(57)【要約】【課題】加水分解酵素の活性をモニタする方法及び生体高分子の加水分解消化をモニタする方法を提供すること。【解決手段】上記課題は、ステップ１：蛍光色素の存在下で生体分子を加水分解剤に接触させるステップであって、前記生体分子が前記加水分解剤によって消化されることを可能にする条件下に行われるステップと、ステップ２：前記色素の蛍光を経時的にモニタするステップであって、蛍光における経時変化が前記生体分子の前記加水分解剤による消化を表すステップと、を含んでなる加水分解剤の活性を測定する方法により解決する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の各ステップ、
ステップ１：蛍光色素の存在下で生体分子を加水分解剤に接触させるステップであって、前記生体分子が前記加水分解剤によって消化されることを可能にする条件下に行われるステップと、
ステップ２：前記色素の蛍光を経時的にモニタするステップであって、蛍光における経時変化が前記生体分子の前記加水分解剤による消化を表すステップと、を含んでなる加水分解剤の活性を測定する方法。
【請求項２】
以下の各ステップ、
ステップ１：蛍光色素の存在下で生体分子を加水分解剤に接触させるステップであって、前記生体分子が前記加水分解剤によって消化されることを可能にする条件下に行われるステップと、
ステップ２：前記色素の蛍光を経時的にモニタするステップであって、蛍光においてさらなる変化が存在しなくなることが前記生体分子の消化の終了点を表すステップと、を含んでなる生体分子の加水分解剤による消化の終了点を決定する方法。
【請求項３】
以下の各ステップ、
ステップ１：生体分子を加水分解剤に接触させて反応混合物を形成するステップと、
ステップ２：前記反応混合物の第１の試料を蛍光色素と接触させ、かつ第１の試料の蛍光を決定するステップと、
ステップ３：ステップ１の前記反応混合物を、前記生体分子の前記加水分解剤による消化を可能にする条件下におくステップと、
ステップ４：前記生体分子の消化中の所望の時点において、前記反応混合物の第２の試料を蛍光色素に接触させるステップと、
ステップ５：前記第２の試料の蛍光を決定するステップであって、前記第１の試料と比較された場合の前記第２の試料の蛍光における変化が前記生体分子の前記加水分解剤による消化の度合いを表すステップと、を含んでなる生体分子の加水分解剤による消化をモニタする方法。
【請求項４】
必要に応じ、消化中に規則的間隔で追加のサンプリングを行う工程及び追加のサンプルのそれぞれに蛍光色素を加えた後、前記追加のサンプルの蛍光を決定する工程を更に含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記混合物のサンプリングを繰り返し、前記色素の添加と蛍光の決定を前記蛍光の変化が観察されなくなるまで行うことを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルがクエンチされる、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
以下の各ステップ、
ステップ１：生体分子に対して加水分解消化を行い、タンパク質又はペプチドフラグメントを得るステップと、
ステップ２：前記タンパク質又はペプチドフラグメントを蛍光色素に接触させるステップと、
ステップ３：前記色素の蛍光の変化を検出するステップであって、前記色素の蛍光の前記変化が前記タンパク質又はペプチドフラグメントの量に比例するステップと、を含んでなる加水分解消化反応の生成物を測定及び／又は検出する方法。
【請求項８】
前記生体分子が生体高分子である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記生体分子が加水分解可能である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記生体分子が炭水化物、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、脂質及びこれらの混合物からなる群から選ばれる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記生体分子がゲノム、プロテオーム又は細胞抽出物中に存在する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記加水分解剤が前記生体分子の疎水性を変更する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
変性させない量の洗剤が添加される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記洗剤がＳＤＳ、ＬＤＳ、トリトンＸ−１００、ＣＨＡＰＳ、ＡＬＳ、ＣＴＡＢ、ＤＤＡＯ及びＤＯＣからなる群から選ばれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記洗剤が前記生体分子の疎水性を変更し、これにより前記蛍光色素の前記生体分子への結合に影響を与える、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記加水分解剤が酵素である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記加水分解剤が、生体分子を少なくとも１つの位置で切断できるプロテアーゼ、エステラーゼ、グリコシラーゼ、ホスファターゼ又はヌクレアーゼである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記プロテアーゼが、アミノペプチターゼ、ジペプチターゼ、ジペプチジル−ペプチダーゼ及びトリペプチジル−ペプチダーゼ、ペプチジル−ジペプチターゼ、セリン型カルボキシペプチダーゼ、金属カルボキシペプチダーゼ、システイン型カルボキシペプチダーゼ、オメガペプチダーゼ、セリンエンドペプチダーゼ、システインエンドペプチダーゼ、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ、金属エンドペプチダーゼ及びスレオニンエンドペプチダーゼからなる族から選ばれる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記エステラーゼが、カルボン酸エステルヒドロラーゼ、チオールエステルヒドロラーゼ、リン酸モノエステルヒドロラーゼ、リン酸ジエステルヒドロラーゼ、トリリン酸モノエステルヒドロラーゼ、硫酸エステルヒドロラーゼ、ジリン酸モノエステルヒドロラーゼ、リン酸トリエステルヒドロラーゼ、５’−ホスホモノエステルを生成するエキソデオキシリボヌクレアーゼ、５’−ホスホモノエステルを生成するエキソリボヌクレアーゼ、３’−ホスホモノエステルを生成するエキソリボヌクレアーゼ、リボ−又はデオキシリボ核酸のいずれかに対して活性なエキソヌクレアーゼ、リボ−又はデオキシリボ核酸のいずれかに対して活性なエキソヌクレアーゼ、５’−ホスホモノエステルを生成するエンドデオキシリボヌクレアーゼ、５’−ホスホモノエステル以外を生成するエンドデオキシリボヌクレアーゼ、変化した塩基に対して特異的な部位特異性エンドデオキシリボヌクレアーゼ、５’−ホスホモノエステルを生成するエンドリボヌクレアーゼ、５’−ホスホモノエステル以外を生成するエンドリボヌクレアーゼ、リボ−又はデオキシリボ核酸のいずれかに対して活性なエンドリボヌクレアーゼ及びリボ−又はデオキシリボ核酸のいずれかに対して活性なエンドリボヌクレアーゼからなる族から選ばれる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記グリコシラーゼが、グリコシダーゼ類（Ｎ−、Ｏ−及びＳ−グリコシル基を加水分解する酵素）からなる族から選ばれる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記蛍光色素が前記生体分子と疎水的に結合又は相互作用する、請求項７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記蛍光色素が環境の親油性に応じて蛍光の働きを実質的に変化させる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記蛍光色素が、エピココノン、シアニン色素、ラウルダン／プロダンファミリーの色素、ｄａｐｏｘｙｌ誘導体、ピレン色素、ジフェニルヘキサトリエン誘導体、ＡＮＳ及びその類似体、スチリル色素、両親媒性フルオレセイン、ローダミン並びにクマリンからなる群から選ばれる、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記蛍光色素が、エピココノン、ＳＹＴＯＸグリーン、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、ヨウ化プロピジウム、エピココノン、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ  Ｃ５セラミド、５−オクタデカノイルアミノフルオレセイン、ＳＹＰＲＯオレンジ及びナイルレッドからなる群から選ばれる、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記加水分解は、バッファの存在下に行われる、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記バッファがグッドバッファである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記バッファがビシンバッファである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記生体分子の加水分解は、前記蛍光色素によって実質的に影響されない、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
蛍光は、経時的に測定され反応速度係数を示すデータを提供する、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
消化は、終了点が得られた際に停止させられる、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記反応混合物の詳細な分析が消化の停止後に行われる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記詳細な分析は、ペプチドマスフィンガープリンティング（ＰＭＦ）、ペプチドマッピング及びＨＰＬＣからなる群から選ばれる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
更に塩基が前記蛍光色素に付加される、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記生体分子は、生体試料又は食品試料由来である、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記生体分子は、タンパク質又はタンパク質の混合物である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記生体分子は、炭水化物又は炭水化物の混合物である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記生体分子は、糖タンパク質又はデンプンである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記生体分子は脂質である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記生体分子は植物油である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
前記生体分子はオリゴヌクレオチドである、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
前記生体分子はＤＮＡである、請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
蛍光色素、１つ以上の加水分解剤、必要に応じて前記加水分解剤のための基準基質、及び前記生体分子の消化をモニタするための使用方法の使用説明書を含んでなる、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法において使用するためのキット。
【請求項４３】
基準タンパク質又はペプチド基質を含む、請求項４２に記載のキット。
【請求項４４】
前記基質が、ＢＳＡ、アポ−トランスフェリン、α−カゼイン、β−カゼイン、炭酸脱水酵素、フェチュイン、サケ精子ＤＮＡ、可溶性デンプン及びオリーブ油からなる群から選ばれる、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
更にバッファを含む、請求項４２〜４４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項４６】
前記バッファがグッドバッファである、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
前記バッファがビシンバッファである、請求項４５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、加水分解酵素の活性をモニタする方法及び生体高分子の加水分解消化をモニタする方法に関する。特に、本発明は、蛍光色素を使用してタンパク質及び／若しくはペプチド消化、又はプロテアーゼ活性をモニタする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒドロラーゼは、アポトーシス、細胞分化、骨再形成、血液凝固、病態、ガン浸潤、細胞情報伝達及び多くの病原生物の感染サイクル（ほんの一部の例を挙げた）等の多くの生体プロセスにとって不可欠である。さまざまな基質特異性を有する広範囲の既知ヒドロラーゼによって多くのアッセイが開発されてきた。これらのアッセイはそれぞれに異なる特殊な基質を必要とするので、お互いを容易には比較できない。
【０００３】
一般に、例えば、プロテアーゼ酵素に対して、これらのアッセイは、加水分解による結合切断後に生じる分光光度変化（吸収又は蛍光）を介して連続してモニタされるプロテアーゼ基質のペプチド類似体に依拠する（例えば、ＷＯ２００３／０８９６６３及びその引用文献）。この方法は、一次配列特異性の探索、特定のヒドロラーゼの活性の測定及び推定インヒビタの分析に有用であるが、これを使用して異なるプロテアーゼの活性を比較することはできない。なぜなら、基質選択に制限があり、かつ利用可能な基質は、ほんのわずかなプロテアーゼだけに対して適切であるからである。あるいは、カゼイン又はＢＳＡ等の一般の基質タンパク質は、フルオロフォアを用いて濃密に標識することができ、かつ消光の低減をプロテアーゼ活性の尺度に使用できる（例えば、Ｊｏｎｅｓ、ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９７）２５１（２）、１４４−１５２）。しかし、基質は、不均一に標識され、かつその結果得られるペプチドの標識はばらつくので、その後にペプチド分析を行って配列特異性を探索することはできない。また、タンパク質を物理的に標識することは、プロテアーゼのタンパク質消化能力に影響を与える。
【０００４】
Ｓｐｅｎｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９７５）６４、５５６−５６６）によると、疎水ポケットを含む無傷のタンパク質基質（ＢＳＡ、α−カゼイン、ウレアーゼ及びカタラーゼ等）に対するいくつかのプロテアーゼの加水分解活性を、これらのポケットからのフルオロフォア（１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネート）の放出によって追跡する方法が報告されている。しかし、この方法は、汎用でない。すなわち、疎水ポケットを含むタンパク質だけにしか機能しない。
【０００５】
従来技術として、色素で標識されたプロテアーゼ基質を必要とする方法がある。しかし、これらの方法は、基質を混乱させる。なぜなら、標識は、必ず非タンパク質性であり、かつ非常に大きいことが多く、プロテアーゼの天然の基質に対する妥当なモデルとしての有用性に疑義が生じる。色素を使わない方法には、電気泳動、ＨＰＬＣ及び質量分析がある。しかし、これらの方法は、面倒であり、リアルタイム測定に適さず、かつ動態データを抽出することが困難である。
【０００６】
さらに、さまざまなプロテアーゼを用いたタンパク質分解消化は、プロテオミクスにおけるタンパク質同定のための手法における第一のかつ重要なステップとして一般に使用される。
【０００７】
ＤＮＡの加水分解は、Ｐｉｃｏグリーン（Ｔｏｌｕｎ、ｅｔ  ａｌ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００３）３１（１８）、ｅ１１１／１〜ｅ１１１／６）又は臭化エチジウム（例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （２００２）３０（２０）、ｅ１１２／１〜  ｅ１１２／９）等のＤＮＡ結合色素の変位によって測定されてきた。これらの方法は、蛍光標識された基質に依拠しないが、ＤＮＡの一様な構造に依拠して、ＤＮＡマイナーグルーブ又はインターカレーション部位からの色素の変位によってヌクレアーゼ又はヘリカーゼ活性をリアルタイムでモニタすることを可能にする。このタイプのアッセイがプロテアーゼ、エステラーゼ、グリコシラーゼ、ホスファターゼ等の他のヒドロラーゼに対して開発できたならば、格別の効果が得られるであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、定量的であり、例えば、異なるプロテアーゼの比較が可能であり、かつ基質非依存性である、ヒドロラーゼ活性のための高速かつ容易なリアルタイムアッセイには大きな需要がある。生成されたフラグメントが質量分析又はＨＰＬＣによって分析されることを可能にするようにヒドロラーゼ活性を測定する必要のあるプロテオミクスでは、さらに要求が大きい。このように、タンパク質又はペプチド消化の進行をモニタする新規かつ汎用なアプローチ（ここでは、生成されたペプチド及び他のフラグメントがさらなる下流の分析に対して利用可能である）に対する需要も存在する。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、従来技術の欠点のうちの少なくとも一つを克服又は改善すること、又は有用な代替を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
第１の態様によると、本発明は、加水分解剤の活性を測定する方法であって、ステップ１：蛍光色素の存在下で生体分子を加水分解剤に接触させるステップであって、前記生体分子が前記加水分解剤によって消化されることを可能にする条件下に行われるステップと、ステップ２：前記色素の蛍光を経時的にモニタするステップであって、蛍光における経時変化が前記生体分子の前記加水分解剤による消化を表すステップと、を含む方法を提供する。
【００１１】
前記生体分子は、いずれの生体高分子であってもよい。しかし、前記生体高分子は、好ましくはタンパク質、ペプチド又はプロテオームである。前記変化は、蛍光の増加又は低減であってもよい。
【００１２】
第２の態様によると、本発明は、生体分子の加水分解剤による消化をモニタする方法であって、ステップ１：蛍光色素の存在下で生体分子を加水分解剤に接触させるステップであって、前記生体分子が前記加水分解剤によって消化されることを可能にする条件下に行われるステップと、ステップ２：前記色素の蛍光を経時的にモニタするステップであって、蛍光における経時変化が前記生体分子の前記加水分解剤による消化を表す、ステップと、を含む方法を提供する。
【００１３】
第３の態様によると、本発明は、生体分子の加水分解剤による消化の終了点を決定する方法であって、ステップ１：蛍光色素の存在下で生体分子を加水分解剤に接触させるステップであって、前記生体分子が前記加水分解剤によって消化されることを可能にする条件下に行われるステップと、ステップ２：前記色素の蛍光を経時的にモニタするステップであって、蛍光においてさらなる変化が存在しなくなることが前記生体分子の消化の終了点を表すステップと、を含む方法を提供する。
【００１４】
第４の態様によると、本発明は、生体分子の加水分解剤による消化をモニタする方法であって、ステップ１：生体分子を加水分解剤に接触させて反応混合物を形成するステップと、ステップ２：前記反応混合物の第１の試料を蛍光色素と接触させ、かつ第１の試料の蛍光を決定するステップと、ステップ３：ステップ１の前記反応混合物を、前記生体分子の前記加水分解剤による消化を可能にする条件下におくステップと、ステップ４：前記生体分子の消化中の所望の時点において、前記反応混合物の第２の試料を蛍光色素に接触させるステップと、ステップ５：前記第２の試料の蛍光を決定するステップであって、前記第１の試料と比較された場合の前記第２の試料の蛍光における変化が前記生体分子の前記加水分解剤による消化の度合いを表すステップと、を含む方法を提供する。
【００１５】
上記方法の一実施形態によると、前記反応混合物を消化中に規則的間隔でサンプリングするステップ、及び前記試料のそれぞれに蛍光色素を加えた後、蛍光の経時変化を蛍光のさらなる低減が観察されなくなるまで測定するステップが考えられる。前記方法のこの変形例を使用して、生体高分子の消化の終了点を決定することができる。蛍光は、経時的に測定され、反応速度係数を示すデータを提供するという利点がある。サブサンプリングされた反応混合物は、測定の前に適切に停止される。
【００１６】
第５の態様によると、本発明は、上記態様のいずれか１つの方法において使用される、蛍光色素又はその組成物を提供する。
【００１７】
第６の態様によると、本発明は、上記請求項のいずれかの１つの方法において使用されるキットであって、蛍光色素、１つ以上の加水分解剤、必要に応じて前記加水分解剤のための基準基質、及び前記キットを前記生体高分子の消化をモニタするためにどのように使用するかの使用説明書を含むキットを提供する。
【００１８】
好ましくは、前記キットは、基準タンパク質又はペプチド基質又は任意の他の生物学的基準を含む。
【００１９】
好ましくは、前記キットは、前記酵素に対して適切な基準バッファを含む。上記好適なバッファは、ビシン（ｂｉｃｉｎｅ）、ＢＥＳ等のグッドバッファ（Ｇｏｏｄ’ｓ  ｂｕｆｆｅｒｓ）のうちの１つを含む。
【００２０】
任意の加水分解性生体分子を本発明において使用してもよい。
【００２１】
前記生体分子は、任意のサイズ／分子量を有してもよいが、好ましくは高分子である。最も好ましくは、前記高分子は、炭水化物、脂質、ペプチド／タンパク質、プロテオーム、リンタンパク質、糖タンパク質又はオリゴヌクレオチドである。
【００２２】
本発明の関連において、用語「生体分子」は、天然分子及び合成分子の両方を含み、ここで、合成分子は、天然分子において見られる部分と同様の部分、又は類似体、同族体、誘導体若しくはそれらの改変体（ここで、改変体は、生体によって／内で、又は合成手段によってのいずれかで作成されてもよい）を含んでもよいことがが当業者には明らかとなる。
【００２３】
典型的には、本発明の生体分子は、２つ以上のアミノ酸によって形成されるアミノ酸のオリゴマー／ポリマー、すなわち、任意のサイズのペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質、２つ以上の核酸によって形成されるオリゴマー／ポリマー（例えば、ＤＮＡ（ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ及び任意の非コードＤＮＡを含む）又はＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ又は任意の非コードＲＮＡ、等を含む））、又は脂質中に見られるオリゴマー／ポリマー若しくはその部分である。
【００２４】
本発明はまた、生体分子の混合物に関することが当業者には明らかとなり得る。
【００２５】
任意の加水分解性生体高分子を使用してもよい。しかし、前記生体高分子は、好ましくは炭水化物、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、脂質又はそれらの混合物である。前記生体分子は、ゲノム、プロテオーム又は細胞抽出物中に存在してもよい。
【００２６】
あるいは、好ましくは、前記生体高分子は、加水分解剤によって切断又は消化されることが可能なタンパク質、ペプチド又はプロテオームである。
【００２７】
好ましくは、前記基質は、強化された疎水性を有する。そのような強化された疎水性を提供する任意の手段が適切であり得る。しかし、好適な実施形態においては洗剤であるタンパク質変性剤を、変性させない量だけ使用して、タンパク質の疎水性を強化し、これにより、蛍光色素の結合が強化又は変更される。そのような洗剤は、ＳＤＳ、ＬＤＳ、トリトンＸ−１００、ＣＨＡＰＳ、ＡＬＳ、ＣＴＡＢ、ＤＤＡＯ、ＤＯＣ等を含むが、これらに限定されない。
【００２８】
好ましくは、前記加水分解剤は、前記生体分子の疎水性を変更する。
【００２９】
本明細書全体にわたり、「タンパク質」なる用語は、特に、組み換えタンパク質を含むと解釈されるべきである。前記タンパク質又はペプチドは、複雑なタンパク質／ペプチド混合物（例えば、全プロテオーム）中に存在してもよい。
【００３０】
好ましくは、前記加水分解剤は、酵素であり、さらにより好ましくは、それは、生体分子を少なくとも１つの位置で切断できるプロテアーゼ、エステラーゼ、グリコシラーゼ、ホスファターゼ又はヌクレアーゼ等のタンパク質分解剤である。本発明において使用できるヒドロラーゼの例としては、カルボン酸エステルヒドロラーゼ、チオールエステルヒドロラーゼ、リン酸モノエステルヒドロラーゼ、リン酸ジエステルヒドロラーゼ、トリリン酸モノエステルヒドロラーゼ、硫酸エステルヒドロラーゼ、ジリン酸モノエステルヒドロラーゼ、リン酸トリエステルヒドロラーゼ、５’−ホスホモノエステルを生成するエキソデオキシリボヌクレアーゼ、５’−ホスホモノエステルを生成するエキソリボヌクレアーゼ、３’−ホスホモノエステルを生成するエキソリボヌクレアーゼ、リボ−又はデオキシリボ核酸のいずれかに対して活性なエキソヌクレアーゼ、リボ−又はデオキシリボ核酸のいずれかに対して活性なエキソヌクレアーゼ、５’−ホスホモノエステルを生成するエンドデオキシリボヌクレアーゼ、５’−ホスホモノエステル以外を生成するエンドデオキシリボヌクレアーゼ、変化した塩基に対して特異的な部位特異性エンドデオキシリボヌクレアーゼ、５’−ホスホモノエステルを生成するエンドリボヌクレアーゼ、５’−ホスホモノエステル以外を生成するエンドリボヌクレアーゼ、リボ−又はデオキシリボ核酸のいずれかに対して活性なエンドリボヌクレアーゼ、リボ−又はデオキシリボ核酸のいずれかに対して活性なエンドリボヌクレアーゼ、グリコシダーゼ類（すなわち、Ｏ−及びＳ−グリコシルを加水分解する酵素）、Ｎ−グリコシル化合物を加水分解する酵素、チオエーテル及びトリアルキルスルホニウムヒドロラーゼ、エーテルヒドロラーゼ、アミノペプチターゼ、ジペプチターゼ、ジペプチジル−ペプチダーゼ及びトリペプチジル−ペプチダーゼ、ペプチジル−ジペプチターゼ、セリン型カルボキシペプチダーゼ、金属カルボキシペプチダーゼ、システイン型カルボキシペプチダーゼ、オメガペプチダーゼ、セリンエンドペプチダーゼ、システインエンドペプチダーゼ、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ、金属エンドペプチダーゼ、スレオニンエンドペプチダーゼがあるが、これらに限定されない。
【００３１】
上記好適な蛍光色素は、タンパク質又はペプチドに疎水的に結合又は相互作用する蛍光色素である。一実施形態において、前記蛍光色素は、ＳＹＴＯＸ  グリーンである。別の実施形態において、前記蛍光色素は、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２である。別の実施形態において、前記蛍光色素は、ヨウ化プロピジウムである。別の実施形態において、前記蛍光色素は、ＡＮＳである。別の実施形態において、前記蛍光色素は、エピココノン（ｅｐｉｃｏｃｃｏｎｏｎｅ）である。別の実施形態において、前記蛍光色素は、ナイルレッドである。別の実施形態において、前記蛍光色素は、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ  Ｃ５セラミドである。別の実施形態において、前記蛍光色素は、５−オクタデカノイルアミノフルオレセインである。別の実施形態において、前記蛍光色素は、ＳＹＰＲＯオレンジである。別の実施形態において、前記蛍光色素は、シアニン色素である。別の実施形態において、前記蛍光色素は、ラウルダン（ｌａｕｒｄａｎ）／プロダン（ｐｒｏｄａｎ）ファミリーの色素から選択される。別の実施形態において、前記蛍光色素は、ｄａｐｏｘｙｌ誘導体である。別の実施形態において、前記蛍光色素は、ピレン色素である。別の実施形態において、前記蛍光色素は、ジフェニルヘキサトリエン誘導体である。別の実施形態において、前記蛍光色素は、ローダミン誘導体である。別の実施形態において、前記蛍光色素は、クマリン誘導体である。しかし、疎水的に活性である任意の色素が本発明の方法において有用であることは、本明細書における教示から明らかとなる。有用な色素の例としては、シアニン色素、ラウルダン／プロダンファミリーの色素、ｄａｐｏｘｙｌ誘導体、ピレン色素、ジフェニルヘキサトリエン誘導体、ＡＮＳ及びその類似体、スチリル色素、ナイルレッド、両親媒性フルオレセイン、ローダミン及びクマリン又は環境の親油性に応じて蛍光の働きを実質的に変化させる任意の他のフルオロフォア（疎水的に活性）がある。さらに、タンパク質の疎水性を変化させるトランスフェラーゼ（例えば、メチルトランスフェラーゼ、ヒドロキシメチル−、ホルミル−及び関連のトランスフェラーゼ、カルボキシル−及びカルバモイルトランスフェラーゼ、アミジノトランスフェラーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ヘキソシルトランスフェラーゼ、ペントシルトランスフェラーゼ、他のグリコシル基を転移させる酵素、アルキル又はアリール基を転移させる酵素、トランスアミラーゼ（アミノトランスフェラーゼ）、オキシイミノトランスフェラーゼ、並びにタンパク質キナーゼ、硫黄トランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、ＣｏＡ−トランスフェラーゼ及びセレノトランスフェラーゼ等のリン含有基を転移させる酵素）等の生体分子を誘導体化する酵素が上記の色素と相互作用し、トランスフェラーゼ活性をリアルタイムでモニタすることを可能にし得ることが本明細書における教示から明らかである。
【００３２】
好ましくは、前記蛍光色素は、その環境の親油性に応じて蛍光の働きを実質的に変化させる。好ましくは、前記生体分子の加水分解は、前記蛍光色素によって実質的に影響されない。
【００３３】
本発明の関連において、用語「エピココノン及び関連の色素」は、ＷＯ２００４／０８５５４６に詳細に記載されるように、エピココノン自身及び関連の蛍光色素を含むように意図される。ＷＯ２００４／０８５５４６は、本明細書中において参考として援用される。
【００３４】
第７の態様によると、本発明は、加水分解消化反応の生成物を測定及び／又は検出する方法であって、ステップ１：生体分子に対して加水分解消化を行い、タンパク質又はペプチドフラグメントを得るステップと、ステップ２：前記タンパク質又はペプチドフラグメントを蛍光色素に接触させるステップと、ステップ３：前記色素の蛍光の変化を検出するステップであって、前記色素の蛍光の前記変化が前記タンパク質又はペプチドフラグメントの量に比例するステップと、を含む方法を提供する。先行する請求項のいずれか１つにかかる方法であって、前記生体分子が生体高分子である、方法。
【００３５】
好ましくは、前記加水分解は、グッドバッファ又はビシンバッファ（ｂｉｃｉｎｅ  ｂｕｆｆｅｒ）等のバッファの存在下に行われる。
【００３６】
好ましくは、蛍光は、経時的に測定され、反応速度係数を示すデータを提供する。好ましくは、前記消化は、終了点が得られた際に停止され、かつ前記反応混合物の詳細な分析が消化の停止後に行われる。前記詳細な分析は、ペプチドマスフィンガープリンティング（ＰＭＦ）、ペプチドマッピング及びＨＰＬＣからなる群から選択されてもよい。
【００３７】
他の実施形態において、塩基が前記蛍光色素に付加されてもよい。
【００３８】
さらなる実施形態において、前記生体分子は、生体試料又は食品試料由来である。前記生体分子は、タンパク質又はタンパク質の混合物であってもよい。好ましくは、前記生体分子は、炭水化物又は炭水化物の混合物である。好ましくは、前記生体分子は、糖タンパク質又はデンプンである。好ましくは、前記生体分子は、脂質である。好ましくは、前記生体分子は、植物油である。好ましくは、前記生体分子は、オリゴヌクレオチドである。好ましくは、前記生体分子は、ＤＮＡである。
【００３９】
前記キットはまた、ＢＳＡ、アポ−トランスフェリン、α−カゼイン、β−カゼイン、炭酸脱水酵素、フェチュイン（ｆｅｔｕｉｎ）、サケ精子ＤＮＡ、可溶性デンプン、及びオリーブ油からなる群から選択される基準タンパク質又はペプチド基質を含んでもよい。
【００４０】
本発明の好ましい態様を添付する図面を参照して、例示することにより示す。
図１：エピココノン（Ａ；λｅｘ５４０＋１０ｎｍ，λｅｍ６３０±１０ｎｍ）をレポータ色素として用いたＰＮＧａｓｅ  Ｆによるフェチュインの脱グリコシル化のリアルタイム反応速度モニタリング及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｂ）による消化の検証フルオロフォアを用いた糖タンパク質（白正方形）を二位相指数関数的会合／分離モデル（Ｙ＝Ｙｍａｘ＊ｅｘｐ（１−ｋ１Ｘ）＋ｓｐａｎ＊ｅｘｐ（−ｋ２Ｘ）＋ｐｌａｔｅａｕ）にフィッティングし、決定したｋ１及びｋ２の値を酵素ＰＮＧａｓｅ  Ｆ（白丸）を用いたフェチュインの酵素加水分解のための三位相指数関数的会合／分離モデル（Ｙ＝ｓｐａｎｌ＊ｅｘｐ（１−ｋ１Ｘ）＋  ｓｐａｎ２＊ｅｘｐ（−ｋ２Ｘ）＋  ｓｐａｎ３＊ｅｘｐ（ｌ−ｋ３Ｘ）＋ｐｌａｔｅａｕ）におけるｋ１及びｋ２の固定値として用いた。挿入図は誘導された速度定数と加水分解半減期を示す。図１Ｂは元の（レーン２）及び脱グリコシル化されたフェチュイン（レーン３）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ検証を示す。レーン１はＬＭＷマーカ（９７，６６，４５，３０，２０．１及び１４．４ｋＤａ）を、レーン４はＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素のみ（４８．４ｋＤａ）を示す。
図２：Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（λｅｘ３５５ｎｍ，λｅｍ４６０ｎｍ）（Ａ）、ＳＹＴＯＸ−グリーン（λｅｘ４８５ｎｍ，λｅｍ５２０ｎｍ（Ｂ）及びヨウ化プロピジウム（λｅｘ５４０＋１０ｎｍ，λｅｍ６３０＋１０ｎｍ）（Ｃ）をレポータ色素として用いたＤＮａｓｅ  １によるサケの精子２重鎖ＤＮＡの加水分解のリアルタイム反応速度モニタリング色素とＤＮＡ（白正方形）及びＤｎａｓｅと色素とＤＮＡ（白丸）について、進行曲線を蛍光データに対してフィッティングした。それぞれのケースにおいて、フルオロフォアを用いたＤＮＡの進行曲線を単一位相指数関数的減衰（Ｙ＝ｓｐａｎ＊ｅｘｐ（−ｋＸ）＋ｐｌａｔｅａｕ）にフィッティングし、決定したｋの価をＤＮＡ＋ＤＮａｓｅについての二位相指数関数的減衰（Ｙ＝ｓｐａｎｌ＊ｅｘｐ（−ｋ１Ｘ）＋ｓｐａｎ２＊ｅｘｐ（−ｋ２Ｘ）＋ｐｌａｔｅａｕ）における固定値ｋ１として用いた。挿入図は擬一次速度定数と加水分解半減期とを示す。図２Ｄは、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（レーン２及び３）、ＳＹＴＯＸ−グリーン（レーン４及び５）及びヨウ化プロピジウム（レーン６及び７）を用いたＤＮＡ試料の加水分解のＤＮＡゲル電気泳動に基づく検証を示す。レーン１及び８はＳＰＰｌ  ＤＮＡ分子量マーカを示す。
図３：エピココノン（λｅｘ５４０＋１０ｎｍ，λｅｍ６３０＋１０ｎｍ）をレポータ色素として用いたα−アミラーゼによるデンプンの加水分解のリアルタイム反応速度モニタリング図３Ａはエピココノンの蛍光の減少が起きたデンプンとアミラーゼであり、図３Ｂでは洗剤トリトンＸ−１００（０．０２％）を添加した。それぞれのケースにおいて、フルオロフォアを用いたタンパク質（白正方形）を単一位相指数関数的減衰（Ｙ＝ｓｐａｎ＊ｅｘｐ（−ｋＸ）＋ｐｌａｔｅａｕ）にフィッティングし、ｋの値がデンプンとアミラーゼを用いる二位相指数関数的減衰（白丸）（Ｙ＝ｓｐａｎｌ＊ｅｘｐ（−ｋ１Ｘ）＋ｓｐａｎ２＊ｅｘｐ（−ｋ２Ｘ）＋ｐｌａｔｅａｕ）における固定値ｋ１として用いられた。挿入図は擬一次速度定数と加水分解半減期とを示す。
図４：ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ  Ｃ５−セラミド（λｅｘ４８５ｎｍ，λｅｍ５２０ｎｍ）をレポータ色素として用いたアルカリ性ホスファターゼによるβ−カゼイン（β−ＣＮ）の脱リン酸化のリアルタイム反応速度モニタリングフルオロフォアを用いたリンタンパク質のみ（白正方形）を一次指数関数的増加（Ｙ＝ｓｐａｎ＊ｅｘｐ（１−ｋＸ）＋ｐｌａｔｅａｕ）にフィッティングし、決定したｋの値がホスファターゼを用いるリンタンパク質の酵素加水分解の二位相指数関数的増加（白丸）（Ｙ＝ｓｐａｎｌ＊ｅｘｐ（１−ｋ１Ｘ）＋ｓｐａｎ２＊ｅｘｐ（１−ｋ２Ｘ）＋ｐｌａｔｅａｕ）における固定値ｋ１として用いられた。挿入図は誘導された速度定数とアルカリ性ホスファターゼを用いたβ−カゼインの加水分解半減期とを示す。
図５：５−オクタデカノイルアミノフルオレセイン（λｅｘ４８５ｎｍ，λｅｍ５２０ｎｍ）をレポータ色素として用いたリパーゼ（０．０１μＬ，Ｇｒｅａｓｅｘ（登録商標））によるオリーブオイルの加水分解のリアルタイム反応速度モニタリング正方形は酵素なしのオリーブオイルのリアルタイムデータであり、丸はリパーゼを添加したオリーブオイルである。フルオロフォアを用いたオリーブオイルのみ（白正方形）を単一位相指数関数的減衰（Ｙ＝ｓｐａｎ＊ｅｘｐ（−ｋＸ）＋ｐｌａｔｅａｕ）にフィッティングし、決定したｋの値がリパーゼを用いるオイルの酵素加水分解の二位相指数関数的減衰（白丸）（Ｙ＝ｓｐａｎｌ＊ｅｘｐ（−ｋ１Ｘ）＋ｓｐａｎ２＊ｅｘｐ（−ｋ２Ｘ）＋ｐｌａｔｅａｕ）における固定値ｋ１として用いられた。挿入図は誘導された速度定数と加水分解半減期とを示す。
図６：フルオロフォアのエピココノン（λｅｘ５４０＋１０ｍ，λｅｍ６３０＋１０ｎｍ）をレポータ色素として用いた非特異的プロテアーゼ（パパイン）による４種類の異なるタンパク質消化のリアルタイム反応速度モニタリングの例それぞれのケースにおいて、フルオロフォアを用いたタンパク質（白正方形）を単一位相指数関数的減衰（Ｙ＝ｓｐａｎ＊ｅｘｐ（−ｋＸ）＋ｐｌａｔｅａｕ）にフィッティングし、ｋの値がタンパク質とパパインを用いる二位相指数関数的減衰（白三角形）（Ｙ＝ｓｐａｎｌ＊ｅｘｐ（−ｋ１Ｘ）＋ｓｐａｎ２＊ｅｘｐ（−ｋ２Ｘ）＋ｐｌａｔｅａｕ）における固定値ｋ１として用いられた。ＢＳＡ（Ａ）、カゼイン（Ｂ）、アポ−トランスフェリン（Ｃ）及び炭酸脱水酵素（Ｄ）を例として示す。挿入図は擬一次速度定数と消化半減期とを示す。図６Ｅは、パパインを用いた異なるタンパク質の消化のＳＤＳ−ＰＡＧＥ検証を示す。レーン１：ＬＭＷマーカ（９７，６６，４５，３０，２０．１及び１４．４ｋＤａ）；２：ＢＳＡ；３：ＢＳＡ／パパイン；４：α−カゼイン；５：カゼイン／パパイン；６：アポ−トランスフェリン；７，：アポ−トランスフェリン／パパイン；８：炭酸脱水酵素（ウシ）；９：炭酸脱水酵素／パパイン；１０：パパインのみ。
図７：この例は、種々のフルオロフォアのプロテアーゼによるＢＳＡ加水分解のモニタリングへの適用を示す。ＳＹＰＲＯオレンジ（Ａ）、ナイルレッド（Ｂ）及びエピココノン（Ｃ）を用いたトリプシンによる、並びにＡＮＳ（Ｄ）を用いたパパインによるタンパク質分解のリアルタイムモニタリングそれぞれのケースにおいて、フルオロフォアを用いたタンパク質（白正方形）を単一位相指数関数的減衰（Ｙ＝ｓｐａｎ＊ｅｘｐ（−ｋＸ）＋ｐｌａｔｅａｕ）にフィッティングし、決定したｋの値がタンパク質とプロテアーゼを用いる二位相指数関数的減衰（白丸）（Ｙ＝ｓｐａｎｌ＊ｅｘｐ（−ｋ１Ｘ）＋ｓｐａｎ２＊ｅｘｐ（−ｋ２Ｘ）＋ｐｌａｔｅａｕ）における固定値ｋ１として用いられた。各グラフ中の挿入図は誘導された速度定数と加水分解半減期とを示す。図７Ｅは、異なるフルオロフォア（連２及び３：ＳＹＰＲＯオレンジ、レーン４及び５：ナイルレッド、レーン６及び７：エピココノン、レーン８及び９：ＡＮＳ）を用いたトリプシン（レーン２〜７）及びパパイン（レーン８及び９）によるＢＳＡタンパク質分解のＳＤＳ−ＰＡＧＥ検証を示す。レーン１はＬＭＷマーカ（９７，６６，４５，３０，２０．１及び１４．４ｋＤａ、上部から下部方向）を示す。
図８：ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：白丸）及び炭酸脱水酵素（ＣＡ：逆三角形）のトリプシン消化をレポータ色素を添加することなしで行った。各反応は、指定された時間でサンプルを採取し、レポータ色素（エピココノン）添加及び蛍光の測定の前に、トリプシン活性をロイペプチン（Ａ）又は大豆トリプシンインヒビタ（Ｂ）のいずれかによってクエンチした。挿入図は、データを一次指数関数的減衰にフィッティングすることにより算出された見かけ上の消化の一次速度定数を示す。
図９：蛍光レポータ色素（エピココノン、λｅｘ５４０＋１０ｎｍ，λｅｍ６３０＋１０ｎｍ）を用いた加水分解酵素（トリプシン）による複雑なプロテオーム（酵母）のトリプシン消化のリアルタイム反応速度モニタリングフルオロフォアを用いた糖タンパク質のみ（白正方形）を二位相指数関数的会合／解離モデル（Ｙ＝Ｙｍａｘ＊ｅｘｐ（１−ｋ１Ｘ）＋ｓｐａｎ＊ｅｘｐ（−ｋ２Ｘ）＋ｐｌａｔｅａｕ）にフィッティングし、決定したｋ１及びｋ２の値が酵素トリプシンＦを用いる酵母プロテオームの酵素加水分解の三位相指数関数的会合／解離式（白丸）（Ｙ＝ｓｐａｎｌ＊ｅｘｐ（１−ｋ１Ｘ）＋ｓｐａｎ２＊ｅｘｐ（−ｋ２Ｘ）＋ｓｐａｎ３＊ｅｘｐ（ｌ−ｋ３Ｘ）＋ｐｌａｔｅａｕ）における固定値ｋ１及びｋ２として用いられた。挿入図は誘導された速度定数と加水分解半減期とを示す。良好なフィットは、プロテオーム及び色素（黒正方形）とプロテオーム、加水分解酵素及び色素（黒丸）との残差により示される。
図１０：エピココノンをレポータ色素として用いた変性させない量の洗剤（ＳＤＳ）の存在下及び非存在下における炭酸脱水酵素（ＣＡ）のトリプシン消化のリアルタイム反応速度モニタリングＣＡ及びＳＤＳを含みトリプシンを含まない（白正方形）と、蛍光のゆっくりした低下がみられ、トリプシンが存在すると（白丸）蛍光の位相指数関数的減衰がみられた。ＳＤＳが存在しないと、ＣＡ周囲の疎水性の低下のため信号は一層低い（逆三角形）。
図１１：ビシンバッファ（青）、トリプシン（黄）、ウシ血清アルブミン（マゼンタ）及びトリプシン消化ＢＳＡ（シアン）の蛍光の変化を示す生データ
図１２：０−１２８分に逐次採取し、８５℃でゲルローディングバッファ中でクエンチした（Ａ）ＢＳＡトリプシン消化（エピココノン含有）ゲル電気泳動トリプシン以外の成分を全て含む対照（コントロール）ゲル（Ｂ）は１２８分経っても変化を生じない。ゲルを「Ｄｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ  Ｔｏｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎ」により染色した。第１レーンはＬＭＷマーカを示し、最後のレーンは一晩インキュベートしたものを示す。
図１３：図１２に示すサンプルのゲート領域から測定した総蛍光強度
図１４：図１１からの生データの反応速度分析図１４Ａは、染色の展開及び引き続き分解を示すビシンバッファ（ｐＨ８．４）中のエピココノンの反応の分析である。見かけ上の一次定数が示唆される。分解速度はトリプシン消化（Ｂ）の一次反応定数を算出する際に用いられる。図１３のタンパク質ゲル（Ｃ）からのデータの分析からも同様の結果が得られた。
図１５：ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるトリプシン消化の可視化レーン１：マーカ、レーン２：トリプシンのみ（Ｔ＝０）、レーン３：Ｔ＝０（トリプシンなし）、レーン４：Ｔ＝０（トリプシン添加直後）、レーン５：Ｔ＝０．２５時間、レーン６：Ｔ＝０．５時間、レーン７：Ｔ＝１時間、レーン８：Ｔ＝６時間、レーン９：Ｔ＝１８時間、レーン１０：トリプシンのみ（Ｔ＝１８時間）
図１６：引き続きエピココノン処理が行われるＢＳＡの消化におけるキモトリプシン動態のリアルタイムモニタリング
図１７：引き続きエピココノン処理が行われるＢＳＡの消化におけるトリプシン動態のリアルタイムモニタリング
図１８：引き続きＳＹＰＲＯオレンジ処理が行われるＢＳＡの消化におけるトリプシン動態のリアルタイムモニタリング上側のグラフは時間の経過に対するＳＹＰＲＯオレンジのＢＳＡへの応答（ｒ２＝０．９９９５）を示し、下側のグラフはトリプシンを添加したほかは同じ条件での応答を示す。トリプシン加水分解速度は０．１４６６分−１（ｒ２＝０．９７３９）と決定された。
図１９：ＦｌｕｏｒｏＰｒｏｆｉｌｅアッセイ第１及び第２行は３７℃で１８時間インキュベートした（トリプシンなしの）未消化ＢＳＡ試料の複製試料である。第３及び第４行は３７℃で１８時間インキュベートした（トリプシありの）消化ＢＳＡ試料の複製試料である。かかる試料は最終的に１０２４分の１になるように連続的に四倍希釈した（注釈参照）。第５及び第６行はそれぞれ、２５０μｇｍＬ−１から６１ｎｇｍＬ−１に連続希釈されたＢＳＡ標準及びアプロチニン標準である。第１列は対照として５０ｍＭのビシンバッファを含む。
図２０：４倍希釈系に対し蛍光をプロットした。
図２１：蛍光対既知ＢＳＡ濃度（グラフは表Ａ２からプロットした。）
図２２Ａ：ＢＳＡ標準曲線図２２Ｂ：アプロチニン標準曲線
図２３：ナイルレッド、疎水環境下で蛍光を増すその他の色素を用いた後続トリプシン消化上側のグラフは時間の経過に対するナイルレッドのＢＳＡへの応答（ｒ２＝０．９９６９）を示し、下側のグラフはトリプシンを添加したほかは同じ条件での応答を示す。トリプシン加水分解速度は０．１３０２分−１（ｒ２＝０．０．９８９４）と決定された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
本発明は、蛍光色素の疎水性環境に対する応答を使用して非侵襲的に加水分解酵素の活性を追跡できるという発見に基づく。色素は、永久的な共有結合で基質を修飾するわけではないので、色素の酵素の活性に対する影響は大きくない。理論に束縛されることを望まないが、加水分解の最終生成物の親水性が増加すると、環境に対して感受性のあるフルオロフォアによる蛍光がそれに伴って低減する。
【００４２】
より具体的には、本発明は、蛍光色素であるエピココノンの蛍光が、タンパク質及び加水分解酵素（例えば、パパイン等）を含む加水分解反応において使用される場合に、タンパク質消化が完了まで進行するにつれ、低減するという驚くべき発見に基づく。
【００４３】
エピココノン、その誘導体及び使用は、国際特許出願Ｎｏ．ＰＣＴ／ＡＵ２００４／０００３７０（ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ２００４／０８５５４６）に記載されている。この文献は、本明細書中において参考として援用される。エピココノン及び関連の色素は、特にタンパク質及び他の生体高分子の検出及び定量に対して首尾よく使用されてきた。これらの方法は、エピココノン等の色素の蛍光がタンパク質の濃度が増加するにつれて強化されることに基づく。本明細書中において記載される研究について、消化されたタンパク質試料の蛍光強度は、タンパク質消化の結果としてのリジン残基の暴露の増加に比例して経時的に増加すると仮定した。しかし、予想に反して、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）のパパイン消化においてエピココノンを含めたところ、蛍光が急速に低減することが示された。この蛍光の低減は、消化プロセスを有効に追従し、かつタンパク質消化の完了時には最低レベルに達した。このことは、ＳＤＳーＰＡＧＥによって確認された。
【００４４】
理論又はいずれの特定の作用メカニズムにも束縛されることを望まないが、より小さなペプチドフラグメントを生じるタンパク質又はペプチドの加水分解消化によってタンパク質の電荷密度又は疎水性が変更され、したがって、タンパク質と疎水的に活性な蛍光色素との相互作用が影響を受け、その結果、色素の蛍光が低減するようである。さらに、変性させない量の界面活性剤（例えば、ＳＤＳ、トリトンＸ−１００又はＣＴＡＢ）を加えると、加水分解されたタンパク質と加水分解されないタンパク質との間の蛍光の差が劇的に増加した。この原理は、開始材料よりも極性の大きい又は小さい生成物を放出するすべての加水分解酵素又は他の加水分解剤、及び環境の疎水性に応じて量子収率が増加又は低減するすべてのフルオロフォアに対して一般に適用できる。
【００４５】
上記のように、エピココノン等の疎水的に活性な色素の蛍光がプロテアーゼによるタンパク質消化中に低減することが観察されることはまた、他の疎水的に活性な蛍光色素に当てはまり得ることが明らかであり得る。例えば、シアニン色素、ラウルダン／プロダンファミリーの色素、ｄａｐｏｘｙｌ誘導体、ピレン色素、ジフェニルヘキサトリエン誘導体、ＡＮＳ及びその類似体、スチリル色素、ナイルレッド、両親媒性フルオレセイン、ローダミン並びにクマリン又は環境の親油性に応じて蛍光の働きを実質的に変化させる任意の他のフルオロフォア等の色素ファミリー。同様の性質を有する他の色素が当業者に公知であり得る。
【００４６】
さらに、上記の原理、及び蛍光色素を用いて観察される効果は、タンパク質の切断若しくは消化、又はタンパク質若しくは生体分子（例えば、トランスフェラーゼ、キナーゼ）への基の転移のための任意の方法に当てはまるはずである。
【００４７】
上記原理に基づいて、一実施形態において、本発明は、加水分解酵素を適切な基質（例えば、タンパク質又はペプチド）及び基質と相互作用可能な蛍光色素と組み合わせることによってプロテアーゼ等の加水分解酵素の活性を測定し、かつ加水分解酵素の活性を示す蛍光の経時的な低減又は増加（変化）を測定又は観察する方法に関する。そのような用途に対して、基準タンパク質基質（例えば、ＢＳＡ又は同様のもの）を使用することができる。
【００４８】
別の実施形態において、本発明は、リン酸塩、硫酸塩又は炭水化物等の極性基がタンパク質から除去されるにつれ、蛍光が経時的に増加することをモニタする方法に関する。
【００４９】
別の実施形態において、本発明は、上記と同様の反応におけるタンパク質等の生体分子の加水分解消化を、リアルタイムで又は連続サンプリングによってのいずれかで、モニタし、かつやはり、加水分解消化の進行を示すものとして蛍光の経時的低減又は増加を検出又は観察する方法に関する。
【００５０】
上記方法は、本明細書中において、自動化又は連続フロー手法に容易に適用される。
【００５１】
ここで、非限定的な例を参照して本発明をより詳細に説明する。本明細書中で提供されるプロテアーゼの例としては、トリプシン及びパパインがあり、蛍光色素の例としては、エピココノン、ＡＮＳ、ナイルレッド及びＳＹＰＲＯオレンジがあるが、これらは、単に本発明の原理及び働きを明示するための便宜上のシステムである。本明細書において提供される加水分解酵素の他の例としては、エステラーゼ（ホスファターゼ、リパーゼ、ＤＮａｓｅ）及びグリコシラーゼ（アミラーゼ、ＰＮＧａｓｅ）があるが、やはり、これらは、単に本発明の有用性を明示するための便宜上のものである。提供される適切なフルオロフォアのさらなる例としては、ＳＹＴＯＸグリーン、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、ヨウ化プロピジウム、エピココノン、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ  Ｃ５セラミド又は５−オクタデカノイルアミノフルオレセインがあるが、やはり、これらは、単に本発明の広い有用性を明示するための便宜上のものである。
【００５２】
準備例
例Ａ：エピココノンを使用したトリプシン消化のリアルタイムモニタリングこの研究の目的は、エピココノン等の蛍光色素がトリプシンタンパク質消化をリアルタイムでモニタするために使用可能かどうかを確認することであった。
【００５３】
Ａ．１  材料
ビシン（５０ｍＭ、ｐＨ８．４、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｂ３８７６）ＢＳＡ（５０ｍＭビシン中１０ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ａ３０５９）トリプシン（２０μｇ／２０μＬ  １ｍＭ  ＨＣｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｔ６５６７）ヨードアセタミド（１００ｍＭビシン中１Ｍ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  １６１２５）ＤＴＴ（１００ｍＭビシン中２００ｍＭ、Ｂｉｏ−ｒａｄ  １６１−０６１１）９６穴透明底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、６５５０９６）エピココノン（ＤＭＳＯ中２４ｍＭ、ＦＬＵＯＲＯｔｅｃｈｎｉｃｓ）Ｄｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ全タンパク質ゲル染色（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ１２％ビス−トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＮＰ０３４１）ＬＭＷマーカ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、１７−０４４６−０１）
【００５４】
Ａ．２  装置
Ｔｙｐｈｏｏｎ  ９２００  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）ＦｌｕｏＳｔａｒ  （ＢＭＧ）電気泳動システム（ＸＣｅＩｌ  ＳｕｒｅＬｏｃｋ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
【００５５】
Ａ．３  方法
Ａ．３．１  消化のためのＢＳＡの調製
１  トリプシン消化をビシンバッファ中で行った（ｐｈ８．４）。
２  ＢＳＡを５０ｍＭビシンバッファ中１０ｍｇ／ｍＬとなるように調製した。
３  １００μｌのＢＳＡ試料をトリプシン消化のための使用した。
【００５６】
Ａ．３．２  還元及びアルキル化
１  １００μＬのＢＳＡ試料に５μＬのＤＴＴストックを８０℃で１０分間加えて還元した。
２  試料に４μＬのヨードアセタミドストックを室温で４５分〜１時間加えてアルキル化した。
３  試料に残ったヨードアセタミドに２０μＬのＤＴＴを室温で４５分〜１時間加えて中和した。
【００５７】
Ａ．３．３  エピココノンを使用したトリプシン消化のリアルタイムモニタリング（ＦｌｕｏＳｔａｒアッセイ）
１  上記３．２からの還元及び変性化ＢＳＡ試料を５０ｍＭビシンバッファ中で１０倍に希釈した（２５μＬ＋２２５μＬのビシンバッファ）。ＢＳＡのモル濃度は、約４μＭであると計算された。
２  １００μＬの試料（ステップ１）の複製を調製し、マイクロタイタープレートに加えた。コントロールは、ビシンを基にした消化バッファ、トリプシン試料のみ、及び未消化ＢＳＡ試料（トリプシンなし）を含んだ。
３  エピココノンストック溶液を５０ｍＭビシン中で１００倍に希釈した。１００μＬの希釈エピココノン溶液を各対応の穴に加えた。最終濃度は、１２μＭであった。この時点で、適切なＦｌｕｏＳｔａｒ設定条件を得るために約１０分かかった。
４  １ｍＭ  ＨＣｌ中で再調製されたトリプシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｔ６５６７）を１：４０の比で加えた。
５  ＦｌｕｏＳｔａｒ（Ｅｘ／Ｅｍ＝５４０／６３０±１２）を使用して、蛍光発色を２分ごとに６時間までモニタした。ＦｌｕｏＳｔａｒの設定は、以下のとおりであった。温度３７℃、１サイクル当たり１０回のフラッシュを１８０サイクル。
６  データをＥｘｃｅｌのグラフにプロットした（図１１）。
【００５８】
Ａ．３．４  トリプシン消化のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける可視化
１  上記３．２からの還元及び変性化ＢＳＡ試料を５０ｍＭビシンバッファ中で１０倍に希釈した（２５μＬ＋２２５μＬのビシンバッファ）。ＢＳＡのモル濃度は、約４μＭであると計算された。
２  １００μＬの試料（ステップ１）を１．５ｍＬマイクロチューブに加えた。コントロールは、ビシンを基にした消化バッファ、及び未消化ＢＳＡ試料（トリプシンなし）を含んだ。
３  エピココノンストック溶液を５０ｍＭビシン中で１００倍に希釈した。１００μＬの希釈エピココノン溶液を各対応の穴に加えた。最終濃度は、１２μＭであった。この時点（時間０）で、１５μＬの試料を取り出し、１５μＬのタンパク質ゲルローディングバッファ（２×）と混合し、そして８５℃で５分間変性させた。
４  １ｍＭ  ＨＣｌ中で再調製されたトリプシンを１：４０の比で加えた。次いで、試料チューブを３７℃でインキュベートした。
５  副次試料を２、４、８、１６、３２、６４、１２８分、及び一晩（１８時間）後に採取した。各サンプリング時点で、１５μＬの試料を取り出し、直ちに１５μＬのタンパク質ゲルローディングバッファ（２×）と混合し、８５℃で５分間変性し、そして−８０℃で保存した。
６  上記のように採取した副次試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎｕｐａｇｅ、１２％ＢＴゲル）に流し、そしてゲルをＤｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅで染色して可視化した。
７  Ｄｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ染色ゲルをＴｙｐｈｏｏｎスキャナ（Ｅｘ：Ｅｍ＝５３２：５６０  ＬＰ、４４０ＰＭＴ）で画像化した。
８  消化されたタンパク質試料（図１２Ａ）及び未消化タンパク質試料（図１２Ｂ）を示すすべてのゲルレーンを等しくゲートでコントロールし（ｇａｔｅｄ）、そして蛍光強度をＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（ｖ５．２）ソフトウェアによって測定した。
【００５９】
Ａ．４  データ分析及び結果
これらの研究の結果を図１１〜１４にまとめた。
【００６０】
ＢＳＡ及びＢＳＡ＋トリプシンのエピココノンとの反応から得られた生データを記載のように測定し、そしてＰｒｉｓｍ（バージョン４．０．３、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）を使用して単純第一次動態モデルにフィットさせた。
【００６１】
ビシンバッファにおけるＢＳＡのエピココノンとの反応について、少なくとも２つの反応があり、１つは、エピココノンのＢＳＡとの時間依存性の会合、及び次いでよりゆっくりとした分解、及び／又はこの蛍光複合体の光退色であることが明らかである。このプロセスを単純な会合／解離モデルを用いてモデル化した。
【数１】
2009514510.tif 000002
ここで、第１項は、信号の指数関数的な増加を意味し、及び第２項は、指数関数的な低減を意味する。図１１からの値を背景の蛍光（ビシン＋トリプシン）から引き、そして実験の実際の開始時間（第１の読み取りから１０分と推定）について調節した。このモデルについて、０．９９９２のｒ２値を得た（図１４）。
【００６２】
時間とともに信号が低下するのは、エピココノンのタンパク質（及びおそらくはペプチド）との相互作用の特性であるので、ｋ２についての値をトリプシン動態の分析に使用した。二位相指数関数的減衰
【数２】
2009514510.tif 000003
を使用した。ここで、ｋ２は、ＢＳＡ単独で見られた値に設定した。このように、実験条件下のトリプシンについて推定された見かけの一次速度定数は、０．１０９分−１（ｒ２＝０．９８７１）であることが分かった。明らかに、実際の動態は、より複雑であるが、これは、多くの場合に加水分解活性のモニタリングに対して非常に有用となり得るよい近似である。
【００６３】
サブサンプリングされた反応からの結果を同様に分析するが、信号の経時的な低下に関連する項は、ゲルとは関係がないので使用しない。このように、見かけの一次速度定数が０．３１３６分−１（ｒ２＝０．９７５７）であることが分かった。しかし、非常に少ないポイントではあるが、大きな９５％の信頼区間が見られた（０．１９７６〜０．４２９６分−１）。測定が比較的不正確なモードであること（例えば、より高い見かけの速度定数を生じるサブサンプリング手順中にもトリプシン消化が継続する）を合わせると、エピココノンを用いたトリプシン消化のインサイチュのモニタリングは、サブサンプリングの面倒なプロセスと同程度であり、かつ酵素動態は、色素の存在によって著しくは影響されないことが示唆される。
【００６４】
上記の実験はまた、炭酸バッファ（ＮＨ４ＨＣＯ３、１００ｍＭ又は５０ｍＭ、ｐＨ８．２）において行い、そして結果をビシンバッファを使用して得たデータと比較した。比較結果を図１５に示す。
【００６５】
ＳｉｇｍａーＡｌｄｒｉｃｈプロテオミクスグレードのトリプシン（Ｔ６５６７）は、両方の消化バッファにおいて十分に機能した。消化は、０．５〜１時間内に完了に達したように見えた。
【００６６】
提示するデータは、還元及びアルキル化ＢＳＡが急速にトリプシンによって消化され、かつこのプロセスを環境に感受性のある蛍光色素を用いてそのまま（ｉｎ  ｓｉｔｕ）追跡できることを示す。
【００６７】
例Ｂ−エピココノンを使用したＢＳＡ−消化におけるキモトリプシンの動態
Ｂ．１  材料
ビシン（５０ｍＭ、ｐＨ７．８、Ｂ３８７６）ＢＳＡ（５０ｍＭビシン中１０ｍｇ／ｍＬ、Ａ３０５９）キモトリプシン（Ｃ４１２９、１ｍｇ／ｍＬの１ｍＭ  ＨＣｌ）ＣａＣｌ２（ＲＯ水中１Ｍ）ヨードアセタミド（１００ｍＭビシン中１Ｍ、１６１２５）ＤＴＴ（１００ｍＭビシン中２００ｍＭ、Ｂｉｏ−ｒａｄ  １６１−０６１１）エピココノン（ＤＭＳＯ中２４ｍＭ、Ｆｌｕｏｒｏｔｅｃｈｎｉｃｓ）ＦｌｕｏＳｔａｒ（ＢＭＧ）９６穴透明底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、６５５０９６）
【００６８】
Ｂ．２．  方法
Ｂ．２．１  消化のためのＢＳの調製
１．  キモトリプシン消化をビシンバッファ中で行った。
２．  ＢＳＡを５０ｍＭビシンバッファ中で１０ｍｇ／ｍＬとなるように調製した。
３．  １００μＬのＢＳＡ試料をキモトリプシン消化のために使用した。
【００６９】
Ｂ．２．２  還元、アルキル化及び中和
１．  ＢＳＡ試料（１００μＬ）に５μＬのＤＴＴストックを加え、そして（８０℃）で１０分加熱して還元した。
２．  試料にヨードアセタミド（４μＬ）ストックを加えて室温で４５分〜１時間アルキル化した。
３．  試料に残ったヨードアセタミドにＤＴＴ（２０μＬ）を加え、そして室温で４５分〜１時間インキュベートして中和した。
【００７０】
Ｂ．２．３  エピココノンを使用したキモトリプシン消化のリアルタイムモニタリング（ＦｌｕｏＳｔａｒアッセイ）
１．  上記２．２からの還元及び変性化ＢＳＡ試料を５０ｍＭビシンバッファ中で１０倍に希釈した（２５μＬ＋２２５μＬのビシンバッファ）。ＢＳＡモル濃度は、約６μＭであると計算された。
２．  １００μＬの試料（ステップ１）の複製を調製し、マイクロタイタープレートに加えた。コントロールは、ビシンを基にした消化バッファ、キモトリプシン試料のみ、及び未消化ＢＳＡ試料（キモトリプシンなし）を含んだ。
３．  エピココノンストック溶液を５０ｍＭビシン中で１００倍に希釈し、そして１００μＬを各穴に加えた。エピココノンの最終濃度は、１２μＭであった。この時点で、適切なＦｌｕｏＳｔａｒ設定条件を得るために約１０分かかった。
４．  ２μＬのＣａＣｌ２を加えた。
５．  １ｍＭ  ＨＣｌ中で再調製されたキモトリプシン（Ｃ４１２９）を１：３０の比で加えた。
６．  ＦｌｕｏＳｔａｒ（Ｅｘ／Ｅｍ＝５４０／６３０−１２）を使用して、蛍光発色を２分ごとに６時間までモニタした。ＦｌｕｏＳｔａｒの設定は、以下のとおりであった。温度３０℃、１サイクル当たり１０回のフラッシュを１８０サイクル。
７．  データをＥｘｃｅｌのグラフにプロットした（図１１）。
【００７１】
Ｂ．３．  結果及び考察
図１６に、ＢＳＡ消化におけるキモトリプシン動態のリアルタイムモニタリングを示す。図１６にまた、トリプシン（図１７）と同様の動態パターンであって、蛍光が未消化ＢＳＡにおいて指数関数的に増加し、かつ消化されたＢＳＡにおいて指数関数的に減衰するパターンを表示する。これらの条件下においてキモトリプシンについて得られた見かけの一次速度定数は、０．０４４７分−１であった。
【００７２】
例Ｃ−ＳＹＰＲＯオレンジの付加によって追跡したＢＳＡのトリプシン消化
Ｃ．１  材料
上記の例２の通り。ＳＹＰＲＯオレンジ（ＤＭＳＯ中２４ｍＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を５０ｍＭビシン中で１００倍に希釈。
【００７３】
Ｃ．２  方法
例２の通り。ただし、Ｆｌｕｏｒｏｓｔａｒのプレートリーダを４８０ｎｍ励起及び６００（±１０ｎｍ）帯域通過発光フィルタに設定した点が異なる。
【００７４】
Ｃ．３  結果
結果によると、ＳＹＰＲＯオレンジ（疎水性環境において蛍光を増加する別の色素）は、タンパク質消化のリアルタイム分析においてエピココノンと同様の性能であることが示された（図１８）。特に、蛍光の経時的な降下を追跡することによってトリプシン消化についての見かけの一次速度定数を抽出することが可能であった。この色素を使用して同様の値（ｋ＝０．１４６６分−１）を得た。エピココノンとＳＹＰＲＯオレンジとの顕著な違いは、エピココノンを用いて観察された蛍光の増強がＳＹＰＲＯオレンジでははっきりとは見られなかったこと、及び蛍光の光退色／低下がエピココノンを用いた場合よりも速いことである。
【００７５】
例Ｄ−トリプシン消化後に生成されたペプチドを定量するためのＦｌｕｏｒｏＰｒｏｆｉｌｅの使用（１８時間）
Ｄ．１  材料及び装置
ビシン（５０ｍＭ、ｐＨ８．４、Ｂ３８７６）ＢＳＡ（５０ｍＭビシン中１０ｍｇ／ｍＬ、Ａ３０５９）トリプシン（２０μｇ／２０μＬ  １ｍＭ  ＨＣｌ、Ｔ６５６７）ヨードアセタミド（１００ｍＭビシン中１Ｍ、１６１２５）ＤＴＴ（１００ｍＭビシン中２００ｍＭ、Ｂｉｏ−ｒａｄ  １６１−０６１１）９６穴透明底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、６５５０９６）ＢＳＡ基準（Ａ３０５９ＢＳＡ基準（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ３０５９）アプロチニン基準（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ１１５３）ＦｌｕｏｒｏＰｒｏｆｉｌｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）９２００  Ｔｙｐｈｏｏｎスキャナ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
【００７６】
Ｄ．２  方法
１．  これまでに記載したようにトリプシン消化ためにＢＳＡを変性、還元、アルキル化、そして中和した。下記に簡単にまとめる。１００μＬのＢＳＡ試料（１０ｍｇ／ｍＬ）５μＬの２００ｍＭ  ＤＴＴ（Ｂｉｏｃｉｎｅ製）：７０℃で１０分間４μＬの１Ｍ  ＩＤＡ（Ｂｉｏｃｉｎｅ製）：室温で４５分２０μＬの２００ｍＭ  ＤＴＴ（Ｂｉｏｃｉｎｅ製）：室温で４５分
２．  還元、アルキル化、そして中和した後、上記ＢＳＡ試料を５０ｍＭビシンバッファ中で１０倍に希釈し（５０μＬの試料＋４５０μＬの５０ｍＭビシンバッファ）、トリプシン消化のための試料を得た。すなわち、それぞれＴ＝０時間及びＴ＝ＯＮ（一晩）でサブサンプリングされた、未消化ＢＳＡに対する複製試料、及び消化されたＢＳＡに対する複製試料（２．５μＬの１ｍＭ  ＨＣｌを加えた）、及びそれぞれＴ＝０時間及びＴ＝ＯＮでサブサンプリングされた、消化されたＢＳＡに対する複製試料（２．５μｇのトリプシンを含む２．５μＬを加えた）。
３．  トリプシン消化の終了時に、１μＬの１０％ＴＦＡを加え、そして−８０℃で保存した。消化に対するＢＳＡの量は、７４９μｇ／ｍＬであると計算された。
【００７７】
Ｄ．２．１  試料の調製
未消化ＢＳＡ（複製）及び消化されたＢＳＡ（複製）について、試料を５０ｍＭビシン中で４倍ずつ連続希釈し、最後には１０２４倍希釈を得た。ＢＳＡを新たにビシンバッファ中に調製し、そして連続希釈して、６１ｎｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの範囲の希釈系列を得た。アプロチニンを新たにビシンバッファ中に調製し、そして連続希釈して、６１ｎｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの範囲の希釈系列を得た。
【００７８】
Ｄ．２．２  ＦｌｕｏｒｏＰｒｏｆｉｌｅアッセイ
８部の５０ｍＭビシン、１部のパートＡ、及び１部のパートＢから作業用ＦｌｕｏｒｏＰｒｏｆｉｌｅキットミックスを調製した。試料（５０μＬ）を９６穴プレートに置き、そしてＦｌｕｏｒｏＰｒｏｆｉｌｅ作業用溶液（５０μＬ）を各穴に加えた。試料を３０分間室温でインキュベートした。蛍光をＴｙｐｈｏｏｎスキャナを使用して５３２／６１０（Ｅｘ／Ｅｍ）で読み取った。
【００７９】
Ｄ．３  結果
Ｄ．３．１  未消化及び消化されたＢＳＡの蛍光レベルのＦｌｕｏｒｏＰｒｏｆｉｌｅ分析
図１９に、試料をＦｌｕｏｒｏＰｒｏｆｉｌｅによってアッセイしたプレートのＴｙｐｈｏｏｎ−スキャンイメージを示す。表Ａ１及び図２０に示すように、消化されたＢＳＡ試料についての蛍光は、未消化試料よりも著しく高い。
【００８０】
表Ａ１  連続希釈された未消化（３番目のカラム）及び消化されたＢＳＡ試料（７番目のカラム）の蛍光試料は、ＦｌｕｏｒｏＰｒｏｆｉｌｅによってアッセイし、そしてＴｙｐｈｏｏｎスキャナで蛍光を読み取った。
【表１】
2009514510.tif 000004
【００８１】
未消化及び消化された試料（連続希釈したもの）の蛍光をトリプシン消化のために使用したＢＳＡ濃度に対してプロットした（表Ａ２及び図２１）。トリプシン消化のための使用したＢＳＡ（変性させたもの）の濃度は、７４９μｇ／ｍＬであると計算された（表２を参照）。
【００８２】
表Ａ２  トリプシン消化のために使用したＢＳＡ（７４９μｇ／ｍＬ）の希釈並びに対応する未消化ＢＳＡ及び消化されたＢＳＡの蛍光
【表２】
2009514510.tif 000005
【００８３】
Ｄ．３．２  ＦｌｕｏｒｏＰｒｏｆｉｌｅを使用した、消化されたＢＳＡの定量
未消化ＢＳＡ（変性化、１８時間インキュベート）において濃度７０４μｇ／ｍＬを生ＢＳＡ基準曲線（図２２Ａ）に対して補間することによって決定した（表Ａ３）。消化されたＢＳＡは、１０５７μｇ／ｍＬであると推定された。
【００８４】
表Ａ３  生ＢＳＡ基準を使用した、消化されたＢＳＡ（ＢＳＡ＋トリプシン）の定量
【表３】
2009514510.tif 000006
【００８５】
未消化ＢＳＡ（変性化、１８時間インキュベート）における濃度５６０μｇ／ｍＬをアプロチニン基準曲線（図２２Ｂ）に対して補間することによって決定した（表Ａ４）。消化されたＢＳＡは、９３８μｇ／ｍＬであると推定された。
【００８６】
表Ａ４  アプロチニン基準を使用した、消化されたＢＳＡ（ＢＳＡ＋トリプシン）の定量
【表４】
2009514510.tif 000007
【００８７】
消化されたＢＳＡにおける蛍光の増加をＦｌｕｏｒｏＰｒｏｆｉｌｅアッセイにおいて観察した。ここで、１８時間のトリプシン消化の後に採取された副次試料に対してパートＡ及びＢを使用した。生のＢＳＡ基準（図２２Ａ）及びアプロチニン基準（図２２Ｂ）を使用し、消化されたＢＳＡの蛍光の増加は、未消化ＢＳＡ（表Ａ３及び表Ａ４）よりも約５０％及び６７％高いことが観察された。
【００８８】
例Ｅ−ナイルレッドの付加によって追跡したＢＳＡのトリプシン消化
Ｅ．１  材料
上記例２の通り。ナイルレッド（エタノール中２０ｍＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、７３１８９）を５０ｍＭビシン中で１００倍に希釈。
【００８９】
Ｅ．２  方法
例２の通り。ただし、Ｆｌｕｏｒｏｓｔａｒのプレートリーダを５２０ｎｍ励起及び６３０（±１０ｎｍ）帯域通過発光フィルタに設定した点は異なる。
【００９０】
Ｅ．３  結果
結果によると、ナイルレッドも、タンパク質消化のリアルタイム分析においてエピココノン及びＳＹＰＲＯオレンジと同様の性能であることが示された（図２３）。特に、蛍光の経時的な降下を追跡することによってトリプシン消化についての見かけの一次速度定数を抽出することが可能であった。この色素を使用して同様の値（ｋ＝０．１３０２分−１）を得た。エピココノンとナイルレッドとの顕著な違いは、エピココノンを用いて観察された蛍光の増強がナイルレッドでははっきりとは見られなかったこと、及び蛍光の光退色／低下がエピココノンを用いた場合よりも速く、かつＳＹＰＲＯオレンジを用いた場合よりも速いことである。
【００９１】
例１〜３及び５において、ＢＳＡトリプシン消化に対する見かけの一次動態定数がすべての示した例について同じ（誤差内）であることに留意されたい。
【実施例】
【００９２】
例１：フルオロフォアを使用したグリコシラーゼ活性のリアルタイムモニタリング
１．１  材料
ビシン（１００ｍＭ、ｐＨ８、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｂ３８７６）フェチュイン（ＲＯ水中２０ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｆ３００４）ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮａｓｅＦ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｐ７３６７）エピココノン（ＤＭＳＯ中２４ｍＭ、ＦＬＵＯＲＯｔｅｃｈｎｉｃｓ）ＳＤＳ（ＢＤＨ  ４４２４４４Ｈ）２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｍ７１５４）黒色９６穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、６５５２０９）Ｄｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ全タンパク質ゲル染色（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ  １２％  ビス−トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＮＰ０３４１）ＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳ試料バッファ（４×、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＮＰ０００７）ＬＭＷマーカ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、１７−０４４６−０１）
【００９３】
１．２  装置
Ｔｙｐｈｏｏｎ  ９２００（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）ＦｌｕｏＳｔａｒ  （ＢＭＧ）電気泳動システム（ＸＣｅｌｌ  ＳｕｒｅＬｏｃｋ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
【００９４】
１．３  方法
１．３．１  洗剤の存在下のエピココノンを使用した脱グリコシル化のリアルタイムモニタリング
１．  フェチュインタンパク質をビシンバッファ中で１：２０に希釈した。
２．  タンパク質（９０μｇ／９０μＬ）を１０μＬの洗剤（１００ｍＭの２−メルカプトエタノールを用いた０．２％ＳＤＳ）を使用して１００℃で１０分間変性させた。
３．  １００μｌの試料（ステップ２）をマイクロタイタープレート穴に加えた。コントロールは、ビシンを基にした消化バッファ、ＰＮＧａｓｅＦ試料だけ、及び脱グリコシル化フェチュイン試料（ＰＮＧａｓｅＦなし）を含んだ。
４．  エピココノンストック溶液を１００ｍＭビシン中で１００倍に希釈した。１００μｌの希釈エピココノン溶液を各穴に加えた。
５．  試料を３７℃で２０分間放置して平衡化した（プレインキュベート）。ＦｌｕｏＳｔａｒは、適切なゲイン設定を得るために約１分かかった。
６．  逆浸透（ＲＯ）水中で再調製した１単位のＰＮＧａｓｅＦを各フェチュインタンパク質試料及びコントロール（例えば、ビシンバッファ＋ＰＮＧａｓｅＦ）に加えた。
７．  ＦｌｕｏＳｔａｒ（Ｅｘ／Ｅｍ＝５４０±１０／６３０±１０ｎｍ）を使用して、蛍光発色を３分ごとに６９分までモニタした。ＦｌｕｏＳｔａｒの設定は、以下のとおりであった。温度３７℃、１０フラッシュ／サイクル。
８．  進行曲線を、コントロールを引くことによってマイクロソフトのＥｘｃｅｌにおいて操作した。バッファ／色素をフェチュイン／色素だけを含む試料から引き、及びＰＮＧａｓｅ＋バッファ／色素をフェチュイン／ＰＮＧａｓｅ／色素試料から引いた。
９．  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  ｖ．４）を使用して、正規化データをプロット及びフィッティングした（図１を参照）。フェチュイン試料を二位相会合／解離指数関数（Ｙ＝Ｙｍａｘ＊（１−ｅｘｐ（−ｋ１＊Ｘ））＋ＳＰＡＮ＊（ｅｘｐ（−ｋ２＊Ｘ））−ｂｏｔｔｏｍ）にフィッティングした。ここで、Ｙは、蛍光データであり、及びＸは、時間である（単位：分）。ｋ１及びｋ２に対する値を使用して三位相会合／解離指数関数（Ｙ＝ＳＰＡＮ１＊（１−ｅｘｐ（−ｋ１＊Ｘ））＋ＳＰＡＮ２＊（ｅｘｐ（−ｋ２＊Ｘ））＋ＳＰＡＮ３＊（１−ｅｘｐ（−ｋ３＊Ｘ））−ｂｏｔｔｏｍ）をフィッティングした。ここで、ｋ３は、ＰＮＧａｓｅによるフェチュインの脱グリコシル化についての擬一次速度定数である。
【００９５】
１．３．２  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける脱グリコシル化試料の可視化
１．  アッセイの終了時に副次試料を採取した。両方の消化からの副次試料（６．５μＬ）を採取し、３．５μＬの試料ローディングバッファ（２．５μＬのＮｕＰＡＧＥ試料バッファ及び１μＬの５００ｍＭ  ＤＴＴ）中で混合し、そして８０℃で１０分間インキュベートした。
２．  次いで、各試料を１２％ポリアクリルアミドゲル（ＮｕＰＡＧＥビス−トリス、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に装填し、そして青色ローディングバッファ色素がゲルをちょうど流れ切るまで５０分間流した（２００Ｖ一定）。
３．  Ｄｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ染色ゲルをＴｙｐｈｏｏｎスキャナで画像化した（Ｅｘ：Ｅｍ＝５３２：５６０  ＬＰ、４４０ＰＭＴ）．
【００９６】
１．４  データ分析及び結果
糖は、比較的極性が強いので、タンパク質を脱グリコシル化すると、疎水性が増加する。低濃度の洗剤（ＳＤＳ等）の存在下では、糖が切断されるにつれ、より多くの洗剤がタンパク質と会合するはずである。このように、環境に感受性のある蛍光分子は、疎水性の変化に応答して、酵素活動（例えば、フェチュインの脱グリコシル化があるが、これに限定されない）のための痕跡を残さない、リアルタイムアッセイを容易にするはずである。
【００９７】
フェチュイン（４８．４ｋＤａ）は、７４％のポリペプチド、８．３％のヘキソース糖、５．５％のヘキソサミン及び８．７％のシアル酸から構成され、かつ一般の糖タンパク質基準である。
【００９８】
フルオロフォアであるエピココノンの存在下でのフェチュインのＰＮＧａｓｅＦとの反応から得られた、正規化された（上記ステップ８）、リアルタイムの蛍光データを測定し、そしてＰｒｉｓｍ（バージョン４．０．３、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、サンディエゴ、米国）を使用して三成分指数関数的会合−解離動態モデルにフィッティングした。天然フェチュイン試料は、わずかに蛍光が増加し、そして次いで光退色／分解により低減する。これは、一位相指数関数的会合及びそれに続くゆっくりとした指数関数的解離を使用してモデル化できる。対照的に、酵素を用いた試料は、蛍光が増加し、及び三位相指数関数にフィッティングして脱グリコシル化についての擬一次速度定数を得た。分析結果を図１に示す。
【００９９】
図１Ａは、３７℃で１時間の脱グリコシル化中に疎水性が増加したために試料（フェチュイン＋ＰＮＧａｓｅＦ）中の蛍光が増加したことを明示する。リアルタイムデータをフィッティングすることによって、実際の基質における酵素活性の分析、並びに加水分解の動態定数及び半減期の決定が可能になる。半減期の１０倍が完全な加水分解の尺度として使用できる（この場合、５９分）。図１Ｂは、リアルタイムアッセイの独立したＳＤＳ−ＰＡＧＥ検証であり、脱グリコシル化時の天然フェチュイン（レーン２）及びＰＮＧａｓｅＦ処理されたフェチュイン（レーン３）間の分子シフトを示す。
【０１００】
例２：３つの異なるフルオロフォアを使用したオリゴヌクレオチド加水分解のリアルタイムモニタリング
２．１  材料及び装置
これまでの例の通りであるが、以下の追加及び／又は置き換えを伴う。ビシン（５００ｍＭ、ｐＨ７．５、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｂ３８７６）ＭｇＣｌ２（１Ｍ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｍ−８２６６）ＣａＣｌ２（１Ｍ、ＢＤＨ  ０１００７０−０５００）０．１Ｍビシン、０．４Ｍ  ＭｇＣｌ２及び０．０２Ｍ  ＣａＣｌ２を含むＤＮａｓｅ１バッファ（×２０）サケ精子ＤＮＡ（１ＲＯ水中１．２５ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｆ３００４）ＤＮａｓｅ１（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ中５ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＤＮ２５）Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｈ１３９９）ヨウ化プロピジウム（ＲＯ水中１．５ｍＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｐ４１７０）ＳＹＴＯＸ−グリーン（ＤＭＳＯ中５ｍＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓ７０２０）ＳＰＰ１／ＥｃｏＲＩ  ＤＮＡ分子量マーカ（Ｂｒｅａｓｔｅｃ  Ｌｔｄ．  ＤＭＷ−Ｓ１）ＤＮＡグレードアガロース（１．５％ｗ／ｖ、Ｐｒｏｇｅｎ  ２００−００１１）核酸試料ローディングバッファ（５×、Ｂｉｏ−ｒａｄ  １６１−０７６７）トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ  ＤＮＡランニングバッファ（１０×、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｂ５２）臭化エチジウム（１０ｍｇ／ｍＬ  ＲＯ水、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｅ７６３７）Ｍｉｎｉ−Ｓｕｂ（登録商標）細胞ＧＴ（Ｂｉｏ−ｒａｄ）ＣｈｅｍｉＩｍａｇｅｒ（商標）４４００（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ）
【０１０１】
２．２  方法
２．２．１  ＤＮａｓｅ酵素を用いたｄｓ−ＤＮＡ加水分解のＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、ＳＹＴＯＸ  グリーン及びヨウ化プロピジウムを使用したリアルタイムモニタリング
１．  ＤＮＡ試料を１×ＤＮａｓｅ１バッファ中で５倍に希釈し、２５０μｇ／ｍＬにした。
２．  １００μｌの試料（ステップ１）をマイクロタイタープレートに加えた。コントロールは、１×ＤＮａｓｅ１バッファ、ＤＮａｓｅ１試料だけ、及び未消化ＤＮＡ試料（ＤＮａｓｅ１なし）を含んだ。
３．  各フルオロフォアストック溶液を１×ＤＮａｓｅ１バッファ中で１００倍に希釈した。１００μｌの希釈フルオロフォア溶液を各穴に加えた。試料を３７℃で５０分間平衡化した。ＦｌｕｏＳｔａｒは、適切なゲイン設定を得るために約１分かかった。
４．  ０．１５Ｍ  ＮａＣｌ中で再調製した１単位のＤＮａｓｅ１を消化すべき各ＤＮＡ試料、及び１つのコントロール（例えば、１×ＤＮａｓｅ１バッファ＋ＤＮａｓｅ１）に加えた。
５．  ＦｌｕｏＳｔａｒ（Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２に対してはＥｘ／Ｅｍ＝３５５／４６０ｎｍ、ヨウ化プロピジウムに対しては５４０±１０／６３０±１０、ＳＹＴＯＸ−グリーンに対しては４８５／５２０ｎｍ）を使用して、蛍光発色を３分ごとに１２０分までモニタした。ＦｌｕｏＳｔａｒの設定は、以下のとおりであった。温度３７℃、１０フラッシュ／サイクル。
６．  進行曲線を、コントロール（対照）を引くことによってマイクロソフトのＥｘｃｅｌにおいて操作した。ＤＮａｓｅバッファをＤＮＡだけを含む試料から引き、及びＤＮａｓｅ＋バッファをＤＮＡ／ＤＮＡｓｅ試料から引いた。
７．  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  ｖ．４）を使用して正規化データをプロットした（図２を参照）。フルオロフォアを用いたＤＮＡの進行曲線をまず単一位相指数関数的減衰（Ｙ＝ｓｐａｎ＊ｅｘｐ（−ｋＸ）＋ｐｌａｔｅａｕ）にフィッティングし、そして得られたｋについての値を、ＤＮＡ＋ＤＮａｓｅ酵素についての二位相指数関数的減衰（Ｙ＝ｓｐａｎ１＊ｅｘｐ（−ｋ１Ｘ）＋ｓｐａｎ２＊ｅｘｐ（−ｋ２Ｘ）＋ｐｌａｔｅａｕ）におけるｋ１についての固定値として使用し、ｋ２を導出した。
【０１０２】
２．２．２  エキソヌクレアーゼ活性のアガロース電気泳動による可視化
１．  アッセイの終了時に、副次試料を採取した。両方の消化からの副次試料（８μＬ）を採取し、２μＬの核酸試料−ローディングバッファと混合した。
２．  次いで、各試料を５μｇの臭化エチジウムを含む２％アガロースゲル上に装填し、そして青色ローディングバッファ色素がゲルをちょうど流れ切るまで１時間流した（１５０Ｖ一定）。
３．  臭化エチジウム染色ゲルをＣｈｅｍｉＩｍａｇｅｒ（商標）４４００によって画像化した。
【０１０３】
２．３  データ分析及び結果
実験を行って、環境に感受性のあるフルオロフォアを使用してオリゴヌクレオチド試料（例えば、酵素ＤＮａｓｅ１を用いた二重鎖サケ精子ＤＮＡがあるが、これに限定されない）の加水分解を痕跡を残さずに追跡できることを明示した。
【０１０４】
図２は、３つの異なるフルオロフォアを使用したＤＮａｓｅ駆動加水分解のリアルタイムモニタリングを示す。ＤＮａｓｅ１を加えた場合に、蛍光における指数関数的減衰がすべてのケースで観察され、かつ加水分解についての擬一次速度定数（Ｋ２）が非線形回帰分析によって得られた。典型的には、酵素進行曲線を有さないバッファにおけるオリゴヌクレオチドを一位相指数関数的減衰にフィッティングさせて、フルオロフォアの光退色及び／又は分解による蛍光の経時的に観察されるゆっくりとした低減にフィッティングさせる。酵素触媒加水分解を、一次速度定数をＤＮＡだけの試料から速度定数の１つとして取りながら、二位相指数関数的減衰にフィッティングさせた。このとき、第２の速度定数（図２のＫ２）は、ＤＮＡの加水分解についての擬一次速度定数の妥当な近似である。３つの異なる色素を使用した速度は、非常によく一致し、１１〜０．１５分−１で変動する。各場合において、ＤＮＡ加水分解の半減期を測定でき、及びこの値の１０倍がＤＮＡの完全な加水分解（この場合、４６〜６４分）に対応し得る。
【０１０５】
図２Ｄは、リアルタイムアッセイの独立したＤＮＡゲル電気泳動に基づく検証であり、ＤＮＡ試料がＤＮａｓｅ１によって完全に加水分解され（レーン３、５及び７）、他方ＤＮａｓｅを加えていないＤＮＡ試料がＤＮＡの複雑な混合物の存在によって強いしみ（ｓｍｅａｒ）を見せること（レーン２、４及び６）を示す。この例は、オリゴヌクレオチド（ゲノム）の複雑な混合物に対する酵素の加水分解活性を追跡する際のいくつかの色素の有用性を明示する。
【０１０６】
例３：変性させない量の洗剤及びフルオロフォアの存在下における多糖類加水分解のリアルタイムモニタリング
３．１  材料及び装置
これまでの例の通りであるが、以下の追加及び／又は置き換えを伴う。ビシン（５０ｍＭ、ｐＨ７、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｂ３８７６）デンプン（ビシンバッファ中１％、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓ２６３０）α−アミラーゼ（１．８単位／ｍｇ  固体、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ａ２７７１）トリトンＸ−１００  （ＢＤＨ  ３０６３２）
【０１０７】
３．２  方法
３．２．１  エピココノンを用いてモニタされるデンプンのα−アミラーゼ駆動加水分解のリアルタイムモニタリング
１．  デンプン溶液を、試料を１５分間煮沸することによって、５０ｍＭビシンバッファ中１％の濃度（ｐＨ７）となるように調製した。
２．  トリトンＸ−１００を最終濃度が０．０２％となるようにデンプン溶液に加えた。
３．  １００μｌの試料（ステップ１）をマイクロタイタープレートに加えた。コントロールは、ビシンに基づく消化バッファ、α−アミラーゼ試料だけ、及び天然のデンプン試料（アミラーゼなし）を含んだ。
４．  エピココノンストック溶液を５０ｍＭビシン中で１００倍に希釈した。１００μｌの希釈エピココノン溶液を各穴に加えた。試料を３７℃で５０分間インキュベートした。ＦｌｕｏＳｔａｒは、適切な設定条件を得るために約１分かかった。
５．  ビシンバッファ中で再調製された２μＬ（０．０３６単位）のα−アミラーゼをデンプン試料、及び１つのコントロール（例えば、ビシンバッファ＋α−アミラーゼ）に加えた。
６．  ＦｌｕｏＳｔａｒ（Ｅｘ／Ｅｍ＝５４０＋１０／６３０±１０ｎｍ）を使用して、蛍光発色をリアルタイムに３分ごとに約２００分までモニタした。ＦｌｕｏＳｔａｒの設定は、以下のとおりであった。温度３７℃、１０フラッシュ／サイクル。
７．  進行曲線を、コントロールを引くことによってマイクロソフトのＥｘｃｅｌにおいて操作した。バッファをデンプンだけを含む試料から引き、及びアミラーゼ＋バッファをデンプン／アミラーゼ試料から引いた。
８．  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  ｖ．４）を使用して正規化データをプロットした（図３を参照）。
【０１０８】
３．３  データ分析及び結果
実験を行って、環境に感受性のあるフルオロフォア（エピココノン等）を使用して、炭水化物試料（例えば、ジャガイモデンプンがあるが、これに限定されない）のアミラーゼによる加水分解を、基質の周辺の局所疎水性を測定することによってモニタできることを明示した。
【０１０９】
図３に、エピココノンを使用したアミラーゼ駆動加水分解のリアルタイムモニタリングを示す。洗剤トリトンＸ−１００の存在下において、加水分解の開始時の蛍光信号は、洗剤がない場合よりも約２０％高かった。このことは、洗剤がデンプンに結合し、デンプンの周辺により高い疎水性の環境を生成することを示す。デンプンは、加水分解によって破壊されると、蛍光が指数関数的に低減する。この予想外の現象を使用して、酵素反応の進行を痕跡を残さずに追跡できる。アミラーゼによるデンプンの加水分解についての擬一次速度定数は、単一位相指数関数的減衰をデンプン／バッファ／エピココノンコントロールにフィッティングし、そして次いでこの値（ｋ１）を使用して、二位相指数関数的減衰をデンプン／アミラーゼ／エピココノン試料にフィッティングすることによって得た。ここで、第１の指数は、コントロールについて決定されたｋ１値に固定した。このとき、ｋ２値は、α−アミラーゼによるデンプンの加水分解についての擬一次速度定数である。この場合、その値は、トリトンＸ−１００の存在下で、０．５５分−１及び０．６５分−１である。完全な消化は、半減期の１０倍として決定できる。この場合、それぞれ、１２７及び１０７分である。
【０１１０】
例４：疎水的に活性なフルオロフォアを使用したタンパク質脱リン酸化のリアルタイムモニタリング
４．１  材料及び装置
これまでの例の通りであるが、以下の追加及び／又は置き換えを伴う。β−カゼイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃ６９０５）ビシンバッファ中に溶解されたアルカリ性ホスファターゼ（１０〜３０ＤＥＡ単位／ｍｇ  固体、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｐ７６４０）。濃度は、２ｍｇ／ｍＬ。ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ  Ｃ５−セラミド（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｄ３５２１）
【０１１１】
４．２  方法
４．２．１  ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ  Ｃ５−セラミドを使用したホスファターゼ活性のリアルタイムモニタリング
１．  β−カゼイン（β−ＣＮ）を５０ｍＭビシンバッファ中１ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した（ｐＨ７．５）。
２．  １００μｌの試料（ステップ１）をマイクロタイタープレートに加えた。コントロールは、ビシンに基づく消化バッファ、アルカリ性ホスファターゼ試料だけ、及び天然のβ−ＣＮ試料（ホスファターゼなし）を含んだ。
３．  ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ  Ｃ５−セラミドストック溶液を５０ｍＭビシン中で１００倍に希釈した。１００μｌの希釈フルオロフォア溶液を各穴に加えた。試料を３０℃で５０分間インキュベートした。ＦｌｕｏＳｔａｒは、適切な設定条件を得るために約１分かかった。
４．  ビシンバッファ中で再調製された２μＬのホスファターゼを１つのβ−ＣＮ試料、及び１つのコントロール（例えば、ビシンバッファ＋ホスファターゼ）に加えた。
５．  ＦｌｕｏＳｔａｒ（Ｅｘ／Ｅｍ＝４８５／５２０ｎｍ）を使用して、蛍光発色をリアルタイムに３分ごとに約３０分までモニタした。ＦｌｕｏＳｔａｒの設定は、以下のとおりであった。温度３０℃、１０フラッシュ／サイクル。
６．  進行曲線を、コントロールを引くことによってマイクロソフトのＥｘｃｅｌにおいて操作した。バッファ／色素をβ−ＣＮ／色素だけを含む試料から引き、及びホスファターゼ＋バッファ／色素をβ−ＣＮ／ホスファターゼ／色素試料から引いた。
７．  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  ｖ．４）を使用してデータをプロットした（図４を参照）。
【０１１２】
４．３  データ分析及び結果
この限定されない例において、どのようにフルオロフォアＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ  Ｃ５−セラミドを使用してβ−カゼイン（β−ＣＮ）のアルカリ性ホスファターゼ駆動加水分解をモニタできるかを示す。図４に、極性リン酸基の除去に関連して疎水性が増加することによるリンタンパク質の脱リン酸化のリアルタイムモニタリングを示す。ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ  Ｃ５−セラミドとカゼインとの会合から得られる正規化データを測定し、Ｐｒｉｓｍ（バージョン４．０．３、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、サンディエゴ、米国）を使用して単純一次指数関数的会合モデルにフィッティングした。得られた速度定数（ｋ１）を、アルカリ性ホスファターゼを用いたカゼインの二位相指数関数的増加における定数として使用して、脱リン酸化反応についての擬一次速度定数を得た。蛍光の増加は、リン酸基が除去されたことによる疎水性の増加の結果である（図４）。この場合、完全な加水分解は、４２分（１０×ｔ１／２）として計算できる。
【０１１３】
例５：フルオロフォアを使用したエステラーゼ活性のリアルタイムモニタリング
５．１  材料及び装置
これまでの例の通りであるが、以下の追加及び／又は置き換えを伴う。オリーブ油（ブランド名なし、Ｗｏｏｌｗｏｒｔｈｓ、オーストラリア）リパーゼ（５０ＫＬＵ／ｇ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ｇｒｅａｓｅｘ（登録商標）リパーゼ５−オクタデカノイルアミノフルオレセイン（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ７４７３５）
【０１１４】
５．２  方法
５．２．１  オリーブ油のリパーゼ触媒加水分解のリアルタイムモニタリング
１．  オリーブ油を１００ｍＭビシンバッファ中に５％の濃度となるように調製した。水／油懸濁液をＢｒａｎｓｏｎ  ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ（６０％パワーで２×１５秒）を使用して乳化した。
２．  １００μｌの試料（ステップ１）をマイクロタイタープレートに加えた。コントロールは、ビシンに基づく消化バッファ、リパーゼ試料だけ、及び天然のオリーブ油試料（リパーゼなし）を含んだ。
３．  ５−オクタデカノイルアミノフルオレセインストック溶液を１００ｍＭビシン中で１００倍に希釈した。１００μｌの希釈フルオロフォア溶液を各穴に加えた。
４．  試料を室温で５０分間インキュベートした。ＦｌｕｏＳｔａｒは、適切な設定条件を得るために約３０秒かかった。
５．  テストした種々の量のＧｒｅａｓｅｘ（登録商標）（リパーゼ）（０．０１、０．１、１及び１０μＬ）を油試料に加えた。
６．  ＦｌｕｏＳｔａｒ（Ｅｘ／Ｅｍ＝４８５／５２０ｎｍ）を使用して、蛍光発色をリアルタイムに３分ごとに約２００分までモニタした。ＦｌｕｏＳｔａｒの設定は、以下のとおりであった。温度３７℃、１０フラッシュ／サイクル。
７．  進行曲線を、コントロールを引くことによってマイクロソフトのＥｘｃｅｌにおいて操作した。バッファ／色素をオリーブ油／色素だけを含む試料から引き、及びＧｒｅａｓｅｘ＋バッファ／色素をオリーブ油／Ｇｒｅａｓｅｘ／色素試料から引いた。
８．  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  ｖ．４）を使用して正規化データをプロットした（図５を参照）。
【０１１５】
５．３  データ分析及び結果
この限定されない例において、どのように５−オクタデカノイルアミノフルオレセイン等の環境に感受性のあるフルオロフォアを使用して脂質等のエステルのリアルタイム加水分解を痕跡なしに追跡できるかを示す。この場合、市販のリパーゼによるオリーブ油の加水分解を示すが、当業者は、同じ又は同様のアッセイを使用して他のエステラーゼを用いた他のエステルの加水分解を追跡できることを理解し得る。図５に、５−オクタデカノイルアミノフルオレセインをレポータとして使用した、１穴当たり０．０１μＬのリパーゼＧｒｅａｓｅｘ（登録商標）によるオリーブ油の加水分解のリアルタイムモニタリングを示す。プログラムであるＰｒｉｓｍは、進行曲線を単一位相（オリーブ油＋バッファ＋色素）又は二位相（オリーブ油＋バッファ＋リパーゼ＋色素）指数関数的減衰のいずれかにフィッティング可能であり、かつ加水分解についての擬一次速度定数を決定可能であった（図５、挿入図）。
【０１１６】
観察された蛍光における指数関数的低減は、オリーブ油試料が元のエステルよりも極性の高い脂肪酸及びアルコールに加水分解される際の疎水性の喪失として合理的に説明できる。この例において、完全な加水分解は、半減期の１０倍（３２分）として推定でき、この発明の食品産業への有用性が明示される。
【０１１７】
例６．変性させない量の洗剤の存在下におけるエピココノンを使用したタンパク質分解のリアルタイムモニタリング
実験を行って、エピココノンを使用した非特異的プロテアーゼ（例えば、パパイン）によるタンパク質消化のリアルタイムモニタリングを研究した。
【０１１８】
６．１  材料及び装置
これまでの例の通りであるが、以下の追加及び／又は置き換えを伴う。タンパク質試料：ＢＳＡ（１００ｍＭビシン中１０ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ａ３０５９）、アポ−トランスフェリン（１００ｍＭビシン中１０ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｔ２０３６）、α−カゼイン（１００ｍＭビシン中１０ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃ６７８０）、及び炭酸脱水酵素（１００ｍＭビシン中１０ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃ７０２５）。ＳＤＳ（ＢＤＨ  ４４２４４４Ｈ）パパイン（ＲＯ水中２ｍｇ／ｍＬ  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｐ４７６２）ヨウ化アセタミド（１００ｍＭビシン中１Ｍ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  １６１２５）ＤＴＴ（１００ｍＭビシン中２００ｍＭ、ＢｉｏＲａｄ  １６１−０６１１）
【０１１９】
６．２  方法
６．２．１  エピココノンを使用したパパインを用いた異なるタンパク質の加水分解
６．２．１．１  消化のためのＢＳＡの調製
１  パパイン消化をビシンバッファ中で行った（ｐＨ７．０）。
２  タンパク質試料を１００ｍＭビシンバッファ中１０ｍｇ／ｍＬとなるように調製した。
３  １００μＬのタンパク質試料をパパイン消化のために使用した。
【０１２０】
６．２．１．２  還元及びアルキル化
１  １００μＬのタンパク質試料に１μＬの１０％ＳＤＳ及び５μＬのＤＴＴストックを８０℃で１０分間加えて還元した。
２  試料に４μＬのヨードアセタミドストックを室温で４５分〜１時間加えてアルキル化した。
３  試料に残存したヨードアセタミドに２０μＬのＤＴＴを室温で４５分〜１時間加えて中和した。
【０１２１】
６．２．２  洗剤の存在下においてフルオロフォアを用いたパパイン消化のリアルタイムモニタリング
１．  還元及び変性化タンパク質試料を１００ｍＭビシンバッファ中で１０倍に希釈した（２５μＬ＋２２５μＬのビシンバッファ）。
２．  １００μＬのＢＳＡ試料（ステップ１）を９６穴マイクロタイタープレートの１つの穴に加えた。コントロールは、ビシンに基づく消化バッファ、パパイン試料だけ、及び未消化試料（パパインなし）含んだ。アッセイは、エピココノンを使用したＢＳＡタンパク質分解の４穴試料セットからなる。３セットの試料を残りのタンパク質試料（例えば、アポ−トランスフェリン、α−カゼイン及び炭酸脱水酵素）について同じやり方で調製した。
３．  エピココノンを１００ｍＭビシン中で１００倍に希釈した（ｐＨ７．０）。
４．  １００μＬの作業用フルオロフォア溶液を各対応の穴に加えた。適切なＦｌｕｏＳｔａｒ設定条件を得るために約９０秒かかった。
５．  次いで、試料を５０分間３７℃でプレインキュベートした。
６．  タンパク質試料をアッセイにおいて４μＬのパパイン（＝０．２４８単位／μＬ）を用いて消化した。
７．  ＦｌｕｏＳｔａｒ（Ｅｘ／Ｅｍ＝５４０±１０／６３０±１０）を使用して、蛍光発色をリアルタイムに２分ごとに４００分までモニタした。
８．  進行曲線を、コントロールを引くことによってマイクロソフトのＥｘｃｅｌにおいて操作した。バッファ／色素をタンパク質／色素だけを含む試料から引き、及びパパイン＋バッファ／色素をタンパク質／パパイン／色素試料から引いた。
９．  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  ｖ．４）を使用して正規化データをプロット及びフィッティングした（図６を参照）。
【０１２２】
６．３  データ分析及び結果
この限定されない例において、エピココノンを使用して非特異的プロテアーゼ（パパイン）を用いたタンパク質分解を測定できることを示す。パパインは、システインプロテアーゼであるが、この方法はまた、セリンプロテアーゼ、カルボキシプロテアーゼ及びメタロプロテアーゼに適用可能である。パパインは、ほとんどのタンパク質試料を完全に消化するという広い特異性を有する（トリプシン又はキモトリプシンと異なる）。ここで、異なる性質を有するタンパク質の例としてＢＳＡ、カゼイン、アポ−トランスフェリン及び炭酸脱水酵素の加水分解を示す。それらの加水分解は、本発明によって追跡できる。図６Ｅは、パパインを用いて処理されたタンパク質の試料は、１２０分後には完全に消化されるが、他方パパインを用いて処理されなかったタンパク質は、それぞれのタンパク質の分子量に対応するバンドを示すことを示す。いくつかの場合、消化後に残存するいくつかのより大きなペプチドフラグメントも存在し、それらはさらなる加水分解に抵抗する。
【０１２３】
図６Ａ〜Ｄは、タンパク質消化を痕跡を残さずにかつリアルタイムに追跡するための、フルオロフォアであるエピココノンを使用し本発明を用いて生成された進行曲線を示す。各場合に、フルオロフォア（正方形）を用いたタンパク質を単一位相指数関数的減衰（Ｙ＝ｓｐａｎ＊ｅｘｐ（−ｋＸ）＋ｐｌａｔｅａｕ）にフィッティングし、及びｋについての値をタンパク質＋パパイン（三角形）についての二位相指数関数的減衰（Ｙ＝ｓｐａｎ１＊ｅｘｐ（−ｋ１Ｘ）＋ｓｐａｎ２＊ｅｘｐ（−ｋ２Ｘ）＋ｐｌａｔｅａｕ）におけるｋ１に対する固定値として使用した。動態データから、完全な消化に必要な時間（例えば、異なるタンパク質についての半減期の１０倍）を予測することが可能であり得る（各タンパク質に対する半減期についての挿入図を参照）。観察された蛍光における指数関数的低減は、タンパク質試料が元のタンパク質よりもはるかに疎水性の低いペプチドフラグメントに加水分解される際の疎水性の喪失として合理的に説明できる。
【０１２４】
例７．変性させない量の洗剤の存在下において異なるフルオロフォアを使用したタンパク質分解のリアルタイムモニタリング
７．１  材料及び装置
これまでの例の通りであるが、以下の追加及び／又は置き換えを伴う。ＢＳＡ（１００ｍＭビシン中１０ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ａ３０５９）トリプシン（２０μｇ／２０μＬ  １ｍＭ  ＨＣｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｔ６５６７）パパイン（ＲＯ水中２ｍｇ／ｍＬ  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｐ４７６２）ＳＤＳ（ＢＤＨ  ４４２４４４Ｈ）ヨウ化アセタミド（１００ｍＭビシン中１Ｍ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  １６１２５）ＤＴＴ（１００ｍＭビシン中２００ｍＭ、ＢｉｏＲａｄ  １６１−０６１１）９６穴透明底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、６５５０９６）ＳＹＰＲＯオレンジ（×５０００濃縮、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓ−６６５０）ナイルレッド（エタノール中１ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｎ−３０１３）ＡＮＳ（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ａ１０２８）
【０１２５】
７．２  方法
７．２．１  エピココノン、ＳＹＰＲＯオレンジ、ナイルレッド及びアニリノナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）を使用したトリプシン及びパパインを用いたタンパク質の加水分解
７．２．１．１  消化のためのＢＳＡの調製
１  トリプシン及びパパイン消化をビシンバッファ中でそれぞれｐＨ８．４及びｐＨ７．０で行った。
２  ＢＳＡを１００ｍＭビシンバッファ中で１０ｍｇ／ｍＬとなるように調製した。
３  １００μＬのＢＳＡ試料をトリプシン及びパパイン消化のために使用した。
【０１２６】
７．２．１．２  還元及びアルキル化
ＢＳＡ試料をこれまでに記載したように還元及びアルキル化した（セクション６．２．１．２）。
７．２．２  洗剤の存在下においてフルオロフォアを用いたトリプシン消化のリアルタイムモニタリング
１．  還元及び変性化ＢＳＡ試料を１００ｍＭビシンバッファ中で１０倍に希釈した（２５μＬ＋２２５μＬのビシンバッファ）。
２．  １００μＬの試料（ステップ１）を９６穴マイクロタイタープレートの１つの穴に加えた。コントロールは、ビシンに基づく消化バッファ、トリプシン試料又はパパインだけ、及び未消化ＢＳＡ試料（トリプシンなし又はパパインなし）を含んだ。アッセイは、１つのフルオロフォア（例えば、ＳＹＰＲＯオレンジ）に対して４穴試料セットからなる。３セットの試料を残りのフルオロフォア（例えば、ナイルレッド、エピココノン及びＳＹＰＲＯオレンジ）について同じやり方で調製した。
３．  ＳＹＰＲＯオレンジストック溶液をビシンバッファ中で５０００倍に希釈した（ｐＨ８．４）。ナイルレッド及びエピココノンのストック溶液を１００ｍＭビシン中で１００倍に希釈した（ｐＨ８．５）。ＡＮＳをビシンバッファ中で１００倍に希釈した（ｐＨ７．０）。
４．  １００μＬの作業用フルオロフォア溶液（例えば、ＳＹＰＲＯオレンジ、ナイルレッド、エピココノン及びＡＮＳ）を各対応の穴に加えた。適切なＦｌｕｏＳｔａｒ設定条件を得るために、ナイルレッドについて約３０秒、ＳＹＰＲＯオレンジ及びＡＮＳについては９０秒かかった。
５．  次いで、試料を５０分間３７℃でプレインキュベートした。ａ）１ｍＭ  ＨＣｌ中で再調製されたトリプシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｔ６５６７）を消化されるべき試料に１：４０の比で加えた。同じ量の酵素をバッファ成分だけを含むコントロールに加えた。ｂ）４μＬのパパイン（２ｍｇ／ｍＬ）を消化されるべき試料に加えた。同じ量の酵素をバッファ成分だけを含むコントロールに加えた。
６．  ＳＹＰＲＯオレンジについてＦｌｕｏＳｔａｒ（Ｅｘ／Ｅｍ＝４８５／６００±１０）、エピココノン及びナイルレッドについて５４０±１０／６３０±１０、及びＡＮＳについて３５５／４６０を使用し、蛍光発色をリアルタイムに２分ごとに４００分までモニタした。ＦｌｕｏＳｔａｒの設定は、以下のとおりであった。温度３７℃、１０フラッシュ／サイクル。
７．  進行曲線を、コントロールを引くことによってマイクロソフトのＥｘｃｅｌにおいて操作した。バッファ／色素をタンパク質／色素だけを含む試料から引き、及び酵素＋バッファ／色素をタンパク質／酵素／色素試料から引いた。Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  ｖ．４）を使用して正規化データをプロット及びフィッティングした（図７を参照）。
【０１２７】
７．３  データ分析及び結果
図７に、４つの異なるフルオロフォアを使用したタンパク質分解（例えば、ＢＳＡ／トリプシン及びＢＳＡ／パパイン）のリアルタイムモニタリングを示す。本例におけるフルオロフォアをタンパク質における疎水性の元の状態（加水分解前）及びタンパク質における疎水性の後の状態（加水分解時）を測定する能力についてテストした。
【０１２８】
速度定数を得るためのＰｒｉｓｍ分析のために正規化データを使用した。各場合に、フルオロフォアを用いたタンパク質（白正方形）を単一位相指数関数的減衰（Ｙ＝ｓｐａｎ＊ｅｘｐ（−ｋＸ）＋ｐｌａｔｅａｕ）にフィッティングし、及びｋについての値をタンパク質＋パパイン（白三角形）についての二位相指数関数的減衰（Ｙ＝ｓｐａｎ１＊ｅｘｐ（−ｋ１Ｘ）＋ｓｐａｎ２＊ｅｘｐ（−ｋ２Ｘ）＋ｐｌａｔｅａｕ）におけるｋ１に対する固定値として使用した。この方法を介して、加水分解についての速度定数を測定し、そして完全な加水分解の時点を予測することが可能であった。図７Ｅは、実際のリアルタイム試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用した消化の独立した検証であり、異なるフルオロフォアの存在下にトリプシン又はパパインを用いたＢＳＡの完全な消化を示す。この図から明らかなように、タンパク質に対応づけられたバンドが１２０分後に消失し、かつ残留するパパイン又はトリプシンに対するかすかなバンドだけが見られた。いくつかの場合に、消化後に残存するいくつかのより大きなペプチドフラグメントも存在し、それらはさらなる加水分解に抵抗する。
【０１２９】
本発明を特定の例を参照して記載したが、本発明が多くの他の形態で実施されてもよいことが当業者には理解される。
【０１３０】
例８．環境に感受性のあるフルオロフォアを使用し、サブサンプリングによって加水分解活性をモニタする別の方法
８．１  材料及び装置
これまでの例の通りであるが、以下の追加及び／又は置き換えを伴う。エピココノン（１ｍｇ／ｍＬ  ２０％ＡＣＮ／８０％ＤＭＳＯ、Ｆｌｕｏｒｏｔｅｃｈｎｉｃｓ）タンパク質試料、ウシ血清アルブミン（Ａ−３０５９、Ｌｏｔ  ０８３Ｋ１２９１）及び炭酸脱水酵素（Ｃ−７０２５、Ｌｏｔ  ０９３Ｋ９３１０）ＳＤＳ（ＢＤＨ  ４４２４４４Ｈ）トリプシン（２０μｇ／２０μＬ  １ｍＭ  ＨＣｌ、Ｔ６５６７、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）ロイペプチン（Ｌ２８８４、Ｌｏｔ  ０６４Ｋ８６２８３、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）トリプシンインヒビタ（Ｔｙｐｅ  Ｈ−Ｓ、Ｔ９１２８、Ｌｏｔ  ０２５Ｋ７０１４）
【０１３１】
８．２  方法
１．  トリプシンインヒビタ、ロイペプチン及びトリプシン−インヒビタ（大豆）をそれぞれＲＯ水中１ｍＭ及びＲＯ水中０．４８ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した。
２．  タンパク質試料を例６に上記したように調製した。還元及びアルキル化タンパク質試料を１００ｍＭビシンバッファ中で１：１０に希釈した（ｐＨ８．４〜５）。
３．  トリプシン（４．６２μｇ）を各タンパク質試料（２３１μｇ／３００μＬ）に１：５０の比で加え、そして試料を３７℃でインキュベートした。
４．  ロイペプチン又はトリプシンインヒビタ（大豆）のいずれかによるトリプシン活性の阻害について副次試料を採取した。
ａ．４５μｌのトリプシン消化を０、１０、２０、３０、６０、６０、９０、及び１２０分にサブサンプリングし、そして直ちに５μＬの１ｍＭロイペプチンを含む１．５ｍＬチューブに加えた。ロイペプチンインヒビタを用いて処理した副次試料を蛍光が読み取れるまで室温で放置した。
ｂ．４５μＬのトリプシン消化を０、１０、２０、３０、６０、６０、９０、及び１２０分にサブサンプリングし、そして直ちに５μＬの大豆トリプシンインヒビタを含む１．５ｍＬチューブに加えた。大豆トリプシンインヒビタを用いて処理した副次試料を蛍光が読み取れるまで室温で放置した。
５．  ロイペプチンインヒビタに対するコントロールは、ビシンバッファだけ、及びトリプシン又はトリプシン＋ロイペプチンを含むビシンバッファを含んだ。また、トリプシンインヒビタ（大豆）に対するコントロールは、ビシンバッファだけ、トリプシン又はトリプシン＋大豆トリプシンインヒビタを含んだビシンバッファを含んだ。
６．  エピココノン溶液を１００ｍＭビシン中に１：１００に希釈することによって調製した（ｐＨ８．４〜８．５）。
７．  上記のように調製した副次試料（４０μＬ）を９６穴プレートに加えた。等しい体積のエピココノン溶液をその９６穴プレートに加えた。プレートをＦｌｕｏＳｔａｒに挿入し、そして５０分間３７℃でインキュベートした。
８．  副次試料の蛍光をＥｘ／Ｅｍ＝５４０−１０／６３０−１０ｎｍで１０回のフラッシュを行って読み取った。
９．  蛍光値を対応するコントロールの基礎蛍光を副次試料の生蛍光から引いて正規化した。
１０．  正規化データをプロットした（図８を参照）。
【０１３２】
８．３  データ分析及び結果
図８は、種々の時点でサブサンプリングされたＢＳＡ及びＣＡのトリプシン消化の蛍光減衰を示す。各副次試料において、トリプシン活性は、ロイペプチン（Ａ）又は大豆トリプシンインヒビタ（Ｂ）のいずれかによって阻害された。この別の方法をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又は炭酸脱水酵素（ＣＡ）のトリプシン消化のモニタリングに対する適用可能性についてテストしたところ、リアルタイムアッセイ（例えば、例６）から生成される結果と比較して同様の蛍光減衰結果が生成された。
【０１３３】
本方法におけるＢＳＡ及びＣＡ両方の消化速度は、リアルタイムアッセイの消化速度よりも若干速いように見えた。これは、インヒビタによるトリプシンの完全な阻害が有効となるのに要する時間によるものか、又はトリプシン消化がフルオロフォアの存在しない場合に若干速く進むことによる可能性があり得る。
【０１３４】
本発明の別の実施形態は、色素を存在させずに加水分解消化を実行することである。この例において、２つのタンパク質のトリプシン消化は、プロテアーゼインヒビタを用いた消化をサブサンプリングし、停止し、次いで色素を加え、そして蛍光を測定することによって追跡できる。トリプシンの阻害が時間依存性であり、かつ完全でないこともあることを考慮すると、ＢＳＡの消化について測定された擬一次速度定数（０．３分−１）は、例７の方法によって見られた擬一次速度定数（０．１〜０．２分−１）と同様であった。
【０１３５】
例９：蛍光レポータ色素を使用した複雑なプロテオームにおける加水分解活性のリアルタイムモニタリング
９．１  材料及び装置
例７の通り。圧搾パン酵母（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｇｅｎ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ、オーストラリア）ＮａＯＨ（１Ｍ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ４８０８７８）ＦｌｕｏｒｏＰｒｏｆｉｌｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＦＰ００１０）
【０１３６】
９．２  方法
９．２．１  酵母の調製
１  小さなペレットの圧搾パン酵母（１００ｍｇ）をトリプシン消化のために使用した。
２  ペレットを２ｍＬの１Ｍ  ＮａＯＨ中に懸濁した。次いで、試料を２１００×ｇで１０分間遠心分離した。
３  １アリコートの上清をＲＯ水中で５倍に希釈し、ＮａＯＨ濃度を２００ｍＭに低減した。
４  ＦｌｕｏｒＰｒｏｆｉＬｅキットを使用することによって、タンパク質含有量は、１．３ｍｇ／ｍＬであると測定された。
５  少量アリコートのタンパク質抽出物（１５μＬ）を８５μＬのビシンバッファ（５０ｍＭ、ｐＨ８．５）と混合した。
６  １００μｌの最終酵母試料をトリプシン消化のために使用した。
【０１３７】
９．２．２  エピココノンを使用した酵母プロテオームのトリプシン消化のリアルタイムモニタリング
１  １００μｌの最終酵母試料をマイクロタイタープレート穴に加えた。コントロールは、ビシンに基づく消化バッファ、トリプシン試料だけ、及び未消化酵母試料（トリプシンなし）．含んだ。
３  エピココノンストック溶液を５０ｍＭビシン中で１００倍に希釈した。１００μｌの希釈エピココノン溶液を各穴に加え、４−穴アッセイを作成した。ＦｌｕｏＳｔａｒは、適切な設定条件を得るために約３０秒かかった。
４  １ｍＭ  ＨＣｌ中で再調製されたトリプシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｔ６５６７）を１：２０の比で加えた。
５  ＦｌｕｏＳｔａｒ（Ｅｘ／Ｅｍ＝５４０±１０／６３０±１０ｎｍ）を使用して、蛍光発色をリアルタイムに２分ごとに４００分までモニタした。ＦｌｕｏＳｔａｒの設定は、以下のとおりであった。温度３７℃、１０フラッシュ／サイクル。
６  進行曲線を、コントロールを引くことによってマイクロソフトのＥｘｃｅｌにおいて操作した。ビシンバッファをタンパク質だけを含む試料から引き、及びトリプシン＋バッファをタンパク質／トリプシン試料から引いた。
７  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  ｖ．４）を使用して正規化データをプロットした（図１３を参照）。エピココノンを用いた酵母プロテオームについての進行曲線を二位相指数関数的会合／解離（Ｙ＝Ｙｍａｘ＊（１−ｅｘｐ（−ｋ１＊Ｘ））＋ｓｐａｎ＊（ｅｘｐ（−ｋ２＊Ｘ））−ｂｏｔｔｏｍ）にフィッティングして、ｋ１（会合定数）及びｋ２（解離定数）についての値を導出した。これらの値を使用して、酵母プロテオームのトリプシン消化を三位相指数関数にフィッティングして、ｋ３についての値を導出した。ここで、ｋ１及びｋ２は、等式Ｙ＝ｓｐａｎ１＊（１−ｅｘｐ（−ｋ１＊Ｘ））＋ｓｐａｎ２＊（ｅｘｐ（−ｋ２＊Ｘ））＋ｓｐａｎ３ｅｘｐ（−ｋ３＊Ｘ）−ｂｏｔｔｏｍ）において、上記に見出された値に固定された。
【０１３８】
９．３  データ分析及び結果
この例は、複雑なタンパク質混合物（例えば、酵母プロテオームがあるが、これに限定されない）における加水分解活性をモニタするための方法の有用性を示す。図９は、疎水的に活性な色素のエピココノン及び洗剤のＳＤＳを使用して、タンパク質が加水分解される際の蛍光の低減を介して消化を追跡した、酵母プロテオームのトリプシン消化のリアルタイムモニタリングを示す。対照的に、エピココノを用いたがトリプシンを用いない酵母プロテオームの試料の結果は、まずエピココノンとタンパク質との時間依存性会合による蛍光の増加、そして次いでフルオロフォア及び／又はフルオロフォア−タンパク質付加物の光退色及び／又は分解によるゆっくりとした指数関数的低減であった。これは、二位相指数関数的会合／解離にモデル化して、これらのプロセスについて擬一次速度定数を得ることができる。次いで、これらの値を使用し、非線形回帰によって複雑な混合物の加水分解についての擬一次速度定数を決定できる。二位相指数関数的会合／解離（黒正方形）の非線形フィッティングからの残差は、レポータ色素とプロテオームとの会合についての実験データと理論とが良好にフィットすることを示す。同様に、三位相指数関数の残差は、複雑なプロテオームの加水分解について決定された擬一次速度定数（ｋ３）が正確に決定されることを示す、等しく良好なフィット（黒丸）を示す。
【０１３９】
例１０．洗剤有及び無のフルオロフォアを使用したタンパク質分解のリアルタイムモニタリングこの例は、加水分解のリアルタイムモニタリングの関連において、疎水的に活性な色素の蛍光出力に対する洗剤の効果に関する。
【０１４０】
１０．１  材料及び装置
例６の通り。
【０１４１】
１０．２  方法
１０．２．１  ＳＤＳ有及び無のエピココノンを使用した炭酸脱水酵素（ＣＡ）の加水分解
１０．２．１．１  消化のためのＢＳＡの調製
１  トリプシン消化をビシンバッファ中で行った（ｐＨ８．４）。
２  タンパク質試料を１００ｍＭビシンバッファ中１０ｍｇ／ｍＬで調製した。
３  １００μＬのタンパク質試料をトリプシン消化のために使用した。
【０１４２】
１０．２．１．２  還元及びアルキル化
４．  １００μＬのタンパク質試料に１μＬの１０％ＳＤＳ及び５μＬのＤＴＴストックを８０℃で１０分間加えて還元した。
５．  別の試料を５μＬのＤＴＴストックだけを８０℃で１０分間用いて還元した（ＳＤＳなし）。
３  試料に４μＬのヨードアセタミドストックを室温で４５分〜１時間加えてアルキル化した。
４  試料に残存するヨードアセタミドに２０μＬのＤＴＴを室温で４５分〜１時間加えて中和した。
【０１４３】
１０．２．２  洗剤の存在下及び非存在下におけるフルオロフォアを用いたトリプシン消化のリアルタイムモニタリング
１０．  還元及び変性化タンパク質試料を１００ｍＭビシンバッファ中で１０倍に希釈した（２５μＬ＋２２５μＬのビシンバッファ）。
１１．  １００μＬのＣＡ試料（ステップ１）を９６穴マイクロタイタープレートの１つの穴に加えた。コントロールは、ビシンに基づく消化バッファ、パパイン試料だけ、及び未消化試料（パパインなし）含んだ。アッセイは、エピココノンを使用したＣＡタンパク質分解についての４穴試料セットからなる。
１２．  エピココノンを１００ｍＭビシン中で１００倍に希釈した（ｐＨ８．４）。
１３．  １００μＬの作業用フルオロフォア溶液を各対応の穴に加えた。適切なＦｌｕｏＳｔａｒ設定条件を得るために約９０秒かかった。
１４．  タンパク質試料をアッセイにおいて４μＬのトリプシン溶液を用いて消化した。
１５．  ＦｌｕｏＳｔａｒ（Ｅｘ／Ｅｍ＝５４０±１０／６３０±１０）を使用して、蛍光発色をリアルタイムに２分ごとに４００分までモニタした。
１６．  進行曲線を、コントロールを引くことによってマイクロソフトのＥｘｃｅｌにおいて操作した。バッファ／色素をタンパク質／色素だけを含む試料から引き、及びパパイン＋バッファ／色素をタンパク質／パパイン／色素試料から引いた。
１７．  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  ｖ．４）を使用して正規化データをプロット及びフィッティングした（図６を参照）。
【０１４４】
１０．３  データ分析及び結果
進行曲線を例６の通りにフィッティングした（図１０）。変性させない量の洗剤の存在下に（白正方形）、炭酸脱水酵素（ＣＡ）は、より疎水性が高くなり、かつ環境に感受性のあるフルオロフォア（エピココノン等）にさらされた場合に蛍光が増加する。トリプシンを加えた際に、蛍光が例６の通りに降下するが、ＳＤＳなし（逆三角形）の試料において、蛍光の変化は、ＳＤＳが存在する場合（白丸）に比べて５０％より大きく低減される。両方の場合において、観察された速度定数は、同様であるが（０．０２５分−１）、ＳＤＳなしの試料についての９５％信頼区間は、はるかにより高くなる。なぜなら、信号がはるかにより低いためである。この例は、疎水的に活性なフルオロフォアによる加水分解活性のリアルタイムモニタリングにおいて少量の洗剤が重要であることが明示する。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】本発明による消化の検証を示す図である。
【図２】本発明による加水分解反応速度を示す図である。
【図３】本発明による加水分解反応速度を示す図である。
【図４】本発明による脱リン酸化反応速度を示す図である。
【図５】本発明による加水分解反応速度を示す図である。
【図６】本発明によるタンパク質消化反応速度を示す図である。
【図７】本発明によるＢＳＡ加水分解反応速度を示す図である。
【図８】本発明によるトリプシン消化反応速度を示す図である。
【図９】本発明によるトリプシン消化反応速度を示す図である。
【図１０】本発明によるトリプシン消化反応速度を示す図である。
【図１１】本発明によるトリプシン消化を示す図である。
【図１２】本発明によるトリプシン消化ゲル電気泳動を示す図である。
【図１３】図１２に示すサンプルのゲート領域から測定した総蛍光強度を示す図である。
【図１４】図１１からの生データの反応速度分析を示す図である。
【図１５】ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるトリプシン消化ゲル電気泳動を示す図である。
【図１６】キモトリプシン動態を示す図である。
【図１７】トリプシン動態を示す図である。
【図１８】トリプシン動態を示す図である。
【図１９】ＦｌｕｏｒｏＰｒｏｆｉｌｅアッセイを示す図である。
【図２０】４倍希釈系に対する蛍光を示す図である。
【図２１】蛍光対既知ＢＳＡ濃度を示す図である。
【図２２】ＢＳＡ標準曲線（Ａ）及びアプロチニン標準曲線（Ｂ）を示す図である。
【図２３】ナイルレッド、疎水環境下で蛍光を増すその他の色素を用いた後続トリプシン消化を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
2009514510.tif 000031
2009514510.tif 000032
2009514510.tif 000033