(57)【要約】【解決手段】本発明は、ＤＮＡにおけるシトシンメチル化の検出方法、および本発明の方法によるアッセイを行うためのキットに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡにおけるシトシンメチル化の検出方法であって、以下の工程が実施されることを特徴とする、方法：
ａ）ゲノムＤＮＡサンプルを、テトラヒドロフルフリルアルコールの存在下、０．１〜６mol/lの濃度範囲の重亜硫酸塩（＝亜硫酸水素塩、二硫酸塩）溶液とインキュベートする工程；
ｂ）得られた反応混合物を、工程ａ）で添加された試薬を除去するために精製または除去工程に付すか、または、処理されたＤＮＡサンプルを、工程ａ）で添加された試薬がその後の反応を妨げないように、水または水溶液で希釈する工程；
ｅ）ゲノムＤＮＡサンプルと比較して、工程ａ）の処理によって配列が変化した程度の検出を実施し、ゲノムＤＮＡサンプルの少なくとも１つの遺伝子座でのメチル化状態に関する結果を出す工程。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、工程ａ）において少なくとも１つのラジカル捕捉剤が存在する、方法。
【請求項３】
前項のうちの１つに記載の方法であって、ＤＮＡサンプルを精製または除去工程の間に脱スルホン化工程に付すか、または、ＤＮＡサンプルをその後の反応において脱スルホン化工程に付す、方法。
【請求項４】
前項のうちの１つに記載の方法であって、ＤＮＡサンプルを、工程ｅ）における検出の前にポリメラーゼ反応において増幅する、方法。
【請求項５】
請求項１に記載のアッセイを実施するためのキットであって、重亜硫酸塩およびテトラヒドロフルフリルアルコールを含む少なくとも１つの試薬を含む、キット。
【請求項６】
請求項５に記載のキットであって、少なくとも１つのラジカル捕捉剤をさらに含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡにおけるシトシンメチル化の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の分子生物学における方法論的開発の結果として、遺伝子自体、これら遺伝子のＲＮＡ中への翻訳、および得られるタンパク質の観察がよく研究されている。個体の発生過程において、どの遺伝子にスイッチが入るか、および、ある細胞および組織で特定の遺伝子の活性化および阻害がどのように制御されるかは、遺伝子またはゲノムのメチル化の程度および形質に関係し得る。
【０００３】
5-メチルシトシンは、真核細胞のＤＮＡにおいて最も高い頻度で共有結合的に修飾される塩基である。5-メチルシトシンは、例えば、転写調節、遺伝子刷り込み、および発癌に関与する。従って、遺伝子情報の要素としての5-メチルシトシンの同定は相当興味深い。しかしながら、5-メチルシトシンは、シトシンと同様の塩基対挙動を有することから、シークエンシングによってその位置を特定することはできない。さらに、5-メチルシトシンが持つエピジェネティックな情報は、ＰＣＲ増幅の間に完全に損なわれる。
【０００４】
5-メチルシトシンに関するＤＮＡの研究において、相対的に新しく、一方で最も頻繁に使用される方法は、重亜硫酸とシトシンとの特異的反応に基づくが、シトシンは続くアルカリ加水分解の後、ウラシルに変換され、ウラシルはその塩基対挙動においてチミジンに対応する。対照的に、5-メチルシトシンは、これらの条件下では修飾されない。従って、元のＤＮＡは、元来ハイブリダイゼーション挙動においてシトシンと区別できないメチルシトシンを、「標準的」分子生物学的手法、例えば、増幅およびハイブリダイゼーションまたはシークエンシングによって、唯一残るシトシンとして検出することができるような方法で修飾される。これら全ての技術は塩基対合に基づき、これは現在では完全に活用されている。感度の点での最新技術は、調査下のＤＮＡをアガロースマトリックス中に取り込む方法によって特徴付けられるが、この方法はＤＮＡの拡散および再生を阻害し（重亜硫酸は一本鎖ＤＮＡに対してのみ反応する）、全ての沈殿および精製工程を迅速な透析で置き換えるものである（オレク(Olek),A.ら、Nucl. Acids Res. 1996年、24巻、5064-5066頁）。個々の細胞はこの方法で調査することが可能であり、そのことによりこの方法の将来性が示される。しかし、これまで約3000塩基対の長さまでの個々の領域のみが調査されたが、幾千のメチル化分析が見込まれる細胞の包括的研究は可能ではない。しかしながら、この方法もまた、少量のサンプルからの極小断片を確実に分析することはできない。拡散に対して保護しても、極小断片はマトリックスから失われる。
【０００５】
ほとんど例外なく（例えば、B.ツェヒニク(Zechnigk),Mら、Eur. J. Hum. Gen.、1997年、5巻、94-98頁）、これまで重亜硫酸技術は研究において唯一使用されてきた。知られている遺伝子の短くて特異的な断片は常に重亜硫酸処理の後に増幅され、完全にシークエンシングされるか（オレク(Olek),A.およびワルター(Walter),J.、Nat Genet.、1997年、17巻、275-276頁）、または、「プライマー伸長反応」（ゴンザルゴ(Gonzalgo),M.L.およびジョーンズ(Jones),P.A.、Nucl. Acids Res.、1997年、25巻、2529-2531頁、国際特許WO-95/00669-A1号）または酵素消化（ソング(Xiong),Z.およびレイヤド(Laird),P.W.、Nucl. Acid Res.、1997年、25巻、2532-2534頁）において個々のシトシン位置が同定される。ハイブリダイゼーションによる検出もまた記載されている（オレクら、国際特許WO-99/28498-A2号）。
【０００６】
蛍光標識したプローブは、固定化したＤＮＡアレイのプロービングに頻繁に使用される。各プローブの5'-OHへのCy3およびCy5色素の簡単な結合は、蛍光標識に特に好適である。ハイブリッドプローブの蛍光検出は、例えば共焦点顕微鏡を用いて実施される。多数の他のものに加えて、色素Cy3およびCy5は市販されている。
【０００７】
ポリメラーゼ連鎖反応（またはＰＣＲ）法は、所望のＤＮＡ配列の少数の分子をインビトロで短時間に106〜108倍で増やすことが可能な、遺伝子工学において使用される方法である。通常、約15〜30個のヌクレオチドを有する２つの合成オリゴデオキシヌクレオチドプライマーが必要であり、それらの配列は、4-デオキシヌクレオチド-5-トリホスフェートと少なくとも95℃での短時間の加熱に機能を損なわずに耐え得る熱安定性ＤＮＡポリメラーゼとの混合物と共に増やされる（「増幅される」）、ＤＮＡの姉妹染色分体の開始および終止配列に相補的である。
【０００８】
多くの目的で、元々存在するＤＮＡ分子の数を定量することはＰＣＲにおいて必要である。従って、ＰＣＲの個々の工程の間であっても、形成されたＤＮＡのコピー数を計算し、故にこの値に到達し得る、種々のアプローチがある。通常、ＰＣＲの中間期、いわゆる対数期が選択され、ここでは、ＤＮＡテンプレートの数は実際に各サイクル間でほぼ２倍である。
【０００９】
マトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析（MALDI-TOF）は、生体分子分析に非常に有効な開発である。（カラス(Karas),M.およびヒレンカンプ(Hillenkamp),F.(1988年)、10,000ダルトンを超える分子量を有するタンパク質のレーザー脱離イオン化。Anal. Chem. 60巻:2299-2301頁）。被分析物は光吸収マトリクスにはめ込まれる。マトリクスを短レーザパルスで濃縮し、被分析分子を断片化せずに気相に送る。マトリクス分子との衝突により、被分析物のイオン化を達成する。加電圧によりイオンがフィールドフリー飛行管中で加速される。イオンはその質量によって加速が異なる。より小さいイオンは、より大きいものより速く検出器に到達する。MALDI-TOF分光法は、ペプチドおよびタンパク質の分析に理想的に適合する。
【００１０】
核酸の分析は、幾分かより困難である（グート(Gut),I.G.およびベック(Beck),S.、１(1995年)、DNAおよびマトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析。分子生物学：カレント・イノベーションズ・アンド・フューチャー・トレンド(Current Innovations and Future Trends)、1巻、147-157頁）。核酸に対する感度は、ペプチドの約１００倍劣り、断片のサイズが大きくなるに従って、比率以上に低下する。マトリクスによるイオン化工程は、多数重なり負に帯電した骨格を有する核酸について、効率が有意に劣る。
【００１１】
マトリクスの選択は、MALDI-TOF分光法において極めて重要な役割を演じる。多数の非常に効率の良いマトリクスが、非常に細かく結晶体するペプチドの脱離用に発見されている。ＤＮＡに好適なマトリクスは非常にたくさんあるが、結果として感度の差は低下していない。感度の差は、ＤＮＡがよりペプチドに近くなるようにＤＮＡを化学的に修飾することによって低下し得る。ホスホロチオエート核酸は、骨格の通常のホスフェートがチオフォスフェートで置換されているが、単純なアルキル化反応によって電荷が中性のＤＮＡに変換され得る（グート(Gut),I.G.およびベック(Beck),S.、(1995年)、質量分析による選択的ＤＮＡアルキル化および検出方法。Nucleic Acids Res.、 23巻、1367-1373頁）。この修飾したＤＮＡに「電荷タグ」を結合することにより、ペプチドに対する感度と同程度に感度が上がる。修飾されない基質の検出を非常に困難にする不純物の分析の安定性が上がることは、「電荷タグつけ」のさらなる優位点である。
【００１２】
ゲノムＤＮＡは、標準的な方法で、細胞、組織または他の実験試料より得られる。この標準的な方法論は、フリッツ(Fritsch)およびマニアティス(Maniatis)編、分子クローニング：実験室マニュアル、1989年、等の出典に見られる。
【００１３】
ゲノムＤＮＡにおいて、尿素は、5-メチルシトシンのシークエンシングの前の重亜硫酸処理の効率を改善する（パウリン(Paulin)R、グリッグ(Grigg)GW、デイビー(Davey)MW、パイパー(Piper)AA。(1998年)、Nucleic Acids Res. 26巻、5009-5010頁）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の課題は、従来技術の不利点を克服する、ＤＮＡにおけるシトシンメチル化の改良された検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
この課題は、以下の手順が実施されるシトシンメチル化の検出方法が提供されることにおいて解決される：
ａ）ゲノムＤＮＡサンプルを、テトラヒドロフルフリルアルコールの存在下、０．１〜６mol/lの濃度範囲内の重亜硫酸塩（＝亜硫酸水素塩、二硫酸塩）溶液とインキュベートする；
ｂ）得られた反応混合物を、工程ａ）で添加された反応物質を除去するために精製または除去工程に付すか、または、処理されたＤＮＡサンプルを、工程ａ）で添加された試薬が以下の反応を妨げないように、水または水溶液で希釈する；
ｅ）ゲノムＤＮＡサンプルと比較して、工程ａ）の処理によって配列が変化した程度の検出を実施し、ゲノムＤＮＡサンプルの少なくとも１つの遺伝子座でのメチル化状態に関する結果を出す。
【００１６】
この課題は、以下の手順法が実施される、ＤＮＡにおけるシトシンメチル化の検出方法が提供されることにおいても解決され得る：
ａ）少なくとも１つのラジカル捕捉剤およびテトラヒドロフルフリルアルコールに加えて、任意にさらなる変性試薬および／または溶媒の存在下、ゲノムＤＮＡサンプルを、０．１〜６mol/lの濃度範囲内の重亜硫酸塩（＝亜硫酸水素塩、二硫酸塩）溶液とインキュベートする；
ｂ）得られた反応混合物を、工程ａ）で添加された反応物質を除去するために精製または除去工程に付すか、または、処理されたＤＮＡサンプルを、工程ａ）で添加された試薬が以下の反応を妨げないように、水または水溶液で希釈する；
ｃ）ＤＮＡサンプルを、精製または除去工程の間、任意に脱スルホン化工程に付すか、または、ＤＮＡサンプルをその後の反応において脱スルホン化工程に付す；
ｄ）ＤＮＡサンプルを、ポリメラーゼ反応において任意に増幅する；
ｅ）ゲノムＤＮＡサンプルと比較して、工程ａ）の処理によって配列が変化した程度の検出を実施し、ゲノムＤＮＡサンプルの少なくとも１つの遺伝子座でのメチル化状態に関する結果を出す。
【００１７】
驚くべきことに、他の洗浄剤または溶媒と比較して、環境適合性および毒性の点で、テトラヒドロフルフリルアルコールは、本発明の方法における使用に、他の使用される溶媒と比較して有利であることがわかった。
【００１８】
従って、変性剤および／または溶媒を以下の化合物または化合物群のリストより選択することが好ましい：ポリエチレングリコールジアルキルエーテル、ジオキサンおよび置換誘導体、尿素または誘導体、アセトニトリル、第一級アルコール、第二級アルコール、第三級アルコール、ジエチレングリコールジアルキルエーテル、トリエチレングリコールジアルキルエーテル、テトラエチレングリコールジアルキルエーテル、ペンタエチレングリコールジアルキルエーテル、ヘキサエチレングリコールジアルキルエーテル、DMSO、THF。
【００１９】
ラジカル捕捉剤を以下の化合物群より選択することがさらに好ましい：
ジ−、トリヒドロキシベンゼン、緑茶抽出物、松樹皮抽出物（ピクノジェノール）、イチョウ葉抽出物（EGb761）、種々の果物および野菜抽出物のフラボノイド混合物（GNLD）、バイオノーマライザー(Bio-Normalizer)（サンオー社(Sun-O Corp)）、DPPH（1,1-ジフェニル-2-ピクリルヒドラジル）、NDGA（ノルジヒドログアファレチン酸(nordihydroguajaretic acid)）、トロロックス(Trolox)（6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチルクロマン-2-カルボン酸）、2,6-ジ-t-ブチルフェノール、4-メチル-ジ-t-ブチルフェノール、4-メトキシ-ジ-t-ブチルフェノール、2,6-ジ-t-ブチル-p-クレゾール、3,4-ジヒドロキシ安息香酸、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＱ、ヒドロキノン、ユビキノン、リグナン、ヒドロキシテルペン、フラボノイド、クルクミン、タンニン、レチノイン酸化合物、Ge-132 ビス-β-カルボキシエチルゲルマニウムセスキオキサイド、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）、スーパーオキシドカタラーゼ、α-ナフトフラボン、イチョウ葉抽出物（EGb761）、ジ(2-メチル-5-クロロフェニル)ジチオナートおよびCu(ll)-誘導体、メベンダゾール、CS(クロロホルム可溶性)アルカロイド抽出物、4-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-3-ヒドロキシ-1,2-ナフトキノン、4-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-3-メトキシ-1,2-ナフトキノン、4-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-1,2-ナフトキノン、2-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-3-ブロモ-1,4-ナフトキノン、2-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-3-クロロ-1,4-ナフトキノン、2-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-3-メトキシ-1,4-ナフトキノン、2-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-3-ヒドロキシ-1,4-ナフトキノン、2-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-1,4-ナフトキノン、4-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-3-ヒドロキシ-5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-1,2-アントラキノン、4-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-3-メトキシ-5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-1,2-アントラキノン、4-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-1,2-アントラキノン、3-ブロモ-4-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-1,2-アントラキノン、2-(3,5-ジ-t-ブチル-4-オキソシクロヘキサ-2,5-ジエニリデン)-インダン-1,3-ジオン、2-(3,5-ジ-t-ブチル-4-オキソシクロヘキサ-2,5-ジエニリデン)-3,4-エポキシ-3-ヒドロキシ-4-メトキシ-3,4-ジヒドロ-2H-ナフタレン-1-オン、2-(3,5-ジ-t-ブチル-4-オキソシクロヘキサ-2,5-ジエニリデン)-3,4-エポキシ-3,4-ジメトキシ-3,4-ジヒドロ-2H-ナフタレン-1-オン、2-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-インダン-1-オン、3,3-ジ[2-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-インデン-1-オン]-3-イル、2-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-3-ブロモ-5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-1,4-アントラキノン、2-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-3-クロロ-5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-1,4-アントラキノン、2-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-3-メトキシ-5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-1,4-アントラキノン、2-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-3-ヒドロキシ-5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-1,4-アントラキノン、2-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-1,4-アントラキノン、2-ブロモ-3-(3-ブロモ-5-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-1,4-アントラキノン、2-ブロモ-3-(3,5-ジブロモ-4-ヒドロキシフェニル)-5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-1,4-アントラキノン、2-ブロモ-3-(3-ブロモ-5-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-3-ヒドロキシ-5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-1,4-アントラキノン、3-ブロモ-2-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-1,4-アントラキノン、2-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-3-メトキシ-1,4-アントラキノン、2-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-3-ヒドロキシ-1,4-アントラキノン、5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロナフタレン-1,3-ジオール、3-メトキシ-5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロナフタレン-1-オール、4-(3-クロロ-5,5,8,8-テトラメチル-1,4-ジオキソ-1,4,5,6,7,8-ヘキサヒドロアントラセン-2-イル)安息香酸、メチル-4-(3-クロロ-5,5,8,8-テトラメチル-1,4-ジオキソ-1,4,5,6,7,8-ヘキサヒドロアントラセン-2-イル)ベンゾエート、4-(3-ヒドロキシ-1,4-ジオキソ-1,4-ジヒドロナフタレン-2-イル)安息香酸、メチル-(3-メトキシ-1,4-ジオキソ-1,4-ジヒドロナフタレン-2-イル)安息香酸、(3-メチル-1,4-ジオキソ-1,4-ジヒドロナフタレン-2-イル)安息香酸メチル、4-(3-ヒドロキシ-5,5,8,8-テトラメチル-1,4-ジオキソ-1,4,5,6,7,8-ヘキサヒドロアントラセン-2-イル)安息香酸、メチル-4-(3-ヒドロキシ-1,4-ジオキソ-1,4-ジヒドロナフタレン-2-イル-アゾ)ベンゾエート、4-(3-ヒドロキシ-5,5,8,8-テトラメチル-1,4-ジオキソ-1,4,5,6,7,8-ヘキサヒドロアントラセン-2-イル-アゾ)安息香酸、3-(3,5-ジ-t-ブチル-4-オキソシクロヘキサ-2,5-ジエニリデン)-5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロシクロペンタ[b]ナフタレン-1,2-ジオン、3-(3,5-ジ-t-ブチル-4-オキソシクロヘキサ-2,5-ジエニリデン)-5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロアントラセン-3H-1,2,4-トリオン、2-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-3-メトキシ-5,8-ジメチル-1,4-ナフトキノン、2-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-3-メトキシ-6,7-ジメチル-1,4-ナフトキノン、2-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-3-メトキシ-5-メチル-1,4-ナフトキノン、2-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-2-メトキシ-5-メチル-1,4-ナフトキノン、2-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-3-メトキシ-6-メチル-1,4-ナフトキノン、3-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-2-メトキシ-6-メチル-1,4-ナフトキノン、2-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-3-メトキシ-5,6-ジメチル-1,4-ナフトキノン、3-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-2-メトキシ-6-メチル-1,4-ナフトキノン、2-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-3-メトキシ-5,6-ジメチル-1,4-ナフトキノン、3-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-2-メトキシ-5,6-ジメチル-1,4-ナフトキノン、2-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-3-メトキシ-5,7-ジメチル-1,4-ナフトキノン、3-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-2-メトキシ-5,7-ジメチル-1,4-ナフトキノン、2-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-3-エチルチオ-5-メチル-1,4-ナフトキノン、2-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-3-エチルチオ-6-メチル-1,4-ナフトキノン、2-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-3-ヒドロキシ-5,8-ジメチル-1,4-ナフトキノン、2-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-3-ヒドロキシ-6,7-ジメチル-1,4-ナフトキノン、2-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-3-ヒドロキシ-5-メチル-1,4-ナフトキノン、3-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-2-ヒドロキシ-5-メチル-1,4-ナフトキノン、2-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-3-ヒドロキシ-6-メチル-1,4-ナフトキノン、3-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-2-ヒドロキシ-6-メチル-1,4-ナフトキノン、2-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-3-ヒドロキシ-5,6-ジメチル-1,4-ナフトキノン、2-(3-ブロモ-5-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-3-ヒドロキシ-5,6-ジメチル-1,4-ナフトキノン、3-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-2-ヒドロキシ-5,6-ジメチル-1,4-ナフトキノン、2-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-3-ヒドロキシ-5,7-ジメチル-1,4-ナフトキノン、3-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-2-ヒドロキシ-5,7-ジメチル-1,4-ナフトキノン。
【００２０】
特に最も好ましいものは、トロロックス(Trolox)(6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチルクロマン-2-カルボン酸)である。
【００２１】
文献に記載された通り、本発明の方法は、４℃〜９０℃で実施され得る。この方法は、好ましくは３５℃〜７０℃の温度で実施される。
【００２２】
当業者には、好適な精製および除去反応が知られている。例えば、干渉試薬は、限外濾過膜、透析または吸着クロマトグラフィーによって除去される。しかしながら、反応物質、特に重亜硫酸が、さらなる反応工程を妨げない限り、処理されたＤＮＡサンプルを水または水溶液で希釈することが可能である。また、処理されたＤＮＡサンプルを沈殿によって分離し、洗浄後、再溶解形態でさらなる工程に単独で加えることも、有益であり得る。
【００２３】
さらに、当業者には、好適な脱スルホン化反応、特に、好適な塩基を精製および除去反応の間または後に使用する脱スルホン化反応が知られている。
【００２４】
ゲノムＤＮＡサンプルは、好ましくは、処理前に熱的に変性される。
【００２５】
工程ｄ）を以下の通りの２つの小工程で実行することが有益であり得る：
ｄ１）請求項１の前処理したＤＮＡサンプルに非特異的にハイブリッド形成する異なる配列の少なくとも１組のプライマー対でＰＣＲプレ増幅を実施し；
ｄ２）プレ増幅において形成された産物のＰＣＲ増幅を、請求項１の前処理したＤＮＡサンプル[(+)-ストランドまたは(-)-ストランド]の断片に毎回同一であるかまたは逆に補完的であり、かつ、増幅されるＤＮＡに特異的にハイブリッド形成する、異なる配列のプライマー対で実施する。
【００２６】
いくつかのＤＮＡ断片の増幅を、１つの反応器内で実施することも、有益であり得る。
【００２７】
ポリメラーゼ反応には熱安定ＤＮＡポリメラーゼを用いるのが好ましい。
【００２８】
ＤＮＡの脱スルホン化は、本発明の方法の工程ｄ）の前に実施することが特に好ましい。しかし、ＤＮＡの脱スルホン化を工程ｄ）またはｅ）の期間に実施することもまた有益であり得る。
【００２９】
また、前処理したＤＮＡの検出には、ＰＣＲ産物をオリゴヌクレオチドアレイにハイブリッド形成し、次に以下の小工程を実施することも好ましい：
ａ）増幅されたゲノムＤＮＡを、二本鎖を形成しながら、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドにハイブリッド形成するが、ハイブリッド形成したオリゴヌクレオチドは、その3'-末端と直接隣接するか、ゲノムＤＮＡサンプルにおいてメチル化を調査する位置に最大１０塩基離れて隣接する；
ｂ）配列が分かっているｎ個のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを、ポリメラーゼによって少なくとも１つのヌクレオチドで延長するが、ヌクレオチドは検出可能なタグを有し、延長は、ゲノムＤＮＡサンプル中の各シトシンのメチル化状態に依存する。
【００３０】
前処理したＤＮＡの検出には、ＰＣＲ産物をオリゴヌクレオチドアレイにハイブリッド形成し、次に以下の小工程を実施することが好ましい：
（ａ）一組のオリゴヌクレオチドを、二本鎖を形成しながら、増幅されたゲノムＤＮＡにハイブリッド形成するが、この一組のオリゴヌクレオチドは、２つの異なる種から成り、第一の種のハイブリッド形成したオリゴヌクレオチドは、その3'-末端と直接隣接するか、ゲノムＤＮＡサンプルにおいてメチル化を調査する位置に最大１０塩基離れて隣接し、第二の種の第二のオリゴヌクレオチドは、第二の種のオリゴヌクレオチドの5'-末端が、選択された位置の部位において、第一の種のハイブリッド形成されたオリゴヌクレオチドの3'-末端から１個のヌクレオチドまたは最大１０個のヌクレオチド離れて、標的分子の第二の領域にハイブリッド形成する；
（ｂ）配列が分かっているｎ個のヌクレオチドの第一の種のオリゴヌクレオチドを、最大で第一の種のオリゴヌクレオチドの3'-末端と第二の種のオリゴヌクレオチドの5'-末端との間にあるヌクレオチド数のポリメラーゼによって延長するが、延長は、ゲノムＤＮＡ種中の各シトシンのメチル化状態に依存する；
（ｃ）オリゴヌクレオチドをリガーゼの存在下でインキュベートするが、ポリメラーゼ反応において延長された第一の種の隣接するオリゴヌクレオチドと、第二の種のオリゴヌクレオチドは連結し、以下の場合、そのような方法で連結反応産物が得られる：前工程で、第一の種のオリゴヌクレオチドの延長が、利用可能な3'-ヒドロキシ基を有する延長されたオリゴヌクレオチドの3'-末端が第二の種のオリゴヌクレオチドの5'-末端に直接隣接するように起きる場合。
【００３１】
従って、使用される第一の種のオリゴヌクレオチドおよび／または使用される第二の種のオリゴヌクレオチドは、Ｔ、ＡおよびＣの塩基のみであるか、Ｔ、ＡおよびＧの塩基のみを含むことが特に好ましい。
【００３２】
また、前処理したＤＮＡの検出には、ＰＣＲ産物をオリゴヌクレオチドアレイにハイブリッド形成し、次に以下の小工程を実施することも好ましい：
（ａ）増幅されたゲノムＤＮＡを、二本鎖を形成しながら、配列が分かっているｎ個のヌクレオチドの少なくとも１つのオリゴヌクレオチドにハイブリッド形成するが、その3'-末端でハイブリッド形成されたオリゴヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡサンプルにおいてメチル化を調査する位置に部分的または完全にハイブリッド形成し；
（ｂ）オリゴヌクレオチドは、塩基の誤対合なく、事前に調査下の位置にその3'-末端でハイブリッド形成するならば、ポリメラーゼによって少なくとも１個のヌクレオチドで延長されるが、少なくとも１個のヌクレオチドは、検出可能なタグを有し、延長は、ゲノムＤＮＡサンプル中の各シトシンのメチル化状態に依存する。
【００３３】
検出可能なタグを有するＰＣＲ産物および／または延長反応産物および／または連結反応産物が提供されることもまた好ましい。
【００３４】
従って、特に、タグが蛍光タグであり、かつ／または、タグが放射性核種であることが好ましい。その結果、ヌクレオチドのタグが、質量分析計において検出され得る着脱可能な質量タグであることが特に好ましい。
【００３５】
また、ＰＣＲ産物および／または延長反応産物および／または連結反応産物が、質量分析計において全体として検出され、従って、その質量によって明確に特徴付けられることも特に好ましい。また、本発明によれば、それぞれの場合において、ＰＣＲ産物および／または延長反応産物および／または連結反応産物の断片が質量分析計において毎回検出されることも好ましい。
【００３６】
また、本発明の方法は、好ましくは、ＰＣＲ産物および／または延長反応産物および／または連結反応産物の断片が、１以上のエキソまたはエンドヌクレアーゼによる消化によって産生されることを特徴とすることも好ましい。
【００３７】
質量分析計における検出能の向上のために、産生される断片が単一の正または負の正味の電荷を有して提供されることがさらに好ましい。
【００３８】
ＰＣＲ産物および／または延長反応産物および／または連結反応産物が、マトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析（MALDI-TOF）またはエレクトロスプレー質量分析（ESI）によって検出および視覚化されることが最も特別に好ましい。
【００３９】
本発明の方法は、細胞外原料由来のＤＮＡおよび細胞由来のＤＮＡの両者に好適である。
【００４０】
本発明の方法は、ゲノムＤＮＡが複合ＤＮＡ原料より得られる場合の適用に特に好適であり、この原料は、特に、細胞株、精液、膣液、肺および気管支洗浄液、血液、唾液、大便、尿、脳脊髄液および自由流動性の細胞外ＤＮＡを含有し得る他の体液、非包埋または包埋組織、例えば、目、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、胸部、肝臓または他の器官または筋肉組織由来の包埋または非包埋組織、組織学的顕微鏡スライドおよびそれらの全ての可能な組み合わせを含む。
【００４１】
本発明のさらなる主題は、患者または個人の有害事象の診断および／または予後診断のための本発明の方法の使用であるが、これらの有害事象は、以下のカテゴリーの少なくとも一つに属する：望ましくない薬効；癌；ＣＮＳ障害、攻撃または行動障害の損傷または症状；脳損傷、精神病性障害および人格障害、認知症および／または関連する症候群の臨床的、心理的および社会的結果；心血管系の疾患、機能不全および損傷；胃腸管の機能不全、損傷または疾患；呼吸器系の機能不全、損傷または疾患；外傷、炎症、感染、免疫および／または回復；発達の過程における異常としての体の機能不全、損傷または疾患；皮膚、筋肉、結合組織または骨の障害、損傷または疾患；内分泌または代謝の機能不全、損傷または疾患；頭痛または性的機能不全。
【００４２】
また、本発明の主題は、細胞型または組織の識別のため、または細胞分化の調査のための本発明の方法の使用である。
【００４３】
本発明のさらなる主題は、最終的には、重亜硫酸、テトラヒドロフルフリルアルコール（任意に変性試薬および／または溶媒）およびラジカル捕捉剤を含む少なくとも１つの試薬、および任意に増幅物製造のためのプライマーおよび本発明の方法のアッセイを行うための指示書を含む、キットである。
【００４４】
本発明は、ピペッティング工程のみを含む、自動化可能なメチルシトシンの検出方法を提供する。この方法では、操作の単純さ、品質、コストおよび最も有益な処理量に関して、現在の方法の効率が向上する。
【国際調査報告】
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