(57)【要約】  サーモアナエロバクター・マスラニ群に属する偏性嫌気性好熱性細菌およびその変異体および誘導体。本細菌は、発酵産物の産生、例えばリグノセルロース系バイオマスからのエタノール、乳酸、酢酸および水素の産生に特に好適である。【選択図】なし
2009537156.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
BG1 (DSMZ受託番号18280) およびその変異体から選択される、サーモアナエロバクター・マスラニ株。
【請求項２】
乾物含量が少なくとも10% wt/wtである加水分解リグノセルロース系バイオマス材料を含む培地で増殖可能である、請求項１の株。
【請求項３】
乾物含量が少なくとも15% wt/wtである、請求項２の株。
【請求項４】
乾物含量が少なくとも20% wt/wtである、請求項２の株。
【請求項５】
乾物含量が少なくとも25% wt/wtである、請求項２の株。
【請求項６】
該加水分解リグノセルロース系バイオマス材料が、庭くず、粉砕木、わら、干し草、果実外皮および種子外皮からなる群から選択される、請求項２の株。
【請求項７】
70℃以上で増殖可能である、請求項１の株。
【請求項８】
ガラクトースを唯一の炭素源として増殖可能である、請求項１の株。
【請求項９】
酸、アルコール、ケトン、および水素からなる群から選択される発酵産物を産生可能である、請求項１の株。
【請求項１０】
アルコールが、エタノール、ブタノール、プロパノール、メタノール、プロパンジオールおよびブタンジオールからなる群から選択される、請求項９の株。
【請求項１１】
酸が、乳酸、プロプリオナート、酢酸塩、コハク酸塩、酪酸塩およびギ酸塩からなる群から選択される、請求項９の株。
【請求項１２】
ケトンがアセトンである、請求項９の株。
【請求項１３】
１以上の遺伝子が挿入、欠失、または実質的に不活性化されている、請求項１の株。
【請求項１４】
乳酸デヒドロゲナーゼ (LDH) (EC 1.1.1.27)をコードする遺伝子がダウンレギュレートされている、または実質的に不活性化されている、請求項１の株。
【請求項１５】
乳酸デヒドロゲナーゼ (LDH) (EC 1.1.1.27)をコードする遺伝子が該遺伝子の欠失により不活性化されている、請求項１４の株。
【請求項１６】
乳酸デヒドロゲナーゼ (LDH) (EC 1.1.1.27)をコードする遺伝子が該遺伝子における１以上のアミノ酸の変異、欠失、または挿入により実質的に不活性化されている、請求項１４の株。
【請求項１７】
BG1L1 (DSMZ 受託番号 18283)である、請求項１４の株。
【請求項１８】
ピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素(EC 1.2.7.1)をコードする遺伝子がダウンレギュレートされている、または実質的に不活性化されている、請求項１の株。
【請求項１９】
ピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素(EC 1.2.7.1)をコードする遺伝子が該遺伝子における１以上のアミノ酸の変異、欠失、または挿入により実質的に不活性化されている、請求項１の株。
【請求項２０】
BG1PF1 (DSMZ 受託番号 18282)である、請求項１８の株。
【請求項２１】
ヒドロゲナーゼまたはヒドロゲナーゼサブユニットをコードする遺伝子がダウンレギュレートされている、または実質的に不活性化されている、請求項１の株。
【請求項２２】
ヒドロゲナーゼまたはヒドロゲナーゼサブユニットをコードする遺伝子が該遺伝子における１以上のアミノ酸の変異、欠失、または挿入により実質的に不活性化されている、請求項２１の株。
【請求項２３】
ヒドロゲナーゼまたはヒドロゲナーゼサブユニットをコードする遺伝子が、[Fe]-ヒドロゲナーゼおよび[NiFe]-ヒドロゲナーゼ (EC 1.6.5.3、EC 1.12.7.2、1.12.99.6)、例えば、NuoE、NuoF、NuoG、EchB、EchC、EchD、EchE、EchF、からなる群から選択される、請求項２１の株。
【請求項２４】
BG1H1 (DSMZ 受託番号 18281)である、請求項２１の株。
【請求項２５】
酢酸キナーゼ(EC 2.7.2.1)をコードする遺伝子が該遺伝子における１以上のアミノ酸の変異、欠失、または挿入により実質的に不活性化されている、請求項１の株。
【請求項２６】
リン酸アセチルトランスフェラーゼ(EC 2.3.1.8)をコードする遺伝子が該遺伝子における１以上のアミノ酸の変異、欠失、または挿入により実質的に不活性化されている、請求項１の株。
【請求項２７】
１以上の遺伝子が挿入されている、請求項１の株。
【請求項２８】
１以上のポリサッカラーゼをコードする遺伝子が挿入されている、請求項２７の株。
【請求項２９】
ポリサッカラーゼが、セルラーゼ (EC 3.2.1.4);グルカン-1,3 β-グルコシダーゼ (エキソ-1,3 β-グルカナーゼ、EC 3.2.1.58)、1,4-β-セロビオヒドロラーゼ (EC 3.2.1.91) およびエンド-1,3(4)-β-グルカナーゼ (EC 3.2.1.6)を含む、β-グルカナーゼ;エンド-1,4-β-キシラナーゼ (EC 3.2.1.8) およびキシラン 1,4-β-キシロシダーゼ (EC 3.2.1.37) を含むキシラナーゼ; ペクチナーゼ (EC 3.2.1.15); α-グルクロニダーゼ、α-L-アラビノフラノシダーゼ (EC 3.2.1.55)、アセチルエステラーゼ (EC 3.1.1.-)、アセチルキシランエステラーゼ (EC 3.1.1.72)、α-アミラーゼ (EC 3.2.1.1)、β-アミラーゼ (EC 3.2.1.2)、グルコアミラーゼ (EC 3.2.1.3)、プルラナーゼ (EC 3.2.1.41)、β-グルカナーゼ (EC 3.2.1.73)、ヘミセルラーゼ 、アラビノシダーゼ、マンナンエンド-1,4-β-マンノシダーゼ (EC 3.2.1.78) およびマンナンエンド-1,6-α-マンノシダーゼ (EC 3.2.1.101) を含むマンナナーゼ、ペクチンヒドロラーゼ、ポリガラクツロナーゼ (EC 3.2.1.15)、エキソポリガラクツロナーゼ (EC 3.2.1.67) およびペクチン酸リアーゼ (EC 4.2.2.10)からなる群から選択される、請求項２８の株。
【請求項３０】
１以上のピルビン酸デカルボキシラーゼ(EC 4.1.1.1)をコードする遺伝子が挿入されている、請求項２７の株。
【請求項３１】
１以上のアルコールデヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.1、EC 1.1.1.2、EC 1.1.1.71、EC 1.1.99.8)をコードする遺伝子が挿入されている、請求項２７の株。
【請求項３２】
１以上のアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の発現が増加している、請求項１の株。
【請求項３３】
請求項１−３２のいずれかの株を適切な条件下で培養することを含む、発酵産物の産生方法。
【請求項３４】
発酵プロセスが厳しい嫌気性条件下で行われる、請求項３３の方法。
【請求項３５】
約40-95℃の範囲、例えば約50-90℃の範囲、例えば約60-85℃の範囲、例えば約65-75℃の範囲の温度で行われる、請求項３３の方法。
【請求項３６】
発酵プロセスがバッチ発酵プロセスである、請求項３４の方法。
【請求項３７】
発酵プロセスが連続的発酵プロセスである、請求項３４の方法。
【請求項３８】
発酵産物が、酸、アルコール、ケトンおよび水素からなる群から選択される、請求項３３の方法。
【請求項３９】
アルコールが、エタノール、ブタノール、プロパノール、メタノール、プロパンジオールおよびブタンジオールからなる群から選択される、請求項３８の方法。
【請求項４０】
酸が、乳酸、プロプリオナート、酢酸塩、コハク酸塩、酪酸塩およびギ酸塩からなる群から選択される、請求項３８の方法。
【請求項４１】
ケトンがアセトンである、請求項３８の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サーモアナエロバクター・マスラニ（Thermoanaerobacter mathranii）群に属する新規好熱性細菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
エタノールや乳酸のような発酵産物の製造業界は、比較的容易に変換可能であるが高価なデンプン材料から、複雑ではあるが安価な木やわらなどの農作物の残渣のようなリグノセルロース系バイオマスへの生産プロセスの転換の問題に直面している。均一で容易に加水分解されるポリマーを含むデンプンと異なり、リグノセルロース系バイオマスは、セルロース (25-53%)、ヘミセルロース (20-35%)、ポリフェノールリグニン (10-25%) その他の抽出可能成分を含む。典型的には、リグノセルロース系バイオマスの利用における第１の工程は、リグノセルロース材料の成分を分画しその表面積を増加させるための前処理工程である。最も頻繁に使用される前処理方法は酸加水分解であり、その場合リグノセルロース材料を硫酸などの酸にさらし、それにより糖ポリマーのセルロースおよびヘミセルロースを部分的または完全に加水分解し、その構成糖モノマーとする。別のタイプのリグノセルロース加水分解は蒸気爆発であり、これはリグノセルロース材料を蒸気噴射により温度190-230℃まで加熱することを含む方法である。第３の方法は湿式酸化であり、この場合は150-185℃において材料を酸素で処理する。前処理の後に酵素加水分解を行って、糖モノマーの放出を完了させることができる。この前処理工程の結果、セルロースはグルコースに加水分解され、一方ヘミセルロースは五炭糖のキシロースおよびアラビノースならびに六炭糖のグルコース、ガラクトース、およびマンノースに転換される。このように、デンプンとは異なり、リグノセルロース系バイオマスの加水分解は六炭糖に加えて五炭糖の放出をもたらす。このことは、有用な発酵生物は六炭糖と五炭糖の両方をエタノールのような所望の発酵産物に変換できる必要があることを意味する。
【０００３】
エタノールなどの発酵に使用される従来の微生物、サッカロミセス・セレビシエおよび ザイモモナス・モビリスは、キシロースやアラビノースのような五炭糖を代謝せず、よってリグノセルロース基質に対するパフォーマンスを改善するために高度な代謝工学を必要とする。グラム陽性好熱性細菌は、常套的エタノール産生株と比較して独自の長所を有する。第１の長所は、その広範な基質特異性および高度のエタノール自然産生である。さらに、高温 (55-70℃)でのエタノール発酵は中温発酵と比較して多くの長所を有する。好熱性発酵の長所の１つは連続培養におけるコンタミネーションの問題の最小化であり。これは非無毒化リグノセルロース加水分解物においてそれほど高温で増殖できる微生物は非常に少ないことによる。
【０００４】
現在のところ、前処理方法に依存して、多くの場合糖モノマーを放出させるためにセルラーゼおよびヘミセルラーゼを前処理したリグノセルロース加水分解物に添加しなければならない。これらの酵素は発酵産物の生産コストに非常に関係する。しかしながら、多くの好熱性グラム陽性株は様々な関連酵素を有しており、好熱性グラム陽性株を使用すれば補助的な添加はより安価になりうる。高温における発酵もまた、生産性および基質変換性が高く、産物回収が促進されるというさらなる長所を有する。
【０００５】
リグノセルロース加水分解物は、フルフラール、フェノール、カルボン酸のような、発酵生物を阻害する可能性のある阻害物質を含む。それゆえ、その生物はまたこれら阻害物質に耐性がなければならない。この加水分解物の抑制効果は、発酵の前に無毒化プロセスを適用することで減少させることができる。しかしながら、この追加のプロセス工程を含めることで発酵産物の全体コストが著しく上昇するので、避けることが好ましい。例えば、柳加水分解物のアルカリ処理（overliming）は、大腸菌によるエタノール産生のコストを22 %増加させると試算されている (Von Sivers et al., 1994)。それゆえ、非無毒化プロセスのコストが高いため、工業的なリグノセルロースに基づく発酵方法において使用可能なように、微生物は非無毒化ヘミセルロースまたはホロセルロース加水分解物から発酵産物を産生できることが好ましい。
【０００６】
また、可能性ある微生物は、高濃度のリグノセルロース加水分解物、例えば高乾物含量のリグノセルロース加水分解物上で増殖できれば特に好都合である。このことは、微生物がアルコール産生用、例えばエタノール産生用である場合に特に重要であり、なぜならアルコール濃度が減少するにつれて蒸留コストが増加するからである。
【０００７】
米国特許第6555350号は、五炭糖をエタノールに変換することができるサーモアナエロバクター株について記載する。しかしながら、この株は副産物の乳酸塩を多く産生し、乾物濃度が6% wt/wt未満のリグノセルロース加水分解物においてしか試験されていない。
【０００８】
Larsen et al., 1997は、サーモアナエロバクター・マスラニA3株について記載し、この株は6% 乾物濃度の小麦わら加水分解物(60 g/l 乾燥重量のキシロース添加小麦わら)中で増殖できるのみであり、ガラクトース上で増殖できないと報告されている。
【０００９】
それゆえ、本発明の目的の１つは、上記障害を克服しうる微生物、特にエタノール産生のための微生物、を提供することである。
【発明の概要】
【００１０】
すなわち本発明は、BG1 (DSMZ受託番号18280) およびその変異体から選択されるサーモアナエロバクター・マスラニ細菌株に関する。本発明は、非常に高い乾物濃度のリグノセルロース加水分解物上で増殖でき発酵産物を産生することができる細菌株BG1の単離に基づく。さらに、BG1は広範な基質特異性を有し、キシロースおよびアラビノースなどの五炭糖および六炭糖を利用することができる。本株はさらに好熱性という利点を有し、そのため高温で増殖可能であり、結果として生産性および基質変換率が高く、コンタミネーションの危険性が低く、産物回収が促進される。
【００１１】
本発明はさらに、本発明の株を適切な条件下で培養することにより発酵産物を産生する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】近縁の好熱性クロストリジウム属（Clostridia）の中のBG1株の位置を示す、16S rDNA 配列解析に基づく系統樹。T.はサーモアナエロバクター種、Tm.はサーモアナエロバクテリウムである。バーは2%のヌクレオチド置換を示す。
【図２】BG1の24時間バッチ発酵由来の産物分布。黒三角: キシロース (mM)、白三角: 乳酸塩 (mM)、白四角: 酢酸塩 (mM)、黒丸: エタノール (mM)、黒ダイヤ: 水素 (mM)、黒四角: 細胞密度 (OD578)。
【図３】5 g/l キシロース存在下バッチ中で嫌気的に増殖するBG1株の特異的増殖速度に対する温度の効果。3回の独立した測定の標準偏差をバーで示す。
【図４】各種pHにおけるBG1バッチ発酵による産物形成。白三角: 乳酸塩 (mM)、白四角: 酢酸塩 (mM)、黒丸: エタノール (mM)。
【図５】5 g/l キシロースおよび各種濃度のエタノールを添加したBA培地で増殖したBG1株によるバッチ発酵。消費キシロース 1gあたりの産物収率（mM 産物） を培地中の初期のエタノール濃度の関数として示す。白四角: 酢酸塩、白三角: 乳酸塩、黒丸: エタノール。
【図６】炭素源として混合糖を用いたバッチ発酵におけるBG1の糖消費。2種類の異なる糖混合物の実験(それぞれデュプリケート)の糖濃度を、BG1株とのインキュベーション後の時間の関数として示す。黒四角: グルコース、黒三角: キシロース、白丸: アラビノース、x: ガラクトース、白四角: マンノース。
【図７】各種グルコース濃度においてバッチ中で増殖したBG1 (白記号) およびBG1L1 (黒記号)。 A: エタノール (四角)、乳酸塩 (丸) および酢酸塩 (三角)、エタノール濃度の関数として。B: Aに示す実験の炭素回収率。
【図８】各種キシロース濃度においてバッチ中で増殖したBG1 (白記号) およびBG1L1 (黒記号) 。A: エタノール (四角)、乳酸塩 (丸) および酢酸塩 (三角) 、エタノール濃度の関数として。B: Aに示す実験の炭素回収率。
【図９】外部から添加したエタノールの各種濃度においてバッチ中で増殖したBG1 (白記号) およびBG1L1 (黒記号) 。A: エタノール (四角)、乳酸塩 (丸) および酢酸塩 (三角) 、エタノール濃度の関数として。A: エタノール (四角)、乳酸塩 (丸) および酢酸塩 (三角) 、エタノール濃度の関数として。B: Aに示す実験の炭素回収率。
【図１０】表中の略号: HRT: 水保持時間、Glu: グルコース、Xyl: キシロース、Ace: 酢酸塩、CGlu: 消費グルコース、CXyl: 消費キシロース、CS: 全糖消費、YAce/TS: 酢酸塩収率 (g / g 初期の糖、YEtOH/TS: エタノール収率 (g / g 初期の糖)、YEtOH/TS:エタノール蒸発について補正した初期の糖のエタノール収率、QEtOH: エタノール容積生産性、CR: 炭素回収率。
【図１１】異なる小麦わら加水分解物懸濁液の流入液糖濃度。非希釈小麦わら加水分解物 (23% DM; 77 g/l 可溶性糖; 57 g/l グルコースおよび20 g/l キシロース)。
【図１２】BG1L1により異なる小麦わら加水分解物懸濁液からFBR中70℃において得られた産物収率。
【図１３】固定化好熱性嫌気性細菌 BG1L1による異なる酸加水分解トウモロコシ茎葉加水分解物懸濁液についての70℃における連続流動層リアクタからの流入液糖濃度 (A) および糖変換 (B)。
【図１４】固定化好熱性嫌気性細菌 BG1L1による異なる酸加水分解トウモロコシ茎葉加水分解物懸濁液についての70℃における連続流動層リアクタからの流出液産物濃度 (酢酸およびエタノール) および流入液酢酸濃度。
【図１５】固定化好熱性嫌気性細菌 BG1L1による異なる酸加水分解トウモロコシ茎葉加水分解物懸濁液についての70℃における連続流動層リアクタからのエタノール収率および炭素回収率。
【図１６】固定化好熱性嫌気性細菌 BG1L1による70℃における連続流動層リアクタからの異なる蒸気爆発小麦わら加水分解物懸濁液についてのエタノールおよび酢酸塩収率。
【図１７】BG1染色体由来のピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素サブユニットをコードする遺伝子を含む7762 bpの領域の欠失に使用したコンストラクト。up:BG11ピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素の上流領域。down: BG1ピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素の下流領域。HTK: 高度耐熱性カナマイシン耐性カセットをコードする遺伝子。
【図１８】BG1PFの5種類の独立クローンによる70℃におけるバッチ発酵後の最終産物分布。
【図１９】BG1染色体へのアンチセンスカセットの導入に使用したコンストラクト。up: BG1乳酸デヒドロゲナーゼの上流領域。down: 乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の下流領域。HTK: 高度耐熱性カナマイシン耐性カセットをコードする遺伝子。 prom: プロモーター、ter: ターミネーター。hydA由来の335 bpのフラグメントをアンチセンス方向にてプロモーターとターミネーターの間のクローニングサイトにクローン化した。
【図２０】グルコースまたはキシロース上で増殖したBG1、BG1L1およびBG1H1由来のトータルRNAのノーザン・ブロット解析。RNAは、指数増殖細胞から単離した。上図:  hydA アンチセンスに対するプローブを使用した。下図: hyd mRNAのhydA部分に対するプローブを使用した。RNAサイズマーカーのバンドを右に示す。
【図２１】バッチ中で増殖したBG1 (白および黒四角)、BG1L1 (三角) およびBG1H1 (白および黒丸)の、増殖、キシロース消費、酢酸塩、乳酸塩、エタノールおよび水素産生。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
前述のとおり、本発明はBG1およびその変異体から選択されるサーモアナエロバクター・マスラニ株に関する。
【００１４】
本発明は、ブダペスト条約にしたがい2006年5月17日にDSMZ （Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Germany）にDSMZ受託番号18280として寄託された単離細菌BG1株に基づく。
【００１５】
以下から明らかなように、本発明の好ましい細菌は寄託されている。それゆえ本発明の他の細菌は、寄託された細菌を変異させ、改良された特性を有する派生変異体を選択することにより得ることができる。所望の特性には、増加した利用可能な糖の範囲、上昇した増殖速度、エタノールなどの発酵産物をより多く提供する能力が含まれる。細菌を変異させ所望の変異体を選択するのに好適な方法は、Functional analysis of Bacterial genes: A practical Manual（W. Schumann, S.D. Ehrlich & N. Ogasawara, 2001）に記載される。
【００１６】
基本のBG1株は、非常に高い乾物濃度のリグノセルロース加水分解物上で増殖し、発酵産物を産生することができる。本明細書において、「リグノセルロース加水分解物」なる用語は、前処理工程にかけられ、それによりリグノセルロース材料が少なくとも部分的にセルロース、ヘミセルロースおよびリグニンに分離されることで材料の表面積が増加している、リグノセルロース系バイオマスを意味する。リグノセルロース材料は、典型的には植物材料、例えばわら、干し草、庭くず、粉砕木、果実外皮および種子外皮に由来しうる。
【００１７】
最も頻繁に使用される前処理方法は酸加水分解であり、この場合リグノセルロース材料を硫酸などの酸にさらし、それにより糖ポリマーであるセルロースおよびヘミセルロースを部分的または完全に加水分解してその構成糖モノマーとする。別のタイプのリグノセルロース加水分解は蒸気爆発であり、これはリグノセルロース材料を190-230℃の温度の蒸気噴射により加熱することを含む方法である。第３の方法は湿式酸化であり、この場合は材料を150-185℃で酸素により処理する。前処理の後に酵素加水分解を行い、糖モノマーの放出を完了させてもよい。この前処理工程の結果、セルロースは加水分解されてグルコースとなり、一方ヘミセルロースは五炭糖のキシロースおよびアラビノースならびに六炭糖のグルコース、ガラクトース、およびマンノースに転換される。ある態様において、前処理工程にはセルロースおよびヘミセルロースのさらなる加水分解をもたらす処理が追加されうる。このさらなる加水分解処理の目的は、発酵性の糖(例えばグルコース、キシロース、および他の単糖もありうる)を形成するためのセルロースおよび／またはヘミセルロース源の酸加水分解、湿式酸化、または蒸気爆発の間に産生されるオリゴ糖および産生されうる多糖類を加水分解することである。このさらなる処理は、化学的であっても酵素的であってもよい。化学的加水分解は、典型的には、約100-150℃の範囲の温度における酸による処理、例えば硫酸水溶液による処理、によって達成される。酵素加水分解は、典型的には、１以上の適切なカルボヒドラーゼ酵素、例えばセルラーゼ、グルコシダーゼ、およびキシラナーゼを含むヘミセルラーゼ、による処理によって行われる。
【００１８】
驚くべきことに、本発明の細菌株は、加水分解リグノセルロース系バイオマス材料の乾物含量 (または本明細書中「全固形分（TS）」ともいう) が少なくとも10% wt/wt、例えば少なくとも15% wt/wt、例えば少なくとも20% wt/wt、および少なくとも25% wt/wtもの高さである培地中で増殖できることが明らかとなった。前述のように、このことは、発酵プロセスの前に加水分解物を希釈する必要がなく、それゆえエタノールなどの発酵産物をより高濃度で得ることができ、よってその後の発酵産物の回収コストが減少しうるという、優れた利点を有する。例えば、エタノールの蒸留コストはアルコールの濃度が減少するにつれて増加する。
【００１９】
本発明の細菌株は、嫌気性好熱性細菌であり、70℃以上のも高温で増殖することができる。本株がこのような高温で機能可能であることは、リグノセルロース材料の発酵産物への変換に非常に重要である。炭水化物のエタノールなどへの変換速度は、高温で行うとより速くなる。例えば、好熱性バシルスにおけるエタノール生産性は、30℃で行われる常套的酵母発酵プロセスよりも最大で10倍速い。結果として、所定の容積生産性に必要とされる生産工場がより小さくなり、よって工場建築コストが減少する。また前述のように、高温では他の微生物からのコンタミネーションの危険性が減少し、休止時間が短くなり、工場の生産性が上昇し、原材料の滅菌に必要なエネルギーが低下する。また、高い作業温度により、得られる発酵産物のその後の回収が促進されうる。
【００２０】
食品業界および化学業界などの各種技術分野において利用される貴重な商品で発酵産物は数多くある。現在、世界的なエネルギー需要が増加していることにより、エネルギー源としての化石燃料の代替物に注目が集まっており、植物材料由来のエタノール (バイオエタノール) は石油由来の液体炭化水素産物の有力な置換物または補完物として特に注目されている。
【００２１】
別の発酵産物である乳酸は、抗加齢化学物質として化粧業界で広く使用されており、食品業界は乳酸を各種食品に酸性度調節剤として使用している。近年、乳酸は生分解性ポリエステルにおける使用可能性について非常に注目されている。
【００２２】
本発明の株は、酸、アルコール、ケトン、および水素などの数多くの各種発酵産物を産生できる可能性がある。アルコールは、エタノール、ブタノール、プロパノール、メタノール、プロパンジオールおよびブタンジオールから選択される。さらなる態様において、酸は、乳酸、プロプリオナート、酢酸塩、コハク酸塩、酪酸塩またはギ酸塩であり、ケトンはアセトンである。
【００２３】
前述のように、BG1はアイスランドの温泉から単離された野生型株であり、リグノセルロース系バイオマス材料の変換に必要ないくつかの非常に有利な特徴を有する。すなわち、この基本株は、五炭糖と六炭糖の両方の糖を乳酸やエタノールなどの各種発酵産物に変換するためのすべての遺伝子機構を有する。
【００２４】
以下の実施例から明らかなように、完全16S rDNA 配列 (配列番号14) の実験により、BG1株はサーモアナエロバクター・マスラニ A3株 (Larsen et al., 1997)と近縁関係にあることがわかった。これによりBG1はクロストリジウム属のクラスターVに位置づけられる。これら株は近縁関係にあるが、ヘミセルロース加水分解物に対する耐性に関しては非常に相違する。A3は小麦わら加水分解物(60 g/l乾燥重量（すなわち乾物濃度6% wt/wt）のキシロース添加小麦わら)において最大40%増殖できるのみであるが、BG1は高い乾物濃度 (少なくとも最大25%)で増殖し、糖または酵素の添加なしに非希釈加水分解物からエタノールを提供できる。さらに、A3株はガラクトース上で増殖できないと報告されているが (Larsen et al., 1997)、BG1はガラクトースを唯一の炭素源として良好に増殖し、エタノールを主として産生する。すなわち、本発明の株は、ガラクトースを唯一の炭素源として増殖することができる。
【００２５】
以下の実施例に示すように、キシロース最小培地、pH=7、70℃におけるBG1増殖のはじめの数時間は、エタノールと酢酸塩が等モル量産生される。その後培養が後期指数増殖期にはいると、特異的エタノール産生が酢酸塩の産生を顕著にうわまわる。発酵後のpHは変化しなかったので、この効果がpHにより生じたとは考えられない。同様に、上部空間のN2/CO2 を純粋な水素で置換しても、酢酸塩を添加しても、発酵に影響しないことが示され、それゆえ後期指数増殖期におけるエタノール形成へのシフトの裏に存在するメカニズムはいまだ明らかでない。
【００２６】
実施例はまた、培地のpHがBG1の産物プロファイルに強く影響することを示す。pH 6.5より上では、エタノールの産生が優勢であり、乳酸塩はほとんど産生されなかった。pH 6.0より下では、乳酸塩の産生がエタノールのかわりに増加し、pH 5.0では増殖が観察されなかった。乳酸塩産生に対するpHの同じ効果が、近縁の好熱性細菌サーモアナエロバクター・ウィゲリ（Thermoanaerobacter wiegelii）で観察されている。未精製細胞抽出物は、フルクトース-1,6-ジホスフェート (FDP) 活性化乳酸デヒドロゲナーゼ (LDH)を含むことがわかった。FDPの親和性は細胞外pHに依存する。最大の活性化がpH 6.2で観察され、pH 8.2では活性化は観察されなかった (Cook, 2000)。この効果はサーモアナエロバクター種で共通であるので、これもBG1における原因と考えられる (Lamed and Zeikus, 1980; Carreira et al., 1982; Bryant, 1991)。
【００２７】
以下の実施例はまた、BG1の増殖速度および代謝物分布に対するエタノール添加の効果を示す。低エタノール耐性は、好熱性細菌の商業的活用の主要な障害であり、それゆえエタノール耐性株の選択は非常に重要である。しかしながら、クロストリジウム・サーモヒドロスルフリカム）（Clostridium thermohydrosulfuricum）のエタノール耐性変異体である39EAは、45℃で最大 8% (w/v)、68℃で最大 3.3% (w/v) のエタノール濃度で増殖でき (Lovitt et al., 1984)、サーモアナエロバクター・エタノリカス（Thermoanaerobactor ethanolicus）の変異株である39E-H8は60℃で8%のエタノール耐性を示した  (Burdette et al., 2002)。BG1は、他の好熱性嫌気性株と比較して、70℃でエタノールに対して非常に耐性があった (Herrero and Gomez, 1980; Larsen et al., 1997; Lovitt et al., 1988; Wiegel and Ljungdahl, 1981; Rani et al., 1996)。非適合培地において、2.8% の外因性エタノールにおいて増殖速度はエタノール添加なしの速度の27％であった。
【００２８】
サーモアナエロバクター・エタノリカス E39は、一級アルコールデヒドロゲナーゼを用いて外部から添加したエタノールを消費することが報告されている (Burdette et al., 2002)。これは、一級アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有さない（またはその活性が減少している）エタノール耐性変異体 E39-H8においても同様である。これに対して、BG1は高濃度の外因性エタノール存在下でもエタノールを産生することが明らかとなった。エタノールを添加するとBG1において乳酸塩産生が増加することがわかった。高エタノール濃度におけるエタノール産生は、エタノール産生微生物にとって重要である。
【００２９】
ほぼグルコースのみに分解されるデンプン質およびセルロース性の基質とは異なり、リグノセルロース系バイオマスは六炭糖と五炭糖の両方を含むいくつかの異なる糖モノマーを含む。これらが連続的プロセスにおいてエタノールのような発酵産物に変換される場合、全ての糖が取り込まれ同時に代謝される必要がある。共発酵は、従来のエタノール産生微生物の多くにおいて問題であることが証明されている。サッカロミセス・セレビシエおよびザイモモナス・モビリスは、グルコースとキシロースの共発酵用の改変には成功したが、アラビノースとの共発酵はより難しいようである(Dien et al., 2000; Lawford and Rousseau, 2002; Ho et al., 1998)。炭素代謝が分子レベルで研究されているグラム陰性細菌において、グルコースはキシロースの初期代謝に関与する酵素をコードするxylAB オペロンの転写を異化代謝産物抑制により阻害することが示された (Hueck and Hillen, 1995)。これに対して、サーモアナエロバクター・エタノリカスのxylABオペロンの転写はグルコースにより抑制されず、グルコースおよびキシロースの同時分解が観察された(Erbeznik et al., 1998)。実施例に示すように、BG1はグルコース、キシロース、アラビノースおよびガラクトースの糖混合物を同時に分解し、またグルコース、キシロース、ガラクトースおよびマンノースの混合物も分解した。
【００３０】
リグノセルロース系バイオマスの加水分解の結果、微生物阻害物質が放出され (Klinke et al., 2004)、それゆえ加水分解物の洗浄によりBG1のエタノール生産性が増加しうる。しかしながら、実施例に示す実験では、洗浄によりBG1のエタノール生産性が顕著に減少した。この効果は、容易に発酵可能なペントサンが洗浄除去されたために初期糖濃度が低下したことによると考えられる。全処理したアスペン材に対する同様の研究において、洗浄により効率的に阻害物質は除去されたが、利用可能なペントサンが75%も消失する結果となったことが示された (Saddler and Chan, 1984)。加水分解物中の阻害物質はBG1発酵の主要な障害ではないようであり、BG1は濃縮された非無毒化リグノセルロース加水分解物において従来のエタノール産生微生物よりも優れた利点を有すると考えられる。
【００３１】
以下の実施例において、有利な態様における基本のBG1株を改変して、特性の改良されたBG1の変異体または誘導体を得ることができることが示された。すなわち、ある態様において、本発明の菌株として１以上の遺伝子が挿入、欠失、または実質的に不活性化されているBG1の変異体が提供される。遺伝子は、当業界で周知の好適な遺伝子操作手段および遺伝子工学手法、例えば、遺伝子クローニングシステム、相同組換、およびSambrook & Russell “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (Third Edition), Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載の技術により、挿入、欠失、または実質的に不活性化することができる。
【００３２】
具体的には、驚くべきことにBG1のエタノール産生能が乳酸デヒドロゲナーゼ (LDH) (EC 1.1.1.27)をコードする遺伝子を不活性化することによって上昇しうることが、本発明者らにより示された。すわわち、エタノール産生は、グルコース上で増殖した場合、約51-56%（野性型BG1における理論上の最大収率）から約84-91%（乳酸デヒドロゲナーゼ欠損BG1L1株）まで増加した。
【００３３】
それゆえ、本発明の株は、乳酸デヒドロゲナーゼ (LDH) (EC 1.1.1.27)をコードする遺伝子が該遺伝子の欠失により不活性化されている、あるいは前記遺伝子が遺伝子中の１以上のアミノ酸の変異、欠失または挿入により実質的に不活性化されている、BG1の改変体でありうることが理解される。
【００３４】
ある態様において、ブダペスト条約に基づき2006年5月17日にDSMZ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Germany）にDSMZ受託番号18283として寄託された、乳酸デヒドロゲナーゼ欠損変異体 BG1L1株が提供される。
【００３５】
前述のように、乳酸(または乳酸塩)は、食品業界などにおいて広く使用されており、それゆえ貴重な発酵産物である。本発明者らにより明らかにされたように、ピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素(EC 1.2.7.1)をコードする遺伝子を不活性化することにより野性型BG1株を改変して、野性型と比較して乳酸塩の産生量を増加させることができる。すなわち、野性型BG1の代謝が完全にエタノールの産生から乳酸塩の産生に移行しうることが明らかとなった。したがって、本発明の目的の1つは、ピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素(EC 1.2.7.1)をコードする遺伝子がダウンレギュレートされている、または実質的に不活性化されている、例えば遺伝子中の１以上のアミノ酸の変異、欠失または挿入により不活性化されている、BG1に由来する株を提供することである。より具体的には、乳酸塩産生が増加した特性を有するBG1の誘導体が提供され、これはBG1PF1と呼ばれ、ブダペスト条約に基づき2006年5月17日にDSMZ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Germany）にDSMZ受託番号18282として寄託されている。
【００３６】
水素は、石油産業および化学産業において、とりわけ化石燃料の加工、ヒドロアルキル化（hydroalkylation）、水素化脱硫および水素化分解に広く使用され、また脂肪および油の水素化（マーガリンのようなもので見られる）やメタノールの産生に使用されている。さらに、水素はエネルギー源として使用することができ、燃焼エンジンなどにおいて燃焼されうる。
【００３７】
酢酸は、産業上広く使用される貴重な産物であり、主にビニル酢酸モノマーの産生、エステル産生、酢の産生に使用され、溶媒としても使用される。全世界の酢酸の需要は一年あたり約650万トンである。
【００３８】
本発明者らは、水素と酢酸（酢酸塩の形態）の両方を野性型BG1株より多く産生することができる、改良されたBG1変異株を構築した。これは、BG1のヒドロゲナーゼをコードするHydABCD遺伝子のダウンレギュレーションによりなされた。
【００３９】
すなわち、本発明により、ヒドロゲナーゼまたはヒドロゲナーゼサブユニットをコードする遺伝子がダウンレギュレートされている、または実質的に不活性化されている、BG1の変異株または誘導体が提供される。この遺伝子の不活性化は、遺伝子中の１以上のアミノ酸の変異、欠失または挿入によりなされうる。より具体的には、ヒドロゲナーゼまたはヒドロゲナーゼサブユニットをコードする遺伝子は、[Fe]-ヒドロゲナーゼおよび[NiFe]-ヒドロゲナーゼ (EC 1.6.5.3, EC 1.12.7.2, EC 1.12.99.6)、例えば、NuoE、NuoF、NuoG、EchB、EchC、EchD、EchEおよびEchFから選択することができる。
【００４０】
したがって、ある態様において、水素産生能および酢酸産生能が改善された本発明の株が提供され、これはBG1H1と呼ばれる。BG1H1は、ブダペスト条約に基づき2006年5月17日にDSMZ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Germany）にDSMZ受託番号18281として寄託されている。
【００４１】
さらに考えられることに、ある態様において、酢酸キナーゼ(EC 2.7.2.1)をコードする遺伝子および／またはリン酸アセチルトランスフェラーゼ(EC 2.3.1.8)をコードする遺伝子をBG1またはその変異体においてダウンレギュレートまたは実質的に不活性化することは有用でありうる。不活性化は、遺伝子中の１以上のアミノ酸の変異、欠失または挿入によりなされうる。
【００４２】
前述のように、BG1は、六炭糖と五炭糖の両方をエタノールなどの広範な所望の発酵産物に変換可能とする遺伝子機構を有する。
【００４３】
しかしながら、ある態様について、１以上のさらなる遺伝子を本発明の株に挿入することが望ましい場合がある。すなわち、特異的発酵産物の収率を改善するため、１以上のポリサッカラーゼをコードする遺伝子を本発明の株に挿入することが有益でありうる。したがって、具体的態様において、以下から選択される１以上のポリサッカラーゼをコードする遺伝子が挿入された本発明の株が提供される：セルラーゼ (例えば、EC 3.2.1.4); β-グルカナーゼ、例えばグルカン-1,3 β-グルコシダーゼ (エキソ-1,3 β-グルカナーゼ、例えば、EC 3.2.1.58)、1,4-β-セロビオヒドロラーゼ (例えば、EC 3.2.1.91) およびエンド-1,3(4)-β-グルカナーゼ (例えば、EC 3.2.1.6); キシラナーゼ、例えばエンド-1,4-β-キシラナーゼ (例えば、EC 3.2.1.8) およびキシラン 1,4-β-キシロシダーゼ (例えば、EC 3.2.1.37); ペクチナーゼ (例えば、EC 3.2.1.15); α-グルクロニダーゼ、α-L-アラビノフラノシダーゼ (例えば、EC 3.2.1.55)、アセチルエステラーゼ (例えば、EC 3.1.1.-)、アセチルキシランエステラーゼ (例えば、EC 3.1.1.72)、α-アミラーゼ (例えば、EC 3.2.1.1)、β-アミラーゼ (例えば、EC 3.2.1.2)、グルコアミラーゼ (例えば、EC 3.2.1.3)、プルラナーゼ (例えば、EC 3.2.1.41)、β-グルカナーゼ (例えば、EC 3.2.1.73)、ヘミセルラーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、例えばマンナンエンド-1,4-β-マンノシダーゼ (例えば、EC 3.2.1.78) およびマンアンエンド-1,6-α-マンノシダーゼ (例えば、EC 3.2.1.101)、ペクチンヒドロラーゼ、ポリガラクツロナーゼ (例えば、EC 3.2.1.15)、エキソポリガラクツロナーゼ (例えば、EC 3.2.1.67) およびペクチン酸リアーゼ (例えば、EC 4.2.2.10)。
【００４４】
所望の発酵産物に依存して、ある態様においては、ピルビン酸デカルボキシラーゼ(例えば、EC 4.1.1.1)をコードする異種遺伝子を挿入すること、またはアルコールデヒドロゲナーゼ(例えば、EC 1.1.1.1、EC 1.1.1.2、 EC 1.1.1.71、またはEC 1.1.99.8)をコードする異種遺伝子を挿入すること、あるいはアルコールデヒドロゲナーゼをコードする既存の遺伝子をアップレギュレートすることが有用と考えられる。
【００４５】
本発明により、本発明の株を適切な条件下で培養することを含む発酵産物の産生方法もまた提供される。
【００４６】
本発明の株は偏性嫌気性微生物であり、それゆえ発酵産物は厳しい嫌気性条件下で行われる発酵プロセスにより産生されることが好ましい。さらに、本発明の株は好熱性微生物であり、それゆえそのプロセスは約40-95℃の範囲、例えば約50-90℃、約60-85℃、約65-75℃の範囲の温度において行われる場合に最適に行われうる。
【００４７】
ある発酵産物の産生のため、特定の発酵プロセス、例えばバッチ発酵プロセス、例えばフェッドバッチ（fed batch）プロセスまたは連続的発酵プロセスなどを選択することが有用でありうる。
【００４８】
本発明の方法は、酸、アルコール、ケトン、および水素を含む、広範な発酵産物の産生に有用である。すなわち、本発明により、エタノール、ブタノール、プロパノール、メタノール、プロパンジオール、ブタンジオール、乳酸、プロプリオナート、酢酸塩、コハク酸塩、酪酸塩、ギ酸塩およびアセトンなどの発酵産物を産生することができる。
【００４９】
本発明を、以下の非限定的な実施例および図面においてさらに説明する。
【実施例】
【００５０】
材料および方法
次の材料および方法を、以下の実施例に使用した：
株および増殖条件
BG1株は、嫌気的に70℃のアイスランドの温泉から単離された。いずれの株も、特記なきかぎり、70℃で嫌気的に最小培地(BA) （2 g/l 酵母抽出物含有）において既報のように培養した (Larsen et al., 1997) 。固形培地として、BA培地（11 g/l フィタゲル（phytagel）および追加の 3.8 g/l MgCl2.6H2O含有）を含むロールチューブ (Hungate RE, 1969; Bryant MP, 1972)を使用した。クローニングを目的として、大腸菌Top10 (Invitrogen, USA) を使用した。Top10は、37℃でLuria-Bertani 培地(Ausubel et al., 1997) （必要な場合、100 μg/ml アンピシリンおよび25μg/ml カナマイシン添加）中でルーチン的に培養した。
【００５１】
連続リアクタ
連続培養に使用した発酵培地は、前述のように調製し、同じミネラル、微量金属、および酵母抽出物を添加した。培地の初期のpHは7.4-7.7に調製し、120℃で30分間オートクレー部にかけた。嫌気性条件を保証するため、培地を45分間N2/CO2 (4:1)の混合物でフラッシュし、最後に終濃度0.25 g/lとなるようNa2Sをボトルに注入した。
【００５２】
リアクタは、内径4.2 cmおよび高さ20 cmの水ジャケット付きガラスカラムであった。リアクタの作業容積は200 mlであった。リアクタの底からの流入液および供給は、蠕動ポンプ (モデル 503S-10rpm, Watson Marlow, Falmouth, UK)により調節した。再循環流は、同じ蠕動ポンプ(モデル 503-50rpm, Watson Marlow, Falmouth, UK)により達成し、リアクタにおける上方流速が1 m/hとなるような再循環の程度とした。pHは、特記なき限り、NaOH (1-2M)を添加して7.0に維持した。リアクタに75 mlの担体材料をロードし、最後に管類と再循環リザーバを含むリアクタ系全体を120℃で30分間オートクレーブした。液体サンプルは、リアクタ上部に位置するリアクタ排出口近くのサンプルポートから取得した。実験は、外部からの加熱およびガラスジャケット中の温水の再循環により70℃で行った。
【００５３】
実験中、定常状態が達成されているときに、HRTまたは糖濃度を変化させた。定常状態条件の基準は、全てのパラメータが少なくとも5滞留時間の間一定に維持されなければならないというものである。異なる定常状態におけるリアクタのパフォーマンスは、糖濃度および最終発酵産物濃度を測定することによりモニターした。実験中、滅菌シリンジおよび注射針を使用して流入液および流出液からサンプルを取得し、サンプルは解析まで−20℃で保存した。流出ガスサンプルを取得して炭素ジオキシドおよび水素含量を決定した。
【００５４】
コンタミネーションについての試験
1 mlのサンプルをリアクタから取得し、染色体DNAをDNA精製キット（A&A Biotech (Poland)）を使用して精製した。PCR反応を、Pfu ポリメラーゼ (MBI Fermentas, Germany) および細菌rDNAにアニールするプライマーB-all 27F (配列番号1; GAG TTT GAT CCT GGC TCA G) およびB-all 1492R (配列番号2; ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT)を使用して設定した。フラグメントをQiaex II kit（Qiagen）を使用して精製し、PNK (MBI Fermentas)を処理し、pBluescript SK+ (Stratagene) （CIAP (MBI Fermentas)処理）にクローン化し、大腸菌Top10 (Invitrogen)にトランスフォームした。50クローンをひろい、挿入物をB-all 27FおよびB-all 1492Rプライマーを用いて増幅した。得られたフラグメントをAluIおよびMboI制限酵素 (MBI Fermentas)で消化し、3%アガロースゲル上に流した。消化パターンは1つだけ観察された。2つのフラグメントを配列決定に送り(MWG Biotech, Germany)、A10株と同定された。PCR反応は、それぞれ乳酸デヒドロゲナーゼの上流領域および下流領域にアニーリングするプライマーldhcw1およびldhccw2を使用しても行った。それ以外は、B-allプライマーと同じ反応条件を使用した。得られたフラグメントをクローン化し (前述)、26を制限断片長ポリモルフィズムにより解析した。再び、これにより得られたパターンは１つだけであった。2つのフラグメントをシークエンスした。
【００５５】
分析方法
これらの株は、前述のとおりバッチにおいてBA培地（抗生物質不含）中で24-48時間増殖させた。培養上清を、グルコース、キシロース、酢酸塩、乳酸塩およびエタノールについて、有機酸解析カラム (Aminex HPX-87H カラム (Bio-Rad)) を使用してHewlett Packard series 1100 HPLC 上65℃で4 mM H2SO4を溶離液として使用して分析した。
【００５６】
酵素および試薬
特記なきかぎり、酵素はMBI Fermentas (Germany) から供給を受け、供給元の推奨にしたがい使用した。PCR反応は、Taq ポリメラーゼとPfu ポリメラーゼとの1ユニット: 1ユニット混合物を使用して行った。化学物質は分子グレードであり、Sigma-Aldrich Sweden ABから購入した。
【００５７】
16S rRNA 解析
200ｌμ のBG1オーバーナイト培養物を回収し、2分間最大有効量の電磁波を処理し、PCRテンプレートとして使用した。1500 bpの16S rDNAをプライマー B1 (GAG TTT GAT CCT GGC TCA G) (配列番号3) およびB2 (ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT) (配列番号4)を使用してPCRにより増幅した。ブラントエンドのPCRフラグメントをプリヌクレオチドキナーゼで処理し、SmaI消化CIP (Calf Intestinal Phosphatase) 処理pBluescript SK+ ベクター (Stratagene)にクローン化した。得られたDNAライブラリー由来の24クローンをAluI、MboIおよびHin6I制限酵素を用いて制限酵素断片解析により解析した。6のフラグメントMWG-Biotech (Germany)での配列決定に送った。アライメントは、VectorNTiを資料して作成し、系統樹はMEGA2 プログラム(Kumar et al., 2001)を用いて描画した。
【００５８】
分析技術
培養上清を、セロビオース、グルコース、キシロース、酢酸塩、乳酸塩およびエタノールについて、有機酸解析カラム(Aminex HPX-87H カラム (Bio-Rad Laboratories, CA USA)) を用いてHPLC上65℃で4 mM H2SO4を溶離液として解析した。エタノールおよび酢酸塩測定は、炎イオン化検出を用いるガスクロマトグラフィーにより検証した。混合糖は、HPLCによりPhenomenex, RCM Monosaccharide (00H-0130-K0) カラムを用いて80℃で水を溶離液として測定した。マンノースおよびアラビノースはこの設定では区別することができなかったので、別個の培養物において試験した。水素は、GC82 Gas chromatograph (MikroLab Aarhus, Denmark)を用いて測定した。
【００５９】
ldhノックアウトカセットの構築
最終的なノックアウトコンストラクトであるp3CHは、1) BG1のl-ldh 遺伝子の上流のDNAフラグメント（プライマーldhup1F (配列番号5; 5’-TTCCATATCTGTAAGTCCCGCTAAAG) およびldhup2R (配列番号6; 5’-ATTAATACAATAGTTTTGACAAATCC)を使用して増幅）、2) 高度熱安定性カナマイシン耐性をコードする遺伝子（プラスミドpUC18HTK (Hoseki et al., 1999)から増幅）、および 3) BG1のl-ldh 遺伝子の下流のDNAフラグメント（プライマー ldhdown3F (配列番号7; 5’- ATATAAAAAGTCACAGTGTGAA)およびldhdown4R (配列番号8; 5’- CACCTATTTTGCACTTTTTTTC)を使用して増幅）。プラスミドp3CHは直鎖化してBG1にエレクトロポレーションした。
【００６０】
ヒドロゲナーゼアンチセンスコンストラクトの構築
ヒドロゲナーゼ A アンチセンスカセットを含むDNAフラグメント（配列番号9 ）をp3CHに挿入した。
【００６１】
pforノックアウトカセットの構築
最終的なノックアウトコンストラクトであるpPFは、1) BG1のl-ldh 遺伝子の上流のDNAフラグメント（プライマー pforup1F (配列番号10; 5’- GAGGATTTAAGAAGGGGAGTTGG)およびpforup2R (配列番号11; 5’- ATTTCATCTCCCCCTGGATAAAG)により増幅、2) 高度熱安定性カナマイシン耐性をコードする遺伝子（プラスミドpUC18HTK (Hoseki et al., 1999)から増幅、および 3) BG1のl-ldh 遺伝子の下流のDNAフラグメント（プライマー pfordown3F (配列番号12; 5’- CGAGAGCTGATTCCCACGAAGA) およびpfordown4R (配列番号13; 5’- CAGACTACTACAACTGGATCTAGC)により増幅）。プラスミドp3PFは直鎖化してBG1にエレクトロポレーションした。
【００６２】
BG1のエレクトロポレーション
エレクトロポレーション事象以外はすべて嫌気性条件下で行った。コンピテント細胞の調製のため、150 ml BA （2 g/l 酵母抽出物および5 g/l キシロースにより補正）にBG1の新鮮ON培養をOD578が0.1となるよう接種し、70℃でインキュベートした。OD578 = 0.5で細胞を氷上冷却し、回収し (3500 rpm、35分、4℃) 、10 mlの冷EPバッファー (0.3M スクロース、10% グリセリン、3.20 mM Na2S、pH 7、滅菌 N2 ガスを流入洗浄)に再懸濁した。洗浄を繰り返し、最終的にペレットを4 mlのEPバッファー（Na2S不含）に再懸濁した。細胞を分割して−80℃で保存した。0.2 mlのコンピテント細胞を、2μgの直鎖化プラスミドDNAを含むエレクトロポレーションキュベット (0.1 cm 電極ギャップ) に移し、25μF、500 ohm、2.0 kVのパルスをかけた。細胞を10 mlのBA培地（2 g/l 酵母抽出物含有）を含む嫌気性血清ボトルに移した。エレクトロポレーションした細胞を70℃で16時間回復させた。その後それらを5μg/mlカナマイシン含有BA培地に10倍希釈した。24時間後、カナマイシン含有培地への移行を繰り返し、培養物を24時間70℃で増殖させた。Hungate 技術 (Bryant MP, 1972; Hungate RE, 1969)を使用して、0.5 mlの培養物を35μg/mlのカナマイシンを含むロールチューブに移した。70℃で2日間インキュベーションした後、コロニーをひろい、抗生物質不含のBA培地に接種した。染色体DNAを4つの独立の組換クローンおよびwt BG1から精製した。それぞれldh遺伝子のすぐ上流とすぐ下流にアニーリングするプライマー ldhcw1およびldhccw2を使用して染色体DNAから2.1 kbのフラグメントが増幅された。これらのフラグメントを制限酵素消化により解析して、シークエンスした。wt BG1を鋳型として使用した場合のみ、内部l-ldh プライマーを用いたPCR反応で産物が生成した。
【００６３】
ノーザン・ブロット 解析
50 mlの指数増殖サーモアナエロバクター細胞から、Total RNA キット（A&A Biotechnology (Poland)）を用いて供給元の推奨にしたがいRNAを精製した。5μgのトータルRNAを、1%アガロースゲル（80 mM グアニジンチオシアネート (mRNAブロット)または5 % 変性アクリルアミドゲル (アンチセンスブロット)含有）に流した。ブロッティングは、TurboBlotter システム (Scleicher & Schuell BioScience GmbH, Germany) を推奨にしたがい使用して行った。ハイブリダイゼーションはUltrahyb 溶液 （Ambion, Inc. (TX, USA)）を使用して行い、洗浄は標準的方法にしたがった (Ausubel et al., 1997)。センスおよびアンチセンスプローブは、pSKPhydD (アンチセンスコンストラクトでｈしようしたのと同じhydD フラグメントであるが、プロモーターおよびターミネーター配列がなく、pBluescript SK+ (Invitrogen)のMCSに挿入されている)から標識α-P32CTPを使用して転写した。
【００６４】
収率および炭素回収率
理論的最大収率および炭素回収率は、以下の反応に基づき計算した (ATP変換およびNAD(P)+変換は含まれていない):
1 M グルコース → 2 M 乳酸塩、
1 M グルコース → 2 M 酢酸塩 + 2 M CO2、
1 M グルコース → 2 M エタノール + 2 M CO2、
3 M キシロース → 5 M 乳酸塩、
3 M キシロース → 5 M 酢酸塩 + 5 M CO2、
3 M キシロース → 5 M エタノール + 5 M CO2。
したがって、グルコースおよびキシロースからのエタノールの理論的最大収率はそれぞれ2および1.67モル/モルである。
【００６５】
炭素回収率は以下のように計算した：
【化１】
2009537156.tif 000003
（式中、nはキシロースについて5、グルコースについて6である）。
【００６６】
実施例１
BG1の16S 解析
BG1株由来の1500 bp 16S rDNAフラグメントのライブラリーを構築し、各種配列について制限断片長多型解析により解析した。1つの消化パターンのみが見られ、6つのクローンをシークエンスした。この6つのシークエンスは同一であり、www.ncbi.nlm.nih.govでのDNAホモロジーサーチにより、BG1株はサーモアナエロバクター・マスラニ群に位置づけられ、これは現在A3株およびBG1株からなっている。BG1の16S rDNA 配列を配列表に配列番号１４として示す。A3株のGenBank配列(Benson et al., 2005)において配列決定されていない7箇所を除き、これら2つの株は同じ16S rDNA 配列を有する。図１に示すように、最も近縁の他の類縁体は、サーモアナエロバクター・サーモコプリエ（Thermoanaerobacter thermocopriae） (98% 同一)、サーモアナエロバクター・アセトエチリカス（Thermoanaerobacter acetoethylicus） (95%) およびサーモアナエロバクター・イタリカス（Thermoanaerobacter italicus） (95%)である。BG1は、サーモアナエロバクター・マスラニ A3株 (Larsen et al., 1997)の近縁である。これにより既報のようにBG1はクロストリジウム属のクラスターVに位置づけられる (Collins et al., 1994)。これら株は近縁であるが、ヘミセルロース加水分解物に対する耐性に関しては非常に異なっている。A3は小麦わら加水分解物 (60 g/l 乾燥重量のキシロース添加小麦わら)において最大40%増殖できるのみであるが、BG1は非希釈加水分解物から糖または酵素の添加なしに増殖し、エタノールを産生することができる。さらに、A3株はガラクトース上で増殖できないことが報告されているが (Larsen et al., 1997)、BG1はガラクトースを唯一の炭素源として良好に増殖し、主としてエタノールを産生することができる(データ非提示)。
【００６７】
実施例２
BG1の発酵産物
BG1をバッチ中で24時間27 mM キシロースを唯一の炭素源として嫌気的に増殖させた (図２)。発酵の始めの4時間では、ほぼ等量の酢酸塩とエタノールが産生された。増殖の4−6時間の間に、エタノール産生が酢酸塩と比較して増加し、後期指数増殖期および静止期においてはほぼエタノールのみが産生された。乳酸塩は実験をとおしてほんの少量しか産生されなかった。水素産生は酢酸塩の産生にしたがうようであり、2つの化合物はほぼ等量産生された。
【００６８】
実施例３
BG1の温度、pH、およびエタノール耐性
図３に示すように、BG1株に最適な温度は約70℃であり、これはBG1が単離された温泉の温度と同じである。BG1はpH=5.0-7.5のpH 範囲において増殖することがわかった。各種pHの培養培地における産物形成をバッチ実験において試験した。図４に示すように、エタノール産生には6.5-7.5のpH 範囲が有利であったが、乳酸塩産生はより低いpHにおいて顕著であった。最適なエタノールの収率は、pH = 6.5およびpH = 7.5において1.15 mM エタノール / mM キシロースであった。pH 5.5ではエタノール収率は0.44 mM / mMであった。これはぞれぞれ、理論的最大収率の69%および26%に相当する。
【００６９】
エタノール耐性は、エタノール産生に非常に重要である。外部エタノール濃度を増加させて産物形成を検討した。図５に示すように、エタノール収率はエタノール濃度が増加すると急落した。培地中の初期エタノール0%では、収率は1.05 mM エタノール / mM 消費キシロースであったが、2.8% エタノールでは0.31 mM/mMであった。エタノール産生におけるこの減少はおもに乳酸塩産生の増加 (6.4倍増加)によるが、酢酸塩産生もまた40%増加した。酢酸塩、エタノール、乳酸塩収率から計算した炭素回収率はすべての濃度において92-99%の範囲であったので (データ非提示)、他の主要な産物は形成されなかったようである。
【００７０】
実施例４
ヘミセルロース糖のBG1共発酵
異なる糖の同時摂取および代謝は、エタノール産生に使用される微生物にとって望ましいがあまり一般的でない性質である。BG1を、バッチにおいて、各々4つの異なるヘミセルロース糖モノマーを含む2つの異なる糖混合物上で試験し、混合モノマーを同時に代謝できるかについて調べた（図６）。マンノースとアラビノースは我々のHPLC設定では区別できなかったので、別の混合物において試験した。図６に示されるように、添加したすべての糖の同時分解が増殖の6-8時間の間に観察された。キシロースの分解速度はグルコースと同じであったが、キシロース分解の開始がわずかに遅かった。ガラクトースとアラビノースは最後に分解され、分解速度はグルコースおよびキシロースのいずれの速度よりも遅かった。マンノース分解の速度は最も速く観察されたが、ここでも分解の開始はグルコースと比較して遅かった。
【００７１】
実施例５
BG1L1およびBGL2: BG1からのl-ldh 遺伝子の欠失
乳酸塩の形成を防ぐため、BG1のL-LDHを欠失させた。ldhの上流および下流の領域に挟まれた熱安定性カナマイシン耐性遺伝子を含む精製pKHFr3rev プラスミドを直鎖化し、BG1にエレクトロポレーションし、陽性組換体を熱安定性カナマイシン耐性遺伝子を用いて選択した。いくつかの独立クローンを単離し、PCRした。次に2つのクローンからのPCR産物をシークエンスし、予想どおり乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のかわりにカナマイシン耐カセットを含むことがわかった。この2つの変異株をBG1L1およびBG1L2と命名した。
【００７２】
wt BG1株および2つのBG1L1株およびBG1L2株を各種グルコースおよびキシロース濃度上で増殖させ、そのエタノール産生能を試験した（図７および８）。便宜上BG1L1のみを示すが、類似のBG1L2株は非常によく似た結果を示し、BG1L1よりもキシロース上での最大収率が多少高いほどであった。
【００７３】
図７および８からわかるように、産物分布は変異体において非常に変化した。グルコースまたはキシロースのいずれを基質として用いても検出可能な乳酸塩は産生されず、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の欠失が確認された。また、ここに記載するldh 遺伝子がBG1における唯一のldh 遺伝子であるか、または主要なldh 遺伝子であることが示された。野性型BG1株は、特にキシロース上で増殖した場合に、基質濃度の増加に反応して乳酸塩産生が増加する。対応するエタノール産生および酢酸塩産生の低下が見られる。より高い糖濃度では酢酸塩産生は一定であるかまたはより低く、乳酸塩が産生されないため、一定の高いエタノール産生またはエタノール産生の増加が観察される。エタノール収率は変異体において顕著に改善されている:グルコース上で、wt 株では理論上最大収率の51 - 56%の収率であったのに対して、BG1L1では84 - 91%の収率が観察された。キシロース上で、BG1L1およびBG1wtのエタノール収率はそれぞれ76 - 80%および40 - 63%であった。炭素回収率は91-106%の間であった（図７Ｂおよび８Ｂ）。100%を上回る回収率はおそらく酵母抽出物成分の代謝により生じたと思われる。
【００７４】
図９は、培地中のエタノール濃度を増加させた場合のBG1のエタノール産生をBG1Lと比較して示す。wt BG1株は、培地中のエタノール濃度の増加に反応して急激に乳酸塩産生が増加する。酢酸塩産生は約2倍増加する。2.8% (v/v) エタノールを添加すると、エタノール収率は最大理論上収率の20 %まで減少する。BG1Lでは、乳酸塩産生は観察されず、酢酸塩の産生はより高いエタノール濃度において顕著に増加はしない。結果として、いずれの培地中のエタノール濃度においてもエタノール収率が高い。実際、測定された最高の収率は1.95%のエタノールの添加において理論上最大の84%であり、2.8%のエタノールにおいても収率は72%である。炭素回収率は84-99 %の間であった（図９Ｂ）。独立クローンであるBG1L2を用いて実験を繰り返し、同様の結果を得た。
【００７５】
実施例６
BG1L1を用いた糖の連続発酵
固定化好熱性嫌気性細菌の連続エタノール発酵における使用可能性を、実験室規模の流動床リアクタを70℃で作動させて検討した（図１０）。水保持時間 (hydraulic retention time, HRT) のエタノール産生および生産性に対する効果を、10 g/l キシロースの供給流において実験した。産物濃度とキシロース変換は、8時間から1時間の漸減HRTによりほとんど影響されなかった。糖変換は97.8% より高く0.33 g-エタノール/g-初期糖が生じ、エタノール生産性は0.43 g/l/h から3.34 g/l/hに漸増した。第２の実験を行い、グルコースとキシロースの共発酵について検討した。両方の糖が同時にかつ効率的にエタノールに変換され、最大54 g/lまでの糖混合物において糖利用は90.6%より高かった。これらの糖濃度において、エタノール産生は漸増し、達成された最大エタノール濃度は15.35 g/lであった。エタノール収率は、0.28-0.40 g-エタノール /g-初期糖であった。得られた最大のエタノール生産性は、8時間のHRTおよび30 g/lの糖において1.1 g/l/hであった。本研究は、活性ある好熱性嫌気性細菌の固定化細胞培養が可能であることを示す。リアクタは140日間コンタミネーションなく作動し、良好な長期パフォーマンスを示した。
【００７６】
実施例７
BG1L1を用いた蒸気爆発小麦わらの連続発酵
蒸気爆発小麦わら加水分解物 (SEWS) は、蒸気爆発およびそれに続く構成糖であるグルコースおよびキシロースを放出させる酵素加水分解 (CelluclastおよびNovozyme188 （Novozymes A/Sより供給）を使用) により調製された。SEWSはELSAM, DKより供給された。この加水分解物は乾物含量が 23% (DM)であり、グルコースおよびキシロースはそれぞれ57 g/lおよび30 g/lであった。細菌のコンタミネーションを防ぐため、SEWS加水分解物培地を121℃まで1分間加熱した。それぞれ12 g/lおよび43 g/lのグルコース-キシロース混合物に対応する所望の濃度である7.5%および15% DMを与える量の水をそれぞれ添加して、2つのSEWS懸濁液を調製した（図１１）。SEWS培地は滅菌されており、また無毒化されていなかったにもかかわらず、BG1L1株は同様にグルコースおよびキシロースを0.39-0.4 g/gという比較的高いエタノール収率で効率的に共発酵することができた（図１２）。グルコースは試験したいずれのSEWS懸濁液についても完全に利用され (>98%) 、一方キシロース変換は15% (DM) SEWSにおいて99%から80%に減少したが、全体の糖変換は90%より高かった。酢酸塩が主な副産物であり、発酵全体をとおして比較的低いままであった(0.07-0.08 g /g) （図１２）。
【００７７】
これら発酵のいずれにおいても乳酸塩はほんの少量しか産生されず、これは本株が乳酸デヒドロゲナーゼ欠損変異体であることから予想されるとおりである。
【００７８】
約140日継続する両実験中、リアクタサンプルから染色体DNAを精製してリアクタをコンタミネーションについて定期的にチェックしたが、BG1L1以外の種は見つからなかった。また、乳酸デヒドロゲナーゼ領域の配列決定により、乳酸デヒドロゲナーゼの欠失は安定であることがわかった。
【００７９】
実施例８
BG1L1を用いた酸前処理トウモロコシ茎葉の連続発酵
希硫酸加水分解により調製されたトウモロコシ茎葉加水分解物 (PCS)は、National Renewable Energy Laboratory (Golden, CO, USA)より供給された。加水分解物は、全固形分 (TS) 含量30% (wt)であり、キシロース、グルコース、および酢酸塩濃度はそれぞれ 67 g/l、15 g/l、および14 g/lであった。濃度2.5% - 15% TS のトウモロコシ茎葉加水分解物を使用した。加水分解物懸濁液における全糖濃度が2.5%および5% TSと低いため、追加の5 g/l キシロースをこれら懸濁液に添加し、糖含量が比較的低いことにより起こる最終的なプロセスの問題を予防した。
【００８０】
2.5-10% TSの範囲のPCS 加水分解物濃度を用いると、エタノール産生が漸増し、比較的高く安定したエタノール収率が0.41-0.43 g/gの範囲で得られた（図１５）。2.5-7.5% TSのPCSについてほぼ完全な糖利用 (95%より高) が達成されたが、10% (TS)では糖変換は約85%まで減少した（図１６）。15% TSのPCS濃度において、糖変換は70%であり、0.35 g/gに近い比較的高いエタノール収率が得られた。他の加水分解物濃度と比較して15% (TS) PCSにおいて糖変換が低い(図１３)ことは、酢酸塩、加水分解物中に存在する他の阻害物質、およびpH調節のために添加された塩基により生じた塩蓄積の濃度が高いことの負の組み合せ効果により起こった増殖および産物阻害が原因である可能性がある (Lynd et al, 2001; Palmqvist and Hahn-Hagerdal 2000; Zalvidar et al. 2001)。しかしながら、15% TSのPCSにおける低エタノール収率(図１５)は、炭素回収率が低い (CR<0.9)ことからおそらく予想より高いエタノール蒸発によるものであろう。
【００８１】
酢酸塩産生は、約1 g/lから約3.5 g/lに増加した（図１４）。しかしながら、供給流中の初期酢酸塩濃度が高いため (約1-7 g/l) 、ほぼ10 g/lのかなり高い酢酸塩が流出液中に存在し、これは発酵に対する酢酸塩の抑制効果に関して顕著である。これら結果は、非無毒化PCS中に存在する代謝阻害物質に対する本生物の高度耐性を明確に示す。
【００８２】
実施例９
BG1PF: BG1株の乳酸塩産生変異体
図２０に示すDNAフラグメントをBG1の染色体に導入することにより、BG1由来の株を作成した。pforの上流および下流の領域に挟まれた熱安定性カナマイシン耐性遺伝子を含む精製ppta32K プラスミドを直鎖化し、BG1にエレクトロポレーションし、陽性組換体を熱安定性カナマイシン耐性遺伝子を用いて選択した。いくつかの独立クローンを単離し、PCRにより検証した。次に2つのクローンからのPCR産物をシークエンスし、予想どおりpfor 遺伝子のかわりにカナマイシン耐性カセットを含むことがわかった。
【００８３】
BG1PFの5つの独立クローンをバッチ中で2日間5 g/l キシロースを唯一の炭素源として増殖させた。図２１からわかるように、代謝における完全なシフトが見られ、乳酸塩の産生が現在の主な発酵産物である。
【００８４】
実施例１０
BG1H1: 取り込みヒドロゲナーゼのダウンレギュレーションにより構築された水素産生の増加したBG1変異体
【００８５】
ヒドロゲナーゼは、水素の産生と取り込みの両方に関与しうる。BG1において、既知のヒドロゲナーゼの2つの類似性を有する配列が見つかった。1つ (hydA BG1) は、DNAレベルでサーモアナエロバクター・テンコンジェンシス （Thermoanaerobacter tengcongensis） hydA 遺伝子と80.4% 同一であり、アミノ酸レベルで対応するHydA タンパク質と91.8% 同一である。HydAタンパク質は、Ta. テンコンジェンシス（Ta. Tengcongensis） (1015)の細胞質NAD(H)依存Fe-ヒドロゲナーゼにおける4つのサブユニットのうちの1つである。NADH依存ヒドロゲナーゼの活性は高水素分圧により阻害されるが、アルデヒドデヒドロゲナーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼの活性は上昇したp(H2)において増殖するT. テンコンジェンシスの方が高い。同様に、エタノール産生も低p(H2)における発酵培養ではほぼ消失する。
【００８６】
ヒドロゲナーゼに類似性を有するBG1における第2の配列は、サーモアナエロバクター・テンコンジェンシスのechE遺伝子と73%同一であり、サーモアナエロバクター・テンコンジェンシスのEchヒドロゲナーゼのEchEタンパク質サブユニットと76% 同一である。Echヒドロゲナーゼは、サーモアナエロバクター・テンコンジェンシス抽出物の膜画分に見られるフェレドキシン依存 [NiFe] ヒドロゲナーゼである。両サーモアナエロバクター・テンコンジェンシスヒドロゲナーゼは、主として水素発生酵素である。
【００８７】
サーモアナエロバクター BG1において、高p(H2)下および低p(H2)下のいずれにおいても主な産物はエタノールである。それゆえ、これは水素産生とエタノール産生について異なるストラテジーを用いているようである。echEおよびhydAの発現をダウンレギュレーションするためのカセットをBG1の染色体に導入して、2つのヒドロゲナーゼのダウンレギュレーションの効果を研究した。カセットの基本構築を図２２に示す。カセットがBG1に導入されると、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が除去され、プロモーターが活性化される。その結果、hydAおよびechEをそれぞれ含むmRNAに相補的な小さい転写物が発現する。この発現の結果、大抵の場合において二本鎖RNAの消化によりmRNAのレベルが低下する。
【００８８】
hydA アンチセンス RNAの発現および対応するhydA mRNAのダウンレギュレーションは、ノーザン・ブロットにより検証した（図２３）。トータルRNAをBG1から精製し、膜に転写し、hydAアンチセンスRNAおよびhydA mRNAにそれぞれ相補的なプローブにより調べた。アンチセンスRNAの発現に使用したプロモーターは、グルコースにより抑制され、キシロースの存在により誘導されることが示された。これにしたがい、アンチセンスはキシロース上での増殖中にのみ見られた。野生型BG1株およびldhを欠失するがアンチセンスは挿入されていないBG1L1株もまた対照として示す。予想どおり、hydAアンチセンスRNAはこれら株では見られなかった。hydA オペロン由来の転写物は約500 bの長さと予想される。hydAを含むmRNAに対するプローブを使用する場合、約6000-7000 bを移動するバンドが見られる。また、特に細胞がキシロースを唯一の炭素源として増殖した場合、約3000-4000 bの1-2本のより小さくかつ強いバンドが見られる。最も小さいバンドは、おそらく16S rRNAに対するクロス-ハイブリダイゼーションである。3-4000 bのRNAに対応するRNAは強度が非常に多様である。この種のレベルは、グルコースと比較してキシロース上で増殖中のほうがより高く、また野性型と比較して乳酸デヒドロゲナーゼを欠損する株のほうが高い。グルコース上で増殖した場合、このバンドのレベルはBG1L1とBG1H1とで等しい。一方キシロース上で増殖中は、アンチセンスが発現していない株のほうがより強い。これは、上図のアンチセンスRNA発現の発現とよく一致する。
【００８９】
図２４に示すように、BG1H1は対照株と比較して、より多くの酢酸塩、より多くの水素を産生し、エタノールの産生が少ない。このことは、Ta. テンコンジェンシスについて示されたように、BG1のHydABCD ヒドロゲナーゼが水素産生よりもむしろ水素取り込みに関与することを示唆する。NAD(P)HはアセチルCoAのアセトアルデヒドへの還元およびアセトアルデヒドのエタノールへの還元に必要であるので、HydABCD ヒドロゲナーゼはこれらのコファクターの水素を用いる還元に関与するようである。酢酸塩と水素はいずれも貴重な産物であり、それゆえ、より高い水素産生および酢酸塩産生を目的とするならばBG1H1株が好ましい場合がある。
【００９０】
参考文献
Benson,D.A., Karsch-Mizrachi,I., Lipman,D.J., Ostell,J., and Wheeler,D.L. (2005). GenBank. Nucleic Acids Res. 33 Database Issue, D34-D38.
Bryant,F.O. (1991). Characterization of the fructose 1,6-bisphosphate-activated, L(+)-lactate dehydrogenase from Thermoanaerobacter ethanolicus. J Enzyme Inhib. 5, 235-248.
Burdette,D.S., Jung,S.H., Shen,G.J., Hollingsworth,R.I., and Zeikus,J.G. (2002). Physiological function of alcohol dehydrogenases and long-chain (C(30)) fatty acids in alcohol tolerance of Thermoanaerobacter ethanolicus. Appl. Environ. Microbiol. 68, 1914-1918.
Carreira,L.H., Ljungdahl,L.G., Bryant,F., Szulczynski,M., and Wiegel,J. (1982). Control of product formation with Thermoanaerobacter ethanolicus, enzymology and physiology. In Genetics of industrial micoorganisms, Y.Ikeda, ed. American Society for Microbiology, Washington DC), pp. 351-355.
Collins,M.D., Lawson,P.A., Willems,A., Cordoba,J.J., Fernandez-Garayzabal,J., Garcia,P., Cai,J., Hippe,H., and Farrow,J.A. (1994). The phylogeny of the genus Clostridium: proposal of five new genera and eleven new species combinations. Int J Syst. Bacteriol. 44, 812-826.
Cook,G.M. (2000). The intracellular pH of the thermophilic bacterium Thermoanaerobacter wiegelii during growth and production of fermentation acids. Extremophiles 4, 279-284.
Dien,B.S., Nichols,N.N., O'Bryan,P.J., and Bothast,R.J. (2000). Development of new ethanologenic Escherichia coli strains for fermentation of lignocellulosic biomass. Appl Biochem. Biotechnol 84-86, 181-196.
Erbeznik,M., Dawson,K.A., and Strobel,H.J. (1998). Cloning and characterization of transcription of the xylAB operon in Thermoanaerobacter ethanolicus. J. Bacteriol. 180, 1103-1109.
Herrero,A.A. and Gomez,R.F. (1980). Development of ethanol tolerance in Clostridium thermocellum: effect of growth temperature. Appl. Environ. Microbiol. 40, 571-577.
Ho,N.W., Chen,Z., and Brainard,A.P. (1998). Genetically engineered Saccharomyces yeast capable of effective cofermentation of glucose and xylose. Appl. Environ. Microbiol. 64, 1852-1859.
Hueck,C.J. and Hillen,W. (1995). Catabolite repression in Bacillus subtilis: a global regulatory mechanism for the gram-positive bacteria? Mol. Microbiol 15, 395-401.
Klinke,H.B., Thomsen,A.B., and Ahring,B.K. (2004). Inhibition of ethanol-producing yeast and bacteria by degradation products produced during pre-treatment of biomass. Appl. Microbiol. Biotechnol. 66, 10-26.
Kumar,S., Tamura,K., Jakobsen,I.B., and Nei,M. (2001). MEGA2: molecular evolutionary genetics analysis software. Bioinformatics. 17, 1244-1245.
Lamed,R. and Zeikus,J.G. (1980). Ethanol production by thermophilic bacteria: relationship between fermentation product yields of and catabolic enzyme activities in Clostridium thermocellum and Thermoanaerobium brockii. J Bacteriol 144, 569-578.
Larsen,L., Nielsen,P., and Ahring,B.K. (1997). Thermoanaerobacter mathranii sp nov, an ethanol-producing, extremely thermophilic anaerobic bacterium from a hot spring in Iceland. Arch. Microbiol. 168, 114-119.
Lawford,H.G. and Rousseau,J.D. (2002). Performance testing of Zymomonas mobilis metabolically engineered for cofermentation of glucose, xylose, and arabinose. Appl Biochem. Biotechnol 98-100, 429-448.
Lovitt,R.W., Longin,R., and Zeikus,J.G. (1984). Ethanol-Production by Thermophilic Bacteria - Physiological Comparison of Solvent Effects on Parent and Alcohol-Tolerant Strains of Clostridium-Thermohydrosulfuricum. Appl. Environ. Microbiol. 48, 171-177.
Lovitt,R.W., Shen,G.J., and Zeikus,J.G. (1988). Ethanol-Production by Thermophilic Bacteria - Biochemical Basis for Ethanol and Hydrogen Tolerance in Clostridium-Thermohydrosulfuricum. J. Bacteriol. 170, 2809-2815.
Lynd,L.R. (1989). Production of ethanol from lignocellulosic materials using thermophilic bacteria. Critical evaluation of potential and review. In Advances in biochemical engineering/Biotechnology, A.Fiechter, ed. (New York: Springer Verlag), pp. 1-52.
Rani,K.S. and Seenayya,G. (1999). High ethanol tolerance of new isolates of Clostridium thermocellum strains SS21 and SS22. World J. Microbiol. Biotechnol. 15 , 173-178.
Rani,K.S., Swamy,M.V., Sunitha,D., Haritha,D., and Seenayya,G. (1996). Improved ethanol tolerance and production in strains of Clostridium thermocellum. World J. Microbiol. Biotechnol. 12, 57-60.
Saddler, J. N and Chan, M. K. H. Conversion of pretreated lignocellulosic substrates to ethanol by Clostridium thermocellum in mono- and co-culture with Clostridium thermosaccharolyticum and Clostridium thermohydrosulfuricum. Can J Microbiol 30, 212-220. 1984. 
Wiegel, J. and Ljungdahl, L. G. Thermoanaerobacter ethanolicus gen. nov., spec. nov., a new, extreme thermophilic, anaerobic bacterium. Arch Microbiol 128, 343-348. 1981.
【図１】
2009537156.tif 000004
【図２】
2009537156.tif 000005
【図３】
2009537156.tif 000006
【図４】
2009537156.tif 000007
【図５】
2009537156.tif 000008
【図６】
2009537156.tif 000009
【図７】
2009537156.tif 000010
【図８】
2009537156.tif 000011
【図９】
2009537156.tif 000012
【図１０】
2009537156.tif 000013
【図１１】
2009537156.tif 000014
【図１２】
2009537156.tif 000015
【図１３】
2009537156.tif 000016
【図１４】
2009537156.tif 000017
【図１５】
2009537156.tif 000018
【図１６】
2009537156.tif 000019
【図１７】
2009537156.tif 000020
【図１８】
2009537156.tif 000021
【図１９】
2009537156.tif 000022
【図２０】
2009537156.tif 000023
【図２１】
2009537156.tif 000024
【配列表】
2009537156000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成21年1月23日(2009.1.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2009537156000001.app
【国際調査報告】
2009537156.tif 000030
2009537156.tif 000031
2009537156.tif 000032
2009537156.tif 000033