(57)【要約】  本発明は、アポトーシス関連障害に関する新規使用および試薬に関する。特に、PI3KクラスIIα活性の調節は、アポトーシスに影響を与えることが示されており、PI3KクラスIIαは、細胞生存因子であると考えられている。これらの発見に基づき、本発明は、アポトーシス関連障害の処置のために有用な治療法および医薬組成物を提供する。さらに、PI3KクラスIIαを、治療薬の開発のための標的として提供する。したがって、本発明は、PI3KクラスIIα活性を調節する候補化合物を同定するためのスクリーニング法を提供し、故に、アポトーシス関連障害、例えば、心臓血管障害、自己免疫疾患、神経変性疾患、および癌を処置するために使用し得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アポトーシス関連障害を処置するための方法であって、PI3KクラスIIαをコードする遺伝子の発現を調節するか、またはPI3KクラスIIα遺伝子産物の活性を調節する薬剤の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項２】
アポトーシス関連障害が心臓血管障害である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アポトーシス関連障害が神経変性疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
アポトーシス関連障害が癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
アポトーシス関連障害が自己免疫疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
薬剤が阻害性核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
薬剤が配列番号1〜7からなる群から選択されるsiRNAである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
PI3KクラスIIαをコードする遺伝子の発現を調節することができるか、またはPI3KクラスIIα遺伝子産物の活性を調節することができる薬剤の有効量および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項９】
PI3KクラスIIαモジュレーターが阻害性核酸である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
PI3KクラスIIα阻害剤が配列番号1〜7からなる群から選択されるsiRNAである、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
アポトーシス関連障害を処置するために有用な化合物を同定するための方法であって、
(a) PI3KクラスIIαポリペプチドに試験化合物を接触させ;そして
(b) PI3KクラスIIα生物学的活性の調節を検出すること
を含む、方法。
【請求項１２】
アポトーシス関連障害が心臓血管障害、神経変性疾患、自己免疫疾患、および癌から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
患者がアポトーシス関連障害を患っているか、またはアポトーシス関連障害を患うリスクがあるか否かを決定する方法であって、
(a) 対象から取得した試験生物学的試料を提供し;そして
(b) 生物学的試料中のPI3KクラスIIα核酸またはポリペプチドの発現レベルが、健康な対象から取得した同等な生物学的試料中のPI3KクラスIIαの発現レベルと異なるか否かを決定すること
を含む、方法。
【請求項１４】
アポトーシス関連障害が心臓血管障害、神経変性疾患、自己免疫疾患、および癌から選択される、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
アポトーシス、すなわち“プログラムされた細胞死”は、生物の分化および成熟の正常な特性であり、それを介して、該生物の細胞は、特異的な自殺過程により死ぬ。細胞は、目的を果たしたとき、欠損したとき、または老化したときに“自殺を行い”、そして、とりわけ、アポトーシスは、細胞が他の細胞間に腫瘍を形成し、蓄積させるのを妨げる。
【背景技術】
【０００２】
アポトーシスは、形態学的に壊死とは異なり、正常な生理学と関連する。(Kerr et al. (1972) Br J Cancer 26(24): 239)。成長している細胞は、正確に制御された数の分裂を特徴とし、それは、老化過程の中で遅くなり、最終的には、アポトーシスで終わる。プログラムされた細胞死は、また、細胞関連免疫の重要な機能である。体が、異物の侵入を避ける1つの方法は、標的細胞自身がアポトーシスにより殺されるようにそれらを誘導する、細胞毒性Tリンパ球(CTL)の能力を介する。CTL細胞が他の細胞を殺すとき、それらは、標的における潜在的なアポトーシス経路を活性化する。
【０００３】
異常で無秩序な、および/または疾患関連アポトーシスは、さまざまな病状に関与しており、ある処置における望む標的である。例えば、癌は、しばしば、非常に少ないアポトーシスにより特徴づけられ、一方で、抑制のないアポトーシスは、神経変性疾患を生じ得る。p53遺伝子における突然変異は、非常に頻繁に癌細胞で見られ、必要なアポトーシスを妨害し、癌細胞が死を回避するのを助け、その結果、誤った細胞増殖を生じる。アポトーシス機構を遅らせまたは停止させる欠陥は、また、エリテマトーデスおよびリウマチ性関節炎のような自己免疫疾患と関連している。
【０００４】
増殖因子およびインターロイキンのような“生存因子”は、アポトーシスを阻害することにより細胞の生存を延長し、正常な組織ホメオスタシスの維持および感染または障害への応答のために重要である。生存因子を除去すると、デフォルトのアポトーシス死プログラムが誘発される。一例として、炎症部位における好中球の蓄積を制御するメカニズムは、たいてい、炎症性細胞および構造細胞での好中球生存因子の合成を制限し得る。(Simon, HU (2003) Eur Respir J Suppl. 44:20s)。
【０００５】
ホスホイノシチド3-キナーゼ(以後、“PI3K”と示す)は、ホスホイノシチド“PI”のイノシトール環の3-ヒドロキシル位をリン酸化する酵素であり、細胞遊走、細胞増殖、発癌性形質転換、細胞生存、およびタンパク質の細胞内トラフィッキングのような種々の細胞イベントに関与する。PI3Kには、さまざまなアイソフォームおよび型を有する3つのクラスが存在する;たいていのPI3K生物学的活性は、もっぱら、クラスI PI3Kについて記載されている。他のPI3Kクラスの解明は、科学界において重要であり、特に、クラスII PI3K(例えば、PI3KクラスIIα)が、生存因子として役割を果たし得ることを示す証拠を踏まえて、重要である。
【発明の開示】
【０００６】
発明の要約
本発明は、患者におけるアポトーシス関連障害(例えば、異常なまたは無秩序なアポトーシスと関連した障害;例えば、正常な生理学的状態と比較したとき、過剰アポトーシス(不随する細胞欠損により特徴づけられる)、または過少アポトーシス(細胞蓄積により特徴づけられる)と関連した障害)の処置、改善、および診断のためにPI3KクラスIIαを調節することに関する。該アポトーシス関連障害は、非限定的に、癌、自己免疫疾患、心臓血管障害、および神経変性疾患を含む。
【０００７】
最初の局面では、本発明は、異常なアポトーシスに関連した疾患を処置するための方法を提供し、該方法は、PI3KクラスIIαをコードする遺伝子の発現を阻害するか、またはPI3KクラスIIα遺伝子産物の活性を阻害する薬剤の有効量を投与することを含む。1つの態様では、これらの処置法は、アポトーシスの不足により特徴づけられる障害、例えば、癌および自己免疫疾患で使用される。
【０００８】
本発明の1つの局面では、薬剤は、特異的にPI3KクラスIIαを阻害することができる阻害性核酸であり、好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物、より好ましくは、siRNA化合物である。
【０００９】
別の局面では、本発明は、異常なアポトーシスに関連した疾患を処置するための方法を提供し、該方法は、PI3KクラスIIαをコードする遺伝子の発現を高めるか、またはPI3KクラスIIα遺伝子産物の活性を促進する薬剤の有効量を投与することを含む。好ましい態様では、これらの処置法は、アポトーシスの過剰により特徴づけられる障害、例えば、神経変性疾患および心臓血管障害で使用される。
【００１０】
本発明の別の局面では、PI3KクラスIIαを調節することができる組成物(compositions of matter)を含む。好ましい態様では、該組成物は、特異的にPI3KクラスIIαを調節することができる核酸を含み、好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物、より好ましくは、siRNA化合物を含む。
【００１１】
また別の局面では、本発明は、PI3KクラスIIαをコードする遺伝子の発現を調節する(例えば、阻害または促進する)か、またはPI3KクラスIIα遺伝子産物の活性を調節する(例えば、阻害または促進する)薬剤の有効量を含む医薬組成物を提供する。好ましくは、医薬組成物は、PI3KクラスIIαを調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量を含む。
【００１２】
さらなる局面では、本発明は、アポトーシス関連障害の処置のために有用な化合物を同定するための方法に関し、該方法は、(a) PI3KクラスIIαポリペプチドに試験化合物を接触させること、および、(b) PI3KクラスIIα生物学的活性の調節を検出することを含む。PI3KクラスIIα生物学的活性の調節を試験する1つの方法は、PI3KクラスIIαの下流の標的(例えば、PI3K/Akt経路の下流の標的であるmTOR)の活性をアッセイすることである。
【００１３】
また別の局面では、本発明は、患者がアポトーシス関連障害を患っているか、またはアポトーシス関連障害を患うリスクがあるか否かを決定する方法に関し、該方法は、(a) 対象から取得した試験生物学的試料を提供し、そして、(b) 生物学的試料中のPI3KクラスIIα核酸またはポリペプチドの発現レベルが、健康な対象から取得した同等な生物学的試料中のPI3KクラスIIαの発現レベルと異なるか否かを決定することを含む。該発現レベルの差異は、試験対象が、アポトーシス関連障害を患っているか、またはアポトーシス関連障害を患うリスクがあることを示す。
【００１４】
また、別の局面では、本発明は、PI3KクラスIIαにより制御される1個またはそれ以上のポリペプチドの量または活性を調節するための方法に関し、該方法は、PI3KクラスIIαの発現を調節する(例えば、阻害性核酸の投与による)ことを含む。PI3KクラスIIα制御遺伝子またはタンパク質は、IκB、Bad、カスパーゼ9、フォークヘッド関連転写因子1、およびラパマイシンのほ乳類標的(mTOR)からなる群から選択され得る。
【００１５】
本発明の他の特徴および利点は、下記の詳細な説明、図面および請求項から明らかであるだろう。
【００１６】
図の簡単な説明
図1は、PI3KクラスIIαに対して作製した種々のsiRNAをトランスフェクションしたHela細胞での、PI3KクラスIIαRNAレベル間の比較を示す(定量的RT-PCRにより測定した)。レーン1は、コントロールを示し、次の4つのレーンは、本明細書で記載したとおり、PI3KクラスIIαに向けられた種々のsiRNAを反映する。
【００１７】
図2aおよび2bは、PI3KクラスIIαタンパク質に対する抗体を用いたPI3KクラスIIαノックダウンのウエスタンブロット解析を示す。アポトーシスは、PI3KクラスIIαに対するsiRNAの72時間後、カスパーゼ9およびPARPの切断により測定した。
【００１８】
図3は、PI3KクラスIIαに向けられた異なるsiRNAをトランスフェクションした結果として、Hela細胞で生じているアポトーシスの比較を示す(DNA断片ELISAにより測定した)。
【００１９】
図4aおよび4bは、それぞれ、Hela細胞およびU20S細胞において位相差顕微鏡により視覚化した、原形質膜気泡形成および細胞性生存性を示す。
【００２０】
発明の詳細な説明
本明細書に記載した発明は、特定の方法論、プロトコール、および記載した試薬に制限されないことを意図する(これらは、変わり得るので)。また、本明細書で使用する専門用語は、特定の態様を記載する目的のためにのみ使用し、本発明の範囲を制限することは全く意図していないものと理解されるべきである。
【００２１】
他に定義がないならば、本明細書で使用するあらゆる技術的および科学的用語は、本発明が属する分野における当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載したものと類似するか、または同等であるすべての方法および材料は、本発明の実施または試験で使用し得るが、好ましい方法、装置および材料を、本明細書で記載している。本明細書に記載したあらゆる出版物は、本発明に関連して使用し得る、出版物中で報告される材料および方法論を記載しおよび開示する目的のために、引用により本明細書の一部とする。
【００２２】
本発明の実施において、分子生物学の多くの慣用的な技術を使用する。これらの技術は既知であり、例えば、Harlow, E. and Lane, eds., 1988, “Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I, II, and III, 1997 (F. M. Ausubel ed.); Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II, 1985 (D. N. Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis, 1984 (M. L. Gait ed.); Nucleic Acid Hybridization, 1985, (Hames and Higgins); Transcription and Translation, 1984 (Hames and Higgins eds.); Animal Cell Culture, 1986 (R. I. Freshney ed.); Immobilized Cells and Enzymes, 1986 (IRL Press); Perbal, 1984, A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987 (J. H. Miller and M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory);およびMethods in Enzymology Vol. 154 and Vol. 155 (Wu and Grossman, and Wu, eds., respectively)で説明される。
【００２３】
本発明の記載において、“処置”なる用語は、アポトーシス関連障害のリスクがある患者および病気の患者の処置を含み、予防的もしくは防止的処置および治癒的もしくは疾患抑制的処置を含む。この用語はさらに、疾患の進行の遅延に関する処置を含む。
【００２４】
例えば、患者でのアポトーシスに関連した障害(例えば、自己免疫疾患)を“抑制および/または回復に向かわせる”ことにより、本出願人は、該状態をなくすか、または該状態を、処置前もしくは処置なしの状態よりも重篤ではないようにすることを意味する。
【００２５】
本明細書で使用するとき、“調節する”は、直接または間接的に、制御するかまたは影響を与える能力を示し、または、非限定的な例として、阻害するまたは刺激する、アゴナイズするまたはアンタゴナイズする、妨害するまたは促進する、および強めるまたは弱めることを意味し得る。
【００２６】
本明細書で使用するとき“治癒”は、処置を通して、患者におけるアポトーシスに関連した障害または進行中の症状の発現の寛解に導くことを意味する。
【００２７】
“予防的”または“防止的”は、アポトーシス関連障害、例えば、自己免疫疾患の発病または再発を妨げることを意味する。
【００２８】
本明細書で使用するとき“進行の遅延”は、障害(例えば、患者での異常なアポトーシスに関連した障害(例えば、自己免疫疾患))の前段階または早期段階にある患者への薬剤または医薬組成物の投与が、疾患のさらなる進行を妨げるか、または医薬組成物の投与をしないときの疾患の進行と比較して疾患の進行を遅らせることを意味する。
【００２９】
“アポトーシス関連障害”は、非限定的に、癌、心臓血管障害、神経変性疾患、および自己免疫疾患を含む。
【００３０】
“心臓血管障害”は、非限定的に、卒中、不安定狭心症、血栓症および心筋梗塞を含む急性冠症候群; アテローム性動脈硬化症(すなわち、動脈硬化症); プラーク破裂; 冠状動脈または末梢動脈における一次および二次(ステント中)再狭窄; 移植誘導硬化症; 末梢肢疾患; 虚血性心疾患(例えば、狭心症、心筋梗塞、および慢性虚血性心疾患); 高血圧性心疾患; 肺性心疾患; 弁膜性心疾患(例えば、リウマチ熱およびリウマチ性心疾患、心内膜炎、僧帽弁逸脱、および大動脈弁狭窄); 子癇前症; 末梢血管疾患; 心房性または心室中隔欠損症; 心筋疾患(例えば、心筋炎、心筋虚血、うっ血性心筋症、および肥大型心筋症); および糖尿病性合併症(虚血性心臓疾患、末梢動脈疾患、うっ血性心不全、網膜症、ニューロパシーおよびネフロパシーを含む)を含む。
【００３１】
“神経変性疾患”は、非限定的に、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、ジストニア、認知症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、およびクロイツフェルトヤコブ病を含む。
【００３２】
“自己免疫疾患”は、非限定的に、リウマチ性関節炎、グレイブス病、多発性硬化症、強皮症、自己免疫性肝炎、繊維筋痛症、重症筋無力症(MG)、全身性エリテマトーデス(SLE)、移植片拒絶(例えば、同種移植片拒絶反応)、およびT細胞性障害(後天性免疫不全症候群(AIDS)を含む)を含む。
【００３３】
本明細書で使用するとき、“癌”なる用語は、ほ乳類固形腫瘍および血液悪性腫瘍を含む。“ほ乳類固形腫瘍”は、頭頸部、肺、中皮腫、縦隔、食道、胃、膵臓、肝胆道系、小腸、結腸、結腸直腸、直腸、肛門、腎臓、尿道、膀胱、前立腺、尿道、陰茎、精巣、婦人科的臓器、卵巣、乳房、内分泌系、皮膚、中枢神経系の腫瘍;軟組織および骨の肉腫;および皮膚および眼球由来の黒色腫を含む。“血液悪性腫瘍”は、小児白血病およびリンパ腫、ホジキン病、リンパ球および皮膚由来のリンパ腫、急性および慢性白血病、血漿細胞腫瘍ならびにAIDSに関連した腫瘍を含む。さらに、進行のあらゆる段階における癌、例えば、原発、転移、および再発癌を処置し得る。多くの型の腫瘍に関する情報は、例えば、American Cancer Societyまたは例えば、Wilson et al. (1991) Harrison’s Principles of Internal Medicine, 12th Edition, McGraw-Hill, Inc.から見出し得る。ヒトおよび獣医の使用の両方が検討されている。
【００３４】
本明細書で使用するとき、“正常なほ乳類細胞”および“正常な動物細胞”は、正常な増殖制御メカニズム(例えば、遺伝学的制御)の下で増殖し、正常な細胞分化を示す細胞として定義する。癌細胞は、それらの増殖様式および細胞表面の性質において、正常な細胞と異なる。当業者に既知の他の特徴の中で、とりわけ、例えば、癌細胞は、近隣の細胞に関係なく、継続して無秩序に成長する傾向がある。
【００３５】
本明細書で使用するとき“阻害性核酸”なる用語は、遺伝子発現の遺伝子特異的阻害を産生することができる核酸化合物のことを言う。典型的な阻害性核酸は、非限定的に、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんDNA、RNAアプタマー、リボザイムおよび低分子阻害性RNA(“siRNA”)を含む。例えば、ヌクレオチド配列の知識は、クラスII PI3Kの発現を強く阻害するsiRNAまたはアンチセンス分子を設計するのに使用し得る。同様に、リボザイムは、遺伝子の特定のヌクレオチド配列を認識し、それを切断するために合成し得る。遺伝子発現の標的阻害における使用のためのそのような分子の設計に関する技術は、当業者に既知である。
【００３６】
本発明は、アポトーシス関連障害、例えば、自己免疫疾患の処置、診断、および/または改善のための方法および組成物に関する。好ましい態様では、本発明は、アポトーシス関連障害、例えば、自己免疫疾患を処置するための阻害性核酸の使用に関する。
【００３７】
PI3Kとして本明細書で言及しているホスホイノシチド3-キナーゼは、増殖因子結合細胞表面受容体上で細胞内シグナリング分子を活性化する酵素である。これらの脂質キナーゼは、ホスファチジルイノシトールのイノシトール環および関連する化合物を、主要な3位でリン酸化する;それらは、ホスファチジルイノシトール(また、“PtdIn”と呼ばれる)およびホスホイノシチド(ホスファチジルイノシトールのリン酸化バージョンである、“PI”)の両方をリン酸化することができる。
【００３８】
これらの反応産物は、成長シグナリング経路における二次伝達物質として働き、例えば、細胞生存、遊走、運動性、および増殖;発癌性形質転換;組織血管新生;および細胞内タンパク質トラフィッキングのような細胞内イベントに影響を与える。細胞表面受容体は、シグナルを細胞表面から細胞質に伝える、ホスファチジルイノシトール4,5-ビスホスフェート3のようなセカンドメッセンジャーの産生を誘導する。これらの二次伝達物質は、PI3K-依存性タンパク質キナーゼ-1を活性化し、順に、キナーゼAktを活性化する。Akt活性化の結果、細胞生存を導くタンパク質のリン酸化を生じる。(Cantley et al. (1999) PNAS 96:4240)。
【００３９】
一例として、Aktは、IκBをリン酸化し、それによりNFκBを活性化し、細胞生存を促進する。Aktはまた、Bad(プロアポトーシスBcl-2ファミリーメンバー)およびカスパーゼ9をリン酸化し、両方の場合において、アポトーシスの誘導を妨害する。Aktの他の下流の標的は、フォークヘッド関連転写因子1およびラパマイシンのほ乳類標的(mTOR)を含む。
【００４０】
PI3Kは、3つのクラスに分類され、それらの構造、基質特異性、生理学的機能、および組織特異性にしたがい類別される。(Domin et al. (1997) FEBS Lett. 410:91)。クラスI PI3Kは、たいてい、細胞質に存在し、p110触媒サブユニットおよびアダプター/制御サブユニットを含むヘテロダイマーであり、さらに2つのクラスに分類される: クラスIA PI3Kは、SH2ドメイン含有サブユニットp85と結合するp110触媒サブユニットからなり、多くのチロシンキナーゼ結合膜貫通受容体により活性化される; クラスIB PI3Kは、p110γ触媒サブユニットと結合するp101制御サブユニットからなり、ヘテロトリマーGタンパク質共役受容体により活性化される。(Katso et al. (2001) Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17:615)。クラスII PI3Kは、本明細書に記載した3つのアイソフォームからなる。クラスIII PI3Kは、ホスファチジルイノシトールのみを基質として利用し、リソソームを介したタンパク質トラフィッキングで重要な役割を果たす。(Volinia, et al. (1995) EMBO J. 14:3339)。
【００４１】
クラスII PI3Kは、主に、細胞の膜画分と結合しており、C末端のC2ドメインにより特徴づけられ、そして3つのアイソフォームからなる(PI3K-C2α、PI3K-C2β、およびPI3K-C2γ)。(Sheikh, et al. (2003) BMC Clin. Pathol. 3:1)。PI3K-C2αおよびPI3K-C2βの発現は普遍的であり、一方で、PI3K-C2γは、主に肝臓で見られる。PI3KクラスIIのC2ドメインは、インビトロで、カルシウムに依存しない方法でリン脂質に結合し得る(Arcaro et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:33082)。このドメインの欠損は、このクラスのPI3Kの細胞内局在に影響を与えない。これに反して、PI3KクラスIIのN末端領域に関してはほとんど知られておらず、既知タンパク質に対する相同性は証明されていない。
【００４２】
PI3KクラスIIαは、普遍的に発現しており、一般に増殖因子インスリン、上皮細胞増殖因子(EGF)、単球走化性ペプチド-1(MCP-1)、および血小板由来増殖因子(PDGF)の下流で活性化することが知られている。細胞増殖を促進することが既知であるこれらの増殖因子が、それらの細胞表面受容体に結合するとき、PI3KクラスIIαは活性化され、細胞内二次シグナルを伝える。
【００４３】
本明細書で示すとおり、PI3KクラスIIαを調節すると、アポトーシスに影響を与える。本出願の実施例のセクション(下記)には、PI3KクラスIIαの発現を阻害することにより、アポトーシスで示される細胞内変化がどのようにして生じるか(PI3KクラスIIαが細胞生存因子として機能することを強く示している)について詳細に記載している。
【００４４】
アポトーシスは、形態学的に壊死とは異なり、正常な生理学と関連する。(Kerr et al. (1972) Br J Cancer 26(24): 239)。発生の間およびその後、過剰な数の神経細胞、リンパ球および多くの他の種の細胞が、この遺伝学的にプログラムされた一連の変化を通して死ぬ;例えば、ヒトの指は、それらに参加する胚性細胞が、細胞死を受けるようにプログラムされているので、発生の間に分離する。成長している細胞は、正確に制御された数の分裂を特徴とし、それは、老化過程の間に遅くなり、最終的にはアポトーシスに至る。
【００４５】
プログラムされた細胞死は、また、細胞関連免疫の重要な機能である。体が、異物の侵入を避ける1つの方法は、標的細胞自身がアポトーシスにより殺されるようにそれらを誘導する、細胞毒性Tリンパ球(CTL)による。CTL細胞が他の細胞を殺すとき、それらは、標的における潜在的なアポトーシス経路を活性化する。成熟したCTLは、その標的(例えば、悪性ウイルスに感染した細胞)に対して毒性分子を分泌し、ここでアポトーシスを誘発する。
【００４６】
アポトーシスはまた、例えば、体から細胞欠陥を除去するために、修復メカニズムの能力を超えるDNA損傷により誘導され得る。細胞は、腫瘍サプレッサーでありアポトーシスの有力なインデューサーであるp53の産生を増加させることにより、DNA損傷に応答する。アポトーシスは、自己反応性Tリンパ球を除去するために胸腺で使用され、それにより、CTLがそれらの義務を果たした後の自己免疫を避ける。クロマチン結合酵素ポリ(ADP−リボース)ポリメラーゼ(“PARP”)は、アポトーシスを誘導すると考えられている、クロマチン結合酵素である。
【００４７】
異常で無秩序な、および/または疾患関連アポトーシスは、さまざまな状態に関与しており、ある処置における望む標的である。例えば、癌は、しばしば、非常に少ないアポトーシスにより特徴づけられ、一方で、抑制のないアポトーシスは、神経変性疾患を生じ得る。p53遺伝子における突然変異は、非常に頻繁に癌細胞で見られ、必要なアポトーシスを妨害し、癌細胞が死を回避するのを助け、その結果、誤った細胞増殖を生じる。アポトーシス機構を遅らせまたは停止させる欠陥は、また、エリテマトーデスおよびリウマチ性関節炎のような自己免疫疾患と関連している。
【００４８】
細胞が膨張し、破裂し、それらの内容物が隣の細胞まで漏出するネクローシス細胞死(しばしば炎症性応答を誘発する)とは異なり、アポトーシスでは、細胞核が凝縮し(核クロマチン凝縮)、細胞自身が細胞質が縮むに連れて縮む。アポトーシスはまた、拡張した小胞体および膜気泡形成により特徴づけられる; ミトコンドリアは、形態学的に、変化しないままである。
【００４９】
アポトーシス細胞における変化は、非活性化マクロファージによるファゴサイトーシスを誘発し、細胞の死骸を取り込み、分解する。マクロファージは、いくつかの異なる認識システムにより、アポトーシス細胞を認識するように思われる。例えば、アポトーシス細胞が、それらの原形質膜における正常なリン脂質非対称性を失う十分な証拠があり、二重層の外部表面上への内部表面(inward-facing)ホスファチジルセリンの正常な暴露により明らかにされている。マクロファージは、この曝された脂質頭部基(headgroup)を未知の受容体により認識し、ファゴサイトーシスを誘発し得る。
【００５０】
増加したように見えるアポトーシス細胞死の別の生化学的ホールマークは、ced-3、すなわち、線虫の“死遺伝子”と関連したシステインプロテアーゼであるカスパーゼの活性化である。カスパーゼは、たいていの細胞において、不活性なプロ酵素の形態で広く発現しているように見える。異なるカスパーゼは、隣のアミノ酸の認識を含む異なる高度な特異性を有するが、それらのタンパク質分解活性は、タンパク質をアスパラギン酸残基で切断する独特の能力により特徴づけられる。活性化カスパーゼは、しばしば、他のプロカスパーゼを活性化し得て、プロテアーゼカスケードの開始を可能にする。これらのプロテアーゼが、アポトーシス細胞死のたいていの例で関与している説得力のある証拠は、特異的なカスパーゼ阻害剤には細胞死を妨害する能力があること、およびカスパーゼ3、8および9を欠いたノックアウトマウスは、正常な胚発生を完成できないことの証明から生じた。
【００５１】
増殖因子およびインターロイキンのような“生存因子”は、アポトーシスを阻害することにより細胞の生存を延長し、正常な組織ホメオスタシスおよび感染または障害への応答のために重要である。生存因子を除去すると、デフォルトのアポトーシス死プログラムが誘発される。一例として、炎症部位における好中球の蓄積を制御するメカニズムは、たいてい、炎症性細胞および構造細胞での好中球生存因子の合成を制限し得る。(Simon, HU (2003) Eur Respir J Suppl. 44:20s)。
【００５２】
PI3KクラスIIαヌクレオチドまたはタンパク質発現が阻害される(例えば、本明細書に記載したsiRNAにより)と、アポトーシスが、妨害されずに生じ得る。このため、本明細書に記載した実験は、PI3KクラスIIαの阻害で引き起こされるアポトーシスの兆候、例えば、原形質膜気泡形成(例えば、図4aおよび4b)を記載している。実験はまた、PI3KクラスIIαを阻害した結果として、カスパーゼ9活性およびPARP切断を表す。
【００５３】
カスパーゼは、アポトーシスの主なエフェクターの1つであるタンパク質のファミリーである。これらのシステインプロテアーゼは、不活性な前型または酵素前駆体として細胞内に存在する。これらの酵素前駆体は、アポトーシスの誘導後、活性型酵素を形成するために切断し得て、それにより、活性型酵素は、お互いにおよび他のタンパク質のC末端アスパラギン酸残基を切断できるようになる。
【００５４】
アポトーシスの誘導は、イニシエーターカスパーゼ、例えば、カスパーゼ8、9、または10の活性化を生じ、次いで、タンパク質分解カスケードの他のカスパーゼを活性化し、エフェクターカスパーゼの活性化を生じる。エフェクターカスパーゼ(例えば、カスパーゼ3および6)は、主要な細胞内タンパク質の切断に関与し、アポトーシスを受けている細胞で観察される典型的な変化、例えば、細胞質での構造タンパク質の消化、染色体DNAの分解、および細胞のファゴサイトーシスを生じる。
【００５５】
PARP、またはポリ(ADP−リボース)ポリメラーゼは、DNAの修復、分化、およびクロマチン構造形成に関与する116 kDaのタンパク質である。PARP活性化および次の切断(例えば、カスパーゼによる)は、アポトーシスにおいて活発で複雑な役割を有する。アポトーシスの間に、このタンパク質は、カスパーゼにより89 kDa断片および24 kDa断片に切断され、その検出は、アポトーシスのホールマークである。ユビキチン/プロテアソーム経路によりアポトーシスの間に分解される活性化カスパーゼ3を測定するのとは対照に、PARP切断の測定は、アポトーシスの後期段階においてさえ、持続したシグナル検出を可能にする。
【００５６】
PI3KクラスIIは、本明細書に記載した実験で示したとおり、生存因子であると考えられているので、PI3KクラスIIヌクレオチドまたはタンパク質発現が抑制されると、アポトーシスが妨害されずに生じる。不断の細胞死の形態でのアポトーシスの異常調節は、AIDS、神経変性疾患、血液疾患(例えば、再生不良性貧血)、または心臓血管障害(例えば、心臓発作または卒中のような低酸素障害)を含むさまざまな状態と関連している。
【００５７】
一例として、アポトーシスを介した心臓単球の欠損は、心不全の進行に貢献する。研究は、心臓単球アポトーシスが、また、急性心筋梗塞後および高い頻度で心不全の発症と関連した状態である肥大心および老化した心臓で生じることを示している。(Sabbah et al. (1998) Prog Cardiovasc Dis. 40(6):549)。
【００５８】
さらなる例として、神経変性疾患は、過剰なアポトーシスおよび結果としての細胞欠損と関連している。ALSは、脊髄運動ニューロンアポトーシスにより特徴づけられ、麻痺および死を生じる; アルツハイマー病およびパーキンソン病はまた、異常な神経欠損と関連している。これらの状態の下での該アポトーシスは、神経栄養支持の欠如、グルタミン酸受容体およびカルシウム流入の過剰活性化、および増加した酸化ストレスを含むさまざまな誘因から生じ得る。(Mattson (2000) Nat Rev Mol Cell Biol. 1(2):120)。
【００５９】
したがって、上記に記載した障害のための適当な処置レジメンは、例えば、PI3KクラスIIαの促進によるような人工的なアポトーシスの阻害である。本発明の1つの局面は、異常なアポトーシスに関連した疾患の処置のための方法であり、PI3KクラスIIαをコードする遺伝子の発現を促進するか、またはPI3KクラスIIα遺伝子産物の活性を促進する薬剤の有効量を投与することを含む。
【００６０】
本発明はまた、PI3KクラスIIαをコードする遺伝子の発現を促進するか、またはPI3KクラスIIα遺伝子産物の活性を促進する薬剤の有効量を含む、医薬組成物を提供する。
【００６１】
PI3KクラスIIαは、本明細書に記載した実験で示したとおり、生存因子であると考えられているので、PI3KクラスIIαヌクレオチドまたはタンパク質発現を抑制すると、アポトーシスがスムーズに生じる。PI3KクラスIIαを阻害することにより軽減し得る、プログラムされた細胞死の不足(および付随する細胞の過剰)の形態でのアポトーシスの異常調節は、癌、自己免疫疾患、およびウイルス感染を含むさまざまな状態と関連している。
【００６２】
一例として、癌細胞は、アポトーシスの欠損のために、体内において容赦のない方法で増殖する。癌性細胞は、例えば、あるタンパク質を過剰発現し、結果としてアポトーシス誘導シグナルをかき消す(drowning out)ことによる(例えば、いくつかのB細胞性白血病およびリンパ腫の場合には、高レベルのBcl-2(アポトーシスの重要なレギュレーターのファミリー)を発現する);および、アポトーシスのために必要なリガンド−受容体結合対の1つに結合し、それにより必要な結合イベントを妨げる“おとり”分子を分泌することによる(例えば、肺癌および結腸癌の場合には、FasLがFasに結合するのを妨げる)さまざまなメカニズムを介して、アポトーシスを避ける。癌ウイルスは、アポトーシスプロモーター(例えば、p53)に結合し不活性化するタンパク質を、活性化(protein)することができる。
【００６３】
さらなる例として、自己免疫疾患は、細胞仲介免疫応答が減弱した後、体がそれ自身から免疫細胞を除去できないときに生じる。正常な生理学では、アポトーシスは、該免疫細胞で誘導され、それらは健康なシステムから除去されるが、アポトーシスメカニズムの欠損により、免疫細胞は、侵入した異物よりも体自身の構成要素を攻撃する。
【００６４】
したがって、上記に記載した障害のための適当な処置レジメンは、例えば、PI3KクラスIIαの阻害によるような人工的なアポトーシスの促進である。本発明の1つの局面は、異常なアポトーシスに関連した疾患の処置のための方法であり、PI3KクラスIIαをコードする遺伝子の発現を阻害するか、またはPI3KクラスIIα遺伝子産物の活性を阻害する薬剤の有効量を投与することを含む。
【００６５】
本発明の1つの局面では、薬剤は、特異的にPI3KクラスIIαを阻害することができる阻害性核酸である。典型的な阻害性核酸は、非限定的に、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんDNA、RNAアプタマー、リボザイムおよび低分子阻害性RNA(“siRNA”)を含む。本発明の好ましい態様では、薬剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物であり、より好ましくは、siRNA化合物である。
【００６６】
本発明のとりわけ好ましい態様では、siRNA化合物は、下記から選択される: agaggaagtgctgcagaataa (C2a-1として既知である; 配列番号1); ttgaagagagatcgacagcaa (2a-2として既知である; 配列番号2); aaggatttcagctaccagtta (C2a-3として既知である; 配列番号3); cacaaggaagcttacctatct (C2a-4として既知である; 配列番号4); ttagcttctttactgattctg (C2a-5として既知である; 配列番号5); ttgaatacttgtaagttctgg (C2a-6として既知である; 配列番号6); およびcagaatcagtaaagaagctaa (C2a-7として既知である; 配列番号7)。
【００６７】
本発明はまた、PI3KクラスIIαをコードする遺伝子の発現を阻害するか、またはPI3KクラスIIα遺伝子産物の活性を阻害する薬剤の有効量を含む医薬組成物を提供する。好ましくは、PI3KクラスIIα阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAである。より好ましくは、PI3KクラスIIα阻害剤は、下記から選択されるsiRNA化合物である: agaggaagtgctgcagaataa (C2a-1として既知である; 配列番号1); ttgaagagagatcgacagcaa (2a-2として既知である; 配列番号2); aaggatttcagctaccagtta (C2a-3として既知である; 配列番号3); cacaaggaagcttacctatct (C2a-4として既知である; 配列番号4); ttagcttctttactgattctg (C2a-5として既知である; 配列番号5); ttgaatacttgtaagttctgg (C2a-6として既知である; 配列番号6); およびcagaatcagtaaagaagctaa (C2a-7として既知である; 配列番号7)。
【００６８】
本発明はさらに、アポトーシス関連障害の処置のために有用な化合物を同定するための方法を提供し、該方法は、(a) PI3KクラスIIαポリペプチドに試験化合物を接触させること、および、(b) PI3KクラスIIα生物学的活性の調節を検出することを含む。PI3KクラスIIα生物学的活性の調節を試験する1つの方法は、PI3KクラスIIαの下流の標的の存在または活性をアッセイすることである。
【００６９】
また別の局面では、本発明は、患者がアポトーシス関連障害を患っているか、またはアポトーシス関連障害を患うリスクがあるか否かを決定する方法に関し、該方法は、(a) 対象から取得した試験生物学的試料を提供すること、および、(b) 生物学的試料中のPI3KクラスIIα核酸またはポリペプチドの発現レベルが、健康な対象から取得した比較され得る生物学的試料中のPI3KクラスIIαの発現レベルと異なるか否かを決定することを含む。該発現レベルの差異は、試験対象が、アポトーシス関連障害を患っているか、またはアポトーシス関連障害を患うリスクがあることを示す。
【００７０】
また、別の局面では、本発明は、PI3KクラスIIαにより制御される1個またはそれ以上のポリペプチドの量または活性を調節するための方法に関し、該方法は、PI3KクラスIIαの発現を調節する(例えば、阻害性核酸の投与による)ことを含む。PI3KクラスIIα制御遺伝子またはタンパク質は、IκB、Bad、カスパーゼ9、フォークヘッド関連転写因子1、およびラパマイシンのほ乳類標的(mTOR)からなる群から選択され得る。
【００７１】
RNAi
本発明の阻害性核酸は、購入可能な自動DNA合成機、例えば、Applied Biosystems (Foster City, CA)モデル380B、392または394 DNA/RNA合成機などの装置での慣用的な方法により製造し得る。ホスホアミダイト化学を使用し得る。本発明の阻害性核酸化合物は、また、修飾し得て、例えば、多くの文献で記載されているヌクレアーゼ耐性骨格、例えば、チオリン酸、ジチオリン酸、ホスオホロアミデイトなどを使用し得る。阻害性核酸の長さは、生物学的活性が阻害されることを保証するのに十分でなければならない。したがって、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの場合には、特異的な結合が、望む標的ポリヌクレオチドにのみ起こり、他の予期しない部位では起こらないことを保証するのに十分に大きくなければならない。長さの上限の範囲は、長さが、約30-40ヌクレオチドより大きいオリゴマーを合成および精製する不便さおよび費用、ならびにより短いオリゴヌクレオチドよりもミスマッチに関するより長いオリゴヌクレオチドのより大きい耐性などを含むいくつかの要因により決定される。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約15から40ヌクレオチドの範囲の長さを有する。より好ましくは、オリゴヌクレオチド部分は、約18から25ヌクレオチドの範囲の長さを有する。
【００７２】
二本鎖RNA、すなわち、センス−アンチセンスRNA(また、低分子干渉RNA(siRNA)分子と呼ばれる)は、また、PI3KクラスIIのための核酸の発現を阻害するために使用し得る。RNA干渉は、外因性の短いRNA二本鎖を投与する方法である(ここで、一本鎖が、標的mRNAのコード領域に一致する(Elbashir et al.(2001) Nature 411: 494))。細胞へ導入すると、siRNA分子は、外因性RNA二本鎖の分解および同一の配列を有する一本鎖RNA(内因性メッセンジャーRNAを含む)の分解を生じる。したがって、siRNAは、該技術が触媒機構を介して作用すると考えられているので、伝統的なアンチセンスRNA方法論よりもより有力でより効果的であり得る。好ましいsiRNA分子は、典型的には、19から25ヌクレオチド長、好ましくは、長さが、約21ヌクレオチドであり、E2-EPF5に関する核酸配列を含む。siRNAを標的細胞へ送達するための有効な戦略は、例えば、物理的または化学的トランスフェクションを用いた導入を含む。あるいは、例えば、機能的siRNAまたはその前駆体の転写を可能にするさまざまなPolIIIプロモーター発現カセットを用いて、siRNAを細胞で発現し得る。例えば、Scherr et al. (2003) Curr. Med. Chem. 10(3):245; Turki et al. (2002) Hum. Gene Ther. 13(18):2197; Cornell et al. (2003) Nat. Struct. Biol. 10(2):91を参照のこと。発明はまた、RNA干渉(RNAi)を仲介することができる他の小分子RNAに及び、例えば、マイクロRNA(miRNA)および小分子ヘアピンRNA(shRNA)に及ぶ。
【００７３】
スクリーニングアッセイ
特に好ましい態様では、PI3KクラスIIは、異常なアポトーシスが役割を果たす疾患(例えば、自己免疫疾患、心臓血管障害、癌関連疾患、または神経変性疾患)の処置に有用な治療薬をスクリーニングするための標的として提供される。本発明は、PI3KクラスIIαの調節のために有用な化合物を同定するための方法を提供し、該方法は、(a) PI3KクラスIIαポリペプチドに試験化合物を接触させること、および、(b) PI3KクラスIIα生物学的活性の調節を検出することを含む。調節は、通常、試験化合物を欠いたコントロール反応に関して検出される。本明細書で使用するとき、調節は、生物学的活性の増加または減少のことを言い、好ましくは、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも50%、または少なくとも100%の増加または減少のことを言う。
【００７４】
別の態様では、本発明は、異常なアポトーシスに関連した疾患の処置のために有用な化合物を同定するための方法を提供し、該方法は、(a) PI3KクラスIIαポリペプチドに試験化合物を接触させること、および、(b) PI3KクラスIIα生物学的活性の調節を検出することを含む。PI3KクラスIIα生物学的活性の調節を試験する1つの方法は、PI3KクラスIIαの下流の標的の存在または活性をアッセイすることである。
【００７５】
化合物スクリーニングアッセイは、細胞に基づく系または無細胞系を含み得る。細胞に基づく系は、生検サンプルとして天然の、すなわち、通常PI3KクラスIIαを発現する細胞であり得るか、または細胞培養に拡張し得る。しかしながら、1つの態様では、細胞に基づくアッセイは、PI3KクラスIIαを発現する組み換え宿主細胞を含む。PI3KクラスIIαと相互作用する試験化合物の能力を決定することは、また、該ポリペプチドに結合することが知られている結合分子の能力と比較して、選択的に該ポリペプチドに結合する試験化合物の能力を決定することを含み得る。
【００７６】
また別の態様では、本発明のアッセイは、タンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触させ、該試験化合物のPI3KクラスIIαタンパク質またはその生物学的に活性な部分に結合する能力を決定する無細胞アッセイである。試験化合物のPI3KクラスIIαタンパク質への結合は、上記で記載したとおり、直接または間接的に決定し得る。好ましい態様では、該アッセイは、PI3KクラスIIαタンパク質またはその生物学的に活性な部分にPI3KクラスIIαタンパク質に結合することが既知の化合物を接触させることによりアッセイ混合物を形成し、アッセイ混合物に試験化合物を接触させ、そしてPI3KクラスIIαタンパク質と相互作用する試験化合物の能力を決定することを含み、ここで、PI3KクラスIIαタンパク質と相互作用する試験化合物の能力を決定することは、既知化合物と比較して、PI3KクラスIIαタンパク質またはその生物学的に活性な部分に優先的に結合する試験化合物の能力を決定することを含む。
【００７７】
ポリペプチドは、PI3KクラスIIα活性を調節する化合物を同定するために使用し得る。そのような化合物は、例えば、PI3KクラスIIαタンパク質基質、例えば、ホスファチジルイノシトール(また、“PtdIn”と呼ばれる)またはホスホイノシチド(ホスファチジルイノシトールのリン酸化型である“PI”)に関する親和性を増加させるか、または減少させ得る。そのような化合物は、また、例えば、これらの基質への結合速度を増加させるか、または減少させ、PI3KクラスIIαへの結合に関してこれらの基質と競合し、または、PI3KクラスIIαへ結合したこれらの基質を置き換え得る。
【００７８】
PI3KクラスIIα、誘導体および断片は、迅速スクリーニング法、例えば、自動ハイスループットスクリーン(HTS)で、候補化合物のPI3KクラスIIαに結合する能力に関してアッセイするために使用し得る。多くの適当な迅速スクリーニングアッセイが、当業者に既知である。
【００７９】
これらの化合物は、PI3KクラスIIαに関する化合物の効果を決定するために、機能的PI3KクラスIIαに対してさらにスクリーニングし得る。望む程度までPI3KクラスIIαを活性化するか(アゴニスト)、または不活性化する化合物(アンタゴニスト)を同定し得る。調節方法は、インビトロで(例えば、薬剤と共に細胞を培養することにより)、または、あるいはインビボで(例えば、対象に薬剤を投与することにより)行い得る。PI3KクラスIIαポリペプチドは、PI3KクラスIIαタンパク質と通常はPI3KクラスIIαタンパク質と相互作用する標的分子の間の相互作用を刺激するか、または阻害する能力に関してスクリーニングするために使用し得る。標的は、PI3KクラスIIαタンパク質が、通常、相互作用する経路の任意の構成要素であり得る。アッセイは、PI3KクラスIIαタンパク質または断片が、標的分子と相互作用し、そしてPI3KクラスIIαタンパク質と標的間の複合体の形成を検出するか、またはPI3KクラスIIαと標的の相互作用の生化学的結果を検出するのを可能にする条件下で、PI3KクラスIIαタンパク質に候補化合物を接触させる工程を含む。PI3KクラスIIα機能の関連する効果のすべてを、アッセイし得る。これは、リン酸化ホスファチジルイノシトールもしくはホスホイノシチドの産生、PI3KクラスIIαの下流の標的の調節、またはアポトーシスの停止もしくは促進を含む。
【００８０】
PI3KクラスIIαの標的分子へ結合する能力を決定することは、また、例えば、リアルタイム二分子相互作用解析(BIA)のような技術を用いて達成し得る。本明細書で使用するとき、“BIA”は、反応体のいずれにも標識することなしに、リアルタイムでの生体特異性相互作用を研究するための技術である(例えば、BIAcore(登録商標))。光学現象表面プラズモン共鳴(SPR)の変化は、生物学的分子間のリアルタイム反応の指標として使用し得る。本発明の試験化合物は、当業者に既知のコンビナトリアルライブラリー法での多くの方法のいずれかを用いて取得し得て、当該方法は、下記のものを含む: 生物学的ライブラリー; 空間的に接近可能な平行固相または溶液相ライブラリー; デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法; ‘1ビーズ1化合物’ライブラリー法;およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いた合成ライブラリー法。生物学的ライブラリー法は、ポリペプチドライブラリーに限定され、一方で、他の4つの方法は、ポリペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の小分子ライブラリーに適用可能である(Lam, K. S. (1997) Anticancer Drug Des. 12:145)。分子ライブラリーの合成に関する方法の実施例は、当分野で、例えば、DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al. (1993) Science 261:1303; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061;およびGallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37:1233で見出し得る。
【００８１】
化合物のライブラリーは、溶液で(例えば、Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421)、またはビーズで(Lam (1991) Nature 354:82-84)、チップで(Fodor (1993) Nature 364:555-556)、細菌で(Ladner米国特許第5,223,409号)、胞子で(Ladner米国特許第‘409号)、プラスミドで(Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869)またはファージで(Scott and Smith (1990) Science 249:386- 390); (Devlin (1990) Science 249:404-406); (Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 97:6378-6382); (Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310)提供され得る。
【００８２】
候補化合物は、例えば、(1) Ig-テール融合ペプチドおよびランダムペプチドライブラリーのメンバー(例えば、Lam et al. (1991) Nature 354:82-84; Houghten et al. (1991) Nature 354:84-86を参照のこと)ならびにD-および/またはL-構造アミノ酸からなるコンビナトリアルケミストリー由来分子ライブラリーを含む、可溶性ペプチドのようなペプチド; (2) リン酸化ペプチド(例えば、ランダムおよび部分的縮重に向けられたリン酸化ペプチドライブラリーのメンバー、例えば、Songyang et al. (1993) Cell 72:767-778を参照のこと); (3) 抗体(例えば、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラ、および一本鎖抗体ならびに抗体のFab、F(ab')2、Fab発現ライブラリー断片、およびエピトープ結合断片);および(4) 有機小分子および無機小分子(例えば、コンビナトリアルライブラリーおよび天然産物ライブラリーから取得した分子)を含む。
【００８３】
1つの局面では、本発明にしたがったスクリーニング法により同定した化合物を提供する。そのような化合物は、好ましくは、低分子量化合物または抗体、特に、モノクローナル抗体、または阻害性核酸である。化合物は、好ましくは、アポトーシスに対する調節効果を有し、すなわち、当該化合物は、アポトーシスを阻害または促進し、その決定は、当業者に既知の方法によりなされ得る。そのような方法は、例えば、細胞の形態学的変化(例えば、膜気泡形成、核凝縮)の検出、PARP切断および/またはカスパーゼ活性化の検出、およびホスファチジルイノシトール(PtdIn)またはホスホイノシチド(PI)のリン酸化の検出を含む。
【００８４】
本発明の試験化合物は、生物学的ライブラリー、空間的に接近可能な平行固相または溶液相ライブラリー、デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法、“1ビーズ1化合物”ライブラリー法、およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いた合成ライブラリー法を含む、当業者に既知のコンビナトリアルライブラリーでの多くの方法のいずれかを用いて取得し得る。生物学的ライブラリー法は、ペプチドライブラリーに限定され、一方で、他の4つの方法は、ペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の小分子ライブラリーに適用可能である(Lam et al., 1997, Anticancer Drug Des. 12:145)。
【００８５】
分子ライブラリーの合成に関する方法の実施例は、例えば、DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al. (1993) Science 261:1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061;およびGallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37:1233において、当業者は見出し得る。
【００８６】
本発明の上記アッセイ方法の2以上の態様では、PI3KクラスIIαを固定し、タンパク質の非複合体型からの複合体型の分離を促進すること、およびアッセイの自動化に適応させることを望み得る。試験化合物のPI3KクラスIIαタンパク質、またはタンパク質標的への結合は、反応物を含むために適当な任意の容器で達成し得る。そのような容器の例は、マイクロタイタープレート、試験管、および微小遠心管を含む。1つの態様では、タンパク質がマトリックスに結合するのを可能にするドメインを加える、融合タンパク質を提供し得る。例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ/キナーゼ融合タンパク質またはグルタチオン-S-トランスフェラーゼ/標的融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ(Sigma Chemical, St. Louis, Mo.)またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着し得て、次いで、試験化合物または試験化合物および非吸着PI3KクラスIIαタンパク質と結合させ、混合物を、複合体形成を誘導する条件下で(例えば、塩およびpHに関して生理学的な条件下で)、インキュベートする。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを、すべての非結合成分、ビーズの場合には非結合マトリックスを除去するために洗浄し、複合体を、直接または間接的に、例えば、上記に記載したとおり決定する。あるいは、複合体をマトリックスから解離し得て、結合レベルを標準的な技術を用いて決定する。
【００８７】
マトリックスへタンパク質を固定化するための他の技術は、また、本発明のスクリーニングアッセイのために使用し得る。例えば、PI3KクラスIIαタンパク質を、ビオチンおよびストレプトアビジンの結合を利用して、固定化し得る。ビオチン化PI3KクラスIIαタンパク質または標的分子は、当業者に既知の技術(例えば、biotinylation kit, Pierce Chemicals, Rockford, Ill.)を用いて、ビオチン-NHS(N-ヒドロキシ-スクシンイミド)から製造し得て、ストレプトアビジン被覆96ウェルプレート(Pierce Chemical)のウェルに固定し得る。あるいは、PI3KクラスIIαタンパク質と反応する抗体または標的分子を、プレートのウェルに誘導体化し得て、非結合PI3KクラスIIαタンパク質を、抗体結合によりウェルにトラップする。そのような複合体を検出するための方法は、GST固定化複合体に関して上記に記載したものに加えて、PI3KクラスIIαタンパク質と反応する抗体または標的分子を用いた複合体の免疫検出を含む。
【００８８】
本発明のまた別の局面では、PI3KクラスIIαタンパク質は、two-hybridアッセイまたはthree-hybridアッセイ(例えば、米国特許第5,283,317号; Zervos et al., 1993 Cell 72:223-232; Madura et al., 1993 J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartel et al., 1993 Biotechniques 14:920-924; Iwabuchi et al., 1993 Oncogene 8:1693-1696;およびBrent WO94/10300を参照のこと)における“ベイトタンパク質”として使用し、PI3KクラスIIαタンパク質に結合する他のタンパク質を同定し得る。そのようなPI3KクラスIIα結合タンパク質はまた、PI3KクラスIIα結タンパク質によるシグナルの伝播に関与し得る。
【００８９】
two-hybrid系は、分離可能なDNA結合および活性化ドメインからなるたいていの転写因子のモジュール性質に基づく。簡潔には、該アッセイは、2個の異なるDNAコンストラクトを利用する。1つのコンストラクトでは、PI3KクラスIIαタンパク質をコードする遺伝子は、既知転写因子のDNA結合ドメインをコードする遺伝子(例えば、GAL-4)と融合する。他のコンストラクトでは、同定されていないタンパク質をコードするDNA配列ライブラリーからのDNA配列(“プレイ”または“試料”)は、既知転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子と融合する。“ベイト”および“プレイ”タンパク質が、インビボで相互作用し、キナーゼ依存性複合体を形成し得るとき、転写因子のDNA結合および活性化ドメインは、接近するようになる。この接近により、転写因子に応答する転写制御サイトに操作可能に結合しているレポーター遺伝子(例えば、LacZ)の転写が可能になる。レポーター遺伝子の発現は、検出し得て、機能的転写因子を含む細胞コロニーを、単離し、PI3KクラスIIαタンパク質と相互作用する該タンパク質をコードするクローン遺伝子を取得するために使用し得る。
【００９０】
本発明はさらに、上記に記載したスクリーニングアッセイにより同定した新規薬剤に関する。したがって、本明細書に記載したとおり同定した薬剤を、適当な動物モデルにおいてさらに使用することは、本発明の範囲内にある。例えば、本明細書に記載したとおり同定した薬剤(例えば、PI3KクラスIIα調節剤)は、そのような薬剤を用いた処置の効果、毒性、または副作用を決定するために、動物モデルで使用し得る。あるいは、本明細書に記載したとおり同定した薬剤は、そのような薬剤の作用機構を決定するために、動物モデルで使用し得る。さらに、発明は、本明細書に記載した処置のための、上記に記載したスクリーニングアッセイにより同定した新規薬剤の使用に関する。
【００９１】
医薬組成物
本発明のさらなる局面は、上記した治療効果のいずれかのために、薬学的に許容される担体と共に医薬組成物の投与に関する。そのような医薬組成物は、PI3KクラスIIαをコードする遺伝子の発現を調節するか、またはPI3KクラスIIα遺伝子産物の活性を調節する薬剤の有効量を含む。
【００９２】
本発明の医薬組成物は、例えば、抗体、模倣剤、アゴニスト、アンタゴニスト、または本発明にしたがったPI3KクラスIIαの阻害性核酸を含む。組成物は、単独で、または少なくとも1個の他の薬剤、例えば、安定化化合物との組合せで投与し得て、非限定的に、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、および水を含む任意の滅菌した生体適合性医薬担体で投与し得る。組成物は、単独で、または他の薬剤、薬物またはホルモンとの組合せで、患者に投与し得る。
【００９３】
本発明に包含される医薬組成物は、非限定的に、経口、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、経鼻、腸内、局所、舌下、または直腸の手段を含むあらゆる経路により投与し得る。有効成分に加えて、これらの医薬組成物は、活性化合物の薬学的に使用し得る製剤への加工を容易にする賦形剤および助剤を含む、適当な薬学的に許容される担体を含み得る。製剤および投与のための技術に関するさらなる詳細は、Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, Pa.)の最新版に見出し得る。
【００９４】
経口投与のための医薬組成物は、当業者に既知の薬学的に許容される担体を、経口投与のために適当な用量で用いて製剤し得る。そのような担体は、患者による摂取のために、医薬組成物が、錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして製剤されるのを可能にする。
【００９５】
医薬組成物は塩として提供され得て、非限定的に、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などを含む多くの酸と共に形成し得る。塩は、相当する遊離塩基形よりも、水性溶媒または他のプロトン性溶媒により溶けやすい傾向がある。他の場合には、好ましい調製物は、下記のいずれかまたはすべてを含み得る凍結乾燥粉末であり得る: 1-50 mMヒスチジン、0. 1%-2%スクロース、および2-7%マンニトール(pHの範囲は、4.5から5.5であり、使用前にバッファーと合わせる)。
【００９６】
医薬組成物を製造後、それらを適当な容器に入れ、示される状態の処置に関して標識し得る。投与のために、標識は、投与の量、頻度、および方法を含み得る。
【００９７】
本発明の使用のために適当な医薬組成物は、有効成分が、意図する目的を達成するために有効な量で含まれる組成物を含む。有効量の決定は、当業者の能力の範囲内にある。
【００９８】
すべての化合物に関して、治療上有効量は、最初、細胞培養アッセイ(例えば、新生物の細胞培養アッセイ)または動物モデル(通常は、マウス、ウサギ、イヌ、またはブタ)で概算され得る。動物モデルはまた、適当な濃度範囲および投与経路を決定するのに使用し得る。次いで、そのような情報は、ヒトでの有用な用量および投与経路を決定するのに使用し得る。
【００９９】
治療上有効量は、異常なアポトーシスに関連した障害の症状または状態を軽減する、有効成分、その断片、抗体、アゴニスト、アンタゴニストまたはPI3KクラスIIαの阻害剤の量のことを言う。治療効果および毒性は、細胞培養または実験動物での標準的な薬学手順により、例えば、ED50 (治療上、集団の50%に有効である用量)およびLD50 (集団の50%に致死である用量)により決定し得る。毒性および治療効果間の用量割合は、治療指数であり、LD50/ED50割合として表現し得る。大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物研究から得たデータは、ヒト使用のための用量範囲を規定するために使用する。そのような組成物に含まれる用量は、好ましくは、毒性がほとんどないか、または全くないED50を含む循環濃度の範囲内にある。用量は、使用する用量型、患者の重篤度、および投与経路に依存して、この範囲内で変わる。
【０１００】
正確な用量は、処置を必要とする対象に関連した因子を考慮して、臨床医により決定される。用量および経路は、十分なレベルの活性化部分を提供し、望む効果を維持するために調節される。考慮され得る因子は、疾患状態の重篤度、対象の一般的健康、年齢、体重、および対象の性、食事、投与の時間および頻度、薬剤組合せ(複数を含む)、反応感受性、および治療に対する耐性/応答を含む。長期作用医薬組成物は、特定の製剤の半減期および排泄率に依存して、3日から4日毎、1週間毎、2週間毎に1回、投与し得る。通常の投与量は、投与経路に依存して、0.1μgから100,000 μg(約1 gの全用量まで)で変わり得る。特定の用量および送達の方法に関する手引きは、文献で提供され、一般に、当業者に利用可能である。当業者は、タンパク質またはそれらの阻害剤に関してよりもヌクレオチドのために、異なる製剤を使用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、場所などに特異的であるであろう。タンパク質の経口投与のために適当な医薬組成物は、例えば、米国特許第5,008,114号; 第5,505,962号; 第5,641,515号; 第5,681,811号; 第5,700,486号; 第5,766,633号; 第5,792,451号; 第5,853,748号; 第5,972,387号; 第5,976,569号;および第6,051,561号に記載されている。
【実施例】
【０１０１】
実施例1: siRNA配列の作製
siRNA配列設計は、21-merオリゴリボヌクレオチドを評価するために、BIOPREDsi有効性予測アルゴリズムを使用する。トップスコアの配列を、実験的に定義された選択基準siRNAにしたがって、特定のトランスクリプトームに対する理論上の選択のために調べる。さらに、siRNAは、19塩基対二本鎖領域および各鎖の3'末端での2個のデオキシヌクレオチドオーバーハングを有する21-ntのオリゴリボヌクレオチドとして、Qiagen (Qiagen, Valencia, CA)およびDharmacon (Lafayette, CO)により合成した。センス鎖のDNAはdTdTであり、一方で、アンチセンス鎖のオーバーハングは、標的mRNAに相補的であった。
【０１０２】
作製したsiRNA配列は、下記のとおりである:
【表１】
2009506062.tif 000002
【０１０３】
実施例2: アポトーシスELISA
siRNAを、オリゴフェクトアミン(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて、24時間前に96ウェルプレートに播種した(3000細胞/ウェル)HeLa細胞にトランスフェクションした。各siRNA実験で、ネガティブコントロールスクランブルsiRNAを、siRNAコントロールとして使用した。標的ノックダウンの72時間後、アポトーシス細胞死の定量化を、アポトーシスの間に産生される細胞質ヒストン-DNA断片を測定するELISAにより決定した(Roche, Indianapolis, IN)。次に、96ウェルプレートを、10分間遠心分離し(200 x g)、上清を捨て、溶解バッファーを加えた。溶解後、試料を遠心分離し、20μlの上清を、ストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレートに移した。抗ヒストンビオチンおよび抗DNAペルオキシダーゼ抗体を、各ウェルに加え、プレートを、室温で2時間、インキュベートした。バッファーで3回洗浄後、ペルオキシダーゼ基質を、各ウェルに加えた。5分のインキュベーション後、プレートを、マイクロプレートリーダーを用いて405 nmで読み取った。ヒストン-DNA断片の集積を、コントロール(非サイレンシング)siRNAと比較した吸光度の倍率増加として表した。プロアポトーシスsiRNAを、スクランブルsiRNAコントロールに対するアポトーシスの2倍増加で同定した。
【０１０４】
実施例3: 細胞溶解およびイムノブロッティング
細胞抽出物を、細胞を収集し、氷冷PBSで洗浄し、溶解バッファー(pH 7.2; 10 mM KPO4、1 mM EDTA、10 mM MgCl2、50 mM β-グリセロホスフェート、5 mM EGTA、0.5% NP-40、0.1% Brij-35、1 mMオルトバナジウム酸ナトリウム、40 μgフッ化フェニルメチルスルホニル/ml、10 μgロイペプチン/ml、5 μgペプスタチンA/ml)中に採取することにより調製した。抽出物を、15,000 r.p.m.で10分間、4℃で遠心分離し、細胞ライゼートを、抗PI3K p170、抗PI3KクラスIIベータ(BD Biosciences, San Jose, CA)、抗切断カスパーゼ9、抗PARP (Cell Signaing, Beverly, MA)およびチューブリン(Sigma, St. Louis, MO)を用いてイムノブロットにかけた。
【０１０５】
実施例4: 定量的リアルタイムPCR(Q-PCR)による全RNA単離アッセイ
全RNAを、トランスフェクションの30時間後にHeLa細胞から抽出し、RNeasy kit (Qiagen)を用いて精製する。リアルタイムPCRのためのプライマー対およびFAM-標識TaqManプローブを、TaqMan Gene Expression Assay (Applied Biosystems, Foster City, CA)から、PI3Kアイソフォームに対して設計する。Q-PCR反応のために、81ngのcDNAを、TaqMan Universal PCR reagent kitプロトコール(Applied Biosystems)に従い、5'および3' プライマー(各0.9 μM)、ならびにTaqManプローブ(0.25 μM)と、全量20 μlで混合した。リアルタイムPCRを、PRISM 7900HT検出システムで、下記のとおり行った:50℃で2分、95℃で10分変性、その後、95℃で15秒の変性および60℃で1分のアニーリングおよび伸張を40サイクル。相対的な発現のために使用した比較Cγ法は、PRISM 7900HT検出システム(Applied Biosystems, Foster City, CA)で曲線を描く。
【０１０６】
本発明は、本明細書に記載した特定の態様による範囲に限定されるべきではない。実際に、本明細書に記載したものに加えて、本発明の様々な修飾が、上記の記載および付随する図から当業者に明らかになるであろう。そのような修飾は、添付した特許請求の範囲の範囲内にあることを意図する。
【０１０７】
様々な出版物を本明細書で引用しており、その開示は、それらの全体を引用により本明細書の一部とする。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】図1は、PI3KクラスIIαに対して作製した異なるsiRNAをトランスフェクションしたHela細胞での、PI3KクラスIIαRNAレベル間の比較を示す(定量的RT-PCRにより測定した)。レーン1は、コントロールを示し、次の4つのレーンは、本明細書で記載したとおり、PI3KクラスIIαに向けられた異なるsiRNAを反映する。
【図２】図2aおよび2bは、PI3KクラスIIαタンパク質に対する抗体を用いたPI3KクラスIIαノックダウンのウエスタンブロット解析を示す。アポトーシスは、PI3KクラスIIαに対するsiRNAの72時間後、カスパーゼ9およびPARPの切断により測定した。
【図３】図3は、PI3KクラスIIαに向けられた異なるsiRNAをトランスフェクションした結果として、Hela細胞で生じているアポトーシスの比較を示す(DNA断片ELISAにより測定した)。
【図４】図4aおよび4bは、それぞれ、Hela細胞およびU20S細胞において位相差顕微鏡により視覚化した、原形質膜気泡形成および細胞性生存性を示す。
【国際調査報告】
2009506062.tif 000003
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