(57)【要約】  活性部位領域へのヌクレオチドアナログ導入を改善し、活性部位領域でヌクレオチドアナログと配位するための特徴をもつポリメラーゼを含有する組成物を提供する。前記ポリメラーゼの作製方法、シーケンシングとＤＮＡ複製及び増幅における前記ポリメラーゼの使用方法、ポリメラーゼ活性の反応速度モデル、並びに前記モデルを使用するコンピューター実施方法も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えＤＮＡポリメラーゼを含有する組成物であって、組換えＤＮＡポリメラーゼが野生型ＤＮＡポリメラーゼの野生型活性部位領域に相同の改変活性部位領域を含み、改変活性部位領域が改変活性部位領域へのヌクレオチドアナログ導入の立体妨害を軽減するか又はヌクレオチドアナログの１種以上の非天然特徴に相補的である１種以上の構造改変を野生型活性部位領域に対して含み、ヌクレオチドアナログに対する組換えＤＮＡポリメラーゼの特性が野生型ポリメラーゼに比較して改変されている前記組成物。
【請求項２】
組換えＤＮＡポリメラーゼがΦ２９ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ欠損Ｔａｑポリメラーゼ、ＤＮＡ  Ｐｏｌ  Ｉポリメラーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｔ５ポリメラーゼ、ＲＢ６９ポリメラーゼ、Ｔ５ポリメラーゼ又はＤＮＡ  Ｐｏｌ  Ｉポリメラーゼのクレノウフラグメントに対応するフラグメントに相同である請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
組換えＤＮＡポリメラーゼが野生型又はエキソヌクレアーゼ欠損Φ２９ＤＮＡポリメラーゼに相同である請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
組換えＤＮＡポリメラーゼがΦ２９、Ｂ１０３、ＧＡ−１、ＰＺＡ、Φ１５、ＢＳ３２、Ｍ２Ｙ、Ｎｆ、Ｇ１、Ｃｐ−１、ＰＲＤ１、ＰＺＥ、ＳＦ５、Ｃｐ−５、Ｃｐ−７、ＰＲ４、ＰＲ５、ＰＲ７２２、又はＬ１７に相同である請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
組換えＤＮＡポリメラーゼがその活性部位内又はその近位に野生型又はエキソヌクレアーゼ欠損Φ２９ＤＮＡポリメラーゼに対して残基５０５−５２５の欠失、残基５０５−５２５内の欠失、Ｋ１３５Ａ突然変異、Ｅ３７５Ｈ突然変異、Ｅ３７５Ｓ突然変異、Ｅ３７５Ｋ突然変異、Ｅ３７５Ｒ突然変異、Ｅ３７５Ａ突然変異、Ｅ３７５Ｑ突然変異、Ｅ３７５Ｗ突然変異、Ｅ３７５Ｙ突然変異、Ｅ３７５Ｆ突然変異、Ｅ４８６Ａ突然変異、Ｅ４８６Ｄ突然変異、Ｋ５１２Ａ突然変異及びその組み合わせから選択される構造改変を含む請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
組換えＤＮＡポリメラーゼが更にＬ３８４Ｒ突然変異を含む請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
組換えＤＮＡポリメラーゼが更に表８から選択される別の突然変異又は突然変異組み合わせを含む請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
組換えＤＮＡポリメラーゼが野生型ポリメラーゼに対して組換えポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を低下させる構造改変を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
ポリメラーゼがΦ２９ＤＮＡポリメラーゼに相同であり、構造改変がエキソヌクレアーゼ活性を低下させるアミノ酸欠失又は改変である請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
改変が野生型Φ２９ＤＮＡポリメラーゼに対するＮ６２の突然変異に対応する請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
組換えＤＮＡポリメラーゼが１個以上の外来アフィニティータグ配列を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
アフィニティータグ配列が６Ｈｉｓタグ配列、ＧＳＴタグ、ＨＡタグ配列、複数の６Ｈｉｓタグ配列、複数のＧＳＴタグ、複数のＨＡタグ配列及びその組み合わせから選択される請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
組換えＤＮＡポリメラーゼが表３から選択される請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
ヌクレオチドアナログを含有する請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
ヌクレオチドアナログがフルオロフォア又は色素部分を含む請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
ヌクレオチドアナログがリン酸標識ヌクレオチドアナログである請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
ヌクレオチドアナログがモノデオキシ又はジデオキシヌクレオチドアナログである請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
ヌクレオチドアナログが３〜６個のリン酸基をもつ標識ヌクレオチドアナログである請求項１４に記載の組成物。
【請求項１９】
ヌクレオチドアナログが三リン酸塩、四リン酸塩、五リン酸塩又は六リン酸塩である請求項１４に記載の組成物。
【請求項２０】
構造改変がヌクレオチドアナログのリン酸残基と結合する正電荷アミノ酸残基の付加を含む請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
改変特性がＫｍ、ｋｃａｔ、Ｖｍａｘ、ヌクレオチドアナログの存在下における組換えポリメラーゼプロセッシビティ、ヌクレオチドアナログの存在下における組換えポリメラーゼによる平均鋳型読み取り長、ヌクレオチドアナログに対する組換えポリメラーゼの特異性、ヌクレオチドアナログの結合速度、産物放出速度、及び分岐速度から選択される請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
改変特性がヌクレオチドアナログに対するＫｍの低下を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
改変特性がヌクレオチドアナログに対するｋｃａｔ／Ｋｍ又はＶｍａｘ／Ｋｍの増加を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項２４】
天然ヌクレオチドに対する組換えポリメラーゼの比活性が野生型ポリメラーゼよりも少なくとも約５％高く、鋳型の存在下におけるプロセッシビティが天然ヌクレオチドの存在下における野生型ポリメラーゼよりも少なくとも５％高い請求項１に記載の組成物。
【請求項２５】
天然ヌクレオチドに対する組換えポリメラーゼのｋｃａｔ／Ｋｍ又はＶｍａｘ／Ｋｍが野生型ポリメラーゼよりも少なくとも約５％高い請求項１に記載の組成物。
【請求項２６】
天然ヌクレオチドに対する組換えポリメラーゼのｋｃａｔ／Ｋｍ又はＶｍａｘ／Ｋｍが野生型ポリメラーゼよりも少なくとも約２５％高い請求項１に記載の組成物。
【請求項２７】
ヌクレオチドアナログとＤＮＡ鋳型を含有しており、組換えポリメラーゼが鋳型ＤＮＡに応答してヌクレオチドアナログをコピー核酸に組込む請求項１に記載の組成物。
【請求項２８】
鋳型が環状鋳型である請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
組成物がＤＮＡシーケンシングシステムに存在している請求項１に記載の組成物。
【請求項３０】
シーケンシングシステムがゼロモード導波管を含む請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
ＤＮＡの作製方法であって、
鋳型と、鋳型と複合体化又は一体化する複製開始部分と、鋳型依存的ポリメラーゼ反応で前記部分を使用して鋳型の少なくとも一部を複製することが可能なポリメラーゼと、アナログヌクレオチドを含む１個以上のヌクレオチドを含有する反応混合物を準備する段階（なお、前記組換えＤＮＡポリメラーゼは野生型ＤＮＡポリメラーゼの野生型活性部位領域に相同の改変活性部位を含み、改変活性部位は改変活性部位領域へのヌクレオチドアナログ導入の立体妨害を軽減するか又はヌクレオチドアナログの１種以上の非天然特徴に相補的である１種以上の構造改変を野生型活性部位に対して含む）と；
組換えポリメラーゼが鋳型の少なくとも一部を鋳型依存的に複製するように混合物を反応させる段階を含む前記方法。
【請求項３２】
ＤＮＡの作製方法であって、
鋳型と、鋳型と複合体化又は一体化する複製開始部分と、鋳型依存的ポリメラーゼ反応で前記部分を使用して鋳型の少なくとも一部を複製することが可能なポリメラーゼと、リン酸標識アナログヌクレオチドを含む１個以上のヌクレオチドを含有する反応混合物を準備する段階（なお、ヌクレオチドアナログに対する組換えポリメラーゼのＫｍ値はヌクレオチドアナログに対する対応する相同野生型ポリメラーゼのＫｍよりも小さい）と；
ポリメラーゼが鋳型の少なくとも一部を鋳型依存的に複製するように混合物を反応させることにより、得られるＤＮＡに少なくとも１個のヌクレオチドアナログ残基を組込む段階を含む前記方法。
【請求項３３】
ＤＮＡの作製方法であって、
鋳型と、鋳型と複合体化又は一体化する複製開始部分と、鋳型依存的ポリメラーゼ反応で前記部分を使用して鋳型の少なくとも一部を複製することが可能なポリメラーゼと、リン酸標識アナログヌクレオチドを含む１個以上のヌクレオチドを含有する反応混合物を準備する段階（なお、前記ポリメラーゼはΦ２９ＤＮＡポリメラーゼに相同であり、Ａ４８８ｄＣ４Ｐ、Ａ５６８ｄＣ４Ｐ又は両者に対するＫｍはＡ４８８ｄＣ４Ｐ、Ａ５６８ｄＣ４Ｐ又は両者に対するＧＳＴ−Ｎ６２Ｄ  Φ２９ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体のＫｍの約７５％未満である）と；
ポリメラーゼが鋳型の少なくとも一部を複製するように混合物を反応させる段階を含む前記方法。
【請求項３４】
複製開始部分がオリゴヌクレオチドプライマー、鋳型における自己相補性領域、又は鋳型と結合するポリペプチドを含む請求項３１、３２又は３３に記載の方法。
【請求項３５】
アナログに対するポリメラーゼのＫｍが対応する野生型ポリメラーゼのＫｍの約７５％未満である請求項３１、３２又は３３に記載の方法。
【請求項３６】
アナログに対するポリメラーゼのＫｍが対応する野生型ポリメラーゼのＫｍの約４０％未満である請求項３１、３２又は３３に記載の方法。
【請求項３７】
アナログに対するポリメラーゼのＫｍが対応する野生型ポリメラーゼのＫｍの約１５％未満である請求項３１、３２又は３３に記載の方法。
【請求項３８】
ヌクレオチドアナログに対するポリメラーゼのｋｃａｔ／Ｋｍ又はＶｍａｘ／Ｋｍがヌクレオチドアナログに対する野生型Φ２９のｋｃａｔ／Ｋｍ又はＶｍａｘ／Ｋｍよりも高い請求項３１、３２又は３３に記載の方法。
【請求項３９】
ポリメラーゼが野生型Φ２９ＤＮＡポリメラーゼに対して残基５０５−５２５の欠失、残基５０５−５２５内の欠失、Ｋ１３５Ａ突然変異、Ｅ３７５Ｈ突然変異、Ｅ３７５Ｓ突然変異、Ｅ３７５Ｋ突然変異、Ｅ３７５Ｒ突然変異、Ｅ３７５Ａ突然変異、Ｅ３７５Ｑ突然変異、Ｅ３７５Ｗ突然変異、Ｅ３７５Ｙ突然変異、Ｅ３７５Ｆ突然変異、Ｅ４８６Ａ突然変異、Ｅ４８６Ｄ突然変異、Ｋ５１２Ａ突然変異、及びその組み合わせから選択される構造改変を含む組換えＤＮＡポリメラーゼである請求項３１、３２又は３３に記載の方法。
【請求項４０】
組換えＤＮＡポリメラーゼの作製方法であって、
第１のポリメラーゼを構造的にモデル化する段階と；
活性部位へのヌクレオチド接近に影響を与える１種以上の立体妨害特徴又は活性部位におけるヌクレオチドアナログの相補性特徴を同定する段階と；
少なくとも１種の立体妨害特徴を軽減もしくは排除するか又は少なくとも１種のヌクレオチドアナログ相補性特徴を付加するように第１のＤＮＡポリメラーゼを突然変異させる段階と；
得られる組換えポリメラーゼのヌクレオチドアナログに対する活性が第１のＤＮＡポリメラーゼに比較して改変されているか否かを試験する段階を含む前記方法。
【請求項４１】
ヌクレオチドアナログに対する組換えＤＮＡポリメラーゼのｋｃａｔ、Ｋｍ、Ｖｍａｘ、又はｋｃａｔ／Ｋｍを測定する段階を含む請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
天然ヌクレオチドに対する組換えＤＮＡポリメラーゼのｋｃａｔ、Ｋｍ、Ｖｍａｘ、又はｋｃａｔ／Ｋｍを測定する段階を含む請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
組換えＤＮＡポリメラーゼのライブラリーを作製する段階を含み、ライブラリーの複数のメンバーが１種以上の立体妨害特徴突然変異又は相補性特徴突然変異を含む請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
改変活性を含む少なくとも１個のメンバーを同定するようにライブラリーをスクリーニングする段階を含む請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
鋳型重合反応中の離散時間ステップについて複数のポリメラーゼ状態遷移を定義する段階と；
状態間の複数の速度遷移速度を定義する段階と；
所与核酸鋳型配列、反応混合物中のヌクレオチド及びポリメラーゼ状態遷移に基づいて、可能な状態遷移の多次元確率行列を作成する段階と；
コンピューター読み取り可能な媒体に多次元確率行列を保存する段階を含むコンピューター実施方法。
【請求項４６】
ポリメラーゼ遷移状態がユーザー選択可能である請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
状態間の速度遷移速度がヌクレオチド濃度、鋳型配列及び鋳型に沿うポリメラーゼの位置により異なる請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
反応混合物中のヌクレオチドが１個以上のヌクレオチドアナログを含む請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
状態間の速度遷移速度がポリメラーゼによるヌクレオチドアナログの使用中のポリメラーゼの配座遷移速度を含み、前記速度が天然ヌクレオチドの配座遷移速度に等しくなるように設定される請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
多次元確率行列が鋳型配列、確率状態の標準化行列、及び反応混合物中のヌクレオチドに基づいて自動的に作成される請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
可能な全ワトソン・クリック塩基対が全状態遷移で等しいと仮定することにより確率行列を単純化する請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
確率行列の出力に基づいて、鋳型に沿うポリメラーゼの位置に起因する試薬濃度変化を考慮するために第２の試薬濃度行列を作成する請求項４５に記載の方法。
【請求項５３】
複数鋳型について確率行列をベクトル化する段階と、得られたベクトル化確率行列に多次元確率行列を乗じ、状態分布行列を得る段階を含む請求項４５に記載の方法。
【請求項５４】
鋳型配列内の反復配列を考慮するために確率行列の指数時間係数を定義する段階を含む請求項４５に記載の方法。
【請求項５５】
連続モデル又は計数モデルを使用してポリメラーゼヌクレオチドミスマッチ率を定義する段階を含む請求項４５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願とのクロスリファレンス）
本願は先行予備特許出願ＵＳＳＮ６０／７５３，６７０（出願日２００５年１２月２２日、発明の名称「ヌクレオチドアナログ組込み用ポリメラーゼ（ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥＳ  ＦＯＲ  ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ  ＡＮＡＬＯＧＵＥ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）」、発明者Ｄａｖｉｄ  Ｋ．Ｈａｎｚｅｌら）の優先権と特典を主張し、言及によりその開示内容全体を全目的で本明細書に組込む。
【０００２】
（連邦政府支援研究開発から創出された発明の権利に関する陳述）
本発明の一部はＮＨＧＲＩ助成番号Ｒ０１  ＨＧ００３７１０−０１として米国政府助成下に創出され、米国政府は本発明に所定の権利をもつことができる。
【０００３】
（発明の技術分野）
本発明は活性部位領域へのヌクレオチドアナログ導入を改善し、活性部位領域でヌクレオチドアナログと配位するための特徴をもつポリメラーゼに関する。前記ポリメラーゼの作製方法、シーケンシングとＤＮＡ複製及び増幅における前記ポリメラーゼの使用方法、ポリメラーゼ活性の反応速度モデル、並びに前記モデルを使用するコンピューター実施方法も記載する。
【背景技術】
【０００４】
ＤＮＡポリメラーゼは生体のゲノムを複製する。生物学におけるこの中心的役割に加え、ＤＮＡポリメラーゼはバイオテクノロジーの汎用ツールでもある。例えば、シーケンシング、核酸増幅、クローニング、蛋白工学、診断、分子医学及び他の多くの技術等の各種用途の中心的技術である逆転写、増幅、標識及びシーケンシングに広く使用されている。
【０００５】
ＤＮＡポリメラーゼはその重要性により広く研究されている。この研究は例えばポリメラーゼ間の系統発生関係、ポリメラーゼの構造、ポリメラーゼの構造−機能特徴、ＤＮＡ複製や他の基本生物学におけるポリメラーゼの役割、及びバイオテクノロジーにおけるＤＮＡポリメラーゼの使用方法に焦点を当てている。ポリメラーゼの概要については、例えばＨｕｂｓｃｈｅｒら（２００２）ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＤＮＡ  ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥＳ  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．７１：１３３−１６３；Ａｌｂａ（２００１）“Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｒｅｖｉｅｗ：Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ”Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２（１）：ｒｅｖｉｅｗｓ  ３００２．１−３００２．４；Ｓｔｅｉｔｚ（１９９９）“ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｏｍｍｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ”Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４：１７３９５−１７３９８及びＢｕｒｇｅｒｓら（２００１）“Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ：ｐｒｏｐｏｓａｌ  ｆｏｒ  ａ  ｒｅｖｉｓｅｄ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ”Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７６（４７）：４３４８７−９０参照。多くのポリメラーゼの結晶構造が解明されており、その多くは類似構造をもつ。多くのポリメラーゼの基本作用メカニズムが決定されている。
【０００６】
ＤＮＡテクノロジーの基本的利用はＤＮＡポリメラーゼにより生成されるＤＮＡを標識するための各種標識ストラテジーを必要とする。これはマイクロアレイテクノロジー、ＤＮＡシーケンシング、ＳＮＰ検出、クローニング、ＰＣＲ分析、及び他の多くの用途で有用である。標識は各種合成後ハイブリダイゼーション又は化学標識スキームで実施されることが多いが、ＤＮＡポリメラーゼは例えばニック翻訳、逆転写、ランダムプライミング、増幅、ポリメラーゼ連鎖反応等により各種用途で各種標識ヌクレオチドを直接組込むためにも使用されている。例えばＧｉｌｌｅｒら（２００３）“Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ．Ｉ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｒｏｕｐ−ｌａｂｅｌｅｄ  ２’−ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ−５’−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１（１０）：２６３０−２６３５；Ａｕｇｕｓｔｉｎら（２００１）“Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｔｏｗａｒｄｓ  ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｌａｂｅｌｅｄ  ＤＮＡ”Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８６：２８９−３０１；Ｔｏｎｏｎら（２０００）“Ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｋａｒｙｏｔｙｐｉｎｇ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｗｉｔｈ  ｌｏｃｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＦＩＳＨ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｓ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｓ”Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍ．Ｃａｎｃｅｒ  ２７：４１８−４２３；Ｚｈｕ  ａｎｄ  Ｗａｇｇｏｎｅｒ（１９９７）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｉｎｔｏ  ＤＮＡ  ｂｙ  ＰＣＲ．”Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２８：２０６−２１１．Ｙｕら（１９９４）“Ｃｙａｎｉｎｅ  ｄｙｅ  ｄＵＴＰ  ａｎａｌｏｇｓ  ｆｏｒ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｐｒｏｂｅｓ”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２２：３２２６−３２３２；Ｚｈｕら（１９９４）“Ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｌａｂｅｌｅｄ  ＤＮＡ  ｐｒｏｂｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｌｉｎｋｅｒｓ．”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：３４１８−３４２２；Ｒｉｅｄら（１９９２）“Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｖｅｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ＤＮＡ  ｐｒｏｂｅｓ  ｂｙ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１３８８−１３９２参照。
【０００７】
対応する野生型酵素に対して改変されたヌクレオチドアナログ組込み特性をもつＤＮＡポリメラーゼ突然変異体も同定されている。例えば、ＶｅｎｔＡ４８８ＬＤＮＡポリメラーゼは天然Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼよりも高い効率で所定の非標準ヌクレオチドを組込むことができる。Ｇａｒｄｎｅｒら（２００４）“Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９（１２），１１８３４−１１８４２；Ｇａｒｄｎｅｒ  ａｎｄ  Ｊａｃｋ  “Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｕｇａｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｎ  ａｒｃｈａｅｏｎ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２７（１２）２５４５−２５５３参照。この突然変異体における改変残基Ａ４８８は酵素のヌクレオチド結合部位と反対の方向を向いていると予想される。この位置の特異性低下パターンは置換アミノ酸側鎖の寸法とほぼ相関し、酵素による各種改変ヌクレオチド糖の組込みに影響を与える。
【非特許文献１】Ｈｕｂｓｃｈｅｒら（２００２）ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＤＮＡ  ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥＳ  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．７１：１３３−１６３
【非特許文献２】Ｓｔｅｉｔｚ（１９９９）“ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｏｍｍｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ”Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４：１７３９５−１７３９８
【非特許文献３】Ａｌｂａ（２００１）“Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｒｅｖｉｅｗ：Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ”Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２（１）：ｒｅｖｉｅｗｓ  ３００２．１−３００２．４
【非特許文献４】Ｂｕｒｇｅｒｓら（２００１）“Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ：ｐｒｏｐｏｓａｌ  ｆｏｒ  ａ  ｒｅｖｉｓｅｄ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ”Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７６（４７）：４３４８７−９０
【非特許文献５】Ｇｉｌｌｅｒら（２００３）“Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ．Ｉ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｒｏｕｐ−ｌａｂｅｌｅｄ  ２’−ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ−５’−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１（１０）：２６３０−２６３５
【非特許文献６】Ａｕｇｕｓｔｉｎら（２００１）“Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｔｏｗａｒｄｓ  ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｌａｂｅｌｅｄ  ＤＮＡ”Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８６：２８９−３０１
【非特許文献７】Ｔｏｎｏｎら（２０００）“Ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｋａｒｙｏｔｙｐｉｎｇ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｗｉｔｈ  ｌｏｃｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＦＩＳＨ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｓ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｓ”Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍ．Ｃａｎｃｅｒ  ２７：４１８−４２３
【非特許文献８】Ｚｈｕ  ａｎｄ  Ｗａｇｇｏｎｅｒ（１９９７）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｉｎｔｏ  ＤＮＡ  ｂｙ  ＰＣＲ．”Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２８：２０６−２１１
【非特許文献９】Ｙｕら（１９９４）“Ｃｙａｎｉｎｅ  ｄｙｅ  ｄＵＴＰ  ａｎａｌｏｇｓ  ｆｏｒ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｐｒｏｂｅｓ”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２２：３２２６−３２３２
【非特許文献１０】Ｚｈｕら（１９９４）“Ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｌａｂｅｌｅｄ  ＤＮＡ  ｐｒｏｂｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｌｉｎｋｅｒｓ．”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：３４１８−３４２２
【非特許文献１１】Ｒｉｅｄら（１９９２）“Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｖｅｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ＤＮＡ  ｐｒｏｂｅｓ  ｂｙ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１３８８−１３９２
【非特許文献１２】Ｇａｒｄｎｅｒら（２００４）“Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９（１２），１１８３４−１１８４２
【非特許文献１３】Ｇａｒｄｎｅｒ  ａｎｄ  Ｊａｃｋ  “Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｕｇａｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｎ  ａｒｃｈａｅｏｎ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２７（１２）２５４５−２５５３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
例えば核酸標識が所望される各種状況（例えばＤＮＡ増幅、シーケンシング、標識、検出、クローニング及び他の多くの状況）では、標識ヌクレオチドアナログに対するＤＮＡポリメラーゼの特異性、プロセッシビティ又は他の特徴を改善できることが非常に望ましい。本発明は標識ヌクレオチドアナログに対する特性を改変した新規ＤＮＡポリメラーゼ、前記ポリメラーゼの作製方法、前記ポリメラーゼの使用方法、及び以下の記載を精読することにより明らかになる他の多くの特徴を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明はＤＮＡ増幅中に成長中の鋳型コピーにリン酸アナログ等のヌクレオチドアナログを組込むポリメラーゼに関する。特定作用理論に結び付けるものではないが、これらのポリメラーゼは場合により活性部位へのアナログの立体導入妨害を軽減するため、及び／又はヌクレオチドアナログの１種以上の他の非天然特徴に対する相補性を提供するためにポリメラーゼの活性部位を変異させるように改変されている。このようなポリメラーゼは例えばポリメラーゼによるアナログ残基のＤＮＡ組込みを含む増幅又はシーケンシングプロトコールにおけるリアルタイム用途を含むＤＮＡ増幅及び／又はシーケンシング用途に特に好適である。組込まれるアナログ残基は例えばアナログのラベル又は他の部分が組込み中にポリメラーゼの作用により除去される場合には天然残基と同一とすることができるが、そうでない場合には、アナログ残基は天然ヌクレオチド残基と異なる１種以上の特徴をもつことができる。
【００１０】
従って、本発明は組換えＤＮＡポリメラーゼを含有する組成物に関する。組換えＤＮＡポリメラーゼは野生型ＤＮＡポリメラーゼの野生型活性部位領域と相同の改変活性部位領域を含む。改変活性部位領域は例えば天然ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログに対する酵素の所望活性を改善するように野生型活性部位領域に対して１種以上の構造改変を含む。所定側面では、特定作用理論に結び付けるものではないが、このような改変は改変活性部位領域への天然ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ導入の立体妨害を軽減するか、及び／又は活性部位領域を天然ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログの１種以上の非天然特徴に相補的にする改変を含む。組換えＤＮＡポリメラーゼはヌクレオチドアナログに対する特性が野生型ポリメラーゼに比較して改変されている。
【００１１】
場合により改変活性部位領域を含むように各種ＤＮＡポリメラーゼを改変する。例えば、組換えＤＮＡポリメラーゼは場合によりΦ２９ＤＮＡポリメラーゼ又はその突然変異体、Ｔａｑポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ欠損Ｔａｑポリメラーゼ、ＤＮＡ  Ｐｏｌ  Ｉポリメラーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ、ＲＢ６９ポリメラーゼ、Ｔ５ポリメラーゼ又はＤＮＡ  Ｐｏｌ  Ｉポリメラーゼのクレノウフラグメントに対応するポリメラーゼに相同である。例えば、組換えＤＮＡポリメラーゼは例えば米国特許第５，００１，０５０号、５，１９８，５４３号、又は５，５７６，２０４号に記載されているように野生型又はエキソヌクレアーゼ欠損Φ２９ＤＮＡポリメラーゼに相同とすることができる。同様に、組換えＤＮＡポリメラーゼはΦ２９、Ｂ１０３、ＧＡ−１、ＰＺＡ、Φ１５、ＢＳ３２、Ｍ２Ｙ、Ｎｆ、Ｇ１、Ｃｐ−１、ＰＲＤ１、ＰＺＥ、ＳＦ５、Ｃｐ−５、Ｃｐ−７、ＰＲ４、ＰＲ５、ＰＲ７２２、又はＬ１７等に相同とすることができる。命名法については、Ｍｅｉｊｅｒら（２００１）“Φ２９  Ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  Ｐｈａｇｅｓ”Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，６５（２）：２６１−２８７も参照。
【００１２】
改変活性部位領域は立体妨害を軽減するため及び／又は領域をヌクレオチドアナログの１種以上の非天然特徴に相補的にするための各種改変の任意のものを含むことができる。例えば、野生型Φ２９ＤＮＡポリメラーゼに対する活性部位内又はその近位の構造改変はΔ５０５−５２５欠失、Δ５０５−５２５内の欠失、Ｋ１３５Ａ突然変異、Ｌ３８４Ｒ突然変異と本明細書に記載する別の突然変異の組み合わせ（Ｌ３８４Ｒ突然変異が存在する場合には、一般にヌクレオチドアナログの導入の立体妨害を軽減する１種以上の他の突然変異との組み合わせとなる）、Ｅ３７５Ｈ突然変異、Ｅ３７５Ｓ突然変異、Ｅ３７５Ｋ突然変異、Ｅ３７５Ｒ突然変異、Ｅ３７５Ａ突然変異、Ｅ３７５Ｑ突然変異、Ｅ３７５Ｗ突然変異、Ｅ３７５Ｙ突然変異、Ｅ３７５Ｆ突然変異、Ｅ４８６Ａ突然変異、Ｅ４８６Ｄ突然変異、Ｋ５１２Ａ突然変異、及びその組み合わせから選択される。ポリメラーゼは表８に示す突然変異から選択される別の突然変異又は突然変異組み合わせも含むことができる。
【００１３】
ポリメラーゼは場合により更に内在エキソヌクレアーゼ活性を低下又は排除させるように野生型ポリメラーゼに対して１種以上の突然変異／欠失を含む。例えば、野生型Φ２９ＤＮＡポリメラーゼに対して、Ｎ６２は場合によりエキソヌクレアーゼ活性を低下させるように突然変異又は欠失しており、例えばポリメラーゼはＮ６２Ｄ突然変異を含むことができる。エキソヌクレアーゼ活性を低下させる他の代表的突然変異としては、Ｄ１２Ａ、Ｔ１５Ｉ、Ｅ１４Ｉ、及び／又はＤ６６Ａが挙げられ、従って、本発明のポリメラーゼは場合によりこれらの突然変異の１種以上を含む。
【００１４】
組換えＤＮＡポリメラーゼは場合により野生型又はヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼ等の対応するＤＮＡポリメラーゼに対して外来又は異種の他の特徴を含む。例えば、組換えポリメラーゼは場合により１種以上の外来アフィニティータグ（例えば６Ｈｉｓタグ配列、ＧＳＴタグ、ＨＡタグ配列、複数の６Ｈｉｓタグ配列、複数のＧＳＴタグ、複数のＨＡタグ配列、ＳＮＡＰタグ等の精製又は基質結合タグ）を含む。これらは蛋白質内の各種位置の任意のものに挿入することができるが、１個以上の末端（例えば蛋白質のＣ末端又はＮ末端）が好ましく、蛋白質の３Ｄ構造で活性部位に最も遠位の末端がより好ましい。
【００１５】
本発明の代表的ポリメラーゼとしては表３に示すものが挙げられる。
【００１６】
組成物は場合によりヌクレオチドアナログを含有する。代表的ヌクレオチドアナログとしてはフルオロフォア及び／又は色素部分を含むものが挙げられる。例えば、ヌクレオチドアナログは標識ヌクレオチド（例えば塩基、糖及び／又はリン酸で標識したヌクレオチド）とすることができる。アナログはモノデオキシ又はジデオキシヌクレオチドアナログとすることができる。
【００１７】
ヌクレオチドアナログの代表的な１分類はリン酸標識ヌクレオチドアナログであり、モノデオキシリン酸標識ヌクレオチドアナログ及び／又はジデオキシリン酸標識ヌクレオチドアナログが挙げられる。例えば、ヌクレオチドアナログは３〜６個のリン酸基をもつ標識ヌクレオチドアナログとすることができる（例えばヌクレオチドアナログは三リン酸塩、四リン酸塩、五リン酸塩又は六リン酸塩である）。
【００１８】
例えば、組成物は式：
【化１】
2009521227.tif 000002
の標識化合物を含有することができ、上記式中、Ｂはヌクレオ塩基であり（なお、Ｂは場合によりラベルを含む）；Ｓは糖部分、非環状部分又は炭素環部分から選択され（なお、Ｓは場合によりラベルを含む）；Ｌは非必須の検出可能なラベルであり；Ｒ１はＯ及びＳから選択され；Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は独立してＯ、ＮＨ、Ｓ、メチレン、置換メチレン、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（ＣＨ２）、ＣＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２、Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２Ｒ（式中、Ｒは４−ピリジン又は１−イミダゾールである）から選択され、但し、Ｒ４は更に、
【化２】
2009521227.tif 000003
及び
【化３】
2009521227.tif 000004
から選択してもよく；Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１１及びＲ１３が存在する場合には、各々独立してＯ、ＢＨ３、及びＳから選択され；Ｒ９、Ｒ１０及びＲ１２は独立してＯ、ＮＨ、Ｓ、メチレン、置換メチレン、ＣＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２、Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２Ｒ（式中、Ｒは４−ピリジン又は１−イミダゾールである）から選択される。場合により、例えばＲ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、Ｒ１０又はＲ１２の１個がＯ以外のものであり、例えばメチル等である場合には、ホスホン酸アナログをアナログとして利用してもよい。
【００１９】
組換えＤＮＡポリメラーゼは野生型ポリメラーゼに比較してヌクレオチドアナログに対する特性が改変されている。例えば、改変特性は例えばＫｍ、ｋｃａｔ、Ｖｍａｘ、ヌクレオチドアナログ（又は天然ヌクレオチド）の存在下における組換えポリメラーゼプロセッシビティ、ヌクレオチドアナログの存在下における組換えポリメラーゼによる平均鋳型読み取り長、ヌクレオチドアナログに対する組換えポリメラーゼの特異性、ヌクレオチドアナログの結合速度、産物（ピロリン酸塩、三リン酸塩等）放出速度、及び／又は分岐速度とすることができる。望ましい１態様では、改変特性はヌクレオチドアナログに対するＫｍの低下及び／又はヌクレオチドアナログに対するｋｃａｔ／Ｋｍ又はＶｍａｘ／Ｋｍの増加である。同様に、組換えポリメラーゼは場合により野生型ポリメラーゼに比較してヌクレオチドアナログの結合速度が増加、産物放出速度が増加、及び／又は分岐速度が低下している。
【００２０】
同時に、組換えＤＮＡポリメラーゼは成長中のコピー核酸に天然ヌクレオチド（例えばＡ、Ｃ、Ｇ及びＴ）を組込むことができる。例えば、組換えポリメラーゼは場合により天然ヌクレオチドに対する比活性が対応する野生型ポリメラーゼよりも少なくとも約５％（例えば５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％又はそれ以上）高く、鋳型の存在下における天然ヌクレオチドによるプロセッシビティが天然ヌクレオチドの存在下における野生型ポリメラーゼよりも少なくとも５％（例えば５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％又はそれ以上）高い。場合により、組換えポリメラーゼは天然ヌクレオチドに対するｋｃａｔ／Ｋｍ又はＶｍａｘ／Ｋｍが野生型ポリメラーゼよりも少なくとも約５％（例えば約５％、１０％、２５％、５０％、７５％又は１００％以上）高い。
【００２１】
場合によりヌクレオチドアナログとＤＮＡ鋳型を本発明の組成物に加え、例えば組換えポリメラーゼは鋳型ＤＮＡに応答してヌクレオチドアナログをコピー核酸に組込む。鋳型ＤＮＡは線状又は環状ＤＮＡとすることができ、所定シーケンシング用途では、環状鋳型が望ましい。従って、組成物はＤＮＡ増幅及び／又はシーケンシングシステムで利用することができる。場合により、１分類の態様では、シーケンシングシステムはゼロモード導波管を含む。
【００２２】
前記組成物の作製方法及び使用方法も本発明の特徴である。例えば、１側面では、例えば１個以上のヌクレオチドアナログ残基を含むＤＮＡの作製方法を提供する。これらの方法では、反応混合物を準備する。反応混合物は一般に少なくとも部分的に鋳型を複製することが可能な成分（例えば鋳型、ヌクレオチド、ポリメラーゼ、及びポリメラーゼをプライミングするために鋳型と複合体化又は一体化する複製開始部分）を含有する。この場合の複製開始部分はポリメラーゼを開始するための部位として機能することが可能な任意部分であり、例えば鋳型に相補的な別個のオリゴヌクレオチド、鋳型のヘアピン又は他の自己相補領域（例えば１本鎖鋳型におけるヘアピン）、末端蛋白質等である。ポリメラーゼは（例えば複製開始部分を開始部位として使用する）鋳型依存的ポリメラーゼ伸長反応で鋳型を少なくとも部分的に複製することが可能な組換えポリメラーゼである。一般に、１個以上のヌクレオチドはヌクレオチドアナログからなる。好ましい側面では、少なくとも１個、好ましくは２個以上、３個以上又は少なくとも４個のヌクレオチドはヌクレオチドアナログである。組換えＤＮＡポリメラーゼは野生型ＤＮＡポリメラーゼの野生型活性部位に相同の改変活性部位（改変されると、ポリメラーゼの活性が変化するポリメラーゼの領域）をもつ。組成物に関して上記に記載したように、改変活性部位は１種以上の天然ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログに対する酵素の活性を改善するように野生型活性部位に対して１種以上の構造改変を含むことができる。少なくとも１例では、特定作用理論に結び付けるものではないが、活性部位の改変は改変活性部位へのヌクレオチドアナログ導入の立体妨害を軽減するか、及び／又は改変はヌクレオチドアナログの１種以上の非天然特徴に相補的である。
【００２３】
組換えポリメラーゼが鋳型の少なくとも一部を鋳型依存的に複製するように混合物を反応させることにより、得られるＤＮＡに少なくとも１個のヌクレオチドアナログ残基を組込む。アナログの組込みにより、伸長したＤＮＡに非標準残基を（例えば標識ヌクレオチド残基として）組込むことができ、あるいはポリメラーゼの作用により、伸長したＤＮＡに組込まれたヌクレオチドアナログ残基が標準ヌクレオチド残基と構造的に同一となるようにアナログを改変することができる。例えば、後者態様では、各種ラベルがポリメラーゼの作用により開裂され、例えば本明細書により詳細に記載する所定のリン酸ラベルが成長中のＤＮＡに組込まれるにつれてヌクレオチドアナログから開裂される（一般にラベルが放出されるとシグナルを発生する）。
【００２４】
関連分類の方法では、鋳型、複製開始部分、鋳型依存的組換えポリメラーゼ及び１個以上のヌクレオチドを含有する反応混合物を準備する。１個以上のヌクレオチドはリン酸標識ヌクレオチドを含む。ヌクレオチドアナログに対する組換えポリメラーゼのＫｍ値はヌクレオチドアナログに対する対応する相同野生型ポリメラーゼのＫｍよりも小さい。ポリメラーゼが鋳型の少なくとも一部を鋳型依存的に複製するように混合物を反応させることにより、例えば得られるＤＮＡに少なくとも１個のヌクレオチドアナログ残基を組込む。上述したように、組込まれると、残基は天然ヌクレオチド残基と同一になる場合もあるし、天然ヌクレオチド残基と異なる場合もある。
【００２５】
別の関連分類のＤＮＡ作製方法では、鋳型と、鋳型と複合体化又は一体化する複製開始部分と、鋳型依存的ポリメラーゼ伸長反応で前記部分を使用して鋳型の少なくとも一部を複製することが可能なポリメラーゼと、１個以上のヌクレオチドを含有する反応混合物を準備する。この場合も、１個以上のヌクレオチドは一般にリン酸標識ヌクレオチドアナログを含む。この分類の態様におけるポリメラーゼはΦ２９ＤＮＡポリメラーゼに相同である。ポリメラーゼはＡ４８８ｄＣ４Ｐ、Ａ５６８ｄＣ４Ｐ又は両者に対するＫｍがＡ４８８ｄＣ４Ｐ、Ａ５６８ｄＣ４Ｐ又は両者に対するＧＳＴ−Ｎ６２Ｄ  Φ２９ＤＮＡポリメラーゼのＫｍの約７５％未満である。例えば、４８８ｄＣ４Ｐ、Ａ５６８ｄＣ４Ｐに対するＫｍはＧＳＴ−Ｎ６２Ｄ  Φ２９ＤＮＡポリメラーゼの約４０％以下、例えば約１５％以下とすることができる。ポリメラーゼが鋳型の少なくとも一部を複製するように混合物を反応させる。
【００２６】
上記方法で使用されるポリメラーゼは組成物に関して上記に記載した任意のものとすることができる。上記方法で使用されるポリメラーゼの特性は組成物に関して上記に記載した任意のものとすることができる。例えば、ポリメラーゼは場合によりヌクレオチドアナログに対するｋｃａｔ／Ｋｍがヌクレオチドアナログに対する野生型Φ２９のｋｃａｔ／Ｋｍよりも高い。同様に、上記方法で使用されるヌクレオチドアナログは本発明の組成物に関して記載する任意のものとすることができる。本発明の組換えポリメラーゼは組換えポリメラーゼに相同な天然ポリメラーゼのＫｍに比較してヌクレオチドアナログに対するＫｍを例えば約９０％、約８０％、約７５％、約６０％、約５０％、約４０％、約２５％、約１５％、約１０％、又は約５％未満にすることができる。組換えポリメラーゼは場合により対応する野生型ポリメラーゼに比較してヌクレオチドアナログの結合速度が増加、産物放出速度が増加、及び／又は分岐速度が低下している。
【００２７】
本発明の組成物の使用方法に加え、本発明は組成物の作製方法も含む。例えば、１側面では、組換えＤＮＡポリメラーゼ（例えば本発明の組成物に関して記載する任意のもの）の作製方法を提供する。例えば、前記方法は例えば入手可能な任意結晶構造及び分子モデリングソフトウェア又はシステムを使用して第１のポリメラーゼを構造的にモデル化する段階を含むことができる。モデル化に基づき、活性部位へのヌクレオチド接近に影響を与える１種以上の立体妨害特徴又は相補性特徴及び／又は活性部位領域内のヌクレオチドアナログの結合を例えば活性部位又はその近位で同定する。少なくとも１種の立体妨害特徴を軽減もしくは排除するか又は相補性特徴を付加するように第１のＤＮＡポリメラーゼを突然変異させる。
【００２８】
前記方法は更に得られた組換えポリメラーゼのヌクレオチドアナログに対する活性が第１のＤＮＡポリメラーゼに比較して改変されているか否かを判定するためのスクリーニング又は他のプロトコールを含むことができる。例えば、ヌクレオチドアナログに対する組換えＤＮＡポリメラーゼのｋｃａｔ、Ｋｍ、Ｖｍａｘ、又はｋｃａｔ／Ｋｍを測定することができる。更に、天然ヌクレオチドに対する組換えＤＮＡポリメラーゼのｋｃａｔ、Ｋｍ、Ｖｍａｘ、又はｋｃａｔ／Ｋｍも測定することができる（例えばポリメラーゼはアナログと天然ヌクレオチドの両者の組込み活性を含むことが望ましい）。
【００２９】
組換えＤＮＡポリメラーゼのライブラリーを作製し、これらの特性についてスクリーニングすることができる。例えば、１種以上の立体妨害特徴突然変異及び／又はヌクレオチドアナログの１種以上の非天然特徴に対する相補性を生じるための突然変異を含むようにライブラリーの複数のメンバーを作製した後、該当特性についてスクリーニングする。一般に、該当改変活性を含む少なくとも１個のメンバーを同定するようにライブラリーをスクリーニングすることができる。
【００３０】
別の側面では、本発明は例えば酵素反応速度のモデル化のためのコンピューター実施方法を含む。本方法は例えば鋳型重合反応中の離散時間ステップについて複数のポリメラーゼ状態遷移を定義する段階と；状態間の複数の速度遷移速度を定義する段階と；所与核酸鋳型配列、反応混合物中のヌクレオチド及びポリメラーゼ状態遷移に基づいて、可能な状態の多次元確率行列を作成する段階と；コンピューター読み取り可能な媒体に多次元確率行列を保存する段階を含む。
【００３１】
上記方法の各種特徴は多様である。例えば、ポリメラーゼ状態遷移は場合によりユーザー選択可能である。状態間の速度遷移速度は場合によりヌクレオチド濃度、鋳型配列及び鋳型に沿うポリメラーゼの位置により異なる。反応混合物中のヌクレオチドは場合により１個以上のヌクレオチドアナログを含む。状態間の速度遷移速度は場合によりポリメラーゼによるヌクレオチドアナログの使用中のポリメラーゼの配座遷移速度を含み、前記速度は天然ヌクレオチドの配座遷移速度に等しくなるように設定される。多次元確率行列は場合により鋳型配列、確率状態の標準化行列、及び反応混合物中のヌクレオチドに基づいて自動的に作成される。場合により可能な全ワトソン・クリック塩基対が全状態遷移で等しいと仮定することにより確率行列を単純化する。
【００３２】
同様に、確率行列の出力に基づいて、鋳型に沿うポリメラーゼの位置に起因する試薬濃度変化を考慮するために場合により第２の試薬濃度行列を作成する。場合により複数鋳型について確率行列をベクトル化し、得られたベクトル化確率行列に多次元確率行列を乗じると、状態分布行列が得られる。鋳型配列内の反復配列を考慮するために確率行列の指数時間係数を使用することができる。連続モデル又は計数モデルを使用してポリメラーゼヌクレオチドミスマッチ率を定義することができる。
【００３３】
図１はタグ付きＮ６２ＤΦ２９ＤＮＡポリメラーゼの発現用ベクターを模式的に示す。
【００３４】
図２Ａは残基５０５−５２５の前後の領域におけるΦ２９様ポリメラーゼ（Φ２９配列番号３５、Ｂ１０３配列番号３６、ＰＺＡ配列番号３７、Ｍ２配列番号３８、Ｇ１配列番号３９、ｃｐ−１配列番号４０）の配列アラインメントを示す。図２Ｂは残基５０５−５２５をもつもの（上段）ともたないもの（下段）のΦ２９の構造を示す。３種の異なる角度から見た構造図を示す。
【００３５】
図３ＡはΦ２９のＥ３７５の前後の領域におけるΦ２９様ポリメラーゼ（Φ２９配列番号４１、Ｂ１０３配列番号４２、ＰＺＡ配列番号４３、Ｍ２配列番号４４、Ｇ１配列番号４５、ｃｐ−１配列番号４６）の配列アラインメントを示す。図３ＢはΦ２９（上段）とＥ３７５Ｈ突然変異体（下段）の構造を示す。３種の異なる角度から見た構造図を示す。
【００３６】
図４ＡはΦ２９のＥ４８６の前後の領域におけるΦ２９様ポリメラーゼ（Φ２９配列番号４７、Ｂ１０３配列番号４８、ＰＺＡ配列番号４９、Ｍ２配列番号５０、Ｇ１配列番号５１、ｃｐ−１配列番号５２）の配列アラインメントを示す。図４ＢはΦ２９（上段）とＥ４８６Ａ突然変異体（下段）の構造を示す。３種の異なる角度から見た構造図を示す。
【００３７】
図５ＡはΦ２９のＫ５１２の前後の領域におけるΦ２９様ポリメラーゼ（Φ２９配列番号５３、Ｂ１０３配列番号５４、ＰＺＡ配列番号５５、Ｍ２配列番号５６、Ｇ１配列番号５７、ｃｐ−１配列番号５８）の配列アラインメントを示す。図５ＢはΦ２９（上段）とＫ５１２Ａ突然変異体（下段）の構造を示す。３種の異なる角度から見た構造図を示す。
【００３８】
図６ＡはΦ２９のＫ１３５の前後の領域におけるΦ２９様ポリメラーゼ（Φ２９配列番号５９、Ｂ１０３配列番号６０、ＰＺＡ配列番号６１、Ｍ２配列番号６２、Ｇ１配列番号６３、ｃｐ−１配列番号６４）の配列アラインメントを示す。図６ＢはΦ２９（上段）とＫ１３５Ａ突然変異体（下段）の構造を示す。３種の異なる角度から見た構造図を示す。
【００３９】
図７Ａは結合速度と産物放出速度を測定するために使用したＦＲＥＴ停止型フローアッセイを模式的に示す。図７Ｂ〜ＤはΦ２９  Ｎ６２Ｄ（図７Ｂ）、Ｎ６２Ｄ：Ｅ３７５Ｙ（図７Ｃ）、及びＮ６２Ｄ：Ｅ３７５Ｗ（図７Ｄ）のアッセイの結果を示す。
【００４０】
図８Ａは分岐速度を測定するために使用したＦＲＥＴ停止型フローアッセイを模式的に示す。図８Ｂ〜ＤはΦ２９  Ｎ６２Ｄ（図８Ｂ）、Ｎ６２Ｄ：Ｅ３７５Ｙ（図８Ｃ）、及びＮ６２Ｄ：Ｅ３７５Ｗ（図８Ｄ）のアッセイの結果を示す。
【００４１】
図９は濃度低下に対する反応速度行列ジャンプサイズのプロットを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
概説
各種技術は実験結果を観測するためにラベルの核酸組込みに依存している。例えば、シーケンシング、核酸増幅及びニック翻訳反応の結果はいずれも一般に産物核酸を標識することによりモニターされる。これは例えば標識プローブを産物核酸と結合することにより、ラベルを産物核酸と共有又は非共有的に結合させることにより実施することが多い。他のアプローチでは、産物核酸の合成中にヌクレオチドアナログを産物核酸に組込む。これは一般に例えば組込み法や、所定のリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）及びリアルタイムＬＣＲ反応（ＲＴ−ＬＣＲ）によりシーケンシングで実施される。アナログに付加したラベルはＤＮＡに組込んでもよいし、ポリメラーゼの作用により放出してもよい。アナログ残基の産物核酸組込みをモニターするようにラベルの組込み又は放出をモニターすることができる。
【００４３】
本発明は色素標識リン酸標識アナログ等のヌクレオチドアナログをＤＮＡ増幅中に成長中の鋳型コピーに組込む新規ポリメラーゼを提供する。これらのポリメラーゼは活性部位へのアナログの立体導入妨害を軽減する（活性部位へのヌクレオチドアナログの導入を助長）するため、及び／又はヌクレオチドアナログの１種以上の特徴との相補性を提供するためにポリメラーゼの活性部位を変異させるように改変されている。
【００４４】
これらの新規ポリメラーゼは例えばＤＮＡアンプリコンへの標識アナログの組込みを含む増幅又はシーケンシングプロトコールにおけるＤＮＡ増幅（例えばＲＴ−ＰＣＲ及びＲＴ−ＬＣＲ）及び／又はシーケンシング用途に特に好適である。
【００４５】
ＤＮＡポリメラーゼ
活性部位への立体導入妨害の軽減又はアナログに相補的な特徴の付加によりヌクレオチドアナログと相互作用するように改変可能なＤＮＡポリメラーゼは一般に入手可能である。ＤＮＡポリメラーゼは比較的最近になって各種系統発生関係に基づいて６つの主要なグループに分類されており、例えば大腸菌Ｐｏｌ  Ｉ（クラスＡ）、大腸菌Ｐｏｌ  ＩＩ（クラスＢ）、大腸菌Ｐｏｌ  ＩＩＩ（クラスＣ）、ユリアーキオータＰｏｌ  ＩＩ（クラスＤ）、ヒトＰｏｌβ（クラスＸ）、並びに大腸菌ＵｍｕＣ／ＤｉｎＢ及び真核ＲＡＤ３０／色素性乾皮症変異体（クラスＹ）に分類される。最近の命名法の概要については、例えばＢｕｒｇｅｒｓら（２００１）“Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ：ｐｒｏｐｏｓａｌ  ｆｏｒ  ａ  ｒｅｖｉｓｅｄ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ”Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７６（４７）：４３４８７−９０参照。ポリメラーゼの概要については、例えばＨｕｂｓｃｈｅｒら（２００２）ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＤＮＡ  ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥＳ  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．７１：１３３−１６３；Ａｌｂａ（２００１）“Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｒｅｖｉｅｗ：Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ”Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２（１）：ｒｅｖｉｅｗｓ  ３００２．１−３００２．４；及びＳｔｅｉｔｚ（１９９９）“ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｏｍｍｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ”Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４：１７３９５−１７３９８参照。多数のポリメラーゼの基本作用メカニズムが決定されている。文字通り数百種のポリメラーゼの配列が公共入手可能であり、これらの多くのものの結晶構造が決定されており、あるいは相同ポリメラーゼについて解明された結晶構造との類似性に基づいて推測することができる。例えば、Φ２９の結晶構造が入手可能である。
【００４６】
入手可能なＤＮＡポリメラーゼ酵素は更に、例えばエキソヌクレアーゼ活性を軽減又は排除するため（多くの天然ＤＮＡポリメラーゼは例えばシーケンシング用途を妨げるプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ機能をもつ）や、クレノウフラグメント組換え体等のプロテアーゼ酵素消化フラグメントを作製することにより生産を単純化するために各種方法で改変されている。活性部位へのアナログ導入の立体妨害を軽減するため、又はアナログに相補的な特徴を提供するために、このような入手可能なポリメラーゼの任意のものを本発明により改変することができる。改変に適した多くのこのようなポリメラーゼは例えばシーケンシング、標識及び増幅技術で使用するのに利用可能である。例えば、ヒトＤＮＡポリメラーゼβはＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能である。ＤＮＡポリメラーゼＩはＥｐｉｃｅｎｔｅｒ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ及び他の多数の業者から入手可能である。ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントは例えばＡｍｂｉｏｎ、Ｃｈｉｍｅｒｘ、ｅＥｎｚｙｍｅ  ＬＬＣ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ及び他の多数の業者から組換え体及びプロテアーゼ消化物として入手可能である。Φ２９ＤＮＡポリメラーゼは例えばＥｐｉｃｅｎｔｅｒから入手可能である。Ｐｏｌｙ  Ａポリメラーゼ、逆転写酵素、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、ＳＰ６  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、及び各種熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ、ｈｏｔ  ｓｔａｒｔ、ｔｉｔａｎｉｕｍ  Ｔａｑ等）は上記及び他の各種業者から入手可能である。最近の市販ＤＮＡポリメラーゼとしてはＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅがＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから市販されており；ＧｏＴａｑ（登録商標）Ｆｌｅｘｉ  ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅがＰｒｏｍｅｇａから市販されており；ＲｅｐｌｉＰＨＩ（登録商標）Φ２９ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅがＥＰＩＣＥＮＴＲＥから市販されており；ＰｆｕＵｌｔｒａ（登録商標）Ｈｏｔｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅがＳｔｒａｔａｇｅｎｅから市販されており；ＫＯＤ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅがＮｏｖａｇｅｎ及び他の多数の業者から市販されている。Ｂｉｏｃｏｍｐａｒｅ（ｄｏｔ）ｃｏｍは多種多様な市販ポリメラーゼの比較を掲載している。
【００４７】
立体妨害を軽減するため又はヌクレオチドアナログに相補的な特徴を付加するための突然変異に好ましい基質であるＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ欠損Ｔａｑポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１、クレノウフラグメント、逆転写酵素、Φ２９関連ポリメラーゼ（エキソヌクレアーゼ欠損型誘導体等のこのようなポリメラーゼの野生型Φ２９ポリメラーゼ誘導体を含む）、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＢ６９ポリメラーゼ等が挙げられる。例えば、組換えＤＮＡポリメラーゼは例えば米国特許第５，００１，０５０号、５，１９８，５４３号、又は５，５７６，２０４号に記載されているように、野生型又はエキソヌクレアーゼ欠損Φ２９ＤＮＡポリメラーゼに相同とすることができる。同様に、組換えＤＮＡポリメラーゼはΦ２９、Ｂ１０３、ＧＡ−１、ＰＺＡ、Φ１５、ＢＳ３２、Ｍ２Ｙ、Ｎｆ、Ｇ１、Ｃｐ−１、ＰＲＤ１、ＰＺＥ、ＳＦ５、Ｃｐ−５、Ｃｐ−７、ＰＲ４、ＰＲ５、ＰＲ７２２、又はＬ１７等に相同とすることができる。
【００４８】
ヌクレオチドアナログ
上記のように、本発明の各種ポリメラーゼは成長中のオリゴヌクレオチド鎖に１個以上のヌクレオチドアナログを組込むことができる。組込み後、アナログは成長中のオリゴヌクレオチドに含まれる天然ヌクレオチドと同一又は異なる残基を放出することができる（ポリメラーゼはアナログの任意非標準部分を組込むことができ、又はオリゴヌクレオチドへの組込み中にこれを開裂することができる）。本明細書において「ヌクレオチドアナログ」とは、特定用途で天然ヌクレオシド三リン酸（「ヌクレオチド」）と類似又は同様の方法で機能する化合物であり、それ以外には特定構造を意味しない。ヌクレオチドアナログは標準天然ヌクレオチド以外、即ちＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、又はＵ以外のアナログであるが、オリゴヌクレオチドに組込まれると、オリゴヌクレオチド中に得られる残基はＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ又はＵ残基と同一になる（又は異なる）場合がある。
【００４９】
多数のヌクレオチドアナログが入手可能である。これらのアナログとしては天然ヌクレオチドに基本的類似性をもつアナログ構造が挙げられ、例えば天然ヌクレオシド又はヌクレオチドに対してヌクレオシド又はヌクレオチドのリン酸、糖又は塩基部分に１個以上の置換基を含むものが挙げられる。１態様では、ヌクレオチドアナログはヌクレオシド三リン酸に対して１個以上の付加リン酸を含むことができる。例えば、言及によりその開示内容全体を全目的で本明細書に組込む米国特許出願第１１／２４１，８０９号（出願日２００５年９月２９日）には、例えば４〜６個のリン酸を含む各種ヌクレオチドアナログが記載されている。
【００５０】
例えば、アナログは式：
【化４】
2009521227.tif 000005
の標識化合物を含むことができ、上記式中、Ｂはヌクレオ塩基であり（場合によりラベルを含む）；Ｓは糖部分、非環状部分又は炭素環部分から選択され（場合によりラベルを含む）；Ｌは非必須の検出可能なラベルであり；Ｒ１はＯ及びＳから選択され；Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は独立してＯ、ＮＨ、Ｓ、メチレン、置換メチレン、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（ＣＨ２）、ＣＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２、Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２Ｒ（式中、Ｒは４−ピリジン又は１−イミダゾールである）から選択され、但し、Ｒ４は更に、
【化５】
2009521227.tif 000006
及び
【化６】
2009521227.tif 000007
から選択してもよく；Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１１及びＲ１３が存在する場合には、各々独立してＯ、ＢＨ３、及びＳから選択され；Ｒ９、Ｒ１０及びＲ１２は独立してＯ、ＮＨ、Ｓ、メチレン、置換メチレン、ＣＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２、Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２Ｒ（式中、Ｒは４−ピリジン又は１−イミダゾールである）から選択される。場合により、例えばＲ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、Ｒ１０又はＲ１２の１個がＯ以外のものであり、例えばメチル等である場合には、ホスホン酸アナログをアナログとして利用してもよい。例えば言及によりその開示内容全体を全目的で本明細書に組込む上記米国特許出願第１１／２４１，８０９号参照。
【００５１】
アナログに組込まれる塩基部分は一般に天然又は非天然ヌクレオ塩基又はヌクレオ塩基アナログの任意のものから選択され、例えば核酸及び入手可能な核酸アナログに通常存在するプリン又はピリミジン塩基が挙げられ、例えばアデニン、チミン、グアニン、シチジン、ウラシル、及び場合によりイノシンが挙げられる。上記のように、塩基は場合によりラベル部分を含む。便宜上、ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログは一般に天然ヌクレオチドとのそれらの相対的類似に基づいて呼称する。従って、アデノシン三リン酸と機能的に同様に作用するアナログを本明細書では一般に略称Ａで呼称する場合がある。同様に、一般にＴ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＩの標準略称で呼称される天然ヌクレオシド及びヌクレオチドのアナログの呼称に同様の略称を使用する場合がある。場合により、塩基はより普遍的な方法で機能する場合があり、例えば任意ピリミジン塩基とハイブリダイズできるという点で任意プリン塩基と同様に機能し、あるいは任意プリン塩基とハイブリダイズできるという点で任意ピリミジン塩基と同様に機能する。本発明で使用される塩基部分としては本明細書に記載する通常の塩基が挙げられ、あるいは１個以上の側基を置換されたこのような塩基、又は付加環構造によりＢ基をプリンでもピリミジンでもないものにする他の蛍光塩基もしくは塩基アナログ（例えば１，Ｎ６エテノアデノシン又はピロロＣ）が挙げられる。例えば、場合により、塩基部分の１個以上の側基を標識基又は標識基の成分（例えばドナー又はアクセプターフルオロフォアの一方）、又は他の標識基で置換することが望ましい場合がある。標識ヌクレオ塩基とこのような塩基の標識方法の例は例えば各々言及によりその開示内容全体を全目的で本明細書に組込む米国特許第５，３２８，８２４号及び５，４７６，９２８号に記載されている。
【００５２】
アナログにおいて、Ｓ基は場合により合成核酸鎖に適切な主鎖を提供する糖部分である。例えば、糖部分は場合によりＤ−リボシル、２’もしくは３’−Ｄ−デオキシリボシル、２’，３’−Ｄ−ジデオキシリボシル、２’，３’−Ｄ−ジデヒドロジデオキシリボシル、２’もしくは３’アルコキシリボシル、２’もしくは３’アミノリボシル、２’もしくは３’メルカプトリボシル、２’もしくは３’アルコチオリボシル、非環状、炭素環又は他の修飾糖部分から選択される。例えば言及によりその開示内容全体を全目的で本明細書に組込む上記公開米国特許出願第２００３／０１２４５７６号に記載のもの等の各種炭素環又は非環状部分を糖部分の代わりに「Ｓ」基として組込むことができる。
【００５３】
殆どの場合に、アナログのリン含有鎖（例えば通常のＮＴＰにおける三リン酸塩）は天然ヌクレオシド三リン酸と同様に５’ヒドロキシ基と結合することが好ましい。しかし、場合によっては、３’ヒドロキシ基によりリン含有鎖をＳ基と結合する。
【００５４】
Ｌは一般にＲ４（又はＲ１０又はＲ１２）基を介して末端リン原子と結合される検出可能な標識基を意味する。本発明のアナログで利用される標識基は各種検出可能なラベルの任意のものを含むことができる。検出可能なラベルとは一般にこのような標識基をもたない同一化合物とは別個のアナログ化合物の検出の基礎となる化学部分を意味する。ラベルの例としては、例えば光学ラベル（例えばアナログに検出可能な光学的性質を付与するラベル）、電気化学的ラベル（例えばアナログに検出可能な電気的又は電気化学的性質を付与するラベル）、物理的ラベル（例えばアナログに別の物理的又は空間的性質を付与するラベル、例えば質量タグ又は分子容量タグ）が挙げられる。場合により、本発明のアナログに上記性質の２種以上を付与する個々のラベル又は組み合わせを使用してもよい。
【００５５】
場合により、アナログに組込まれる標識基は光学的に検出可能な部分（例えば発光、化学発光、蛍光、蛍光発生、発色及び／又は呈色部分）を含み、蛍光及び／又は蛍光発生ラベルが好ましい。多種多様なラベル部分がヌクレオチドアナログで容易に利用される。このような基としてはフルオレセインラベル、ローダミンラベル、シアニンラベル（即ちＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ部門から一般に入手可能なＣｙ３、Ｃｙ５等）、Ａｌｅｘａファミリーの蛍光色素、並びにＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ／Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．から入手可能であり、‘Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ−Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ’（２００５）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから入手可能）に記載されている他の蛍光色素及び蛍光発生色素が挙げられる。本発明のポリメラーゼにより組込まれるヌクレオチドアナログにも適用可能と思われるヌクレオシドポリリン酸用の他の各種蛍光及び蛍光発生ラベルは例えば言及によりその開示内容全体を全目的で本明細書に組込む公開米国特許出願第２００３／０１２４５７６号に記載されている。
【００５６】
アナログとこのようなアナログの作製方法に関するその他の詳細は言及によりその開示内容全体を全目的で本明細書に組込む米国特許出願第１１／２４１，８０９号（出願日２００５年９月２９日）に記載されている。
【００５７】
従って、１具体例では、アナログは例えばＡｌｅｘａ色素ラベルを含むリン酸アナログ（例えばリン酸塩がヌクレオシド三リン酸に存在する典型数よりも多いアナログ）とすることができる。例えば、Ａｌｅｘａ４８８色素をδ−リン酸に標識することができ（例えばＡ４８８ｄＣ４Ｐと言う）、あるいはＡｌｅｘａ５６８又はＡｌｅｘａ６３３色素を使用することができ（例えば夫々Ａ５６８ｄＣ４Ｐ及びＡ６３３ｄＣ４Ｐ）、あるいはＡｌｅｘａ５４６色素を使用することができ（例えばＡ５４６ｄＧ４Ｐ）、あるいはＡｌｅｘａ５９４色素を使用することができる（例えばＡ５９４ｄＴ４Ｐ）。同様に、色分離を容易にするために、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を示す１対のフルオロフォアを四リン酸アナログのδ−リン酸に標識することができる（例えばＦＡＭ−ａｍｂ−Ａ５３２ｄＧ４Ｐ又はＦＡＭ−ａｍｂ−Ａ５９４ｄＴ４Ｐと言う）。
立体障害特徴を軽減するため及び／又は相補性特徴を付加するためのＤＮＡポリメラーゼの改変
【００５８】
組換えポリメラーゼの構造に基づく設計
改変活性部位領域をもつ組換えポリメラーゼを作製するための突然変異誘発候補としてアミノ酸残基を簡便に同定するためにはポリメラーゼの構造データを使用することができる。例えば、ポリメラーゼの三次元構造分析により、天然ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ又はそのアナログによる活性部位への接近を立体的に妨害する残基あるいは例えば電荷、疎水性、サイズ等の付加又は改変により、アナログの非天然特徴に相補的な特徴を導入するように突然変異させることが可能な残基を同定することができる。
【００５９】
鋳型、ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログを結合したポリメラーゼの構造を含めて多数のＤＮＡポリメラーゼの三次元構造がＸ線結晶構造解析及び核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法により決定されている。多数のこのようなこのような構造はＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｒｃｓｂ（ｄｏｔ）ｏｒｇ／ｐｄｂ）からダウンロード用に自由に入手可能である。構造と共にドメイン及びホモロジー情報もＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ’ｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ＤａｔａＢａｓｅ（ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｎｃｂｉ（ｄｏｔ）ｎｌｍ（ｄｏｔ）ｎｉｈ（ｄｏｔ）ｇｏｖ／Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ＭＭＤＢ／ｍｍｄｂ（ｄｏｔ）ｓｈｔｍｌ）から検索及びダウンロード用に自由に入手可能である。例えば、構造が既に決定されているポリメラーゼとポリメラーゼの相同性に基づいて他のポリメラーゼの構造をモデル化することができる。あるいは、場合によりヌクレオチドアナログ等と複合体化した所与ポリメラーゼの構造を決定することができる。
【００６０】
結晶構造決定技術は周知である。例えば、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（１９９９）Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｂｅｒｇｆｏｒｓ（１９９９）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｌｉｎｅ；Ｍｕｌｌｉｎ（１９９３）Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｔｔｅｒｗｏｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ；Ｓｔｏｕｔ  ａｎｄ  Ｊｅｎｓｅｎ（１９８９）Ｘ−ｒａｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ｇｕｉｄｅ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｗｉｌｅｙ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｌａｄｄ  ａｎｄ  Ｐａｌｍｅｒ（１９９３）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｘ−ｒａｙ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｌｕｎｄｅｌｌ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ（１９７６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｇｌｕｓｋｅｒ  ａｎｄ  Ｔｒｕｅｂｌｏｏｄ（１９８５）Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  ｐｒｉｍｅｒ，２ｎｄ  Ｅｄ．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔａｂｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，Ｖｏｌ．Ｆ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（２００２）Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ；ＭｃＲｅｅ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ（１９９９）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｄｒｅｎｔｈ（１９９９）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｘ−Ｒａｙ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｅｘｔｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；Ｆａｎｃｈｏｎ  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ（１９９１）Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅ  ５  ＩＵＣｒ／Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓの第１５章；Ｍｕｒｔｈｙ（１９９６）Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓの第５章；Ｄａｕｔｅｒら（２０００）“Ｎｏｖｅｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｐｈａｓｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｈｏｒｔ  ｃｒｙｏ−ｓｏａｋｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｈａｌｉｄｅｓ”Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ５６：２３２−２３７；Ｄａｕｔｅｒ（２００２）“Ｎｅｗ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｐｈａｓｉｎｇ”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌ．１２：６７４−６７８；Ｃｈｅｎら（１９９１）“Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｂｏｖｉｎｅ  ｎｅｕ���ｏｐｈｙｓｉｎ−ＩＩ  ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｔ  ２．８  Å  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  ａｎｏｍａｌｏｕｓ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  ｉｏｄｉｎｅ  ａｔｏｍ”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：４２４０−４２４４；及びＧａｖｉｒａら（２００２）“Ａｂ  ｉｎｉｔｉｏ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｏ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｈａｎｄｌｉｎｇ”Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ５８：ｌ  １４７−１１５４参照。
【００６１】
更に、データ収集、フェーズ決定、モデル構築及び精巧化等を容易にするための各種プログラムも公共入手可能である。例としては限定されないが、ＨＫＬ２０００パッケージ（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ  ａｎｄ  Ｍｉｎｏｒ（１９９７）“Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  Ｘ−ｒａｙ  Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｄａｔａ  Ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ  ｉｎ  Ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｅ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２７６：３０７−３２６）、ＣＣＰ４パッケージ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（１９９４）“Ｔｈｅ  ＣＣＰ４  ｓｕｉｔｅ：ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ”Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  ５０：７６０−７６３）、ＳＯＬＶＥ  ａｎｄ  ＲＥＳＯＬＶＥ（Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂｅｒｅｎｄｚｅｎ（１９９９）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  ５５（Ｐｔ４）：８４９−８６１）、ＳＨＥＬＸＳ  ａｎｄ  ＳＨＥＬＸＤ（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ａｎｄ  Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ（２００２）“Ｓｕｂｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＳＨＥＬＸＤ”Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ５８：１７７２−１７７９）、Ｒｅｆｍａｃ５（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖら（１９９７）“Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｍａｘｉｍｕｍ−Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  Ｍｅｔｈｏｄ”Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  ５３：２４０−２５５）、ＰＲＯＤＲＧ（ｖａｎ  Ａａｌｔｅｎら（１９９６）“ＰＲＯＤＲＧ，ａ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｏｐｏｌｏｇｉｅｓ  ａｎｄ  ｕｎｉｑｕｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｓｃｒｉｐｔｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌ  Ｄｅｓ  １０：２５５−２６２）、及びＯ（Ｊｏｎｅｓら（１９９１）“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｅｌｓ  ｉｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｍａｐｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｒｒｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ”Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ａ  ４７（Ｐｔ２）：１１０−１１９）が挙げられる。
【００６２】
ＮＭＲ分光法による構造決定技術も文献に詳細に記載されている。例えばＣａｖａｎａｇｈら（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＮＭＲ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｌｅｖｉｔｔ（２００１）Ｓｐｉｎ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ：Ｂａｓｉｃｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；Ｅｖａｎｓ（１９９５）Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｗｕｔｈｒｉｃｈ（１９８６）ＮＭＲ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（Ｂａｋｅｒ  Ｌｅｃｔｕｒｅ  Ｓｅｒｉｅｓ），Ｋｕｒｔ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｎｅｕｈａｕｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ（２０００）Ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｏｖｅｒｈａｕｓｅｒ  Ｅｆｆｅｃｔ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ；Ｍａｃｏｍｂｅｒ（１９９８）Ａ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｏｄｅｒｎ  ＮＭＲ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｄｏｗｎｉｎｇ（２００４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＮＭＲ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｌｏｒｅ  ａｎｄ  Ｇｒｏｎｅｎｂｏｒｎ（１９９４）ＮＭＲ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ｒｅｉｄ（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＮＭＲ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｋｒｉｓｈｎａ  ａｎｄ  Ｂｅｒｌｉｎｅｒ（２００３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＮＭＲ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ），Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；Ｋｉｉｈｎｅ  ａｎｄ  Ｄｅ  Ｇｒｏｏｔ（２００１）Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｏｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｓｔａｔｅ  ＮＭＲ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１），Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；Ｊｏｎｅｓら（１９９３）Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｅｓ：ＮＭＲ，Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１７），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇｏｔｏ  ａｎｄ  Ｋａｙ（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：５８５；Ｇａｒｄｎｅｒ（１９９８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２７：３５７；Ｗｕｔｈｒｉｃｈ（２００３）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４２：３３４０；Ｂａｘ（１９９４）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．４：７３８；Ｐｅｒｖｕｓｈｉｎら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１２３６６��Ｆｉａｕｘら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：２０７；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ａｎｄ  Ｗｉｄｅｒ（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１３：５７０；Ｅｌｌｍａｎら（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：７９５９；Ｗｉｄｅｒ（２０００）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９：１２７８−１２９４；Ｐｅｌｌｅｃｃｈｉａら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．（２００２）１：２１１−２１９；Ａｒｏｒａ  ａｎｄ  Ｔａｍｍ（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１１：５４０−５４７；Ｆｌａｕｘら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：２０７−２１１；Ｐｅｌｌｅｃｃｈｉａら（２００１）Ｊ．Ａｍ−Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２３：４６３３−４６３４；及びＰｅｒｖｕｓｈｉｎら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１２３６６−１２３７１参照。
【００６３】
所与ヌクレオチドアナログを活性部位に組込んだポリメラーゼの構造は上記のように例えばＸ線結晶構造解析又はＮＭＲ分光法により直接決定することもできるし、ポリメラーゼの構造及び／又は天然ヌクレオチドを結合したポリメラーゼの構造に基づいて構造をモデル化することもできる。ポリメラーゼの活性部位領域は例えば他のポリメラーゼとの相同性、ポリメラーゼ−鋳型もしくはポリメラーゼ−ヌクレオチド共複合体の試験、突然変異体ポリメラーゼの生化学的分析、及び／又は同等方法により同定することができる。活性部位におけるヌクレオチドアナログの位置は例えば、活性部位における別のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログの既に決定された位置に基づいてアナログの非天然特徴（例えばヌクレオチドに結合したリン含有鎖における付加リン酸基又はホスホン酸基、例えば四、五又は六リン酸基、検出可能な標識基、例えば蛍光色素等）の位置を推定することによりモデル化することができる。
【００６４】
活性部位におけるヌクレオチドアナログのこのようなモデル化は例えば、ＰｙＭＯＬビューアー（ワールドワイドウェブｗｗｗ（ｄｏｔ）ｐｙｍｏｌ（ｄｏｔ）ｏｒｇで自由に入手可能なオープンソース）又はＩｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ（Ａｃｃｅｌｒｙｓから（ｗｗｗ（ｄｏｔ）ａｃｃｅｌｒｙｓ（ｄｏｔ）ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｉｎｓｉｇｈｔ）で市販）を使用してポリメラーゼのモデルの単なる目視検査により実施することができる。あるいは、ポリメラーゼ又は推定突然変異体ポリメラーゼの活性部位におけるヌクレオチドアナログのモデル化は例えば、コンピューター支援ドッキング法、分子力学法、自由エネルギー最小化法、及び／又は同等計算法により実施することができる。このようなモデル化技術は文献に詳細に記載されている。例えばＢａｂｉｎｅ  ａｎｄ  Ａｂｄｅｌ−Ｍｅｇｕｉｄ（編）（２００４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｌｙｎｅ（２００２）“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  ｖｉｒｔｕａｌ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：Ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ”  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ  ７：１０４７−１０５５；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｂｅｇｉｎｎｅｒｓ，ａｔ（ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｕｓｍ（ｄｏｔ）ｍａｉｎｅ（ｄｏｔ）ｅｄｕ／〜ｒｈｏｄｅｓ／ＳＰＶＴｕｔ／ｉｎｄｅｘ（ｄｏｔ）ｈｔｍｌ）；及びＭｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｔ（ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｄｄｄｃ（ｄｏｔ）ａｃ（ｄｏｔ）ｃｎ／ｅｍｂｏ０４）；並びにその引用文献参照。このようなモデル化を容易にするためのソフトウェアは広く入手可能であり、例えば、ハーバード大学から学術資料として入手可能であるか又はＡｃｃｅｌｒｙｓ（ｗｗｗ（ｄｏｔ）ａｃｃｅｌｒｙｓ（ｄｏｔ）ｃｏｍ）から市販されているＣＨＡＲＭｍシミュレーションパッケージ、Ｄｉｓｃｏｖｅｒシミュレーションパッケージ（Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ，前出に同梱）、及びＤｙｎａｍａ（ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｃｓ（ｄｏｔ）ｇｓｕ（ｄｏｔ）ｅｄｕ／〜ｃｓｃｒｗｈ／ｐｒｏｇｓ／ｐｒｏｇｓ（ｄｏｔ）ｈｔｍｌで入手可能）が挙げられる。ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｎｅｔｓｃｉ（ｄｏｔ）ｏｒｇ／Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ｍｏｄｅｌｉｎｇ／ＭＭＭＤ／ｔｏｐ（ｄｏｔ）ｈｔｍｌに掲載されているモデル化ソフトウェアの大規模なリストも参照。
【００６５】
ポリメラーゼモデルの目視検査及び／又はコンピューター分析により、例えば、活性部位へのヌクレオチドアナログの導入を立体的に妨害し得る残基（例えばアナログをポリメラーゼと結合したときに、アナログ内の１個以上の原子の推定位置に不適切に近接する残基）等の活性部位領域の該当特徴を同定することができる。このような残基は例えば、欠失させるか又はより小さい側鎖をもつ残基で置換することができ、例えば、多くの残基はアミノ酸側鎖が短い以外は類似特徴をもつ残基（例えばアラニン）で簡便に置換することができる。同様に、ヌクレオチドアナログとの望ましい相互作用を導入するために改変可能な残基も同定することができる。このような残基はアナログの非天然特徴に相補的な残基で置換することができ、例えば、アナログと水素結合することが可能な残基（例えばセリン、スレオニン、ヒスチジン、アスパラギン、又はグルタミン）、アナログ上の疎水性基と相互作用することが可能な疎水性残基、アナログ上の基（例えばフルオロフォア）と好ましい疎水性相互作用を生じることが可能な芳香族残基、アナログの芳香族基とのπ−πもしくはｅｄｇｅ−ｆａｃｅスタッキング相互作用に関与することが可能な芳香族残基、アナログとのカチオン−π相互作用に関与することが可能な残基、又はアナログ上の逆電荷部分（例えば付加リン酸基）と静電的に相互作用することが可能な荷電残基（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、又はヒスチジン）で置換することができる。
【００６６】
このような構造に基づく設計のほんの１特定例として、Φ２９ポリメラーゼのモデルの検査の結果、Δ５０５−５２５ドメインと残基Ｋ１３５、Ｅ４８６、及びＫ５１２が活性部位へのアナログの導入を潜在的に立体的に妨害するとして同定され、Ｅ３７５をヒスチジン、リジン、又はアルギニンに突然変異させたならば、アナログ上の非天然四リン酸に相補的な正電荷が導入されると予想された。同様に、モデルの検査の結果、Ｅ３７５をトリプトファン、チロシン、又はフェニルアラニン等の芳香族残基に突然変異させたならば、アナログ上のフルオロフォアとの疎水性相互作用が改善することも予想された。その他の詳細については下記実施例２及び３参照。
【００６７】
従って、本発明のポリメラーゼ及び他の組成物の使用方法に加え、本発明はポリメラーゼの作製方法も含む。上記のように、組換えＤＮＡポリメラーゼの作製方法は、例えば入手可能な任意結晶構造及び分子モデリングソフトウェア又はシステムを使用して第１のポリメラーゼを構造的にモデル化する段階を含むことができる。モデル化に基づき、活性部位へのヌクレオチド接近に影響を与える１種以上の立体妨害特徴又は相補性特徴及び／又は活性部位領域内のヌクレオチドアナログの結合を例えば活性部位又はその近位で同定する。少なくとも１種の立体妨害特徴を軽減もしくは排除するか又は相補性特徴を付加するように第１のＤＮＡポリメラーゼを突然変異させる。
【００６８】
活性部位領域の突然変異
例えば上記のようなポリメラーゼモデル及びモデル予想に従って、例えば相補性特徴を含む変異体を作製するように又は立体障害特徴を軽減するようにポリメラーゼを改変するために、本発明では場合により各種突然変異誘発法を使用する。一般に、このような突然変異体を作製するためには入手可能な任意突然変異誘発法を使用することができる。このような突然変異誘発法は場合により１種以上の該当活性（例えばヌクレオチドアナログに対するＫｍ、Ｖｍａｘ、ｋｃａｔ等）について突然変異体核酸及びポリペプチドを選択する段階を含む。使用可能な方法としては限定されないが、部位特異的点突然変異誘発法、ランダム点突然変異誘発法、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ相同組換え法（ＤＮＡシャフリング）、ウラシル含有鋳型を使用する突然変異誘発法、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発法、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発法、ギャップ入り２本鎖ＤＮＡを使用する突然変異誘発法、点ミスマッチ修復、修復欠損宿主株を使用する突然変異誘発法、制限−選択及び制限−精製、欠失突然変異誘発法、全遺伝子合成による突然変異誘発法、縮重ＰＣＲ法、２本鎖切断修復、及び当業者に公知の他の多くの方法が挙げられる。
【００６９】
場合により、天然ポリメラーゼ分子からの既知情報、又は（例えばエキソヌクレアーゼ活性の低下を示す既存突然変異体ポリメラーゼを使用する）既知改変もしくは突然変異ポリメラーゼの情報、例えば上記のような配列、配列比較、物理的性質、結晶構造及び／又は同等事項により突然変異誘発法を誘導することができる。他方、別の分類の態様では、改変は（例えば古典的ＤＮＡシャフリングの場合のように）本質的にランダムとすることができる。
【００７０】
突然変異フォーマットに関するその他の情報はＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄ．），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０００（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（２００６年補遺）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」））及びＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）（Ｉｎｎｉｓ）に記載されている。突然変異フォーマットに関するその他の詳細は以下の刊行物とその引用文献に記載されている。Ａｒｎｏｌｄ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｕｎｕｓｕａｌ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：４５０−４５５（１９９３）；Ｂａｓｓら，Ｍｕｔａｎｔ  Ｔｒｐ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｎｅｗ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：２４０−２４５（１９８８）；Ｂｏｔｓｔｅｉｎ  ＆  Ｓｈｏｒｔｌｅ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１１９３−１２０１（１９８５）；Ｃａｒｔｅｒら，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍ１３  ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：４４３１−４４４３（１９８５）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３７：１−７（１９８６）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍ１３  ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３８２−４０３（１９８７）；Ｄａｌｅら，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｍｅｔｈｏｄ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５７：３６９−３７４（１９９６）；Ｅｇｈｔｅｄａｒｚａｄｅｈ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｔｏ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ｌａｒｇｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：５１１５（１９８６）；Ｆｒｉｔｚら，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ：ａ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ��ｎ  ｖｉｔｒｏ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：６９８７−６９９９（１９８８）；Ｇｒｕｎｄｓｔｒｏｍら，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ  ‘ｓｈｏｔ−ｇｕｎ’  ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３３０５−３３１６（１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．ａｎｄ  Ｌｉｌｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．Ｊ，編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）（１９８７）；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２（１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌら，Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３６７−３８２（１９８７）；Ｋｒａｍｅｒら，Ｔｈｅ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：９４４１−９４５６（１９８４）；Ｋｒａｍｅｒ  ＆  Ｆｒｉｔｚ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｖｉａ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３５０−３６７（１９８７）；Ｋｒａｍｅｒら，Ｐｏｉｎｔ  Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｒｅｐａｉｒ，Ｃｅｌｌ  ３８：８７９−８８７（１９８４）；Ｋｒａｍｅｒら，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：７２０７（１９８８）；Ｌｉｎｇら，Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５４（２）：１５７−１７８（１９９７）；Ｌｏｒｉｍｅｒ  ａｎｄ  Ｐａｓｔａｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，３０６７−８（１９９５）；Ｍａｎｄｅｃｋｉ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：７１７７−７１８１（１９８６）；Ｎａｋａｍａｙｅ  ＆  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｎｃｉ  Ｉ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｂｙ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｇｒｏｕｐｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：９６７９−９６９８（１９８６）；Ｎａｍｂｉａｒら，Ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：１２９９−１３０１（１９８４）；Ｓａｋａｍａｒ  ａｎｄ  Ｋｈｏｒａｎａ，Ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａ−ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｒｏｄ  ｏｕｔｅｒ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎ），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６３６１−６３７２（１９８８）；Ｓａｙｅｒｓら，Ｙ−Ｔ  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：７９１−８０２（１９８８）；Ｓａｙｅｒｓら，Ｓｔｒａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ，（１９８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：８０３−８１４；Ｓｉｅｂｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９：４５６−４６０（２００１）；Ｓｍｉｔｈ，Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９：４２３−４６２（１９８５）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００（１９８３）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３２９−３５０（１９８７）；Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７０，３８９−９１（１９９４）；Ｔａｙｌｏｒら，Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｐｒｅｐａｒｅ  ｎｉｃｋｅｄ  ＤＮＡ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：８７４９−８７６４（１９８５）；Ｔａｙｌｏｒら，Ｔｈｅ  ｒａｐｉｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：８７６５−８７８７（１９８５）；Ｗｅｌｌｓら，Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ，Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ａ  ３１７：４１５−４２３（１９８６）；Ｗｅｌｌｓら，Ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｉｔｅｓ，Ｇｅｎｅ  ３４：３１５−３２３（１９８５）；Ｚｏｌｌｅｒ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍ１３−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ：ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｎｙ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４８７−６５００（１９８２）；Ｚｏｌｌｅｒ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｃｌｏｎｅｄ  ｉｎｔｏ  Ｍ１３  ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００（１９８３）；及びＺｏｌｌｅｒ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｕｓｉｎｇ  ｔｗｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ａｎｄ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  ｔｅｍｐｌａｔｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３２９−３５０（１９８７）。上記方法の多くに関するその他の詳細はＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  １５４に記載されており、同書は各種突然変異誘発法に伴う問題のトラブルシューティングに有用な対策についても記載している。
【００７１】
反応速度パラメーターの決定
ヌクレオチドアナログに対するポリメラーゼの活性が第１のＤＮＡポリメラーゼ（例えば組換えポリメラーゼの誘導元である対応する野生型ポリメラーゼ）に比較して改変されているか否かを判定するために本発明のポリメラーゼをスクリーニング又は他の方法で試験することができる。例えば、ヌクレオチドアナログに対する組換えＤＮＡポリメラーゼのｋｃａｔ、Ｋｍ、Ｖｍａｘ、ｋｃａｔ／Ｋｍ、Ｖｍａｘ／Ｋｍ、ｋｐｏｌ、及び／又はＫｄを測定することができる。更に、天然ヌクレオチドに対する組換えＤＮＡポリメラーゼのｋｃａｔ、Ｋｍ、Ｖｍａｘ、Ｖｍａｘ／Ｋｍ、ｋｃａｔ／Ｋｍ、ｋｐｏｌ、及び／又はＫｄも測定することができる（例えばポリメラーゼはアナログ及び天然ヌクレオチド両者の組込み活性を含むことが望ましい）。
【００７２】
当分野で周知の通り、単純なミカエリス・メンテン式に従う酵素では、反応速度パラメーターは各種基質濃度で測定した触媒速度から容易に誘導される。ミカエリス・メンテン式Ｖ＝Ｖｍａｘ［Ｓ］（［Ｓ］＋Ｋｍ）−１は未結合基質濃度（［Ｓ］，総基質濃度により近似）、最大速度（Ｖｍａｘ，酵素が基質で飽和されるときに達せられる）、及びミカエリス定数（Ｋｍ，反応速度がその最大値の２分の１である基質濃度に等しい）と反応速度（Ｖ）の関係を表す。
【００７３】
多くの酵素では、Ｋｍは酵素−基質複合体の解離定数に等しいため、酵素−基質複合体の強度の尺度である。このような酵素では、Ｋｍを比較すると、Ｋｍが小さいほど複合体の結合は強く、Ｋｍが大きいほど複合体の結合は弱い。ｋｃａｔ／Ｋｍ比（特異性定数と言う場合もある）は基質と遊離酵素の結合の見かけの速度定数である。特異性定数が大きいほど、酵素が基質と結合して産物に変換する効率は高い。
【００７４】
Ｖｍａｘ＝ｋｃａｔ［ＥＴ］であるので、総酵素濃度（［ＥＴ］，即ち活性部位の濃度）が分かっているならば、ｋｃａｔ（酵素の回転数とも言う）を決定することができる。総酵素濃度を測定することが困難な状況では、効率の尺度としてＶｍａｘ／Ｋｍ比を代用することが多い。ＫｍとＶｍａｘは例えば、１／［Ｓ］に対する１／Ｖのラインウィーバー・バークプロット（ここで、ｙ切片は１／Ｖｍａｘを表し、ｘ切片は−１／Ｋｍを表し、傾きはＫｍ／Ｖｍａｘである）、又はＶ／［Ｓ］に対するＶのイーディー・ホフスティープロット（ここで、ｙ切片はＶｍａｘを表し、ｘ切片はＶｍａｘ／Ｋｍを表し、傾きは−Ｋｍである）から決定することができる。触媒速度データからの反応速度パラメーターの決定はＫｉｎｅｔＡｓｙｓｔ（登録商標）やＥｎｚｆｉｔ（Ｂｉｏｓｏｆｔ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）等のソフトウェアパッケージにより容易にすることができる。
【００７５】
ポリメラーゼのように複数の基質をもつ酵素では、１種のみの基質の濃度を変化させ、その他は適切な過剰（例えば有効に一定）濃度に維持すると、一般に正常なミカエリス・メンテン反応速度が得られる。
【００７６】
１態様では、定常状態前の反応速度を使用すると、速度ｋｏｂｓ（ｄＮＴＰ組込みの実測一次速度定数）のヌクレオチド濃度依存性により、基底状態結合のＫｍの推定値と最大重合速度（ｋｐｏｌ）が得られる。ｋｏｂｓはバーストアッセイを使用して測定する。アッセイの結果をバースト式：産物＝Ａ［１−ｅｘｐ（−ｋｏｂｓ＊ｔ）］＋ｋｓｓ＊ｔ（式中、Ａは酵素活性濃度の推定値の振幅を表し、ｋｓｓは実測定常状態速度定数であり、ｔは反応インキュベーション時間である）にフィットさせる。ポリメラーゼ−ＤＮＡ複合体と結合するｄＮＴＰのＫｍとｋｐｏｌは式ｋｏｂｓ＝（ｋｐｏｌ＊［Ｓ］）＊（Ｋｍ＋［Ｓ］）−１（式中、［Ｓ］は基質濃度である）を使用してｋｏｂｓのｄＮＴＰ濃度依存的変化をフィットさせることにより計算する。結果は、場合により例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ（１９８６）“Ｒａｐｉｄ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍｅｃｈａｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ”  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３４：６７７−７０５，Ｐａｔｅｌら（１９９１）“Ｐｒｅ−ｓｔｅａｄｙ−ｓｔａｔｅ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅ  ＤＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｕｔａｎｔ”  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０（２）：５１１−２５、及びＴｓａｉ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ（２００６）“Ａ  ｎｅｗ  ｐａｒａｄｉｇｍ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ”  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４５（３２）：９６７５−８７に記載の方法に基づく急速クエンチ実験（クエンチフロー測定とも言う）から得られる。
【００７７】
ヌクレオチドアナログと組換えポリメラーゼの結合速度、組換えポリメラーゼによる産物放出速度、又は組換えポリメラーゼの分岐速度（「分岐速度」はヌクレオチド又はヌクレオチドアナログが組込まれずにポリメラーゼ活性部位から解離する速度であり、このヌクレオチド又はヌクレオチドアナログは組込まれた場合には鋳型の相補的ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログと正しく塩基対合する）等のパラメーターも測定することができ、場合により第１のポリメラーゼ（例えば対応する野生型ポリメラーゼ）のパラメーターと比較することができる。例えば下記実施例３参照。
【００７８】
酵素反応速度の更に詳細については、例えばＢｅｒｇ，Ｔｙｍｏｃｚｋｏ，ａｎｄ  Ｓｔｒｙｅｒ（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ；及びＦｅｒｓｈｔ（１９８５）Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ参照。
【００７９】
上記のように、該当ＤＮＡポリメラーゼは野生型ＤＮＡポリメラーゼの野生型活性部位領域に相同の改変活性部位領域をもち、この領域は例えば天然ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログの１種以上に対する酵素の相対活性を増加するように野生型活性部位領域に対して１種以上の構造改変を含み、ヌクレオチドアナログに対する活性増加が好ましい目的である。少なくとも１側面では、特定作用理論に結び付けるものではないが、改変は改変活性部位へのヌクレオチドアナログ導入の立体妨害を軽減することを目的とするか、及び／又はヌクレオチドアナログの１種以上の非天然特徴に相補的である。ヌクレオチドアナログに対する組換えポリメラーゼのＫｍ値は一般にヌクレオチドアナログに対する対応する相同野生型ポリメラーゼのＫｍよりも小さい。
【００８０】
１側面では、モデルアナログ又はアナログセットを参照して本発明の酵素の改善された活性を測定し、所与親酵素と比較する。例えば、Φ２９親酵素に由来する酵素の場合には、本発明の改善型酵素は親酵素（例えば野生型Φ２９又はＮ６２Ｄ  Φ２９）よりも所与アナログに対するＫｍが低くなる。一般に、説明の目的で、本発明の改善型酵素の例は夫々Φ２９由来酵素により妥当に十分にプロセシングされたものと妥当に十分にプロセシングされていないものとの２種のアナログであるＡ４８８ｄＣ４Ｐ及び／又はＡ５６８ｄＣ４Ｐに対するＫｍが同一アナログに対するＮ６２Ｄ  Φ２９のＫｍの例えば約５％以下〜約９０％以下であると特徴付けることができよう。例えば、下記実施例（例えば表２）により詳細に記載するように、Ａ４８８ｄＣ４Ｐに対するＨｉｓ−３７５Ｈ−Ｎ６２Ｄ  Φ２９のＫｍはＮ６２Ｄ  Φ２９のＫｍの約４０％であり、Ａ４８８ｄＣ４Ｐに対するＨｉｓ−３７５Ｓ−Ｎ６２Ｄ  Φ２９のＫｍはＮ６２Ｄ  Φ２９のＫｍの約７５％である。同様に、Ａ５６８ｄＣ４Ｐに対するＨｉｓ−３７５Ｈ−Ｎ６２Ｄ  Φ２９のＫｍはＮ６２Ｄ  Φ２９のＫｍの約１５％であり、Ａ５６８ｄＣ４Ｐに対するＨｉｓ−３７５Ｓ−Ｎ６２Ｄ  Φ２９のＫｍはＮ６２Ｄ  Φ２９のＫｍの約３８％である。上記特徴は特性決定ツールとして使用することができるが、本発明の特に限定的な反応を意味するものではない。
【００８１】
ポリメラーゼのスクリーニング
ヌクレオチドアナログに対するポリメラーゼの活性が第１のＤＮＡポリメラーゼに比較して改変されているか否かを判定するためにはスクリーニング又は他のプロトコールを使用することができる。例えば、上記のようにヌクレオチドアナログに対する組換えＤＮＡポリメラーゼのｋｃａｔ、Ｋｍ、Ｖｍａｘ、又はｋｃａｔ／Ｋｍを測定することができる。更に、天然ヌクレオチドに対する組換えＤＮＡポリメラーゼのｋｃａｔ、Ｋｍ、Ｖｍａｘ、又はｋｃａｔ／Ｋｍも測定することができる（例えばポリメラーゼはアナログ及び天然ヌクレオチド両者の組込み活性を含むことが望ましい）。
【００８２】
望ましい１側面では、組換えＤＮＡポリメラーゼのライブラリーを作製し、これらの特性についてスクリーニングすることができる。例えば、１種以上の立体妨害特徴突然変異及び／又はヌクレオチドアナログの１種以上の非天然特徴に対する相補性を生じると推定される突然変異を含むようにライブラリーの複数のメンバーを作製した後、該当特性についてスクリーニングする。一般に、該当改変活性を含む少なくとも１個のメンバーを同定するようにライブラリーをスクリーニングすることができる。
【００８３】
ポリメラーゼライブラリーは本質的に物理的又は論理的なものとすることができる。更に、多様なライブラリーフォーマットの任意のものを使用することができる。例えば、ポリメラーゼを蛋白質アレイとして固体表面に固定することができる。同様に、ポリメラーゼを含有する溶液の簡便な高スループット流体操作のために（例えばマイクロウェルプレートで）ポリメラーゼの液相アレイを構築することができる。組換えポリメラーゼを発現する細胞の液相、エマルション又はゲル相ライブラリーも例えばマイクロウェルプレート内、又は寒天プレート上に構築することができる。ポリメラーゼ又はポリメラーゼドメイン（例えば活性部位領域を含む）のファージディスプレイライブラリーを作製することもできる。ライブラリーの作製及び使用に関する手引きは例えば本明細書に引用するＳａｍｂｒｏｏｋ、Ａｕｓｕｂｅｌ及びＢｅｒｇｅｒに記載されている。
【００８４】
マイクロタイタープレートの流体移出入を伴うライブラリーの作製には、場合により流体操作ステーションを使用する。このような移送を実施するための数種の「既製」流体操作ステーションが市販されており、例えばＣａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）のＺｙｍａｔｅシステムや、例えばプレート移動用ロボット（例えばＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）から市販されている各種実験室システムで使用されるＯＲＣＡ（登録商標）ロボット）と共に自動ピペッターを利用する他のステーションが挙げられる。
【００８５】
代替態様では、マイクロチップで流体操作を実施し、例えばマイクロウェルプレート又は他のウェルからチップ上のマイクロチャネルを介して宛先サイト（マイクロチャネル領域、ウェル、チャンバー等）まで材料を移送する。市販マイクロフルイディックシステムとしてはＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ／Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されているシステム（例えばＨＰ２１００バイオアナライザー）やＣａｌｉｐｅｒ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍが挙げられる。Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍは標準マイクロウェルライブラリーフォーマットとＬａｂｃｈｉｐ技術の連携の１具体例である。更に、流体操作のためにマイクロウェルプレートと直接連携することが可能なマイクロフルイディックシステムの多数の例が特許及び技術文献に記載されている。
【００８６】
望ましい特性
本発明のポリメラーゼは用途に応じて天然又はヌクレオチドアナログに対する各種改変特性の任意のものを含むことができ、速度増加、組込まれた塩基の保持時間増加（又は速度低下）、プロセッシビティ増加等が挙げられる。例えば、より高レベルのヌクレオチドアナログ組込みが所望される場合には、所与ヌクレオチドアナログに対する対応する相同野生型ポリメラーゼよりもＫｍが低く、Ｖｍａｘが高く、及び／又はｋｃａｔが高くなるように本発明のポリメラーゼを選択する。所定態様では、（例えば組込みをモニターするために使用される装置の解像度に応じて）ポリメラーゼの総ヌクレオチド組込み速度を増減すること、又はプロセッシビティ、特異性等を改善することが望ましい。所定態様では、組換えポリメラーゼは対応する相同野生型ポリメラーゼに比較してヌクレオチドアナログの結合速度が増加、産物放出速度が増加、及び／又は分岐速度が低下している。本発明のポリメラーゼを選択するにはこれらの特徴の任意のものについてスクリーニングすることができる。
【００８７】
例えば、本発明のポリメラーゼは一般に成長中のコピー核酸に天然ヌクレオチド（例えばＡ、Ｃ、Ｇ及びＴ）を組込むことができる。例えば、組換えポリメラーゼは場合により天然ヌクレオチドに対する比活性が対応する相同野生型ポリメラーゼよりも少なくとも約５％（例えば５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％又はそれ以上）高く、鋳型の存在下における天然ヌクレオチドによるプロセッシビティが天然ヌクレオチドの存在下における野生型ポリメラーゼよりも少なくとも５％（例えば５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％又はそれ以上）高い。場合により、組換えポリメラーゼは更に天然ヌクレオチドに対するｋｃａｔ／Ｋｍ又はＶｍａｘ／Ｋｍが野生型ポリメラーゼよりも少なくとも約１０％（例えば１０％、２５％、５０％、７５％又は１００％以上）高い。
【００８８】
その他の具体的な詳細
本明細書には改変活性部位領域の多数の特定例を記載する。「活性部位領域」は折り畳まれたポリメラーゼの三次元構造の活性部位を含むか又はその近位（例えば活性部位から約２ｎｍ以内）のポリメラーゼの部分である。本明細書にはΦ２９ＤＮＡポリメラーゼの活性部位内又はその近位の構造改変の特定例を記載する。例えば、野生型Φ２９ＤＮＡポリメラーゼに対して、これらの改変としてはΔ５０５−５２５の欠失、Δ５０５−５２５ドメイン内の欠失、Ｋ１３５Ａ突然変異、（例えば本明細書に記載する別の突然変異と組み合わせた）Ｌ３８４Ｒ突然変異、Ｅ３７５Ｈ突然変異、Ｅ３７５Ｓ突然変異、Ｅ３７５Ｋ突然変異、Ｅ３７５Ｒ突然変異、Ｅ３７５Ａ突然変異、Ｅ３７５Ｑ突然変異、Ｅ３７５Ｗ突然変異、Ｅ３７５Ｙ突然変異、Ｅ３７５Ｆ突然変異、Ｅ４８６Ａ突然変異、Ｅ４８６Ｄ突然変異、Ｋ５１２Ａ突然変異、表８に示す突然変異、及びその組み合わせの任意のものが挙げられる。例えば、ポリメラーゼは表８の組み合わせリストから選択される突然変異の組み合わせを含むことができる。
【００８９】
ポリメラーゼは場合により更に内在エキソヌクレアーゼ活性を低下又は排除させるように野生型ポリメラーゼに対して１種以上の突然変異／欠失を含む。例えば、野生型Φ２９ＤＮＡポリメラーゼに対して、Ｎ６２は場合によりエキソヌクレアーゼ活性を低下させるように突然変異又は欠失しており、例えばポリメラーゼはＮ６２Ｄ突然変異を含むことができる。エキソヌクレアーゼ活性を低下させる他の代表的突然変異としては、Ｄ１２Ａ、Ｔ１５Ｉ、Ｅ１４Ｉ、及び／又はＤ６６Ａが挙げられ、従って、本発明のポリメラーゼは場合によりこれらの突然変異の１種以上を含む。
【００９０】
当然のことながら、アミノ酸残基のナンバリングはΦ２９ポリメラーゼの野生型配列を基準とする番号であり、本発明の分子内の実際の位置は野生型Φ２９酵素に対して酵素に実施される各種改変の種類（例えば欠失及び／又は末端又は分子自体の内部の分子への付加）により変動し得る。
【００９１】
アフィニティータグ及び他の非必須ポリメラーゼ特徴
組換えＤＮＡポリメラーゼは場合によりポリメラーゼに対して外来又は異種の他の特徴を含む。例えば、組換えポリメラーゼは場合により１個以上の外来アフィニティータグ（例えば６Ｈｉｓタグ配列、ＧＳＴタグ、ＨＡタグ配列、複数の６Ｈｉｓタグ配列、複数のＧＳＴタグ、複数のＨＡタグ配列、ＳＮＡＰタグ等の精製又は基質結合タグ）を含む。例えばポリメラーゼを表面に結合する際にポリメラーゼ活性部位を方向付けるため及び／又は保護するために、これらの特徴及びポリメラーゼと表面の結合に関して有用な他の特徴を場合により付加する。他の有用な特徴としては、酵素の組換え二量体ドメインや、例えば活性部位に遠位のポリメラーゼと結合した大型の外部ポリペプチドドメインが挙げられる。例えば、Φ２９では、活性部位は蛋白質のＣ末端領域に位置するので、付加表面結合エレメント（付加ドメイン、Ｈｉｓタグ等）はポリメラーゼを表面に結合する際に活性部位を妨害しないように一般にＮ末端領域に配置される。
【００９２】
一般に、（組換えにより又は例えば化学的に）ポリメラーゼに付加することができる表面結合エレメント及び精製タグとしては、例えばポリヒスチジンタグ、ＨＩＳ−６タグ、ビオチン、アビジン、ＧＳＴ配列、ＢｉＴａｇ配列、Ｓタグ、ＳＮＡＰ−タグ、エンテロキナーゼ部位、トロンビン部位、抗体もしくは抗体ドメイン、抗体フラグメント、抗原、受容体、受容体ドメイン、受容体フラグメント、リガンド、色素、アクセプター、クエンチャー、又はその組み合わせが挙げられる。
【００９３】
表面に対してポリペプチドを方向付けるため及び／又はポリメラーゼの表面結合を強化するために、複数の表面結合ドメインを付加することができる。２個以上の別個のタグを介して２カ所以上の部位で表面と結合することにより、ポリメラーゼは表面に対して比較的固定した方向に維持される。ポリメラーゼの表面固定に関するその他の詳細は言及により全目的で本明細書に組込む米国特許出願第６０／７５３，４４６号、発明の名称「表面結合蛋白質の活性を最適化するための蛋白質工学ストラテジー（ＰＲＯＴＥＩＮ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＳＴＲＡＴＥＧＩＥＳ  ＴＯ  ＯＰＴＩＭＩＺＥ  ＡＣＴＩＶＩＴＹ  ＯＦ  ＳＵＲＦＡＣＥ  ＡＴＴＡＣＨＥＤ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ）」、発明者Ｈａｎｚｅｌら及び米国特許出願第６０／７５３，５１５号、発明の名称「活性表面結合ポリメラーゼ（ＡＣＴＩＶＥ  ＳＵＲＦＡＣＥ  ＣＯＵＰＬＥＤ  ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥＳ）」、発明者Ｈａｎｚｅｌら（出願日いずれも２００５年１２月２２日）、並びに言及により全目的で本明細書に組込む代理人整理番号１０５−００１２１０ＵＳ、発明の名称「表面結合蛋白質の活性を最適化するための蛋白質工学ストラテジー（ＰＲＯＴＥＩＮ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＳＴＲＡＴＥＧＩＥＳ  ＴＯ  ＯＰＴＩＭＩＺＥ  ＡＣＴＩＶＩＴＹ  ＯＦ  ＳＵＲＦＡＣＥ  ＡＴＴＡＣＨＥＤ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ）」、発明者Ｈａｎｚｅｌら及び代理人整理番号１０５−００８１０ＵＳ、発明の名称「活性表面結合ポリメラーゼ（ＡＣＴＩＶＥ  ＳＵＲＦＡＣＥ  ＣＯＵＰＬＥＤ  ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥＳ）」、発明者Ｈａｎｚｅｌら（いずれも本願と同日出願）に記載されている。
【００９４】
ＤＮＡポリメラーゼによるヌクレオチドアナログの組込み強化の用途
場合により鋳型核酸を複製するために、本発明のポリメラーゼと、天然及び／又はヌクレオチドアナログと、核酸鋳型（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を使用する。即ち、ポリメラーゼがプライマーを鋳型依存的に伸長するように、ポリメラーゼと、ヌクレオチドアナログと、場合により天然ヌクレオチド及び他の試薬と、鋳型と、複製開始部分の混合物を反応させる。複製開始部分は標準オリゴヌクレオチドプライマー、あるいは鋳型の成分とすることができ、例えば鋳型は自己プライミング１本鎖ＤＮＡ、ニック入り２本鎖ＤＮＡ等とすることができる。同様に、末端蛋白質を開始部分として使用することもできる。少なくとも１個のヌクレオチドアナログをＤＮＡに組込むことができる。鋳型ＤＮＡは線状又は環状ＤＮＡとすることができ、所定用途では、環状鋳型が望ましい（例えばローリングサークル型複製や環状鋳型のシーケンシング）。場合により、組成物は自動ＤＮＡ複製及び／又はシーケンシングシステムで利用することができる。
【００９５】
本発明のポリメラーゼによる標識ヌクレオチドアナログの組込みはＤＮＡ重合のリアルタイムモニターを含む多様な核酸分析で特に有用である。ラベルはそれ自体を組込んでもよいが、組込み中に放出するほうが好ましい。例えば、ポリメラーゼによるアナログの組込み中にラベル放出をモニターすることによりアナログ組込みをリアルタイムでモニターすることができる。組込まれるアナログの部分は天然ヌクレオチドと同一でもよいし、天然ヌクレオチドとは異なるアナログの特徴を含んでいてもよい。
【００９６】
一般に、成長中の核酸鎖の存在と組成を指示し、例えば鋳型複製／増幅及び／又は鋳型の配列を実証するために、ラベル組込み又は放出を使用することができる。組込みからのシグナルは例えば固相アッセイで組込まれたアナログから遊離される標識基の検出結果として発生することもできるし、組込み反応の結果として発生することもできる。例えば、結合したラベルをクエンチし、遊離ラベルをクエンチしないＦＲＥＴラベルの場合には、組込まれたアナログからのラベル基の放出により蛍光シグナルを発生することができる。あるいは、活性部位に近位のＦＲＥＴ対の１メンバーで酵素を標識し、他のメンバーを担持するアナログを組込むと、組込み後にエネルギー移動が生じる。核酸シーケンシング用途における酵素結合ＦＲＥＴ成分の使用は例えば言及により本明細書に組込む公開米国特許出願第２００３−００４４７８１号に記載されている。
【００９７】
代表的な１該当反応では、個々のポリメラーゼ分子を有効に観測できるような極めて小さい観測容積内でポリメラーゼ反応物を単離することができる。その結果、組込みイベントにより、組込んでいるヌクレオチドアナログを組込まれなかったヌクレオチドアナログから容易に区別可能に観測できる。好ましい側面では、このような小さい観測容積はゼロモード導波管等の光学的閉じ込め構造内にポリメラーゼ酵素を固定化することにより得られる。ＺＭＷと単分子分析、特に核酸シーケンシングにおけるその適用については、例えば各々言及によりその開示内容全体を全目的で本明細書に組込む公開米国特許出願第２００３／００４４７８１号及び米国特許第６，９１７，７２６号参照。
【００９８】
一般に、１個以上のヌクレオチド及び／又は１個以上の本発明のヌクレオチドアナログの存在下でポリメラーゼ酵素を鋳型鎖と複合体化する。例えば、所定態様では、４種の天然ヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｇ及びＣの各々に類似する化合物に相当する標識アナログを例えば古典的サンガーシーケンシングのように別個のポリメラーゼ反応で使用するか、又は多重化シーケンシングアプローチのように単一反応で相互に多重化する。鋳型鎖の特定塩基が重合反応中にポリメラーゼと遭遇すると、このようなヌクレオチドに相補的な利用可能なアナログと複合体化し、成長中の新生核酸鎖にこのアナログを組込む。１側面では、組込みの結果、例えばポリリン酸アナログ中のラベルが放出され、アナログ中のαリン原子とβリン原子の間が開裂し、従って標識基（又はその一部）を放出することができる。組込みイベントはアナログが長くなっているために複合体中のラベルにより検出されるか、又はラベル基が周囲媒体中に放出されることにより検出される。各種アナログの各々（例えばＡ、Ｔ、Ｇ又はＣ）に異なる標識基を使用する場合には、組込まれたアナログのラベルの同定によりこのアナログを同定し、従って、この時点でプロセッシングされている鋳型鎖中の相補的ヌクレオチドを決定することができる。連鎖反応とモニターにより、重合反応のリアルタイムモニターと鋳型核酸の配列決定が可能になる。上記のように、特に好ましい側面では、ポリメラーゼ酵素／鋳型複合体は個々の複合体の観測を可能にする光学的閉じ込め構造（例えばゼロモード導波管）内に固定化した状態で提供される。シーケンシングにおけるその使用に加え、本発明のアナログは他の各種ゲノタイピング分析（例えば一塩基伸長法を使用するＳＮＰゲノタイピング）、増幅のリアルタイムモニター（例えばＲＴ−ＰＣＲ法）等でも同様に有用である。
【００９９】
シーケンシングと核酸増幅に関するその他の詳細はＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄ．），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０００（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（２００６年補遺）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」））及びＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）（「Ｉｎｎｉｓ」）に記載されている。
【０１００】
組換えポリメラーゼの作製及び単離
一般に、本発明のポリメラーゼをコードする核酸はクローニング、組換え、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅及び／又は他の利用可能な方法により作製することができる。本発明のポリメラーゼ（特定理論に結び付けるものではないが、例えば本発明のヌクレオチドアナログの立体障害を軽減するか、及び／又は相補性特徴を含む突然変異体ポリメラーゼ）をコードする発現ベクターを発現させるためには各種組換え法を使用することができる。核酸作製、発現及び発現産物の単離のための組換え法は例えばＳａｍｂｒｏｏｋ、Ａｕｓｕｂｅｌ及びＩｎｎｉｓに記載されている。
【０１０１】
更に、プラスミド又は他の該当核酸を細胞から精製するための多数のキットが市販されている（例えばいずれもＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製品であるＥａｓｙＰｒｅｐ（登録商標）、ＦｌｅｘｉＰｒｅｐ（登録商標）；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製品ＳｔｒａｔａＣｌｅａｎ（登録商標）；及びＱｉａｇｅｎ製品ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標））。単離及び／又は精製された任意核酸を更に操作して他の核酸を作製することもできるし、細胞にトランスフェクトするために使用することもできるし、発現用生物に感染させるために関連ベクターに組込むこともできるし、及び／又は同等の操作が可能である。典型的なクローニングベクターは転写及び翻訳ターミネーターと、転写及び翻訳開始配列と、特定ターゲット核酸の発現の調節に有用なプロモーターを含む。ベクターは場合により少なくとも１個の独立ターミネーター配列と、真核生物又は原核生物又は両者（例えばシャトルベクター）でカセットの複製を可能にする配列と、原核系と真核系の両者の選択マーカーを含む包括的発現カセットを含む。ベクターは原核生物、真核生物、又は好ましくは両者での複製及び組込みに適している。Ｇｉｌｉｍａｎ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ  ８：８１（１９７９）；Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２８：７３１（１９８７）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｂ．ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．６４３５：１０（１９９５）；Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｂｅｒｇｅｒ（前出）参照。クローニングに有用な細菌とバクテリオファージのカタログは例えばＡＴＣＣから入手でき、例えばＴｈｅ  ＡＴＣＣ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  ＢａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅがＡＴＣＣから毎年発行されている。シーケンシング、クローニング及び分子生物学の他の側面のその他の基本手順と基礎理論事項もＷａｔｓｏｎら（１９９２）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，ＮＹに記載されている。
【０１０２】
更に、各種非天然アミノ酸の任意のものを組換え蛋白質（例えば本発明のポリメラーゼ）に組込むことが可能な直交成分のシステムも入手可能である。要約すると、直交ｔＲＮＡ（「ＯｔＲＮＡ」；アンバー又は４塩基ｔＲＮＡ等の細胞の内在翻訳機構により認識されないｔＲＮＡ）と直交ｔＲＮＡシンテターゼ（「ＯＲＳ」；これは細胞の内在ｔＲＮＡをアミノアシル化しないが、セレクターコドンに応答してＯｔＲＮＡをアミノアシル化することができるシンテターゼである）を含む細胞又は他の翻訳系（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系）を構築する。ＯｔＲＮＡにより特異的に認識される選択部位にセレクターコドンを含むように酵素をコードする核酸を構築する。ＯＲＳは（例えば活性部位の遠位の）１個以上の選択部位に所望化学官能基をもつ非天然アミノ酸を特異的に組込む。この化学官能基は例えばケト又は他の官能基を組込むアミノ酸に元々存在している官能基に比較してユニークであると言える。直交系に関する詳細な情報は例えばＷａｎｇら，（２００１），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８−５００；Ｃｈｉｎら，（２００２）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２４：９０２６−９０２７；Ｃｈｉｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  １１：１１３５−１１３７；Ｃｈｉｎら，（２００２），ＰＮＡＳ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９９：１１０２０−１１０２４；及びＷａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，１−１０に記載されている。国際公開ＷＯ２００２／０８６０７５、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ｔＲＮＡ  ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−ｔＲＮＡ  ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ  ＰＡＩＲＳ）」；ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」；ＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」；ＷＯ２００５／０１９４１５（出願日２００４年７月７日）；ＷＯ２００５／００７８７０（出願日２００４年７月７日）；及びＷＯ２００５／００７６２４（出願日２００４年７月７日）も参照。
【０１０３】
（例えば後期核酸単離のための）例えば細胞単離及び培養に関する他の有用な文献としては、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋとその引用文献；Ｐａｙｎｅら（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇａｍｂｏｒｇ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（編）（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）及びＡｔｌａｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｓ（編）Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬが挙げられる。
【０１０４】
更に、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）等の各種販売会社からほぼ任意核酸をオーダーメード又は標準注文することができる。
【０１０５】
各種蛋白質単離及び検出方法が公知であり、例えば本発明の組換えポリメラーゼを発現する細胞の組換え培養液からポリメラーゼを単離するために使用することができる。各種蛋白質単離及び検出方法が当分野で周知であり、例えばＲ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１８２：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｓａｎｄａｎａ（１９９７）Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｏｌｌａｇら（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮＹ；Ｗａｌｋｅｒ（１９９６）Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ，Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ａｎｇａｌ（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ａｎｇａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｓｃｏｐｅｓ（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ；Ｊａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒｙｄｅｎ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，ＮＹ；及びＷａｌｋｅｒ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｎ  ＣＤ−ＲＯＭ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ；並びにその引用文献に記載されている方法が挙げられる。蛋白質精製及び検出方法に関するその他の詳細はＳａｔｉｎｄｅｒ  Ａｈｕｊａ編，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）に記載されている。
【０１０６】
キット
本発明は例えばシーケンシング、核酸増幅等の用途のために例えば１種以上のヌクレオチドアナログと共に本発明のポリメラーゼを含むキットも提供する。このようなキットはポリメラーゼの使用を可能にする方法でパッケージングされた本発明のポリメラーゼと、本発明の各種ヌクレオチドアナログ（例えばＡ、Ｔ、Ｇ、及びＣに類似するヌクレオチドアナログ）のセットを含むことができ、例えばアナログの少なくとも１個は検出可能な部分をもち、好ましい側面では２個以上の検出可能な部分をもち、多くの場合には、場合により他のアナログの存在下で同定できるように、各々が検出可能な異なる標識基をもつ。所望用途に応じて、本発明のキットは場合により天然ヌクレオチド、対照鋳型、及び他の試薬（例えば緩衝溶液及び／又は例えば２価金属イオン即ちＭｇ＋＋、Ｍｎ＋＋及び／又はＦｅ＋＋を含む塩類溶液、標準溶液（例えば検出器校正用色素標準））等の付加試薬を含む。このようなキットは一般に更に所望適用方法（例えば核酸シーケンシング、増幅等）に従って化合物及び他の試薬を使用するための説明書を含む。
【０１０７】
核酸及びポリペプチド配列と変異体
本明細書に記載するように、本発明は例えば本明細書に記載するようなポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。立体障害又は相補性特徴を含むポリメラーゼ配列の例を本明細書（例えば表３）に示す。しかし、当業者に自明の通り、本発明はこれらの配列に限定されない。例えば、当業者に自明の通り、本発明は例えば本明細書に記載する機能をもつ多数の関連配列（例えば、表３のポリメラーゼの保存変異体をコードするポリヌクレオチド及びポリペプチド）も提供する。
【０１０８】
従って、本発明は各種ポリペプチド（ポリメラーゼ）とポリヌクレオチド（ポリメラーゼをコードする核酸）を提供する。本発明のポリヌクレオチドの例としては、例えば表３に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド又はそのポリヌクレオチド配列に相補的であるかもしくは前記配列をコードするポリヌクレオチドが挙げられる（例えば所与配列がＤＮＡである場合には、例えば逆転写によりこのＤＮＡをコードする配列の１例はＲＮＡである）。本発明のポリヌクレオチドは更に場合により表３のポリメラーゼをコードする任意ポリヌクレオチドを含む。遺伝コードの縮重により、多数のポリヌクレオチドが所与ポリメラーゼ配列を等しくコードする。同様に、核酸の実質的に全長にわたって高ストリンジェント条件下で上記ポリヌクレオチドとハイブリダイズする人工又は組換え核酸（天然ポリヌクレオチド以外のもの）も本発明のポリヌクレオチドである。１態様では、組成物は本発明のポリペプチドと賦形剤（例えば緩衝液、水、医薬的に許容可能な賦形剤等）を含有する。本発明は本発明のポリペプチドに対して特異的に免疫反応性の抗体又は抗血清（例えば改変立体障害又はヌクレオチドアナログ相補性特徴を特異的に認識するもの）も提供する。
【０１０９】
所定態様では、ベクター（例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス等）に本発明のポリヌクレオチドを組込む。１態様では、ベクターは発現ベクターである。別の態様では、発現ベクターは本発明のポリヌクレオチドの１種以上と機能的に連結されたプロモーターを含む。別の態様では、本発明のポリヌクレオチドを組込んだベクターを細胞に導入する。
【０１１０】
同様に当業者に自明の通り、開示配列の多数の変異体も本発明に含まれる。例えば、機能的に類似する配列となる開示配列の保存変異体も本発明に含まれる。少なくとも１種の開示配列とハイブリダイスする核酸ポリヌクレオチド配列の変異体も本発明に含むものとする。例えば標準配列比較法により判定した場合に本明細書に開示する配列のユニークサブ配列であると判断される配列も本発明に含まれる。
【０１１１】
保存変異
遺伝コードの縮重により、「サイレント置換」（即ちコードされるポリペプチドに変化を生じない核酸配列の置換）はアミノ酸配列をコードする全核酸配列の暗黙の特徴である。同様に、「保存アミノ酸置換」はアミノ酸配列中の１個又は少数のアミノ酸を高度に類似する性質をもつ別のアミノ酸で置換するものであり、このような置換も開示構築物と高度に類似することが容易に認められる。各開示配列のこのような保存変異体は本発明の特徴である。
【０１１２】
特定核酸配列の「保存変異体」とは同一又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を意味し、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には本質的に同一の配列を意味する。当業者に自明の通り、コードされる配列中の単一アミノ酸又は低百分率（一般に５％未満、より一般には４％、２％又は１％未満）のアミノ酸を置換、付加又は欠失させる個々の置換、欠失又は付加の結果として、該当する立体障害軽減又はヌクレオチドアナログ相補性特徴を維持しながら、アミノ酸を欠失するか、アミノ酸が付加されるか、又はアミノ酸が化学的に類似するアミノ酸で置換される場合には、これらの変異は「保存改変変異」である（例えば、保存置換としては活性部位領域に対して遠位の残基の置換が挙げられる）。従って、本発明の指定ポリペプチド配列の「保存変異体」としては、ポリペプチド配列のアミノ酸の低百分率、一般に５％未満、より一般には２％又は１％未満が同一保存置換基のアミノ酸で置換されたものが挙げられる。最後に、非機能的配列又はタグ配列（核酸中のイントロン、コードされるポリペプチド中のポリＨｉｓ又は同様の配列等）の付加のように核酸分子のコードされる活性を変えない配列の付加も基本核酸又はポリペプチドの保存変異である。
【０１１３】
１側面では、保存置換はアミノ酸残基３７５に対応するポリメラーゼのアミノ酸残基における１以上の残基欠失又は置換を含む。
【０１１４】
機能的に類似するアミノ酸を示す保存置換表は当分野で周知であり、このようなアミノ酸では、あるアミノ酸残基が類似の化学的性質（例えば芳香族側鎖又は正荷電側鎖）をもつ別のアミノ酸残基に置換しているため、ポリペプチド分子の機能的性質は実質的に変化しない。化学的性質が類似する天然アミノ酸を含む代表的グループを以下に示すが、これらのグループ内の置換は「保存置換」である。
【表１】
2009521227.tif 000008
【０１１５】
核酸ハイブリダイゼーション
本発明の核酸の保存変異体を含めて本発明の核酸を同定するためには比較ハイブリダイゼーションを使用することができる。更に、天然Φ２９又はＮ６２Ｄ突然変異体を除く表３に示す核酸と高、超高及び超々高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするターゲット核酸も本発明の特徴である。このような核酸の例としては表３の所与核酸配列と比較して１又は少数のサイレント又は保存核酸置換を含むものが挙げられる。
【０１１６】
試験核酸が完全にマッチする相補的ターゲットに比較して少なくとも５０％の割合でプローブとハイブリダイズする場合、即ちマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも約５倍〜１０倍で完全にマッチするプローブが完全にマッチする相補的ターゲットと結合する条件下におけるプローブとターゲットのハイブリダイゼーションに比較してシグナル対ノイズ比が少なくとも１／２である場合に試験核酸はプローブ核酸と特異的にハイブリダイズすると言う。
【０１１７】
核酸は一般に溶液中で会合するときに「ハイブリダイズ」する。核酸は水素結合、溶媒排除、塩基スタッキング等の種々の十分に特性決定された物理化学的力によりハイブリダイズする。核酸ハイブリダイゼーションの詳しい手引きはＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｐａｒｔ  Ｉ  ｃｈａｐｔｅｒ  ２，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ，”（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００４年補遺）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）に記載されており、Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  １  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，（Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  １）と、Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  ２  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ２）はオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡとＲＮＡの合成、標識、検出及び定量について詳細に記載している。
【０１１８】
１００個を上回る相補的残基をもつ相補的核酸のハイブリダイゼーションをフィルター上でサザン又はノーザンブロット法で実施するためのストリンジェントハイブリダイゼーション条件の１例は、５０％ホルマリンにヘパリン１ｍｇを加え、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを実施する。ストリンジェント洗浄条件の１例は６５℃、０．２×ＳＳＣで１５分間洗浄する（ＳＳＣ緩衝液の説明についてはＳａｍｂｒｏｏｋ，前出参照）。多くの場合には高ストリンジェンシー洗浄の前に低ストリンジェンシー洗浄を実施してバックグラウンドプローブシグナルを除去する。低ストリンジェンシー洗浄の１例は４０℃、２×ＳＳＣで１５分間である。一般に、シグナル対ノイズ比が特定ハイブリダイゼーションアッセイで無関係プローブに観測される比の５倍（以上）である場合に特異的ハイブリダイゼーションが検出されたとみなす。
【０１１９】
サザン及びノーザンハイブリダイゼーション等の核酸ハイブリダイゼーション実験において「ストリンジェントハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存性であり、各種環境パラメーターにより異なる。核酸ハイブリダイゼーションの詳しい手引きはＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３），前出やＨａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  １及び２に記載されている。ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件は任意試験核酸について経験により容易に決定することができる。例えば、ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件を決定するには、一連の選択基準に合致するまで（例えばハイブリダイゼーション又は洗浄における温度上昇、塩濃度低下、界面活性剤濃度増加及び／又はホルマリン等の有機溶媒濃度増加により）ハイブリダイゼーション及び洗浄条件を徐々に増加する。例えば、高ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件では、マッチしないターゲットとプローブのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも約５倍でプローブが完全にマッチする相補的ターゲットと結合するまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件を徐々に増加する。
【０１２０】
「超ストリンジェント」条件は特定プローブの熱融点（Ｔｍ）に等しくなるように選択される。Ｔｍは（規定イオン強度及びｐＨ下で）試験配列の５０％が完全にマッチするプローブとハイブリダイズする温度である。本発明の目的には、一般に規定イオン強度及びｐＨで特定配列のＴｍよりも約５℃低くなるように「高ストリンジェント」ハイブリダイゼーション及び洗浄条件を選択する。
【０１２１】
「超高ストリンジェンシー」ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は完全にマッチする相補的ターゲット核酸とプローブの結合に観測されるシグナル対ノイズ比がマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも１０倍になるまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件のストリンジェンシーを増加する条件である。完全にマッチする相補的ターゲット核酸のシグナル対ノイズ比の少なくとも１／２で前記条件下にプローブとハイブリダイズする場合にターゲット核酸は超高ストリンジェンシー条件下でプローブと結合すると言う。
【０１２２】
同様に、該当ハイブリダイゼーションアッセイのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件を徐々に増加することにより更に高レベルのストリンジェンシーを決定することもできる。例えば、完全にマッチする相補的ターゲット核酸とプローブの結合に観測されるシグナル対ノイズ比がマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも１０倍、２０倍、５０倍、１００倍又は５００倍以上になるまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件のストリンジェンシーを増加する条件を決定できる。完全にマッチする相補的ターゲット核酸のシグナル対ノイズ比の少なくとも１／２で前記条件下にプローブとハイブリダイズする場合にターゲット核酸は超々高ストリンジェンシー条件下でプローブと結合すると言う。
【０１２３】
ストリンジェント条件下で相互にハイブリダイズしない核酸でも、これらの核酸によりコードされるポリペプチドが実質的に同一である場合には実質的に同一である。これは、例えば遺伝コードに許容される最大コドン縮重を使用して核酸のコピーを作製する場合に該当する。
【０１２４】
ユニークサブ配列
所定側面では、本発明は表３のポリメラーゼをコードする核酸中にユニークサブ配列を含む核酸を提供する。ユニークサブ配列は野生型Φ２９又はそのＮ６２Ｄ突然変異体に対応する核酸に比較してユニークであり得る。例えばデフォルトパラメーターに設定したＢＬＡＳＴを使用してアラインメントを実施することができる。任意ユニークサブ配列は例えば本発明の核酸を同定するためのプローブとして有用である。
【０１２５】
同様に、本発明は表３のポリメラーゼ中にユニークサブ配列を含むポリペプチドを含む。この場合には、ユニークサブ配列は野生型Φ２９又はそのＮ６２Ｄ突然変異体に比較してユニークである。
【０１２６】
本発明は表３の配列から選択されるポリペプチド中のユニークサブ配列をコードするユニークコーディングオリゴヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするターゲット核酸も提供し、この場合には、ユニークサブ配列は野生型Φ２９又はＮ６２Ｄ突然変異体に対応するポリペプチド（例えば本発明のポリメラーゼを例えば突然変異により誘導した元の親配列）に比較してユニークである。ユニーク配列は上記のように決定する。
【０１２７】
配列比較、一致度及び相同度
２種以上の核酸又はポリペプチド配列に関して「一致」又は「一致度百分率」なる用語は２種以上の配列又はサブ配列を最大限に対応するように対比及び整列させ、以下に記載する配列比較アルゴリズム（又は当業者に入手可能な他のアルゴリズム）の１種を使用するか又は目視により測定した場合に相互に同一であるか又は同一のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの百分率が特定値であることを意味する。
【０１２８】
２種以上の核酸又はポリペプチド（例えばポリメラーゼをコードするＤＮＡ又はポリメラーゼのアミノ酸配列）に関して「実質的に一致」なる用語は２種以上の配列又はサブ配列を最大限に対応するように対比及び整列させ、配列比較アルゴリズムを使用するか又は目視により測定した場合にヌクレオチド又はアミノ酸残基一致度が少なくとも約６０％、約８０％、約９０〜９５％、約９８％、約９９％又はそれ以上であることを意味する。このような「実質的に一致」する配列は一般に実際の祖先が記載されていなくても「相同」であるとみなす。少なくとも約５０残基長の配列の領域、より好ましくは少なくとも約１００残基長の領域にわたって「実質的一致」が存在していることが好ましく、少なくとも約１５０残基又は比較する２配列の全長にわたって配列が実質的に一致していることが最も好ましい。
【０１２９】
蛋白質及び／又は蛋白質配列は共通の祖先蛋白質又は蛋白質配列から天然又は人工的に誘導される場合に「相同」である。同様に、核酸及び／又は核酸配列は共通の祖先核酸又は核酸配列から天然又は人工的に誘導される場合に相同である。相同性は一般に２種以上の核酸又は蛋白質（又はその配列）間の配列類似度から推定される。相同性の判定に有用な配列間類似度の厳密な百分率は該当核酸及び蛋白質により異なるが、通常は５０個、１００個、１５０個又はそれ以上の残基にわたる２５％程度の低い配列類似度を使用して相同性を判定する。より高レベルの配列類似度（例えば３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％以上）を使用して相同性を判定することもできる。配列類似度百分率の決定方法（例えばデフォルトパラメーターを使用するＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ）は本明細書に記載し、一般に入手可能である。
【０１３０】
配列比較及び相同性判定には、一般にある配列を参照配列としてこれに試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合には、試験配列と参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じてサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。こうすると、配列比較アルゴリズムは指定プログラムパラメーターに基づいて参照配列に対する試験配列の配列一致度百分率を計算する。
【０１３１】
比較のための最適な配列アラインメントは例えばＳｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性探索法、これらのアルゴリズムのコンピューター実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）、又は目視（一般にＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００４年補遺）参照）により実施することができる。
【０１３２】
配列一致度及び配列類似度百分率を決定するのに適したアルゴリズムの１例はＡｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから公共入手可能である。このアルゴリズムはデータベース配列中の同一長さの単語と整列させた場合に所定の正の閾値スコアＴと一致するか又はこれを満足するクエリー配列中の長さＷの短い単語を識別することによりまず高スコア配列対（ＨＳＰ）を識別する。Ｔを隣接単語スコア閾値と言う（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，前出）。これらの初期隣接単語ヒットをシードとして検索を開始し、これらの単語を含むもっと長いＨＳＰを探索する。次に、累積アラインメントスコアを増加できる限り、単語ヒットを各配列に沿って両方向に延長する。ヌクレオチド配列の場合にはパラメーターＭ（１対のマッチ残基のリウォードスコア、常に＞０）及びＮ（ミスマッチ残基のペナルティースコア、常に＜０）を使用して累積スコアを計算する。アミノ酸配列の場合には、スコアリングマトリクスを使用して累積スコアを計算する。累積アラインメントスコアがその最大到達値から量Ｘだけ低下するか、累積スコアが１カ所以上の負スコア残基アラインメントの累積によりゼロ以下になるか、又はどちらかの配列の末端に達したら各方向の単語ヒットの延長を停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ及びＸはアラインメントの感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は語長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、カットオフ１００、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列用として、ＢＬＡＳＴＰプログラムは語長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスをデフォルトとして使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５参照）。
【０１３３】
配列一致度百分率の計算に加え、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２配列間の類似性の統計分析も実施する（例えばＫａｒｌｉｎ  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７（１９９３）参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１尺度は２種のヌクレオチド又はアミノ酸配列間に偶然にマッチが起こる確率を示す最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸を参照核酸に比較した場合の最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合に核酸は参照核酸に類似しているとみなす。
【０１３４】
コンピューターによる反応速度のモデル化方法
別の側面では、本発明は例えば酵素反応速度をモデル化するためのコンピューター実施方法を含む。本方法では、鋳型重合反応中の離散時間ステップについて複数のポリメラーゼ状態遷移を定義する。最小離散時間ステップでは、モデル化される酵素速度反応に従って多くのポリメラーゼ状態遷移が禁止される。状態間の複数の速度遷移速度を定義し、所与核酸鋳型配列、反応混合物中のヌクレオチド及びポリメラーゼ状態遷移に基づいて最小離散時間ステップで可能な状態遷移の多次元確率行列を定義する。得られた多次元確率行列をコンピューター読み取り可能な媒体に保存する。
【０１３５】
上記方法の各種特徴は多様である。例えば、ポリメラーゼ状態遷移は場合によりユーザー選択可能である。状態間の遷移速度は場合によりヌクレオチド濃度、ポリメラーゼ濃度、鋳型濃度、鋳型配列、鋳型に沿うポリメラーゼの位置、現在のワトソン・クリック鋳型−ヌクレオチド対の特徴、１つ前のワトソン・クリック鋳型−ヌクレオチド対の特徴、又は組込まれるヌクレオチドの特徴により異なる。反応混合物中のヌクレオチドは場合により１個以上のアナログヌクレオチドを含む。状態間の遷移速度は場合により上記多次元依存性の全組み合わせ間に完全な直交性を含む。多次元確率行列は場合により鋳型配列、確率状態の標準化行列、及び反応混合物中のヌクレオチドに基づいて自動的に作成される。場合により可能な全ワトソン・クリック塩基対が全状態遷移で等しいと仮定することにより確率行列を単純化する。所定状態遷移（例えばＤＮＡに沿うポリメラーゼ転位）が確率行列の各次元（例えば先に組込まれたヌクレオチドの所定特徴）間で等しいと仮定することにより確率行列を場合により更に単純化する。
【０１３６】
同様に、確率行列の出力に基づいて、鋳型に沿うポリメラーゼの位置に起因する試薬濃度変化を考慮するために場合により第２の試薬濃度行列を作成する。場合により複数鋳型について確率行列をベクトル化し、得られたベクトル化確率行列に多次元確率行列を乗じると、状態分布行列が得られる。鋳型配列内の反復配列を考慮するために確率行列の指数時間係数を使用することができる。連続モデル又は計数モデルを使用してポリメラーゼヌクレオチドミスマッチ率を定義することができる。
【０１３７】
当然のことながら、本明細書に記載する実施例と態様は例証の目的に過ぎず、これらの記載に鑑み、種々の変形又は変更が当業者に想到されよう。従って、以下の実施例は特許請求の範囲に記載する発明を例証するものであり、これを限定するものではない。
【０１３８】
改変活性部位領域とヌクレオチドアナログに対する改変特性をもつ各種組換えＤＮＡポリメラーゼの構築と特性決定を実証する一連の実験を以下に記載する。
【実施例１】
【０１３９】
組換えポリメラーゼの発現
図１に模式的に示すΦ２９ポリメラーゼの発現用ベクターを構築した。エキソヌクレアーゼ活性を低下させるために野生型Φ２９（配列番号１）にＮ６２Ｄ突然変異を導入し、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、Ｈｉｓ、及びＳタグを付加した。得られたタグ付きＮ６２Ｄ  Φ２９アミノ酸配列を配列番号２として示す。ベクターの配列を配列番号１４として示す。タグ付きＮ６２Ｄ  Φ２９ポリメラーゼはベクター配列のヌクレオチド４８３９−７４２８によりコードされ、ポリメラーゼはヌクレオチド５７００−７４２８に位置し、Ｎ６２Ｄ突然変異はヌクレオチド５８８３−５８８５に位置する。ベクターの他の特徴としては、ＧＳＴ−Ｈｉｓ−Ｓタグ配列（ヌクレオチド４８３８−５６９９）、リボソーム結合部位（ヌクレオチド４８２２−４８２９）、Ｔ７プロモーター（ヌクレオチド４７４６−４７５８）、及びカナマイシン耐性マーカー（ヌクレオチド５６３−１３７５の相補配列）が挙げられる。
【０１４０】
例えば、改変活性部位領域をもつ組換えΦ２９ポリメラーゼの発現を容易にするために、所望により他の突然変異もこの構築物に容易に導入される。例えば配列番号１５−２３参照。組換え蛋白質は例えば大腸菌で発現させることができ、ＧＳＴ、Ｈｉｓ、及び／又はＳタグと標準技術を使用して精製することができる。適切なプロテアーゼ（例えばトロンビンやエンテロキナーゼ）で消化することにより場合によりタグを除去する。
【実施例２】
【０１４１】
代表的な組換えポリメラーゼ
改変活性部位領域をもつ各種組換えΦ２９ポリメラーゼを構築した。特定メカニズムに限定する意図はないが、改変活性部位領域へのヌクレオチドアナログ導入の立体妨害を軽減することができ、これらの基を相補する特徴（例えば正電荷アミノ酸側鎖）を提供することにより余分なリン酸基に配位することができ、及び／又は他の方法でポリメラーゼのヌクレオチドアナログ組込み能を強化することができる構造改変を以下に例証する。
【０１４２】
図２Ａは残基５０５−５２５（括り記号で示す）の前後の領域におけるΦ２９様ポリメラーゼの配列アラインメントを示す。Φ２９と異なるアミノ酸残基を下線で示す。ｃｐ−１  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇ１と同様に、Φ２９に遠縁）ではこの領域の大部分が欠失している。更に、この領域はフランキング配列よりも配列保存が著しく少ない。これらの点から、この領域を除去しても有害になる可能性は低いと思われる。
【０１４３】
図２Ｂの上段３図はΦ２９ポリメラーゼの構造を示す（例えばＫａｍｔｅｋａｒら（２００４）“Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｉｍｅｄ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Φ２９”  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １６（４）：６０９−６１８参照）。下段３図は残基５０５−５２５を除去したポリメラーゼを示し、この領域の除去によりヌクレオチド結合ポケットが形成されることが分かる。例えば、異なる配列を使用してこの領域を除去する配列番号１２及び１３又は３３及び３４参照。
【０１４４】
図３ＡはΦ２９のＥ３７５の前後の領域におけるΦ２９様ポリメラーゼの配列アラインメントを示す。図３Ｂの上段３図はΦ２９ポリメラーゼの構造を示す。３７５位のグルタミン酸（矢印で示す）は次に入ってくるｄＮＴＰの三リン酸部分と接触する正電荷残基（Ｋ３７１，Ｋ３７９，Ｋ３８３；ミディアムグレーにダークグレーが点在している部分）の近位に位置する。図３Ｂの下段３図に示すように、四リン酸ヌクレオチドアナログの余分なリン酸に配位させるために、この負電荷アミノ酸（Ｅ）を正電荷アミノ酸（Ｈ）で置換した。更に、この位置の余分な正電荷は三リン酸アナログに配位するのにも利用できる。組換えポリメラーゼの分析によると、Ｅ３７５Ｈ突然変異はリン酸標識ヌクレオチドアナログを組込むために酵素の反応速度を改善したと思われる（下記実施例３参照）。この位置に中性残基を導入するため、及び／又は、例えばイネーブル機能への配座変化を容易にするために、突然変異体Ｅ３７５Ｓも構築した。配列番号４−７及び２５−２８も参照。
【０１４５】
図４ＡはΦ２９のＥ４８６の前後の領域におけるΦ２９様ポリメラーゼの配列アラインメントを示す。図４Ｂの上段３図はΦ２９ポリメラーゼの構造を示し、Ｅ４８６の位置を矢印で示す。下段３図に示すように、Ｅ４８６をアラニン残基で置換すると、触媒カルボン酸（Ｄ２４９及びＤ４５８，白で示す）の近傍の活性部位領域に余分な空間が形成され、負電荷が除去される。別の例として、Ｅ４８６をアスパラギン酸残基で置換すると、炭素が除去され、負電荷を維持しながらヌクレオチドアナログ結合の立体干渉が軽減する。配列番号９−１０及び３０−３１も参照。
【０１４６】
図５ＡはΦ２９のＫ５１２の前後の領域におけるΦ２９様ポリメラーゼの配列アラインメントを示す。図５Ｂの上段３図はΦ２９ポリメラーゼの構造を示す。Ｋ５１２（矢印で示す）は残基５０５−５２５領域から突出し、次に入ってくるｄＮＴＰとの結合部位の開口を部分的に塞ぐ。下段３図に示すように、Ｋ５１２をアラニン残基で置換すると、活性部位領域へのヌクレオチドアナログ導入の立体妨害が減り、結合ポケットに入るための余分なスペースが得られる。配列番号１１及び３２も参照。
【０１４７】
図６ＡはΦ２９のＫ１３５の前後の領域におけるΦ２９様ポリメラーゼの配列アラインメントを示す。図６Ｂの上段３図はΦ２９ポリメラーゼの構造を示す。Ｋ１３５（矢印で示す）は次に入ってくるｄＮＴＰとの結合部位の開口に突出している。下段３図に示すように、Ｋ１３５をアラニン残基で置換すると、活性部位領域へのヌクレオチドアナログ導入の立体妨害が減り、結合ポケットに入るための余分なスペースが得られる。配列番号３及び２４も参照。
【実施例３】
【０１４８】
組換えポリメラーゼのスクリーニング及び特性決定
実施例２に記載したように作製するか、又は本質的に任意の他の合理的もしくはランダム突然変異誘発ストラテジーにより作製した組換えポリメラーゼを場合により特性決定し、各種天然及び／又はヌクレオチドに対するその特性を決定する。組換えポリメラーゼを特性決定するための代表的な５段階プロトコールの１例を以下に記載する。
【０１４９】
組換えポリメラーゼをまず蛋白調製物の品質と基本的触媒活性について評価する。天然（野生）ヌクレオチドでポリメラーゼの活性を分析し、その比活性（単位／ｍｇ）を決定する。触媒能をもつ突然変異体のみを次段階に選択する。
【０１５０】
「トラップ」（未標識競合ＤＮＡ又はヘパリン）の存在下で実施するプライマー伸長反応でポリメラーゼのプロセッシビティ（解離／ｋｂ）を推定する。プロセッシビティアッセイは天然ヌクレオチドによる連続重合試験（重合再開なし）で長いＤＮＡ産物を合成する能力を維持する突然変異体を選択するように設計する。プロセッシビティが有意に低下した突然変異体は次段階に選択しない。
【０１５１】
１０μＭのアナログ４種（Ａ４８８ｄＡ４Ｐ，Ａ６３３ｄＣ４Ｐ，Ａ５４６ｄＧ４Ｐ及びＡ５９４ｄＴ４Ｐ）と環状鋳型（ＡＧＴＣ，反復ＡＧＴＣモチーフから主に構成される７２量体環状鋳型）による重合速度（塩基数／分）を測定する。
【０１５２】
環状鋳型（ＡＧＴＣ）を使用してＡ４８８ｄＣ４Ｐ及びＡ５６８ｄＣ４Ｐと天然ヌクレオチドのサブセット（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）の重合速度とＫｍを決定することにより最も有望なポリメラーゼ突然変異体を特性決定する。アナログＡ４８８ｄＣ４Ｐ（代表的な良好な基質）及びＡ５６８ｄＣ４Ｐ（代表的な好ましくない基質）の濃度を数種に変化させて速度を測定する。
【０１５３】
ヌクレオチドアナログによるプライマー伸長アッセイを使用し、末端リン酸標識ヌクレオチドアナログについて反応速度が改善されたポリメラーゼ突然変異体の初期選択を実施し、実験条件下でアナログの速度を決定する。１０μＭ  Ａ４８８ｄＣ４Ｐ、２０μＭ  ３ｄＮＴＰ−ｄＣＴＰ、及び環状鋳型（ＡＧＴＣ）の存在下と、１０μＭ  Ａ５６８ｄＣ４Ｐ、２０μＭ  ３ｄＮＴＰ−ｄＣＴＰ、及び環状鋳型（ＡＧＴＣ）の存在下の２種の別個の実験を一般に実施する。
【０１５４】
例えば、忠実度、滞留時間（１／Ｖｍａｘ）、エキソヌクレアーゼ活性（例えば１０ｕＭ，ミスマッチプライマーの伸長による）、活性率（バースト頻度）、ｄＮＴＰ、ｄＮ５Ｐ、リンカー単独アナログ及び／又はＦＲＥＴアナログの速度、Ｍｎ２＋に対するＭｇ２＋の反応速度（アナログの利用能）、光損傷感受性、１本鎖ＤＮＡ結合、モノマー状態（例えばゲル濾過又は天然ゲルを使用）、及び／又は貯蔵寿命等の組換えポリメラーゼの他の特徴を場合により試験する。
【０１５５】
代表的な組換えΦ２９ポリメラーゼの蛋白品質評価と重合速度及び速度定数測定の結果を夫々表１及び２に示す。
【表２】
2009521227.tif 000009
【表３】
2009521227.tif 000010
Ａ列：呼称。
Ｂ列：  ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ（Ｇフォークなし）、２０μＭのＶ；天然ヌクレオチド３種（ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＡＴＰ）を使用するアッセイにより測定。
Ｃ列：  Ａ４８８ｄＣ４Ｐ、ｋｅｌ（ｂｐ／分）；重合速度のヌクレオチドアナログ濃度依存性を試験することにより測定。
Ｄ列：  Ａ４８８ｄＣ４Ｐ、Ｋｍ；  重合速度のヌクレオチドアナログ濃度依存性を試験することにより測定。
Ｅ列：  Ａ５６８ｄＣ４Ｐ、ｋｅｌ；  重合速度のヌクレオチドアナログ濃度依存性を試験することにより測定。
Ｆ列：  Ａ５６８ｄＣ４Ｐ、Ｋｍ；  重合速度のヌクレオチドアナログ濃度依存性を試験することにより測定。
Ｇ列：  Ａ４８８ｄＣ４Ｐ、１０μＭのＶ；低濃度（１０μＭ）のアナログ１種と天然ヌクレオチド３種を使用するアッセイにより測定。
Ｈ列：  Ａ５６８ｄＣ４Ｐ、１０μＭのＶ；低濃度（１０μＭ）のアナログ１種と天然ヌクレオチド３種を使用するアッセイにより測定。
Ｉ列：  Ａ４８８ｄＡ４Ｐ、Ａ６３３ｄＣ４Ｐ、Ａ５４６ｄＧ４Ｐ、Ａ５９４ｄＴ４Ｐ、１０μＭのＶ；末端標識ヌクレオチドアナログ４種を使用するアッセイにより測定。
Ｊ列：  プロセッシビティ（ｋｂ−１）；プロセッシビティアッセイにより測定。
【０１５６】
低濃度（１０μＭ）のアナログ１種と天然ヌクレオチド３種を使用するアッセイ
ＤＮＡプライマーをアニールさせたＤＮＡ鋳型（反復配列ＡＧＴＣから主に構成される７２ヌクレオチド環状ＤＮＡ）の存在下でΦ２９ＤＮＡポリメラーゼ（親酵素又は突然変異体）をプレインキュベートした。プレインキュベーションミックスには天然ヌクレオチド３種（ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ及びｄＧＴＰ）と１０μＭ濃度の末端標識ヌクレオチドアナログ（Ａ４８８ｄＣ４Ｐ又はＡ５６８ｄＣ４Ｐ）を加える。短時間プレインキュベーション後、ＭｎＣｌ２で反応を開始した。ＥＤＴＡで反応を停止し、アガロースゲル電気泳動を使用して産物を分離し、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。ＤＮＡポリメラーゼにより生成されたＤＮＡの平均長を測定し、これを使用して重合速度を推定した。例えば表２のＧ及びＨ列参照。
【０１５７】
末端標識ヌクレオチドアナログ４種を使用するアッセイ
本アッセイでは全ヌクレオチドを末端標識（いずれも１０μＭのＡ４８８ｄＡ４Ｐ、Ａ６３３ｄＣ４Ｐ、Ａ５４６ｄＧ４Ｐ、Ａ５９４ｄＴ４Ｐ）する以外は、基本的に上記「低濃度（１０μＭ）のアナログ１種と天然ヌクレオチド３種を使用するアッセイ」なる表題のセクションに記載した通りの手順とする。例えば表２のＩ列参照。
【０１５８】
天然ヌクレオチド３種（ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＡＴＰ）を使用するアッセイ
天然ヌクレオチド３種（ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ及びｄＧＴＰ）をプレインキュベーションミックスに加え、ＤＮＡプライマーをアニールさせたＤＮＡ鋳型（Ｇ残基を含まない反復配列ＣＡＴから主に構成される環状ＤＮＡ）の存在下でΦ２９ＤＮＡポリメラーゼ（親酵素又は突然変異体）をプレインキュベートした。その後の全段階は基本的に上記「低濃度（１０μＭ）のアナログ１種と天然ヌクレオチド３種を使用するアッセイ」なる表題のセクションに記載した通りに実施した。例えば表２のＢ列参照。
【０１５９】
重合速度のヌクレオチドアナログ濃度依存性
ＤＮＡプライマーをアニールさせたＤＮＡ鋳型（反復配列ＡＧＴＣから主に構成される７２ヌクレオチド環状ＤＮＡ）の存在下でΦ２９ＤＮＡポリメラーゼ（親酵素又は突然変異体）をプレインキュベートした。プレインキュベーションミックスは更に天然ヌクレオチド３種（ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ及びｄＧＴＰ各２０μＭ）と各種濃度の末端標識アナログ（Ａ４８８ｄＣ４Ｐ又はＡ５６８ｄＣ４Ｐ）を加える。その後の全段階は基本的に上記「低濃度（１０μＭ）のアナログ１種と天然ヌクレオチド３種を使用するアッセイ」なる表題のセクションに記載した通りに実施した。各アナログ濃度でＤＮＡポリメラーゼにより生成されたＤＮＡ産物の平均長を測定し、結果を式：ｋ＝ｋｅｌ＊［Ｓ］＊（Ｋｄ＋［Ｓ］）−１（式中、ｋは実測重合速度であり、ｋｅｌは飽和基質濃度における重合速度（ｋｅｌは複数残基の組込みに相当する）であり、［Ｓ］は基質濃度である）にフィットさせた。例えば表２のＣ、Ｄ、Ｅ、及びＦ列参照。
【０１６０】
プロセッシビティアッセイ
ＤＮＡプライマーをアニールさせたＤＮＡ鋳型（反復配列ＡＧＴＣから主に構成される７２ヌクレオチド環状ＤＮＡ）の存在下でΦ２９ＤＮＡポリメラーゼ（親酵素又は突然変異体）をプレインキュベートした。短時間プレインキュベーション後、ＭｎＣｌ２、ｄＮＴＰ及びヘパリンを含有する開始ミックスで反応を開始した。反応にヘパリンを加えると、鋳型／プライマーからのポリメラーゼ解離後に重合を再開できなくなるので、生成された全ＤＮＡ産物が連続重合試験の結果となる。２０分間インキュベーション後、ＥＤＴＡで反応を停止し、アガロースゲル電気泳動を使用して産物を分離し、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。基本的にＢｉｂｉｌｌｏ  Ａ，Ｅｉｃｋｂｕｓｈ  ＴＨ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００２  Ｓｅｐ  ２０；２７７（３８）：３４８３６−４５，Ｅｐｕｂ  ２００２  Ｊｕｌ５に記載されているようにＤＮＡ産物を分析した。結果を単一指数方程式：Ａ＊ｅｘｐ（−Ｐｏｆｆ＊ｋｂ）（式中、Ａは振幅であり、Ｐｏｆｆは早期ポリメラーゼ解離確率であり、ｋｂはＤＮＡ長（１０００ヌクレオチド）である）にフィットさせた。鎖伸長確率（プロセッシビティ）はＰｏｆｆ値を１．０から引くことにより容易に計算することができる。例えば表２のＪ列参照。
【０１６１】
代表的組換えポリメラーゼの配列
野生型Φ２９及び代表的組換えポリメラーゼのアミノ酸及びポリヌクレオチド配列を表３に示す。
【表４−１】
2009521227.tif 000011
【表４−２】
2009521227.tif 000012
【表４−３】
2009521227.tif 000013
【表４−４】
2009521227.tif 000014
【表４−５】
2009521227.tif 000015
【表４−６】
2009521227.tif 000016
【表４−７】
2009521227.tif 000017
【表４−８】
2009521227.tif 000018
【表４−９】
2009521227.tif 000019
【表４−１０】
2009521227.tif 000020
【表４−１１】
2009521227.tif 000021
【表４−１２】
2009521227.tif 000022
【表４−１３】
2009521227.tif 000023
【表４−１４】
2009521227.tif 000024
【０１６２】
ヌクレオチドアナログによる組換えポリメラーゼの特性決定
代表的な組換えΦ２９ポリメラーゼと各種ヌクレオチドアナログについてＫｍとＶｍａｘを測定した。結果を表４に示す。
【表５】
2009521227.tif 000025
１  Ａｌｅｘａ６３３−Ｏ−ｄＣ４Ｐ（本明細書ではＡ６３３ｄＣ４Ｐとも言う）で測定。
２  Ａｌｅｘａ５５５−Ｃ２−ｄＴ４Ｐで測定。このアナログはδリン酸とラベル部分の間に２炭素リンカー（「Ｃ２」）をもち、下記構造：をもつ。
【化７】
2009521227.tif 000026
３  Ａｌｅｘａ５５５−Ｃ２−ｄＴＴＰで測定。
４  Ａｌｅｘａ５３２−Ｏ−ｄＧ４Ｐで測定。
【０１６３】
各種ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログを使用して一連の代表的な組換えΦ２９ポリメラーゼを特性決定した。結果を表５に示す。
【表６】
2009521227.tif 000027
１  比＝１ｍＭ  ＭｎＣｌ２における（５μＭ  Ａ６３３ｄＣ４Ｐ＋２０μＭ  ｄＡ，ｄＧ，ｄＴＴＰの速度）／（２５μＭ  Ａ６３３ｄＣ４Ｐ＋２０μＭ  ｄＡ，ｄＧ，ｄＴＴＰの速度）。比が大きいほどＫｍは小さい。
２  ２５μＭ  Ａ６３３ｄＣ４Ｐ＋２０μＭ  ｄＡ，ｄＧ，ｄＴＴＰの速度。
３  １０μＭ  Ａｌｅｘａ４８８−Ｏ−ｄＡ４Ｐ、１０μＭ  ＦＡＭ−Ａｌｅｘａ５３２−Ｏ−ｄＧ４Ｐ、１０μＭ  ＦＡＭ−  Ａｌｅｘａ５９４−Ｏ−ｄＴ４Ｐ、１０μＭ  Ａｌｅｘａ６３３−Ｏ−ｄＣ４Ｐ＋１  ｍＭ  ＭｎＣｌ２の速度。ヌクレオチドアナログ４種の代表的組み合わせによるＫｍ及びＶｍａｘ両者の指標である。
４バックグラウンド突然変異（存在する場合）。組換えポリメラーゼは野生型Φ２９ポリメラーゼ＋突然変異１＋突然変異２に対応する。
５固定化及び／又は精製用タグ。
【０１６４】
図７Ａに模式的に示すようなＦＲＥＴ停止型フローアッセイを使用して代表的な組換えΦ２９ポリメラーゼとヌクレオチドアナログＡ５９４−ｄＴ４Ｐの結合速度と産物放出速度を測定した。図７にΦ２９  Ｎ６２Ｄ（Ｂ）、Ｎ６２Ｄ：Ｅ３７５Ｙ（Ｃ）、及びＮ６２Ｄ：Ｅ３７５Ｗ（Ｄ）の結果をグラフで示す。産物放出速度を表６に示す。
【０１６５】
Ｅ３７５Ｙ及びＥ３７５Ｗ突然変異体ポリメラーゼは結合速度と産物放出速度の増加を示し、親酵素よりも良好にアナログを利用することが分かった。
【表７】
2009521227.tif 000028
【０１６６】
図８Ａに模式的に示すようなＦＲＥＴ停止型フローアッセイを使用して代表的な組換えΦ２９ポリメラーゼとヌクレオチドアナログＡｌｅｘａ５６８−ｄＡ４Ｐ（Ａ５６８−ｄＡ４Ｐとも言う）の相対分岐速度（取込まれないアナログの解離、即ち基質解離）も測定した。この手法では、ヌクレオチドアナログ上の対応する色素と共にＦＲＥＴに適合性のＦＲＥＴドナー色素で標識した鋳型を使用する。プライマーは取込みを生じないように３’末端をジデオキシヌクレオチドで停止する。アナログを酵素−鋳型−ジデオキシプライマー複合体とプレミックスする。停止型フロー装置で、解離後にアナログの再結合を阻止するための「トラップ」として機能する過剰の対応する天然ヌクレオチド（本実施例では天然ｄＡＴＰ）とこの予備形成した複合体を迅速に混合する。アナログの解離／分岐速度をモニターする手段としてドナー色素蛍光の増加をモニターする。
【０１６７】
図８にΦ２９  Ｎ６２Ｄ（Ｂ）、Ｎ６２Ｄ：Ｅ３７５Ｙ（Ｃ）、及びＮ６２Ｄ：Ｅ３７５Ｗ（Ｄ）の結果をグラフで示す。分岐速度を表７に示す。
【表８】
2009521227.tif 000029
【０１６８】
その他の代表的な組換えポリメラーゼ
本発明のポリメラーゼとしては、単独又は他の突然変異（例えば本明細書に記載する他の突然変異）との組み合わせとして表８に示す突然変異の任意のものを含むΦ２９ポリメラーゼ（又はそのホモログ）が挙げられる。例えば、本発明のポリメラーゼとしては、場合により表８に特定するような突然変異の組み合わせを含むΦ２９ポリメラーゼ（又はそのホモログ）が挙げられる。
【表９−１】
2009521227.tif 000030
【表９−２】
2009521227.tif 000031
【表９−３】
2009521227.tif 000032
【表９−４】
2009521227.tif 000033
【０１６９】
Φ２９ポリメラーゼの数種の突然変異が従来文献に記載されている。Ｎ６２Ｄ突然変異については、ｄｅ  Ｖｅｇａら（１９９６）“Ｐｒｉｍｅｒ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｔ  ｔｈｅ  ３’−５’  ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｐｈｉ２９ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｗｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｈｉｇｈｌｙ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｉｎ  ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ”  ＥＭＢＯ  Ｊ．１５（５）：１１８２−９２参照。Ｄ１２Ａ突然変異と、Ｅ１４位、６６位、１６５位、１６９位、１２位と６６位、及び１４位と６６位の突然変異については、Ｅｓｔｅｂａｎら（１９９４）“３’−＞５’  ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｐｈｉ  ２９ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆａｖｏｒｉｎｇ  ａ  ｍｅｔａｌ  ｉｏｎ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ”  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６９（５０）：３１９４６−５４参照。Ｓ２５２の突然変異については、Ｂｌａｓｃｏら（１９９３）“Ｐｈｉ  ２９  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ．Ｒｅｓｉｄｕｅ  ＡＳＰ２４９  ｏｆ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｍｏｔｉｆ  ‘Ｄｘ２ＳＬＹＰ’  ｉｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｏｒ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ”  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６８（３２）：２４１０６−１３参照。Ｙ２５４の突然変異については、Ｂｌａｓｃｏら（１９９２）“Ｐｈｉ  ２９  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ．Ｍｕｔａｎｔｓ  ｉｎ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  Ｔｙｒ２５４  ａｎｄ  Ｔｙｒ３９０  ａｒｅ  ａｆｆｅｃｔｅｄ  ｉｎ  ｄＮＴＰ  ｂｉｎｄｉｎｇ”  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６７（２７）：１９４２７−３４参照。Ｋ３７１の突然変異については、Ｔｒｕｎｉｇｅｒら（２００２）“Ａ  ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ  ｃｈａｒｇｅｄ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｏｆ  ｐｈｉ２９ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ｈｉｇｈｌｙ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ  ｆｒｏｍ  ｆａｍｉｌｉｅｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ，ｉｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｎｃｏｍｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ”  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０（７）：１４８３−９２参照。Ｋ３７９の突然変異については、Ｔｒｕｎｉｇｅｒら（２００４）“Ｔｗｏ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ  Ｃｈａｒｇｅｄ  Ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｏｆ  φ２９ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｉｍｅｄ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ，ａｒｅ  Ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  Ｓｔａｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｃｏｍｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ”  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３３５（２）：４８１−４９４参照。Ｎ３８７の突然変異については、Ｂｌａｓｃｏら（１９９３）“Ｐｈｉ  ２９  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ．Ｔｈｅ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｍｏｔｉｆ  ‘Ｋｘ３ＮＳｘＹＧ’  ｉｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉ��  ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｐｒｉｍｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｄＮＴＰ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ”  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６８（２２）：１６７６３−７０参照。Ｙ３９０の突然変異については、Ｂｌａｓｃｏら（１９９２）“Ｐｈｉ  ２９  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ．Ｍｕｔａｎｔｓ  ｉｎ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  Ｔｙｒ２５４  ａｎｄ  Ｔｙｒ３９０  ａｒｅ  ａｆｆｅｃｔｅｄ  ｉｎ  ｄＮＴＰ  ｂｉｎｄｉｎｇ”  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６７（２７）：１９４２７−３４参照。Ｄ４５６の突然変異については、Ｂｅｒｎａｄら（１９９０）“Ｔｈｅ  ｈｉｇｈｌｙ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｍｏｔｉｆ  Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ  ｉｎ  ａｌｐｈａ−ｌｉｋｅ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ  ｐｈｉ  ２９ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｉｍｅｄ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ”  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．８７（１２）：４６１０−４参照。
【実施例４】
【０１７０】
ＤＮＡポリメラーゼの酵素反応速度をモデル化及び試験し、全動的プロセスと自由変数を同時に割り当てるためのコンピューターフレームワーク
ポリメラーゼ反応状態遷移を離散時間ステップについて確率行列に保存する。状態確率分布のベクトルは連続モデルに従う多数のポリメラーゼ状態から特定ポリメラーゼを発見する確率を表すことができる。状態分布ベクトルと状態遷移確率行列の線形代数乗算により、状態遷移確率行列の離散時間ステップに等しい時間経過の効果を表すポリメラーゼ状態分布の新しいベクトルが得られる。
【数１】
2009521227.tif 000034
状態遷移確率行列を特定指数乗（例えば１００）に増加することにより、特定数の離散時間ステップ（例えば１００時間ステップ）の時間経過をシミュレートする。多数の離散時間ステップを使用してＤＮＡ重合をシミュレートする。定常状態モデル。
【数２】
2009521227.tif 000035
遷移速度はユーザーにより定義される。確率行列は鋳型配列とハードコード化状態遷移規則を使用して自動作成する。試薬濃度、反応速度値、及び確率行列構成等の各種パラメーターは本実施例に記載するパラメーターと異なっていてもよい。
【０１７１】
定常状態ポリメラーゼ反応速度モデルの１例を以下に示す。
【表１０】
2009521227.tif 000036
Ｒｐ  ＝  触媒速度。
Ｃ６  ＝  状態６のポリメラーゼを発見する確率。
Ｋ６１  ＝  状態６から状態１へのポリメラーゼの遷移速度。
ｋｉｊ  ＝  反応速度定数。
Ｐｉｊ  ＝  ｋｉｊΔｔ反応速度定数。
Ｐｉｊ  ＝  ｉ→ｊ確率。
＊  Ｋ５４≒０（ピロリン酸濃度として）。
↓
Ｒｐ  ＝  Ｃ６Ｋ６１  −  Ｃ１Ｋ１６  ＝触媒速度。
Ｒｐ  ＝  飽和まで増加するヌクレオチド濃度条件としてＫ６１→∞，  Ｃ６→  ０における（Ｒｐ）ｍａｘ。
（Ｒｐ）ｍａｘを求めるには、
【表１１】
2009521227.tif 000037
＊Δｔ↓につれて、Ｒｐの漸近線を求める。
【０１７２】
巨大行列
ポリメラーゼ−鋳型−ｄＮＴＰ系の可能な全反応状態を捕えるための単一２−Ｄ行列を以下に示す。
【表１２】
2009521227.tif 000038
【０１７３】
＊この結果、以下の状態から構成される６５６状態行列となる。
【表１３】
2009521227.tif 000039
＊この場合、状態７は鋳型からのポリメラーゼの解離であり、場合により、発生しないものとして単純化することができる。
【０１７４】
この場合には、ＤＮＡ鋳型は反復配列（ＡＣＧＴ）である。鋳型反復配列が延長するにつれて状態も比例して増加し、延長した鋳型反復配列が元の鋳型配列を含まなくなる程度まで増加する。例えば、配列：
．．．［ＡＣＧＴ］ＡＣＧＴ．．．
に作成される確率遷移行列は配列：
．．．［ＡＣＧＴＡＣＧＴ］ＡＣＧＴ．．．．
に作成される行列と等価になる。他方、配列：
．．．［ＡＡＣＣＧＧＴＴ］ＡＡＣＣ．．．
に作成される確率遷移行列は元の行列で許容されない多数の状態遷移（例えば鋳型配列中の「Ａ」から別の「Ａ」へのポリメラーゼ転位）を含むので異なる。更に、この反復配列は４個ではなく８個のワトソン・クリック塩基を含むので、６５６ではなく１，３１２状態の行列が作成される。
【０１７５】
状態によっては全変数を定義する必要はない（上記表参照）。例えば、状態６にまだ取込まれていないヌクレオチドの特徴は状態６の実質に影響しない。
【表１４】
2009521227.tif 000040
【０１７６】
＊２状態間の遷移速度は以下のように定義されよう。
【表１５】
2009521227.tif 000041
【０１７７】
Ｐ５６ＴＡｘＣ＝ｋ５６ＴＡｘＣ＊ｔｉｍｅ＿ｓｔｅｐ
式中、Ｐ５６ＴＡｘＣは「ＴＡｘＣ」により表される付加ヌクレオチド−鋳型条件で状態５から状態６への転位を完了するポリメラーゼの確率である。Ｋ５６ＴＡｘＣはこの転位の遷移速度である。
【０１７８】
一般に、この６５６状態システムでは、定義する遷移速度数は１５６８である。ユーザーが入力する必要がある入力数を減らすために実施することができる近似法には多数のものがある。
【０１７９】
以下の組み合わせは全状態遷移で同等に処理することができる：
鋳型ヌクレオチド：ＡＣＧＴ
ＴＧＣＡ。
同様に、全ミスマッチを等しく処理することができる。
Ｋ１２ＡＴ０Ａ＝ｋ１２ｘＺ０Ｚ
Ｋ１２ＣＧ０Ｔ＝ｋ１２ｘＺ０Ｚ
Ｋ１２ＣＴ０Ｔ＝ｋ１２ｘＹ０Ｚ
Ｋ１２ＣＴ１Ｃ＝ｋ１２ｘＹ１Ｙ
Ｘ＝任意変数
Ｙ＝任意ミスマッチ
Ｚ＝任意マッチ。
【０１８０】
こうしてユーザー入力選択をユニークな遷移速度変数〜１００個まで減らす。明示的に定義された全速度は適切なユーザー入力に自動的に割り当てられる。
【表１６】
2009521227.tif 000042
【０１８１】
ユーザーに定義される遷移速度を行列に自動的に挿入する目的で対称を利用するために、６５６状態行列の構成を変更することができる。
【表１７】
2009521227.tif 000043
【０１８２】
これには２つの利点がある。
（１）行列を僅かに変更するだけで鋳型を伸長することができる。反復配列の各鋳型塩基が１６４状態を追加する。従来は、新しい状態を行列に組み入れる必要があった。
【表１８】
2009521227.tif 000044
（２）行列は以前よりも対称度が高いので、自動コードを使用して行列を構築し易い。
【数３】
2009521227.tif 000045
７個の「ｅｖａｌ」ステートメント（人工的に構築されたコマンドを評価する関数）は７個のポリメラーゼ状態を構築する。
【０１８３】
これを更に拡張し、任意所与鋳型配列の行列を自動的に構築した。
【０１８４】
全該当試薬（ポリメラーゼ、鋳型、ヌクレオチド等）の濃度を含む濃度行列の構築により状態遷移確率行列の作成を更に自動化する。この濃度行列は（線形濃度限度内で）
ｋｉｎｅｔｉｃ＿ｍａｔｒｉｘ＝ｒａｔｅ＿ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ＿ｍａｔｒｉｘ  ＊  ｃｏｎｃ＿ｍａｔｒｉｘ
ｓｔａｔｅ＿ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ＿ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ＿ｍａｔｒｉｘ＝ｋｉｎｅｔｉｃ＿ｍａｔｒｉｘ  ＊  ｔｉｍｅ＿ｓｔｅｐ
となるように速度遷移行列を補完し、上記式では、速度遷移行列の各要素に濃度行列におけるその対応する依存変数を乗じている。このように、濃度依存状態遷移を捕える（例えばヌクレオチド取込み速度はヌクレオチド濃度に依存する）。濃度に依存しない行列の要素は変化させない。非線形濃度依存性は反応速度行列を定義する非線形式を使用して表すことができる。
【０１８５】
状態遷移確率行列を以下に示す。
【表１９】
2009521227.tif 000046
上記式中、行列に挿入された各確率値はユーザーに定義された遷移速度、濃度値、及び離散時間ステップを使用して計算している。なお、行の最初の要素は状態間に遷移がない確率であり、従って、１００％とこの特定状態以外の全状態遷移の確率の差である。
【０１８６】
シミュレーション効率の増加：
状態遷移確率行列を特定指数乗（例えば１００）に増加することにより、特定数の離散時間ステップ（例えば１００時間ステップ）の時間経過をシミュレートする。
多数のポリメラーゼ−鋳型複合体を同時にベクトル化することによりシミュレーションの効率を更に改善することができる。
【数４】
2009521227.tif 000047
【０１８７】
速度限界：ポリメラーゼが鋳型の何処に存在するかを確認することによりＤＮＡ合成を追跡することができる。
【化８】
2009521227.tif 000048
【０１８８】
移動が早過ぎる（即ち遷移行列指数中の時間ステップ数が多過ぎる）と、ポリメラーゼが「Ａ」から直接「Ｇ」に移り、転位が順方向であったのか逆方向であったのか分からなくなる可能性がある。従って、ｋｉｎｅｔｉｃ＿ｍａｔｒｉｘの指数時間係数を定義する誤差限界（〜１ｅ−６）を設定する。速度限界は「Ａ」から「Ｇ」への逆方向転位の確率と「Ａ」から「Ｔ」への順方向転位の確率のいずれもが誤差率限界を越えないように設定する。ＤＮＡ反復配列が長いほうが速く移動できるが、反復配列が長過ぎると、コンピューターの負担が増す。
【０１８９】
このプログラムの別のアプリケーションとして試薬消費速度のシミュレーションが挙げられる。非常に大きなステップサイズで移動し、鋳型に沿ってポリメラーゼ移動をシミュレーションする。このアプローチは（離散状態の鋳型１０００＋個ではなく）状態の連続分布におけるただ１個の鋳型を使用する。こうして試薬消費を継時的に追跡する。
【０１９０】
システムの現在の集合と遷移速度定数に基づいて試薬の濃度変化を求める：
【数５】
2009521227.tif 000049
【０１９１】
これらの確率がｋｉｎｅｔｉｃ＿ｍａｔｒｉｘから１ｅ−６ｓｅｃ時間ステップの場合には、１ループサイクル（経過時間＝ｎｕｍ＿ｓｔｅｐｓ＊１ｅ−６ｓｅｃ）における試薬ｄＴＡＰ（天然）の濃度変化（モル）は以下の通りである。
【数６】
2009521227.tif 000050
Ｎが大きくなるにつれて、各ループサイクルの濃度調整は大きくなり、不正確になる。これを使用してｋｉｎｅｔｉｃ＿ｍａｔｒｉｘの指数時間係数を設定する。
濃度低下に対する反応速度行列ジャンプをプロットする図９参照。
【０１９２】
ｎｕｍ＿ｓｔｅｐｓ＝１ｅ６としても「十分に」正確な濃度曲線が得られる（ステップサイズが減少するにつれて平滑に近づく点に留意されたい）。
【０１９３】
得られる４０９６×４０９６正方行列は妥当なメモリ限界である。
【０１９４】
このプログラムの別のアプリケーションとして連続モデル又は計数モデルを使用するポリメラーゼミスマッチ率の推定が挙げられる。一般に、２つ前の鋳型−ヌクレオチド対は常にマッチであると仮定する。（これは行列サイズの４分の１の縮小であり、エキソヌクレアーゼ活性が大きくない限り、誤差は小さくなるはずである）。
【０１９５】
従って、前のミスマッチを含む状態５からの任意順方向転位は永久ミスマッチとなる（バックアップすればそうはならない）。
順方向合計転位率＝Ｃ５．＊Ｃ６．−Ｃ６．＊ｋ６５
反応＝（ミスマッチ率）／（合計率）
Ｃ５は状態５のポリメラーゼを含む全行列状態の濃度を表す（１２８頁参照）。
ｋ５６は対応する全順方向転位率の完全なセットである。
順方向ミスマッチ転位＝Ｃ５（ｍ）．＊ｋ５６（ｍ）−Ｃ６（ｍ）．＊ｋ６５（ｍ）
（逆方向転位では、前のミスマッチを含むポリメラーゼ状態５にはならない。上記参照）。
【０１９６】
前の鋳型／ヌクレオチドミスマッチをもち且つ同様に順方向に転位する（ミスマッチを永久にする）ポリメラーゼ／鋳型複合体数を計数する計数モデルを作成し、これを全ポリメラーゼで平均してミスマッチ率を得ることもできる。これは上記連続モデル推定値とほぼ同一範囲となる。
１）まず、Ｐａｔｅｌら（１９９１）“Ｐｒｅ−Ｓｔｅａｄｙ−Ｓｔａｔｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅ  ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ−Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｍｕｔａｎｔ”  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：５１１−５２５に示されているように、全速度定数をＴ７ポリメラーゼと等しくなるように設定する。
【表２０】
2009521227.tif 000051
【０１９７】
特定速度定数等。
Ｋ６１≧５０μｍ−１ｓ−１
Ｋ１２＝３００μｍ−１ｓ−１
Ｋ２３≧９０００μｍ−１ｓ−１
Ｋ３４＝１２００μｍ−１ｓ−１
Ｋ６４５≧１０００μｍ−１ｓ−１
Ｋ１６≧１０００μｍ−１ｓ−１
Ｋ２１＝１００μｍ−１ｓ−１
Ｋ３２＝１８，０００μｍ−１ｓ−１
Ｋ４３＝１８μｍ−１ｓ−１
Ｋ５４≧０．５μｍ−１ｓ−１
（Ｖｍａｘ）ｎａｔｉｖｅ＝５０ｂｐｓ
（Ｖｍａｘ）ａｎａｌｏｇ＝５ｂｐｓ
（ｋｍ）ｎａｔｉｖｅ＝０．２μｍ
（ｋｍ）ａｎａｌｏｇ＝６μｍ
２）ｄＮＴＰ濃度飽和（≧１ｍＭ）を使用し、（主に）ｋ１２と（必要に応じて）他の速度定数を変化させることによりＶｍａｘ＝５０ｂｐｓを設定する。全アナログ遷移速度を天然ｄＮＴＰ遷移速度と同一に維持する。当面、解離を抑える（速度→０）。
３）アナログ−ｄＮＴＰ濃度飽和（≧１ｍＭ）を使用し、アナログのみのｋ４５を変化させることによりＶｍａｘ＝５ｂｐｓを設定する。
４）天然ｄＮＴＰ濃度を０．２μｍに設定し、Ｖ＝２５ｂｐｓとなるようにｋ６１（天然のみ）を変化させることにより（ｋｍ）ｎａｔｉｖｅ＝０．２μｍを設定する。
５）アナログｄＮＴＰ濃度を６μｍに設定し、Ｖ＝２．５ｂｐｓとなるようにｋ６１（アナログのみ）を変化させることにより（ｋｍ）ｎａｔｉｖｅ＝６μｍを設定する。
天然ｄＮＴＰ
ｋ６１＝３６５μｍ−１ｓ−１
ｋ１２＝６０μｍ−１ｓ−１
Ｋ２３＝９０００μｍ−１ｓ−１
ｋ３４＝１２００μｍ−１ｓ−１
ｋ４５＝１０００μｍ−１ｓ−１
ｋ５６＝５００μｍ−１ｓ−１
ｋ１６＝１０μｍ−１ｓ−１
ｋ２１＝１００μｍ−１ｓ−１
ｋ３２＝１８００μｍ−１ｓ−１
ｋ４３＝１８μｍ−１ｓ−１
ｋ５４＝０．５μｍ−１ｓ−１
ｋ６５＝１００μｍ−１ｓ−１
アナログｄＮＴＰ
ｋ６１＝１．１μｍ−１ｓ−１
ｋ１２＝６０μｍ−１ｓ−１
Ｋ２３＝９０００μｍ−１ｓ−１
ｋ３４＝５．５μｍ−１ｓ−１
ｋ４５＝５．５μｍ−１ｓ−１
ｋ５６＝５００μｍ−１ｓ−１
ｋ１６＝１０μｍ−１ｓ−１
ｋ２１＝１００μｍ−１ｓ−１
ｋ３２＝１８００μｍ−１ｓ−１
ｋ４３＝１８μｍ−１ｓ−１
ｋ５４＝０．１μｍ−１ｓ−１
ｋ６５＝１００μｍ−１ｓ−１。
全速度は今後の実験で更に校正されよう。
ｐｏｌ＿ｉｎｄｅｘ．ｍ：ＤＮＡ配列に基づいて必要な全行列指数リスト及びポインターを初期化する。
Ｐｏｌ＿ｒａｔｅｍａｔｒｉｘ．ｍ：全ユニーク速度定数のリストを含むエクセルファイルを入力として取込み、ＤＮＡ配列に基づいて遷移速度行列を作成する。
Ｐｏｌ＿ｃｏｎｍａｔｒｉｘ．ｍ：試薬濃度を取込み、
（全非対角線要素について）確率行列＝ｔｉｍｅ＿ｓｔｅｐ  ＊  ｒａｔｅ＿ｍａｔｒｉｘ  ＊  ｃｏｎｃ＿ｍａｔｒｉｘ
となるように濃度行列を構築する。
Ｐｏｌ＿ｄｎｔｐ＿ｃｏｎｃｕｍｐｔｉｏｎ．ｍ：連続モデルに基づいて試薬消費速度を計算する。
ＰＯＬ＿ｄｎａ．ｍ：ＰＯＬ＿ＤＮＡ、ＰＯＬ＿ＲＥＡＧＥＮＴＳ、ＰＯＬ＿ＣＵＲＶＥＭＡＰの以前の全関数を統合し、
以前の全消費を追跡し、
ＤＮＡ合成長分布を追跡し、
遊離鋳型、完成したｄｓＤＮＡ鋳型、現在処理中の鋳型、可能な複数濃度試験、ユーザー定義された反復ＤＮＡ配列、有限長鋳型を追跡する。
ｐｏｌ＿ｍｅｔａｌ．ｍ：ＰＯＬ＿ＤＮＡの機能縮小版を使用したＭｇ＋消耗実験の完全態様。
【０１９８】
以上、明確に理解できるように本発明を多少詳細に記載したが、本発明の真の範囲を逸脱することなく形態や細部に種々の変更が可能であることは以上の開示から当業者に自明である。例えば、上記全技術及び装置は種々に組合せて使用することができる。本明細書に引用した全刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献は言及によりその開示内容全体を全目的で本明細書に組込み、各刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献を言及により全目的で本明細書に組込むと個々に記載しているものとみなす。
【図面の簡単な説明】
【０１９９】
【図１】タグ付きＮ６２ＤΦ２９ＤＮＡポリメラーゼの発現用ベクターを模式的に示す。
【図２Ａ】図２Ａは残基５０５−５２５の前後の領域におけるΦ２９様ポリメラーゼ（Φ２９配列番号３５、Ｂ１０３配列番号３６、ＰＺＡ配列番号３７、Ｍ２配列番号３８、Ｇ１配列番号３９、ｃｐ−１配列番号４０）の配列アラインメントを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは残基５０５−５２５をもつもの（上段）ともたないもの（下段）のΦ２９の構造を示す。３種の異なる角度から見た構造図を示す。
【図３Ａ】図３ＡはΦ２９のＥ３７５の前後の領域におけるΦ２９様ポリメラーゼ（Φ２９配列番号４１、Ｂ１０３配列番号４２、ＰＺＡ配列番号４３、Ｍ２配列番号４４、Ｇ１配列番号４５、ｃｐ−１配列番号４６）の配列アラインメントを示す。
【図３Ｂ】図３ＢはΦ２９（上段）とＥ３７５Ｈ突然変異体（下段）の構造を示す。３種の異なる角度から見た構造図を示す。
【図４Ａ】図４ＡはΦ２９のＥ４８６の前後の領域におけるΦ２９様ポリメラーゼ（Φ２９配列番号４７、Ｂ１０３配列番号４８、ＰＺＡ配列番号４９、Ｍ２配列番号５０、Ｇ１配列番号５１、ｃｐ−１配列番号５２）の配列アラインメントを示す。
【図４Ｂ】図４ＢはΦ２９（上段）とＥ４８６Ａ突然変異体（下段）の構造を示す。３種の異なる角度から見た構造図を示す。
【図５Ａ】図５ＡはΦ２９のＫ５１２の前後の領域におけるΦ２９様ポリメラーゼ（Φ２９配列番号５３、Ｂ１０３配列番号５４、ＰＺＡ配列番号５５、Ｍ２配列番号５６、Ｇ１配列番号５７、ｃｐ−１配列番号５８）の配列アラインメントを示す。
【図５Ｂ】図５ＢはΦ２９（上段）とＫ５１２Ａ突然変異体（下段）の構造を示す。３種の異なる角度から見た構造図を示す。
【図６Ａ】図６ＡはΦ２９のＫ１３５の前後の領域におけるΦ２９様ポリメラーゼ（Φ２９配列番号５９、Ｂ１０３配列番号６０、ＰＺＡ配列番号６１、Ｍ２配列番号６２、Ｇ１配列番号６３、ｃｐ−１配列番号６４）の配列アラインメントを示す。
【図６Ｂ】図６ＢはΦ２９（上段）とＫ１３５Ａ突然変異体（下段）の構造を示す。３種の異なる角度から見た構造図を示す。
【図７Ａ】図７Ａは結合速度と産物放出速度を測定するために使用したＦＲＥＴ停止型フローアッセイを模式的に示す。
【図７Ｂ】図７ＢはΦ２９  Ｎ６２Ｄ（図７Ｂ）、Ｎ６２Ｄ：Ｅ３７５Ｙ（図７Ｃ）、及びＮ６２Ｄ：Ｅ３７５Ｗ（図７Ｄ）のアッセイの結果を示す。
【図７Ｃ】図７ＣはΦ２９  Ｎ６２Ｄ（図７Ｂ）、Ｎ６２Ｄ：Ｅ３７５Ｙ（図７Ｃ）、及びＮ６２Ｄ：Ｅ３７５Ｗ（図７Ｄ）のアッセイの結果を示す。
【図７Ｄ】図７ＤはΦ２９  Ｎ６２Ｄ（図７Ｂ）、Ｎ６２Ｄ：Ｅ３７５Ｙ（図７Ｃ）、及びＮ６２Ｄ：Ｅ３７５Ｗ（図７Ｄ）のアッセイの結果を示す。
【図８Ａ】図８Ａは分岐速度を測定するために使用したＦＲＥＴ停止型フローアッセイを模式的に示す。
【図８Ｂ】図８ＢはΦ２９  Ｎ６２Ｄ（図８Ｂ）、Ｎ６２Ｄ：Ｅ３７５Ｙ（図８Ｃ）、及びＮ６２Ｄ：Ｅ３７５Ｗ（図８Ｄ）のアッセイの結果を示す。
【図８Ｃ】図８ＣはΦ２９  Ｎ６２Ｄ（図８Ｂ）、Ｎ６２Ｄ：Ｅ３７５Ｙ（図８Ｃ）、及びＮ６２Ｄ：Ｅ３７５Ｗ（図８Ｄ）のアッセイの結果を示す。
【図８Ｄ】図８ＤはΦ２９  Ｎ６２Ｄ（図８Ｂ）、Ｎ６２Ｄ：Ｅ３７５Ｙ（図８Ｃ）、及びＮ６２Ｄ：Ｅ３７５Ｗ（図８Ｄ）のアッセイの結果を示す。
【図９】濃度低下に対する反応速度行列ジャンプサイズのプロットを示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【国際調査報告】
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