(57)【要約】本発明は、液体サンプル中の検体を判定するための装置に関する。本発明の装置は：  横向き移動が関与し、参照毛管作用方向を規定し、液体サンプル沈着領域(3)、および沈着領域の下流に配置される検体検出領域(5)を具備している毛管作用手段(1)；視認可能な及び／又は測定可能なマーカーに結合され、湿った場合に前述の毛管作用手段(1)における毛管作用の手段によって参照方向に沿って自由に移動する第一の検体に特異的な結合試薬(4)；および検出領域に固定化された第二の検体に特異的な結合試薬(6)からなる。本発明は、検出領域（5）が第二の特異的な結合試薬（6）から特定の距離で固定化および配置された検体（7）または検体のアナログを具備することを特徴とする。
2009506315.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体サンプル中の検体を判定するための装置であって：
参照毛管作用方向を規定し横向き移動が関与し、液体サンプル沈着領域(3)、および前記沈着領域の下流に配置される検体検出領域(5)を具備している、毛管作用手段(1)、
視認可能な及び／又は測定可能なマーカーに結合し、湿った場合に、前記毛管作用手段(1)において参照方向に沿う毛管作用の手段で、自由に移動する、第一の検体に特異的な結合試薬(4)、
検出領域(5)が第二の特異的な結合試薬(6)から特定の距離で固定化および配置された検体(7)または検体のアナログを具備することを特徴とする、検出領域に固定化された第二の検体に特異的な結合試薬(6)、
を具備する装置。
【請求項２】
請求項1に記載の装置であって、毛管作用手段と独立して、前記液体サンプルを前記沈着領域に流すための、前記沈着領域と接触させることが可能な液体サンプル捕獲部を具備することを特徴とする装置。
【請求項３】
請求項1に記載の装置であって、毛管作用手段(1)が、前記毛管作用手段の中または上に乾燥し自由な第一の結合試薬の沈着領域(4)を具備することを特徴とする装置。
【請求項４】
請求項1に記載の装置であって、第一の結合試薬の沈着領域が、サンプル沈着領域(3)と併合されるか又は後者の下流に配置されるが、検出領域(5)の上流にあることを特徴とする装置。
【請求項５】
請求項1に記載の装置であって、検出領域(5)において、検体(7)または検体のアナログは、第二の特異的な結合試薬に対し上流または下流に配置されることを特徴とする装置。
【請求項６】
請求項1に記載の装置であって、第二の特異的な結合試薬(6)および／または検体(7)または検体のアナログは、参照方向と横断するラインに沿って毛管作用手段に配置されることを特徴とする装置。
【請求項７】
請求項1に記載の装置であって、前記毛管作用手段は、検出領域(5)の下流の対照領域(c)を具備することができることを特徴とする装置。
【請求項８】
請求項1〜7の何れか１項に記載の装置を実行するための方法であって：
液体サンプルを、毛管作用手段の沈着領域(20)に沈着させることと、
液体サンプルの毛管作用での移動のために十分な時間を待つことと、
検出領域において、一方で検体と複合型の第一の特異的な結合試薬(4)は第二の特異的な結合試薬に付着し、第一のシグナルが得られ、他方で第一の非結合型の結合試薬は検体に付着し、第二のシグナルが得られる程度を観察することと、
検体を、第一および第二のシグナルから判定することと、
を備える方法。
【請求項９】
請求項8に記載の方法であって、第一の結合試薬(4)の量は、液体サンプルに存在する検体の量または前記液体サンプルに存在する複合体部位の数よりも多いことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項8に記載の方法であって、低い検体濃度は、第一のシグナルの非存在および第二のシグナルの存在によって検出されることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項8に記載の方法であって、高い検体濃度は、両方のシグナルの非存在によって検出されることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明は、サンドイッチ検査及び競合検査を用いて液体サンプル中の検体を同時に判定することを可能とする横向き移動を備えたイムノクロマト装置に関する。
【０００２】
横向き移動を備えたイムノクロマト装置は、例えば、特許EP 0 284 232に記載されている。これらの装置は、その中でサンプルおよび試薬が毛管作用で移動する多孔性で固体の支持体の形態での毛管作用手段を提供する。従って、これらの装置は、凍結乾燥、乾燥、または脱水された形態での第一の支持領域、視認可能な及び／又は測定可能なマーカーに結合させた検体に特異的な結合試薬、および検体に特異的な捕獲試薬が固定化された検出領域を備えている多孔性で固形の(またはイムノクロマト)支持体を統合する又は具備する。検体に特異的な結合試薬は、乾いた場合に不動であるが、湿った場合に固体の支持体において可動となる。従って、固体の支持体が液体サンプルと接触される場合、後者はこの支持中で毛管作用で移動することによって、視認可能な及び／又は測定可能なマーカーに結合させた、検体に特異的な結合試薬を駆動する。サンプルおよび検体に特異的な結合試薬は、固体の支持体中で、固定化された検体に特異的な捕獲試薬を保持している検出領域へと毛管作用で移動する。
【０００３】
視認可能な及び／又は測定可能なマーカーに結合された結合試薬が直ちに液剤の形態に添加されることはWO 2004/088320に記載されている。
【０００４】
これらの装置は、もともとサンドイッチ検査または競合検査によって検体を検出する能力がある。
【０００５】
サンドイッチ検査において、マークされた結合試薬は検体に結合し、後者は固体の支持体に捕獲試薬で固定化される。サンプル中での検体の存在または非存在は、捕獲試薬の水準で、視認可能な又は測定可能なシグナルの存在または非存在で測定される。
【０００６】
競合検査において、検体および結合試薬は、捕獲試薬への結合と競合する。サンプル中での検体の存在または非存在は、捕獲試薬の水準で、視認可能な又は測定可能なシグナルの非存在または存在で測定される。
【０００７】
特許EP 0 291 194, EP 0 560 411 およびEP 0 560 410は、一つの部分にのみでイムノクロマトの固体の支持体が、液体サンプルを保持するための開口部および結果を読む為の観察窓を備えたケースに導入された装置を記載している。
【０００８】
特許EP 1 091 808は、サンプルのより良い採集が可能な液体サンプルのための捕獲部（移動性）を有し、多孔性で固体の支持体を幾つかの部分に含んでいる改善された装置を記載している。
【０００９】
これらの装置は、単回の自宅での使用に適用することができる。実際、それらの使用は容易で迅速であり、非常に僅かな操作が要求されるだけである。というのも、全ての試薬が装置に統合もしくは具備されるからである。
【００１０】
しかしながら、これらの固相のイムノクロマト検査によって、サンプル中の検体量の判定は可能とはならない。
【００１１】
そのうえ、サンドイッチ検査において、幾つかの検体に「フック」効果が、観察された。フック効果は、周知の免疫学的検査に望ましくない効果である。この効果は、検体が非常に高濃度で存在する場合に発生する。フック効果によって、偽陰性へと導かれ、誤ってサンプル中に検体の非存在が結論付けられる。
【００１２】
サンドイッチ型の免疫学的アッセイの間のフック効果を呈する検体は、ガウス曲線型のシグナル/濃度曲線を有する（図1を参照されたい）。図1は、検体の二つの可能な濃度(C1およびC2)と対応して与えられたシグナル(S)を示している〔規定時間で結果を読む間に一つの低い(C1)および他の高い(C2)濃度〕。
【００１３】
競合を用いたアッセイのためのシグナル/濃度曲線は、図2に示される。競合検査に関して、二つの異なるシグナル(S1 および S2)が、アッセイされる二つの異なる夫々の濃度(C1およびC2)の検体に対して得られる。
【００１４】
しかしながら、競合検査もすぐにそれらの限界が明らかとなる。というのも、シグナルが、相対的に低い濃度の検体で消滅するからである。
【００１５】
サンドイッチおよび競合検査のこれらの欠点を解決するために一般に適用される一つの解決策は、液体サンプルの希釈系列から検体をアッセイすることである。しかしながら、希釈系列の使用は、自宅での使用に適切ではない。そのうえ、サンプルの希釈系列の使用には、付加的な操作および単回使用の検査装置の消費数の増加が必要とされる。というのも、各サンプルが、何回か異なる希釈で検査されるからである。
【００１６】
DE 10054093によると、それぞれサンドイッチ型の検査および競合型の検査に割当られる二つの別の又は独立の部分から構成されるイムノフィルター装置が提案される。この装置で、蛍光マーカーへ結合させた特異的な結合試薬は、直ちに検体に混合される。得られた混合物は、次に二つの部分に分けられる。第一の部分は、サンドイッチ部分で濾過され、第二の結合試薬と反応し、固定化される。第二の部分は、装置の競合部分で濾過され、固定化され検体または検体のアナログと同一の捕獲試薬と反応する。それぞれ得られた蛍光シグナルによって、検体の判定が可能となる。
【００１７】
この装置は、検体の判定の感度または精度を改善するための性質ではない。というのも、各々の基本検査は、特異的な結合試薬の初濃度で機能するからである。
【００１８】
US 2005/0112729(特に、パラグラフ0063および請求項1を参照されたい)によると、検体とマークした第一の特異的な結合試薬との間の複合体を判定するための装置が記載されており、該装置は以下を具備する、つまり：
毛管作用手段、
一つの毛管作用手段の競合領域、第二の検体に特異的な結合試薬、これは固定化され、リガンドと複合化され、マークされる、
毛管作用手段の検出領域、固定化され、上述の複合体およびマークされたリガンドの両方に結合することができる捕獲試薬、後者は前記複合体が競合領域において毛管作用手段において循環することによって置換または複合体化されえる。
【００１９】
検体の判定は、競合および検出領域において得られるシグナルから得られる。
【００２０】
この検査の型式は、実行するために複雑であり、検体の高精度の判定のみにあてはまる。
【００２１】
本発明は、以前に議論された装置の欠点を解決することを目標としている。特に、本発明は、検査装置に関し、検査装置の使用方法にも関する。これらによって、十分な信頼度および／または精度で、全ての状況（即ち、前記検体の濃度にかかわらず、特に前記検体の初濃度が相対的に強い又は相対的に弱い場合）において検体の判定が可能である。
【００２２】
本発明によると（図3を参照して）、液体サンプル中の検体を判定するための装置を提案し、該装置は以下を具備する：
参照毛管作用方向2を決定する横向き移動が関与し、液体サンプル沈着領域3、および前記沈着領域の下流に配置される検体検出領域5を具備している、毛管作用手段1
視認可能な及び／又は測定可能なマーカーに結合し、湿った場合に、前述の毛管作用手段1において参照方向に沿う毛管作用の手段で、自由に移動する、第一の検体に特異的な結合試薬4、
検出領域5が第二の特異的な結合試薬6から特定の距離で固定化および配置された検体または検体のアナログを具備することを特徴とする、検出領域5に固定化された第二の検体に特異的な結合試薬6。
【００２３】
さらに図3を参照して説明される、この装置は、好ましくは単独または組み合わせて一つ又は幾つかの以下の二次的な特性を有する：
この装置は、毛管作用手段と独立して、サンプルを沈着領域に循環させるための、沈着領域と接触させることが可能な液体サンプル捕獲部を具備してもよい。
【００２４】
毛管作用手段1は、第一の結合試薬4を、乾いた自由な状態で前記毛管作用手段の中に又は上に配置するための領域を具備してもよい；前記第一の結合試薬を配置するための領域は、サンプルの沈着領域と併合されるか又は後者の下流に配置されるが、検出領域5の上流にある。
【００２５】
検出領域5において、検体7または検体のアナログは、第二の特異的な結合試薬の上流または下流に配置される。
【００２６】
第二の特異的な結合試薬6および／または検体7または検体のアナログは、参照方向と横断するラインに沿って毛管作用手段などに配置される。
【００２７】
毛管作用手段は、検出領域5の下流の対照領域(C)を具備することができる。
【００２８】
本発明によると、「毛管作用手段」の用語は、横向き移動（即ち、毛管作用のために供給された毛管材料の厚さ方向と垂直の方向）で連続的な毛管作用単位として構成される又は作用する任意の手段を意味する。係る毛管作用手段の一つは、例えば、毛管作用の方向および／または経路（横向き移動）に沿った長方形の支持体であり、単一で同じ毛管または多孔性の材料から又は幾つかの異なる毛管要素または材料によって構成され、これらはオーバーラップなどで互いに関連して配置されて、一つの要素または材料から別のものへと毛管作用の方向に沿った連続性の毛細管循環が得られる。
【００２９】
このタイプの毛管作用手段によって、前記手段の一端から他端に向かって受け取られる又は沈着される全液体に関する毛管作用の方向および／または経路が決定される。
【００３０】
本発明による毛細管（または横向き移動によるイムノクロマト）作用は、液体が多孔性の濾過材料の厚みを浸透するイムノフィルター技術に提供されたものとは区別されなければならない。
【００３１】
本発明によると、考慮される検体または検体のアナログは、第一および第二の結合試薬に加えて第三の試薬を形成する。この第三の試薬は、任意の適切な手段を用いて、検出領域に固定または固定化される。毛管作用手段における、この第三の試薬は、第一の特異的な結合試薬と特異的に反応して、全ての他の実体を排除するために利用可能である。特に,毛管作用手段で一度沈着したら、例えば、視認可能な及び／又は測定可能なマーカーと結合される任意の他の実体または試薬と複合体を形成しない。
【００３２】
図3を参照して、このタイプの装置を、以下に規定される前記方法または使用の形態にしたがって提供しえる：
液体サンプルは、毛管作用手段の沈着領域に沈着する、
十分な時間によって、液体サンプルが検出領域5へと毛管作用で移動するための通過が認容される、
検出領域において、一方で検体と複合型の特異的な結合試薬4は第二の特異的な結合試薬6に付着し、第一のシグナルが得られ、他方で第一の非結合型の結合試薬は検体7または検体のアナログに付着し、第二のシグナルが得られることでその程度が観察され、
検体は、第一および第二のシグナルから判定される。
【００３３】
好ましくは,本発明によると、第一の結合試薬4の量は、液体サンプルに存在する検体の量または液体サンプルに存在する第一の結合試薬との複合体の数よりも多い。
【００３４】
定性的モードにおいて、低い検体濃度は、第一のシグナルの非存在および第二のシグナルの存在によって検出される；顕著な検体濃度は、両方のシグナルの非存在によって検出される。通常の検体濃度は、第一および第二のシグナルの存在によって検出される。
【００３５】
有利には、本発明による装置および／または方法は、サンプル中に低い又は非常に高い濃度に濃縮された検体を、偽陽性または偽陰性を生じることなくアッセイすることができる。そのうえ、驚くことに本発明による装置および／または方法は、検体の定量的なアッセイが可能である。
【００３６】
本発明による装置および／または方法は、妊娠ホルモン(hCG), Ｃ反応性たんぱく, アルブミンなどの有意なフック効果を呈する検体のアッセイに特に適切である。
【００３７】
［発明の記載］
本発明は、液体サンプル中の検体を判定するための装置に関し、該装置は毛管作用の方向(2)に以下を含んでいる毛管作用手段(1)を具備する：
a)  サンプルの沈着または受領領域(3);
b)  毛管作用手段(1)において湿った場合に、毛管作用で自由に移動する、視認可能な及び／又は測定可能なマーカーに結合させた検体に特異的な結合試薬；
c)  検体検出領域(5);
ここで、検体検出領域(5)は、連続的に、毛管作用の方向(2)に、一方に第二の固定化された検体特異的結合試薬(6)、他方に固定化された検体(7)または検体のアナログを；第一の検体に特異的な結合試薬(4)および第二の検体に特異的な結合試薬(6)が液体サンプル中の検体をサンドイッチ検査で判定できるよう、他方で第一の検体に特異的な結合試薬(4)および固定化された検体(7)または検体のアナログが競合検査を用いて液体サンプル中の検体を判定できるように具備する。
【００３８】
一態様において、視認可能な及び／又は測定可能なマーカーに結合させた第一の検体に特異的な結合試薬(4)は支持体上で沈着乾燥するので、本発明は毛管作用の方向(2)に以下を含んでいる毛管作用手段(1)を具備する液体サンプル中の検体を判定するための装置に関する：
a)  サンプルの沈着領域(3);
b)  沈着乾燥し、毛管作用手段(1)において湿った場合に、自由に移動する、視認可能な及び／又は測定可能なマーカーに結合させた第一の検体に特異的な結合試薬(4)；
c)  検体検出領域(5);
ここで、検体検出領域(5)は、連続的に、毛管作用の方向(2)に、固定化された第二の検体に特異的な結合試薬(6)、固定化された検体(7)または検体のアナログを；第一の検体に特異的な結合試薬(4)および第二の検体に特異的な結合試薬(6)が、液体サンプル中の検体をサンドイッチ検査で判定できるよう、他方で固定化された第一の検体に特異的な結合試薬(4)および検体(7)または検体のアナログが競合検査を用いて液体サンプル中の検体を判定できるように具備する。
【００３９】
別の態様において、視認可能な及び／又は測定可能なマーカーに結合させた第一の検体に特異的な結合試薬(4)は、直ちに液剤形態の試薬の形態で添加される。
【００４０】
「液剤形態の試薬」の用語は、結合試薬が溶液または懸濁液中に存在する任意の試薬を意味する。液剤形態の視認可能な及び／又は測定可能なマーカーに結合させた結合試薬の調製は、文献に記載の技術にしたがって行われる。典型的には、結合した結合試薬は、緩衝塩類溶液中で溶液または懸濁液中に存在する。この溶液は、安定化剤および他の化合物（例えば、抗細菌剤または抗真菌剤）も含んでもよい。係る安定化剤は、例えば、ウシアルブミン血清(BSA)およびカゼインを含む。
【００４１】
本発明による幾つかの方法において、液体サンプルが血漿、血清、または全血などの場合に希釈剤が使用される。この希釈剤は、固体の支持体に移動し、サンプルおよびマークされた結合試薬を駆動する。典型的には、この希釈剤は、緩衝塩類溶液から構成され、反応に必要な洗浄剤または任意の他の構成要素も具備してもよい。
【００４２】
好ましくは、第一の検体に特異的な結合試薬(4)は、特異的なマーカーに結合される。
【００４３】
好ましくは、毛管作用手段(1)は、強固な支持体上に固定されたクロマトグラフィー検査ストリップである。
【００４４】
一つの好適な態様において、毛管作用手段(1)は、検出領域(5)を観察できる少なくとも一つの観察窓(9)を備えた握り保持部(8)に統合される。
【００４５】
「結合試薬」の用語は、検体と又は検体に競合する捕獲試薬と特異的に結合する性質の任意の化学的な, 生化学的な又は生物学的な実体を意味する。
【００４６】
「結合」および「結合する」の用語は、任意の強い結合（例えば、共有結合性）または任意の弱い結合（例えば、抗原/抗体またはアビジン/ストレプトアビジン型）を意味する。
【００４７】
結合試薬は、例えば、抗体、抗原、または核酸である。
【００４８】
競合検査において、結合試薬は、固相で存在する、また検体自身または検体の適切なアナログに固定される。「検体の適切なアナログ」は、検体と競合して、第一の検体に特異的な結合試薬に特異的に結合する任意の実体を意味する。
【００４９】
サンドイッチ型の検査において、第一のマークされた結合試薬は、視認可能な及び／又は測定可能なマーカーに結合した抗検体である（例えば、前記マーカーに結合した検体の特異的な抗体）。
【００５０】
サンドイッチ型の検査において、第二の結合試薬は、検体に特異的に結合する。第二のマークされた結合試薬も、抗検体である（例えば、視認可能な及び／又は測定可能なマーカーに結合した検体の特異的な抗体）。
【００５１】
「視認可能な及び／又は測定可能なマーカー」の用語は、裸眼で又はシグナル（該シグナルは、例えば、蛍光, 発色, 同位元素の存在, 磁力のシグナルである）の発光による装置の援助で直接または間接的な検出を可能とする任意のマークする方法を意味する。例えば、当業者は、特別な色マーカー（例えば、コロイド性の金または蛍光、着色ラテックスの粒子, 蛍光ラテックスの粒子, およびアビジンおよびストレプトアビジンに結合した粒子）を使用できる。
【００５２】
本発明は、液体サンプル中の検体を判定するための装置に関し、該装置は毛管作用の方向(2)に以下を含んでいる毛管作用手段(1)を具備する：
a)  サンプルの沈着または受領領域(2);
b)  毛管作用手段(1)において湿った場合に、毛管作用で自由に移動する、視認可能な及び／又は測定可能なマーカーに結合させた第一の検体の特異的な抗体(4)；
c)  検体検出領域(5);
装置において、検体検出領域(5)は、連続的に、毛管作用の方向(2)に、一方で固定化された第二の検体に特異的な抗体(6)、他方で固定化された検体(7)または検体のアナログを；一方で固定化された第一の検体に特異的な抗体(4)および他方で検体(7)または検体のアナログが競合検査で液体サンプル中の検体を判定可能である間に、第一の検体に特異的な抗体(4)および第二の検体に特異的な抗体(6)が液体サンプル中の検体をサンドイッチ検査で判定可能であるように具備する。
【００５３】
一態様において、視認可能な及び／又は測定可能なマーカーに結合させた第一の検体に特異的な抗体(4)は支持体上で沈着乾燥するので、本発明は毛管作用の方向(2)に以下を含んでいる毛管作用手段(1)を具備する液体サンプル中の検体を判定するための装置に関する：
a)  サンプルの沈着または受領領域(3);
b)  沈着乾燥し、毛管作用手段(1)において湿った場合に、毛管作用で自由に移動する、視認可能な及び／又は測定可能なマーカーに結合させた第一の検体特異的抗体(4)；
c)  検体検出領域(5);
装置において、検体検出領域(5)は、連続的に、毛管作用の方向(2)に、一方で固定化された第二の検体特異的抗体(6)、他方で固定化された検体(7)または検体のアナログを；一方で固定化された第一の検体に特異的な抗体(4)および他方で検体(7)または検体のアナログが競合検査で液体サンプル中の検体を判定可能である間に、第一の検体に特異的な抗体(4)および第二の検体に特異的な抗体(6)が液体サンプル中の検体をサンドイッチ検査で判定可能であるように具備する。
【００５４】
別の態様において、視認可能な及び／又は測定可能なマーカーに結合させた第一の検体に特異的な抗体(4)は、即時に液剤形態の試薬の形態で添加される。
【００５５】
好ましくは、第一の検体に特異的な抗体(4)は、視認可能な及び／又は測定可能なマーカーに結合される。
【００５６】
好ましくは、毛管作用手段(1)は、強固な支持体上に固定されたクロマトグラフィー検査ストリップである。
【００５７】
一つの好適な態様において、毛管作用手段(1)は、検出領域(5)を観察できる少なくとも一つの観察窓(9)を備えた握り保持部(8)に統合される。
【００５８】
また、本発明は、以前に規定した装置を提供して、液体サンプル中の検体を判定するための方法に関し、該方法は以下の工程を備える：
a)  少なくとも一つの沈着または受領領域, および検出領域を提供された少なくとも一つの毛管作用手段、前記検出領域に固定化された少なくとも一つの捕獲試薬を有させる工程、
b)  液体サンプルを少なくとも一回、毛管作用手段の沈着領域に別々に沈着させる工程、
c)  視認可能な及び／又は測定可能なマーカーに結合させた第一の特異的な結合試薬を含んでいる領域への液体サンプルの毛管作用での移動のために十分な時間を待つ工程、
d)  視認可能な及び／又は測定可能なマーカーに結合させた第一の特異的な結合試薬の及び前記検出領域への液体サンプルの毛管作用での移動のために十分な時間を待つ工程、
e)  視認可能な及び／又は測定可能なマーカーに結合させた特異的な結合試薬が検出領域に固定される程度を観察し、検体をサンドイッチ検査および競合検査で同時に判定する工程。
【００５９】
一態様によると、視認可能な及び／又は測定可能なマーカーに結合させた第一の特異的な結合試薬は、多孔性で固体の支持体において沈着し、乾燥し、遊離する。
【００６０】
一態様によると、視認可能な及び／又は測定可能なマーカーに結合させた第一の特異的な結合試薬は、検体が沈着すると同時に、後に、又は前に、直ちに液剤形態の試薬の形態で添加される。
【００６１】
一態様によると、液剤形態の希釈剤は、多孔性で固体の支持体に添加される又は沈着される。
【００６２】
本発明の方法の一態様によると、工程a)の間に、検出領域は少なくとも二つの捕獲試薬を具備し、二つのうちの一つは固定化された検体または検体のアナログであり、二つのうちの他のものは固定化された検体に特異的な結合試薬である。
【００６３】
「捕獲試薬」の用語は、検体または検体のアナログと特異的に結合する性質の任意の化学的な, 生化学的な又は生物学的な実体を意味する。
【００６４】
競合検査の場合において、捕獲試薬は、第一の結合試薬と結合する。検体および捕獲試薬は、典型的にリガンド/抗リガンド, 抗原/抗体, DNA/RNAまたはDNA/DNA対を形成する。従って、検体が抗原またはハプテンである場合、捕獲試薬は検体の特異的な抗体などである。検体が抗体である場合、捕獲試薬は前記抗体によって認識される抗原または検体を特異的に認識する抗体である。検体が核酸である場合、捕獲試薬は一例を挙げると相補的なＤＮＡプローブである。
【００６５】
固定化された捕獲試薬は、例えば、検体に強い親和性を有しているポリクローナル又はモノクローナル抗体（特に、モノクローナル抗体であってもよい）である。
【００６６】
感受性を増加させるために、例えば、アビジンビオチンまたはストレプトアビジンビオチンの形成を介した検出を間接的に可能にするビオチン抗体などの間接的な検出に関して当業者に既知の技術にしたがってマークした抗体を使用してもよい。
【００６７】
これらのマークされた及びビオチン抗体は、感受性を増加させるために検出領域の検査ラインに事前に直接的に沈着させてもよい又は第一の特異的な抗体と沈着させてもよい及び溶出され、前記検体または前記抗体が接触時間を増加させ、特に固定の部位の数などにより感受性が増加されるように固定されてもよい。
【００６８】
検体に特異的な捕獲試薬は、当業者に既知の技術による固体の支持体に固定化される。この捕獲試薬は、湿った際に移動しないように固定化される。この固定化は、例えば、吸収によって又は共有結合性の共役によって実施できる。
【００６９】
「抗検体」の用語は、検体と又は検体に競合する捕獲試薬（例えば、抗体、抗原、または核酸）と特異的に結合する性質の任意の化学的な, 生化学的な又は生物学的な実体を意味する。
【００７０】
一態様によると、本発明は、液体サンプル中の検体を判定するための方法に関し、該方法は以下の工程を備える：
a)  以前に記載した装置を提供する工程；
b)  工程(a)からの装置の毛管作用手段(1)の沈着または受領領域(3)に液体サンプルを沈着させる工程；
c)  沈着または受領領域(3)から検出領域(5)への液体サンプルの毛管作用による移動のために十分な時間を待機し、視認可能な及び／又は測定可能なマーカーに結合させた第一の検体に特異的な抗体(4)を駆動する工程；
d)  視認可能な及び／又は測定可能なマーカーに結合させた第一の検体に特異的な抗体(4)が検出領域(5)に固定される程度を観察し、検体をサンドイッチ検査および競合検査で同時に判定する工程。一つの効果的な態様において、工程（b）で、工程（a）の装置の毛管作用手段(1)の沈着または受領領域(3)に液体サンプルおよび希釈剤を沈着させる工程を備える。
【００７１】
「検体」の用語は、サンプル中の検出することが望まれる任意の化学的な, 生化学的な又は生物学的な実体を意味する。本発明の装置および方法によって検出される検体は、特にタンパク質, ペプチド類, 抗体, ホルモン, ステロイド, 感染因子または腫瘍細胞から由来する抗原, 感染因子（例えば、細菌, ウイルスまたは寄生虫）, 核酸(DNAまたはRNA), 治療化合物, 薬物または抗生物質である。
【００７２】
「検出」および「判定」の用語は、サンプル中の検体の存在または非存在を判定することを意味するが、サンプル中の検体の測定および定量をも意味する。実際、本発明の装置および方法の性能によって、定量的な又は半定量的な測定が許容される。
【００７３】
本発明の特定の一態様において、検体は、hCG(絨毛性ゴナドトロピンホルモン), Ｃ反応性タンパクまたはアルブミンである。
【００７４】
「液体サンプル」の用語は、求める検体が溶液または懸濁液中に存在する任意のサンプルを意味する。この液体サンプルは、任意の生物学的または身体の流体であってもよい。液体サンプルは、生物学的または身体の流体から直接的または間接的に得られてもよい。サンプルは、固形サンプルの液体抽出物であってもよい。
【００７５】
典型的には、液体サンプルは、尿, 全血, 血漿または血清である。
【００７６】
本発明による幾つかの方法において、液体サンプルが血漿、血清、または全血などの場合に希釈剤が使用される。希釈剤は、多孔性で固体の支持体にサンプルとともに沈着される。或いは、希釈剤は、多孔性で固体の支持体にサンプルの前または後に沈着される。この希釈剤は、固体の支持体中で移動し、多孔性の支持体のサンプルの移動を、マークされた結合試薬と共に駆動する、または促進する。典型的には、この希釈剤は、緩衝塩類溶液から構成される；この希釈剤は、反応に必要な洗浄剤または任意の他の構成要素も具備してもよい。
【００７７】
「毛管作用手段」の用語は、単純な毛管作用による液体の移動を許容する多孔性で固体の支持体を意味する。この支持体の空隙率によって、液体または湿性のサンプルおよび／または試薬の毛管作用(または横向き移動)が可能となる。係る毛管作用手段は、特に横向き移動を有する全てのイムノクロマト技術に広く使用される。
【００７８】
従って、本発明によるイムノクロマト装置に提供される毛管作用手段は、当業者に周知である（EP 0 284 232を参照されたい）。例として、これらの毛管作用手段は、多様なイムノクロマト支持体（例えば、セルロース, ナイロン, ニトロセルロース, ポリエチレンまたはガラス繊維）から構成されてもよい。
【００７９】
毛管作用手段は、一つ又は幾つかの別の部分から構成されてもよい。支持体の多様な部分が、異なる材料から構成されてもよい。毛管作用手段が異なる部分または異なる材料から構成される場合、これらの要素は毛管作用手段中の毛細管循環の連続性を可能にするように配置される。
【００８０】
典型的には、毛管作用手段は、毛管作用の方向に沿った長方形の多孔性で固体の支持体から構成される。好ましくは、本発明による装置の毛管作用手段は、イムノクロマト検査ストリップの形態で多孔性で固体の支持体を具備する。毛管作用手段は、例えば、幾つかのスーパーインポーズされた又はオーバーラップする検査ストリップから構成されるイムノクロマト検査ストリップの形態で存在する。
【００８１】
本発明による装置は、例えば、強固な支持体に固定されたクロマトグラフィー検査ストリップから構成されてもよい。強固な支持体は、厚紙、プラスチック被覆した厚紙、または最も好ましくはプラスチック材料などの多様な材料から構成されてもよい。好ましくは、強固な支持体は、ポリスチレンから構成される。
【００８２】
毛管作用手段は、サンプルの沈着または受領領域, およびサンプルの検出領域を具備する。沈着領域および検出領域は、毛管作用手段と別個であり、分離される。これらの領域は、沈着または受領領域から検出領域に毛管作用の方向に沿った毛管作用の連続性が許容されるように配置される。典型的には、沈着領域および検出領域は、それぞれ毛管作用手段の２つの反対の端に対応する。従って、毛管作用手段は、例えば、それぞれ沈着領域および検出領域を形成している近位の端および遠位の端を有している毛管作用の方向に沿って長方形の多孔性で固体の支持体から構成される。
【００８３】
これらの領域は、例えば、単一の材料から構成される同じストリップに存在しえる。有利には、特定の多孔性の材料は、毛管作用手段の各領域に対応する。多孔性の吸収材料は、例えば、サンプルの沈着領域に使用できる。実際、毛管作用手段の沈着領域は、尿の流れと接触させること又は液体サンプルを受け取ることが企図される。従って、当業者は適切な吸収材料を選択する。これらの材料は、当業者に周知である。また、別の吸収材料を、第一の特異的な結合試薬を受け取る領域および／または検出領域のために提供することができる。
【００８４】
毛管作用手段のサンプル沈着領域は、吸収材料での捕獲部と協力できる。この捕獲部は、例えば、尿の流れに直接の接触させることができる。WO 00/00288に記載のとおり、捕獲部は、二つのポジションの間で移動でき、一つは毛管作用手段から特定の距離で液体サンプルを収集するためのもの、他は毛管作用手段の沈着領域と接触される連絡又は毛細管接触部である。
【００８５】
毛管作用手段は、例えば、視認可能な及び／又は測定可能なマーカーに結合された第一の検体に特異的な抗体を保持する。この抗体は、毛管作用手段中で沈着乾燥し、湿った場合に毛管作用で自由に移動する。この第一の検体に特異的な抗体は、サンプルの沈着または受領領域に局在することができる。しかしながら、この第一の抗体は、サンプルの沈着に際して洗浄効果での試薬の欠損を回避するためにサンプルの沈着または受領領域の下流で沈着乾燥される。従って、液体サンプルは毛管作用手段の沈着領域で沈着し、このサンプルは毛管作用で毛管作用手段をとおして移動し、マーカーが結合した第一の検体に特異的な抗体を駆動する。
【００８６】
有利には、毛管作用手段は、握り保持部に導入できる。この握り保持部によって、毛管作用手段の操作が促進され、特に水分から防御もできる。
【００８７】
握り保持部は、毛管作用手段を部分的に又は完全に囲むことができる。
【００８８】
握り保持部は、厚紙、プラスチック被覆した厚紙、またはより好ましくはプラスチック材料などの多様な材料から形成されてもよい。有利には、握り保持部は、強固で不透過性の材料から構成される。これらの握り保持部またはケースは、特に特許EP 0 291 194, EP 0 560 411, EP 0 560 410 および EP 1 091 808に記載されている。
【００８９】
握り保持部は、通常はケースの形態で存在する。
【００９０】
本発明の一態様において、毛管作用手段は、液体サンプルを受け取るために、握り保持部と関連して突出しているサンプルの沈着または採集領域を具備できる。
【００９１】
本発明の別の態様において、握り保持部またはケースは、液体サンプルを沈着させるための少なくとも一つの開口部を具備する。
【００９２】
典型的には、握り保持部は、毛管作用手段の検出領域を観察するための少なくとも一つの観察窓も備える。
【００９３】
液体サンプル中の検体の判定を可能にする本発明による方法に提供される試薬は、当業者に周知である。
【００９４】
視認可能な及び／又は測定可能なマーカーに結合させた第一の検体に特異的な抗体は毛管作用手段において沈着乾燥するが、しかし、湿った場合に毛管作用で自由に移動する。
【００９５】
第二の検体に特異的な抗体は、毛管作用手段の検出領域に永続的に固定化される。
【００９６】
「検体に特異的な抗体」の用語は、抗原/抗体型の結合において検体と特異的に結合する能力のある抗体を意味する。典型的には、検体に強い親和性を有しているポリクローナル又はモノクローナル抗体が関与する。好ましくは、モノクローナル抗体が関与する。
【００９７】
第二の検体に特異的な抗体は、当業者に既知の技術にしたがって毛管作用手段の検出領域に固定化される。
【００９８】
この第二の検体は、湿った際に移動しないように固定化される。この固定化は、例えば、吸収または共有結合性の共役によって実施できる。
【００９９】
第一および第二の抗体は、検体と同一の又は異なる二つのエピトープ部位などにおいて検体とそれぞれ特異的に結合する。
【０１００】
本発明の装置の第一および第二の抗体によって、液体サンプル中の検体をサンドイッチ検査で判定することが可能である。
【０１０１】
そのうえ、本発明による装置は、毛管作用手段の検出領域に固定化された検体自身または検体のアナログを具備する。
【０１０２】
検体または検体のアナログは、当業者に既知の技術にしたがって毛管作用領域の検出領域に固定化される。検体または検体のアナログは、湿った際に移動しないように固定化される。この固定化は、例えば、吸収によって又は共有結合性の共役によって実施できる。
【０１０３】
この検出領域の第二の試薬は、検体自身または検体の適切なアナログと同一である。「検体の適切なアナログ」の用語は、検体と競合して、検体の第一の結合試薬または特異的な抗体に特異的に結合する任意の実体を意味する。
【０１０４】
一態様において、一方で視認可能な及び／又は測定可能なマーカーに結合させた第一の検体に特異的な抗体、他方で毛管作用手段の検出領域に固定化された検体または検体のアナログによって、液体サンプル中の検体を競合検査で検出することが可能である。好ましくは、第二の検体に特異的な抗体は、毛管作用の方向に対して、検体または検体のアナログの上流に沈着できる。
【０１０５】
湿った場合に自由に移動する第一の検体に特異的な抗体は、視認可能な及び／又は測定可能なマーカーに結合されて、サンドイッチ検査および競合検査の両方の結果の測定または直接観察が可能となる。任意の視認可能なマーカーは、毛管作用手段の検出領域で濃縮された場合に裸眼で直接的に観察できる。マーカーの測定は、裸眼で直接的に又は測定装置の援助のもとに実施できる。この測定は、付加的な操作を必要としない直接的な観察で実施できる。
【０１０６】
有利には、本発明による装置は、視認可能な及び／又は測定可能なマーカーに結合された第一の検体に特異的な抗体を具備する。
【０１０７】
本発明にしたがって使用されるマーカーは、裸眼での直接的な検出またはシグナル（該シグナルは、例えば、蛍光, 発色, 同位元素の存在, 磁力のシグナルである）の発光による装置の援助を伴う間接的な検出が可能である。
【０１０８】
例えば、水に不溶性の小さい粒子（従って、液相で、懸濁液、分散剤またはsolsを形成する）から構成される特定のマーカー（色または蛍光）を使用できる。
【０１０９】
特定のマーカーは、当業者に周知である。特に知られているものは、色または蛍光の特定のマーカー（例えば、コロイド性の金、着色ラテックスの粒子, 蛍光ラテックスの粒子, およびアビジンおよびストレプトアビジンに結合した粒子）である。
【０１１０】
裸眼での直接的な観察を可能とするマーカーのなかには、デキストラン型マーカー（Hansen T.M., IVD Technology 4, 35-40, 2003）がある。結合試薬は、デキストラン鎖(ポリサッカライド誘導体)を保持している蛍光体に結合される。
【０１１１】
結合試薬は、当業者に既知の技術による視認可能な及び／又は測定可能なマーカーに結合される。
【０１１２】
本発明の一態様において、毛管作用手段の検出領域は、第二の検体に特異的な抗体の下流に及び検体または検体のアナログの下流に毛管作用の方向性で配置される第三の試薬を具備する。この第三の試薬は、毛管作用手段の沈着領域から検出領域への液体サンプルの効果的な毛管作用が保証されるような正の対照を有してもよい。
【０１１３】
この第三の試薬は、毛管作用手段の検出領域に永続的に固定化される。
【０１１４】
例えば、マーカーに結合された第一の検体に特異的な抗体に結合している抗体を含みえる。この場合において、この第三の試薬によって、マーカーに結合された第一の検体に特異的な抗体の毛管作用手段の検出領域への移動を検証することが可能である。或いは、この第三の試薬は、検体と独立しており、単純に検出領域への液体サンプルの行動の検証が可能である。
【０１１５】
本発明は、添付の図面を参照してより詳細に記載される：
図1は、サンドイッチ検査での免疫学的なアッセイに関して得られたシグナル/濃度曲線を示す。得られた曲線は、ガウス曲線型であり、検体の二つの可能な濃度(C1およびC2)と対応して与えられたシグナル(S)を示している〔規定時間での結果を読む間に一つの低い(C1)および他の高い(C2)濃度〕。
【０１１６】
図2は、競合でのアッセイに関するシグナル/濃度曲線を示す。アッセイされる検体の二つの濃度(C1およびC2)に関して、二つの異なるシグナル(S1 および S2)が観察される。しかしながら、シグナルが相対的に低い濃度の検体で消滅することが観察される。
【０１１７】
図 3は、本発明による検体を同時アッセイするための装置を示す。A)握り保持部のない装置を示す。B)握り保持部を具備する装置。
【０１１８】
3Aは、毛管作用(2)の方向に毛管作用手段(1)を具備している装置を示す:
a)  第一の毛細管材料20におけるサンプルの沈着または受領領域(3)；
b)  毛管作用手段(1)において湿った場合に、毛管作用で自由に移動する、視認可能な及び／又は測定可能なマーカーに結合させた第一の検体特異的抗体(4)；  この第一のマークされた抗体は沈着乾燥し、第一の毛細管材料20での頻繁な毛細管循環において第二の毛細管材料21上で遊離する；
c)  検体検出領域(5)は、連続的に、毛管作用の方向(2)に、一方に第二の固定化された検体に特異的な抗体(6)、他方に固定化された検体(7)または検体のアナログを具備しており；第二の抗体および検体（または検体のアナログ）は、第二の毛細管材料21での頻繁な毛細管循環において第三の毛細管材料上で配置される又は沈着される；
B)で握り保持部(8)に統合された毛管作用手段(1)が示され、ここには検出領域(5)を観察できる少なくとも一つの観察窓(9)、および液体サンプルが沈着される又は受け取られる採取のための開口部23を備えている。
【０１１９】
［例］
妊娠検査（尿の絨毛性ゴナドトロピンホルモン、またはhCGの検出）
図4は、本発明のクロマトグラフィー検査ストリップが挿入されたケース型の迅速検査の外観を示す。
【０１２０】
検査ストリップ1は、コロイド性の金でマークされた抗βhCG  モノクローナル抗体4を含み、これはガラス繊維21に沈着され、脱水される（結合される）。サンプルのウェル（S）に配置される場合、この特定のマーカーは、液体サンプルで溶解され、検査ストリップでの移動を介して、固定された抗hCG  ポリクローナル抗体(T1)を含有している第一の領域、固定されたhCG(T2)を含有している第二の領域、およびポリクローン性ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体(C)を含有している第三の領域と連続的に接触する（図5を参照されたい）。
【０１２１】
沈着したサンプル中にhCGが存在しない場合（又は非常に低い濃度である場合）、実際には視認可能な反応は領域T1では生じず、ラインが領域T2および領域Cに出現する（図6）。
【０１２２】
サンプル中でhCG濃度が非常に高い場合、領域T1の反応は非常に弱いか又は存在しなく（上述のフック効果のため）；視認可能な反応は領域T2で発生しない。というのも、サンプルの検体(hCG)と反応している金コロイドでマークされた殆ど全ての抗βhCG抗体は、検体（又は任意の検体のアナログ）との反応にもはや利用可能ではないからであり、領域Cは陽性である（図7）。
【０１２３】
以上のように、この系によって、低い検体濃度(2つの陽性のライン:T2 + C)または高い検体濃度(1つの陽性のライン:C)の場合の結果の解釈を効果的に識別することが可能となる。そのうえ、ラインは、異なる場所に出現する（T1またはT2）。
【０１２４】
以下の表は、視覚的な読みの援助のもとに行われる検査で、サンプル中の検体濃度に応じて検出領域(T1, T2 および C)で得られた結果を要約している。
【表１】
2009506315.tif 000003
結果の視覚的な解釈に加えて、全体的に機械を用いた測定を行うことが可能であり、サンプルを事前に希釈することなく、濃度範囲を用いることなく、検体濃度の定量的または半定量的な結果を提供することができる。実際には、濃度領域に依存して、検出領域で得られる結果が異なる。そして、この差の解釈によって、較正後に又は視覚的な観察によって検体の濃度を数量化することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】サンドイッチ検査での免疫学的なアッセイのための検体のシグナル/濃度曲線
【図２】競合検査での免疫学的なアッセイのための検体のシグナル/濃度曲線
【図３】本発明による検査で検体を同時アッセイするための装置
【図４】ケースにイムノクロマト検査ストリップを含んでいる本発明の迅速な検査装置
【図５】hCG検出のためのイムノクロマト検査ストリップ
【図６】低い検体濃度の場合における、図5による検査の結果
【図７】高い検体濃度の場合における、図5による検査の結果
【図１】
2009506315.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2009506315.tif 000008
【図６】
2009506315.tif 000009
【図７】
2009506315.tif 000010
【国際調査報告】
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2009506315.tif 000012
2009506315.tif 000013
2009506315.tif 000014
2009506315.tif 000015
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