(57)【要約】  本発明は、高度グリコシル化形態（天然ＥＰＯ中の３個のＮ結合グリコシル化とは対照的に全部で５個のＮ結合グリコシル化）のエリスロポエチン生成のために使用される組み換え法に関する。追加されたグリコシル化部位は、ヒトＥＰＯよりも多数の炭水化物鎖とより高いシアル酸含量とをもたらし、それは次に組み換え分子により長い半減期を与える。本発明はさらに、高度グリコシル化形態のエリスロポエチンをコードする核酸配列を含む発現カセットの構築、および宿主細胞における安定発現に関する。本発明はさらに、赤血球新生刺激タンパク質精製のための最適化された方法に関する。本発明に従った組み換えＥＰＯならびにその塩および機能性誘導体は、貧血治療および患者の健康と生活の質の回復のためのヘマトクリット増大のための医薬組成物の活性成分を構成してもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）（ｉ）配列番号１および配列番号２で記載されるＤＮＡ配列、（ｉｉ）配列番号３で記載されるタンパク質コード配列、および（ｉｉｉ）ストリンジェントな条件下で（ｉ）および（ｉｉ）で定義されるＤＮＡ配列にハイブリダイズするＤＮＡ配列、またはそれらの相補鎖よりなる群から選択される単離ＤＮＡ配列で形質転換または形質移入された宿主細胞を適切な栄養条件下で増殖させるステップと、
（ｂ）そこから前記エリスロポエチン生成物を単離するステップ
とを含む、生体内で生物学的に活性な赤血球新生刺激タンパク質を調製する方法。
【請求項２】
宿主細胞を配列番号３のエリスロポエチンアミノ酸配列をコードする合成ＤＮＡ配列で形質転換するステップと、前記宿主細胞またはその増殖培地から前記エリスロポエチン生成物を単離するステップとを含む、生体内で生物学的に活性なエリスロポエチン生成物を調製する方法。
【請求項３】
前記宿主細胞が哺乳類細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記宿主細胞が好ましくはＣＨＯ  Ｋ１細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
ａ）配列番号３の成熟エリスロポエチンアミノ酸配列をコードするＤＮＡと作動可能に連結する、ヒトエリスロポエチンプロモーターＤＮＡ以外のプロモーターＤＮＡを含む哺乳類細胞を適切な栄養条件下で増殖させるステップと、
ｂ）前記細胞によって発現される前記グリコシル化エリスロポエチンポリペプチドを単離するステップ
とを含む、骨髄細胞に網状赤血球および赤血球の生成増大を引き起こす生体内生物学的特質を有するグリコシル化エリスロポエチンポリペプチドを生成する方法。
【請求項６】
前記プロモーターＤＮＡがウイルス性プロモーターＤＮＡである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
宿主細胞を図１０または１１のベクターコンストラクトで形質転換するステップと、前記エリスロポエチン生成物を前記宿主細胞またはその増殖培地から単離するステップとを含む、生体内で生物学的に活性なエリスロポエチン生成物を調製する方法。
【請求項８】
前記ベクターが哺乳類細胞特異的発現ベクター、最も好ましくは図１０および１１で表されるようなベクターである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
培養物中で増殖させた哺乳類細胞から精製される治療的有効量のヒトエリスロポエチン、および薬学的に許容可能な希釈剤、アジュバントまたは担体を含む医薬組成物。
【請求項１０】
請求項９に記載の医薬組成物中の治療的有効量のエリスロポエチンの過グリコシル化類似体を投与するステップを含み、前記類似体が等モル量の組み換えヒトエリスロポエチンよりも頻度が低く投与されて、同等の標的ヘマトクリットが得られる、哺乳類においてヘマトクリットを上昇させて維持する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高度グリコシル化形態（天然ＥＰＯ中の３個のＮ結合グリコシル化とは対照的に、全部で５個のＮ結合グリコシル化）のエリスロポエチン生成のために使用される組み換え法に関する。追加されたグリコシル化部位はヒトＥＰＯよりも多数の炭水化物鎖とより高いシアル酸含量とをもたらし、次にそれは組み換え分子により長い半減期を与える。
【０００２】
本発明はさらに、高度グリコシル化形態エリスロポエチンをコードする核酸配列を含む発現カセットの構築、および宿主細胞における安定発現に関する。
【０００３】
本発明はさらに、赤血球新生刺激タンパク質の精製のための最適化された方法に関する。
【０００４】
本発明に従った組み換えＥＰＯおよびその塩と機能性誘導体は、貧血治療のため、および患者の健康と生活の質回復のためのヘマトクリット増大のための医薬組成物の活性成分を構成してもよい。
【背景技術】
【０００５】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、赤血球新生の一次制御因子または身体の赤血球質量の最適レベル維持の一次制御因子である、糖タンパク質ホルモンである。組織酸素化の減少に応答して、ＥＰＯ合成が腎臓において増大する。分泌ホルモンは骨髄中の赤血球前駆体表面の特異的受容体に結合し、それらの生存、増殖、分化、そして究極的にヘマトクリット（濃縮赤血球が占める容積と全血容積との比率）の増大をもたらす。
【０００６】
１０年以上前の導入以来、組み換えヒトＥＰＯ（ｒＨｕＥＰＯ）は、慢性腎不全（ＣＲＦ）と関連する貧血の治療におけるケアの標準になっている。これは貧血を矯正し、エネルギーレベルを回復させて、患者の健康および生活の質を増大させるのに高度に効果的である。これはまた、癌と関連する貧血、ＨＩＶ感染症の治療のために、および外科的状況で使用して同種輸血の必要性を減少させるために認可されている。
【０００７】
推奨されるそして通常のｒＨｕＥＰＯでの治療法は、毎週２〜３回の皮下または静脈内注射による。ＣＲＦ患者では治療法の継続期間は患者の寿命と同じか、または成功裏の腎臓組織移植によってホルモン生成を含む腎機能が回復するまでである。癌患者では貧血が持続する限り、一般に化学療法過程の全体を通してｒＨｕＥＰＯ治療法が指示される。しかしＥＰＯなどの市販されるタンパク質治療薬の生体利用能は、それらの短い血漿中半減期、およびプロテアーゼ分解に対する感受性によって制限される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって本発明の目的は、規定のシアル酸含量、より長い半減期、ひいては生物学的活性増大を有する分離され単離されたイソ型エリスロポエチン生成のために使用される組み換え法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、高度グリコシル化形態（天然ＥＰＯにおける３個のＮ結合グリコシル化とは対照的に全部で５個のＮ結合グリコシル化）のエリスロポエチン生成のために使用される組み換え法に関する。追加されたグリコシル化部位は、ヒトＥＰＯよりも多数の炭水化物鎖とより高いシアル酸含量とをもたらし、次にそれは組み換え分子により長い半減期を与え得る。
【００１０】
本発明のＤＮＡ配列を組み込んだ、新規の生物学的に機能性の生きている環状プラスミドＤＮＡベクター、および前記ベクターで安定的に形質転換または形質移入された宿主生物もまた、本発明によって提供される。
【００１１】
同様に、ベクターによって運ばれる外来性ＤＮＡ配列の大規模発現を促進する条件下におけるこのような形質転換宿主または形質移入宿主の培養増殖、および増殖培地、細胞溶解産物または細胞膜画分からの所望ポリペプチドの単離を含む、有用なポリペプチド生成のための新しい方法が本発明によって提供される。
【００１２】
本発明の一態様は、高度グリコシル化形態のエリスロポエチンをコードする核酸配列を含む発現カセット構築に関する。
【００１３】
非修飾ＥＰＯおよび従来のＥＰＯ−ＰＥＧコンジュゲートと比べて、本発明のタンパク質は、循環半減期と血漿滞留時間の増大、クリアランスの減少、および生体内における臨床活性増大を有する。本発明に従った組み換えＥＰＯ、ならびにその塩および機能性誘導体は、貧血治療、および患者の健康と生活の質の回復のためのヘマトクリット値増大のための医薬組成物の活性成分を構成してもよい。
【００１４】
本発明の多数の態様および利点は、現在好ましいその実施態様における本発明の実施の例証を提供する以下の詳細な説明を参照すれば、当業者には明らかになるであろう。
【００１５】
配列の詳細な説明
配列番号１：新規の赤血球新生刺激タンパク質をコードするヌクレオチド配列
配列番号２：新規の赤血球新生刺激タンパク質をコードするヌクレオチド配列のコドン最適化バージョン
配列番号３：ＮＥＳＰまたはダルベポエチン アルファのアミノ酸配列
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、エリスロポエチンイソ型生成ための代替となる新しい組み換え法を提供する。本発明に従って得られるエリスロポエチンの特定のイソ型およびそれらの特性は、出発原料源次第で変動してもよい。好ましい実施態様では、本発明は組み換えヒトエリスロポエチン（ｒＨｕＥＰＯ）および天然ヒトＥＰＯと５箇所（Ａｌａ  ３０  Ａｓｎ；Ｈｉｓ  ３２  Ｔｈｒ；Ｐｒｏ  ８７  Ｖａｌ；Ｔｒｐ  ８８  ＡｓｎおよびＰｒｏ  ９０  Ｔｈｒ）で異なる、エリスロポエチンイソ型の生成ための代替となる新しい組み換え法に関する。
【００１７】
本明細書において「エリスロポエチンイソ型」という用語は、単一等電点（ｐＩ）を有し、同一アミノ酸配列を有するエリスロポエチン調製品を指す。本明細書において「エリスロポエチン」という用語は、天然エリスロポエチン、尿由来ヒトエリスロポエチン、ならびにアミノ酸配列およびグリコシル化が天然のエリスロポエチンと十分に重複して、骨髄細胞に網状赤血球および赤血球の生成増大を引き起こす生体内生物学的特性を有する、非天然ポリペプチドを含む。
【００１８】
本発明に従い、新規アプローチによって、高度グリコシル化形態のヒトエリスロポエチンをコードするＤＮＡ配列が合成された。このアプローチは、使用される特定の哺乳類細胞に関するより良いコドン最適化を可能にする。さらに合成ＤＮＡは真核／原核細胞発現の対象となり、これは天然のエリスロポエチン（ＥＰＯ）の生物学的特性、ならびに生体内および生体外の双方でのＥＰＯの生物学的活性を示す、単離できる量のポリペプチドを提供した。
【００１９】
以下の実施例は本発明の例証のために提示され、具体的にはサルｃＤＮＡクローンおよびヒトゲノムのクローンをコードするＥＰＯの同定に先だって実施される手順、このような同定をもたらす手順、ならびにこのような発現系における配列決定、発現系開発、およびＥＰＯ発現の免疫学的検証に関するものである。
【実施例】
【００２０】
実施例１：組み換え赤血球新生刺激タンパク質（ＮＥＳＰ）の合成
新規アプローチによって、高度グリコシル化形態のヒトエリスロポエチンをコードするＤＮＡ配列を合成した。このアプローチは、使用する特定の哺乳類細胞に関するより良いコドン最適化を可能にする。さらに合成ＤＮＡは、真核／原核細胞発現の対象となり、これは天然のエリスロポエチン（ＥＰＯ）の生物学的特性、ならびに生体内および生体外の双方でのＥＰＯの生物学的活性を示す、単離できる量のポリペプチドを提供した。
【００２１】
赤血球新生刺激タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１で表されている。エリスロポエチンをコードする天然ヒト遺伝子転写物と比べて、前記赤血球新生刺激タンパク質中に追加的グリコシル化部位を組み込むように改変されたヌクレオチド残基は、大文字で強調表示されている。
【００２２】
赤血球新生刺激タンパク質のコード領域中のコドンは、ＣＨＯ  Ｋ１およびＨＥＫ  ２９３などの哺乳類細胞系において最適な組み換えタンパク質発現を確実にするためのコドン最適化過程の一部として改変されている。配列番号２は、赤血球新生刺激タンパク質をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を表す。
【００２３】
赤血球新生刺激タンパク質をコードする非最適化ヌクレオチド配列およびコドン最適化ヌクレオチド配列のペアワイズ配列比較は、図１に表される。
【００２４】
配列番号３は、本発明の赤血球新生刺激タンパク質の完全な一次アミノ酸配列を図示する。天然のヒトＥＰＯと比べて改変されたＮＥＳＰのアミノ酸残基が強調表示されている。
【００２５】
実施例２：赤血球新生刺激タンパク質をコードする新規合成ｃＤＮＡの確実性検証
新規合成ｃＤＮＡ配列オリジナル（ＡＶＣＩＰ−Ｎｅｓｐ）およびコドン最適化ｃＤＮＡ配列（ＡＶＣＩＰ−Ｎｅｓｐ−Ｏｐｔ）の確実性検証を自動化ＤＮＡ配列決定によって行い、得られた結果を図２および３に示す。
【００２６】
実施例３：ｐｃＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓ哺乳類細胞特異的発現ベクター中へのＡＶＣＩＰ−ＮｅｓｐおよびＡＶＣＩＰ−Ｎｅｓｐ−Ｏｐｔ  ｃＤＮＡのサブクローニング
新規合成ｃＤＮＡ配列オリジナル（ＡＶＣＩＰ−Ｎｅｓｐ）およびコドン最適化ｃＤＮＡ配列（ＡＶＣＩＰ−Ｎｅｓｐ−Ｏｐｔ）を哺乳類細胞特異的発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓ中に個別にサブクローニングして、形質移入対応のコンストラクトを生成させた。使用した手順の詳細を下で述べる。
Ａ．試薬および酵素：
１．ＱＩＡＧＥＮゲル抽出キットおよびＰＣＲ精製キット
２．ｐｃＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５−ＨｉｓベクターＤＮＡ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））
【００２７】
【表１】
2009502117.tif 000002
【００２８】
すべての反応は製造業者が推奨するように実施した。各反応では、提供された１０×反応緩衝液を１×の最終濃度に希釈した。
【００２９】
Ｂ．ベクターおよび挿入断片の制限消化
手順
以下のＤＮＡサンプルおよび制限酵素を使用した。
【００３０】
【表２】
2009502117.tif 000003
【００３１】
制限酵素消化反応
【表３】
2009502117.tif 000004
【００３２】
反応液を混合し、遠沈して３７℃で２時間インキュベーションした。制限消化をアガロースゲル電気泳動法によって分析した。予想された消化パターンが観察され、それは約６００ｂｐ（反応３および４）の遺伝子断片フォールアウトを特色とし、ベクター（反応１および２）については約５．５ｋｂのベクター骨格断片が見られた（図４）。
【００３３】
ＡＶＣＩＰ−ＮｅｓｐおよびＡＶＣＩＰ−Ｎｅｓｐ−Ｏｐｔ  ｃＤＮＡを表す約６００ｂｐのＤＮＡ断片は、キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）ゲル抽出キットを使用してゲル抽出法により別々に精製した。ｐｃＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓ哺乳類発現ベクターの約５．５ｋｂの消化済みベクター骨格もまた、同一のキットを使用して精製した。
【００３４】
必須ｃＤＮＡおよびベクターＤＮＡ断片の制限消化およびゲル抽出に引き続いて、図５に示すように、アガロースゲル電気泳動法を使用して、各精製ＤＮＡサンプルのアリコート（１〜２μＬ）を分析し、純度および完全性について調べた。
【００３５】
Ｃ．ｐｃＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓ骨格とＡＶＣＩＰ−ＮｅｓｐおよびＡＶＣＩＰ−Ｏｐｔ−Ｎｅｓｐ  ｃＤＮＡとのライゲーション
消化され精製されたベクターおよび挿入断片のＤＮＡ濃度を推定し、ライゲーションを次のように設定した。
【００３６】
【表４】
2009502117.tif 000005
【００３７】
反応液を穏やかに混合し、遠沈して室温で２〜３時間インキュベーションした。ＪＭ１０９コンピテント細胞をライゲーション反応混合物の内容物で形質転換した。
【００３８】
Ｄ．ＡＶＣＩＰｐｃＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓ／ＮｅｓｐおよびＡＶＣＩＰｐｃＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓ／Ｎｅｓｐ−Ｏｐｔの推定上のクローンの制限消化分析
アンピシリン含有ＬＢ寒天プレート上で得られたコロニーから、プラスミドＤＮＡを個別に精製し、図６に示すように、単離されたプラスミドＤＮＡの制限消化分析によって、所望のｃＤＮＡ挿入断片の存在を確認した。
【００３９】
ＡＶＣＩＰｐｃＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓ／ＮｅｓｐおよびＡＶＣＩＰｐｃＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓ／Ｎｅｓｐ−Ｏｐｔを含有するいくつかの推定上のクローンの制限消化後に得られた結果に従って、ＡＶＣＩＰ−ＮｅｓｐおよびＡＶＣＩＰ−Ｎｅｓｐ−Ｏｐｔ  ｃＤＮＡを内部切断することにより下記の図７に示すような変動するサイズの断片を生じる制限酵素を使用したさらなる制限消化分析のために、所望の制限パターンを示したクローンのいくつかを選択した。
【００４０】
Ｅ．ＤＮＡ配列決定によるＡＶＣＩＰｐｃＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓ／ＮｅｓｐおよびＡＶＣＩＰｐｃＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓ／Ｎｅｓｐ−Ｏｐｔの選択クローンの確認
制限マッピング分析の結果として選択されたＡＶＣＩＰｐｃＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓ／ＮｅｓｐおよびＡＶＣＩＰｐｃＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓ／Ｎｅｓｐ−Ｏｐｔのクローンを自動化ＤＮＡ配列決定によってさらに確認した。
【００４１】
【表５】
2009502117.tif 000006
【００４２】
図８および９に示すように、ＡＶＣＩＰｐｃＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓ／ＮｅｓｐおよびＡＶＣＩＰｐｃＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓ／Ｎｅｓｐ−Ｏｐｔのクローンは、テンプレート配列と１００％の同一性を示した。
【００４３】
新規合成ＡＶＣＩＰ−ＮｅｓｐおよびＡＶＣＩＰ−Ｎｅｓｐ−Ｏｐｔ  ｃＤＮＡを使用して作成した、組み換え発現コンストラクトのマップを図１０および１１に図示する。
【００４４】
実施例４：ｃＤＮＡ融合コンストラクトの維持および増殖
新規の赤血球新生刺激タンパク質をコードするｃＤＮＡコンストラクトの維持および増殖は、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのトップ（Ｔｏｐ）１０などの標準細菌細胞系中で行った。
【００４５】
実施例５：ＣＨＯ−Ｋ１細胞における一過性／安定組み換えタンパク質発現
（ａ）ＣＨＯ  Ｋ１細胞における赤血球新生刺激タンパク質の一過性発現
プラスミドＤＮＡの形質移入のための最適化プロトコルを使用して、ＣＨＯ細胞を下記：
１．ｐｃＤＮＡ３．１／ＮＥＳＰ（天然）
２．ｐｃＤＮＡ３．１／ＮＥＳＰ（Ｏｐｔ  ｓｅｑ）
を用いて形質移入した。
【００４６】
付着性ＣＨＯ  Ｋ１細胞の一過性形質移入
１．形質移入の前日、２４ウェルプレート内のウェルあたり１ｍＬの増殖培地（Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ  １：１）中に１×１０５個の細胞を播種する。播種された細胞数は、形質移入日に８０％の集密を生じなくてはならない。
２．それらの通常の増殖条件下（一般に３７℃および５％ＣＯ２）で細胞をインキュベーションする。
３．形質移入の当日、試験管Ａ内で、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．０のＴＥ緩衝液に溶解した２μｇのＤＮＡ（最小ＤＮＡ濃度０．１μｇ／μｌ）をＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）で総容積１００μｌに希釈する。溶液を混合して数秒間遠沈し、試験管上部から液滴を除去する。
４．試験管Ｂに１００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）中の６μＬのリポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（登録商標）２０００形質移入試薬を入れて、室温で５分間静置する。
５．ピペットを５回上下させて、試験管Ａおよび試験管Ｂの内容物を混合する。
６．サンプルを室温（１５〜２５℃）で１５分間インキュベーションして、形質移入複合体を形成させる。
７．複合体形成が起きている間にディッシュから増殖培地を穏やかに吸引し、２ｍｌのＰＢＳで細胞を１回洗浄する。
８．形質移入複合体を含有する反応試験管に、０．１ｍｌの細胞Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）を入れる。ピペットを２回上下させて混合し、細胞全容積を２４ウェルプレート内の１つのウェルに即座に移す。
９．細胞を形質移入複合体と共に、それらの通常の増殖条件下で６時間インキュベーションする。
１０．穏やかな吸引によって、残存する複合体を含有する培地を細胞から除去し、細胞を４ｍｌのＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で１回洗浄する。
１１．新鮮な細胞増殖培地（血清および抗生物質を含有）を入れる。適切なインキュベーション時間後、細胞を形質導入遺伝子の発現についてアッセイする。
【００４７】
これらの形質移入された細胞を抗エリスロポエチン抗体で染色し、タンパク質発現を評価した。図１２および１３に図示するように、前記タンパク質の特異的発現は、ｐｃＤＮＡ３．１／ＮＥＳＰ（天然）およびｐｃＤＮＡ３．１／ＮＥＳＰ（Ｏｐｔ  ｓｅｑ）で独立して形質移入されたＣＨＯ  Ｋ１細胞系に相当する、一過性形質移入実験の双方のセットで検出された。
【００４８】
（ｂ）ウエスタンブロットによる形質移入ＣＨＯ  Ｋ１細胞系における赤血球新生刺激タンパク質の一過性発現の検出
全細胞溶解産物は、ｐｃＤＮＡ３．１／ＮＥＳＰ（天然）またはｐｃＤＮＡ３．１／ＮＥＳＰ（Ｏｐｔ  ｓｅｑ）のどちらかで独立して形質移入されたＣＨＯ  Ｋ１細胞系から調製した。形質移入イベントの４８時間後に前記細胞溶解産物を調製し、ＰＶＤＦ膜上へのブロッティングに先だって、２つの異なる量の細胞溶解産物の全タンパク質調製物（１０μｇおよび２０μｇ）を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動した。次にＰＶＤＦ膜を２μｇ／ｍＬのウサギ抗ヒトエリスロポエチン抗体でプローブし、得られた結果を図１４に示す。
【００４９】
図８から明らかなように、赤血球新生刺激タンパク質の存在は、使用されたタンパク質調製物のより高濃度（約２０μｇ）で、ｐｃＤＮＡ３．１／ＮＥＳＰ（天然）またはｐｃＤＮＡ３．１／ＮＥＳＰ（Ｏｐｔ  ｓｅｑ）のどちらかで形質移入されたＣＨＯ  Ｋ１細胞系の全細胞溶解産物において特異的に検出された。形質移入ＣＨＯ  Ｋ１細胞系の細胞溶解産物中に存在する前記赤血球新生刺激タンパク質の電気泳動の移動度は、治療用製剤アラネスプ（Ａｒａｎｅｓｐ）（登録商標）で観察されたものに匹敵することが判明し、これにより発現組み換えタンパク質の予期された過グリコシル化性質が示唆された。
【００５０】
（ｃ）赤血球新生刺激タンパク質を発現する安定ＣＨＯ  Ｋ１細胞系の開発
レポーター遺伝子およびその他の遺伝子の染色体へのＤＮＡ組み込み、またはレポーター遺伝子およびその他の遺伝子の安定エピソームの維持については、比較的低頻度で起きることが知られている。致死的な薬物に対する抵抗性をコードする遺伝子を使用して、これらの細胞が選択できる。このような組み合わせの例は、ネオマイシンリン酸転移酵素のマーカー遺伝子と薬剤ジェネティシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（登録商標）である。薬剤処置により生残する個々の細胞を、個別に選択、増殖、および分析できるクローン群に増殖させる。安定系の開発に伴うステップを表すフローチャート図１５に示す。
【００５１】
プロトコル２：付着性ＣＨＯ  Ｋ１細胞の安定形質移入
１．形質移入の前日、２４ウェルプレート内のウェルあたり１ｍｌの増殖培地（Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ １：１）中に１×１０５個の細胞を播種する。播種された細胞数は、形質移入日に８０％の集密を生じなくてはならない。
２．それらの通常の増殖条件下（一般に３７℃および５％ＣＯ２）で細胞をインキュベーションする。
３．形質移入の当日、試験管Ａ内で、ｐＨ７〜ｐＨ８のＴＥ緩衝液に溶解した２μｇのＤＮＡ（最小ＤＮＡ濃度０．１μｇ／μｌ）をＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）で総容積１００μＬに希釈する。溶液を混合して数秒間遠沈し、試験管上部から液滴を除去する。
４．試験管Ｂに１００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）中の６μｌのリポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（登録商標）２０００形質移入試薬を入れて、室温で５分間静置する。
５．ピペットを５回上下させて、試験管Ａおよび試験管Ｂの内容物を混合する。
６．サンプルを室温（１５〜２５℃）で１５分間インキュベーションして、形質移入複合体を形成させる。
７．複合体形成が起きている間に、ディッシュから増殖培地を穏やかに吸引し、２ｍｌのＰＢＳで細胞を１回洗浄する。
８．形質移入複合体を含有する反応試験管に、０．１ｍｌの細胞Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）を入れる。ピペットを２回上下させて混合し、細胞全容積を２４ウェルプレート内の１つのウェルに即座に移す。
９．細胞を形質移入複合体と共に、それらの通常の増殖条件下で６時間インキュベーションする。
１０．穏やかな吸引によって細胞から、残る複合体を含有する培地を除去し、細胞を４ｍｌのＰＢＳで１回洗浄する。
１１．新鮮な細胞増殖培地（血清および抗生物質含有）を入れる。適切なインキュベーション時間後、細胞を形質導入遺伝子の発現についてアッセイする。
１２．細胞を１：１０〜１：１５で、適切な選択培地に継代培養する。コロニーが出現するまで、細胞をそれらの通常の増殖条件下で選択培地中に維持する。
【００５２】
実施例６：赤血球新生刺激タンパク質を発現する安定ＣＨＯ  Ｋ１細胞系の選択
ｐｃＤＮＡ３．１／ＮＥＳＰ（天然）およびｐｃＤＮＡ３．１／ＮＥＳＰ（Ｏｐｔ  ｓｅｑ）のどちらかで形質移入された一過性発現ＣＨＯ細胞をトリプシン処理して、１ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（登録商標）を含有する選択培地中で希釈した。コロニーが単離できるまで、細胞を選択培地中で１４日間インキュベーションした（下の図２ＡおよびＢ）。全部で８９個のｐｃＤＮＡ３．１ＮＥＳＰ（天然）および９１個のｐｃＤＮＡ３．１ＮＥＳＰ（Ｏｐｔ−Ｓｅｑ）コロニーを無菌条件で選択して、コロニー毎に９６ウェルプレートの単一ウェルに播種した。
【００５３】
アベスタゲン（Ａｖｅｓｔｈａｇｅｎ）は、赤血球新生刺激タンパク質を過剰発現する生成細胞系を開発するために、８９個のＣＨＯ  Ｋ１／ｐｃＤＮＡ３．１／ＮＥＳＰ（天然）コロニー、および９１個のＣＨＯ／ｐｃＤＮＡ３．１／−ＮＥＳＰ（Ｏｐｔ−ｓｅｑ）コロニーを選択した。これまでに選択されたすべてのＣＨＯ  Ｋ１細胞コロニーは、前記発明の赤血球新生刺激タンパク質を安定的に発現する単一細胞由来ＣＨＯ  Ｋ１生成細胞系を発生させるように、免疫蛍光、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ、および細胞ベースの機能性アッセイによって分析される。
【００５４】
実施例７：新しい赤血球新生刺激タンパク質の精製
生物医薬品の品質およびバイオセーフティーは、精製された生成物を製造するのに使用される抽出手順に大いに依存する。一方では、下流処理は、細胞培養過程中に得られた培養ブロスまたは細胞材料からの所望生成物の効果的で経済的な単離を確実にしなくてはならない。しかし他方では、最終生成物を汚染する構成要素を確実に分離しなくてはならない。最終生成物調合物中に存在してはならない異なるタイプの構成要素は、これらのステップ中で除去されなくてはならない。
【００５５】
第１の群は、タンパク様または非タンパク様性質であり得る、培地由来または工程由来不純物（例えば脂質、消泡剤、抗生物質）を含む。この群は、好ましくない免疫応答を誘起し得るタンパク質や、または健康なヒト細胞中に組み込む場合に、それらが潜在的に有害な遺伝的情報を潜在的に有し得るために大きな懸案事項である、核酸などの宿主細胞由来不純物をもまた含む。第２の群は、外来性物質(adventitious agents)および汚染物質からなり、ウイルス、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、細菌、真菌、マイコプラズマなどを含む。
【００５６】
培地構成要素およびタンパク様不純物の除去は、生成物単離における不可欠な部分である。抗生物質または細胞毒性物質などの培地添加剤（例えばジェニティシンまたはメトトレキサート）の除去を目的とする手順は精製ストラテジーに組み込まれ、そして適切な試験が確立されてそれらの効率を確証する。ＤＮＡなどのいくつかの不純物は、培養および収集条件の注意深い選択によって低下させることができる。実際的な理由から、１００％純粋な生成物を製造することは不可能であり、最終生成物調合物中の不純物存在について許容可能濃度レベルが定義されている。例えば世界保健機関（ＷＨＯ）は、ＤＮＡの最大許容可能量を生物工学的に誘導されたタンパク質薬剤の単一用量あたり１００ｐｇと確定した。精製段階において外来性物質を不活性化する可能性を活用でき、またはさらなる不活性化ステップを精製ストラテジー内に含めることができる。ウイルスおよびＶＬＰは、例えば不活性化化学物質（例えばＮ−アセチルエチレンイミン、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート）１０、有機溶剤、カオトロピック塩、極度のｐＨ値、照射などを施すことで不活性化できる。マイクロ波技術の応用によって達成される温度処理もまた、ウイルスを不活性化することが示されている。上記にもかかわらず、選択された不活性化技術の可能性は依然として検証されておらず、この検証はまた、不活性化法が生成物の完全性を害さないことを証明しなくてはならない。
【００５７】
成熟ヒトＥＰＯタンパク質は、１９３個のアミノ酸前駆体から２段階で誘導される、１６５個のアミノ酸の不変配列を含む。Ｎ末端の２７個のアミノ酸リーダー配列はホルモン分泌に先だって切断され、Ｃ末端Ａｒｇは内在性カルボキシペプチダーゼによってタンパク質分解により除去される。規制機関のガイドライン通りに汚染物質を含まない、所望の組み換えタンパク質を過剰発現する細胞培養系の確立に引き続いて、透析濾過と、アニオン交換および逆相マトリックスを伴うカラムクロマトグラフィー手順とを伴う一連のステップを使用して、新規の赤血球新生刺激タンパク質タンパク質の精製が実施できる。最も高度に分枝したグリカンおよび最大シアル酸含量を含有する画分を回収して、生体内活性を最大化する。
【００５８】
実施例８：精製手順の最適化
上述の推奨される機能性／結合アッセイに従った、再現可能な生物活性の確立に引き続いて、安定した高発現細胞系からの組み換えＮＥＳＰの収率を最大化するように、精製手順を最適化する努力がなされる。精製ストラテジーは、主要目的として、プロセス経済、製品を市場に出すまでの時間の短縮、拡張性(scalability)、再現性、および機能安定性と構造完全性がある生成物の最大純度を目指す。この趣旨で、濾過（通常濾過および接線流濾過）およびクロマトグラフィーの双方によるコンビナトリアルアプローチが探索される。工程検証要件および合格基準の研究は３つのバッチで行われる。
【００５９】
捕捉標的として選択的に糖タンパク質のグリカン構成要素を使用するタンパク質精製は、一般に親和クロマトグラフィーを使用して実施される。最も一般的なマトリックスは、ｍ−アミノフェニルボロン酸アガロースおよび固定化レクチン、コンカナバリンＡセファロース（ＣｏｎＡセファロース）および小麦胚芽凝集素セファロース（ＷＧＡ−セファロース）である。上述の内、ｍ−アミノフェニルボロン酸マトリックスは１，２−ｃｉｓ−ジオール基を含有するあらゆる分子と一時的な結合を形成できるのに対し、ＣｏｎＡマトリックスはＣ３、Ｃ４、およびＣ６位に非修飾水酸基を含有するマンノシルおよびグルカノシル残基と特異的に結合する。ＷＧＡセファロースマトリックスは、糖タンパク質のＮ−アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）またはＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡまたはシアル酸）残基に対して高度に特異的である。
【００６０】
したがって精製工程は、以下の下流過程を含む。
ａ．通常濾過および接線流濾過手順を使用した初期浄化および濃縮。
ｂ．限外濾過／透析濾過（接線流濾過に基づく）。
ｃ．クロモステップ(Chromo step)−Ｉ：レクチン／ｍ−アミノフェニルベースのマトリックスを使用したアフィニティークロマトグラフィー。Ｍ−アミノフェニルリガンドベースのアフィニティ媒体がより好ましい。
ｄ．クロモステップ−ＩＩ：Ｑ−セファロース陰イオン交換体を使用したイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）。
ｅ．クロモステップ−ＩＩＩ：ブチル−セファロースを使用した疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）。
ｆ．ウイルス除去および無菌濾過。
ｇ．内毒素除去。
ｈ．製剤化(Formulation)。
【００６１】
注記：高純度および最大生成物回収率のために、クロモステップ中の単位操作の順序を改変してもよい。物理化学的および免疫学的方法を使用して、各ステップにおける精製工程の結果をタンパク質の構造および機能完全性について評価する。
【００６２】
別の好ましい実施態様では、精製工程は、従来の充填床形態に対比して、膨張床吸着形態の陰イオン交換樹脂を使用して、粗製培養ブロスからの標的タンパク質の直接捕捉を目指し、以下のステップを含む。
ａ．捕捉段階として塩段階溶出によるＱ−セファロースＸＬを使用した陰イオン交換クロマトグラフィー。
ｂ．ブチルセファロースを使用した疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）。
ｃ．最終精製ステップとしてリソース（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）Ｑを使用した、第２の陰イオン交換クロマトグラフィー。
ｄ．ウイルス除去および無菌濾過。
ｅ．内毒素除去。
ｆ．製剤化。
【００６３】
より好ましくは、％生成物回収率および純度次第では、主要クロマトグラフィーステップとして、陰イオン交換クロマトグラフィーおよびＨＩＣを使用した二段階精製工程が用いられる。次に、上述のストラテジーで概説されるような次のステップが続く。
【００６４】
注記：高グリコシル含量および高シアリル含量の酸性ｐＩイソ型を選択的に濃縮するために、そして夾雑する無関係な塩基性タンパク質を除去するために、捕捉効率次第で、上で概説した両方のストラテジーにおいて、陰イオン交換捕捉後に任意の酸洗浄ステップを組み込んでもよい。さらにセルファイン（ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ）サルフェートなどの通過ベースの(flow through based)陰イオン交換体が、プロセス汚染物質、内在性／外来性ウイルス、およびカラム抽出物の選択的結合のために使用される。
【００６５】
実施例９：生化学的、免疫学的、および物理化学的方法を使用した標的タンパク質の同一性の確立
各段階における全タンパク質の％回収率は、ビシンコニン酸法（ＢＣＡ）／ブラッドフォード色素結合法を使用して定量化される。各精製段階における標的タンパク質濃度は、直接的または間接的サンドイッチＥＬＩＳＡなどの高度に特異的で信頼性のある酵素ベースの免疫測定法を使用して調べられる。より好ましくは、二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡが標的タンパク質濃度を評価するために適合される。ＮＥＳＰは糖タンパク質であるので、グリコシル化度の定性的評価は、還元条件下において電気泳動されたＳＤＳゲルの糖タンパク質検出のための特異的染色手順を使用して調べられる。定性的および標的特異的ウエスタン分析が、各段階に続く。逆相クロマトグラフィー、等電点電気泳動、および二次元ゲル電気泳動法を用いて、精製された生成物を評価する。遠ＵＶ円偏光二色性を使用して、二次構造分析を評価する。サイズ排除およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを使用して、分子量およびオリゴマー状態を調査する。研究はまた、ｐＨおよび温度に関するタンパク質の安定性にも着目する。ＮＥＳＰは過グリコシル化タンパク質であるので、精製タンパク質のグリコシル化パターンはガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析を使用して記録される。
【００６６】
実施例１０：新しい赤血球新生刺激タンパク質の生体外および生体内活性のアッセイ
以下を使用して、新規の赤血球新生刺激タンパク質の生体外ＥＰＯ受容体結合を検出するための生物検定を行う。
（ａ）Ｉ１２５標識された新規の赤血球新生刺激タンパク質を使用した競合的結合。
（ｂ）Ｕｔ７／ＥＰＯなどの推奨されるヒト細胞系を使用した［Ｈ］３−チミジン取り込み。新規の赤血球新生刺激タンパク質の前臨床生体内生物活性（正常ヘマトクリット回復能力）は、ＢＤＦｌなどの推奨マウス系列で試験される。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図１は、新規の赤血球新生刺激タンパク質をコードするＤＮＡヌクレオチド配列の非最適化バージョンとコドン最適化バージョンとのペアワイズ配列比較である。
【図２】図２は、新規合成された赤血球新生刺激タンパク質（ＡＶＣＩＰ−Ｎｅｓｐ−Ｏｐｔ）の最適化ｃＤＮＡ配列と、確立されてさらに最適化された赤血球新生刺激タンパク質の配列（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ＿Ｎｅｓｐ−Ｏｐｔ）との配列比較である。
【図３】図３は、新規合成された赤血球新生刺激タンパク質（ＡＶＣＩＰ−Ｎｅｓｐ）のｃＤＮＡ配列と確立された赤血球新生刺激タンパク質の配列（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ＿Ｎｅｓｐ）との配列比較である。
【図４】図４は、ベクターおよび挿入断片の制限消化である。
【図５】図５は、ＡＶＣＩＰ−Ｎｅｓｐ、ＡＶＣＩＰ−Ｎｅｓｐ−Ｏｐｔ、およびｐｃＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓのゲル精製された制限消化断片である。
【図６】図６は、ＡＶＣＩＰｐｃＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓ／ＮｅｓｐおよびＡＶＣＩＰｐｃＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓ／Ｎｅｓｐ−Ｏｐｔの推定上のクローンの制限消化分析である。
【図７】図７は、ＡＶＣＩＰ−ＮｅｓｐおよびＡＶＣＩＰＮｅｓｐ−Ｏｐｔ  ｃＤＮＡを内部切断する酵素を使用した、ＡＶＣＩＰｐｃＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓ／ＮｅｓｐおよびＡＶＣＩＰｐｃＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓ／Ｎｅｓｐ−Ｏｐｔクローンの制限消化分析である。
【図８】図８は、ＡＶＣＩＰ−Ｎｅｓｐ−Ｏｐｔ  ｃＤＮＡクローン＃４（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ＿Ｎｅｓｐ−Ｏｐｔ）と確立されたＮｅｓｐ−Ｏｐｔ遺伝子配列との配列比較である。
【図９】図９は、ＡＶＣＩＰ−Ｎｅｓｐ  ｃＤＮＡクローン＃９（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｎｅｓｐ）と確立されたＮｅｓｐ遺伝子配列との配列比較である。
【図１０】図１０は、ＡＶＣＩＰｐｃＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓ／Ｎｅｓｐのコンストラクトマップである。
【図１１】図１１は、ＡＶＣＩＰｐｃＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓ／Ｎｅｓｐ−Ｏｐｔのコンストラクトマップである。
【図１２】図１２は、ｐｃＤＮＡ３．１／ＮＥＳＰ（天然）である。
【図１３】図１３は、ｐｃＤＮＡ３．１／ＮＥＳＰ（Ｏｐｔ  Ｓｅｑ）である。
【図１４】図１４は、ウサギ抗ヒトエリスロポエチン抗体（２μｇ／ｍｌ）を使用した、ｐｃＤＮＡ３．１／ＮＥＳＰ（天然）またはｐｃＤＮＡ３．１／ＮＥＳＰ（Ｏｐｔ  ｓｅｑ）のどちらかおよびアラネスプ（Ａｒａｎｅｓｐ）（登録商標）で形質移入されたＣＨＯ  Ｋ１細胞系の全細胞溶解産物のウエスタンブロット分析である。
【図１５】図１５は、安定細胞系開発のフローチャートである。
【図１６】図１６は、ダルベポエチン アルファを発現する安定ＣＨＯ  Ｋ１細胞系開発のために選択されたコロニーのスナップ写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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