(57)【要約】可溶性ヒトＭ−ＣＳＦ受容体、ならびにこのような受容体を含む医薬組成物、医薬組成物を含むキット、および溶骨性疾患に罹患した被験体における骨量減少などのＭ−ＣＳＦに関連する疾患および障害を診断および治療する方法が提供される。本発明の癌を診断する方法は、（ａ）患者由来の流体試料を可溶性Ｍ−ＣＳＦ受容体のレベルに関して分析する工程を含み、閾値を上回る可溶性Ｍ−ＣＳＦ受容体のレベルは癌の存在と相関し、前記閾値未満のレベルは患者が癌を有する可能性が低いことを示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を診断する方法であって、
（ａ）患者由来の流体試料を可溶性Ｍ−ＣＳＦ受容体のレベルに関して分析する工程を含み、閾値を上回る可溶性Ｍ−ＣＳＦ受容体のレベルは癌の存在と相関し、該閾値未満のレベルは該患者が癌を有する可能性が低いことを示す、方法。
【請求項２】
前記流体試料が、尿、血漿または血清から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
癌に罹患した被験体の予後を判定する方法であって、
（ａ）患者由来の流体試料を可溶性Ｍ−ＣＳＦ受容体のレベルに関して分析する工程を含み、閾値を上回る可溶性Ｍ−ＣＳＦ受容体のレベルは該患者が予後不良である可能性が高いことを示し、該閾値未満のレベルは該患者が予後良好である可能性が高いことを示す方法。
【請求項４】
前記流体試料が、尿、血漿または血清から成る群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
癌に罹患した被験体において癌治療をモニタリングする方法であって、
（ａ）癌治療薬による治療の開始前に、患者由来の流体試料を可溶性Ｍ−ＣＳＦ受容体のレベルに関して分析する工程と；
（ｂ）該癌治療薬による治療の開始後に、該流体試料を分析する工程とを含み、
該癌治療薬による治療の開始後での可溶性Ｍ−ＣＳＦ受容体レベルの減少は、該患者が治療有効量の該癌治療薬を受容していることを示す、方法。
【請求項６】
前記流体試料が、尿、血漿または血清から成る群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記癌が、乳癌、肺癌、腎臓癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、前立腺癌、腺癌、白血病およびリンパ腫を含む血球悪性疾患；頭頚部癌；食道癌、胃癌、大腸癌、腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胆管癌または胆嚢癌を含む消化管癌；卵巣癌腫、子宮内膜癌、膣癌、および子宮頸癌を含む女性生殖管の悪性疾患；膀胱癌；神経芽細胞腫を含む脳癌；肉腫、骨肉腫；ならびに悪性黒色腫または扁平上皮癌を含む皮膚癌から成る群から選択される、請求項１、３または５に記載の方法。
【請求項８】
前記癌が乳癌である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
女性における月経周期をモニタリングする方法であって、
（ａ）女性患者由来の流体試料を可溶性Ｍ−ＣＳＦ受容体のレベルに関して分析する工程を含み、閾値を上回る可溶性Ｍ−ＣＳＦ受容体のレベルは該患者が妊娠している可能性が高いことを示し、該閾値未満のレベルは該患者が妊娠している可能性が低いことを示す方法。
【請求項１０】
前記流体試料が、尿、血漿または血清から成る群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）ｓｈＭ−ＣＳＦＲに特異的に結合する第１抗体と、
（ｂ）既知量のＭ−ＣＳＦＲを含むＭ−ＣＳＦＲ標準物質と
を含むキット。
【請求項１２】
前記第１抗体が検出可能な標識に結合している、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記標識が酵素である、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記酵素が検出可能なシグナルを放出する基質をさらに含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
ｓｈＭ−ＣＳＦＲに結合する第２抗体をさらに含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項１６】
前記第１抗体に結合する第２抗体をさらに含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項１７】
ｓｈＭ−ＣＳＦＲに結合する第２抗体をさらに含む、請求項１１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｍ−ＣＳＦを結合できるヒトＭ−ＣＳＦの受容体の天然に存在する可溶性フラグメント、治療にこの可溶性フラグメントを使用する方法、および患者試料中のこの可溶性フラグメントを検出することにより疾患および病態を診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
毎年およそ１４０万の癌の新規症例が生じ、毎年およそ６０万人が癌で死亡する。検出と治療方法の改善によって、これらの患者の多くは、かなりの長期間に亙って生存する。２００２年１月１日現在で、人口の約３．４％に相当するおよそ１０１０万人の癌生存者が存在していた。これらの癌生存者のうちで、乳房（２２％）、前立腺（１８％）、結腸直腸（１０％）および婦人科（１０％）に関すものが、最も一般的な癌の部位である。
【０００３】
一般に癌の罹患率および死亡率は、癌の進行の初期に検出されない場合著しく増加する。治療方法の決定は、診断時の癌の病期に関連することが多い。したがって、診断、病期分類、予後の予測、および治療期間を通じて癌の進行または退縮をモニタリングするための高感度で精確な方法が非常に必要とされている。
【０００４】
マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦまたはＣＳＦ−１）は、マクロファージおよびそれらの前駆体ならびに破骨細胞およびそれらの前駆体の生存、増殖、および分化を制御する。Ｍ−ＣＳＦ活性は、Ｍ−ＣＳＦおよびその膜結合受容体（Ｍ−ＣＳＦＲ）の遺伝子発現を調節するメカニズムによって、ならびに受容体依存性エンドサイトーシス、代謝的プロセシング、および下流シグナル伝達の阻害によって厳密に制御されている。
【０００５】
Ｍ−ＣＳＦは、間質細胞、骨芽細胞およびその他の細胞で発現する。Ｍ−ＣＳＦはまた、乳房、子宮、および卵巣腫瘍細胞で発現する。これらの腫瘍で発現の程度は、高悪性度および予後不良に相関する（非特許文献１；非特許文献２）。乳癌において、Ｍ−ＣＳＦの発現は、腺管内（浸潤前）癌とは対照的に浸潤性腫瘍細胞でよく見られる（非特許文献３）。さらに、Ｍ−ＣＳＦは、悪性に乳癌の進行を促進することが示されている（非特許文献４）。
【０００６】
ヒト膜結合型Ｍ−ＣＳＦ受容体は、ｃ−ｆｍｓ癌原遺伝子によってコードされ、骨髄および分化した血液単核細胞で発現されたタイプＩ膜タンパク質であるタンパク質チロシンキナーゼ膜貫通受容体である。Ｍ−ＣＳＦ受容体は、ＴｙｒプロテインキナーゼファミリーおよびＣＳＦ−１／ＰＤＧＦ受容体サブファミリーに属している。これは５つのＩｇ様Ｃ２タイプ（免疫グロブリン様）ドメイン、１つの膜貫通ドメイン、および２つのキナーゼドメインを有する細胞内で中断されたＳｒｃ関連ドメインを含む。Ｍ−ＣＳＦは典型的には、生物学的効果を発揮するためにその受容体と結合する。ｃ−ｆｍｓに対するＭ−ＣＳＦの結合は、細胞質のキナーゼドメインを活性化して自己リン酸化および他の細胞タンパク質のリン酸化を生じる受容体のホモ二量体化をもたらす。これらの現象は、多様な細胞応答、すなわち有糸分裂、サイトカインの分泌、膜の波打ち、およびＭ−ＣＳＦＲの転写調節を引き起こすＪＡＫ／ＳＴＡＴ、Ｐ１３Ｋ、ならびにＥＲＫ経路を含むシグナル伝達経路のカスケードを開始する。（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７）。
【非特許文献１】Ｋａｃｉｎｓｋｉ、Ａｎｎ．Ｍｅｄ．（１９９５年）２７巻：７９〜８５頁
【非特許文献２】Ｓｍｉｔｈら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９５年）１巻：３１３〜２５頁
【非特許文献３】Ｓｃｈｏｌｌら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．（１９９４年）８６巻：１２０〜６頁
【非特許文献４】Ｌｉｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（２００１年）９３巻：７２７〜３９頁
【非特許文献５】Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｊ．Ａ．、Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ（１９９７年）６２巻（２号）：１４５〜５５頁
【非特許文献６】Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｊ，Ａ．、Ｉｍｍｕｎｏ  Ｔｏｄａｙ．（１９９７年）１８巻（７号）：３１３〜７頁
【非特許文献７】ＦｉｘｅとＰｒａｌｏｒａｎ、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ（１９９８年）１０巻：３２〜３７頁
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
要旨
本発明の材料および方法は、当技術分野における前述の必要性および他の関連する必要性を満たす。本発明の一態様では、ヒトＭ−ＣＳＦ（ＣＳＦ−１）受容体（膜貫通ドメインを欠く）の天然に存在する可溶性フラグメント（複数可）の発見が、Ｍ−ＣＳＦ活性の中和が望まれる治療的使用のためにそのような天然に存在するフラグメントの組み換え型の産生を可能にする。
【０００８】
関連する実施形態では、本発明は、前述のポリペチドおよび第２のポリペチドを含む融合タンパク質を提供し、前述のポリペチドおよび第２のポリペチドは、前述のポリペチドの正常な生物活性が損なわれないように結合している。典型的な融合タンパク質は、免疫グロブリンＦｃ融合を含む。
【０００９】
本発明のさらに別の実施形態では、可溶性Ｍ−ＣＳＦ受容体の特異的な天然に存在する形態または融合タンパク質を含む医薬組成物、ならびに癌または破骨細胞活性の増加と関連した代謝的骨疾患を治療するために、そのような医薬組成物を使用する方法が提供される。
【００１０】
別の態様では、本発明は、癌を診断する方法であって、（ａ）患者由来の流体試料を可溶性Ｍ−ＣＳＦ受容体のレベルに関して分析する工程を含み、閾値を上回る可溶性Ｍ−ＣＳＦ受容体のレベルは癌の存在と相関し、前記閾値未満のレベルは患者が癌を有する可能性が低いことを示す方法を提供する。本発明の別の典型的な実施形態では、癌に罹患した被験体の予後を判定する方法であって、（ａ）患者由来の流体試料を可溶性Ｍ−ＣＳＦ受容体のレベルに関して分析する工程を含み、閾値を上回る可溶性Ｍ−ＣＳＦ受容体のレベルは患者が予後不良である可能性が高いことを示し、前記閾値未満のレベルは患者が予後良好である可能性が高いことを示す方法が提供される。さらに別の実施形態では、癌に罹患した被験体において癌治療をモニタリングする方法であって、（ａ）癌治療薬による治療の開始前に、患者由来の流体試料を可溶性Ｍ−ＣＳＦ受容体のレベルに関して分析する工程と；（ｂ）癌治療薬による治療の開始後に、流体試料を分析する工程とを含み、癌治療薬による治療の開始後の可溶性Ｍ−ＣＳＦ受容体のレベルの減少は、患者が治療有効量の癌治療薬を受容していることを示す方法が提供される。
【００１１】
本発明は、診断、予後または癌治療のモニタリングを含む前記方法はいずれも任意の癌について実施できることを企図する。典型的な癌には、乳癌、肺癌、腎臓癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、前立腺癌、腺癌、白血病およびリンパ腫を含む血球悪性疾患；頭頚部癌；食道癌、胃癌、結腸癌、腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胆管癌または胆嚢癌を含む消化管癌；卵巣癌腫、子宮内膜癌、膣癌、および子宮頸癌を含む女性生殖管の悪性疾患；膀胱癌；神経芽細胞腫を含む脳癌；肉腫、骨肉腫；ならびに悪性黒色腫または扁平上皮癌を含む皮膚癌が含まれる。
【００１２】
本発明の別の実施形態では、女性における月経周期をモニタリングする方法であって、（ａ）女性患者由来の流体試料を可溶性Ｍ−ＣＳＦ受容体のレベルに関して分析する工程を含み、閾値を上回る可溶性Ｍ−ＣＳＦ受容体のレベルは患者が妊娠している可能性が高いことを示し、閾値未満のレベルは患者が妊娠している可能性が低いことを示す方法が提供される。関連する実施形態では、女性の子宮内膜増殖を検出する方法であって、同様の工程を含み、閾値を上回る可溶性Ｍ−ＣＳＦ受容体のレベルは異常な子宮内膜増殖、たとえば子宮内膜症と相関し、閾値未満のレベルは患者が正常な子宮内膜増殖状態を有する可能性が高いことを示す方法が提供される。
【００１３】
癌または子宮内膜増殖に関して前記方法のいずれに従っても分析することができる典型的な流体試料には、尿、血漿、または血清が含まれる。
【００１４】
関連する実施形態では、本発明はまた、プロセッサ、コンピュータ可読メモリ、ならびにコンピュータ可読メモリに保存され、プロセッサで実行されるように適合されたルーチンを提供して、前記方法のいずれかを実施し、かつ／または「正常」範囲外のレベルが上記の病態のうちの１つまたは複数と相関するように、可溶性Ｍ−ＣＳＦ受容体の検出されたレベルおよび「正常」とみなされた閾値または閾値レベルの範囲をアウトプットとして生成する。本発明はさらに、プログラムまたは同様の機能を実施するルーチンを含むコンピュータで読出し可能な媒体を提供する。コンピュータの適切なシステム、環境および／または構成の例には、パーソナルコンピュータ、サーバコンピュータ、ハンドヘルドもしくはラップトップ装置、マルチプロセッサシステム、マイクロプロセッサをベースとしたシステム、セットトップボックス、プログラム可能な家庭用電化製品、ネットワークＰＣ、ミニコンピュータ、メインフレームコンピュータ、上記のシステムもしくは装置のいずれかを含む分散コンピュータ環境、または当技術分野で知られている他の任意のシステムが含まれる。
【００１５】
本発明のさらに別の実施形態では、（ａ）可溶性Ｍ−ＣＳＦ受容体に特異的に結合する第１抗体と；（ｂ）既知量のＭ−ＣＳＦ受容体を含むＭ−ＣＳＦ受容体標準物質とを含むキットが提供される。関連する態様では、第１抗体が検出可能な標識に結合している前述のキットが提供される。さらに関連する態様では、この標識は酵素である。さらに別の態様では、キットは、酵素が検出可能なシグナル放出する基質をさらに含む。別の関連する態様では、前述のキットは、可溶性Ｍ−ＣＳＦ受容体に結合する第２抗体をさらに含む。さらに別の関連する態様では、前述のキットは、第１抗体に結合する第２抗体をさらに含む。さらに別の関連する態様では、前述のキットは、可溶性Ｍ−ＣＳＦ受容体に結合する第２抗体をさらに含む。
【００１６】
本発明の他の実施形態では、可溶性Ｍ−ＣＳＦ受容体レベルは、代謝的骨疾患、内分泌障害（コルチゾン過剰症、性腺機能不全、原発性または二次性副甲状腺機能亢進症、甲状腺機能亢進症）、高カルシウム血症、欠乏症（くる病／骨軟化症、壊血病、栄養失調）、慢性疾患（吸収不良症候群、慢性腎不全（腎性骨形成異常症）、慢性肝疾患（肝性骨形成異常症））、薬剤（グルココルチコイド（グルココルチコイド誘発骨粗鬆症）、ヘパリン、アルコール）、ならびに遺伝性疾患（骨形成不全症、ホモシスチン尿症）、癌、骨粗鬆症、プロステーシス周囲骨量減少（たとえば、骨中への外来インプラント、または全人工股関節置換術を含む人工器官を用いる関節置換に起因する）、関節炎および関節リウマチに伴う骨の炎症、歯周疾患、線維異形成、および／またはパジェット病を含めた、破骨細胞活性の相対的増大または骨再形成に必要とされる破骨／造骨細胞のプロセスに伴う溶骨性疾患から成る群から選択される疾患の存在を検出し、予後または重篤度を予測し、または進行をモニタリングする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
詳細な説明
本発明は、通常は膜結合型の受容体であるヒトＭ−ＣＳＦ受容体の天然に存在する可溶性形態の発見に基づく。受容体のこの可溶性形態（ｓｈＭ−ＣＳＦＲ）の濃度は、癌、破骨細胞分化および月経周期と相関していることが示されている。ｓｈＭ−ＣＳＦＲの濃度増加は、癌の重篤度および細胞の増殖状態と相関していることが示されている。
【００１８】
したがって、本発明は、細胞の増殖状態、特に癌で認められる増殖状態、子宮内膜症、および女性の妊孕期間の子宮内層の蓄積を検出またはモニタリングする方法を提供する。本方法は、診断、病期分類、予後の予測または重篤度、ならびにそのような増殖状態の進行または退縮のモニタリング、たとえば癌化学療法の間および／または癌化学療法後、子宮内膜症治療または月経周期間をモニタリングする方法を含む。
【００１９】
別の態様では、本発明はまた、破骨細胞増殖状態、特に破骨細胞分化を含む増殖状態の検出またはモニタリングする方法を提供する。本方法は、診断、病期分類、予後の予測または重篤度、ならびに治療の間および／または治療後の代謝的骨疾患の進行または退縮をモニタリングする方法を含む。
【００２０】
別の態様では、本発明はまた、精製されたｓｈＭ−ＣＳＦＲを提供する。このｓｈＭ−ＣＳＦＲは、ヒト血清または尿から精製され、当技術分野で知られている方法に従って配列決定される。たとえばｃ−ｆｍｓに対する特異的抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーが親和性精製に使用される。本明細書に記載される（たとえば、実施例１を参照）可溶性受容体ＥＬＩＳＡアッセイで使用された抗体（Ｄｕｏ  Ｓｅｔ  Ｅｌｉｓａ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ｈＭ−ＣＳＦ  Ｒ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＤＹ３２９））が使用される。これとは別に、またはこれに加えて、ｓｈＭ−ＣＳＦＲはグリコシル化されることが見出されたので、グリコシル化されたタンパク質を精製するレクチン親和性クロマトグラフィー工程が使用される。またイオン交換クロマトグラフィーが、ｓｈＭ−ＣＳＦＲをさらに精製するために使用され得る。精製されたｓｈＭ−ＣＳＦＲをタンパク質配列決定に供する前に、当技術分野で知られており本明細書に記載された方法を使用する脱グリコシル反応が実施される（たとえば、実施例１を参照）。Ｎ末端配列決定、ペプチドマッピング、および質量分析法を組み合わせた方法が、ｓｈＭ−ＣＳＦＲの全配列の決定に使用される。
【００２１】
患者試料中の可溶性タンパク質を検出するいずれかの方法が、いずれかの上記の疾患または病態と関連したｓｈＭ−ＣＳＦＲの存在または相対的量を検出するために使用され得る。特に好ましい方法には、当技術分野で知られている任意の抗体に基づくイムノアッセイ、たとえばＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ＬＩＡ（ルミネセンスイムノアッセイ）、およびＦＬＡ（蛍光イムノアッセイ）が含まれる。第１または第２抗体のどちらの抗体も、放射性同位元素（たとえば、１２５Ｉ）、蛍光色素（たとえば、ＦＩＴＣ）または蛍光もしくは発光反応を触媒する酵素（たとえば、ＨＲＰまたはＡＰ）を含む、当技術分野で知られている任意の標識で標識することができる。
【００２２】
そのような方法の工程は、患者由来の流体試料をｓｈＭ−ＣＳＦ受容体の存在または相対的レベルに関して分析することを含み、閾値を上回る可溶性Ｍ−ＣＳＦ受容体レベルは、患者が病状または病態を有する可能性が高いことを示し、前記閾値未満のレベルは、患者がそのような病状または病態を有する可能性が低いことを示す。感受性および特異性は、それぞれ任意の所望のレベル、たとえば８５５、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上に設定することができる。
【００２３】
任意の患者試料を使用することができるが、流体試料、たとえば血液（全血、血漿または血清を含む）、尿、唾液、脳脊髄液、腹水、胸膜液、吸引液、または他のあらゆる身体の滲出液もしくは分泌物が好ましい。
【００２４】
本明細書で用いる用語「診断」とは、疾患もしくは障害を検出すること、または疾患もしくは障害の病期もしくは程度を決定することを意味する。用語「診断」はまた、疾患もしくは障害に対する素因を検出すること、薬剤治療の治療効果を測定すること、または薬剤治療に対する応答パターンを予測することを包含する。本発明の診断方法は、独立に使用し、または特定の疾患または障害に関して医療分野で知られている他の診断および／または病期分類方法と組み合わせて使用することができる。したがって一実施形態では、診断の方法は、本明細書で記載された方法のいずれか１つを使用して、患者で本発明のｓｈＭ−ＣＳＦＲの濃度を検出し、患者がこのタンパク質の異常な濃度を有するがどうかを測定することにより実施される。典型的な実施形態では、この診断方法は、疾患の他の臨床的徴候または症状のため疾患または病態を有する疑いがある患者のサブセットに適用される。
【００２５】
「予後」とは、発病または疾患の予想される転帰に関する予測、および／または疾患の性質および症状により示されるような疾患からの回復に関する見込みである。例としては、予後不良は回復の可能性が低く、場合によれば死亡することを予測するが、予後良好は回復の可能性があり、完全な健康状態への回復の可能性のあることを予測する。
【００２６】
用語「閾値」とは、病態の存在または欠如と相関する所定の条件下で、既知の物質（たとえば、分子、化合物など）の定量的または定性的な測定単位（たとえば、濃度、レベル、活性、その他）を意味する。このようにして、既知の物質の測定単位を種々の条件下で、患者がその病態に罹患しているかどうかの決定を助けるために閾値測定単位と比べることができる。
【００２７】
用語「標準物質」とは、所定の条件下で既知の物質（たとえば、Ｍ−ＣＳＦＲ）の特異的な測定単位の設定範囲（たとえば、濃度）を表す。
【００２８】
用語「分析する」とは、複合体物質（たとえば、血清のような流体）中の成分を検出または測定することを意味する。「モニタリングする」とは、処置（たとえば、癌に罹患した患者を治療する処置）の効果を定期的に観察または調べるプロセスである。「病期分類」とは、認められた医業基準で決定した臨床病期と相関しているマーカーレベルを分析することによる癌または他の疾患の臨床病期（たとえば、初期または進行期）の予測を表す。
【００２９】
本明細書で用いる「腫瘍」とは、悪性または良性にかかわらず全ての腫瘍性細胞増殖および増殖、ならびに全ての前癌性および癌性の細胞と組織を表す。
【００３０】
用語「癌」および「癌性の」とは、典型的には無秩序な細胞増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的病態を表すかまたは意味する。癌の例には限定されるものではないが、癌、；リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が含まれる。このような癌のより特定の例には、乳癌、前立腺癌、結腸癌、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、消化管癌、膵臓癌、グリア芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌腫、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌および種々のタイプの頭頚部癌が含まれる。
【００３１】
「治療」とは、発症を阻止するかまたは障害の病理を変更することを意図して実施される介入である。したがって「治療」とは、治療処置および予防的または防止的処置の両方を表す。治療を必要とする被験体には、すでに障害を有する被験体ならびに障害を予防しようとする被験体が含まれる。腫瘍（たとえば、癌）治療において、治療剤は腫瘍細胞の病理を直接に減少させ得るか、または腫瘍細胞を他の治療剤、たとえば放射線および／または化学療法による治療により感受性にし得る。骨変性などの疾患の臨床的、生化学的、放射線学的または自覚的症状に罹患している患者の治療は、そのような症状の一部または全てを緩和することまたは疾患に対する素因を低減することを含み得る。癌の「病理」には、患者の健康を損なう全ての現象が含まれる。これには限定されるものではないが、異常かまたは制御不能な細胞増殖、転移、隣接した細胞の正常機能に対する干渉、異常なレベルのサイトカインまたは他の分泌産物の放出、炎症性もしくは免疫学的応答の抑制または悪化その他が含まれる。したがって治療後の改善は、腫瘍の大きさの減少、腫瘍増殖速度の低下、既存の腫瘍細胞もしくは転移性細胞の破壊および／または転移の大きさもしくは数の減少として表し得る。
【００３２】
治療目的の「哺乳動物」とは、ヒト、家畜および動物園、スポーツまたは愛玩動物、たとえばイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含む哺乳動物として分類された任意の動物を表す。
哺乳動物はヒトであるのが好ましい。
【００３３】
本明細書で用いる「転移癌」という語句は、身体の他の領域、特に骨に転移する可能性を有する癌として定義される。種々の癌が骨に転移することができるが、最も一般的な転移性の癌は、乳癌、肺癌、腎臓癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌および前立腺癌である。例として、骨に転移する可能性を有する他の癌には、限定されるものではないが、腺癌、白血病およびリンパ腫を含む血球悪性疾患；頭頚部癌；食道癌、胃癌、結腸癌、腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胆管癌または胆嚢癌を含む消化管癌；卵巣癌腫、子宮内膜癌、膣癌、および子宮頸癌を含む女性生殖管の悪性疾患；膀胱癌；神経芽細胞腫を含む脳癌；肉腫、骨肉腫；ならびに悪性黒色腫および扁平上皮癌を含む皮膚癌が含まれる。本発明は、特に骨における腫瘍誘導性骨溶解病変の予防および治療を意図する。
【００３４】
本明細書で用いる「治療有効量」という語句は、所望の治療法に従って投与された場合、所望の治療的または予防的効果または応答を誘発する本発明の実施形態に適切であると考えられる治療的または予防的Ｍ−ＣＳＦ受容体の可溶性フラグメントの量を表す。
【００３５】
本明細書で用いるヒト「Ｍ−ＣＳＦ」は、各々が参考として本明細書中に組み込まれる、Ｋａｗａｓａｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０巻：２９１頁（１９８５年）、Ｃｅｒｒｅｔｔｉら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ２５巻：７６１頁（１９８８年）、またはＬａｄｎｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ６巻：２６９３頁（１９８７年）に記載されている成熟ヒトＭ−ＣＳＦα、Ｍ−ＣＳＦβ、またはＭ−ＣＳＦγポリペチドと実質的に同じアミノ酸配列を有するヒトポリペチドを表す。そのような用語は、上記のようにこの３つの成熟Ｍ−ＣＳＦは異なるアミノ酸配列を有し、Ｍ−ＣＳＦの活性型はジスルフィド結合した二量体であるという知識を反映しており、したがって用語「Ｍ−ＣＳＦ」が生物学的活性型を表す場合、二量体型を意味する。「Ｍ−ＣＳＦ二量体」は、二量体化し、ホモダイマー（Ｍ−ＣＳＦモノマーの同じタイプの２つから成る）およびヘテロダイマー（２つの異なるモノマーから成る）の両方を含む２つのＭ−ＣＳＦポリペチドモノマーを表す。参考として本明細書中に組み込まれる米国特許第４，９２９，７００号に記載の通り、Ｍ−ＣＳＦモノマーは、Ｍ−ＣＳＦ二量体にｉｎ  ｖｉｔｒｏで変換することができる。
【００３６】
「可溶性ヒトＭ−ＣＳＦ受容体」（ｓｈＭ−ＣＳＦＲ）は、配列番号２のＭ−ＣＳＦＲの細胞外部分として実質的に同じアミノ酸配列を有するポリペチドを意味する。
【００３７】
抗ｓｈＭ−ＣＳＦＲ抗体
モノクローナルまたはポリクローナル抗体を本発明の検出方法で使用することができるが、一貫性および特異性を有するのでモノクローナル抗体が好都合に使用される。マウスのモノクローナル抗体などのげっ歯類の抗体は、診断法に使用するのに好都合である。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体産生を必要とするものとして解釈されない。
【００３８】
抗体産生に使用される抗原は、たとえば完全なｓｈＭ−ＣＳＦＲまたは場合によってはエピトープが、その固有のコンフォメーションを表示することができる別のポリペチドに融合された所望のエピトープを保持するｓｈＭ−ＣＳＦＲのフラグメントであり得る。あるいは、ｓｈＭ−ＣＳＦＲを発現する細胞を使用して抗体を作製することができる。そのような細胞は、Ｍ−ＣＳＦを発現するように形質転換することができ、またはｓｈＭ−ＣＳＦＲを発現する他の天然に存在する細胞であってもよい。抗体の作製に有用なｓｈＭ−ＣＳＦＲの他の形態は、当業者には明らかであろう。
【００３９】
ｓｈＭ−ＣＳＦＲの組み換え産生のために、当技術分野でよく知られているように、ｓｈＭ−ＣＳＦＲをコードする核酸を単離し、さらにクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現するために複製可能なベクターに挿入する。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、容易に単離され、通常の手法（たとえば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによる）を用いて配列決定される。多くのベクターが利用できる。ベクター成分には一般に、限定されるものではないが、シグナル配列、複製開始点、１つまたは複数の選択マーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終結配列のうちの１つまたは複数が含まれる。
【００４０】
当技術分野で知られている任意の方法、たとえばＫｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ２５６巻：４９５頁［１９７５年］により最初に記載されたハイブリドーマ法、または組み換えＤＮＡ法（たとえば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）を使用して、モノクローナル抗体を作製するために抗原が使用され、またはモノクローナル抗体は、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻：６２４６２８頁［１９９１年］およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２巻：５８１〜５９７頁（１９９１年）に記載されている技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離される。
【００４１】
ハイブリドーマ法では、マウスまたはハムスターもしくはマカクザルなどの他の適切な宿主動物を、本明細書で記載されるように免疫して、免疫に使用されたタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生することができるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球はｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫することもできる。次いで、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を用いてリンパ球を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５９〜１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６年））。
【００４２】
このように調製されたるハイブリドーマ細胞を、好ましくは融合していない親ミエローマ細胞の増殖または生存を阻害する１つまたは複数の物質を含む適切な培地に接種し増殖する。たとえば、親ミエローマ細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠いている場合、ハイブリドーマ用の培地は典型的にはヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（ＨＡＴ培地）を含み、これらの物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を阻止する。
【００４３】
好ましいミエローマ細胞は、効率良く融合して、選択された抗体産生細胞による安定した高レベルの抗体産生を保持し、培地に対して感受性である細胞である。ヒトモノクローナル抗体の産生のための、ヒトミエローマおよびマウスヒトヘテロミエローマ細胞系も記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３巻：３００１頁（１９８４年）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１〜６３頁（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７年））。典型的なマウスのミエローマ系には、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡ．から入手可能なＭＯＰ−２１およびＭ．Ｃ．−１１マウス腫瘍に由来する細胞系ならびにＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．ＵＳＡ．から入手可能なＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞が含まれる。
【００４４】
ハイブリドーマ細胞が増殖している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特性を、免疫沈降またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける結合アッセイ、たとえばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により決定する。たとえばモノクローナル抗体の結合親和性を、スキャッチャード解析により決定することができる（Ｍｕｎｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ１０７巻：２２０頁（１９８０年））。
【００４５】
所望の特性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、このクローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的方法により増殖することもできる（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５９〜１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６年））。この目的に適した培養培地には、たとえばＤ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物の腹水癌としてｉｎ  ｖｉｖｏで増殖することもできる。サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、通常の免疫グロブリン精製法、たとえば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーにより、培地、腹水液、または血清から適切に分離される。
【００４６】
用語「抗体」は、最も広い意味で用いられ、完全に組み立てられた抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体（たとえば、二重特異性抗体）、抗原を結合できる抗体フラグメント（たとえばＦａｂ’、Ｆ’（ａｂ）２、Ｆｖ、単鎖抗体、ダイアボディ）、キメラ抗体、ヒト化またはヒト由来の抗体、およびそれらが所望の生物活性を示す限りは前記を含む組み換え型ペプチドを含む。
【００４７】
キメラまたはヒト化抗体は、ヒトにおいて元のマウスモノクローナル抗体よりも免疫原性が少ないでないので、はるかに低いアナフィラキシーリスクでこれらはヒトの治療に使用することができる。したがって、これらの抗体は、ヒトに対するｉｎ  ｖｉｖｏ投与を含む治療的適用において好適であり得る。
【００４８】
マウスモノクローナル抗体の可変Ｉｇドメインがヒト不変Ｉｇドメインに融合されたキメラモノクローナル抗体は、当技術分野で知られている標準的な方法を用いて作製することができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓ．Ｌ．ら、（１９８４年）Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ；Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｒｅｇｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１巻、６８４１〜６８５５頁；およびＢｏｕｌｉａｎｎｅ，Ｇ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ３１２巻、６４３〜６４６頁（１９８４年）を参照のこと）。一部のキメラモノクローナル抗体は、ヒトにおいて免疫原性が低いと判明したが、まだマウス可変Ｉｇドメインは顕著なヒト抗マウス応答を誘導できる。
【００４９】
ヒト化抗体は、たとえば（１）ヒト以外の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、ヒトフレームワークおよび定常領域上に移植すること（当技術分野で「ＣＤＲ移植」によりヒト化すると呼ぶ工程）、あるいは（２）ヒト以外の可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によりヒト様表面でそれらを「覆い隠す」こと（当技術分野で「被覆（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）」と呼ぶ工程）を含む種々の方法によって達成することができる。本発明では、ヒト化抗体は「ヒト化した」抗体および「被覆した」抗体の両方を含む。これらの方法は、たとえばＪｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ３２１巻：５２２  ５２５頁（１９８６年）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．８１巻：６８５１  ６８５５頁（１９８４年）；ＭｏｒｒｉｓｏｎとＯｉ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４巻：６５  ９２頁（１９８８年）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９巻：１５３４  １５３６頁（１９８８年）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８巻：４８９  ４９８頁（１９９１年）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１巻（３号）：１６９  ２１７頁（１９９４年）；およびＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  Ｃ．Ａ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．４巻（７号）：７７３  ８３頁（１９９１年）で開示され、これらの各々は参考として本明細書中に組み込まれる。
【００５０】
ｓｈＭ−ＣＳＦＲを検出する方法
本発明は、生物試料中のｓｈＭ−ＣＳＦＲを検出する方法であって、試料を、ｓｈＭ−ＣＳＦＲに特異的に結合する抗体と接触させること、およびｓｈＭ−ＣＳＦＲに結合した抗体または結合していない抗体のいずれかを検出することを含む方法を提供する。どちらの相対的な量も、試料中のｓｈＭ−ＣＳＦＲの量に相関する。抗体は、検出可能な標識で直接的にまたは間接的に標識される。
【００５１】
適切な検出可能な標識には、種々の酵素、結合グループ、蛍光物質、発光物質および放射性物質が含まれる。典型的な酵素標識には、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれ；典型的な結合グループ複合体には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが含まれ；典型的な蛍光標識には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが含まれ；典型的な発光性標識にはリミノールが含まれ；典型的な放射性標識には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが含まれる。
【００５２】
ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）で、検出可能な標識に結合したｓｈＭ−ＣＳＦＲ標準物質と未標識抗ｓｈＭ−ＣＳＦＲ抗体を用いる競合イムノアッセイにより、ｓｈＭ−ＣＳＦＲは検出され得る。生体試料、標識ｓｈＭ−ＣＳＦＲ標準物質および抗ｓｈＭ−ＣＳＦＲ抗体を組み合わせ、未標識抗体に結合した標識抗ｓｈＭ−ＣＳＦＲ標準物質の量が決定される。生体試料中のｓｈＭ−ＣＳＦＲ量は、抗ｓｈＭ−ＣＳＦＲ抗体に結合した標識ｓｈＭ−ＣＳＦＲ標準物質量に反比例する。
【００５３】
ＥＬＩＳＡアッセイは、最初にｓｈＭ−ＣＳＦＲに特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を調製することを含む。さらに、特異的にｓｈＭ−ＣＳＦＲに結合するレポーター抗体が一般に調製される。レポーター抗体は、放射性、蛍光または酵素試薬などの検出可能な試薬、たとえばホースラディッシュペルオキシダーゼ酵素（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＰ）に結合される。ＥＬＩＳＡを実施するために、ｓｈＭ−ＣＳＦＲに特異的な抗体を、抗体を結合する固体支持体、たとえばポリスチレンディッシュ上でインキュベートする。次いで、ディッシュ上の全ての遊離タンパク質結合部位を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの非特異的なタンパク質と共にインキュベートすることにより覆う。次に、分析しようとする試料を、ｓｈＭ−ＣＳＦＲがポリスチレンディッシュに結合した特異的抗体に結合するまでディッシュ中でインキュベートする。結合していない試料を緩衝液で洗浄除去する。ｓｈＭ−ＣＳＦＲに対して特異的に作られ、ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合されたレポーター抗体をディッシュに入れると、ｓｈＭ−ＣＳＦＲと結合した全てのモノクローナル抗体へのレポーター抗体の結合が生じる。次いで、結合していないレポーター抗体を洗浄する。次いで、発色基質を含むペルオキシダーゼ活性用の試薬をディッシュに添加する。抗ｓｈＭ−ＣＳＦＲ抗体に結合した固定化ペルオキシダーゼは、着色反応生成物を産生する。所与時間内に発現する色の量は、試料中に存在するｓｈＭ−ＣＳＦＲタンパク質の量と比例する。定量的結果が、典型的には標準曲線を参照することによって得られる。
【００５４】
これらの一般的なアッセイは、以下に記載する装置およびキットを含む種々の形式で利用することができる。
【００５５】
ｓｈＭ−ＣＳＦＲを検出する装置およびキット
１つの典型的な実施形態では、アッセイ装置はラテラルフロー試験ストリップであり、場合によってハウジング内に入れられている。ｓｈＭ−ＣＳＦＲに対する第１標識抗体は溶液の中にあるが、ｓｈＭ−ＣＳＦＲに対する第２抗体は試験ストリップ上に固定化されている。ｓｈＭ−ＣＳＦＲを含む患者試料が両方の抗体と接触する場合、抗体−標的−抗体サンドイッチ複合体が形成され、固体支持体上に固定化されているこの生じた複合体は標識により検出可能である。次いで試験ストリップを読取機に挿入し、ここで複合体の標識からのシグナルを測定する。結果は、陽性もしくは陰性の結果のいずれであるか、または疾患もしくは障害のリスクもしくは存在を示す結果と相関する試料中のｓｈＭ−ＣＳＦＲの濃度の定量であり得る。この全工程は、自動化および／またはコンピュータ制御することもできる。あるいは、試験ストリップは、適切な色の視覚的な基準と比較することにより、目視で読出しを行い得る。この試験はｓｈＭ−ＣＳＦＲ  ＥＬＩＳＡと同様であるが、非常に短時間に治療の時点で臨床的な関連情報を提供する。
【００５６】
別の典型的な実施形態では、装置は、流体試料中のｓｈＭ−ＣＳＦＲが限られた標識抗体結合部位を、固定化されたｓｈＭ−ＣＳＦＲと競合するイムノアッセイ法を使用するｓｈＭ−ＣＳＦＲ迅速検出用のテストストリップである。このアッセイ方法では、体液試料は標識抗体−色素コンジュゲートと混合され、多孔性膜に沿って移動する。ｓｈＭ−ＣＳＦＲの濃度がこの試験の検出限界未満の場合は、結合していない抗体−色素コンジュゲートは膜上に固定化されたｓｈＭ−ＣＳＦＲコンジュゲートに結合して、「陰性」試験帯域にカラーバンドを生じる。これとは反対に、ｓｈＭ−ＣＳＦＲレベルが検出限界またはそれ以上である場合は、遊離ｓｈＭ−ＣＳＦＲは、膜上に固定化されたｓｈＭ−ＣＳＦＲコンジュゲートと、抗体−色素コンジュゲートに対する結合により競合して、抗原抗体複合体を形成し、これによってカラーバンドの発現を阻止する。試料中のｓｈＭ−ＣＳＦＲレベルに関係なく、カラーバンドはそれぞれのコントロール帯域に生じ、これは試薬が化学的に活性であることを確かめる品質管理の手段として機能する。
【００５７】
色の強さのグラデーションに基づくｓｈＭ−ＣＳＦＲレベルのより定量的な測定に同様の方法を使用することができる。
【００５８】
病状、予後などを測定することにより閾値を設定する方法は、当技術分野では周知である。例として、十分に代表的な数の正常被験体（たとえば、検出される病態を伴わない健全集団）に由来する流体試料中のｓｈＭ−ＣＳＦＲタンパク質のレベルを、十分に代表的な数の疾患を有する被験体（たとえば、疾患または病態を有すると認められた集団）に由来するｓｈＭ−ＣＳＦＲタンパク質レベルに対して分析する。大部分の疾患を有する集団と正常集団を区別するカットオフ閾値を決定することができる。あるいは陰性、不明確および陽性結果に関する有効なエンドポイント値をデータから決定することができる。たとえば大部分の正常集団のｓｈＭ−ＣＳＦＲレベルを含むが、ほとんど全ての疾患を有する集団を除外する正常範囲（陰性結果を示す）を決定することができる。同様に、大部分の疾患を有する集団のｓｈＭ−ＣＳＦＲレベルを含むが、ほとんど全ての正常集団を除外する陽性の結果を示す範囲を決定することができる。
【００５９】
所定の閾値を超える（または適切ならば未満の）ｓｈＭ−ＣＳＦＲタンパク質の測定されたレベルが、疾患とｓｈＭ−ＣＳＦＲタンパク質の関連を示す。この閾値を使用するためには、正常集団に由来する試料は、病的集団に由来する試料と同一のプロトコル（すなわち、調製と保存）を受けなければならない。正常集団からの試料に由来する測定されたｓｈＭ−ＣＳＦＲタンパク質レベルの範囲に注目し、病的集団からの試料に由来する測定されたｓｈＭ−ＣＳＦＲタンパク質レベルの範囲を考慮に入れた比較のための適切な閾値レベルおよび所望の特異性または感受性、予後ならびに診断に関しては当業者には明らかであろう。
【００６０】
理想的にはそのような閾値の決定には、総合的な医学的かつ疫学的因子を考慮する。考慮すべき因子には、臨床検査の臨床目的および高い陽性適中率または高い陰性適中率を有する必要があるかどうかということ、ならびに試験集団における疾患の罹患率が含まれる。
【００６１】
キットもまた本発明の範囲内に考慮される。典型的なキットは、所望により検出可能な標識に結合されたｓｈＭ−ＣＳＦＲに特異的に結合する第１抗体、およびＭ−ＣＳＦＲの既知量を含むＭ−ＣＳＦＲ標準物質を含むことができる。他の成分には、所望によりイムノアッセイ実施用試薬、たとえばｓｈＭ−ＣＳＦＲかまたは第１抗体に結合する検出可能な標識に結合された第２抗体を含み得て、標識が酵素である場合、キットはまた酵素が検出可能なシグナルを放出する基質を含み得る。
【００６２】
併用療法
２つ以上のＭ−ＣＳＦアンタゴニスト（たとえば、ｓｈＭ−ＣＳＦＲおよび抗Ｍ−ＣＳＦ抗体）を混合して、Ｍ−ＣＳＦを伴う疾患または障害（たとえば、癌、癌転移および／または骨変性）に対してさらに改善された有効性を提供することは有利であり得る。１つまたは複数のＭ−ＣＳＦアンタゴニストを含む組成物を、癌転移および／または癌転移を伴う骨量減少に罹患しているか、または患う素因を有するヒトまたは哺乳動物に投与され得る。２つの治療剤の同時投与は、薬剤がその治療薬効果を発揮している期間に重複部分がある限り、同時にまたは同経路によって薬剤が投与されることを必要としない。同時または連続投与は、異なる日または異なる週の投与が意図されている。またｓｈＭ−ＣＳＦＲ治療法を化学療法または放射線療法と組み合わせることも実施され得る。
【００６３】
投与および調製
本発明の方法の実行において使用されるｓｈＭ−ＣＳＦＲは、所望の送達方法に適切な担体を含む医薬組成物に調製することができる。適切な担体はｓｈＭ−ＣＳＦＲと組み合わせた場合、ｓｈＭ−ＣＳＦＲの抗腫瘍機能を保持し、被験体の免疫系に対して非反応性である任意の物質を含む。例として、これらに限定するものではないが、多くの標準の製剤学上の担体のいずれか、たとえば滅菌リン酸緩衝食塩水溶液、静菌水などが含まれる。種々の水性担体、たとえば水、緩衝水、０．４％の生理食塩水、０．３％のグリシンなどを使用することができ、安定性を向上するために他のタンパク質、たとえば軽度の化学的修飾などを付したアルブミン、リポタンパク質、グロブリンなどを含み得る。
【００６４】
薬剤の治療用製剤は、所望の純度を有する薬剤を、任意の生理学的に許容し得る担体、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編、（１９８０年））と混合して、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で保存用に調製される。許容し得る担体、賦形剤、または安定剤は、使用される用量および濃度において受容者に対して無毒であり、緩衝液、たとえばリン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（たとえばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンザルコニウムクロライド、ベンゼトニウムクロライド；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、たとえばメチルもしくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ‐クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペチド；タンパク質、たとえば血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、たとえばポリビニルピロリドン；アミノ酸、たとえばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシン；単糖、二糖、およびグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、たとえばＥＤＴＡ；糖、たとえばシュークロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール；塩成形対イオン、たとえばナトリウム；金属錯塩（たとえば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；ならびに／または非イオン性活性剤、たとえばＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
【００６５】
本発明の組成物を、癌、癌転移および／または骨変性の進行を阻止するかまたは少なくとも部分的に阻止するのに十分な量で、哺乳動物に投与する。これを達成するのに適した量は、「治療有効量」として定義される。組成物の１回または複数回の投与が実施でき、用量レベルおよびパターンは治療者により選択することができる。疾患の予防または治療に関して、上記で定義されたように適切な用量は、治療しようとする疾患のタイプ、疾患の重篤度および経過、薬剤が予防のために投与されるのか、治療目的で投与されるのか、過去の治療法、患者の病歴および薬剤に対する応答、ならびに主治医の判断に依存するであろう。
【００６６】
非治療的使用
本発明のｓｈＭ−ＣＳＦＲは、Ｍ−ＣＳＦに対する親和性精製薬剤として、またはたとえば、特異的な細胞、組織もしくは血清におけるその発現を検出する、Ｍ−ＣＳＦタンパク質用の診断アッセイにおいて使用することもできる。ｓｈＭ−ＣＳＦＲは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける診断アッセイに使用することもできる。一般にこれらの目的のために、ｓｈＭ−ＣＳＦＲは、腫瘍がイムノシンチオグラフィーを用いて局所化できるように、放射性核種（たとえば１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、３Ｈ、３２Ｐまたは３５Ｓ）で標識される。
【００６７】
本発明のｓｈＭ−ＣＳＦＲは、任意の既知のアッセイ方法、たとえば競合結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、たとえばＥＬＩＳＡ、ならびに免疫沈降アッセイにおいて使用することができる。Ｚｏｌａ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１４７〜１５８頁（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７年）。
【００６８】
簡便のために、本発明のｓｈＭ−ＣＳＦＲは、Ｍ−ＣＳＦの検出に用いる場合、キット、すなわち既知量のＭ−ＣＳＦを含有するＭ−ＣＳＦ標準物質を場合によって含む、所定量の試薬と診断アッセイを実施するための使用説明書とのパッケージ化された組合せとして提供される。さらに、安定剤、緩衝剤（たとえば、ブロック緩衝液または細胞溶解緩衝液）などの他の添加剤を含まれ得る。種々の試薬の相対的な量は、アッセイ感度を十分最適化する試薬溶液中の濃度を提供するために大きく変わり得る。特に試薬は、溶解と同時に適切な濃度を有する試薬溶液を与える賦形剤を含む通常は凍結乾燥された乾燥粉末として提供され得る。
【００６９】
以下の実施例により本発明を例示するが、これによりいかなる意味においても限定されるものではない。
【実施例】
【００７０】
（実施例１）
この実施例は、ヒトＭ−ＣＳＦに対する可溶性受容体の同定を記載し、この可溶性受容体はＭ−ＣＳＦを結合できることを示す。
【００７１】
Ｉ．血清試料中の可溶性ヒトＭ−ＣＳＦ受容体の同定
Ａ．材料および方法
マイクロタイタープレート（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＣＰ００１１）を、ＰＢＳ中１００ｎｇ／ｍｌ作用希釈の１００μｌ／ウェル捕捉抗体（Ｄｕｏ  Ｓｅｔ  Ｅｌｉｓａ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ｈＭ−ＣＳＦ  Ｒ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＤＹ３２９））でコートした。プレートをシールし、一夜室温でインキュベートした。マニホルドディスペンサ／ワッシャ（ｍａｎｉｆｏｌｄ  ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ／ｗａｓｈｅｒ）を用いて洗浄緩衝液（ＰＢＳ中、０．０５％Ｔｗｅｅｎ、ｐＨ７．２〜７．４）で３回ウェルを洗浄後、プレートを３００μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液（１％ＢＳＡ、ＰＢＳ中５％スクロース、ｐＨ７．２〜７．４）を用いて、室温で少なくとも１時間ブロックした。
【００７２】
洗浄工程を繰り返した後に、プレートは試料添加の準備が整う。１００μｌ／ウェルの試料または試薬希釈剤中の標準物質のいずれかを添加した。プレートを接着用テープでカバーし、室温で２時間インキュベート後、３サイクルの洗浄を行った。１００μｌの検出抗体（Ｄｕｏ  Ｓｅｔ  Ｅｌｉｓａ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ｈＭ−ＣＳＦＲ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＤＹ３２９））を添加後、プレートをカバーし、室温で２時間インキュベート後、３サイクルの洗浄を行った。
【００７３】
次に、ストレプトアビジンＨＲＰ（Ｄｕｏ  Ｓｅｔ  Ｅｌｉｓａ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ｈＭ−ＣＳＦＲ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＤＹ３２９））の作用希釈１００μｌを添加した後、室温、暗所で２０分インキュベーションした。３サイクルの洗浄後、ウェル当り１００μｌの基質溶液（試薬ＡとＢの１：１混合物（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＤＹ９９９））を用いてプレートを５分間発色させた後、５０μｌの停止液（２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４）を添加し、完全に混合するためにプレートを軽くたたいた。最終の読出しは、停止液添加の直後に４５０〜５４０ｎｍの吸光度であった。
【００７４】
Ｂ．結果
ＥＬＩＳＡアッセイを血清試料中の可溶性ヒトＭ−ＣＳＦ受容体の存在を測定するために使用した場合、強い陽性シグナルがヒト血清試料で検出された。このＥＬＩＳＡアッセイで用いた捕捉抗体および検出抗体は、ヒトＭ−ＣＳＦ受容体の細胞外ドメインに特異的であった。図２に示すように、強い陽性シグナルがヒト血清試料で検出された。このシグナルは、ヒト血清の濃度に依存している。捕捉抗体が使用されなかった場合にはシグナルは存在しない。
【００７５】
比較タンパク質として組み換え型のヒトＭ−ＣＳＦ受容体およびヒト抗体Ｆｃフラグメント融合タンパク質を使用して、標準曲線が可溶性ヒトＭ−ＣＳＦ受容体濃度を定量するために確立された（図１）。このＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ヒト血清中の可溶性受容体の量が、基準としてｃ−ｆｍｓヒトＦｃ融合タンパク質を用いて算出された。約０．５μｇ／ｍｌの可溶性ヒトＭ−ＣＳＦ受容体がヒト血清中に存在することが見出された（図２）。
【００７６】
ＩＩ．可溶性Ｍ−ＣＳＦ受容体のＥＬＩＳＡ結合アッセイ
Ａ．材料および方法
マイクロタイタープレート（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＣＰ００１１）を、ＰＢＳ中１００ｎｇ／ｍｌ作用希釈の１００μｌ／ウェル捕捉抗体（Ｄｕｏ  Ｓｅｔ  Ｅｌｉｓａ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ｈＭ−ＣＳＦ  Ｒ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＤＹ３２９））でコートした。プレートをシールして一夜室温でインキュベートした。マニホルドディスペンサ／ワッシャを用いて、洗浄緩衝液（ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ、ｐＨ７．２〜７．４）で３回ウェルを洗浄後、プレートを３００μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液（１％ＢＳＡ、ＰＢＳ中５％シュークロース、ｐＨ７．２〜７．４）を用いて、室温で少なくとも１時間ブロックした。
【００７７】
洗浄工程を繰り返した後、プレートは試料添加の準備が整う。１００μｌ／ウェルの試料または試薬希釈剤中の標準物質のいずれかを添加した。プレートを接着用テープでカバーし、室温で２時間インキュベート後、３サイクルの洗浄を行った。１μｇ／ｍＬのヒトＭ−ＣＳＦをプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。ヒトＭ−ＣＳＦに対する１００μｌの検出抗体（ＨＲＰ結合ポリクローナル抗ヒトＭ−ＣＳＦ抗体：Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ  ＤＭＣ００，ｐａｒｔ＃８９０１５４）を添加後、プレートをカバーし、室温で２時間インキュベート後、３サイクルの洗浄を行った。プレートを、ウェル当り１００μｌの基質溶液（試薬ＡとＢの１：１混合物（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＤＹ９９９））を用いて５分間発色させた後、５０μｌの停止液（２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４）を添加し、完全に混合するためにプレートを軽くたたいた。最終の読出しは、停止液添加の直後に４５０〜５４０ｎｍの吸光度であった。
【００７８】
Ｂ．結果
ヒト血清中に存在する可溶性受容体は、Ｍ−ＣＳＦを結合することができる。図３に示すように、ヒト血清試料の階段希釈を、マウスモノクローナル抗ヒトｃ−ｆｍｓ抗体でコートしたＥＬＩＳＡプレートにアプライした。アルカリホスファターゼ結合ポリクローナル抗ヒトＭ−ＣＳＦ抗体によるヒトＭ−ＣＳＦの検出前に、１μｇ／ｍｌの外来性ヒトＭ−ＣＳＦ（四角）またはＰＢＳ（ひし形）のいずれかを添加した。明白なＭ−ＣＳＦの結合が約５％のヒト血清に見出された。しかしヒト血清中の可溶性受容体は、組み換え型のｃ−ｆｍｓ  Ｆｃ融合タンパク質と比べて低い結合親和性を有することが見出された（図４）［組み換え型ｃ−ｆｍｓ  Ｆｃ融合タンパク質の結合親和性は、リガンド誘導二量体化のため天然の膜結合型ｃ−ｆｍｓの結合親和性に近いと考えられる］。可溶性受容体の低親和性に対する１つの解釈は、この受容体はリガンドに対する１つの結合部位のみを有するが、組み換え型ｃ−ｆｍｓ  Ｆｃ融合タンパク質は、結合活性効果に関して２つの結合部位を有することである。
【００７９】
ＩＩＩ．血清試料由来ヒトＭ−ＣＳＦ受容体の免疫沈降
Ａ．材料および方法
５００μｌのストレプトアビジンビーズ（＃２０３４７、Ｐｉｅｒｃｅ）を、１５ｍｌファルコンチューブ中の１０ｍｌの２０％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ  カタログ番号  Ｓ  ７０２３、あらかじめ凍結されている）に添加し、穏やかに振盪して４℃で１時間インキュベートした。試料を４００ｒｐｍで５分間遠心して上清を新たなチューブに移した。１０μｇの抗ｈＭＣＳＦＲ抗体（Ｒ＆Ｄ  ＃  ＢＡＦ  ３２９）を上清に添加し、穏やかに振盪して４℃で１時間インキュベートした。５００μｌのストレプトアビジンビーズを添加後、試料を４℃で一夜振盪してインキュベートした。試料を４００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を新しいチューブへ移し、そして同時に上清を保存した。ビーズをエッペンドルフチューブへ移し、洗浄緩衝液＃１（０．５Ｍ  ＬｉＣＬ２）、＃２（０．５Ｍ  ＬｉＣＬ２／０．５％Ｔｒｉｔｏｎ）および＃３（１０ｍＭ  ＴＲＩＳ  ｐＨ７．４）のそれぞれ１ｍｌで１回洗浄した。最後の遠心後、大部分の洗浄緩衝液を除去した（ビーズがほぼ乾燥でするまで）。次いでビーズを５００μｌのＰＢＳに再懸濁した。ゲル（１０％Ｎｏｖｅｘ）泳動前に、ＤＴＴを有する５×ＳＤＳ試料緩衝液を添加し、試料を１００℃で２分間煮沸した。
【００８０】
免疫沈降したヒトＭ−ＣＳＦ受容体を脱グリコシル化するために、上記の免疫沈降方法からの冷凍ビーズ（約２００μｌ）を２００μｌのＰＢＳを用いて１：１の比率に希釈した。希釈した試料を、１００℃で１０分間、１×変性緩衝液（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ、ＮＥＢ＃  Ｐ０７０５Ｓ）中でインキュベートした。Ｇ７反応緩衝液（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ、ＮＥＢ＃  Ｐ０７０５Ｓ）を、１×最終濃度およびＮＰ４０（最終濃度１％）になるように添加後、試料を５μｌのＰＮＧａｓｅ  Ｆと共に１時間、３７℃でインキュベートした。
【００８１】
Ｂ．結果
可溶性ヒトＭ−ＣＳＦ受容体は、分子量９７ＫＤを有するグリコシル化タンパク質であることが分かった（図５）。脱グリコシル化後、可溶性ヒトＭ−ＣＳＦ受容体の分子量は約６０ＫＤである（図６）。
【００８２】
可溶性ヒトＭ−ＣＳＦ受容体は、ヒトＭ−ＣＳＦに対する膜結合受容体であるヒトｃｆｍｓタンパク質のタンパク質配列を少なくとも部分的に共有することが分かった。上記の図で示すように、可溶性ヒトＭ−ＣＳＦ受容体はまた、ヒトｃ−ｆｔｎｓタンパク質を認識する多数の抗体によって認識され得る。可溶性ヒトＭ−ＣＳＦ受容体のタンパク質配列をさらに確認するために、タンパク質分析を以下のように行った：脱グリコシル化後の可溶性受容体に対応するタンパク質バンドをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で同定した（図７のバンド＃４）。このバンド中のタンパク質をトリプシンで消化した。ペプチド混合物であるこの消化産物を分析した。１つのペプチドは、ヒトｃ−ｆｍｓタンパク質の細胞外ドメインのセグメントと同様の、正確な分子量およびアミノ酸の配列（配列番号１）を有することが見出された（図８）。この証拠は、可溶性ヒトＭ−ＣＳＦ受容体は、ヒトＭ−ＣＳＦに対する膜結合受容体であるヒトｃ−ｆｍｓタンパク質のタンパク質配列を共有することを示すものである。
【００８３】
（実施例２）
この実施例は、可溶性Ｍ−ＣＳＦ受容体がヒト尿試料中に認められたことを示す。この実施例は、さらにこの受容体が正常被験体および乳癌患者両方の血清中に存在し、Ｍ−ＣＳＦレベルと相関した可溶性Ｍ−ＣＳＦ受容体レベルであることを示している。最後にこの実施例は、可溶性Ｍ−ＣＳＦ受容体は霊長類にも認められることを示している。
【００８４】
Ｉ．可溶性ヒトＭ−ＣＳＦ受容体は尿試料にも認められた。
【００８５】
実施例１に記載のように同じＥＬＩＳＡ装置を用いて、正常ヒトボランティアからの多数の尿試料を採取し、可溶性ヒトＭ−ＣＳＦ受容体の存在についてアッセイした。様々なレベルの可溶性ヒトＭ−ＣＳＦ受容体が成人女性（年齢２５〜６６）、成人男性（年齢３５〜７０）および年齢３〜９の子供の間で検出された。可溶性ヒトＭ−ＣＳＦ受容体濃度の定量は、基準として組み換え型ｃ−ｆｍｓヒトＦｃ融合タンパク質を用いて決定した（図９）。
【００８６】
尿試料を、１人の女性被験体の月経周期の全体を通じて毎日採取した。この試料は朝の最初の排尿として採取し、−２０℃に凍結した。全ての試料は、同じ日にアッセイした。可溶性受容体は、本明細書に記載したようにアッセイした。図１０で示すように、尿サンプルの可溶性受容体レベルは、月経周期間に変動する。この所見は可溶性受容体を、月経周期または妊娠テストのための潜在的診断マーカーにしている。
【００８７】
ＩＩ．乳癌患者におけるＭ−ＣＳＦレベルと可溶性Ｍ−ＣＳＦ受容体レベルの相関
可溶性ヒトＭ−ＣＳＦ受容体濃度を、以下のように乳癌血清試料で分析した。ヒト血清試料の階段希釈を、上記のように可溶性ヒトＭ−ＣＳＦ受容体の存在に関してＥＬＩＳＡでアッセイした。ヒト血清をこのＥＬＩＳＡ構成（「標準」と呼ぶ）でアッセイした場合、強い陽性シグナルが検出された。対照としての、捕捉抗体または検出抗体のいずれかの除去はシグナルを消去し、このシグナルはこれら抗ヒトｃ−ｆｍｓ抗体に対して特異的であることを示した。基準として組み換え型ｃ−ｆｍｓヒトＦｃ融合タンパク質を用いる可溶性ヒトＭ−ＣＳＦ受容体濃度の定量は、０．５μｇ／ｍｌであると測定された。
【００８８】
図１１で示すように、可溶性受容体のレベルは患者間で変化する。患者試料の可溶性受容体濃度は上記濃度よりもはるかに低く、血清試料の調製および貯蔵に用いられた異なるプロトコルによる可能性があることに留意されたい（図２）。したがってＭ−ＣＳＦとＭ−ＣＳＦ可溶性受容体濃度の比較は、同じプロトコルに従って採取されて処理された試料間でのみ有効である。図１２は、同じ試料における乳癌患者のＭ−ＣＳＦレベルに対するＭ−ＣＳＦ可溶性受容体濃度間の直線相関を示している。この所見は、Ｍ−ＣＳＦ可溶性受容体を癌進行に関する潜在的バイオマーカーにしている。さらに、Ｍ−ＣＳＦの直接的測定が困難な場合（たとえば、Ｍ−ＣＳＦ中和抗体が癌治療に用いられる場合）、Ｍ−ＣＳＦ可溶性受容体はさらに有効なバイオマーカーとなる。
【００８９】
ＩＩＩ．可溶性Ｍ−ＣＳＦ受容体がまた、他の霊長類で見出される
ヒトＭ−ＣＳＦ可溶性受容体に関する上記のＥＬＩＳＡアッセイはまた、他の動物種からの血清試料を調べるために使用される（図１３）。カニクイザルおよびアカゲザルの血清試料は強い陽性シグナルを示し、可溶性受容体の存在を示す。カニクイザルおよびアカゲザルに関する膜結合Ｍ−ＣＳＦ受容体タンパク質配列は入手不可能である。しかしこれらの配列は、そのヒト対応物と高いレベルのタンパク質相同性を共有すると考えられる。したがって、ヒト膜結合型Ｍ−ＣＳＦ受容体の細胞外ドメインを認識するＥＬＩＳＡアッセイで用いた抗体はまた、カニクイザルおよびアカゲザルのこの細胞外ドメインを認識する。
【００９０】
非霊長類血清由来の陽性シグナルの欠如は、Ｍ−ＣＳＦ可溶性受容体の欠如を示さないことに留意されたい。むしろ、可溶性受容体の存在を検出するために用いたＥＬＩＳＡアッセイの抗体特異性による可能性が一番高いようである。
【００９１】
（実施例３）
この実施例は、可溶性ヒトＭ−ＣＳＦ受容体の発現を、破骨細胞分化と密接に関連していることを示している。この実施例は、さらに分化した破骨細胞のみが可溶性ヒトＭ−ＣＳＦ受容体を発現し、そのレベルがＭ−ＣＳＦの除去により増加することを示している。
【００９２】
Ａ．材料および方法
Ｍ−ＣＳＦ可溶性受容体の発現を、膜結合Ｍ−ＣＳＦ受容体の発現が見出されたヒト破骨細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ系で研究した。特に可溶性受容体の発現を、破骨細胞分化に関連して調べた。初代のヒト破骨細胞前駆体（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、Ｉｎｃ．カタログ番号２Ｔ−１１０）を、３０ｎｇ／ｍｌのヒトＭ−ＣＳＦおよび１００ｎｇ／ｍｌのＲＡＮＫＬを含む細胞培養培地中、０．２ｍｌ／ウェルの１０，０００細胞／ウェルで接種した。細胞のプレーティングと同日に、試験抗体を１μｇ／ｍＬでウェルに添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下でインキュベートした。７日目に、破骨細胞を異常に大きな多核細胞として位相差顕微鏡で同定した。フィーディングして培養をさらに１週間続けることができ、その間に破骨細胞は大きさが増し続ける。培養の最後に、細胞を酒石酸塩耐性酸性ホスファターゼで染色し、この陽性の染色は破骨細胞の存在を示す。各ウェル中の破骨細胞数を光学顕微鏡下で計数し、顕微鏡の視野下の破骨細胞の平均としてグラフに示した。
【００９３】
破骨細胞馴化培地のＴＲＡＰ活性を、ＳＢＡ−ＳｃｉｅｎｃｅｓのＢｏｎｅＴＲＡＰ  Ａｓｓａｙキット（ＴＲ２０１）を用いて検定した。ＢｏｎｅＴＲＡＰ（登録商標）Ａｓｓａｙ（ＴＲ２０１）は、ヒト血清試料由来の骨吸収速度の迅速で特異的な判定用の固相免疫固定酵素活性アッセイである。これはヒト破骨細胞培養で用いることができる。
【００９４】
Ｂ．結果
図１４で示すように、Ｍ−ＣＳＦ可溶性受容体は破骨細胞で発現した。分化した破骨細胞の馴化培地における可溶性受容体の濃度を測定した。可溶性受容体の発現は破骨細胞に特異的であった。このケースではＭ−ＣＳＦ中和抗体であるＣｈｉｒ−ＲＸ１による破骨細胞分化の阻害は、可溶性受容体の抑制を生じた。
【００９５】
可溶性受容体は分化した破骨細胞でのみ発現し、破骨細胞前駆体では発現しない。図１５ａに示した時間経過実験で示すように破骨細胞分化アッセイで、可溶性受容体の発現は１０日目に始まり、１２日目にプラトーに達する。この発現パターンは、ＴＲＡＰ活性により追跡して図１５ｂに示したように厳密に破骨細胞分化パターンに対応する。
【００９６】
興味深いことには、分化した破骨細胞において、Ｍ−ＣＳＦ可溶性受容体の発現はＭ−ＣＳＦの除去により上方制御されている。図１６は、ＩｇＧ１対照抗体またはＭ−ＣＳＦ中和抗体であるＣｈｉｒ−ＲＸ１のいずれかを添加後、２４時間以内のＭ−ＣＳＦ可溶性受容体の発現を示す。データは、Ｍ−ＣＳＦ活性が中和された場合、可溶性受容体の発現が増加することを明確に示している。発現の増加は８日目に始まり最高レベルに１２日目に達し、これは発現の増加が分化した破骨細胞で生じることを示している。
【００９７】
分化した破骨細胞において、破骨細胞活性の阻害剤であるＺｏｍｅｔａは、Ｍ−ＣＳＦ可溶性受容体の発現に及ぼす効果を有してない（図１７）。同じ実験で、ＩｇＧ１対照ではなく、Ｍ−ＣＳＦ中和抗体が発現を刺激した。
【００９８】
本明細書中に挙げられおよび／またはアプリケーションデータシートにリストされた、上記の全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許公開は、その全体が参考として本明細書中に組み込まれる。
【００９９】
前述より、本発明の特定の実施形態を例示の目的で本明細書中に記載したが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の改変がなされ得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】図１は、可溶性ヒトＭ−ＣＳＦ受容体濃度の定量に用いた標準曲線を示す。
【図２】図２は、ヒト血清サンプルにおける可溶性ヒトＭ−ＣＳＦ受容体の検出を示す。
【図３】図３は、ヒト血清中の可溶性ｃ−ｆｍｓによるヒトＭ−ＣＳＦの結合を示す。
【図４】図４は、可溶性ヒトＭ−ＣＳＦ受容体の親和性分析を示す。
【図５】図５は、可溶性ヒトＭ−ＣＳＦ受容体の免疫沈降（ＩＰ）を示す。
【図６】図６は、可溶性ヒトＭ−ＣＳＦ受容体の脱グリコシル化を示す。
【図７】図７は、可溶性ヒトＭ−ＣＳＦ受容体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図８】図８は、脱グリコシル化した可溶性ヒトＭ−ＣＳＦ受容体のトリプシン消化に由来するペプチド（配列番号１）の配列分析を示す。
【図９】図９は、ヒト尿試料における可溶性ヒトＭ−ＣＳＦ受容体の検出を示す。
【図１０】図１０は、月経周期間の尿試料における可溶性ヒトＭ−ＣＳＦ受容体レベルを示す。
【図１１】図１１は、乳癌患者試料における可溶性ヒトＭ−ＣＳＦ受容体レベルを示す。
【図１２】図１２は、乳癌患者血清試料における可溶性ヒトＭ−ＣＳＦ受容体とＭ−ＣＳＦレベル間の相関を示す。
【図１３】図１３は、可溶性のＭ−ＣＳＦ受容体は、カニクイザルおよびアカゲザルで認められることを示す。
【図１４】図１４は、破骨細胞分化の間の可溶性ヒトＭ−ＣＳＦ受容体の発現は、Ｍ−ＣＳＦ活性に依存することを示す。
【図１５】図１５は、可溶性ヒトＭ−ＣＳＦ受容体発現は、破骨細胞のＴＲＡＰ活性に続くことを示す。
【図１６】図１６は、培養培地からＭ−ＣＳＦを除去すると、分化した破骨細胞の可溶性ヒトＭ−ＣＳＦ受容体発現が刺激されることを示す。
【図１７】図１７は、分化した破骨細胞における可溶性ヒトＭ−ＣＳＦ受容体発現に及ぼすＺｏｍｅｔａおよびＭ−ＣＳＦ中和抗体の効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
2009521685000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成20年9月4日(2008.9.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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