(57)【要約】  ジアステレオマー混合物の5(RS)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンまたは5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンよりも、トポイソメラーゼＩのより良好な阻害剤である5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンジアステレオマーが記載される。5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンジアステレオマーの医薬組成物、並びにトポイソメラーゼＩの阻害および癌の治療のために該化合物を使用する方法もまた記載される。【選択図】    なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを含まない、5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン。
【請求項２】
光学的に実質的に純粋である、請求項１に記載の5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン。
【請求項３】
98％を超える化学的純度を有する、請求項１に記載の5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン。
【請求項４】
5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンが約1.5％ w/wの量で存在する、請求項１に記載の5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン。
【請求項５】
5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンが約1％ w/w未満の量で存在する、請求項１に記載の5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン。
【請求項６】
5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンが約0.5％ w/w未満の量で存在する、請求項１に記載の5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン。
【請求項７】
5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンが約0.1％ w/w未満の量で存在する、請求項１に記載の5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン。
【請求項８】
5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンの中に式Ｖの化学構造を有するカンプトセシン二量体不純物が約1.5％ w/w未満の量で存在する、請求項１に記載の5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン。
【請求項９】
5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンの中に式Ｖの化学構造を有するカンプトセシン二量体不純物が約1％ w/w未満の量で存在する、請求項１に記載の5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン。
【請求項１０】
5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンの中に式Ｖの化学構造を有するカンプトセシン二量体不純物が約0.1％ w/w未満の量で存在する、請求項１に記載の5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン。
【請求項１１】
細胞中においてトポイソメラーゼＩの活性を阻害する方法であって、該方法は、前記細胞に対して、実質的に5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを含まない阻害有効量の5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを投与することを含んでなる方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記5(S)-(2'- ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンがインビトロで前記細胞に投与される方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法であって、前記5(S)-(2'- ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンがインビボで前記細胞に投与される方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の5(S)-(2'- ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンと、医薬的に許容可能なキャリアとを含有してなる医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の医薬組成物であって、ヒト成人のための該組成物の1回投与量が、約5 mg〜約25 mgの5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを含んでなる組成物。
【請求項１６】
医薬組成物を製造するための5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンの使用であって、該方法は、請求項１に記載の5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを医薬的に許容可能なキャリアと混合することを含んでなる方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを製造する方法であって、該方法は、
ａ）5(RS)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを、n-ブタノールまたはテトラヒドロフランから選択される溶媒と混合する工程と；
ｂ）該混合物を約１〜約４時間還流する工程と；
ｃ）該混合物を約40℃〜約50℃の温度に冷却する工程と；
ｄ）該混合物から、固体の5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを分離する工程
を含んでなる方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載方法であって：更に、
ｅ）前記固体の5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを、n-ブタノールまたはテトラヒドロフランから選択される溶媒で洗浄する工程と；
ｄ）該固体の5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを乾燥して、実質的に5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを含まない5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを得る工程
を含んでなる方法。
【請求項１９】
患者における癌を治療するために5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを使用する方法であって：該方法は、前記患者に対して、有効量の請求項１に記載の5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを投与することを含んでなる方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、前記患者が哺乳類である方法。
【請求項２１】
請求項１９に記載の方法であって、前記患者が人である方法。
【請求項２２】
請求項１９に記載の方法であって、前記5(S)-(2'- ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンが経口で前記患者に投与される方法。
【請求項２３】
請求項１９に記載の方法であって、前記癌が、卵巣癌、骨肉種、白血病、リンパ腫、小細胞性肺癌、非小細胞性肺癌、中枢神経系（CNS）癌、乳癌、結腸直腸癌、腎臓癌、膀胱癌、乳癌、類表皮癌、肺癌、メラノーマ、前立腺癌、子宮癌、軟組織肉腫、膵臓癌および横紋筋肉腫からなる群から選択されるものである方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、前記癌が、大腸癌、卵巣癌および骨肉種からなる群から選択されるものである方法。
【請求項２５】
請求項２３に記載の方法であって、前記癌が、骨肉種、結腸直腸癌および膵臓癌からなる群から選択されるものである方法。
【請求項２６】
請求項２３に記載の方法であって、前記癌が、膀胱癌、乳癌、CNS癌、結腸直腸癌、類表皮癌、肺癌、卵巣癌、メラノーマ、前立腺癌、腎臓癌、および子宮癌からなる群から選択されるものである方法。
【請求項２７】
請求項１９に記載の方法であって、前記5(S)-(2'- ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンが、約0.1〜約10 mg/kg/dayの量で前記患者に投与される方法。
【請求項２８】
請求項１９に記載の方法であって、前記5(S)-(2'- ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンが、約0.1〜約5 mg/kg/dayの量で前記患者に投与される方法。
【請求項２９】
請求項１９に記載の方法であって、前記患者は癌の治療を必要としているものである方法。
【発明の詳細な説明】
【関連の特許および特許出願に対する相互参照】
【０００１】
本発明の主題は、2001年１月23日に発行された米国特許第6,177,439号、並びに本願と同日に出願され、5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンの結晶形態の名称を有し、且つDRF 3.01-031 US の代理人事件番号を有する、共通人に所有されている同時継続の米国非仮特許出願に関連するものであり、これらの各々は、その全体が本明細書の一部として本願に援用される。
【０００２】
本願は、特許協力条約出願であり、2006年5月24日に出願されたインド国仮出願第897/CHE/2006号、および2007年1月31日に出願された米国仮出願第60/887,416号の利益を主張するものであり、これらの各出願は、その全体が本明細書の一部として本願に援用される。
【発明の分野】
【０００３】
本発明は、カンプトセシンの5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンジアステレオマー、および癌の治療のためのその使用に関する。
【関連技術の説明】
【０００４】
カンプトセシン（CPT）は、ウオール等によって中国産の樹木カンプトセカ・アキュミネート（Camptotheca acuminate ）から最初に単離された五環系植物アルカロイドである（Wall et al., J. Am. Chem. Soc, 88: 3888 (1966)）。カンプトセシンの構造は次式Ｉに示される。
【化１】
2009538345.tif 000003
【０００５】
未修飾では、カンプトセシンは高度に親油性であり水溶性に乏しい。水酸化ナトリウムにより水に可溶化されたカンプトセシンナトリウムを用いた初期の臨床試験によって、該化合物は抗新生物活性を有することが示され、更なる研究によって、当該活性はＤＮＡトポイソメラーゼＩの阻害剤としての該化合物の活性に起因するものであることが示された。しかし、カンプトセシンの治療的能力は、毒性の問題および制限された水溶性のために充分には理解されてこなかった。
【０００６】
この化合物のための改善された性質を提供しようとする試みには、カンプトセシンの多くの類似鯛の剛性および試験が含められた。例えば、米国特許第5,004,758号 は水溶性のカンプトセシン類似物を記載し、また米国特許第5,734,056号は カンプトセシン類似体を記載している。カンプトセシン類似体であるトポテカンが、米国特許第5,004,758号および米国特許公開2007/0105885号において議論されている。
【０００７】
20(S)-カンプトセシンの種々の炭素５置換類似体が、米国特許第6,177,439号に記載されている。このような一つの類似体である5(RS)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンは次式ＩＩに示す構造を有している。
【化２】
2009538345.tif 000004
【０００８】
前記6,177,439号特許は、この類似体のジアステレオ異性体混合物［ここでは、5(RS)- (2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン、または 5-(Z-ヒドロキシエトキシ)-20(S)- カンプトセシンと言う］の調製方法を開示している。
【０００９】
5(RS)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンは、五環系構造を有する5-アルコキシ置換された、20(S)-カンプトセシン類似体である。それは炭素５位および炭素２０位にキラル中心を有している。炭素２０のキラル中心は、天然のＳコンフィギュレーションに対応している。しかし、該炭素２０の置換体は、概ね等しい比率でのＲおよびＳジアステレオ異性体を表す。5(RS)-(Z-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンの分子式は、C22H20N2O6である。該化合物は408.41ｇ／モルの分子量および190℃の融点を有する。該ジアステレオ異性体混合物の5(RS)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン、または5-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンは、乏しい水溶性を有する。
【００１０】
5(RS)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンの5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンジアステレオマーは、化学的には5(S)-(2-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンと記載されるのに対して、5(RS)-(2'- ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンの5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンジアステレオマーは、化学的には5(R)-(2’-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンと記載される。5(S)-(2’-ヒドロキシエトキシ)-20(S)- カンプトセシンはまた、化学的には、4-(S)-エチル-4-ヒドロキシ-12(S)-(2-ヒドロキシエトキシ)-1,12-ジヒドロ-4H-2-オキサ-6,12a-ジアザジベンゾ[b,h]フルオレン-3,13-ジオンとも記載され、これは次式ＩＩＩに示される化学構造を有している。
【化３】
2009538345.tif 000005
【００１１】
5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンは、次式ＩＶに示す化学構造を有する。
【化４】
2009538345.tif 000006
【００１２】
一般的に言えば、エナンチオマーである異性体は、対称的な環境に存在するときは、それらが面偏光した光を等しい量で且つ反対方向に回転させる能力を有することを除き、同一の化学的および物理的性質を有する。他方、ジアステレオマー（またはジアステレオ異性体）は、立体異性体ではあるがエナンチオマーではない。ジアステレオマーは、異なる物理的性質および異なる反応性を有することができ、殆どの場合はそうである。もう一つの定義において、ジアステレオマーは、１以上のキラル中心において反対のコンフィギュレーションを有するが、相互に鏡像体ではない異性体である。
【００１３】
従って、上記のことから、これまでその有用性を制限してきた1以上の望ましくない副作用または不利益を低減または回避しながら、癌の治療におけるカンプトセシンの利益を提供することが望ましいことは明らかである。
【発明の概要】
【００１４】
従って、簡単に言えば、本発明は5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン ジアステレオ異性体を実質的に含まない、新規な5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン ジアステレオ異性体 に向けられている。
【００１５】
本発明はまた、細胞におけるトポイソメラーゼIの活性を阻害する新規な方法に向けられており、該方法は、前記細胞に対して、トポイソメラーゼIを阻害する有効量の、実質的に5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン ジアステレオ異性体を含まない5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン ジアステレオ異性体を投与することを含んでなるものである。
【００１６】
本発明はまた、上記で述べた5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシント、医薬的に許容可能なキャリアとを含有してなる新規な医薬組成物に向けられている。
【００１７】
本発明はまた、医薬組成物を製造するために5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを使用する新規方法であって、上記の5(S)- (2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを 医薬的に許容可能なキャリアと混合することを含んでなる方法に向けられている。
【００１８】
本発明はまた、上記の5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン を製造する方法に向けられており、該方法は、
ａ）5(RS)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを、n-ブタノールまたはテトラヒドロフランから選択される溶媒と混合する工程と；
ｂ）該混合物を約１〜約４時間還流する工程と；
ｃ）該混合物を約40℃〜約50℃の温度に冷却する工程と；
ｄ）該混合物から、固体の5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを分離する工程 を含んでなるものである。
【００１９】
本発明はまた、患者における癌を治療するために 5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを使用する新規な方法に向けられており、該方法は、前記患者に対して、有効量の上記5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを投与することを含んでなるものである。
【００２０】
本発明により達成されることが見出された幾つかの利点のうち、癌の治療において、カンプトセシンの利点を提供する一方、その有用性を制限してきた望ましくない副作用または欠点の1以上を低減または回避する方法および組成物の提供が注目される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンの一つのサンプルのHPLCクロマトグラムを示している。
【図２】図２は、5(S)- (2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン.のもう一つのサンプルのHPLCクロマトグラムを示している。
【好ましい実施形態の詳細な説明】
【００２２】
本発明に従って、5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン ジアステレオ異性体は、ジアステレオ異性体混合物の 5(RS)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン、または 5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン ジアステレオ異性体よりも、顕著に良好なトポイソメラーゼＩ阻害剤であることが見出された。
【００２３】
事実、5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンは、5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンよりも20倍以上強く、またジアステレオ異性体混合物である 5(RS)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンより殆ど12倍以上強い。
【００２４】
更に、5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンジアステレオ異性体は、ジアステレオ異性体混合物の5(RS)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン、または5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンジアステレオ異性体よりも、腫瘍および癌細胞の増殖の良好な阻害剤であることが示されている。
【００２５】
しかし、予想に反して、5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン ジアステレオ異性体の増大した抗癌活性には、正常なヒト細胞に対する毒性の相応する増大を伴わない。事実、5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン-5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンジアステレオ異性体の癌細胞に対する能力を、健康なヒト細胞におけるそのインビトロ毒性と比較したときに、安全性マージン（GI90/GI50）は、5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンジアステレオ異性体のそれの２倍以上である。
【００２６】
更に、5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンジアステレオ異性体の存在は、5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンジアステレオ異性体の生体利用性に対して負の影響を有する。結局、癌の治療のためには、実質的に5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンジアステレオ異性体を含まない5(S)-(2'- ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンジアステレオ異性体を患者に投与するのが有利である。
【００２７】
本発明を説明するために、ここで、一定の用語を次のように定義する。
【００２８】
「5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン」の用語は、より活性の高いラクトン形態の5(S)-(2'- ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンだけでなく、より活性の低いカルボキシレート形態（これから形成される何れかの塩を含む）をもカバーすることを意図している。
【００２９】
「阻害する」の用語およびその変形は、ここに記載した方法を介して測定できる、トポイソメラーゼＩ活性のような細胞活性の何らかの減少を意味する。
【００３０】
「医薬的に許容可能な」の用語は、以下で更に詳細に定義するが、適切な医学的判断の範囲内において、過大な毒性、刺激、アレルギー応答等を伴わずに、ヒトおよび下等動物の組織と接触させて使用するのに適し、合理的な利益／リスク比に相応し、且つ添えれの目的とする用途のために効果的な、活性剤、水和物、溶媒和物、塩、多形、キャリア等を言う。
【００３１】
ここで使用し且つ以下で更に詳細に定義する「固体」、「対象」および「患者」の用語は、そのための診断、処置または治療が望ましい何れかの動物を言う。ここで用いる「動物」の語は、ヒトおよび他の動物、並びに他の動物を言う。
【００３２】
ここで使用する状態、障害、疾病または症状の「治療をすること」および「治療」の用語は、（１）当該状態、障害、疾病または症状に罹患し、またはそれらの素因をもっているが、未だ当該状態、障害、疾病または症状の臨床的もしくは副臨床的症候群を経験または呈示していない患者において発生する、当該状態、障害、疾病または症状の臨床症候群の出現を予防または遅延させること、（２）当該状態、障害、疾病または症状を阻害すること、即ち、当該疾患またはその少なくとも一つの臨床的または副臨床的症候群の発生を停止または低減すること、または（３）当該疾患を緩和すること、即ち、当該状態、障害、疾病または症状の退行、或いはその臨床的もしくは副臨床的趣向群の少なくとも一つの退行を生じさせることを意味する。治療すべき患者への利益は、統計的に有意であるか、或いは少なくとも患者および／または医師が認識できる。
【００３３】
ここで使用し且つ以下で更に詳細に定義する「有効量」および「治療的有効量」の用語は、状態、招待、疾患または症状を治療するために患者に投与されたときに、このような治療を行うために充分な化合物の量を言う。有効量または治療的有効量は、化合物、疾患およびその重篤度、並びに治療すべき固体の年齢、体重、身体状態および応答性に応じて変化するであろう。
【００３４】
ここで使用し且つ以下で更に詳細に定義する「送達する」および「投与する」の用語は、治療的有効量の活性剤を患者内の１以上の特定の場所に提供して、前記特定の場所に活性剤の治療的有効濃度を生じさせることを意味する。これは、例えば、以下で更に詳細に述べるように、活性成分のホストへの局部投与または全身投与によって達成することができる。
【００３５】
ここで使用する「組成物」の用語は、特定の物質を含有する製品、並びに前記特定の成分の組合せから直接的もしくは間接的に生じる何等かの製品を意味する。以下で更に詳細に説明する「医薬組成物」は、活性物質と、不活性または活性な１以上の医薬的に許容可能なキャリアの組合せを含むものであり、該キャリアは、当該組成物をインビボ、インビトロまたはエキスビボでの診断もしくは治療のために適したものにする。該組成物はまた、安定剤、保存剤、アジュバント、充填剤、風味剤および他の賦形剤を含むことができる。
【００３６】
カンプトセシンに関してここで使用するとき、「炭素-5位」の用語は、上記式ＩＩに示した 5(S)-(2-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンの化学構造の第5位に存在する炭素原子を意味し、また「炭素-20位」の用語は、上記式ＩＩに示した 5(S)-(2-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンの化学構造の第20位に存在する炭素原子を意味する。
【００３７】
ここで使用するとき、この説明の全体を通して、化学的には「5(S)-(2'- ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン」とは、「4(S)-エチル-4-ヒドロキシ- 12(S)-(2-ヒドロキシエトキシ)-1 , 12-ジヒドロ-4H-2-オキサ-6, 12a-ジアザ- ジベンゾ[b,h]フルオリン-3, 13-ジオン」として知られる 「5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)- 20(S)-カンプトセシン」を意味する。 
ここで使用するとき、この説明の全体を通して、「5(R)-(2'- ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン」とは、化学的には「4(S)-エチル-4-ヒドロキシ- 12(R)-(2-ヒドロキシエトキシ)-1, 12-ジヒドロ-4H-2-オキサ-6, 12a-ジアザ- ベンゾ[b,h]フルオリン-3, 13-ジオン」として知られる「5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)- 20(S)-カンプトセシン」を意味する。 
ここで使用するとき、この説明の全体を通して、「5(RS)-(2'- ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン」とは、化学的には「4(S)-エチル-4-ヒドロキシ-12(RS)-(2-ヒドロキシエトキシ)- 1 , 12-ジヒドロ-4H-2-オキサ-6, 12a-ジアザ-ジベンゾ[b,h]フルオリン-3, 13-ジオン」として知られる「5(RS)-(2'-ヒドロキシエトキシ)- 20(S)-カンプトセシン」または「5-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを意味する。
【００３８】
ここで使用する「約」の用語は、測定された量を言うときには、測定を行い且つ或るレベルの注意を払う当業者が予測するであろう測定品質が測定の目的および測定装置の精度に相応しいことにおいて、測定された量における正常な変動を意味する。
【００３９】
「実質的に含まない」の用語は、以下で定義する。
【００４０】
'439号特許の実施例26は、R-およびS-ジアステレオマー、即ち、5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンおよび5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンの混合物である、5-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンの調製を記載している。今回、5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンは、5(R)-(2'- ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンおよび5(RS)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンに比較して、一定の予測されない改善された性質を有することが発見された。上記で簡単に述べたように、発明者は、5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンが、例えば毒性、インビトロ抗腫瘍活性、生体利用性およびトポイソメラーゼＩ阻害を含む幾つかの重要な特性において、ジアステレオマー混合物の5(RS)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンとは異なることを見出した。
【００４１】
更に今回、実質的に5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを含まない5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンは望ましい抗癌性医薬化合物であることが分かった。
【００４２】
本発明の一つの側面は、実質的に5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを含まない5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンである。
【００４３】
5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンが実質的に5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを含まないと言うとき、それは5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンおよび5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンの両方を含有する化合物中に存在する5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンの量が、存在する5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンおよび5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンの合計量の約２重量％未満であることを意味する。5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンの量は、約1.5％w/w未満であることができ、または約1％未満であることができ、また約0.5％未満であるとができ、更には0.1％w/w未満であることができる。
【００４４】
この側面の変形において、本発明の化合物は実質的に光学的に純粋である。この側面の一実施形態において、該化合物は、98％を超える全体的な化学純度を有する。
【００４５】
本発明のもう一つの実施形態においては、約1.5％未満の式Ｖに示したカンプトセシンへテロ二量体を含有する5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンが提供され、或いは、それは約1％未満の式Ｖのヘテロ二量体、或いは約0.8％未満のヘテロ二量体、更には約0.5％未満のヘテロ二量体、また約0.1％未満のヘテロ二量体を含有してよく、これらは全て全てw/wベースである。
【化５】
2009538345.tif 000007
もう一つの側面では、実質的に5(R)-(2'- ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを含有しない、5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを調製する方法が提供される。この方法は、
ａ）5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンの溶解度の方が5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンの溶解度よりも大きい有機溶媒（n-ブタノールまたはテトラヒドロフランを使用することができる）中の、5(RS)-(2'- ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンの溶液および／または懸濁液を提供する工程と；
ｂ）該溶液および／または懸濁液を加熱する工程と；
ｃ）該溶液および／または懸濁液を冷却して、沈殿を形成させることと；
ｄ）該沈殿を単離して、前記実質的に5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを含まない5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを得る工程
を含んでなるものである。
【００４６】
この方法は、前記溶液および／または懸濁液を還流させることを備えてなる加熱工程を含んでよい。この方法は更に、単離された沈殿を追加の有機溶媒を用いて還流させることを含んでよい。
【００４７】
特に、この5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを製造する方法は、
ａ）5(RS)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを、n-ブタノールまたはテトラヒドロフランから選択される溶媒と混合する工程と；
ｂ）該混合物を約１〜約４時間還流する工程と；
ｃ）該混合物を約40℃〜約50℃の温度に冷却する工程と；
ｄ）該混合物から、固体の5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを分離する工程を具備することができる。
【００４８】
より純粋な5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン生成物が望ましければ、当該方法は更に、
ｅ）前記固体の5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを、n-ブタノールまたはテトラヒドロフランから選択される溶媒で洗浄する工程と；
ｄ）該固体の5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを乾燥して、実質的に5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを含まない5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを得る工程
を含むことができる。
【００４９】
もう一つの側面において、本発明は、細胞内でトポイソメラーゼＩ活性を阻害する方法であって、前記細胞に対して、実質的に5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを含まないある量の5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを投与することを含んでなり、前記量はトポイソメラーゼＩを阻害するのに充分である（「トポイソメラーゼＩ阻害有効量」）方法を包含する。標的細胞は癌であってよく、投与はインビトロまたはインビボで行われてよい。
【００５０】
発明者は、5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンが、例えば毒性、インビボ抗腫瘍活性、生体利用性およびトポイソメラーゼＩ阻害を含む幾つかの重要な特性において、ジアステレオマー混合物の5(RS)-(2'- ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンとは異なることを見出した。更に、実質的に5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを含まない5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンは、望ましい抗癌性医薬化合物であることも発見された。
【００５１】
本発明において、5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンは、癌を治療する目的のために当業者に周知の薬物送達の標準経路に従って投与される。
【００５２】
5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンは、純粋な化合物として、または医薬的に活性な塩の形態で供給することができる。例示的な医薬的に許容可能な塩は、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、メシル酸、ステアリン酸、サリチル酸、p-ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボン酸（パモ酸）、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、トルエンスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、スルファニル酸、シクロヘキシルアミンスルホン酸、エタンスルホン酸、アルギン酸、β-ヒドロキシ酪酸、ガラクタル酸、およびガラクツロン酸から調製される。
【００５３】
本発明の化合物の適切な医薬的に許容可能な塩基付加塩には、金属イオン塩および有機イオン塩が含まれる。より好ましい金属イオン塩には、適切なアルカリ金属（第Ia族）の塩、アルカリ土類金属（第IIa族）の塩、および他の生理学的に許容可能な金属イオンの塩が含まれるが、これらに限定されない。このような塩は、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムおよび亜鉛のイオンから製造することができる。好ましい有機塩は、三級アミンおよび四級アンモニウム塩から製造することができ、その一部にはトリエチルアミン、ジエチルアミン、N,N-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コロン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（N-メチルグルカミン）およびプロカインが含まれる。全ての上記塩は、対応する本発明の化合物から従来の手段によって当業者が調製することができる。
【００５４】
本発明の5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンは、医薬組成物を形成するために、医薬的に許容可能なキャリアおよび賦形剤（ここでの「キャリア」および「賦形剤」は何れの用語で記述されることもできる）中に提供される。医薬的に許容可能なキャリアおよび賦形剤には、生理食塩水、リンゲル氏溶液、リン酸塩溶液もしくは緩衝液、緩衝塩水、および当該技術において知られた他のキャリアが含まれるが、これらに限定されない。医薬組成物はまた、安定化剤、抗酸化剤、着色剤および希釈剤を含有してもよい。医薬的に許容可能なキャリアおよび添加剤は、当該医薬化合物からの副作用が最小化されるように、また治療が無効であるような範囲にまで当該化合物の特性が相殺もしくは阻害されないように選択される。
【００５５】
本発明の一実施形態において、5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを含有する医薬組成物は、必要に応じて、5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを実質的に含まない。
【００５６】
この医薬組成物は、典型的には0.1〜 50％ w/w、好ましくは1〜20％ w/wの活性な5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン化合物を含有し、該組成物の残部は医薬的に許容可能なキャリア、希釈剤または溶媒である。好ましくは、該医薬組成物は適切な量の活性化合物、例えば、所望の目的を達成するために有効な量の活性化合物を含有する単位投与量形態である。
【００５７】
本発明の医薬組成物は、経腸的および／または非経腸的に投与されてよい。経口（胃内）投与は好ましい投与経路である。本発明の方法のための医薬的に許容可能なキャリアは、錠剤、カプセル、ピル、および顆粒を含む固形投与量形態であることができ、これらはコーティングおよびシェル、例えば当該技術において周知のエンテリックコーティング等を伴って調製することができる。経口投与のための液体投与量形態には、医薬的に許容可能なエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシールが含まれる。
【００５８】
非経腸的投与には、皮下投与、筋肉内投与、皮内投与、乳房内投与、静脈内投与、および当業者に既知の他の投与方法が含まれる。経腸的投与には、溶液、錠剤、持続放出型カプセル、エンテリックコートされたカプセル、およびシロップが含まれる。投与されるとき、該医薬組成物は体温またはそれに近い温度であってよい。
【００５９】
経口使用を目的とした組成物は、医薬組成物の製造のための当該技術で既知の何れかの方法に従って調製されてよく、また斯かる組成物は、医薬的に上品でかつ味のよい製剤を提供するために、甘味剤、風味剤、着色剤、および保存剤からなる群から選択される1以上の物質を含有してよい。錠剤は、錠剤の製造に適した無毒の医薬的に許容可能な賦形剤との混合物中に活性成分を含有する。これらの賦形剤は、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、乳糖、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムのような不活性な希釈剤、顆粒化剤および崩壊剤（例えばトウモロコシ澱粉もしくはアルギン酸）結合剤（例えば澱粉、ゼラチンもしくはアカシア）、および潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸もしくはタルク）であってよい。該錠剤はコーティングされなくてもよく、或いは、それらは胃腸管内での崩壊および吸収を遅延させて長期に亘る持続的作用を提供するために、既知の技術によってコーティングされてもよい。例えば、グリセリルモノステアレート、グリセリルジステアレートのような時間遅延材が用いられてよい。
【００６０】
経口使用のための処方はまた、5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンが不活性な固形希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウムもしくはカオリンと混合される硬質ゼラチンカプセルとして、或いは、活性成分がそれ自体として、または水もしくは油性媒質、例えばピーナッツ油、液状パラフィンもしくはオリーブ油と混合されて存在する軟質ゼラチンカプセルとして提示されてよい。
【００６１】
水性懸濁液の製造に適した賦形剤との混合物の中に5(S)-(2'- ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを含有する水性懸濁液を製造することができる。このような賦形剤は懸濁剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル-セルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカンスガム、アカシアがムである；分散剤または湿潤剤は、天然に存在するホスファチド（例えばレシチン）、またはアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物（例えばステアリン酸ポリオキシエチレン）、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪アルコールとの縮合生成物（例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール）、またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール由来の部分エステルルとの縮合生成物（例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート）、エチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール無水物由来の部分エステルとの縮合生成物（例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）であってよい。
【００６２】
この水性懸濁液はまた、1以上の保存剤（例えばp-ヒドロキシ安息香酸エチルもしくはn-プロピル）、1以上の着色剤、1以上の風味剤、または1以上の甘味剤（例えば蔗糖もしくはサッカリン）を含有してもよい。
【００６３】
油性懸濁液は、5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを、オメガ-3脂肪酸、植物油（例えばアカシア油、オリーブ油、ゴマ油、もしくはココナツ油）、または鉱油（例えば液体パラフィン）の中に懸濁させるとによって処方されてよい。該油性懸濁液は濃化剤、例えば蜜蝋、硬質パラフィン、もしくはセチルアルコールを含有してよい。
【００６４】
水性懸濁液の調製に適した分散性の粉末および顆粒は、水の添加により、分散剤もしくは湿潤剤、懸濁剤および1以上の保存剤との混合物中の5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを与える。適切な分散剤もしくは湿潤剤、および懸濁剤は、上記で既述したものにより例示される。追加の賦形剤、例えば甘味剤、風味剤および着色剤もまた存在してよい。
【００６５】
5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンおよびこれを含んでなる組成物は、非経腸的に投与されてよく、皮下、または静脈内、または筋肉内、または胸骨内の何れかにより、或いは滅菌注射用の水性懸濁液もしくはコラーゲン懸濁液の形態で注入技術によって投与することもできる。このような懸濁液は、上記で記述した適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤、または他の許容可能な物質を使用して、既知の技術に従って処方すればよい。この滅菌注射製剤はまた、無毒の非経腸的に許容可能な希釈剤もしくは溶媒中の、滅菌注射溶液もしくは滅菌注射懸濁液、例えば1,3-ブタンジオール中の溶液であってもよい。用いてよい許容可能な担体および溶媒の中には、水、リンゲル氏溶液および等張塩化ナトリウム溶液がある。加えて、滅菌の不揮発油が溶媒または懸濁媒質として慣用的に用いられる。この目的のために、合成のモノグリセリドもしくはジグリセリドを含む何れかのブランドの不揮発油が用いられよい。加えて、n-3ポリ不飽和脂肪酸が、注射可能な製剤の調製に使用されてよい。
【００６６】
投与はまた、ネブライザ用のエアロゾルもしくは溶液の形態で吸入によって、或いは薬物を適切な非刺激性の賦形剤（これは常温で固形であるが直腸温度では液体であり、従って直腸内で溶融して薬物を放出する）と混合することにより調製された座薬の形態で、経直腸的にも行うことができる。このような賦形剤の材料は、ココアバター、およびポリエチレングリコールである。
【００６７】
バッカルまたは「舌下」投与もまた本発明に包含され、これには、ここに記載した当該化合物を含有するロゼンジまたは咀嚼可能なガムが含まれる。該化合物は風味付けされた基材、通常は蔗糖およびアカシアもしくはトラガカンスの中に沈着させることができ、またゼラチンおよびグリセリンまたは蔗糖およびアカシアのような不活性基材の中に該化合物を含有する香錠とすることができる。
【００６８】
局所的送達系もまた本発明に包含され、これには軟膏、粉末、スプレー、クリーム、ジェル、洗眼剤、溶液または懸濁液が含まれる。
【００６９】
粉末は、湿った表面に固着し、結果的に長期に亘り活性なまま残ることができる利点を有している。従って、粉末は癌、例えば耳導管内の癌を治療するために特に魅力的である。同じ理由で、クリームもまた有効な医薬的に許容可能なキャリアである。
【００７０】
本発明の組成物は、任意に、例えば粘度向上剤、保存剤、表面活性剤および浸透増強剤のような追加の薬剤を補充することができる。
【００７１】
このような粘性発生剤には、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、または当業者に既知の他の薬剤が含まれる。このような薬剤は、典型的には0.01重量％〜2重量％のレベルで用いられる。
【００７２】
保存剤は、使用の際の微生物汚染を防止するために任意に用いられる。適切な保存剤には、ポリクアテルニウム-1（polyquaternium-1）、塩化ベンザルコニウム、チメロサール、クロロブタノール、メチルパラベン、プロピルパラベン、フェニルエチルアルコール、エデテート二ナトリウム、ソルビン酸または当業者に既知の他の薬剤が含まれる。抗菌剤としてのポリクアテルニウム-1の使用が好ましい。典型的には、このような保存剤は0.001重量％〜1.0重量％のレベルで用いられる。
【００７３】
本発明の組成物の成分の溶解度は、該組成物中の表面活性剤または他の適切な共溶媒によって向上されてよい。このような共溶媒には、ポリソルベート20、60および80、ポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレン表面活性剤（例えばプルロニックF-68、F-84およびP-103）、シクロデキストリン、または当業者に既知の他の薬剤が含まれる。典型的には、このような共溶媒は0.01重量％〜2重量％のレベルで用いられる。
【００７４】
医薬的に許容可能な賦形剤およびキャリアには、上記の全部等が包含される。有効な処方剤および投与方法に関する上記の考察は当業者に周知であり、標準の教科書に記載されている。例えば、Gennaro, A. R., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, (Lippincott, Williams and Wilkins), 2000；Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton Pennsylvania, 1975；Liberman, et al., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980；および Kibbe, et al., Eds., Handbook of Pharmaceutical Excipients (3rd Ed.), American Pharmaceutical Association, Washington, 1999を参照されたい。
【００７５】
本発明の目的のためには、5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンの量が該化合物の有効量を含んでいるのが好ましい。従って、本発明は癌、新生組織形成および／新生組織形成関連の疾患または障害（ここでは、これらを一緒に「癌」と称する）を予防または治療する方法を包含し、ここでの治療はそのような予防または治療を必要としている患者に対して与えることができ、該方法はここに記載した5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)- カンプトセシンの有効量を患者に投与することを含んでなるものである。
【００７６】
5(S)-(2'- ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンの有効量または投与量/
を決定する際には、診断医師によって多くの因子が考慮され、これには使用される化合物の作用の能力および持続時間、治療すべき病気の性質および重得度、並びに治療される患者の性別、年齢、体重、一般的健康状態、個々の応答性、および他の関連状況が含まれるが、これらに限定されない。癌の治療または予防に使用するために必要とされる5(S)- (2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンの量は広範囲に変化し、また各々の特定の場合における個々の要件に適合するように調節されるであろう。
【００７７】
何れの化合物についても、治療的に有効な投与量は、最初は細胞培養または動物モデルにおいて推定することができる。治療的に有効な投与量とは、症状またはその症候群を緩和する活性化合物の量を意味する。細胞培養物または動物モデルにおける治療効果および毒性は、標準の方法によって決定すればよい（例えば、ED50：集団の50％において治療的に有効な投与量；LD50：集団の50％において致死的な投与量）。細胞培養物および動物モデルから得られたデータは、次いで、患者において使用するための化合物の投与量範囲を定式化するために使用することができる。
【００７８】
一般に、成人に対する投与については適切な1日投与量がここに記載されるが、そのほうが得策であれば、好ましいとして特定される限界を超えてもよい。1日投与量は、1回投与量として、または分割された投与量として投与することができる。投与量は文献［Goodman & Goldman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Edition (1996), Appendix II, pp. 1707-1711］からの指針を用いて決定してよいことを、当業者は理解するであろう。典型的な推奨される投与量計画は、一般には約0.01 mg/kg/day〜約50 mg/kg/day、または約0.05 mg/kg/day〜約25 mg/kg/day、または約0.1 mg/kg/day〜約10 mg/kg/day、または約0.1 mg/kg/day〜約5 mg/kg/day、または更に約0.2 mg/kg/day〜約3 mg/kg/dayの範囲に亘るであろう。
【００７９】
一つの実施形態において、当該結晶性5(S)-CPTは、カプセル当たり約1 mg〜約1000 mg、或いはカプセル当たり約2 mg〜約500 mgまたは約5 mg〜約250 mgの5(S)-CPTの5(S)-CPTを含有する経口投与のための硬質ゼラチンカプセルとして提供することができる。5(S)-CPTが投与される患者が平均体重約70kgのヒト成人であるとき、5(S)-CPTの1日投与量は、約0.01 mg/kg/day〜約50 mg/kg/day、または約0.05 mg/kg/day〜約25 mg/kg/day、または約0.1 mg/kg/day〜約10 mg/kg/day、または約0.1 mg/kg/day〜約5 mg/kg/day、または更に約0.2 mg/kg/day〜約3 mg/kg/dayであることができる。
【００８０】
ここで使用するとき、治療の目的のための「患者」の用語は、如何なる患者も含むものであり、癌の治療を必要としている患者であることができる。ここで使用するとき、「それを必要とする患者」の用語は、癌に罹患しているか、または癌の素因のある何れかの患者を意味する。「それを必要とする患者」の用語は、低投与量の従来の癌治療剤を必要とする何れかの患者を意味する。加えて、「それを必要とする患者」の用語は、従来の治療剤の副作用低減を必要としている何れかの患者を意味する。更に、「それを必要とする患者」の用語は、癌治療のための従来の何れかの治療剤に対する改善された耐容性を必要とする何れかの患者を意味する。
【００８１】
患者は、典型的には動物であり、更に典型的には哺乳類である。ここで使用する「哺乳類」の用語は、ヒト、家畜、動物園の動物、スポーツ動物またはペット動物として分類される何れかの動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ等を意味する。患者はまた、癌を発症するリスク、または癌の再発のリスクがあるヒト患者であってよい。
【００８２】
本発明の方法および組成物は、幾つかの癌の治療または予防のために使用されてよく、これら癌には卵巣癌、骨肉種、白血病、リンパ腫、小細胞性肺癌、非小細胞性肺癌、中枢神経系（CNS）癌、乳癌、結腸直腸癌、腎臓癌、膀胱癌、乳癌、類表皮癌、肺癌、メラノーマ、前立腺癌、子宮癌、軟組織肉腫、膵臓癌および横紋筋肉腫が含まれるが、これらに限定されない。
【００８３】
本発明の化合物および製剤は、大腸癌、卵巣癌および骨肉種の治療のためにも使用することができる。
【００８４】
本発明の化合物および製剤はまた、骨肉種、結腸直腸癌および膵臓癌の治療のためにも使用することができる。
【００８５】
以下の実施例は本発明の好ましい実施形態を記載するものである。ここでの特許請求の範囲内の他の実施形態は、明細書またはここに開示された発明の実施を考慮することから当業者に明らかになるであろう。明細書は、実施例と共に例示のみを目的としたものと看做されるべきであり、本発明の範囲および精神は特許請求の範囲によって示されるものである。以下の実施例において、全てのパーセンテージは、他に指示しない限り重量ベースで与えられる。
【００８６】
実施例１
この例は、5(RS)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンジアステレオ異性体混合物と比較し、また5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンジアステレオ異性体と比較したときの、5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンの予測されない改善されたトポイソメラーゼI阻害活性を示す。
【００８７】
＜5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン、5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)- カンプトセシン、および5(RS)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンの調製＞：
米国特許第6,177,439号の例26に記載されたようにして調製された5(RS)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンのサンプル（75グラム）をn-ブタノール（約600 mL）中に懸濁させ、2〜3時間に亘って還流させた。この反応塊の温度を約１時間に亘って約40〜50℃にまで低下させ、得られた個体物質を濾過し、n-ブタノール（約15〜20 mL）で洗浄し、約50-55℃で減圧下に乾燥して、5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを実質的に含まない固体の5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを得た。該生成物は、n-ブタノール中で反復して還流することにより更に富化されて、実質的に5(R)-CPTを含まない5(S)-CPTを得た（一般的には2〜4回；収量25〜35グラム）。
【００８８】
n-ヘプタンを滴下添加し、続いて10μヌッチェフィルタを使用して濾過することにより、母液から5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンを単離した。
【００８９】
米国特許第6,177,439号の例26に記載されたようにして、5(RS)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン（ジアステレオマー混合物）を得た。
【００９０】
＜トポイソメラーゼI試験＞：
トポイソメラーゼIは、特定の部位においてＤＮＡに一時的な切り目を導入する。これら一時的なＤＮＡの切れ目の検出には、タンパク質変性剤を使用して、切り目の入った中間複合体中のＤＮＡ上に当該酵素をトラップすることを必要とする。得られた共有結合したＤＮＡ／トポI複合体は、切れ目の入って開いた環状ＤＮＡを含んでおり、これはアガロースゲル電気泳動（臭化エチジウムを用いて）によって検出することができる。しかし、切り目の入った中間体をトラップすることは比較的非効率的であり、天然物であるカンプトセシンのような阻害剤が中間体を安定化させて、切り目の入ったＤＮＡ産物の増大を導く。これは、切り目の入った中間複合体を安定化させることによりトポイソメラーゼに影響を与える物質の検出を可能にするように設計された、機構的な薬物スクリーニングのための基礎を形成する。
【００９１】
TopoGEN（登録商標）トポI薬物スクリーニングキット（Topogen, Inc., Port Orange, FL）は、研究者が、トポイソメラーゼの新規な阻害剤を迅速に同定することを可能にするように設計される。該キットは、切り目の入った中間体を安定化させるか、さもなければトポイソメラーゼIの触媒活性を阻害する新規な化合物の検出を可能にする。
【００９２】
＜使用したアッセイキット＞：TopogenR 薬物スクリーニングキット
製造業者              ：TOPOGEN、Cat No: 1018 .
各反応混合物は下記を含有する：
ａ．1O×反応緩衝液： 2 μL 
ｂ．TOPO I酵素    ： 2 μL
ｃ．pHOT I DNA     ： 1.2 μL (0.5μg) 
ｄ．水            ： 14.8 μL
ＤＭＳＯ中の薬物  ： 1 μL
合計              ： 20 μL
＜プロトコル＞
上記の反応混合物を、37℃で30分間インキュベートする。該反応を、2μLの10％ＳＤＳを添加することにより停止させ、該混合物を迅速にボルテックスで撹拌する（管を冷却すると切り目を入れたＤＮＡが再度閉じる可能性があるので、ＳＤＳは37℃の間に添加すべきである）。1O×色素、約2.5μL／管を添加し、等容積のクロロホルムおよびイソアミルアルコールの混合物（24：1）を加え、13000rpmで10分間遠心する。サンプルを1％アガロースゲル上に載せ、80ボルトで1時間電気泳動させる。該ゲルをＵＶ光透過器で観察し、バンドの濃度測定評価を計算する。
【００９３】
＜計算＞：
超螺旋形態および緩和形態のＤＮＡバンドの濃度を、濃度計を使用して測定した。治療群（単一濃度の試験薬物で）および薬物なし群（即ち、対照群）のバンド強度を記録した。超螺旋形態のＤＮＡと比較したときの緩和形態のＤＮＡのパーセンテージを、治療群および対照群を含む全てのレーンについて計算した。
【００９４】
トポイソメラーゼ活性の阻害％を、次のようにして計算した：
＝（100-(100×(対照における1/％阻害)×治療群における％阻害)）。
【００９５】
表１は、これら試験の結果を示し、また相互に実質的に他方を含まない5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンおよび5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンのインビトロでのトポイソメラーゼＩ活性を、5(RS)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンの活性と比較して示している。
【００９６】
表１： 5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン、5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンおよび5(RS)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンのトポイソメラーゼＩ活性
化合物                                              ＩＣ50（μM）
5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン         1.65
5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン         22
5(RS)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン        12.5        。
【００９７】
この結果は、トポイソメラーゼIの阻害において、5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンは、5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンよりも約21倍活性であり、また5(RS)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンよりも約12倍活性であることを示している。このような活性における相違は、特に酵素活性におけるE環の重要性が知られているので、ジアステレオマーの間の構造的相違に基づいては予想されなかったであろう。
【００９８】
実施例２
この例は、5(RS)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンの活性と比較したときの、ヌードマウスにおけるNCI-H460（ヒト小細胞性肺癌）異種移植片に対する5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンの抗腫瘍活性を示している。
【００９９】
5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンおよび5(RS)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンのサンプルは、実施例１に記載したようにして提供された。 
＜ヌードマウスでの、NCI-H460異種移植片に対する5(RS)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンおよび5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンの比較研究のプロトコール＞：
NCI-H460異種移植片研究を行うために、〜60 mm3の計量されたNCI-H460 腫瘍片を、雌の胸腺欠損マウスにおける背側脇腹（dorsal lateral flanks）のスペースに移植し、増殖を開始させた。腫瘍が〜150-1000 mm3に成長したとき、動物を五つの群にランダムに分けた後、治療を開始した。各グラムの5(RS)-CPTを処方して、102.65 mgの活性化合物、801.62 mgのヒドロキシプロピルβシクロデキストラン、80.62 mgの無水デキストロース、および13.33 mgの炭酸ナトリウムを含有させた。各グラムの5(S)-CPTを処方して、105.57 mgの活性化合物、800.99 mgのヒドロキシプロピルβシクロデキストラン、80.13 mgの無水デキストロース、および 13.34 mgの炭酸ナトリウムを含有させた。各グラムのプラセボを処方して、895.2 mgのヒドロキシプロピルβシクロデキストラン、89.52 mgの無水デキストロース、および14.9 mgの炭酸ナトリウムを含有させた。各々の処方を2 mLの滅菌水の中に溶解し、経口経路を通して、(dx5)2スケジュールで投与した。腫瘍直径を、ノギスを使用して１週間に２回測定した。
【０１００】
腫瘍が楕円であると仮定し、次式を使用して腫瘍体積を計算した：
Ｖ＝（Ｄｘｄ２）／２
ここで、Ｖ（ｍｍ３）は腫瘍体積であり、Ｄはｍｍでの最長直径であり、ｄはｍｍでの最短直径である。各治療群（Ｔ）および対象群（Ｃ）の腫瘍体積の変化（Δ）は、特定の観察日における平均腫瘍体積から治療第１日における平均腫瘍体積を差引くことによって計算した。これらの値は、次式を使用して成長パーセンテージ（％T/C）を計算するため使用された：
％Ｔ／Ｃ＝（ΔＴ／ΔＣ）ｘ１００；  ここで、ΔＴ＞０、
または
％Ｔ／Ｃ＝（ΔＴ／ΔＴｉ）ｘ１００；  ここで、ΔＴ＜０
および
Ｔｉは、平均腫瘍体積である。
【０１０１】
次いで、腫瘍増殖阻害パーセンテージ（％ＴＧＩ）を、式 ：％ＴＧＩ＝１００−％ＴＣを使用して計算した。
【０１０２】
約150 - 800 mm3と計測された皮下腫瘍を有する全てのマウスを、(dx5)2スケジュールを使用して経口投与による試験化合物で治療した。腫瘍直径を、ノギスを使用して１週間に２回測定し、腫瘍が楕円であると仮定して、次式を使用して腫瘍体積を計算した：
Ｖ＝（Ｄｘｄ２）／２
ここで、Ｖ（ｍｍ３）は腫瘍体積であり、Ｄはｍｍでの最長直径であり、ｄはｍｍでの最短直径である。各治療群（Ｔ）および対象群（Ｃ）の腫瘍体積の変化（Δ）は、特定の観察日における平均腫瘍体積から治療第１日における平均腫瘍体積を差引くことによって計算した。これらの値は、次式を使用して成長パーセンテージ（％T/C）を計算するため使用された：
％Ｔ／Ｃ＝（ΔＴ／ΔＣ）ｘ１００；  ここで、ΔＴ＞０、
または
％Ｔ／Ｃ＝（ΔＴ／ΔＴｉ）ｘ１００；  ここで、ΔＴ＜０
および
Ｔｉは、治療開始時における平均腫瘍体積である。
【０１０３】
腫瘍増殖阻害パーセンテージ（％ＴＧＩ）は、式 ：％ＴＧＩ＝１００−％Ｔ／Ｃを使用して計算した。腫瘍の退行は、腫瘍体積が63 mm3未満にまで低下することなく、治療開始時の腫瘍体積の50％以下にまで減少したときには部分的として定義される。完全な退行は、腫瘍体積が測定可能な限界未満（＜63 mm3）に低下した場合に定義される。
【０１０４】
各動物の開始日の体重に比較した体重変化のパーセンテージは、次式を使用して計算された：
体重変化パーセンテージ
＝［（特定の観察日の体重―開始日の体重）／開始日の体重］×１００
観察された他のパラメータは死亡率であった。
【０１０５】
試験の結果を表２示す。ここでは、二つの試験化合物の各々および対照についての腫瘍増殖阻害および死亡率が示されている。
【０１０６】
表２：  NCI-H460 (ヒト小細胞性肺癌)異種移植片を有するヌードマウスの腫瘍増殖阻害および死亡率に対する5(S) -(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンおよび 5(RS) -(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン の効果
化合物                        投与量（mg/kg）  腫瘍増殖阻害％    死亡率
5(S) -(2'-ヒドロキシエトキシ)     ２                68              0/5
-20(S)-カンプトセシン             ４                76              0/5
5(RS)-(2'-ヒドロキシエトキシ)     ２                60              0/5
-20(S)-カンプトセシン            ４                64              0/5  。
【０１０７】
この試験データは、ジアステレオ異性体混合物5(RS)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンよりも、5(S) -(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンの方が、NCI-H460 (ヒト小細胞性肺癌)異種移植片に対して更に良好なインビボ活性を示したことを示している。表２に示すように、5(RS) -(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンの投与に比較して、5(S) -(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンの投与は同一の投与量において、死亡率の増大を伴うことなく予測し得ない優れた腫瘍増殖阻害を導いた（2 mg/kgにおいて68％ vs 60％、および4 mg/kgにおいて76％ vs 64％）。
【０１０８】
実施例３
この例は、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）試験でのインビトロ細胞増殖の阻害における、5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン vs. 5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンの効力を示している。
【０１０９】
5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンおよび5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンのサンプルは、実施例１に記載したようにして提供された。
【０１１０】
＜インビトロ細胞増殖試験のためのプロトコール＞
細胞増殖はスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）試験によって評価され、ここでは染色後の細胞に結合した色素の量が細胞増殖の尺度を与える。本明細書の一部として援用するJNCI, vol 83, No.1 1 , June 5, 1991を参照されたい。
【０１１１】
簡単に言えば、細胞（膀胱癌、乳癌、ＣＮＳ癌、大腸癌、類表皮癌、肺癌、卵巣癌、メラノーマ、前立腺癌、腎臓癌、および子宮癌により表される３４のヒト癌細胞株）を、ウエル当り10000細胞の濃度で96ウエルの細胞培養プレートに播種し、CO2インキュベータ中において37℃でインキュベートした。24時間後、培地中において、0.05％の最終濃度までのDMSO中に溶解した異なる濃度の試験化合物で処理し、48時間露出させた。氷冷した50％のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を添加し、4℃で１時間インキュベートすることにより細胞を固定した。該プレートを蒸留水で洗浄し、空気乾燥し、室温において10分間ＳＲＢ溶液（1％酢酸中の0.4％ wt/vol）で染色した。1％酢酸で充分に洗浄することにより未結合SRBを除去し、該プレートを空気乾燥した。結合したSRB染色を10 mMのTris緩衝液で可溶化し、分光光度計プレート読取り器において515 nmの単一波長で光学密度を読取った。薬物添加時に、ゼロ時間（薬物を添加したとき）における細胞増殖についての別の参照プレートもまた、上記のようにして測定した。光学濃度から、次式を使用して増殖パーセンテージを計算した：
ＴがＴ０以上であれば、
増殖パーセンテージ＝１００×［（Ｔ−Ｔｏ）／（Ｃ−Ｔｏ）］  
ＴがＴ０未満であれば、
増殖パーセンテージ＝１００×［（Ｔ−Ｔ０）／Ｔ０）］  
ここで、Ｔは試験の光学密度であり、Ｃは対照の光学密度であり、Ｔ０はゼロ時の光学密度である。
【０１１２】
増殖パーセンテージから、投与量応答曲線を作成し、該増殖曲線からＧＩ５０値を補間した。表３はこの結果を示している。
【０１１３】
表３：  5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン vs 5
(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンのＧＩ５０値
化合物                                              ＧＩ５０値
5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン        5.0
5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン        14.6        。
【０１１４】
この試験結果は、5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンジアステレオマーが、この試験における細胞増殖に対して、5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンよりも殆ど３倍活性であることを示した。
【０１１５】
実施例４
この例は、幾つかの骨肉腫の腫瘍モデルにおける5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンの効力を示している。
【０１１６】
5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンおよび5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンのサンプルは、実施例１に記載したようにして提供された。
【０１１７】
この試験は、Cancer Res., Oct. 15:64(2)7491-9 (2004)、およびClin. Cancer Res., Nov. 15:9(15):5442-53 (2003)に記載された方法を使用して行われた。
【０１１８】
直径約0.2〜1 cmと計測された皮下（「ｓｃ」）腫瘍を有する全てのマウスを、[(dx5)2]3 スケジュールを使用して、経口投与により試験化合物で治療した。ノギスを使用して腫瘍直径を７日間毎日測定し、また腫瘍は球形であると仮定すると共に、式［Π/6) x d3］を使用して腫瘍体積を計算した。ここでのｄは平均直径である。試験化合物に対する腫瘍応答は次のように定義された：個々の腫瘍について、部分的な退行（ＰＲ）は、体積減少＞50％であるが、全ての時点で測定可能な腫瘍を持つものとして定義された。完全な退行（ＣＲ）は、治療の開始後12週間以内の幾つかの時点における、測定可能な腫瘍塊の消失として定義された。持続するＣＲは、12週の研究時間フレーム内において腫瘍再増殖がないこととして定義される。全ての研究が少なくとも12週間持続されるので、この時点が選択された。12週間の研究機関の終了前で且つ応答を達成する前に死亡したマウスは、腫瘍応答がなかったものと見なした。その結果（28 mg/kgの投与量）が、表４に提示されている。
【０１１９】
表４：マウス腫瘍退行モデルにおける5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン vs. 5(RS)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンの効果
異種移植片    5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)    5(RS)-(2'-ヒドロキシエトキシ) 
-20(S)-カンプトセシン          -20(S)-カンプトセシン  
骨肉腫29                6+                          5+
骨肉腫17                6+                          4+
骨肉腫2                 6+                          5+
骨肉腫32                6+                          3+
6+ ；維持された完全な退行
5+ ；完全な退行
4+ ；部分的な対抗
3+ ；安定な疾病
表４のデータによって示されるように、維持された完全な退行（6+）が四つの全ての異種移植株において達成されたことに示されるように、5(S) -(2'-ヒドロキシエトキシ)- 20(S)-カンプトセシンの投与は、5(RS) -(2'-ヒドロキシエトキシ)- 20(S)-カンプトセシンの投与に比較して予測しなかった優れた結果を導いた。 
実施例３および４で与えられたデータは、5(S) -(2'-ヒドロキシエトキシ)- 20(S)-カンプトセシンが、幾つかの試験モデルにおいて予測しなかった優れた活性／能力を有することを示している。更に、5(S) -(2'-ヒドロキシエトキシ)- 20(S)-カンプトセシンは5(R) -(2'-ヒドロキシエトキシ)- 20(S)-カンプトセシンよりも実質的に更に強力である一方、思いがけないことに、この能力の増大には対応する毒性の増大を伴わない。
【０１２０】
実施例５
この例は、5(S)--(2'-ヒドロキシエトキシ)- 20(S)-カンプトセシン vs. 5(R)--(2'-ヒドロキシエトキシ)- 20(S)-カンプトセシンのヒト骨髄毒性を示している。
【０１２１】
5(S)--(2'-ヒドロキシエトキシ)- 20(S)-カンプトセシンおよび5(R)--(2'-ヒドロキシエトキシ)- 20(S)-カンプトセシンのサンプルは、実施例１に記載したようにして提供された。
【０１２２】
＜ヒト骨髄試験のためのプロトコール＞
この試験のために、Iscove's MDM 中のメチルセルロース、ウシ胎児血清、ウシ血清アルブミン、2-メルカプトエタノール、L-グルタミン、rh幹細胞因子、rhGM-CSFおよびrhIL-3を含有するMethocult（登録商標）GF（Cat No: H4534, Poietics, Biowhittakar, USA）培地を使用した。ヒト骨髄単球（Cat No.2M-125C, Poietics, Biowhittakar, USA）をMethocult（登録商標）GFと混合し、細胞密度を3 x 105 cells/mLに調節した。この標品から500μLのアリコートを作製し、各アリコートに2.5μLの2O×薬物溶液または担体を添加し、充分に混合した。100μLのクローン原性培地を各ウエルにプレーティングし、該プレートを4℃で15分間ゲル化させた。プレートを、インキュベータ中で、充分に加湿された5％CO2雰囲気中において37℃で14日間インキュベートした。CFU-GMコロニーを、50細胞以上の凝集体として、倒立顕微鏡の下で計数した。コロニー阻害パーセンテージを、次式を使用して計算した：
100−［(薬物処理ウエル中のコロニー数／対照ウエル中のコロニー数)×100］
二つのジアステレオマーの癌細胞株に対するインビトロ能力を、健康な細胞におけるそれらのインビトロ毒性と比較した。表５は、ヒト細胞における骨髄毒性比較研究の結果を提示している。
【０１２３】
表５：インビトロの人骨髄細胞についての5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンおよび5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンのＧＩ90
化合物                                                  ＧＩ90
5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン            0.69
5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン            0.89
表３および表５に示したデータを参照すると、5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンは、予想に反して、34種のヒト癌細胞株（膀胱癌、乳癌、ＣＮＳ癌、大腸癌、類表皮癌、肺癌、卵巣癌、メラノーマ、前立腺癌、腎臓癌、および子宮癌を含む）に対して、5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンよりも殆ど３倍強力であるが、両ジアステレオマーの毒性は同等であることを見ることができる。実際のところ、表６に示すように、安全性マージンは、抗癌活性についてのGI50に対するヒト細胞毒性についてのGI90の比率として評価されるならば、予想に反して、5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンが癌の治療のための医薬化合物として5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンおよび5(RS)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンよりも優れていることは明らかである。換言すれば、5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン化合物は、R-ジアステレオマーおよびジアステレオマー混合物に比較して、癌の治療に関して増大した効力を有している。事実、患者に与えられる5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン中に存在する5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンの量を最小化することが、思いがけず重要である。
【０１２４】
表６：  5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンおよび 5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンについての、抗癌活性GI50に対するヒト細胞毒性GI90の比率
化合物                                  安全性マージン（GI90／GI50）
5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)                0.14
-20(S)-カンプトセシン              
5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)                0.06
-20(S)-カンプトセシン                                。
【０１２５】
実施例６
この例は、ラットおよびマウスにおける5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンの生体利用性に対する、5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンの存在の影響を示している。
【０１２６】
5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン（「5(S)-CPT」）および5(RS)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン（「5(RS)-CPT」）のサンプルは、実施例３に記載したようにして提供された。
【０１２７】
＜雄ウィスターラットにおける生体利用性＞
経口薬物動態学を評価するために、5(S)-CPT（2.5 mg/kg）および5(RS)-CPT（5 mg/kg、混合物の中に2.5 mg/kgの5(S)-CPTを含む）を雄ウィスターラットに投与した。
【０１２８】
6〜8週齢で体重205〜218gの雄ウィスターラットをラット４匹の群に分けた。一晩絶食させた条件で経口薬物動態学的試験を実施し、また食餌供給条件において静脈内での薬物動態学を実施した。試験薬物は経口胃管栄養法により、または側方尾内静脈注射により溶液として投与した。約250マイクロリットルの低密度血液サンプルを、設計された時点で、後部眼窩血管叢（retro-orbital plexus）から25マイクロリットルのEDTAを含む微小遠心管の中に回収した。血液を12,800 rpmで2分間遠心分離することにより血漿を分離し、分析時まで冷蔵した。
【０１２９】
試験薬物の存在について、次のようにしてサンプルを試験した。100μLの血漿（8℃で保存）のアリコートを、合計（ラクトン＋炭酸塩）を評価するために、400μLの冷メタノールで沈殿させた。2分間の混合および12,800 rpmで4分の遠心の後に、透明な上清を300μLの自動サンプラー瓶の中に分離し、この混合物20μLをHPLC分析のための分析カラム上に注入した。試験薬物の濃度を、ブランクのラット血漿の中に既知濃度の試験薬物をスパイクすることによって、プロットされた線形性から計算した。試験薬物の薬物動態学は、非区画化分析（non-compartmental analysis）を使用して計算された。この研究の結果が表７に提示されている。
【０１３０】
表７：雄ウィスターラットにおける5(S)-CPTの経口薬物動態学パラメータ
化合物                      投与量                      AUC(o-t)μM＊h
5(S)-CPT                    5 mg/kg                      5.76
5(RS)-CPT                   5 mg/kg                      5.08
（2.5 mg/kgの5(S)-CPT 
＋ 2.5 mg/kgの5(R)-CPT）
5(RS)-CPTにおける          2.5 mg/kg                      1.21
5(S)-CPTの寄与                                  。
【０１３１】
＜スイスアルビノマウスにおける生体利用性＞：
5(S)-CPT（2.5 mg/kg）および 5(RS)-CPT（5 mg/kg、該混合物の中に2.5 mg/kg の5(S)-CPTを含む）を、経口薬物動態学を評価するためにスイスアルビノマウスに投与した。 
3〜6週齢で体重28〜34gのスイスアルビノマウスを研究に使用した。研究毎に12匹のマウスを使用した。一晩絶食させた条件で経口薬物動態学的試験を実施し、また食餌供給条件において静脈内での薬物動態学を実施した。試験薬物は経口胃管栄養法により、または側方尾内静脈注射により溶液として投与した。約250マイクロリットルの低密度血液サンプル（sparse blood samples）を、設計された時点で、後部眼窩血管叢（retro-orbital plexus）から25マイクロリットルのEDTAを含む微小遠心管の中に回収した。血液を12,800 rpmで2分間遠心分離することにより血漿を分離し、分析時まで冷蔵した。
【０１３２】
試験薬物の存在について、次のようにしてサンプルを試験した。100μLの血漿（8℃で保存）のアリコートを、合計（ラクトン＋炭酸塩）を評価するために、400μLの冷メタノールで沈殿させた。2分間の混合および12,800 rpmで4分の遠心の後に、透明な上清を300μLの自動サンプラー瓶の中に分離し、この混合物20μLをHPLC分析のための分析カラム上に注入した。試験薬物の濃度を、ブランクのラット血漿の中に既知濃度の試験薬物をスパイクすることによって、プロットされた線形性から計算した。試験薬物の薬物動態学は、非区画化分析を使用して計算された。この研究の結果が表８に提示されている。
【０１３３】
表８：スイスアルビノマウスにおける5(S)-CPTの経口薬物動態学パラメータ
化合物                      投与量                      AUC(o-t)μM＊h
5(S)-CPT                    5 mg/kg                      5.18
5(RS)-CPT                   5 mg/kg                      5.20
（2.5 mg/kgの5(S)-CPT 
＋ 2.5 mg/kgの5(R)-CPT）
5(RS)-CPTにおける          2.5 mg/kg                      1.10
5(S)-CPTの寄与                                  。
【０１３４】
表７および表８を参照すると、「5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンの寄与」とは、RSジアステレオマー混合物においてS-ジアステレオマーに帰することができる曲線下の面積（「ＡＵＣ」）である。表７および表８から分るように、5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンの存在は、予想に反して望ましい5(S)-CPTジアステレオマーの生体利用性を減少させる。更に、このような予想に反した望ましいジアステレオマーの生体利用性の減少は、ヒト患者においても観察されるであろう。上記に基づいて、本発明者等は、5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンにおけるRジアステレオマー の量を最小化することが望ましいことを認識した。
【０１３５】
実施例７
この例は、BCRP変異体および乳癌耐性タンパク質（BCRP）を過剰発現するSaos-2細胞に対する、5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン vs. 5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンおよび5(RS)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンの効力を示す。
【０１３６】
5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン、5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンおよび5(RS)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンのサンプルは、実施例１に記載したようにして提供された。 
＜乳癌耐性タンパク質（BCRP）試験のためのプロトコール＞
機能的BCRP #4および非機能的BCRP mut#10を過剰発現するSaos-2に対する5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンおよび5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンの抗癌効果を、ラセミ体5(RS)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンに対して評価した。ヒト骨肉腫細胞株のSaos-2は、ATCC（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、Cat#HTB-85, Manassas, VA）から入手し、10％ウシ胎児血清、1％ペニシリン／ストレプトマイシン、および2 mM グルタミンを含有するDMEM中で維持した。Saos-2細胞にBCRP#4をトランスフェクトして機能的BCRPを過剰発現させ、またはBCRP#10をトランスフェクトして非機能的BCRPトランスポータを過剰発現させた。この細胞を、各ウエル当たり1000細胞の密度で、0.1 mLの培地中の96ウエルプレートに播種して一晩付着させた。翌朝、培地を穏やかに吸引し、試験すべき化合物の連続希釈液を添加した。細胞を、5％ CO2インキュベータ中において37℃でインキュベートした。試験薬物への6日間に亘る露出の後、10μLのアラマー青（Alamar blue）を各ウエルに無菌的に添加し、該プレートを6時間の間前記インキュベータに戻した。産生された蛍光色素の量を、530 nmの励起波長および590 nmの発光波長を使用して、Cytofluor 2300（Millipore, Bedford, MA）上で測定した。得られた相対的な蛍光単位を使用して、未処理の対照値に対する各濃度における増殖パーセンテージを計算した。この増殖パーセンテージ値から、ＩＣ50（対照細胞増殖に比較して50％の細胞増殖を阻害するのに必要な阻害濃度）値を誘導した。得られたＩＣ50値が、表９に提示されている。
【０１３７】
表９：BCRP変異体および乳癌耐性タンパク質（BCRP）を過剰発現するSaos-2
細胞に対する、5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン、5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンおよび5(RS)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンのＩＣ50値
薬物                                              ＩＣ50（nM）
BCRP mut#10          BCRP #4
5(RS)-CPT(2'-ヒドロキシエトキシ)            387                  1256
-20(S)-カンプトセシン
5(S) -CPT(2'-ヒドロキシエトキシ)             213                   788
-20(S)-カンプトセシン
5(R)-CPT(2'-ヒドロキシエトキシ)            1299                  ＞2000    。
【０１３８】
-20(S)-カンプトセシン
表９に示したように、5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンは、BCRP変異体ならびにBCRPを過剰発現するSaos-2に対するその細胞障害活性に関して、5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンおよび5(RS)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンよりも優れている。これらの結果は、BCRP mut#10およびBCRP #4の両者に対する細胞障害性の順位が、5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン＞5(RS)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシン＞5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンであったことを示している。5(S)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンは、5(R)-(2'-ヒドロキシエトキシ)-20(S)-カンプトセシンよりも、BCRP mut#10 およびBCRP#4を過剰発現するSaos-2 細胞に対して、それぞれ〜6倍および＞2.5倍細胞障害性であった。
【０１３９】
特定の実施形態を参照して本発明を説明してきたが、これらの実施形態は単に、本発明の原理および応用を示すに過ぎないものであることが理解されるべきである。従って、例示した実施形態には、特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲を逸脱することなく多くの変形がなされてよく、また他の構成が考案されてよいことが理解されるべきである。
【０１４０】
明細書に引用された多くの刊行物（全ての論文、刊行物、特許、特許出願、プレゼンテーション、テキスト、報告、手書き原稿、パンフレット、書籍、インターネットポスティング、雑誌論文、定期刊行物等を含むが、これらに限定されない）は、その全体を本明細書の一部として援用される。ここでの引用文献の議論は、それらの著者によってなされた主張を単に要約することを目的としており、何れかの引用文献が先行技術を構成することを認めるものではない。出願人は、引用文献の正確さおよび適切さに反論する権利を留保するものである。
【０１４１】
上記を考慮すれば、本発明の幾つかの利点が達成され、且つ幾つかの有利な結果が得られることが分かるであろう。
【０１４２】
当業者は、本発明の範囲を逸脱することなく、上記の方法および組成物において種々の変更を行うことができるであろうから、上記の記述に含まれる全ての事項および添付図面に示された事項は、例示として解釈されるべきであり、限定的意味で解釈されるべきではないことが意図されている。加えて、種々の実施形態の側面は、全体としてまたは部分的に、相互に交換され得るものであることが理解されるべきである。
【図１】
2009538345.tif 000008
【図２】
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【国際調査報告】
2009538345.tif 000010