(57)【要約】  核酸配列の検出又は分析のためのＲＮＡ含有プローブを用いた分析方法を記載する。これらのプローブは、核酸配列を含有すると疑われるサンプルと接触され、そしてそれらが２本鎖を形成する場合、それらは加水分解される。これは、例えば、増幅反応の最中に実行されうる。加水分解の結果として生成されたＡＭＰはＡＴＰに変換される。次いでＡＴＰは生物発光試薬を用いて検出されうる。少なくとも１のプローブ内に修飾アデノシンを含ませることは、１のプローブから生じたシグナルが異なる、かつ、区別しうる生物発光シグナルを生じ、それゆえ、例えば、生物発光により報告された核酸試験における内部対照の使用を可能にすることを意味する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の２以上の核酸配列の検出方法であって、以下のステップ：
前記サンプルを、第１核酸配列にハイブリダイズすることができる第１ＲＮＡ含有プローブ、及び第２核酸配列にハイブリダイズすることができる第２ＲＮＡ含有プローブと、前記第１ＲＮＡ含有プローブが前記サンプル中に存在する第１核酸配列に結合し、そして前記第２ＲＮＡ含有プローブが前記サンプル中に存在する第２核酸配列に結合する条件下で、接触させる、ここで、前記第１ＲＮＡ含有プローブと第２ＲＮＡ含有プローブ内の少なくとも１のアデノシンは、アデノシンの修飾形態であり、かかる修飾形態は、対応の３リン酸化形態にリン酸化されるとき、生物発光シグナリング系と相互作用して、当該生物発光シグナリング系が３リン酸化形態におけるアデノシンと相互作用するとき、当該生物発光シグナリング系により生成されるシグナルに比較して、変更された生物発光シグナルを生成する；
核酸に結合したＲＮＡ含有プローブが加水分解されて、アデノシン１リン酸（ＡＭＰ）、及び／又は修飾アデノシン１リン酸（ＡＭＰm）を生成する条件下に、核酸／プローブ複合体をもっていき；
存在するＡＭＰとＡＭＰmを全てリン酸化して、それぞれ、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）又は修飾アデノシン３リン酸（ＡＴＰm）を生成し；
ＡＴＰに比較してＡＴＰmと反応するとき異なるシグナルを生成する生物発光シグナリング系を検出し；
そうして生成されたシグナルの性質を測定し、そしてその測定値を、前記サンプル中の前記第１核酸と第２核酸の存在又は不存在に関係付ける；
を含む方法。
【請求項２】
ＡＭＰと修飾ＡＭＰが、それぞれ、ＡＴＰと修飾ＡＴＰに、酵素反応により変換される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＲＮＡ含有プローブがＲＮＡ分子である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＲＮＡ含有プローブがＲＮＡ／ＤＮＡヘテロポリマーである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記第１又は第２ＲＮＡ含有プローブの内の１つの２以上のアデノシン・ヌクレオシドが、アデノシンの修飾された形態である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記修飾されたアデノシンがｄＡＴＰである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＲＮＡ含有プローブは、核酸／プローブ複合体の形態にあるとき、酵素を用いて加水分解される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記酵素は、ポリメラーゼ酵素、又はＲＮＡｓｅ酵素又はそれらの組合せから選択される、但し、前記酵素は、１本鎖形態でＲＮＡ含有プローブを非選択的に加水分解するＤＮＡｓｅ又はＲＮＡｓｅ活性を有さない、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記酵素はＲＮＡｓｅを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記酵素はＴ７エキソヌクレアーゼ又はヘビ毒ホスホジエステラーゼである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１又は第２核酸プローブの加水分解により得られるＡＭＰ又はＡＭＰmは、１以上のリン酸化酵素を用いてアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）又は修飾アデノシン３リン酸（ＡＴＰm）にリン酸化される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記１以上のリン酸化酵素は、ホスホエノールピルベート・シンターゼ、又はヌクレオシド３リン酸−アデニレート・キナーゼとＮＴＰ又はピルベート・ホスフェート・ジキナーゼの組合せである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記生物発光シグナリング系は、酵素ルシフェラーゼと、酵素基質、ルシフェリンとの組合せを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１ＲＮＡ含有プローブと第２ＲＮＡ含有プローブは、遊離状態にあるとき、核酸／プローブ複合体の形態にあるときプローブの加水分解を生じないように、使用される酵素により加水分解されないことを保証するように、修飾される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記プローブは、その５′末端で化学的にブロックされる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
核酸増幅反応とともに実施される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記増幅反応は等温反応である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
核酸／プローブ複合体の形態にあるときプローブの加水分解を生じさせるために必要な酵素又は試薬とともに、そしてまた場合により、ＡＭＰ又はＡＭＰmのリン酸化のために必要な試薬及び生物発光シグナリング系とともに、第１ＲＮＡプローブ及び第２ＲＮＡプローブが、増幅反応の全体を通して存在する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記増幅反応は、ポリメラーゼ・チェイン・リアクションである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
核酸／プローブ複合体の形態にあるときプローブの加水分解を生じさせるために必要な酵素又は試薬とともに、そしてまた場合により、ＡＭＰ又はＡＭＰmのリン酸化のために必要な試薬とともに、第１ＲＮＡプローブ及び第２ＲＮＡプローブが、増幅反応の全体を通じて存在する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
核酸／プローブ複合体の形態にあるときプローブの加水分解を生じさせるために必要な酵素又は試薬が、ＰＣＲ反応を実行するために使用されるＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
核酸／プローブ複合体の形態にあるときプローブの加水分解を生じさせるために必要な酵素又は試薬が、追加の加水分解酵素をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１プローブと第２プローブは、３′末端での伸長をブロックされる、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
ＤＮＡポリメライゼーションのための基質として作用するけれども、生物発光シグナリング系内で有意な活性をもたない、ｄＡＴＰの他形態の存在下で、ＰＣＲが実行される、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ｄＡＴＰの他形態は、２′−デオキシアデノシン−５′−Ｏ−１−チオトリホスフェート（ｄＡＴＰαＳ）又は７−デアザ−２′−デオキシアデノシン−５′−トリホスフェート（ｃ７ｄＡＴＰ）である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
生物発光シグナリング系の試薬は、増幅反応の終りに添加される、請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
生物発光シグナリング系の試薬は、各サイクルの終りに添加され、そして生成したシグナルは、その時点で読まれる、請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１又は第２核酸配列の内の１は、標的配列であり、そして他は、反応混合物に添加される内部対照配列である、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
核酸配列の検出方法であって、以下のステップ：
（ａ）ポリメラーゼ・チェイン・リアクションのアニーリング期の最中に第１核酸配列にハイブリダイズすることができる第１ＲＮＡ含有プローブ、及びポリメラーゼ・チェイン・リアクションの同じくアニーリング期の最中に第２核酸配列にハイブリダイズすることができる第２ＲＮＡ含有プローブ、ここで前記第１又は第２ＲＮＡ含有プローブの内の少なくとも１つのアデノシンは、アデノシンの修飾形態であり、かかる修飾形態は、対応の３リン酸化形態にリン酸化されるとき、生物発光シグナリング系が３リン酸化された形態のアデノシンと相互作用するときに当該生物発光シグナリング系により生成されるシグナルに比較して、変更された生物発光シグナルを生成するように生物発光シグナリング系と相互作用する、（ｂ）２本鎖形態（例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ２本鎖）で存在するとき前記ＲＮＡ含有プローブを加水分解する酵素又は酵素混合物、及び（ｃ）アデノシン１リン酸をアデノシン３リン酸へ又は修飾アデノシン１リン酸を修飾アデノシン３リン酸へ変換するために必要な１以上の酵素又は試薬の存在下でポリメラーゼ・チェイン・リアクションを実行し；
存在するＡＭＰ及び修飾アデノシン１リン酸を、それぞれ、ＡＴＰ又は修飾アデノシン３リン酸にリン酸化し；
ＡＴＰと修飾ＡＴＰの存在に対して、異なって、かつ、区別しうる状態で反応する生物発光試薬を、前記サンプルに添加し；そして
そうして生成されたシグナルの性質を測定し、そして当該測定値を、前記サンプル中の前記第１核酸及び第２核酸の存在又は不存在と関係付ける、
を含む前記方法。
【請求項３０】
核酸の配列を決定する方法であって、以下のステップ：
（ｉ）第１ＲＮＡ含有プローブと第２ＲＮＡ含有プローブを前記配列の知られた領域に結合させて、当該プローブの末端にある少なくとも１のヌクレオチドを当該配列の知られていない又は不明な領域内に到達するようにする、そしてここで前記第１ＲＮＡ含有プローブと第２ＲＮＡ含有プローブは、その末端に存在するヌクレオシドが異なり、そしてここで前記第１又は第２ＲＮＡ含有プローブ内の少なくとも１のアデノシンは、アデノシンの修飾された形態であり、そしてかかる修飾された形態は、対応の３リン酸化形態にリン酸化されるとき、生物発光シグナリング系が３リン酸化形態のアデノシンと相互作用するときに当該生物発光シグナリング系により生成されるシグナルに比較して、変更された生物発光シグナルを生成するように生物発光シグナリング系と相互作用する；
（ii）２本鎖形態（例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ２本鎖）で存在するとき前記ＲＮＡ含有プローブを加水分解する酵素を用いて前記ＲＮＡ含有プローブを加水分解し；
（iii）生成されたアデノシン１リン酸をアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）に、そして修飾アデノシン１リン酸（ＡＭＰm）を修飾アデノシン３リン酸（ＡＴＰm）に変更し；
（iv）ＡＴＰ及びＡＴＰmの存在に対して異なって反応する生物発光試薬を前記サンプルに添加し；
（ｖ）前記生物発光試薬からのシグナルを検出し；そして
（vi）前記シグナルを、前記プローブの内の１の末端に相補するか又はそうではない配列の領域の存在と関係付ける、
を含む前記方法。
【請求項３１】
各々がその末端に異なるヌクレオチドをもち、かつ、各々がアデノシンの異なる形態を含有する４つのＲＮＡ加水分解プローブを用いて実施される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ステップ（iii）において、ホスホエノールピルベート・シンターゼ、ホスフェート、及びホスホエノールピルベートを添加することにより、変更が行われる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ステップ（iii）において、ヌクレオシドトリホスフェート−アデニレート・キナーゼ、ヌクレオシド５′−トリホスフェート（ＮＴＰ）、及びアデニレート・キナーゼの組合せにより、変換が行われる、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３４】
ステップ（iv）において使用される生物発光試薬は、ルシフェリンとルシフェラーゼを含む、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
各々が標的配列に特異的であり、その内の１が修飾アデノシンを含む少なくとも２のＲＮＡ含有プローブを含む分析用キット。
【請求項３６】
２本鎖形態で存在するときＲＮＡ含有プローブを加水分解することができる酵素又は酵素混合物をさらに含む、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
ＡＭＰからＡＴＰに又はＡＭＰmからＡＴＰmに変換するための手段をさらに含む、請求項３５又は３６に記載のキット。
【請求項３８】
生物発光試薬をさらに含む、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３９】
前記生物発光試薬が、ルシフェラーゼ及び／又はルシフェリンを含む、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
前記ルシフェラーゼが組換え耐熱性ルシフェラーゼである、請求項３９に記載のキット。
【請求項４１】
少なくとも２つの増幅プライマーをさらに含む、請求項３５〜４０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項４２】
ＲＮＡ含有プローブが、オリゴヌクレオチドのプローブ領域を増幅する伸長反応を妨害するブロッキング基によりＲＮＡ含有プローブ領域に連結された、核酸増幅反応におけるプライマーとして機能しうるＤＮＡポリマーを含む前記オリゴヌクレオチドを含む、請求項３５〜４０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項４３】
対応の３リン酸化形態にリン酸化されるとき、生物発光シグナリング系が３リン酸化形態のアデノシンと相互作用するとき当該生物発光シグナリング系により生成されるシグナルに比較して変更された生物発光シグナルを生成するように生物発光シグナリング系と相互作用する、アデノシンの修飾形態を含むＲＮＡ含有プローブ。
【請求項４４】
少なくとも１のアデノシンヌクレオチド又は、対応の３リン酸化形態にリン酸化されるとき、生物発光シグナリング系が３リン酸化形態のアデノシンと相互作用するときに当該生物発光シグナリング系により生成されるシグナルに比較して変更された生物発光シグナルを生成するように生物発光シグナリング系と相互作用するアデノシンの修飾形態を含むＲＮＡ／ＤＮＡヘテロポリマーを含むＲＮＡ含有プローブ。
【請求項４５】
ＤＮＡポリマーを含み、ここで、１以上のデオキシ−アデノシンヌクレオチドが、場合により修飾されたアデノシンヌクレオチドにより置換されており、かかる修飾されたアデノシンヌクレオチドは、対応の３リン酸化形態にリン酸化されるとき、生物発光シグナリング系が３リン酸化形態のアデノシンと相互作用するときに当該生物発光シグナリング系により生成されるシグナルに比較したとき変更された生物発光シグナリング系を生成するように生物発光シグナリング系と相互作用する、請求項４４に記載のＲＮＡ含有プローブ。
【請求項４６】
オリゴヌクレオチドのプローブ領域を増幅する伸長反応を妨害するブロッキング基によりＲＮＡ含有プローブ領域に連結された、核酸増幅反応においてプライマーとして機能しうるＤＮＡポリマーを含む前記オリゴヌクレオチド。
【請求項４７】
核酸の検出における、請求項４４〜４６のいずれか１項に記載のプローブの使用。
【請求項４８】
サンプル中の核酸配列の検出方法であって、以下のステップ：
ＲＮＡ含有プローブが前記サンプル中に存在する標的核酸配列に結合する条件下で、前記サンプルを、標的核酸配列にハイブリダイズすることができる請求項４４〜４６のいずれか１項に記載のＲＮＡ含有プローブと、接触させ；
核酸に結合したＲＮＡ含有プローブがアデノシン１リン酸（ＡＭＰ）又は修飾アデノシン１リン酸（ＡＭＰm）を生じるように加水分解される条件に、核酸／プローブ複合体をもっていき；
存在するＡＭＰ又は修飾アデノシン１リン酸を、それぞれ、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）又は修飾アデノシン３リン酸（ＡＴＰm）にリン酸化し；
生物発光シグナリング系を用いてＡＴＰ又は修飾アデノシン３リン酸を検出する、
を含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、サンプル中の特定の配列の存在を検出するための、又は特定の核酸の正確な配列を決定するための、核酸配列の分析方法に、及びこれらの方法に使用されるキット及び試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、核酸の分析を行うための多種多様な方法が在る。分析方法は、特定の核酸配列を含有すると疑われるサンプル中の当該サンプルの存在又は量を検出する方法に関するものでありうる。他の方法は、情報又は診断目的のためにヌクレオチドの配列を決定するために核酸の構造を明らかにする。
【０００３】
増幅反応は、特に特定の核酸配列が少量でのみ存在する場合に、上記分析を行い又は支援するために、一般に用いられる。標的核酸配列の検出のための増幅反応、例えばポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）の使用は周知である。特定の配列に特異的な１以上のプライマーが、増幅反応混合物中に含まれる。これらは、サンプル管内で１本鎖で存在するとき、特定の標的配列にハイブリダイズするであろう。標的配列が存在する場合、プライマーはそれに結合し、その上で混合物中に存在するポリメラーゼ酵素が、一定の温度条件で、プライマーを延長して完全な相補鎖を形成するであろう。この材料は、その後、変性、プライマー・アニーリング、及び伸長のその後のサイクルにおける増幅のためのさらなるテンプレート（鋳型）を形成する。
【０００４】
等温増幅技術も知られており、そしてこれらは、Strand Displacement Amplification (SDA) (Walker et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89, 392-396）、ループ仲介等温増幅（ＬＡＭＰ）（Notomi et al. Nucleic Acids Res. 28, 2000)（ここで、使用されるポリメラーゼはストランド変位活性を有する）、ローリング・サークル増幅（ＲＣＡ）などを含む。
【０００５】
増幅された生成物は、例えば、電気泳動ゲル上で検出されうる。しかしながら、蛍光ラベリング法は、増幅反応が行われたときを検出し、そして／又はその進行をモニターするために、今日頻繁に使用される。このようなアッセイの例は、ＴＡＱＭＡＮTMアッセイ、並びに、例えば、ＷＯ９９／２８５００、ＷＯ９９／２８５０１、ＷＯ９９／４２６１１、及びＷＯ９９／６６０７１中に記載され、そして請求されるアッセイを含む。標識されたリボ−オリゴヌクレオチド・プローブを使用するアッセイは、ＷＯ９８／０４７３８中に記載されている。しかしながら、プローブの標識付けは、費用を増大させる複雑なプロセスである。
【０００６】
核酸配列をシークエンスする方法も周知である。ゲル法が慣用される。より最新の方法は、正しいヌクレオチドが、１本鎖核酸テンプレート上での相補鎖の構築の間に添加されるとき、生物発光シグナルの生成に頼るデバイス、例えば、Ｂｉｏｔａｇｅ  ＡＢから入手可能なＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いて行われる。熱リン酸分解（ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｏｌｙｓｉｓ）反応を用いる核酸サンプル中の特定の塩基の同一性を質問する他の方法は、ＷＯ９９／４６４０９中に記載されている。
【０００７】
ＷＯ０２／０９０５８６は、標識されていないリボ核酸（ＲＮＡ）プローブがどのようにして、上記事件をモニターし又は検出するための有用な手段を提供しうるかについて記載する。この場合の検出は、特異的プローブの加水分解、その後の、加水分解により生じたアデノシン１リン酸（ＡＭＰ）の検出に頼る。特に、プローブ加水分解の副生成物として作られたＡＭＰはリン酸化されてアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）が作られ、これは、例えば、生物発光シグナリング系、例えばルシフェラーゼ／ルシフェリン系を用いて、その後に検出されうる。
【０００８】
生物発光シグナリング系は特に好ましい。なぜなら、それらは、一般に、蛍光系よりも感度が良く、そしてより大きなダイナミックレンジを提供するからである。したがって、分析方法におけるＲＮＡ加水分解プローブの使用は、サンプル中の核酸レベルにおける相互作用の検出を容易にし、そしてそれゆえ、強化された分析方法をもたらす。
【０００９】
さらに、生物発光シグナルを検出するために要求される装置は、蛍光シグナルを検出するために要求される装置よりも簡易である。光検出器、例えば、ＣＣＤカメラは、生物発光シグナルを検出することができるが、蛍光シグナルを計測するためには検出器に加えて、フィルター視準光源及び光学装置が要求される。
【００１０】
しかしながら、蛍光シグナリング系は各種プローブに対して異なる蛍光染料等の使用により、多重アッセイにおいて使用されうるが、ＷＯ０２／０９０５８６中に記載されるシステムは、多重アッセイに使用するためには好適でない。なぜなら、そのシグナリングは、全てのプローブの加水分解において遍在するＡＭＰの生成に頼るからである。
【００１１】
さらに、このようなシステムを使用するとき、これまで、内部対照を使用することはできなかった。例えば、内部対照反応は、一般に、試験反応に類似した反応であるが、異なる標的配列を用いたものである。それらは、試験反応、例えば、増幅反応と、反応容器内で、同時に実行される。このような反応の例は、米国特許第６，７２３，５０７号中に記載されている。内部対照反応の標的は、反応容器内の全体にわたり存在することが知られており、そしてその増幅は、特にアッセイが試験の標的に関してネガティブな結果を正しく提供する場合に、アッセイが機能したことを保証するために、使用される。内部対照は、偽陰性結果が除外されるようにアッセイが機能したという保証を提供する。
【００１２】
しかしながら、シグナリング系のための基準としてＡＭＰを使用するとき、内部対照は不可能である。なぜなら、それが生成するシグナルは、源にかかわらず同じものとなるからである。
【００１３】
本願出願人らは、かかる問題を解決する方法を発見した。かかる方法は、有利な生物発光系が多重アッセイにおいて適用され、そして／又は内部対照に供されることを可能にする。
【００１４】
本発明によれば、サンプル中の２以上の核酸配列の検出方法であって、以下のステップ：
前記サンプルを、第１核酸配列にハイブリダイズすることができる第１ＲＮＡ含有プローブ、及び第２核酸配列にハイブリダイズすることができる第２ＲＮＡ含有プローブと、前記第１ＲＮＡ含有プローブが前記サンプル中に存在する第１核酸配列に結合し、そして前記第２ＲＮＡ含有プローブが前記サンプル中に存在する第２核酸配列に結合する条件下で、接触させる、ここで、前記第１ＲＮＡ含有プローブと第２ＲＮＡ含有プローブ内の少なくとも１のアデノシンは、アデノシンの修飾形態であり、かかる修飾形態は、対応の３リン酸化形態にリン酸化されるとき、生物発光シグナリング系と相互作用して、当該生物発光シグナリング系が３リン酸化形態における非修飾アデノシンと相互作用するとき、当該生物発光シグナリング系により生成されるシグナルに比較して、変更された生物発光シグナルを生成する；
核酸に結合したＲＮＡ含有プローブが加水分解されて、アデノシン１リン酸（ＡＭＰ）、及び／又は修飾アデノシン１リン酸（ＡＭＰm）を生成する条件下に、核酸／プローブ複合体をもっていき；
存在するＡＭＰとＡＭＰmを全てリン酸化して、それぞれ、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）又は修飾アデノシン３リン酸（ＡＴＰm）を生成し；
ＡＴＰに比較してＡＴＰmと反応するとき異なるシグナルを生成する生物発光シグナリング系を検出し；
そうして生成されたシグナルの性質を測定し、そしてその測定値を、前記サンプル中の前記第１核酸と第２核酸の存在又は不存在に関係付ける；
を含む方法が提供される。
【００１５】
疑義をただすため、本明細書中に使用するとき、表現「アデノシンの修飾形態」とは、アデノシンの構造が変更されているが、アデノシンと同様の方法で未だリン酸化されることができ、そしてそれが対応の３リン酸化形態にリン酸化されるとき、生物発光シグナリング系が３リン酸化形態の非修飾アデノシンと相互作用するときに当該生物発光シグナリング系により生成されるシグナルに比較して変更された生物発光シグナルを生成するように生物発光シグナリング系と相互作用することを意味する。当該分子は、それが糖分子に連結されたプリン環を含有するであろう点でアデノシン誘導体として未だ認識されるであろう。しかしながら、それは、一般に、他の修飾成分、例えば、ビオチン等を含有しないであろう。
【００１６】
本明細書中に使用するとき、表現「ＲＮＡ含有プローブ」は、少なくともいくつかのＲＮＡを含む核酸配列に関する。したがって、それは、前記した少なくとも１のアデノシンヌクレオチド又はアデノシンの修飾形態を含むＲＮＡ／ＤＮＡヘテロポリマー、並びにＲＮＡ分子を含む。例えば、プローブは、１以上のデオキシ−アデノシンヌクレオチドが前記したアデノシン又はアデノシンの修飾形態により置換されたＤＮＡポリマーを本質的に含むことができるであろうし、又はプローブは、ＤＮＡ、又は、ＲＮＡ又は修飾ＲＮＡテールをもつ混合ＤＮＡ／ＲＮＡ塩基のストレッチを含むことができるであろう。
【００１７】
１の態様においては、プローブはＲＮＡ分子である。
しかしながら、他の態様においては、プローブは、前記したようにＲＮＡ／ＤＮＡヘテロポリマーである。これらの分子は、例えば、プローブを加水分解するために使用される酵素がこのタイプの分子を加水分解するためにより有効である場合に、好ましいものであることができる。いくつかのＡＭＰが加水分解の間に解放される場合には、検出可能なシグナルは、前記した方法を用いて生成されるであろう。
【００１８】
ＲＮＡ含有プローブの配列は、それらが特定の標的核酸にハイブリダイズするようなものであろう。
プローブと特にＲＮＡ含有プローブは、それに相補的な又は実質的に相補的な核酸配列にハイブリダイズするであろう。好ましくは、前記第１又は第２ＲＮＡ含有プローブ内に含まれるアデノシンの修飾形態は、ワトソン−クリック結合により非修飾アデノシンと同じ方法で相補的な核酸であるチミジン又はウリジンに結合するであろう。しかしながら、この修飾は前記結合を弱め又は除去する可能性があり、そしてプローブは十分な長さを有しそしてまたは有意な相補性を有する場合には、それは標的配列に未だハイブリダイズするであろう。
【００１９】
疑義をただすため、表現「２本鎖形態にあるときのＲＮＡ含有プローブ」とは、本明細書中に使用するとき、当該ＲＮＡ含有プローブが、２本鎖核酸の１の要素であり、そして当該２本鎖の他の要素が、ＤＮＡ，ＲＮＡ又はさらにＤＮＡ／ＲＮＡヘテロポリマーを含むいずれかの核酸であることを意味する。
【００２０】
前記第１又は第２ＲＮＡ含有プローブ内のアデノシンヌクレオシドの内の少なくとも１のアデノシン、好適には２以上、そして好ましくは全てのアデノシンが、アデノシンの修飾形態である。同様に修飾されたアデノシンが前記プローブの内の１つのみの内に存在すべきであり、その結果、当該プローブの加水分解は、他のプローブの生物発光シグナルとは異なり、かつ、区別しうる生物発光シグナルを生成するであろう。
【００２１】
３以上のＲＮＡ含有プローブが、さらなる核酸配列を検出するために本発明に係る方法において使用されうる。但し、追加のプローブの各々は、当該システム内の他のプローブ内に含まれるものとは異なって修飾されている少なくとも１つのアデノシンを含み、そしてかかる異なる修飾は、異なる、かつ、区別しうる生物発光シグナルを導く。
【００２２】
前記した修飾アデノシンを取り込んだものを含むＲＮＡ含有プローブは、２本鎖形態にあるとき、さまざまな方法で、例えば酵素又はリボザイムを使用して加水分解されることができる。好ましくは、プローブは酵素を用いて加水分解される。
【００２３】
さまざまな酵素が使用されることができ、そして選択は、使用されるプローブの正確な性質、アッセイが行われるところの条件、及び他の反応、例えば増幅反応、例えばポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）とともにそれが行われるか否かの如き要因に依存するであろう。これらは、以下詳細に記載するＰＣＲ反応において一般に使用されるポリメラーゼ酵素、例えば、Ｔａｑポリメラーゼを含む。
【００２４】
あるいは又はさらに、それらは、２本鎖形態、例えばＲＮＡ／ＤＮＡ２本鎖として存在するときにのみ、それらを加水分解するであろうＲＮＡｓｅ酵素により加水分解されうる。このような２本鎖は、必ずしもそうではないが、増幅反応、例えばＰＣＲ反応の経過とともに形成されうる。このような酵素の例は、Ｔ７エキソヌクレアーゼ（ＢｉｏＬａｂｓから入手可能）、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤ（Ｓｉｇｍａ及びＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能）、ＲＮＡｓｅ  Ｈ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅから入手可能）を含む。しかしながら、この方法で使用される酵素は、例えば１本鎖形態においてＲＮＡ含有プローブを非選択的に加水分解するであろう不所望の活性、例えばＤＮＡｓｅ又はＲＮＡｓｅ活性を有さないことを保証することが重要である。この特性は、日常的な方法を用いて試験されうる。例えば、酵素は、使用前にプローブのサンプルとともにインキュベートされ、そしてその後、例えばゲル電気泳動、又は核酸のサイズの違いを検出する他の慣用方法によりサンプルが分析されうる。
【００２５】
特に好ましい酵素はＴ７エキソヌクレアーゼ及びＳＶＰＤである。しかしながら、特別な状況においては、酵素は前に概説したものの如き日常的な手順を用いて試験されて、少なくともいくつかの遊離ＡＭＰ又はＡＭＰmが解放されることを保証するために十分に良く２本鎖形態にあるＲＮＡ含有プローブを、それらが加水分解することが保証される。
【００２６】
第１又は第２核酸プローブの加水分解により得られたアデノシン１リン酸（ＡＭＰ）又は修飾アデノシン１リン酸（ＡＭＰm）は、それぞれ、酵素により直接的に又はアデノシン２リン酸の生成により、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）又は修飾アデノシン３リン酸（ＡＴＰm）にリン酸化されうる。
【００２７】
（例えば、以下の（ｃ）において使用されるような）生成されたＡＭＰ又はＡＭＰmをそれぞれＡＴＰ又はＡＴＰmに変換するために必要な１以上の酵素は、同様に試薬として反応混合物に添加されるホスフェート及びホスホエノールピルベートの存在下でＡＭＰから直接的にＡＴＰを作り出すホスホエノールピルベート・シンターゼから選択されうる。あるいは、ヌクレオシド３リン酸−アデニレート・キナーゼとＮＴＰの組合せは、アデニレート・キナーゼの如き酵素の含有又は添加により、それぞれＡＴＰ又はＡＴＰmにその後変換されうるアデノシン２リン酸（ＡＤＰ）又は修飾アデノシン２リン酸（ＡＤＰm）を作り出すであろう。（例えば、ポリメラーゼ・チェイン・リアクションとともに使用される場合、ＮＴＰはいずれにしても反応混合物中に存在しうる。）
【００２８】
好適な酵素のさらなる例は、ピルベート・ホスフェート・ジキナーゼ、例えば、Eisaki et al, Biochim. et Biophys Acta 1431 (1999) 363-373により記載されるものを含む。
【００２９】
ＡＴＰ又はＡＴＰmは、生物発光系を用いて容易に検出されうる。最も一般的な生物発光シグナリング系の内の１つは、生物、特にコエレオプテラ（Ｃｏｅｌｅｏｐｔｅｒａ）、例えばホタル、及びツチボタルの幼虫（ｇｌｏｗ−ｗｏｒｍｓ）に天然に存在する酵素ルシフェラーゼ、及び酵素基質、ルシフェリンを使用する。全細胞内に存在するアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）の存在下、ルシフェラーゼはルシフェリンを酸化して、オキシルシフェリン及びＡＭＰ並びに生物発光シグナルを作り出し、これは、例えば照度計を用いてモニターされうる。
【００３０】
シグナリング反応は、以下のように表される：
【化１】
2009504173.tif 000002
｛式中、垂直方向の矢印は生物発光シグナルを示す。｝。ＣＯ2とＡＭＰ（又はＡＭＰm、ここでＡＴＰmはルシフェラーゼの基質である）は他の反応生成物である。
【００３１】
このような検出系の適用の例は、例えば、ＷＯ９６／０２６６５中に記載されている（その内容を本明細書中援用する）。
【００３２】
したがって、ＡＴＰの存在に対して反応する特に好適な生物発光試薬は、ルシフェリンとルシフェラーゼを含む。使用されるルシフェラーゼは、好ましくは、天然形態に比較して、基質に対して同様の効果を及ぼす組換えルシフェラーゼ、例えば、高められた熱安定性を有するルシフェラーゼでありうる。このような形態の特別な例は、例えば、ＥＰ−Ａ−０５２４４４８、ＷＯ９５／２５７９８、ＷＯ９９／１４３３６、ＷＯ００／２３８７８、ＷＯ０１／２０００２、及びＷＯ０１／３１０２８中に記載されている。
【００３３】
これらの試薬は、必要により、マグネシウムインオ源、例えば酢酸マグネシウムを同伴しうる。しかしながら、このような塩は、例えば、増幅反応、例えば、ポリメラーゼ・チェイン・リアクションの経過とともに要求される場合には、いずれにしても反応混合物中に存在しうる。
【００３４】
シグナルを生成するとき、これらの試薬は、ＡＭＰ又はＡＭＰm分子を再生産し、これは、ＡＭＰ又はＡＭＰmをＡＴＰ又はＡＴＰmにリン酸化する酵素及び／又は試薬の存在下で、ＡＴＰ又はＡＴＰmに再変換されるであろう。したがって、シグナルは、指数関数的に生成され、そしてそれゆえ、直ちに及び迅速に検出されるであろう。このようなシステムの１例は、Sakakibara et al.,によりAnalytical Biochemistry, 268, 94-101 (1999)により記載されている。このシグナルの指数関数的上昇は、増幅反応が従来要求されてきた状況において、直接的に実施されうることを意味する。
【００３５】
ＡＴＰがルシフェラーゼ／ルシフェリン反応系を触媒するとき、得られるシグナルは、約５６２nmにおける黄緑色のシグナルである。しかしながら、ＡＴＰの特定の修飾形態（ＡＴＰm）、例えば、デオキシ・アデノシン３リン酸（ｄＡＴＰ）は、上記反応を未だ触媒するであろうが、生成された生物発光シグナルは、より長い波長、例えば、約６１０nm〜６２０nmにおける赤色シグナル、かつ、かなり低いレベル（例えば、上記アッセイにおけるＡＴＰの活性の約１％）であることが、今日知られている。このシグナルは、低いレベルにあっても、観察される光に対して好適なフィルターを用いて検出されうる。
【００３６】
ＡＴＰ及びｄＡＴＰの構造を以下に示す：
【化２】
2009504173.tif 000003
【化３】
2009504173.tif 000004
他の修飾されたアデノシンも使用されうる。
【００３７】
生成されたシグナルの波長は、異なる波長のシグナルを区別しうる（光源のスイッチ−オフにより操作される）波長選択フィルター又は高感度スペクトロフル・オリメーターを好適には備えた、慣用の照度計を用いて読まれることができる。非修飾ＡＴＰにより触媒されるルシフェラーゼ／ルシフェリン反応のみからのシグナルの生成は、修飾されたアデノシンを含んでいなかったプローブのみが当該アッセイの間に加水分解されたこと、そしてそれゆえ、かかるプローブがそれにハイブリダイズするところの核酸配列のみが当該反応混合物中に存在したことを指標するであろう。しかしながら、発光された光の波長の差は、修飾されたアデノシンを含むプローブ内の少なくともいくつかが加水分解されたこと、そしてそれゆえ、当該サンプルが、当該プローブがそれにハイブリダイズするところの核酸配列の内のいくつかを含むことを指標するであろう。
【００３８】
特に好ましい態様においては、本発明の方法は、元のサンプル中にほんの少量で存在する配列を検出するために、増幅反応、例えばポリメラーゼ・チェイン・リアクション又は等温増幅反応、例えば前記したものとともに使用される。
【００３９】
それは、例えば、アニールされたプローブの加水分解及びＡＭＰ又はＡＭＰmのリン酸化をもたらすために必要な酵素又は試薬とともに第１ＲＮＡプローブ及び第２ＲＮＡプローブが、増幅反応の終わりに生物発光試薬とともに添加され、そして得られた混合物が、前記したようにアッセイが行われるために好適な条件にもっていかれるような、終点アッセイとして応用される。
【００４０】
しかしながら、あるいは、これらの試薬は、増幅反応の全体を通じて存在して、増幅と同時にシグナルが生成されうる可能性がある。
【００４１】
例えば、ＲＮＡ含有プローブが増幅の全体を通じて存在する場合、プローブは、増幅プロセスのアニーリング期の間（最中）にそれらの対応の標的配列にアニールするようにデザインされうる。好適には、増幅反応に使用されるポリメラーゼは、２本鎖形態にあるときＲＮＡ含有プローブを加水分解するものである。この場合、反応は、プローブが伸長期の間に少なくとも部分的に加水分解されてＡＭＰ又はＡＭＰmが、そしてリン酸化後に、検出のためのＡＴＰ又はＡＴＰmが作られるようにデザインされることができる。
【００４２】
慣用のＰＣＲ反応の文脈において使用されうる好適なＤＮＡポリメラーゼの例は、熱安定性（耐熱性）ポリメラーゼ、例えば、サームス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ポリメラーゼ（Ｔａｑ）、サームス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ポリメラーゼ（Ｔｔｈ）、サームス種ＮＨポリメラーゼ（ＴｓｐＮＨ）、サームス・ブロキアナス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）ポリメラーゼ（Ｔｂｒ）（これらの全ては、例えば、ＧｅｎｅＳｙｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｆａｒｎｂｏｒｏｕｇｈ，Ｕ．Ｋ．から入手可能である）、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）ポリメラーゼ（Ｐｆｕ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能である）、９°Ｎ７エキソ−ＤＮＡポリメラーゼ、及びサーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（ＶＥＮＴTM  ＤＮＡポリメラーゼとしてＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから入手可能である）である。
【００４３】
しかしながら、使用されるポリメラーゼがＲＮＡ含有プローブを十分に速く加水分解しない場合、例えば、迅速ＰＣＲが使用される場合、又はＡＭＰ又はＡＭＰmを含む単一のヌクレオチドが解放される程度にプローブを十分に加水分解しない場合、ポリメラーゼにより解放される小さな断片をＡＭＰを含む遊離のヌクレオチドまで消化するために、追加の加水分解酵素が添加されうる。このような酵素の例は、先に列記したもの、例えば、Ｔ７エキソヌクレアーゼ又はＳＶＰＤを含む。
【００４４】
このような加水分解酵素が使用されるとき、遊離の状態にあるこれらの酵素によりプローブが加水分解されないように各プローブを修飾することが好ましいかもしれない。例えば、酵素が、小さな１本鎖の断片に対して５′−３′エキソヌクレアーゼ活性を有する場合、当該プローブは、好適には、その５′末端でブロックされる。３′末端においては、ブロッキングは、さらにもっと必要とされうる。なぜなら、不所望の３′−５′エキソヌクレアーゼ活性を妨害することに加え、プローブは、ポリメラーゼ活性による伸長を妨害するようにブロックされることも必要とされるからである。好適なブロッキング方法は本分野において周知である。例えば、３′ヒドロキシ成分は、伸長をブロックするために、例えば、リン酸基の導入により、化学的に修飾されうる。
【００４５】
このような増幅反応は、生物発光シグナリング系と有意に反応するＡＴＰのいずれかの形態の不存在下で行われなければならない。特定の増幅反応、例えば、ＰＣＲ反応は、ポリメラーゼの効率的なオペレーションのために、ＡＴＰのある形態、例えばデオキシＡＴＰ（ｄＡＴＰ）の存在下で実施されることを要求する。明らかに、このような試薬は、前記した方法の間に使用されるプローブの内のいずれかが同様に修飾されたアデノシンを含む場合に、含まれることはできない。なぜなら、これは、偽陽性の結果を導くであろうからである。このような場合、ｄＡＴＰとは別の形態、好ましくは、ＤＮＡ重合の基質として作用するけれども、生物発光反応において有意な活性を有さない形態を使用することが必要かもしれない。好適な別形態の特別な例は、２′−デオキシアデノシン−５′−Ｏ（１−チオトリホスフェート（ｄＡＴＰαＳ）又は７−デアザ−２′−デオキシアデノシン−５′−トリホスフェート（ｃ７ｄＡＴＰ）であることができ、これらの構造を以下に示す：
【化４】
2009504173.tif 000005
【化５】
2009504173.tif 000006
【００４６】
これらの分子は、ＰＣＲにおけるポリメラーゼ活性を支援するが、ピコモルの濃度レンジで検出可能なシグナルを生成するＡＴＰ又はｄＡＴＰに比較して、ナノモル濃度の如きひじょうに高いレベルでのみ生物発光系内で相互作用する（J. Eriksson, Doctoral Thesis, Advancements〔sic〕in Firefly Luciferase-Based Assays and Pyrosequencing Technology, KTH, Stockholm, Sweden, 2004）。結果として、それらは、ＰＣＲを支援するレベルで反応混合物中に含まれることができるが、そのようなレベルにおいては、プローブの加水分解の結果として生成されたシグナルを妨害するために十分な強度又は波長の生物発光シグナルを生成しない。
【００４７】
この方法で、他の目的、例えばＰＣＲの実行のために反応混合物に添加されるＡＴＰの別の形態の存在から生じるシグナルは、ＲＮＡ含有プローブの加水分解の結果として生成されるシグナルを妨害しないであろう。
【００４８】
前記した方法を使用するポリメラーゼ・チェイン・リアクションは、２以上の配列、例えば、標的配列と、増幅前の反応混合物に添加される内部対照配列とが増幅される多重ＰＣＲを含みうる。このような場合、２セットの反応プライマー、本分野において理解されるであろうような、増幅されるべき各配列に適用可能な１セットを添加することが適当であるかもしれない。しかしながら、第１プローブと第２プローブが、類似配列の異なる形態に、例えば異なる対立遺伝子形態にアニールする場合、単一セットのプライマーが両形態の増幅を引き起こすために十分なものであることができる。
【００４９】
生物発光試薬は、終点検出手順を実施するために、増幅の終わりに添加されることができる。しかしながら、反応の進行をモニターするために増幅反応の全体を通じて、それらは存在し又は添加されることができる。
【００５０】
本方法において使用されるルシフェラーゼの好ましい形態は、野生型よりも高いレベルの熱安定性を有するものであることができる。このような酵素の特別な例は、例えば、ＥＰ−Ａ−０５２４４４８、ＷＯ９５／０２５７９８、ＷＯ９９／１４３３６、ＷＯ００／２４８７８、ＷＯ０１／２０００２、ＷＯ０１／３１０２８中に記載され、これらの内容を本明細書中に援用する。しかしながら、それらが、アデノシンのリン酸化に由来するＡＴＰに比較してアデノシンの修飾形態のリン酸化に由来するＡＴＰにより活性化されるとき、区別しうるシグナルを作り出す場合には、それらは、本発明に係る方法において使用されうる。これは、本分野において慣用される日常的な方法を用いて試験されうる。
【００５１】
しかしながら、一般的には、ルシフェラーゼの如き試薬の熱安定性は、ＰＣＲ反応の如き熱サイクリングを含む増幅反応の全体を通じてそれが存在することを可能ならしめるためには十分なものではない。それゆえ、連続モニタリングが要求される場合には、等温増幅反応が好ましいかもしれない。しかしながら、モニタリング情報を作成するように、生物発光試薬が各サイクルの終りに添加され、そして生成されたシグナルがその時点で読まれるようにＰＣＲ反応を改作することもできる。このような情報は、その後、本分野において知られたアルゴリズム等を用いて、サンプル中の標的核酸配列の定量において使用されうる。
【００５２】
増幅反応は、通常の方法で、例えば、変性、アニーリング、及び伸長温度を通じて反応混合物をサイクリングすることにより、行われることができる。
【００５３】
前記した反応は、さまざまな慣用の装置内で実施されうる。これらは、例えば、適当なシグナル検出手段が既に提供されている、（Ｂｉｏｔａｇｅ  ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎから入手可能な）Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｅｒを含む。あるいは、反応は、例えばＥＰ−Ａ−０８１００３０中に記載され、そしてｔｈｅ  Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより供給されるブロック加熱装置、又はＷＯ９８／２４５４８中に記載されるものの如き他のタイプのサーマル・サイクラーであって、好適な光検出手段、例えば適当なフィルターを備えたＣＣＤカメラを付加されたものを使用して、実施されうる。
【００５４】
したがって、さらに特別な態様においては、本発明は、核酸配列の検出方法であって、以下のステップ：
（ａ）ポリメラーゼ・チェイン・リアクションのアニーリング期の最中に第１核酸配列にハイブリダイズすることができる第１ＲＮＡ含有プローブ、及びポリメラーゼ・チェイン・リアクションの同じくアニーリング期の最中に第２核酸配列にハイブリダイズすることができる第２ＲＮＡ含有プローブ、ここで前記第１又は第２ＲＮＡ含有プローブの内の少なくとも１つのアデノシンは、アデノシンの修飾形態であり、かかる修飾形態は、対応の３リン酸化形態にリン酸化されるとき、生物発光シグナリング系が３リン酸化された形態のアデノシンと相互作用するときに当該生物発光シグナリング系により生成されるシグナルに比較して、変更された生物発光シグナルを生成するように生物発光シグナリング系と相互作用する、（ｂ）２本鎖形態（例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ２本鎖）で存在するとき前記ＲＮＡ含有プローブを加水分解する酵素又は酵素混合物、及び（ｃ）アデノシン１リン酸をアデノシン３リン酸へ又は修飾アデノシン１リン酸を修飾アデノシン３リン酸へ変換するために必要な１以上の酵素又は試薬の存在下でポリメラーゼ・チェイン・リアクションを実行し；
存在するＡＭＰ及び修飾アデノシン１リン酸を、それぞれ、ＡＴＰ又は修飾アデノシン３リン酸にリン酸化し；
ＡＴＰと修飾ＡＴＰの存在に対して、異なって、かつ、区別しうる状態で反応する生物発光試薬を、前記サンプルに添加し；そして
そうして生成されたシグナルの性質を測定し、そして当該測定値を、前記サンプル中の前記第１核酸及び第２核酸の存在又は不存在と関係付ける、
を含む前記方法を提供する。
【００５５】
上記方法を、以下の図１において図示して説明する。
２つの特別な核酸配列、“標的ＤＮＡ配列１”と“標的ＤＮＡ配列２”（これは、標的ＤＮＡ配列１と同じプライマーを用いて増幅される対照配列であるかもしれない）を含む又は含むと疑われるサンプルは、ＰＣＲに供され、かかるＰＣＲはｄＮＴＰｓを添加して行われるが、この場合、ｄＡＴＰはｄＡＴＰαＳで置き替えられている。
【００５６】
各標的配列に特異的な異なるＲＮＡ含有プローブが存在する。これらのプローブは、Ａ）ＡＭＰ塩基又はＢ）修飾ＡＭＰ塩基（ＡＭＰm）、例えば、結合依存性加水分解及び酵素的リン酸化の後に、ルシフェラーゼと相互作用して区別しうるシグナルを生じるｄＡＭＰ塩基のいずれかを含む。
【００５７】
図１に説明するＰＣＲ反応のＤＮＡ重合ステップの間に、プライマーと相補的ＲＮＡ含有プローブの両者が標的配列に結合する。
【００５８】
ポリメラーゼ酵素を含みうるヌクレアーゼは、これが５′→３′ヌクレアーゼ活性をもつもの、例えばＴａｑポリメラーゼである場合、点線で示すようにＲＮＡ含有プローブを加水分解するように働き、第１の反応（Ａ）の場合にはＡＭＰを解放し、そして第２の反応（Ｂ）の場合にはｄＡＭＰを解放する。次いで、ＡＭＰはその場でＡＴＰに変換され、一方、ＡＭＰm、例えばｄＡＭＰは、次いでその場でｄＡＴＰに変換される。ＡＴＰとｄＡＴＰの両者が、生物発光試薬、例えばルシフェリンとルシフェラーゼの添加後に、光シグナルとして検出されうる。
【００５９】
しかしながら、ＡＴＰにより生成される光の波長は、ｄＡＴＰにより生成される波長とは異なるであろう。ＲＮＡ含有プローブ内に正常なアデノシン塩基をもつ、第１の反応は、これらの条件下、約５６２nmの波長において緑色の光の発光を生じるであろう。第２の反応が進行する場合には、ＲＮＡ含有プローブ内の修飾アデノシン塩基は、異なる波長の光の発光を生じ、例えばｄＡＭＰの場合、最終的なシグナルは、約６１０nmの波長にある赤色の光を含むであろう。それゆえ、標的配列の内の１方又は両者の存在は、発光された光の波長を分析することにより、決定されることができる。
【００６０】
同時に、ポリメラーゼ活性は、ＰＣＲが進行することを保証するであろう。但し、ＡＴＰmがｄＡＴＰである場合、この内のいくつかは、副反応として得られたＤＮＡ産物中に取り込まれるであろう。
【００６１】
前記した方法は、特定のサンプルが１以上の特異的核酸配列を含むか否かを決定するために使用されうる。
例えば、本法は、異なる配列の存在、例えば異なる生物、例えば微生物、例えば細菌又はウイルスに由来するものの存在が疑われる場合に、利用されうる。第１の生物内に存在する核酸配列に特異的な第１ＲＮＡ含有プローブ、及び第２の生物内に存在する第２ＲＮＡ含有プローブを使用することは、生成された生物発光シグナルが、これらの生物の内の１方又は両者の存在又は不存在が決定されることを可能にするであろう。これは、衛生上の用途及び臨床診断において有用でありうる。
【００６２】
例えば、それは、特異的遺伝子型、多形等の存在について遺伝子サンプルを分析するために使用しうる。この場合、第１の核酸は、特定の遺伝子の１の形態であり、そして第２の核酸は別の形態であろう。サンプルが遺伝子のホモ接合体又は特別な形態であるとき、第１のプローブ又は第２のプローブだけが加水分解されるであろう。このプローブが修飾アデノシンを含まない場合、検出される生物発光シグナルはＡＴＰのみを特徴とするであろう。同様に、サンプルが、遺伝子の他の形態についてホモ接合である場合、計測される生物発光シグナルは、修飾アデノシンを含むプローブの加水分解のみを特徴とするであろう。好ましくは、このプローブ内のアデノシンの全てが修飾され、それゆえ単一の波長をもつシグナルが検出されるであろう。しかしながら、「混合」シグナルが測定されることもでき、そこでは、異なる波長をもつシグナルが発光され、そして光学フィルター等のシステムを用いて検出される。このようなシステムは、サンプルが遺伝子型についてヘテロ接合である場合に、要求されるであろう。
【００６３】
本発明に係る方法が増幅反応、例えばＰＣＲとともに使用される場合、ＲＮＡ含有プローブを、好適には化学リンカー又は非増幅性モノマー、例えばヘキセチレン・グリコールである「ブロッキング基」により反応に対してプライマーとして作用し、かつ、オリゴヌクレオチドのプローブ領域を増幅する伸長反応を妨害するＤＮＡ配列に、連結することが望ましい。このリンカーは、プローブの加水分解が、プライマーに沿って伸長することをさらに妨害するであろう。
【００６４】
この一般的なタイプのプローブ／プライマーは「スコルピオン（Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ）」として周知であり、そしてそれらは、例えばＷＯ９９／６６０７１中に記載されている。
【００６５】
慣用のスコルピオンTMプローブを用いて、単一のオリゴヌクレオチドを用いることにより配列特異的プライミング及びＰＣＲ産物検出が達成される。スコルピオンTMプローブは、ハイブリダイズされていない状態でステムループ立体配置を維持する。一対の相互作用性蛍光団がオリゴヌクレオチドに付着され；例えばオリゴヌクレオチドの５′プライマー末端にある蛍光団が、３′プローブ末端に結合された成分によりクエンチされる。このプローブのセクションは、プライマーの伸長産物に相補的な配列を含む。スコルピオンTMプライマーの伸長後、特異的なプローブ配列は、伸長されたアンプリコン内のその相補物に結合することによりヘアピンループを開くことができる。これは、蛍光団がクエンチされることを妨害し、そしてシグナルが観察される。
【００６６】
本発明に係る方法に使用するためには、単一のオリゴヌクレオチド・プローブ／プライマーは、特異的なシグナリング成分、例えば蛍光団を担持する必要はない。なぜなら、シグナルは、プローブ・セクションの加水分解の結果として生成されるからである。これは、費用及び調製の困難さを低下させるであろう。さらに、それは、プローブ・セクションが前記したようなＲＮＡ含有プローブを含む程度で、修飾されることのみが必要とされる。ＲＮＡ含有プローブは、当該プロセスの実行のために要求されるときアデノシン又は修飾アデノシンを含むであろう。
【００６７】
このようなプライマー／プローブの組合せは、新規であり、そして本発明のさらなる側面を形成する。
本発明に係る方法は、シーケンシング適用のために、及び／又はＤＮＡ又はＲＮＡ配列内の多形又は変化を検出するために改作されることもできる。
【００６８】
さらなる局面においては、本発明は、核酸の配列を決定する方法であって、以下のステップ：
（ｉ）第１ＲＮＡ含有プローブと第２ＲＮＡ含有プローブを前記配列の知られた領域に結合させて、当該プローブの末端にある少なくとも１のヌクレオチドを当該配列の知られていない又は不明な領域内に到達するようにする、そしてここで前記第１ＲＮＡ含有プローブと第２ＲＮＡ含有プローブは、その末端に存在するヌクレオシドが異なり、そしてここで前記第１又は第２ＲＮＡ含有プローブ内の少なくとも１のアデノシンは、アデノシンの修飾された形態であり、そしてかかる修飾された形態は、対応の３リン酸化形態にリン酸化されるとき、生物発光シグナリング系が３リン酸化形態のアデノシンと相互作用するときに当該生物発光シグナリング系により生成されるシグナルに比較して、変更された生物発光シグナルを生成するように生物発光シグナリング系と相互作用する；
（ii）２本鎖形態（例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ２本鎖）で存在するとき前記ＲＮＡ含有プローブを加水分解する酵素を用いて前記ＲＮＡ含有プローブを加水分解し；
（iii）生成されたアデノシン１リン酸をアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）に、そして修飾アデノシン１リン酸（ＡＭＰm）を修飾アデノシン３リン酸（ＡＴＰm）に変更し；
（iv）ＡＴＰ及びＡＴＰmの存在に対して異なって反応する生物発光試薬を前記サンプルに添加し；
（ｖ）前記生物発光試薬からのシグナルを検出し；そして
（vi）前記シグナルを、前記プローブの内の１の末端に相補するか又はそうではない配列の領域の存在と関係付ける、
を含む前記方法を提供する。
【００６９】
このような場合、プローブの末端にある１以上のヌクレオチドが、知られていない又は不明な配列に正確に相補的である場合、プローブはそれに対し最も効率的に結合するであろうし、その結果、酵素は、ステップ（ii）の最中に結合されたプローブを効率的に加水分解するであろう。結果として、ＡＭＰ又はＡＭＰmが生成され、それに依存してプローブがこの方法で加水分解し、そしてこれは前記したように、それぞれ、ＡＴＰ又はＡＴＰmに変換され、そして生物発光システムを用いて検出される。
【００７０】
しかしながら、ＲＮＡ含有プローブの末端にあるヌクレオチドが、テンプレートＤＮＡに正しく対合しない場合、ステップ（ii）における酵素の効果は、テンプレートからの無傷のプローブを大きく追い払うこととなるであろう。その結果、有意な加水分解は生じず、そしてこれは当該プローブから生成される生物発光シグナルの欠如又は実質的な低下となるであろう。
【００７１】
この反応は、末端領域に異なるヌクレオチドをもつプローブを用いて同時に、又は望ましくは、２回以上行われる。例えば、この位置にある配列内に存在するヌクレオチドが知られていない場合、それぞれ末端に異なるヌクレオチドＣ，Ｇ，Ｕ、及びＡをもつ４つの異なるプローブが調製されうる。可能であれば、各プローブはアデノシンの異なる形態を含むであろうし、その内の３つは好適には修飾され、そしてその内の１つは修飾されない。あるいは、プローブの内の２つは、修飾されたアデノシンを用いて調製されることができ、そして反応は２回実行され、各反応時において、１のプローブは修飾アデノシンを有し、そして１のプローブは非修飾アデノシンを有する。
【００７２】
これらの反応を実行することにより、生成されたシグナルのレベルにより、どれがこの位置にある正しいヌクレオチドであるかが直ちに明らかとなるはずである。良好なシグナルは、プローブがその末端に相補的ヌクレオチドを含むところの反応においてのみ、予測されるであろう。
【００７３】
所望により、２以上の、例えば３までの知られていないヌクレオチドが、その末端に含まれうる。このような場合には、当該位置に可能である配列組合せの全てを提示するプローブが実施されうる。末端で正確に相補的な配列をもつプローブが効率的に加水分解されることが予想される。
【００７４】
使用される末端は、知られた配列対知られていない又は不明な配列の性質に依存して、プローブの３′又は５′末端でありうる。ステップ（ii）で使用される酵素は、これを考慮して選ばれるであろう。緊密に結合するＲＮＡ含有プローブの加水分解は、その末端が５′末端であり、そしてステップ（ii）で使用される酵素が、良好な「プルーフリーディング（校正）」機能をもつと認められる酵素においてしばしば見られるような（３′−５′加水分解に比較して）５′−３′加水分解することができるときに、より良好に実行されうる。
【００７５】
前記方法において使用される酵素及び試薬は、前記した核酸サンプルの存在又は量を検出するための方法において使用されるものに類似したものである。同様に、反応は、前記したような装置内で実行されうる。
【００７６】
シーケンシング反応は、増幅反応、例えばＰＣＲ反応とともに使用されうる。例えば、反応は、ＰＣＲ反応の後に実施されうる。ＰＣＲ反応の少なくともいくつかのステージは、ステップ（ii）での加水分解を達成するために実行されうる。しかしながら、一般には、これは必要ではない。なぜなら、検出されるＡＭＰの「リサイクリング」の結果として、当該システム自体が良好な増幅シグナルを提供するからである。
【００７７】
このような方法は、出発配列の少なくとも１部が知られている（例えばユニバーサル・プライミング配列）である場合に、シーケンシングにおいて使用されるであろう。その後、完全な配列が、その配列の長さに沿って当該プロセスを繰り返すことにより、解明されうる。例えば配列が、例えばリボダイピングの最中に生じるように、その長さに沿っていくつかの保存された領域を含むことが知られている場合に、配列を明らかにするための並行反応は、プローブとしてＲＮＡオリゴヌクレオチド・ライブラリーを使用することができる。これらの領域は、各々、ＲＮＡ含有プローブを位置決めするための知られた配列として使用されうる。
【００７８】
確認のための逆方向のシーケンシングも、前記した方法を用いて実施されうる。可能な場合、保存された領域の存在の結果として、これは、反応のアレイを用いて並行して行われうる。
【００７９】
あるいは、前記方法は、診断の使用のために多形又は対立遺伝子変異の検出に使用されうる。このような場合には、配列は、多形又は変異の座において不明でありうる１以上のヌクレオチドの小さな領域を除き、広く知られたものであることができる。このような場合には、ＲＮＡ含有プローブは、少なくとも末端領域のヌクレオチドが配列内の多形又は変異に相当するようにデザインされ、その結果、効率的な加水分解又はその他のものが、実際の配列がプローブ配列に相補的であるか否かを指標するであろう。
【００８０】
検出、増幅、及びシーケンシング反応を含む前記した反応は、適宜、及び本分野において知られているように、反応管、ウェル又は容器内で行われることができる。
【００８１】
前記した複数の反応、例えば増幅又はシーケンシング反応が実行される場合、これらは、好適には、アレイに整列された別個の反応管、ウェル又は容器内で同時に実行されうる。管ウェル又は容器は、一緒に、熱サイクルされ（又は、使用されるプロセスの性質に依存して、等温インキュベートされ）、そして各管からのシグナルは、適当に形状化された照度システムを用いてモニターされる。
【００８２】
あるいは、プローブは、例えば、先に概説したような特別な試験配列内の多形又は対立遺伝子変異のための診断試験を提供するために、例えば、「ディップスティック」デザイン又はスライド又はチップの支持体上に固定化されうる。
【００８３】
さらなる局面においては、本発明は、前記した方法に使用されるキットを提供する。このようなキットは、標的配列に特異的な少なくとも２つのＲＮＡ含有プローブであって、その内の１つは前記したような少なくとも１の修飾アデノシンを含むものを含むであろう。
【００８４】
キットは、場合により、ＡＭＰをＡＴＰに又はＡＭＰmをＡＴＰmに変換するための手段をも含みうる。このような手段の特別な例は、当該文脈において使用される先に列記した酵素である。
【００８５】
多形を検出するための方法の場合には、キットは、３′末端にある異なるヌクレオチドの存在のみが相違する、４つまでの類似のＲＮＡ含有プローブを含みうる。このような場合には、異なる修飾アデノシンが、当該プローブの少なくとも３つの内に存在するであろう。
【００８６】
キットは、好適には、本法に使用される１以上のさらなる試薬を含むであろう。特に、それらは、生物発光試薬、例えばルシフェラーゼ及び／又はルシフェリンを含みうる。好適には、ルシフェラーゼは、前記したような組換え熱安定性ルシフェラーゼである。
【００８７】
キットの他の特別な任意成分は、特別な増幅又は複数の増幅に使用される１以上のプライマー・セットを含みうる。前記したように、プライマーは、それらが単一のオリゴヌクレオチドを形成するように、前記したようなブロッキング基によりＲＮＡ含有プローブに連結されうる。
【００８８】
さらに、キットは、核酸に結合されたＲＮＡ含有プローブを加水分解してアデノシン１リン酸（ＡＭＰ）、及び／又は修飾アデノシン１リン酸（ＡＭＰm）を生成することができる１以上の酵素（例えば、酵素混合物）を含みうる。このような酵素の例は、ＲＮＡ含有プローブを加水分解するＤＮＡポリメラーゼ又は他の加水分解酵素、例えば前記したＲＮＡｓｅを含む。
【００８９】
増幅を行うために要求されるかもしれない、他の試薬、例えば、バッファー、ヌクレオチド、ポリメラーゼ酵素等も含有されうる。
【００９０】
それゆえ、ＲＮＡ含有加水分解プローブは、サンプル中のきわめて特異的な核酸配列の存在を指標するシグナルを生成するためのきわめて用途の広い手段を提供する。生物発光検出システムと組合せた前記プローブを用いたアッセイの感度は高く、そしてシグナルは迅速に生成されうる。
【００９１】
前記したような修飾アデノシンを含むＲＮＡ含有プローブも新規であり、そして本発明のさらなる局面を形成する。
前記したアデノシンの修飾形態を含むＲＮＡ分子又はＤＮＡ／ＲＮＡヘテロポリマーのいずれかである、前記したＲＮＡ含有プローブは新規であり、そして本発明のさらなる局面を形成する。さらに、それらが加水分解されてＡＭＰ又はＡＭＰmを解放し、これらがＡＴＰ又はＡＴＰmにリン酸化され、そして生物発光系を用いて検出されるところの、特別の核酸配列のためのアッセイにおいて個々に使用される前記プローブの使用も、本発明のさらなる局面を形成する。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
（原文記載なし）
【図１】
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【国際調査報告】
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