(57)【要約】ARJV1Dを発症する個体の遺伝的リスクを予測するための方法を、本方法を実施するために使用しうるアレイおよびキットとして開示する。本方法は、ARMD関連分子、例えば、CFH、LOC387715、BF、C2、ABCR、フィブリン5、VMD2、TLR4、CX3CR1、CST3、MnSOD、MEHE、パラオキソナーゼ、APOE、EL0VL4、およびhemicentin-1における変異および/または多型をスクリーニングする工程を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における加齢黄斑変性(ARMD)に対する遺伝的素因を検出するための方法であって、前記対象が、少なくとも9つのARMDリスク関連分子に1つ以上の変異を有するかどうかを判定する工程を含み、前記少なくとも9つのARMD分子は、CFH、LOC387715、BF、C2、ABCR、フィブリン5、VMD2、TLR4、CX3CR1、CST3、MnSOD、MEHE、パラオキソナーゼ、APOE、ELOVL4、およびhemicentin-1からなる群より選択され、1つ以上の変異の存在は、前記対象がARMDの遺伝的素因を有することを示す、方法。
【請求項２】
前記1つ以上の変異は、表1AのCFH、LOC387715、BF、C2、ABCR、フィブリン5、VMD2、TLR4、CX3CR1、CST3、MnSOD、MEHE、パラオキソナーゼ、APOE、ELOVL4、およびhemicentin-1に関して記載された1つ以上の変異を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも1つ以上の変異は、表1AのCFH、LOC387715、BF、C2、ABCR、フィブリン5、VMD2、TLR4、CX3CR1、CST3、MnSOD、MEHE、パラオキソナーゼ、APOE、ELOVL4、およびhemicentin-lに関して記載された11の変異を含む、請求項2記載の方法。
【請求項４】
対象が表1AのCFH、LOC387715、BF、C2、ABCR、フィブリン5、VMD2、TLR4、CX3CR1、CST3、MnSOD、MEHE、パラオキソナーゼ、APOE、ELOVL4、およびhemicentin-1に関して記載された少なくとも20の変異において1つ以上の変異を有するかどうかを判定する工程を含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
対象が表1AのCFH、LOC387715、BF、C2、ABCR、フィブリン5、VMD2、TLR4、CX3CR1、CST3、MnSOD、MEHE、パラオキソナーゼ、APOE、ELOVL4、およびhemicentin-1に関して記載された少なくとも105の変異において1つ以上の変異を有するかどうかを判定する工程を含む、請求項1記載の方法。
【請求項６】
対象が表1AのCFH、LOC387715、BF、C2、ABCR、フィブリン5、VMD2、TLR4、CX3CR1、CST3、MnSOD、MEHE、パラオキソナーゼ、APOE、ELOVL4、およびhemicentin-1に関して記載された11を超えない変異において1つ以上の変異を有するかどうかを判定する工程を含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
約80％〜約98％の範囲で、ARMDを発症する可能性をもたらす、請求項1記載の方法。
【請求項８】
少なくとも9つのARMD関連分子が核酸分子を含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
核酸分子が前記対象から増幅され、これにより増幅産物が生成され、該増幅産物が、1つ以上の変異を検出するオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズする、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチドをハイブリダイズする工程が下記の工程を含む、請求項9記載の方法:
a) 増幅産物とオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な時間で、増幅産物とオリゴヌクレオチドプローブをインキュベートし、これにより増幅産物:オリゴヌクレオチドプローブ複合体を形成する工程、および
b) 増幅産物が、ARMD関連核酸中に1つ以上の変異を含むかどうかを判定するために、増幅産物:オリゴヌクレオチドプローブ複合体を解析する工程であって、1つ以上の変異の存在は、対象がARMDの遺伝的素因を有することを示す工程。
【請求項１１】
増幅産物:オリゴヌクレオチドプローブ複合体を解析する工程が、核酸ハイブリダイゼーションの量を測定する工程を含み、対応する野生型配列に対するハイブリダイゼーションの量と比較して、変異配列の1つ以上に対するハイブリダイゼーションの量が多い場合、対象がARMDの遺伝的素因を有することを示す、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
増幅産物:オリゴヌクレオチドプローブ複合体を解析する工程が、該複合体を検出し定量する工程を含む、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
オリゴヌクレオチドプローブがアレイ基板上に存在する、請求項9記載の方法。
【請求項１４】
アレイが、野生型ARMD関連核酸分子に相補的なオリゴヌクレオチドプローブをさらに含む、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
野生型ARMD関連核酸分子が、野生型CFH、野生型LOC387715、野生型BF、野生型C2、野生型ABCR、野生型フィブリン5、野生型VMD2、野生型TRL4、野生型CX3CR1、野生型CST3、野生型MnSOD、野生型MEHE、野生型パラオキソナーゼ、野生型APOE、野生型ELOVL4、および野生型hemicentin-1核酸配列、またはこれらの組み合わせに対して相補的なオリゴヌクレオチドプローブを含む、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも9つのARMD関連分子が、CFH、LOC387715、ABCR、TRL4、CX3CR1、CST3、MnSOD、MEHE、およびパラオキソナーゼからの配列で構成される、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
対象が、ARMDを発症するリスクが潜在的にあるグループに属する、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
対象が喫煙する、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
対象から得られる核酸分子が、血清から得られる、請求項9記載の方法。
【請求項２０】
下記の工程を含む、対象におけるARMDに対する遺伝的素因を検出する方法:
a) 対象から得られた増幅産物をアレイに添加する工程であって、該アレイは、CFH、LOC387715、BF、C2、ABCR、フィブリン5、VMD2、TLR4、CX3CR1、CST3、MnSOD、MEHE、パラオキソナーゼ、APOE、ELOVL4、およびhemicentin-1から成る群より選択される、少なくとも9つの分子における9つ以上の変異または多型に相補的なオリゴヌクレオチドプローブを含む工程、
b) 増幅産物とオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な条件下で、増幅産物とアレイをインキュベートし、これにより増幅産物:オリゴヌクレオチドプローブ複合体を形成する工程、ならびに
c) 増幅産物が、少なくとも9つの分子において1つ以上の変異または多型を含むかどうかを判定するために、増幅産物:オリゴヌクレオチドプローブ複合体を解析する工程であって、1つ以上の変異または多型の存在は、対象がARMDの遺伝的素因を有することを示す工程。
【請求項２１】
下記の工程を含む、ARMD療法を選択する方法:
a) 請求項1記載の方法を用いて、対象の少なくとも1つのARMD関連分子における変異を検出する工程、および
b) そのような変異が特定された場合に、ARMDを治療するための治療を選択する工程。
【請求項２２】
野生型遺伝子配列、変異型遺伝子配列、または両方に相補的なオリゴヌクレオチドプローブを含むアレイであって、遺伝子配列が、CFH、LOC387715、BF、C2、ABCR、フィブリン5、VMD2、TLR4、CX3CR1、CST3、MnSOD、MEHE、パラオキソナーゼ、APOE、ELOVL4、およびhemicentin-1、またはこれらの組み合わせからのコード配列または非コード配列を含む、アレイ。
【請求項２３】
変異型遺伝子配列が、表1Aの、CFH、LOC387715、BF、C2、ABCR、フィブリン5、VMD2、TLR4、CX3CR1、CST3、MnSOD、MEHE、パラオキソナーゼ、APOE、ELOVL4、およびhemicentin-1に関して記載された11以上の変異または多型を含む、請求項22記載のアレイ。
【請求項２４】
変異型遺伝子配列が、表1Aの、CFH、LOC387715、BF、C2、ABCR、フィブリン5、VMD2、TLR4、CX3CR1、CST3、MnSOD、MEHE、パラオキソナーゼ、APOE、ELOVL4、およびhemicentin-1に関して記載された変異または多型から本質的に成る、請求項23記載のアレイ。
【請求項２５】
下記の工程を含む、対象における、加齢黄斑変性(ARMD)に対する遺伝的素因を検出する方法:
a) 請求項22記載のアレイに増幅産物を添加する工程であって、増幅産物が、対象から得られた増幅核酸を含み、核酸が、CFH、LOC387715、BF、C2、ABCR、フィブリン5、VMD2、TLR4、CX3CR1、CST3、MnSOD、MEHE、パラオキソナーゼ、APOE、ELOVL4、およびhemicentin-1から成る群より選択される少なくとも9つの分子からのコード配列または非コード配列を含む工程、
b) 増幅産物とオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な条件下で、増幅産物とアレイをインキュベートし、これにより増幅産物:オリゴヌクレオチドプローブ複合体を形成する工程、ならびに
c) 増幅産物が、少なくとも9つの分子において1つ以上の変異または多型を含むかどうかを判定するために、増幅産物:オリゴヌクレオチドプローブ複合体を解析する工程であって、1つ以上の変異または多型の存在は、対象がARMDの遺伝的素因を有することを示す工程。
【請求項２６】
請求項22記載のアレイを含む、対象における加齢黄斑変性(ARMD)に対する遺伝的素因を検出するためのキット。
【請求項２７】
増幅産物を得るために、対象から得られた核酸分子を増幅させるためのプライマーを個別包装でさらに含み、該増幅産物が、CFH、LOC387715、BF、C2、ABCR、フィブリン5、VMD2、TLR4、CX3CR1、CST3、MnSOD、MEHE、パラオキソナーゼ、APOE、ELOVL4、およびhemicentin-1遺伝子からの配列を含む、請求項26記載のキット。
【請求項２８】
増幅酵素を個別包装でさらに含む、請求項26記載のキット。
【請求項２９】
緩衝溶液を個別包装でさらに含む、請求項26記載のキット。
【請求項３０】
アレイが、ストリンジェントな条件下で、野生型CFH、野生型LOC387715、野生型BF、野生型C2、野生型ABCR、野生型フィブリン5、野生型VMD2、野生型TRL4、野生型CX3CR1、野生型CST3、野生型MnSOD、野生型MEHE、野生型パラオキソナーゼ、野生型APOE、野生型ELOVL4、および野生型hemicentin-1とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項27記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本出願は、加齢黄斑変性に対する個体の遺伝的感受性を予測する方法、ならびに開示される方法を実施するために使用しうるアレイに関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は2005年11月2日に申請され、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、米国仮特許出願第60/733,042号の恩典を主張するものである。
【背景技術】
【０００３】
背景
加齢黄斑変性(ARMD)は、精密な視覚を提供する中心網膜内の光受容体が豊富な領域である、黄斑部に発生する眼の変性疾患である。ARMDは、中心視の突然の悪化を招き、通常は影響がでないのは周辺視力のみである。黄斑変性は、米国や先進国の65歳以上の人々における重篤な失明の最大の原因である。本疾患は、典型的に片方の目の中心視の低下を示し、その後数ヵ月または数年のうちに、もう一方の目の中心視が同様に失われる。本疾患の臨床的徴候には、黄斑部の沈着物(ドルーゼン)の存在が含まれる。
【０００４】
社会において健康上の重大な懸念であるにもかかわらず、ARMDの病因および発生機序はほとんど解明されていない。ARMDのような状態に関する、遺伝疫学の研究は比較的わずかであるが、それでもなお、遺伝的素因を持つ対象において疾病表現型を誘発する、環境因子によって発生する多因子疾患として、ARMDを提唱する十分なエビデンスが存在する。ARMDは多重遺伝子疾患であり、ARMDの発症を誘発する、浸透性が変化する多くの遺伝子変異および/または多型を持つ。各遺伝子欠損に関連するリスクは、単独では比較的低いかもしれないが、複数の変異体が同時に存在すると、ARMDの一因となる状態または危険因子、例えば、加齢、喫煙、および食生活の存在下で疾患の感受性を劇的に増加させる可能性がある。
【０００５】
これまでの報告では、ARMDに関連する1つ以上の多型のスクリーニングが記載されている(例えば、PCT公報WO2005077006(特許文献1)、米国特許第5,498,521号(特許文献2)を参照されたい)。概して、これらのアッセイは、臨床的な予測値を持たないため限定されている。従って、ある個体がARMDを発症するリスクを性格に予測できる方法が求められており、一部の実施例ではこの方法を複数の民族集団をスクリーニングするのに使用できる。
【０００６】
【特許文献１】PCT公報WO2005077006
【特許文献２】米国特許第5,498,521号
【発明の開示】
【０００７】
概要
本発明者らは、ARMDの同時遺伝子検査が遺伝的感受性リスクを正確に評価でき、また臨床的に応用できる十分な予測力を持つと判断した。一実施例では、ARMDとの関連が知られる分子中の多型を含む変異の組み合わによって、ARMD発症に対するある個体の総合的な遺伝的感受性の予測を、非常に正確に予測することができる。
【０００８】
一部の実施例における、開示される方法を用いた少なくとも9つの遺伝子における少なくとも11のARMDリスク関連性遺伝的変異の同時検査に関する、開示される統計学的解析は、ARMDの予測が最大で98％であることを示した。開示される方法(本明細書ではARMD(MERT-ARMD)の認識と検査に関する発展した方法と呼ぶ)は、ARMD感受性と現在のところ関連がある全ての分子、例えば、補体因子H(CFH)、LOC387715、補体因子B(BF)、補体成分2(C2)、ATP結合カセットR(ABCR)、フィブリン5(FBLN5)、卵黄様黄斑変性(VMD2)、トール様受容体4(TLR4)、CX3CR1、シスタチンC(CST3)、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ(MnSOD)、ミクロソーム型エポキシドヒドロラーゼ(MEHE)、パラオキソナーゼ、アポリポタンパク質E(APOE)、ELOVL4、およびhemicentin-1における同時遺伝子検査を可能にする、迅速かつ費用効率の高いアッセイを提供する。一つの態様では、本方法は、CFH、LOC387715、BF、C2、ABCR、フィブリン5、VMD2、TLR4、CX3CR1、CST3、MnSOD、MEHE、パラオキソナーゼ、APOE、ELOVL4、およびhemicentin-1からの配列を含む、それらから本質的に成る、またはそれらから成る、ARMD関連分子において1つ以上の変異、多型、または両方を持つがどうかを判定する工程を含む。特定の態様では、16の異なる遺伝子における多型を含む、105のARMD関連変異についてスクリーニング、例えばハイブリダイゼーションベースの高密度オリゴヌクレオチドアレイ技術が実施される。一実施例では、オリゴヌクレオチドアレイは、野生型および変異型対立遺伝子を含む、少なくとも210の対立遺伝子に対するプローブを含む。この実施例に関する、16の異なる遺伝子における105のARMD関連変異を表1Aに示す。
【０００９】
他の実施例では、対照集団とARMD患者の両方において発生率が確立された、少なくとも11のARMD関連遺伝子における少なくとも14のARMD関連性感受性遺伝子型、例えば、表2の遺伝子についてスクリーニングが実施される。
【００１０】
個々の変異または多型の検査は、ARMD発症の可能性に関する、限定された予測的情報をもたらす(疾患の事後確率は、各検査単独で0.1％〜0.98％に及ぶ)。特定の実施例では、MERT-ARMDを用いることでARMDの事後確率は98％まで上昇し、これは90倍を超える上昇である。本願で開示される方法およびアレイは、例えば、ARMDに関連する全ての遺伝子における変異および/または多型をスクリーニングすることによって、非常に正確で、総合的なARMD遺伝的感受性予測を初めて提供するものである。特定の実施例では、現在ARMDと関連がある105の変異および/または多型(表1A)、またはそのような既知の変異および/または多型の全てのサブセット、例えばそのような変異および/または多型の少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも100、例えば、10、20、30、40、50、60、70、75、80、90、95、96、97、98、99、101、102、103、および104がスクリーニングされる。
【００１１】
特定の実施例では、本方法は、対象のARMDに対する遺伝的感受性を検出するためにゲノムDNAマイクロアレイ技術を利用し、マイクロアレイデータをARMD関連感受性遺伝子のパネルに関する混合尤度比と直接的に関連付ける。
【００１２】
特定の実施例では、本方法は、増幅産物を得るために、対象から得られた核酸分子を増幅する工程を含む。例えば、増幅産物は、CFH、LOC387715、BF、C2、ABCR、フィブリン5、VMD2、TLR4、CX3CR1、CST3、MnSOD、MEHE、パラオキソナーゼ、APOE、ELOVL4、およびhemicentin-1からの配列(例えば少なくとも100、または少なくとも200のそのような配列の連続ヌクレオチド)を含む、該配列から本質的に成る、または該配列から成る。結果として得られる増幅産物を、アレイに接触または添加する。アレイは、1つ以上の変異および/または多型を含む、CFH、LOC387715、BF、C2、ABCR、フィブリン5、VMD2、TLR4、CX3CR1、CST3、MnSOD、MEHE、パラオキソナーゼ、APOE、ELOVL4、およびhemicentin-1配列とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドプローブを含むことができる。特定の変異の例を表1Aに示すが、その他の変異および/または多型が将来特定される可能性があることを当業者が理解するように、本開示はこれらに限定されない。一部の実施例では、アレイは、野生型CFH、野生型LOC387715、野生型BF、野生型C2、野生型ABCR、野生型フィブリン5、野生型VMD2、野生型TLR4、野生型CX3CR1、野生型CST3、野生型MnSOD、野生型MEHE、野生型パラオキソナーゼ、野生型APOE、野生型ELOVL4、および野生型hemicentin-1とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドをさらに含む。増幅産物は、幅産物とオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションに十分な条件下でアレイとともにインキュベートされ、これにより増幅産物:オリゴヌクレオチドプローブ複合体を形成する。次に、増幅産物が、CFH、LOC387715、BF、C2、ABCR、フィブリン5、VMD2、TLR4、CX3CR1、CST3、MnSOD、MEHE、パラオキソナーゼ、APOE、ELOVL4、およびhemicentin-1において1つ以上の変異および/または多型を含むがどうかを判定するために増幅産物:オリゴヌクレオチドプローブ複合体を解析する。1つ以上の変異または1つ以上の多型の検出は、対象がARMDの遺伝的素因を有することを示唆する。特定の実施例では、1つより多い変異および/または多型(例えば少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、または少なくとも11の変異および/または多型)の存在は、変異または多型を1つだけ持つ対象よりも、対象がARMDを発症するリスクが高いことを示唆する。
【００１３】
開示される方法は、ARMD発症おの総合的な遺伝的リスクを正確に評価することができ、これにより、例えば、遺伝的感受性の影響を最小限にし、視力を温存する環境的、食事的、および将来の薬学的様式を提供することにより、ARMDの減少、または回避をもたらす。本願に示す結果は、ARMDに関連する少なくとも11の分子に関する一連の遺伝子検査を同時に行うことが、ARMD、またはその発症に対する素因の検出に使用された場合、90倍以上の陽性適中率を上昇させることを示す。従って、ARMD療法を選択する方法が開示され、これには、本願で開示される方法を用いて、対象の少なくとも1つのARMD関連分子における変異(例えば1つ以上の置換、欠失、または挿入)や、統計学的に有意な数のARMD関連分子を検出する工程と、そのような変異および/または多型が特定された場合に、ARMDを治療するために遺伝的感受性の影響を最小限にする(例えば、ARMDを回避する、ARMDの発症を遅らせる、またはその転帰を最小限にする)ための、治療的なアプローチ(例えば、環境的、食事的、将来的な薬学的様式を組み合わせたもの)を選択する工程を含む。
【００１４】
ARMD遺伝的感受性、例えば、総合的なARMD遺伝的感受性に関する迅速で、費用効率の高い複数の遺伝子検査が可能なアレイもまた開示される。一部の実施例におけるそのようなアレイは、CFH、LOC387715、BF、C2、ABCR、フィブリン5、VMD2、TLR4、CX3CR1、CST3、MnSOD、MEHE、パラオキソナーゼ、APOE、ELOVL4、およびhemicentin-1の野生型または変異配列、または両方の少なくとも10、例えば、25の連続ヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドを含む。対象におけるARMDに対する遺伝的素因を検出するための、そのようなアレイを含むキットもまた開示される。
【００１５】
本開示の、前述の、およびその他の特徴や利点は、以下の複数の態様の詳細な説明から明らかになるであろう。
【００１６】
配列表
本開示の方法において有用な核酸配列を下記に記載する。実際のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は当技術分野で既知である。下記に示されるアクセッションNo.は、本開示の方法において利用可能な配列の例である。
【００１７】
SEQ ID NO:1〜210は、CFH、LOC387715、BF、C2、ABCR、フィブリン5、VMD2、TLR4、CX3CR1、CST3、MnSOD、MEHE、パラオキソナーゼ、APOE、ELOVL4、およびhemicentin-1の存在を検出するのに利用可能な、典型的な核酸プローブである。
【００１８】
いくつかの態様の詳細な説明
I. はじめに
加齢黄斑変性は老人の失明の主な原因であるが、本疾患が診断された時点で利用できる治療は現在のところ存在しない。故に、ARMDを発症するリスクが高い個体を、彼らに症状が現れる前、または重篤な症状を示す前に特定するのが遺伝的感受性の影響を最小限にし、視力を温存するために、治療的なアプローチ(例えば、環境的、食事的、および将来の薬理学的様式を組み合わせたもの)を提供する上で重要である。
【００１９】
開示されるMERT-ARMD法およびオリゴヌクレオチドマイクロアレイは、ARMD感受性に関連する、現在知られている全ての遺伝子欠損の同時スクリーニングによる、非常に正確なARMDの予測を提供する。
【００２０】
II. 略語および用語
ABC                 アデノシン三リン酸結合カセット
Apo E               アポリポタンパク質E
ARMD                加齢黄斑変性
BF                  補体因子B
bp                  塩基対
C2                  補体成分C2
CFH                 補体因子H
CST3                シスタチンC
ELOVL4              超長鎖脂肪酸伸長4
FBLN5               フィブリン5
MEHE                ミクロソームエポキシド加水分解酵素
MERT-ARMD           加齢黄斑変性の識別および検査のための発展した方法
MnSOD               マンガンスーパーオキシドジスムターゼ
SNP                 一塩基変異多型
TRL4                トール様受容体4
VMD2                卵黄様黄斑変性遺伝子2
【００２１】
以下の用語と方法の説明は、本開示を詳細に説明するため、また当業者が本開示を実施する上での指針とするために提供される。単数形の「ある」および「その」は、文脈がそうでないと明示しない限りは、1つまたは複数を意味する。例えば、用語「ある核酸を含む」には、単一のまたは複数の核酸が含まれ、「少なくとも1つの核酸を含む」という表現と同義であると考えられる。用語「または」は、文脈がそうでないと明示しない限りは、記載された代替要素の単一の要素、または2つ以上の要素の組み合わせを意味する。本願で用いる場合、「含む」は、「含包する」を意味する。故に、「AまたはBを含む」は、「A、B、またはAおよびBを含包する」を意味し、追加の要素を除外しない。例えば、表現「変異または多型」または「1つ以上の変異または多型」は、ある変異、ある多型、またはそれらの組み合わせを意味し、「ある」は1つより多くを意味することができる。
【００２２】
別途説明されない限りは、本明細書で用いる全ての技術的および科学的用語は、本開示が属する当業者が通常理解するものと同一の意味を持つ。本開示の実施または検査において、本明細書で用いられるものと類似または同等の方法と材料を用いてもよいが、適切な方法と材料を下記で説明する。材料、方法、および実施例は一例に過ぎず、限定することを意図するものではない。
【００２３】
ABCR:
ABCRタンパク質は、アデノシン三リン酸結合カセット(ABC)トランスポータースーパーファミリーのメンバーであり、脂質、疎水性薬物、およびペプチドの運搬に関与している。特に、視細胞外節の円板からレチナールおよび/またはレチナール-リン脂質複合体を細胞質に運搬し、光情報伝達を促進すると考えられている。ABCRはABCA4としても知られる。
【００２４】
用語ABCRには、いかなる生物からのABCR遺伝子、cDNA、mRNA、またはタンパク質も含まれ、これがABCRであり、ARMDの発症に関与している。
【００２５】
ABCRの核酸配列は公表されている。例えば、GenBankアクセッションNo:NM_00350およびNM_007378が典型的なABCR核酸配列を開示している。
【００２６】
一実施例では、ABCRは、野生型(または天然)完全長配列だけでなく、ARMDの形成に関与する能力を持つ、ABCR対立遺伝子多型、フラグメント、ホモログ、または融合配列を含む。ある例では、ABCRは、ABCRに対して少なくとも80％の配列同一性、例えば、少なくとも85％、90％、95％または98％の配列同一性を持つ。他の実施例では、ABCRは、非常に高ストリンジェントな条件下で、GenBankアクセッションNo.NM_00350およびNM_007378において示される配列とハイブリダイズする配列を持ち、ABCR活性(例えば、ARMDの発症に関与する能力)を保持する。
【００２７】
アフリカ人:
アフリカの黒人人種グループのどれかに起源を持つ人々を含むヒトの人種区分。一部の実施例では、アフリカ先住民、または居住者の浅黒い肌の人々、加えてアフリカ人の血統の人々、例えば、アフリカ系アメリカ人を含み、そのような人々はまた、アフリカ先住民、または居住者と、かなりの遺伝的類似性を持つ。特定の実施例では、あるアフリカ人は少なくとも1/64のアフリカ人である。
【００２８】
加齢黄斑変性(ARMD):
黄斑部の感光性細胞が正常に機能せず、時間と共に機能が停止する医学的状態である。黄斑変性では、最終の状態は、中心の、認識部の視野の喪失または低下をもたらす。外層の、視覚の周辺部の機能は損なわれない。ARMDはさらに、「萎縮型」または非滲出型と、滲出型とに分けられる。症例の85〜90％は、「萎縮型」黄斑変性に分類され、ドルーゼンとして知られる脂肪組織が網膜裏側に徐々に形成される。症例の10〜15％は、網膜下の異常血管の成長を伴う。これらの症例は、網膜の裏側から血液や他の液体が眼球へ漏出することから「滲出型」黄斑変性と呼ばれる。滲出型黄斑変性は萎縮型として始まることが多い。治療を受けずに進行が許されれば、黄斑を完全に破壊する。滲出型黄斑変性の、医学的治療、光線力学療法、レーザー光凝固術、およびレーザー治療が可能である。
【００２９】
ARMDの危険因子には、加齢、喫煙、家族歴、太陽光、特に青色光への曝露、高血圧、心臓血管系危険因子、例えば、高コレステロールおよび肥満、脂肪の過剰摂取、酸化ストレス、および人種が含まれる。
【００３０】
加齢黄斑変性関連(関係)分子:
ARMDの発症に関与する分子。そのような分子には、例えば核酸(例えば、DNA、cDNA、またはmRNA)やタンパク質が含まれる。例えば、表1Aと1Bに記載されるもの、加えてARMDに対する個体の感受性を増大させる原因となる変異(1つまたは複数)を含む、完全長遺伝子またはcDNAのフラグメント、ならびにそれによりコード化されるタンパク質やタンパク質フラグメントがある。
【００３１】
ARMD関連分子は、原因となるもの(ARMD関連分子中のある変化がARMDの発症、またはARMDへの進行をもたらす)または結果として生じるもの(ARMDの発症または進行がARMD関連分子中のある変化の原因になる、またはある変化をもたらす)を含む、様々な方式で、ARMDに関与する、またはARMDによって影響を受ける。
【００３２】
対立遺伝子:
ある遺伝子の多型変異体。
【００３３】
核酸分子の増幅:
ある核酸分子、例えば、ある遺伝子またはある遺伝子のフラグメント、例としては、加齢黄斑変性(ARMD)関連遺伝子のある領域のコピーの数を増加させること。結果として得られる増幅された産物は、増幅産物と呼ばれる。
【００３４】
インビトロでの増幅の例は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)であり、ある対象から得られた生体サンプルを、サンプル中のある核酸分子へのプライマーのハイブリダイゼーションを促すような条件下で、一対のオリゴヌクレオチドプライマーに接触させる。核酸分子のコピーの数を増幅するために、プライマーは適切な条件下で伸長し、テンプレートから分離し、その後再びアニーリングが起こり、伸長し、分離する。インビトロでの増幅技術の他の例には、定量的リアルタイムPCR、SDA法(米国特許第5,744,311号参照)、非転写等温増幅(米国特許第6,033,881号参照)、修復連鎖反応増幅(WO90/01069参照)、リガーゼ連鎖反応増幅(欧州特許出願第320 308号参照)、ギャップフィリングリガーゼ連鎖反応増幅(米国特許第5,427,930号参照)、結合リガーゼ検出およびPCR(米国特許第6,027,889号参照)、ならびにNASBA(商標)RNA非転写増幅(米国特許第6,025,134号参照)が含まれる。
【００３５】
アポリポタンパク質E(Apo E):
アポリポタンパク質は、アポタンパク質のクラスであり、機能するために他の小分子、すなわち共同因子の存在に依存するタンパク質である。故に、アポリポタンパク質は、リポタンパク質の構成成分であるタンパク質であり、これはまた、リン脂質、トリアシルグリセロール、コレステロール、およびコレステロールエステルから構成される。5つの主要な種類のアポリポタンパク質が存在する:A、B、C、D、E。
【００３６】
Apo Eタンパク質は、299アミノ酸長のカイロミクロンのコアアポタンパク質であり、リポタンパク質、脂溶性ビタミン、コレステロールをリンパ系中に、その後血液中にに運搬する。
【００３７】
Apo Eタンパク質をコードするApo E遺伝子は第19番染色体上に位置し、合計3597塩基対の4つのエクソンと3つのイントロンから成る。遺伝子は多型性で、Apo E-3、Apo E-2、Apo E-4の3つの主要な対立遺伝子があり、これらは3つのアイソフォームのタンパク質に翻訳される:E3(正常)、E2およびE4(機能不全)。これらのアイソフォームの違いは、112と158の位置での単一のアミノ酸置換でしかないが、重大な生理学的影響を持つ。
【００３８】
用語Apo Eは、いかなる生物からのApo E遺伝子、cDNA、mRNA、またはタンパク質をも含み、これがApo Eであり、ARMDの発症に関与している。Apo Eの核酸配列は公表されている。例えば、GenBankアクセッションNo:NM_000041、NM_009696、およびNM_138828が典型的なApo E核酸配列を開示している。
【００３９】
一実施例では、Apo Eは、野生型(または天然)完全長配列だけでなく、Apo Eの形成に関与する能力を保持するApo E対立遺伝子多型、フラグメント、ホモログ、または融合配列を含む。ある例では、Apo Eは、Apo Eに対して少なくとも80％の配列同一性、例えば、少なくとも85％、90％、95％または98％の配列同一性を持つ。他の実施例では、Apo Eは、非常に高ストリンジェントな条件下で、GenBankアクセッションNo:NM_000041、NM_009696およびNM_138828で示される配列とハイブリダイズする配列を持ち、Apo E活性(例えば、ARMDの発症に関与する能力)を保持する。
【００４０】
アレイ:
ある基板上、またはその内部の位置が特定可能な場所における、分子、例えば、生体高分子(例えば、ポリペプチドまたは核酸)または生体サンプル(例えば、組織切片)の配列。「マイクロアレイ」は、評価または解析用のために、顕微鏡検査を必要とする、または顕微鏡検査による支援のために微小化されたアレイである。アレイは時にDNAチップまたはバイオチップと呼ばれる。
【００４１】
分子のアレイ(「フィーチャー」)は、サンプルに関する非常に多数の解析を一度に実施できるようにする。特定の例のアレイでは、1つ以上の分子(例えば、あるオリゴヌクレオチドプローブ)は、例えばインターナルコントロールを提供するために、そのアレイ上に複数回(例えば、二回)登場する。アレイ上の位置の同定が可能な場所の数は、例えば、少数(例えば、3つ)から少なくとも50、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも1000、少なくとも10,000、またはそれ以上まで変化しうる。特定の実施例では、あるアレイは、核酸分子、例えば、長さが少なくとも15ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド配列、例えば長さが約15〜40ヌクレオチド、例えば長さが少なくとも18ヌクレオチド、長さが少なくとも21ヌクレオチド、または長さがさらに少なくとも25ヌクレオチドの核酸分子を含む。一実施例では、分子は、それらの5'末端または3'末端を介してアレイに結合するオリゴヌクレオチドを含む。
【００４２】
特定の実施例では、あるアレイは、SEQ ID NO:1〜210からの配列、またはそれらのサブセット、例えば、SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、および209(野生型ARMD関連配列を検出するため)、またはSEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、および210(変異型ARMD関連配列を検出するため)だけでなく、SEQ ID NO:1〜210中に示される配列の少なくとも20、SEQ ID NO:1〜210に示される配列の例えば少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100を含む。
【００４３】
アレイ内では、アレイされた各サンプルは、その場所をそのアレイの少なくとも2つの面の内部で、常に確実にその場所を決定できることから、位置の同定が可能である。あるアレイ上のフィーチャーアプリケーションの場所は、異なる形状をとることが可能である。例えば、アレイは規則的な配列(例えば、一定の横列と縦列に配置される)または不規則な配列であってもよい。故に、規則的な配列のアレイでは、サンプルがアレイに添加される時点で、各サンプルの場所はそのサンプルに割り当てられており、適切な標的またはフィーチャーの位置とそれぞれの場所を相関させるためにキーが提供されてもよい。多くの場合、規則的な配列のアレイは、左右対称のグリッドパターンに配置されるが、他のパターン(例えば、放射状ライン、渦巻きライン、または規則的な配列の一団)に配置することも可能である。位置の同定が可能なアレイは、アレイ上の特定のアドレスをその位置のサンプルに関する情報(例えば、シグナル強度を含む、ハイブリダイゼーションまたは結合データ)と相関させるようにコンピュータをプログラムできるため、通常はコンピュータによる読み取りが可能である。コンピュータによる読み取りが可能なフォーマットの一部の例では、アレイの個々のフィーチャーは規則的、例えばデカルト格子パターンに配置され、これはコンピュータによってアドレス情報と相関させることができる。
【００４４】
本明細書ではタンパク質ベースのアレイも企図され、この場合プローブ分子はタンパク質である、またはタンパク質を含む、あるいは標的分子はタンパク質である、またはタンパク質を含み、アレイはタンパク質/ペプチドが結合する、またはその逆の核酸を含む。
【００４５】
アジア人:
極東、東南アジア、インド亜大陸、または太平洋諸島の人々のどれかに起源を持つ人々を含むヒトの人種区分。この地域には、例えば中国、インド、日本、韓国、フィリピン諸島、サモア諸島が含まれる。特定の実施例では、アジア人には、アジア人の血統の人々、例えば、アジア系アメリカ人が含まれ、彼らは、アジアの先住民、または居住者と、かなりの遺伝的類似性を持つ。特定の実施例では、あるアジア人は少なくとも1/64のアジア人である。
【００４６】
結合または安定的結合:
2つの物質または分子間の結びつき、例えば、1つの核酸分子の別のもの(またはそれ自体)へのハイブリダイゼーションである。十分な量のオリゴヌクレオチド分子が塩基対を形成する、またはその標的核酸分子にハイブリダイズされる場合、その結合の検出を可能にするために、あるオリゴヌクレオチド分子は、標的核酸分子に結合または安定的に結合する。例えば、標的オリゴヌクレオチド複合体の物理的または機能的特性によって、当業者に既知のどの方法を用いても結合を検出できる。例えば、結合が、例えば、遺伝子の発現、DNA複製、転写、翻訳などの生合成過程の際に、観察可能な効果を持つかどうかを判定することによって、結合を機能的に検出できる。
【００４７】
核酸分子の相補鎖の結合を物理的に検出する方法には、DNase Iまたはケミカルフットプリント法、ゲルシフトおよびアフィニティー切断アッセイ、ノーザンブロット法、ドットブロット法、および吸光度検出法などの方法が含まれるが、これに限定されない。例えば、一方法は、あるオリゴヌクレオチド(または類似体)と標的核酸を含む、ある溶液の吸光度の220〜300nmでの変化を、温度を徐々に上げながら観察する工程を含む。オリゴヌクレオチドまたは類似体がその標的物に結合していたら、オリゴヌクレオチド(または類似体)と標的物質がお互いから分離、または溶出する特性温度において急激な吸光度の上昇が見られる。別の実施例では、方法は、一方または両方の相補鎖上に存在するシグナル、例えば、検出可能な標識を検出する工程を含む。
【００４８】
あるオリゴマーとその標的核酸間の結合は、そのオリゴマーの50％がその標的物質から溶出する温度(Tm)によってしばしば特徴付けられる。(Tm)が高いということは、低い(Tm)を持つ複合体に比べてより強固なまたはより安定した複合体を意味する。
【００４９】
白色人種:
ヨーロッパ、北アフリカ、または中東の人々のどれかに起源を持つ人々を含む、身体特性、例えば、非常白い肌から褐色の皮膚色素沈着や、ストレートからからウェーブ状またはカールした髪によって伝統的に区別される、ヒトの人種区分。一般に、「白人」という言葉は、北アメリカにおいて「白色人種」と同義として用いられる。そのような人々はまた、ヨーロッパ、北アフリカ、または中東の先住民、または居住者とかなりの遺伝的類似性を持つ。特定の実施例では、ある白色人種は少なくとも1/64の白色人種である。
【００５０】
相補性と相補性の割合:
相補核酸を持つ分子は、鎖が互いに結合する(ハイブリダイズ)時、ワトソン-クリック型、フーグスティーン型、または逆フーグスティーン型塩基対を作ることによって、安定した二重らせんまたは三重らせんを作る。所要の条件下で、あるオリゴヌクレオチド分子が標的核酸配列に検出可能に結合したままの状態の時、安定した結合が起こる。
【００５１】
相補性は、1つの核酸らせんの塩基が、第二の核酸らせんの塩基と塩基対を形成する程度である。相補性はこれまで比率で表されてきた、すなわち2つの鎖の間、または2つの鎖のある特定の領域またはドメイン内で塩基対を作るヌクレオチドの割合である。例えば、15ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドの10ヌクレオチドが、あるDNA分子の標的領域と塩基対を作る場合、そのオリゴヌクレオチドは、標的DNAの領域に対して66.67％の相補性を持つと表される。
【００５２】
本開示では、「十分な相補性」は、オリゴヌクレオチド分子と標的核酸配列(例えば、CFH、LOC387715、BF、C2、ABCR、フィブリン5、VMD2、TLR4、CX3CR1、CST3、MnSOD、MEHE、パラオキソナーゼ、APOE、ELOVL4、hemicentin-1、GPR75、LAMC1、LAMC2、およびLAMB3)間に、検出可能な結合を達成するのに十分な数の塩基対が存在することを意味する。形成された塩基対の比率によって表される、または測定されるとき、この目的を果たす相補性の割合は、少なければ約50％の相補性から完全な(100％)相補性まで変化しうる。通常は、十分な相補性は、少なくとも約50％、例えば、少なくとも約75％の相補性、少なくとも約90％の相補性、少なくとも約95％の相補性、少なくとも約98％の相補性、またはさらには少なくとも約100％の相補性(例えば表1Aに記載の遺伝子の標的核酸配列に対する少なくとも約50％、例えば、少なくとも約75％の相補性、少なくとも約90％の相補性、少なくとも約95％の相補性、少なくとも約98％の相補性、またはさらには少なくとも約100％の相補性)である。
【００５３】
所望の条件下で使用するための適切なオリゴヌクレオチドを、当業者がデザインできるようにする、結合条件の確立に関与する定性的および定量的検討材料の完全な取り扱いは、BeltzらのMethods Enzymol 100: 266-285, 1983、およびSambrookらの(編)、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、2nd ed., vol.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989によって提供される。
【００５４】
補体因子H(CFH):
代替となる補体活性化経路の機能を制御し、第I因子(C3b不活性化因子)とともに共同因子としてふるまう血清糖タンパク質。補体因子Hは、C3転換酵素、例えば、C4b2aの活性を調節する。ベータ-1Hとしても知られる。
【００５５】
用語CFHは、いかなる生物からのCFH遺伝子、cDNA、mRNA、またはタンパク質をも含み、これがCFHであり、ARMDの発症に関与している。
【００５６】
CFHの核酸配列は公表されている。例えば、GenBankアクセッションNo:DQ_233256とBC012610は、典型的なCFH核酸配列を開示している。
【００５７】
一実施例では、CFHは、野生型(または天然)完全長配列だけでなく、CFHの形成に関与する能力を保持する、CFH対立遺伝子多型、フラグメント、ホモログ、または融合配列を含む。ある例では、CFHは、CFHに対して少なくとも80％の配列同一性、例えば、少なくとも85％、90％、95％または98％の配列同一性を持つ。他の実施例では、CFHは、非常に高ストリンジェントな条件下でGenBankアクセッションNo.:DQ_233256とBC012610に示される配列とハイブリダイズする配列を持ち、CFH活性(例えば、ARMDの発症に関与する能力)を保持する。
【００５８】
補体因子B(BF):
代替となる補体活性化経路の機能に関与するセリンプロテアーゼ。C3bとともに活性化C3転換酵素を作成する補体因子複合体。
【００５９】
用語BFは、いかなる生物からのBF遺伝子、cDNA、mRNA、またはタンパク質をも含み、これがBFであり、ARMDの発症に関与している。
【００６０】
BFの核酸配列は公表されている。例えば、GenBankアクセッションNo:NM_001710、NM_008198やBC087084は、典型的なBF核酸配列を開示する。
【００６１】
一実施例では、BFは、野生型(または天然)完全長配列だけでなく、BFの形成に関与する能力を保持する、BF対立遺伝子多型、フラグメント、ホモログ、または融合配列を含む。ある例では、BFは、BFに対して少なくとも80％の配列同一性、例えば、少なくとも85％、90％、95％または98％の配列同一性を持つ。他の実施例では、BFは、非常に高ストリンジェントな条件下で、GenBankアクセッションNo.:NM_001710、NM_008198、およびBC087084で示される配列とハイブリダイズするある配列を持ち、BF活性(例えば、ARMDの発症に関与する能力)を保持する。
【００６２】
補体成分C2(C2):
古典的補体活性化経路の一部であるタンパク質。補体成分C2は、C3とC5の活性化に関与する。
【００６３】
用語C2は、いかなる生物からのC2遺伝子、cDNA、mRNA、またはタンパク質をも含み、これがC2でありであり、ARMDの発症に関与している。
【００６４】
C2の核酸配列は公表されている。例えば、GenBankアクセッションNo:NM_000063やNM_013484は典型的なC2核酸配列を開示する。
【００６５】
一実施例では、C2は、野生型(または天然)完全長配列だけでなく、C2の形成に関与する能力を保持する、C2対立遺伝子多型、フラグメント、ホモログ、または融合配列を含む。ある例では、C2は、C2に対して少なくとも80％の配列同一性、例えば、少なくとも85％、90％、95％または98％の配列同一性を持つ。他の実施例では、C2は、非常に高ストリンジェントな条件下で、GenBankアクセッションNo.:NM_000063やNM_013484に示される配列とハイブリダイズするある配列を持ち、C2活性(例えば、ARMDの発症に関与する能力)を保持する。
【００６６】
シスタチンC(CST3):
腎臓によって血液からろ過され、腎機能の指標としての役割を果たす血清タンパク質。シスタチンCは、身体中の全てのタイプの有核細胞によって絶えず産生される。分子量が小さいため、腎臓内で糸球体膜によって自由にろ過される。この物質の血中濃度は糸球体ろ過率と相関する。シスタチンCの濃度は、体重や身長、筋肉量、年齢(1歳を過ぎると)、性別とは無関係である。単一の無作為サンプルで測定を行い解釈が可能である。シスタチンCは、腎機能の測定に最も多く用いられていたクレアチニンよりも糸球体ろ過率、故に腎機能のマーカーとして優れている。
【００６７】
用語シスタチンCは、いかなる生物からのシスタチンC遺伝子、cDNA、mRNA、またはタンパク質をも含み、これがシスタチンCであり、ARMDの発症に関与している。
【００６８】
シスタチンCの核酸配列は公表されている。例えば、GenBankアクセッションNo:NM_000099やNM_009976は、典型的なシスタチンC核酸配列を開示する。
【００６９】
一実施例では、シスタチンCは、野生型(または天然)完全長配列だけでなく、シスタチンCの形成に関与する能力を保持する、シスタチンC対立遺伝子多型、フラグメント、ホモログ、または融合配列を含む。ある例では、シスタチンCは、シスタチンCに対して少なくとも80％の配列同一性、例えば、少なくとも85％、90％、95％または98％の配列同一性を持つ。他の実施例では、シスタチンCは、非常に高ストリンジェントな条件下で、GenBankアクセッションNo:NM_000099やNM_009976に示される配列とハイブリダイズするある配列を持ち、シスタチンC活性(例えば、ARMDの発症に関与する能力)を保持する。
【００７０】
CX3CR1:
リンパ球の移動と接着に関与し、網膜およびRPE細胞に発現するフラクタルカインの接着および移動機能の両方を仲介する、7回膜貫通型高親和性受容体。
【００７１】
用語CX3CR1は、いかなる生物からのCX3CR1遺伝子、cDNA、mRNA、またはタンパク質をも含み、これがCX3CR1であり、ARMDの発症に関与している。
【００７２】
CX3CR1の核酸配列は公表されている。例えば、GenBankアクセッションNo:NM_001337やNM_009987は、典型的なCX3CR1核酸配列を開示する。
【００７３】
一実施例では、CX3CR1は、野生型(または天然)完全長配列だけでなく、CX3CR1の形成に関与する能力を保持するCX3CR1対立遺伝子多型、フラグメント、ホモログ、または融合配列を含む。ある例では、CX3CR1は、CX3CR1に対して少なくとも80％の配列同一性、例えば、少なくとも85％、90％、95％または98％の配列同一性を持つ。他の実施例では、CX3CR1は、非常に高ストリンジェントな条件下で、GenBankアクセッションNo.:NM_001337やNM_009987に示される配列とハイブリダイズするある配列を持ち、CX3CR1活性(例えば、ARMDの発症に関与する能力)を保持する。
【００７４】
DNA(デオキシリボ核酸):
大多数の生物の遺伝物質を含む(一部のウイルスは、リボ核酸(RNA)を含む遺伝子を持つ)長鎖ポリマー。DNAポリマーの繰り返し単位は、4つの異なるヌクレオチドであり、それらは、リン酸基が結合しているデオキシリボース糖に結合する、4つの塩基、アデニン、グアニン、シトシン、チミンのうちの1つをそれぞれ含む。DNA分子中の、コドンと呼ばれるヌクレオチドのトリプレットは、ポリペプチド中のアミノ酸をコードする。用語コドンは、DNA配列が転写されるmRNA中の3つのヌクレオチドの対応(および相補)配列にも用いられる。
【００７５】
欠失:
核酸配列からの1つ以上のヌクレオチド(またはタンパク質配列からの1つ以上のアミノ酸)の欠如であり、欠如した配列の両側の領域はつながっている。
【００７６】
ELOVL4:
超長鎖脂肪酸の伸長に関与する光受容細胞特異性因子。
【００７７】
用語ELOVL4は、いかなる生物からのELOVL4遺伝子、cDNA、mRNA、またはタンパク質をも含み、これがELOVL4であり、ARMDの発症に関与している。
【００７８】
ELOVL4の核酸配列は公表されている。例えば、GenBankアクセッションNo:AF279654、AF277093、およびAY037298は、典型的なELOVL4核酸配列を開示する。
【００７９】
一実施例では、ELOVL4は、野生型(または天然)完全長配列だけでなく、ELOVL4の形成に関与する能力を保持するELOVL4対立遺伝子多型、フラグメント、ホモログ、または融合配列を含む。ある例では、ELOVL4は、ELOVL4に対して少なくとも80％の配列同一性、例えば、少なくとも85％、90％、95％または98％の配列同一性を持つ。他の実施例では、ELOVL4は、非常に高ストリンジェントな条件下で、GenBankアクセッションNo.:AF279654、AF277093、およびAY037298に示される配列とハイブリダイズする配列を持ち、ELOVL4活性(例えば、ARMDの発症に関与する能力)を保持する。
【００８０】
フィブリン5(FBLN5):
血管の基底膜に発現する細胞外タンパク質のファミリーに属するタンパク質。フィブリン5は、エラスチンの重合において重要な可能性がある。フィブリン5をコードする遺伝子である、FBLN5のミスセンス変異体は、加齢黄斑変性(ARMD)症例の1〜2％関与するようである。FBLN5は第14番染色体上の14q32.1に位置する。
【００８１】
用語FBLN5は、いかなる生物からのFBLN5遺伝子、cDNA、mRNA、またはタンパク質をも含み、これがFBLN5であり、ARMDの発症に関与している。
【００８２】
FBLN5の核酸配列は公表されている。例えば、GenBankアクセッションNo:NM_006329やNM_011812は、典型的なFBLN5核酸配列を開示する。
【００８３】
一実施例では、FBLN5は、野生型(または天然)完全長配列だけでなく、FBLN5の形成に関与する能力を保持するFBLN5対立遺伝子多型、フラグメント、ホモログ、または融合配列を含む。ある例では、FBLN5は、FBLN5に対して少なくとも80％の配列同一性、例えば、少なくとも85％、90％、95％または98％の配列同一性を持つ。他の実施例では、FBLN5は、非常に高ストリンジェントな条件下で、GenBankアクセッションNo:NM_006329、およびNM_011812に示される配列とハイブリダイズする配列を持ち、FBLN5活性(例えば、ARMDの発症に関与する能力)を保持する。
【００８４】
遺伝的素因:
遺伝的疾患、例えば、ARMDに対する対象の感受性。しかし、そのような感受性を持つことは、その疾患を実際の発症をもたらす可能性もあるし、もたらさない可能性もある。
【００８５】
遺伝子型:
ある個体の特定の遺伝的構造、DNAの形である。
【００８６】
Hemicentin-1:
一連の予想されるカルシウム結合上皮成長因子様(cbEGF)ドメインを含むタンパク質をコードし、単一の非典型的なEGF様ドメインを、そのカルボキシ末端に持っている。Hemicentin-1は、保存細胞外マトリックスタンパク質であり、48の免疫グロブリンの縦列反復を持ち、新規の末端ドメインにつながる。Hemicentin-1はフィブリン6としても知られる。Hemicentin-1は、骨格筋および性腺リーダー細胞から分泌され、hemicentinは特定の部位で繊細な線状に集合しており、その場所では細胞接着の幅広い領域が線状の領域を形成している。いくつかの線状構造は、ヘミデスモソームを覆っている表皮中に形成している。Hemicentin線状構造は、表皮への機械的感覚神経細胞の固定、上皮基底膜に沿った生殖腺の形成の移動、生殖細胞の細胞配列を形成を促進する(VogelおよびHedgecock, Development 128(6):883-894, 2001)。
【００８７】
用語hemicentin-1は、いかなる生物からのhemicentin-1遺伝子、cDNA、mRNA、またはタンパク質をも含み、これがhemicentin-1であり、ARMDの発症に関与している。
【００８８】
hemicentin-1の核酸配列は公表されている。例えば、GenBankアクセッションNo:NM_031935、BC016539は、典型的なhemicentin-1核酸配列を開示する。
【００８９】
一実施例では、hemicentin-1は、野生型(または天然)完全長配列だけでなく、hemicentin-1の形成に関与する能力を保持する、hemicentin-1対立遺伝子多型、フラグメント、ホモログ、または融合配列を含む。ある例では、hemicentin-1は、hemicentin-1に対して少なくとも80％の配列同一性、例えば、少なくとも85％、90％、95％または98％の配列同一性を持つ。他の実施例では、hemicentin-1は、非常に高ストリンジェントな条件下で、GenBankアクセッションNo.:NM_001337、BC016539に示される配列とハイブリダイズする配列を持ち、hemicentin-1活性(例えば、ARMDの発症に関与する能力)を保持する。
【００９０】
ヒトGタンパク質共役受容体75(GPR75)遺伝子:
Gタンパク質共役型受容体ファミリーのメンバー。GPRは、リガンドの結合の際に、グアニン-ヌクレオチド結合タンパク質を活性化する細胞表面受容体である。
【００９１】
用語GPR75は、いかなる生物からのGPR75遺伝子、cDNA、mRNA、またはタンパク質をも含み、これがGPR75であり、ARMDの発症に関与している。
【００９２】
GPR75の核酸配列は公表されている。例えば、GenBankアクセッションNo:NM_006794やNM_175490は、典型的なGPR75核酸配列を開示する。
【００９３】
一実施例では、GPR75は、野生型(または天然)完全長配列だけでなく、GPR75の形成に関与する能力を保持する、GPR75対立遺伝子多型、フラグメント、ホモログ、または融合配列を含む。ある例では、GPR75は、GPR75に対して少なくとも80％の配列同一性、例えば、少なくとも85％、90％、95％または98％の配列同一性を持つ。他の実施例では、GPR75は、非常に高ストリンジェントな条件下で、GenBankアクセッションNo.:NM_001337やNM_175490に示される配列とハイブリダイズする配列を持ち、GPR75活性(例えば、ARMDの発症に関与する能力)を保持する。
【００９４】
ハイブリダイゼーション:
DNAの二重らせん、RNA、またはDNAとRNAの間の相補領域間に塩基対を形成し、これにより二本鎖の分子を形成すること。特定の程度のストリンジェンシーをもたらすハイブリダイゼーションの条件は、ハイブリダイゼーションの方法やハイブリダイズする核酸配列の構成や長さに応じて変わる。通常は、ハイブリダイゼーションの温度とハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度(例えば、Na＋の濃度)によって、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーが決定する。特定の程度のストリンジェンシーを得るためのハイブリダイゼーション条件に関する計算は、Sambrookら(1989)のMolecular Cloning、第二版、Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY(第9章および11章)で考察されている。以下は、ハイブリダイゼーション条件の典型的なセットであるが、限定されない。
【００９５】
非常に高ストリンジェント(少なくとも90％の同一性を共有する配列を検出する)
ハイブリダイゼーション:5×SSC、65℃で16時間
洗浄(2回): 0.5×SSC、65℃でそれぞれ20分間
洗浄(2回): 0.1×〜0.2×SSC、室温(RT)から65℃でそれぞれ15分間
【００９６】
高ストリンジェント(少なくとも80％の同一性を共有する配列を検出)
ハイブリダイゼーション: 5×〜6×SSC、65℃〜70℃で16〜20時間
洗浄(2回): 1×SSC、55℃〜70℃でそれぞれ30分間
洗浄(2回): 0.5×SSCまたは0.5％SSCと0.5％SDSで、RTから65℃でそれぞれ5〜20分間
【００９７】
低ストリンジェント(少なくとも50％の同一性を共有する配列を検出)
ハイブリダイゼーション: 6×SSC、RTから65℃で16〜20時間
洗浄(少なくとも二回): 2×〜4×SSCまたは2×SSCと0.5％SDSで、RTから65℃でそれぞれ15〜30分間。
【００９８】
挿入:
1つ以上のヌクレオチドのある核酸配列への追加、あるいは1つ以上のアミノ酸のあるタンパク質配列への追加。
【００９９】
単離された:
ある「単離された」生物学的要素(例えば、ある核酸分子、タンパク質、または細胞小器官)は、要素が自然に発生する、生物の細胞中の他の生物学的要素、例えば、他の染色体および染色体外DNAやRNA、タンパク質、ならびに細胞小器官から実質的に分離された、または精製されている。「単離された」核酸分子やタンパク質には、標準的な精製方法で精製された核酸分子やタンパク質が含まれる。用語はまた、宿主細胞内で組み換え発現によって作成された核酸分子やタンパク質だけでなく、化学的に合成された核酸分子やタンパク質も含包する。
【０１００】
標識:
例えば、ELISA、分光偏光法、フローサイトメトリー、または顕微鏡によって検出可能な物質。例えば、ある核酸分子(例えば、表1Aに記載した遺伝子のうちの1つに特異的なあるプローブ、例えば、表1Bに記載したSEQ ID NO:1〜210に記載したもの、あるいは増幅産物)にある標識を結合させ、これによりその核酸分子の検出が可能にある。標識の例には、放射性同位元素、酵素基質、コファクター、リガンド、化学発光物質、蛍光プローブ、ハプテン、酵素、およびそれらの組み合わせが含まれるがこれに限定されない。標識の方法と、様々な目的に適した標識の選択の手引きは、例えば、Sambrookら(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989)や、Ausubelら(In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, New York, 1998)によって考察されている。
【０１０１】
LAMC1:
細胞外マトリックス糖タンパク質のファミリーであるラミニンは、基底膜の主要な非膠原性成分である。これらは細胞の接着、分化、運動、シグナリング、神経突起伸展、および転移に関わっている。ラミニンは、3本の非同一の鎖、ラミニンα、β、γ(以前はそれぞれA、B1、B2)から構成される。これらは一本の異なる鎖からそれぞれ形成される3本の短腕と、3本すべての鎖から成る長腕で構成される十字架構造を形成する。各ラミニン鎖は、異なる遺伝子によってコードされる多ドメインタンパク質である。各鎖のいくつかのアイソフォームが報告されている。異なるα、β、およびγ鎖異性体の組み合わせによって、異なるヘテロ三量体ラミニンアイソフォームが生じ、これらは発見順にアラビア数字で指定され、例えば、α1β1γ1三量体は、ラミニン1である。異なる鎖と三量体分子の生物学的機能の大部分は解明されていないが、鎖のいくつかは、それらの組織分布について異なることが示されており、恐らくこれはインビボでの多様な機能を反映している。LAMC1遺伝子は、γ鎖アイソフォームラミニン、γ1をコードする。かつてはβ鎖と考えられていたγ1鎖は、β鎖に類似した構造ドメインを有するが、ドメインIとIIを分離する短いα領域を持たない。LAMC1遺伝子の構造的構成もまた、これが、明らかにβ鎖遺伝子から分化したことを示唆する。相同的組み換えによってγ1鎖遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化された、トランスジェニックマウスの胎児では基底膜がなく、これはラミニン、γ1鎖がラミニンヘテロ三量体の形成に必要であることを示唆する。マウスのラミニンγ1cDNAにおける、著しく類似した3'UTR配列との相似から、複数のポリアデニル化部位が、ヒトにおいて、ノーザン解析で認められる2つの異なるサイズのmRNA(5.5と7.5kb)を作成するのに利用されていると推測されている。
【０１０２】
用語LAMC1は、いかなる生物からのLAMC1遺伝子、cDNA、mRNA、またはタンパク質をも含み、これがLAMC1であり、ARMDの発症に関与している。
【０１０３】
LAMC1の核酸配列は公表されている。例えば、GenBankアクセッションNo:NM_002293やNM_010683は、典型的なLAMC1核酸配列を開示する。
【０１０４】
一実施例では、LAMC1は、野生型(または天然)完全長配列だけでなく、LAMC1の形成に関与する能力を保持する、LAMC1対立遺伝子多型、フラグメント、ホモログ、または融合配列を含む。ある例では、LAMC1は、LAMC1に対して少なくとも80％の配列同一性、例えば、少なくとも85％、90％、95％または98％の配列同一性を持つ。他の実施例では、LAMC1は、非常に高ストリンジェントな条件下で、GenBankアクセッションNo.:NM_002293やNM_010683に示される配列とハイブリダイズする配列を持ち、LAMC1活性(例えば、ARMDの発症に関与する能力)を保持する。
【０１０５】
LAMC2:
γ鎖アイソフォームラミニン、γ2をコードする。以前はβ鎖の切断バージョンと考えられていた(B2t)、γ2鎖は、γ1鎖と高い相同性を持つが、ドメインVIはなく、ドメインV、IV、IIIは短い。これは複数の胎生組織において発現されているが、γ1とは異なり、また皮膚、肺、および腎臓の上皮細胞に特異的に局在している。α3 およびβ3鎖とともに、γ2鎖はラミニン5(以前はカリニンとして知られていた)を構成し、これは上皮細胞とその下にある基底膜をつなぐ、固定フィラメントの不可欠な部分である。γ2鎖の上皮特異性発現は、上皮接着分子としてのその役割を示唆し、この遺伝子における変異は、表皮真皮境界部の崩壊による水疱によって特徴付けられる皮膚疾患である、接合部型表皮水疱症に関連がある。3'末端エクソンの選択的スプライシングに起因し、γ2鎖の異なるアイソフォームをコードする2つの転写変異体が説明されている。2つの変異体は、胚組織において異なって発現される。別のポリAシグナルを利用する転写変異体もまた、文献に記載されている。
【０１０６】
用語LAMC2は、いかなる生物からのLAMC2遺伝子、cDNA、mRNA、またはタンパク質をも含み、これがLAMC2であり、ARMDの発症に関与している。
【０１０７】
LAMC2の核酸配列は公表されている。例えば、GenBankアクセッションNo:AH006634やNM_008485は、典型的なLAMC2核酸配列を開示する。
【０１０８】
一実施例では、LAMC2は、野生型(または天然)完全長配列だけでなく、LAMC2の形成に関与する能力を保持する、LAMC2対立遺伝子多型、フラグメント、ホモログ、または融合配列を含む。ある例では、LAMC2は、LAMC2に対して少なくとも80％の配列同一性、例えば、少なくとも85％、90％、95％または98％の配列同一性を持つ。他の実施例では、LAMC2は、非常に高ストリンジェントな条件下で、GenBankアクセッションNo.:AH006634やNM_008485に示される配列とハイブリダイズする配列を持ち、LAMC2活性(例えば、ARMDの発症に関与する能力)を保持する。
【０１０９】
LAMB3:
ラミニンのβ3サブユニットをコードする。ラミニンは、3つのサブユニット(α、β、γ)から成り、基底膜タンパク質のファミリーを意味する。例えば、LAMB3はラミニン-5中のβ鎖として機能する。LAMB3における変異は、各種の表皮水疱症の原因として特定されている。同一のタンパク質をコードする2つの選択的スプライスによる転写変異体がこの遺伝子に関して発見されている。
【０１１０】
用語LAMB3は、いかなる生物からのLAMB3遺伝子、cDNA、mRNA、またはタンパク質をも含み、これがLAMB3であり、ARMDの発症に関与している。
【０１１１】
LAMB3の核酸配列は公表されている。例えば、GenBankアクセッションNo:L25541、U43298やNM_008484は、典型的なLAMB3核酸配列を開示する。
【０１１２】
一実施例では、LAMB3は、野生型(または天然)完全長配列だけでなく、LAMB3の形成に関与する能力を保持する、LAMB3対立遺伝子多型、フラグメント、ホモログ、または融合配列を含む。ある例では、LAMB3は、LAMB3に対して少なくとも80％の配列同一性、例えば、少なくとも85％、90％、95％または98％の配列同一性を持つ。他の実施例では、LAMB3は、非常に高ストリンジェントな条件下で、GenBankアクセッションNo.:L25541、U43298およびNM_008484に示される配列とハイブリダイズする配列を持ち、LAMB3活性(例えば、ARMDの発症に関与する能力)を保持する。
【０１１３】
LOC387715:
未知の生態を持つ、2つのエクソンを持つ遺伝子であり、主に胎盤に発現している107アミノ酸タンパク質をコードし、近年では網膜に弱く発現していることが報告されている(Riveraら、Hum. Mol. Genet. 14: 3227-3236, 2005、Schmidtら、Am. J Hum. Genet. 78: 852-864, 2006)。
【０１１４】
用語LOC387715は、いかなる生物からのLOC387715遺伝子、cDNA、mRNA、またはタンパク質をも含み、これがLOC387715であり、ARMDの発症に関与している。
【０１１５】
LOC387715の核酸配列は公表されている。例えば、GenBankアクセッションNo:NW_924884、NT_030059、XM_001131263、およびXM_001131282は、典型的なLOC387715核酸配列を開示する。
【０１１６】
一実施例では、LOC387715は、野生型(または天然)完全長配列だけでなく、LOC387715の形成に関与する能力を保持する、LOC387715対立遺伝子多型、フラグメント、ホモログ、または融合配列を含む。ある例では、LOC387715は、LOC387715に対して少なくとも80％の配列同一性、例えば、少なくとも85％、90％、95％または98％の配列同一性を持つ。他の実施例では、LOC387715は、非常に高ストリンジェントな条件下で、GenBankアクセッションNo.:NW_924884、NT_030059、XM_001131263、およびXM_001131282に示される配列とハイブリダイズする配列を持ち、LOC387715活性(例えば、ARMDの発症に関与する能力)を保持する。
【０１１７】
マンガンスーパーオキシドジスムターゼ(MnSOD):
スーパーオキシドアニオンの2つの分子の水と過酸化水素への不均化を触媒し、網膜やRPE細胞に発現している。
【０１１８】
用語MnSODは、いかなる生物からのMnSOD遺伝子、cDNA、mRNA、またはタンパク質をも含み、これがMnSODであり、ARMDの発症に関与している。
【０１１９】
MnSODの核酸配列は公表されている。例えば、GenBankアクセッションNo:X65965、AH004779、およびD85499は、典型的なMnSOD核酸配列を開示する。
【０１２０】
一実施例では、MnSODは、野生型(または天然)完全長配列だけでなく、MnSODの形成に関与する能力を保持する、MnSOD対立遺伝子多型、フラグメント、ホモログ、または融合配列を含む。ある例では、MnSODは、MnSODに対して少なくとも80％の配列同一性、例えば、少なくとも85％、90％、95％または98％の配列同一性を持つ。他の実施例では、MnSODは、非常に高ストリンジェントな条件下で、GenBankアクセッションNo.:X65965、AH004779、D85499に示される配列とハイブリダイズする配列を持ち、MnSOD活性(例えば、ARMDの発症に関与する能力)を保持する。
【０１２１】
ミクロソームエポキシド加水分解酵素(MEHE):
生体異物化学物質や汚染物質の酸化的代謝に由来するエポキシドの加水分解を触媒し、網膜やRPE細胞に発現している。
【０１２２】
用語MEHEは、いかなる生物からのMEHE遺伝子、cDNA、mRNA、またはタンパク質をも含み、これがMEHEであり、ARMDの発症に関与している。
【０１２３】
MEHEの核酸配列は公表されている。例えば、GenBankアクセッションNo:NM_000120やNM_010145は、典型的なMEHE核酸配列を開示する。
【０１２４】
一実施例では、MEHEは、野生型(または天然)完全長配列だけでなく、MEHEの形成に関与する能力を保持する、MEHE対立遺伝子多型、フラグメント、ホモログ、または融合配列を含む。ある例では、MEHEは、MEHEに対して少なくとも80％の配列同一性、例えば、少なくとも85％、90％、95％または98％の配列同一性を持つ。他の実施例では、MEHEは、非常に高ストリンジェントな条件下で、GenBankアクセッションNo.:NM_000120やNM_010145に示される配列とハイブリダイズする配列を持ち、MEHE活性(例えば、ARMDの発症に関与する能力)を保持する。
【０１２５】
変異:
遺伝的変異、例えば、多型の源としての核酸配列の変化。例えば、変異は、染色体の非コード領域における特定の部位をはじめとする、遺伝子または染色体内部で起こりうる、例えば遺伝子の調節領域内、または近くにおける変化である。変異の種類には、塩基置換点変異(例えば、転位または転換)、欠失、挿入が含まれるがこれに限定されない。ミスセンス変異は、コードされたタンパク質の配列に、ある異なるアミノ酸が導入されるものであり、ナンセンス変異は、新規のストップコドンが導入されるものであり、サイレント変異は、コドンの第三の位置に多くの場合一つの塩基変化を持つ、同じアミノ酸が導入されるものである。挿入または欠失の場合、変異はフレーム内変異(全体の配列のフレームを変化させない)、または大量のコドンの読み誤りをもたらす可能性がある(代わりのフレーム中に存在するストップコドンによって、コード化産物の異常終了をもたらすことが多い)フレームシフト変異の可能性がある。
【０１２６】
本開示を通して、当業者に通常は既知で、用いられている用語に従って各種の変異を略してある。例えば、Y遺伝子の特定のアミノ酸位置(例えば、62番)において、IのかわりにVをコードするあるヌクレオチドの置換は、I62Vと表す。一実施例では、5196＋1G→A変異体をコードするあるヌクレオチド配列は、ヌクレオチド残基5197の位置に、Gの代わりにAを持つ。さらなる実施例では、6519Δ11塩基対変異体をコードするヌクレオチドは、ヌクレオチドの位置6519から始まる11塩基対の欠失を持つヌクレオチド配列を表す。
【０１２７】
核酸アレイ:
基盤上の場所に割り当てられた核酸分子(例えば、DNAまたはRNA)の配置、例えば、cDNAアレイ、またはオリゴヌクレオチドアレイで見られるもの。
【０１２８】
遺伝子を代表する核酸分子:
プローブまたはその他のインジケータ分子としての使用に適した長さで、対応遺伝子に関する情報を提供する、任意の核酸分子、例えば、DNA(イントロンまたはエクソンまたは両方)、cDNAまたはRNA。
【０１２９】
核酸分子:
cDNA、mRNA、ゲノムDNA、合成(例えば、化学合成)DNAを制限なく含む、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマー。核酸分子は二本鎖または一本鎖でありうる。一本鎖の場合、核酸分子は、センス鎖またはアンチセンス鎖でありうる。加えて、核酸分子は環状または線状でありうる。
【０１３０】
本開示は、特定の長さのあるARMD関連ヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を含む。そのような分子は、これらの配列の少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、または少なくとも50の連続するヌクレオチド、またはそれ以上を含むことができる。
【０１３１】
ヌクレオチド:
ある糖に結合するある塩基を含むモノマー、例えば、ピリミジン、プリン、またはそれらの合成類似化合物、あるアミノ酸に結合する塩基、例えばペプチド核酸(PNA)などのようなものを含むが、これに限定されない。あるヌクレオチドは、あるポリヌクレオチド中の1つのモノマーである。あるヌクレオチド配列は、あるポリヌクレオチド中の塩基の配列を意味する。
【０１３２】
オリゴヌクレオチド:
あるオリゴヌクレオチドは、天然のリン酸ジエステル結合によって結合する、複数の重合したヌクレオチドであり、例えば長さが少なくとも6ヌクレオチドである。あるオリゴヌクレオチド類似体は、オリゴヌクレオチドに類似した機能を持つ分子を意味するが、天然では発生しない部分を持つ。例えば、オリゴヌクレオチド類似体は、天然では発生しない部分、例えば、変化した糖成分または糖間結合、例えば、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドを含むことがある。
【０１３３】
特定のオリゴヌクレオチドやオリゴヌクレオチド類似体は、長さが最大約200ヌクレオチド、例えば、少なくとも6塩基の配列(例えば、DNAまたはRNA)、例えば、少なくとも8、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも100、またはさらに長さが少なくとも200塩基、または約6〜約50塩基、例えば、約10-25塩基、例えば、12、15、20、21、または25塩基を含むことができる。
【０１３４】
パラオキソナーゼ:
高密度のリポタンパク質と関連し、LDL酸化を防ぐことが示された、カルシウム依存性糖タンパク質。
【０１３５】
用語パラオキソナーゼは、いかなる生物からのパラオキソナーゼ遺伝子、cDNA、mRNA、またはタンパク質をも含み、これがパラオキソナーゼであり、ARMDの発症に関与している。
【０１３６】
パラオキソナーゼの核酸配列は公表されている。例えば、GenBankアクセッションNo:NM_000446およびNM_011134は、典型的なパラオキソナーゼ核酸配列を開示する。
【０１３７】
一実施例では、パラオキソナーゼは、野生型(または天然)完全長配列だけでなく、パラオキソナーゼの形成に関与する能力を保持する、パラオキソナーゼ対立遺伝子多型、フラグメント、ホモログ、または融合配列を含む。ある例では、パラオキソナーゼは、パラオキソナーゼに対して少なくとも80％の配列同一性、例えば、少なくとも85％、90％、95％または98％の配列同一性を持つ。他の実施例では、パラオキソナーゼは、非常に高ストリンジェントな条件下で、GenBankアクセッションNo.:NM_000446やNM_011134に示される配列とハイブリダイズする配列を持ち、パラオキソナーゼ活性(例えば、ARMDの発症に関与する能力)を保持する。
【０１３８】
多型:
変異の結果、遺伝子配列は個体間で異なることがある。異なる配列は対立遺伝子と呼ばれる。既知の遺伝子座(染色体上の遺伝子の場所は遺伝子座と呼ばれる)に存在する対立遺伝子は、個体の遺伝子型と呼ばれる。一部の遺伝子座は個体間で大きく異なる。遺伝子座が2つ以上の対立遺伝子を持ち、その頻度が集団においてそれぞれ1％を超える場合、その遺伝子座は多型と呼ばれる。多型性部位は多型と呼ばれる。用語多型はまた、変化した機能を持つ遺伝子産物、すなわち、機能的に同等でない遺伝子産物をもたらす遺伝子配列における変異体を産生するバリエーションを含包する。この用語はまた、遺伝子産物を産生しない、不活性の遺伝子産物、または遺伝子産物の活性が増加または低下した、または生物学的作用を持たないものを産生するバリエーションも含包する。
【０１３９】
多型性は、例えば、バリエーションが存在するヌクレオチドポジションによって、ヌクレオチドバリエーションによって生じたアミノ酸配列の変化によって、またはそのバリエーションに結合する核酸分子またはタンパク質のその他の一部の特性の変化によって表すことができる。
【０１４０】
プライマー:
短い核酸分子、例としては長さが10〜100ヌクレオチド、例えば長さが約15、20、21、25、30、または50ヌクレオチド、またはそれ以上のDNAオリゴヌクレオチド。プライマーと標的DNA鎖間にハイブリッドを形成するために、核酸ハイブリダイゼーションによってプライマーを相補的な標的DNA鎖にアニーリングすることができる。例えば、PCRまたは当技術分野で既知の他の核酸増幅方法による核酸配列の増幅にプライマーペアを使用できる。
【０１４１】
核酸プライマーを作成し使用する方法は、例えば、Sambrookら(In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1989)、Ausubelら(編)(In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, New York, 1998)、Innisら(PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1990)に記載されている。PCRプライマーペアは、既知の配列、例えば、このような目的のためのコンピュータプログラム、例えば、Primer(Version 0.5, c 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA)などを用いて、既知の配列から得ることができる。特定のプライマーの特異性は、その長さとともに増加することを当業者は理解するであろう。故に、例えば、あるARMD関連タンパク質コードヌクレオチドの30の連続するヌクレオチドを含むあるプライマーは、標的配列、例えば、指定したARMD関連タンパク質の別のホモログと、15ヌクレオチドのみからなる対応するプライマーよりも高い特異性でアニーリングを起こす。故に、高い特異性を得るために、あるARMD関連タンパク質コードヌクレオチド配列の、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、またはより多くの連続するヌクレオチドを含むプライマーを選択することができる。
【０１４２】
プローブ:
ある単離核酸分子、例えば、少なくとも10ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであり、標的核酸の検出を可能にする、少なくとも1つの検出可能な標識を含むことができる。 プローブを作成し使用する方法は、例えば、Sambrookら(In Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor、New York、1989)、Ausubelら(In Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publ. Assoc. and Wiley-Intersciences、1992)、Innisら(PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications、Academic Press, Inc., San Diego、CA、1990)に記載されている。
【０１４３】
故に、本開示は、特定の長さのARMD関連遺伝子配列を含むプローブを含む。そのような分子は、これらの配列の少なくとも20、25、30、35、または40の連続するヌクレオチドを含むことができ、開示される配列の領域、例えばARMDに関連する変異および/または多型を検出できる領域から得られる。ARMD関連遺伝子の任意の部分の少なくとも20、25、30、35、または40の連続するヌクレオチドを含むプローブ配列として、核酸分子を選択することができる。特定の実施例では、プローブは、プローブ:標的配列ハイブリダイゼーション複合体の検出を可能にする標識を含む。
【０１４４】
本明細書で開示される方法で使用するプローブは、ARMD関連分子の既知のヌクレオチド配列からデザインすることができる。例えば、GenbankアクセッションNoは、野生型対立遺伝子を検出するプローブをデザインするのに有用な、有力なヌクレオチド配列を提供する。多型性/変異型対立遺伝子を検出するためのプローブをデザインするのに使用可能な変異体配列が記載される。プローブは、ARMD関連遺伝子配列のフラグメントを含むことができ、また、例えば、これらのARMD関連配列の少なくとも20、25、30、35、または40の連続するヌクレオチドを含むことができる。プローブは、変異型対立遺伝子の存在を検出できる。
【０１４５】
精製:
用語「精製」は、完全な純度を必要とせず、むしろ相対語として意図されるものである。故に、例えば、精製タンパク質製剤は、言及されるタンパク質が、細胞内部の自然の環境にあるタンパク質よりも純度が高いものである。例えば、あるタンパク質製剤は、そのタンパク質が製剤の総タンパク質量の少なくとも50％に相当するように精製される。同様に、精製オリゴヌクレオチド製剤は、そのオリゴヌクレオチドがある環境でよりも純度が高いものであり、オリゴヌクレオチドの複合化合物を含む。
【０１４６】
サンプル:
生体試料、例えば、ゲノムDNA、RNA(mRNAを含む)、タンパク質、またはそれらの組み合わせを含むもの。例には、末梢血、尿、唾液、組織生検、外科材料、羊水穿刺サンプル、剖検材料が含まれるがこれに限定されない。
【０１４７】
配列同一性/類似性:
2つ以上の核酸配列、または2つ以上のアミノ酸配列間の同一性/類似性は、その配列間の同一性または類似性の観点から表される。配列同一性は、同一性の割合の観点から測定でき、割合が高いほど、配列の同一性は高い。配列類似性は、類似性の割合の観点から測定でき(保存的アミノ酸置換を考慮する)、割合が高いほど、その配列の類似性は高い。核酸またはアミノ酸配列のホモログまたはオルソログは、標準的な方法を用いて並べた場合、比較的高い度合いの配列同一性/類似性を有する。
【０１４８】
比較のために配列を並べる方法は当技術分野で周知である。Smith ＆ Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482、1981； Needleman ＆ Wunsch, J Mol. Biol. 48: 443、1970、Pearson ＆ Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 2444、1988、Higgins ＆ Sharp, Gene、73: 237-44、1988、Higgins ＆ Sharp, CABIOS 5: 151-3、1989、Corpetら、Nuc. Acids Res. 16: 10881-90、1988、Huangら、Computer Appls. in the Biosciences 8、155-65、1992、Pearsonら、Meth.Mol.Bio.24: 307-31、1994などにおいて様々なプログラムやアラインメントアルゴリズムが説明されている。Altschulら、J. Mol. Biol. 215: 403-10、1990では、配列アラインメント方法と相同性の計算が詳細に検討されている。
【０１４９】
NCBIベーシック・ローカル・アラインメント・サーチ・ツール(Basic Local Alignment Search Tool)(BLAST)(Altschulら、J. Mol. Biol. 215: 403-10、1990)は、配列解析プログラムblastp、blastn、blastx、tblastn、tblastxに関連する使用について、National Center for Biological Information(NCBI、National Library of Medicine、Building 38A、Room 8N805、Bethesda、MD 20894)やインターネット上を初めとした、いくつかの情報源から入手可能である。さらに詳しい情報は、NCBIのウェブサイトで入手できる。
【０１５０】
BLASTNが核酸配列を比較するために用いられる一方、BLASTPはアミノ酸配列を比較するために用いられる。2つの核酸配列を比較するために、オプションを以下のように設定できる:-iを比較する第一の核酸配列を含むファイルに設定する(例えば、C:＼seq1.txt)。-jを比較する第二の核酸配列を含むファイルに設定する(例えば、C:＼seq2.txt)。-pをblastnに設定する。-oは任意の所望のファイル名に設定できる(例えば、C:＼output.txt)。-qを-1に設定する。-rを2に設定する。他の全てのオプションを、それらのデフォルトの設定のままにする。例えば、2つの配列間の比較を含む出力ファイルを作成するために、以下のコマンドを使用できる: C:＼B12seq-i c:＼seq1.txt-j c:＼seq2.txt-p blastn-o c:＼output.txt-q-1-r2。
【０１５１】
2つのアミノ酸配列を比較するために、B12seqのオプションを以下のように設定できる:-iを比較する第一のアミノ酸配列を含むファイルに設定する(例えば、C:＼seq1.txt)。-jを比較する第二のアミノ酸配列を含むファイルに設定する(例えば、C:＼seq2.txt)；-pをblastpに設定する。-oは任意の所望のファイル名に設定できる(例えば、C:＼output.txt)。他の全てのオプションをそれらのデフォルトの設定のままにする。例えば、2つのアミノ酸配列間の比較を含む出力ファイルを作成するために、以下のコマンドを使用できる: C:＼B12seq-i c:＼seql.txt-j c:＼seq2.txt-p blastp-o c:＼output.txt。2つの比較した配列が相同性を共有する場合、指定した出力ファイルはそれらの相同性領域を並べた配列として提示する。2つの比較した配列が相同性を共有しない場合は、指定した出力ファイルは並べた配列を提示しない。
【０１５２】
並べた後は、ある同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が両方の配列中に存在する位置の数を算定することで、一致の数を決定する。一致の数を、同定された配列において示される配列の長さ、あるいはある連結した長さ(例えば、ある同定された配列に示されるある配列からの100の連続するヌクレオチドまたはアミノ酸残基)のいずれかで割ることで配列同一性の割合を決定する、その後結果として得られる値を100で乗じることで。例えば、1154ヌクレオチドを持つテスト配列と並べた場合に、1166の一致を持つある核酸配列は、テスト配列と75.0％同一である(すなわち、1166÷1554＊100＝75.0)。配列同一性の割合の値は、小数点第二位で四捨五入する。例えば、75.11、75.12、75.13、75.14は75.1に切り捨てられ、75.15、75.16、75.17、75.18、75.19は75.2に切り上げられる。長さの値は常に整数である。別の実施例では、以下のように、ある同定された配列からの20の連続するヌクレオチドと並べた20ヌクレオチド領域を含むある標的配列は、その同定された配列と75％の配列同一性を共有する領域を含む(すなわち、15÷20＊100＝75)。
2009514534.tif 000002
【０１５３】
約30アミノ酸より長いアミノ酸配列の比較のため、デフォルトのBLOSUM62マトリックスセットをデフォルトパラメータに使用するBlast2配列の機能を用いる(ギャップ存在費用は11で、残留あたりのギャップ費用は1である)。ホモログは通常、NCBI Basic Blast2.0、例えば、nrまたはswissprotデータベースなどのデータベースを持つギャップドblastpを用いて、あるアミノ酸配列と並べた完全長上でカウントされる、少なくとも70％の配列同一性を持つことによって特徴付けられる。Blastnプログラムで検索されたクエリは、DUSTでフィルタにかけられる(HancockおよびArmstrong, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10: 67-70)。その他のプログラムはSEGを使用する。さらに、マニュアルアラインメントを実施することもできる。さらに高い類似性を持つタンパク質は、本方法で評価された場合、同一性割合の増加、例えば表1Aに記載された遺伝子でコードされるタンパク質に対して、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または少なくとも99％の配列同一性を示す。
【０１５４】
2つの核酸分子が密接に関連する指標の1つは、上述のように2つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。高度な同一性を示さない核酸配列は、それでもなお、遺伝子コードの縮重により、同一のまたは類似した(保存)アミノ酸配列をコードする可能性がある。実質的に同一のタンパク質を完全にコードする複数の核酸分子を作成するため、この縮重を用いて核酸配列の変化を作成することができる。そのような相同核酸配列は、本方法によって決定される、例えば、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または少なくとも99％の配列同一性を含むことができる。例えば、相同核酸配列は、表1Aに記載される遺伝子に関する核酸配列に対して。少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または少なくとも99％の配列同一性を持つことができる。2つの核酸配列が実質的に同一であるという、他の(必ずしも追加ではない)指標は、第一の核酸がコードするポリペプチドが、第二の核酸によってコードされるポリペプチドと、免疫学的に交差反応性を持つことである。
【０１５５】
当業者は、提供される特定の配列同一性の範囲は指針にすぎないことを理解するであろう。提供される範囲に含まれない、極めて重要なホモログが得られる可能性もある。
【０１５６】
一塩基多型(SNP):
ある集団の個体における、あるDNA配列における単一の塩基(ヌクレオチド)の違い。SNPは、原因になりうる(SNPが関与する状態または形質に、実際に関与する、あるいは影響を与える)、または関連する(SNPが関与する状態または形質に関連するが、直接的な関与または影響を持たない)可能性がある。
【０１５７】
対象:
生きた多細胞性の脊椎動物、ヒトおよびヒト以外の哺乳動物(例えば、動物対象)を含む区分。
【０１５８】
標的配列:
1つ以上の特異的な遺伝的異常、例えば、1つ以上のヌクレオチド置換、欠失、挿入、増幅、またはそれらの組み合わせに対応する、ゲノム(例えば、ヒトゲノムまたはいずれかの哺乳動物のゲノム)中の特定の領域に位置するあるヌクレオチドの配列。標的は、例えばコード配列であってもよく、またコード配列に対応する非コード鎖であってもよい。標的配列の例には、ARMDに関連する配列、例えば、表1Aと1Bに記載されたものが含まれる。
【０１５９】
トール様受容体4(TRL4):
TLR4遺伝子は、炎症性シグナル経路およびコレステロール流出の仲介のにおけるその役割によってアテローム性動脈硬化に対する感受性の調節に関与する(Castrilloら、Mol. Cell. 12: 805-816、2003、Gordon S. Dev. Cell. 5: 666-668、2003、Zareparsiら、Hum. Mol. Genet. 14: 1449-1455、2005)。TRL4は、その機能障害がARMDをもたらす可能性がある、網膜色素上皮による光受容体外側部のファゴサイトーシスへに関与することが示されている(Bok D. Proc. Natl. Acad. Sci USA 99: 14619-14621、2002、Kindzelskiiら、J. Gen. Physiol. 124: 139-149、2004、Zareparsiら、Hum. Mol. Genet. 14: 1449-1455、2005)。
【０１６０】
用語TLR4は、いかなる生物からのTLR4遺伝子、cDNA、mRNA、またはタンパク質 をも含み、これがTLR4であり、ARMDの発症に関与している。 
【０１６１】
TLR4の核酸配列は公表されている。例えば、GenBankアクセッションNo:NM_138554やNM_019178は、典型的なTLR4核酸配列を開示する。
【０１６２】
一実施例では、TLR4は、野生型(または天然)完全長配列だけでなく、TLR4の形成に関与する能力を保持する、TLR4対立遺伝子多型、フラグメント、ホモログ、または融合配列を含む。ある例では、TLR4は、TLR4に対して少なくとも80％の配列同一性、例えば、少なくとも85％、90％、95％または98％の配列同一性を持つ。他の実施例では、TLR4は、非常に高ストリンジェントな条件下で、GenBankアクセッションNo.:NM_138554やNM_019178に示される配列とハイブリダイズする配列を持ち、TLR4活性(例えば、ARMDの発症に関与する能力)を保持する。
【０１６３】
疾患の治療:
「治療」は、疾患または病態の徴候または症状、例えば、ARMDの徴候または症状を改善する治療的介入を意味する。治療はまた、状態、例えば、ARMDの寛解や治癒をもたらすこともできる。特定の実施例では、治療は、例えば、疾患の完全な発症を抑制する、例えば、ARMDの発症の抑制による疾患の予防を含む。疾患の予防は、その疾患が完全にない状態を必要としない。例えば、少なくとも50％の軽減は十分である。
【０１６４】
十分な条件下で:
所望の活性を促すいずれかの環境を説明するために用いられる表現。
【０１６５】
一実施例では、所望の活性を促すのに十分な時間、サンプル(例えば増幅産物)をインキュベートする工程を含む。特定の実施例では、所望の活性は、サンプルの、それらの基板へのハイブリダイゼーションである。例えば、所望の活性は、オリゴヌクレオチドプローブへの増幅産物のハイブリダイゼーションであり、これにより増幅産物:オリゴヌクレオチドプローブ複合体を形成し、1つ以上のARMD変異を検出する工程である。
【０１６６】
卵黄様黄斑変性遺伝子2(VMD2):
68kDの分子量と6.9の等電点を持つ、585アミノ酸タンパク質をコードする網膜特異的遺伝子(あるいはBestrophin遺伝子とも呼ばれる)である。VMD2は、一般的にBest病として知られる、卵黄様黄斑変性の若年での発症の原因遺伝子として特定されている。
【０１６７】
用語VMD2は、いかなる生物からのVMD2遺伝子、cDNA、mRNA、またはタンパク質をも含み、これがVMD2であり、ARMDの発症に関与している。
【０１６８】
VMD2の核酸配列は公表されている。例えば、GenBankアクセッションNo:NM_004183、AH006947、およびAY450527は、典型的なVMD2核酸配列を開示する。
【０１６９】
一実施例では、VMD2は、野生型(または天然)完全長配列だけでなく、VMD2の形成に関与する能力を保持する、VMD2対立遺伝子多型、フラグメント、ホモログ、または融合配列を含む。ある例では、VMD2は、VMD2に対して少なくとも80％の配列同一性、例えば、少なくとも85％、90％、95％または98％の配列同一性を持つ。他の実施例では、VMD2は、非常に高ストリンジェントな条件下で、GenBankアクセッションNo.:NM_004183、AH006947、およびAY450527に示される配列とハイブリダイズする配列を持ち、VMD2活性(例えば、ARMDの発症に関与する能力)を保持する。
【０１７０】
野生型:
生物の自然集団中に多く見られる遺伝子型であり、変異型のそれと対照をなす。
【０１７１】
III. 加齢黄斑変性(ARMD)に関与する変異
複雑な特性、例えば、ARMDは、候補となる感受性遺伝子における異なる変異(例えば、多型)間の反応を推測することで理解できる。各遺伝子欠損に関連するリスクは、単独では比較的低いかもしれないが、複数の変異または多型が同時に存在すると、ARMDの一因となる状態または危険因子、例えば、加齢、喫煙、および食生活の存在下で疾患の感受性を劇的に増加させる可能性がある。
【０１７２】
ARMDの発症のリスクに関連する、遺伝子における複数の変異および多型(例えば1つ以上のヌクレオチド置換、挿入、欠失、またはそれらの組み合わせ)が知られている。しかし、複数の民族グループにおいて、対象のARMDに対する総合的な遺伝的素因を正確に予測できる変異および多型の組み合わせ(例えば、ARMDに統計学的に関連する遺伝子における)はこれまで特定されていない。
【０１７３】
補体因子H(CFH)
補体因子H遺伝子中のチロシン→ヒスチジン変化(Y402H)をもたらす、エクソン9中のヌクレオチド1277でのT→C置換の多型と、ARMDのリスクの増加の間の有意な関連性が報告されている(Kleinら、Science 308:385-389, 2005；Hainesら、Science 308: 419-421, 2005、Edwardsら、Science.308: 421-424, 2005)。これらの研究は、C対立遺伝子のキャリアでは3.3〜4.6の範囲、CC同型接合体では3.3〜7.4の範囲の、ARMDに関する奇妙な比率を報告した。この関連は確認されている(Zareparsiら、Am. J. Hum. Genet. 77: 149-153、2005、Hagemanら、PNAS. 102: 7227-7232、2005、Liら、Nat. Genet. 38: 1049-1054、2006、Mallerら、Nat. Genet. 38: 1055-1059、2006)。
【０１７４】
3つの研究では、予期せず27の他の共通SNPが、Y402H多型に加えてARMDと関連することが認められた(Hagemanら、PNAS.102:7227-7232、2005、Liら、Nat.Genet.38:1049-1054, 2006、Mallerら、Nat. Genet. 38: 1055-1059, 2006)。
【０１７５】
Hagemanらは、8つのCFH多型が連鎖不均衡にあり、これらの多型セットを持つ、危険な状態にある1つの共通のハロタイプが、対照の29％に対して、症例の50％に検出されたことを示した［OR＝2.46、95％ CI(1.95〜3.11)］。このハプロタイプの同型接合体は、症例の24.2％と対照の8.3％に認められた。また、2つの共通保護ハプロタイプが、対照の34％と症例の18％に認められた［OR＝0.48、95％ CI(0.33〜0.69)］および［OR＝0.54、95％ CI(0.33〜0.69)］。
【０１７６】
Liらは、22のさらなるCFH変異体(それらのうち2つは既にHagemanらによって報告されている)と、ARMDに対する感受性の間の重要な関連を報告した。それらのCFH変異体の中の18は、Y402H変異体よりも強い疾患の感受性を示した。従って、たとえY402H変異体がARMDの病因において、原因的役割を果たすとしても、ARMDに対する感受性の、唯一の主要な決定要因になる可能性は低い。
【０１７７】
Mallerらは、Y402H変異体とは関係ない、共通する、非コードCFH変異体(Liらによって報告された22のCFH変異体中の)と、ARMDに対する感受性の間の第二の関連を示した。
【０１７８】
LOC387715遺伝子
ARMDファミリーのゲノム全体での結合スキャンによって、染色体10q26上の有意な結合ピークが特定され(Majewskiら、Am. J. Hum. Genet. 73: 540-550、2003、Seddonら、Am. J. Hum. Genet. 73: 780-790、2003、Iyengarら、Am. J. Hum. Genet. 74: 20-39、2004、Weeksら、Am. J. Hum. Genet. 75: 174-189、2004、Kenealyら、Mil. Vis. 10: 57-61、2004)、3つの研究がARMD感受性を与える10q26変異体を報告した。(Jakobsdottirら、Am. J. Hum. Genet. 77: 389-407、2005、Riveraら、Hum. Mol. Genet. 14: 3227-3236、2005、Schmidtら、Am. J. Hum. Genet. 78: 852-864、2006)。10q26変異体の中で、LOC387715遺伝子の位置でのAla69Ser多型と、ARMD間の強い関連が報告された(Riveraら、Hum. Mol. Genet. 14: 3227-3236、2005、Schmidtら、Am. J. Hum. Genet. 78: 852-864、2006)。
【０１７９】
LOC387715のエクソン1中のAla69Ser(G→T)多型は、対照よりもARMD患者で頻度が高く(Riveraら、Hum. Mol. Genet. 14: 3227-3236、2005、Schmidtら、Am. J. Hum. Genet. 78: 852-864、2006、Mailerら、Nat. Genet. 38: 1055-1059、2006)、ARMD発症のリスクは、T対立遺伝子にヘテロ接合性を持つ個体では〜2.7倍増加し、GG同型接合体に比べると、TT同型接合性のリスクは8.2倍増加する(OR＝8.21、95％ CI:5.79、11.65)(Riveraら、Hum. Mol. Genet. 14: 3227-3236、2005)。
【０１８０】
補体因子B(BF)および補体成分2(C2)遺伝子
ARMDおよびCFH遺伝子の病理生理学において炎症が役割を果たすことから、代替となる補体活性化経路の主要な抑制因子がARMD感受性に関連があると報告されている。4つの変異体間の著しい関連と、ARMDのリスクの低減が観察されている。C2のE318D変異体とほぼ完全な連鎖不均衡にあるBFのL9H変異体、C2のイントロン10中のrs547154SNPとほぼ完全な連鎖不均衡にあるBFのR32Q変異体は、ARMDに対して極めて保護性である(Goldら、Nat. Genet. 38: 458-462, 2006、Mallerら、Nat. Genet. 38: 1055-1059、2006)。
【０１８１】
代替となる補体活性経路の活性因子であるBFと、補体古典的活性経路の活性因子であるC2は、ヒト染色体6p21上の主要組織適合体複合体(MHC)クラスIII領域内で500塩基対離れた位置にあり、神経網膜、RPE、および脈絡膜に発現している。
【０１８２】
ABCR
シュタルガルト黄斑変性1(STGD1)は、ARMDと多くの特徴を共有する常染色体劣性網膜変性疾患である。ABCR遺伝子、STGD1遺伝子は、ATP結合カセット(ABC)トランスポータースーパーファミリーのメンバーであり、桿体細胞光受容体特異性膜タンパク質をコードし、染色体1p22.2-1p22.3領域上に位置する。ABCR遺伝子はARMDとの関連が認められている。
【０１８３】
33のABCRの変化は、疾患リスクが増加する変化として解釈され、対照と比べてARMD患者で認められる頻度が有意に高いもの、ARMDでは認められるが対照では認められないものがある。2つの多型(D2177NとG1961E)が、ARMDと統計学的に有意な関連があることが報告され(フィッシャーの両側正確確率検定、p<0.0001)、D1177N キャリアではリスク増加はおよそ3倍、G1961Eキャリアではリスク増加が5倍である(Allikmetsら、Am. J. Hum. Genet. 67: 487-491, 2000)。ミスセンス変異と欠失を含む、ABCR遺伝子中の31の変化が654名のARMD患者(8.3％)の54名に報告され、467(0/467)名の対照には認められなかった(Allikmetsら、Science 277: 1805-1807, 1997、De La Pazら、Ophthalmology. 106: 1531-1536、1999、Websterら、Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 42: 179-1189, 2001、Baumら、Ophthalmologica.217:111-114、2003)。患者と対照における各変化の個々の頻度は、それらの頻度が非常に低いためAMDとの関連に関する統計学的エビデンスを持たなかったが、この比較は、これらの変化とARMD間の有意な関連を示した(イエーツ補正カイ二乗検定＝38.7、p<0.0001)。
【０１８４】
フィブリン5(FBLN5)
網膜色素上皮およびドルーゼン間のフィブリン3の沈着が発見されたが、ARMD患者におけるフィブリン3-コード配列変異体が見られなかった後、フィブリン5は、アミノ酸変異体とARMD間の著しい関連を示した ［7名の異なるARMD患者(7/402)における7つの異なる変異体、対照にはなし(0/429)、(x2＝5.59、p＝0.0181)］(Marmorstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99: 13067-13072, 2002、Stone et al., N. Engl. J. Med. 352: 346-353、2004)。さらに、ARMD患者において2つの新たなFBLN5変異体が認められたが、対照では見られなかった(Loteryら、Hum. Mut. 27: 568-574、2006)。
【０１８５】
VMD2
卵黄様黄斑変性(Best病、VMD2)は、ARMDと、一部の臨床的および組織学的特徴を共有する、常染色体優性の若年発症型黄斑変性である。Best病遺伝子は、11q13上に位置し、VMD2遺伝子として特定される。VMD2遺伝子は、RPEに選択的に発現するbestrophinをコードする。それぞれの研究では統計学的有意性は検出できなかったが、2つの研究を組み合わせた場合、580名のARMD患者の11名において(1.9 ％)9つの異なるVMD2変異が認められたが、388名の対照中には見られなかったことで、VMD2変異体とARMD間の有意な関連を明らかになった(Yates x2＝5.85、p＝0.0156)(Allikmetsら、Hum. Genet. 104: 449-453, 1999、Loteryら、Inves. Ophthalmol. Vis. Sci. 41: 1292-1296, 2000)。
【０１８６】
トール様受容体4(TLR4)遺伝子
循環器疾患や高血圧はARMDの危険因子として報告されており、アテローム性動脈硬化はARMDの発生機序に関与している(Kleinら、Am. J. Hum. Genet. 137: 486-495、2004、Andersonら、Am. J. Ophthalmol. 131: 767-781, 2001、Hagemanら、Prog. Retin. Eye. Res. 20: 705-732, 2001、Zarbin MA. Arch. Ophthalmol. 122: 598-614, 2004、Ambatiら、Surv. Ophthalmol. 48: 257-293, 2003、Zareparsiら、Hum. Mol. Genet. 14: 1449-1455, 2005)。
【０１８７】
TLR4遺伝子は、染色体9q32-33上の領域に位置し、炎症性シグナル経路の仲介とコレステロール流出におけるその役割によって、アテローム性動脈硬化に対する感受性の調節に関与している(Castrilloら、Mol. Cell. 12: 805-816, 2003、Gordon S. Dev. Cell. 5: 666-668, 2003、Zareparsiら、Hum. Mol. Genet. 14: 1449-1455, 2005)。
【０１８８】
TRL4D299G(A/G)変異体は、対照よりもARMD患者において、有意に頻度が高いと報告され、G対立遺伝子キャリアにおけるARMD発症リスクを少なくとも2倍上昇させる(Zareparsiら、Hum. Mol. Genet. 14: 1449-1455, 2005)。
【０１８９】
CX3CR1
CX3CR1は(ケモカイン、CX3CL1)受容体をコードする。2つのCX3CR1SNP、V249IとT280M間の関連が、ARMD患者において認められており、対照(41.7％および23.9％)に対して、ARMD症例におけるM280およびI249キャリアの有病率は有意に上昇していた(55.3 ％および39.3％)(x2＝4.88、p＝0.0272および(x2＝9.57、p＝0.002)(Tuoら、FASEB. J. 18: 1297-1299, 2004)。これらの2つの多型は完全な連鎖不均衡にある。
【０１９０】
シスタチンC遺伝子(CST3)
シスタチンCは、後眼部の網膜色素上皮(RPE)に主に局在するシステインプロテアーゼ阻害剤であり、カテプシンSを含む、複数のカテプシンを阻害する。
【０１９１】
シスタチンC遺伝子(CST3)は、染色体20p11.2に位置する。3つの多型、-157G/C、-72A/C、＋73G/Aが、CST3遺伝子のプロモータ領域からの220塩基対フラグメントにおいて報告されている(BalbinおよびAbrahamson. Hum. Genet. 87: 751-752、1991)。これらの3つの多型は強い連鎖不均衡にあり、ただ二つハプロタイプが認められる:CST3AおよびB。CST3B/B遺伝子型(-157C、-72C、＋73A)は近年、滲出型ARMDに関連することが167名のARMD患者と517名の対象を含むケースコントロール研究において示されている。CS3B/B遺伝子型は、対照よりも(12/517)、ARMD患者(11/167)で有意に頻度が高いことが認められた(x2＝7.07、p＝0.0078)(Zurdelら、Br. J. Ophthalmol. 86: 214-219, 2002)。
【０１９２】
抗酸化酵素をコードする遺伝子、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ(MnSOD)遺伝子、ミクロソームエポキシド加水分解酵素(MEHE)遺伝子、パラオキソナーゼ遺伝子
活性酸素種からの酸化ストレスは、加齢性疾患の原因になる可能性があり、これにはRPEが主要な標的と考えられるARMDが含まれる(Kasaharaら、Invest. Ophthalmol. Vis, Sci. 46: 3426-3434, 2005)。異物代謝と抗酸化酵素は、日本人患者におけるARMDの発症の一因となる(Kimuraら、Am. J. Ophthalmol. 130: 769-773, 2000、Ikedaら、Am. J. Ophthalmol. 132: 191-195, 2001)。MnSOD遺伝子Ala/Ala遺伝子型［x2(Yates)＝9.86、p＝0.0017)］、MEHEエクソン3、H113T多型(x2＝5.1、p≦0.025)、ならびにパラオキソナーゼGln-Arg192B/B遺伝子型(x2＝6.21、p＝0.0127)およびLeu-Met54L/L遺伝子型(x2＝6.82、p＝0.009)は日本人の滲出型ARMD患者において、対照よりも有意に頻度が高かった。
【０１９３】
アポリポタンパク質E(Apo E)ε4対立遺伝子
アポリポタンパク質E(ApoE)は、リポタンパク質の代謝に関与し、損傷に対するニューロンの反応において役割を果たす。Apo Eは、染色体19q上に位置し、3つの主要な多型性対立遺伝子、ε2、ε3、ε4を持つ。ARMD患者ではApo Eε4対立遺伝子の頻度が低下し、保護効果と一致している(Zareparsiら、Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45: 1306-1310, 2004、Klaverら、Am. J. Hum. Genet. 63: 200-206, 1998、Schmidtら、Ophthal. Genet. 23: 209-223, 2002)。ε2 Apo E対立遺伝子は、対照者よりもARMD患者において、有意ではないがわずかに高いことが報告されており、ε2対立遺伝子がARMDにおいて、原因となる役割をわずかに果たすことを示している(Klaverら、Am. J. Hum. Genet. 63: 200-206, 1998、Simonelliら、Ophthal. Res. 33: 325-328, 2001)。
【０１９４】
ELOVL4
一グループはELOVL4中のMet299Val変異体とARMDの関連を認めなかったが(Ayyagariら、Ophthalmic. Genet. 22: 233-239, 2001)、ORが0.45(95％CI:0.29-0.71)の、ELOVL4に関する家族および症例対照(対立遺伝子テストはP＝0.001、遺伝子型テストはP＝0.001、家族および症例対照テストはP<0.0001)を用いた研究において、ARMDと有意な関連を持つことが認められ、これは299番残基におけるバリンが保護作用を持つことを示す(Conleyら、Hum. Mol. Genet. 14: 1991-2002, 2005)。
【０１９５】
Hemicentin-1遺伝子
ヒトhemicentin-1遺伝子は、107のエクソンを持ち、5635個のアミノ酸、600kDaのタンパク質をコードする、フィブリンファミリーのメンバーである。(Schultzら、Ophthalmic. Genet. 26: 101-105, 2005)。フィブリンは、細胞外マトリックスに寄与し、上皮と血管の基底膜に広範に発現している(Schultzら、Ophthalmic. Genet. 26: 101-105, 2005)。
【０１９６】
第1番染色体のq25-31領域に位置するhemicentin-1(FIBULIN-6)遺伝子のエクソン104における5345番アミノ酸でのグルタミンからアルギニンへの変化をもたらすA16,263G(Gln5345Arg)変異が、ARMD表現型から分離されたと報告された(Schultzら、Hum. Mol. Genet. 12: 3315-3323, 2003、Kleinら、Arch. Ophthalmol. 116: 1082-1088, 1998、Weeksら、Am. J. Ophthalmol. 132: 682-692, 2001、Weeksら、Am. J. Hum. Genet. 75: 174-189、2004、Seddonら、Am. J. Hum. Genet. 73: 780-790、2003)。
【０１９７】
ARMDを患う100家族中3家族、2,110例のARMD症例中の5例の個体、981名の対照中の3例の個体にGln5345Arg変異体が認められた(Schultzら、Hum. Mol. Genet. 12: 3315-3323, 2003、Stoneら、N. Engl. J. Med. 351: 346-353, 2004、Hayashiら、Ophthalmic. Genet. 25: 111-119, 2004；McKayら、Mol. Vis. 10: 682-687, 2004、Schultzら、Ophthalmic. Genet. 26: 101-105, 2005)。
【０１９８】
hemicentin-1遺伝子における、その他の11の稀なミスセンス変異体、Met2328Ile、Ala2463Pro、Glu2494Gln、Ile4638Val、Asp4744Glu、Asp5088Val、Arg5173His、His5245Gln、Ile5256Thr、Leu5372Phe and Tyr5382Cysが、合計851名の患者のうち16名に検出され、2つの異なる研究の合計612名の対照には認められなかったが、 Tyr5382Cys変異体は、一対の患者同胞における疾病表現型から分離されないことが示された(Stoneら、N. Engl. J. Med. 351: 346-353, 2004、Hayashiら、Ophthalmic. Genet. 25: 111-119, 2004)。
【０１９９】
ヒトGタンパク質共役受容体75(GPR75)
GPR75は、Gタンパク質共役受容体スーパーファミリーメンバーをコードする。コーディング領域全体と、隣接するスプライス部位、5'-UTRと3'-UTR配列の直接的配列解析によって、535名の非血縁ARMD患者において6つの異なる変異体が決定されたが、252名の対応対照では認められなかった(Sauerら、Br. J. Ophthalmol. 85: 969-975, 2001)。
【０２００】
ラミニン:LAMC1、LAMC2、およびLAMB3をコードする遺伝子
細胞外マトリックスタンパク質クラスのであるラミニンをコードする遺伝子は、1q25-31領域に位置する(Hayashiら、Ophthalmic. Genet. 25: 111-119, 2004)。ARMD患者のLAMC1、LAMC2、LAMB3遺伝子における12の配列変異体が検出されたが、対照には認められず、統計的有意性はなかった。
【０２０１】
IV. ARMDの遺伝的素因の判定
対象、例えば、それ以外は健康な対象が、ARMDを発症しやすいかどうかを判定するための方法が本明細書で提供される。方法は、少なくとも1つのARMD関連分子におけるある異常(例えば、変異)、例えば、対照者には存在しないが、ARMDを患う対照に存在するヌクレオチド変異体、または統計学的にARMD感受性に関連するヌクレオチド変異体を検出する工程を含む。特定の包括された態様には、個体の細胞内の、あるARMD関連核酸分子における1つ以上の変異または多型が検出される、診断的または予測的方法が含まれる。特定の態様では、対象がARMDを発症する遺伝的素因を選択的に検出する、ARMD関連分子のサブセット(例えば、核酸配列)において、あるいは全ての既知のARMD関連分子において異常が検出される。
【０２０２】
特定の実施例では、分子のサブセットは、ARMDに関連する、少なくとも7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20セットのARMD関連感受性遺伝子型を含み、ARMD関連感受性遺伝子型は、ARMDのリスクを有する対象の最大80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、または98％、例えば少なくとも80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、または97％、例えば、80-98％に存在する。一実施例では、分子のサブセットは、ARMDに関連する、少なくとも16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、または31セットのARMD関連感受性遺伝子型を含む。
【０２０３】
さらに他の実施例では、スクリーニングされるARMD関連感受性遺伝子型の数は、少なくとも10、例えば、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも50、少なくとも80、少なくとも100、少なくとも120、少なくとも140、少なくとも160、少なくとも180、少なくとも200、少なくとも201、少なくとも202、少なくとも203、少なくとも204、少なくとも205、少なくとも206、少なくとも207、少なくとも208、少なくとも209、少なくとも210、少なくとも211、少なくとも212、少なくとも213、少なくとも214、少なくとも215、少なくとも216、少なくとも217、少なくとも218、少なくとも219、少なくとも220、少なくとも221、少なくとも222、少なくとも223、少なくとも224、少なくとも225、少なくとも226、少なくとも227、少なくとも228、少なくとも229、少なくとも230、少なくとも231、少なくとも232、少なくとも233、少なくとも234、少なくとも235、少なくとも236、少なくとも237、少なくとも238、少なくとも239、少なくとも240、少なくとも241、少なくとも242、少なくとも243、少なくとも244、少なくとも245、少なくとも246、少なくとも247、少なくとも248、少なくとも249、少なくとも250、少なくとも255、少なくとも260、少なくとも265、少なくとも270、少なくとも275、少なくとも280、少なくとも285、少なくとも290、少なくとも295、少なくとも300、少なくとも325、少なくとも350、少なくとも400、または少なくとも500遺伝子型である。他の実施例では、方法は、500遺伝子型未満、400未満、350未満、300未満、295未満、290未満、285未満、280未満、275未満、270未満、265未満、260未満、255未満、250未満、249未満、248未満、247未満、246未満、245未満、244未満、243未満、242未満、241未満、240未満、230未満、229未満、228未満、227未満、226未満、225未満、224未満、223未満、222未満、221未満、220未満、219未満、218未満、217未満、216未満、215未満、214未満、213未満、212未満、211未満、210未満、209未満、208未満、207未満、206未満、205未満、204未満、203未満、202未満、201未満、200未満、180未満、160未満、140未満、120未満、100未満、80未満、50未満、20未満、18未満、15未満、10未満、または9未満のARMD関連感受性遺伝子型のスクリーニングを用いる。特定のARMD関連感受性遺伝子型の例を表1Aと1Bに示す。
【０２０４】
本明細書で用いる場合、用語「ARMD関連分子」は、ARMD関連核酸分子(例えば、DNA、RNAまたはcDNA)およびARMD関連タンパク質を含む。用語は、表1Aと1Bに記載される分子(および記載されたものに対応する分子)に限定されず、ARMDによってまたはARMDの間に影響を受ける(例えば、濃度、活性、局在性に)、他の核酸分子やタンパク質も含み、本願に記載するそのような分子は全て含まれる。
【０２０５】
ARMD関連遺伝子の例には、CFH、LOC387715、BF、C2、ABCR、フィブリン5、VMD2、TLR4、CX3CR1、CST3、MnSOD、MEHE、パラオキソナーゼ、APOE、ELOVL4、hemicentin-1、GPR75、LAMC1、LAMC2、LAMB3が含まれる。ある例では、異常は少なくとも1つのARMD関連核酸、例としては少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、またはそれ以上のARMD関連核酸分子において検出される。特定の実施例では、開示される方法のいくらかは、500遺伝子型未満、400未満、350未満、325未満、300未満、295未満、290未満、285未満、280未満、275未満、270未満、265未満、260未満、255未満、250未満、249未満、248未満、247未満、246未満、245未満、244未満、243未満、242未満、241 未満、240未満、230未満、229未満、228未満、227未満、226未満、225未満、224未満、223未満、222未満、221未満、220未満、219未満、218未満、217未満、216未満、215未満、214未満、213未満、212未満、211 未満、210未満、209未満、208未満、207未満、206未満、205未満、204未満、203未満、202未満、201未満、200未満、180未満、160未満、140未満、120未満、100未満、80未満、50未満、40未満、30未満、20未満、18未満、11未満、または9未満のARMD関連遺伝子のスクリーニングを用いる。
【０２０６】
本開示法(MERT-ARMD)は、無症候性キャリアの特定に対して高い予測力を持つ、1つのアッセイで総合的なARMDの遺伝的感受性をスクリーニングするための、迅速で、容易、かつ正確で安価な、複数の遺伝子検査法を提供する。開示されるアッセイを、遺伝的なリスクを持つ個体を早期に特定することによって、ARMDの発生率を減少させるために用いることができる。症状が発生する前に個体を発見することにより、効果的な予防手段を講じることができる。
【０２０７】
人種や民族集団間のARMDの有病率の違いや、アフリカ系の集団における低い有病率が報告されている。さらに、人種や民族集団間のARMD感受性に関連する、遺伝子における違い、さらには同一の遺伝子の配列変異における違いが存在する可能性がある。ARMD感受性に関連する遺伝子における変異および/または多型の大多数は白色人種の集団において報告されているが、特定の遺伝的変異の発生における違いを明らかにするデータがアジア系の集団から集められている。例えば、ABCR遺伝子のARMD関連性D2177N やG1961E多型はARMDと統計学的に著しい関係があり、白色人種の集団において、D1177Nキャリアのリスクはおよそ3倍、G1961Eキャリアのリスクは5倍増加していると報告されたが、調査された中国人および日本人のどちらのARMD患者または対照でもこれらは認められず、これはアジア人にこれらの変異が存在しないことを示唆する(Allikmetsら、Am. J. Hum. Genet. 67: 487-491, 2000、Baumら、Ophthalmologic 217: 111-114, 2003、Kuroiwaら、Br. J. Ophthalmol. 83: 613-615, 1999)。一方で、白色人種において1/167名のARMD患者にのみ認められ、220名の対照には認められなかった、ARMD関連性の、稀なABCRT1428M変異が、アジア人の集団ではより頻度が高いことがわかり、日本におけるARMD患者では7/80、対照では8/100の頻度、中国からのARMD患者では18/140、対照では15/95の頻度であり、頻度の高い多型として出現していた(Allikmetsら、Science 277: 1805-1807, 1997、Kuroiwaら、Br. J. Ophthalmol. 83: 613-615, 1999、Baumら、Ophthalmologica 217: 111-114, 2003)。さらに、これまで白色人種では報告されていない、2つのARMD関連性ABCR変異が中国人のARMD患者に認められた。
【０２０８】
その他の例は、白色人種におけるARMDに対する遺伝的危険因子と考えられる変異体である、CFHのY402H多型と、日本人患者におけるARMDの間の関連の欠如と、中国人のARMD患者におけるApoEε4対立遺伝子の保護効果の欠如である(Gotohら、Hum. Genet. 120: 139-143, 2006、Pangら、Ophthalmologica 214: 289-291, 2000)。この情報に基づいて、スクリーニングする対象の人種に応じて、スクリーニングする特定の変異または多型を選択できる。
【０２０９】
臨床材料
対象のARMDに対する遺伝的素因を判定する上で、本開示とともに使用するのに適切な試料には、従来の臨床サンプル、例えば血液または血液分画(例えば、血清)が含まれる。そのようなサンプルを採取するための技術は当技術分野で周知である(例えば、血清サンプルの採取には、Schlugerら、J. Exp. Med. 176: 1327-33, 1992を参照されたい)。血清またはその他の血液分画は、従来の方法で調製することができる。例えば、約200μLの血清を、増幅反応に使用するDNAの抽出に用いることができる。
【０２１０】
サンプルが得られたら、そのサンプルを直接、濃縮して、(例えば、遠心分離またはろ過によって)、精製して、またはそれらの組み合わせで使用することができ、増幅反応を実施する。例えば、市販のキット(例えば、Insta Gene Matrix、BioRad、Hercules、CA、the NucliSens isolation kit、Organon Teknika、Netherlands)を用いて迅速にDNAを調製できる。一実施例では、DNA調製方法は、核酸増幅に利用しやすく、核酸増幅に適したヌクレオチドの調整をもたらす。
【０２１１】
核酸分子の増幅
CFH、LOC387715、BF、C2、ABCR、フィブリン5、VMD2、TLR4、CX3CR1、CST3、MnSOD、MEHE、パラオキソナーゼ、APOE、ELOVL4、hemicentin-1、GPR75、LAMC1、LAMC2、LAMB3配列を含む、対象から採取された核酸サンプルを、検出前に臨床サンプルから増幅できる。一実施例では、DNA配列を増幅させる。別の実施例では、RNA配列を増幅させる。
【０２１２】
任意の核酸増幅方法を用いてもよい。ある特定の、限定されない例では、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)をARMDに関連する核酸配列を増幅するために使用する。その他の典型的な方法には、RT-PCRや転写媒介増幅(TMA)が含まれるがこれに限定されない。
【０２１３】
対象から採取される、増幅されるべき標的配列には、CFH、LOC387715、BF、C2、ABCR、フィブリン5、VMD2、TLR4、CX3CR1、CST3、MnSOD、MEHE、パラオキソナーゼ、APOE、ELOVL4、hemicentin-1、GPR75、LAMC1、LAMC2、LAMB3配列が含まれる。特定の実施例では、増幅されるべきARMD関連標的配列は、CFH、LOC387715、BF、C2、ABCR、フィブリン5、VMD2、TLR4、CX3CR1、CST3、MnSOD、MEHE、パラオキソナーゼ、APOE、ELOVL4、およびhemicentin-1で実質的に構成される、またはこれらのみで構成される。他の実施例では、増幅されるべきARMD関連標的配列は、CFH、LOC387715,ABCR、TLR4、CX3CR1、CST3、MnSOD、MEHE、パラオキソナーゼで実質的に構成される、またはこれらのみで構成される。
【０２１４】
増幅反応においてプライマーを利用できる。プライマーの1つ以上を、例えば、検出可能な放射性標識、蛍光プローブ、またはビオチン分子で標識できる。例えば、ある遺伝子用の一対のプライマーには、ある上流プライマー(下流プライマーに5'を結合する)と下流プライマー(上流プライマーに3'を結合する)が含まれる。増幅反応に用いられるプライマーは、ARMDに関与する核酸の増幅を可能にする選択的プライマーである。プライマーを、表1Aと1Bに記載したある核酸分子、または表1Aと1Bに記載したものによって代表されるものを増幅するために選択してもよい。
【０２１５】
インターナルコントロールとして、追加のセットのプライマーを増幅反応に含めてもよい。 例えば、これらのプライマーは、ある「ハウスキーピング」核酸分子を増幅するために用いられてもよく、また適切な増幅の確認を提供するために機能する。別の実施例では、プライマーハイブリダイゼーション部位を含む標的核酸分子を作成し、増幅反応因子に含めることができる。当業者は、インターナルコントロールプライマーとして機能するプライマーセットを容易に特定できるであろう。
【０２１６】
核酸配列を検出するためのアレイ
特定の実施例では、少なくとも1つのARMD関連遺伝子における異常を検出するための方法は、本願で開示するアレイを用いる。そのようなアレイは核酸分子を含んでもよい。一実施例では、アレイは、野生型または変異型ARMD遺伝子配列、例えば、CFH、LOC387715、BF、C2、ABCR、フィブリン5、VMD2、TLR4、CX3CR1、CST3、MnSOD、MEHE、パラオキソナーゼ、APOE、ELOVL4、hemicentin-1、GPR75、LAMC1、LAMC2、LAMB3をハイブリダイズできる核酸オリゴヌクレオチドプローブを含む。特定の実施例では、あるアレイは、表1A、表1Bに記載される105のARMD関連反復変異またはそれらのサブセットを認識可能なオリゴヌクレオチドを含む。他の実施例では、あるアレイは、変異型および野生型両方のCFH、LOC387715、BF、C2、ABCR、フィブリン5、VMD2、TLR4、CX3CR1、CST3、MnSOD、MEHE、パラオキソナーゼ、APOE、ELOVL4、およびhemicentin-1配列を認識可能なオリゴヌクレオチドプローブを含む。そのようなアレイ(加えて本願で開示される方法)のいくつかは、表1Aと1Bに記載されていないARMD関連分子だけでなく、他の配列、例えば1つ以上のハウスキーピング遺伝子を認識する1つ以上のプローブを含むことができる。
【０２１７】
ARMDに関与する増幅配列、例えば、CFH、LOC387715、BF、C2、ABCR、フィブリン5、VMD2、TLR4、CX3CR1、CST3、MnSOD、MEHE、パラオキソナーゼ、APOE、ELOVL4 hemicentin-1 GPR75、LAMC1、LAMC2、LAMB3配列の存在を検出するために、特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いてアレイを利用することができる。本願では「ARMD検出アレイ」と呼ぶアレイは、ARMDの発症に対する対象の遺伝的感受性を判定するために使用される。一実施例では、オリゴヌクレオチドプローブセット、例えば、SEQ ID NO:1〜210に示されるもの(またはそれらのサブセット)は、ARMD関連配列、例えば、対象から得られた増幅核酸配列の検出に使用するために、固体支持体の表面に貼り付けられる。さらに、あるインターナルコントロール用核酸配列が増幅反応において増幅された場合(上記参照)、この増幅核酸分子の存在を検出するためにあるオリゴヌクレオチドプローブを含めてもよい。
【０２１８】
アレイに張りつけたオリゴヌクレオチドプローブは、増幅反応において増幅された配列と特異的に結合することができる(例えば、高ストリンジェントな条件下で)。故に、本方法とともに使用する配列は、ARMD関連配列、例えば、CFH、LOC387715、BF、C2、ABCR、フィブリン5、VMD2、TLR4、CX3CR1、CST3、MnSOD、MEHE、パラオキソナーゼ、APOE、ELOVL4、hemicentin-1、GPR75、LAMC1、LAMC2、LAMB3遺伝子配列を認識するオリゴヌクレオチドプローブである。そのような配列は、異なる種の配列を検査すること、特定の野生型または変異型配列(例えば、表1Aと1Bに記載されるもの、または表1Aと1Bに記載されるものによって代表されるもの)と特異的にアニーリングを行うが、他のものとは行わないプライマーを選択することによって決定することができる。特定の例は、SEQ ID NO:1〜210に示したが、本開示はそれらのプローブだけの使用に限定されない。当業者は、他の増幅されたARMD関連核酸配列の検出のために、固体の支持体表面に貼り付けることが可能な他のARMD関連オリゴヌクレオチド分子を特定できるであろう。ARMD関連配列、例えば、CFH、LOC387715、BF、C2、ABCR、フィブリン5、VMD2、TLR4、CX3CR1、CST3、MnSOD、MEHE、パラオキソナーゼ、APOE、ELOVL4、hemicentin-1、GPR75、LAMC1、LAMC2、LAMB3配列の少なくとも15、20、25、30、35、40、またはそれ以上の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを用いてもよい。
【０２１９】
本開示に従う方法および装置は、適切な条件下において、オリゴヌクレオチドが、相補的な塩基配列を持つ核酸分子と塩基対二本鎖を形成するという事実を利用する。二本鎖の安定性は、オリゴヌクレオチドの長さ、塩基の組成、ハイブリダイゼーションが生じる溶液の組成をはじめとする多くの要素に依存する。二本鎖の安定性に対する塩基組成の効果は、ハイブリダイゼーションを特定の溶液、例えば、高濃度の第三級または第四級のアミンの存在下で実施することによって低下する可能性がある。
【０２２０】
二本鎖の温度安定性もまた、配列間の配列類似性の度合いに依存する。標的配列と、アレイに結合するオリゴヌクレオチド間に形成されると予想される二本鎖の種類の、予想されるTmに近い温度でハイブリダイゼーションを実施することで、二本鎖ミスマッチの形成率はかなり減少する可能性がある。
【０２２１】
アレイに用いる各オリゴヌクレオチド配列の長さを、標的ARMD関連核酸配列の結合を最適化するために選択することができる。特定のスクリーニング条件下で、特定のARMD関連核酸配列とともに使用するための最適な長さは実験的に決定できる。故に、アレイに含まれるオリゴヌクレオチド配列のセットのそれぞれの個々の要素の長さをスクリーニング用に最適化できる。一実施例では、オリゴヌクレオチドプローブは長さが約20〜約35ヌクレオチド、または長さが約25〜約40ヌクレオチドである。
【０２２２】
アレイを形成するオリゴヌクレオチドプローブ配列は、例えば、プローブの5'-または3'末端を介して支持体に直接結合してもよい。一実施例では、オリゴヌクレオチドは5'末端によって固体支持体に結合する。しかし、当業者は、オリゴヌクレオチドの3'末端または5'末端の使用が、固体支持体への結合に適切かどうかを決定できる。概して、相補性3'末端と5'末端の領域におけるオリゴヌクレオチドプローブの内部相補性が、支持体への結合を決定する。代替的には、オリゴヌクレオチドプローブは、非ARMD関連配列、例えば、固体支持体へのスペーサーまたはリンカーとして機能するオリゴヌクレオチドまたはその他の分子によって、支持体に結合してもよい。
【０２２３】
マイクロアレイ材料
特定の実施例では、マイクロアレイ材料はガラス(二酸化ケイ素)から作られる。固体支持体に適切な二酸化ケイ素の種類にはアルミノケイ酸塩、ホウケイ酸塩、シリカ、ソーダライム、亜鉛チタニア、石英ガラスが含まれるがこれに限定されない(例えば、Schena、Microarray Analysis. John Wiley ＆ Sons, Inc, Hoboken、New Jersey、2003を参照されたい)。核酸のガラス表面への貼り付けは、当技術分野で既知の方法、例えば、有機ポリマーから形成される表面処理によって行うことができる。特定の例には、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリイソブチレン、ポリブタジエン、ポリイソプレン、ポリビニルピロリジン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンジフルオライド、ポリフルオロエチレン-プロピレン、ポリエチレンビニルアルコール、ポリメチルペンテン、ポリクロロトリフルオロエチレン、polysulfornes、水酸化2軸延伸ポリプロピレン、アミノ化2軸延伸ポリプロピレン、チオール化2軸延伸ポリプロピレン、エチレンアクリル酸、thylene methacrylic acid、それらの共重合体の混合(参照することにより本願に引用したものとする米国特許第5,985,567号を参照されたい)、化学的に活性なアミンまたはアルデヒド基を提供するオルガノシラン化合物、マイクロアレイのエポキシまたはポリリシン処理が含まれるがこれに限定されない。固体支持体表面の別の例はポリプロピレンである。
【０２２４】
概して、固体支持体表面を形成するのに使用できる材料の適切な特性には、そのような 活性化に際して、その支持体の表面が、生体分子、例えば、オリゴヌクレオチドをその場所へ共有結合できるように、表面の活性化の影響を受けやすいことと、生体分子の「in situ」合成の影響を受けやすいことと、支持体上の、オリゴヌクレオチドが存在しない領域が非特異的な結合の影響を受けないように化学的に不活性であることと、あるいは非特異結合が起こった場合、そのような材料を、オリゴヌクレオチドを除去することなく、表面から容易に除去できることが含まれる
【０２２５】
一実施例では、表面処理は、アミン含有シラン誘導体である。アミン表面への核酸の貼り付けは、DNA骨格上の負に荷電したリン酸基と正に荷電したアミノ基間の反応によって起こる(参照することにより本願に引用したものとするSchena, Micraoarray Analysis. John Wiley ＆ Sons, Inc, Hoboken, New Jersey、2003)。別の実施例では、反応性アルデヒド基を表面処理として用いる。アルデヒド表面への貼り付けは、目的とするDNAへの5'-アミノ基またはアミノリンカーの添加によって行われる。アミンリンカー上の、アルデヒド基の陽性炭素原子と反応する非結合電子対が求核剤として働く場合に結合が起こる(同文献)。
【０２２６】
本開示に従って、様々なアレイフォーマットを用いることができる。一例には、当技術分野でディップスティックと通常呼ばれる、オリゴヌクレオチドバンドのリニアアレイが含まれる。別の適切なフォーマットには、分離細胞の二次元パターン(例えば、64×64アレイ中の4096スクエア)が含まれる。当業者は理解するように、その他のアレイフォーマットには、スロット(長方形)が含まれるがこれに限定されず、円形アレイも同様に使用に適している(参照することにより本願に引用したものとする米国特許第5,981,185号を参照されたい)。一実施例では、アレイは糸、膜、またはフィルムのポリマー媒体上に形成される。有機ポリマー媒体の一例は、約1ミル(0.001インチ)〜約20ミルの厚さのポリプロピレンシートであるが、フィルムの厚さは重要ではなくかなり広い範囲で変化することができる。今回、アレイの作成用に特に開示されるのは、2軸延伸ポリプロピレン(BOPP)フィルムであり、BOPPフィルムは、耐久性に加えて、バックグラウンドの蛍光発光が低い。特定の実施例では、アレイは固相の、対立遺伝子特異性オリゴヌクレオチド(ASO)ベース核酸アレイである。
【０２２７】
本開示のアレイフォーマットは、様々な異なるタイプのフォーマットに含めることができる。「フォーマット」は、固体支持体を貼り付けることができる任意のフォーマット、例えば、マイクロタイタープレート、試験管、無機性シート、ディップスティックなどをも含む。例えば、固体支持体がポリプロピレン糸の場合、1つ以上のポリプロピレン糸をプラスチックディップスティックタイプの装置に貼り付けることができ、ポリプロピレン膜はガラススライドに貼り付けることができる。特定のフォーマットは、それ自体は重要ではない。固体支持体を、その固体支持体、またはそれに吸収されるいずれのバイオポリマーの機能的作用に影響を与えずに、そこに貼り付けられること、ならびにフォーマット(例えば、ディップスティックまたはスライド)が、装置が導入されるいかなる材料(例えば、臨床サンプルやハイブリダイゼーション溶液)にも適していることが必要なのである。
【０２２８】
本開示のアレイは様々な手法で作成できる。一実施例では、オリゴヌクレオチド配列を個別に合成した後、固体支持体に貼り付ける(参照することにより本願に引用したものとする米国特許第6,013,789号を参照されたい)。別の実施例では、所望のアレイを提供するために、配列を直接支持体上で合成していく(参照することにより本願に引用したものとする米国特許第5,554,501号を参照されたい)。固体支持体にオリゴヌクレオチドを共有結合で貼り付ける、および支持体上にオリゴヌクレオチドを直接合成するのに適切な方法は当業者に既知である。適切な方法の概要はMatson et al., Anal. Biochem. 217: 306-10, 1994に認められる。一実施例では、オリゴヌクレオチドを固体支持体に作成するための従来の化学的技術を用いて、オリゴヌクレオチドを支持体上に合成する(例えば、参照することにより本願に引用したものとするPCT出願WO85/01051およびWO89/10977、または米国特許第5,554,501号を参照されたい)。
【０２２９】
アレイの細胞中にオリゴヌクレオチドを合成する自動手段を用いて、4つの塩基の前駆体を既定のパターンに定めることで適切なアレイを作成できる。簡単に言うと、基板全体に平行に並んだオリゴヌクレオチドプローブ集団(デリバリーシステム中のチャネルの数に、数の上で対応する)を作成するために、マルチチャネルの自動化学デリバリーシステムを用いる。第一の方向のオリゴヌクレオチド合成の終了後、基板を90°回転させ、第一のセットと直角になる第二の(2°)列のセット内での合成を行う。このプロセスにより、マルチチャネルアレイが作成され、その交点が複数の離散細胞をもたらす。
【０２３０】
特定の実施例では、アレイ上のオリゴヌクレオチドプローブは、オリゴヌクレオチドプローブ:標的配列ハイブリダイゼーション複合体の検出を可能にする1つ以上の標識を含む。
【０２３１】
核酸の検出
対象から得られる核酸分子は、ARMDに関連する1つ以上の遺伝子、例えば、表1Aと1Bに記載されるものにおいて、1つ以上の挿入、欠失、置換、またはそれらの組み合わせを含む可能性がある。ARMDの発症に対して対象が遺伝的素因を持つかどうかを判定するために、そのような変異または多型(または両方)を検出することができる。ある核酸分子を検出する任意の方法、例えば物理的または機能的アッセイをも使用できる。
【０２３２】
核酸分子を、それらを検出できるように標識する方法は周知である。そのような標識の例には、非放射性標識や放射性標識が含まれる。非放射性標識には、酵素、化学発光化合物、蛍光化合物(例えば、FITC、Cy3、Cy5)、金属複合体、ハプテン、酵素、比色物質、色素、またはそれらの組み合わせが含まれるがこれに限定されない。放射性標識には、125Iや35Sが含まれるがこれに限定されない。例えば、放射性および蛍光標識法に加えて、当技術分野で既知のその他の方法が、本開示とともに使用するのに適している。一実施例では、対象の核酸を増幅するのに用いるプライマーを標識する(例えば、ビオチン、放射性標識、または蛍光プローブを用いて)。別の実施例では、標識増幅材料を作成するために、増幅された核酸サンプルを末端標識する。例えば、標識ヌクレオチドを増幅反応に含めることによって、増幅核酸分子を標識することができる。
【０２３３】
ARMDに関連する増幅核酸分子を、ハイブリダイゼーション複合体を形成するのに適した条件下で、ARMD検出アレイに加える。特定の実施例では、増幅核酸分子は標識を含む。一実施例では、有機化合物の前処理液、有機化合物を含む溶液、またはお湯をハイブリダイゼーションの前に加える(参照することにより本願に引用したものとする米国特許第5,985,567号を参照されたい)。
【０２３４】
アレイと標的材料の既知の組み合わせのためのハイブリダイゼーション条件を、予想される二本鎖のTmに近い実験的方法で日常的に最適化し、これにより、この方法の識別力を最大にすることができる。アレイ内の場所、例えば、結合が起こる細胞はの識別は、迅速かつ正確な、増幅材料中に存在する、ARMDに関連する配列の識別を可能にする(下記参照)。
【０２３５】
ハイブリダイゼーション条件は、一致した、また不一致のオリゴヌクレオチド間の識別を可能にするように選択される。標準的な手技においてフィルタへのハイブリダイゼーションに適することが知られるものに対応するように条件を選択した後、本開示のアレイとともに使用するために最適化してもよい。例えば、一種類の標的のハイブリダイゼーションに適した条件は、アレイのために、その他の標的の使用のために調整されるであろう。特に、厳密に相補的なARMD関連野生型の変異配列以外の配列間の、二本鎖の形成を大幅に除去するために温度を制御する。様々な既知のハイブリダイゼーション溶媒を用いることができるが、選択は当業者の判断次第である(参照することにより本願に引用したものとする米国特許第5,981,185号を参照されたい)。
【０２３６】
ARMDに関連する増幅核酸分子がARMD検出アレイ中に存在するオリゴヌクレオチドとハイブリダイズした後は、ハイブリダイゼーション複合体の存在を、例えばその複合体を検出することによって、解析できる。
【０２３７】
オリゴヌクレオチドプローブのあるアレイにおいてハイブリダイズした複合体を検出する工程は、これまでに説明されている(参照することにより本願に引用したものとする米国特許第5,985,567号を参照されたい)。一実施例では、検出は、オリゴヌクレオチド、増幅配列、または両方上に存在する1つ以上の標識を検出する工程を含む。特定の実施例では、発現させる工程は、緩衝液を加える工程を含む。一態様では、緩衝液は、クエン酸ナトリウム緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液、塩化テトラメチルアンモニウム、クエン酸ナトリウム緩衝液含有エチレンジアミン四酢酸、クエン酸ナトリウム緩衝液含有ドデシル硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム緩衝液含有エチレンジアミン四酢酸、リン酸ナトリウム緩衝液含有ドデシル硫酸ナトリウム、塩化テトラメチルアンモニウム含有エチレンジアミン四酢酸、塩化テトラメチルアンモニウム含有ドデシル硫酸ナトリウム、またはそれらの組み合わせである。しかし、その他の適切な緩衝溶液もまた使用できる。
【０２３８】
検出は、ハイブリダイズした複合体と検出標識の共役または結合を生じさせるため、ハイブリダイズした複合体を、共役溶液で処理する工程と、共役したハイブリダイズした複合体を検出試薬で処理する工程をさらに含んでもよい。一実施例では、共役溶液は、ストレプトアビジンアルカリフォスファターゼ、アビジンアルカリフォスファターゼ、または西洋ワサビペルオキシダーゼを含む。共役試薬の、特定の限定されない例には、ストレプトアビジンアルカリフォスファターゼ、アビジンアルカリフォスファターゼ、または西洋ワサビペルオキシダーゼが含まれる。共役した、ハイブリダイズした複合体を検出試薬で処理してもよい。一実施例では、検出試薬は、酵素標識蛍光試薬、または比色試薬を含む。1つの特定の限定されない例では、検出試薬はMolecular Probes, Inc.(Eugene, OR)の酵素標識蛍光試薬(ELF)である。その後、ハイブリダイズした複合体を検出装置、例えば、紫外線(UV)トランスイルミネーター(Upland,CAのUVP,Inc社製)に設置できる。シグナルが発現し、シグナル強度の増強を記録装置、例えば、電荷結合素子(CCD)カメラ(Tucson, AZのPhotometries, Inc社製)で記録できる。特定の実施例では、これらの工程は放射性標識を使用する場合には行わない。
【０２３９】
特定の実施例では、方法は、例えばハイブリダイゼーションの量を決定することによる定量化をさらに含む。
【０２４０】
V.キット
本開示は、対象、例えば、その他の点では健康な対象が、遺伝的にARMDを発症しやすいかどうかを判定するために用いることができるキットを提供する。そのようなキットを用いると、ある対象が、表1Aと1Bに記載されたものをはじめとする、ARMDに関連する配列に1つ以上の遺伝子変異または多型を持つかどうかを判定できる。
【０２４１】
開示されるキットは、キットの標的である、あるARMD関連分子(例えば、変異型または野生型核酸分子)と選択的にハイブリダイズするある結合分子、例えば、あるオリゴヌクレオチドプローブを含む。一実施例では、キットは、SEQ ID NO:1〜210に示されるオリゴヌクレオチドプローブ、またはそれらのサブセット、例えば、SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、および209(野生型ARMD関連配列を検出するため)、あるいはSEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、および210(変異型ARMD関連配列を検出するため)を含む。別の実施例では、キットは、SEQ ID NO:1〜210で示される配列からデザインされる少なくとも20のプローブ、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも125、少なくとも150、少なくとも175、少なくとも200、少なくとも225、または少なくとも250のプローブを含む。プローブは、SEQ ID NO:1〜210のいずれかの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、例えばSEQ ID NO:1〜210のいずれかの少なくとも16の連続ヌクレオチド、例えば少なくとも17の連続ヌクレオチド、例えば少なくとも18の連続ヌクレオチド、例えば少なくとも19の連続ヌクレオチド、例えば少なくとも20の連続ヌクレオチド、例えば少なくとも21の連続ヌクレオチド、例えば少なくとも22の連続ヌクレオチド、例えば少なくとも23の連続ヌクレオチド、または例えば少なくとも24の連続ヌクレオチドを含むことができる。
【０２４２】
特定の実施例では、キットは、野生型ARMD関連タンパク質、または変異型または多型性タンパク質に結合できる抗体を含む。そのような抗体は、野生型と、変異型または多型性ARMD関連タンパク質間を識別する能力を持つ。
【０２４３】
キットは、1つ以上の緩衝溶液、目的のシグナルを発現させるための共役溶液、目的のシグナルを検出するための検出試薬を、それぞれ個別の包装、例えば容器に入った状態でさらに含むことができる。別の実施例では、キットは、陽性コントロールとして機能するための、あるARMD検出アレイとのハイブリダイゼーション用の複数のARMD関連標的核酸配列を含む。標的核酸配列は、オリゴヌクレオチド、例えば、DNA、RNA、ペプチド核酸を含むことができる、またはPCRフラグメントを含むことができる。
【０２４４】
VI. ARMD療法
ARMDを予防する、または治療するための方法が本願で開示される。一実施例では、ある疾患または病態の徴候または症状、例えば、ARMDの徴候または症状が治療される。特定の実施例では、治療は、例えば、疾患の完全な発症を抑制する、例えば、ARMDの発症の抑制による疾患の予防を含む。疾患の予防は、その疾患が完全にない状態を必要としない。例えば、少なくとも25％の軽減は十分である。
【０２４５】
一実施例では、治療は、ARMDの発症に対して遺伝的素因を持つを判定された対象において、ARMDの発生を回避するまたは減少させる工程を含む。例えば、上述のスクリーニング方法を用いて、対象における少なくとも1つのARMD関連分子中の変異または多型が検出された場合、ARMDの発生を回避する、または減少させるため、あるいはARMDの発症を遅らせるため、対象によって生活様式が選択されてもよい。例えば、対象は、喫煙を中止したり、脂質の摂取量を減らすために食生活を変えたり、抗酸化ビタミンやミネラル補給の摂取量を増やしたり、または網膜新生血管の発生を抑制する、予防量の薬剤を摂取するかもしれない。一部の実施例では、選択される治療は、1つ以上のARMD関連分子に対するプロファイルの解析に基づいて、対象に固有に調整される。そのような治療は、経験のある臨床医が決定することができる。
【０２４６】
本開示は、以下の限定されない実施例によってさらに説明される。
【０２４７】
実施例1
ARMDに関連する変異および多型
この実施例は、現在知られている全てのARMD関連核酸およびタンパク質配列を提供する。
【０２４８】
表1Aは、20の異なる遺伝子における、ARMD関連変異および多型のスクリーニングを可能にするアレイをデザインするのに用いられる、現在知られている全てのARMD関連核酸およびタンパク質配列を記載する。一実施例では、あるアレイは、16の異なる遺伝子における105のARMD関連変異および多型をスクリーニングするようにデザインされ、16の異なる遺伝子は、CFH、LOC387715、BF、C2、ABCR、フィブリン5、VMD2、TLR4、CX3CR1、CST3、MnSOD、MEHE、パラオキソナーゼ、APOE、EL0VL4、およびhemicentin-1(表1B)である。当業者は、現在は特定されていないさらなるARMD関連変異および多型もまた使用できることを理解するであろう。変異/多型の各潜在的部位については、2つのオリゴヌクレオチドプローブがデザインされてもよい(実施例3参照)。
【０２４９】
（表１Ａ）ARMDに関連する典型的な変異
2009514534.tif 000003
2009514534.tif 000004
2009514534.tif 000005
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【０２５０】
（表１Ｂ）16の異なる遺伝子において、105のARMD関連変異を検出するために使用可能な典型的な核酸プローブ
2009514534.tif 000007
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【０２５１】
実施例2
ARMDの予測における統計学的解析
この実施例は、たとえリスクに対する各遺伝子型の寄与が小さく、ARMDをもたらすのに十分でないとしても、ARMDを発症するリスクが非常に高い個体を特定する上で、ARMD関連性の105の遺伝子型を同時に評価することによって、MERT-ARMDが非常に重要な臨床的価値を提供することを示す。
【０２５２】
下記に記載する結果は、複数の遺伝的素因因子を同時に検討することで、加齢黄斑変性の遺伝的感受性の予測が大きく向上することを示す。加齢黄斑変性のための複数の遺伝子検査を同時におこなうことが、いかに加齢黄斑変性に対する遺伝的感受性の予測を向上させるかを示すため、単一のARMDリスク関連遺伝子欠損のそれぞれの尤度比を、加齢黄斑変性関連性遺伝的感受性の実際のデータを用いてロジスティック回帰によってコンピュータで算出した後、ARMDリスク関連感受性遺伝子検査のパネルの混合尤度比(LR)を、各検査がそうでないと証明されるまでは独立していると考えて、個々の検査の尤度比(LR)の結果として算定した。
【０２５３】
MERT-ARMDの臨床的妥当性を検査するために、各ARMD関連遺伝子型陽性検査結果の陽性適中率、その後検査結果のパネルの組み合わせの陽性適中率を算定した。
【０２５４】
算定に関しては、対照とARMD患者の両方において有病率が確立された、11のARMDリスク関連遺伝子中の14のARMDリスク関連遺伝子型を選択した。
【０２５５】
CFHのY402H多型、LOC387715のAla69Ser多型、TLR4のD299G多型、フィブリン5のARMD関連変異、ABCRのD2177N多型、ABCRのG1961E多型、ABCRのARMD関連変異、VMD2のARMD関連変異、CX3CR1多型、CST B/B遺伝子型、MnSOD多型、MEHE多型、パラオキソナーゼGln-Arg192多型、およびパラオキソナーゼLeu-Met54多型に関して、これまでに報告されたデータを用いて遺伝子型の頻度を導いた(Edwards et al., Science 308: 421-424, 2005、Zareparsi et al., Am. J. Hum. Genet. 77: 149-153, 2005、Hageman et al., PNAS 102: 7227-7232, 2005、Allikmets et al., Am. J. Hum. Genet. 67: 487-491, 2000、Allikmets et al., Science 277: 1805-1807, 1997、De La Paz et al., Ophthalmology 106: 1531-1536, 1999、Webster et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 42: 1179-1189, 2001, Baum et al., Ophthalmologica 217: 111-114, 2003、Allikmets et al., Hum. Genet. 104: 449-453, 1999、Lotery et al., Inves. Ophthalmol Vis. Sci. 41: 1292-1296, 2000、Stone et al., N. Engl. J. Med. 352: 346-353, 2004、Tuo et al., FASEB. J 18: 1297-1299, 2004、Zurdel et al., Br. J. Ophthalmol. 86: 214-219, 2002、Kimura et al., Am. J. Ophthalmol. 130: 769-773, 2000、Ikeda et al., Am. J. Ophthalmol. 132: 191-195, 2001、Rivera et al., Hum. Mol. Genet. 14: 3227-3236, 2005、およびZareparsi et al., Hum. Mol. Genet. 14: 1449-1455, 2005)(表2)。
【０２５６】
（表２）加齢黄斑変性患者と対応対照におけるARMDリスク関連遺伝子型の頻度
2009514534.tif 000013
【０２５７】
前述のようにこれまでに報告された、各ARMD関連遺伝子型に関する症例対照研究から得られたデータを用いて、ロジスティック回帰の結果の累乗法により、11のARMDリスク関連遺伝子中の14のARMDリスク関連遺伝子型のそれそれのLRを算定した(Albert, Clin. Chem. 28: 1113-9, 1982、McCullagh and Nelder, Chapman and Hall, London, 1989、Yang et al., Am. J. Hum. Genet., 72: 636-49, 2003)。
【０２５８】
米国では1,359人につき一人(0.07％)と概算されている、加齢黄斑変性の事前リスク(一般集団における加齢黄斑変性の総合発生率)を用いて、加齢黄斑変性の事後確率(加齢黄斑変性を発症する可能性)を、各遺伝子検査に関する遺伝子型陽性検査結果を持つ個体について決定した(各遺伝子検査の陽性適中率としても知られる)。
【０２５９】
フィブリン5のARMD関連変異、ABCRのARMD関連変異、VMD2のARMD関連変異のLRが、おそらくこれらが対照には存在しないことに関連して、極値、例えば、フィブリン5のARMD関連変異で1722435010、ABCRのARMD関連変異で1153423138、VMD2のARMD関連変異で1080866402を示したため、これらが対照に比べてARMD患者において有意に頻度が高いことがわかっているにもかかわらず、これらは残りの計算から除外した。
【０２６０】
次に、9つの異なる遺伝子中の11の遺伝子欠損のそれぞれを独立したものと考え、混合LRを、個々の検査結果の尤度比の結果として、11のARMD関連遺伝的感受性検査のパネルについて算定した(Yang et al., Am. J. Hum. Genet. 72:639-646、2003)。11のARMDリスク関連感受性遺伝子検査のそれぞれと、検査の組み合わせについて算定した尤度比と陽性適中率を表3に示した。
【０２６１】
（表３）単一の感受性遺伝子と、加齢黄斑変性の遺伝的リスクを評価するためのM.E.R.T.-ARMDを用いる、複合遺伝子スクリーニングの尤度比と陽性適中率
2009514534.tif 000014
【０２６２】
表3に示すように、各遺伝子検査が、加齢黄斑変性の発症の可能性に関して限られた予測情報を提供する(疾患の事後確率は、各検査単独で0.1％〜0.98％に及ぶ)一方で、MERT-ARMDを用いることによって、加齢黄斑変性発生の事後確率は98％にまで上昇し、これは90倍を超える上昇である。
【０２６３】
実施例3
ARMDに対する感受性を検出するためのアレイ
変異/多型の各潜在的部位については(表1Aと1B)、2つのオリゴヌクレオチドプローブをデザインする。第一のものは、野生型配列(SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、および209)に相補的で、第二のものは変異型配列(SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102,104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、および210)に相補的である。例えば、第一のプローブは、野生型CFH配列に相補的であり、第二のプローブは変異型CFH配列に相補的であり、これをY402H変異体の存在をの検出に用いることができる。オリゴヌクレオチドプローブは、プローブと標的配列間のハイブリダイゼーションシグナルの検出を可能にするため、1つ以上の検出可能な標識をさらに含むことができる。
【０２６４】
ハイブリダイゼーションシグナルの「ロス」および「ゲイン」の集合によって、105のARMD関連欠損に関する個体の遺伝的状態が明らかになる。
【０２６５】
実施例4
核酸ベース解析
本願で提供されるARMD関連核酸分子を、野生型核酸分子と比較したARMD関連核酸分子多型/変異により、ARMDの素因に関する遺伝子検査の方法において使用することができる。そのような手技については、あるARMD関連核酸分子、例えば、表1Aと1Bに記載されるものにおける、多型または変異(または両方)に関して対象の生体サンプルを検査する。適切な生体サンプルには、対象の細胞、例えば、末梢血、尿、唾液、組織生検、外科材料、羊水穿刺サンプル、剖検材料に存在するものから採取された、ゲノムDNAまたはRNA(mRNAを含む)を含むサンプルが含まれる。
【０２６６】
生体サンプル中の、1つ以上のARMD関連核酸分子、例えば、表1Aと1Bに記載されるものにおける多型/変異の検出は、方法、例えば、対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチド(ASO)を用いるハイブリダイゼーション(Wallace et al., CSHL Symp. Quant. Biol. 51 :257-61, 1986)、DNA直接シークエンシング(Church and Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1991-1995, 1988)、制限酵素の使用(Flavell et al., Cell 15: 25, 1978、Geever et al., 1981)、変性剤を用いた、ゲル中の電気泳動移動度に基づく識別(Myers and Maniatis, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 275-84, 1986)、RNaseプロテクション(Myers et al., Science 230: 1242, 1985)、化学分解(Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4397-401, 1985)、リガーゼ仲介検出手技(Landegren et al., Science 241: 1077, 1988)によって行うことができる。
【０２６７】
野生型または変異型ARMD関連配列に特異的なオリゴヌクレオチドを、市販されている機械を用いて化学的に合成できる。次に、これらのオリゴヌクレオチドを、例えば、放射性同位元素(例えば、32P)または非放射性標識、例えば、ビオチン(Ward and Langer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6633-6657, 1981)、または蛍光プローブで標識し、ドットブロット法、または電気泳動後にゲルから切り出すことで、メンブレンまたはその他の固体の支持体に固定化した個々のDNAサンプルとハイブリダイズさせる。これらの特異的配列は、方法、例えば、オートジオグラフィーまたは蛍光反応(Landegren et al., Science 242: 229-237, 1989)または比色反応(Gebeyehuら、Nucleic Acids Res. 15: 4513-4534, 1987)によって可視化される。野生型対立遺伝子に特異的なASOを用いると、ハイブリダイゼーションがない場合、遺伝子の特定の領域における変異または多型を示唆する。対照的に、変異対立遺伝子に特異的なASOが臨床サンプルとハイブリダイズした場合、これはASOによって定められる領域における変異または多型の存在を意味する。
【０２６８】
実施例5
タンパク質ベース解析
この実施例では、ある量のARMD関連タンパク質における欠損を検出するため、またはアミノ酸配列それ自体における変化を検出するために用いることが出来る方法を説明する。ARMD関連性タンパク質配列を、野生型タンパク質と比較したARMD関連タンパク質多型または変異(または両方)により、ARMDの素因に関する遺伝子検査の方法において使用することができる。用いることができる。そのような手技では、対象の生体サンプルを、あるARMD関連タンパク質、例えば、表1Aと1Bに記載されるものにおける多型または変異について分析する。適切な生体サンプルには、対象の細胞から得られるタンパク質を含むサンプル、例えば、末梢血、尿、唾液、組織生検、外科材料、羊水穿刺サンプル、剖検材料に存在するものが含まれる。
【０２６９】
対象において、1つ以上のARMD関連タンパク質の量の変化は、対象にARMDの発症に対する感受性の増加があることを示しうる。同様に、野生型タンパク質と比較して、あるARMD関連タンパク質において1つ以上の変異または多型が存在すると、その対象に、ARMDの発症に対する感受性の増加があることを示しうる。
【０２７０】
正常な対象(例えば、ARMDの発症の素因がない対象)における発現と比較した、ARMD関連タンパク質濃度の変化(例えば、減少、または増加)の判定は、上記で概要を述べた方法による、ARMD関連核酸変異または多型の存在の直接的な測定に対する代替的または補足的な手法である。特定のARMD関連タンパク質(1つまたは複数)に特異的な抗体を利用できると、当技術分野で周知多くの免疫測定法、例えば、Harlow and Lane(Antibodies, A Laboratory Manual, CSHL, New York、1988)に記載されるものなどの1つによる、細胞のARMD関連タンパク質(1つまたは複数)の検出と定量化が容易になる。そのような抗体を作成する方法は当技術分野で既知である。
【０２７１】
野生型ARMD関連タンパク質と比較した、あるARMD関連タンパク質における1つ以上の変異または多型の存在の判定は、上記で概要を述べた方法による、ARMD関連核酸変異または多型の存在の直接的な判定に対する、別の代替的、または補足的な手法である。変異型または多型性タンパク質と野生型タンパク質間を区別できる抗体を、当技術分野で既知の方法を用いて作成できる。
【０２７２】
ARMD関連ポリペプチドまたはタンパク質濃度を測定するために、またARMD関連タンパク質における変異または多型を検出するために、標準的な免疫測定フォーマット(例えば、ELISA、ウエスタンブロット、またはRIAアッセイ)のいずれかを用いることができる。野生型(正常)ARMD関連タンパク質濃度との比較や、ARMD関連ポリペプチド濃度の変化は、ARMDの発症の素因を示唆するものである。同様に、1つ以上の変異または多型性ARMD関連タンパク質の存在は、ARMDの発症の素因を示唆するものである。免疫組織化学技術もまた、ARMD関連ポリペプチドまたはタンパク質の検出や定量に利用することができる。例えば、ある対象から組織サンプルを採取し、適切なARMD関連タンパク質に特異的な結合剤と、いずれかの標準的な検出系(例えば、西洋わさびペルオキシダーゼと複合体化させた二次抗体を含むもの)を用いて、野生型または多型性または変異型ARMD関連タンパク質の存在に関して切片を染色できる。そのような技術に関する一般的な手引きは、BancroftおよびStevens(Theory and Practice of Histological Techniques, Churchill Livingstone, 1982)やAusubelら(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, New York, 1998)に認められる。
【０２７３】
あるARMD関連タンパク質を定量する目的で、細胞タンパク質を含む対象の生体サンプルを用いることができる。あるARMD関連タンパク質の定量は免疫測定によって行うことができ、ARMDの発症の遺伝的素因を持たない対象からの細胞中に認められたタンパク質の濃度とその量を比較する。正常なヒトの細胞中に認められる同じARMD関連タンパク質の量と比較した、対象の細胞中の1つ以上のARMD関連タンパク質の量の有意な変化は、通常は約30％、またはそれ以上の差である。1つ以上のARMD関連タンパク質(1つまたは複数)の著しい発現の低下または過剰発現は、ARMDの発症に対する遺伝的素因を示しうる。
【０２７４】
実施例6
キット
対象が、あるARMD関連核酸配列(例えば、ARMD検出アレイを含むキット)における1つ以上の変異(例えば、多型)を持つかどうかを判定するためのキットが提供される。あるアレイ上のオリゴヌクレオチドと対象から増幅されたARMD関連核酸間に形成されたハイブリダイゼーション複合体を検出するのに必要な試薬を含むキットもまた提供される。これらのキットは、それぞれ説明書、例えば決定された(例えば、実験的に測定された)値と比較するための検量線またはチャートを提供する説明書を含むことができる。
【０２７５】
一実施例では、キットは、ARMD関連核酸分子、例えば、表1Aと1Bに記載されるものを増幅することができるプライマーを含む。特定の実施例では、プライマーは、水溶液に懸濁されて、またはフリーズドライすなわち凍結乾燥パウダーとして提供される。プライマーが提供される容器(1つまたは複数)は、提供された形態を入れることができるいずれかの従来の容器、例えばマイクロフュージチューブ、アンプル、またはボトルであってもよい。いくつかの応用では、プライマーのペアは、個別の、通常は使い捨てのチューブまたは同等の容器に、予め測定された単回使用量で提供される。
【０２７６】
キットに提供される各プライマーの量は、例えば、その製品が標的とする市場に応じてどのような量であってもよい。例えば、研究または臨床の用途にキットを合わせる場合、提供される各オリゴヌクレオチドプライマーの量は、複数回のインビトロ増幅反応を行うのに十分な量になることが多い。当業者は、単回の増幅反応の使用に適切なオリゴヌクレオチドプライマーの量を理解している。例えば、Innisら(PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., San Diego, CA、1990)、Sambrookら(In Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York、1989)、Ausubelら(In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, New York、1998)などに一般的な手引きが認められる。
【０２７７】
特定の実施例では、キットは、野生型、変異型、または多型性ARMD関連配列、例えば、表1Aと1Bに記載されるものを認識するオリゴヌクレオチドを用いるアレイを含む。アレイは、例えば、陰性または陽性コントロールとして働くためのその他のオリゴヌクレオチドを含むことができる。野生型および変異配列を認識するオリゴヌクレオチドは、同一のアレイ上にあってもよいし、異なるアレイ上にあってもよい。特定のアレイは実施例3で開示されている。例えば、キットは、SEQ ID NO:1〜210のフラグメント、またはそれらのサブセットを含むオリゴヌクレオチド、例えばSEQ ID NO:1〜210のフラグメントを含む少なくとも10オリゴヌクレオチド、例えば、SEQ ID NO:1〜210のフラグメントを含む少なくとも20、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも143、さらには少なくとも250オリゴヌクレオチドを含むことができる。
【０２７８】
一部の実施例では、キットは、ハイブリダイゼーションと検出反応を行うのに必要な試薬例えば、適切な緩衝液をさらに含む。説明書もまた含まれてもよい。
【０２７９】
ARMD関連タンパク質発現、例えば、コードされたタンパク質の発現の低下の、表1Aと1Bに記載されるある核酸分子による検出のためのキットが提供される。そのようなキットは、1つ以上の野生型または変異型CFH、LOC387715、BF、C2、ABCR、フィブリン5、VMD2、TLR4、CX3CR1、CST3、MnSOD、MEHE、パラオキソナーゼ、APOE、ELOVL4、hemicentin-1、GPR75、LAMC1、LAMC2、LAMB3タンパク質(完全長、フラグメント、または融合)、または特異的結合剤(例えばポリクローナルまたはモノクローナル抗体または抗体フラグメント)を含み、少なくとも1つのコントロールを含むことができる。ARMD関連タンパク質特異的結合剤およびコントロールは、個別の容器に入れられてもよい。キットはまた、ARMD関連タンパク質:結合剤複合体を検出するための手段を含むことができ、例えば結合剤を検出可能に標識してもよい。検出可能な物質が標識されない場合、これを二次抗体またはタンパク質Aで検出することができ、例えば、これらのどちらか、または両方が1つ以上の個別容器で一部のキットに提供される。そのような技術は周知である。
【０２８０】
一部のキットの追加的な要素にはアッセイを実施するための説明書が含まれる。説明書によって、ARMD関連発現レベルが対照サンプルと比べて低下しているかどうかを、検査を行う者が判定できる。反応容器や補助試薬、例えば、色素原、緩衝液、酵素などもキットに含むことができる。
【０２８１】
明細書内で言及した全ての出版物および特許出願は、本発明が属する当業者の技術レベルを示すものである。全ての出版物および特許出願は、各出版物および特許出願それぞれが、あたかも具体的および単独で、参照として組み込まれるよう示されたのと同程度で、参照として本明細書に組み込まれる。
【０２８２】
本発明者らの開示の原則が適用されうる、多くの可能な態様の観点から、示された態様は本開示の一例であることを理解し、本開示の範囲を限定するものと認識するべきではない。むしろ、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によって定められる。従って、本発明者らは、これらの請求項の精神と範囲に含まれる全ての本発明者らの発明として特許を請求する。
【配列表】
2009514534000001.app
【国際調査報告】
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