(57)【要約】  本発明はＧタンパク質共役型受容体ＧＰＲ３９の機能的特性決定、およびＧＰＲ３９タンパク質活性を修飾または調節する化合物に関する。より詳細には本発明は炭水化物代謝をモジュレートすることができる化合物を同定するために、ＧＰＲ３９のアゴニストもしくはアンタゴニストをスクリーニングする方法、およびこれら化合物の治療的使用に関する。特に個体のグルコースコントロールを強化することができ、そして減損した炭水化物代謝、特に随伴する合併症を含む糖尿病の、または随伴する合併症を含むメタボリック症候群の防止および／または処置に効果的な化合物の同定法におけるＧＰＲ３９の使用に関する。１型（インスリン依存性またはＩＤＤＭ）、２型（インスリン非依存性糖尿病）、若年者の成人発症型糖尿病（ＭＯＤＹ）および妊娠糖尿病を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＰＲ３９受容体タンパク質の全部または部分の使用を含んでなる、個体のグルコースコントロールを強化し、そして減損した炭水化物代謝に関連する病状の防止および／または処置、特に随伴する合併症を含む糖尿病の、または随伴する合併症を含むメタボリック症候群の防止および／または処置に効果的な化合物の同定方法。
【請求項２】
ＧＰＲ３９受容体タンパク質が、配列番号２、配列番号４、上記の配列番号を有するタンパク質のスプライスバリアント、および配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列に少なくとも８０％、そして好ましくは少なくとも９０％、９５％、９６％または９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＧＰＲ３９受容体タンパク質の部分が、配列番号２または配列番号４のポリペプチドの少なくとも１０個のアミノ酸のフラグメントから成る、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
個体のグルコース調節を強化し、そして減損した炭水化物代謝に関連する病状の防止および／または処置、特に随伴する合併症を含む糖尿病の、または随伴する合併症を含むメタボリック症候群の防止および／または処置に効果的な化合物の同定方法であって：
（ｉ）本発明のＧＰＲ３９受容体タンパク質の全部または部分を発現する宿主細胞を、結合に適する条件下で該化合物と接触させ、そして
（ｉｉ）化合物の該受容体タンパク質への結合を検出する
ことを含んでなる上記化合物の同定方法。
【請求項５】
個体のグルコース調節を強化し、そして減損した炭水化物代謝に関連する病状の防止および／または処置、特に随伴する合併症を含む糖尿病の、または随伴する合併症を含むメタボリック症候群の防止および／または処置に効果的な化合物の同定方法であって：
（ｉ）本発明のＧＰＲ３９受容体タンパク質の全部または部分を発現する宿主細胞からの膜調製物を、結合に適する条件下で該化合物と接触させ、そして
（ｉｉ）化合物の該受容体タンパク質への結合を検出する
ことを含んでなる上記化合物の同定方法。
【請求項６】
化合物のＧＰＲ３９受容体タンパク質への結合が、試験される化合物に直接的もしくは間接的に会合した標識によるか、または標識した競合体との競合が関与するアッセイで検出される請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
標識された競合体が標識されたオベスタチンである、請求項６に記載方法。
【請求項８】
工程（ｉ）において、化合物が請求項２および３に定義するＧＰＲ３９タンパク質の全部もしくは部分を発現する宿主細胞と接触させられる、請求項４ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
（ｉ）ＧＰＲ３９受容体タンパク質の全部または部分を、試験される化合物と接触させ、そして
（ｉｉ）ＧＰＲ３９受容体タンパク質の活性を測定し、ここで試験化合物の存在下でのＧＰＲ３９活性の変化が、炭水化物の代謝をモジュレートする化合物の能力の指標である、工程を含んでなる、炭水化物の代謝をモジュレートする化合物の同定方法。
【請求項１０】
工程ｉ）において、化合物が、請求項２および３に定義するＧＰＲ３９タンパク質の全部または部分を発現する宿主細胞と接触させられる、請求項９に記載方法。
【請求項１１】
ＧＰＲ３９受容体タンパク質の活性が細胞内メッセンジャーのモジュレーションとして測定される、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
細胞内第二メッセンジャーがｃＡＭＰ、カルシウムまたはレポーター遺伝子産物である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の方法において、
（ｉ）配列番号２もしくは配列番号４のポリペプチドの全部または部分をコードする核酸配列、
（ｉｉ）配列番号１もしくは配列番号３から成る核酸配列、または
（ｉｉｉ）配列番号１もしくは配列番号３の核酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列、
からなる群から選択される単離された核酸配列の使用。
【請求項１４】
請求項１、４、５、８、９または１０のいずれか１項に記載の方法において、請求項１３に定義されたような核酸配列を含んでなるベクターの使用。
【請求項１５】
請求項１、４、５、８、９または１０のいずれか１項に記載の方法において、請求項１３に定義する核酸配列または請求項１４に定義するベクターを含んでなる宿主細胞の使用。
【請求項１６】
ヒトまたは動物内で減損したグルコースコントロールを処置するための、ＧＰＲ３９受容体アゴニストもしくはアンタゴニストを含んでなる製薬学的組成物。
【請求項１７】
減損した炭水化物代謝、特に１型（インスリン依存性もしくはＩＤＤＭ）、２型（インスリン非依存性糖尿病）、若年者の成人発症型糖尿病（ＭＯＤＹ）および妊娠糖尿病を含む糖尿病（随伴するその合併症を含む）に関連する疾患状態を処置するための薬剤の製造におけるＧＰＲ３９アゴニストもしくはアンタゴニストの使用。
【請求項１８】
（ｉ）配列番号２もしくは配列番号４のポリペプチドの全部または部分をコードする核酸配列、
（ｉｉ）配列番号１もしくは配列番号３から成る核酸配列、または
（ｉｉｉ）配列番号１もしくは配列番号３の核酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列、
からなる群から選択される単離された核酸配列を含んでなる診断用製品。
【請求項１９】
工程（ｉ）において、ポリペプチドの部分が請求項３で定義される通りである請求項１８に記載の診断用製品。
【請求項２０】
ＧＰＲ３９受容体タンパク質の全部または部分を含んでなる診断用製品。
【請求項２１】
ＧＰＲ３９受容体タンパク質が請求項２に定義されている通りであり、そしてＧＰＲ３９受容体タンパク質の部分が請求項３に定義されている通りである、請求項２０に記載の診断用製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体ＧＰＲ３９の機能的特性決定およびＧＰＲ３９タンパク質活性を修飾または調節する化合物に関する。具体的には本発明は、グルコースのコントロールが必要な個体におけるグルコースのコントロールを強化する方法に関し、この方法はＧＰＲ３９タンパク質活性をモジュレートまたは調節することができる化合物を治療に有効な量で含んでなる組成物を個体に投与することを含んでなる。別の態様では本発明は、グルコースの調節での、すなわち糖尿病および肥満を含むメタボリック症候群で観察される血糖症、糖尿病、心血管疾患、アテローム硬化症、アテローム性脂質異常症（ａｔｈｅｒｏｇｅｎｉｃ  ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）、高血圧、高トリグリセリド血症および脂肪組織障害でのＧＰＲ３９シグナル伝達の関与に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇタンパク質）は、ホルモンのようなリガンドおよび他の化学的媒介物質のＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）への結合と、細胞内エフェクターの活性化との間の媒介物として作用する。リガンドがＧＰＣＲへ結合すると、受容体の細胞質ドメインは、受容体とＧタンパク質との相互作用が可能となり、それは次いで細胞内中間体、例えばアデニル酸シクラーゼ、ホスホリパーゼＣまたはイオンチャンネルの活性化を可能とする立体構造的変化を受ける。ＧＰＣＲにおける単一リガンドの結合に応答して多数の第二メッセンジャーが産生され得るので、このような系は当初のシグナルの増幅を可能とする。このメカニズムを介して、細胞はそれらの外部環境の変化を感知し、そして応答することができる。
【０００３】
Ｇタンパク質共役型受容体は、内在性細胞膜タンパク質のスーパーファミリーを形成し、各受容体は、７個の疎水性膜貫通ドメインの共通特徴を共有し、その各々が２０〜３０個のアミノ酸長であり、そしてそれらは種々の長さの親水性アミノ酸配列により連結されている。受容体のアミノ末端は細胞外にあり、カルボキシ末端は細胞の細胞質内に見い出される。
【０００４】
ＧＰＣＲは、広範囲の組織および細胞型内に見い出され、そして多数の異なる生理学的プロセスに関与する。それらは、広範囲のリガンド、例えばホルモン、例えば黄体形成ホルモン、濾胞刺激ホルモン、絨毛膜刺激ホルモン、チロトロピン、副腎皮質刺激ホルモン、グルカゴンおよびバソプレッシンあるいは神経伝達物質、例えば５−ＨＴ、アセチルコリン（ムスカリン性ＡｃｈＲ）、ヒスタミン、プロスタグランジン、カルシトニン、ロイコトリエンおよびＣａ２＋により活性化される。ＧＰＣＲの広範囲の分布および広い役割は、ＧＰＣＲが様々な病理学的状態で重要な役割を有する可能性を示す。実際にＧＰＣＲは、気管支収縮、高血圧、炎症、ホルモン失調、糖尿病、アポトーシス、侵害応答、神経伝達の促進および振せん障害に関連する疾患に関与することが見いだされている。
【０００５】
Ｇタンパク質共役型受容体スーパーファミリー内で、それへの天然のリガンドが未知の推定ＧＰＣＲは、「オーファン（ｏｒｐｈａｎ）受容体」と呼ばれる。Ｇタンパク質共役型受容体は市販薬剤の約５０％の標的なので、価値のある薬剤標的であることが証明されている。従って、多数のオーファンＧＰＣＲが、新規の可能性がある標的を同定するために評価されている。
【０００６】
ＧＰＲ３９は、成長ホルモン分泌促進受容体（ＧＨＳ−Ｒ）およびニューロテンシン受容体１および２（ＮＴ−Ｒ１およびＮＴ−Ｒ２）との配列類似性に基づいて同定された（ＭｃＫｅｅ，ｅｔ ａｌ．、１９９７）。予測された４５３アミノ酸のＧＰＲ３９タンパ
ク質は、ＧＰＣＲの特徴である７個の膜貫通ドメインを含む。他のＧＰＣＲとの配列比較により、ＭｃＫｅｅら（１９９７）は、ＧＰＲ３９のタンパク質配列がＧＳＨＲ、ＭＴＬＲ１（モチリン受容体）およびニューロテンシン受容体−１にそれぞれ２７％、２９％および３２％一致することを見いだした。ノーザンブロット分析は、ＧＰＲ３９が広範な組織分布を有することを明らかにした。１．８〜２ｋｂの単一ハイブリダイジングｍＲＮＡ転写物は、試験した殆どの脳領域内に検出された。しかし、この種に加えて、長さ３ｋｂの別の転写物が種々の末梢組織、例えば胃および小腸内で観察された。膵臓、甲状腺および結腸などの組織では、この３ｋｂ種は検出された唯一の転写物であった（ＭｃＫｅｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９７）。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションでの蛍光により、ＭｃＫｅｅら（１９９７）は、ＧＰＲ３９遺伝子を２ｑ２１−ｑ２２にマップした。ＴＭ３内の酸性残基は、ＧＰＲ３９内に保存されている。この残基は構造的に異なるＧＨＳによるＧＨＳ−Ｒの結合および活性化に必須であることが知られている。
【０００７】
これらの組織分布研究に基づき、ＧＰＲ３９は心血管疾患状態（特許文献１および特許文献２）、ガンおよび特に脳のガン、例えば膠芽腫（特許文献３および特許文献４）、炎症および神経疾患状態（特許文献５および特許文献６）および胃腸および肝臓疾患（特許文献６）に関与すると仮定されてきた。ようやく最近になってＧＰＲ３９の推定されるリガンドであるオベスタチンが同定された（Ｚｈａｎｇ  Ｊ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，２００５）。オベスタチンは食物摂取を抑制し、そして胃排出および空腸運動を含む胃腸管機能を低下することが分かった。これらの食欲不振誘発性作用に基づき、ＧＰＲ３９は新規な抗肥満の標的として仮定されてきた。それにもかかわらず引用したどの文献でも、ＧＰＲ３９エネルギーホメオスタシス、そして特に炭水化物代謝における機能的役割は提供されたことがなかった。
【０００８】
糖尿病はインスリンの不十分な作用によるグルコース、タンパク質および脂質の異常な代謝の発生により引き起こされる。糖尿病の典型的な兆候には血清グルコースレベルの異常な上昇、インスリン不全およびグルコースの尿中への排出がある。
【０００９】
幾つかの臨床的サブクラスが知られており、それらには：１型（インスリン依存性もしくはＩＤＤＭ）、２型（インスリン非依存性糖尿病）、若年者の成人発症型糖尿病（ＭＯＤＹ）および妊娠糖尿病を含む。それらは疫学的、病理学的、遺伝的、発症年齢および処置において異なる。
【００１０】
より重篤な状態の糖尿病である１型糖尿病は、糖尿病の５〜１０パーセントを占め、そして最も多くは子供および若年者で発症する。この糖尿病の状態では、身体がインスリンを生産せず、そしてインスリンの定期的注射なしでは患者は昏睡状態となり死亡する。１型糖尿病に罹患している人は完全にインスリン依存性である。
【００１１】
より一般的な種類の糖尿病である２型糖尿病は、通常、徐々に発症し、そして主に４０歳以上の人で起こることが特徴である。２型糖尿病は特にその人が太り過ぎである場合に、身体が十分なインスリンを作れないか、または身体の必要に合ったインスリンを正しく使用できないことから生じる代謝障害である。これはこの疾患の最も一般的な状態であり、そして糖尿病の症例の９０〜９５パーセントを占めている。最初に食事の調整、体重減少および経口投薬の組み合わせにより一定期間、コントロール下の状態に維持することができるが、２型糖尿病の人のほとんどが最終的にインスリン注射を必要とする。
【００１２】
糖尿病はインスリンにより、そして場合よっては注意深い食事を介してもコントロールできるが、最少の副作用で、しかもインスリン注射の侵襲的手法無しに糖尿病の安全かつ効果的な処置が必要とされている。
【００１３】
減損した炭水化物代謝、そして特に糖尿病またはメタボリック症候群は、（多発性）神経障害（末梢、自律神経、近位、病巣）、腎症、腎臓疾患、腎不全、膀胱機能不全、網膜症、大−および小−血管の脈管合併症、脳卒中、心筋梗塞、大血管閉塞疾患、冠状（虚血性）動脈疾患、脳血管疾患、心不全、末梢動脈疾患、高血圧、性的機能不全、胃不全麻痺を含む幾つかの合併症も随伴する。このような合併症も本発明による減損した炭水化物代謝の処置から利益を得るだろう。
【００１４】
【特許文献１】国際公開第２００１／０８１６３４号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００４／００４２７９号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００１／０３６６８５号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０１／０４２２８８号パンフレット
【特許文献５】米国特許出願公開第２００３／２３２７６９号明細書
【特許文献６】国際公開第２００４／００４２７９号パンフレット
【発明の開示】
【００１５】
発明の要約
上記のように、本発明はＧＰＲ３９受容体の新規の機能の同定に関する。本明細書で以下に記載する実施例で示すように、哺乳動物内のＧＰＲ３９変異は血中グルコース濃度に影響し、そしてＧＰＲ３９が炭水化物代謝の調節において鍵となる要素として示されている。この知見は、ＧＰＲ３９活性のモジュレーションを介して随伴する合併症を含む糖尿病の、または随伴する合併症を含むメタボリック症候群の処置における新規の治療方法への道を提供する。この知見は、ＧＰＲ３９活性のモジュレーションを介して随伴する合併症を含む糖尿病の、または関連する合併症を含むメタボリック症候群の処置における新規の治療方法への道を提供する。この知見は、随伴する合併症を含む糖尿病または随伴する合併症を含むメタボリック症候群の防止または処置に有用な化合物を同定するための新規のスクリーニング方法も提供する。
【００１６】
従って本発明の第一の観点は、個体のグルコースコントロールを強化し、そして減損した炭水化物代謝に関連する病状の防止および／または処置、特に随伴する合併症を含む糖尿病の、または随伴する合併症を含むメタボリック症候群の防止および／または処置に効果的な化合物の同定法におけるＧＰＲ３９タンパク質の全部または部分の使用を提供する。あるいは、本発明はそのような方法でＧＰＲ３９タンパク質の全部または部分を発現する細胞の使用を提供する。特定の態様では、ＧＰＲ３９は配列番号２、配列番号４、上記配列番号を有するタンパク質のスプライスバリアント、および配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列に少なくとも８０％そして好ましくは少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％または９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する単離されたタンパク質である。
【００１７】
本明細書でこれまで使用したように、ＧＰＲ３９タンパク質の部分とは、配列番号２または配列番号４のポリペプチドのフラグメントを含むことを意味し、該フラグメントは少なくとも１０個、例えば少なくとも２０、３０、４０、５０、７５、１００または１５０個以上のアミノ酸のサイズである。該フラグメントは、配列番号２または配列番号４のそれぞれのＮ−末端領域から誘導されることができる。Ｎ−末端領域を含むフラグメントは、受容体結合部位を提供するために受容体の細胞外部分を再構築するために使用することができる。好ましくはフラグメントは天然のリガンドを含めＧＰＲ３９に結合することが知られている作用物質、ならびにこれから定義するような受容体のアゴニストおよび／またはアンタゴニストに結合する能力を保持し、特にＧＰＲ３９の推定上のリガンドへ結合する能力、すなわちオベスタチンに結合する能力を保持する。
【００１８】
本発明は、個体のグルコースコントロールを強化し、そして減損した炭水化物代謝に関
連する病状の防止および／または処置、特に随伴する合併症を含む糖尿病の、または随伴する合併症を含むメタボリック症候群の防止および／または処置に効果的な化合物の同定法における配列番号２または配列番号４のポリペプチドの全部もしくは部分をコードする単離された核酸配列の使用も提供する。本発明の方法に使用される核酸配列は、配列番号１もしくは配列番号３からなる単離された核酸配列、および配列番号１もしくは配列番号３の核酸配列に少なくとも８０％、そして好ましくは少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％もしくは９８％の配列同一性を有する核酸配列を含むことを意図する。
【００１９】
本発明の核酸は、配列番号１もしくは配列番号３またはそれらの相補体の核酸配列に少なくとも８０％、そして好ましくは少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％または９８％の配列同一性を有する配列を含んでなる核酸をさらに含む。好ましくは、それらの配列は、非特異性結合を最小化するように制御された条件下で相当する核酸にハイブリダイズする。好ましくは、ストリンジェントないし中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が好ましい、適合する条件は、例えば約８０〜９０％同一である配列の検出のために、一晩、４２℃、０．２５Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２、６．５％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン中でハイブリダイゼーションし、そして最終洗浄を５５℃で０．１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で行うことを含む。約９０％以上同一である配列を検出するために適合する条件は、一晩、６５℃で、０．２５Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２、６．５％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン中でハイブリダイゼーションし、そして最終洗浄を６０℃で０．１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で行うことを含む。
【００２０】
そのような核酸は必ずしも「完全長」ポリペプチドをコードする必要はなく、従って例えば、終止コドンをもたらす置換またはフレームシフト変異のいずれかによりコード配列が早く終止されたＧＰＲ３９遺伝子の変異形態を示す核酸を含むことが考えられる。それらも本発明の核酸である。
【００２１】
また本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸のフラグメントである核酸の使用も提供する。一つの観点では、本発明は、本発明のポリペプチドまたはその相補体をコードする配列の１５〜５０、例えば１５〜３５、１８〜３５、１５〜２４、１８〜３０、１８〜２１もしくは２１〜２４個のヌクレオチドから本質的に成る核酸プライマーを提供する。
【００２２】
本発明の核酸およびポリペプチドは、疾患を処置するために治療的に使用することができる。特にそれらは疾患を処置するために使用することができ、その病状は、ＧＰＲ３９受容体での作用と関連する病状であり、特に減損した炭水化物代謝に関連する病状の防止および／または処置、特に随伴する合併症を含む糖尿病の、または随伴する合併症を含むメタボリック症候群の防止および／または処置に関連するものである。
【００２３】
さらなる観点では、該核酸の配列を含んでなるベクター、特に本発明の核酸配列に操作可能に連結されたプロモーターを含んでなる発現ベクターが提供される。ベクターは、宿主細胞により運搬され、そして該細胞内で発現され得る。該発現に続いて、該細胞は本発明に従う方法に使用することができる。
【００２４】
本明細書で言及するように、本発明の目的はポリペプチドに結合するか、またはその活性をモジュレートする化合物（以後薬剤とも呼ぶ）の同定のためのアッセイ方法を提供することである。具体的にはそのような化合物は任意のサイズの原子の有機もしくは無機集合体であり、そして低分子（約２５００ダルトン未満）またはさらに大きい分子、例えばペプチド、ポリペプチド、全タンパク質およびポリヌクレオチドを含むと考えられ、ここで該化合物は上記のような処置の方法に使用することができる。
【００２５】
本発明者らは、ＧＰＲ３９を炭水化物代謝の調節において鍵となる要素としての受容体として最初に同定したので、本発明はＧＰＲ３９自体および／またはこの受容体を作動または拮抗する化合物の治療的応用への使用の可能性を開く。従って、本発明は、ヒトまたは動物身体の処置の方法にさらに拡張され、該方法はＧＰＲ３９アゴニストまたはアンタゴニストの使用を含んでなる。本明細書で使用する「アゴニスト」は、ＧＰＲ３９に結合し、そしてそれを活性化する、すなわち薬理学的応答を生じる作用物質を指し、そして受容体上のアゴニスト結合部位とは異なる部位に結合し、そして受容体の天然のアゴニストに対する受容体の応答性を強化する正のアロステリックモジュレーターを含む。本明細書で使用する「アンタゴニスト」は、ＧＰＲ３９のアゴニストの効果を弱める作用物質を指す。拮抗作用は競合的および可逆性（すなわちアゴニストと共通する受容体の領域に結合し、そして十分大量のアゴニストと置き換わることができる）であることができるか、または非競合的および／または不可逆性（すなわちアンタゴニストは結合部位に共有的に結合し、そしてアゴニストの量では阻害を克服することができない）であることができる。他の種類の拮抗作用は非競合的拮抗作用であり、ここで作用物質は受容体のアロステリック部位に結合するか、あるいは作用を逆転させ、ここで構成的受容体に関してはＧＰＲ３９について報告されたように（Ｈｏｌｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、作用物質はアゴニスト結合部位に結合し、そして受容体の構成的活性を弱める。
【００２６】
特に本発明は、減損した炭水化物代謝に関連する疾患状態を処置する方法、特に随伴する合併症を含む糖尿病の防止および／または処置、または随伴する合併症を含むメタボリック症候群の防止および／または処置における方法を提供する。基底のグルコースレベルの低下が必要とされるそのような状態における該方法は、ヒトまたは動物にＧＰＲ３９受容体アゴニストを治療に有効な投薬用量で投与することを含んでなる。ＧＰＲ３９アゴニストの使用は、随伴する合併症を含むメタボリック症候群の処置における具体的な用途であり、特に本発明の方法を使用して同定可能なＧＰＲ３９アゴニストの使用を含んでなる。あるいは随伴する合併症を含む糖尿病の処置において、該方法はヒトまたは動物にＧＰＲ３９受容体アンタゴニストを治療に有効な投薬用量で投与することを含んでなり、特に本発明の方法を使用して同定可能なＧＰＲ３９アンタゴニストの使用を含んでなる。
【００２７】
本発明のこれらおよび他の観点は、本明細書でさらに詳細に説明される。
【００２８】
配列の説明
配列番号１は、マウスＧＰＲ３９のヌクレオチド配列である。
配列番号２は、マウスＧＰＲ３９のアミノ酸配列である。
配列番号３は、ヒトＧＰＲ３９のヌクレオチド配列である。
配列番号４は、ヒトＧＰＲ３９のアミノ酸配列である。
配列番号５は、ヒトオベスタチンである。
配列番号６は、サルオベスタチンである。
配列番号７は、マウスオベスタチンである。
配列番号８は、ラットオベスタチンである。
配列番号９は、アレチネズミオベスタチンである。
配列番号１０は、ブタオベスタチンである。
配列番号１１は、ネコオベスタチンである。
配列番号１２は、イヌオベスタチンである。
配列番号１３は、ヤギオベスタチンである。
配列番号１４は、ヒツジオベスタチンである。
配列番号１５は、ウシオベスタチンである。
配列番号１６は、オベスタチンのコンセンサス配列である。
【００２９】
発明の詳細な説明
核酸
本発明の方法で使用される核酸は、ＤＮＡ（ゲノムおよびｃＤＮＡの双方を含む）およびＲＮＡを含む。本発明による核酸がＲＮＡを含む場合、添付の表に示される配列の引用は、ＴがＵに置換されたＲＮＡの等価物も引用されると解釈するべきである。
【００３０】
本発明の核酸は、一本鎖または二本鎖でよい。本発明の一本鎖核酸は、アンチセンス核酸を含む。従って、配列番号１または配列番号１を含んでなる配列またはそれらのフラグメントの引用は、文脈が明らかに反対でない限り、相補的配列も含むと理解されるべきである。同様のことは配列番号３にも当てはまる。
【００３１】
一般的に、本発明による核酸は、単離物、単離および／または精製された形態、または天然に同伴する物質を含まないかまたは本質的に含まず、例えば、場合により発現のための１個もしくは複数の調節配列を除き、ヒトゲノム内の遺伝子に隣接する核酸を含まないかまたは本質的に含まずに提供される。核酸は、全体または部分的に合成されてもよくそしてゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡを含んでもよい。換言すると、「単離された」とは自然に存在する配列がその通常の細胞内容物から取り出されていることを示す。すなわち配列は無細胞溶液であるか、または異なる環境もしくは核酸内容物中に置かれることができる。したがって本発明で請求する核酸は全細胞もしくは細胞溶解物中でヘテロロガスな物質として存在するか、または部分的に、実質的に、もしくは完全に精製された状態で存在することができる。
【００３２】
また本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸のフラグメントである核酸も提供する。一つの観点では、本発明は、本発明のポリペプチドまたはその相補体をコードする配列の１５〜５０、例えば１５〜３５、１８〜３５、１５〜２４、１８〜３０、１８〜２１または２１〜２４ヌクレオチドから本質的に成る核酸プライマーを提供する。
【００３３】
「本質的になる」（Ａｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ≡）の用語は、いかなる追加の５’または３’核酸配列も含まない核酸を指す。本発明のさらなる観点において、上記に定義した１５〜３０個のヌクレオチドから本質的になる本発明の核酸は、しかしながら、自然には連結されていない短い（例えば４〜１５、例えば４〜１０ヌクレオチド）追加の配列に３’末端で、しかし好ましくは５’末端で連結していてもよい。そのような追加の配列は、好ましくは、本発明の核酸が例えばＰＣＲプライマーとして使用される場合に、クローニングを容易にするための制限酵素認識部位を含んでなるリンカーである。
【００３４】
本発明のプライマーは、望ましくは、本発明のポリペプチドをコードする核酸に選択的にハイブリダイズできる。「選択的」（Ａｓｅｌｅｃｔｉｖｅ≡）とは、他のプリン受容体をコードする配列に関し、そして具体的にはアデニン受容体以外の受容体に関して選択的であることを意味する。選択的にハイブリダイズする配列の能力は、実験または計算で測定することができる。
【００３５】
例えばプライマーのＴｍを計算する一つの方法は、相同的な標的配列へのプライマーのＴｍを算出するための式を参照することによる。この式は、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ）＋４（Ｇ＋Ｃ）−５である。これは３ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ（ここでＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７である）の条件下でのＴｍを与える。この式は一般的に約５０ヌクレオチド長までのプライマーに適合する。本発明では、この式は、本発明のポリペプチドをコードする配列から誘導された特定の配列に対するプライマーの見かけのＴｍを算出するためのアルゴリズムとして使用されてもよい。該Ｔｍは、それら他の配列のいずれかの部分に対して対合する最大数に基づき、ヒトおよびラットのＧＰＣＲ配列に対して算出されたＴｍと比較することができる。
【００３６】
標的配列にハイブリダイズするプライマーに適合する条件も、実験的に測定することができる。適する実験条件は、本発明のポリペプチドをコードする核酸および他のＧタンパク質共役型受容体をコードする核酸の双方に対する候補プライマーを、低いストリンジェンシーのハイブリダイズ条件（例えば５５℃で６ｘＳＳＣ）下で固体支持体上でハイブリダイズし、還元ＳＳＣおよび／またはより高い温度、例えば０．２ｘＳＳＣ、４５℃で洗浄し、そしてハイブリダイゼーション温度を段階的に上げて、プライマーが本発明のポリペプチドをコードする核酸にはハイブリダイズできるが、他のＧＰＣＲをコードする核酸にはハイブリダイズしないようにするハイブリダイゼーション条件を決定することを含んでなる。
【００３７】
本発明の核酸、特にプライマーは、明示的な標識を有していてもよい。適当な標識は、放射性同位元素、例えば３２Ｐまたは３５Ｓ、蛍光標識、酵素標識、または他のタンパク質標識、例えばビオチンを含む。そのような標識は、本発明のポリヌクレオチドまたはプライマーに加えることができ、そしてそれ自体公知の技術を用いて検出することができる。
【００３８】
本発明のプライマーは、合成核酸、例えば細胞内の核酸の安定性を改善することを意図して修飾された骨格構造を有するものを含んでなることができる。多数の異なる種類のオリゴヌクレオチドへの修飾が当該技術分野では公知である。それらには、メチルホスホネートおよびホスホロチオエート骨格、アクリジン、または分子の３’および／または５’末端でのポリリシン鎖の付加を含む。本発明の目的のために、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、当該技術分野で利用できる任意の方法により修飾できると理解される。そのような修飾は、本発明のポリペプチドヌクレオチドのインビボ活性または寿命を増大するために行うことができる。
【００３９】
さらに本発明内の範囲に含まれるのは、本明細書中に記載の核酸配列、好ましくはオリゴヌクレオチド、具体的には安定化されたオリゴヌクレオチド、またはリボザイムの形態に基づくアンチセンス配列である。
【００４０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、核酸、前ｍＲＮＡもしくは成熟ｍＲＮＡの相補的配列にハイブリダイズして、所定の標的ＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドの産生に干渉し、その発現を低下もしくは防止もするように設計することができる。リボザイムは、本発明の核酸配列をコードするＧＰＲ３９ ＧＰＣＲによりコードされるｍＲＮＡを、望ましくはＧＰＲ３９  ＧＰＣＲに特異的な標的配列、すなわち他のＧＰＣＲ配列に共通でない配列で切断するように設計される。アンチセンス配列の構造およびその使用は、Ｐｅｙｍａｎ ａｎｄ Ｕｌｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，９０：５４３−５８４（１９９０）、Ｃｒｏｏｋｅ，Ａｎｎ Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，３２：３２９−３７６（１９９２）、およびＺａｍｅｃｎｉｋ ａｎｄ
Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ，７５：２８０−２８４（１９７４）に記載されている。リボザイムの構造およびそれらの使用は、例えばＧｉｂｓｏｎ ａｎｄ Ｓｈｉｌｌｉｔｏｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７（２）：１２５−１３７（１９９７）に記載されている。
【００４１】
一つの態様では、本発明のＲＮＡは、二本鎖（ｄｓＲＮＡ）（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９１：８０６−８１１，１９９８）または短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）配列（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９９：６０４７−５２，２００２）を用いるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の導入のために使用できる。「ＲＮＡｉ」は、ｄｓＲＮＡが相補ｍＲＮＡの相同性依存的分解を誘導するプロセスである。一つの態様では、本発明の核酸分子は本発明の「センス」リボ核酸との相補的塩基対形成によりハイブリダイズされて二本鎖ＲＮＡを形成する。ｄｓＲＮＡアンチセンスおよびセンス核酸分子は、少なくとも約２０、２５、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチドまたはＧＰＲ３９コード鎖に、またはその部分のみに相当するものを備える。別の態様では、ｓｉＲＮＡは３０ヌクレオチド長以下であり、そしてさらに好ましくは２１〜２３ヌクレオチドであり、特徴的な２〜３ヌクレオチド の３’オーバーハング末端を有し、それらはより長いｄｓＲＮＡからリボヌクレアーゼＩＩＩ切断により生成される。例えばＴｕｓｃｈｌ Ｔ．（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４４６−４８，２００２）参照。
【００４２】
小ＲＮＡ分子の細胞内転写は、ｓｉＲＮＡ鋳型を、通常は小さい核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）Ｕ６またはヒトＲＮＡアーゼＰ ＲＮＡ Ｈ１をコードするＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩＩ）転写単位内にクローン化して達成できる。ｓｉＲＮＡを発現するために二つの方法を使用できる：一つの態様では、ｓｉＲＮＡ二重鎖を構成するセンスおよびアンチセンス鎖が、個別のプロモーターにより転写される（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５００−５０５，２００２）：別の態様では、ｓｉＲＮＡが細胞内プロセシングの後にｓｉＲＮＡを生成するステム−ループヘアピンＲＮＡ構造として発現される（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２９６：５５０−５５３，２００２）（引用により本明細書に編入される）。
【００４３】
ｄｓＲＮＡ／ｓｉＲＮＡは、最も多くは生物体に送達される前にインビトロでセンスおよびアンチセンスＲＮＡ鎖をアニーリングすることにより投与される。別の態様では、ＲＮＡｉは、投与の前にアニールされることなく同じ溶液中で本発明のセンスおよびアンチセンス核酸を投与することにより行ってもよく、そしてさらに非常に近い時間範囲内に別の媒体内で核酸を投与して行ってもよい。ＧＰＲ３９またはＧＰＲ３９核酸配列に相補的なアンチセンス核酸のフラグメント、相同体、誘導体および類似体をコードする核酸分子がさらに提供される。
【００４４】
本発明のアンチセンス、ｓｉＲＮＡおよびリボザイム配列は、カルチャー内の哺乳動物細胞株に導入されて、例えばこの遺伝子の下方制御を起こし、そして表現型的効果を、またはＧＰＲ３９ ＧＰＣＲと関連する本明細書に記載のタンパク質の発現もしくは位置を観察することにより、ＧＰＲ３９ ＧＰＣＲの機能を研究することができる。ＧＰＲ３９ ＧＰＣＲの異常な発現が起きる細胞内で、そのようなアンチセンス、ｓｉＲＮＡおよびリボザイム配列は、遺伝子の発現を下方制御するために使用することができる。
【００４５】
本発明のＧＰＲのｃＤＮＡ配列は、標準的ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術を用いてクローン化することができる。これは、配列番号１の反対鎖上の５’および３’末端にプライマーの対を作り、このプライマーを哺乳動物表層細胞から得たｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡと接触させ、所望の領域の増幅をもたらす条件下でポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅されたフラグメントを単離し（例えばアガロースゲル上で反応混合物を精製することにより）、そして増幅されたＤＮＡを回収することを含む。プライマーは、増幅されＤＮＡが適当なクローニングベクター内にクローン化できるように適当な制限酵素認識部位を含むように設計することができる。同様なことは配列番号３にも適用される。
【００４６】
配列番号１もしくは配列番号３に１００％相同的ではないが、しかし配列番号２もしくは配列番号４のいずれかまたはその他の本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、多数の方法で入手できる。
【００４７】
例えば、配列番号１または配列番号３の配列の部位指定変異誘発を行うことができる。これは、例えば、ポリヌクレオチド配列が発現されている特定の宿主細胞のコドン優先性
を最適化するためにサイレントコドン変化が配列に要求される場合に有用である。他の配列変化は、制限酵素認識部位を導入するため、またはポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの性質もしくは機能を改変するために望まれるかもしない。さらなる変化は、例えば保存的置換をもたらすために必要とされる特定のコーディング変化を表すために望ましいであろう。
【００４８】
本発明の核酸は、５’または３’末端に追加の配列を含んでなることができる。例えば、合成または天然の５’リーダー配列が、本発明のポリペプチドをコードする核酸に付加されてもよい。また追加の配列は、本発明の核酸、具体的には宿主細胞の転写のために必要な５’または３’非翻訳領域も含むことができる。
【００４９】
さらに、その他の動物、特に哺乳動物（例えばヒトまたはウサギ）、さらに特別にはヒトを含む霊長類では、ＧＰＲ３９の相同体が得られ、そして本発明の方法で使用される。そのような配列は、他の動物種からの分裂している細胞もしくは組織から作製されるｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーを作成または入手し、そしてそのようなライブラリーを中程度ないし高いストリンジェンシーの条件下（例えば、０．０３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、約５０ＮＣ〜約６０ＮＣ）で、配列番号１もしくは配列番号３の全てもしくは部分を含んでなるプローブをプロービングして得ることができる。
【００５０】
本発明は、本発明のポリペプチドをコードする配列を含んでなる単離されたＤＮＡ配列にさらに拡張されるが、しかしここでコード配列は２個以上（好ましくは５個を越えず、例えば４個または３個）のエキソンに分割される。そのようなエキソン配列は、天然そしてゲノムクローンから得られても、または合成でもよい。エキソン配列は、配列が１個もしくは複数のエキソン配列により中断されている本発明のポリペプチドをコードする核酸を含んでなるミニ遺伝子配列の構築物中に使用することができる。
【００５１】
またミニ遺伝子は、任意の真核生物源から誘導された異種エキソンを用いて構築されてもよい。
【００５２】
ポリペプチド
本発明の方法で使用される単離されたポリペプチドは、単離された形態であり、それが細胞内に見い出される他のポリペプチドなどの自然に付随する物質を含まないか、または実質的に含まないと上記に定義されたものである。ポリペプチドは、当然ながら希釈剤もしくは補助剤と一緒に調剤され、そしてさらに実際的な目的で単離されてもよく、例えばポリペプチドは通常、免疫アッセイに使用するためにマイクロタイタープレートをコーティングするために使用される場合に、ゼラチンまたは他の担体と混合される。ポリペプチドは、天然にもしくは異種真核生物細胞系によるかのいずれかでグリコシル化されてもよく、またはそれらはグリコシル化されていなくてもよい（例えば原核生物細胞内の発現により産生された場合）。ポリペプチドはリン酸化および／またはアセチル化されてもよい。
【００５３】
本発明のポリペプチドは、実質的に精製された形態でよく、その場合は一般に調製物中のポリペプチドの９０％以上、例えば調製物中に９５％、９８％もしくは９９％が本発明のポリペプチドであるポリペプチドを含んでなる。
【００５４】
本発明のポリペプチドは、例えばそれらの精製を支援するためのヒスチジン残基の添加により、または細胞からのそれらの分泌を促進するためのシグナル配列の添加により修飾されてもよい。
【００５５】
図６のアライメントに示すように、哺乳動物のＧＰＲ３９タンパク質は、ヒトまたはマウスのいずれかの配列と少なくとも８０％の全体的な配列同一性を有する。そのような理由から、配列番号２もしくは配列番号４に少なくとも８０％、例えば９０％、９５％、９６％、９７％もしくは９８％の配列同一性を有するポリペプチドも本発明で提供される。該ポリペプチドはそれぞれ配列番号２もしくは配列番号４のアミノ酸配列バリアント、対立遺伝子、誘導体もしくは変異体であるポリペプチドを含む。例えばそのようなポリペプチドは、１もしくは複数（例えば１〜２０個、例えば２、３、４、または５〜１０個）のアミノ酸の１もしくは複数の付加、置換、欠失および挿入により、配列番号２もしくは配列番号４中に与えられたものとは異なるアミノ酸配列を有することができる。
【００５６】
ポリペプチド配列の同一性百分率は、参照配列（例えば本発明の配列番号２または配列番号４）とクエリ（ｑｕｅｒｙ）配列とを比較する市販のアルゴリズムを用いて算出できる。同一性をアッセイする方法のさらなる詳細を以下に記載する。
【００５７】
クエリ配列が配列番号２または配列番号４の配列と少なくとも８０％、そして好ましくは少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％または９８％の同一性を有し、該配列がＧＰＲ３９受容体活性を保持するポリペプチドのものであると決定された場合に、そのような配列は本発明の部分を形成する。
【００５８】
本発明によるポリペプチドは、例えばコードする核酸からの発現により産生された後に単離および／または精製（例えば抗体を使用して）することができる。単離および／または精製されたポリペプチドは組成物の製剤に使用されてもよく、それは少なくとも１種の追加の成分、例えば製薬学的に許容できる賦形剤、媒体または担体を含む製薬学的組成物を含んでもよい。
【００５９】
本発明によるポリペプチドは免疫原として、または特異的抗体を得るために使用することができる。抗体はポリペプチドの精製およびその他の操作、診断スクリーニングおよび治療の内容において有用である。
【００６０】
本発明によるポリペプチドは、それに結合しているかまたはその活性もくは機能をモジュレートする分子のスクリーニングに使用することができる。そのような分子は、治療（可能ならば予防も含む）の内容で有用となり得る。
【００６１】
本発明のポリペプチドもしくは標識されたポリペプチドまたはそのフラグメントは、固相、例えばイムノアッセイウェルもしくはディップスティックの表面に固定されてもよい。
【００６２】
そのような標識および／または固定化されたポリペプチドは、適当な試薬、対照、説明書などと一緒に適当な容器中にキットとして包装され得る。
【００６３】
そのようなポリペプチドおよびキットは、イムノアッセイによりサンプルに存在するそのようなポペプチドまたはそれらの活性部分もしくはフラグメントに対する抗体を検出する方法に使用することができる。
【００６４】
イムノアッセイ法は当該技術分野では周知でありそして一般に、
（ａ）該タンパク質に対する抗体により結合可能なエピトープを含んでなるポリペプチドを準備し；
（ｂ）抗体−抗原複合体を形成させる条件下で該ポリペプチドと一緒に生物学的サンプルをインキュベーションし、そして
（ｃ）該ポリペプチドを含んでなる抗体−抗原複合体が形成されたかどうかを決定する
ことを含んでなる。
【００６５】
配列同一性
核酸およびポリペプチドの配列同一性の百分率は、参照配列とクエリ配列を比較する市販のアルゴリズムを用いて算出できる。下記のプログラム（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎにより提供される）を、相同性／同一性を決定するために使用することができる：ＢＬＡＳＴ、ギャップドＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴＮおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、これらはデフォルトパラメーターを用いて使用することができる。
【００６６】
アルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓ  ｏｎ，ＷＩ）は、一致の数を最大とし、そしてギャップの数を最小とする２個の完全配列を整列するニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびヴンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）のアルゴリズムを使用する。一般に、ｇａｐ ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ＝１２およびｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ＝４のデフォールトパラメーターが使用される。
【００６７】
核酸配列またはその部分とクエリ配列との間の最高の全体的一致を決定するための別の方法は、ブルトラグら（Ｂｒｕｔｌａｇ ｅｔ ａｌ，Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．，６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムの使用である。このプログラムは包括的な配列アライメントを提供する。この包括的な配列アライメントの結果は、同一性百分率である。同一性百分率を算出するためのＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢサーチで使用される適当なパラメーターは下記である：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５、およびＷｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００、またはヌクレオチド塩基で表したクエリ配列長のいずれか短い方。アミノ酸アライメントの同一性百分率および類似性を算出するための適当なパラメーターは下記である：Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ１５０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５、およびＷｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００、またはクレオチド塩基で表したクエリ配列長さのいずれか短い方。
【００６８】
ベクター
本発明の単離された核酸配列は、ベクター、特に発現ベクター内に組み込まれることができる。ベクターは、適合する宿主細胞内で核酸を複製するために使用することができる。従ってさらなる態様では、本発明は複製可能なベクターに本発明の単離されたポリヌクレオチドを導入し、適合する宿主細胞にベクターを導入し、そしてベクターの複製をもたらす条件下で宿主細胞を増殖させることにより本発明のポリヌクレオチドを作製する方法を提供する。ベクターは、宿主細胞から回収することができる。適する宿主細胞は、発現ベクターと関連して以下に記載する。
【００６９】
好ましくは、ベクター中の本発明の単離されたポリヌクレオチドは、宿主細胞によりコード配列の発現をもたらすことができる制御配列に操作可能に連結され、すなわちベクターは発現ベクターである。
【００７０】
「操作可能に連結された」という用語は、記載された成分がそれらの意図された様式でそれらを機能させるような関係にある近接した並置を指す。コード配列に「操作可能に連結」された制御配列は、コード配列の発現が制御配列に適合する条件下で達成されるような様式で結合されている。
【００７１】
適切なベクターは、プロモーター配列、ターミネーターフラグメント、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子およびその他の適当な配列を含む正しい調節配列を含むように選択または構築できる。ベクターは、適するプラスミド、ウイルス、例えばファージ、ファジェミドもしくはバキュロウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＢＡＣ、またはＰＡＣなどでよい。ベクターは、遺伝子治療ベクター、例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス（例えばＨＩＶもしくはＭＬＶ）またはアルファウイルスベクターに基づくベクターを含む。
【００７２】
ベクターには、複製起点、場合により該ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーターおよび場合によりプロモーターのレギュレーターが提供され得る。ベクターは、１もしくは複数の選択可能なマーカー遺伝子、例えば細菌プラスミドの場合にはアンピシリン耐性遺伝子または哺乳動物ベクターではネオマイシン耐性遺伝子を含んでもよい。ベクターはインビトロで、例えばＲＮＡの産生のために使用され、または宿主細胞をトランスフェクションもしくは形質転換するために使用されることができる。ベクターはインビボで、例えば遺伝子治療の方法で使用されるように適合させることができる。種々の異なる宿主細胞内でのポリペプチドのクローニングおよび発現の系は周知である。適当な宿主細胞には、細菌、真核生物細胞、例えば哺乳動物および酵母、およびバキュロウイルス系がある。異種ポリペプチドの発現のために当該技術分野で利用できる哺乳動物細胞株には、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＣＯＳ細胞および多数のその他のものが含まれる。
【００７３】
プロモーターおよびその他の発現調節シグナルは、発現ベクターが設計される宿主細胞と適合するように選択することができる。例えば酵母プロモーターは、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＡＬ４およびＡＤＨプロモーター、Ｓ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）ｎｍｔ１およびａｄｈプロモーターを含む。哺乳動物プロモーターは、重金属、例えばカドミウムに応答して誘導できるメタロチオネインプロモーターを含む。ウイルスプロモーター、例えばＳＶ４０ラージＴ抗原プロモーターまたはアデノウイルスプロモーターを使用してもよい。すべてのこれらのプロモーターは、当該技術分野で容易に入手できる。
【００７４】
ベクターは、他の配列、例えばポリペプチドが融合体として産生されるように挿入された核酸の発現を駆動するプロモーターもしくはエンハンサー、および／または宿主細胞内で産生されるポリペプチドが細胞から分泌されるように分泌シグナルをコードする核酸のような核酸配列を含んでもよい。
【００７５】
遺伝子治療に使用するための本発明のポリペプチドの産生のためのベクターは、本発明のミニ遺伝子配列を有するベクターを含む。従って、ＧＰＲ３９ ＧＰＣＲおよびその活性の低発現に関係する異常状態を処置するための方法を提供することが本発明の一つの目的であり、該方法は、ＧＰＲ３９ ＧＰＣＲをコードするポリヌクレオチドの使用を含んでなる。具体的には、随伴する合併症を含む糖尿病のような減損した炭水化物代謝を処置するための方法にである。遺伝子治療においては、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、個体の関係する細胞によるＧＰＲ３９ ＧＰＣＲの内部産生に作用するように使用される。例えば、ＧＰＲ３９  ＧＰＣＲをコードするポリヌクレオチドは、上記で提供される複製欠陥レトロウイルスベクター内で発現するように操作することができる。次いでレトロウイルス発現構築物は単離され、そしてパッケージング細胞がここで目的の遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生するように、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルスプラスミドベクターを用いて形質導入されたパッケージング細胞内に導入することができる。これらの生産細胞は、インビボでの細胞操作およびインビボでのポリペプチドの発現のために個体に投与することができる。遺伝子治療の総説に関しては、Ｃｈａｐｔｅｒ  ２０，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ−ｂａｓｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ，ｉｎ  Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｔ．Ｓｔｒａｃｈａｎ ａｎｄ Ａ．Ｐ．Ｒｅａｄ，ＢＩＯＳＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｌｔｄ．（１９９６）を参照されたい。
【００７６】
これ以上の詳細に関しては、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。核酸の操作のための多数の公知の技術およびプロトコール、例えば核酸構築物の調製、突然変異誘発、配列決定、細胞内へのＤＮＡの導入および遺伝子発現、およびタンパク質の分析は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆ Ｓｏｎｓ，１９９２に詳細に記載されている。
【００７７】
ベクターは、上記のようにして適当な宿主細胞内に形質転換して本発明のポリペプチドの発現を提供することができる。すなわち本発明のさらなる観点では、本発明によるポリペプチドを調製する方法を提供し、この方法は本発明のポリペプチドをコードするコード配列のベクターによる発現が生じる条件下で、上記のような発現ベクターを用いて形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞を培養し、そして発現されたポリペプチドを回収することを含んでなる。ポリペプチドは、インビトロ系、例えば網状赤血球溶解物中に発現されてもよい。
【００７８】
本発明のさらなる態様は、本発明のポリヌクレオチドの複製および発現のためのベクターを用いて形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞を提供する。細胞は、該ベクターに適合するように選択され、そして例えば細菌、酵母、昆虫または哺乳動物性でよい。宿主細胞は、コードされたポリペプチドが産生されるように、遺伝子の発現のための条件下で培養され得る。ポリペプチドが適当なシグナルリーダーペプチドに結合して発現される場合には、それは細胞から培養基に分泌され得る。発現による産生に続いて、ポリペプチドは該当する場合には宿主細胞および／または培養基から単離および／または精製されることができ、そして引き続き所望により、例えば１もしくは複数の追加の成分を含んでもよい組成物、例えば１もしくは複数の製薬学的に許容できる賦形剤、媒体もしくは担体を含む製薬学的組成物の製剤中で使用される。
【００７９】
本発明によるポリヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイムの産生をもたらすためにアンチセンス方向で上記のベクター内に挿入されてもよい。
【００８０】
アッセイ
本発明の１つの目的は、個体のグルコースコントロールを強化し、そして減損した炭水化物代謝に関連する病状の防止および／または処置、特に随伴する合併症を含む糖尿病の、または随伴する合併症を含むメタボリック症候群の防止および／または処置に効果的な化合物を同定するためのアッセイを提供することであり、該アッセイは：本発明によるＧＰＲ３９受容体タンパク質の全部または部分を準備し、該タンパク質を推定される結合化合物と接触させ、そして該化合物が該タンパク質と相互作用できるかどうかについて決定することを含んでなる。ＧＰＣＲはＧタンパク質、ならびに他のアクセサリータンパク質と相互作用できることが知られているので、本明細書で提供されるアッセイは、ＧＰＲ３９受容体タンパク質の全部または部分に加えて、Ｇタンパク質または他のアクセサリータンパク質を含んでなることができる。
【００８１】
ＧＰＣＲはＧタンパク質、ならびにアレスチン、受容体活性調節タンパク質（ＲＡＭＰ
）、ＰＤＺドメインを含むタンパク質およびその他を含む他のアクセサリータンパク質と相互作用することが知られている。ＧＰＣＲとそのようなアクセサリータンパク質との相互作用は、膜への、または膜からの輸送、その薬理学の定義、そのグリコシル化状態またはＧタンパク質の共役とは無関係に機能するメカニズムを介するシグナル伝達の測定のような受容体の様々な重要な生物学的特性の決定をもたらすことができる（Ｌａｂｕｒｔｈｅ  ｅｔ  ａｌ  ２００２）。一例として、カルシトニン受容体様受容体とＲＡＭＰ１、特異的な単一膜貫通タンパク質との会合は、カルシトニン遺伝子−リート（ｇｅｎｅ−ｒｅａｔｅｄ）ペプチドに結合することができるカルシトニン受容体様受容体の発現を導くが、一方ＲＡＭＰ２またはＲＡＭＰ３との会合はアドレノメジュリン結合受容体としての発現を導く（Ｌａｔｃｈｉｅ  ｅｔ  ａｌ  １９９８）。ＲＡＭＰの同様の相互作用が、ＶＰＡＣ１−：グルカゴン−、ＰＴＨ１−およびＰＨＴ２−受容体についても証明され（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ  ２００１，２００３）、Ｇタンパク質共役型受容体のシグナリングのモジュレーティングにおけるアクセサリータンパク質のより全般的役割が示唆された。
【００８２】
アッセイの一つの態様では、受容体または受容体のサブユニットを、結合アッセイに使用することができる。結合アッセイは競合的でも非競合的であってもよい。そのようなアッセイは、存在する場合に、どの化合物がポリペプチドに結合できるかを決定するために多数の化合物の迅速なスクリーニングを処理できる。引き続いてそのような化合物が本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用するかどうかをさらに決定するために、さらに詳細なアッセイを、結合することが分かったそれらの化合物を用いて実行できる。
【００８３】
従って本発明の１つの目的は、個体のグルコースコントロールを強化し、そして減損した炭水化物代謝に関連する病状の防止および／または処置、特に随伴する合併症を含む糖尿病の、または随伴する合併症を含むメタボリック症候群の防止および／または処置に効果的な化合物を同定するための方法を提供することであり、この方法は：
（ｉ）本発明によるＧＰＲ３９受容体タンパク質の全部または部分を発現する宿主細胞を、結合に適する条件下で該化合物と接触させ、そして
（ｉｉ）該受容体タンパク質への化合物の結合を検出する
ことを含んでなる。
【００８４】
さらなる態様では、本発明は個体のグルコースコントロールを強化し、そして減損した炭水化物代謝に関連する病状の防止および／または処置、特に随伴する合併症を含む糖尿病の、または随伴する合併症を含むメタボリック症候群の防止および／または処置に効果的な化合物を同定するための方法を提供し、この方法は：
（ｉ）本発明によるＧＰＲ３９受容体タンパク質の全部または部分を発現する宿主細胞からの膜調製物を、結合に適する条件下で該化合物と接触させ、そして
（ｉｉ）該受容体タンパク質への化合物の結合を検出する、
ことを含んでなる。
【００８５】
さらに別の態様では、本発明は個体のグルコースコントロールを強化し、そして減損した炭水化物代謝に関連する病状の防止および／または処置、特に随伴する合併症を含む糖尿病の、または随伴する合併症を含むメタボリック症候群の防止および／または処置に効果的な化合物を同定する方法を提供し、該方法は競合結合アッセイを含み、ここで
（ｉ）本発明によるＧＰＲ３９受容体タンパク質の全部または部分を発現する宿主細胞を、試験される化合物の存在または不存在下の双方で、ＧＰＲ３９受容体タンパク質に結合することが既知の化合物と接触させ、そして
（ｉｉ）ＧＰＲ３９受容体タンパク質に結合することが既知の該化合物の結合に対する該化合物の効果をアッセイする。
【００８６】
試験される化合物の存在下でＧＰＲ３９受容体タンパク質に結合することが既知の化合物の結合の低下は、該化合物がＧＰＲ３９受容体タンパク質に結合する指標である。ＧＰＲ３９受容体タンパク質への天然のリガンドであるオベスタチンは、グレリン（ｇｈｒｅｌｉｎ）のような同じプロホルモンから誘導される別のペプチドとして最近同定された（Ｚｈａｎｇ，Ｊ．Ｖ．ｔ ａｌ．，２００４  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌ．３１０，９９６−９９９）。特定の態様では、受容体に結合することが既知の化合物はオベスタチンから成り、さらに特定すると配列番号５〜１６から選択されるオベスタチン配列の一つから選択され、さらに特定すると配列番号５または配列番号７から選択される。あるいは、本明細書中で使用されるオベスタチンは、配列番号５または配列番号７のアミノ酸配列に少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するペプチドを指す。
【００８７】
別の態様では、上記の競合的結合アッセイは、本発明によるＧＰＲ３９受容体タンパク質の全部または部分を発現する宿主細胞の膜調製物に関して行われる。該宿主細胞の調製法およびそのような細胞から膜を調製する方法を以下に記載する。
【００８８】
具体的な態様では、上記の結合アッセイにおけるＧＰＲ３９受容体タンパク質は、配列番号２、配列番号４、上記の配列番号を有するタンパク質のスプライスバリアント、および配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列に少なくとも８０％、そして好ましくは少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する単離されたタンパク質である。
【００８９】
上記に使用されたＧＰＲ３９タンパク質の部分は、配列番号２または配列番号４のポリペプチドのフラグメントを含むことを意味し、該フラグメントは、少なくとも１０個、例えば、少なくとも２０、３０、４０、５０、７５、１００もしくは１５０個以上のアミノ酸のサイズである。そのようなフラグメントは、配列番号２または配列番号４それぞれのＮ−末端領域から誘導することができる。Ｎ−末端領域を含むフラグメントは、受容体結合部位をもたらすために受容体の細胞外部分を再構成するために使用することができる。好ましくは、フラグメントは、ＧＰＲ３９受容体タンパク質に結合することが既知の化合物を結合する能力を保持する。より詳細にはフラグメントは上記定義のオベスタチンに結合する能力を保持する。
【００９０】
膜調製物
本発明の受容体タンパク質を発現する細胞膜は、限定するわけではないがリガンド結合アッセイ、ＧＴＰ−γ−Ｓ結合アッセイなどを含む特定の種類のアッセイに有用である。そのような細胞膜を調製するための詳細は、一部の場合にはその後のアッセイの性質により決定され得るが、しかし典型的には全細胞を回収し、そして例えば氷冷緩衝液（例えば２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４、４℃において）中の音波処理により細胞を破壊することを含む。得られた粗細胞溶解物は、引き続き低速遠心分離、例えば４℃で５分間、２００ｘｇにより細胞残渣を分離する。さらなる清澄化および膜濃縮は、高速遠心分離工程、例えば４℃で２０分間、４０，０００ｘｇを用いて最終的に行われ、そして得られた膜ペレットは氷冷緩衝液中に懸濁して洗浄され、そして高速遠心分離工程を繰り返す。最終的に洗浄された膜ペレットをアッセイ緩衝液中に再懸濁する。タンパク質濃度は、標準としてウシ血清アルブミンを用いるＢｒａｄｆｏｒｄ（１９７６）の方法により測定される。膜は直ちに使用でき、または後の使用のために冷凍されてもよい。
【００９１】
放射性標識リガンド結合アッセイ
本発明の受容体を発現する細胞は、該受容体へのリガンドについてスクリーニングするために使用することができる。同じアッセイを使用して、各種の治療目的に使用できる受容体のアゴニストまたはアンタゴニストを同定することができる。
【００９２】
放射性リガンド結合アッセイは、受容体を発現する細胞から調製した膜を適当な緩衝液、例えば、２．１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、アプロチニン（ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）（０．００５ｍｇ／ｍｌ、Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）およびプロテアーゼ阻害剤としてのベスタチン（ｂｅｓｔａｔｉｎ）（０１．ｍＭ、Ｓｉｇｍａ）を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（０℃でｐＨ７．４）中で希釈して行われる。アッセイにおける最終タンパク質濃度は典型的には１２〜４０μｇ／ｍｌである。
【００９３】
次いで膜は、９６ウェルのマイクロタイタープレートの全体積２５０μｌ中、６０分間、氷上で競合するリガンドの存在または不存在のいずれかで放射性リガンドと一緒にインキュベーションされる。次いで結合したリガンドは、Ｔｏｍｔｅｃ（Ｗａｌｌａｃｅ）真空濾過装置を用いて０．５％ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）中に予備含浸したＧＦ／Ｂフィルターを通す濾過により遊離リガンドから分離される。Ｒｅａｄｙ Ｓａｆｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ）シンチレーション液の添加後、結合した放射能は、Ｔｒｉｌｕｘ（Ｗａｌｌａｃ）シンチレーションカウンター（結合カウントの約４０％計数効率）を用いて定量される。あるいは、結合されたリガンドを捕集し、次いで当該技術分野で周知の手順を用いて受容体からリガンドを分離すると好ましい。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍを用いて非線型曲線にフィッティングされる。
【００９４】
この様式で、受容体に結合するアゴニストまたはアンタゴニスト化合物は、該受容体を発現する細胞の膜タンパク質への放射性標識リガンドの結合をそれらが阻害するとして同定されてもよい。非特異性結合は、使用した放射性リガンドに相当する非標識ペプチドの１００ｎＭの存在下で、膜タンパク質のインキュベーションの後に残留した放射能の量として定められる。平衡飽和結合アッセイにおいて、受容体を用いてトランスフェクションされた膜調製物または無欠（ｉｎｔａｃｔ）の細胞を、標識化合物が濃度を上げて存在する中でインキュベーションして、標識リガンドの結合親和性を決定する。非標識化合物の結合親和性は、置換リガンドの濃度が変化して存在する中で標識化合物を固定された濃度で用いて平衡競合結合アッセイで測定することができる。
【００９５】
特定の態様では、上記の放射性リガンド結合アッセイは、上記に定義した放射性標識オベスタチンを用いて行われる。オベスタチンの標識付けおよび受容体結合は、Ｚｈａｎｇ，Ｊ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．（２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ  ３１０；９９６−９９９）に記載されている。簡単に説明すると；
オベスタチンのヨード化は、イオドゲン（Ｉｏｄｏｇｅｎ、Ｐｉｅｒｃｅ，Ｕｐｌａｎｄ，ＩＮ）法を用いて行われた。ペプチド（２０μｇ）と１ｍＣｉ〔１２５Ｉ〕ＮａＩの混合物を前被覆されたイオドゲンのバイアルに移し、そして４分間インキュベーションした。１２５Ｉ標識したペプチドをＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ）に適用し、その後６０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡを用いて溶出した。放射性リガンド結合アッセイのために、ラット空腸またはその他の組織を緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１０μＭアミジノフェニルメタンスルホニルフルオリド、５ｍｇ／Ｌロイペプチン、１００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．５）を用いて洗浄し、小片に切断し、そして電動ホモジナイザーを用いて均一化した。ホモジネートを１．０００ｇで５分間遠心分離し、そして上清を３００，０００ｇで１時間、２℃で遠心分離した。ペレット（粗膜画分）をＫＣｌを含まない緩衝液Ａに再懸濁し、液体窒素中で迅速に冷凍し、そして使用するまで−８０℃で保存した。組織ホモジネートを、１，０００倍過剰の非標識オベスタチンの存在または不存在下で、種々の濃度の１２５Ｉオベスタチンを用いて、０．１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝化生理食
塩水１００μｌ中で１８時間、室温でインキュベーションした。インキュベーションの後、試験管を１０分間、１０．０００ｇで遠心分離し、そしてペレットを氷冷ＰＢＳ中で２回洗浄した後、γ−分光分析計を用いて放射能を定量した。特異的結合は、全結合から非特異性結合を差し引いて算出した。移動曲線のために、固定濃度の１２５Ｉオベスタチンを、オベスタチンもしくはその他のペプチドの濃度を上げて存在する中、もしくは不存在下でインキュベーションした。
【００９６】
上記の結合アッセイに加えて、該化合物が本発明によるＧＰＲ３９受容体タンパク質の活性を調節すること特徴とする、個体のグルコースコントロールを強化する化合物を同定するための機能アッセイを提供することも本発明の目的である。そのようなアッセイは、（ｉ）ＧＰＲ３９受容体タンパク質の全部または部分を、試験する化合物と接触させ、そして
（ｉｉ）ＧＰＲ３９受容体タンパク質の活性を測定し、ここで、試験化合物の存在下でのＧＰＲ３９活性の変化は炭水化物代謝をモジュレートする化合物の能力の指標である、
工程を含んでなる。
【００９７】
ＧＰＲ３９活性に結合および／またはそれをモジュレートする化合物を同定するためのすべての開示された態様において、炭水化物代謝におけるＧＰＲ３９の観察された関与を考慮して、該アッセイはヒトおよび温血動物を含む個体のグルコースホメオスタシスに影響し得る化合物を同定するために使用できる。
【００９８】
本発明のポリペプチドの活性をモジュレートする化合物とは、ポリペプチドが化合物の不存在の場合とは異なって、化合物の存在下で挙動するように、ポリペプチドの活性を改変する化合物を指す。モジュレートに影響する化合物は、アゴニストおよびアンタゴニストを含む。アゴニストは、ＧＰＲ３９ ＧＰＣＲ機能を活性化する化合物を包含する。あるいは、アンタゴニストは、ＧＰＲ３９ ＧＰＣＲ機能を妨害する化合物を含む。典型的には、アンタゴニストの効果は、アゴニスト誘導の受容体活性化の遮断として観察されるが、しかし最近、構成的活性受容体として記述されたＧＰＲ３９の場合には、ＧＰＲ３９
ＧＰＣＲ機能を妨害する化合物が、逆アゴニスト、すなわち該受容体に対してアゴニストと同じ受容体結合部位に結合するが逆の薬理学的効果を及ぼす作用物質も含む。アンタゴニストは競合的ならびに非競合的アンタゴニストを含む。競合的アンタゴニスト（または競合的ブロッカー）は、アゴニスト結合に特異的な部位とまたはその近くで相互作用する。非競合的アンタゴニストまたはブロッカーは、アゴニスト相互作用部位以外の部位と相互作用することにより、受容体の機能を不活性化する。
【００９９】
従って、個体のグルコースコントロールを強化できる化合物を同定するための方法を提供することが本発明の一つの目的であり、該方法は；
（ｉ）該受容体タンパク質の活性化を可能とする条件下でＧＰＲ３９受容体タンパク質の全部または部分を発現する宿主細胞を、試験する化合物と接触させ、そして
（ｉｉ）ＧＰＲ３９受容体活性における任意の増加を検出し、それにより個体のグルコースコントロールを強化できる化合物として試験化合物を同定する、
ことを含んでなる。
【０１００】
さらなる態様では、本発明はＧＰＲ３９活性を低下できる化合物を同定するための方法を提供し、該方法は；
（ｉ）該受容体タンパク質の活性化を可能とする条件下でＧＰＲ３９受容体タンパク質の全部または部分を発現する宿主細胞を、試験する化合物と接触させ、そして
（ｉｉ）ＧＰＲ３９受容体活性における任意の低下を検出し、それによりヒトまたは動物におけるグルコース耐性を正常化できる化合物として試験化合物を同定する、すなわち試験化合物を、その合併症も含め糖尿病の処置に有用であると同定する、
ことを含んでなる。
【０１０１】
ここでも本明細書中の上に述べた結合アッセイに関して、上記活性アッセイは、炭水化物代謝をモジュレートする化合物を同定するために使用できる。観察された表現型に基づき、ＧＰＲ３９活性を増加する化合物は血中グルコース耐性の低下をもたらすであろうし、そしてＧＰＲ３９活性を低下する化合物は血中グルコース耐性の増加をもたらすであろうことが期待される。特定の態様において、本発明は血中グルコース耐性を低下できる化合物を同定する方法を提供し、該方法は；
（ｉ）該受容体タンパク質の活性化を可能とする条件下でＧＰＲ３９受容体タンパク質の全部または部分を発現する宿主細胞を、試験する化合物と接触させ、そして
（ｉｉ）ＧＰＲ３９受容体活性における任意の増加を検出し、それにより血中グルコース耐性を低下できる化合物として試験化合物を同定する、
ことを含んでなる。
【０１０２】
ＧＰＲ３９活性に対する化合物の効果は、ＧＰＲ３９により媒介される細胞内第二メッセンジャー、例えば細胞内カルシウム、ｃＡＭＰまたはレポーター遺伝子産物の形成の増加または減少であることができる。ＧＰＲ３９は、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）として知られるタンパク質の種類に属する。ＧＰＣＲは、リガンドの結合の際に細胞膜を通過してシグナルを伝達する。リガンド結合ＧＰＣＲは、ヘテロ三量体Ｇタンパク質により媒介される細胞内シグナル伝達イベントを活性化、例えばアデニル酸シクラーゼ経路の活性化またはホスホリパーゼＣ−β経路の活性化を行う。上記の細胞内シグナル伝達イベントの活性化を評価するアッセイは当該技術分野では一般的に既知であり、そしてなかでも、キメラリガンド誘導性転写因子を含んでなるシグナル伝達の細胞に基づくアッセイ、蛍光強度分布分析を用いるＧタンパク質共役型受容体の結合アッセイ、蛍光団に結合する環状ヌクレオチドもしくは多重応答素子を用いるＧタンパク質共役型受容体からの応答の測定を用いる細胞シグナル伝達アッセイまたはｃＡＭＰ応答因子−指令レポーターアッセイを含む。そのようなアッセイの幾つかを以下に記載する。
【０１０３】
本発明は、ＧＰＲ３９ ＧＰＣＲ遺伝子の制御領域を調節する化合物を同定するためのバイオアッセイも提供する。そのようなアッセイは、本発明のポリペプチド（好ましくは配列番号２または配列番号４）を発現できるラットまたはヒト細胞を利用して行われる。細胞は少なくとも１種の化合物と接触さられ、ここで制御領域を調節する該化合物の能力は既知である。その後、細胞は本発明の核酸の発現に関して監視される。あるいは、プロモーターがレポーター遺伝子に連結されてもよい。使用できる適当なレポーター遺伝子は、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子などを含む。
【０１０４】
当業者には理解されているように、本発明のポリペプチドのような受容体の活性をモジュレートする化合物を同定するためのバイオアッセイ法は、一般に対照との比較を必要とする。「対照」の一つのタイプは、化合物に暴露される試験細胞または試験培養物と実質的には同様に処理されるが、対照細胞または培養物が化合物に暴露されない点のみが相違する細胞または培養物である。使用できる対照細胞または培養物の他のタイプは、対照細胞または培養物が機能性ＧＰＲ３９ ＧＰＣＲを発現しない点を除き、トランスフェクションされた細胞と同様の細胞または培養物である。従って、トランスフェクションされた細胞の応答は、同じ反応条件下で同じ化合物に対する対照細胞または培養物のものと比較できる。
【０１０５】
特に好ましいアッセイのタイプは、結合アッセイおよび機能アッセイを含み、それらは以下のように行われる。
【０１０６】
結合アッセイ
細胞株（哺乳動物ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞およびＳｆ９昆虫細胞を含む）内の本発明のポリペプチドをコードする核酸の過剰発現は、リガンド結合研究のための該ポリペプチド（便宜的に本節内ではＧＰＲ３９ ＧＰＣＲと呼ぶ）を有する膜調製物を産生するために使用されてもよい。それらの膜調製物は、通常のフィルター結合アッセイ（例えばＢｒａｎｄｅｌフィルターアッセイ装置を使用）または高処理量シンチレーション近接型結合アッセイ（ＳＰＡおよびＣｙｔｏｓｔａｒ−Ｔフラッシュプレート技術；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で、放射性標識リガンドの結合および結合部位に対する競合物によるそのような放射性リガンドの転置を検出するために使用できる。放射能は、９６−、３８４−、１５３６−マイクロタイターウェル形式から迅速な測定が行えるＰａｃｋａｒｄ Ｔｏｐｃｏｕｎｔ、または同様の装置を用いて測定できる。ＳＰＡ／Ｃｙｔｏｓｔａｒ−Ｔ技術は高処理量スクリーニングに特に適合し、従ってこの技術は標準リガンドを転置できる化合物のスクリーニングに使用するために適している。
【０１０７】
自然な状態に近似した環境内でＧＰＲ３９ ＧＰＣＲタンパク質へのリガンドの結合を研究する別の取り組みは、Ｂｉａｃｏｒｅ装置（Ｍａｌｍｑｖｉｓｔ Ｍ．，ＢｉｏｃｈｅｍＳｏｃ．Ｔｒａｎｓ．１９９９ Ｆｅｂ；２７（２）：３３５−４０）により開発された表面プラズモン共鳴効果を利用する。膜調製物または全細胞内のＧＰＲ３９ ＧＰＣＲはＢｉｏｃｏｒｅのバイオセンサーチップに付き、そして結合部位の競合物を同定するために、化合物の存在または不存在においてリガンドの結合を調査できる。
【０１０８】
機能アッセイ
ＧＰＲ３９ ＧＰＣＲは、通常ＧＩＲＫ（内向き選別カルシウムチャンネル）と相互作用するＧｉまたはＧｏ（阻害性Ｇタンパク質）を介して作用するので、カリウムイオン流出はそれらの受容体の活性化をもたらすであろう。このイオン流出は、特定の化合物のアゴニスト的またはアンタゴニスト的効果を測定する各種の技術を使用してリアルタイムで測定することができる。従って細胞株、すなわち例えばアメリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞内で発現された組換えＧＰＲ３９ ＧＰＣＲ受容体は、全細胞および単一チャンネル電気生理学を用いて特性決定して目的とする化合物の作用機作を決定することができる。ＧＰＲ３９ ＧＰＣＲで活性な化合物に対する電気生理学スクリーニングは、通例の電気生理学技術、そして利用できるようになれば、現在開発中の新規の高処理量方法を用いて行ってもよい。
【０１０９】
蛍光−カルシウムおよびナトリウム流出は、フルオ（ｆｌｕｏ）−３、フルオ−４、フルオ−５Ｎ、フラ（ｆｕｒａ）レッド、ナトリウムグリーン、ＳＢＦＩおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓを含む供給者からのその他同様のプローブを含め、数種のイオン感受性蛍光物質を用いて測定できる。従って、ＧＰＲ３９ ＧＰＣＲの結果としてのカルシウムおよびナトリウム流入は、イメージ分析アルゴリズムと組み合わせたレーザー共焦点法を使用または使用しない蛍光顕微鏡法を含め、蛍光測定および蛍光イメージング技術を用いてリアルタイムで特性を決定することができる。
【０１１０】
別の方法は、カルシウム濃度変化（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）に影響を及ぼすアゴニストまたはモジュレーターのいずれかとして活性な化合物に対する高処理量スクリーニングアッセイである。このアッセイは、蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ（商標）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と呼ばれる装置にほぼ基づく。その最もよくある構成では、それはフルオレセインに基づく色素により発光される蛍光を励起し、そして測定する。それは蛍光団の４８８ｎｍにおける高出力励起を生成するアルゴンイオンレーザー、９６−／３８４−ウェルプレートの底部全体を迅速に走査する光学系および射出された蛍光を捕捉する高感度、冷却ＣＣＤカメラを用いる。それは９６−／３８４−ウェルプレートのウェル内へ試験剤の溶液を送達するための装置を可能とする９６−／３８４−ウェルピペティングヘッドも含む。ＦＬＩＰＲアッセイは、化合物の添加の前、その間およびその後において、リアルタイムですべての９６−／３８４−ウェルから同時に細胞集団からの蛍光シグナルを測定するように設計されている。ＦＬＩＰＲアッセイは、細胞株内で発現される組換えＧＰＲ３９ ＧＰＣＲ、例えばラットまたはヒトのＧＰＲ３９ ＧＰＣＲで機能的に活性な化合物をスクリーニングし、そして特性を決定するために使用することができる。以下に記載のように、ＧＰＲ３９  ＧＰＣＲを用いてトランスフェクションされた細胞内のカルシウム濃度変化は、受容体の天然リガンドを決定するために、種々の基質による受容体の活性化を測定するＦＬＩＰＲアッセイを用いて測定された。
【０１１１】
環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）アッセイ−環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）形成の受容体媒介刺激または阻害は、受容体を発現する細胞内でアッセイすることができる。ｃＡＭＰアッセイの例示的なプロトコールを以下に提示する。
【０１１２】
このプロトコールにおいて、ＣＯＳ−７細胞は、ＤＥＡＥデキストラン法を用いて受容体遺伝子を用いて一時的にトランスフェクションされ、そして９６−ウェルにプレーティングされる。トランスフェクションから４８時間後に、細胞は１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭグルコースおよび５ｍＭテオフィリンを補足したダルベッコのリン酸緩衝塩水（ＦＥＳ）を用いて２回洗浄され、そして同じ緩衝液中、２０分間、３７℃、５％ＣＯ２中でインキュベーションされる。試験化合物を加え、そして細胞をさらに３７℃で１０分間インキュベーションする。次いで培地を吸引除去し、そして１００ｍＭ ＨＣｌを加えて反応を停止する。プレートは−２０℃で２〜５日間、ｃＡＭＰ測定のために保存し、プレートを解凍し、そして各ウェル内のｃＡＭＰ含量をｃＡＭＰシンチレーション近接アッセイ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）により測定する。放射能は、マイクロベータＴｒｉｌｕｘカウンター（Ｗａｌｌａｃ）を用いて定量される。
【０１１３】
微量生理機能測定アッセイ−細胞代謝は広範囲の細胞イベント（多重メッセンジャー経路の受容体活性化を含む）に複雑に関与するので、細胞代謝の微量生理機能測定の使用は、受容体のシグナル伝達経路の特異性とは関係なく、あらゆるオーファン受容体の活性化から生じる細胞活性の包括的なアッセイを提供できる。
【０１１４】
一時的受容体発現、細胞調製および微量生理機能測定記録の一般的ガイドラインは、別の文献に記載されている（Ｓａｌｏｎ，Ｊ．Ａ．ａｎｄ Ｃｗｉｃｋｉ，Ｊ．Ａ．１９９６）。典型的には、受容体を発現する細胞を回収し、そして実験の２４時間前に完全培地内で微量生理機能測定用カプセルあたりに３ｘ１０５個の細胞を接種する。寄せ集めで一定ではない血清因子による非特異性代謝刺激を最小にするために、記録の１６時間前に培地を無血清培地と交換する。実験の日に、細胞カプセルを微量生理機能測定機器に移し、そして記録媒体（低い緩衝液ＲＰＭＩ １６４０、重炭酸水素塩を含まず、無血清（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）、無脂肪酸ＢＳＡ０．１〜１％を含む）内で平衡化し、その間に基礎代謝活性の基線測定が確定する。
【０１１５】
標準的な記録手順は、２分間の全ポンプサイクル（これは酸性化速度（ｒａｔｅ）の測定が行われる３０秒間の中断を含む）で１００μｌ／分の流速を規定している。リガンドチャレンジにはサンプルへの１分２０秒間の暴露を含み、その直後に第１回のチャレンジ後速度測定が行われ、続いて２回の追加のポンプサイクルが全体で５分２０秒間のサンプル暴露に行われる。典型的には、一次スクリーン中の薬剤は、最終濃度１０μＭで細胞に提示される。
【０１１６】
次いで活性化合物の用量依存性を調査するための追跡実験は、閾値から最高レベルまでの範囲の応答を生成するために必要な量を越える薬剤濃度範囲を用いて、細胞を段階的にチャレンジすることにより行われる。次いでリガンドサンプルを良く洗浄し、そして報告された酸性化速度は、チャレンジの直前に観察された基線速度を起こすピーク応答の上昇百分率として表される。
【０１１７】
本発明のポリペプチドの活性をモジュレートすることが見いだされた化合物は、ＧＰＲ３９が炭水化物代謝の調節に関与するという知見に基づき、多数の治療用途を有する。具体的にはこれには１型（インスリン依存性またはＩＤＤＭ）、２型（インスリン非依存性糖尿病）、若年者の成人発症型糖尿病（ＭＯＤＹ）および妊娠糖尿病を含め糖尿病（その随伴する合併症を含む）のような上昇した血中グルコースレベルに関連する疾患を含む。まとめるとＧＰＲ３９  ＧＰＣＲおよび関連する受容体は、様々な治療薬の分野における薬剤の開発のための価値あるツールとして使用することができる。
【０１１８】
結合剤
従って本発明は、本発明に従うアッセイにより得られたモジュラトリー剤を含む新規の結合剤、およびそのような薬剤（ａｇｅｎｔ）を含んでなる組成物をさらに提供する。受容体に結合し、そしてアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有することができる薬剤は、その病理がＧＰＲ３９ ＧＰＣＲ受容体を介する作用を特徴とする上に列挙した特性の疾患を処置する方法に使用することができ、そしてそのような使用は本発明のさらなる観点を形成する。
【０１１９】
この薬剤は、本発明の薬剤の有効量を投与することができる。多数の上に述べた状態は慢性そしてしばしば治療不能なので、「処置」はある期間、例えば数時間、数日または数週間の間の症状の緩和を達成することを含み、そして疾患の経過の進行を遅らせることを含むことを意図するものと理解される。
【０１２０】
そのような薬剤は、製薬学的に許容できる担体または希釈剤と一緒に薬剤を含んでなる組成物に配合することができる。薬剤は生理学的に機能性の誘導体、例えばエステルもしくは塩、例えば酸付加塩もしくは塩基性金属塩またはＮもしくはＳ酸化物の形態でもよい。組成物は、投与に適する経路および手段のために配合することができる。製薬学的に許容できる担体または希釈薬剤は、経口、直腸、鼻、吸入、局所（頬内または舌下を含む）、膣または非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、髄腔内および硬膜を含む）投薬に適する製剤に使用されるものを含む。担体または希釈剤の選択は推薦される投薬経路に依存することは勿論であるが、それは薬剤およびその治療目的に依存するであろう。製剤は都合よく単位剤形として提供され、そして製薬学の技術分野では周知のいずれの方法により調製されてもよい。そのような方法には１もしくは複数の付加成分を構成する担体と有効成分を一緒にする工程を含む。一般に製剤は、有効成分を液状担体もしくは微細に分割された固体担体または双方と均一かつ緊密に混合し次いで、必要な場合には製品に成形して調製される。
【０１２１】
固体組成物には、例えば医薬級のマンニトール、ラクトース、セルロース、セルロース誘導体、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、グルコース、シュクロース、炭酸マグネシウムなどを含む通例の無毒性固体担体を使用することができる。上記に定義された活性化合物は、例えばポリアルキレングリコール、アセチル化トリグリセリドなどを担体として使用して座薬として調剤されてもよい。液状の製薬学的に投与可能な組成物は、例えば上記に定義した活性化合物と場合により製薬学的補助剤とを担体、例えば水、デキストロース塩水、グリセロール、エタノールなどの中に溶解、分散などして調製し、それにより溶液または分散液を形成することができる。所望の場合には、投与される製薬学的組成物は、少量の無毒性助剤、例えば湿潤または乳化剤、ｐＨ
緩衝剤など、例えば酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、トリエタノールアミンナトリウムアセテート、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンなどを含んでもよい。そのような剤形を調製する実際の方法は、当業者には公知であるか、または明らかになるであろうし、例えば「レミントンの製薬科学」（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，第１５版、１９７５）を参照されたい。
【０１２２】
投与される組成物または製剤は、いかなる場合でも、処置される個体の病状を軽減するために有効な量の活性化合物の量を含む。
【０１２３】
０．２５〜９５％の範囲内の有効成分を無毒生担体から成るバランスと共に含む剤形または組成物を調製することができる。
【０１２４】
経口投薬のために、製薬学的に許容できる無毒性組成物は、通常使用される賦形剤、例えば医薬級のマンニトール、ラクトース、セルロース、セルロース誘導体、クロスカルメロース（ｃｒｏｓｓｃａｒｍｅｌｌｏｓｅ）ナトリウム、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、グルコース、シュクロース、マグネシウム、炭酸塩のようないずれかを組み込んで形成される。そのような組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル剤、散剤、徐放性製剤などの形態をとる。そのような組成物は、１〜９５％の有効成分、さらに好ましくは２〜５０％、最も好ましくは５〜８％を含むことができる。
【０１２５】
非経口投与は、一般に皮下、筋肉内または静脈内のいずれかへの注入を特徴とする。注入用薬剤は、慣用の形、液状溶液もしくは懸濁液、注入の前に液体の溶液もしくは懸濁液に適する固体形状で、またはエマルションとしてのいずれかで調製できる。適する賦形剤は、例えば水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどである。さらに所望の場合には、投薬される製薬学的組成物は、少量の無毒性補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤など、例えば酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン、酢酸トリエタノールアミンナトリウムなども含んでもよい。
【０１２６】
そのような非経口組成物中に含まれる活性化合物の百分率は、その特異的な性質、ならびに化合物の活性および個体の必要性に大きく依存する。しかし溶液中０．１％〜１０％の有効成分の百分率で使用可能であり、そして組成物が上記の百分率にその後希釈される固体である場合には、さらに高いであろう。好ましくは組成物は溶液中に０．２〜２％の活性剤を含んでなる。
【０１２７】
したがって本発明の一つの目的は、例えば１型（インスリン依存性またはＩＤＤＭ）、２型（インスリン非依存性糖尿病）、若年者の成人発症型糖尿病（ＭＯＤＹ）および妊娠糖尿病を含め糖尿病（その随伴する合併症を含む）のような個体の減損した炭水化物代謝の処置のための製薬学的組成物を提供することであり、該組成物はＧＰＲ３９受容体アンタゴニストを含んでなる。
【０１２８】
診断用製品 
本発明は；
（ｉ）配列番号２もしくは配列番号４のポリペプチドの全部または部分をコードする核酸配列、
（ｉｉ）配列番号１もしくは配列番号３から成る核酸配列、または
（ｉｉｉ）配列番号１もしくは配列番号３の核酸配列に少なくとも８０％の配列同一性
、そして好ましくは少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％または９８％の配列同一性を有する核酸配列、
からなる群から選択される単離された核酸配列を含んでなる診断用製品も提供する。
【０１２９】
本発明のＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、ｓｉＲＮＡをプローブとして使用することにより、ヒトを含む哺乳動物のＧＰＲ３９受容体またはその部分をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの遺伝子異常を検出することができ、したがってこれらの核酸配列はＧＰＲ３９受容体またはその部分、その突然変異、その過少発現もしくは過剰発現をコードするＤＮＡもしくはｍＲＮＡの傷害に関する有用な遺伝子診断薬である。
【０１３０】
上記の遺伝子診断は例えば公に知られているノーザンハイブリダイゼーションアッセイまたはＰＣＲ−ＳＳＣＰアッセイにより行うことができる。
【０１３１】
ＧＰＲ３９受容体の過少発現が検出される場合、これは個体が例えば随伴する合併症を含むメタボリック症候群のようなＧＰＲ３９受容体の機能不全に随伴する疾患を患っていることを診断することができる。
【０１３２】
ＧＰＲ３９受容体の過剰発現が検出される場合、これは個体が例えば随伴する合併症を含む糖尿病のようなＧＰＲ３９受容体の過剰発現に随伴する疾患を患っていることを診断することができる。
【０１３３】
また本発明はＧＰＲ３９タンパク質の全部または部分を含んでなる診断用製品も提供する。該タンパク質はＧＰＲ３９受容体の過少もしくは過剰発現を診断するために、例えば適切なサンプル、例えば血液サンプル中に検出することができる。
【０１３４】
本発明は、下記の実験の詳細を参照してさらに良く理解できるであろうが、当業者は、それらが以下の特許請求の範囲にさらに完全に記載される本発明の例示に過ぎないことを容易に認めるであろう。さらに本出願中を通して、種々の出版物が引用されている。それら出版物の開示は、本発明が関係する技術分野の状態をさらに完全に記述するために引用により本明細書に編入される。
【実施例】
【０１３５】
実施例
以下の実施例は本発明を具体的に説明する。その他の態様は、これらの実施例を参考にして当業者により認識されるであろう。
【０１３６】
材料および方法
ＧＰＲ３９ノックアウトマウス
ＧＰＲ３９ノックアウトマウスは、Ｌｅｘｉｃｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃから入手した。ＧＰＲ３９のオープンリーディングフレームの破壊は、ＩＲＥＳ ＬａｃＺ／ＭＣｌ−Ｎｅｏレポーター遺伝子／選択カセットを用いて、ＧＰＲ３９遺伝子の第一コーディングエキソンのコード領域を置換して行った。動物は、動物管理のためのすべてのベルギーおよびヨーロッパの要件に適合するＳＰＦ施設内で養育した。マウスは、別途指示しないかぎり飼料および水を自由に摂取できる１２時間明暗サイクル（照明点灯７：００ ＥＳＴ）の空調動物コロニー内に群で収容した。苦痛および不快を最小化するために適切な手段をとった。すべての実験は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ Ｃｏｕｎｃｉｌ Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅｓ（８６／６０９／ＥＥＣ）に従って行い、そして現地倫理委員会で承認された。
【０１３７】
膵臓内のＧＰＲ３９発現の組織学的分布
膵臓はＷＴおよびＧＰＲ３９−／−マウスから摘出し、そして全体に展開する（ｗｈｏｌｅ−ｍｏｕｎｔ）ＬａｃＺ染色を行った。簡単に説明すると、組織を氷上のＰＢＳ溶液に分離し、４℃で２時間、０．５％グルタルアルデヒド（ＰＢＳ中）に固定した。次いで組織を３回、ＰＢＳ中で穏やかに振盪しながらすすいだ。染色は３０℃で一晩、１ｍｇ／ｍｌ  Ｘ−ｇａｌ、５ｍＭ  フェリシアン化カリウムおよび５ｍＭ  フェロシアン化カリウムを補充した染色バッファー中で行った。染色後、組織をＰＢＳ洗浄バッファー中ですすぎ、アルコールで脱水し、キシロール中で清澄化し、パラフィンに包埋し、そして５μｍの切片とした。Ｈａｒｒｉｓ  Ｈ＆Ｅカウンター染色を用いて、または用いずに１０μｍの組織切片について組織学的調査を行った。  
【０１３８】
ＷＴおよびＧＰＲ３９−／−マウスの体重の比較
動物は２２±１℃、１２時間−１２時間の明−暗サイクルで個別にケージに収容した。動物には標準食（２２％タンパク質、４．３％脂質および４％セルロース、フランスのＵ．Ａ．Ｒ．から）を自由に与えた。これら動物の体重は８〜１２週齢から初めて１６〜２０週齢まで追跡した。
【０１３９】
ＷＴおよびＧＰＲ３９−／−マウスを対象とした耐糖負荷試験
ＧＰＲ３９−／−およびＷＴマウス（オスおよびメス）を一晩、絶食させ（５．３０ｐ．ｍ．から始める）、次いで２ｇ／ｋｇのグルコース（最終濃度２００ｍｇ／ｍｌの塩溶液）を皮下注射した。血液サンプルを尾の静脈切開により採取した。最後にベースラインは動物の体重を測定する前に取り、次いでグルコースを測定した。血中グルコース濃度は、グルコース投与から１５、３０、４５、６０、９０および１２０分後にＯｎｅ  Ｔｏｕｃｈ  Ｕｌｔｒａ（Ｌｉｆｅｓｃａｎ  Ｉｎｃ．，米国）により測定した。
【０１４０】
ＷＴおよびＧＰＲ３９−／−マウスを対象とした体組成の比較
体脂肪および体筋肉は、意識があるＧＰＲ３９−／−および野生型マウスを対象として９．００から１１．００ａ．ｍ．の間に定量的核磁気共鳴（ＮＭＲ）（Ｍｉｎｉｓｐｅｃｍｑ１０  ＮＭＲ分析機、Ｂｒｕｋｅｒ，ドイツ）により測定した。これは意識のあるマウスにおける体組成の非侵襲的な迅速な測定に特別に開発された方法である。赤身肉（ｌｅａｎ  ｂｏｄｙ）、体脂肪および流体をＮＭＲにより定量した。動物はＮＭＲ測定の前に体重を測定した。  
【０１４１】
結果
膵臓におけるＧＰＲ３９発現の組織学的分析
手元のＧＰＲ３９−／−マウスでは、第１コードエキソンのコード領域がＬａｃＺレポーター遺伝子に置き換えられているので、我々は膵臓内の内因性ＧＰＲ３９発現パターンの指標としてＬａｃＺ発現を調査した。膵臓では、発現はランゲルハンス島全体、ＧＰＲ３９−／−の膵臓の内分泌部分で検出されたが（図１Ａ）、ＷＴマウスでは検出されなかった（図１Ｂ）。
【０１４２】
ＷＴおよびＧＰＲ３９−／−マウスの体重の比較
これらの動物の体重は、８〜１２週齢から初めて１６〜２０週齢まで追跡した。オスのＧＰＲ３９−／−マウスは対応するオスの野生型マウスよりも体重が増えた（図２）。この週齢の範囲のこれらのメスのマウスでは差異がなかった。
【０１４３】
ＷＴおよびＧＰＲ３９−／−マウスを対象とした耐糖負荷試験
１６時間の絶食期間後、血中グルコースはＷＴマウス（オスおよびメス）と比較してＧＰＲ３９−／−マウス（オスおよびメス）で有意に変化しなかった（１２〜１６週齢）。給餌条件でも、両遺伝子型の間に血中グルコースの差異は観察されなかった（図３）。
【０１４４】
グルコース投与後、血中グルコースはオスのＷＴマウスに比べてオスのＧＰＲ３９−／−マウスで有意に低かった（１２〜１６週齢）（Ｐ＜０．０５）。メスのマウスでは、両遺伝型の間で観察される差異はなかった（１２〜１６週齢）。（図４）。
【０１４５】
ＷＴおよびＧＰＲ３９−／−マウスを対象とした体組成の比較
体組成は１３〜１７および１６〜２０週齢のマウスで測定した。１３〜１６週齢のマウスでは、標準食を給餌した両遺伝型の間に体組成の差異は観察されなかった。３週間後、同じ動物でオスのＧＰＲ３９−／−マウスの体脂肪は、オスの野生型マウスに比べて増加したようであったが（１５．７６±５．３０％対１１．９７±２．６０％）、赤身肉の重量は野生型マウスに比べてオスのＧＰＲ３９−／−マウスで減少したようであった（４１．２２±３．４１％対４３．４５±１．７８％）（図５）。
【０１４６】
考察
野生型の同腹子に比べて両性別のＧＰＲ３９ノックアウトマウスにおいてコレステロールレベルの上昇を示すＧＰＲ３９−／−マウスの表現型分析（公開していないデータ）の結果と共に、ＧＰＲ３９受容体が膵臓組織で高度に発現されるという前述の知見に基づき、血糖症のコントロールにおけるＧＰＲ３９受容体に関する役割の可能性を調査すべきである。血糖症のコントロールにおけるＧＰＲ３９関与の検証は、この受容体が合併症を含む糖尿病およびメタボリック症候群に関連するすべての疾患を処置するための良い標的と確認するものである。これらの理由から、我々の研究目的は最初に膵臓組織中のＧＰＲ３９受容体の位置をｌａｃＺ発現技術を使用して定め、次にＧＰＲ３９−／−マウス  対  ＷＴ同腹子マウスを耐糖負荷試験で試験することであった。これらの結果の相関において、耐糖負荷試験でインスリン濃度の測定をグルコース投与の前後に行い、血糖症のコントロールにおいてＧＰＲ３９が果たす役割を確認する。これらのすべての実験と平行して、体組成もＮＭＲデバイスを用いて測定した。ここでもまた予備結果との相関で、ＷＴ同腹子マウスとの比較におけるＧＰＲ３９−／−マウスの代謝を標準的な代謝ケージの設定で調査することが可能である。
【０１４７】
【表１】
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【０１４８】
【表２】
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【０１４９】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】膵臓でのＧＰＲ３９−ＬａｃＺ発現。ＧＰＲ３９−／−由来の膵臓では、発現は青色の染色が証明するように、ランゲルハンス島（丸）で検出された（図１Ａ、４０ｘ）。ＷＴの膵臓は染色されなかった（図１Ｂ、４０ｘ）。
【図２】８〜１２週齢から１６〜２０週齢のオスおよびメス両方の動物を追跡したＧＰＲ３９−／−およびＷＴマウスの体重の比較。データは平均±ＳＤで表す。
【図３】給餌（Ａ）および絶食（Ｂ）の両条件でオスおよびメスの両方の動物を追跡したＧＰＲ３９−／−およびＷＴマウスにおけるベースライン血中グルコース濃度の比較。
【図４】オスおよびメスの両方の動物を追跡した絶食ＧＰＲ３９−／−およびＷＴマウスの耐糖負荷試験の比較。血中グルコース濃度はグルコース投与から１５、３０、４５、６０、９０および１２０分後に測定し、そしてベースライン値からの変化のパーセントで表した。データは平均±ＳＤで表す。
【図５】オスおよびメスの両方のマウスを追跡したＧＰＲ３９−／−およびＷＴマウスの体組成の比較。脂肪および赤身肉の重量を、体重のパーセントとして表す。データは平均±ＳＤで表す。
【図６Ａ】ヒト（ＮＰ００１４９９）、マウス（ＡＡＨ８５２８５）、ラット（ＸＰ２２２５７８）、イヌ（一部分）（ＸＰ８５３３３２）および畜牛（一部分）（ＸＰ５８９８３６）のＧＰＲ３９タンパク質配列のアライメントである。このアライメントは、ヒトＧＰＲ３９タンパク質配列を最上に、他の種をヒトに対する配列類似性が下がる順に示す。各配列の名前はＮＣＢＩｎｒデータベースの配列寄託番号、遺伝子記号および種の名前を反映している。アライメントにおいて、イヌおよび畜牛の配列は元の公表されたドメイン配列から異なっている；他のＧＰＲ３９配列に対する類似性を欠くＣ−末端のアミノ酸は除いた。争点は削除したアミノ酸が低い質のシークエンシング結果に由来することであった。ヒトの配列は参照として使用され、そしてアミノ酸を灰色に着色した。他の配列のアミノ酸は、ヒトの配列に類似する場合は着色した。
【図６Ｂ】各配列間の同一性、類似性およびギャップを示すマトリックスを提供する。イヌ、畜牛の配列と他のすべての配列との間にはより多くのギャップがあるのは、前者の配列が部分的だからである。重複しているフラグメントに関して、同一性の程度は同一性の％とギャップの％との和である。例えばイヌとヒトでは、重複しているフラグメントに関する同一性の程度は８６％である。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａａ】
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【図６Ａｂ】
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【図６Ａｃ】
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【図６Ｂ】
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【図１】
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【国際調査報告】
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