(57)【要約】  本発明では、（ａ）胚性幹（ＥＳ)細胞を供給することと、（ｂ）胚性幹細胞から前駆細胞株を樹立することとを含み、前駆細胞株は、当該前駆細胞株の自己複製能に基づいて選択される方法を開示する。好適には、この方法では、体細胞は、当該体細胞は自己複製ができないことに基づいて、選択されない。好適には、前駆細胞株は、共培養なしで、好適には、フィーダー細胞なしで誘導又は樹立される。また、共培養がないことで、胚性幹細胞は選択されない。オプションとして、この方法は、（ｄ）前駆細胞株から分化細胞を誘導することを含む。【選択図】  図１
2009506770.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）一の胚性幹（ＥＳ）細胞を供給することと、
（ｂ）前記胚性幹細胞から一の前駆細胞株を樹立することと、
を含み、
前記前駆細胞株は、当該前駆細胞株の自己複製能に基づいて選択される、方法。
【請求項２】
複数の体細胞は、当該複数の体細胞は自己複製ができないことに基づき、選択されない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記前駆細胞株は、共培養なしで、好適には、複数のフィーダー細胞なしで誘導又は樹立される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
共培養がないことで、複数の胚性幹細胞は選択されない、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記前駆細胞株は、形質転換なしで樹立される、請求項１乃至４のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記前駆細胞株は、複数の胚性幹細胞又はその子孫細胞を、複数の推定前駆細胞の自己複製を促進する条件に暴露することにより樹立される、請求項１乃至５のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
自己複製を促進する前記条件は、複数の胚性幹細胞の増殖を抑制する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
自己複製を促進する前記条件は、富栄養培地での成長を含む、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
自己複製を促進する前記条件は、ＬＩＦなしで複数の細胞を成長させることを含む、請求項６乃至８のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
自己複製を促進する前記条件は、連続継代を含む、請求項６乃至９のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
自己複製を促進する前記条件は、少なくとも１２の連続継代を含む、請求項６乃至１０のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記前駆細胞株は、前記胚性幹細胞に比べて能力が減少する、請求項１乃至１１のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記前駆細胞株は、系統限定される、好適には、非多能性である、請求項１乃至１２のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記前駆細胞株は、非発癌性である、請求項１乃至１３のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記前駆細胞株を誘導することは、前記胚性幹細胞を、一の特定系統への分化を増進する条件に暴露することを含む、請求項１乃至１４のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
分化を増進する前記条件は、前記胚性幹細胞から一の胚様体を形成することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
多分化能がなくなった後、前記複数の細胞は、分化を促進する前記条件から外される、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記系統限定−促進条件から前記複数の細胞を外すことは、一の胚様体を分離することを含む、請求項１５乃至１７のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
約３−６日間成長させられた複数の胚様体を分離することを含む、請求項１５乃至１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記前駆細胞株は、ＯＣＴ４及びアルカリホスファターゼ活性のいずれか又は両方の発現を減少するか、又は、それらの発現は実質的にない、請求項１乃至１９のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記前駆細胞株は、当該前駆細胞株が誘導される一の胚性幹細胞に比べて、一の多分化能マーカーの発現を減少し、
前記多分化能マーカーは、好適には、Ｎａｎｏｇ、ＢＭＰ４、ＦＧＦ５、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ−２、及びＵｔｆ１から構成される群から選択される、請求項１乃至２０のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記前駆細胞株は、
（ａ）４０世代を超えて細胞培養中で維持可能である特徴と、
（ｂ）少なくとも１０世代の間、細胞培養中で維持される場合に実質的に安定した核型又は染色体数を有する特徴と、
（ｃ）何世代にも亘って実質的に安定した遺伝子発現パターンを有する特徴と、
のうち１つ以上の特徴を示す、請求項１乃至２１のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記前駆細胞株は、好適には免疫力が低下した被移植動物である被移植動物に移植される場合、好適には３週間後、より好適には２乃至９ヶ月後でも奇形腫の形成を実質的に誘発しない、請求項１乃至２２のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記胚性幹細胞又は前記前駆細胞株は、哺乳類細胞又は哺乳類細胞株であり、好適にはマウス又はヒトの胚性幹細胞又は前駆細胞株である、請求項１乃至２３のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記前駆細胞株は、内皮前駆細胞株、好適にはＥ−ＲｏＳＨ細胞株を含む、請求項１乃至２４のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記前駆細胞株は、間葉系前駆細胞株、好適にはｈｕＥＳ９．Ｅ１細胞株を含む、請求項１乃至２４のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
（ｄ）前記前駆細胞株から一の分化細胞を誘導することをさらに含む、請求項１乃至２６のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記前駆細胞株は、分化の前に少なくとも５世代の間増殖される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
一の胚性幹（ＥＳ）細胞から一の分化細胞を形成する、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記分化細胞は、内皮細胞又は間葉細胞である、請求項２７乃至２９のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記分化細胞は、含脂肪細胞又は骨細胞である、請求項２７乃至３０に記載の方法。
【請求項３２】
一の細胞の間葉マーカー又は内皮マーカーの発現を上方調節する、請求項１乃至３１のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
一の細胞の幹細胞マーカー又は多分化能マーカーの発現を下方調節する、請求項１乃至３２のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
一の幹細胞の自己複製又は分化を促進又は遅延可能な一の作用因子を特定する方法であって、
一の候補分子の存在下で請求項１乃至３３のうちいずれか一項に記載する方法を実行することと、
前記候補分子への影響を決定することと、
を含む方法。
【請求項３５】
再生療法により治療可能な疾病、心臓疾患、骨髄疾患、皮膚疾患、火傷、また、糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病といった変性疾患、及び癌のうちのいずれか１つの治療、又は、治療のための一の薬剤組成物の調製の目的で、一の前駆細胞株又は一の分化細胞を形成する請求項１乃至３４のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
請求項１乃至２６のうちいずれか一項に記載する方法により形成される前駆細胞株。
【請求項３７】
請求項２７乃至３１のうちいずれか一項に記載する方法により形成される分化細胞。
【請求項３８】
一の胚性幹（ＥＳ）細胞から一の分化細胞を形成する方法であって、
（ａ）前記胚性幹細胞から一の前駆細胞株を誘導することと、
（ｂ）前記前駆細胞株を増殖することと、
（ｃ）前記前駆細胞株から一の分化細胞を誘導することと、
を含む方法。
【請求項３９】
（ａ）一の胚性幹（ＥＳ）細胞を供給することと、
（ｂ）前記胚性幹細胞から一の前駆細胞を誘導することと、
（ｃ）前記前駆細胞から一の前駆細胞株を樹立することと、
を含み、
前記前駆細胞は、当該前駆細胞の自己複製能に基づいて選択される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
２００５年９月２日に出願した米国仮特許出願番号第６０／７１３，９９２号を参照する。
【０００２】
上記出願、各本願及び上記出願にて引用又は参照される各文書（各上記出願の審査経過時も含む）（「出願及び記事に引用される文書」）、及び、各上記出願及び記事、並びに出願及び記事に引用される文書に引用又は記載される製品の製造業者による取扱説明書又はカタログは、本願に参考として組み込む。さらに、本文書にて引用する全ての文書、本文書にて引用される文書にて引用又は参照される全ての文書、及び、本文書又は任意の文書にて引用又は記載される製品の製造業者による取扱説明書又はカタログは、本願に参考として組み込む。本文書に参考として組み込む文書又はそれらの文書における教示内容は、本発明の実施に使用してもよい。本文書に参考として組み込む文書は、先行技術として認めるものではない。
【０００３】
本発明は、発生、細胞生物学、分子生物学、及び遺伝学の分野に関する。より具体的には、本発明は、胚性幹細胞から前駆細胞を誘導する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
分化細胞とは異なり、幹細胞は分裂し、また、自己複製するか、表現型及び機能が異なる娘細胞に分化する能力を有する（Keller，Genes Dev. 2005;19:1129-1155; Wobus and Boheler，Physiol Rev. 2005;85:635-678; Wiles，Methods in Enzymology. 1993;225:900-918; Choiら，Methods Mol Med. 2005;105:359-368）。
【０００５】
マウスの胚性幹細胞（ＥＳＣ）の多分化能と、全ての三胚葉からの細胞に分化するその能力によって、胚性幹細胞は、多くの疾病及び組織傷害に対する再生療法の理想的な細胞源となっている（Keller，Genes Dev. 2005;19:1129-1155; Wobus and Boheler，Physiol Rev. 2005;85:635-678）。しかし、この胚性幹細胞のまさにこの特性は、独特の課題も提起する。即ち、治療効力を確実にするために特定の疾病又損傷組織の治療のための適切な細胞型を十分な量及び均質性で生成し、また、組織修復及び再生に悪影響を及ぼしうる他の細胞型の発生を抑制することである。今日、胚性幹細胞の特定系統への分化を増進する及び／又は特定組織細胞型に対して濃縮するプロトコルはあまりにも非効率的で、一般的に、発癌性でありうる不均質な細胞集団を生じる（Keller，Genes Dev. 2005;19:1129-1155；Wobus and Boheler，Physiol Rev. 2005；85：635-678）。
【０００６】
本発明は、当該技術における上述の課題及び他の問題を解決することを目的とする。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の第１の面では、（ａ）胚性幹（ＥＳ)細胞を供給することと、（ｂ）胚性幹細胞から前駆細胞株を樹立することとを含み、前駆細胞株は、当該前駆細胞株の自己複製能に基づいて選択される、方法を提供する。
【０００８】
好適には、この方法では、体細胞は、当該体細胞は自己複製ができないことに基づき、選択されない。
【０００９】
好適な実施形態では、前駆細胞株は、共培養なしで、好適には、フィーダー細胞なしで誘導又は樹立される。好適には、共培養がないことで、胚性幹細胞は選択されない。
【００１０】
好適な実施形態では、前駆細胞株は、形質転換なしで樹立される。好適には、前駆細胞株は、複数の胚性幹細胞又はその子孫細胞を、推定前駆細胞の自己複製を促進する条件に暴露することにより樹立される。好適には、自己複製を促進する条件は、複数の胚性幹細胞の増殖を抑制する。
【００１１】
好適には、自己複製を促進する条件は、富栄養培地での成長を含む。より好適には、自己複製を促進する条件は、ＬＩＦ（白血病阻止因子）なしで細胞を成長させることを含む。
【００１２】
好適には、自己複製を促進する条件は、連続継代を含む。好適には、自己複製を促進する条件は、少なくとも１２の連続継代を含む。
【００１３】
好適な実施形態では、前駆細胞株は、胚性幹細胞に比べて能力が減少する。好適には、前駆細胞株は、系統限定される、好適には、非多能性である。好適には、前駆細胞株は、非発癌性である。
【００１４】
好適には、前駆細胞株を誘導することは、胚性幹細胞を、特定系統への分化を増進する条件に暴露することを含む。好適には、分化を増進する条件は、胚性幹細胞から胚様体を形成することを含む。好適には、多分化能がなくなった後、細胞は、分化を促進する条件から外される。
【００１５】
好適には、系統限定−促進条件から細胞を外すことは、胚様体を分離することを含む。好適には、この方法は、約３−６日間成長させられた胚様体を分離することを含む。
【００１６】
好適な実施形態では、前駆細胞株は、ＯＣＴ４及びアルカリホスファターゼ活性のいずれか又は両方の発現を減少する、又は、それらの発現は実質的にない。
【００１７】
好適には、前駆細胞株は、当該前駆細胞株が誘導される胚性幹細胞に比べて、多分化能マーカーの発現を減少し、多分化能マーカーは、好適には、Ｎａｎｏｇ、ＢＭＰ４、ＦＧＦ５、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ−２、及びＵｔｆ１から構成される群から選択される。
【００１８】
好適な実施形態では、前駆細胞株は、（ａ）４０世代を超えて細胞培養中で維持可能である特徴と、（ｂ）少なくとも１０世代の間、細胞培養中で維持される場合に実質的に安定した核型又は染色体数を有する特徴と、（ｃ）何世代にも亘って実質的に安定した遺伝子発現パターンを有する特徴とのうち１つ以上の特徴を示す。
【００１９】
好適には、前駆細胞株は、好適には免疫力が低下した被移植動物である被移植動物に移植される場合、好適には３週間後、より好適には２乃至９ヶ月後でも奇形腫の形成を実質的に誘発しない。
【００２０】
好適には、胚性幹細胞又は前駆細胞株は、哺乳類細胞又は哺乳類細胞株であり、好適にはマウス又はヒトの胚性幹細胞又は前駆細胞株である。
【００２１】
好適には、前駆細胞株は、内皮前駆細胞株、好適にはＥ−ＲｏＳＨ細胞株を含む。或いは、又は、追加として、前駆細胞株は、間葉系前駆細胞株、好適にはｈｕＥＳ９．Ｅ１細胞株を含む。
【００２２】
一部の実施形態では、この方法は、（ｄ）前駆細胞株から分化細胞を誘導することをさらに含む。
【００２３】
好適には、前駆細胞株は、分化の前に少なくとも５世代の間増殖される。
【００２４】
本発明の第２の面では、胚性幹（ＥＳ）細胞から分化細胞を形成するための本発明の第１の面による方法を提供する。
【００２５】
好適には、分化細胞は、内皮細胞又は間葉細胞である。より好適には、分化細胞は、含脂肪細胞又は骨細胞である。
【００２６】
本発明の第３の面では、細胞の間葉マーカー又は内皮マーカーの発現を上方調節するための第１の面又は第２の面による方法を提供する。
【００２７】
本発明の第４の面では、細胞の幹細胞マーカー又は多分化能マーカーの発現を下方調節するための第１又は第２の面による方法を提供する。
【００２８】
本発明の第５の面では、幹細胞の自己複製又は分化を促進又は遅延可能な作用因子を特定する方法であって、候補分子の存在下で本発明の任意の上述の面による方法を実行することと、候補分子への影響を決定することとを含む方法を提供する。
【００２９】
第６の面において、本発明は、再生療法により治療可能な疾病、心臓疾患、骨髄疾患、皮膚疾患、火傷、また、糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病といった変性疾患、及び癌のうちのいずれか１つの治療、又は、治療のための薬剤組成物の調製の目的で、前駆細胞株又は分化細胞を形成する方法を提供する。
【００３０】
本発明の第７の面では、本発明の任意の上述の面による方法により形成される前駆細胞株を提供する。
【００３１】
本発明の第８の面では、本発明の任意の上述の面による方法により形成される分化細胞を提供する。
【００３２】
本発明の第９の面では、胚性幹（ＥＳ）細胞から分化細胞を形成する方法であって、（ａ）胚性幹細胞から前駆細胞株を誘導することと、（ｂ）前駆細胞株を増殖することと、（ｃ）前駆細胞株から分化細胞を誘導することとを含む方法を提供する。
【００３３】
本発明の第１０の面では、（ａ）胚性幹（ＥＳ）細胞を供給することと、（ｂ）胚性幹細胞から前駆細胞を誘導することと、（ｃ）前駆細胞から前駆細胞株を樹立することとを含み、前駆細胞は、当該前駆細胞の自己複製能に基づいて選択される、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】Ｅ−ＲｏＳＨ細胞株の誘導。
【００３５】
【図１Ａ】胚性幹細胞は、胚様体（ＥＢ）を形成するようメチルセルロース系の培地上に単独にプレーティングされる。３−６日目に胚様体は採取され、コラゲナーゼにより解離され、ゼラチンが被覆されたフィーダープレート上に単層培養として培養される。付着短（adherent short）線維芽細胞様細胞と環状構造を有するＲｏＳＨ様コロニーが選択され、ゼラチンが被覆されたプレート上で増殖されてＥ−ＲｏＳＨ１、２、３、…が形成される。各培養は、１つの１０ｃｍプレートあたりに１０−１００個の細胞の低密度でプレーティングされ、単一のＲｏＳＨ様コロニーが選択されて副系統Ｅ−ＲｏＳＨ２．１、２．２、２．３、…等が樹立される。
【００３６】
【図１Ｂ】経時的に増殖する、特徴的な環状細胞（差込図）を有する付着短線維芽細胞様細胞からなる推定ＲｏＳＨ様コロニーを示す図である。
【００３７】
【図１Ｃ】サブコンフルエント培養におけるＥ−ＲｏＳＨ２．１細胞とＲｏＳＨ２細胞間の形態的類似性を示す図である。
【００３８】
【図１Ｄ】Ｅ−ＲｏＳＨ２．１及びその親のＥ１４胚性幹細胞のアルカリホスファターゼ染色を示す図である。
【００３９】
【図１Ｅ】継代３及び１３におけるＥ−ＲｏＳＨ２．１及び３．２系統における２０の中期細胞核からの平均染色体数を示す図である。
【００４０】
【図２】定量ＲＴ−ＰＣＲ分析による相対遺伝子発現分析を示す図である。発現レベルは胚性幹細胞の発現レベルに対して正規化され、対数関数で表される。
【００４１】
【図２Ａ】３つの異なる継代におけるＥ−ＲｏＳＨ２．１細胞の遺伝子発現プロファイルを示す図である。
【００４２】
【図２Ｂ】Ｅ−ＲｏＳＨ２．１細胞、Ｅ−ＲｏＳＨ３．２細胞、及びＲｏＳＨ２細胞における比較遺伝子発現プロファイルを示す図である。
【００４３】
【図２Ｃ−２Ｄ】定量ＲＴ−ＰＣＲ分析により測定される、親Ｅ１４胚性幹細胞とＥ−ＲｏＳＨ２．１細胞における多分化能及び内皮化能に関連付けられる遺伝子の相対発現を示す図である。
【００４４】
【図３】Ｅ−ＲｏＳＨ細胞の特徴付け。
【００４５】
【図３Ａ】マトリゲル被覆されたプレート上でのＲｏＳＨ２．１細胞のインビトロ分化を示す図である。２週間後、ＲｏＳＨ２．１細胞は、組織皿の表面全体を覆う管状構造の網状構造を形成するよう分化する。
【００４６】
【図３Ｂ】Ｅ−ＲｏＳＨ由来の管状構造は、開放性の内腔とエンドサイトーシスされたアセチル化ＬＤＬを有することを示す図である。この構造は、ＣＦＤＡ、細胞質緑色蛍光染料（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ、オレゴン州ユージーン）、及びＰＩ（Propidium Iodide）で標識が付けられ、共焦点顕微鏡により観察される（左パネル）。管状構造は、アセチル化赤色蛍光ｄｉＩ標識ＬＤＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ、オレゴン州ユージーン）で２４時間インキュベートされ、共焦点顕微鏡による分析の前に緑色蛍光核染料であるＳＹＴＯＸＧｒｅｅｎ（ＴＭ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ、オレゴン州ユージーン）を用いて対比染色される。
【００４７】
【図３Ｃ】ＨＲＰに基づいた検出システムを使用して、Ｅ−ＲｏＳＨ２．１由来の管状構造のパラフィン埋め込み断片のｖＷＦに対する免疫反応性が観察される。ブラウンの沈殿物は、陽性染色を示す。細胞核は、Ｍａｙｅｒのヘマトキシリンを用いて染色される。
【００４８】
【図３Ｄ】定量ＲＴ−ＰＣＲ分析により測定されるＥ−ＲｏＳＨ２．１細胞の内皮細胞分化時の遺伝子発現を示す図である。相対遺伝子発現は、時間０における遺伝子発現に対して正規化され、対数関数として表される。
【００４９】
【図３Ｅ】７日目の胚性幹細胞及びＥ−ＲｏＳＨの懸濁培養を示す。
【００５０】
【図３Ｆ】０、２、３、及び７日間懸濁培養で培養された場合の胚性幹細胞およびＥ−ＲｏＳＨ２．１細胞による遺伝子発現の定量ＲＴ−ＰＣＲプロファイリングを示す図である。相対遺伝子発現は、時間０における胚性幹細胞の遺伝子発現に対して正規化され、対数関数として表される。
【００５１】
【図３Ｇ】インビボ分化を示す図である。Ｑｄｏｔ（Ｒ）ナノ結晶（６５５ｎｍ発光）で標識される１×１０５個のＥ−ＲｏＳＨ細胞は、ＳＣＩＤマウス内に誘発された胚性幹細胞由来の奇形腫内に注入される。３日後、マウスは安楽死させられ、腫瘍が摘出される。腫瘍は、４％のパラホルムアルデヒド中で固定され、２０μｍの厚さで低温切断される。断片は、ラット抗ＰＥＣＡＭ１、続けて、ＦＩＴＣ接合ウサギ抗ラット抗体を使用してＰＥＣＡＭ−１免疫活性について分析され、ＤＡＰＩで対比染色される。断片は、光学顕微鏡、次に共焦点顕微鏡で観察される。
【００５２】
【図４】ＨｕＥＳ９．Ｅ１細胞の特徴付け。
【００５３】
【図４Ａ】増殖性の間質線維芽細胞（矢印）によって囲まれる分裂不活性ＭＥＦ上に成長するＨｕＥＳ９コロニーを示す図である。
【００５４】
【図４Ｂ】ＨｕＥＳ９．Ｅ１  ＭＳＣ様細胞及び骨髄由来のＭＳＣの代表的なコンフルエント培養を示す図である。
【００５５】
【図４Ｃ】ヒト胚性幹細胞株（ＨｕＥＳ９）、マウス胚性幹細胞株（Ｅ１４ｍＥＳＣ）、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）、及び間充織幹細胞（ＭＳＣ）様細胞（ＨｕＥＳ９．Ｅ１）は、アルカリホスファターゼ活性を見つけるべく染色される。
【００５６】
【図４Ｄ】ＨｕＥＳ９細胞とＨｕＥＳ９．Ｅ１  ＭＳＣ様細胞は、ＴａｑＭａｎ（Ｒ）プライマーを使用する定量ＲＴ−ＰＣＲ分析によってＰｏｕ５ｆ１の発現について試験される。ＨｕＥＳ９ヒト胚性幹細胞におけるＰｏｕ５ｆ１の転写レベルは、１に正規化される。
【００５７】
【図４Ｅ】ＨｕＥＳ９．Ｅ１  ＭＳＣ様細胞におけるヒト特異的なＡｌｕ反復配列及びマウス特異的なｃ−ｍｏｓ反復配列の存在に対する遺伝子ＰＣＲ分析を示す図である。
【００５８】
【図４Ｆ】継代４及び８におけるＨｕＥＳ９．Ｅ１の核型分析を示す図である。
【００５９】
【図４Ｇ】ＦＡＣＳ分析による表面抗原のプロファイルを示す図である。ＨｕＥＳ９．Ｅ１細胞は、免疫反応性について、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ３４、及びＣＤ４５に対して試験される。
【００６０】
【図４Ｈ】ＨｕＥＳ９．Ｅ１の含脂肪細及び骨細胞への分化を示す図である。コンフルエントなＨｕＥＳ９．Ｅ１細胞は、標準培養培地で培養され、脂質生成又は骨形成を誘発する。１２日後、脂質生成を誘発された細胞は、赤色油によって油滴が染色され、定量ＲＴ−ＰＣＲによってＰＰＡＲγの発現について分析される（上図）。一方、骨形成を誘発された細胞は、フォン・コッサ染色によってカルシウム堆積が染色され、定量ＲＴ−ＰＣＲによって骨特異的なアルカリホスファターゼＡＬＰの発現について分析される（下図）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６１】
本願では、前駆細胞の自己複製能に基づき胚性幹（ＥＳ）細胞から前駆細胞株を誘導可能であること明らかにする。最終分化細胞とは異なり、自己複製特性を有する推定前駆細胞は、形質転換することなく選択及び増殖可能である。
【００６２】
従って、本発明の方法は、一般的に、多能性細胞をインビトロで培養することで胚性幹細胞から限定された能力を有する前駆細胞株を誘導することに関する。これにより、分化時に、腫瘍形成能が少ない又はない、高度に濃縮された特定細胞型の集団を形成する、高度に限定された分化能を有する前駆細胞の増殖が可能となる。
【００６３】
従って、本願では、前駆細胞の自己複製特性を、胚性幹細胞から系統限定された前駆細胞株を形成するための自己選択の基本原理として使用する。
共培養の不要
【００６４】
しかし、好適な実施形態では、本発明の方法はさらに、前駆細胞の成長を促進し、また、任意選択的に、胚性幹細胞の成長又は増殖を遅延又は阻止する条件下で細胞を培養することを含む。
【００６５】
従って、非常に好適な実施形態では、本発明の方法は、共培養なしで、単層培養として、又は、フィーダー細胞なしで推定前駆細胞を培養することを含む。「共培養」とは、基質フィーダー細胞といった共に成長させられる２つ以上の異なる種類の細胞の混合を指す。本願に記載する方法の好適な実施形態では、胚性幹細胞をフィーダー細胞なしで培養することで前駆細胞株を樹立する。
分化の偏倚
【００６６】
好適な実施形態では、特定系統の胚性幹細胞由来の前駆細胞株を形成する方法は、好適には、胚性幹細胞の分化を、特定の所望系統又は関心系統に向けて偏倚させる第１の工程をさらに含む。本発明の方法はさらに、推定前駆細胞の自己複製を促進し、胚性幹細胞の増殖を阻止する第２の工程を含んでもよい。
【００６７】
第１の工程には、特定の関心系統の成長又は増殖を促進することを含みうる。特定の関心系統の様々な前駆細胞株は、これらの関心系統の分化を促進する条件下に細胞を置くことによって作られうる。例えば、胚性幹細胞は、成長因子、又は、分化を促進或いは可能にするリガンドといった小分子に暴露されてもよい。
【００６８】
従って、本願に記載する特定系統の胚性幹細胞由来の細胞株を樹立する方法は、胚性幹細胞の分化を特定系統に向けて増進する工程を含むことが好適である。この分化増進工程は、所定時間の間行われることが好適である。従って、胚性幹細胞及びその子孫は、分化増進環境に過渡的に暴露されることが好適である。
【００６９】
分化を増進するか又は偏倚する方法の選択は、前駆細胞の形成が所望される対象である特定の関心細胞系統に依存する。当業者は、様々な細胞のために使用されうる様々な方法を認識するであろう。
内胚葉前駆細胞
【００７０】
胚性幹細胞の分化を内胚葉系組織に向けて偏倚することが望まれる場合、例えば、胚様体が形成され、分解（disaggregated）されうる（後述参考）。分解された胚様体は、内胚葉分化を誘導する成長因子、成長剤、又はそれらの組み合わせに暴露されうる。そのような成長因子及び成長剤の例には、アクチビンＡ、ＦＧＦ４、デキサメタゾン、及びレチノイン酸が含まれる。
造血先駆細胞及び内皮前駆細胞
【００７１】
その一方で、胚性幹細胞の分化を造血又は内皮系統に向けて偏倚することが望まれる場合、分解された胚様体は、造血又は内皮分化を誘導する成長因子、成長剤、又はそれらの組み合わせに暴露されうる。そのような成長因子及び成長剤の例には、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ−３、エリスロポエチン、トロンボポエチン、ＴＮＦα、及びラパマイシンが含まれる。
心臓中胚葉前駆細胞及び骨格筋芽細胞前駆細胞
【００７２】
その一方で、胚性幹細胞の分化を心臓中胚葉又は骨格筋芽細胞系統に向けて偏倚することが望まれる場合、分解された胚様体は、心臓中胚葉又は骨格筋芽細胞分化を誘導する成長因子、成長剤、又はそれらの組み合わせに暴露されうる。そのような成長因子及び成長剤の例には、デキサメタゾン、ＰＰＡＲγの阻止因子、テストステロン及びその類似物が含まれる。
【００７３】
第２の工程には、分化細胞を富栄養培地でプレーティングすることを含みうる。このような実施形態では、継続増殖は選択的に前駆細胞を濃縮する。濃縮された前駆細胞は、その後、クローン化可能である。
胚様体の形成
【００７４】
一部の実施形態では、分化増進工程には、胚性幹細胞から胚様体を形成することが含まれる。胚様体及びそれらを形成する方法は当該技術において既知である。「胚様体」とは、液体培養中の胚性幹細胞の成長により形成された培養中に見られる球状コロニーを指す。胚様体は、混合の細胞型であり、特定の細胞型の出現の分布及び時期は、胚において観察されるものに対応する。胚様体は、半固体培地、好適には、ＬｉｍらによってＢｌｏｏｄ．１９９７;９０:１２９１−１２９９に記載されているようなメチルセルロース培地に胚性幹細胞をプレーティングすることによって形成されることが好適である。胚様体は、形成後３乃至６日であることが好適である。
【００７５】
このような実施形態では、胚様体は解離される、即ち、例えば、コラゲナーゼ又はトリプシン処理によって互いから構成細胞を離し、それにより、細胞を系統限定‐促進条件から外す。
【００７６】
好適な実施形態における方法は、所望の特定系統のための推定前駆細胞を選択する工程を含む。この選択は、細胞の形態に基づいて、又は、マーカーの発現等によって行われうる。遺伝子発現プロファイリング又は抗原プロファイリングを使用して、所望の系統の特定前駆細胞を選択してもよい。所望の特定系統に対して選択された推定前駆細胞は、次に、培養されるか、又は、更なる選択工程が行われうる。
【００７７】
好適な実施形態では、分化促進工程の後には、推定前駆細胞の自己複製を促進し、また、胚性幹細胞の増殖を抑制する条件下に分化細胞を暴露することが続く。このような条件には、共培養又はフィーダー細胞なしでの培養を含むことが好適である（上記参照）。
富栄養培地
【００７８】
代替として、又は、追加的に、上述のような条件は、富栄養培地でのプレーティングを含む。本文書で使用する「富栄養培地」とは、栄養分に富んだ培地を指す。そのような培地は、関連細胞の成長に必要な必須栄養素を含むことが好適である。富栄養培地は、血清を含むことが好適である。富栄養培地は、そのような成長に必要な実質的にすべての栄養素を含むことがより好適である。富栄養培地は、関連細胞の成長を支持、促進、及び助長することが最も好適である。非常に好適な実施形態では、関連細胞とは、関心の前駆細胞又は推定前駆細胞である。富栄養培地の例は、２０％ウシ胎仔血清、非必須アミノ酸、Ｌ‐グルタミン酸、及びβメルカプトエタノールを加えた、４５００ｍｇ／ｌのＤ−グルコースを有するＤＭＥＭである。
【００７９】
好適な実施形態では、そのような富栄養培地は、白血病阻止因子（ＬＩＦ）といった、胚性幹細胞の成長を可能にする、促進又は助長する追加の成長調節因子又はホルモンを含まない。
【００８０】
このような実施形態では、継続増殖は選択的に前駆細胞を濃縮する。濃縮された前駆細胞は、その後、クローン化することが可能である。
培養での長期維持
【００８１】
好適には、本願に記載する方法は、胚性幹細胞又はその子孫細胞を、１世代を超えて培養することを含む。細胞は、５、１０、１５、２０、２５、５０、４０、４５、５０、１００、２００、５００、又は８００世代を超えて培養されることが好適である。特に、細胞株は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、２００、５００又はそれ以上の世代数の間維持されうる。
【００８２】
培養中の細胞は、一般的に、接触阻止により細胞分裂及び成長が停止されるコンフルエンスに到達するまで成長を続ける。このような細胞は、次に、基板又はフラスコから分離され、組織培養培地での希釈及び再プレーティングによって「分割（split）」又は継代される。従って、前駆細胞は、培養時に継代又は分割されうる。前駆細胞は、１：２以上、好適には１：３以上、より好適には１：４、１：５以上のスプリット比で分割されることが好適である。「継代」とは、細胞株のコンフルエントな培養の一部分を取り出し、それを新しい培地に植え、その細胞株をコンフルエンス又は飽和状態が得られるまで培養する過程を指す。
【００８３】
しかし、本願に記載する方法により誘導される前駆細胞は、その自己複製能に基づいて多数の世代に亘って維持されうる。その一方で、有機体から直接誘導される「正常」（即ち、形質転換していない体）細胞は、不死ではないことが分かっている。つまり、このような体細胞は、培養において限定された寿命を有する（死に至る細胞である）。体細胞は、無限に成長し続けるのではなく、最終的には、特定の世代数の経過後、増殖又は分裂する能力を失う。「危機段階」に到達後、このような細胞は、約５０世代後に死滅する。従って、このような体細胞は、限られた回数だけ継代しうる。
【００８４】
重要なことは、前駆細胞は、形質転換の必要なく自己複製を維持できることである。従って、例えば、腫瘍細胞又は腫瘍細胞株といった不死化細胞との融合、ＳＶ４０、ＥＢＶ、ＨＢＶ、又はＨＴＬＶ−１といった形質転換ウイルスでの細胞株のウイルス感染、ラージＴ抗原の配列を含むＳＶ４０ベクター（R. D. Berryら、Br. J. Cancer，57，287-289，1988）、テロメラーゼ（Bodnar-A-Gら、Science（1998）279:p349-52）、又はヒト乳頭腫ウイルスのＤＮＡ配列を含むベクター（米国特許第５，３７６，５４２号）といった特殊に改良されたベクターを使用するトランスフェクション、優性の腫瘍遺伝子の導入、又は変異誘導による既知の形質転換処理は、前駆細胞株を形成する本願に記載する方法には必要ではない。
【００８５】
本願に記載する方法の好適な実施形態では、前駆細胞は、形質転換なしで５０世代以上増殖しうる。好適な実施形態では、前駆細胞は、前駆細胞株として無限に増殖し、また、形質転換しないことが可能である。前駆細胞及び前駆細胞株は、それらの親胚性幹細胞に比べて系統が限定されることが好適である。特に、前駆細胞及び前駆細胞株は、全三胚葉を形成することはできない。非常に好適な実施形態では、前駆細胞株は、非多能性であることが好適である。
前駆細胞の特徴
【００８６】
好適な実施形態では、前駆細胞及び細胞株（又はそれらから誘導される分化細胞）は、胚性幹細胞が有する特徴を示さない。好適には、そのような特性には、ＯＣＴ４遺伝子及びアルカリホスファターゼ活性の発現を含む。前駆細胞株は、多分化能の１つ以上の特徴マーカーの発現は減少することが好適である。このような多分化能マーカーは、以下に詳細に説明するが、Ｎａｎｏｇ、ＢＭＰ４、ＦＧＦ５、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ−２、及びＵｔｆ１を含む。
【００８７】
本願に記載する方法により形成する前駆細胞は、非発癌性であることが好適である。好適には、前駆細胞は、免疫力が低下した又は免疫不全の宿主動物に移植しても、腫瘍の形成をもたらさず、これは、腫瘍形成をもたらす親胚性幹細胞の移植と対照的である。好適には、免疫力が低下した又は免疫不全の宿主動物は、ＳＣＩＤマウス又はＲａｇ１−／−マウスである。前駆細胞は、好適には２週間以上、より好適には２ヶ月以上、最も好適には９ヶ月以上の長期の移植期間後も腫瘍を形成しないことが好適である。発癌性テストの詳細なプロトコルを以下の例に提示する。
【００８８】
本願に記載する方法により形成される前駆細胞はさらに、以下の１つ以上の特徴を示すことが好適である。前駆細胞は、好適には、少なくとも１０世代の間、細胞培養中に維持される場合に、染色体数により評価される実質的に安定した核型を有する。前駆細胞はさらに、何世代にも亘って実質的に安定した遺伝子発現パターンを示すことが好適である。つまり、１つ以上、好適には、実質的に全ての選択遺伝子セットの発現レベルは、１つの世代における前駆細胞と次世代における前駆細胞との間では顕著に異ならないことを意味する。
【００８９】
遺伝子のセットは、以下のうちの１つ以上、サブセット、又は全てを含むことが好適である。即ち、ｃｅｒｂｅｒｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿００９８８７、ＡＦ０３１８９６、ＡＦ０３５５７９）、ＦＡＢＰ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿００７９８０、M６５０３４、ＡＹ５２３８１８、ＡＹ５２３８１９）、Ｆｏｘａ２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿０１０４４６、Ｘ７４９３７、Ｌ１０４０９）、Ｇａｔａ−１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿００８０８９、Ｘ１５７６３、ＢＣ０５２６５３）、Ｇａｔａ−４（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿００８０９２、ＡＦ１７９４２４、Ｕ８５０４６、Ｍ９８３３９、ＡＢ０７５５４９）、Ｈｅｓｘ１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿０１０４２０、Ｘ８００４０、Ｕ４０７２０、ＡＫ０８２８３１）、ＨＮＦ４ａ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿００８２６１、Ｄ２９０１５、ＢＣ０３９２２０）、ｃ−ｋｉｔ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿０２１０９９、Ｙ００８６４、ＡＹ５３６４３０、ＢＣ０７５７１６、ＡＫ０４７０１０、ＢＣ０２６７１３、ＢＣ０５２４５７、ＡＫ０４６７９５）、ＰＤＧＦＲα（ＮＭ＿０１１０５８、Ｍ５７６８３、Ｍ８４６０７、ＢＣ０５３０３６）、Ｏｃｔ４（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿０１３６３３、Ｘ５２４３７、Ｍ３４３８１、ＢＣ０６８２６８）、Ｒｕｎｘ１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿００９８２１、Ｄ２６５３２、ＢＣ０６９９２９、ＡＫ０５１７５８）、Ｓｏｘ１７（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿０１１４４１、Ｄ４９４７４、Ｌ２９０８５、ＡＫ００４７８１）、Ｓｏｘ２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿０１１４４３、Ｕ３１９６７、ＡＢ１０８６７３）、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（ＮＭ＿００９３０９、Ｘ５１６８３）、ＴＤＧＦ１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿０１１５６２、Ｍ８７３２１）、及びＴｉｅ−２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿０１３６９０、Ｘ６７５５３、Ｘ７１４２６、Ｄ１３７３８、ＢＣ０５０８２４）。
【００９０】
本願に記載する方法は、前駆細胞及び前駆細胞株、並びに、前駆細胞のクローン子孫を含む分化細胞の形成を可能にする。細胞の「クローン子孫」とは、実質的に任意の形質転換又は遺伝子変化を経ていない細胞子孫を指す。実質的な遺伝子変化を経ていないこのようなクローン子孫は、親細胞又は祖先細胞、好適には胚性幹細胞と遺伝子的に略同一である（能力は減少されて保存される）。「前駆細胞」も、前駆細胞から誘導された細胞株、即ち、前駆細胞株を含み、また、前駆細胞株には前駆細胞が含まれると解釈すべきである。
自己複製及び分化の調節因子
【００９１】
本発明の方法は、自己複製又は分化の推定調節因子を特定するよう使用されてもよい。この方法には、候補分子の存在又は不在時に前駆細胞株又は分化細胞の形成について説明した方法を行うことと、分子の存在が過程に任意の影響を与えているか否かを特定することを含む。例えば、前駆細胞又は分化細胞の形成を加速する分子は、分化の正の調節因子として（又は、或いは自己複製の阻止因子として）使用されうる。反対に、過程を遅延させる分子は、分化の阻止因子、又は、自己複製の促進因子と考えられる。
【００９２】
好適な実施形態において、さらに、本発明の方法により得ることのできる選択された系統の細胞、好適には、前駆体を提供する。今までは、前駆体の調製は多くの不純物を含んでいたので、任意の選択された細胞が前駆細胞であるか否かに関して確実にすることができなかった。略１００％純粋な前駆体の調製を生成可能な本発明の培養では、単一の前駆体の単離が実現される。
【００９３】
さらに、好適な実施形態において、複数の細胞を含む組成物を提供する。この組成物中、細胞の大部分は、選択系統の前駆細胞である。好適には、６０％の細胞は選択系統の前駆細胞である。より好適には、６０％の細胞は前駆細胞である。さらに、本発明は、単離された前駆細胞を提供する。「細胞株」とは、培養中で維持及び成長可能であり、また、不死の又は無限の寿命を示す細胞を指すことが好適である。
【００９４】
本願に記載する方法は、本願に参考として組み込む米国特許出願番号第６０／６０９，２１６号に記載されるように分化促進のためのｍＴＯＲの活性の減少と組み合わされてもよい。
前駆細胞及び幹細胞
【００９５】
本願に記載する方法は、前駆細胞及びその細胞株を形成可能である。
【００９６】
胚性幹細胞の分化時、一般的に、胚性幹細胞が一連の系統限定を通過する早期の哺乳類の発生の複雑さという、系統発生の反復を行い、全三胚葉を形成する最終分化細胞を最終的に形成する前に系統化能が減少した前駆細胞を形成する（Wiles，Methods in Enzymology. 1993;225:900-918）。これは、造血過程によって例示される。この過程では、マウス胚において見られるのと同様の一連の過程で出現する徐々に系統限定された造血前駆細胞を胚様体内で特定可能である（Choiら，Methods Mol Med. 2005;105:359-368）。
【００９７】
一般的に、幹細胞は、その完全に分化された状態に達成する前に１つの又は複数の中間細胞型を形成する。これらは、前駆体又は前駆細胞と呼ばれる。胎生又は成体組織内の前駆体又は前駆細胞は、分裂し分化細胞を生じる部分的に分化した細胞である。このような細胞は、通常、特定の細胞発生経路に沿って分化するよう「コミットしている」とみなされ、従って、前駆細胞は、時に「コミットした幹細胞」とも呼ばれる。
【００９８】
本発明の方法は、様々な細胞型の前駆細胞及び細胞株を形成することが可能である。
【００９９】
例えば、本願では、末梢血前駆細胞（ＰＢＰＣ）、神経前駆細胞、造血前駆細胞、骨髄前駆細胞、上皮前駆細胞、骨髄間質細胞、骨格筋前駆細胞、膵島前駆細胞、間葉系前駆細胞、心臓中胚葉系幹細胞、肺上皮前駆細胞、肝前駆細胞、及び内胚葉系前駆細胞を形成する方法を開示する。
【０１００】
本願に記載する方法により形成される前駆細胞は、様々な商業上重要な研究、診断、及び治療目的に使用可能である。これらの使用法は一般的に周知であるが、ここで簡単に説明する。
【０１０１】
例えば、幹細胞を、再生療法用の前駆細胞集団を形成するために使用しうる。前駆細胞は、エクスビボ増殖によって形成されるか、又は、患者に直接投与されうる。前駆細胞は、外傷後の損傷組織の再増殖にも使用されうる。
【０１０２】
従って、造血前駆細胞は骨髄置換に、心臓前駆細胞は心臓障害患者に使用しうる。皮膚前駆細胞は患者の植皮片の成長に、また、内皮前駆細胞は、ステント又は人工心臓といった人工プロテーゼの内皮化に使用しうる。
【０１０３】
胚性幹細胞及びその組織幹細胞派生物は、糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病等の変性疾患の治療のための前駆細胞源として使用しうる。幹細胞を、例えば、癌の免疫治療のためのＮＫ細胞又は樹枝状細胞の前駆体源として使用しうる。これらの前駆体は、本願に記載する方法及び構成により形成されうる。
【０１０４】
本願に記載する方法及び構成は、前駆細胞の形成を可能にする。これらの前駆細胞は、当然ながら、当該技術において周知の方法を使用して分化することが可能でありうる。従って、分化細胞の任意の使用法は、分化細胞の発生源である前駆細胞に等しく付随する。
【０１０５】
本願に記載する方法及び構成により形成される前駆細胞は、疾病の治療に、又は、疾病の治療のための薬剤組成物の調製に使用しうる。このような疾病には、心臓疾患、骨髄疾患、皮膚疾患、火傷、また、糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病といった変性疾患等や癌を含む再生療法により治療可能な疾病を含みうる。
【０１０６】
本願に疾病の治療法を記載する。この方法は、（ａ）胚性幹（ＥＳ）細胞を供給することと、（ｂ）その胚性幹細胞から前駆細胞株を樹立すること（前駆細胞株は、その自己複製能に基づいて選択される）と、（ｄ）その前駆細胞株から分化細胞を任意選択的に誘導することと、（ｅ）前駆細胞株又は分化細胞を患者に投与することを含む。
分化細胞
【０１０７】
最終分化細胞といった分化細胞は、本願に記載する方法により形成される前駆細胞又は細胞株から誘導されうる。従って、本願に分化細胞の形成法を開示する。この方法は、上述したように前駆細胞又は細胞株を形成することと、前駆細胞又は細胞株から分化細胞を誘導することを含む。
【０１０８】
本願に記載する方法により形成されうる分化細胞は、以下のうちいずれか又は全てを含みうる。
ｉ）含脂肪細胞：体内のどこにでもあり、特に皮膚下にある脂肪又は脂肪組織の機能細胞型。含脂肪細胞は、エネルギー、体温調節、及び機械衝撃に対する緩衝作用のために脂肪を蓄え、合成する。
ｉｉ）心筋細胞：心臓が連続的且つ周期的に鼓動することを可能にする心臓の機能筋細胞型。
ｉｉｉ）軟骨細胞：関節、外耳道、気管、喉頭蓋、喉頭、脊椎間、肋骨の端間の椎間板の軟骨を形成する機能細胞型。
ｉｖ）線維芽細胞：体の大部分の組織内に見つけられる結合又は支持細胞。線維芽細胞は、特定の臓器の機能細胞型が正しく機能することを支援する指導支持骨格を与える。
ｖ）肝細胞：代謝廃棄物を解毒し、赤血球を破壊し、その構成要素を再生する酵素を作り、血漿タンパク質を合成する肝臓の機能細胞型。
ｖｉ）造血細胞：血液を作る機能細胞型。造血細胞は、成体の骨髄内にある。胎児では、造血細胞は、肝臓、脾臓、骨髄、及び子宮内の胎児を囲む支持組織内にある。
ｖｉｉ）筋細胞：筋肉の機能細胞型。
ｖｉｉｉ）神経細胞：インパルスの伝達に特化された脳の機能細胞型。
ｉｘ）骨芽細胞：骨形成に関与する機能細胞型。
ｘ）島細胞：インスリン、グルカゴン、ガストリン、及びソマトスタチンの分泌に関与する膵臓の機能細胞。これらの分子は共に、炭水化物代謝及び脂肪代謝、血糖値、及び胃酸分泌を含む多数の作用を調節する。
前駆細胞及び分化細胞の使用法
【０１０９】
本願に記載する方法及び構成により形成される前駆細胞株及び分化細胞は、様々な商業上重要な研究、診断、及び治療目的に使用可能である。
【０１１０】
例えば、未分化細胞の集団を、分化表現型に対して特異的な抗体及びｃＤＮＡライブラリを作成するために使用しうる。抗体の調達、精製、及び修飾に使用する一般的な技法、及び抗体の免疫学的検定及び免疫隔離方法における使用は、Handbook of Experimental Immunology（Weir & Blackwell，eds.）; Current Protocols in Immunology （Coligan et al.，eds.）;及びMethods of Immunological Analysis （Masseyeff et al.，eds.，Weinheim: VCH Verlags GmbH）に記載される。ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡライブラリの作成に関連する一般的な技法は、RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and Characterization （R. E. Farrell， Academic Press，1998）; cDNA Library Protocols （Cowell & Austin，eds.，Humana Press）;及びFunctional Genomics （Hunt & Livesey， eds.，2000）に記載される。比較的均質な細胞集団は、薬剤スクリーニング及び治療適用での使用に特に適している。
【０１１１】
前駆細胞株及び分化細胞のこれらの及び他の使用法は、本明細書中、以下にさらに詳細に説明する。前駆細胞株及び分化細胞は、特に、疾病の治療用の薬剤組成物の調合に使用されうる。このような疾病には、心臓疾患、骨髄疾患、皮膚疾患、火傷、また、糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病といった変性疾患や癌を含む再生療法により治療可能な疾病を含みうる。
薬剤スクリーニング
【０１１２】
本願に記載する方法及び構成により形成される前駆細胞株及び分化細胞は、分化細胞の特徴に悪影響を与える因子（例えば、溶媒、小分子薬剤、ペプチド、ポリヌクレオチド等）又は環境条件（例えば、培養条件又は処置）をスクリーニングするよう使用しうる。
【０１１３】
一部の適用では、前駆細胞株及び分化細胞を、成熟を促進する又は長期培養におけるそのような細胞の増殖及び維持を促進する因子をスクリーニングするよう使用する。例えば、候補の成熟因子又は成長因子は、それらを様々なウェル内の前駆細胞又は分化細胞に加え、その後、更に培養する、また、細胞を使用するための所望の基準に応じて、結果的に生じる任意の表現型の変化を決定することによって試験される。
【０１１４】
さらに、前駆細胞株及び分化細胞の遺伝子発現プロファイリングを、これらの細胞に一意である又は高度に発現されるレセプタ、転写因子、シグナリング分子を特定するよう使用しうる。レセプタ、転写因子、及びシグナリング分子の特定のリガンド、小分子阻止因子、又は活性化因子を使用して前駆細胞株及び分化細胞の分化及び特性を調節しうる。
【０１１５】
特定のスクリーニング適用は、薬学研究における薬剤化合物の試験に関連する。標準テキストブックである「In vitro Methods in Pharmaceutical Research」（Academic Press，1997）及び米国特許第５，０３０，０１５号、及び本願に記載する薬剤スクリーニングに関する一般的な説明を参照されたい。候補薬剤化合物の活性の評価には、一般的に、分化細胞を候補化合物と合わせ、化合物に起因する細胞の形態、マーカー表現型、又は代謝活性における任意の変化（未処理細胞、又は、不活性化合物で処理された細胞と比較して）を判別し、そして、化合物の影響を観察された変化と相関させることが含まれる。
【０１１６】
スクリーニングは、例えば、化合物が特定の細胞型に対し薬理効果を有するよう作られる、又は、他で効果を有するよう作られた化合物が意図しない副作用を有しうることから行われうる。２つ以上の薬物を組み合わせて（細胞を同時に又は連続的に合わせることにより）検査することができ、それにより、生じている可能性のある薬物‐薬物相互作用を検出する。一部の適用では、化合物は、最初に潜在毒性を見つけるべくスクリーニングされる（Castellら，「In vitro Methods in Pharmaceutical Research」，Academic Press，1997，pp. 375-410）。細胞毒性は、細胞の生存可能性、生存、形態への影響、及び、特定マーカー、レセプタ、又は酵素の発現又は放出（release）への影響によりすぐに決定可能である。染色体ＤＮＡへの薬物の影響は、ＤＮＡ合成又は修復を測定することにより決定可能である。特に、細胞周期の不定期時における、又は、細胞複製に必要なレベルを超える［３Ｈ］チミジン又はＢｒｄＵの取り込みは、薬物効果と一貫している。望ましくない効果にはさらに、分裂中期スプレッド（metaphase spread）により決定される異常な姉妹染色分体交換率を含みうる。詳細は、A. Vickersによる「In vitro Methods in Pharmaceutical Research」（Academic Press，1997，PP 375-410）を参照されたい。
組織再生
【０１１７】
本願に記載する方法及び構成により形成される前駆細胞株及び分化細胞はさらに、組織再構成又は再生を必要とするヒト患者の組織再構成又は再生に使用しうる。これらの細胞は、対象組織部位に移植され、機能性が欠けた領域を再構成又は再生することが可能となるよう投与される。
【０１１８】
例えば、本願に記載する方法及び構成は、幹細胞の分化を調節するよう使用しうる。前駆細胞株及び分化細胞は、植皮片の成長といったヒト組織工学に使用されうる。幹細胞分化の調節は、人工臓器又は組織の生体工学、又は、ステントといったプロテーゼに対して使用されうる。
【０１１９】
別の例では、神経前駆細胞は、治療される疾病に応じて、中枢神経系の実質部位又は鞘内部位に直接移植される。移植片は、１μＬあたり２５，０００‐５００，０００個の細胞の密度の単個細胞懸濁液又は小会合体を使用して移植される（米国特許第５，９６８，８２９号）。神経細胞移植の有効性は、McDonaldら（Nat. Med. 5:1410，1999）によって説明されるように、急性的に損傷した脊髄についてラットモデルにおいて評価することができる。移植が成功する場合、２−５週間後、損傷部において、星状細胞、乏突起膠細胞、及び／又は神経細胞に分化し、損傷末端から脊髄に沿って移動する移植に由来する細胞が発見でき、また、ゲート、筋肉運動の協調、及び、重量負荷において改善が見られる。
【０１２０】
特定の神経前駆細胞は、神経系の急性損傷又は慢性損傷の治療のために作られる。例えば、興奮毒性は、てんかん、脳梗塞、虚血、ハンチントン病、パーキンソン病、及びアルツハイマー病を含む様々な健康状態に関連していると考えられている。本願に記載する方法により形成される特定の分化細胞はさらに、ペリツェウス・メルツバッヘル病、多発性硬化症、大脳白質萎縮症、神経炎、及び神経障害といった髄鞘形成障害性疾患の治療にも適切でありうる。再ミエリン化を促進するよう乏突起膠細胞及び乏突起膠細胞前駆体が加えられた細胞培養がこれらの目的に適している。
【０１２１】
本本発明の方法を使用して調製した肝細胞及び肝細胞前駆体は、肝臓損傷を修復する能力について動物モデルにおいて評価することができる。１つのそのような例は、Ｄ‐ガラクトサミンの腹腔内投与により生じる損傷である（Dabevaら，Am. J. Pathol. 143:1606， 1993）。治療の有効性は、肝細胞マーカーについての免疫組織化学的染色、細管構造が成長組織内に形成されるか否かの顕微鏡的決定、及び、肝特異的なタンパク質の合成を回復する治療の能力によって決定することができる。肝細胞は、直接投与によって、又は、劇症肝炎後に被験者の肝組織が肝組織を再生する間に一時的に肝機能を提供するバイオ支援装置の一部として治療において使用することができる。
【０１２２】
本願に記載する方法により調製される心筋細胞の有効性は、処置がない場合は、５５％の左心室壁組織が瘢痕組織になることを引き起こす心臓の低温障害（cardiac cryoinjury）について動物モデルにおいて評価することができる（Liら，Ann. Thorac. Surg. 62:654，1996; Sakaiら，Ann. Thorac. Surg. 8:2074，1999，Sakaiら，J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 118:715，1999）。治療が成功する場合、瘢痕組織の面積は減少し、瘢痕組織の拡大は制限され、また、収縮期圧、拡張期圧、及び発生圧により決定される心機能が改善される。心外傷は、左冠動脈前下行枝の末端部において塞栓コイルを使用してモデル化することもできる（Watanabeら，Cell Transplant. 7:239，1998）。また、治療の有効性は、組織学及び心機能により評価することができる。心筋細胞の調製物は、心筋を再生し、また、心機能障害を治す治療に使用することができる（米国特許第５，９１９，４４９号及びＷＯ９９/０３９７３）。
癌
【０１２３】
本願に記載する方法及び構成により形成される前駆細胞株及び分化細胞は、癌の治療に使用されうる。
【０１２４】
「癌」及び「癌性」とは、一般的に、無秩序な細胞成長によって特徴付けられる哺乳類の生理学的状態を指す又は表す。癌の例として、以下に限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が挙げられる。
【０１２５】
このような癌のより具体的な例として、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃癌、膵臓癌、また、グリア芽腫及び神経線維腫症といったグリア細胞腫瘍、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌（liver cancer）、膀胱癌、肝臓癌（hepatoma）、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌（kidney cancer）、腎臓癌（renal cancer）、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌（hepatic carcinoma）、及び、様々な種類の頭部及び頸部癌が挙げられる。更なる例としては、結腸癌、乳癌、肺癌、及び前立腺癌を含む固形腫瘍癌、白血病及びリンパ腫を含む造血器悪性腫瘍、ホジキン病、再生不良性貧血、皮膚癌、及び身近な腺腫様ポリープが挙げられる。更なる例としては、脳新生物、結腸直腸新生物、乳房新生物、頸部新生物、眼新生物、肝新生物、肺新生物、膵臓新生物、卵巣新生物、前立腺新生物、皮膚新生物、精巣新生物、新生物、骨新生物、栄養膜新生物、卵管新生物、直腸新生物、結腸新生物、腎臓新生物、胃新生物、及び、上皮小体新生物が挙げられる。乳癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、悪性黒色腫、白血病、リンパ腫、卵巣癌、子宮頸癌、及び胆道癌も含まれる。
【０１２６】
好適な実施形態では、本願に記載する方法及び構成により形成される前駆細胞株及び分化細胞は、Ｔ細胞リンパ腫、メラノーマ、又は肺癌の治療に使用されうる。
【０１２７】
本願に記載する方法及び構成により形成される前駆細胞株及び分化細胞は、エンドスタチン及びアンギオスタチンといった抗癌剤、又は、細胞毒性薬、又は、化学療法薬と組み合わされて使用してもよい。例えば、アドリアマイシン、ダウノマイシン、シスプラチン、エトポシド、タクソール、タキソテール、及び、ビンクリスチンといったアルカロイド、並びに、メトトレキサートといった代謝拮抗物質。本願に使用する「細胞毒性薬」とは、細胞の機能を抑制又は阻止する、及び／又は、細胞を破壊する物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ｉ、Ｙ、Ｐｒ）、化学療法薬、及び、細菌起源、真菌起源、植物起源、又は動物起源の酵素活性毒素といった毒素、又はそれらの残留物質を含むことを意図する。
【０１２８】
さらに、この用語は、ＷＯ９４／２２８６７に開示されるような二環式アンサマイシン、欧州特許第６００８３２号に開示される１，２‐ビス（アリールアミノ）安息香酸誘導体、欧州特許第６００８３１号に開示される６，７−ジアミノ−フタラジン−１-ワン（one）誘導体、欧州特許第５１６５９８号に開示される４，５−ビス（アリールアミノ）−フタルイミド誘導体、又は、ＳＨ２含有基質タンパク質へのチロシン・キナーゼの結合を抑制するペプチド（例えば、ＷＯ９４／０７９１３を参照されたい）といった癌遺伝子産物／チロシン・キナーゼ阻害剤を含む。「化学療法薬」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法薬の例としては、アドリアマイシン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、チトキン（Cytoxin）、タクソール、メトトレキサート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ＶＰ−１６、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、ニコチンアミド、エスペラミシン（米国特許第４，６７５，１８７号を参照されたい）、メルファラン、及び他の関連するナイトロジェン・マスタード及び内分泌療法（ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）、タモキシフェン、ＬＨＲＨ拮抗薬、プロゲスチン、抗黄体ホルモン等）が挙げられる。
幹細胞
【０１２９】
本文書において使用する用語「幹細胞」とは、分裂時に２つの発生オプションを有する細胞を指す。即ち、娘細胞が、起源細胞と同一であることが可能である（自己複製）、又は、娘細胞が、より分化した細胞型の前駆体であってもよい（分化）。従って、幹細胞は、どちらか一方の経路をたどることが可能である（様々な細胞型のうちの１つを形成可能な更なる経路が存在する）。従って、幹細胞は、最終分化細胞ではなく、また、他の型の細胞を形成可能な細胞である。
【０１３０】
本文書において参照する幹細胞は、全能性幹細胞、多能性幹細胞、及び複能性幹細胞を含みうる。
全能性幹細胞
【０１３１】
用語「全能性」細胞とは、成体における任意の細胞型、又は、胚体外膜（例えば、胎盤）の任意の細胞になりうる能力を有する細胞を指す。従って、受精卵、及びその卵割により形成される最初の四細胞期辺りまでだけが全能性細胞である。
多能性幹細胞
【０１３２】
「多能性幹細胞」は、体内の任意の分化細胞を形成可能な能力を有する真の幹細胞である。しかし、多能性幹細胞は、栄養膜から誘導される胚体外膜は形成することができない。幾つかの細胞型の多能性幹細胞が発見されている。
胚性幹細胞
【０１３３】
胚性幹（ＥＳ）細胞は、移植が行われた場合の胚発生の段階である胚盤胞の内部細胞塊（ＩＣＭ）から単離されうる。
胚性生殖細胞
【０１３４】
胚性生殖（ＥＧ）細胞は、流産／堕胎した胎児内の生殖腺の前駆体から単離されうる。胚性腫瘍細胞
【０１３５】
胚性腫瘍（ＥＣ）細胞は、胎児の生殖腺に時々発生する腫瘍である奇形癌腫から単離される。ＥＳ細胞及びＥＧ細胞とは異なり、ＥＣ細胞は、通常、異数性である。これらの３つの全ての細胞型の多能性幹細胞は、胚組織又は胎児組織からのみ単離可能であり、また、培養で成長させることが可能である。これらの多能性細胞の分化を阻止する方法は当該技術において既知である。
成体幹細胞
【０１３６】
成体幹細胞は、神経、皮膚、及び、骨髄移植における活性成分である造血幹細胞を含む様々な細胞型を含む。造血幹細胞型は、臍帯由来幹細胞の主要な特徴でもある。成体幹細胞は、研究室及び体内の両方で、機能的なより分化した細胞型に成熟することが可能であるが、細胞型の正確な数は、選択した幹細胞の細胞型により限定される。
複能性幹細胞
【０１３７】
複能性幹細胞は、真の幹細胞であるが、限られた数の細胞型にしか分化することができない。例えば、骨髄は、血液に関する全ての細胞を生じるが他の細胞型は生じない複能性幹細胞を含む。複能性幹細胞は、成体動物内に見つけられる。体内の全ての臓器（脳、肝臓）には複能性幹細胞があり、複能性幹細胞は、死細胞又は損傷細胞を置換することができると考えられている。
【０１３８】
幹細胞を特徴付ける方法は、当該技術において既知であり、また、クローン検定、フローサイトメトリー、長期培養、及び、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、及びサザンブロッティング等の分子生物学的手法といった標準検定法を使用する。
【０１３９】
形態的相違に加えて、ヒト多能性幹細胞とマウス多能性幹細胞は、多数の細胞表面抗原（幹細胞マーカー）のその発現において異なる。胎児性抗原１及び４（ＳＳＥＡ−１及びＳＳＥＡ−４）及び腫瘍拒絶抗原１−６０及び１−８１（ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１）を含む幹細胞マーカー同定用の抗体は、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社（米国カリフォルニア州テメキュラ）から市販される。単クローン抗体を用いたこれらの抗原の免疫学的検出は、多能性幹細胞を特徴付けるのに広く使用されてきている（Shamblott M.J.ら（1998）PNAS 95: 13726-13731，Schuldiner M.ら（2000）。PNAS 97: 11307-11312，Thomson J.A.ら（1998）。Science 282: 1145-1147，Reubinoff B.E.ら（2000）。Nature Biotechnology 18: 399-404，Henderson J.K.ら（2002）。Stem Cells 20: 329-337，Pera M.ら（2000)）。J. Cell Science 113: 5-10）。
幹細胞源
【０１４０】
以下の非限定例を含みうる様々な細胞型の幹細胞を、本願に記載する方法及び構成に使用して、前駆細胞、前駆細胞株、及び分化細胞を形成しうる。
【０１４１】
米国特許番号第５，８５１，８３２号は、脳組織から得られる複能性神経幹細胞を開示する。米国特許番号第５，７６６，９４８号は、新生児の大脳半球から神経芽細胞を形成することを開示する。米国特許番号第５，６５４，１８３号及び第５，８４９，５５３号は、哺乳類の神経堤幹細胞の使用を開示する。米国特許番号第６，０４０，１８０号は、哺乳類の複能性ＣＮＳ幹細胞の培養から分化神経細胞のインビトロ形成を開示する。ＷＯ９８／５０５２６及びＷＯ９９／０１１５９は、神経上皮幹細胞、乏突起膠細胞−星状細胞前駆体、及び系統限定された神経細胞前駆体の形成及び単離を開示する。米国特許番号第５，９６８，８２９号は、胚前脳から得られ、グルコース、トランスフェリン、インスリン、セレン、プロゲステロン、及び幾つか他の成長因子を含む培地で培養される神経幹細胞を開示する。
【０１４２】
初代肝細胞培養は、ヒト生検、又は、コラゲナーゼ及びヒアルロニダーゼの適切な組み合わせを用いた灌流による外科摘出組織から得られる。或いは、欧州特許第０９５３６３３号は、細分化したヒト肝組織を調製し、成長培地に濃縮組織細胞を再懸濁し、培養で細胞を増殖させて肝細胞を単離することを開示する。成長培地は、グルコース、インスリン、トランスフェリン、Ｔ３、ＦＣＳ、及び肝細胞が悪性形質転換なしで成長することを可能にする様々な組織抽出物を含む。肝臓内の細胞には、肝実質細胞、クッパー細胞、類洞内皮、及び胆管上皮を含む特異性細胞と、成熟肝細胞又は胆管上皮細胞に分化する能力を有する前駆細胞（「肝幹細胞（hepatoblasts）」又は「卵形細胞」と呼ばれる）が含まれると考えられている（L. E. Rogler，Am. J. Pathol. 150:591，1997、M. Alison，Current Opin. Cell Biol. 10:710，1998、Lazaroら，Cancer Res. 58:514，1998）。
【０１４３】
米国特許番号第５，１９２，５５３号は、ヒト新生児又は胎児の造血幹細胞又は前駆細胞を単離する方法を開示する。米国特許番号第５，７１６，８２７号は、Ｔｈｙ−１陽性の前駆体であるヒト造血細胞と、それらの細胞をインビトロで再生することを開示する。米国特許番号第５，６３５，３８７号は、ヒト造血細胞及びその前駆体を培養する方法及び装置を開示する。米国特許番号第６，０１５，５５４号は、ヒトリンパ細胞及び樹状細胞を再構成する方法を記載する。
【０１４４】
米国特許番号第５，４８６，３５９号は、骨、軟骨、腱、靱帯、及び真皮といった２以上の結合組織型の細胞に分化可能なヒト間葉幹細胞の均質な集団を開示する。この均質集団は、骨髄又は骨膜から得られる。更に、間葉幹細胞の増殖に使用される培養条件も開示する。ＷＯ９９／０１１４５は、Ｇ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦといった成長因子で処理された個体の末梢血から単離されるヒト間葉幹細胞を開示する。ＷＯ００／５３７９５は、実質的に含脂肪細胞及び赤血球のない脂肪由来幹細胞及び格子を開示する。これらの細胞は、開示によればホルモン及び条件付き培養培地を形成するよう膨張及び培養可能である。
【０１４５】
任意の脊椎種の幹細胞が使用可能である。これには、ヒト、非ヒト霊長類、家畜、及び他の非ヒト哺乳類の幹細胞が含まれる。
【０１４６】
幹細胞のうち、本発明での使用に適した幹細胞は、胚盤胞といった妊娠後に形成された組織、又は、妊娠期間の任意の時間に取られた胎児又は胚組織から誘導される霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞であることが好適である。非限定的な例は、胚性幹細胞の初代培養又は樹立系統である。
培地及びフィーダー細胞
【０１４７】
ｐＰＳ細胞を単離し、増殖するための培地は、得られる細胞が所望の特徴を有し、さらに増殖可能である限り任意の様々な処方を有することが可能である。好適な供給源は以下の通りである。ＤＭＥＭ（Dulbecco's modified Eagles medium）、Ｇｉｂｃｏ＃１１９６５−０９２、ＫＯ  ＤＭＥＭ（Knockout Dulbecco's modified Eagles medium）、Ｇｉｂｃｏ＃１０８２９−０１８、２００ｍＭのＬ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ＃１５０３９−０２７、非必須アミノ酸溶液、Ｇｉｂｃｏ１１１４０−０５０、β−メルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ＃Ｍ７５２２、ｂＦＧＦ（ヒト組換え型塩基性線維芽細胞成長因子）、Ｇｉｂｃｏ＃１３２５６−０２９。例示的な血清含有胚性幹（ＥＳ）培地は、８０％ＤＭＥＭ（一般的には、ＫＯ  ＤＭＥＭ）、加熱不活性化されていない２０％デファインドウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０.１ｍＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのＬ−グルタミン、及び０.１ｍＭのβ−メルカプトエタノールで作成される。培地はろ過され、２週間を超えない期間の間摂氏４度で保存される。血清のない胚性幹（ＥＳ）培地は、８０％ＫＯ  ＤＭＥＭ、２０％血清代替物、０.１ｍＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのＬ−グルタミン、及び０.１ｍＭ  β−メルカプトエタノールで作成される。有効な血清代替物は、Ｇｉｂｃｏ＃１０８２８−０２８である。培地はろ過され、２週間を超えない期間の間摂氏４度で保存される。使用直前に、ヒトｂＦＧＦを、４ｎｇ／ｍＬの最終濃縮物に添加する（Bodnarら，Geron Corp，国際特許公報ＷＯ９９／２０７４１）。
【０１４８】
フィーダー細胞は（使用される場合）、９０％ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ＃１１９６５−０９２）、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ＃３００７１−０３）、及び、２ｍＭのグルタミンを含むｍＥＦ培地で増殖される。ｍＥＦは、Ｔ１５０フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃４３０８２５）内で増殖され、細胞はトリプシンを用いて一日おきに１：２に分割され、細胞をサブコンフルエント状態に維持する。フィーダー細胞層を調製するには、細胞を、増殖を阻害するが、ヒト胚性幹細胞を支持する重要な因子の合成を許容する線量（約４０００ラドのγ線照射）で照射する。６ウェル培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ＃３０４など）は、１ウェルあたり１ｍＬの０.５％ゼラチンで一晩摂氏３７度でインキュベートして被覆され、１ウェルあたり３７５，０００個の被照射ｍＥＦがプレーティングされる。フィーダー細胞層は、一般的に、プレーティングの５時間乃至４日間後に使用される。培地は、ｐＰＳ細胞を植える直前に新しいヒト胚性幹（ｈＥＳ）培地で交換される。
【０１４９】
他の幹細胞を培養する条件は既知であり、細胞型に応じて適切に最適化されうる。前述した特定の細胞型の培地及び培養技法は、引用参照文献に記載する。
胚性幹細胞
【０１５０】
胚性幹細胞は、ある種の霊長類種の胚盤胞から単離可能である（Thomsonら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844，1995）。ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞は、Ｔｈｏｍｓｏｎら（米国特許番号第５，８４３，７８０号、Science 282:1145，1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff.，1998）及びＲｅｕｂｉｎｏｆｆら（Nature Biotech. 18:399，2000）によって記載されるような技術を使用してヒト胚盤胞細胞から調製可能である。
【０１５１】
簡潔に述べるに、ヒト胚盤胞は、ヒトのインビボ着床前胚から得られる。或いは、インビトロ受精（ＩＶＦ）胚を使用可能である。又は、１細胞期のヒト胚を胚盤胞段階まで増殖可能である（Bongsoら，Hum Reprod 4:706，1989）。ヒト胚は、胚盤胞段階まで、Ｇ１．２及びＧ２．２培地で培養される（Gardnerら，Fertil. Steril. 69:84，1998）。発生する胚盤胞は、胚性幹細胞の単離のために選択される。プロナーゼに短時間暴露することによって胚盤胞から透明帯が除去される（Sigma）。内部細胞塊は、免疫手術により単離される。この免疫手術では、胚盤胞は、ウサギ抗ヒト脾臓細胞抗血清の１：５０希釈物に３０分間暴露され、次に、５分間、ＤＭＥＭ中で３回洗浄され、モルモット補体の１:５希釈物（Ｇｉｂｃｏ）に３分間暴露される（Solterら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:5099，1975を参照されたい）。２回の更なるＤＭＥＭでの洗浄後、溶解した栄養外胚葉細胞が、緩やかなピペット操作により無傷内部細胞塊（ＩＣＭ）から除去され、ＩＣＭはｍＥＦフィーダー層上にプレーティングされる。
【０１５２】
９乃至１５日経過後、内部細胞塊由来の生成物は、１ｍＭのＥＤＴＡを含むカルシウム及びマグネシウム不含のリン酸緩衝生理食塩水への暴露、ディスパーゼ又はトリプシンへの暴露、又は、マイクロピペットを使用する機械的解離によって凝集塊に解離され、新しい培地内のｍＥＦ上に再プレーティングされる。解離された細胞は、新しい胚性幹（ＥＳ）培地内のｍＥＦフィーダー層上に再プレーティングされ、コロニー形成が観察される。未分化形態を示すコロニーは、マイクロピペットによって個別に選択され、凝集塊に機械的に解離され、再プレーティングされる。胚性幹細胞様の形態は、明らかに高い細胞核／細胞質比と明確な核小体を有する緻密なコロニーとして特徴付けられる。結果として得られる胚性幹細胞は、簡単なトリプシン処理、ＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ（カルシウム又はマグネシウムを不含、また、２ｍＭのＥＤＴＡを含有）への暴露、ＩＶ型コラゲナーゼ（約２００Ｕ／ｍＬ；Ｇｉｂｃｏ）への暴露、又は、マイクロピペットによる個々のコロニーの選択によって定期的に１−２週間毎に分割される。凝集塊の大きさは、約５０乃至１００細胞が最適である。
胚生殖細胞
【０１５３】
ヒト胚生殖（ｈＥＧ）細胞は、最後の月経期から約８−１１週間後に取られるヒト胎児物質にある始原生殖細胞から調製可能である。好適な調製法は、ＳｈａｍｂｌｏｔｔらによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726，1998及び米国特許番号第６，０９０，６２２号に記載される。
【０１５４】
簡潔に述べるに、生殖隆起は等張性緩衝液で洗浄処理され、次に、０．１ｍＬの０．０５％トリプシン／０．５３ｍＭのナトリウムＥＤＴＡ溶液（ＢＲＬ）中に入れられ、＜１ｍｍ３の塊に分けられる。次に、この組織は、１００／μｌの先端を有するピペットを使って取られ、それにより、さらに細胞をばらばらにする。組織は、約５分間、摂氏３７度でインキュベートされ、次に、約３．５ｍＬのＥＧ成長培地が添加される。ＥＧ成長培地は、ＤＭＥＭ、４５００ｍｇ／ＬのＤ‐グルコース、２２００ｍｇ／Ｌ  ｍＭの重炭酸ナトリウム、１５％胚性幹（ＥＳ）クオリファイドウシ胎児血清（ＢＲＬ）、２ｍＭのグルタミン（ＢＲＬ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ＢＲＬ）、１０００−２０００Ｕ／ｍＬのヒト組換え型白血病阻止因子（ＬＩＦ、Ｇｅｎｚｙｍｅ）、１-２ｎｇ／ｍｌのヒト組換え塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ、Ｇｅｎｚｙｍｅ）、及び１０μＭのホルスコリン（１０％のＤＭＳＯ中）である。別のアプローチでは、ＥＧ細胞は、ヒアルロニダーゼ／コラゲナーゼ／デオキシリボヌクレアーゼを使用して単離されうる。腸間膜を有する生殖腺原基又は生殖隆起は、胎児物質から解離され、生殖隆起は、ＰＢＳで洗浄処理され、次に、０．１ｍｌのＨＣＤ消化溶液（０．０１％のヒアルロニダーゼＶ型、０．００２％のＤＮＡｓｅ  Ｉ、０．１％コラゲナーゼＩＶ型、これらは全てＳｉｇｍａ社からのものであり、ＥＧ成長培地で調製される）に入れられる。組織は細分化され、摂氏３７度で１時間又は一晩インキュベートされ、１−３ｍＬのＥＧ成長培地で再懸濁され、フィーダー層上にプレーティングされる。
【０１５５】
９６ウェル組織培養プレートは、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ、又はホルスコリンのない修飾ＥＧ成長培地で３日間培養されたフィーダー細胞のサブコンフルエント層を用いて調製され、５０００ラドのｙ照射により不活性化される。好適なフィーダーは、ＳＴＯ細胞である（ＡＴＣＣ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＣＲＬ１５０３）。０．２ｍＬの１次生殖細胞（ＰＧＣ）懸濁液が各ウェルに添加される。第１継代は、ＥＧ成長培地において７−１０日後に行われ、各ウェルを、被照射ＳＴＯマウス線維芽細胞を用いて前に調製された２４ウェル培養皿の１つのウェルに移す。この細胞は、ＥＧ細胞と一致する細胞形態が観察されるまで、一般的に、７−３０日後、又は、１−４継代後まで毎日培地を交換して培養される。
自己複製及び分化
自己複製
【０１５６】
自己複製能を有する幹細胞は、例えば、形態学、免疫組織化学、分子生物学等といった当該技術において既知である様々な手段によって特定しうる。
【０１５７】
このような幹細胞では、Ｏｃｔ４及び／又はＳＳＥＡ−１の発現が増加することが好適である。Ｆｌｋ−１、Ｔｉｅ−２、及びｃ−ｋｉｔのうち任意の１つ以上の発現は減少することが好適である。自己複製能を有する幹細胞は、自己複製能を有さない幹細胞と比較して細胞周期が短縮することが好適である。
【０１５８】
例えば、標準的な二次元顕微鏡画像では、ヒト胚性幹細胞は、画像面において高い細胞核／細胞質比、明確な核小体、及び明確に識別することのできない細胞間結合を有する緻密なコロニー形成を示す。細胞株は、標準Ｇバンディング技術（カリフォルニア州オークランドにある細胞遺伝子学研究所といった日常的に核型決定サービスを提供する多くの臨床診断研究所から入手可能）を使用して核型決定することが可能であり、また、公開されたヒト核型と比較される。
【０１５９】
ヒト胚性幹細胞及びヒト胚性生殖細胞はさらに、発現する細胞マーカーにより特徴付けられうる。一般的に、本開示に記載する組織特異的マーカーは、膜結合型マーカーに対するフローサイトメトリー、細胞内マーカーに対する免疫組織化学、及び培地中に分泌されたマーカーに対する酵素結合免疫学的検定といった好適な免疫学的技法を用いて検出可能である。タンパク質マーカーの発現も、マーカー特異的プライマーを用いた逆転写酵素ＰＣＲによってｍＲＮＡレベルで検出可能である。更なる詳細は、米国特許番号第５，８４３，７８０号を参照されたい。
【０１６０】
発生段階特異的胎児性抗原（ＳＳＥＡ）は、特定の胚細胞型の特徴である。ＳＳＥＡマーカーの抗体は、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ（メリーランド州ベテスダ）から入手可能である。他の有用なマーカーは、Ｔｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１と命名された抗体（Andrewsら、Cell Linesfrom Human Gern Cell Tumors、E. J. Robertson，1987、前出）を用いて検出可能である。ヒト胚性幹細胞は、一般的に、ＳＳＥＡ−１陰性及びＳＳＥＡ−４陽性である。ｈＥＧ細胞は、一般的に、ＳＳＥＡ−１陽性である。ｐＰＳ細胞のインビトロでの分化は、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、及びＴｒａ−１−８１発現をなくし、ＳＳＥＡ−１の発現を増加する。ｐＰＳ細胞はさらに、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、次に、製造業者（カリフォルニア州バーリンゲームのＶｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により説明されるように、基質としてベクターレッドを使用して顕出させることによって検出可能なアルカリホスファターゼ活性があることによって特徴付けられる。
【０１６１】
胚性幹細胞は、さらに、一般的に、テロメラーゼ陽性及びＯＣＴ−４陽性である。テロメラーゼ活性は、市販されるキット（ＴＲＡＰｅｚｅ（ＲＴＭ）ＸＹテロメラーゼ検出キット、Ｃａｔ．ｓ７７０７、Ｉｎｔｅｒｇｅｎ  Ｃｏ．、ニューヨーク州パーチェス、又は、ＴｅｌｏＴＡＧＧＧ（ＴＭ）テロメラーゼＰＣＲ  ＥＬＩＳＡプラス、Ｃａｔ．２，０１３，８９、Roche Diagnostics、インディアナポリス）を使用するＴＲＡＰ活性アッセイ（Kimら，Science 266:2011，1997）を使用して決定可能である。ｈＴＥＲＴ発現も、ＲＴ−ＰＣＲによってｍＲＮＡレベルで評価可能である。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＴｅｌｏＴＡＧＧＧ（ＴＭ）ｈＴＥＲＴ定量化キット（Ｃａｔ．３，０１２，３４４、Roche Diagnostics）も研究目的のために市販されている。
分化
【０１６２】
前駆細胞株及び前駆細胞株から誘導される分化細胞を含む分化細胞では、４Ｅ−ＢＰ１及び／又はＳ６Ｋ１の脱リン酸化が増加することが好適である。分化細胞は、Ｏｃｔ４及び／又はＳＳＥＡ−１の発現が減少することが好適である。Ｆｌｋ−１、Ｔｉｅ−２、及びｃ−ｋｉｔのうち任意の１つ以上の発現が増加することが好適である。ブラーキュリー（Brachyury）、ＡＦＰ、ネスチン、及びｎｕｒｒ１発現のうち任意の１つ以上の発現が増加することが好適である。自己複製能を有する幹細胞は、自己複製能を有さない幹細胞と比較して細胞周期が延長することが好適である。
【０１６３】
分化する幹細胞、即ち、分化経路を開始した又はコミットした細胞は、特に転写変化を含む多数の表現型基準に応じて特徴付けられることが可能である。この基準には、以下に限定されないが、形態学的特徴の特徴付け、発現細胞マーカー及び酵素活性の検出又は定量法、インビボでの細胞の機能特性の遺伝子発現及び決定を含む。一般的に、分化幹細胞は、分化過程の最終生成物、即ち、分化細胞である細胞型の１つ以上の特徴を有する。例えば、標的細胞型が筋細胞である場合、そのような細胞への分化過程にある幹細胞は、例えば、ミオシン発現の特徴を有する。
【０１６４】
従って、多くの点において、この基準は、分化する幹細胞の運命に依存し、また、様々な細胞型の一般的な説明を以下に記す。
【０１６５】
分化した又は分化する神経系細胞に対する関心マーカーは、神経細胞の特徴であるβチューブリンＥＩＩＩ又は神経フィラメント、星状細胞内に存在するグリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、乏突起膠細胞の特徴であるガラクトセレブロシド（ＧａＩＣ）又はミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、未分化ヒト胚性幹細胞の特徴であるＯＣＴ−４、神経前駆体及び他の細胞の特徴であるネスチンを含む。Ａ２Ｂ５及びＮＣＡＭは、それぞれ、グリア前駆体及び神経前駆体の特徴である。細胞は、特徴的な生物活性物質の分泌についても検査可能である。例えば、ＧＡＢＡ分泌神経細胞は、グルタミン酸脱炭酸酵素又はＧＡＢＡの形成により同定可能である。ドーパミン作動性神経細胞は、ドーパ脱炭酸酵素、ドーパミン、又はチロシン・ヒドロキシラーゼの形成により同定可能である。
【０１６６】
分化した又は分化する肝細胞に対する関心マーカーは、α−フェトプロテイン（肝前駆体）と、アルブミン、α１−抗トリプシン、グルコース−６−ホスファターゼ、シトクロムｐ４５０活性、トランスフェリン、アシアロ糖タンパクレセプタ、及びグリコーゲン貯蔵 （肝細胞）と、ＣＫ７、ＣＫ１９と、γグルタミン酸転移酵素（胆上皮組織）を含む。肝細胞分化には、転写因子ＢＮＦ−４α（Liら，Genes Dev. 14:464，2000）が必要であることが報告されている。ＨＮＦ−４α発現と無関係のマーカーは、α１−抗トリプシン、α−フェトプロテイン、ＡｐｏＥ、グルコキナーゼ、インスリン成長因子１及び２、ＩＧＦ−１レセプタ、インスリンレセプタ、及びレプチンを含む。ＨＮＦ−４α発現に依存するマーカーは、アルブミン、ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＢ、ＡｐｏＣＩＩＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、アルドラーゼＢ、フェニルアラニン水酸化酵素、Ｌ型脂肪酸結合タンパク質、トランスフェリン、レチノール結合タンパク質、及びエリスロポエチン（ＥＰＯ）を含む。
【０１６７】
ｐＰＳ細胞から誘導される混合細胞集団における細胞型は、それらの細胞が発現する特徴的形態及びマーカーにより認識可能である。骨格筋については、ＭｙｏＤ、ミオゲニン、及びｍｙｆ−５である。内皮細胞については、ＰＥＣＡＭ（platelet endothelial cell adhesion molecule）、Ｆｌｋ−１、Ｔｉｅ−ｉ、Ｔｉｅ−２、血管内皮（ＶＥ）カドヘリン、ＭＥＣＡ−３２、及びＭＥＣ−１４．７である。平滑筋細胞については、特異的なミオシン重鎖である。心筋細胞については、ＧＡＴＡ−４、Ｎｋｘ２．５、心臓トロポニンＩ、α−ミオシン重鎖、及びＡＮＦである。膵臓細胞については、ｐｄｘ及びインスリン分泌である。造血細胞及びその前駆体については、ＧＡＴＡ−１、ＣＤ３４、ＡＣ１３３、β−主要グロブリン、及びβ−主要グロブリン様遺伝子ＰＨ１である。
【０１６８】
本開示に列挙する又は当該技術において既知である特定の組織特異的マーカーは、細胞表面マーカーに対するフロー免疫細胞化学、細胞内又は細胞表面マーカーに対する（例えば、固定の細胞又は組織切片の）免疫組織化学、細胞抽出物のウエスタンブロット分析、及び、細胞抽出物又は培地に分泌される生成物の酵素連結免疫学的検定といった免疫学的技術によって検出可能である。組織特異的遺伝子の生成物の発現は、ノーザンブロット分析、ドットブロットハイブリダイゼーション分析、又は、標準増幅方法における配列特異的プライマーを使用する配列逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により、ｍＲＮＡレベルで検出可能である。本開示に列挙する特異的マーカーの配列データは、ＧｅｎＢａｎｋといった公共データベースから入手可能である（ＵＲＬ：www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez）。
実施例
実施例１．方法：Ｅ−ＲｏＳＨ細胞株の誘導
【０１６９】
胚性幹細胞（ＥＳＣ）は、Limら（Blood.1997;90:1291−1299）によって説明されるメチルセルロースに基づく方法を用いて胚様体（ＥＢ）を形成するよう分化誘導される。
【０１７０】
形成後３日乃至６日の胚様体が採取され、コラゲナーゼ消化により単個細胞懸濁液に分離され（Robertson EJ. Embryo-derived stem celllines. In: Robertson EJ，ed. Teratocarcinomas and embryonic stem cells: a practical approach. Oxford: IRL Press Limited; 1987:71-112）、１つの１０ｃｍフィーダープレートあたり１−５×１０５個の細胞の密度でプレーティングされる。約１週間後、細胞は増殖し、複雑な混合の細胞型に分化する。
【０１７１】
胚由来ＲｏＳＨ細胞に類似する、高速分裂する細胞のコロニーが選択され、４８ウェルプレート、２４ウェルプレート、６ウェルプレート、及び１０ｃｍプレートに順次展開される。各コロニーからの培養は、各培養が樹立された順序でＥ−ＲｏＳＨ１、２、３、…と命名する。
【０１７２】
これらの細胞培養のそれぞれは、次に、１つの１０ｃｍプレートあたり１０乃至１００個の細胞でプレーティングされる。コロニーは、親株に基づいて命名される副系統、例えば、Ｅ−ＲｏＳＨ１．１、１．２、１．３、…等を樹立するよう選択且つ展開される。懸濁培養では、１×１０６個の細胞が、攪拌／振盪器上に置かれる１０ｃｍ細菌ペトリ皿上にプレーティングされる。
【０１７３】
Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（カリフォルニア州テメキュラ）及びＢｉｏａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州ヘイワード）からのアッセイキットを使用してアルカリ性ホスファターゼアッセイ及びＭＴＴアッセイが行われる。染色体の計数が、上述したように行われる（Robertson、前出）。
実施例２．方法：ＨｕＥＳ９．Ｅ間葉系幹細胞（ＭＳＣ）様細胞株の誘導
【０１７４】
ＨｕＥＳ９細胞は、Ｃｏｗａｎら（N Engl J Med.2004;350:1353-1356）によって説明されるように上述したように培養される。
【０１７５】
ＨｕＥＳ９．Ｅ  ＭＳＣ様細胞を誘導する目的で、ＨｕＥＳ９細胞は、ＨｕＥＳ９培養培地を使用してゼラチン化されたフィーダーなしのプレート上に１：４で分割される。コンフルエントな培養はトリプシン処理され、１：４で分割される。含脂肪細胞及び骨細胞への分化が上述したように行われる（Barberiら，PLoS Med．2005;2:e161）。
【０１７６】
ＢＭ  ＭＳＣが、Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒら（Science.1999;284:143-147）によって説明されるように調製される。
【０１７７】
マウス及びヒト特異的な反復配列に対する遺伝子ＰＣＲが、Ｑｕｅら（In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2004;40:143-149）によって説明されるように上述したように行われる。
実施例３．方法：ＲＴ−ＰＣＲ分析
【０１７８】
全ＲＮＡは、標準プロトコルを使用して調製され、また、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎのＲＮＡ定量キット及びＰｉｃｏＧｒｅｅｎのｄｓＤＮＡ定量キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）をそれぞれ使用して定量化される。
【０１７９】
定量ＲＴ−ＰＣＲは、ＴａｑＭａｎ（Ｒ）プライマー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）を使用して行われる。
実施例４．方法:インビトロでの内皮細胞の分化
【０１８０】
Ｅ−ＲｏＳＨ細胞の内皮細胞分化、及び、分化したＥ−ＲｏＳＨ細胞によるアセチル化ＬＤＬ摂取は、上述の通り（Yinら，Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004;24:691-696）に行われる。
【０１８１】
インビトロで分化したＥ−ＲｏＳＨ血管構造は、ホルマリン中で固定され、パラフィン内に埋め込まれ、４μｍで切断され、多クローン性のウサギ由来抗体及びＥｎｖｉｓｉｏｎ+Ｓｙｓｔｅｍペルオキシダーゼ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、デンマーク、ゴストラップ（Gostrup））を使用してｖＷＦに対して染色される。断片は、Ｍａｙｅｒのヘマトキシリンで対比染色される。
実施例５．方法:インビボでの内皮細胞の分化
【０１８２】
１×１０６個の胚性幹細胞がＳＣＩＤマウスに皮下移植される。胚性幹細胞由来腫瘍が直径約１ｃｍとなる３週間後、Ｑｔｒａｃｋｅｒ（Ｒ）細胞標識化キット（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ社、カリフォルニア州ヘイワード）を使用してＱｄｏｔ（Ｒ）ナノ結晶（６５５ｎｍ発光）で標識される１×１０５個のＥ−ＲｏＳＨ細胞が、胚性幹細胞由来の奇形種内に注入される。
【０１８３】
３日後、マウスは麻酔薬の過剰摂取で安楽死させられ、腫瘍が摘出された。腫瘍は、４％のパラホルムアルデヒド中で固定され、２０μｍの厚さで低温切断された。断片は、ラット抗ＰＥＣＡＭ１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）、続けて、ＦＩＴＣ接合ウサギ抗ラット抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カリフォルニア州テメキュラ）を使用してＰＥＣＡＭ−１免疫活性について分析され、ＤＡＰＩで対比染色された。断片は、共焦点顕微鏡検査で分析される。
実施例６．マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）からの系統限定された内皮前駆細胞株の誘導
【０１８４】
マウス胚性肝細胞（ｍＥＳＣ）から内皮前駆細胞株を誘導するには、交配後５．５日の遅延胚盤胞及び早期の着床後マウス胚からＲｏＳＨ内皮前駆細胞株を誘導する上述の経験に依存する（Yinら，Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004;24:691-696）。
【０１８５】
胚性幹細胞（ＥＳＣ）の胚様体（ＥＢ）への分化は、哺乳類の発生における幾つかの初期変化を反復するので、交配後５．５日の遅延胚盤胞及び早期の着床後胚に発生的に類似する形成後３乃至６日の胚様体は、ＰｏＳＨ前駆細胞を発生する細胞に対して濃縮されることを理論的に説明する。従って、形成後３乃至６日の胚様体は、半固体のメチルセルロース培地（Limら，Blood. 1997;90:1291-1299）を用いて形成され、コラゲナーゼ消化によって細胞懸濁液に解離され、それにより、胚様体の分化微小環境を破壊し、また、マウス胚性幹細胞の増殖を抑制するようＬＩＦの追加なしで胚性幹（ＥＳ）培地においてゼラチンが塗布された組織培養プレート上に、１つの１０ｃｍプレートあたりに１−５×１０５個の細胞の密度でプレーティングされる（図１Ａ）。
【０１８６】
解離細胞の増殖は、それらが、ＲｏＳＨ前駆細胞の誘導について上述したように胎児線維芽細胞フィーダー上にプレーティングされる場合に増進されるが（Yinら，Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004;24:691-696）、これは、胚性幹細胞の成長を促進する傾向がある。約１週間後、細胞の大部分は、不均質な細胞培養に分化した。
【０１８７】
次に、培養は、大きい細胞核／細胞質比を有する高速分裂する細胞と、フォン・ヴィレブランド因子（即ち、ｖＷＦに対して免疫反応性である環状細胞からなるＲｏＳＨ様コロニーについてスクリーニングされる（Yinら，Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004;24:691-696）（図１Ｂ）。
【０１８８】
２−３００個の細胞の規模に到達したときに、安定した増殖率及び安定した形態を維持した培地のみが選択され、胎児線維芽細胞フィーダー又はゼラチンで被覆したプレート上で増殖して、株、即ち、Ｅ−ＲｏＳＨ１、２、…等を形成する。
【０１８９】
これらの株のそれぞれは、次に、１つの１０ｃｍプレートあたりに１０−１００個の細胞という低密度で細胞をプレーティングすることによってサブクローン化され、コロニーが選択されて副系統Ｅ−ＲｏＳＨ１．１、１．２等を誘導する。或いは、低密度でプレーティングすることによってクローン化する前に約２又は３回１：４で継代することによって自己複製ＲｏＳＨ様細胞を濃縮可能である。１−５×１０５個の胚様体細胞あたり約１のＲｏＳＨ様コロニーの最も効率のよい収量は、胚様体の年齢と親胚性幹細胞株に依存する。例えば、Ｅ１４胚性幹細胞株から誘導される形成後３日乃至５日の胚様体と、ＣＳＬ３胚性幹細胞株から誘導される形成後６日の胚様体（Bourc'hisら，Science. 2001;294:2536-2539）は、ＲｏＳＨ様株の誘導に最も効率的である。
【０１９０】
その一方で、ＬＩＦなしで又は胚様体の他の発生段階において成長される分化胚性幹細胞からのＲｏＳＨ様株の誘導が可能ではあるが、効率はかなり低い。ここでは、ＣＳＬ３胚性幹細胞株から５つ、また、Ｅ１４胚性幹細胞株から４つで合計９つの独立して誘導される株を樹立した。
実施例７．Ｅ−ＲｏＳＨ内皮前駆細胞の特徴付け
【０１９１】
Ｅ−ＲｏＳＨ２．１に代表されるようなＥ−ＲｏＳＨ細胞は、胚由来ＲｏＳＨ細胞株（図１Ｃ）と形態学的に類似し、また、それらの親胚性幹細胞株とは異なり、検出可能なアルカリホスファターゼ活性を有さない（図１Ｄ）。
【０１９２】
集団倍加時間は、ＭＴＴアッセイ（データは図示せず）によって〜１５時間と推定される。Ｅ−ＲｏＳＨ細胞は、２日おきに１：４乃至１：５で継代されて＞４０世代の連続培養中に維持された（データは図示せず）。
【０１９３】
染色体数により観察されるＥ−ＲｏＳＨ２．１及び３．２の核型は、４０の正常平均染色体数で少なくとも１０継代の間安定する（図１Ｅ）。
【０１９４】
Ｅ−ＲｏＳＨ２．１における遺伝子発現は、１５個の遺伝子の定量ＲＴ−ＰＣＲ分析により観察され、様々な継代において安定していることが示される（図２Ａ）。さらに、この遺伝子発現プロファイルは、他の独立して誘導されたＥ−ＲｏＳＨ株及びマウス胚由来ＲｏＳＨ株の遺伝子発現プロファイル（図２Ｂ）と類似する。
【０１９５】
Ｅ−ＲｏＳＨ細胞のＳＣＩＤ又はＲａｇ１−／−免疫不全マウスへの皮下移植は２乃至９ヶ月間の観察期間時に奇形腫を形成せず、その一方で親胚性幹細胞の同様の移植は、３週間以内で２ｃｍの奇形種を常に形成し、これは、Ｅ−ＲｏＳＨ細胞における多分化能の喪失を示唆する（データは図示せず）。
【０１９６】
この多分化能の喪失はさらに、ＢＭＰ４、ＦＧＦ５、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ−２、及びＵｔｆ１といった多能性細胞に関連付けられる幾つかの遺伝子の発現が減少することによっても明白にわかる（図２Ｃ）（Wei D，Xu GL，Lin CS，Bollman B，Bestor TH. Dnmt3L and the establishment of maternal genomic imprints. Stem Cells. 2005;23:166-185; Rao M. Dev Biol. 2004;275:269-286）。
【０１９７】
対照的に、ｒｕｎｘ−１、ｆｌｋ−１、ＰＤＧＦＲα、Ｔｉｅ−２、及びｃ−ｋｉｔから構成される遺伝子のセットは、高度に発現する（図２Ｄ）。これらの遺伝子の発現は、内皮前駆細胞に一般に関連付けられる（Jaffredoら，Int J Dev Biol. 2005;49:269-277）。
【０１９８】
上述した観察はまとめて、Ｅ−ＲｏＳＨ細胞は、もはや多能性ではなく、内皮化能（endothelial potential）を有する可能性が高い、限定された分化能を有する胚性幹細胞派生物であることを示す。
実施例８．インビトロ及びインビボでのＥ−ＲｏＳＨ細胞の内皮細胞への分化
【０１９９】
Ｅ−ＲｏＳＨ細胞の内皮化能を確認する目的で、これらの細胞をマトリゲル上にプレーティングする。
【０２００】
２週間以内で、これらの細胞は、組織培養皿全体を覆う血管様小管の網状構造を形成した（図３Ａ）。これらの小管は開放性であり、また、内腔にエンドサイトーシスされたアセチル化ＬＤＬ（lumen endocytosed acetylated LDL）を裏打ち（lining）する細胞（図３Ｂ）であり、また、ｖＷＦに対して免疫反応性である（図３Ｃ）。
【０２０１】
Ｔｉｅ−２といった内皮遺伝子の発現も増加した（図３Ｄ）。
【０２０２】
懸濁液中で成長される場合、Ｅ−ＲｏＳＨ細胞は、胚性幹細胞と同様に、球体を形成した。しかし、密集した胚性幹細胞由来の胚様体とは異なり、Ｅ−ＲｏＳＨ由来の胚様体は、中空の中心部を有して形態的に異なり（図３Ｅ）、これは、胚性幹細胞とＥ−ＲｏＳＨ細胞との間のもう１つの特徴的な相違点を示す。
【０２０３】
胚発生時の早期の系統コミットメントと関連付けられる発現を有する遺伝子は、胚様体形成時のと比較してＥ−ＲｏＳＨ由来の胚様体の形成時には顕著に減少する。これらの遺伝子には、早期の原腸胚形成時に発現するｃｅｒｂｅｒｕｓ（ｃｅｒ−１）（De Robertisら，Int J Dev Biol. 2001;45:189-197）、原索（axial mesendoderm）の形態形成及びパタニングに重要であるｍｉｘｌ１（Hartら，Development. 2002;129:3597-3608; Mohnら，Dev Dyn. 2003;226:446-459）、及び神経内分泌組織内で発現されるＰＣＳＫ１（Seidahら，Mol Endocrinol. 1991;5:111-122; Benjannetら，Proc Natl Acad Sci U S A. 1991;88:3564-3568）（図３Ｆ）を含む。
【０２０４】
これらの遺伝子の比較的低い発現レベルは、Ｅ−ＲｏＳＨの能力の減少と一致し、また、Ｅ−ＲｏＳＨ細胞がもはや全ての三胚葉からの様々な細胞型に分化する胚性幹細胞の能力を有さないことを示唆する。
【０２０５】
対照的に、ｃ−ｋｉｔ及びＴｉｅ−２といった内皮遺伝子の１０倍の発現の増加（図３Ｆ）は、Ｅ−ＲｏＳＨ細胞が、その親の胚性幹細胞に対して１０倍の効率で内皮細胞に選択的に分化することを示唆する。Ｅ−ＲｏＳＨ細胞の遺伝子発現は、造血細胞に分化する能力を有することを示唆したが、標準造血分化アッセイを使用してこれらの細胞の強力な造血分化を誘導することはできなかった。
【０２０６】
Ｅ−ＲｏＳＨ細胞はＱ−ｔｒａｃｋｅｒ、長期の細胞透過性の蛍光細胞標識で標識が付けられ、Ｅ−ＲｏＳＨ細胞の分化に好適な微小環境を与える親胚性幹細胞由来の奇形腫に移植されると、Ｅ−ＲｏＳＨ細胞は、奇形腫内の毛管網に取り込まれ、ＰＥＣＡＭ−１に対して免疫反応性であることが分かった（図３Ｇ）。腫瘍血管系に取り込まれない移植細胞の多くは、ＰＥＣＡＭ−１に対して免疫反応性ではない（データは図示せず）。
実施例９．ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞株からの系統限定された前駆細胞株の誘導
【０２０７】
本発明のアプローチの一般的適用性を明らかにする目的で、ｈｕＥＳ９ヒト胚性幹細胞株からＭＳＣ様株を誘導した（Cowanら，N Engl J Med. 2004;350:1353-1356）。
【０２０８】
ヒト胚性幹細胞培養の大部分において、ヒト胚性幹細胞コロニーは、増殖性の間質線維芽細胞と均衡状態で成長することを観察した（図４Ａ）。このことは、間質線維芽細胞がヒト胚性幹細胞由来の前駆細胞であることを示唆する。これらの細胞の増殖を促進し、ヒト胚性幹細胞の増殖を抑制する目的で、ｈｕＥＳ９細胞は、フィーダーなしで培養及び継代される。骨髄由来のＭＳＣ（ＢＭ−ＭＳＣ）培養に形態学的に類似する線維芽細胞様細胞の均質培養が形成される（図４Ｂ）。
【０２０９】
ｈｕＥＳ９．Ｅ１及びｈｕＥＳ９．Ｅ３と命名される２つの多クローン性の細胞株は、独立して形成される。その親ｈｕＥＳ９細胞とは異なり、ｈｕＥＳ９．Ｅ１は、検出可能なアルカリホスファターゼ活性（図４Ｃ）を有さず、ＯＣＴ４を発現しなかった（図４Ｄ）。
【０２１０】
以前の経験から、推定幹細胞とフィーダー細胞との融合は、自己複製細胞を形成するよう発生することが示唆され（Queら，In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2004;40:143-149）、これらの培養は試験され、マウス特異的なｃ−ｍｏｓ反復配列に対して陰性であり、ヒト特異的なａｌｕ反復配列に対して陽性であることを示した（図４Ｅ）。
【０２１１】
これらの細胞は、その親ｈｕＥＳ９細胞株と同様に４６、ＸＸ、染色体を有する（Cowanら，N Engl J Med. 2004;350:1353-1356）（図４Ｆ）。
【０２１２】
血清代替物培地が加えられた培地内で成長させられる場合、集団倍加時間は、４乃至５日であり、１０％ウシ胎仔血清が加えられた培地では、集団倍加時間は、約３６時間である。
【０２１３】
ｈｕＥＳ９．Ｅ１及びｈｕＥＳ９．Ｅ３のＢＭ−ＭＳＣへの酷似に基づいて、ｈｕＥＳ９．Ｅ１の系統化能を、その表面抗原プロファイルをＢＭ−ＭＳＣの表面抗原プロファイルと比較することによってさらに概算した。これらの細胞は、典型的なＭＳＣ表面マーカー、即ち、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ１０５＋、及びＣＤ１６６＋（Barry及びMurphy，Int J Biochem Cell Biol. 2004;36:568−584）を発現し、ＣＤ３４及びＣＤ４５は発現しなかった（図４Ｆ）。
【０２１４】
ｈｕＥＳ９．Ｅ１細胞は、標準分化条件を用いて含脂肪細胞及び骨細胞に分化誘導することができる（Barberi Tら，PLoS Med. 2005;2:e161）。含脂肪細胞分化は、分化細胞における油滴の存在及びＰＰＡＲγｍＲＮＡの発現（図４Ｇ）により確認され、一方で、骨形成は、細胞間質内のカルシウム堆積に対するフォン・コッサ染色及び骨特異的なアルカリ性ホスファターゼＡｌｐ１の発現により決定される（図４Ｈ）。
実施例９．ディスカッション
【０２１５】
要約するに、本願に示す研究は、系統限定された胚性幹細胞由来の前駆細胞株は、ユニークな自己複製能を有する前駆細胞は形質転換なしで増殖可能であるという原理を使用して樹立可能であることを証明する。これらの細胞は、老化することなく安定した増殖率を有することによって最終分化細胞とは区別される。
【０２１６】
この際立った特徴に基づき、これらの前駆細胞は、絶えず増殖するコロニーを選択するよう低密度で分化培養をプレーティングすることによって、又は、増殖する細胞を選択し、同時に、最終分化細胞は老化し培養から消滅するよう培養を連続継代することによって単離することが可能である。１つの要件は、培養培地は、親の胚性幹細胞の増殖を促進しないことである。
参考文献
【０２１７】
１）Keller G. Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine. Genes Dev. 2005;19:1129-1155
２）Wobus AM，Boheler KR. Embryonic stem cells: prospects for developmental biology and cell therapy. Physiol Rev. 2005;85:635-678
３）Wiles MV. Embryonic stem cell differentiation in Vitro. Methods in Enzymology. 1993;225:900-918
４）Choi K，Chung YS、Zhang WJ. Hematopoietic and endothelial development of mouse embryonic stem cells in culture. Methods Mol Med. 2005;105:359-368
５）Yin Y，Que J，Teh M，Cao WP，El Oakley RM，Lim S-K. Embryonic Cell Lines with Endothelial Potential: An In Vitro System for Studying Endothelial Differentiation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004;24:691-696
６）Lim SK，Bieker JJ，Lin CS，Costantini F. A shortened life span of EKLF-/- adult erythrocytes，due to a deficiency of beta-globin chains，is ameliorated by human gamma-globin chains. Blood. 1997;90:1291-1299
７）Bourc'his D，Xu GL，Lin CS，Bollman B，Bestor TH. Dnmt3L and the establishment of maternal genomic imprints. Science. 2001;294:2536-2539
８）Wei CL，Miura T，Robson P，Lim SK，Xu XQ，Lee MY，Gupta S，Stanton L，Luo Y，Schmitt J，Thies S，Wang W，Khrebtukova I，Zhou D，Liu ET，Ruan YJ，Rao M，Lim B. Transcriptome profiling of human and murine ESCs identifies divergent paths required to maintain the stem cell state. Stem Cells. 2005;23:166-185
９）Rao M. Conserved and divergent paths that regulate self-renewal in mouse and human embryonic stem cells. Dev Biol. 2004;275:269-286
１０）Jaffredo T，Bollerot K，Sugiyama D，Gautier R，Drevon C. Tracing the hemangioblast during embryogenesis: developmental relationships between endothelial and hematopoietic cells. Int J Dev Biol. 2005;49:269-277
１１）De Robertis EM，Wessely O，Oelgeschlager M，Brizuela B，Pera E，Larrain J，Abreu J，Bachiller D. Molecular mechanisms of cell-cell signaling by the Spemann-Mangold organizer. Int J Dev Biol. 2001;45:189-197
１２）Hart AH，Hartley L，Sourris K，Stadler ES，Li R、Stanley EG，Tam PP，Elefanty AG，Robb L. Mixl1 is required for axial mesendoderm morphogenesis and patterning in the murine embryo. Development. 2002;129:3597-3608
１３）Mohn D，Chen SW，Dias DC，Weinstein DC，Dyer MA，Sahr K，Ducker CE，Zahradka E，Keller G，Zaret KS，Gudas LJ，Baron MH. Mouse Mix gene is activated early during differentiation of ES and F9 stem cells and induces endoderm in frog embryos. Dev Dyn. 2003;226:446-459
１４）Seidah NG，Marcinkiewicz M，Benjannet S，Gaspar L，Beaubien G，Mattei MG，Lazure C，Mbikay M，Chretien M. Cloning and primary sequence of a mouse candidate prohormone convertase PC1 homologous to PC2， Furin， and Kex2: distinct chromosomal localization and messenger RNA distribution in brain and pituitary compared to PC2. Mol Endocrinol. 1991;5:111-122
１５）Benjannet S，Rondeau N，Day R，Chretien M，Seidah NG. PC1 and PC2 are proprotein convertases capable of cleaving proopiomelanocortin at distinct pairs of basic residues. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991;88:3564-3568
１６）Cowan CA，Klimanskaya I，McMahon J，Atienza J，Witmyer J，Zucker JP，Wang S，Morton CC，McMahon AP，Powers D，Melton DA. Derivation of embryonic stem cell lines from human blastocysts. N Engl J Med. 2004;350:1353-1356
１７）Que J，El Oakley RM，Salto-Tellez M，Wong N，de Kleijn DP，Teh M，Retnam L，Lim SK. Generation of hybrid cell lines with endothelial potential from spontaneous fusion of adult bone marrow cells with embryonic fibroblast feeder. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2004;40:143-149
１８）Barry FP，Murphy JM. Mesenchymal stem cells: clinical applications and biological characterization. Int J Biochem Cell Biol. 2004;36:568-584
１９）Barberi T，Willis LM，Socci ND，Studer L. Derivation of multipotent mesenchymal precursors from human embryonic stem cells. PLoS Med. 2005;2:e161
２０）Robertson EJ. Embryo-derived stem cell lines. In: Robertson EJ， ed. Teratocarcinomas and embryonic stem cells: a practical approach. Oxford: IRL Press Limited; 1987:71-112
２１）Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，Jaiswal RK，Douglas R，Mosca JD，Moorman MA，Simonetti DW，Craig S，Marshak et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 1999;284:143-147
【０２１８】
本文書に記載する各出願及び特許、各出願及び特許に引用又は参照される各文書（各出願及び特許の審査経過時も含む）（「出願に引用される文書」）、及び、各出願及び特許、並びに出願に引用される文書に引用又は記載される製品の製造業者による取扱説明書又はカタログは、本願に参考として組み込む。さらに、本文書にて引用する全ての文書、本文書にて引用される文書にて引用又は参照される全ての文書、及び、本文書にて引用又は記載される製品の製造業者による取扱説明書又はカタログは、本願に参考として組み込む。
【０２１９】
当業者には、本発明の記載方法及びシステムの様々な変更及び変形が、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく明らかであろう。本発明は、特定の好適な実施形態に関連して説明したが、請求項の範囲に記載される発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではなく、そのような特定の実施形態への多くの変更および追加が発明の範囲内で可能であることを理解すべきである。さらに、分子生物学および関連の分野の当業者には明らかである発明を実施する記載方法の様々な変更は、請求項の範囲内であることを意図する。さらに、従属項の様々な特徴は、本発明の範囲から逸脱することなく独立項の特徴と様々に組み合わせることが可能である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ−１】
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【図４Ｈ−２】
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【国際調査報告】
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