(57)【要約】  野生型ＣＫＩタンパク質に対して優性ネガティブな拮抗活性を有する変異ＣＤＫインヒビター（ＣＫＩ）ポリペプチド、並びに変異ＣＫＩポリペプチドをコードする核酸及びベクターを含む関連の組成物、そしてこのような核酸及びベクターを含む形質転換宿主細胞及びトランスジェニック植物が開示される。また、変異タンパク質を使用して、細胞、特に植物細胞において細胞分裂を調節するための関連の方法が開示される。
2009502175.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された、変異植物ＣＫＩポリペプチドであって、
（ａ）サイクリンについての結合親和性を付与するサイクリン結合領域、（ｂ）ＣＤＫについての結合親和性を付与するＣＤＫ結合領域を揺する野生型植物のＣＫＩポリペプチドに比較して少なくとも１つの改変を有するＣＫＩアミノ酸配列を含み、
該少なくとも１つの改変は、野生型ＣＫＩポリペプチドに比較して、ＣＤＫについての、変異ＣＫＩポリペプチドの改変された結合親和性を付与するように、ＣＤＫ結合領域内にあり；
変異ＣＫＩポリペプチドは、野生型ＣＫＩポリペプチドに比較して、サイクリンについての結合親和性を実質的に維持し；
変異ＣＫＩポリペプチドは、ＣＤＫ結合領域への結合について、該野生型ＣＫＩと競合し得る、変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項２】
前記野生型植物ＣＫＩポリペプチドが、ＫＩＰ関連性タンパク質（ＫＲＰ）ファミリーのメンバーである請求項１に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項３】
前記ＫＲＰファミリーのメンバーが、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ、トウモロコシ、コムギ、イネ、アルファルファ、綿花、又はポプラのＣＫＩポリペプチドである請求項２に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項４】
前記ＫＲＰファミリーのメンバーが、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ又はＢｒａｓｓｉｃａＫＲＰ１ポリペプチドである請求項２に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項５】
前記少なくとも１つの改変が、ＢｒａｓｓｉｃａＫＲＰ１（ＢｎＫＲＰ１）のアミノ酸１４５〜１６８位に対応する領域内にある請求項２に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項６】
ＢｒａｓｓｉｃａＫＲＰ１（ＢｎＫＲＰ１）のアミノ酸１４５〜１６８位に対応する領域内に少なくとも２つの改変を含む請求項５に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項７】
前記少なくとも１つの改変がアミノ酸置換を含む請求項５に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項８】
アミノ酸置換は、非アラニンからアラニンへの置換である請求項７に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項９】
アミノ酸置換は、非保存的な置換である請求項７に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項１０】
請求項７に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチドであって、少なくとも２つのアミノ酸置換を含み、各アミノ酸置換は、
（ａ）ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１４５位に対応する位置；
（ｂ）ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１４９位に対応する位置；
（ｃ）ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１５１位に対応する位置；
（ｄ）ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１５３位に対応する位置；
（ｅ）ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１６４位に対応する位置；
（ｆ）ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１６５位に対応する位置、
からなる群より独立して選択される位置にある、変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項１１】
少なくとも２つのアミノ酸置換のうちの１つ以上、必要に応じて全てが、非アラニンからアラニンへの置換である請求項１０に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項１２】
少なくとも２つのアミノ酸置換のうちの１つ以上、必要に応じて全てが、非保存的な置換である請求項１０に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの改変が、ＫＹＮＦＤＦモチーフ内にある請求項５に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項１４】
ＫＹＮＦＤＦモチーフ内に少なくとも２つの改変を含む請求項１３に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項１５】
ＫＹＮＦＤＦモチーフ内の少なくとも２つの改変が、ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１５１位と１５３位に対応する位置でのアミノ酸置換を含む請求項１４に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項１６】
ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１５１位と１５３位に対応する位置でのアミノ酸置換の少なくとも１つが非アラニンからアラニンへの置換である請求項１５に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項１７】
ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１５１位と１５３位に対応する位置でのアミノ酸置換のそれぞれが、非アラニンからアラニンへの置換である請求項１６に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項１８】
ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１５１位と１５３位に対応する位置でのアミノ酸置換の少なくとも１つが、逆帯電されたアミノ酸でのアミノ酸の置換である請求項１５に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項１９】
ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１５１位と１５３位に対応する位置でのアミノ酸置換のそれぞれが、逆帯電されたアミノ酸でのアミノ酸の置換である請求項１８に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項２０】
ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１４９位に対応する位置でのアミノ酸置換をさらに含む請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項２１】
ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１４９位に対応する位置でのアミノ酸置換は、非アラニンからアラニンへの置換である請求項２０に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項２２】
ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１４９位に対応する位置でのアミノ酸置換は、非保存的な置換である請求項２０に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項２３】
請求項１５〜２２のいずれか１項に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチドであって、
（ａ）ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１６４位に対応する位置；
（ｂ）ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１６５位に対応する位置；
の少なくとも１つでのアミノ酸置換をさらに含む、変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項２４】
（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つでのアミノ酸置換は、非アラニンからアラニンへの置換である請求項２３に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項２５】
（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つでのアミノ酸置換は、非保存的置換である請求項２３に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項２６】
（ａ）及び（ｂ）のそれぞれでのアミノ酸置換を含む請求項２３に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項２７】
（ａ）及び（ｂ）でのアミノ酸置換のそれぞれが非アラニンからアラニンへの置換である請求項２６に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項２８】
（ａ）及び（ｂ）でのアミノ酸置換のそれぞれが非保存的置換である請求項２６に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項２９】
変異ＢｎＫＲＰ１ポリペプチドである請求項４〜２８のいずれか１項に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項３０】
請求項２９に記載の変異ＢｎＫＲＰ１ポリペプチドであって、これが
（１）ＢｎＫＲＰ１  Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ；
（２）ＢｎＫＲＰ１  Ｙ１４９Ａ；Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ
（３）ＢｎＫＲＰ１  Ｅ１６４Ａ；Ｗ１６５Ａ；又は
（４）ＢｎＫＲＰ１  Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ；Ｅ１６４Ａ；Ｗ１６５Ａ、
である、変異ＢｎＫＲＰ１ポリペプチド。
【請求項３１】
前記少なくとも１つの改変がＣＤＫ結合領域の切断を含む請求項１〜５のいずれか１項に記載の変異ＣＫＩポリペプチド。
【請求項３２】
変異ＢｎＫＲＰ１ポリペプチドである請求項３１に記載の変異ＣＫＩポリペプチド。
【請求項３３】
請求項１〜３２のいずれか１項に記載の変異ＣＫＩポリペプチドをコードする組換え核酸。
【請求項３４】
レプリコン及び請求項３３に記載の組換え核酸を含むベクター。
【請求項３５】
組換え核酸に作動可能に連結されるプロモーター領域をさらに含む請求項３４に記載のベクター。
【請求項３６】
プロモーター領域が植物細胞において作動可能である請求項３５に記載の発現ベクター。
【請求項３７】
プロモーター領域がＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター又はＬＦＡＨ１２プロモーターを含む請求項３６に記載の発現ベクター。
【請求項３８】
プロモーター領域が、組織及び／又は器官特異的な様式において転写的に活性である請求項３５に記載の発現ベクター。
【請求項３９】
請求項３３に記載の組換え核酸を含む宿主細胞。
【請求項４０】
請求項３４〜３８のいずれか１項に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項４１】
変異ＣＫＩポリペプチドを産生する方法であって、該方法は：
変異ＣＫＩポリペプチドをコードする核酸の発現に適切な条件下で請求項３９又は４０に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、方法。
【請求項４２】
前記変異ＣＫＩポリペプチドを回収する工程をさらに含む請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
変異ＣＫＩポリペプチドをコードする導入遺伝子を含むトランスジェニック植物であって、該トランスジェニック植物は野生型ＣＫＩポリペプチドを発現し、該野生型ＣＫＩポリペプチドは、（ａ）サイクリンについての結合親和性を付与するサイクリン結合領域と（ｂ）ＣＤＫについての結合親和性を付与するＣＤＫ結合領域とを含み、該変異ＣＫＩポリペプチドは、参照ＣＫＩポリペプチドに比較して少なくとも１つの改変を有するＣＫＩアミノ酸配列を含み、該参照ＣＫＩポリペプチドは、
（１）トランスジェニック植物により発現される野生型植物ＣＫＩポリペプチド、
（２）（１）に異種な、トランスジェニック植物の細胞内で（１）の野生型ＣＫＩ機能に実質的に等価な野生型ＣＫＩ機能を提供し得る野生型ＣＫＩポリペプチドからなる群より選択され；
該少なくとも１つの改変は、参照ＣＫＩポリペプチドに比較して、ＣＤＫについての、変異ＣＫＩポリペプチドの改変された結合親和性を付与するように、ＣＤＫ結合領域内にあり、さらに変異ＣＫＩポリペプチドは、参照ＣＫＩポリペプチドに比較して、サイクリンについての結合親和性を実質的に維持する、トランスジェニック植物。
【請求項４４】
単子葉植物である請求項４３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４５】
双子葉植物である請求項４３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４６】
前記参照ＣＫＩポリペプチドが、ＫＩＰ関連性タンパク質（ＫＲＰ）ファミリーのメンバーである請求項４３〜４５のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４７】
前記ＫＲＰファミリーのメンバーがＢｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ、トウモロコシ、コムギ、イネ、アルファルファ、綿花、又はポプラのＣＫＩポリペプチドである請求項４６に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４８】
前記ＫＲＰファミリーのメンバーがＫＲＰ１ポリペプチドである請求項４６に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４９】
前記少なくとも１つの改変がＢｒａｓｓｉｃａＫＲＰ１（ＢｎＫＲＰ１）のアミノ酸１４５〜１６８位に対応する領域内にある請求項４６に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５０】
前記変異ＣＫＩポリペプチドが、ＢｒａｓｓｉｃａＫＲＰ１（ＢｎＫＲＰ１）のアミノ酸１４５〜１６８位に対応する領域内に少なくとも２つの改変を含む請求項４９に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５１】
前記少なくとも１つの改変がアミノ酸置換を含む請求項４９に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５２】
アミノ酸置換が非アラニンからアラニンへの置換である請求項５１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５３】
アミノ酸置換が逆帯電されたアミノ酸でのアミノ酸の置換である請求項５１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５４】
前記少なくとも１つの改変が、ＫＹＮＦＤＦモチーフ内にある請求項４９に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５５】
前記変異ＣＫＩポリペプチドが、ＫＹＮＦＤＦモチーフ内に少なくとも２つの改変を含む請求項５４に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５６】
ＫＹＮＦＤＦモチーフ内の少なくとも２つの改変が、ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１５１位と１５３位に対応する位置でのアミノ酸置換を含む請求項５４に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５７】
ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１５１位と１５３位に対応する位置でのアミノ酸置換の少なくとも１つが、非アラニンからアラニンへの置換である請求項５６に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５８】
ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１５１位と１５３位に対応する位置でのアミノ酸置換のそれぞれが、非アラニンからアラニンへの置換である請求項５７に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５９】
ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１５１位と１５３位に対応する位置でのアミノ酸置換の少なくとも１つが、逆帯電されたアミノ酸でのアミノ酸の置換である請求項５６に記載のトランスジェニック植物。
【請求項６０】
ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１５１位と１５３位に対応する位置でのアミノ酸置換のそれぞれが、逆帯電されたアミノ酸でのアミノ酸の置換である請求項５９に記載のトランスジェニック植物。
【請求項６１】
変異ＣＫＩポリペプチドが、ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１４９位に対応する位置でのアミノ酸置換をさらに含む請求項５６〜６０のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項６２】
ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１４９位に対応する位置でのアミノ酸置換は、非アラニンからアラニンへの置換である請求項６１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項６３】
ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１４９位に対応する位置でのアミノ酸置換は、非保存的な置換である請求項６１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項６４】
請求項５６〜６３のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物であって、変異ＣＫＩポリペプチドが、
（ａ）ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１６４位に対応する位置；
（ｂ）ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１６５位に対応する位置；
の少なくとも１つでのアミノ酸置換をさらに含む、トランスジェニック植物。
【請求項６５】
（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つでのアミノ酸置換は、非アラニンからアラニンへの置換である請求項６４に記載のトランスジェニック植物。
【請求項６６】
（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つでのアミノ酸置換は、非保存的置換である請求項６４に記載のトランスジェニック植物。
【請求項６７】
変異ＣＫＩポリペプチドが（ａ）及び（ｂ）のそれぞれでのアミノ酸置換を含む請求項６４に記載のトランスジェニック植物。
【請求項６８】
（ａ）及び（ｂ）でのアミノ酸置換のそれぞれが、非アラニンからアラニンへの置換である請求項６７に記載のトランスジェニック植物。
【請求項６９】
（ａ）及び（ｂ）でのアミノ酸置換のそれぞれが、非保存的置換である請求項６７に記載のトランスジェニック植物。
【請求項７０】
参照ＣＫＩポリペプチドが、ＢｎＫＲＰ１ポリペプチドである請求項４６〜６９のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項７１】
請求項７０に記載のトランスジェニック植物であって、変異ＣＫＩポリペプチドが、
（１）ＢｎＫＲＰ１  Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ；
（２）ＢｎＫＲＰ１  Ｙ１４９Ａ；Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ
（３）ＢｎＫＲＰ１  Ｅ１６４Ａ；Ｗ１６５Ａ；又は
（４）ＢｎＫＲＰ１  Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ；Ｅ１６４Ａ；Ｗ１６５Ａ、
である、トランスジェニック植物。
【請求項７２】
前記少なくとも１つの改変が、ＣＤＫ結合領域の切断を含む請求項４３〜４９のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項７３】
参照ＣＫＩポリペプチドがＢｎＫＲＰ１ポリペプチドである請求項７２に記載のトランスジェニック植物。
【請求項７４】
Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ、トウモロコシ、コムギ、イネ、アルファルファ、綿花、ポプラ、カメリナからなる群より選択される請求項４３〜７３のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項７５】
Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ、トウモロコシからなる群より選択される請求項７４に記載のトランスジェニック植物。
【請求項７６】
参照ＣＫＩポリペプチドが、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のＣＫＩポリペプチドである請求項７５に記載のトランスジェニック植物。
【請求項７７】
請求項４３〜７４のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物を産生するための方法であって、変異ＣＫＩポリペプチドをコードする導入遺伝子を含むベクターを植物に導入する工程を含む、方法。
【請求項７８】
野生型ＣＫＩポリペプチドを発現する植物細胞において細胞分裂を調節する方法であって、該野生型ＣＫＩポリペプチドは、（ａ）サイクリンについての結合親和性を付与するサイクリン結合領域、（ｂ）ＣＤＫについての結合親和性を付与するＣＤＫ結合領域を含み；方法は以下の工程：
参照ＣＫＩポリペプチドに比較して少なくとも１つの改変を有するＣＫＩアミノ酸配列を含む変異ＣＫＩポリペプチドを細胞内で発現する工程であって、該参照ＣＫＩポリペプチドは、
（１）植物細胞内で発現される野生型植物ＣＫＩポリペプチド、
（２）（１）に異種な、植物細胞内で（１）の野生型ＣＫＩ機能に実質的に等価な野生型ＣＫＩ機能を提供し得る野生型ＣＫＩポリペプチドからなる群より選択され；
該少なくとも１つの改変は、参照ＣＫＩポリペプチドに比較して、ＣＤＫについての、変異ＣＫＩポリペプチドの改変された結合親和性を付与するように、ＣＤＫ結合領域内にあり、そして変異ＣＫＩポリペプチドは、参照ＣＫＩポリペプチドに比較して、サイクリンについての結合親和性を実質的に維持する、工程；並びに
該変異ＣＫＩポリペプチドが、植物細胞内で野生型ＣＫＩの生物学的活性を阻害することを許容する工程、
を含む、方法。
【請求項７９】
前記参照ＣＫＩポリペプチドがＫＩＰ関連性タンパク質（ＫＲＰ）ファミリーのメンバーである請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
変異ＣＫＩポリペプチドが、植物細胞内の複数の内因性ＫＲＰファミリーのメンバーを拮抗する請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記ＫＲＰファミリーのメンバーが、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ、又はトウモロコシのＣＫＩポリペプチドである請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
前記ＫＲＰファミリーのメンバーが、ＫＲＰ１ポリペプチドである請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
前記少なくとも１つの改変が、ＢｒａｓｓｉｃａＫＲＰ１（ＢｎＫＲＰ１）のアミノ酸１４５〜１６８位に対応する領域内にある請求項７９に記載の方法。
【請求項８４】
変異ＣＫＩポリペプチドが、ＢｒａｓｓｉｃａＫＲＰ１（ＢｎＫＲＰ１）のアミノ酸１４５〜１６８位に対応する領域内に少なくとも２つの改変を含む請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記少なくとも１つの改変がアミノ酸置換を含む請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
アミノ酸置換は、非アラニンからアラニンへの置換である請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
アミノ酸置換は、逆帯電されたアミノ酸でのアミノ酸の置換である請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
前記少なくとも１つの改変が、ＫＹＮＦＤＦモチーフ内にある請求項８３に記載の方法。
【請求項８９】
変異ＣＫＩポリペプチドが、ＫＹＮＦＤＦモチーフ内に少なくとも２つの改変を含む請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
ＫＹＮＦＤＦモチーフ内の前記少なくとも２つの改変が、ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１５１位と１５３位に対応する位置でのアミノ酸置換を含む請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１５１位と１５３位に対応する位置でのアミノ酸置換の少なくとも１つが、非アラニンからアラニンへの置換である請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１５１位と１５３位に対応する位置でのアミノ酸置換のそれぞれが、非アラニンからアラニンへの置換である請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１５１位と１５３位に対応する位置でのアミノ酸置換の少なくとも１つが、逆帯電されたアミノ酸でのアミノ酸の置換である請求項９０に記載の方法。
【請求項９４】
ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１５１位と１５３位に対応する位置でのアミノ酸置換のそれぞれが、逆帯電されたアミノ酸でのアミノ酸の置換である請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１４９位に対応する位置での変異ＣＫＩポリペプチドがアミノ酸置換をさらに含む請求項９０〜９４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９６】
ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１４９位に対応する位置でのアミノ酸置換は、非アラニンからアラニンへの置換である請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１４９位に対応する位置でのアミノ酸置換は、非保存的な置換である請求項９５に記載の方法。
【請求項９８】
請求項９０〜９７のいずれか１項に記載の方法であって、変異ＣＫＩポリペプチドが、以下
（ａ）ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１６４位に対応する位置；及び
（ｂ）ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１６５位に対応する位置；
の少なくとも１つでのアミノ酸置換をさらに含む、方法。
【請求項９９】
（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つでのアミノ酸置換は、非アラニンからアラニンへの置換である請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つでのアミノ酸置換は、非保存的置換である請求項９８に記載の方法。
【請求項１０１】
変異ＣＫＩポリペプチドが、（ａ）及び（ｂ）のそれぞれでのアミノ酸置換を含む請求項９８に記載の方法。
【請求項１０２】
（ａ）及び（ｂ）でのアミノ酸置換のそれぞれが、非アラニンからアラニンへの置換である請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
（ａ）及び（ｂ）でのアミノ酸置換のそれぞれが、非保存的置換である請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０４】
参照ＣＫＩポリペプチドが、ＢｎＫＲＰ１ポリペプチドである請求項８２〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０５】
請求項１０４に記載の方法であって、変異ＣＫＩポリペプチドが、
（１）ＢｎＫＲＰ１  Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ；
（２）ＢｎＫＲＰ１  Ｙ１４９Ａ；Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ
（３）ＢｎＫＲＰ１  Ｅ１６４Ａ；Ｗ１６５Ａ；又は
（４）ＢｎＫＲＰ１  Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ；Ｅ１６４Ａ；Ｗ１６５Ａ、
からなる群より選択される、方法。
【請求項１０６】
前記少なくとも１つの改変が、ＣＤＫ結合領域の切断を含む請求項７８〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０７】
参照ＣＫＩポリペプチドがＢｎＫＲＰ１ポリペプチドである請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
変異ＣＫＩポリペプチドをコードする組換え核酸を植物細胞に導入する工程をさらに含む請求項７８〜１０７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０９】
組換え核酸が発現ベクターである請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
植物細胞が、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ、トウモロコシからなる群より選択される植物由来である請求項７８〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１１】
植物が、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ、トウモロコシからなる群より選択される請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
参照ＣＫＩポリペプチドがＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａのＣＫＩポリペプチドである請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
植物の活力を増大するための方法であって、以下の工程：
参照ＫＲＰポリペプチドに比較して少なくとも１つの改変を有するＫＲＰアミノ酸配列を含む変異ＫＲＰポリペプチドを植物内で発現する工程であって、該参照ＫＲＰポリペプチドは、
（１）植物内で発現される野生型ＫＲＰポリペプチド、
（２）（１）に異種な、植物の細胞内で（１）の野生型ＫＲＰ機能に実質的に等価な野生型ＫＲＰ機能を提供し得る野生型ＫＲＰポリペプチドからなる群より選択され；
該少なくとも１つの改変は、参照ＫＲＰポリペプチドに比較して、ＣＤＫについての、変異ＫＲＰポリペプチドの改変された結合親和性を付与するように、ＣＤＫ結合領域内にあり、そして変異ＫＲＰポリペプチドは、参照ＫＲＰポリペプチドに比較して、サイクリンについての結合親和性を実質的に維持する、工程；並びに
該変異ＫＲＰポリペプチドが、植物の活力を増大するように植物内で野生型ＫＲＰの生物学的活性を阻害することを許容する工程、
を含む、方法。
【請求項１１４】
植物の根の質量を増大するための方法であって、以下の工程：
参照ＫＲＰポリペプチドに比較して少なくとも１つの改変を有するＫＲＰアミノ酸配列を含む変異ＫＲＰポリペプチドを植物内で発現する工程であって、該参照ＫＲＰポリペプチドは、
（１）植物内で発現される野生型ＫＲＰポリペプチド、
（２）（１）に異種な、植物の細胞内で（１）の野生型ＫＲＰ機能に実質的に等価な野生型ＫＲＰ機能を提供し得る野生型ＫＲＰポリペプチドからなる群より選択され；
該少なくとも１つの改変は、参照ＫＲＰポリペプチドに比較して、ＣＤＫについての、変異ＫＲＰポリペプチドの改変された結合親和性を付与するように、ＣＤＫ結合領域内にあり、そして変異ＫＲＰポリペプチドは、参照ＫＲＰポリペプチドに比較して、サイクリンについての結合親和性を実質的に維持する、工程；並びに
該変異ＫＲＰポリペプチドが、植物において根の質量を増大するように植物内で野生型ＫＲＰの生物学的活性を阻害することを許容する工程、
を含む、方法。
【請求項１１５】
植物の種子の大きさを増大するための方法であって、以下の工程：
参照ＫＲＰポリペプチドに比較して少なくとも１つの改変を有するＫＲＰアミノ酸配列を含む変異ＫＲＰポリペプチドを植物内で発現する工程であって、該参照ＫＲＰポリペプチドは、
（１）植物内で発現される野生型ＫＲＰポリペプチド、
（２）（１）に異種な、植物の細胞内で（１）の野生型ＫＲＰ機能に実質的に等価な野生型ＫＲＰ機能を提供し得る野生型ＫＲＰポリペプチドからなる群より選択され；
該少なくとも１つの改変は、参照ＫＲＰポリペプチドに比較して、ＣＤＫについての、変異ＫＲＰポリペプチドの改変された結合親和性を付与するように、ＣＤＫ結合領域内にあり、そして変異ＫＲＰポリペプチドは、参照ＫＲＰポリペプチドに比較して、サイクリンについての結合親和性を実質的に維持する、工程；並びに
該変異ＫＲＰポリペプチドが、植物の種子の大きさを増大するように植物内で野生型ＫＲＰの生物学的活性を阻害することを許容する工程、
を含む、方法。
【請求項１１６】
植物において早期の発芽を増すための方法であって、以下の工程：
参照ＫＲＰポリペプチドに比較して少なくとも１つの改変を有するＫＲＰアミノ酸配列を含む変異ＫＲＰポリペプチドを植物内で発現する工程であって、該参照ＫＲＰポリペプチドは、
（１）植物内で発現される野生型ＫＲＰポリペプチド、
（２）（１）に異種な、植物の細胞内で（１）の野生型ＫＲＰ機能に実質的に等価な野生型ＫＲＰ機能を提供し得る野生型ＫＲＰポリペプチドからなる群より選択され；
該少なくとも１つの改変は、参照ＫＲＰポリペプチドに比較して、ＣＤＫについての、変異ＫＲＰポリペプチドの改変された結合親和性を付与するように、ＣＤＫ結合領域内にあり、そして変異ＫＲＰポリペプチドは、参照ＫＲＰポリペプチドに比較して、サイクリンについての結合親和性を実質的に維持する、工程；並びに
該変異ＫＲＰポリペプチドが、植物において早期の発芽を増すように植物内で野生型ＫＲＰの生物学的活性を阻害することを許容する工程、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、本明細書中にその全体が参考として援用される、２００５年７月２９日に出願された米国特許出願第６０／７０３，９９９号に優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
植物は、真核生物と同じ基本的な細胞周期を有する。驚くべきことではないが、これらはまた、細胞周期の異なる相間の移行を調節するサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）と呼ばれる真核生物のキナーゼを共有する。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（アラビドプシス）は、細胞周期を研究するために使用されるモデル植物系であり、いくつかのＣＤＫ亜群を有する。ＣＤＫＡは哺乳動物のｃｄｃ２（ＣＤＫ１）に最も類似し、そして高度に保存されたＰｒｏ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ（ＰＳＴＡＩＲＥ）アミノ酸配列（配列番号１）を、それらのサイクリン対応物との相互作用を媒介する領域において含む。アラビドプシスはまた、高等動物において保存されない、ＣＤＫＢと呼ばれるＣＤＫの植物特異的な群を有する。しかし、植物は、Ｇ1  ＣＤＫｓ−ＣＤＫ４及びＣＤＫ６に関して、哺乳動物対応物を欠く。ＣＤＫＡは、Ｇ1  ＣＤＫ（これは植物Ｄ型サイクリンにより活性化される）であると提唱されてきたが、ＣＤＫＢは、Ｓ期以降において優先的に発現されることが実証され、それゆえ、Ｇ2／Ｍ特異的ＣＤＫであると同定された。
【０００３】
これらのＣＤＫの活性化／不活性化は、細胞周期を通して細胞を駆動し、そしてまた細胞が細胞周期を抜け出るべき時期を指図する。アラビドプシスは１０個のサブクラスに分類される多くとも４９個のサイクリンを含む（非特許文献１を参照のこと）。Ａ、Ｂ、Ｄクラスのみが、細胞周期における役割を果たし、そしてＣＤＫを活性化するようである（非特許文献１）。ＣＤＫＡは、Ｄ型サイクリンにより活性化され、一方ＣＤＫＢは、Ａ及びＢ型サイクリンにより活性化される。
【０００４】
動物において、ＣＤＫは、２つのファミリーのＣＤＫインヒビター（ＣＫＩ）によってネガティブに調節される。１つのクラスは、ＣＤＫ４のインヒビター（ＩＮＫ４）と呼ばれ、４つのメンバー（ｐ１５、ｐ１６、ｐ１８、ｐ１９）から構成され、これはＧ1  ＣＤＫ、すなわちＣＤＫ４及びＣＤＫ６に結合し、そしてサイクリンを結合することから阻害する。インヒビターの他の群は、キナーゼインヒビタータンパク質（ＫＩＰ）又はＣＩＰ（ＣＤＫ相互作用タンパク質）タンパク質と呼ばれ、そしてこれらは全ての動物において高度に保存される。ＣＩＰ／ＫＩＰファミリーは、サイクリンＡとＥ−ＣＤＫ２キナーゼ活性を主に阻害する。植物において、推定のＣＫＩが同定されており（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）、そして精製されたサイクリン／ＣＤＫキナーゼ活性をインビトロにおいて阻害することが示されている（非特許文献２；非特許文献６；非特許文献７）。植物ＣＫＩの発現は生長を低減することが示され、より小さな器官がより大きな細胞を含有する（非特許文献６；非特許文献８；非特許文献４；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１を参照のこと）。アラビドプシスにおいて、これらのＣＫＩは、ＣＤＫのインヒビター（ＩＣＫ）又はＫＩＰ関連性タンパク質（ＫＲＰ）と呼ばれる。ＣＫＩのＣＩＰ／ＫＩＰファミリーを最も密接に類似する７つのＩＣＫファミリーメンバーが同定されている。これらのＩＣＫ／ＫＲＰファミリーメンバーのそれぞれは、ｐ２７KIP1に高度なアミノ酸配列同一性を有するが、同一性は、最もＣ末端の３０アミノ酸に制限される。今日までに、ＩＮＫ関連性ＣＫＩはいずれの植物においても同定されていない。
【０００５】
サイクリンの過剰発現又はＣＫＩのノックアウトは、十分に均衡された細胞周期エンジンが哺乳動物において容易に混乱されることを説明する。この不均衡は、最終的に加速された細胞周期、増大された動物の大きさ、及び／又は腫瘍発生を導く。ＣＫＩ「活性」の減少又は完全な消失は、増加されたサイクリン／ＣＤＫキナーゼ活性を生じる。この増加された活性は、細胞周期の進行に必要な下流標的のリン酸化を生じ、そして動物は最終的に細胞の過剰増殖を生じる（非特許文献１２）。マウスにおけるｐ２７KIP1遺伝子の欠失は、過剰な細胞増殖を導く過剰なサイクリン／ｃｄｋ活性に起因して、より大きなマウスを生じる（非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５）。
【０００６】
ＫＲＰファミリーの種々のメンバーの発現を抑制するための機構が存在する。植物における転写後遺伝子抑制（ＰＴＧＳ）は、動物におけるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に類似するＲＮＡ分解機構である。ＲＮＡｉは二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の、短い２１〜２３塩基対のｄｓＲＮＡフラグメントへの特異的な分解であり、これは最終的に相同的なＲＮＡの集団の分解において役割を果たす。植物において、ＰＴＧＳは、２〜３例を挙げるとトウモロコシ、ダイズ、カノーラ（Ｃａｎｏｌａ）のような作物を含む多くの植物種において、遺伝子発現を抑制するために逆位反復（ＩＲ）戦略を使用する。しかし、ＩＲ技術は、ＩＲ配列の性能、的外れな遺伝子調節（非特許文献１６）、一過性の抑制、全体的なＩＲ安定性などのようないくつかの不都合を有する。これらの不都合は同時に１つよりも多い遺伝子を抑制する必要性により、この場合においてより悪化される。
【０００７】
従来の植物育種は、過去７５年にわたり、増加される作物収量について積極的に推進されてきた（非特許文献１７）。より最近は、例えば害虫や除草剤に耐性を有するトランスジェニック作物が利用可能になった。しかし、これらのトランスジェニック植物は、収量の不利な条件を伴う（非特許文献１８；非特許文献１９）。今日までに、種子の大きさの増大又は作物の収量の増加を有する商業的に利用可能なトランスジェニック植物はなんら知られていない。
【０００８】
当該分野において、ある商業的に価値がある作物の特性を改善する、例えば、制限されないが、作物の収量を増加する、種子の大きさを増す、発芽の速度を増す、根の質量を増加するなどの方法が必要とされる。本明細書中に記載されるように、本発明はこれらの及び他の必要性を満たす。
【０００９】
【非特許文献１】Ｗａｎｇら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ.  １３５：１０８４〜１０９９、２００４年
【非特許文献２】Ｗａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：４５１〜４５２、１９９７年
【非特許文献３】Ｗａｎｇら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ.  １５：５０１〜５１０、１９９８年
【非特許文献４】Ｄｅ  Ｖｅｙｌｄｅｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １３：１６５３〜１６６７、２００１年
【非特許文献５】Ｊａｓｉｎｓｋｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、１３０：１８７１〜１８８２、２００２年
【非特許文献６】Ｗａｎｇら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ.  ２４：６１３〜６２３、２０００年
【非特許文献７】Ｌｕｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ.  ２１：３７９〜３８５、２０００年
【非特許文献８】Ｊａｓｉｎｓｋｉら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１５：９７３〜９８２、２００１年
【非特許文献９】Ｚｈｏｕら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２０：９６７〜９７５、２００２年
【非特許文献１０】Ｚｈｏｕら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．３５：４７６〜４８９、２００３年
【非特許文献１１】Ｓｃｈｎｉｔｔｇｅｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １５：３０３〜３１５、２００３年
【非特許文献１２】Ｃｏａｔｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：８７７〜８８０、１９９６年
【非特許文献１３】Ｆｅｒｏら、Ｃｅｌｌ  ８５：７３３〜７４４、１９９６年
【非特許文献１４】Ｋｉｙｏｋａｗａら、Ｃｅｌｌ  ８５：７２１〜７３２、１９９６年
【非特許文献１５】Ｎａｋａｙａｍａら、Ｃｅｌｌ  ８５：７０７〜７２０、１９９６年
【非特許文献１６】Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２１：６３５〜６３７、２００３年
【非特許文献１７】Ｊ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｃｏｒｎｅｊｏ、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＮＯ．（ＡＩＢ７８６）８１頁、２００４年２月
【非特許文献１８】Ｅｌｍｏｒｅら、Ａｇｒｏｎ．Ｊ．９３：４０８〜４１２、２００１年
【非特許文献１９】Ｅｌｍｏｒｅら、Ａｇｒｏｎ．Ｊ．９３：４０４〜４０７、２００１年
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、野生型ＣＫＩポリペプチドに関して少なくとも１つの改変を有する、改変植物サイクリン依存性キナーゼインヒビター（ＣＫＩ）ポリペプチドを提供する。ある実施態様において、サイクリンタンパク質についての結合親和性を実質的に維持しながら、野生型ＣＫＩタンパク質に比較して、ＣＤＫタンパク質についての改変された結合親和性を付与するように、改変はＣＤＫ結合領域内にある。本発明の改変ＣＫＩポリペプチドは、野生型ＣＫＩ機能に対して優性ネガティブな拮抗活性を有する。改変体は、対応する野生型ＣＫＩタンパク質を発現する細胞内で、又は、対応する野生型タンパク質に異種であるが、とりわけサイクリン及びＣＤＫ結合に関して実質的に等価な野生型機能を有する野生型ＣＫＩを発現する細胞内で発現される場合、野生型ＣＫＩの生物学的活性が阻害され、細胞周期を通して加速される進行、及び増加される細胞増殖を導く。
【００１１】
別の局面において、本発明は、改変ＣＫＩポリペプチドをコードする組換え核酸、又は組換え核酸を含むベクターを提供する。改変ＣＫＩをコードする核酸又はベクターは、核酸の増幅又は発現のために宿主細胞に導入される。宿主細胞は、例えば、改変ＣＫＩポリペプチドを産生するための本発明の方法において、使用される。さらに、細胞における改変ＣＫＩポリペプチドの発現は、細胞分裂を調節するための本発明の方法において使用できる。例えば、細胞における改変ＣＫＩポリペプチドの発現は、細胞周期を通して加速される進行を導き得、そして増加される細胞増殖を導き得る。
【００１２】
なお、他の局面において、改変ＣＫＩポリペプチドをコードする導入遺伝子を含むトランスジェニック植物が提供される。トランスジェニック植物における改変ＣＫＩポリペプチドの発現は、例えば、植物の活力を増大するための、根の質量を増大するための、植物の大きさを増すための、又は早期の発芽を増すためなどの本発明の方法において使用できる。
【００１３】
定義
そうでないと定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術的な用語や科学的な用語は、本発明が属する当該分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法と材料に類似する任意の方法と材料が、本発明の実施及び試験において使用できるが、例示的な方法と材料のみが記載される。本発明の目的のために、以下の用語が以下に定義される。
【００１４】
本明細書中で使用される用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」は、情況が明らかにそうでないと示さない限りは複数形の指示対象を含む。
【００１５】
本明細書中で使用されるように、用語「サイクリン依存性キナーゼインヒビター」（また本明細書中で「ＣＤＫインヒビター」又は「ＣＫＩ」といわれる）は、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）をネガティブに調節するタンパク質のクラスをいう。本発明に適するＣＫＩは、サイクリン及びＣＤＫを独立して結合し得る別々のポリペプチド領域を有するＣＫＩである。このようなＣＫＩとしては、例えば、植物ＣＫＩの同定されたファミリー（７個の同定されたアラビドプシスＣＫＩ）が挙げられ、動物におけるキナーゼインヒビタータンパク質（ＫＩＰ）に相同性を有し、ＫＩＰ関連性タンパク質（ＫＲＰ）といわれる（「ＣＤＫ」のインヒビター、又は「ＩＣＫ」としてもまた知られる）。
【００１６】
用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、アミノ酸残基の重合体をいうために本明細書中で交換可能に使用される。
【００１７】
用語「核酸」は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、及び１本鎖又は２本鎖の形態のいずれかにおけるそれらの重合体をいう。特に制限されない限り、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、そして天然に存在するヌクレオチドに類似の様式において代謝される、天然のヌクレオチドの公知のアナログを含む核酸を含む。そうでないと示されない限り、特定の核酸配列は、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換）を暗に含む。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（又は全ての）コドンの第３位が、混合型塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換される配列を作製することにより達成できる（例えば、Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１、１９９１年；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５〜２６０８、１９８５年；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１〜９８、１９９４年を参照のこと）。用語核酸は、遺伝子、ｃＤＮＡ、及び遺伝子によりコードされるｍＲＮＡと交換可能に使用される。
【００１８】
ＣＫＩポリペプチド及び核酸の情況において、用語「天然に存在する」は、天然において見出されるアミノ酸又はヌクレオチド配列、すなわち、天然の供給源（生物体）から単離でき、そして人為的介入により意図的に改変されていないアミノ酸又はヌクレオチド配列を有するポリペプチド又は核酸を意味する。本明細書中で使用されるように、伝統的な遺伝学に従って選択的に交配されたかもしれない植物の実験室株は、天然に存在する植物も考慮される。
【００１９】
本明細書中で使用されるように、「野生型ＣＫＩ遺伝子」又は「野生型ＣＫＩ核酸」は、生物体のゲノム中のＣＫＩ遺伝子配座に対応する核酸の配列をいい、これは遺伝子配座に対応する天然に存在するヌクレオチド配列によりコードされるＣＫＩタンパク質の正常な機能を行う遺伝子産物をコードする。遺伝子配座は、個体の集団において１つよりも多い配列又は対立遺伝子を有し得、そして用語「野生型」は、正常な機能を行う遺伝子産物をコードする全てのこのような天然に存在する対立遺伝子を含む。また、「野生型」は、必ずしも天然に存在しないが、正常な機能を伴う遺伝子産物をなおコードする遺伝子配列（例えば、サイレント変異を有する又は保存的な置換を伴うタンパク質をコードする遺伝子）を含む。
【００２０】
用語「野生型ＣＫＩポリペプチド」又は「野生型ＣＫＩタンパク質」は、野生型遺伝子によりコードされるＣＫＩポリペプチドをいう。遺伝子配座は、個体の集団において１つよりも多い配列又は対立遺伝子をも有し、そして用語「野生型」は、正常な機能を行う遺伝子産物をコードする全てのこのような天然に存在する対立遺伝子を含む。
【００２１】
用語「変異体」又は「改変体」は、本発明のＣＫＩポリペプチド及び核酸の情況において、対応する野生型ポリペプチド又は核酸に比較して改変されるポリペプチド又は核酸を意味する。
【００２２】
用語「参照ＣＫＩポリペプチド」は、変異又は改変ＣＫＩポリペプチドを定義する目的のために本明細書中で使用される用語であり：この用語は、アミノ酸配列中の改変を定義する目的のために、変異ＣＫＩポリペプチドが比較されるＣＫＩポリペプチドをいう。従って、「参照ＣＫＩポリペプチドに比較して少なくとも１つの改変を有するＣＫＩアミノ酸配列を含む」変異ＣＫＩポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸改変を除いて、そのほかでは変異ＣＫＩポリペプチドが参照ポリペプチドのアミノ酸配列を含むことを意味する。本明細書中に記載されるように本発明を実施する際には、参照ＣＫＩポリペプチドは予め決定される。参照ＣＫＩポリペプチドは、例えば、野生型及び／又は天然に存在するＣＫＩポリペプチド、又は意図的に改変されたＣＫＩポリペプチドなどである。
【００２３】
用語「改変された結合」又は「変化された結合」は、その参照ＣＫＩポリペプチドがサイクリン／ＣＤＫ複合体を結合する野生型遺伝子によりコードされる変異ＣＫＩポリペプチドをいう。用語「改変された結合」又は「変化された結合」は、本明細書中で、サイクリン／ＣＤＫキナーゼ複合体への変異ＣＫＩの結合をいう。用語「改変された結合」又は「変化された結合」は、参照ＣＫＩポリペプチドに比較した変異ＣＫＩポリペプチドの相対的な結合をいう。「改変された結合」又は「変化された結合」は、参照ＣＫＩポリペプチドに比較して、サイクリン／ＣＤＫ複合体への等しい結合、減少された結合、又は等価な結合を有する変異ＣＫＩポリペプチドをいう。
【００２４】
本明細書中で使用されるように「組換え体」は、組換え方法により意図的に改変されたアミノ酸配列又はヌクレオチド配列をいう。本明細書中で用語「組換え核酸」により、概して、天然において通常見いだされない形態において、エンドヌクレアーゼによる核酸の操作によって、インビトロで元来形成される核酸配列が意味される。従って、線状の形態における、単離された変異若しくは改変ＣＫＩ核酸、又は通常結合されないＤＮＡ配列を連結することによりインビトロで形成される発現ベクターはともに、本発明の目的のための組換え体と考慮される。一旦組換え核酸が作製され、そして宿主細胞又は生物体に再導入されると、これは非組換え的に、すなわち、インビトロでの操作ではなく宿主細胞のインビボでの細胞機構を使用して、複製されることが理解されるが；このような核酸は、一旦組換え的に産生されると、続いて非組換え的に複製されるが、なお本発明の目的のためには組換え体と考えられる。「組換えタンパク質」は、組換え技術を使用して、すなわち、上記のような組換え核酸の発現を介して、作製されるタンパク質である。組換えタンパク質は、少なくとも１つ以上の特徴により、天然に存在するタンパク質から区別される。
【００２５】
アミノ酸配列に関して、「非保存的」改変は、野生型残基と変異残基が、疎水性、帯電、大きさ、形状を含む１つ以上の物理的特性において有意に異なる改変を意味する。例えば、極性残基から非極性残基への、またその逆の改変、正に帯電される残基から負に帯電される残基への、またその逆の改変、及び大きな残基から小さな残基への、またその逆の改変は、非保存的な改変である。例えば、変化の領域におけるポリペプチド骨格の構造、例えばα−らせん若しくはβ−シート構造；標的部位での分子の帯電若しくは疎水性；又は側鎖の巨大さ、をより有意に影響する置換がなされ得る。概してポリペプチドの特性において最も大きな変化を生じることが予測される置換は、（ａ）親水性残基、例えば、セリル、スレオニルが、疎水性残基、例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、若しくはアラニルに（若しくはそれにより）置換される；（ｂ）システイン若しくはプロリンが、任意の他の残基に（若しくはそれにより）置換される；（ｃ）電気的陽性の側鎖を有する残基、例えば、リジル、アルギニル、若しくはヒスチジルが、電気的陰性の側鎖、例えば、グルタミル若しくはアスパチルに（若しくはそれにより）置換される；（ｄ）又は巨大な側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが、側鎖を有しない残基、例えばグリシンに（若しくはそれにより）置換される、置換である。
【００２６】
保存的な改変は一般的に以下に示される改変であるが、当該分野において知られるように、他の置換も保存的とされる。
Ａｌａ：Ｓｅｒ
Ａｒｇ：Ｌｙｓ
Ａｓｎ：Ｇｌｎ、Ｈｉｓ
Ａｓｐ：Ｇｌｕ
Ｃｙｓ：Ｓｅｒ
Ｇｌｎ：Ａｓｎ
Ｇｌｕ：Ａｓｐ
Ｇｌｙ：Ｐｒｏ
Ｈｉｓ：Ａｓｎ、Ｇｌｎ
Ｉｌｅ：Ｌｅｕ、Ｖａｌ
Ｌｅｕ：Ｉｌｅ、Ｖａｌ
Ｌｙｓ：Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ
Ｍｅｔ：Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
Ｐｈｅ：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ
Ｓｅｒ：Ｔｈｒ
Ｔｈｒ：Ｓｅｒ
Ｔｒｐ：Ｔｙｒ
Ｔｙｒ：Ｔｒｐ、Ｐｈｅ
Ｖａｌ：Ｉｌｅ、Ｌｅｕ
【００２７】
タンパク質の作用の機構又は遺伝子表現型の情況において、用語「優性ネガティブな」は、野生型機能を有する対応するタンパク質を、野生型の機能を行うことから実質的に妨げる、変異若しくは改変タンパク質、又は変異若しくは改変タンパク質をコードする遺伝子をいう。
【００２８】
本明細書中で使用されるように句「野生型ＣＫＩのアンタゴニスト」は、変異ＣＫＩポリペプチドが、アンタゴニストの不在下での野生型ＣＫＩポリペプチドによるキナーゼ活性に比較して、野生型ＣＫＩポリペプチドがＣＤＫ／サイクリン複合体のキナーゼ活性を阻害する能力を有意に減少（阻害する）ことを意味する。
【００２９】
核酸は、これが、別の核酸配列と機能的な関係に配置される場合、「作動可能に連結される」。例えば、プロモーター若しくはエンハンサーは、これが配列の転写を影響する場合、コード配列に作動可能に連結され；又はリボソーム結合部位は、これが翻訳を促進するように配置される場合、コード配列に作動可能に連結される。
【００３０】
用語「植物」は、全植物体、植物器官（例えば、葉、茎、花、根など）、及び植物細胞（組織培養細胞を含む）とその子孫を含む。本発明の方法において使用できる植物のクラスは、一般的に、裸子植物及び被子植物、単子葉植物及び双子葉植物の両方を含む形質転換技術に適する高等植物、並びに藻類のようなある下等植物の広範なクラスである。これは多様な倍数性レベルの植物を含み、倍数体、２倍体、半数体を含む。単子葉被子植物の例としては、例えば、アスパラガス、飼料用と甘味種のトウモロコシ、オオムギ、コムギ、イネ、モロコシ、サトウキビ、タマネギ、キビ、ライムギ、オートムギ、そして他の穀物が挙げられる。双子葉被子植物の例としては、トマト、タバコ、綿花、菜種（カノーラ）、カメリナ、飼料用マメ、ダイズ、ペパー、レタスなどが挙げられるが、これらに制限されない。樹木種の例としては、ポプラ、マツ、シーダー、オーク、モミなどが挙げられる。
【００３１】
「異種配列」は、異なる種に起源する配列であるか、又は同じ種起源である場合、その元来の形態から実質的に改変される。例えば、構造遺伝子に作動可能に連結される異種プロモーターは、構造遺伝子が由来する種とは異なる種に由来するか、又は同じ種に由来する場合、その元来の形態から実質的に改変される。
【００３２】
用語「ベクター」は、ＤＮＡ、典型的に２本鎖の断片をいい、外来ＤＮＡの断片がこれに導入され得る。ベクター又はレプリコンは、例えば、プラスミド又はウイルス起源である。ベクターは、宿主細胞においてベクターの自律的な複製を促進する「レプリコン」ポリヌクレオチド配列を含む。本発明の開示の情況において、用語「レプリコン」は、宿主染色体へのベクター配列の組換えを標的する、又はそうでなければ促進するポリヌクレオチド配列領域を含む。さらに、外来ＤＮＡは例えば、ＤＮＡウイルスベクターに最初に挿入されるが、宿主細胞へのウイルスベクターＤＮＡの形質転換は、ウイルスＲＮＡベクター分子へのウイルスＤＮＡの変換を生じる。外来ＤＮＡは異種ＤＮＡとして定義され、これは宿主細胞において天然には見出されないＤＮＡであり、これは例えばベクター分子を複製し、選択可能な若しくはスクリーニング可能なマーカー又は導入遺伝子をコードする。ベクターは、外来又は異種ＤＮＡを適切な宿主細胞に輸送するために使用される。一旦宿主細胞に入ると、ベクターは、宿主染色体ＤＮＡから独立して又はこれと同時に複製でき、そしてベクター及びその挿入されたＤＮＡのいくつかのコピーを生成できる。あるいは、ベクターは、宿主染色体への外来又は異種ＤＮＡの挿入を標的し得る。さらに、ベクターはまた、ｍＲＮＡ分子への、挿入されたＤＮＡの転写を許容するか、又はそうでなければＲＮＡの複数のコピーへの、挿入されたＤＮＡの複製を引き起こす。いくつかの発現ベクターはさらに、挿入されたＤＮＡに近接する配列エレメントを含み、これはタンパク質分子への、ｍＲＮＡの翻訳を許容する。従って、挿入されるＤＮＡによってコードされるｍＲＮＡの多くの分子及びポリペプチドは、迅速に合成できる。
【００３３】
用語「導入遺伝子ベクター」は、ＤＮＡの挿入されたセグメント、「導入遺伝子」を含み、これは宿主細胞内でｍＲＮＡに翻訳されるか、又はＲＮＡとして複製される。用語「導入遺伝子」は、ＲＮＡに変換される挿入されたＤＮＡの部分のみでなく、ＲＮＡの転写又は複製に必要であるベクターのそれらの部分もまたいう。さらに、導入遺伝子は、タンパク質を産生し得るオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチド配列を必ずしも含む必要はない。
【００３４】
用語「形質転換された宿主細胞」、「形質転換された」、「形質転換」は、細胞へのＤＮＡの導入をいう。細胞は、「宿主細胞」と呼ばれ、そしてこれは真核生物又は原核生物の細胞である。典型的な原核生物宿主細胞としては、Ｅ．ｃｏｌｉの種々の株が挙げられる。典型的な真核生物宿主細胞は、植物細胞（例えば、カノーラ、ダイズ、イネ、若しくはトウモロコシの細胞など）、酵母細胞、昆虫細胞、又は動物細胞である。導入されたＤＮＡ配列は通常、ＤＮＡの挿入された断片を含むベクターの形態にある。導入されたＤＮＡ配列は、宿主細胞と同じ種に由来し得るか、又は宿主細胞とは異なる種に由来し得るか、又はこれはいくつかの外来ＤＮＡと、宿主種に由来するいくつかのＤＮＡとを含むハイブリッドＤＮＡ配列である。
【００３５】
ＣＫＩポリペプチド及び核酸の情況において、別の配列（例えば、領域、フラグメント、ヌクレオチド又はアミノ酸の位置など）に対する「対応」は、ヌクレオチド又はアミノ酸の位置番号に従い番号付けし、次いで各位置にて適合するヌクレオチド又はアミノ酸の数が最大になる様式において、すなわち、配列同一性のパーセンテージを最大にする様式において、配列をアラインする従来の方法に基づく。所与の「対応する領域」と、全ての位置が同一である必要はないので、対応する領域内の非適合部分は、「対応する位置」として考慮される。従って、本明細書中で使用されるように、「特定のＣＫＩポリペプチドのアミノ酸位置Ｘに対応するアミノ酸位置」の照会は、他の認識されるＣＫＩポリペプチドにおける及び、構造的相同体やファミリーにおける等価な位置のコレクションへの照会を表す。
【００３６】
ＫＲＰスーパーファミリーのＣＫＩのポリペプチド及び核酸に関連される本発明の典型的な実施態様において、アミノ酸又はヌクレオチド位置の「対応」は典型的に、ＣＤＫ結合領域内のアミノ酸、又はＣＤＫ結合領域をコードするヌクレオチドに関して決定される。一般的に、ＫＲＰポリペプチドの他の領域に比較して、ＫＲＰ  ＣＫＩのＣＤＫ結合領域は、実質的な配列同一性又は類似性を共有する。従って、ＫＲＰ  ＣＫＩポリペプチドのＣＤＫ結合領域を決定するための１つの適切な技術は、第２のＫＲＰ  ＣＫＩの公知のＣＤＫ結合領域（例えば、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ（アブラナ科ナパス）Ｋｒｐ１（Ｂｎ  Ｋｒｐ１）のアミノ酸の約１４５〜１６８位由来）に対して実質的な配列同一性又は類似性を共有するアミノ酸領域を同定することである。（例えば、いくつかのＣＫＩファミリーメンバー及び、ＢｎＫｒｐ１とのアミノ酸配列アラインメントを示す図１を参照のこと）。一旦、ＣＤＫ結合領域に対応する配列が、配列アラインメントにより決定されると、対応するアミノ酸又はヌクレオチドの位置がしかるべく決定される。
【００３７】
本明細書中で使用されるように、「配列同一性のパーセンテージ」は、２つの至適にアラインされた配列を、比較ウインドウにわたって比較することによって決定され、ここで比較ウインドウにおける配列の部分は、２つの配列の至適なアラインメントについて、参照配列（これは付加又は欠失を含まない）に比較して付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含む。パーセンテージは、両方の配列中に同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が生じる位置の数を決定し、適合される位置の数を得、比較のウインドウにおける位置の総数で適合される位置の数を割り、そして結果に１００を掛けることによって算定される。
【００３８】
用語「同一」又は「同一性」パーセントは、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の情況において、比較ウインドウ、若しくは設計される領域にわたって、以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用して測定されるように、又は手動のアラインメント及び視覚的検討により、最大の対応について比較されアラインされる場合、同じであるか、又は同じであるヌクレオチド若しくはアミノ酸残基の特定のパーセンテージ（例えば、特定される領域にわたって６０％の同一性、必要に応じて、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の同一性）を有する、２つ以上の配列をいう。配列は、それらが少なくとも約２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、又は少なくとも５５％同一である場合、互いに「実質的に同一である」。これらの定義は、試験配列の相補体をいう。必要に応じて、同一性は、少なくとも約６アミノ酸残基長、少なくとも約１５アミノ酸残基長、少なくとも約２５アミノ酸残基長、少なくとも約３５アミノ酸残基長、少なくとも約５０アミノ酸残基長、若しくは少なくとも約１００以上のアミノ酸残基長であるポリペプチド領域にわたって、又はこのようなポリペプチド領域をコードする核酸領域にわたって存在する。本発明のある好ましい局面において、比較のために設計される領域は、ＣＫＩポリペプチドのＣＤＫ結合領域、このようなＣＤＫ結合領域の１部分を含むポリペプチド領域、又はこのようなＣＤＫ結合領域を含むポリペプチド領域である。
【００３９】
用語「類似性」又は「類似性パーセント」は、２つ以上のポリペプチド配列の情況において、保存的なアミノ酸置換により定義されるように、比較ウインドウ、又は設計される領域にわたって、以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用して測定されるように、又は手動のアラインメントや視覚的検討により、最大の対応について比較され、アラインされる場合、同じであるか、又は保存的なアミノ酸置換により定義されるように類似であるかのいずれかであるアミノ酸残基の特定のパーセンテージ（例えば、特定される領域にわたって６０％の類似性、必要に応じて６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の類似性）を有する２つ以上の配列又はサブ配列をいう。配列は、それらが互いに少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、又は少なくとも５５％類似である場合、互いに「実質的に類似」である。必要に応じて、この類似性は、少なくとも約６アミノ酸残基長、少なくとも約１５アミノ酸残基長、少なくとも約２５アミノ酸残基長、少なくとも約３５アミノ酸残基長、少なくとも約５０アミノ酸残基長、又は少なくとも約１００アミノ酸残基長である領域にわたって存在する。
【００４０】
本発明のある局面において、配列同一性又は類似性の決定のために、比較のために設計される領域は、ＣＫＩポリペプチドのＣＤＫ結合領域、このようなＣＤＫ結合領域の１部分を含むポリペプチド領域、又はこのようなＣＤＫ結合領域を含むポリペプチド領域である。
【００４１】
配列比較のために、典型的に、１つの配列は参照配列として作用し、これに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列は、コンピュータに入力され、必要であれば、配列座標が設計され、そして配列アルゴリズムパラメーターが設計される。規定値プログラムパラメーターが使用できるか、又は代替のパラメーターが設計される。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメーターに基づいて、参照配列に比較して試験配列についての配列同一性又は類似性のパーセントを算定する。
【００４２】
「比較ウインドウ」は、本明細書中で使用されるように、連続的なアミノ酸又はヌクレオチドの位置の区分に対する参照を含み、この中で配列は２つの配列が至適にアラインされた後、連続的な位置の同じ数の参照配列に比較される。本発明に従うＣＫＩポリペプチドの比較に関して、比較ウインドウは典型的に、約６個〜約２００個以上の連続的なアミノ酸であり、典型的に約６個〜約５０個の、約６個〜約２５個の、約１５個〜約１００個の、約１５個〜約５０個の、約１５個〜約３０個の、約２０個〜約５０個の、又は約２５個〜約５０個の、連続的なアミノ酸である。比較のための配列のアラインメントの方法は当該分野において周知である。比較のための配列の至適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎの局所的な相同性アルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２、１９７０年）により、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈの相同性アラインメントアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３、１９７０年）により、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎの類似性についての検索法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４、１９８８年）により、これらのアルゴリズムのコンピュータ実行（例えば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ.における、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）により、又は手動のアラインメントと視覚的検討（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５年増刊））により、行うことができる。
【００４３】
有用なアルゴリズムの１つの例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、漸進的な、一対のアラインメントを使用して、関連される配列の群から複数の配列アラインメントを作製して、関係及び配列同一性のパーセントを示す。これはまた、アラインメントを作製するために使用されるクラスタリング関係を示す系図又は系統図をプロットする。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅの漸進的なアラインメント法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．  ３５：３５１〜３６０、１９８７年）の簡素化法を使用する。使用される方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐ（ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１〜１５３、１９８９年）によって記載される方法に類似する。プログラムは、３００配列までアラインされ、それぞれ５,０００個のヌクレオチド又はアミノ酸の最大長である。複数のアラインメント手順が、２つの最も類似する配列の一対のアラインメントを伴って開始され、２つのアラインされた配列のクラスターを生成する。次いで、このクラスターは、アラインされた配列の次に最も関連される配列又はクラスターに対してアラインされる。２つの配列のクラスターは、２つの個々の配列の一対のアラインメントの単純な伸長によりアラインされる。最終的なアラインメントは、一連の漸進的な、一対のアラインメントにより達成される。プログラムは、特異的な配列及びそれらのアミノ酸又はヌクレオチド座標を配列比較の領域について設計することにより、及びプログラムパラメーターを設計することにより、実行される。ＰＩＬＥＵＰを使用して、参照配列は他の試験配列に比較されて、以下のパラメーター：規定値ギャップ加重（３.００）、規定値ギャップ長加重（０.１０）、及び加重エンドギャップを使用して配列同一性関係のパーセントを決定する。ＰＩＬＥＵＰは、ＧＣＧ配列解析ソフトウェアパッケージ（例えば、第７.０版（Ｄｅｖｅｒｅａｕｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１２：３８７〜３９５、１９８４年）から得ることができる。
【００４４】
配列同一性及び配列類似性のパーセントを決定するのに適切であるアルゴリズムの別の例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２.０アルゴリズムであり、これはＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２、１９７７年）、及びＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０、１９９０年）において、それぞれ記載される。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を介して公共的に利用可能である。このアルゴリズムは、照会配列中の長さＷの短いワードを同定することにより高スコアの配列対（ＨＳＰ）を先ず同定することを含み、これはデータ−ベース配列中の同じ長さのワードでアラインされる場合、いくつかのポジティブに評価される閾値スコアＴを適合するか又は満たすかのいずれかである。Ｔは、近傍ワードスコア閾値といわれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）。これらの最初の近傍ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見出すための検索を開始する種として作用する。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加され得る限り、各配列に沿って両方の方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメーターＭ（適合する残基の対についての報酬スコア；常に０より大きい）及びＮ（適合しない残基についてのペナルティースコア；常に０より小さい）を使用して算定される。アミノ酸配列について、評点マトリクスが累積スコアを算定するために使用される。各方向におけるワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアがその最大の活性化値から量Ｘまで低下する場合；１つ以上のネガティブな評点残基アラインメントの集積に起因して、累積スコアがゼロ以下になる場合、又はいずれかの配列の末端が到達される場合、停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、Ｘは、アラインメントの感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、規定値として、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、規定値として、ワード長３、及び期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２評点マトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５〜１０９１９、１９９２年を参照のこと）、アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖の比較を使用する。
【００４５】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計的解析を行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５８８７、１９９３年を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの測度は、最小の合計確立（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の適合が偶然により生じる確立の指標を提供する。例えば、核酸は、参照核酸に対する試験核酸の比較における最小の合計確立が約０.２未満、典型的に約０.０１未満、及びより典型的に約０.００１未満である場合、参照配列への類似が考慮される。
【００４６】
遺伝子ホモログ及びオルソログは、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅリソースを使用して同定される。第１の遺伝子のホモログ又はオルソログは、第１の遺伝子によってコードされる遺伝子産物と同じ又は類似の機能を有する遺伝子産物をコードし得る。２つの核酸配列又はポリペプチドがオルソログである別の指標は、異種遺伝子が、真核生物細胞の発現系における内因性遺伝子のヌル対立遺伝子を相補（例えば、救済）できることである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
本発明は、植物細胞分裂を調節するための組成物及び方法を含む。特に、野生型ＣＫＩタンパク質機能を、優性ネガティブな機能を介して拮抗するポリペプチドのみならず、関連されるポリヌクレオチド、宿主細胞、トランスジェニック植物が提供され、及びそれらの使用のための方法が提供される。改変の、優性ネガティブなＣＫＩポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する、広範に多様なトランスジェニックベクターが本発明を実施するために使用できる。本発明のＣＫＩ導入遺伝子が植物に導入され、そして発現される場合、植物細胞分裂が調節される。細胞分裂の調節は、改変ＣＫＩ導入遺伝子に作動可能に連結されるプロモーター配列のタイプに依存して、植物全体で、又は組織若しくは器官特異的な様式において生じる。特に、本明細書中で提供される組成物及び方法は、細胞周期を通り抜ける植物細胞の進行を加速するために使用され、細胞増殖の付随する増加を伴う。この様式において組成物及び方法を使用することは、例えば、任意の広範に多様な植物において、増加された作物収量及び／又は増大された種子の大きさの生成を許容する。作物収量の増加としては、例えば、増大された葉組織、増大された果実、増加された花生成、増大された根の質量などが挙げられる。
【００４８】
本発明の特定の実施形態において、改変ＣＫＩポリペプチドは、ＫＲＰファミリーメンバーである。本発明のこの局面は、ＫＲＰファミリーメンバーのＣＤＫ結合領域はサイクリン−ＣＤＫ複合体の阻害を主に担うという発見に、少なくとも部分的に、基づく。従って、ＫＲＰファミリーメンバーにおいてＣＤＫ結合領域を標的することは（サイクリン結合領域とは対照的に）、野生型ＣＫＩ機能の特に有効な優性ネガティブなアンタゴニストである変異タンパク質の生成を許容する。
【００４９】
変異ＣＫＩポリペプチド、核酸、ベクター
本発明のＣＫＩポリペプチドは、天然に存在する又は野生型のＣＫＩから区別可能な変異又は改変タンパク質である。改変ＣＫＩポリペプチドは、参照ＣＫＩポリペプチド（例えば、野生型ＣＫＩタンパク質）に比較して、タンパク質のＣＤＫ又はサイクリン結合領域中に、少なくとも１つの改変を含む。典型的な改変としては、対応する野生型配列に比較して、アミノ酸の置換、挿入、及び／又は欠失が挙げられる。特に適切な改変はアミノ酸置換である。ある実施形態において、改変ＣＫＩポリペプチドは少なくとも１つの非保存的な改変（例えば、置換）を含む。
【００５０】
本発明の変異ＣＫＩポリペプチドは、優性ネガティブなタンパク質である。優性ネガティブなアプローチは、ＣＤＫやサイクリンの結合に別々に関与される２つのポリペプチド領域を有するＣＫＩポリペプチドに特に適する。本発明の優性ネガティブな変異体を作製するための一般的なアプローチは、「野生型」のＣＤＫ又はサイクリンの結合を改変するように個々のＣＤＫやサイクリンの結合領域の１つを改変することを含む。この改変されたＣＤＫ又はサイクリンの結合領域は、野生型ポリペプチドに比較して、サイクリン又はＣＤＫに対する、等価な、減少される、又は消失されるいずれかの結合を生じる。いずれの場合においても、変異は、ＣＫＩキナーゼ阻害活性を減少又は消失する。野生型タイプの機能を干渉する優性ネガティブなＣＫＩポリペプチドを設計するために、変異ポリペプチドは、（１）サイクリン／ＣＤＫ複合体に実質的に結合しなくてはならず；（２）高濃度であってもサイクリンＣＤＫ複合体を実質的に阻害してはならず、（３）サイクリン／ＣＤＫ複合体への結合について野生型ＣＫＩポリペプチドと競合しなくてはならない。インビボで、これらの要件の全てを満たす変異ＣＫＩポリペプチドは、細胞中で上昇されたサイクリン／ＣＤＫ活性を生じ、これは次いで、増加された細胞増殖及びより高い分裂指標を生じ、最終的に、増加された収量、より大きな種子、及び／又は植物の１つ以上の領域における上昇されたサイクリン／ＣＤＫキナーゼ活性と関連されるいくつかの他の特徴を伴う植物を導く。
【００５１】
ＫＲＰポリペプチドの特定の場合において、ＣＤＫ結合領域は、ＣＫＩポリペプチドのこのファミリーにおいてサイクリン／ＣＤＫキナーゼ阻害を主に担い、改変のために標的化される。
【００５２】
特に適切な改変としては、アミノ酸の置換、挿入、又は欠失が挙げられる。例えば、アミノ酸置換は、結合を減少又は消失する改変として、ＣＤＫ又はサイクリンの結合領域において作製される。同様に、アミノ酸置換は、ＣＫＩ阻害活性を減少又は消失する改変として、ＣＤＫ又はサイクリン結合領域において作製される。典型的な実施形態において、少なくとも１つの非保存的アミノ酸の置換、挿入又は欠失が、ＣＤＫ又はサイクリンタンパク質に対するＣＫＩポリペプチドの結合を破壊又は改変するために、ＣＤＫ又はサイクリンの結合領域においてなされる。
【００５３】
実質的なＣＫＩポリペプチド変異体は、参照ＣＫＩタンパク質配列において、同じ位置にて除去されるか、又はその場所において異なるアミノ酸が挿入される少なくとも１つのアミノ酸残基を有する変異体である。置換は、単一でよく、ここでは分子中でただ１つのアミノ酸が置換されており、又はそれらは複数であり、ここでは同じ分子中で２つ以上のアミノ酸が置換されている。本発明のＣＫＩタンパク質分子の活性における実質的な変化は、側鎖が、帯電及び構造においてネイティブなアミノ酸のものとは有意に異なる別のアミノ酸、ネイティブなアミノ酸の帯電の逆帯電を伴うアミノ酸、又はネイティブなアミノ酸のもとのとは反対の親水性を伴うアミノ酸で置換することによって獲得される。これらの置換のタイプは、ポリペプチド骨格の構造、又は置換の領域における分子の帯電若しくは疎水性を影響することが予期される。本発明のある例示的な実施形態において、実質的なＣＫＩ変異体は、アラニンでの非アラニン残基の置換を含む。他の改変体において、実質的なＣＫＩは、例えば、逆帯電されるアミノ酸残基、より大きな側鎖を伴うアミノ酸残基、反対の親水性を伴うアミノ酸、小さな非極性アミノ酸（例えば、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、若しくはＧｌｙ）、又は極性アミノ酸（例えば、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、若しくはＧｌｎ）での、アミノ酸残基の置換を含む。
【００５４】
ＣＫＩポリペプチドの挿入変異体は、参照ＣＫＩタンパク質分子における特定の位置でのアミノ酸に極めて近接して挿入される１つ以上のアミノ酸を伴う変異体である。アミノ酸に極めて近接するは、アミノ酸のα−カルボキシ官能基又はα−アミノ官能基のいずれかに連結されることを意味する。挿入は１つ以上のアミノ酸である。挿入は、例えば、１つ又は２つの保存的なアミノ酸からなる。挿入の部位に近接するアミノ酸に対して、帯電及び／又は構造において類似するアミノ酸は、保存的として定義される。あるいは、変異ＣＫＩは、挿入の部位に近接するアミノ酸とは実質的に異なる帯電及び／又は構造を伴うアミノ酸の挿入を含む。
【００５５】
ＣＫＩポリペプチドの欠失変異体は、参照ＣＫＩタンパク質分子において１つ以上のアミノ酸が除去されている変異体である。いくつかの実施形態において、欠失変異体は、ＣＫＩタンパク質分子の特定の領域において欠失された、１つ、２つ、又はそれ以上のアミノ酸を有する。欠失変異体は、例えば、アミノ末端又はカルボキシ末端の切除を有する変異体を含む。
【００５６】
本発明の方法は、個々の領域がＣＤＫ機能を阻害するための、ＣＤＫやサイクリンタンパク質の結合に関与する、ＣＫＩファミリーのタンパク質の任意の認識されたメンバーに適用される。１つの実施形態において、変異ＣＫＩタンパク質は、ＣＫＩのＫＲＰファミリーに属するタンパク質の変異体又は改変体である。上記されるように、ＫＲＰファミリーメンバーのＣＤＫ結合領域は、キナーゼ阻害を主として担う。従って、ＣＤＫ結合領域は、改変ＫＲＰ  ＣＫＩポリペプチドの設計における改変のために、好ましく標的される。ＫＲＰタンパク質のＣＤＫ結合領域は、一般的に、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ  Ｋｒｐ１（ＢｎＫｒｐ１）（配列番号１７）のアミノ酸１４５〜１６８位に対応する。ある実施形態において、ＫＲＰファミリーメンバーのＣＤＫ結合領域の改変は、ＢｎＫｒｐ１の１４５〜１６８位に対応する領域内での少なくとも１つのアミノ酸位置、２つのアミノ酸位置、又はそれ以上の改変を含む。（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（ミミナクレス・アラビドプシス）  Ｋｒｐ１における対応する領域は、アミノ酸１６７〜１９０位を含む）。改変のために特に適切なアミノ酸位置は、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ  Ｋｒｐ１（ＢｎＫｒｐ１）のアミノ酸１４５、１４８、１４９、１５１、１５３、１５５、１６３、１６４、１６５、及び／又は１６７位に対応するそれらの位置を含む。他のＣＫＩポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基は、公知の方法を使用して、及び本明細書中にさらに使用されるように、配列アラインメントにより容易に決定される。
【００５７】
いずれの場合においても、上記のアミノ酸は、哺乳動物ｐ２７において保存され、そして全て、サイクリンＡ及びＣＤＫ２と複合体化されるｐ２７の結晶構造においてＣＤＫを接触する。１つの実施形態において、ＫＲＰ  ＣＤＫ結合領域の改変は、ＢｎＫｒｐ１のアミノ酸１５１位及び１５３位に対応するアミノ酸の改変（例えば、これらの各部位での、アラニン又は逆帯電されるアミノ酸へのアミノ酸置換）を含む。他の例示的な改変体において、ＢｎＫｒｐ１の１５１位及び１５３位に対応するアミノ酸の改変に加えて、ＫＲＰ  ＣＤＫ結合領域の改変はさらに、ＢｎＫｒｐ１のアミノ酸１４９位、１６４位、及び／又は１６５位に対応する位置での改変（例えば、ＢｎＫｒｐ１のアミノ酸１４９位に対応する位置でのさらなるアミノ酸置換；又はＢｎＫｒｐ１のアミノ酸１６４位及びアミノ酸１６５位の両方に対応する位置での２つのさらなるアミノ酸置換）を含む。ＫＲＰ  ＣＫＩポリペプチドに対するこのような改変は、ＣＤＫタンパク質についての結合親和性を改変するが、改変体タンパク質がサイクリンタンパク質を結合する能力は保存される。
【００５８】
特に目的のＫｒｐ  ＣＤＫ結合領域の改変は、以下のアミノ酸置換のいずれかに対応する改変を含むが、これらに制限されない。
ＢｎＫｒｐ１  Ｆ１４５Ａ；Ｙ１４９Ａ
ＢｎＫｒｐ１  Ｆ１４５Ａ；Ｙ１４９Ａ；Ｆ１５１Ａ
ＢｎＫｒｐ１  Ｆ１４５Ａ；Ｙ１４９Ａ；Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ
ＢｎＫｒｐ１  Ｙ１４９Ａ；Ｆ１５１Ａ
ＢｎＫｒｐ１  Ｙ１４９Ａ；Ｆ１５３Ａ
ＢｎＫｒｐ１  Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ
ＢｎＫｒｐ１  Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ；Ｙ１４９Ａ
ＢｎＫｒｐ１  Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ；Ｅ１６４Ａ
ＢｎＫｒｐ１  Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ；Ｗ１６５Ａ
ＢｎＫｒｐ１  Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ；Ｅ１６４Ａ；Ｗ１６５Ａ
ＢｎＫｒｐ１  Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ；Ｙ１４９Ａ；Ｅ１６４Ａ
ＢｎＫｒｐ１  Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ；Ｙ１４９Ａ；Ｗ１６５Ａ
ＢｎＫｒｐ１  Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ；Ｙ１４９Ａ；Ｅ１６４Ａ；Ｗ１６５Ａ
ＢｎＫｒｐ１  Ｅ１６４Ａ；Ｗ１６５Ａ
ある実施形態において、上述のように改変されるＣＫＩポリペプチドはＢｎＫｒｐ１である。他の改変において、上述のように改変されるＣＫＩはＢｎＫｒｐ１ではなく（例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、上記のそれらに対応する置換されたアミノ酸を伴う。
【００５９】
ＣＤＫ又はサイクリンの結合を影響する他の改変（例えば、置換、挿入、欠失）は、ＫＲＰファミリーメンバーのさらなる改変を含み、構造アラインメント法、配列アラインメント法などを含む多様な技術を使用して同定される。変異又は改変タンパク質は、例えば、米国特許第６，１８８，９６５号；同第６，２９６，３１２号；及び同第６，４０３，３１２号において以前に記載されるＰＤＡ（商標）系；アラニン走査（米国特許第５，５０６，１０７号を参照のこと）、遺伝子シャッフリング（ＷＯ  ０１／２５２７７）、部位飽和変異誘発、平均場、配列相同性、又は以下にさらに記載されるような、点変異の部位及びタイプの選択を導く、当業者に公知の、他の方法を使用することによって作製される。
【００６０】
本発明のＣＫＩポリペプチド改変体は、例えば、部位特異的変異誘発と一般的にいわれる技術を使用することにより、対応する野生型ＣＫＩ、又は改変体が由来する他の対応するＣＫＩをコードするＤＮＡ配列を、変異することによって構築される。ＣＫＩタンパク質をコードする核酸分子は、当業者に周知の多様なポリメラーゼ連鎖反応技術（ＰＣＲ）により変異される。（例えば、ＰＣＲ戦略（ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ）（Ｍ．Ａ．  Ｉｎｎｉｓ、Ｄ．Ｈ．Ｇｅｌｆａｎｄ、及びＪ．Ｊ．Ｓｎｉｎｓｋｙ編、１９９５年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）の第１４章）；ＰＣＲプロトコル（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）：方法及び適用に対する指針（Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）（Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ、Ｄ．Ｈ．Ｇｅｌｆａｎｄ、Ｊ．Ｊ．Ｓｎｉｎｓｋｙ、及びＴ．Ｊ．Ｗｈｉｔｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９９０年を参照のこと）。さらに、周知の化学的変異誘発法及び／又は放射線変異誘発法は当該分野において周知であり、ＫＲＰファミリーメンバータンパク質のコード領域において変異を誘導するために使用できる。スクリーニングは、本発明の変異又は改変Ｋｒｐをコードする所望のヌクレオチド配列を含むそれらの植物を位置付けるために行うことができる。植物は、ＣＫＩのアミノ酸配列における変化、キナーゼ活性における変化、又は表現型において予測される変化についてスクリーニングされ、次いで配列解析される。
【００６１】
制限されない例として、ＣｌｏｎｔｅｃｈからのＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔを利用する２つのプライマー系が、ＣＫＩタンパク質をコードする遺伝子に部位特異的変異を導入するために用いられる。この系における標的プラスミドの変性後、２つのプライマーはプラスミドに同時にアニールされ；これらのプライマのうちの１つは、所望される部位特異的変異を含み、他方はプラスミドにおける別の点での、制限部位の消失を生じる変異を含む。次いで２本鎖合成が行われ、これらの２つの変異を密接に連鎖し、そして得られるプラスミドはＥ，ｃｏｌｉのｍｕｔＳ株に形質転換される。プラスミドＤＮＡは、形質転換された細菌から単離され、関連の制限酵素で制限処理され（それにより未変異のプラスミドは線状化される）、次いでＥ．ｃｏｌｉに再形質転換される。この系は、サブクローニング又は１本鎖ファージミドの作製の必要性を伴わずに、発現プラスミド中に直接的な変異の作製を許容する。２つの変異の密接な連鎖、及びその後の未変異のプラスミドの鎖状化は、高い変異効率を生じ、そして最小のスクリーニングを許容する。最初の制限部位プライマーの合成後、この方法は、変異部位あたりただ一つの新しいプライマーの使用を必要とする。各位置の変異体を別々に調製するのではなく、「所望される縮重」オリゴヌクレオチドプライマーのセットが、所与の部位にて、所望される変異の全てを同時に導入するために合成できる。形質転換体は、変異誘発された領域を介してプラスミドＤＮＡを配列決定することによりスクリーニングされ、変異クローンが同定され、分類される。次いで、各変異ＤＮＡは制限処理され、そして例えば、変異検出増強（Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）ゲル（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）上での電気泳動により解析されて、配列中に他の変化がなんら生じていないことを（変異誘発されていないコントロールに対するバンド移行比較により）確認する。あるいは、全ＤＮＡ領域が配列決定され、標的領域の外側にさらなる変異事象がなんら生じていないことを確認する。
【００６２】
ｐＥＴ（又は他の）過剰発現ベクター中の確認された変異二重鎖は、変異タンパク質の高レベルな産生と、標準的なプロトコルによる精製のために、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳのようなＥ．ｃｏｌｉに形質転換するために用いられる。ＦＡＢ−ＭＳマッピングの方法が、変異発現の忠実性を迅速に確認するために用いられる。この技術は、全タンパク質を通してセグメントを配列決定することを提供し、そして配列割り当てにおいて必要な信頼を提供する。このタイプのマッピング実験において、タンパク質はプロテアーゼ（その選択は、改変されるべき特定の領域に、このセグメントが非常に重要であり、そして残りのマップは変異誘発されていないタンパク質のマップに同一であるべきであるので、依存する）で消化される。切断フラグメントのセットは、例えば、マイクロボアＨＰＬＣ（逆相又はイオン交換、ここでも改変されるべき特定の領域に依存する）により分画されて、各画分中にいくつかのペプチドを提供し、そしてペプチドの分子量が、ＦＡＢ−ＭＳのような標準的な方法により決定される。次いで各フラグメントの決定された質量は、予測される配列の消化から予期されるペプチドの分子量に比較され、そして配列の正確さが迅速に確認される。タンパク質改変に対するこの変異誘発アプローチは指向性であるので、変化されたペプチドの配列決定は、ＭＳデータが予測と一致する場合、必要であるべきはない。帯電された残基を確認することが必要である場合、ＣＡＤ−タンデム  ＭＳ／ＭＳが問題の混合物のペプチドを配列決定するために用いられるか、又は標的ペプチドは、サブトラクトＥｄｍａｎ分解又はカルボキシペプチターゼＹ消化のために精製され、改変の位置に依存する。
【００６３】
特定の部位特異的変異誘発の設計において、非保存的置換を先ず作製し、及び（ａ）標的されるＣＤＫ又はサイクリン結合活性が損なわれたか否かを決定し、そして（ｂ）その結果、任意の標的されない活性（例えば、ＣＤＫ結合領域が標的される場合、サイクリン結合）が非常に損なわれるか否かを決定することが一般的に所望される。この手段により、残基が標的されない生物学的活性に重要であることが実証される場合、保存的な置換がなされる。
【００６４】
他の部位特異的変異誘発がまた、ＣＫＩヌクレオチド配列とともに用いられる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング；実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）（第２版、１９８９年  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ）の第１５.３節において概して記載されるように、ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化、その後のライゲーションが、ＣＫＩの欠失改変体を作製するために使用できる。類似の戦略が、上述のＳａｍｂｒｏｏｋらの第１５.３節において記載されるように、挿入改変体を構築するために使用できる。より最近になって、Ｚｈｕら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｓ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：８７６８〜８７７３、１９９９年）は、キメラＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用して、インビボで植物遺伝子に変異を標的化する方法を考案した。
【００６５】
１つ以上の置換されたアミノ酸を伴う変異ポリペプチドは、いくつかの方法の１つにおいて作製される。アミノ酸がポリペプチド鎖中に共に密接に位置される場合、これらは所望されるアミノ酸置換の全てをコードする１つのオリゴヌクレオチドを使用して同時に変異される。しかし、アミノ酸が互いにいくらか離れて位置される（例えば、１０よりも多いアミノ酸により隔てられる）場合、所望される変化の全てをコードする単一のオリゴヌクレオチドを作製することはより困難である。代わりに、２つの代替法のうちの１つが用いられる。第１の方法において、別々のオリゴヌクレオチドが、置換されるべき各アミノ酸について作製される。次いでオリゴヌクレオチドは、１本鎖鋳型ＤＮＡに同時にアニールされ、そして鋳型から合成される第２鎖のＤＮＡは、所望されるアミノ酸置換の全てをコードする。代替の方法は、所望される変異体を生成するために２回以上の変異誘発を含む。第１回目は、単一変異体について記載されたようであり；野生型ＣＫＩ  ＤＮＡが鋳型として使用され、第１の所望されるアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドはこの鋳型にアニールされ、次いでヘテロ２本鎖ＤＮＡ分子が作製される。変異誘発の第２回目は、鋳型として第１回目において生成された変異ＤＮＡを利用する。従って、この鋳型はすでに１つ以上の変異を含む。次いで、さらに所望されるアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドがこの鋳型にアニールされ、そして得られるＤＮＡの鎖は今や、変異誘発の第１回目及び第２回目の両方からの変異をコードする。この得られるＤＮＡは、変異誘発の第３回目の鋳型として使用され、以下同様である。
【００６６】
適切な改変の同定を導くための１つの特に適切な技術は、配列アラインメントによりＣＫＩタンパク質をアニーリングすることを含む。使用できる、上述で考察された多くの配列アラインメント方法論がある。配列ベースのアラインメントプログラムとしては、例えば、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ検索、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ、Ｄｏｕｂｌｅ  Ａｆｆｉｎｅ  Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ、フレーム検索、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ／ＧＣＧプロフィール検索、Ｇｒｉｂｓｃｏｖ／ＧＣＧプロフィール走査、プロフィールフレーム検索、Ｂｕｃｈｅｒの一般化プロフィール、Ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖモデル、Ｈｆｒａｍｅ、Ｄｏｕｂｌｅ  Ｆｒａｍｅ、Ｂｌａｓｔ、Ｐｓｉ−Ｂｌａｓｔ、Ｃｌｕｓｔａｌ、及びＧｅｎｅＷｉｓｅが挙げられる。（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０、１９９０年；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２、１９９７年を参照のこと、ともに参考として援用される）。
【００６７】
関連されるＣＫＩポリペプチドのアミノ酸配列は、例えば、複数の配列アラインメント（ＭＳＡ）にアラインされる（例えば、図１を参照のこと）。ＭＳＡはまた、いまだ同定されていないかもしれないさらなるＣＫＩポリペプチドに対して（典型的に実質的な配列同一性を共有するＣＫＩポリペプチドに対して）、１つ以上のＣＫＩポリペプチドについての公知の構造的情報を供与するために使用できる。異なるＣＫＩ間の高い程度の構造相同性に起因して、ＭＳＡはアラインメント内の種々の位置での改変の効果の、信頼できる予測因子として使用できる。従って、ＫＲＰファミリーメンバーの場合において、例えば、図１において示されるＣＫＩの配列と番号付けは、任意の他のＫＲＰファミリーメンバーのタンパク質配列についてのＭＳＡ基準点として使用できる。以前に記載されたように、改変のために特に適切なアミノ酸位置としては、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ  ＫＲＰ１（ＢｎＫｒｐ１）のアミノ酸１４５位、１４８位、１４９位、１５１位、１５３位、１５５位、１６３位、１６４位、１６５位、及び／又は１６７位に対応する位置が挙げられる。図１において示されるアラインメントを使用して、及び／又は本明細書中に記載されるプログラムのような当該分野で公知のアラインメントプログラムを使用して、アラインメントプログラムの番号付け系を基準点として使用でき、そしてＣＫＩの他の認識されるメンバー、構造ホモログ、及びファミリーにおける等価な位置と、ＣＫＩポリペプチドの関連の位置とを相関し得る。類似の方法が、さらに配列決定されるべきＣＫＩポリペプチドのアミノ酸配列をアラインメントするために使用できる。
【００６８】
ある場合において、ＣＤＫ又はサイクリンタンパク質と相互作用するＣＫＩポリペプチドにおけるアミノ酸が、ＣＫＩ／ＣＤＫ又はＣＫＩ／サイクリン複合体の三次元構造から直接的に同定される。等価な情報は、関連されるＣＫＩポリペプチドのＣＫＩ／ＣＤＫ又はＣＫＩ／サイクリン複合体の解析により得られる。従って、構造アラインメントは、本発明の改変ＣＫＩポリペプチドを作製するために使用できる。当該分野において知られる広範に多様な構造アラインメントプログラムがある。例えば、ＮＣＢＩウェブサイトからのＶＡＳＴ；ＳＳＡＰ（Ｏｒｅｎｇｏ及びＴａｙｌｏｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、２６６：６１７〜６３５、１９９６年）；ＳＡＲＦ２（Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．９：７２７〜７３２、１９９６年）ＣＥ（Ｓｈｉｎｙｄｙａｌｏｖ及びＢｏｕｒｎｅ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１１：７３９〜７４７、１９９８年）；（Ｏｒｅｎｇｏら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５：１０９３〜１０８、１９９７年；Ｄａｌｉ（Ｈｏｌｍら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２６：３１６〜９、１９９８年を参照のこと、これらの全ては参考として援用される）。
【００６９】
従って、ＣＫＩ／ＣＤＫ又はＣＫＩ／サイクリン界面での有用な改変は、ＰＤＡ（商標）技術（米国特許第６，１８８，９６５号；同第６，２６９，３１２号；及び同第６，４０３，３１２号を参照のこと、本明細書中に参考として援用される）のようなタンパク質設計又はモデリングアルゴリズムを使用して選択される。このクラスにおけるアルゴリズムは、一般的に、タンパク質の全体の３次構造及び４次構造と、アミノ酸配列との適合性を評価するために、原子レベル又はアミノ酸レベルの評点関数を使用する。従って、このクラスのアルゴリズムは、改変ＣＫＩタンパク質が、正確に折り畳む、及びタンパク質の改変されていない領域に対応する天然に存在する標的と相互作用する能力が実質的に混乱されていない、ＣＤＫ又はサイクリンの結合の改変及び／又は破壊を選択するために使用できる。これらの技術は典型的に、標的タンパク質の高分解能の構造情報を入力として使用する。１つの実施形態において、適切なＣＫＩタンパク質の実験的に決定された構造は、入力として使用される。代替の実施形態において、ＭＳＡは、３次元構造が結晶学的な方法又は関連の方法を使用して決定されたファミリーのサブセットに基づき、ＣＫＩメンバーについての原子レベルの相同性モデルの構築を導くために使用できる。なお別の実施形態において、哺乳動物ｐ２７／サイクリン界面の構造モデルが、植物ＣＫＩについての接触アミノ酸残基を予測するために使用できる。
【００７０】
改変された、例えば、ＣＤＫ又はサイクリンタンパク質についての減少された結合を有する変異ＣＫＩポリペプチドは、広範に多様な他の方法により同定され、例えば、指向性進化（例えば、変異性ＰＣＲ、ＤＮＡシャッフリングなど）、単一部位飽和変異誘発、及びアラニン走査変異誘発が挙げられる。ＫＲＰ  ＣＫＩの場合において、例えば、これらの及び／又は他の方法の使用は、ＣＤＫ結合活性を減少する、及び本明細書中に記載されるＣＤＫ結合領域の外側に存在する、さらなる改変の同定を許容し得る。
【００７１】
また、分子動力学の算定が、変異配列のスコアを個々に算定し、そして表を蓄積することによって、配列をコンピュータによりスクリーニングするために使用できる。また、コンピュータによるスクリーニングの間、残基対ポテンシャルが配列をスコアするために使用できる（Ｍｉｙａｚａｗａら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｃｕｌｅｓ  １８：５３４〜５５２、１９８５年、本明細書中に参考として援用される）。
【００７２】
あるいは、変異ＣＫＩタンパク質のライブラリーが試験のために作製される。例えば、変異ＣＫＩアミノ酸配列のライブラリーが、変異ＣＫＩ配列をコードする核酸を設計するために使用され、次いでこの核酸は宿主細胞にクローン化され、発現され、そして解析される。コドン、適切な発現ベクター、及び適切な宿主細胞の選択は典型的に、多くの因子に依存して変化し、そして必要とされるように容易に至適化される。
【００７３】
本明細書中で概説されるように、優性ネガティブな拮抗活性及び／又は他の所望される活性について試験する変異体のライブラリーをスクリーニングするための１つの特に適切な方法において、プールされたオリゴヌクレオチドでの複数のＰＣＲ反応が行われる。完全長遺伝子に対応する重複するオリゴヌクレオチドが合成される。これらのオリゴヌクレオチドは、改変の各位置又は各サブセットにて、異なるアミノ酸の全てを表現できる。これらのオリゴヌクレオチドは等しい割合でプールされ、そして複数のＰＣＲ反応が、ライブラリーによって規定される変異の組み合わせを含む完全長配列を作製するために行われる。さらに、これは変異性ＰＣＲ法を使用して行うことができる。
【００７４】
典型的に、各重複するオリゴヌクレオチドは、変化されるべきただ１つの位置を含む。あるいは、このことを許容するには改変位置は互いに近すぎ、そしてオリゴヌクレオチド当たり複数の改変が、完全な組み合わせの全ての可能性を許容するために使用される（すなわち、各オリゴは、変異される単一の位置についての、又は変異される１つよりも多い位置についてのコドンを含む）。変異される複数の位置は好ましくは、オリゴヌクレオチド長が不正確になることを防ぐために、配列において近接する。オリゴヌクレオチド上の複数の位置を変異するために、変異の特定の組み合わせが、その組み合わせをコードするオリゴヌクレオチドを含むか又は排除することにより、ライブラリーにおいて含まれるか、又は排除される。例えば、本明細書中で考察されるように、可変領域間で相関され；すなわち、Ｘ位がある残基である場合、Ｙ位は特定の残基であるべきである（又はあるべきではない）。可変位置のこれらのセットは、本明細書中で時折「クラスター」といわれる。クラスターは共に近接する残基からなり、従って１つのオリゴヌクレオチドプライマー上に存在し得る場合、クラスターは「良好な」相関に設定され、そしてライブラリーの有効性を減少し得る悪い組み合わせを排除する。しかし、クラスターの残基が配列中で非常に離れ、従って合成のために異なるオリゴヌクレオチド上に存在する場合、残基を「良好な」相関にセットするか、又は可変残基全体としてそれらを排除するかのいずれかが望ましい。あるいは、ライブラリーは、いくつかの工程において作製され、それによりクラスター変異が共にのみ出現する。この手順、すなわち、変異クラスターを同定し、そしてこれらを同じオリゴヌクレオチド上に配置するか、又はクラスターを保存するいくつかの工程において、ライブラリー又はライブラリー作製からそれらを排除するかのいずれかである手順は、正確に折り畳まれるタンパク質を伴うライブラリーをかなり富化し得る。クラスターの同定は、多くの方法により、例えば、公知のパターン認識法、変異の出現の頻度の比較を使用することにより、又は実験的に作製される配列のエネルギー解析を使用することにより（例えば、相互作用のエネルギーが高い場合、その位置は相関される）、行うことができる。これらの相関は位置相関（例えば、可変位置１及び２は常に共に変化するか、又は共には決して変化しない）、配列相関（例えば、位置１に残基Ａがある場合、位置２には常に残基Ｂがある）である。（生体分子データにおけるパターンの発見：手段、技術、適用（Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｉｎ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄａｔａ：Ｔｏｏｌｓ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；（Ｊａｓｏｎ  Ｔ．Ｌ．Ｗａｎｇ、Ｂｒｕｃｅ  Ａ．Ｓｈａｐｉｒｏ、Ｄｅｎｎｉｓ  Ｓｈａｓｈａ編、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、１９９９年）；Ａｎｄｒｅｗｓ、パターン認識における数学的技術入門（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、１９７２年）；パターン認識��適用（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）（Ｋ．Ｓ．Ｆｕ編、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９８２年）；パターン認識における遺伝子アルゴリズム（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）（Ｓａｎｋａｒ  Ｋ．Ｐａｌ及びＰａｕｌ  Ｐ．Ｗａｎｇ編、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６年）；Ｐａｎｄｙａ、Ｃ＋＋におけるニューラルネットワークでのパターン認識（Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｉｎ  Ｃ＋＋）（Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６年；パターン認識及びコンピュータビジョンの手引き（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ＆  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｖｉｓｉｏｎ）（Ｃ．Ｈ．Ｃｈｅｎ、Ｌ．Ｆ．Ｐａｕ，及びＰ．Ｓ．ＰＷａｎｇ編、第２版、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ；Ｒｉｖｅｒ  Ｅｄｇｅ、Ｎ．Ｊ．Ｗｏｒｌｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃ１９９９年）；Ｆｒｉｅｄｍａｎ、パターン認識入門；統計学的、構造学的、ニューラル的、及びファジー論理的なアプローチ（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ：Ｓｔａｔｉｓｔｉａｌ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ、Ｎｅｕｒａｌ、ａｎｄ  Ｆｕｚｚｙ  Ｌｏｇｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ）（Ｒｉｖｅｒ  Ｅｄｇｅ、Ｎ．Ｊ．Ｗｏｒｌｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１９９９年、シリーズ名称：機械知覚及び人工知能におけるシリーズ（Ｓｅｒｉｅｓ  ｉｎ  ｍａｃｈｉｎｅ  ｐｅｒｃｅｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｉｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ）第３２巻）を参照のこと；これらの全ては明らかに参考として援用される。さらにコンセンサスモチーフについて検索するために使用されるプログラムが同様に使用できる。
【００７５】
コドンの挿入又は欠失を伴うオリゴヌクレオチドが、異なる長さのタンパク質を発現するライブラリーを作製するために使用できる。特に、挿入又は欠失についての、コンピュータによる配列スクリーニングは、異なる長さのタンパク質を規定する第２のライブラリーを生じ得、これは異なる長さのプールされたオリゴヌクレオチドのライブラリーにより発現される。
【００７６】
別の実施形態において、本発明の変異ＣＫＩポリペプチドは、ファミリー（例えば、変異体のセット）をシャッフルすることにより作製される；すなわち、変異性ＰＣＲを用いるか又は用いずに、上位配列のいくつかのセットがシャッフル（序列表が使用される場合）される。この情況における「シャッフリング」は、一般的にランダムな様式における、関連される配列の組み合わせを意味する。これは、米国特許第５，８３０，７２１号；同第５，８１１，２３８号；同第５，６０５，７９３号；同第５，８３７，４５８号、及びＰＣＴ  ＵＳ／１９２５６（これらの全ては本明細書中に参考として援用される）において規定及び例示されるような「シャッフリング」を含む。配列のこのセットはまた、人工的なセットであり得；例えば、確立テーブル（例えば、ＳＣＭＦを使用して作製される）又はＭｏｎｔｅ  Ｃａｒｌｏセット由来である。同様に、「ファミリー」は、上位１０よび及び下位１０の配列、上位１００の配列などである。これはまた、変異性ＰＣＲを使用してなされる。
【００７７】
従って、in silicoシャッフリングは、本明細書中に使用されるコンピュータ法を使用して行うことができる（例えば、２つのライブラリー又は２つの配列で開始し、配列のランダムな組換えが作製され、そして評価される）。
【００７８】
変異性ＰＣＲは、変異ＣＫＩポリペプチドのライブラリーを作製するために行うことができる。米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号、同第５，８３０，７２１号を参照のこと、これらは本明細書中に参考として援用される。このことは、至適な配列に対して、又はライブラリー、又はいくつかの他の人工的なセット若しくはファミリーの上位メンバーに対して行うことができる。この方法において、１次ライブラリーのコンピュータスクリーニングにおいて見出される至適な配列についての遺伝子が合成できる。次いで、ライブラリーの改変位置での変異をコードするオリゴヌクレオチド（偏向オリゴヌクレオチド）の存在下、変異性ＰＣＲが、至適な配列の遺伝子に対して行われる。オリゴヌクレオチドの付加は、ライブラリーにおける変異の取り込みを有利にする偏向を作製する。あるいは、ある変異についてのオリゴヌクレオチドのみが、ライブラリーを偏向するために使用できる。
【００７９】
遺伝子シャッフリングは、ＣＫＩライブラリーにおいて見出される変異の割合を影響するＤＮＡ配列ライブラリーを作製するために、偏向オリゴヌクレオチドの存在下、変異性ＰＣＲを用いて、至適な配列の遺伝子に対して行うことができる。偏向オリゴヌクレオチドの選択は、多様な方法において行われ得；これらはそえらの頻度の偏向に対して選択され、例えば、高い変異頻度の位置をコードするオリゴヌクレオチドが使用できるか；あるいは、最も可変性の位置を含むオリゴヌクレオチドが使用され、その結果、多様性が増加され；２次ライブラリーが格付けされる場合、上位評点の位置のいくつかが、偏向オリゴヌクレオチドを作製するために使用され；ランダムな位置が選択され；いくつかの上位評点及びいくつかの下位評点のものが選択される。重要なことは、好ましい可変性の位置及び配列に基づいて新規な配列を作製することである。
【００８０】
別のバリエーションにおいて、野生型遺伝子又は他の遺伝子を用いるＰＣＲが使用できる。この実施形態において、開始遺伝子が使用される（例えば、野生型遺伝子、全体的に至適化される配列、又は例えば、異なる生物体由来の相同配列をアラインすることから得られるコンセンサス配列をコードする遺伝子）。この実施形態において、改変位置に対応し、及びライブラリーの異なるアミノ酸を含むオリゴヌクレオチドが使用される。ＰＣＲは、末端でのＰＣＲプライマーを使用して行われる。これは、２つの利点を提供する。第１に、これは一般的により少ないオリゴヌクレオチドを必要とし、そしてより少ない誤りを生じ得る。第２に、これは、野生型遺伝子が使用される場合、合成される必要がないという点で、実験的利点を有する。
【００８１】
変異ＣＫＩポリペプチドは、任意の数の生物体由来であり、植物由来のＣＫＩポリペプチドは特に好ましい。適切な植物としては、例えば、単子葉植物と双子葉植物の両方を含む、形質転換技術に適する高等植物だけでなく、藻類のようなある下等のクラスも挙げることができる。これは多様な倍数性レベルの植物を含み、倍数体、２倍体、半数体を含む。特定の実施形態において、植物は、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ（グリシンマックス）、トウモロコシ、イネ、コムギ、アルファルファ、綿花、又はポプラなどである。
【００８２】
上記のように、本発明の変異ＣＫＩポリペプチドは、野生型ＣＫＩポリペプチドの優性ネガティブなアンタゴニストである。ある実施形態において、変異ＣＫＩポリペプチドは、その対応するサイクリン又はＣＤＫタンパク質（すなわち、ＣＫＩ変異体が由来する種からの内因性の、天然に存在するＣＤＫ又はサイクリンタンパク質）の１つのみ、又は両方と物理学的に相互作用し、それにより変異ＣＫＩを含むＣＤＫ／サイクリン複合体は、野生型ＣＫＩタンパク質によるＣＤＫ／サイクリンキナーゼ阻害について防御される。
【００８３】
代替の、相互排他的でない実施形態において、変異ＣＫＩポリペプチドは、異種ＣＤＫ又はサイクリンタンパク質（すなわち、ＣＫＩ変異体が由来する種とは異なる種由来の、天然に存在するＣＤＫ又はサイクリンタンパク質）の１つのみ、又は両方と物理学的に相互作用し、それにより変異ＣＫＩを含む異種ＣＤＫ／サイクリンの複合体は、複合体内のＣＤＫやサイクリンタンパク質に対応する野生型ＣＫＩタンパク質による（すなわち、ＣＤＫやサイクリンタンパク質に対して内因性である野生型ＣＫＩタンパク質による）ＣＤＫ／サイクリンキナーゼ阻害から、防御される。
【００８４】
いくつかの実施形態において、本発明の変異ＣＫＩポリペプチドは、対応する野生型ＣＫＩタンパク質について非常に特異的なアンタゴニストである。代替の実施形態において、本発明の変異体ＣＫＩポリペプチドは、１つよりも多い野生型ポリペプチドについて特異的なアンタゴニストである。例えば、変異アラビドプシスＣＫＩポリペプチドは、野生型アラビドプシスＣＫＩポリペプチドのみの特異的なアンタゴニストであるか、又は野生型のアラビドプシス、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ、トウモロコシ、コムギ、イネ、綿花、及び／又はポプラのＣＫＩポリペプチドについて特異的である。また、変異アブラナＣＫＩポリペプチドは野生型アブラナＣＫＩポリペプチドのみの特異的なアンタゴニストであるか、又は野生型のアラビドプシス、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ、トウモロコシ、コムギ、イネ、綿花、及び／又はポプラについて特異的である。
【００８５】
変異ＣＫＩポリペプチドは、野生型ＣＫＩポリペプチドに比較して、実質的に減少された生物学的活性を表し、ＣＤＫ又はサイクリンタンパク質のうちの１つに対する改変された結合、及びＣＤＫ／サイクリンキナーゼ複合体の減少された阻害を含む。このような減少された生物学的活性は、インビボ及び／又はインビトロのアッセイを使用して試験され、確認される。適切なアッセイとしては、ＣＤＫ／サイクリンキナーゼ活性アッセイ；ＣＤＫ又はサイクリン結合アッセイ；細胞増殖アッセイが挙げられるが、これらに制限されない。野生型ＣＫＩポリペプチドに比較して、生物学的活性における実質的な減少は、改変ＣＫＩポリペプチドの生物学的活性が対応する野生型ＣＫＩポリペプチドの生物学的活性の８０％未満又は７０％未満、典型的に６０％未満又は５０％未満、より典型的に４０％未満又は３０％未満、好ましくは２０％未満又は１０％未満である。
【００８６】
いくつかの実施形態において、変異ＣＫＩポリペプチドは、野生型ＣＫＩポリペプチドに比較して、本明細書中に概説される改変に加えて、ある改変を含む（すなわち、変異ＣＫＩタンパク質は、対応する野生型ＣＫＩタンパク質に比較して、優性ネガティブタンパク質を作製するために使用される改変以外のさらなる改変を含む）。例としては、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて可溶性発現を可能にするために導入されるアミノ酸置換、及び溶液挙動を至適化するために導入されるアミノ酸置換が挙げられるが、これらに制限されない。さらに、本明細書中で概説されるように、本明細書中に記載される任意の変異は、さらなる改変ＣＫＩポリペプチドを形成するためにいかようにも組み合わされる。さらに、変異ＣＫＩポリペプチドは、対応する野生型タンパク質よりも長い変異ＣＫＩポリペプチドが、例えば、エピトープ若しくは精製タグの付加、他の融合配列の付加などにより作製されるか、又は変異ＣＫＩポリペプチドはより短くよい。
【００８７】
変異ＣＫＩポリペプチドはまた、変異ＣＫＩ核酸によりコードされるとして同定される。核酸の場合において、核酸配列の全体の配列同一性は、アミノ酸配列同一性と相応するが、遺伝子コードにおける縮重及び異なる生物体のコドン偏向を考慮する。従って、核酸配列同一性は、タンパク質配列の同一性よりも低いか又は高いかのいずれかであり、より低い配列同一性が典型的である。
【００８８】
当業者により理解されるように、遺伝子コードの縮重に起因して、極めて多数の核酸が作製され、その全ては本発明の変異ＣＫＩポリペプチドをコードする。従って、特定のアミノ酸配列を同定することが、変異タンパク質をコードする任意の数の異なる核酸を、変異ＣＫＩポリペプチドのアミノ酸配列を変化しない方法で１つ以上のコドンの配列を単に改変することによって、なされる。
【００８９】
本発明の変異ＣＫＩポリペプチド及び核酸は、好ましくは（合成的に作製されない限り）組換えである。上記されるように、変異体は典型的に、変異体をコードするＤＮＡを生成するために、カセット若しくはＰＣＲ変異誘発、又は当該分野で周知の別の技術を使用し、その後組換え細胞培養物中でＤＮＡを発現して、対応するＣＫＩタンパク質をコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異的変異誘発により調製される。アミノ酸配列変異体は、変異の予め決定された性質、天然に存在する対立遺伝子又は変異ＣＫＩタンパク質アミノ酸配列の種間の多様性とは異なるそれらを設定する特徴により、特徴づけられる。上述で概説されるように、改変体は典型的に、ＣＤＫ又はサイクリンタンパク質のいずれかの類似の結合を表す（従って、対応する野生型ＣＫＩタンパク質に比較して、変異体はその阻害活性における実質的な減少を表すが；さらなる改変特徴を有する改変体がまた選択される）。
【００９０】
アミノ酸配列変異を導入するための部位又は領域は予め決定されるが、変異自身は予め決定される必要はない。例えば、所与の部位での変異の性能を至適化するために、ランダムな変異誘発が標的コドン又は領域にて行われ、そして発現される改変ＣＫＩタンパク質は、所望される活性の至適な組み合わせについてスクリーニングされる。公知の配列を有するＤＮＡ中の予め決定された部位にて置換変異を作製するための技術、例えば、Ｍ１３プライマー変異誘発及びＰＣＲ変異誘発が周知である。変異体のスクリーニングは、至適な特徴についての変異体ＣＫＩタンパク質活性のアッセイを使用して行われる。
【００９１】
いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は単一の残基である。他の実施形態において、複数のアミノ酸残基が置換される（例えば、２個、３個、４個、又はそれ以上のアミノ酸が置換される）。挿入は典型的に、アミノ酸について約１〜２０個であるが、かなりのより大きな挿入が容認される。欠失は、約１〜約２０残基、又は約１〜約３０残基にわたるが、いくつかの場合において、欠失は非常により大きくよい。ある実施形態において、変異ＣＫＩポリペプチドは２つ以上の野生型ＣＫＩタンパク質に由来するキメラであり、本明細書中で概説されるように、ＣＤＫ又はサイクリン結合領域において少なくとも１つの改変を伴う。
【００９２】
置換、欠失、挿入、又は任意のそれらの組み合わせが、最終的な変異体に到達するために使用される。一般的に、改変は、分子の変化を最小にするために比較的少ないアミノ酸に関して行われる。しかし、より大きな変化がある情況において容認される。
【００９３】
変異ＣＫＩポリペプチドをコードする本発明の核酸を使用して、多様なベクターが作製される。宿主細胞と適合性の種に由来するレプリコン又は制御配列を含む任意のベクターが、本発明の実施において使用できる。ベクターは、自己複製する染色体外ベクター又は宿主ゲノムに取り込まれるベクターのいずれかである。一般的に、発現ベクターは変異ＣＫＩポリペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結される転写調節核酸領域及び翻訳調節核酸領域を含む。用語「制御配列」は、作動可能に連結されるコード配列の、特定の宿主生物体における発現に必要なＤＮＡ配列をいう。原核生物に適切である制御配列としては、例えば、プロモーター、必要に応じてオペレーター配列、及びリボソーム結合部位が挙げられる。転写調節核酸領域及び翻訳調節核酸領域は一般的に、ポリペプチドを発現するために使用される宿主細胞に適合する。
【００９４】
ある実施形態において、ＣＫＩ核酸は、コドンの至適化を使用して、宿主細胞における増強される遺伝子発現のために改変され、これはコドン配列を、ＤＮＡ分子が発現される細胞の種において高度に使用される翻訳コドン（同じアミノ酸に対応する）で置き換えることを含む。トウモロコシにおける発現のために至適化されたＢｎＫｒｐ１変異コード配列（ＢｎＫｒｐ１  Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ、及びＹ１４９Ａ；Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ）の例が図３において示される。コドン至適化の手順は一般的に当該分野において周知であり、そして本発明に従う他の、コドンが至適化された変異体Ｋｒｐ１配列を得るために、当業者により使用できる。
【００９５】
多数のタイプの適切な発現ベクター、及び適切な調節配列が、多様な宿主細胞について当該分野において知られる。一般的に、転写調節配列及び翻訳調節配列としては、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写開始と停止配列、翻訳開始と停止配列、及びエンハンサー又はアクチベーター配列が挙げられる。典型的な実施形態において、調節配列は、プロモーター及び転写開始と停止配列を含む。ベクターはまた、典型的に、外来ＤＮＡの挿入のためのいくつかの制限部位を含むポリリンカー領域を含む。複製配列、調節配列、表現型選択遺伝子をコードするＤＮＡ、及び目的の改変ＣＫＩ  ＤＮＡを含む適切なベクターの構築は、標準的な組換えＤＮＡ手順を使用して調節される。単離されたプラスミド、ウイルスベクター、ＤＮＡフラグメントは、当該分野において周知であるように、切断され、調整され、そして所望されるベクターを作製するために特定の順序においてともに連結される（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ、前出、及びＳａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと）。
【００９６】
プロモーター配列は、構成的プロモーター又は誘導性プロモーターのいずれかをコードする。プロモーターは、天然に存在するプロモーター又はハイブリッドプロモーターのいずれかである。ハイブリッドプロモーターは、１つよりも多いプロモーターのエレメントを組み合わせ、当該分野においてまた公知であり、そして本発明において有用である。典型的な実施形態において、プロモーターは強力なプロモーターであり、細胞、特に植物細胞中での高発現を許容する。本発明に従う使用に特に適切であるプロモーターは、さらに以下に記載される。
【００９７】
さらに、発現ベクターは、さらなるエレメントを含む。例えば、発現ベクターは、２つの複製系を有し、従って、２つの生物体において、例えば、発現のために植物細胞又は昆虫細胞において、及びクローニング及び増殖のために原核生物宿主において、ベクターが維持されることを許容する。さらに、発現ベクターを取り込むために、発現ベクターは、宿主細胞ゲノムに対して少なくとも１つの配列相同性、及び好ましくは発現構築物に近接する２つの相同な配列を含む。組込まれるベクターは、ベクター中の封入のために適切な相同配列を選択することにより、宿主細胞の特定の遺伝子座に指向される。ベクターを組込むための構築物は、当該分野において周知である。
【００９８】
ある実施形態において、発現ベクターは形質転換された宿主細胞の選択を許容する選択可能なマーカー遺伝子を含む。選択遺伝子は当該分野において周知であり、そして使用される宿主細胞とともに変わる。適切な選択遺伝子としては、例えば、アンピシリン及び／又はテトラサイクリン耐性をコードする遺伝子が挙げられ、これはこれらのベクターで形質転換された細胞が、これらの抗体の存在下で増殖することを可能にする。
【００９９】
本発明の１つの局面において、変異ＣＫＩ核酸は、単独で又はベクターと組み合わせてのいずれかで、細胞に導入される。「へ導入される」又は本明細書中の文法的に対応する言葉により、その後の核酸の組み込み、増殖、及び／又は発現に適切である様式で、核酸が細胞に入ることを意味する。導入の方法は、標的される細胞型により非常に影響される。例示的な方法としては、ＣａＰＯ4沈降、リポソーム融合、リポフェクチン（登録商標）、エレクトロポレーション、ウイルス感染などが挙げられる。植物細胞への導入に特に適切な方法は当該分野において公知であり、そしてまた、以下に記載される（第ＩＩ節「トランスジェニック植物」を参照のこと）。このような方法としては、例えば、ＤＮＡを含む微小発射体（マイクロプロジェクタイル）での細胞のボンバードメントが挙げられる。変異ＣＫＩ核酸は、宿主細胞のゲノムに安定に取り込まれ得るか、又は細胞質中に、一過的に若しくは安定してのいずれかで存在し得る（例えば、伝統的なプラスミドの使用を通して、標準的な調節配列、選択マーカーなどを利用する）。
【０１００】
原核生物は、本発明の最初のクローニング工程のために宿主細胞として使用できる。これらは、大量のＤＮＡの迅速な産生のために、部位特異的変異誘発のために使用される１本鎖ＤＮＡ鋳型の産生のために、多くの変異体を同時にスクリーニングするために、又は作製される変異体のＤＮＡを配列決定するために、特に有用である。適切な原核生物宿主細胞としては、Ｅ.ｃｏｌｉ  Ｋ１２株９４（ＡＴＣＣ番号３１，４４６）、Ｅ.ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ番号２７，３２５）、Ｅ.ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ番号３１，５３７）、及びＥ.ｃｏｌｉ  Ｂが挙げられるが；ＨＢ１０１、ＪＭ１０１、ＮＭ５２２、ＮＭ５３８、ＮＭ５３９のようなＥ.ｃｏｌｉの多くの他の株、並びにＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのような桿菌を含む原核生物の多くの他の種及び属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ又はＳｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓａｎｓのような他の腸内細菌、種々のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種が、全て宿主として使用される。原核生物宿主細胞又は硬い細胞壁を伴う他の宿主細胞は典型的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出の第１.８２節において記載されるように、塩化カルシウム法を使用して形質転換される。あるいは、エレクトロポレーションが、これらの細胞の形質転換のために使用できる。原核生物の形質転換技術は、例えば、Ｄｏｗｅｒ、遺伝子操作、原理及び方法（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ）１２：２７５〜２９６（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．、１９９０年）；Ｈａｎａｈａｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｙｍｏｌ．，２０４：６３、１９９１年）において記載される。Ｅ.ｃｏｌｉの形質転換のために典型的に使用されるプラスミドとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣＩ８、ｐＵＣＩ９、ｐＵＣＩ１８、ｐＵＣ１１９、及びＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  Ｍ１３が挙げられ、これらの全ては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出の第１.１２〜１.２０節において記載される。しかし、多くの他の適切なベクターが同様に利用可能である。
【０１０１】
本発明の変異ＣＫＩポリペプチドは典型的に、変異ＣＫＩポリペプチドの発現を誘導する、又は引き起こすのに適切な条件下で、変異ＣＫＩポリペプチドをコードする核酸を含むベクターで形質転換された宿主細胞を培養することにより、産生される。細胞分裂の調節のために、ＣＫＩタンパク質は、その通常の細胞内の形態において発現される。変異ＣＫＩポリペプチドの回収又は単離を含む本発明の適用のために、ＣＫＩ変異体は、細胞内タンパク質として、あるいは宿主細胞から分泌される形態において発現される。細胞から通常分泌される多くの真核生物タンパク質は、アミノ酸配列の部分として内因性の分泌シグナル配列を含む。従って、細胞質中に通常見出されるタンパク質は、タンパク質にシグナル配列を連結することにより、分泌について容易に標的される。このことは、タンパク質をコードするＤＮＡの５’末端にシグナル配列をコードするＤＮＡを連結し、次いで適切な宿主細胞においてこの融合タンパク質を発現することにより、容易に達成される。シグナル配列をコードするＤＮＡは、シグナル配列を伴うタンパク質をコードする任意の遺伝子から、制限フラグメントとして得ることができる。従って、原核生物、酵母、真核生物のシグナル配列が本明細書中で使用され、本発明を実施するために利用される宿主細胞のタイプに依存する。例えば、ヒト成長ホルモン、プロインスリン、プロアルブミンを含む、いくつかの真核生物遺伝子のシグナル配列部分をコードするＤＮＡ及びアミノ酸配列が知られ（Ｓｔｒｙｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ及びＣｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ，１９８８年、７６９頁）を参照のこと）、そして適切な真核生物宿主細胞においてシグナル配列として使用できる。例えば、酸ホスファターゼ（Ａｒｉｍａら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１１：１６５７、１９８３年）、α因子、アルカリホスファターゼ、インベルターゼのような酵母シグナル配列は、酵母宿主細胞からの分泌を指向するために使用できる。例えば、ＬａｍＢ又はＯｍｐＦ（Ｗｏｎｇら、Ｇｅｎｅ  ６８：１９３、１９８８年）、ＭａｌＥ、ＰｈｏＡ、又はβ−ラクタマーゼをコードする遺伝子、及び他の遺伝子由来の原核生物のシグナル配列は、原核生物において発現されるタンパク質を、培養培地中へ標的するために使用できる。
【０１０２】
変異ＣＫＩポリペプチド発現に適切な条件は、発現ベクターや宿主細胞の選択によって変わり、そして日常的な実験を通して当業者により容易に確認できる。例えば、発現ベクターにおける構成的プロモーターの使用は、宿主細胞の成長と増殖を至適化することが必要とされるのに対し、誘導性プロモーターの使用は、誘導のための適切な成長条件を必要とする。さらに、いくつかの実施形態において、回収の時期は重要である。例えば、昆虫細胞発現において使用されるバキュロウイルス系は、溶菌ウイルスであり、従って回収時期の選択が、産物の収量にとって重要である。
【０１０３】
原核生物ベクターにおいて最も一般的に使用されるプロモーターとしては、ｐ−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）やラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７５：６１５、１９７８年；Ｉｔａｋｕｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６、１９７７年；Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ  ２８１：５４４、１９７９年）及びトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８：４０５７、１９８０年；ＥＰＯ  Ａｐｐｌ．Ｐｕｂｌ．第３６巻、７７６）、並びにアルカリホスファターゼ系が挙げられる。これらは最も一般的に使用されるが、他の微生物プロモーターが利用されており、そしてそれらのヌクレオチド配列に関する詳細が公開されており、当業者がそれらをプラスミドベクターへ機能的に連結することを可能にする（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔら、Ｃｅｌｌ  ２０：２６９、１９８０年を参照のこと）。
【０１０４】
本発明の実施において使用できる応答性プロモーター系の実例は、トウモロコシにおけるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）系である。ＧＳＴは、発芽前除草剤としてしばしば使用される多くの疎水性の求電子化合物を解毒し得る酵素のファミリーである（Ｗｅｉｇａｎｄら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７：２３５〜２４３、１９８６年）。研究は、ＧＳＴがこの増強された除草剤耐性を引き起こすことに直接的に関与することを示した。この作用は主に、特異的な１.１ｋｂ  ｍＲＮＡ転写産物を介して媒介される。簡潔には、トウモロコシは、天然に存在する静止遺伝子を有し、外部刺激に応答し、そして遺伝子産物を産生するように誘導されることを既に示す。この遺伝子は、以前に同定及びクローン化されている。従って、本発明の１つの実施形態において、プロモーターはＧＳＴ応答性遺伝子から取り出され、そして変異ＣＫＩコード配列に接続される。変異ＣＫＩ遺伝子がゲノムＤＮＡ供給源に由来する場合、キメラ遺伝子の構築の間にネイティブなプロモーターを除去することが必要とされる。この操作された遺伝子は、外部の化学的な刺激に応答するプロモーターと、変異ＣＫＩタンパク質の首尾よい産生を担う遺伝子との組み合わせである。
【０１０５】
誘導性プロモーターは、誘導因子に応答して１つ以上のＤＮＡ配列又は遺伝子の転写を直接的に又は間接的に活性化し得るプロモーターである。誘導因子の不在下で、ＤＮＡ配列又は遺伝子は転写されない。典型的に、タンパク質因子は、転写を活性化するための誘導性プロモーターに特異的に結合し、不活性な形態で存在し、次いでこれは誘導因子により活性な形態に直接的に又は間接的に変換される。誘導因子は、タンパク質、代謝物質、成長調節因子、除草剤、若しくはフェノール化合物のような化学的因子、又は熱、低温、塩、若しくは毒性要素により直接的に、若しくはウイルスのような病原体又は疾病因子の作用を介して間接的に課せられる生理学的ストレスである。誘導性プロモーターを含む植物細胞は、噴霧、散水、加熱、又は類似の方法によるように、細胞又は植物に対して誘導因子を外的に適用することによって、誘導因子に曝露される。植物の発達の間の特定の時間に標的遺伝子の発現を活性化することが所望される場合、誘導因子はその時点でそのように適用される。
【０１０６】
このような誘導性プロモーターの例としては、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｐｈｉｌｉａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）の誘導性７０ＫＤ熱ショックプロモーター（Ｆｒｅｅｌｉｎｇら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９：２９７〜３２３）のような熱ショックプロモーター；アブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）由来の低温誘導性プロモーター（Ｗｈｉｔｅら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、１０６、１９９４年）のような低温誘導性プロモーター；エタノールにより誘導されるアルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（Ｎａｇａｏら、Ｓｕｒｖｅｙｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  第３巻、３８４〜４３８頁（Ｂ．Ｊ．Ｍｉｆｌｉｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８６年）が挙げられる。
【０１０７】
構成的プロモーターは、トランスジェニック植物の全ての組織において、１つ以上のＤＮＡ配列又は遺伝子の転写を直接的に又は間接的に活性化し得るプロモーターである。典型的に、ＣａＭＣの３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ、Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０〜８１２、１９８５年）のような構成的プロモーターが使用される。植物において有用な構成的プロモーターの他の例としては、イネアクチンプロモーター（Ｅｌｒｏｙら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１６３〜１７１、１９９０年）、トウモロコシ  ＨＥヒストン（Ｌｅｐｅｔｉｔら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３１：２７６〜２８５、１９９２年）などが挙げられる。
【０１０８】
本発明のＣＫＩ導入遺伝子は、ＢＣＥＡ（Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ胚）プロモーターのようなプロモーターを使用して発現され、これは非常に初期の種子発達において高レベルの発現を指向することが見出されている（すなわち、ナピン（ｎａｐｉｎ）プロモーターの前に転写される）。これは、保存物質蓄積の前の期間であるが、アブラナ種子（Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｆｌａｎａｇａｎら、Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３６：１８０、１９８９年；Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｆｌａｎａｇａｎら、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  ８１：３０１、１９９１年に由来する）における迅速な色素生合成の期間である。種子保存タンパク質プロモーターはまた、種子特異的様式において高レベルの発現を指向することが示されている（Ｖｏｅｌｋｅｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：９５、１９８９年；Ａｌｔｅｎｂａｃｈら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３：５１３、１９８９年；Ｌｅｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：６１８１、１９９１年；Ｒｕｓｓｅｌｌら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．６：１５７〜６８、１９９７年）。ナピンプロモーターは、トランスジェニックアブラナにおいてオレオシン（ｏｌｅｏｓｉｎ）遺伝子発現を指向することが示され、それにより全種子タンパク質のうちの約１％にオレオシンが蓄積される（Ｌｅｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：６１８１、１９９１年）。プロモーターを選択する際に、他の組織における発現を影響することなく、ある組織における抑制又は過剰発現を許容する組織特異的プロモーター又は発達調節性プロモーターを使用することが所望される。「組織特異的プロモーター」は、例えば、根、葉、茎、雌しべ、葯、花弁、種皮、種子珠心、又は表皮層のような特異的組織において主に遺伝子発現を指向するコード領域をいう。組織特異性を保持する高レベルの活性を伴うプロモーターを作製するために、転写刺激因子、エンハンサー、又は活性因子は、組織特異的プロモーター中に組込まれ得る。例えば、過剰発現において利用されるプロモーターは、好ましくは、組織特異的である。種子保存領域において過剰発現する試みにおいて、葉のような間違った組織における過剰発現は有害である。特に適切なプロモーターは、例えば、種子特異的、根特異的、葉特異的、果実特異的発現などを許容するプロモーターである。これは、種子、根、葉、果実は特に重要であるので、特に有用である。異なる組織のタイプに特異的であるいくつかのプロモーターはすでに利用可能であるか、又は十分に確立された技術により（例えば、米国特許第５，７９２，９２５号；同第５，７８３，３９３号；同第５，８５９，３３６号；同第５，８６６，７９３号；同第５，８９８，０９６号；及び同第５，９２９，３０２号を参照のこと）、及び以下にさらに記載されるように、単離できる。表１は、本発明を実施するために使用できる、他の胚特異的プロモーターを列挙する。
【０１０９】
【表１】
2009502175.tif 000003
【０１１０】
特に、本発明の実施形態において、未成熟の種子の胚植物の発達の間に特に活性である種子特異的プロモーターは、非常に重要である。種子発達における初期の、本発明の優性ネガティブ変異体の発現が、種子発達における初期の細胞分裂を増加するように所望される。この段階でのより多くの細胞分裂は、より大きな胚を導く。胚組成は約３３％が油であり、それゆえ、より大きな胚は、油含量の増加を導く。胚における本発明の発現に、及び他の植物組織におけるより低い発現又は未発現に適切であるプロモーターは、種子の油含量を増加するために重要である。特に重要であるのは、初期相特異的胚発達において発現を開始するそれらのプロモーター配列である。初期相特異的プロモーターは、アラビドプシスにおいて受粉（ナナフシ）後７日目の前に、又は別の植物種において等価な段階で、タンパク質の発現を開始するプロモーターである。特に重要なプロモーター配列の例としては、アミノ酸パーミアーゼ遺伝子（ＡＡＰ１）についてのプロモーター（例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来のＡＡＰ１プロモーター）、オレイン酸１２−ヒドロキシラーゼ：デサチュラーゼ遺伝子についてのプロモーター（例えば、Ｌｅｓｑｕｅｒｅｌｌａ  ｆｅｎｄｌｅｒｉ由来のＬＦＡＨ１２に指定されるプロモーター、２Ｓ２アルブミン遺伝子についてのプロモーター（例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来の２Ｓ２プロモーター、脂肪酸エロンガーゼ遺伝子プロモーター（ＦＡＥ１）（例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来のＦＡＥ1プロモーター）、及び葉の子葉遺伝子プロモーター（ＬＥＣ２）（例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来のＬＥＣ２プロモーター）が挙げられる。ＡＡＰ１、ＬＥＡＨ１２、２Ｓ２、及びＦＡＥ１プロモーターは、胚発達の最も初期の段階で不活性である。これらは、発達の後期にて徐々に転写的に活性になり、ＡＡＰ１から開始され、ＬＦＡＨ１２、２Ｓ２、次いでＦＡＥが続く。次いで全ての４つのプロモーターは、胚発達後期を通して活性なままである。ＬＥＣ２プロモーターは、逆の発現プロフィールを有する。これは、非常に初期の胚発達において活性であり、次いでその活性は、後期を通して徐々に減退する。目的の他の胚特異的プロモーターとしては、以下の遺伝子由来のプロモーターが挙げられる：Ｓｅｅｄｓｔｉｃｋ（Ｐｉｎｖｏｐｉｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ  ４２４：８５〜８８、２００３年）、Ｆｂｐ７及びＦｂｐ１１（ペチュニアＳｅｅｄｓｔｉｃｋ）（Ｃｏｌｏｍｂｏら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ．９：７０３〜７１５、１９９７年）、Ｂａｎｙｕｌｓ（Ｄｅｖｉｃ、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、１９：３８７〜３９８、１９９９年）、ＡＢＩ３（Ｎｇら、Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５４：２５〜３８、２００４年）、ａｇｌ−１５、Ａｇｌ１８（Ｌｅｈｔｉ−Ｓｈｉｕら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５８：８９〜１０７、２００５年）、Ｐｈｅ１（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．１７：１５４０〜１５5３、２００３年）、ｅｍｂ１７５（Ｃｕｓｈｉｎｇら、Ｐｌａｎｔａ．２２１：４２４〜４３６、２００５年）、Ｌ１１（Ｋｗｏｎｇら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １５：５〜１���、２００３年）、Ｌｅｃ１（Ｌｏｔａｎ、Ｃｅｌｌ  ９３：１１９５〜１２０５、１９９８年）、Ｆｕｓｃａ３（Ｋｒｏｊら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３０：６０６５〜６０７３、２００３年）、ＴＴ１２（Ｄｅｂｅａｕｊｏｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １３：８５３〜８７１、２００１年）、ＴＴ１６（Ｎｅｓｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １４：２４６３〜２４７９、２００２年）、Ａ−ＲＺｆ（Ｚｏｕ及びＴａｙｌｏｒ、Ｇｅｎｅ  １９６：２９１〜２９５、１９９７年）、ＴＴＧ１（Ｗａｌｋｅｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １１：１３３７〜１３５０、１９９９年）、ＴＴ１（Ｓａｇａｓｓｅｒら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６：１３８〜１４９、２００２年）、ＴＴ８（Ｎｅｓｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １２：１８６３〜１８７８、２０００年）、及びＧｅａ−８（ニンジン）（Ｌｉｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔａｎｙ  ５０：１１３９〜１１４７、１９９９年）のプロモーター。単子葉植物由来の胚特異的プロモーターとしては、グロブリン（Ｇｌｏｂｕｌｉｎ）、Ｋｎｏｘ（イネ）（Ｐｏｓｔｍａ−Ｈａａｒｓｍａ、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３９：２５７〜２７１、１９９９年）、オレオシン（Ｏｌｅｏｓｉｎ）（Ｐｌａｎｔ、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５：１９３〜２０５、１９９４年）、Ｋｅｄｄｅ、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３２７〜３４０、１９９４年）、ペルオキシレドキシン（Ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ）（Ｐｅｒ１）（Ｈａｓｌｅｋａｓら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６：８３３〜８４５、１９９８年）、Ｈａｓｌｅｋａｓら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３：３１３〜３２６、２００３年）、ＨｖＧＡＭＹＢ（Ｄｉａｚら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２９：４５３〜４６４、２００２年）、及びオオムギ由来のＳＡＤ１（Ｉｓａｂｅｌ−ＬａＭｏｎｅｄａら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ３３：３２９〜３４０、１９９９年）、並びに、トウモロコシ（Ｚｅａ  Ｍａｉｚｅ）ハイブリッドプロリンリッチタンパク質プロモーター（Ｊｏｓｅ−Ｅｓｔａｎｙｏｌら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４：４１３〜４２３、１９９２年；Ｊｏｓｅ−Ｅｓｔａｎｙｏｌら、Ｇｅｎｅ  ３５６：１４６〜１５２、２００５年）が挙げられる。
【０１１１】
種子保存タンパク質は、多くの植物において全種子タンパク質の９０％までも示すので、種子タンパク質のプロモーターはまた特に重要である。種子保存タンパク質は厳密に調節され、非常に組織特異的な及び段階特異的な様式において、種子中でほとんど排他的に発現される（Ｈｉｇｇｉｎｓら、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３５：１９１〜２２１、１９８４年；Ｇｏｌｄｅｒｇら、Ｃｅｌｌ  ５６：１４９〜１６０、１９８９年）。さらに、異なる種子保存タンパク質が、種子発達の異なる段階にて発現される。種子特異的遺伝子の発現は、非常に詳細に研究されている（Ｇｏｌｄｂｅｒｇら、前出、及びＨｉｇｇｉｎｓら、前出による概説を参照のこと）。種子特異的プロモーターの例としては、アラビドプシスや他の植物のＬＦＡＨ１２、及びＴｈｏｍａｓらに対する米国特許第５，９７７，４３６号（その全体が参考として援用される）において記載されるような、アラビドプシスオレオシン遺伝子の５’調節領域が挙げられ、これは異種遺伝子のコード配列又はネイティブな植物遺伝子に相補的な配列のいずれかに作動可能に連結される場合、植物種子において、異種遺伝子又は相補的な配列の発現を指向する。
【０１１２】
双子葉植物についての適切な種子保存タンパク質のプロモーターとしては、例えば、マメ−β−ファセオリン、レクチン、及びフィトヘマグルチニンのプロモーター（Ｓｅｎｇｕｐｔａ−Ｇｏｐａｌａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：３３２０〜３３２４、１９８５年；Ｈｏｆｆｍａｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１：７１７〜７２９、１９８８年：Ｖｏｅｌｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３５７１〜３５７７、１９８７年）；ナタネ（カノーラ（Ｃａｎｏｌａ））ナピンプロモーター（Ｒａｄｋｅら、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７５：６８５〜６９４、１９８８年）；ダイズグリシニン及びコングリシニンのプロモーター（Ｃｈｅｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．７：２９７〜３０２、１９８８年；Ｎｉｅｌｓｏｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：３１３〜３２８、１９８９年、Ｈａｒａｄａら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：４１５〜４２５、１９８９年；Ｂｅａｃｈｙら、ＥＭＢＯ  Ｊ．４：３０４７〜３０５３、１９８５年）；ダイズレクチンプロモーター（Ｏｋａｍｕｒｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８２４０〜８２４４、１９８６年）；ダイズＫｕｎｉｚトリプシンインヒビタープロモーター（Ｐｅｒｅｚ−Ｇｒａｕら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：１０９５〜１１０９、１９８９年；Ｊｏｆｕｋｕら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：１０７９〜１０９３、１９８９年）；ジャガイモパタチン（ｐａｔａｔｉｎ）プロモーター（Ｒｏｃｈａ−Ｓｏｓａら、ＥＭＢＯ  Ｊ．８：２３〜２９、１９８９年）；エンドウマメのコンビシリン、ビシリン、及びレグミンのプロモーター（Ｒｅｒｉｅら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５９：１４８〜１５７、１９９１年；Ｎｅｗｂｉｇｉｎら、Ｐｌａｎｔａ  １８０：４６１〜４７０、１９９０年；Ｈｉｇｇｉｎｓら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１：６８３〜６９５、１９８８年；Ｓｈｉｒｓａｔら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１５：３２６〜３３１、１９８９年）；並びにサツマイモスポラミンプロモーター（Ｈａｔｔｏｒｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４：５９５〜６０４、１９９０年）が挙げられる。
【０１１３】
単子葉植物について、本発明を実施する際に有用な種子保存タンパク質のプロモーターとしては、例えば、トウモロコシゼイン（ｚｅｉｎ）プロモーター（Ｓｃｈｅｒｎｔｈａｎｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．７：１２４９〜１２５５、１９８８年；Ｈｏｆｆｍａｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３２１３〜３２２１、１９８７年（トウモロコシ  １５ｋＤ  ゼイン））；トウモロコシ１８ｋＤ  オレオシンプロモーター（Ｌｅｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８８：６１８１〜６１８５、１９９１年）；ｗａｘｙプロモーター、ｓｈｒｕｎｋｅｎ−１プロモーター、グロブリン  １プロモーター；ｓｈｒｕｎｋｅｎ−２プロモーター；イネグルテリンプロモーター；オオムギホルデイン（ｈｏｒｄｅｉｎ）プロモーター（Ｍａｒｒｉｓら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  １０：３５９〜３６６、１９８８年）；ＲＰ５（Ｓｕら、Ｊ．Ｐｌａｎｔ  ｐｈｙｓｉｏｌ、１５８：２４７〜２５４、２００１年）；ＥＢＥ１及び２トウモロコシプロモーター（Ｍａｇｎａｒｄら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ５３：８２１〜８３６、２００３年）、並びにコムギグルテニン及びグリアジンプロモーター（米国特許第５，６５０，５５８号；Ｃｏｌｏｔら、ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３５５９〜３５６４、１９８７年）が挙げられる。
【０１１４】
また、本発明の実施に適切であるのは、アブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）のイソクエン酸リアーゼ及びマレイン酸合成酵素（Ｃｏｍａｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：２９３〜３００、１９８９年）；ベニバナ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：２５７８〜２５８２、１９９１年）、及びトウゴマ（Ｓｈａｎｋｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：２５１０〜２５１４、１９９１年）由来のδ−９不飽和化酵素；アラビドプシス（Ｐｏｓｔ−Ｂｅｉｔｔｅｎｍｉｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１７：１７７７、１９８９）、アブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）（Ｓａｆｆｏｒｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７４：２８７〜２９５、１９８８年）、及びアブラナ（Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）（Ｒｏｓｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：７１９７、１９８７年）由来のアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）；オオムギ由来のβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素（Ｓｉｇｇａａｒｄ−Ａｎｄｅｒｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：４１１４〜４１１８、１９９１）；並びにトウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）（Ｌｅｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：６１８１〜６１８５、１９９１）、ダイズ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号Ｘ６０７７３）、及びアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）（Ｌｅｅら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９６：１３９５〜１３９７、１９９１）由来のオレオシンについての遺伝子のプロモーターである。
【０１１５】
本発明の実施において有用な他のプロモーターは、当業者に公知である。さらに公知の方法が、本発明に従う使用に適切なさらなるプロモーターを単離するために使用できる。例えば、特異的スクリーニング技術が、果実発達のような特定の（発達の）時期に発現されるプロモーターを単離するために使用できる。
【０１１６】
キメラ遺伝子において異種コード配列に作動可能に連結される種子特異的遺伝子のプロモーターは、トランスジェニック植物においてそれらの時間的な及び空間的な発現を維持する。このような例としては、アラビドプシスやアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）の種子においてエンケファリンペプチドを発現するためのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ２Ｓ種子保存タンパク質遺伝子のプロモーター（Ｖａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：９２９：９３２、１９８９年）、マメレクチンプロモーターや、ルシフェラーゼを発現するためのマメβ−ファセオリン（β−ｐｈａｓｅｏｌｉｎ）プロモーター、さらにクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを発現するためのコムギグルテニンプロモーター（Ｃｏｌｏｔら、前出）の使用が挙げられる。
【０１１７】
本発明の核酸フラグメントの発現の正確なレベルを獲得することは、異なるプロモーターを利用する、異なるキメラ遺伝子の使用に必要である。このようなキメラ遺伝子は、単一の発現ベクターにおいてともに、又は１つよりも多いベクターを使用して連続的にのいずれかで、宿主細胞に移入される。
【０１１８】
さらに、エンハンサーがしばしば、本発明の遺伝子の発現を増大するために必要とされるか、又は役立つ。これらのエレメントが所望されるタンパク質をコードする配列に作動可能に連結されること、及び調節エレメントが作動可能であることが必要とされる。エンハンサー又はエンハンサー様エレメントは、ネイティブ又はキメラのいずれかの核酸フラグメントである。これは、３５Ｓプロモーターにおいて見出されるようなウイルスエンハンサー（Ｏｄｅｌｌら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０：２６３〜２７２、１９８８年）、オピン遺伝子由来のエンハンサー（Ｆｒｏｍｍら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：９７７〜９８４、１９８９年）、又は本発明の核酸フラグメントに作動可能に連結されるプロモーターに配置される場合に増大された転写を生じる任意の他の供給源由来のエンハンサーを含む。例えば、構築物は、タバコＥｔｃｈウイルス（ＴＥＶ）５’非翻訳リーダーに連結される二重転写エンハンサーとともにＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターを含む。ＴＥＶリーダーは、生成されるタンパク質の増加するための翻訳エンハンサーとして作用する。
【０１１９】
本明細書中で記載されるような、適切なプロモーターエレメントは、十分に確立された手順に従って、変異ＣＫＩ核酸配列及び適切なターミネーター（ポリアデニル化領域）に融合される。
【０１２０】
トランスジェニック植物
本発明の別の局面において、変異ＣＫＩ導入遺伝子を含むトランスジェニック植物が提供される。変異ＣＫＩポリペプチドを発現するトランスジェニック植物は、例えば、変異ポリペプチドをコードするトランスジェニックベクター（例えば、プラスミド又はウイルスベクター）を植物に移入することにより獲得される。典型的に、ベクターがプラスミドである場合、ベクターは、例えば、カナマイシンに対する耐性をコードするネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子のような選択可能なマーカー遺伝子を含む。植物形質転換の最も一般的な方法は、Ｈｏｅｃｋｅｍａら（Ｎａｔｕｒｅ  ３０３：１７９〜１８１、１９８３年）において記載されるように、標的導入遺伝子を植物形質転換ベクターにクローニングすることにより行われ、次いでこのベクターはヘルパーＴｉプラスミドを含有するアグロバクテリア（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｉｆａｃｉｅｎｓ）に形質転換される。導入遺伝子ベクターを含有するアグロバクテリア細胞は、Ａｎら（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ８１：３０１〜３０５、１９８６年）により記載されるように形質転換される植物の葉切片とともにインキュベートされる（Ｈｏｏｙｋａａｓ、Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  １３：３２７〜３２６、１９８９年もまた参照のこと）。培養された植物宿主細胞の形質転換は通常、上記のようにアグロバクテリア（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｉｆａｃｉｅｎｓ）を介して達成される。硬い細胞膜障壁を有しない宿主細胞の培養物は通常、Ｇｒａｈａｍら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：５４６、１９７８年）により最初に記載されるようにリン酸カルシウム法を使用して形質転換され、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら、前出の第１６.３２〜１６.３７節において記載されるように改変される。しかし、ポリブレン（Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）（Ｋａｗａｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ  ４：１１７２、１９８４年）、プロトプラスト融合（Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：２１６３、１９８０年）、エレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎら、１９８２  ＥＭＢＯ  Ｊ．１：８４１、１９８２年）、及び核への直接的なマイクロインジェクション（Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｃｅｌｌ  ２２：４７９、１９８０年）のような、細胞にＤＮＡを導入するため他の方法が使用される。形質転換された植物細胞は、例えば、カナマイシンを含むとともに、カルスとシュート誘導とのためのナフタレン酢酸や、ベンジルアデニンのような適切な量の植物ホルモンを含む、培地上で細胞を増殖することにより、選択可能なマーカーを介して選択される。次いで、植物細胞は再生され、そして得られる植物は、当業者に周知の技術を使用して土壌に移される。
【０１２１】
上記の方法に加えて、クローン化ＤＮＡを、裸子植物、被子植物、単子葉植物、双子葉植物を含む、広範に多様な植物種に移入するための多数の方法が当該分野において公知である（例えば、植物分子生物学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｇｌｉｃｋ及びＴｈｏｍｐｓｏｎ編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬ、１９９３年）；Ｖａｓｉｌ、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２５：９２５〜９３７、１９９４年；及びＫｏｍａｒｉら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．１：１６１〜１６５、１９９８年（概説）；Ｌｏｏｐｓｔｒａら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．１５：１〜９、１９９０年；及びＢｒａｓｉｌｅｉｒｏら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．１７：４４１〜４５２、１９９１年（樹木の形質転換）；Ｅｉｍｅｒｔら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．１９：４８５〜４９０、１９９２年（アブラナの形質転換）；Ｈｉｅｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．６：２７１〜２８２、１９９４年；Ｈｉｅｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．３５：２０５〜２１８、１９９７年；Ｃｈａｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２２：４９１〜５０６、１９９３年；米国特許第５，５１６，６６８号及び同第５，８２４，８５７号（イネ形質転換）；並びに米国特許第５，９５５，３６２号（コムギ形質転換）；同第５，９６９，２１３号（単子葉植物形質転換）；同第５，７８０,７９８号（トウモロコシ形質転換）；同第５，９５９，１７９号、及び同第５，９１４，４５１号（ダイズ形質転換）を参照のこと）。代表的な例としては、プロトプラストによるエレクトロポレーションにより促進されるＤＮＡ取り込み（Ｒｈｏｄｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：２０４〜２０７、１９８８年；Ｂａｔｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１１：３５９〜３６６、１９９９年；Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎら、Ｍｅｔｈｏｄ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１１：３６７〜３７３、１９９９年；米国特許第５，９１４，４５１号）；ポリエチレングリコールでのプロトプラストの処理（Ｌｙｚｎｉｋら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３：１５１〜１６１、１９８９年；Ｄａｔｔａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１１：３３５〜３３４、１９９９年）；及びＤＮＡを含む微小発射体での細胞のボンバードメント（Ｋｌｅｉｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：４４０〜４４４、１９８９年；Ｂｏｙｎｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１５３４〜１５３８、１９８８年；Ｒｅｇｉｓｔｅｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２５：９５１〜９６１、１９９４年；Ｂａｒｃｅｌｏら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．５：５８３〜５９２、１９９４年；Ｖａｓｉｌら、Ｍｅｔｈｏｄ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１１：３４９〜３５８、１９９９年；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５：１９７〜２０３、１９９７年；Ｆｉｎｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４０：５９〜８０、１９９９年）が挙げられる。さらに、形質転換の戦略及び技術は、Ｂｒｉｃｈ、Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．４８：２９７、１９９７��；Ｆｏｒｅｓｔｅｒら、Ｅｘｐ．Ａｇｒｉｃ．３３：１５〜３３、１９９７年において概説される。微細な変化は、これらの技術を広範な植物種に適用可能にする。
【０１２２】
単子葉植物形質転換の場合において、パーティクルボンバードメントは典型的な選択の方法である。しかし、トウモロコシのような単子葉植物はまた、Ｈｉｅｉらに対する米国特許第５，５９１，６１６号において記載されるようなアグロバクテリア形質転換法を使用することによって形質転換される。単子葉植物、例えば、トウモロコシの形質転換を達成するための別の方法は、胚発達浮遊培養物由来の細胞を、繊維の懸濁液（５％  ｗ／ｖ、Ｓｉｌａｒ  ＳＣ−９  ｗｈｉｓｋｅｒｓ）及びプラスミドＤＮＡ（１μｇ／uｌ）と混合し、次いでこれが、Ｖｏｒｔｅｘ  Ｇｅｎｉｅ  ＩＩボルテックスミキサー（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｏｈｅｍｉａ、ＮＹ、ＵＳＡ）上の複数のサンプルヘッドに直立して、又はＭｉｘｏｍａｔ歯科用アマルガムミキサー（Ｄｅｇｕｓｓａ  Ｃａｎａｄａ  Ｌｔｄ．、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）のホルダー中に水平にしてのいずれかで、置かれる。次いで形質転換は、６０秒間、全速で混合することにより（例えば、Ｖｏｒｔｅｘ  Ｇｅｎｉｅ  ＩＩを用いる）、又は１秒間、定速で振とうすることにより（Ｍｉｘｏｍａｔ）、行われる。このプロセスは、細胞集団の生成を生じ、そこから安定な形質転換体が選択される。植物は安定に形質転換されたカルスから再生され、そしてこれらの植物とそれらの子孫は、サザンハイブリダイゼーション解析によりトランスジェニックであることが示される。このアプローチの主な利点は、その単純さとコストの低さである。パーティクルボンバードメントとは異なり、高価な装置や補給品は必要とされない。植物細胞、特にトウモロコシの形質転換のためのウイスカーの使用は、例えば、Ｃｏｆｆｅｅらに対する米国特許第５，４６４，７６５号において記載される。
【０１２３】
Ｄａｎらに対する米国特許第５，９６８，８３０号は、ダイズを形質転換し、そして再生する方法を記載する。Ｈａｌｌらに対する米国特許第５，９６９，２１５号は、テンサイのようなサトウダイコン（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）の形質転換植物を生成するための形質転換技術を記載する。
【０１２４】
上記の形質転換技術のそれぞれは、利点と欠点を有する。技術のそれぞれにおいて、プラスミド由来のＤＮＡは、これが目的の遺伝子のみでなく、ま選択可能な、スクリーニング可能なマーカー遺伝子を含むように遺伝子操作される。選択可能なマーカー遺伝子は、取り込まれたプラスミド（目的の遺伝子並びに選択可能なマーカー及びスクリーニング可能な遺伝子が１つの単位として移入されるような構築）のコピーを有するそれらの細胞のみを選択するために使用される。スクリーニング可能な遺伝子は、目的の遺伝子を保有するそれらの細胞のみを首尾よく培養するための別の確認を提供する。
【０１２５】
抗体耐性の選択可能なマーカーを伴う伝統的なアグロバクテリア形質転換は、このような植物が、動物やヒトに抗生物質耐性を伝播する過度の危険性を提示する一般市民の反対の声のために、問題がある。このような抗生物質マーカーは、Ｋｏｍａｒｉらに対する米国特許第５，７３１，１７９号において記載される技術に類似するアグロバクテリア技術を使用して植物を形質転換することにより、植物から排除される。抗生物質耐性の問題はまた、米国特許第５，７１２，１３５号において記載されるように、ｂａｒ又はｐａｔコード配列の使用により効果的に回避される。これらの好ましいマーカーＤＮＡは、グルタミン合成酵素インヒビター除草剤ホスフィノトリシン（グルホシネート）及びグルホシネートアンモニウム塩（Ｂａｓｔａ、Ｉｇｎｉｔｅ）の作用を阻害又は中和する第２のタンパク質又はポリペプチドをコードする。
【０１２６】
これらの遺伝子の１つ以上を含有するプラスミドは、以前に記載される技術いずれかにより、植物のプロトプラスト又はカルス細胞のいずれかに導入される。マーカー遺伝子が選択可能な遺伝子である場合、組込まれたＤＮＡパッケージを有するこれらの細胞のみが、適切な植物毒性剤での選択の下で生存する。一旦、適切な細胞が同定され、そして増殖されると、植物は再生される。形質転換された植物からの子孫は、ＤＮＡパッケージが植物ゲノムに首尾よく取り込まれたことを確実にするために試験されなくてはならない。
【０１２７】
形質転換の成功を影響する多数の要素がある。外因性遺伝子構築物やその調節配列の設計と構築は、植物の核の染色体ＤＮＡへの外因性遺伝子の取り込み、及び細胞により発現される導入遺伝子の能力を影響する。非致死的な様式において、外因性遺伝子構築物を植物細胞核へ導入するための適切な方法が必要不可欠である。重要なことに、構築物が導入される細胞のタイプは、全植物体が再生される場合、適切な再生プロトコルを考慮して、再生に適するタイプでなくてはならない。
【０１２８】
使用の方法
本発明の別の局面によれば、植物において細胞分裂が調節され、例えば、増加される。本明細書中に記載される方法を使用する細胞分裂の増加のような調節に適する植物細胞は、別々のサイクリンとＣＤＫ結合領域とを有する野生型ＣＫＩポリペプチドを発現する植物細胞である。一般的に、方法は、本明細書中で記載されるように変異ＣＫＩポリペプチドを植物細胞内で発現する工程、及び変異ＣＫＩポリペプチドが、植物細胞内で野生型ＣＫＩの生物学的活性を阻害することを許容する工程を含む。変異ＣＫＩポリペプチドは、変異タンパク質をコードする組換え核酸から発現される。さらに、ある実施形態において、方法は、変異ＣＫＩポリペプチドをコードする組換え核酸を植物細胞に導入する工程をさらに含む。変異ＣＫＩポリペプチドをコードする組換え核酸は、このような組換え分子の構築及びそれらの植物細胞への導入を含み、概して上記に記載され、そして以下の実施例においてさらに例示される。細胞分裂の調節は、トランスジェニック植物に関して上記されるように、インビボで、植物細胞において行うことができる。あるいは、方法は、インビトロで、植物細胞において行うことができる。
【０１２９】
上記されるように、変異ＣＫＩポリペプチドは、参照ＣＫＩポリペプチドに比較して少なくとも１つの改変を有するＣＫＩアミノ酸配列を含む。細胞分裂の調節のための方法に関して、参照ＣＫＩポリペプチドは、細胞分裂の調節が行われる植物細胞内で発現される野生型植物ＣＫＩポリペプチドである（典型的に、内因性野生型ＣＫＩ）。あるいは、本明細書中に記載されるように変異ＣＫＩタンパク質の使用は、変異が由来する野生型ＣＫＩの構造的相同体又はファミリーメンバーに対する優性ネガティブな拮抗活性を許容し得るので、参照ＣＫＩポリペプチドは、植物細胞で発現される野生型ＣＫＩポリペプチドに異種の野生型ＣＫＩポリペプチドであり、これは実質的に等価な野生型機能を与える。従って、いくつかの場合において、変異体ＣＫＩタンパク質は、内因性ＣＫＩタンパク質に由来せず、内因性野生型ＣＫＩ機能を阻害するために植物細胞内で発現される。例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａの野生型ＫＲＰタンパク質由来の変異ＣＫＩポリペプチドは、例えば、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ、トウモロコシの細胞などのような非相同の（ｎｏｎ−ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）植物細胞において野生型ＫＲＰ機能を阻害するために使用できる。Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓのような他の植物由来の他の異種な変異ＣＫＩポリペプチドがまた使用できる。
【０１３０】
さらに、方法のある実施形態において、複数の関連性ＣＫＩが、本発明の変異ＣＫＩを使用して、植物細胞において同時に阻害される。例えば、いくつかの実施形態において、ファミリー内の全ての内因性ＣＫＩ（例えば、ＫＲＰファミリーメンバー）は、同時に阻害される。上記のように、本明細書中で記載される変異ＣＫＩタンパク質は、改変体が由来する野生型ＣＫＩの構造的相同体又はファミリーメンバー内の優性ネガティブな拮抗活性を許容し、それにより、複数の相同体又はファミリーメンバーのこのような同時の阻害を許容する。従って、典型的な実施形態において、標的にされるＣＤＫ又はサイクリンの結合領域内の実質的な配列同一性又は類似性を有する複数の（及び好ましくは全ての）ＣＫＩは、植物細胞内で阻害される。例えば、ある実施形態において、ＫＲＰファミリーメンバーは、ＣＤＫ結合領域内に実質的な配列同一性を共有し、これは主にサイクリン−ＣＤＫキナーゼ活性の阻害を担うので、植物細胞内の複数の、及び好ましくは全ての内因性ＫＲＰファミリーメンバーは、細胞分裂を調節するように、変異体ＫＲＰ  ＣＫＩの発現を介して阻害される。
【０１３１】
上記のように、サイクリン／ＣＤＫ活性を阻害することから内因性ＣＫＩタンパク質を効果的にブロックすることにより、植物細胞内の細胞分裂は調節される。このような調節は、細胞周期を通した進行の加速、そして最終的に増加される細胞増殖を含む。従って、本明細書中に記載される方法をインビボで使用して（例えば、トランスジェニック植物、前出を参照のこと）、作物収量及び／又は種子の大きさにおける増加、増大される植物の活力、増加される根の質量、増大される果実の大きさなどが達成される。
【０１３２】
増加される作物収量は、多様な形態においてそれ自身を示し、植物の細胞周期がサイクリン／ＣＤＫ活性を阻害することから内因性ＣＫＩタンパク質をブロックすることにより調節されている特定の植物組織及び植物種に依存する。
【０１３３】
トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、ダイズ、カノーラのような種子作物において、増加された収量は、増加された種子の総数、増大された種子の大きさ、又は増加された種子数と増大された種子の大きさの両方の形態をとり得る。１つの実施形態において、増加された収量は、変異ＣＫＩタンパク質をコードする導入遺伝子を発現し、増加された細胞分裂と増加された総種子数、より大きな種子、又は増加された種子数と増大された種子の大きさの両方を生じることにより、任意の種子作物のトランスジェニック改変体において得られる。１つの実施形態において、変異ＣＫＩタンパク質の導入遺伝子の発現は、構成的なプロモーターにより制御される。別の例示的な実施形態において、変異ＣＫＩタンパク質の導入遺伝子の発現は、種子作物の農学的に重要な成分である種子に変異ＣＫＩタンパク質の効果を標的化する種子特異的プロモーターにより、制御される。
【０１３４】
ダイズ、カノーラ、カメリナ、亜麻、トウモロコシ、ベニバナ、又はヒマワリなどのような油糧種子作物について、所望される産物が油である場合、増加される収量は、植物当たりのより優れた油収量の形態をとる。油は、種子中の胚に由来する。1つの実施形態において、増加される油収量は、変異ＣＫＩタンパク質をコードする導入遺伝子を発現し、増加される細胞分裂を引き起こし、増加される種子の総数、増大される胚の大きさ、又は増加される種子の数と増大される胚の大きさの両方を導くことにより、任意の油糧種子作物のトランスジェニック改変体において得られる。植物当たりの増加される種子の総数は、植物当たりの増加される油の総収量を生じる。増大される胚の大きさは、種子当たりのより優れた油含量、そして植物当たりの増加される油の総収量を生じる。好ましい実施形態において、変異ＣＫＩタンパク質の導入遺伝子の発現は、胚特異的プロモーターにより制御され、初期胚発達において増加される細胞分裂を与え、より大きな胚、種子当たりの増加される油の質量、そして植物当たりの油の総収量における対応する増加を生じる。
【０１３５】
種子でないバイオマス生産は、アルファルファ、レタス、タバコ、ユーカリ、ポプラのような作物の主な収量成分である。このような作物における増加される収量は、植物の増大される全体の成長において見られ、バイオマスの増強される蓄積を生じる。１つの実施形態において、増加されるバイオマスは、変異ＣＫＩタンパク質をコードする導入遺伝子を発現し、増加される細胞分裂を引き起こし、増大される生長とバイオマスを導くことにより、任意のバイオマス植物のトランスジェニック改変体から得られる。１つの実施形態において、変異ＣＫＩタンパク質の導入遺伝子の発現は、植物の大部分の又は全ての組織において変異ＣＫＩタンパク質をコードする導入遺伝子の構成的な発現を与えるプロモーターにより、制御される。好ましい実施形態において、変異ＣＫＩタンパク質の導入遺伝子の発現は、標的組織におけるバイオマスの蓄積を増加するために、レタス若しくはタバコにおける葉、又はユーカリ若しくはポプラにおける幹のような、農学的に重要な植物の成分に、導入遺伝子の発現を標的化する組織特異的プロモーターにより制御される。
【０１３６】
糖又はセルロースは、エタノールの生成のために栽培される作物の主な収量成分であり、サトウキビ、テンサイ、トウモロコシ、スイッチグラスが挙げられる。１つの実施形態において、増加される糖は、変異ＣＫＩタンパク質をコードする導入遺伝子を発現し、増加される細胞分裂、植物の糖を蓄積する組織の増大される生長、植物当たりの増大される糖の総含量を引き起こすことにより、サトウキビ又はテンサイのような糖を産生する任意の作物のトランスジェニック改変体において得られる。１つの実施形態において、糖を産生する植物における変異ＣＫＩタンパク質の導入遺伝子の発現は、植物の大部分の又は全ての組織において変異ＣＫＩタンパク質をコードする導入遺伝子の構成的な発現を与えるプロモーターにより、制御される。好ましい実施形態において、変異ＣＫＩタンパク質の導入遺伝子の発現は、導入遺伝子の発現を、サトウキビの茎まやはテンサイの根のような植物の糖を蓄積する組織に標的する組織特異的プロモーターにより制御され、それにより細胞増殖を増加し、かつ植物の糖保存や蓄積組織の生長を増加し、増加された糖の総含量を得る。別の実施形態において、増加されるセルロースが、変異ＣＫＩタンパク質をコードする導入遺伝子を発現し、増加される細胞分裂及び細胞壁合成を引き起こし、それにより細胞壁の成分であるセルロースの含量を増加することにより、トウモロコシ又はスイッチグラスのような任意のセルロース産生作物のトランスジェニック改変体において得られる。１つの実施形態において、変異ＣＫＩタンパク質の導入遺伝子の発現は、植物の大部分の又は全ての組織において変異ＣＫＩタンパク質をコードする導入遺伝子の構成的な発現を与えるプロモーターにより制御される。その後の細胞増殖における一般的な増加は、細胞壁の増加される堆積を、それゆえ植物のセルロースの増加される総含量を生じる。
［実施例］
【０１３７】
以下の実施例は説明のために提供されるが、本発明を制限しない。
【実施例１】
【０１３８】
活性サイクリン：ＣＤＫ複合体の産生／精製及びＫｒｐ分子の産生／精製
昆虫細胞及び培地
バキュロウイルス発現系は、異種遺伝子発現のための万能な真核生物系である。この系は、タンパク質の正確な折り畳み、ジスルフィド結合形成、及び他の重要な翻訳後修飾を提供する。全ての方法は、バキュロウイルス発現ベクター系：手順及び方法のマニュアル（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ；Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｍａｎｕａｌ）（ＢＤ、  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、第６版）から採用した。報告される研究について、Ｓｆ９昆虫細胞を、ＴＮＭ−ＦＨ昆虫細胞培地（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で２７℃にて増殖した。代替の培地が当業者に周知であり、及びまた有用であることが注目されるべきである。同様に、ＳＦ２１及びＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ  ＴＭ細胞のような代替の昆虫細胞系統はまた、ウイルス産生及びタンパク質産生のために機能する。
【０１３９】
ウェスタンブロット及び免疫沈降
昆虫細胞において発現される組換えタンパク質を、ウェスタンブロットによりモニターした。タンパク質抽出物（３５μｇ）をＬａｅｍｍｌｉ緩衝液の存在下で煮沸し、１０％又は１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動し、そして水中トランスファー装置（ＢｉｏＲａｄ）を使用してＰＶＤＦメンブレン上にトランスファーした。トランスファー後、メンブレンを、５％脱脂粉乳を含有するＴＢＳ−Ｔ（２５ｍＭ、Ｔｒｉｓ  ｐＨ７.５；７５ｍＭ  ＮａＣｌ；０.０５％  Ｔｗｅｅｎ）中でブロックした。１次抗体を、ＴＢＳ−Ｔブロッキング緩衝液中で、一晩、１：１０００希釈にて使用した。ブロットを室温にて、１５分間、３回洗浄した。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合された適切な２次抗体を、ＴＢＳ−Ｔブロッキング緩衝液中で、１：１０,０００希釈にて使用した。ブロットを１時間、２次抗体中でインキュベートし、次いで、ＴＢＳ−Ｔ中で３回、それぞれ１５分間洗浄した。次いで、ブロットをＥＣＬ系プロトコル（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において記載されるようにプロセスした。共通して使用した抗体は：抗−ｆｌａｇ  Ｍ２モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）、抗ＨＡモノクローナル又はポリクローナル抗体（Ｂａｂｃｏ）、抗ＰＳＴＡＩＲ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、抗ｍｙｃモノクローナル又はポリクローナル（Ａ−１４）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）であった。使用した２次抗体は、抗マウス  ＩＧ−ＨＲＰ、及び抗ウサギ  ＩＧ−ＨＲＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）であった。
【０１４０】
免疫沈降は、ＡｔＣｙｃｌｉｎＤ２：１、ＡｔＣＤＫＡ、及びＫｒｐ分子間での複合体形成をモニターすることにより行われた。タンパク質抽出物（１４μｇ）を、０.５ｍｌ結合緩衝液(１００ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７.０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  １００、及びプロテアーゼインヒビター)中に希釈した。タンパク質／抗体混合物を４℃にて約２時間、穏やかに揺り動かし、次いで適切な抗体を添加した。（２μｇの抗ｆｌａｇＭ２抗体；５μｌの抗ＨＡ抗体；５μｌの抗ｍｙｃポリクローナル）。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａセファロースを添加して、１０μｌのベッド容量にした。免疫沈降物を、１時間、４℃にて穏やかに混合し、次いで１ｍｌの結合緩衝液で３回洗浄した。次いで、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａセファロースビーズに結合したタンパク質複合体をＬａｅｍｍｌｉ緩衝液の存在下で煮沸した。タンパク質混合物を、１０％又は１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、そしてＰＶＤＦメンブレン上にトランスファーした。メンブレンを上記のようにブロットした。
【０１４１】
バキュロウイルスベクター構築
アラビドプシスサイクリンＤ２；１（ＡｔｃｙｃｌｉｎＤ２；１）及びアラビドプシスＣＤＫＡ  （ＡｔＣＤＫＡ）のｃＤＮＡ配列を、エピトープでタグし、そしてバキュロウイルス移入ベクター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にクローン化した。当業者に公知の他の移入ベクター系がまた使用できる。ＡｔＣｙｃｌｉｎＤ２；１を、Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ（ＭＤＹＫＡＦＤＮＬ）アミノ酸配列（配列番号１８）をＰＣＲにより添加することによって、ＦＬＡＧエピトープ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でＮ末端上にタグし、次いでｐＡｃＨＬＴ移入ベクター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｅｎｃｅｓ）にクローン化した。Ｂａｃｕｌｏｄｉｒｅｃｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のような他のバキュロウイルス移入ベクター系がまた、この目的のために使用できる。ヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープアミノ酸配列Ｔｙｒ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ａｌａ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ；配列番号１９）を、ＡｔＣＤＫＡの５’末端でＰＣＲによりインフレームに配置し、次いでｐＶＬ１３９３移入ベクター（ＡＢ  Ｖｅｃｔｏｒ、ＣＡ）にクローン化した。サイクリン及びＣＤＫをウェスタンブロットによる同定を可能にするために、及び免疫沈降実験のためにエピトープタグした。タグを欠損するサイクリン又はＣＤＫがまた使用できる。他の適合性の移入ベクター系がまた使用できる。
【０１４２】
組換えウイルスの産生
使用されたバキュロウイルスゲノムは、Ｂａｃｕｌｏｇｏｌｄ  Ｂｒｉｇｈｔ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）である。代替のバキュロウイルスゲノムがまた使用できる。ＦｌａｇでタグされたバージョンのＡｔｃｙｃｌｉｎＤ２；１を、相同組換えを使用してバキュロウイルスの非必須領域に導入した。サイクリンＤ２；１を含有する移入ベクターを、線状化ＢＤ  Ｂａｃｕｌｏｇｏｌｄ  Ｂｒｉｇｈｔ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ＤＮＡともにＳｆ９昆虫細胞に同時トランスフェクトした場合に、相同組換えが生じた。Ｓｆ９細胞を、２×１０6細胞にて６０ｍｍ皿上に播種し、そして製造業者（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）のプロトコルに従ってＦｕｇｅｎｅ６トランスフェクション試薬を使用して、２μｇのサイクリンＤ２；１移入ベクター（ｐＡｃＨＬＴ−ｃｙｃｌｉｎＤ２；１）及び０.５μｇの線状化ＢＤ  Ｂａｃｕｌｏｇｏｌｄ  Ｂｒｉｇｈｔ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ＤＮＡで一過的に同時トランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後、Ｆｕｇｅｎｅ／ＤＮＡ溶液を除去し、そして３ｍｌのＴＮＭ−ＦＨ培地で置き換えた。（４）日後、上清を回収し、続いてウイルスの増殖のためにより多くの細胞を感染するために使用した。この適用を、ウイルス力価が少なくとも１０9ウイルス粒子／ｍｌになるまで反復した。ウイルスを、１未満の感染の多重度（ｍｏｉ）でＳｆ９細胞を感染することにより増殖した。ウイルス力価を、光学顕微鏡や蛍光顕微鏡を使用してモニターした。
【０１４３】
ＡｔＣＤＫＡ１のＨＡタグバージョンを、相同組換えを使用してバキュロウイルスの非必須領域に導入した。サイクリンＤ２；１を含有する移入ベクターを線状化ＢＤ  Ｂａｃｕｌｏｇｏｌｄ  Ｂｒｉｇｈｔ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ＤＮＡともにＳｆ９昆虫細胞に同時トランスフェクトした場合に、相同組換えが生じた。Ｓｆ９細胞を、２×１０6細胞にて６０ｍｍ皿上に播種し、そして製造業者（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）のプロトコルに従ってＦｕｇｅｎｅ６トランスフェクション試薬を使用して、２μｇのＡｔＣＤＫＡ移入ベクター（ｐＶＬ１３９３−ＡｔＣＤＫＡ）及び０.５μｇの線状化ＢＤ  Ｂａｃｕｌｏｇｏｌｄ  Ｂｒｉｇｈｔ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ＤＮＡで一過的に同時トランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後、Ｆｕｇｅｎｅ／ＤＮＡ溶液を除去し、そして３ｍｌのＴＮＭ−ＦＨ培地で置き換えた。（４）日後、上清を回収し、続いてウイルスの増殖のためにより多くの細胞を感染するために使用した。この増殖を、ウイルス力価が少なくとも１０9ウイルス粒子／ｍｌになるまで反復した。ウイルスを、１未満の感染の多重度（ＭＯＩ）でＳｆ９細胞を感染することにより増殖した。ウイルス力価を、光学顕微鏡及び蛍光顕微鏡を使用してモニターした。
【０１４４】
昆虫細胞における組換えタンパク質の産生
Ｆｌａｇタグ化ＡｔｃｙｃｌｉｎＤ２；１タンパク質の産生：タグ化ＡｔｃｙｃｌｉｎＤ２；１を、ＡｔｃｙｃｌｉｎＤ２；１バキュロウイルスでＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  Ｓｆ９細胞を感染することにより達成した。この目的のために、懸濁液中に２×１０6／ｍｌにて増殖されたＳｆ９細胞を、５よりも大きいＭＯＩで（しかし、他のより高い又は僅かに低いＭＯＩがまた機能する）、約４〜５日間、組換えバキュロウイルスで感染し、次いで採集した。細胞を４℃にて、３０００ｒｐｍで遠心分離した。細胞ペレットを−８０℃にて凍結するか又は即座に溶解した。溶解緩衝液は、１０ｍｌの溶解緩衝液当たり１錠で、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７.５、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０％  グリセロール、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、プロテアーゼインヒビターからなった（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ、ＥＤＴＡ非含有、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）。細胞溶解物を氷上で２回、１５秒間、超音波処理した。次いでタンパク質溶解物を２時間、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＴＬＡ  １００.２ローターにおいて４０，０００ｒｐｍにて遠心分離した。タグ化ＡｔＣｙｃｌｉｎＤ２；１を含有する上清を等分し、そして−２０℃にて凍結した。発現を、抗−Ｆｌａｇ  Ｍ２モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用してウェスタンブロットによりモニターした。
【０１４５】
タグ化ＡｔＣＤＫＡを、ＡｔＣＤＫＡバキュロウイルスでの、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  Ｓｆ９細胞の感染により達成し、そして上記と同じ様式においてプロセスした。発現を、抗−ＨＡモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体（Ｂａｂｃｏ）を使用してウェスタンブロットによりモニターした。発現はまた、抗−ＰＳＴＡＩＲ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用してウェスタンブロットによりモニターされる。
【０１４６】
ＡｔｃｙｃｌｉｎＤ２；１／ＡｔＣＤＫＡの活性なキナーゼ複合体を、ＡｔｃｙｃｌｉｎＤ２；１（ＭＯＩ＞５）及びＡｔＣＤＫＡ（ＭＯＩ＞５）バキュロウイルスでＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  Ｓｆ９細胞を同時感染することにより調製した。この活性な複合体を上記のように精製した。タンパク質発現を、抗−Ｆｌａｇ  Ｍ２抗体又は抗−ＨＡ抗体を使用する昆虫細胞抽出物のウェスタンブロットによりモニターした。ＡｔｃｙｃｌｉｎＤ２；１及びＡｔＣＤＫＡの相互作用を、以下に記載するように同時免疫沈降によりモニターした。
【０１４７】
キナーゼアッセイ
種々のＫＲＰ／ＩＣＫ分子がサイクリン／ＣＤＫ複合体を阻害する能力を試験するために、インビトロアッセイを開発した。
【０１４８】
個々のバキュロウイルスで感染された、又は２つのバキュロウイルスで同時感染された昆虫細胞からのタンパク質抽出物におけるキナーゼ活性を、標準的なキナーゼアッセイでモニターした。ヒストンＨＩ（ＨＨＩ）は、使用される主な基質であるが、組換えタバコ網膜芽腫タンパク質（Ｎｔ  Ｒｂ）はまた、基質として使用された（Ｋｏｒｏｌｅｖａら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １６、２３４６〜７９、２００４年を参照のこと）。キナーゼアッセイを以下のように行った：７μｇの昆虫細胞タンパク質抽出物を、最終容量３０μｌに、キナーゼ緩衝液のカクテル（ＫＡＢ：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８.０、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０μＭ  ＡＴＰ、及び０.５μＣｉ／ｍｌ、32ＰγＡＴＰ、２μｇのＨＨＩ）へ添加した。反応物を、２７℃にて３０分間インキュベートした。キナーゼ反応を、等容量（３０μｌ）の２×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液で停止した。[32Ｐ]リン酸取り込みを、１２％ゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に、オートラジオグラフィー及び／又はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒによりモニターした。ＣＤＫキナーゼアッセイを行うための代替の緩衝液条件がまた使用できる。（例えば、Ｗａｎｇ及びＦｏｗｋｅ、Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：４５１〜４５２、１９９７年；Ａｚｚｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０３：３５３〜３６０、１９９２年；Ｆｉｒｐｏら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：４８８９〜４９０１、１９９４年を参照のこと）。
【０１４９】
結果：ＡｔｃｙｃｌｉｎＤ２；１単独、又はＡｔＣＤＫＡ単独で感染された昆虫細胞からのタンパク質抽出物は、ＨＨＩを基質として使用するキナーゼ活性を何ら示さなかった。ＡｔｃｙｃｌｉｎＤ２；１ウイルス及びＡｔＣＤＫＡウイルスで同時感染された昆虫細胞は、強いキナーゼ活性を含んだ。活性ＣＤＫ−様（ｃｄｃ２−様）キナーゼはまた、植物タンパク質組織抽出物から、又は植物組織培養細胞抽出物から、ｐ１３ｓｕｃ１アガロースビーズ（Ｗａｎｇ及びＦｏｗｋｅ、Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：４５１〜４５２、１９９７；Ａｚｚｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０３：３５３〜３６０、１９９２を参照のこと）を使用することにより精製され、そして上記の類似のアッセイにおいて、及び実施例２〜８において以下に記載される競合実験において使用できる。
【０１５０】
細菌発現ベクターへのＫｒｐ  ｃＤＮＡのクローニング
ＡｔＫｒｐ１クローニング
ＡｔＫｒｐ１ｃＤＮＡを、以下のオリゴヌクレオチドを使用して、ＰＣＲによりアラビドプシスｃＤＮＡからクローン化した：
（開始）５’ＡＴＧＧＴＧＡＧＡＡＡＡＴＡＴＡＧＡＡＡＡＧＣＴ−３’（配列番号２０）；
（終止）５’−ＴＣＡＣＴＣＴＡＡＣＴＴＴＡＣＣＣＡＴＴＣＧＴＡ−３’（配列番号２１）。
得られるＰＣＲフラグメントを、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。得られるベクターＡｔＫｒｐ１番号３５９を配列決定し、ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｕ９４７７２に対する正確な配列を確認した。
【０１５１】
Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ  Ｋｒｐ１クローニングの５’ＲＡＣＥ
ＡｔＫｒｐ１  ｃｄｓに相同なアブラナの配列を見出すために、国立バイオテクノロジー情報センターウェブサイトにてＢｌａｓｔｎを使用した。サーチは、２つのＥＳＴ候補、ＣＤ８２０３２０とＣＤ８２９０５２を生じ、これは同一の配列であることが判明した。ＣＤ８２０３２０をＪｏｒｊａのｂｌａｓｔｘから入手し、ＥＳＴの翻訳されたヌクレオチド配列が、ＡｔＫＲＰ１タンパク質配列に有意に適合することを確認した。
【０１５２】
ＣＤ８２９０５２は、６４６ｂｐであり、及びアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）ＫＲＰ１配列の少なくとも１０６アミノ酸と３２１ｂｐの３’ＵＴＲを含む。５’ＲＡＣＥプライマー（ＧＳＰ１ｂｒａｓｓｋｒｐ１＿５’ＲＡＣＥ：５’−ＣＴＣＴＧＡＴＡＡＴＴＴＡＡＣＣＣＡＣＴＣＧＴＡＧＣＧＴＣＣＴＴＣＴＡＡＴＧＧＣＴＴＣＴＣ−３’；配列番号２２）を、完全長Ｂｎ  ＫＲＰ１を得るために設計した。ＲＡＣＥプライマーは、ＣＤ８２０３２０のコード配列の少なくとも４５ヌクレオチドを含んだ。
【０１５３】
５’ＲＡＣＥ−ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡを、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓＤＨ１２０７５の葉から作製した。５’ＲＡＣＥを、Ｋｌｅｎｔａｑの代わりにｐｆｕ酵素及び緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用した以外は、キットの指示に従ってこのｃＤＮＡに対して行った。ＰＣＲ条件は：９４℃、５分間の最初の変性、続いて３５サイクルの９４℃、５秒間、６８℃、１０秒間、７２℃３分間であった。得られるＰＣＲ産物は、約６００ｂｐの非常にぼやけたバンドであった。次いで、２.５μｌのこのＰＣＲ産物を上述のＰＣＲ条件を使用して再増幅した。得られるＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ  Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、そしてαゴールド細胞（Ｂｉｏｌｉｎｅ）に形質転換した。２つの形質転換体からのプラスミドＤＮＡを回収し、そして挿入物を、Ｍ１３正方向プライマーとＭ１３逆方向プライマーで配列決定した。１つの候補挿入物の配列は、ＣＤ８２０３２０に同一であり、及びＢｎ  ＫＲＰ１−ＩＩと命名された（ＲＡＣＥからはさらなる新しい配列はもたらされなかった）。Ｂｎ  ＫＲＰ1−Ｉと命名された、他の候補挿入物の配列は、コード領域においてヌクレオチドレベルで、Ｂｎ  ＫＲＰ１−ＩＩに９４％同一であり、そして後半の１０６残基についてアミノ酸レベルで８６％同一であった。ＲＡＣＥは、ＴＯＰＯ  Ｂｌａｎｔベクター（ｐＴＧ３１３）において、さらなる１０８ｂｐの５’ＵＴＲとともに、Ｂｎ  ＫＲＰ１−Ｉの完全なコード配列を回収した。ＢｎＫｒｐ１コード配列（配列番号２３）は以下に示される：
【０１５４】
【化１】
2009502175.tif 000004
【０１５５】
ｐＥＴ１６ｂ細菌発現ベクターは、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（Ｎｏｖａｇｅｎ）によるタンパク質精製を可能にするための、連続的に６つのヒスチジンをコードする配列（６ＸＨｉｓ、又は（Ｈｉｓ）６あるいはｈｅｘａＨｉｓ）を含む。このベクターは、６ＸＨｉｓコード配列のすぐ下流に、及びインフレームに、ポリ−Ｍｙｃエピトープをまた含むように改変された（ｐＥＴ１６ｂ−５ＭＹＣ）。完全長ＡｔＫｒｐ１  ｃＤＮＡを、完全なコード配列を隣接する２つのオリゴヌクレオチドを使用して、ｐＴＧ番号３５９  ＴｏｐｏＩＩＡｔＫｒｐ１  ｃｄｓから増幅した。これらのオリゴヌクレオチドは、ｐＥＴ１６Ｂ−５ＭＹＣベクターへのクローニングを容易にするために、制限酵素部位を含んだ（５’ＡｔＫｒｐ１  ＢａｍＨＩ／ＮｄｅＩ：ＡＣＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＧＴＧＡＧＡＡＡＡＴＡＴＡＧ（配列番号２４）及び３’ＡｔＫｒｐ１  ＸｈｏＩ：ＡＴＣＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＴＣＴＡＡＣＴＴＴＡＣ（配列番号２５）。得られるＰＣＲフラグメントを、ｐＥＴ１６ｂ−５ｍｙｃのＢａｍＨＩとＸｈｏＩ部位にサブクローン化した。得られるベクターＡｔＫｒｐ番号３８５は、６ＸＨｉｓ及びｍｙｃタグとインフレームにＡｎＫｒｐ１野生型ｃＤＮＡを含んだ。
【０１５６】
以下の２つのオリゴヌクレオチドを、ＢｎＫｒｐ１の３’末端において５’  ＢａｍＨＩ／ＮｄｅＩ部位及びＸｈｏＩ部位制限酵素を付加するＢｎＫｒｐ１  ｃＤＮＡを増幅するために使用した（５’ＢｎＫｒｐ１  ＢａｍＨＩ／ＮｄｅＩ：ＡＣＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＧＴＧＡＧＡＡＡＡＴＧＣ（配列番号２６）及び３’ＢｎＫｒｐ１  ＸｈｏＩ：ＡＴＣＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＴＣＴＧＡＴＡＡＴＴＴＡＡＣ（配列番号２７）。ＰＣＲフラグメントをｐＴＧ番号３１３（ＴｏｐｏＩＩ  ＢｎＫｒｐ１）から増幅し、そしてｐＥＴ１６ｂ−５ｍｙｃのＢａｍＨＩとＸｈｏＩ部位にサブクローン化し、そして配列決定した。得られるベクターＢｎＫｒｐ番号４６１は、６ＸＨｉｓ及びｍｙｃタグとインフレームにＢｎＫｒｐ１野生型ｃＤＮＡを含んだ。
【０１５７】
組換えＫｒｐタンパク質の細菌における発現及び精製
挿入物を保有する全ての細菌発現プラスミドｐＥＴ１６ｂとｐＥＴ１６ｂ−５ＭＹＣとを、ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。この新鮮な形質転換からの細菌コロニーを使用して、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する４００ｍｌのＬＢを接種し、そして３７℃にて増殖させた。培養物が０.６と０.８との間のＯＤ600に達した場合、組換えタンパク質発現を、０.５ｍＭイソプロピル−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導した。次いで、細胞を３０℃にて３時間増殖した。細胞を、ＪＬＡ  １０.５００  Ｂｅｃｋｍａｎローターにおける遠心分離により回収した。細菌細胞ペレットを、−８０℃にて保存するか、又は即座に溶解した。細菌を、プロテアーゼインヒビターを含有し、ＥＤＴＡを欠く１０ｍｌのリン酸溶解緩衝液（１００ｍＭ  リン酸緩衝液  ｐＨ７.０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００）中で溶解した。再懸濁した細菌培養物を、４×２０秒間、水を含む氷上で４０％の出力にて超音波処理した。溶解した細胞をＢｅｃｋｍａｎ  ＪＡ２０.１ローターにおいて、１５分間、４℃にて、１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。細胞ペレットを、１０ｍｌのリン酸溶解緩衝液で洗浄し、そして細胞ペレットを再度遠心分離により回収した。タグ化ＫＲＰ分子は主に不溶性であった。不溶性のタグ化ＫＲＰを、尿素緩衝液（８Ｍ尿素、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７.５）中に可溶化した。再懸濁した細胞ペレットを、３×１５秒間、水を含む氷上で４０％の出力にて短く超音波処理した。尿素−不溶性タンパク質を、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＪＡ２０.１ローターにおいて、１５分間、４℃にて、１４，０００ｒｐｍでの遠心分離により排除した。タグ化ＫＲＰを、尿素緩衝液で平衡化したＢＤ  Ｔａｌｏｎ  ＣＯ2+金属アフィニティー樹脂を使用してバッチ中で精製した。バッチ精製物を、低速回転下で３時間から一晩、４℃にてインキュベートした。スラリーをカラム上に負荷し、そして樹脂を３６ベッド容量の尿素緩衝液、続いて５ｍＭイミダゾール  ｐＨ７.５を含有する１２ベッド容量の尿素緩衝液で洗浄した。結合されたタグ化ＫＲＰタンパク質を、３００ｍＭ  イミダゾール  ｐＨ７.５を含有する尿素緩衝液を使用して溶出した。画分をＳＤＳ−Ｐａｇｅにより、及び／又はＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（ＢｉｏＲａｄ）によりタグ化ＫＲＰについてモニターした。変性されたタグ化ＫＲＰ１の再折り畳みを、段階的希釈透析を使用して行った。タグ化ＫＲＰタンパク質の大部分を含む画分を合わせ、そして１Ｍ尿素、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７.５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、及び５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、及び５ｍＭベンズアミジン中で、２０時間、４℃にて透析した。次いで、透析緩衝液を、０.５Ｍ尿素、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７.５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、及び５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、及び５ｍＭベンズアミドに交換し、そしてさらに１２時間継続した。組換えタンパク質を回収し、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイにより定量し、そして４℃にて保存した。
【０１５８】
Ｋｒｐの変異誘発
ＡｔＫＲＰファミリーメンバーとＢｎＫＲＰのファミリーメンバーの野生型バージョンを、配列決定及び変異誘発の目的のために、基本的なｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローン化した。
【０１５９】
操作された５’−ＢａｍＨＩ部位と３’−ＸｈｏＩ部位を含む同じＡｔＫＲＰ１野生型ｃＤＮＡ  ＰＣＲフラグメント（前出の「細菌発現ベクターへのＫｒｐ  ｃＤＮＡのクローニング」を参照のこと）を、変異誘発のためにｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローン化した。得られるベクターＴｏｐｏ−ＡｔＫｒｐ番号３８５Ｂは、ＡｔＫＲＰ１野生型ｃＤＮＡを含み、そして標準的な自動化配列決定を使用して、正確な配列について確認された。上述からの同じＢｎＫＲＰ１野生型ｃＤＮＡフラグメントを、変異誘発のためにｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローン化した。得られるベクターＴｏｐｏ−ＢｎＫｒｐ番号５３９は、ＢｎＫＲＰ１野生型ｃＤＮＡを含み、そして標準的な自動化配列決定解析を使用して、正確な配列について確認した。
【０１６０】
ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キットについてのプロトコルに従って、部位特異的変異誘発を行った。
【０１６１】
推定のサイクリン結合領域において複数のアミノ酸置換（Ｅ１２９Ａ、Ｅ１３０Ａ、Ｉ１３１Ａ、Ｄ１３２Ａ）を伴うＢｎＫｒｐ１番号４６２を構築するために、センスＢｎＫｒｐ１ＤｂｌｅＭｕｔ番号１（ＧＧＡＧＣＡＡＣＣＡＣＣＡＡＣＧＧＣＡＧＴＧＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＴＴＴＴＴＣＧＴＧ；配列番号２８）及びアンチセンスＢｎＫｒｐ１ＤｂｌｅＭｕｔ番号１ｂ（ＣＡＣＧＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＣＴＧＣＣＧＴＴＧＧＴＧＧＴＴＧＣＴＣＣ；配列番号２９）を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発について、鋳型としてＴｏｐｏＢｎＫｒｐ番号５３９とともに使用した。変異誘発産物を所望される変異の存在を確認するために配列決定した。次いで変異産物を、ｐＥＴ１６ｂ−５ＭＹＣのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位にサブクローン化して、最終的にＢｎＫｒｐ１番号４６２を得た。
【０１６２】
ＣＤＫ結合部位の高度に保存された残基において２つのアミノ酸置換（Ｆ１５１Ａ、Ｆ１５３Ａ）を伴うＢｎＫｒｐ１番号５１２を構築するために、センスＢｎＫｒｐ１ＤｂｌｅＭｕｔ番号２オリゴヌクレオチド（ＣＣＴＴＣＴＡＡＴＧＧＣＴＴＣＴＣＣＴＴＴＴＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＧＴＴＡＴＡＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＡＡ；配列番号３０）及びアンチセンスＢｎＫｒｐ１ＤｂｌｅＭｕｔ番号２ｂオリゴヌクレオチド（ＴＴＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＴＡＴＡＡＣＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＡＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＣＣＡＴＴＡＧＡＡＧＧ；配列番号３１）を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発について、鋳型としてＴｏｐｏＢｎＫｒｐ番号５３９とともに使用した。変異誘発産物を所望される変異の存在を確認するために配列決定し、次いでｐＥＴ１６ｂ−５ＭＹＣのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位にサブクローン化した。同じアミノ酸置換をまた、ＡｔＫｒｐ１−Ｔｏｐｏ番号３８５Ｂを鋳型として用いて、以下のオリゴヌクレオチド「ＱＣ  ＩＣＫ１  ｃｄｓ  Ｆ１７３Ａ、Ｆ１７５Ａ−ｃｏｄｉｎｇ」５’−ＴＴＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＴＡＣＡＡＴＧＣＣＧＡＴＧＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＣＣＡＴＴＡ−３’；（配列番号３２）及び「ＱＣ  ＩＣＫ１  ｃｄｓ  Ｆ１７３Ａ、Ｆ１７５Ａ−ｎｏｎｃｏｄ」５’−ＴＴＡＴＧＧＣＴＴＣＴＣＣＴＴＣＴＧＧＧＣＡＴＣＧＧＣＡＴＴＧＴＡＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＡＡ−３’（配列番号３３）を使用して、ＡｔＫＲＰ１に導入した。
【０１６３】
推定のサイクリン結合領域とＣＤＫ結合領域における非常に保存された残基のアミノ酸置換（Ｅ１２９Ａ、Ｅ１３０Ａ、Ｉ１３１Ａ、Ｄ１３２Ａ、+Ｆ１５１Ａ、Ｆ１５３Ａ）を伴うＢｎＫｒｐ１番号４６３のために、センスＢｎＫｒｐ１ＤｂｌｅＭｕｔ番号２オリゴヌクレオチド（ＣＣＴＴＣＴＡＡＴＧＧＣＴＴＣＴＣＣＴＴＴＴＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＧＴＴＡＴＡＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＡＡ；配列番号３０）及びアンチセンスＢｎＫｒｐ１ＤｂｌｅＭｕｔ番号２ｂオリゴヌクレオチド（ＴＴＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＴＡＴＡＡＣＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＡＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＣＣＡＴＴＡＧＡＡＧＧ；配列番号３２）を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発について、鋳型としてＢｎＫｒｐ番号４６２とともに使用した。変異誘発産物を、所望の変異の存在を確認するために配列決定し、次いでｐＥＴ１６ｂ−５ＭＹＣのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位にサブクローン化した。
【０１６４】
ＣＤＫ結合領域において単一のアミノ酸置換（Ｋ１４８Ａ）を伴うＢｎＫｒｐ１番号５８６を構築するために、センスＢｎＫｒｐ１Ｋ１４８Ａオリゴヌクレオチド（ＧＡＴＡＡＴＴＴＣＡＡＧＡＡＧＧＣＧＴＡＴＡＡＣＴＴＴＧＡＴＴＴＣ；配列番号３４）及びアンチセンスＢｎＫｒｐ１Ｋ１４８Ａオリゴヌクレオチド（ＧＡＡＡＴＣＡＡＡＧＴＴＡＴＡＣＧＣＣＴＴＣＴＴＧＡＡＡＴＴＡＴＣ；配列番号３５）を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発について、鋳型としてＴｏｐｏＢｎＫｒｐ番号５３９とともに使用した。変異誘発産物を、所望の変異の存在を確認するために配列決定し、次いでｐＥＴ１６ｂ−５ＭＹＣのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位にサブクローン化した。
【０１６５】
ＣＤＫ結合領域において単一のアミノ酸置換（Ｙ１４９Ａ）を伴うＢｎＫｒｐ１番号５８７を構築するために、センスＢｎＫｒｐ１Ｙ１４９Ａオリゴヌクレオチド（ＡＡＴＴＴＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＣＴＡＡＣＴＴＴＧＡＴＴＴＣＧＡＡ；配列番号３６）及びアンチセンスＢｎＫｒｐ１Ｙ１４９Ａオリゴヌクレオチド（ＴＴＣＧＡＡＡＴＣＡＡＡＧＴＴＡＧＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＡＡＡＴＴ；配列番号３７）を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発について、鋳型としてＴｏｐｏＢｎＫｒｐ番号５３９とともに使用した。変異誘発産物を、所望の変異の存在を確認するために配列決定し、次いでｐＥＴ１６ｂ−５ＭＹＣのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位にサブクローン化した。
【０１６６】
ＣＤＫ結合領域において単一のアミノ酸置換（Ｎ１５０Ａ）を伴うＢｎＫｒｐ１番号５８８を構築するために、センスＢｎＫｒｐ１Ｎ１５０Ａオリゴヌクレオチド（ＴＴＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＴＡＴＧＣＣＴＴＴＧＡＴＴＴＣＧＡＡＡＡＧ；配列番号３８）及びアンチセンスＢｎＫｒｐ１Ｎ１５０Ａオリゴヌクレオチド（ＣＴＴＴＴＣＧＡＡＡＴＣＡＡＡＧＧＣＡＴＡＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＡＡ；配列番号３９）を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発について、鋳型としてＴｏｐｏＢｎＫｒｐ番号５３９とともに使用した。変異誘発産物を、所望の変異の存在を確認するために配列決定し、次いでｐＥＴ１６ｂ−５ＭＹＣのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位にサブクローン化した。
【０１６７】
ＣＤＫ結合領域において単一のアミノ酸置換（Ｆ１５１Ａ）を伴うＢｎＫｒｐ１番号５７２を構築するために、センスＢｎＫｒｐ１Ｆ１５１Ａオリゴヌクレオチド（ＡＧＡＡＧＡＡＧＴＡＴＡＡＣＧＣＴＧＡＴＴＴＣＧＧＡＡＡＧＧＡ；配列番号４０）及びアンチセンスＢｎＫｒｐ１Ｆ１５１Ａオリゴヌクレオチド（ＴＣＣＴＴＴＴＣＧＡＡＡＴＣＡＧＣＧＴＴＡＴＡＣＴＴＣＴＴＣＴ；配列番号４１）を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発について、鋳型としてＴｏｐｏＢｎＫｒｐ番号５３９とともに使用した。変異誘発産物を、所望の変異の存在を確認するために配列決定し、次いでｐＥＴ１６ｂ−５ＭＹＣのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位にサブクローン化した。
【０１６８】
ＣＤＫ結合領域において単一のアミノ酸置換（Ｆ１５３Ａ）を伴うＢｎＫｒｐ１番号５７３を構築するために、センスＢｎＫｒｐ１Ｆ１５３Ａオリゴヌクレオチド（ＡＧＴＡＴＡＡＣＴＴＴＧＡＴＧＣＣＧＡＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＣＣ；配列番号４２）及びアンチセンスＢｎＫｒｐ１Ｆ１５３Ａオリゴヌクレオチド（ＧＧＣＴＴＣＴＣＣＴＴＴＴＣＧＧＣＡＴＣＡＡＡＧＴＴＡＴＡＣＴ；配列番号４３）を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発について、鋳型としてＴｏｐｏＢｎＫｒｐ番号５３９とともに使用した。変異誘発産物を、所望の変異の存在を確認するために配列決定し、次いでｐＥＴ１６ｂ−５ＭＹＣのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位にサブクローン化した。
【０１６９】
ＣＤＫ結合領域において２つのアミノ酸置換（Ｋ１５７Ａ；Ｐ１５８Ａ）を伴うＢｎＫｒｐ１番号５５３を構築するために、センスＢｎＫｒｐ１ＫＰ→ＡＡオリゴヌクレオチド（ＧＡＴＴＴＣＧＡＡＡＡＧＧＡＧＧＣＧＧＣＡＴＴＡＧＡＡＧＧＡＣＧＣＴ；配列番号４４）及びアンチセンスＢｎＫｒｐ１ＫＰ→ＡＡオリゴヌクレオチド（ＡＧＣＧＴＣＣＴＴＣＴＡＡＴＧＣＣＧＣＣＴＣＣＴＴＴＴＣＧＡＡＡＴＣ）（配列番号４５）を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発について、鋳型としてＴｏｐｏＢｎＫｒｐ番号５３９とともに使用した。変異誘発産物を、所望の変異の存在を確認するために配列決定し、次いでｐＥＴ１６ｂ−５ＭＹＣのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位にサブクローン化した。
【０１７０】
ＣＤＫ結合領域において２つのアミノ酸置換（Ｒ１６２Ａ；Ｙ１６３Ａ）を伴うＢｎＫｒｐ１番号５５４を構築するために、センスＢｎＫｒｐ1ＲＹ→ＡＡオリゴヌクレオチド（ＧＣＣＡＴＴＡＧＡＡＧＧＡＧＣＣＧＣＣＧＡＧＴＧＧＧＴＴＡＡＡＴＴ；配列番号４６）及びアンチセンスＢｎＫｒｐ1ＲＹ→ＡＡオリゴヌクレオチド（ＡＡＴＴＴＡＡＣＣＣＡＣＴＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＡＡＴＧＧＣ；配列番号４７）を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発について、鋳型としてＴｏｐｏＢｎＫｒｐ番号５３９とともに使用した。変異誘発産物を、所望の変異の存在を確認するために配列決定し、次いでｐＥＴ１６ｂ−５ＭＹＣのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位にサブクローン化した。
【０１７１】
ＣＤＫ結合領域において２つのアミノ酸置換（Ｅ１６４Ａ；Ｗ１６５Ａ）を伴うＢｎＫｒｐ１番号５５５を構築するために、センスＢｎＫｒｐ1ＥＷ→ＡＡオリゴヌクレオチド（ＡＧＡＡＧＧＡＣＧＣＴＡＣＧＣＧＧＣＧＧＴＴＡＡＡＴＴＡＴＣＡＧＡ；配列番号４８）及びアンチセンスＢｎＫｒｐ1ＥＷ→ＡＡオリゴヌクレオチド（ＴＣＴＧＡＴＡＡＴＴＴＡＡＣＣＧＣＣＧＣＧＴＡＧＣＧＴＣＣＴＴＣＴ；配列番号４９）を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発について、鋳型としてＴｏｐｏＢｎＫｒｐ番号５３９とともに使用した。変異誘発産物を、所望の変異の存在を確認するために配列決定し、次いでｐＥＴ１６ｂ−５ＭＹＣのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位にサブクローン化した。
【０１７２】
ＣＤＫ結合領域において２つのアミノ酸置換（Ｋ１６７Ａ；Ｌ１６８Ａ）を伴うＢｎＫｒｐ１番号５５６を構築するために、センスＢｎＫｒｐ1ＫＬ→ＡＡオリゴヌクレオチド（ＣＧＣＴＡＣＧＡＧＴＧＧＧＴＴＧＣＡＧＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＧＡＧＣ；配列番号５０）及びアンチセンスＢｎＫｒｐ1ＫＬ→ＡＡオリゴヌクレオチド（ＧＣＴＣＴＣＡＣＴＣＴＧＡＴＧＣＴＧＣＡＡＣＣＣＡＣＴＣＧＴＡＧＣＧ；配列番号５１）を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発について、鋳型としてＴｏｐｏＢｎＫｒｐ番号５３９とともに使用した。変異誘発産物を、所望の変異の存在を確認するために配列決定し、次いでｐＥＴ１６ｂ−５ＭＹＣのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位にサブクローン化した。
【０１７３】
ＣＤＫ結合領域において複数のアミノ酸置換（Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ；Ｅ１６４Ａ、Ｗ１６５Ａ）を伴うＢｎＫｒｐ１番号５７４を構築するために、ＢｎＫｒｐ1Ｆ１５１Ａ、Ｆ１５３Ａオリゴヌクレオチド（ＣＣＴＴＣＴＡＡＴＧＧＣＴＴＣＴＣＣＴＴＴＴＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＧＴＴＡＴＡＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＡＡ；配列番号５２）アンチセンスＦ１５１Ａ、Ｆ１５３Ａオリゴヌクレオチド（ＴＴＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＴＡＴＡＡＣＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＡＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＣＣＡＴＴＡＧＡＡＧＧ；配列番号５３）を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発について、鋳型としてＢｎＫｒｐ１番号５５５とともに使用した。変異誘発産物を、所望の変異の存在を確認するために配列決定し、次いでｐＥＴ１６ｂ−５ＭＹＣのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位にサブクローン化した。
【０１７４】
ＣＤＫ結合領域において複数のアミノ酸置換（Ｙ１４９Ａ；Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ）を伴うＢｎＫｒｐ１番号５９８を構築するために、センスＢｎＫｒｐ1Ｙ１４９Ａオリゴヌクレオチド（ＡＡＴＴＴＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＣＴＡＡＣＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＡＡ；配列番号５４）及びアンチセンスＢｎＫｒｐ1Ｙ１４９Ａオリゴヌクレオチド（ＴＴＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＧＴＴＡＧＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＡＡＡＴＴ；配列番号５５）を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発について、鋳型としてＴｏｐｏＢｎＫｒｐ番号５１２とともに使用した。変異誘発産物を、所望の変異の存在を確認するために配列決定し、次いでｐＥＴ１６ｂ−５ＭＹＣのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位にサブクローン化した。
【０１７５】
ＢｎＫｒｐ１番号５４７を構築するために、以下の２つのオリゴヌクレオチドを使用して、最もＣ末端の２つのアミノ酸、すなわち、ＳｅｒとＧｌｕを欠損するＢｎＫｒｐ１  ｃＤＮＡを増幅し、これは５’ＢａｍＨＩ／ＮｄｅＩ部位及びＢｎＫｒｐ１の３’末端にＸｈｏＩ制限部位を付加する（５’ＢｎＫｒｐ1  ＢａｍＨＩ／ＮｄｅＩ：ＡＣＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＧＴＧＡＧＡＡＡＡＴＧＣ（配列番号２６）及び３’ＢｎＫｒｐ１  ＳＥ＞ｓｔｏｐ  ＸｈｏＩ：ＣＴＣＧＡＧＴＣＡＡＧＣＡＧＣＴＡＡＴＴＴＡＡＣＣＣＡＣＴＣＧＴＡ（配列番号５６）。ＰＣＲフラグメントをｐＴＧ番号３１３（ＴｏｐｏＩＩ  ＢｎＫｒｐ１）から増幅し、そしてｐＥＴ１６ｂ−５ｍｙｃのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位にサブクローン化し、そして配列決定した。得られるベクターＢｎＫｒｐ番号５４７は、６ＸＨｉｓ及びｍｙｃタグとインフレームにＢｎＫｒｐ１  ｃＤＮＡを含んだ。
【０１７６】
ＢｎＫｒｐ１番号６１４を構築するために、以下の２つのオリゴヌクレオチドを使用して、全ＣＤＫ結合ドメインを欠損するＢｎＫｒｐ１  ｃＤＮＡを増幅した。５’ＢｎＫｒｐ1  ＢａｍＨＩ／ＮｄｅＩ：ＡＣＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＧＴＧＡＧＡＡＡＡＴＧＣ（配列番号２６）及びＸｈｏＩ部位を含む３’ＢｎＫｒｐ１Δｃｄｋ：ＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＴＴＣＴＴＧＡＡＡＴＴＡＴＣ（配列番号５７）。ＰＣＲフラグメントをｐＴＧ番号４２０（ＴｏｐｏＩＩ  ＢｎＫｒｐ１）から増幅し、そしてＴｏｐｏＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローン化し、そして配列決定した。次いで、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩフラグメントをｐＥＴ１６ｂ−５ｍｙｃにサブクローン化した。得られるベクターＢｎＫｒｐ番号６１４は、ＣＤＫ結合領域についてのコード配列を欠損し、６ＸＨｉｓ及びｍｙｃタグとインフレームにＢｎＫｒｐ１  ｃＤＮＡを含んだ。
【実施例２】
【０１７７】
哺乳動物ｐ２７KIP1と植物ＫＲＰとの間のアミノ酸相同性
ＣＫＩのＣＩＰ１／ＫＩＰ１ファミリーは、キナーゼ複合体を結合し、そして阻害するために２つの接触領域を利用する。結合と阻害のこの態様に基づいて、これらの２つの領域のうちの１つの結合能力を変化することは、複合体になお相互作用し得（無傷のドメインを介して）るが、キナーゼ活性をもはや阻害し得ず、そして野生型ＣＫＩを、活性なサイクリン／ＣＤＫ複合体を阻害することから妨げられる、優性ネガティブなタンパク質を潜在的に生じた。例えば、サイクリン結合領域が非機能的にされる場合、変異タンパク質はなお、ＣＤＫ結合領域を通じて、キナーゼ複合体と無傷のドメインを介して相互作用する。同様に、ＣＤＫ結合領域が非機能的にされる場合、変異タンパク質は、なおサイクリン結合領域を通じて、キナーゼ複合体と相互作用する。
【０１７８】
ＣＫＩのＡｔＫｒｐファミリーは、全タンパク質を通して相同性を共有し、最も高い相同性は、最もＣ末端の４０〜４５アミノ酸に横たわる（Ｗａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：４５１〜４５２、１９９７年；Ｗａｎｇら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１５：５０１〜５１０、１９９８年；Ｌｕｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２１：３７９〜３８５、２０００年；Ｄｅ  Ｖｅｙｌｄｅｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １３：１６５３〜１６６７、２００１年；Ｊａｓｉｎｓｋｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３０：１８７１〜１８８２、２００２年；Ｚｈｏｕら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２０：９６７〜９７５、２００２年；Ｚｈｏｕら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．３５：４７６〜４８９、２００３年を参照のこと）。しかし、Ｋｒｐファミリーの最後の約２３アミノ酸のみが、哺乳動物ｐ２７Kip1に相同性を示す（図１を参照のこと）。
【０１７９】
インビトロでの結合実験を、代表的なＫＲＰ、すなわちＢｎＫＲＰ１と、ＡｔｃｙｃｌｉｎＤ２；１及びＡｔＣＤＫＡとの間の結合相互作用を解明することを補助するために、行った。他のＫＲＰファミリーメンバーの結合相互作用も、以下に記載される同じインビトロでの結合実験を使用して解明される。ＣＤＫ結合領域において高度に保存されたアミノ酸のアミノ酸置換を含有するＢｎＫｒｐ１の変異バージョンを使用するインビトロでの結合実験は、この領域単独が、ＣＤＫに対する結合に必要であったことを示し、一方Ａｔｃｙｃｌｉｎに対する結合はなお無傷のままであった。より重要なことに、無傷なＣＤＫ結合ドメインは、ＡｔＣｙｃｌｉｎＤ２／ＣＤＫＡ複合体の阻害に絶対的に必要とされる。ＣＤＫ結合領域の直ぐ上流に横たわるアミノ酸は、本発明者らがサイクリン結合領域であると提唱する領域において、ＫＲＰファミリーメンバー間で保存されたが（図１を参照のこと）、ｐ２７KIP1においては保存されなかった。この提唱されるサイクリン結合ドメイン内のいくつかの保存された残基の変異は、ＡｔｃｙｃｌｉｎＤ２；１との相互作用を無効にするが、ＡｔＣＤＫＡとの相互作用は無傷のままである。興味深いことに、この推定のサイクリン結合領域の変異体はなお、ＡｔｃｙｃｌｉｎＤ２／ＣＤＫＡキナーゼ複合体を、野生型ＫＲＰ１ほど効果的にではなく阻害する。キナーゼ活性を５０％まで減少する阻害濃度（ＩＣ50）は、野生型ＫＲＰ１（ＢｎＫｒｐ番号４６１）について０.０３５μｇであるのに対し、サイクリン結合変異体（ＢｎＫｒｐ番号４６２）は１.２５μｇであった。
【０１８０】
類似の観察が、哺乳動物ｐ２７KIP1対応物でみられた（Ｖｌａｃｈら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：５３３４〜４４、１９９７年を参照のこと）。ｐ２７KIP1サイクリン結合変異体のＩＣ50は、野生型ｐ２７KIP1に比較して増加された。しかし、対照的に、高濃度のｐ２７KIP1ＣＤＫ結合変異体はなお、キナーゼ複合体を阻害し得た。このことは、植物Ｋｒｐに不在である、哺乳動物ｐ２７KIP1における３１０へリックスの存在により説明される（説明については実施例３を参照のこと）。
【０１８１】
これらのデータは、ＫＲＰにおける２つの領域が存在することを暗示し、これらは活性なキナーゼ複合体との相互作用を担う哺乳動物ｐ２７KIP1対応物に類似する。興味深いことに、サイクリンドメイン変異体はなお、キナーゼ複合体を阻害し、ＣＤＫ結合領域は、サイクリン／ＣＤＫキナーゼ阻害を主に担ったことを示唆する。同様に、ｐ２７KIP1のサイクリン結合領域は、活性なＣＤＫ複合体の阻害において付加的な役割を果たす。さらにこれらの結果は、ｐ２７KIP1とは対照的に、ＫＲＰ１のＣＤＫ結合領域は、キナーゼ阻害においてより有意な役割を果たすことを説明する。
【０１８２】
それゆえ、ＣＤＫ結合領域残基において、ＫＲＰファミリーとｐ２７KIP1との間の高い相同性に焦点が絞られ、なお複合体を結合し、野生型ＢｎＫＲＰ１を、キナーゼ複合体を阻害することから妨げ得、それでも複合体自身を妨げ得ない優性ネガティブなＢｎＫｒｐ１分子を最終的に作製するために変化される。
【実施例３】
【０１８３】
植物ＫＲＰにおいて保存されるＣＤＫを接触する重要なアミノ酸を同定するために使用される、サイクリン／ＣＤＫとの複合した哺乳動物ｐ２７KIP1のタンパク質構造
野生型Ｋｒｐ機能を最終的に妨げる優性ネガティブなＫｒｐ分子の設計を容易にするために、サイクリン  Ａ−ＣＤＫ２キナーゼ複合体と複合した哺乳動物ｐ２７KIP1の以前に公開された構造を使用した（Ｒｕｓｓｏら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８２：３２５〜３３１、１９９６年）。この構造情報と、アラインメント情報とを、アラニン又は他のアミノ酸残基に交換する場合に、優性ネガティブな特徴を伴うタンパク質を生じる重要なアミノ酸を同定するために組み合わせた。これらの優性な特徴は以下のようであった：１）変異Ｋｒｐはサイクリン／ＣＤＫ複合体に結合する、２）変異タンパク質は、高濃度であってもサイクリン／ＣＤＫ複合体の形成を実質的に阻害しない、３）変異タンパク質は、サイクリン／ＣＤＫ複合体に対する結合について、野生型ＫＲＰ分子と実質的に競合するべきである。インビボで、これらの特徴を満たす変異体Ｋｒｐは、細胞において上昇されたサイクリン／ＣＤＫ活性を生じ、このことは最終的に、増加される細胞増殖及びより高い分裂指数を導く。
【０１８４】
哺乳動物、サイクリンＡ／ＣＤＫ２キナーゼ活性は、ｐ２７KIP1の結合により、完全に停止される。ｐ２７KIP1が、サイクリンＡ／ＣＤＫ２キナーゼ複合体を阻害する機構は、複雑なプロセスであることが示されている（Ｒｕｓｓｏら、前出）。ｐ２７KIP1は、活性なキナーゼ複合体を阻害するために２つの手段を利用する。阻害に対する第１の成分としては、ｐ２７KIP1３１０へリックスが挙げられ、これはＣＫＩの植物ＫＲＰファミリーのいずれにおいても明らかに保存されていない。３１０へリックスは、キナーゼの触媒の裂隙にそれ自身を挿入して、ＡＴＰ基質を模倣する。３１０へリックスによるこの裂隙領域の占有は、ＡＴＰ結合及びキナーゼ活性を効果的にブロックする。しかし、３１０へリックスの不在下であっても、ｐ２７KIP1はなおキナーゼ複合体を阻害し得る（Ｐｏｌｙａｋら、Ｃｅｌｌ  ７８：５９〜６６、１９９４年を参照のこと）。
【０１８５】
サイクリンＡ／ＣＤＫ２に結合されるｐ２７KIP1とキナーゼ複合体単独との結晶構造の比較は、Ｎ−末端突出（ｌｏｂｅ）が、ｐ２７KIP1を結合する際に有意な立体配座的変化を受けることを説明する（Ｒｕｓｓｏら、前出を参照のこと）。事実、通常活性部位にＡＴＰを配置することを補助するキナーゼのＮ末端突出内の特異的なβシートは、ｐ２７KIP1の結合の際に失われる。ｐ２７KIP1の結合は、ｐ２７KIP1のβ−ヘアピン、β鎖残基、及び３１０へリックスと、ＣＤＫ２のＮ末端突出のβシートアミノ酸とを含む再折り畳みを誘導し、これは再折り畳みを行い、分子間β−サンドイッチを形成する（同文献を参照のこと）。この構造の変化は単独で、サイクリンＡ／ＣＤＫ２のキナーゼ活性を有意に阻害し得る。このβ−サンドイッチを形成するｐ２７KIP1内の残基は、全ての哺乳動物ｐ２７KIP1ファミリーメンバーにおいて高度に保存され、及び全てのＫＲＰファミリーメンバーにおいてもまた十分に保存される。実施例１において記載される結果、及び保存される３１０へリックスの欠損に基づいて、ＫＲＰファミリーメンバーにおいて保存されるＣＤＫ結合領域は、活性なキナーゼ複合体を結合し、そしてＡｔＣＤＫＡキナーゼのＮ末端突出における立体配座的変化を誘導することにより、キナーゼ活性を阻害する。しかし、ＫＲＰの別の領域は、３１０へリックス同様に触媒裂隙に挿入することにより、ＡＴＰ結合を正確に模倣するので、除外されない。
【０１８６】
ＫＲＰファミリーの最もカルボキシ末端の２３アミノ酸は、哺乳動物ｐ２７KIP1に対して最も優れたアミノ酸同一性を示す（図１を参照のこと）。ＣＫＩとキナーゼ複合体との間でβサンドイッチを形成する際に役割を果たす、哺乳動物ｐ２７KIP1に対する配列同一性に基づいて、ＢｎＫＲＰ１におけるいくつかの保存された領域を全体的に変化した。各変異体を、キナーゼ複合体を阻害するその能力について、野生型ＢｎＫＲＰ１（ＢｎＫｒｐ番号４６１）に比較した。いくつかの場合において、変異ＢｎＫｒｐ１をまた、ＡｔｃｙｃｌｉｎＤ２；１又はＡｔＣＤＫＡに対する結合についてモニターした。これらの実験についての結果は、以下の表２においてまとめられる。
【０１８７】
変異を、実施例４「変異体ＫＲＰ  ＣＫＩポリペプチド」において詳細に記載されるように導入した。
【０１８８】
ＣＤＫ結合領域の最もＮ末端に、Ｌｙｓ  Ｔｙｒ  Ａｓｎ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｐｈｅ（ＫＹＮＦＤＦ）モチーフ（配列番号５８）がある。このモチーフは、アラビドプシス及びＢｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ種由来のＫＲＰファミリーメンバーにおいて高度に保存される。これらの残基は、ｐ２７KIP1において保存されるほとんどの部分である。ｐ２７KIP1において、これらはβ−ヘパリンターンの部分を形成し、これは最終的に、サイクリンＡ−ＣＤＫ２複合体において、ＣＤＫ２とともにβ−サンドイッチを形成する。これらの保存される残基のそれぞれをアラニンに交換し、そしてキナーゼ複合体を阻害するそれらの能力について試験した（表２を参照のこと）。多くの単一アミノ酸置換変異は、インビトロにおいてキナーゼ複合体を阻害する能力を影響しなかった。しかし、ＢｎＫｒｐ１番号５８７及びＢｎＫｒｐ１番号５７２は、興味深い結果を示した。各場合において、キナーゼ阻害は野生型タンパク質に比較して軽減され、このＫＲＰ１の領域はキナーゼ阻害において役割を果たすことを示唆する。
【０１８９】
ｐ２７KIP1におけるフェニルアラニン６２と６４の両方の側鎖は、ＣＤＫ２を接触し、β−サンドイッチを形成する際に不可欠の役割を果たし、かつＫＰＲ１において保存される。（図１を参照のこと）。Ｋｒｐ１  Ｆ１５１Ａ（ＢｎＫｒｐ１番号５７２）の阻害活性は、部分的に損なわれるので、フェニルアラニン１５１と１５３の両方をアラニンに交換した。この二重変異体、ＢｎＫｒｐ１番号５１２は、サイクリンＤ２；１を介してキナーゼ複合体をなお結合するその能力にかかわらず、キナーゼ複合体をもはや阻害しなかった。複合体のＣＤＫ部分に対するこの変異体のいくらかの残存する結合が、なおよい。
【０１９０】
ＫＲＰ１のチロシン１４９は、ｐ２７KIP1において保存されない；しかし、これはＣＤＫ２を接触しかつβ−サンドイッチの部分を形成するβ−ヘパリンのＮ末端部分に横たわる。チロシン１４９は、アラビドプシスとアブラナのＫＲＰファミリーメンバーにおいて高度に保存される。チロシン残基をアラニンに交換した場合（ＢｎＫｒｐ１番号５８７）、阻害活性は部分的に損なわれ、これが、ＣＤＫＡの結合及び／又は阻害において重要な役割を果たすことを示唆する。それゆえ、この部分の変異（Ｙ１４９Ａ）は、２重変異Ｋｒｐ１  Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａと組み合わされる。この３重変異体は、キナーゼ活性を阻害するその能力を喪失するが、キナーゼ複合体に対するその結合を保持することが予期される。
【０１９１】
ＫＲＰ１におけるＫＹＮＦＤＦモチーフ（配列番号５８）に対してＣ末端の領域は、ｐ２７KIP1において保存されるいくつかのアミノ酸を含む。（図１を参照のこと）。これらの残基多くは、β−サンドイッチの一部分を形成するｐ２７KIP1のβ鎖において保存される。これらの保存されるアミノ酸のいくつかを、対でアラニンに交換した（まとめについて表２を参照のこと）。１つ以外の全ての場合において、阻害機能は有意に損なわれなかった。例外は、Ｋｒｐ１番号５４５（Ｅ１６４Ａ；Ｗ１６５Ａ）変異体であり、これは野生型ＫＲＰ１よりも非常に弱いインヒビターであった。トリプトファン１６５は、その側鎖をβ−サンドイッチ内に伸長する。フェニルアラニン１５１、１５３及びＥ１６４とＷ１６５を全てアラニンに交換した（Ｋｒｐ１番号５７４）。この複合変異体ＢｎＫｒｐ１は、高濃度にて使用された場合であっても、キナーゼ複合体を阻害できなかった。
【０１９２】
また、ＫＲＰ１の完全なＣＤＫ結合領域の切除はキナーゼ複合体を阻害できなかった。このことは、ＣＤＫを結合することを担う全領域が欠失されたので驚くべきことではなかった。しかし、本発明者らは、このような切除は不安定なタンパク質を生じると考える。
【実施例４】
【０１９３】
変異ＫＲＰ  ＣＫＩポリペプチド。
転写後ＲＮＡレベルでの遺伝子発現を封じるために使用される以前の技術の改善として、植物におけるＫＲＰファミリーメンバーの抑制が、優性ネガティブな戦略を使用して、タンパク質レベルで達成された。優性ネガティブな戦略の基本的な原理は、同じタンパク質の正常なコピーが、それらの機能を行うことを妨げる変異タンパク質を生成するように、遺伝子を操作することである。この場合において、正常なＫＲＰタンパク質は、サイクリン／ＣＤＫ複合体と複数のサブユニット複合体を形成して、キナーゼ活性を不活性化する。それゆえ、野生型ＫＲＰ１の変異バージョンを発現することは、ＫＲＰ１の正常なコピーが、サイクリン／ＣＤＫキナーゼ活性を阻害することを妨げる。それゆえ、アブラナの７つのＫＲＰファミリーメンバー高程度の相同性を考慮して、変異Ｋｒｐ１は、他のファミリーメンバー又は潜在的に全てのファミリーメンバーに対して優性ネガティブとして挙動する。最後に、ＫＲＰのサイクリン及びＣＤＫ結合領域は、他の植物種において十分に保存される。それゆえ、この優性ネガティブＫｒｐ１は、例えば、トウモロコシ、コムギ、カノーラ（Ｃａｎｏｌａ）、ダイズ、イネ、綿花、ポプラなどのような他の植物における内因性ＫＲＰによる阻害から、サイクリン／ＣＤＫキナーゼ複合体を防御する。
【０１９４】
前には、優性ネガティブ変異体は、種々のシグナル形質導入経路の解明を補助するために使用されてきた。特に、優性ネガティブなＲａｓ、ＧＴＰアーゼの一種は、今日までに最も一般的に使用される優性ネガティブなタンパク質であり、かつ他のＧＴＰアーゼを研究するために使用される戦略において主要な役割を果たしてきた（Ｆｅｉｇ及びＣｏｏｐｅｒ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３２３５〜３２４３、１９８８年）。同様に、ＣＤＫの優性ネガティブなバージョンは、細胞周期の制御におけるＣＤＫについての役割を同定するために使用された（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｅｕｖｅｌ及びＨａｒｌｏｗ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：２０５０〜２０５４、１９９３年）。
【０１９５】
ＫＩＰ／ＣＩＰファミリーのＣＫＩは、キナーゼ複合体を阻害するためにそれらが使用する機構において、ＩＮＫファミリーのインヒビターとは異なる。ＩＮＫファミリーは、ＣＤＫのみに結合するのに対し、ＣＩＰ／ＫＩＰファミリーは、サイクリンやＣＤＫに独立して結合する２つの保存された領域を有する。ＣＩＰ／ＫＩＰ１ファミリーのＣＫＩやＫＲＰファミリーのＣＫＩが、複合体を結合するために２つの接触領域を利用するという事実は、それらを優性ネガティブな戦略のための理想的な候補にする。このことは、ＣＤＫ結合領域が、サイクリンを結合するＫＲＰ１の領域を無傷で維持しながら、ＣＤＫとの相互作用を無効にする変異体について標的されるので、当てはまる。
【０１９６】
本発明において、カノーラ（Ｃａｎｏｌａ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ（Ｂｎ）のＫＲＰ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（Ａｔ）のＫＲＰ分子がクローン化され、そしてサイクリン／ＣＤＫ活性を阻害するそれらの能力が確認された。この目的のために、インビトロアッセイが、サイクリン／ＣＤＫ複合体を阻害する、種々のＫＲＰの能力を試験するために開発された。アラビドプシスサイクリンＤ２；１（ＡｔｃｙｃｌｉｎＤ２；１）及びアラビドプシスＣＤＫＡ（ＡｔＣＤＫＡ）をエピトープでタグ化し、そしてバキュロウイルス発現ベクター系（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にクローン化した。ＡｔｃｙｃｌｉｎＤ２；１を、Ｎ末端においてＦＬＡＧエピトープ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でタグ化した。ヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープをＡｔＣＤＫＡの５’末端とインフレームに配置した。ＡｔｃｙｃｌｉｎＤ２；１タンパク質の産生を、ＡｔｃｙｃｌｉｎＤ２；１バキュロウイルスでＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  Ｓｆ９細胞を感染することにより達成した。ＡｔＣＤＫＡの産生を、ＣＤＫＡバキュロウイルスでのＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  Ｓｆ９細胞の感染により達成した。サイクリンＤ２；１／ＣＤＫＡの活性な複合体を、ＡｔｃｙｃｌｉｎＤ２；１バキュロウイルス及びＡｔＣＤＫＡバキュロウイルスでのＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  Ｓｆ９細胞の同時感染により達成した。サイクリン、ＣＤＫ、及び活性な複合体を精製し、そしてキナーゼ活性についてアッセイした。キナーゼ活性を、ヒストンＨＩ（ＨＨＩ）を基質として用いる標準的なキナーゼアッセイを使用して、又は組換えＮｔＲｂを使用することにより（Ｎａｋａｇａｍｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １４：１８４７〜１８５７、２００２年）、モニターした。サイクリンＤ２；１を感染された昆虫細胞は、活性な複合体をなんら産生しなかった。同様に、ＣＤＫＡを感染された細胞は、活性なキナーゼをなんら産生しなかった。細胞が、ＡｔｃｙｃｌｉｎＤ２；１と、ＡｔＣＤＫＡとの両方で感染された場合、キナーゼ活性は容易に検出された。活性なサイクリンＣＤＫ複合体は、植物タンパク質組織抽出物から、又は植物組織培養細胞抽出物から、ｐ１３ｓｕｃｌアガロースビーズ（Ｗａｎｇら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１５：５０１〜５１０、１９９８年）を使用することにより精製される。
【０１９７】
ｋｒｐ  ｃＤＮＡを、ｐＥＴ１６ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）においてＨＩＳタグのコード配列とインフレームにサブクローニングすることにより、Ｋｒｐを、Ｎ末端ポリヒスチジンエピトープタグ（Ｈｉｓタグ）を含むように設計した。野生型Ｋｒｐタンパク質と変異Ｋｒｐタンパク質の発現を細菌中で誘導し、続いてＮｉ−アガロースを使用して、ＨＩＳタグ融合タンパク質として精製した。
【０１９８】
試験した全ての野生型Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ（Ｂｎ）Ｋｒｐ（ＢｎＫＲＰ１、ＢｎＫＲＰ４、ＢｎＫＲＰ５）は、サイクリンＤ２；１／ＣＤＫＡ複合体を阻害するのに極めて効果的であった。また、全ての場合において、阻害は、用量依存性であった。いくつかの他のアラビドプシス  ＡｔＫｒｐ（ＡｔＫＲＰ１、ＡｔＫＲＰ２）はまた、効果的なインヒビターであった。
【０１９９】
ＣＩＰ１／ＫＩＰ１ファミリーのＣＫＩは、キナーゼ複合体を結合と阻害するために、２つの接触領域を利用する。結合と阻害のこの態様に基づいて、これらの結合と阻害のこの態様に基づいて、これらの２つの領域のうちの１つの結合能力を変化することは、優性ネガティブな特徴を伴う変異タンパク質を潜在的に生じる。例えば、サイクリン結合領域が非機能的にされると、変異タンパク質はなお、サイクリン結合領域を通じて、キナーゼ複合体と無傷のドメインを介して相互作用する。同様に、ＣＤＫ結合領域が非機能的にされると、変異タンパク質は、なおサイクリン結合領域を通じて、キナーゼ複合体と相互作用する。
【０２００】
ＩＣＫ／ＫＲＰファミリーメンバーは、哺乳動物ｐ２７KIP1ファミリーに対して、制限されるアミノ酸同一性を有する。この同一性は、最もＣ末端の２４〜３０アミノ酸に制限される。実際、哺乳動物ｐ２７KIP1のサイクリン／ＣＤＫ結合ドメインの位置は、タンパク質のＮ末端に位置されるが、植物Ｋｒｐにおける相同な領域は、タンパク質の最もＣ末端の部分にて見出される。（図１を参照のこと、ｐ２７KIP1及び種々のＫｒｐファミリーメンバーのアラインメントを示す）。哺乳動物ｐ２７KIP1内のサイクリン結合領域は、植物ＫＲＰにおいて保存されない。しかし推定のＣＤＫ結合領域の直ぐ上流の領域は、全ての植物ＫＲＰにおいて保存される。ｐ２７KIP1に相同ではないがこの保存された領域は、サイクリンとの相互作用を担い得た。ＢｎＫＲＰ１のこの提唱されるサイクリン結合領域（アミノ酸１２５〜１３８）におけるいくつかの残基のアミノ酸置換は、サイクリンへの結合を無効にするが、ＣＤＫに対する結合を影響しない。これらのデータは、ＫＲＰに存在する２つの領域が、活性なキナーゼ複合体との相互作用を媒介する哺乳動物ｐ２７KIP1対応物に類似することを示唆する。興味深いことに、サイクリン結合領域を変異することは、キナーゼ複合体の阻害を完全には無効にせず、ＣＤＫ結合領域が主に、サイクリン／ＣＤＫ阻害を担うことを示唆する。
【０２０１】
植物のＣＤＫ結合領域と、哺乳動物ＣＫＩとの間の高い程度の相同性を考慮して、サイクリンＡ／ＣＤＫ複合体に結合するｐ２７KIP1の結晶構造は、サイクリンとＣＤＫを結合するｐ２７KIP1の接触残基の同定を補助するために使用された（Ｒｕｓｓｏら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８２：３２５〜３３１、１９９６年）。接触残基は、種々のＫＲＰ配列と比較されて、それらがｐ２７KIP1に対して最も高い相同性を保有する領域において保存されるか否かを決定した。ＣＤＫ結合領域の最もＮ末端にて、ＬｙｓＴｙｒＰｈｅＡｓｐＰｈｅ（ＫＹＮＦＤＦ）（配列番号５８８）モチーフが横たわる。これらの残基は、ｐ２７において保存されるほとんどの部分である。これらは、サイクリンＡ−ＣＤＫ２複合体においてＣＤＫ２を接触するβ−シートを形成する。
【０２０２】
これらの保存された残基のそれぞれをアラニンに交換し、そしてキナーゼ複合体を阻害するそれらの能力について試験した。興味深いことに、これらの単一アミノ酸置換変異の多くは、インビトロにおいてキナーゼ複合体を阻害する能力に影響しなかった。しかし、Ｋｒｐ１  Ｆ１５１Ａ変異体とＫｒｐ１  Ｙ１４９Ａ変異体は、キナーゼ複合体への結合を影響することなく、ＣＫＩ活性を減少した。
【０２０３】
フェニルアラニン１５１と１５３の両方の側鎖はＣＤＫに接触し、Ｋｒｐ１  Ｆ１５１Ａ阻害活性は部分的に損なわれるので、フェニルアラニン１５１と１５３の両方がアラニンで置き換えられた。この二重変異ＢｎＫｒｐ１（ＢｎＫｒｐ１  Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ）は、サイクリンＤ２；１を介してキナーゼ複合体を結合するその能力にかかわらず、キナーゼ複合体をもはや阻害しない。複合体のＣＤＫ部分に対するこの変異体のいくらかの残存する結合が、なおあり得ることは除外されない。
【０２０４】
Ｋｒｐ１のチロシン１４９は、ｐ２７KIP1において保存されないが；哺乳動物ｐ２７の構造モデルにおいて、類似のアミノ酸残基がＣＤＫ２を接触するβ−シートの位置に横たわる。アラニンに交換した場合（Ｋｒｐ１Ｙ１４９Ａ）、阻害活性は部分的に損なわれ、このアミノ酸が、ＣＤＫＡの結合及び／又は阻害において重要な役割を果たすことを示唆する。それゆえ、２重変異Ｋｒｐ１  Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａと組み合わされるこの部分の変異（Ｙ１４９Ａ）は、キナーゼ複合体をもはや阻害しない改変タンパク質を生成した。この３重変異体（ＢｎＫｒｐ１  Ｙ１４９Ａ；Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ）は、キナーゼ活性を阻害できないが、キナーゼ複合体に対する結合をなお保持することが予期される。
【０２０５】
上記のように、Ｙ１４９ＡとＦ１５１Ａの単一アミノ酸置換はともに、キナーゼ複合体を阻害する、変異ＢｎＫｒｐ１ポリペプチドの能力を個々に減少した。ＢｎＫｒｐ１  Ｙ１４９ＡとＦ１５１Ａの二重変異体は、キナーゼ複合体をもはや阻害しない変異タンパク質を生成することが予期される。
【０２０６】
ＫＲＰ１におけるＫＹＮＦＤＦモチーフ（配列番号５８）に対してＣ末端の領域は、ｐ２７KIP1において保存されるいくつかのアミノ酸を含む。これらの保存されるアミノ酸のいくつかを、対でアラニンに交換した。１つ以外の全ての場合において、阻害機能は有意に損なわれなかった。例外は、Ｋｒｐ１  Ｅ１６４Ａ；Ｗ１６５Ａ変異体であり、これは野生型ＫＲＰ１よりも非常に弱いインヒビターであった。別個の派生体タンパク質において、フェニルアラニン１５１、１５３とＥ１６４、Ｗ１６５を全てアラニンに置き換えた。ＢｎＫｒｐ１のこの複合変異体はまた、キナーゼ複合体を阻害できなかった。
【０２０７】
ＫＲＰ１の完全なＣＤＫ結合領域の切除はまた、キナーゼ複合体を阻害し得なかった。このことは、ＣＤＫを結合することを担う全領域が欠失されたので驚くべきことではなかった。
【０２０８】
生物学的活性についての種々のＢｎＫｒｐ１変異体の評価の結果は表２においてまとめられる。
【０２０９】
【表２】
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【０２１０】
以前に記載されたように、サイクリン結合ドメインを破壊することは、いくらかの阻害活性をなお保持する変異Ｋｒｐ１タンパク質を生じた。それにもかかわらず、推定のサイクリン結合領域内（アミノ酸１２５〜１３８）に、至適な優性ネガティブな特徴を満たす変異タンパク質を作製するために変化される、他のアミノ酸が存在する。さらに、アラニンが、これらの特定の研究において全ての置換に使用されたが、同定されたアミノ酸残基を、１つ以上の物理的特性において有意に異なる別の非アラニンアミノ酸残基で置き換えること（他の非保存的置換）は、優性ネガティブなタンパク質を生じると予期される。特に、特定のアミノ酸残基を、逆帯電されるアミノ酸で、又は親水性残基を疎水性残基で、又はその逆などのように、実質的に異なる決定的な特徴を伴うアミノ酸で置き換えることは、さらにより良好な優性ネガティブな候補を生じると予期される。
【０２１１】
理想的な優性ネガティブな候補は、キナーゼ活性を無効にするために必要とされる野生型インヒビターの最小量の１０倍まで使用した場合であっても、キナーゼ活性を阻害しない。いくつかの変異体はこの要件を満たす（表２を参照のこと）。この特徴の重要性は、インビボで発現される場合、変異タンパク質のレベルが野生型タンパク質に比較して過剰なレベルにあり得るという事実にある。
【０２１２】
本研究において同定された優性ネガティブなＢｎＫｒｐ１分子は、サイクリンＤ２；１／ＣＤＫＡ複合体を、野生型ＢｎＫＲＰ１阻害から効果的に防御する。同じ優性ネガティブな派生体Ｋｒｐ１分子はまた、トウモロコシ、ダイズ、イネ、綿花、ポプラ、及びアルファルファのような他の種由来のＫＲＰ分子による阻害から、キナーゼ複合体を防御する（実施例７を参照のこと）。
【実施例５】
【０２１３】
変異ＢｎＫｒｐ１タンパク質は、野生型ＣＫＩタンパク質がキナーゼ複合体を阻害することを競合的にブロックする。
特に有用である優性ネガティブな候補は、キナーゼ活性を無効にするために必要とされる野生型インヒビターの最小量の１０倍まで使用した場合であっても、キナーゼ活性を阻害しない。いくつかの変異体はこの要件を満たす（表２、図１、実施例２を参照のこと）。この特徴の重要性は、インビボで発現される場合、変異タンパク質のレベルが野生型タンパク質に比較して過剰なレベルにあるという事実にあり、変異タンパク質は、事実上いかなる濃度であってもキナーゼ複合体を実質的に阻害しないことは重要である。
【０２１４】
いくつかの優性ネガティブな候補を、サイクリンＤ２；１／ＣＤＫＡ複合体を野生型ＢｎＫＲＰ１から防御するそれらの能力について試験した。競合実験は以下のように行われた。活性なサイクリンＤ２；１／ＣＤＫＡキナーゼ複合体（７μｇ）を、候補の優性ネガティブなＢｎＫｒｐ１変異体（５μｇ又は１０μｇ）とともに、２０分間、１×キナーゼ緩衝液中で、予めインキュベートした。次いで、複合体を、ＨＨＩを基質として使用して、野生型ＢｎＫｒｐ１の不在下での、又は野生型ＢｎＫｒｐ１の添加後（０.５μｇ、１.０μｇ、又は２μｇ）の、そのキナーゼ活性について試験した。次いで、実施例１、「キナーゼアッセイ」において記載されるように、キナーゼ反応物をＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分離した。結果をｐｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）により定量した。
【０２１５】
ＢｎＫｒｐ１  Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ（ＢｎＫｒｐ１番号５１２）は、キナーゼ複合体を、野生型ＢｎＫｒｐ１による阻害から防御し得た。５μｇのＢｎＫｒｐ１  Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａは、０.６μｇ野生型Ｋｒｐ１の存在下で、最大４０％のキナーゼ活性を回復した。この優性ネガティブな効果は用量依存性であり、１０μｇのＢｎＫｒｐ１  Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａが使用された場合、最大６０％のキナーゼ活性が回復された。
【０２１６】
変異ＢｎＫｒｐ１番号５５５（Ｅ１６４Ａ；Ｗ１６５Ａ）は、反応当たり１０μｇ使用された場合であってもキナーゼ活性を阻害でなかったので、これは有望な優性ネガティブな候補である。競合実験において、この変異体は、活性なキナーゼ複合体を野生型ＫＲＰ１による阻害から防御したが、５μｇが使用された場合１４％まで、及び１０μｇが使用された場合１５％まで活性を回復しただけであった。ＢｎＫｒｐ１番号５１２及びＢｎＫｒｐ１番号５５５からの変異を、ＢｎＫｒｐ１番号５７４（Ｆ１５１Ａ、Ｆ１５３Ａ、Ｅ１６４Ａ、Ｗ１６５Ａ）と呼ばれる１つの変異タンパク質に合わせた。この複合変異体は、５μｇと１０μｇの量にて、それ自身でキナーゼ活性を阻害できなかった。この複合変異体は、キナーゼ複合体を、野生型ＢｎＫＲＰ１による阻害から防御し得たが、せいぜい３５％まで活性を回復し得ただけであった。変異ＢｎＫｒｐ１番号５９８（Ｙ１４９Ａ；Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ）は、キナーゼ複合体を、野生型ＢｎＫＲＰ１による阻害から防御し得た。５μｇのＢｎＫｒｐ１  Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａは、０.６μｇの野生型ＫＲＰ１の存在下、最大５５％のキナーゼ活性を回復した。この優性ネガティブな効果は用量依存性であり、１０μｇのＢｎＫｒｐ１  Ｙ１４９Ａ；Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａが使用された場合、最大８０％のキナーゼ活性が回復された。
【０２１７】
これらのデータは、優性ネガティブについて標的するための至適な領域は、β−ヘパリン領域であることを示唆する。しかしもちろん他の残基が変化される。いくつかの単一アミノ酸置換は、優性ネガティブなＫｒｐを作製できなかった（実施例３を参照のこと）、しかし事実、保存された残基を余計に交換することは、優性ネガティブの大部分の要件を満たす変異体を生じるが、ただしこれは最終的に優性ネガティブとして挙動できない。ＡｔＫｒｐ２は、ＢｎＫＲＰ１とＡｔＫＲＰ１に最も密接に関連される。ＫＹＮＦＤＦモチーフ（配列番号５８）がＫＡＡＡＡＡ（配列番号５９）に交換された変異ＡｔＫｒｐ２は、優性ネガティブなＫｒｐ分子の有望な特徴を有した。高濃度で、このＢｎＫｒｐ２変異体は、予期されたようにキナーゼ複合体を阻害できなかった。興味深いことに、この変異体は、野生型ＢｎＫｒｐ１による阻害から、キナーゼを防御できなかった。
【０２１８】
まとめると：ＢｎＫｒｐ１  Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａは、野生型ＫＲＰがキナーゼを阻害することをブロックする、Ｋｒｐ１  Ｅ１６４Ａ；Ｗ１６５Ａは、野生型ＫＲＰをブロックするのに良好ではないのに対して、ＢｎＫｒｐ１（Ｙ１４９Ａ；Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ）は、インビトロでの競合アッセイにおいて最も良好な優性ネガティブな候補であった。二重変異ＢｎＫｒｐ１（Ｙ１４９Ａ；Ｆ１５１Ａ）は、キナーゼ複合体を阻害から防御し得る。
【０２１９】
以前に記載されたように、サイクリン結合ドメインを破壊することは、いくらかの阻害活性を保持する変異Ｋｒｐ１タンパク質を生じる。それにもかかわらず、優性ネガティブな特徴の全てを満たす変異タンパク質を作製するために変化される他のアミノ酸が存在する。さらにアラニンは全ての置換について最適なアミノ酸であった。示される多くの変異体において、残基を非保存的なアミノ酸で置き換えることは、さらに良好な優性ネガティブな候補を生じ得た。
【実施例６】
【０２２０】
ＢｎＫｒｐ１  Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ及びＢｎＫｒｐ１  Ｙ１４９Ａ；Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａは、他のＢｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ  ＫＲＰファミリーメンバーに対して優性ネガティブとして挙動する。
優性ネガティブな戦略の全目的のうちの１つは、その野生型対応物に対してのみでなく、そのファミリーメンバーの全てに対して優性ネガティブとして挙動するＫＲＰファミリーの単一メンバーに変異を導入することであった。Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓにおける、及びアラビドプシスにおける、ＣＫＩのＫＲＰファミリーのアラインメントは、タンパク質のＣ末端の最端にある高い配列同一性を説明する。データは上記に示されており、ＣＤＫ結合ドメインに対して直ぐＮ末端の保存された領域が、サイクリンを結合することを担うことを実証する。さらに、いくつかのグループは、２−ハイブリッド配列決定データを示し、いくつかのＫＲＰ分子が、サイクリン結合について重複する特異性を有することを説明する。
【０２２１】
ＢｎＫＲＰ４は、β−ヘパリンにおいてＢｎＫＲＰ１とは異なる。Ｐｈｅ１５１は、ＢｎＫＲＰ１とＢｎＫＲＰ４との間で保存されるが、ＢｎＫＲＰ１  Ｆ１５３はＢｎＫＲＰ４においてはプロリンである。これは、必ずしも保存的なアミノ酸置換ではなく、そしてＢｎＫＲＰ４がＢｎＫＲＰ１とは異なってサイクリン／ＣＤＫＡ複合体と相互作用し得ることを示唆する。しかし、ＣＤＫ結合ドメイン内のこの部位は、サイクリン／ＣＤＫＡ阻害において重要な役割を果たさないことが既に示されている（変異ＢｎＫｒｐ１番号５７３、実施例１を参照のこと）。
【０２２２】
ＢｎＫｒｐ４を、５’ＢａｍＨＩ／ＮｄｅＩ部位とＸｈｏＩ制限部位をＢｎＫｒｐ４−１の３’末端上に付加するＢｎＫｒｐ４  ｃＤＮＡを増幅するために、以下の２つのオリゴヌクレオチドを使用してクローン化した（５’ＢｎＫｒｐ４−１  ＢａｍＨＩ／ＮｄｅＩ：ＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＧＧＡＡＡＡＴＡＣＡＴＡＡＡＧ（配列番号６０）及び３’ＢｎＫｒｐ４−１  ＸｈｏＩ：ＣＴＣＧＡＧＣＴＡＡＴＣＡＴＣＴＡＣＣＴＴＣＴＴ（配列番号６１）。ＰＣＲフラグメントをｐＴＧ番号３１５（ＴｏｐｏＩＩ  ＢｎＫｒｐ４−１）から増幅し、そしてｐＥＴ１６ｂ−５ｍｙｃのＢａｍＨＩ部位とＸｈｏＩ部位にサブクローン化し、そして配列決定した。得られるベクターＢｎＫｒｐ番号６０５は、６ＸＨｉｓ及びｍｙｃタグとインフレームにＢｎＫＲＰ４野生型ｃＤＮＡを含んだ。実施例１において記載されるようにタンパク質を発現し、そして精製した。
【０２２３】
ＢｎＫｒｐ４はＡｔｃｙｃｌｉｎＤ２；１／ＣＤＫＡキナーゼ複合体の強力なインヒビターであり、ＩＣ50は野生型ＢｎＫｒｐ１のそれに非常に類似した。競合実験を実施例４において記載されるように行った。この場合において、ＢｎＫｒｐ１番号５１２（Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ）とＢｎＫｒｐ１番号５９８（Ｙ１４９Ａ；Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ）はともに、キナーゼ複合体を、野生型ＢｎＫｒｐ４による阻害から防御可能である。この観察に基づいて、ＢｎＫｒｐ１番号５１２とＢｎＫｒｐ１番号５９８は、全てでないにしても、ほとんどのＢｎＫＲＰファミリーメンバーに対して優性ネガティブとして挙動することが予期される。
【実施例７】
【０２２４】
ＢｎＫｒｐ１  Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ及びＢｎＫｒｐ１  Ｙ１４９Ａ；Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａは、他の植物種のＫｒｐに対して優性ネガティブとして挙動する。
優性ネガティブな戦略の全目的は、その野生型対応物に対してのみでなく、異なる植物種にかかるＫＲＰファミリーメンバーに対してもまた優性ネガティブとして挙動するＫＲＰファミリーの単一メンバーに１つ以上の変異を導入することであった。本発明における目的の作物としては、ダイズ、カノーラ、トウモロコシ、コムギ、アルファルファ、イネ、トマトのような野菜作物、さらにポプラのような樹木さえ挙げられるが、これらに制限されない。
【０２２５】
ＡｔＫＲＰ１（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｕ９４７７２）のヌクレオチド配列を使用して、ｔＢＬＡＳＴｎサーチを、トウモロコシ、ダイズ、タバコ、イネのＫＲＰ配列について行った。いくつかの短いＥＳＴは、サイクリン／ＣＤＫ結合ドメインに制限される高い相同性を示した。これらの短い配列のいくつかをアラインし、そして種々の植物種にかかるこの領域の保存を説明する（図２を参照のこと）。
【０２２６】
トウモロコシにおいて、１つの特に、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＡＹ９８６７９２は、５７３ｂｐのオープンリーディングフレームを含み、いくつかのＢｎ  ＫＲＰファミリーメンバーと高い同一性を伴う完全長タンパク質をコードする。このタンパク質は、ＺｍＫＲＰ４と呼ばれたが、これは必ずしも、ＢｎＫｒｐ４又はＡｔＫＲＰ４のトウモロコシ相同体ではない。ＢｎＫｒｐ４のように、ＺｍＫＲＰ４は、β−ヘアピンにおいてＢｎＫｒｐ１とは異なる。Ｐｈｅ１５１はＢｎＫＲＰ１と、ＢｎＫＲＰ４と、ＺｍＫＲＰ４との間で保存された。しかし、ＢｎＫＲＰ１  Ｆ１５３は、ＢｎＫＲＰ４及びＺｍＫＲＰ４の両方においてプロリンであった。ＺｍＫＲＰ４を、成熟トウモロコシの房から単離された全ＲＮＡから作製されたｃＤＮＡから増幅した。オリゴヌクレオチドの配列はＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＡＹ９８６７９２から集められた。ＺｍＫＲＰ４  ５’ＢａｍＨＩ／ＮｄｅＩ：ＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＧＧＣＡＡＧＴＡＣＡＴＧＣＧＣ（配列番号６２）及びＺｍＫＲＰ４  ３’ＢａｍＨＩ：ＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＴＣＴＡＧＣＴＴＣＡＣＣＣＡ（配列番号６３）。ＰＣＲ産物をＴＯＰＯＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローン化し、そして配列決定した。ＺｍＫＲＰ４のタンパク質産物について、５７３ｂｐのＢａｍＨＩフラグメントをｐＥＴ１６ｂ−５ＭｙｃベクターのＢａｍＨＩ部位にクローン化し、そして挿入物の方向を、制限酵素マッピングにより決定した。組換えタンパク質を、実施例４において記載されるように産生した。
【０２２７】
同様にダイズにおいて、１つの特定の、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＡＹ４３９１０４は、４９９ｂｐのオープンリーディングフレームを含み、いくつかのＢｎ  ＫＲＰファミリーメンバーと高い同一性を伴う完全長タンパク質をコードする。ＧｍＫＲＰ２−２と呼ばれるこのタンパク質は、β−ヘパリン内でＢｎＫＲＰ１に実質的に同一である。ＧｍＫＲＰ２−２は、若い発達するダイズ小植物から単離された全ＲＮＡから作製されたｃＤＮＡから増幅された。オリゴヌクレオチドはＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＡＹ４３９１０４の配列から設計された。ＧｍＫＲＰ２−２  ５’ＸｈｏＩ／ＮｄｅＩ：ｃｔｃｇａｇｇａｃａｔａｔｇｇａｇａｔｇｇｃｔｃａｇｇｔｔａａｇｇｃａ（配列番号６２）及びＧｍＫｒｐ２−１  ３’ＸｈｏＩ：ｃｔｃｇａｇｔｃａａｃｔｇａａｃｃｃａｃｔｃｇｔａｔｃｇｔｃｃ（配列番号６５）。ＰＣＲ産物をＴＯＰＯＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローン化し、そして配列決定した。ＧｍＫＲＰ２−２のタンパク質発現について、４９９ｂｐのＸｈｏＩフラグメントをｐＥＴ１６ｂ−５ＭｙｃベクターのＸｈｏＩ部位にクローン化し、そして挿入物の方向を、制限酵素マッピングにより決定した。組換えタンパク質を、実施例４において記載されるように産生した。
【０２２８】
ＺｍＫＲＰ４及びＧｍＫｒｐ２−２の両方を、組換えサイクリンＣＤ２；１／ＣＤＫＡキナーゼ複合体を阻害するそれらの能力について試験した。ＺｍＫＲＰ４はキナーゼ複合体の強力なインヒビターであり、ＩＣ50は、野生型ＢｎＫＲＰ、０．０３５μｇのＩＣ50に非常に類似した。同様に、ＧｍＫｒｐ２−２はまた、キナーゼ複合体の強力なインヒビターであった。優性ネガティブなＢｎＫｒｐＩ（ＢｎＫｒｐ１番号５１２と番号５９８）の両方は、ＺｍＫｒｐ４とＧｍＫｒｐ２−２を、キナーゼ複合体を阻害することからブロックした。各場合において、防御は、ＢｎＫｒｐ１番号５１２がＢｎＫＲＰ１阻害に対して与える防御に匹敵した。この結果は、本発明の優性ネガティブなＫｒｐの異種間の効果を説明する。
【０２２９】
実験はまた、ＢｎＫｒｐ１番号５１２と番号５９８が、イネ、コムギ、ソルガム、サトウキビ、テンサイなどのような他の異種ＫＲＰファミリーメンバーに対して類似の効果を有することを示唆する。これらの植物由来のＫＲＰ分子は、他の分子と同様に、類似の研究においてクローン化され、組換えタンパク質として発現され、そして評価され、ＢｎＫｒｐ１番号５１２と番号５９８がこれらのファミリーメンバーに対して類似の効果を有することが実証される。
【実施例８】
【０２３０】
他の植物種ＫＲＰ分子における平行変異は優性ネガティブな分子を生じる。
優性ネガティブな効果を生じるようにＢｎＫＲＰ１において交換された残基は、カノーラ（Ｃａｎｏｌａ）、トウモロコシ、ダイズ、イネ、アルファルファ、ポプラ、タバコなどにおけるＫＲＰのいくつかのファミリーメンバーにおいて保存される。アラニン残基への保存されたフェニルアラニンの置換は、これらの作物のいくつかのＫＲＰにおいて行われ、そして優性ネガティブ分子として挙動するそれらの能力について試験される。
【０２３１】
Ｆ１５１とＦ１５３は、カノーラ（Ｃａｎｏｌａ）、ダイズ、トウモロコシにおけるＫＲＰの全てではないが、いくつかにおいて保存された。ダイズとトウモロコシのＫＲＰにおけるこれらの保存された残基の変異は、類似の優性ネガティブなＫｒｐ分子を生じる。
【実施例９】
【０２３２】
Ｋｒｐ１（Ｆ１５１ａ；Ｆ１５３ａ）の胚特異的及び構成的な発現を付与するように設計された導入遺伝子構築物を発現するトランスジェニックカノーラ植物。
上述の実験において示されるインビトロでの結果に基づいて、培養植物細胞における又はトランスジェニック植物における本発明の発現は、内因性ＣＤＫキナーゼ活性を増加することが予測される。ＣＤＫキナーゼ活性における増加は、細胞周期に対してポジティブなｄｒｉｎｇ  ｉｎｃｌｕｅｎｃｅを有する。本発明を、植物発現ベクターにクローン化した。植物発現ベクターは、上記の本発明に連結されるネイティブな又は非ネイティブなプロモーターを含む。プロモーターは、強力、弱い、誘導性、組織特異的、器官特異的、発達特異的に及ぶ。
【０２３３】
ＢｎＫｒｐ１（Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ）変異の等価物を、以下のオリゴヌクレオチドを使用して、ＡｔＫＲＰ１に導入した：「ＱＣ  ＡｔＫｒｐ１  ｃｄｓ  Ｆ１７３Ａ；Ｆ１７５Ａ−ｃｏｄｉｎｇ」５’−ＴＴＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＴＡＣＡＡＴＧＣＣＧＡＴＧＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＣＣＡＴＴＡ−３’（配列番号６６）及び「ＱＣ  ＡｔＫｒｐ１  ｃｄｓ  Ｆ１７３Ａ；Ｆ１７５Ａ−ｎｏｎｃｏｄ」５’−ＴＴＡＴＧＧＣＴＴＣＴＣＣＴＴＣＴＧＧＧＣＡＴＣＧＧＣＡＴＴＧＴＡＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＡＡ−３’（配列番号６７）。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを使用して、ＡｔＫｒｐ１番号３５９を鋳型として用いた。ＡｔＫｒｐ１  Ｆ１７３Ａ；Ｆ１７５Ａ（ｐＴＧ３５６）を配列決定により確認した。ＬＦＡＨ１２プロモーターを、ｐＴＧ３５６において変異ＡｔＫｒｐ１（Ｆ１７３Ａ；Ｆ１７５Ａ）の５’末端に２工程で挿入した。先ず、ｐＣＡＭＢＩＡ  ２３８１Ｚ（ｐＴＧ２５４）からのＳａｌＩとＰｓｔＩ  ＬＦＡＨ１２プロモーターを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に、ＳａｌＩとＰｓｔＩにおいてサブクローン化して、ｐＴＧ３５７を得た。次いで、ＬＦＡＨ１２プロモーターをＰｓｔＩとＢａｍＨＩを使用して、ｐＴＧ３５７から切断し、そしてｐＴＧ３５６に挿入して、ｐＴＧ３６１を得た。最後に、ｐＴＧ３６１をＫｐｎＩとＮｏｔＩで消化し、ｐＬＡＹ１１２をＮｏｔＩとＢｇｌＩＩ（ｍａｓ３’  ｕｔｒ成分）で消化し、ｐＣＧＮ  １５４７をＫｐｎＩとＢａｍＨＩで消化し、そして３元ライゲーションを行った。これは、ＬＦＡＨ１２−ＡｔＬＣＫ１  ｃｄｓ  ＤＮ−ｍａｓ３’  ｕｔｒカセット（ｐＴＧ３６９）を生じた。
【０２３４】
構成的なプロモーター３５Ｓの制御下にＢｎＫｒｐ１（Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ）を含有する植物発現ベクターを、以下の方法において構築した。ＢｎＫｒｐ１（Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ）ｃｄｓを含むＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩフラグメントを、同じ部位を使用してｐＴＧ２７１（３５Ｓ／ＴＯＰＯ  Ｂｌｕｎｔ）にクローン化した。得られる構築物（ｐＴＧ５２９）を、ＫｐｎＩとＸｂａＩで切断した。ｐＬＡＹ１１２を、ＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｐＣＧＮ１５４７をＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、そして三元ライゲーションを行った。これは、３５Ｓ−ＢｎＫｒｐ１（Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ）−ｍａｓ３  ｕｔｒカセット（ｐＴＧ５３３）を得た。
【０２３５】
カノーラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）形質転換
２倍体カノーラ品種ＤＨ１２０７５を、Ｍａｌｏｎｅｙら（Ｍａｌｏｎｅｙら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ８：２３８、１９８９年）に基づくアグロバクテリア媒介性形質転換法を使用して、ＬＦＡＨ−１２  ＡｔＫｒｐ１（Ｆ１７３Ａ；Ｆ１７５Ａ）及び３５−Ｓ  ＢｎＫｒｐ１（Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ）導入遺伝子発現構築物（本実施例においてまた、「変異Ｋｒｐ１導入遺伝子発現構築物」とまとめて呼ばれる）で形質転換した。
【０２３６】
１５Ｘ６０ｍｍペトリ皿において、５日間、プレート当たり約４０〜約６０種子で、１％スクロールを含有する１／２ＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ＆  Ｓｋｏｏｇ）培地上で滅菌された種子を発芽した。各形質転換構築物について合計約１５００個の種子を発芽させた。種子を発芽培地中に完全には埋没させなかった。発芽された芽生えを、組織培養室において、２５℃にて１６時間の明期／８時間の暗期の周期で生長させた。
【０２３７】
子葉を頂端分裂組織の直ぐ上で、任意の分裂組織を得ることなく切断した。これは、頂端分列組織領域の直ぐ上の２つの葉柄を鉗子で穏やかにつかむことにより行われた。葉柄を鉗子で砕かないように注意を払った。鉗子の先端をガイドとして使用して、葉柄を、鋭いＮＯ．１２の刃を備える外科用メスを使用して切断した。子葉を共存培養培地の１５ｍｍＸ１００ｍｍプレート上に放出した。正確に切断された子葉は容易に分離した。そうでなかった場合、分裂組織が得られた可能性が非常に高く、このような子葉は使用しなかった。各プレートは、約２０個の子葉を保持した。プロトコルのその後の段階においてネガティブな影響を有するしおれを回避するように調製されたいくつかのプレートごとに、子葉外殖片をアグロバクテリアで接種した。
【０２３８】
変異Ｋｒｐ１導入遺伝子発現構築物を、アグロバクテリア（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）エレクトロポレーションに導入した。変異Ｋｒｐ１導入遺伝子発現構築物を保有するアグロバクテリアを、適切な抗生物質を含有するＡＢ培地上で、２日間、２８℃にて振とうして、増殖した。子葉外殖片を接種するために、小容量のアグロバクテリア培養物を１０ｍｍ  ｘ  ３５ｍｍペトリ皿に添加した。各外殖片の葉柄をアグロバクテリア培養物に浸し、そして切断端部をペトリ皿中の共存培養培地においた。プレートを密閉し、そして組織培養室に、２５℃で、１６時間の明期／８時間の暗期にて３日間置いた。
【０２３９】
３日後、外殖片を、シュート誘導培地を含有する新鮮な２５ｍｍ  ｘ  １００ｍｍペトリ皿に、１０片を１セットとして移した。この培地は、選択剤（２０ｍｇ／Ｌカナマイシン）及びホルモン（４.５ｍｇ／Ｌ  ＢＡ）を含んだ。健常に見える外殖片のみを移した。外殖片を、シュート誘導培地上に、１４〜２１日間維持した。この時に、緑色カルスと潜在的ないくつかのシュートの発達、及びいくつかの非形質転換シュートが観察された。非形質転換シュートは、それらの白及び紫の色により容易に認識された。カナマイシン感受性シュートを、それらを切り取ることにより取り出し、そして全ての健常に見えるカルスを、シュート誘導培地の新鮮なプレートに移した。外殖片はこれらのプレート上にさらに１４〜２１日間維持された。
【０２４０】
２〜３週間後、色が暗緑色であったシュートを、シュート伸長培地を含有するプレートに移した。この培地は、選択剤（２０ｍｇ／Ｌカナマイシン）を含んだがホルモンは何ら含まなかった。５個のシュートを各プレートに移した。プレートを密閉し、そして組織培養室に戻した。ガラス質に見える形質転換されたシュートを、フロログルシノール（１５０ｍｇ／Ｌ）を含有するシュート伸長培地に移した。健常にかつ緑色になったシュートを、シュート伸長プレートに戻した。同じ培地の新鮮なプレートへの種々のシュートの反復される移動が、正常な見かけのシュートを得るために、いくつかの場合において必要とされた。
【０２４１】
正常な形態学を伴うシュートを、０.５ｍｇ／Ｌインドール酪酸を含有する発根培地を含む４オンスのベビーフードの瓶に移した。瓶にシュートを移す場合に任意の過剰なカルスを切り出した。シュートはそれらを、６週間毎に０.２ｍｇ／Ｌインドール酪酸を含有する新鮮な瓶に移すことにより、瓶中に無期限に維持される。
【０２４２】
一旦、良好な根系が形成されると、Ｔ0世代のシュートを瓶から取り出し、寒天を根から取り除き、そして小植物体を鉢植え用の土に移した。各独立したＴ0小植物体は、カノーラゲノムへの導入遺伝子の挿入の独立した発達を示し、１つの事象といわれる。透明なカップを小植物体上に数日間置き、植物を新しい環境に順応させた。一旦植物が慣れると、カップを取り除いた。次いで、Ｔ0トランスジェニック事象を、温室において成熟体に生長させ、そしてＴ1種子を回収した。
【０２４３】
Ｔ0事象の特徴づけ
導入遺伝子挿入部位の遺伝子座の数を、サザン解析により各事象において決定した。Ｔ0事象における変異Ｋｒｐ１導入遺伝子の発現を、ノーザン解析又は終点ＲＴ−ＰＣＲにより確認した。変異Ｋｒｐ１導入遺伝子の発現データを、胚発達、受粉から１９日後（ＤＡＰ）における単一の時点について得た。これらのデータから、この発達の時点で、ＬＦＡＨ１２プロモーターは、高レベルのＡｔＫｒｐ１（Ｆ１７３Ａ；Ｆ１７５Ａ）ｍＲＮＡを駆動したことを結論付けた。３５Ｓ  ＢｎＫｒｐ１（Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ）導入遺伝子発現を、葉サンプルにおいてモニターした。これは多くの事象において中程度から高レベルの発現を有した。発現データは、両方のプロモーターがトランスジェニックカノーラ植物中で変異Ｋｒｐ１導入遺伝子の発現を駆動する際に機能的であることを実証した。
【０２４４】
キナーゼ活性は、内因性サイクリン−ＣＤＫキナーゼ活性に対する変異Ｋｒｐ１タンパク質発現の効果を決定するために測定される。トランスジェニック植物又は非トランスジェニック植物の組織又は細胞からの等価な量のタンパク質抽出物を、ｐ１３Ｓｕｃ１樹脂（Ｕｐｓｔａｔｅ、Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を使用してＣＤＫについて富化し、そしてヒストンキナーゼアッセイを実施例４において、又はＷａｎｇら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１５：５０１〜５１０、１９９８年において記載されるように行う。キナーゼ反応はＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＰｈｏｓｐｏｒＩｍａｇｅｒにより定量されるＨＨＩリン酸化により解明される。
【０２４５】
Ｔ0植物を、両方の変異Ｋｒｐ１導入遺伝子発現構築物について首尾よく再生した。試験した構築物は、（ａ）ＬＦＨ１２／ＡｔＫｒｐ１（Ｆ１７３Ａ；Ｆ１７５Ａ）；（ｂ）３５Ｓ  ＢｎＫｒｐ１（Ｆ１５１Ａ：Ｆ１５３Ａ）を含んだ。
【実施例１０】
【０２４６】
インビボでの発現は生長／早期発芽を加速する。
トランスジェニック植物における本発明の変異タンパク質の発現は、サイクリン−ＣＤＫキナーゼ活性を上昇することにより、それらの効果を行使する。このことは、細胞周期に対してポジティブな駆動影響を有し、これは最終的に増大される器官の大きさを生じる。植物において、逆反復アプローチを使用して、胚における内因性Ｋｒｐ１遺伝子の発現を抑止することによる減少されたＫｒｐ１発現レベルは、増大された種子の大きさと、増加された作物の収量を生じる。収量に対する効果に加えて、増大される種子の大きさは、増大される活力又は種子を生じる。より大きな種子は、発芽と苗生長の間に利用されるより多くの量の保存タンパク質とデンプンの蓄積を含む。このことは、より早期の発芽とより迅速な早期の生長を生じる。早期の発芽と早期の迅速な生長は、これらがより迅速な作物の定着を導くので、農学的に価値がある形質である。このことは、定着の前に作物を障害又は破壊する厳しい環境条件などに対する脆弱性の時期を減少することにより、首尾よい作物の見込みを増加する。
【０２４７】
生長と発達の増大される速度が、実施例９において記載されるＡｔＫｒｐ１（Ｆ１７３Ａ；Ｆ１７５Ａ）優性ネガティブな発現構築物（ｐＴＧ３６９）で形質転換されたトランスジェニックカノーラ植物の温室発芽された苗において観察された。ＡｔＫｒｐ１（Ｆ１７３Ａ；Ｆ１７５Ａ）優性ネガティブな発現構築物の、１５体の独立した形質転換事象のそれぞれから、２４個の種子を、トレイ中のＪｉｆｆｙピートペレットに植え、そして温室で発芽した。またＬＦＡＨ１２プロモーターの制御下、野生型ＫＲＰ１遺伝子で形質転換された１５体の独立した事象のそれぞれからの２４個の種子を、平行して植えた。さらに、形質転換されていない親ＤＨ１２０７５カノーラ品種、及び任意の９つの未関連の導入遺伝子構築物で形質転換された合計１３５体のトランスジェニック事象を、同時に植えた。
【０２４８】
３週間の生長後、全ての苗を種子に育てるために、試験農場に植え替えた。各事象についての２４個の苗の各セットを、個々のプロットとして植えた。植え替えの際、プロット間での苗の生長における差異が容易に観察された。全ての導入遺伝子構築物についての苗の全集団にわたり、大きさは１インチの高さから約４〜５インチの高さに異なった。発達の進行もまた変化し、子葉のみを有する数個の苗から、数枚の本葉を伴う苗に及んだ。形質転換されていない親品種のプロットはこの範囲の中間に収まった。トランスジェニックプロットにおける差異は、構築物特異的であった。最上位の大きさと発達の範囲に苗を含む、試験農場におけるプロットの大部分は、ＡｔＫｒｐ1（Ｆ１７３Ａ；Ｆ１７５Ａ）優性ネガティブな発現構築物（ｐＴＧ３６９）で形質転換された植物を含むプロットであった。他の構築物はこの特徴を示さず、ほとんどのプロットは形質転換されていない親品種に匹敵するか、又はそれよりも少ない生長及び発達を示す。これらの結果は、優性ネガティブな変異Ｋｒｐ導入遺伝子の発現は、増加される早期生長速度を付与し、かつ加速される発達ペースを付与することを示す。
【０２４９】
モニターされるさらなる特性としては、例えば、発達前／発芽の持続時間、子葉の出現の時期、子葉の大きさ、最初の本葉が現れる時期、及び第二の本葉が現れる時期が挙げられる。ロゼット直径は、トランスジェニック植物や非トランスジェニック植物においてモニターされる。他の特徴はまた、トランスジェニック植物と非トランスジェニック植物との間でモニターされ、そして例えば、蕾の出現の時期、蕾束の大きさ、主な総状花序の最終的な大きさ、最初の花が出現する時期、最初の鞘が出現する時期などが挙げられる。
【実施例１１】
【０２５０】
インビボでの発現は、良好な発根をもたらす。
カノーラ種子は非常に小さく、発芽のために比較的高い湿潤を必要とし、そして発芽力を最大にするために、土壌表面近くに植えられなくてはならない。小さな種子及び浅植えは、作物を、乾燥土壌や洪水のような非生物的ストレスへの被害に受けやすくする。種々のプロモーターの制御下での本発明の変異ポリペプチドの恒常的な発現又は根発達における初期の発現は、加速された根成長と発達をもたらす。根発達の間の増加される細胞分裂は、堅固な根基盤を確立し、かつ潜在的に非トランスジェニック植物コントロールよりも大きな根基盤を確立することにより、苗の活力に利益をもたらす。トランスジェニック植物の根系の大きさは、非トランスジェニック植物に比較される。
【実施例１２】
【０２５１】
反復された試験農場実験において、カノーラ収率に対する、胚発達の間のＡｔＫｒｐ１（Ｆ１７３Ａ；Ｆ１７５Ａ）導入遺伝子発現の効果の評価。
本実施例において、ＬＦＡＨ１２胚特異的プロモーターの制御下のアラビドプシスＫｒｐ１（Ｆ１７３Ａ；Ｆ１７５Ａ）導入遺伝子（ｐＴＧ３６９）を含むトランスジェニックカノーラ植物を、農場実験において試験した。
【０２５２】
トランスジェニックＡｔＫｒｐ１（Ｆ１７３Ａ；Ｆ１７５Ａ）事象の農場試験に対する進展
Ｔ0事象を、導入遺伝子発現と、導入遺伝子挿入の遺伝子座数との組み合わせに基づいて、農場試験に対する進展のために選択した。検証された導入遺伝子発現及び行われるべき最も高い優先度を割り当てられた単一の導入遺伝子挿入の遺伝子座を伴う事象は、農場試験に送られた。いくつかの例において、複数の挿入遺伝子座を伴う事象は、複数遺伝子の存在が、遺伝子用量に依存して導入遺伝子の全体的に高い発現レベルを与える場合に選択された。
【０２５３】
選択された事象からのＴ1種子を、農場プロットにおいて、分離するＴ1集団として生育させた。各事象を２列の、２４体の植物プロットとして植えた。単一の導入遺伝子挿入遺伝子座を伴う事象について、２４体のＴ1植物間での導入遺伝子の分離は、導入遺伝子を欠損する約６体のヌル植物、１２体のヘテロ接合植物、６体のホモ接合植物の分布を生じた。各Ｔ1植物は、異系交配を防ぐために、開花前に個々に袋に入れた。２４体のＴ1植物それぞれからのＴ2種子を別々に回収した。
【０２５４】
Ｔ2種子ストックを、２４体の親Ｔ1植物のうちのどれがヌル、ヘテロ接合、又はホモ接合であるかを同定するために使用した。各Ｔ1植物からの約３０個のＴ2種子を、カナマイシンのアナログの抗生物質Ｇ４１８を含有する溶液を含むペトリ皿中のフィルター紙上で発芽させた。植物は、選択可能なマーカーとしてｎｐｔＩＩ耐性遺伝子で同時形質転換したので、導入遺伝子を保有するこれらの種子のみが発芽し、そして生長を続けた。プレート上の全ての種子がＧ４１８に感受性であることを証明した場合、Ｔ1親をヌル系統として同定した。プレート上の全ての種子がＧ４１８に耐性であった場合、Ｔ1親をホモ接合系統として同定した。プレート上の約４分の１の種子が感受性であり、そして残りが耐性であった場合、Ｔ1親を異種接合系統として同定した。同じ形質転換事象からのホモ接合Ｔ1親からのＴ2種子をバルクして、農場試験のためのホモ接合種子ストックを生成した。同じ形質転換事象からのヌルＴ1親からのＴ2種子をバルクして、農場試験のためのヌル同胞種の種子ストックを生成した。
【０２５５】
農場試験の設計
トランスジェニックカノーラ系統における収量特質に対するＡｔＫｒｐ１（Ｆ１７３Ａ；Ｆ１７５Ａ）の効果を、農場での大規模な反復される試験において、各トランスジェニック系統と、そのヌル同胞種とを直接的に比較することにより評価した。ヌル同胞種は、Ｔ1世代における導入遺伝子の分離から生じるので、ヌル及びホモ接合同胞種は、ほとんど遺伝的に同一である。唯一の有意な差異は、ＡｔＫｒｐ１（Ｆ１７３Ａ；Ｆ１７５Ａ）導入遺伝子の存在又は不在である。この近い遺伝的同一性は、ヌル同胞種を、ＡｔＫｒｐ１（Ｆ１７３Ａ；Ｆ１７５Ａ）導入遺伝子の効果の評価についての至適なコントロールにする。試験の主な目的は、そのヌル分離物に対する事象からのトランスジェニック系統の比較であり、分割法設計を選択した。この設計は、トランスジェニック亜集団と非トランスジェニック亜集団との間の相互作用に対する、事象間のトランスジェニックサブプロット間の差異（サブプロットとメインプロットとの相互作用）に対する高レベルの評価を与える一方、全体の事象又はメインプロット間の差異に対するより低いレベルの評価を与える。
【０２５６】
農場試験を、カノーラが典型的に生育される環境条件の範囲の下での収量表現型を評価するために、草原地帯にわたり複数の位置にて行った。全ての位置にて、各トランスジェニック事象を、近接したプロットにおいて、そのヌル同胞種と物理的に一組にした。ホモ接合とヌル同胞種の各プロット対を、各試験位置にて４回複製した。各試験における４つの複製プロット対の位置は、各試験位置にてランダムに分布した。プロットは、１.６ｍ×６ｍであり、そして平方メートルあたり１４２個の種子を植えた。植物を、カノーラの商業生産に典型的な標準の農作業を使用して成体に生育させた。
【実施例１３】
【０２５７】
胚特異的プロモーターを使用して、胚発達の間にＡｔＫｒｐ１（Ｆ１７３Ａ；Ｆ１７５Ａ）を発現するトランスジェニックカノーラにおける増加された収量
各収量農場試験位置での全てのプロットを、コンバインで個別に採集した。種子総収量データを、種子総重量として集計し、各プロットからの湿潤含量に修正した。各試験におけるトランスジェニック事象ごとに、各ホモ接合系統の４つの複製プロットからの総収量の平均を、関連のヌル同胞種系統の４つの複製プロットからの総収量の平均に比較した。この比較は、種子総収量に対するＡｔＫｒｐ１（Ｆ１７３Ａ；Ｆ１７５Ａ）導入遺伝子の効果を評価するために使用された。複数の試験位置のそれぞれからの結果を合わせて、種子総収量に対するＡｔＫｒｐ１（Ｆ１７３Ａ；Ｆ１７５Ａ）導入遺伝子の効果の試験解析を、試験にわたって与えた。各試験位置での分散の統計学的解析は、ホモ接合トランスジェニック系統とそれらのヌル同胞種との間の種子総収量における差異について、閾値の割り当てを有意（Ｐ＝０.０５）と認めた。
【０２５８】
種子総収量において統計学的に有意な増加を示したトランスジェニックＡｔＫｒｐ１（Ｆ１７３Ａ；Ｆ１７５Ａ）カローナ系統は、表３においてまとめられる。これらの結果は、胚特異的プロモーター（ＬＦＡＨ１２）を使用するＡｔＫｒｐ１（Ｆ１７３Ａ；Ｆ１７５Ａ）の過剰発現は、増加される種子収量を生じることを実証する。
【０２５９】
【表３】
2009502175.tif 000006
【０２６０】
本明細書に記載される実施例及び実施形態は例示の目的のためのみであること、そしてそれらを考慮して種々の改変及び変更が当業者に示唆され、そして本願の精神及び範囲、並びに添付の請求の範囲の中に含まれることが理解される。本明細書中で引用される全ての文献、特許、及び特許出願は、全ての目的のために、それらの全体が本明細書中で参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０２６１】
【図１Ａ】アブラナＫｒｐファミリーメンバーと、アラビドプシスＫＲＰファミリーメンバーとのアミノ酸配列アラインメントを示す。アラビドプシスＫＲＰは、公共のデータベースから得られた：ＡｔＫｒｐ１（Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｕ９４７７２）（配列番号２）；ＡｔＫｒｐ２（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＣＡＢ７６４２４）（配列番号３）；ＡｔＫｒｐ３（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＣＡＣ４１６１７）（配列番号４）；ＡｔＫｒｐ４（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＣＡＣ４１６１８）（配列番号５）；ＡｔＫｒｐ５（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＣＡＣ４１６１９）（配列番号６）；ＡｔＫｒｐ６（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＣＡＣ４１６２０）（配列番号７）；及びＡｔＫｒｐ７（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＣＡＣ４１６２１）（配列番号８）。アブラナＫｒｐについての配列（ＢｎＫｒｐ１（配列番号６８）、ＢｎＫｒｐ３（配列番号６９）、ＢｎＫｒｐ４（配列番号７０）、ＢｎＫｒｐ５（配列番号７１）、及びＢｎＫｒｐ６（配列番号７２））は、以下の実施例１において記載されるように得られた。また、ｐ２７についてのアミノ酸配列（配列番号７３）が示される。
【図１Ｂ】アブラナＫｒｐファミリーメンバーと、アラビドプシスＫＲＰファミリーメンバーとのアミノ酸配列アラインメントを示す。アラビドプシスＫＲＰは、公共のデータベースから得られた：ＡｔＫｒｐ１（Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｕ９４７７２）（配列番号２）；ＡｔＫｒｐ２（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＣＡＢ７６４２４）（配列番号３）；ＡｔＫｒｐ３（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＣＡＣ４１６１７）（配列番号４）；ＡｔＫｒｐ４（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＣＡＣ４１６１８）（配列番号５）；ＡｔＫｒｐ５（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＣＡＣ４１６１９）（配列番号６）；ＡｔＫｒｐ６（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＣＡＣ４１６２０）（配列番号７）；及びＡｔＫｒｐ７（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＣＡＣ４１６２１）（配列番号８）。アブラナＫｒｐについての配列（ＢｎＫｒｐ１（配列番号６８）、ＢｎＫｒｐ３（配列番号６９）、ＢｎＫｒｐ４（配列番号７０）、ＢｎＫｒｐ５（配列番号７１）、及びＢｎＫｒｐ６（配列番号７２））は、以下の実施例１において記載されるように得られた。また、ｐ２７についてのアミノ酸配列（配列番号７３）が示される。
【図２】トウモロコシ（配列番号９）、カノーラ、ダイズ（配列番号１１）、ポプラ（配列番号１２）、タバコ（配列番号１３）、コムギ、イネ（配列番号１５）、及びジャガイモ（配列番号１６）のサイクリン及びＣＤＫ結合ドメインのアミノ酸配列アラインメントを示し、ＣＤＫ結合ドメイン内の高度な配列同一性を説明する。
【図３】トウモロコシにおける発現について至適化されたコドンを有する変異ＢｎＫｒｐ１核酸配列を示し、ＢｎＫｒｐ１  Ｆ１５１Ａ；１５３Ａ（配列番号７４）、又はＢｎＫｒｐ１  Ｙ１４９Ａ；Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ（配列番号７５）のいずれかをコードする。
【図１Ａ】
2009502175.tif 000007
【図１Ｂ】
2009502175.tif 000008
【図２】
2009502175.tif 000009
【図３】
2009502175.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成20年5月13日(2008.5.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された、変異植物サイクリン依存性キナーゼ・インヒビター（ＣＫＩ）ポリペプチドであって、
（ａ）サイクリンについての結合親和性を付与するサイクリン結合領域、（ｂ）ＣＤＫについての結合親和性を付与するＣＤＫ結合領域を揺する野生型植物のＣＫＩポリペプチドに比較して少なくとも１つの改変を有するＣＫＩアミノ酸配列を含み、
該少なくとも１つの改変は、野生型ＣＫＩポリペプチドに比較して、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）についての、変異ＣＫＩポリペプチドの改変された結合親和性を付与するように、ＣＤＫ結合領域内にあり；
変異ＣＫＩポリペプチドは、野生型ＣＫＩポリペプチドに比較して、サイクリンについての結合親和性を実質的に維持し；
変異ＣＫＩポリペプチドは、ＣＤＫ結合領域への結合について、該野生型ＣＫＩと競合し得る、変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項２】
前記野生型植物ＣＫＩポリペプチドが、ＫＩＰ関連性タンパク質（ＫＲＰ）ファミリーのメンバーである請求項１に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項３】
前記ＫＲＰファミリーのメンバーが、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ、トウモロコシ、コムギ、イネ、アルファルファ、綿花、又はポプラのＣＫＩポリペプチドである請求項２に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項４】
前記ＫＲＰファミリーのメンバーが、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ又はＢｒａｓｓｉｃａＫＲＰ１ポリペプチドである請求項２に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項５】
前記少なくとも１つの改変が、ＢｒａｓｓｉｃａＫＲＰ１（ＢｎＫＲＰ１）のアミノ酸１４５〜１６８位に対応する領域内にある請求項２に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項６】
ＢｒａｓｓｉｃａＫＲＰ１（ＢｎＫＲＰ１）のアミノ酸１４５〜１６８位に対応する領域内に少なくとも２つの改変を含む請求項５に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項７】
前記少なくとも１つの改変がアミノ酸置換を含む請求項５に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項８】
アミノ酸置換は、非アラニンからアラニンへの置換であり、非保存的な置換である請求項７に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項９】
請求項７に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチドであって、少なくとも２つのアミノ酸置換を含み、各アミノ酸置換は、
（ａ）ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１４５位に対応する位置；
（ｂ）ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１４９位に対応する位置；
（ｃ）ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１５１位に対応する位置；
（ｄ）ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１５３位に対応する位置；
（ｅ）ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１６４位に対応する位置；
（ｆ）ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１６５位に対応する位置、
からなる群より独立して選択される位置にある、変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項１０】
少なくとも２つのアミノ酸置換のうちの１つ以上、必要に応じて全てが、非アラニンからアラニンへの置換又は非保存的な置換である請求項９に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの改変又は少なくとも２つの改変が、ＫＹＮＦＤＦモチーフ内にある請求項５に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項１２】
ＫＹＮＦＤＦモチーフ内の少なくとも２つの改変が、ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１５１位と１５３位に対応する位置でのアミノ酸置換を含む請求項１１に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項１３】
ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１５１位と１５３位に対応する位置でのアミノ酸置換の少なくとも１つが非アラニンからアラニンへの置換又は逆帯電されたアミノ酸でのアミノ酸の置換である請求項１２に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項１４】
ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１５１位と１５３位に対応する位置でのアミノ酸置換のそれぞれが、逆帯電されたアミノ酸でのアミノ酸の置換である請求項１２に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項１５】
ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１４９位に対応する位置でのアミノ酸置換をさらに含む請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項１６】
ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１４９位に対応する位置でのアミノ酸置換は、非アラニンからアラニンへの置換又は非保存的な置換である請求項１５に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチドであって、それぞれが
（ａ）ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１６４位に対応する位置；
（ｂ）ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１６５位に対応する位置；
の少なくとも１つでのアミノ酸置換をさらに含む、変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項１８】
（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つでのアミノ酸置換は、非アラニンからアラニンへの置換又は非保存的な置換である請求項１７に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項１９】
変異ＢｎＫＲＰ１ポリペプチドである請求項４〜１８のいずれか１項に記載の変異植物ＣＫＩポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１９に記載の変異ＢｎＫＲＰ１ポリペプチドであって、これが
（１）ＢｎＫＲＰ１  Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ；
（２）ＢｎＫＲＰ１  Ｙ１４９Ａ；Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ
（３）ＢｎＫＲＰ１  Ｅ１６４Ａ；Ｗ１６５Ａ；又は
（４）ＢｎＫＲＰ１  Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ；Ｅ１６４Ａ；Ｗ１６５Ａ、
である、変異ＢｎＫＲＰ１ポリペプチド。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの改変がＣＤＫ結合領域の切断を含む請求項１〜５のいずれか１項に記載の変異ＣＫＩポリペプチド。
【請求項２２】
変異ＢｎＫＲＰ１ポリペプチドである請求項２１に記載の変異ＣＫＩポリペプチド。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の変異ＣＫＩポリペプチドをコードする組換え核酸。
【請求項２４】
レプリコン及び請求項２３に記載の組換え核酸を含むベクター。
【請求項２５】
組換え核酸に作動可能に連結されるプロモーター領域をさらに含む請求項２４に記載のベクター。
【請求項２６】
プロモーター領域が植物細胞において作動可能である請求項２５に記載の発現ベクター。
【請求項２７】
プロモーター領域がＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター又はＬＦＡＨ１２プロモーターを含む請求項２６に記載の発現ベクター。
【請求項２８】
プロモーター領域が、組織及び／又は器官特異的な様式において転写的に活性である請求項２５に記載の発現ベクター。
【請求項２９】
請求項２３に記載の組換え核酸を含む宿主細胞。
【請求項３０】
請求項２４〜２８のいずれか１項に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３１】
変異ＣＫＩポリペプチドを産生する方法であって、該方法は：
変異ＣＫＩポリペプチドをコードする核酸の発現に適切な条件下で請求項２９又は３０に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、方法。
【請求項３２】
前記変異ＣＫＩポリペプチドを回収する工程をさらに含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
変異ＣＫＩポリペプチドをコードする導入遺伝子を含むトランスジェニック植物であって、該トランスジェニック植物は野生型ＣＫＩポリペプチドを発現し、該野生型ＣＫＩポリペプチドは、（ａ）サイクリンについての結合親和性を付与するサイクリン結合領域と（ｂ）ＣＤＫについての結合親和性を付与するＣＤＫ結合領域とを含み、該変異ＣＫＩポリペプチドは、参照ＣＫＩポリペプチドに比較して少なくとも１つの改変を有するＣＫＩアミノ酸配列を含み、該参照ＣＫＩポリペプチドは、
（１）トランスジェニック植物により発現される野生型植物ＣＫＩポリペプチド、
（２）（１）に異種な、トランスジェニック植物の細胞内で（１）の野生型ＣＫＩ機能に実質的に等価な野生型ＣＫＩ機能を提供し得る野生型ＣＫＩポリペプチドからなる群より選択され；
該少なくとも１つの改変は、参照ＣＫＩポリペプチドに比較して、ＣＤＫについての、変異ＣＫＩポリペプチドの改変された結合親和性を付与するように、ＣＤＫ結合領域内にあり、さらに変異ＣＫＩポリペプチドは、参照ＣＫＩポリペプチドに比較して、サイクリンについての結合親和性を実質的に維持する、トランスジェニック植物。
【請求項３４】
単子葉植物又は双子葉植物である請求項３３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項３５】
前記参照ＣＫＩポリペプチドが、ＫＩＰ関連性タンパク質（ＫＲＰ）ファミリーのメンバーである請求項３３又は３５に記載のトランスジェニック植物。
【請求項３６】
前記ＫＲＰファミリーのメンバーがＢｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ、トウモロコシ、コムギ、イネ、アルファルファ、綿花、又はポプラのＣＫＩポリペプチドである請求項３５に記載のトランスジェニック植物。
【請求項３７】
前記ＫＲＰファミリーのメンバーがＫＲＰ１ポリペプチドである請求項３６に記載のトランスジェニック植物。
【請求項３８】
前記少なくとも１つの改変がＢｒａｓｓｉｃａＫＲＰ１（ＢｎＫＲＰ１）のアミノ酸１４５〜１６８位に対応する領域内にある請求項３５に記載のトランスジェニック植物。
【請求項３９】
前記少なくとも２つの改変がアミノ酸置換を含む請求項３８に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４０】
アミノ酸置換が非アラニンからアラニンへの置換又はアミノ酸置換が逆帯電されたアミノ酸でのアミノ酸の置換である請求項３９に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４１】
前記少なくとも１つの改変が、ＫＹＮＦＤＦモチーフ内にある請求項４９に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４２】
ＫＹＮＦＤＦモチーフ内の少なくとも１つの改変又は少なくとも２つの改変が、ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１５１位と１５３位に対応する位置でのアミノ酸置換を含む請求項４１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４３】
ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１５１位と１５３位に対応する位置での少なくとも１つのアミノ酸置換又はアミノ酸置換のそれぞれが、非アラニンからアラニンへの置換又は逆帯電されたアミノ酸でのアミノ酸の置換である請求項４２に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４４】
変異ＣＫＩポリペプチドが、ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１４９位に対応する位置でのアミノ酸置換をさらに含む請求項４２〜４３のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４５】
ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１４９位に対応する位置でのアミノ酸置換は、非アラニンからアラニンへの置換又は非保存的な置換である請求項４４に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４６】
請求項４４〜４５のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物であって、変異ＣＫＩポリペプチドが、
（ａ）ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１６４位に対応する位置；
（ｂ）ＢｎＫＲＰ１のアミノ酸１６５位に対応する位置；
の少なくとも１つ又はそれぞれでのアミノ酸置換をさらに含む、トランスジェニック植物。
【請求項４７】
（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つ又はそれぞれでのアミノ酸置換は、非アラニンからアラニンへの置換である請求項４６に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４８】
参照ＣＫＩポリペプチドが、ＢｎＫＲＰ１ポリペプチドである請求項３８〜４７のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４９】
請求項４８に記載のトランスジェニック植物であって、変異ＣＫＩポリペプチドが、
（１）ＢｎＫＲＰ１  Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ；
（２）ＢｎＫＲＰ１  Ｙ１４９Ａ；Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ
（３）ＢｎＫＲＰ１  Ｅ１６４Ａ；Ｗ１６５Ａ；又は
（４）ＢｎＫＲＰ１  Ｆ１５１Ａ；Ｆ１５３Ａ；Ｅ１６４Ａ；Ｗ１６５Ａ、
である、トランスジェニック植物。
【請求項５０】
前記少なくとも１つの改変が、ＣＤＫ結合領域の切断を含む請求項４３〜４９のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５１】
参照ＣＫＩポリペプチドがＢｎＫＲＰ１ポリペプチドである請求項５０に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５２】
Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ、トウモロコシ、コムギ、イネ、アルファルファ、綿花、ポプラ、カメリナからなる群より選択される請求項３８〜５１のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５３】
参照ＣＫＩポリペプチドが、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のＣＫＩポリペプチドである請求項５２に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５４】
請求項３８〜５３のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物を産生するための方法であって、変異ＣＫＩポリペプチドをコードする導入遺伝子を含むベクターを植物に導入する工程を含む、方法。
【請求項５５】
野生型ＣＫＩポリペプチドを発現する植物細胞において細胞分裂を調節する方法であって、該野生型ＣＫＩポリペプチドは、（ａ）サイクリンについての結合親和性を付与するサイクリン結合領域、（ｂ）ＣＤＫについての結合親和性を付与するＣＤＫ結合領域を含み；方法は、
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の変異ＣＫＩポリペプチドを細胞内で発現する工程を含む方法。
【請求項５６】
変異ＣＫＩポリペプチドをコードする組換え核酸を植物細胞に導入する工程をさらに含む請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
組換え核酸が発現ベクターである請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
植物細胞が、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ、トウモロコシからなる群より選択される植物由来である請求項５５〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
植物の活力を増大するための方法であって、
請求項１〜２２のいずれかのＣＫＩを含む変異ＣＫＩポリペプチドを植物内で発現する工程と、
該変異ＣＫＩポリペプチドが、植物の活力を増大するように植物内で野生型ＣＫＩの生物学的活性を阻害することを許容する工程と、
を含む、方法。
【請求項６０】
植物の根の質量を増大するための方法であって、
請求項１〜２２のいずれかのＣＫＩを含む変異ＣＫＩポリペプチドを植物内で発現する工程と、
該変異ＣＫＩポリペプチドが、植物において根の質量を増大するように植物内で野生型ＣＫＩの生物学的活性を阻害することを許容する工程と、
を含む、方法。
【請求項６１】
植物の種子の大きさを増大するための方法であって、
請求項１〜２２のいずれかのＣＫＩを含む変異ＣＫＩポリペプチドを植物内で発現する工程と、
該変異ＣＫＩポリペプチドが、植物の種子の大きさを増大するように植物内で野生型ＣＫＩの生物学的活性を阻害することを許容する工程と、
を含む、方法。
【請求項６２】
植物において早期の発芽を増すための方法であって、
請求項１〜２２のいずれかのＣＫＩを含む変異ＫＲＰポリペプチドを植物内で発現する工程と、
該変異ＣＫＩポリペプチドが、植物において早期の発芽を増すように植物内で野生型ＣＫＩの生物学的活性を阻害することを許容する工程、
を含む、方法。
【国際調査報告】
2009502175.tif 000011
2009502175.tif 000012