(57)【要約】  性腺刺激ホルモン効果の阻害のための抗体組成物および方法が提供される。それを必要とする哺乳動物の被験体に該抗体組成物を投与することによる、癌を処置するための方法および受胎能を調節する方法が提供される。
2009504659.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２記載の重鎖可変領域のアミノ酸配列、または配列番号：２と少なくとも９０％の相同性のあるアミノ酸配列を含む、ヒト絨毛性ゴナドトロピンと結合する、単離されたモノクローナル抗体。
【請求項２】
配列番号：４記載の重鎖可変領域のアミノ酸配列、または配列番号：４と少なくとも９０％の相同性のあるアミノ酸配列を含む、ヒト絨毛性ゴナドトロピンと結合する、単離されたモノクローナル抗体。
【請求項３】
抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、分泌性ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ抗体であるところの、請求項２記載の抗体。
【請求項４】
抗体が、ＩｇＧ１κまたはＩｇＧ１λアイソタイプであるところの、請求項１記載の抗体。
【請求項５】
抗体が、ＩｇＧ４κまたはＩｇＧ４λアイソタイプであるところの、請求項１記載の抗体。
【請求項６】
抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、分泌性ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ抗体であるところの、請求項１記載の抗体。
【請求項７】
抗体が、ＩｇＧ１κまたはＩｇＧ１λアイソタイプであるところの、請求項２記載の抗体。
【請求項８】
抗体が、ＩｇＧ４κまたはＩｇＧ４λアイソタイプであるところの、請求項２記載の抗体。
【請求項９】
抗体が、ヒト、ヒト以外の霊長類、ラビット、ラットまたはマウス、あるいはそれらの組み合わせであるところの、請求項１記載の抗体。
【請求項１０】
抗体が、ヒト、ヒト以外の霊長類、ラビット、ラットまたはマウス、あるいはそれらの組み合わせであるところの、請求項２記載の抗体。
【請求項１１】
軽鎖可変領域および重鎖可変領域のアミノ酸配列を含み、その重鎖可変領域が、配列番号：２もしくは配列番号：４記載のアミノ酸配列、または配列番号：２もしくは配列番号：４記載のものと少なくとも９０％の相同性のあるアミノ酸配列である、ヒト絨毛性ゴナドトロピンと結合する、単離されたモノクローナル抗体。
【請求項１２】
抗体が、次の１つまたは複数の特徴：（ｉ）インビトロでＢＸＰＣ−３脾臓癌細胞の増殖を阻害すること；および（ｉｉ）インビトロでＭＣＦ−７乳癌細胞またはＨｅＬａ細胞の増殖を阻害しないことを有するところの、請求項１１記載の抗体。
【請求項１３】
アナライトとして組換えヒト絨毛性ゴナドトロピンを、そしてリガンドとして抗体を用いる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定される、約１０−８Ｍもしくはそれ未満の解離平衡定数（ＫＤ）を有する、請求項１１記載の抗体。
【請求項１４】
抗体が、約１０８Ｍ−1もしくはそれより高い結合能でもって、ヒト絨毛性ゴナドトロピンと結合しうるところの、請求項１１記載の抗体。
【請求項１５】
真核細胞においてグリコシル化されている、無傷の抗体、無傷のＩｇＧ１抗体、無傷のＩｇＧ２抗体、無傷のＩｇＧ３抗体、無傷のＩｇＧ４抗体、無傷のＩｇＭ抗体、無傷のＩｇＡ１抗体、無傷のＩｇＡ２抗体、無傷の分泌型ＩｇＡ抗体、無傷のＩｇＤ抗体、または無傷のＩｇＥ抗体であるところの、請求項１１記載の抗体。
【請求項１６】
抗体断片または一本鎖抗体であるところの、請求項１１記載の抗体。
【請求項１７】
（ｉ）リンカーペプチドを介して可変部の軽鎖アミノ酸配列と融合され、免疫グロブリンのヒンジ領域ポリペプチドと融合された、配列番号：２記載の可変部の重鎖アミノ酸配列、または配列番号：２と少なくとも９０％の相同性のある可変部の重鎖配列、（ｉｉ）該ヒンジ領域に融合された免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域、および（ｉｉｉ）該ＣＨ２定常領域に融合された免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域を含む、結合ドメイン免疫グロブリン融合蛋白質であるところの、請求項１１記載の抗体。
【請求項１８】
（ｉ）リンカーペプチドを介して可変部の軽鎖アミノ酸配列と融合され、免疫グロブリンのヒンジ領域ポリペプチドと融合された、配列番号：４記載の可変部の重鎖アミノ酸配列、または配列番号：４と少なくとも９０％の相同性のある可変部の重鎖配列、（ｉｉ）該ヒンジ領域に融合された免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域、および（ｉｉｉ）該ＣＨ２定常領域に融合された免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域を含む、結合ドメイン免疫グロブリン融合蛋白質であるところの、請求項１１記載の抗体。
【請求項１９】
少なくとも１０１０Ｍ−１の平衡結合定数（Ｋａ）でもって、所定の抗原と結合するところの、請求項１１記載の抗体。
【請求項２０】
少なくとも１０９Ｍ−１の平衡結合定数（Ｋａ）でもって、所定の抗原と結合するところの、請求項１１記載の抗体。
【請求項２１】
少なくとも１０８Ｍ−１の平衡結合定数（Ｋａ）でもって、所定の抗原と結合するところの、請求項１１記載の抗体。
【請求項２２】
モノクローナルであるところの、請求項１１記載の抗体。
【請求項２３】
Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ＦｖまたはＦｄ断片であるところの、請求項１１記載の抗体。
【請求項２４】
抗原特異的であるところの、請求項１１記載の抗体。
【請求項２５】
配列番号：２記載のヒト重鎖可変領域のアミノ酸配列、または配列番号：２と少なくとも９０％の相同性のあるアミノ酸配列を含む、ヒト絨毛性ゴナドトロピンと結合する、単離されたヒトモノクローナル抗体。
【請求項２６】
配列番号：４記載のヒト重鎖可変領域のアミノ酸配列、または配列番号：４と少なくとも９０％の相同性のあるアミノ酸配列を含む、ヒト絨毛性ゴナドトロピンと結合する、単離されたヒトモノクローナル抗体。
【請求項２７】
請求項１記載の抗体および医薬上許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項２８】
請求項２記載の抗体および医薬上許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項２９】
請求項２５記載の抗体および医薬上許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項３０】
請求項２６記載の抗体および医薬上許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項３１】
抗体または抗原結合断片が、（ｉ）２Ｂ２．６Ｆ５抗体（ＡＴＣＣ受入番号Ｎｏ．          ）のヒト絨毛性ゴナドトロピンに対する結合を競合的に阻害し、（ｉｉ）表面プラズモン共鳴により決定され、結合定数（Ｋａ）として測定された少なくとも１×１０８リットル／モルの親和力でもって、インビボでヒト絨毛性ゴナドトロピンの中和エピトープと結合するところの、ヒト定常領域を含む単離された組換え抗−ヒト絨毛性ゴナドトロピン抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３２】
ヒト定常領域およびヒト可変領域を含むところの、請求項３１記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項３３】
少なくとも１つのヒト軽鎖および少なくとも１つのヒト重鎖を含むところの、請求項３１記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項３４】
軽鎖が、２Ｂ２．６Ｆ５抗体（ＡＴＣＣ受入番号Ｎｏ．          ）の軽鎖の全抗原結合領域を含むところの、請求項３３記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項３５】
重鎖が、２Ｂ２．６Ｆ５抗体（ＡＴＣＣ受入番号Ｎｏ．          ）の重鎖の全抗原結合領域を含むところの、請求項３３記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項３６】
軽鎖が、２Ｂ２．６Ｆ５抗体（ＡＴＣＣ受入番号Ｎｏ．          ）の軽鎖の全抗原結合領域を含み、そして、重鎖が、２Ｂ２．６Ｆ５抗体（ＡＴＣＣ受入番号Ｎｏ．          ）の重鎖の全抗原結合領域を含むところの、請求項３３記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項３７】
抗体または抗原結合断片が、（ｉ）２Ｂ３．３Ｅ８抗体（ＡＴＣＣ受入番号Ｎｏ．          ）のヒト絨毛性ゴナドトロピンに対する結合を競合的に阻害し、（ｉｉ）表面プラズモン共鳴により決定され、結合定数（Ｋａ）として測定された少なくとも１×１０８リットル／モルの親和力でもって、インビトロでヒト絨毛性ゴナドトロピンの中和エピトープと結合する、ヒト定常領域を含む、単離された組換え抗−ヒト絨毛性ゴナドトロピン抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３８】
ヒト定常領域およびヒト可変領域を含むところの、請求項３７記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項３９】
少なくとも１つのヒト軽鎖および少なくとも１つのヒト重鎖を含む、請求項３７記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項４０】
軽鎖が、２Ｂ３．３Ｅ８抗体（ＡＴＣＣ受入番号．            ）の軽鎖の全抗原結合領域を含むところの、請求項３９記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項４１】
重鎖が、２Ｂ３．３Ｅ８抗体（ＡＴＣＣ受入番号．            ）の重鎖の全抗原結合領域を含むところの、請求項３９記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項４２】
軽鎖が、２Ｂ３．３Ｅ８抗体（ＡＴＣＣ受入番号．            ）の軽鎖の全抗原結合領域を含み、重鎖が、２Ｂ３．３Ｅ８抗体（ＡＴＣＣ受入番号．            ）の重鎖の全抗原結合領域を含むところの、請求項３９記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項４３】
試料中のヒト絨毛性ゴナドトロピンを検出する方法であって、（ａ）試料を供すること；（ｂ）（ａ）の試料を、ヒト絨毛性ゴナドトロピンを含むポリペプチドリガンドのヒト絨毛性ゴナドトロピンに対する結合を可能にする条件下で、該ポリペプチドを特異的に結合するヒトモノクローナル抗体２Ｂ２．６Ｆ５（ＡＴＣＣ受入番号．          ）またはヒトモノクローナル抗体２Ｂ３．３Ｅ８（ＡＴＣＣ受入番号．            ）と接触させること；および（ｃ）試料中のヒト絨毛性ゴナドトロピンの存在を示す、抗体２Ｂ２．６Ｆ５または抗体２Ｂ３．３Ｅ８の試料中のヒト絨毛性ゴナドトロピンとの結合を検出し、それにより、試料中のヒト絨毛性ゴナドトロピンを検出することを含む、方法。
【請求項４４】
請求項１、２、２５または２６記載の抗体の重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列をコードする、単離された核酸。
【請求項４５】
請求項４４記載の抗体および医薬上許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項４６】
請求項１、２、２５または２６記載の抗体の免疫グロブリン可変ドメイン配列をコードする、１つまたは複数の核酸を含有する、組換え細胞。
【請求項４７】
抗体のＨＣ可変ドメインを含むポリペプチドをコードする第一の核酸配列、および請求項１、２、２５または２６記載の蛋白質である抗体のＬＣ可変ドメインを含むポリペプチドをコードする第二の核酸配列を有する、宿主細胞。
【請求項４８】
ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβ−Ｌ２ループのアミノ酸３８−５７（配列番号：７）と特異的に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体、またはその類似体。
【請求項４９】
哺乳動物被検体の腫瘍性疾患を処置するための方法であって、哺乳動物被検体に、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβ−Ｌ２ループ（配列番号：７）またはβ−Ｌ２ループの類似体と特異的に結合する抗体を含む医薬組成物を、該哺乳動物被検体の腫瘍性疾患を軽減または除去するのに有効な量で投与することを含む、方法。
【請求項５０】
抗体が、配列番号：２または配列番号：４記載のアミノ酸配列を含むところの、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
抗体が、ヒトモノクローナル抗体２Ｂ２．６Ｆ５（ＡＴＣＣ受入番号．          ）であるところの、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
抗体が、ヒトモノクローナル抗体２Ｂ３．３Ｅ８（ＡＴＣＣ受入番号．          ）であるところの、請求項５０記載の方法。
【請求項５３】
抗体が、ｈＣＧのＬＨ／ｈＣＧ受容体に対する結合を遮断するところの、請求項４９記載の方法。
【請求項５４】
抗体が、細胞傷害性物質と連結されているところの、請求項４９記載の方法。
【請求項５５】
細胞傷害性物質が、細胞傷害性薬であるところの、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
細胞傷害性物質が放射性同位体であるところの、請求項５４記載の方法。
【請求項５７】
化学療法剤を含む医薬組成物を哺乳動物被検体に投与することをさらに含む、請求項５４記載の方法。
【請求項５８】
腫瘍性疾患が、固形癌、肺癌、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、胃癌、膵臓癌、頭頸部癌、腎細胞癌、卵巣癌、膀胱癌、黒色腫、子宮癌、子宮平滑筋腫、子宮内膜癌、多嚢胞性卵巣症候群、子宮内膜ポリープ、下垂体癌、腺筋症、腺癌、髄膜腫、骨肉腫、血液悪性腫瘍、白血病、多発性骨髄腫、神経膠腫、グリア芽腫または星状細胞腫であるところの、請求項４９記載の方法。
【請求項５９】
腫瘍性疾患が、該哺乳動物被検体における腫瘍細胞転移であるところの、請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
腫瘍性疾患を有することが疑われる、または腫瘍性疾患に関する危険性があると疑われる哺乳動物被検体の癌を診断する方法であって、
該被検体の血液または組織から、細胞集団を含む試験試料を得ること、
細胞集団内の細胞におけるヒト絨毛性ゴナドトロピンマーカーの有無を検出するために、ヒトモノクローナル抗体２Ｂ２．６Ｆ５  （ＡＴＣＣ受入番号．          ）またはヒトモノクローナル抗体２Ｂ３．３Ｅ８  （ＡＴＣＣ受入番号．          ）を供すること、
細胞を特定し特徴付けるために、ヒト絨毛性ゴナドトロピンマーカーにより検出された細胞集団を分析し、その細胞上もしくは内におけるヒト絨毛性ゴナドトロピンマーカーの存在が、哺乳動物被検体の腫瘍性疾患または腫瘍性疾患の危険性を示すことを含む、方法。
【請求項６１】
抗体が、配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列を含むところの、請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
被検物中の細胞上もしくは内におけるヒト絨毛性ゴナドトロピンマーカーの存在が、哺乳動物被検体における転移性癌の存在を示すところの、請求項６０記載の方法。
【請求項６３】
被検物中の細胞上もしくは内におけるヒト絨毛性ゴナドトロピンマーカーの存在が、哺乳動物被検体における早期癌の存在を示すところの、請求項６０記載の方法。
【請求項６４】
被検物中の細胞上もしくは内にヒト絨毛性ゴナドトロピンマーカーが存在しないことが、哺乳動物被検体における疾患のない状態または測定不能な疾患状態にあることを示すところの、請求項６０記載の方法。
【請求項６５】
被検物中の細胞上もしくは内におけるヒト絨毛性ゴナドトロピンマーカーの有無により、癌治療または癌回復中の治療管理を監視するところの、請求項６０記載の方法。
【請求項６６】
抗体と会合されたイメージング部分をさらに含む、請求項６０記載の方法。
【請求項６７】
画像化部分が、磁気共鳴分光法、Ｘ線分光法、または陽電子断層撮影法（ＰＥＴ）を通じて画像化され得るところの、請求項６６記載の方法。
【請求項６８】
会合が、共有結合であるところの、請求項６６記載の方法。
【請求項６９】
会合が、非共有結合であるところの、請求項６６記載の方法。
【請求項７０】
腫瘍性疾患が、固形癌、肺癌、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、胃癌、膵臓癌、頭頸部癌、腎細胞癌、卵巣癌、膀胱癌、黒色腫、子宮癌、子宮平滑筋腫、子宮内膜癌、多嚢胞性卵巣症候群、子宮内膜ポリープ、下垂体癌、腺筋症、腺癌、髄膜腫、骨肉腫、血液悪性腫瘍、白血病、多発性骨髄腫、神経膠腫、グリア芽腫または星状細胞腫であるところの、請求項６０記載の方法。
【請求項７１】
医薬上許容される担体中の、配列番号：２または配列番号：４記載のアミノ酸配列を含み、ヒト絨毛性ゴナドトロピンに特異的に結合する抗体を、哺乳動物被検体のホルモンの不均衡により生じる疾患を軽減しまたは除去するのに有効な量で哺乳動物被検体に投与することを含む、哺乳動物被検体におけるホルモンの不均衡により生じる疾患を処置する方法。
【請求項７２】
抗体が、ヒトモノクローナル抗体２Ｂ２．６Ｆ５（ＡＴＣＣ受入番号．          ）またはヒトモノクローナル抗体２Ｂ３．３Ｅ８（ＡＴＣＣ受入番号．            ）であるところの、請求項７１記載の方法。
【請求項７３】
疾患が、前立腺癌、多嚢胞性卵巣疾患、リウマチ性疾患、敗血症性ショック、子宮内膜症、平滑筋腫、細胞障害性化学療法中の卵巣変性、またはアルツハイマー病であるところの、請求項７１記載の方法。
【請求項７４】
医薬上許容される担体中の、配列番号：２または配列番号：４記載のアミノ酸配列を含み、ヒト絨毛性ゴナドトロピンに特異的に結合する抗体を、哺乳動物被検体の流産を誘導するのに有効な量で哺乳動物被検体に投与することを含む、哺乳動物被検体に流産を誘導する方法。
【請求項７５】
抗体が、ヒトモノクローナル抗体２Ｂ２．６Ｆ５（ＡＴＣＣ受入番号．          ）またはヒトモノクローナル抗体２Ｂ３．３Ｅ８（ＡＴＣＣ受入番号．            ）であるところの、請求項７４記載の方法。
【請求項７６】
医薬上許容される担体中の、配列番号：２または配列番号：４記載のアミノ酸配列を含み、ヒト絨毛性ゴナドトロピンに特異的に結合する抗体を、哺乳動物被検体の受胎能を低下させるのに有効な量で哺乳動物被検体に投与することを含む、哺乳動物被検体の受胎能を低下させる方法。
【請求項７７】
抗体が、ヒトモノクローナル抗体２Ｂ２．６Ｆ５（ＡＴＣＣ受入番号．          ）またはヒトモノクローナル抗体２Ｂ３．３Ｅ８（ＡＴＣＣ受入番号．            ）であるところの、請求項７６記載の方法。
【請求項７８】
哺乳動物被検体における癌の処置のための薬物候補化合物をスクリーニングする方法であって、
癌を有することが疑われる被検体に治療上有効量の薬物候補化合物を投与すること、
薬物候補化合物を用いた処置の前後に、該被検体の血液または組織から、腫瘍細胞を含むことが疑われる細胞集団を含む試験試料を得ること、
該試験試料中の細胞におけるヒト絨毛性ゴナドトロピンマーカーの有無を検出するために、ヒトモノクローナル抗体２Ｂ２．６Ｆ５（ＡＴＣＣ受入番号．            ）またはヒトモノクローナル抗体２Ｂ３．３Ｅ８（ＡＴＣＣ受入番号．            ）を供すること、
処置前の検体中の腫瘍細胞の数と比較して処置後の検体中の減少した数の腫瘍細胞の存在が、哺乳動物被検体の癌を処置するにあたっての薬物候補化合物の有効性を示すため、薬物候補化合物を用いた処置後と比較される、薬物候補化合物を用いた処置前の試験試料中の腫瘍細胞を特定するためにヒト絨毛性ゴナドトロピンマーカーにより検出される細胞集団を分析することを含む、方法。
【請求項７９】
抗体が、配列番号：２または配列番号：４記載のアミノ酸配列を含むところの、請求項７８記載の方法。
【請求項８０】
癌が、転移性癌または早期癌であるところの、請求項７８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本特許出願は、２００５年８月８日に出願され、表題「PASSIVE IMMUNITY TO TARGET AND BLOCK RECEPTOR BINDING OF GONADOTROPINS」の米国仮出願番号第６０／７０６，５０６号（その全内容は出典明示により本明細書の一部とされる）に基づき、またその優先権を主張する。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、性腺刺激ホルモン効果の阻害のための抗体組成物、そしてそれを必要とする哺乳動物被験体に該抗体組成物を投与することによる癌を処置するための方法および受胎能を調節するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の研究は、３つの要素Ａ）ｈＣＧタンパク鎖および炭水化物の構造；Ｂ）受胎能および癌におけるｈＣＧの生物学；そして、Ｃ）体液性もしくはＴ細胞媒介性免疫応答のいずれかを産生する、ｈＣＧペプチド、β鎖または炭水化物に対するものを含む、ｈＣＧを標的とする免疫のためのワクチン接種戦略、に関する。
【０００４】
ヒト絨毛性ゴナドトロピンは、３８ｋＤのヘテロ二量体糖蛋白質である。Morganら、J Biol. Chem. 250: 5247, 1975；HearnおよびGomme, J. Mol. Recognit. 13: 223, 2000。ｈＣＧ構造の重要な特徴は、図１Ａで描かれるように、ｈＣＧのα鎖とβ鎖の一次構造の図で確かめることができる。Birkenら、Clin Chem 49: 144, 2003。ｈＣＧのαサブユニット（α−ｈＣＧ、または図１ＡのｈＣＧα）は、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）および甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）を含む糖蛋白ホルモンで共通する。α−ｈＣＧタンパク鎖は、９２個のアミノ酸から成り、５２番目と７８番目の残基に２個のＮ結合型オリゴ糖を有する。ｈＣＧホルモン特異的なβ鎖（β−ｈＣＧ、または図１ＡのｈＣＧβ）は１４５個のアミノ酸から成る。糖蛋白ホルモン間のＬＨβ鎖の高い相同性と独自性と比較して、β−ｈＣＧはさらに３１個のアミノ酸をそのカルボキシル末端に有する。4 Morganら、J. Biol. Chem. 250: 5247, 1975。このカルボキシル末端ペプチド（ＣＴＰ）は、９個のプロリン（２９モル％）と８個のセリン（２６モル％）残基を有し、屈曲しまた親水性である。β−ｈＣＧは、１３番目と３０番目の残基に２個のＮ結合型オリゴ糖を有し、また１２１番目、１２７番目、１３２番目と１３８番目の残基に4個のＯ結合型オリゴ糖を有する。
【０００５】
ｈＣＧヘテロ二量体の三次構造は、サイトカインのシスチンノット成長因子ファミリー（ＣＫＧＦ）の一員のため注目される。Lapthornら、Nature 369: 455, 1994; Wuら、Structure 2: 545, 1994。ＣＫＧＦファミリーは、他のそのような蛋白質の少なくとも４０個中、糖蛋白ホルモン、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）やトランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）を含む。HearnおよびGomme, J. Mol. Recognit. 13: 223, 2000。ＣＫＧＦサイトカインは、２つのサブニットの強力な特異的非共有結合の二量体形成により特徴付けられる。各々のサブユニットは、３個のシスチンジスルフィド結合を含み、その内の２個のジスルフィドが３つ目のジスルフィド結合を通り抜けて環を形成する、顕著な保存された構造（ノット（knot））を特徴としている。二次構造は、主としてβ鎖である。各サブユニットの三次構造は、非常に伸びた状態であり、高い表面：容積比を有しており、明確な疎水性コア領域は存在しない。ｈCGの四次構造は、その長軸に沿って、それらの表面領域の約２５％が関与するヘッド−テイル会合を有する。二量体形成は、β−ｈＣＧのシスチンノットから伸びる２１アミノ酸ループと、α−ｈＣＧ付近のループがジスルフィド結合された「シートベルト」を形成し、それにより安定化される。β−ｈＣＧは、４４番目と４５番目に、または４７番目と４８番目の残基の間に蛋白質加水分解によりニックが入っている場合がある（図１ＡのｈＣＧβｎ）。ニックは、ｈＣＧの失活をもたらし、サブユニットの解離を促進する。Coleら、J. Clin. Edocrinol. Metab. 76: 704, 1993。尿代謝産物であるβ−ｈＣＧのコア断片（図１ＡのｈＣＧβｃｆ）は、未知の機能を有する。Normanら、J. Endocrinol. 164: 299, 2000；Birkenら、Arch. Med. Res. 32: 635, 2001。α−βへテロ二量体に加えて、β−ｈＣＧは、単量体とホモ二量体型の両方が見出された。Butlerら、J. Mol. Endocrinol. 22: 185, 1999。
【０００６】
８個のオリゴ糖は、ｈＣＧの分子量の約３０％を占める。これは、近縁の相同体（ＬＨは、３個のＮ連結オリゴ糖を、そのα鎖に２個、β鎖に１個有するのみである）で見られる炭水化物よりも多い。各オリゴ糖は、最大２価の負に帯電した末端の糖を有する。従って、ｈＣＧは、顕著なことに最終的に負に帯電している。ｈＣＧと会合するオリゴ糖は非常に不均一であり、ホルモンの大きさや帯電の不均一性の理由となる。
【０００７】
α−βへテロ二量体ｈＣＧは、ＬＨ／ｈＣＧ受容体に結合し、活性化する。Ascoliら、Endocr. Rev. 23: 141, 2002。対照的に、α−ｈＣＧ、β−ｈＣＧ、ニック入りのβ−ｈＣＧ、またはβ−ｈＣＧコア断片はいずれも、組換えヒトＬＨ−ｈＣＧ受容体に結合しない。Hoら、Early Pregnancy 3: 204, 1997。β−ｈＣＧのこの領域に特異的な抗体がＬＨ／ｈＣＧ受容体のシグナル伝達を干渉しないので、そのカルボキシル末端ペプチドは受容体の結合またはシグナル伝達にほとんど重要でないようである。Iversonら、Curr. Opin. Mol. Ther. 5: 156, 2003；Dirnhoferら、FAEB J. 7: 1381, 1993。化学的に脱グリコシル化したｈＣＧは、ラットＬＨ／ｈＣＧ受容体と結合するが、活性化しない。Chenら、J. Biol. Chem. 257: 14446, 1982。個々のＮ−連結炭水化物部分は、ｈＣＧの機能に影響を及ぼさないようである。HearnおよびGomme, J. Mol. Recognit. 13: 223, 2000。
【０００８】
ヒト絨毛性ゴナドトロピンは、生殖において実際に示された役割を有する。AscheimおよびZondek, Klin. Wochenschr 248, 1927。ｈＣＧは、生殖に絶対的に必要とされ、多くの組織におけるＬＨ／ｈＣＧ受容体の発現を考慮すると、妊娠に極めて多面的な役割を有するようである。Rao, Semin. Reprod. Med. 19: 7, 2001；Filicoriら、Fertil. Steril 84: 275, 2005。提案されているこれらの受容体が行う役割の幾つかには、細胞栄養芽層の浸潤の容易化、血管形成および免疫抑制（Islamiら、Semin. Reprod. Med. 19: 49, 2001；Lichtら、Semin. Reprod. Med. 19: 37, 2001）、ならびにアポトーシス抑制が含まれる。Kurodaら、Int. J. Cancer 91: 309, 2001。加えて、合胞体栄養細胞表面にあるｈＣＧの広範囲のシアリル化により付与される正味の負電荷は、それ自身によっても免疫抑制性となり得る。Vanら、Int. J. Cancer 38: 915, 1986。
【０００９】
妊娠していない状態では、血清ｈＣＧは下垂体前葉からの微少量の脈動的分泌を介して低濃度で存在し得る。Birkenら、Endocrinology 137: 1402, 1996。それにもかかわらず、ｈＣＧはまた、多くの非生殖組織の癌細胞により産生される。Cosgroveら、Biochim. Biophys. Acta. 1007: 44, 1989；Stenmanら、Clin. Biochem. 37: 549, 2004。ヒト生殖と悪性形質転換との類似性に鑑み、かくして、ｈＣＧは悪性形質転換のマーカーとして提案された。Acevedo, J. Exp. Ther. Oncol 2: 133, 2002；MurrayおよびLessey, Semin. Reprod. Endocrinol 17: 275, 1999。これと一致して、α−βへテロ二量体ｈＣＧは、ＬＨ／ｈＣＧ受容体を発現する卵巣癌細胞においてシスプラチン誘導性のアポトーシスを抑制することが見られた。Kurodaら、Int. J. Cancer 76: 571, 1998。しかしながら、ｈＣＧは悪性腫瘍に感受性でも特異的でもない。
【００１０】
癌におけるｈＣＧの推定の役割に関して、２つの驚くべき観察がなされた。第一に、膜に結合したｈＣＧが、多種多様な培養癌細胞の表面に見られた。Acevedoら、Cancer 69: 1829, 1992。ｈＣＧが膜貫通領域を持たない分泌型蛋白質であるため、このことは注目すべきことである。第二に、血清β−ｈＣＧは、膀胱癌のより侵略的な悪性の提示と関係していることは注目される。liesら、Br. J. Urol. 64: 241, 1989。また、転移表現型は、動物モデルにおけるβ−ｈＣＧ発現との一致が見い出された。AcevedoおよびHartsock, Cancer 78: 2388, 1996。これらの知見は、β−ｈＣＧがＬＨ／ｈＣＧ受容体と結合しないので、不確かな意味を示す。次に、ｈＣＧ−βは、結腸直腸、胃、口、膵臓、卵巣および腎臓細胞を含む６つの異なる上皮癌の独立した陰性の予後指標であることが多変量解析によって分かった。Louhimoら、Int. J. Cancer 101: 545, 2002；Louhimoら、Int. J. Cancer 111: 929, 2004；Hedstromら、Int. J. Cancer 84: 525, 1999；Louhimoら、Oncology 66: 126, 2004；Vartianinenら、Int. J. Cancer 95: 313, 2001；Hotakainenら、Br. J. Cancer 86: 185。不思議なことに、免疫組織化学ではβ−ｈＣＧの組織レベルは結腸直腸癌の陰性の予後徴候でもあったが、血清のβ−ｈＣＧだけは腎細胞癌で有意に予後徴候を示した。Lundinら、Int. J. Cancer 95: 18, 2001；Hotakainenら、Int. J. Cancer 104: 631。このように、可溶性β−ｈＣＧは、現在では癌の進行に重要な役割を果たすと推定することができる。
【００１１】
β−ｈＣＧは、単量体もしくはホモ二量体のいずれかがインビトロで、膀胱癌細胞のアポトーシスを抑制することが見出された。Butlerら、Br. J. Cancer 82: 1553, 2000；ButlerおよびIles, Tumour Biol. 25: 18, 2004。著者らは、β−ｈＣＧがＴＧＦ−β受容体を活性化することなく結合することで、ＴＧＦ−βに媒介されるアポトーシスを抑制する機序を提案する。同様に、β−ｈＣＧが他のＣＫＧＦサイトカイン、ＰＤＧＦの活性を抑制し得ることも想像できる。Pietrasら、Cancer Res. 62: 5476, 2002。前立腺癌細胞におけるβ−ｈＣＧの改変発現により、下方制御のＥ−カドヘリンと上方制御の侵襲性が見られた。WuおよびWalker, Cancer 106: 68, 2006。後の実験において、馴化培地で同じ効果が確認され、このことは、培地上清中の可溶性β−ｈＣＧがこの効果を生じさせたことを示す。この例でもその受容体は不明であったが、少なくとも４０個のＣＫＧＦサイトカインファミリーのメンバーは存在するため(HearnおよびGomme, J. Mol. Recognit. 13: 223, 2000)、いまだ未確認のさらなる受容体（類）の関与はありそうである。ｈＣＧがカポジ肉腫を阻害するという知見は、より幅広い公衆衛生上重要な様々な上皮癌におけるｈＣＧの役割と相容れないとは考えられない。Butler およびIles, Clin Cancer Res. 9: 4666, 2003。
【００１２】
受胎能を制御するためにｈＣＧを標的とするワクチン接種が、数十年間求められてきた。Nazら、Hum. Reprod. 20: 3271, 2005。最初、これらのワクチンは、β−ｈＣＧのＣＴＰに、または、全長β−ｈＣＧに活性のある特異的な体液性免疫を起こすことを試みた。Leeら、Mol. Immunol. 17: 749, 1980；Talwarら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 8532, 1994。そのようなワクチンの効力は、原理的には実証された。Stevensら、Fertil. Steril. 36: 98, 1981；Talwarら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 8532, 1994。これらのアプローチの確立には、様々なβ−ｈＣＧ成分または融合蛋白質としての組換え抗原発現が用いられた。Rockら、Vaccine 14: 1560, 1996；RoutおよびVrati, Vaccine 15: 1503, 1997；Xuら、Sheng Wu Gong. Cheng. Xue. Bao. 20: 49, 2004；Yankaiら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 345: 1365, 2006；Geisslerら、Lab Invest. 76: 859, 1997。
【００１３】
同様のアプローチが、癌治療のために続行された。TriozziおよびStevens, Oncol Res. 6: 7, 1999；Moultonら、Clin. Cancer Res. 8: 2044, 2002。さらなる改良には、受動投与される抗体（Butlerら、Oncol. Res. 14: 93, 2003）、ＣＴＰに特異的なモノクローナル抗体（KalantarovおよびAcevedo, Cancer 83: 783, 1998）、一般的な免疫付与（Geisslerら、Lab Invest. 76: 859, 1997）およびβ−ｈＣＧに対して活性のあるＴ細胞媒介性免疫を起させるための標的化融合蛋白質が含まれる。Heら、Clin. Cancer Res. 10: 1920, 2004。さらに別には、モノクローナル抗体を介し、高グリコシル化ｈＣＧ（Ｈ−ｈＣＧ）のＣＴＰに提示されたオリゴ糖アイソフォームを含むＯ−結合型コア２糖を標的することを試みる。Birkenら、Arch. Med. Res. 32: 635, 2001；Birkenら、Endocrine 10: 137, 1999；Birken, Tumour Biol 26: 131, 2005；Coleら、Gynecol. Oncol. 102: 145, 2006；米国特許第６，７６４，６８０号明細書；米国特許出願第２００５／０２６０１９６号。
【００１４】
上記アプローチのほとんどは、能動免疫方策を用いる。このように、これらの方法は抗体またはＴ細胞媒介免疫のいずれかが出現することを要求し、一部の受容者は十分な免疫応答を起こすのに失敗する。β−ｈＣＧまたはＨ−ｈＣＧの免疫標的化に対する上記アプローチはいずれも、明確にはＬＨ／ｈＣＧまたは他のいずれかの受容体に対するβ−ｈＣＧの結合を阻害するものではない。特に、ＣＴＰまたはＨ−ｈＣＧのいずれかを標的とする製剤は、受容体結合を阻害しない。表面結合型β−ｈＣＧを有する癌細胞の標的化を可能にする実験法が開発されたが、β−ｈＣＧの予後的意義に関するデータの意義は、有害効果を媒介する受容体に対する血清β−ｈＣＧ結合による阻害が、ｈＣＧの免疫標的化による癌治療にきわめて重要であると示す。さらにまた、上記アプローチのいずれも、癌化学療法で相乗作用を示さなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
このように、当分野にはβ−ｈＣＧを分泌する癌のより有効な処置法を作り上げる必要性がある。この問題を扱うため、次の2つの基準を満たす方法でβ−ｈＣＧを標的とする手法が必要とされる。第一に、作り出される物質は、受動投与に素早く追従して血清β−ｈＣＧを標的とすることが可能でなければならない。実際には、これはモノクローナル抗体または免疫特異性を有する類似のメディエイタの使用によって達成することができた。第二に、方法は、癌進行と関係する悪影響を媒介するβ−ｈＣＧのその受容体（群）に対する結合を阻害する処置を作り出さなければならない。具体的には、このことは、立体構造が明らかにされ、そして表面の接近可能なエピトープに特異的な免疫の創出を意味する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、一般に、性腺刺激ホルモン効果の阻害のための抗体組成物および方法に関し、その必要のある哺乳動物被験体に該抗体組成物を投与することによって、癌を処置する方法および受胎能を調整する方法を含む。さらに、本発明は、ヒト絨毛性ゴナドトロピンβ鎖とその同起源の受容体のいずれかとの結合の阻害し、その結果としてのヒトの癌増殖における抑制効果に関する。
【００１７】
哺乳動物被検体の腫瘍性疾患を軽減もしくは除去するのに有効な量で、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）のβ−Ｌ２ループに特異的に結合する抗体を含む医薬組成物を、哺乳動物被検体に投与することを含む、哺乳動物被検体の腫瘍性疾患を処置する方法が提供される。本方法では、抗体は、配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列を含み得る。抗体は、ヒトモノクローナル抗体２Ｂ２．６Ｆ５（ＡＴＣＣ受入番号．          ）またはヒトモノクローナル抗体２Ｂ３．３Ｅ８  （ＡＴＣＣ受入番号．          ）である。配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列を含む抗体組成物が提供される。ヒトモノクローナル抗体２Ｂ２．６Ｆ５  （ＡＴＣＣ受入番号．          ）またはヒトモノクローナル抗体２Ｂ３．３Ｅ８  （ＡＴＣＣ受入番号．          ）を含む抗体組成物が提供される。さらなる態様において、抗体は、細胞障害性物質、例えば、細胞障害薬もしくは放射性同位体と連結される。さらなる態様において、腫瘍性疾患を処置する方法は、該モノクローナル抗体と組み合わせて化学療法剤を含む医薬組成物を哺乳動物被検体に投与することをさらに含む。
【００１８】
哺乳動物被検体において中絶を誘導するのに有効な量で、ヒト絨毛性ゴナドトロピンに特異的に結合するヒトモノクローナル抗体２Ｂ２．６Ｆ５（ＡＴＣＣ受入番号．          ）またはヒトモノクローナル抗体２Ｂ３．３Ｅ８（ＡＴＣＣ受入番号．          ）を含む医薬組成物を哺乳動物被検体に投与することを含む、哺乳動物被検体に中絶を誘導する方法が提供される。哺乳動物被検体の受胎能を低下させるのに有効な量で、ヒト絨毛性ゴナドトロピンに特異的に結合するヒトモノクローナル抗体２Ｂ２．６Ｆ５（ＡＴＣＣ受入番号．          ）またはヒトモノクローナル抗体２Ｂ３．３Ｅ８（ＡＴＣＣ受入番号．          ）を含む医薬組成物を哺乳動物被検体に投与することを含む、哺乳動物被検体の受胎能を低下させる方法が提供される。該抗体は、さらに配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列を含み得る。
【００１９】
配列番号：２に記載の重鎖可変領域のアミノ酸配列または配列番号：２と少なくとも９０％の相同性のあるアミノ酸配列を含む、ヒト絨毛性ゴナドトロピンと結合する、単離されたモノクローナル抗体が提供される。
【００２０】
配列番号：４に記載の重鎖可変領域のアミノ酸配列または配列番号：４と少なくとも９０％の相同性のあるアミノ酸配列を含、むヒト絨毛性ゴナドトロピンと結合する、単離されたモノクローナル抗体が提供される。
【００２１】
その軽鎖可変領域と、配列番号：２もしくは配列番号：４に記載のものであるかまたは配列番号：２もしくは配列番号：４と少なくとも９０％の相同性のあるアミノ酸配列である重鎖可変領域を含む、ヒト絨毛性ゴナドトロピンと結合する、単離されたモノクローナル抗体が提供される。
【００２２】
1つの態様において、単離されたモノクローナル抗体は、次の特徴：（ｉ）インビトロでＢＸＰＣ−３脾臓癌細胞の増殖を阻害すること；および（ｉｉ）インビトロでＭＣＦ−７乳癌細胞またはＨｅＬａ細胞の増殖を阻害しないこと、の１つまたはそれ以上のを有する。さらなる態様において、抗体は、アナライトとしてヒト絨毛性ゴナドトロピンそしてリガンドとして抗体を用いた表面共鳴プラズモン（ＳＰＲ）により決定された、約１０−８Ｍまたはそれ以下の解離平衡定数（ＫＤ）を有する。抗体は、約１０８Ｍ−1またはそれ以上の結合力でもってヒト絨毛性ゴナドトロピンと結合することができる。単離されたモノクローナル抗体は、抗体断片であっても一本鎖抗体であってもよい。
【００２３】
単離されたモノクローナル抗体は、（ｉ）リンカーペプチドを介して可変軽鎖アミノ酸配列に融合され、免疫グロブリンのヒンジ領域ポリペプチドと融合された、配列番号：2に記載の可変重鎖アミノ酸配列または配列番号：２と少なくとも９０％の相同性のある可変重鎖配列、（ｉｉ）ヒンジ領域と融合された免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域、および（ｉｉｉ）ＣＨ２定常領域と融合された免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域を含む、結合ドメイン免疫グロブリン蛋白質であってよい。単離されたモノクローナル抗体は、（ｉ）リンカーペプチドを介して可変軽鎖アミノ酸配列に融合され、免疫グロブリンのヒンジ領域ポリペプチドと融合された、配列番号：４に記載の可変重鎖アミノ酸配列または配列番号：４と少なくとも９０％の相同性のある可変重鎖配列、（ｉｉ）ヒンジ領域と融合された免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域、および（ｉｉｉ）ＣＨ２定常領域と融合された免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域を含む、結合ドメイン免疫グロブリン蛋白質であってよい。単離されたモノクローナル抗体は、少なくとも１０１０Ｍ−１の平衡結合定数（Ｋａ）でもって所定の抗原と結合できる。単離されたモノクローナル抗体は、少なくとも１０９Ｍ−１の平衡結合定数（Ｋａ）でもって所定の抗原と結合できる。抗体は少なくとも１０８Ｍ−１の平衡結合定数（Ｋａ）でもって所定の抗原と結合できる。
【００２４】
配列番号：２に記載のヒト重鎖可変領域のアミノ酸配列または配列番号：２と少なくとも９０％の相同性のあるアミノ酸配列を含み、ヒト絨毛性ゴナドトロピンと結合する、単離されたヒトモノクローナル抗体が提供される。配列番号：４に記載のヒト重鎖可変領域のアミノ酸配列または配列番号：４と少なくとも９０％の相同性のあるアミノ酸配列を含み、ヒト絨毛性ゴナドトロピンと結合する、単離されたヒトモノクローナル抗体が提供される。該抗体および医薬上許容される担体を含む医薬組成物が提供される。ヒト定常領域を含む単離された組換え抗−ヒト絨毛性ゴナドトロピン抗体またはその抗原結合断片であって、（ｉ）ヒト絨毛性ゴナドトロピンに対する２Ｂ２．６Ｆ５抗体（ＡＴＣＣ受入番号．          ）の結合を競合的に阻害し、そして、（ｉｉ）表面共鳴プラズモンにより決定され、結合定数（Ｋａ）として測定された、少なくとも１×１０８リットル／モルの親和力でもってインビボでヒト絨毛性ゴナドトロピンの中和エピトープと結合する、抗体または抗原結合断片が提供される。ヒト定常領域を含む単離された組換え抗−ヒト絨毛性ゴナドトロピン抗体またはその抗原結合断片であって、（ｉ）ヒト絨毛性ゴナドトロピンに対する２Ｂ３．３Ｅ８抗体（ＡＴＣＣ受入番号．          ）の結合を競合的に阻害し、そして、（ｉｉ）表面共鳴プラズモンにより決定され、結合定数（Ｋａ）として測定された、少なくとも１×１０８リットル／モルの親和力でもってインビボでヒト絨毛性ゴナドトロピンの中和エピトープと結合する、抗体または抗原結合断片が提供される。
【００２５】
試料中のヒト絨毛性ゴナドトロピンを検出する方法であって、（ａ）試料を供すること；（ｂ）（ａ）の試料を、ヒト絨毛性ゴナドトロピンを含むポリペプチドリガンドのヒト絨毛性ゴナドトロピンに対する結合を可能にする条件下で、該ポリペプチドを特異的に結合するヒトモノクローナル抗体２Ｂ２．６Ｆ５（ＡＴＣＣ受入番号．          ）またはヒトモノクローナル抗体２Ｂ３．３Ｅ８（ＡＴＣＣ受入番号．          ）と接触させること；および（ｃ）試料中のヒト絨毛性ゴナドトロピンの存在を示す、抗体２Ｂ２．６Ｆ５または抗体２Ｂ３．３Ｅ８の試料中のヒト絨毛性ゴナドトロピンとの結合を検出し、それにより、試料中のヒト絨毛性ゴナドトロピンを検出すること、を含む方法が提供される。
【００２６】
ヒト絨毛性ゴナドトロピンβ−Ｌ２ループのアミノ酸３８−５７（配列番号：７）またはその類似物と特異的に結合する、単離されたヒトモノクローナル抗体が提供される。１つの態様において、抗体は、ｈＣＧのＬＨ／ｈＣＧ受容体に対する結合を阻害する。
【００２７】
腫瘍性疾患を有することが疑われる、または腫瘍性疾患に関する危険性のあることが疑われる哺乳動物被検体の癌を診断する方法であって、該被検体の血液または組織から細胞集団を含む試験試料を得ること、細胞集団内の細胞におけるヒト絨毛性ゴナドトロピンマーカーの有無を検出するために、ヒトモノクローナル抗体２Ｂ２．６Ｆ５（ＡＴＣＣ受入番号．          ）またはヒトモノクローナル抗体２Ｂ３．３Ｅ８（ＡＴＣＣ受入番号．          ）を供すること、および、細胞上もしくは内におけるヒト絨毛性ゴナドトロピンマーカーの存在は、哺乳動物被検体の腫瘍性疾患または腫瘍性疾患の危険性を示すため、その細胞を特定し特徴付けるために、ヒト絨毛性ゴナドトロピンマーカーにより検出された細胞集団を分析することを含む、方法が提供される。
【００２８】
哺乳動物被検体の癌の処置のための薬物候補化合物をスクリーニングする方法であって、癌を有することが疑われる被検体に治療上有効量の薬物候補化合物を投与すること、薬物候補化合物を用いた処置の前後に、該被検体の血液または組織から、腫瘍細胞を含むことが疑われる細胞集団を含む試験試料を得ること、該試験試料中の細胞においてヒト絨毛性ゴナドトロピンマーカーの有無を検出するため、ヒトモノクローナル抗体２Ｂ２．６Ｆ５（ＡＴＣＣ受入番号．            ）またはヒトモノクローナル抗体２Ｂ３．３Ｅ８（ＡＴＣＣ受入番号．            ）を供すること、  処置前の検体中の腫瘍細胞の数と比較して処置後の検体中の減少した数の腫瘍細胞の存在が、哺乳動物被検体の癌を処置するにあたっての薬物候補化合物の有効性を示すため、薬物候補化合物を用いた処置後と比較される、薬物候補化合物を用いた処置前の試験試料中の腫瘍細胞を特定するためにヒト絨毛性ゴナドトロピンマーカーにより検出される細胞集団を分析すること含む、方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明は、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を標的とする、またはｈＣＧの基質成分を標的とする抗体を含むワクチンの分野に関する。本発明は、性腺刺激ホルモン効果抑制のための抗体組成物および方法に関し、癌を処置するための方法およびその必要のある哺乳動物被検体に該抗体組成物を投与することにより受胎能を調整する方法が含まれる。本発明は、ヒト絨毛性ゴナドトロピンβ鎖のその同起源受容体のいずれかに対する結合の阻害、そしてその結果としてのヒト癌増殖の抑制効果に関する。結合阻害は、本発明の抗体組成物を用いて行うことができる。
【００３０】
本発明の抗体組成物は、癌治療のより効果的な方法および受胎能を調整する方法を提供するため、細胞が分泌するβ−ｈＣＧを標的とする。抗体は、次の２つの基準を満たす方法でβ−ｈＣＧを標的とし得る。第一に、抗体組成物は、受動投与に素早く追従して血清β−ｈＣＧを標的とできるべきである。実際には、これはモノクローナル抗体または免疫特異性を有する類似のメディエイタの使用によって達成できた。第二に、方法は、癌進行と関係する悪影響を媒介するβ−ｈＣＧのその受容体（群）に対する結合を阻害する治療的処置を作り出さなければならない。具体的には、このことは、立体構造が明らかにされ、そして表面の接近可能なエピトープに特異的な免疫の創出を意味する。
【００３１】
そのような方法は、４８番目から５３番目の表面の接近可能なアミノ酸を含むβ−ｈＣＧ  Ｌ２ロングループに対する免疫特異性の生成により達成され得る。β−ｈＣＧの３８番目〜５７番目の環状ペプチドは、ラット卵巣の膜受容体に対するｈＣＧの結合と、ライディッヒ細胞によるテストステロン産生を阻害した。Keutmannら、Proc.Natl Acad. Sci. U.S.A. 84: 2038-2042, 1987。しかしながら、結合阻害の確認は、別個の２つの系で再現できなかった。Salesseら、Mol. Cell Endocrinol. 68:113-119, 1990；Jagtapら、J Endocrinol. 172: 311-320,2002。この環状ペプチドによって産生される構造エピトープに対して生じるポリクローナル抗血清は、インビボ・アッセイでホルモンを中和することが可能であり、これは、エピトープが受容体の結合部位の近くにあることを示す。一方、この知見は、結合されたｈＣＧのより迅速な除去によっても理解された。最後に、Ｌ２ロングループは、４４番目の残基と４５番目の残基、並びに４７番目の残基と４８番目の残基の間で切断されることが知られている。そのような開裂は抗体の結合を変化させ、提案するアプローチを妨げるかもしれない。要約すると、β−ｈＣＧによって受容体結合を阻害することは、癌治療と受胎能調節に有用であろう。本発明は、β−ｈＣＧによるＬＨ／ｈＣＧ受容体結合を阻害することが実証されたβ−ｈＣＧ  Ｌ２ロングループに対する免疫特異性のある抗体組成物を提供する。
【００３２】
図１Ｂは、ＨＣＧとＨＣＧ  β鎖の蛋白質構造のＬ２  β・ロングループに相当するｈＣＧ、ＬＨとＦＳＨのβ鎖のアミノ酸配列を示す。Ｌ２  β・ロングループは、ヘアピン・ターンで連結されるアミノ酸の２本の鎖から成るβ−ｈＣＧタンパク鎖の既知の三次元構造の領域を記載する。「Ｌ２」は、ＨＣＧβ蛋白質配列の鎖間の３個のヘアピン・ターンの第２番目のものであることを示す。図の中の数字２は、Ｌ２  β・ロングループ中のアミノ酸番号３８番目から５７番目のβ−ｈＣＧタンパク鎖のアミノ酸番号付けを示す。数字４は、特異的に特定のゴナドトロピンβ鎖、例えばｈＣＧのＬ２  βロングループを標的とするモノクローナル抗体または関連する蛋白質の選択を可能にする免疫原を含むアミノ酸を示す。数字６は、ｈＣＧ蛋白質結晶構造のＬ２  βロングループにおいて表面の接近可能なアミノ酸を示す。数字８は、ＨＣＧ対ＬＨの特異的な標的を可能にするＨＣＧとＬＨとの間の非保存的アミノ酸の差異（５１番目がＡ→Ｐ）を示す。
【００３３】
図２は、ヘテロ二量体ゴナドトロピンおよびＨＣＧ  β鎖の、それぞれの受容体に対する結合の概要図を示す。数字１０は、ヘテロ二量体ゴナドトロピン、例えばＨＣＧ、ＬＨまたはＦＳＨを示す。数字１２は、ＬＨ−ＨＣＧ、ＦＳＨおよびＴＳＨ受容体を含むゴナドトロピン受容体を示す。数字２０は、単量体、ホモ二量体または他の多重結合型を含む、会合する共通のα鎖糖蛋白ホルモン鎖を含まない型のｈＣＧ  β鎖を示す。数字２２は、ＬＨ−ＨＣＧ、ＦＳＨとＴＳＨ受容体とは異なるＨＣＧ  βが結合するそれぞれの受容体（群）を表す。数字３０は、ゴナドトロピンβ鎖のＬ２  βヘアピンループを示す。これは、本明細書中に記載の本発明により標的とされるゴナドトロピンの蛋白質構造の特異的な領域である。
【００３４】
図３は、ゴナドトロピンのＬ２  β・ロングループに対する免疫特異性を誘導するための本明細書中に記載の方法を示す。数字４０は、ゴナドトロピンβ鎖のβ−ｈＣＧ  Ｌ２ロングループのアミノ酸配列（３８−５７）を表す。この配列は、分子内シスチン・ジスルフィド結合を形成するために導入され得る２個のシステイン部分により結合され、ペプチドの環化を引き起こす。３８−５７のシスチン・ジスルフィド結合は天然のゴナドトロピン蛋白質構造では形成されないが、３８−５７の配列の分子内ジスルフィド結合の形成は、天然のＬ２  βロングループに近い三次元立体配座を誘導する。そのような環状ペプチド（群）は、免疫特異性を与えるモノクローナル抗体または関連蛋白質を生成するために用いられる動物（群）またはインビボ実験系（群）における抗ペプチド免疫応答を促進するために、ジフテリアトキソイドのような担体蛋白質と共有結合により連結されてもよい。かくして、３８−５７のジスルフィド結合の形成は、ゴナドトロピンＬ２  βロングループに特異的なモノクローナル抗体または関連蛋白質の選択を可能にする。数字４２は、ＨＣＧ  β鎖のＬ２  βロングループに対する免疫特異性を与えるモノクローナル抗体を表し、数字４０に対する応答で生成される。数字４４は、エフェクター機能（類）に影響する共有結合で連結されたいずれかの小分子または巨大分子を表す。そのようなエフェクター機能は、ゴナドトロピンＬ２  βロングループを標的とする免疫特異性の結果（４２部分）をモディファイする。
【００３５】
図４は、ヘテロ二量体ゴナドトロピン（類）（１０）またはＨＣＧ  β鎖（２０）による受容体（１２、２２）に対する結合およびそれに伴ういずれかの細胞内シグナル伝達事象を妨げるにあたって、Ｌ２  βロングループ（３０）に対する免疫特異性を有するモノクローナル抗体（４２）の作用を概略的に示す。このように、本発明は、それがヘテロ二量体ｈＣＧ、単量体β−ｈＣＧ、またはホモ二量体β−ｈＣＧの形態であるかどうかに関係なく、β−ｈＣＧ蛋白質の受容体結合を阻害する。別の実施形態は、Ｌ２  βロングループ（３０）に対する免疫特異性を提供する、該モノクローナル抗体の断片（４２）および／または該蛋白質の組換え型に基づいてもよい。さらなる他の実施形態は、元のモノクローナル抗体の定常領域と異なる免疫エフェクター機能（４４）を作り出すことによって誘導されてもよい。
【００３６】
図５は、ゴナドトロピンＬ２  βロングループに対する特異性を提供するモノクローナル抗体または断片に固有の機能に、別の、異なるおよび／または付加的な潜在的免疫エフェクター機能（群）（４４）を示す。
【００３７】
図１〜５中の参照番号は、ＨＣＧ  β鎖のアミノ酸番号付け（２）；Ｌ２  βロングループに対する免疫特異性を誘導する免疫原（４）；Ｌ２  βロングループのＨＣＧの表面の接近可能なアミノ酸（６）；ＬＨ対ＨＣＧ  β鎖免疫特異性の基礎（８）；ヘテロ二量体ゴナドトロピン（１０）；ヘテロ二量体ゴナドトロピン受容体（１２）；ｈＣＧ  β鎖（２０）；ＨＣＧ  β鎖が結合する受容体（群）（２２）；ゴナドトロピンβ鎖のＬ２  βヘアピンループ（３０）；ＨＣＧ  β鎖の３８−５７ループペプチド（４０）；ゴナドトロピン  β鎖に特異的な液性免疫を与える蛋白質（４２）；免疫エフェクター機能を与える蛋白質（４４）を示す。
【００３８】
本発明は、β−ｈＣＧ蛋白質のＬ２ロングループに結合する抗体組成物を提供する。その抗体組成物は、哺乳動物被検体における腫瘍性疾患を処置する方法、中絶を誘発する方法、および哺乳動物被検体において受胎能を低下させる方法に用いることができる。この抗体組成物は、配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列を含み得る。さらに、抗体は、ヒトモノクローナル抗体２Ｂ２．６Ｆ５（ＡＴＣＣ受入番号．          ）たはヒトモノクローナル抗体２Ｂ３．３Ｅ８（ＡＴＣＣ受入番号．          ）をさらに含んでいてもよい。
【００３９】
更なる態様において、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）または甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）に対するモノクローナル抗体を投与することを含み、疾病が哺乳動物被検体において軽減もしくは排除される、哺乳動物被検体において疾病を処置する方法が提供される。詳細な態様において、モノクローナル抗体は、ＦＳＨ、ＬＨまたはＴＳＨのβサブユニット・ポリペプチドのＬ２ロングループに対するものである。
【００４０】
本発明が、特定の方法、試薬、化合物、組成物または生体系に限られていないこと、もちろんそれらが変化してもよいことはを理解されるべきである。本明細書中で用いられる用語が、特定の実施形態を記載するためだけのものであって、限定することを目的としないとも理解されるべきである。本明細書および添付の請求の範囲で用いられるように、その内容が特に明確に示されない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」、は複数形を含む。したがって、例えば、「細胞（a cell）」に対する言及は、2つまたはそれ以上の細胞などの組み合わせを含む。
【００４１】
測定可能な値、例えば、量、時間的な期間などに言及する場合、本明細書中で用いられる用語「約」、は、所定の値から±２０％または±１０％、より望ましくは±５％、いっそうより望ましくは±１％、さらにより望ましくは±０．１％の変動を含むものであり、そのような変動は開示された方法を実施するために適当なものである。
【００４２】
特に定義されない限り、本明細書中で用いられるすべての専門用語および科学用語は、本発明に関する当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中で記載の方法および材料と類似するまたは同等の方法および材料は、本発明を試験するための実地に用いることができるが、好ましい材料および方法を本明細書中で記載する。本発明を記載し、特許請求するにあたって、以下の用語を用いる。
【００４３】
「患者」、「被検体」または「哺乳動物」は、交換可能に用いられ、ヒト患者およびヒト以外の霊長類ならびに実験動物、例えばウサギ、ラットやマウスおよび他の動物を示す。動物は、例えば哺乳類と非哺乳類の脊椎動物、例えばヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類および爬虫類を含む。
【００４４】
「処置すること」または「処置」は、疾病の症状、合併症または生化学徴候（例えば癌、転移癌、転移性上皮癌、結腸直腸癌、胃癌、口腔癌、膵癌、卵巣癌または腎細胞癌）の発症を予防するか遅延させるため、症状を軽減させるか、または疾病、病状または障害のさなる進行を抑制もしくは阻止するため、本発明の抗体組成物、化合物または作用剤の投与を含む。処置は、症状の予防であるか（疾病の発症を予防するか遅延させる、あるいはその臨床症状もしくは無症状の徴候を予防すること）、疾病の徴候後の治療上の抑制または緩和でもよい。
【００４５】
「癌」または「悪性腫瘍」は、同意義語として用いられ、細胞の抑制されていない異常な増殖、局所的にまたは血流やリンパ系を通じて体の他の部分に伝播する病的細胞の能力（すなわち転移）、並びに多くの特性構造的および／または分子的特徴のいずれかにより特徴づけられる、多くの疾病のいずれかを示す。「癌性」または「悪性細胞」は、特異な構造上の特性を有し、分化能が欠如しており、浸潤および転移できる細胞として理解されている。癌の例には、乳癌、肺癌、脳腫瘍、骨肉腫、肝癌、腎臓癌、大腸癌および前立腺癌がある（DeVitaら編、Cancer Principles and Practice of Oncology, 第６版、Lippincott WilliamsおよびWilkins, Philadelphia, PA, 2001；全ての目的についてその全部は出典明示により本明細書の一部とされる）。
【００４６】
「癌関連」は、核酸とその発現もしくはその欠如、または蛋白質とそのレベルもしくは活性、もしくはその欠如の、被検体細胞での悪性腫瘍の発症との関係を示す。例えば、癌は、正常な健康な細胞では発現されないか、または低レベルで発現されている特定の遺伝子の発現と関連する。反対に、癌関連遺伝子は、悪性細胞（または形質転換を受けている細胞）で発現されない遺伝子であるか、または正常な健康な細胞で発現されるより、悪性細胞では低レベルで発現される遺伝子であってもよい。
【００４７】
癌の内容において、用語「形質転換」は、正常細胞が悪性となる際に正常細胞が受ける変化を示す。真核細胞において用語「形質転換」は、細胞培養で正常細胞の悪性細胞への転換を示すために用いてもよい。
【００４８】
「増殖性細胞」は、活発に細胞分裂をしており、指数関数的に増殖している細胞である。「細胞増殖制御の喪失」は、細胞分裂の適当な制限を正常に保つ細胞周期制御を失った細胞の特性を示す。そのような制御を失った細胞は、刺激性の信号なしに正常な速度より急速に増殖し、そして阻害シグナルに反応しない。
【００４９】
「進行癌」は、初期の腫瘍部位にもはや留まらなくなった癌、または対癌米国合同委員会（American Joint Committee on Cancer）（ＡＪＣＣ）によるステージＩＩＩまたはＩＶにある癌を意味する。
【００５０】
「寛容性が高い」は、処置の結果として生じ、処置決定に影響を及ぼし、健康状態の不都合な変化がないことを示す。
【００５１】
「転移性」は、乳房脂肪体の注射に応じて免疫不全マウスの消化管、腎臓、膵臓、卵巣、肺、肝臓、骨または脳に、および／または免疫不全マウスの循環器中で続発性腫瘍病変を確立することができる腫瘍細胞、例えばヒト上皮癌、結腸直腸癌、胃癌、口腔癌、膵癌、卵巣癌または腎細胞癌を示す。
【００５２】
「非転移性」は、乳房脂肪体および／または循環への注射によっては免疫不全マウスにおいて上皮細胞転移、例えば結腸直腸癌、胃癌、口腔癌、膵癌、卵巣癌または腎細胞癌の肺、肝臓、骨または脳または他の標的器官で続発性腫瘍病変を確立することができない腫瘍細胞、例えばヒト上皮癌細胞を示す。非転移性として本明細書中で用いられ、本明細書中で扱われるヒト腫瘍細胞は、免疫不全マウスの乳房脂肪体への注射によって原発腫瘍を確立できるが、その原発腫瘍から伝播することができない。
【００５３】
本明細書中で用いられる「リンパ球」は、当分野の通常の意味を有し、血液、リンパおよびリンパ組織で見出される単核白血球、非食細胞白血球、例えばＢリンパ球およびとＴリンパ球を示す。
【００５４】
「ホルモン失調に起因する疾病」は、哺乳動物被検体におけるゴナドトロピン・ホルモン、例えばヒト絨毛性ゴナドトロピンの不均衡に起因する疾病を示す。ホルモン失調に起因する疾病は、限定するものではないが、前立腺癌、多嚢胞性卵巣疾病、リウマチ性疾患、敗血症性ショック、子宮内膜症、平滑筋腫、細胞毒性化学療法期間中の卵巣の変性またはアルツハイマー病を含む。「ホルモン失調に起因する疾病」は、哺乳動物被検体におけるゴナドトロピン・ホルモン、例えば卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）または甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ））の不均衡に起因する疾病をさらに意味する。
【００５５】
本明細書中で用いられる「ポリペプチド断片」は、アミノ末端基および／またはカルボキシ末端欠失があるが、残りのアミノ酸配列は、例えば、全長ｃＤＮＡ配列から推論される天然の配列に対応する位置と同一であるポリペプチドを示す。断片は、典型的に少なくとも５個、６個、８個のまたは１０個のアミノ酸長、望ましくは少なくとも１４個のアミノ酸長、より望ましくは少なくとも２０個のアミノ酸長、通常少なくとも５０個のアミノ酸長、さらに望ましくは少なくとも７０個のアミノ酸長である。本明細書中で用いられる用語「類似体」は、推論アミノ酸配列の一部と実質的な同一性を有する、少なくとも２５個のアミノ酸の部分を含むポリペプチドを示し、そして、以下の特性：（１）適切な結合状態の下で、ヒト絨毛性ゴナドトロピンβ鎖に対する特異的な結合、（２）黄体形成ホルモン（ＬＨ）／ｈＣＧ受容体に対するβ−ｈＣＧの結合を阻害する能力、または（３）インビトロまたはインビボでβ−ｈＣＧ発現細胞が増殖する能力、のうちの少なくとも１つを有する。典型的に、ポリペプチド類似体は天然の配列に関して保存的アミノ酸置換（または付加または欠失）を含む。類似体は、典型的には、少なくとも２０個のアミノ酸長、望ましくは少なくとも５０個のアミノ酸長またはそれ以上であって、しばしば全長の天然ポリペプチドの長さであってもよい。
【００５６】
ペプチド類似体は、鋳型ペプチドの特性と類似した特性を有する非ペプチド薬として、一般に医薬産業で用いられる。これら非ペプチド型の化合物は、「ペプチド模倣体」または「ペプチド模倣物」と称される。Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15: 29, 1986；VeberおよびFreidinger TINS p. 392 (1985)；およびEvans ら、J. Med. Chem. 30: 1229, 1987（これらは、出典明示により本明細書の一部とされる）。そのような化合物は、しばしば、コンピュータ処理による分子モデリングの助けを借りて開発される。治療上有用なペプチドと構造上類似するペプチド模倣体は、同等の治療上の効果もしくは予防効果を生じさせるために用いることができる。通常、ペプチド模倣物は、パラダイム・ポリペプチド（すなわち、生化学特性または薬理活性を有するポリペプチド）、例えばヒト抗体と構造上類似しているが、以下の群：−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−および−ＣＨ２ＳＯ−から選択される結合と、当分野で周知の方法により置換されていてもよい１つまたはそれ以上のペプチド結合を有する。同じ型のＤ−アミノ酸による共通配列の１つまたはそれ以上のアミノ酸の系統的な置換（例えばＬ−リジンの代わりにＤ−リジン）は、より安定なペプチドを生成するために用いることができる。加えて、共通配列または実質的に同一となる共通配列の変化を含む制約的な（constrained）ペプチドは、当分野で既知の方法（RizoおよびGierasch Ann. Rev. Biochem. 61: 387, 1992（出典明示により本明細書の一部とされる））によって；例えば、ペプチドを環化する分子内ジスルフィド架橋を形成することができる内部のシステイン残基を加えることによって作り出すことができる。
【００５７】
ポリペプチドに適用される用語「実質的な同一性」は、例えば、デフォルト・ギャップ・ウェイト（gap weight）を用いるプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによって最適に整列された場合に、２つのペプチド配列が、少なくとも８０パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも９０パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも９５パーセントの配列同一性、最も好ましくは少なくとも９９パーセントの配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換により異なる。保存的アミノ酸置換は、類似の側鎖を有する残基との互換を示す。例えば、脂肪族側鎖を有する一群のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンである；アミド含有側鎖を有する一群のアミノ酸は、アスパラギンおよびグルタミンである；芳香族側鎖を有する一群のアミノ酸は、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンである；塩基性側鎖を有する一群のアミノ酸は、リジン、アルギニンおよびヒスチジンである；そして、硫黄含有側鎖を有する一群のアミノ酸は、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン・アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸およびアスパラギン−グルタミンである。
【００５８】
本明細書中で述べられるように、抗体または免疫グロブリン分子のアミノ酸配列における僅かな変異は、アミノ酸配列の変異体が、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％および最も好ましくは９９％の相同性を維持する場合、本発明に包含されると考えられる。特に、保存的アミノ酸置換が考えられる。保存的アミノ酸置換体は、全体の相同性に対するものではなく、それは、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％および最も好ましくは９９％の相同性を維持し得る。保存的置換は、それらの側鎖と関係があるアミノ酸ファミリー内で生じるものである。遺伝的にコードされたアミノ酸は、通常、ファミリー：（１）酸性＝アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩；（２）塩基性の＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）無極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非電化極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシンに分けられる。より好ましいファミリー：セリンおよびスレオニンは、脂肪族ヒドロキシ・ファミリーである；アスパラギンおよびグルタミンは、アミド含有ファミリーである；アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンは、脂肪族ファミリーである；そして、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、芳香族のファミリーである。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンによる、アスパラギン酸塩のグルタミン酸塩による、スレオニンのセリンによる単一の置換、またはあるアミノ酸の構造的に関連したアミノ酸による類似の置換が、特にその置換がフレームワーク内のアミノ酸を含まない場合、結果として生じる分子の結合性または特性に大きな影響を及ぼさないと予想することは合理的である。アミノ酸変化が機能的なペプチドになるかどうかは、ポリペプチド誘導体の比活性を検定することで容易に決定できる。アッセイは、本明細書中で詳細に記載される。抗体または免疫グロブリン分子の断片または類似体は、当業者によって容易に調製され得る。断片または類似体のアミノ末端およびカルボキシ末端は、機能ドメインの境界の近くで生じることが好ましい。構造ドメインおよび機能ドメインは、そのヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列データの、公共のもしくは所有者の配列データベースとの比較によって同定し得る。好ましくは、コンピュータ処理による比較法を用い、既知の構造および／または機能を有する他の蛋白質にある配列のモチーフまたは予想される蛋白高次構造領域を同定する。既知の三次元構造に折りたたまれる蛋白質配列を同定する方法は既知である。Bowieら、Science 253: 164, 1991。このように、上記の例は、当業者が本発明に従って、構造ドメインおよび機能ドメインを明らかにするために用いることができる配列モチーフと構造上のコンフォメーションを認識し得ることを示す。
【００５９】
好ましいアミノ酸置換は：（１）蛋白質分解に対する感受性を低減するもの、（２）酸化に対する感受性を低減するもの、（３）蛋白質複合体形成のための結合親和性を変化させるもの、（４）結合親和性を変化させるもの、および、そのような類似体の他の物理化学的特定もしくは機能的特性を与えるかまたはモディファイするものがある。類似体は、天然のペプチド配列以外の配列のさまざまな突然変異蛋白質を含んでもよい。例えば、単一もしくは複数のアミノ酸置換（好ましくは保存的アミノ酸置換）は、天然の配列に（好ましくは、分子間接触を形成するドメイン(群)の外側のポリペプチド部分に）生じてもよい。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造上の特徴を実質的には変えないものである（例えば、置換アミノ酸は、親配列にあるヘリックスを破壊するものであってはならず、また親配列を特徴づける他のタイプの二次構造を崩壊してはならない）。当分野で認められたポリペプチドの二次構造および三次構造の例は、Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton編、W. H. FreemanおよびCompany, New York (1984))；Introduction to Protein Structure (C. BrandenおよびJ. Tooze編、Garland Publishing, New York, N.Y. (1991))；およびThorntonら、Nature 354: 105, 1991（出典明示により本明細書の一部とされる）に記載されている。
【００６０】
「抗体」または「抗体ペプチド（群）」は、インタクト（無傷な）抗体または無傷の抗体と特異的結合に関して競合するその結合断片を意味する。結合断片は、組換えＤＮＡ技術によって、または、無傷の抗体の酵素的分解もしくは化学分解によって産生される。結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖおよび一本鎖抗体が含まれる。無傷の「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互連結された少なくとも２つの重鎖（Ｈ）および２つの軽鎖（Ｌ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書中ＨＣＶＲまたはＶＨと略記される）と重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書中ＬＣＶＲまたはＶＬと略記される）と軽鎖定常領域を含む軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬを含む。ＶＨとＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称され、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域で分断された超可変領域に更に分類され得る。各ＶＨおよびＶＬは、３個のＣＤＲと４個のＦＲから成り、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシル末端まで配列されている。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの、免疫系のさまざまな細胞（例えばエフェクター細胞）と古典的な補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織または因子との結合を媒介し得る。用語、抗体は、β−ｈＣＧを結合する能力を保持する無傷の抗体の抗原結合部分を含む。結合体の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）断片、ヒンジ領域でジスルフィド結合により連結された２個のＦａｂ断片を含む二価のＦａｂ断片；（ｉｉｉ）ＶＨとＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の一本のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片(Wardら、Nature 341: 544-546, 1989)；ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。
【００６１】
「二重特異性」もしくは「二重機能性」抗体以外の抗体は、それぞれ同一の結合部位を有すると理解される。過剰の抗体が少なくとも約２０％、４０％、６０％または８０％、および、より一般的には約８５％を超えて（インビトロでの競合結合測定で測定される）、カウンター受容体に結合される受容体の量を低下させる場合、抗体は受容体のカウンター受容体に対する付着を実質的に阻害する。
【００６２】
「Ｆａｂ抗体」または「Ｆａｂ断片」は、免疫グロブリン定常領域の全部または一部を失っており、抗体のＦａｂ領域を含んでいる抗体断片を示す。Ｆａｂ抗体は、本明細書中で記載されるように調製される。
【００６３】
「一本鎖抗体」または「一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）」は、Ｆｖ断片、ＶＬとＶＨの２つのドメインの抗体融合分子を示す。Ｆｖ断片、ＶＬとＶＨの２つのドメインは別々の遺伝子にコードされるが、組換え方法を用い、ＶＬとＶＨ領域が対となって一価の分子を形成し、それらを単一のタンパク鎖とし得る合成リンカーにより連結することができる（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている;例えば、Birdら、Science 242: 423-426, 1988；およびHustonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883, 1988を参照のこと）。そのような一本鎖抗体は、組換え技術または無傷の抗体の酵素的分解もしくは化学的分解により調製することができる、用語「抗体」断片に対する言及に含まれる。
【００６４】
「ヒト配列抗体」は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列から誘導された可変および定常領域（存在する場合）を有する抗体を含む。本発明のヒト配列抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列にコードされないアミノ酸残基（例えばインビトロでのランダムもしくは部位特異的突然変異生成によって、または、インビボでの体細胞突然変異によって導入される突然変異）を含んでもよい。そのような抗体は、例えば、国際公開第０１／１４４２４号パンフレットおよび第  ００／３７５０４号パンフレットに記載されるように、ヒト以外のトランスジェニック動物で生成することができる。しかしながら、本明細書中で用いられる用語「ヒト配列抗体」は、別の哺乳動物種、例えばマウスの生殖細胞系から誘導されたＣＤＲ配列がヒト・フレームワーク配列に埋め込まれた抗体（例えばヒト化抗体）を含むことを意図しない。
【００６５】
また、組換え免疫グロブリンが産生されてもよい。Cabilly、米国特許第４，８１６，５６７号（全ての目的について、その全部を出典明示により本明細書の一部とする）；およびQueenら、Proc. NaflAcad. Sci. USA 86: 10029-10033, 1989。
【００６６】
「モノクローナル抗体」は、単一の分子組成の抗体分子の調製物を意味する。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性と親和性を示す。したがって、用語「ヒト・モノクローナル抗体」は、可変部分と定常領域（存在する場合）がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列から誘導された単一の結合特異性を示す抗体を意味する。１つの実施形態において、ヒト・モノクローナル抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子と軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するヒト以外のトランスジェニック動物（例えばトランスジェニックマウス）から得られたＢ細胞を不死化細胞と融合させたハイブリドーマにより産生される。
【００６７】
「ポリクローナル抗体」は、細胞表面受容体またはリガンド、例えばＬＨ／ｈＣＧ受容体に結合するβ−ｈＣＧに対する１種超（２種もしくはそれ以上）の様々な抗体調製物を示す。そのような調製物は、ＬＨ／ｈＣＧ受容体と結合するβ−ｈＣＧの範囲に結合する抗体を含む。同様に、β−ｈＣＧに対する抗体は、ＬＨ／ｈＣＧ受容体と結合して、したがってＬＨ／ｈＣＧ受容体に結合するβ−ｈＣＧを阻害するペプチド模倣物として作用し得る。本発明の使用に適している抗体および他の抗体は、当分野で周知のおよび／または本明細書中の引用文献に記載の方法により調製され得る。好ましい実施形態において、本発明で用いられる抗β−ｈＣＧ抗体は、「ヒト抗体」、例えば、ヒトから単離された抗体、あるいは「ヒト配列抗体」である。
【００６８】
「免疫細胞応答」は、結果として免疫細胞遊走、標的細胞の殺害、貪食作用、抗体の産生、免疫応答の他の可溶性作動因子およびその他の類似物を生じる、免疫細胞の生化学変化を起させる外部もしくは内部刺激（例えば抗原、細胞表面受容体、β−ｈＣＧ、ＬＨ／ｈＣＧ受容体、サイトカイン、ケモカインおよび他の細胞）に対する免疫系細胞の反応を意味する。
【００６９】
「免疫応答」は、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、そして上記の細胞または肝臓によって産生される可溶性巨大分子（抗体、サイトカインおよび補体を含む）の共同作用であり、結果として癌細胞、転移性腫瘍細胞、転移性上皮癌、結腸直腸癌、胃癌、口腔癌、膵癌、卵巣癌または腎細胞癌、侵入した病原体、病原体に感染している細胞または組織、あるいは自己免疫もしくは病理学的炎症の場合には、正常なヒトの細胞または組織の選択的な破損、人体から排除または除去となる作用を示す。
【００７０】
「Ｔリンパ球応答」と「Ｔリンパ球活性」は、本明細書中交換可能に用いられ、Ｔリンパ球に依存する免疫応答成分を意味する（例えばヘルパーＴリンパ球、細胞障害性キラーＴリンパ球またはサプレッサーＴリンパ球へのＴリンパ球の増殖および／または分化、抗体産生を生じるかもしくは妨げるＢリンパ球に対するヘルパーＴリンパ球によるシグナルの供給、細胞障害性リンパ球による特異的な標的細胞の殺害と他の免疫細胞の機能をモジュレートするサイトカインのような可溶性因子の放出）。
【００７１】
癌の処置
抗体組成物、例えば特異的にヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）のβ−Ｌ２ループと結合する抗体によるＬＨ／ｈＣＧ受容体に対するβ−ｈＣＧ結合の阻害は、患者における癌細胞に対する記憶または二次免疫応答を増強し得る。ｈＣＧに対する抗体は、免疫を促進するため、免疫原作用剤、例えば癌細胞、精製された腫瘍抗原（組換え蛋白質、ペプチドと炭水化物分子を含む）、細胞ならびに免疫刺激性サイトカインおよび細胞表面抗原をコードする遺伝子でトランスフェクションされた細胞と組み合わせられてもよいし、あるいは単独で用いられてもよい。
【００７２】
ワクチン接種手順に続く場合、β−ｈＣＧに対する抗体は効果的である。腫瘍に対するワクチン接種に関する多くの実験方策が考案された（Rosenberg, ASCO Educational Book Spring: 60-62, 2000；Logothetis, ASCO Educational Book Spring: 300-302, 2000；Khayat, ASCO Educational Book Spring: 414-428, 2000；Foon, ASCO Educational Book Spring: 730-738, 2000を参照のこと；また、Restifoら、Cancer: Principles and Practice of Oncology, 61: 3023-3043, 1997も参照のこと）。これらの方策のうちの１つでは、ワクチンは、自己由来のまたは同種異系の腫瘍細胞を用いて調製される。これらの細胞ワクチンは、腫瘍細胞をＧＭ−ＣＳＦを発現するよう形質導入した場合、最も効果的であることが示された。GM-CSFが、腫瘍ワクチン接種に対する抗原提示の強力なアクチベーターであることが示された。Dranoffら、Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 90: 3539-43, 1993。
【００７３】
β−ｈＣＧに対する抗体は、ＧＭ−ＣＳＦモディファイされた腫瘍細胞ワクチンを増強し、乳癌（Hurwitzら、1998、上掲）、原発性前立腺癌（Hurwitzら、1998、上掲）および黒色腫（van Elsasら、J. Exp. Med., 190: 355-66, 1999）のような多くの実験腫瘍モデルにおいてワクチンの効能を改善する。これらの例において、非免疫原性腫瘍、例えばＢ１６黒色腫は、免疫系による破壊を受けやすくなった。腫瘍細胞ワクチンは、ＩＬ２のような他の免疫アクチベーターとそれらの間の副刺激分子の発現をモディファイし得る。
【００７４】
「抗腫瘍薬」は、ヒトで腫瘍、特に悪性（癌）病変、例えば癌腫、肉腫、リンパ腫または白血病の発症または進行を抑制する機能特性を有する作用剤を意味するものとして本明細書中で用いられる。しばしば、転移の抑制は抗腫瘍薬の特性である。
【００７５】
腫瘍疾患の処置方法において、化学療法剤は、β−ｈＣＧに対するモノクローナル抗体（例えば、ｈＣＧのβ−Ｌ２ループと特異的に結合する抗体）と組み合わせて用いられてもよい。β−ｈＣＧに対する抗体を含む抗体−細胞毒素結合体（コンジュゲート）は、標準的な癌治療を通じて誘導される免疫を増強するために用いることができる。この例において、投与される化学療法試薬の用量を低下させることが可能であり得る（Mokyrら、Cancer Research 58: 5301-5304, 1998）。β−ｈＣＧに対する抗体と化学療法の併用法の背景となる科学的根拠は、多くの化学療法化合物の細胞障害作用の結果である細胞死が、抗原提示経路における腫瘍抗原の増加レベルをもたらすはずであるということである。このように、β−ｈＣＧに対する抗体は、腫瘍細胞の化学療法物質の放出に感作された免疫応答を増強し得る。β−ｈＣＧに対する抗体を用いた処置と組み合わせられる化学療法剤の例としては、限定するものではないが、放線菌またはストレプトマイセス属抗生物質、デュオカルマイシン、アルデスロイキン、アルトレタミン、アミホスチン、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クラドリビン、シサプリド、シスプラチン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドロナビノール、デュオカルマイシン、エポエチン・アルファ、エトポシド、フィルグラスチム、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、グラニセトロン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、インターフェロンα、イリノテカン、ランソプラゾール、レバミゾール、ロイコボリン、メゲストロール、メスナ、メトトレキセート、メトクロプラミド、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、オメプラゾール、オンダンセトロン、パクリタキセル（タキソール（登録商標））、ピロカルピン、プロクロルペラジン、リツキシマブ、サプロイン（saproin）、タモキシフェン、タキソール、塩酸トポテカン、トラスツズマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチンと酒石酸ビノレルビンが挙げられる。前立腺癌処置について、抗β−ｈＣＧと組み合わせ得る好ましい化学療法剤は、パクリタキセル（タキソール）である。黒色腫癌治療について、抗β−ｈＣＧと組み合わせ得る好ましい化学療法剤は、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）である。
【００７６】
「固形腫瘍」は、限定されるものではないが、肉腫、黒色腫、癌腫または他の固形腫瘍癌を含む。
【００７７】
「肉腫」は、胎児結合組織のような物質から成る腫瘍を示し、通常、小繊維もしくは均一な物質に埋没する緊密に集合した細胞から成る。肉腫には、限定されるものではないが、軟骨肉腫、線維肉腫、リンパ肉腫、黒色肉腫、粘液肉腫、骨肉腫、アベメチ（Abemethy）肉腫、脂肪肉腫、脂肪肉腫、胞状軟部肉腫、エナメル上皮肉腫、ブドウ状肉腫、緑色腫肉腫、絨毛腫、胎児性肉腫、ウィルムス腫瘍肉腫、子宮内膜肉腫、間質性肉腫、ユーイング肉腫、筋膜肉腫、線維形成肉腫、巨細胞肉腫、顆粒球性肉腫、ホジキン肉腫、特発性多発性着色出血肉腫、Ｂ細胞の免疫芽球性肉腫、リンパ腫、Ｔ細胞の免疫芽球性肉腫、イェンセン肉腫、カポジ肉腫、クッパー星細胞肉腫、血管肉腫、白血肉腫、悪性間葉腫肉腫、傍骨性骨肉腫、細網肉腫、ラウス肉腫、漿液嚢胞性肉腫、滑膜肉腫と毛細血管拡張性肉腫が含まれる。
【００７８】
「黒色腫」は、皮膚と他の器官の色素細胞系に起因する腫瘍を示す。黒色腫には、例えば、末端部黒子黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫、良性若年性黒色腫、クラウドマン黒色腫、S91黒色腫、ハーディング‐パッセー黒色腫、若年性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、悪性黒色腫、結節性黒色腫、爪下黒色腫と表在拡大型黒色腫が含まれる。
【００７９】
「癌腫」は、周囲の組織を浸潤し転移を引き起こす傾向のある上皮細胞から成る悪性腫瘍を示す。典型的な癌腫は、例えば、腺房癌腫、小葉癌、腺嚢癌腫、腺様嚢胞癌、腺癌、副腎皮質の癌腫、槽癌腫、肺胞細胞癌、基底細胞癌、基底細胞癌、類基底細胞癌、基底有棘細胞癌、肺胞上皮癌、細気管支癌、気管支原性癌、大脳様癌腫、胆管細胞癌、絨毛癌、膠様癌、面皰癌、子宮体部癌、篩状癌、鎧状癌、皮膚癌、円筒状癌腫、円柱細胞癌腫、腺管癌、癌腫デューラム（carcinoma durum）、胎生期癌、髄様癌、類表皮癌、咽頭上皮癌腫（carcinoma epitheliale adenoides）、外方増殖性癌腫、癌腫Ｘ潰瘍（carcinoma ex ulcere）、線維癌、膠様癌、膠状癌腫、巨細胞癌、カルシノーマ・ギガトセルラー（carcinoma gigantocellulare）、腺癌、顆粒膜細胞癌腫、毛母癌、血様癌、肝細胞癌、ヒュルトレ細胞癌、硝子質癌腫、ハイパーメフォロイド・カルシノーマ（hypemephroid carcinoma）、小児胎生期癌、上皮内癌、表皮内癌、上皮内癌腫、Krompecher癌腫、Kulchitzky-細胞癌腫、大細胞癌腫、レンズ形癌腫、レンズ状癌腫、脂肪腫様癌、リンパ上皮癌、延髄癌腫、髄様癌、黒色癌、軟性癌腫、粘液性癌腫、粘液分泌癌、粘膜細胞癌腫、表皮粘膜癌腫（mucoepidernoid carcinoma）、粘液癌、粘液癌腫、粘液腫様癌、鼻咽腔癌、燕麦細胞癌、骨化性癌、骨状癌腫、乳頭状癌、門脈周囲癌、上皮内癌、有棘細胞癌腫、浸軟癌腫、腎臓の腎細胞癌、予備細胞癌、肉腫様癌、シュナイダー癌腫、硬癌、陰嚢癌、印環細胞癌、単純癌、小細胞型癌腫、ソラノイド・カルシノーマ（solanoid carcinoma)、回転楕円面細胞癌腫、紡錘体細胞癌、海綿様癌、扁平上皮癌、扁平上皮癌、ストリング癌腫、血管拡張癌、毛細血管拡張症様癌腫、移行上皮癌、結節癌、結節癌、いぼ状癌とカルシノーマ・ビフロサム（carcinoma viflosum)が挙げられる。
【００８０】
「白血病」は造血臓器の進行性の悪性疾患を意味し、通常、血液と骨髄中の白血球およびその前駆体の間違った増殖と発生により特徴づけられる。一般に、白血病は臨床学的に（１）疾病の期間および特徴−急性または慢性；（２）脊髄（骨髄）、リンパ様（リンパ行性）または単核球性；ならびに（３）血中白血球または非白血性（亜白血病）の異常な細胞数の増加もしくは非増加に基づいて分類される。白血病には、例えば、急性非リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性前骨髄球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、非白血性白血病、白血病性白血病（leukocythemic leukemia）、好塩基球性白血病、芽細胞白血病、ウシの白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚白血病、幹細胞性白血病、好酸球性白血病、グロースの白血病（Gross' leukemia）、ヘアリーセル白血病、血芽球性白血病（hemoblastic leukemia）、血球母細胞性白血病（hemocytoblastic leukemia）、組織球性白血病、幹細胞性白血病、急性単球白血病、白血球減少性白血病、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、リンパ性白血病、リンパ性白血病、リンパ性白血病、リンパ肉腫細胞白血病、肥胖細胞白血病、骨髄巨核球性白血病、小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄性白血病、骨髄様顆粒球性白血病、骨髄単球性白血病、ネーゲリ白血病、形質細胞性白血病、プラズマ細胞性白血病、前骨髄球性白血病、リーダー細胞性白血病、シリング白血病、幹細胞性白血病、亜白血性白血病および未分化細胞白血病が挙げられる。
【００８１】
さらなる癌には、例えば、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、横紋筋肉腫、原発性血小板血症、原発性マクログロブリン血、小細胞型肺腫瘍、原発性脳腫瘍、胃癌、大腸癌、悪性膵島細胞腫、悪性カルチノイド、尿膀胱癌、前悪性皮膚病変、精巣癌、リンパ腫、甲状腺癌、神経芽腫、食道癌、尿生殖路癌、悪性高カルシウム血症、子宮頸癌、子宮内膜癌、副腎皮質性癌と前立腺癌が挙げられる。
【００８２】
抗体の構造
基本的な抗体構造上の単位は、四量体から成ることは知られている。各四量体は２対の同一のポリペプチド鎖から成り、各対は１個の「軽鎖」（約２５ｋＤａ）と１個の「重鎖」（約５０−７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識に関与する約１００個〜１１０個もしくはそれ以上のアミノ酸から成る可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主に作動因子機能に関与する定常領域を特徴とする。ヒト軽鎖は、カッパとラムダ軽鎖とに分類される。重鎖はμ、δ、γ、αまたはεに分類され、それぞれ、抗体のアイソタイプは、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡとＩｇＥと定義される。軽鎖および重鎖内で、可変領域と定常領域は、重鎖で、約１２個またはそれ以上のアミノ酸からなる「Ｊ」領域により、約１０個以上のアミノ酸からなる「Ｄ」領域と連結される。一般的に、Fundamental Immunology Ch. 7（Paul, W編、第2版. Raven Press, N.Y. (1989)）（すべての目的について、その全部を出典明示により一部とする）を参照のこと。各一対の軽鎖／重鎖の可変領域は、抗体結合部位を形成する。
【００８３】
したがって、無傷のＩｇＧ抗体は、２つの結合部位を有する。二重機能性抗体または二重特異性抗体を除き、その２つの結合部位は同じものである。
【００８４】
この鎖はすべて、比較して保全されたフレームワーク領域（ＦＲ）が３個の超可変領域（相補性決定領域またはＣＤＲとも称される）で連結された、同一の一般的構造を示す。各対の２個の鎖のＣＤＲは、特定のエピトープに対する結合を可能にするようにフレームワーク領域により配置される。軽鎖および重鎖の両方は、Ｎ末端からＣ末端にかけ、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各ドメインのアミノ酸配置は、 Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))、またはChothiaおよびLesk J. Mol Biol. 196: 901-917, 1987；Chothiaら、Nature 342: 878-883, 1989の定義に従う。
【００８５】
二重特異性抗体または二重機能性抗体は、２個の異なる１対の重鎖／軽鎖と２個の異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ断片を連結することを含む種々の方法によって産生され得る。例えば、SongsivilaiおよびLachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321, 1990、Kostelnyら、J. Immunol. 148: 1547-1553, 1992を参照のこと。加えて、二重特異性抗体は、「ディアボディ（diabody）」として形成され得る(Holligerら、PNAS USA 90: 6444-6448, 1993または「Janusins」 (Trauneckerら、EMBO J. 10: 3655-3659, 1991およびTrauneckerら、Int J Cancer 7:51-52, 1992)。二重特異性抗体の産生は、従来の抗体の産生と比較してと相対的に困難な過程であり得るし、二重特異性抗体については、通常、収率および精製度はより低い。二重特異性抗体は、単一の結合部位を有している断片の形態（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦｖ）では存在しない。
【００８６】
ＦａｂまたはｓｃＦｖファージライブラリー
β−ｈＣＧと特異的に結合する抗体組成物、例えば、ｈＣＧのβ−Ｌ２ループと特異的に結合する抗体、または転移細胞のリガンドまたは細胞表面受容体、例えば、ＬＨ／ｈＣＧ受容体と特異的に結合する抗体を特定するためのファージディスプレイ・ライブラリー法には、Ｆａｂ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ファージライブラリーの使用がある。例えば、Hustonら、Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 85: 5879-5883, 1988；Chaudharyら、Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 87: 1066-1070, 1990；Zhangら、J. Virol. 78: 9233-9242, 2004を参照のこと。バクテリオファージ・コート蛋白質上に提示されたＦａｂまたはｓｃＦｖライブラリのさまざまな例が記載されている。ファージディスプレイ法の改良法も知られており、例えば、第９６／０６２１３号パンフレットおよび第９２／０１０４７号パンフレット（Medical Research Councilら）および第９７／０８３２０号パンフレット（Morphosys）に記載されており、それらは出典明示により本明細書の一部とされる。Ｆａｂライブラリの提示（ディスプレイ）は既知であり、第９２／０１０４７号パンフレット（ＣＡＴ／ＭＲＣ）および第９１／１７２７１号パンフレット（Affymax）に記載されている。
【００８７】
ハイブリッド抗体またはその抗体断片はファージまたはファージミド粒子の表面に存在するこことなるので、良好な結合活性を維持した変異型を確認するために、ディスプレイベクターにクローニングされるハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体断片は、転移細胞と関係する適当な抗原、例えば、細胞表面受容体または転移腫瘍細胞の細胞表面受容体に対するリガンドに対して選択され得る。例えば、Barbas IIIら、Phage Display, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001（これらの開示内容は出典明示により本明細書の一部とされる）を参照のこと。例えば、Ｆａｂ断片の場合、軽鎖と重鎖のＦｄ産物は、ｌａｃプロモーターの制御下にあり、そして各鎖は、細菌宿主の細胞膜周辺腔に向かうための、それに融合されたリーダーシグナルを有する。その空間で、抗体断片は適切に組み立てられ得る。重鎖断片は、組み立てられた抗体断片が新たに作られるファージまたはファージミド粒子の被膜に組み込まれることを可能にするファージ・コート蛋白質ドメインとの融合体として発現される。新しいファージミド粒子の形成には、必要なファージ遺伝子のすべてを含むヘルパーファージの添加が必要である。抗体断片のライブラリがファージまたはファージミド表面に提示されたら、パニングと称される過程を続ける。これは、ｉ）ファージまたはファージミド粒子の表面上に提示された抗体を、所望の抗原に結合させる、ｉｉ）非結合体を洗い流す、ｉｉｉ）結合した粒子を抗原から溶出する、そして、ｉｖ）溶出された粒子をさらなる選択ラウンドのため、それに富むプールを増幅するにあたって、新鮮な細菌宿主に曝すことによる方法である。典型的に、パニングは、３ラウンドまたは４ラウンド、特異的に結合する抗体クローンのスクリーニングの前に実施される。このように、ファージ／ファージミド粒子は、結合表現型（抗体）と遺伝子型（ＤＮＡ）との連結を可能にし、抗体のディスプレイ技術の使用は、よい結果をもたらす。しかしながら、他のベクター形式は、このヒト化過程（選択および／またはスクリーニングのために溶菌ファージ・ベクター（修飾されたＴ７またはラムダＺａｐ系）に抗体断片ライブラリのクローンを作ること）の間用いられることができた。しかしながら、他のベクター形式は、例えば、選択および／またはスクリーニングのために溶菌ファージ・ベクター（モディファイされたＴ７またはラムダＺａｐシステム）に抗体断片ライブラリをクローニングする、ヒト化過程に用いることができた。
【００８８】
所望のハイブリッド抗体および／またはハイブリッド抗体断片の選択後、それらは、当業者に既知の技術のいずれか、例えば、原核細胞もしくは真核生物細胞発現、およびその他の類似の方法によって、大容量に産生し得ることが考えられる。例えば、ハイブリッド抗体または断片は、抗体重鎖をコードする発現ベクターを構築する従来技術を用いることにより作製することができ、そのＣＤＲと、要すれば元の種の抗体結合特異性を維持するのに必要とされる可変領域のフレームワークの最小部分は元の種の抗体から誘導され（本明細書に記載の技術に従って作製される）、そしてその抗体の残りの部分は、本明細書に記載のように操作することができる目的とする種の免疫グロブリンから誘導され、それによりハイブリッド抗体重鎖の発現用ベクターが作製される。
【００８９】
詳細な実施形態において、Ｆａｂまたは一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体ライブラリは、５例、１０例、１５例または２０例またはそれ以上の様々な癌疾病患者の末梢血リンパ球から調製されてもよい。次いで、完全なヒトの高親和性ＦａｂまたはｓｃＦｖ抗体は、合成シアリルＬｅｗｉｓｘおよびＬｅｗｉｓｘＢＳＡ結合体を用いることにより選択することができる。１つの試験で、膵臓腺癌細胞の細胞表面に結合することがＥＬＩＳＡ、ＢＩＡｃｏｒｅおよび流動細胞計測法結合により実証され、これらのヒトｓｃＦｖ抗体はシアリルＬｅｗｉｓｘとＬｅｗｉｓｘに特異的であった。ヌクレオチド配列決定は、少なくとも４個の独自のｓｃＦｖ遺伝子が得られたことを明らかにした。Ｋｄ値は、１．１〜６．２×１０−７Ｍの範囲にあり、二次免疫応答で誘導されるｍＡｂの親和性に相当した。これらの抗体は、糖鎖抗原の構造と機能を調査するための、そしてヒト腫瘍疾病の処置に有益な試薬であり得る。Maoら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 6953-6958, 1999。
【００９０】
さらなる詳細な実施形態において、ファージに提示された組合せの抗体ライブラリは、転移細胞と関連した適当な抗原、例えば細胞表面受容体または転移腫瘍細胞の細胞表面受容体のリガンドに対する、多種多様な抗体を作り出し、選択するために用いることができる。ファージ・コート蛋白質ｐＶＩＩおよびｐＩＸは、抗体Ｆｖ領域のヘテロ二量体構造を提示するのに用いることができる。この技術の態様は、線状バクテリオファージのｐＩＸ上に提示された４．５×１０９メンバーの大きいヒトＦａｂまたは一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ライブラリを構築するために拡張された。さらに、ライブラリの多様性、質および有用性は、６個の異なる蛋白抗原に対するＦａｂまたはｓｃＦｖクローンの選択によって実証された。特に、選択されたクローンの９０％以上は、わずか３ラウンドのパニングの後、それぞれの抗原に対して陽性結合を示した。分析されたＦａｂまたはｓｃＦｖは高親和性であることも分かった。例えば、動態解析（ＢＩＡｃｏｒｅ）で、ブドウ球菌エンテロトキシン（staphylococcal enterotoxin）Bとコレラ毒素（cholera toxin）Ｂサブユニットに対するＦａｂまたはｓｃＦｖは、それぞれナノモルおよびｎＭ以下の解離定数を有することが分かり、免疫から得られたｍＡｂと相当するか、またはそれ以上の親和性を示した。非常に異なった蛋白質間だけでなく、２個の間の配列相同性が＞８０％配列相同性を示す密接に関連した蛋白質、例えばトウゴマ（Ricinus communis）（「リシン」）アグルチニン（ＲＣＡｅｏとＲＣＡｉｉｏ））の場合でも、高い特異性が達成された。この結果は、ｐＩＸ−ディスプレイ・ライブラリの成績が潜在的にｐＩＩＩ−ディスプレイ形式の成績を上回る場合があり、多種多様な標的抗原をパニングすることに理想的には適していることを示した。Gaoら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 12612-12616, 2001。
【００９１】
抗体または他の結合試薬と抗原との間の特異的な結合は、少なくとも１０−６Ｍの結合親和性を意味する。好ましい結合試薬は、少なくとも約１０−７Ｍ、および好ましくは１０−８Ｍ〜１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍまたは１０−１２Ｍの親和性でもって結合する。用語「エピトープ」は、抗体に特異的に結合できる抗原決定基を意味する。エピトープは、通常、アミノ酸または糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面基から成り、通常、特異的な三次元構造上の特性ならびに特異的な電荷特性を有する。
【００９２】
「エピトープ」は、抗体のまたはＴ細胞受容体の抗原結合領域の１つまたはそれ以上で抗体またはＴ細胞受容体により認識され、結合され得るいずれかの分子の一部を意味する。エピトープは、通常、アミノ酸または糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面基から成り、通常、特異的な三次元構造上の特性ならびに特異的な電荷特性を有する。「エピトープを阻害および／または中和する」は、あるエピトープが抗体により結合された場合（ＬＨ／ｈＣＧ受容体に対するｈＣＧの結合を含む）、インビボで（生体内で）、インビトロで（試験管内で）またはインシトゥーで（その場で）、より好ましくはインビボで、そのエピトープを含む分子または生物の生物活性が消失することとなるエピトープが意味される。抗体は、その解離定数が１μＭより小さい、好ましくは１００ｎＭより小さい、そしてさらに最も好ましくは１０ｎＭよりも小さい場合に、特異的に抗原を結合すると称される。立体構造エピトープおよび非立体構造エピトープは、変性溶媒の存在下で前者の結合性は失われるが後者は失われない点で識別される。
【００９３】
本発明の抗体、その断片および領域によって認識されるエピトープは、抗β−ｈＣＧ活性を含む、本発明の抗体、その断片および可変領域により認識され、および／または結合するβ−ｈＣＧの局所的もしくは３次元エピトープを提供する、以下のβ−ｈＣＧのアミノ酸配列の少なくとも１個のアミノ酸のそれぞれまたは両方を含む５個またはそれ以上のアミノ酸を含んでもよく：β−ｈＣＧの中和および／または阻害活性を決定するためのスクリーニング方法もまた本発明において提供される。本発明の内容において、抗β−ｈＣＧの中和活性またはβ−ｈＣＧの阻害活性は、β−ｈＣＧの少なくとも1つの生物活性を阻害するβ−ｈＣＧを中和する化合物の能力、例えば、β−ｈＣＧがLH/hCG受容体に結合することを妨げる能力、細胞内プロセッシング、例えば転写、翻訳または翻訳後修飾、細胞表面での発現、分泌、または生理活性β−ｈＣＧの組み立てによるβ−ｈＣＧの産生を阻害する能力を意味する。加えて、β−ｈＣＧを中和する化合物は、β−ｈＣＧ産生の上方もしくは下方調節に関わるような代謝経路の調節を誘導することによって作用し得る。別には、β−ｈＣＧを中和する化合物は、そのような感受性を低下させることによって、β−ｈＣＧに対する細胞の感受性をモジュレートしてもよい。β−ｈＣＧを中和する化合物は、β−ｈＣＧ活性をインビトロで、インシトゥーまたはインビボで中和し、本発明に従って用いられる場合にβ−ｈＣＧを中和する化合物と考えられる抗体、その断片または一部、ペプチド、ペプチド模倣化合物または有機金属模倣化合物からなる群から選択され得る。β−ｈＣＧを中和する化合物のβ−ｈＣＧ中和活性を決定するために用いられ得るスクリーニング方法は、インビトロ・アッセイまたはインビボ・アッセイを含んでもよい。そのようなインビトロ・アッセイは、（ｉ）ＢＸＰＣ−３膵癌細胞のインビトロでの増殖の阻害；および（ｉｉ）約４ｎＭもしくはそれ以上の抗体濃度でのＭＣＦ−７乳癌細胞またはＨｅＬａ細胞のインビトロで増殖の阻害がないこと；（ｉｉ）ＬＨ／ｈＣＧ受容体に対するβ−ｈＣＧの結合の阻害；または（ｉｉｉ）細胞遊走アッセイにおける細胞遊走の阻害に関する、アッセイを含んでいてもよい。別には、または、さらに、β−ｈＣＧ中和化合物のβ−ｈＣＧ中和活性のインビボ試験は、本明細書で記載されるように、約４ｎＭまたはそれ以上の抗体濃度でＢＸＰＣ−３膵癌細胞のインビトロでの増殖の阻害についてインビトロ・アッセイを用いて試験してもよい。
【００９４】
「中和」は、結合が生じて、ヒトβ−ｈＣＧのその特異的な受容体、ＬＨ／ｈＣＧ受容体に対する結合を妨げることによって、または、その受容体を通じてβ−ｈＣＧのシグナル伝達を阻害することによって、β−ｈＣＧ活性を阻害する抗体を示す。モノクローナル抗体は、例えば、インビトロ細胞アッセイで、例えば（ｉ）インビトロでのＢＸＰＣ−３膵癌細胞の増殖阻害；そして、（ｉｉ）インビトロでのＭＣＦ−７乳癌細胞またはＨｅＬａ細胞の増殖阻害のないことにより測定されて、β−ｈＣＧ活性を阻害するにあたって、９０％の有効性、好ましくは９５％の有効性、最も好ましくは１００％の有効性がある場合、中和する。
【００９５】
「試薬」は、化学化合物、生体高分子または生物学的材料から作られる抽出物の混合物を意味して、本明細書中で用いられる。
【００９６】
「改変された抗体」は、選択された宿主細胞で発現によって得ることができる、改変された免疫グロブリン・コード領域によってコードされる蛋白質を示す。そのような改変された抗体は、免疫グロブリン定常領域の全部または一部を欠く作り出された抗体（例えばキメラであるかヒト化抗体）または抗体断片である（例えばＦｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ）２その他の類似物）。
【００９７】
「改変された免疫グロブリン・コード領域」は、本発明の改変された抗体をコードする核酸配列を意味する。改変された抗体がCDRを移植されたかヒト化抗体であるとき、ヒト以外の免疫グロブリンからの相補性決定領域（CDR）をコードする配列はヒト可変部分フレームワーク配列を含む第一の免疫グロブリン・パートナー中に挿入される。場合により、第一の免疫グロブリン・パートナーは、第二の免疫グロブリン・パートナーと作動可能に連結される。
【００９８】
「高親和性」は、表面プラズモン共鳴によって決定された、ヒトβ−ｈＣＧ対して３．５×１０−１１Ｍまたはそれ以下のＫｄにより特徴付けられる結合親和性を有する抗体を意味する。
【００９９】
「ヒトβ−ＣＧに対する結合特異性」は、ヒト絨毛性ゴナドトロピンに対する高親和性を意味する。モノクローナル抗体は、β−ｈＣＧに対して高い結合特異性を有しており、他の関連するｈＣＧサブユニットまたは受容体に対しては高親和性でもって結合しない。モノクローナル抗体ｍＡｂ  ２Ｂ２．６Ｆ５および２Ｂ３．３Ｅ８は、β−ｈＣＧに対して高い結合特異性を有しており、α−ｈＣＧまたはＬＨ／ｈＣＧ受容体とは結合しない。
【０１００】
用語、Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆｃ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ）２は、その標準的な意味で用いられる（例えば、Harlowら、Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)を参照のこと)。
【０１０１】
「作り出された抗体」は、ある種の改変された抗体、すなわち全長の合成抗体（例えば抗体断片とは対照的にキメラ抗体またはヒト化抗体）であり、選択されたアクセプター抗体の一部の軽鎖および／または重鎖可変部分ドメインが、選択されたエピトープに対する特異性を有する１つまたはそれ以上のドナー抗体の類似部分で置換された抗体を記載する。例えば、そのような分子は、モディファイされていない軽鎖（またはキメラ軽鎖）とのヒト化重鎖によって特徴付けられる抗体、または、その逆の抗体を含み得る。作り出された抗体は、ドナー抗体結合特異性を保持するよう、アクセプター抗体軽鎖および／または重鎖の可変部分ドメインのフレームワーク領域をコードする核酸配列の改変によって、特徴づけられ得る。これらの抗体は、アクセプター抗体からの１つまたはそれ以上ＣＤＲ（好ましくは全部）の、本明細書中で記載されるドナー抗体のＣＤＲでの置換を含み得る。
【０１０２】
「キメラ抗体」は、アクセプター抗体から誘導される軽鎖および重鎖定常領域と共にドナー抗体から誘導された天然の可変領域（軽鎖および重鎖）を含むある種の作り出された抗体を意味する。
【０１０３】
「ヒト化抗体」は、ヒト以外のドナー免疫グロブリンから誘導されたＣＤＲを有し、その分子の残りの免疫グロブリン誘導部分は、１つの（またはそれ以上）ヒト免疫グロブリン（群）から誘導された、一種の作り出された抗体である。加えて、フレームワークのサポート残基は、結合親和性を保存するために改変されてもよい。例えば、Queenら、Proc. Natl Acad Sci USA, 86: 10029-10032, 1989、Hodgsonら、Bio/Technology, 2:421,1991を参照のこと。
【０１０４】
「ドナー抗体」は、改変された免疫グロブリン・コード領域を与え、そのドナー抗体に特有の抗原特異性と中和活性を有する改変された抗体を発現する結果となるよう、第一の免疫グロブリン・パートナーにその可変領域、ＣＤＲまたは他の機能的断片もしくは類似体の核酸配列を与える抗体（モノクローナルまたは組換え体）を意味する。
【０１０５】
「アクセプター抗体」は、第一の免疫グロブリン・パートナーにその重鎖および／または軽鎖のフレームワーク領域および／または重鎖および／または軽鎖の定常領域をコードする核酸配列の全部（または、いずれかの部分であるが、全部が好ましい）を与える、ドナー抗体と異種の抗体（モノクローナルまたは組換え体）を意味する。好ましくは、ヒト抗体がアクセプター抗体である。
【０１０６】
「ＣＤＲ」は、抗体の相補性決定領域アミノ酸配列と定義され、それは免疫グロブリン重鎖および軽鎖の超可変領域である。例えば、Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第４版、U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)を参照のこと。３個の重鎖ＣＤＲと３個の軽鎖ＣＤＲ（またはＣＤＲ領域）は、免疫グロブリンの可変領域中にある。したがって、本明細書中で用いられる「ＣＤＲ」は、３個すべての重鎖ＣＤＲまたは３個すべての軽鎖ＣＤＲ（また、適当な場合には重鎖ＣＤＲ全部と軽鎖ＣＤＲ全部の両方）を意味する。
【０１０７】
ＣＤＲは、抗体の抗原またはエピトープに対する結合に関する接触残基の大部分を与える。本発明の興味あるＣＤＲは、ドナー抗体可変部の重鎖および軽鎖配列から誘導されるか、また、それらが誘導されたドナー抗体と同じ抗原結合特異性および／または中和能を共有または保持する天然のＣＤＲの類似体もまた含む。
【０１０８】
例えば、「抗原結合特異性または中和能を共有する」は、例えば、ｍＡｂ２Ｂ２．６Ｆ５または２Ｂ３．３Ｅ８が特定のレベルの抗原親和性により特徴づけることができるが、適当な構造環境下にあるｍＡｂ２Ｂ２．６Ｆ５または２Ｂ３．３Ｅ８の核酸配列によりコードされるＣＤＲが、より低いまたはより高い親和性を有してもよいことを意味する。
【０１０９】
「機能的断片」は、その断片が誘導された抗体と同じ抗原結合特異性および／または中和能を保持する、部分的な重鎖または軽鎖可変部分配列（免疫グロブリン可変領域のアミノ末端またはカルボキシ末端のわずかな欠失）である。
【０１１０】
「類似体」は、少なくとも１個のアミノ酸によりモディファイされたアミノ酸配列であり、該モディファイは２、３個のアミノ酸（すなわち、１０個程度）の化学的もしくは置換または再編成であってもよく、そして該モディファイは、そのアミノ酸配列がモディファイされていない配列の生物学的特徴、例えば、抗原特異性および高親和性の保持を可能にする。例えば、（サイレント）突然変異は、置換を介して、特定のエンドヌクレアーゼ制限部位がＣＤＲコード領域内にまたは付近に作り出された場合に構築され得る。
【０１１１】
類似体は、対立遺伝子変異として生じることがある。「対立遺伝子変異またはモディファイ」は、本発明のアミノ酸またはペプチド配列をコードする核酸配列の改変である。そのような変異またはモディファイは、遺伝暗号で縮重によるものであってもよいし、または所望の特徴を与えるために故意に作り出されてもよい。
【０１１２】
「担体試薬」または「エフェクター試薬」は、改変された抗体および／またはドナー抗体の天然もしくは合成の軽鎖または重鎖、またはドナー抗体の他の断片が従来法により関係する、非タンパク担体分子を意味する。そのような非タンパク担体には、診断分野で用いられる一般的な担体、例えばポリスチレンまたは他のプラスチック・ビーズ、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）［ファルマシア］系で用いられるような多糖、あるいは、医薬分野で有用であり、そしてヒトおよび動物への投与にあたって安全な他の非タンパク物質が含まれる。他のエフェクター試薬には、重金属原子または放射性同位体をキレートするための巨大環が挙げられる。そのようなエフェクター試薬は、改変された抗体の半減期を増大させるために有用であり得る（例えばポリエチレングリコール）。
【０１１３】
免疫応答の成分は、当業者に周知の様々な方法によってインビトロで検出され得る。例えば、（１）細胞障害性リンパ球は、放射性で標識化された標的細胞と一緒にインキュベートし、そして標的細胞の溶解が放射性物質の放出によって検出され得る；（２）ヘルパーＴリンパ球は、抗原および抗原提示細胞と一緒にインキュベートし、サイトカインの合成および分泌を標準方法により検出し得る（Windhagenら、Immunity, 2: 373-80, 1995）；（３）抗原提示細胞は、蛋白質抗原全体と一緒にインキュベートし、ＭＨＣ上へのその抗原の提示をＴリンパ球活性化アッセイまたは生物物理学的方法により検出する（Hardingら、Proc. Natl. Acad. Sci., 86: 4230-4, 1989）；（４）肥満細胞は、そのＦｃ−イプシロン受容体を架橋する試薬と一緒にインキュベートし、ヒスタミン放出を酵素免疫学的検定により測定する（Siraganianら、TIPS, 4: 432-437, 1983）。
【０１１４】
同様に、モデル生物（例えばマウス）またはヒト患者における免疫応答の生成は、当業者に周知の様々な方法によって検出され得る。例えば、（１）ワクチン接種に応答する抗体の産生は、臨床検査室で一般に用いられる標準的な方法（例えばＥＬＩＳＡ）により容易に検出され得る；（２）炎症部位への免疫細胞の遊走は、皮膚の表面をひっかいて、無菌容器に配置し、そのかき傷部への遊走細胞を捕えることによって検出できる（Petersら、Blood, 72: 1310-5, 1988）；（３）有糸分裂促進物質または混合リンパ球培養反応に応答する末梢血単核細胞の増殖は、３Ｈチミジンを用いて測定できる；（４）ＰＢＭＣの顆粒球、大食細胞と他の食細胞の食細胞能力は、ウェルに標識化粒子と共にＰＭＢＣを配置することで測定できる；および（５）免疫系細胞の分化は、ＣＤ分子、例えばＣＤ４およびＣＤ８に対する抗体を用いてＰＢＭＣを標識化し、これらのマーカーを発現しているＰＢＭＣの割合を測定することで測定できる。
【０１１５】
便宜上、免疫応答は、本発明ではしばしば「一次」もしくは「二次」免疫応答のいずれかと記載される。「防御」免疫応答とも記載される一次免疫応答は、特定の抗原、例えば細胞表面受容体、リガンド、β−ｈＣＧまたはＬＨ／ｈＣＧ受容体に対するいくつかの初期暴露（例えば初回「免疫」）の結果として個体に生じる免疫応答を示す。そのような免疫化は、例えば、抗原（例えば、抗原を提示するか、示す一部の病原体による初感染から）に対する一部の自然暴露の結果として、または、個体中の一部の腫瘍（例えば転移性上皮癌、結腸直腸癌、胃癌、口腔癌、膵癌、卵巣癌または腎細胞癌）の癌細胞によって示される抗原から生じ得る。別には、免疫は、抗原を含むワクチンで個人にワクチン接種する結果として生じ得る。例えば、ワクチンは、癌細胞、例えば転移性上皮癌、結腸直腸癌、胃癌、口腔癌、膵癌、卵巣癌または腎細胞癌からの細胞の抗原を１つまたはそれ以上含む癌ワクチンであってよい。
【０１１６】
一次免疫応答は、時間とともに弱まり、もしくは減弱し得るし、消え去ってしまいさえし、減弱してそれを検出できなくなることもあり得る。したがって、本発明は、本明細書中「記憶免疫応答」とも記載される「二次」免疫応答にも関する。用語「二次免疫応答」は、一次免疫応答がすでに生じた後の個人に誘発される免疫応答を示す。したがって、二次免疫応答は、例えば、弱められたか減弱された既存の免疫応答を増強するために、または、消えたかもはや検出できない以前の免疫応答を再形成させるために、誘発し得る。二次免疫応答を誘発するために投与され得る薬剤は、その薬剤が一次免疫応答を「促進する」と言いうことができるので、後に「効果促進剤」と称される。
【０１１７】
例えば、制限するためのものではなく、二次免疫応答は、一次免疫応答を誘発した抗原をその個体に再び導入することによって誘発することができる（例えば、ワクチンを再び投与することによって）。しかしながら、抗原に対する二次免疫応答は、実際の抗原を含まない他の試薬を投与することによって引き起こすこともできる。例えば、本発明は、個体にβ−ｈＣＧに対する抗体を投与することによって二次免疫応答を強化する方法を提供する。そのような方法では、必ずしも実際の抗原が、β−ｈＣＧに対する抗体と共に投与される必要があるというわけではなく、また抗体を含む組成物が、必ずしも抗原を含む必要があるというわけではない。二次または記憶免疫応答は体液性（抗体）応答か細胞応答でもよい。二次または記憶体液性応答は、最初の抗原提示で生じた記憶Ｂ細胞の刺激により生じる。遅延型過敏（ＤＴＨ）反応は、ＣＤ４＋細胞によって媒介されるある種の細胞性二次または記憶免疫応答である。最初の抗原暴露は免疫系を惹起し、さらなる暴露（群）はＤＴＨの結果となる。
【０１１８】
「免疫学的に交差反応する」または「免疫学的に反応する」は、同じ抗原（「免疫学的に反応する」）または異なる抗原（「免疫学的に交差反応する」）を用いて産生された抗体と特異的に反応する抗原を意味する。一般に、抗原はβ−ｈＣＧもしくはＬＨ／ｈＣＧ受容体またはその一部である。
【０１１９】
「免疫学的反応条件」は、抗原の特定のエピトープに産生された抗体が、その抗体が実質的に他の全てのエピトープと結合するより検出可能な量より多くの量で、一般にはバックグラウンド結合より少なくとも２倍、好ましくはバックグラウンドより少なくとも５倍でそのエピトープと結合することを可能にする条件を意味する。免疫学的反応条件は抗体結合反応の形式に依存し、典型的には免疫測定プロトコルで利用されるものである。免疫学的検定の形式および条件の記載については、HarlowおよびLane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York, 1988を参照のこと。
【０１２０】
「細胞表面受容体」は、シグナルを受けることができ、そのシグナルを細胞の形質膜を超えて伝達できる分子および分子の複合体を示す。本発明の「細胞表面受容体」の例としては、転移細胞のＬＨ／ｈＣＧ受容体がある。
【０１２１】
「非特異的Ｔ細胞活性化」は、その抗原特異性に依存しないＴ細胞の刺激を示す。
【０１２２】
免疫応答の認識相と活性化相とは対照的に、「エフェクター細胞」は免疫応答のエフェクター相が関与する免疫細胞を示す。例示的な免疫細胞は、骨髄起源もしくはリンパ起源の細胞（例えばリンパ球（例えば細胞溶解Ｔ細胞（ＣＴＬ）、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、単球、好酸球、好中球、多核白血球、顆粒球、肥満細胞および塩基好性を含むＢ細胞およびＴ細胞）を含む。エフェクター細胞は、特定のＦｃ受容体を発現し、特定の免疫機能を行う。エフェクター細胞は、抗体依存細胞媒介細胞障害（ＡＤＣＣ）を誘導し得る（例えばＡＤＣＣを誘導することができる好中球）。例えば、単球、マクロファージ、好中球、好酸球およびＦｃαＲを発現するリンパ球は、特異的に標的細胞を殺すこと、免疫系の他の成分に抗原を提示すること、または抗原を示す細胞に結合することに関与する。エフェクター細胞は、目標抗原、標的細胞、転移癌細胞または微生物を食菌し得る。
【０１２３】
「標的細胞」は、本発明の抗体または抗体組成物によって標的とされ得る被検体（例えばヒトまたは動物）におけるいずれかの望ましくない細胞を示す。標的細胞は、ヒトＬＨ／ｈＣＧ受容体を発現しているか過剰発現している細胞であってもよい。ヒトＬＨ／ｈＣＧ受容体を発現する細胞は、腫瘍細胞、例えば転移性上皮癌、結腸直腸癌、胃癌、口腔癌、膵癌、卵巣癌または腎細胞癌を含み得る。
【０１２４】
抗体組成物が目的とする標的は、転移癌細胞、例えば転移上皮癌細胞であり、限定するものではないが、細胞表面受容体、成長因子受容体、β−ｈＣＧ、ＬＨ／ｈＣＧ受容体（例えば、Burtrum Dら、Cancer Res., 63: 8912-8921, 2003；Luら、J. Biol. Chem. 279: 2856-2865, 2004；Miyamotoら、Clin. Cancer Res. 11: 3494-3502, 2005；Goyaら、Cancer Research 64: 6252-6258, 2004を参照のこと）、抗イディオタイプ抗体を含む抗体、さらに癌、例えば転移癌、転移性上皮癌、結腸直腸癌、胃癌、口腔癌、膵癌、卵巣癌または腎細胞癌に存在する自己抗原が含まれる。他の標的は、接着蛋白質、例えばインテグリン、セレクチンおよび免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。Springer, Nature, 346: 425-433, 1990；Osborn, Cell, 62: 3, 1990；Hynes, Cell, 69: 11, 1992。他の興味ある標的は、成長因子受容体（例えばＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＥＯＦ、ｈｅｒ／ｎｅｕ、ＮＧＦＲとＶＥＧＦ）およびそれらのリガンドである。他の標的はＧタンパク質受容体であって、サブスタンスＫ受容体、アンギオテンシン受容体、α−およびβ−アドレナリン受容体、セロトニン受容体とＰＡＦ受容体を含む。例えば、Oilman, Ann. Rev. Biochem. 56: 625-649, 1987を参照のこと。他の標的は、イオンチャネル（例えばカルシウム、ナトリウム、カリウムチャネル、多剤耐性を媒介するチャネル蛋白質）、ムスカリン受容体、アセチルコリン受容体、ＧＡＢＡ受容体、グルタミン酸受容体とドーパミン受容体（Harpoｌｄ、米国特許第５，４０１，６２９号明細書および米国特許第５，４３６，１２８号明細書を参照のこと）を含む。他の標的は、サイトカイン、例えばインターロイキンＩＬ−１〜ＩＬ−１３、腫瘍壊死因子αおよびβ、インターフェロンα−、β−およびγ、腫瘍成長因子β（ＴＧＦ−β）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）および顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）がある。Aggrawalら、編、Human Cytokines: Handbook for Basic ＆ Clinical Research, Blackwell Scientific, Boston, Mass., 1991を参照のこと。他の標的は、ホルモン類、酵素と細胞内および細胞間メッセンジャー、例えばアデニルシクラーゼ、グアニルシクラーゼとホスホリパーゼＣである。薬物は、興味の標的でもあり得る。標的分子は、ヒト、哺乳動物または細菌のものであってもよい。他の標的は、抗原、例えば微生物病原体、ウィルスと細菌の両方および腫瘍からの蛋白質、糖蛋白および炭水化物である。さらなる他の標的は、米国特許第４，３６６，２４１号明細書（その全部はすべての目的について出典明示により本明細書の一部とされる）に記載されている。標的についてスクリーニングされた多くの試薬は、標的と結合するのみである。他の試薬は、標的を苦しめるかもしくは中和する。
【０１２５】
抗ヒトβ−ＣＧ抗体の組換え発現
β−ｈＣＧに結合する組換えヒト抗体、例えば、ｈＣＧのβ−Ｌ２に特異的に結合する抗体は、β−ｈＣＧがＬＨ／ｈＣＧ受容体に結合するのを阻害し、本明細書で提供される教示に基づき、既知技術を用いて本発明に従って提供される。例えば、Ausubelら編 Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, N.Y. (1987, 1992, 1993)；およびSambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)（これらの開示内容は出典明示により本明細書の一部とされる）を参照のこと。
【０１２６】
本発明の抗ｈＣＧ抗体をコードするＤＮＡは、重鎖定常領域（ＣＨ）、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）のうちの少なくとも１つをコードするゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであってよい。ネズミＶ領域の抗原結合部分をコードするＤＮＡの供給源としての染色体遺伝子断片の使用に便利な代替手段は、例えば、Liuら、Proc. Natl. Acad. Sci, USA 84:3439 (1987)およびJ. Immunology 139: 3521 (1987)（これらは出典明示により完全に本明細書の一部とされる）により報告されるように、キメラ免疫グロブリン遺伝子の構築物のためのｃＤＮＡの使用がある。ｃＤＮＡの使用は、所望する蛋白質の合成を達成するために、宿主細胞に適した遺伝子発現要素がその遺伝子と組み合わせられることを要求する。ｃＤＮＡ配列の使用は、適当なＲＮＡスプライシング系がない細菌または他の宿主でｃＤＮＡ配列が発現されることができるという点で、ゲノム配列（イントロンを含）より有利である。
【０１２７】
そのようなオリゴヌクレオチドを合成する技術は、周知であり、例えば、Wuら、Prog. Nucl. Acid. Res. Molec. Biol. 21:101-141 (1978))およびAusubelら編. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience (1987, 1993)により開示されており、その全開示内容は、出典明示により本明細書の一部とされる。
【０１２８】
遺伝暗号には縮重があるので、１つ以上のコドンが特定のアミノ酸をコードするために用いられ得る(Watsonら、以下参照）。遺伝暗号を用いて、１つまたはそれ以上の異なるオリゴヌクレオチドが認められ得るし、その各々はそのアミノ酸をコードし得る。特定のオリゴヌクレオチドが、現実の抗β−ｈＣＧ抗体のコード配列を構成するかという確率は、異常な塩基対形成の関係と、特定のコドンが実際に抗β−ｈＣＧ抗体または断片を発現する真核生物もしくは原核細胞で実際に（特定のアミノ酸をコードするために）用いられる頻度を考慮することにより見積もることができる。そのような「コドン使用頻度規則」は、Latheら、J. Molec. Biol. 183:1-12 (1985)により開示されている。このLatheの「コドン使用頻度規則」を用いれば、抗β−ｈＣＧ可変領域または定常領域の配列をコードし得る理論的な「最確の（most probable）」ヌクレオチド配列を含む単一のオリゴヌクレオチドまたは一組のオリゴヌクレオチドが同定される。
【０１２９】
時には、あるアミノ酸配列はあるオリゴヌクレオチドのみによりコードされてもよいが、しばしば、そのアミノ酸配列は一組の類似したオリゴヌクレオチドのいずれかによってコードさることがある。重要なことは、この組みのメンバーのは全て、ペプチド断片をコードすることができるオリゴヌクレオチドを含んでおり、したがって、潜在的にペプチド断片をコードする遺伝子と同じオリゴヌクレオチド配列を含むのに対して、その組みの１つのメンバーだけがその遺伝子のヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列を含む。このメンバーはその組みト内に存在し、その組みの他のメンバーの存在下でさえＤＮＡとハイブリダイズすることができるので、その蛋白質をコードする遺伝子のクローンを作るために単一のオリゴヌクレオチドを用いるのと同じ様式で、分画されていないオリゴヌクレオチドの組みを用いることが可能である。
【０１３０】
可変領域または定常領域を含む抗β−ｈＣＧ抗体または断片をコードすることができる理論的な「最確の」配列を含むオリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドの組みは、「最確の」配列または配列の組みにハイブリダイズすることができる相補オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの組みの配列を同定するために用いられる。そのような相補的配列を含むオリゴヌクレオチドは、可変領域または定常領域の抗β−ｈＣＧ遺伝子を特定して単離するプローブとして用いることができる（Sambrookら、以下参照）。
【０１３１】
可変もしくは定常領域のβ−ｈＣＧの断片をコードする適切なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの組み（あるいは、そのようなオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの組みと相補的である）が特定されて（上記の手順を用いて）、合成され、そして当分野で周知の手段で、抗β−ｈＣＧ抗体またはその可変領域もしくは定常領域を発現することができる細胞から誘導されたＤＮＡ、またはより好ましくはｃＤＮＡに対してハイブリダイズさせる。「最確の」可変もしくは定常抗β−ｈＣＧ領域ペプチドのコード配列と相補的な一本鎖オリゴヌクレオチド分子は、当業者には周知の手順を用いて合成することができる(Belagajeら、J. Biol. Chem. 254: 5765-5780 (1979)；Maniatisら、In: Molecular Mechanisms in the Control of Gene Expression、Nierlichら編、Acad. Press, NY (1976)；Wuら、Prog. Nud. Acid Res. Molec. Biol. 21: 101-141 (1978)；Khorana, Science 203: 614-625 (1979))。加えて、DNA合成は自動合成装置を用いることにより達成され得る。核酸ハイブリダイゼーションの技術は、Sambrookら、(以下参照)により、そしてHayrnesら、(In: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985))（これらの報文は、出典明示により本明細書の一部とされる）。例えば、上記の技術と類似する技術は、ヒトアルデヒド脱水酵素(Hsuら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3771-3775 (1985))、フィブロネクチン(Suzukiら、Bur. Mol. Biol. Organ. J. 4: 2519-2524 (1985))、ヒトエストロゲン受容体遺伝子(Walterら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7889-7893 (1985))、組織型プラスミノーゲン活性化物質(Pennicaら、Nature 301: 214-221 (1983))およびヒト妊娠末期胎盤（human term placental）アルカリホスファターゼ相補ＤＮＡ(Keunら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 8715-8719(1985))の遺伝子クローニングの成功を可能にした。
【０１３２】
抗β−ｈＣＧ抗体の可変領域または定常領域をコードするポリヌクレオチドのクローンを作る別の方法において、発現ベクターのライブラリは、発現ベクターにＤＮＡまたはより好ましくはｃＤＮＡ（抗β−ｈＣＧ抗体または可変もしくは定常領域を発現することができる細胞からのもの）をクローニングすることにより調製される。次いで、そのライブラリを、抗β−ｈＣＧ抗体（例えばｍＡｂ  ２Ｂ２．６Ｆ５または２Ｂ３．３Ｅ８）のＬＨ／ｈＣＧ受容体に対する結合を競争的に阻害し、そして抗β−ｈＣＧ抗体またはその断片と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができるヌクレオチド配列を有する蛋白質を発現することができるメンバーについてスクリーニングする。この例では、ＤＮＡまたはより好ましくはｃＤＮＡは、抗β−ｈＣＧ抗体または断片を発現することができる細胞から抽出されて、精製される。精製されたｃＤＮＡは、ＤＮＡまたはｃＤＮＡ断片のプールを得るために断片化される（剪断、エンドヌクレアーゼ消化、その他の方法によって）。次いで、このプールからのＤＮＡまたはｃＤＮＡ断片は、発現ベクターのゲノム・ライブラリを得るために、発現ベクターにクローニングされ、そのメンバーは各々、原核細胞（例えば細菌）または真核生物細胞（例えば、哺乳動物、酵母、昆虫または真菌）での発現のため、例えばラムダファージ・ライブラリに唯一のクローン化ＤＮＡまたはｃＤＮＡ断片を含む。例えば、Ausubel（以下参照）、Harlow（以下参照）、Colligan（以下参照）、；Nyyssonenら、Bio/Technology 11: 591-595 (Can 1993)；Marksら、Bio/Technology 11: 1145-1149, 1993を参照のこと。ひとたび、そのような可変もしくは定常領域の抗β−ｈＣＧをコードする核酸が単離されると、その核酸は、阻害活性を有するβ−ｈＣＧを結合する組換えｍＡｂを得るために、他の定常もしくは可変部の重鎖または軽鎖をコードする他核酸と共に、宿主細胞で適当に発現させることができる。そのような抗体は、好ましくは、抗原結合に寄与する相補性決定残基を有するフレームワーク残基を含む、ネズミもしくはヒト抗β−ｈＣＧ可変領域を含む。好ましい実施形態において、上記のように核酸によりコードされる抗β−ｈＣＧ可変部の軽鎖または重鎖は、配列番号：２、配列番号：４または配列番号：６に記載の、少なくとも５個のアミノ酸のエピトープと結合する。
【０１３３】
本発明のネズミおよびキメラ抗体の定常（Ｃ）領域、断片および領域をコードするヒト遺伝子は、ヒト胎生肝臓ライブラリから既知の方法によって誘導され得る。ヒトＣ領域遺伝子は、ヒト免疫グロブリンを発現し産生する細胞を含むいずれかのヒト細胞から誘導され得る。ヒトＣＨ領域は、ヒトＨ鎖の既知のクラス、またはγ、μ、α、δもしくはεを含むアイソタイプ、またはそのサブタイプ、例えばＧ１、Ｇ２、Ｇ３およびＧ４のいずれかから誘導され得る。Ｈ鎖アイソタイプは、抗体の様々なエフェクター機能の要因となるので、ＣＨ領域の選択は所望のエフェクター機能、例えば補体結合または抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）の活性によって導かれる。好ましいＣＨ領域は、ガンマ１（ＩｇＧ１）、ガンマ３（ＩｇＧ３）、ガンマ４（ＩｇＧ４）またはミュー（ＩｇＭ）である。
【０１３４】
ヒト抗体および抗体のヒト化
ヒト抗体は、ネズミまたはラット可変領域および／または定常領域を有する抗体に付随する特定の問題を避ける。そのようなネズミまたはラット誘導蛋白質の存在は、抗体の迅速な除去につながり得るし、その抗体に対する患者による免疫応答の産生につながり得る。ネズミまたはラット誘導された抗体の利用を避けるために、ヒト化抗体を開発し、あるいは、げっ歯類が完全なヒト配列を有する抗体を産生するようにげっ歯類中へのヒト抗体機能の導入を通じて完全なヒト抗体を産生し得ることが提唱された。
【０１３５】
ＹＡＣにおいてメガベース・サイズのヒト遺伝子座をクローン化して再構築し、そしてそれらをマウス生殖細胞系に導入する能力は、それらをマウス生殖細胞系に導入する能力は、非常に大きく未完成の状態での遺伝子座マッピングの機能的な成分を解明するにあたって、ならびに、ヒト疾病の有用なモデルを作製するにあたって強力な手法を提供する。さらに、マウス遺伝子座のそれらのヒトと同等の遺伝子座による置換に関する技術の利用は、その発生段階の発現および調節、その他の系との伝達、および疾患誘導および増悪におけるそれらの関与に対する独自の知見を提供し得る。
【０１３６】
そのような方策の重要な事実上の適用は、マウス体液性免疫系の「ヒト化」である。内因性のＩｇ遺伝子が不活性化されたマウスへのヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座の導入は、抗体のプログラムされた発現および組立ての基礎をなす機序、ならびにＢ細胞の発生におけるそれらの役割を研究する機会を提供する。さらに、そのような方策は、完全なヒト・モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の産生のための理想的な供給源を提供し、ヒト疾病における抗体療法の将来性を達成する方向に重要な一里塚を築いた。完全なヒト抗体は、マウスまたはマウス誘導化ｍＡｂに備わる免疫原およびアレルギー応答を最小化し、かくして投与された抗体の有効性と安全性を増加させることが期待される。完全なヒト抗体の使用は、繰り返しの抗体投与を要求する、慢性および再発性ヒト疾病、例えば炎症、自己免疫および癌の処置で実質的な利点を提供することが期待される。
【０１３７】
この目標に対する１つのアプローチは、マウス抗体産生を欠き、ヒトＩｇ遺伝子座の大部分の断片を有するマウス株を作り出すことであり、予想では、そのようなマウスはマウス抗体が存在しない状態で多数のヒト抗体レパートリーを生じる。多数のヒトＩｇ断片は、多数の可変部分遺伝子の多様性、ならびに抗体産生と発現の適当な調節を保存するであろう。抗体の多様化と選択に関するマウス機序、およびヒト蛋白質に対する免疫学的寛容の欠如を利用することによって、これらのマウス株において再産生されたたヒト抗体レパートリーは、ヒト抗原を含むいずれかの興味ある抗原に対して高親和性の抗体を産生するであろう。ハイブリドーマ技術を用いることで、所望の特異性を有する抗原特異性ヒトｍＡｂを、容易に生じさせることができ選択できた。
【０１３８】
そのような手法は、１９９０年１月１２日に出願された米国特許出願番号第０７／４６６，００８号、１９９０年１１月８日に出願された出願番号第０７／６１０，５１５号、１９９２年７月２４日に出願された出願番号第０７／９１９，２９７号、１９９２年７月３０日に出願された出願番号第０７／９２２，６４９号、１９９３年３月１５日に出願された出願番号第０８／０３１，８０１号、１９９３年８月２７日に出願された出願番号第０８／１１２，８４８号、１９９４年４月２８日に出願された出願番号第０８／２３４，１４５号、１９９５年１月２０日に出願された出願番号第０８／３７６，２７９号、４月２７日に出願された出願番号第０８／４３０，９３８号、１９９５年６月５日に出願された出願番号第０８／４６４，５８４号、１９９５年６月５日に出願された出願番号第０８／４６４，５８２号、１９９５年６月５日に出願された出願番号第０８／４６３，１９１号、１９９５年６月５日に出願された出願番号第０８／４６２，８３７号、１９９５年６月５日に出願された出願番号第０８／４８６，８５３号、１９９５年６月５日に出願された出願番号第０８／４８６，８５７号、１９９５年６月５日に出願された出願番号第０８／４８６，８５９号、１９９５年６月５日に出願された出願番号第０８／４６２，５１３号、１９９６年１０月２日に出願された出願番号第０８／７２４，７５２号、および１９９６年１２月３日に出願された出願番号第０８／７５９，６２０号にさらに記載され詳述されている。また、Mendezら、Nature Genetics 15: 146-156, 1997およびGreen and Jakobovits, J. Exp. Med. 188: 483-495, 1998を参照のこと。また、１９９６年６月１２日に認可発行された欧州特許番号第ＥＰ  ０  ４６３  １５１  Ｂｌ号、１９９４年２月３日に発行された国際特許出願ＷＯ９４／０２６０２号、１０月３１日に発行された国際特許出願ＷＯ９６／３４０９６号、および１９９８年６月１１日に発行されたＷＯ９８／２４８９３号を参照のこと。以上で引用した特許、特許出願および報文の各開示内容は、その全部を出典明示により本明細書の一部する。
【０１３９】
別の手法では、ジェンファーム・インターナショナル（GenPharm International）社を含む他のもので、「ミニローカス（minilocus）」法が利用される。ミニローカス法では、外来のＩｇ遺伝子座を、Ｉｇ遺伝子座の小片（個々の遺伝子）含有物を通じて模倣する。このように、１つまたはそれ以上のＶＨ遺伝子、１つまたはそれ以上のＤＨ遺伝子、１つまたはそれ以上のＪＨ遺伝子、μ定常領域および第２の定常領域（好ましくはγ定常領域）を、動物に挿入するための構築物に形成させる。この手法は、このアプローチは、Suraniらによる米国特許第５，５４５，８０７号、およびLonbergとKayによる米国特許第５，５４５，８０６号明細書、第５，６２５，８２５号明細書、第５，６２５，１２６号明細書、第５，６３３，４２５号明細書、第５，６６１，０１６号明細書、第５，７７０，４２９号明細書、第５，７８９，６５０号明細書および第５，８１４，３１８号明細書、KrimpenfortとBernsによる米国特許第５，５９１，６６９  号明細書、Bernsら、による米国特許第５，６１２，２０５号明細書、第５，７２１，３６７号明細書、第５，７８９，２１５号明細書、およびChoiとDunnによる米国特許第５，６４３，７６３号明細書、およびジェンファーム・インターナショナルの１９９０年８月２９日に出願された米国特許出願番号第０７／５７４７４８号、１９９０年８月３１日に出願された第０７／５７５９６２号、１９９１年１２月１７日に出願された第０７／８１０２７９号、１９９２年３月１８日に出願された第０７／８５３４０８号、１９９２年６月２３日に出願された第０７／９０４０６８号、１９９２年１２月１６日に出願された第０７／９９０８６０号、１９９３年４月２６日に出願された第０８／０５３１３１号、１９９３年７月２２日に出願された第０８／０９６７６２号、１９９３年１１月１８日に出願された第０８／１５５３０１号、１９９３年１２月３日に出願された第０８／１６１７３９号、１９９３年１２月１０日に出願された第０８／１６５６９９号、１９９４年３月９日に出願された第０８／２０９７４１号に記載されている（これらの開示内容は出典明示により本明細書の一部とされる）。また、ヨーロッパ特許番号０  ５４６  ０７３  Ｂｌ号、国際特許出願ＷＯ９２／０３９１８号、ＷＯ９２／２２６４５号、ＷＯ９２／２２６４７号、ＷＯ９２／２２６７０号、ＷＯ９３／１２２２７号、ＷＯ９４／００５６９号、ＷＯ９４／２５５８５号、ＷＯ９６／１４４３６号、ＷＯ９７／１３８５２号、ＷＯ９８／２４８８４号を参照のこと（これらの開示内容は、その全部を出典明示により本明細書の一部とする）。さらに、Taylorら、1992、Chenら、1993、Tuaillonら、1993、Choiら、1993、Lonbergら、1994, Taylorら、1994およびTuaillonら、1995、Fishwildら、1996を参照のこと（これらの開示内容は、その全部を出典明示により本明細書の一部とする）。
【０１４０】
Ｉｇ遺伝子座を有するトランスジェニックマウスは、ミニローカス法を用いることにより作製された。ミニローカス法の長所は、Ｉｇ遺伝子座の一部を含む構築物を作製でき、動物に導入することを迅速に行える点である。しかしながら、対応するミニローカス法の重大な不利益は、理論的に、少数のＶ、ＤおよびＪ遺伝子を含めることにより、不十分な多様性を導入する点である。実際、発表された研究は、この懸念を裏づけるようである。ミニローカス法を用いることにより産生された動物のＢ細胞発生および抗体産生は、阻害されるようである。従って、本発明に関する研究は、より大きな多様性とその動物の免疫レパートリーを再構成する努力を達成するため、大部分のＩｇ遺伝子座を導入する方向に一貫して向かっている。
【０１４１】
ヒト抗マウス抗体（ＫＡＭＡ）応答は、キメラで抗体また別にはヒト化抗体を調製する方に産業を導いた。キメラ抗体はヒト定常領域とネズミ可変領域を有するが、特に抗体の慢性利用または多数用量利用においては、特定のヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）応答が観察されると予想される。したがって、ＨＡＭＡまたはＨＡＣＡ応答の懸念および／または影響を無視するためにも、β−ｈＣＧ対する完全なヒト抗体を与えることが望ましい。
【０１４２】
ヒト化および提示技術
ヒト抗体作製と関連して上述したように、低下した免疫原性を有する抗体を産生することに利益がある。ある程度までは、そのことは、ヒト化技術および適切なライブラリを用いている提示技術と関連して達成され得る。ネズミ抗体または他の種からの抗体を、当分野の周知技術を用いてヒト化もしくは霊長類化できることは認められよう。例えば、WinterおよびHarris, Immunol Today 14: 43-46, 1993およびWrightら、Crit. Reviews in Immunol. 12:125-168, 1992を参照のこと。興味ある抗体は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジ領域および／またはフレームワーク領域を対応するヒト配列と置換する組換えＤＮＡ技術により作り出すことができる（ＷＯ９２／０２１９０号および米国特許番号５，５３０，１０１号明細書、第５，５８５，０８９号明細書、第５，６９３，７６１号明細書、第５，６９３，７９２号明細書、第５，７１４，３５０号明細書と第５，７７７，０８５号明細書を参照のこと）。キメラ免疫グロブリン遺伝子の構築のためのＩｇ  ｃＤＮＡの使用もまた、当分野で知られている（Liuら、PNAS USA 84: 3439, 1987およびJ. Immunol. 139: 3521, 1987）。ｍＲＮＡは、抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞から単離されて、ｃＤＮＡを産生するために用いられる。興味あるｃＤＮＡは、特異的なプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応法により増幅することができる（米国特許第４，６８３，１９５号明細書および第４，６８３，２０２号明細書）。別には、ライブラリを作製し、興味ある配列を単離するためにスクリーニングする。次いで、抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列は、ヒト定常領域配列に融合される。ヒト定常領域遺伝子の配列は、Kabatら、(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH publication no. 91-3242において見い出すことができる。ヒトＣ領域遺伝子は、既知のクローンから容易に入手できる。アイソタイプの選択は、所望のエフェクター機能、例えば、補体結合または抗体依存性細胞障害の活性により誘導される。好ましいアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４である。本発明の抗体に特に好ましいアイソタイプは、ＩｇＧ２とＩｇＧ４である。ヒト軽鎖定常領域、カッパまたはラムダのいずれも用いることができる。次いで、キメラ、ヒト化抗体は、従来法により発現される。
【０１４３】
抗体断片、例えばＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂは、無傷の蛋白質の開裂によって、例えば蛋白質分解酵素または化学的開裂により調製することができる。別には、切断された遺伝子が設計される。例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片の一部をコードするキメラ遺伝子は、Ｈ鎖のＣＨ１ドメインとヒンジ領域、続いて切断された分子を産生するための翻訳終止コドンをコードするＤＮＡ配列を含む。
【０１４４】
１つのアプローチにおいて、重鎖および軽鎖Ｊ領域をコードする共通配列は、Ｖ領域部分を後ろのヒトＣ領域部分に連結するにあたって、有用な制限部位をＪ領域に導入するプライマーとして使用するための、オリゴヌクレオチドを設計するために用いることができる。Ｃ領域ｃＤＮＡを部位特異的突然変異導入によってモディファイし、ヒト配列の類似位置に制限部位を配置することができる。
【０１４５】
発現ベクターは、プラスミド、レトロウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＥＢＶ誘導エピソーム、その他の類似物を含む。便利なベクターは、機能的に完全なヒトＣＨまたはＣＬ免疫グロブリン配列をコードし、ＶＨまたはＶＬ配列のいずれかを容易に挿入し発現させることができるよう作られた適当な制限部位を有するベクターである。そのようなベクターにおいて、スプライシングは通常、挿入されたＪ領域のスプライス供与部位とヒトＣ領域の前のスプライス受容部位との間で、また、ヒトＣＨエキソン内に生じるスプライス領域で生じる。ポリアデニル化と転写終結は、コード領域の下流の天然の染色体部位で生じる。結果として得られるキメラ抗体は、レトロウイルスＬＴＲ、例えばＳＶ−４０早期プロモーター（Okayamaら、Mol. Cell. Bio. 3: 280, 1983）、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ（Gormanら、P.N.A.S. 79: 6777, 1982）およびモロニー・マウス白血病ウイルスＬＴＲ（Grosschedlら、Cell 41: 885, 1985）；ネイティブ１ｇプロモーターなどを含む、いずれかの強力なプロモーターと連結されてよい。
【０１４６】
さらに、ヒト抗体または他の種由来の抗体は、限定するものではないが、ファージ・ディスプレイ、レトロウイルス・ディスプレイ、リボソーム・ディスプレイおよび当分野で周知の技術を用いた他の技術を含む提示（ディスプレイ）形式の技術を通じて作製することができ、その結果得られた分子は、さらなる成熟、例えば親和性成熟などの当分野で周知の技術を受けてもよい。WrightおよびHarris, 上掲, HanesおよびPlucthau, PNAS USA 94: 4937-4942, 1997 (リボソーマル・ディスプレイ)、ParmleyおよびSmith, Gene 73: 305-318, 1988 (ファージ・ディスプレイ)、Scott, TIBS 17: 241-245, 1992、Cwirlaら、PNAS USA 87: 6378-6382, 1990、Russelら、Nucl. Acids Research 21: 1081-1085, 1993、Hoganboomら、Immunol. Reviews 130: 43-68, 1992、ChiswellおよびMcCafferty, TIBTECH10: 80-84, 1992、ならびに米国特許第5,733,743号明細書。ディスプレイ技術がヒト以外の抗体を産生するために用いられても、そのような抗体は上述のようにヒト化することができる。
【０１４７】
これらの技術を用い、抗体は、β−ｈＣＧ発現細胞、β−ｈＣＧ、ｈＣＧ、またはｈＣＧ、そのエピトープもしくはペプチドの形態、および発現ライブラリに対して産生することができ（例えば米国特許第５，７０３，０５７号を参照のこと）、次いで、上述のように活性に関してスクリーニングすることができる。
【０１４８】
他の治療法の設計および作成
本発明に従い、そして、本明細書中で産生され特徴づけられた抗体、例えば、β−ｈＣＧに対する抗体または特異的にｈＣＧのβ−Ｌ２ループと結合する抗体の活性に基づき、他の抗体、他の拮抗剤または抗体以外の化学部分を含む他の治療形態の設計は容易になされる。そのような形態には、類似の結合活性または機能を有する抗体、例えば二重特異性抗体、免疫毒素および放射性同位元素で識別された療法、ペプチド療学、遺伝子療法、特に細胞内発現抗体（intrabody）、アンチセンス療法および小分子の生成を含むが、これに限定されるものではない。さらにまた、上記のように、本発明の抗体のエフェクター機能が、様々な治療上の使用のため、アイソタイプ転換によってＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＭに変えられてもよい。
【０１４９】
高度な抗体療法の生成と関連して、補体結合が望ましい特性である場合、例えば、二重特異性、免疫毒素または放射標識の使用を通じて、細胞致死に関する補体の依存を回避することは可能であり得る。
【０１５０】
二重特異性抗体に関して、二重特異性抗体は、（ｉ）２個の抗体、１つはβ−ｈＣＧに特異性を有するもので、もう１つは第二の分子に対するもので、それらが互いに結合されたもの、（ｉｉ）単一の抗体であって、一方の鎖はβ−ｈＣＧに対する特異性を有し、第二の鎖は第二の分子に対する特異性を有するもの、あるいは（ｉｉｉ）一本鎖抗体であって、β−ｈＣＧと他の分子に対する特異性を有するものを含み、作製することができる。そのような二重特異性抗体は、周知の技術を用いて生成することができ、例えば、（ｉ）および（ｉｉ）に関するものとしては、例えば、Fangerら、Immunol Methods 4: 72-81, 1994ならびにWrightおよびHarris,上掲、を参照のこと、また（ｉｉｉ）に関しては、例えば、Trauneckerら、Int. J. Cancer 7: 51-52, 1992を参照のこと。
【０１５１】
加えて、「カッパボディ（Kappabodies）」（Illら、Protein Eng 10: 949-57, 1997)、「ミニボディ（Minibodies）」（Martinら、EMBO J. 13: 5303-9, 1994)、「ディアボディ（Diabodies）」（Holligerら、PNAS USA 90: 6444-6448, 1993）または「ヤヌシン（Janusins）」（Trauneckerら、EMBO J 10: 3655-3659, 1991）およびTrauneckerら、Int J Cancer 7:51-52, 1992）もまた調製することができる。
【０１５２】
免疫毒素と関連して、抗体は、当分野で周知の技術を利用して、免疫毒素として作用させるためにモディファイすることができる。例えば、Vitetta, Immunol Today 14: 252, 1993を参照のこと。また、米国特許第５，１９４，５９４号明細書を参照のこと。放射性同位元素で識別された抗体の調製と関連して、そのようなモディファイされた抗体は、当分野で周知の技術を利用して、容易に調製することができる。例えば、Junghansら、Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 （第２版、ChafierおよびLongo編、Lippincott Raven, 1996)を参照のこと。また、米国特許第４，６８１，５８１号明細書、第４，７３５，２１０号明細書、第５，１０１，８２７号明細書、第５，１０２，９９０号明細書（ＲＥ３５，５００）、第５，６４８，４７１号明細書、第５，６９７，９０２号明細書を参照のこと。免疫毒素および放射性同位元素で識別された分子のそれぞれは、β−ｈＣＧを発現する細胞、特に本発明の抗体が効果的な細胞を殺害するであろう。
【０１５３】
β−ｈＣＧおよびそれに対する抗体、例えば、本発明の抗体に関する構造上の情報の利用（小分子と関連して後述するように）、またはペプチドライブラリーのスクリーニングを通じた治療ペプチドの生成に関し、治療ペプチドは、β−ｈＣＧに対するものとして生成し得る。ペプチド治療の設計およびスクリーニングは、Houghtenら、Biotechniques 13: 412-421, 1992、Houghten PNAS USA 82: 5131-5135, 1985、Pinallaら、Biotechniques 13: 901-905, 1992、Blake およびLitzi-Davis, BioConjugate Chem. 3: 510-513, 1992に関連して議論される。免疫毒素および放射性同位元素で識別された分子は、抗体に関連して上述のように、ペプチド模倣体に関して同様の方法で、調製することができる。
【０１５４】
抗原に対する抗体の結合に関する重要な情報は、ファージ・ディスプレイ実験を通して集めることができる。そのような実験は、ランダム・ペプチドを発現するファージライブラリーで、結合するペプチドを単離できるかを決定するため、本発明の抗体との結合についてパニングすることを通じて、通常、達成される。成功した場合、特定のエピトープ情報を、結合したペプチドから得ることができる。
【０１５５】
一般に、ランダムなペプチドを発現しているファージライブラリーは、バクテリオファージＭ１３系に基づき、ニューイングランド・バイオラボ（７マーおよび１２マーのライブラリ、Ｐｈ．Ｄ．７ペプチド  ７マー・ライブラリキットおよびＰｈ．Ｄ．１２ペプチド  １２マーライブラリキット、それぞれ）から購入することができる。７マーのライブラリは、約２．０×１０９の独立したクローンの多様性を示し、全部ではないが、２０７＝１．２８×１０９の可能な７マー配列の大部分を表す。１２マーのライブラリは、約１．９×１０９の独立したクローンを含み、可能な配列空間、２０１２＝４．１×１０１５の１２マー配列のごく一部の試料のみを示す。７マーおよび１２マーのライブラリのそれぞれは、プレートを適当な抗体を補足するための抗体で被覆し（例えば、ＩｇＧ抗体のためのヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体Ｆｃ）、続いて、洗浄するという製造業者の指示に従って、パニングまたはスクリーニングを行う。結合したファージを、０．２Ｍのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．２で溶出する。一定のストリンジェントな条件（０．５％  Ｔｗｅｅｎ）で、３ラウンドの選択／増幅の後、ＤＮＡ配列決定を用いることにより、抗体の１つまたはそれ以上と反応性のある、ライブラリ由来のクローンを特徴づけることができる。ペプチドの反応性は、ＥＬＩＳＡにより決定することができる。ペプチドのエピトープ分析のさらなる議論については、ScottおよびSmith, Science 249: 386-390,1990；Cwirlaら、PNAS USA 87: 6378-6382, 1990；Feliciら、J. Mol. Biol. 222: 301-310, 1991、およびKuwabaraら、Nature Biotechnology 15: 74-78, 1997もまた参照のこと。
【０１５６】
従来技術を通じた遺伝子治療および／またはアンチセンス治療法は、本発明を通じて容易になされる。そのような形態は、β−ｈＣＧの機能をモジュレートするために利用することができる。それと関連して、本発明の抗体はそれに関連する機能的アッセイの設計および使用を容易にする。アンチセンス治療の設計および方策は、国際特許出願第９４／２９４４４号で詳細に記載されている。遺伝子治療の設計および方策は、周知である。しかしながら、特に、イントラボディに関係する遺伝子治療技術の使用は、特に利益があることが示された。例えば、Chenら、Human Gene Therapy 5: 595-601, 1994およびMarasco, Gene Therapy 4: 11-15, 1997を参照のこと。遺伝子治療に関する一般的な設計および要点は、国際特許出願第９７／３８１３７号にもまた記載されている。本発明の抗体（例えば、ｍＡｂ  ２Ｂ２．６Ｆ５または２Ｂ３．３Ｅ８もしくは類似物）をコードする遺伝物質は、適切な発現系（ウイルス、減弱ウイルス、非ウイルス、裸ウイルスもしくは他のもののいずれか）に含ませ、宿主内での抗体のインビボ産生のため宿主に投与することができる。
【０１５７】
小分子治療もまた、本発明に関して想定され得る。薬物は、本発明に基づくｈＣＧの活性をモジュレートするよう設計することができる。β−ｈＣＧ分子構造、そして本発明に関係する他の分子、例えば、本発明の抗体、ＬＨ／ｈＣＧ受容体およびその他の分子との相互作用から収集される知識は、理性的にさらなる治療形態を設計するために利用されてもよい。この点に関しては、Ｘ線結晶学、コンピュータ支援（または補助）分子モデリング（ＣＡＭＭ）、定量もしくは定性的な構造活性相関（ＱＳＡＲ）、および類似技術などの合理的な薬物設計技術は、創薬効果に着目して利用することができる。論理的設計は、分子またはその特定の型と相互作用でき、そして、ｈＣＧの活性をモディファイもしくはモジュレートするために用い得る、蛋白質または合成構造の予測を可能にする。そのような構造は、化学的に合成されてもよいし、生物系で発現されてもよい。これらのアプローチは、Capseyら、Genetically Engineered Human Therapeutic Drugs (Stockton Press, NY, 1988)にて報告されている。実際、他の分子（例えば、本発明の抗体）との、既知もしくは詳細に報告された構造活性相関に基づく、分子（ペプチド、ペプチド模倣体、小分子、またはその類似物のいずれか）の論理的な設計は、一般に日常的操作となった。例えば、Fryら、Proc NatlAcad Sci USA 95: 12022-7, 1958；Hoffmanら、J Mol Biol 282: 195-208, 1998；Ginalskiら、Acta Biochim Pol 44: 557-64, 1997；Joukoら、Biochem J 322: 927-35, 1997；Singhら、J Med Chem 40: 1130-5, 1997；Mandelら、Nat Biotechnol 14: 323-8, 1996；Monfardiniら、Proc Assoc Am Physicians 108: 420-31, 1996；Furetら、J Comput Aided Mol Des 9: 465-72, 1995を参照のこと。
【０１５８】
さらに、組み合わせライブラリは、設計し、合成することができ、ハイスループット・スクリーニング効果などのスクリーニング計画を用いることができる。
【０１５９】
トランスジェニックマウスにおける抗体の調製
本発明に関する抗体は、ヒト抗体の実質的な部分を有し、挿入されたゲノムを生じるが、内因性の、ネズミ抗体の産生に欠陥が生じたトランスジェニックマウスの利用を通じて、好ましくは調製される。このように、そのようなマウスは、ヒト免疫グロブリン分子および抗体を産生することができるが、ネズミ免疫グロブリン分子および抗体の産生は欠損している。しかしながら、特にマウスと抗体の遺伝子組換えによる産生の好ましい実施形態は、１９９６年１２月３日に出願された米国特許出願番号第０８／７５９６２０号に開示されており、その開示内容は出典明示により本明細書の一部とされる。また、Mendezら、Nature Genetics 15: 146-156, 1997を参照のこと（その開示内容は出典明示により本明細書の一部とされる）。
【０１６０】
そのような技術を用いることにより、我々は種々の抗原に対する完全なヒト・モノクローナル抗体を産生した。本質的には、我々は興味ある抗原でマウス系を免疫し、抗体を発現するマウスからリンパ細胞（例えばＢ細胞）を回収し、回収された細胞を骨髄系の細胞系統と融合させ、無限増殖するハイブリドーマ細胞系を調製し、そして該ハイブリドーマ細胞系をスクリーニングして、興味ある抗原に特異的な抗体を生じるハイブリドーマ細胞系を特定して選択する。我々は、β−ｈＣＧに特異的な抗体の調製のために、本発明に従ってこれらの技術を利用した。本明細書中で、我々はβ−ｈＣＧに特異的な抗体を生じる複数のハイブリドーマ細胞系の産生を記載する。さらに、我々は、該細胞系により産生される抗体の、重鎖および軽鎖のヌクレオチドとアミノ酸配列分析を含む特徴を提供する。
【０１６１】
本明細書中で述べられるように、ｍＡｂ２Ｂ２．６Ｆ５および２Ｂ３．３Ｅ８に関するハイブリドーマ細胞系から誘導される抗体が発現された。上述の細胞系により産生される抗体のそれぞれは、いずれも完全なヒトＩｇＧｌ重鎖およびヒトＩｇＧｌ軽鎖である。一般に、本発明に関する抗体は、非常に高い結合性を有し、典型的には、固相または液相のいずれかにより測定されたＫｄは約１０−９Ｍ〜１０−１１Ｍを有する。
【０１６２】
認められるように、本発明に関する抗体は、ハイブリドーマ細胞系以外の細胞系で発現されてもよい。特定の抗体のｃＤＮＡまたはゲノム・クローンをコードする配列は、適切な哺乳動物または非哺乳類宿主細胞の形質転換に用いることができる。形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するいずれかの既知方法、例えば、ポリヌクレオチドをウイルス（またはウィルス・ベクターに）に被包し、そのウイルス（またはベクター）を、宿主細胞に形質導入する方法、あるいは当分野で既知のトランスフェクション手順による方法によるものであってよく、米国特許第４，３９９，２１６号明細書、第４，９１２，０４０号明細書、第４，７４０，４６１号明細書および第４，９５９，４５５号明細書により例証される（いずれの特許も、出典明示により本明細書の一部とされる）。形質転換手順は、形質転換に用いられる宿主に依存する。哺乳動物細胞への異種ポリヌクレオチドの導入方法は、当分野で周知であり、限定するものではないが、デキストラン媒介型トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介型トランスフェクション、プロトプラストの融合、電気穿孔法、微粒子銃、リポソームのポリヌクレオチド（類）の被包、ペプチド・結合体、デンドリマーおよび核へのＤＮＡの直接のマイクロインジェクションが含まれる。
【０１６３】
発現のため宿主として利用可能な哺乳動物細胞系は、当分野で周知であり、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）入手可能な多くの不死化細胞系が含まれ、限定するものではないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯｏ、ＨｅＬａ細胞、乳児ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎培養細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えばＨｅｐ  Ｇ２）と多くの他の細胞系が挙げられる。細菌、酵母、昆虫および植物を含むがこれに限定されない哺乳動物以外の細胞もまた、組換え抗体を発現させるために用いることができる。糖鎖形成を除去する抗体ＣＨ２ドメインの部位特異的突然変異導入は、ヒト以外の糖鎖形成の結果生じる免疫原性、薬物動態学的および／またはエフェクター機能のいずれかの変化を防ぐために好ましい。発現方法は、どの系が最も高い発現レベルを産生するか、また構成要素のβ−ｈＣＧ結合特性を有する抗体を産生するか決定することによって選択される。
【０１６４】
さらに、本発明の抗体（またはその他の部分）の産生細胞系による発現は、多くの既知の技術を用いて向上させることができる。例えば、グルタミン合成酵素およびＤＨＦＲ遺伝子発現系は、特定の条件下で発現を向上させるための共通のアプローチである。高発現細胞クローンは、従来の技術、例えば限界希釈クローニングおよびマイクロドロップ技術を用いて確認することができる。ＧＳシステムは、ヨーロッパ特許第０２１６  ８４６号明細書、第０  ２５６  ０５５号明細書および第０  ３２３  ９９７号明細書、そしてヨーロッパ特許出願第８９３０３９６４．４号の全体または関連部分で議論されている。
【０１６５】
本発明の抗体は、興味ある免疫グロブリンの重鎖および軽鎖配列に関する遺伝子組換え動物または植物の作製を通じて、また回収可能な形態での抗体産生を通じ、遺伝子組換え的に産生され得る。哺乳動物の遺伝子組換え産生と関連して、抗体はヤギ、ウシまたは他の哺乳動物の乳に産生させ回収することができる。例えば、米国特許第５，８２７，６９０号明細書、第５，７５６，６８７号明細書、第５，７５０，１７２号明細書および第５，７４１，９５７号明細書を参照のこと。
【０１６６】
本発明に係る抗体の機能分析に関連して、該抗体が、β−ｈＣＧおよびそのＬＨ／ｈＣＧ受容体に対する結合の強力な阻害剤であると判明した。例えば、本発明に係る抗体、例えばｍＡｂ２Ｂ２．６Ｆ５と２Ｂ３．３Ｅ８がβ−ｈＣＧと結合して、ｈＣＧのＬＨ／ｈＣＧ受容体への結合を阻害することが実際に示された。図６および７を参照のこと。例えば、本発明に係る抗体、例えばｍＡｂ２Ｂ２．６Ｆ５および２Ｂ３．３Ｅ８が、（ｉ）ＢＸＰＣ−３膵癌細胞のインビトロでの増殖を阻害すること；および（ｉｉ）ＭＣＦ−７乳癌細胞またはＨｅＬａ細胞のインビトロでの増殖を阻害しないことが示された。
【０１６７】
本発明に従って実際に示された結果は、本発明の抗体が、腫瘍疾患の処置のためのβ−ｈＣＧに対する現在の治療抗体より本抗体が高い効能があり得るという特定の特性を有することを示す。
【０１６８】
特に、本発明の抗体ｍＡｂ２Ｂ２．６Ｆ５または２Ｂ３．３Ｅ８は、非常に望ましい特性を所有する。これらの構造上の特徴、機能または活性は、上記のようにさらなる抗体または他の分子の設計または選択を容易にする基礎を与える。
【０１６９】
処置療法
本発明は、１つの抗体または抗体の組み合わせ、例えばβ−ｈＣＧに対する抗体（モノクローナル、ポリクローナルまたは一本鎖Ｆｖ；無傷の抗体またはその結合断片）を含み、医薬上許容される担体と共に処方される医薬組成物を提供する。いくつかの組成物は、複数（例えば２個またはそれ以上）の本発明のモノクローナル抗体または抗原結合部分の組み合わせを含む。いくつかの組成物において、組成物中の抗体またはその抗原結合部分の各々は、抗原の異なる予め選択されたエピトープに結合するモノクローナル抗体またはヒト配列抗体である。
【０１７０】
予防適用において、医薬組成物または医薬は、疾病または病態（すなわち腫瘍疾患）に罹患し易いかもしくは特に危険性のある患者に、その疾病の進行の間に示される疾病の症状、その合併症および中間の病理学的表現型の生化学、組織学的および／または、行動的症状を含む危険性を除去もしくは低下させる、重症度を小さくする、あるいは疾病の発症を遅延せるのに十分な量で投与される。治療上の適用において、組成物または薬剤は、該疾病に罹患している疑いのあるまたは既に罹患している患者に、疾病の進行における合併症および中間の病理学的表現型を含む（生化学的、組織学的および／または行動学的）疾病の症状を治癒するのに、または少なくとも部分的に抑止するのに十分な量で投与される。治療的もしくは予防的処置を達成するのに十分な量は、治療上または予防上の有効量と定義される。予防的および治療的療法において、十分な免疫応答が達成されるまで、試薬は通常いくつかの投薬量で投与される。典型的には、免疫応答は監視され、免疫応答が弱まり始めると、反復投薬を行う。
【０１７１】
有効な投薬
本明細書中で記載される癌関連の病態および疾病（例えば転移癌）の処置のための本発明の抗体組成物（例えばβ−ｈＣＧに対する抗体）の有効量は、多種多様な要素、投与方法、標的部位、患者の生理的状態、その患者がヒトであるかもしくは、動物であるか、他に医薬が投与されるか、そして処置は予防的なものか治療的なものかどうかに応じて変化する。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含むヒト以外の哺乳動物もまた処置し得る。処置投薬量は、安全性および有効性を最適化するために滴定される必要がある。
【０１７２】
抗体を用いた投与に関して、その投薬量は、約０．０００１〜１００ｍｇ／宿主体重ｋｇ、より一般的には０．０１〜５ｍｇ／宿主体重ｋｇの範囲にある。例えば、投薬量は、１ｍｇ／体重ｋｇ、または１０ｍｇ／体重ｋｇ、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。例示的な処置療法は、２週ごとに一回、１ヵ月に一回、３〜６ヵ月毎に一回の投与を必要とする。いくつかの方法では、異なる結合特異性を有する２個またはそれ以上のモノクローナル抗体が同時に投与され、この場合、投与される各抗体の投薬量は所定の範囲である。抗体は通常複数回投与される。一回の投薬量の間隔が、毎週、毎月または毎年があってもよい。間隔は、患者における抗体の血中レベルを測定することにより示されて不規則となってもよい。いくつかの方法では、投薬量は、１−１０００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度、いくつかの方法では２５−３００μｇ／ｍｌを達成するために調整される。別には、抗体は徐放製剤として投与されてもよく、この場合あまり頻繁でない投与が要求とされる。投薬量と頻度は、患者における抗体の半減期によって変化する。一般に、ヒト抗体が最も長い半減期を示し、次にはヒト化抗体、キメラ抗体およびヒト以外の抗体が続く。投与の投薬量と頻度は、処置が予防的であるか治療的であるかどうかに応じて変化し得る。予防的適用においては、比較的低投薬量で、長期間にわたって比較的低頻度に投与される。一部の患者は、一生の残りの期間中処置を受け続ける。治療的適用においては、比較的短い間隔での比較的高い投薬量が、時には、病気の進行が低下されか停止するまで、好ましくは患者が疾病の症状の部分的なもしくは完全な改善を示すまで要求される。その後、患者は予防的療法を施されてもよい。
【０１７３】
免疫原をコードする核酸の用量は、患者につき１０ｎｇ〜１ｇ、１００ｎｇ〜１００ｍｇ、１μｇ〜１０ｍｇまたは３０μｇ〜３００μｇのＤＮＡの範囲にある。感染性ウィルスベクターの用量は、用量につき１０個〜１００個またはそれ以上のウイルス粒子で変わる。
【０１７４】
投与経路
癌関連の病態および疾病、例えば転移癌の処置のための免疫応答を誘導するための抗体組成物、例えばβ−ｈＣＧに対する抗体は、脳病変および／または治療上の処置を標的とする抗体調製についての吸入剤として予防のため、非経口、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内、筋肉内手段によって投与されてもよい。他の経路が同じように効果的であっても、免疫原作用剤の最も典型的な投与経路は皮下である。次に最も一般的な経路は、筋肉内注射である。この種の注射は、最も典型的には腕または脚の筋肉で実施される。いくつかの方法では、試薬は直接、堆積物が蓄積される特定の組織に注射される（例えば頭蓋内注射）。静脈注入に関する筋肉内注射は、抗体の投与に関して好ましい。いくつかの方法では、特定の治療抗体は、直接頭蓋に注射される。いくつかの方法では、抗体は、徐放組成物または装置（例えばメディパッド装置（登録商標））として投与される。
【０１７５】
本発明の試薬は、様々な癌関連の疾病を含む様々な疾病を処置するにあたって、少なくとも部分的な効果を有する他の試薬と組み合わせて選択的に投与してもよい。脳への腫瘍転移の場合、本発明の試薬は、脳血液関門（ＢＢＢ）を越える本発明の試薬の通過を増加させる他の試薬と共に投与されてもよい。
【０１７６】
製剤
免疫応答を誘導するための抗体組成物、癌関連の状態および疾病、例えば転移性癌の処置のためのβ−ｈＣＧに対する抗体は、すなわち活性治療薬および様々な他の医薬上許容される成分を含む医薬品組成物としてしばしば投与される。（Remington's Pharmaceutical Science, 第１５版、Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1980を参照のこと）。好ましい形態は、投与と医療適用の意図する方法に依存する。組成物はまた、望まれる製剤によって、医薬的に許容できる、無毒な担体または希釈剤を含ませることもでき、それは動物もしくはヒト投与のための医薬組成物を製剤化するために通常用いられる賦形剤と定義される。希釈剤は、組み合わせる物質の生物活性に影響を及ぼさないよう選択される。そのような希釈剤の例には、蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液およびハンク溶液がある。加えて、医薬組成物または製剤は、他の担体、アジュバントまたは無毒性、非治療性、非免疫原性の安定剤およびその類似物を含んでもよい。
【０１７７】
医薬組成物は、大きな、ゆっくり代謝される巨大分子、例えば蛋白質、多糖、例えばキトサン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸とコポリマー（例えば、ラテックス官能性セファロース、アガロース、セルロースおよびその他の類似物）、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマーおよびリピド凝集体（例えば、油滴またはリポソーム）を含むこともできる。加えて、これらの担体は、免疫賦活性作用剤（すなわちアジュバント）として機能し得る。
【０１７８】
非経口投与について、本発明の組成物は、無菌の液体、例えば水油、食塩水、グリセロールまたはエタノールであり得る製薬担体と共に、生理的に許容される希釈剤中の物質の溶液または懸濁液の注射可能な投薬量として投与することができる。加えて、補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝物質およびその他の類似物は、組成物中に存在してもよい。医薬組成物の他の成分は、石油、動物性油、植物油または合成起源の油、例えば落花生油、大豆油および鉱油である。一般に、特に注射可能な溶剤については、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールのようなグリコールは、好ましい液体担体である。抗体は、活性成分の徐放を可能にする方法で製剤化され得る蓄積注射または埋め込み調剤の形態で投与することができる。典型的な組成物は、ＨＣ１でｐＨ６．０に調整された、５ｍｇ／ｍＬのモノクローナル抗体、５０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む水性緩衝液で製剤化される。
【０１７９】
典型的に、組成物は注射可能薬として調製される。液体溶液または懸濁剤のいずれか；注射前に注射剤を調製することもできる、液体ビヒクル中の液剤もしくは懸濁剤のための固体製剤として調製される。製剤は、上記のように、リポソームまたはマイクロ粒子、例えば増強されたアジュバント効果のためのポリ乳酸、ポリグリコリドまたはコポリマーで乳化することもできるしカプセル化することもできる。Langer, Science 249: 1527, 1990およびHanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28: 97-119, 1997。本発明の試薬は、活性成分の徐放もしくはパルス放出を可能にする方法で処方され得る蓄積注射または埋め込み調剤の形態で投与することができる。
【０１８０】
他の投与様式に適したさらなる製剤は、経口、鼻腔内および肺製剤、坐薬および経皮適用を含む。
【０１８１】
坐剤について、結合剤および担体は、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含み；そのような坐剤は０．５％〜１０％（望ましくは１％〜２％）の範囲で活性成分を含む混合剤から製剤化できる。経口製剤は、賦形剤、例えば医薬等級のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウム・サッカリン、セルロースおよび炭酸マグネシウムを含む。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤、ピル、カプセル剤、徐放製剤または粉剤の形態をとり、活性成分の１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％を含む。
【０１８２】
局所適用は、経皮送達もしくは皮内送達となってよい。局所投与は、コレラ毒素もしくは解毒された誘導剤またはそのサブユニットまたは他の類似の細菌毒素と共に作用剤を同時投与することにより容易にすることができる。Glennら、Nature 391: 851, 1998。同時投与は、混合としてまたは化学架橋によって得られた連結分子としての成分、あるいは融合蛋白質としての発現を用いることにより達成することができる。
【０１８３】
別法として、経皮送達は、皮膚用パッチ剤を用いるか、またはトランスフェロソーム（transferosome）を用いて達成することができる。Paulら、Eur. J. Immunol. 25: 3521-24, 1995；Cevcら、Biochem. Biophys. Acta 1368: 201-15, 1998。
【０１８４】
医薬組成物は、通常、無菌で、実質的に等張性があり、そして米食品医薬品局のすべての医薬品製造品質管理基準（ＧＭＰ）規則に完全に従ったものとして製剤化される。
【０１８５】
診断的使用
診断試薬としての使用のための抗体および抗体組成物の特徴。転移腫瘍細胞、例えば転移性上皮癌、結腸直腸癌、胃癌、口腔癌、膵癌、卵巣癌または腎細胞癌からの細胞を特定する診断法のためのヒト抗体は、好ましくは上記の方法を用いて産生される。この方法は、実質的に無限数の、いずれかのエピトープ結合特異性およびいずれかの所望の抗原に対する非常に強い結合親和力のある、本発明の抗体および抗体組成物を得ることとなる。一般に、その標的に対する抗体のより高い結合親和性、より厳しい洗浄条件は、標的抗原を取り除くことなく非特異的に結合する物質を取り除く免疫測定で実施することができる。したがって、通常、上記アッセイで用いられる本発明の抗体および抗体組成物は、少なくとも１０８、１０９、１０１０、１０１１または１０１２Ｍ−１の結合親和力を持つ。さらに、診断試薬として用いられる抗体は、標準的な条件下で平衡に達するまでの十分な時間、少なくとも１２時間、望ましくは少なくとも５時間、およびより望ましくは少なくとも１時間を要することが望ましい。
【０１８６】
好ましくは、特許請求する方法に用いられる本発明の抗体および抗体組成物は、高い免疫活性（すなわち、それらがその標的抗原を特異的に結合できるよう、正しく折り畳まれた抗体分子のパーセンテージ）を有する。それは、上記のように大腸菌における抗体をコードする配列の発現によって行われ得る。そのような発現は、通常少なくとも８０％、９０％、９５％または９９％の免疫活性になる。
【０１８７】
発明のいくつかの方法は、診断試薬として抗体ポリクローナル産物および発明の抗体組成物を用い、そして、他の方法ではモノクローナル単離物を用いる。ポリクローナル混合物の使用には、１つのモノクローナル抗体から成る組成物に関するより多くの利点がある。標的上の複数の部位に結合することにより、ポリクローナル抗体または他のポリペプチドは、単一の部位と結合するモノクローナル体より強い信号（診断法のための）を作り出すことができる。さらに、モノクローナル抗体が元となる配列またはそれと非常に狭い範囲の配列にのみ結合するのに対して、ポリクローナル体は元となる標的配列の多数の異型（例えば対立形質の異型、種異型、株異型、薬物誘導型エスケープ変異型）と結合することができる。しかしながら、モノクローナル抗体は、非常に近い抗原の存在または存在の可能性がある中で単一の抗原を検出のに有利である。
【０１８８】
上記の方法に従って調製されるポリクローナルヒト抗体を用いる方法では、調製物は、典型的には、標的抗原に対し異なるエピトープ特異性を有する抗体の組み合わせを含む。モノクローナル抗体を用いる幾つかの方法では、異なるエピトープ結合特異性を有する２つの抗体があることが望ましい。エピトープ結合特異性の差は、競合アッセイで測定することができる。
【０１８９】
試料および標的。ヒト抗体はどのような試料の診断試薬としても用い得るが、それらはヒト試料の診断試薬として最も有効である。試料は、患者のいずれかの組織または体液から得ることができる。試料の好ましい供給源は、全血、血漿、精液、唾液、涙、尿、糞便、汗、頬、皮膚および毛が挙げられる。試料は、内部臓器生検から、または癌から得ることもできる。試料は、診断または研究のために臨床患者から得ることがでる、また対照として病気に罹患していない個体から、基礎研究のために得ることができる。
【０１９０】
本方法は、いずれかのタイプの標的抗原を検出するのに用いることができる。例示的な腫瘍抗原には、腫瘍抗原、例えば転移性上皮癌、結腸直腸癌、胃癌、口腔癌、膵癌、卵巣癌または腎細胞癌の腫瘍抗原がある。他の標的抗原は、その発現レベルまたは組成がヒト疾患または他の表現型と相関するヒト蛋白質である。そのような抗原の例には、接着蛋白質、ホルモン類、成長因子、細胞受容体、自己抗原、自己抗体およびアミロイド沈着物が含まれる。興味のある他の標的は、腫瘍細胞抗原、例えば癌胎児抗原を含む。興味のある他の抗原は、クラスＩとクラスＩＩのＭＨＣ抗原である。
【０１９１】
診断アッセイの形式。ヒト抗体は、種々の標準的なアッセイ形式で所定の標的を検出するために用いることができる。そのような形式には、免疫沈降法、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ、放射免疫測定法および免疫定量（immunometric）アッセイが含まれる。HarlowおよびLane（上掲）；米国特許第３，７９１，９３２号明細書；第３，８３９，１５３号明細書；第３，８５０，７５２号明細書；第３，８７９，２６２号明細書；第４，０３４，０７４号明細書；第３，７９１，９３２号明細書；第３，８１７，８３７号明細書；第３，８３９，１５３号明細書；第３，８５０，７５２号明細書；第３，８５０，５７８号明細書；第３，８５３，９８７号明細書；第３，８６７，５１７号明細書；第３，８７９，２６２号明細書；第３，９０１，６５４号明細書；第３，９３５，０７４号明細書；第３，９８４，５３３号明細書；第３，９９６，３４５号明細書；第４，０３４，０７４号明細書および第４，０９８，８７６号明細書（それぞれ、その全部および全ての目的について、出典明示により本明細書の一部とされる）を参照のこと。
【０１９２】
免疫定量アッセイまたはサンドイッチアッセイが好ましい形式である。米国特許第４，３７６，１１０号明細書；第４，４８６，５３０号明細書；第５，９１４，２４１号明細書および第５，９６５，３７５号明細書（それぞれ、それぞれ、その全部および全ての目的について、出典明示により本明細書の一部とされる）を参照のこと。そのようなアッセイは、固相に固定された１つの抗体または集団を、および溶液中の１つの抗体または集団が用いられる。典型的には、溶液の抗体もしくは抗体の両方は標識化される。抗体集団を用いる場合、典型的には、その集団は、標的抗原内の異なる特異エピトープに結合する抗体を含む。したがって、同じ集団を、固相と溶液の抗体の双方に用いることができる。モノクローナル抗体を用いる場合、異なる結合特異性のある第１および第２のモノクローナル抗体は、固体と溶液相に用いることができる。固相と液相の抗体は、順にまたは同時に標的抗原と接触できる。固相抗体が最初に接触する場合、そのアッセイはフォワードアッセイと称される。反対に、溶液の抗体が最初に接触する場合、そのアッセイはリバースアッセイと称される。標的が同時に両方の抗体に接触される場合、そのアッセイは同時アッセイと称される。標的を、抗体を用いて接触させた後、試料は通常約１０分から約２４時間の間で変更して、通常約１時間インキュベートされる。次いで、洗浄工程を、診断試薬として用いる抗体に特異的に結合していない試料成分を取り除くために実施する。固相および溶液の抗体が別の工程で結合される場合、洗浄はいずれかの結合工程または両方の後に実施することができる。典型的には、結合は、洗浄後に標識化された溶液の抗体の結合を通じて固相に連結された標識を検出することによって、定量化される。通常、抗体もしくは抗体集団の所定の対および所定の反応条件に関し、較正曲線は、既知濃度の標的抗原を含む試料から調製される。次いで、試験される試料中の抗原濃度は、較正曲線から当てはめることにより読みとられる。分析物は、平衡状態で結合された標識化された溶液の抗体量から、または、平衡に達するまでの一連の時点の結合された標識化された溶液の抗体の反応速度測定により、測定することができる。その曲線の傾きは、試料中の標的物の濃度の量である。
【０１９３】
上記の方法に使用するのに適した支持体は、例えば、ニトロセルロース膜、ナイロン膜および誘導化ナイロン膜、さらには粒子、例えばアガロース、デキストラン系ゲル、ディプスティック（dipstick）、微粒子、ミクロスフェア、磁気粒子、試験管、マイクロタイター・ウェル、セファデックス（SEPHADEX（登録商標））（アマシャム・ファルマシア・バイオテック、ピスカタウェイ（Piscataway）、ニュージャージー州）が含まれる。固定化は、吸着によってか、または共有結合によってであってよい。他には、抗体は、アビジンのような表面に結合させたリンカーに対して結合させためのリンカー分子、例えばビオチンと連結されてもよい。
【０１９４】
標識
アッセイに用いられる特定の標識または検出可能な群は、アッセイに用いられる抗体の特異的な結合を顕著に干渉しない限り本発明の重要な態様ではない。検出可能な群は、検出可能な物理的もしくは化学的特徴を有するいずれかの物質であってよい。そのような検出可能な標識は、免疫学的検定の分野で広く開発されており、一般に、該方法に有用な標識の大部分は本発明にいずれも適用可能である。従って、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気学的もしくは化学的手法により検出可能ないずれかの組成物である。本発明に有用な標識は、磁気ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標））、蛍光色素（例えば、フルオロセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミンおよびその類似物）、放射標識（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１２１Ｉ、１１２Ｉｎ、９９ｍＴｃ）、他のイメージング試薬、例えば超微粒気泡（超音波画像化用）、１８Ｆ、１１Ｃ、１５Ｏ（陽電子断層撮影法用）、９９ｍＴＣ、１１１Ｉｎ（単一光子放出型断層撮影用）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよび一般にＥＬＩＳＡに用いられる他のもの）および熱量測定標識、例えばコロイド金、または着色ガラスもしくはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスおよびその類似物）ビーズが挙げられる。そのような標識の使用を記載する特許には、米国特許第３，８１７，８３７号明細書；第３，８５０，７５２号明細書；第３，９３９，３５０号明細書；第３，９９６，３４５号明細書；第４，２７７，４３７号明細書；第４，２７５，１４９号明細書および第４，３６６，２４１号明細書が挙げられ、それぞれは全ての目的に関して、その全部を出典明示により本明細書の一部とされる。また、Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 第６版、Molecular Probes, Inc., Eugene ORを参照のこと。
【０１９５】
標識は、当分野で周知の方法に従って、アッセイ中の所望の成分と直接的にもしくは間接的に結合させることができる。以上で示すように、多種多様な標識を用いることができ、要求される感度、化合物との抱合化の容易さ、安定性要件、利用できる機器および廃棄規定に応じて標識の選択を行う。
【０１９６】
非放射性標識は、しばしば間接的な手法で結合される。一般に、リガンド分子（例えば、ビオチン）は、分子に共有結合される。次いで、そのリガンドが、本質的に検出可能な、もしくはシグナル系、例えば、検出可能な酵素、蛍光分子または化学発光分子と共有結合した抗リガンド分子（例えば、ストレプトアビジン）に結合する。多くのリガンドおよび抗リガンドを用いることができる。リガンドが天然の抗リガンド、例えばビオチン、チロキシンおよびコルチゾールを有する場合、それは、標識化された天然の抗リガンドと連結するのに用いることができる。別には、いずれかのハプテンまたは抗原性化合物を、抗体と組み合わせて用いてもよい。
【０１９７】
該分子もまた、シグナル生成化合物に、例えば、酵素もしくは発蛍光分子と連結することにより直接連結されてもよい。標識として関心のある酵素は、第一に、加水分解酵素、特にホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼ、または酸化還元酵素、特にペルオキシダーゼであろう。蛍光分子には、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンおよびその類似物が挙げられる。化学発光化合物には、ルシフェリンおよび２，３−ジヒドロフタラジンジオン、例えば、ルミノールが挙げられる。用いることができる標識もしくはシグナル生成系の様々な報文については、米国特許第４，３９１，９０４号明細書（すべての目的に関して、その全部を出典明示により本明細書の一部とする）を参照のこと。
【０１９８】
標識を検出する方法は、当業者には周知である。従って、例えば、標識が放射標識である場合、検出手法には、シンチレーション計数器または放射能写真の感光フィルムが挙げられる。標識が蛍光標識である場合、その蛍光色素に適切な光波長で励起し、その結果得られる蛍光を検出することにより検出することができる。電子感知器、例えば、電荷結合素子（ＣＣＤ）または光電子増倍管およびその類似物の使用により、視覚的に蛍光を検出できる。同様に、酵素標識は、その酵素に適した基質を提供し、その結果得られる反応生成物を検出することにより、検出することができる。最後に、単純な熱量測定標識は、標識に付随する色を単純に観察することにより検出することができる。かくして、様々な計量アッセイにおいて、様々な連結されたビーズはそのビーズの色を呈するが、連結された金はしばしばピンク色を呈する。
【０１９９】
幾つかのアッセイ形式では、標識化成分の使用が要求されない。例えば、凝集アッセイは、標的抗体の存在を検出するために用いることができる。この場合、抗原被覆された粒子が、その標的抗体を含む試料により凝集される。この形式では、成分は標識化される必要はなく、標的抗体は単純に視覚観察により検出される。
【０２００】
しばしば、β−ｈＣＧ蛋白質およびβ−ｈＣＧに対する抗体は、検出可能なシグナルを発する基質と、共有結合もうしくは非共有結合のいずれかにより連結されて標識化され得る。
【０２０１】
毒性
好ましくは、治療上有効量の本明細書に記載の抗体組成物は、実質的な毒性を引き起こさず治療上の利益を提供するであろう。
【０２０２】
本明細書に記載の蛋白質の毒性は、細胞培養分津または実験動物において、一般的な医薬手順により、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％致死量）またはＬＤ１００（集団の１００％致死量）を決定することにより、決定することができる。毒性と治療効果との用量比は、治療指標である。細胞培養アッセイおよび動物実験から得らたデータは、ヒトでの使用に関して毒性のない投薬量範囲を計画するのに用いることができる。本明細書に記載の蛋白質の投薬量は、好ましくは、毒性がほとんどないかもしくは毒性のないその有効量を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、用いられる投与剤型および利用される投与経路に応じてその範囲内で変更され得る。正確な製剤、投与経路および投薬量は、患者の状態に鑑みて個々の医師により選択され得る（例えば、Finglら、1975, In: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1を参照のこと）。
【０２０３】
キット
本発明の範囲内には、本発明の組成物（例えば、モノクローナル抗体、ヒト配列抗体、ヒト抗体、多特異的および二重特異性分子）および使用説明書を含むキットもある。さらに、キットには、少なくとも１つのさらなる試薬、または１つまたはそれ以上のさらなる本発明のヒト抗体（例えば、第一のヒト抗体と異なる抗原のエピトープと結合する、競合活性を有するヒト抗体）を含んでいてもよい。典型的には、キットは、そのキット内容の予定された使用を示すラベルを含む。用語「ラベル」は、いずれかの記述、またはキットにもしくはキットと共に提供される記録用具、その他キットに付随する他のものを含む。
【０２０４】
詳細な説明に記載のおよび以下の実施例に記載の以下のｃＤＮＡクローンは、ブダペスト条約のもとアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）、10801 University Boulevard、Manassas、Va. 20110-2209に寄託された。ｍＡｂ  ２Ｂ２．６Ｆ５のハイブリドーマ細胞株は、          で示されるＡＴＣＣ受入番号を有する。ｍＡｂ  ２Ｂ３．３Ｅ８のハイブリドーマ細胞株は、          で示されるＡＴＣＣ受入番号を有する。
【０２０５】
他の実施形態および使用は、本開示内容に照らして、当業者には明らかであろう。
【０２０６】
実施例１
抗原
モノクローナル抗体の産生のための免疫原は、ペプチドと担体蛋白質の結合体である。ペプチドは、β−ｈＣＧ  Ｌ２ロングループアミノ酸３８−５７（ＬＰ、ループペプチド）に基づいた。担体蛋白質は、ジフテリアトキソイド(ＤＴ、Sanofi Aventis、トロント、カナダ)であった。この抗原性製剤の化学名は、Ａｌａ−（Ｐｒｏｅ）−β−ｈＣＧ（３８−５７）−Ｇｌｙ［Ｈｙｐ３９］−ＤＴ複合体である。β−ｈＣＧ蛋白質配列の３９番目のプロリンが、ヒドロキシプロリンに置換されている。β−ｈＣＧ（３８−５７）ＬＰのアミノ酸配列は、Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｈｙｐ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｃｙｓである。他のいずれかの糖蛋白質シスチンノット成長因子の相同Ｌ２ロングループは、β−ｈＣＧの３８−５７残基に換えて、３９番目にヒドロキシプロリン置換を有していても、有していなくてもよい。別の担体蛋白質もまた、この手順に従う。米国特許第６，７１６，４２８号明細書を参照のこと。
【０２０７】
ループペプチド（ＬＰ）は、ＡＣＴ合成機で自動化手順を用いた標準的なＦｍｏｃ合成法と製造元の説明(Advanced ChemTech、ルーイビル、ケンタッキー州)により合成した。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、１，２エタンジチオール（ＥＤＴ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤｆｆｉＡ）およびベンゾトリアゾリルＮ−オキシ−トリスジメチルアミノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）は、シグマ社（セントルイス、ミズーリ州）から得た。Ｆｍｏｃ保護されたグリシン−ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂（Wang resin）は、固体支持体として用いた。これは、ＤＭＦとＤＣＭにおいて洗浄することにより調製した。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙは、ＤＭＦ中で２０％ピペリジンを用いて脱保護した。カップリングした後、その樹脂はＤＭＦにおいて洗浄した。Ｆｍｏｃシステイン、ＬＰ中の次のアミノ酸残基を、ＢＯＰの存在下でＤＩＥＡを用いてカップリングした。カップリングの効率は、ニンヒドリンを用いて確認した。カップリングが不完全の場合、最大２回のさらなるカップリング工程を繰返し行う。脱保護、中和、カップリングおよび洗浄の２７の標準的なサイクルの完了後、ペプチド樹脂試料を、樹脂からの完了したペプチド混合物の開裂前に、アミノ酸組成について評価した。保護されたペプチド樹脂を、側鎖保護基を取り除くために、ｐ−クレゾール：ＴＦＡ：ＥＤＴ：Ｅ２Ｏから成る開裂試薬に２時間曝した。このペプチド／樹脂混合物を、焼結ガラス漏斗によりエチルエーテルを用いて連続的に洗浄した。これに続いて、ペプチドを溶解させ、樹脂から分離するために、７０％酢酸で洗浄した。粗ペプチドを、フェリシアン化カリウム（Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ６）を用いて２０時間室温で処理することにより、鎖内のジスルフィド結合の形成を介して結晶化した。環化したペプチドは、Ｂｉｏｒｅｘ−７０陽イオン交換樹脂(バイオ−ラッド、ハーキュリーズ、カルフォルニア州)によるイオン交換クロマトグラフィーにより７０％酢酸を用いて環化していないペプチドから取り出した。ペプチドのクロマトグラフした貯蔵物を、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ  ＨＰＬＣ）により確認し、ペプチド混合物を評価した。ペプチドを、粗結晶化混合物から２段階の工程を経て精製した。第一に、低圧逆相クロマトグラフィーを、Ｑ１８シリカ樹脂において０．１％トリフルオロ酢酸に加えてアセトニトリル勾配を用いて行った。これに続いて、陰イオン交換クロマトグラフィーを、ＡＧ−１ｘ８陰イオン交換カラム（バイオ−ラッド、ハーキュリーズ、カルフォルニア州)にて行い、１０％酢酸を用いて溶出した。純度について、一部の試料を薄層クロマトグラフィーと逆相ＨＰＬＣにより試験した。適切な純度のペプチド試料の一部を、残存する溶媒を取り除くため凍結乾燥した。ペプチドの一部の乾燥試料を、ＵＳＰ純水に溶解させ、シェル凍結（shell frozen）させ、その後凍結乾燥させた。次いで、試料の一部を集め、収量は重量測定により確認した。
【０２０８】
ジフテリアトキソイド（ＤＴ、サノフィ−アベンティス、トロント、カナダ）を、記載の実施例では担体として用いた。しかしながら、当業者には既知であるように、種々の多くの単体蛋白質をこの目的に用いることができる。ＤＴ製造は、コリネバクテリウム・ジフテリア（Corynebacterium diphtheriae）株Ｌ３４Ｔ１培養液のトルエン処理に基づく。この毒素を精製し、透析し、ホルムアルデヒドを用いて解毒し、そして、限外ろ過により濃縮した。硫酸アンモニウム沈殿の後、トキソイドを溶解させ、硫酸アンモニウムを除くため透析した。
【０２０９】
ＬＰ−ＤＴ結合体は、２種の異なるヘテロ二機能リンカー試薬、Ｎ−スクシンイミジル−３（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ、ピアース・ケミカル（Pierce Chemical）、ロックフォード、イリノイ州)およびε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｅＭＣＳ、シグマ・アルドリッチ・ファイン・ケミカルズ、セントルイス、ミズーリ州）を用いた２つの２段階工程により産生した。この工程の結果、ＤＴのリジンアミノ基（ＳＰＤＰを介する）のペプチドのＮ末端との連結が行われる。精製されたＤＴは、ＳＰＤＰと反応して、中間体、ＳＰＤＰ−ＤＴを形成する。ＬＰはｅＭＣＳと反応して、他の中間体、マレイミド−ＬＰ（Ｍ−ＬＰ）を形成する。次いで、ＳＰＤＰ−ＤＴおよびＭ−ＬＰは、互いに反応し、チオエーテル結合を介してＬＰ−ＤＴ結合体を形成する。未反応試薬の除去、中間体の精製、および緩衝液交換は、一連のダイアフィルトレーション（膜分離）工程により行った。精製されたＤＴは、ホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．２を用いて２０ｍｇ／ｍｌに調整した。ＳＰＤＰを、１８モルのペプチドに対して１モルのＤＴでカップリングさせるため、ＤＴを活性化するのに十分な１０ｍｌ／分で添加した。その混合物を室温で１時間攪拌し、その活性型のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを介して、ＤＴのアミノ基に対してＳＰＤＰをカップリングさせ、ＳＰＤＰ−ＤＴを生成した。この反応混合液を濃縮し、次いで３０倍容量のクエン酸カップリング緩衝液（ＣＣＢ，ｐＨ６．０）に対するダイアフィルトレーションにより精製した。試料を、ｐＨ（６．０±０．２）で、サイズ排除クロマトグラフィーＨＰＬＣにより純度を、ロウリー法により濃度を、そして１モルのＤＴあたり１５−２１モルであることを確認するため、５，５’−ジチオ−ビス−２−ニトロ安息香酸（エルマン試薬、シグマ・アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州）によりチオール定量を評価した。ＬＰは、１モルのＳＰＤＰ−ＤＴと反応するＭ−ＬＰ中間体のモル量を生成するのに十分なｅＭＣＳのＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルと反応させた。Ｍ−ＬＰは、スーパーデックス（Sephadex）Ｇ１０（ファルマシア、ウプサラ、スウェーデン）のカラムにより精製した。マレイミド含量は、エルマン試薬を用いて定量した。ＳＰＤＰ−ＤＴをＭ−ＬＰと反応させて、ＬＰ−ＤＴ結合体を生成した。生成したＳＰＤＰ−ＤＴ溶液はＣＣＢを用いて約２０ｍｇ／ｍｌに調整した。十分量のＭ−ＬＰペプチド、ＣＣＢ中５０ｍｇ／ｍｌを１モルのＤＴあたり１８モルのペプチドとカップリングさせるために１０ｍｌ／分で加えた。混合物を室温で少なくとも６時間攪拌し、そのＣ末端のグリシン残基のマレイミドを介してＳＰＤＰ−ＤＴのチオール部分に対してＬＰをカップリングさせ、ＬＰ−ＤＴ結合体を生成した。この結合反応混合物を、次いで、約３０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、１５倍容量のＰＢＳ（ｐＨ７．２）に対するダイアフィルトレーションにより精製した。ｐＨを調べた（７．２±０．２）。純度は、ＳＥＣ  ＨＰＬＣにより確認した。精製したＬＰ  ＤＴは、次いで、滅菌０．２２μｍフィルター（ミリポア、ビルリカ、マセチューセッツ州）に通じて濾過し、滅菌ＰＢＳ（ｐＨ７．２）を用いて最終のバルクＬＰ−ＤＴ濃度に調整し、凍結乾燥後保存した。
【０２１０】
実施例２
免疫法
当業者には既知のように、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Charles River Laboratories, Wilmington, MA）は、この同系交配マウス株の既知の性質のため、体液性応答反応およびβ−ｈＣＧに特異的なハイブリドーマを産生するため免疫処置のために選択した。動物に関係する全ての手順は、Institutional Animal CareおよびUse Committeeを参照のこと。マウスは、３つの群で免疫した。免疫処置はすべて、１箇所もしくは２箇所のいずれかの皮下または筋肉内とした。ＬＰ−ＤＴ複合体は、滅菌水で可溶化し、その後、完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ；シグマ・アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州）または不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ；シグマ・アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州）のいずれかで完全に乳化させた。ＣＦＡは、使用前にボルテックスした。乳化は、水性免疫原溶液とＣＦＡもしくはＩＦＡのいずれかと、ルアーロックにより連結された２個の１ｍｌガラスの注射器の間で混合し、その混合液が乳白色になり、押すことが困難になるまで混合した。免疫原の終濃度は、１ｍｌあたり０．５ミリグラムであった。
【０２１１】
ハイブリドーマ第一世代（融合体１）において、最初の免疫はＣＦＡ中０．１ｍｇのＬＰ−ＤＴ結合体を用いた。２箇所にそれぞれ、２５ゲージ針(ベクトン・ディッキンソン、フランクリンレイクス、ニュージャージー州)を介して乳化した免疫原０．１ミリリットルを皮下注射した。次の免疫は、ＩＦＡ中のループ−ＤＴ結合体０．０５ミリグラムを用いて２週間隔で行い、各回で２箇所に注射した。４回目の免疫後２週間目に、尻尾から採血し、各マウスの血清の結合容量を評価した。マウスを個々に拘束具に移し、尻尾を少しの間また赤外線ランプ下で温めた。アルコールを塗布した後、マウスの尻尾を外科用メスで切開し、血液を数滴得た。血液を１時間３７℃でインキュベートした。次いで、各チューブをはじき血液塊を取り出した後、一晩４℃で保存した。チューブを１０，０００ｇで回転させ、血清を各チューブから別の容器に移した。血清は、スクリーニング前に−２０℃で凍結した。
【０２１２】
第二実験（融合体２）において、マウスは４週間隔で別々の３つの場所に免疫された。上記のように、最初の免疫はマウスあたり０．１ミリグラムを用いるが、次の免疫はマウスあたり０．５ミリグラムを用いた。最初の手順と他の手順は同じである。
【０２１３】
実施例３
放射免疫測定法
血清、培養上清、または精製した抗体試料は、１０％マウス血清（ＭＳ）および１ミリモーラーエチレンジアミンテトラ酢酸塩（ＥＤＴＡ）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に希釈した。スクリーニングを目的とした最初の希釈は、１：１０であった。他の試薬は、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；２．５ｎｇ／ｍｌの１２５Ｉ  ｈＣＧ；試験前までに高い、中程度および低度の抗体レベルが明らかにさたｈＣＧに特異的な代表的なラビット抗血清を含むアッセイ対照；非特異的なモノクローナル抗体血清；４０％ウシ血清（４０％ＣＳ）を含むＰＢＳ−ＥＤＴＡ；および２５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。１２５Ｉ  ｈＣＧは、クロラミンＴ法により調製した。
【０２１４】
１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む１００マイクロリットルのＰＢＳを、４通りで４個の１０×７５ｍｍの使い捨てガラス管の組みに加えた。次に、２．５ナノグラム／ミリリットルの１２５Ｉ  ｈＣＧ１００マイクロリットルを、全ての管の組みに、さらに一組の４個の空の管（全計数管として用いる）に分配した。次に、希釈した試料１００マイクロリットルを、４通りの管の組みに加えた。管の組みを、陰性対照として非特異的モノクローナル抗体血清と一緒に、そして陽性対照として３つの代表的な抗ｈＣＧ血清と一緒にインキュベートした。管を穏やかに混合するために攪拌し、プラスチック製のフィンガーラックに置き、そしてパラフィルム、続いてアルミ箔で覆った。おおいをしたプラスチック管のラックを、４℃で１６〜２４時間インキュベートした。次に、管の覆いを外し、それぞれの管に１００マイクロリットルのＰＢＳ−ＥＤＴＡ−４０％ＣＳ、続いて４００マイクロリットルの２５％ＰＥＧを加えた。次に、チューブをボルテックスした後、室温で１５分間インキュベートした。次に、チューブを４℃で２０分間、１５００×ｇで遠心分離した。液体を破棄し、管内に残った放射線活性をガンマ線分光計で少なくとも１管あたり１分間計数した。
【０２１５】
１分あたりの平均計数は、４通りの各チューブの組みについて計算した。これを、非特異モノクローナル抗体血清を用いたチューブの平均計数を減じて補正した。結合／遊離（Ｂ／Ｆ）比は、それぞれの希釈物について計算した（全結合数＝遊離数）。
【０２１６】
受容体結合アッセイ。おとなの雄ラットの精巣を皮膜剥離し、２．０ｍｌの注射器の１９ゲージ針を用いてＰＢＳ中でばらした。分散した物質塊を５分間攪拌し、ナイロンメッシュと脱脂綿に通じて濾過し、次いで、１２０ｇで２０分間遠心分離した。１００ミリグラム蛋白質相当のホモジェネートを、１０×７５ｍｍ管に移した。次に、２．５ナノグラム／ミリリットルの１２５Ｉ  ｈＣＧ１００マイクロリットルを、全ての組みの管に、さらに１組の４個の空の管（全計数管として用いる）に分配した。次に、１００マイクロリットルの希釈した試料を４通りの管の組みに加えた。標準曲線は、５、１０、２５、５０および１００ｎｇの未標識ｈＣＧを用いて作成した。さらなる管の組みは、濃度を増加させたモノクローナル抗体を用いて調製した。管を穏やかに混合するために攪拌し、プラスチック製のフィンガーラックに置き、そしてパラフィルム、続いてアルミ箔で覆った。覆いをしたプラスチック管のラックを、４℃で１６〜２４時間インキュベートした。次に、それぞれの管に１００マイクロリットルのＰＢＳ−ＥＤＴＡ−４０％ＣＳ、続いて４００マイクロリットルの２５％ＰＥＧを加えた。次に、チューブをボルテックスした後、室温で１５分間インキュベートした。４℃で２０分間、１５００×ｇで遠心分離した後、液体を破棄した。ペレットの放射線活性をガンマ線分光計で少なくとも１管あたり１分間計数した。１分あたりの平均計数は、４通りの各チューブの組みについて計算した。
【０２１７】
実施例４
細胞系および細胞培養およびハイブリドーマ作製
次の表現型の特徴を有するＮＳ−１ネズミ骨髄腫細胞および３つのヒト細胞系は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、マナッサス、ＶＡから入手した。第一に、ＢＸＰＣ−３ヒト膵臓癌細胞は、β−ｈＣＧ蛋白質を産生するが、ｈＣＧへテロ二量体が結合するＬＨ／ｈＣＧ受容体には結合しない。第二に、ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞は対照的に、ほとんどもしくはまったくβ−ｈＣＧ蛋白質を発現しないが、ｈＣＧへテロ二量体（β−ｈＣＧ鎖単独を除く）が結合するＬＨ／ｈＣＧ受容体を発現する。最後に、ＨｅＬａヒト子宮頸癌細胞は、ヒトへテロ二量体糖蛋白質ファミリーとＬＨ／ｈＣＧ受容体の共通のα鎖の両方を産生する。
【０２１８】
ＮＳ１骨髄腫細胞およびハイブリドーマ細胞は、ＲＰＭＩ−１６４０（シグマ・アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州）にて培養した。培地には、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、０．１ミリグラムミリグラム／ミリリットルのストレプトマイシン、および２ｍＭのＬ−グルタミンを補充した。融合させ限界希釈サブクローニング後初期のハイブリドーマの培養については、２０％ＦＢＳを用いた。ＲＰＭＩもまた、終濃度１００ユニット毎ミリリットルのペニシリン；１００マイクログラム毎ミリリットルのストレプトマイシンとともに補充した。ハイブリドーマ選択用培地は、１０％ＦＢＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびＬ−グルタミンとともに、最終作用濃度１００μＭヒポキサチン、０．４μＭアミノプテリン、および１６μＭチミジンを得るため、ＲＰＭＩ１６４０にハイブリ−マックスＨＡＴメディア・サプリメント（Hybri-Max HAT Media Supplement）（シグマ・アルドリッチ・バイオテクノロジー、セントルイス、ミズーリ州）を加えて作製した。ＢＸＰＣ−３およびＭＣＦ−７細胞は、１０％ＦＢＳ、ペニシリン−ストレプトマイシンおよびＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０にて培養した。ＨｅＬａ細胞は、１０％ＦＢＳおよびペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭで培養した。細胞培養培地は、メディアテック社（Mediatech, Inc.）（ハーンドン、バージニア州）またはシグマ・アルドリッチ（セントルイス、ミズーリ州）から入手した。
【０２１９】
細胞培養は、５％ＣＯ２の湿気のある大気下で３７℃にて行った。培養液中の細胞濃度が約１０細胞毎ミリリットルに達したら、１：１０または１：２０希釈を新鮮な培地を用いて行った。細胞凍結は、以下のように行った。良い状態の細胞を素早く分け、滅菌、凍結用遠心管に移し、４℃で５分間、４００ｇで回転させた。上清を廃棄し、ペレットを最終の細胞濃度約１０７細胞毎ミリリットルにするのに十分な７５％ＲＰＭＩ／２０％ＦＢＳ／５％ＤＭＳＯを用いて再懸濁した。この懸濁液の一部分０．５ｍｌを氷上で凍結バイアルに分配した。バイアルは凍結用ラック中一晩−７０℃で、次いで、長期保存は液体窒素中で保存した。細胞は、３７℃の水浴中で凍結バイアルを暖めて融解させる。室温でＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳを用いて洗浄した後、細胞を同じ培地１０ｍｌで再懸濁し、３７℃で培養した。
【０２２０】
ハイブリドーマ作製。ポリエチレングリコール１５００（ＰＥＧ１５００、Boehringer Mannheim、インディアナポリス、インディアナ州）およびウシ胎児血清（ＦＢＳ、インビトロジェン／ギブコ（ＧＩＢＣＯ）、カールズバッド、カルフォルニア州）は、細胞融合およびハイブリドーマ増殖を助ける能力についてそれぞれ予め篩いにかけた。ＮＳ−１骨髄腫細胞は、マイコプラズマ試験サービス(Bionique Testing Laboratories、サラナックレーク、ニューヨーク州)を介してマイコプラズマが存在しないことを確認した。
【０２２１】
マウスは、融合前４日に静脈（尾部）経路を介して、０．０５μｇのＬＰ−ＤＴ結合体による抗原ブーストを受けた。これは、Ｂリンパ球細胞の循環を誘導し、ならびに脾臓へのＢリンパ球の移動を促進するものである。細胞融合の日に、０．５グラムのＰＥＧ  １５００を５０℃の水浴で溶解させ、０．５ｍｌの無添加のＲＰＭＩと合わせ、３７℃の水浴で維持した。動物を、頚椎脱臼により犠牲にした。脾臓は無菌的に摘出されて、３７℃で１０ｍｌの無添加のＲＰＭＩ１６４０を含む１００ｍｍの組織培養プレートに置かれた。ほとんどの細胞が放出されるまで、脾臓を２．０ｍｌの注射器の１９−ゲージ針を使用し、細かい区画に分離した。細胞塊はピペット操作により崩した。細胞と培地は、５０ｍｌの無菌ポリスチレン遠心管に移した。組織培養プレートを、さらに１０ｍｌの無添加のＲＰＭＩ１６４０ので洗浄し、そして、遠心管の内容物に加えた。３分後に、上清を、沈着した残骸から新しい無菌の５０ｍｌの遠心管にピペットで移した。こうして得られた脾細胞を、無添加の予熱したＲＰＭＩ  １６４０で二回洗浄し、５分間４００ｇで遠心分離した。対数増殖期の骨髄腫細胞を、一度、無添加ＲＰＭＩ  １６４０で洗った。洗われた脾細胞と骨髄腫細胞は、ヌーバウエアー（Neubauer）チャンバー血球計（ライヘルト・サイエンティフィック社（Reichert Scientific Instruments）、バッファロー、ニューヨーク州）を用いて視覚的に計数した。次いで、最大１，０００，０００，０００個の脾細胞を２０，０００，０００個のＮＳ−１骨髄腫細胞と合せ、５分間４００ｇで遠心分離した。３７℃の５０％ＰＥＧ１５００溶液を、無菌のパスツール・ピペットを用いて同期した細胞再懸濁液とともに脾細胞−骨髄腫細胞ペレットに、１分かけてゆっくり移した。穏やかに攪拌した１分後に、１０ｍｌの予熱した無添加のＲＰＭＩ１６４０を、次に２分かけて加えた。細胞を５分間４００ｇで遠心分離し、破棄し、そして２０％ＦＢＳ、ペニシリン−ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミンおよびＨＡＴが補充された５０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０を用いて再懸濁した。細胞を含む０．５ｍｌのＨＡＴ選択培地を、４枚の２４ウェルの組織培養プレートの各ウェルに移した。翌日、細胞に等量の２×ＨＡＴ選択培地を与えた。６日後に、細胞に再び１×ＨＡＴ選択培地を与え、目視できる細胞のコロニーのあるウェルから上清を回収した。さらなる細胞のコロニーが見られたので、断続的に上清の回収を約２週間続けた。実施例３（放射免疫測定法）に記載のように、上清をスクリーニングした。最初のスクリーニングで陽性の上清を含んだウェルを再びスクリーニングした。ヘテロ二量体ｈＣＧを結合する再現性が見られたウェルを、培地１０ｍｌに増量し凍結した。
【０２２２】
限界希釈法サブクローニング。９６ウエルプレートは、１０％のＦＢＳ、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩを用いて調製した。ハイブリドーマ細胞を計数し、そして２０個、１０個と２個の細胞／ミリリットルに２０ミリリットルの培地を用いて再懸濁した。次いで、各細胞懸濁液を、２つの９６ウェルプレート（フィッシャー・サイエンティフィック、オタワ、オンタリオ、カナダ）に、マルチチャンネルピペッター（フィッシャー・サイエンティフィック、オタワ、オンタリオ、カナダ）を用いてウェルあたり１００マイクロリットルで播種した。６日後に、細胞に同じ培地を与えた。適当なクローン細胞集団を有するウェルを、記載の免疫放射測定法もしくはｈＣＧ酵素免疫測定法のいずれかによりスクリーニングした（Rock, E.Pら、Immunogenicity of a fusion protein linking the beta subunit carboxyl terminal peptide (CTP) of human chorionic gonadotropin to the B subunit of Escherichia coli heat-labile enterotoxin (LTB).Vaccine. 14: 1560-1568. 1996）。検出は、西洋ワサビペルオキシダーゼ−連結ラビット抗−ヤギＩｇＧ重鎖および軽鎖抗体（ベチル・ラボラトリー（Bethyl Laboratories）、モンゴメリー、テキサス州）を介し、次にＥＬＩＳＡ用の化学発光ペルオキシダーゼ基質（シグマ・アルドリッチ、セントルイス）であった。
【０２２３】
アイソタイプの決定、凍結保存およびマイコプラズマ試験。アイソタイプの決定は、固相として９６ウェルプレートのウェルあたりプロテインＧで精製されたモノクローナル抗体１マイクログラムを用いるＥＬＩＳＡ形式で製造業者の指示に従い、イムノタイプ。マウスモノクローナル抗体タイピング・キット（シグマケミカル社、セントルイス、ミズーリ州）を用いて個々のモノクローナル抗体について行った。既知アイソタイプのモノクローナル抗体を対照として用いた。凍結保存用の冷凍培地は、７５％ＲＰＭＩ、２０％ＦＢＳおよび５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（シグマアルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州）を含んだ。凍結保存のため、細胞を４℃で回転させ、そして、２０，０００，０００細胞／ミリリットルに凍結用培地でゆっくり再懸濁し、凍結用バイアルに分けた。バイアルは、発泡スチロール・ボックスでゆっくり−７０℃まで凍結させ、それから１日後に液体窒素へ移した。マイコプラズマ試験は、バイオニック・テスティング。ラボラトリーズ（Bionique Testing Laboratories）（サラナックレーク、ニューヨーク州）により実施した。
【０２２４】
遺伝子配列。細胞質ＲＮＡは、バイオテック（セントカサリンズ、オンタリオ州、カナダ）から入手したサイトプラズミック・アンド・ニュクレアー・ＲＮＡピューリフィケーションキット（Cytoplasmic and Nuclear RNA Purification Kit）を用い、製造業者のプロトコルによりハイブリドーマ細胞から得た。全長ポリ（Ａ）ＲＮＡは、増幅のためにアンビオン・ファーストチョイス（Ambion FirstChoice ）・ＲＬＭ−ＲＡＣＥキット（アプライド・バイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州）を用い、製造業者のプロトコルにより選択し調製した。３’プライマーは、インビトロジェン（カールズバッド、カルフォルニア州）から入手した。ネステッドＰＣＲを実施し、内部反応はアガロースゲルで行った。正しい予想された断片サイズのバンドを切り出し、ゲル・エクストラクション・キット（Gel Extraction Kit）（キアゲン、バレンシア、カルフォルニア州）を用い、製造業者のプロトコルにより抽出した。汚染するプライマー、ヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、油および塩から精製するため、ジーンエリュートＰＣＲクリーンアップ・キット（GenElute PCR Clean-Up Kit）(シグマ・アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州)を用いて実施した。次いで、ＤＮＡ配列決定は、アプライドバイオシステム（Applied Biosystems）配列決定装置（フォスターシティー、カルフォルニア州）を用い、製造業者のプロトコルにより実施した。
【０２２５】
モノクローナル抗体産生および精製。ハイブリドーマ細胞は、１分当たり２回転するコーニング・ポリスチレン・ローラー瓶を用い（フィッシャーサイエンティフィック、オタワ、オンタリオ、カナダ）、１０％ＦＢＳ、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびＬ−グルタミンを含む２５０ｍｌのＲＰＭＩで増殖させた。培養液が１ミリリットルあたり約１，０００，０００個の細胞の飽和状態に達すると、細胞を遠心により取り除いた。抗体を硫安沈殿により濃縮し、次に再懸濁し、そして２０ミリモーラーのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）に４℃で一晩透析した。後の抗体精製は、ハイ・トラップ（Hi-Trap）プロテインＧカラム（ＧＥヘルスケア／アマシャム・バイオサイエンス、ウプサラ、スウェーデン）を用い、製造業者プロトコルにより実施した。カラムからの溶出は、０．１モーラーのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．７）であった。溶出に続いて、溶出液は、次にｐＨ７．０まで１．０モーラーのトリスを用いて緩衝し、１２，０００の分子量分離管を用いてリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に４℃で一晩透析した。抗体は、４℃で保存するか、または５０％グリセロールを含むＰＢＳもしくは水中のいずれかで凍結した。
【０２２６】
実施例５
癌細胞増殖および異種移植片
癌細胞増殖に対する効果は、以下のように評価した。９６ウエルプレートに、ウェルあたり培地中１０３個の細胞を播種した。２もしくは２０マイクログラムの精製モノクローナル抗体を、各ウェルに加えた。ネズミ・モノクローナル抗体（マウスモノクローナル（muromonab）−ＣＤ３（ＯＫＴ３；Orthoclone OKT3、Ortho Biotech Products、L.P.、ブリッジウォーター、ニュージャージー州））を陰性対照として用いた。細胞は、２つの方法による細胞増殖測定のため、回収前に７２時間培養した。
【０２２７】
ＭＴＳ比色アッセイは、ＮＡＤＨとＮＡＤＰＨの細胞縮小する能力を測定する。これらの一部は代謝活性細胞において脱水素酵素により作り出され、細胞生存度の減少に伴って減少する。ＭＴＳ試薬を製造業者により推奨されるように９６ウェル細胞培養液に加え（セルタイター９６アクオス・ノン−ラジオアクティブ・セルプロリフィケーション・アッセイ（AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay）；プロメガ、マディソン、ウィスコンシン州）、そして、吸光度は４９２ｎｍで読みとった。データは、三重決定のため、平均％抑制［（１−（実験の吸光度−バックグラウンドの吸光度）／（対照培養液の吸光度−バックグラウンドの吸光度）×１００］±ＳＤで示される。
【０２２８】
細胞内ＡＴＰ濃縮は、ＡＴＰｌｉｔｅ（登録商標）ルミネセンスＡＴＰディテクション・アッセイ・システム（Luminescence ATP Detection Assay System）（パーキンエルマー・ライフサイエンス、ウェルズリー、マサチューセッツ州）を用い、製造業者の使用法に従い決定した。この手順は米国の特許出願番号第０９／８０６１６５号明細書（出典明示により本明細書の一部とされる）に記載されている。このアッセイの長所には、感度、直線性および簡便性が挙げられる。この試験において、ＡＴＰはホタル（Photinus pyralis）ルシフェラーゼにより光に変換され、その生じた光は、発光計数器で１秒あたりの計数（ｃｐｓ）として定量化できる。環境中の、例えば手の上に存在するＡＴＰとこのキットの試薬との汚染を避けるために管理した。この手順の間、常に手袋を着用する。製造業者の細胞溶解溶液５０マイクロリットルを、９６ウェル・マイクロプレートのウェル中、１００マイクロリットルの細胞懸濁液に加える。プレートを、１分につき７００回転（ｒｐｍ）で作動している回転振盪機上で５分の間インキュベートする。次いで、製造業者の基質溶液５０マイクロリットルを、細胞可溶化物を含むウェルに加え、そして、そのプレートを７００ｒｐｍの回転振盪機で再び５分間インキュベートした。プレートを少なくとも１０分間暗がりに置き、その後、発光を２つのパーキンエルマー照度計のいずれかで読みとる。各実験で、１種類の照度計だけを用いた。図８と９のデータは、三重決定のため、平均％抑制［（１―実験のｃｐｓ／対照のｃｐｓ）×１００％］±ＳＤとして示す。
【０２２９】
ヒト−マウス腫瘍異種移植。７週齢のＮＣＲ雄の胸腺欠損のヌード・ホモ接合型（ｎｕ／ｎｕ）マウスは、タコニック（ジャーマンタウン、ニューヨーク州）から購入した。多くの場合４群の群あたりマウスを、１日目に２×１０６のＢＸＰＣ−３細胞を中腋窩線の側面に皮下接種をした。陰性対照群は、その後の処置を受けなかった（ＮＴ）。ドセタキセル群は、１週間隔３回の処置を１０日目に開始し、３０ミリグラム／体重キログラムで腹腔内ドセタキセルが投与された。６Ｆ５群は、週２回の間隔で６回の処置を６日目に開始し、１００マイクログラムの抗βｈＣＧ  Ｌ２ループ・モノクローナル抗体６Ｆ５が投与された。６Ｆ５＋ドセタキセル群は、上記の用量と間隔でドセタキセルとモノクローナル抗体６Ｆ５が投与された。マウスは、デジタル・マイクロキャリパー装置（測径器）の使用によりヒト腫瘍異種移植片の二次元サイズを週二回評価された。腫瘍容積（立方ミリメートル）は、式（長さ×幅２）÷２を用いてマウスごとに算出した。データは、平均腫瘍容積±平均の標準誤差として群について表す。
【０２３０】
実施例６
ＬＰ−ＤＴ結合体は、β−ｈＣＧ  Ｌ２ループに特異的なモノクローナル抗体を作り出す。
３匹の雌のＣ５７ＢＬ／６マウスは、融合１の前に３週間隔で４回ＬＰ−ＤＴ結合体の接種を受けた。同種のマウスは、融合２の前に３週間隔で３回接種を受けた。それぞれ一連の免疫後、ｈＣＧに対して最も高いＲＩＡタイターをもつマウスは、ＮＳ−１細胞との融合と、その後のハイブリドーマ産生のために犠牲にした。融合１は、モノクローナル抗体２Ｂ３．３Ｅ８（３Ｅ８）、２Ｂ３．３Ｆ５（３Ｆ５）および２Ｂ３．６Ａ１１（６Ａ１１）を産生した。融合２は、２Ｂ２．６Ｆ５（６Ｆ５）を産生した。１２５Ｉ  ｈＣＧに対する特異的な結合は、すべてのモノクローナル抗体の増加と精製の後に確かめた。これら４つ全ての抗体が、ＩｇＧ１アイソタイプであることが分かった。
【０２３１】
ＬＨに対する交差反応は、未標識のＬＨを用いた競合実験を介してＲＩＡにより評価した。未標識のｈＣＧによる標準曲線は、それぞれの抗体について作成し、ＬＨを用いて作成した曲線と比較した。カウントにおいてｈＣＧ標準曲線のそれと同等の低下を引き起こすＬＨの相対量は、交差反応の程度を確かめるために用いた。同様の実験を、融合２からは抗体６Ｆ５で行った。しかしながら、後の例で説示しない培養上清の濃度は試験した。結果を図６に示す。融合１抗体３Ｅ８、３Ｆ５および６Ａ１１は、それぞれ融合１の抗体３Ｅ８、３Ｆ５および６Ａ１１はＬＨに対して８．６％、１２％および５５％の交差反応を示した。融合２の抗体６Ｆ５は、４．６％の交差反応を示した。これらの結果は、ＬＰ−ＤＴ結合体による免疫が、β−ｈＣＧ  Ｌ２ループの表面の接近可能な残基において、これらの２つのタンパク質間にただ１つしかアミノ酸の差異がないにもかかわらず、ＬＨよりもｈＣＧに強い優先的な結合をするモノクローナル抗体の産生を生じさせ得ることを示す。
【０２３２】
モノクローナル抗体２Ｂ２．６Ｆ５は、異種移植実験のためにより大量に増やした。１回の産生作業で、７８１ミリリットルの培養上清から、プロテインＧ精製により２３ｍｇの抗体を得た。限界希釈サブクローニング後の２Ｂ２．６Ｆ５を用いた第二の該産生実験では、１．５リットルの培養液から、４８ミリグラムの精製抗体を得た。
【０２３３】
実施例７
抗β−ｈＣＧ  Ｌ２ループ抗体は、ＬＨ／ｈＣＧ受容体に対するｈＣＧの結合を阻害する
ヨード化したｈＣＧ（０．２５ｎｇのｈＣＧ）を、二重に管内の約０．２ミリグラムのラット睾丸抽出物と一緒にインキュベートした。これは、２８％の標識化ｈＣＧが結合される結果となった。次いで、これを有効な受容体に１００％の結合を示すために考慮した。図７は、シリーズ１として、すべてデュプリケートでラット睾丸抽出物および０．２５ｎｇの１２５Ｉ  ｈＣＧを含む管で、５、１０、２５、５０および１００ｎｇ用量のｈＣＧを用いて作成された未標識ｈＣＧの標準曲線を示す。予想したように、この曲線は、未標識のｈＣＧが、ＬＨ／ｈＣＧ受容体に対する結合で標識化ｈＣＧと競合することを実際に示す。次いで、モノクローナル抗体３Ｅ８の増加量を、０．２５ｎｇの１２５Ｉ  ｈＣＧのＬＨ／ｈＣＧ受容体に対する結合の１００ｎｇの未標識ｈＣＧによる阻害を阻止する能力について試験した。１００、２００、４００および８００ｎｇのモノクローナル抗体３Ｅ８は、それぞれ対照結合の１２％、１８％、２１％および２９％となった。標準曲線からすると、これらの効果は、それぞれ９、２４、３０および５０ｎｇのｈＣＧ結合阻害を示す。これは、シリーズ２として図７に示す。かくして、モノクローナル抗体３Ｅ８は、平均で抗体１ミリグラムあたり８８マイクログラムのｈＣＧを中和した。これらの結果は、β−ｈＣＧ  Ｌ２ループに特異的なモノクローナル抗体が、ＬＨ／ｈＣＧ受容体と結合するｈＣＧを用量依存的に阻害することを実際に示す。
【０２３４】
実施例８
ヒト腫瘍細胞の成長に関する抗β−ｈＣＧ抗体の効果
Ｌ２ロングループを標的とする３つの抗β−ｈＣＧ抗体のインビトロでの癌細胞系増殖をモジュレートする能力を調べた。上記の実施例で記載のように、モノクローナル抗体３Ｆ５（３Ｅ８）６Ａ１１を作製した。それぞれ、β−ｈＣＧのＬ２ロングループに対する特異性とＩｇＧｌアイソタイプを有する。陰性対照モノクローナル抗体もまた試験した。陰性対照は、ネズミ・モノクローナル抗体・ｍｕｒｏｍｏｎａｂ−ＣＤ３であった（ＯＫＴ３；オルトクローンＯＫＴ３；オルト・バイオテック・プロダクト、Ｌ．Ｐ．、ブリッジウォーター、ニュージャージー州）。これらの４つの抗体はそれぞれ、次の３つの癌細胞系に対してインビトロでの活性を試験した。ＢＸＰＣ−３膵臓癌細胞は、β−ｈＣＧを産生するが、ＬＨ／ｈＣＧ受容体は発現しない。ＭＣＦ−７乳癌細胞は、相対的にほとんどβ−ｈＣＧを産生しないが、ＬＨ／ｈＣＧ受容体を発現する。ヒーラ子宮頸癌細胞はα−ｈＣＧを産生し、ＬＨ／ｈＣＧ受容体を発現するが、β−ｈＣＧを産生しない。
【０２３５】
１．０×１０３の細胞を、細胞増殖アッセイ前に、７２時間２または２０μｇの精製モノクローナル抗体と共に三重でインキュベートした。２つの細胞増殖アッセイを用いた。上記実施例で記載のように、それらは細胞の縮小能力（ＭＴＳ）または細胞内ＡＴＰ濃度（ＡＴＰｌｉｔｅ）のいずれかに基づいた。
【０２３６】
図８で示すように、各抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体は、β−ｈＣＧを産生し分泌することが知られているＢＸＰＣ−３膵癌細胞のインビトロで増殖を阻害した。増殖の阻害は、各抗体によって用量依存的であった。それぞれの例において、細胞内ＡＴＰ濃度（ＡＴＰｌｉｔｅ）に対する効果は、ＭＴＳによる細胞の縮小能に対する効果より大きかった。対照的に、３つのモノクローナル抗体のいずれも、ＭＣＦ−７またはＨｅＬａ細胞の増殖には何ら識別できる影響も及ぼさなかった。予想されたように、ＯＫＴ３は、３つの細胞系のいずれにも影響を及ぼさなかった（データは示さない）。このように、Ｌ２ロングループを標的とする抗β−ｈＣＧ抗体は、β−ｈＣＧを発現しない細胞でなくβ−ｈＣＧを発現する細胞の増殖を阻害する単一の試薬として機能する。
【０２３７】
実施例９
抗β−ｈＣＧ  Ｌ２ループ抗体は、細胞傷害化学療法と相乗作用を示す
インビトロで癌細胞系の増殖をモジュレートする細胞傷害性化学療法と相乗作用する、Ｌ２ロングループを標的とする抗β−ｈＣＧ抗体の能力もまた試験した。モノクローナル抗体６Ｆ５は、上記の実施例に記載のように産生した。この抗体は、β−ｈＣＧのＬ２ロングループに特異的に結合し、またＩｇＧ１アイソタイプを有する。陰性対照のモノクローナル抗体もまた試験した。陰性対照は、マウスモノクローナル抗体ｍｕｒｏｍｏｎａｂ−ＣＤ３（ＯＫＴ３；Orthoclone OKT3；Ortho Biotech Products, L.P., ブリッジウォーター、ニュージャージー州）であった。ＯＫＴ３は、ヒトＴリンパ球に見られるＣＤ３抗原に特異的であり、以下に記載の上皮癌細胞に結合しない。モノクローナル抗体６Ｆ５およびＯＫＴ３は、膵臓癌および／または乳癌の処置に関して米国食品医薬品局  （ＦＤＡ）により認可された２種の細胞障害性化学療法薬と組み合わせて試験した。ゲムシタビン（ジェムザール（登録商標）、イーライリリー・アンド・カンパニー、インディアナポリス、インディアナ州）、代謝拮抗物質は、フッ素置換されたデオキシシチジン類似体であり、進行性の膵臓癌と転移性乳癌の両方の処置についてＦＤＡの認証を受けている。ドセタキセル（タキソテール（登録商標）、サノフィ−アベンティス、ブリッジウォーター、ニュージャージー州）は、微小管を標的とする半合成タキサンであり、先の化学療法不適合後の乳癌の処置についてＦＤＡの認証を受けている。ＢＸＰＣ−３脾臓癌細胞は、β−ｈＣＧを産生するが、ＬＨ／ｈＣＧ受容体を発現しない。ＭＣＦ−７乳癌細胞は、相対的にほとんどβ−ｈＣＧを発現しないが、ＬＨ／ｈＣＧ受容体を発現する。
【０２３８】
１．０×１０３個の細胞を、ゲムシタビンまたはドセタキセルの付加前に２４時間、２０μｇの精製した6Ｆ５またはＯＫＴ３を用いて三重でインキュベートした。最終のドセタキセル濃度は、０、１、３、１０、３０および１００ナノグラム毎ミリリットルであった。最終のゲムシタビン濃度は、０、５、１０、２０、４０、８０および１６０ナノモーラーであった。細胞障害性化学療法剤の存在下の４８時間の培養後、細胞増殖を、上記実施例に記載のように細胞内ＡＴＰ濃度（ＡＴＰｌｉｔｅ）アッセイにより評価した。図９に示すデータは、３回の細胞内ＡＴＰアッセイ全ての平均阻害パーセントとして示す。データは、Ｌ２−ロングループを標的とする抗−ｈＣＧモノクローナル抗体が、β−ｈＣＧを産生し分泌することが知られている癌細胞の細胞増殖を低下させるにあたって、細胞障害性化学療法を用いて相乗作用を示すことを示す。
【０２３９】
モノクローナル抗体６Ｆ５を用いた前処理は、ＢＸＰＣ−３細胞に対するドセタキセルの抗増殖活性を増大させた（ｐ＝０．００００１、対応のあるｔ検定）。代謝拮抗物質ゲムシタビンの抗増殖活性は、有意に向上しなかった。期待されたように、モノクローナル抗体６Ｆ５は、β−ｈＣＧを産生しないＭＣＦ−７細胞に対し、どちらの細胞障害物質の抗増殖活性も増大させなかった。これらをもとにすると、これらの結果は、Ｌ２ロングループを標的とする抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体は、β−ｈＣＧを産生するヒト癌細胞の細胞増殖を低下させるにあたって、微小管を標的とする細胞障害性化学療法（ドセタキセル）と相乗作用を発揮することを示す。
【０２４０】
実施例１０
抗β−ｈＣＧ  Ｌ２ループ抗体は、ヒト−マウス腫瘍異種移植片を抑制する
インビボで癌細胞の増殖をモジュレートするＬ２ロングループを標的とする抗−ｈＣＧ抗体の能力もまた試験した。モノクローナル抗体６Ｆ５は、上記の実施例に記載のように産生した。モノクローナル抗体６Ｆ５は、ドセタキセル（タキソテール（登録商標）、サノフィ−アベンティス、ブリッジウォーター、ニュージャージー州）、微小管を標的とする半合成タキサンと組み合わせて試験した。ＢＸＰＣ−３  脾臓癌細胞はβ−ｈＣＧを産生するが、ＬＨ／ｈＣＧ受容体を発現しない。数週齢のＮＣＲ雌の無胸腺ヌードホモ接合体（ｎｕ／ｎｕ）マウス（タコニック、ジャーマンタウン、ニューヨーク州）を、ＢＸＰＣ−３ヒト膵臓癌異種移植片を接種した。１群あたり１０匹のマウスからなる４つの実験群で研究した。群には、未処理（ＮＴ）とドセタキセル、抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体６Ｆ５のみ、また抗体６Ｆ５とドセタキセルを用いて処理した動物が含まれる。
【０２４１】
図１０は、Ｌ２ロングループを標的とする抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体もまた、インビボで腫瘍の成長を、それ自身により、また細胞傷害性化学療法との相乗作用により減じることができる。
【０２４２】
２×１０６の培養ＢＸＰＣ−３腫瘍細胞を、１日目に各マウスの中腋窩線の側面に接種した。抗体を受ける動物は、１００マイクログラムの精製６Ｆ５を、腹膜内経路を介して６、９、１３、１６、２０および２３日目にそれぞれ与えられた。これは、６日目に開始して週２回を３週間である。化学療法を受ける動物は、３０ｍｇ／ｋｇドセタキセルを、腹膜内経路を介して１０、１７および２４日目にそれぞれ与えられた。これは、１０日目に開始して週１回を３週間である。すべてのマウスの腫瘍は、２〜３日ごとにキャリパスを用いて二次元的に測定した。腫瘍容積は、式（長さ×幅２）÷２を用いて計算した。図１０に示すデータは、平均の腫瘍容積±標準誤差（ＳＥＭ、Ｎ＝１０）として表す。
【０２４３】
抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体６Ｆ５を用いたマウス処理もまた、ＮＴ陰性対照群と比較して、インビボで顕著な抗腫瘍活性を示す結果となった（ｐ＝０．０００００１、対応のあるｔ検定)。さらに、異種移植片を有するマウスの抗体６Ｆ５を用いた処理もまた、ドセタキセル単独の処理と比較して、インビボでドセタキセルの抗腫瘍活性を向上させた（ｐ＝０．００００１、対応のあるｔ検定）。これらの結果は、インビトロで得られた結果を確認し、拡大するものである。我々は、β−ｈＣＧのＬ２ロングループに対するモノクローナル抗体それ自身が、ヒト膵臓癌に対してインビボで顕著な抗腫瘍活性を生じることを見出した。この抗腫瘍活性は、癌細胞表面にある同起源の受容体に対するβ−ｈＣＧの結合を阻害するこの抗体の能力と一致する。さらに、記載のモノクローナル抗体は、別の試薬、ドセタキセルと相乗効果を示した。ドセタキセルは、別個の機構により、微小管機能を干渉することにより作用し、癌の処理に有効であることが知られている。このように、記載のモノクローナル抗体は、既存の明白な有効性のある癌治療を補充し、無毒な癌治療の創設についての期待を提供する。
【０２４４】
実施例１１
β−ｈＣＧ  Ｌ２ループモノクローナル抗体重鎖のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列
図１１は、ｍＡｂ  ２Ｂ２．６Ｆ５重鎖のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列、ならびにｍＡｂ  ２Ｂ３．３Ｅ８重鎖のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列、ならびにｍＡｂ  ２Ｂ３．３Ｆ５重鎖のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す。読み取り枠は強調して示す。ｍＡｂ  ２Ｂ３．３Ｅ８重鎖のアミノ酸配列、およびｍＡｂ  ２Ｂ３．３Ｆ５重鎖のアミノ酸配列は、同じ重鎖配列を示す。
【０２４５】
範囲を物理的性質、例えば分子量、または化学的性質、例えば化学式について用いる場合、範囲および具体的なその実施態様のすべての組み合わせおよび部分的な組み合わせは包含されることを意図する。
【０２４６】
本明細書中で引用もしくは記載する特許、特許出願および文献はそれぞれ、その全部を出典明示により本明細書の一部とされる。
【０２４７】
当業者であれば、本発明の実施形態に対して様々な変更及び改変を行うことができ、そのような変更および改変は、本発明の精神から逸脱することなく行うことができる。従って、添付する特許請求の範囲は、そのような均等的な変化に及び、本発明の精神および目的の範囲内にあるものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０２４８】
【図１Ａ】ｈＣＧおよび代謝産物の構造の図を示す。
【図１Ｂ】β−ｈＣＧ  Ｌ２ロングループの近接のアミノ酸配列を示す。
【図２】それぞれの受容体に結合するゴナドトロピンへテロ二量体およびｈＣＧβ鎖の概略図を示す。
【図３】ゴナドトロピンＬ２  βロングループに特異的な免疫の生成の概略図を示す。
【図４】ゴナドトロピンＬ２  βループに特異的なモノクローナル抗体による受容体結合の阻害の概略図を示す。
【図５】ゴナドトロピン  β鎖に対する特異性を与える抗体結合断片により標的化される、免疫エフェクター機能の概略図を示す。
【図６】ｈＣＧ対ＬＨのモノクローナル抗体の相対的な親和力を示す。
【図７】ｈＣＧのＬＨ／ｈＣＧ受容体に対する結合のモノクローナル抗体による阻害を示す。
【図８】インビトロにおける癌細胞増殖における抗体の効果を示す。
【図９】インビトロにおける、癌細胞増殖を抑制するモノクローナル抗体の化学療法との相乗作用を示す。
【図１０】インビボでの腫瘍増殖におけるモノクローナル抗体の効果を示す。
【図１１】ｍＡｂ  ２Ｂ２．６Ｆ５重鎖のＤＮＡおよびアミノ酸配列、ｍＡｂ  ２Ｂ３．３Ｅ８重鎖のＤＮＡおよびアミノ酸配列、およびｍＡｂ  ２Ｂ３．３Ｆ５重鎖のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。
【図１Ａ】
2009504659.tif 000003
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2009504659.tif 000009
【図７】
2009504659.tif 000010
【図８】
2009504659.tif 000011
【図９】
2009504659.tif 000012
【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年4月3日(2008.4.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2009504659000001.app
【国際調査報告】
2009504659.tif 000015
2009504659.tif 000016