）フラグメント、Ｆａｂｃフラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆａｂｃフラグメント、Ｓｃ抗体（単鎖抗体）、ダイアボディ、個々の抗体軽鎖、個々の抗体重鎖、抗体鎖と他の分子とのキメラ融合、重鎖単量体または二量体、軽鎖単量体または二量体、重鎖１つと軽鎖１つから成る二量体などの分子を含む。すべてのクラスの免疫グロブリン（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）とそのサブクラスが含まれる。
【００５３】
抗体は毒性または非毒性部分で標識するか、これと結合することができる。毒性部分には、例えば、細菌毒素、ウイルス毒素、放射性同位元素などを含む。抗体は、前記抗体の検出を助けるため、生物学的アッセイ（例えば、放射標識、蛍光標識）で使用するために標識することができる。抗体は、診断または治療の目的で、例えば、放射免疫治療（Ｇａｒｍｅｓｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，２８：４０９，２００１）、画像法および放射免疫誘導手術などの望みの適用部位に直接放射線を照射する放射性同位元素、または特定の抗体／抗原複合体のインビボでの画像化または検出を可能とする標識により、標識／結合することもできる。抗体は、免疫毒素を提供する毒素と結合することもできる（Ｋｒｅｉｔｍａｎ，Ｒ．Ｊ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．，３１：５３，１９９８を参照）。
【００５４】
抗体について、前記「免疫学的に特異的な」という用語は、対象タンパク質の１若しくはそれ以上のエピトープに結合する抗体を指すが、抗原性生体分子の混合集団を含むサンプル中の他の分子を十分認識し、結合することはない。
【００５５】
「キメラ」または「キメラ化」抗体（免疫グロブリン）は、所望の生物活性を示す限り、前記重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種に由来するか、特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同的であるが、前記鎖の残りの部分が別の種に由来するか、別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体、またそのような抗体のフラグメントの対応する配列と同一または相同的である抗体を指す（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１：６８５１−６８５５，１９８４）。
【００５６】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそのフラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合配列など）である。ヒト化抗体は大部分がヒト免疫グロブリン（受容抗体）であり、前記受容抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、望みの特異性、親和性、および能力を有する、マウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種のＣＤＲ残基（供与抗体）によって置換される。場合によっては、前記ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）の残基が、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、前記供与抗体、または移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列にはない残基を有することができる。これらの修飾を行い、抗体性能をさらに洗練し、最適化する。一般に、前記ヒト化抗体は少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを有し、前記ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域と一致し、前記ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域と一致する。前記ヒト化抗体は、選択的に免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの一部も有する。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５，１９８６；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９，１９８８；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６，１９９２を参照。
【００５７】
「完全ヒト」とは、抗体などの免疫グロブリンを指し、前記分子全体がヒト由来であるか、前記抗体のヒト型と同一のアミノ酸配列から成る。
【００５８】
「ハイブリドーマ」は、培養した腫瘍化リンパ球と、親細胞の特異的免疫力を発現し初回抗原刺激を受けたＢまたはＴリンパ球との細胞融合生成物を指す。
【００５９】
他に定義のない限り、本明細書で用いたすべての技術および科学用語は、本発明に関連する当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で説明されたものと同一または同等のいかなる方法および材料も、本発明の検証実施に用いることができるが、好ましい材料および方法が本明細書において説明される。本発明を説明および請求項において、以下の用語が使用される。
【００６０】
様々な特許および他の文献が本明細書に引用されており、それぞれの全開示内容は参照によって本明細書中に組み込まれる。
【００６１】
抗体
本発明の抗体は特異的にＦＲＡに結合し、インアウト活性（つまり、選択的に免疫エフェクター活性を誘導し、エンドシアリン陽性細胞に内部移行する能力）を示す。一部の実施形態では、前記抗体がＬＫ２６またはＭＯｖ１８と同じエピトープに結合する。他の実施形態では、前記抗体がＬＫ２６またはＭＯｖ１８が結合したエピトープ以外のエピトープと結合する。本発明の抗体が結合するＦＲＡは好ましくは哺乳類であり、さらに好ましくはヒトである。ヒトＦＲＡは配列ＩＤ番号：１でコードされ、配列ＩＤ番号：２のアミノ酸配列を有する。
【００６２】
【表２】
2009521206.tif 000004
【００６３】
【表３】
2009521206.tif 000005
【００６４】
好ましい抗体、および本発明の方法で使用するのに適した抗体には、例えば、完全ヒト抗体、ヒト抗体相同体、単鎖抗体、ヒト化抗体相同体、キメラ抗体、キメラ抗体相同体、および抗体重鎖または軽鎖またはその混合物の単量体または二量体を含む。    
本発明の抗体には、タイプＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ（およびそのサブタイプ）を含む、すべてのアイソタイプの完全な免疫グロブリンを含む。前記免疫グロブリンの軽鎖はκまたはλである。
【００６５】
本発明の抗体には、抗原結合特異性を保持する完全な抗体の一部、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ｖ）フラグメント、重鎖単量体または二量体、軽鎖単量体または二量体、重鎖１つおよび軽鎖１つから成る二量体などを含む。従って、抗原結合フラグメント、および前述の抗体由来の、完全な長さの二量体または三量体ポリペプチドは、それ自体がインアウト活性を生じるために有用である。
【００６６】
齧歯類モノクローナル抗体をヒトの治療薬として直接使用すると、ヒト抗齧歯類抗体（「ＨＡＲＡ（ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉ−ｒｏｄｅｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」）反応が生じ、この反応は前記齧歯類由来抗体を投与した有意に多数の患者において発生することが分かった（Ｋｈａｚａｅｌｉ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１５：４２−５２）。齧歯類のアミノ酸配列がより少ないキメラ抗体は、ヒトで免疫反応を誘発するという問題が回避できると考えられた。
【００６７】
キメラ抗体は組み換えＤＮＡ技術によって作製することができ、この技術では、免疫グロブリン軽鎖、重鎖、またはその両方のヒンジおよび定常領域のすべてまたは一部が、別の動物の免疫グロブリン軽鎖または重鎖の対応領域と置換されてきた。この方法では、前記親モノクローナル抗体の抗原結合部分が、別の種の抗体の骨格に移植（グラフト）される。Ｗｉｎｔｅｒらの欧州特許第ＥＰ  ０２３９４００号明細書に報告された１つのアプローチでは、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン可変領域のＣＤＲｓをマウス可変領域ドメインのＣＤＲｓと置換するなど、１つの種の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）と別の種のＣＤＲｓとの置換について報告している。これらの変化させた抗体は、その後ヒト免疫グロブリン定常領域と組み合わせることにより、置換された前記抗原に特異的なマウスＣＤＲｓを除いてはヒトである抗体を形成する。抗体のＣＤＲ領域を移植（グラフト）する方法は、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６において見出される。
【００６８】
限定されない例として、ＣＤＲグラフトの実行方法は、前記標的抗原（例えば、ＦＲＡ）に結合する対象抗体の重鎖および軽鎖のマウスでの配列を決定し、前記ＣＤＲ  ＤＮＡ配列の遺伝子を操作し、部位特異的突然変異によりこれらのアミノ酸配列を対応するヒトＶ領域に与えることで、実行することができる。前記望みのアイソタイプのヒト定常領域の遺伝子セグメントを追加し、前記キメラ重鎖および軽鎖遺伝子を哺乳類細胞に同時発現させ、可溶性抗体を作製する。典型的な発現細胞は、チャイニーズハムスター卵巣由来（ＣＨＯ）細胞である。他の発現細胞には、ＨＥＫ２９３および骨髄腫細胞を含む。前記キメラ抗体を作製するのに適した方法は、例えばＪｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９；およびＯｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：３８３３において見出される。
【００６９】
ＨＡＲＡ反応の問題を回避するため、さらに抗体を改良すると、「ヒト化抗体」の開発につながる。ヒト化抗体は組み換えＤＮＡ技術により作製され、この技術では、抗原の結合に不必要なヒト免疫グロブリン軽鎖または重鎖のアミノ酸の少なくとも１つが、対応する非ヒト哺乳類免疫グロブリン軽鎖または重鎖のアミノ酸と置換されている。例えば、前記免疫グロブリンがマウスモノクローナル抗体の場合、抗原の結合に必要のない少なくとも１つのアミノ酸が、対応するヒト抗体のその部位にあるアミノ酸を用いて置換されている。いかなる特定の操作理論に縛られることなく、前記モノクローナル抗体の「ヒト化」は外来性免疫グロブリン分子に対するヒトの免疫反応を抑制すると考えられている。
【００７０】
Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３および国際公開第ＷＯ  ９０／０７８６１号パンフレットでは、ヒト化抗体の調製について報告している。ヒトおよびマウスの可変フレームワーク領域は、タンパク質配列の相同性が最適となるように選択される。前記マウス可変領域の三次構造はコンピューターによりモデル化され、相同的なヒトのフレームワークに重ね合わせることにより、アミノ酸残基と前記マウスＣＤＲｓとの最適な相互作用が示された。これにより、抗原に対する結合親和性（ＣＤＲを移植したキメラ抗体を作製する際は通常低下する）が向上した抗体が開発された。ヒト化抗体を作製する代替アプローチは当該分野で周知であり、例えばＴｅｍｐｅｓｔ（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：２６６−２７１において報告されている。
【００７１】
本発明の抗体には、例えば、あらゆるタイプの分子と前記抗体との共有結合により、共有結合が前記抗体のエピトープへの結合を阻害しないように修飾された誘導体を含む。適切な誘導体の例には、これに限定されるものではないが、グリコシル化抗体およびフラグメント、アセチル化抗体およびフラグメント、ポリエチレングリコール化抗体およびフラグメント、リン酸化抗体およびフラグメント、およびアミド化抗体およびフラグメントが含まれる。本発明の抗体とその誘導体は、それ自体、既知の保護基／封鎖基、タンパク質分解的切断、細胞のリガンドまたは他のタンパク質との結合などにより誘導体化されていても良い。さらに、本発明の抗体とその誘導体は、１若しくはそれ以上の非古典的アミノ酸を含んでいても良い。
【００７２】
本発明の抗体には、単一または複数のアミノ酸置換、欠失、付加、または交換され、本発明の抗体の生物学的特性（例えば、内部移行、結合親和性または結合活性、または免疫エフェクター活性）を保持した変異体が含まれる。当業者であれば、単一または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、または交換された変異体を作製することができる。これらの変異体には、とりわけ、（ａ）１若しくはそれ以上のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸と置換された変異体、（ｂ）１若しくはそれ以上のアミノ酸がポリペプチドに追加されるか、ポリペプチドから欠失した変異体、（ｃ）１若しくはそれ以上のアミノ酸が置換基を含む変異体、および（ｄ）例えば、抗体エピトープ、ポリヒスチジン配列、ビオチン部分など、前記ポリペプチドに有用な特性を与えることができる、融合パートナー、タンパク質標識、または他の化学部分など、別のペプチドまたはポリペプチドと、前記ポリペプチドが融合した変異体を含む。本発明の抗体は、保存的または非保存的な位置で、１種のアミノ酸残基が別の種の対応する残基と置換された変異体を含む。別の実施形態において、非保存的な位置のアミノ酸残基は保存的または非保存的残基と置換される。遺伝的（抑制、欠失、変異など）、化学的、および酵素的技術を含む、これらの変異体を得る技術は、当業者に周知である。本発明の抗体には抗体フラグメントが含まれる。「フラグメント」とはポリペプチド配列を指し、好ましくは少なくとも約４０、より好ましくは少なくとも約５０、より好ましくは約６０、より好ましくは少なくとも約７０、より好ましくは少なくとも約８０、より好ましくは少なくとも約９０、より好ましくは少なくとも約１００アミノ酸長であり、例えば、ＦＲＡ結合親和性または結合活性、内部移行能力、免疫エフェクター活性など、前記完全な長さの配列の生物活性または免疫活性を一部保持する。
【００７３】
本発明には、ＦＲＡ関連癌患者の末梢血単核細胞に由来する抗体など、完全ヒト抗体も含む。そのような細胞は骨髄腫細胞と融合し、例えば完全ヒト抗ＦＲＡ抗体を産生するハイブリドーマ細胞を形成することができる。
【００７４】
本発明の抗体とその誘導体は、解離定数（Ｋｄ）が１×１０−２未満である結合親和性を有する。一部の実施形態によると、前記Ｋｄは１×１０−３未満である。他の実施形態によると、前記Ｋｄは１×１０−４未満である。一部の実施形態によると、前記Ｋｄは１×１０−５未満である。さらに他の実施形態によると、前記Ｋｄは１×１０−６未満である。他の実施形態によると、前記Ｋｄは１×１０−７未満である。他の実施形態によると、前記Ｋｄは１×１０−８未満である。他の実施形態によると、前記Ｋｄは１×１０−９未満である。他の実施形態によると、前記Ｋｄは１×１０−１０未満である。さらに他の実施形態によると、前記Ｋｄは１×１０−１１未満である。一部の実施形態によると、前記Ｋｄは１×１０−１２未満である。他の実施形態によると、前記Ｋｄは１×１０−１３未満である。他の実施形態によると、前記Ｋｄは１×１０−１４未満である。さらに他の実施形態によると、前記Ｋｄは１×１０−１５未満である。
【００７５】
いかなる特定の操作理論にも縛られることなく、本発明の抗体は、前記抗体の両方の「アーム（ａｒｍ）」（Ｆａｂフラグメント）の増加された親和力により、ＦＲＡ分子を分離するため、特にＦＲＡの結合に有用であると考えられている。このため前記抗体の解離定数（Ｋｄ）が低下し、前記観察された親和性（ＫＤ）が全体的に上昇する。さらに、本発明の抗体は、前記抗体−抗原複合体の内部移行を可能にするエピトープに結合する必要がある。本発明の抗体は正常組織よりも腫瘍組織に強固に結合し、細胞傷害性を有する免疫細胞を引き寄せ、結合薬物を送達し治療効果を追加するために内部移行することができるため、これらの特徴は腫瘍の標的化に特に適している。
【００７６】
本発明の抗体は、単独、または細胞傷害性薬または細胞増殖抑制物質など、１若しくはそれ以上の生体分子または化学治療物質と併用して使用することが可能である。一部の実施形態では、前記化学治療物質が、鉛−２１２、ビスマス−２１２、アスタチン−２１１、ヨウ素−１３１、スカンジウム−４７、レニウム−１８６、レニウム−１８８、イットリウム−９０、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２５、臭素−７７、インジウム−１１１、およびホウ素−１０またはアクチニドなどの核分裂性核種を含む（これに限定されるものではないが）放射性同位元素である。他の実施形態では、前記化学治療物質がリシン、修飾シュードモナスエンテロトキシンＡ、カリケアマイシン、アドリアマイシン、５−フルオロウラシルなどを含む（これに限定されるものではないが）毒素または細胞傷害性薬である。そのような薬物への抗体および抗体フラグメントの結合方法は、文献に知られている。
【００７７】
本発明には、本発明のインアウト抗体を産生する細胞も含まれる。本発明の抗体産生細胞は細菌、酵母、昆虫、動物細胞であり、好ましくは哺乳類細胞である。例えば、本発明の抗体産生細胞には、例えばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞などの昆虫細胞、例えば酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）細胞などの酵母細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣由来細胞、胎仔ハムスター腎細胞、ヒト胎児腎臓株２９３、正常イヌ腎臓細胞株、正常ネコ腎臓細胞株、サル腎細胞、アフリカミドリザル腎細胞、ＣＯＳ細胞、および非腫瘍化マウス筋芽細胞Ｇ８細胞、線維芽細胞株、骨髄腫細胞株、マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＬＭＴＫ細胞、マウスｓｅｒｔｏｌｉ細胞、ヒト子宮頸癌細胞、バッファローラット肝細胞、ヒト肺細胞、ヒト肝細胞、マウス乳癌細胞、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ  ５細胞、およびＦＳ４細胞などの哺乳類細胞を含む。抗体産生細胞は２００６年４月２４日にＡｍｅｒ．Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔ．Ｃｏｌｌ．（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０−２２０９）に掲載され、受入番号＿＿＿＿＿＿＿を割り当てられた。本発明のインアウト抗体の例は、そのような細胞によって産生された抗体である。
【００７８】
核酸
本発明には、本発明の抗ＦＲＡ抗体の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸も含まれる。本明細書において用いられる「核酸」または「核酸分子」は、一本鎖または二本鎖のすべてのＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指し、一本鎖の場合は直鎖または環状型の相補的配列の分子を指す。核酸分子について考察する場合、５’から３’方向の配列を提供する通常の慣習に従い、特定の核酸分子の配列または構造について本明細書に説明することがある。本発明の一部の実施形態では、核酸分子は「単離」されている。この用語は、核酸分子に用いられる場合、由来する生物体の天然型ゲノムに隣接する配列から分離された核酸分子を指す。例えば、「単離核酸」は、プラスミドまたはウイルスベクターなどのベクターに挿入されるか、原核または真核細胞または宿主微生物のゲノムＤＮＡに組み込まれたＤＮＡ分子を有する。ＲＮＡに用いる場合、前記「単離核酸」という用語は、主に、上記に定義した単離ＤＮＡ分子によってコードされるＲＮＡ分子を指す。あるいは、前記用語は、天然の状態（つまり、細胞または組織中）で関連すると考えられる他の核酸から十分分離されたＲＮＡ分子を指す。単離核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、さらに生物学的方法または合成法によって直接作製されたか、その作製中に存在する他の成分から分離された分子を示す。
【００７９】
本発明の核酸には、本発明の核酸と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、最も好ましくは少なくとも約９８％の相同性を有する核酸を含む。特定の配列を指す場合の「％類似性」、「％同一性」および「％相同性」という用語は、ウィスコンシン大学ＧＣＧソフトウェアプログラムに定義されたとおりに使用する。本発明の核酸には相補的核酸も含む。いくつかの例では、前記配列を並べたとき、完全に相補的となる（ミスマッチなし）。他の例では、前記配列に最高約２０％のミスマッチがある。
【００８０】
本発明の核酸には、本発明の核酸のフラグメントも含まれる。「フラグメント」は、好ましくは少なくとも約１０核酸長、より好ましくは約４０核酸、最も好ましくは約１００核酸長の核酸配列を指す。「フラグメント」は、１若しくはそれ以上の欠失、挿入、または置換を含む、少なくとも約１００連続ヌクレオチド長を意味することもできる。「フラグメント」は、遺伝子の全コード化配列を意味し、５’および３’非翻訳領域を含む場合がある。
【００８１】
本発明の核酸はベクターにクローン化することもできる。「ベクター」はプラスミド、コスミド、バクミド、ファージ、人工染色体（ＢＡＣ、ＹＡＣ）またはウイルスなどのレプリコンであり、これに別の遺伝子配列または遺伝要素（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を挿入し、結合した配列または要素の複製を作ることができる。「レプリコン」は例えば、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージ、人工染色体（ＢＡＣ、ＹＡＣ）またはウイルスなどの遺伝的要素であり、大部分は独自の制御で複製することができる。レプリコンはＲＮＡまたはＤＮＡとすることができ、一本鎖または二本鎖とすることができる。いくつかの実施形態では、前記発現ベクターに構成的に活性なプロモーターセグメント（これに限定されるものではないが、ＣＭＶ、ＳＶ４０、伸長因子、またはＬＴＲ配列）またはステロイド誘導ｐＩＮＤベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの誘導プロモーター配列を含み、前記核酸の発現を制御することができる。本発明の発現ベクターは、さらに例えば内部リボソーム侵入部位などの制御配列を有することもある。前記発現ベクターは、例えばトランスフェクションにより細胞に導入することができる。
【００８２】
本発明の抗体をコードする核酸は、組み換えにより発現させることができる。本発明の発現細胞には、例えばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞など、既知の昆虫発現細胞株を含む。前記発現細胞株は、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ細胞などの酵母細胞株とすることもできる。前記発現細胞は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞、胎仔ハムスター腎細胞、ヒト胎児腎臓株２９３、正常イヌ腎臓細胞株、正常ネコ腎臓細胞株、サル腎細胞、アフリカミドリザル腎細胞、ＣＯＳ細胞、および非腫瘍化マウス筋芽細胞Ｇ８細胞、線維芽細胞株、骨髄腫細胞株、マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＬＭＴＫ細胞、マウスｓｅｒｔｏｌｉ細胞、ヒト子宮頸癌細胞、バッファローラット肝細胞、ヒト肺細胞、ヒト肝細胞、マウス乳房腫瘍細胞、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、およびＦＳ４細胞などの哺乳類細胞とすることもできる。本発明の核酸は、例えばトランスフェクションにより細胞に導入することができる。組み換えにより発現された抗体は、例えば細胞の成長培地から回収することができる。
【００８３】
抗ＦＲＡインアウト抗体の作製法
免疫化動物
本発明では、ＦＲＡに特異的に結合するインアウトモノクローナル抗体を作製する方法も提供する。ＦＲＡは、タンパク質を単離および精製するための様々な既知の技術を利用し、細胞または組み換え系から精製することができる。例えば、これに限定されるものではないが、ＦＲＡは前記タンパク質の見かけ上の分子量に基づき、前記タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに流し、前記タンパク質を膜にブロットすることで単離することができる。その後、ＦＲＡに対応する適切なサイズのバンドを膜から切り取り、直接動物で免疫原として利用するか、まず前記タンパク質を前記膜から抽出または溶出してから利用することができる。代替例として、前記タンパク質はサイズ排除クロマトグラフィーのみ、または他の単離および精製法との併用で単離することができる。他の精製法は、Ｚｏｌａ，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＵＳＥ  ＯＦ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＥＤ  ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＤＥＲＩＶＡＴＩＶＥＳ  （ＢＡＳＩＣＳ：  ＦＲＯＭ  ＢＡＣＫＧＲＯＵＮＤ  ＴＯ  ＢＥＮＣＨ）  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０００；ＢＡＳＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＺＡＴＩＯＮ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １１，"Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，"Ｈｏｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｂｅｔｈｅｌｌ，Ｅｄｓ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，２０００；ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ（ＳＰＲＩＮＧＥＲ  ＬＡＢ  ＭＡＮＵＡＬ．），Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，２００１などの標準的な参考書籍で参照可能である。
【００８４】
抗ＦＲＡインアウト抗体を作製する１つの戦略には、ＦＲＡ発現細胞を持つ動物を免疫化することを含む。そのように免疫化した動物は、前記タンパク質に対する抗体を産生する。ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ&Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７を参照）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ４：７２を参照）、およびヒトモノクローナル抗体を作製するＥＢＶハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅ，ｅｔ  ａｌ．ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５，ｐｐ．７７−９６を参照）を含む（これに限定されるものではないが）、モノクローナル抗体を作製する標準的な方法が知られている。
【００８５】
本発明の抗体は、インビボまたはインビトロで作製することができる。インビボでの抗体作製においては、一般的に動物がエンドシアリンの免疫原性部分で免疫化される。前記抗原または抗原陽性細胞は、一般的に免疫原性を促進するアジュバントと併用される。アジュバントは免疫化に使用する種によって異なる。アジュバントの例には、（これに限定されるものではないが）フロイント完全アジュバント（「ＦＣＡ（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ）」）、フロイント不完全アジュバント（「ＦＩＡ（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ」）、無機質ゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン）、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン（「ＫＬＨ（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）」）、ジニトロフェノール（「ＤＮＰ（ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ）」）、およびカルメット・ゲラン桿菌（「ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ」）およびｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍなどの潜在的に有用なヒトアジュバントを含む。そのようなアジュバントは当該分野で周知である。
【００８６】
免疫化は周知の方法により達成することができる。用量と免疫化法は、免疫化される哺乳類の種、その免疫状態、体重、および／または表面積の計算値などに依存する。典型的には、免疫化する哺乳類から血清を採取し、例えば、以下に説明する適切なスクリーニング法により抗ＦＲＡ抗体を分析する。
【００８７】
免疫化動物の脾細胞は、（前記抗体産生Ｂ細胞を含む）前記脾細胞と骨髄腫株などの不死化細胞株を融合することで不死化することができる。典型的には、骨髄腫細胞株は前記脾細胞ドナーと同じ種のものとする。一実施形態では、前記不死化細胞株がヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む培地（「ＨＡＴ培地」）に感受性を示す。一部の実施形態では、前記骨髄腫細胞がエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）感染陰性である。好適な実施形態では、前記骨髄腫細胞がＨＡＴ感受性、ＥＢＶ陰性、およびＩｇ発現陰性である。すべての適切な骨髄腫を使用することができる。マウスハイブリドーマは、マウス骨髄腫細胞株（例えば、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３、またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫株）により作製することができる。これらのマウス骨髄腫株はＡＴＣＣから入手できる。これらの骨髄腫細胞は、前記ドナー脾細胞のポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、好ましくは１５００分子量のポリエチレングリコール（「ＰＥＧ１５００」）に融合する。前記融合で得られるハイブリドーマ細胞は、未融合の骨髄腫細胞と非生産的に融合された骨髄腫細胞を死滅させるＨＡＴ培地で選択される。未融合の脾細胞は培養時に短期間で死滅する。いくつかの実施形態では、前記骨髄腫細胞が免疫グロブリン遺伝子を発現しない。
【００８８】
以下に説明するようなスクリーニング方法で検出される、所望の抗体を産生するハイブリドーマは、培養または動物で抗体を作製するために使用することができる。例えば、前記ハイブリドーマ細胞は、前記ハイブリドーマ細胞が前記培地に前記モノクローナル抗体を十分分泌できる条件および時間で、培養液中で培養することができる。これらの技術と培地は、当業者に周知である。或いは、前記ハイブリドーマ細胞を非免疫化動物の腹膜に注入することができる。前記細胞は腹腔で増殖し、前記抗体を分泌し、これが腹水として蓄積する。前記腹水は、前記モノクローナル抗体が豊富な供給源として、腹腔からシリンジで抜くことができる。
【００８９】
ヒト抗体を作製するための別の限定されない方法は米国特許第５，７８９，６５０号明細書に報告されており、この明細書では、自らの内因性免疫グロブリン遺伝子が不活性化され、別の種（例えば、ヒト）の抗体を産生するトランスジェニック哺乳類について説明している。前記異種抗体の遺伝子は、ヒト免疫グロブリン遺伝子によってコードされている。再配列されていない免疫グロブリンのコード領域を含む導入遺伝子は、非ヒト動物に導入される。得られたトランスジェニック動物は、前記トランスジェニック免疫グロブリン配列を機能的に再配列し、ヒト免疫グロブリン遺伝子でコードされた様々なアイソタイプの抗体レパートリーを産生することができる。前記トランスジェニック動物のＢ細胞は、その後、不死化細胞株（例えば、骨髄腫細胞）と融合させるなど、様々な方法のいずれかによって不死化される。
【００９０】
抗ＦＲＡインアウト抗体は、当該分野で既知の様々な技術によりインビトロで調整することができる。例えば、（これに限定されるものではないが）抗ＦＲＡ完全ヒトモノクローナル抗体は、インビトロで初回抗原刺激したヒト碑細胞を用いて調整することができる（Ｂｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８６−９５）。
【００９１】
或いは、例えば、本発明の抗体を「レパートリークローニング」により調整することができる（Ｐｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：２４３２−２４３６；およびＨｕａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｔｏｌｌａｒ（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １４１：２２７−２３６）。さらに、米国特許第５，７９８，２３０号明細書では、エプスタインバーウイルス核抗原２（ＥＢＮＡ２）を発現したエプスタインバーウイルスに感染させることで不死化した、ヒトＢ抗体産生Ｂ細胞のヒトモノクローナル抗体の調整について報告している。その後不死化に必要なＥＢＮＡ２を不活化し、抗体力価を上昇させる。
【００９２】
別の実施形態では、抗ＦＲＡ  インアウト抗体が末梢血単核細胞（「ＰＢＭＣｓ」）のインビトロでの免疫化によって形成される。これは、例えば文献に報告された方法を用いるなど、当該分野で既知の方法により達成することができる（Ｚａｆｉｒｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００：１８１−１９０）。
【００９３】
抗ＦＲＡインアウト抗体を作製する別の戦略では、ＦＲＡの膜結合型の領域に対応するペプチドを持つ動物を免疫化する工程を含み、これにより確実な免疫エフェクター活性を保持する抗体を内部移行させる。そのように免疫化した動物は、前記タンパク質に対する抗体を産生する。ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ  &  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７を参照）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ４：７２を参照）、およびヒトモノクローナル抗体を作製するＥＢＶハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅ，ｅｔ  ａｌ．ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５，ｐｐ．７７−９６を参照）を含む（これに限定されるものではないが）モノクローナル抗体を作製する標準的な方法が知られている。
【００９４】
本発明の一実施形態では、インビトロでの免疫化法がハイブリドーマ細胞の定向進化により補完され、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＰＭＳ２−１３４、ＰＭＳＲ２、ＰＭＳＲ３、ＭＬＨ１、ＭＬＨ２、ＭＬＨ３、ＭＬＨ４、ＭＬＨ５、ＭＬＨ６、ＰＭＳＬ９、ＭＳＨ１、およびＭＳＨ２などのミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子が、前記碑細胞の融合後に前記ハイブリドーマ細胞に導入されるか、融合前に前記骨髄腫細胞に導入される。前記ドミナントネガティブ突然変異を含む細胞は超変異となり、形質移入していない対照細胞よりも高い割合で変異を蓄積する。前記突然変異細胞のプールから、高親和性抗体を産生するか、高力価抗体を産生するか、単純に特定の条件でより早く、良好に増殖するクローンをスクリーニングすることができる。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を用いて超変異細胞を作製する方法は、２０００年１１月４日発行の米国特許第６，１４６，８９４号明細書に報告されている。代わりに、Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓらが２００２年７月１８日公開のＷＯ  ０２／０５４８５６「Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｒｅｐａｉｒ」に報告した、ミスマッチ修復の化学的阻害剤を用いて、ミスマッチ修復を阻害することもできる。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子またはミスマッチ修復の化学的阻害剤を用いて抗体を強化する方法は、クローン化免疫グロブリン遺伝子も発現した哺乳類の発現細胞に適用されることもある。前記ドミナントネガティブ対立遺伝子をオフとし、誘導できる場合は前記細胞から排除することで、前記細胞をもう一度遺伝的に安定させ、異常に高い割合で突然変異が蓄積しないようにできるという点において、前記ドミナントネガティブ対立遺伝子を発現する細胞は「矯正」することができる。
【００９５】
インアウト抗体のスクリーニング
ＦＲＡに特異的に結合するインアウト抗体のスクリーニングは、酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を利用し、免疫エフェクター活性を持つ抗体をスクリーニングする、および／または内部移行をアッセイすることで達成することができる。免疫エフェクター活性を示す抗体は、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）をモニターする標準的な免疫エフェクター法を利用することで同定することができる。内部移行可能な抗体は、前記抗体を蛍光色素またはプロドラッグなどの検出可能な標識と結合させ、可視化した内部移行能力または毒性をモニターすることで、同定可能である。１若しくはそれ以上のこれらのアッセイ（ＥＬＩＳＡ、免疫エフェクター法、および内部移行法）は、本発明のインアウト抗体を同定する任意の順序で実行することができる。
【００９６】
例えば、前記ＥＬＩＳＡは、抗原（タンパク質全体またはペプチド）を免疫化したコーティングマイクロタイタープレートを有することもある。陽性反応を示したクローンの抗体は、ＦＲＡに対するＥＬＩＳＡを基本としたアッセイで反応性をスクリーニングすることができる。葉酸受容体アルファ型に特異的な抗体は、１若しくはそれ以上の他の葉酸受容体アイソタイプを利用し、ＥＬＩＳＡで同定することができる。ＦＲＡに対して反応性を示す抗体を産生するクローンは、さらなる発展と開発のために選択される。インアウト活性を示すＦＲＡ反応性抗体は、例えば、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）をモニターする標準的な免疫エフェクター法を用いて確認することができる。免疫エフェクター活性を示すＦＲＡ特異的抗体については、次に蛍光色素またはプロドラッグと結合し、可視化した内部移行能力、またはプロドラッグが内部移行し、前記抗体が遊離することで前記毒素が生じる際に発生する毒性をモニターすることができる。
【００９７】
抗体の薬学的組成物
本発明の別の観点によると、本発明の抗エンドシアリン抗体の医薬品を特徴としている。前記医薬品を使用し、患者のエンドシアリン陽性細胞の成長を抑制または軽減することができる。特定の実施形態では、前記医薬品が製剤化され、注射または注入により投与される。
【００９８】
本発明の薬学的組成物は、さらに１若しくはそれ以上の生体分子、化学治療物質を有していても良い。一部の実施形態において、前記抗体は生体分子または化学治療物質に結合する。適切な化学治療物質は、これに限定されるものではないが、鉛−２１２、ビスマス−２１２、アスタチン−２１１、ヨウ素−１３１、スカンジウム−４７、レニウム−１８６、レニウム−１８８、イットリウム−９０、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２５、臭素−７７、インジウム−１１１、およびホウ素−１０またはアクチニドなどの核分裂性核種を含む放射性同位元素を含む。他の実施形態では、前記化学治療物質がリシン、修飾シュードモナスエンテロトキシンＡ、カリケアマイシン、アドリアマイシン、５−フルオロウラシルなどを含む（これに限定されるものではないが）、毒素または細胞傷害性薬である。
【００９９】
本発明の医薬品は、薬学的に許容される担体または媒体とともに製剤化されることもある。適切な薬学的に許容される担体には、水、ＰＢＳ、食塩水（リンガー溶液など）、アルコール、オイル、ゼラチン、およびラクトース、アミロール、またはデンプンなどの炭水化物、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、およびポリビニル・ピロリジンを含む。そのような製剤は滅菌し、望ましい場合は、潤滑剤、保存料、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響する塩、緩衝液、および着色剤などの助剤と混合することができる。本発明での使用に適した薬学的担体は当該分野で既知であり、例えばＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１７版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ペンシルバニア州イーストン）に説明されている。
【０１００】
キット
本発明のさらに別の観点では、インビトロまたはインビボでＦＲＡ陽性細胞の成長を阻害または抑制するキットが提供される。また、インビトロまたはインビボでＦＲＡ陽性細胞の有無を確認するキットも提供される。
【０１０１】
本発明のキットは、本発明の抗体または抗体組成、およびＦＲＡ陽性細胞、好ましくは異型細胞の成長をインビトロまたはインビボで阻害または抑制する方法、または生物サンプル中のＦＲＡ陽性細胞、好ましくは異型細胞の有無を同定する方法において、前記キットを使用するための使用説明書を有する。前記キットは少なくとも１つの生体分子、抗葉酸化合物、または化学治療物質を有することができる。前記キットは、少なくとも１つの診断試薬を有することができる。診断試薬の例は、例えば放射性、蛍光性、または発色試薬（例えば、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ）などの（これに限定されるものではないが）検出可能な標識である。前記検出可能な標識は酵素を有することもある。前記キットは、前記抗体または抗体組成を、例えば注射または注入により投与するための使用説明書および／または手段を有することもある。
【０１０２】
ＦＲＡ陽性細胞の検出法
本発明の方法には、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、または肺癌細胞を含む（これに限定されるものではないが）、表面にＦＲＡを提示する、異型細胞などの細胞を検出する方法を含む。前記方法は、生物サンプルに対してインビトロで、またはインビボで実行することができる。本発明に沿ったＦＲＡ陽性細胞の検出方法は、本発明の抗ＦＲＡ抗体を生物サンプルと接触させる工程または本発明の抗ＦＲＡ抗体を患者に投与する工程（前記抗体は例えば放射性、蛍光性、または発色試薬（例えば、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ）などの（これに限定されるものではないが）検出可能な標識で標識される）、および前記抗体の細胞への結合を決定する工程を有する。前記検出可能な標識は酵素とすることもある。
【０１０３】
ＦＲＡ陽性細胞の成長を抑制する方法
本発明のインアウト抗ＦＲＡ抗体は、インビトロまたはインビボでＦＲＡ陽性細胞の成長を抑制するための使用に適している。本発明の方法は、ＦＲＡの発現増加に伴う腫瘍状態を有すると同定されたヒトおよび非ヒト動物での使用に適している。本発明の利益を受ける非ヒト動物には、ペット、外来性（例えば、動物園の動物）および国産家畜を含む。好ましくは、前記非ヒト動物は哺乳類である。
【０１０４】
本発明は、正常組織に関連し、新生物でＦＲＡの発現が増加することで特徴付けられる、形成異常症を有すると同定されたヒトまたは動物患者での使用に適している。そのような患者がそのような状態を治療する必要があると同定されると、前記状態の治療を達成するため、本発明の方法が適応されることがある。治療可能な異型組織には、（これに限定されるものではないが）肺、膵臓、および前立腺を含む。
【０１０５】
本発明で使用される抗体とその誘導体は、カプセル、錠剤、水性懸濁液、溶液など、許容される剤形であれば経口投与することができる。前記抗体とその誘導体は、非経口投与することもできる。その場合、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、鼻腔内、局所、くも膜下腔内、肝内、病巣内、および頭蓋内注射または注入法の投与経路とする。一般に前記抗体と誘導体は、筋肉内または静脈内注射として提供される。
【０１０６】
本発明の抗体と誘導体は、単独、または許容されるアジュバント、賦形剤、および添加物を含む、薬学的に許容される担体との併用で投与することができる。
【０１０７】
本発明の抗体と誘導体は、１若しくはそれ以上の抗葉酸化合物を併用して投与することもできる。前記抗葉酸化合物には、これに限定されるものではないが、５−フルオロ−２’−デオキシ−ウリジン−５’−一リン酸（ＦｄＵＭＰ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、Ｌ−５−ホルミルテトラヒドロ葉酸（「ロイコボリン」）、Ｎ−［５−（Ｎ−（３，４−ジヒドロ−２−メチル−４−オキソキナゾリン−６−イル−メチル）−アミノ）−２−テニル）］−Ｌ−グルタミン酸（「ＺＤ１６４９」；「トムデックス」としても知られる）（Ｊａｃｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：５５７９−５５８６）、Ｎ−（４−（２−（２−アミノ−４，７−ジヒドロ−４−オキソ−３Ｈ−ピロロ［２，３−Ｄ］ピリミジン−５−イル）−エチル）−ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸（「マルチターゲット葉酸」（ｍｕｌｔｉ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｎｔｉｆｏｌａｔｅ：ＭＴＡ）、「ＬＹ２３１５１４」、「ＡＬＩＭＴＡ」、および「ペメトレキセド」としても知られる）（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５：４４５０−４４５４；Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：１１１６−１１２３）、（Ｓ）−２−（５）−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル−１−オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）−メチル）−アミノ）−オキソ−２−イソインドリニル）−グルタル酸（「ＧＷ１８４３Ｕ８９」）（Ｈａｎｌｏｎ  ａｎｄ  Ｆｅｒｏｎｅ（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：３３０１−３３０６）；（２Ｓ）−２−｛Ｏ−フルオロ−ｐ−［Ｎ−（２，７−ジメチル−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−６−イル−メチル）−Ｎ−プロパ−２−イニル）アミノ］ベンズアミド｝−４−（テトラゾール−５−イル）−酪酸（「ＺＤ９３３１」）（Ｊａｃｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３：９１１−９２１）；３，４−ジヒドロ−アミノ−６−メチル−４−オキソ−５−（４−ピリジルチオ）−キナゾリン（「ＡＧ３３７」；「チミタック（Ｔｈｙｍｉｔａｑ）」としても知られる）（Ｗｅｂｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３７：５０９−５１７；Ｒａｆｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１６：１３３１−１３４１）、およびＮα−（４−アミノ−４−デオキシプテロイル）−Ｎδ−（ヘミフタロイル−Ｌ−オルニチン）（「ＰＴ５２３」）（Ｒｈｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４５：７８３−７９１；Ｒｏｗｏｗｓｋｙ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．６：３２９−３５２）を含む。前記抗葉酸化合物は、本発明の抗ＦＲ−α抗体の前後、または同時に投与することができる。投与される抗葉酸化合物の量は現在使用されている用量とするか、増減することができ、これは前記患者に対して有害作用を生じずに、腫瘍の成長抑制または腫瘍の除去を達成することを基本に、医師が容易に決定することができる。
【０１０８】
本発明の抗体は、別の治療薬または診断薬の前後、または同時に投与することができる。例えば、本発明のインアウト抗体は単独、またはアドリアマイシン、ドキソルビシン、ゲムシタビン、または５−フルオロウラシルなど（これに限定されるものではないが）細胞傷害性薬と併用して投与することができる。本発明のインアウト抗体は単独、またはタルセバおよびアバスチンなど（これに限定されるものではないが）細胞増殖抑制物質と併用して投与することができる。本発明のインアウト抗体と誘導体は単独、またはワクチン剤と併用して投与することができる。本発明のインアウト抗体および誘導体は単独、またはインターロイキン−２、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、リツキサン、ゼバリン、ハーセプチン、エルビタックス、アバスチンなど（これに限定されるものではないが）別の生体分子と併用して投与することができる。
【０１０９】
本発明のインアウト抗体および誘導体は、非複合型または複合型抗体の均一混合物として、または非複合型または複合型インアウト抗体の不均一混合物として投与することができる。
【０１１０】
有効量は様々な因子によって決まり、これは体重、治療目標、最高耐量、使用される特定の製剤、投与経路などの様々なパラメーターによって、特定患者の用量を調整する熟練医師の権限の範囲内である。一般に、前記抗体またはその誘導体の用量レベルは、１日約０．００１および約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲が適切である。いくつかの実施形態では、前記抗体またはその誘導体の用量が１日約０．１〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重である。他の実施形態では、前記用量が約０．１ｍｇ／ｋｇ体重／日〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重／日である。さらに他の実施形態では、前記用量が約０．１ｍｇ／ｋｇ体重／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日である。投与はボーラスまたは注入とすることができる。投与は、１日１回または１日複数回とすることができる。さらに、投与は一定期間に複数回とすることができる。いくつかの実施形態では、前記用量を１〜１４日おきに投与する。いくつかの実施形態では、前記抗体またはその誘導体が腹腔内に約３〜１ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。他の実施形態では、前記抗体またはその誘導体は静脈内に約５〜１２．５ｍｇ／ｋｇで提供される。さらに他の実施形態では、前記抗体またはその誘導体が、血漿レベルを少なくとも約１ｕｇ／ｍｌに維持するように提供される。
【０１１１】
治療が有効であるかについては、様々な方法で評価することができる。１つの実施形態では、腫瘍成長の進行が遅くなったことで治療が有効であると判断する。他の実施形態では、前記腫瘍の縮小（つまり、前記腫瘍サイズの減少）によって治療が有効であると決定される。他の実施形態では、前記腫瘍の転移が抑制されたことで治療が有効であると決定される。さらに他の実施形態において、治療の有効性は、体重増加、体力回復、疼痛軽減、視界の回復、成長、および健康回復および疾患の抑制に関する前記患者からの主観的指標などの徴候を含む、前記患者の満足感（ｗｅｌｌ−ｂｅｉｎｇ）向上により決定される。
【０１１２】
以下の実施例は、本発明を図示するために提供されるものであり、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例１】
【０１１３】
ＦＲＡに結合可能なインアウト抗体
前記モノクローナル抗体ＭＬ−１は、ヒトＩｇＧ１定常領域にＦＲＡ特異的マウス抗体の可変ドメインのＣＤＲをグラフトすることで開発された。前記抗体はＦＲＡタンパク質およびＦＲＡ発現癌細胞に特異的に結合することが示され、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）を用いた場合、約５ｎＭの結合定数を有することが分かった。ＦＲＡ特異的な結合を証明するため、当業者が使用する方法に従い、９６ウェルフォーマットで組み換えＦＲＡを用いて抗原特異的ＥＬＩＳＡが行われた（図１Ａ）。ＥＬＩＳＡに反応することが分かった抗体は、製造業者のプロトコールに従い、さらにＦＡＣＳ分析によりＦＲＡ結合を分析した。図１Ｂに前記ＦＡＣＳ分析の代表的なデータを示しており、それによるとＦＲＡ発現卵巣腫瘍細胞はヌル細胞と対照的にＭＬ−１結合が陽性であった。抗原特異的ＥＬＩＳＡは、ＦＲＡ発現細胞全体、そのようなＦＲＡ発現細胞から得られた膜標本、または全ＦＲＡアミノ酸配列を含む合成重複ペプチドを用いてフォーマットすることもできる。
【実施例２】
【０１１４】
免疫エフェクター活性に対するＭＬ−１抗体の活性は、ＦＲＡ発現ＯＶＣＡＲ−３細胞株について、標準的な抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）分析により評価した。簡潔に述べると、ＯＶＣＡＲ−３標的細胞を完全成長培地（１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン含有ＲＰＭＩ−１６４０）中、平底９６ウェルマイクロプレートに播種した。翌日、前記完全培地を１００ｕｌのＣＨＯ−ＣＤ無血清培地（Ｓｉｇｍａ）と交換し、抗体含有ならし培地５０μｌを標的細胞に追加し、３７℃で２０分間インキュベートした。その後、２×１０５のエフェクター細胞を含む１００ｕｌの無血清培地を加え、５％ＣＯ２、３７℃で５〜６時間インキュベートした。エフェクター細胞はヒト末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ：ＰＢＭＣｓ）から誘導し、健常ドナーから単離した（Ｉｎｔｅｒｓｔａｔｅ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋより購入）。ＡＤＣＣにて使用する前に、ＰＢＭＣｓを約１０ｎｇ／ｍｌのヒト組み換え型インターロイキン２（Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む完全ＲＰＭＩ中に２．５×１０６／ｍｌで播種し、３７℃、５％ＣＯ２にて３日間、ＰＢＭＣｓを活性化した。次に、活性化ＰＢＭＣｓをエフェクター細胞：標的細胞比を５：１としてＯＶＣＡＲ−３細胞に追加し、この培地を３７℃、５％ＣＯ２にて５〜６時間インキュベートした。各ウェルから上清を回収し、ＥＬＩＳＡプレートに移し、以下のとおりＡＤＣＣを分析行った。ＡＤＣＣは乳酸脱水素酵素（ｌａｃｔａｓｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ＬＤＨ）、標準分析においてＡＤＣＣの測定に使用される内因性酵素の放出によってモニターした。ＬＤＨは、１００μｌのＬＤＨ基質（Ｒｏｃｈｅ）を上清に添加し、周囲温度で１０分間インキュベートすることによってモニターし、ＬＤＨによって変換された化学物質は分光光度法でＯＤ４９０にて検出可能であった。ＬＤＨ活性は、溶解標的細胞から放出される前記ＬＤＨ酵素の量と比例する。４９０ｎｍの吸光度（ＯＤ４９０）は分光光度法で得られる。２％トリトンＸを「最大値（ｍａｘ）」の陽性対照としてエフェクター細胞単独に追加し、抗体は加えてないがＰＢＭＣを伴った標的細胞は「自然値（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）」としての陰性対照とした。ＬＤＨ値を取得し、以下の式により細胞傷害性の割合を決定した。（サンプル値−自然値）／（最大値−自然値）×１００％（式中、「自然値」＝エフェクター細胞不在下での標的細胞の溶解、「最大値」＝２％トリトン混在下での標的細胞の溶解）。１００ｎｇ／ｍｌのＭＯＲＡｂ−Ａ９２（精製タンパク質Ａ）により誘発された細胞傷害性を陽性対照として使用する。１００ｎｇ／ｍｌの正常ヒトＩｇＧ１抗体を用い、非特異的細胞傷害性をモニターする。前記％細胞傷害性を各ウェル／クローンの抗体濃度で割って得られた比（つまり、比＝５０（％）／１００（ｎｇ／ｍｌ）＝０．５）を、エフェクター機能が高いと考えられるリードクローンを選択する基準として設定する。
【０１１５】
ＭＬ−１の分析において、対照Ｉｇあり、または抗体なしでインキュベートした細胞のＡＤＣＣ活性増強力（ｐ＝０．０１８）を示している（図２）。図２は、ＭＬ−１が強力な抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）活性を誘発することを証明している。ＦＲＡを発現する腫瘍細胞株ＯＶＣＡＲ３（標的と呼ぶ）をヒトＰＢＭＣｓのみ（抗体なし）、ＭＬ−１、または対照Ｉｇ（正常ＩｇＧ）とインキュベートした。細胞溶解時に発生する乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出をモニターすることにより、細胞培養液の殺細胞を分析した。ＭＬ−１はＦＲＡ発現細胞上でＡＤＣＣ活性を有していた。これらのデータは、ＭＬ−１が免疫エフェクター機能を介して細胞傷害作用を有するという所見を支持するものである。
【実施例３】
【０１１６】
ＭＬ−１はＦＲＡ発現細胞に結合すると内部移行する。この所見は、Ｈｕｍ−ＺＡＰ分析を用いた図３に示した。第２の免疫毒素は、２次抗体とリボソーム不活化タンパク質サポリンの複合体である。試験している１次抗体が内部移行すると、前記サポリンは前記２次抗体と結合して前記細胞に運ばれる。内部移行したサポリンがそのＩｇＧ複合体から一旦分離すると、タンパク質合成が阻害され、最終的に細胞死が引き起こされる。Ｈｕｍ−ＺＡＰ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｃａｔ＃ＩＴ−２２）は、ヒトモノクローナル抗体を認識するアフィニティー精製したヤギ抗ヒトＩｇＧ（分子量２１０ｋＤａ）の２次化学的複合体である。対照分子のヤギＩｇＧ−ＳＡＰ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｃａｔ＃ＩＴ−１９）は、正常なヤギＩｇＧとサポリンの複合体である。簡潔に述べると、１０％ＦＣＳ、２．０ｍＭグルタミン、１．０ｍＭピルビン酸ナトリウム、および０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸を含む８０ｕｌのＲＰＭＩ  １６４０中の平底９６ウェル組織培養プレートに、２５００／ウェルで細胞を播種した。２４時間後、１０μｌの１次抗体ＭＬ−１またはＭＯＲＡｂ−Ａ９２を１０μｌのＨｕｍ−ＺＡＰまたはヤギＩｇＧ−ＳＡＰとともに添加し、総量を１００ｕｌにした。実験では抗体の滴定を行い、１次抗体および２次抗体を対照として含ませた。４日後、分光光度法により生存細胞数を読み取るＰｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ（登録商標）細胞傷害性アッセイ（ｃａｔ＃  Ｇ３５８１）を用いて、細胞の生存率を評価した。すべての検査は３回ずつ行った。データは処理および未処理ウェルを比較することにより評価し、結果は対照のパーセントとして表した。図３に示すとおり、ＭＬ−１はＦＲＡを過剰発現したＯＶＣＡＲ−３細胞に内部移行した。ＭＬ−１非複合体（四角）と対照的に、サポリンに結合したＭＬ−１（ダイアモンド）で処理することにより細胞は死滅したが、アイソタイプ対照抗体ＭＯＲＡｂ−Ａ９２は複合または非複合毒素形態で細胞を死滅させなかった（それぞれ三角およびＸ）。対照としてＦＲＡを発現していない細胞を用い、ＭＬ−１は毒素複合体または非複合体で毒性作用を有していないことが示された。これらのデータは、ＭＬ−１がＦＲＡ提示細胞に内部移行するという所見を支持するものである。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１Ａ】図１は、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳによる、ＦＲＡ特異的結合抗体ＭＬ−１について示した図である。図１Ａは、インアウト活性を有するＦＲＡ特異的抗体について示した図である（ＭＬ−１）。様々な量の組み換え型ＦＲＡ抗原に特異的に結合可能な抗体を同定したＥＬＩＳＡを示した図である。ＥＬＩＳＡは、精製標本、半精製標本、膜標本、またはＦＲＡ発現細胞全体を用いてフォーマットすることも可能である。
【図１Ｂ】図１は、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳによる、ＦＲＡ特異的結合抗体ＭＬ−１について示した図である。図１Ｂは、ＦＲＡ−ヌルＨ２２６細胞では結合が認められないが、ＦＲＡ発現細胞（ＩＧＲＯＶ−１）に結合するＭＬ−１のＦＡＣＳ分析結果を示した図である。これらのデータは、ウエスタンブロット分析により確認された。
【図２】図２は、ＭＬ−１が強い抗体依存性細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＡＤＣＣ）活性を誘発することを示した図である。ＦＲＡを発現する腫瘍細胞株ＯＶＣＡＲ３（標的と呼ぶ）は、ヒト末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ：ＰＢＭＣｓ）単独（抗体なしのレーン）、ＭＬ−１と共に、または対照Ｉｇ（正常ＩｇＧ）とインキュベートした。細胞溶解時に発生する乳酸脱水素酵素（ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ＬＤＨ）の放出をモニターすることにより、細胞培養物の死滅について分析した。ＭＬ−１はＦＲＡ発現細胞に対してＡＤＣＣ活性を有する。
【図３】図３は、ＭＬ−１がＦＲＡ発現細胞に内部移行することを示した図である。図３は、アイソタイプ対照抗体ＭＯＲＡｂ−Ａ９２は複合体毒素形態または非複合毒素で細胞を死滅させなかったが（それぞれ三角およびＸ）、サポリンに結合したＭＬ−１（ダイアモンド）の殺細胞力をＭＬ−１非複合体（四角）と対比し示した図である。対照としてＦＲＡを発現していない細胞を用い、ＭＬ−１は毒素複合体または非複合体で毒性作用を示さないことが分かった（図示せず）。これらのデータは、ＭＬ−１がＦＲＡ提示細胞に内部移行するという所見を支持している。データは処理および未処理のウェルを比較することによって評価しており、結果は対照のパーセントとして表している。
【図１Ａ】
2009521206.tif 000006
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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