(57)【要約】グラム陽性細菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅが含まれる）由来の線毛および線毛様構造を単離する方法ならびにかかる単離された線毛を含む組成物を示す。これらの組成物は、抗体の産生および免疫刺激のための免疫原性組成物として有用である。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを阻害する方法およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのインヒビターを同定する方法も示す。上記線毛は、肺炎球菌および他のグラム陽性細菌の病原性で役割を果たし、特に、グラム陽性細菌感染の処置方法およびこれに対する免疫化で有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された連鎖球菌性の線毛。
【請求項２】
前記線毛が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ線毛である、請求項１に記載の線毛。
【請求項３】
前記線毛が、ＲｒｇＢタンパク質を含む、請求項２に記載の線毛。
【請求項４】
分子量が、２×１０６Ｄａ〜３×１０６Ｄａである、請求項１または請求項２に記載の線毛。
【請求項５】
酵素消化または機械的剪断によって細胞から分離された、請求項１または請求項２に記載の線毛。
【請求項６】
前記機械的剪断が、超音波処理を含む、請求項５に記載の線毛。
【請求項７】
細菌細胞を実質的に含まない、請求項１または請求項２に記載の線毛。
【請求項８】
請求項１または請求項２に記載の１つ以上の線毛を含む、免疫原性組成物。
【請求項９】
線毛を産生する細菌細胞を酵素消化または機械的剪断に供する工程および該細胞から該線毛を単離する工程を含む、請求項１または請求項２に記載の線毛を産生する方法。
【請求項１０】
グラム陽性細菌の線毛を単離する方法であって、該方法は、
グラム陽性細菌の線毛を産生する細菌細胞を酵素消化または機械的剪断に供する工程；および
該細胞から該線毛を単離する工程；
を含む、方法。
【請求項１１】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ線毛を単離する方法であって、該方法は、
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ線毛を産生する細菌細胞を酵素消化または機械的剪断に供する工程；および
該細胞から該線毛を単離する工程；
を含む、方法。
【請求項１２】
前記機械的剪断が、超音波処理を含む、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記酵素消化が、ムタノリシンを使用して行う、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記単離する工程が、１つ以上の密度勾配遠心分離またはクロマトグラフィ工程を含む、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記単離する工程が、多分散性を減少させる工程を含む、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
グラム陽性線毛に特異的に結合する、抗体。
【請求項１７】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ線毛に特異的に結合する、抗体。
【請求項１８】
前記抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、またはＦａｂフラグメントからなる群から選択される、請求項１６または請求項１７に記載の抗体。
【請求項１９】
前記抗体が、標識されている、請求項１６または請求項１７に記載の抗体。
【請求項２０】
前記標識が、酵素、放射性同位体、造影剤、毒素、またはフルオロフォアである、請求項１９に記載の抗体。
【請求項２１】
前記抗体が、ＲｒｇＡ、ＲｒｇＢ、およびＲｒｇＣからなる群から選択される非複合体化線毛タンパク質への該抗体の結合と比較して、線毛複合体に優先的に結合する、請求項１７に記載の抗体。
【請求項２２】
前記抗体が、非複合体化ＲｒｇＡ、非複合体化ＲｒｇＢ、または非複合体化ＲｒｇＣに特異的に結合しない、請求項１７に記載の抗体。
【請求項２３】
グラム陽性細菌に対する免疫応答を誘導する方法であって、該方法は、有効量のグラム陽性細菌の線毛を被験体に投与する工程を含む、方法。
【請求項２４】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する免疫応答を誘導する方法であって、該方法は、有効量のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ線毛を被験体に投与する工程を含む、方法。
【請求項２５】
前記線毛が、単離されている、請求項２３または請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記被験体が、ヒトである、請求項２３または請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
被験体におけるグラム陽性細菌感染を検出する方法であって、該方法は、該被験体由来のサンプルをグラム陽性細菌の線毛に対する抗体の存在についてアッセイする工程を含む、方法。
【請求項２８】
前記抗体が、線毛成分と比較して線毛複合体に優先的に結合する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
被験体におけるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染を検出する方法であって、該方法は、該被験体由来のサンプルをＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ線毛に対する抗体の存在についてアッセイする工程を含む、方法。
【請求項３０】
前記抗体が、線毛成分と比較して、線毛複合体に優先的に結合する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記サンプルが、血清である、請求項２７〜請求項３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記被験体が、ヒトである、請求項２７〜請求項３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
被験体におけるグラム陽性細菌感染を検出する方法であって、該方法は、サンプルを請求項１６に記載の抗体と接触させる工程および該サンプルの成分への該抗体の結合を検出する工程を含む、方法。
【請求項３４】
被験体におけるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染を検出する方法であって、該方法は、サンプルを請求項１７に記載の抗体と接触させる工程および該サンプルの成分への該抗体の結合を検出する工程を含む、方法。
【請求項３５】
グラム陽性細菌感染を有する被験体を処置する方法であって、該方法は、グラム陽性細菌の線毛に特異的に結合する有効量の薬剤を該被験体に投与する工程を含む、方法。
【請求項３６】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染を有する被験体を処置する方法であって、該方法は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ線毛に特異的に結合する有効量の薬剤を被験体に投与する工程を含む、方法。
【請求項３７】
前記薬剤が、抗体である、請求項３５または請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、またはＦａｂフラグメントからなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記抗体が、細胞へのグラム陽性細菌の付着を遮断する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記抗体が、細胞へのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの付着を遮断する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
細胞が、上皮細胞である、請求項３９または請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記上皮細胞が、肺上皮細胞または鼻咽頭上皮細胞である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記抗体が、ＲｒｇＡ、ＲｒｇＢ、およびＲｒｇＣからなる群から選択される非複合体化線毛タンパク質への該抗体の結合と比較して、線毛複合体に優先的に結合する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
前記抗体が、非複合体化ＲｒｇＡ、非複合体化ＲｒｇＢ、または非複合体化ＲｒｇＣに特異的に結合しない、請求項３７に記載の方法。
【請求項４５】
前記抗体が、コントロールと比較して、Ａ５４９肺上皮細胞へのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの付着を測定するアッセイにおいて、測定された該細胞へＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの付着の少なくとも５０％を遮断する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
前記抗体が、コントロールと比較して、Ａ５４９肺上皮細胞へのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの付着を測定するアッセイにおいて、測定された該細胞へＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの付着の少なくとも５０％を遮断する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
前記被験体が、ヒトである、請求項３５または請求項３６に記載の方法。
【請求項４８】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染を有する被験体の処置過程を決定する方法であって、該方法は、
被験体由来のサンプルをＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ線毛に対する抗体の存在についてアッセイする工程；および
該抗体の有無に基づいて処置過程を選択する工程；
を含む、方法。
【請求項４９】
前記抗体の存在が検出されない場合に、抗生物質製剤を前記被験体に投与する工程をさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記抗体の存在が検出された場合に、抗炎症薬を前記被験体に投与する工程をさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記被験体が、ヒトである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
３０個までのアミノ酸の置換、挿入、または欠失を有するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ線毛タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、単離された線毛または線毛様多量体。
【請求項５３】
２０個までのアミノ酸の置換、挿入、または欠失を有する、請求項５２に記載の線毛または線毛様多量体。
【請求項５４】
１０個までのアミノ酸の置換、挿入、または欠失を有する、請求項５２に記載の線毛または線毛様多量体。
【請求項５５】
５個までのアミノ酸の置換、挿入、または欠失を有する、請求項５２に記載の線毛または線毛様多量体。
【請求項５６】
前記アミノ酸の置換、挿入、または欠失がアミノ酸置換である、請求項５２〜請求項５５のいずれか１項に記載の線毛または線毛様多量体。
【請求項５７】
前記アミノ酸置換が、保存的アミノ酸置換である、請求項５６に記載のポリペプチド。
【請求項５８】
前記タンパク質が、ＲｒｇＡ、ＲｒｇＢ、またはＲｒｇＣである、請求項５２に記載の線毛または線毛様多量体。
【請求項５９】
細胞中に抗Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ線毛抗体を発現させる方法であって、該方法は、該細胞中で抗Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ線毛抗体をコードする核酸を発現させる工程を含む、方法。
【請求項６０】
前記抗Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ線毛抗体が、非複合体化ＲｒｇＡ、非複合体化ＲｒｇＢ、または非複合体化ＲｒｇＣに特異的に結合しない、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを含むサンプルからＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを精製する方法であって、該方法は、
ａ）固体支持体に結合した請求項１７に記載の抗体を含むアフィニティマトリックスを提供する工程；
ｂ）該サンプルを該アフィニティマトリックスと接触させてアフィニティマトリックス−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ複合体を形成する工程；
ｃ）該アフィニティマトリックス−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ複合体を該サンプルの残りから分離する工程；および
ｄ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを該アフィニティマトリックスから放出させる工程；
を含む、方法。
【請求項６２】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに細胞毒性薬または診断薬を送達する方法であって、該方法は、
ａ）請求項１７に記載の抗体またはそのフラグメントに結合体化した細胞毒性薬または診断薬を提供する工程；および
ｂ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを抗体−薬剤結合体またはフラグメント−薬剤結合体に曝露する工程；
を含む、方法。
【請求項６３】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ活性のモジュレーターを同定する方法であって、該方法は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染に感受性を示す細胞を候補化合物およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅと接触させる工程、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ活性が阻害されたかどうかを決定する工程を含み、ここで、該Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ活性の阻害が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅインヒビターを示す、方法。
【請求項６４】
前記Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ活性が、Ａ５４９肺上皮細胞へのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの付着である、請求項５９の方法。
【請求項６５】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ線毛結合のモジュレーターを同定する方法であって、該方法は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ線毛結合に感受性を示す動物細胞を候補化合物およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ線毛を有する細菌細胞と接触させる工程、ならびに該動物細胞への該細菌細胞の結合が阻害されるかどうかを決定する工程を含み、ここで、結合活性の阻害が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ線毛結合のインヒビターを示す、方法。
【請求項６６】
前記動物細胞が、単離動物細胞または培養動物細胞である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ線毛結合のモジュレーターを同定する方法であって、該方法は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ線毛結合に感受性を示す細胞を候補化合物およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ線毛と接触させる工程、ならびに該細胞への線毛の結合が阻害されるかどうかを決定する工程を含み、ここで、結合活性の阻害が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ線毛結合のインヒビターを示す、方法。
【請求項６８】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ線毛結合のモジュレーターを同定する方法であって、該方法は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ線毛結合に感受性を示す細胞を候補化合物およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ線毛タンパク質またはその細胞結合フラグメントと接触させる工程、ならびに該細胞への該線毛タンパク質またはそのフラグメントの結合が阻害されるかどうかを決定する工程を含み、ここで、結合活性の阻害が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ線毛結合のインヒビターを示す、方法。
【請求項６９】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ線毛を単離する方法であって、該方法は、
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ線毛を産生するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞を超音波処理または溶菌酵素での消化に供する工程；
非細胞成分を分離する工程；および
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ線毛を単離する工程；
を含む、方法。
【請求項７０】
前記溶菌酵素が、ムタノリシンである、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記非細胞成分が、密度勾配遠心分離を使用して分離される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
前記Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ線毛を産生するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＴＩＧＲ４細胞である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
前記方法が、核酸をヌクレアーゼで分解する工程をさらに含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７４】
前記方法が、ゲル濾過クロマトグラフィを使用してサイズにより前記Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ線毛を分離することによって多分散性を減少させる工程をさらに含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７５】
前記線毛が、３つのプロトフィラメントを含む、請求項１〜請求項７のいずれかに記載の線毛。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２００６年２月１７日に出願された米国仮出願第６０／７７４，４５０号（この内容は、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、グラム陽性細菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅが含まれる）から得た線毛、線毛を産生および単離する方法、ならびにグラム陽性細菌に対する免疫応答を誘導するための線毛の使用に関する。本発明はまた、とりわけ、グラム陽性細菌感染を検出する方法、グラム陽性細菌感染を処置する方法、および基質へのグラム陽性細菌の線毛の結合を同定する方法を提供する。線毛に結合する抗体も提供する。
【背景技術】
【０００３】
背景
グラム陽性細菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎球菌としても公知）は、世界規模での罹患率および死亡率の主な原因であり、ＨＩＶ、マラリア、および結核症と並ぶ四大感染症の１つである（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。これは、中耳炎、副鼻腔炎、および院外感染性肺炎などの気道感染の主な原因であるが、敗血および髄膜炎などの浸潤性疾患における重要な病原体でもある。肺炎球菌が破壊的病原体であるにもかかわらず、託児所に預けられた健康な児童にも広範に無害に定着する（非特許文献６、非特許文献７）。肺炎球菌疾患の主な病原性因子は多糖莢膜であり、この莢膜によって肺炎球菌は少なくとも９０種の異なる血清型に分類される（非特許文献８）。ＣｂｐＡ（コリン結合タンパク質Ａ）およびニューモリシンなどの他の遺伝因子は、病原性に重要であると記載されている（非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１）。
【０００４】
肺炎球菌による感染により、最初の上咽頭への定着によって誘発される浸潤性疾患を発症するが、接着機構は十分に理解されていない。莢膜発現が上気道の首尾のよい定着に不可欠であるにもかかわらず、被包肺炎球菌のｉｎ  ｖｉｔｒｏ接着は、非被包非病原性誘導体よりもはるかに低い（非特許文献４）。これらの所見により、ｉｎ  ｖｉｖｏで肺炎球菌は、厚い莢膜を産生するにもかかわらず、接着性を示す（非特許文献５）。
【０００５】
ジフテリア菌（非特許文献１２、非特許文献１３）、放線菌属（非特許文献１４）、ならびに最近のＡ群連鎖球菌（ＧＡＳ）およびＢ群連鎖球菌（ＧＢＳ）（非特許文献１５、非特許文献１６）などの他のグラム陽性細菌では、電子顕微鏡法によって線毛様表面構造が同定されており、遺伝的および生化学的に特徴づけられている（非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１５、非特許文献１６）。放線菌属では、１型線毛遺伝子は歯および粘膜の表面への接着を媒介する（非特許文献１７）。しかし、病原性連鎖球菌属における線毛の感染症における生理学的役割および機能に関する機能的データが必要である。
【０００６】
グラム陽性線毛は、特定のソルターゼ（ｓｏｒｔａｓｅ）によってアセンブリされる特定のアミノ酸モチーフを含む共有結合性架橋サブユニットタンパク質を含むトランスペプチダーゼ反応によって形成される伸長されたポリマーである。ソルターゼはまた、ペプチドグリカン細胞壁への線毛の共有結合性付着を担う。
【非特許文献１】Ｂｒｕｙｎ，Ｇ．Ａ．Ｗ．およびｖａｎ  Ｆｕｒｔｈ，Ｒ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１９９１年、第１０巻、ｐ．８９７−９１０
【非特許文献２】Ｒｙａｎ，Ｍ．Ｗ．およびＡｎｔｏｎｅｌｌｉ，Ｐ．Ｊ．、Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ、２０００年、第１１０巻、ｐ．９６１−９６４
【非特許文献３】Ｃｕｔｔｓ，Ｆ．Ｔ．，Ｚａｍａｎ，Ｓ．Ｍ．，Ｅｎｗｅｒｅ，Ｇ．，Ｊａｆｆａｒ，Ｓ．，Ｌｅｖｉｎｅ，Ｏ．Ｓ．，Ｏｋｏｋｏ，Ｃ．Ｏｌｕｗａｌａｎａ，Ａ．，Ｖａｕｇｈａｎ，Ｓ．，Ｏｂａｒｏ，Ａ．，Ｌｅａｃｈ，Ａ．ら、Ｌａｎｃｅｔ、２００５年、第３６５巻、ｐ．１１３９−１１４６
【非特許文献４】Ｓｗｉａｔｌｏ，Ｅ．，Ｃｈａｍｐｌｉｎ，Ｆ．Ｒ．，Ｈｏｌｍａｎ，Ｓ．Ｃ，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｗ．Ｗ．およびＷａｔｔ，Ｊ．Ｍ．、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、２００２年、第７０巻、ｐ．４１２−４１５
【非特許文献５】Ｓａｎｄｇｒｅｎ，Ａ．，Ａｌｂｉｇｅｒ，Ｂ．，Ｏｒｉｈｕｅｌａ，Ｃ，Ｔｕｏｍａｎｅｎ，Ｅ．，Ｎｏｒｍａｒｋ，Ｓ．およびＨｅｎｒｉｑｕｅｓ−Ｎｏｒｍａｒｋ，Ｂ．、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、２００５年、第１９２巻、ｐ．７９１−８００
【非特許文献６】Ｈｅｎｒｉｑｕｅｓ  Ｎｏｒｍａｒｋ，Ｂ．，Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎ，Ｂ．，Ｓａｎｄｇｒｅｎ，Ａ．，Ｎｏｒｅｅｎ，Ｂ．，Ｓｙｌｖａｎ，Ｓ．，Ｂｕｒｍａｎ，Ｌ．Ｇ．およびＯｌｓｓｏｎ−Ｌｉｌｊｅｑｕｉｓｔ，Ｂ．、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔ．、２００３年、第９巻、ｐ．３３７−３４４
【非特許文献７】Ｎｕｎｅｓ，Ｓ．，Ｓａ−Ｌｅａｏ，Ｒ．，Ｃａｒｒｉｃｏ，Ｊ．，Ａｌｖｅｓ，Ｃ．Ｒ．，Ｍａｔｏ，Ｒ．，Ａｖｏ，Ａ．Ｂ．，Ｓａｌｄａｎｈａ，Ｊ．，Ａｌｍｅｉｄａ，Ｊ．Ｓ．，Ｓａｎｃｈｅｓ，Ｉ．Ｓ．およびｄｅ  Ｌｅｎｃａｓｔｒｅ，Ｈ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２００５年、第４３巻、ｐ．１２８５−１２９３
【非特許文献８】Ｈｅｎｒｉｃｈｓｅｎ，Ｊ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９９５年、第３３巻、ｐ．２７５９−２７６２
【非特許文献９】Ｌａｕ，Ｇ．Ｗ．，Ｈａａｔａｊａ，Ｓ．，Ｌｏｎｅｔｔｏ，Ｍ．，Ｋｅｎｓｉｔ，Ｓ．Ｅ．，Ｍａｒｒａ，Ａ．，Ｂｒｙａｎｔ，Ａ．Ｐ．，ＭｃＤｅｖｉｔｔ，Ｄ．，Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｄ．Ａ．およびＨｏｌｄｅｎ，Ｄ．Ｗ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２００１年、第４０巻、ｐ．５５５−５７１
【非特許文献１０】Ｒｏｓｅｎｏｗ，Ｃ，Ｒｙａｎ，Ｐ．，Ｗｅｉｓｅｒ，Ｊ．Ｎ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｓ．，Ｆｏｎｔａｎ，Ｐ．，Ｏｒｔｑｖｉｓｔ，Ａ．およびＭａｓｕｒｅ，Ｈ．Ｒ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９９７年、第２５巻、ｐ．８１９−８２９
【非特許文献１１】Ｔｕｏｍａｎｅｎ，Ｅ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．、１９９９年、第２巻、ｐ．３５−３９
【非特許文献１２】Ｔｏｎ−Ｔｈａｔ，Ｈ．，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，Ｌ．Ａ．およびＳｃｈｎｅｅｗｉｎｄ，Ｏ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２００４年、第５３巻、ｐ．２５１−２６１
【非特許文献１３】Ｔｏｎ−Ｔｈａｔ，Ｈ．およびＳｃｈｎｅｅｗｉｎｄ，Ｏ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２００３年、第５０巻、ｐ．１４２９−１４３８
【非特許文献１４】Ｋｅｌｓｔｒｕｐ，Ｊ．，Ｔｈｅｉｌａｄｅ，Ｊ．およびＦｅｊｅｒｓｋｏｖ，Ｏ．、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．、１９７９年、第８７巻、ｐ．４１５−４２３
【非特許文献１５】Ｍｏｒａ，Ｍ．，Ｂｅｎｓｉ，Ｇ．，Ｃａｐｏ，Ｓ．，Ｆａｌｕｇｉ，Ｆ．，Ｚｉｎｇａｒｅｔｔｉ，Ｃ，Ｍａｎｅｔｔｉ，Ａ．Ｇ．Ｏ．，Ｍａｇｇｉ，Ｔ．，Ｔａｄｄｅｉ，Ａ．Ｒ．，Ｇｒａｎｄｉ，Ｇ．およびＴｅｌｆｏｒｄ，Ｊ．Ｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００５年、第１０２巻、ｐ．１５６４１−１５６４６
【非特許文献１６】Ｌａｕｅｒ，Ｐ．，Ｒｉｎａｕｄｏ，Ｃ．Ｄ．，Ｓｏｒｉａｎｉ，Ｍ．，Ｍａｒｇａｒｉｔ，Ｌ，Ｍａｉｎｏｎｅ，Ｄ．，Ｒｏｓｉｎｉ，Ｒ．，Ｔａｄｄｅｉ，Ａ．Ｒ．，Ｍｏｒａ，Ｍ．，Ｒａｐｐｕｏｌｉ，Ｒ．，Ｇｒａｎｄｉ，Ｇ．およびＴｅｌｆｏｒｄ，Ｊ．Ｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００５年、第３０９巻、ｐ．１０５
【非特許文献１７】Ｌｉ，Ｔ．，Ｋｈａｈ，Ｍ．Ｋ．，Ｓｌａｖｎｉｃ，Ｓ．，Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｉ．およびＳｔｒｏｅｍｂｅｒｇ，Ｎ．、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．、２００１年、第６９巻、ｐ．７２２４−７２３３
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
本開示は、特に、グラム陽性細菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の線毛の単離および特徴づけを説明する。線毛は、肺炎球菌および他のグラム陽性細菌の病原性で役割を果たし、特に、グラム陽性細菌感染の処置方法およびこれに対する免疫化で有用である。
【０００８】
いくつかの態様では、単離グラム陽性細菌線毛（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ線毛、Ａ群連鎖球菌（ＧＡＳ）線毛、またはＢ群連鎖球菌（ＧＢＳ）線毛）を開示する。いくつかの実施形態では、線毛は、肺炎球菌ＲｒｇＡタンパク質、肺炎球菌ＲｒｇＢタンパク質、および肺炎球菌ＲｒｇＣタンパク質（例えば、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはそのプロセシング形態）の少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、単離された線毛の分子量は１×１０５〜１×１０７Ｄａであるか、いくつかの実施形態では、２×１０６〜３×１０６Ｄａである。いくつかの実施形態では、単離された線毛のフィラメント長は、約０．１〜２μｍ（例えば、約０．１、０．２、０．５、１、１．５、または２μｍ）である。いくつかの実施形態では、単離された線毛の直径は、約１０ｎｍ（例えば、約８、９、１０、１１、または１２ｎｍ）である。いくつかの実施形態では、単離された線毛は、３つのプロトフィラメントを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、線毛は、酵素消化（例えば、ペプチドグリカン加水分解酵素（例えば、ムタノリシン、リソスタフィン、およびリゾチーム）などの１つ以上の溶菌酵素）によって細胞から分離される。いくつかの実施形態では、線毛を、機械的剪断（例えば、超音波処理）によって細胞から分離する。いくつかの実施形態では、線毛を、ＳｒｔＡ活性の減少または阻害によって細胞から分離する。いくつかの実施形態では、線毛を、細胞壁の完全性を妨害する化合物（例えば、抗生物質）での細胞の処理によって細胞から分離する。いくつかの実施形態では、線毛は、細菌細胞を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、線毛は、ペプチドグリカンを実質的に含まない。いくつかの実施形態では、グラム陽性細菌線毛（例えば、肺炎球菌線毛）を産生する細菌細胞を酵素消化または機械的剪断に供する工程および細胞から線毛を単離する工程を含む、単離グラム陽性細菌線毛（例えば、肺炎球菌線毛）の産生方法を開示する。
【００１０】
いくつかの態様では、１つ以上の単離グラム陽性細菌線毛（例えば、肺炎球菌線毛）を含む免疫原性組成物を開示する。
【００１１】
いくつかの態様では、グラム陽性細菌線毛を産生する細菌細胞（例えば、グラム陽性細菌細胞またはグラム陽性線毛を産生するように形質転換された細菌細胞）から線毛を分離する工程および細胞から線毛を単離する工程を含む、グラム陽性細菌線毛（例えば、肺炎球菌、ＧＡＳ、またはＧＢＳの線毛）を単離する方法を開示する。いくつかの実施形態では、線毛を、酵素消化（例えば、ペプチドグリカン加水分解酵素（例えば、ムタノリシン、リソスタフィン、およびリゾチーム）などの１つ以上の溶菌酵素を使用）によって細胞から分離する。いくつかの実施形態では、線毛を、機械的剪断（例えば、超音波処理）によって細胞から分離する。いくつかの実施形態では、線毛を、ＳｒｔＡ活性の減少または阻害によって細胞から分離する。いくつかの実施形態では、線毛を、細胞壁の完全性を妨害する化合物（例えば、抗生物質）での細胞の処理によって細胞から分離する。いくつかの実施形態では、単離は、密度勾配遠心分離の使用を含む。いくつかの実施形態では、単離は、単離は、多分散性の減少（例えば、ゲル濾過クロマトグラフィを使用したサイズによる成分の単離など）を含む。いくつかの実施形態では、単離は、１つ以上のクロマトグラフィ工程（例えば、ゲル濾過クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、またはアフィニティクロマトグラフィ）を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、さらに、１つ以上の濃縮工程を含む。
【００１２】
いくつかの態様では、単離グラム陽性細菌線毛（例えば、肺炎球菌線毛）に特異的に結合する抗体を開示する。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、またはＦａｂフラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、例えば、酵素、放射性同位体、毒素、造影剤（例えば、金粒子）、またはフルオロフォアで標識されている。いくつかの実施形態では、抗体は、線毛を作製する各タンパク質への抗体の結合と比較して、単離細菌線毛またはそのフラグメントに優先的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＲｒｇＡ、ＲｒｇＢ、およびＲｒｇＣからなる群から選択される非複合体化線毛タンパク質への抗体の結合と比較して線毛複合体に優先的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、非複合体化ＲｒｇＡ、非複合体化ＲｒｇＢ、または非複合体化ＲｒｇＣに特異的に結合しない。
【００１３】
いくつかの態様では、有効量のグラム陽性細菌線毛（例えば、肺炎球菌線毛（例えば、単離肺炎球菌線毛））を被験体（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）に投与する工程を含む、グラム陽性細菌（例えば、肺炎球菌）に対する免疫応答を誘導する方法を開示する。
【００１４】
いくつかの態様では、グラム陽性細菌線毛（例えば、肺炎球菌線毛）の存在を証明するために被験体由来のサンプル（例えば、血清または唾液）をアッセイする工程を含む、被験体（例えば、ヒト）におけるグラム陽性細菌感染（例えば、肺炎球菌感染）を検出する方法を開示する。いくつかの実施形態では、グラム陽性細菌線毛（例えば、肺炎球菌線毛）の存在は、グラム陽性細菌線毛（例えば、肺炎球菌線毛）に対する抗体の存在によって証明される。いくつかの実施形態では、抗体は、非複合体化線毛タンパク質（例えば、ＲｒｇＡ、ＲｒｇＢ、およびＲｒｇＣ）への抗体の結合と比較して、線毛複合体に優先的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、非複合体化線毛タンパク質（例えば、ＲｒｇＡ、ＲｒｇＢ、またはＲｒｇＣ）に特異的に結合しない。
【００１５】
いくつかの態様では、サンプルをグラム陽性細菌線毛（例えば、肺炎球菌線毛）に特異的に結合する薬剤（例えば、抗体）と接触させる工程およびサンプル成分への薬剤の結合を検出する工程を含む、被験体におけるグラム陽性細菌感染（例えば、肺炎球菌感染）を検出する方法を開示する。いくつかの実施形態では、抗体は、非複合体化線毛タンパク質（例えば、ＲｒｇＡ、ＲｒｇＢ、およびＲｒｇＣ）への抗体の結合と比較して、線毛複合体に優先的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、非複合体化線毛タンパク質（例えば、ＲｒｇＡ、ＲｒｇＢ、またはＲｒｇＣ）に特異的に結合しない。
【００１６】
いくつかの態様では、有効量のグラム陽性線毛に特異的に結合する薬剤を被験体に投与する工程を含む、グラム陽性細菌（例えば、肺炎球菌）感染を有するか有すると疑われる被験体（例えば、ヒト被験体）を処置する方法を開示する。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗体（例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、またはＦａｂフラグメント）である。いくつかの実施形態では、薬剤（例えば、抗体）は、宿主細胞などの細胞へのグラム陽性細菌の付着または結合を遮断する。細胞は、上皮細胞（例えば、肺上皮細胞または鼻咽頭上皮細胞）であり得る。いくつかの実施形態では、抗体は、線毛を作製する各タンパク質への抗体の結合と比較して、単離細菌線毛またはそのフラグメントに優先的に結合する。いくつかの実施形態では、薬剤（例えば、抗体）は、１つ以上の肺炎球菌線毛タンパク質（例えば、ＲｒｇＡ、ＲｒｇＢ、またはＲｒｇＣ（例えば、配列番号２、４、または６のアミノ酸配列を有する１つ以上のポリペプチドまたはその任意のプロセシング形態））に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、薬剤（例えば、抗体）は、配列番号４のアミノ酸残基３１６〜４１９を有するポリペプチドに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、薬剤（例えば、抗体）は、付着アッセイで測定したところ、コントロールと比較して、Ａ５４９肺上皮細胞への肺炎球菌の付着を少なくとも５０％遮断する。
【００１７】
いくつかの態様では、被験体由来のサンプルをグラム陽性線毛への抗体の存在についてアッセイする工程および抗体の有無に基づいて処置過程を選択する工程を含む、グラム陽性細菌（例えば、肺炎球菌）感染を有するか有すると疑われる被験体（例えば、ヒト被験体）の処置過程を決定する方法を開示する。本方法は、抗体の存在が検出されない場合に抗生物質製剤を被験体に投与する工程をさらに含む。本方法は、抗体の存在が検出された場合に抗炎症薬で被験体を処置する工程も含むことができる。
【００１８】
５０個まで（例えば、４０、３０、２０、１０、または５まで）のアミノ酸の置換、挿入、または欠失を有するグラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む単離グラム陽性線毛も開示する。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、グラム陽性線毛タンパク質は、ＲｒｇＡ（例えば、配列番号２）、ＲｒｇＢ（例えば、配列番号４）、またはＲｒｇＣ（例えば、配列番号６）である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、２つまたはそれを超える配列番号２、４、または６のアミノ酸配列またはその任意の免疫原性フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２、４、および６のアミノ酸配列またはその全ての免疫原性フラグメントを含む。単離グラム陽性線毛の免疫原性フラグメント（例えば、ＲｒｇＡ、ＲｒｇＢ、およびＲｒｇＣなどの肺炎球菌線毛タンパク質を含む免疫原性フラグメント）（例えば、配列番号２、４、および６の免疫原性フラグメント）も開示する。有効量の単離グラム陽性線毛を被験体（例えば、ヒト被験体）に投与する工程を含む、グラム陽性細菌（例えば、肺炎球菌）に対する免疫応答を誘導する方法も開示する。宿主細胞を１つ以上の線毛産生に十分な核酸で形質転換して線毛を産生し、宿主細胞から線毛を単離することによる単離グラム陽性線毛を産生する方法も開示する。
【００１９】
いくつかの態様では、細胞中で抗グラム陽性線毛をコードする核酸を発現する工程を含む、細胞中で抗グラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛抗体を発現する方法を開示する。
【００２０】
いくつかの態様では、固体支持体に結合したグラム陽性線毛に特異的に結合する抗体を含むアフィニティマトリックスを提供する工程、サンプルをアフィニティマトリックスと接触させてアフィニティマトリックス／グラム陽性細菌複合体を形成する工程、サンプルの残りからアフィニティマトリックス／グラム陽性細菌複合体を分離する工程、およびアフィニティマトリックスからグラム陽性細菌を放出させる工程を含む、グラム陽性細菌を含むサンプルからグラム陽性（例えば、肺炎球菌）細菌を精製する方法を開示する。
【００２１】
いくつかの態様では、グラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントに結合体化した細胞毒性薬または診断薬を準備する工程、および抗体−薬剤結合体またはフラグメント−薬剤結合体に細菌を曝露する工程を含む、グラム陽性細菌（例えば、肺炎球菌）に細胞毒性薬または診断薬を送達する方法を開示する。
【００２２】
いくつかの態様では、肺炎球菌感染に感受性を示す細胞（例えば、ＨＥＰ２細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、またはＡ５４９肺上皮細胞）を候補化合物および肺炎球菌と接触させる工程ならびに肺炎球菌活性（例えば、細胞（例えば、Ａ５４９肺上皮細胞）への付着）が阻害されるかどうかを決定する工程を含み、ここで、肺炎球菌活性の阻害が肺炎球菌インヒビターを示す、肺炎球菌のモジュレーターを同定する方法を開示する。
【００２３】
いくつかの態様では、グラム陽性線毛結合に感受性を示す動物細胞を候補化合物およびグラム陽性線毛を有する細菌細胞と接触させる工程ならびに動物細胞への細菌細胞の結合が阻害されるかどうかを決定する工程を含み、ここで、結合活性の阻害がグラム陽性線毛結合のインヒビターを示す、グラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛結合のモジュレーターを同定する方法を開示する。
【００２４】
いくつかの態様では、グラム陽性線毛結合に感受性を示す細胞を候補化合物およびグラム陽性線毛と接触させる工程ならびに細胞への線毛の結合が阻害されるかどうかを決定する工程を含み、ここで、結合活性の阻害がグラム陽性線毛結合のインヒビターを示す、グラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛結合のモジュレーターを同定する方法を開示する。
【００２５】
いくつかの態様では、グラム陽性線毛結合に感受性を示す細胞を候補化合物およびグラム陽性線毛タンパク質またはその細胞結合フラグメントと接触させる工程ならびに細胞への線毛タンパク質またはそのフラグメントの結合が阻害されるかどうかを決定する工程を含み、ここで、結合活性の阻害がグラム陽性線毛結合のインヒビターを示す、グラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛結合のモジュレーターを同定する方法を開示する。
【００２６】
いくつかの態様では、グラム陽性線毛結合に感受性を示すタンパク質（例えば、細胞外基質タンパク質またはそのグラム陽性線毛結合フラグメント）を候補化合物およびグラム陽性線毛、グラム陽性線毛タンパク質、またはそのフラグメントと接触させる工程ならびに２つのタンパク質またはそのフラグメントの間の結合が阻害されるかどうかを決定する工程を含み、ここで、結合活性の阻害がグラム陽性線毛結合のインヒビターを示す、グラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛結合のモジュレーターを同定する方法を開示する。
【００２７】
単離グラム陽性細菌線毛（例えば、肺炎球菌線毛）を含む薬学的組成物、免疫原性組成物、およびワクチン組成物も開示する。グラム陽性細菌感染の治療または予防のための免疫原性組成物またはワクチン組成物の調製のためのグラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛（または上記の任意のポリペプチドまたは核酸）の使用も開示する。薬物で使用するためのグラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛（または上記の任意のポリペプチドまたは核酸）も開示する。グラム陽性細菌感染の治療または防止で使用するためのグラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛（または上記の任意のポリペプチドまたは核酸）も開示する。
【００２８】
肺炎球菌線毛に特異的に結合する薬剤（例えば、抗体）を含む薬学的組成物も開示する。肺炎球菌感染の治療薬または予防薬の調製のための肺炎球菌線毛に特異的に結合する薬剤（例えば、抗体）の使用も開示する。薬物で使用するためのかかる薬物も開示する。グラム陽性細菌感染の治療または防止で使用するためのかかる薬物も開示する。
【００２９】
肺炎球菌線毛を産生する肺炎球菌（例えば、肺炎球菌ＴＩＧＲ４）から線毛を分離する工程および肺炎球菌線毛を単離する方法を含む、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ線毛を単離する方法も開示する。いくつかの実施形態では、線毛を、酵素消化（例えば、ペプチドグリカン加水分解酵素（例えば、ムタノリシン、リソスタフィン、およびリゾチーム）などの１つ以上の溶菌酵素）によって肺炎球菌細胞から分離する。いくつかの実施形態では、線毛を、機械的剪断（例えば、超音波処理）によって肺炎球菌細胞から分離する。いくつかの実施形態では、線毛を、ＳｒｔＡ活性の減少または阻害によって肺炎球菌細胞から分離する。いくつかの実施形態では、線毛を、細胞壁の完全性を妨害する化合物（例えば、抗生物質）での細胞の処理によって肺炎球菌細胞から分離する。いくつかの実施形態では、本方法は、ヌクレアーゼで核酸を分解する工程を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ゲル濾過クロマトグラフィを使用してサイズにより肺炎球菌線毛を分離することによって多分散性を減少させる工程を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、１つ以上のクロマトグラフィ工程（例えば、ゲル濾過クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、またはアフィニティクロマトグラフィ）を含む。いくつかの実施形態では、肺炎球菌線毛を産生する肺炎球菌細胞は、肺炎球菌ＴＩＧＲ４よりも多くの線毛を発現する。
【００３０】
他で定義しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明に属する当業者によって一般的に理解される意味を有する。本明細書中に記載の方法および材料と類似するか等価な方法および材料を、本発明の実施または試験で使用することができるにもかかわらず、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書中で言及した全ての刊行物、特許出願、特許、および他の引例は、その全体が参考として援用される。矛盾する場合、本明細書（定義が含まれる）に従う。さらに、材料、方法、および実施例は、例示のみを目的とし、本発明を制限することを意図しない。
【００３１】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細を、添付の図面および以下の説明に記載する。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面ならびに以下のさらなる実施形態から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
詳細な説明
出願人は、グラム陽性細菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎球菌としも公知）由来の線毛を単離し、特徴づけた。これらの線毛は肺炎球菌ＴＩＧＲ４（臨床株、莢膜血清型４単離物）によって発現されると同定し、そのゲノムを、Ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ワールドワイドウェブサイトｔｉｇｒ．ｏｒｇを参照のこと）によって配列決定した。これらの線毛は、病原性アイランドのｒｌｒＡアイレットによってコードされ、ｒｌｒＡアイレットは、全てではないがいくつかの肺炎球菌単離物中に存在する。線毛は、肺上皮細胞への肺炎球菌接着およびマウス感染モデルにおける定着に重要であることが示されている。同様に、線毛はまた、マウスにおける肺炎および菌血症の発症に影響を及ぼすことも示されている。さらに、線毛発現肺炎球菌は、非線毛化同質遺伝子変異体よりも全身感染中により高い腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）応答を誘発し、線毛が宿主炎症反応で役割を果たすことを示す。したがって、この開示は、とりわけ、グラム陽性細菌（例えば、肺炎球菌）の線毛および線毛タンパク質組成物ならびにグラム陽性細菌（例えば、肺炎球菌）感染に対する処置方法および免疫化方法におけるその使用を特徴とする。
【００３３】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ線毛
肺炎球菌線毛は、肺炎球菌ＴＩＧＲ４中に存在するｒｌｒＡアイレットによってコードされ、このアイレットは３つのソルターゼおよびＬＰＸＴＧモチーフを含むタンパク質をコードする３つのＩ遺伝子（ｒｒｇＡ、ｒｒｇＢ、およびｒｒｇＣ）を含む。ＲｒｇＡ、ＲｒｇＢ、およびＲｒｇＣタンパク質に対する抗体で標識した免疫金は、肺炎球菌表面上の伸長したフィラメント構造を検出した。抗ＲｒｇＡは、細菌細胞表面を標識することが示され、ＲｒｇＡが線毛構造を細胞壁に繋留することが示唆された。抗ＲｒｇＢは、全線毛に遍在することが示されたのに対して、抗ＲｒｇＣは線毛の先端に集中していた。線毛遺伝子の欠失によって線毛染色が排除されたのに対して、線毛オペロンの負の制御因子（ｍｇｒＡ）の欠失により、細胞表面上の線毛量が増加した。肺炎球菌線毛の細胞表面上の配置により、抗原として魅力的になる。
【００３４】
肺炎球菌ＴＩＧＲ４から線毛を均一またはほぼ均一に単離し、その分子量範囲は２×１０６〜３×１０６Ｄａであった。精製線毛は、約１μｍ超および直径１０ｎｍまでの伸長フィラメントとして存在した。免疫金標識により、単離された線毛中のＲｒｇＢおよびＲｒｇＣタンパク質の両方が検出された。
【００３５】
ｒｒｇＡ核酸配列の例（ＴＩＧＲ注釈番号ｓｐ０４６２）をここに提供する：
【００３６】
【化１】
2009538116.tif 000002
ＲｒｇＡ  アミノ酸配列の例（ＴＩＧＲ注釈番号ＳＰ０４６２）をここに提供する：
【００３７】
【化２】
2009538116.tif 000003
ＲｒｇＡは、上記の配列番号２中の下線に示すソルターゼ基質モチーフＹＰＸＴＧ（配列番号８）を含む。２つの推定Ｃｎａタンパク質Ｂ型ドメイン（Ｄｅｉｖａｎａｙａｇａｍら，２０００，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，８：６７−７８）を、配列番号２のアミノ酸残基６２〜１３２および７５１〜８２４で同定した。推定フォンウィルブランド因子Ａ型ドメインを同定した（Ｓａｄｌｅｒ，１９９８，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７：３９５−４２４；Ｐｏｎｔｉｎｇら，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２８９：７２９−４  ２２６−５７９）。このフォンウィルブランド因子Ａ型ドメインは、肺炎球菌線毛の細胞接着または細胞シグナル伝達特性の媒介に関与し得る。
【００３８】
ｒｒｇＢ核酸配列の例（ＴＩＧＲ注釈番号ｓｐ０４６３）を、ここに提供する：
【００３９】
【化３−１】
2009538116.tif 000004
【００４０】
【化３−２】
2009538116.tif 000005
ＲｒｇＢアミノ酸配列の例（ＴＩＧＲ注釈番号ＳＰ０４６３）を、ここに提供する：
【００４１】
【化４】
2009538116.tif 000006
ＲｒｇＢは、上記の配列番号４中の下線に示すソルターゼ基質モチーフＩＰＸＴＧ（配列番号９）を含む。推定Ｃａｎタンパク質Ｂ型ドメイン（Ｄｅｉｖａｎａｙａｇａｍら，２０００，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，８：６７−７８）を、配列番号４のアミノ酸残基４６１〜６０５で同定した。
【００４２】
ｒｒｇＣ核酸配列の例（ＴＩＧＲ注釈番号ｓｐ０４６４）を、ここに提供する：
【００４３】
【化５−１】
2009538116.tif 000007
【００４４】
【化５−２】
2009538116.tif 000008
ＲｒｇＣアミノ酸配列の例（ＴＩＧＲ注釈番号ＳＰ０４６４）を、ここに提供する：
【００４５】
【化６】
2009538116.tif 000009
２つの推定Ｃａｎタンパク質Ｂ型ドメイン（Ｄｅｉｖａｎａｙａｇａｍら，２０００，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，８：６７−７８）を、配列番号６のアミノ酸残基１６３〜２５１および２７３〜３５２で同定した。ＲｒｇＣは、上記配列番号６中の下線に示すソルターゼ基質モチーフＶＰＸＴＧ（配列番号１０）を含む。
【００４６】
他のグラム陽性細菌線毛
本明細書中に記載の方法および組成物を、任意のグラム陽性細菌由来の線毛と共に使用することができる。公知および推定される線毛タンパク質は、ＧＡＳ（例えば、連鎖球菌化膿性連鎖球菌）（Ｍｏｒａら，２００５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０２：１５６４１−６）、ＧＢＳ（例えば、ストレプトコッカス・アガラクチア）（Ｌａｕｅｒら，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９：１０５；ＷＯ  ２００６／０７８３１８）、アクチノミセス・ネスルンディ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ  ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）（Ｙｅｕｎｇら，１９９８，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６６：１４８２−９１），ジフテリア菌（Ｔｏｎ−Ｔｈａｔら，２００３，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５０：１４２９−３８；Ｔｏｎ−Ｔｈａｔ  ａｎｄ  Ｓｃｈｎｅｅｗｉｎｄ，２００４，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１２：２２８−３４）、ウエルシュ菌、およびフェカリス菌で同定されている。
【００４７】
他のグラム陽性細菌の線毛を、本明細書中に記載の方法および組成物で使用することができる。かかるグラム陽性細菌には、連鎖球菌属（例えば、肺炎球菌、Ｓ．アガラクチア、化膿性連鎖球菌、ブタ連鎖球菌、Ｓ．ズーエピデミカス、緑色連鎖球菌、ミュータンス菌、Ｓ．ゴルドニ、腺疫菌）、バチルス属（例えば、炭疽菌、セレウス菌、枯草菌）、リステリア属（例えば、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）、Ｌ．モノサイトゲネス）、ブドウ球菌属（例えば、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、Ｓ．カプラエ（Ｓ．ｃａｐｒａｅ）、腐性ブドウ球菌、Ｓ．ルジュネンシス（Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、Ｓ．シュレイフェリ（Ｓ．ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉ））、腸球菌属（例えば、フェカリス菌、フェシウム菌）、乳酸桿菌属、ラクトコッカス属（例えば、Ｌ．ラクティス）、ロイコノストック属（例えば、Ｌ．メセンテリオデス（Ｌ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ））、ペクチナタス属、ペディオコッカス属、アセトバクテリウム属、クロストリジウム属（例えば、ボツリヌス菌、Ｃ．ディフィシル、ウエルシュ菌、破傷風菌）、ルミノコッカス属（例えば、Ｒ．アルブス）、ヘリオバクテリウム属、ヘリオスピリルム属（Ｈｅｌｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、およびスプロムサ属（Ｓｐｐｒｏｍｕｓａ）などのグラム陽性細菌門ならびに放線菌属（例えば、Ａ．ネスルンディ）、コリネバクテリウム属（例えば、ジフテリア菌、Ｃ．エフィシエンス（Ｃ．ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ））、アルスロバクター属、ビフィドバクテリウム属（例えば、Ｂ．ロングム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ））、フランキア属、ミクロコッカス属、ミクロモノスポラ属、マイコバクテリウム属（例えば、結核菌、ライ菌、Ｍ．ボビス、Ｍ．アフリカヌム、ネズミ型結核菌）、ノカルジア属（例えば、Ｎ．アステロイデス）、プロピオニバクテリウム属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｎ）、およびストレプトマイセス属（例えば、Ｓ．ソマリエンシス、Ｓ．アベルミチリス（Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、Ｓ．セリカラー）などの放線菌門が含まれるが、これらに限定されない。
【００４８】
単離された線毛
グラム陽性線毛タンパク質（例えば、ＲｒｇＡ、ＲｒｇＢ、およびＲｒｇＣ）またはそのフラグメントもしくは変異型（ｖａｒｉａｎｔ）を含む単離グラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛および他の線毛様構造を、本明細書中に記載の方法で、被験体における抗体の産生および／または免疫応答の刺激のための免疫原性組成物として使用することができる。グラム陽性線毛タンパク質の変異型を含む線毛を、本明細書中に記載の方法で、被験体における抗体の産生および／または免疫応答の刺激のための免疫原性組成物として使用することもできる。グラム陽性タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２、４、または６）と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％）の配列が同一なグラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛様ポリペプチドも新規の方法で有用である。さらに、５０まで（例えば、１、３、５、１０、１５、２０、２５、３０、または４０）のアミノ酸が置換、欠失、または置換されたグラム陽性線毛のポリペプチドは、本明細書中に記載の組成物および方法で有用であろう。
【００４９】
２つのアミノ酸配列間の同一率の決定を、ＢＬＡＳＴ２．０プログラムを使用して行うことができる。このプログラムは、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴで公的に利用可能である。ギャップ無しのアラインメントおよびデフォルトパラメータ（ＢＬＯＳＵＭ  ６２行列、ギャップ存在コスト（ｇａｐ  ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ  ｃｏｓｔ）１１、残基あたりのギャップコスト１、およびλ比０．８５）を使用して配列比較を行った。ＢＬＡＳＴプログラムで使用した数学アルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５：３３８９−３４０２に記載されている。
【００５０】
本明細書中で使用する場合、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸ファミリー内のポリペプチド中のアミノ酸の置換を意味する。アミノ酸ファミリーは当該分野で認識されており、アミノ酸側鎖の物理的および化学的性質に基づいている。ファミリーには、以下が含まれる：塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、およびヒスチジン）；酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸）；無電荷極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、およびシステイン）；非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、およびトリプトファン）；分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、およびイソロイシン）；および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびヒスチジン）。アミノ酸は、１つを超えるファミリーに属し得る。
【００５１】
いくつかの実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、オリゴマー（線毛）形態で処方または精製することができるグラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛を含む。いくつかの実施形態では、オリゴマー形態は、ハイパーオリゴマー（ｈｙｐｅｒｏｌｉｇｏｍｅｒ）である。いくつかの実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、オリゴマー（線毛）形態で単離されたグラム陽性線毛タンパク質を含む。グラム陽性線毛タンパク質を含むオリゴマーまたはハイパーオリゴマーの線毛構造を、免疫原性組成物で使用するために精製するかそうでなければ処方することができる。  
【００５２】
１つ以上の肺炎球菌線毛タンパク質の読み取り枠のポリヌクレオチド配列を、置換したＯＲＦのフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列と置換することができる。あるいは、１つ以上の肺炎球菌線毛タンパク質の読み取り枠を、置換したＯＲＦと配列相同性を有する配列と置換することができる。
【００５３】
１つ以上のグラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛のタンパク質配列は、典型的には、ＬＰＸＴＧモチーフ（ＬＰＸＴＧ（配列番号１１）など）または他のソルターゼ基質モチーフを含む。肺炎球菌線毛タンパク質のＬＰＸＴＧソルターゼ基質モチーフを、一般に、式：Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｇ（式中、アミノ酸位置１のＸは、Ｌ、Ｖ、Ｅ、Ｙ、Ｉ、またはＱであり、アミノ酸位置２のＸは、アミノ酸位置１のＸがＬの場合にＰであり、アミノ酸位置２のＸは、アミノ酸位置１のＸがＥまたはＱである場合にＶであり、アミノ酸位置２のＸは、アミノ酸位置１の位置がＶである場合にＶまたはＰであり、アミノ酸位置３のＸは、任意のアミノ酸残基であり、アミノ酸位置４のＸは、アミノ酸位置１のＸがＶ、Ｅ、またはＱである場合にＴであり、アミノ酸位置４のＸは、アミノ酸位置１のＸがＬである場合にＴ、Ｓ、またはＡである）で示すことができる。ＬＰＸＴＧモチーフのいくつかの例には、ＹＰＸＴＧ（配列番号８）、ＩＰＸＴＧ（配列番号９）、ＬＰＸＳＧ（配列番号５７）、ＶＶＸＴＧ（配列番号１２）、ＥＶＸＴＧ（配列番号１３）、ＶＰＸＴＧ（配列番号１０）、ＱＶＸＴＧ（配列番号１４）、ＬＰＸＡＧ（配列番号１５）、ＱＶＰＴＧ（配列番号１６）、およびＦＰＸＴＧ（配列番号１７）が含まれる。
【００５４】
１つ以上のグラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛タンパク質配列は、線毛モチーフ配列を含み得る。線毛モチーフ配列のいくつかの例には、ＷＬＱＤＶＨＶＹＰＫＨＱＸＸＸＸＸＸＫ（配列番号５８）、ＷＮＹＮＶＶＡＹＰＫＮＴＸＸＸＸＸＸＫ（配列番号５９）、ＷＬＹＤＶＮＶＦＰＫＮＧＸＸＸＸＸＸＫ（配列番号６０）、ＷＩＹＤＶＨＶＹＰＫＮＥＸＸＸＸＸＸＫ（配列番号６１）、ＷＮＹＮＶＨＶＹＰＫＮＴＸＸＸＸＸＸＫ（配列番号６２）、ＦＬＳＥＩＮＩＹＰＫＮＶＸＸＸＸＸＸＫ（配列番号６３）、およびＤＶＶＤＡＨＶＹＰＫＮＴＸＸＸＸＸＸＫ（配列番号６４）が含まれる。コンセンサス線毛モチーフ配列の例は、（Ｗ／Ｆ／Ｅ／Ｄ）−Ｘ−Ｘ−Ｘ−（Ｖ／Ｉ／Ａ）−Ｘ−（Ｖ／Ｉ／Ａ）−（Ｙ／Ｆ）−Ｐ−Ｋ−（Ｎ／Ｈ／Ｄ）−ＸＸＸＸＸＸＸ−（Ｋ／Ｌ）（配列番号６５）またはＷＸＸＸＶＸＶＹＰＫ（配列番号７６）である。線毛モチーフの保存内部リジンは、ソルターゼ反応で求核試薬として作用することができる。
【００５５】
１つ以上のグラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛タンパク質配列は、Ｅボックスモチーフ配列を含む。Ｅボックスモチーフ配列のいくつかの例には、ＦＣＬＶＥＴＡＴＡＳＧＹ（配列番号６６）、ＦＣＬＫＥＴＫＡＰＡＧＹ（配列番号６７）、ＹＶＬＶＥＴＥＡＰＴＧＦ（配列番号６８）、ＹＣＬＶＥＴＫＡＰＹＧＹ（配列番号６９）、ＹＫＬＫＥＴＫＡＰＹＧＹ（配列番号７０）、ＹＰＩＴＥＥＶＡＰＳＧＹ（配列番号７１）、ＹＲＬＦＥＮＳＥＰＡＧＹ（配列番号７２）、ＹＹＬＷＥＬＱＡＰＴＧＹ（配列番号７３）、およびＹＹＬＥＥＴＫＱＰＡＧＹ（配列番号７４）が含まれる。Ｅボックスモチーフコンセンサス配列の例は、（Ｙ／Ｆ）−Ｘ−（Ｌ／Ｉ）−Ｘ−Ｅ−Ｔ−Ｘ−（Ａ／Ｑ／Ｔ）−（Ｐ／Ａ）−Ｘ−Ｇ−（Ｙ／Ｆ）（配列番号７５）またはＬＸＥＴ（配列番号７７）である。
【００５６】
本明細書中に記載のグラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛は、グラム陽性細菌（例えば、肺炎球菌）が上皮細胞に接着して侵入する能力に影響を及ぼし得る。線毛はまた、グラム陽性細菌（例えば、肺炎球菌）が上皮細胞層を介して移動する能力に影響を及ぼし得る。好ましくは、１つ以上のグラム陽性線毛は、上皮細胞表面に結合するか、そうでなければ会合することができる。グラム陽性線毛はまた、フィブリノゲン、フィブロネクチン、またはコラーゲンに結合または会合することができる。
【００５７】
グラム陽性（例えば、肺炎球菌）ソルターゼタンパク質は、ＬＰＸＴＧ含有表面タンパク質の分泌および繋留に関与すると考えられている。肺炎球菌ソルターゼタンパク質は、ｒｒｇＡ、ｒｒｇＢ、およびｒｒｇＣ遺伝子と同一の病原性アイレットで見出される遺伝子（ｓｒｔＢ、ｓｒｔＣ、およびｓｒｔＤ）によってコードされる。本明細書中に記載の方法で有用なソルターゼタンパク質およびソルターゼタンパク質の変異型を、グラム陽性細菌から得ることができる。
【００５８】
グラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛タンパク質を、膜結合型トランスペプチダーゼ（ソルターゼなど）によって細菌細胞に共有結合することができる。ソルターゼは、好ましくは、ＬＰＸＴＧモチーフのトレオニン残基とグリシン残基との間の表面タンパク質を切断するように機能することができる。次いで、ソルターゼは、トレオニンのカルボキシル基と細胞壁前駆体（脂質ＩＩ）との間のアミド結合の形成を補助することができる。次いで、前駆体を、細菌壁合成のトランスグリコシル化およびトランスペプチド化反応を介してペプチドグリカンに組み込むことができる。Ｃｏｍｆｏｒｔら，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ＆  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００４）７２（５）：２７１０−２７２２を参照のこと。
【００５９】
いくつかの実施形態では、本発明は、グラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛タンパク質（例えば、ＲｒｇＡ、ＲｒｇＢ、またはＲｒｇＣ（例えば、配列番号２、４、または６））を含むオリゴマーの線毛様構造を含む組成物を含む。オリゴマーの線毛様構造は、多数の線毛タンパク質単位を含むことができる。いくつかの実施形態では、オリゴマーの線毛様構造は、２つまたはそれを超える線毛タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、オリゴマーの線毛様構造は、少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１５０、２００、またはそれを超える）オリゴマー単位を含むハイパーオリゴマー線毛様構造を含み、ここで、各サブユニットは線毛タンパク質またはそのフラグメントを含む。オリゴマーサブユニットを、線毛モチーフ内の保存リジンを介して共有結合することができる。オリゴマーサブユニットを、ＬＰＸＴＧモチーフ、好ましくは、トレオニンまたはセリンアミノ酸残基をそれぞれ介して共有結合することができる。いくつかの実施形態では、オリゴマーの線毛様構造は、単離された線毛である。
【００６０】
本発明のオリゴマーの線毛様構造に組み込むべきグラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛タンパク質またはそのフラグメントは、いくつかの実施形態では、線毛モチーフ含むであろう。
【００６１】
オリゴマー線毛を、単独または本発明の組み合わせ中で使用することができる。いくつかの実施形態では、本発明は、オリゴマー形態の肺炎球菌線毛を含む。いくつかの実施形態では、線毛はハイパーオリゴマー形態である。
【００６２】
線毛の精製方法
線毛を、細胞からの線毛の分離（例えば、機械的剪断または酵素消化および分離した線毛の単離による）によって、グラム陽性線毛または線毛様構造（例えば、肺炎球菌，Ａ群連鎖球菌およびＢ群連鎖球菌由来の線毛などの連鎖球菌線毛）を発現する細菌細胞などの細胞から精製することができる。
【００６３】
線毛精製に適切な細菌細胞には、１つ以上のグラム陽性線毛タンパク質（肺炎球菌ＲｒｇＡ、ＲｒｇＢ、およびＲｒｇＣ（例えば、配列番号２、４、および６）など）で形質転換された線毛化グラム陽性細菌株、非線毛化グラム陽性細菌、および１つ以上のグラム陽性線毛タンパク質（肺炎球菌ＲｒｇＡ、ＲｒｇＢ、およびＲｒｇＣ（例えば、配列番号２、４、および６）など）で形質転換されたグラム陰性細胞または他の細胞が含まれる。典型的には、線毛精製のために使用される細胞は、所望の線毛型（例えば、内因性線毛または異種線毛）のみを産生するであろう。異種線毛の酸性のために、細胞を、例えば、変異または組換えＤＮＡ法によって内因性線毛を産生しないように変化させることができる。典型的には、精製に有用な線毛産生グラム陽性細菌細胞は、細胞表面上で線毛が発現されるように１つ以上の適合性ソルターゼを発現するであろう。
【００６４】
グラム陽性細菌細胞からの線毛の分離を、典型的には、機械的剪断、酵素消化、ＳｒｔＡ活性の減少もしくは阻害、または細胞壁の完全性を妨害する化合物での処理によって行う。機械的剪断は物理的に細胞から線毛を除去することができるのに対して、他の方法は、（例えば、細胞壁または線毛成分の分解によって）線毛の付着点を排除することができる。細胞からの線毛の分離後、線毛および細胞を、例えば、遠心分離によって分離することができる。
【００６５】
機械的剪断法の非限定的な例には、超音波処理、ガラスビーズ剪断、および混合が含まれる。超音波処理法は、例えば、Ｙａｍａｇｕｃｈｉら，２００４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４９：５９−６５で考察されている。ガラスビーズ剪断法は、例えば、Ｌｅｖｅｓｑｕｅら，２００１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８３：２７２４−３２で考察されている。一般的機械的剪断法は、例えば、Ｗｏｌｆｇａｎｇら，１９９８，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２９：３２１−３０；Ｔｒａｃｈｔｅｎｂｅｒｇら，２００５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３４６：６６５−６７６；Ｐａｒｇｅら，１９９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：２２７８−８５；Ｉｓａａｃｓｏｎら，１９８１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１４６：７８４−９；Ｋｏｒｈｏｎｅｎら，１９８０，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，２７：５６９−７５；Ｈａｈｎら，２００２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３２３：８４５−５７；Ｓｔ．Ｇｅｍｅら，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：１１９１３−１８；Ｗｅｂｅｒら，２００５，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８７：２４５８−６８；およびＭｕら，２００２，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８４：４８６８−７４で考察されている。
【００６６】
酵素消化に適切な酵素の非限定的な例には、ムタノリシン、リソスタフィン、およびリゾチームなどの細胞壁分解酵素が含まれる。酵素消化方法は、例えば、Ｂｅｎｄｅｒら，２００３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８５：６０５７−６６；Ｔｏｎ−Ｔｈａｔら，２００４，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５３：２５１−６１；およびＴｏｎ−Ｔｈａｔら，２００３，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５０：１４２９−３８で考察されている。被験体への線毛の下流投与（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）のために、多数の酵素を使用して、望ましくない宿主反応を引き起こし得る細胞壁成分を除去することができる。
【００６７】
ＳｒｔＡ活性を阻害または減少する方法の非限定的な例には、ＳｒｔＡの機能喪失型遺伝子座の導入、内因性ＳｒｔＡ遺伝子の欠失、ＳｒｔＡ発現を減少させる核酸（例えば、アンチセンスまたはｍｉＲＮＡ）の発現、およびＳｒｔＡ活性を阻害する化合物での細胞の処理によるＳｒｔＡ活性の減少が含まれる（例えば、Ｍａｒｒａｆｉｎｉら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，７０：１９２−２２１，２００６を参照のこと）。
【００６８】
ソルターゼＡインヒビターの例には、メタンチオスルホン酸塩（例えば、ＭＴＳＥＴおよびメタンチオスルホン酸（２−スルホナトエチル））（Ｔｏｎ−Ｔｈａｔ  ａｎｄ  Ｓｃｈｎｅｅｗｉｎｄ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：２４３１６−２４３２０，１９９９）、ｐ−ヒドロキシメルクリ安息香酸、グリコシルステロールβ−シトステロール−３−Ｏ−グルコピラノール（Ｋｉｍら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７：２４７７−７９，２００３）、塩化ベルベリン（Ｋｉｍら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６８：４２１−２４，２００４）、ペプチジルジアゾメタン（ＬＰＡＴ−ＣＨＮ２）（Ｓｃｏｔｔら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３６６：９５３−５８，２００２）、ペプチジルクロロメタン（ＬＰＡＴ−ＣＨ２Ｃｌ）、ペプチジルビニルスルホン（ＬＰＡＴ−ＳＯ２（Ｐｈ））（Ｃｏｎｏｌｌｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８：３４０６１−６５，２００３）、ビニルスルホン（例えば、ジ−，エチル−，メチル−，およびフェニルビニルスルホン）（Ｆｒａｎｋｅｌら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２６：３４０４−３４０５，２００４）、ホスフィン酸基に置換されたトレオニン残基を有するＬＰＸＴＧモチーフペプチド（例えば、ＬＰＥΨ｛ＰＯ２Ｈ−ＣＨ２｝Ｇ）（Ｋｒｕｇｅｒら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１２：３７２３−２９，２００４）、置換（Ｚ）−ジアリール−アクリロニトリル（Ｏｈら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４７：２４１８−２１，２００４）、および種々の薬用植物の抽出物（Ｋｉｍら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６６：２７５１−５４，２００２）が含まれる。
【００６９】
細胞壁の完全性を妨害する化合物の非限定的な例には、グリシン、抗生物質（ペニシリン（例えば、メチシリン、アモキシシリン、アンピシリン）、セファロスポリン（例えば、セファレキシン、セフプロキシル（ｃｅｆｐｒｏｘｉｌ）、セフェピム）、糖ペプチド（例えば、バンコマイシン、テイコプラニン、ラモプラニン）、およびシクロセリンが含まれる。
【００７０】
分離線毛を、例えば、密度勾配遠心分離の使用により、密度によって他の成分から分離することができる。例えば、線毛を、ショ糖密度勾配での遠心分離によって分離することができる。
【００７１】
典型的には、グラム陽性線毛を含むサンプルは、線毛中に存在する線毛タンパク質サブユニット数の相違によって異なる分子量のポリマーを含むであろう。多分散性を減少させるために、グラム陽性線毛を含むサンプルを、サイズによって分離することができる。例えば、ゲル濾過カラムまたはサイズ排除カラムを使用することができる。限外濾過膜を使用して、グラム陽性線毛の多分散性を減少させることができる。
【００７２】
グラム陽性線毛を、アフィニティクロマトグラフィなどのアフィニティ法を使用して単離することもできる。グラム陽性線毛に特異的に結合するタンパク質（例えば、線毛成分に特異的に結合する抗体または線毛に優先的に結合する抗体）を、固体担体（例えば、クロマトグラフィ担体）に固定し、グラム陽性線毛を含むサンプルを固定した結合タンパク質に曝露することができる。かかるアフィニティ単離方法を使用して、グラム陽性線毛を発現する細胞の調製物を単離、精製、または富化することもできる。
【００７３】
グラム陽性線毛を、当該分野で公知の任意の他のタンパク質精製方法（例えば、沈殿、カラムクロマトグラフィ法、およびサンプルの濃縮）を使用して単離することもできる。単離は、例えば、ゲル濾過クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、またはアフィニティクロマトグラフィを含むことができる。さらなる方法は、例えば、Ｒｕｆｆｏｌｏら，１９９７，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６５：３３９−４３に記載されている。タンパク質の精製方法は、例えば、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．Ｋ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，３ｒｄ．ｅｄ．，１９９４，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎ．Ｙ．に詳述されている。
【００７４】
精製中の画分中のグラム陽性線毛の存在を、電気泳動（例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動）、グラム陽性線毛に特異的に結合する作用因子（ａｇｅｎｔ）（例えば、線毛タンパク質に対する抗体または線毛に優先的に結合する抗体）の結合の測定、および／またはタンパク質または細胞結合などの線毛の活性の測定によって追跡することができる。
【００７５】
抗体
本発明のグラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛を使用して、グラム陽性線毛またはグラム陽性線毛タンパク質に特異的な抗体を調製することもできる。いくつかの実施形態では、抗体は、グラム陽性線毛タンパク質のオリゴマー形態またはハイパーオリゴマー形態に特異的に（例えば、優先的に）結合する。本発明はまた、多くの範囲の血清型および株単離物から防御するために選択したグラム陽性線毛タンパク質に特異的な抗体の組み合わせも含む。
【００７６】
本発明のグラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛特異的抗体は、化学的手段または物理的手段によってグラム陽性線毛ポリペプチドのエピトープに結合または会合することができる１つ以上の生物学的部分を含む。本発明の抗体には、単離された線毛タンパク質と比較してグラム陽性線毛に優先的に結合する抗体が含まれる。本発明は、ポリクローナル調製物およびモノクローナル調製物の両方から得た抗体ならびに以下の抗体を含む：ハイブリッド（キメラ）抗体分子（例えば、Ｗｉｎｔｅｒら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−２９９および米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）、Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ａｂ）フラグメント、Ｆｖ分子（非共有結合性ヘテロ二量体（例えば、Ｉｎｂａｒら（１９７２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ６９：２６５９−２６６２およびＥｈｒｌｉｃｈら（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９：４０９１−４０９６を参照のこと）、単鎖Ｆｖ分子（ｓＦｖ）（例えば、Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：５８９７−５８８３を参照のこと）、二量体および三量体の抗体フラグメント構築物、ミニボディ（例えば、Ｐａｃｋら（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３１：１５７９−１５８４；Ｃｕｍｂｅｒら（１９９２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４９Ｂ：１２０−１２６を参照のこと）、ヒト化抗体分子（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６；１９９４年９月２１日公開の英国特許公報第ＧＢ２，２７６，１６９号）、ならびにかかる分子から得た任意の機能的フラグメント（かかるフラグメントは親抗体分子の免疫学的結合特性を保持している）。本発明は、さらに、ファージディスプレイなどの非従来的過程によって得た抗体を含む。
【００７７】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体ｋ、組換え抗体（例えば、キメラ抗体またはヒト化抗体）、全ヒト抗体、非ヒト抗体（例えば、マウス抗体）、または単鎖抗体であり得る。かかる抗体の作製方法は公知である。いくつかの場合、抗体は、エフェクター機能を有し、補体を固定することができる。抗体を、毒素、レポーター基、または造影剤にカップリングすることもできる。
【００７８】
いくつかの実施形態では、本発明のグラム陽性線毛タンパク質特異的抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体には、均一な抗体集団を有する抗体組成物が含まれる。モノクローナル抗体をマウスハイブリドーマから得ることができ、同様に、ヒトモノクローナル抗体をマウス抗体よりもむしろヒトを使用して得ることができる。例えば、Ｃｏｔｅ，ら．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，１９８５，ｐ７７を参照のこと。
【００７９】
ヒト被験体への反復投与（例えば、治療上の処置）を含む適用（およびいくつかの診断への適用）のためには、キメラ、ヒト化（例えば、完全ヒト）抗体が望ましい。
【００８０】
抗体を、グラム陽性細菌（例えば、肺炎球菌）感染の予防または治療上の処置で使用することもできる。抗体は、宿主細胞におけるグラム陽性細菌の付着またはいくつかの活性を遮断することができる。さらに、抗体を使用して、毒素または抗体などの治療薬をグラム陽性細菌細胞に送達させることができる。
【００８１】
抗体を診断に適用して、例えば、生体サンプル中のグラム陽性線毛またはグラム陽性線毛タンパク質の有無を検出することができる。抗線毛または線毛タンパク質抗体を診断で使用して、例えば、所与の治療計画の有効性を決定するための臨床試験手順の一部として組織中のタンパク質レベルをモニタリングすることができる。検出可能な物質（すなわち、抗体標識）への抗体のカップリング（すなわち、例えば、直接または間接的な物理的結合）によって検出を容易にすることができる。検出可能な物質の例には、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、造影剤、発光物質、生体発光物質、放射性物質が含まれる。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼが含まれ、適切な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが含まれ、適切な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリンが含まれ、造影剤の例には、電子顕微鏡法に有用な高電子密度物質（金粒子など）または磁気共鳴画像法に有用な磁気活性物質（ｍａｇｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｍａｔｅｒｉａｌ）（超磁性鉄粒子など）が含まれ、発光物質の例には、ルミノールが含まれ、生体発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが含まれ、適切な放射性物質の例には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、および３Ｈが含まれる。かかる診断抗体を、例えば、患者由来のサンプルの試験によって感染患者中の線毛化グラム陽性細菌（例えば、肺炎球菌）の存在を検出する方法で使用することができる。次いで、処置過程を、線毛化グラム陽性細菌の有無に基づいて選択することができる。例えば、非線毛化グラム陽性細菌に感染した患者を抗生物質で処置することができるのに対して、線毛化グラム陽性細菌に感染した患者を線毛結合化合物（抗体および／または抗炎症薬（例えば、ＩＬ−６または抗ＴＮＦ抗体などの抗ＴＮＦ薬）など）で処置することもできる。
【００８２】
スクリーニングアッセイ
いくつかの態様では、本発明は、グラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛またはグラム陽性線毛タンパク質の活性（例えば、結合）を阻害する１つ以上の化合物（例えば、抗体、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、ペプトイド、無機小分子、非核酸有機小分子、核酸（例えば、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、または合成オリゴヌクレオチド）または他の薬物）から同定されたモジュレーター（すなわち、候補化合物または薬剤）の同定方法（本明細書中で「スクリーニングアッセイ」ともいう）を提供する。上述のように同定された化合物を使用して、治療プロトコールにおけるグラム陽性細菌結合または付着の活性を調整するか、グラム陽性線毛の生物学的機能を推敲することができる。
【００８３】
いくつかの実施形態では、グラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛、グラム陽性線毛タンパク質、またはその部分に結合することができる化合物を同定するための試験化合物のスクリーニングを提供する。グラム陽性線毛またはグラム陽性線毛タンパク質に結合する化合物を、グラム陽性線毛に関連する活性（付着、感染、または炎症反応など）を調整する能力について試験することができる。
【００８４】
本明細書中に記載の方法で使用される試験化合物を、当該分野で公知の組み合わせライブラリー法（生物学的ライブラリー、ペプトイドライブラリー（ペプチドの機能性を有するが、新規の非ペプチド骨格を有し、酵素分解に耐性を示すが、生物活性を保持する分子のライブラリー）（例えば、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら，１９９４，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３７：２６７８−２６８５を参照のこと）、空間的にアドレス可能な並行固相または液相ライブラリー（ｓｐａｔｉａｌｌｙ  ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｏｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）、逆重畳積分を必要とする合成ライブラリー法、「１ビーズ１化合物（ｏｎｅ−ｂｅａｄ  ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」ライブラリー法、およびアフィニティクロマトグラフィ選択を使用した合成ライブラリー法が含まれる）における任意の多数のアプローチを使用して得ることができる。生物学的ライブラリーおよびペプトイドライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに制限される一方で、他の４つのアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物の小分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ，１９９７，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．，１２：１４５）。
【００８５】
分子ライブラリーの合成方法の例を、当該分野、例えば、ＤｅＷｉｔｔら（１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６９０９；Ｅｒｂら，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら，１９９４，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３７：２６７８；Ｃｈｏら，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら，１９９４，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら，１９９４，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら，１９９４，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３７：１２３３）に見出すことができる。
【００８６】
化合物のライブラリーは、溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１３：４１２−４２１）、またはビーズ上（Ｌａｍ，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２−８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ，３６４：５５５−５５６）、細菌上（Ｌａｄｎｅｒの米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子上（Ｌａｄｎｅｒの米国特許第５，２２３，４０９号）、プラスミド上（Ｃｕｌｌら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１８６５−１８６９）、またはファージ上（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａら，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３７８−６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：３０１−３１０；およびＬａｄｎｅｒ  ｓｕｐｒａ）に存在することができる。
【００８７】
いくつかの実施形態では、アッセイは、グラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛、グラム陽性線毛タンパク質、またはその生物学的に活性な部分を発現する細胞（例えば、細菌細胞）を試験化合物と接触させ、試験化合物がグラム陽性線毛またはグラム陽性線毛タンパク質活性を調整する能力を、例えば、細胞結合のモニタリングによって決定する細胞ベースのアッセイである。細胞は、例えば、哺乳動物起源であり得る（例えば、マウス、ラット、またはヒト起源）。細胞は、上皮細胞（例えば、Ａ５４９肺上皮細胞）であり得る。
【００８８】
リガンドまたは基質（例えば、細胞またはタンパク質（フィブリノゲン、フィブロネクチン、またはコラーゲンなど））へのグラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛またはグラム陽性線毛タンパク質の結合活性を調整する試験化合物の能力を、グラム陽性線毛またはグラム陽性線毛タンパク質への化合物（例えば、基質）の結合を複合体中の標識化合物（例えば、基質）の検出によって決定することができるように、例えば、化合物（例えば、基質）を放射性同位体または酵素標識にカップリングすることによって評価することができる。あるいは、グラム陽性線毛またはグラム陽性線毛タンパク質を、放射性同位体または酵素標識にカップリングして、複合体中の基質へのグラム陽性線毛またはグラム陽性線毛タンパク質の結合を調整する試験化合物の能力をモニタリングすることができる。例えば、化合物（例えば、グラム陽性線毛またはグラム陽性線毛タンパク質結合パートナー）を、放射性同位体（例えば、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈ）で直接または間接的に標識し、放射線放出の直接的計数またはシンチレーションカウンティングによって放射性同位体を検出することができる。あるいは、化合物を、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素標識し、酵素標識を、適切な基質の生成物への変換の決定によって検出することができる。
【００８９】
任意の相互作用物を使用するか使用しないで化合物がグラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛またはグラム陽性線毛タンパク質と相互作用する能力を評価することができる。例えば、マイクロフィジオメーターを使用して、化合物またはグラム陽性線毛またはグラム陽性線毛タンパク質のいずれも標識することなく化合物とグラム陽性線毛またはグラム陽性線毛タンパク質との相互作用を検出することができる（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌら，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：１９０６−１９１２）。本明細書中で使用される場合、「マイクロフィジオメーター」（例えば、Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ（登録商標））は、光電的にアドレス可能な電位差測定センサ（ｌｉｇｈｔ−ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ  ｐｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｒｉｃ  ｓｅｎｓｏｒ）（ＬＡＰＳ）を使用した細胞がその環境を酸性化する速度を測定する分析機器である。この酸性化速度の変化を、化合物とグラム陽性線毛またはグラム陽性線毛タンパク質との間の相互作用の指標として使用することができる。
【００９０】
いくつかの実施形態では、無細胞アッセイを提供する。このアッセイは、グラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛、グラム陽性線毛タンパク質、またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触させ、試験化合物がグラム陽性線毛、グラム陽性線毛タンパク質、またはその生物学的に活性な部分に結合する能力を評価する。一般に、新規のアッセイで使用すべきグラム陽性線毛またはグラム陽性線毛タンパク質の生物学的に活性な部分には、グラム陽性線毛またはグラム陽性線毛タンパク質分子との相互作用に関与するフラグメントが含まれる。
【００９１】
無細胞アッセイは、標的遺伝子タンパク質と試験化合物との反応混合物を２つの成分が相互作用して結合し、それにより、除去および／または検出できる複合体を形成するのに十分な条件および時間で調製する工程を含む。
【００９２】
２分子間の相互作用を、例えば、蛍光エネルギー移動（ＦＥＴ）を使用して検出することもできる（例えば、Ｌａｋｏｗｉｃｚらの米国特許第５，６３１，１６９号およびＳｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓらの米国特許第４，８６８，１０３号を参照のこと）。第１の「ドナー」分子上のフルオロフォア標識を選択し、その結果、その放射された蛍光エネルギーが第２の「アクセプター」分子上の蛍光標識によって吸収され、それにより、吸収されたエネルギーによって蛍光を発する。あるいは、「ドナー」タンパク質分子は、トリプトファン残基の天然の蛍光エネルギーを簡潔に使用することができる。「アクセプター」分子標識を「ドナー」の標識と区別することができるように、異なる波長の光を放射する標識を選択する。標識間のエネルギー移動効率が分子を分離する距離に関連するので、分子間の空間的関係を評価することができる。分子間で結合が起こる状況では、アッセイにおける「アクセプター」分子標識の蛍光放射は最大であるべきである。ＦＥＴ結合事象を、当該分野で周知の標準的な蛍光検出手段（例えば、蛍光光度計）によって都合良く測定することができる。
【００９３】
いくつかの実施形態では、グラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛またはグラム陽性  （例えば、肺炎球菌）線毛タンパク質が標的分子（例えば、フィブリノゲン，フィブロネクチン、コラーゲンポリペプチド、またはそのフラグメント）に結合する能力を、リアルタイム生体分子相互作用分析（ＢＩＡ）を使用して決定することができる（例えば、Ｓｊｏｌａｎｄｅｒら，１９９１，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６３：２３３８−２３４５およびＳｚａｂｏら，１９９５，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，５：６９９−７０５）。「表面プラズモン共鳴」または「ＢＩＡ」は、いかなる相互作用物（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ）の標識も行うことなくリアルタイムで生体特異的相互作用を検出する。結合表面での質量の変化（結合事象を示す）によって表面付近の光の屈折率（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学的現象）が変化し、それにより、生体分子間のリアルタイム反応の表示として使用することができる検出可能なシグナルが得られる。
【００９４】
いくつかの実施形態では、標的遺伝子産物または試験物質を固相に繋留する。固相に繋留された標的遺伝子産物／試験化合物複合体を、反応終了時に検出することができる。標的遺伝子産物を固体表面上に繋留し、繋留していない試験化合物を、本明細書中で考察した検出可能な標識で直接または間接的に標識することができる。
【００９５】
複数の標的遺伝子産物を、他の名称でも公知のタンパク質マイクロアレイテクノロジー（タンパク質チップテクノロジーおよび固相タンパク質アレイテクノロジーが含まれる）を使用して固相上に繋留することができる。タンパク質アレイテクノロジーは当業者に周知であり、固定された基板上で同定されたペプチドまたはタンパク質のアレイを得ること、ペプチドに標的分子または生体構成要素を結合すること、およびかかる結合を評価すること（これらに限定されない）に基づく。例えば、Ｇ．ＭａｃＢｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｓ．Ｌ．Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，“Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｓ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ，”  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９（５４８５）：１７６０−１７６３，２０００を参照のこと。マイクロアレイ基板には、ガラス、シリカ、アルミノケイ酸塩、ホウケイ酸塩、金属酸化物（アルミナおよび酸化ニッケル）、種々のクレイ、ニトロセルロース、またはナイロンが含まれるが、これらに限定されない。マイクロアレイ基板を、基板上でプローブ（例えば、ペプチド）の合成を増強するための化合物でコーティングする。基板上のカップリング剤またはカップリング基を使用して、第１のアミノ酸を基板に共有結合することができる。種々のカップリング剤またはカップリング基は、当業者に公知である。ペプチドプローブを、基板上の所定のグリッド中で直接合成することができる。あるいは、ペプチドプローブを基板上にスポットすることができ、かかる場合に、基板を基板へのプローブの結合を増強する化合物でコーティングすることができる。これらの実施形態では、好ましくは、インクジェットまたは圧電性送達などの接触プリント様式または非接触様式で基板にプローブを適用するためのコンピュータ制御のロボットを使用して、予め合成したプローブを正確な所定の体積およびグリッドパターンで基板に適用する。プローブを、基板に共有結合することができる。いくつかの実施形態では、１つ以上のコントロールペプチドまたはタンパク質分子を、基盤に付着させる。コントロールペプチドまたはタンパク質分子により、ペプチドまたはタンパク質の質および結合特性、試薬の特性および有効性、ハイブリッド形成の成功、ならびに分析の閾値および成功などの要因を決定可能である。
【００９６】
いくつかの実施形態では、一方または両方のタンパク質の非複合体化形態からの複合体化形態を容易にし、アッセイの自動化に対応するために、グラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛もしくはグラム陽性線毛タンパク質、抗線毛もしくは線毛タンパク質抗体、またはグラム陽性線毛結合タンパク質（例えば、抗体）を固定することが望ましい。候補化合物の存在下または非存在下でのグラム陽性線毛またはグラム陽性線毛タンパク質への試験化合物の結合またはグラム陽性線毛またはグラム陽性線毛タンパク質と標的分子との相互作用を、反応物を含めるのに適切な任意の容器中で行うことができる。かかる容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、微量遠心管が含まれる。１つの実施形態では、一方または両方のタンパク質がマトリックスに結合可能なドメインを付加した融合タンパク質を提供することができる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／線毛タンパク質融合タンパク質またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質を、グルタチオンセファロース（商標）ビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）またはグルタチオン誘導マイクロタイタープレート上に吸着し、次いで、試験化合物または試験化合物と非吸着標的タンパク質、グラム陽性線毛、またはグラム陽性線毛タンパク質のいずれかと組み合わせ、混合物を複合体形成を誘導する条件下（例えば、塩およびｐＨについての生理学的条件下）でインキュベーションすることができる。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートを洗浄して非結合成分を除去し、ビーズの場合はマトリックスを固定し、複合体を上記のように直接または間接的に決定する。あるいは、複合体をマトリックスから解離し、グラム陽性線毛またはグラム陽性線毛タンパク質の結合または活性レベルを標準的技術を使用して決定する。
【００９７】
グラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛、グラム陽性線毛タンパク質、または結合標的をマトリックスに固定するための他の技術は、ビオチンおよびストレプトアビジンの結合体化の使用を含む。ビオチン化グラム陽性線毛、グラム陽性線毛タンパク質、または標的分子を、当該分野で公知の技術（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬのビオチン化キット）を使用してビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から調製し、ストレプトアビジンコーティングした９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェル中に固定することができる。
【００９８】
アッセイを行うために、非固定成分を、繋留成分を含むコーティング表面に添加する。反応完了後、形成された任意の複合体が個チア表面上に固定されたままであるような条件下で未反応成分を除去する（例えば、洗浄による）。固体表面上に繋留した複合体を、多数の方法で検出することができる。事前に固定していない成分を予め標識する場合、表面上に固定された標識の検出は複合体が形成したことを示す。事前に固定していない成分を予め標識しない場合、間接的標識を使用して（例えば、固定化成分に特異的な標識抗体を使用して）、表面上に繋留した複合体を検出することができる（それにより、抗体を、例えば、標識抗Ｉｇ抗体で直接または間接的に標識することができる）。
【００９９】
いくつかの実施形態では、グラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛またはグラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛タンパク質または結合標的に特異的に結合するが、グラム陽性線毛またはグラム陽性線毛タンパク質のその標的への結合を妨害しない抗体を使用してこのアッセイを行う。かかる抗体を、プレートのウェルに誘導体化し、非結合標的、グラム陽性線毛、またはグラム陽性線毛タンパク質を、抗体結合体化によってウェルに捕捉することができる。かかる複合体の検出方法は、ＧＳＴ固定化複合体のための上記の検出方法に加えて、グラム陽性線毛、グラム陽性線毛タンパク質、または標的分子に反応性を示す抗体を使用した複合体の免疫検出およびグラム陽性線毛、グラム陽性線毛タンパク質、または標的分子に関連する酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイを含む。
【０１００】
いくつかの実施形態では、無細胞アッセイを液相で行うことができる。かかるアッセイでは、多数の標準的な技術（分画遠心法（例えば、Ｒｉｖａｓら，１９９３，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１８：２８４−２８７）、クロマトグラフィ（ゲル濾過クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ）、電気泳動（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら，ｅｄｓ．，１９９９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．）、および免疫沈降（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら，ｅｄｓ．，１９９９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）が含まれるが、これらに限定されない）のいずれかによって反応生成物を未反応成分から分離する。かかる樹脂およびクロマトグラフィ技術は、当業者に公知である（例えば、Ｈｅｅｇａａｒｄ，１９９８，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．，１１：１４１−１４８およびＨａｇｅら，１９９７，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ａｐｐｌ．，６９９：４９９−５２５）。さらに、上記のように蛍光エネルギー移動も都合良く使用して、複合体を溶液からさらに精製することなく結合を検出することができる。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、アッセイは、グラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛またはグラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛タンパク質またはその生物学的に活性な部分をグラム陽性線毛またはグラム陽性線毛タンパク質に結合する化合物（例えば、タンパク質）と接触させてアッセイ混合物を形成する工程、アッセイ混合物を試験化合物と接触させる工程、および試験化合物が細胞また化合物へのグラム陽性線毛またはグラム陽性線毛タンパク質の結合に影響を及ぼす能力を決定する工程を含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、肺炎球菌線毛を発現する細菌細胞の結合のアッセイは、肺炎球菌線毛を発現する細菌細胞をＡ５４９肺上皮細胞とインキュベーションする工程、洗浄して非接着性細菌細胞を除去する工程、および接着性細菌細胞を検出する工程を含む。細菌接着を、当該分野の任意の手段（例えば、接着性細菌細胞への抗体の結合または上皮細胞の溶解および会合した細菌細胞の計数）によって測定することができる。ＨＥＰ２細胞、ＣＨＯ細胞、またはＨｅＬａ細胞を、肺炎球菌線毛を発現する細菌細胞の結合アッセイで使用する個ともできる。
【０１０３】
免疫原性組成物
グラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛を含む本発明の免疫原性組成物は、１つ以上の抗原性作用因子（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）をさらに含むことができる。抗原の例には、以下に列挙の抗原が含まれる。さらに、本発明の組成物を使用して、任意の以下に列挙の微生物または関連微生物に起因する感染を治療または防止することができる。免疫原性組成物で使用するための抗原には、１つ以上の下記の抗原または１つ以上の下記の抗原由来の抗原が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０４】
細菌抗原
髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）：髄膜炎菌血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、Ｙ、および／またはＢ由来のタンパク質抗原（１〜７）、髄膜炎菌血清群Ｂ由来の外膜小胞（ＯＭＶ）調製物（８、９、１０、１１）、髄膜炎菌血清群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５、および／またはＹ由来の糖抗原（ＬＰＳが含まれる）（血清群Ｃ由来の少糖など）（ＰＣＴ／ＵＳ９９／０９３４６；ＰＣＴ  ＩＢ９８／０１６６５；およびＰＣＴ  ＩＢ９９／００１０３を参照のこと）；
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ：糖抗原またはタンパク質抗原、特に、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の糖または以下のタンパク質または抗原ペプチド：ＰｈｔＤ（ＢＶＨ−１１−２、ＳＰ１００３、ｓｐｒ０９０７）（Ａｄａｍｏｕら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６９：９４９−５３，２００１；Ｈａｍｅｌら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，７２：２６５９−７０，２００４）、ＰｈｔＥ（ＢＶＨ−３、ＳＰ１００４、ｓｐｒ０９０８）（Ａｄａｍｏｕら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６９：９４９−５３，２００１；Ｈａｍｅｌら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，７２：２６５９−７０，２００４）、ＰｈｔＢ（ＰｈｐＡ、ＢＶＨ−１１、ＳＰ１１７４、ｓｐｒ１０６０）（Ａｄａｍｏｕら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６９：９４９−５３，２００１；Ｚｈａｎｇら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６９：３８２７−３６，２００１；Ｈａｍｅｌら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，７２：２６５９−７０，２００４）、ＰｈｔＡ（ＢＶＨ−１１−３、ＳＰ１１７５、ｓｐｒ１０６１）（Ａｄａｍｏｕら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６９：９４９−５３，２００１；Ｗｉｚｅｍａｎｎら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６９：１５９３−９８，２００１；Ｚｈａｎｇら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６９：３８２７−３６，２００１；Ｈａｍｅｌら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，７２：２６５９−７０，２００４）、ＮａｎＡ（ＳＰ１６９３、ｓｐｒ１５３６）（Ｔｏｎｇら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，７３：７７７５−７８，２００５）、ＳＰ１８７２（ｓｐｒ１６８７）（Ｂｒｏｗｎら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６９：６７０２−０６，２００１）、ＰｓｐＣ（ＣｂｐＡ、ＳＰ２１９０、ｓｐｒ１９９５）（Ｏｇｕｎｎｉｙｉら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６９：５９９７−６００３，２００１）、ＰｓｐＡ（ＳＰ０１７７、ｓｐｒ０１２１、ｓｐｒ１２７４）（Ｂｒｉｌｅｓら，Ｖａｃｃｉｎｅ，１９：Ｓ８７−Ｓ９５，２００１）；ＳＰ０４９８（ｓｐｒ０４４０）、ＬｙｔＢ（ＳＰ０９６５、ｓｐｒ０８６７）（Ｗｉｚｅｍａｎｎら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６９：１５９３−９８，２００１）、ＡｌｉＢ（ＳＰ１５２７、ｓｐｒ１３８２）、ＰｐｍＡ（ＳＰ０９８１、ｓｐｒ０８８４）（Ｏｖｅｒｗｅｇら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６８：４１８０−４１８８，２０００）、ＬｙｔＣ（ＳＰ１５７３、ｓｐｒ１４３１）（Ｗｉｚｅｍａｎｎら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６９：１５９３−９８，２００１）、ＰｓａＡ（Ｂｒｉｌｅｓら，Ｖａｃｃｉｎｅ，１９：Ｓ８７−Ｓ９５，２００１）、ＰｄＢ（Ｏｇｕｎｎｉｙｉら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６９：５９９７−６００３，２００１）、ＲＰｈｐ（Ｚｈａｎｇら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６９：３８２７−３６，２００１）、ＰｉｕＡ（Ｊｏｍａａら，Ｖａｃｃｉｎｅ，２４：５１３３−３９，２００６）、ＰｉａＡ（Ｊｏｍａａら，Ｖａｃｃｉｎｅ，２４：５１３３−３９，２００６）、６ＰＧＤ（Ｄａｎｉｅｌｙら，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４４：２５４−２６３，２００６）、またはＰｐｐＡ（Ｇｒｅｅｎら，Ｉｎｆｅｃｔ��Ｉｍｍｕｎ．，７３：９８１−８９，２００５）；
ストレプトコッカス・アガラクチア：特に、Ｂ群連鎖球菌抗原；
化膿性連鎖球菌：特に、Ａ群連鎖球菌抗原；
フェカリス菌またはフェシウム菌：特に、三糖類反復または米国特許第６，７５６，３６１号に記載の他の腸球菌由来の抗原；
ピロリ菌：Ｃａｇ、Ｖａｃ、Ｎａｐ、ＨｏｐＸ、ＨｏｐＹ、および／またはウレアーゼ抗原が含まれる；
百日咳菌：百日咳菌ホロ毒素（ＰＴ）および百日咳菌由来の線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）、また、任意選択的に、パータクチンおよび／または凝集原２および３抗原との組み合わせなど；
黄色ブドウ球菌：任意選択的に非毒性組換え緑膿菌外毒素Ａ（ＳｔａｐｈＶＡＸ（商標）に結合体化した黄色ブドウ球菌５型および８型莢膜多糖または表面タンパク質インベイシン（ロイコシジン、キナーゼ、ヒアルロニダーゼ）、食細胞貪食を阻害する表面因子（莢膜、タンパク質Ａ）、カロテノイド、カタラーゼ酸性、タンパク質Ａ、凝固酵素、凝固因子、および／または真核細胞膜を溶解する膜損傷毒素（任意選択的に解毒されている）（ヘモリシン、ロイコトキシン、ロイコシジン）由来の抗原が含まれる；
表皮ブドウ球菌：特に、表皮ブドウ球菌粘液関連抗原（ＳＡＡ）；
腐性ブドウ球菌：（尿路感染の原因菌）特に、腐性ブドウ球菌抗原の１６０ｋＤａ血球凝集素；
緑膿菌：特に、内毒素Ａ、Ｗｚｚタンパク質、緑膿菌ＬＰＳ、さらに、ＰＡＯ１（Ｏ５血清型）から単離したＬＰＳ、および／または外膜タンパク質（外膜タンパク質Ｆ（ＯｐｒＦ）が含まれる）（Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００１  Ｍａｙ；６９（５）：３５１０−３５１５）；
炭疽菌（炭疽菌）：Ａ成分由来の炭疽菌抗原（任意選択的に解毒）（致死因子（ＬＦ）および浮腫因子（ＥＦ））（共に防御抗原（ＰＡ）として公知の共通のＢ成分を有することができる）など；
カタル球菌：（呼吸器）（外膜タンパク質抗原（ＨＭＷ−ＯＭＰ）、Ｃ抗原、および／またはＬＰＳが含まれる）；
ペスト菌（ペスト）：Ｆ１莢膜抗原（Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００３  Ｊａｎ；７１（１）：３７４−３８３）、ＬＰＳ（Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．１９９９  Ｏｃｔｏｂｅｒ；６７（１０）：５３９５）、ペスト菌Ｖ抗原（Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．１９９７  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；６５（１１）：４４７６−４４８２）など；
エンテロコリチカ菌（胃腸病原体）：特に、ＬＰＳ（Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００２  Ａｕｇｕｓｔ；７０（８）：４４１４）；
偽結核菌：胃腸病原体抗原；
結核菌：リポタンパク質、ＬＰＳ、ＢＣＧ抗原、抗原８５Ｂの融合タンパク質（Ａｇ８５Ｂ）、および／または任意選択的にカチオン性脂質小胞中に処方されたＥＳＡＴ−６（Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００４  Ｏｃｔｏｂｅｒ；７２（１０）：６１４８）、結核菌（Ｍｔｂ）イソシトレートデヒドロゲナーゼ関連抗原（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００４  Ａｕｇ  ２４；１０１（３４）：１２６５２）、および／またはＭＰＴ５１抗原（Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００４  Ｊｕｌｙ；７２（７）：３８２９）など；
レジオネラ・ニューモフィラ（レジオネラ症）：任意選択的に破壊ａｓｄ遺伝子を有する細胞株由来のＬ．ニューモフィラ抗原（Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．１９９８  Ｍａｙ；６６（５）：１８９８）；
リケッチア属：（外膜タンパク質（外膜タンパク質Ａおよび／またはＢ（ＯｍｐＢ）（Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．２００４  Ｎｏｖ  １；１７０２（２）：１４５）が含まれる）、ＬＰＳ、および表面タンパク質抗原（ＳＰＡ）（Ｊ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．１９８９  Ｊｕｎ；２  Ｓｕｐｐｌ：８１）が含まれる）；
大腸菌：（腸幹毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）、凝集付着性大腸菌（ＥＡｇｇＥＣ）、均一付着性大腸菌（ＤＡＥＣ）、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）、および／または腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）由来の抗原が含まれる）；
コレラ菌：（プロテイナーゼ抗原、ＬＰＳ、特にコレラ菌ＩＩのリポ多糖、Ｏ１  Ｉｎａｂａ  Ｏ特異的多糖、コレラ菌Ｏ１３９、ＩＥＭ１０８ワクチンの抗原（Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００３  Ｏｃｔ；７１（１０）：５４９８−５０４）、および／または閉鎖帯毒素（Ｚｏｔ）が含まれる）；
チフス菌（チフス熱）：（莢膜多糖、好ましくは結合体（Ｖｉ、すなわち、ｖａｘ−ＴｙＶｉ）が含まれる）；
ネズミチフス菌（胃腸炎）：ネズミチフス菌由来の抗原は、微生物および癌療法（血管形成の阻害およびｆｌｋの調整が含まれる）が意図される；
リステリア菌（免疫不全患者または高齢者における全身感染、胎児の感染）：Ｌ．モノサイトゲネス由来の抗原を、本発明の結合体／関連組成物の細胞質内送達のためのキャリア／ベクターとして使用することが好ましい；
ジンジバリス菌：特に、ジンジバリス菌外膜タンパク質（ＯＭＰ）；
破傷風：好ましくは、本発明の組成物との結合体化でのキャリアタンパク質として使用される破傷風毒素（ＴＴ）抗原など；
ジフテリア：ジフテリアトキソイド（例えば、ＣＲＭ１９７）など、さらに、ＡＤＰリボシル化を調整するか、阻害するか、関連することができる抗原は、本発明の組成物との組み合わせ／同時投与／結合体化が意図され、ジフテリアトキソイドをキャリアタンパク質として使用することができる；
ライム病ボレリア（ライム病）：Ｐ３９およびＰ１３に関連する抗原（膜内在性タンパク質、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００１  Ｍａｙ；６９（５）：３３２３−３３３４）、ＶｌｓＥ抗原変異タンパク質（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９９  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ；３７（１２）：３９９７）など；
インフルエンザ菌Ｂ型：これに由来する糖抗原など；
クレブシエラ属：ＯＭＰ（ＯＭＰ  Ａが含まれる）または任意選択的に破傷風トキソイドに結合体化した多糖など；
淋菌（Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）：Ｐｏｒ（またはポリン）タンパク質（ＰｏｒＢなど）（Ｚｈｕら，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００４）２２：６６０−６６９を参照のこと）、トランスフェリン結合タンパク質（ＴｂｐＡおよびＴｂｐＢなど）（Ｐｒｉｃｅら，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００４）７１（１）：２７７−２８３）、不透明タンパク質（ｏｐａｃｉｔｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（Ｏｐａなど）、還元修飾タンパク質（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ−ｍｏｄｉｆｉａｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（Ｒｍｐ）、および外膜小胞（ＯＭＶ）調製物（Ｐｌａｎｔｅら，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ（２０００）１８２：８４８−８５５）を参照のこと、例えば、ＷＯ９９／２４５７８号、ＷＯ９９／３６５４４号、ＷＯ９９／５７２８０号、ＷＯ０２／０７９２４３も参照のこと）が含まれる、
クラミジア・ニューモニエ：特に、Ｃ．ニューモニエタンパク質抗原；
クラミジア・トラコーマチス：血清型Ａ、Ｂ、ＢａおよびＣ（トラコーマ（失明の原因））、血清型Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３（性病性リンパ肉芽腫症）、および血清型Ｄ〜Ｋ由来の抗原が含まれる；
梅毒トレポネーマ（梅毒）：特に、ＴｍｐＡ抗原；および
軟性下疳菌（軟性下疳の原因菌）：（外膜タンパク質（ＤｓｒＡ）が含まれる）。
【０１０５】
特に参照しない場合、本発明のさらなる細菌抗原は、上記の任意の莢膜抗原、多糖抗原、またはタンパク質抗原であり得る。さらなる細菌抗原には、外膜小胞（ＯＭＶ）調製物も含まれ得る。さらに、抗原には、任意の上記細菌の生きている、弱毒化、および／または精製バージョンが含まれる。本発明の細菌または微生物由来の抗原は、グラム陰性またはグラム陽性および好気性または嫌気性であり得る。
【０１０６】
さらに、任意の上記細菌由来の糖（多糖、ＬＰＳ、ＬＯＳ、または少糖）を、別の薬剤または抗原（キャリアタンパク質（例えば、ＣＲＭ１９７）など）に結合体化することができる。米国特許第５，３６０，８９７号およびＣａｎ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９８４  Ｍａｙ；６２（５）：２７０−５に示すように、かかる結合体化は、タンパク質上のアミノ基への糖上のカルボニル部分の還元的アミノ化によって影響を受ける直接結合体化であり得る。あるいは、糖を、スクシンアミドまたはＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９６およびＣＲＣ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ，１９９３に記載の他の結合などのリンカーによって結合体化することができる。
【０１０７】
ウイルス抗原
インフルエンザ：血球凝集素（ＨＡ）および／またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）表面タンパク質を含む全ウイルス粒子（弱毒化）、分割物（ｓｐｌｉｔ）、またはサブユニットが含まれ、インフルエンザ抗原は、ニワトリ胚に由来し得るか、細胞培養で増殖させることができ、そして／またはインフルエンザ抗原は、特に、インフルエンザＡ型、Ｂ型、および／またはＣ型に由来する。
【０１０８】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）：（ＲＳＶのＡ２株のＦタンパク質（Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．２００４  Ｎｏｖ；８５（Ｐｔ  １１）：３２２９）および／またはＧ糖タンパク質が含まれる）；
パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）：（好ましくは血球凝集素、ノイラミニダーゼ、および／または融合糖タンパク質を含むＰＩＶ１型、２型、および３型が含まれる）；
ポリオウイルス：（ピコルナウイルス科由来の抗原、好ましくはポリオウイルス抗原（ＯＰＶなど）、好ましくはＩＰＶが含まれる）；
麻疹：（任意選択的にプロトリンと組み合わせた麻疹ウイルス（ＭＶ）成分抗原またはＭＭＲワクチンが中に存在する抗原が含まれる）；
ムンプス：（ＭＭＲワクチン中に存在する抗原が含まれる）；
風疹：（ＭＭＲワクチン中に存在する抗原およびトガウイルス科（デングウイルスが含まれる）由来の他の抗原が含まれる）；
狂犬病：凍結乾燥不活化ウイルス（ＲａｂＡｖｅｒｔ（商標））など；
フラビウイルス科のウイルス：黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、デングウイルス（１型、２型、３型、または４型）、ダニ媒介脳炎ウイルス、およびウエストナイルウイルス（およびこれら由来の抗原）など；
カリシウイルス科：カリシウイルス科由来の抗原；
ＨＩＶ：（ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２株抗原（ｇａｇ（ｐ２４ｇａｇおよびｐ５５ｇａｇ）、ｅｎｖ（ｇｐ１６０およびｇｐ４１）、ｐｏｌ、ｔａｔ、ｎｅｆ、ｒｅｖ  ｖｐｕ、ミニタンパク質（ｍｉｎｉｐｒｏｔｅｉｎ）、（好ましくは、ｐ５５ｇａｇおよびｇｐ１４０ｖ欠失）など）および単離物ＨＩＶＩＩＩｂ、ＨＩＶＳＦ２、ＨＩＶＬＡＶ、ＨＩＶＬＡ１、ＨＩＶＭＮ、ＨＩＶ−１ＣＭ２３５、ＨＩＶ−１ＵＳ４、ＨＩＶ−２由来の抗原；特に、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が含まれる）；
ロタウイルス：（ＶＰ４、ＶＰ５、ＶＰ６、ＶＰ７、ＶＰ８タンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ．２００４  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ；３８（２）：２０５）、および／またはＮＳＰ４が含まれる）；
ペスチウイルス：古典的ブタ発熱ウイルス（ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、ウシウイルス性下痢症ウイルス、および／またはボーダー病ウイルス由来の抗原など；
パルボウイルス：パルボウイルスＢ１９など；
コロナウイルス：（ＳＡＲＳウイルス抗原、特に、スパイクタンパク質または由来するプロテアーゼならびにＷＯ０４／９２３６０号に含まれる抗原が含まれる）；
Ａ型肝炎ウイルス：不活化ウイルスなど；
Ｂ型肝炎ウイルス：表面および／またはコア抗原（ｓＡｇ）ならびにプレ表面配列（ｐｒｅｓｕｒｆａｃｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）（ｐｒｅ−Ｓ１およびｐｒｅ−Ｓ２（以前は、ｐｒｅ−Ｓと呼ばれていた））、ならびに上記の組み合わせ（ｓＡｇ／ｐｒｅ−Ｓ１、ｓＡｇ／ｐｒｅ−Ｓ２、ｓＡｇ／ｐｒｅ−Ｓ１／ｐｒｅ−Ｓ２、およびｐｒｅ−Ｓ１／ｐｒｅ−Ｓ２など）（例えば、ＡＨＢＶ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ−Ｈｕｍａｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ，ｐｐ．１５９−１７６；および米国特許第４，７２２，８４０号、同第５，０９８，７０４号、同第５，３２４，５１３号；Ｂｅａｍｅｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９５）６９：６８３３−６８３８，Ｂｉｒｎｂａｕｍら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９０）６４：３３１９−３３３０；およびＺｈｏｕら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９１）６５：５４５７−５４６４を参照のこと）など；
Ｃ型肝炎ウイルス：Ｅ１、Ｅ２、Ｅ１／Ｅ２（Ｈｏｕｇｈｔｏｎら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９１）１４：３８１を参照のこと）、ＮＳ３４５ポリタンパク質、ＮＳ  ３４５−コアポリタンパク質、コア、および／または非構造領域由来のペプチド（国際公開番号ＷＯ８９／０４６６９号；ＷＯ９０／１１０８９号；およびＷＯ９０／１４４３６号）など；
デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）：デルタ肝炎ウイルス由来の抗原特に、ＨＤＶ由来のδ抗原（例えば、米国特許第５，３７８，８１４号を参照のこと）；
Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）；Ｅ型肝炎ウイルス由来の抗原；
Ｇ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）；Ｇ型肝炎ウイルス由来の抗原；
水痘帯状疱疹ウイルス（Ｖａｒｃｉｃｅｌｌａ  ｚｏｓｔｅｒ  ｖｉｒｕｓ）：水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）由来の抗原（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）６７：１７５９）；
エプスタイン・バーウイルス：ＥＢＶ由来の抗原（Ｂａｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３１０：２０７）；
サイトメガロウイルス：ＣＭＶ抗原（ｇＢおよびｇＨ（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｊ．Ｋ．ＭｃＤｏｕｇａｌｌ，ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  １９９０）ｐｐ．１２５−１６９）が含まれる）；
単純ヘルペスウイルス：（ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２株由来の抗原および糖タンパク質ｇＢ、ｇＤ、およびｇＨ（ＭｃＧｅｏｃｈら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）６９：１５３１および米国特許第５，１７１，５６８号）が含まれる）；
ヒトヘルペスウイルス：他のヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ６およびＨＨＶ７）由来の抗原；および
ＨＰＶ：（ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に関連するか由来する抗原（例えば、１つ以上のＥ１〜Ｅ７、Ｌ１、Ｌ２、およびその融合物）が含まれる）（特に、本発明の組成物は、Ｌ１主要キャプシドタンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含むことができ、さらに、ＨＰＶ抗原は、１つ以上のＨＰＶ血清型６、１１、１６、および／または１８から防御する）。
【０１０９】
Ｖａｃｃｉｎｅｓ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｐｌｏｔｋｉｎ  ａｎｄ  Ｏｒｅｎｓｔｅｉｎ  ｅｄ．２００４）；Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍｕｒｒａｙらｅｄ．２００２）；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ  ｅｄ．１９８８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，ｅｄｓ．１９９１）（本発明の組成物との結合体化で意図される）に含まれる抗原、組成物、方法、および微生物をさらに提供する。
【０１１０】
さらに、抗原には、任意の上記細菌の生きている、弱毒化、成分、および／または精製バージョンが含まれる。
【０１１１】
真菌抗原
ワクチンに関連する本明細書中で使用するための真菌抗原には、トリコフィトン・メンタグロフィトに起因する白癬（ｔｒｉｃｈｏｐｙｔｏｓｉｓ）の予防よび治療のための米国特許第４，２２９，４３４号および同第４，３６８，１９１号；動物（モルモット、ネコ、ウサギ、ウマ、および子羊など）における皮膚糸状菌感染の予防のための広範な皮膚糸状菌ワクチンについての米国特許第５，２７７，９０４号および同第５，２８４，６５２号（これらの抗原は、有効量の死滅したＴ．エクイヌム（Ｔ．ｅｑｕｉｎｕｍ）、Ｔ．メンタグロフィト（Ｔ．ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ）（変種グラニュラレ（ｖａｒ．ｇｒａｎｕｌａｒｅ））、Ｍ．カニス、および／またはＭ．ギプセウムを含み、任意選択的にアジュバントと組み合わせる）；有効量の均質化ホルムアルデヒド死滅真菌（すなわち、ミクロスポルム・カニス培養物を含むキャリア）を含む白癬ワクチンについての米国特許第５，４５３，２７３号および同第６，１３２，７３３号；ピシウム感染症（ｐｙｔｈｉｏｓｉｓ）の細胞外タンパク質および細胞内タンパク質を含む米国特許第５，９４８，４１３号に記載の真菌抗原が含まれる。抗真菌ワクチン内で同定されたさらなる抗原には、Ｒｉｎｇｖａｃ  ｂｏｖｉｓ  ＬＴＦ−１３０およびＢｉｏｖｅｔａが含まれる。
【０１１２】
さらに、本明細書中で使用される真菌抗原は、皮膚糸状菌（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｙｔｒｅｓ）（エピダーモフィートン・フロクスム（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ  ｆｌｏｃｃｕｓｕｍ）、ミクロスポルム・オドウニ（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ａｕｄｏｕｉｎｉ）、ミクロスポルム・カニス、ミクロスポルム・ジストルツム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｄｉｓｔｏｒｔｕｍ）、ミクロスポルム・エクイヌム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｅｑｕｉｎｕｍ）、ミクロスポルム・ギプスム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｇｙｐｓｕｍ）、ミクロスポルム・ナヌム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｎａｎｕｍ）、トリコフィトン・コンセントリクム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍ）、トリコフィトン・エクイヌム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｅｑｕｉｎｕｍ）、トリコフィトン・ガリナエ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｇａｌｌｉｎａｅ）、トリコフィトン・ギプセウム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｇｙｐｓｅｕｍ）、トリコフィトン・メグニニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｇｎｉｎｉ）、トリコフィトン・メンタグロフィト（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ）、トリコフィトン・キンケアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｑｕｉｎｃｋｅａｎｕｍ）、トリコフィトン・ルブルム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ）、トリコフィトン・ショエンレイニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｓｃｈｏｅｎｌｅｉｎｉ）、トリコフィトン・トンスランス（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｔｏｎｓｕｒａｎｓ）、トリコフィトン・ベルコスム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ）、Ｔ．ベルコスム変種アルブム、変種ジスコイデス（ｖａｒ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｓ）、変種オクラセウム（ｖａｒ．ｏｃｈｒａｃｅｕｍ）、トリコフィトン・ビオラセウム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）、および／またはトリコフィトン・ファビホルム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｆａｖｉｆｏｒｍｅ）が含まれる）に由来し得る。
【０１１３】
抗原として使用するか、本発明の組成物との結合体化における抗原の誘導における真菌病原体は、アスペルギルス・フミガーツス、アスペルギルス・フラバス、クロコウジカビ、アスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・テレウス、アスペルギルス・シドウィ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｙｄｏｗｉ）、アスペルギルス・フラバタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖａｔｕｓ）、アスペルギルス・グラウクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｇｌａｕｃｕｓ）、ブラストシゾマイセス・カピタツス（Ｂｌａｓｔｏｓｃｈｉｚｏｍｙｃｅｓ  ｃａｐｉｔａｔｕｓ）、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・エノラーゼ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｅｎｏｌａｓｅ）、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・グラブラタ、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ）、カンジダ・パラプシローシス、カンジダ・ステラトイデア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｔｅｌｌａｔｏｉｄｅａ）、カンジダ・クセイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｕｓｅｉ）、カンジダ・パラクセイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｋｗｓｅｉ）、カンジダ・ルシタニエ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、カンジダ・シュードトロピカリス、カンジダ・ギリールモンディ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉ）、クラドスポリウム・カリオニイイ（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｃａｒｒｉｏｎｉｉ）、コクシジオイデス・イミチス、ブラストミセス・デルマティディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｄｉｓ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ジオトリカム・クレバタム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃｌａｖａｔｕｍ）、ヒストプラズマ・カプスラーツム、南アメリカ分芽菌、ニューモシスチス・カリニ、ピチウム・イインシディオスム（Ｐｙｔｈｉｕｍｎ  ｉｎｓｉｄｉｏｓｕｍ）、ピチロスポルム・オバーレ（Ｐｉｔｙｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｏｖａｌｅ）、出芽酵母（Ｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、サッカロマイセス・ブラウディ、サッカロマイセス・プロンベ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、セドスポリウム・アピオスペルム（Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ａｐｉｏｓｐｅｒｕｍ）、スポロトリクス・シエンキイ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）、トリコスポロン・ベイゲリイ（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｂｅｉｇｅｌｉｉ）、トキソプラズマ・ゴンディ、ペニシリウム・マルネフェイ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍａｒｎｅｆｆｅｉ）、マラセジア属、フォンセカヤ属（Ｆｏｎｓｅｃａｅａ  ｓｐｐ．）、ワンギエラ属（Ｗａｎｇｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、スポロトリクス属（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｐｐ．）、バシジオボラス属、コニディオボラス属、リゾプス属、ケカビ属、アブシディア属、モルチエレラ属、クスダマカビ属、およびサクセネア属（Ｓａｋｓｅｎａｅａ  ｓｐｐ．）を含む。
【０１１４】
抗原が由来し得る他の真菌には、アルテルナリア属、カーブラリア属、ヘルミントスポリウム属、フザリウム属、アスペルギルス属、アオカビ属、モノリニア属（Ｍｏｎｏｌｉｎｉａ  ｓｐｐ）、リゾクトニア属、ペシロマイセス属、ピトマイセス属（Ｐｉｔｈｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ）、およびクラドスポリウム属が含まれる。
【０１１５】
真菌抗原の産生過程は、当該分野で周知である（米国特許第６，３３３，１６４号を参照のこと）。いくつかの実施形態では、可溶化画分を抽出し、細胞壁が実質的または少なくとも部分的に除去された真菌細胞から得ることができる不溶性画分から分離し、過程が、生きている真菌細胞を得る工程、細胞壁が実質的または少なくとも部分的に除去された真菌細胞を得る工程、細胞壁が実質的または少なくとも部分的に除去された真菌細胞を破裂させる工程、不溶性画分を得る工程、および不溶性画分から可溶性画分を抽出および分離する工程を含むという点で特徴づける。
【０１１６】
ＳＴＤ抗原
いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法を実施することができる微生物（細菌、ウイルス、および／または真菌）には、性感染症（ＳＴＤ）を引き起こすものおよび／または本発明の標的または抗原組成物であり得る抗原の表面上に示されるものが含まれる。本発明のいくつかの実施形態では、組成物を、ウイルスまたは細菌のＳＴＤ由来の抗原と組み合わせる。細菌またはウイルス由来の抗原を、本発明の組成物と併せて投与して、特に、少なくとも１つの以下のＳＴＤから防御することができる：クラミジア、陰部ヘルペス、肝炎（特に、ＨＣＶ）、陰部疣贅、淋病、梅毒、および／または軟性下疳（例えば、ＷＯ００／１５２５５を参照のこと）。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物を、ＳＴＤの防止または治療のために抗原と同時投与する。
【０１１８】
ＳＴＤに関連する以下のウイルス由来の抗原（上記にさらに詳述している）を、本発明の組成物と同時投与する：肝炎（特にＨＣＶ）、ＨＰＶ、ＨＩＶ、またはＨＳＶ。
【０１１９】
さらに、ＳＴＤに関連する以下の細菌由来の抗原（上記にさらに詳述している）を、本発明の組成物と同時投与する：淋菌（Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、肺炎クラミジア、トラコーマクラミジア、梅毒トレポネーマ、または軟性下疳菌．
呼吸器抗原
いくつかの実施形態では、グラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛抗原は、呼吸器抗原であり、特に、呼吸器ウイルスの感染および／または感染の１つ以上の症状の軽減または防止による、呼吸器病原体（ウイルス、細菌または真菌（呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ＰＩＶ、ＳＡＲＳウイルス、インフルエンザ、炭疽菌など）が含まれる）による感染の防止および／または処置方法のための免疫原性組成物で使用される。本明細書中に記載の抗原（呼吸器ウイルス、細菌、または真菌由来の抗原など）を含む組成物を、本発明の組成物と併せて、特定の呼吸器微生物に曝されているリスクがあるか、呼吸器微生物に曝されていたか、呼吸器ウイルス、細菌、または真菌に感染している個体に投与する。本発明の組成物を、呼吸器病原体の抗原と同時または同一の処方物中で同時投与することができる。組成物の投与により、呼吸器感染の１つ以上の症状の発生率および／または重症度が軽減される。
【０１２０】
小児／高齢者抗原
いくつかの実施形態では、本発明の組成物を、小児抗原（ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）などの小児科集団の治療のための１つ以上の抗原と併せて使用する。いくつかの実施形態では、小児科集団中の被験体の年齢は、約３歳未満、約２歳未満、または約１歳未満である。いくつかの実施形態では、（本発明の組成物と併せた）小児抗原を、少なくとも１、２、または３年間にわたって複数回投与する。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物を、高齢者抗原（ｇｅｒｉａｔｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）などの高齢者集団（ｇｅｒｉａｔｒｉｃ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）の治療のための１つ以上の抗原と併せて使用する。いくつかの実施形態では、高齢者集団中の被験体の年齢は、５０、５５、６０、６５、７０、または７５歳を超える。
【０１２２】
他の抗原
本発明の組成物と併せて使用するための他の抗原には、院内感染（病院）関連抗原が含まれる。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物と併せて寄生虫抗原を意図する。寄生虫抗原の例には、疾患（マラリアおよび／またはライム病が含まれるが、これらに限定されない）を引き起こす成分由来の抗原が含まれる。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物と併せた抗原は、蚊媒介性疾患に関連し、そして／または有効である。いくつかの実施形態では、本発明の組成物と併せた抗原は、脳炎に関連し、そして／または有効である。いくつかの実施形態では、本発明の組成物と併せた抗原は、神経系感染に関連し、そして／または有効である。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物と併せた抗原は、血液または体液を介して伝播し得る抗原である。
【０１２６】
抗原処方物
本発明のいくつかの態様では、本方法は、（ａ）（ｉ）水、（ｉｉ）界面活性剤、（ｉｉｉ）有機溶媒、および（ｉｖ）ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルソエステル、ポリ酸無水物、およびポリシアノアクリラートからなる群から選択される生分解性ポリマーを含む混合物の分散によって乳濁液を準備する工程（ポリマーは、典型的には、混合物中に有機溶媒に対して約１％〜約３０％の濃度で存在する一方で、界面活性剤は、典型的には、混合物中に界面活性剤：ポリマーの重量比で約０．００００１：１〜約０．１：１（より典型的には、約０．０００１：１〜約０．１：１、約０．００１：１〜約０．１：１、または約０．００５：１〜約０．１：１）で存在する）、（ｂ）乳濁液から有機溶媒を除去する工程、および（ｃ）微粒子表面上の抗体を吸着する工程を含む。いくつかの実施形態では、生分解性ポリマーは、有機溶媒に対して約３％〜約１０％の濃度で存在する。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、本明細書中で使用するための微粒子を、滅菌可能、非毒性、および生分解性の材料から形成することができる。かかる材料には、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルソエステル、ポリ酸無水物、ＰＡＣＡ、およびポリシアノアクリラートが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明と共に使用するための微粒子は、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、特に、ポリ（ラクチド）（「ＰＬＡ」）またはＤ，Ｌ−ラクチドとグリコリドまたはグリコール酸とのコポリマー（ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（「ＰＬＧ」または「ＰＬＧＡ」）など）またはＤ，Ｌ−ラクチドとカプロラクトンとのコポリマーに由来する。微粒子は、種々の分子量の任意の種々の高分子出発物質に由来し得、コポリマーの場合、種々のラクチド：グリコリド比のＰＬＧであり、その選択は、同時投与される高分子に一部依存して、概して選択可能である。これらのパラメーターを、以下により完全に考察する。
【０１２８】
さらなる抗原には、外膜小胞（ＯＭＶ）調製物も含まれ得る。
【０１２９】
Ｂｏｓｍａら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７２：８８０−８８９，２００６（その内容全体が本明細書中で参考として援用される）に記載のように、抗原を、種々のグラム陽性細菌のペプチドグリカンに吸着させて、グラム陽性エンハンサーマトリックス（ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｍａｔｒｉｘ）（ＧＥＭ）粒子を作製することもできる。この方法は、酸処理細胞の細胞壁ペプチドグリカンへのＬｙｓＭモチーフ（Ｂｕｉｓｔら，Ｊ．Ｂａｃｔ．，１７７：１５５４−６３，１９９５；Ｂａｔｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｂｙｃｒｏｆｔ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９９：１１１３−１９，２０００）の非共有結合に依存する。簡潔に述べれば、１つ以上のＬｙｓＭモチーフに結合した（例えば、非共有結合または共有結合した（例えば、融合タンパク質としてか結合体化による））ポリペプチド抗原を、酸処理したグラム陽性細菌に添加する。抗原ペプチドは抗親和性で結合し、これを、免疫原性組成物中で使用することができる。これらの方法で使用した酸の例には、トリクロロ酢酸（例えば、０．１％〜１０％）、酢酸（例えば、５．６Ｍ）、ＨＣｌ（例えば、０．０１Ｍ）、乳酸（例えば、０．７２Ｍ）、およびギ酸（例えば、０．５６Ｍ）が含まれる。
【０１３０】
さらなる処方方法および抗原（特に、腫瘍抗原）は、米国特許出願番号０９／５８１，７７２号に記載されている。
【０１３１】
抗原の引例
以下の引例は、それぞれがその全体が参考として具体的に援用され、本発明の組成物と併せて有用な抗原を含む。
【０１３２】
【数１】
2009538116.tif 000010
【０１３３】
【数２】
2009538116.tif 000011
【０１３４】
【数３】
2009538116.tif 000012
融合タンパク質
本発明で使用されるグラム陽性（例えば、肺炎球菌）タンパク質は、それぞれ個別のポリペプチドとして組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも２つ（すなわち、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８）の抗原を、線毛サブユニットを含む単一のポリペプチド鎖（「ハイブリッド」または「融合」ポリペプチド）として発現する。かかる融合ポリペプチドは、以下の２つの主な利点を付与する。第１に、単独で不安定であり得るか不十分に発現し得るポリペプチドを、問題を克服する適切な融合パートナーの付加によって補助することができる。第２に、商業的製造を、共に抗原的に有用である２つのポリペプチドを産生するためにたった１つの発現および精製しか必要がないように簡潔にする。
【０１３５】
融合ポリペプチドは、１つ以上のグラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛ポリペプチド配列を含むことができる。したがって、本発明は、第１のアミノ酸配列および第２のアミノ酸配列を含む１つ以上の融合ペプチドを含み、第１および第２のアミノ酸配列は、グラム陽性線毛タンパク質またはそのフラグメントから選択される。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチド中の第１および第２のアミノ酸配列は、同一タンパク質の異なるエピトープを含む。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、本発明は、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の抗原由来のアミノ酸配列を含むハイブリッド（または融合物）を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、２、３、４、または５個の抗原由来のアミノ酸配列を含むハイブリッドを提供する。
【０１３７】
異なるハイブリッドポリペプチドを、単一の処方物中に混合することができる。かかる組成物内で、グラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛配列は、１つを超えるハイブリッドポリペプチドおよび／または非ハイブリッドポリペプチド中に存在し得る。いくつかの実施形態では、抗原は、ハイブリッドまたは非ハイブリッドのいずれかとして存在するが、両方では存在しない。
【０１３８】
ハイブリッドポリペプチドを、式：ＮＨ２−Ａ−｛−Ｘ−Ｌ−｝ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨ（式中、Ｘは、グラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛タンパク質またはそのフラグメントのアミノ酸配列であり、Ｌは、任意選択的なリンカーアミノ酸配列であり、Ａは、任意選択的なＮ末端アミノ酸配列であり、Ｂは、任意選択的なＣ末端アミノ酸配列であり、ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である）で示すことができる。
【０１３９】
−Ｘ−部分がその野生型形態のリーダーペプチド配列である場合、これを、ハイブリッドタンパク質中に含めても省略してもよい。いくつかの実施形態では、ハイブリッドタンパク質のＮ末端に存在する−Ｘ−部分のリーダーペプチド（すなわち、Ｘ１のリーダーペプチド）が保持されるが、Ｘ２．．．Ｘｎのリーダーペプチドが省略されることを除き、リーダーペプチドを欠失する。これは、全リーダーペプチドの欠失および部分−Ａ−としてのＸ１のリーダーペプチドの使用と等価である。
【０１４０】
｛−Ｘ−Ｌ−｝の場合の各ｎについて、リンカーアミノ酸配列−Ｌ−は、存在しても存在しなくても良い。例えば、ｎ＝２の場合、ハイブリッドは、ＮＨ２−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−Ｌ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｌ２−ＣＯＯＨなどであり得る。リンカーアミノ酸配列−Ｌ−は、典型的には、短いであろう（例えば、２０以下のアミノ酸（すなわち、１９，１８，１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１））。例は、クローニングを容易にする短いペプチド配列、ポリグリシンリンカー（すなわち、Ｇｌｙｎ（式中、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれを超える）を含む）、およびヒスチジンタグ（すなわち、Ｈｉｓｎ（式中、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超える））を含む。他の適切なリンカーアミノ酸配列は、当業者に明らかである。有用なリンカーは、ＧＳＧＧＧＧ（配列番号５３）（Ｇｌｙ−ＳｅｒジペプチドがＢａｍＨＩ制限部位から形成され、それにより、クローニングおよび操作を補助し、（Ｇｌｙ）４テトラペプチドが典型的なポリグリシンリンかーである）である。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、−Ａ−は、任意選択的なＮ末端アミノ酸配列である。これは、典型的には、短いであろう（例えば、４０またはそれ未満のアミノ酸（すなわち、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１））。例には、タンパク質輸送を指示するためのリーダー配列またはクローニングまたは精製を容易にするための短いペプチド（例えば、ヒスチジンタグ（すなわち、Ｈｉｓｎ（式中、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超える）））が含まれる。他の適切なＮ末端アミノ酸配列は、当業者に明らかである。Ｘ１がそれ自体のＮ末端メチオニンを欠く場合、いくつかの実施形態では、−Ａ−はＮ末端メチオニンが得られるオリゴペプチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８個のアミノ酸を有する）である。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、−Ｂ−は、任意選択的なＣ末端アミノ酸配列である。これは、典型的には、短いであろう（例えば、４０またはそれ未満のアミノ酸（すなわち、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１））。例には、タンパク質輸送を指示するための配列、クローニングまたは精製を容易にするための短いペプチド（例えば、ヒスチジンタグ（すなわち、Ｈｉｓｎ（式中、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超える）））、またはタンパク質安定性を増強する配列が含まれる。他の適切なＣ末端アミノ酸配列は、当業者に明らかである。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、ｎは２または３である。
【０１４４】
免疫原性組成物および薬物
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、免疫原性組成物である。いくつかの実施形態では、組成物は、ワクチン組成物である。いくつかの実施形態では、組成物のｐＨは、６と８との間であり、いくつかの実施形態では、約７である。緩衝液の使用によってｐＨを維持することができる。組成物は、滅菌および／または無発熱物質であり得る。組成物は、ヒトに関して等張であり得る。いくつかの実施形態では、組成物は、滅菌注射用組成物である。
【０１４５】
本発明のワクチンは、予防用（すなわち、感染を防止する）または治療用（すなわち、感染を処置する）のいずれかであり得る。したがって、本発明は、動物に治療または予防量の本発明の組成物を投与する工程を含む、かかるグラム陽性細菌（例えば、肺炎球菌）感染に感受性を示す動物におけるグラム陽性細菌（例えば、肺炎球菌）感染の治療的または予防的処置方法を提供する。例えば、本発明は、動物に治療または予防量の本発明の組成物を投与する工程を含む、連鎖球菌感染に感受性を示す動物における肺炎球菌感染の治療的または予防的処置方法を含む。
【０１４６】
本発明はまた、薬物として本明細書中に記載の組成物を使用するための本発明の組成物を提供する。いくつかの実施形態では、薬物は、哺乳動物における免疫応答を誘発する（すなわち、免疫原性組成物である）。いくつかの実施形態では、薬物はワクチンである。
【０１４７】
本発明はまた、哺乳動物における免疫応答を惹起するための薬物の製造における本発明の組成物の使用を提供する。いくつかの実施形態では、薬物はワクチンである。
【０１４８】
本発明はまた、本発明の組成物の１つ以上の容器を含むキットを提供する。組成物は、個別の抗原であり得る場合、液体形態または凍結乾燥であり得る。組成物のための適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管が含まれる。容器を、種々の材料（ガラスまたはプラスチックが含まれる）から形成することができる。容器は、滅菌アクセスポートを有することができる（例えば、容器は、静脈注射用液用バッグまたは皮下注射針によって突き刺すことができるストッパーを有するバイアルであり得る）。組成物は、１つ以上のグラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛または線毛タンパク質を含む第１の成分を含むことができる。いくつかの実施形態では、グラム陽性線毛または線毛タンパク質は、オリゴマー形態またはハイパーオリゴマー形態である。
【０１４９】
キットは、薬学的に許容可能な緩衝液（リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル液、またはデキストロース溶液など）を含む第２の容器をさらに含むことができる。最終使用者に有用な他の材料（他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジが含まれる）も含むことができる。キットはまた、別の活性成分（ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）（例えば、抗生物質）を有する第２または第３の容器を含むことができる。
【０１５０】
キットはまた、グラム陽性細菌（例えば、肺炎球菌）に対する免疫の誘導またはグラム陽性細菌感染の処置についての書面での指示を含む添付文書を含むことができる。添付文書は、非承認の添付文書または食品医薬品局（ＦＤＡ）もしくは他の規制機関によって承認された添付文書であり得る。
【０１５１】
本発明はまた、本発明の免疫原性組成物を予め充填した送達デバイスを提供する。
【０１５２】
本発明はまた、有効量の本発明の組成物を投与する工程を含む、哺乳動物において免疫応答を誘導する方法を提供する。免疫応答は、いくつかの実施形態では、防御的であり、抗体および／または細胞媒介免疫を含む。この免疫応答は、好ましくは、持続性（例えば、中和）抗体１つ以上のグラム陽性（例えば、肺炎球菌）抗原への曝露の際に迅速に応答することができるおよび細胞性免疫を誘導するであろう。本方法は、追加免疫応答を惹起することができる。
【０１５３】
本発明は、有効量の本発明の免疫原性組成物、本発明のワクチン、または本発明の免疫原性組成物を認識する抗体を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物におけるグラム陽性細菌（例えば、肺炎球菌）感染を中和する方法を提供する。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトである。ワクチンが予防用である場合、ヒトは、男性または女性（出産適齢期またはティーンエイジャーのいずれか）であり得る。あるいは、ヒトは、高齢者（例えば、５０、５５、６０、６５、７０、または７５を超える）であってよく、糖尿病または癌などの基礎疾患を有し得る。いくつかの実施形態では、ヒトは、妊婦または高齢者である。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、これらの使用および方法は、グラム陽性細菌（例えば、肺炎球菌）によって生じる疾患の防止および／または治療のためのものである。組成物は、他の連鎖球菌細菌に対しても有効であり得る。組成物は、他のグラム陽性細菌に対しても有効であり得る。
【０１５６】
治療上の処置の１つのチェック方法は、１つ以上の本発明の組成物の投与後にグラム陽性（例えば、肺炎球菌）細菌感染をモニタリングする工程を含む。組成物中のグラム陽性（例えば、肺炎球菌）抗原に対する免疫応答を、組成物の投与にモニタリングすることができる。
【０１５７】
本発明の免疫原性組成物の成分タンパク質の免疫原性の１つの制限されない評価方法は、タンパク質を組換え的に発現し、免疫ブロットによって血清または粘液の分泌をスクリーニングすることである。タンパク質と患者の血清との間の陽性反応は、患者が問題のタンパク質に対する免疫応答を以前に開始していた（すなわち、タンパク質が免疫原である）ことを示す。この方法を使用して、免疫優性タンパク質および／またはエピトープを同定することもできる。
【０１５８】
治療上の処置の有効性の別の制限されないチェック方法は、本発明の組成物の投与後にグラム陽性細菌（例えば、肺炎球菌）感染をモニタリングする工程を含む。予防上の処置の有効性の１つのチェック手段は、組成物の投与後の本発明の組成物中のグラム陽性（例えば、肺炎球菌）抗原に体する全身性（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ産生レベルのモニタリングなど）および粘膜性（ＩｇＡ産生レベルのモニタリングなど）の免疫応答をモニタリングする工程を含む。典型的には、グラム陽性細菌血清特異的抗体応答を、免疫化後であるが攻撃誘発前に決定する。
【０１５９】
本発明のワクチン組成物を、いくつかの実施形態では、宿主（例えば、ヒト）への投与前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルで評価することができる。
【０１６０】
本発明の免疫原性組成物の有効性を、免疫原性組成物でのグラム陽性細菌（例えば、肺炎球菌）感染の動物モデル（例えば、モルモットまたはマウス）の攻撃誘発によってｉｎ  ｖｉｖｏで決定することもできる。免疫原性組成物は、攻撃誘発血清型と同一の血清型に由来しても由来しなくても良い。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、攻撃誘発血清型と同一の血清型から誘導することができる。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物および／または攻撃誘発血清型は、グラム陽性（例えば、肺炎球菌）血清型から誘導可能である。
【０１６１】
ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性モデルには、（ｉ）ヒトグラム陽性細菌（例えば、肺炎球菌）血清型を使用するマウス感染モデル、（ｉｉ）マウス適合グラム陽性細菌（例えば、肺炎球菌）株（マウスにおいて特に毒性のある株など）を使用したマウスモデルであるマウス疾患モデル、および（ｉｉｉ）ヒトグラム陽性細菌（例えば、肺炎球菌）単離物を使用した霊長類モデルが含まれるが、これらに限定されない。
【０１６２】
免疫応答は、ＴＨ１免疫応答およびＴＨ２応答の一方または両方であり得る。
【０１６３】
免疫応答は、改良されているか、増強されているか、変化した免疫応答であり得る。
【０１６４】
免疫応答は、全身性免疫応答および粘膜性免疫応答であり得る。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、免疫応答は、増強された全身および／または粘膜応答である。
【０１６６】
増強された全身および／または粘膜免疫は、増強されたＴＨ１および／またはＴＨ２免疫応答を反映する。いくつかの実施形態では、増強された免疫応答には、ＩｇＧ１および／またはＩｇＧ２ａおよび／またはＩｇＡの産生の増加が含まれる。  
【０１６７】
いくつかの実施形態では、粘膜免疫応答はＴＨ２免疫応答である。いくつかの実施形態では、粘膜免疫応答には、ＩｇＡ産生の増加が含まれる。
【０１６８】
活性化されたＴＨ２細胞は、抗体産生を増強し、したがって、細胞外感染に対する応答で有益である。活性化されたＴＨ２細胞は、１つ以上のＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０を分泌することができる。ＴＨ２免疫応答は、さらなる防御のためにＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡ、および記憶Ｂ細胞を産生することができる。
【０１６９】
ＴＨ２免疫応答には、ＴＨ２免疫応答に関連する１つ以上のサイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０など）の増加またはＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡ、および記憶Ｂ細胞の産生の増加の１つ以上が含まれ得る。いくつかの実施形態では、増強されたＴＨ２免疫応答には、ＩｇＧ１産生の増加が含まれるであろう。
【０１７０】
ＴＨ１免疫応答には、ＣＴＬの増加、ＴＨ１免疫応答に関連する１つ以上のサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦβなど）の増加、活性化マクロファージの増加、ＮＫ活性の増加、またはＩｇＧ２産生の増加の１つ以上が含まれ得る。いくつかの実施形態では、増強されたＴＨ１免疫応答には、ＩｇＧ２産生の増加が含まれるであろう。
【０１７１】
本発明の免疫原性組成物、特に、１つ以上の本発明のグラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛抗原を、単独または任意選択的にＴｈ１および／またはＴｈ２応答を誘発することができる免疫調節薬と共に他の抗原と組み合わせて使用することができる。
【０１７２】
本発明の組成物を、一般に、患者に直接投与するであろう。一定の組成物には一定の経路が好ましく、その結果、より有効な免疫応答、好ましくはＣＭＩ応答が得られるか、副作用を誘導する可能性が低くなるか、投与がより容易になり得る。非経口注射（例えば、皮下、腹腔内、皮内、静脈内、筋肉内、または組織の間質腔）、直腸、経口（例えば、錠剤、噴霧）、膣内、局所、経皮（例えば、ＷＯ９９／２７９６１号を参照のこと）、経皮（例えば、ＷＯ０２／０７４２４４号およびＷＯ０２／０６４１６２号を参照のこと）、鼻腔内（例えば、ＷＯ０３／０２８７６０号を参照のこと）、眼内、耳腔内、肺内、または他の粘膜投与によって直接送達することができる。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、本発明を使用して、全身免疫および／または粘膜免疫を誘発することができる。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、中和抗体応答を誘発する１つ以上のグラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛抗原および細胞性免疫応答を誘発する１つ以上のグラム陽性（例えば、肺炎球菌）線毛抗原を含む。いくつかの実施形態では、中和抗体応答は、初期グラム陽性細菌感染を防止または阻害する一方で、増強されたＴｈ１細胞応答を誘発することができる細胞性免疫応答は感染のさらなる拡大を防止する。免疫原性組成物は、１つ以上のグラム陽性線毛抗原および１つ以上の非線毛グラム陽性抗原（例えば、細胞質抗原）を含むことができる。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、１つ以上のグラム陽性表面抗原などおよび１つ以上の他の抗原（Ｔｈ１細胞応答を誘発することができる細胞質抗原など）を含む。
【０１７５】
投薬処置（Ｄｏｓａｇｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）は、単回投与計画または複数回投与計画であり得る。複数回投与計画を、一次免疫計画および／または追加免疫計画で使用することができる。複数回投与計画では、種々の用量を、同一または異なる経路（例えば、非経口一次投与および粘膜追加免疫、粘膜一次投与および非経口追加免疫など）で投与することができる。
【０１７６】
本発明の組成物を、種々の形態で調製することができる。例えば、組成物を、注射液（溶液または懸濁液のいずれか）として調製することができる。注射前の溶液、懸濁液、液体ビヒクルに適切な固体形態も調製することができる（例えば、凍結乾燥組成物）。組成物を、局所投与のために、例えば、軟膏、クリーム、または粉末として調製することができる。組成物を、経口投与のために、例えば、錠剤またはカプセル、噴霧、またはシロップ（任意選択的に、風味づけした）として調製することができる。組成物を、例えば、肺投与のために、微粉末または噴霧を使用した吸入物質（ｉｎｈａｌｅｒ）として調製することができる。組成物を、座剤またはペッサリーとして調製することができる。組成物を、鼻腔内、耳腔内、または眼内投与のために、例えば、点滴薬として調製することができる。組成物を、組み合わせた組成物が患者への投与直前に再構成されるようにデザインされたキット形態であり得る。かかるキットは、液体形態の１つ以上の抗体および１つ以上の凍結乾燥抗体を含むことができる。
【０１７７】
ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的有効量の抗原および任意の他の成分（抗体など）（必要に応じて）を含む。「免疫学的有効量」は、単回投与または一連の投与の一部のいずれかでのその抗体への投与が治療または防止に有効であるか、重要な免疫応答を増加させるか、臨床症状を防止または減少させることを意味する。この量は、治療を受ける個体の結構状態および身体の状態、年齢、治療受ける個体（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）の分類群、個体の免疫応答が抗体を合成する能力、所望の防御の程度、ワクチンの処方、担当医による医学的状態の評価および他の関連する要因によって変化する。量は、日常的試験によって決定することができる比較的広い範囲内にあるであろうと予想される。
【０１７８】
組成物のさらなる成分
本発明の組成物は、典型的には、上記成分に加えて、１つ以上の「薬学的に許容可能なキャリア」を含み、このキャリアには、キャリア自体が組成物を投与する個体に有害な抗体の産生を誘導しない任意のキャリアが含まれる。適切なキャリアは、典型的には、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および脂質凝集体（油性液滴またはリポソームなど）などの巨大でゆっくり代謝される高分子である。かかるキャリアは、当業者に周知である。ワクチンは、水、生理食塩水、グリセロールなどの希釈剤も含むことができる。さらに、湿潤剤または乳化剤、およびｐＨ緩衝化剤などの補助剤が存在することができる。薬学的に許容可能な賦形剤の徹底的な考察は、Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ．２０ｔｈ  ｅｄ．，ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２で利用可能である。
【０１７９】
アジュバント
本発明のワクチンを、他の免疫調節薬と併せて投与することができる。特に、組成物は、通常、１つ以上のアジュバントを含むであろう。本発明と共に使用するアジュバントには、１つ以上の下記のアジュバントが含まれるが、これらに限定されない。
【０１８０】
Ａ．ミネラル含有組成物
本発明でアジュバントとしての使用に適切なミネラル含有組成物には、アルミニウム塩およびカルシウム塩などのミネラル塩が含まれる。本発明は、水酸化物（例えば、オキシヒドロキシド）、リン酸塩（例えば、ヒドロキシリン酸塩、正リン酸塩）、硫酸塩などのミネラル塩（例えば、ｃｈａｐｔｅｒｓ  ８  ＆  ９  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ．．．（１９９５）ｅｄｓ．Ｐｏｗｅｌｌ  ＆  Ｎｅｗｍａｎ．ＩＳＢＮ：０３０６４４８６７Ｘ．Ｐｌｅｎｕｍ．を参照のこと）、または異なるミネラル化合物と任意の適切な形態を取る化合物（例えば、ゲル、結晶、無定形など）との混合物（例えば、任意選択的に過剰なリン酸塩を含むリン酸塩とヒドロキシドアジュバントとの混合物）が含まれ、塩への吸着が好ましい。ミネラル含有組成物を、菌属塩粒子として処方することもできる（ＷＯ００／２３１０５号）。
【０１８１】
Ａｌ３＋の用量が０．２ｍｇ／用量と１．０ｍｇ／用量との間であるように、アルミニウム塩を本発明のワクチンに含めることができる。
【０１８２】
Ｂ．油性乳濁液
本発明のアジュバントとしての使用に適切な油性乳濁液組成物は、スクアレン−水乳濁液（ＭＦ５９（マイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）を使用してサブミクロン粒子に処方した５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ（商標）８０、および０．５％Ｓｐａｎ（商標）８５）など）を含む。ＷＯ９０／１４８３７号を参照のこと。Ｐｏｄｄａ，“Ｔｈｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｗｉｔｈ  ｎｏｖｅｌ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ：ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ＭＦ５９−ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ”，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００１）１９：２６７３−２６８０；Ｆｒｅｙら，“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓａｆｅｔｙ，ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ＭＦ５９−ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｎｄ  ａ  ｎｏｎ−ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｅｌｄｅｒｌｙ  ａｄｕｌｔｓ”，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００３）２１：４２３４−４２３７も参照のこと。ＭＦ５９を、ＦＬＵＡＤ（商標）インフルエンザウイルス３価サブユニットワクチン中のアジュバントとして使用する。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、組成物中で使用するためのアジュバントは、サブミクロン水中油滴型乳濁液である。いくつかの実施形態では、本明細書中で使用するためのサブミクロン水中油滴型乳濁液は、任意選択的に種々の量のＭＴＰ−ＰＥを含むスクアレン／水乳濁液（４〜５％ｗ／ｖ  スクアレン、０．２５〜１．０％ｗ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ（商標）８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）、および／または０．２５〜１．０％Ｓｐａｎ（商標）８５（ソルビタントリオレアート）、および、任意選択的に、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ（ｈｕｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｐｈｏｒｙｌｏｘｙ））−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）を含むサブミクロン水中油滴型乳濁液など）（例えば、「ＭＦ５９」として公知のサブミクロン水中油滴型乳濁液（国際公開番号ＷＯ９０／１４８３７号；米国特許第６，２９９，８８４号および同第６，４５１，３２５号（その全体が本明細書中で参考として援用される）；およびＯｔｔら，“ＭＦ５９−Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｓａｆｅ  ａｎｄ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ”  ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．ａｎｄ  Ｎｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｊ．ｅｄｓ：）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９５，ｐｐ．２７７−２９６）である。ＭＦ５９は、４〜５％ｗ／ｖスクアレン（例えば、４．３％）、０．２５〜０．５％ｗ／ｖＴｗｅｅｎ  ８０（商標）、および０．５％ｗ／ｖＳｐａｎ  ８５（商標）を含み、任意選択的に、種々の量のＭＴＰ−ＰＥを含み、Ｍｏｄｅｌ  １１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ．）などのマイクロフルイダイザーを使用してサブミクロン粒子に処方する。例えば、ＭＴＰ−ＰＥは、約０〜５００μｇ／用量、約０〜２５０μｇ／用量、および約０〜１００μｇ／用量の量で存在し得る。本明細書中で使用する場合、用語「ＭＦ５９−０」は、ＭＴＰ−ＰＥを欠く上記サブミクロン水中油滴型乳濁液をいう一方で、用語「ＭＦ５９−ＭＴＰ」は、ＭＴＰ−ＰＥを含む処方物を示す。例えば、「ＭＦ５９−１００」は、１００μｇ  ＭＴＰ−ＰＥ／用量などを含む。ＭＦ６９（本明細書中で使用するための別のサブミクロン水中油滴型乳濁液）は、４．３％ｗ／ｖスクアレン、０．２５％ｗ／ｖＴｗｅｅｎ  ８０（商標）、および０．７５％ｗ／ｖＳｐａｎ８５（商標）、および任意選択的にＭＴＰ−ＰＥを含む。さらに別のサブミクロン水中油滴型乳濁液は、ＭＦ７５であり、ＳＡＦとしても公知であり、１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０（商標）、５％プルロニックブロック重合体Ｌ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含み、これもサブミクロン乳濁液に微小流動化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｄ）されている。ＭＦ７５−ＭＴＰは、ＭＴＰ（１００〜４００μｇ  ＭＴＰ−ＰＥ／用量など）を含むＭＦ７５処方物を示す。
【０１８４】
組成物中で使用するためのサブミクロン水中油滴型乳濁液、その作製方法、および免疫賦活剤（ムラミルペプチドなど）は、国際公開番号ＷＯ９０／１４８３７号ならびに米国特許第６，２９９，８８４号および同第６，４５１，３２５号（その全体が本明細書中で参考として援用される）に詳述されている。
【０１８５】
フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）およびフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）を、本発明でアジュバントとして使用することもできる。
【０１８６】
Ｃ．サポニン処方物
サポニン処方物を、本発明でアジュバントとして使用することもできる。サポニンは、ステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種群であり、広範な植物種の樹皮、葉、幹、根、およびさらに花に見出される。キラヤ（Ｑｕｉｌｌａｉａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ）樹皮由来のサポニンは、アジュバントとして広く研究されている。スミラック・オルナタ（Ｓｍｉｌａｘ  ｏｒｎａｔａ）（サルサパリラ（ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ））、シュッコンカスミソウ（ブライダルベール（ｂｒｉｄｅｓ  ｖｅｉｌ））、サポナリア・オフィシアナリス（Ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ）（サボンソウ根（ｓｏａｐ  ｒｏｏｔ））由来のサポニンはまた、市販されている。サポニンアジュバント処方物には、精製処方物（ＱＳ２１）および脂質処方物（ＩＳＣＯＭなど）が含まれる。
【０１８７】
サポニン組成物は、高速薄層クロマトグラフィ（ＨＰ−ＬＣ）および逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を使用して精製されている。これらの技術を使用した特定の精製画分は、同定されている（ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−Ｂ、およびＱＨ−Ｃが含まれる）。好ましくは、サポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１の産生方法は、米国特許第５，０５７，５４０号に開示されている。サポニン処方物は、コレステロールなどのステロールも含むことができる（ＷＯ９６／３３７３９号を参照のこと）。
【０１８８】
サポニンとコレステロールとの組み合わせを使用して、免疫賦活複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれる固有の粒子を形成することができる。ＩＳＣＯＭは、典型的には、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンなどのリン脂質も含む。任意の公知のサポニンを、ＩＳＣＯＭで使用することができる。いくつかの実施形態では、ＩＳＣＯＭは、１つ以上のＱｕｉｌ  Ａ、ＱＨＡ、およびＱＨＣを含む。ＩＳＣＯＭは、欧州特許第０１０９９４２号、ＷＯ９６／１１７１１号、およびＷＯ９６／３３７３９号にさらに記載されている。任意選択的に、ＩＳＣＯＭＳは、さらなる界面活性剤を欠くことができる。ＷＯ００／０７６２１号を参照のこと。
【０１８９】
サポニンベースのアジュバントの開発についての概説を、Ｂａｒｒ，ら．，“ＩＳＣＯＭｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｓａｐｏｎｉｎ  ｂａｓｅｄ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ”，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９８）３２：２４７−２７１に見出すことができる。Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，ら．，“Ｕｐｔａｋｅ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｏｒａｌｌｙ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｓａｐｏｎｉｎ  ａｎｄ  ＩＳＣＯＭ  ｖａｃｃｉｎｅｓ”，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９８）３２：３２１−３３８も参照のこと。
【０１９０】
Ｄ．ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）
ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）を、本発明でアジュバントとして使用することもできる。これらの構造は、一般に、任意選択的にリン脂質と組み合わせるか配合したウイルス由来の１つ以上のタンパク質を含む。これらは、一般に、非病原性、非複製性であり、一般に、未変性のウイルスゲノムを含まない。ウイルスタンパク質を、組換え的に産生するか、全ウイルスから単離することができる。ビロソームまたはＶＬＰでの使用に適切なこれらのウイルスタンパク質には、インフルエンザウイルス（ＨＡまたはＮＡ）、Ｂ型肝炎ウイルス（コアまたはキャプシドタンパク質など）、Ｅ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビス・ウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、ＨＩＶ、ＲＮＡ−ファージ、Ｑβ−ファージ（コートタンパク質）、ＧＡ−ファージ、ｆｒ−ファージ、ＡＰ２０５ファージ、およびＴｙ（レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐｌなど）由来のタンパク質が含まれる。ＶＬＰは、ＷＯ０３／０２４４８０号、ＷＯ０３／０２４４８１号、およびＮｉｉｋｕｒａら，“Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｅ  ｖｉｒｕｓ−Ｌｉｋｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｓ  ａｎ  Ｏｒａｌ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｖｅｈｉｃｌｅ  Ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  Ｆｏｒｅｉｇｎ  Ｅｐｉｔｏｐｅｓ”，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００２）２９３：２７３−２８０；Ｌｅｎｚら，“Ｐａｐｉｌｌｏｍａｒｉｖｕｒｓ−Ｌｉｋｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  Ｉｎｄｕｃｅ  Ａｃｕｔｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００１）５２４６−５３５５；Ｐｉｎｔｏ，ら．，“Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ（ＨＰＶ）−１６  Ｌ１  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ  Ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＨＰＶ−１６  Ｌ１  Ｖｉｒｕｓ−Ｌｉｋｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（２００３）１８８：３２７−３３８；およびＧｅｒｂｅｒら，“Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  Ｖｉｒｕｓ−Ｌｉｋｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  Ａｒｅ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｏｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｓ  ｗｈｅｎ  Ｃｏａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｈｅａｔ−Ｌａｂｉｌｅ  Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｒ１９２Ｇ  ｏｒ  ＣｐＧ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００１）７５（１０）：４７５２−４７６０にさらに考察されている。ビロソームは、例えば、Ｇｌｕｃｋら，“Ｎｅｗ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｌａｔｆｏｒｍｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ”，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００２）２０：Ｂ１０−Ｂ１６でさらに考察されている。免疫増強再構成インフルエンザビロソーム（ＩＲＩＶ）を、鼻腔内３価ＩＮＦＬＥＸＡＬ（商標）製品（Ｍｉｓｃｈｌｅｒ  ＆  Ｍｅｔｃａｌｆｅ（２００２）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０  Ｓｕｐｐｌ  ５：Ｂ１７−２３）およびＩＮＦＬＵ���ＡＣ  ＰＬＵＳ（商標）製品におけるサブユニット抗原送達系として使用する。
【０１９１】
Ｅ．細菌または微生物誘導体
いくつかの実施形態では、本発明での使用に適切なアジュバントには、以下などの細菌または微生物誘導体が含まれる。
【０１９２】
（１）腸内細菌リポ多糖（ＬＰＳ）の非毒性誘導体
かかる誘導体には、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）が含まれる。３ｄＭＰＬは、３Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａと４、５、または６つのアシル化鎖との混合物である。３Ｏ−脱アシル化ホスホリル脂質Ａの「小粒子」形態の非限定的な例は、欧州特許第０  ６８９  ４５４号に開示されている。３ｄＭＰＬのかかる「小粒子」は、０．２２ミクロン膜で濾過滅菌するのに十分に小さい（欧州特許第０  ６８９  ４５４号を参照のこと）。他の非毒性ＬＰＳ誘導体には、モノホスホリル脂質Ａ模倣物（アミノアルキルグルコサミニドリン酸誘導体など（例えば、ＲＣ−５２９））が含まれる。Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９９）Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ  ９：２２７３−２２７８を参照のこと。
【０１９３】
（２）脂質Ａ誘導体
脂質Ａ誘導体には、ＯＭ−１７４などの大腸菌由来の脂質Ａの誘導体が含まれる。ＯＭ−１７４は、例えば、Ｍｅｒａｌｄｉら，“ＯＭ−１７４，ａ  Ｎｅｗ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｕｓｅ，Ｉｎｄｕｃｅｓ  ａ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｗｉｔｈ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ２４２−３１０  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｈｅｉ”，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００３）２１：２４８５−２４９１；およびＰａｊａｋ，ら．，“Ｔｈｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ＯＭ−１７４  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｂｏｔｈ  ｔｈｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ”，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００３）２１：８３６−８４２に記載されている。
【０１９４】
（３）免疫賦活性オリゴヌクレオチド
本発明でのアジュバントとしての使用に適切な免疫賦活性オリゴヌクレオチドには、ＣｐＧモチーフ（非メチル化シトシンおよびその後にグアノシンを含み、リン酸結合によって結合した配列）を含むヌクレオチド配列が含まれる。回文配列またはポリ（ｄＧ）配列を含む細菌二本酸ＲＮＡまたはオリゴヌクレオチドも免疫賦活性を示した。  
【０１９５】
ＣｐＧは、ホスホチオアート修飾などのヌクレオチド修飾物／アナログを含むことができ、二本鎖または一本鎖であり得る。任意選択的に、グアノシンを、２’−デオキシ−７−デアザグアノシンに置換することができる。可能なアナログ置換の例については、Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ，ら．，“Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｏｔｉｆ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎ：ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｇｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００３）３１（９）：２３９３−２４００；ＷＯ０２／２６７５７号およびＷＯ９９／６２９２３号を参照のこと。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、Ｋｒｉｅｇ，“ＣｐＧ  ｍｏｔｉｆｓ：ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｅｘｔｒａｃｔｓ？”，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００３）９（７）：８３１−８３５；ＭｃＣｌｕｓｋｉｅ，ら．，“Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ａｎｄ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｎｄ  ＣｐＧ  ＤＮＡ”，ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）３２：１７９−１８５；ＷＯ９８／４０１００号；米国特許第６，２０７，６４６号；米国特許第６，２３９，１１６号、および米国特許第６，４２９，１９９でさらに考察されている。
【０１９６】
ＣｐＧ配列は、ＴＬＲ９（モチーフＧＴＣＧＴＴ（配列番号５４）またはＴＴＣＧＴＴ（配列番号５５）など）に指向し得る。Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ，ら．，“Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ９：ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｎｏｖｅｌ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＣｐＧ  ＤＮＡｓ”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ（２００３）３１（ｐａｒｔ  ３）：６５４−６５８を参照のこと。ＣｐＧ配列は、ＴＨ１免疫応答の誘導に特異的であり得るか（ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮなど）、Ｂ細胞応答の誘導により特異的であり得る（ＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮなど）。ＣｐＧ−ＡおよびＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮは、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ら．，“ＣｐＧ−Ａ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ−Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−１０  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｓ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  Ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ＩＦＮ−ａｌｐｈａ”，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００３）１７０（８）：４０６１−４０６８；Ｋｒｉｅｇ，“Ｆｒｏｍ  Ａ  ｔｏ  Ｚ  ｏｎ  ＣｐＧ”，ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００２）２３（２）：６４−６５およびＷＯ０１／９５９３５号で考察されている。好ましくは、ＣｐＧはＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮである。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、５’末端が受容体認識に利用しやすいようにＣｐＧオリゴヌクレオチドを構築する。任意選択的に、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列をその３’末端で結合して、「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成することができる。例えば、Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ，ら．，“Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｉｎ  ＣｐＧ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｆｆｅｃｔ  ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ”，ＢＢＲＣ（２００３）３０６：９４８−９５３；Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ，ら．，“Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ９：ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｎｏｖｅｌ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＧｐＧ  ＤＮＡｓ”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ（２００３）３１（ｐａｒｔ  ３）：６６４−６５８；Ｂｈａｇａｔら，“ＣｐＧ  ｐｅｎｔａ−  ａｎｄ  ｈｅｘａｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔｓ”  ＢＢＲＣ（２００３）３００：８５３−８６１およびＷＯ０３／０３５８３６号を参照のこと。
【０１９８】
（４）ＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒誘導体
細菌ＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒誘導体を、本発明でアジュバントとして使用することができる。いくつかの実施形態では、タンパク質は、大腸菌に由来する（すなわち、大腸菌熱不安定性エンテロトキシン（「ＬＴ」）、コレラ（「ＣＴ」）、または百日咳（「ＰＴ」）。粘膜アジュバントとしての解毒ＡＤＰ−リボシル化毒素の使用は、ＷＯ９５／１７２１１号に記載されており、非経口アジュバントとしての使用はＷＯ９８／４２３７５号に記載されている。いくつかの実施形態では、アジュバントは、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、およびＬＴＲ１９２Ｇなどの解毒ＬＴ変異体である。ＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒誘導体、特に、ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２のアジュバントとしての使用は、以下の引例に見出すことができ、それぞれ、その全体が本明細書中で参考として具体的に援用される：Ｂｅｉｇｎｏｎ，ら．，“Ｔｈｅ  ＬＴＲ７２  Ｍｕｔａｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｔ−Ｌａｂｉｌｅ  Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  Ａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｔｏ  Ｅｌｉｃｉｔ  ＣＤ４＋  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｅ  Ｇａｍｍａ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｆｔｅｒ  Ｃｏａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｎｔｏ  Ｂａｒｅ  Ｓｋｉｎ”，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００２）７０（６）：３０１２−３０１９；Ｐｉｚｚａ，ら．，“Ｍｕｃｏｓａｌ  ｖａｃｃｉｎｅｓ：ｎｏｎ  ｔｏｘｉｃ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  ＬＴ  ａｎｄ  ＣＴ  ａｓ  ｍｕｃｏｓａｌ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ”，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００１）１９：２５３４−２５４１；Ｐｉｚｚａ，ら．，“ＬＴＫ６３  ａｎｄ  ＬＴＲ７２，ｔｗｏ  ｍｕｃｏｓａｌ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｒｅａｄｙ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ”  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２０００）２９０（４−５）：４５５−４６１；Ｓｃｈａｒｔｏｎ−Ｋｅｒｓｔｅｎら，“Ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＡＤＰ−Ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｎｇ  Ｅｘｏｔｏｘｉｎｓ，Ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ａｎｄ  Ｕｎｒｅｌａｔｅｄ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ”，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２０００）６８（９）：５３０６−５３１３；Ｒｙａｎら，“Ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｈｅａｔ−Ｌａｂｉｌｅ  Ｔｏｘｉｎ  Ａｃｔ  ａｓ  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｎａｓａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａｎ  Ａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  Ｖａｃｃｉｎｅ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｏｎｔｏｘｉｃ  ＡＢ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｎ  Ｔｈ１  ａｎｄ  Ｔｈ２  Ｃｅｌｌｓ”  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９９）６７（１２）：６２７０−６２８０；Ｐａｒｔｉｄｏｓら，“Ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｎｔ  ＬＴＫ６３  ｅｎｈａｎｃｅ  ｔｈｅ  ｐｒｏｌｉｆ���ｒａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｉｎｔｒａｎａｓａｌｌｙ  ｃｏ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９９）６７（３）：２０９−２１６；Ｐｅｐｐｏｌｏｎｉら，“Ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  ａｓ  ｓａｆｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｏｎｇ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｆｏｒ  ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｖａｃｃｉｎｅｓ”，Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２００３）２（２）：２８５−２９３；ａｎｄ  Ｐｉｎｅら，（２００２）“Ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｎｄ  ａ  ｄｅｔｏｘｉｆｉｅｄ  ｍｕｔａｎｔ  ｏｆ  ｈｅａｔ  ｌａｂｉｌｅ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＬＴＫ６３）”  Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ（２００２）８５（１−３）：２６３−２７０。アミノ酸置換についての多数の引例は、好ましくは、Ｄｏｍｅｎｉｇｈｉｎｉら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９５）１５（６）：１１６５−１１６７（その全体が本明細書中で参考として具体的に援用される）に記載のＡＤＰ−リボシル化毒素のＡおよびＢサブユニットのアラインメントに基づく。
【０１９９】
Ｆ．生体接着剤および粘膜接着剤
生体接着剤および粘膜接着剤を、本発明でアジュバントとして使用することもできる。適切な生体接着剤には、エステル化ヒアルロン酸ミクロスフィア（Ｓｉｎｇｈら（２００１）Ｊ．Ｃｏｎｔ．Ｒｅｌｅ．７０：２６７−２７６）または粘膜接着剤（ポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖、およびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体など）が含まれる。キトサンおよびその誘導体も、本発でアジュバントとして使用することもできる。例えば、ＷＯ９９／２７９６０号を参照のこと。
【０２００】
Ｇ．微粒子
微粒子を、本発明でアジュバントとして使用することもできる。微粒子（すなわち、直径１００ｎｍ〜１５０μｍ、直径２００ｎｍ〜３０μｍ、および直径５００ｎｍ〜１０μｍの粒子）を、生分解性且つ非毒性の材料（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルソエステル、ポリ酸無水物、ポリカプロラクトンなど）から形成した。材料は、任意選択的に負電荷の表面（例えば、ＳＤＳを使用）または正電荷の表面（例えば、ＣＴＡＢなどのカチオン性界面活性剤を使用）を有する用に処理したポリ（ラクチド−コ−グリコリド）が好ましい。
【０２０１】
Ｈ．リポソーム
アジュバントとしての使用に適切なリポソーム処方物の例は、米国特許第６，０９０，４０６号、米国特許第５，９１６，５８８号、および欧州特許第０  ６２６  １６９号に記載されている。
【０２０２】
Ｉ．ポリオキシエチレンエーテル処方物およびポリオキシエチレンエステル処方物
いくつかの実施形態では、本発明での使用に適切なアジュバントには、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルが含まれる。ＷＯ９９／５２５４９。かかる処方物には、さらに、オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（ＷＯ０１／２１２０７号）および少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤（オクトキシノールなど）と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤（ＷＯ０１／２１１５２号）が含まれる。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、ポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス（ｌａｕｒｅｔｈ）９）、ポリオキシエチレン−９−ステオリルエーテル（ｓｔｅｏｒｙｌ  ｅｔｈｅｒ）、ポリオキシエチレン（ｐｏｌｙｏｘｙｔｈｅｙｌｅｎｅ）−８−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
【０２０４】
Ｊ．ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ）
ＰＣＰＰ処方物は、例えば、Ａｎｄｒｉａｎｏｖら，“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｂｙ  ｃｏａｃｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｏｐｈａｚｅｎｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ”，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（１９９８）１９（１−３）：１０９−１１５およびＰａｙｎｅら，“Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ  Ｍａｔｒｉｃｅｓ”，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗ（１９９８）３１（３）：１８５−１９６に記載されている。
【０２０５】
Ｋ．ムラミルペプチド
本明細書中でのアジュバントとしての使用に適切なムラミルペプチドの例には、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−１−アラニル−ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−１−アラニル−ｄ−イソグルタミニル−１−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン  ＭＴＰ−ＰＥ）が含まれる。
【０２０６】
Ｌ．イミダゾキノロン化合物
本明細書中でアジュバントとしての使用に適切なイミダゾキノロン化合物の例には、イミクアモド（Ｉｍｉｑｕａｍｏｄ）およびそのホモログ（Ｓｔａｎｌｅｙ，“Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｍｉｄａｚｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ”  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ（２００２）２７（７）：５７１−５７７およびＪｏｎｅｓ，“Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ  ３Ｍ”，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ（２００３）４（２）：２１４−２１８にさらに記載されている）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２０７】
本発明はまた、上記で同定したアジュバントの組み合わせを含む組成物を提供する。例えば、以下のアジュバント組成物は、本発明で使用することができるアジュバント組成物の非限定的な例である。
【０２０８】
（１）サポニンおよび水中油滴型乳濁液（ＷＯ９９／１１２４１号）；
（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）（ＷＯ９４／００１５３を参照のこと）；
（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；
（４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（任意選択的に、＋ステロール）（ＷＯ９８／５７６５９号）；
（５）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油滴型乳濁液との組み合わせ（欧州特許出願番号０８３５３１８号、同第０７３５８９８号、および同第０７６１２３１号を参照のこと）；
（６）１０％スクアラン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロック重合体Ｌ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含み、サブミクロン乳濁液に微小流動化されているか、ボルテックスしてより大きな粒子サイズの乳濁液を生成したＳＡＦ。
【０２０９】
（７）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、およびモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコラート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群から選択される１つ以上の細菌細胞壁成分（好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））を含むＲｉｂｉ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）；
（８）１つ以上のミネラル塩（アルミニウム塩など）＋ＬＰＳの非毒性誘導体（３ｄＰＭＬなど）。
【０２１０】
（９）１つ以上のミネラル塩（アルミニウム塩など）＋免疫賦活性オリゴヌクレオチド（ヌクレオチド配列（ＣｐＧモチーフが含まれる）など）。組み合わせ番号（９）は、好ましいアジュバント組み合わせである。
【０２１１】
Ｍ．ヒト免疫調節薬
本明細書中でのアジュバントとしての使用に適切なヒト免疫調節薬には、サイトカイン（インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子など）が含まれる。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、アルミニウム塩およびＭＦ５９は、注射用インフルエンザワクチンとの使用に好ましいアジュバントである。いくつかの実施形態では、細菌毒素および生体接着剤は、粘膜送達ワクチン（鼻ワクチンなど）との使用に好ましいアジュバントである。
【０２１３】
本発明の免疫原性組成物を、抗生物質治療計画と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗生物質を、本発明の抗原または１つ以上の本発明の抗原を含む組成物の投与前に投与する。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、抗生物質を、１つ以上の本発明の抗原または１つ以上の本発明の抗原を含む組成物の投与後に投与する。連鎖球菌感染の治療での使用に適切な抗生物質の例には、ペニシリンもしくはその誘導体またはクリンダマイシンなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０２１５】
本発明を、以下の実施例（これらに制限されない）によってさらに説明する。
【実施例】
【０２１６】
実施例１．材料と方法
肺炎球菌変異体の構築
これらの背景で作製した肺炎球菌株および欠失変異体を、表１に記載する。ＰＣＲライゲーション変異誘発（２３）を使用して、Ｔ４およびＳＴ１６２１９Ｆのノックアウト変異体を作製した。標的遺伝子の上流および下流のフラグメントを、特異的プライマー対を使用して増幅した。ＡｐａＩ部位を使用して上流フラグメントを構築し、ＢａｍＨＩ部位を使用して下流フラグメントを構築した。欠失遺伝子座の構築およびスクリーニングのために使用したプライマーを、表２に列挙する。ＰＣＲ産物（１，０００ｂｐ）を、対応する制限酵素を使用して消化し、精製し、ｅｒｍカセット（１，３０６ｂｐ）（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＢ０５７６４４）またはＡｐａＩ部位およびＢａｍＨＩ部位を含むＫａｎ−ｒｐｓＬカセット（Ｊａｎｕｓ）（２４）（１，３６８ｂｐ）とライゲーションした。次いで、（２５）に記載のように、ライゲーション混合物をレシピエント肺炎球菌株に形質転換し、エリスロマイシン（１μｇ／ｍｌ）またはカナマイシン（４００μｇ／ｍｌ）のいずれかを含む血液寒天培地にプレートした。ＰＣＲおよび配列決定によって正確な挿入を確認した。
【０２１７】
【表１】
2009538116.tif 000013
【０２１８】
【表２−１】
2009538116.tif 000014
【０２１９】
【表２−２】
2009538116.tif 000015
【０２２０】
【表２−３】
2009538116.tif 000016
ｒｌｒＡアイレットを含むＤ３９（血清型２株）の挿入変異体を作製するために、相補Ｄ３９細胞を、ＣＨ１５５（ｒｌｒＡアイレットに隣接する１つのＩＳ１１６７エレメント中にマゼラン５トランスポゾン挿入を有する血清型４肺炎球菌株）由来のゲノムＤＮＡで形質転換した。スペクチノマイシンへのプレーティングによって二重組換え事象を選択し、ＰＣＲによってアイレットの存在を確認した。Ｄ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）のｒｌｒＡ変異誘導体を生成するために、変異血清型４株中の変異領域を、プライマー対ＲＬＲＡＦＲ／ＲＬＲＡＲＸを使用してＰＣＲ増幅し、精製したアンプリコンを必要な血清型２バックグラウンドに形質転換した。組換え事象を、クロラムフェニコールへのプレーティングによってｒｌｒＡについて選択し、ＰＣＲによって確認した。
ＲｒｇＡ、ＲｒｇＢ、およびＲｒｇＣのクローニング、発現、および精製
標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して、全発現プラスミドを構築した。ｐＥＴ  ２１ｂ＋を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  Ｔａｑ（商標）（Ｒｏｃｈｅ）を使用したゲノムＤＮＡでの２５増幅サイクルでＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を、精製し、消化し、ベクターにライゲーションし、大腸菌ＴＯＰＯ１０に形質転換し、その後に大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）にサブクローニングした。製造者の説明書に従って、組換えタンパク質を発現し、形質転換細菌から精製した。
【０２２１】
動物血清
精製組換えＲｒｇＡ、ＲｒｇＢ、およびＲｒｇＣを、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  ＹＭ−３０スピンカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮し、その後にこれを使用して、ＢＡＬＢ／ｃマウス（２０μｇ）およびニュージーランド白ウサギ（１００μｇ）を免疫化した。
【０２２２】
ネガティブ染色
ネガティブ染色のために、細菌を血液寒天上で１６時間まで成長させ、コロニーを０．１５Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液中に再懸濁した。４μｌのアリコートを、Ｆｏｒｍｖａｒ（商標）補助フィルム（ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  ｆｉｌｍ）でコーティングしたグリッドに５分間添加した。過剰な溶液を濾紙で吸い取り、グリッドを０．５％酢酸ウラニル水で５秒間染色し、風乾した。サンプルを、Ｔｅｃｎａｉ（商標）１０電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）で８０ｋＶにて試験した。
【０２２３】
免疫電子顕微鏡法
肺炎球菌を、液体ＴＨＹ培地中で一晩成長させた。１ｍｌのＯＤ６００が０．５の細菌懸濁液を、４℃で３，０００ｒｐｍにて遠心分離し、５００μｌの濾過滅菌ＰＢＳに再懸濁した。２０μｌのサンプルを、Ｆｏｒｍｖａｒ（商標）コーティングしたニッケルグリッドに添加し、５分間静置した。その後、グリッドを１％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ中で固定し、１：１０のマウスポリクローナル抗体：ＲｒｇＡ、ＲｒｇＢ、またはＲｒｇＣを含むブロッキング緩衝液（１％正常ウサギ血清、１％ＢＳＡ、１×ＰＢＳ）とインキュベーションした。サンプルを、ブロッキング緩衝液中にて５分で５回洗浄し、金結合体化二次抗体と１：２０でインキュベーションした（ヤギ抗マウスＩｇＧ、５ｎｍ金粒子、ヤギ抗ウサギＩｇＧ、１０ｎｍ）。サンプルを、ブロッキング緩衝液中にて５分間で５回洗浄し、１％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ中で３０分間固定した。サンプルを、蒸留水にて５分間で５回洗浄し、乾燥させた。グリッドを、酢酸ウラニル水溶液で１５分間染色し、Ｔｅｃｎａｉ（商標）高分解能（ｈｉｇｈ−ｆｉｅｌｄ）透過型電子顕微鏡で処理した。
【０２２４】
ウェスタンブロッティング
細菌を、血液寒天プレート上で１６時間まで成長させた。細菌（湿重量３０ｍｇ）を、４００単位のムタノリシン（Ｓｉｇｍａ）を含む１ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）中に再懸濁し、３７℃で２時間インキュベーションした。３サイクルの凍結融解後、細胞デブリを、１３，０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離によって除去した。５０μｌの上清をＮｕＰａｇｅ（商標）サンプル緩衝液およびメルカプトエタノールにて７０℃で１０分間処理し、１０μｌを、４〜１２％または３〜８％ＮｕＰａｇｅ  Ｎｏｖｅｘ（商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上にロードした。エレクトロブロッティングおよび５００倍希釈したＲｒｇＢ抗体（マウス免疫血清）での検出を、供給者の説明書にしたがって行った。
【０２２５】
Ａ５４９接着アッセイ
対数増殖中期（ＯＤ６００＝０．３〜０．４）まで成長させた肺炎球菌細胞を、Ａ５４９細胞と、５％ＣＯ２／９５％空気雰囲気下にて３７℃で３０〜４０分間インキュベーションし、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄して非接着細菌を除去した。接着細菌および／または内在化細菌を列挙するために、２００μｌの０．２５％トリプシン／１ｍＭ  ＥＤＴＡでの処理によって上皮細胞をウェルから剥離し、８００μｌの氷冷０．０２５％Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００の添加によって溶解した。適切な希釈物を血液寒天プレート上にプレートし、真核細胞に接着した細菌を計数した。各株についての接着細菌の力価を入力力価と比較し、接着性細菌の比率を決定した。
【０２２６】
蛍光顕微鏡法のために、Ａ５４９単層を、２４ウェル組織培養プレート中のカバーガラス上で成長させた。カバーガラス上の感染細胞層を、３％パラホルムアルデヒド中で固定し、３０〜４０分のインキュベーションおよびＰＢＳでの洗浄後に抗体で標識した。細菌を抗莢膜抗体で標識し、上皮細胞を透過処理後にローダミン結合体化ファロイジンでのＦ−アクチンの染色によって視覚化した。全実験を、四連で行い、各実験を異なる日に３回繰り返した。
【０２２７】
マウス攻撃誘発
Ｔ４およびＳＴ１６２１９Ｆおよびその各同質遺伝子変異体を、血液寒天プレート上で５％ＣＯ２下にて３７℃で１６時間成長させた。コロニーをプレートから直接採取し、ＰＢＳ中でＯＤ６２０＝０．５まで再懸濁するか、半合成Ｃ＋Ｙ培地に接種し、鼻腔内接種のためには対数増殖中期（ＯＤ６２０＝０．５）まで成長させ、腹腔内接種のためにはＯＤ６２０＝０．２まで成長させた。適切に希釈して所望の濃度を得た。（５）に記載のように、６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを、Ｔ４、ＳＴ１６２１９Ｆ、およびその変異体の鼻腔内およびｉ．ｐ．細菌攻撃誘発のために使用した。Ｄ３９およびその同質遺伝子変異体を、適切な抗生物質を補足したＴＨＹブロス中で成長させた。６〜１０週齢の雌ＣＤ１（ＵＫ）マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、１×１０７細菌での鼻腔内攻撃誘発のために使用した。
【０２２８】
競合実験のために、変異体および野生型細菌を、１：１の比で混合した。エリスロマイシン、ストレプトマイシン、および／またはクロラムフェニコール血液寒天プレート上での選択によって、野生型ｃｆｕと比較した変異体ｃｆｕの出力を決定した。ｉｎ  ｖｉｖｏ競合指数（ＣＩ）を、変異体対野生型出力ｃｆｕを変異体対野生型入力ｃｆｕで割った比として計算した。
【０２２９】
血清中のｉ．ｐ．攻撃誘発後のＴＮＦおよびＩＬ−６を、市販のＥＬＩＳＡキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の使用によって割り出した。
【０２３０】
統計分析
ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭ（商標）バージョン４の使用によって、統計的有意性についてデータを分析した。連続型変数を、ｔ検定またはノンパラメトリックマン−ホイットニー検定の使用によって比較した。統計的有意性を、Ｐ＜０．０５と定義した。
【０２３１】
ＦＡＣＳ分析
肺炎球菌（Ｔ４、ＳＴ１６２１９Ｆ、Ｔ４Δ（ｍｇｒＡ）、およびＴ４Δ（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ））の分離菌を、ＴＨＹ液体培地中で５％ＣＯ２下にて３７℃で一晩成長させた。サンプルを希釈し、ＯＤ６２０＝０．２５０（１×１０８／ｍｌ）まで成長させた。細菌培養物を３，０００ｒｐｍで遠心分離し、１×ＰＢＳ中に再懸濁した。１５μｌの細菌懸濁液を、９６ウェルプレートに添加した。５μｌの２０％正常ウサギ血清を、３，２００倍希釈の一次抗体（抗ＲｒｇＢ、ＰＩ抗ＲｒｇＢ、Ｎｍ抗９６１）と共に各ウェルに添加した。サンプルを氷上で３０分間インキュベーションし、その後に１５０μｌのブロッキング緩衝液（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）をウェルに添加した。９６ウェルプレートを、２，５００ｒｐｍにて４℃で５分間遠心分離した。フィコエリトリン（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で標識した抗マウス二次抗体を、最終濃度１：１００で添加し、混合物を氷上で３０分間インキュベーションした。次いで、１５０μｌのブロッキング緩衝液を添加し、サンプルを上記のように遠心分離した。サンプルを、２００μｌの１％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ中に再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析した。
【０２３２】
Ｔ４Δ（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）の復帰変異体の作製
カナマイシンカセットと共にノックアウト遺伝子を再導入することによって、ｒｌｒＡアイレットをＴ４Δ（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）に再導入した。カナマイシンカセットを、ＰＣＲライゲーション変異誘発によって野生型Ｔ４株中の標的遺伝子の下流に最初に組み込んだ。これらの変異体由来の染色体ＤＮＡを使用してノックアウトを形質転換し、野生型表現型を修復した。第１の工程では、プライマーＫａｎ−ＡｐａおよびＫａｎ−Ｂａｍを使用してカナマイシンカセットをＪａｎｕｓ（Ｓｕｎｇら，２００１，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６７：５１９０−６）から増幅し、ＡｐａＩおよびＢａｍＨＩ末端を有するＰＣＲ産物を作製した。標的部位の蒸留および下流のフラグメントを、Ｔ４Δ（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）変異体のためのプライマーｐｉｌｉ−ｒｅｖ−１−４を使用して増幅した。フラグメントの上流をＡｐａＩ部位を使用して構築し、下流フラグメントをＢａｍＨＩ部位を使用して構築した。全フラグメントを、対応する制限エンドヌクレアーゼを使用して消化し、等モル量の上流フラグメント、下流フラグメント、およびカナマイシンフラグメントを使用してライゲーションを行った。Ｔ４への形質転換後、形質転換体を、２００ｍｇ／Ｌカナマイシンを含む血液寒天プレート上で選択した。コントロールＰＣＲによって正確な構築の確認後、これらの形質転換体由来の染色体ＤＮＡを使用して、Ｔ４Δ（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）を形質転換した。カナマイシン含有プレート上で再度選択を行い、エリスロマイシン感受性および線毛発現のチェックによって変異体を確認した。
【０２３３】
実施例２．肺炎球菌における線毛様構造の透過電子顕微鏡法による証拠
透過電子顕微鏡法およびネガティブ染色により、血液寒天プレート上および（Ｃ＋Ｙ）または（ＴＨＹ）培地中で１６時間まで培養した肺炎球菌が線毛様構造を発現することが見出された。これらの構造は、多遺伝子座配列型ＳＴ２０５の高浸潤性血清型４クローンに属するＴ４株（ＴＩＧＲ４）および多遺伝子座配列型１６２を有する１９Ｆ型の臨床分離菌（ＳＴ１６２１９Ｆ株）で見出された（図１Ａ）。この１９Ｆクローンは、ヒトにおける輸送（ｃａｒｒｉａｇｅ）および浸潤性疾患の両方に関連し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＢＡＬＢ／ｃマウスの気道の有効な生着菌であることが示されている（５）。Ｔ４の非被包変異体（Ｔ４Ｒ）は、線毛を形成することができたが、非被包実験株Ｒ６では線毛は認められなかった。
【０２３４】
実施例３．肺炎球菌ゲノム中のｒｌｒＡアイレットは線毛様構造をコードする
ジフテリア菌由来のｓｐａＡＢＣオペロン（１２）とＢ群連鎖球菌由来の接着アイレット１（１６）との比較により、Ｔ４ゲノム内の推定線毛遺伝子のクラスターが明らかとなった（図２）。線毛遺伝子は、前に記載したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｒｌｒＡ病原性アイレット中に存在する（１８、１９）。肺炎球菌ｒｌｒＡアイレットは７つの遺伝子からなり、そのうちのｒｒｇＡ、ｒｒｇＢ、およびｒｒｇＣは、宿主の細胞外基質の成分に結合する接着マトリックス分子を認識する微生物表面成分（ＭＳＣＲＡＭＭ）を含むＬＰＸＴＧをコードするお予想される（２０）。さらに、ｒｌｒＡアイレットはまた、３つのソルターゼ遺伝子（ｓｒｔＢ、ｓｒｔＣ、およびｓｒｔＤ）およびｒｌｒＡ（ｒｏｆＡ様制御因子）（遺伝子クラスターの正の制御因子）を含む（１８）（図２）。ゲノムアイレットは、移動性ゲノムエレメントに特徴的な逆反復を含むＩＳ１１６７に隣接する（図２）。配列決定したＲ６株およびその前駆体Ｄ３９は、ｒｌｒＡ−線毛アイレットを欠く（図２）。転写リプレッサーｍｇｒＡは、ｒｌｒＡアイレットの外部に存在し、線毛遺伝子の調節に関与する（２１）。血清型１９Ｆの臨床分離菌ＳＴ１６２１９Ｆ中の対応する領域のＰＣＲ増幅後の配列分析により、Ｔ４ｒｌｒＡアイレットと９８％同一の相同遺伝子クラスターが明らかとなった。しかし、Ｔ４の未知の機能の小ＯＲＦは、ＳＴ１６２１９Ｆ分離菌中に存在しなかった。Ｔ４およびＳＴ１６２１９ＦのｍｇｒＡ遺伝子が欠失したノックアウト変異体を、ＰＣＲライゲーション変異誘発によって構築し、それにより、ｒｌｒＡアイレットの遺伝子を過剰発現する株が産生された。さらに、Ｔ４およびＳＴ１６２１９Ｆ中ならびにその各ｍｇｒＡ誘導体中のｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ領域（図１Ｂ）を欠失した。ネガティブ染色および電子顕微鏡法の際、Ｔ４ｍｇｒＡおよびＳＴ１６２１９ＦのｍｇｒＡ変異体は線毛を豊富に産生することが見出されたのに対して（図１Ｃ）、ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ欠失した細菌は線毛を完全に欠いていた（図１Ｄ）。
【０２３５】
抗血清を、大腸菌中で発現したＲｒｇＡ、ＲｒｇＢ、およびＲｒｇＣタンパク質に対して惹起し、Ｔ４によって発現した線毛の免疫金標識で使用した。ＲｒｇＢ抗体は、線毛ポリマー全体に遍在していた（図１のＥ〜Ｇ）。ＲｒｇＢ特異的抗体を使用したＦＡＣＳ分析により、Ｔ４およびＳＴ１６２１９Ｆのそれぞれ８４％および９０％が線毛構造を発現することが明らかとなった。ｍｇｒＡ変異誘導体では、ほとんど全て（９９％）の細菌が線毛化した。ＦＡＣＳ分析で測定したところ、ｒｌｒＡアイレットを欠く細胞は線毛を持たなかった。
【０２３６】
Ｔ４およびＳＴ１６２１９Ｆで認められた線毛構造の重合体の性質を検証するために、これらの株およびその各ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ欠失誘導体の全抽出物を、ムタノリシンで処理し、４〜１２％（図３Ａ）および３〜８％（図３Ｂ）のポリアクリルアミド勾配ゲルで分離し、抗血清特異的ＲｒｇＢを使用して免疫ブロッティングした。１００ｋＤａ未満〜１，０００ｋＤａ超の範囲の高分子量（ＨＭＷ）ポリマーのラダーが認められ、これは、ジフテリア菌において前に記載のラダーに類似していた（１２、１３）。等量のタンパク質抽出物をゲルにロードしたにもかかわらず、ＲｒｇＢ抗体によって染色されたバンドは、その対応する野生型株よりもｍｇｒＡ変異体でより強く、より高い比率の肺炎球菌がｍｇｒＡ変異体バックグラウンド中で線毛構造を発現したという透過電子顕微鏡法およびＦＡＣＳ分析由来のデータを支持する。予想通り、Ｔ４およびＳＴ１６２１９Ｆ中のｒｒｇＡ−ｓｒｔＤの欠失変異体は、それぞれ、ＲｒｇＢ反応性バンドを示さなかった（図３）。しかし、線毛アイレットが欠失変異体Ｔ４Δ（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）に再導入された場合、ＲｒｇＢ抗血清を使用したウェスタンブロット分析では、野生型Ｔ４株に類似のＨＭＷポリマーが検出された。ウェスタンブロッティングの使用により、透過電子顕微鏡法の使用によって常に検出できるわけではないが、液体培地中およびプレート上の両方で培養された肺炎球菌株中に線毛が存在することが認められ、線毛が以前に見出されなかった理由が示唆された。
【０２３７】
実施例４．ｒｌｒＡアイレットは、肺上皮細胞への肺炎球菌接着に重要である
血清型２のＤ３９株は、非被包誘導体Ｒ６と同様に、ｒｌｒＡアイレットを欠く（図２）。Ｔ４由来の完全なｒｌｒＡアイレットを、Ｄ３９（Ｄ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ））に導入した。抗ＲｒｇＢを使用したウェスタンブロッティングに基づいてＨＭＷポリマーのリーダーによって証明されるように、このＤ３９のアイレット挿入変異体は線毛を発現した（図３Ｂ）。Ｄ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）中の線毛発現は、正の制御因子ｒｌｒＡに依存したが、これは、ＨＭＷポリマーがＤ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）のｒｌｒＡ変異誘導体で検出されなかったためである（図３Ｂ）。Ｄ３９、Ｄ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）、およびＤ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）Δ（ｒｌｒＡ）を使用して、Ａ５４９肺上皮細胞への接着を研究した（図４）。線毛発現Ｄ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）のみがこれらの細胞に結合した（図４）。この結合は、線毛発現Ｔ４の結合に類似していたのに対して、Ｔ４のｒｌｒＡ変異体はＡ５４９細胞への検出可能な結合を示さなかった。
【０２３８】
実施例５．ｒｌｒＡアイレットはマウスモデルにおける病原性に影響を及ぼす
肺炎球菌の定着および浸潤性疾患における線毛の役割を調査するために、株Ｔ４およびＴ４Δ（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）株を、マウス感染モデルで使用した。天然の感染経路を最小にするために、６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに、高用量（５×１０６コロニー形成単位（ｃｆｕ））および中用量（５×１０５ｃｆｕ）の肺炎球菌を接種した。死後の動物における鼻咽頭−気管洗浄の実施によって定着を評価した。変異体に感染したマウスの生存率がより高いことによって明らかなように、非線毛化変異体は、野生型株よりも病原性が低かった（図５Ａおよび５Ｂ）。この病原性の欠損を、ｒｌｒＡアイレットの再導入によって修復することができる。
【０２３９】
個別に投与した野生型および変異肺炎球菌は、類似の程度にマウスに定着することができる（マン・ホイットニーＵ検定では有意ではない、Ｐ＞０．０５）。しかし、同数の野生型および変異Ｔ４細菌を共に鼻腔内に投与した場合、大部分のマウスで、上気道、肺、および血液中で、線毛欠損変異体は野生型によって打ち負かされた（図５Ｃ〜Ｅ）。鼻咽頭輸送および肺炎についての競合実験において、２型Ｄ３９株、アイレット挿入誘導体Ｄ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）、およびｒｌｒＡ変異体Ｄ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）Δ（ｒｌｒＡ）も使用した。非線毛化野生型Ｄ３９は、線毛化アイレット挿入変異体Ｄ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）に打ち負かされたのに対して、ｒｌｒＡを欠く変異体はそうではなかった（図５Ｆ）。本データは、肺炎球菌線毛が、定着、肺炎、および浸潤性疾患で役割を果たすことを証明する。
【０２４０】
実施例６．ｒｌｒＡアイレットは宿主炎症反応で役割を果たす
肺炎球菌感染の結果は、宿主の炎症反応に影響を受ける。炎症反応は、細菌クリアランスを促進することができ、同様に、局所損傷（肺炎）または全身損傷（その最も重篤な系チアが敗血症性ショックである）に寄与し得る。本発明者らは、マウスにｉ．ｐ．投与した場合、多様な肺炎球菌クローンが異なる炎症誘発性サイトカイン応答を引き起こすことを最近示した（２６）。ここで線毛を産生することを示した血清型６Ｂ株、Ｔ４、およびＳＴ１６２１９Ｆ株の全てが、ｉ．ｐ．攻撃誘発後に高いＴＮＦ応答を惹起した（５）。対照的に、異なるクローン型の血清型１９Ｆ株（ＳＴ４２５１９Ｆ）は、マウスの上気道の定着に有効ではなく、低ＴＮＦ応答を惹起した（５）。これは、血清型１および血清型７Ｆ分離菌についても真であり（５、２２）、これらの分離菌は、比較的軽度の浸潤性疾患に関連し、ヒトが死亡しない浸潤性クローン型に属する（２２）。これらのクローンを、ＰＣＲ、配列決定、およびサザンブロットハイブリッド形成によってｒｌｒＡ線毛アイレットの存在について分析した。結果は、ｒｌｒＡアイレット陽性肺炎球菌株（それぞれ、４型および１９ＦのＳＴ２０５４およびＳＴ１６２１９Ｆ）が高サイトカイン応答を誘発するのに対して、ｒｌｒＡアイレット陰性株（それぞれ、７Ｆ型および１型のＳＴ１９１７Ｆ、ＳＴ２２８１、およびＳＴ３０６１）低ＴＮＦ応答を誘導することを証明した（５）。したがって、肺炎球菌線毛アイレットの有無によってＴＮＦ応答の相違を説明することができる。この可能性を直接試験するために、線毛化野生型および線毛を欠くｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ欠失変異体でのマウスのｉ．ｐ．攻撃誘発後の浸潤性肺炎球菌感染中の炎症反応を測定した。より高い感染用量での２つの欠失変異体内の感染も行い、低ＴＮＦ応答が血流中のより少ない細菌数に起因しないことを裏付けた。Ｔ４およびＳＴ１６２１９Ｆバックグラウンドの線毛欠損変異体は、その各野生型株と比較して、有意に低いＴＮＦ応答（図６）およびＩＬ−６応答（図７）を示した。細菌数に対するＴＮＦ値のプロッティングにより、線毛化肺炎球菌に対するＴＮＦ応答が同数の非線毛化肺炎球菌よりも有意に高いことを証明した（図６ＣおよびＤ）。さらに、Ｔ４Δ（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）へのｒｌｒＡアイレットの再導入により、線毛化Ｔ４の高ＴＮＦ応答が修復された。
【０２４１】
これらの結果は、肺炎球菌が細菌細胞から突出した線毛様構造を産生することを証明する。肺炎球菌線毛は、ｒｌｒＡ線毛アイレットによってコードされ、いくつかの肺炎球菌株で見出されるが、全てでは見出されない。被包肺炎球菌では、線毛は、培養上皮細胞への接着ならびに感染マウスモデルにおける定着および浸潤性疾患に寄与する。線毛発現は、宿主の炎症反応を増大させる。肺炎球菌は、異なる感染段階でその宿主と相互作用するための種々の機構を使用する。線毛の発現は、初期細菌接着を容易にし、上咽頭の定着を促進することができる。同時に、これらの構造を発現する細菌は粘膜炎症を誘発する傾向があり、それによってクリアランスを促進することができるが、炎症によって粘膜バリアが損傷する場合、潜在的に組織に肺炎球菌を進入させ得る。
【０２４２】
実施例７．Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ線毛の精製
肺炎球菌ＴＩＧＲ４グリセロールストック（−８０℃）を、５％脱線維ヒツジ血液を補足したトリプシンダイズ寒天上で成長させた（５％ＣＯ２中にて３７℃で一晩）。新鮮な細菌を使用して、新規の寒天プレートに接種し、５％ＣＯ２中にて３７℃で約１２時間培養した。約１０プレートの採取した細菌を、３５ｍｌ  ＰＢＳで１回洗浄し、プロテアーゼインヒビターカクテルセット（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を含む２ｍｌプロトプラスト緩衝液ＰＰＢ（１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．３）、２０％スクロース）中に再懸濁した。約４５０Ｕのムタノリシンを含む１００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ６．３）を、懸濁液の半分にそれぞれ添加し、顕微鏡法によってプロトプラスト形成が検出されるまで、穏やかに振盪しながら３７℃で約５〜８時間インキュベーションした。消化線毛物質を含む上清を、ショ糖密度勾配（２５〜５６％の１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．３））にロードし、３８，０００ｒｐｍにて４℃で２０時間運転した（図１０Ａ）。全てのさらなる工程を、プロテアーゼインヒビターを含む緩衝液を使用して、４℃で行った。さらに、エンゾナーゼ（商標）ヌクレアーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を添加して、ＤＮＡおよびＲＮＡ夾雑物を除去した。回収した勾配画分を、抗ＲｒｇＢ抗体を使用して、線毛物質について試験した。線毛含有画分をプールし、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．３）に対して約１日間透析して、スクロースを除去した。
【０２４３】
多分散性を減少させるために、さらなるクロマトグラフィ工程を追加した。必要に応じて、プールした線毛調製物を、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（商標）６  １０／３００ＧＬカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にロードする前に濃縮した（図１０Ｂ）。ゲル濾過によって、異なる分子量の物質を含む線毛を分離した。精製線毛画分を、電子顕微鏡法、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気得動、および抗体特異的形態ＲｒｇＢを使用した免疫ブロッティングに基づいて均一であることを判断した（図１０Ｃ）。サンプルを、さらなる使用まで−８０℃または液体窒素中で保存した。
【０２４４】
高分子量の精製線毛は、２×１０６〜３×１０６Ｄａの範囲の分子量を示した。ＳＤＳの存在下での線毛の熱処理によってより小さな分子に解離し、ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル上に低分子量バンドのラダーが得られた。精製線毛のエドマン分解により、シグナル配列（ＡＧＴＴＴＴＳＶＴＶＨＸＬ；配列番号５６）の切断によって産生されたＲｒｇＢタンパク質の推定Ｎ末端に対応する配列が同定された（図１１Ａ）。線毛トリプシンペプチド配列のアミノ酸配列分析により、アミノ酸配列ＬＡＧＡＥＦＶＩＡＮＡＤＮＡＧＱＹＬＡＲ（配列番号７）を有する肺炎球菌ＴＩＧＲ４  ＲｒｇＢタンパク質のフラグメントが同定された（図１１Ｂ）。陰性染色された（１％ＰＴＡ）免疫金標識精製線毛調製津に対して電子顕微鏡法による調査を行った。長さ１μｍおよび直径約１０ｎｍまでの伸長した管状フィラメントが認められ、これは、全細菌で検出されたものに類似していた。単一の線毛フィラメントに加えて、強固に固められた各構造の束状構造が認められた。精製ＲｒｇＢおよびＲｒｇＣに対する抗血清は、免疫金ＥＭ（図１５）およびウェスタン分析（図１０Ｃ）下で単離された線毛と反応した。抗ＲｒｇＡ、抗ＲｒｇＢ、および抗ＲｒｇＣの金標識パターンを、図１６に示す。
【０２４５】
実施例８．線毛タンパク質ＲｒｇＡおよびＲｒｇＢはｉｎ  ｖｉｔｒｏで会合する
線毛タンパク質ＲｒｇＡ、ＲｒｇＢ、およびＲｒｇＣを、実施例１に記載のように精製した。精製タンパク質調製物を、室温、３７℃、６５℃、および９５℃で５分間インキュベーションした。インキュベーションした調製物を、変性ポリアクリルアミドゲルで泳動した。高分子量複合体はＲｒｇＡおよびＲｒｇＢ調製物で認められたが、ＲｒｇＣ−Ｈｉｓ調製物では認められなかった（図９Ａ）。高分子量複合体中のＲｒｇＡおよびＲｒｇＢを、ウェスタンブロッティングによって確認した（図９Ｂ）。高分子量複合体は、サイズ排除クロマトグラフィによってＲｒｇＡおよびＲｒｇＢ調製物中でも検出された（図９Ｃ）。
【０２４６】
実施例９．線毛に対して調製した抗血清は感染を防御する
マウスに精製線毛に対する抗血清（抗線毛）、同一条件下で線毛を産生した細菌から精製した調製物に対する抗血清（抗Δ線毛）、または整理食塩水コントロール（ｃｔｒｌ）を投与したこと以外は、実施例１に記載のように、マウスをＴ４細菌でｉ．ｐ．攻撃誘発した。並行実験では、マウスに、１０倍希釈した同一の抗血清を投与した。動物を、１０日間にわたって死亡率について観察し、攻撃誘発から２４時間後に細菌負荷を測定した。非希釈抗線毛血清で処置した全マウスは、細菌負荷が検出レベル未満であり、１０倍希釈の血清での処置により、依然としていくらかの防御が得られた（図１２Ａ）。希釈および非希釈抗線毛血清は共に、整理食塩水コントロールと比較して死亡率の有意な減少が認められた（図１２Ｂ）。さらに、線毛に対して調製した血清は、抗Δ線毛血清よりも菌血症および死亡率に対する防御がより高かった（図１２Ａ〜Ｂ）。この実施例は、精製線毛に特異的な血清が動物モデルにおいて肺炎球菌感染に対して有意な防御を示したことを証明する。
【０２４７】
実施例１０．精製線毛および線毛タンパク質は細胞外基質成分に結合する
細胞外成分へのＲｒｇＡ、ＲｒｇＢ、ＲｒｇＣ、精製線毛、および偽精製線毛の結合を、ＥＬＩＳＡによって決定した。細胞外基質成分であるムチンＩ、ビトロネクチン、ラクトフェリン、コラーゲンＩおよびＩＶ、ラミニン、フィブロネクチン、およびフィブリノゲンへの線毛成分の結合を測定した。簡潔に述べれば、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）９６ウェル平底プレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を、３７℃で１時間コーティングし、その後に２μｇ／ウェルのムチンＩ、ビトロネクチン、ラクトフェリン、コラーゲンＩおよびＩＶ、およびフィブリノゲン、ならびに１μｇ／ウェルのラミニンおよびフィブロネクチンを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）（ＰＢＳ））と４℃で一晩インキュベーションした。ＢＳＡコーティングプレートを、ネガティブコントロールとして使用した。コーティングしたウェルを、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０で３回洗浄し、２００μｌの１％ＢＳＡにて３７℃で２時間ブロッキングした。プレートを、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０で３回洗浄した。タンパク質サンプル（ＲｒｇＡ、ＲｒｇＢ、およびＲｒｇＣ）を、最初にＰＢＳで０．４μｇ／μｌに希釈した。２００μｌのタンパク質溶液、２５μｌ線毛調製物（ＰＢＳで全体積を２００μｌにする）、および各コントロールを、コーティング−ブロッキングプレートに移し、サンプルをＰＢＳで２倍に連続希釈した。プレートを、３７℃で２時間および４℃で一晩インキュベーションした。プレートを、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０で３回洗浄し、一次マウス抗Ｒｒｇ抗体（１０，０００倍希釈）と３７℃で２時間インキュベーションした：ＲｒｇＡ、ＲｒｇＢ、およびＲｒｇＣコーティングプレートを、抗ＲｒｇＡ、抗ＲｒｇＢ、および抗ＲｒｇＣとそれぞれインキュベーションし、線毛コーティングプレートを抗ＲｒｇＢ抗体とインキュベーションした。さらなる３回の洗浄工程後、アルカリホスファターゼ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，ＳＡ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）との３７℃で２時間のインキュベーション後に抗原特異的ＩｇＧが明らかとなった。
【０２４８】
コラーゲンＩ、ラクトフェリン、ラミニン、フィブロネクチン、およびフィブリノゲンへの有意な結合が認められた（図１３）。全ての場合、ＲｒｇＡで最も強い結合が認められ、より低いレベルでＲｒｇＣおよびＲｒｇＢが続いた。精製線毛は、より弱いが検出可能な結合を示した。本実施例は、細胞外基質成分への精製線毛および単離された線毛タンパク質の結合が証明され、接着／定着における線毛の機能が示唆される。
【０２４９】
実施例１１．精製線毛は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのサイトカイン応答を誘導する
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）および単球を、ｉｎｖｉｔｒｏで精製線毛調製物および線毛を発現しないＴ４から精製した偽調製物と接触させた。線毛と応答した細胞によるサイトカインの産生を、ＥＬＩＳＡによって測定した。精製線毛は、Δ線毛コントロールと比較して、炎症性サイトカインであるＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ４０、およびＩＬ−６の産生を誘導した（図１４）。ＴＬＲ２、７、８、および９については誘導は認められなかった。
【０２５０】
実施例１２．精製線毛の電子顕微鏡分析
５μｌの精製線毛調製物を、薄いカーボンフィルムでコーティングした３００メッシュの銅グリッド上においた。次いで、グリッドを、５μｌの１％ＰＴＡ（リンタングステン酸）の添加によってネガティブ染色した。過剰な液体を吸い取った。
【０２５１】
ＦＥＧ２００電子顕微鏡を使用して、グリッドを観察した。加速電圧１００ｋＶおよび低用量条件下での５００００倍の名目上の倍率で画像を記録した。線毛は、伸長した可動性の構造として認められた（図１８）。
【０２５２】
電子顕微鏡をスキャニングし、画像をＩＭＡＧＩＣ５形式（ｉｍａｇｉｃ５．ｄｅ）に変換した。同一の線毛部分を、ＥＭＡＮソフトウェアの使用による四角いボックス（３００×３００ピクセル）の使用によってデジタル化したネガから選別した。全てのボックス化したコレクションの間で、同一の成長方向および類似の直径の直鎖状の線毛のみを処理した。
【０２５３】
第１の分析では、ボックス化した線毛の密度を反転し、高域および低域をフィルタリングし、同一直径のモデルシリンダーの投影と整列させた（図１８）。自己相関関数を使用して回転整列を適用し、その後に、シリンダー軸のみに対して垂直に並進整列を行った。
【０２５４】
平均のフィラメント軸にわたる密度プロフィールを計算し、グラフで示した。密度プロフィールは、線毛が小型で中央に穴のない中身の詰まった構造であり、全構造の計算された平均直径が１１．５ｎｍであることを強く示した（図１８）。類似の直径（１１ｎｍ）を、整列した柄状のセグメントへの無作為な回転角の割り当てによって得られた回転によって対称な三次元塊（ｖｏｌｕｍｅ）から計算した（図１９）。さらに、塊は、線毛表面が滑らかではないことを示した（図１８〜１９）。
【０２５５】
１３ｎｍ反復の強い構造特性を示す予め整列させたいくつかの柄状セグメントを、軸平均化によってさらに整列させて、より強いシグナルを有する改良された２Ｄ画像を作成した（図２０）。
【０２５６】
２Ｄ画像（３Ｄ構造の投影）（図２１〜２２）は、線毛が、平均直径が１０．５〜１１．０ｎｍでピッチが１３．２ｎｍのコイルドコイル構造に配置された少なくとも３つの「プロトフィラメント」によって作製されることを明確に示す（図２３）。ノード位置の線毛の直径は６．８ｎｍであり、各々の単一の「プロトフィラメント」の直径は３．５ｎｍである（図２３）。
【０２５７】
（参照文献）これらは、その全体が参考として援用される。
【化７】
2009538116.tif 000017
【０２５８】
【化８】
2009538116.tif 000018
他の実施形態
多数の本発明の実施形態が記載されている。それにもかかわらず、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、種々の修正形態を実施することができると理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２５９】
【図１】図１。（Ａ）細菌表面上に豊富な線毛を示す肺炎球菌Ｔ４株のネガティブ染色。（Ｂ）線毛を示さない変異株Ｔ４Δ（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）のネガティブ染色。（Ｃ）豊富な線毛を示すＴ４Δ（ｍｇｒＡ）変異体のネガティブ染色。（Ｄ）細菌表面上に線毛を示さないＴ４Δ（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ、ｍｇｒＡ）変異体のネガティブ染色。（Ｅ）抗ＲｒｇＡの使用によるＴ４の免疫金標識。（Ｆ）抗ＲｒｇＢ（５ｎｍ）および抗ＲｒｇＣ（１０ｎｍ）でのＴ４の免疫金染色。抗ＲｒｇＢは、全線毛に遍在していた（バー、２００ｎｍ）。（Ｇ）抗ＲｒｇＢ（５ｎｍ）および抗ＲｒｇＣ（１０ｎｍ）で二重標識したＴ４線毛の高倍率画像。矢印で示すように、抗ＲｒｇＣによる線毛の特異的標識を示す（バー、１００ｎｍ）。（Ｈ）抗ＲｒｇＢおよび抗ＲｒｇＣによって検出可能な表面上の視覚可能な線毛が認められない欠失変異体肺炎球菌Ｔ４Δ（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）の免疫金標識（バー、２００ｎｍ）。
【図２】図２。血清型４のＴ４株（ＴＩＧＲ４）中のｒｌｒＡアイレット（ｉｓｌｅｔ）のゲノム構成および利用可能な配列由来の実験株Ｒ６との比較。１９Ｆ株であるＳＴ１６２１９Ｆは、全部で９８％の配列が同一な類似の構成を共有するのに対して、非被包株Ｒ６およびその子孫Ｄ３９は、線毛−アイレット陰性株である。挿入配列（ＩＳ１１６７）は、陽性株（トランスポザーゼの１つがフレームシフト（ｆｓ）している）中の遺伝子座に隣接しているのに対して、ＲＵＰエレメント（肺炎球菌中の反復単位）は絨毛−アイレット陰性株で同定される。遺伝子座のサイズおよびその相対的Ｇ＋Ｃ含量を示す。負の制御因子ｍｇｒＡの位置を示す。ストレプトコッカス・アガラクチアおよびジフテリア菌における線毛構造をコードするアイレットのゲノム構成を比較として含む。
【図３】図３。（Ａ）４〜１２％ポリアクリル勾配ゲルを使用したウェスタンブロット。ＲｒｇＢ抗血清は線毛を発現する株（Ｔ４、Ｔ４Δ（ｍｇｒＡ）、ＳＴ１６２１９Ｆ、およびＳＴ１６２１９ＦΔ（ｍｇｒＡ））における高分子量（ＨＭＷ）ポリマーのラダーを検出するのに対して、線毛を欠く変異株（Ｔ４Δ（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）、Ｔ４Δ（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ、ｍｇｒＡ）、およびＳＴ１６２１９ＦΔ（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ））はＨＭＷポリマーを持たない。ｍｇｒＡ変異体は、各野生型と比較した場合、強度が増加する。（Ｂ）アイレットを欠くＤ３９、ｒｌｒＡアイレットが導入された変異Ｄ３９（Ｄ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ））、およびそのｒｌｒＡ欠失誘導体（Ｄ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）Δ（ｒｌｒＡ））についての４〜１２％勾配ゲルを使用したＲｒｇＢ抗血清でのウェスタンブロット。
【図４Ａ】図４。（Ａ）Ａ５４９肺上皮細胞の単層へのＤ３９およびＤ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）ならびにＤ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）Δ（ｒｌｒＡ）の接着。（Ｂ〜Ｄ）Ｄ３９（Ｂ）、Ｄ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）（Ｃ）、およびＤ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）Δ（ｒｌｒＡ）の免疫蛍光顕微鏡法。（Ｄ）Ａ５４９肺上皮細胞への接着。抗莢膜抗体（緑色）での肺炎球菌の標識およびローダミンでの上皮Ｆ−アクチンの視覚化（赤色）を示す。
【図４Ｂ】図４。（Ａ）Ａ５４９肺上皮細胞の単層へのＤ３９およびＤ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）ならびにＤ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）Δ（ｒｌｒＡ）の接着。（Ｂ〜Ｄ）Ｄ３９（Ｂ）、Ｄ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）（Ｃ）、およびＤ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）Δ（ｒｌｒＡ）の免疫蛍光顕微鏡法。（Ｄ）Ａ５４９肺上皮細胞への接着。抗莢膜抗体（緑色）での肺炎球菌の標識およびローダミンでの上皮Ｆ−アクチンの視覚化（赤色）を示す。
【図４Ｃ】図４。（Ａ）Ａ５４９肺上皮細胞の単層へのＤ３９およびＤ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）ならびにＤ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）Δ（ｒｌｒＡ）の接着。（Ｂ〜Ｄ）Ｄ３９（Ｂ）、Ｄ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）（Ｃ）、およびＤ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）Δ（ｒｌｒＡ）の免疫蛍光顕微鏡法。（Ｄ）Ａ５４９肺上皮細胞への接着。抗莢膜抗体（緑色）での肺炎球菌の標識およびローダミンでの上皮Ｆ−アクチンの視覚化（赤色）を示す。
【図４Ｄ】図４。（Ａ）Ａ５４９肺上皮細胞の単層へのＤ３９およびＤ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）ならびにＤ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）Δ（ｒｌｒＡ）の接着。（Ｂ〜Ｄ）Ｄ３９（Ｂ）、Ｄ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）（Ｃ）、およびＤ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）Δ（ｒｌｒＡ）の免疫蛍光顕微鏡法。（Ｄ）Ａ５４９肺上皮細胞への接着。抗莢膜抗体（緑色）での肺炎球菌の標識およびローダミンでの上皮Ｆ−アクチンの視覚化（赤色）を示す。
【図５Ａ】図５。（Ａ〜Ｅ）線毛化（ｐｉｌｉａｔｅｄ）Ｔ４およびその同質遺伝子非線毛化欠失変異体Ｔ４Δ（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）でのＣ５７ＢＬ／６マウスの鼻腔内攻撃誘発。（ＡおよびＢ）５×１０６ｃｆｕ（高用量、Ａ）または５×１０５ｃｆｕ（中用量、Ｂ）での接種後のマウスの生存率。カプラン・マイヤー対数順位検定の使用によって生存率を分析した。（Ｃ〜Ｅ）ｉｎ  ｖｉｖｏ競合感染実験。Ｔ４およびその同質遺伝子変異体Ｔ４Δ（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）を、鼻腔内感染前に１：１の比率で混合した。競合指数（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｉｎｄｅｘ）（ＣＩ）を下記のように計算し、各サークルは各競合実験組における各マウスについてのＣＩを示す。１未満のＣＩは、野生型株と比較した場合に変異体が競合的に不利であることを示す。１０−４未満のＣＩ値を１０−４に設定した。全マウスが定着した。（Ｃ）高用量攻撃誘発後の定着、肺炎、および菌血症のＣＩ（ｎ＝２０）。２０匹のマウスのうち、１４匹のみが肺炎（肺から回収された細菌として定義）を示し、１４匹が菌血症を示した。（Ｄ）中用量での攻撃誘発後の定着におけるＣＩ（ｎ＝１０）。１０匹のうち、たった５匹が肺炎を示し、１匹が菌血症を示した。（Ｅ）低用量での攻撃誘発後の定着におけるＣＩ（ｎ＝１０）。１０匹のうち、たった４匹が肺炎を示し、菌血症を発症しなかった。（Ｆ）野生型Ｄ３９およびその同質遺伝子線毛アイレット挿入誘導体Ｄ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）または不活化ｒｌｒＡ遺伝子を有するＤ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）Δ（ｒｌｒＡ）での混合感染後の定着および肺炎におけるＣＩ。１を超えるＣＩは、Ｄ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）中のｒｌｒＡアイレットの存在による病原性の増幅を示す。
【図５Ｂ】図５。（Ａ〜Ｅ）線毛化（ｐｉｌｉａｔｅｄ）Ｔ４およびその同質遺伝子非線毛化欠失変異体Ｔ４Δ（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）でのＣ５７ＢＬ／６マウスの鼻腔内攻撃誘発。（ＡおよびＢ）５×１０６ｃｆｕ（高用量、Ａ）または５×１０５ｃｆｕ（中用量、Ｂ）での接種後のマウスの生存率。カプラン・マイヤー対数順位検定の使用によって生存率を分析した。（Ｃ〜Ｅ）ｉｎ  ｖｉｖｏ競合感染実験。Ｔ４およびその同質遺伝子変異体Ｔ４Δ（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）を、鼻腔内感染前に１：１の比率で混合した。競合指数（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｉｎｄｅｘ）（ＣＩ）を下記のように計算し、各サークルは各競合実験組における各マウスについてのＣＩを示す。１未満のＣＩは、野生型株と比較した場合に変異体が競合的に不利であることを示す。１０−４未満のＣＩ値を１０−４に設定した。全マウスが定着した。（Ｃ）高用量攻撃誘発後の定着、肺炎、および菌血症のＣＩ（ｎ＝２０）。２０匹のマウスのうち、１４匹のみが肺炎（肺から回収された細菌として定義）を示し、１４匹が菌血症を示した。（Ｄ）中用量での攻撃誘発後の定着におけるＣＩ（ｎ＝１０）。１０匹のうち、たった５匹が肺炎を示し、１匹が菌血症を示した。（Ｅ）低用量での攻撃誘発後の定着におけるＣＩ（ｎ＝１０）。１０匹のうち、たった４匹が肺炎を示し、菌血症を発症しなかった。（Ｆ）野生型Ｄ３９およびその同質遺伝子線毛アイレット挿入誘導体Ｄ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）または不活化ｒｌｒＡ遺伝子を有するＤ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）Δ（ｒｌｒＡ）での混合感染後の定着および肺炎におけるＣＩ。１を超えるＣＩは、Ｄ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）中のｒｌｒＡアイレットの存在による病原性の増幅を示す。
【図５Ｃ】図５。（Ａ〜Ｅ）線毛化（ｐｉｌｉａｔｅｄ）Ｔ４およびその同質遺伝子非線毛化欠失変異体Ｔ４Δ（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）でのＣ５７ＢＬ／６マウスの鼻腔内攻撃誘発。（ＡおよびＢ）５×１０６ｃｆｕ（高用量、Ａ）または５×１０５ｃｆｕ（中用量、Ｂ）での接種後のマウスの生存率。カプラン・マイヤー対数順位検定の使用によって生存率を分析した。（Ｃ〜Ｅ）ｉｎ  ｖｉｖｏ競合感染実験。Ｔ４およびその同質遺伝子変異体Ｔ４Δ（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）を、鼻腔内感染前に１：１の比率で混合した。競合指数（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｉｎｄｅｘ）（ＣＩ）を下記のように計算し、各サークルは各競合実験組における各マウスについてのＣＩを示す。１未満のＣＩは、野生型株と比較した場合に変異体が競合的に不利であることを示す。１０−４未満のＣＩ値を１０−４に設定した。全マウスが定着した。（Ｃ）高用量攻撃誘発後の定着、肺炎、および菌血症のＣＩ（ｎ＝２０）。２０匹のマウスのうち、１４匹のみが肺炎（肺から回収された細菌として定義）を示し、１４匹が菌血症を示した。（Ｄ）中用量での攻撃誘発後の定着におけるＣＩ（ｎ＝１０）。１０匹のうち、たった５匹が肺炎を示し、１匹が菌血症を示した。（Ｅ）低用量での攻撃誘発後の定着におけるＣＩ（ｎ＝１０）。１０匹のうち、たった４匹が肺炎を示し、菌血症を発症しなかった。（Ｆ）野生型Ｄ３９およびその同質遺伝子線毛アイレット挿入誘導体Ｄ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）または不活化ｒｌｒＡ遺伝子を有するＤ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）Δ（ｒｌｒＡ）での混合感染後の定着および肺炎におけるＣＩ。１を超えるＣＩは、Ｄ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）中のｒｌｒＡアイレットの存在による病原性の増幅を示す。
【図５Ｄ】図５。（Ａ〜Ｅ）線毛化（ｐｉｌｉａｔｅｄ）Ｔ４およびその同質遺伝子非線毛化欠失変異体Ｔ４Δ（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）でのＣ５７ＢＬ／６マウスの鼻腔内攻撃誘発。（ＡおよびＢ）５×１０６ｃｆｕ（高用量、Ａ）または５×１０５ｃｆｕ（中用量、Ｂ）での接種後のマウスの生存率。カプラン・マイヤー対数順位検定の使用によって生存率を分析した。（Ｃ〜Ｅ）ｉｎ  ｖｉｖｏ競合感染実験。Ｔ４およびその同質遺伝子変異体Ｔ４Δ（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）を、鼻腔内感染前に１：１の比率で混合した。競合指数（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｉｎｄｅｘ）（ＣＩ）を下記のように計算し、各サークルは各競合実験組における各マウスについてのＣＩを示す。１未満のＣＩは、野生型株と比較した場合に変異体が競合的に不利であることを示す。１０−４未満のＣＩ値を１０−４に設定した。全マウスが定着した。（Ｃ）高用量攻撃誘発後の定着、肺炎、および菌血症のＣＩ（ｎ＝２０）。２０匹のマウスのうち、１４匹のみが肺炎（肺から回収された細菌として定義）を示し、１４匹が菌血症を示した。（Ｄ）中用量での攻撃誘発後の定着におけるＣＩ（ｎ＝１０）。１０匹のうち、たった５匹が肺炎を示し、１匹が菌血症を示した。（Ｅ）低用量での攻撃誘発後の定着におけるＣＩ（ｎ＝１０）。１０匹のうち、たった４匹が肺炎を示し、菌血症を発症しなかった。（Ｆ）野生型Ｄ３９およびその同質遺伝子線毛アイレット挿入誘導体Ｄ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）または不活化ｒｌｒＡ遺伝子を有するＤ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）Δ（ｒｌｒＡ）での混合感染後の定着および肺炎におけるＣＩ。１を超えるＣＩは、Ｄ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）中のｒｌｒＡアイレットの存在による病原性の増幅を示す。
【図５Ｅ】図５。（Ａ〜Ｅ）線毛化（ｐｉｌｉａｔｅｄ）Ｔ４およびその同質遺伝子非線毛化欠失変異体Ｔ４Δ（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）でのＣ５７ＢＬ／６マウスの鼻腔内攻撃誘発。（ＡおよびＢ）５×１０６ｃｆｕ（高用量、Ａ）または５×１０５ｃｆｕ（中用量、Ｂ）での接種後のマウスの生存率。カプラン・マイヤー対数順位検定の使用によって生存率を分析した。（Ｃ〜Ｅ）ｉｎ  ｖｉｖｏ競合感染実験。Ｔ４およびその同質遺伝子変異体Ｔ４Δ（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）を、鼻腔内感染前に１：１の比率で混合した。競合指数（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｉｎｄｅｘ）（ＣＩ）を下記のように計算し、各サークルは各競合実験組における各マウスについてのＣＩを示す。１未満のＣＩは、野生型株と比較した場合に変異体が競合的に不利であることを示す。１０−４未満のＣＩ値を１０−４に設定した。全マウスが定着した。（Ｃ）高用量攻撃誘発後の定着、肺炎、および菌血症のＣＩ（ｎ＝２０）。２０匹のマウスのうち、１４匹のみが肺炎（肺から回収された細菌として定義）を示し、１４匹が菌血症を示した。（Ｄ）中用量での攻撃誘発後の定着におけるＣＩ（ｎ＝１０）。１０匹のうち、たった５匹が肺炎を示し、１匹が菌血症を示した。（Ｅ）低用量での攻撃誘発後の定着におけるＣＩ（ｎ＝１０）。１０匹のうち、たった４匹が肺炎を示し、菌血症を発症しなかった。（Ｆ）野生型Ｄ３９およびその同質遺伝子線毛アイレット挿入誘導体Ｄ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）または不活化ｒｌｒＡ遺伝子を有するＤ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）Δ（ｒｌｒＡ）での混合感染後の定着および肺炎におけるＣＩ。１を超えるＣＩは、Ｄ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）中のｒｌｒＡアイレットの存在による病原性の増幅を示す。
【図５Ｆ】図５。（Ａ〜Ｅ）線毛化（ｐｉｌｉａｔｅｄ）Ｔ４およびその同質遺伝子非線毛化欠失変異体Ｔ４Δ（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）でのＣ５７ＢＬ／６マウスの鼻腔内攻撃誘発。（ＡおよびＢ）５×１０６ｃｆｕ（高用量、Ａ）または５×１０５ｃｆｕ（中用量、Ｂ）での接種後のマウスの生存率。カプラン・マイヤー対数順位検定の使用によって生存率を分析した。（Ｃ〜Ｅ）ｉｎ  ｖｉｖｏ競合感染実験。Ｔ４およびその同質遺伝子変異体Ｔ４Δ（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）を、鼻腔内感染前に１：１の比率で混合した。競合指数（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｉｎｄｅｘ）（ＣＩ）を下記のように計算し、各サークルは各競合実験組における各マウスについてのＣＩを示す。１未満のＣＩは、野生型株と比較した場合に変異体が競合的に不利であることを示す。１０−４未満のＣＩ値を１０−４に設定した。全マウスが定着した。（Ｃ）高用量攻撃誘発後の定着、肺炎、および菌血症のＣＩ（ｎ＝２０）。２０匹のマウスのうち、１４匹のみが肺炎（肺から回収された細菌として定義）を示し、１４匹が菌血症を示した。（Ｄ）中用量での攻撃誘発後の定着におけるＣＩ（ｎ＝１０）。１０匹のうち、たった５匹が肺炎を示し、１匹が菌血症を示した。（Ｅ）低用量での攻撃誘発後の定着におけるＣＩ（ｎ＝１０）。１０匹のうち、たった４匹が肺炎を示し、菌血症を発症しなかった。（Ｆ）野生型Ｄ３９およびその同質遺伝子線毛アイレット挿入誘導体Ｄ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）または不活化ｒｌｒＡ遺伝子を有するＤ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）Δ（ｒｌｒＡ）での混合感染後の定着および肺炎におけるＣＩ。１を超えるＣＩは、Ｄ３９∇（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）中のｒｌｒＡアイレットの存在による病原性の増幅を示す。
【図６】図６。全身宿主炎症応答におけるｒｌｒＡ線毛アイレットの役割。マウスを、高攻撃誘発用量（５×１０６〜２×１０７ｃｆｕ）のＴ４、ＳＴ１６２１９Ｆ、その同質遺伝子変異体Ｔ４Δ（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）、およびＳＴ１６２１９ＦΔ（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）で攻撃誘発し、感染６時間後に屠殺した。（Ａ）高用量ｉ．ｐ．攻撃誘発後の血中の細菌増殖。各マウス由来の結果を示す。横線は中央値を示し、マン・ホイットニーＵ検定による分析では、有意差は認められない（Ｐ＞０．０５）。（Ｂ）血清ＴＮＦ応答。データを、平均およびＳＥＭとして示す。マン・ホイットニーＵ検定によって有意差が得られた（＊＊、Ｐ＜０．０００１；＊、Ｐ＜０．００１）。（ＣおよびＤ）Ｔ４およびＴ４Δ（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）（Ｃ）またはＳＴ１６２１９ＦおよびＳＴ１６２１９ＦΔ（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）（Ｄ）での接種後の細菌レベルに相関した各マウスのＴＮＦ応答。
【図７】図７。図６に示すｉ．ｐ．攻撃誘発についてのＩＬ−６応答の分析。血中での細菌成長を図６Ａに示す。（Ａ）感染６時間後の血清ＩＬ−６応答。データを、平均およびＳＥＭとして示す（マン・ホイットニーＵ検定；＊、Ｐ＜０．０００１）。（Ｂ）Ｔ４およびＴ４Δ（ｒｒｇＡ−ｓｒｔＤ）接種後の細菌レベルに相関した各マウスについてのＩＬ−６応答。
【図８】図８は、肺炎球菌Ｔ４線毛の構造タンパク質ＲｒｇＡ、ＲｒｇＢ、およびＲｒｇＣの分析である。８Ａは、グラム陽性線毛タンパク質中に見出された推定モチーフの略図である。８Ｂは、肺炎球菌（Ｔ４）中の予想される線毛およびＥボックスモチーフ（存在する場合）の配列を示す。基準としてコリネバクテリウム属の線毛およびＥボックスモチーフを示す（Ｔｏｎ−Ｔｈａｔら，２００４，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５３：２５１−２６１；Ｔｏｎ−Ｔｈａｔ  ａｎｄ  Ｓｃｈｎｅｅｗｉｎｄ，２００４，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１２：２２８−３４；Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｚaｈｎｅｒ；２００６，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６２：３２０−３３０）。８Ｃは、肺炎球菌Ｔ４のＲｒｇＡ、ＲｒｇＢ、およびＲｒｇＣで見出されたモチーフのまとめである。８Ａおよび８Ｃ、Ｓ：Ｎ末端シグナルペプチド、Ｐ：線毛モチーフ、Ｅ：Ｅボックス、Ｃ：細胞壁選別シグナルモチーフ、Ｍ：疎水性ストレッチ（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｓｔｒｅｔｃｈ）および荷電テール。
【図９Ａ】図９Ａは、精製されたＲｒｇＡおよびＲｒｇＢタンパク質の自己会合を示す、クーマシーブルーで染色したポリアクリルアミドゲルを示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、精製されたＲｒｇＡおよびＲｒｇＢタンパク質の自己会合を示す、免疫ブロットを示す。
【図９Ｃ】図９Ｃは、精製されたＲｒｇＡ、ＲｒｇＢ、およびＲｒｇＣタンパク質のサイズ排除クロマトグラフィの一連の軌跡を示す。ＲｒｇＡおよびＲｒｇＢについてより高い分子量の複合体が認められた。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ショ糖密度勾配による高分子量で未変性の肺炎球菌Ｔ４線毛の精製を示す線グラフを示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、サイズ排除クロマトグラフィによる高分子量で未変性の肺炎球菌Ｔ４線毛の精製を示す軌跡を示す。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、高分子量で未変性の肺炎球菌Ｔ４線毛の精製結果を示すポリアクリルアミドゲルを示す。左側のゲルは、銀染色の結果を示す。右側のゲルは、ＲｒｇＢに特異的に結合する抗体での免疫ブロットを示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ＲｒｇＢの推定アミノ酸配列と比較した線毛タンパク質のＮ末端アミノ酸配列（下線）を決定するためのエドマン分析の結果を示す。線毛タンパク質のＮ末端は、推定シグナルペプチド切断部位（／）に対応する。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、精製された高分子量線毛のトリプシン消化の質量分析の結果を示す。高分子量の線毛（ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから単離）のトリプシンペプチド配列（斜体）は、推定ＲｒｇＢアミノ酸配列（太字）と適合する。
【図１２Ａ】図１２は、ＨＭＷ線毛（５０μｌ／マウス）に対する抗血清で免疫化し（ＩＰ）、２６０ＣＦＵのＴ４／マウスで攻撃誘発した（ＩＰ）ＢＡＬＢ／ｃマウスの菌血症および死亡率を示す。Ｔ４Δ線毛調製物は、ネガティブコントロールとしての機能を果たした。Ａ．攻撃誘発から２４時間後の菌血症。円＝単一動物の血液１ｍｌあたりのＣＦＵ値；横棒＝各群の相乗平均；点線＝検出限界（すなわち、点線未満で血液サンプル中にＣＦＵは検出されなかった）。Ｂ．死亡率の経過。菱形＝単一の動物の生存日数、横棒＝各群の生存日数の中央値、；破線＝観察終点（すなわち、終点で生存している破線を超えた動物）。ｃｔｒｌ＝対応するアジュバント＋生理食塩水のみを投与したマウス；抗線毛＝精製ＨＭＷ線毛に対する抗血清；抗Δ線毛＝精製コントロール（Ｔ４Δ線毛）に対する抗血清；＊＝Ｐ＜０．０５および＊＊＝Ｐ＜０．０１（対応するコントロール群との比較）。
【図１２Ｂ】図１２は、ＨＭＷ線毛（５０μｌ／マウス）に対する抗血清で免疫化し（ＩＰ）、２６０ＣＦＵのＴ４／マウスで攻撃誘発した（ＩＰ）ＢＡＬＢ／ｃマウスの菌血症および死亡率を示す。Ｔ４Δ線毛調製物は、ネガティブコントロールとしての機能を果たした。Ａ．攻撃誘発から２４時間後の菌血症。円＝単一動物の血液１ｍｌあたりのＣＦＵ値；横棒＝各群の相乗平均；点線＝検出限界（すなわち、点線未満で血液サンプル中にＣＦＵは検出されなかった）。Ｂ．死亡率の経過。菱形＝単一の動物の生存日数、横棒＝各群の生存日数の中央値、；破線＝観察終点（すなわち、終点で生存している破線を超えた動物）。ｃｔｒｌ＝対応するアジュバント＋生理食塩水のみを投与したマウス；抗線毛＝精製ＨＭＷ線毛に対する抗血清；抗Δ線毛＝精製コントロール（Ｔ４Δ線毛）に対する抗血清；＊＝Ｐ＜０．０５および＊＊＝Ｐ＜０．０１（対応するコントロール群との比較）。
【図１３−１】図１３は、ＢＳＡおよび細胞外基質タンパク質であるムチンＩ、ヒアルロン酸、ビトロネクチン、コンドロイチン硫酸、ラクトフェリン、コラーゲンＩおよびＩＶ、ラミニン、フィブロネクチン、およびフィブリノゲンへの精製組換えタンパク質（ＢＳＡ、ＲｒｇＡ、ＲｒｇＢ、ＲｒｇＣ）および未変性線毛の結合結果を示す一連のグラフを示す。ＢＳＡをネガティブコントロールとして使用した。結合を、ＥＬＩＳＡによって４０５ｎｍの吸光度で定量した。
【図１３−２】図１３は、ＢＳＡおよび細胞外基質タンパク質であるムチンＩ、ヒアルロン酸、ビトロネクチン、コンドロイチン硫酸、ラクトフェリン、コラーゲンＩおよびＩＶ、ラミニン、フィブロネクチン、およびフィブリノゲンへの精製組換えタンパク質（ＢＳＡ、ＲｒｇＡ、ＲｒｇＢ、ＲｒｇＣ）および未変性線毛の結合結果を示す一連のグラフを示す。ＢＳＡをネガティブコントロールとして使用した。結合を、ＥＬＩＳＡによって４０５ｎｍの吸光度で定量した。
【図１４】図１４は、精製された線毛およびΔ線毛コントロール調製物にてｉｎ  ｖｉｔｒｏで攻撃誘発された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）および単球による炎症性サイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ４０、およびＩＬ−６の誘導を示す一連の棒グラフを示す。
【図１５】図１５は、ＲｒｇＢに特異的な抗体で標識されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細菌免疫金の電子顕微鏡写真を示す。
【図１６】図１６は、ＲｒｇＡ（１５ｎｍ金粒子に結合体化）、ＲｒｇＢ（５ｎｍ金粒子に融合）、およびＲｒｇＣ（１０ｎｍ金粒子に融合）に特異的な抗体で標識した精製線毛免疫金調製物の電子顕微鏡写真を示す。ＲｒｇＢは、線毛の主成分である。ＲｒｇＡおよびＲｒｇＣは、線毛の長さに沿って見出され、ＲｒｇＡはしばしばクラスター中に見出される。
【図１７】図１７は、リンタングステン酸（ＰＴＡ）でネガティブ染色し、５０００倍で観察した精製線毛の電子顕微鏡写真を示す。
【図１８】図１８は、平均線毛直径を決定するための線毛構造分析の概略図である。
【図１９】図１９は、線毛体積を決定するための線毛構造分析の概略図である。
【図２０】図２０は、線毛電子顕微鏡写真の平均化およびフィルタリングによる線毛の改良された二次元描写の作製方法の概略図である。
【図２１】図２１は、３つのプロトフィラメントで構成されるらせん構造を示す線毛の回転二次元図の概略図である。
【図２２】図２２は、２つの位置での線毛構造にわたる密度プロフィールの決定の概略図である。
【図２３】図２３は、線毛構造モデルを示す。線毛は、少なくとも３つの「プロトフィラメント」によって作製されており、これらがコイルドコイル構造に配置され、平均直径が１０．５〜１１．０ｎｍであり、ピッチが１３．２ｎｍである。節での線毛の直径は６．８ｎｍであり、１つ１つの「プロトフィラメント」の直径は３．５ｎｍである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年11月5日(2008.11.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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