(57)【要約】1種または複数の非ブタシトシン脱アミノ酵素を発現するトランスジェニックブタに加え、そのようなブタの作出および使用の方法が説明される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有核細胞が核酸構築体を含み、該核酸構築体が、非ブタシトシン脱アミノ酵素ポリペプチドをコードしている核酸配列に機能的に連結された調節領域を含む転写単位を含み、このブタの細胞の少なくとも一部における該非ブタシトシン脱アミノ酵素ポリペプチドの発現が、ヒト細胞との共培養すると、該細胞のブタ内在性レトロウイルスをヒト細胞へ伝達する能力を低下する、トランスジェニックブタ。
【請求項２】
調節領域が、構成的プロモーターである、請求項1記載のトランスジェニックブタ。
【請求項３】
ブタの調節領域が、組織特異的または臓器特異的プロモーターである、請求項1記載のトランスジェニックブタ。
【請求項４】
インスレーターエレメントおよびトランスポゾン逆向き反復配列が、転写単位の各側に隣接している、請求項1記載のトランスジェニックブタ。
【請求項５】
非ブタシトシン脱アミノ酵素が、AID、APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D、APOBEC3E、APOBEC3F、APOBEC3G、およびAPOBEC3Hからなる群より選択される、請求項1記載のトランスジェニックブタ。
【請求項６】
非ブタシトシン脱アミノ酵素が、ヒトAPOBEC3FまたはヒトABOBEC3Gである、請求項1記載のトランスジェニックブタ。
【請求項７】
請求項1記載のトランスジェニックブタ由来の細胞。
【請求項８】
請求項1記載のトランスジェニックブタから単離された組織。
【請求項９】
請求項1記載のトランスジェニックブタの子孫。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、ブタ内在性レトロウイルスのようなレトロエレメントを非ブタ細胞および組織へ伝達する能力が低下したトランスジェニックブタおよびブタの細胞に関し、より詳細に述べると、非ブタシトシン脱アミノ酵素を含むトランスジェニックブタおよびブタの細胞に関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、2005年6月24日に出願された米国特許出願第60/694,054号の米国特許法施行規則119条(e)項の下での恩恵を主張するものであり、この出願はその全体が本明細書に参照として組入れられている。
【背景技術】
【０００３】
背景
糖尿病の治療は、患者とその家族にとってかなりの負担となっており、患者の最大50％は、一生涯上昇したブドウ糖レベルに曝されるために、破壊的な二次合併症を経験している。現在高血糖または低血糖の関連したリスクを伴わずにインスリンを回復し維持する唯一の方法は、患者のインスリン産生細胞であるランゲルハンス島の交換であり：これは、血管新生された膵臓の移植か、または単離された島の注入のいずれかによる。しかし好適なヒト膵臓ドナーは、非常に稀である。ブタは、糖尿病患者への異種移植のための島の可能性がある無限の給源を提供し、および幹細胞のような他の開発中の技術より早く潜在的に良好に、臨床適用性のある時点まで開発されている。
【０００４】
ドナーから宿主組織へのウイルス伝達の可能性は、糖尿病治療のための異種移植の使用の妨げとなり続けている。厳格なバイオセキュリティーおよび試験は、可能性のあるドナーブタ由来のほとんどの物質を排除することができるが、ひとつの物質は特に、この方法では手に負えない。ブタおよびヒトを含むほとんどの、おそらく全ての哺乳類ゲノムは、過去のレトロウイルス感染による可動性の核酸配列を持っている。これらのほとんどは機能的に不活性であるが、ブタ細胞は、活性(ACTIVE)レトロエレメントのいくつかの型を含み、これらはブタ内在性レトロウイルス(PERV)と称される。これらの物質は一般に、ブタには無害であるが、異種移植に関しては大きい懸念である。ヒト細胞とブタ細胞が共培養される実験条件下で、ブタからヒト組織へのPERVの伝達が明らかにされている(Patienceら (1997) Nat Med 3, 282-286（非特許文献1）)。患者にとってこの伝達が細分化があるかは不明だが、、PERV単独またはヒト物質との組合せが疾患を引き起こすという理論的可能性は、異種移植の広範な適用の大きな障害として出現しているかは不明である。
【０００５】
【非特許文献１】Patienceら (1997) Nat Med 3, 282-286
【発明の開示】
【０００６】
概要
本発明は、ブタ細胞および組織における非ブタシトシン脱アミノ酵素ポリペプチドの発現を基にしている。本明細書に説明されるように、ブタの細胞および組織における非ブタシトシン脱アミノ酵素(例えば、ヒトシトシン脱アミノ酵素)の発現は、PERVのようなレトロエレメントのヒト細胞への伝達の制御を促進することができる。結果的に非ブタシトシン脱アミノ酵素を含むブタ細胞および組織は、PERVのヒト細胞への低下した伝達能力を有し、従って異種間の遺伝子転移からの異種移植に関連したリスクを低下することができる。
【０００７】
ひとつの局面において、本発明は、転写単位が、非ブタシトシン脱アミノ酵素ポリペプチドをコードしている核酸配列へ機能的に連結されたブタの調節領域を含むような、転写単位を含む核酸構築体を特徴としている。トランスポゾンの逆向き反復配列は、この転写単位の各側に隣接することができる。インスレーターエレメントも、この転写単位の各側に隣接することができる。この核酸構築体は更に、トランスポゼースをコードしている核酸配列を含むことができる。
【０００８】
シトシン脱アミノ酵素ポリペプチドは、AID、APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D、APOBEC3E、APOBEC3F、APOBEC3G、およびAPOBEC3Hからなる群より選択することができる。例えばシトシン脱アミノ酵素ポリペプチドは、APOBEC3Fポリペプチド、例えばヒトAPOBEC3Fポリペプチドであるか、またはAPOBEC3Gポリペプチド、例えばヒトAPOBEC3Gポリペプチドであることができる。ある態様において、この核酸配列は、少なくとも2種のシトシン脱アミノ酵素ポリペプチドをコードしている(例えば、APOBEC3FポリペプチドおよびAPOBEC3Gポリペプチド)。ブタの調節領域は、構成的プロモーターまたは組織特異的プロモーターである。
【０００９】
別の局面において本発明は、核酸構築体が、非ブタシトシン脱アミノ酵素ポリペプチドをコードしている核酸配列に機能的に連結された調節領域を含むような、核酸構築体を含む単離されたブタの細胞を特徴としている。この細胞は、胚細胞、ブタの胎仔細胞(例えば、線維芽細胞)、成体ブタ細胞(例えば、皮膚線維芽細胞)、生殖細胞(例えば、卵母細胞または卵子)、幹細胞(例えば、成体幹細胞または胚性幹細胞)、または後代細胞であることができる。
【００１０】
本発明は、非ブタシトシン脱アミノ酵素を含む、単離されたブタの細胞も特徴としている。この細胞は更に、非ブタシトシン脱アミノ酵素をコードしている核酸を含むことができる。シトシン脱アミノ酵素ポリペプチドは、AID、APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D、APOBEC3E、APOBEC3F、APOBEC3G、およびAPOBEC3Hからなる群より選択される。例えば、シトシン脱アミノ酵素ポリペプチドは、APOBEC3Fポリペプチド、例えばヒトAPOBEC3Fポリペプチドであるか、またはAPOBEC3Gポリペプチド、例えばヒトAPOBEC3Gポリペプチドであることができる。ある態様において、この核酸配列は、少なくとも2種のシトシン脱アミノ酵素ポリペプチドをコードしている(例えば、APOBEC3FポリペプチドおよびAPOBEC3Gポリペプチド)。この調節領域は、構成的プロモーターまたは組織特異的プロモーターであることができる。
【００１１】
別の局面において、本発明は、トランスジェニックブタ、トランスジェニックブタ由来の細胞、トランスジェニックブタから単離された組織、およびトランスジェニックブタの子孫を特徴としている。このブタの有核細胞は、非ブタシトシン脱アミノ酵素ポリペプチドをコードしている核酸配列に機能的に連結された調節領域を含む転写単位を含む、核酸構築体を含む。ヒト細胞との共培養すると、ブタの細胞の少なくとも一部における非ブタシトシン脱アミノ酵素ポリペプチドの発現は、この細胞の、ブタ内在性レトロウイルスのヒト細胞への伝達能の低下を生じる。この調節領域は、構成的プロモーターまたは組織特異的プロモーターであることができる。インスレーターエレメントおよびトランスポゾン逆向き反復配列は、転写単位の各側に隣接することができる。シトシン脱アミノ酵素ポリペプチドは、AID、APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D、APOBEC3E、APOBEC3F、APOBEC3G、およびAPOBEC3Hからなる群より選択される。例えば、シトシン脱アミノ酵素ポリペプチドは、APOBEC3Fポリペプチド、例えばヒトAPOBEC3Fポリペプチドであるか、またはAPOBEC3Gポリペプチド、例えばヒトAPOBEC3Gポリペプチドであることができる。
【００１２】
別の局面において、本発明は、トランスジェニックブタの作出法を特徴としている。この方法は、組合せ細胞を確立するために、非ブタシトシン脱アミノ酵素ポリペプチドをコードしている核酸配列に機能的に連結された調節領域を含む転写単位を含む核酸構築体を含むトランスジェニックブタ細胞を、除核したブタ卵母細胞へ導入する工程；この組合せ細胞からブタ胚を作出する工程；このブタ胚をレシピエント雌に移植する工程；および、ブタ胚のレシピエント雌における発生を可能にし、トランスジェニックブタを作出する工程を含む。インスレーターエレメントおよびトランスポゾン逆向き反復配列は、この転写単位の各側に隣接することができる。
【００１３】
本発明は、トランスジェニックブタを作出する方法も特徴としている。この方法は、非ブタシトシン脱アミノ酵素ポリペプチドをコードしている核酸配列に機能的に連結された調節領域を含む転写単位を含む核酸構築体を、受精卵へ導入し、注入された受精卵を作製する工程；注入された受精卵をレシピエント雌へ移植する工程；および、注入された受精卵をレシピエントブタの雌において発生させ、トランスジェニックブタを作出する工程を含む。
【００１４】
更に別の局面において本発明は、トランスジェニックブタ細胞を作製する方法を特徴としている。この方法は、非ブタシトシン脱アミノ酵素ポリペプチドをコードしている核酸配列に機能的に連結された調節領域を含む転写単位を含む核酸構築体を、ブタ細胞へ導入する工程を含む。
【００１５】
本発明は、トランスジェニックブタ細胞を作製する方法も特徴としている。この方法は、ブタ細胞へ：a)非ブタシトシン脱アミノ酵素ポリペプチドをコードしている核酸配列に機能的に連結された調節領域を含む転写単位を含む核酸構築体であり、インスレーターエレメントおよびトランスポゾン逆向き反復配列が、転写単位の各側に隣接するもの；ならびに、b)トランスポゼースの給源：を導入する工程を含む。このトランスポゼースの給源は、トランスポゼースをコードしている核酸を含むことができる。トランスポゾンおよびトランスポゼースの給源は、個別の核酸構築体上または同じ核酸構築体上に存在することができる。
【００１６】
特に規定しない限りは、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に説明されたものに類似したまたは同等の方法および材料を、本発明を実践するために使用することができるが、好適な方法および材料が以下に説明される。本明細書において言及された全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、それらの全体が本明細書に参照として組入れられている。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配するものとする。加えて材料、方法および実施例は、単に例証であり、限定を意図するものではない。
【００１７】
本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、および特許請求の範囲から明らかであると思われる。
【００１８】
詳細な説明
本明細書に説明されたように、APOBEC3Gおよび3Fのようなヒトシトシン脱アミノ酵素は、真核細胞のゲノムDNAを脱アミノ化することが可能である。APOBEC3GまたはそのホモログAPOBEC3Fの発現は、cDNAシトシンの脱アミノ化が関与する機構により、サッカロミセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)におけるレトロトランスポゾンTy1の移動を阻害することができる。これは、シトシン脱アミノ酵素標的の範囲を、各々病理学的および生理学的関連がある核DNAおよび内在性レトロエレメントを含むように拡大する。これらのデータは、レトロエレメント制限のAPOBEC3依存型機構は高度に保存されること、およびAPOBEC3基質の範囲は当初予想されたものよりもはるかに広いことを示している。APOBEC3タンパク質は、哺乳類以外には存在しないので、APOBEC3Fまたは-3Gは、酵母Ty1レトロ転位を阻害することができることを示す本明細書に説明された結果は予想外であった。従って本明細書に説明されたTy1データは、単にこの機構の驚くべき保存を明らかにするのみではなく、重要なことにこれらは哺乳類の因子(APOBEC3Fまたは-3Gに加え)はレトロエレメント制限には不要であることも示す。
【００１９】
更に本明細書に明らかにされたように、ブタの細胞におけるヒトシトシン脱アミノ酵素の発現は、ブタの細胞が、内在性レトロエレメント(例えばレトロウイルスおよびレトロトランスポゾン)をヒト細胞へ伝達する能力を低下する。従って本発明は、非ブタシトシン脱アミノ酵素ポリペプチドを発現するトランスジェニックブタおよびブタ細胞を提供する。そのようなトランスジェニックブタ由来の臓器および組織は、内在性シトシン脱アミノ酵素を発現しているブタ由来の臓器および組織と比べ、ブタ内在性レトロウイルスのヒト細胞への伝達のリスクが低下するために、異種移植に有用である。
【００２０】
非ブタシトシン脱アミノ酵素
本明細書において使用される「シトシン脱アミノ酵素ポリペプチド」は、核酸内でシトシンをウラシルへ脱アミノ化する能力を有し、ならびに以下の亜鉛結合シトシン脱アミノ酵素ドメインを含む、翻訳後修飾にかかわらず、以下のアミノ酸鎖のいずれかを意味する(標準1文字表記で提示されたアミノ酸)：H/CXE(または別の触媒残基、例えばD)X20-30PCX2-4C。HarrisおよびLiddament (2004) Nat. Rev. Immunol. 4:868-877を参照のこと。アミノ酸の置換、欠失、および挿入は、公知の亜鉛結合シトシン脱アミノ酵素ドメインに導入することができ、得られるポリペプチドは、「シトシン脱アミノ酵素」であり、但しこのポリペプチドは、シトシンをウラシルへ脱アミノ化する能力を維持することとする。
【００２１】
好適な非ブタ哺乳類のシトシン脱アミノ酵素ポリペプチドは、シングルドメインDNAシトシン脱アミノ酵素およびダブルドメインDNAシトシン脱アミノ酵素を含む。例えばシングルドメインDNAシトシン脱アミノ酵素は、例えば、活性化誘導脱アミノ酵素(AID)、APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3A、APOBEC3C、APOBEC3D、APOBEC3E、およびAPOBEC3Hポリペプチドを含む。ダブルドメインDNAシトシン脱アミノ酵素は、例えばAPOBEC3B、APOBEC3F、およびAPOBEC3Gポリペプチドを含む。APOBEC3DおよびAPOBEC3Eは、ダブルドメインシトシン脱アミノ酵素としても産生され得る。例えば、HarrisおよびLiddament(2004)、前掲；および、Jarmuzら Genomics (2002) 79(3):285-96を参照のこと。APOBEC3Gおよび/またはAPOBEC3Fは、特に有用である。ヒトAPOBEC3G(アポリポタンパクB mRNA-編集酵素触媒性ポリペプチド様3G、CEM15としても公知)は、シトシンのウラシルへの脱アミノ化を使用し、HIV-1を含む様々なレトロウイルスの複製を阻害する。APOBEC3Gは、哺乳類細胞の細胞質に主に局在する。レトロウイルス-感染細胞において、この局在は、細胞膜から放出されるウイルス粒子へのAPOBEC3Gの取込みを促進することができる。APOBEC3Gは、ウイルスGagタンパク質および/またはウイルスゲノムRNAとの会合を介して、ビリオンにも特異的に取込まれる。一旦レトロウイルスが細胞へ侵入すると、そのゲノムRNAは逆転写され、この過程で、APOBEC3Gは、cDNAシトシンのウラシルへの脱アミノ化(C->U)が可能である。これらの障害は、それらがウイルスを最終的に失活するほどの高頻度で生じる(ウイルスのゲノム鎖上での読み出し（read-out）として、G->A超変異を引き起こす)。APOBEC3Fは、APOBEC3Gのホモログであり、同様の機構により、HIV-1感染を制限する。APOBEC3Fおよび-3Gは、各々、5'-TCおよび5'-CCを優先する、異なる局所的状況内でシトシンを脱アミノ化する。
【００２２】
シトシン脱アミノ酵素をコードしている核酸配列は、cDNAであるか、またはイントロンもしくは隣接5'-もしくは3'-非翻訳領域を含むことができる(例えばゲノム核酸)。例えばこの核酸配列は、ヒトAPOBEC3FまたはAPOBEC3Gポリペプチドをコードすることができる。GenBankアクセッション番号NM_145298およびNM_021822は、各々、ヒトAPOBEC3FおよびAPOBEC3GのcDNA配列を提供する。この核酸配列は、本明細書に説明されたようにヒツジまたはウシAPOBEC3Fポリペプチドをコードすることもできる。ヒツジおよびウシAPOBEC3Fタンパク質は、活性アミノ末端DNAシトシン脱アミノ酵素ドメインを有し、これらはより広範なジヌクレオチド脱アミノ化優先を誘発し、およびHIV-1 Vifに対し十分に抵抗性がある。
【００２３】
コードされたアミノ酸を変化しないサイレント変異または1個もしくは複数のコードされたアミノ酸を変更するが、酵素機能を廃止しない配列変種を有する核酸配列も使用することができる。例えば本明細書において使用されるAPOBEC3Gの核酸配列は、NM_021822のコード配列とは、ヌクレオチド588位でのCからTへの転位が異なる。この転位は、サイレントであり、および119位(F)でコードされたアミノ酸は変更しない。ある態様において、2種またはそれよりも多いシトシン脱アミノ酵素ポリペプチド(例えば、ヒトAPOBEC3FおよびAPOBEC3Gポリペプチド)が、核酸構築体上にコードされている。
【００２４】
核酸構築体
本発明の核酸構築体は、非ブタシトシン脱アミノ酵素をコードしている核酸配列を含む。本明細書において使用される用語「核酸」は、DNA、RNA、および核酸アナログ、および2本鎖または1本鎖(すなわち、センスまたはアンチセンス1本鎖)である核酸を含む。核酸アナログは例えば、核酸の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解度を改善するように、塩基部分、糖鎖部分、またはリン酸骨格において修飾することができる。塩基部分での修飾は、デオキシチミジンのためのデオキシウリジン、ならびにデオキシシチジンのための5-メチル-2'-デオキシシチジンおよび5-ブロモ-2'-デオキシシチジンを含む。糖鎖部分の修飾は、2'-O-メチルまたは2'-O-アリル糖を形成するための、リボース糖の2'ヒドロキシルの修飾を含む。デオキシリボースリン酸骨格は修飾され、各塩基部分が6員のモルホリノ環へ連結されたモルホリノ核酸、またはデオキシリン酸骨格が偽ペプチド骨格により交換され、4個の塩基は保持されるペプチド核酸を生成することができる。SummertonおよびWeller (1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7(3):187-195；および、Hyrupら (1996) Bioorgan. Med. Chem 4(1):5-23を参照のこと。加えてデオキシリン酸骨格は、例えば、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオアート骨格、ホスホロアミダイトまたはアルキルホスホトリエステル骨格と交換することができる。
【００２５】
シトシン脱アミノ酵素をコードしている核酸配列は、プロモーターのような調節領域へ機能的に連結することができる。調節領域は、ブタの調節領域であるか、または他の種に由来することができる。本明細書において使用される「機能的に連結される」とは、コードされたポリペプチドの発現を許容または促進するような様式においての、ポリペプチドをコードしている核酸配列に対する調節領域の配置を意味する。
【００２６】
任意のプロモーター型は、シトシン脱アミノ酵素をコードしている核酸配列へ機能的に連結される。プロモーターの例は、組織特異的プロモーター、構成的プロモーター、および特定の刺激に対し反応性または非反応性のプロモーターを含むが、これらに限定されるものではない。好適な組織特異性プロモーターは、島細胞における核酸転写の優先的発現を生じることができ、例えばヒトインスリンプロモーターを含む。他の組織特異性プロモーターは、例えば肝細胞または心臓組織において優先的発現を生じることができ、ならびに各々、アルブミンプロモーターまたはα-ミオシン重鎖プロモーターを含むことができる。
【００２７】
別の態様において、著しい組織特異性または時間特異性を伴わない核酸分子の発現を促進するプロモーターを、使用することができる(すなわち構成的プロモーター)。例えば、トリβ-アクチン遺伝子プロモーターのようなβ-アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)プロモーター、または3-ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)プロモーターに加え、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(TK)プロモーター、SV40プロモーター、またはサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターなどのウイルスプロモーターを使用することができる。ある態様において、トリβアクチン遺伝子プロモーターおよびCMVエンハンサーの融合を、プロモーターとして使用することができる。例えば、Xuら (2001) Hum. Gene Ther. 12(5):563-73；および、Kiwakiら (1996) Hum. Gene Ther. 7(7):821-30を参照のこと。
【００２８】
誘導的プロモーターの例は、テトラサイクリン(tet)-オン プロモーターシステムであり、これは核酸の転写を調節するために使用することができる。このシステムにおいて、変異されたTetリプレッサー(TetR)は、単純ヘルペスVP16(トランス作用因子タンパク質)の活性化ドメインへ融合され、テトラサイクリン-制御性転写活性化因子(tTA)を生じ、これはtetまたはドキシサイクリン(dox)により調節される。抗生物質が存在しない場合、転写は最小であるが、tetまたはdoxが存在する場合、転写は誘導される。別の誘導性システムは、エクジソンまたはラパマイシンシステムを含む。エクジソンは、その生成が、エクジソン受容体のヘテロ二量体およびウルトラスピラクル(ultraspiracle)遺伝子(USP)の生成物により制御される昆虫の脱皮ホルモンである。発現は、エクジソンまたはムリステロンAのようなエクジソンアナログによる処理により誘導される。
【００２９】
核酸構築体において有用であってよい追加の調節領域は、ポリアデニル化配列、翻訳制御配列(例えば配列内リボソーム進入部位、IRES)、エンハンサー、誘導性エレメント、またはイントロンを含むが、これらに限定されるものではない。このような調節領域は、必須ではないが、転写、mRNA安定性、翻訳効率などに影響することにより、発現を増大することができる。このような調節領域は、細胞における核酸の最適な発現を得るために望ましいように、核酸構築体に含まれ得る。しかし十分な発現は、時には、そのような追加のエレメントを伴わずに得ることができる。
【００３０】
核酸構築体上に含むことができる他のエレメントは、シグナルペプチドまたは選択マーカーをコードしている。シグナルペプチドは、コードされたポリペプチドが、特定の細胞位置(例えば、細胞表面)に方向付けられるように使用することができる。選択マーカーの非限定的例は、ピューロマイシン、アデノシン脱アミノ酵素(ADA)、アミノ配糖体リン酸転移酵素(neo、G418、APH)、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)、ハイグロマイシン-B-リン酸転移酵素、チミジンキナーゼ(TK)、およびキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(XGPRT)を含む。そのようなマーカーは、培養物中で安定した形質転換体を選択するために有用である。
【００３１】
ある態様において、シトシン脱アミノ酵素をコードしている核酸配列は、コードされたポリペプチドの引き続きの操作を促進するよう(例えば、局在化または検出を促進するため)にデザインされた「タグ」をコードしているタグ配列を含むことができる。タグ配列は、シトシン脱アミノ酵素ポリペプチドをコードしている核酸配列へ挿入することができ、その結果コードされたタグは、シトシン脱アミノ酵素ポリペプチドのカルボキシル末端またはアミノ末端のいずれかに位置する。コードされたタグの非限定的例は、緑色蛍光タンパク質(GFP)、グルタチオンS-転移酵素(GST)、およびFlag(商標)タグ(Kodak, ニューヘブン, CT)を含む。
【００３２】
核酸構築体は、例えば卵母細胞または卵子のような生殖細胞、前駆細胞、成体または胚性幹細胞、PK-15細胞のような腎細胞、島細胞、β細胞、肝細胞、または皮膚線維芽細胞のような線維芽細胞を含むいずれかの型の、胚、胎仔または成体のブタ細胞へ、様々な技術を用い導入することができる。この技術の非限定的例は、トランスポゾンシステム、細胞を感染することができる組換えウイルス、もしくはリポソームの使用、または核酸を細胞へ送達することが可能である他の非ウイルス法、例えば電気穿孔、微量注入、またはリン酸カルシウム沈降法を含む。
【００３３】
トランスポゾンシステムにおいて、核酸構築体の転写単位、すなわちシトシン脱アミノ酵素ポリペプチドをコードしている核酸配列へ機能的に連結される調節領域は、トランスポゾンの逆向き反復配列により隣接される。例えば、Sleeping Beauty(米国特許第6,613,752号および米国特許出願公開第20050003542号参照)、Frog Prince(Miskeyら (2003) Nucleic Acids Res 31(23):6873-81)、およびSkipperを含むいくつかのトランスポゾンシステムが、マウス細胞、ヒト細胞およびブタ細胞を含む細胞へ核酸を導入するために開発されている。Sleeping Beautyトランスポゾンは特に有用である。トランスポゼースは、同じ核酸構築体上にコードされるか、または個別の核酸構築体上に導入され得る。
【００３４】
インスレーターエレメントも、シトシン脱アミノ酵素ポリペプチドの発現を維持し、かつ宿主遺伝子の望ましくない転写を阻害するために、核酸構築体に含むことができる。例えば、米国特許出願公開第20040203158号を参照のこと。典型的にはインスレーターエレメントは、転写単位の各側に隣接し、およびトランスポゾンの逆向き反復配列に対し内側である。インスレーターエレメントの非制限的例は、マトリックス付着領域(MAR)型インスレーターエレメントおよび境界型(border-type)インスレーターエレメントを含む。例えば、米国特許第6,395,549号、同第5,731,178号、同第6,100,448号および同第5,610,053号、ならびに米国特許出願公開第20040203158号を参照のこと。
【００３５】
使用することができるウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レトロウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、麻疹ウイルス、ヘルペスウイルス、およびウシパピローマウイルスのベクターを含む。ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターに関する総説については、Kayら (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 12744-12746を参照のこと。天然のトロピズムおよびそのウイルスの病原性が変更または除去されるように、ウイルスベクターは修飾される。ウイルスのゲノムも、その感染力を増大し、かつ関心対象のポリペプチドをコードしている核酸のパッケージングを収容するように修飾することができる。
【００３６】
アデノウイルスベクターは、実験室において容易に操作することができ、分裂細胞および非分裂細胞を効率的に形質導入することができ、かつ宿主ゲノムへ組込まれることは稀である。Smithら (1993) Nat. Genet. 5, 397-402；ならびに、SpectorおよびSamaniego (1995) Meth. Mol. Genet., 7, 31-44を参照のこと。アデノウイルスは、E1領域が2本鎖DNAゲノムから除去されるように修飾され、このポリペプチドをコードしている核酸に空間を提供し、およびそのウイルスは複製することができないようにトランス活性化するE1aタンパク質を除去することができる。アデノウイルスは、とりわけ角化細胞、肝細胞および上皮細胞を含む、様々な細胞型の形質導入に使用されている。
【００３７】
アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターは、広範なトロピズムおよび感染力を示すが、これらはヒト病原性を示さず、炎症反応を誘発しない。AAVベクターは、位置特異的組込みを見せ、非分裂細胞を感染することができる。AAVベクターは、動物において、核酸を脳、骨格筋、および肝臓へ、長期間(例えばマウスにおいて＞9ヶ月)送達するために使用されている。AAVベクターの説明については、例えば、米国特許第5,139,941号を参照のこと。
【００３８】
レトロウイルスは、最も特徴付けられたウイルス送達システムであり、臨床試験において使用されている。レトロウイルスベクターは、高い核酸転移効率および発現の媒介となる。レトロウイルスは、細胞膜への直接的融合により、細胞へ進入し、および細胞分裂時に宿主染色体へ組込まれる。
【００３９】
レンチウイルスも、核酸の細胞、特に非分裂細胞への送達に使用することができる。複製欠損HIV I型ベースのベクターを使用し、幹細胞を含む様々な細胞型が形質導入される。Uchiddaら (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 11939-11944を参照のこと。
【００４０】
非ウイルスベクターは、人工的膜小胞であるリポソームにより細胞へ送達することができる。リポソームの組成は通常、リン脂質、特に高い相転移温度のリン脂質の組合せ、通常ステロイド、特にコレステロールとの組合せである。他のリン脂質または他の脂質も、使用することができる。リポソームの物理特性は、pH、イオン強度、および二価カチオンの存在に左右される。リポソームの形質導入効率は、形質導入時のジオレオイルホスファチジルエタノールアミンの使用により増大することができる。Felgnerら (1994) J. Biol. Chem. 269, 2550-2561参照のこと。高効率リポソームは、市販されている。例えば、Qiagen(バレンシア, CA)からのSuperFect(登録商標)を参照のこと。
【００４１】
トランスジェニックブタ
本明細書において提供されたトランスジェニックブタの有核細胞は、先に説明された核酸構築体を含む。本明細書において使用される「トランスジェニックブタ」は、初代トランスジェニックブタに加え、子孫がその核酸構築体を維持するという条件で、この初代の子孫、子孫の子孫などを含む。例えば初代トランスジェニック動物を使用し、その核酸構築体を含む追加の動物を繁殖することができる。
【００４２】
トランスジェニックブタから得られた組織およびトランスジェニックブタから由来した細胞も、本明細書において提供される。本明細書において使用される「から由来した」とは、細胞は、ブタから直接単離することができ、およびそのような細胞の子孫であることができることを示す。例えば脳、肺、肝臓、膵臓、心臓および心弁、筋肉、腎臓、甲状腺、結腸、皮膚、血管または他の結合組織を、ブタから得ることができる。例えば血液細胞および造血細胞、ランゲルハンス島、β細胞、脳細胞、肝細胞、腎細胞、ならびに他の臓器および体液由来の細胞も、トランスジェニックブタから由来することができる。トランスジェニックブタからの臓器および細胞は、ヒト患者へ移植することができる。例えば、トランスジェニックブタからの島は、ヒト糖尿病患者へ移植することができる。
【００４３】
当技術分野において公知の様々な技術を使用し、核酸構築体を非ヒト動物へ導入し、その核酸構築体がゲノムに組込まれた初代の系統を作出することができる。このような技術は、非限定的に、前核微量注入(米国特許第4,873,191号)、生殖系列へのレトロウイルス媒介型遺伝子導入(Van der Puttenら (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-1652)、胚性幹細胞への遺伝子標的化(Thompsonら (1989) Cell 56, 313-321)、胚の電気穿孔(Lo (1983) Mol. Cell. Biol. 3, 1803-1814)、および卵丘細胞もしくは乳腺細胞などの体細胞、または成体、胎児もしくは胚性幹細胞のインビトロ形質転換、それに続く核移植(Wilmutら (1997) Nature 385, 810-813；および、Wakayamaら (1998) Nature 394, 369-374)を含む。前核微量注入および体細胞核移植は、特に有用な技術である。
【００４４】
典型的には、前核微量注入において、先に説明された核酸構築体は、受精卵へ導入され；精子頭部および卵子からの遺伝物質を含む前核は、原形質内に認められるので、1または2細胞の受精卵が使用される。直線化された核酸構築体は、前核のひとつへ注入され、その後注入された卵子を、レシピエント雌(例えばレシピエント雌の卵管へ)へ移植し、レシピエント雌において発生させ、トランスジェニックブタを作出する。
【００４５】
体細胞核移植において、先に説明された核酸構築体を含む胎仔線維芽細胞のようなトランスジェニックブタ細胞は、除核された卵母細胞へ導入され、組合せ細胞を確立することができる。卵母細胞は、極体近傍での部分的透明帯の切開、およびその後の切開部分での細胞質の押し出しにより、除核することができる。典型的には、鋭角の先端を伴う注入ピペットを用い、トランスジェニック細胞を、第2期減数分裂で停止された除核卵母細胞へ注入する。ある慣習においては、第2期減数分裂で停止された卵母細胞を「卵子」と称する。ブタ胚の作出(例えば、卵母細胞の融合および活性化により)後、ブタ胚を、活性化後約20〜24時間で、レシピエント雌の卵管に移植する。例えばCibelliら (1998) Science 280, 1256-1258、および米国特許第6,548,741号を参照のこと。レシピエント雌は、胚移植の約20〜21日後に妊娠についてチェックすることができる。
【００４６】
標準的繁殖手法を使用し、最初の初代ヘテロ接合性動物からシトシン脱アミノ酵素ポリペプチドについてホモ接合性である動物を作出することができる。しかし、PERVをヒト細胞へ伝達する能力の低下を観察するためには、ホモ接合性は必要ではない。
【００４７】
一旦トランスジェニックブタが作出されると、シトシン脱アミノ酵素ポリペプチドの発現は、標準的手法を用い評価することができる。構築体の組込みが生じたかどうかを決定する、最初のスクリーニングは、サザンブロット解析により実現することができる。サザン解析の説明については、Sambrookら, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Press, プレインビュー；NYの9.37-9.52項を参照のこと。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術も、最初のスクリーニングにおいて使用することができる。PCRは、標的核酸が増幅される手順または技術を意味する。一般に、関心対象の領域の末端またはこれ以上ものからの配列情報を利用し、増幅される鋳型の反対鎖の配列と同じまたは同様のオリゴヌクレオチドプライマーをデザインする。PCRを使用し、総ゲノムDNAまたは総細胞RNAからの配列を含む、DNAに加えRNAからの特異的配列を増幅することができる。プライマーは典型的には、14〜40ヌクレオチド長であるが、10ヌクレオチドから数百ヌクレオチド長の範囲であることができる。PCRは、例えば、PCR Primer : A Laboratory Manual, DieffenbachおよびDveksler編, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995に説明されている。核酸は、リガーゼ連鎖反応、鎖交換増幅、自己-維持型（self-sustained）配列複製、または核酸配列-ベースの増幅により増幅することもできる。例えば、Lewis (1992) Genetic Engineering News 12,1；Guatelliら (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874-1878；および、Weiss (1991) Science 254, 1292-1293を参照のこと。
【００４８】
トランスジェニックブタの組織内のシトシン脱アミノ酵素ポリペプチド(例えば、APOBEC3Fおよび/またはAPOBEC3Gポリペプチド)をコードしている核酸配列の発現は、非限定的に、動物から得られた組織試料のノーザンブロット解析、インサイチュハイブリダイゼーション解析、ウェスタン解析、酵素結合免疫吸着アッセイ法のような免疫学的検定、および逆転写PCR(RT-PCR)を含む技術を用い評価することができる。ブタの細胞の少なくとも一部における非ブタシトシン脱アミノ酵素ポリペプチドの発現は、ヒト細胞との共培養すると、ヒト細胞へPERVを伝達する細胞の能力の低下を生じる。
【００４９】
低下したPERV伝達能は、例えば共培養アッセイ法により評価することができる。トランスジェニックブタ細胞およびヒト細胞(例えば293T細胞)は、1ミクロン-サイズの細孔を伴う薄膜により物理的に分離し、約50世代または25日間共培養することができる。このような膜は、ウイルス粒子を含む小型分子の自在な拡散は可能であるが、細胞の拡散は許さない。培養期間の最後に、ヒト細胞を収集し、ELISA法(例えばCavidi Tech, ウプサラ, スウェーデン)を用い、PERV逆転写酵素活性(感染力の測定として)について試験することができる。トランスジェニック動物の特定の表現型は典型的には、トランスジェニック動物の表現型の、この導入遺伝子を欠いている対照非ヒト動物により示された対応する表現型との比較により評価することができることは理解される。
【００５０】
本発明のトランスジェニックブタは、他の関心対象の動物(例えば、失活したα-1,3 ガラクトシル転移酵素遺伝子を持つブタのような移植適合性の背景を持つ動物)と交配することができる。得られる子孫動物は、内在性レトロウイルスのヒト細胞への伝達リスクの低下および超急性拒絶のリスクの低下のために、異種移植に特に有用である。このような動物は、例えば、(a)非ブタシトシン脱アミノ酵素ポリペプチドを発現しているトランスジェニックブタと、(b)失活したα-1,3 ガラクトシル転移酵素遺伝子を持つトランスジェニックブタの交配により作出することができる。あるいは、トランスジェニックブタの単独の系統を、適当な導入遺伝子を用いブタを最初に調製することにより作出することができる。
【００５１】
本発明は更に、以下の実施例により説明されるが、これらは特許請求の範囲に説明された本発明の範囲を限定するものではない。
【００５２】
実施例
実施例1
実施例2-7の方法および材料
酵母株
酵母変異アッセイ法は、L40(MATa his3Δ200 trp1-901 leu2-3112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 URA3::(lexAop)8-lacZ GAL4)(1)において行った。レトロ転位アッセイ法は、DG1251(MATa ura3-167 trp1-hisG spt3-101 his3Δ200)、または大腸菌β-ガラクトシダーゼが酵母PGK1プロモーターから構成的に発現されているDG1251誘導体であるGRY1990において行った(Nissleyら, (1996) Nature 380, 30；Nissleyら (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 13905-10)。内在性レトロ転位アッセイ法は、DG1141[MAT α trp1-hisG ura3-167 his3 Δ200 Ty1-2y2his3AI；(CurcioおよびGarfinkel (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 936-40)において行った。L40 ung1::kanMX4は、酵母欠失株36067(R. Wright, ミネソタ大学)由来のung1::kanMX4カセットの増幅、L40の得られるPCR産物による形質転換、およびG418-耐性コロニーの選択(Wachら (1994) Yeast 10, 1793-1808))により、構築した。ung1欠失は、中程度(modest)CAN1ミューテーター表現型のPCRおよびスクリーニングにより確認した。
【００５３】
プラスミド
構築体は、pHybLex-ZeoまたはpJG4-5(Invitrogen, カールスバッド, CA)を基にした。LexAAPOBEC3G融合タンパク質は、NotIおよびPstIを使用する、pAPOBEC3G-IRES-bleo(Harrisら (2003) Cell 113, 803-809)からのAPOBEC3Gのサブクローニングにより構築した。pHybLex-Zeo中のタグなしAPOBEC3Gは、LexAおよびAPOBEC3Gのオープンリーディングフレームの間に、5bpの挿入を含んだ。
【００５４】
Ugiは、pcDNA3.1(Invitrogen)へ、EcoRIおよびNotI断片としてのpEF-Ugi(Di NoiaおよびNeuberger (2002) Nature 419, 43-48)からサブクローニングした。これは、pYES3-CTへ、HindIIIおよびNotl(Invitrogen)を用いサブクローニングした。Ugi発現は、CAN1変異アッセイ法を用いて確認した。野生型HIV-1 Vif配列は、HIV-1 YU-2およびIIIBプロウイルスプラスミド(M. Malim, キングス大学、ロンドン)からのPCRにより増幅し、NcoIおよびBamHIで消化し、ならびに同様に切断したpTrc99A(AP Biotech)へ最初にクローニングした。引き続きVifは、NcoIおよびPstI消化物を用い、pHybLex-Zeoへサブクローニングし、ならびに最後にEcoRIおよびSphIを用い、pJG4-5へサブクローニングした。APOBEC3Fは、pTrc99A-APOBEC3F(Liddamentら (2004) Curr. Biol. 14, 1385-1391)から、EcoRIおよびSalIを用い、pHybLex-ZeoおよびpJG4-5の両方へサブクローニングした。
【００５５】
Ty1のガラクトース(GAL)-誘導性his3AIで記しを付けた変種(pGALTy1)およびTyHRT(pHART21)は、先に説明されている(Nissleyら, 1996, 前掲；Nissleyら, 1998, 前掲)。
【００５６】
酵母変異アッセイ法
pHybLex-Zeo、pJG4-5、pYES3-CTおよびそれらの誘導体を、L40へ形質転換し、ゼオシン(300μg/mL)を含有しおよびトリプトファンを含まない合成完全培地(SC+ZEO-TRP)を用い選択した(Ausubelら (2002)(John Wiley and Sons, Inc.)。独立したコロニー由来の数千個の生存細胞を用い、SC+GAL+RAF+ZEO-TRP(2％ガラクトース、1％ラフィノース、300μg/mLゼオシン)2.5mlへ接種した。培養物を、30℃で3〜4日間増殖し、5倍の濃度とし、および画分をSC+CAN-ARG(30μg/mL CAN)へプレーティングし、カナバニン耐性(CanR)変異体を得た。生存細胞の計数は、リッチ培地への希釈物のプレーティングにより得た。生存細胞を、2日後に計数し、CanRコロニーは30℃で3〜4日インキュベーションした後に計数した。CanRコロニーのCAN1遺伝子は、PCRにより増幅し、先に報告されたように配列決定した(Marsischkyら (1996) Gene Dev. 10, 407-420)。変異頻度の正確な値は、各実験において各株について複数の独立した培養物(6〜8種)を用い、および各実験を少なくとも2回および7回ほど反復することにより得た。変異の解析には、Sequencher(Genes Codes Corp)を使用した。
【００５７】
イムノブロッティング
対数増殖期培養物10mLからの細胞ペレットを、20％トリクロロ酢酸(TCA)1mLで洗浄し、50μLの20％TCA中に再浮遊させ、その後等量のガラスビーズと共に4℃でボルテックスし溶解した。上清を遠心し、タンパク質ペレットとした。ペレット化したタンパク質を、SDS-ゲル装荷緩衝液100μL中に再浮遊し、SDS-PAGEにより分離し、PVDFメンブレンに移し、APOBEC3G(Newmanら (2005) Curr. Biol. 15, 166-170)、LexA(Invitrogen)、またはVif(Fouchierら (1996) J. Virol. 70, 8263-8269；Simonら (1997) J. Virol. 69, 4166-4172；Simonら (1997) J. Virol. 71, 5259- 5267)に対する抗体でプロービングした。
【００５８】
Ty1レトロ転位アッセイ法
Ty-his3AI、TyHRT-his3AI、Ty-lucAIまたはTyHRT-lucAIプラスミドを、pJG4-5、pJG4-5-APOBEC3GまたはpJG4-5-APOBEC3FによりDG1251またはGRY1990へ同時形質転換し(Gietzら (1995) Yeast 11, 355-360)、SC-URA-TRP+GLCを用い選択した。
【００５９】
his3AI形質転換体を、SC-URA-TRP+GLCにおいて飽和まで増殖した。約106個細胞を、1mlのSC-URA-TRP+GAL中で12時間継代培養し、アリコートをSC-HISにプレーティングした。細胞生存度を、希釈物をリッチ培地へプレーティングすることにより決定した。レトロ転位は、His+コロニーの頻度を決定することにより、定量した。
【００６０】
lucAI形質転換体を、SC-URA-TRP+GLCにおいて1日増殖した。細胞を、SC-URA-TRP+GALへ移し、更に2日間、30℃で増殖し、レトロエレメント発現および逆転写を誘導した。ルシフェラーゼのβ-ガラクトシダーゼに対する相対活性レベルを測定することにより、レトロ転位を定量した。プラスミド-ベースのTy1アッセイ法のための全てのインキュベーションは、30℃であった。
【００６１】
内在性レトロ転位アッセイ法に関して、DG1141を、pJG4-5、pJG4-5-APOBEC3G、またはpJG4-5-APOBEC3Fにより形質転換した。単独のコロニーを、水中に再浮遊し、10〜50,000個の細胞を、2mLのSC-TRP+GALへ移し、培養物が飽和に達するまで、20℃で7〜10日間増殖した。出発培養物および最終培養物の希釈物を、リッチ培地にプレーティングし、生存細胞の数を決定し、および飽和培養物1mLの同等物を、SC-HISにプレーティングし、レトロ転位事象をスコア化した。
【００６２】
Ty1 DNA配列決定
レトロ転位されたTy1およびTyHRT cDNAを、His+コロニーをSC-HIS 10ml中、30℃で一晩増殖し、標準ガラスビーズ/フェノール抽出法によりDNAを調製することにより、単離した。得られたDNAを使用し、RT遺伝子およびHIS3に広がる1,026(Ty)または971(TyHRT)bp領域を、
2009502120.tif 000002
または
2009502120.tif 000003
および
2009502120.tif 000004
を使用し増幅した。PCR産物を、精製し(Qiagen)、
2009502120.tif 000005
により配列決定した。GFP陰性レトロ転位事象を、大腸菌への形質転換により、His+コロニーゲノムDNAのプールから得た。GFP陰性コロニーは、蛍光を用いて同定し、レジデントプラスミドDNAを、増幅し(生成物がTy RTについて2.1kbであること以外は前述のように)、
2009502120.tif 000006
および
2009502120.tif 000007
を用い配列決定した。
【００６３】
実施例2
APOBEC3Gはウラシル除去経路によりサッカロミセス・セレビシアエにおける変異を刺激する
ヒトAPOBEC3Gは、酵母においてその特徴的なミューテーター活性を誘発することができるかどうかを試験するために、LexA-APOBEC3G融合タンパク質を、一倍体株L40で発現し、および有毒アミノ酸カナバニンに対する耐性を付与された変異の蓄積を、モニタリングした。液体培養物を、APOBEC3Gまたは対照ベクターを発現している個々のコロニーから増殖し、次にカナバニンを含有する固形培地上にプレーティングした。カナバニン-耐性(CanR)コロニーの数を、3〜4日間増殖後に決定した。対照ベクターを発現している細胞とは対照的に、LexAAPOBEC3Gを発現している細胞は、CanR変異頻度の中央値の20倍の増加を示し、これは、APOBEC3Gは、酵母ゲノムDNA内でシトシンを脱アミノ化することが可能であることを示している(図1A；図2)。
【００６４】
LexA-APOBEC3G-誘導したミューテーター表現型が、C->U脱アミノ化機構により引き起こされるかどうかの決定を開始するために、ウラシルDNAグリコシラーゼ欠損は、この表現型を悪化するかどうかを調べた。ほとんどのDNA-ベースの生物は、ウラシルDNAグリコシラーゼを使用し、それらのゲノムのウラシルを取り除くので(BarnesおよびLindahl (2004) Annu. Rev. Genet. 38, 445-476)、これがその機構である場合、多くのAPOBEC3G-誘導したウラシル障害は修復され、ならびに観察された変異頻度は、APOBEC3G活性を過小評価する可能性があった。実際に、APOBEC3GおよびウラシルDNAグリコシラーゼインヒビター(Ugi)タンパク質の両方を発現している酵母は、CanRへの変異頻度の中央値の320倍の増加を示した(図1B)。この刺激は、LexA-APOBEC3G発現している酵母細胞およびUgi発現している酵母細胞において認められるものよりも、各々、約6倍および26倍高く、このことは多くのAPOBEC3G依存型ウラシルは、ウラシル除去機構により修復されたことを示している。
【００６５】
酵母において、主要なウラシルDNAグリコシラーゼは、Ung1p(ウラシルDNA N- グリコシラーゼ1タンパク質)である。Ung1pおよび細菌からヒトまでのほとんどの他のUngタンパク質は、Ugiにより強力に阻害される(Molら, (1995) Cell 82, 701-708)。しかしUgi-耐性ウラシル除去活性は、SMUG1およびTDG1タンパク質により誘発されるもののように(BarnesおよびLindahl (2004) 前掲)、哺乳類細胞において生じた。APOBEC3G-誘導したウラシルの一部が、酵母の補助システムにより修復される可能性を排除するために、相同組換えを用い、Ung1p欠失株L40ung1::kanMX4を構築した。この株は、APOBEC3Gの存在または非存在下でUgi発現している細胞から事実上識別不可能なCanR変異のレベルを示した(図3)。従って酵母における主要なAPOBEC3G-誘導した障害は、Ung1p依存型機構により修復された。Ung1pがウラシルについて持つ絶妙な特異性と共に、これらのデータは、APOBEC3G依存型ミューテーター表現型は、DNAシトシン脱アミノ化機構に起因することを示した。
【００６６】
APOBEC3Gは、主に哺乳類細胞の細胞質に局在化される。従って酵母におけるその発現が、高い変異頻度を引き起こしたことは驚くべきことであった。高い変異頻度は、LexAタグのDNA結合特性に起因しないことを確実にするために、CAN1変異頻度を、LexA-APOBEC3GまたはタグなしAPOBEC3Gのいずれかを発現している細胞においてモニタリングした。CanR変異頻度の全体の中央値の差異はほとんど認められず、このことはLexAのDNA結合ドメインは、APOBEC3G依存型ミューテーター表現型の原因でないこと(図1B)を明らかにしている。
【００６７】
実施例3
APOBEC3Gは酵母において主にC/G->T/A転位変異を引き起こす
CAN1は、有毒なアルギニンアナログのカナバニンの存在下で生じる増殖のために失活されなければならない、膜貫通アルギニン輸送体をコードしている。多種多様な塩基置換、挿入、欠失およびより複雑な変異は、CanRをもたらすことができる[例えば(Huangら, (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 11529-11534；Rattrayら (2002) Genetics 162, 1063-1077]。APOBEC3G-誘導したミューテーター表現型の機構を更に調べるために、多数のCanRコロニーのCAN1遺伝子を、配列決定した。先の研究と一致して、対照ベクターを含む細胞は、転位(26％)、トランスバース(43％)、挿入(3％)および欠失(28％)を含む、広範なCAN1変異を示した(図4A-4B)。対照的に、APOBEC3G発現細胞におけるCAN1変異の大部分(90％)は、C/G->T/A転位であった。APOBEC3G誘導した転位は、他の種類の変異を犠牲にして生じ、上昇したCanR変異頻度を説明している(図4A-4B)。
【００６８】
Ugi発現のためにUng1pを欠いている酵母も、ウラシル除去修復を欠いている細胞で予想されるように、増加したレベルのC/G->T/A転位変異(64％)を示した(図4C-4D)。しかしこれらの転位の5/7は、APOBEC3G発現細胞において変異されない位置で生じた。UgiおよびAPOBEC3Gの同時発現は、更に強力なC/G->T/A転位バイアス(95％)を生じ、これらの変異の19/21は、APOBEC3G発現している(Ugi陰性)酵母細胞においても変異された位置で生じた(図4C-4D)。これらのデータは更に、APOBEC3Gは、C->U脱アミノ化機構により酵母におけるゲノム超変異を引き起こすことが可能であることを明らかにした。
【００６９】
実施例4
酵母における局所的APOBEC3G変異の優先はモデルレトロウイルス基質において認められるものとほぼ同じである
APOBEC3G発現によりを引き起こされたC/G->T/A転位のより綿密な実験は、37/37が、ジヌクレオチド5'-CC内で生じ、DNA二本鎖のいずれかの鎖において認められることができたことを明らかにした(図4および5)。APOBEC3G発現は単独で、CAN1遺伝子内の14の個別の位置でC/G->T/A転位変異を引き起こされた。APOBEC3GおよびUgiの同時発現は、6箇所の同じ位置および2箇所の追加の位置でC/G->T/A転位変異を引き起こした。3つの最も頻繁なAPOBEC3Gは、5'-CCジヌクレオチド位置C356、C656、およびC1195で変異し、合計の一緒にしたAPOBEC3G-およびAPOBEC3G-プラス-Ugi依存型塩基置換変異の48％を占めた。酵母システムにおけるAPOBEC3Gの拡大された配列の優先を、5'-YCCA[Y＝CまたはT]としてモデルHIVおよびMLVレトロウイルスシステムにおいて先に規定されたものと比較した。興味深いことに、APOBEC3Gは、酵母においてひときわ類似した5'-CCCA優先を示し(図5)、これは他のシステムにおいて観察されたようにその優先は損なわれていないことを示した。
【００７０】
更に、多数のC/G->T/A転位変異に加え、4つの欠失および1つの挿入が、APOBEC3G発現している酵母細胞のCAN1遺伝子において検出されたことは注目される(図4；Ugi実験を含むまとめたデータ)。5つのこれらの変更のうちの3つは、好ましいまたは可能性のあるAPOBEC3Gホットスポット5'-CCCの中、または直ぐ隣に生じた。対照的に、対照ベクターを含む細胞において認められた欠失および挿入のわずかに1/12が、同様の位置で生じた。その残り(11/12)は、CAN1遺伝子全体に分布され、おそらく様々な機構により引き起こされた。APOBEC3Gホットスポットに関連した欠失および挿入の存在は、C->U脱アミノ化事象は、全体(gross)のゲノム不安定性を助長することができることを示唆した。これは更に、CanR変異体の小さい(約5％)の割合が、CAN1遺伝子特異性PCR産物を生じることに失敗し、おそらくより大規模な障害を意味しているという、本発明者らの知見により裏付けられた。
【００７１】
実施例5
HIV-1 VifのAPOBE3G-誘導した酵母超変異に対する影響
ヒトおよびチンパンジーのような霊長類において、Vifは、プロテアソーム分解のためにそれを標的化することにより、APOBEC3Gの抗-レトロウイルス活性を相殺する。Vifは、これを、APOBEC3Gに結合することにより達成する。いくつかのデータは、この関係のみが、APOBEC3G機能を直接損なうことができることを示唆している(Stopakら (2003) Mol. Cell. 12, 591-601)。従って、VifとAPOBEC3Gの間の相互作用は、この酵母アッセイシステムを用い、検出されるかどうかを、評価した。
【００７２】
YU2またはIIIBプロウイルスに由来したHIV-1 Vifは、酵母ツーハイブリッドバイトベクターまたはプレイベクターを用い、APOBEC3Gと一緒に発現された。全ての可能性のある対のある組合せを、酵母ツーハイブリッドリポーター遺伝子lacZまたはHIS3を駆動する能力について試験した。繰り返し試みたにもかかわらず、有意なβ-ガラクトシダーゼ活性またはヒスチジン原栄養体は認められなかった(データは示さず)。両方のタンパク質はイムノブロッティングにより細胞溶解液中に検出されたので、この結果は発現失敗に起因しなかった。
【００７３】
しかし、ある弱いかまたは一過性の相互作用は、酵母ツーハイブリッドアッセイ法による検出を回避するので、感度の良いCAN1変異アッセイ法は、この相互作用をモニタリングするより強固な方法を提供すると判断した。HIV-1 Vifは、酵母におけるAPOBEC3G-媒介型超変異に影響を及ぼすかどうかを試験するために、VifおよびAPOBEC3Gを同時発現している細胞のCanR変異頻度を、いずれかのタンパク質単独を発現している細胞のそれと比較した。APOBEC3Gの強固な超変異性は、HIV-1 Vif同時発現により有意に影響されなかった。従って、酵母におけるVif-APOBEC3G相互作用は検出されなかった。
【００７４】
実施例6
APOBEC3FおよびAPOBEC3GはTy1レトロ転位を阻害する
APOBEC3タンパク質が、LTR配列を用い複製する内在性レトロエレメントの移動を妨げるように機能する可能性を調べるために、酵母レトロトランスポゾンTy1の複製能を、APOBEC3GまたはそのホモログAPOBEC3Fの存在下でアッセイした。Ty1活性は、イントロン-破壊されたレトロ転位インジケーター遺伝子を用い、モニタリングした(図6A)。Ty1 RNA発現、スプライシング、逆転写および組込みは、ヒスチジン原栄養体またはルシフェラーゼ活性のいずれかをコードしている、機能性レポーター遺伝子cDNAコピーを生じた。
【００７５】
レトロ転位するTy1-his3AIの能力は、ヒトAPOBEC3Fまたは-3Gの存在下でモニタリングした(図6B)。対照ベクターを含む細胞と比較し、APOBEC3Fまたは-3Gの存在下で、各々、平均51％または70％より少ないHis+コロニーが検出された。液体培養物中に存在するルシフェラーゼの相対レベルによりモニタリングされた、Ty1-lucAIレトロ転位におけるわずかに大きいAPOBEC3依存型減少も認められた(図6C)。しかし、ゲノムTy1-his3AIエレメントのレトロ転位が、APOBEC3Fまたは-3Gの存在下でアッセイされた場合には、ほとんど全ての阻害(94〜98％)が認められ、これはAPOBEC3タンパク質のレトロ転位中間体(および/またはTy宿主因子)に対する比は、この阻害機構の重要な決定因子であることを示している(図7)。まとめると、これらのデータは、APOBEC3Fまたは-3Gは、Ty1レトロ転位を阻害することができることを明確に明らかにした。
【００７６】
酵母におけるレトロ転位のAPOBEC3依存型阻害が、逆転写酵素または組込み経路により影響されるかどうかを評価するために、同様のアッセイ法を、通常の逆転写酵素がHIV-1由来のものと交換されたTy1構築体[TyHRT]により行った。TyHRT組込みは、主に相同組換えにより主に生じるのに対し、Ty1組込みは、ほとんどそれ自身のインテグラーゼを使用する。TyHRT-his AIおよびTyHRT-lucAIの両方のレトロ転位(すなわち、HIV-1逆転写酵素産物の蓄積)も、APOBEC3FまたはAPOBEC3Gの発現により阻害された(図6D、E)、阻害レベルは、Ty1逆転写酵素により認められたレベルとおおまかに類似しており、これは逆転写酵素も、組込み経路も、APOBEC3-与えたレトロ転位ブロックの重要なエフェクターではないことを示している。これらのデータは更に、APOBEC3およびHIV-1の両方の生物学の局面を研究するための酵母Ty1システムの有用性を強調している。
【００７７】
実施例7
APOBEC3FおよびAPOBEC3GによるTy1制限はcDNAシトシン脱アミノ化機構に関与する
cDNA C->U脱アミノ化は、APOBEC3Fおよび-3Gの抗-レトロウイルス活性の特徴であるので、これは、観察されたTy1レトロ転位ブロックを説明することができるかどうかを調べた。そうであるならば、不規則な数のレトロトランスポゾンマイナス鎖C->T転位変異は、とりわけHis+組込体(プラス鎖G->A転位と同等)において認められることが予想された。各々、APOBEC3Fおよび-3Gの存在下で作出されたTyRT-HIS3鋳型の26および47kbpにわたり配列決定し、わずかに2つのC->T転位が、APOBEC3G曝露鋳型において認められた。1つは、このタンパク質により稀に好ましいジヌクレオチドコンセンサス5'-GCにおいて生じ、従ってこれはおそらく逆転写またはPCRエラーを意味すると考えられる。二番目は、トリヌクレオチド5'-CCCにおいて生じ、これは最も一般的なAPOBEC3Gの好ましい位置である。しかしこの塩基置換のわずかな数は、部分的に機能的His+(およびHis-ではない)組込体が分析されたという事実によるものである。更に、当初レトロウイルスについて仮定されたように(Harrisら (2003) Cell 113, 803-809)、レトロトランスポゾンcDNA内のウラシル残基は、その分解を引き起こすことは可能である。
【００７８】
従って、前者の可能性を説明しかつ変異を豊富高めるために、GFPカセットがhis3AIの上流に配置されたTy-his3AIシステムの修飾型が使用された(図8A)。これは、His+組込体の選択およびその後の選択されなかったGFP陰性変種のスクリーニングが可能である。20の独立したGFP変異体を、APOBEC3Gが発現されたレトロ転位実験から回収した。各配列は、少なくとも1つの変異および15ほどの変異を含んだ。合計で、57塩基置換の変異が同定され、およびこれらの47は、マイナス鎖C->T転位であった(図8B、図9A)。APOBEC3G依存型転位のほとんど全ては、コンセンサス5'-YCC内で生じ、CAN1遺伝子および様々な他のシステム中の好ましいシトシン脱アミノ化コンセンサス部位と同じであった(例えば、図9Bおよび図5の比較)。更に、多くのC->T転位が、GFP-コードしているHIVまたはMLVにおいて先に認められたものと同じ位置で生じた。同様の鎖特異性転位バイアスおよび複数の転位を伴う配列は、APOBEC3Fの存在下で作出されたGFP陰性鋳型において認められた(図9C；図8B)。しかし、APOBEC3Gとは対照的に、APOBEC3F依存型変異は、異なる5'-TTCコンセンサスにおいて生じた[図9D；HIV基質により先に認められた]。従って、Th1レトロ転位は、APOBEC3Fおよび-3Gにより阻害することができ、この作用の多く(およびおそらく全ては)、cDNAシトシン脱アミノ化機構に起因することができる。
【００７９】
実施例8
ブタ細胞におけるヒトAPOBEC3Gの発現はブタ内在性レトロウイルス(PERV)のヒト293T細胞への移入を減少する
ヒトAPOBEC3Gの発現のための構築体を、発現を駆動するためのサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターおよび選択マーカーとしてのネオマイシン遺伝子を用いて作出した。APOBEC3Gタンパク質は、ヒト細胞へのPERV伝達を阻害することができるかどうかを評価するために、この構築体を、ブタPK-15腎細胞(ATCC#CCL-33)へ、Fugene(登録商標)6試薬(Roche Applied Science, インディアナポリス, IN)を用い安定して導入し、ならびに細胞を、ネオマイシン耐性について選択した。PK-15細胞を、これらの実験のために選択したが、その理由は、これらの細胞中に存在するPERVは、簡単な上清混合実験により、ヒト293T細胞を感染することができるからである(Patienceら, (1997) Nat Med 3, 282-286)。(PERVは、溶液-可溶性無細胞粒子としておよび/または細胞-細胞接触を通じて伝達することができることに注意)。PK-15細胞におけるAPOBEC3G発現は、特異抗体を用い確認した(Newmanら (2004) Curr Biol. 15(2):166-70)。
【００８０】
ベクター対照、ヒトAPOBEC3G(hA3G)、またはブタAPOBEC3F(SsA3F)を発現しているPK-15細胞を、ヒト293T細胞と25日間(約50細胞世代)共培養し；これらふたつの細胞型を、ウイルス粒子を含む小型分子の自由拡散は許すが、細胞の拡散は許さない、1μm-サイズの孔を有する薄膜により物理的に分離した。25日後、全細胞タンパク質抽出物を、標準手順を用い、293T細胞から調製した。細胞溶解液(10μg)を、C型レトロウイルスRT(商標)活性ELISA法を用い、PERV逆転写酵素(RT)活性(ヒト細胞へのPERV移入の測定として)について試験し；これは製造業者Cavidi Tech、ウプサラ、スウェーデン、の推奨に従い行った。ヒトAPOBEC3G発現しているPK-15細胞の存在下で増殖された293T細胞において、活性はほとんど検出されなかったのに対し、対照では、著しいレベルの感染が検出された(図10)。図10の結果は、空ベクターを発現しているPK-15細胞と共に培養された293T細胞におけるRT活性に対し標準化されたRT活性の相対阻害倍率として示している。この実験は、PK-15細胞におけるヒトA3Gの発現(追加のブタAPOBEC3Fの発現ではない)は、PK-15細胞から293T細胞へのPERV転移を阻害することを示している。
【００８１】
半定量的かつ定量的リアルタイムPCRアッセイ法を行い、ヒト293T細胞に組込まれたPERV DNAの存在についてモニタリングした。半定量的PCRは、ヒト293T細胞由来の鋳型ゲノムDNAを75ngおよびプライマー
2009502120.tif 000008
を使用し行い、PERV pol遺伝子(生成物サイズ：196bp)を生じた。図11Aに示されたように、ヒトAPOBEC3G発現しているPK-15細胞の存在下で増殖された293T細胞において、ごくわずかなPERV DNAが検出されたのに対し、他の試料では有意なレベルが検出された。ヒト細胞共培養コンパートメントは、ブタ細胞により夾雑されない(すなわちマイクロキメラ現象)ことを確実にするために、PCRは、ブタDNAに特異的なプライマーを用いても行った
2009502120.tif 000009
(351bp生成物)。図11Bの左側パネルは、ブタPCR産物は、この共培養実験において、293T試料において検出されなかったことを示す。右側パネルは、陽性または陰性対照を含む。マイクロキメラ現象は、検出されなかった。
【００８２】
定量的リアルタイムPCRアッセイ法を、293TゲノムDNAを10ng、100nMプライマー、および2×iQ SYBR Greenスーパーミックス(BioRad, ハーキュレス, CA)を含有する反応液25μLにおいて行い、iCycler iQマルチカラーリアルタイムPCR検出システム(BioRad, ハーキュレス, CA)上で試行した。サーマルサイクラー条件は、95℃で5分間、それに続く95℃で15秒間および6O℃で30秒間を50サイクルであった。融解曲線解析を直接サイクリングに続け、PERV pol遺伝子PCR産物の増幅を証明した(前述のように増幅された)。ヒトβ-アクチン遺伝子(ハウスキーピング遺伝子)を、下記プライマーを使用し、内部対照として増幅した：フォワード
2009502120.tif 000010
およびリバース
2009502120.tif 000011
(生成物サイズ：約100bp)。全てのデータは標準化し、およびPERV遺伝子コピーは、100,000個のβ-アクチンコピー当たりで示された(図12)。PERV移入は、ベクター対照細胞において連続共培養の20日後に明らかであったのに対し、ヒトAPOBEC3Gの存在下ではほとんど移入は生じなかった。従って、ブタPK-15細胞におけるヒトAPOBEC3Gの発現は、PK-15細胞からヒト293T細胞へのPERV移入を阻害した。
【００８３】
実施例9
偶蹄目動物ダブル脱アミノ酵素ドメインAPOBEC3Fタンパク質
クエリーポリペプチドとしてヒトおよびマウスA3脱アミノ酵素ドメインを用い、NCBI BLAST検索を行った。いくつかの偶蹄目動物(蹄が割れた有蹄類)ESTを同定し、これは、ウシ(ボス・タウラス(Bos taurus)(Bt), GenBankアクセッション番号BE684372, Smithら, Gen. Res. 11(4):626-630, 2001)およびブタ(サス・スクロファ(Sus scrofa)(Ss), GenBankアクセッション番号BI346898, Fahrenkrugら, 2002, Mamm Genome, 13, 475-478)の少なくとも1種のA3タンパク質の存在を示唆した。対応するcDNAクローンを得、配列決定し、ふたつの推定亜鉛結合ドメイン、シトシン脱アミノ酵素ドメインを伴うA3タンパク質をコードしていることを示した。オルソログヒツジ(オビス・アリエス(Ovis aries), Oa)ダブルドメインA3 cDNA配列を、変性PCRおよびネステッド3'プライムRACEの組合せを用いて得た。独自のC末端のセリンリッチな伸長のためにわずかに長いブタA3タンパク質を除き、これらのA3タンパク質の3種全ては、373アミノ酸のHsA3Fタンパク質とサイズが類似していた。ウシ、ヒツジおよびブタA3タンパク質はは、各々、BtA3F(配列番号:8)、OaA3F(配列番号:9)およびSsA3F(配列番号:10)と称されている。BtA3F、OaA3FおよびSsA3Fのアミノ酸配列のアラインメントは、図13に示した。
【００８４】
活性脱アミノ酵素ドメイン(各側＋5個の残基)のアミノ酸アラインメントを、Clustal Wソフトウェア(Higginsら 1994, Methods Mol Biol. 25:307-18)を用いて作製した。ウシおよびヒツジのA3活性部位は、78％同一であった。ウシおよびヒツジの両方のタンパク質は、ブタタンパク質とのより低いレベルの同一性(56％)を共有していた。これらの偶蹄目動物A3タンパク質の活性部位は、HsA3Fと56〜62％同一であった(図14)。
【００８５】
偶蹄目動物A3Fタンパク質は、1本鎖DNA内にシトシンを脱アミノする能力を有するかどうかを試験するために、これらのタンパク質の内因的ミューテーター活性を、大腸菌ベースの変異アッセイ法を用いてモニタリングした。リファンピシン耐性(RifR)は、大腸菌RNAポリメラーゼB(rpoB)遺伝子における塩基置換変異に起因し、これは500万個の細菌細胞毎にほぼ1回生じる。従ってこのアッセイ法は、内因的DNAシトシン脱アミノ酵素活性の強固な測定を提供する。例えば、Hacheら (2005) J Biol Chem, 280, 0920-10924；Harrisら (2002) Molecular Cell, 10, 1247-1253を参照のこと。各偶蹄目動物A3タンパク質の発現は、大腸菌において、RifR変異頻度を3倍から7倍まで増大し、HsA3Fに起因したものよりも高いが、HsA3Gにより引き起こされるものよりもわずかに低いレベルである。BtA3FおよびSsA3F発現は、RifR変異頻度におけるHsAID様増加を引き起こす。
【００８６】
偶蹄目動物のA3F DNAシトシン脱アミノ化の優先は、少なくとも100の独立したRifR変異体のrpoB遺伝子の配列決定により決定した。各々、rpoBヌクレオチド位置1721および1691において5'-TCおよび5'-CCの、シトシンを優先的に脱アミノ化するHsA3FおよびHsA3Gとは対照的に、偶蹄目動物A3Fタンパク質は、よりバイアスが少ないrpoB変異スペクトルを示した。OaA3Fは、5'-GCジヌクレオチドの一部である、シトシン1576を優先的に脱アミノ化した。SsA3Fは、シトシン1576も好む。しかしSsA3Fは、5'-ACジヌクレオチドの一部であるシトシン1586も明らかに脱アミノ化した。RifR変異アッセイ法からの主な結論は、偶蹄目動物A3Fタンパク質の3種全ては、DNAシトシンの脱アミノ化、およびrpoB変異基質内のC/G->T/A転位変異のパターンの対応するシフトを引き起こすことが可能であることである。HsA3FおよびHsA3Gの内因的DNAシトシン脱アミノ化の優先は、レトロウイルス様HIV-1において明らかであるので、これらのデータは、OaA3FおよびSsA3Fの生理的ジヌクレオチド基質は、各々、5'-GCおよび5'-RC(R＝AまたはG)であることを示唆している。
【００８７】
偶蹄目動物A3Fタンパク質の可能性のあるレトロエレメント標的を理解する最初の段階として、これらのタンパク質の細胞下分布を、生存細胞蛍光顕微鏡により決定した。約7,500個のHeLa細胞を、LabTekチャンバードカバーグラス(Nunc)上に播種した。24時間インキュベーションした後、細胞を、pEGFP-A3-ベースのDNA構築体200ngによりトランスフェクションした。更に24時間インキュベーションした後、生存細胞の画像を、Zeiss Axiovert 200顕微鏡を用い、総倍率400×で集めた。各々、核および細胞全体に局在化されているHsA3BおよびeGFP対照とは対照的に、偶蹄目動物A3Fタンパク質およびMmA3(マウス)は、主に細胞質に存在し、ある細胞においては点状体(punctate bodies)の外観であった。この局在化パターンは、HsA3FおよびHsA3Gにおいて認められるものと同一であり、このことは、偶蹄目動物A3Fタンパク質は同様に、HIVまたはMLVのようなLTR依存型レトロウイルスの複製を阻害するように機能することを示している。
【００８８】
実施例10
偶蹄目動物A3Fタンパク質によるレトロウイルス制限
偶蹄目動物A3Fタンパク質は、HIV-およびMLV-ベースのレトロウイルスの感染力を阻害することができるかどうかを試験した。これらのシステムにおいて、プロウイルスDNA中に埋め込まれたGFP遺伝子は、トランスフェクション効率(これはウイルス産生レベルに直接相関する)およびウイルス感染力の両方の測定を提供する。293T細胞は、10％ウシ胎仔血清(Gemini Bioproducts)、ペニシリン、およびストレプトマイシン(Invitrogen)を含有するダルベッコ改変イーグル培地(Invitrogen)において増殖した。HIV-GFP[同じくCS-CGと称される]を、CS-CG 0.22μg、pRK5/Pack1(Gag-Pol) 0.14μg、pRK5/Rev 0.07μg、pMDG(VSV-G Env) 0.07μg、および先に説明されたAPOBEC発現または空ベクター対照プラスミド0.5μg(Liddamentら (2004) Curr Biol, 14:1385-1391)を含有するプラスミド混合物による、50〜70％周密な293T細胞のFuGENE(登録商標)6(Roche Applied Sciences)-媒介型トランスフェクションにより作出した。48時間のインキュベーション後、ウイルス含有する上清を、低速遠心分離により透明とし、濾過し(0.45μm)、逆転写酵素活性ベースのELISA(Cavidi Tech)を用いて定量した。逆転写酵素標準化された上清を、新鮮な293T細胞に塗布し、感染を96時間進行させた。その後感染力(GFP蛍光)を、フローサイトメトリー(FACSCalibur, BD Biosciences)により測定した。超変異解析のためにレトロウイルスDNAの回復を必要とする実験については、293T細胞感染の前に、ウイルス上清を、50単位/ml DNase(Sigma)で処理した。
【００８９】
HsA3FおよびHsA3Gの発現は、HIV-GFP感染力の4倍および24倍の減少を引き起こした。MmA3は、HIV-GFPの強力な阻害も可能であった。比較のために、BtA3F、OaA3FまたはSsA3Fの発現は、各々、HIV-GFPの感染力の30倍、8倍および29倍の減少を引き起こした(図15A)。これらの強力な抗-HIV活性は、偶蹄目動物A3Fタンパク質は、少なくとも1種のレトロウイルス制限活性を有することを明らかにしている。これらの結果は更に、偶蹄目動物のA3Fタンパク質は、HIV Gag/ゲノムRNA複合体と特異的に会合することができ、これにより集成しているウイルス粒子へのアクセスを獲得することを暗示している。
【００９０】
HIV-GFP感染力も、HIV-1 Vifおよびヒト、偶蹄目動物またはマウスのA3タンパク質の存在または非存在についてモニタリングした。HIV-1 Vifの発現は、HsA3GおよびHsA3Fを中和し(但し後者はより低い程度である)、HIV-GFP感染力の比例した回復を引き起こした。HIV-1 Vifの発現は、MmA3またはいずれかの偶蹄目動物のA3Fタンパク質の存在下で作出されたHIV-GFPの感染力はほとんど増強しなかった。従って偶蹄目動物A3Fタンパク質は、HIV-1 Vifに完全に抵抗性である。
【００９１】
MmA3の発現は、MLV感染力にほとんど作用せず、これはおそらくMLVは、このA3タンパク質を排除する(exclude)(または単純に回避する)ためであると考えられる(図15B)。対照的に、HsA3FおよびHsA3Gは、MLV-ベースのレトロウイルスの感染力を阻害するが、HIV-ベースのウイルスよりも少ない程度である(図15B)。従って、偶蹄目動物A3Fタンパク質は広範なHsA3F様もしくはHsA3G様、または狭いMmA3様レトロウイルス制限能を有するかどうかの調べを開始するために、これらのA3タンパク質の存在下で作出されたMLV-GFPの感染力を、モニタリングした。興味深いことに、HsA3FおよびHsA3Gタンパク質に酷似したように、偶蹄目動物A3Fタンパク質の発現は、MLV-GFPの感染力を2〜4倍低下した(図15B)。従ってHTV-GFPおよびMLV-GFP感染力データをまとめると、偶蹄目動物A3Fタンパク質は、比較的広範なレトロウイルス制限能を有することを示唆している。
【００９２】
実施例11
偶蹄目動物A3Fタンパク質のN末端亜鉛結合、脱アミノ酵素ドメインはC->U脱アミノ化を触媒する
偶蹄目動物A3Fタンパク質によるレトロウイルス制限の機構を解き明かすために、およびこれらのタンパク質のN-またはC末端(または両方)の亜鉛結合ドメインが、DNAシトシン脱アミノ化を触媒するかどうかを試験するために、位置特異的変異誘発を用い各活性部位の保存されたグルタミン酸(E)をグルタミン(Q)へ変更し、得られる変異体を、HIV-GFP制限活性について試験した。
【００９３】
先に報告されたように、HsA3GのN-およびC末端の両方の亜鉛結合ドメインのグルタミン酸は、HIV感染力の阻害に貢献するが、C末端触媒性グルタミン酸は、より重要であるように見える。N-およびC-の両末端のBtA3F亜鉛結合ドメインE→Q変異体は、抗-HIV活性の完全なレベルを保持するように見える。対照的に、N末端のOaA3FおよびSsA3Fの亜鉛結合ドメインE→Q変異体は、HIV-GFP感染力の阻害が、対応するC末端ドメイン変異体よりも低かった。この結果は、SsA3Fについて特に明らかであった。これらのデータは、本質的にHsA3FおよびHsA3G E→Q変異体試験の逆であり、従ってこれらは、これらのタンパク質のN末端亜鉛結合ドメインは、レトロウイルスcDNA C→U脱アミノ化を触媒することを示唆している。MmA3は、N-およびC末端の両方の亜鉛結合ドメイングルタミン酸が、HIV-GFP制限に必要であるので、明らかに異なる。
【００９４】
ヒトおよび偶蹄目動物A3タンパク質のNおよびC末端の両方のドメインE→Q変異体は依然有意なレベルの抗-レトロウイルス活性を示すが、本当の(bonafide)触媒部位変異体は、レトロウイルスcDNA C→U脱アミノ化を触媒することができないはずであると推測された[しかしこれらは依然レトロウイルス感染力を阻害することができる]。マイナス鎖ウラシルは、プラス鎖アデニンの取込みの鋳型であり、最終的にはレトロウイルスプラス鎖G→A超変異として顕在化する。従って、どの亜鉛結合ドメインがDNAシトシン脱アミノ化を触媒するかを直接試験し、および偶蹄目動物A3Fレトロウイルス制限機構の追加の洞察を得るために、前述のHIV-GFP感染力実験からのGFP遺伝子を、高忠実度PCRにより増幅し、クローニングし、DNA配列解析に供した。対照ベクターの存在下で作出されたHIV-GFPは、1塩基当たり0.00014変異という低い塩基置換変異頻度を示し、これは逆転写およびPCRのエラーに起因した。対照的に、HsA3F、HsA3G、偶蹄目動物A3Fタンパク質の3種全てまたはMmA3の存在下で作出されたウイルスは、30〜80倍より多い塩基置換変異を示し、これはほぼ全てレトロウイルス G→A転位変異であった。C末端ドメインE→Q変異を伴うHsA3Gは、レトロウイルス超変異を引き起こすことに失敗したが、この変種はHIV-GFP感染力を依然有意に阻害した。HsA3F C末端亜鉛結合ドメイン変異体は、レトロウイルス超変異の明確な徴候を伴わずに、HIV-GFP感染力を依然中等度に阻害することができた。
【００９５】
偶蹄目動物A3Fタンパク質の3種全てのN末端(C末端ではない)ドメインにおけるE→Q置換は、レトロウイルス超変異の蓄積を無効にした。従って一緒にしたこれらのデータは、偶蹄目の動物A3Fタンパク質のN末端亜鉛結合脱アミノ酵素ドメインは触媒性であること、ならびに脱アミノ酵素依存型および-独立型の両活性は、完全レベルのレトロウイルス制限に必要とすることを明らかにしている。
【００９６】
実施例12
偶蹄目動物A3Fタンパク質のレトロウイルス超変異特性
先に説明されたように、BtA3F、OaA3FおよびSsA3FのrpoB変異スペクトルは、これらのタンパク質は、各々、5'-YC、5'-GC、および5'-RC(R＝AまたはG)に対してバイアスがかかったレトロウイルス超変異パターンを引き起こすことを示唆している。この予想を検証するために、偶蹄目動物A3Fタンパク質の発現に起因した塩基置換変異の種類および局所的レトロウイルスcDNA脱アミノ化の優先を試験した。ジヌクレオチド変異の優先に関して、標的化されたシトシンのすぐ5'側の塩基は、重要な標的部位決定基である。HsA3FおよびHsA3Gは、各々、5'-CC(84％)および5'-TC(84％)が圧倒的に好ましいのに対し、MmA3は、5'-TC(61％)および5'-CC(29％)が好ましい。マウスA3同様、ウシおよびヒツジA3Fタンパク質は、脱アミノ化されたシトシンの5'側ピリミジン(Y)が好ましいように見えた(各々、93％および79％)。しかし大腸菌rpoB変異データをおおまかに並べると、ブタA3Fタンパク質は、5'-GCが好ましい(47％)。これは、5'-プリン-Cを好むA3タンパク質の唯一の例を構成するので、注目に値する(免疫グロブリン遺伝子脱アミノ酵素AIDも、この優先性を有する)。加えてこれらの解析において特徴付けられる全てのA3タンパク質は、-2位のピリミジンが好ましい(これは、C＞Tが好ましいHsA3Gを除き、常にTである)。
【００９７】
実施例13
APOBEC3Fおよび/またはAPOBEC3Gを発現している操作されたブタ
年齢9歳のプライズ・ボア(prize boar)由来の皮膚線維芽細胞を、ヒトAPOBEC3F、ヒトAPOBEC3G、または両方をコードしている発現構築体でトランスフェクションし、G418選択下に置いた。耐性コロニーを採取し、増殖した。APOBEC3F、APOBEC3Gまたは両方を発現しているコロニーは、RT-PCRにより同定した。
【００９８】
除核およびドナー細胞移植
インビボにおいて成熟した卵(ova)を、HCG投与後46〜50時間のドナー動物から外科的に回収した。除核直前に、増殖した卵丘細胞および冠細胞(corona cell)を、鈍切開、および0.1％ヒアルロニダーゼを補充したHEPES緩衝したノースカロライナ大学23(NCSU-23, PettersおよびWells (1993) J Reprod Fertil Suppl. 48:61-73)培地中での卵の反復ピペッティングにより、両方の型の卵から除去した。卵の群を、9mm×50mmペトリ皿の蓋に円柱状に配置された、10％ウシ胎仔血清、2.5μg/mlサイトカラシンB(CB)および5μg/ml Hoechst 33343を含有するHEPES緩衝したNCSU-23液滴5μlへ移入した。除核は、ES細胞移植ピペットを用い、第2中期板を含む極体および隣接細胞質の物理的除去により実現した。全細胞移植は、鋭い斜角のついたチップ(細胞の種類に応じ内径10〜25μm)を備えた、ES細胞移植ピペット(Eppendorf, ウェスベリー, ニューヨーク)を用い行った。
【００９９】
ドナー細胞(すなわちトランスフェクションされた皮膚線維芽細胞)は、24時間の血清飢餓(0.5％)により、推定G0/G1に同調した。卵母細胞を含有する微量液滴を、除核前に3時間を超えずトリプシン処理した少量のドナー細胞でスパイク（spike）した。対(couplet)は、除核後2時間以内に融合した。5〜10対の群を、マンニトール融合培地(0.28Mマンニトール, 0.2mM MgSO4×7H2O, 0.01％PVA)を積層した1mmギャップの融合チャンバー(BTX, サンディエゴ, CA, 米国)の電極間に、手作業により並置した。対は、60マイクロ秒間、150V/mmの単独のパルスに曝すことにより融合した。融合後、対を、活性化前0.5〜1.5時間、HEPES緩衝したNCSU＋10％ウシ胎仔血清中で培養した。0.1mM CaCl2×2H2Oを補充したマンニトール培地を積層した1mmギャップの融合チャンバー内に対を配置し、およびこれらを150V/mmの60マイクロ秒パルスに2回曝すことにより、対を活性化した。
【０１００】
クローン胚のインビトロ培養
活性化処置の後、再構築クローン胚を、十分に洗浄し、1％MEM非必須アミノ酸、2％BMEアミノ酸および0.4mg/ml BSAを補充したNCSU23液滴50μl中で、大気中5％CO2下で38.5℃で5日間、培地を交換することなく培養した。120時間培養後、ウシ胎仔血清(10％)を、再構築胚を含有する微量液滴全体に添加した。発生率を、活性化後のインビトロ卵割について毎日試験し、および2〜4細胞期に卵割された胚を、移植のために選択した。
【０１０１】
過剰排卵および胚移植
8〜10月齢の思春期(pubertal)交雑した雌ブタを、市販の供給材料中に混合したRegumate(0.4％アルトレノジスト含有；10mg/日；Intervet, Boxmeer, オランダ)を17〜19日間毎朝投与し、同調した。全てのドナー雌ブタに、2,000 IU PMSG(Folligon & Chorulon)を注射し、80時間後1,000 IU hCG(Folligon & Chorulon)を注射した。レシピエント雌ブタには、ドナーに投与されるPMSGおよびhCGの半分の用量を注射した。卵母細胞は、hCG注射の46〜50時間後、HEPES緩衝NCSU-23による卵管のフラッシュにより、外科的に収集した。
【０１０２】
クローンブタを作出するために、再構築した胚を、活性化後20〜24時間までに、各同調した仮腹母親の卵管へ外科的に移植した。1日目に、核移植胚(N＝385)を、3匹のレシピエント2302、5570および2175へ移植した。1週間後、再構築胚の追加群(N＝360)を、3匹の追加のレシピエント2306、5638および2211に移植した。取付式3.5MHz経腹壁的プローブを備える超音波スキャナー(Aloka SSD-500, 日本)を使用し、胚移植後25および35日目に妊娠をチェックし；この時点で、6匹のレシピエント中5匹が、少なくとも1胎仔を有した(83％)。5匹の妊娠ブタを得た。妊娠したレシピエントは、分娩予定日の約30日前に、超音波で再度試験した。レシピエント2211は妊娠せず、移植後約1ヶ月で発情を示し、全体で67％の妊娠率であった。
【０１０３】
分娩予定日の1週間前に、全ての雌ブタを、分娩用畜舎に移した。雌ブタ2302、5570および2175には、妊娠113、112および111日目にPGF2α 2mLを、および24時間後にオキシトシン2mLを投与した。胚移植後118日目に、1匹の70Og雄クローンを、レシピエント5570から手作業で取り出した。同日に、レシピエント2175は、1匹の変質した(degenerated)死仔を排出した。残りのレシピエント2302は、オキシトシンの皮下注射(shot)後質の下がった実質的な乳汁を示したが、これは畜舎から移動させ、リドカイン15mLを、下部腰椎のひとつのセットの間の椎間板へ注射した。麻酔が効くまで20分間待った後、高い位置での側腹切開を行い、子宮の両角を露出した。いずれの角も、胎仔または死仔を含まなかった。しかし両角の内膜は、膿疱性子宮内膜増殖を示し、これは子宮に妊娠している(gravid)外観をもたらした。その後レシピエント2302は、全身麻酔(アセプロマジン＋ケタミン)を施し、安楽死させた。レシピエント2175も、麻酔をかけ安楽死させ、その子宮を、追加の胎仔または死仔の存在について試験したが；何も認められなかった。
【０１０４】
妊娠112日目に、レシピエント5638は、PGF2α 2mLを受け取った。オキシトシン(2mL)を、翌日午前6時に投与した。午前7時20分に、5匹の雄クローンの最初の1匹を、レシピエントから手作業で取り出した。午前11時までに、合計5匹の雄クローンを、出産させた。従って6匹の生産仔トランスジェニッククローンが、合計6匹のレシピエントから生じた。
【０１０５】
全てのクローンは、後肢に中程度から重度の関節拘縮を示し、これはそれらの移動性を大きく低下した。クローン1(70Og)は、レシピエント5570から手作業で取り出したが、乳を飲むことができなかったので、写真撮影し、翌日安楽死させた。クローン2(1000g)および3(700g)は、誕生後数時間以内に死亡した。クローン4(700g)は、かなり重度の関節拘縮症例であり、同日に死亡した。クローン5(1200g)および6(1200g)は、Esbilac(代替ミルク配合物)により、注射器およびマウス飼育用針を介し毎時手作業により飼育した。クローン6の健康は、この授乳期間に目に見えて改善されたのに対し、クローン5の健康は減弱した。クローン5は極めて弱く、最早Esbilacを嚥下せず、翌日安楽死させた。クローン6は、その母獣(dam)へ戻し、2週間生存したが、後肢の頂端の大きい膿瘍および膨潤した前踵を有した。Tylan 200およびペニシリンの毎日の注射は、この状態を寛解せず、そのためこの子ブタは安楽死させ、細胞を収集した。
【０１０６】
エピジェネティックリプログラミングは、クローン胚において欠けている。核は、クローニングの複数ラウンドを通じそれらを継代し、および子ブタの出産前の胎仔線維芽細胞の単離により、より効果的にリプログラミングされる。既に作出されたトランスジェニック細胞を使用し、再構築胚を作出することができ、これは次に移植し、約40日間発生し、その後妊娠中絶した。次に線維芽細胞を、これらの胎仔から単離し、体細胞核移植の別のラウンドにおいて使用する前に短期間培養し、新たな子ブタを作出した。別の代替法は、稀に出発のための胎仔線維芽細胞の使用に頼り、すなわち、APOBECタンパク質を発現している新規トランスジェニック細胞の作出のために胎仔線維芽細胞を使用し、その後前述のような体細胞核移植によりブタを作出する。最も成功したブタクローニング実験は、本実施例で使用した成熟(aged)雄ブタとは対照的に、胎仔線維芽細胞由来の細胞を利用した。胚性幹細胞または成体幹細胞を含む、別の細胞給源も使用することができる。
【０１０７】
その他の態様
本発明は、前述の詳細な説明および実施例と組合せて説明されているが、前記説明および実施例は、本発明を例証することを意図し、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明は添付された特許請求の範囲により規定される。他の局面、利点および変更は、特許請求の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】図1Aおよび1Bは、APOBEC3Gは、ウラシル除去経路によるS.セレビシアエにおける変異を刺激することを示すヒストグラムである。(A)APOBEC3G発現は、CanRへの変異頻度の中央値の増加を引き起こす。各Xは、独立した培養物由来の頻度を表し、および中央値が示されている。Y-軸は、100万個生存酵母細胞当たりの観察されたCanR数を表す。対照ベクターを発現する酵母は、先に報告された値に類似しているCanRへの自然変異の頻度を示した(Huangら (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100, 11529-34；Rattrayら (2002) Genetics 162, 1063-77)。このデータは、7回の独立した実験の代表である。（図2は、これらの実験の中央値の平均を意味する。）(B)APOBEC3GおよびUgi同時発現は、CanIへの変異頻度の相乗的増加を引き起こす。APOBEC3Gは、特に記さなくとも、LexAのDNA結合ドメインでタグ付けされる。パラメータは、図1Aと同じである。
【図２】各々、6〜8種の独立したAPOBEC3Gまたは対照ベクターを発現している酵母培養物で行った7回の独立した実験からのAPOBEC3G依存型CAN1ミューテーター表現型をまとめているヒストグラムである。変異頻度の中央値の平均および対応するSEMを示している。ベクター対照を発現している酵母の変異頻度の中央値の平均は、1.3×10-6であり；この数値は、APOBEC3Gミューテーター表現型の大きさ(33倍)を標準化しかつ強調するために、値1に割り当てられた。図1Aおよび1Bおよび図3からのデータは、3回の追加実験からのデータと共に含まれる。各実験の個々の培養物間および7回の実験の中央値間の値の変動は、増殖培養物中のCanR変異体の確率論的出現(stochastic appearance)から予想される。
【図３】APOBEC3Gは、ウラシル除去経路IIによるS. セレビシアエにおける変異を刺激することを示すヒストグラムである。UgiによるウラシルDNAグリコシラーゼ阻害、または欠失によるそのアブレーションは、事実上同じ表現型を引き起こした。実験パラメータは、図1Aについて説明されたものと同じである。
【図４】図4A-4Dは、APOBEC3Gは、S.セレビシアエにおけるC/G->T/Aの転位変異を引き起こすことを明らかにしている。(A)対照ベクターまたはAPOBEC3Gを発現しているS.セレビシアエのCAN1遺伝子において認められる変異の種類をまとめているヒストグラム。Lex-APOBEC3GおよびタグなしAPOBEC3G発現細胞からのデータはほぼ同一であり、これらの解析のためにプールした。変異は、転位(Trs)、トランスバース(Trv)、欠失(Del)または挿入(Ins)として分類した。(B)対照ベクターまたはAPOBEC3Gを発現しているS.セレビシアエのCAN1遺伝子において認められる塩基置換変異のまとめ。(C)Ugiおよび対照ベクターまたはAPOBEC3Gを発現しているS.セレビシアエのCAN1遺伝子において認められる変異の種類をまとめているヒストグラム。図4Aのように記した。(D)Ugiおよび対照ベクターまたはAPOBEC3Gを発現しているS.セレビシアエのCAN1遺伝子において認められる塩基置換変異のまとめ。
【図５】APOBEC3G発現細胞(n=37)における、C/G->T/A転位変異部位に対する示された位置で、各塩基が、認められる割合(％)を示するグラフである。最も頻繁に認められた塩基は、下側に示されている。モデルレトロウイルス基質HIV-GFPまたはMLV-GFPにおいて認められたAPOBEC3Gコンセンサス部位が示されている(Liddamentら (2004) Curr. Biol. 14, 1385-91)。複数塩基は、同じ割合を有し、一文字コードにより示されており、D=A/G/T、R=A/Q、S=G/CおよびY=C/Tである。CAN1遺伝子のG/C含量は、破線により示した。
【図６】図6A-6Dは、APOBEC3FおよびAPOBEC3Gは、Ty1レトロ転位を阻害することを示している。(A)Ty1またはTyHRTによるレトロ転位は、ヒスチジン原栄養体またはルシフェラーゼ活性を生じることを概略的に示す。GA、PR、IN、RTおよびLTRは、各々、gag、プロテアーゼ、インテグラーゼ、逆転写酵素および長末端反復となる。(B,D)APOBEC3Fまたは-3G発現は、His+コロニー数によりモニタリングされるTy1またはTyHRTレトロ転位を縮小する。各条件に関して、少なくとも8種の独立した培養物が分析され、エラーバーは、平均の1標準誤差を示す。(C,E)APOBEC3Fまたは-3G発現は、ルシフェラーゼ活性によりモニタリングされるTy1またはTyHRTレトロ転位を縮小する。条件は先に説明したものと同じである。
【図７】染色体Ty1-his3AIエレメントのレトロ転位に対するAPOBEC3Fまたは-3G発現の作用を示す代表的実験のグラフである。APOBEC3Fおよび-3G発現は、His+レトロ転位の頻度を、各々94倍および98倍低下した。APOBEC3Fおよび-3G発現培養物のいくつかは、His+コロニーを生じることに失敗した(しかし生存細胞数は、それらが飽和まで増殖したことを示す)ので、これらの作用は、過小評価される可能性がある。この実験のHis+レトロ転位のベクター対照レベルは、図6に示されたレベルよりもはるかに低いことは注目され、その理由は、Ty1-his3AI構築体は単コピーであり、およびその内在性プロモーターは、細胞下制御であるが、図6において使用された構築体は、高効率のGALプロモーターにより多コピープラスミドから発現されるからである。エラーバーは、1SEMを示し、これらは、APOBEC3Fおよび-3Gについてはかろうじて認められる。
【図８】図8A-8Bは、APOBEC3FおよびAPOBEC3Gは、Ty1 cDNA超変異を誘導したことを示している。(A)GFPパッセンジャー遺伝子を持つTy1のLTR依存型His+レトロ転位を概略的に示す。His+レトロ転位事象は、プールされ、GFP陰性変種は、材料および方法に説明されたようにDNA配列決定のために回収された。GA、PR、IN、RTおよびLTRは、各々、gag、プロテアーゼ、インテグラーゼ、逆転写酵素および長末端反復となる。(B)His+/GFP-レトロトランスポゾンのGFPパッセンジャー遺伝子(および周囲の領域)(配列番号:1)において認められたゲノム(+)鎖塩基置換変異の全てを概略的に示す。APOBEC3Gまたは-3F発現に起因した変異は、各々、1488bpコンセンサス配列の上側および下側に示した。GFP開始コドンは、下線をつけた。全ての変異は、Ty1実験から回収したが、但し3個のG->A置換は、TyHRT実験から回収した(1個は、APOBEC3Fがコンセンサス位置681に示されたため；第二のものは、APOBEC3Fが、および1個はAPOBEC3Gが、それらがHIV RT配列に生じたので、示されなかったため)。これら全ての配列決定生データは、図9にまとめている。4種のGFP陰性対照が認められた。2種は、PCRにより回収されず、2種は、より小さいPCR産物が生成され、配列決定されなかった(おそらく欠失)。
【図９】Ty1 cDNAにおけるAPOBEC3GおよびAPOBEC3Fの変異優先を示す表である。(A,C)各々、APOBEC3Gまたは-3Fの存在下で生じた、His+レトロ転位のプールにおいて認められたGFP遺伝子(および周囲の領域)の塩基置換変異のまとめ。(B,D)各々、APOBEC3Gまたは-3Fの発現に起因するTy1 cDNA C->T転位部位の周囲の塩基優先。APOBEC3Gは、5'-YCCに明らかな優先を示すのに対し、APOBEC3Fは、5'-TTCを優先する(Y=CまたはT；変異したシトシンは下線をつけた)。
【図１０】長期共培養実験において、ブタ腎臓(PK-15)細胞におけるヒトAPOBEC3G発現は、ヒト293T細胞へのPERV移入の3倍の減少を引き起こすことを示すグラフである。上側のふたつのパネルは、PK-15細胞(中央線)におけるヒトAPOBEC3G(HsA3G)の発現を示す免疫ブロット法であるが、これはベクター単独またはブタAPOBEC3F(SsA3F)発現細胞(各々左側および右側レーン)では示さない。非特異的バンドは、装荷対照として示した。
【図１１】図11Aは、ヒトAPOBEC3Gは、ブタ細胞からヒト細胞へのPERV移入を強力に消滅することを示す、代表的半定量的なPCRアッセイ法からのPCR産物の写真である。図11Bは、ブタ特異性対照である。
【図１２】ヒトAPOBEC3Gは、ブタ細胞からヒト細胞へのPERV移入を強力に消滅することを示す、代表的定量的リアルタイムPCRアッセイ法のグラフである。
【図１３】ウシ(BtA3F, 配列番号:8)、ヒツジ(OaA3F, 配列番号:9)、およびブタ(SsA3F, 配列番号:10)のAPOBEC3Fタンパク質の配列アラインメントである。
【図１４】ヒト(HsA3F, 配列番号:11)、ウシ(BtA3F, 配列番号:12)、ヒツジ(OaA3F, 配列番号:13)、およびブタ(SsA3F, 配列番号:14)のAPOBEC3Fタンパク質の活性部位の配列アラインメントである。保存モチーフは、ボックス内である。
【図１５】図15Aは、ベクター対照または示されたA3タンパク質の存在下で産生されたHIV-GFPの相対感染力のグラフである。比較を促進するために、全てのデータは、任意に1に割り当てられたベクター対照の存在下で産生されたHIV-GFPの感染力に対し標準化された。3回の独立した実験の平均およびSEMを示している。HIV Vifは、これらの実験においては存在しなかった。図15Bは、示された構築体の存在下で産生されたMLV-GFPの相対感染力のグラフである。パラメータは、図15Aのものと同じである。
【図１】
2009502120.tif 000012
【図２】
2009502120.tif 000013
【図３】
2009502120.tif 000014
【図４】
2009502120.tif 000015
【図５】
2009502120.tif 000016
【図６】
2009502120.tif 000017
【図７】
2009502120.tif 000018
【図８】
2009502120.tif 000019
【図９】
2009502120.tif 000020
【図１０】
2009502120.tif 000021
【図１１】
2009502120.tif 000022
【図１２】
2009502120.tif 000023
【図１３】
2009502120.tif 000024
【図１４】
2009502120.tif 000025
【図１５】
2009502120.tif 000026
【手続補正書】
【提出日】平成20年3月26日(2008.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
Ty1 DNA配列決定
レトロ転位されたTy1およびTyHRT cDNAを、His+コロニーをSC-HIS 10ml中、30℃で一晩増殖し、標準ガラスビーズ/フェノール抽出法によりDNAを調製することにより、単離した。得られたDNAを使用し、RT遺伝子およびHIS3に広がる1,026(Ty)または971(TyHRT)bp領域を、
2009502120.tif 000027
または
2009502120.tif 000028
および
2009502120.tif 000029
を使用し増幅した。PCR産物を、精製し(Qiagen)、
2009502120.tif 000030
により配列決定した。GFP陰性レトロ転位事象を、大腸菌への形質転換により、His+コロニーゲノムDNAのプールから得た。GFP陰性コロニーは、蛍光を用いて同定し、レジデントプラスミドDNAを、増幅し(生成物がTy RTについて2.1kbであること以外は前述のように)、
2009502120.tif 000031
および
2009502120.tif 000032
を用い配列決定した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009502120000001.app