(57)【要約】  除草剤耐性ヒマワリ植物、除草剤耐性及び野生型アセトヒドロキシ酸シンターゼ大サブユニット（ＡＨＡＳＬ）ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、及びこれらのポリペプチドのアミノ酸配列についで述べる。本発明のポリヌクレオチドを含む発現カセットと形質転換ベクター、さらにこれらのポリヌクレオチドで形質転換した植物や宿主細胞について述べる。これらのポリヌクレオチドを用いて除草剤に対する植物の耐性を増強する方法や除草剤耐性植物の近くの雑草を防除する方法についても述べる。【選択図】なし
2009504137.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノム中に少なくとも一種のアセトヒドロキシ酸シンターゼ大サブユニット（ＡＨＡＳＬ）ポリヌクレオチドを少なくとも一コピー有するヒマワリ植物であって、前記ＡＨＡＳＬポリヌクレオチドが、位置１０７又はそれに相当する位置にトレオニンを有する除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質をコードし、前記植物の少なくとも一種の除草剤に対する耐性が、野生型ヒマワリ植物と比較して増加していることを特徴とするヒマワリ植物。
【請求項２】
前記植物の、イミダゾリノン除草剤、スルホニル尿素除草剤、トリアゾロピリミジン除草剤、ピリミジニルオキシベンゾエート除草剤、及びスルホニルアミノ−カルボニルトリアゾリノン除草剤からなる群から選択される少なくとも一種の除草剤に対する耐性が増加している請求項１に記載のヒマワリ植物。
【請求項３】
前記ＡＨＡＳＬポリヌクレオチドが、ＡＨＡＳＬ１ポリヌクレオチド、ＡＨＡＳＬ２ポリヌクレオチド、及びＡＨＡＳＬ３ポリヌクレオチドからなる群から選択される請求項１又は２に記載のヒマワリ植物。
【請求項４】
前記除草剤耐性のＡＨＡＳＬタンパク質が除草剤耐性ＡＨＡＳＬ１タンパク質である
請求項１〜３のいずれか１項に記載のヒマワリ植物。
【請求項５】
前記除草剤耐性ＡＨＡＳＬ１タンパク質が配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む
請求項４に記載のヒマワリ植物。
【請求項６】
前記除草剤耐性のＡＨＡＳＬポリヌクレオチドが配列番号１で表される核酸配列を含む請求項１〜５のいずれか１項に記載のヒマワリ植物。
【請求項７】
前記除草剤耐性のＡＨＡＳＬタンパク質が、更に、
（ａ）アミノ酸位置１８２又はそれに相当する位置に、アラニン、トレオニン、ヒスチジン、ロイシン、アルギニン、イソロイシン、グルタミン、又はセリン；
（ｂ）アミノ酸位置１８８又はそれに相当する位置にイソロイシン；  
（ｃ）アミノ酸位置１９０又はそれに相当する位置に、アスパラギン酸又はバリン；
（ｄ）アミノ酸位置５５９又はそれに相当する位置にロイシン；及び
（ｅ）アミノ酸位置６３８又はそれに相当する位置にアスパラギン、トレオニン、フェニルアラニン、又はバリン；  
からなる群から選択される少なくとも一種のアミノ酸を含む請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒマワリ植物。
【請求項８】
前記植物が遺伝子組換え体である請求項１〜７のいずれか１項に記載のヒマワリ植物。
【請求項９】
前記植物が非遺伝子組換え体である請求項１〜７のいずれか１項に記載のヒマワリ植物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のヒマワリ植物の種子であって、前記種子が、ゲノム中に前記ＡＨＡＳＬポリヌクレオチドを少なくとも一コピー含むことと特徴とする種子。
【請求項１１】
Ｓ４８９７、ＧＭ４０、ＧＭ１６０６、ＡＴＧＣ特許寄託番号ＰＴＡ−６７１６のヒマワリ植物、又はＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−７６０６のヒマワリ植物の除草剤耐性を含むことを特徴とするヒマワリ植物。
【請求項１２】
前記植物が、
（ａ）Ｓ４８９７、ＧＭ４０、ＧＭ１６０６、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−６７１６のヒマワリ植物、又はＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−７６０６のヒマワリ植物；  
（ｂ）Ｓ４８９７、ＧＭ４０、ＧＭ１６０６、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−６７１６のヒマワリ植物、又はＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−７６０６のヒマワリ植物の子孫；  
（ｃ）Ｓ４８９７、ＧＭ４０、ＧＭ１６０６、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−６７１６の植物、又はＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−７６０６の植物の変異体、組換え体、又は遺伝子組換え誘導体；あるいはＳ４８９７、ＧＭ４０、ＧＭ１６０６、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−６７１６の植物、またはＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−７６０６の植物の子孫；あるいは
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）の植物の少なくとも一種の子孫の植物、
である請求項１１に記載のヒマワリ植物。
【請求項１３】
前記植物が遺伝子組換え体である請求項１１又は１２に記載のヒマワリ植物。
【請求項１４】
前記植物が非遺伝子組換え体である請求項１１又は１２に記載のヒマワリ植物。
【請求項１５】
請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のヒマワリ植物の種子であって、前記種子が、Ｓ４８９７、ＧＭ４０、ＧＭ１６０６、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−６７１６のヒマワリ植物、又はＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−７６０６のヒマワリ植物の除草剤耐性を有することを特徴とする種子。
【請求項１６】
有効量のイミダゾリノン除草剤、スルホニル尿素除草剤、トリアゾロピリミジン除草剤、ピリミジニルオキシベンゾエート除草剤、スルホニルアミノ−カルボニルトリアゾリノン除草剤、あるいはこれらの混合物を、雑草及びヒマワリ植物に施用することによりヒマワリ植物の近くの雑草を防除する方法であって、前記ヒマワリ植物が、
（ａ）ゲノム中に、少なくとも一種の除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質をコードし、位置１０７又はそれに相当する位置にトレオニンを有するＡＨＡＳＬポリヌクレオチドを少なくとも一コピー有し、
その結果、前記植物が、少なくとも一種の除草剤に対する耐性が、野生型ヒマワリ植物と比較して増加しているヒマワリ植物；
（ｂ）Ｓ４８９７、ＧＭ４０、ＧＭ１６０６、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−６７１６の植物、又はＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−７６０６の植物の除草剤耐性を有するヒマワリ植物；
（ｃ）Ｓ４８９７、ＧＭ４０、ＧＭ１６０６、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−６７１６の植物、又はＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−７６０６の植物；  
（ｄ）Ｓ４８９７、ＧＭ４０、ＧＭ１６０６、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−６７１６の植物、又はＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−７６０６の植物の子孫のヒマワリ植物であって、Ｓ４８９７、ＧＭ４０、ＧＭ１６０６、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−６７１６の植物、又はＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−７６０６の植物の除草剤耐性を有する前記ヒマワリ植物；
（ｅ）Ｓ４８９７、ＧＭ４０、ＧＭ１６０６、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−６７１６の植物、又はＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−７６０６の植物、又はＳ４８９７、ＧＭ４０、ＧＭ１６０６、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−６７１６の植物、又はＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−７６０６の植物のいずれかの子孫の変異体、組換え体、又は遺伝子組換え誘導体であるヒマワリ植物であって、Ｓ４８９７、ＧＭ４０、ＧＭ１６０６、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−６７１６の植物、又はＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−７６０６の植物の除草剤耐性を有する前記ヒマワリ植物；及び
（ｆ）（ｂ）〜（ｆ）のヒマワリ植物の少なくとも一種の子孫のヒマワリ植物であって、Ｓ４８９７、ＧＭ４０、ＧＭ１６０６、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−６７１６の植物、又はＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−７６０６の植物の除草剤耐性を有している前記ヒマワリ植物；
からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項１７】
前記イミダゾリノン除草剤が、［２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−］イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル）−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−３−キノリンカルボン酸、［５−エチル−２−（４−イソプロピル−４−メチル−］５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−メチルニコチン酸、メチル６−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｍ−トルエートとメチル［２−（４−］イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｐ−トルエートとの混合物、およびこれらの混合物からなる群から選択される請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記スルホニル尿素除草剤が、クロルスルフロン、メトスルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチル、チフェンスルフロンメチル、トリベヌロンメチル、ベンスルフロンメチル、ニコスルフロン、エタメトスルフロンメチル、リムスルフロン、トリフルスルフロンメチル、トリアスルフロン、プリミスルフロンメチル、シノスルフロン、アミドスルフロン、フルザスルフロン、イマゾスルフロン、ピラゾスルフロンエチル、ハロスルフロン、およびこれらの混合物からなる群から選択される請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）配列番号１又は３で表される核酸配列；
（ｂ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列：
（ｃ）配列番号１で表される核酸配列に少なくとも７５％の配列同一性を持つ核酸配列（ただし、前記核酸配列は、位置１０７あるいは相当する位置にトレオニンを有すタンパク質をコードし、前記タンパク質は除草剤耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）活性を有している）；  
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に少なくとも７５％の配列同一性を持つタンパク質をコードする核酸配列（ただし、前記タンパク質は位置１０７又はそれに相当する位置にトレオニンを有し、除草剤耐性のＡＨＡＳ活性を有している）；及び
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）で表される核酸配列からなる群から選択される少なくとも一種の核酸配列に完全に相補的な核酸配列、
からなる群から選択される核酸配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチド分子単離物。
【請求項２０】
核酸配列（ｃ）又は（ｄ）でコードされた前記タンパク質が、更に、
（ａ）アミノ酸位置１８２又はそれに相当する位置に、アラニン、トレオニン、ヒスチジン、ロイシン、アルギニン、イソロイシン、グルタミン、又はセリン；  
（ｂ）アミノ酸位置１８８又はそれに相当する位置にイソロイシン；
（ｃ）アミノ酸位置１９０又はそれに相当する位置に、アスパラギン酸又はバリン；
（ｄ）アミノ酸位置５５９又はそれに相当する位置にロイシン；及び
（ｅ）アミノ酸位置６３８又はそれに相当する位置にアスパラギン、トレオニン、フェニルアラニン、又はバリン；
からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸を含む請求項１９に記載のポリヌクレオチド分子単離物。
【請求項２１】
請求項１９又は２０に記載のポリヌクレオチド分子の作動可能な状態で連結しているプロモーターを含むことを特徴とする発現カセット。
【請求項２２】
前記プロモーターが、細菌、真菌細胞、動物細胞、又は植物細胞において遺伝子発現を引き起こすことが可能である請求項２１記載の発現カセット。
【請求項２３】
請求項２１又は２２に記載の発現カセットにより形質転換されたことと特徴とする非ヒト宿主細胞。
【請求項２４】
前記宿主細胞が、細菌、真菌細胞、動物細胞、及び植物細胞からなる群から選択される請求項２３に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
目的遺伝子と選択マーカー遺伝子を含む形質転換ベクターであって、前記選択マーカー遺伝子がある核酸配列に作動可能な状態で連結しているプロモーターを含み、前記プロモーターがある宿主細胞で発現を実施させ、前記核酸配列が、
（ａ）配列番号１で表される核酸配列；  
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列；
（ｃ）配列番号１で表される核酸配列に少なくとも７５％の配列同一性を持つ核酸配列（ただし、前記核酸配列は、位置１０７あるいは相当する位置にトレオニンを有すタンパク質をコードし、前記タンパク質は除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を有している）；及び  
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に少なくとも７５％の配列同一性を持つタンパク質をコードする核酸配列（ただし、前記タンパク質は位置１０７又はそれに相当する位置にトレオニンを有し、除草剤耐性のＡＨＡＳ活性を有している）；
からなる群から選択されることを特徴とする形質転換ベクター。
【請求項２６】
前記プロモーターが、植物細胞中で発現可能である請求項２５に記載の形質転換ベクター。
【請求項２７】
前記プロモーターが構成的なプロモーターである請求項２５又は２６に記載の形質転換ベクター。
【請求項２８】
前記選択マーカー遺伝子が、更に作動可能な状態で連結している葉緑体ターゲティング配列を含んでいる請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の形質転換ベクター。  
【請求項２９】
前記プロモーターが、細菌又は酵母で発現可能である請求項２５に記載の形質転換ベクター。
【請求項３０】
請求項２５〜２９のいずれか１項に記載の形質転換ベクターを含むことを特徴とする非ヒト宿主細胞。
【請求項３１】
植物細胞内で発現を引き起こすプロモーターに作動可能な状態で連結しているある核酸配列を含むポリヌクレオチドコンストラクトを、ゲノム中に安定にとり込んだ形質転換植物であって、
前記核酸配列が
（ａ）配列番号１又は３で表される核酸配列；
（ｂ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列：
（ｃ）配列番号１で表される核酸配列に少なくとも７５％の配列同一性を持つ核酸配列（ただし、前記核酸配列は、位置１０７あるいは相当する位置にトレオニンを有すタンパク質をコードし、前記タンパク質は除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を有している）；  
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に少なくとも７５％の配列同一性を持つタンパク質をコードする核酸配列（ただし、前記タンパク質は位置１０７又はそれに相当する位置にトレオニンを有し、除草剤耐性のＡＨＡＳ活性を有している）；及び
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）で表される核酸配列からなる群から選択される少なくとも一種の核酸配列に完全に相補的な核酸配列、
からなる群から選択されることを特徴とする形質転換植物。
【請求項３２】
前記プロモーターが、構成的なプロモーターと組織選択性プロモーターからなる群から選択される請求項３１に記載の形質転換植物。
【請求項３３】
前記ポリヌクレオチドコンストラクトが、更に作動可能な状態で連結している葉緑体ターゲティング配列を有する請求項３１又は３２に記載の形質転換植物。
【請求項３４】
前記形質転換植物のＡＨＡＳ活性が形質転換されなかった植物と較べて増加している請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の形質転換植物。
【請求項３５】
前記形質転換植物の少なくとも一種の除草剤に対する耐性が、形質転換されなかった植物と較べて増加している請求項３１〜３４のいずれか１項に記載の形質転換植物。
【請求項３６】
前記除草剤がイミダゾリノン除草剤である請求項３１〜３５のいずれか１項に記載の形質転換植物。
【請求項３７】
前記イミダゾリノン除草剤が［２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−］イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル）−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−３−キノリンカルボン酸、［５−エチル−２−（４−イソプロピル−４−メチル−］５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−メチルニコチン酸、及びメチル６−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｍ−トルエートとメチル［２−（４−］イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｐ−トルエートとの混合物からなる群から選択される請求項３６に記載の形質転換植物。
【請求項３８】
前記除草剤がスルホニル尿素除草剤である請求項３１〜３５のいずれか１項に記載の形質転換植物。
【請求項３９】
前記スルホニル尿素除草剤が、クロルスルフロン、メトスルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチル、チフェンスルフロンメチル、トリベヌロンメチル、ベンスルフロンメチル、ニコスルフロン、エタメトスルフロンメチル、リムスルフロン、トリフルスルフロンメチル、トリアスルフロン、プリミスルフロンメチル、シノスルフロン、アミドスルフロン、フルザスルフロン、イマゾスルフロン、ピラゾスルフロンエチル、ハロスルフロン、及びそれらの混合物からなる群から選択される請求項３８に記載の形質転換植物。
【請求項４０】
前記形質転換植物が双子葉植物または単子葉植物である請求項３１〜３９のいずれか１項に記載の形質転換植物。
【請求項４１】
前記双子葉植物が、ヒマワリ、ダイズ、ワタ、アブラナ科、シロイヌナズナ、タバコ、ジャガイモ、テンサイ、アルファルファ、ベニバナ、及びピーナッツからなる群から選択される請求項４０に記載の形質転換植物。
【請求項４２】
前記単子葉植物がコムギ、コメ、トウモロコシ、オオムギ、ライムギ、カラスムギ、ライコムギ、キビ、及びソルガムからなる群から選択される請求項４０に記載の形質転換植物。
【請求項４３】
請求項３１〜４２のいずれか１項に記載の形質転換植物の形質転換種子であって、
前記種子が前記ポリヌクレオチドコンストラクトを含むことを特徴とする種子。
【請求項４４】
植物細胞内で発現を引き起こすプロモーターに作動可能な状態で連結しているある核酸配列を含むポリヌクレオチドコンストラクトを、ゲノム中に安定にとり込んだ形質転換植物細胞であって、前記核酸配列が、
（ａ）配列番号１又は３で表される核酸配列；  
（ｂ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列：
（ｃ）配列番号１で表される核酸配列に少なくとも７５％の配列同一性を持つ核酸配列（ただし、前記核酸配列は、位置１０７あるいは相当する位置にトレオニンを有すタンパク質をコードし、前記タンパク質は除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を有している）；  
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に少なくとも７５％の配列同一性を持つタンパク質をコードする核酸配列（ただし、前記タンパク質は位置１０７又はそれに相当する位置にトレオニンを有し、除草剤耐性のＡＨＡＳ活性を有している）；及び
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）で表される核酸配列からなる群から選択される少なくとも一種の核酸配列に完全に相補的な核酸配列、
からなる群から選択されることを特徴とする形質転換植物細胞。
【請求項４５】
植物細胞を植物細胞内で発現を引き起こすプロモーターに作動可能な状態で連結しているある核酸配列を含むポリヌクレオチドコンストラクトで形質転換し、前記形質転換植物細胞から形質転換植物を再生することで植物のＡＨＡＳ活性を増加させる方法であって、前記核酸配列が
（ａ）配列番号１又は３で表される核酸配列；
（ｂ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列：
（ｃ）配列番号１で表される核酸配列に少なくとも７５％の配列同一性を持つ核酸配列（ただし、前記核酸配列は、位置１０７あるいは相当する位置にトレオニンを有すタンパク質をコードし、前記タンパク質は除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を有している）；及び  
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に少なくとも７５％の配列同一性を持つタンパク質をコードする核酸配列（ただし、前記タンパク質は位置１０７又はそれに相当する位置にトレオニンを有し、除草剤耐性のＡＨＡＳ活性を有している）；
からなる群から選択され、
ＡＨＡＳ活性が、前記植物中あるいは少なくともその一部で、形質転換されなかった植物と較べて増加していることを特徴とする方法。
【請求項４６】
植物細胞を植物細胞内で発現を引き起こすプロモーターに作動可能な状態で連結しているある核酸配列を含むポリヌクレオチドコンストラクトで形質転換し、前記形質転換植物細胞から形質転換植物を再生することで除草剤耐性植物を産生する方法であって、前記核酸配列が、
（ａ）配列番号１で表される核酸配列；  
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列；
（ｃ）配列番号１で表される核酸配列に少なくとも７５％の配列同一性を持つ核酸配列（ただし、前記核酸配列は、位置１０７あるいは相当する位置にトレオニンを有すタンパク質をコードし、前記タンパク質は除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を有している）；及び  
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に少なくとも７５％の配列同一性を持つタンパク質をコードする核酸配列（ただし、前記タンパク質は位置１０７又はそれに相当する位置にトレオニンを有し、除草剤耐性のＡＨＡＳ活性を有している）；
からなる群から選択され、
前記形質転換植物の少なくとも一種の除草剤に対する耐性が、形質転換されなかった植物の前記除草剤への耐性と比較して増加していることを特徴とする方法。
【請求項４７】
前記プロモーターが、構成的なプロモーターと組織選択性プロモーターからなる群から選択される請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ポリヌクレオチドコンストラクトが、更に作動可能な状態で連結している葉緑体ターゲティング配列を有する請求項４６又は４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記形質転換植物のＡＨＡＳ活性が形質転換されなかった植物と較べて増加している
請求項４６〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記除草剤がイミダゾリノン除草剤である請求項４６〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記イミダゾリノン除草剤が、［２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−］イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４イソプロピル）−４−メチルー５オキソ−２−イミダゾリン−２イル）−３−キノリンカルボン酸、［５−エチル−２−（４−イソプロピル−４−メチル−］５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−メチルニコチン酸、及びメチル６−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｍ−トルエートとメチル［２−（４−］イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｐ−トルエートとの混合物からなる群から選択される請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記除草剤がスルホニル尿素除草剤である請求項４６〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記スルホニル尿素除草剤が、クロルスルフロン、メトスルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチル、チフェンスルフロンメチル、トリベヌロンメチル、ベンスルフロンメチル、ニコスルフロン、エタメトスルフロンメチル、リムスルフロン、トリフルスルフロンメチル、トリアスルフロン、プリミスルフロンメチル、シノスルフロン、アミドスルフロン、フルザスルフロン、イマゾスルフロン、ピラゾスルフロンエチル、ハロスルフロン、およびこれらの混合物からなる群から選択される請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記形質転換植物が双子葉植物または単子葉植物である請求項４６〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記双子葉植物が、ヒマワリ、ダイズ、ワタ、アブラナ科、シロイヌナズナ、タバコ、ジャガイモ、テンサイ、アルファルファ、ベニバナ、及びピーナッツからなる群から選択される請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記単子葉植物が、コムギ、コメ、トウモロコシ、オオムギ、ライムギ、カラスムギ、ライコムギ、キビ、及びソルガムからなる群から選択される請求項４６〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記植物細胞が、前記形質転換段階の前に、少なくとも一種の除草剤に対する耐性を有している請求項４６〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
植物細胞内で発現を引き起こすプロモーターに作動可能な状態で連結しているある核酸配列を含むポリヌクレオチドコンストラクトで形質転換する工程と、前記形質転換植物細胞から形質転換植物を再生する工程とからなる、除草剤耐性植物中の除草剤耐性を増強する方法であって、前記核酸配列が
（ａ）配列番号１で表される核酸配列；  
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列；
（ｃ）配列番号１で表される核酸配列に少なくとも７５％の配列同一性を持つ核酸配列（ただし、前記核酸配列は、位置１０７あるいは相当する位置にトレオニンを有すタンパク質をコードし、前記タンパク質は除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を有している）；及び  
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に少なくとも７５％の配列同一性を持つタンパク質をコードする核酸配列（ただし、前記タンパク質は位置１０７又はそれに相当する位置にトレオニンを有し、除草剤耐性のＡＨＡＳ活性を有している）；
からなる群から選択され、
前記除草剤耐性植物の除草剤耐性が、形質転換されなかった除草剤耐性植物と較べて、前記植物において増強されていることを特徴とする方法。
【請求項５９】
前記除草剤耐性植物が、前記形質転換工程の前に、除草剤耐性のＡＨＡＳＬタンパク質を含んでいる請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記除草剤耐性植物が、前記除草剤耐性のＡＨＡＳＬタンパク質を発現するように遺伝子組み換えされている請求項５８又は５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記除草剤耐性植物が前記除草剤耐性のＡＨＡＳＬタンパク質を発現するように遺伝子組み換えされている請求項５８又は５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記除草剤耐性植物が、前記形質転換段階の前に、イミダゾリノン耐性植物である請求項５８〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
植物細胞を植物形質転換ベクターで形質転換する工程、
前記形質転換植物細胞を、形質転換されなかった植物細胞の成長を阻害する濃度で少なくとも一種の除草剤に暴露する工程、及び
前記除草剤の存在下でも成長可能な前記形質転換植物細胞を特定する工程からなる
形質転換植物細胞を選択する方法であって、
前記植物形質転換ベクターが、プロモーターと作動可能な状態で連結する核酸配列とを含む選択マーカー遺伝子を含み、前記プロモーターが植物細胞中で発現を引き起こし、
前記核酸配列が、
（ａ）配列番号１で表される核酸配列；  
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列；
（ｃ）配列番号１で表される核酸配列に少なくとも７５％の配列同一性を持つ核酸配列（ただし、前記核酸配列は、位置１０７あるいは相当する位置にトレオニンを有すタンパク質をコードし、前記タンパク質は除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を有している）；及び  
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に少なくとも７５％の配列同一性を持つタンパク質をコードする核酸配列（ただし、前記タンパク質は位置１０７又はそれに相当する位置にトレオニンを有し、除草剤耐性のＡＨＡＳ活性を有している）；
からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項６４】
前記除草剤が、イミダゾリノン除草剤、スルホニル尿素除草剤、あるいはそれらの混合物である請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記植物形質転換ベクターが、更に少なくとも一種の目的遺伝子を含んでいる請求項６３又は６４に記載の方法。
【請求項６６】
更に、前記形質転換植物細胞から形質転換植物を再生する工程を含む請求項６３〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
有効量のイミダゾリノン除草剤、スルホニル尿素除草剤、トリアゾロピリミジン除草剤、ピリミジニルオキシベンゾエート除草剤、スルホニルアミノ−カルボニルトリアゾリノン除草剤、あるいはこれらの混合物を、雑草及び形質転換植物に施用することにより形質転換植物の近くの雑草を防除する方法であって、前記形質転換植物のイミダゾリノン除草剤に対する耐性が、形質転換されなかった植物と較べて強化されており、形質転換植物が、ゲノム中に、植物細胞中で遺伝子発現させるプロモーターに作動可能な状態で連結している核酸配列を含む発現カセットを少なくとも一個含んでいるおり、
前記核酸配列が、
（ａ）配列番号１で表される核酸配列；  
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列；
（ｃ）配列番号１で表される核酸配列に少なくとも７５％の配列同一性を持つ核酸配列（ただし、前記核酸配列は、位置１０７あるいは相当する位置にトレオニンを有すタンパク質をコードし、前記タンパク質は除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を有している）；及び  
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に少なくとも７５％の配列同一性を持つタンパク質をコードする核酸配列（ただし、前記タンパク質は位置１０７又はそれに相当する位置にトレオニンを有し、除草剤耐性のＡＨＡＳ活性を有している）；
からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項６８】
前記イミダゾリノン除草剤が、［２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−］イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル）−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−３−キノリンカルボン酸、［５−エチル−２−（４−イソプロピル−４−メチル−］５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−メチルニコチン酸、及びメチル６−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｍ−トルエートとメチル［２−（４−］イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｐ−トルエートとの混合物、及びこれらの混合物からなる群から選択される請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記スルホニル尿素除草剤が、クロルスルフロン、メトスルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチル、チフェンスルフロンメチル、トリベヌロンメチル、ベンスルフロンメチル、ニコスルフロン、エタメトスルフロンメチル、リムスルフロン、トリフルスルフロンメチル、トリアスルフロン、プリミスルフロンメチル、シノスルフロン、アミドスルフロン、フルザスルフロン、イマゾスルフロン、ピラゾスルフロンエチル、ハロスルフロン、及びこれらの混合物からなる群から選択される請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記植物が双子葉植物又は単子葉植物である請求項６７〜６９のいずれかに１項に記載の方法。
【請求項７１】
前記双子葉植物がヒマワリ、ダイズ、ワタ、アブラナ科、シロイヌナズナ、タバコ、ジャガイモ、テンサイ、アルファルファ、ベニバナ、及びピーナッツからなる群から選択される請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記単子葉植物がコムギ、ライコムギ、トウモロコシ、コメ、ソルガム、ライムギ、キビ、及びオオムギからなる群から選択される請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
（ａ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１又は３で表される核酸配列によりコードされたアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に少なくとも７５％の配列同一性を持つアミノ酸配列（ただし、前記ポリペプチドは、位置１０７又はそれに相当する位置にトレオニンを有し、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性をもつ）；及び
（ｄ）配列番号１で表される核酸配列に少なくとも７５％の配列同一性を持つ核酸配列によりコードされたアミノ酸配列（前記核酸配列は位置１０７又はそれに相当する位置にトレオニンを有するタンパク質をコードし、前記タンパク質は、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を有する）、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とするポリペプチド単離物。
【請求項７４】
ある除草剤に耐性がある第一の植物を、除草剤に耐性がない第二の植物と交配させることにより除草剤耐性植物を産生する方法であって、第一の植物が、請求項１〜９、１１〜１４、及び３１〜４２のいずれか１項に記載の植物であることを特徴とする方法。
【請求項７５】
更にその除草剤に耐性の子孫植物を選択する請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
請求項７４又は７５に記載の方法で産生したことを特徴とする除草剤耐性植物。
【請求項７７】
第一の植物の除草剤耐性を有していることを特徴とする請求項７６の植物の種子。
【請求項７８】
第一の植物と第二の植物を交配させて植物の除草剤耐性を増加させる方法であって、第一の植物が請求項１〜９、１１〜１４、３１〜４２、及び７６のいずれか１項の植物であることを特徴とする方法。
【請求項７９】
更に前記第二の植物の除草剤耐性と較べると増加した除草剤耐性を持つ子孫植物を選択する請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
請求項７８又は７９の方法により産生されたことを特徴とする植物。
【請求項８１】
除草剤耐性が増加していることを特徴とする請求項８０の植物の種子。
【請求項８２】
ＡＨＡＳ阻害性の除草剤で処理されたことを特徴とする請求項１〜９、１１〜１４、３１〜４２、７６及び８０のいずれか１項の植物の種子。
【請求項８３】
前記ＡＨＡＳ阻害性の除草剤が、イミダゾリノン除草剤、スルホニル尿素除草剤、トリアゾロピリミジン除草剤、ピリミジニルオキシベンゾエート除草剤、及びスルホニルアミノ−カルボニルトリアゾリノン除草剤、あるいはこれらの混合物からなる群から選択される請求項８２に記載の種子。
【請求項８４】
請求項１〜９、１１〜１４、３１〜４２、７６及び８０のいずれか１項に記載の植物の種子を、播種前及び／又は前発芽の後に、ＡＨＡＳ阻害性の除草剤に接触させることを特徴とする好ましくない植生を防止する方法。
【請求項８５】
前記ＡＨＡＳ阻害性の除草剤が、イミダゾリノン除草剤、スルホニル尿素除草剤、トリアゾロピリミジン除草剤、ピリミジニルオキシベンゾエート除草剤、及びスルホニルアミノ−カルボニルトリアゾリノン除草剤、又はこれらの混合物からなる群から選択される請求項８４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、農業のバイオテクノロジーの分野、特に除草剤耐性ヒマワリ植物及び野生型及び除草剤耐性のヒマワリアセトヒドロキシ酸シンターゼ大サブユニットタンパク質をコードする新規なポリヌクレオチド配列に関する。
【背景技術】
【０００２】
アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ；ＥＣ４．１．３．１８、アセト乳酸合成酵素ＡＬＳともよぶ）は、分枝アミノ酸のバリン、ロイシンやイソロイシンの生合成を触媒する最初の酵素である（Ｓｉｎｇｈ（１９９９）「バリン、ロイシン、イソロイシンの生合成」、Plant Amino Acid, Singh, B.K., ed., Marcel Dekker Inc. New York, New York, pp. 227-247）．ＡＨＡＳは、以下の五種の構造的に多様な除草剤の作用部位となっている。即ち、スルホニル尿素類（Tan et al. (2005) Pest Manag. Set 61:246-57; Mallory-Smith and Retzinger (2003) Weed Technology 17: 620-626; LaRossa and Falco (1984) Trends Biotechnol. 2:158-161）；イミダゾリノン類（Shaner et al (1984) Plant Physiol. 76:545-546);トリアゾロピリミジン類(Subramanian and Gerwick (1989) “Inhibition of acetolactate synthase by triazolopyrimidines,” in Biocatalysis in Agricultural Biotechnology, Whitaker, J.R. and Sonnet, P.E.. eds., ACS Symposium Series, American Chemical Society, Washington, D.C., pp. 277-288）；ピリミジニルオキシベンゾエート類（Subramanian et al. (1990) Plant Physiol. 94: 239-244）；スルホニルアミノ−カルボニルトリアゾリノン類（Tan et al. (2005) Pest Manag. Sci. 61:246-57; Mallory-Smith and Retzinger (2003) Weed Technology 17:620-626）。イミダゾリノン除草剤やスルホニル尿素除草剤は、非常に低い散布比率で有効であるため、また比較的動物に非毒性であるため、近年農業で広範に使用されている。これらの系統の除草剤は、ＡＨＡＳ活性を阻害して、多くの雑草などを含む高感受性植物の成長や分化を防げる。商業的に入手可能なイミダゾリノン除草剤の例としては、パースート（登録商標）（イマゼタピル）、セプター（登録商標）（イマザキン）やアーセナル（登録商標）（イマザピル）があげられる。スルホニル尿素除草剤の例としては、クロルスルフロン、メトスルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチル、チフェンスルフロンメチル、トリベヌロンメチル、ベンスルフロンメチル、ニコスルフロン、エタメトスルフロンメチル、リムスルフロン、トリフルスルフロンメチル、トリアスルフロン、プリミスルフロンメチル、シノスルフロン、アミドスルフロン、フルザスルフロン、イマゾスルフロン、ピラゾスルフロンエチル及びハロスルフロンがあげられる。
【０００３】
有効性が高く毒性が低いため、広範囲の植生上への散布には、イミダゾリノン除草剤が好ましく利用されている。広範な植生上に除草剤を噴霧することで、植栽や栽培にかかるコストを減少させることができ、農薬使用に先立って栽培地の準備の必要性を減らすことができる。目的の耐性種の上に噴霧すると、競合する種がなくなるため、目的種を最大収量で得ることが可能となる。しかしながら、このような広域噴霧技術が使えるかどうかは、その噴霧地域に目的の植生のイミダゾリノン耐性種があるかどうかにかかっている。
【０００４】
主な農作物の中では、ダイズなどいくつかのマメ科植物は、除草剤化合物を分解する能力が高く、自然にイミダゾリノン除草剤耐性となる（Shaner and Robinson (1985) Weed Sci. 33 :469- 471）。トウモロコシなどの他の作物（Newhouse et al. (1992) Plant Physiol. 100:882-886）やコメ（Barrett et al. (1989) Crop Safeners for Herbicides, Academic Press, New York, pp. 195-220）は、イミダゾリノン除草剤にやや高い感受性をもっている。イミダゾリノン除草剤に対するこのような感受性の差は、特定の除草剤の化学的な性質により、また各植物における毒性から非毒性に至る化合物の代謝の差に基づいている（Shaner et al (1984) Plant Physiol. 76:545-546; Brown et al, (1987) Pestic. Biochem. Physiol. 27:24-29）。吸収や移行などの他の植物生理学的な差も、感受性に重要な役割を果たしている（Shaner and Robinson (1985) Weed Sci. 33:469-471）。
【０００５】
イミダゾリノンやスルホニル尿素、トリアゾロピリミジン、ピリミジニルオキシベンゾエートに対して耐性を示す植物が、種子や小胞子、花粉、カルス突然変異を用いて、トウモロコシ、シロイヌナズナ、アブラナ、ダイズ、タバコ、サトウダイコンやイネで成功裏に開発されている（Sebastian et al. (1989) Crop Sci. 29: 1403-1408; Swanson et al, 1989 Theor. Appl. Genet. 78:525-530; Newhouse et al (1991) Theor. Appl Genet. 83:65-70; Sathasivan et al (1991) Plant Physiol. 97:1044-1050; Mourand et al. (1993) J. Heredity 84:91-96; Wright and Penner (1998) Theor. Appl Genet. 96:612-620; U.S. Patent No. 5,545,822）。いずれの場合も、単一の部分的に優性の核内遺伝子が耐性を作っている。コムギの（Triticum aestivum L. cv. Fidel）種子の突然変異により、四種のイミダゾリノン耐性コムギ植物が単離された（Newhouse et al. (1992) Plant Physiol. 100:882-886）。遺伝研究の結果、単一の部分的に優性な遺伝子が耐性を作り出していた。対立形質の検討の結果、著者らは、これらの四種の系統の突然変異が、同じ遺伝子座で起こっていると結論した。このＦｉｄｅｌ種の一つの耐性遺伝子は、ＦＳ−４とよばれる（Newhouse et al. (1992) Plant Physiol. 100:882- 886）。  
自然にできる植物集団が、イミダゾリノン及び／又はスルホニル尿素除草剤に耐性を示すこともあり、このような集団を用いて、除草剤耐性のヒマワリ品種が開発された。最近、スルホニル尿素除草剤に耐性を示す２種のヒマワリ系統が、通常のヒマワリ（Helianthus annuus）の野生集団から得られた生殖質を除草剤耐性の源として開発された（Miller and Al-Khatib (2004) Crop Sci. 44: 1037- 1038)。以前に、ホワイトらは(White et al. ((2002) Weed Sci. 50:432-437)）米国サウスダコタの通常のヒマワリ野生集団の個体中に、イミダゾリノン除草剤とスルホニル尿素除草剤の両方に耐性を持つものがあることを報告している。この集団の個体のアセトヒドロキシ酸シンターゼ大サブユニット（ＡＨＡＳＬ）遺伝子のコード領域の一部の分析の結果、ヒマワリＡＨＡＳＬタンパク質中でＡｌａからＶａｌへのアミノ酸置換の点変異が起こっており、これは野生型シロイヌナズナＡＨＡＳＬタンパク質のＡｌａ205に相当することがわかった（White et al. (2003) Weed Sci. 51:845-853）。以前に、アルカチブとミラー（Al-Khatib and Miller ((2000) Crop Sci. 40:869)）が、四種のイミダゾリノン耐性のヒマワリ品種の生産について報告している。
【０００６】
コンピュータモデリングによるＡＨＡＳ−阻害剤複合体の三次元立体配座の解析により、阻害剤結合ポケット中のいくつかのアミノ酸が、誘発変異により選択的にイミダゾリノン耐性を与える可能性がある部位に存在していることが明らかとなった（Ott et al (1996) J. Mol. Biol 263:359-368）。ＡＨＡＳ酵素の結合部位と考えられる部分で、論理的にデザインした突然変異でつくったタバコ植物では、実際、ある種の除草剤に特異的に耐性を示した（Ott et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:359-368）。
【０００７】
イミダゾリノン除草剤耐性植物が既に多くの特許に報告されている。米国特許４，７６１，３７３、５，３３１，１０７、５，３０４，７３２、６，２１１，４３８、６，２１１，４３９及び６，２２２，１００は、改変したＡＨＡＳ遺伝子を植物に除草剤耐性を誘発するのに利用することについて一般的に述べており、具体的には、ある種のイミダゾリノン耐性のトウコロコシ系統を開示している。米国特許５，０１３，６５９は、一箇所以上の保存領域の少なくとも一個のアミノ酸の突然変異に由来する除草剤耐性植物を開示している。この突然変異は、イミダゾリノンとスルホニル尿素に対するクロス耐性、あるいはスルホニル尿素に特異的な耐性を示すもので、イミダゾリノン特異的な耐性については述べられていない。米国特許５，７３１，１８０と米国特許５，７６７，３６１は、野生型単子葉植物のＡＨＡＳアミノ酸配列の単一アミノ酸置換の結果、イミダゾリノン特異的な耐性を示す単離された遺伝子について述べている。また、ＡＨＡＳを阻害して除草剤耐性を示すコメ植物が、突然変異育種により、また葯培養のコメ植物の中からの除草剤耐性種の選抜により開発されている。米国特許５，５４５，８２２、５，７３６，６２９、５，７７３，７０３、５，７７３，７０４、５，９５２，５５３及び６，２７４，７９６を参照。
【０００８】
他のすべての生物と同様に、植物では、ＡＨＡＳ酵素は、二つのサブユニット：大サブユニット（触媒作用）と小サブユニット（調節作用）からなる（Duggleby and Pang (2000) J. Biochem. Mol. Biol. 33: 1-36）。ＡＨＡＳ大サブユニット（以下、ＡＨＡＳＬとも表すこともある）は、シロイヌナズナやテンサイの場合のように単一の遺伝子でコードされていることもあれば、トウモロコシやアブラナ、ワタ中のように複数の遺伝子ファミリーでコードされていることもある。大サブユニットに特異的な単一ヌクレオチド置換をおこすと、この酵素が、一種以上の除草剤に非感受性となる（Chang and Duggleby (1998) Biochem J. 333:765-777）。
【０００９】
例えば、パンコムギ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．，は、三種の同祖のアセトヒドロキシ酸シンターゼ大サブユニット遺伝子を有している。各遺伝子は、除草剤に応答してかなりの発現を示し、これら三種の遺伝子の変異体から生化学的なデータも得られている（Ascenzi et al. (2003) International Society of Plant Molecular Biologists Congress, Barcelona, Spain, Ref. No. S10-17）。全三種の遺伝子がコードする配列は、ヌクレオチドレベルで高い相同性を示す（ＷＯ０３／０１４３５７）。コムギのいくつかの品種からＡＨＡＳＬ遺伝子をシークエンシングした結果、ほとんどのＨＶＨ耐性（イミダゾリノン耐性）系統の除草剤耐性の分子的機序が、Ｓ６５３（Ａｔ）Ｎの突然変異であり、シロイヌナズナのアミノ酸６５３のセリンの位置のセリンからアスパラギンへの置換であることが明らかとなった（ＷＯ０３／０１４３６；ＷＯ０３／０１４３５７）。この突然変異は、ＡＨＡＳＬタンパク質をコードするＤＮＡ配列における単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）によるものである。
【００１０】
双子葉類植物でも、複数のＡＨＡＳＬ遺伝子の存在が知られている。最近、コークマンら（Kolkman et al. ((2004) Theor. Appl Genet. 109: 1147-1159)）は、除草剤耐性及び野生遺伝子型のヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ  Ｌ．）からの三種のＡＨＡＳＬ遺伝子（ＡＨＡＳＬ１とＡＨＡＳＬ２とＡＨＡＳＬ３）の同定、クローニング、及びシークエンシングを報告している。コークマンらは、除草剤耐性は、ＡＨＡＳＬ１タンパク質におけるＰｒｏ１９７Ｌｅｕ（シロイヌナズナＡＨＡＳＬアミノ酸の位置命名法による）置換、又はＡｌａ２０５Ｖａｌ置換のよるもので、どちらの置換も、イミダゾリノン除草剤とスルホニル尿素除草剤の両方に対する耐性を与えると報告している。効力が高く毒性が低いため、イミダゾリノン除草剤が、農業用途に好ましく使用されている。しかしながら、特定の作物の生産系でイミダゾリノン除草剤を使用できるかどうかは、
イミダゾリノン耐性をもつ目的の作物植物が入手可能かどうかによる。イミダゾリノン耐性の品種を生産するには、農家はイミダゾリノン耐性をもつ品種を開発する必要がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、イミダゾリノン耐性の育種系統や作物植物の品種の開発や、イミダゾリノン耐性育種系統や品種の生産及び使用ための方法や組成物の開発が、さらに必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、除草剤に対する耐性が、野生型ヒマワリ植物と比較して増大したヒマワリ植物を提供する。特に、本発明のヒマワリ植物は、野生型ヒマワリ植物と比較して、イミダゾリノン除草剤に対する耐性が増大している。本発明の除草剤耐性ヒマワリ植物は、除草剤耐性のアセトヒドロキシ酸シンターゼ大サブユニット（ＡＨＡＳＬ）をコードするポリヌクレオチドや遺伝子の少なくとも一コピーを有している。このような除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質は、アミノ酸位置１０７又はそれに相当する位置にトレオニンを有している。植物本発明の除草剤耐性ヒマワリは、本発明の除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質コードする遺伝子又はポリヌクレオチドを、１、２、３、４、５、６コピー、あるいはそれ以上有していてもよい。本発明のヒマワリ植物はまた、本発明の除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質をコードする遺伝子又はポリヌクレオチドを少なくとも１コピー有する種子や子孫植物を含んでいる。
【００１３】
ある実施様態においは、本発明は、Ｓ４８９７のヒマワリ系統、およびＳ４８９７の除草剤耐性を含むその子孫や誘導体の除草剤耐性ヒマワリ植物を提供する。ＧＭ４０で示す遺伝系統は、Ｓ４８９７除草剤耐性に由来し、それを有している。ＧＭ４０系統の種子サンプルは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ）にＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−６７１６で寄託されている。従って、ＧＭ４０除草剤耐性を有する本発明のヒマワリ植物、あるいはＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−６７１６のヒマワリ植物は、Ｓ４８９７の除草剤耐性を有している。Ｓ４８９７、ＧＭ４０の除草剤耐性をもつ、Ｓ４８９７ヒマワリ植物、ＧＭ４０ヒマワリ植物、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−６７１６のヒマワリ植物、及びこれらの子孫や誘導体、あるいはＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−６７１６のヒマワリ植物は、ゲノム中に、配列番号１で表される核酸配列をもち、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＡＨＡＳＬ１タンパク質をコードするＡＨＡＳＬ１遺伝子を有している。野生型ヒマワリ植物のＡＨＡＳＬ１遺伝子（配列番号３）でコードされたＡＨＡＳＬ１タンパク質（配列番号４）のアミノ酸配列と比較すると、配列番号２で表されるアミノ酸配列は、野生型アミノ酸配列から一アミノ酸分異なっている。配列番号２で表されるアミノ酸配列では、アミノ酸位置７にトレオニンがはいっている。この位置は、配列番号１２で表される核酸配列でコードされた完全長ヒマワリＡＨＡＳＬ１タンパク質（登録番号ＡＹ５４１４５１）の位置１０７に相当する。本発明の野生型ＡＨＡＳＬ１アミノ酸配列（配列番号４）において、この相当するアミノ酸位置にはアラニンがある。特記しない場合、本明細書中でのアミノ酸位置は、配列番号１２で表される完全長アミノ酸配列のアミノ酸位置に相当するヒマワリＡＨＡＳＬタンパク質の位置である。
【００１４】
他の実施様態においては、本発明は、ＧＭ１６０６で表されるヒマワリ系統の除草剤耐性ヒマワリ植物を提供する。ＧＭ１６０６遺伝物質の種子のサンプルは、ＡＴＣＣにＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−７６０６で寄託されている。したがって、本発明は、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−７６０６を持つ除草剤耐性ヒマワリ植物と、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−７６０６を持つヒマワリ植物の除草剤耐性を含むその子孫や誘導体を提供する。上記のＳ４８９７及びＧＭ４０ヒマワリ植物と同様に、ＧＭ１６０６の除草剤耐性を有するＧＭ１６０６とその子孫や誘導体は、ゲノム中に、完全長ヒマワリＡＨＡＳＬ１タンパクの位置１０７にトレオニンを有するＡＨＡＳＬ１タンパク質をコードするＡＨＡＳＬ１遺伝子を有している。同様に、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−７６０６のヒマワリ植物の除草剤耐性をもつ、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−７６０６のヒマワリ植物やその子孫や誘導体は、そのゲノム中に、完全長ヒマワリＡＨＡＳＬ１のタンパクの位置１０７にトレオニンを含むＡＨＡＳＬ１タンパク質をコードするＡＨＡＳＬ１遺伝子を有している。
【００１５】
本発明は更に、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）ＡＨＡＳＬタンパク質の単離されたポリヌクレオチド及びポリペプチド単離物を提供する。本発明のポリヌクレオチドには、除草剤耐性及び野生型のＡＨＡＳＬタンパク質をコードする核酸配列が含まれ、具体的には、ヒマワリＡＨＡＳＬ１、ＡＨＡＳＬ２、およびＡＨＡＳＬ３遺伝子によりコードされたタンパク質をコードする核酸配列が含まれるが、これらに限定されるわけではない。本発明の除草剤耐性ヒマワリＡＨＡＳＬタンパク質は、完全長ヒマワリＡＨＡＳＬ１タンパク質の位置１０７又はそれに相当する位置にアラニン以外のアミノ酸を含むイミダゾリノン耐性のＡＨＡＳＬタンパク質である。好ましく、アミノ酸位置１０７あるいは相当する位置に、トレオニンが存在している。本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１と３で表される核酸配列、配列番号２と４で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列、及びＡＨＡＳ活性を含むタンパク質をコードする上記核酸配列のフラグメントや変異体を含んでいる。
【００１６】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを植物、植物細胞や他の非ヒト宿主細胞で発現させるための発現カセットを提供する。この発現カセットは、植物、植物細胞や他の目的の宿主細胞で発現可能な、野生型又は除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質をコードする本発明のポリヌクレオチドに作動可能な状態で連結したプロモーターを含んでいる。必要なら、葉緑体でＡＨＡＳＬタンパク質の発現を起こすために、発現カセットは、作動可能な状態で連結している、葉緑体輸送ペプチドをコードする葉緑体ターゲティング配列を有していてもよい。本発明の発現カセットは、植物や宿主細胞の除草剤耐性を増強する方法に利用することができる。本方法では、本発明の発現カセットを用いて植物又は宿主細胞を形質転換させるが、この際、発現カセットは植物又は目的の宿主細胞で発現可能なプロモーターをもち、このプロモーターは本発明の除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質をコードする本発明のポリヌクレオチドに作動可能な状態で連結している。本方法では、更に形質転換植物細胞から形質転換植物を再生させる。
【００１７】
本発明は、植物細胞内で発現を引き起こすプロモーターに作動可能な状態で連結している核酸配列を含むポリヌクレオチドコンストラクトで植物細胞を形質転換させ、形質転換細胞から形質転換植物を再生させることにより植物のＡＨＡＳ活性を増加させる方法を提供する。この核酸配列は、本発明除草剤耐性又は野生型のＡＨＡＳＬタンパク質をコードする核酸配列から、特に配列番号１と３で表される核酸配列、配列番号２と４で表されるアミノ酸配列コードする核酸配列、及びそれらのフラグメントや変異体から選択される。この方法で作られた植物では、形質転換されなかった植物と較べると、ＡＨＡＳ活性あるいは除草剤耐性ＡＨＡＳ活性が増加している。本発明は、植物細胞内で発現を引き起こすプロモーターに作動可能な状態で連結している核酸配列を含むポリヌクレオチドコンストラクトを用いて植物細胞を形質転換させ、この形質転換細胞から形質転換植物を再生させることによる除草剤耐性植物を生産する方法を提供する。この核酸配列は、本発明の除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質をコードする核酸配列から、特に配列番号１で表される核酸配列、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列、およびそれらのフラグメントや変異体から選択される。この方法により得られた除草剤耐性植物では、形質転換されなかった植物と較べると、少なくとも一種の除草剤に対する耐性、特にイミダゾリノン除草剤に対する耐性が増加している。
【００１８】
本発明は、除草剤耐性植物中の除草剤耐性を増強する方法を提供する。本方法は、野生型植物なら死滅させるか、かなりの損傷を与える程度の除草剤に対して耐性を示す植物の耐性を更に増強する方法に使用できる。このような除草剤耐性植物は、遺伝子組換えで作られた除草剤耐性植物であってもよいし、組換えＤＮＡが関与しない方法で開発された除草剤耐性植物、例えば、本発明のＳ４８９７、ＧＭ４０、およびＧＭ１６０６ヒマワリ植物であってもよい。本方法では、植物細胞内で発現を引き起こすプロモーターに作動可能な状態で連結している核酸配列を含むポリヌクレオチドコンストラクトにて除草剤耐性植物を形質転換させ、この形質転換植物細胞から形質転換植物に再生させる。この核酸配列は、本発明の除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質をコードする核酸配列から、特に配列番号１で表される核酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする核酸配列、及びそれらのフラグメントや変異体を含む核酸配列から選択される。
【００１９】
本発明は、本発明の選択マーカー遺伝子を含む形質転換ベクターを提供する。この選択マーカー遺伝子は本発明の除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドに作動可能な状態で連結している、宿主細胞に発現を引き起こすプロモーターを含んでいる。この形質転換ベクターは、さらに宿主細胞で発現させる目的の遺伝子を含み、必要なら、本発明のポリヌクレオチドに作動可能な状態で連結している葉緑体ターゲティング配列を有してもよい。
【００２０】
本発明は、更に、本発明の形質転換ベクターを用いて、興味のある遺伝子で形質転換した細胞を選抜する方法を提供する。このような方法では、形質転換ベクターで宿主細胞を形質転換させ、非形質転換宿主細胞を殺傷又は成長を阻害する程度までその細胞をイミダゾリノン除草剤に暴露させ、除草剤の存在下で成長できる形質転換宿主細胞を同定する。本発明のある実施様態においては、この宿主細胞が植物細胞であり、選択マーカー遺伝子が、植物細胞内で発現を引き起こすプロモーターを含んでいる。
【００２１】
本発明は、本発明の除草剤耐性植物、例えば上述の除草剤耐性ヒマワリ植物や本発明の除草剤耐性ＡＨＡＳＬポリヌクレオチドで形質転換した植物の近くの雑草を防除する方法を提供する。このような形質転換細胞は、ゲノム中に、植物細胞中で遺伝子発現を引き起こすプロモーターを含む少なくとも一個の発現カセットを有しており、このプロモーターは、本発明のＡＨＡＳＬポリヌクレオチドに作動可能な状態で連結している。本方法では、有効量の除草剤を雑草と除草剤耐性植物に散布するが、その際、除草剤耐性植物は少なくとも一種の除草剤に対して、特にイミダゾリノン除草剤に対して、野生型あるいは形質転換されなかった植物と較べると、大きな耐性を有している。本発明の植物は、遺伝子組換え体であっても、非遺伝子組換え体であってもよい。イミダゾリノン及び／又はスルホニル尿素除草剤に対して強い耐性をもつ非遺伝子組換えヒマワリ植物の例としては、Ｓ４８９７、ＧＭ４０、又はＧＭ１６０６ヒマワリ植物、ＡＴＣＣ特許寄託番号がＰＴＡ−６７１６又はＰＴＡ−７６０６のヒマワリ植物；Ｓ４８９７、ＧＭ４０、あるいはＧＭ１６０６、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−６７１６又はＰＴＡ−７６０６のヒマワリ植物、Ｓ４８９７とＧＭ４０とＧＭ１６０６の二種以上、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−６７１６のヒマワリ植物、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−７６０６のヒマワリ植物の変異体、組換え体、あるいは遺伝子組換え誘導体；Ｓ４８９７、ＧＭ４０、あるいはＧＭ１６０６、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−６７１６又はＰＴＡ−７６０６のヒマワリ植物、Ｓ４８９７とＧＭ４０とＧＭ１６０６の二種以上、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−６７１６のヒマワリ植物、およびＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−７６０６のヒマワリ植物の子孫；これらの植物のいずれかの子孫たる植物；Ｓ４８９７、ＧＭ４０、ＧＭ１６０６、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−６７１６のヒマワリ植物、及び／又はＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−７６０６のヒマワリ植物の除草剤耐性を持つ植物があげられる。
【００２２】
本発明は、また、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、又は形質転換ベクターで形質転換した植物や植物器官、植物組織、植物細胞、種子、非ヒト宿主細胞を提供する。このような形質転換された細胞や植物器官、植物組織、植物細胞、種子、非ヒト宿主細胞は、形質転換されなかった植物や植物組織、植物細胞、非ヒト宿主細胞なら殺傷するか成長を阻害する除草剤レベルで、少なくとも一種の除草剤に対して強い許容あるいは耐性性を示す。好ましくは、本発明の形質転換された細胞、植物組織、植物細胞、および種子は、シロイヌナズナ、ヒマワリ、及び他の作物植物である。本発明は、更に、イミダゾリノン耐性及び野生型ヒマワリＡＨＡＳＬタンパク質を含むポリペプチド単離物を提供する。このポリペプチド単離物には、配列番号２と４で表されるアミノ酸配列、配列番号１と３の核酸配列でコードされるアミノ酸配列、及びＡＨＡＳ活性をもつタンパク質をコードする上記アミノ酸配列のフラグメントや変異体が含まれる。
【００２３】
［図面の簡単な説明］
図１は、除草剤耐性ヒマワリＡＨＡＳＬ１遺伝子（配列番号１）、野生型ヒマワリＡＨＡＳＬ１遺伝子（配列番号３）、ジェンバンク登録番号Ｕ１６２８０（配列番号５）、ジェンバンク登録番号ＡＹ５４１４５１（配列番号１１）、及びジェンバンク登録番号ＡＹ１２４０９２（配列番号１３）の核酸配列の核酸配列アラインメントである。突然変異部位（配列番号１）をアステリスクで示す。突然変異は、配列番号１のヌクレオチド位置２１でのＧからＡへの変異である。
図２は、除草剤耐性ヒマワリＡＨＡＳＬ１タンパク質（配列番号２）、野生型ヒマワリＡＨＡＳＬ１タンパク質（配列番号４）、ジェンバンク登録番号Ｕ１６２８０  （配列番号６）、ジェンバンク登録番号ＡＹ５４１４５１（配列番号１２）、及びジェンバンク登録番号ＡＹ１２４０９２（配列番号１４）のアミノ酸配列アラインメントである。アステリスクは、除草剤耐性ヒマワリＡＨＡＳＬ１タンパク質中の単一アミノ酸置換（Ａｌａ−ｔｏ−Ｔｈｒ）部位を示している。この置換部位は、配列番号２で表される部分長ＡＨＡＳＬ１アミノ酸配列のアミノ酸位置７に相当する。配列番号１２で表される完全長ヒマワリＡＨＡＳＴ１アミノ酸配列での相当する置換位置は、１０７である。
図３は、ＭＩＳＵＮ−１ヒマワリ植物の除草剤耐性（Al-Khatib and Miller (2000) Crop Set 40:869-870）と比較した、温室研究での、Ｓ４８９７ヒマワリ植物（右側）植物の除草剤耐性の増加を示す写真である。Ｓ４８９７とＩＭＩＳＵＮ−１のそれぞれのヒマワリ植物は、イマザモックスで、２００ｇ−活性成分／ｈａの散布率で、噴霧処理したものである。コントロールの野生型ヒマワリ植物は、散布率が１００あるいは２００ｇ−活性成分／ｈａ（図示せず）でのイマザモックス噴霧処理で、生存できなかった。写真は、植物の噴霧処理の数日後にとったものである。
図４は、ＭＩＳＵＮ−１、野生型、及びＳ４８９７ヒマワリ植物のイマザモックスの散布比率１００（白棒）あるいは２００ｇ−活性成分／ｈａ（黒棒）での噴霧処理後の温室試験における薬害を示すグラフである。この図は、イマザモックスの二種の散布比率において、ＩＭＩＳＵＮ−１植物と野生型植物の除草剤耐性と比較してＳ４８９７除草剤耐性ヒマワリ植物の耐性あるいは許容性が有意に高いことを示している。薬害は、イマザモックス散布後１７日目に評価した。ＩＭＩＳＵＮ−１植物は、アミノ酸１９０に、アラニンからバリンへの置換を有している（Kolkman et al. (2004) Theor. Appl Genet. 109: 1147-1159）。
図５は、実施例４の温室試験において、Ｓ４８９７ヒマワリ植物（右側）が、ＭＩＳＵＮ−１ヒマワリ植物の除草剤耐性と比較して、高い除草剤耐性を持つことをしめしている写真である
図６は、実施例５の温室試験において、Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ（登録商標）Ａヒマワリ植物と比較して、Ｓ４８９７ヒマワリ植物が高い除草剤耐性を持つことを示す写真である。
図７は、実施例５の、非−Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ種ラプター、Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ種とＳ４８９７ヒマワリ植物によるＡＨＡＳの阻害を比較する図である。
図８は、実施例５の、非−Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ種グリーン、Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ種とＳ４８９７ヒマワリ植物によるＡＨＡＳの阻害を比較する図である。
図９は、イマザピルの葉面処理が、処理後１４日目に、二種のヒマワリ変異体の草高に与える影響を示す図である。平均長（無処置品に対する％）を黒四角で表示し、誤差バーは、平均値の標準偏差を表す。
図１０は、イマザピルの葉面処理が、処理後１４日目に、二種のヒマワリ変異体の草高に与える影響を示す図である。平均長（無処置品に対する％）を黒四角で表示し、誤差バーは、平均値の標準偏差を表す。
図１１は、イマザピルの葉面処理が、処理後１４日目に、二種のヒマワリ変異体の生物量に与える影響を示す図である。平均乾燥重量（無処置品に対する％）を黒四角で表示し、誤差バーは、平均値の標準偏差を表す。
図１２は、イマザピルの葉面処理が、処理後１４日目に、二種のヒマワリ変異体の根の生物量に与える影響を示す図である。根の平均乾燥重量（無処置品に対する％）を黒四角で表示し、誤差バーは、平均値の標準偏差を表す。
【００２４】
配列リスト
以下の配列表のヌクレオチド配列とアミノ酸配列は、標準的なヌクレオチドの塩基の省略文字とアミノ酸の三文字コードを使用して表示した。核酸配列は、配列の５’末端から始まり３’末端にいたる標準的な規則にしたがっている（即ち、いずれの行も左から右へ）。各核酸配列の一ストランドのみを示したが、相補鎖も、含まれているものとする。アミノ酸配列は、アミノ末端から始まりカルボキシ末端にすすむ標準的な規則にのっとっている。（即ち、いずれの行も左から右へ）。
【００２５】
配列番号１は、ヒマワリ系統Ｓ４８９７の除草剤耐性ＡＨＡＳＬ１タンパク質をコードする部分長核酸配列を示す。
配列番号２は、配列番号１で表される核酸配列コードされた除草剤耐性のＡＨＡＳＬ１タンパク質の部分長アミノ酸配列を示す。
配列番号３は、ヒマワリ系統ＢＴＫ４７の野生型ＡＨＡＳＬ１タンパク質をコードする部分長核酸配列を示す。
配列番号４は、配列番号３の核酸配列でコードされた野生型ＡＨＡＳＬ１タンパク質の部分長アミノ酸配列をしめす。
配列番号５は、ジェンバンク登録番号Ｕ１６２８０の核酸配列である。
配列番号６は、ジェンバンク登録番号Ｕ１６２８０の核酸配列でコードされたアミノ酸配列である。
配列番号７は、実施例２で述べたＡ１Ｕ４０９プライマーの核酸配列を示す。
配列番号８は、実施例２で述べたＨＡ１Ｌ１３７９プライマーの核酸配列を示す。
配列番号９は、実施例２で述べたＨＡ１Ｕ１３１３プライマーの核酸配列を示す。
配列番号１０は、実施例２で述べたＨＡ１Ｌ２１３１プライマーの核酸配列を示す。
配列番号１１は、ジェンバンク登録番号ＡＹ５４１４５１の核酸配列である。
配列番号１２は、ジェンバンク登録番号ＡＹ５４１４５１の核酸配列でコードされた
アミノ酸配列である。
配列番号１３は、ジェンバンク登録番号ＡＹ１２４０９２の核酸配列である。
配列番号１４は、ジェンバンク登録番号ＡＹ１２４０９２の核酸配列でコードされたアミノ酸配列である。
【００２６】
好ましい実施形態の説明
本発明は、野生型ヒマワリ植物と比較して、除草剤に対する耐性の増加したヒマワリ植物に関する。以下に記載のように、除草剤耐性ヒマワリ植物は、野生型（除草剤耐性において）のヒマワリ植物を変異原物質に暴露し、その植物を成熟させて複製させ、野生型ヒマワリ植物の耐性と比較してイミダゾリノン除草剤に対する耐性の増加した子孫植物を選抜することで得られている。本発明は、除草剤耐性ヒマワリ系統（ここではＳ４８９７とＧＭ４０とＧＭ１６０６と称す）を提供する。
【００２７】
Ｓ４８９７除草剤耐性ヒマワリ植物とＢＴＫ４７野生型ヒマワリ植物とから、アセトヒドロキシ酸シンターゼ大サブユニット遺伝子（ＡＨＡＳＬ１と称す）のコード領域がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅により単離され、その配列が決定された。除草剤耐性のヒマワリ植物と野生型ヒマワリ植物のポリヌクレオチド配列を比較した結果、除草剤耐性ヒマワリ植物のＡＨＡＳＬ１ポリヌクレオチド配列のコード領域が、野生型植物のＡＨＡＳＬ１ポリヌクレオチド配列とは、単一ヌクレオチドで異なる、具体的にはヌクレオチド２１（配列番号１）がＧからＡへ変異していることが明らかとなった。ＡＨＡＳＬ１ポリヌクレオチド配列内でのＧからＡへの変異の結果、除草剤耐性ヒマワリＡＨＡＳＬ１タンパク質（配列番号２）の予想されるアミノ酸配列（配列番号２）の保存領域中のアミノ酸７で、ヒマワリ系統ＢＴＫ４７の野生型ＡＨＡＳＬ１タンパク質の相当するアミノ酸位置（すなわち、配列番号４のアミノ酸７）と比べて、アラニンからトレオニンへの置換が起こる。
【００２８】
配列番号１で表される核酸配列はＡＨＡＳＬタンパク質の完全長コード領域に相当するものでないため、配列番号２で表されるアミノ酸配列もまた完全長ではない。特記しない限り、あるいはこのような位置に関して明らかな場合を除き、他のヒマワリＡＨＡＳＬアミノ酸配列との比較を容易にするため、本発明においては、ヒマワリＡＨＡＳＬタンパク質のアミノ酸位置とは、ジェンバンク登録番号ＡＹ５４１４５１の核酸配列（配列番号１２）がコードするヒマワリＡＨＡＳＬ１タンパク質の完全長アミノ酸配列中のアミノ酸の位置に相当するものとする。従って、配列番号２のアミノ酸位置７でのアラニンからトレオニンへの置換は、配列番号１２のアミノ酸配列のアミノ酸位置１０７に一致する。
【００２９】
したがって、本発明は、除草剤耐性ヒマワリＡＨＡＳＬタンパク質の製造に利用可能なアミノ酸の置換、このようなタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び除草剤の耐性植物や植物組織、植物細胞、種子を開示する。野生型完全長ヒマワリＡＨＡＳＬ１タンパク質のアミノ酸位置１０７、あるいは相当する位置にあるアラニンは、植物種を超えて保存されるアミノ酸領域内にあり、他のヒマワリＡＨＡＳＬタンパク質（例えば、ＡＨＡＳＬ２やＡＨＡＳＬ３）中に同様に保存されたアラニンを、他のアミノ酸、好ましくはトレオニンで置換すると除草剤耐性を与える可能性がある。従って、ヒマワリＡＨＡＳＬタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、既知のいずれかの方法、例えば部位特異的突然変異によって変異させ、ＡＨＡＳＬタンパク質をコードするヒマワリポリヌクレオチドの位置１０７、あるいは相当する位置で、トレオニン置換させることができる。対応するヒマワリＡＨＡＳＬ１、ＡＨＡＳＬ２、及びＡＨＡＳＬ３遺伝子によりコードされるポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、ジェンバンク登録番号ＡＹ５４１４５１（配列番号１１及び１２）、ＡＹ５４１４５２、ＡＹ５４１４５３、ＡＹ５４１４５４、ＡＹ５４１４５５、ＡＹ５４１４５６、ＡＹ５４１４５７、及びＡＹ５４１４５８であり、なお、これらすべてを、参照として本願明細書に組み込むこととする。従って、これらのポリヌクレオチド及びこれらによりコードされる除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質は、本発明で開示される方法により除草剤耐性の植物や植物細胞、植物組織、種子の生産に用いられる。
【００３０】
本発明は、さらにそれぞれ除草剤耐性ＡＨＡＳＬ２タンパク質とＡＨＡＳＬ３タンパク質をコードする単離されたヒマワリＡＨＡＳＬ２及びＡＨＡＳＬ３ポリヌクレオチドを含む。除草剤耐性ＡＨＡＳＬ２タンパク質及びＡＨＡＳＬ３タンパク質は、いずれも位置１０７あるいは相当する位置に、アラニン以外のアミノ酸を有している。好ましくは、除草剤耐性ＡＨＡＳＬ２タンパク質とＡＨＡＳＬ３タンパク質は、アミノ酸位置１０７あるいは相当する位置に、トレオニンを有する。
【００３１】
本発明は、更にアセトヒドロキシ酸シンターゼ大サブユニット（ＡＨＡＳＬ）をコードするタンパク質核酸配列を含むポリヌクレオチド分子単離物、及びそのようなＡＨＡＳＬタンパク質に関する。本発明は、野生型ヒマワリ植物の化学的突然変異で製造した除草剤耐性ヒマワリ植物の除草剤耐性ヒマワリＡＨＡＳＬ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドの単離とその核酸配列を開示する。本発明の除草剤耐性ヒマワリＡＨＡＳＬ１タンパク質は、相当する野生型アミノ酸配列と較べると、それぞれのアミノ酸配列中の位置１０７あるいは相当する位置でアラニンからトレオニンへの置換が起こっている。本発明は、更に野生型ヒマワリＡＨＡＳＬ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子の単離とその核酸配列を開示する。
【００３２】
本発明は、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ  Ｌ．）ＡＨＡＳＬタンパク質をコードする、新たにポリヌクレオチド分子単離物を提供する。具体的には、本発明は、配列番号１と３で表される核酸配列と、配列番号２と４で表されるアミノ酸配列とを含むＡＨＡＳＬタンパク質をコードする核酸配列と、このような機能するＡＨＡＳＬタンパク質をコードする核酸配列のフラグメントや変異体を含む、ポリヌクレオチド分子単離物を提供する。本発明の除草剤耐性ＡＨＡＳＬポリヌクレオチド分子単離物は、除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質をコードする核酸配列を含んでいる。これらのポリヌクレオチド分子は、植物、特に作物植物の形質転換用のポリヌクレオチドコンストラクトの作成に使用して、除草剤に対する、特にＡＨＡＳ活性を阻害することが知られている除草剤、より具体的には、イミダゾリノン除草剤に対する植物の耐性を増強することに利用される。これらのポリヌクレオチドコンストラクトは、発現カセット、発現ベクター、形質転換ベクター、プラスミドなどの中で使用できる。このようなポリヌクレオチドコンストラクトを用いて、下記のような形質転換後に得られた形質転換植物は、ＡＨＡＳ阻害性の除草剤に対し、例えばイミダゾリノン除草剤やスルホニル尿素除草剤に対しより大きな耐性を示す。
【００３３】
本発明の組成物は、ＡＨＡＳＬタンパク質をコードする核酸配列を含んでいる。特に、本発明は、ＡＨＡＳ活性を持つポリペプチドをコードしている、配列番号２と４で示されるアミノ酸配列、それらのフラグメントや変異体をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド分子単離物を提供する。更に、ＡＨＡＳ活性を持つポリペプチドをコードする本発明記載のポリヌクレオチド分子、例えば、配列番号１と３で表されるものや、そのフラグメントや変異体によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドが、提供される。
【００３４】
本発明は、単離され実質的に精製された核酸またはタンパク質組成物を含んでいる。「単離された」又は「精製された」ポリヌクレオチド分子又はタンパク質、又はその生物学的な活性部位は、自然発生的な環境で通常見受けられるポリヌクレオチド分子やタンパク質に随伴する、あるいはこれらと相互作用する成分を実質的にあるいは基本的に含まない。したがって、単離された、あるいは精製されたポリヌクレオチド分子やタンパク質は、他の細胞物質や、組換え技術で製造する場合は培養液を実質的に含まず、化学合成の場合には、化学原料その他の化学物質を実質的に含まない。好ましくは、“単離された”核酸は、核酸を得ようとする生物体のゲノムＤＮＡ中の、目的とする核酸に自然に隣接する配列（例えば、核酸の５’末端や３’末端に位置する配列）（好ましくはタンパク質をコードする配列）を含まない。例えば、いろいろな実施様態において、ポリヌクレオチド分子単離物中の、核酸を得ようとする細胞のゲノムＤＮＡ中のポリヌクレオチド分子に自然に隣接する核酸配列の大きさは、好ましくは約５ｋｂ未満であり、さらに４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、又は０．１ｋｂ未満である。細胞物質を実質的に含まないタンパク質には、汚染タンパク質の含量が、約３０％未満、さらに２０％、１０％、５％、又は１％未満（乾燥重量）のタンパク質製品が含まれる。本発明のタンパク質、あるいはその生物学的な活性部位が、組換え技術により製造される場合、培養液中の化学原料や非目的タンパク質の化学物質の含量は、好ましくは、約３０％未満、さらに２０％、１０％、５％、又は１％未満（乾燥重量）である。
【００３５】
本発明は、ＡＨＡＳＬタンパク質を含むポリペプチド単離物を提供する。ポリペプチド単離物は、配列番号２と４で表されるアミノ酸配列、配列番号１と３で表される核酸配列でコードされるアミノ酸配列、ＡＨＡＳ活性を持つＡＨＡＳＬポリペプチドをコードする上記アミノ酸配列の機能性のフラグメントや変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでいる。「機能性のフラグメントや変異体」とは、ＡＨＡＳ活性を有する例示ポリペプチドのフラグメントや変異体をいう。
【００３６】
本発明のある実施様態においては、本方法は、除草剤許容植物又は除草剤耐性植物を含む。“除草剤許容”植物又は“除草剤耐性”植物は、通常の植物あるいは野生型植物を枯らすか、これらの成長を阻害するレベルにおいても、少なくとも一種の除草剤を許容するあるいは耐性を示す植物をいう。本発明のある実施様態においては、本発明の除草剤許容植物は、除草剤許容性タンパク質又は除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質を含んでいる。「除草剤許容性ＡＨＡＳＬタンパク質」や「除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質」とは、野生型ＡＨＡＳＬタンパク質のＡＨＡＳ活性を阻害することがわかっている除草剤濃度又は除草剤レベルで、ＡＨＡＳ活性を妨害するとわかっている少なくとも一種の除草剤の存在下で、このようなＡＨＡＳＬタンパク質が、野生型ＡＨＡＳＬタンパク質のＡＨＡＳ活性と比べて高いＡＨＡＳ活性を示すことを意味する。さらに、除草剤許容性タンパク質又は除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質のＡＨＡＳ活性を、ここでは「除草剤許容性ＡＨＡＳ活性」又は「除草剤耐性ＡＨＡＳ活性」という。本発明においては、「除草剤許容性の」と「除草剤耐性の」の用語は、区別なく使用され、その意味するもの、範囲は同じである。同様に、「除草剤許容性」と「除草剤耐性」の用語も、区別なく使用され、その意味するもの、範囲は同じである。同様に、「イミダゾリノン耐性の」と「イミダゾリノン耐性」の用語も、区別なく使用され、その意味するもの、範囲は同じであり、「イミダゾリノン耐性の」と「イミダゾリノン耐性」も同じである。
【００３７】
本発明は、除草剤耐性ＡＨＡＳＬポリヌクレオチドと除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質を含んでいる。「除草剤耐性ＡＨＡＳＬポリヌクレオチド」は、除草剤耐性ＡＨＡＳを有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。「除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質」は、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を持つタンパク質又はポリペプチドを意味する。
【００３８】
更に、除草剤許容性タンパク質又は除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質は、除草剤許容性タンパク質又は除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質をコードする核酸配列によって植物またはその祖先を形質転換することで、植物に導入することが可能である。このような除草剤許容性タンパク質又は除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質は、除草剤許容性ポリヌクレオチド又は除草剤耐性ＡＨＡＳＬポリヌクレオチドによってコードされている。また、植物又はその祖先のゲノム中の内在性のＡＨＡＳＬ遺伝子の自然発生的な突然変異あるいは誘発による突然変異により、除草剤許容性ＡＨＡＳＬタンパク質又は除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質が、植物中に現れることもある。
【００３９】
本発明は、少なくとも一種の除草剤、特にイミダゾリノン除草剤又はスルホニル尿素除草剤に対する耐性あるいは許容性の増加した植物、植物組織、植物細胞、及び宿主細胞を提供する。好ましい除草剤の量や濃度を、「有効量」と「有効濃度」と表記する。「有効量」と「有効濃度」とは、類似の野生型の植物、植物組織、植物細胞や宿主細胞を殺傷またはその成長を阻害するのには十分な量や濃度であるが、本発明の除草剤耐性の植物、植物組織、植物細胞や宿主細胞の殺傷または成長阻害には至らない量や濃度をいう。具体的には、除草剤の有効量とは、農業生産の場において、目的の雑草を駆逐するのに日常的に使用される量である。このような量は、当業界の通常の技術をもつものにとっては公知である。
【００４０】
「類似の野生型の植物、植物組織、植物細胞や宿主細胞」とは、本明細書記載の除草剤耐性及び／又は本発明の特定のポリヌクレオチドを保有しない植物、植物組織、植物細胞や宿主細胞を意味する。したがって、「野生型」という用語は、植物や植物組織、植物細胞、あるいは他宿主細胞が、そのゲノム中に組換えＤＮＡを含まず、及び／又は本明細書記載のものとは異なる除草剤耐性特性を持っていないことを示すのに使用する。特記しない場合、「植物」という用語は、いかなる発生段階の植物をもさし、また植物のいかなる部分をも、同様に、元々の全体の植物に付着したあるいはこれから分離可能な植物の部分のいずれをも含んでいる。このような植物の一部分には、植物の器官や組織や細胞が含まれるが、これらに限定されるわけではない。この植物の一部分の具体例としては、茎、葉、根、花序、花、小花、果実、茎、花弁、花柄、葯、柱頭、花柱、子房、花弁、萼片、心皮、根端、根冠、根毛、葉毛、種子毛、花粉粒子、小胞子、子葉、胚軸、上胚軸、木部、師部、柔組織、胚乳、伴細胞、孔辺細胞、及びその他のあらゆる既知の植物の器官、組織や細胞が含まれる。また、種子も植物に含まれる。
【００４１】
本発明の植物には、非形質転換植物と形質転換植物の両方が含まれる。「非形質転換植物」は、ゲノム内に組換えＤＮＡを含まない植物を意味する。「形質転換植物」は、ゲノム内に組換えＤＮＡを含む植物を意味する。このような形質転換植物は、植物のゲノムに組換えＤＮＡを導入して作ることができる。このような組換えＤＮＡが形質転換植物のゲノムに導入された場合、植物の子孫もこの組換えＤＮＡを含んでいる。少なくとも一代前の形質転換植物の組換えＤＮＡの少なくとも一部を含む子孫植物もまた、形質転換植物である。
【００４２】
本発明は、Ｓ４８９７と称する除草剤耐性ヒマワリ系統と、Ｓ４８９７と称するその除草剤耐性を持つその子孫と誘導体とを提供する。ヒマワリ系統Ｓ４８９７由来でＳ４８９７の除草剤耐性をもつＧＭ４０ヒマワリの種子は、ＡＴＣＣ、米国に、２００５年５月１７日に特許寄託され、そのＡＴＣＣ特許寄託番号はＰＴＡ−６７１６である。ヒマワリ系統ＧＭ４０の寄託の期間は、少なくとも３０年、また、それもＡＴＣＣによる最近の寄託サンプル提供の請求日より少なくとも５年後からの期間である。なお、寄託者は、サンプルの生存度の証明等、37C.F.R. pp1.801-1.809に記載の要求項目のすべてを満たしている。
【００４３】
本発明はまた、以下にＧＭ１６０６と称する除草剤耐性ヒマワリ系統を提供する。ヒマワリＧＭ１６０６の種子は、ＡＴＣＣ、米国の２００６年５月１９日に特許寄託され、そのＡＴＣＣ特許寄託番号はＰＴＡ−７６０６である。ヒマワリＧＭ１６０６の寄託期間は、少なくとも３０年であり、また、それもＡＴＣＣによる最も最近の寄託サンプル提供の請求日より少なくとも５年後からの期間である。なお、寄託者は、サンプルの生存度の証明等、37C.F.R. pp1.801-1.809に記載の要求項目のすべてを満たしている。
【００４４】
本発明は、突然変異育種により作られた除草剤耐性ヒマワリ植物を提供する。野生型ヒマワリ植物の突然変異は、植物を、変異原物質に、特に化学的変異原物質、さらに特にメタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）に暴露して引き起こされる。しかしながら、本発明は、化学的変異原物質ＥＭＳを用いる突然変異誘発法により作られた除草剤耐性ヒマワリに限定されるわけではない。既知の、どの突然変異誘発法を、本発明の除草剤耐性ヒマワリ植物の生産に用いてもよい。このような突然変異誘発法では、例えば、下記の変異原物質のいずれか一種以上を使用可能である。放射線、例えば、Ｘ線、γ線（例えば、コバルト６０又はセシウム１３７）、中性子、（例えば、原子炉中でのウラン２３５の核分裂によるもの）、β線（例えば、リン３２や炭素１４などの放射性同位元素から放出されるもの）、および紫外線（好ましくは、２５００〜２９００ｎｍ）、及び化学的変異原物質、例えば、塩基類似体（例えば、５−ブロモウラシル）、関連化合物（例えば、８−エトキシカフェイン）、抗生物質（例えば、ストレプトニグリン）、アルキル化剤（例えば、スルファマスタード、ナイトロジェンマスタード、エポキシド、エチレンアミン類、硫酸塩、スルホン酸塩、スルホン、ラクトン）、アジ化物、ヒドロキシルアミン、亜硝酸、アクリジン。除草剤耐性植物を、除草剤耐性変異を含む植物細胞を選抜して、それから除草剤耐性植物を再生する組織培養法により作ってもよい。例えば、米国特許５，７７３，７０２と５，８５９，３４８を参照。いずれも参照として本願明細書に組み込むこととする。突然変異性育種の更なる詳細は、「栽培品種開発の方法」Fehr、1993 Macmillan Publishing会社に、開示されており、この文献を、参照として本願明細書に組み込むこととする。
【００４５】
Ｓ４８９７とＧＭ１６０６系統のヒマワリ植物のＡＨＡＳＬ１遺伝子の分析の結果、突然変異により、配列番号４の野生型ＡＨＡＳＬ１アミノ酸配列のアミノ酸位置７のトレオニンがアラニンに置換されていることが明らかとなった。配列番号２と４のアミノ酸位置７は、配列番号１２で表されるヒマワリＡＨＡＳＬ１タンパク質の完全長アミノ酸配列のアミノ酸位置１０７に相当する。従って、本発明は、ＡＨＡＳＬタンパク質内のアミノ酸位置１０７で、またはそれに相当する位置で、アラニンを他のアミノ酸で置換することで、ヒマワリ植物のある除草剤に対する耐性が、特にイミダゾリノン除草剤及び／又はスルホニル尿素除草剤に対する耐性が増加することを示す。下記の実施例６に示されるように、アミノ酸位置１０７のアラニンは、ＡＨＡＳＬタンパク質の保存領域内に起こる。同様に、他のＡＨＡＳＬタンパク質の保存領域内でのアミノ酸置換が、このようなＡＨＡＳＬタンパク質を含む植物に除草剤耐性を付与することがわかっている。従って、本発明の除草剤耐性ヒマワリ植物は、ゲノム内にアミノ酸位置１０７又はそれに相当する位置にトレオニンを含む除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質をコードするＡＨＡＳＬポリヌクレオチドを少なくとも１コピー有するヒマワリ植物を含むが、これに限定されるわけではない。
【００４６】
本発明のヒマワリ植物は、更に、野生型ＡＨＡＳＬタンパク質と較べると、アミノ酸位置１０７又はそれに相当する位置にトレオニン又は他のアラニン以外のアミノ酸を有し、さらにそのＡＨＡＳＬタンパク質内に、野生型ＡＨＡＳＬタンパク質とは異なる他の一種以上のアミノ酸置換を有し、その結果野生型ヒマワリ植物と比較して、少なくとも一種の除草剤に対して耐性が増加している植物を含んでいる。このようなヒマワリ植物は、アミノ酸位置１０７又はそれに相当する位置にトレオニンあるいは他のアラニン以外のアミノ酸を含み、さらにアミノ酸位置１８２又はそれに相当する位置に、アラニン、トレオニン、ヒスチジン、ロイシン、アルギニン、イソロイシン、グルタミン、又はセリン；アミノ酸位置１８８又はそれに相当する位置に、イソロイシンまたはトレオニン以外のアミノ酸；アミノ酸位置１９０又はそれに相当する位置に、アスパラギン酸又はバリン；アミノ酸位置５５９又はそれに相当する位置にロイシン；及びアミノ酸位置６３８又はそれに相当する位置に、アスパラギン、トレオニン、フェニルアラニン、又はバリンからなる群から選択される、少なくとも一種のメンバーを含むＡＨＡＳＬタンパク質を含有している。
【００４７】
本発明は、本明細書に開示するヒマワリＡＨＡＳＬタンパク質の保存領域内の特定のアミノ酸位置にアミノ酸置換を有するＡＨＡＳＬタンパク質を提供する。さらに、通常の技術を有する人には、例えば、アミノ酸配列のＮ末端からアミノ酸が付加されるか除去されるかでこのようなアミノ酸位置が変化することは自明であろう。したがって、本発明は、上述の位置又はそれに相当する位置（例えば、「アミノ酸位置１０７又はそれに相当する位置」）でのアミノ酸置換を含んでいる。なお、「相当する位置」は、上述のアミノ酸位置と同様に、保存領域内の位置である。このような保存領域は、当業界では公知であり（下記表４参照）、あるいは本明細書に開示の複数配列アラインメントや他の既知の方法により決定可能である。
【００４８】
また、本発明は、少なくとも一種の除草剤に対する、特にイミダゾリノン除草剤及び／又はスルホニル尿素除草剤に対する耐性を植物に与えることがわかっているアミノ酸置換を含むＡＨＡＳＬポリペプチドを提供する。このようなＡＨＡＳＬポリペプチドとしては、例えば、アミノ酸位置１０７にトレオニンを含み、さらにアミノ酸位置１８２又はそれに相当する位置に、アラニン、トレオニン、ヒスチジン、ロイシン、アルギニン、イソロイシン、グルタミン、又はセリン；アミノ酸位置１８８又はそれに相当する位置に、イソロイシンまたはトレオニン以外のアミノ酸；アミノ酸位置１９０又はそれに相当する位置に、アスパラギン酸又はバリン；アミノ酸位置１９０又はそれに相当する位置に、アスパラギン酸又はバリン；アミノ酸位置５５９又はそれに相当する位置にロイシン；及びアミノ酸位置６３８又はそれに相当する位置に、アスパラギン、トレオニン、フェニルアラニン、又はバリンからなる群から選択される、少なくとも一種のメンバーを含むものがあげられる。本発明は更に、このようなＡＨＡＳＬポリペプチドをコードするポリヌクレオチド単離物を提供し、また、このようなポリヌクレオチドを含む発現カセット、形質転換ベクター、形質転換宿主細胞、形質転換細胞や方法を提供する。
【００４９】
本発明は、ＡＨＡＳ酵素の活性を阻害する少なくとも一種の除草剤に対する、植物、植物組織、植物細胞、あるいは他の宿主細胞の耐性あるいは許容性を増強する方法を提供する。好ましくは、このような除草剤は、イミダゾリノン除草剤、スルホニル尿素除草剤、トリアゾロピリミジン除草剤、ピリミジニルオキシベンゾエート除草剤、スルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン除草剤、あるいはこれらの混合物である。より好ましくは、イミダゾリノン除草剤、スルホニル尿素除草剤、またはこれらの混合物である。本発明のイミダゾリノン除草剤の例としては、ＰＵＲＳＵＩＴ（登録商標）（イマゼタピル）、ＣＡＤＲＥ（登録商標）（イマザピック）、ＲＡＰＴＯＲ（登録商標）（イマザモックス）、Ｓ  ＣＥＰＴＥＲ（登録商標）（イマザキン）、ＡＳ  ＳＥＲＴ（登録商標）（イマザベンツ）、ＡＲＳＥＮＡＬ登録商標）（イマザピル）、上述の除草剤の誘導体、上述の除草剤二種以上の混合物、例えば、イマザピル／イマザモックス（ＯＤＹＳＳＥＹ（登録商標））があげられる。イミダゾリノン除草剤の具体例としては、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、［２−（４−イソプロピル）−４−］［メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−３−キノリンカルボン酸、［５−エチル−２−（４−イソプロピル−］４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸、［２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−］イミダゾリン−２−イル）−５−メチルニコチン酸、及びメチル［６−（４−イソプロピル−４−］メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｍ−トルエートとメチル［２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−］オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｐ−トルエートの混合物があげられるが、これらに限定されるわけではない。５−エチル−２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸と［２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−］イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸の使用が好ましい。［２−（４−イソプロピル−４−］メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸の使用が特に好ましい。
【００５０】
本発明においては、スルホニル尿素除草剤の例として、クロルスルフロン、メトスルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチル、チフェンスルフロンメチル、トリベヌロンメチル、ベンスルフロンメチル、ニコスルフロン、エタメトスルフロンメチル、リムスルフロン、トリフルスルフロンメチル、トリアスルフロン、プリミスルフロンメチル、シノスルフロン、アミドスルフロン、フルザスルフロン、イマゾスルフロン、ピラゾスルフロンエチル、ハロスルフロン、アジムスルフロン、シクロスルフロン、エトキシスルフロン、フラザスルフロン、フルピルスルフロンメチル、ホラムスルフロン、イオドスルフロン、オキサスルフロン、メソスルフロン、プロスルフロン、スルホスルフロン、トリフロキシスルフロン、トリトスルフロン、上述の除草剤の誘導体、上述の除草剤二種以上の混合物があげられるが、これらに限定されるわけではない。本発明のトリアゾロピリミジン除草剤は、クロランスラム、ジクロスラム、フロラスラム、フルメトスラム、メトスラム、ペノクススラムを含むが、これらに限定されるわけではない。本発明のピリミジニルオキシベンゾエート除草剤としては、ビスピリバック、ピリチオバック、ピリミノバック、ピリベンゾキシム、ピリフタリドを含むが、これらに限定されるわけではない。スルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン除草剤としては、フルカルバゾンとプロポキシカルバゾンとを含むが、これらに限定されるわけではない。
【００５１】
ピリミジニルオキシベンゾエート除草剤は、一般にピリミジニルチオベンゾエート除草剤と類似しているとされ、米国雑草学会では、後者の名前で一般化されている。従って、本発明の除草剤は、更にピリミジニルチオベンゾエート除草剤を含み、その例としては、上述のピリミジニルオキシベンゾエート除草剤を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００５２】
本発明は本発明のＡＨＡＳＬ１核酸配列に、作動可能な状態で連結したプロモーターを含むポリヌクレオチドコンストラクトで植物を形質転換して、植物中のＡＨＡＳ活性を増強する方法を提供する。この方法では、本発明のポリヌクレオチドコンストラクトを少なくとも一種の植物細胞に導入し、その形質転換細胞を再生する。この方法では、植物細胞に遺伝子を発現させることの可能なプロモーターを使用する。好ましくは、このようなプロモーターは、構成的なプロモーターであるか、組織選択性プロモーターである。この方法は、ＡＨＡＳ酵素の触媒活性を阻害する少なくとも一種の除草剤、特にイミダゾリノン除草剤に対する耐性を植物に与えるのに使用される。
【００５３】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを植物、植物組織、植物細胞や他の宿主細胞に発現させるための発現カセットを提供する。この発現カセットは、本発明のポリヌクレオチドに作動可能な状態で連結した、目的の植物、植物組織、植物細胞、あるいは他の宿主細胞で発現可能な完全長タンパク質（すなわち、葉緑体輸送ペプチドを含む）あるいは、成熟したＡＨＡＳＬ１タンパク質（すなわち、葉緑体輸送ペプチドを含まない）のいずれかをコードする核酸配列を含むプロモーターを含んでいる。植物又は植物細胞のプラスチドや葉緑体で発現させる場合には、発現カセットは、作動可能な状態で連結する葉緑体輸送ペプチドをコードする葉緑体−ターゲティング配列を含んでいてもよい。
【００５４】
本発明の発現カセットは、植物又は宿主細胞の除草剤耐性を増強するのに使用される。本方法は、植物又は宿主細胞を本発明の発現カセットで形質転換するものであり、この発現カセットは、目的の植物又は宿主細胞で発現可能なプロモーターを含み、このプロモーターは、本発明のイミダゾリノン耐性のＡＨＡＳＬタンパク質をコードする核酸配列を含む本発明のポリヌクレオチドに作動可能な状態で連結している。
【００５５】
本発明において、「ポリヌクレオチドコンストラクト」とは、ＤＮＡを含むポリヌクレオチドコンストラクトに限定されるものではない。当業界の通常の技術を有するものには明らかなように、リボヌクレオチドからなる、あるいはリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドとの組合わせからなるポリヌクレオチドコンストラクト、特にポリヌクレオチドやオリゴヌクレオチドを、本明細書に開示の方法で使用してもよい。従って、本発明のポリヌクレオチドコンストラクトは、本発明の植物の形質転換方法に使用可能なすべてのポリヌクレオチドコンストラクトを含み、例えば、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、及びこれらの組合わせからポリヌクレオチドコンストラクトを含んでいる。このようなデオキシリボヌクレオチドやリボヌクレオチドは、天然に存在する分子と合成類縁体の両方を含んでいる。本発明のポリヌクレオチドコンストラクトはまた、あらゆる形のポリヌクレオチドコンストラクトを含み、具体的には、一本鎖、二本鎖、ヘアピン、ステム・ループ構造などを含むが、これらに限定されるわけではない。さらに、当業界の通常の技術を有するものには明らかなように、本明細書に開示される各核酸配列は、例示の核酸配列の相補配列を含んでいる。
【００５６】
本発明の方法では、形質転換植物内で、少なくとも一種のタンパク質、あるいは少なくとも一種のＲＮＡの発現、例えば、あるｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的なアンチセンスＲＮＡの発現を指揮可能なポリヌクレオチドコンストラクトを使用することができる。典型的には、このようなポリヌクレオチドコンストラクトは、５’及び３’転写調節領域に作動可能な状態で連結するタンパク質又はＲＮＡのコード配列を有している。また、本発明の方法において、形質転換植物においてタンパク質あるいはＲＮＡの発現を指揮できないポリヌクレオチドコンストラクトを使用してもよい。
【００５７】
更に、目的の宿主細胞内で本発明のポリヌクレオチドを発現させるには、このポリヌクレオチドは、通常、典型的に目的の宿主細胞において遺伝子発現を実施可能なプロモーターに、作動可能な状態で連結している必要がある。宿主細胞内でポリヌクレオチドを発現させる本発明の方法は、特定のプロモーターに依存するわけではない。本方法は、目的の宿主細胞において遺伝子発現を実施可能な、既知のいずれのプロモーターを用いてもよい。
【００５８】
本発明の範囲内には、ＡＨＡＳＬポリヌクレオチド分子とそのフラグメントや変異体が含まれている。これらの核酸配列のフラグメントであるポリヌクレオチド分子も、本発明の範囲に含まれる。「フラグメント」とは、本発明のＡＨＡＳＬタンパク質をコードする核酸配列の一部をいう。本発明のＡＨＡＳＬ核酸配列のフラグメントは、ＡＨＡＳＬタンパク質の生物学的な活性部位をコードしていてもよいし、以下の方法を用いてハイブリダイゼーションプローブやＰＣＲプライマーとして使用可能なフラグメントであってもよい。ＡＨＡＳＬタンパク質の生物学的な活性部位は、本発明のＡＨＡＳＬ核酸配列の一部を単離し、ＡＨＡＳＬタンパク質がコードされた部分を発現し（例えば、生体外での組換え）、ＡＨＡＳＬ１タンパク質のコードされた部分の活性を測定することで得られる。ＡＨＡＳＬ核酸配列のフラグメントであるポリヌクレオチド分子には、ヌクレオチド数が少なくとも約１５、２０、５０、７５、１００、２００、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、又は１１００のヌクレオチド、あるいは、使用目的によっては、本明細書に開示の完全長核酸配列中に存在するヌクレオチド数（例えば、配列番号１と３の場合、いずれも１１７８ヌクレオチド）であってもよい。
【００５９】
本発明のＡＨＡＳＬタンパク質の生物学的な活性部位をコードするＡＨＡＳＬ核酸配列のフラグメントは、少なくとも約１５、２５、３０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、又は３５０のアミノ酸鎖であり、最大では本発明の完全長ＡＨＡＳＬ１タンパク質アミノ酸のアミノ酸数（例えば、配列番号２と４の場合いずれも３９２アミノ酸）である。ＰＣＲプライマーのハイブリダイゼーションプローブとして有用なＡＨＡＳＬ１核酸配列のフラグメントは、一般にＡＨＡＳＬ１タンパク質の生物学的活性部位をコードしている必要はない。
【００６０】
本明細書に開示の核酸配列の変異体であるポリヌクレオチド分子も本発明の範囲に含まれる。本発明のＡＨＡＳＬ核酸配列の「変異体」には、本明細書に開示のＡＨＡＳＬタンパク質をコードするが遺伝暗号の縮重のため保存的に異なる配列も含まれる。自然に発生する対立変異体は、既知の分子生物学的方法を用いて、例えば以下に記載のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）やハイブリダイゼーション技術を用いて同定が可能である。変異体核酸配列には、合成的に作成した核酸配列も含まれ、例えば、部位特異的突然変異が含まれる。後述のように、これらは、なお本発明で開示されるＡＨＡＳＬ１タンパク質をコードしている。一般に、本発明の核酸配列変異体は、本明細書に開示の特定の核酸配列に対して、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同である。ＡＨＡＳＬ核酸配列変異体は、本明細書に開示のＡＨＡＳＬタンパク質アミノ酸配列に対して、アミノ酸配列が約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％相同であるＡＨＡＳＬタンパク質をコードしていることとなる。
【００６１】
また、熟練者には公知のように、突然変異により本発明の核酸配列に変化を起こさせ、ＡＨＡＳＬタンパク質の生物活性を変化させることなく、コードするＡＨＡＳＬタンパク質のアミノ酸配列に変化を起こすことができる。従って、ＡＨＡＳＬタンパク質をコードする、配列番号１又は３とは異なる配列を有するポリヌクレオチド分子単離物は、それぞれ、本明細書に開示の核酸配列中に一種以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を起こして、コードするタンパク質に一種以上のアミノ酸置換、付加又は欠失を引き起こすことにより得られる。突然変異は、標準的な方法で、例えば部位特異的突然変異やＰＣＲ法による突然変異で実施される。このような変異体核酸配列も、本発明の範囲に含まれる。
【００６２】
例えば、好ましくは、保存的なアミノ酸置換は、一箇所以上の予知された、好ましくは非必須のアミノ酸残基において行う。「非必須の」アミノ酸残基とは、生物活性を変えることなく、ＡＨＡＳＬタンパク質の野生型配列から変更可能な残基をいい（例えば、配列番号２と４の配列）、一方「必須の」アミノ酸残基は、生物活性に必要である。「保存的なアミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の側鎖を持つアミノ酸で置換されることをいう。類似側鎖をもつアミノ酸残基のグループが定義されている。これらのグループとしては、塩基性側鎖を持つアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖をもつアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷の極性側鎖をもつアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性の側鎖を持つアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝の側鎖をもつアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖を持つアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）があげられる。このような置換は、保存的なアミノ酸残基では、保存的なグループのアミノ酸残基では行われないであろう。
【００６３】
本発明のタンパク質は、アミノ酸置換や欠失、切断、挿入などいろいろな方法で変異させられる。このような方法は、当業界では公知である。例えば、ＡＨＡＳＬタンパク質のアミノ酸配列変異体は、ＤＮＡの突然変異により作られる。突然変異誘発方法や核酸配列の変異方法は、業界公知である。例えば、Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad Sci. USA 82:488-492;Kunkel et al., (1987)、Methods in Enzymol. 154:367-382；米国特許４，８７３，１９２；Walker and Gaastra、eds. (1983) Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company, New York）、およびその引用文献。目的のタンパク質の生物活性に悪影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換のガイダンスが、Ｄａｙｈｏｆｆらのモデル(1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found.、Washington、D.C.)に開示されている。これを、参照として本願明細書に組み込むこととする。保存的な置換、例えばあるアミノ酸と類似の性質をもつ他のアミノ酸との置換が好ましいであろう。
【００６４】
また、ＡＨＡＳＬ核酸配列変異体は、ＡＨＡＳＬコード配列の全部又は一部に沿って、例えば飽和突然変異によりランダムに突然変異を起こすことで得られる。得られた変異体を、ＡＨＡＳ活性を指標にスクリーニングして、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を含む、ＡＨＡＳ活性を保有するものを同定する。突然変異の後に、コードされたタンパク質は、組換え的に発現され、そのタンパク質の活性が、標準的な分析方法を用いて決定される。
【００６５】
このように、本発明の核酸配列は、本明細書に開示の配列、ならびにそれらのフラグメントや変異体を含んでいる。本発明のＡＨＡＳＬ核酸配列やそれらのフラグメントや変異体は、ＡＨＡＳＬ同族体を同定及び／又はクローン化するためのプローブ及び／又はプライマーとして使用可能である。このようなプローブは、同一のタンパク質をコードする転写物やゲノム配列を検出するのに使用できる。
【００６６】
このように、ＰＣＲやハイブリダイゼーションなどの方法を、このような配列が本発明の配列とどれほど一致するかを検証するのに使用できる。例えば、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY) and Innis, et al (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY) 参照。本明細書に規定するＡＨＡＳＬ１核酸配列あるいはそのフラグメントや変異体との一致を元に単離されたＡＨＡＳＬ核酸配列もまた、本発明の範囲に含まれる。
【００６７】
ハイブリダイゼーション法においては、既知のＡＨＡＳＬ核酸配列の全部又は一部を用いて、ｃＤＮＡライブラリーあるいはゲノムライブラリをスクリーニングすることができる。このようなｃＤＮＡライブラリーやゲノムライブラリーの作成方法は、一般には公知であり、例えば、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY)に開示されている。いわゆるハイブリダイゼーションプローブは、ゲノムのＤＮＡフラグメント、ｃＤＮＡフラグメント、ＲＮＡフラグメント、あるいは他のオリゴヌクレオチドであってもよく、また、検出可能な基、例えば３２Ｐや、放射性同位元素や蛍光化合物、酵素、補酵素などの他の検出可能マーカーで標識されていてもよい。ハイブリダイゼーション用プローブは、既知の本明細書に開示のＡＨＡＳＬ核酸配列をもとに作った合成オリゴヌクレオチドを標識することで合成できる。既知のＡＨＡＳＬ核酸配列あるいはコードされたアミノ酸配列中の保存性のヌクレオチドやアミノ酸残基をもとにデザインされた縮重プライマーを用いてもよい。このプローブは、典型的には、ストリンジェントな条件で本発明のＡＨＡＳＬ核酸配列あるいはそのフラグメントや変異体の少なくとも約１２個の、好ましくは約２５個の、より好ましくは約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、あるいは１１７８個の連続するヌクレオチドにハイブリダイズする核酸配列の領域を有している。ハイブリダイゼーション用プローブの製造方法は一般に公知であり、例えば、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)に記載されている。これを、参照として本願明細書に組み込むこととする。
【００６８】
例えば、本明細書に開示のＡＨＡＳＬ配列全体あるいはその一部を、相当するＡＨＡＳＬ配列やｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズ可能なプローブとして使用することができる。ハイブリダイゼーション技術には、プレート状ＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングを含む（プラークまたはコロニー；例えば、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York参照）。
【００６９】
このような配列のハイブリダイゼーションを、ストリンジェントな条件下で行ってもよい。「ストリンジェントな条件」あるいは「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、プローブが、他の配列より検出可能な程度大きく、標的配列にハイブリダイズする（例えば、少なくともバックグランドの二倍）ことを意味する。ストリンジェントな条件は配列に依存し、状況により異なる。
【００７０】
ストリンジェントな条件では、典型的には、塩濃度が約１．５ＭＮａイオンであり、典型的には約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（あるいは他の塩類）で、ｐＨが７．０〜８．３で、温度は、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）では少なくとも約３０℃、長いプローブでは（例えば、５０ヌクレオチド超）、少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件を、ホルムアミドなどの不安定化剤を入れて作ってもよい。例えば、低ストリンジェント条件では、３０〜３５％ホルムアミド、１ＭＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）で３７℃の緩衝液と１Ｘ〜２ＸのＳＳＣ（２０ＸＳＳＣ  ＝  ３．０ＭＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）で５０〜５５℃の洗浄液を用いてハイブリダイゼーションを行う。例えば、中ストリンジェント条件では、４０〜４５％のホルムアミド、１．０ＭＮａＣｌ、１％ＳＤＳで３７℃の液と、０．５Ｘ〜１ＸのＳＳＣで５５〜６０℃の洗浄系を用いてハイブリダイゼーションを行う。高いストリンジェント条件では、５０％ホルムアミド、１ＭＮａＣｌ、１％ＳＤＳで３７℃の液と、０．１ＸＳＳＣで６０〜６５℃の洗浄液でハイブリダイゼーションを行う。洗浄用バッファーは、約０．１％〜約１％のＳＤＳをさらに含んでいてもよい。ハイブリダイゼーションの時間は、一般に約２４時間未満であり、普通約４〜約１２時間である。
【００７１】
特異性は、一般にハイブリダイゼーション後の洗浄に依存し、最終洗浄液のイオン強度と温度が非常に重要である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの場合、そのＴｍは、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｈｌの式で近似される。Meinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem, 138:267-284：Tm = 81.5℃+ 16.6 (log M)+ 0.41 (%GC) - 0.61 (% form) - 500/L；なお、式中、Ｍは、一価のカチオンのモル濃度であり、％ＧＣは、グアノシンとシトシンヌクレオチドのパーセントであり、％ｆｏｒｍは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの比率であり、Ｌは、ハイブリッドの塩基対の数である。Ｔｍは、相補的な標的配列の５０％が完全に適合するプローブにハイブリダイズする温度（特定のイオン強度とｐＨ下での）である。１％のミスマッチごとに、Ｔｍは約１℃低下する。したがって、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション、及び／又は洗浄条件は、調整して、目的の配列にハイブリダイズさせることができる。例えば、＞９０％が同一の配列が必要な場合、Ｔｍを１０℃下げることができる。一般に、ストリンジェントな条件では、温度が特定のイオン強度とｐＨでの、特異的な配列とその補体の熱的な融点（Ｔｍ）より約５℃下に、設定される。しかしながら、激しくストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を熱的な融点（Ｔｍ）より１、２、３、あるいは４℃下で行い、中程度にストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を熱的な融点（Ｔｍ）より６、７、８、９、あるいは１０℃下で行い、低度にストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を熱的な融点（Ｔｍ）より１１、１２、１３、１４、１５、あるいは２０℃下で実施する。上記の式やハイブリダイゼーション及び洗浄組成、目的のＴｍを用いれば、通常の技術を有する人は、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄液の厳密性の変動が、もともと存在することを容易に理解できる。好ましいミスマッチの程度が、４５℃未満の（水溶液）あるいは３２℃未満（ホルムアミド溶液）のＴｍに相当する場合、ＳＳＣ濃度をあげて高温が使えるようにすることが好ましい。核酸ハイブリダイゼーションについては、以下に詳細に記載されている。Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York); and Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York). Sambrookなど(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York）参照。
【００７２】
本発明のポリヌクレオチド分子とタンパク質の範囲には、配列番号１及び／又は３の核酸配列、あるいは配列番号２及び／又は４のアミノ酸配列と十分に一致するヌクレオチドあるいはアミノ酸配列を含むポリヌクレオチド分子やタンパク質が含まれる。用語「十分に一致する」とは、第一のアミノ酸あるいは核酸配列が、十分な数のあるいは最小数の、第二のアミノ酸あるいは核酸配列と同一の又は類似の（例えば、類似側鎖を持つ）アミノ酸残基またはヌクレオチドをもち、第一と第二のアミノ酸あるいは核酸配列が通常の構造領域及び／又は通常の機能活性を持つことを意味する。例えば少なくとも約４５％、５５％、または６５％の同一性、好ましくは７５％の同一性、より好ましくは８５％、９５％、又は９８％の同一性をもつ通常の構造領域を含むアミノ酸あるいは核酸配列を、本明細書において十分に一致するという。
【００７３】
二種のアミノ酸配列あるいは二種の核酸配列間の同一性の比率を決めるには、これらの配列を、比較のために並べる。二種の配列間の同一性比率は、これらの配列間で共有される同一位置の数の関数である。（即ち、同一性比率＝同一位置の数／全位置の数（例えば、重複位置の数）ｘ１００）。ある実施様態においては、二種の配列の長さが同じである。二種の配列間の同一性比率は、ギャップがあってもなくても、以下に記載したものと同様な方法を用いて決めることができる。同一性比率の計算に当たり、通常、正確な一致数が数えられる。
【００７４】
二種の配列間の同一性比率は、数学的アルゴリズムでもって得られる。二種の配列の比較に用いられる数学的なアルゴリズムの好ましい例として、Karlin and Altschulのアルゴリズム、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad、Sci. USA 87:2264、modified as in Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:5873-5877.があげられるが、これに限定されるわけではない。このようなアルゴリズムは、ＡｌｔｓｃｈｕｌらのＮＢＬＡＳＴプログラムやＸＢＬＡＳＴプログラム、Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403、に組み込まれている。本発明のポリヌクレオチド分子に相同の核酸配列を得るのに、スコア＝１００で、ワード長＝１２で、ＮＢＬＡＳＴプログラムを用いてＢＬＡＳＴヌクレオチド検索がされる。スコア＝５０、ワード長＝３で、ＸＢＬＡＳＴプログラムを用いて、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を行い、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を求めてもよい。
【００７５】
比較用のギャップを含むアラインメントを得るために、ギャップドＢＬＡＳＴを用いてもよいAltschul el al., (1997) nucleic Res. 25 :3389.また、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いて、分子間の離れた関係を検出する繰返し検索を行ってもよい。Ａｌｔｓｃｈｕｌなど（１９９７）前出参照。ＢＬＡＳＴやギャップドＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合、それぞれのプログラムのデフォルト値（例えば、ＸＢＬＡＳＴとＮＢＬＡＳＴ）を使用することができる。http://wvw.ncbi.nim.nih.gov．参照。配列比較に使用される数学的アルゴリズムの他の好ましい非制限的な例はＭｙｅｒｓとＭｉｌｌｅｒのアルゴリズムMyers and Miller (1988) CABIOS4: 11-17、である。このようなアルゴリズムは、ＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０）に組み込まれ、このプログラムはまた、ＧＣＧ配列アラインメント・ソフトウェアパッケージの一部でとなっている。アミノ酸配列の比較にＡＬＩＧＮプログラムを使用する場合、PAM120 weight residue table、gap length penalty 12、gap penalty 4を用いることができる。アラインメントはまた検査により手動で行うこともできる。
【００７６】
特記しない場合、本明細書の配列同一性／類似性値は、ソフトウェアパッケージベクター  NTI Suite Version 7に（インフォマックス社、米国）に含まれるＡｌｉｇｎＸプログラム、あるいは他のいずれかの同等のプログラムを用いて、デフォルト値を用い、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Nucleic Acid Research、22(22):4673-4680, 1994）により、本発明の完全長配列と複数のアラインメントを巣かって得た値である。「同等のプログラム」とは、目的の二種の配列に対して、ソフトウェアパッケージVector NTI Suite Version 7でＡｌｉｇｎＸにより作られた相当するアラインメントと比較して同一のヌクレオチド又はアミノ酸基マッチングと同一の配列同一性比率を持つアラインメントを発生させる何らかの配列比較プログラムである。
【００７７】
本発明のＡＨＡＳＬ核酸配列は、自然にできる配列及び変異体、特にＡＨＡＳＬ除草剤耐性ＡＨＡＳを有するタンパク質をコードする変異体の両方を含む。同様に、本発明のタンパク質の範囲には、自然にできるタンパク質およびその変異体が含まれる。このような変異体は、目的のＡＨＡＳ活性を保持している。明らかに変異体をコードするＤＮＡが、リーディングフレームから配列が出発するのでなく、ｍＲＮＡ構造を形成する相補的な領域を作らないように、突然変異を行う必要がある。ＥＰ特許出願Ｎｏ．７５，４４４、参照。
【００７８】
本明細書に含まれるタンパク質配列の欠失や挿入、置換は、タンパク質の性質の大きな変化をもたらすものではない。しかしながら、事前にこの置換や欠失、挿入の影響を正確に予測することが難しい場合には、当業界の熟練者は、この影響がルーチンなスクリーニングアッセイで評価可能であることを知っている。すなわち、この活性を、ＡＨＡＳ活性アッセイで評価可能である。例えば、Singh et al. (1988) Anal. Biochem. 171 : 173-179を参照。これを、参照として本願明細書に組み込むこととする。
【００７９】
変異体の核酸配列やタンパク質の範囲には、変異誘発や遺伝子組み換え手法、例えばＤＮＡシャフリングなどに由来する配列やタンパク質が含まれる。このような方法で、一種以上の異なるＡＨＡＳＬコード配列を操作して、望ましい性質を持つ新たなＡＨＡＳＬタンパク質を作ることができる。このように、かなりの配列同一性を有し生体外及び生体内で相同的に組換え可能な配列領域を持つ関連配列のポリヌクレオチド群から、組換え体ポリヌクレオチドのライブラリーが作成される。例えば、アプローチを用いて、目的の領域をコードする配列モチーフを本発明のＡＨＡＳＬ遺伝子と他の既知のＡＨＡＳＬ遺伝子との間でシャフルして、改善されたタンパク質、例えば酵素の場合Ｋｍが増加した酵素をコードする新しい遺伝子を得ることができる。このようなＤＮＡシャフリングの方法は、公知である。例えば、Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad Sci. USA 91: 10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389- 391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391 :288-291；及び米国特許５，６０５，７９３及び５，８３７，４５８を参照。
【００８０】
本発明の核酸配列を、相当する配列を、他の生物体、特に他の植物、さらに特に他の双子葉植物からの分離に使用できる。このように、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションなどの方法を上記の配列に対する配列相同性をもとに、このような配列の同定に使用できる。上記ＡＨＡＳＬポリヌクレオチド配列全体、あるいはそのフラグメントへの配列同一性により単離された配列も、本発明の範囲に含まれる。従って、ＡＨＡＳＬタンパク質をコード本明細書に開示の配列またはそのフラグメントにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチド配列も、本発明の範囲に含まれる。
【００８１】
ＰＣＲ法では、興味のある植物から抽出されたｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡから相当するＤＮＡ配列をＰＣＲ反応で増幅するために、オリゴヌクレオチドプライマーを設計する。ＰＣＲプライマーやＰＣＲクローニングを設計する方法は公知であり、例えば、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York）に開示されている。これ以外にも、以下を参照。Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York);Innis and Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); and Innis and Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York).既知のＰＣＲ法の例としては、ペアードプライマー、ネステッドプライマー、単一の特異性プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分ミスマッチプライマーなどを使用する方法が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００８２】
本発明のＡＨＡＳＬポリヌクレオチド配列は、目的の植物中で発現させるための発現カセットとして提供される。このカセットは、本発明のＡＨＡＳＬポリヌクレオチド配列に．作動可能な状態で連結する５’及び３’制御配列を含んでいる。「作動可能な状態で連結する」とは、プロモーターと第二の配列の間の機能的な結合をいい、この状態では、プロモーター配列が、第二の配列に相当するＤＮＡ配列の転写を開始させ仲介する。一般に、作動可能な状態で連結するとは、連結される核酸配列が互いに近接していること、二個のタンパク質コード領域を連結する必要がある場合は、これらの配列が近接して同一のリーディングフレーム中に存在していることを意味する。このカセットは、生物体に一緒に形質転換される少なくとも一個の他の遺伝子を含んでいてもよい。また、この追加の遺伝子（群）が、複数の発現カセットで提供されてもよい。
【００８３】
このような発現カセットは、ＡＨＡＳＬポリヌクレオチド配列の挿入が制御領域の転写制御下に行われるよう複数の制限酵素認識部位を有していてもよい。この発現カセットは、さらに適当な標識遺伝子を有していてもよい。
【００８４】
この発現カセットは、転写の５’から３’方向に、植物内で機能する転写及び翻訳開始領域（即ち、プロモーター）と、本発明のＡＨＡＳＬポリヌクレオチド配列と、転写及び翻訳終止領域（即ち、終止領域）を有している。このプロモーターは、宿主植物及び／又は本発明のＡＨＡＳＬポリヌクレオチド配列に対して天然または類似のものであっても、外来性又は異種のものであってもよい。また、このプロモーターは、自然配列であっても合成配列であってもよい。プロモーターが、宿主植物にとって「外来性」又は「異種」であるとは、このプロモーターが、導入される天然の植物中に見られないことを意味する。プロモーターが、本発明のＡＨＡＳＬポリヌクレオチド配列に対して「外来性」あるいは「異種」であるとは、このプロモーターが、本発明のＡＨＡＳＬポリヌクレオチド配列に作動可能な状態で連結することのできる天然のあるいは自然にできるプロモーターでないことを意味する。本明細書中、キメラ遺伝子とは、コード配列には非相同である転写開始領域に作動可能な状態で連結するコード配列を含んでいる。
【００８５】
異種のプロモーターを用いて本発明のＡＨＡＳＬポリヌクレオチドを発現することが好ましいかもしれないが、天然のプロモーター配列を使用することもできる。このようなコンストラクトは、植物又は植物細胞中でのＡＨＡＳＬタンパク質の発現レベルを変化させることとなる。この結果、植物又は植物細胞の表現形が変化する。  
この終止領域は、転写開始領域にもともと対応していたものでもよいし、作動可能な状態で連結する目的のＡＨＡＳＬ配列に対応するものでもよいし、宿主植物に対応するものでもよいし、他の原料（即ち、プロモーター、目的のＨｉｓ−ＡＨＡＳＬポリヌクレオチド配列、宿主植物、あるいはこれらの組合わに対して外来性あるいは異種である原料）由来のものであってもよい。好適な終止領域を、例えばオクトピンシンターゼ終止領域やノパリンシンターゼ終止領域を、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドから得ることができる。Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262: 141-144; Proudfoot (1991) Cell64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; and Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639、参照。
【００８６】
適当なら、形質転換細胞中での発現を増加させるために、遺伝子（類）を最適化させてもよい。つまり、発現を増加させるため、植物選択性コドンを用いてこの遺伝子を合成してもよい。例えば、Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol. 92: 1- 11 for a discussion of host-preferred codon usage.参照。植物選択性遺伝子を合成する方法は、公知である。例えば、米国特許５，３８０，８３１及び５，４３６，３９１、及びMurray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498を参照。これを、参照として本願明細書に組み込むこととする。
【００８７】
さらに配列を修飾して、細胞性宿主での遺伝子発現を増強することもできる。このような修飾には、偽ポリアデニル化シグナル、エキソン−イントロンスプライス部位シグナル、トランスポゾン様反復配列、他の遺伝子発現に有害であるかもしれない既知配列などの配列の除去が含まれる。特定の細胞性宿主に対して、配列のＧＣ含量を、この宿主細胞で発現される既知遺伝子を参考にして、平均的な値に調整してもよい。可能なら、ヘアピン状の二次的なｍＲＮＡ構造が予想されるなら、それを避けるように配列を修飾してもよい。
【００８８】
遺伝子発現を増強する核酸配列を、植物発現ベクター内に使用してもよい。このような配列としては、トウモロコシのイントロンＡｄｈＩ，イントロン遺伝子（Callis et al. Genes and Development 1 : 1183- 1200, 1987）、およびタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、トウモロコシクロロティックモトルウイルスやアルファルファモザイクウイルスのリーダー配列（Ｗ配列）（Gallie et al. Nucleic Acid Res. 15:8693-8711, 1987 and Skuzeski et al. Plant Mol.Biol. 15:65-79, 1990）が含まれる。トウモロコシのｓｈｒｕｎｋｅｎ−１遺伝子座の第一イントロンが、キメラの遺伝子コンストラクト中の遺伝子の発現を増加させるのに有効であった。米国特許５，４２４，４１２と５，５９３，８７４は、遺伝子発現コンストラクト中での特定のイントロンの使用を開示しており、Ｇａｌｌｉｅら（Plant Physiol. 106:929-939, 1994）は、組織特異性のために、遺伝子発現を調整するうえでイントロンが有用であることを示している。ＡＨＡＳ大サブユニットの遺伝子発現を更に増強し最適化するために、本発明の植物発現ベクターは、マトリックス結合領域（ＭＡＲ）を含むＤＮＡ配列を含んでいてもよい。このように修飾された発現系を用いて植物細胞を形質転換すると、本発明の核酸配列が、過剰発現されたり、恒常的に発現される場合がある。
【００８９】
この発現カセットは、さらに発現カセットコンストラクト中に５’リーダー配列を有していてもよい。このようなリーダー配列が翻訳を増強することもある。翻訳リーダー配列は既知であり、その例としては、ピコルナウイルスリーダー、例えば、ＥＭＣＶリーダー  （脳心筋炎５’非翻訳領域）  （Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6126-6130）；ポティウイルスリーダー、例えば、ＴＥＶリーダー  （タバコ・エッチ・ウイルス）  （Gallie et al. (1995) Gene 165(2):233-238）、ＭＤＭＶリーダー  （トウモロコシ矮化モザイクウイルス）（Virology 154:9-20）、および、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）（Macejak et al. (1991) Nature 353 :90-94）；アルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ  ＲＮＡ  ４）のコートタンパク質ｍＲＮＡの非翻訳リーダー（Jobling et al. (1987) Nature 325:622-625）；タバコモザイクウイルスリーダー  （TMV) (Gallie et al. (1989) in Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, New York), pp. 237-256）；及びトウモロコシ・クロロティックモトル・ウイルス・リーダー  （ＭＣＭＶ）  （Lommel et al. (1991) Virology 81 :382-385）が挙げられる。Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol 84:965-968も参照。他の翻訳を加速する方法、例えばイントロンを利用してもよい。
【００９０】
発現カセットの作成に当たり、適当なリーディングフレーム内に適当な立体配置でＤＮＡ配列を与えるように、種々のＤＮＡフラグメントを修飾してもよい。この目的のために、ＤＮＡフラグメントを結合させるのにアダプターやリンカーを使用してもよいし、他の操作を行って、適当な制限酵素認識部位を作ったり、不要なＤＮＡを除いたり、制限酵素認識部位を除いたりすることができる。この目的のために、インビトロの突然変異誘発、プライマーの修復、制限、アニーリング、再置換、例えば転移や塩基転換を行ってもよい。
【００９１】
本発明の実施に当たり、多くのプロモーターが使用可能である。目的とする成果をもとに、これらのプロモーターは選択される。植物での発現において、これらの核酸を、他の構成的で組織選択性のプロモーターとともに用いてもよい。
【００９２】
このような構成的プロモーターとしては、Ｒｓｙｎ７プロモーターのコアプロモーターや他の構成的なプロモーター（ＷＯ９９／４３８３８及び米国特許６，０７２，０５０）；コアＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（Odell et al. (1985) Nature 313 :810-812）；コメアクチン（McElroy et al. (1990) Plant Cell 2: 163-171）；ユビキチン（Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 and Christensen et al (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689);PEMU Christensen et al (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588);MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730）；ＡＬＳプロモーター（米国特許５，６５９，０２６）、などがあげられる。他の構成的なプロモーターとしては、例えば、米国特許５，６０８，１４９；５，６０８，１４４；５，６０４，１２１；５，５６９，５９７；５，４６６，７８５；５，３９９，６８０；５，２６８，４６３；５，６０８，１４２；及び６，１７７，６１１に記載のものがあげられる。
【００９３】
特定の植物組織内において、ＡＨＡＳＬ１発現を増強するのに、組織選択性プロモーターを用いてもよい。このような組織選択性プロモーターの例としては、葉選択性プロモーター、根選択性プロモーター、種子選択性プロモーター、や茎選択性プロモーターがあげられる。組織選択性プロモーターには、Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255-265;Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803;Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2): 157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3): 1331- 1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524; Yamamoto et al (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773- 778;Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 181-196; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23(6): 1129-1138; Matsuoka et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590;及びGuevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3):495-505に記載のものがあげられる。このようなプロモーターを、必要なら、発現を低下させるように修飾してもよい。
【００９４】
ある実施様態においては、目的の核酸の発現目標は葉緑体である。このように、目的の核酸が直接的に葉緑体に挿入されない場合、葉緑体に目的の遺伝子産物を発現させるために、発現カセットは、葉緑体輸送ペプチドをコードする核酸配列を含む葉緑体−ターゲティング配列を含んでいてもよい。このような輸送ペプチドは公知である。葉緑体−ターゲティング配列に関して、「作動可能な状態で連結する」とは、輸送ペプチドをコードする核酸配列（即ち、葉緑体−ターゲティング配列）を、本発明のＡＨＡＳＬポリヌクレオチドに結合させて、両配列が互いに近接して同じリーディングフレーム内に存在するようにすることである。例えば、Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126;Clark et al. (1989) 7. Biol. Chem. 264: 17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem, Biophys. Res. Commun. 196: 1414-1421; and Shah et al. (1986) Science 233:478-481を参照。本発明のＡＨＡＳＬタンパク質は天然の葉緑体輸送ペプチドを含むが、本発明の成熟ＡＨＡＳＬタンパク質をコードする核酸配列の５’末端に、葉緑体ターゲティング配列を作動可能な状態で連結することにより、どのような既知の葉緑体輸送ペプチドも、成熟した本発明のＡＨＡＳＬタンパク質のアミノ酸配列に連結可能である。
【００９５】
葉緑体ターゲティング配列は公知であり、そのような例としては、リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）の葉緑体小サブユニット（de Castro Silva Filho et al. (1996) Plant Mol. Biol 30:769-780; Schnell et al. (1991) J. Biol. Chem. 266(5): 3335-3342)；５−（エノールピルビル）シキミ酸の−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）（Archer et al. (1990)J. Bioenerg, Biomemb. 22(6):789-810）；トリプトファンシンターゼ（Zhao et al (1995) J. Biol Chem. 270(11):6081-6087）；プラストシアニン（Lawrence et al (1997) J. Biol. Chem. 272(33):20357-20363）；  コリスミ酸シンターゼ（Schmidt et al (1993) J. Biol. Chem. 268(36):27447-27457）；及び集光性クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質（ＬＨＢＰ）（Lamppa et al (1988) J. Biol. Chem. 263: 14996-14999).また、Von Heijne et al. (1991)Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126; Clark et al. (1989) J. Biol Chem. 264:17544- 17550; Della-Cioppa et al (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1414-1421; and Shah et al. (1986) Science 233:478-481を参照。
【００９６】
葉緑体の形質転換方法は公知である。例えば、Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad Set USA 87:8526-8530; Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab and Maliga (1993) EMBO J. 12:601- 606を参照。この方法は、選択マーカーを含むＤＮＡを粒子ガンを用いてプラスチドゲノムに供給して相同的組換えを起こすものである。また、プラスチドの形質転換は、核にコードされプラスチドで指令されるＲＮＡポリメラーゼの組織選択な発現による、プラスチド上に存在する導入沈黙遺伝子のトランス活性化を伴うことがある。このような系は、McBride et al (1994) Proc. Natl. Acad Sci. USA 91 :7301-7305で報告されている。
【００９７】
植物核とこの細胞小器官との間でコドン使用に差があるかどうかを説明するために、葉緑体に導入しようとする目的の核酸を、葉緑体での発現に適すように最適化することも可能である。このように、目的の核酸を、葉緑体選択性コドンを用いてつくることも可能である。例えば、米国特許５，３８０，８３１参照。これを、参照として本願明細書に組み込むこととする。
【００９８】
上述のように、本発明のＡＨＡＳＬ核酸配列除草剤許容性のＡＨＡＳＬタンパク質をコードする遺伝子をゲノム中の持つ植物の除草剤耐性を増加させるのに使用される。このような遺伝子は、内在性遺伝子であっても、導入遺伝子であってもよい。また、いくつかの実施様態においては、望ましい表現型の植物を作成するのに、本発明の核酸配列を、さらに他の興味あるポリヌクレオチド配列と組合わせてもよい。例えば、本発明のポリヌクレオチドを、殺虫活性をもつポリペプチドをコードしている他のポリヌクレオチド、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素タンパク質（米国特許５，３６６，８９２；５，７４７，４５０；  ５，７３７，５１４；５，７２３，７５６；  ５，５９３，８８１；及びGeiser et al. (1986)Gene 48:109）、と連結してもよい。このような組合わせには、興味のあるポリヌクレオチドのいずれかの複数コピーも含まれる。
【００９９】
これらの核酸配列を用いて、上記ＡＨＡＳＬポリヌクレオチド配列のｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的なアンチセンスを作成することができる。アンチセンスヌクレオチドは、相当するｍＲＮＡにハイブリダイズするように作成される。アンチセンス配列は、その配列がｍＲＮＡにハイブリダイズしその発現を阻害する限り、いかようにも修飾可能である。このように、相当する配列に、７０％、好ましくは８０％、より好ましくは８５％、配列相同性を示すアンチセンスコンストラクションが使用可能である。さらに、このようなアンチセンスヌクレオチドの一部を使って、標的遺伝子の発現を乱すこともできる。一般に、少なくとも５０ヌクレオチドの、１００ヌクレオチドの、２００ヌクレオチドの、あるいはそれ以上のヌクレオチドの配列が使用される。
【０１００】
本発明の核酸配列を、植物内での内在性遺伝子の発現を抑制するために、センスオリエンテーション内で用いてもよい。センスオリエンテーションの核酸配列をもちいる植物の遺伝子発現抑制方法は公知である。これらの方法では一般に、内在性の遺伝子の転写物に相当する．核酸配列の少なくとも一部に作動可能な状態で連結している、植物内で発現を引き起こすプロモーターを含むＤＮＡコンストラクトで、植物を処理する。典型的に、このような核酸配列は、内在性遺伝子の転写物の配列に対してかなりの大きな配列相同性をもち、好ましく約６５％を超える配列同一性、より好ましくは約８５％を超える配列同一性、さらに好ましくは約９５％をこえる配列同一性を有している。米国特許５，２８３，１８４と５，０３４，３２３を参照。これを、参照として本願明細書に組み込むこととする。
【０１０１】
本発明の除草剤耐性ＡＨＡＳＬ１ポリヌクレオチドは、植物形質転換用の選択マーカー遺伝子として使用可能であるが、本発明の発現カセットは、さらに他の形質転換細胞選択用選択マーカー遺伝子を含んでいてもよい。本発明の選択マーカー遺伝子も含め、これらの遺伝子は、形質転換細胞又は組織の選択に利用される。標識遺伝子の例としては、抗生物質耐性をコードする遺伝子、例えばネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ネオ）やハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードする遺伝子、および、除草剤化合物、例えばアンモニウムグルホシネート、ブロモキシニル、イミダゾリノン類、２，４−ジクロロフェノキシアセテート（２，４−Ｄ）に対する耐性を付与する遺伝子が上げられるが、これらに限定されるわけではない。一般に、Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech 3:506-511; Christopherson et al. {1992) Proc. Nail. Acad Sci. USA 89:6314-6318; Yao et al. (1992) Cell 71 :63-72; Reznikoff(1992)Mol. Microbiol 6:2419-2422; Barkley et al (1980) in The Operon, pp. 177-220; Hu et al (1987) Cell 48:555-566; Brown et al (1987) Cell 49:603-612; Figge et al. (1988) Cell 52:713-722; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad Act USA 86:5400-5404; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad Sci. USA 86:2549-2553; Deuschle et al. (1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Reines et al (1993)Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:1917-1921; Labow et al. (i990) AM Cell Biol. 10:3343-3356; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:3952-3956; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad Sci. USA 88:5072-5076; Wyborski et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10: 143-162; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry 27: 1094-1104; Bonin (1993)Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:5547-5551; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin); Gill et al. (1988) Nature 334:721-724. Such disclosures are herein incorporated by reference.
【０１０２】
上記の選択マーカー遺伝子のリストは、遺伝子を制限するためのものではない。どのような選択マーカー遺伝子も、本発明で使用可能である。
【０１０３】
本発明のＡＨＡＳＬタンパク質をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド分子単離物は、植物を形質転換して除草剤に対する、特にイミダゾリノン除草剤に対する耐性を増強するベクターとして用いることができる。本発明の単離されたＡＨＡＳＬポリヌクレオチド分子は、植物に除草剤耐性を与えるにあたり、単独でベクターとして用いてもよいが、ＡＨＡＳ（ＡＨＡＳＳ）酵素の小サブユニットをコードする核酸配列と組合わせて使用してもよい。米国特許６，３４８，６４３参照；これを、参照として本願明細書に組み込むこととする。
【０１０４】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド分子単離物に作動可能な状態で連結する、植物内で発現を引き起こすプロモーターを含む植物発現ベクターに関する。このポリヌクレオチド分子単離物は、ＡＨＡＳＬタンパク質、特に配列番号２または４で表されるアミノ配列またはその機能性のフラグメントや変異体を含むＡＨＡＳＬタンパク質をコードする核酸配列を含んでいる。本発明の植物発現ベクターは、もし植物細胞中で遺伝子発現を起こすことが可能なら、どのようなプロモーターを使用してもよい。好ましいプロモーターには、構成的なプロモーターと組織選択性プロモーターとがある。
【０１０５】
本発明の形質転換ベクターは、興味のある遺伝子で形質転換された植物のせいさんに使用できる。この形質転換ベクターは、本発明の選択マーカー遺伝子と導入される興味のある遺伝子とを含み、通常形質転換細胞で発現される。このような選択マーカー遺伝子は、宿主細胞に発現を引き起こすプロモーターに作動可能な状態で連結している本発明の除草剤耐性ＡＨＡＳＬポリヌクレオチドを含んでいる。植物や植物細胞で使用のために、この形質転換ベクターは、植物細胞内で発現を引き起こすプロモーターに作動可能な状態で連結している本発明のＡ除草剤耐性ＨＡＳＬポリヌクレオチドを含む選択マーカー遺伝子を含んでいる。
【０１０６】
本発明の目的遺伝子は、望ましい成果により異なる。例えば、好ましいいろいろな表現型の変化としては、植物の脂肪酸組成の変更、植物のアミノ酸含量の変更、植物の昆虫及び／又は病原体防御メカニズムの変更などがある。異種の産物の発現、あるいは植物内在性の産物の発現量の増加により、このような成果が得られる。また、一種以上の内在性産物の発現量の抑制、特に植物の酵素やコファクターの抑制により、このような成果が得られることもある。このような変化は、形質転換細胞の表現型の変化として現れる。
【０１０７】
本発明のある実施様態においては、このような興味のある遺伝子として、昆虫耐性遺伝子、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素タンパク質遺伝子（米国特許５，３６６，８９２；５，７４７，４５０；５，７３６，５１４；５，７２３，７５６；５，５９３，８８１；及びGeiser et al. (1986) Gene 48:109）があげられる。  
本発明のＡＨＡＳＬタンパク質またはポリペプチドは、例えばヒマワリ植物から精製され、組成物として使用できる。また、本発明のＡＨＡＳＬタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子単離物は、本発明のＡＨＡＳＬタンパク質を大腸菌や酵母などの微生物で発現するのに使用されうる。発現されたＡＨＡＳＬタンパク質は、当業界の通常の技術を有するものに公知の方法により、大腸菌や酵母抽出物から精製される。
【０１０８】
本発明はまた、植物を本発明のポリヌクレオチド分子単離物に作動可能な状態で連結している植物内で発現を引き起こすプロモーターを含む植物発現ベクターで処理してなる、除草剤に耐性を示す形質転換植物を作成する方法に関する。ポリヌクレオチド分子単離物は、本発明のＡＨＡＳＬタンパク質をコードする核酸配列、特に配列番号２で表されるアミノ配列、配列番号１で表されるアミノ酸配列、あるいはこのアミノ酸配列の機能性のフラグメントや変異体からなるＡＨＡＳＬタンパク質を有している。
【０１０９】
本発明はまた、ＨＡＳ酵素を阻害する除草剤、特にイミダゾリノン除草剤やスルホニル尿素除草剤に対する耐性が強化・増加された、本発明の方法により作成した非形質転換ヒマワリ植物や形質転換植物、及びこれらの非形質転換及び形質転換植物の子などの子孫に関する。本発明のＡＨＡＳＬポリヌクレオチド、特に除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質をコードするものは、除草剤耐性植物の耐性の強化の方法に使用される。本発明のある実施様態においては、この除草剤耐性植物が、除草剤許容性タンパク質又は除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質を含んでいる。この除草剤耐性植物には、除草剤耐性のＡＨＡＳＬ核酸配列で形質転換された植物とゲノム中に除草剤耐性のＡＨＡＳＬタンパク質をコードする内在性の遺伝子を含んでいる植物の両方が含まれる。除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質をコードする核酸配列と除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質をコードする内在性遺伝子を含む除草剤耐性植物は、本発明のポリヌクレオチドや植物を含み、また既知のポリヌクレオチドや植物をも含んでいる。例えば、米国特許５，０１３，６５９、５，７３１，１８０、５，７６７，３６１、５，５４５，８２２、５，７３６，６２９、５，７７３，７０３、５，７７３，７０４、５，９５２，５５３及び６，２７４，７９６を参照；なお、これらすべてを、参照として本願明細書に組み込むこととする。このような除草剤耐性植物の耐性を増強する方法としては、除草剤耐性植物を、除草剤耐性本発明のＡＨＡＳＬポリヌクレオチド作動可能な状態で連結している植物内で発現を引き起こすプロモーター含む、特に配列番号１で表される除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質をコードするポリヌクレオチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、および、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を持つポリペプチドをコードする上記のポリヌクレオチドのフラグメントや変異体を含む少なくとも一つのポリヌクレオチドコンストラクションを用いて形質転換することがあげられる。
【０１１０】
植物の形質転換用のいろいろな植物形質転換ベクターや方法が存在する。例えば、以下を参照：An, G. et al. (1986) Plant Pysiol., 81 :301-305; Fry, J, et al. (1987) Plant Cell Rep. 6:321-325; Block, M. (1988) Theor. Appl Genet.76: 767-774; Hinchee, et al (1990) Stadler. Genet. Symp.203212.203-2l2; Cousins, et al. (1991) Aust, J. Plant Physiol. 18:481-494; Chee, P. P. and Slightom, J. L. (1992) Gene. 118:255-260; Christou, et al. (1992) Trends. Biotechnol. 10:239-246; D’Halluin, et al. (1992) Bio/Technol. 10:309-314; Dhir, et al. (1992) Plant Physiol. 99:81-88; Casas et al. (1993) Proc. Nat. Acad Sci. USA 90:11212-11216; Christou, P. (1993) In Vitro Cell. Dev. Biol- Plant; 29P;119-124; Davies, et al. (1993) Plant Cell Rep. 12:180-183; Dong, J. A. and Mchughen, A. (1993) Plant Sci. 91:139-148; Franklin, C. I. and Trieu, T. N. (1993) Plant. Physiol. 102: 167; Golovkin, et al. (1993) Plant Sci. 90:41-52; Guo Chin Set Bull. 38:2072-2078; Asano, et al. (1994) Plant Cell Rep. 13; Ayeres N. M. and Park, W. D. (1994) Crit. Rev. Plant. Sci. 13:219-239; Barcelo, et al. (1994) Plant. J. 5:583-592; Becker, et al. (1994) Plant. J. 5:299-307; Borkowska et al. (1994) Acta. Physiol Plant. 16:225-230; Christou, P. (1994) Agro. Food. Ind, Hi Tech. 5: 17-27; Eapen et al. (1994) Plant Cell Rep. 13:582-586; Hartman, et al. (1994) Bio-Technology 12: 919923; Ritala, et al. (1994) Plant. Mol. Biol. 24:317-325; and Wan, Y. C. and Lemaux, P. G. (1994) Plant Physiol. 104:3748。
【０１１１】
本発明の方法では、ポリヌクレオチドコンストラクトを植物に導入する。「導入」とは、コンストラクトが植物細胞の内部に入りこむようにポリヌクレオチドコンストラクトを植物に供給することを意味する。本発明の方法は、特定のポリヌクレオチドコンストラクトを植物に導入する方法を用いるのでなく、もしポリヌクレオチドコンストラクトが植物の一個の細胞の内部に進入可能ならどのような方法でもよい。ポリヌクレオチドコンストラクトを植物内部に導入する方法は公知であり、その例としては、安定形質転換法、一時的形質転換法やウイルス仲介法が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０１１２】
「安定形質転換」とは、植物に導入されたポリヌクレオチドコンストラクトが植物のゲノムに取り込まれ、子孫に遺伝されることを意味する。「一時的形質転換」とは、植物に導入されたポリヌクレオチドコンストラクトが植物のゲノムに一体化しないことを意味する。
【０１１３】
植物や植物細胞の形質転換のためには、標準的な方法により。植物又は植物細胞内での核酸配列の発現に適した既知のベクターに本発明の核酸配列を挿入する。ベクターの選択は、好ましい形質転換法と転換対象の植物種とに依存する。本発明のある実施様態においては、ＡＨＡＳＬ１核酸配列は、植物細胞中で高レベルで発現するとされる植物プロモーターに作動可能な状態で連結している。また、このコンストラクトは、次いでイミダゾリノン除草剤に感受性の高い植物に導入された後、形質転換細胞が再生される。この形質転換細胞は、形質転換されていない植物を殺傷するか大きく損なう程度の除草剤レベルでも、イミダゾリノン除草剤に対して耐性を示す。この方法は、いかなる植物種に適用可能ではあるが、作物植物に適用することがもっとも有益である。
【０１１４】
植物発現カセットを作成し外来性の核酸を植物に導入する方法は、一般に公知であり、以前より実施されてきた。例えば、外来性のＤＮＡを、腫瘤誘起性（Ｔｉ）プラスミドベクターを用いて植物に導入することができる。他の方法では、外来性のＤＮＡを供給するのに、ＰＥＧ仲介プロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションウィスカー、微粒子銃あるいは直接的なＤＮＡ取り込みのための微粒子銃を利用する。このような方法は公知である。（U.S. Pat. No. 5,405,765 to Vasil et al; Bilang et al (1991) Gene 100: 247-250; Scheid et al, (1991) Mol. Gen. Genet., 228: 104-112; Guerche et al., (1987) Plant Science 52: 111-116; Neuhause et al, (1987) Theor. Appl Genet. 75: 30-36; Klein et al, (1987) Nature 327: 70-73; Howell et al, (1980) Science 208: 1265; Horsch et al., (1985) Science 227: 1229-1231; DeBlock et al, (1989) Plant Physiology 91: 694-701; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds.) Academic Press, Inc. (1988) and Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds.) Academic Press, Inc. (1989).  形質転換の方法は、転換する植物細胞や使用するベクターの安定性、遺伝子産物の発現レベル、他のパラメータに依存する。
【０１１５】
他の好ましい核酸配列を植物細胞に導入し次いで植物ゲノムに挿入させる方法としては、マイクロインジェクション（Crossway et al (1986) Biotechniques 4:320-334）、エレクトロポレーション（Riggs et al (1986) Proc. Natl. Acad Sci. USA 83 :5602-5606）、アグロバクテリウム仲介形質転換（Townsend et al, U.S. Patent No. 5,563,055, Zhao et al, U.S. Patent No. 5,981,840）、直接遺伝子転位（Paszkowski et al (1984) EMBO J. 3:2717-2722）、及び衝撃粒子加速（例えば、  Sanford et al, U. S. Patent No. 4,945,050; Tomes et al, U.S. Patent No. 5,879,918; Tomes et al, U.S. Patent No. 5,886,244; Bidney et al., U.S. Patent No. 5,932,782; Tomes et al (1995)）；“Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment,” （Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin); McCabe et al. (1988)Biotechnology 6:923-926）；及びＬｅｃ１形質転換（ＷＯ００／２８０５８）があげられる。また、以下の文献も参照：Weissinger et al. (1988)Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford et al. (1987)Particulate Science and Technology 5 :27-37（タマネギ）；Christou et al (1988)Plant Physiol 87:671-674（ダイズ）；McCabe et al. (1988)Bio/Technology 6:923-926（ダイズ）；Finer and McMullen (1991)In Vitro Cell Dev. Biol. 27P: 175-182（ダイズ）；Singh et al. (1998)Theor. Appl. Genet. 96:319-324（ダイズ）；Datta et al. (1990)Biotechnology 8:736-740（コメ）；Klein et al. (1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305-4309（トウモロコシ）；Klein et al (1988)Biotechnology 6:559-563 トウモロコシ）；Tomes, U.S. Patent No. 5,240,855; Buising et al, U.S. Patent Nos. 5,322,783 and 5,324,646; Tomes et al (1995)“Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment,” in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg (Springer-Verlag, Berlin)（トウモロコシ）；Klein et al. (1988)Plant Physiol 91:440-444（トウモロコシ）；Fromm et al. (1990)Biotechnology 8:833-839 トウモロコシ）；Hooykaas- Van Slogteren et al (1984)Nature (London)311 :763-764; Bowen et al, 米国特許５，７３６，３６９（穀物）；Bytebier et al (1987)Proc. Natl. Acad Sci. USA 84:5345-5349 （ユリ）；  De Wet et al. (1985)in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al (Longman, New York), pp. 197-209（花粉）；  Kaeppler et al (1990)Plant Cell Reports 9:415-418 and Kaeppler et al. (1992)Theor. Appl Genet. 84:560-566（ウィスカー仲介形質転換）；  D’Halluin et al. (1992)Plant Cell 4: 1495- 1505 (electroporation); Li et al (1993)Plant Cell Reports 12:250-255 and Christou and Ford (1995)Annals of Botany 75 :407-413 (コメ); Osjoda et al. (1996)Nature Biotechnology 14:745-750（トウモロコシ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによる）；これらの開示内容はすべて引用によりここに援用される。
【０１１６】
植物をウイルス又はウイルス性の核酸に接触させて、本発明のポリヌクレオチドを植物に導入してもよい。一般に、このような方法では、本発明のポリヌクレオチドコンストラクトがウイルス性のＤＮＡ又はＲＮＡ分子に導入される。本発明のＡＨＡＳＬタンパク質を、ひとまずウイルス性のポリタンパク質の一部として合成し、ついで生体内であるいは生体外でのタンパク分解で目的の組換え体タンパク質に変換してもよい。また、本発明のプロモーターには、ウイルスのＲＮＡポリメラーゼによって転写に使用されるプロモーターも含まれている。ウイルスのＤＮＡやＲＮＡ分子を用いて、ポリヌクレオチドコンストラクトを植物に導入し、そこにコードされたタンパク質を発現させる方法は公知である。例えば、米国特許５，８８９，１９１、５，８８９，１９０、５，８６６，７８５、５，５８９，３６７、及び５，３１６，９３１参照；これらの開示内容はすべて引用によりここに援用される。
【０１１７】
形質転換された細胞は従来の方法により植物にまで成長させる。例えば、McCormick et al (1986)Plant Cell Reports 5:81-84参照。これらの植物を成長させ、同じく形質転換した系統あるいは異なる系統との間で受粉させ、得られるハイブリッド中での目的の表現型の特性の構成的な発現を同定する。二世代以上を栽培し、目的の表現型の特性の発現が安定に維持され、遺伝されていることを確認して、得られた種子が目的の表現型の特性を発現しているとする。このように、本発明は、本発明のポリヌクレオチドコンストラクトを有する、例えばゲノムに安定に取り込まれた本発明の発現カセットを有する形質転換種子（「遺伝子組換え種子」ともよぶ）を提供する。
【０１１８】
本発明は、いかなる植物種の形質転換にも使用可能で、単子葉植物でも双子葉植物でもよく、またこれらに限られない。興味のある植物種としては、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）やアブラナ（例えば、Ｂ．ｎａｐｕｓ、Ｂ．ｒａｐａ、Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）があげられるが、特に種子油の原料として有用なアブラナ属植物、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）、コメ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｌｉｖａ）、ライムギ（Ｓｅｃｅｄｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）、ソルガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ，  Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、キビ（例えば、パールキビ（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｇｌａｕｃｕｍ）、プロソキビ（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｍｉｌｉａｃｅｕｍ）、フォックステイルキビ（Ｓｅｔａｒｉａ  ｉｔａｌｉｃａ）、フィンガーキビ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ  ｃｏｒａｃａｎａ））、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ，  Ｔ，  Ｔｕｒｇｉｄｕｍ  ｓｓｐ．  ｄｕｒｕｍ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ））、ジャガイモ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、ピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ  ｂａｔａｔｕｓ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ  ｓｐｐ．）、ココナツ（Ｃｏｃｏｓ  ｎｕｃｉｆｅｒａ）、パイナップル（Ａｎａｎａｓ  ｃｏｍｏｓｕｓ）、柑橘類（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｐｐ．）、カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ）、茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、バナナ（Ｍｕｓａ  ｓｐｐ．）、アボカド（Ｐｅｒｓｅａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）、イチジク（Ｆｉｃｕｓ  ｃａｓｉｃａ）、グアバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ）、マンゴ（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ  ｉｎｄｉｃａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ）、パパイア（Ｃａｒｉｃａ  ｐａｐａｙａ）、カシュー（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）、マカダミア（Ｍａｃａｄａｍｉａ  ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）、アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｍｙｇｄａｌｕｓ）、テンサイ（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ  ｓｐｐ．）、カラスムギ、オオムギ、野菜類、装飾植物類、及び針葉樹類があげられる。好ましく、本発明の植物は、作物植物（例えば、ヒマワリ、アブラナ、ワタ、テンサイ、ダイズ、ピーナッツ、アルファルファ、ベニバナ、タバコ、トウモロコシ、コメ、コムギ、ライムギ、オオムギライコムギ、ソルガム、キビ、など．）である。
【０１１９】
本発明の除草剤耐性植物は、雑草を防除するのに使用する方法を提供する。したがって、本発明はさらに、本発明の除草剤耐性植物の近くの雑草の防除する方法を提供する。本方法では、有効量の除草剤を、雑草および除草剤耐性植物に塗布するが、この植物は、少なくとも一種の除草剤に対して、特にイミダゾリノン序増剤又はスルホニル尿素除草剤に対して、野生型植物と較べて高い耐性をもっている。このような雑草の防除方法において、本発明の除草剤耐性植物は、好ましくは作物植物であり、具体的には、ヒマワリ、アルファルファ、アブラナ、ダイズ、ワタ、ベニバナ、ピーナッツ、タバコ、トマト、ジャガイモ、コムギ、コメ、トウモロコシ、ソルガム、オオムギ、ライムギ、キビ、ソルガムがあげられるが、これらに限られるわけではない。
【０１２０】
除草剤の対する、特にイミダゾリノン除草剤やスルホニル尿素除草剤に対する耐性の増加した植物を提供することで、いろいろな製剤を用いて、植物を雑草から守り、植物成長を増強し、養分の取り合いを減らすことができるようなる。ある除草剤は、単独で、雑草の出現前にあるいは出現後に、栽培前にあるいは栽培中に、上記の植物の周囲の領域の雑草の防除に使用でき、イミダゾリノン除草剤製剤は、他の添加剤とともに使用することもできる。この除草剤を、種子の処理に用いることもできる。イミダゾリノンやスルホニル尿素除草剤製剤への添加剤としては、他の除草剤や界面活性剤、補助剤、延展剤、固着剤、安定化剤などがあげられる。この除草剤製剤は、湿式調剤でも乾性調剤でもよく、例えば流動性の粉末、乳化濃縮物あるいは液状濃縮物であってもよい。これらの除草剤や除草剤製剤は、通常の方法で散布可能であり、例えば、噴霧、潅漑、粉状散布などがあげられる。
【０１２１】
本発明は、少なくとも一種の除草剤、特にＡＨＡＳ阻害性の除草剤、さらに特にイミダゾリノン除草剤やスルホニル尿素除草剤に対しての耐性が増加した非遺伝子組換え及び遺伝子組換え種子を提供する。このような種子としては、例えば、ヒマワリ植物Ｓ４８２７、ヒマワリ植物ＧＭ４０、ヒマワリ植物ＧＭ１６０６、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−６７１６のヒマワリ植物、やＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−７６０６のヒマワリ植物などの除草剤耐性をもつ非遺伝子組換えヒマワリ種子や、除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質をコードする本発明のポリヌクレオチド分子を含む遺伝子組換え種子があげられる。
【０１２２】
本発明は、有性生殖を伴う通常の植物育種による、除草剤耐性植物、特に除草剤耐性ヒマワリ植物の育種方法を提供する。この方法は、除草剤に耐性がある第一の植物と除草剤に耐性がない第二の植物とを交配することを含む。第一の植物は、本発明の除草剤耐性植物のいずれでもよく、例えば、除草剤耐性のＡＨＡＳＬタンパク質をコードする本発明のポリヌクレオチド分子の少なくとも一つを含む形質転換植物や、ヒマワリ植物Ｓ４８９７、ヒマワリ植物ＧＭ４０、ヒマワリ植物ＧＭ１６０６、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−６７１６のヒマワリ植物あるいはＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−７６０６のヒマワリ植物の除草剤耐性を持つ非遺伝子組換えヒマワリ植物があげられる。第二の植物は、第一の植物と交配するとき生育可能な子孫植物（即ち、種子）を与えることのできるいずれかの植物である。常にではないが、通常、第一の植物と第二の植物は同じ種に属している。本発明の方法は、さらに、同系統の植物あるいは第一又は第二の植物の遺伝子型への第一交配子孫植物のもどし交配によって得られる少なくとも一世代を含んでいる。また、第一交配子孫や引き続く交配子孫を、異なる系統の、あるいは第一あるいは第二の植物とは遺伝子型が異なる第三の植物と交配してもよい。本発明の方法ではまた、第一の植物の除草剤耐性特性をもつ植物を選択してもよい。
【０１２３】
本発明はさらに、有性生殖を伴う通常の植物育種で植物の除草剤耐性を、特にヒマワリ植物の除草剤耐性を増強する方法を提供する。この方法は、除草剤に耐性がある第一の植物と、除草剤に耐性があってもなくてもよい、異なる除草剤に耐性を示す、又は第一の植物より強い耐性を示す第二の植物とを、交配させることを含んでいる。第一の植物は、本発明の除草剤耐性植物のいずれでもよく、例えば、除草剤耐性のＡＨＡＳＬタンパク質をコードする本発明のポリヌクレオチド分子の少なくとも一つを含む形質転換植物や、ヒマワリ植物Ｓ４８９７、ヒマワリ植物ＧＭ４０、ヒマワリ植物ＧＭ１６０６、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−６７１６のヒマワリ植物あるいはＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−７６０６のヒマワリ植物の除草剤耐性を持つ非遺伝子組換えヒマワリ植物があげられる。第二の植物は、第一の植物とかけ合わせたとき生育可能な子孫植物（即ち、種子）を与えることのできるいずれかの植物である。常にというわけではないが、通常、第一の植物と第二の植物は同じ種に属している。第一の植物又は第二の植物、あるいは両方と比較した場合、本発明の方法により作成された子孫植物は、除草剤に対する耐性が増加している。第一の植物と第二の植物とが異なる除草剤に耐性を示す場合、子孫植物は、第一の植物と第二の植物の混合した除草剤耐性特性を示すはずである。本発明の方法は、さらに、同系統の植物、あるいは第一の植物又は第二の植物のいずれかの遺伝子型をもつ植物をもどし交配して得られる少なくとも一世代を含んでいる。また、第一交配子孫や引き続く交配子孫を、異なる系統の、あるいは第一あるいは第二の植物とは遺伝子型が異なる第三の植物と交配してもよい。本発明の方法ではまた、第一の植物の、第二の植物の、あるいは第一と第二両方の植物の除草剤耐性特性をもつ植物を選択してもよい。
【０１２４】
本発明の植物は、遺伝子組換え体であっても非遺伝子組換え体であってもよい。イミダゾリノンへの耐性が増加した非遺伝子組換えヒマワリ植物の例としては、ヒマワリ植物Ｓ４８９７、ヒマワリ植物ＧＭ４０、ヒマワリ植物ＧＭ１６０６、ＡＴＣＣ特許寄託番号がＰＴＡ−６７１６のヒマワリ植物、あるいはＡＴＣＣ特許寄託番号がＰＴＡ−７６０６のヒマワリ植物；ヒマワリ植物Ｓ４８９７、ヒマワリ植物ＧＭ４０、ヒマワリ植物ＧＭ１６０６、ＡＴＣＣ特許寄託番号がＰＴＡ−６７１６のヒマワリ植物、あるいはＡＴＣＣ特許寄託番号がＰＴＡ−７６０６のヒマワリ植物の変異体、組換え体、又は遺伝子組換え誘導体；あるいはヒマワリ植物Ｓ４８９７、ヒマワリ植物ＧＭ４０、ヒマワリ植物ＧＭ１６０６、ＡＴＣＣ特許寄託番号がＰＴＡ−６７１６のヒマワリ植物、あるいはＡＴＣＣ特許寄託番号がＰＴＡ−７６０６のヒマワリ植物の子孫のいずれかが挙げられる。
【０１２５】
本発明はまた、少なくとも一種の本発明のポリヌクレオチド分子、発現カセット、または形質転換ベクターで形質転換された植物、植物器官、植物組織、植物細胞、種子および非ヒト宿主細胞を提供する。このように形質転換された細胞、植物器官、植物組織、植物細胞、種子及び非ヒト宿主細胞では、形質転換されなかった植物、植物組織、植物細胞、あるいは非ヒト宿主細胞を殺傷するか、その成長を阻害する除草剤レベルで、少なくとも一種の除草剤に対する耐性あるいは許容性が増強されている。好ましく、これらの形質転換された本発明の細胞、植物組織、植物細胞や種子は、シロイヌナズナ及び作物植物のものである。
【０１２６】
本発明は、イミダゾリノン除草剤、スルホニル尿素除草剤、トリアゾロピリミジン除草剤、ピリミジニルオキシベンゾエート除草剤、スルホニルアミノ−カルボニルトリアゾリノン除草剤、及びこれらの混合物からなる群から選択される少なくとも一種のＡＨＡＳ阻害性除草剤を用いる方法を提供する。これらの方法では、本ＡＨＡＳ阻害性除草剤は、既知のいずれかの方法で散布され、例えば、種子処理、土壌処理や葉の処理が行われるが、これに限ることはない。
【０１２７】
散布の前に、このＡＨＡＳ阻害性の除草剤を通常の製剤とすることも可能で、その例としては、溶液、乳濁液、懸濁液、ダスト、粉末、ペーストや顆粒があげられる。使用形態は、特定の利用目的により変わり、いずれの場合も本発明の化合物の均一な分布を保証する必要がある。
【０１２８】
これらの製剤は、既知の方法により作られる（例えば、以下を参照：総説ＵＳ３，０６０，０８４，ＥＰ−Ａ７０７４４５（液体濃縮物），Browning, “Agglomeration”,Chemical Engineering, Dec. 4, 1967, 147-48, Perry' s Chemical Engineer's Handbook, 4th Ed., McGraw-Hill, New York, 1963, pages 8-57 and et seq. WO 91/13546, US 4,172,714, US 4,144,050, US 3,920,442, US 5,180,587, US 5,232,701, US 5,208,030, GB 2,095,558, US 3,299,566, Klingman, Weed Control as a Science, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1961, Hance et al., Weed Control Handbook, 8th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1989 and Mollet, H., Grubemann, A., Formulation technology, Wiley VCH Verlag GmbH, Weinheim (Germany), 2001, 2. D. A. Knowles, Chemistry and Technology of Agrochemical Formulations, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 1998 (ISBN 0-7514-0443-8). 例えば、活性化合物を、溶媒及び／又は担体などの農薬製剤用の適当な添加物で希釈して、必要なら、種子処理剤用に、乳化剤、界面活性剤、分散剤、保存剤、消泡剤、凍結防止剤などの、更に色素及び／又は結合剤及び／又はゲル化剤を加えて、製剤化してもよい。
【０１２９】
適当な溶媒の例としては、水、芳香族系溶媒（例えば、ソルベッソ製品、キシレン）、パラフィン（例えば、ミネラル油画分）、アルコール（例えば、メタノール、ブタノール、ペンタノール、ベンジルアルコール）、ケトン（例えば、シクロヘキサノン、γ−ブチロラクトン）、ピロリドン（ＮＭＰ、ＮＯＰ）、酢酸塩類（グリコール二酢酸）、グリコール類、脂肪酸ジメチルアミド、脂肪酸及び脂肪酸エステル類があげられる。原則として、溶媒の混合物を使用してもよい。
【０１３０】
適当な担体の例としては、粉砕天然ミネラル（例えばカオリン、粘土、タルク、チョーク）や粉砕合成ミネラル（例えば高度分散シリカ、ケイ酸塩）があげられる。
【０１３１】
適当な乳化剤の例としては、非イオン性乳化剤やアニオン性乳化剤（例えば、ポリオキシエチレンの脂肪性アルコールエーテル、アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸類）があげられる。
【０１３２】
分散剤の例としては、亜硫酸リグニン廃棄液やメチルセルロースがあげられる。
【０１３３】
好ましい界面活性剤の例としては、リグノスルホン酸のアルカリ金属、アルカリ土類金属やアンモニウム塩、ナフタレンスルホン酸、フェノールスルホン酸、ジブチルナフタレンスルホン酸、アルキルアリールスルホン酸塩、アルキル硫酸塩、アルキルスルホン酸塩、脂肪族アルコール硫酸塩、脂肪酸及び硫酸化の脂肪族アルコールグリコールエーテルがあげられ、さらにスルホン化ナフタレンの縮合物およびナフタレンのホルムアルデヒド誘導体、ナフタレン縮合物あるいはナフタレンスルホン酸とフェノールとホルムアルデヒドの縮合物、ポリオキシエチレンオクチルフェノールエーテル、エトキシ化イソオクチルフェノール、オクチルフェノール、ノニルフェノール、アルキルフェノールポリグリコールエーテル、トリブチルフェニルポリグリコールエーテル、トリステアリルフェニルポリグリコールエーテル、アルキルアリールポリエーテルアルコール、アルコールと脂肪族アルコールエチレンオキシド縮合物、エトキシ化ヒマシ油、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、エトキシ化ポリオキシプロピレン、ラウリルアルコールポリグリコールエーテルアセタール、ソルビトールエステル、リグノスルファイト廃棄液、およびメチルセルロースがあげられる。
【０１３４】
直接噴霧可能な溶液、乳濁液、ペーストあるいは油分散液の調剤に好適な物質としては、軽油やディーゼル油などの中沸点から高沸点のミネラル油画分であり、さらにコールタール油や植物油や動物油、脂肪族環状や芳香族の炭化水素、例えばトルエン、キシレン、パラフィン、テトラヒドロナフタレン、アルキル化ナフタレンやその誘導体、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、シクロヘキサノール、シクロヘキサノン、イソホロン、高極性溶媒、例えばジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドンや水があげられる。
【０１３５】
また、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコールなどの凍結防止剤や、殺菌剤を、製剤に加えることもできる。
【０１３６】
好ましい消泡剤としては、例えば、ケイ素系消泡剤やステアリン酸マグネシウムがあげられる。
【０１３７】
好適な保存剤として、例えばジクロロフェンやベンジルアルコールヘミホルマールがあげられる。
【０１３８】
種子処理用製剤は、さらに結合剤や必要に応じて色素を含む。
【０１３９】
結合剤は、種子の処理後の活性物質の付着を改善するために添加される。好ましい結合剤は、ブロックコポリマーのＥＯ／ＰＯ界面活性剤であるが、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレード、ポリメタクリレート、ポリブテン、ポリイソブチレン、ポリスチレン、ポリエチレンアミン、ポリエチレンアミド、ポリエチレンイミン（ルパソル（登録商標）、ポリミン（登録商標））、ポリエーテル、ポリウレタン、ポリビニルアセテート、チロース、及びこれらのポリマー由来のコポリマーなどである。
【０１４０】
必要に応じて、色素を製剤に加えてもよい。種子処理製剤に適当な色素や染料としては、ローダミンＢ、Ｃ．Ｉ．ピグメントレッド１１２、Ｃ．Ｉ．ソルベンドレッド１、ピグメントブルー１５：４、ピグメントブルー１５：３、ピグメントブルー１５：２、ピグメントブルー１５：１、ピグメントブルー８０、ピグメントイエロー１、ピグメントイエロー１３、ピグメントレッド１１２、ピグメントレッド４８：２、ピグメントレッド４８：１、ピグメントレッド５７：１、ピグメントレッド５３：１、ピグメントオレンジ４３、ピグメントオレンジ３４、ピグメントオレンジ５、ピグメントグリーン３６、ピグメントグリーン７、ピグメントホワイト６、ピグメントブラウン２５、ベイシックバイオレット１０、ベイシックバイオレット４９、アシッドレッド５１、アシッドレッド５２、アシッドレッド１４、アシッドブルー９、アシッドイエロー２３、ベイシッシックレッド１０、ベイシックレッド１０８があげられる。
【０１４１】
好適なゲル化剤の例は、カラギーナン（サチアゲル（登録商標））である。
【０１４２】
粉末、散布用物質やダスト状物質は、活性成分を固体担体とともに混合・粉砕することで調整される。
【０１４３】
被覆顆粒や含浸顆粒や均一顆粒などの顆粒は、活性化合物と固体担体とを結合して調整される。固体担体の例としては、シリカゲル、ケイ酸塩、タルク、カオリン、アタクレー、石灰石、石灰、チョーク、ボール粘土、黄土、粘土、ドロマイト、珪藻土、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、酸化マグネシウム、粉砕合成材料などのミネラルアース類；硫安、リン安、硝安、尿素などの肥料；穀類ミール、樹皮ミール、木材ミール、堅果殻ミールなどの植物産物；セルロース粉末や他の固体担体があげられる。
【０１４４】
通常、これらの製剤は、０．０１〜９５重量％の、好ましくは０．１〜９０重量％のＡＨＡＳ阻害性の除草剤を含有している。この場合のＡＨＡＳ阻害性の除草剤の純度は、９０％〜１００重量％であり、好ましく９５％〜１００重量％（ＮＭＲスペクトル）である。種子処理の際には、各製剤は、２〜１０倍希釈して、活性化合物として、噴霧可能な０．０１〜６０重量％、好ましくは０．１〜４０重量％とする。
【０１４５】
ＡＨＡＳ阻害性の除草剤は、上述の製剤あるいは使用形態で使用可能で、例えば、直接噴霧可能な溶液、粉末、懸濁液又は分散液、乳濁液、油分散液、ペースト、ダスト状産物、散布材料、あるいは顆粒の形で、噴霧、気化、ダスト化、散布、流し込みなどの方法を用いて使用可能である。使用形態は、もっぱら利用目的により、本発明のＡＨＡＳ阻害性の除草剤が細かく分布して散布できるようにする。
【０１４６】
水使用形態の製品は、乳濁液濃縮物、ペーストあるいは可湿性粉末（噴霧可能な粉末、油分散液）に水を加えて調整する。乳濁液、ペーストあるいは油分散液を調整するには、その物質を、そのまま又は油か溶媒に溶解して、湿潤剤、粘着剤、分散剤あるいは乳化剤とともに水中で分散させる。しかし、活性物質、湿潤剤、粘着剤、分散剤あるいは乳化剤、適当なら溶媒や油からなる濃縮物をつくり、この濃縮物を水で希釈してもよい。
【０１４７】
すぐに使用可能な調剤中の活性化合物濃度は、大きく変動しうる。通常、濃度は０．０００１〜１０％であるが、好ましくは０．０１〜１重量％である。
【０１４８】
ＡＨＡＳ阻害性の除草剤を超低容量プロセス（ＵＬＶ）でうまく使用することもでき、また、９５重量％を加える活性化合物を含む製剤を、更には添加剤を含まない活性化合物を散布することもできる。
【０１４９】
製剤の例としては次のものが挙げられる：  
【０１５０】
１．水希釈・葉面処理製品．
種子処理のためには、このような製品は、希釈してあるいは希釈せずに種子に添付される。
【０１５１】
Ａ）水溶性の濃縮物（ＳＬ、ＬＳ）
１０重量部のＡＨＡＳ阻害性の除草剤を９０重量部の水あるいは水溶性溶媒に溶解する。代わりに、湿潤剤などの添加物を加えてもよい。ＡＨＡＳ阻害性の除草剤は、水希釈で溶解し、１０％（ｗ／ｗ）のＡＨＡＳ阻害性の除草剤を含む製剤が得られる。
【０１５２】
Ｂ）分散濃縮物（ＤＣ）
２０重量部のＡＨＡＳ阻害性の除草剤を、１０重量部の分散剤、例えばポリビニルピロリドンとともに７０重量部のシクロヘキサノンに溶解する。水希釈で分散液を与え、２０％（ｗ／ｗ）のＡＨＡＳ阻害性の除草剤を含む製剤が得られる。
【０１５３】
Ｃ）乳化濃縮物（ＥＣ）
１５重量部のＡＨＡＳ阻害性の除草剤を、ドデシルベンゼンスルホン酸カルシウムおよびエトキシ化ヒマシ油（いずれの場合も５重量部）とともに７重量部のキシレンに溶解する。水希釈で乳濁液を与え、１５％（ｗ／ｗ）のＡＨＡＳ阻害性の除草剤を含む製剤が得られる。
【０１５４】
Ｄ）乳濁液（ＥＷ、ＥＯ、ＥＳ）
２５重量部のＡＨＡＳ阻害性の除草剤を、ドデシルベンゼンスルホン酸カルシウムとエトキシ化ヒマシ油（いずれの場合も５重量部）とともに、３５重量部のキシレンに溶解する。この混合物を、３０重量部の水に投入し、乳化機（例えばウルトラタラックス）を用いて均一な乳濁液とする。水で希釈すると乳濁液となり、２５％（ｗ／ｗ）のＡＨＡＳ阻害性の除草剤を含む製剤が得られる。
【０１５５】
Ｅ）懸濁液（ＳＣ、ＯＤ、ＦＳ）
攪拌ボールミル中で、２０重量部のＡＨＡＳ阻害性の除草剤を、１０重量部の分散剤と湿潤剤及び７０重量部の水又は有機溶媒とともに微粉砕し、微細なＡＨＡＳ阻害性の除草剤懸濁液を得る。水で希釈して、ＡＨＡＳ阻害性の除草剤の安定な懸濁液とし、２０％（ｗ／ｗ）のＡＨＡＳ阻害性の除草剤を含む製剤を得る。
【０１５６】
Ｆ）水分散性顆粒及び水溶性顆粒（ＷＧ、ＳＧ）
５０重量部のＡＨＡＳ阻害性の除草剤を、５０重量部の分散剤と湿潤剤とともに、微粉砕し、適当な技術装置（例えば、押出機、噴霧塔、流動床）で水分散性又は水溶性顆粒とする。水で希釈して、安定なＡＨＡＳ阻害性の除草剤の分散物または溶液とし、５０％（ｗ／ｗ）のＡＨＡＳ阻害性の除草剤を含む製剤を得る。
【０１５７】
Ｇ）水分散性粉末及び水溶性粉末（ＷＰ、ＳＰ、ＳＳ，ＷＳ）
７５重量部のＡＨＡＳ阻害性の除草剤を、２５重量部の分散剤、湿潤剤及びシリカゲルとともに、ローターステーターミル中で微粉砕する。水で希釈して、ＡＨＡＳ阻害性の除草剤の安定な分散物又は溶液とし、７５％（ｗ／ｗ）のＡＨＡＳ阻害性の除草剤を含む製剤を得る。
【０１５８】
Ｉ）ゲル製剤（ＧＦ）
攪拌ボールミル中で、２０重量部のＡＨＡＳ阻害性の除草剤を、１０重量部の分散剤、１重量部ゲル化剤、湿潤剤及び７０重量部の水または有機溶媒とともに微粉砕微細なＡＨＡＳ阻害性の除草剤の懸濁液を得る。水で希釈して、ＡＨＡＳ阻害性の除草剤の安定な懸濁液とし、２０％（ｗ／ｗ）のＡＨＡＳ阻害性の除草剤を含む製剤を得る。このゲル製剤は、種子処理での使用に適している。
【０１５９】
２．無希釈で葉面処理に用いる製品
これらの製品は、種子処理のために無希釈で種子に添付される。
【０１６０】
Ａ）ダスト性粉末（ＤＰ、ＤＳ）
５重量部のＡＨＡＳ阻害性の除草剤を微粉砕し、９５重量部の微粉砕カオリンと混合する。この結果、５％（ｗ／ｗ）のＡＨＡＳ阻害性の除草剤を含むダスト性製剤が得られる。
【０１６１】
Ｂ）顆粒（ＧＲ、ＦＧ、ＧＧ、ＭＧ）
０．５重量部のＡＨＡＳ阻害性の除草剤を微粉砕し、９５．５重量部の担体と混合し、０．５％（ｗ／ｗ）のＡＨＡＳ阻害性の除草剤を含む製剤を得る。現在実施されている方法は、押し出し、噴霧乾燥、流動床である。この結果、無希釈で葉に使用する顆粒が得られる。
【０１６２】
通常の種子処理製剤としては、例えば、流動性濃縮物ＦＳ、溶液ＬＳ、乾処理用粉末ＤＳ、スラリー処理用水分散粉末ＷＳ、水溶性粉末ＳＳ、乳濁液ＥＳやＥＣ、及びゲル製剤ＧＦが上げられる。これらの製剤を種子に塗布するときに、希釈しても、しなくてもよい。種子への塗布は、播種前に種子上に直接塗布する。
【０１６３】
好ましい実施様態においては、種子処理にＦＳ製剤が使用される。典型的には、ＦＳ製剤は、１〜８００ｇ／ｌの主成分、１〜２００ｇ／ｌの界面活性剤、０〜２００ｇ／ｌの凍結防止剤、０〜４００ｇ／ｌの結合剤、０〜２００ｇ／ｌのピグメント、及び１リットルの溶媒、好ましくは水を含んでいる。
【０１６４】
本発明の除草剤耐性植物の、非遺伝子組換え及び遺伝子組換え種子。このような種子には、例えば、ＮＣＩＭＢ登録番号ＮＣＩＭＢ４１２６２の植物の除草剤耐性を持つ非遺伝子組換えヒマワリ種子や、ＩＭＩタンパク質をコードする本発明のポリヌクレオチド分子を含む遺伝子組換え種子があげられる。
【０１６５】
種子処理では、本発明の除草剤耐性植物の種子を除草剤で、好ましくは、アミドスルフロン、アジムスルフロン、ベンスルフロン、クロリムロン、クロルスルフロン、シノスルフロン、シクロスルファムロン、エタメトスルフロン、エトキシスルフロン、フラザスルフロン、フルピルスルフロン、ホラムスルフロン、ハロスルフロン、イマゾスルフロン、イオドスルフロン、メソスルフロン、メトスルフロン、ニコスルフロン、オキサスルフロン、プリミスルフロン、プロスルフロン、ピラゾスルフロン、リムスルフロン、スルホメツロン、スルホスルフロン、チフェンスルフロン、トリアスルフロン、トリベヌロン、トリフロキシスルフロン、トリフルスルフロン、トリトスルフロン、イマザメタベンズ、イマザモックス、イマザピック、イマザピル、イマザキン、イマゼタピル、クロランスラム、ジクロスラム、フロラスラム、フルメトスラム、メトスラム、ペノクススラム、ビスピリバック、ピリミノバック、プロポキシカルバゾン、フルカルバゾン、ピリベンゾキシム、ピリフタリド、ピリチオバック、およびこれらの混合物からなる群から選択されるＡＨＡＳ阻害性の除草剤、またはＡＨＡＳ阻害性の除草剤を含む製剤で処理する。
【０１６６】
この種子処理には、既知の種子処理技術、たとえば種子被覆、種子コーティング、種子ダスティング、種子浸漬や種子ペレット化などのすべてが含まれる。
【０１６７】
本発明の他の実施様態においては、本発明は、土壌の処理方法、特にＡＨＡＳ阻害性の除草剤を成分／製剤として含む顆粒状製剤（例えば、顆粒状製剤）と、必要に応じて一種以上の固体又は液体状の農業で許容される担体及び／又は必要に応じて一種以上の農業で許容される界面活性剤とを種子穴に散布する処理方法に関する。この方法は、例えば、穀類、トウモロコシ、ワタやヒマワリの苗床に、好適に使用される。
【０１６８】
本発明はまた、アミドスルフロン、アジムスルフロン、ベンスルフロン、クロリムロン、クロルスルフロン、シノスルフロン、シクロスルファムロン、エタメトスルフロン、エトキシスルフロン、フラザスルフロン、フルピルスルフロン、ホラムスルフロン、ハロスルフロン、イマゾスルフロン、イオドスルフロン、メソスルフロン、メトスルフロン、ニコスルフロン、オキサスルフロン、プリミスルフロン、プロスルフロン、ピラゾスルフロン、リムスルフロン、スルホメツロン、スルホスルフロン、チフェンスルフロン、トリアスルフロン、トリベヌロン、トリフロキシスルフロン、トリフルスルフロン、トリトスルフロン、イマザメタベンズ、イマザモックス、イマザピック、’イマザピル、イマザキン、イマゼタピル、クロランスラム、ジクロスラム、フロラスラム、フルメトスラム、メトスラム、ペノクススラム、ビスピリバック、ピリミノバック、プロポキシカルバゾン、フルカルバゾン、ピリベンゾキシム、ピリフタリド及びピリチオバックからなる群から選択される少なくとも一種のＡＨＡＳ阻害性の除草剤で処理された、あるいはそれを含む種子を含んでいる。
【０１６９】
この「種子」とは、あらゆる種類の種子や植物栄養繁殖体をいい、例えば、本来の種子、種子断片、地下ほふく枝、球茎、鱗茎、果実、塊茎、子実、切穂、切苗などがあげられるがこれらに限定されるわけではない。好ましい実施様態においては、本来の種子である。
【０１７０】
「処理された及び／又は含む」とは、一般に塗布時には主成分の大部分が繁殖体の表面に存在することを意味するが、塗布方法にも夜が、多かれ少なかれこの成分は繁殖体内に浸透していくこととなる。この繁殖体を（再）播種すると、主成分が吸収される。
【０１７１】
ＡＨＡＳ阻害性の除草剤あるいはＡＨＡＳ阻害性の除草剤を含む製剤を用いる種子処理は、植物播種前、発芽前の種子に、噴霧又は散布により実施される。
【０１７２】
種子の処理においては、有効量のＡＨＡＳ阻害性の除草剤又はＡＨＡＳ阻害性の除草剤を含む製剤を用いて種子を処理する。なお、塗布比率は、一般に１００ｋｇの種子当たり、活性成分当たり０．１ｇ〜１０ｋｇ（活性成分又は製剤の混合物の）、好ましくは１００ｋｇの種子当たり１ｇ〜５ｋｇ、特に１ｇ〜２．５ｋｇである。レタスなどの特定作物では、この比率を大きくしてもよい。
【０１７３】
本発明は、播種前及び／又は前出芽後に、本発明の耐性植物の種子をＡＨＡＳ阻害性の除草剤に接触させて好ましくない植生を避け、雑草を防除する方法を提供する。この方法では、播種を屋外の土壌で行っても、温室の培養土で行ってもよい。この方法は、種子のごく近くでの好ましくない植生を防止し、雑草を防除するに使用される。
【０１７４】
好ましくない植生の防除とは、雑草を殺す及び／又は雑草の通常の成長を阻害することを意味する。雑草とは、広い意味で、好ましくない場所で成長する植物すべてをさす。
【０１７５】
本発明の雑草としては、例えば、双子葉類及び単子葉の雑草があげられる。双子葉類の雑草には、次の種類の雑草があげられるが、これらに限定されるわけではない。シナピス、マメグンバイナズナ、ガリウム、ミドリハコベ、カミツレ、ローマンカモミール、ハキダメギク、ケノボディウム、セイヨウイラクサ、セネキオ、アマランサス、マツバボタン、オオオナモミ、セイヨウヒルガオ、ソライロアサガオ、ミズヒキ、セスバニア、ブタクサ、アメリカオニアザミ、カルドゥウス、ノゲシ、ナス、イヌガラシ、キカシグサ、アメリカアゼナ、ヒメオドリコソウ、ベロニカ、イチビ、エメックス、ケチョウセンアサガオ、マキノスミレ、ガレオプシス、オニゲシ、ケンタウレア、ムラサキツメクサ、キツネノボタン、タンポポ。単子葉の雑草には、次の種類の雑草があげられるが、これらに限定されるわけではない。イヌビエ、イタリアンミレット、ヌカキビ、メヒシバ、ミヤマアワガエリ、スズメノカタビラ、オニウシノケグサ、オヒシバ、ブラキアリア、ネズミムギ、イヌムギ、アベナ、カミガヤツリ、ソルガム、カモジグサ、シノドン、ミズアオイ、フィンブリスチスリス、サギッタリア、オオクログワイ、ウキヤガラ、タチスズメノヒエ、ケカモノハシ、スフェノクレア、ダクチロクテニウム、アグロスチス、スズメノテッポウ、アペラ。
【０１７６】
また、本発明の雑草には、例えば、好ましくない場所でせいちょうする作物植物も含まれる。例えば、主にダイズ植物が生えるべき場所に自然に生えてくるトウモロコシ植物は、このトウモロコシ植物がダイズ植物の畑で好ましくないなら、雑草と考えられる。
【０１７７】
本明細書で使用される「ある」とか「一つ」という表現は、一つ以上（即ち、少なくとも一つ）を意味している。例えば、「ある要素」とは、一つ以上の要素を意味する。
【０１７８】
本明細書において、「含む」、あるいは「含んでいる」などは、述べられた要素、数字やステップ、要素の集まり、複数の数字やステップ、が含まれていることを意味し、他の要素、数字やステップ、要素の集まり、複数の数字やステップを排除するものではない。
【０１７９】
以下の実施例は、本発明を説明するためのものであって、制限を目的とするものではない。
【０１８０】
実施例１：ヒマワリ系統ＢＴＫ４７の突然変異とイミダゾリノン耐性植物の選択
ＢＴＫ４７、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ  Ｌ．）育種系統を、化学的に突然変異させた。ＢＴＫ４７系統の種子６万個を、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）の溶液で１５時間処理した。処理した種子は、２００２年１２月１６日に、ネデラ試験施設（サンタフェ、アルゼンチン）で野外条件で播種した。約３０，０００個のＭ１植物が花をつけた。自己受粉をさせるため各花を袋で覆った。各植物は、手で収穫し脱穀した。２００３年５月１０日、フォルモサのニデラ試験施設において、頭花から得た２０個のＭ２種子を温室条件下で播種した。Ｖ２〜Ｖ４期に、約５９０，０００本の植物に対して、イマザピルを８０ｇ−活性成分／ｈａの比率で散布した。８本の植物がこの除草剤処理に耐えた。これらの植物を自己受粉させた後、収穫した。これら８本の植物から得たＭ３種子の、イマザピルに対する耐性を調べた。これらの８種のＭ３系統のうち、１系統（Ｓ４８９７）は、除草剤耐性が優れ分離した（即ち、イミダゾリノン除草剤の通常使用量で耐性を示す）。２系統は、中間耐性（即ち、部分的に耐性の）であり、１系統は、感受性を示した。完全に稔性であり除草剤耐性の植物を、自己受粉させて、収穫し、Ｓ４８９７系統として繁殖させた。
【０１８１】
耐性と中間耐性の両方のＭ３のＳ４８９７植物の葉の組織を用いて、実施例２に記載の方法によりＡＨＡＳＬ１遺伝子の配列の分析を行った。
【０１８２】
実施例２：ＰＣＲ増幅、イミダゾリノン耐性タンパク質と野生型ＡＨＡＳＬ１タンパク質をコードするヒマワリポリヌクレオチドのシークエンシング
Ｍ３のＳ４８９７及びＢＴＫ４７（野生型）ヒマワリ植物とから単離されたＤＮＡから、ＡＨＡＳＬ１遺伝子を、ＰＣＲにより二種の重なるフラグメントとして増幅した。ＰＣＲ増幅は、ホットスタートＴａｑ・ＤＮＡポリメラーゼ及びその試薬（キアゲン社、米国；カタログ番号：２０３２０５）を用い、標準法により実施した。これら二つのフラグメント用のＰＣＲプライマーを、表１および配列リストに示した。ＨＡ１Ｕ４０９（配列番号７）が、第一のフラグメント用のフォワードプライマーであり、ジェンバンク登録番号ＡＹ１２４０９２の塩基対４０９に相当する。ＨＡ１Ｌ１３７９（配列番号８）は、第一のフラグメント用のリバースプライマーであり、ジェンバンク登録番号ＡＹ１２４０９２の塩基対１３７９に相当する。ＨＡ１Ｕ１３１３（配列番号９）は、第二のフラグメント用のフォワードプライマーであり、ジェンバンク登録番号ＡＹ１２４０９２の塩基対１３１３に相当する。ＨＡ１Ｌ２１３１（配列番号１０）は、第二のフラグメントのリバースプライマーであり、ジェンバンク登録番号ＡＹ１２４０９２の塩基対２１３１に相当する。ＨＡ１Ｕ４０９−ＨＡ１Ｌ１３７９のプライマー対により、９７０塩基対のフラグメントが得られた。ＨＡ１Ｕ１３１３−ＨＡ１Ｌ２１３１の組み合わせにより、８１８塩基対のフラグメントが得られた。
【０１８３】
得られたＰＣＲ産物の配列を解析して、Ｓ４８９７とＢＴＫ４７のＡＨＡＳＬ１配列を決定した。これらの核酸配列のアラインメントと、オオオナモミｓｐ．ＡＬＳ遺伝子（ジェンバンク登録番号Ｕ１６２８０；配列番号５）の核酸配列を、図１に示した。このアラインメントにより、Ｓ４８９７のＡＨＡＳＬ１遺伝子が、ＢＴＫ４７のＡＨＡＳＬ１の単一突然変異であることがわかる。図１中の突然変異の部位を、アステリスクで示した。この突然変異は、配列番号１のヌクレオチド２１におけるＧからＡへの変異である。
【０１８４】
Ｓ４８９７、ＢＴＫ４７、及びオオオナモミｓｐ．のＡＨＡＳＬ１核酸配列から予想されるアミノ酸配列のアラインメントを図２に示す。ＢＴＫ４７のＡＨＡＳＬ１アミノ酸配列と較べると、Ｓ４８９７のＡＨＡＳＬ１アミノ酸配列では、アミノ酸位置７（配列番号２）でアラニンからトレオニンへの置換が起こっている。配列番号２のこのアミノ酸位置は、ジェンバンク登録番号ＡＹ５４１４５１（配列番号４）のヒマワリＡＨＡＳＬ１核酸配列でコードされた完全長アミノ酸配列のアミノ酸位置１０７に相当し、ジェンバンク登録番号Ｘ５１５１４のシロイヌナズナＡＨＡＳＬ核酸配列でコードされる完全長アミノ酸配列のアミノ酸位置１２２に相当する。
【０１８５】
【表１】
2009504137.tif 000003
【０１８６】
実施例３：Ｓ４８９７の除草剤耐性にホモ接合のヒマワリ系統の作成
除草剤耐性に関してホモ接合であるヒマワリ系統をＳ４８９７の自家受粉で得て、
イマザピルに対する耐性でスクリーニングした。このヒマワリ系統とその植物をＧＭ４０と称する。除草剤耐性に関する子孫の相同性を確認後、ＧＭ４０ヒマワリ系統の植物を、温室条件下で移植して、自己受粉させて、種子を得た。
【０１８７】
実施例４：Ｓ４８９７のイマザピックに対する耐性
アルゼンチンでの野外試験で、Ｓ４８９７植物のイマザピック耐性を評価した。
イマザピック耐性は、明らかにＭＩＳＵＮ−１（Ａｌａ190からＶａｌへの突然変異；シロイヌナズナ中の相当する位置は２０５；下記表４参照）より優れていた。この試験は、一列で行い、処理日は風が強かった。このため、実際の除草剤の植物への到達量は、散布量より少ないと考えられる。にもかかわらず、Ｓ４８９７は、Ａｌａ190からＶａｌへの置換より優れたイマザピック耐性を示した。なお、この野外試験のデータは本明細書には示されていない。
Ｓ４８９７とＩＭＩＳＵＮ−１の植物を、温室条件下でイマザピック処理した。
図５の写真は、これらの植物をイマザピックで１００ｇ−活性成分／ｈａで処理した場合を比較するものである。
【０１８８】
実施例５：Ｓ４８９７ヒマワリ系統と他のいろいろなクリアフィールド（登録商標）除草剤耐性ヒマワリの耐性とＡＨＡＳ活性のまとめ
方法：植物が２〜３葉期になった頃、ヒマワリ系統Ｓ４８９７、クリアフィールド（登録商標）ヒマワリ変種Ａ、Ｂ、Ｃ、および従来の非クリアフィールド変種に、１００、２００および３００ｇｍ−活性成分／ｈａの３種の散布比率のイマザモックス（ラプターＴＭ）と０．５％サンイトＩＩ、および１６０および３６０ｇｍ−活性成分／ｈａの２種の散布比率のイマザピル（アーセナルＴＭ）と０．５％サンイトＩＩを散布した。散布から（ＤＡＴ）１４日後に損傷を評点した。損傷は、０：損傷なしから９：死滅の０〜９の段階で評価した。各除草剤／散布比率ごとに、１２個の植物に散布した。統計分析を、分散分析及び最小有意作法を用いたスタットグラフィックスプラス５．０により行った。
【０１８９】
除草剤を散布されていない植物から活発に成長している葉を選抜して、定植約４週間後のＡＨＡＳ活性を分析した。
【０１９０】
結果；植物に散布後、Ｓ４８９７と他のヒマワリ変種の高さの差が、実際に到達した除草剤の量に影響を与えていると理解された。噴霧ブームの高さはＳ４８９７に合わせられたが、他の変種はより背が高くブームにより近いので、除草剤をより大量に散布されたと考えられる。他の変種に対しては、比率を再検討して散布を受けた近似量を決定した。高さの影響により直接の比較が難しいため、評価を表２のように行った。例えば損傷スコアは、イマザモックスを１００ｇｍ−活性成分／ｈａの割合で処理したＳ４８９７と、７５ｇｍ−活性成分／ｈａで処理した他の変種とで比較した。Ｓ４８９７系統への３００ｇｍ−活性成分／ｈａの処理量は、他の変種への２００ｇｍ−活性成分／ｈａ処理と同等であり、それは約３００ｇｍ−活性成分／ｈａであった。
【０１９１】
【表２】
2009504137.tif 000004
【０１９２】
Ｓ４８９７系統は全除草剤処理において有意に損傷が少なかった（表３）。
【０１９３】
事実、最高添付量のマザモックスまたはイマザピルにおいても、ごくわずかな損傷しか観察されなかった。他の変種は予想どおり、除草剤比率に応じて損傷の程度が増加した。図６は、Ｓ４８９７系統、クリアフィールド（登録商標）変種Ａ、および非クリアフィールド対照種の２００／１５０ｇｍ−活性成分／ｈａでの損傷の比較を示している。Ｓ４８９７の成長先端部ではわずかな損傷しか認められないか、損傷が認められなかったが、一方クリアフィールド（登録商標）変種Ａでは、損傷が著しく、成長が停止した。
【０１９４】
【表３】
2009504137.tif 000005
【０１９５】
ＡＨＡＳ活性の結果はまた、クリアフィールド（登録商標）ヒマワリおよび従来の非クリアフィールド変種と比較して、最高濃度のイマザモックスにおいて少ししか阻害を示さなかった（図７）。グリーンＴＭによる阻害は３種のヒマワリ変種にわたって類似していた（図８）。Ｓ４８９７系統の親植物の情報が入手できなかったため、フィードバックは示されなかった。両方の突然変異が同じＡＨＡＳＬ１の遺伝子座にあり、すべてのテストされた変種はホモ接合であるので、Ｓ４８９７のＡＨＡＳＬ１タンパク質中のアミノ酸置換により得られる耐性には質的な差がある。このように、この新しい置換の（即ち、Ａｌａ１０７→Ｔｈｒ）ＡＨＡＳ酵素は、除草剤存在下でも、同量のＡｌａ１９０→Ｖａｌ置換のＡＨＡＳより多くの産物の形成を触媒することができる。このことは、Ａｌａ１０７→Ｔｈｒ置換したＡＨＡＳは、Ａｌａ１９０→Ｖａｌ置換したＡＨＡＳより優れたイミダゾリノン除草剤耐性を有することを示している。
【０１９６】
例６：除草剤耐性ヒマワリＡＨＡＳＬタンパク質
本発明は、野生型および除草剤耐性ヒマワリＡＨＡＳＬポリペプチドの、ヌクレオチド配列とアミノ酸配列の両方を開示する。除草剤耐性ＡＨＡＳＬポリペプチドを含む植物は以前にもしられており、除草剤耐性を与えるアミノ酸置換部位である多くのＡＨＡＳＬポリペプチド保存領域が報告されている。デヴィーン、エーベルライン（１９９７）“標的部位の変更による除草剤耐性の生理学的、生化学的および分子的側面”、参照。Herbicide Activity: Toxicology, Biochemistry and Molecular Biology, Roe et al. (eds.), pp. 159-185, IOS Press, Amsterdam; and Devine and Shukla, (2000)Crop Protection 19:881-889。
【０１９７】
本発明のＡＨＡＳＬ配列やその技術分野で通常の技術を有する人には公知の方法を用いて、これらの保存領域中の同定された部位に１、２、３個またはそれ以上のアミノ酸置換を有する除草剤耐性ＡＨＡＳＬポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを、さらに生産することができる。表４にＡＨＡＳＬタンパク質の保存領域、これらの保存領域に除草剤耐性を与えることが知られているアミノ酸置換、および配列番号４に示されたヒマワリＡＨＡＳＬ１タンパク質中の対応するアミノ酸を示す。
【０１９８】
【表４】
2009504137.tif 000006
【０１９９】
１デヴィーン、エーベルライン（１９９７）“標的部位の変更による除草剤耐性の生理学的、生化学的および分子的側面”からの保存領域。Herbicide Activity: Toxicology, Biochemistry and Molecular Biology, Roe et al. (eds.), pp. 159- 185, IOS Press, Amsterdam and Devine and Shukla, (2000)Crop Protection 19:881-889. 
２シロイヌナズナＡＨＡＳＬ１ポリペプチドのアミノ酸配列に相当するアミノ酸番号。
３配列番号２および４に示されたヒマワリＡＨＡＳＬ１アミノ酸配列は完全長ではなく、それぞれアミノ酸配列ＦＡＹＰＧＧＡＳＭＥＩＨＱＡＬＴＲＳおよびＦＡＹＰＧＧＴＳＭＥＩＨＱＡＬＴＲＳで始まる。
４配列番号２および４に示されたヒマワリＡＨＡＳＬアミノ酸配列はこの保存領域を有する。
５この保存領域に対応するヒマワリＡＨＡＳＬ１領域（ジェンバンク登録番号ＡＹ５４１４５１）はＩＰＡＧＧ配列を有する。
６Bernasconi et al. (1995)J. Biol. Chem. 270(29): 17381-17385. 
７Boutsalis et al. (1999)Pestic. Set 55:507-516.  
８Guttieri et al. (1995)Weed Sci. 43: 143-178.  
９Guttieri et al. (1992)Weed Sci. 40:670-678. 
１０Hartnett et al.（１９９０）「変異アセト乳酸合成酵素遺伝子を保持する除草剤耐性植物」、
Managing Resistance to Agrochemicals: Fundamental Research to Practical Strategies, Green et al. (eds.), American Chemical Soc. Symp., Series No. 421, Washington, DC, USA 
１１Simpson (1998)Down to Earth 53(l):26-35.
１２Ｂｒｕｎｉａｒｄ（２００１）ヒマワリにおけるイミダゾリノン耐性の遺伝、交差耐性型の特徴、および分子マーカーの同定（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ  Ｌ．）．  Ph.D. Thesis, North Dakota State University, Fargo, ND, USA, pp 1-78. 
１３デヴィーンおよびエーベルライン（１９９７）“標的部位の変更による除草剤耐性の生理学的、生化学的および分子的側面”．
Herbicide Activity: Toxicology, Biochemistry and Molecular Biology, Roe et al. (eds.), pp. 159-185, IOS Press, Amsterdam 
１４Wright and Penner (1998)Theor. Appl. Genet. 96:612-620. 
１５Kolkman et al. (2004)Theor. Appl Genet. 109: 1147-11 59.  
１６White et al (2003)Weed Sci. 51 :845-853.
１７Chang and Duggleby (1998)Biochem J. 333:765-777.
【０２００】
例７：  ＧＭ１６０６ヒマワリ系統の作成
基本的に上述の実施例１に記載の方法を用いて、除草剤耐性において野生型であるヒマワリ種子の突然変異誘発により、第二の除草剤耐性ヒマワリ系統を作成した。新しい系統およびその系統の植物をここではＧＭ１６０６という。このＧＭ１６０６ヒマワリ系統には、Ｓ４８９７ヒマワリ系統と同じＡＨＡＳＬ１遺伝子の突然変異を含む。ＧＭ１６０６中のこの突然変異は、配列番号１のヌクレオチド２１に相当するＧからＡへの転移である。このような突然変異は、アミノ酸位置７（配列番号２）におけるアラニンからトレオニンへの置換を引き起こす。配列番号２のこのアミノ酸位置は、ジェンバンク登録番号ＡＹ５４１４５１  （配列番号４）のヒマワリＡＨＡＳＬ１核酸配列によってコードされた完全長アミノ酸配列中のアミノ酸位置１０７、およびジェンバンク登録番号Ｘ５１５１４のシロイヌナズナＡＨＡＳＬ核酸配列によってコードされた完全長アミノ酸配列中のアミノ酸位置１２２に相当する。
【０２０１】
例８：変異体Ａ１２２Ｔと変異体Ａ２０５Ｖのイマザピルへの反応
ヒマワリにおける、全植物レベルの異なった遺伝的背景での変異体Ａ１２２ＴおよびＡ２０５Ｖのイマザピル感受性を、温室での研究により定量化、および比較した。この研究に用いられた異なるヒマワリ系統の種子は、野外条件下得られた。この研究に用いられた系統を表５に示す。
【０２０２】
【表５】
2009504137.tif 000007
【０２０３】
方法
種子をペトリ皿にまき、発芽後、小植物を等量のバーミキュライト、土壌及び砂からなる培養土の入った直径１０ｃｍの鉢に移植した。植物を、温室で４００Ｗナトリウムハロゲンランプにより１６時間昼光を与える自然光条件下で育てた。日と夜の温度はそれぞれ２５と２０℃であった。Ｖ２期に、各遺伝子型の１０種の植物をランダムに、７種のイマザピル量（０、４０、８０、１６０、２４０、３２０、４００および４８０ｇ−活性成分／ｈａ）からなる処理を施し、ゼロ時間の生物量を測定した。実験は、処理の全要因（ヒマワリ系統ｘ処理）の配列および１０種の複製について乱塊法で進められた。
【０２０４】
除草剤を散布する日に、各遺伝子型の１０種の植物を子葉節で切り、６０℃で４８時間乾燥し、ゼロ時間の乾燥重量とした。
【０２０５】
残りの植物をイマザピル処理後１０日間育成し（ＤＡＴ）、その高さ、および根と地上部の乾燥生物量を記録した。高さは子葉節と各植物の頂端の距離とした。根の生物量の定量の際には、各植物を鉢から取り出し、根から培養土を洗い落とした。各サンプルから適正な平均ゼロ時間生物量を差し引することにより、各系統からの地上部の生物量データを、処理後に蓄積した生物量に変換した。乾燥生物量データを、グループ間で直接比較できる各系統の無処理の比較植物の割合に変換した。
【０２０６】
結果
１．高さ
Ａ２０５Ｖ突然変異のヒマワリ系統の高さは、イマザピルを０．５Ｘまたは１Ｘの割合で処理した時、無処理の比較群と変わらなかった。２Ｘから６Ｘの範囲では、これらの系統には、無処理比較群の６８．９％±３に達する有意な高さの減少が見られた（表６および図９）。一方、Ａ１２２Ｔ突然変異のヒマワリ系統では、高さの減少はより少なかった（それぞれ０．５Ｘおよび６Ｘの割合のイマザピルに対して無処理比較群の０．６〜１５．８％）。両系統群は、２Ｘ〜６Ｘの範囲での除草剤の増加に対する応答に、有意な差を認めた（表６および図９）。
【０２０７】
２．植物毒性指数
両変異体は０．５Ｘ〜６Ｘの除草剤散布比率の増加に対する応答に大きな差が認められた（図１０）。除草剤比率が増加すると、Ａ１２２Ｔ突然変異のヒマワリ系統では、コントロールの植物に較べて、葉の大きさがすこし減少し、色が淡い緑色を呈した（表７）。対照的に、Ａ２０５Ｖ突然変異の植物は、０．５Ｘ又は１Ｘの除草剤比率では、損傷がなかったが、２Ｘから６Ｘでは、損傷レベル（黄色がかった葉の変形と葉の壊死）が、急激に増加した（表７）。２Ｘ〜６Ｘの散布比率では、両変異体の植物毒性指数に有意な差が認められた（表７）。
【０２０８】
３．地表バイオマス乾燥重量
変異体Ａ１２２ＴとＡ２０５Ｖの乾燥重量の用量応答曲線を図１１に示す。Ａ１２２Ｔのバイオマスは、４Ｘ、５Ｘ及び６Ｘの比率で、コントロールの植物より減少し、更に比率が上昇すると２５％にまで低下した。一方、Ａ２０５Ｖの乾燥重量は、０．５Ｘ（４ｇ有効成分／ｈａ）〜６Ｘの範囲の比率でコントロールの植物と比べて低下した。両変異体では、０．５Ｘ〜６Ｘの範囲のこの値で大きな差が認められた（表８）。遺伝子型の違いにより初期の乾燥重量に違いがあったが、特に悪影響なく、乾重量でも同様な傾向が認められた（図示せず）。
【０２０９】
４．根の生物量
イマザピルの散布量の増加に伴い両変異体の根の乾燥重量が減少したが、減少速度は、Ａ１２２ＴとＡ２０５Ｖで大きく異なっていた（図１２）。実際、Ａ２０５Ｖは、０．５Ｘ（４０ｇ−有効成分／ｈａ）で１２．８％、６Ｘで７５．６％と大きな乾燥生物重量の低下を示した（表９）。一方、Ａ１２２Ｔは、３Ｘ〜６Ｘの範囲で大きな生物量の減少を示し、さらに投与量が増えると減少は３８．３％にまで達した（表９）。両変異体は、根乾燥重量の除草剤散布率の０．５Ｘ〜６Ｘの変化に対する応答の点で、大きな差を示した（表９及び図１２）。
【０２１０】
【表６】
2009504137.tif 000008
【０２１１】
【表７】
2009504137.tif 000009
【０２１２】
本明細書に引用する全文献及び出願特許は、本発明の関係する業界の熟練者のレベルを示すものである。それぞれ個々の文献あるいは特許が本明細書に取り入れられるのと同様に、本明細書に引用する全文献及び出願特許すべてが援用される。
以上、上記発明を例を挙げて明確な理解が得られるように詳細に記述したが、以下の請求の範囲内である程度の変更や修正が可能であることは明白であろう。
【図面の簡単な説明】
【０２１３】
【図１】図１は、除草剤耐性ヒマワリＡＨＡＳＬ１遺伝子（配列番号１）、野生型ヒマワリＡＨＡＳＬ１遺伝子（配列番号３）、ジェンバンク登録番号Ｕ１６２８０（配列番号５）、ジェンバンク登録番号ＡＹ５４１４５１（配列番号１１）、及びジェンバンク登録番号ＡＹ１２４０９２（配列番号１３）の核酸配列の核酸配列アラインメントである。突然変異部位（配列番号１）をアステリスクで示す。突然変異は、配列番号１のヌクレオチド位置２１でのＧからＡへの変異である。
【図２】図２は、除草剤耐性ヒマワリＡＨＡＳＬ１タンパク質（配列番号２）、野生型ヒマワリＡＨＡＳＬ１タンパク質（配列番号４）、ジェンバンク登録番号Ｕ１６２８０  （配列番号６）、ジェンバンク登録番号ＡＹ５４１４５１（配列番号１２）、及びジェンバンク登録番号ＡＹ１２４０９２（配列番号１４）のアミノ酸配列アラインメントである。アステリスクは、除草剤耐性ヒマワリＡＨＡＳＬ１タンパク質中の単一アミノ酸置換（Ａｌａ−ｔｏ−Ｔｈｒ）部位を示している。この置換部位は、配列番号２で表される部分長ＡＨＡＳＬ１アミノ酸配列のアミノ酸位置７に相当する。配列番号１２で表される完全長ヒマワリＡＨＡＳＴ１アミノ酸配列での相当する置換位置は、１０７である。
【図３】図３は、ＭＩＳＵＮ−１ヒマワリ植物の除草剤耐性（Al-Khatib and Miller (2000) Crop Set 40:869-870）と比較した、温室研究での、Ｓ４８９７ヒマワリ植物（右側）植物の除草剤耐性の増加を示す写真である。Ｓ４８９７とＩＭＩＳＵＮ−１のそれぞれのヒマワリ植物は、イマザモックスで、２００ｇ−活性成分／ｈａの散布率で、噴霧処理したものである。コントロールの野生型ヒマワリ植物は、散布率が１００あるいは２００ｇ−活性成分／ｈａ（図示せず）でのイマザモックス噴霧処理で、生存できなかった。写真は、植物の噴霧処理の数日後にとったものである。
【図４】図４は、ＭＩＳＵＮ−１、野生型、及びＳ４８９７ヒマワリ植物のイマザモックスの散布比率１００（白棒）あるいは２００ｇ−活性成分／ｈａ（黒棒）での噴霧処理後の温室試験における薬害を示すグラフである。この図は、イマザモックスの二種の散布比率において、ＩＭＩＳＵＮ−１植物と野生型植物の除草剤耐性と比較してＳ４８９７除草剤耐性ヒマワリ植物の耐性あるいは許容性が有意に高いことを示している。薬害は、イマザモックス散布後１７日目に評価した。ＩＭＩＳＵＮ−１植物は、アミノ酸１９０に、アラニンからバリンへの置換を有している（Kolkman et al. (2004) Theor. Appl Genet. 109: 1147-1159）。
【図５】図５は、実施例４の温室試験において、Ｓ４８９７ヒマワリ植物（右側）が、ＭＩＳＵＮ−１ヒマワリ植物の除草剤耐性と比較して、高い除草剤耐性を持つことをしめしている写真である
【図６】図６は、実施例５の温室試験において、Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ（登録商標）Ａヒマワリ植物と比較して、Ｓ４８９７ヒマワリ植物が高い除草剤耐性を持つことを示す写真である。
【図７】図７は、実施例５の、非−Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ種ラプター、Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ種とＳ４８９７ヒマワリ植物によるＡＨＡＳの阻害を比較する図である。
【図８】図８は、実施例５の、非−Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ種グリーン、Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ種とＳ４８９７ヒマワリ植物によるＡＨＡＳの阻害を比較する図である。
【図９】図９は、イマザピルの葉面処理が、処理後１４日目に、二種のヒマワリ変異体の草高に与える影響を示す図である。平均長（無処置品に対する％）を黒四角で表示し、誤差バーは、平均値の標準偏差を表す。
【図１０】図１０は、イマザピルの葉面処理が、処理後１４日目に、二種のヒマワリ変異体の草高に与える影響を示す図である。平均長（無処置品に対する％）を黒四角で表示し、誤差バーは、平均値の標準偏差を表す。
【図１１】図１１は、イマザピルの葉面処理が、処理後１４日目に、二種のヒマワリ変異体の生物量に与える影響を示す図である。平均乾燥重量（無処置品に対する％）を黒四角で表示し、誤差バーは、平均値の標準偏差を表す。
【図１２】図１２は、イマザピルの葉面処理が、処理後１４日目に、二種のヒマワリ変異体の根の生物量に与える影響を示す図である。根の平均乾燥重量（無処置品に対する％）を黒四角で表示し、誤差バーは、平均値の標準偏差を表す。
【図１−１】
2009504137.tif 000010
【図１−２】
2009504137.tif 000011
【図１−３】
2009504137.tif 000012
【図１−４】
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【図１−５】
2009504137.tif 000014
【図１−６】
2009504137.tif 000015
【図２−１】
2009504137.tif 000016
【図２−２】
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【図３】
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【図７】
2009504137.tif 000019
【図８】
2009504137.tif 000020
【図９】
2009504137.tif 000021
【図１０】
2009504137.tif 000022
【図１１】
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【図１２】
2009504137.tif 000024
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
2009504137000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年9月11日(2007.9.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノム中に少なくとも一種のアセトヒドロキシ酸シンターゼ大サブユニット（ＡＨＡＳＬ）ポリヌクレオチドを少なくとも一コピー有するヒマワリ植物であって、前記ＡＨＡＳＬポリヌクレオチドが、位置１０７又はそれに相当する位置にトレオニンを有する除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質をコードし、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、前記植物が、少なくとも一種の除草剤に対する耐性が、野生型ヒマワリ植物と比較して増加していることを特徴とするヒマワリ植物。
【請求項２】
前記植物の、イミダゾリノン除草剤、スルホニル尿素除草剤、トリアゾロピリミジン除草剤、ピリミジニルオキシベンゾエート除草剤、及びスルホニルアミノ−カルボニルトリアゾリノン除草剤からなる群から選択される少なくとも一種の除草剤に対する耐性が増加している請求項１に記載のヒマワリ植物。
【請求項３】
前記ＡＨＡＳＬポリヌクレオチドが、ＡＨＡＳＬ１ポリヌクレオチド、ＡＨＡＳＬ２ポリヌクレオチド、及びＡＨＡＳＬ３ポリヌクレオチドからなる群から選択される請求項１又は２に記載のヒマワリ植物。
【請求項４】
前記除草剤耐性のＡＨＡＳＬタンパク質が除草剤耐性ＡＨＡＳＬ１タンパク質である
請求項１〜３のいずれか１項に記載のヒマワリ植物。
【請求項５】
前記除草剤耐性のＡＨＡＳＬポリヌクレオチドが配列番号１で表される核酸配列を含む請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒマワリ植物。
【請求項６】
前記除草剤耐性のＡＨＡＳＬタンパク質が、
（ａ）アミノ酸位置１８２又はそれに相当する位置に、アラニン、トレオニン、ヒスチジン、ロイシン、アルギニン、イソロイシン、グルタミン、又はセリン；
（ｂ）アミノ酸位置１８８又はそれに相当する位置にイソロイシン；  
（ｃ）アミノ酸位置１９０又はそれに相当する位置に、アスパラギン酸又はバリン；
（ｄ）アミノ酸位置５５９又はそれに相当する位置にロイシン；及び
（ｅ）アミノ酸位置６３８又はそれに相当する位置にアスパラギン、トレオニン、フェニルアラニン、又はバリン；  
からなる群から選択される少なくとも一種のアミノ酸を含む請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒマワリ植物。
【請求項７】
前記植物が遺伝子組換え体である請求項１〜６のいずれか１項に記載のヒマワリ植物。
【請求項８】
前記植物が非遺伝子組換え体である請求項１〜６のいずれか１項に記載のヒマワリ植物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のヒマワリ植物の種子であって、前記種子が、ゲノム中に前記ＡＨＡＳＬポリヌクレオチドを少なくとも一コピー含むことを特徴とする種子。
【請求項１０】
Ｓ４８９７、ＧＭ４０、ＧＭ１６０６、ＡＴＧＣ特許寄託番号ＰＴＡ−６７１６のヒマワリ植物、又はＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−７６０６のヒマワリ植物の除草剤耐性を含むことを特徴とするヒマワリ植物であって、前記植物が、
（ａ）Ｓ４８９７、ＧＭ４０、ＧＭ１６０６、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−６７１６のヒマワリ植物、又はＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−７６０６のヒマワリ植物；  
（ｂ）Ｓ４８９７、ＧＭ４０、ＧＭ１６０６、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−６７１６のヒマワリ植物、又はＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−７６０６のヒマワリ植物の子孫；  
（ｃ）Ｓ４８９７、ＧＭ４０、ＧＭ１６０６、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−６７１６の植物、又はＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−７６０６の植物の変異体、組換え体、又は遺伝子組換え誘導体；あるいはＳ４８９７、ＧＭ４０、ＧＭ１６０６、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−６７１６の植物、又はＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−７６０６の植物の子孫；あるいは
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）の植物の少なくとも一種の子孫の植物、
であるヒマワリ植物。
【請求項１１】
前記植物が遺伝子組換え体である請求項１０又は１１に記載のヒマワリ植物。
【請求項１２】
前記植物が非遺伝子組換え体である請求項１０又は１１に記載のヒマワリ植物。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のヒマワリ植物の種子であって、前記種子が、Ｓ４８９７、ＧＭ４０、ＧＭ１６０６、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−６７１６のヒマワリ植物、又はＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−７６０６のヒマワリ植物の除草剤耐性を有することを特徴とする種子。
【請求項１４】
有効量のイミダゾリノン除草剤、スルホニル尿素除草剤、トリアゾロピリミジン除草剤、ピリミジニルオキシベンゾエート除草剤、スルホニルアミノ−カルボニルトリアゾリノン除草剤、あるいはこれらの混合物を、
雑草及びヒマワリ植物に施用することによりヒマワリ植物の近くの雑草を防除する方法であって、
前記ヒマワリ植物が、
（ａ）ゲノム中に、少なくとも一種の除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質をコードし、位置１０７又はそれに相当する位置にトレオニンを有するＡＨＡＳＬポリヌクレオチドを少なくとも一コピー有し、また配列番号２で表されるアミノ酸配列を有し、その結果、前記植物が、少なくとも一種の除草剤に対する耐性が、野生型ヒマワリ植物と比較して増加しているヒマワリ植物；
（ｂ）Ｓ４８９７、ＧＭ４０、ＧＭ１６０６、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−６７１６の植物、又はＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−７６０６の植物；  
（ｃ）Ｓ４８９７、ＧＭ４０、ＧＭ１６０６、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−６７１６の植物、又はＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−７６０６の植物の子孫のヒマワリ植物であって、Ｓ４８９７、ＧＭ４０、ＧＭ１６０６、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−６７１６の植物、又はＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−７６０６の植物の除草剤耐性を有する前記ヒマワリ植物；
（ｄ）Ｓ４８９７、ＧＭ４０、ＧＭ１６０６、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−６７１６の植物、又はＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−７６０６の植物、又はＳ４８９７、ＧＭ４０、ＧＭ１６０６、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−６７１６の植物、又はＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−７６０６の植物のいずれかの子孫の変異体、組換え体、又は遺伝子組換え誘導体であるヒマワリ植物であって、
Ｓ４８９７、ＧＭ４０、ＧＭ１６０６、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−６７１６の植物、又はＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−７６０６の植物の除草剤耐性を有する前記ヒマワリ植物；及び
（ｅ）（ｂ）〜（ｆ）のヒマワリ植物の少なくとも一種の子孫のヒマワリ植物であって、Ｓ４８９７、ＧＭ４０、ＧＭ１６０６、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−６７１６の植物、又はＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−７６０６の植物の除草剤耐性を有している前記ヒマワリ植物；
からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項１５】
前記イミダゾリノン除草剤が、［２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−］イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル）−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−３−キノリンカルボン酸、［５−エチル−２−（４−イソプロピル−４−メチル−］５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−メチルニコチン酸、メチル６−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｍ−トルエートとメチル［２−（４−］イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｐ−トルエートとの混合物、及びこれらの混合物からなる群から選択される請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記スルホニル尿素除草剤が、クロルスルフロン、メトスルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチル、チフェンスルフロンメチル、トリベヌロンメチル、ベンスルフロンメチル、ニコスルフロン、エタメトスルフロンメチル、リムスルフロン、トリフルスルフロンメチル、トリアスルフロン、プリミスルフロンメチル、シノスルフロン、アミドスルフロン、フルザスルフロン、イマゾスルフロン、ピラゾスルフロンエチル、ハロスルフロン、及びこれらの混合物からなる群から選択されるからなる群から選択される請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）配列番号１又は３で表される核酸配列；
（ｂ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列：
（ｃ）配列番号１で表される核酸配列に少なくとも７５％の配列同一性を持つ核酸配列（ただし、前記核酸配列は、位置１０７あるいは相当する位置にトレオニンを有すタンパク質をコードし、前記タンパク質は除草剤耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）活性を有している）；  
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に少なくとも７５％の配列同一性を持つタンパク質をコードする核酸配列（ただし、前記タンパク質は位置１０７又はそれに相当する位置にトレオニンを有し、除草剤耐性のＡＨＡＳ活性を有している）；及び
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）で表される核酸配列からなる群から選択される少なくとも一種の核酸配列に完全に相補的な核酸配列、
からなる群から選択される核酸配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチド分子単離物。
【請求項１８】
核酸配列（ｃ）又は（ｄ）でコードされた前記タンパク質が、更に
（ａ）アミノ酸位置１８２又はそれに相当する位置に、アラニン、トレオニン、ヒスチジン、ロイシン、アルギニン、イソロイシン、グルタミン、又はセリン；  
（ｂ）アミノ酸位置１８８又はそれに相当する位置にイソロイシン；
（ｃ）アミノ酸位置１９０又はそれに相当する位置に、アスパラギン酸又はバリン；
（ｄ）アミノ酸位置５５９又はそれに相当する位置にロイシン；及び
（ｅ）アミノ酸位置６３８又はそれに相当する位置にアスパラギン、トレオニン、フェニルアラニン、又はバリン；
からなる群から選択される少なくともアミノ酸を含む請求項１７に記載のポリヌクレオチド分子単離物。
【請求項１９】
請求項１７又は１８に記載のポリヌクレオチド分子の作動可能な状態で連結しているプロモーターを含むことを特徴とする発現カセット。
【請求項２０】
前記プロモーターが、細菌、真菌細胞、動物細胞、又は植物細胞において遺伝子発現を引き起こすことが可能である請求項１９記載の発現カセット。
【請求項２１】
請求項１９又は２０に記載の発現カセットにより形質転換されたことと特徴とする非ヒト宿主細胞。
【請求項２２】
前記宿主細胞が、細菌、真菌細胞、動物細胞、及び植物細胞からなる群から選択される請求項２１に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
目的遺伝子と選択マーカー遺伝子を含む形質転換ベクターであって、前記選択マーカー遺伝子がある核酸配列に作動可能な状態で連結しているプロモーターを含み、前記プロモーターがある宿主細胞で発現を実施させ、前記核酸配列が、
（ａ）配列番号１で表される核酸配列；  
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列；
（ｃ）配列番号１で表される核酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を持つ核酸配列（ただし、前記核酸配列は、位置１０７あるいは相当する位置にトレオニンを有すタンパク質をコードし、前記タンパク質は除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を有している）；及び  
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を持つタンパク質をコードする核酸配列（ただし、前記タンパク質は位置１０７又はそれに相当する位置にトレオニンを有し、除草剤耐性のＡＨＡＳ活性を有している）；
からなる群から選択されることを特徴とする形質転換ベクター。
【請求項２４】
前記プロモーターが、植物細胞中で発現可能である請求項２３に記載の形質転換ベクター。
【請求項２５】
前記プロモーターが構成的なプロモーターである請求項２３又は２４に記載の形質転換ベクター。
【請求項２６】
前記選択マーカー遺伝子が、更に作動可能な状態で連結している葉緑体ターゲティング配列を含んでいる請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の形質転換ベクター。
【請求項２７】
前記プロモーターが、細菌又は酵母で発現可能である請求項２３に記載の形質転換ベクター。
【請求項２８】
請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の形質転換ベクターを含むことを特徴とする非ヒト宿主細胞。
【請求項２９】
植物細胞内で発現を引き起こすプロモーターに作動可能な状態で連結しているある核酸配列を含むポリヌクレオチドコンストラクトを、ゲノム中に安定にとり込んだ形質転換植物であって、前記核酸配列が
（ａ）配列番号１又は３で表される核酸配列；
（ｂ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列：
（ｃ）配列番号１で表される核酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を持つ核酸配列（ただし、前記核酸配列は、位置１０７あるいは相当する位置にトレオニンを有すタンパク質をコードし、前記タンパク質は除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を有している）；  
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を持つタンパク質をコードする核酸配列（ただし、前記タンパク質は位置１０７又はそれに相当する位置にトレオニンを有し、除草剤耐性のＡＨＡＳ活性を有している）；及び
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）で表される核酸配列からなる群から選択される少なくとも一種の核酸配列に完全に相補的な核酸配列、
からなる群から選択されることを特徴とする形質転換植物。
【請求項３０】
前記プロモーターが、構成的なプロモーターと組織選択性プロモーターからなる群から選択される請求項２９に記載の形質転換植物。
【請求項３１】
前記ポリヌクレオチドコンストラクトが、更に作動可能な状態で連結している葉緑体ターゲティング配列を有する請求項２９又は３０に記載の形質転換植物。
【請求項３２】
前記形質転換植物のＡＨＡＳ活性が形質転換されなかった植物と較べて増加している請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の形質転換植物。
【請求項３３】
前記形質転換植物の少なくとも一種の除草剤に対する耐性が、形質転換されなかった植物と較べて増加している請求項２９〜３２のいずれか１項に記載の形質転換植物。
【請求項３４】
前記除草剤がイミダゾリノン除草剤である請求項２９〜３３のいずれか１項に記載の形質転換植物。
【請求項３５】
前記イミダゾリノン除草剤が、［２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−］イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル）−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−３−キノリンカルボン酸、［５−エチル−２−（４−イソプロピル−４−メチル−］５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−メチルニコチン酸、及びメチル６−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｍ−トルエートとメチル［２−（４−］イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｐ−トルエートとの混合物からなる群から選択される請求項３４に記載の形質転換植物。
【請求項３６】
前記除草剤がスルホニル尿素除草剤である請求項２９〜３３のいずれか１項に記載の形質転換植物。
【請求項３７】
前記スルホニル尿素除草剤が、クロルスルフロン、メトスルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチル、チフェンスルフロンメチル、トリベヌロンメチル、ベンスルフロンメチル、ニコスルフロン、エタメトスルフロンメチル、リムスルフロン、トリフルスルフロンメチル、トリアスルフロン、プリミスルフロンメチル、シノスルフロン、アミドスルフロン、フルザスルフロン、イマゾスルフロン、ピラゾスルフロンエチル、ハロスルフロン、及びそれらの混合物からなる群から選択される請求項３６に記載の形質転換植物。
【請求項３８】
前記形質転換植物が双子葉植物または単子葉植物である請求項２９〜３７のいずれか１項に記載の形質転換植物。
【請求項３９】
前記双子葉植物が、ヒマワリ、ダイズ、ワタ、アブラナ科、シロイヌナズナ、タバコ、ジャガイモ、テンサイ、アルファルファ、ベニバナ、及びピーナッツからなる群から選択される請求項３８に記載の形質転換植物。
【請求項４０】
前記単子葉植物がコムギ、コメ、トウモロコシ、オオムギ、ライムギ、カラスムギ、ライコムギ、キビ、及びソルガムからなる群から選択される請求項３８に記載の形質転換植物。
【請求項４１】
請求項２９〜４０のいずれか１項に記載の形質転換植物の形質転換種子であって、前記種子が前記ポリヌクレオチドコンストラクトを含むことを特徴とする種子。
【請求項４２】
植物細胞内で発現を引き起こすプロモーターに作動可能な状態で連結しているある核酸配列を含むポリヌクレオチドコンストラクトを、ゲノム中に安定にとり込んだ形質転換植物細胞であって、
前記核酸配列が、
（ａ）配列番号１又は３で表される核酸配列；  
（ｂ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列：
（ｃ）配列番号１で表される核酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を持つ核酸配列（ただし、前記核酸配列は、位置１０７あるいは相当する位置にトレオニンを有すタンパク質をコードし、前記タンパク質は除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を有している）；  
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を持つタンパク質をコードする核酸配列（ただし、前記タンパク質は位置１０７又はそれに相当する位置にトレオニンを有し、除草剤耐性のＡＨＡＳ活性を有している）；及び
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）で表される核酸配列からなる群から選択される少なくとも一種の核酸配列に完全に相補的な核酸配列、
からなる群から選択されることを特徴とする形質転換植物細胞。
【請求項４３】
植物細胞を植物細胞内で発現を引き起こすプロモーターに作動可能な状態で連結しているある核酸配列を含むポリヌクレオチドコンストラクトで形質転換し、前記形質転換植物細胞から形質転換植物を再生することで植物のＡＨＡＳ活性を増加させる方法であって、前記核酸配列が
（ａ）配列番号１又は３で表される核酸配列；
（ｂ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列：
（ｃ）配列番号１で表される核酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を持つ核酸配列（ただし、前記核酸配列は、位置１０７あるいは相当する位置にトレオニンを有すタンパク質をコードし、前記タンパク質は除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を有している）；及び  
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を持つタンパク質をコードする核酸配列（ただし、前記タンパク質は位置１０７又はそれに相当する位置にトレオニンを有し、除草剤耐性のＡＨＡＳ活性を有している）；
からなる群から選択され、
ＡＨＡＳ活性が、前記植物中あるいは少なくともその一部で、形質転換されなかった植物と較べて増加していることを特徴とする方法。
【請求項４４】
植物細胞を植物細胞内で発現を引き起こすプロモーターに作動可能な状態で連結しているある核酸配列を含むポリヌクレオチドコンストラクトで形質転換し、前記形質転換植物細胞から形質転換植物を再生することで除草剤耐性植物を産生する方法であって、
前記核酸配列が、
（ａ）配列番号１で表される核酸配列；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列；
（ｃ）配列番号１で表される核酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を持つ核酸配列（ただし、前記核酸配列は、位置１０７あるいは相当する位置にトレオニンを有すタンパク質をコードし、前記タンパク質は除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を有している）；及び  
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を持つタンパク質をコードする核酸配列（ただし、前記タンパク質は位置１０７又はそれに相当する位置にトレオニンを有し、除草剤耐性のＡＨＡＳ活性を有している）；
からなる群から選択され、
前記形質転換植物の少なくとも一種の除草剤に対する耐性が、形質転換されなかった植物の前記除草剤への耐性と比較して増加していることを特徴とする方法。
【請求項４５】
前記プロモーターが、構成的なプロモーターと組織選択性プロモーターからなる群から選択される請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ポリヌクレオチドコンストラクトが、更に作動可能な状態で連結している葉緑体ターゲティング配列を有する請求項４４又は４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記形質転換植物のＡＨＡＳ活性が形質転換されなかった植物と較べて増加している請求項４４〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記除草剤がイミダゾリノン除草剤である請求項４４〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記イミダゾリノン除草剤が、［２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−］イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４イソプロピル）−４−メチルー５オキソ−２−イミダゾリン−２イル）−３−キノリンカルボン酸、［５−エチル−２−（４−イソプロピル−４−メチル−］５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−メチルニコチン酸、及びメチル６−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｍ−トルエートとメチル［２−（４−］イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｐ−トルエートとの混合物からなる群から選択される請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記除草剤がスルホニル尿素除草剤である請求項４４〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記スルホニル尿素除草剤が、クロルスルフロン、メトスルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチル、チフェンスルフロンメチル、トリベヌロンメチル、ベンスルフロンメチル、ニコスルフロン、エタメトスルフロンメチル、リムスルフロン、トリフルスルフロンメチル、トリアスルフロン、プリミスルフロンメチル、シノスルフロン、アミドスルフロン、フルザスルフロン、イマゾスルフロン、ピラゾスルフロンエチル、ハロスルフロン、およびこれらの混合物からなる群から選択される請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記形質転換植物が双子葉植物または単子葉植物である請求項４４〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記双子葉植物が、ヒマワリ、ダイズ、ワタ、アブラナ科、シロイヌナズナ、タバコ、ジャガイモ、テンサイ、アルファルファ、ベニバナ、及びピーナッツからなる群から選択される請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記単子葉植物が、コムギ、コメ、トウモロコシ、オオムギ、ライムギ、カラスムギ、ライコムギ、キビ、及びソルガムからなる群から選択される請求項４４〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記植物細胞が、前記形質転換段階の前に、少なくとも一種の除草剤に対する耐性を有している請求項４４〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
植物細胞内で発現を引き起こすプロモーターに作動可能な状態で連結しているある核酸配列を含むポリヌクレオチドコンストラクトで形質転換する工程と、
前記形質転換植物細胞から形質転換植物を再生する工程とからなる、
除草剤耐性植物中の除草剤耐性を増強する方法であって、
前記核酸配列が
（ａ）配列番号１で表される核酸配列；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列；
（ｃ）配列番号１で表される核酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を持つ核酸配列（ただし、前記核酸配列は、位置１０７あるいは相当する位置にトレオニンを有すタンパク質をコードし、前記タンパク質は除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を有している）；及び  
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を持つタンパク質をコードする核酸配列（ただし、前記タンパク質は位置１０７又はそれに相当する位置にトレオニンを有し、除草剤耐性のＡＨＡＳ活性を有している）；
からなる群から選択され、
前記除草剤耐性植物の除草剤耐性が、形質転換されなかった除草剤耐性植物と較べて、前記植物において増強されていることを特徴とする方法。
【請求項５７】
前記除草剤耐性植物が、前記形質転換段階の前に、除草剤耐性のＡＨＡＳＬタンパク質を含んでいる請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記除草剤耐性植物が、前記除草剤耐性のＡＨＡＳＬタンパク質を発現するように遺伝子組み換えされている請求項５６又は５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記除草剤耐性植物が、前記除草剤耐性のＡＨＡＳＬタンパク質を発現するように遺伝子組み換えされている請求項５６又は５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記除草剤耐性植物が、前記形質転換工程の前に、イミダゾリノン耐性植物である請求項５６〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
植物細胞を植物形質転換ベクターで形質転換する工程、
前記形質転換植物細胞を、形質転換されなかった植物細胞の成長を阻害する濃度で少なくとも一種の除草剤に暴露する工程、及び
前記除草剤の存在下でも成長可能な前記形質転換植物細胞を特定する工程
からなる形質転換植物細胞を選択する方法であって、
前記植物形質転換ベクターが、プロモーターと作動可能な状態で連結する核酸配列とを含む選択マーカー遺伝子を含み、前記プロモーターが植物細胞中で発現を引き起こし、
前記核酸配列が、
（ａ）配列番号１で表される核酸配列；  
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列；
（ｃ）配列番号１で表される核酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を持つ核酸配列（ただし、前記核酸配列は、位置１０７あるいは相当する位置にトレオニンを有すタンパク質をコードし、前記タンパク質は除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を有している）；及び  
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を持つタンパク質をコードする核酸配列（ただし、前記タンパク質は位置１０７又はそれに相当する位置にトレオニンを有し、除草剤耐性のＡＨＡＳ活性を有している）；
からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項６２】
前記除草剤が、イミダゾリノン除草剤、スルホニル尿素除草剤、あるいはそれらの混合物である請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記植物形質転換ベクターが、更に少なくとも一種の目的遺伝子を含んでいる請求項６１又は６２に記載の方法。
【請求項６４】
更に、前記形質転換植物細胞から形質転換植物を再生する工程を含む請求項６１〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
有効量のイミダゾリノン除草剤、スルホニル尿素除草剤、トリアゾロピリミジン除草剤、ピリミジニルオキシベンゾエート除草剤、スルホニルアミノ−カルボニルトリアゾリノン除草剤、あるいはこれらの混合物を、雑草及び形質転換植物に施用することにより形質転換植物の近くの雑草を防除する方法であって、
前記形質転換植物のイミダゾリノン除草剤に対する耐性が、形質転換されなかった植物と較べて強化されており、
形質転換植物が、ゲノム中に、植物細胞中で遺伝子発現させるプロモーターに作動可能な状態で連結している核酸配列を含む発現カセットを少なくとも一個含んでいるおり、前記核酸配列が、
（ａ）配列番号１で表される核酸配列；  
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列；
（ｃ）配列番号１で表される核酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を持つ核酸配列（ただし、前記核酸配列は、位置１０７あるいは相当する位置にトレオニンを有すタンパク質をコードし、前記タンパク質は除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を有している）；及び  
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を持つタンパク質をコードする核酸配列（ただし、前記タンパク質は位置１０７又はそれに相当する位置にトレオニンを有し、除草剤耐性のＡＨＡＳ活性を有している）；
からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項６６】
前記イミダゾリノン除草剤が、［２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−ｊイミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル）−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−３−キノリンカルボン酸、［５−エチル−２−（４−イソプロピル−４−メチル−］５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−メチルニコチン酸、及びメチル６−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｍ−トルエートとメチル［２−（４−］イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｐ−トルエートとの混合物、及びこれらの混合物からなる群から選択される請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記スルホニル尿素除草剤が、クロルスルフロン、メトスルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチル、チフェンスルフロンメチル、トリベヌロンメチル、ベンスルフロンメチル、ニコスルフロン、エタメトスルフロンメチル、リムスルフロン、トリフルスルフロンメチル、トリアスルフロン、プリミスルフロンメチル、シノスルフロン、アミドスルフロン、フルザスルフロン、イマゾスルフロン、ピラゾスルフロンエチル、ハロスルフロン、及びこれらの混合物からなる群から選択される請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記植物が双子葉植物又は単子葉植物である請求項６５〜６７のいずれかに１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記双子葉植物がヒマワリ、ダイズ、ワタ、アブラナ科、シロイヌナズナ、タバコ、ジャガイモ、テンサイ、アルファルファ、ベニバナ、及びピーナッツからなる群から選択される請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記単子葉植物がコムギ、ライコムギ、トウモロコシ、コメ、ソルガム、ライムギ、キビ、及びオオムギからなる群から選択される請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
（ａ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１又は３で表される核酸配列によりコードされたアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を持つアミノ酸配列（ただし、前記ポリペプチドは、位置１０７又はそれに相当する位置にトレオニンを有し、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性をもつ）；及び
（ｄ）配列番号１で表される核酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を持つ核酸配列によりコードされたアミノ酸配列（前記核酸配列は位置１０７又はそれに相当する位置にトレオニンを有するタンパク質をコードし、前記タンパク質は、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を有する）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とするポリペプチド単離物。
【請求項７２】
ある除草剤に耐性がある第一の植物を、除草剤に耐性がない第二の植物と交配させることにより除草剤耐性植物を産生する方法であって、第一の植物が、請求項１〜８、１０〜１２、及び２９〜４０のいずれか１項に記載の植物であることを特徴とする方法。
【請求項７３】
更にその除草剤に耐性の子孫植物を選択する請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
請求項７２又は７３に記載の方法で産生したことを特徴とする除草剤耐性植物。
【請求項７５】
第一の植物の除草剤耐性を有していることを特徴とする請求項７４の植物の種子。
【請求項７６】
第一の植物と第二の植物を交配させて植物の除草剤耐性を増加させる方法であって、第一の植物が請求項１〜８、１０〜１２、２９〜４０、及び７４のいずれか１項の植物であることを特徴とする方法。
【請求項７７】
更に前記第二の植物の除草剤耐性と較べると増加した除草剤耐性を持つ子孫植物を選択する請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
請求項７６又は７７の方法により産生されたことを特徴とする植物。
【請求項７９】
除草剤耐性が増加していることを特徴とする請求項７８の植物の種子。
【請求項８０】
ＡＨＡＳ阻害性の除草剤で処理されたことを特徴とする請求項１〜８、１０〜１２、２９〜４０、７４、及び７８のいずれか１項の植物の種子。
【請求項８１】
前記ＡＨＡＳ阻害性の除草剤が、イミダゾリノン除草剤、スルホニル尿素除草剤、トリアゾロピリミジン除草剤、ピリミジニルオキシベンゾエート除草剤、及びスルホニルアミノ−カルボニルトリアゾリノン除草剤、あるいはこれらの混合物からなる群から選択される請求項８０に記載の種子。
【請求項８２】
請求項１〜８、１０〜１２、２９〜４０、７４、及び７８のいずれか１項に記載の植物の種子を、播種前及び／又は前発芽の後に、ＡＨＡＳ阻害性の除草剤に接触させることを特徴とする、好ましくない植生を防止する方法。
【請求項８３】
前記ＡＨＡＳ阻害性の除草剤が、イミダゾリノン除草剤、スルホニル尿素除草剤、トリアゾロピリミジン除草剤、ピリミジニルオキシベンゾエート除草剤、及びスルホニルアミノ−カルボニルトリアゾリノン除草剤、又はこれらの混合物からなる群から選択される請求項８２に記載の方法。
【国際調査報告】
2009504137.tif 000046
2009504137.tif 000047
2009504137.tif 000048
2009504137.tif 000049
2009504137.tif 000050