(57)【要約】  本発明は、幹細胞、特にヒト胚性幹細胞を増殖し、分化し、及び培養するための方法を提供する。本方法は、コラーゲンバイオファブリック、特に哺乳動物胎盤由来の、羊膜、絨毛膜、又は両方に由来するコラーゲンバイオファブリック上で、ある期間の間、幹細胞を培養することを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞を培養する方法であって、該幹細胞をコラーゲンバイオファブリックと共に培養液中で培養することを含み、前記コラーゲンバイオファブリックが、胎盤に由来し、かつ前記幹細胞が、前記コラーゲンバイオファブリックに対して外来性である、前記方法。
【請求項２】
前記コラーゲンバイオファブリックが哺乳動物胎盤から単離された羊膜を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記コラーゲンバイオファブリックが哺乳動物胎盤から単離された絨毛膜を含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
前記コラーゲンバイオファブリックが哺乳動物胎盤からの羊膜及び絨毛膜を含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
前記コラーゲンバイオファブリックが前記培養前に実質的に乾燥している、請求項1記載の方法。
【請求項６】
前記コラーゲンバイオファブリックが前記培養前に脱細胞化されている、請求項1記載の方法。
【請求項７】
前記コラーゲンバイオファブリックが前記培養前に脱細胞化されていない、請求項1記載の方法。
【請求項８】
前記コラーゲンバイオファブリックが、該コラーゲンバイオファブリックが由来する胎盤に対して内在性の細胞を含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
前記コラーゲンバイオファブリックが、該コラーゲンバイオファブリックが由来する胎盤に対して外来性の細胞を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
前記コラーゲンバイオファブリックが照射される、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
前記コラーゲンバイオファブリックが照射される、請求項9記載の方法。
【請求項１２】
前記幹細胞が胚性幹細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
前記幹細胞が胎盤幹細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
前記幹細胞が間充織幹細胞、造血幹細胞、胎盤血若しくは臍帯血由来幹細胞、骨髄由来幹細胞又は成体体細胞幹細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
前記成体体細胞幹細胞が神経幹細胞、肝臓幹細胞、膵臓幹細胞、内皮幹細胞、心臓幹細胞、又は筋肉幹細胞である、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
前記幹細胞が24時間以上培養される、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
前記幹細胞が2日間以上培養される、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
前記幹細胞が7日間以上培養される、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
幹細胞を増殖させる方法であって、前記幹細胞が増殖されるように、前記幹細胞をコラーゲンバイオファブリックと共に培養液中で培養することを含む、前記方法。
【請求項２０】
前記コラーゲンバイオファブリックが哺乳動物胎盤から単離された羊膜を含む、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
前記コラーゲンバイオファブリックが哺乳動物胎盤から単離された絨毛膜を含む、請求項19記載の方法。
【請求項２２】
前記コラーゲンバイオファブリックが哺乳動物胎盤からの羊膜及び絨毛膜を含む、請求項19記載の方法。
【請求項２３】
前記コラーゲンバイオファブリックが前記増殖前に実質的に乾燥している、請求項19記載の方法。
【請求項２４】
前記コラーゲンバイオファブリックが前記増殖前に脱細胞化されている、請求項19記載の方法。
【請求項２５】
前記コラーゲンバイオファブリックが前記増殖前に脱細胞化されていない、請求項19記載の方法。
【請求項２６】
前記コラーゲンバイオファブリックが、該コラーゲンバイオファブリックが由来する胎盤に対して内在性の細胞を含む、請求項19記載の方法。
【請求項２７】
前記コラーゲンバイオファブリックが、コラーゲンバイオファブリックが由来する胎盤に対して外来性の細胞を含む、請求項19記載の方法。
【請求項２８】
前記コラーゲンバイオファブリックが照射される、請求項26記載の方法。
【請求項２９】
前記コラーゲンバイオファブリックが照射される、請求項27記載の方法。
【請求項３０】
前記幹細胞が胚性幹細胞である、請求項19記載の方法。
【請求項３１】
前記幹細胞が胎盤幹細胞である、請求項19記載の方法。
【請求項３２】
前記幹細胞が間充織幹細胞、造血幹細胞、胎盤血若しくは臍帯血由来幹細胞、骨髄由来幹細胞又は成体体細胞幹細胞である、請求項19記載の方法。
【請求項３３】
前記成体体細胞幹細胞が神経幹細胞、肝臓幹細胞、膵臓幹細胞、内皮幹細胞、心臓幹細胞又は筋肉幹細胞である、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
前記幹細胞が少なくとも24時間増殖される、請求項19記載の方法。
【請求項３５】
前記幹細胞が少なくとも2日間増殖される、請求項19記載の方法。
【請求項３６】
前記幹細胞が少なくとも１週間増殖される、請求項19記載の方法。
【請求項３７】
幹細胞を分化させる方法であって、前記細胞の分化のために十分な時間の間コラーゲンバイオファブリックと共に培養液中で前記細胞を培養することを含む、前記方法。
【請求項３８】
前記コラーゲンバイオファブリックが哺乳動物胎盤から単離された羊膜を含む、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
前記コラーゲンバイオファブリックが哺乳動物胎盤から単離された絨毛膜を含む、請求項37記載の方法。
【請求項４０】
前記コラーゲンバイオファブリックが哺乳動物胎盤からの羊膜及び絨毛膜を含む、請求項37記載の方法。
【請求項４１】
前記コラーゲンバイオファブリックが前記分化する前に実質的乾燥している、請求項37記載の方法。
【請求項４２】
前記コラーゲンバイオファブリックが前記分化する前に脱細胞化されている、請求項37記載の方法。
【請求項４３】
前記コラーゲンバイオファブリックが前記分化する前に脱細胞化されていない、請求項37記載の方法。
【請求項４４】
前記コラーゲンバイオファブリックが、該コラーゲンバイオファブリックが由来する胎盤に対して内在性の細胞を含む、請求項37記載の方法。
【請求項４５】
前記コラーゲンバイオファブリックが、該コラーゲンバイオファブリックが由来する胎盤に対して外来性の細胞を含む、請求項37記載の方法。
【請求項４６】
前記コラーゲンバイオファブリックが照射される、請求項44記載の方法。
【請求項４７】
前記コラーゲンバイオファブリックが照射される、請求項45記載の方法。
【請求項４８】
前記コラーゲンバイオファブリックの上で体細胞を培養することを更に含む、請求項37記載の方法。
【請求項４９】
前記幹細胞が胚性幹細胞である、請求項37記載の方法。
【請求項５０】
前記幹細胞が胎盤幹細胞である、請求項37記載の方法。
【請求項５１】
前記幹細胞が間充織幹細胞、造血幹細胞、胎盤血若しくは臍帯血由来幹細胞、骨髄由来幹細胞又は成体体細胞幹細胞である、請求項37記載の方法。
【請求項５２】
前記成体体細胞幹細胞が神経幹細胞、肝臓幹細胞、膵臓幹細胞、内皮幹細胞、心臓幹細胞又は筋肉幹細胞である、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
前記細胞が神経性細胞に分化される、請求項37記載の方法。
【請求項５４】
前記分化が、前記細胞をβメルカプトエタノール又はブチルヒドロキシアニゾールと接触させることを含む、請求項53記載の方法。
【請求項５５】
前記コラーゲンバイオファブリックが前記βメルカプトエタノール又はブチルヒドロキシアニゾールを含む、請求項54記載の方法。
【請求項５６】
前記神経細胞が、神経成長因子受容体の産生；神経成長因子をコードする遺伝子の発現；神経フィラメント重鎖の産生；又は神経フィラメント重鎖をコードする遺伝子の発現；を示す、請求項53記載の方法。
【請求項５７】
前記細胞が脂肪細胞に分化される、請求項37記載の方法。
【請求項５８】
前記分化が、前記細胞をデキサメサゾン、インドメタシン、インスリン、及び3-イソブチル-1-メチルキサンチンと接触させることを含む、請求項57記載の方法。
【請求項５９】
前記コラーゲンバイオファブリックが前記デキサメサゾン、インドメタシン、インスリン及び3-イソブチル-1-メチルキサンチンを含む、請求項58記載の方法。
【請求項６０】
前記脂肪細胞が、脂肪親和性染色によって検出可能な細胞質内脂肪小胞の産生；リパーゼをコードする遺伝子の発現；又はリパーゼの産生；を示す、請求項57記載の方法。
【請求項６１】
前記細胞が軟骨細胞に分化される、請求項37記載の方法。
【請求項６２】
前記分化が、前記細胞をトランスフォーミング増殖因子β-3と接触させることを含む、請求項61記載の方法。
【請求項６３】
前記コラーゲンバイオファブリックが、前記トランスフォーミング増殖因子β-3を含む、請求項62記載の方法。
【請求項６４】
前記軟骨細胞が、軟骨細胞の細胞形態学的特徴；コラーゲン2の産生；コラーゲン2をコードする遺伝子の発現、コラーゲン9の産生；又はコラーゲン9をコードする遺伝子の発現；を示す、請求項61記載の方法。
【請求項６５】
前記細胞が骨細胞に分化される、請求項37記載の方法。
【請求項６６】
前記分化が、前記細胞をデキサメサゾン、アスコルビン酸-2-ホスフェート及びグリセロリン酸と接触させることを含む、請求項65記載の方法。
【請求項６７】
前記コラーゲンバイオファブリックが前記デキサメサゾン、アスコルビン酸-2-ホスフェート及びグリセロリン酸を含む、請求項66記載の方法。
【請求項６８】
前記骨細胞が、骨細胞のカルシウムレベル特徴；アルカリホスファターゼの産生；アルカリホスファターゼをコードする遺伝子の発現；オステオポンチンの産生；又は子オステオポンチンをコードする遺伝子の発現；を示す、請求項65記載の方法。
【請求項６９】
前記細胞が肝細胞に分化される、請求項37記載の方法。
【請求項７０】
前記分化が、前記細胞を肝細胞増殖因子及び上皮細胞増殖因子と接触させることを含む、請求項69記載の方法。
【請求項７１】
前記コラーゲンバイオファブリックが前記肝細胞増殖因子及び上皮細胞増殖因子を含む、請求項70記載の方法。
【請求項７２】
前記肝細胞が、肝細胞特異的な遺伝子の発現又は肝細胞特異的なタンパク質の産生を示す、請求項69記載の方法。
【請求項７３】
前記細胞が膵細胞に分化される、請求項37記載の方法。
【請求項７４】
前記分化が、前記細胞を塩基性線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β-1、及びネスチン-ポジティブニューロン細胞による条件培地と接触させることを含む、請求項73記載の方法。
【請求項７５】
前記コラーゲンバイオファブリックが塩基性線維芽細胞増殖因子及びトランスフォーミング増殖因子β-1を含む、請求項74記載の方法。
【請求項７６】
前記膵細胞がインスリンの産生又はインスリンをコードする遺伝子の発現を示す、請求項73記載の方法。
【請求項７７】
前記細胞が心臓細胞に分化される、請求項37記載の方法。
【請求項７８】
前記分化が、前記細胞をレチノイン酸、塩基性線維芽細胞増殖因子及びトランスフォーミング増殖因子と接触させることを含む、請求項77記載の方法。
【請求項７９】
前記コラーゲンバイオファブリックが、前記レチノイン酸、基礎線維芽細胞増殖因子及びトランスフォーミング増殖因子を含む、請求項78記載の方法。
【請求項８０】
前記分化が、前記細胞をカルジオトロピンと接触させることを含む、請求項77記載の方法。
【請求項８１】
前記コラーゲンバイオファブリックが前記カルジオトロピンを含む、請求項80記載の方法。
【請求項８２】
前記心臓細胞が、拍動；心臓アクチンの産生；又は心臓アクチンをコードする遺伝子の発現；を示す、請求項77記載の方法。
【請求項８３】
細胞に対する化合物の毒性を決定する方法であって、前記細胞を該細胞の生存のために適した条件下でコラーゲンバイオファブリックと共に培養すること；前記細胞を該化合物と接触させること；及び同等の条件下で培養され、かつ前記化合物と接触していない細胞と比較して、アポトーシス、壊死若しくは細胞死、又はアポトーシス、壊死若しくは細胞死に向かう傾向を示す前記細胞の代謝パラメーターの変化を同定すること；を含み、前記変化が同定される場合、前記化合物が前記細胞に対して有毒である、前記方法。
【請求項８４】
前記細胞が体細胞である、請求項83記載の方法。
【請求項８５】
前記細胞が胚性幹細胞である、請求項83記載の方法。
【請求項８６】
前記細胞が胎盤幹細胞である、請求項83記載の方法。
【請求項８７】
前記細胞が間充織幹細胞、造血幹細胞、胎盤血若しくは臍帯血由来幹細胞、骨髄由来幹細胞又は成体体細胞幹細胞である、請求項83記載の方法。
【請求項８８】
前記成体体細胞幹細胞が神経幹細胞、肝臓幹細胞、膵臓幹細胞、内皮幹細胞、心臓幹細胞又は筋肉幹細胞である、請求項87記載の方法。
【請求項８９】
幹細胞を培養する方法であって、前記幹細胞を複数の胎盤幹細胞を含むコラーゲンバイオファブリックと共に培養すること；及び前記幹細胞の生存に適した条件下で前記幹細胞を培養すること；を含む、前記方法。
【請求項９０】
前記幹細胞が胚性幹細胞である、請求項89記載の方法。
【請求項９１】
前記コラーゲンバイオファブリックがヒアルロン酸を含む、請求項1記載の方法。
【請求項９２】
前記ヒアルロン酸が前記コラーゲンバイオファブリックに対して架橋される、請求項91記載の方法。
【請求項９３】
前記コラーゲンバイオファブリックがヒアルロン酸を含む、請求項89記載の方法。
【請求項９４】
前記ヒアルロン酸が前記コラーゲンバイオファブリックに対して架橋される、請求項93記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（1.発明分野）
本発明は、胎盤コラーゲンバイオファブリックを使用して、幹細胞、特にヒト胚性幹細胞培養し、増殖し、又は分化させる方法を提供する。本発明は、例えば、細胞培養、組織移植、創薬及び遺伝子療法の領域における適用を有する。
【背景技術】
【０００２】
（2.発明の背景）
ヒト胚性幹（HES）細胞は、胚盤胞段階胚の内部細胞塊（ICM）又は胚の生殖腺隆線に由来した多能性細胞である。HES細胞は、細胞の任意のタイプに発達する可能性及び生物体全体を含む組織、器官又は体の部位の任意のタイプを発生する可能性を有する。従って、オンデマンドで正常なクローンのHES細胞を提供する能力及びその分化を操作する能力は、生物医学的、産業的及び科学的な分野における進歩を前進することができる強力なツールを提供するであろうことが予想される。
【０００３】
しかし、HES細胞の実用的な開発のためには、著しいハードルが残っている。例えば、未分化な状態でES細胞を維持するために、ES細胞は、通常支持細胞上で培養される。しかし、支持細胞層依存的な培養系における潜在的な問題には：（1）動物支持細胞からHES細胞に対する病原体の伝染の潜在的リスク、及び現在の増殖系（ヒト／動物又はヒト／ヒト共培養）が、異種移植として構築されたという事実、（2）支持細胞は、主に初代細胞に由来し、それは有意なロット間変動を示して、品質管理が困難となる；（3）支持細胞の供与源及び数が限定されていることにより、HES細胞の大量生産及び適用を妨げること；を含む。従って、支持細胞を伴わない未分化HES細胞の維持及び増殖に対する需要がある。
【０００４】
Xuらの論文（Nat. Biotechnol., 19（10）：971-974, （2001）。WO03/020920及びU.S.2003/0017589）は、フィーダーを含まない培養系において未分化ES細胞を首尾よく維持した最初のものである。この系では、ES細胞を、マウス胚性線維芽細胞による条件培地においてEngelbreth Holm Swarm（EHS）肉腫からのMATRIGEL（商標）又はラミニン上で培養した。しかし、このような合成マトリックス及び限定されたマトリックス巨大分子は、支持細胞によって提供されるより複雑な細胞-マトリックス相互作用を模倣するには十分でない。また、研究では、この培養系が特定のES株化細胞（例えば、H1及びH9）に対してのみ適しているが、その他のES株化細胞を支持できないことを示した（Hovattalらの論文、Hum. Reprod. 18 （7）：1404-1409, 2003）。そのうえ、支持細胞層細胞は、例えば病原体又はシアル酸Neu5Gcなどの非胚性若しくは非ヒト生体分子による混入の供与源であり得ることが最近認識された。
【０００５】
そのうえ、全ての供与源からの幹細胞、例えば胎盤幹細胞への関心の増加により、当該技術分野において、このような細胞を培養する改善された方法に対する需要がある。
【０００６】
従って、当該技術分野において、幹細胞のための改善されたフィーダーを伴わない培養系に対する需要が残っている。本発明は、胎盤由来コラーゲンバイオファブリックを使用するこのような培養系を提供する。
【発明の概要】
【０００７】
（3. 発明の要旨）
本発明は、コラーゲンバイオファブリック、特に哺乳動物胎盤からの羊膜、絨毛膜又は両方に由来するコラーゲンバイオファブリックと共にしばらくの間幹細胞を培養することを含む、幹細胞、例えばヒト胚性幹細胞、胎盤幹細胞、例えばCD34-又はCD34+胎盤幹細胞の培養の改善に向けられる。コラーゲンバイオファブリックは、一部の実施態様において、典型的には培養において幹細胞を支持するために使用される支持細胞層に取って代わる。その他の実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、幹細胞の付着及び増殖のための基体を提供する。
【０００８】
いずれの理論によって限定されることも意図しないが、本発明のコラーゲンバイオファブリックは、細胞付着のための基層を提供し、及び少なくとも特定の実施態様において、培養の間に幹細胞の成長を支持する適切な成長因子を提供すると考えられる。
【０００９】
一つの態様において、本発明は、幹細胞を培養するための方法であって、幹細胞をコラーゲンバイオファブリックと共に培養液中で培養することを含み、前記コラーゲンバイオファブリックが、胎盤に由来する、前記方法を提供する。好ましい実施態様において、前記幹細胞は、コラーゲンバイオファブリックに対して外来性である。幹細胞は、当業者により、幹細胞の生存のために適した条件下及び適した時間培養することができる。好ましい実施態様において、幹細胞は、胚性幹細胞又は胎盤幹細胞である。別の好ましい実施態様において、前記培養には、前記幹細胞又は前記幹細胞の集団の増殖を含む。
【００１０】
別の態様において、本発明は、幹細胞を分化させるための方法であって、幹細胞の分化を助長するか、又は促進する1つ以上の薬剤の存在下においてコラーゲンバイオファブリックと共に培養液中で幹細胞を培養する工程を含む、前記方法を提供する。このような薬剤は、本明細書に記述したような、例えば成長因子、小分子、その他であることができる。種々の実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、一つ以上のこのような薬剤を含むか、幹細胞が培養される培養液が、一つ以上のこのような薬剤を含むか、又はコラーゲンバイオファブリック及び培養液が、一つ以上のこのような薬剤を含む。
【００１１】
幹細胞は、細胞培養において幹細胞の成長を助長することが当業者に公知の条件下で培養することができる。幹細胞、例えば胎盤幹細胞、例えばCD34-若しくはCD34+胎盤幹細胞は、増殖させることができ、又はコラーゲンバイオファブリック上で当業者に周知であるような細胞への分化を助長し、若しくは促進する適切な薬剤を使用して、例えば神経細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞、肝細胞、膵細胞又は心臓細胞に分化させることができる。
【００１２】
胚性幹細胞、胎盤幹細胞（例えば、CD34-又はCD34+胎盤幹細胞）、間充織幹細胞、造血幹細胞、胎盤血若しくは臍帯血由来幹細胞、骨髄由来幹細胞、成体体細胞幹細胞、前駆細胞（例えば、造血前駆細胞）、又は特定の細胞タイプに分化するように関係づけられた細胞を含むが、限定されない、任意の幹細胞を本発明の方法に従って培養し、増殖し、又は分化させることができる。一部の実施態様において、幹細胞は、胚性幹細胞である。好ましい実施態様において、幹細胞は、ヒト胚性幹細胞又は胎盤幹細胞である。また、特定の実施態様において、本発明は、幹細胞を培養する方法であって、幹細胞が、骨髄からの角膜輪部細胞、角膜輪部幹細胞又は間充織幹細胞ではない、前記方法を提供する。
【００１３】
本発明に使用されるコラーゲンバイオファブリックは、哺乳動物胎盤に由来する。好ましいコラーゲンバイオファブリックは、実質的に乾燥しており、すなわち重量の約20％以下の水分である。具体的実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、プロテアーゼ処理されていない。別の特定の実施態様において、前記コラーゲンバイオファブリック内のタンパク質は、人工的に化学的架橋されていない、すなわちコラーゲンバイオファブリックが固定されていない。別の具体的実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、胎盤細胞を欠いており、例えば脱細胞化されている。別の特定の実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、胎盤細胞を含み、例えば脱細胞化されていない。
【００１４】
コラーゲンバイオファブリックは、ヒアルロン酸、例えばヒアルロン酸の層を含むことができる。具体的実施態様において、ヒアルロン酸は、架橋されている。より具体的実施態様において、ヒアルロン酸は、コラーゲンバイオファブリックに対して架橋される。
【００１５】
加えて、コラーゲンバイオファブリックは、コラーゲンバイオファブリックには天然に存在しないか、又は生物活性化合物が添加されていないコラーゲンバイオファブリックとは異なる濃度で存在する生物活性化合物を含んでいてもよい。より具体的実施態様において、前記生物活性化合物は、小有機分子、抗生物質、アミノ酸、疼痛薬、抗炎症薬、サイトカイン、成長因子、酵素阻害剤、キナーゼ阻害剤、抗腫瘍薬、抗真菌薬、抗ウイルス薬又は抗感染剤である。
【００１６】
一部の実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、幹細胞の分化を助長し、又は促進する1つ以上の薬剤を含んでいてもよい。このような薬剤は、当業者に周知であり、及び以下に詳細に記述してある。また、コラーゲンバイオファブリックは、該コラーゲンバイオファブリックが由来する胎盤に対して内在性又は外来性の細胞を含んでいてもよい。このような細胞は、本明細書に記述してある。
【００１７】
幹細胞が由来するか、又は幹細胞が分化するであろう細胞／組織の供与源に適した、当業者に公知の、幹細胞を培養し、増殖し、又は分化するために適した、すなわち幹細胞が特定幹細胞のための標準的な培養条件において増殖する、任意の培養液を本発明に使用することができる。
【００１８】
本発明は、幹細胞、前駆細胞若しくは特異的細胞タイプ又はその集団の使用であって、該細胞又は細胞群が本発明の方法に従って培養され、又は分化される、前記使用を更に包含する。特定の実施態様において、細胞は、本発明の方法に従って幹細胞を分化することによって作製される神経細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞、肝細胞、膵細胞又は心臓細胞である。
【００１９】
一部の実施態様において、本発明は、疾患又は状態を治療し、又は予防するための、本発明の方法に従って産生されるコラーゲンバイオファブリックと共に、又は伴わない未分化の、又は分化した幹細胞の移植を提供する。
【００２０】
更に、本発明は、細胞に対する化合物の毒性を決定する方法を提供する。一部の実施態様において、本方法は、幹細胞が生存する、例えば増殖する条件下で、コラーゲンバイオファブリックと共に細胞を培養することを含む。次いで、細胞を化合物と接触させて、細胞の活性の変化、例えばアポトーシス、壊死若しくは細胞死又はアポトーシス、壊死若しくは細胞死に向かう傾向を示す細胞の代謝性パラメーターがアッセイされる。同等の条件下で培養され、かつ化合物と接触していない細胞と比較して変化が検出される場合、化合物は、細胞に対して有毒であるとして同定される。細胞は、体細胞又は幹細胞であることができる。
【００２１】
別の態様において、本発明は、本発明のコラーゲンバイオファブリック細胞培養系を使用することにより、幹細胞の分化に対する化合物の効果を決定するための方法を提供する。一部の実施態様において、本方法は、前記細胞を細胞の分化のために適した条件下でコラーゲンバイオファブリックと共に培養することを含む。細胞を化合物と接触させる。次いで、細胞を候補化合物の有無において、分化のマーカーについて解析する。分化のマーカーは、細胞表面マーカー、細胞形態又は1つ以上の差動的に発現される遺伝子であることができる。変化が同定される場合、前記化合物は、前記細胞の分化に対して効果を有するとして同定される。
【００２２】
本明細書に使用される、「コラーゲンバイオファブリック」は、哺乳動物羊膜及び／又は絨毛膜に由来するか、又はこれらから得られる材料を含む実質的に平らな、又はシート様のコラーゲンである。好ましい実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、実質的にHariri、米国特許出願公開第2004/0048796号に記載されているように、脱細胞化され、脱水された（すなわち、重量の20％以下の水分）羊水膜、絨毛膜、又は羊水膜及びプロテアーゼ処理又は60℃を超える熱処理がされていない絨毛膜である。特定の実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、人工の化学的に誘導された架橋がなく、すなわち固定されていない。コラーゲンバイオファブリックは、典型的には、例えば本発明に従って細胞を培養し、増殖し、及び／又は分化する前に、培養液で再水和される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】コラーゲンバイオファブリック（羊膜）、コラーゲン、フィブロネクチン又はガラス上での培養後の胎盤幹細胞を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（5. 発明の詳細な記載）
本発明は、コラーゲンバイオファブリックを使用して、幹細胞を培養し、増殖し、又は分化するための方法を提供する。
【００２５】
（5.1. 幹細胞）
幹細胞、例えば胚性幹細胞又は成人幹細胞は、本発明の方法に従ってコラーゲンバイオファブリックと共に培養することができる。本明細書に使用される「幹細胞」という用語は、分化全能性、多能性及び多分化能細胞、体細胞幹細胞又は前駆細胞、その他を包含する。幹細胞は、例えば胎盤幹細胞（例えば、CD34-又はCD34+胎盤幹細胞）、臍帯幹細胞、間充織幹細胞、造血幹細胞、胎盤血若しくは臍帯血由来幹細胞、骨髄由来幹細胞又は体細胞幹細胞であることができる。体細胞幹細胞は、例えば神経幹細胞、肝臓幹細胞、膵臓幹細胞、内皮幹細胞、心臓幹細胞、筋肉幹細胞又は上皮性幹細胞、皮膚幹細胞、脳幹細胞、皮膚幹細胞、内胚葉幹細胞、外胚葉性幹細胞、米国特許第5,486,359号、第6,261,549号及び第6,387,367号（間充織幹細胞）並びに米国特許第5,962,325号（胎児性間質性細胞）に記述された細胞であることができる。特定の実施態様において、幹細胞は、角膜輪部幹細胞ではない。
【００２６】
本発明に使用される幹細胞は、例えば胎盤、臍帯、骨髄、胚、間充織、神経組織、膵組織、筋組織（心筋など）、肝臓、皮膚、小腸、鼻上皮、骨、膵臓、その他に由来することができる。
【００２７】
一部の実施態様において、本発明に使用される幹細胞は、ヒト胎盤幹細胞である。このような幹細胞は、例えば米国出願公開第2002/0123141号、第2003/0032179号、第2003/0180269号、第2004/0048796号（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる）に記述されており、及びこれらに記載されたとおりにルーチン的に単離してもよい。
【００２８】
一部の実施態様において、本発明に使用される幹細胞は、胚性幹細胞である。胚性幹細胞は、例えば米国特許第5,843,780号、第6,200,806号；及びThomsonらの論文、1995、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92：7844に記載されているように、ルーチン的に単離することができる。特定の実施態様において、本発明の方法に使用される幹細胞は、ヒト胚性幹細胞である。ヒト胚性幹細胞は、例えばThomsonらの論文、1998、Science、282：1145、及び米国特許第6,200,806号に記述されている。
【００２９】
また、本発明は、細胞が骨髄由来間充織幹細胞又は角膜輪部細胞、例えば角膜輪部幹細胞ではない、幹細胞の培養を提供する。
【００３０】
本発明に使用される幹細胞は、当業者に公知の方法又は材料を使用して得ることができる。例えば、幹細胞は、市販のサービスLifeBank USA (Cedar Knolls, N.J.), ViaCord (Boston Mass.), Cord Blood Registry (San Bruno, Calif.)及びCryocell (Clearwater, FIa.)から得ることができる。また、幹細胞は、当該技術分野において公知の方法又は手順を使用して収集することができる。霊長類原基幹細胞は、例えば米国特許第6,200,806号及び第6,800,480号に記載されているように得ることができる。胎盤幹細胞は、例えば米国出願公開第2003/0032179号に記載されているように得ることができ、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ヒト胚性幹細胞は、胚、胚盤胞若しくは内部細胞塊（ICM）細胞などの天然の供与源から、又は胚性細胞の以前の、若しくは確立された培養から得ることができる。ヒト胚性幹細胞は、Thomsonら（米国特許第5,843,780号；Science 282：1145、1998；Curr. Top. Dev. Biol. 38：133 ff.,（1998））及びReubinoffらの論文、2000、Nature Biotech. 18：399又は米国出願公開第2003/0032179号などによって記述された技術を使用してヒト胚盤胞細胞から調製することができる。ヒト胚性幹細胞は、例えば、Reubinoffらの論文、2000、Nature、18：399-404又は米国特許第6,090,622号（ヒト胚性胚細胞）及び第6,562,619号に記載されているようにヒト胚の生殖腺の隆線から、又は例えば米国特許第6,921,632号に記載されているように凍結受精卵から、又は米国出願公開第2003/0032179号、第2002/0123141号、第2003/0032179号、第2003/0180269号、第2004/0048796号に記載されているようにヒト胎盤から得ることができる。これらの内容は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【００３１】
本発明に使用される幹細胞は、当業者に公知の任意の種由来であることができる。このような幹細胞は、例えば、サカナ、トリ、爬虫類又は哺乳動物の幹細胞であることができる。例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、サル、ヒト、その他由来の幹細胞を含むが、限定されない、任意の哺乳動物幹細胞を本発明の方法に従って使用することができる。特定の実施態様において、幹細胞は、マウス幹細胞である。一部の実施態様において、幹細胞は、霊長類幹細胞である。好ましい実施態様において、幹細胞は、ヒト幹細胞である。特に好ましい実施態様において、幹細胞は、ヒト胚性細胞である。
【００３２】
本発明に使用される幹細胞は、臍帯血又は胎盤血のものなどの比較的精製されていない形態で、又はアフェレーシスによって得られた末梢血単核細胞の集団で使用してもよい。本発明に使用可能な幹細胞は、比較的単離され、すなわちその他の細胞タイプから実質的に単離されていてもよい。幹細胞には、幹細胞の単一のタイプ又は幹細胞の複数のタイプを含むことができる。
【００３３】
本発明に使用される幹細胞は、培養前に、又はコラーゲンバイオファブリックを使用して培養する間に、遺伝的に操作することができる。ポリヌクレオチドは、当業者に公知の任意の技術を使用して、例えばアデノウイルス若しくはレトロウイルスベクターなどのウイルスベクターによって、又はリポソーム若しくは米国出願公開第2004/0028660号（この内容は、これらの全体が参照により組み込まれる）に記載されているような化学物質を媒介したDNAの取り込みなどの生体力学的手段によって、幹細胞に導入することができる。
【００３４】
（5.2. 胎盤幹細胞）
コラーゲンバイオファブリック上で培養可能な、胎盤幹細胞、例えばCD34-胎盤幹細胞は、以下において、単に「胎盤幹細胞」といい、組織培養基質に接着し、かつ非胎盤細胞タイプに分化する能力を有する胎盤又はその一部から得られる幹細胞である。胎盤幹細胞は、胎児起源又は母系起源のいずれであることもできる（すなわち、母又は胎児の遺伝子型を有することができる）。胎盤幹細胞又は胎盤幹細胞を含む細胞の集団は、単に胎児起源若しくは母系起源である胎盤幹細胞を含むことができ、又は胎児起源若しくは母系起源の両方の胎盤幹細胞の混合集団を含むことができる。本発明の方法に使用することができる胎盤幹細胞は、例えば米国出願公開第2005/0019908号及び第2003/0180269号に記述されており、これらの開示は、その全体が本明細書に組み込まれる。胎盤幹細胞、及び胎盤幹細胞を含む細胞の集団は、形態学的、マーカー及び下記に論議した培養特徴によって同定すること、及び選択することができる。
【００３５】
（5.2.1. 物理的及び形態学的特徴）
胎盤幹細胞は、初代培養において、又は細胞培養において培養したときに、組織培養基体、例えば組織培養容器表面（例えば、組織培養プラスチック）に接着する。培養における胎盤幹細胞は、一般に線維芽細胞様の、星状の外見を呈し、中心細胞体（central cell body）から伸長する多数の細胞質突起を伴う。しかし、胎盤幹細胞は、線維芽細胞よりも多数のこのような突起を示すので、胎盤幹細胞は、同じ条件下で培養された線維芽細胞から形態学的に識別可能である。また、形態学的に、胎盤幹細胞は、支持細胞層又は基体、例えばMATRIGEL（商標）において培養されるかどうにかかわらず、一般に培養においてより丸く、又は丸石の形態である造血幹細胞及び丸い形態をとる胚性幹細胞又は胚性胚細胞からも識別可能である。
【００３６】
典型的には、培養において、胎盤幹細胞は、胚性幹細胞の培養組織において発生する胚様体に似ている胚様体様体（embryoid-like bodies）と呼ばれる細胞のクラスターを発生する。
【００３７】
（5.2.2. 細胞表面、分子及び遺伝子マーカー）
胎盤幹細胞は、幹細胞を同定し、及び／又は単離するために使用することができる複数のマーカーを発現する。胎盤幹細胞は、胎盤全体又はその任意の部分（例えば、羊膜、絨毛膜、胎盤の子葉、臍帯、その他）からの幹細胞を含む。しかし、胎盤幹細胞は、栄養膜ではない。
【００３８】
胎盤幹細胞は、一般にマーカーCD73、CD105、CD200、HLA-G及び／又はOCT-4を発現し、一般にCD34、CD38又はCD45を発現しない。また、胎盤幹細胞は、HLA-ABC（MHC-1）及びHLA-DRを発現することができる。これらのマーカーは、胎盤幹細胞を同定するために、及びその他幹細胞タイプから胎盤幹細胞を区別するために使用することができる。胎盤幹細胞は、CD73及びCD105を発現し得るので、これらは、間充織幹細胞様の特徴を有し得る。しかし、胎盤幹細胞は、胎児特異的マーカーであるCD200及びHLA-Gを発現し得るので、これらは、CD200もHLA-Gも発現しない間充織幹細胞、例えば骨髄由来間充織幹細胞から区別することができる。同様に、CD34、CD38及び／又はCD45の発現の欠如により、非造血性幹細胞として胎盤幹細胞を同定する。特定の実施態様において、胎盤幹細胞は、SSEA3及び／又はSSEA4についてネガティブである。特定の実施態様において、胎盤幹細胞は、SSEA3及び／又はSSEA4についてポジティブである。
【００３９】
従って、一つの実施態様において、胎盤幹細胞は、CD200+又はHLA-G+である。具体的実施態様において、幹細胞は、CD200+及びHLA-G+である。別の特定の実施態様において、前記幹細胞は、CD73+及びCD105+である。別の特定の実施態様において、前記幹細胞は、CD34-、CD38-又はCD45-である。別の特定の実施態様において、前記幹細胞は、CD34-、CD38-及びCD45-である。別の特定の実施態様において、前記幹細胞は、CD34-、CD38-、CD45-、CD73+及びCD105+である。別の特定の実施態様において、前記CD200+又はHLA-G+幹細胞は、胚様体様体を形成することができる条件下で、幹細胞を含む胎盤細胞の集団において胚様体様体の形成を助長する。
【００４０】
胎盤幹細胞は、複数の胎盤細胞からCD200又はHLA-G胎盤細胞を選択することによって選択することができ、これにより前記細胞は、胎盤幹細胞である。具体的実施態様において、前記選択は、CD200+及びHLA-G+である胎盤細胞を選択することを含む。具体的実施態様において、前記選択は、またCD73+及びCD105+である胎盤細胞を選択することを含む。別の特定の実施態様において、前記選択は、またCD34-、CD38-又はCD45-である胎盤細胞を選択することを含む。別の特定の実施態様において、前記選択は、またCD34-、CD38-及びCD45-である胎盤細胞を選択することを含む。別の特定の実施態様において、前記選択は、またCD34-、CD38-、CD45-、CD73+及びCD105+である胎盤細胞を選択することを含む。別の特定の実施態様において、前記選択は、また胚様体様体を形成することができる条件下で、幹細胞を含む胎盤細胞の集団における胚様体様体の形成を助長する胎盤細胞を選択することを含む。
【００４１】
別の実施態様において、胎盤幹細胞は、CD73+、CD105+及びCD200+である。別の特定の実施態様において、前記幹細胞は、HLA-G+である。別の特定の実施態様において、前記幹細胞は、CD34-、CD38-又はCD45-である。別の特定の実施態様において、前記幹細胞は、CD34-、CD38-及びCD45-である。より具体的実施態様において、前記幹細胞は、CD34-、CD38-、CD45-及びHLA-G+である。別の特定の実施態様において、単離されたCD73+、CD105+及びCD200+幹細胞は、集団を胚様体様体を形成することができる条件下で培養するときに、幹細胞を含む胎盤細胞の集団における1つ以上の胚様体様体の形成を助長する。
【００４２】
胎盤幹細胞は、またCD73+、CD105+及びCD200+胎盤細胞を選択することによって、複数の胎盤細胞から選択することができ、これにより前記細胞は、胎盤幹細胞である。具体的実施態様において、前記選択は、またHLA-G+である胎盤細胞を選択することを含む。別の特定の実施態様において、前記選択は、またCD34-、CD38-又はCD45-である胎盤細胞を選択することを含む。別の特定の実施態様において、前記選択は、またCD34-、CD38-及びCD45-である胎盤細胞を選択することを含む。別の特定の実施態様において、前記選択は、またCD34-、CD38-、CD45-及びHLA-G+である胎盤細胞を選択することを含む。別の特定の実施態様において、前記選択は、加えて、集団を胚様体様体の形成を助長する条件下で培養するときに、幹細胞を含む胎盤細胞の集団における1つ以上の胚様体様体の形成を助長するCD73+、CD105+及びCD200+幹細胞を選択することを含む。
【００４３】
別の実施態様において、胎盤幹細胞は、CD200+及びOCT-4+である。具体的実施態様において、幹細胞は、CD73+及びCD105+である。別の特定の実施態様において、前記幹細胞は、HLA-G+である。別の特定の実施態様において、前記幹細胞は、CD34-、CD38-又はCD45-である。別の特定の実施態様において、前記幹細胞がCD34-、CD38-及びCD45-である。より具体的実施態様において、前記幹細胞は、CD34-、CD38-、CD45-、CD73+、CD105+及びHLA-G+である。別の特定の実施態様において、幹細胞は、集団を胚様体様体を形成することができる条件下で培養するときに、幹細胞を含む胎盤細胞の集団による1つ以上の胚様体様体の産生を助長する。
【００４４】
胎盤幹細胞は、またCD200+及びOCT-4+胎盤細胞を選択することによって複数の胎盤細胞から選択することができ、これにより前記細胞は、胎盤幹細胞である。具体的実施態様において、前記選択は、またHLA-G+である胎盤細胞を選択することを含む。別の特定の実施態様において、前記選択は、またCD34-、CD38-又はCD45-である胎盤細胞を選択することを含む。別の特定の実施態様において、前記選択は、またCD34-、CD38-及びCD45-である胎盤細胞を選択することを含む。別の特定の実施態様において、前記選択は、またCD34-、CD38-、CD45-、CD73+、CD105+及びHLA-G+である胎盤細胞を選択することを含む。別の特定の実施態様において、前記選択は、また集団を胚様体様体を形成することができる条件下で培養するときに、幹細胞を含む胎盤細胞の集団による1つ以上の胚様体様体の産生を助長する胎盤幹細胞を選択することを含む。
【００４５】
別の実施態様において、胎盤幹細胞は、CD73+、CD105+及びHLA-G+である。別の特定の実施態様において、前記幹細胞は、CD34-、CD38-又はCD45-である。別の特定の実施態様において、前記幹細胞は、CD34-、CD38-及びCD45-である。別の特定の実施態様において、前記幹細胞は、OCT-4+である。別の特定の実施態様において、前記幹細胞は、CD200+である。より具体的実施態様において、前記幹細胞は、CD34-、CD38-、CD45-、OCT-4+及びCD200+である。別の特定の実施態様において、前記幹細胞は、集団を胚様体様体を形成することができる条件下で培養するときに、前記幹細胞を含む胎盤細胞の集団における胚様体様体の形成を助長する。
【００４６】
胎盤幹細胞はまた、CD73+、CD105+及びHLA-G+胎盤細胞を選択することによって複数の胎盤細胞から選択することができ、これにより前記細胞は、胎盤幹細胞である。具体的実施態様において、前記選択は、またCD34-、CD38-又はCD45-である胎盤細胞を選択することを含む。別の特定の実施態様において、前記選択は、またCD34-、CD38-及びCD45-である胎盤細胞を選択することを含む。別の特定の実施態様において、前記選択は、またOCT-4+である胎盤細胞を選択することを含む。別の特定の実施態様において、前記選択は、またCD200+である胎盤細胞を選択することを含む。別の特定の実施態様において、前記選択は、またCD34-、CD38-、CD45-、OCT-4+及びCD200+である胎盤細胞を選択することを含む。別の特定の実施態様において、前記選択は、また前記集団を胚様体様体を形成することができる条件下で培養するときに、前記幹細胞を含む胎盤細胞の集団における1つ以上の胚様体様体の形成を助長する胎盤細胞を選択することを含む。
【００４７】
別の実施態様において、胎盤幹細胞は、CD73+及びCD105+であり、かつ前記集団を胚様体様体を形成することができる条件下で培養するときに、前記幹細胞を含む単離された胎盤細胞の集団における1つ以上の胚様体様体の形成を助長する。具体的実施態様において、前記幹細胞は、CD34-、CD38-又はCD45-である。別の特定の実施態様において、前記幹細胞は、CD34-、CD38-及びCD45-である。別の特定の実施態様において、前記幹細胞は、OCT4+である。より具体的実施態様において、前記幹細胞は、OCT4+、CD34-、CD38-及びCD45-である。
【００４８】
胎盤幹細胞は、また前記集団を胚様体様体を形成することができる条件下で培養するときに、前記幹細胞を含む単離された胎盤細胞の集団における1つ以上の胚様体様体の形成を助長するCD73+及びCD105+胎盤細胞を選択することにより複数の胎盤細胞から選択することができ、したがって前記細胞は胎盤幹細胞である。具体的実施態様において、前記選択は、またCD34-、CD38-又はCD45-である胎盤細胞を選択することを含む。別の特定の実施態様において、前記選択は、またCD34-、CD38-及びCD45-である胎盤細胞を選択することを含む。別の特定の実施態様において、前記選択は、またOCT-4+である胎盤細胞を選択することを含む。別の特定の実施態様において、前記選択は、またCD200+である胎盤細胞を選択することを含む。別の特定の実施態様において、前記選択は、またCD34-、CD38-、CD45-、OCT-4+及びCD200+である胎盤細胞を選択することを含む。
【００４９】
別の実施態様において、胎盤幹細胞は、OCT-4+であり、かつ前記集団を胚様体様体を形成することができる条件下で培養したときに、前記幹細胞を含む単離された胎盤細胞の集団における1つ以上の胚様体様体の形成を助長する。具体的実施態様において、前記幹細胞は、CD73+及びCD105+である。別の特定の実施態様において、前記幹細胞は、CD34-、CD38-又はCD45-である。別の特定の実施態様において、前記幹細胞は、CD200+である。より具体的実施態様において、前記幹細胞は、CD73+、CD105+、CD200+、CD34-、CD38-及びCD45-である。
【００５０】
胎盤幹細胞は、また複数の胎盤細胞から、例えば前記集団を胚様体様体を形成することができる条件下で培養するときに、前記幹細胞を含む単離された胎盤細胞の集団における1つ以上の胚様体様体の形成を助長するOCT-4+胎盤細胞を選択することによって選択することができ、これにより前記細胞は、胎盤幹細胞である。具体的実施態様において、前記選択は、またCD34-、CD38-又はCD45-である胎盤細胞を選択することを含む。別の特定の実施態様において、前記選択は、またCD34-、CD38-及びCD45-である胎盤細胞を選択することを含む。別の特定の実施態様において、前記選択は、またCD200+である胎盤細胞を選択することを含む。別の特定の実施態様において、前記選択は、またCD200+である胎盤細胞を選択することを含む。別の特定の実施態様において、前記選択は、またCD73+、CD105+、CD200+、CD34-、CD38-及びCD45-である胎盤細胞を選択することを含む。
【００５１】
別の実施態様において、コラーゲンバイオファブリック上で培養可能又は識別可能な胎盤幹細胞は、CD10+、CD34-、CD105+及びCD200+である。胎盤幹細胞の単離集団は、例えば前記胎盤幹細胞の少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％又は少なくとも約99％を含むことができる。上記実施態様の特定の実施態様において、前記幹細胞は、加えて、CD90+及びCD45-である。具体的実施態様において、前記幹細胞又は胎盤幹細胞の集団は、幹細胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の特定の実施態様において、前記幹細胞又は胎盤幹細胞の集団は、これらの特徴を示さない胎盤幹細胞から単離されている。別の特定の実施態様において、前記単離された胎盤幹細胞は、非母系起源である。別の特定の実施態様において、胎盤幹細胞の前記単離集団の少なくとも約90％、少なくとも約95％又は少なくとも約99％の前記細胞は、非母系起源である。
【００５２】
別の実施態様において、コラーゲンバイオファブリック上で培養可能又は識別可能な胎盤幹細胞は、HLA-A,B,C-、CD45-、CD133-及びCD34-である。胎盤幹細胞の単離集団は、例えば少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％又は少なくとも約99％のHLA-A,B,C-、CD45-、CD133-及びCD34-である胎盤幹細胞を含むことができる。具体的実施態様において、前記幹細胞又は胎盤幹細胞の集団は、幹細胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の特定の実施態様において、胎盤幹細胞の前記集団は、これらの特徴を示さない胎盤幹細胞から単離されている。別の特定の実施態様において、前記単離された胎盤幹細胞は、非母系起源である。別の特定の実施態様において、胎盤幹細胞の前記単離集団における少なくとも約90％、少なくとも約95％又は少なくとも約99％の前記細胞は、非母系起源である。別の実施態様において、胎盤幹細胞は、胎盤灌流液から単離される。
【００５３】
別の実施態様において、コラーゲンバイオファブリック上で培養可能又は識別可能な胎盤幹細胞は、CD10+、CD13+、CD33+、CD45-、CD117-及びCD133-である。胎盤幹細胞の単離集団は、例えば少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％又は少なくとも約99％のCD10+、CD13+、CD33+、CD45-、CD117-及びCD133-である胎盤幹細胞を含むことができる。具体的実施態様において、前記幹細胞又は胎盤幹細胞の集団は、幹細胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の特定の実施態様において、前記単離された胎盤幹細胞は、非母系起源である。別の特定の実施態様において、胎盤幹細胞の前記単離集団の少なくとも約90％、少なくとも約95％又は少なくとも約99％の前記細胞は、非母系起源である。別の特定の実施態様において、前記幹細胞又は胎盤幹細胞の集団は、これらの特徴を示さない胎盤幹細胞から単離されている。別の実施態様において、胎盤幹細胞は、胎盤灌流液から単離されている。
【００５４】
別の実施態様において、コラーゲンバイオファブリック上で培養可能又は識別可能な胎盤幹細胞は、CD10-、CD33-、CD44+、CD45-及びCD117-である。胎盤幹細胞の単離集団は、例えば少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％又は少なくとも約99％のCD10-、CD33-、CD44+、CD45-及びCD117-である胎盤幹細胞を含むことができる。具体的実施態様において、前記幹細胞又は胎盤幹細胞の集団は、幹細胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の特定の実施態様において、前記単離された胎盤幹細胞は、非母系起源である。別の特定の実施態様において、胎盤幹細胞の前記単離集団における少なくとも約90％、少なくとも約95％又は少なくとも99％の前記細胞は、非母系起源である。別の特定の実施態様において、前記幹細胞又は胎盤幹細胞の集団は、これらの特徴を示さない胎盤幹細胞から単離されている。別の実施態様において、胎盤幹細胞は、胎盤の灌流液から単離されている。
【００５５】
別の実施態様において、コラーゲンバイオファブリック上で培養可能又は識別可能な胎盤幹細胞は、CD10-、CD13-、CD33-、CD45-及びCD117-である。このような胎盤幹細胞の単離集団は、例えば少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％又は少なくとも約99％のCD10-、CD13-、CD33-、CD45-及びCD117-である胎盤幹細胞を含むことができる。具体的実施態様において、前記幹細胞又は胎盤幹細胞の集団は、幹細胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の特定の実施態様において、前記単離された胎盤幹細胞は、非母系起源である。別の特定の実施態様において、胎盤幹細胞の前記単離集団における少なくとも約90％、少なくとも約95％又は少なくとも99％の前記細胞は、非母系起源である。別の特定の実施態様において、前記幹細胞又は胎盤幹細胞の集団は、これらの特徴を示さない胎盤幹細胞から単離されている。別の実施態様において、胎盤幹細胞は、胎盤灌流液から単離されている。
【００５６】
別の実施態様において、コラーゲンバイオファブリック上で培養可能又は識別可能な胎盤幹細胞は、HLA A,B,C-、CD45-、CD34-、CD133-で、CD10、CD13、CD38、CD44、CD90、CD105、CD200及び／又はHLA-Gについてポジティブ、及び／又はCD117についてネガティブである。別の実施態様において、幹細胞又は胎盤幹細胞の単離集団は、HLA A,B,C-、CD45-、CD34-、CD133-である幹細胞を含み、かつ集団の幹細胞の少なくとも約20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％又は約99％がCD10、CD13、CD38、CD44、CD90、CD105、CD200及び／又はHLA-Gについてポジティブで、及び／又はCD117についてネガティブである。具体的実施態様において、前記幹細胞又は胎盤幹細胞の集団は、幹細胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の特定の実施態様において、前記単離された胎盤幹細胞は、非母系起源である。別の特定の実施態様において、胎盤幹細胞の前記単離集団における前記細胞の少なくとも約90％、少なくとも約95％又は少なくとも約99％は、非母系起源である。別の特定の実施態様において、前記幹細胞又は胎盤幹細胞の集団は、これらの特徴を示さない胎盤幹細胞から単離されている。別の実施態様において、本発明は、HLA A,B,C-、CD45-、CD34-、CD133-で、かつCD10、CD13、CD38、CD44、CD90、CD105、CD200及び／又はHLA-Gについてポジティブ、及び／又はCD117についてネガティブである胎盤幹細胞を得る方法であって、胎盤灌流液から前記細胞を単離することを含む、前記方法を提供する。
【００５７】
別の実施態様において、コラーゲンバイオファブリック上で培養可能又は識別可能な胎盤幹細胞は、抗体結合によって決定するとCD200+及びCD10+で、かつ抗体結合及びRT-PCRの両方によって決定するとCD117-である。別の実施態様において、胎盤幹細胞は、CD10+、CD29-、CD54+、CD200+、HLA-G+、HLAクラスI-及びβ-2-ミクログロブリン-である。別の実施態様において、胎盤幹細胞、又は胎盤幹細胞群は、間充織幹細胞（例えば、骨髄由来間充織幹細胞）についてよりも少なくとも2倍高い少なくとも1つマーカーの発現を示す。別の特定の実施態様において、前記胎盤幹細胞は、非母系起源である。別の特定の実施態様において、胎盤幹細胞の単離集団における細胞の少なくとも約90％、少なくとも約95％又は少なくとも99％は、非母系起源である。
【００５８】
別の実施態様において、胎盤幹細胞又は胎盤幹細胞の単離集団は、アルデヒド脱水素酵素活性アッセイ法によって評価すると、アルデヒド脱水素酵素（ALDH）についてポジティブである胎盤幹細胞を含む。このようなアッセイ法は、当該技術分野において公知である（例えば、Bostian及びBettsの論文、Biochem. J., 173、787、（1978）を参照されたい）。具体的実施態様において、前記ALDHアッセイ法は、アルデヒド脱水素酵素活性のマーカーとしてALDEFLUOR（登録商標）（Aldagen、Inc., Ashland、Oregon）を使用する。具体的実施態様において、前記複数は、前記細胞の集団において約3％〜約25％の細胞である。別の実施態様において、本発明は、臍帯幹細胞の集団を提供し、複数の前記臍帯幹細胞は、アルデヒド脱水素酵素活性の指標としてALDEFLUOR（登録商標）を使用するアルデヒド脱水素酵素活性アッセイ法によって評価すると、アルデヒド脱水素酵素についてポジティブである。具体的実施態様において、前記複数は、前記細胞の集団において約3％〜約25％の細胞である。別の実施態様において、胎盤幹細胞又は臍帯幹細胞の前記集団は、同数の細胞を有し、かつ同じ条件下で培養された骨髄由来間充織幹細胞の集団よりも少なくも3倍又は少なくとも5倍高いALDH活性を示す。
【００５９】
任意の上記胎盤幹細胞、又は胎盤幹細胞の集団の種々の実施態様において、幹細胞又は胎盤幹細胞の集団は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18若しくは20回以上継代されており、又は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38又は40集団倍加以上の間増殖されている。
【００６０】
その他の実施態様において、上記胎盤幹細胞又は幹細胞は、骨髄由来間充織幹細胞よりも検出可能に高いレベルにて1つ以上の遺伝子を発現し、前記1つ以上の遺伝子は、ACTG2、ADARB1、AMIGO2、ARTS-1、B4GALT6、BCHE、C11orf9、CD200、COL4A1、COL4A2、CPA4、DMD、DSC3、DSG2、ELOVL2、F2RL1、FLJ10781、GATA6、GPR126、GPRC5B、HLA-G、ICAM1、IER3、IGFBP7、IL1A、IL6、IL18、KRT18、KRT8、LIPG、LRAP、MATN2、MEST、NFE2L3、NUAK1、PCDH7、PDLIM3、PJP2、RTN1、SERPINB9、ST3GAL6、ST6GALNAC5、SLC12A8、TCF21、TCFB2、VTN及び／又はZC3H12Aの1つ以上であり、前記骨髄由来幹細胞は、前記胎盤幹細胞が受けた継代の数と同等の継代回数を培養において受けている。これらの遺伝子に対応する配列は、Affymetrix GENECHIP（登録商標）アレイ上に見いだされる。また、これらの遺伝子は、2006年12月現在のもののGenBankアクセッション番号NM_001615（ACTG2）、BC065545（ADARB1）（NM_181847（AMIGO2）、AY358590（ARTS-1）、BC074884（B4GALT6）、BC008396（BCHE）、BC020196（C11orf9）、BC031103（CD200）、NM_001845（COL4A1）、NM_01846（COL4A2）、BC052289（CPA4）、BC094758（DMD）、AF293359（DSC3）、NM_001943（DSG2）、AF338241（ELOVL2）、AY336105（F2RL1）、NM_018215（FLJ10781）、AY416799（GATA6）、BC075798（GPR126）、NM_061235（GPRC5B）、AF340038（ICAM1）、BC000844（IER3）、BC066339（IGFBP7）、BC013142（IL1A）、BT019749（IL6）、BC007461（IL18）、BC072017）KRT18、BC075839（KRT8）、BC060825（LIPG）、BC065240（LRAP）、BC010444（MATN2）、BCO11908（MEST）、BC068455（NFE2L3）、NM_14840（NUAK1）、AB006755（PCDH7）、NM_014476（PDLIM3）、BC126199（PKP-2）、BC090862（RTN1）、BC002538（SERPINB9）、BC023312（ST3GAL6）、BC001201（ST6GALNAC5）、BC126160又はBC065328（SLC12A8）、BC025697（TCF21）、BC096235（TGFB2）、BC005046（VTN）及びBC005001(ZC3H12A)にて見いだすことができる。
【００６１】
より具体的実施態様において、胎盤幹細胞又は胎盤幹細胞群は、骨髄由来間充織幹細胞よりも検出可能に高いレベルにてACTG2、ADARB1、AMIGO2、ARTS-1、B4GALT6、BCHE、C11orf9、CD200、COL4A1、COL4A2、CPA4、DMD、DSC3、DSG2、ELOVL2、F2RL1、FLJ10781、GATA6、GPR126、GPRC5B、HLA-G、ICAM1、IER3、IGFBP7、IL1A、IL6、IL18、KRT18、KRT8、LIPG、LRAP、MATN2、MEST、NFE2L3、NUAK1、PCDH7、PDLIM3、PKP2、RTN1、SERPINB9、ST3GAL6、ST6GALNAC5、SLC12A8、TCF21、TCFB2、VTN及び／又はZC3H12Aを発現する。
【００６２】
一般に、胎盤幹細胞は、生理的に許容し得る溶液、例えば幹細胞収集組成物を使用して、哺乳動物胎盤から得られる。幹細胞収集組成物は、2006年12月28日に出願された「胎盤幹細胞を収集するため、及び器官を保存するための改善された媒体」の表題の関連した米国特許出願第11/648,812号に詳述されている。
【００６３】
胎盤幹細胞収集組成物には、幹細胞の収集及び／又は培養のために適した任意の生理学的に許容し得る溶液、例えば食塩水（例えば、リン酸塩緩衝食塩水、Kreb溶液、修正Kreb溶液、イーグル溶液、0.9％ NaCl、その他）、培養液（例えば、DMEM、H.DMEM、その他）その他を含むことができる。
【００６４】
胎盤幹細胞収集組成物は、胎盤幹細胞を保存する、すなわち胎盤幹細胞を死滅から妨げるか、又は収集の時から培養の時までに、胎盤幹細胞の死を遅延させ、死滅する細胞の集団における胎盤幹細胞の数を減少させ、若しくはその他の傾向がある1つ以上の成分を含むことができる。このような成分は、例えばアポトーシス阻害剤（例えば、カスパーゼ阻害剤又はJNK阻害剤）；血管拡張薬（例えば硫酸マグネシウム、降圧剤、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP）、副腎皮質刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、ニトロプルシドナトリウム、ヒドララジン、アデノシン三リン酸、アデノシン、インドメタシン又は硫酸マグネシウム、ホスホジエステラーゼ阻害剤、その他）；壊死阻害剤（例えば、2-(1H-インドール-3-イル)-3-ペンチルアミノ-マレイミド、ピロリジンジチオカルバメート又はクロナゼパム）；TNF-α阻害剤；及び／又は酸素含有パーフルオロカーボン（例えば、パーフルオロオクチルブロミド、パーフルオロデシルブロミド、その他）;であることができる。
【００６５】
胎盤幹細胞収集組成物には、1つ以上の組織分解酵素、例えばメタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、RNase若しくはDNase、又はその他を含むことができる。このような酵素には、コラゲナーゼ（例えば、コラゲナーゼI、II、III又はIV、ヒストリチクス菌(Clostridium histolyticum)由来のコラゲナーゼ、その他）；ディスパーゼ、サーモリシン、エラスターゼ、トリプシン、LIBERASE、ヒアルロニダーゼ、その他を含むが、限定されない。
【００６６】
胎盤幹細胞収集組成物には、抗生物質の殺菌的に、又は静菌的に有効な量を含むことができる。特定の非限定的な実施態様において、抗生物質には、マクロライド（例えば、トブラマイシン）、セファロスポリン（例えば、セファレキシン、セフラジン、セフロキシム、セフプロジル、セファクロル、セフィキシム又はセファドロキシル）、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ペニシリン（例えば、ペニシリンV）又はキノロン（例えば、オフロキサシン、シプロフロキサシン又はノルフロキサシン）、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、その他である。特定の実施態様において、抗生物質は、Gram（+）及び／又はグラム（-）細菌、例えば緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、その他に対して活性である。
【００６７】
また、胎盤幹細胞収集組成物は、以下の化合物の1つ以上を含むことができる：アデノシン（約1mM〜約50mM）；D-グルコース（約20mM〜約100mM）；マグネシウムイオン（約1mM〜約50mM）；一つの実施態様において、内皮統合性及び細胞生存力を維持するために十分な量で存在する20,000ダルトンよりも大きな分子量の巨大分子（例えば、約25g/l〜約100g/l又は約40g/l〜約60g/lにて存在する、デキストラン若しくはポリエチレングリコールなどの、合成又は天然に存在するコロイド、多糖体）；抗酸化剤（例えば、約25μM〜約100μMにて存在する、ブチルヒドロキシアニゾール、ブチルオキシトルエン、グルタチオン、ビタミンC又はビタミンE）；還元剤（例えば、約0.1mM〜約5mMにて存在する、N-アセチルシステイン）；細胞へのカルシウム流入を防止する薬剤（例えば、約2μM〜約25μMにて存在する、ベラパミル）；ニトログリセリン（例えば、約0.05g/L〜約0.2g/L）；一つの実施態様において、残留する血液の凝固を防止するのを補助するために十分な量において存在する抗凝固薬（例えば、約1000単位/l〜約100,000単位/lの濃度にて存在する、ヘパリン又はヒルジン）；又はアミロライド含有化合物（例えば、約1.0μM〜約5μMにて存在する、アミロライド、エチルイソプロピルアミロライド、ヘキサメチレンアミロライド、ジメチルアミロライド又はイソブチルアミロライド）。
【００６８】
（5.2.3. 胎盤の収集及び取扱）
通常、ヒト胎盤は、出生後のその娩出直後に回収される。一つの実施態様において、胎盤は、インフォームドコンセントの後に、及び患者の完全な病歴を受け取った後に患者から回収し、胎盤と関連させる。好ましくは、病歴は、分娩後も続ける。このような病歴は、胎盤又はそこから収集される幹細胞のその後の使用を連携するために使用することができる。例えば、ヒト胎盤幹細胞は、病歴を考慮して、胎盤と関連した乳児のための、又は乳児の親、同胞又はその他の親類のための個別化医療のために使用することができる。
【００６９】
胎盤幹細胞の回収の前に、臍帯血及び胎盤血が除去される。特定の実施態様において、送達後に、胎盤の臍帯血が回収される。胎盤は、従来の臍帯血回収過程に供することができる。典型的には、針又はカニューレを、重力の助けを借りて使用して、胎盤を失血させる（例えば、Anderson、米国特許第5,372,581号；Hesselら、米国特許第5,415,665号を参照されたい）。針又はカニューレを通常臍静脈に置いて、胎盤から臍帯血を抜くのを助けるために、胎盤を穏やかにマッサージすることができる。このような臍帯血回収は、商業的に、例えばLifeBank Inc., Cedar Knolls、N.J., ViaCord、Cord Blood Registry及びCryocellが行ってもよい。好ましくは、胎盤は、臍帯血回収の間に組織破壊を最小化するために、さらなる操作を伴わずに重力で抜かれる。
【００７０】
典型的には、胎盤は、例えば灌流又は組織分離による臍帯血の回収及び幹細胞の収集のために、分娩質又は出産室から別の場所、例えば研究室に輸送される。胎盤は、好ましくは、例えば胎盤を固定された近位の臍帯と共に、無菌のジップ-ロックプラスチック袋に置き、次いでこれを断熱された容器に置くことによって、無菌の、熱的に絶縁された輸送装置（胎盤の温度を20〜28℃の間に維持する）で輸送される。別の実施態様において、胎盤は、係属中の米国特許出願公報第2006/0060494号に記載されているように、実質的に臍帯血収集キットで輸送される。好ましくは、胎盤は、分娩の4〜24時間後に研究室に送達される。特定の実施態様において、近位の臍帯は、好ましくは臍帯血回収より前に、胎盤円板への挿入の4〜5cm（センチメートル）以内に固定される。その他の実施態様において、近位の臍帯は、臍帯血回収の後、しかしさらなる胎盤のプロセシングの前に、固定される。
【００７１】
胎盤は、幹細胞収集の前に、無菌条件下で、及び室温又は5〜25℃（摂氏）のいずれかの温度にて貯蔵することができる。胎盤は、任意の残留する臍帯血を除去するために胎盤を灌流する前に、48時間より長い期間の間、及び好ましくは4〜24時間の期間の間、貯蔵してもよい。胎盤は、好ましくは5〜25℃（摂氏）の温度にて抗凝血溶液中に貯蔵される。適切な抗凝血溶液は、当該技術分野において周知である。例えば、ヘパリン又はワルファリンナトリウムの溶液を使用することができる。好ましい実施態様において、抗凝血溶液には、ヘパリンの溶液（例えば、1：1000溶液において1％w/w）を含む。失血させた胎盤は、好ましくは、胎盤幹細胞を収集する前に36時間以下の間貯蔵される。
【００７２】
一旦収集され、及び一般に上記の様に調製された、哺乳動物胎盤又はその一部は、任意の技術公知の様式で処理することができ、例えば、幹細胞を得るために灌流すること、又は崩壊させること、例えば1つ以上の組織を破壊する酵素で消化することができる。
【００７３】
（5.2.4. 胎盤組織の物理的破壊及び酵素消化）
一つの実施態様において、幹細胞は、器官の物理的破壊、例えば酵素消化によって哺乳動物胎盤から収集される。例えば、胎盤又はその一部は、例えば粉砕し、剪断し、細かく切り刻み、さいの目に切り、切り刻み、消化し、又はその他をしてもよく、その一方で、本発明の幹細胞収集組成物と接触して、組織をその後に1つ以上の酵素で消化してもよい。また、胎盤又はその一部は、物理的に破壊して、1つ以上の酵素で消化し、次いで生じる材料を本発明の幹細胞収集組成物に浸漬し、又は混合してもよい。物理的破壊の任意の方法を使用することができるが、ただし破壊の方法は、例えばトリパンブルー排除によって決定すると、生存可能な前記器官における細胞の複数、より好ましくは多数及びより好ましくは少なくとも60％、70％、80％、90％、95％、98％又は99％を残すことを条件とする。
【００７４】
胎盤は、物理的破壊及び／又は酵素消化及び幹細胞回収の前に、構成要素に解体することができる。例えば、胎盤幹細胞は、羊膜、絨毛膜、臍帯、胎盤子葉又は任意のこれらの組み合わせから得ることができる。好ましくは、胎盤幹細胞は、羊膜及び絨毛膜を含む胎盤組織から得られる。典型的には、胎盤幹細胞は、胎盤組織の小さなブロック、例えば約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900又は約1000立方ミリメートルの体積である胎盤組織のブロックの破壊によって得ることができる。
【００７５】
好ましい幹細胞収集組成物は、1つ以上の組織破壊的酵素（類）を含む。酵素消化には、好ましくは酵素の組み合わせ、例えばマトリックスメタロプロテアーゼと中性プロテアーゼとの組み合わせ、例えばコラゲナーゼとディスパーゼとの組み合わせを使用する。一つの実施態様において、胎盤組織の酵素消化には、コラゲナーゼ、ディスパーゼ及びヒアルロニダーゼの組み合わせ又はLIBERASE（Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis、Ind.）及びヒアルロニダーゼの組み合わせなどのヒアルロン酸の消化のためのマトリックスメタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ及び粘液溶解薬酵素の組み合わせを使用する。胎盤組織を崩壊させるために使用することができるその他の酵素には、パパイン、デオキシリボヌクレアーゼ、トリプシン、キモトリプシン又はエラスターゼなどのセリンプロテアーゼを含む。セリンプロテアーゼは、血清中のα2ミクログロブリンによって阻害され得るので、消化のために使用される培地は、通常無血清である。EDTA及びDNaseは、一般に細胞回収の効率を上昇させるために酵素消化手順において使用される。消化剤は、酸塩が、粘稠性消化内に幹細胞をトラップすることを回避するために、好ましくは希釈される。
【００７６】
組織消化酵素の任意の組み合わせを使用することができる。組織消化酵素のための典型的な濃度には、例えばコラゲナーゼI及びコラゲナーゼIVについて50〜200 U/mL、ディスパーゼについて1〜10 U/mL及びエラスターゼについて10〜100 U/mLを含む。プロテアーゼは、組み合わせて、すなわち同じ消化反応において2つ以上プロテアーゼを使用することができ、又は胎盤幹細胞を遊離するために連続して使用することができる。例えば、一つの実施態様において、胎盤又はその一部は、最初にコラゲナーゼIの適切な量で、2mg/mlにて30分間消化し、続いて、トリプシン（0.25％）で37℃にて10分間消化する。セリンプロテアーゼは、好ましくはその他の酵素の使用に続いて連続的に使用される。
【００７７】
別の実施態様において、組織は、幹細胞収集組成物と共に幹細胞の単離の前に、キレート剤、例えばエチレングリコールビス（2-アミノエチルエーテル)-N,N,N'N'-四酢酸（EGTA）又はエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を、幹細胞を含む幹細胞収集組成物に、又は組織が破壊され、及び／若しくは消化されている溶液に添加することにより、更に破壊することができる。
【００７８】
無傷の胎盤又は胎盤の一部が胎児細胞及び母系細胞の両方を含む場合（例えば、胎盤の一部が絨毛膜又は子葉を含む場合）、収集される胎盤幹細胞には、胎児及び母系の供与源に由来する胎盤幹細胞の混合物を含むであろうことが認識されるであろう。母親細胞を全く含まないか、又はごくわずかな数を含む胎盤の一部（例えば、羊膜）の場合、収集される胎盤幹細胞は、ほぼ排他的に胎児胎盤幹細胞を含むだろう。
【００７９】
（5.2.5. 胎盤の灌流）
また、胎盤幹細胞は、哺乳動物胎盤の灌流によって得ることができる。幹細胞を得るために哺乳動物胎盤を灌流する方法は、例えばHariri、米国出願公開第2002/0123141号において、及び2005年12月29日に出願された「胎盤幹細胞を収集するため、及び器官を保存するための改善された媒体」の表題の関連した米国仮出願第60/754,969号に開示されている。
【００８０】
胎盤幹細胞は、例えば灌流溶液として幹細胞収集組成物を使用して、例えば胎盤脈管構造を介して、灌流によって収集することができる。一つの実施態様において、哺乳動物胎盤は、臍帯動脈及び臍静脈の一方又は両方を通す灌流溶液の通過によって灌流される。胎盤を通す灌流溶液の流れは、例えば胎盤内への重力流を使用して達成してもよい。好ましくは、灌流溶液は、強制的にポンプ、例えばペリスタル型ポンプを使用して胎盤を通う。臍静脈は、例えば、カニューレ、例えばTEFLON（登録商標）又は無菌の管などの無菌の接続装置に接続されているプラスチックカニューレでカニューレ処置することができる。無菌の連絡装置は、灌流マニホルドに接続される。
【００８１】
灌流に備えて、胎盤は、好ましくは臍帯動脈及び臍静脈が胎盤の最も高い位置に位置するような方法で配向される（例えば、懸濁される）。胎盤は、灌流液、例えば本発明の幹細胞収集組成物を、胎盤の脈管構造を通し、又は胎盤の脈管構造及び周囲組織を通すことによって灌流することができる。一つの実施態様において、臍帯動脈及び臍静脈は、フレキシブルコネクタを介して灌流溶液の貯蔵所に接続されているピペットに同時に接続される。灌流溶液は、臍静脈及び動脈へと通過する。灌流溶液は、胎盤の周囲組織へ血管壁から滲出し、及び／又は血管壁を通過して、妊娠の間に母の子宮に付着した胎盤の表面から適切な開放容器に収集される。また、灌流溶液は、臍帯開口部を介して導入してもよく、及び母系の子宮壁をつなぎ合わせる胎盤壁の開口部の外へ流し、又はろ過することができる。別の実施態様において、灌流溶液は、臍静脈を通して通過し、及び臍帯動脈から収集され、又は臍帯動脈を通して通過し、臍静脈から収集される。
【００８２】
一つの実施態様において、近位の臍帯は、灌流の間に固定され、及びより好ましくは、胎盤円板内の臍帯の挿入の4〜5cm（センチメートル）以内に固定される。
【００８３】
失血過程の間の哺乳動物胎盤からの灌流液の最初の収集では、一般に残留する臍帯血及び／又は胎盤血の赤血球で着色されている。灌流液は、灌流が進行するにつれて、無色になり、残留する臍帯血細胞は、胎盤から洗い流される。一般に30〜100ml（ミリリットル）の灌流液は、最初に胎盤を失血させるために適しているが、観察される結果に応じてより多く又はより少ない灌流液を使用してもよい。
【００８４】
胎盤幹細胞を収集するために使用される灌流液の体積は、収集される幹細胞の数、胎盤のサイズ、単一の胎盤からなされる収集の数、その他に応じて変更してもよい。種々の実施態様において、灌流液の体積は、50mL〜5000mL、50mL〜4000mL、50mL〜3000mL、100mL〜2000mL、250mL〜2000mL、500mL〜2000mL又は750mL〜2000mLであってもよい。典型的には、胎盤は、失血に続いて700〜800mLの灌流液で灌流される。
【００８５】
胎盤は、数時間又は数日の経過にわたって複数回灌流することができる。胎盤が複数回灌流される場合、これは、抗凝固薬（例えば、ヘパリン、ワルファリンナトリウム、クマリン、ビスヒドロキシクマリン）の有無において、及び／又は抗菌薬（例えば、γ-メルカプトエタノール（0.1mM）；ストレプトマイシン（例えば、40〜100μg/mlにて）ペニシリン（例えば、40U/mlにて）アンフォテリシンB（例えば、0.5μg/mlにて）などの抗生物質の有無において、入れ物又はその他の適切な容器において無菌条件下で維持しても、又は培養しても、及び幹細胞収集組成物若しくは標準的な灌流溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水（「PBS」）などの通常の生理食塩溶液）で灌流してもよい。一つの実施態様において、単離された胎盤は、灌流液を収集することなく、ある期間の間維持され、又は培養され、その結果、胎盤は、灌流及び灌流液の収集の前に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23若しくは24時間、又は2若しくは3日以上の間維持され、又は培養される。灌流された胎盤は、1回以上のさらなる回数、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24又はそれ以上の時間維持すること、及び例えば700〜800mLの灌流液で二度目に灌流することができる。胎盤は、1、2、3、4、5回又はそれ以上、例えば1、2、3、4、5又は6時間ごとに1回灌流することができる。好ましい実施態様において、回収された有核細胞の数が100細胞/mlを下回るまで、胎盤及び灌流溶液の収集物、例えば幹細胞収集組成物の灌流は、繰り返される。異なる時点での灌流液を個々に更に処理して、時間依存的な細胞、例えば幹細胞の集団を回収することができる。また、異なる時点からの灌流液をプールすることもできる。
【００８６】
任意の理論によって拘束されることは望まないが、失血及び胎盤の灌流の十分な時間の後、胎盤幹細胞は、本発明の方法に従って、これらが好ましくは灌流によって収集容器内に洗浄することによって収集される場合に、失血させ、及び灌流した胎盤の微小循環内に遊走すると考えられる。単離された胎盤の灌流により、残留する臍帯血を除去するためだけでなく、胎盤に酸素を含む適切な栄養素を提供するために役にも立つ。胎盤は、好ましくは、抗血液凝固剤を添加することなく、残留する臍帯血細胞を除去するために使用したのと同様の溶液で培養しても、及び灌流してもよい。
【００８７】
本発明の方法に従った灌流は、前記溶液で灌流されておらず、かつ他に幹細胞を得るための処理（例えば組織破壊、例えば酵素消化による）がなされてない哺乳動物胎盤から得られる数よりも有意に多くの胎盤幹細胞の収集を生じる。この状況において、「有意に多い」とは、少なくとも10％以上を意味する。本発明の方法に従った灌流では、例えば胎盤（又はその一部）を培養した培養液から得られる胎盤幹細胞の数よりも有意に多くの胎盤幹細胞を生じる。
【００８８】
幹細胞は、1つ以上のプロテアーゼ又はその他の組織破壊酵素を含む溶液での灌流によって胎盤から単離することができる。具体的実施態様において、胎盤又はその一部（例えば、羊膜、羊膜及び絨毛膜、胎盤小葉又は子葉、臍帯又は前述のいずれかの組み合わせ）を25〜37℃にさせて、1つ以上の組織破壊酵素と共に200mLの培養液中で30分間インキュベートさせる。灌流液からの細胞を収集して、4℃にさせて、5mM EDTA、2mMジチオスレイトール及び2mMβ-メルカプトエタノールを含む冷却阻害剤混合物で洗浄する。数分後に、幹細胞を本発明の冷却（例えば、4℃）幹細胞収集組成物で洗浄する。
【００８９】
パン（pan）法を使用する灌流、すなわち灌流液が胎盤の母側から滲出した後に収集されることにより、胎児細胞と母系細胞との混合物を生じる。その結果、この方法によって収集される細胞には：胎児起源及び母系起源の両方の胎盤幹細胞の混合集団を含む。対照的に、単に胎盤脈管構造のみを介した灌流では、灌流液が1つ又は2つの胎盤血管を通過し、単に残りの血管を介して収集されることにより、ほぼもっぱら胎児起源の胎盤幹細胞の集団の収集を生じる。
【００９０】
（5.2.6. 胎盤幹細胞の単離、ソーティング及び特徴付け）
哺乳動物胎盤からの幹細胞は、灌流又は酵素消化によって得られたかどうかにかかわらず、最初にフィコール勾配遠心分離によってその他の細胞から精製すること、すなわち単離することができる。このような遠心分離は、遠心分離速度などについて、任意の標準的なプロトコルに従うことができる。一つの実施態様において、例えば、胎盤から収集される細胞は、5000×gにて室温で15分間遠心分離によって灌流液から回収され、これにより、例えば混入する細片及び血小板から細胞を分離する。別の実施態様において、胎盤の灌流液を約200mlまで濃縮し、穏やかにフィコール上で階層化して、約1100×gで22℃にて20分間遠心分離して、細胞の低密度界面層をさらなるプロセシングのために収集する。
【００９１】
細胞ペレットは、新鮮な幹細胞収集組成物又は幹細胞維持のために適した培地、例えば2U/ml ヘパリン及び2mM EDTA（GibcoBRL、NY）を含むIMDM無血清培地に再懸濁することができる。総単核細胞分画は、例えば製造業者の推奨された手順に従ってLYMPHOPREP（商標）（Nycomed Pharma、Oslo、Norway）を使用して単離することができる。
【００９２】
本明細書に使用される、胎盤幹細胞を「単離すること」とは、幹細胞が無処置の哺乳動物胎盤において通常付随する細胞の少なくとも20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％又は99％を除去することを意味する。器官からの幹細胞は、それが、無処置の器官において幹細胞が通常付随する細胞の50％未満を含む細胞の集団に存在するときに、「単離されている」。
【００９３】
灌流又は消化によって得られた胎盤細胞は、例えば更に、又は最初に、0.2％ EDTAを含む0.05％ トリプシンの溶液（Sigma、St. Louis MO）を使用して、差動的トリプシン処理によって、例えば単離することができる。胎盤幹細胞は、典型的には約5分以内にプラスチック表面から剥離するが、その他の接着性集団は、典型的には20〜30分以上のインキュベーションが必要であるので、差動的トリプシン処理が可能である。剥離された胎盤幹細胞は、トリプシン処理及び例えばトリプシン中和溶液（TNS、Cambrex）を使用するトリプシン中和後に収集することができる。接着細胞の単離の一つの実施態様において、例えば、約5〜10×106細胞の一定分量を、それぞれのいくつかのT-75フラスコ、好ましくはフィブロネクチンコートしたT75フラスコに置く。このような実施態様において、細胞は、市販の間充織幹細胞増殖培地（MSCGM）（Cambrex）で培養して、組織培養恒温器（37℃、5％CO2）に置く。10〜15日後に、非接着細胞をPBSで洗浄することによってフラスコから除去する。次いで、PBSをMSCGMに置き換える。フラスコは、好ましくは種々の接着細胞タイプの存在について、及び特に線維芽細胞様細胞のクラスターの同定及び増殖について、毎日調べる。
【００９４】
哺乳動物胎盤から収集された細胞の数及びタイプは、例えばフローサイトメトリー、細胞選別、免疫細胞化学（例えば、組織特異的又は細胞-マーカー特異的抗体での染色）、蛍光標示式細胞分取（FACS）、磁気標示式細胞分取（MACS）などの標準的な細胞検出技術を使用して形態及び細胞表面マーカーの変化を測定することによって、光学顕微鏡観察又は共焦点顕微鏡観察を使用する細胞の形態の検査によって、並びに／又はPCR及び遺伝子発現プロファイリングなどの当該技術分野における周知技術を使用して遺伝子発現の変化を測定することによってモニターすることができる。これらの技術は、1つ以上の特定のマーカーについてポジティブである細胞を同定するためにも使用することができる。例えば、CD34に対して抗体を使用すると、上記の技術を使用して、細胞がCD34の検出可能な量を含むかどうかを決定することができ；その場合は、細胞は、CD34+である。同様に、細胞がRT-PCRによって検出可能であるのに十分なOCT-4 RNA又は成体細胞よるも有意に多くのOCT-4 RNAを産生する場合、細胞はOCT-4+である。細胞表面マーカー（例えば、CD34などのCDマーカー）及びOCT-4などの幹細胞特異的遺伝子の配列に対する抗体は、当該技術分野において周知である。
【００９５】
胎盤細胞、特にフィコール分離、差動的接着又は両方の組み合わせによって単離された細胞は、蛍光標示式細胞分取器（FACS）を使用してソートしてもよい。蛍光標示式細胞分取（FACS）は、粒子の蛍光性の特性に基づいて、細胞を含む粒子を分離するための周知の方法である（Kamarch、1987、Methods Enzymol、151：150-165）。個々の粒子における蛍光部分のレーザー励起により、小さな電荷が生じて、混合物から正及び負の粒子を電磁分離することができる。一つの実施態様において、細胞表面マーカー特異的抗体又はリガンドは、異なる蛍光標識で標識される。細胞を、細胞選別機を通して処理して、これらが使用した抗体に結合する能力に基づいて細胞を分離させる。FACSソートされた粒子は、96ウェル又は384-ウェルプレートの個々のウェルに直接沈澱させて、分離及びクローン化を促進させてもよい。
【００９６】
1つのソーティングスキームにおいて、胎盤からの幹細胞は、マーカーCD34、CD38、CD44、CD45、CD73、CD105、OCT-4及び／又はHLA-Gの発現に基づいてソートされる。これは、培養におけるこれらの接着特性に基づいて幹細胞を選択するための手順と組み合わせて達成することができる。例えば、接着選択幹は、マーカー発現に基づいて,ソーティングの前後に達成することができる。一つの実施態様において、例えば、細胞を最初にこれらのCD34の発現に基づいてソートし；CD34-細胞を保持して、CD200+HLA-G+である細胞をその他の全てのCD34-細胞から分離する。別の実施態様において、胎盤からの細胞は、これらのマーカーCD200及び／又はHLA-Gの発現に基づき；例えば、これらのマーカーのいずれかを示す細胞を更に使用するために単離する。例えばCD200及び／又はHLA-Gを発現する細胞を、具体的実施態様において、これらのCD73及び／若しくはCD105の発現、又は抗体SH2、SH3若しくはSH4によって認識されるエピトープ、又はCD34、CD38若しくはCD45の発現の欠如に基づいて更にソートすることができる。例えば、一つの実施態様において、胎盤細胞をCD200、HLA-G、CD73、CD105、CD34、CD38及びCD45の発現又はその欠如によってソートして、CD200+、HLA-G+、CD73+、CD105+、CD34-、CD38-及びCD45-である胎盤細胞を更なる使用のためにその他の胎盤細胞から単離する。
【００９７】
別の実施態様において、磁気ビーズを使用して細胞を分離することができる。細胞は、これらが磁気ビーズ（0.5〜100μM直径）に結合する能力に基づいて粒子を分離するための方法である磁気標示式細胞分取（MACS）技術を使用してソートしてもよい。特定の細胞表面分子又はハプテンを特異的に認識する抗体の共有結合性付加を含む種々の有用な修正を磁気微粒子に対して行うことができる。次いで、ビーズを細胞と混合させて結合させる。次いで、細胞を、磁場に通過させて、特異的な細胞表面マーカーを有する細胞を分離する。一つの実施態様において、これらの細胞を単離して、次いでさらなる細胞表面マーカーに対する抗体に結合された磁気ビーズと再び混合することができる。細胞を、磁場を通過させて、両抗体に結合した細胞を単離する。次いで、このような細胞を、クローン単離のためのマイクロタイターディッシュなどの分離ディッシュ内で希釈することができる。
【００９８】
また、胎盤幹細胞は、細胞形態及び増殖特性に基づいて特徴づけること、及び／又はソートすることができる。例えば、胎盤幹細胞は、例えば、培養において線維芽細胞様の外見を有するとして特徴づけること、及び／又はこれに基づいて選択することができる。また、胎盤幹細胞は、これらが胚様体様体を形成する能力を有するとして特徴づけること、及び／又はこれに基づいて選択することができる。一つの実施態様において、例えば形状が線維芽細胞様であり、CD73及びCD105を発現し、かつ培養において1つ以上の胚様体様体を産生する胎盤細胞が、その他の胎盤細胞から単離される。別の実施態様において、培養において1つ以上の胚様体様体を産生するOCT-4+胎盤細胞が、その他の胎盤細胞から単離される。
【００９９】
別の実施態様において、胎盤幹細胞は、コロニー形成単位アッセイ法によって同定すること、及び特徴づけることができる。コロニー形成単位アッセイ法は、MESENCULT（商標）培地（Stem Cell Technologies、Inc., Vancouver British Columbia）などの当該技術分野において共通に公知である。
【０１００】
胎盤幹細胞は、トリパンブルー排除アッセイ法、フルオレセイン二酢酸摂取アッセイ法、ヨウ化プロピジウム摂取アッセイ法（生存度を評価するため）；及びチミジン摂取アッセイ法、MTT細胞増殖アッセイ法（増殖を評価するため）などの当該技術分野において公知の標準的な技術を使用して生存度、増殖能及び寿命について評価することができる。寿命は、長期培養における集団倍加の最大数を決定することによってなど、当該技術分野において周知方法によって決定してもよい。
【０１０１】
また、胎盤幹細胞は、当該技術分野において公知のその他の技術、例えば所望の細胞の選択増殖（ポジティブ選択）、望まれない細胞の選択的破壊（ネガティブ選択）；例えばダイズ凝集素での混合集団における差動的細胞凝集力に基づいた分離；凍結融解法；濾過；従来の遠心分離及びゾーン遠遠心分離；遠心溶出法（カウンタ-ストリーミング遠心分離）；単位重力分離；向流分配；電気泳動法；その他を使用してその他の胎盤細胞から分離することができる。
【０１０２】
（5.3. コラーゲンバイオファブリックを使用する幹細胞培養）
本発明は、幹細胞を培養するための、特に胚性幹細胞又は胎盤幹細胞を培養するための方法を提供する。本方法は、コラーゲンバイオファブリックと共に培養液中で幹細胞を培養する工程を含む。一つの実施態様において、幹細胞は、コラーゲンバイオファブリックに対して外来性である、すなわち幹細胞は、コラーゲンバイオファブリックが由来する胎盤に由来しない。
【０１０３】
一部の実施態様において、本方法は、複数の胎盤幹細胞を含むコラーゲンバイオファブリックと共に幹細胞を培養すること；及び幹細胞の生存に適した条件下で前記幹細胞を培養すること；を含む。
【０１０４】
幹細胞は、当業者に従ってしばらく培養することができる。一部の実施態様において、幹細胞は、少なくとも1、2、5、10、15、20又は24時間以上の間コラーゲンバイオファブリック培養液中で培養される。一部の実施態様において、幹細胞は、少なくとも2、5、7、10、14、20、25又は30日以上の間培養される。一部の実施態様において、幹細胞は、約2時間〜約24時間、約2時間〜約7日、約2時間〜約14日、約2時間〜約30日、約24時間〜約2日、約24時間〜約7日、約24時間〜約14日又は約24時間〜約30日培養される。
【０１０５】
幹細胞は、当業者に周知の幹細胞の成長に適した条件下で培養することができる。幹細胞を培養するための温度は、例えば約30℃〜約40℃、約30℃〜約50℃、約35℃〜約40℃、約35℃〜約50℃、約35℃〜約40℃、約35℃〜約45℃又は約35℃〜約50℃であることができる。幹細胞を培養するための温度は、例えば約35℃、約36℃、約38℃、約39℃又は約40℃、好ましくは約37℃であることができる。培養する環境におけるCO2レベルは、例えば約3％ CO2〜約20％ CO2、約5％ CO2〜約20％ CO2、約4％ CO2〜約10％ CO2又は約5％ CO2であることができる。
【０１０６】
本発明の実施に有用な幹細胞培養のための一般的な技術は、例えば米国特許第6,387,367号及び第6,200,806号；米国特許出願公開第2006/0057718号に開示されており；また、奇形癌腫及び胚性幹細胞：実用的アプローチ（Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach）（E. J. Robertson、編、IRL Press社 1987）；マウス発生における技法に対するガイド（Guide to Techniques in Mouse Development）（P. M. Wassermanらの論文、編、Academic Press 1993）；インビトロにおける胚性幹細胞分化（Embryonic Stem Cell Differentiation in Vitro）（M. V. Wiles, Meth. Enzymol. 225:900, 1993）；胚性幹細胞の特性及び使用：ヒト生物学及び遺伝子療法に対する適用のための展望（P. D. Rathjenらの論文、Reprod. Fertil. Dev. 10:31, 1998）を参照されたい。
【０１０７】
特定の実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、該コラーゲンバイオファブリックが由来する胎盤に対して内在性の細胞を含む。このような細胞には、胎盤幹細胞、前駆細胞、多能性細胞及び多分化能細胞を含むが、限定されない。一部の実施態様において、細胞は、ヒト胎盤由来接着細胞である。
【０１０８】
特定の実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、該コラーゲンバイオファブリックが由来する胎盤に対して外来性の細胞を含む。このような細胞は、例えば本発明幹細胞と共培養される支持細胞であってもよい。一部の実施態様において、培養される幹細胞は、ヒト幹細胞であり、かつ支持細胞は、ヒト起源である。支持細胞は、例えばWO 03/02944、WO 03/014313、Parkらの論文、Biol. Reprod., 69：2007-2017、2003、Amitらの論文、Biol. Reprod., 68（6）：2150-2156、2003、Hovattalらの論文、Hum. Reprod., 18（7）：1404-1409、2003、Richardsらの論文、Nat Biotechnol., 20（9）：933-936、2002、Jamesらの論文、Science、282（6）：1145-1147、1998及びChengらの論文、Stem Cells,（21）：131-142、2003に記述されているような、初代マウス胚性線維芽細胞（PMEF）、マウス胚性線維芽細胞株化細胞（MEF）、マウス胎児線維芽細胞（MFF）、ヒト胚性線維芽細胞（HEF）、ヒト胎児筋細胞（HFM）、ヒト胎児皮膚細胞（HFS）、ヒト成体皮膚細胞、ヒト包皮線維芽細胞（HFF）、ヒト成体ファロピウス管上皮細胞（HAFT）又はヒト骨髄間質性細胞（hMSCs）を含むが、限定されない当業者に公知の任意の支持細胞であることができる。
【０１０９】
一部の実施態様において、コラーゲンバイオファブリックには、コラーゲンバイオファブリックが由来する胎盤に対して内在性及び外来性の細胞の組み合わせを含む。
【０１１０】
本発明において、コラーゲンバイオファブリックと共に培養される幹細胞は、コラーゲンバイオファブリックに対して外来性である。一部の実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、外来性幹細胞を培養することができるように全ての内在性細胞を除去するように処理される。内在性細胞の除去のための方法は、当該技術分野において周知である。例えば、内在性細胞は、中性洗剤、例えばデオキシコール酸を使用して除去することができる。別の実施態様において、内在性細胞は、幹細胞を培養する前に死滅される。細胞を死滅する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、コラーゲンバイオファブリックは、全ての残りの生存可能な内在性細胞を根絶するために、電磁気、UV、X線、γ-又はβ-放射での照射されることができる。一つの実施態様において、致死量以下の放射に対する曝露、例えば500〜1500cGyを使用して、胎盤を保存するが、望まれない細胞を根絶することができる。United States Department of Defenseからの「電離放射線の生物物理学的及び生物学的効果（Biophysical and Biological Effects of Ionizing Radiation）」の5章は、例えば、致死v.非致死電離放射線についての国際規格を提供する。
【０１１１】
幹細胞は、適切な分布様式で、並びに細胞生存及び成長を促進する培養液の存在下において、コラーゲンバイオファブリック上にまいてもよい。幹細胞は、当業者の判断に従って、いつでも、及びいかなる方法でも、コラーゲンバイオファブリック上にまくことができる。例えば、コラーゲンバイオファブリックは、細胞継代時に、又は定型的供給の一部として幹細胞培養に置いてもよい。或いは、幹細胞は、単離後に直接コラーゲンバイオファブリック上にまいてもよい。
【０１１２】
コラーゲンバイオファブリックの表面上にまかれる幹細胞又は前駆細胞の数は、変更することができるが、少なくとも1×103、3×103、1×104、3×104、1×105、3×105、1×106、3×106、1×107、3×107、1×108、3×108、1×109、3×109、1×1010、3×1010、1×1011、3×1011若しくは1×1012個の幹細胞であってもよく；又は1×103、3×103、1×104、3×104、1×105、3×105、1×106、3×106、1×107、3×107、1×108、3×108、1×109、3×109、1×1010、3×1010、1×1011、3×1011若しくは1×1012個以下の幹細胞又は前駆細胞であってもよい。
【０１１３】
本明細書の任意の培養する実施態様の別の実施態様において、幹細胞は、臍帯に、例えば臍帯膜に由来するコラーゲンに基づいた生体材料上で培養される。好ましい実施態様において、臍帯由来生体材料は、コラーゲンバイオファブリックの調製のために本明細書に開示したように、脱細胞化し、及び実質的に処理される。好ましくは、幹細胞は、臍帯生体材料の実質的に平らなシート又は小片上で培養される。
【０１１４】
（5.3.1. 培養媒体）
一旦単離されたら、幹細胞は、コラーゲンバイオファブリックと共に培養液中で培養される。培養液は、幹細胞を培養するために適した任意の培養液、例えば支持細胞を含まない条件において幹細胞を培養するために適した培養液であることができる。このような培養液は、米国特許第6,800,480号、米国出願公開代2005/0153445号に記述されたものを含むが、限定されない。具体的実施態様において、本発明に使用することができる培養液は、約500mLの蒸留水；60mLのDMEM（Gibco-BRL）；水に溶解された約40mLのMCDB201（Sigma）、pH 7.2；約2mLのFCS（Hyclone）；約1mLの10O×ITS（インスリントランスフェリンセレン；Sigma）；pen&strep；約10ng/mLのLA；ウシ血清アルブミン；約50nMのデキサメサゾン（Sigma）；約10ng/mlのPDGF（血小板由来成長因子；及び約10ng/mLのEGF（上皮細胞増殖因子）；を含む。
【０１１５】
利用される培地には、血清を含んでも、又は含まなくてもよいが、当業者であれば、細胞が血清媒介の病原体に曝露されないように、無血清培地を使用することが有利であろうことを認識する。
【０１１６】
当業者であれば、培養培地には、幹細胞が元々由来する組織に、又はこれらが分化するであろう組織に応じて、培養又は増殖を促進するための1つ以上の増殖因子を補ってもよいことを認識するであろう。例えば、胚性幹細胞について、エキソビボでの増殖因子には、以下の1つ以上を含んでいてもよい：FGFβ、Wnt-3a、コラーゲン、フィブロネクチン及びラミニン。間充織幹細胞について、例えば、エキソビボでの増殖因子には、FGFβ、EGF、PDGF及びフィブロネクチンの1つ以上を含んでいてもよい。造血幹細胞について、エキソビボでの増殖因子には、IL-3、IL-6、SCF、Flt-3/Flk-2、Tpo、Shh、Wnt-3a及びKirreの1つ以上を含んでいてもよい。神経幹細胞について、エキソビボでの増殖因子には、FGFβ、EGF、フィブロネクチン及びシスタチンCを含んでいてもよい。
【０１１７】
一部の実施態様において、条件培地は、幹細胞を培養するためのコラーゲンバイオファブリックと共に使用される。本明細書に使用される条件培地は、支持細胞がすでにしばらくの間培養された培地をいう。
【０１１８】
当業者であれば、培養する（幹細胞を培養する、増殖させる、又は分化させる）目的、幹細胞が由来する供与源、幹細胞が分化するように誘導することができる細胞のタイプ、培養に使用されるコラーゲンバイオファブリック、及び幹細胞以外の細胞の有無に応じて、異なる培養培地を使用することができることを理解するであろう。
【０１１９】
（5.4. コラーゲンバイオファブリックを使用する幹細胞の増殖）
本発明は、培養液中でにコラーゲンバイオファブリック幹細胞又は幹細胞の集団を増殖するための方法であって、幹細胞又は幹細胞の集団を、前記幹細胞又は幹細胞の集団が増殖することができる条件下で培養することを含む、前記方法を提供する。
【０１２０】
幹細胞又は幹細胞の集団は、当業者に従って、適切な条件下及び時間培養することができる。一部の実施態様において、幹細胞は、24時間以上の間コラーゲンバイオファブリックと共に培養液中で培養される。一部の実施態様において、幹細胞は、2日以上の間培養される。一部の実施態様において、幹細胞は、7日以上の間培養される。一部の実施態様において、幹細胞は、10日以上の間培養される。一部の実施態様において、幹細胞は、14日以上の間培養される。一部の実施態様において、幹細胞は、30日以上の間培養される。
【０１２１】
一部の実施態様において、単一幹細胞、又は約、又は少なくとも、又は多くとも10、20、50、100、200、500、1×103、5×103,l×104若しくは5×1O4個の幹細胞が、コラーゲンバイオファブリックと共に培養液中で増殖される。その他の実施態様において、幹細胞は、本発明及び幹細胞の数の方法に従って培養され、及び増殖され、かつ幹細胞の数は、元々の培養される幹細胞と比較して2、5、10、20、50、100、200、500、1×103、5×103,l×104、又は5×104倍増加する。その他の実施態様において、培養における幹細胞の数は、約又は少なくとも1×106、5×106,l×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011若しくは1×1012個の幹細胞まで増加され；又は1×106、5×106、1×107、5×107 1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011又は1×1012個以下の幹細胞であってもよい。
【０１２２】
（5.5. コラーゲンバイオファブリックを使用する幹細胞の分化）
本発明は、幹細胞の分化のために十分な時間コラーゲンバイオファブリックと共に培養液中で幹細胞を培養することを含む、幹細胞を分化させるための方法を提供する。本発明は、幹細胞を、間充織、造血性、脂肪生成、肝性、神経原性、神経膠腫生成、軟骨形成性、血管原性、筋原性、膵臓原性、軟骨形成性又は骨原性の系統を含むが、限定されない、特定の細胞系統に分化する方法を包含する。
【０１２３】
当業者であれば、幹細胞の分化のために十分な時間は、培養される幹細胞のタイプ及び幹細胞が分化される細胞タイプに応じて、変化させてもよいことを理解するであろう。一部の実施態様において、幹細胞は、少なくとも、又は約、又は多くとも2、5、10、15、20若しくは24時間以上コラーゲンバイオファブリックと共に培養液中で培養される。一部の実施態様において、幹細胞は、少なくとも、又は約、又は多くとも1、2、5、7、10、14、20、25若しくは30日以上培養される。一部の実施態様において、幹細胞は、約2時間〜約24時間、約2時間〜約7日、約2時間〜約14日、約2時間〜約30日、約24時間〜約2日、約24時間〜約7日、約24時間〜約14日又は約24時間〜約30日培養される。
【０１２４】
特定の実施態様において、本方法は、幹細胞を、所望の分化を促進する1つ以上の薬剤と接触させることを更に含む。例えば、薬剤は、表現型の変化を誘導しても、若しくは助長しても、特定の表現型で細胞増殖を促進しても、又はその他の増殖を遅らせても、又は未知のメカニズムを介してその他の薬剤と協調して作用してもよい。このような薬剤は、米国出願公開第2003/0235909号、第2004/0028660号（小分子）、米国特許第6,335,195号（アンジオテンシノーゲン及びアンジオテンシンの存在下における造血幹細胞及び間充織幹細胞）、米国特許第6,022,743号（膵臓実質細胞-3次元培養）、米国特許第6,613,568号（造血系統）に開示されたものなどの、小分子又はサイトカインであることができる。
【０１２５】
幹細胞は、例えば米国出願公開第2005/015344号及び2005/0158855号（一般的）、米国特許第6,833,269号及び第6,887,706号及び米国出願公開第2005/0095706号（神経性細胞）、米国出願公開第2005/0170502号（肝臓系統）、Kehatの論文、2003, Methods in Enzymology 365:465-473、米国出願公開第2005/0191744号及び第2005/0214939号（心臓細胞））及びAssadyらの論文、2001, Diabetes, 50:1691-97（膵細胞）に記述されたものなどの、幹細胞の分化のために適した任意の培地又は条件において分化させることができる。
【０１２６】
本発明の方法に従って得られた幹細胞の分化状態の評価は、特定の細胞表面マーカーの有無によって同定してもよい。胎盤幹細胞は、例えばマーカーOCT-4及びABC-p又は異なる哺乳動物種におけるその同等物によって同定してもよい。また、胎盤幹細胞は、マーカーCD73若しくはCD105の存在、及び／又はマーカーCD34、CD38若しくはCD45の非存在、又は異なる哺乳動物種におけるその均等物によって同定することもできる。特定の実施態様において、胎盤幹細胞は、SSEA3及び／又はSSEA4についてポジティブである。特定のその他の実施態様において、胎盤幹細胞は、SSEA3及び／又はSSEA4についてネガティブである。このような細胞表面マーカーの有無は、当該技術分野において周知方法に従って、例えばフローサイトメトリーによってルーチンで決定することができる。例えば、CD34又はCD38の存在を決定するためには、細胞をPBS中で洗浄し、次いで抗CD34フィコエリトリン及び抗CD38フルオレッセインイソチオシアネート（Becton Dickinson、Mountain View, Calif）で二重染色してもよい。
【０１２７】
別の実施態様において、分化した幹細胞は、MESENCULT（商標）（Stem Cell Technologies, Inc., Vancouver British Columbia）などの一般に当該技術分野において公知であるコロニー形成単位アッセイ法によって同定し、及び特徴づけられる。
【０１２８】
幹細胞が特定の細胞タイプに分化したことの決定は、当該技術分野において周知の方法によって、例えばフローサイトメトリー又は免疫細胞化学（例えば、組織特異的又は細胞-マーカー特異的抗体で細胞を染色すること）などの技術を使用して形態及び細胞表面マーカーの変化を測定すること、光学顕微鏡観察若しくは共焦点顕微鏡観察を使用する細胞の形態の検査によって、又はPCR及び遺伝子-発現プロファイリングなどの当該技術分野において周知技術を使用して遺伝子発現の変化を測定することによって達成することができる。
【０１２９】
特定の実施態様において、分化細胞は、差動的に発現される遺伝子を特徴づけることによって、例えば関心対象の未分化幹細胞又は前駆細胞からの複数の遺伝子の発現レベルを、そのタイプの前駆細胞に由来する分化細胞における前記複数の遺伝子の発現レベルと比較することによって同定してもよい。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）又は転写に基づいた増幅方法（例えば、インビトロ転写（IVT））などの核酸増幅方法を使用して、例えばポリヌクレオチドマイクロアレイを使用することによって細胞の異なる集団における遺伝子発現のプロフィールを得てもよい。差次的遺伝子発現のプロフィールを得るためのこのような方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Wielandらの論文、1990、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87：2720-2724；Lisitsynらの論文、1993、Science 259：946-951；Lisitsynらの論文、1995、Meth. Enzymol.254：291-304の；米国特許第5,436,142号；米国特許第5,501,964号；Lisitsynらの論文、1994、Nature Genetics 6：57-63；Hubank及びSchatzの論文、1994、Nucleic Acids Res. 22：5640-5648；Zengらの論文、1994、Nucleic Acids Research 22：4381-4385；米国特許第5,525,471号；Linsleyら、米国特許第6,271,002号；Van Gelderら、米国特許第5,716,785号；Stofletらの論文、1988、Science 239：491-494；Sarkar及びSommerの論文、1989、Science 244：331-334；Mullisら、米国特許番号4,683,195；Malekら、米国特許第5,130,238号；Kacian及びFultz、米国特許第5,399,491号；Burgら、米国特許第5,437,990号；van Gelderらの論文、1990、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87：1663；Lockhartらの論文、1996、 Nature Biotechnol 14：1675；Shannon、米国特許第6,132,997号；Lindemannら、米国米国特許第6,235,503号を参照されたい。
【０１３０】
（5.5.1. 神経細胞への分化）
一つの態様において、本発明は、幹細胞の神経細胞への分化のための方法であって、幹細胞の神経細胞への分化を促進する条件下で、コラーゲンバイオファブリック上で幹細胞を培養することを含む、前記方法を包含する。特定の実施態様において、本方法は、幹細胞を、幹細胞の神経細胞への分化を促進する1つ以上の薬剤で接触させる工程を含む。例示的な薬剤には、βメルカプトエタノール（Woodburyらの論文、J. Neurosci. Res., 61:364-370）又はブチルヒドロキシアニゾールを含むが、限定されない。一部の実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、1つ以上の薬剤を含む。当該技術分野において公知の神経の分化のために適した任意の培養液を細胞培養に使用してもよい。例えば、分化は、分化が観察されるまで、2％のDMSO及び200μMブチルヒドロキシアニゾールを含むDMEM培地中で幹細胞を培養することによって誘導することができる。
【０１３１】
幹細胞が神経細胞タイプに分化されたことの評価及び決定は、当該技術分野において公知の任意の方法によって達成してもよい。例えば、RT／PCRを使用して、例えば神経成長因子受容体及び神経フィラメント重鎖遺伝子の発現を評価してもよい。一部の実施態様において、神経細胞は、神経成長因子受容体の産生；神経成長因子をコードする遺伝子の発現；神経フィラメント重鎖の産生；又は神経フィラメント重鎖をコードする遺伝子の発現；を示す。
【０１３２】
（5.5.2. 脂肪細胞への分化）
別の態様において、本発明は、幹細胞を脂肪細胞へ分化させる方法であって、幹細胞の脂肪細胞への分化を促進する条件下で、コラーゲンバイオファブリック上で幹細胞を培養することを含む、前記方法を包含する。一部の実施態様において、脂肪細胞は、脂肪親和性染色によって検出可能な細胞質内脂肪小胞の産生；リパーゼをコードする遺伝子の発現；又はリパーゼの産生；を示す。特定の実施態様において、分化は、幹細胞を、コラーゲンバイオファブリック及び幹細胞の脂肪細胞への分化を促進する1つ以上の薬剤と接触させることを含む。例示的薬剤は、デキサメサゾン、インドメタシン、インスリン、及び3-イソブチル-1-メチルキサンチンである。一部の実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、1つ以上の薬剤を含む。
【０１３３】
当該技術分野において公知の脂肪細胞分化のために適した任意の培養液を細胞培養に使用してもよい。例えば、1μMデキサメサゾン、0.2mMインドメタシン、0.01mg/mlインスリン、0.5mM IBMX、DMEM-高グルコース、FBS、及び抗生物質を含む脂肪生成維持培地（Bio Whittaker）を、分化を誘導するために使用してもよい。
【０１３４】
幹細胞が脂肪細胞タイプに分化されたことの決定は、当該技術分野において公知の方法によって達成してもよい。例えば、脂肪生成を、脂肪親和性染色油red Oを使用して容易に観察することができる複数の細胞質内の脂肪小胞の発症によって評価してもよい。また、分化は、例えばRT-PCRを使用して、リパーゼ及び脂肪酸結合タンパク質遺伝子の発現を検出することによっても確立することができる。
【０１３５】
（5.5.3. 軟骨細胞への分化）
別の態様において、本発明は、幹細胞を軟骨細胞に分化させる方法であって、幹細胞の軟骨細胞への分化を促進する条件下で、コラーゲンバイオファブリック上で幹細胞を培養することを含む、前記方法を包含する。一部の実施態様において、軟骨細胞は、軟骨細胞の細胞形態特徴；コラーゲン2の産生；コラーゲン2をコードする遺伝子の発現、コラーゲン9の産生；又はコラーゲン9をコードする遺伝子の発現；を示す。特定の実施態様において、分化は、幹細胞を、コラーゲンバイオファブリック単独及び幹細胞の軟骨細胞への分化を促進する1つ以上の薬剤と接触させることを含む。例示的薬剤は、トランスフォーミング増殖因子β-3である。一部の実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、1つ以上の薬剤を含む。
【０１３６】
当該技術分野において公知の軟骨細胞分化のために適した任意の培養液を細胞培養に使用してもよい。例えば、0.01μg/ml TGFβ-3を含む完全軟骨形成培地（Bio Whittaker）を、分化を誘導するために使用してもよい。
【０１３７】
幹細胞が軟骨細胞タイプに分化されたことの決定は、当該技術分野において公知の方法によって達成してもよい。例えば、軟骨形成は、好酸球基質の産生の観察、軟骨細胞細胞形態の発生、並びに／又は例えばRT-PCRを使用してコラーゲン2及びコラーゲン9遺伝子発現の検出によって、確立してもよい。
【０１３８】
（5.5.4. 骨細胞への分化）
別の態様において、本発明は、幹細胞を骨細胞に分化させる方法であって、幹細胞の骨細胞への分化を促進する条件下で、コラーゲンバイオファブリック上で幹細胞を培養することを含む、前記方法を包含する。一部の実施態様において、骨細胞は、骨細胞のカルシウムレベル特徴；アルカリホスファターゼの産生；アルカリホスファターゼをコードする遺伝子の発現；オステオポンチンの産生；又はオステオポンチンをコードする遺伝子の発現；を示す。特定の実施態様において、分化は、幹細胞を、コラーゲンバイオファブリック及び当該技術分野において公知の幹細胞の骨細胞への分化を促進する1つ以上の薬剤と接触させることを含む。例示的薬剤は、デキサメサゾン、アスコルビン酸-2-ホスフェート、及びグリセロリン酸である。一部の実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、1つ以上の薬剤を含む。
【０１３９】
当該技術分野において公知の骨細胞分化のために適した任意の培養液を細胞培養に使用してもよい。例えば、0.1μMデキサメサゾン、0.05mMアスコルビン酸-2-ホスフェート及び10mMβグリセロリン酸を含む骨形成誘導培地（Bio Whittaker）を、分化を誘導するために使用してもよい。
【０１４０】
幹細胞が骨細胞に分化されたことの決定は、当該技術分野において公知の方法によって達成してもよい。例えば、分化は、カルシウム特異的染色及びアルカリホスファターゼの検出及び／又は例えばRT-PCRを使用するオステオポンチン遺伝子発現を使用して明示することができる。
【０１４１】
（5.5.5. 肝細胞への分化）
別の態様において、本発明は、幹細胞を肝細胞に分化させる方法であって、幹細胞の肝細胞への分化を促進する条件下で、コラーゲンバイオファブリック上で幹細胞を培養することを含む、前記方法を包含する。一部の実施態様において、肝細胞は、肝細胞特異的な遺伝子の発現又は肝細胞特異的なタンパク質の産生を示す。このような遺伝子及びタンパク質は、当該技術分野において公知であり、米国出願公開第2005/0170502号に記載されているような、アルブミン、プレアルブミン、グルコース-6-ホスファターゼ、α1-アンチトリプシン、その他であることができる。
【０１４２】
分化は、幹細胞を、コラーゲンバイオファブリック及び幹細胞の肝細胞への分化を促進する1つ以上の薬剤と接触させることを含むことができる。例えば、肝細胞増殖因子及び／又は上皮細胞増殖因子。一部の実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、1つ以上の薬剤を含む。当該技術分野において公知の肝細胞分化のために適した任意の培養液を細胞培養に使用してもよい。例えば、肝細胞増殖因子、20ng/ml；及び上皮細胞増殖因子、100ng/mlを補った20％CBS含有DMEM培地を、分化を誘導するために使用してもよい。ノックアウト血清交換（KnockOut Serum Replacement）をFBSの代わりに使用してもよい。
【０１４３】
肝細胞への分化は、アルブミン、プレアルブミン、グルコース-6-ホスファターゼ、α1-アンチトリプシンの産生又はこれらをコードする遺伝子の発現の検出によって明示してもよい。
【０１４４】
（5.5.6. 膵細胞への分化）
別の態様において、本発明は、幹細胞を膵細胞に分化させる方法であって、幹細胞の膵細胞への分化を促進する条件下で、コラーゲンバイオファブリック上で幹細胞を培養することを含む、前記方法を包含する。一部の実施態様において、膵細胞は、インスリンの産生又はインスリンをコードする遺伝子の発現を示す。
【０１４５】
分化は、幹細胞を、コラーゲンバイオファブリック及び当該技術分野において公知の幹細胞の膵細胞への分化を促進する1つ以上の薬剤と接触させることを含むことができる。例示的薬剤は、塩基性線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β-1、及びネスチン-ポジティブニューロン細胞による条件培地である。一部の実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、1つ以上の薬剤を含む。当該技術分野において公知の膵臓の細胞分化のために適した任意の培養液を細胞培養に使用してもよい。例えば、DMEM培地と混合したネスチン-ポジティブニューロン細胞培養からの条件培地を使用してもよい。
【０１４６】
幹細胞が膵細胞に分化されたことの決定は、当該技術分野において公知の方法によって達成してもよい。例えば、分化は、インスリンの産生の、又は例えばRT-PCRを使用するインスリン遺伝子発現の検出によって明示することができる。
【０１４７】
（5.5.7. 心臓細胞への分化）
別の実施態様において、本発明は、幹細胞を心臓細胞に分化させる方法であって、幹細胞の心臓細胞への分化を促進する条件下で、コラーゲンバイオファブリック上で幹細胞を培養することを含む、前記方法を包含する。一部の実施態様において、心臓細胞は、拍動；心臓アクチンの産生；又は心臓アクチンをコードする遺伝子の発現；を示す。
【０１４８】
分化は、幹細胞を、幹細胞の心臓細胞への分化を促進する1つ以上の薬剤と接触させることを含むことができる。例示的薬剤は、レチノイン酸、塩基性線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子又はカルジオトロピン（cardiotropin）を含む。一部の実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、1つ以上の薬剤を含む。
【０１４９】
当該技術分野において公知の心臓細胞分化のために適した任意の培養液を細胞培養に使用してもよい。例えば、レチノイン酸、1μM；塩基性線維芽細胞増殖因子、10ng/ml；及びトランスフォーミング増殖因子β-1、2ng/ml；及び上皮細胞増殖因子、100ng/mlを補った20％CBS含有DMEM培地を培養に使用してもよい。ノックアウト血清交換（KnockOut Serum Replacement）（Invitrogen、Carlsbad、California）をCBSの代わりに使用してもよい。或いは、50ng/ml カルジオトロピン-1を補った20％CBSを伴うDMEM培地を使用してもよい。その上、幹細胞は、無タンパク質培地において5〜7日間維持し、次いでヒト心筋抽出物で刺激してもよい（用量を増大して解析）。心筋抽出物は、1gmヒト心筋を、1％臍帯血清を補った1％HEPES緩衝液中でホモジナイズすることによって作製される。懸濁液を60分間インキュベートし、次いで遠心分離して、上清を収集する。
【０１５０】
幹細胞が心臓細胞型に分化されたことの決定は、当該技術分野において公知の方法によって達成してもよい。例えば、分化は、例えば拍動、心臓アクチンの産生又は心臓アクチンをコードする遺伝子の発現によって明示される。
【０１５１】
（5.6. コラーゲンバイオファブリック）
本発明は、コラーゲンバイオファブリックを使用して、幹細胞を培養し、増殖し、又は分化する方法を提供する。任意の理論によって限定されることは意図しないが、コラーゲンバイオファブリックは、培養において細胞付着のための基層及び幹細胞増殖のために適した成長因子を提供すると考えられる。
【０１５２】
コラーゲンバイオファブリックは、乾燥形態若しくは天然形態で（すなわち、胎盤から切開されたもの）、及び／又は脱細胞化され、若しくは非脱細胞化された形態で使用することができる。
【０１５３】
一部の実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、該コラーゲンバイオファブリックが由来する胎盤に対して内在性の細胞を含む。その他の実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、該コラーゲンバイオファブリックが由来する胎盤に対して外来性の細胞を含む。一部の実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、該コラーゲンバイオファブリックが由来する胎盤に対して外来性の細胞及び内在性の細胞を含む。
【０１５４】
（5.6.1. 記述）
本発明に使用されるコラーゲンバイオファブリックは、任意の哺乳類、例えばウマ、ウシ、ブタ又は狭鼻猿類供与源の羊膜、柔毛膜又は両方に由来してもよいが、最も好ましくはヒト胎盤に由来する。好ましい実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、実質的乾燥している、すなわち重量の20％以下の水分である。別の好ましい実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、プロテアーゼ処理されていない。別の好ましい実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、コラーゲン、及び人工的に架橋された、例えば化学的に架橋されたその他の構造タンパク質を含まない、すなわち、好ましいコラーゲンバイオファブリックは、固定されない。好ましいコラーゲンバイオファブリックは、Hariri、米国出願公開U.S.2004/0048796（これは、その全体が本明細書によって組み込まれる）に記述された乾燥され、非固定された、プロテアーゼ処理されていない羊膜材料であり、これは、その中に、及び本明細書に（実施例1、2を参照されたい）記述された方法によって作製される。しかし、本発明の方法には、任意の手順によって作製された任意の胎盤コラーゲン材料を利用することができる。
【０１５５】
好ましい実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、半透明である。その他の実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、不透明にされ、又は着色若しくは染色され、例えば医学的に許容し得る浸染剤若しくは着色剤を使用して永久に着色若しくは染色される；このような薬剤は、コラーゲンバイオファブリックに吸着されてもよく、又はコラーゲンバイオファブリックは、このような薬剤を含浸させても、又は被覆されていてもよい。本実施例において、任意の公知の非毒性、非刺激性の着色剤又は色素を使用してもよい。
【０１５６】
コラーゲンバイオファブリックが実質的に乾燥のときに、これは、約0.1g/cm2〜約0.6g/cm2である。具体的実施態様において、コラーゲンバイオファブリックの単層は、少なくとも2ミクロンの厚さである。別の特定の実施態様において、鼓膜を修復するために使用されるコラーゲンバイオファブリックの単層は、およそ10〜40ミクロンの厚さであるが、乾燥状態においておよそ2〜150、2〜100ミクロン、5〜75ミクロン又は7〜60ミクロンの厚さであってもよい。
【０１５７】
一つの実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、主にコラーゲン（I型、III型及びIV型；バイオファブリックのマトリックスの約90％）、フィブリン、フィブロネクチン、エラスチンで構成され、並びに更にグリコサミノグリカン及びプロテオグリカンを含む。その他の実施態様において、バイオファブリックの非構造成分には、例えば成長因子、例えば血小板由来成長因子（PDGF）、血管内皮成長因子（VEGF）、線維芽細胞増殖因子（FGF）及びトランスフォーミング増殖因子-βlを含んでいてもよい。従って、コラーゲンバイオファブリックの組成物は、理想的には、線維芽細胞及びマクロファージの遊走を促進するために、及び従って創傷治癒の促進に適する。
【０１５８】
コラーゲンバイオファブリックは、例えば単層シート又は非積層膜として単層形式で使用してもよい。或いは、コラーゲンバイオファブリックは、例えば二層又は複数層形式で使用してもよく、コラーゲンバイオファブリックは、積層されてもよい。積層は、治癒過程の間により大きな剛性及び耐久性を提供することができる。コラーゲンバイオファブリックは、例えば後述するように積層されてもよい。
【０１５９】
コラーゲンバイオファブリックは、非胎盤供与源からのコラーゲンを更に含んでいてもよい。例えば、コラーゲンバイオファブリックの1つ以上の層は、精製された抽出コラーゲンで被覆されていても、若しくは含浸させても、又は層化されてもよい。このようなコラーゲンは、例えば市販の供与源から得られてもよく、又は米国特許第4,420,339号、第5,814,328号及び第5,436,135号に開示したものなどの公知の方法に従って生産してもよい。
【０１６０】
コラーゲンバイオファブリックは、該コラーゲンバイオファブリックに由来する胎盤に対して内在性の細胞を含んでいてもよい。コラーゲンバイオファブリックは、該コラーゲンバイオファブリックに由来する胎盤に対して外来性の細胞をまた含んでいてもよい。一部の実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、該コラーゲンバイオファブリックに由来する胎盤に対して外来性の細胞及び内在性の細胞を含んでいてもよい。
【０１６１】
コラーゲンバイオファブリックは、コラーゲンバイオファブリックが由来する胎盤材料に存在しない1つ以上の化合物又は物質を含んでいてもよい。例えば、コラーゲンバイオファブリックには、生物活性化合物を含浸させてもよい。このような生物活性化合物には、小有機分子（例えば、薬物）、抗生物質（例えば、クリンダマイシン、ミノサイクリン、ドキシサイクリン、ゲンタマイシン）、ホルモン、成長因子、抗腫瘍薬、抗真菌薬、抗ウイルス薬、疼痛薬、抗ヒスタミン剤、抗炎症薬、銀（硝酸銀及びスルファジアジン銀を含むが、限定されない銀塩など）を含むが、限定されない抗感染薬、元素銀(elemental silver)、抗生物質、殺菌性酵素（リゾチームなど）、創傷治癒薬（PDGF、TGFを含むが限定されないサイトカインなど；チモシン）、創傷治癒薬としてのヒアルロン酸、創傷シーラント（トロンビンを伴う、又は伴わないフィブリンなど）、細胞誘引剤及び足場試薬（フィブロネクチンの添加など）、その他を含むが、限定されない。具体例において、コラーゲンバイオファブリックには、少なくとも1つの成長因子、例えば線維芽細胞増殖因子、上皮成長因子、その他を含浸させてもよい。また、バイオファブリックは、特定の生化学的プロセスの特異的な阻害剤、例えば膜受容体阻害剤、キナーゼ阻害剤、成長抑制物質、抗癌薬、抗生物質、その他などの小有機分子を含浸させてもよい。コラーゲンバイオファブリックを生物活性化合物に含浸させるには、例えばコラーゲンバイオファブリックが溶液を吸収し、及び溶液で平衡化させるのみ十分な時間コラーゲンバイオファブリックを所望の濃度の生物活性化合物の溶液中に浸漬することによって；バイオファブリックに溶液を噴霧することによって；バイオファブリックを溶液で湿らせることによって、その他で達成しても良い。
【０１６２】
その他の実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、ヒドロゲルと組み合わせてもよい。当業者に公知の任意のヒドロゲル組成物、例えば以下の総説に開示された任意のヒドロゲル組成物：Grahamの論文、1998, Med. Device Technol. 9(1): 18-22; Peppasらの論文、2000, Eur. J. Pharm. Biopharm. 50(1): 27- 46; Nguyenらの論文、2002, Biomaterials, 23(22): 4307-14; Heninclらの論文、2002, Adv. Drug Deliv. Rev 54(1): 13-36; Skelhorneらの論文、2002, Med. Device. Technol. 13(9): 19-23; Schmedlenらの論文、2002, Biomaterials 23: 4325-32;（これらの全ては、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる）が、本発明の範囲内に包含される。具体的実施態様において、ヒドロゲル組成物は、コラーゲンバイオファブリック上に適用され、すなわちコラーゲンバイオファブリックの表面上に配置される。ヒドロゲル組成物は、例えばコラーゲンバイオファブリック上に吹き付けても、若しくはコラーゲンバイオファブリックの表面上に被覆してもよく、又はバイオファブリックは、ヒドロゲル組成物を浸漬しても、浸しても、又は飽和してもよい。別の特定の実施態様において、ヒドロゲルは、コラーゲンバイオファブリックの2つ以上の層の間に挟まれている。より具体的実施態様において、ヒドロゲルは、コラーゲンバイオファブリックの2つ以上の層の間に挟まれており、バイオファブリックの2つの層の縁は、ヒドロゲルを実質的に、又は完全に含むように封止される。
【０１６３】
本発明の方法及び組成物に有用なヒドロゲルは、ポリビニルアルコール（PVA）、ポリメタクリル酸ヒドロキシエチル、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ヒアルロン酸、アルギナート、コラーゲン、ゼラチン、デキストラン又はこれらの誘導体及び類似体を含むが限定されない、当該技術分野において公知の任意の水相互作用的又は水溶性の重合体から作製することができる。
【０１６４】
具体的実施態様において、コラーゲンバイオファブリックには、ヒアルロン酸を含む。ヒアルロン酸は、例えば水又は生理的に許容し得る緩衝液又は培養液中の溶液として、例えば10mg/mLの溶液として、例えばコラーゲンバイオファブリックに適用すること、又は添加することができる。ヒアルロン酸は、好ましくは液体環境におけるヒアルロン酸の溶解度を減少させ、又は妨げるように十分に架橋される。好ましい実施態様において、ヒアルロン酸は、コラーゲンバイオファブリックに対して架橋される。ヒアルロン酸を架橋するための、又はコラーゲンバイオファブリックにヒアルロン酸を架橋するための架橋剤は、任意の架橋剤であることができるが、例えば1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル（BDDE）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド（EDCI）、ジビニルスルホン、エピクロロヒドリン、グルタルアルデヒド、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）又はその他であることができる。コラーゲンバイオファブリック及びヒアルロン酸の組み合わせは、任意に乾燥させ、例えば気乾させ、凍結乾燥させ、又は同様にすることができる。特定の実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、例えばヒアルロン酸の添加の前に、及び間にコラーゲンバイオファブリックを端に保持するフレーム又は保持具内に置かれる。
【０１６５】
また、本発明は、例えば幹細胞又は幹細胞の集団、例えば接着CD34-胎盤幹細胞の培養のために使用されるヒアルロン酸を含むコラーゲンバイオファブリックを製造する方法であって、少なくとも一部のコラーゲンバイオファブリックをヒアルロン酸溶液と接触させること、ヒアルロン酸をコラーゲンバイオファブリックに架橋すること、及び生じるコラーゲンバイオファブリックを乾燥させることを含む、前記製造方法を提供する。本方法の一つの実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、実質的に乾燥しており、例えば、ヒアルロン酸溶液と接触すること時に20％以下の水分を含む。本方法の別の特定の実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、ヒアルロン酸溶液と接触させる前に脱細胞化される。別の実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、外観上はシート様である。本方法の別の特定の実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、ヒアルロン酸溶液と接触させる前に脱細胞化されない。好ましくは、コラーゲンバイオファブリックは、例えば、ヒアルロン酸溶液と接触する時に、接触の間にコラーゲンバイオファブリックのカールの量を減少させ、又はカールを防ぐために、フレームの1つ以上の側に保持される。特定の実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、四角又は矩形のシートであり、かつヒアルロン酸溶液と接触する間にコラーゲンバイオファブリックの全ての4つの縁に接触する4つの面のフレームに保持される。
【０１６６】
上記の組成物及び方法実施態様について、ヒアルロン酸溶液は、接触するコラーゲンバイオファブリックの部分の表面に対してヒアルロン酸の均一に分布させることができる任意のヒアルロン酸溶液であることができる。例えば、ヒアルロン酸溶液には、1ミリリットルの溶液あたり少なくとも、約、又は多くとも0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95又は100mgのヒアルロン酸を含むことができる。
【０１６７】
一部の実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、1つ以上の生物活性化合物を含み、かつヒドロゲルと組み合わせられる。例えば、コラーゲンバイオファブリックには、ヒドロゲルと組み合わせる前に、1つ以上の生物活性化合物を含浸させることができる。その他の実施態様において、ヒドロゲル組成物には、本発明のコラーゲンバイオファブリック、例えば以下の節に記述した生物活性化合物と共に組み合わせる前に、又は後に、更に1つ以上の生物活性化合物を含浸させる。
【０１６８】
（5.6.2. 生物活性化合物）
本発明の方法に使用されるコラーゲンバイオファブリックは、1つ以上の生物活性化合物を含んでいてもよい（例えば、1つ以上の生物活性化合物を含浸させ、又は被覆される）。本明細書に使用される「生物活性化合物」という用語は、インビトロで、又はインビボで1つ以上の生物系に対して測定可能な効果を生じさせる任意の化合物又は分子を意味する。生物活性化合物の例には、小有機分子（例えば、薬物）、抗生物質、抗ウイルス薬、抗菌薬、抗炎症薬、抗増殖薬剤、サイトカイン、酵素又はタンパク質阻害剤、抗ヒスタミン剤、その他を含むが、限定されない。種々の実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、抗生物質（例えば、クリンダマイシン、ミノサイクリン、ドキシサイクリン、ゲンタマイシン）、ホルモン、成長因子、抗腫瘍薬、抗真菌薬、抗ウイルス薬、疼痛薬（キシロカイン（XYLOCAINE）（登録商標）、リドカイン、プロカイン、ノボカイン、その他を含む）、抗ヒスタミン剤（例えば、ジフェンヒドラミン、ベナドリール（BENADRYL）（登録商標）、その他）、抗炎症薬、銀（硝酸銀及びスルファジアジン銀を含むが、限定されない銀塩など）を含むが、限定されない抗感染薬、元素銀(elemental silver)、抗生物質、殺菌性酵素（リソゾーム（lysozome）など）、創傷治癒薬（PDGF（例えば、レグラネクス（REGRANEX）（登録商標）、TGFを含むが、限定されないサイトカイン；チモシンなど）、創傷治癒薬としてのヒアルロン酸、創傷シーラント（トロンビンを伴う、又は伴わないフィブリンなど）、細胞誘引剤及び足場試薬（フィブロネクチンの添加など）、その他、又は前述の、若しくは前述及び収載されないその他の化合物の任意の組み合わせで被覆されていても、又は含浸させてもよい。このような含浸又はコーティングは、当該技術分野において公知の任意の手段によって達成してもよく、コラーゲンバイオファブリックの一部又は全体を被覆してもよく、又は含浸させてもよい。
【０１６９】
コラーゲンバイオファブリック又はコラーゲンバイオファブリックを含む複合物は、限定なく、個々に、又は任意の組み合わせで、本明細書に収載された化合物のいずれを含んでいてもよい。本明細書に収載された任意の生物学的に活性な化合物、及び強膜又は眼の状況に有用なその他のものを、即時放出又は長時間放出のために公知の方法によって処方してもよい。加えて、コラーゲンバイオファブリックは、異なる様式で2つ以上生物学的に活性な化合物を含んでいてもよく；例えば、バイオファブリックには、1つの生物学的に活性な化合物を含浸させて、及びもう一方で被覆してもよい。別の実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、長時間放出のために処方された1つの生物学的に活性な化合物と即時放出のために処方された第2の生物学的に活性な化合物を含む。
【０１７０】
コラーゲンバイオファブリックには、創傷治癒のために必要とされる1つ以上の栄養素の生理的に利用できる形態を含浸させても、又は被覆してもよい。好ましくは、栄養素は、長時間放出のために処方される。
【０１７１】
コラーゲンバイオファブリック又はコラーゲンバイオファブリックを含む複合物には、抗生物質を含んでいてもよい。特定の実施態様において、抗生物質は、以下である：マクロライド（例えば、トブラマイシン（TOBI（登録商標））、セファロスポリン（例えば、セファレキシン（KEFLEX（登録商標））、セフラジン（VELOSEF（登録商標）））、セフロキシム（CEFTIN（登録商標））、セフプロジル（CEFZIL（登録商標））、セファクロル（CECLOR（登録商標））、セフィキシム（SUPRAX（登録商標））又はセファドロキシル（DURICEF（登録商標））、クラリスロマイシン（例えば、クラリスロマイシン（ビアキシン））、エリスロマイシン（例えば、エリスロマイシン（EMYCIN（登録商標）））、ペニシリン（例えば、ペニシリンV（V-CILLINK（登録商標）又はPEN VEEK（登録商標）））又はキノロン（例えば、オフロキサシン（FLOXIN（登録商標））、シプロフロキサシン（CIPRO（登録商標））、オルノフォキアシン（NOROXIN（登録商標）））、アミノグリコシド抗生物質（例えば、アプラマイシン、アルベカシン、バンベルマイシン、ブチロシン、ジベカシン、ネオマイシン、ネオマイシン、ウンデシレナート、ネチルマイシン、パロモマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン及びスペクチノマイシン）、アムフェニコール抗生物質（例えば、アジダムフェニコール、クロラムフェニコール、フロルフェニコール及びチアンフェニコール）、アンサマイシン抗生物質（例えば、リファミド及びリファンピン）、カルバセフェム（例えば、ロラカルベフ）、カルバペネム（例えば、ビアペネム（biapenem）及びイミペネム）、セファロスポリン（例えば、セファクロル、セファドロキシル、セファマンドール、セファトリジン、セファゼドン（cefazedone）、セフォゾプラン（cefozopran）、セフピミゾール、セフピラミド及びセフピロム）、セファマイシン（例えば、セフブペラゾン、セフィネタゾール（cefinetazole）及びセフミノクス）、モノバクタム（例えば、アズトレオナム、カルモナム及びチゲモナム（tigemonam））オキサセフェム（例えば、フロモキセフ及びモキサラクタム）、ペニシリン（例えば、アムジノシリン、アムジノシリンピボキシル、アモキシシリン、バカンピシリン、ベンジルペニシリン酸、ベンジルペニシリンナトリウム、エピシリン（epicillin）、フェンベニシリン（fenbenicillin）、フロキサシリン、ペナムシリン（penamccillin）、ペネタマートハイドリオダイド（penethamate hydriodide）、ペニシリンo-ベネタミン、ペニシリン0、ペニシリンV、ペニシリンVベンザチン、ペニシリンV ヒドラバミン、ペニメピサイクリン（penimepicycline）及びペニメピサイクリンカリウム）、リンコサミド（例えば、クリンダマイシン及びリンコマイシン）、マクロライド（例えば、アジスロマイシン、カルボマイシン、クラリソマイシン（clarithomycin）、ジリスロマイシン、エリスロマイシン及びエリスロマイシンアシストラート（acistrate））、アンホマイシン、バシトラシン、カプレオマイシン、コリスチン、エンジュラシジン（enduracidin）、エンビオマイシン（enviomycin）、テトラサイクリン（例えば、アピサイクリン（apicycline）、クロルテトラサイクリン、クロモサイクリン及びデメクロサイクリン）、2,4-ジアミノピリミジン（例えば、ブロジモプリム）、��トロフラン（例えば、フラルタドン及びフラゾリウムクロライド）、キノロン及びその類似体（例えば、シノキサシン、シプロフロキサシン、クリナフロキサシン（clinafloxacin）、フルメキン（flumequine）及びグレパフロキサシン）、スルホンアミド（例えば、アセチルスルファメトキシピラジン（sulfamethoxypyrazine）、ベンジルスルファミド、ノプリルスルファミド（noprylsulfamide）、フタリルスルファセタミド、スルファクリソイジン（sulfachrysoidine）及びスルファシチン（sulfacytine））、スルホン（例えば、ジアチモスルホン、グルコスルホンナトリウム及びソラスルホン）、サイクロセリン、ムピロシン及びツベリン。
【０１７２】
特定の実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、抗真菌薬で被覆されていても、又は含浸されていてもよい。適切な抗真菌薬には、アンフォテリシンB、イトラコナゾール、ケトコナゾール、フルコナゾール、イントラセカル(intrathecal)、フルシトシン、ミコナゾール、ブトコナゾール、クロトリマゾール、ニスタチン、テルコナゾール、チオコナゾール、シクロピロックス、エコナゾール、ハロプログリン、ナフチフィン、テルビナフィン、ウンデシレナート及びグリセオフルジン（griseofuldin）を含むが、限定されない。
【０１７３】
特定のその他の実施態様において、コラーゲンバイオファブリック又はコラーゲンバイオファブリックを含む複合物は、抗炎症薬で被覆され、又は含浸される。有用な抗炎症性因子には、サリチル酸、アセチルサリチル酸、サリチル酸メチル、ジフルニサル、サルサラート（salsalate）、オキサラジン、スルファサラジン、アセトアミノフェン、インドメタシン、スリンダク、エトドラク、メフェナム酸、メクロフェナム酸ナトリウム、トルメチン、ケトロラク、ジクロフェナク（dichlofenac）、イブプロフェン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、フェノプロフェン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン、オキサプロジン、ピロキシカム、メロキシカム、アンピロキシカム（ampiroxicam）、ドロキシカム（droxicam）、ピボキシカム（pivoxicam）、テノキシカム、ナブメトン、フェニルブタゾン、オキシフェンブタゾン、アンチピリン、アミノピリン、アパゾン及びニメスリド（nimesulide）などの非ステロイド性抗炎症薬；ジロートン、金チオグルコース、金チオリンゴ酸ナトリウム及びオーラノフィンを含むが、限定されないロイコトリエンアンタゴニスト；並びにメトトレキセート、コルヒチン、アロプリノール、プロベネシド、スルフィンピラゾン及びベンズブロマロンを含むが、限定されないその他の抗炎症薬;を含むが、限定されない。
【０１７４】
特定の実施態様において、コラーゲンバイオファブリック又は複合物の含むコラーゲンバイオファブリックは、抗ウイルス薬で被覆されている、又は含浸させられる。有用な抗ウイルス薬には、ジドブジン、アシクロビル、ガンシクロビル（gangcyclovir）、ビダラビン、イドクスウリジン、トリフルリジン及びリバビリンなどのヌクレオシド類似体、並びにフォスカルネト（foscarnet）、アマンタジン、リマンタジン、サキナビル、インジナビル、リトナビル及びαインターフェロンを含むが、限定されない。
【０１７５】
また、コラーゲンバイオファブリック又はコラーゲンバイオファブリックを含む複合物は、サイトカイン受容体モジュレーターで被覆されていても、又は含浸させてもよい。サイトカイン受容体モジュレーターの例には、可溶性サイトカイン受容体（例えば、TNF-α受容体の細胞外ドメイン又はその断片、IL-10受容体の細胞外ドメイン又はその断片、及びIL-6受容体の細胞外ドメイン又はその断片）、サイトカイン又はその断片（例えば、インターロイキン（IL)-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-1 1、IL-12、IL-15、TNF-α、TNF-β、インターフェロン（IFN)-α、IFN-β、IFN-γ及びGM-CSF）、抗サイトカイン受容体抗体（例えば、抗IFN受容体抗体、抗IL-2受容体抗体（例えば、ゼナパックス（Protein Design Labs））、抗IL-4受容体抗体、抗IL-6受容体抗体、抗IL-10受容体抗体及び抗IL-12受容体抗体）、抗サイトカイン抗体（例えば、抗IFN抗体、抗TNF-α抗体、抗IL-10抗体、抗IL-6抗体、抗IL-8抗体（例えば、ABX-IL-8（Abgenix））及び抗IL-12抗体）を含むが、限定されない。具体的実施態様において、サイトカイン受容体モジュレーターは、IL-4、IL-10又はこれらの断片である。別の実施態様において、サイトカイン受容体モジュレーターは、抗IL-1抗体、抗IL-6抗体、抗IL-12受容体抗体又は抗TNF-α抗体である。別の実施態様において、サイトカイン受容体モジュレーターは、TNF-α受容体の細胞外ドメイン又はその断片である。特定の実施態様において、サイトカイン受容体モジュレーターは、TNF-αアンタゴニストではない。
【０１７６】
好ましい実施態様において、免疫調節薬として利用されるタンパク質、ポリペプチド又はペプチド（抗体を含む）は、これらのタンパク質、ポリペプチド又はペプチドに対する免疫応答の可能性を減少させるために、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドのレシピエントと同じ種に由来する。別の好ましい実施態様において、対象がヒトであるときに、免疫調節薬剤として利用されるタンパク質、ポリペプチド又はペプチドは、ヒトであるか、又はヒト化される。
【０１７７】
また、コラーゲンバイオファブリック又はコラーゲンバイオファブリックを含む複合物は、サイトカインで被覆されても、又は含浸させてもよい。サイトカインの例には、以下を含むが、限定されない：コロニー刺激因子1（CSF-I）、インターロイキン2（IL-2）、インターロイキン3（IL-3）、インターロイキン4（IL-4）、インターロイキン5（IL-5）、インターロイキン6（IL-6）、インターロイキン７（IL-7）、インターロイキン9（IL-9）、インターロイキン10（IL-10）、インターロイキン12（IL-12）、インターロイキン15（IL-15）、インターロイキン18（IL-18）、インスリン様成長因子１（IGF-I）、血小板由来成長因子（PDGF）、エリスロポエチン（EP0）上皮細胞増殖因子（EGF）、線維芽細胞増殖因子（FGF）（塩基性又は酸性）、顆粒球マクロファージ刺激因子（GM-CSF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子（HEGF）、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、プロラクチン、及びインターフェロン（IFN）、例えばIFN-α及びIFN-γ）、トランスフォーミング増殖因子α（TGF-α）、TGFβ1、TGFβ2、腫瘍壊死因子α（TNF-α）、血管内皮成長因子（VEGF）、肝細胞増殖因子（HGF）、その他。
【０１７８】
また、コラーゲンバイオファブリックは、ホルモンで被覆されても、又は含浸させてもよい。ホルモンの例には、黄体形成ホルモン放出ホルモン（LHRH）、成長ホルモン（GH）、成長ホルモン放出ホルモン、ACTH、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ソマトメジン、副甲状腺ホルモン、視床下部放出因子、インスリン、グルカゴン、エンケファリン、バソプレッシン、カルシトニン、ヘパリン、低分子量ヘパリン、ヘパリン類似物質、合成及び天然オピオイド、インスリン甲状腺刺激ホルモン及びエンドルフィンを含むが、限定されない。β-インターフェロンの例には、インターフェロンβ1-a及びインターフェロンβ1-bを含むが、限定されない。
【０１７９】
また、コラーゲンバイオファブリック又はコラーゲンバイオファブリックを含む複合物は、アルキル化剤で被覆されても、又は含浸させてもよい。アルキル化剤の例には、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン、メチルメラミン、アルキルスルホナート、ニトロソ尿素、トリアゼン、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、クロランブシル、ヘキサメチルメライン（hexamethylmelaine）、チオテパ、ブスルファン、カルムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン及びテモゾロマイドを含むが、限定されない。
【０１８０】
また、コラーゲンバイオファブリック又はコラーゲンバイオファブリックを含む複合物は、以下を含むが、限定されない、免疫調節薬で被覆されても、又は含浸させてもよい：メトトレキセート、レフルノミド、シクロホスファミド、シクロスポリンA、マクロライド系抗生物質（例えば、FK506（タクロリムス））、メチルプレドニゾロン（MP）、副腎皮質ステロイド、ステロイド、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシン（シロリムス）、ミゾリビン、デオキシスペルグアリン、ブレキナール、マロノニトリロアミンデス（malononitriloamindes）（例えば、レフルナミド（leflunamide））、T細胞受容体モジュレーター及びサイトカイン受容体モジュレーター、ペプチド擬態及び抗体（例えば、ヒト、ヒト化、キメラ、モノクローナル、ポリクローナル、Fvs、ScFvs、Fab又はF（ab）2断片又はエピトープ結合断片）、核酸分子（例えば、アンチセンス核酸分子及び3重らせん体）、小分子、有機化合物及び無機化合物。特に、免疫調節薬には、メトトレキセート、レフルノミド、シクロホスファミド、サイトキサン（cytoxan）、イムラン（Immuran）、シクロスポリンA、ミノサイクリン、アザチオプリン、抗生物質（例えば、FK506（タクロリムス））、メチルプレドニゾロン（MP）、副腎皮質ステロイド、ステロイド、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシン（シロリムス）、ミゾリビン、デオキシスペルグアリン、ブレキナール、マロノニトリロアミンデス（malononitriloamindes）（例えば、レフルナミド（leflunamide））、T細胞受容体モジュレーター及びサイトカイン受容体モジュレーターを含むが、限定されない。T細胞受容体モジュレーターの例には、以下を含むが、限定されない：抗T細胞受容体抗体（例えば、抗CD4抗体、（例えば、cM-T412（Boehringer）、IDEC-CE9.Is（IDEC及びSKB）、mAb 4162W94、オルトクローン（Orthoclone）及びOKTcdr4a（Janssen-Cilag））、抗CD3抗体（例えば、ヌビオン（Nuvion）（Product Design Labs）、OKT3（Johnson & Johnson）又はRituxan（IDEC））、抗CD5抗体（例えば、抗CD5リシン連結免疫複合物）、抗CD7抗体（例えば、CHH-380（Novartis））、抗CD8抗体、抗CD40リガンドモノクローナル抗体（例えば、IDEC-131（IDEC））、抗CD52抗体（例えば、CAMPATH 1H（Ilex））、抗CD2抗体、抗CD11a抗体（例えば、キサネリム（Xanelim）（Genentech））及び抗B7抗体（例えば、IDEC-114）（IDEC）））及びCTLA4-免疫グロブリン。具体的実施態様において、T細胞受容体モジュレーターは、CD2アンタゴニストである。その他の実施態様において、T細胞受容体モジュレーターは、CD2アンタゴニストではない。別の特定の実施態様において、T細胞受容体モジュレーターは、CD2結合分子（好ましくは、MEDI-507）である。その他の実施態様において、T細胞受容体モジュレーターは、するCD2結合分子ではない。
【０１８１】
また、コラーゲンバイオファブリック又はコラーゲンバイオファブリックを含む複合物は、IMIDs（登録商標）として知られる免疫調節化合物のクラスで被覆されても、又は含浸させてもよい。本明細書に使用され、及び特に明記しない限り、「IMID（登録商標）」及び「IMIDs（登録商標）」（Celgene Corporation）という用語には、TNF-α、LPS誘導された単球IL-1β及びIL-12を著しく阻害し、かつI-L6産生を部分的に阻害する小有機分子を包含する。具体的な免疫調節化合物は、後述する。
【０１８２】
このような免疫調節化合物の具体例には、以下を含むが、限定されない：米国特許第5,929,117号に開示したものなどの置換されたスチレンのシアノ及びカルボキシ誘導体；米国特許第5,874,448号及び第5,955,476号に記述したものなどの1-オキソ-2-(2,6-ジオキソ-3-フルオロピペリジン-3-イル）イソインドリン及び1,3-ジオキソ-2-(2,6-ジオキソ-3-フルオロピペリジン-3-イル）イソインドリン；米国特許第5,798,368号に記述された四置換された2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)-1-オキソイソインドリン；米国特許第5,635,517号、第6,476,052号、第6,555,554号及び第6,403,613号に開示したものを含むが、限定されない1-オキソ及び1,3-ジオキソ-2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル）イソインドリン（例えば、サリドマイドの4-メチル誘導体）；米国特許第6,380,239号に記述されたインドリン環の4又は5位が置換された1-オキソ及び1,3-ジオキソイソインドリン（例えば、4-(4-アミノ-1,3-ジオキソイソインドリン-2-イル)-4-カルバモイル酪酸）；米国特許第6,458,810号に記述された2位が2,6-ジオキソ-3-ヒドロキシピペリジン-5-イルで置換されたイソインドリン-1-オン及びイソインドリン-l,3-ジオン（例えば、2-(2,6-ジオキソ-3-ヒドロキシ-5-フルオロピペリジン-5-イル)-4-アミノイソインドリン-1-オン）；米国特許第5,698,579号及び第5,877,200号に開示された非ポリペプチド環状アミドのクラス；アミノサリドマイド、並びにアミノサリドマイドの類似体、加水分解産物、代謝産物、誘導体及び前駆体、並びに米国特許第6,281,230号及び6,316,471号に記述されたものなどの置換された2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル）フタルイミド及び置換された2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)-1-オキソイソインドール；並びに2001年10月5日に出願の米国特許出願第09/972,487号、2001年12月21日に出願の米国特許出願第10/032,286号及び国際出願第PCT/US01/50401（国際公開番号WO02/059106）に記述されたものなどのイソインドール-イミド化合物。本明細書において同定される米国特許及び米国特許出願公開のそれぞれの全体は、参照により本明細書に組み込まれる。免疫調節化合物には、サリドマイドを含まない。
【０１８３】
コラーゲンをコーティングし、又は含浸させる生物活性化合物の量は、変更してもよく、好ましくは送達される特定の生物活性化合物及び所望の効果に依存するであろう。
【０１８４】
種々の実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、少なくとも0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500、600、700、800、900、100、1250、1500、2000、2500、300、3500、4000,4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、20000、30000,40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000又は少なくとも1000000ナノグラムの生物活性化合物で被覆されても、又は含浸させてもよい。別の実施態様において、本発明の眼プラグ（ocular plug）は、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500、600、700、800、900、100、1250、1500、2000、2500、300、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000又は少なくとも1000000ナノグラム未満の生物活性化合物で被覆されても、又は含浸させてもよい。
【０１８５】
（5.6.3. コラーゲンバイオファブリックの高次構造）
コラーゲンバイオファブリックは、本発明の方法におけるその使用を助長するであろう任意の形状又は高次構造に形成してもよい。例えば、コラーゲンバイオファブリックは、幹細胞を培養するのを助長するであろう任意の形状又は高次構造に形成することができる。一部の実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、培養プレートにあり、かつ培養プレートに従って形づくられる。その他の実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、マイクロウェルプレートのウェルにあり、かつマイクロウェルプレートのウェルに従って形づくられる。
【０１８６】
本明の治療方法に有用なコラーゲンバイオファブリックは、乾燥又は食塩水などの適切な生理的に適合性の医学的に有用な液体中で事前に濡らしてエンドユーザに提供される。一つの実施態様において、溶液は、限定されないが、上記の第5.6.2節に記載されているような1つ以上の生物活性化合物を含む。
【０１８７】
（5.6.4. コラーゲンバイオファブリックの製造方法）
羊膜、柔毛膜、又は両方から作製されるコラーゲンバイオファブリックは、膜の成分：主にコラーゲン、エラスチン、ラミニン及びフィブロネクチンの生化学的及び構造的特徴を保存する任意の手段によって生産してもよい。好ましい材料は、米国出願公開第U.S.2004/0048796 A1（Haririによる「コラーゲンバイオファブリック並びにその製造方法及び使用」）（これは、本明細書によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記述されたコラーゲンバイオファブリックであり、これに開示された方法に従って製造される。
【０１８８】
好ましくは、幹細胞培養に使用されるコラーゲンバイオファブリックは、ヒト被験者に使用するためのヒト胎盤由来であるが、コラーゲンバイオファブリックは、非ヒト哺乳類由来の羊膜から作製してもよい。コラーゲンバイオファブリックが非ヒト動物に使用される場合、コラーゲンバイオファブリックは、その動物の種由来の胎盤に由来することが好ましい。
【０１８９】
好ましい実施態様において、本発明の方法に使用するための胎盤は、新生児の分娩後にできるだけ早く採取される。胎盤は、即座に使用してもよく、又はさらなる治療前に分娩時刻から2〜5日間貯蔵されていてもよい。胎盤は、典型的には失血されており、すなわち出生後に残っている臍帯血が排出されている。好ましくは、妊婦は、当業者に公知の標準的な技術を使用して、出産時の前に、HIV、HBV、HCV、HTLV、梅毒、CMV、及び胎盤組織に混入することが知られているその他のウイルス病原体を含むが、限定されない伝染病についてスクリーニングされる。
【０１９０】
本発明のコラーゲンバイオファブリックを調製するための1つの例示的な方法には、以下の工程を含む：
【０１９１】
工程I. 臍帯を胎盤円板から分離する；任意に、羊膜を柔毛膜から分離する。好ましい実施態様において、羊膜は、胎盤膜を切断する前に柔毛膜から分離する。柔毛膜及び胎盤円板から羊膜の分離に続いて、臍帯断端を、例えば剪刀で切断し、及び胎盤円板から剥離させる。次いで、羊膜を、0.9％の無菌のNaCl溶液などの無菌の、好ましくは緩衝された食塩水に貯蔵してもよい。好ましくは、少なくとも2℃の温度にて、羊膜は、冷蔵によって貯蔵される。
【０１９２】
工程II。羊膜を実質的に脱細胞化させる；すなわち、実質的に全ての細胞材料及び細胞細片（例えば、全ての目に見える細胞物質及び細胞細片）を除去する。当業者に公知の任意の脱細胞化過程を使用してもよいが、しかし、一般に、本発明の羊膜を脱細胞化するために使用される過程は、バイオファブリックを構成するタンパク質の固有の立体配座を崩壊させない。羊膜の「実質的脱細胞化」は、好ましくは細胞の少なくとも90％を除去し、より好ましくは細胞の少なくとも95％を除去し、及び最も好ましくは細胞（例えば、線維芽細胞、羊膜細胞及び絨毛細胞（chorionocytes））の少なくとも99％を除去する。本発明の方法に従って脱細胞化される羊膜は、一様に薄く、乾燥状態で約2〜約150ミクロン間の固有の厚みの変動があり、外観上は平滑（触覚によって定まる）かつ透明である。脱細胞化は、例えば、無菌液での水洗と組み合わせて、無菌の細胞スクレイパーでの物理的な擦過を含んでいてもよい。使用された脱細胞化技術により、羊膜の解剖学的構造の総破壊を生じるべきでなく、又は羊膜の生体力学的性質を変化させるべきでない。好ましくは、羊膜の脱細胞化は、非イオン性界面活性剤、Triton X-100、陰イオン界面活性剤、ドデシル硫酸ナトリウムなどの洗浄剤含有溶液の使用を含み、任意の軽度の陰イオン界面活性剤、すなわちpH6〜8かつ低発泡である非腐蝕性洗浄剤を使用して羊膜を脱細胞化することができる。具体的実施態様において、0.01〜1％のデオキシコール酸ナトリウム塩一水和物が羊膜の脱細胞化に使用される。
【０１９３】
バイオファブリックの調製においてプロテアーゼ活性を制限することが、非常に好ましい。金属イオンキレート剤、例えば1,10-フェナントロリン及びエチレンジアミン四酢酸（EDTA）などの溶解溶液、リンス溶液及び貯蔵溶液に対する添加物は、多くのタンパク質分解酵素にとって好ましくない環境を生じる。コラゲナーゼなどの最適以下の条件をプロテアーゼに提供すると、細胞溶解工程の間の分解からコラーゲンなどの羊水膜成分の保護を助ける。プロテアーゼのための最適以下の条件は、溶液において利用可能なカルシウム及び亜鉛イオンの量を除去するか、又は制限するために低浸透圧性溶解溶液を調合することによって達成してもよい。多くのプロテアーゼは、カルシウム及び亜鉛イオンの存在下において活性であり、カルシウム及び亜鉛イオンのない環境ではこれらの活性の多くを失う。好ましくは、低浸透圧性溶解溶液は、該溶液が天然の細胞を至適に溶解するであろうが、有害なタンパク質分解から基礎を成す羊膜を保護するように、pHの条件、カルシウム及び亜鉛イオンの利用能の減少、金属イオンキレート剤の存在及びコラゲナーゼに対して特異的なタンパク分解性阻害剤の使用を選択して調製されるであろう。例えば、低浸透圧性溶解溶液には、カルシウム及び亜鉛イオンを含まず、かつEDTAなどの金属イオンキレート剤を含む水、pH 5.5〜8、好ましくはpH 7〜8の緩衝された溶液を含んでいてもよい。加えて、また低浸透圧性溶解溶液での羊膜の処理の間の温度及び時間パラメーターの制御を使用して、プロテアーゼの活性を制限してもよい。
【０１９４】
また、羊膜の脱細胞化処理により、新たな免疫学的部位の産生を制限することが好ましい。コラーゲンの酵素的分解は、免疫原性の増大を引き起こすことが考えられるので、本発明は、羊膜の成分のタンパク質分解を最小にし、従って羊膜の構造を保存する、細胞代謝、タンパク質産生及び細胞分裂を阻害するのに有効な酵素、例えばヌクレアーゼでの羊膜の処理を包含する。本発明の方法に従って使用することができるヌクレアーゼの例は、エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼの両方を含む、天然の細胞DNA及びRNAの消化に有効なものである。本発明の方法に従って使用することができるヌクレアーゼの非限定的な例は、細胞活性を阻害するエキソヌクレアーゼ、例えばDNase I（SIGMA Chemical Company、St. Louis, Mo.）及びRNase A（SIGMA Chemical Company、St. Louis, Mo.）及び細胞活性を阻害するエンドヌクレアーゼ、例えばEcoRI（SIGMA Chemical Company、St. Louis, Mo.）及びHindIII（SIGMA Chemical Company、St. Louis, Mo.）を含む。選択されたヌクレアーゼは、ヌクレアーゼの活性のために最適であるイオン、例えばマグネシウム、カルシウムを含む生理学的緩衝液中で適用されることが好ましい。好ましくは、緩衝過された溶液のイオン濃度、処理温度及び処理の長さは、所望のレベルのヌクレアーゼ活性を保証するようにルーチン試験によって当業者によって選択される。緩衝液は、好ましくは細胞内部へのヌクレアーゼのアクセスを促進するために低浸透圧性である。
【０１９５】
上記の工程I及びIIの別の実施態様において、胎盤は、最初の過程の後に、生理食塩水中で簡単にリンスして胎盤の表面から血液を除去させる。次いで、胎盤円板を約0.1％〜約10％、及び具体的実施態様において約0.1％〜約2.0％の濃度にて冷却デオキシコール酸溶液に浸漬させる。次いで、胎盤をこの溶液に中で約1℃〜約8℃間にて約5日〜約6月の間インキュベートする。具体的実施態様において、胎盤円板は、例えば約5〜約15日間；約5〜約30日、約5〜約60日又は約1年までの間浸漬される。典型的には、デオキシコール酸溶液は、インキュベーションの間に2〜5日毎に置き換えられる。別の特定の実施態様において、胎盤円板は、デオキシコール酸溶液中に、約1％の濃度にて、O℃〜約8℃の温度にて、約5日〜約15日の間浸漬される。このインキュベーションは、2つの目的に役立つ。第1に、これにより、胎盤材料及び血液に対して行われる血清学的試験のための時間ができ、その結果、血清学的基準を満たすことができていない胎盤が更に処理されない。第2に、より長いインキュベーションにより、上皮細胞及び線維芽細胞の除去が改善し、これにより、物理的掻爬によって羊膜を脱細胞化するのに費やされる総時間を有意に減少することができる。典型的には、掻爬時間は、例えば約40分から約20分に減少される。次いで、羊膜を後述するように乾燥させる。
【０１９６】
工程III。脱細胞化に続いて、羊膜を洗浄して、細胞タンパク質、細胞脂質及び細胞核酸を含むであろう細胞細片、並びに細胞外可溶性タンパク質、脂質及びプロテオグリカンなどの任意の細胞外細片の除去を保証する。洗浄溶液は、イオン除去水又は水性低浸透圧性緩衝液でもよい。好ましくは、羊膜は、例えば揺れ動くプラットフォーム上で、洗浄剤中で15〜120分間穏やかに撹拌して、脱細胞化を助ける。羊膜は、洗浄剤脱細胞化の後、上記のとおりに再び物理的に脱細胞化してもよく；物理的及び洗浄剤脱細胞化工程は、羊膜の完全性が維持される限り、目に見える細胞性物質及び細胞細片が残らなくなるまで、必要に応じて繰り返してもよい。
【０１９７】
特定の実施態様において、羊膜は、脱細胞化及び洗浄工程の後、即座に（すなわち、30分以内に）乾燥させる。或いは、さらなるプロセシングが即座になされないときは、羊膜を冷蔵してもよく、例えば約1℃〜約20℃、好ましくは約2℃〜約8℃の温度にて乾燥の前に28日までの間貯蔵される。脱細胞化された羊膜が3日を超えて、しかし28日未満の間貯蔵されるときは、羊膜を覆う無菌液は、好ましくは周期的に、例えば1〜3日毎に交換される。
【０１９８】
特定の実施態様において、羊膜が洗浄後に冷蔵されないときは、羊膜を、調製の工程IVへ進む前に、少なくとも3回洗浄する。その他の実施態様において、羊膜が冷蔵され、かつ無菌液を一度交換したときは、羊膜を、調製の工程IVへ進む前に、少なくとも2回洗浄する。更にその他の実施態様において、羊膜が冷蔵され、かつ無菌液が2回以上交換されたときは、羊膜を、調製の工程IVへ進む前に少なくとも一回洗浄する。
【０１９９】
工程IVに進む前に、全ての細菌学的及び血清学的試験を評価して、全ての検査がネガティブであることを確実にすることが好ましい。
【０２００】
工程IV。本実施例におけるコラーゲンバイオファブリック産生の方法の最終工程は、コラーゲンバイオファブリックを産生するために本発明の脱細胞化された羊膜を乾燥させることを含む。平らな、乾燥したコラーゲンのシートを産生するために、羊膜を乾燥させる任意の方法を使用してもよい。しかし、好ましくは、羊膜は、真空下で乾燥される。
【０２０１】
具体的実施態様において、本発明の脱細胞化された羊膜を乾燥させるための例示的方法には、以下の工程を含む：
【０２０２】
乾燥のための脱細胞化された羊膜の構築。脱細胞化された羊膜を無菌液から取り出して、過剰な液体を穏やかに圧搾する。次いで、脱細胞化された羊膜は、それが、例えばトレー上で下方の位置で胎児側に向かって平らになるまで、穏やかに伸ばす。次いで、脱細胞化された羊膜を、胎児側が上方を向いており、かつ乾燥フレーム、好ましくはプラスチックメッシュ乾燥フレーム（例えばQUICK COUNT（登録商標）プラスチックキャンバス、Uniek、Inc., Waunakee、WI）上に置かれるようにひっくり返す。その他の実施態様において、乾燥フレームは、ステンレス鋼メッシュを含むが、限定されない任意の加圧滅菌に耐える材料であってもよい。最も好ましい実施態様において、約0.5センチメートルの羊膜が乾燥フレームの縁に重なる。特定の実施態様において、乾燥フレームを越えて延長して重なった羊膜は、例えばクランプ又は止血薬を使用して、フレームの上部で包まれる。一旦羊膜が乾燥フレーム上に位置したら、滅菌ガーゼを熱乾燥器（又はゲル-乾燥器）（例えば、モデル583、Bio-Rad ory、Hercules、CA）の乾燥プラットフォーム上で置き、その結果、プラスチックメッシュ乾燥フレーム上に残っている羊膜よりもわずかに大きな領域が覆われる。好ましくは、ガーゼ層の総厚みは、1回折り畳まれた4×4ガーゼの厚みを上回らない。乾燥シート様の材料のために適した任意の熱乾燥装置を使用してもよい。乾燥フレームは、好ましくは0.1〜1.0cm、より好ましくは0.5〜1.0cmの間でプラスチックフレームの縁がガーゼの縁を越えて上に延長するように、乾燥プラットフォーム上のガーゼの上で置かれる。最も好ましい実施態様において、羊膜を有する乾燥フレームを滅菌ガーゼ上に、胎児側の羊膜を上に向けて置く。一部の実施態様において、別のプラスチックフレーミングメッシュが羊膜上に置かれる。別の実施態様において、薄いプラスチックのシート（例えば、SW 182、明らかなPVC、AEP Industries Inc., South Hackensack、NJ）又は生体適合性シリコーンをこのように膜カバーされたメッシュ上に置き、その結果、シートは、全ての縁をこえて十分に延長する。本実施例では、第2のメッシュフレームが必要ではない。
【０２０３】
代わりの実施態様において、羊膜は、TYVEK（登録商標）材料（例えば、医療包装のためのTYVEK（登録商標）の1つ以上の無菌シート、DuPont TYVEK（登録商標）、Wilmington、DE）、任意に膜の上部のTYVEK（登録商標）のシート（プラスチック薄膜を置く前）に置かれる。この別法は、バイオファブリックのより平滑なバージョン（すなわち、及び材料の軸に沿った、及び軸に対して垂直な差動的線維圧縮領域のパターンを伴わない）を生産し、これは、例えば細胞の増殖のためのマトリックスとして使用のためになどの特定の適用のために有利であろう。
【０２０４】
羊膜を乾燥。好ましい実施態様において、本発明は、真空下で本発明の羊膜を熱乾燥させることを包含する。乾燥は、約0℃〜約60℃の任意の温度にて真空下で達成してもよいが、羊膜は、好ましくは約35℃〜約50℃の間、及び最も好ましくは約50℃にて乾燥される。一部のコラーゲン分解が50℃を上回る温度にて予想されることに留意すべきである。乾燥温度は、好ましくは、延長されたプローブを使用して、較正されたデジタル温度計を使用してセットされ、及び検証される。好ましくは、真空加圧は、約-22インチ(約-55.88cm)Hgにセットされる。乾燥工程は、羊膜のコラーゲンマトリックスが実質的に乾燥されるまで、すなわち、例えば湿気アナライザーによって決定すると、重量の20％未満の水分、及び好ましくは重量の約3〜12％の水分を含むまで続けられる。これを達成するために、羊膜を例えばおよそ60分間熱真空乾燥して、脱水羊膜を達成してもよい。一部の実施態様において、羊膜は、約30分〜2時間、好ましくは約60分間乾燥される。任意の作用機序によって高速されることは意図しないが、真空加圧と組み合わせた低い熱の設定により、コラーゲンを変性させることのなく、羊膜が脱水状態を達成することができると考えられる。
【０２０５】
本発明に従った乾燥過程の完了後、羊膜を真空ポンプ運転でおよそ2分間冷却させる。
【０２０６】
羊膜のパッケージング及び貯蔵。一旦羊膜が乾燥されたら、膜を穏やかに乾燥フレームから持ち上げる。膜を「持ち上げる」には、以下の工程を含む：ポンプをなおも運転すると共に、プラスチックフィルムを隅から始めて穏やかに羊膜から除去する一方で羊膜を下に保持し；羊膜を伴うフレームを乾燥プラットフォームから持ち上げて、裁断台の上に羊膜側を上にして置き；切開を行って、フレームの縁から1〜2mm離して縁に沿って切断し；次いで、羊膜をフレームから剥離する。好ましくは、この段階での羊膜の取扱いは、無菌手袋をして行う。
【０２０７】
羊膜無菌は、例えば剥離ポーチに置いて、封止する。その他の実施態様において、コラーゲンバイオファブリックの少なくとも一部は、培養トレー又はマルチウェルプレートに置くために適した小片に細分する。例えば、コラーゲンバイオファブリックの1つ以上の環状の小片を、コラーゲンバイオファブリックが培養トレー又はマルチウェルプレートの一部の底面（例えば、培養表面）を少なくとも覆うように、培養トレー又はマルチウェルプレートに置くことができる。好ましい実施態様において、ペトリ皿の全ての環状の培養表面又はマルチウェルプレートの1つ以上のウェルの環状の培養表面を、コラーゲンバイオファブリックによって完全に覆う。
【０２０８】
本発明の方法に従って生産されたバイオファブリックは、単独で、又は一種の組織培養ディッシュ又はマルチウェルプレートと共に、上述したように室温で長期間貯蔵してもよい。
【０２０９】
代わりの実施態様において、コラーゲンバイオファブリックには、柔毛膜、又は柔毛膜及び羊膜の両方を含むことができる。上記の方法は、柔毛膜、又は柔毛膜及び羊膜の両方を含むバイオファブリックを調製する方法に適用できるであろうことが予想される。一つの実施態様において、本発明は、羊膜及び柔毛膜を含む胎盤を提供すること；羊膜を柔毛膜から分離すること；及び柔毛膜を脱細胞化すること；によって調製されるコラーゲンバイオファブリックの使用を包含する。具体的実施態様において、バイオファブリックの調製は、更に、脱細胞化された柔毛膜を洗浄し、及び乾燥させることを伴う。別の実施態様において、本発明は、羊膜及び柔毛膜を含む胎盤を提供し、羊膜及び絨毛膜を脱細胞化することによって調製されるコラーゲンバイオファブリックの使用を包含する。具体的実施態様において、本方法は、更に、脱細胞化された羊膜及び絨毛膜を洗浄し、及び乾燥させることを伴う。
【０２１０】
（5.6.5. コラーゲンバイオファブリックの貯蔵及び取扱）
脱細胞化されたコラーゲンバイオファブリックは、例えば使用前に室温（例えば、25℃）にて脱水されたシートとして貯蔵されてもよい。特定の実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、少なくとも10℃、少なくとも15℃、少なくとも20℃、少なくとも25℃又は少なくとも29℃の温度にて貯蔵することができる。好ましくは、コラーゲンバイオファブリックは、脱水形態で冷蔵されない。一部の実施態様において、コラーゲンバイオファブリックは、約2℃〜約8℃の温度にて冷蔵してもよい。本発明の方法に従って産生されるバイオファブリックは、生化学的又は構造的な完全性の変化がなく（例えば、分解がない）、コラーゲンバイオファブリックの生化学的又は生物物理学的な特性の任意の変化を伴わずに、12月以上の間、任意の規定温度にて貯蔵することができる。バイオファブリックは、生化学的又は構造的な完全性の変化がなく（例えば、分解がない）、コラーゲンバイオファブリックの生化学的又は生物物理学的な特性の任意の変化を伴わずに、数年間貯蔵することができる。バイオファブリックは、長期貯蔵のために適した任意の容器に貯蔵されていてもよい。好ましくは、本発明のコラーゲンバイオファブリックは、無菌の二重の剥離ポーチパッケージに貯蔵される。
【０２１１】
コラーゲンバイオファブリックは、典型的には幹細胞、例えば胚性幹細胞を培養し、増殖し、又は分化する前に水和される。コラーゲンバイオファブリックは、例えば無菌の生理学的緩衝液を使用して再水和することができる。具体的実施態様において、無菌食塩水は、0.9％ NaCl溶液である。いくつかの実施態様において、無菌食塩水は、緩衝化される。好ましくは、幹細胞を培養し、増殖し、又は分化する前に、コラーゲンバイオファブリックは、培養液（例えば第4.2.1節に記述したDMEM、幹細胞培養液又は培養液）中で再水和される。特定の実施態様において、本発明のコラーゲンバイオファブリックの水和は、少なくとも2分、少なくとも5分、少なくとも10分、少なくとも15分又は少なくとも20分必要である。好ましい実施態様において、本発明のコラーゲンバイオファブリックの水和は、5分以内に完了する。更に別の好ましい実施態様において、本発明のコラーゲンバイオファブリックの水和は、10分以内に完了する。更に別の実施態様において、本発明のコラーゲンバイオファブリックの水和は、10分以下しかかからない。一旦水和されたら、コラーゲンバイオファブリックは、溶液、例えば無菌の0.9％ NaCl溶液中に、6月までの間、例えば3日毎に溶液を交換して維持してもよい。
【０２１２】
（5.6.6.滅菌）
バイオファブリックの滅菌は、任意の医学的に適切な手段、好ましくは膜タンパク質を有意に架橋しないか、又は変性させない手段によって達成してもよい。滅菌は、例えばガス、例えば二酸化エチレンを使用して達成してもよい。滅菌は、放射線、例えばガンマ放射線を使用して達成してもよく、好ましくは当業者に公知の方法、例えばGorham、D. Byrom（編）1991、Biomaterials、Stockton Press、New York、55-122を使用して、電子線照射によって行われる。細菌又はその他の潜在的に混入する生物体の少なくとも99.9％を死滅させるのに十分な放射線のいずれの用量も、本発明の範囲内である。好ましい実施態様において、少なくとも18-25kGyの用量を使用して、バイオファブリックの末端滅菌を達成する。
【０２１３】
（5.6.7. 積層）
本発明は、コラーゲンバイオファブリックの積層と共に培養液中で細胞を培養することを含む、幹細胞の培養、増殖又は分化を更に提供する。このような積層は、実質的に平らであること（例えば、細胞培養のために適する）又は三次元であることができる。
【０２１４】
コラーゲンバイオファブリックは、典型的にはコラーゲンバイオファブリックの2つ以上の層の1つをその他のもの上に積み重ねること、及び封止又は乾燥することによって積層される。コラーゲンバイオファブリックは、乾燥又は再水和後に積層されてもよい。或いは、例えば2つ以上の羊膜の層を、例えば細胞掻爬工程を経て（下記の実施例を参照されたい）細胞除去後の最初の乾燥の前に積層してよい。最初の乾燥の前に積層される場合、2つ以上のコラーゲンバイオファブリック層は、1つをその他のもの上に積み重ねて、その後に、例えば凍結乾燥過程を使用して、又は真空で、若しくは真空にすることなく穏やかな熱の下で乾燥して、乾燥させてもよい。適用される熱は、好ましくはコラーゲンバイオファブリックのタンパク質成分、特にコラーゲンの破壊又は分解を生じさせるほどの強度ではない。典型的には、適用される熱は、7O℃以下、好ましくは約60℃以下、及びより好ましくはおよそ50℃である。積層時間は、例えば積層される層の数で変化し、しかし典型的には、鼓膜修復のために使用されるコラーゲンバイオファブリックのサイズの小片について、5O℃にて1〜2時間かかる。
【０２１５】
また、コラーゲンバイオファブリックは、2つ以上のコラーゲンバイオファブリック又は羊膜の層の間の間に適用される接着剤を使用して積層してもよい。このような接着剤は、好ましくは医療用途に適しており、天然の生物学的接着剤、例えばフィブリン接着剤、合成接着剤又はこれらの組み合わせを含むことができる。接着剤は、更に、積層過程の間に前駆体から化学的に変換されてもよい。
【０２１６】
（5.7.キット）
本発明の方法に有用なコラーゲンバイオファブリックは、幹細胞を培養し、増殖し、又は分化するのを助長するためのキットの一部として包装又は容器において提供してもよい。
【０２１７】
一つの実施態様において、キットは、1つ以上の培養トレー又はマイクロウェルプレートを含み、前記ディッシュ又はプレートは、コラーゲンバイオファブリックを含む。一部の実施態様において、コラーゲンバイオファブリックのそれぞれの小片は、培養トレーに、又はマイクロウェルプレートのそれぞれのウェルに提供される。別の実施態様において、キットは、別々に包まれ、又は含まれた2つ以上のコラーゲンバイオファブリックの小片を含む。
【０２１８】
別の実施態様において、キットは、幹細胞の培養のために適した培地を含む。別の実施態様において、キットは、成体細胞に分化する幹細胞を生じさせる1つ以上の化合物を含む。
【０２１９】
（5.8. コラーゲンバイオファブリック上で培養した幹細胞の使用）
本発明に従って培養され、増殖され、分化された幹細胞は、種々の適用を有する。幹細胞は、例えば米国出願公開第2004/0048796号（この内容は、その全体が参照により組み込まれる）に記載されているように、当業者に公知の任意の目的のためにも使用することができる。例えば、幹細胞は、移植及びエキソビボ治療プロトコルに使用することができ、その際に、体の組織又は器官が、幹細胞又は前駆体細胞集団などの所望の細胞集団の移植又は注入によって増大され、修復され、又は置き換えられる。また、これらは、既存の組織を置き換え、若しくは増大するために、新たな、若しくは変化した組織を導入するために、又は生物組織又は構造と共に連結するために使用することができる。また、コラーゲンバイオファブリックとの幹細胞培養は、外科的手技に、例えば外科用移植片としても使用することができる。
【０２２０】
コラーゲンバイオファブリック上で培養された幹細胞は、コラーゲンバイオファブリックなしで使用することができる。すなわち、幹細胞は、当業者に公知の方法、例えばトリプシン処理及び洗浄による除去によってコラーゲンバイオファブリックから分離することができる。次いで、これら幹細胞は、さらなる幹細胞培養のために、又は幹細胞を使用して治療可能である疾患、障害若しくは状態を治療するために使用することができる。別の実施態様において、幹細胞は、コラーゲンバイオファブリックを疾患、障害又は状態を治療するために使用することができる任意の適用において、コラーゲンバイオファブリックと共に使用することができる。例えば、Haririら、米国出願公開第20040048796号、Hariri & Smiell、2005年7月13日に出願の米国仮出願第60/699,441号；Lin & Ray、2005年7月13日に出願の米国仮出願第60/699,440号；及びSulnerら、2005年6月30日に出願の米国仮出願第60/696,197号を参照されたい。別の実施態様において、コラーゲンバイオファブリック上で分化した幹細胞（例えば、成体細胞）は、組織に適した適用においてコラーゲンバイオファブリックなしで使用することができる（例えば、心臓細胞に分化した幹細胞は、心臓梗塞において損傷を受けた組織を修復するために使用することができる）。別の実施態様において、分化された幹細胞は、これらが組織に適した適用において分化されたコラーゲンバイオファブリックと共に使用することができる（例えば、軟骨細胞に分化した幹細胞は、例えばダメージを受けた関節を修復するために、コラーゲンバイオファブリックと共に使用することができる）。
【０２２１】
（5.9. 化合物をスクリーニングする方法）
本発明は、幹細胞の増殖若しくは分化を調整するか、又は細胞の活性を調整する化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニングされる化合物は、小分子、薬物、ペプチド、ポリヌクレオチド、その他又はこのような候補化合物のライブラリーであることができる。細胞は、体細胞又は幹細胞であることができる。細胞は、天然に存在する細胞又は組換遺伝子産物を発現するために操作された細胞であることができる。幹細胞の状況において、コラーゲンバイオファブリックは、培養において支持細胞を置き換えることができるので、本方法は、試験化合物の支持細胞の摂動によって生じる二次効果によって複雑にされないという利点を有する。
【０２２２】
一つの態様において、本発明は、本発明のコラーゲンバイオファブリック細胞培養系を使用して、細胞に対する化合物の毒性を決定するための方法を提供する。一部の実施態様において、本方法は、前記細胞を細胞の生存のために適した条件下でコラーゲンバイオファブリックと共に培養すること、細胞を化合物と接触させること、及びアポトーシス、壊死若しくは細胞死、又はアポトーシス、壊死若しくは細胞死に向かう傾向を検出することを含む。アポトーシス、壊死、細胞死、又はこれらに向かう傾向が検出される場合、前記化合物は、化合物と接触されない細胞と比較して、前記細胞に対して有毒である。具体的実施態様において、前記細胞は、複数の前記幹細胞の一部であり、前記幹細胞のそれぞれは、アポトーシス又は細胞死に対して効果を有する前記複数の化合物のサブセットを同定するために、複数の化合物の1つと接触される。
【０２２３】
別の態様において、本発明は、例えば本発明のコラーゲンバイオファブリック細胞培養系を使用して、幹細胞の分化に対する化合物の効果を決定するための方法を提供する。一部の実施態様において、本方法は、前記細胞を細胞の分化のために適した条件下でコラーゲンバイオファブリックと共に培養することを含む。細胞は、化合物と接触される。次いで、細胞を、候補化合物の有無における分化のマーカーについて解析する。分化のマーカーは、細胞表面マーカー、細胞形態、又は1つ以上の差動的に発現される遺伝子であることができる。変化が同定される場合、前記化合物は、前記細胞の分化に対して効果を有する。具体的実施態様において、前記細胞は、複数の前記幹細胞の一部であり、前記幹細胞のそれぞれは、前記幹細胞の分化に対して効果を有する前記複数の化合物のサブセットを同定するために、複数の化合物と接触される。
【実施例】
【０２２４】
（6. 実施例）
（6.1. 実施例1：コラーゲンバイオファブリックの製造方法）
（材料）
以下の材料をコラーゲンバイオファブリックの製造に使用した。
【０２２５】
（材料／機器）
・送達記録のコピー
・材料／家族の健康歴/インフォームドコンセントのコピー
・供与源のバーコードラベル（ドナーID番号）
・収集#（連続番号が到着材料に割り当てられる）
・組織加工記録（書類ID #ANT-19F）；それぞれのロット番号の処理の詳細な記録を維持する。
・ヒト胎盤（処理開始時において48時間未満経過）
・無菌の外科用クランプ／止血薬
・無菌の剪刀
・無菌の小刀
・無菌のステリラップ（Steri-Wrap）シート
・無菌のセルスクレイパー（Nalgene Nunc Int. R0896）
・無菌のガーゼ（非無菌PSS 4416を滅菌した）
・無菌のリンスステンレス鋼トレー
・消毒された処理ステンレス鋼トレー
・消毒されたプラスチック箱
・無菌の0.9％ NaCl溶液（Baxter 2F7124）
・無菌の水（Milli Q plus 09195又はBaxter 2F7113）
・無菌の検体容器（VWR 15704-014）
・個人の防護装備（無菌及び非無菌手袋を含む）
・認定されたクリーンルーム
・以前に調製した脱細胞化溶液（D-cell）；0.01-1％のデオキシコール酸ナトリウム一水和物
・消毒された箱
・ロッキングプラットホーム（Rocking Platform）（VWR Model 100）
・タイマー（VWR 21376890）
・消毒されたプラスチックフレームメッシュ
・PVCラップフィルム
・真空ポンプ（Schuco-Vac 571 1-130）
・ゲルドライヤー（例えば、熱乾燥器；BioRad Model 583）
・消毒されたステンレス鋼裁断台
・包装のためのポーチ
・無菌のステンレス鋼定規（General Tools MFG. Co 1201）
・トレース可能なデジタル温度計（Model 61161-364, Control Company）
・アキュシール（Accu-Seal）自動シーラー（Accu-Seal, Model 630-1B6）
【０２２６】
妊婦を、出産時に、HIV、HBV、HCV、HTLV、梅毒、CMV、並びに収集される胎盤組織に混入し得るその他のウイルス及び細菌病原体などの伝染病についてスクリーニングした。上述の病原体に対して陰性又は非反応性と試験された母親のドナーから収集した組織だけを、コラーゲンバイオファブリックを産生するために使用した。
【０２２７】
通常の出生後に、胎盤、臍帯及び臍帯血を、収縮している子宮から自発的に排出させた。胎盤、臍帯及び臍帯血を、出生後に収集した。材料を研究室へ運搬し、そこでこれらを、処理の少なくとも1時間前にオンにしたHEPA濾過システムを有するクリーンルームにおいて無菌条件下で処理した。産物を扱う間、手袋（適時、無菌又は非無菌）を常に着用した。組織処理の間に発生する羊膜/絨毛膜の全ての未使用（廃棄）部分及び混入した液体は、可能な限りすぐに処分した。
【０２２８】
工程I.
無菌領域を、無菌のステリラップシートで準備し、処理のための以下の機器及びアクセサリーをその上に置いた。
・無菌のトレーパック
・無菌のセルスクレイパー
・無菌の小刀
・消毒された処理トレー
【０２２９】
無菌パックID番号を処理記録に記録した。
【０２３０】
胎盤を輸送容器から移動して、消毒されたステンレス鋼トレーの上に置いた。外科用クランプ及び剪刀を使用して、臍帯を胎盤円板からおよそ2インチ(約5.08cm)切断した。臍帯をさらなる処理のために、別の無菌容器に置いた。容器を組織IDバーコードで標識して；材料及び現在の貯蔵溶液（例えば、培地のタイプ）を同定した。場合によっては、その他のプロジェクトに要請されない場合、臍帯を廃棄した。
【０２３１】
胎盤膜の端から開始して、羊膜を指による鈍い切開を使用して漿膜から分離した。これは、膜を切断する前に行った。
【０２３２】
羊膜が絨毛膜及び胎盤円板の全表面から分離された後、羊膜を剪刀で臍帯断端周辺にて切断して、胎盤円板から剥離した。羊膜及び絨毛膜の分離が、組織を裂かずにはできない場合には、羊膜及び絨毛膜を一小片として胎盤円板から切断し、次いで別個に剥がした。
【０２３３】
絨毛膜は、別の検体容器に置いて、その他のプロジェクトのために利用した。容器は、組織IDバーコードで標識して、材料及び現在の貯蔵溶液（例えば、培地のタイプ）を同定し、イニシャルを書き、日付を記入した。
【０２３４】
羊膜の任意の小片が胎盤円板になおも付着している場合、これを円盤から剥離し、剪刀で臍帯周辺にて切断した。胎盤は、輸送容器に戻して、その他のプロジェクトのために利用した。
【０２３５】
適切なデータを組織処理記録に記録した。
【０２３６】
羊膜を無菌の0.9％ NaCl溶液と共にトレーにおいて保持した。好ましくは、羊膜は、処理の次の工程の前に、受渡し時刻から最高72時間の冷蔵によって貯蔵する。
【０２３７】
工程II.
羊膜を検体容器から一度に一片を移して、消毒されたステンレス鋼トレー上に置いた。その他の小片を、これらが清浄するための用意ができるまで、滅菌水で満たされた別の無菌のステンレス鋼トレーに置いた。処理トレーからの羊膜の余分の小片を取り除いて、滅菌水で満たされた別のリンスステンレス鋼トレーに置いた。
【０２３８】
羊膜を滅菌水でリンスして、血液物質又は胎児の液体/物質が全体的に混入した場合、必要に応じて滅菌水を交換した。
【０２３９】
羊膜を、母側が上を向くように処理トレーの上に置いた。無菌のセルスクレイパーを使用して、羊膜の母側から、できる限り多くの目に見える混入及び細胞物質を慎重に除去した（注：最小圧をこの工程に適用して膜が裂けるのを防止するべきである）。滅菌水を、細胞及び細胞の細片の除去を助けるために使用した。羊膜を別の無菌のステンレス鋼リンストレーにおいて滅菌水で更にリンスした。
【０２４０】
羊膜を、胎児側が上を向くようにひっくり返し、処理トレーに戻して、滅菌水でリンスした。セルスクレイパーを使用して、目に見える細胞物質及び細片を穏やかに除去した（注：最小圧をこの工程に適用して膜が裂けるのを防止するべきである）。滅菌水を、細胞及び細胞細片の除去を助けるために使用した。
【０２４１】
羊膜を、洗浄ラウンドの間に別の無菌のリンストレーにおいて滅菌水でリンスした。組織を、膜の両側から目に見える細胞物質及び細片の全てではないにしてもほとんどを除去するために必要な回数（洗浄ラウンド）清浄した。滅菌水は、リンスの間にリンストレーにおいて交換した。
【０２４２】
処理トレーを、それぞれの洗浄ラウンドの後に滅菌水でリンスした。
【０２４３】
全ての他の羊膜の小片を同様に処理して、同じ容器に置いた。組織IDバーコードを貼り付け、材料及び現在の貯蔵溶液（例えば、培地のタイプ）を同定して、イニシャルと日付を添付した。
【０２４４】
適切な情報及び日付を組織処理記録に記録した。
【０２４５】
工程III.
羊膜をリンストレーから（又は貯蔵容器から）移し、余剰の液体を指で外へ穏やかに絞り出し、膜を無菌の検体容器に置いた。容器を、D-cell溶液で150mlのマークまで満たし、確実に羊膜の全てを覆って、容器を閉じた。
【０２４６】
容器をロッキングプラットホーム上の箱に置いた。ロッキングプラットホームをオンにして、膜を設定#6にて最小15分及び最高120分間D-cell溶液中で撹拌した。
【０２４７】
新たな無菌領域を、工程Iと同じ様式で新たな無菌の機器及び消毒したトレーで準備した。無菌パックのID番号を処理記録に記録した。
【０２４８】
撹拌が完了した後、ロッキングプラットホームをオフにし、膜を容器から移した。膜を新たな無菌のステンレス鋼処理トレーに置いた。無菌の0.9％ NaCl溶液を添加してトレーの底面を覆った。
【０２４９】
新しい無菌のセルスクレイパーを使用して、残留するD-cell及び細胞物質（もしあれば）を組織の両面から除去した。この工程は、両側の全表面から目に見えて残留する細胞物質を可能な限り除去するために必要とされる回数繰り返した。膜を、洗浄ラウンドの間に別のリンストレーにおいて無菌の0.9％ NaCl溶液でリンスした。無菌の0.9％ NaCl溶液は、リンスの間にリンストレーにおいて交換した。
【０２５０】
最後の洗浄ラウンドを完了した後、膜を無菌の0.9％ NaCl溶液でリンスして、無菌の0.9％ NaCl溶液で満たされた新たな無菌の検体容器に置いた。
【０２５１】
羊膜の全ての残りの小片を正確に同じ様式で処理した。
【０２５２】
全ての羊膜小片が処理され、無菌の0.9％ NaCl溶液と共に容器に存在するときに、容器をロッキングプラットホーム上の箱に置いて、設定#6にて最小5分間撹拌した。撹拌が完了した後、膜を検体容器から移し、無菌の0.9％ NaCl溶液を容器において交換し、膜を検体容器に戻し置いた。
【０２５３】
検体容器を組織IDバーコード及び検疫ラベルで標識した。材料及び現在の貯蔵溶液（例えば、培地のタイプ）を同定して、イニシャルを書き、日付を入れた。検体容器を清潔なジップ-ロックバッグに置き、冷蔵庫（2〜8℃）に置いた。
【０２５４】
全ての適切なデータを組織処理記録に記録した。
【０２５５】
血清学的結果が利用できるようになったときに、適切なラベル（血清学的に陰性又は研究使用のためのみ）を検疫ラベルの上に置き、これらの容器を検疫されたものから分けた。
【０２５６】
工程IV.
工程IVを進める前に、全ての適用できる試験結果が陰性であったことを確認するために組織状態レビューを調べた。
【０２５７】
無菌領域を、無菌のステリラップシートで準備し、全ての無菌及び消毒された機器、並びにアクセサリーを工程II及びIIIと同様に準備した。
【０２５８】
膜を冷蔵庫から移して、新たな無菌のステンレス鋼処理トレーに置いた。無菌の0.9％ NaCl溶液を添加して、トレーの底面を覆った。
【０２５９】
全ての目に見える細胞物質及び細片（もしあれば）を新たな無菌のセルスクレイパーを使用して穏やかに除去した（注：最小圧をこの工程に適用して膜が裂けるのを防止するべきである）。無菌の0.9％ NaCl溶液を細胞及び細片の除去を助けるために使用した。
【０２６０】
膜を無菌の0.9％ NaCl溶液で満たされた別の無菌のステンレス鋼リンストレーにおいてリンスした。0.9％ NaCl溶液を洗浄ラウンドの間に交換した。膜を新たな無菌の検体容器に置き、容器を新鮮な無菌の0.9％ NaCl溶液で満たして、設定#6にて最小5分間の撹拌のためにロッキングプラットホーム上に置いた。
【０２６１】
先の工程を3回繰り返し、無菌の0.9％ NaCl溶液をそれぞれの撹拌の間に交換した。適切なデータを組織処理記録に記録した。
【０２６２】
膜を検体容器から一度に一片移して、余剰の液体を指で外へ穏やかに絞り出し、膜を無菌の処理トレーに置いた。膜を平らになるまで穏やかに伸ばし；確実に胎児面を下にした。
【０２６３】
フレームは、消毒したプラスチックシートを無菌の剪刀で切断することによって調製した。フレームのサイズは、それぞれの方向において、膜セグメントよりもおよそ0.5cm小さくすべきである。フレームを無菌の0.9％ NaCl溶液で満たされたリンストレーにおいてリンスした。
【０２６４】
フレームをわずかに伸ばした膜表面の上に置き、穏やかにそれの上で押圧した。プラスチックフレームの平滑な側は、組織に面することが肝要である。
【０２６５】
小刀を使用して、膜をフレーム周辺で切断し、フレーム縁を越えておよそ0.5cmの延長を残した。余剰の膜を検体容器に戻した。
【０２６６】
フレームを越えて延長した膜の縁により、クランプ又はピンセットを使用してフレームの縁を包み込み、同じトレーに置いた。
【０２６７】
次の膜の小片も同じ様式で処理した。乾燥される総領域は、熱乾燥器あたり300 cm2を上回らないことが好ましい。膜の小片を「フレームアウトする」一方で、フレーム処理されていない小片は、容器において無菌の0.9％ NaCl溶液中のままであることが好ましい。
【０２６８】
乾燥器の乾燥温度をセットして、延長プローブを備えた較正デジタル温度計を使用して検証した。乾燥温度は、50℃にセットした。データを組織処理記録に記録した。
【０２６９】
真空ポンプをオンにした。
【０２７０】
滅菌ガーゼを熱乾燥器の乾燥プラットフォームの上に置き、フレーム処理した膜の領域よりもわずかに大きな領域を覆った。ガーゼ層の総厚みは、一つの折りたたんだ4×4ガーゼの厚みを上回らないようにすることが重要である。
【０２７１】
一つのプラスチックフレームメッシュのシートをガーゼの上に置いた。プラスチックメッシュの縁は、ガーゼの縁を超えておよそ0.5〜1.0cm伸長すべきである。
【０２７２】
フレーム処理した膜を穏やかに持ち上げ、プラスチックメッシュの上に膜側を上に向けて熱乾燥器プラットフォームの上に置いた。膜の最大量（300cm2を上回らない）が熱乾燥器プラットフォームの上になるまで、これを繰り返した。（注：羊膜の胎児の面が上を向いている）。
【０２７３】
PVCラップフィルムの小片を、熱乾燥器更に余分の脚部の全乾燥プラットフォームを覆うのに十分な大きさに切断した。
【０２７４】
真空ポンプ運転により、熱乾燥器の全乾燥プラットフォームを、両側の乾燥プラットフォームの縁を越えて伸長している脚部の1/2を残して、プラスチックフィルムで穏やかに覆った。フィルムが膜及びフレームシートに対してぴんと引っ張ること（すなわち、これが、真空によって「吸い込まれる」）、並びに組織領域において空気の漏れ及びしわがないことに注意を払った。その後、蓋を閉じた。
【０２７５】
真空ポンプは、およそ-22インチ(約-55.88cm)Hgの真空に設定した。ポンプゲージは、乾燥ラウンドの2〜3分後に記録した。膜をおよそ60分間熱真空乾燥させた。乾燥過程のおよそ15〜30分後に、滅菌ガーゼ層を熱乾燥器において新たなものと置き換えた。ガーゼ層の総厚みは、一つの折り畳まれた4×4ガーゼの厚みを上回ってはならない。
【０２７６】
交換後、プラスチックフィルムが、膜及びフレームシートに対してぴんと引っ張られ、かつ膜領域において空気の漏れ及びしわがないように注意を払った。
【０２７７】
真空シールの完全性を、ポンプ圧モノメーターを調べることによって周期的に調べた。乾燥過程の完了後、熱乾燥器を開けて、膜をポンプ運転によっておよそ2分間冷却した。
【０２７８】
新たな無菌領域を、無菌のステリラップで準備して、その下に消毒したステンレス鋼裁断台を置いた。この時点で、無菌の手袋を使用した。なおもポンプを運転しながら、角から始めて手袋をした手で膜シートを下にもってプラスチックフィルムを膜シートから除去した。フレームを膜と共に乾燥プラットフォームから穏やかに持ち上げ、膜側を上に向けて消毒されたステンレス鋼裁断台の上の無菌領域に置いた。小刀を使用して、膜シートを切断し、フレームの縁から1〜2mm離れた縁に沿って切り込みを作った。膜を、手袋（無菌の手袋）をした手で適当な状態に保持した。穏やかに膜シートを、ゆっくりそれを剥くことによってフレームから持ち上げ、次いで裁断台上の無菌領域の上に置いた。
【０２７９】
小刀又は鋭い剪刀を使用して、膜シートを特定されたサイズの切片に切断した。全ての小片を切断して、パッケージングの前に無菌領域の上に確保した。もう一方の手（非無菌）でポーチをもちながら、膜の一つの小片を一方の手（無菌）で内部剥離ポーチパッケージの内側に置いた。「無菌の」手でポーチをさわらないように注意を払った。全ての小片を内部ポーチの内側に置いた後、これらの封をした。適切な情報（例えば、パート#、ロット#、その他）をもつラベルをポーチの外側の指定領域に貼り付けた。膜の全ての小片を同様に処理した。標識して、封をした剥離ポーチパッケージは、これらが滅菌施設又は分配者に出荷されるまで、貯蔵のために防水ジップロックバッグ内に置いた。全ての適切なデータを組織処理記録に記録した。
【０２８０】
（6.2. 実施例2：コラーゲンバイオファブリックを製造する別の方法）
胎盤は、実質的に実施例1の工程Iに記載されているように、その実施例の材料を使用して調製した。妊婦を、出産時に、HIV、HBV、HCV、HTLV、梅毒、CMV、並びに収集される胎盤組織に混入し得るその他のウイルス及び細菌病原体などの伝染病についてスクリーニングした。上述の病原体に対して陰性又は非反応性と試験された母親のドナーから収集した組織だけを、コラーゲンバイオファブリックを産生するために使用した。
【０２８１】
無菌領域を、無菌のステリラップシートで準備し、処理のための以下の機器及びアクセサリーをその上に置いた：無菌のトレーパック；リンストレー、ステンレス鋼カップ、クランプ／止血鉗子、ピンセット、剪刀、ガーゼ。
【０２８２】
胎盤を輸送容器から取り出して、消毒されたステンレス鋼トレーの上に置く。外科用クランプ及び剪刀を使用して、臍帯を胎盤円板からおよそ2インチ(約5.08cm)切断する。
【０２８３】
胎盤膜の端から開始して、羊膜を指による鈍い切開を使用して漿膜から分離する。これは、膜を切断する前に行う。羊膜を絨毛膜及び胎盤円板の全表面から分離した後、羊膜を剪刀で臍帯断端周辺にて切断し、胎盤円板から剥離する。羊膜及び絨毛膜の分離が、組織を裂かずにはできない場合には、羊膜及び絨毛膜を一小片として胎盤円板から切断し、次いで別個に剥がす。
【０２８４】
適切なデータを組織処理記録に記録する。
【０２８５】
羊膜を無菌の0.9％ NaCl溶液でリンスして、血液及び胎児の液体又は物質を除去する。生理食塩水溶液を、このリンスの間に必要に応じて置き換える。
【０２８６】
次いで、羊膜を検体容器の0.9％ 生理食塩水、1.0％ デオキシコール酸溶液中に置き、3〜5日毎の溶液の交換と共に、15日までの間2〜8℃にて冷蔵する。インキュベーションの間又は終了時に、上記の血清学的検査を評価する。検査が1つ以上の病原体による混入を示す場合、羊膜を不採用とし、さらなる処理はしない。しかし、CMV-陽性ドナー由来と示される組織は、バイオファブリックの産生のためになおも適している。
【０２８７】
一旦インキュベーションが完了したら、羊膜を検体容器から取り出して、無菌のトレーに置き、組織からのデオキシコール酸を減少させるために0.9％ NaCl溶液で3回リンスする。羊膜は母側を上にして置いて、羊膜をセルスクレイパーで穏やかに掻爬し、細胞物質をできるだけ多く除去する。さらなる生理食塩水を、必要に応じて細胞及び細胞細片の除去を助けるために添加する。この工程を羊膜の胎児側についても繰り返す。掻爬には、リンスを伴い、両側とも、細胞及び細胞物質を除去するために必要とする回数繰り返す。掻爬した羊膜を、ロッキングプラットホーム上の別の容器の0.9％ 生理食塩水中に羊膜を置くことによって設定#6にて5〜120分間リンスする。生理食塩水溶液を交換し、ロッキングによるリンスを繰り返す。
【０２８８】
リンスが完了した後、羊膜を任意に冷蔵庫のジップロックバッグにおいて貯蔵する。
【０２８９】
次いで、掻爬した羊膜を無菌の処理トレーの上に胎児側を下にして置いた。羊膜を手で穏やかにマッサージして過剰な液体を除去し、かつ膜を平らにする。無菌のプラスチックシートを、その寸法がそれぞれの方向において平らな羊膜よりもおよそ0.5cm小さいように切断する。このプラスチックシートを0.9％ NaCl溶液中で簡単にリンスする。プラスチックシートを、平滑面を下にして、平らな羊膜の上に置き、覆われていない羊膜の縁をそのままにする。小刀を使用して羊膜を切り落とし、シート縁を超えておよそ0.5cm延長したままにする。これらの延長した羊膜の縁をプラスチックシートで包み戻す。乾燥させる総組織領域は、標準的な真空熱乾燥器について300cm2を上回らない。
【０２９０】
1枚の滅菌ガーゼを、真空熱乾燥器に置く。薄いプラスチックメッシュを、およそ0.5〜10.0cmがガーゼの縁から延長するようにガーゼの上に置く。次いで、羊膜及びプラスチックシートを、メッシュ上に、組織面を上にして、真空熱乾燥器内に置き、羊膜を1枚のPVCラップフィルムで覆う。乾燥器を50℃にセットし、温度を周期的に調べて確実に50℃±1℃を維持する。次いで、真空ポンプをオンにし、およそ-22インチ(約-55.88cm)Hg真空にセットする。乾燥を60分間進行させる。
【０２９１】
次いで、乾燥羊膜を、更に使用するために封をしたプラスチック容器において貯蔵する。
【０２９２】
（6.3. 実施例3：コラーゲンバイオファブリックの積層）
上記の方法によって産生したコラーゲンバイオファブリックを以下の通りに積層した。乾燥コラーゲンバイオファブリックを、一部の場合には、無菌の0.9％ NaCl溶液において1時間、10分〜1時間、30分間再水和させた。乾燥コラーゲンバイオファブリックを上（実施例1）で概説した全ての手順によって産生して、次いで積層した；湿ったコラーゲンバイオファブリックを工程IIIまで調製し、次いで積層した。取り付けフレームを切断した後、再水和した組織を、胎児面を下に置いて、組織の上に取り付けフレームを置いて、フレーム周辺に約1cmの縁を残して組織を切断することによって取り付けた。1cmの縁を、細胞スクレイパーを使用してフレームの縁を覆うように折り畳んだ。これらの工程を、湿ったコラーゲンバイオファブリックのさらなる小片を添加するために繰り返した。次いで、積層したバイオファブリックをゲル乾燥器に置き、実質的に乾燥（重量の＜20％の含水量）まで乾燥した。次いで、積層品を2×6 cmの試料に切断した。
【０２９３】
別のロットの積層コラーゲンバイオファブリックを以下の通りに評価した。乾燥（DT）及び湿った（WT）積層したコラーゲンバイオファブリックの寸法を、表1に示したように、2、3、5又は8層を含む積層品について決定した。
【０２９４】
【表１】
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【０２９５】
室温にて乾燥条件下で保存したときに、検体は、積層後の最初の2日間にわたって剥離の徴候を示さなかった。積層コラーゲンバイオファブリックは、更に、撹拌した0.9％ 生理食塩水において室温で10日間保持したときに、剥離の徴候を示さなかった。
【０２９６】
より大きな積層したコラーゲンバイオファブリック検体を、積層耐久性及び剥離に対する耐性について試験した。上に一覧を示した一覧（すなわちDT2、DT3、WT2、WT3、WT5及びWT8）からの1×2 cmの検体を、ペトリトレーの5ml リン酸緩衝生理食塩水中に置いた。検体を95回転数/分にておよそ24時間のオービタルシェーカー上においたままにした。検体の剥離は、振盪の間又はその後の簡単な取扱いの間のいずれにおいても観察されなかった。
【０２９７】
（6.4. 実施例4：コラーゲンバイオファブリックを使用して幹細胞を培養するためのキット）
本実施例は、コラーゲンバイオファブリックを使用して幹細胞を培養し、増殖し、又は分化するためのキットを提供する。
【０２９８】
キットは、密封容器において、幹細胞を培養し、増殖し、又は分化するために適した複数のマイクロウェルプレートを含む。マイクロウェルプレートは、細胞培養のための6、12、24又は96ウェルを含んでいてもよい。それぞれのウェルにおいて、コラーゲンバイオファブリック又はコラーゲンバイオファブリック積層品の単一のシートを提供する。コラーゲンバイオファブリック及びコラーゲンバイオファブリック積層品は、上記の実施例1〜3に記載されているように産生し、調製される。
【０２９９】
また、キットは、幹細胞を培養し、増殖し、又は分化するための説明書のセットを含む。加えて、キットは、幹細胞を培養し、増殖し、又は分化するために適した培養液の1つ以上の容器及び幹細胞の成長又は分化を促進する1つ以上の薬剤を含む。
【０３００】
（6.5. 実施例5：コラーゲンバイオファブリックを使用するヒト胎盤幹細胞の培養、増殖及び分化）
本実施例は、コラーゲンバイオファブリックを使用するヒト胎盤幹細胞の培養、増殖又は分化を提供する。
【０３０１】
本明細書に利用されるヒト胎盤幹細胞は、米国出願公開番号2003/032179に記述されている。このような細胞は、OCT-4+及びABC-p+である。ヒト胎盤幹細胞は、子宮からの娩出後の胎盤から得られる。簡潔には、胎盤から放血させ、抗凝固薬が溶解されている水性等張液などの適切な水性灌流液体で灌流する。放血及び胎盤の十分な時間の灌流の後、胎盤幹細胞は、胎盤の放血及び灌流された微小循環に移動することが観察される。胎盤において十分な時間培養した後、流出灌流液を収集容器に収集して、胎盤幹細胞を収集する。胎盤から収集された胎盤細胞は、当業者に公知の技術、例えば密度勾配遠心分離、フローサイトメトリーなどを使用して、流出灌流液から回収する。
【０３０２】
次いで、胎盤幹細胞を、実施例4において提供したキットを使用してコラーゲンバイオファブリックで培養する。約1〜5×105細胞をキットのマイクロウェルプレートのそれぞれのウェルのコラーゲンバイオファブリック上にまく。5mlの培養液をそれぞれのウェルに添加する。培養液には、60％ DMEM-LG（Gibco）、40％ MCDB-201（Sigma）、2％ ウシ胎児血清（FCS）（Hyclone ory）、1xインスリン-トランスフェリン-セレン（ITS）、1x流出レノレイン酸-ウシ血清アルブミン（LA-BSA）、10-9M デキサメサゾン（Sigma）、10-4M アスコルビン酸2-ホスフェート（Sigma）、上皮細胞成長因子（EGF）10ng/ml（R&D Systems）、血小板由来増殖因子（PDGF-BB）10ng/ml（R&D Systems）及びIOOU ペニシリン/1000Uストレプトマイシンを含む。
【０３０３】
マイクロウェルプレートをインキュベーターにおいて37℃にて5％ CO2で加湿された空気中で培養して、細胞の回復及び付着をさせる。全ての培養液を2日毎に交換する。
【０３０４】
ヒト胎盤幹細胞を以下の通りにニューロンに分化するように誘導する。ヒト胎盤幹細胞をDMEM/20％ FBS及び1mM β-メルカプトエタノールからなる前誘発培地にて24時間、実施例4のキットを使用してコラーゲンバイオファブリックと共に培養する。前誘発培地を除去し、細胞をPBSで洗浄する。DMEM及び1〜10mM β-メルカプトエタノールからなるニューロン誘導培地を添加する。或いは、DMEM/2％ DMSO/200 μMブチルヒドロキシアニゾールからなる誘導培地を使用して、神経分化効率を増強してもよい。特定の実施態様において、形態学的及び分子変化は、無血清培地及びβメルカプトエタノールに対する曝露の後60分程度の早期に生じるであろう（Woodburyらの論文、J. Neurosci. Res. 61：364-370）。RT/PCRを使用して、神経分化の指標である神経成長因子受容体及び神経フィラメント重鎖遺伝子の発現を検出する。また、細胞を、例えば樹状突起及び/又は軸索の発達などのニューロン表現型の発達について調べる。
【０３０５】
ヒト胎盤幹細胞を以下の通りに脂肪細胞に分化するように誘導する。ヒト胎盤幹細胞を実施例4のキットを使用してコラーゲンバイオファブリックと共に50〜70％集密度に培養し、（1）2％ FCS、0.5％ ヒドロコルチゾン、0.5mMイソブチルメチルキサンチン、60μMインドメタシンを含むDMEM/MCDB-201；又は（2）2％ FCS及び0.5％ リノール酸を含むDMEM/MCDB-201；を含む培地で誘導する。細胞を形態学的変化について調べる。典型的には、油滴が3〜7日後に現れる。分化は、脂肪生成と関連する特異的遺伝子、すなわちPPAR-γ2、aP-2、リポ蛋白リパーゼ及びオステオポンチンの発現を調べるための定量的リアルタイムPCRによって評価する。
【０３０６】
胎盤幹細胞の軟骨形成性分化は、以下の通りに達成される。胎盤幹細胞を、MSCGM（Cambrex）又は15％ 臍帯血清を補ったDMEMにおいて、実施例4のキットを使用してコラーゲンバイオファブリックと共に培養する。胎盤幹細胞を無菌のポリプロピレンチューブに一定分量とる。細胞を遠心分離し（5分間、150×g）、不完全軟骨形成培地（Cambrex）中で2回洗浄する。最後の洗浄の後、細胞を0.01μg/ml TGFβ-3を含む完全軟骨形成培地（Cambrex）中に5×10（5）細胞/mlの濃度にて再懸濁する。0.5 mlの細胞を15mlのポリプロピレン培養試験管に一定分量とる。細胞を5分間、150×gにてペレットにする。ペレットは、培地中で無処置のままにする。ゆるくふたを閉めたチューブを37℃、5％ CO2にて24時間インキュベートする。細胞ペレットには、2〜3日毎に新たに調製した完全軟骨形成培地を供給する。ペレットは、低速ボルテックスを使用して日々撹拌することによって、培地中で懸濁させて維持する。軟骨形成細胞のペレットを培養における14〜28日後に収集する。軟骨形成は、例えば好酸球性物質の産生の観察、細胞形態の評価、並びに／又はコラーゲン2及び／若しくはコラーゲン9遺伝子発現のRT/PCRによる確認並びに／又はアルシアンブルー細胞化学染色によって確認される軟骨基質酸性ムコ多糖類の産生により評価する。
【０３０７】
胎盤幹細胞の骨原性分化は、以下の通りに達成される。胎盤幹細胞を骨原性培地において、実施例4のキットを使用してコラーゲンバイオファブリックと共に培養する。骨原性培地は、185mLのCambrex分化基本培地-Osteogenic and SingleQuots（デキサメサゾン、L-グルタミン、アスコルベート、ペニシリン/ストレプトマイシン、MCGS、及びβ-グリセロリン酸のそれぞれ1つ）から調製される。灌流液からの胎盤幹細胞を1cm2の組織培養領域あたり0.2〜0.3mL MSCGMにおいて、1cm2の組織培養表面領域あたり約3×103細胞にてまく。典型的には、全ての細胞は、MSCGM中で37℃にて5％のCO2において、4〜24時間培養表面に付着させる。骨原性分化を、培地を骨原性分化培地と置換することによって誘導する。細胞形態は、接着性胎盤幹細胞の典型的な軸状の外見から、ミネラル化を伴う立方状の外見に変化し始める。いくつかの細胞は、分化の間に組織培養表面から剥離する。
【０３０８】
胎盤幹細胞の膵臓への分化は、以下の通りに達成される。胎盤幹細胞を塩基性線維芽細胞成長因子、10ng/ml；及びトランスフォーミング増殖因子β-1、2ng/mlを補ったDMEM/20％ CBSにおいて、実施例4のキットを使用してコラーゲンバイオファブリックと共に培養する。ノックアウト血清交換（KnockOut Serum Replacement）をCBSの代わりに使用してもよい。ネスチン陽性のニューロン細胞培養からの条件培地を、50/50濃度にて培地に添加する。細胞を14〜28日間培養し、3〜4日毎に再度養分供給する。分化は、インスリンタンパク質又はRT/PCRによるインスリンインスリン遺伝子発現についてアッセイすることによって特徴づける。
【０３０９】
胎盤幹細胞の筋原性（心臓）分化は、以下の通りに達成される。胎盤幹細胞は、レチノイン酸、1μM；塩基性線維芽細胞成長因子、10ng/ml；及びトランスフォーミング増殖因子β-1、2ng/ml；及び上皮細胞成長因子、100ng/mlを補ったDMEM/20％ CBSにおいて、実施例4のキットを使用してコラーゲンバイオファブリックと共に培養する。ノックアウト血清交換（KnockOut Serum Replacement）（Invitrogen、Carlsbad、California）をCBSの代わりに使用してもよい。或いは、胎盤幹細胞を、50ng/ml カルジオトロピン-1を補ったDMEM/20％ CBSにおいて24時間培養する。或いは、胎盤幹細胞を無タンパク質の培地中で5〜7日間維持し、次いでヒト心筋抽出物で刺激する（用量を増大して解析）。心筋抽出物は、1％ 臍帯血清を補った1％ HEPES緩衝液において、1gmのヒト心筋をホモジナイズすることによって産生する。懸濁液を60分間インキュベートし、次いで遠心分離し、上清を収集する。細胞を、10〜14日間培養し、3〜4日毎に再度養分供給する。分化は、RT/PCRによる心臓アクチン遺伝子発現の実証によって確認する。
【０３１０】
（6.6. 実施例6：羊膜上での胎盤幹細胞及び線維芽細胞の培養）
組織工学の主な目標は、病気又は失われた組織/器官の置換のための、生きている組織/器官の再生である。羊膜は、細胞接着性及び分化のための天然の微小環境を提供するための優れた足場である。
【０３１１】
膜標本。本明細書に記述したように調製された羊膜は、正常な満期妊娠の胎盤に由来した。羊膜産物は、洗浄剤に浸すこと及び機械的掻爬の組み合わせを使用して脱細胞化した。最終製品は、穏やかな温度にて脱水して、放射線によって定期的に滅菌した。
【０３１２】
細胞アッセイ法。本明細書に記述したような酵素消化によって得られる正常なヒト皮膚線維芽細胞（Cambrex）又は胎盤幹細胞を、羊膜上、フィブロネクチン-(Sigma）又はVITROGEN（商標）-（Cohesionからのウシコラーゲン）をコートした表面上において4又は24時間培養した。基質上の培養細胞をホルマリン中で固定して、F-アクチンを染色した。
【０３１３】
結果。播種後4時間にて、異なる形態が種々の表面に応答して観察された。フィブロネクチン上の線維芽細胞は、十分に広がっており、接着細胞の表現型の特徴であるアクチンストレスファイバーを示し、一方、コラーゲン上の線維芽細胞は、広がってはいなかったが、その代わりに多数の糸状仮足の投射を示した。羊膜上の線維芽細胞は、フィブロネクチン上で培養された細胞と形態学的に極めて類似しているようにみえる。24時間までに、種々の基質間の細胞形態の相違は、あまり明らかではない。胎盤幹細胞は、実験基質に付着して、線維芽細胞のものと同様の特異な細胞形態を示した。
【０３１４】
別の実験において、乾燥羊膜における接着性胎盤幹細胞の培養の特徴を、フィブロネクチン、コラーゲン又はガラス上の培養の特徴と比較した。カバーガラス表面を10μg/mLフィブロネクチン又は500μg/mL VITROGEN（商標）で吸着した。乾燥羊膜を24ウェルプレートの底面にシリコーンリングで固着させた。胎盤幹細胞を、フィブロネクチン、VITROGEN（商標）、ガラス又は羊膜上におよそ1×104細胞/cm2にて24時間培養した。次いで、細胞を固定して、アクチン細胞骨格を染色した。結果は、羊膜上に広がった胎盤幹細胞が、フィブロネクチン-コートした表面上で観察されるものと非常に類似していることを示した。また、胎盤幹細胞は、細胞培養で処理したカバーガラス及びコラーゲン上にも広がるが、胎盤幹細胞は、比べるとより薄く、伸長した細胞を示すようであった。図1を参照されたい。
【０３１５】
結論。細胞内アクチン細胞骨格の動的構造再編成は、接着、遊走及び増殖などの多くの細胞の活性の基礎をなし、そこに存在する細胞外環境は、これらの細胞の挙動を調節する役割を果たす。羊膜上で培養した線維芽細胞及び胎盤幹細胞は、細胞付着及び成長に最適であることが知られている基質であるタンパク質のフィブロネクチン上で培養した細胞と同様の細胞拡張動態を示した。これは、羊膜が主にコラーゲンで構成されているが、その他の微量成分も、細胞接着及び増殖に影響し得ることを示唆する。また、これらの結果は、未分化及び末端分化の両方のこの研究に使用した細胞では、羊膜が接着のための、及び機能性のための適切な足場だと分かることを示唆する。
【０３１６】
（6.7. 実施例7：羊膜上での胎盤幹細胞の分化）
本実施例は、乾燥羊膜上での胎盤幹細胞の骨原性分化を証明する。
【０３１７】
材料
骨原性分化培地： 10％ ウシ胎児血清（FBS）及び1×P/S + 5OμM アスコルビン酸 + 100nM デキサメタゾン + 10mM βグリセロールリン酸（BGP）を補ったDMEM低グルコース。
【０３１８】
基本培地：10％ FBS及び1×P/Sを伴うDMEM低グルコース
【０３１９】
代わりの炭素源培地：10％ FBS及び1×P/S +10mM BGPを伴うDMEM低グルコースを、これらの細胞がリン酸供与源単独で誘導性であるかどうかを知るために使用した。
【０３２０】
方法
無菌の脱水羊膜を6×8cmシートからおよそ単一のウェル（約1.5cmの直径）のサイズに切断した。シリコーンオーリングによって適所に保持させた羊膜小片をウェル（約1.5cmの直径）のサイズに切断した。胎盤幹細胞、骨髄由来幹細胞（BMSC）及び正常ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）細胞を、10％ FBS及び1×P/Sを伴うDMEMにおいて、約10000細胞/cm2にて膜上に播種した。細胞を5％ CO2において37℃にて2〜3日にわたって培養させた。次いで、培地を分化培地、基本培地又はβグリセロールリン酸（BGP）を含む基本培地に切り替えた。分化を21日間進行させた。培地を2〜3日毎に交換した。
【０３２１】
Mallory-Heidenhain染色技術を使用する組織学的染色を使用して、骨原性分化を評価した。James E. Dennisらの論文、「インビボにおけるの骨形成アッセイ；定量解析のための迅速な方法」、Biomaterials 19：1323-1328（1998）を参照されたい。簡潔には、幹細胞培養を4％ パラホルムアルデヒド中で固定して、パラフィンに包埋した。5μm薄の切片をパラフィンブロックからガラススライド上に切断した。
【０３２２】
染色液の調製。0.5％ 酸性フクシン： 0.5gの酸性フクシンの100mlの蒸留水溶液。アニリンブルー溶液：0.5gアニリンブルー、2g オレンジG、1g リンタングステン酸を100mlの蒸留水に溶解する。全ての試薬は、Sigma-Aldrichからのものであった。
【０３２３】
手順：切片を、キシレンを使用して脱パラフィン化して、段階的エタノールを介して再水和した。次いで、切片を蒸留水でリンスして、染色した。切片を最初に酸性フクシン溶液中で5分間染色した。過剰の色素をスライドから拭い、スライドをアニリンブルー溶液に1時間浸漬した。スライドを95％のエタノールに移して数回交換し、過剰な色素を除去した。切片をきれいに脱水して、合成樹脂に取り付けた。
【０３２４】
（6.8. 実施例8：架橋ヒアルロン酸を含むコラーゲンバイオファブリックの製造）
本実施例は、幹細胞、例えば胎盤幹細胞の培養に使用するための、架橋されたヒアルロン酸コーティングを含む複合コラーゲンバイオファブリックの産生を証明する。
【０３２５】
材料及び方法
コラーゲンバイオファブリックは、脱水された（20％以下の水）、脱細胞された羊膜として提供した。ヒアルロン酸（Fluka BioChimika）を、超純水中の10mg/mLの溶液として提供した。使用した架橋剤は、1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル（BDDE；Sigma Aldrich）、l-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド（EDCI；Sigma Aldrich）又はジビニルスルホン（Fluka）であった。
【０３２６】
ヒアルロン酸複合物
ヒアルロン酸は、容易に利用でき、安価かつ生体適合性のグリコサミノグリカンであり、これは、優れた水保持及び流動特性を有する。
【０３２７】
2つの異なるヒアルロン酸架橋の方法を評価した。ヒアルロン酸をBDDE又はジビニルスルホンのいずれかを使用して、溶液中でヒアルロン酸とそれぞれの架橋剤を組み合わせること、及び一晩撹拌することを含む溶液架橋を使用して架橋した。また、ヒアルロン酸を液浸架橋によってEDCIを使用して架橋し、この場合ヒアルロン酸が固体フィルム又は泡として調製され、続いて架橋剤を含む溶液中で組成物を液浸した。
【０３２８】
ヒアルロン酸溶液を、超純水を使用して作製した。最初に、pHがあまりに高い場合、架橋は、生じないであろうが、架橋は、超純水中で問題なく進行したことを決定した。
【０３２９】
ヒアルロン酸（10mg/ml）の2ml溶液を調製し、BDDE（溶液；2μL/mgヒアルロン酸）又はEDCI（液浸法による；15mM EDCIの80：20 EtOH：水溶液）のいずれかで架橋した。両技術とも、良好に架橋されたフィルムを産生した。視覚的には、 BDDE架橋されたフィルムは、EDCI架橋されたフィルムよりも遙かに多く膨張するように見え、示差走査熱量測定（DSC）解析によって確認した評価で、EDCI架橋されたフィルムが、BDDE架橋されたフィルムよりも多くの架橋を含むことを示した。FTIR解析によれば、本質的に、架橋剤は、ヒアルロン酸フィルムに残らなかった。
【０３３０】
BDDE架橋されたフィルムで注目される大量の膨張のため、架橋密度を増加した。試料を、溶液におけるヒアルロン酸1ミリグラムあたり1、2又は4μLの架橋剤で調製した。架橋は、pH 5又はpH 7にて行った。いずれの場合においても、溶液を一晩架橋して、凍結乾燥してスポンジ様の泡を産生した。1ミリグラムのヒアルロン酸あたり4μL BDDEで産生される泡は、非常に壊れやすく、軽く、水中に置くと、これらは粥状に砕けた。その他の組み合わせでは、許容し得る構造を有する泡を生じ、水中でかなり膨張した。pHもBDDEの量いずれも、平衡含水量（93％〜98％）に、又はFTIRによって定まる構造における相違を生じるようには見えなかった。
【０３３１】
ヒアルロン酸と乾燥羊膜とを組み合わせるためのいくつかのストラテジーを試みた。最初に、架橋されたヒアルロン酸溶液を調製し、1 mLを膜の動作及び溶液の漏出を防止するフレームに保持した乾燥羊膜の切片上に置いた。複合物を空気乾燥し、優れた接着が注目された。しかし、水に置いたときに、羊膜とヒアルロン酸とは分離した。
【０３３２】
第2のストラテジーでは、1mLのヒアルロン酸溶液を羊膜上に置き、複合物を凍結乾燥した。乾燥後、複合物をEDCIの80：20のEtOH：水溶液に浸漬した。しかし、再度凍結乾燥したときに、HAは、羊膜の中から引き抜かれた。自然乾燥が第2の凍結乾燥に置き換えたときに、羊膜とヒアルロン酸との間に堅い結合が形成された。水に置いたときに、ヒアルロン酸は、膜から分離せずに膨張した。
【０３３３】
ヒアルロン酸を含むコラーゲンバイオファブリックは、本明細書に記述したように、培養幹細胞、例えば胎盤幹細胞、例えばCD34-胎盤幹細胞に使用することができる。
【０３３４】
均等物；
本発明は、本明細書に記述された具体的実施態様による範囲に限定されない。実際に、記述したものに加えて本発明の種々の改変は、前述の記述及び添付の図から当業者に明らかになるであろう。このような改変は、添付の請求の範囲内に入ることが意図される。
【０３３５】
種々の刊行物、特許及び特許出願が本明細書に引用されており、これらの開示は、その全体が参照により組み込まれる。
【図１】
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【国際調査報告】
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