(57)【要約】  本発明は、エシェリキア・コリ株ＤＳＭ６６０１のプラスミド不含のクローン、その製造方法並びにクローニング運搬体としてのその使用に関する。
2009514506.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エシェリキア・コリ株ＤＳＭ６６０１のプラスミド不含のクローン。
【請求項２】
請求項１記載のプラスミド不含のクローンの製造方法であって、以下の工程：
ａ）プラスミドｐＭｕｔ１及びｐＭｕｔ２中に耐性遺伝子を組み込む工程、
ｂ）工程ａ）で得られたプラスミド中にｓａｃＢ遺伝子を組み込む工程、
ｃ）工程ｂ）で得られたプラスミドをＥ．コリ株ＤＳＭ６６０１に導入し、そして該菌株を、本来存在するプラスミドｐＭｕｔ１及びｐＭｕｔ２が工程ｂ）で得られたプラスミドによって排除される条件下に培養する工程、及び
ｄ）工程ｃ）で得られたクローンを、実質的にｓａｃＢ遺伝子を欠失した細菌の増殖のみを可能にする条件下に培養する工程
を特徴とする方法。
【請求項３】
耐性遺伝子が発現カセット中に存在する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
耐性遺伝子がテトラサイクリン耐性又はカナマイシン耐性から選択される、請求項２又は３記載の方法。
【請求項５】
プラスミドｐＭｕｔ１をテトラサイクリン耐性カセット及びｓａｃＢ遺伝子で標識し、そして本来のプラスミドｐＭｕｔ２をカナマイシン耐性カセット及びｓａｃＢ遺伝子で標識する、請求項２から４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
テトラサイクリン耐性カセットとｓａｃＢ遺伝子で標識されているプラスミドｐＭｕｔ１で形質転換された細菌をテトラサイクリンを含有するプレート上で培養し、引き続きサッカロースを含有するプレート上で培養し、そして第一工程でのプラスミドｐＭｕｔ１の排除の後に、プラスミドｐＭｕｔ２の排除をカナマイシンプレート上での培養及びサッカロースプレート上での更なる培養によって実施する、請求項２から５までのいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
クローニング菌株としての、請求項１記載のプラスミド不含のクローンの使用。
【請求項８】
動物における胃腸障害の治療のための薬剤の製造のための、請求項１記載のプラスミド不含のクローンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＥ．コリ株ＤＳＭ６６０１のプラスミド不含のクローン、その製造方法並びにこうして得られた細菌のクローニング運搬体としての使用に関する。
【０００２】
Ｅ．コリ、すなわち本来、特にヒト及び動物の腸に存在する細菌は、既に久しい以前から、詳細な微生物学的研究及び遺伝子工学的研究の対象となっており、そして遺伝子工学において、特に規定の遺伝子もしくはタンパク質のクローニング及び／又は発現のために使用される。
【０００３】
エシェリキア属の大部分の菌株は、腸内腔の外部で病原性であり、そして一般に冒された部位に感染をもたらす。エシェリキア・コリ属の非病原性菌株はドイツ微生物保存機関に寄託された菌株ＤＳＭ６６０１であり、該菌株は全てのその他のＥ．コリ株と幾つかの遺伝的特徴において相違している。しかしながら、この菌株は困難な状況下にのみ遺伝子操作できるにすぎず、そして一部で全く遺伝子操作できず、従って容易なクローニング手段として使用することができないことが指摘されていた。
【０００４】
Ｅ．コリ株ＤＳＭ６６０１は、ｐＭｕｔ１又はｐＭｕｔ２と呼ばれ、３１７７ｋｂもしくは５５５２ｋｂのサイズを有する２種のプラスミドを本来保有している。これらのプラスミド及びそれらのＤＮＡ配列は、例えばＵＳ６，３９１，６３１号に記載されている。
【０００５】
Ｅ．コリ細菌の病原性もしくは非病原性が明らかに部分的にそれらのプラスミドによって制御されるという考察と部分的に生じるＥ．コリ株の“遺伝的耐性”がそれらの潜在のプラスミドと関連がありうるという更なる考察とを前提として、本発明の課題は、プラスミド不含であるが、その他にそのゲノムＤＮＡに関して本来の菌株と遺伝的に完全に同一なＥ．コリ株を生み出すことである。
【０００６】
前記課題は、Ｅ．コリ株ＤＳＭ６６０１のプラスミド不含のクローンを提供することと、かかるクローンの製造方法によって解決される。
【０００７】
図面において、
図１は、概略の形式で菌株ＤＳＭ６６０１のプラスミド不含のクローンの製造方法の経路を示しており；
図２はプラスミドｐＭｕｔ１−Ｔｃの物理地図を示しており；
図３はプラスミドｐＭｕｔ２−Ｋｎの物理地図を示している。
【０００８】
本発明に導いた時間のかかる研究によって、菌株ＤＳＭ６６０１のプラスミド不含のクローンは通常の遺伝子工学的手法では全く製造できないか、又は多大な困難を伴ってのみ製造できるに過ぎないので、かかるクローンの発生のために特定の経路をとらねばならないことが明らかとなった。該菌株の野生型はそのゲノムＤＮＡの他に異なるサイズの２種のプラスミドを有するので、これらのプラスミドを複数の、部分的に並行して進行する工程で排除せねばならない。
【０００９】
本発明によるクローンの製造のために、本発明による方法によれば、Ｅ．コリ株ＤＳＭ６６０１中に本来存在するプラスミドｐＭｕｔ１及びｐＭｕｔ２を第一工程でそれぞれ抗生物質耐性により標識する。そのために該プラスミドを従来の方法により単離し、そして耐性遺伝子を所望の部位に組み込む。有利な実施形によれば、耐性遺伝子を、プロモーターを有し、それが構成的又は誘導的であってもよい発現カセットと一緒にそれぞれのプラスミドに組み込む。
【００１０】
こうして得られたプラスミドを次いで従来の方法に従って、例えばＣａＣｌ２法又はエレクトロポレーションによって、適当な宿主に導入し、そしてそこでクローニングし、その際、それぞれのプラスミド中に組み込まれた耐性遺伝子は該プラスミドを有する宿主細胞の選択を容易にする。１つの耐性遺伝子を有するプラスミドのクローニングのために適当な宿主は、例えばＥ．コリ株ＤＨ５α又はＥ．コリ株ＨＢ１０１である。
【００１１】
耐性遺伝子を有するプラスミドを単離し、そして引き続きｓａｃＢ遺伝子を該プラスミド中に組み込み、更なるマーカーを準備する。
【００１２】
こうして得られたもしくは標識されたプラスミドを次いでＥ．コリ株ＤＳＭ６６０１に導入する。
【００１３】
形質転換後に、Ｅ．コリ株ＤＳＭ６６０１を、先行する工程でプラスミド中に組み込まれた耐性遺伝子が耐性を与えた１種以上の抗生物質を含有する培地上で培養する。
【００１４】
かかる培地上での培養によって、栄養培地中に含まれる抗生物質に対して耐性であるクローンのみが増殖する。更に該細菌は本来のプラスミドｐＭｕｔ１及びｐＭｕｔ２をその増殖のためにもはや必要としないので、これらの細菌は不必要な遺伝材料を失い、結果として最後には該細菌は改変されたプラスミドｐＭｕｔ１及びｐＭｕｔ２（これらは１種以上の耐性遺伝子とｓａｃＢ遺伝子を有する）のみを有する。
【００１５】
更なる工程で、こうして培養された細菌を、ｓａｃＢを有する細菌の増殖を阻害し、その際、選択圧がかかり、実質的にｓａｃＢ遺伝子を欠失した細菌の増殖のみを可能にする栄養培地中に移す。このことは、該菌株を３０℃で１０％のサッカロースの存在下に培養することによって行われてよい。それというのもかかる条件ではｓａｃＢ遺伝子を有するプラスミドを欠失したかかるクローンのみを複製することができるからである。
【００１６】
結果として菌株ＤＳＭ６６０１のプラスミド不含の誘導体が得られる。目下、本発明によるプラスミドを損失したクローンはゲノムＤＮＡの改変が全くなされておらず、そして意想外にも良好にクローニング運搬体として使用できることが判明した。
【００１７】
従って該クローンは研究所で多くの遺伝子もしくはタンパク質のクローニングもしくは発現のための宿主細胞として危険なく使用できる。本発明による菌株ＤＳＭ６６０１ΔｐＭｕｔ１／２による試験は、該菌株が外来ＤＮＡについて、これが分離された形で存在する固有のプラスミド中に組み込まれる場合には特に良好なアクセプターである、従ってすなわち固有のプラスミドは外来ＤＮＡのためのクローニングベクターとして機能することを示している。更に該菌株は、これらが非病原性菌株から誘導されるので、動物及びヒトにおける胃腸管の障害の治療のために使用できる。このために、該菌株を所望であれば、粘膜への細菌の接着を促進する外来遺伝子、例えば場合により宿主動物特異的に、例えばウシ及び／又はブタの粘膜への細菌の接着を促進し、従って別の病原性微生物の増殖を妨害もしくは遮断するアドヘシンで形質転換する。
【００１８】
ここで本発明を実施例に関連させて更に詳説する。
【００１９】
実施例１
ｐＭｕｔ１の改変
野生型のＤＳＭ６６０１に本来から存在する両者のプラスミドｐＭｕｔ１及びｐＭｕｔ２をキアゲン（QIAGEN）のプラスミド−ミディプレップ（Midiprep）プロトコール（キアゲンプラスミド調製ハンドブック１２／２００２、第１６〜２０頁）に従って単離した。
【００２０】
プラスミドｐＭｕｔ１の標識のために、ベクターｐＢＲ３２２から誘導されたテトラサイクリン耐性カセットを選択した。付属するプロモーターはプラスミドｐＡＳＫ７５から派生したものである。このクローニングにより得られたプラスミドをｐＫＳ−ｔｅｔＡｔｅｔｐ／ｏと呼称する。インサートのｔｅｔＡｔｅｔｐ／ｏ（インサートサイズ１．５ｋｂ）を制限酵素ＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切り出した。ＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片をＮｄｅＩ制限切断部位を介してプラスミドｐＭｕｔ１に組み込んだ。
【００２１】
このために相応の酵素によるプラスミドの制限消化により制限バッチをカラム（キアゲン、ＰＣＲ精製キット（PCR Purification Kit））を介して精製し、そして“ブラントエンド”を形成するためにクレノウ処理を行った。プラスミドｐＭｕｔ１の再ライゲーションを回避するために、制限酵素ＮｄｅＩで直鎖化され、かつクレノウ酵素で処理されたプラスミドの脱リン酸化を実施した。引き続きベクターｐＭｕｔ１及びインサートのｔｅｔＡｔｅｔｐ／ｏをライゲーションし、そしてそれによりＥ．コリＫ−１２株ＤＨ５αを形質転換した。
【００２２】
コンピテント細胞を製造するために１．５ｍｌのオーバーナイト培地を１５０ｍｌのＬＢ培地（ルリア−ベルタニ培地）に接種し、そして３７℃でＯＤ６００＝０．５になるまで振盪した。次いで細菌培養を２０分間にわたり氷上でインキュベートし、そして１０分間にわたり４℃で４０００ｒｐｍで遠心分離した。細菌ペレットを滅菌された氷冷１０％グリセリン中で、まずは初期容量の１００％で、次いで５０％で、そして最後に１０％で３回洗浄した。最後に、洗浄されたペレットを３００μｌの１０％グリセリン中に再懸濁し、アリコート（４０μｌ）に分け、そして−８０℃で保存した。細菌細胞の形質転換のために、１〜２μｌのプラスミドＤＮＡ（１〜１００ｎｇ）を４０μｌの氷上解凍されたコンピテント細胞と混合し、そして氷上で５分間インキュベートした。次いでこのバッチを両電極間に気泡が入らないようにして、滅菌され事前に冷却された２ｍｍのエレクトロポレーションキュベットにピペット導入した。該キュベットの水分を拭き取り、電極ホルダ中に装填した。２．５ｋＶ、２００Ω及び２５μＦで電気インパルスを通した後に、細菌懸濁液を１ｍｌのＬＢ培地でキュベットからすすぎだし、そして３７℃で１〜２時間にわたり振とう器中でインキュベートした。引き続きこれらの細菌を遠心分離し、そして上清を１００μｌにまで抜き取った。沈殿物を残りの１００μｌ中に再懸濁し、Ｔｃ含有の選択プレート上にプレーティングし、一晩３７℃でインキュベートした。
【００２３】
クローニングの成果を幾つかの細菌クローンのそれぞれのプラスミドの微量調製によって検査した。テトラサイクリンカセットで標識されたプラスミドｐＭｕｔ１をｐＭｕｔ１−Ｔｃと呼称する。図２にプラスミドｐＭｕｔ１−Ｔｃの物理地図を示す。テトラサイクリン耐性を担うＤＮＡ断片についての挿入部位（本来は単一のＮｄｅＩ部位）が示されている。このＤＮＡ断片はクローニングに適当な単一のＥｃｏＲＩ配列をも有している。更にプライマーのＭｕｔａ５及びＭｕｔａ６についての結合部位が示されており、これらはこれらのプラスミドのＰＣＲによる特異的な検出のために適している。
【００２４】
実施例２
ｐＭｕｔ２の改変
プラスミドｐＭｕｔ２の標識のために、ベクターｐＡＣＹＣ１７７から誘導されたカナマイシン耐性カセットを選択した。このために前記ベクターから制限酵素ＳｔｕＩにより耐性カセット（サイズ１．３４ｋｂ）を切り出し、そしてＢｇｌＩＩ制限切断部位を介してプラスミドｐＭｕｔ２に組み込んだ。相応の酵素によるプラスミドの制限消化により制限バッチをカラム（キアゲン、ＰＣＲ分別キット（PCR Fraktion Kit））を介して精製し、そしてプラスミドｐＭｕｔ２に、クローニングのための“ブラントエンド”を形成するためにクレノウ処理を行った。プラスミドｐＭｕｔ２の再ライゲーションを回避するために、制限酵素ＢｇｌＩＩで直鎖化され、かつクレノウ酵素で処理されたプラスミドの脱リン酸化を実施した。引き続きベクターｐＭｕｔ２及びカナマイシンカセットをライゲーションし、そしてそれによりＥ．コリＫ−１２株ＤＨ５αを実施例１に記載のように形質転換した。形質転換体をＫｎ含有のＬＢ寒天培地上にプレーティングした。クローニングの成果を幾つかの細菌クローンのプラスミドの微量調製によって検査した。カナマイシンカセットで標識されたプラスミドｐＭｕｔ２をｐＭｕｔ２−Ｋｎと呼称する。
【００２５】
図３にプラスミドｐＭｕｔ２−Ｋｎの物理地図を示す。カナマイシン耐性カセットについての挿入部位（本来は１つのＢｇｌＩＩ部位）並びに単一でクローニング部位として適したＥｃｏＲＩ配列が書き入れられている。Ｍｕｔａ７乃至Ｍｕｔａ１０によって、前記のプラスミドのＰＣＲによる特異的な検出のために適しているプライマーの配列に対して相補的な各領域を標している。
【００２６】
実施例３
ｓａｃＢ遺伝子の導入
ｓａｃＢ遺伝子（レバンサッカラーゼをコードする）を耐性カセットで標識されたプラスミドｐＭｕｔ１−ＴｃとｐＭｕｔ２−Ｋｎ中に導入するために、両方のプラスミドにおいてそれぞれ単一のＥｃｏＲＩ制限切断部位を選択した。ｓａｃＢ遺伝子（サイズ２．６ｋｂ）をプラスミドｐＣＶＤ４４２から制限酵素ＰｓｔＩで単離した。ベクターｐＭｕｔ１−ＴｃとｐＭｕｔ２−Ｋｎを準備するために、前記のプラスミドをＥｃｏＲＩで直鎖化し、そして引き続き“ブラントエンド”の形成のためにクレノウ処理を行い、そして脱リン酸化させた。インサートのｓａｃＢをＰｓｔＩによる制限消化後に精製し、そしてクレノウ酵素で処理した。直鎖化されたベクター及びインサートをライゲーションし、そしてそれによりＥ．コリＫ−１２株ＤＨ５αを実施例１に記載のようにコンピテントにして、形質転換した。クローニングの成果を幾つかの細菌クローンのプラスミドＤＮＡの微量調製及び引き続いての制限分析によって検査した。ｓａｃＢ遺伝子で標識されたプラスミドｐＭｕｔ１−ＴｃとｐＭｕｔ２−ＫｎをｐＭｕｔ１−ＴｃＳａｃ及びｐＭｕｔ２−ＫｎＳａｃと呼称する。
【００２７】
実施例４
Ｅ．コリ株ＤＳＭ６６０１のプラスミド不含のクローンの製造
まずプラスミドｐＭｕｔ１−ＴｃＳａｃをエレクトロポレーションによって前記の菌株に、実施例１に記載のように形質転換した。プラスミドｐＭｕｔ１−ＴｃＳａｃを菌株ＤＳＭ６６０１に移入させるためのエレクトロポレーションの後に、該バッチをＴｃ含有（５０μｇ／ｍｌ）のＬＢプレート上にプレーティングした。得られたテトラサイクリン耐性の細菌クローンを、プラスミドｐＭｕｔ１−ＴｃＳａｃの保有に関して、そしてそれと結びつく本来存在するプラスミドｐＭｕｔ１の損失に関して検査した。プラスミドｐＭｕｔ１の損失は、プラスミドＤＮＡを調製し、そしてそのＤＮＡを酵素ＥｃｏＲＩにより制限消化し、引き続き直鎖化されたプラスミドを電気泳動により分離し、ｐＭｕｔ１を示すＤＮＡバンドの欠損により検出された。
【００２８】
引き続きこれらのクローンの１つを１０％のサッカロースを含有するＬＢ培地中で３０℃で一晩培養し、次いで１０％のサッカロースを含有するＬＢプレート上にプレーティングした（ＬＢ培地は１０ｇのカゼインからのペプトン、５ｇの酵母エキス及び５ｇの塩化ナトリウムからなり、蒸留水で１ｌにしたもの）。サッカロース含有のＬＢ培地は、オートクレーブ処理された培地に４５℃に冷却した後に、滅菌濾過された５０％（質量／容量）のサッカロース原液からその一部を１０％の最終濃度になるまで添加して製造した。これらのプレートは３０℃でインキュベートした。前記の条件下に、ｓａｃＢをもはや発現しない、すなわちｓａｃＢ遺伝子を有するプラスミドを欠失した各クローンだけが複製できる。こうして得られた菌株ＤＳＭ６６０１ΔｐＭｕｔ１をプラスミドｐＭｕｔ１−ＴｃＳａｃの損失に関して検査した。
【００２９】
次いでエレクトロポレーションによってプラスミドｐＭｕｔ２−ＫｎＳａｃを菌株ＤＳＭ６６０１ΔｐＭｕｔ１中に導入した。
【００３０】
プラスミドｐＭｕｔ２−ＫｎＳａｃを菌株ＤＳＭ６６０１ΔｐＭｕｔ１に移入させるためのエレクトロポレーションの後に、該バッチをＫｎ含有（５０μｇ／ｍｌ）のＬＢプレート上にプレーティングした。得られたカナマイシン耐性の細菌クローンを、プラスミドｐＭｕｔ２−ＫｎＳａｃの保有に関して、そしてそれと結びつく本来存在するプラスミドｐＭｕｔ２の損失に関して試験した。引き続き前記のクローンの１つを１０％のサッカロースを含有するＬＢ培地中で３０℃で一晩培養し、次いで１０％のサッカロースを含有するＬＢプレート上にプレーティングした。これらのプレートは３０℃でインキュベートした。こうして得られた菌株ＤＳＭ６６０１ΔｐＭｕｔ１／２をプラスミドｐＭｕｔ２−ＫｎＳａｃの損失に関して検査した。
【００３１】
更にプラスミド不含の菌株ＤＳＭ６６０１ΔｐＭｕｔ１／２からパルスフィールドゲル電気泳動を実施して、該菌株の場合により起こる染色体改変を排除した。如何なる改変も検出されないことを確認し、そして更なる調査により、プラスミド不含のクローンが形態学的、生化学的又は培養的な変化も示さないことが判明した。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、概略の形式で菌株ＤＳＭ６６０１のプラスミド不含のクローンの製造方法の経路を示している
【図２】図２はプラスミドｐＭｕｔ１−Ｔｃの物理地図を示している
【図３】図３はプラスミドｐＭｕｔ２−Ｋｎの物理地図を示している
【図１】
2009514506.tif 000003
【図２】
2009514506.tif 000004
【図３】
2009514506.tif 000005
【国際調査報告】
2009514506.tif 000006
2009514506.tif 000007
2009514506.tif 000008
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