(57)【要約】  本発明は大腸菌等の真正細菌宿主細胞で産生される蛋白質にクマリン非天然アミノ酸Ｌ−（７−ヒドロキシクマリン−４−イル）エチルグリシンを組込むことが可能なｔＲＮＡとアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの直交対に関する。本発明は限定されないが、例えば新規直交シンテターゼ、前記新規シンテターゼの同定及び作製方法、非天然アミノ酸Ｌ−（７−ヒドロキシクマリン−４−イル）エチルグリシンを組込んだ蛋白質の生産方法、並びに関連翻訳系を提供する。【選択図】図２
2009538136.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）Ｌ−（７−ヒドロキシクマリン−４−イル）エチルグリシン非天然アミノ酸である第１の非天然アミノ酸と；
（ｂ）第１の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；
（ｃ）第１の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含み；
前記第１のＯ−ＲＳが前記第１のＯ−ｔＲＮＡを前記第１の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する翻訳系。
【請求項２】
前記第１のＯ−ＲＳがＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される請求項１に記載の翻訳系。
【請求項３】
前記第１のＯ−ＲＳが野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される請求項１に記載の翻訳系。
【請求項４】
前記第１のＯ−ＲＳが配列番号４に記載のアミノ酸配列及びその保存変異体を含む請求項１に記載の翻訳系。
【請求項５】
前記第１のＯ−ｔＲＮＡがアンバーサプレッサーｔＲＮＡである請求項１に記載の翻訳系。
【請求項６】
前記第１のＯ−ｔＲＮＡが配列番号１に記載のポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされる請求項１に記載の翻訳系。
【請求項７】
該当蛋白質をコードする核酸を更に含み、前記核酸が少なくとも１個のセレクターコドンを含み、前記セレクターコドンが前記第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識される請求項１に記載の翻訳系。
【請求項８】
第２のＯ−ＲＳと第２のＯ−ｔＲＮＡを更に含み、第２のＯ−ＲＳが第１の非天然アミノ酸とは異なる第２の非天然アミノ酸で第２のＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化し、第２のＯ−ｔＲＮＡが第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンとは異なるセレクターコドンを認識する請求項７に記載の翻訳系。
【請求項９】
前記系が前記第１の非天然アミノ酸と、前記第１のＯ−ＲＳと、前記第１のＯ−ｔＲＮＡを含む宿主細胞を含む請求項１に記載の翻訳系。
【請求項１０】
前記宿主細胞が真正細菌細胞である請求項９に記載の翻訳系。
【請求項１１】
前記真正細菌細胞が大腸菌細胞である請求項１０に記載の翻訳系。
【請求項１２】
前記宿主細胞が前記第１のＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む請求項９に記載の翻訳系。
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチドが配列番号５に記載のヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載の翻訳系。
【請求項１４】
前記宿主細胞が前記第１のＯ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む請求項９に記載の翻訳系。
【請求項１５】
選択位置に非天然アミノ酸を含む蛋白質を翻訳系で生産する方法であって、
（ａ）（ｉ）Ｌ−（７−ヒドロキシクマリン−４−イル）エチルグリシン非天然アミノ酸である第１の非天然アミノ酸と；
（ｉｉ）第１の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；
（ｉｉｉ）第１の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）（但し、前記第１のＯ−ＲＳは前記第１のＯ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する）と；
（ｉｖ）前記蛋白質をコードし、前記第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含む核酸を含む翻訳系を提供する段階と；
（ｂ）前記セレクターコドンに応答して前記蛋白質の翻訳中に前記蛋白質の前記選択位置に前記非天然アミノ酸を組込むことにより、前記選択位置に前記非天然アミノ酸を含む前記蛋白質を生産する段階を含む前記方法。
【請求項１６】
翻訳系を提供する前記段階が前記Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを提供する段階を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
翻訳系を提供する前記段階がＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるＯ−ＲＳを提供する段階を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
翻訳系を提供する前記段階が野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるＯ−ＲＳを提供する段階を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
翻訳系を提供する前記段階が配列番号４に記載のアミノ酸配列及びその保存変異体を含むＯ−ＲＳを提供する段階を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
翻訳系を提供する前記段階が部位特異的突然変異誘発により野生型アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼのアミノ酸結合ポケットを突然変異させる段階と、その結果として前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化するＯ−ＲＳを選択する段階を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記選択段階が部位特異的突然変異誘発後に得られた複数のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ分子を含むプールから前記Ｏ−ＲＳをポジティブ選択及びネガティブ選択する段階を含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
翻訳系を提供する前記段階が前記Ｏ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを提供する段階を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
翻訳系を提供する前記段階がアンバーサプレッサーｔＲＮＡであるＯ−ｔＲＮＡを提供する段階を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
翻訳系を提供する前記段階が配列番号１に記載のポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるＯ−ｔＲＮＡを提供する段階を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
翻訳系を提供する前記段階がアンバーセレクターコドンを含む核酸を提供する段階を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
更に前記蛋白質が前記第１の非天然アミノ酸とは異なる第２の非天然アミノ酸を含み、前記翻訳系が更に第２のＯ−ＲＳと第２のＯ−ｔＲＮＡを含み、第２のＯ−ＲＳが第１の非天然アミノ酸とは異なる第２の非天然アミノ酸で第２のＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化し、第２のＯ−ｔＲＮＡが第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンとは異なる核酸中のセレクターコドンを認識する請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
翻訳系を提供する前記段階が宿主細胞を提供する段階を含み、前記宿主細胞が前記第１の非天然アミノ酸と、前記第１のＯ−ＲＳと、前記第１のＯ−ｔＲＮＡと、前記核酸を含み、前記組込み段階が前記宿主細胞を培養する段階を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
宿主細胞を提供する前記段階が真正細菌宿主細胞を提供する段階を含む請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
真正細菌宿主細胞を提供する前記段階が大腸菌宿主細胞を提供する段階を含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
宿主細胞を提供する前記段階が前記Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する段階を含む請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する前記段階が配列番号５に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する段階を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
翻訳系を提供する前記段階が細胞抽出液を提供する段階を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項３３】
配列番号４に記載のアミノ酸配列又はその保存変異体を含むポリペプチドを含有する組成物であって、前記保存変異体ポリペプチドが前記Ｏ−ｔＲＮＡと前記非天然アミノ酸と配列番号４のアミノ酸配列を含むアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む翻訳系で観察される効率の少なくとも５０％の効率でコグネイト直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を非天然アミノ酸でアミノアシル化する前記組成物。
【請求項３４】
請求項３３に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３５】
前記ポリヌクレオチドが配列番号５のヌクレオチド配列を含む請求項３４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３６】
前記組成物がポリペプチドを含む細胞である請求項３３に記載の組成物。
【請求項３７】
配列番号５に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含有する組成物。
【請求項３８】
請求項３７に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３９】
請求項３７に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項４０】
請求項３７に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを含む細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願とのクロスリファレンス）
本願は米国仮出願第６０／８０８，０９９号（出願日２００６年５月２３日）及び米国仮出願第６０／８１３，８５６号（出願日２００６年６月１４日）の優先権と特典を主張し、いずれもその開示内容全体を全目的で本明細書に援用する。
【０００２】
（連邦政府支援研究開発から創出された発明の権利に関する陳述）
本発明はエネルギー省助成番号ＥＲ４６０５１として米国政府助成下に創出された。米国政府は本発明に所定の権利をもつことができる。
【０００３】
（発明の技術分野）
本発明は翻訳生化学の分野に関する。本発明は非天然アミノ酸を蛋白質に組込む直交ｔＲＮＡ、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及びその対を作製及び使用するための組成物と方法に関する。本発明は更に前記対を使用して細胞で蛋白質を生産する方法と前記方法により生産された蛋白質にも関する。
【背景技術】
【０００４】
蛍光は感受性と操作の安全性が高いため、バイオテクノロジーにおける最も重要な検出シグナルの１つとなっている。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）や蛍光偏光法等の方法により、生体分子結合イベント、移動又は構造変化のリアルタイム分析が可能になる。蛋白質を蛍光プローブで選択的に修飾できるため、蛋白質構造及び機能のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ両者の研究が著しく容易になった（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（１９９６）ｉｎ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ；及びＴｓｉｅｎ（１９９８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７：５０
９−５４４）。
【０００５】
蛋白質をｉｎ  ｖｉｖｏ研究するための現在の蛍光法の多くは緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）等の高分子量蛍光蛋白質との融合構築物に依存している。このプローブは蛋白質発現、局在及び生体分子相互作用の研究に有用であることが分かっているが、サイズが大きいため、有意構造変化を生じる可能性がある。ＧＦＰ融合体は更に標的蛋白質のＣ又はＮ末端に限定され、その環境に比較的非感受性である（Ｔｓｉｅｎ（１９９８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７：５０９−４４）。ＧＦＰは更に適切なシグナルを得るために多数の転写産物を必要とし、そのフォールディングとフルオロフォア熟成に遅延時間を要する。
【０００６】
構造変化を最小限にする各種低分子量合成フルオロフォアで蛋白質を選択的に修飾するために化学的方法も使用することもできる（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，ｉｎ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９６）；Ｍａｒｔｉｎら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２３：１３０８−１３１４（２００５）；Ｋｅｐｐｌｅｒら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２１：８６−８９（２００３）；Ｌｉｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１２８：４５４２−３（２００６））。しかし、これらの技術は単離後の蛋白質上の接近可能な固有反応性表面残基に一般に制限され（例えばマレイミド誘導体によるシステインの修飾；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９６）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ参照）、位置選択性が低く、細胞傷害性であり、あるいは色素結合蛋白質モチーフの導入を必要とする。
【０００７】
化学的にミスアシル化したｔＲＮＡを使用する生合成的標識法（Ｍｅｎｄｅｌら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．（１９９５）２４：４３５−４６２；Ｈｏｈｓａｋａら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．（２００４）５６０：１７３−１７７）も実験的に実証されているが、蛋白質収率が低く、一般にｉｎ  ｖｉｔｒｏでしか実施されない。
【０００８】
遺伝的にコードされた蛍光アミノ酸を生体内の蛋白質の規定位置に直接組込むことができるならば、蛋白質の蛍光標識の問題の多くを解決することができよう（Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．（２００５）４４：３４−６６；Ｗａｎｇら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．，（２００６）３５：２２５−２４９）。蛍光アミノ酸の部位特異的組込みは宿主蛋白質の変化を最小限にしながら、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の測定を著しく高精度にできると思われる（Ｔｒｕｏｎｇ  ａｎｄ  Ｉｋｕｒａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏ．２００１，１１：５７３−５７８）。更に、蛍光アミノ酸を使用すると、各アミノ酸位置の局所環境の探索が可能になり、蛋白質中の蛍光アミノ酸の位置を変えることにより他の細胞成分との相互作用を媒介する残基をピンポイントできよう。蛋白質１分子は通常では２個以上のトリプトファン残基を含み、蛍光プローブによる蛋白質の特異的化学標識は困難であるため、これは特に単分子システム（Ｌｉｐｍａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００３）３０１：１２３３−１２３５）で蛋白質フォールディングを研究するためにも非常に有用であると思われる（Ｌａｋｏｗｉｃｚ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  Ｅｄ．２；Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９）。
【０００９】
蛋白質構造及び機能を研究する目的で蛍光非天然アミノ酸を蛋白質に組込むための新規ストラテジーが当分野で必要とされている。各種非天然アミノ酸を原核生物と真核生物の両者で蛋白質にｉｎ  ｖｉｖｏ部位特異的に組込む一般方法が開発されている。これらの方法はｉｎ  ｖｉｖｏポリペプチド翻訳中に所望非天然アミノ酸を規定位置に挿入するために適切なセレクターコドンを認識する直交蛋白質翻訳成分に依存している。これらの方法はセレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を利用しており、対応する特定直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）はＯ−ｔＲＮＡに非天然アミノ酸を負荷する。これらの成分は宿主生体中の内在ｔＲＮＡ、ＲＳ、アミノ酸又はコドンのいずれとも交差反応しない（即ち直交でなければならない）。このような直交ｔＲＮＡ−ＲＳ対を使用することにより、多数の構造的に多様な非天然アミノ酸を遺伝的にコードさせることが可能になった。
【００１０】
１個以上の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質の作製に適した直交翻訳系の使用方法と直交翻訳系の一般作製方法は当分野で一般に公知である。例えば国際公開ＷＯ２００２／０８６０７５、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ｔＲＮＡ−ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−ｔＲＮＡ  ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ  ＰＡＩＲＳ）」；ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」；ＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」；ＷＯ２００５／０１９４１５（出願日２００４年７月７日）；ＷＯ２００５／００７８７０（出願日２００４年７月７日）；ＷＯ２００５／００７６２４（出願日２００４年７月７日）；及びＷＯ２００６／１１０１８２（出願日２００５年１０月２７日、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み用直交翻訳成分（ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ  ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」）参照。これらの出願は各々その開示内容全体を本明細書に援用する。非天然アミノ酸を組込む直交翻訳系と、その作製及び使用方法の他の記載については、各々その開示内容を本明細書に援用するＷａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，”Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（Ｃａｍｂ．）１：１−１１（２００２）；Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，”Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４４（１）：３４−６６（２００５）；Ｘｉｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，“Ａｎ  Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６（３）：２２７−２３８（２００５）；Ｘｉｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，“Ａｄｄｉｎｇ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ，”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９（６）：５４８−５５４（２００５）；Ｗａｎｇら，“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，”Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．，３５：２２５−２４９（２００６）；及びＸｉｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，“Ａ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔｏｏｌｋｉｔ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ，”Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，７（１０）：７７５−７８２（２００６）も参照。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
蛍光非天然アミノ酸を規定位置に組込むことができるように、蛍光非天然アミノ酸を蛋白質に組込む直交翻訳成分の開発が当分野で必要とされている。本発明は以下の開示から明らかなように、上記及び他の必要を満たすものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明はセレクターコドン（例えばアンバー終止コドン）に応答して成長中のポリペプチド鎖にクマリン非天然アミノ酸Ｌ−（７−ヒドロキシクマリン−４−イル）エチルグリシンをｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば宿主細胞中）で組込むための組成物と方法を提供する。これらの組成物は宿主細胞翻訳機構と相互作用しない直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）の対を含む。即ち、Ｏ−ｔＲＮＡは内在宿主細胞アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼにより（天然又は非天然）アミノ酸を負荷されない（又は有意レベルまで負荷されない）。同様に、本発明により提供されるＯ−ＲＳは内在ｔＲＮＡに（天然又は非天然）アミノ酸を有意又は検出可能なレベルまで負荷しない。これらの新規組成物は翻訳によりＬ−（７−ヒドロキシクマリン−４−イル）エチルグリシンを組込んだ大量の蛋白質の生産を可能にする。これらの蛍光標識蛋白質は多様な用途に利用される。
【００１３】
所定側面では、本発明は翻訳系を提供する。これらの系は第１の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、第１の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、Ｌ−（７−ヒドロキシクマリン−４−イル）エチルグリシンである第１の非天然アミノ酸を含み、第１のＯ−ＲＳは第１のＯ−ｔＲＮＡを第１の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。
【００１４】
翻訳系は各種起源に由来する成分を使用することができる。１態様では、第１のＯ−ＲＳはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（例えば野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ）から誘導される。系で使用されるＯ−ＲＳは配列番号４のアミノ酸配列及び前記配列の保存変異体を含むことができる。所定態様では、Ｏ−ｔＲＮＡはアンバーサプレッサーｔＲＮＡである。所定態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは配列番号１を含むか又は前記配列によりコードされる。
【００１５】
所定側面では、翻訳系は更に該当蛋白質をコードする核酸を含み、前記核酸はＯ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンをもつ。
【００１６】
所定側面では、翻訳系は第２の非天然アミノ酸を利用する第２の直交対（即ち、第２のＯ−ＲＳと第２のＯ−ｔＲＮＡ）を含み、従って、系はポリペプチドの異なる選択部位に少なくとも２種類の異なる非天然アミノ酸を組込むことが可能になる。このデュアル系では、第２のＯ−ＲＳは第１の非天然アミノ酸とは異なる第２の非天然アミノ酸で第２のＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化し、第２のＯ−ｔＲＮＡは第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンとは異なるセレクターコドンを認識する。
【００１７】
所定態様では、翻訳系は宿主細胞中に存在する（宿主細胞を含む）。Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡがその宿主細胞環境でその直交性を維持する限り、使用される宿主細胞は特に限定されない。宿主細胞は大腸菌等の真正細菌細胞とすることができる。宿主細胞はＯ−ＲＳ又はＯ−ｔＲＮＡを含む翻訳系の成分をコードする１種以上のポリヌクレオチドを含むことができる。所定態様では、Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドは配列番号５のヌクレオチド配列を含む。
【００１８】
本発明は選択位置に１種以上の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質の生産方法も提供する。これらの方法は上記翻訳系を利用する。一般に、これらの方法は（ｉ）クマリンアミノ酸Ｌ−（７−ヒドロキシクマリン−４−イル）エチルグリシンである第１の非天然アミノ酸と；（ｉｉ）第１の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；（ｉｉｉ）第１の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）（但し、前記Ｏ−ＲＳは前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する）と；（ｉｖ）前記蛋白質をコードし、第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含む核酸を含む翻訳系を提供する段階から開始する。前記方法は次に、セレクターコドンに応答して蛋白質の翻訳中に蛋白質の選択位置に非天然アミノ酸を組込むことにより、選択位置に非天然アミノ酸を含む蛋白質を生産する。
【００１９】
この方法は各種試薬及び段階を使用して広く応用することができる。所定態様では、Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを提供する。所定態様では、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるＯ−ＲＳを提供し、例えば、野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼを提供することができる。所定態様では、前記提供段階は配列番号４のアミノ酸配列及びその保存変異体を含むＯ−ＲＳを提供する段階を含む。
【００２０】
これらの方法の所定態様では、翻訳系を提供する段階は部位特異的突然変異誘発により野生型アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼのアミノ酸結合ポケットを突然変異させる段階と、その結果としてＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化するＯ−ＲＳを選択する段階を含む。前記選択段階は部位特異的突然変異誘発後に得られたアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ分子のプールからＯ−ＲＳをポジティブ選択及びネガティブ選択する段階を含むことができる。所定態様では、前記提供段階はＯ−ｔＲＮＡ（例えばアンバーサプレッサーｔＲＮＡであるＯ−ｔＲＮＡや、配列番号１のポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるＯ−ｔＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドを提供する。これらの方法では、前記提供段階は更に翻訳系により利用されるアンバーセレクターコドンを含む核酸を提供することができる。
【００２１】
これらの方法は２種類以上の非天然アミノ酸を蛋白質に組込むように改変することもできる。これらの方法では、第２の直交翻訳系を第１の翻訳系と併用し、第２の系は異なるアミノ酸及びセレクターコドン特異性をもつ。例えば、提供段階は第２のＯ−ＲＳと第２のＯ−ｔＲＮＡを提供する段階を含むことができ、第２のＯ−ＲＳは第１の非天然アミノ酸とは異なる第２の非天然アミノ酸で第２のＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化し、第２のＯ−ｔＲＮＡは第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンとは異なる核酸中のセレクターコドンを認識する。
【００２２】
非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質の生産方法は宿主細胞中で実施することもできる。これらの場合には、非天然アミノ酸と、Ｏ−ＲＳと、Ｏ−ｔＲＮＡと、核酸を導入した宿主細胞を提供し、宿主細胞を培養することにより非天然アミノ酸を組込む。所定態様では、前記提供段階は真正細菌宿主細胞（例えば大腸菌）を提供する段階を含む。所定態様では、前記提供段階はＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する段階を含む。例えば、Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドは配列番号５のヌクレオチド配列を含むことができる。所定態様では、翻訳系を提供する段階は細胞抽出液を提供することにより実施される。
【００２３】
本発明は更に核酸と蛋白質を含む各種組成物を提供する。組成物が特定核酸又は蛋白質を含む限り、組成物の種類は特に限定されない。本発明の組成物は任意種類の任意数の付加成分を含むことができる。
【００２４】
例えば、本発明はＯ−ＲＳポリペプチドを含有する組成物を提供し、ポリペプチドは配列番号４のアミノ酸配列又はその保存変異体を含み、保存変異体ポリペプチドはＯ−ｔＲＮＡと非天然アミノ酸と配列番号４のアミノ酸配列を含むアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む翻訳系で観察される効率の少なくとも５０％の効率でコグネイト直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を非天然アミノ酸でアミノアシル化する。本発明はこれらの上記ポリペプチドの任意のものをコードするポリヌクレオチドも提供する。所定態様では、これらのポリヌクレオチドは配列番号５のヌクレオチド配列を含むことができる。所定態様では、ポリペプチドは細胞中に存在する。
【００２５】
本発明は配列番号５のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド組成物も提供する。所定態様では、本発明は前記ポリヌクレオチドを含むベクター（例えば発現ベクター）を提供する。所定態様では、本発明は上記ベクターを含む細胞を提供する。
【００２６】
（定義）
本発明を詳細に記載する前に、本発明は特定生物系に限定されず、当然のことながら種々のものに適用できると理解すべきである。同様に、本明細書で使用する用語は特定態様のみの記載を目的とし、限定的でないことも理解すべきである。本明細書と特許請求の範囲で使用する単数形はそうでないことが内容から明白である場合を除き、複数形も含む。従って、例えば「細胞」と言う場合には２個以上の細胞の組合せを含み、「ポリヌクレオチド」と言う場合には実際問題としてそのポリヌクレオチドの多数のコピーを含む。
【００２７】
本欄及び以下に特に定義しない限り、本明細書で使用する全科学技術用語は本発明が属する分野の当業者に通常理解されている通りの意味をもつ。
【００２８】
直交：本明細書で使用する「直交」なる用語は細胞又は翻訳系に内在する対応分子に比較して低効率で細胞の内在成分と共働するか、あるいは細胞の内在成分と共働できない分子（例えば直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）及び／又は直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ））を意味する。ｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼに関して直交とは、内在ｔＲＮＡが内在ｔＲＮＡシンテターゼと共働する能力に比較して直交ｔＲＮＡが内在ｔＲＮＡシンテターゼと共働できないか又は低効率（例えば２０％未満、１０％未満、５％未満、又は１％未満の効率）でしか共働できず、あるいは、内在ｔＲＮＡシンテターゼが内在ｔＲＮＡと共働する能力に比較して直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが内在ｔＲＮＡと共働できないか又は低効率でしか共働できないことを意味する。直交分子は細胞内に機能的に正常な相補的内在分子をもたない。例えば、細胞中の直交ｔＲＮＡがこの細胞の任意内在ＲＳによりアミノアシル化される効率は内在ｔＲＮＡが内在ＲＳによりアミノアシル化される効率に比較して低いか又はゼロである。別の例では、直交ＲＳが該当細胞の任意内在ｔＲＮＡをアミノアシル化する効率は内在ｔＲＮＡが内在ＲＳによりアミノアシル化される効率に比較して低いか又はゼロである。第１の直交分子と共働する第２の直交分子を細胞に導入することができる。例えば、直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対は対照（例えば対応するｔＲＮＡ／ＲＳ内在対、又は活性直交対（例えばチロシル直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対））の効率に比較して所定の効率（例えば４５％の効率、５０％の効率、６０％の効率、７０％の効率、７５％の効率、８０％の効率、９０％の効率、９５％の効率、又は９９％以上の効率）で細胞において共働する導入相補成分を含む。
【００２９】
直交チロシルｔＲＮＡ：本明細書で使用する直交チロシルｔＲＮＡ（チロシルＯ−ｔＲＮＡ）とは該当翻訳系に直交性のｔＲＮＡであり、ｔＲＮＡは（１）天然に存在するチロシルｔＲＮＡと同一であるか又は実質的に類似しているか、（２）自然又は人工突然変異誘発により天然に存在するチロシルｔＲＮＡから誘導されるか、（３）（１）又は（２）の野生型又は突然変異体チロシルｔＲＮＡ配列の配列を利用する任意プロセスにより誘導されるか、（４）野生型又は突然変異体チロシルｔＲＮＡと相同であるか、（５）図９にチロシルｔＲＮＡシンテターゼの基質として指定する任意特定ｔＲＮＡと相同であるか、あるいは（６）図９にチロシルｔＲＮＡシンテターゼの基質として指定する任意特定ｔＲＮＡの保存変異体である。チロシルｔＲＮＡはアミノ酸を負荷した状態でも負荷しない状態でも存在することができる。更に当然のことながら、「チロシルＯ−ｔＲＮＡ」は場合によりコグネイトシンテターゼにより夫々チロシン以外のアミノ酸（例えば非天然アミノ酸）を負荷（アミノアシル化）される。実際に、当然のことながら、本発明のチロシルＯ−ｔＲＮＡは翻訳中にセレクターコドンに応答して成長中のポリペプチドに天然又は人工のいずれかに拘わらずほぼ任意アミノ酸を挿入するために有利に使用される。
【００３０】
直交チロシルアミノ酸シンテターゼ：本明細書で使用する直交チロシルアミノ酸シンテターゼ（チロシルＯ−ＲＳ）とは該当翻訳系においてチロシルＯ−ｔＲＮＡをアミノ酸で優先的にアミノアシル化する酵素である。チロシルＯ−ＲＳがチロシルＯ−ｔＲＮＡに負荷するアミノ酸は天然、非天然又は人工のいずれかを問わずに任意アミノ酸とすることができ、本明細書では限定しない。シンテターゼは場合により天然に存在するチロシルアミノ酸シンテターゼと同一又は相同であるか、あるいは図９にＯ−ＲＳとして指定するシンテターゼと同一又は相同である。例えば、Ｏ−ＲＳは図９のチロシルＯ−ＲＳの保存変異体とすることができ、及び／又は図９のＯ−ＲＳと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％又はそれ以上配列が一致することができる。
【００３１】
コグネイト：「コグネイト」なる用語は共働する成分又は所定の相互特異性側面をもつ成分、例えば直交ｔＲＮＡと直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを意味する。これらの成分は相補的であると言うこともできる。
【００３２】
優先的にアミノアシル化する：本明細書で直交翻訳系に関して使用する場合に、Ｏ−ＲＳはＯ−ＲＳが発現系で任意内在ｔＲＮＡに負荷するよりも効率的にＯ−ｔＲＮＡにアミノ酸を負荷するときにコグネイトＯ−ｔＲＮＡを「優先的にアミノアシル化する」。即ち、Ｏ−ｔＲＮＡと所与の任意内在ｔＲＮＡがほぼ等モル比で翻訳系に存在するとき、Ｏ−ＲＳは内在ｔＲＮＡに負荷するよりも高頻度でＯ−ｔＲＮＡに負荷する。Ｏ−ＲＳにより負荷されるＯ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳにより負荷される内在ｔＲＮＡの相対比は高いことが好ましく、従って、Ｏ−ｔＲＮＡと内在ｔＲＮＡが等モル濃度で翻訳系に存在する場合にはＯ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡに排他的、又はほぼ排他的に負荷することが好ましい。Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳが等モル濃度で存在する場合にＯ−ＲＳにより負荷されるＯ−ｔＲＮＡと内在ｔＲＮＡの相対比は１：１を上回り、好ましくは少なくとも約２：１、より好ましくは５：１、更に好ましくは１０：１、更に好ましくは２０：１、更に好ましくは５０：１、更に好ましくは７５：１、更に好ましくは９５：１、９８：１、９９：１、１００：１、５００：１、１，０００：１、５，０００：１又はそれ以上である。
【００３３】
（ａ）Ｏ−ＲＳが内在ｔＲＮＡに比較してＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化するとき、及び（ｂ）Ｏ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡを任意天然アミノ酸でアミノアシル化する場合に比較してそのアミノアシル化が非天然アミノ酸に特異的であるときにＯ−ＲＳは「Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する」。即ち、非天然アミノ酸と天然アミノ酸がＯ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡを含む翻訳系に等モル量で存在するとき、Ｏ−ＲＳは天然アミノ酸よりも高頻度で非天然アミノ酸をＯ−ｔＲＮＡに負荷する。非天然アミノ酸を負荷されたＯ−ｔＲＮＡと天然アミノ酸を負荷されたＯ−ｔＲＮＡの相対比は高いことが好ましい。Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡに排他的、又はほぼ排他的に非天然アミノ酸を負荷することがより好ましい。天然アミノ酸と非天然アミノ酸の両者が等モル濃度で翻訳系に存在するとき、Ｏ−ｔＲＮＡの非天然アミノ酸負荷とＯ−ｔＲＮＡの天然アミノ酸負荷の相対比は１：１を上回り、好ましくは少なくとも約２：１、より好ましくは５：１、更に好ましくは１０：１、更に好ましくは２０：１、更に好ましくは５０：１、更に好ましくは７５：１、更に好ましくは９５：１、９８：１、９９：１、１００：１、５００：１、１，０００：１、５，０００：１又はそれ以上である。
【００３４】
セレクターコドン：「セレクターコドン」なる用語は翻訳プロセスでＯ−ｔＲＮＡにより認識され、内在ｔＲＮＡにより認識されないコドンを意味する。Ｏ−ｔＲＮＡアンチコドンループはｍＲＮＡ上のセレクターコドンを認識し、そのアミノ酸（例えば非天然アミノ酸）をポリペプチドのこの部位に組込む。セレクターコドンとしては例えば終止コドン（例えばアンバー、オーカー及びオパールコドン）等のナンセンスコドン、４塩基以上のコドン、レアコドン、天然又は非天然塩基対から誘導されるコドン及び／又は同等物を挙げることができる。
【００３５】
サプレッサーｔＲＮＡ：サプレッサーｔＲＮＡは一般にポリペプチドの翻訳中に終止コドンに応答してアミノ酸の組込み（即ち「読み飛ばし」）を可能にすることにより、所与翻訳系でメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の読取りを変更するｔＲＮＡである。所定側面では、本発明のセレクターコドンはサプレッサーコドンであり、例えば終止コドン（例えばアンバー、オーカー又はオパールコドン）、４塩基コドン、レアコドン等である。
【００３６】
抑圧活性：本明細書で使用する「抑圧活性」なる用語は一般に、読み飛ばさないと翻訳終結又は誤訳（例えばフレームシフト）をもたらすコドン（例えばアンバーコドンや４塩基以上のコドンであるセレクターコドン）の翻訳読み飛ばしを行うｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ）の能力を意味する。サプレッサーｔＲＮＡの抑圧活性は第２のサプレッサーｔＲＮＡ又は対照系（例えばＯ−ＲＳをもたない対照系）に比較して観測される翻訳読み飛ばし活性の百分率として表すことができる。
【００３７】
本発明は抑圧活性を定量することが可能な種々の方法を提供する。該当セレクターコドン（例えばアンバーコドン）に対する特定Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳの抑圧百分率とは、Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ及びセレクターコドンをもたない陽性対照構築物に比較して、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡを含む該当翻訳系で発現され、そのコーディング核酸中にセレクターコドンを含む所与試験マーカー（例えばＬａｃＺ）の活性百分率を意味する。従って、例えば、セレクターコドンをもたない活性陽性対照マーカー構築物が所与翻訳系において該当マーカーアッセイに関連する単位で表した観測活性Ｘをもつ場合には、セレクターコドンを含む試験構築物の抑圧百分率は、Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳを更に含む翻訳系で発現される以外は陽性対照マーカーが発現される環境条件とほぼ同一の環境条件下で試験マーカー構築物が示すＸの百分率である。一般に、試験マーカーを発現する翻訳系は更にＯ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡにより認識されるアミノ酸を含む。場合により、抑圧百分率測定値は、Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ及び／又はＯ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳにより認識される該当アミノ酸を含まない系で試験マーカーと同一のセレクターコドンを含む「バックグラウンド」又は「陰性」対照マーカー構築物に試験マーカーを比較することにより精密化することができる。この陰性対照は該当翻訳系におけるマーカーからのバックグラウンドシグナル効果を考慮するように抑圧百分率測定値を正規化するのに有用である。
【００３８】
抑圧効率は当分野で公知の多数のアッセイの任意のものにより測定することができる。例えば、β−ガラクトシダーゼレポーターアッセイを使用することができ、例えば本発明のＯ−ｔＲＮＡを含むプラスミドと共に修飾ｌａｃＺプラスミド（構築物はｌａｃＺ核酸配列中にセレクターコドンをもつ）を適当な生物（例えば直交成分を使用することができる生物）に由来する細胞に導入する。コグネイトシンテターゼも（ポリペプチド又は発現時にコグネイトシンテターゼをコードするポリヌクレオチドとして）導入することができる。細胞を培地で所望密度（例えばＯＤ６００＝約０．５）まで増殖させ、例えばＢｅｔａＦｌｕｏｒ（登録商標）β−ガラクトシダーゼアッセイキット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用してβ−ガラクトシダーゼアッセイを実施する。比較可能な対照（例えば所望位置にセレクターコドンではなく対応するセンスコドンをもつ修飾ｌａｃＺ構築物から観測される値）に対するサンプルの活性百分率として抑圧百分率を計算することができる。
【００３９】
翻訳系：「翻訳系」なる用語は成長中のポリペプチド鎖（蛋白質）にアミノ酸を組込む成分を意味する。翻訳系の成分としては例えばリボソーム、ｔＲＮＡ、シンテターゼ、ｍＲＮＡ等を挙げることができる。本発明のＯ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳは、例えば非真核細胞（例えば細菌（例えば大腸菌））、又は真核細胞（例えば酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、昆虫細胞、及び／又は同等物）でｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳系に付加するか又はその一部とすることができる。
【００４０】
非天然アミノ酸：本明細書で使用する「非天然アミノ酸」なる用語は２０種類の標準天然アミノ酸の１種又はセレノシステインもしくはピロリジン以外の任意アミノ酸、修飾アミノ酸、及び／又はアミノ酸類似体を意味する。例えば、本発明では非天然アミノ酸Ｌ−（７−ヒドロキシクマリン−４−イル）エチルグリシン（別称Ｌ−７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシン；図１、構造１参照）を利用する。
【００４１】
から誘導：本明細書で使用する「から誘導」なる用語は特定分子もしくは生物から単離された成分、あるいは特定分子もしくは生物又は特定分子もしくは生物からの情報を使用して作製された成分を意味する。例えば、第２のポリペプチドから誘導されるポリペプチドは第２のポリペプチドのアミノ酸配列と同一又は実質的に同様のアミノ酸配列を含むことができる。ポリペプチドの場合には、誘導種は例えば自然突然変異誘発、人工的特異的突然変異誘発又は人工的ランダム突然変異誘発により得ることができる。ポリペプチドを誘導するために使用される突然変異誘発は意図的に特異的でも意図的にランダムでもよいし、各々の混合でもよい。第１のポリペプチドから誘導される別のポリペプチドを作製するためのポリペプチドの突然変異誘発は（例えばポリメラーゼの非忠実性に起因する）ランダムなイベントとすることができ、誘導されたポリペプチドの同定は例えば本明細書に記載するような適当なスクリーニング法により実施することができる。ポリペプチドの突然変異誘発は一般にポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの操作を伴う。
【００４２】
ポジティブ選択又はスクリーニングマーカー：本明細書で使用する「ポジティブ選択又はスクリーニングマーカー」なる用語は、このマーカーが存在する（例えば発現、活性化等される）場合に、該当形質をもたない細胞からこの形質を含む細胞（例えばポジティブ選択マーカーをもつ細胞）を識別するマーカーを意味する。
【００４３】
ネガティブ選択又はスクリーニングマーカー：本明細書で使用する「ネガティブ選択又はスクリーニングマーカー」なる用語は、このマーカーが存在する（例えば発現、活性化等される）場合に、（例えば選択性質又は形質をもつ細胞に対して）選択性質又は形質をもたない細胞を識別することができるマーカーを意味する。
【００４４】
レポーター：本明細書で使用する「レポーター」なる用語は該当系の標的成分を同定及び／又は選択するために使用することができる成分を意味する。例えば、レポーターとしては蛋白質、例えば抗生物質耐性又は感受性を付与する酵素（例えばβ−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）等）、蛍光スクリーニングマーカー（例えば緑色蛍光蛋白質（例えばＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＥＧＦＰ、ＲＦＰ等）、発光マーカー（例えばホタルルシフェラーゼ蛋白質）、アフィニティースクリーニングマーカー、又はポジティブもしくはネガティブ選択マーカー遺伝子（例えばｌａｃＺ、β−ｇａｌ／ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）、ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）、ｈｉｓ３、ｕｒａ３、ｌｅｕ２、ｌｙｓ２等）を挙げることができる。
【００４５】
真核生物：本明細書で使用する「真核生物」なる用語は真核生物界に属する生物を意味する。真核生物はその構成が一般に多細胞であり（但し、例えば酵母のように多細胞でないものもある）、膜結合核と他の膜結合オルガネラが存在し、遺伝物質が線状であり（即ち染色体が線状）、オペロンが存在せず、イントロン、メッセージキャッピング及びポリＡ  ｍＲＮＡが存在し、更に他の生化学的特徴（例えば特徴的リボソーム構造）により一般に原核生物から区別できる。真核生物としては例えば動物（例えば哺乳動物、昆虫、爬虫類、鳥類等）、繊毛虫、植物（例えば単子葉植物、双子葉植物、藻類等）、真菌類、酵母、鞭毛虫、微胞子虫、原生生物等が挙げられる。
【００４６】
原核生物：本明細書で使用する「原核生物」なる用語はモネラ界（別称原核生物界）に属する生物を意味する。原核生物はその構成が単細胞であり、出芽又は分裂による無性生殖であり、膜結合核又は他の膜結合オルガネラをもたず、染色体が環状であり、オペロンが存在し、イントロン、メッセージキャッピング及びポリＡ  ｍＲＮＡが存在せず、更に他の生化学的特徴（例えば特徴的リボソーム構造）により一般に真核生物から区別できる。原核生物は真正細菌及び古細菌亜界を含む。シアノバクテリア（藍藻類）とマイコプラズマをモネラ界の別々の分類にする場合もある。
【００４７】
細菌：本明細書で使用する「細菌」及び「真正細菌」なる用語は「古細菌」から区別できる原核生物を意味する。同様に、古細菌は真正細菌から区別できる原核生物を意味する。真正細菌と古細菌は多数の形態学的及び生化学的基準により区別することができる。例えば、リボソームＲＮＡ配列の相違、ＲＮＡポリメラーゼ構造、イントロンの有無、抗生物質感受性、細胞壁ペプチドグリカン及び他の細胞壁成分の有無、膜脂質構造の分岐の有無、並びにヒストン及びヒストン様蛋白質の有無を使用して生物を真正細菌又は古細菌に分類する。
【００４８】
真正細菌の例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓが挙げられる。古細菌の例としては、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（Ｍｊ）、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ（Ｍｍ）、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（Ｍｔ）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ（Ａｆ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ（Ｐｈ）、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ（Ｓｓ）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ（Ａｐ）、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ及びＴｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍが挙げられる。
【００４９】
保存変異体：翻訳成分に関して本明細書で使用する「保存変異体」なる用語は類似する基本成分（例えばＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳ）と同様に機能するが、参照Ｏ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳに比較して配列に変異をもつ翻訳成分（例えば保存変異体Ｏ−ｔＲＮＡ又は保存変異体Ｏ−ＲＳ）を意味する。例えば、Ｏ−ＲＳ、又はこのＯ−ＲＳの保存変異体はコグネイトＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸（例えばＬ−（７−ヒドロキシクマリン−４−イル）エチルグリシン非天然アミノ酸）でアミノアシル化する。この例では、Ｏ−ＲＳと保存変異体Ｏ−ＲＳは同一アミノ酸配列をもたない。保存変異体はこの保存変異体が対応するコグネイトＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳに相補的である（例えば協働する）限り、例えば配列の１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、又は５カ所以上に変異をもつことができる。
【００５０】
所定態様では、保存変異体Ｏ−ＲＳは親Ｏ−ＲＳに比較して１カ所以上の保存アミノ酸置換を含む。所定態様では、保存変異体Ｏ−ＲＳは親Ｏ−ＲＳに比較して１カ所以上の保存アミノ酸置換を含むと共に、更にＯ−ＲＳ生理活性を維持し、例えば保存変異体Ｏ−ＲＳは親Ｏ−ＲＳ分子の生理活性の少なくとも１０％を維持し、あるいは、少なくとも２０％、少なくとも３０％、又は少なくとも４０％を維持する。所定の好ましい態様では、保存変異体Ｏ−ＲＳは親Ｏ−ＲＳ分子の生理活性の少なくとも５０％を維持する。保存変異体Ｏ−ＲＳの保存アミノ酸置換はアミノ酸結合ポケットを含むＯ−ＲＳの任意ドメインに位置することができる。
【００５１】
選択又はスクリーニング物質：本明細書で使用する「選択又はスクリーニング物質」なる用語はこのような物質が存在すると、集団から所定成分を選択／スクリーニングすることができる物質を意味する。例えば、選択又はスクリーニング物質としては限定されないが、例えば栄養素、抗生物質、光波長、抗体、発現されたポリヌクレオチド等が挙げられる。選択物質は例えば濃度、強度等を変動させることができる。
【００５２】
〜に応答して：本明細書で使用する「〜に応答して」なる用語は本発明のＯ−ｔＲＮＡがセレクターコドンを認識し、ｔＲＮＡと結合した非天然アミノ酸を成長中のポリペプチド鎖に組込むのを媒介するプロセスを意味する。
【００５３】
コードする：本明細書で使用する「コードする」なる用語は第１の分子又は配列鎖とは異なる第２の分子又は配列鎖の生産を誘導するためにポリマー巨大分子又は配列鎖中の情報を使用する任意プロセスを意味する。本明細書ではこの用語を広義に使用し、種々に適用することができる。所定側面では、「コードする」なる用語は新規に合成された相補的姉妹鎖をＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによりコードさせるための鋳型として２本鎖ＤＮＡ分子の一方の鎖を使用する半保存的ＤＮＡ複製プロセスを意味する。
【００５４】
別の側面では、「コードする」なる用語は第１の分子とは異なる化学的性質をもつ第２の分子の生産を誘導するためにある分子中の情報を使用する任意プロセスを意味する。例えば、ＤＮＡ分子は（例えばＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ酵素を使用する転写プロセスにより）ＲＮＡ分子をコードすることができる。また、ＲＮＡ分子は翻訳プロセスのようにポリペプチドをコードすることもできる。翻訳プロセスについて使用する場合には、「コードする」なる用語はアミノ酸をコードするトリプレットコドンにも適用する。所定側面では、ＲＮＡ分子は例えばＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用する逆転写プロセスによりＤＮＡ分子をコードすることができる。別の側面では、ＤＮＡ分子はポリペプチドをコードすることができ、この場合に使用する「コードする」とは当然のことながら転写プロセスと翻訳プロセスの両者を意味する。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】Ｌ−（７−ヒドロキシクマリン−４−イル）エチルグリシン（構造１）の化学合成の模式図を示す。
【００５６】
【図２】Ｌ−（７−ヒドロキシクマリン−４−イル）エチルグリシンの吸収スペクトルと発光スペクトルを示す。どちらのスペクトルもｐＨ７．４，１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で記録した。このｐＨでは、Ｌ−（７−ヒドロキシクマリン−４−イル）エチルグリシンはフェノール形態とフェノール酸形態の両者で存在する（約２：１比）。フェノール酸形態は３６０ｎＭで吸光係数１７０００であり、量子収率０．６３である。
【００５７】
【図３】マッコウクジラミオグロビン（ｐｄｂコード１０５Ｍ）の構造を示す。残基Ｓｅｒ４及びＨｉｓ３７のＲ基を示す。
【００５８】
【図４】野生型及び突然変異体ホロミオグロビンの尿素によるアンフォールディングの円二色性分析の結果を示す。分析した突然変異体はＳｅｒ４→７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシン又はＨｉｓ３７→７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシン突然変異体ホロミオグロビンとした。７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシンのＣＤと蛍光強度によりアンフォールディングをモニターした。どちらの実験も１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ７．４中で各種指定尿素濃度で実施した。５Ｍ尿素の存在下では、どちらのミオグロビン突然変異体も０Ｍ尿素に比較して蛍光シグナルの３０％増加を示す。「倍率」は５Ｍ尿素での蛍光シグナル又はモル楕円率を完全にアンフォールディングした状態に正規化することにより計算する。
【００５９】
【図５】ＴＡＧ４突然変異体ミオグロビン発現（黒矢印で示す）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の写真を示す。中央パネルは１ｍＭ  Ｌ−（７−ヒドロキシクマリン−４−イル）エチルグリシンの存在下と不在下で蓄積した蛋白質のクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離を示す。右パネルはＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離後の野生型及びＴＡＧ４突然変異体ミオグロビンの蛍光画像を示す。左パネルは染色分子量マーカーを示す。
【００６０】
【図６】ＴＡＧ４突然変異体ミオグロビンのＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示す。挿入図は逆畳み込みスペクトルを示す。分子量予想値：１８５１２Ｄａ；実測値：１８５１１Ｄａ。
【００６１】
【図７】１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中、６０μＭクマリンアミノ酸Ｌ−（７−ヒドロキシクマリン−４−イル）エチルグリシンの吸収スペクトルを示す。
【００６２】
【図８】突然変異体ＭｊＴｙｒＲＳ（ＣｏｕＲＳ−Ｄ８）活性部位の構造モデルを示す。モデルは野生型ＭｊＴｙｒＲＳ構造（ｐｄｂコード１Ｊ１Ｕ）を使用して作製した。チロシン基質をＬ−（７−ヒドロキシクマリン−４−イル）エチルグリシンで置換し、以下の突然変異：Ｔｙｒ３２Ｇｌｕ、Ｌｅｕ６５Ｈｉｓ、Ａｌａ６７Ｇｌｙ、Ｈｉｓ７０Ｇｌｙ、Ｐｈｅ１０８Ｔｙｒ、Ｇｌｎ１０９Ｈｉｓ、Ａｓｐ１５８Ｇｌｙ及びＬｅｕ１６２Ｇｌｙを示した。ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ（登録商標）ソフトウェア（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．（登録商標），Ｓａｎ，Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，米国）を使用してエネルギー最小化により構造を最適化した。
【００６３】
【図９−１】各種ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す。
【図９−２】各種ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
本発明はセレクターコドン（例えばアンバー終止コドンＴＡＧ）に応答して蛍光アミノ酸Ｌ−（７−ヒドロキシクマリン−４−イル）エチルグリシン（図１、構造１参照）を大腸菌で蛋白質に選択的にｉｎ  ｖｉｖｏ導入することが可能な直交ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を提供する。本発明はコグネイト直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）に非天然アミノ酸Ｌ−（７−ヒドロキシクマリン−４−イル）エチルグリシンを特異的に負荷する新規直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）ポリペプチドを提供する。
【００６５】
蛍光量子収率が高く、ストークスシフトが比較的大きく（図２参照）、サイズが小さく、ｐＨ（図７参照）と溶媒極性（Ｚｉｎｓｌｉ，Ｊ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ（１９７４）３：５５−６９）に感受性であることから、まず７−ヒドロキシクマリン部分を検討した。
【００６６】
所定側面では、（非限定的に）本発明を実証するために、本明細書の開示は非天然アミノ酸部分をモデル蛋白質に組込むことができることを実証する（実施例４及び５参照）。非天然アミノ酸の組込みは特定蛋白質に限定されない。本明細書の開示から自明の通り、特定該当蛋白質への非天然蛍光アミノ酸の組込みは多様な目的に有利である。
【００６７】
本明細書の開示はセレクターコドンに応答して非天然蛍光アミノ酸（例えば図１，構造１に示す非天然アミノ酸Ｌ−（７−  ヒドロキシクマリン−４−イル）エチルグリシン）を部位特異的に組込むために真正細菌で機能する新規直交ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対の進化について記載する。要約すると、本発明者らは大腸菌宿主細胞でサプレッサーｔＲＮＡに非天然アミノ酸を選択的に負荷するＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼの新規突然変異体を同定した。
【００６８】
これらの進化型ｔＲＮＡ−シンテターゼ対は非天然蛍光アミノ酸を蛋白質に部位特異的に組込むために使用することができる。非天然アミノ酸の蛋白質組込みは非天然アミノ酸の組込みを指示するセレクターコドンを含むように該当蛋白質をコードするポリヌクレオチドを操作することにより任意所望位置で行われるようにプログラムすることができる。
【００６９】
本明細書に記載する発明はＬ−（７−ヒドロキシクマリン−４−イル）エチルグリシン非天然アミノ酸を遺伝的にコードさせ、真正細菌（例えば大腸菌）で蛋白質に組込むための直交対を提供し、直交成分は宿主細胞の翻訳機構の内在大腸菌成分と交差反応せず、所望非天然アミノ酸を認識し、セレクターコドン（例えばアンバーナンセンスコドンＴＡＧ）に応答してこれを蛋白質に組込む。本発明により提供される直交成分としては、真正細菌宿主細胞で直交対として機能するＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと突然変異体チロシルｔＲＮＡＣＵＡアンバーサプレッサーが挙げられる。
【００７０】
本発明は付加的な直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対（例えばＬ−（７−ヒドロキシクマリン−４−イル）エチルグリシン非天然アミノ酸を蛋白質に組込むために使用することができるＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対）を同定及び作製するための組成物と方法も提供する。本発明のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対はポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質への７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシンの組込みを媒介することが可能であり、ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。Ｏ−ｔＲＮＡのアンチコドンループはｍＲＮＡ上のセレクターコドンを認識し、ポリペプチドのこの部位に非天然アミノ酸を組込む。一般に、本発明の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼはそのＯ−ｔＲＮＡをただ１種類の特定非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化（ないし負荷）する。
【００７１】
直交ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ技術
本発明の新規組成物及び方法を理解するには、直交ｔＲＮＡと直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの対に関連する活性を理解する必要がある。他の非天然アミノ酸を遺伝コードに付加するためには、宿主翻訳機構で効率的に機能することができるが、翻訳系に内在性のシンテターゼ及びｔＲＮＡから独立して機能するという意味で該当翻訳系に対して「直交性」のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと適切なｔＲＮＡを含む新規直交対が必要である。直交対の所望特徴としては、内在ｔＲＮＡによりデコードされない特定コドン（例えばセレクターコドン）のみをデコード又は認識するｔＲＮＡと、そのコグネイトｔＲＮＡをただ１種類の特定非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化（ないし「負荷」）するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが挙げられる。Ｏ−ｔＲＮＡは更に一般に内在シンテターゼによりアミノアシル化されない（又は低度にしかアミノアシル化即ち負荷されない）。例えば大腸菌宿主系では、直交対は例えば大腸菌に存在する４０種類の内在ｔＲＮＡのいずれとも交差反応しないアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと、例えば大腸菌に存在する２１種類の内在シンテターゼのいずれでもアミノアシル化されない直交ｔＲＮＡを含む。
【００７２】
１個以上の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質の作製に適した直交翻訳系の一般原理と、直交翻訳系の一般作製方法は当分野で公知である。例えば、国際公開ＷＯ２００２／０８６０７５、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ｔＲＮＡ−ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−ｔＲＮＡ  ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ  ＰＡＩＲＳ）」；ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」；ＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」；ＷＯ２００５／０１９４１５（出願日２００４年７月７日）；ＷＯ２００５／００７８７０（出願日２００４年７月７日）；ＷＯ２００５／００７６２４（出願日２００４年７月７日）；ＷＯ２００６／１１０１８２（出願日２００５年１０月２７日、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み用直交翻訳成分（ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ  ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」）；及び米国特許出願第１１／７１５，６７２号（発明の名称「真正細菌宿主細胞における直交翻訳成分の発現用システム（ＳＹＳＴＥＭＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＯＦ  ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ  ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ  ＩＮ  ＥＵＢＡＣＴＥＲＩＡＬ  ＨＯＳＴ  ＣＥＬＬＳ）」、出願日２００７年３月７日）参照。これらの出願は各々その開示内容全体を本明細書に援用する。非天然アミノ酸を組込む直交翻訳系と、その作製及び使用方法のその他の記載については、各々その開示内容全体を本明細書に援用するＷａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，”Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（Ｃａｍｂ．）１：１−１１（２００２）；Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，”Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４４（１）：３４−６６（２００５）；Ｘｉｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，“Ａｎ  Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６（３）：２２７−２３８（２００５）；Ｘｉｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，“Ａｄｄｉｎｇ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ，”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９（６）：５４８−５５４（２００５）；Ｗａｎｇら，“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，”Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．，３５：２２５−２４９（２００６）；及びＸｉｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，“Ａ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔｏｏｌｋｉｔ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ，”Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，７（１０）：７７５−７８２（２００６）も参照。
【００７３】
直交翻訳系
直交翻訳系は一般に直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、非天然アミノ酸を含む細胞（例えば大腸菌等の非真核細胞とすることができる）を含み、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸でアミノアシル化する。本発明の直交対はＯ−ｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ、フレームシフトｔＲＮＡ等）とコグネイトＯ−ＲＳを含むことができる。本発明の直交系は一般に宿主細胞内又は宿主細胞なしにＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を含むことができる。多成分系に加え、本発明は個々の新規成分も提供し、例えば新規直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼポリペプチド（例えば配列番号４）や、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば配列番号５）が挙げられる。
【００７４】
一般に、直交対がセレクターコドンを認識し、セレクターコドンに応答してアミノ酸を負荷するとき、直交対はセレクターコドンを「抑圧」すると言う。即ち、翻訳系の（例えば細胞の）内在機構により認識されないセレクターコドンは通常負荷されないため、そうでなければ核酸から翻訳されるはずのポリペプチドの生産が阻止される。直交対系では、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸でアミノアシル化する。負荷されたＯ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識し、セレクターコドンに起因する翻訳阻止を抑圧する。
【００７５】
所定側面では、本発明のＯ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識し、本明細書の配列表に記載するようなポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるＯ−ｔＲＮＡの抑圧効率に比較してコグネイトシンテターゼの存在下でセレクターコドンに応答して少なくとも例えば約４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％以上の抑圧効率を含む。
【００７６】
所定態様では、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡの併用による抑圧効率はＯ−ＲＳの不在下のＯ−ｔＲＮＡの抑圧効率の例えば約５倍、１０倍、１５倍、２０倍、又は２５倍以上である。１側面では、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡの併用による抑圧効率は本明細書の配列表に記載するような直交シンテターゼ対の抑圧効率の少なくとも例えば約３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％以上である。
【００７７】
宿主細胞は例えば該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を介して成長中のポリペプチド鎖に非天然アミノ酸を組込むためにＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を使用し、ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。所定の好ましい側面では、細胞は１個以上の付加Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を含むことができ、付加Ｏ−ｔＲＮＡは付加Ｏ−ＲＳにより別の非天然アミノ酸を負荷される。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡの一方は４塩基コドンを認識することができ、他方のＯ−ｔＲＮＡは終止コドンを認識することができる。あるいは、複数の異なる終止コドン又は複数の異なる４塩基コドンを同一のコーディング核酸で使用することもできる。
【００７８】
上記のように、所定態様では、２種以上の非天然アミノ酸をポリペプチドに組込むことができるように、細胞又は他の翻訳系に複数のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対が存在する。例えば、細胞は更に別の付加Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対と第２の非天然アミノ酸を含むことができ、この付加Ｏ−ｔＲＮＡは第２のセレクターコドンを認識し、この付加Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対（Ｏ−ｔＲＮＡは例えばアンバーセレクターコドンを認識する）を含む細胞は更に第２の直交対を含むことができ、第２のＯ−ｔＲＮＡは別のセレクターコドン（例えばオパールコドン、４塩基コドン等）を認識する。各直交対は異なるセレクターコドンを認識し易くできるように異なる起源に由来することが望ましい。
【００７９】
所定態様では、系は直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、非天然アミノ酸と、該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む細胞（例えば大腸菌細胞）からなり、ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。翻訳系は無細胞系でもよく、例えば各種市販「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」転写／翻訳系の任意のものを本明細書に記載するようなＯ−ｔＲＮＡ／ＯＲＳ対及び非天然アミノ酸と組み合わせることができる。
【００８０】
Ｏ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳは天然に存在するものでもよいし、例えば種々の生物の任意のものに由来するｔＲＮＡのライブラリー及び／又はＲＳのライブラリーを作製するか及び／又は種々の利用可能な突然変異ストラテジーの任意のものを使用することにより、天然に存在するｔＲＮＡ及び／又はＲＳの突然変異により誘導してもよい。例えば、直交ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための１つのストラテジーは例えば宿主細胞以外の起源又は多重起源に由来する（宿主に対して）異種のｔＲＮＡ／シンテターゼ対を宿主細胞に導入する方法である。異種シンテターゼ候補の特性としては、例えば宿主細胞ｔＲＮＡに負荷しないことが挙げられ、異種ｔＲＮＡ候補の特性としては、例えば宿主細胞シンテターゼによりアミノアシル化されないことが挙げられる。更に、異種ｔＲＮＡは全宿主細胞シンテターゼに対して直交性である。直交対を作製するための第２のストラテジーはＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳをスクリーニング及び／又は選択するための突然変異体ライブラリーを作製する方法である。これらのストラテジーを組み合わせてもよい。
【００８１】
直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）
本発明の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）はＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質への非天然アミノ酸の例えばｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの組込みを媒介することが望ましい。所定態様では、本発明のＯ−ｔＲＮＡは本明細書の配列表のＯ−ｔＲＮＡ配列に記載するようなポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるＯ−ｔＲＮＡに比較してコグネイトシンテターゼの存在下でセレクターコドンに応答して少なくとも例えば約４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％以上の抑圧効率を含む。
【００８２】
抑圧効率は当分野で公知の多数のアッセイの任意のものにより測定することができる。例えば、β−ガラクトシダーゼレポーターアッセイを使用することができ、例えば本発明のＯ−ｔＲＮＡを含むプラスミドと共に修飾ｌａｃＺプラスミド（構築物はｌａｃＺ核酸配列中にセレクターコドンをもつ）を適当な生物（例えば直交成分を使用することができる生物）に由来する細胞に導入する。コグネイトシンテターゼも（ポリペプチド又は発現時にコグネイトシンテターゼをコードするポリヌクレオチドとして）導入することができる。細胞を培地で所望密度（例えばＯＤ６００＝約０．５）まで増殖させ、例えばＢｅｔａＦｌｕｏｒ（登録商標）β−ガラクトシダーゼアッセイキット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用してβ−ガラクトシダーゼアッセイを実施する。比較可能な対照（例えば所望位置にセレクターコドンではなく対応するセンスコドンをもつ修飾ｌａｃＺ構築物から観測される値）に対するサンプルの活性百分率として抑圧百分率を計算することができる。
【００８３】
本発明のＯ−ｔＲＮＡの例を本明細書の配列表に記載する（例えば図９及び配列番号１参照）。本明細書の開示は他の等価Ｏ−ｔＲＮＡ種の設計の手引きも提供する。Ｏ−ＲＳ  ｍＲＮＡ又はＯ−ｔＲＮＡ分子等のＲＮＡ分子では、所与配列又はその相補配列に対してチミン（Ｔ）がウラシル（Ｕ）で置換されている（コーディングＤＮＡでは逆）。機能的にほぼ等価の分子を作製するように塩基に更に別の修飾を加えてもよい。
【００８４】
本発明は本明細書に記載する特定Ｏ−ｔＲＮＡに対応するＯ−ｔＲＮＡの保存変異体も含む。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡの保存変異体としては、例えば本明細書の配列表に記載するような特定Ｏ−ｔＲＮＡと同様に機能し、適当な自己相補性によりｔＲＮＡ  Ｌ形構造を維持するが、例えば本明細書の配列表又は図９に記載する配列と同一配列をもたない分子が挙げられ、更に野生型ｔＲＮＡ分子以外のものであることが望ましい。
【００８５】
Ｏ−ｔＲＮＡを含む組成物は更に直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含むことができ、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。所定態様では、Ｏ−ｔＲＮＡを含む組成物は更に（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ）翻訳系を含むことができる。該当ポリペプチドをコードし、Ｏ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを含む核酸、又はこれらの１種以上の組み合わせも細胞に導入することができる。
【００８６】
直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）の作製方法も本発明の特徴である。本方法により作製されたＯ−ｔＲＮＡも本発明の特徴である。本発明の所定態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは突然変異体ライブラリーを作製することにより作製することができる。突然変異体ｔＲＮＡのライブラリーは当分野で公知の種々の突然変異誘発技術を使用して作製することができる。例えば、突然変異体ｔＲＮＡは例えば配列番号１のＯ−ｔＲＮＡの部位特異的突然変異、ランダム点突然変異、相同組換え、ＤＮＡシャフリングもしくは他の帰納的突然変異誘発法、キメラ構築又はその任意組み合わせにより作製することができる。
【００８７】
ｔＲＮＡの所望ループ又は領域（例えばアンチコドンループ、受容体ステム、Ｄアームもしくはループ、可変ループ、ＴＰＣアームもしくはループ、ｔＲＮＡ分子の他の領域又はその組合せ）の特定位置（例えば非保存位置又は保存位置）、ランダム位置又は両者の組合せに付加突然変異を導入することができる。一般に、ｔＲＮＡの突然変異としてはセレクターコドンの認識を可能にするように突然変異体ｔＲＮＡライブラリーの各メンバーのアンチコドンループを突然変異させる方法が挙げられる。この方法は更にＯ−ｔＲＮＡに付加配列を付加する段階を含むことができる。一般に、Ｏ−ｔＲＮＡは所望ＲＳに対するその親和性等を維持しながら、出発材料（例えば複数のｔＲＮＡ配列）に比較して所望生物に対する直交性が改善されている。
【００８８】
前記方法は場合によりｔＲＮＡ及び／又はアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの配列の類似性（及び／又は推定相同性）を分析し、特定生物に対して直交性であると思われるＯ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ及び／又はその対の潜在候補を決定する段階を含む。分析には、当分野で公知であり、本明細書に記載するコンピュータープログラム（例えばＢＬＡＳＴ及びｐｉｌｅｕｐプログラム）を使用することができる。１例では、大腸菌で使用するための潜在的直交翻訳成分を選択するためには、真正細菌生物に密接な配列類似性を示さないシンテターゼ及び／又はｔＲＮＡを選択する。
【００８９】
一般に、Ｏ−ｔＲＮＡは複数の潜在的Ｏ−ｔＲＮＡのメンバーを含む第１の種の細胞の集団に例えばネガティブ選択を実施することにより得られる。ネガティブ選択は細胞に内在性のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化される潜在的Ｏ−ｔＲＮＡライブラリーのメンバーを含む細胞を排除する。こうして、第１の種の細胞に直交性のｔＲＮＡプールが得られる。
【００９０】
所定態様において、ネガティブ選択では、ネガティブ選択マーカー（例えば抗生物質耐性を付与する酵素（例えばβ−ラクタマーゼ）、検出可能な産物を付与する酵素（例えばβ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ））、例えば毒性物質（例えばバルナーゼ））をコードするポリヌクレオチドの（例えば機能的バルナーゼを依然として産生する）非必須位置等にセレクターコドンを導入する。場合により選択物質（例えばアンピシリン等の抗生物質）の存在下で細胞集団を増殖させることによりスクリーニング／選択を実施する。１態様では、選択物質の濃度を変動させる。
【００９１】
例えば、サプレッサーｔＲＮＡの活性を測定するためには、セレクターコドンのｉｎ  ｖｉｖｏ抑圧に基づく選択システム（例えばネガティブ選択マーカー（例えばβ−ラクタマーゼ遺伝子（ｂｌａ））をコードするポリヌクレオチドに導入されたナンセンス（例えば終止）又はフレームシフト突然変異）を使用する。例えば、所定位置（例えばＡ１８４）にセレクターコドンをもつポリヌクレオチド変異体（例えばｂｌａ変異体）を構築する。細胞（例えば細菌）をこれらのポリヌクレオチドで形質転換する。内在大腸菌シンテターゼにより効率的に負荷することができない直交ｔＲＮＡの場合には、抗生物質耐性（例えばアンピシリン耐性）はプラスミドで形質転換されていない細菌と同等以下のはずである。ｔＲＮＡが非直交性の場合、又はｔＲＮＡに負荷することが可能な異種シンテターゼをシステムで同時発現させる場合には、より高レベルの抗生物質（例えばアンピシリン）耐性が観測される。プラスミドで形質転換されていない細胞とほぼ等しい抗生物質濃度のＬＢ寒天プレートで増殖することができない細胞（例えば細菌）を選択する。
【００９２】
毒性物質（例えばリボヌクレアーゼ又はバルナーゼ）の場合には、複数の潜在的ｔＲＮＡのメンバーが内在宿主（例えば大腸菌）シンテターゼによりアミノアシル化されるとき（即ち、宿主（例えば大腸菌）シンテターゼに非直交性であるとき）にセレクターコドンは抑圧され、生産される毒性ポリヌクレオチド産物は細胞死をもたらす。直交ｔＲＮＡ又は非機能的ｔＲＮＡを含む細胞は生存する。
【００９３】
１態様では、所望生物に直交性のｔＲＮＡプールに次にポジティブ選択を実施し、セレクターコドンを例えばβ−ラクタマーゼ遺伝子等の薬剤耐性遺伝子によりコードされるポジティブ選択マーカーに配置する。ポジティブ選択は細胞に直交性のｔＲＮＡプールのメンバーをコードするか又は前記メンバーを含むポリヌクレオチドと、ポジティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドと、コグネイトＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む細胞で実施される。所定態様では、第２の細胞集団はネガティブ選択により排除されなかった細胞を含む。ポリヌクレオチドを細胞で発現させ、選択物質（例えばアンピシリン）の存在下で細胞を増殖させる。次に、同時発現させたコグネイトシンテターゼによりアミノアシル化され、このセレクターコドンに応答してアミノ酸を挿入することができるｔＲＮＡを選択する。一般に、これらの細胞は非機能的ｔＲＮＡ、又は該当シンテターゼにより効率的に認識することができないｔＲＮＡを含む細胞に比較して高い抑圧効率を示す。非機能的ｔＲＮＡ又は該当シンテターゼにより効率的に認識されないｔＲＮＡを含む細胞は抗生物質に感受性である。従って、（ｉ）内在宿主（例えば大腸菌）シンテターゼの基質ではなく；（ｉｉ）該当シンテターゼによりアミノアシル化することができ；（ｉｉｉ）翻訳で機能的なｔＲＮＡが両者選択後に生存している。
【００９４】
従って、スクリーニングされる状況に応じて同一マーカーがポジティブマーカーにもネガティブマーカーにもなる。即ち、マーカーがポジティブスクリーニングされる場合にはポジティブマーカーであり、ネガティブスクリーニングされる場合にはネガティブマーカーである。
【００９５】
上記方法における選択（例えばポジティブ選択、ネガティブ選択又はポジティブ選択とネガティブ選択の両者）のストリンジェンシーは場合により選択ストリンジェンシーの変動を含む。例えば、バルナーゼは極毒性蛋白質であるので、異なる数のセレクターコドンをバルナーゼ遺伝子に導入するか及び／又は誘導プロモーターを使用することによりネガティブ選択のストリンジェンシーを制御することができる。別の例では、選択又はスクリーニング物質の濃度（例えばアンピシリン濃度）を変動させる。本発明の所定側面では、初期ラウンド中の所望活性は低いと思われるのでストリンジェンシーを変動させる。即ち、初期ラウンドでは低ストリンジェンシー選択基準を適用し、後期ラウンドの選択では高ストリンジェンシー基準を適用する。所定態様では、ネガティブ選択、ポジティブ選択又はネガティブ選択とポジティブ選択の両方を複数回反復することができる。複数の異なるネガティブ選択マーカー、ポジティブ選択マーカー又はネガティブ選択マーカーとポジティブ選択マーカーの両方を使用することができる。所定態様では、ポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーを同一にすることができる。
【００９６】
本発明ではセレクターコドンに応答して非天然アミノ酸を負荷する直交翻訳成分（例えばＯ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ、及びＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対）を作製するために他の型の選択／スクリーニングを使用することもできる。例えば、ネガティブ選択マーカー、ポジティブ選択マーカー又はポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーの両方として、適切な反応体の存在下で蛍光発光するか又は発光反応を触媒するマーカーが挙げられる。別の態様では、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）又は発光によりマーカーの産物を検出する。場合により、マーカーはアフィニティースクリーニングマーカーを含む。Ｆｒａｎｃｉｓｃｏら，（１９９３）“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ，”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．９０：１０４４４−８も参照。
【００９７】
組換え直交ｔＲＮＡのその他の作製方法も例えば国際出願公開ＷＯ２００２／０８６０７５、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ｔＲＮＡ  ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−ｔＲＮＡ  ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ  ＰＡＩＲＳ）」；ＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」；及びＷＯ２００５／０１９４１５（出願日２００４年７月７日）に記載されている。Ｆｏｒｓｔｅｒら，（２００３）“Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅｓ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｄｅ  ｎｏｖｏ，”ＰＮＡＳ  １００（１１）：６３５３−６３５７；及びＦｅｎｇら，（２００３），“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔＲＮＡ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｂｙ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｈａｎｇｅ，”ＰＮＡＳ  １００（１０）：５６７６−５６８１も参照。
【００９８】
直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）
本発明のＯ−ＲＳはｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。本発明のＯ−ＲＳはＯ−ＲＳを含むポリペプチド及び／又はＯ−ＲＳ又はその一部をコードするポリヌクレオチドにより翻訳系（例えば細胞）に提供することができる。例えば、Ｏ−ＲＳの１例は配列番号４に記載するようなアミノ酸配列、又はその保存変異体を含む。別の例では、Ｏ−ＲＳ、又はその一部は本明細書の配列表もしくは実施例に記載する配列を含むアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列、又はその相補的ポリヌクレオチド配列によりコードされる。例えば、配列番号５のポリヌクレオチド参照。
【００９９】
Ｏ−ｔＲＮＡと併用する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）（例えばＯ−ＲＳ）の同定方法も本発明の特徴である。例えば、１方法は第１の種の細胞集団について選択（例えばポジティブ選択）を実施する段階を含み、前記細胞は１）複数のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）のメンバー（例えば複数のＲＳは突然変異体ＲＳ、第１の種以外の種に由来するＲＳ又は突然変異体ＲＳと第１の種以外の種に由来するＲＳの両方を含むことができる）と；２）（例えば１種類以上の種に由来する）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；３）（例えばポジティブ）選択マーカーをコードし、少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを各々含む。複数のＲＳのメンバーを含まないか又はその量の少ない細胞に比較して抑圧効率の高い細胞を選択又はスクリーニングする。抑圧効率は当分野で公知の技術及び本明細書に記載する方法により測定することができる。抑圧効率の高い細胞はＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化する活性ＲＳを含む。第１の種に由来する第１組のｔＲＮＡの活性ＲＳによる（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ）アミノアシル化レベルを第２の種に由来する第２組のｔＲＮＡの活性ＲＳによる（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ）アミノアシル化レベルと比較する。アミノアシル化レベルは検出可能な物質（例えば標識非天然アミノ酸）により測定することができる。第１組のｔＲＮＡに比較して第２組のｔＲＮＡをより効率的にアミノアシル化する活性ＲＳを一般に選択することにより、Ｏ−ｔＲＮＡと併用する効率的（最適化）直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが得られる。この方法により同定されたＯ−ＲＳも本発明の特徴である。
【０１００】
アミノアシル化を測定するためには多数のアッセイの任意のものを使用することができる。これらのアッセイはｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで実施することができる。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアミノアシル化アッセイは例えばＨｏｂｅｎ  ａｎｄ  Ｓｏｌｌ（１９８５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１１３：５５−５９に記載されている。アミノアシル化は直交翻訳成分と共にレポーターを使用し、蛋白質をコードする少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを発現する細胞でレポーターを検出することにより測定することもできる。ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」；及びＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」も参照。
【０１０１】
同定されたＯ−ＲＳを更に操作し、所望非天然アミノ酸のみをＯ−ｔＲＮＡに負荷し、２０種類の標準アミノ酸のいずれをも負荷しないようにシンテターゼの基質特異性を改変することができる。非天然アミノ酸に対して基質特異性をもつ直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの作製方法は例えばシンテターゼの活性部位、シンテターゼの編集メカニズム部位、シンテターゼの各種ドメインを組み合わせることによる各種部位等でシンテターゼを突然変異させる段階と、選択プロセスを適用する段階を含む。ポジティブ選択後にネガティブ選択を行う併用に基づくストラテジーを使用する。ポジティブ選択では、ポジティブマーカーの非必須位置に導入したセレクターコドンが抑圧されると、細胞はポジティブ選択圧下で生存する。従って、天然アミノ酸と非天然アミノ酸の両者の存在下で生存細胞は直交サプレッサーｔＲＮＡに天然又は非天然アミノ酸を負荷する活性シンテターゼをコードする。ネガティブ選択では、ネガティブマーカーの非必須位置に導入したセレクターコドンが抑圧されると、天然アミノ酸特異性をもつシンテターゼは除去される。ネガティブ選択とポジティブ選択の生存細胞は直交サプレッサーｔＲＮＡを非天然アミノ酸のみでアミノアシル化（負荷）するシンテターゼをコードする。その後、これらのシンテターゼに更に突然変異誘発法（例えばＤＮＡシャフリング又は他の帰納的突然変異誘発法）を実施することができる。
【０１０２】
突然変異体Ｏ−ＲＳのライブラリーは当分野で公知の種々の突然変異誘発技術を使用して作製することができる。例えば、突然変異体ＲＳは部位特異的突然変異、ランダム点突然変異、相同組換え、ＤＮＡシャフリングもしくは他の帰納的突然変異誘発法、キメラ構築又はその任意組み合わせにより作製することができる。例えば、突然変異体ＲＳのライブラリーは２個以上の他の例えばサイズとダイバーシティーの小さい「サブライブラリー」から作製することができる。ＲＳのキメラライブラリーも本発明に含まれる。なお、場合により各種生物（例えば真正細菌又は古細菌等の微生物）に由来するｔＲＮＡシンテターゼのライブラリー（例えば天然ダイバーシティーを含むライブラリー）（例えば米国特許第６，２３８，８８４号（Ｓｈｏｒｔら）；米国特許第５，７５６，３１６号（Ｓｃｈａｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒら）；米国特許第５，７８３，４３１号（Ｐｅｔｅｒｓｅｎら）；米国特許第５，８２４，４８５号（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら）；米国特許第５，９５８，６７２号（Ｓｈｏｒｔら）参照）を構築し、直交対についてスクリーニングする。
【０１０３】
シンテターゼにポジティブ及びネガティブ選択／スクリーニングストラテジーを実施した後、これらのシンテターゼに更に突然変異誘発法を実施することができる。例えば、Ｏ−ＲＳをコードする核酸を単離することができ；（例えばランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、組換え又はその任意組み合わせにより）突然変異Ｏ−ＲＳをコードする１組のポリヌクレオチドを核酸から作製することができ；Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する突然変異Ｏ−ＲＳが得られるまでこれらの個々の段階又はこれらの段階の組み合わせを繰り返すことができる。本発明の所定側面では、前記段階を複数回、例えば少なくとも２回実施する。
【０１０４】
Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ、又はその対を作製するための本発明の方法では、付加レベルの選択／スクリーニングストリンジェンシーを使用することもできる。選択又はスクリーニングストリンジェンシーはＯ−ＲＳの作製方法の一方又は両方の段階で変動させることができる。これは例えば選択／スクリーニング物質の使用量等の変動とすることができる。付加ラウンドのポジティブ及び／又はネガティブ選択を実施することもできる。選択又はスクリーニングは更にアミノ酸浸透率の変化、翻訳効率の変化、翻訳忠実度の変化等の１種以上を含むこともできる。一般に、１種以上の変化は蛋白質を生産するために直交ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼ対を使用する生物における１個以上の遺伝子の突然変異に基づく。
【０１０５】
Ｏ−ＲＳの作製と、シンテターゼの基質特異性の改変に関するその他の一般的な詳細については国際公開ＷＯ２００２／０８６０７５、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ｔＲＮＡ  ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−ｔＲＮＡ  ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ  ＰＡＩＲＳ）」；及びＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」に記載されている。その開示内容全体を本明細書に援用するＷａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，”Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４４（１）：３４−６６（２００５）も参照。
【０１０６】
資源及び宿主生物
本発明の直交翻訳成分（Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳ）はＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ成分と宿主系が直交に作用するという条件で他の任意種に由来する宿主翻訳系で使用するために任意生物（又は生物組み合わせ）に由来することができる。直交対のＯ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳは同一生物に由来する必要はない。所定側面では、直交成分は真正細菌宿主系で使用するために古細菌遺伝子（即ち古細菌）に由来する。
【０１０７】
例えば、直交Ｏ−ｔＲＮＡは古細菌生物、例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ（Ｍｍ）、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ（Ｓｓ）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ等の古細菌や、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓ等の真正細菌に由来することができ、直交Ｏ−ＲＳは生物又は生物組み合わせ、例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ等の古細菌や、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓ等の真正細菌に由来することができる。１態様では、例えば植物、藻類、原生動物、真菌類、酵母、動物（例えば哺乳動物、昆虫、節足動物等）等の真核資源もＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳの資源として使用することができる。
【０１０８】
Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の個々の成分は同一生物に由来するものでも異なる生物に由来するものでもよい。１態様では、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対は同一生物に由来する。あるいは、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対のＯ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳは異なる生物に由来する。
【０１０９】
Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ又はＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対はｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで選択又はスクリーニングすることができ、及び／又は非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドを生産するために細胞（例えば真正細菌細胞）で使用することができる。使用される真正細菌細胞は限定されないが、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓ等である。本発明の翻訳成分を含む真正細菌細胞の組成物も本発明の特徴である。
【０１１０】
別の種で使用するためにある種のＯ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳをスクリーニングする方法については、国際出願公開ＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」（出願日２００４年４月１６日）も参照。
【０１１１】
（例えば、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡと非天然アミノ酸を含む）直交翻訳系は非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を生産するために培養宿主細胞を利用することができるが、本発明の直交翻訳系は無傷の生存宿主細胞を必要とするものではない。例えば、直交翻訳系は細胞抽出液の存在下で無細胞系を利用することができる。実際に、蛋白質生産に無細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系を使用することは確立した技術である。本明細書に記載する直交翻訳系成分を使用して非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を生産するようにこれらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ系を適応させることは十分に本発明の範囲に含まれる。
【０１１２】
セレクターコドン
本発明のセレクターコドンは蛋白質生合成機構の遺伝コドン枠を拡張する。例えば、セレクターコドンとしては例えばユニーク３塩基コドン、ナンセンスコドン（例えばアンバーコドン（ＵＡＧ）又はオパールコドン（ＵＧＡ）等の終止コドン）、非天然コドン、少なくとも４塩基のコドン、レアコドン等が挙げられる。例えば１個以上、２個以上、４個以上等の多数のセレクターコドンを所望遺伝子に導入することができる。複数の異なるセレクターコドンを使用することにより、これらの異なるセレクターコドンを使用して（例えば少なくとも１種の非天然アミノ酸を含む）複数の非天然アミノ酸の同時部位特異的組込みを可能にする複数の直交ｔＲＮＡ／シンテターゼ対を使用することができる。
【０１１３】
１態様では、本方法は非天然アミノ酸を細胞でｉｎ  ｖｉｖｏ組込むために終止コドンであるセレクターコドンを使用する。例えば、終止コドンを認識し、Ｏ−ＲＳにより非天然アミノ酸でアミノアシル化されるＯ−ｔＲＮＡを作製する。このＯ−ｔＲＮＡは天然に存在する宿主のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼにより認識されない。慣用部位特異的突然変異誘発法を使用して該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの該当部位に終止コドンを導入することができる。例えばＳａｙｅｒｓら，（１９８８），“５’，３’Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．７９１−８０２参照。Ｏ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ及び該当ポリペプチドをコードする核酸を例えばｉｎ  ｖｉｖｏで併用すると、非天然アミノ酸は終止コドンに応答して組込まれ、特定位置に非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドが得られる。本発明の１態様では、セレクターコドンとして使用される終止コドンはアンバーコドンＵＡＧ及び／又はオパールコドンＵＧＡである。１例では、セレクターコドンとしてＵＡＧとＵＧＡの両者を使用する遺伝コードは存在度が最も高い終結シグナルであるオーカーナンセンスコドンＵＡＡを保存しながら２２種類のアミノ酸をコードすることができる。
【０１１４】
非天然アミノ酸のｉｎ  ｖｉｖｏ組込みは宿主細胞にさほど影響を与えずに実施することができる。例えば、大腸菌等の非真核細胞では、ＵＡＧコドンの抑圧効率はＯ−ｔＲＮＡ（例えばアンバーサプレッサーｔＲＮＡ）と（ＵＡＧコドンと結合してリボソームから成長中のペプチドの放出を開始する）放出因子１（ＲＦ１）の競合に依存するので、例えばＯ−ｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ）の発現レベルを増加するか又はＲＦ１欠損株を使用することにより抑圧効率を調節することができる。真核細胞では、ＵＡＧコドンの抑圧効率はＯ−ｔＲＮＡ（例えばアンバーサプレッサーｔＲＮＡ）と（終止コドンと結合してリボソームから成長中のペプチドの放出を開始する）真核放出因子（例えばｅＲＦ）の競合に依存するので、例えばＯ−ｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ）の発現レベルを増加することにより抑圧効率を調節することができる。更に、付加化合物、例えばジチオスレイトール（ＤＴＴ）等の還元剤も加えてもよい。
【０１１５】
非天然アミノ酸はレアコドンでコードすることもできる。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ蛋白質合成反応でアルギニン濃度を下げると、レアアルギニンコドンＡＧＧはアラニンでアシル化された合成ｔＲＮＡによるＡｌａの挿入に有効であることが分かっている。例えばＭａら（１９９３），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：７９３９参照。この場合には、合成ｔＲＮＡは大腸菌に少量種として存在する天然ｔＲＮＡＡｒｇと競合する。更に、生物によっては全トリプレットコドンを使用しないものもある。Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓで割り当てられないコドンＡＧＡがｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳抽出物へのアミノ酸挿入に利用されている。例えばＫｏｗａｌ  ａｎｄ  Ｏｌｉｖｅｒ（１９９７），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２５：４６８５参照。本発明の成分はこれらのレアコドンをｉｎ  ｖｉｖｏ使用するために作製することができる。
【０１１６】
セレクターコドンは更に拡張コドン（例えば４、５、６塩基以上のコドン等の４塩基以上のコドン）も含むことができる。４塩基コドンの例としては例えばＡＧＧＡ、ＣＵＡＧ、ＵＡＧＡ、ＣＣＣＵ等が挙げられる。５塩基コドンの例としては例えばＡＧＧＡＣ、ＣＣＣＣＵ、ＣＣＣＵＣ、ＣＵＡＧＡ、ＣＵＡＣＵ、ＵＡＧＧＣ等が挙げられる。本発明の方法はフレームシフト抑圧に基づく拡張コドンの使用を含む。４塩基以上のコドンは例えば１又は複数の非天然アミノ酸を同一蛋白質に挿入することができる。他の態様では、アンチコドンループは例えば少なくとも４塩基コドン、少なくとも５塩基コドン、又は少なくとも６塩基コドン又はそれ以上をデコードすることができる。４塩基コドンは２５６種類が考えられるので、４塩基以上のコドンを使用すると同一細胞で複数の非天然アミノ酸をコードすることができる。Ａｎｄｅｒｓｏｎら，（２００２）“Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｌｉｍｉｔｓ  ｏｆ  Ｃｏｄｏｎ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｃｏｄｏｎ  Ｓｉｚｅ，”Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，９：２３７−２４４；及びＭａｇｌｉｅｒｙ，（２００１）“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ：Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ  ｏｆ  Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ  Ｃｏｄｏｎｓ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  “Ｓｈｉｆｔｙ”Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ  Ｃｏｄｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０７：７５５−７６９も参照。
【０１１７】
例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生合成法を使用して非天然アミノ酸を蛋白質に組込むために４塩基コドンが使用されている。例えばＭａら，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，７９３９；及びＨｏｈｓａｋａら，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：３４参照。２個の化学的にアシル化されたフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡを用いて２−ナフチルアラニンとリジンのＮＢＤ誘導体をストレプトアビジンに同時にｉｎ  ｖｉｔｒｏで組込むためにＣＧＧＧとＡＧＧＵが使用されている。例えばＨｏｈｓａｋａら，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：１２１９４参照。ｉｎ  ｖｉｖｏ試験では、ＭｏｏｒｅらはＮＣＵＡアンチコドンをもつｔＲＮＡＬｅｕ誘導体がＵＡＧＮコドン（ＮはＵ、Ａ、Ｇ又はＣであり得る）を抑圧する能力を試験し、４塩基ＵＡＧＡはＵＣＵＡアンチコドンをもつｔＲＮＡＬｅｕにより１３〜２６％の効率でデコードすることができるが、０又は−１フレームでは殆どデコードできないことを見出した。Ｍｏｏｒｅら，（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９８：１９５参照。１態様では、レアコドン又はナンセンスコドンに基づく拡張コドンを本発明で使用し、他の望ましくない部位でのミスセンス読み飛ばしとフレームシフト抑圧を減らすことができる。４塩基コドンは各種直交系でセレクターコドンとして使用されている。例えば、ＷＯ２００５／０１９４１５；ＷＯ２００５／００７８７０；及びＷＯ２００５／００７６２４参照。その開示内容全体を本明細書に援用するＷａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，”Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４４（１）：３４−６６（２００５）も参照。下記実施例ではアンバーセレクターコドンを利用するが、各種非天然アミノ酸Ｏ−ＲＳについて従来記載されている突然変異と同様の突然変異を含むように改変したシンテターゼと４塩基Ｏ−ｔＲＮＡを含むように下記実施例を変更することにより、４塩基以上のコドンも使用することができる。
【０１１８】
所与系では、セレクターコドンは更に天然３塩基コドンの１種を含むことができ、内在系はこの天然塩基コドンを使用しない（又は殆ど使用しない）。例えば、このような系としては、天然３塩基コドンを認識するｔＲＮＡをもたない系、及び／又は３塩基コドンがレアコドンである系が挙げられる。
【０１１９】
セレクターコドンは場合により非天然塩基対を含む。これらの非天然塩基対は更に既存遺伝子アルファベットを拡張する。塩基対が１個増えると、トリプレットコドン数は６４から１２５に増す。第３の塩基対の性質としては安定的且つ選択的な塩基対合、高い忠実度でポリメラーゼによるＤＮＡへの効率的な酵素組込み、及び新生非天然塩基対の合成後の効率的な持続的プライマー伸長が挙げられる。方法と組成物に適応可能な非天然塩基対については、例えばＨｉｒａｏら，（２００２）“Ａｎ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒ  ｆｏｒ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０：１７７−１８２に記載されている。Ｗｕら，（２００２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：１４６２６−１４６３０も参照。他の関連刊行物は以下に挙げる。
【０１２０】
ｉｎ  ｖｉｖｏ使用では、非天然ヌクレオシドは膜透過性であり、リン酸化され、対応する三リン酸塩を形成する。更に、増加した遺伝情報は安定しており、細胞内酵素により破壊されない。Ｂｅｎｎｅｒらによる従来の報告はカノニカルワトソンクリック対とは異なる水素結合パターンを利用しており、そのうちで最も注目される例はイソＣ：イソＧ対である。例えばＳｗｉｔｚｅｒら，（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１１：８３２２；及びＰｉｃｃｉｒｉｌｌｉら，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４３：３３；Ｋｏｏｌ，（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６０２参照。これらの塩基は一般に天然塩基とある程度まで誤対合し、酵素複製することができない。Ｋｏｏｌらは水素結合を塩基間の疎水性パッキング相互作用に置き換えることにより塩基対の形成を誘導できることを立証した。Ｋｏｏｌ（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６０２；及びＧｕｃｋｉａｎ  ａｎｄ  Ｋｏｏｌ，（１９９８）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３６，２８２５参照。上記全要件を満足する非天然塩基対を開発する目的でＳｃｈｕｌｔｚ，Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇらは一連の非天然疎水性塩基を体系的に合成し、試験した。ＰＩＣＳ：ＰＩＣＳ自己対は天然塩基対よりも安定しており、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント（ＫＦ）によりＤＮＡに効率的に組込むことができる。例えばＭｃＭｉｎｎら，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：１１５８６；及びＯｇａｗａら，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：３２７４参照。３ＭＮ：３ＭＮ自己対は生体機能に十分な効率と選択性でＫＦにより合成することができる。例えばＯｇａｗａら，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：８８０３参照。しかし、どちらの塩基もその後の複製のチェーンターミネーターとして作用するものである。ＰＩＣＳ自己対を複製するために使用できる突然変異体ＤＮＡポリメラーゼが最近開発された。更に、７ＡＩ自己対も複製することができる。例えばＴａｅら，（２００１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２３：７４３９参照。Ｃｕ（ＩＩ）と結合すると安定な対を形成する新規メタロ塩基対Ｄｉｐｉｃ：Ｐｙも開発された。Ｍｅｇｇｅｒｓら，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：１０７１４参照。拡張コドンと非天然コドンは天然コドンに本質的に直交性であるので、本発明の方法は天然コドンに直交性のｔＲＮＡを作製するためにこの性質を利用することができる。
【０１２１】
翻訳バイパス系を使用して非天然アミノ酸を所望ポリペプチドに組込むこともできる。１翻訳バイパス系では、大きい配列が遺伝子に挿入されるが、蛋白質に翻訳されない。この配列はリボソームに配列を飛び越させて挿入の下流の翻訳を再開するための合図として機能する構造を含む。
【０１２２】
非天然アミノ酸
本明細書で使用する非天然アミノ酸とはセレノシステイン及び／又はピロリジンと２０種類の遺伝的にコードされた以下のα−アミノ酸、即ちアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン以外の任意アミノ酸、修飾アミノ酸又はアミノ酸類似体を意味する。α−アミノ酸の一般構造は式Ｉ：
【化１】
2009538136.tif 000003
により表される。
【０１２３】
非天然アミノ酸は一般に式Ｉをもつ任意構造であり、式中、Ｒ基は２０種類の天然アミノ酸で使用されている以外の任意置換基である。２０種類の天然アミノ酸の構造については、例えばＬ．Ｓｔｒｙｅｒ著Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３版，１９８８，Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照。なお、本発明の非天然アミノ酸は上記２０種類のα−アミノ酸以外の天然化合物でもよい。
【０１２４】
本発明の非天然アミノ酸は一般に側鎖が天然アミノ酸と異なるので、天然蛋白質と同様に他のアミノ酸（例えば天然又は非天然アミノ酸）とアミド結合を形成する。一方、非天然アミノ酸は天然アミノ酸と異なる側鎖基をもつ。
【０１２５】
本発明では非天然クマリンアミノ酸Ｌ−（７−ヒドロキシクマリン−４−イル）エチルグリシン（別称Ｌ−７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシン；図１、構造１参照）が特に重要である。Ｌ−（７−ヒドロキシクマリン−４−イル）エチルグリシン非天然アミノ酸に加え、例えば本発明により提供される直交対と適切な第２のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を併用して他の非天然アミノ酸を同時に該当ポリペプチドに組込むことができる。多数のこのような付加非天然アミノ酸と適切な直交対が公知である。本明細書の開示と引用文献参照。例えば、各々その開示内容全体を本明細書に援用するＷａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，”Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４４（１）：３４−６６（２００５）；Ｘｉｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，“Ａｎ  Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６（３）：２２７−２３８（２００５）；Ｘｉｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，“Ａｄｄｉｎｇ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ，”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９（６）：５４８−５５４（２００５）；及びＷａｎｇら，“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，”Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．，３５：２２５−２４９  （２００６）参照。
【０１２６】
本明細書に記載する実施例では（図１、構造１に示す）非天然クマリンアミノ酸Ｌ−（７−ヒドロキシクマリン−４−イル）エチルグリシンが特に重要であるが、本発明は前記構造に厳密に限定されるものではない。実際に、基本的蛍光特徴を保持しながら同様に本発明のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（例えば配列番号４のＯ−ＲＳ）により特異的に認識される容易に誘導される構造的に近縁の各種類似体も容易に作製することができる。これらの近縁蛍光類似体も本発明の範囲に含むものとする。
【０１２７】
他の非天然アミノ酸では、例えば、式ＩにおけるＲは場合によりアルキル、アリール、アシル、ヒドラジン、シアノ、ハロ、ヒドラジド、アルケニル、エーテル、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、エノン、イミン、エステル、ヒドロキシルアミン、アミン基等又はその任意組合せを含む。他の該当非天然アミノ酸としては限定されないが、光架橋基をもつアミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合性アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、新規官能基をもつアミノ酸、他の分子と共有又は非共有的に相互作用するアミノ酸、フォトケージド及び／又は光異性化可能なアミノ酸、ビオチン又はビオチン類似体を含有するアミノ酸、ケト含有アミノ酸、グリコシル化アミノ酸、アミノ酸側鎖と結合した糖部分、ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学分解性又は光分解性アミノ酸、天然アミノ酸に比較して延長側鎖（例えばポリエーテル又は例えば約５もしくは約１０炭素長を上回る長鎖炭化水素等）をもつアミノ酸、炭素結合糖含有アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸、並びに１個以上の毒性部分を含むアミノ酸が挙げられる。
【０１２８】
別の側面では、本発明は下式ＩＶ：
【化２】
2009538136.tif 000004
により表される一般構造をもつ非天然アミノ酸を提供する。
【０１２９】
この構造をもつ非天然アミノ酸は一般にＲ１が２０種類の天然アミノ酸の１種（例えば、チロシン又はフェニルアラニン）で使用される置換基であり、Ｒ２が置換基である任意構造である。従って、この種のアミノ酸は天然アミノ酸誘導体とみなすことができる。
【０１３０】
図１、構造１に示すようなクマリン側鎖を含む非天然アミノ酸に加え、非天然アミノ酸は場合により例えば式ＩＩ及びＩＩＩ：
【化３】
2009538136.tif 000005
の構造により表されるような修飾主鎖構造も含むことができ、上記式中、Ｚは一般にＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＮＨ−Ｒ’又はＳ−Ｒ’を含み、ＸとＹは同一でも異なっていてもよく、一般にＳ又はＯであり、ＲとＲ’は場合により同一又は異なり、一般に式Ｉをもつ非天然アミノ酸について上記に記載したＲ基と同一の基及び水素から選択される。例えば、本発明の非天然アミノ酸は場合により式ＩＩ及びＩＩＩにより表されるようにアミノ基又はカルボキシル基に置換を含む。この種の非天然アミノ酸としては限定されないが、例えば２０種類の標準天然アミノ酸に対応する側鎖又は非天然側鎖をもつα−ヒドロキシ酸、α−チオ酸、α−アミノチオカルボキシレートが挙げられる。更に、α炭素の置換は場合によりＬ、Ｄ又はα，α−ジ置換アミノ酸（例えばＤ−グルタミン酸、Ｄ−アラニン、Ｄ−メチル−Ｏ−チロシン、アミノ酪酸等）を含む。他の代替構造としては環状アミノ酸（例えばプロリン類似体や、３、４、６、７、８及び９員環プロリン類似体）、β及びγアミノ酸（例えば置換β−アラニン及びγ−アミノ酪酸）が挙げられる。
【０１３１】
所定側面では、本発明はＬ配置の非天然アミノ酸を利用する。しかし、本発明はＬ配置非天然アミノ酸の使用に限定されない。本発明ではこれらの非天然アミノ酸のＤエナンチオマーも利用できると考えられる。
【０１３２】
本発明で利用される非天然アミノ酸はクマリン非天然アミノ酸Ｌ−（７−ヒドロキシクマリン−４−イル）エチルグリシンに厳密に限定されない。当業者に自明の通り、天然アミノ酸の多種多様な非天然類似体が容易に誘導される。例えば、限定されないが、チロシンから誘導される非天然アミノ酸が容易に作製される。チロシン類似体としては、例えばパラ置換チロシン、オルト置換チロシン、及びメタ置換チロシンが挙げられ、置換チロシンはアルキニル基、アセチル基、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、Ｃ６−Ｃ２０直鎖又は分岐鎖炭化水素、飽和又は不飽和炭化水素、Ｏ−メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基等を含む。更に、多置換アリール環も考えられる。本発明のグルタミン類似体としては限定されないが、α−ヒドロキシ誘導体、γ置換誘導体、環状誘導体及びアミド置換グルタミン誘導体が挙げられる。フェニルアラニン類似体の例としては限定されないが、パラ置換フェニルアラニン、オルト置換フェニルアラニン、及びメタ置換フェニルアラニンが挙げられ、置換基はアルキニル基、ヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド、ニトロ、チオール基又はケト基等を含む。非天然アミノ酸の特定例としては限定されないが、ｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニン、１，５−ダンシル−アラニン、７−アミノ−クマリンアミノ酸、７−ヒドロキシ−クマリンアミノ酸、ニトロベンジル−セリン、Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシン、ｐ−カルボキシメチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、ｍ−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、ビフェニルアラニン、３−アミノ−Ｌ−チロシン、ビピリジルアラニン、ｐ−（２−アミノ−１−ヒドロキシエチル）−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−イソプロピルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン、３−ニトロ−Ｌ−チロシン及びｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニンが挙げられる。更に、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン、３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン（ＤＨＰ）、３，４，６−トリヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、３，４，５−トリヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、４−ニトロ−フェニルアラニン、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチルフェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、３−ニトロ−チロシン、３−チオール−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、及びイソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン等が挙げられる。各種非天然アミノ酸の構造は本明細書に引用する文献に開示されている。国際公開ＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」；及びＷＯ２００６／１１０１８２（出願日２００５年１０月２７日、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み用直交翻訳成分（ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ  ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」）も参照。
【０１３３】
非天然アミノ酸の化学的合成
上記非天然アミノ酸の多くは例えばＳｉｇｍａ（米国）やＡｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，米国）から市販されている。市販されていないものは場合により各種刊行物に記載されている方法や当業者に公知の標準方法を使用して合成される。有機合成技術については、例えばＦｅｓｓｅｎｄｏｎとＦｅｓｓｅｎｄｏｎ著Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８２，第２版，Ｗｉｌｌａｒｄ  Ｇｒａｎｔ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ  Ｍａｓｓ．）；Ｍａｒｃｈ著Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第３版，１９８５，Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；及びＣａｒｅｙとＳｕｎｄｂｅｒｇ著Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第３版，Ｐａｒｔｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ，１９９０，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）参照。非天然アミノ酸の合成について記載しているその他の刊行物としては、例えばＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」；Ｍａｔｓｏｕｋａｓら，（１９９５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３８，４６６０−４６６９；Ｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｋｉｄｄ，（１９４９）“Ａ  Ｎｅｗ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｎｄ  ｏｆ  γ−Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｃ  Ａｃｉｄ  ｆｒｏｍ  Ｐｈｔｈｙｌａｔｅｄ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ，”Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，３３１５−３３１９；Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｔｔｅｒｒｊｉ（１９５９）“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｓ  Ｍｏｄｅｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉ−Ｔｕｍｏｒ  Ａｇｅｎｔｓ，”Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１，３７５０−３７５２；Ｃｒａｉｇら（１９８８）“Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ  ｏｆ  ７−Ｃｈｌｏｒｏ−４［［４−（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−１−ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ（Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ），”Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５３，１１６７−１１７０；Ａｚｏｕｌａｙら（１９９１）“Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ａｓ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌｓ，”Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２６，２０１−５；Ｋｏｓｋｉｎｅｎ  ａｎｄ  Ｒａｐｏｐｏｒｔ，（１９８９）“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ４−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  Ｐｒｏｌｉｎｅｓ  ａｓ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，”Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４，１８５９−１８６６；Ｃｈｒｉｓｔｉｅ  ａｎｄ  Ｒａｐｏｐｏｒｔ（１９８５）“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ  Ｐｕｒｅ  Ｐｉｐｅｃｏｌａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｌ−Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ（＋）−Ａｐｏｖｉｎｃａｍｉｎｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｃａｒｂｏｎｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｉｎｉｕｍ  Ｉｏｎ  Ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏ��，”Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８９：１８５９−１８６６；Ｂａｒｔｏｎら，（１９８７）“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  α−Ａｍｉｎｏ−Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｌ−ａｎｄ  Ｄ−α−Ａｍｉｎｏ−Ａｄｉｐｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｌ−α−ａｍｉｎｏｐｉｍｅｌｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ  Ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，”Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．４３：４２９７−４３０８；及びＳｕｂａｓｉｎｇｈｅら，（１９９２）“Ｑｕｉｓｑｕａｌｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  ２−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｔ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｑｕｉｓｑｕａｌａｔｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ  ｓｉｔｅ，”Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５：４６０２−７が挙げられる。国際公開ＷＯ２００４／０５８９４６、発明の名称「蛋白質アレー（ＰＲＯＴＥＩＮ  ＡＲＲＡＹＳ）」（出願日２００３年１２月２２日）も参照。
【０１３４】
非天然アミノ酸の細胞取込み
細胞による非天然アミノ酸取り込みは例えば蛋白質に組込むように非天然アミノ酸を設計及び選択する場合に一般に考慮される問題の１つである。例えば、α−アミノ酸は電荷密度が高いため、これらの化合物は細胞に浸透しにくいと思われる。天然アミノ酸は異なる程度のアミノ酸特異性を示すことが多い一連の蛋白質輸送システムにより細胞に取り込まれる。非天然アミノ酸が細胞に取り込まれる場合にはどの非天然アミノ酸が取り込まれるかを判断する迅速なスクリーニングを実施することができる。例えば国際公開ＷＯ２００４／０５８９４６、発明の名称「蛋白質アレー（ＰＲＯＴＥＩＮ  ＡＲＲＡＹＳ）」（出願日２００３年１２月２２日）；及びＬｉｕ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ（１９９９）“Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｔｏｗａｒｄ  ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｏｒｇａｎｉｓｍ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ，”ＰＮＡＳ  ９６：４７８０−４７８５における毒性アッセイ参照。取込みは種々のアッセイで容易に分析されるが、細胞取込み経路に利用可能な非天然アミノ酸を設計する代替方法は、アミノ酸をｉｎ  ｖｉｖｏ生産する生合成経路を提供する方法である。
【０１３５】
非天然アミノ酸の生合成
細胞にはアミノ酸と他の化合物を生産するために多数の生合成経路が元々存在している。特定非天然アミノ酸の生合成法は自然界（例えば細胞中）には存在しないと思われるが、本発明はこのような方法を提供する。例えば、新規酵素を付加するか又は既存宿主細胞経路を改変することにより、非天然アミノ酸の生合成経路を場合により宿主細胞で作製する。付加新規酵素は場合により天然酵素又は人工的に進化させた酵素である。例えば、（ＷＯ２００２／０８５９２３の実施例に記載されているような）ｐ−アミノフェニルアラニンの生合成は他の生物に由来する公知酵素の組合せの付加に依存している。これらの酵素の遺伝子はこれらの遺伝子を含むプラスミドで細胞を形質転換することにより細胞に導入することができる。これらの遺伝子は細胞で発現されると、所望化合物を合成するための酵素経路を提供する。場合により付加される酵素種の例は下記実施例に記載する。その他の酵素配列は例えばＧｅｎｂａｎｋに登録されている。人工的に進化させた酵素も場合により同様に細胞に付加する。このように、非天然アミノ酸を生産するように細胞機構と細胞資源を操作する。
【０１３６】
実際に、生合成経路で使用する新規酵素を生産するため又は非天然アミノを生産するように既存経路をｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏで進化させるためには種々の方法の任意のものを使用することができる。非天然アミノ酸を生産するため（又は、実際に新規基質特異性もしくは他の該当活性をもつようにシンテターゼを進化させるため）には、酵素及び他の生合成経路成分を進化させる方法として利用可能な多数の方法を本発明に適用することができる。例えば、非天然アミノ酸を生産（又は新規シンテターゼを生産）するように新規酵素及び／又は前記酵素の経路をｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで開発するためには、場合によりＤＮＡシャフリングを使用する。例えばＳｔｅｍｍｅｒ（１９９４），“Ｒａｐｉｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ，”Ｎａｔｕｒｅ  ３７０（４）：３８９−３９１；及びＳｔｅｍｍｅｒ，（１９９４），“ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｂｙ  ｒａｎｄｏｍ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：１０７４７−１０７５１参照。関連アプローチは所望特性をもつ酵素を迅速に進化させるために関連（例えば相同）遺伝子のファミリーをシャフリングする。このような「ファミリー遺伝子シャフリング」法の１例はＣｒａｍｅｒｉら（１９９８）“ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ”Ｎａｔｕｒｅ，３９１（６６６４）：２８８−２９１に記載されている。（生合成経路成分であるか又はシンテターゼであるかを問わずに）新規酵素は例えばＯｓｔｅｒｍｅｉｅｒら（１９９９）“Ａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｈｙｂｒｉｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １７：１２０５に記載されているような「ハイブリッド酵素作製用インクリメンタルトランケーション（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ：ＩＴＣＨＹ）」として知られるＤＮＡ組換え法を使用して作製することもできる。このアプローチは１種以上のｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ組換え法の基質として使用することができる酵素又は他の経路変異体のライブラリーを作製するために使用することもできる。Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒら（１９９９）“Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｂｙ  Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：３５６２−６７，及びＯｓｔｅｒｍｅｉｅｒら（１９９９），“Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ，”Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７：２１３９−４４も参照。別のアプローチは例えば非天然アミノ酸（又は新規シンテターゼ）の生産に関連する生合成反応を触媒する能力について選択する酵素又は他の経路変異体のライブラリーを作製するために指数的集合突然変異誘発を使用する。このアプローチでは、該当配列中の小群の残基を並行してランダムに突然変異させ、機能的蛋白質をもたらすアミノ酸を各変異位置で同定する。非天然アミノ酸（又は新規シンテターゼ）の生産用新規酵素を作製するように本発明に応用することができるこのような方法の例はＤｅｌｅｇｒａｖｅ  ａｎｄ  Ｙｏｕｖａｎ（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１：１５４８−１５５２に記載されている。更に別のアプローチでは、例えばＡｒｋｉｎ  ａｎｄ  Ｙｏｕｖａｎ（１９９２）“Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｔｏ  ｅｎｃｏｄｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｅｍｉ−ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：２９７−３００；又はＲｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎら（１９９１）“Ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０８：５６４−８６の一般突然変異誘発法を使用することにより、酵素及び／又は経路成分操作にドープ又は縮重オリゴヌクレオチドを使用するランダム又は半ランダム突然変異誘発を使用することができる。ポリヌクレオチドリアセンブリと部位飽和突然変異誘発を使用する更に別のアプローチ（「非確率論的」突然変異誘発と呼ぶことが多い）を使用すると、酵素及び／又は経路成分を作製した後に、（例えば非天然アミノ酸のｉｎ  ｖｉｖｏ生産のための）１種以上のシンテターゼ又は生合成経路機能を実施する能力についてスクリーニングすることができる。例えばＳｈｏｒｔ「遺伝子ワクチン及び酵素の非確率論的作製（ＮＯＮ−ＳＴＯＣＨＡＳＴＩＣ  ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＶＡＣＣＩＮＥＳ  ＡＮＤ  ＥＮＺＹＭＥＳ）」ＷＯ００／４６３４４参照。
【０１３７】
このような突然変異法の代替方法は生物の全ゲノムを組換え、得られた子孫を特定経路機能について選択する方法である（「全ゲノムシャフリング」と呼ぶことが多い）。例えばゲノム組換えと非天然アミノ酸（又はその中間体）の生産能に関する生物（例えば大腸菌又は他の細胞）の選択により、このアプローチを本発明に適用することができる。例えば、非天然アミノ酸をｉｎ  ｖｉｖｏ生産するように細胞で既存及び／又は新規経路を進化させるための経路設計には、以下の刊行物に教示されている方法を適用することができる：Ｐａｔｎａｉｋら（２００２）“Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｏｆ  ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｃｉｄ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０（７）：７０７−７１２；及びＺｈａｎｇら（２００２）“Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｒａｐｉｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ”Ｎａｔｕｒｅ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ７，４１５（６８７２）：６４４−６４６。
【０１３８】
例えば所望化合物を生産するための他の生物及び代謝経路改変技術も利用可能であり、同様に非天然アミノ酸の生産に適用することができる。有用な経路改変アプローチを教示している刊行物の例としては、Ｎａｋａｍｕｒａ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ（２００３）“Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  １，３  ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４（５）：４５４−９；Ｂｅｒｒｙら（２００２）“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｂｏｔｈ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｄｉｇｏ”Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８：１２７−１３３；Ｂａｎｔａら（２００２）“Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ａｎ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ：Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｆａｃｔｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ２，５−ｄｉｋｅｔｏ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｃ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１（２０），６２２６−３６；Ｓｅｌｉｖｏｎｏｖａら（２００１）“Ｒａｐｉｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔｒａｉｔｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ”Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６７：３６４５、及び他の多数の文献が挙げられる。
【０１３９】
使用する方法に関係なく、一般に本発明の改変生合成経路を使用して生産される非天然アミノ酸は効率的な蛋白質生合成に十分な濃度（例えば天然の細胞内の量）で生産されるが、他の細胞内アミノ酸濃度を有意に変化させたり細胞内資源を枯渇させる程ではない。このようにｉｎ  ｖｉｖｏ生産される典型的な濃度は約１０ｍＭ〜約０．０５ｍＭである。特定経路に所望される酵素を生産するように細胞を改変し、非天然アミノ酸を作製したら、場合によりｉｎ  ｖｉｖｏ選択を使用してリボソーム蛋白質合成と細胞増殖の両方に適合するように非天然アミノ酸の生産を更に最適化させる。
【０１４０】
非天然アミノ酸を組込むための直交成分
本発明はセレクターコドン（例えばアンバー終止コドン、ナンセンスコドン、４塩基以上のコドン等）に応答して成長中のポリペプチド鎖に非天然アミノ酸Ｌ−（７−ヒドロキシクマリン−４−イル）エチルグリシン（図１、構造１参照）を例えばｉｎ  ｖｉｖｏで組込むための直交成分を作製するための組成物と方法を提供する。例えば、本発明は直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）及びその対を提供する。これらの対は成長中のポリペプチド鎖に非天然アミノ酸を組込むために使用することができる。
【０１４１】
本発明の組成物は直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含み、前記Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシンで優先的にアミノアシル化する。所定態様では、Ｏ−ＲＳは配列番号４を含むアミノ酸配列及びその保存変異体を含む。本発明の所定態様では、Ｏ−ＲＳは如何なる内在ｔＲＮＡよりも優先的にＯ−ｔＲＮＡを特定非天然アミノ酸でアミノアシル化し、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを優先し、非天然アミノ酸を負荷されるＯ−ｔＲＮＡと同一非天然アミノ酸を負荷される内在ｔＲＮＡの比は１：１を上回り、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡに排他的又はほぼ排他的に負荷することがより好ましい。
【０１４２】
Ｏ−ＲＳを含む組成物は場合により更に直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含むことができ、Ｏ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識する。一般に、本発明のＯ−ｔＲＮＡは本明細書の配列表（例えば配列番号１）及び実施例に記載するようなポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるＯ−ｔＲＮＡの抑圧効率に比較してコグネイトシンテターゼの存在下でセレクターコドンに応答して少なくとも例えば約４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％以上の抑圧効率を含む。１態様では、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡの併用による抑圧効率はＯ−ＲＳの不在下のＯ−ｔＲＮＡの抑圧効率の例えば５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍又はそれ以上である。所定側面では、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡの併用による抑圧効率はＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来する直交チロシルｔＲＮＡシンテターゼ対の抑圧効率の少なくとも４５％である。
【０１４３】
Ｏ−ｔＲＮＡを含む組成物は場合により更に細胞（例えば大腸菌等の真正細菌細胞、又は酵母細胞等の真核細胞）及び／又は翻訳系を含むことができる。
【０１４４】
翻訳系を含む細胞（例えば真正細菌細胞又は酵母細胞）も本発明により提供され、前記翻訳系は直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシン非天然アミノ酸を含む。一般にＯ−ＲＳは如何なる内在ｔＲＮＡよりも優先的にＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸でアミノアシル化し、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを優先し、非天然アミノ酸を負荷されるＯ−ｔＲＮＡと非天然アミノ酸を負荷される内在ｔＲＮＡの比は１：１を上回り、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡに排他的又はほぼ排他的に負荷することがより好ましい。Ｏ−ｔＲＮＡは第１のセレクターコドンを認識し、Ｏ−ＲＳは優先的にＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸でアミノアシル化する。１態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは配列番号１に記載のポリヌクレオチド配列又はその相補的ポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされる。１態様では、Ｏ−ＲＳは配列番号４に記載のアミノ酸配列又はその保存変異体を含む。
【０１４５】
本発明の細胞は場合により更に別の付加Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対と第２の非天然アミノ酸を含むことができ、例えばこのＯ−ｔＲＮＡは第２のセレクターコドンを認識し、このＯ−ＲＳは対応するＯ−ｔＲＮＡを第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、第２のアミノ酸は第１の非天然アミノ酸と異なる。場合により、本発明の細胞は該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含み、前記ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。
【０１４６】
所定態様では、本発明の細胞は直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、非天然アミノ酸と、該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む真正細菌細胞（例えば大腸菌）であり、前記ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。本発明の所定態様では、Ｏ−ＲＳはＯ−ＲＳが任意内在ｔＲＮＡをアミノアシル化する効率よりも高い効率でＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。
【０１４７】
本発明の所定態様では、本発明のＯ−ｔＲＮＡは本明細書の配列表（例えば配列番号１）もしくは実施例に記載するようなポリヌクレオチド配列、又はその相補的ポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされる。本発明の所定態様では、Ｏ−ＲＳは本明細書の配列表に記載するようなアミノ酸配列、又はその保存変異体を含む。１態様では、Ｏ−ＲＳ又はその一部は本明細書の配列表もしくは実施例に記載するようなアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列、又はその相補的ポリヌクレオチド配列によりコードされる。
【０１４８】
本発明のＯ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳは種々の生物（例えば真核及び／又は非真核生物）の任意のものに由来することができる。
【０１４９】
ポリヌクレオチドも本発明の特徴である。本発明のポリヌクレオチド（例えば配列番号５）は本明細書の配列表に記載するようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む人工（例えば人為的に作製され、天然には存在しない）ポリヌクレオチドを含むか、及び／又は前記ポリヌクレオチド配列に相補的であるか又は前記配列をコードする。本発明のポリヌクレオチドは更に核酸の実質的に全長にわたって高ストリンジェント条件下で上記ポリヌクレオチドとハイブリダイズする核酸も含むことができる。本発明のポリヌクレオチドは更に天然に存在するｔＲＮＡ又は対応するコーディング核酸のポリヌクレオチドと例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はそれ以上一致するポリヌクレオチドを含み（但し、本発明のポリヌクレオチドは天然に存在するｔＲＮＡ又は対応するコーディング核酸以外のものである）、前記ｔＲＮＡはセレクターコドン（例えば４塩基コドン）を認識する。上記任意ポリヌクレオチド及び／又は上記任意ポリヌクレオチドの保存変異体を含むポリヌクレオチドと例えば少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はそれ以上一致する人工ポリヌクレオチドも本発明のポリヌクレオチドに含まれる。
【０１５０】
本発明のポリヌクレオチドを含むベクターも本発明の特徴である。例えば、本発明のベクターとしてはプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、発現ベクター及び／又は同等物が挙げられる。本発明のベクターを含む細胞も本発明の特徴である。
【０１５１】
Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の成分の作製方法も本発明の特徴である。これらの方法により作製された成分も本発明の特徴である。例えば、細胞に対して直交性である少なくとも１種のｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）の作製方法は突然変異体ｔＲＮＡのライブラリーを作製する段階と；セレクターコドンを認識できるように突然変異体ｔＲＮＡのライブラリーの各メンバーのアンチコドンループを突然変異させることにより、潜在的Ｏ−ｔＲＮＡのライブラリーを提供する段階と、潜在的Ｏ−ｔＲＮＡのライブラリーのメンバーを含む第１の種の第１の細胞集団についてネガティブ選択を実施する段階を含む。ネガティブ選択は細胞に内在性のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化される潜在的Ｏ−ｔＲＮＡライブラリーのメンバーを含む細胞を排除する。こうして、第１の種の細胞に対して直交性のｔＲＮＡプールが得られ、それにより少なくとも１種のＯ−ｔＲＮＡが得られる。本発明の方法により作製されたＯ−ｔＲＮＡも提供する。
【０１５２】
所定態様では、前記方法は更に第１の種の第２の細胞集団についてポジティブ選択を実施する段階を含み、前記細胞は第１の種の細胞に対して直交性のｔＲＮＡプールのメンバーと、コグネイトアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと、ポジティブ選択マーカーを含む。ポジティブ選択を使用し、コグネイトアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼによりアミノアシル化され、ポジティブ選択マーカーの存在下で所望応答を示すｔＲＮＡプールのメンバーを含む細胞を選択又はスクリーニングすることにより、Ｏ−ｔＲＮＡが得られる。所定態様では、第２の細胞集団はネガティブ選択により排除されなかった細胞を含む。
【０１５３】
非天然アミノ酸をＯ−ｔＲＮＡに負荷する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの同定方法も提供する。例えば、方法は第１の種の細胞集団に選択を実施する段階を含み、前記細胞は、１）複数のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）（例えば複数のＲＳは突然変異体ＲＳ、第１の種以外の種に由来するＲＳ、又は突然変異体ＲＳと第１の種以外の種に由来するＲＳの両方を含むことができる）のメンバーと；２）（例えば１種類以上の種に由来する）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；３）ポジティブ選択マーカーをコードし、少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを各々含む。
【０１５４】
複数のＲＳのメンバーを含まないか又はその量の少ない細胞に比較して抑圧効率の高い細胞（例えば宿主細胞）を選択又はスクリーニングする。これらの選択／スクリーニング後の細胞はＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化する活性ＲＳを含む。この方法により同定された直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼも本発明の特徴である。
【０１５５】
選択位置に非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を細胞（例えば大腸菌細胞等の真正細菌細胞、又は酵母細胞）で生産する方法も本発明の特徴である。例えば、１方法は、少なくとも１個のセレクターコドンを含み、蛋白質をコードする核酸を含む細胞を適当な培地で増殖させる段階と、非天然アミノ酸を提供する段階と、少なくとも１個のセレクターコドンによる核酸の翻訳中に蛋白質の特定位置に非天然アミノ酸を組込むことにより、蛋白質を生産する段階を含む。細胞は更に、細胞で機能し、セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む。この方法により生産された蛋白質も本発明の特徴である。
【０１５６】
本発明は７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシンを組込んだ蛋白質を含有する組成物も提供する。所定態様では、蛋白質は公知蛋白質（例えば治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分）のアミノ酸配列と少なくとも７５％一致するアミノ酸配列を含む。場合により、組成物は医薬的に許容可能なキャリヤーを含有する。
【０１５７】
核酸及びポリペプチド配列と変異体
本明細書に記載するように、本発明は例えばＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチド配列と、ポリペプチドアミノ酸配列（例えばＯ−ＲＳ）と、例えば前記ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列を含む組成物、系及び方法を提供する。前記配列（例えばＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳアミノ酸及びヌクレオチド配列）の例を本明細書に開示する（図９、例えば配列番号４及び５参照）。しかし、当業者に自明の通り、本発明は本明細書、例えば実施例や配列表に開示する配列に限定されない。当業者に自明の通り、本発明は本明細書に記載する機能をもつ多数の関連配列（例えば、本明細書に開示するＯ−ＲＳの保存変異体をコードするポリヌクレオチド及びポリペプチド）も提供する。
【０１５８】
Ｏ−ｔＲＮＡを７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシン非天然アミノ酸でアミノアシル化することが可能な直交シンテターゼ種（Ｏ−ＲＳ）の構築と分析を実施例３〜５に記載する。これらの実施例は非天然アミノ酸７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシンを組込むことが可能なＯ−ＲＳ種の構築と分析について記載する、
【０１５９】
本発明はポリペプチド（Ｏ−ＲＳ）とポリヌクレオチド（例えばＯ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ又はその部分をコードするポリヌクレオチド、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼクローンを単離するために使用されるオリゴヌクレオチド等）を提供する。本発明のポリヌクレオチドとしては、１個以上のセレクターコドンをもつ本発明の該当蛋白質又はポリペプチドをコードするものが挙げられる。更に、本発明のポリヌクレオチドとしては、例えば配列番号５に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと；そのポリヌクレオチド配列に相補的であるか又は前記配列をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドは更に配列番号４を含むＯ−ＲＳアミノ酸配列をコードする任意ポリヌクレオチドを含む。同様に、核酸の実質的に全長にわたって高ストリンジェント条件下で上記ポリヌクレオチドとハイブリダイズする人工核酸（天然ポリヌクレオチド以外のもの）も本発明のポリヌクレオチドである。１態様では、組成物は本発明のポリペプチドと賦形剤（例えば緩衝液、水、医薬的に許容可能な賦形剤等）を含有する。本発明は本発明のポリペプチドに対して特異的に免疫反応性の抗体又は抗血清も提供する。人工ポリヌクレオチドは人為的に作製され、天然には存在しないポリヌクレオチドである。
【０１６０】
本発明のポリヌクレオチドは天然に存在するｔＲＮＡのポリヌクレオチドと例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はそれ以上一致する人工ポリヌクレオチド（但し、天然に存在するｔＲＮＡ以外のもの）も含む。ポリヌクレオチドは天然に存在するｔＲＮＡのポリヌクレオチドと例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はそれ以上一致する（但し１００％は一致しない）人工ポリヌクレオチドも含む。
【０１６１】
所定態様では、ベクター（例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス等）に本発明のポリヌクレオチドを組込む。１態様では、ベクターは発現ベクターである。別の態様では、発現ベクターは本発明のポリヌクレオチドの１種以上と機能的に連結されたプロモーターを含む。別の態様では、本発明のポリヌクレオチドを組込んだベクターを細胞に導入する。
【０１６２】
同様に当業者に自明の通り、開示配列の多数の変異体も本発明に含まれる。例えば、機能的に同一配列となる開示配列の保存変異体も本発明に含まれる。少なくとも１種の開示配列とハイブリダイスする核酸ポリヌクレオチド配列の変異体も本発明に含むものとする。例えば標準配列比較法により判定した場合に本明細書に開示する配列のユニークサブ配列であると判断される配列も本発明に含まれる。
【０１６３】
保存変異
遺伝コードの縮重により、「サイレント置換」（即ちコードされるポリペプチドに変化を生じない核酸配列の置換）はアミノ酸配列をコードする全核酸配列の暗黙の特徴である。同様に、「保存アミノ酸置換」はアミノ酸配列中の１個又は少数のアミノ酸を高度に類似する性質をもつ別のアミノ酸で置換するものであり、このような置換も開示構築物と高度に類似することが容易に認められる。各開示配列のこのような保存変異体は本発明の特徴である。
【０１６４】
特定核酸配列の「保存変異体」とは同一又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を意味し、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には本質的に同一の配列を意味する。当業者に自明の通り、コードされる配列中のアミノ酸１個又は低百分率（一般に５％未満、より一般には４％、２％又は１％未満）のアミノ酸を置換、付加又は欠失させる個々の置換、欠失又は付加の結果としてアミノ酸を欠失するか、アミノ酸が付加されるか、又はアミノ酸が化学的に類似するアミノ酸で置換される場合には、これらの変異は「保存修飾変異」である。従って、本発明の指定ポリペプチド配列の「保存変異体」としては、ポリペプチド配列のアミノ酸の低百分率、一般に５％未満、より一般には２％又は１％未満が同一保存置換基のアミノ酸で置換されたものが挙げられる。最後に、非機能的配列の付加のように核酸分子のコードされる活性を変えない配列の付加も基本核酸の保存変異である。
【０１６５】
機能的に類似するアミノ酸を示す保存置換表は当分野で周知であり、このようなアミノ酸では、あるアミノ酸残基が類似の化学的性質（例えば芳香族側鎖又は正荷電側鎖）をもつ別のアミノ酸残基に置換しているため、ポリペプチド分子の機能的性質は実質的に変化しない。化学的性質が類似する天然アミノ酸を含む代表的グループを以下に示すが、これらのグループ内の置換は「保存置換」である。
【表１】
2009538136.tif 000006
【０１６６】
核酸ハイブリダイゼーション
本明細書の核酸の保存変異体を含めて本発明の核酸を同定するためには比較ハイブリダイゼーションを使用することができ、この比較ハイブリダイゼーション法は本発明の核酸を識別する好ましい１方法である。更に、高、超高及び超々高ストリンジェンシー条件下で配列番号５により示される核酸とハイブリダイズするターゲット核酸も本発明の特徴である。このような核酸の例としては所与核酸配列と比較して１又は少数のサイレント又は保存核酸置換をもつものが挙げられる。
【０１６７】
試験核酸が完全にマッチする相補的ターゲットに比較して少なくとも５０％の割合でプローブとハイブリダイズする場合、即ちマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも約５倍〜１０倍で完全にマッチするプローブが完全にマッチする相補的ターゲットと結合する条件下におけるプローブとターゲットのハイブリダイゼーションに比較してシグナル対ノイズ比が少なくとも１／２である場合に試験核酸はプローブ核酸と特異的にハイブリダイズすると言う。
【０１６８】
核酸は一般に溶液中で会合するときに「ハイブリダイズ」する。核酸は水素結合、溶媒排除、塩基スタッキング等の種々の十分に特性決定された物理化学的力によりハイブリダイズする。核酸ハイブリダイゼーションの詳しい手引きはＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ，”（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００６年補遺）に記載されており、Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  １  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄと、Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  ２  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄはオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡとＲＮＡの合成、標識、検出及び定量について詳細に記載している。
【０１６９】
サザン又はノーザンブロットで１００個を上回る相補的残基をもつ相補的核酸のハイブリダイゼーションをフィルター上で行うためのストリンジェントハイブリダイゼーション条件の１例は、５０％ホルマリンにヘパリン１ｍｇを加え、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを実施する。ストリンジェント洗浄条件の１例は６５℃、０．２×ＳＳＣで１５分間洗浄する（ＳＳＣ緩衝液の説明についてはＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１参照）。多くの場合には高ストリンジェンシー洗浄の前に低ストリンジェンシー洗浄を実施してバックグラウンドプローブシグナルを除去する。低ストリンジェンシー洗浄の１例は４０℃、２×ＳＳＣで１５分間である。一般に、シグナル対ノイズ比が特定ハイブリダイゼーションアッセイで無関係プローブに観測される比の５倍（以上）である場合に特異的ハイブリダイゼーションが検出されたとみなす。
【０１７０】
サザン及びノーザンハイブリダイゼーション等の核酸ハイブリダイゼーション実験において「ストリンジェントハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存性であり、各種環境パラメーターにより異なる。核酸ハイブリダイゼーションの詳しい手引きはＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ，”（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；及びＨａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  １  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄと、Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  ２  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄに記載されている。ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件は任意試験核酸について経験により容易に決定することができる。例えば、ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件を決定するには、一連の選択基準に合致するまで（例えばハイブリダイゼーション又は洗浄における温度上昇、塩濃度低下、界面活性剤濃度増加及び／又はホルマリン等の有機溶媒濃度増加により）ハイブリダイゼーション及び洗浄条件を徐々に増加する。例えば、高ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件では、マッチしないターゲットとプローブのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも約５倍でプローブが完全にマッチする相補的ターゲットと結合するまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件を徐々に増加する。
【０１７１】
「超ストリンジェント」条件は特定プローブの熱融点（Ｔｍ）に等しくなるように選択される。Ｔｍは（規定イオン強度及びｐＨ下で）試験配列の５０％が完全にマッチするプローブとハイブリダイズする温度である。本発明の目的では、一般に規定イオン強度及びｐＨで特定配列のＴｍよりも約５℃低くなるように「高ストリンジェント」ハイブリダイゼーション及び洗浄条件を選択する。
【０１７２】
「超高ストリンジェンシー」ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は完全にマッチする相補的ターゲット核酸とプローブの結合に観測されるシグナル対ノイズ比がマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも１０倍になるまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件のストリンジェンシーを増加する条件である。完全にマッチする相補的ターゲット核酸のシグナル対ノイズ比の少なくとも１／２で前記条件下にプローブとハイブリダイズする場合にターゲット核酸は超高ストリンジェンシー条件下でプローブと結合すると言う。
【０１７３】
同様に、該当ハイブリダイゼーションアッセイのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件を徐々に増加することにより更に高レベルのストリンジェンシーを決定することもできる。例えば、完全にマッチする相補的ターゲット核酸とプローブの結合に観測されるシグナル対ノイズ比がマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも１０倍、２０倍、５０倍、１００倍又は５００倍以上になるまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件のストリンジェンシーを増加する条件が挙げられる。完全にマッチする相補的ターゲット核酸のシグナル対ノイズ比の少なくとも１／２で前記条件下にプローブとハイブリダイズする場合にターゲット核酸は超々高ストリンジェンシー条件下でプローブと結合すると言う。
【０１７４】
ストリンジェント条件下で相互にハイブリダイズしない核酸でも、これらの核酸によりコードされるポリペプチドが実質的に同一である場合には実質的に同一である。これは、例えば遺伝コードに許容される最大コドン縮重を使用して核酸のコピーを作製する場合に該当する。
【０１７５】
ユニークサブ配列
所定側面では、本発明は本明細書に開示するＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳの配列から選択される核酸中にユニークサブ配列を含む核酸を提供する。ユニークサブ配列は任意公知Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ核酸配列に対応する核酸に比較してユニークである。例えばデフォルトパラメーターに設定したＢＬＡＳＴを使用してアラインメントを実施することができる。例えば本発明の核酸又は関連核酸を同定するためのプローブとして任意ユニークサブ配列が有用である。
【０１７６】
同様に、本発明は本明細書に開示するＯ−ＲＳの配列から選択されるポリペプチド中にユニークサブ配列を含むポリペプチドを含む。この場合には、ユニークサブ配列は任意公知ポリペプチド配列に対応するポリペプチドに比較してユニークである。
【０１７７】
本発明はＯ−ＲＳの配列から選択されるポリペプチド中のユニークサブ配列をコードするユニークコーディングオリゴヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするターゲット核酸も提供し、この場合には、ユニークサブ配列は対照ポリペプチド（例えば本発明のシンテターゼを例えば突然変異により誘導した元の親配列）の任意のものに対応するポリペプチドに比較してユニークである。ユニーク配列は上記のように決定される。
【０１７８】
配列比較、一致度及び相同度
２個以上の核酸又はポリペプチド配列に関して「一致」又は「一致度百分率」なる用語は２個以上の配列又はサブ配列を最大限に対応するように対比及び整列させ、以下に記載する配列比較アルゴリズム（又は当業者に利用可能な他のアルゴリズム）の１種を使用するか又は目視により測定した場合に相互に同一であるか又は同一のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの百分率が特定値であることを意味する。
【０１７９】
２個以上の核酸又はポリペプチド（例えばＯ−ｔＲＮＡもしくはＯ−ＲＳをコードするＤＮＡ又はＯ−ＲＳのアミノ酸配列）に関して「実質的に一致」なる用語は２個以上の配列又はサブ配列を最大限に対応するように対比及び整列させ、配列比較アルゴリズムを使用するか又は目視により測定した場合にヌクレオチド又はアミノ酸残基一致度が少なくとも約６０％、約８０％、約９０〜９５％、約９８％、約９９％又はそれ以上であることを意味する。このような「実質的に一致」する配列は一般に実際の起源が記載されていなくても「相同」であるとみなす。少なくとも約５０残基長の配列の領域にわたって「実質的一致」が存在していることが好ましく、少なくとも約１００残基長の領域がより好ましく、少なくとも約１５０残基又は比較する２配列の全長にわたって配列が実質的に一致していることが最も好ましい。
【０１８０】
蛋白質及び／又は蛋白質配列は共通の祖先蛋白質又は蛋白質配列から天然又は人工的に誘導される場合に「相同」である。同様に、核酸及び／又は核酸配列は共通の祖先核酸又は核酸配列から天然又は人工的に誘導される場合に相同である。例えば、１個以上のセレクターコドンを含むように任意天然核酸を利用可能な任意突然変異誘発法により改変することができる。この突然変異誘発した核酸を発現させると、１個以上の非天然アミノ酸を含むポリペプチドをコードする。突然変異法は当然のことながら更に１個以上の標準コドンを変異させ、得られる突然変異体蛋白質の１個以上の標準アミノ酸も変異させることができる。相同性は一般に２個以上の核酸又は蛋白質（又はその配列）間の配列類似度から推定される。相同性の判定に有用な配列間類似度の厳密な百分率は該当核酸及び蛋白質により異なるが、通常は２５％程度の低い配列類似度を使用して相同性を判定する。例えば３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％以上のより高レベルの配列類似度を使用して相同性を判定することもできる。配列類似度百分率の決定方法（例えばデフォルトパラメーターを使用するＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ）は本明細書に記載し、一般に利用可能である。
【０１８１】
配列比較及び相同性判定には、一般にある配列を参照配列としてこれに試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合には、試験配列と参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じてサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。こうすると、配列比較アルゴリズムは指定プログラムパラメーターに基づいて参照配列に対して試験配列の配列一致度百分率を計算する。
【０１８２】
比較のための最適な配列アラインメントは例えばＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性探索法、これらのアルゴリズムのコンピューターソフトウェア（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）、又は目視（一般にＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００６年補遺）参照）により実施することができる。
【０１８３】
配列一致度及び配列類似度百分率を決定するのに適したアルゴリズムの１例はＡｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩウェブサイト参照）から公共入手可能である。このアルゴリズムはデータベース配列中の同一長さの単語と整列した場合に所定の正の閾値スコアＴと一致するか又はこれを満足するクエリー配列中の長さＷの短い単語を識別することによりまず高スコア配列対（ＨＳＰ）を識別する。Ｔを隣接単語スコア閾値と言う（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）。これらの初期隣接単語ヒットをシードとして検索を開始し、これらの単語を含むもっと長いＨＳＰを探索する。次に、累積アラインメントスコアを増加できる限り、単語ヒットを各配列に沿って両方向に延長する。ヌクレオチド配列の場合にはパラメーターＭ（１対のマッチ残基のリウォードスコア、常に＞０）及びＮ（ミスマッチ残基のペナルティースコア、常に＜０）を使用して累積スコアを計算する。アミノ酸配列の場合には、スコアリングマトリクスを使用して累積スコアを計算する。累積アラインメントスコアがその最大到達値から量Ｘだけ低下するか、累積スコアが１カ所以上の負スコア残基アラインメントの累積によりゼロ以下になるか、又はどちらかの配列の末端に達したら各方向の単語ヒットの延長を停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ及びＸはアラインメントの感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は語長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、カットオフ１００、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列用として、ＢＬＡＳＴＰプログラムは語長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスをデフォルトとして使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５参照）。
【０１８４】
配列一致度百分率の計算に加え、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２配列間の類似性の統計分析も実施する（例えばＫａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７（１９９３）参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１尺度は２個のヌクレオチド又はアミノ酸配列間に偶然にマッチが起こる確率を示す最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸を参照核酸に比較した場合の最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合に核酸は参照核酸に類似しているとみなす。
【０１８５】
突然変異誘発及び他の分子生物学技術
本発明のポリヌクレオチドとポリペプチド及び本発明で使用されるポリヌクレオチドとポリペプチドは分子生物学技術を使用して操作することができる。分子生物学技術について記載している一般教科書としてはＢｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，“Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ  １５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００６年補遺）が挙げられる。これらの教科書は突然変異誘発法、ベクターの使用、プロモーターに加え、例えば非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を生産するためのセレクターコドンを含む遺伝子、直交ｔＲＮＡ、直交シンテターゼ及びその対の作製に関連する他の多くの関連事項について記載している。
【０１８６】
例えばｔＲＮＡ分子を突然変異させるため、ｔＲＮＡのライブラリーを作製するため、シンテターゼのライブラリーを作製するため、非天然アミノ酸をコードするセレクターコドンを該当蛋白質又はポリペプチドに挿入するために、本発明では各種突然変異誘発法を使用する。これらの方法としては限定されないが、部位特異的、ランダム点突然変異誘発、相同組換え、ＤＮＡシャフリングもしくは他の再帰的突然変異誘発法、キメラ構築、ウラシル含有鋳型を使用する突然変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発、ギャップデュプレクスＤＮＡを使用する突然変異誘発等、又はその任意組み合わせが挙げられる。他の適切な方法としては点ミスマッチ修復、修復欠損宿主株を使用する突然変異誘発、制限−選択及び制限−精製、欠失突然変異誘発、完全遺伝子合成による突然変異誘発、２本鎖切断修復等が挙げられる。例えばキメラ構築物を使用する突然変異誘発も本発明に含まれる。１態様では、天然分子又は改変もしくは突然変異させた天然分子の既知情報（例えば配列、配列比較、物性、結晶構造等）に基づいて突然変異誘発を誘導することができる。
【０１８７】
本発明のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドを組込んだ構築物（例えばクローニングベクターや発現ベクター等の本発明のベクター）で宿主細胞を遺伝子組換え（例えば形質転換、形質導入又はトランスフェクション）する。例えば、直交ｔＲＮＡ、直交ｔＲＮＡシンテターゼ、及び修飾すべき蛋白質のコーディング領域を所望宿主細胞で機能的な遺伝子発現制御エレメントに機能的に連結する。典型的なベクターは転写及び翻訳ターミネーターと、転写及び翻訳開始配列と、特定ターゲット核酸の発現の調節に有用なプロモーターを含む。ベクターは場合により少なくとも１個の独立ターミネーター配列と、真核生物又は原核生物又は両者（例えばシャトルベクター）でカセットの複製を可能にする配列と、原核系と真核系の両者の選択マーカーを含む包括的発現カセットを含む。ベクターは原核生物、真核生物、又は好ましくは両者での複製及び／又は組込みに適している。Ｇｉｌｉｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ  ８：８１（１９７９）；Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２８：７３１（１９８７）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．６４３５：１０（１９９５）；Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，“Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ  １５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１；及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００６年補遺）参照。ベクターは例えばプラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドコンジュゲートの形態とすることができる。ベクターはエレクトロポレーション（Ｆｒｏｍら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２，５８２４（１９８５））、ウイルスベクターによる感染、核酸を小ビーズもしくは粒子のマトリックスに埋込むか又は表面に付着させて小粒子形態で高速射入する方法（Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２７，７０−７３（１９８７））、及び／又は同等方法等の標準方法により細胞及び／又は微生物に導入する。
【０１８８】
大腸菌でアンバー終止コドン（ＵＡＧ）に応答して非天然アミノ酸を蛋白質に部位特異的に組込むための非常に効率的で万能の単一プラスミドシステムを開発した。新規システムでは、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉサプレッサーｔＲＮＡｔｙｒ（ＣＵＡ）とチロシルｔＲＮＡシンテターゼの対は大半の大腸菌発現ベクターと適合可能な単一プラスミドでコードされる。最適二次構造とｔＲＮＡプロセシングのためにｐｒｏＫプロモーター及びターミネーターの制御下のモノシストロン性ｔＲＮＡオペロンを構築した。シンテターゼの突然変異形ｇｌｎＳプロモーターを導入すると、抑圧効率と忠実度の両者が有意に増加した。ｔＲＮＡ遺伝子のマルチコピーとシンテターゼの特異的突然変異（Ｄ２８６Ｒ）でも抑圧効率の増加が得られた（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら（２００３），“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｔＲＮＡ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｙｒｏｓｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ，”Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１０（６）：４２５−４３２）。蛋白質機能及び構造の研究におけるそのユニークな有用性が従来認められている数種類の異なる非天然アミノ酸が非常に効率的且つ正確に組込まれたことからこの最適化システムの汎用性も実証された。
【０１８９】
クローニングに有用な細菌とバクテリオファージのカタログは例えばＡＴＣＣから得られ、例えばＡＴＣＣから刊行されたＴｈｅ  ＡＴＣＣ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ（１９９６）Ｇｈｅｒｎａら（編）が挙げられる。シーケンシング、クローニング及び分子生物学の他の側面のその他の基本手順と基礎理論事項もＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００６年補遺）；及びＷａｔｓｏｎら（１９９２）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，第２版，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，ＮＹに記載されている。更に、Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＴＸ）、Ｔｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒａｍｏｎａ，ＣＡ）、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ  Ｉｎｃ．（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）及び他の多数の企業等の各種販売会社からほぼ任意核酸（及び標準又は標準外を問わずほぼ任意標識核酸）をオーダーメード又は標準注文することができる。
【０１９０】
遺伝子組換えした宿主細胞は例えばスクリーニング段階、プロモーター活性化又は形質転換細胞選択等の操作に合うように適宜改変した慣用栄養培地で培養することができる。これらの細胞は場合によりトランスジェニック生物で培養することができる。（例えばその後の核酸単離のための）例えば細胞単離及び培養に有用な他の文献としては、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第３版，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋとその引用文献；Ｐａｙｎｅら（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇａｍｂｏｒｇ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（編）（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）及びＡｔｌａｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｓ（編）Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬが挙げられる。
【０１９１】
該当蛋白質及びポリペプチド
特定位置に非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を細胞で生産する方法も本発明の特徴である。例えば、１方法は、少なくとも１個のセレクターコドンを含み、蛋白質をコードする核酸を含む細胞を適当な培地で増殖させる段階と、非天然アミノ酸を提供する段階を含み、細胞は更に、細胞で機能し、セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む。この方法により生産された蛋白質も本発明の特徴である。
【０１９２】
所定態様では、Ｏ−ＲＳは発現系において如何なる内在ｔＲＮＡよりもコグネイトＯ−ｔＲＮＡのアミノアシル化を優先する。Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳが等モル濃度で存在する場合にＯ−ＲＳにより負荷されるＯ−ｔＲＮＡと内在ｔＲＮＡの相対比は１：１を上回り、好ましくは少なくとも約２：１、より好ましくは５：１、更に好ましくは１０：１、更に好ましくは２０：１、更に好ましくは５０：１、更に好ましくは７５：１、更に好ましくは９５：１、９８：１、９９：１、１００：１、５００：１、１，０００：１、５，０００：１又はそれ以上である。
【０１９３】
本発明は非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を含有する組成物も提供する。所定態様では、蛋白質は治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分のアミノ酸配列と少なくとも７５％一致するアミノ酸配列を含む。
【０１９４】
本発明の組成物と本発明の方法により作製された組成物は場合により細胞に導入する。その後、本発明のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対又は個々の成分を宿主系の翻訳機構で使用することができ、その結果として、非天然アミノ酸が蛋白質に組込まれる。国際公開ＷＯ２００４／０９４５９３、出願日２００４年４月１６日、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」、及びＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」はこのプロセスを記載しており、本明細書に援用する。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を宿主（例えば大腸菌細胞）に導入すると、前記対はセレクターコドンに応答して７−ヒドロキシクマリンエチルグリシン等の非天然アミノ酸のｉｎ  ｖｉｖｏ蛋白質組込みを誘導する。系に付加される非天然アミノ酸は合成アミノ酸（例えばフェニルアラニン又はチロシン誘導体）とすることができ、外部から増殖培地に添加することができる。場合により、本発明の組成物はｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系に導入してもよいし、ｉｎ  ｖｉｖｏ系に導入してもよい。
【０１９５】
本発明の細胞は非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を大量の有用な量で合成することができる。所定側面では、組成物は場合により、非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を例えば少なくとも１０μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも７５μｇ、少なくとも１００μｇ、少なくとも２００μｇ、少なくとも２５０μｇ、少なくとも５００μｇ、少なくとも１ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ、又はそれ以上、あるいはｉｎ  ｖｉｖｏ蛋白質生産方法で達成可能な量で含有する（組換え蛋白質生産及び精製に関する詳細は本明細書に記載する）。別の側面では、蛋白質は場合により例えば細胞溶解液、緩衝液、医薬緩衝液、又は他の懸濁液中（例えば約１ｎｌ〜約１００Ｌの任意の容量中）に例えば少なくとも１０μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも５０μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも７５μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも１００μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも２００μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも２５０μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも５００μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも１ｍｇ蛋白質／ｌ、又は少なくとも１０ｍｇ蛋白質／ｌ以上の濃度で組成物中に存在する。少なくとも１種の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を細胞で大量（例えば他の方法、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳で一般に可能な量よりも多量）に生産することも本発明の特徴である。
【０１９６】
非天然アミノ酸の組込みは例えばサイズ、酸性度、求核性、水素結合、疎水性、プロテアーゼ標的部位接近性、（例えば蛋白質アレーのための）部分へのターゲット、ラベル又は反応基の組込み等を変化させるように例えば蛋白質構造及び／又は機能の変化を適応させるために実施することができる。非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質は触媒性又は物性を強化するか又は全く新規にすることができる。例えば、非天然アミノ酸を蛋白質に組込むことにより、場合により毒性、生体分布、構造的性質、分光学的性質、化学的及び／又は光化学的性質、触媒能、半減期（例えば血清半減期）、他の分子との（例えば共有又は非共有結合的）反応性等の性質を改変する。少なくとも１個の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を含有する組成物は例えば新規治療薬、診断薬、触媒酵素、産業用酵素、結合蛋白質（例えば抗体）、及び例えば蛋白質構造と機能の研究に有用である。例えばＤｏｕｇｈｅｒｔｙ，（２０００）Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｓ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４：６４５−６５２参照。
【０１９７】
本発明の所定側面では、組成物は少なくとも１個、例えば少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、又は少なくとも１０個以上の非天然アミノ酸を組込んだ少なくとも１種の蛋白質を含有する。非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよく、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０種以上の異なる非天然アミノ酸を組込んだ１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以上の異なる部位が蛋白質に存在することができる。別の側面では、組成物は蛋白質に存在する特定アミノ酸の全部よりは少ないが少なくとも１個が非天然アミノ酸である蛋白質を含有する。２個以上の非天然アミノ酸を組込んだ所与蛋白質では、非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよい（例えば蛋白質は２個以上の異なる型の非天然アミノ酸を組込んでもよいし、２個の同一非天然アミノ酸を組込んでもよい）。３個以上の非天然アミノ酸を組込んだ所与蛋白質では、非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよいし、同一種の複数の非天然アミノ酸と少なくとも１個の別の非天然アミノ酸の組み合わせでもよい。
【０１９８】
本明細書に記載する組成物と方法を使用して非天然アミノ酸を組込んだほぼ任意蛋白質（又はその部分）（及び例えば１個以上のセレクターコドンを含む対応する任意コーディング核酸）を作製することができる。数十万種の公知蛋白質を列挙するには及ばないが、例えば該当翻訳系に１個以上の適当なセレクターコドンを含むように利用可能な任意突然変異法を調整することにより、１個以上の非天然アミノ酸を組込むように公知蛋白質の任意のものを改変することができる。公知蛋白質の一般的な配列寄託機関としてはＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ及びＮＣＢＩが挙げられる。他の寄託機関もインターネットを検索することにより容易に確認できる。
【０１９９】
一般に、蛋白質は入手可能な任意蛋白質（例えば治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分等）と例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％以上一致しており、１個以上の非天然アミノ酸を含む。１個以上の非天然アミノ酸を組込むように改変することができる治療用、診断用、及び他の蛋白質の例としては限定されないが、国際公開ＷＯ２００４／０９４５９３、出願日２００４年４月１６日、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」；及びＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」に記載されているものが挙げられる。１個以上の非天然アミノ酸を組込むように改変することができる治療用、診断用、及び他の蛋白質の例としては限定されないが、例えばα１アンチトリプシン、アンジオスタチン、抗血友病因子、抗体（抗体の詳細については後述する）、アポリポ蛋白質、アポ蛋白質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン（例えばＴ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、Ｇｒｏ−ａ、Ｇｒｏ−ｂ、Ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ−４、ＭＩＧ）、カルシトニン、ＣＣケモカイン（例えば単球化学誘引蛋白質−１、単球化学誘引蛋白質−２、単球化学誘引蛋白質−３、単球炎症性蛋白質−１α、単球炎症性蛋白質−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２）、ＣＤ４０リガンド、Ｃキットリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン（例えば上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα／ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１δ、ＭＣＰ−１）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン（「ＥＰＯ」）、表皮剥離毒素Ａ及びＢ、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、増殖因子、ヘッジホッグ蛋白質（例えばソニック、インディアン、デザート）、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヒルジン、ヒト血清アルブミン、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、インターフェロン（例えばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）、インターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２等）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病阻害因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成蛋白質、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン（例えばヒト成長ホルモン）、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、発熱外毒素Ａ、Ｂ及びＣ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１、可溶性インターロイキン受容体（ＩＬ−１、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５）、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原即ちブドウ球菌エンテロトキシン（ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、毒素性ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ−１）、チモシンα１、組織プラスミノーゲンアクチベーター、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦβ）、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＥＦ）、ウロキナーゼ並びに他の多数の蛋白質が挙げられる。
【０２００】
本明細書に記載する非天然アミノ酸のｉｎ  ｖｉｖｏ蛋白質組込み用組成物及び方法を使用して作製することができる蛋白質の１類としては転写モジュレーター又はその部分が挙げられる。転写モジュレーターの例としては細胞増殖、分化、制御等を調節する遺伝子及び転写モジュレーター蛋白質が挙げられる。転写モジュレーターは原核生物、ウイルス及び真核生物（例えば真菌、植物、酵母、昆虫、及び哺乳動物を含む動物）に存在し、広範な治療ターゲットを提供する。当然のことながら、発現及び転写アクチベーターは例えば受容体との結合、シグナル伝達カスケードの刺激、転写因子の発現調節、プロモーターやエンハンサーとの結合、プロモーターやエンハンサーと結合する蛋白質との結合、ＤＮＡ巻き戻し、プレｍＲＮＡスプライシング、ＲＮＡポリアデニル化及びＲＮＡ分解等の多数のメカニズムにより転写を調節する。
【０２０１】
本発明の蛋白質（例えば１個以上の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質）の１類としてはサイトカイン、炎症性分子、増殖因子、その受容体、及び腫瘍遺伝子産物等の生理活性蛋白質が挙げられ、例えばインターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−８等）、インターフェロン、ＦＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＮＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＳＣＦ／ｃ−キット、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１及びヒアルリン／ＣＤ４４；シグナル伝達分子及び対応する腫瘍遺伝子産物（例えばＭｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ及びＭｅｔ）；並びに転写アクチベーター及びサプレッサー（例えばｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ、及びステロイドホルモン受容体（例えばエストロゲン、プロゲステロン、テストステロン、アルドステロン、ＬＤＬ受容体リガンド及びコルチコステロン））が挙げられる。
【０２０２】
少なくとも１個の非天然アミノ酸を組込んだ酵素（例えば産業用酵素）又はその部分も本発明により提供される。酵素の例としては限定されないが、例えばアミダーゼ、アミノ酸ラセマーゼ、アシラーゼ、デハロゲナーゼ、ジオキシゲナーゼ、ジアリールプロパンペルオキシダーゼ、エピメラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、エステラーゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、グルコースイソメラーゼ、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ハロペルオキシダーゼ、モノオキシゲナーゼ（例えばｐ４５０類）、リパーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、ニトリルヒドラターゼ、ニトリラーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、スブチリシン、トランスアミナーゼ及びヌクレアーゼが挙げられる。
【０２０３】
これらの蛋白質の多くは市販されており（例えばＳｉｇｍａ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓカタログと価格表参照）、対応する蛋白質配列と遺伝子及び、一般に多くのその変異体も周知である（例えばＧｅｎｂａｎｋ参照）。例えば１種以上の該当治療、診断又は酵素特性に関して蛋白質を改変するように本発明に従って１個以上の非天然アミノ酸を挿入することにより前記蛋白質の任意のものを改変することができる。治療関連特性の例としては血清半減期、貯蔵半減期、安定性、免疫原性、治療活性、（例えば非天然アミノ酸へのレポーター基（例えばラベル又はラベル結合部位）の付加による）検出性、ＬＤ５０又は他の副作用の低減、胃管を経由して体内に導入できること（例えば経口利用性）等が挙げられる。診断特性の例としては貯蔵半減期、安定性、診断活性、検出性等が挙げられる。該当酵素特性の例としては貯蔵半減期、安定性、酵素活性、産生能等が挙げられる。
【０２０４】
他の各種蛋白質も本発明の組成物と方法を使用して１個以上の非天然アミノ酸を組込むように改変することができる。例えば、本発明は例えば感染性真菌（例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ種）；細菌、特に病原細菌モデルとして利用できる大腸菌や医学的に重要な細菌（例えばＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ（例えばａｕｒｅｕｓ）又はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ（例えばｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））；原生動物（例えば胞子虫類（例えばＰｌａｓｍｏｄｉａ）、根足虫類（例えばＥｎｔａｍｏｅｂａ）及び鞭毛虫類（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ、Ｇｉａｒｄｉａ等））；ウイルス（例えば（＋）ＲＮＡウイルス（例えばポックスウイルス（例えばワクシニア）、ピコルナウイルス（例えばポリオ）、トガウイルス（例えば風疹）、フラビウイルス（例えばＨＣＶ）、及びコロナウイルス）、（−）ＲＮＡウイルス（例えばラブドウイルス（例えばＶＳＶ）、パラミクソウイルス（例えばＲＳＶ）、オルトミクソウイルス（例えばインフルエンザ）、ブンヤウイルス及びアレナウイルス）、ｄｓＤＮＡウイルス（例えばレオウイルス）、ＲＮＡ→ＤＮＡウイルス（即ちレトロウイルス、例えばＨＩＶ及びＨＴＬＶ）、及び所定のＤＮＡ→ＲＮＡウイルス（例えばＢ型肝炎））に由来する蛋白質において、１種以上のワクチン蛋白質中の１種以上の天然アミノ酸を非天然アミノ酸で置換することができる。
【０２０５】
昆虫耐性蛋白質（例えばＣｒｙ蛋白質）、澱粉及び脂質産生酵素、植物及び昆虫毒素、毒素耐性蛋白質、マイコトキシン解毒蛋白質、植物成長酵素（例えばリブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ、「ＲＵＢＩＳＣＯ」）、リポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）及びホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシラーゼ等の農業関連蛋白質も非天然アミノ酸修飾の適切なターゲットである。
【０２０６】
所定態様では、本発明の方法及び／又は組成物における該当蛋白質又はポリペプチド（又はその部分）は核酸によりコードされる。一般に、核酸は少なくとも１個のセレクターコドン、少なくとも２個のセレクターコドン、少なくとも３個のセレクターコドン、少なくとも４個のセレクターコドン、少なくとも５個のセレクターコドン、少なくとも６個のセレクターコドン、少なくとも７個のセレクターコドン、少なくとも８個のセレクターコドン、少なくとも９個のセレクターコドン、１０個以上のセレクターコドンを含む。
【０２０７】
該当蛋白質又はポリペプチドをコードする遺伝子は例えば非天然アミノ酸を組込むために１個以上のセレクターコドンを付加するように本明細書の「突然変異誘発及び他の分子生物学技術」のセクションに記載する当業者に周知の方法を使用して突然変異誘発することができる。例えば、１個以上のセレクターコドンを付加するように該当蛋白質の核酸を突然変異誘発し、１個以上の非天然アミノ酸を挿入できるようにする。本発明は例えば少なくとも１個の非天然アミノ酸を組込んだ任意蛋白質のこのような任意変異体（例えば突然変異体、変形）を含む。同様に、本発明は対応する核酸、即ち１個以上の非天然アミノ酸をコードする１個以上のセレクターコドンを含む任意核酸も含む。
【０２０８】
非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を作製するためには、直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対による非天然アミノ酸のｉｎ  ｖｉｖｏ組込みに適した宿主細胞及び生物を使用することができる。直交ｔＲＮＡ、直交ｔＲＮＡシンテターゼを発現する１個以上のベクターと、修飾すべき蛋白質をコードするベクターで宿主細胞を遺伝子組換え（例えば形質転換、形質導入又はトランスフェクション）する。これらの成分の各々を同一ベクターに配置してもよいし、各々別々のベクターに配置してもよいし、２成分を第１のベクターに配置し、第３の成分を第２のベクターに配置してもよい。ベクターは例えばプラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドコンジュゲートの形態とすることができる。
【０２０９】
免疫反応性によるポリペプチドの定義
本発明のポリペプチドは種々の新規ポリペプチド配列（例えば本発明の翻訳系で合成される蛋白質の場合には非天然アミノ酸を含み、例えば新規シンテターゼの場合には標準アミノ酸の新規配列を含むポリペプチド）を提供するので、ポリペプチドは例えばイムノアッセイで認識することができる新規構造特徴も提供する。本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗血清の作製及び前記抗血清と結合するポリペプチドも本発明の特徴である。本明細書で使用する「抗体」なる用語は限定されないが、検体（抗原）と特異的に結合してこれを認識する１又は複数の免疫グロブリン遺伝子又はそのフラグメントにより実質的にコードされるポリペプチドを意味する。例としてはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、及び１本鎖抗体等が挙げられる。Ｆａｂフラグメントやファージディスプレイを含む発現ライブラリーにより作製されたフラグメント等の免疫グロブリンフラグメントも本明細書で使用する「抗体」なる用語に含まれる。抗体構造及び用語については、例えばＰａｕｌ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄ．，１９９９，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照。
【０２１０】
イムノアッセイ用抗血清を作製するためには、免疫原性ポリペプチドの１種以上を本明細書に記載するように作製し、精製する。例えば、組換え蛋白質を組換え細胞で作製することができる。（マウスの仮想遺伝子一致により結果の再現性が高いのでこのアッセイで使用する）近交系マウスに標準マウス免疫プロトコールに従って標準アジュバント（例えばフロイントアジュバント）と共に免疫原性蛋白質を免疫する（抗体作製、イムノアッセイフォーマット及び特異的免疫反応性を測定するために使用可能な条件の標準解説については例えばＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）。蛋白質、抗体、抗血清等に関するその他の詳細は国際公開ＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」；ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」；ＷＯ２００４／０３５６０５、発明の名称「糖蛋白質合成（ＧＬＹＣＯＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）」；及びＷＯ２００４／０５８９４６、発明の名称「蛋白質アレー（ＰＲＯＴＥＩＮ  ＡＲＲＡＹＳ）」に記載されている。
【０２１１】
Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ及びＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の使用
本発明の組成物と本発明の方法により作製された組成物は場合により細胞に導入する。その後、本発明のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対又は個々の成分を宿主系の翻訳機構で使用することができ、その結果として、非天然アミノ酸が蛋白質に組込まれる。国際公開ＷＯ２００２／０８５９２３、発明者Ｓｃｈｕｌｔｚら、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」はこのプロセスを記載しており、本明細書に援用する。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を宿主（例えば大腸菌又は酵母）に導入すると、前記対はセレクターコドン（例えばアンバーナンセンスコドン）に応答して外部から増殖培地に添加することができる非天然アミノ酸の蛋白質（例えばミオグロビン試験蛋白質又は治療用蛋白質）へのｉｎ  ｖｉｖｏ組込みを誘導する。場合により、本発明の組成物はｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系に導入してもよいし、細胞内ｉｎ  ｖｉｖｏ系に導入してもよい。非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質は多様な用途の任意のものに使用することができる。例えば、蛋白質に組込まれた非天然部分は例えば、他の蛋白質、小分子（例えばラベルや色素）及び／又は生体分子との架橋をはじめとする多様な修飾の任意のもののターゲットとして利用することができる。これらの修飾により、非天然アミノ酸の組込みの結果、治療用蛋白質を改善することができ、更に酵素の触媒機能を改変又は改善するために使用することもできる。所定側面では、非天然アミノ酸の蛋白質組込みとその後の修飾は蛋白質構造、他の蛋白質との相互作用等の研究を助長することができる。
【０２１２】
キット
キットも本発明の特徴である。例えば、少なくとも１個の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を細胞で生産するためのキットが提供され、前記キットはＯ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、及び／又はＯ−ｔＲＮＡ、及び／又はＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチド配列、及び／又はＯ−ＲＳを収容する少なくとも１個の容器を含む。１態様では、キットは更に非天然アミノ酸７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシンを含む。別の態様では、キットは更に蛋白質及び／又は宿主細胞を作製するための説明書を含む。
【０２１３】
以下、実施例により本発明を例証するが、これらの実施例により特許請求の範囲に記載する発明を限定するものではない。特許請求の範囲に記載する発明の範囲から逸脱せずに変更可能な種々の非必須パラメーターが当業者に自明である。当然のことながら、本明細書に記載する実施例及び態様は例証の目的に過ぎず、これらの記載に鑑みて種々の変形又は変更が当業者に想到され、このような変形又は変更も本願の精神及び範囲と特許請求の範囲に含むものとする。
【実施例１】
【０２１４】
一般方法
全化学物質は商業的供給業者から入手し、それ以上精製せずに使用した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルはＢｒｕｋｅｒ  ＡＭＸ−４００多核分光計（Ｂｒｕｋｅｒ  ＢｉｏＳｐｉｎ  ＧｍｂＨ，Ｒｈｅｉｎｓｔｅｔｔｅｎ／Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，ドイツ）で記録し、テトラメチルシランに対する化学シフトを報告した。蛋白質質量スペクトルはＳｃｒｉｐｐｓ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）で取得した。
【０２１５】
プラスミドと細胞株
プラスミドｐＢＫ−ｌｉｂ５は残基Ｔｙｒ３２、Ｌｅｕ６５、Ｐｈｅ１０８、Ｇｌｎ１０９、Ａｓｐ１５８及びＬｅｕ１６２をランダムに突然変異させ、更にＨｉｓ７０をＧＩｙに突然変異させ、Ａｌａ６７をＡｌａ又はＧｌｙに突然変異させたＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＭｊＴｙｒＲＳ）突然変異体のライブラリーをコードする。プラスミドｐＲＥＰ（２）／ＹＣはＭｊｔＲＮＡＣＵＡＴｙｒと、残基１１２にＴＡＧコドンをもつクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子と、Ｔ７プロモーターの制御下のＧＦＰ遺伝子と、残基１及び１０７にＴＡＧコドンをもつ突然変異体Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼと、Ｔｅｔｒマーカーをコードする。プラスミドｐＬＷＪ１７Ｂ３はｌｐｐプロモーター及びｒｒｎＣターミネーターの制御下のＭｊｔＲＮＡＣＵＡＴｙｒと、ａｒａプロモーターの制御下の（残基２、４４及び６５に３個のアンバーコドンをもつ）バルナーゼ遺伝子と、Ａｍｐｒマーカーをコードする。プラスミドｐＢＡＤ／ＪＹＡＭＢ−４ＴＡＧ−Ｍｙｏはアラビノースプロモーター及びｒｒｎＢターミネーターをもつ突然変異体マッコウクジラミオグロビン遺伝子と、ｌｐｐプロモーター及びｒｒｎＣターミネーターをもつＭｊｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡと、テトラサイクリン耐性マーカーをコードする。非天然アミノ酸Ｌ−（７−ヒドロキシクマリン−４−イル）エチルグリシンを組込んだ蛋白質を発現させた試験には、大腸菌株ＧｅｎｅＨｏｇ（登録商標）−Ｆｉｓ，Ｆ−ｍｃｒＡΔ（ｍｒｒ−ｈｓｄＲＭＳ−ｍｃｒＢＣ）８０ｌａｃＺΔＭ１５  ΔｌａｃＸ７４  ｒｅｃＡ１  ｅｎｄＡ１  ａｒａＤ１３９Δ（ａｒａ−ｌｅｕ）７６９７  ｇａｌＵ  ｇａｌＫ  λｒｐｓＬ（ＳｔｒＲ）ｎｕｐＧ，ｆｉｓ：：Ｔｎ７（ＤＨＦＲ）を使用した。
【実施例２】
【０２１６】
非天然アミノ酸Ｌ−（７−ヒドロキシクマリン−４−イル）エチルグリシンの合成
非天然クマリンアミノ酸Ｌ−（７−ヒドロキシクマリン−４−イル）エチルグリシン（別称７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシン；図１，構造１参照）は先ずＮ−α−Ｃｂｚ−Ｌ−グルタミン酸α−ベンジルエステルを側鎖β−ケトエステルに変換した後にメタンスルホン酸中でレゾルシノールと反応させ（ｖｏｎ  Ｐｅｃｈｍａｎｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ；Ｂｒｕｎら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．，（２００４）４３：３４３２−３４３６）、アミノ酸Ｌ−（７−ヒドロキシクマリン−４−イル）エチルグリシンを得ることにより合成した。これらの段階を以下に詳述する。
【０２１７】
ステップ１−マロン酸エチルマグネシウムの合成
１．５Ｍ塩化マグネシウムと３Ｍマロン酸エチルカリウムの水溶液に撹拌下にイソプロパノール５容量を加えた。濾過後、マロン酸エチルマグネシウムを減圧乾燥した。
【０２１８】
ステップ２−（２Ｓ）−２−ベンジルオキシカルボニルアミノ−５−オキソヘプタンジオン酸１−ベンジルエステル７−エチルエステル（図１，構造３）の合成
Ｚ−Ｇｌｕ−Ｏｂｚｌ（Ｎ−α−Ｃｂｚ−Ｌ−グルタミン酸α−ベンジルエステル）（５ｇ，１３．４６ｍｍｏｌ）を室温の無水ＴＨＦ  ５０ｍｌに溶かした。Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミタゾール（１．１当量）をゆっくりと加えた後、混合物を室温で２時間撹拌した。マロン酸エチルマグネシウム（０．５５当量）を加え、混合物を室温で一晩撹拌した。生成物をエーテルで抽出し、１０％  ＮａＨＣＯ３、水及びブラインで洗浄した。３を含有する残渣をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン５０：５０）により精製し、ロータリーエバポレーターで濃縮し、白色固体を４０％収率で得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１．２６（ｔ，Ｊ＝７．２，３Ｈ），１．９−２．０１（ｍ，１Ｈ），２．１−２．２８（ｍ，１Ｈ），２．５−２．７（ｍ，２Ｈ），３．３７（ｓ，２Ｈ），４．１８（ｑ，Ｊ＝７．２，２Ｈ），４．４１（ｓ，１Ｈ），５．１１（ｓ，２Ｈ），５．１８（ｓ，２Ｈ），５．４４（ｄ，Ｊ＝８，１Ｈ），７．２５−７．４１（ｍ，１０Ｈ）。ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ２４Ｈ２ＮＯ７の計算値（Ｍ＋Ｈ＋）４４２．１８，実測値４４２．０。
【０２１９】
ステップ３−Ｌ−（７−ヒドロキシクマリン−４−イル）エチルグリシン（図１，構造１）の合成
前段階からの（２Ｓ）−２−ベンジルオキシカルボニルアミノ−５−オキソヘプタンジオン酸１−ベンジルエステル７−エチルエステル（２．３５ｇ，５ｍｍｏｌ）をメタンスルホン酸（２０ｍｌ）中のレゾルシノール（３ｇ，２５ｍｍｏｌ）にゆっくりと加え、室温で２時間撹拌した。次にエーテル５容量を混合物に加え、−３０℃まで冷却した。沈殿を冷エーテルで洗浄し、水に溶かし、濾過し、凍結乾燥した。Ｌ−（７−ヒドロキシクマリン−４−イル）エチルグリシンを逆相ＨＰＬＣにより精製し、茶色固体を５０％収率で得た（ＹＭＣ  ＡＡ１２Ｓ０５２５０３ＷＴカラム，１２ｍｌ／ｍｉｎ流速，１２分間で水中１０％→９０％  ＣＨ３ＣＮ，０．１％  ＴＦＡ（ｗ／ｖ））。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：δ２．０６（ｓ，２Ｈ），２．７０−２．９０（ｍ，２Ｈ），３．８２−４．０（ｍ，１Ｈ），６．０６（ｓ，１Ｈ），６．７５（ｄｄ，Ｊ＝８．８，２．４，１Ｈ），６．８２（ｄ，Ｊ＝２．４，１Ｈ），７．６２（ｄ，Ｊ＝８．８，１Ｈ），８．１７（ｓ，３Ｈ）。ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ１３Ｈ１４ＮＯ５の計算値（Ｍ＋Ｈ＋）２６４．０８Ｄａ，実測値２６４．０Ｄａ。
【実施例３】
【０２２０】
７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシンに特異的な突然変異体シンテターゼの遺伝的選択
７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシンを大腸菌で蛋白質の規定部位に選択的に組込むために、ＴＡＧセレクターコドンに応答して７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシンを特異的に指定する突然変異体Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルアンバーサプレッサーｔＲＮＡ（ＭｊｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡ）／チロシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＭｊＴｙｒＲＳ）対を進化させた。
【０２２１】
ライブラリー構築
非天然アミノ酸７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシンの大きいクマリン側鎖を受容するために、活性部位サイズを増加するように野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ（図９；配列番号２及び３）Ｈｉｓ７０をＧｌｙに突然変異させ、Ａｌａ６７をＡｌａ又はＧｌｙとして固定したＭｊＴｙｒＲＳライブラリーｐＢＫ−ｌｉｂ５を作製した。結合チロシン（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，（２００３）１０：４２５−４３２；Ｚｈａｎｇら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，（２００５）１４：１３４０−１３４９）の極近傍のＴｙｒ−３２、Ｌｅｕ−６５、Ｐｈｅ−１０８、Ｇｌｎ−１０９、Ａｓｐ−１５８及びＬｅｕ−１６２の６個の残基をランダムに突然変異させた。ｐＢＫ−ｌｉｂ５ライブラリーは２×１０９個のＴｙｒＲＳ独立クローンから構成し、標準ＰＣＲ法を使用して構築した。
【０２２２】
ポジティブ／ネガティブ選択
次に、このライブラリーにポジティブ選択とネガティブ選択の両者を数ラウンド実施した。ポジティブ選択では、細胞生存はｐＢＫ−ｌｉｂとＭｊｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡで同時形質転換した細胞を１ｍＭ非天然アミノ酸（ＵＡＡ）とクロラムフェニコールの存在下に増殖させた場合にクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子の許容部位に導入されるアンバーコドンの抑圧に依存する（Ｘｉｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００５）３６：２２７−２３８）。次に、ＭｊｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡと許容部位に３カ所のアンバー突然変異を導入した毒性バルナーゼ蛋白質をコードする遺伝子を含む細胞にポジティブ選択後のクローンを形質転換する。これらの細胞をＵＡＡの不在下に増殖させ、内在アミノ酸を利用するクローンを除去する（ネガティブ選択）。これらのポジティブ選択とネガティブ選択を以下に詳述する。
【０２２３】
ポジティブ選択−ｐＲＥＰ（２）／ＹＣプラスミドを保持する大腸菌ＤＨ１０Ｂをポジティブ選択用宿主株として使用した。細胞をｐＢＫ−ｌｉｂ５ライブラリーで形質転換し、ＳＯＣで１時間回収し、ロイシンを添加したグリセロール最小培地（ＧＭＭＬ）で２回洗浄した後、夫々５０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、１５μｇ／ｍＬ及び１ｍＭのカナマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン及び７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシンを添加したＧＭＭＬ−寒天プレートに置床した。プレートを３７℃で６０時間インキュベートし、生存細胞を掻き取り、プラスミドＤＮＡを抽出し、ゲル電気泳動により精製した。
【０２２４】
ネガティブ選択−次にネガティブ選択プラスミドｐＬＷＪ１７Ｂ３を保持するエレクトロコンピテントセルにｐＢＫ−ｌｉｂ５  ＤＮＡを形質転換し、１時間ＳＯＣで回収した後、０．２％アラビノース、５０μｇ／ｍＬアンピシリン及び５０μｇ／ｍＬカナマイシンを添加したＬＢ−寒天プレートに置床した。次にプレートを３７℃で８〜１２時間インキュベートし、上記のように生存クローンからｐＢＫ−ｌｉｂ５  ＤＮＡを抽出した。
【０２２５】
次にライブラリーに次ラウンドのポジティブ選択を実施した後、ネガティブ選択を実施し、最終ラウンドのポジティブ選択（７０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール）を実施した。この段階で９６個の個体クローンを選択し、９６ウェルプレートでＧＭＭＬ  ５０μＬに懸濁し、ＧＭＭＬプレート２組にリプリカスポットした。一方の組のＧＭＭＬ−寒天プレートにはテトラサイクリン（１５μｇ／ｍＬ）と、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）と、濃度６０、８０、１００及び１２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールと、１ｍＭ  ７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシンを添加した。他方の組のプレートは７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシンを添加せず、使用したクロラムフェニコール濃度を０、２０、４０及び６０μｇ／ｍＬとした以外は同様とした。６０時間３７℃でインキュベーション後に、１個のクローンは１ｍＭ  ７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシンの存在下では１００μｇ／ｍＬクロラムフェニコールで生存するが、７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシンの不在下では２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールでしか生存しないことが判明した。こうして、ポジティブ選択３ラウンドとネガティブ選択２ラウンド後に、７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシンの存在下では１００μｇ／ｍＬクロラムフェニコールで増殖するが、７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシンの不在下では２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールでしか増殖しない単一クローンがこのライブラリーから得られた。
【０２２６】
このクローンＣｏｕＲＳ−Ｄ８を配列決定した処、Ｔｙｒ３２Ｇｌｕ、Ｌｅｕ６５Ｈｉｓ、Ａｌａ６７Ｇｌｙ、Ｈｉｓ７０Ｇｌｙ、Ｐｈｅ１０８Ｔｙｒ、Ｇｌｎ１０９Ｈｉｓ、Ａｓｐ１５８Ｇｌｙ及びＬｅｕ１６２Ｇｌｙ（図９と配列番号４及び５参照）の８カ所の突然変異を含むことが判明した。図９の配列番号４に示す突然変異体シンテターゼポリペプチド配列は突然変異体位置を太字で示す。突然変異体シンテターゼ蛋白質を更に下表にまとめる。
【表２】
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【０２２７】
４個の残基がグリシンに突然変異され、７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシン残基を受容するために十分なスペースを形成している可能性が高い。Ｔｙｒ３２及びＡｓｐ１５８は野生型酵素の結合シロシンとの水素結合も突然変異され、チロシンに対する活性の低下に一致する（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，（２００３）１０：４２５−４３２；Ｚｈａｎｇら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，（２００５）１４：１３４０−１３４９）。
【０２２８】
図８は突然変異体ＭｊＴｙｒＲＳ（ＣｏｕＲＳ−Ｄ８）活性部位の予想構造モデルを示す。モデルは野生型ＭｊＴｙｒＲＳ構造（ｐｄｂコード１Ｊ１Ｕ）を使用して作製した。チロシン基質をＬ−（７−ヒドロキシクマリン−４−イル）エチルグリシンで置換し、以下の突然変異：Ｔｙｒ３２Ｇｌｕ、Ｌｅｕ６５Ｈｉｓ、Ａｌａ６７Ｇｌｙ、Ｈｉｓ７０Ｇｌｙ、Ｐｈｅ１０８Ｔｙｒ、Ｇｌｎ１０９Ｈｉｓ、Ａｓｐ１５８Ｇｌｙ及びＬｅｕ１６２Ｇｌｙを示す。その後、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ（登録商標）ソフトウェア（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．（登録商標），Ｓａｎ，Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，米国）を使用してエネルギー最小化により構造を最適化した。
【実施例４】
【０２２９】
７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシンを組込んだ突然変異体ミオグロビンモデル蛋白質の発現と特性決定
７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシンの蛋白質組込みの効率と忠実度を判定するために、Ｃ末端Ｈｉｓ６タグを含むマッコウクジラミオグロビンの４位（Ｓｅｒ−４）又は３７位（Ｈｉｓ−３７）（図３参照）をアンバーセレクターコドンに置換した。蛋白質発現は最小培地又は１ｍＭ  ７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシンを添加した培地で増殖させた大腸菌で選択シンテターゼＣｏｕＲＳ−Ｄ８とＭｊｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡの存在下に実施した。陰性対照として、７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシンの不在下で同時に蛋白質発現を実施した。この蛋白質産生及び分析について以下に詳述する。
【０２３０】
突然変異体蛋白質産生
ＣｏｕＲＳ−Ｄ８を発現するｐＢＫベクターと共にプラスミドｐＢＡＤ／ＪＹＡＭＢ−４ＴＡＧ−Ｍｙｏ又はｐＢＡＤ／ＪＹＡＭＢ−３７ＴＡＧ−ＭｙｏをＧｅｎｅＨｏｇ（登録商標）−Ｆｉｓ大腸菌細胞に同時形質転換した。カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）とテトラサイクリン（１５μｇ／ｍＬ）を添加した２ＹＴ培地（５ｍＬ）で細胞を増幅した。スターター培養液（１ｍＬ）を使用し、適当な抗生物質と１ｍＭ  ７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシンを添加した液体ＧＭＭＬ又は２ＹＴ  １００ｍＬに接種した。次に、細胞を３７℃でＯＤ６００＝０．５まで増殖させ、０．２％アラビノースの添加により蛋白質発現を誘導した。更に４〜１２時間後、細胞を遠心により回収した。ＴＡＧ４及びＴＡＧ３７ミオグロビン突然変異体を天然条件下でＮｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。次にサンプルを脱塩した。どちらの培地でもＴＡＧ４及びＴＡＧ３７突然変異体ミオグロビンの収量は２ｍｇ／Ｌであった。比較のために、同様の条件下の野生型ミオグロビンの収量は５ｍｇ／Ｌであった。
【０２３１】
蛋白質質量分析
精製ＴＡＧ４突然変異体ミオグロビン蛋白質をＥＳＩ質量分析に付した。突然変異体ミオグロビンのＥＳＩ質量分析によると、平均質量実測値Ｍａｖｇは１８５１１Ｄａであり、１８５１２Ｄａの質量計算値Ｍａｖｇとよく一致した（図６参照）。５％の畳み込み閾値を使用する場合に天然アミノ酸組込みに対応する種はＥＳＩ質量スペクトルで検出されなかったので、蛋白質質量スペクトルのシグナル対ノイズ比から７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシンの最低９５％の組込み純度が得られた。検出閾値はその存在率が主ピークの５％を上回る場合のみに種を検出できるように設定する。主ピークしか観測されないので、突然変異体蛋白質は純度＞９５％である。
【０２３２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離による蛋白質分析
精製蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果、全長蛋白質は７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシンの存在下でしか発現されないことが判明した（図５参照）。更に、遺伝的にコードされた７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシンを組込んだＴＡＧ４突然変異体ミオグロビン蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後に蛍光バンドとして出現し、遺伝的にコードされた７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシンをもたない野生型ミオグロビン蛋白質は蛍光を示さなかった。蛍光イメージングはＳＴＯＲＭ（登録商標）蛍光スキャナー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ／ＧＥ（登録商標）Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用した。
【実施例５】
【０２３３】
蛋白質配置のプローブとしての遺伝的にコードされた７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシンの使用
７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシンの潜在用途の１例を実証するために、このアミノ酸をホロミオグロビンの尿素依存的変性のプローブとして使用した。クマリン蛍光は溶媒極性に感受性であるため、その蛍光強度は７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシンの極近傍の蛋白質の局所アンフォールディングと相関するとはずである。ミオグロビン構造は短いループとターンにより結合された８本の螺旋（Ａ〜Ｈ）から構成される（Ｄｅｌｌｉ  Ｃａｓｔｅｌｌｉら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，（２００２）１１：２２７３−２２７６）。ヘリックスＡのＳｅｒ４とヘリックスＣのＨｉｓ３７（図３参照；どちらの残基も大部分が溶媒に暴露され、他の近傍残基と有意に相互作用しない）を各々独立してセレクターコドンＴＡＧに突然変異させた結果、特定直交Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の存在下で７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシンの遺伝的にプログラムされたｉｎ  ｖｉｖｏ組込みが生じた。
【０２３４】
図４に示すように、野生型、Ｓｅｒ４→７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシン及びＨｉｓ３７→７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシンホロミオグロビンの尿素誘導アンフォールディング曲線を円二色性によりモニターした処、ほぼ同一であり、ヘリックスＡ又はヘリックスＣへの７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシンの導入は蛋白質安定性をさほど変化させないと思われる。２Ｍ尿素濃度では、ホロミオグロビンの４位の７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシンの蛍光強度は３０％増加し（２Ｍ〜５Ｍ尿素ではこのレベルに維持）、この蛋白質のこの領域は無秩序であると予想される（Ｚｈａｎｇら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，（２００５）１４：１３４０−１３４９）。他方、残基３７に７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシンを組込んだ突然変異体ミオグロビンは２Ｍ尿素でその蛍光強度に殆ど変化を示さないが、３Ｍ尿素では同様の蛍光増加を示す。この結果と一致し、尿素濃度が２．２Ｍよりも高いときにヘリックスＡ及びＢはこの領域で短距離及び中距離ＮＯＥが消滅していることから主に無秩序であるが、その後、尿素濃度が３．０Ｍよりも高くなると、ヘリックスＣ、Ｄ、及びＦはアンフォールディングすることが従来のＮＭＲ試験で示されている（Ｄｅｌｌｉ  Ｃａｓｔｅｌｌｉら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，（２００２）１１：２２７３−２２７６）。従って、構造全体で平均した全体的変化を報告する円二色性とは対照的に、アミノ酸７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシンは蛋白質構造変化の部位特異的プローブである。
【０２３５】
図７に示すように、７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシンのｐＨ感受性も試験した。１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中で６０μＭクマリニルアミノ酸７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシンの吸収スペクトルを測定した。ｐＨが増加する間に３６０ｎＭの吸光度は増加した。これらの測定からｐＫａ７．８が計算された。
【０２３６】
７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシンはｐＨ（図７参照）と溶媒極性（Ｚｉｎｓｌｉ，Ｊ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ（１９７４）３：５５−６９）に対して感受性であるため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両者で多くの生物学的研究の有用なプローブになると思われる（Ｂｒｕｎら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ，（２００４）４３：３４３２−３４３６）。例えば、アミノ酸７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシンは生体分子相互作用又は蛋白質の構造変化、又は膜結合蛋白質のトポロジーをモニターするために使用することができる。更に、７−ヒドロキシクマリン−エチルグリシンはｐＫａが７．８であり、クマリン環の置換により体系的に改変することができる（Ｓｕｎら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，（１９９８）８：３１０７−３１１０）ので、オルガネラｐＨとｐＨ依存的細胞プロセスの有用なプローブになると思われる。更に、その分泌状態において、７−ヒドロキシクマリンは強力な光酸である（Ｃｏｈｅｎ  ａｎｄ  Ｈｕｐｐｅｒｔ，Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ａ（２００１）１０５：７１５７−７１６４）と同時に、蛋白質におけるプロトン移動プロセスの研究に役立つと思われる。
【０２３７】
以上、明確に理解できるように本発明を多少詳細に記載したが、本発明の真の範囲を逸脱することなく形態や細部に種々の変更が可能であることは以上の開示から当業者に自明である。本明細書に引用する全刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献はその開示内容全体を全目的で本明細書に援用し、各刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献を全目的で本明細書に援用すると個々に記載しているものとみなす。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０２３８】
【特許文献１】ＷＯ２００２／０８６０７５
【特許文献２】ＷＯ２００２／０８５９２３
【特許文献３】ＷＯ２００４／０９４５９３
【特許文献４】ＷＯ２００５／０１９４１５
【特許文献５】ＷＯ２００５／００７８７０
【特許文献６】ＷＯ２００６／１１０１８２
【非特許文献】
【０２３９】
【非特許文献１】Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（１９９６）ｉｎ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ
【非特許文献２】Ｔｓｉｅｎ（１９９８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７：５０９−５４４
【非特許文献３】Ｔｓｉｅｎ（１９９８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７：５０９−４４
【非特許文献４】Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，ｉｎ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９６）
【非特許文献５】Ｍａｒｔｉｎら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２３：１３０８−１３１４（２００５）
【非特許文献６】Ｋｅｐｐｌｅｒら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２１：８６−８９（２００３）
【非特許文献７】Ｌｉｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１２８：４５４２−３（２００６）
【非特許文献８】Ｍｅｎｄｅｌら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．（１９９５）２４：４３５−４６２
【非特許文献９】Ｈｏｈｓａｋａら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．（２００４）５６０：１７３−１７７
【非特許文献１０】Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．（２００５）４４：３４−６６
【非特許文献１１】Ｗａｎｇら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．，（２００６）３５：２２５−２４９
【非特許文献１２】Ｔｒｕｏｎｇ  ａｎｄ  Ｉｋｕｒａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏ．２００１，１１：５７３−５７８
【非特許文献１３】Ｌｉｐｍａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００３）３０１：１２３３−１２３５
【非特許文献１４】Ｌａｋｏｗｉｃｚ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  Ｅｄ．２；Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９
【非特許文献１５】Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，”Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（Ｃａｍｂ．）１：１−１１（２００２）
【非特許文献１６】Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，”Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４４（１）：３４−６６（２００５）
【非特許文献１７】Ｘｉｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，“Ａｎ  Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６（３）：２２７−２３８（２００５）
【非特許文献１８】Ｘｉｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，“Ａｄｄｉｎｇ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ，”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９（６）：５４８−５５４（２００５）
【非特許文献１９】Ｗａｎｇら，“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，”Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．，３５：２２５−２４９（２００６）
【非特許文献２０】Ｘｉｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，“Ａ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔｏｏｌｋｉｔ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ，”Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，７（１０）：７７５−７８２（２００６）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【国際調査報告】
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