(57)【要約】本発明は、Ｔ細胞で発現される、ｐＧ６ｂといわれるリンパ球阻害受容体として機能する新しく同定されたＣＤ２８ファミリーメンバーを提供する。治療、診断、および研究目的のためのｐＧ６ｂ−媒介陰性シグナル伝達を変調し、およびそのカウンター−受容体の相互作用に干渉する方法および組成物も提供される。１つの態様において、本発明はリンパ球活性を変調する方法を提供する。そのような方法は、一般には、ｐＧ６ｂ−陽性リンパ球を、少なくとも１つのリンパ球活性を変調するのに有効な量のｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達を変調することができる生物活性剤と接触させることを含む。特定の実施形態において、リンパ球はＴリンパ球である。本発明に従って変調することができる典型的なＴリンパ球活性は、例えば、活性化、分化、増殖、生存、細胞溶解活性、およびサイトカイン生産を含む。
2009538830.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンパ球活性を変調するための方法であって、該方法は、ｐＧ６ｂ−陽性リンパ球と、少なくとも１つのリンパ球活性を変調するのに有効な量でｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達を変調することができる生物活性剤とを接触させることを含む、方法。
【請求項２】
前記剤がｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達のアンタゴニストを含み、前記接触がｐＧ６ｂシグナル伝達によって媒介されるリンパ球活性の減衰を阻害する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記接触がリンパ球活性を増加させる、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記アンタゴニストが、ｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の機能的相互作用を妨害することができる遮断薬を含む、請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記遮断薬がｐＧ６ｂの細胞外ドメインに特異的に結合することができる抗―ｐＧ６ｂ抗体を含み、前記結合がｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の相互作用を妨害する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記遮断薬が可溶性ｐＧ６ｂ蛋白質を含む、請求項４記載の方法。
【請求項７】
前記剤がｐＧ６ｂ―媒介シグナル伝達のアゴニストを含み、前記接触がリンパ球活性を減少させる、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記アゴニストがｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の機能的相互作用を模倣または増大させることができる剤を含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記アゴニストがｐＧ６ｂの細胞外ドメインに特異的に結合することができる抗―ｐＧ６ｂ抗体を含み、前記結合がｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の機能的相互作用を模倣または増大させる、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記リンパ球がＴリンパ球であって、前記リンパ球活性が活性化、分化、増殖、生存、細胞溶解活性、およびサイトカイン生産よりなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記リンパ球活性が標的抗原に対する宿主免疫応答を含み、前記標的抗原が病原体抗原、ワクチン抗原、およびそのカウンター受容体以外の腫瘍―関連抗原よりなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
対象において癌を治療するための方法であって、該方法は、該対象にｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達のアンタゴニストを投与することを含み、該投与は該対象において腫瘍細胞に対する宿主免疫応答を増加させるのに有効である、方法。
【請求項１４】
前記アンタゴニストがｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の機能的相互作用を妨害することができる遮断薬を含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記遮断薬がｐＧ６ｂの細胞外ドメインに特異的に結合することができる抗―ｐＧ６ｂ抗体を含み、前記結合はｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の相互作用を妨害する、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
自己反応性ｐＧ６ｂ−陽性リンパ球の存在によって特徴付けられる自己免疫疾患を有する患者を治療するための方法であって、該方法は、該患者にｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達のアゴニストを投与することを含み、該投与がｐＧ６ｂを発現する非―リンパ系非―腫瘍宿主細胞に対する自己反応性免疫応答を阻害するのに有効である、方法。
【請求項１７】
前記アゴニストがｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の機能的相互作用を模倣または増大させることができる剤を含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記アゴニストがｐＧ６ｂの細胞外ドメイン（配列番号３）に特異的に結合することができる抗―ｐＧ６ｂ抗体を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
単離された抗―ｐＧ６ｂ抗体であって、以下：
（ａ）該抗体は、ヒトｐＧ６ｂの細胞外ドメイン（配列番号３）に特異的に結合し、かつ（ｂ）該抗体は、マイクロビーズに共有結合によりカップリングして、該抗体の固定化形態を生じる場合、インビトロにてＴ細胞におけるＴｃＲ―媒介活性化を阻害することができ、該ＴｃＲ−媒介活性化は、該Ｔ細胞を、該マイクロビーズにもカップリングした作動性抗―ＣＤ３抗体と接触させる工程を含むことを特徴とする、抗体。
【請求項２０】
さらに、前記抗体の固定化形態が、前記抗―ｐＧ６ｂ抗体の非存在下において第二のマイクロビーズに共有結合によりカップリングされた抗―ＣＤ３と接触させる対照Ｔ細胞と比較して、少なくとも約５０％前記ＴｃＲ−媒介活性化を阻害することができることを特徴とする、請求項１９記載の抗―ｐＧ６ｂ抗体。
【請求項２１】
さらに、前記抗体の固定化形態がインビトロにて第二のＴ細胞において第二のＴｃＲ―媒介活性化を阻害することができ、該第二のＴｃＲ―媒介活性化は、該Ｔ細胞を、前記マイクロビーズに共有結合によりカップリングされた抗―ＣＤ３抗体、および可溶性の作動性抗―ＣＤ２８抗体と接触させる工程を含むことを特徴とする、請求項１９記載の抗―ｐＧ６ｂ抗体。
【請求項２２】
モノクロ−ナル抗体である、請求項１９記載の抗―ｐＧ６ｂ抗体。
【請求項２３】
単離された抗―ｐＧ６ｂ抗体であって、以下：
（ａ）該抗体はヒトｐＧ６ｂの細胞外ドメイン（配列番号３）に特異的に結合し、かつ（ｂ）可溶性形態の該抗体がインビトロにてＴ細胞におけるＴｃＲ―媒介活性化を阻害することができ、該ＴｃＲ―媒介活性化が、ＣＤ２８―媒介共刺激の非存在下において、該Ｔ細胞を、可溶性の作動性抗―ＣＤ３抗体と接触させる工程を含むことを特徴とする、抗体。
【請求項２４】
さらに、前記抗―ｐＧ６ｂ抗体の可溶性形態が、ＣＤ２８―媒介共刺激の非存在下において、かつ該抗体―ｐＧ６ｂ抗体の非存在下において、前記可溶性抗―ＣＤ３抗体と接触させる対照Ｔ細胞と比較して、少なくとも約５０％前記ＴｃＲ―媒介活性化を阻害することができることを特徴とする、請求項２３記載の抗―ｐＧ６ｂ抗体。
【請求項２５】
さらに、（ｃ）前記抗―ｐＧ６ｂ抗体の可溶性形態がインビトロにて第二のＴ細胞における第二のＴｃＲ―媒介活性化を増強させることができ、該第二のＴｃＲ―媒介活性化は、該第二のＴ細胞を、前記可溶性抗―ＣＤ３抗体および可溶性の作動性抗―ＣＤ２８抗体と接触させる工程を含むことを特徴とする、請求項２３記載の抗―ｐＧ６ｂ抗体。
【請求項２６】
さらに、前記抗―ｐＧ６ｂ抗体の可溶性形態が、前記抗―ｐＧ６ｂ抗体の非存在下において、前記可溶性抗―ＣＤ３抗体および前記可溶性抗―ＣＤ２８抗体双方と接触される対照Ｔ細胞と比較して、少なくとも約２０％前記第二のＴｃＲ−媒介活性化を増強させることができることを特徴とする、請求項２５記載の抗―ｐＧ６ｂ抗体。
【請求項２７】
モノクロ−ナル抗体である、請求項２３または２５記載の抗体。
【請求項２８】
Ｔ細胞活性化を阻害する方法であって、該方法は、Ｔ細胞を、有効量の請求項２３記載の抗体と接触させる工程を含み、該接触工程はＣＤ２８―媒介Ｔ細胞共−刺激の非存在下で行われ、および該Ｔ細胞のＴｃＲ−媒介活性化が阻害される、方法。
【請求項２９】
Ｔ細胞の活性化を増強させる方法であって、該方法は、Ｔ細胞を、有効量の請求項２５記載の抗体と接触させる工程を含み、該接触工程はＣＤ２８−媒介Ｔ細胞共−刺激の存在下で行われ、および該Ｔ細胞のＴｃＲ−媒介活性化が増強される、Ｔ細胞の活性化を増強させる方法。
【請求項３０】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２８または２９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
陽性および陰性共刺激性シグナルはＴ細胞活性の変調において重要な役割を果たし、これらのシグナルを媒介する分子は免疫変調剤のための効果的な標的であることが判明している。陽性共刺激は、Ｔ細胞受容体（ＴｃＲ）関与に加えて、天然Ｔ細胞の最適な活性化で必要とされ、他方、陰性共刺激は自己に対する免疫学的許容性の獲得、ならびにエフェクターＴ細胞機能の停止で必要であると考えられている。抗原―提示細胞（ＡＰＣ）の表ｊ面にあるＢ７−１またはＢ７−２との相互作用に際して、ＣＤ２８、プロトタイプＴ細胞共刺激性分子はＴｃＲ関与に対する応答においてＴ細胞の増殖および分化を促進するシグナルを発し、他方、ＣＤ２８ホモログ細胞傷害性Ｔリンパ球抗原―４（ＣＴＬＡ−４）はＴ細胞増殖およびエフェクター機能の阻害を媒介する（非特許文献１；非特許文献２）。
【０００２】
多くの自己免疫障害は自己反応性Ｔ細胞および自己抗体に関係することが知られている。病原体に対して防御する免疫系の能力を危うくすることなく自己反応性リンパ球を阻害し、または排除することができる剤はかなり望ましい。逆に、養子免疫療法のような多くの癌免疫療法は腫瘍―特異的Ｔ細胞集団を拡大し、それらを腫瘍細胞を攻撃し、殺傷するように向ける（非特許文献３；非特許文献２）。腫瘍攻撃を増大させることができる剤がかなり望ましい。加えて、多くの異なる抗原（例えば、微生物抗原または腫瘍抗原）に対する免疫応答は、検出可能な場合、それらの抗原を発現する剤（例えば、乾癬性微生物または腫瘍細胞）によって媒介される病気プロセスに対する保護を供するには頻繁に不十分な大きさである。しばしば、対象に、抗原と組合せて、対象において抗原に対する免疫応答を増強するように働くアジュバントを投与するのがしばしば望ましい。また、ある状況下においては抗原に対する正常な免疫応答も阻害するのが望ましい。例えば、移植体を受けている患者における正常な免疫応答の抑制が望ましく、そのような免疫抑制活性を呈する剤がかなり望ましい。
【０００３】
共刺激シグナル、特に陽性共刺激シグナルは、Ｂ細胞活性の変調においても役割を演じる。例えば、Ｂ細胞活性化および生殖中心Ｂ細胞は、抗原による刺激に加えてＴ細胞―由来シグナルを必要とする。ヘルパーＴ細胞の表面に存在するＣＤ４０カウンター受容体はＢ細胞の表面にあるＣＤ４０と相互作用し、Ｂ細胞における多くのそのようなＴ−細胞依存性効果を媒介する。興味深いことには、ＣＴＬＡ−４に類似する陰性共刺激受容体はＢ細胞では同定されていない。これは、基本的な差が、自己―許容性、ならびに抗体生産のようなＢ細胞エフェクター機能の阻害のメカニズムに対して関連性を有する、Ｔ細胞およびＢ細胞が抗原に応答するように誘導される方法において存在し得ることを示唆する。機能的ＣＴＬＡ−陽分子がＢ細胞で見出されるとすれば、該知見は、Ｂ細胞刺激のメカニズムの我々の理解を劇的にシフトされるであろう。さらに、そのような受容体の同定は、Ｂ細胞活性化および抗体生産を変調することができ、かつ免疫学的応答の変調で有用な新規な治療剤の開発を提供できるであろう。
【０００４】
従って、Ｔ細胞共刺激活性および／またはＢ細胞共刺激活性のいずれかまたは双方を有する、さらなるＣＤ２８ファミリーのメンバー、およびそれに由来する分子の同定に対する要望が当該分野で存在する。この要望は、それらの基本的な生物学的重要性、およびそれらの活性に影響することができる剤の治療的能力に大いに基づく。共刺激シグナルを変調できるそのような剤は、免疫応答の変調において重要な用途を見出し、大いに望ましい。
【０００５】
本発明は、本明細書中の教示から当業者に明らかとなるはずであるこれらおよび他の使用のためのそのようなポリペプチドを提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００１）１９：５６５−５９４
【非特許文献２】Ｅｇｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００２）３：６１１−６１８
【非特許文献３】Ｄｕｄｌｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００２）２９８：８５０−８５４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
１つの態様において、本発明はリンパ球活性を変調する方法を提供する。そのような方法は、一般には、ｐＧ６ｂ−陽性リンパ球を、少なくとも１つのリンパ球活性を変調するのに有効な量のｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達を変調することができる生物活性剤と接触させることを含む。特定の実施形態において、リンパ球はＴリンパ球である。本発明に従って変調することができる典型的なＴリンパ球活性は、例えば、活性化、分化、増殖、生存、細胞溶解活性、およびサイトカイン生産を含む。特別な実施形態において、リンパ球活性は標的抗原（例えば、病原体抗原、ワクチン抗原、またはｐＧ６ｂカウンター受容体以外の腫瘍―関連抗原）に対する宿主免疫応答を含む。
【０００８】
該方法のいくつかの変形において、該剤はリンパ球と該剤との接触がｐＧ６ｂシグナル伝達によって媒介されるリンパ球活性の減衰を阻害するような、ｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達のアンタゴニストを含む。典型的には、アゴニストは、ｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の機能的相互作用を妨害することができる遮断薬を含む。特に好適な遮断薬は、例えば、ｐＧ６ｂ蛋白質（例えば、配列番号３［ヒトｐＧ６ｂの細胞外ドメイン］または配列番号６［マウスｐＧ６ｂの細胞外ドメイン］に記載されたアミノ酸配列に対するもの）、および可溶性ｐＧ６ｂ融合蛋白質の細胞外ドメインに特異的に結合することができる抗−ｐＧ６ｂ抗体を含む。いくつかの実施形態において、リンパ球とｐＧ６ｂ媒介シグナル伝達のアンタゴニストとの接触はリンパ球の活性を増加させる。
【０００９】
他の変形において、該剤は、リンパ球と該剤との接触がリンパ球活性を阻害するような、ｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達のアゴニストを含む。典型的には、該アゴニストはｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の機能的相互作用を模倣し、または増大させることができる模倣剤を含む。特に好適な模倣剤は、例えば、（例えば、配列番号３または配列番号６に記載されたアミノ酸配列に対する）ｐＧ６ｂ蛋白質の細胞外ドメインに特異的に結合することができる抗−ｐＧ６ｂ抗体を含み、ここに、該抗体の結合はｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の機能的相互作用を模倣し、または増大させる。
【００１０】
もう１つの態様において、患者において癌を治療する方法が提供される。一般には、癌を治療する方法は、患者にｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達のアンタゴニストを投与することを含み、ここに、該投与は対象において腫瘍細胞に対する宿主免疫応答を増加させるのに有効なものである。いくつかの実施形態において、患者の腫瘍細胞はｐＧ６ｂカウンター受容体を発現する。典型的には、ｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達のアンタゴニストは、ｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の機能的相互作用を妨害することができる遮断薬を含む。特に好適な遮断薬は、例えば、結合がｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の相互作用を妨害するような、ｐＧ６ｂの細胞外ドメインに特異的に結合することができる抗−ｐＧ６ｂ抗体を含む。
【００１１】
なおもう１つの態様において、本発明は、自己反応性（ａｕｔｏａｃｔｉｖｅ）ｐＧ６ｂ−陽性リンパ球の存在によって特徴付けられる自己免疫疾患を有する患者を治療する方法を提供する。一般に、該方法は患者にｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達のアゴニストを投与することを含み、ここに、該投与はｐＧ６ｂを発現する非−リンパ系の非−腫瘍宿主細胞に対して自己反応性免疫応答を疎外するのに有効なものである。典型的には、該アゴニストはｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の機能的相互作用を模倣し、または増大させることができる模倣剤を含む。特に好適な模倣剤はｐＧ６ｂ蛋白質の細胞外ドメイン（例えば、配列番号３または配列番号６）に特異的に結合することができる抗−ｐＧ６ｂ抗体を含み、ここに、抗体の結合はｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の機能的相互作用を模倣し、または増大させる。
【００１２】
また、単離された抗−ｐＧ６ｂ抗体も提供される。いくつかの実施形態において、本発明の単離された抗−ｐＧ６ｂ抗体は、（ａ）該抗体はｐＧ６ｂ蛋白質の細胞外ドメイン（例えば、配列番号３または配列番号６）に特異的に結合し、かつ（ｂ）該抗体は、マイクロビーズに共有結合によりカップリングして、抗体の固定化された形態を生じる場合、インビトロにてＴ細胞においてＴｃＲ−媒介活性化を刺激することができ、ここに、該ＴｃＲ−媒介活性化は、Ｔ細胞を、マイクロビーズにもカップリングされた作動性抗−ＣＤ３抗体と接触させる工程を含む。ある変形において、該抗―ｐＧ６ｂ抗体は、さらに、抗−ｐＧ６ｂ抗体の非存在下においてマイクロビーズに共有結合によりカップリングされた抗−ＣＤ３に接触される対照Ｔ細胞と比較して、少なくとも約５０％ＴｃＲ−媒介活性化を刺激することができることを特徴とする。なお他の変形において、該抗−ｐＧ６ｂ抗体は、さらに、抗体の固定化された形態が、Ｔ細胞を、マイクロビーズに共有結合によりカップリングされた抗−ＣＤ３抗体、および可溶性の作動性抗−ＣＤ２８抗体と接触させることにより、ＴｃＲ−媒介活性化を阻害することができることを特徴とする。抗−ｐＧ６ｂは例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。
【００１３】
特定の実施形態において、本発明の単離された抗−ｐＧ６ｂ抗体は、（ａ）該抗体はｐＧ６ｂ蛋白質の細胞外ドメインで（例えば、配列番号３または配列番号６）に特異的に結合し、さらに、以下の特性の少なくとも１つを有し；（ｂ）該抗体は、可溶性形態において、インビトロにてＴ細胞におけるＴｃＲ−媒介活性化を阻害することができ、ここに、ＴｃＲ−媒介活性化は、ＣＤ２８−媒介共刺激の非存在下においてＴ細胞を可溶性の作動性抗−ＣＤ３抗体と接触させる工程を含み、および（ｃ）該抗体は、可溶性形態において、インビトロにてＴ細胞におけるＴｃＲ−媒介活性化を増強させることができ、ここに、ＴｃＲ−媒介活性化は第二のＴ細胞を可溶性抗−ＣＤ３抗体および可溶性の作動性抗−ＣＤ２８抗体と接触させる工程を含むことを特徴とする。典型的には、抗―ｐＧ６ｂ抗体の可溶性形態がインビトロにて抗−ＣＤ３−刺激Ｔ細胞においてＴｃＲ−媒介活性化を刺激することができる場合、可溶性抗体は、ＣＤ２８−媒介共−刺激の非存在下において、かつ抗−ｐＧ６ｂ抗体の非存在下において、可溶性抗−ＣＤ３抗体と接触される対照Ｔ細胞と比較して、少なくとも約５０％ＴｃＲ−媒介活性化を阻害することができる。可溶性抗―ｐＧ６ｂがインビトロにて抗―ＣＤ３／抗―ＣＤ２８―刺激Ｔ細胞においてＴｃＲ−媒介活性化を増強させることができ、ＴｃＲ−媒介活性化が、第二のＴ細胞を、可溶性抗―ＣＤ３抗体および可溶性の作動性抗―ＣＤ２８抗体と接触させる工程を含む場合、可溶性抗―ｐＧ６ｂ抗体は、典型的には、抗―ｐＧ６ｂ抗体の非存在下において可溶性抗―ＣＤ３抗体および可溶性抗―ＣＤ２８抗体双方と接触される対照Ｔ細胞と比較して、少なくとも約２０％ＴｃＲ−媒介活性化を増強させることができる。抗―ｐＧ６ｂ抗体は、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。
【００１４】
そのような抗―ｐＧ６ｂ抗体は、例えば、Ｔ細胞活性化を変調する種々の方法において有用である。従って、なおもう１つの態様において、先に議論した抗―ｐＧ６ｂ抗体を用いてＴ細胞活性化を阻害し、または増強する方法が提供される。いくつかの実施形態において、ＴｃＲ−媒介Ｔ細胞活性化を阻害する方法は、Ｔ細胞を、ＣＤ２８−媒介Ｔ細胞で共刺激の非存在下において、有効量の以下の特性を有する抗体と接触させる工程を含む：（ａ）該抗体はｐＧ６ｂ蛋白質の細胞外ドメイン（例えば、配列番号３または配列番号６）に特異的に結合し、かつ（ｂ）該抗体は、可溶性形態において、インビトロにてＴ細胞におけるＴｃＲ−媒介活性化を阻害することができ、ここに、ＴｃＲ−媒介活性化は、ＣＤ２８−媒介共刺激の非存在下において、Ｔ細胞を作動性抗―ＣＤ３抗体と接触させる工程を含む。そのような方法は、例えば、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで行うことができる。いくつかの変形において、該方法は対象において炎症または自己免疫疾患を治療する方法であり；いくつかのそのような変形においては、抗―ｐＧ６ｂ抗体は、例えば、ＣＤ２８／Ｂ７阻害活性を有する第二の剤と組み合わせる等、ＣＤ２８／Ｂ７共刺激経路が抑制される条件下で用いられる。
【００１５】
他の実施形態において、ＴｃＲ−媒介Ｔ細胞活性化を増強する方法は、Ｔ細胞を、ＣＤ２８−媒介Ｔ細胞共刺激の存在下において、有効量の以下の特性を有する抗体と接触させる工程を含む：（ａ）該抗体はｐＧ６ｂ蛋白質の細胞外ドメイン（例えば、配列番号３または配列番号６）に特異的に結合し、かつ（ｂ）該抗体は、可溶性形態において、インビトロにてＴ細胞におけるＴｃＲ−媒介活性化を増強することができ、ここに、ＴｃＲ−媒介活性化は、Ｔ細胞を、抗―ＣＤ３抗体および作動性抗―ＣＤ２８抗体と接触させる工程を含む。そのような方法は、例えば、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで行うことができる。いくつかの変形において、該方法は対象において癌を治療する方法であり；いくつかのそのような変形において、抗―ｐＧ６ｂ抗体はＣＤ２８／Ｂ７刺激活性を有する第二の剤と組み合わせる。そのような変形は、例えば、ｐＧ６ｂカウンター受容体を発現する腫瘍細胞を含めた腫瘍細胞に対して対象の免疫応答を増加させるのに有効である。
【００１６】
なお他の実施形態において、患者において癌を治療する方法は以下の特性を有する抗体を患者に投与することを含み：（ａ）該抗体はｐＧ６ｂの細胞外ドメインに特異的に結合し、かつ（ｂ）該抗体は、マイクロビーズに共有結合によりカップリングして、抗体の固定化された形態を生じる場合、インビトロにてＴ細胞におけるＴｃＲ−媒介活性化を阻害することができ、ここに、ＴｃＲ−媒介活性化は、Ｔ細胞を、マイクロビーズにもカップリングされた作動性抗―ＣＤ３抗体と接触させる工程を含む。ある変形において、抗―ｐＧ６ｂ抗体は、さらに、抗体の固定化された形態が、抗―ｐＧ６ｂ抗体の非存在下においてマイクロビーズに共有結合によりカップリングされた抗―ＣＤ３と接触される対照Ｔ細胞と比較して、少なくとも約５０％ＴｃＲ−媒介活性化を阻害することができる。なお他の変形において、抗―ｐＧ６ｂ抗体は、さらに、抗体の固定化された形態が、Ｔ細胞をマイクロビーズに共有結合によりカップリングされた抗―ＣＤ３抗体および可溶性の作動性抗―ＣＤ２８抗体と接触させることによりＴｃＲ−媒介活性化を阻害することができることを特徴とする。特別な変形において、抗―ｐＧ６ｂは、ビーズ―カップルド抗―ＣＴＬＡ−４抗体のそのようなインビトロＴ細胞変調活性と同様な、またはほぼ同等なＴ細胞活性化に対するビーズ―カップルドインビトロ活性を呈する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１はエクソンパターンおよびエクソンフェージングを含めたＣＤ２８ファミリーメンバー遺伝子構造のプロファイリングを示す。「Ｓ」はシグナルまたはリーダー配列をコードする第一のエクソンを示し；「ＩｇＶ」はＩｇＶドメインをコードする第二のエクソンを示し；および「ＴＭＤ」は膜貫通ドメインをコードする第三のエクソンを示す。「Ｃ１」および「Ｃ２」は、各々、細胞質ドメインをコードする第四および任意の第五のエクソンを示す。数字０および２はエクソンの間のエクソンフェージングを示す。
【図２】図２Ａ〜２ＤはｐＧ６ｂ−トランスフェクトＰ８１５細胞でのｐＧ６ｂ発現を示す。ＥＬＩＳＡ抗体におけるｐＧ６ｂ−ｍＦｃに対する特異的結合について陽性であるハイブリドーマプールを、ＦＩＴＣ−コンジュゲーテッドラット抗―マウス２次抗体を用いて親ｐ８１５細胞（２Ｂおよび２Ｄ）ではなくｐ８１５／ｐＧ６ｂ細胞（２Ａおよび２Ｃ）に対してＦＡＣＳ解析を介して結合する能力について解析した。相対的ｐＧ６ｂ発現レベルは平均蛍光強度（２Ａおよび２Ｂ）、または抗―ｐＧ６ｂ結合に対して陽性である細胞の割合（２Ｃおよび２Ｄ）いずれかとしてｙ−軸上に示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｄは、二つの異なるドナー（ドナー＃１−３Ａおよび３Ｂ；ドナー＃２−３Ｃおよび３およびＤ）に由来するヒトＰＢＭＣにおける休止ＣＤ４＋細胞（３Ａおよび３Ｃ）およびＣＤ８＋細胞（３Ｂおよび３Ｄ）でのｐＧ６ｂ発現を示す。
【図４Ａ】図４はＴ細胞活性化によるｐＧ６ｂ発現の増加を示す。ヒトＰＢＭＣを抗−ＣＤ３＋抗−ＣＤ２８モノクローナル抗体で刺激し、ｍＡｂ抗―ｐＧ６ｂ（３３７．８．３５）またはＡ６４７染料にカップリングした対照ＩｇＧ  ｍＡｂでのＦＡＣＳによって２４．４８および７２時間においてＣＤ４＋細胞（４Ａ）およびＣＤ８＋細胞（４Ｂ）でのｐＧ６ｂ発現について解析した。未処理細胞は０の時点としてＦＡＣＳによって同様に解析した。
【図４Ｂ】図４はＴ細胞活性化によるｐＧ６ｂ発現の増加を示す。ヒトＰＢＭＣを抗−ＣＤ３＋抗−ＣＤ２８モノクローナル抗体で刺激し、ｍＡｂ抗―ｐＧ６ｂ（３３７．８．３５）またはＡ６４７染料にカップリングした対照ＩｇＧ  ｍＡｂでのＦＡＣＳによって２４．４８および７２時間においてＣＤ４＋細胞（４Ａ）およびＣＤ８＋細胞（４Ｂ）でのｐＧ６ｂ発現について解析した。未処理細胞は０の時点としてＦＡＣＳによって同様に解析した。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、ＣＤ４＋記憶細胞（ＣＤ４５ＲＯ＋；図５Ａ）に対する（ＣＤ４５ＲＡ＋；図５Ｂ）ナイーブ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋；図５Ｂ）でのｐＧ６ｂの増大した発現を示す。ＣＤ４＋ナイーブ細胞は、ＣＤ４＋記憶細胞の２３％と比較してｐＧ６ｂ発現について３７％要請であった。
【図６Ａ】図６Ａおよび６Ｂは、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するビーズ―カップルド抗―ｐＧ６ｂ抗体の効果を示す。抗−ｐＧ６ｂ抗体を抗−ＣＤ３  ｍＡｂと共にトシル活性化４．５μビーズに共有結合によりカップリングさせた。対照ＩｇＧ１は、各々、抗−ＣＤ３と一緒にビーズにもカップリングさせた。Ｔ細胞を抗体―カップルドビーズの存在下で、可溶性ＣＤ２８  ｍＡｂの非存在下（６Ａ）または存在下（６Ｂ）いずれかで培養し、ＬＳＲＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で３日のちに増殖について評価した。抗−ｐＧ６ｂ  ｍＡｂ（３３７．１、３３７．２、３３７．３、３３７．４、３３７．５、３３７．６、３３７．１．７、３３７．３．３、）ならびに抗−ｐＧ６ｂポリクローナル抗体Ｅ９１９４は抗−ＣＤ３−誘導増殖を阻害した（図６Ａ）抗−ｐＧ６ｂ  ｍＡｂは抗−ＣＤ３／ＣＤ２８／誘導増殖も阻害し、他方、抗−ｐＧ６ｂポリクローナル抗体Ｅ９１９４はこれらの条件下で増殖をわずかに増強させた（図６Ｂ）。
【図６Ｂ】図６Ａおよび６Ｂは、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するビーズ―カップルド抗―ｐＧ６ｂ抗体の効果を示す。抗−ｐＧ６ｂ抗体を抗−ＣＤ３  ｍＡｂと共にトシル活性化４．５μビーズに共有結合によりカップリングさせた。対照ＩｇＧ１は、各々、抗−ＣＤ３と一緒にビーズにもカップリングさせた。Ｔ細胞を抗体―カップルドビーズの存在下で、可溶性ＣＤ２８  ｍＡｂの非存在下（６Ａ）または存在下（６Ｂ）いずれかで培養し、ＬＳＲＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で３日のちに増殖について評価した。抗−ｐＧ６ｂ  ｍＡｂ（３３７．１、３３７．２、３３７．３、３３７．４、３３７．５、３３７．６、３３７．１．７、３３７．３．３、）ならびに抗−ｐＧ６ｂポリクローナル抗体Ｅ９１９４は抗−ＣＤ３−誘導増殖を阻害した（図６Ａ）抗−ｐＧ６ｂ  ｍＡｂは抗−ＣＤ３／ＣＤ２８／誘導増殖も阻害し、他方、抗−ｐＧ６ｂポリクローナル抗体Ｅ９１９４はこれらの条件下で増殖をわずかに増強させた（図６Ｂ）。
【図７Ａ】図７Ａおよび７Ｂは、ＣＤ４＋（７Ａ）およびＣＤ８＋（７Ｂ）Ｔ細胞に対するビーズ―カップルド抗−ｐＧ６ｂ抗体の効果を示す。抗−ｐＧ６ｂ  ｍＡｂ  ３３７．１．７および３３７．８．３５．３およびｐＡｂ  Ｅ９１９４を、各々、抗−ＣＤ３  ｍＡｂと共にトシル活性化４．５μビーズに共有結合よりカップリングさせた。ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂおよび対照ＩｇＧ１を、各々、抗−ＣＤ３と一緒にビーズにもカップリングさせた。３つの異なるドナーからのＴ細胞を抗体―カップルドビーズの存在下で培養し、３日のちにＬＳＲＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で増殖について評価した。抗−ｐＧ６ｂ抗体は対照マウスＩｇＧ１に対してＴ細胞増殖を阻害し、ｍＡｂ  ３３７．１はｍＡｂ  ３３７．８．３５．３およびｐＡｂ  Ｅ９１９４よりも大きな効果および抗−ＣＴＬＡ４  ｍＡｂで観察されたのとほぼ同等な効果を示す。
【図７Ｂ】図７Ａおよび７Ｂは、ＣＤ４＋（７Ａ）およびＣＤ８＋（７Ｂ）Ｔ細胞に対するビーズ―カップルド抗−ｐＧ６ｂ抗体の効果を示す。抗−ｐＧ６ｂ  ｍＡｂ  ３３７．１．７および３３７．８．３５．３およびｐＡｂ  Ｅ９１９４を、各々、抗−ＣＤ３  ｍＡｂと共にトシル活性化４．５μビーズに共有結合よりカップリングさせた。ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂおよび対照ＩｇＧ１を、各々、抗−ＣＤ３と一緒にビーズにもカップリングさせた。３つの異なるドナーからのＴ細胞を抗体―カップルドビーズの存在下で培養し、３日のちにＬＳＲＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で増殖について評価した。抗−ｐＧ６ｂ抗体は対照マウスＩｇＧ１に対してＴ細胞増殖を阻害し、ｍＡｂ  ３３７．１はｍＡｂ  ３３７．８．３５．３およびｐＡｂ  Ｅ９１９４よりも大きな効果および抗−ＣＴＬＡ４  ｍＡｂで観察されたのとほぼ同等な効果を示す。
【図８Ａ】図８Ａおよび８Ｂは、ＣＤ４＋（８Ａ）およびＣＤ８＋（８Ｂ）Ｔ細胞に対するビーズ―カップルド抗−ｐＧ６ｂ抗体の効果を示す。抗−ｐＧ６ｂ  ｍＡｂ  ３３７．１．７および３３７．８．３５．３およびｐＡｂ  Ｅ９１９４を、各々、抗−ＣＤ３  ｍＡｂと共にトシル活性化４．５μビーズに共有結合によりカップリングさせた。ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂおよび対照ＩｇＧ１を、各々、抗−ＣＤ３と共にビーズにもカップリングさせた。三つの異なるドナーからのＴ細胞を抗体―カップルドビーズおよび可溶性抗−ＣＤ２８  、ｍＡｂの存在下で培養し、３日後に、ＬＳＲＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で増殖について評価した。抗−ｐＧ６ｂ  ｍＡｂ  ３３７．１．７および３３７．８．３５．３は、対照マウスＩｇＧ１に対してＴ細胞増殖を阻害し、ｍＡｂ  ３３７．１は、ｍＡｂ  ３３７．８．３５．３よりもやや大きな効果、および抗−ＣＴＬＡ４  ｍＡｂで観察されたものとほぼ同等な効果を示す。ｐＡｂ  Ｅ９１９４は対照ＩｇＧ１に対してＴ細胞増殖を増強した。
【図８Ｂ】図８Ａおよび８Ｂは、ＣＤ４＋（８Ａ）およびＣＤ８＋（８Ｂ）Ｔ細胞に対するビーズ―カップルド抗−ｐＧ６ｂ抗体の効果を示す。抗−ｐＧ６ｂ  ｍＡｂ  ３３７．１．７および３３７．８．３５．３およびｐＡｂ  Ｅ９１９４を、各々、抗−ＣＤ３  ｍＡｂと共にトシル活性化４．５μビーズに共有結合によりカップリングさせた。ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂおよび対照ＩｇＧ１を、各々、抗−ＣＤ３と共にビーズにもカップリングさせた。三つの異なるドナーからのＴ細胞を抗体―カップルドビーズおよび可溶性抗−ＣＤ２８  、ｍＡｂの存在下で培養し、３日後に、ＬＳＲＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で増殖について評価した。抗−ｐＧ６ｂ  ｍＡｂ  ３３７．１．７および３３７．８．３５．３は、対照マウスＩｇＧ１に対してＴ細胞増殖を阻害し、ｍＡｂ  ３３７．１は、ｍＡｂ  ３３７．８．３５．３よりもやや大きな効果、および抗−ＣＴＬＡ４  ｍＡｂで観察されたものとほぼ同等な効果を示す。ｐＡｂ  Ｅ９１９４は対照ＩｇＧ１に対してＴ細胞増殖を増強した。
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｄは、ＣＤ４＋（９Ａおよび９Ｂ）およびＣＤ８＋（９Ｃおよび９Ｄ）Ｔ細胞上での初期活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５の発現に対するビーズ―カップルド抗−ｐＧ６ｂ抗体の効果を示す。上述した図７Ａおよび７Ｂについて記載されたように処理されたＴ細胞を、ＦＡＣＳによってＣＤ６９およびＣＤ２５発現について解析した。抗−ｐＧ６ｂ  ｍＡｂ  ３３７．１．７および３３７．８．３５．３は、対照マウスＩｇＧ１に対するＣＤ２５（図９Ａ［ＣＤ４＋］および９Ｃ［ＣＤ８＋］）およびＣＤ６９（図９Ｂ［ＣＤ４＋］および９Ｄ［ＣＤ８＋］の抗−ＣＤ３−誘導発現を阻害し、ｍＡｂ  ３３７．１は、ｍＡｂ  ３３７．８．３５．３よりもいくつかのドナーにおけるやや大きな効果、および抗−ＣＴＬＡ４  ｍＡｂで観察されたのとほぼ同等な効果を示す。
【図９Ｂ】図９Ａ〜９Ｄは、ＣＤ４＋（９Ａおよび９Ｂ）およびＣＤ８＋（９Ｃおよび９Ｄ）Ｔ細胞上での初期活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５の発現に対するビーズ―カップルド抗−ｐＧ６ｂ抗体の効果を示す。上述した図７Ａおよび７Ｂについて記載されたように処理されたＴ細胞を、ＦＡＣＳによってＣＤ６９およびＣＤ２５発現について解析した。抗−ｐＧ６ｂ  ｍＡｂ  ３３７．１．７および３３７．８．３５．３は、対照マウスＩｇＧ１に対するＣＤ２５（図９Ａ［ＣＤ４＋］および９Ｃ［ＣＤ８＋］）およびＣＤ６９（図９Ｂ［ＣＤ４＋］および９Ｄ［ＣＤ８＋］の抗−ＣＤ３−誘導発現を阻害し、ｍＡｂ  ３３７．１は、ｍＡｂ  ３３７．８．３５．３よりもいくつかのドナーにおけるやや大きな効果、および抗−ＣＴＬＡ４  ｍＡｂで観察されたのとほぼ同等な効果を示す。
【図９Ｃ】図９Ａ〜９Ｄは、ＣＤ４＋（９Ａおよび９Ｂ）およびＣＤ８＋（９Ｃおよび９Ｄ）Ｔ細胞上での初期活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５の発現に対するビーズ―カップルド抗−ｐＧ６ｂ抗体の効果を示す。上述した図７Ａおよび７Ｂについて記載されたように処理されたＴ細胞を、ＦＡＣＳによってＣＤ６９およびＣＤ２５発現について解析した。抗−ｐＧ６ｂ  ｍＡｂ  ３３７．１．７および３３７．８．３５．３は、対照マウスＩｇＧ１に対するＣＤ２５（図９Ａ［ＣＤ４＋］および９Ｃ［ＣＤ８＋］）およびＣＤ６９（図９Ｂ［ＣＤ４＋］および９Ｄ［ＣＤ８＋］の抗−ＣＤ３−誘導発現を阻害し、ｍＡｂ  ３３７．１は、ｍＡｂ  ３３７．８．３５．３よりもいくつかのドナーにおけるやや大きな効果、および抗−ＣＴＬＡ４  ｍＡｂで観察されたのとほぼ同等な効果を示す。
【図９Ｄ】図９Ａ〜９Ｄは、ＣＤ４＋（９Ａおよび９Ｂ）およびＣＤ８＋（９Ｃおよび９Ｄ）Ｔ細胞上での初期活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５の発現に対するビーズ―カップルド抗−ｐＧ６ｂ抗体の効果を示す。上述した図７Ａおよび７Ｂについて記載されたように処理されたＴ細胞を、ＦＡＣＳによってＣＤ６９およびＣＤ２５発現について解析した。抗−ｐＧ６ｂ  ｍＡｂ  ３３７．１．７および３３７．８．３５．３は、対照マウスＩｇＧ１に対するＣＤ２５（図９Ａ［ＣＤ４＋］および９Ｃ［ＣＤ８＋］）およびＣＤ６９（図９Ｂ［ＣＤ４＋］および９Ｄ［ＣＤ８＋］の抗−ＣＤ３−誘導発現を阻害し、ｍＡｂ  ３３７．１は、ｍＡｂ  ３３７．８．３５．３よりもいくつかのドナーにおけるやや大きな効果、および抗−ＣＴＬＡ４  ｍＡｂで観察されたのとほぼ同等な効果を示す。
【図１０−１】図１０Ａ〜１０Ｄは、ＣＤ４＋（１０Ａおよび１０Ｂ）およびＣＤ８＋（１０Ｃおよび１０Ｄ）Ｔ細胞に対する可溶性抗−ｐＧ６ｂ抗体の効果を示す。Ｔ細胞を、可溶性で抗−ＣＤ２８  ｍＡｂの存在下（１０Ａおよび１０Ｃ）または非存在下（１０Ｂおよび１０Ｄ）いずれかにて、可溶性抗―ＣＤ３  ｍＡｂと共に、可溶性抗−ｐＧ６ｂ  ｍＡｂ（３３７．１、３３７．２、３３７．３、３３７．４、３３７．５、３３７．６、３３７．７、３３７．１．７、３３７．３．３、）およびｐＡｂ  Ｅ９１９４で別々に処理した。３日後に、増殖をＬＳＲＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で評価した。抗―ｐＧ６ｂ  ｐＡｂ  Ｅ９１９４は、可溶性抗−ＣＤ３（図１０Ａおよび１１Ｂ）で刺激されたヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の応答を刺激した。ポリクローナル抗−ｐＧ６ｂ  Ｅ９１９４を含有する培養に対して抗−ＣＤ２８を含めると、抗−ＣＤ３単独で観察されたのを超えて増加した増殖応答がもたらされた（図１０Ｂおよび１１Ｂ）。
【図１０−２】図１０Ａ〜１０Ｄは、ＣＤ４＋（１０Ａおよび１０Ｂ）およびＣＤ８＋（１０Ｃおよび１０Ｄ）Ｔ細胞に対する可溶性抗−ｐＧ６ｂ抗体の効果を示す。Ｔ細胞を、可溶性で抗−ＣＤ２８  ｍＡｂの存在下（１０Ａおよび１０Ｃ）または非存在下（１０Ｂおよび１０Ｄ）いずれかにて、可溶性抗―ＣＤ３  ｍＡｂと共に、可溶性抗−ｐＧ６ｂ  ｍＡｂ（３３７．１、３３７．２、３３７．３、３３７．４、３３７．５、３３７．６、３３７．７、３３７．１．７、３３７．３．３、）およびｐＡｂ  Ｅ９１９４で別々に処理した。３日後に、増殖をＬＳＲＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で評価した。抗―ｐＧ６ｂ  ｐＡｂ  Ｅ９１９４は、可溶性抗−ＣＤ３（図１０Ａおよび１１Ｂ）で刺激されたヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の応答を刺激した。ポリクローナル抗−ｐＧ６ｂ  Ｅ９１９４を含有する培養に対して抗−ＣＤ２８を含めると、抗−ＣＤ３単独で観察されたのを超えて増加した増殖応答がもたらされた（図１０Ｂおよび１１Ｂ）。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
詳細な説明
１．概観
本発明は、一般には、リンパ球受容体のＣＤ２８ファミリーのメンバーとしてのｐＧ６ｂの同定および特徴づけに向けられる。かくして、本発明は、Ｔリンパ球上に発現されるＣＤ２８ファミリーのメンバーとして新しく同定された受容体を提供する。本発明の受容体は「ｐＧ６ｂ」と命名され、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、ＰＤ−１、およびＢＴＬＡから区別される。例えば、ｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体カウンター受容体の天然相互作用を変調するような、ｐＧ６ｂ−媒介リンパ球シグナル伝達を変調するための方法および組成物も提供され、それは、免疫学的許容性、自己免疫、免疫抑制、および癌免疫療法を含めた免疫療法のための多数の治療的適用を有する。
【００１９】
ｐＧ６ｂは、少なくとも部分的には、ＣＤ２８ファミリー遺伝子プロファイリングに基づいてＣＤ２８ファミリーメンバーとして本発明者らによって同定された。本発明者らは、ＣＤ２８ファミリー遺伝子構造は特徴的なエクソンパターンを含むことを認識し、そこでは、第一のエクソンはリーダー配列をコードし、第二のエクソンはＩｇＶドメインをコードし、第三のエクソンは膜貫通ドメインをコードし、１つのまたは２つのエクソンは細胞質ドメインをコードする（図１参照）。ＣＤ２８ファミリー遺伝子構造のもう１つの特徴はエクソンのフェージングであり、エクソン１および２の間、およびエクソン２および３の間に２の保存されたフェージング；エクソン３および４の間に０または２のフェージング；ここに、エクソン５が存在し、エクソン４および５の間に０の保存されたフェージングがある（上述参照）。
【００２０】
本明細書中において初めて開示するように、ｐＧ６ｂはＴ細胞上に発現され、Ｔリンパ球活性の陰性レギュレーターとして作用し、ここに、ｐＧ６ｂによって媒介されるシグナル伝達の結果、ｐＧ６ｂ−陽性リンパ球活性の阻害がもたらされる。ｐＧ６ｂ−陽性Ｔ細胞において、ｐＧ６ｂシグナル伝達は、例えば、細胞周期進行、分化、生存、サイトカイン生産および細胞溶解活性化のようなＴｃＲ−誘導Ｔ細胞応答を阻害することができる。さらに、ｐＧ６ｂ−陽性Ｂ細胞においては、ｐＧ６ｂシグナル伝達は、細胞周期進行、分化、生存、抗原提示および抗体生産のようなＢ細胞抗原受容体−誘導Ｂ細胞応答を阻害することができる。これらの知見は、疾患の中でも、癌および自己免疫疾患を治療する目的でリンパ球活性を変調する、ｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の相互作用に緩衝し、またはそれを模倣することができる治療剤の使用を可能とする。
【００２１】
従って、本発明は、ｐＧ６ｂアゴニストまたはアンタゴニストのようなｐＧ６ｂモジュレーターのための新しい使用を提供する。これらのモジュレーターは、可溶性受容体、またはｐＧ６ｂまたはその受容体に対する抗体であり得る。また、本発明は、ヒト炎症および自己免疫疾患で用いるための可溶性ｐＧ６ｂポリペプチド断片および融合蛋白質も提供する。本発明のｐＧ６ｂ抗体および可溶性ｐＧ６ｂ受容体を用いて、慢性関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、関節炎、内毒素血症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、結腸炎、多発性硬化症、および本明細書中で開示された他の炎症疾患のような具体的なヒト病気の治療において、ｐＧ６ｂまたはそのカウンター受容体いずれかの活性を変調し、作動し、ブロックし、増加させ、阻害し、低下させ、拮抗し、または中和することができる。
【００２２】
（ｐＧ６ｂｘ１としても相互交換的に調べている）ヒトｐＧ６ｂをコードする例示的なヌクレオチド配列は配列番号１によって提供され；コードされたポリペプチドは配列番号２に示される。ｐＧ６ｂをコードするヒトｃＤＮＡクローン（配列番号１）の解析は、ほぼ１２５アミノ酸残基（（配列番号２；配列番号３）の残基１８〜１４２）の細胞ドメイン、ほぼ２３アミノ酸残基（（配列番号２）の残基１４３〜１６５）の膜貫通ドメインおよびほぼ７６アミノ酸残基（（配列番号２）の残基１６６〜２４１）の細胞内ドメインを含む２４２アミノ酸をコードするオープンリーディングフレーム（配列番号２）を明らかとした。ｐＧ６ｂはほぼ１０２アミノ酸残基（（配列番号２）の残基２２〜１２３）のＩｇＶドメインも有する。ｐＧ６ｂ内では、二つのＩＴＩＭドメイン、ＬＬＹＡＤＬ（（配列番号２）のアミノ酸残基２０９〜２１４）およびＴＩＹＡＶＶ（アミノ酸残基２３５〜２４０）がある。ＩＴＩＭドメインの存在は、ｐＧ６ｂが阻害効果を有することができることを示す。ｐＧ６ｂ内には、４つのＳＨ−３−キナーゼ結合ドメイン、ＰＰＱＰ（配列番号２のアミノ酸残基１７０〜１７３）、ＰＩＲＰ（配列番号２のアミノ酸残基１７３〜１７６）、ＰＱＲＰ（配列番号２のアミノ酸残基１８８〜１９１）およびＰＫＩＰ（アミノ酸残基１９９〜２００）もある。
【００２３】
変種可溶性受容体を配列番号７に示す。
【００２４】
ネズミｐＧ６ｂをコードする例示的なヌクレオチド配列は配列番号４によって提供される；コードされたポリペプチドは配列番号５に示される。細胞外ドメインは配列番号６に示される。
【００２５】
従って、本発明の１つの態様において、本発明は、Ｔリンパ球活性の変調において、および自己免疫疾患、炎症、乾癬、ＩＢＤ、潰瘍性結腸炎およびＳＬＥを含めた免疫障害の治療において有用な、ｐＧ６ｂポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。
【００２６】
また、本発明は、配列番号２または３のアミノ酸配列の少なくとも１５連続アミノ酸残基を含む単離されたポリペプチドおよびエピトープを提供する。例示的なポリペプチドは、配列番号３を含む、またはそれよりなるポリペプチド、その抗原性エピトープ、またはその機能的ｐＧ６ｂ結合断片を含む。さらに、本発明は、ｐＧ６ｂの活性を作動させ、それに結合し、ブロックし、阻害し、低下させ、増加させ、拮抗し、または中和する上述にて開示した単離されたポリペプチドも提供する。
【００２７】
本発明は、さらに、そのようなポリペプチドに特異的に結合する抗体および抗体断片を提供する。例示的な抗体は抗体、中和抗体、ポリクローナル抗体、ネズミモノクローナル抗体に由来するヒト化抗体、およびヒトモノクローナル抗体を含む。例示的な抗体断片はＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、および最小認識単位を含む。中和抗体は、好ましくは、そのカウンター受容体または複数のカウンター受容体とのその相互作用が、ブロックされ、阻害され、低下され、拮抗され、または中和されるようなｐＧ６ｂに結合し；そのカウンター受容体または複数−受容体とのその相互作用がブロックされ、阻害され、低下され、拮抗され、または中和されるような抗−ｐＧ６ｂ中和抗体もまた本発明に含まれる。本発明は、さらに、単体、およびペプチド、ポリペプチド、または本明細書中に記載された抗体を含む組成物を含む。
【００２８】
かくして、１つの実施形態において、Ｔ細胞活性化および、恐らくは、Ｂ細胞活性化を増加するためのｐＧ６ｂシグナル伝達のアンタゴニストが提供される。好ましい実施形態において、そのようなアンタゴニストがそのカウンター受容体または複数カウンター受容体とのｐＧ６ｂの天然相互作用に緩衝することができる遮断薬を含む、それにより、ｐＧ６ｂ−媒介陰性シグナル伝達を阻害し、およびリンパ球活性化、および増殖およびエフェクター機能の増加がもたらされる。
【００２９】
代替実施形態において、Ｔ細胞活性化および、恐らくは、Ｂ細胞活性化を阻害するためのｐＧ６ｂシグナル伝達のアゴニストが提供される。好ましい実施形態において、そのような生物活性剤は、ｐＧ６ｂに結合し、ｐＧ６ｂとそのカウンター受容体または複数のカウンター受容体との天然相互作用を模倣し、および／または増加させることができ、それにより、Ｔ細胞活性化（および恐らくはＢ細胞）および増殖およびエフェクター機能の阻害がもたらされる模倣剤を含む。
【００３０】
１つの実施形態において、ＢおよびＴ細胞活性を増加させ、および／またはアップレギュレートするための生物活性剤および方法が提供される。好ましい実施形態において、そのような生物活性剤はｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達のアンタゴニストを含む。特に好ましい実施形態において、そのような生物活性剤は本明細書中に記載された遮断薬を含み、特別は実施形態においては、そのような遮断薬はｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の相互作用に干渉することができる。更なる実施形態において、ｐＧ６ｂ遮断薬およびｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達の他のアンタゴニストを利用するアジュバント組成物が提供される。
【００３１】
代替実施形態において、ＢおよびＴ細胞活性を阻害し、および／またはダウンレギュレートするための生物活性剤および方法が提供される。好ましい実施形態において、そのような生物活性剤はｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達のアゴニストを含む。特に好ましい実施形態においては、そのような生物活性剤は本明細書中に記載された模倣剤を含みおよび、特別な実施形態においては、そのような模倣剤はｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の相互作用を置き換え、および／または増加させることができる。更なる実施形態において、ｐＧ６ｂ模倣剤、およびｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達の他のアゴニストを利用する免疫抑制組成物が提供される。
【００３２】
更なる実施形態において、Ｂ細胞による免疫グロブリン生産を変調するための方法および組成物が提供される。
【００３３】
本明細書中に記載された方法および組成物は、例えば、自己免疫、免疫抑制、癌免疫療法および免疫アジュバントを含めた免疫療法において有利な用途を見出すであろう。
【００３４】
加えて、本発明は、医薬上許容される単体、およびそのような発現ベクター、またはそのような発現ベクターを含む組換えウイルスの少なくとも１つを含む医薬組成物も提供する。本発明は、さらに、医薬上許容される担体、および本明細書中に記載されたポリペプチドまたは抗体を含む医薬組成物を含む。
【００３５】
また、本発明では、配列番号２または３のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその断片に特異的に結合する抗体または抗体断片に特異的に結合する抗−イディオタイプ抗体、または抗−イディオタイプ抗体断片も考えられる。例示的な抗−イディオタイプ抗体は、配列番号３よりなるポリペプチドに特異的に結合する抗体に結合する。
【００３６】
また、本発明は、ｐＧ６ｂポリペプチドおよび免疫グロブリン部位を含む融合蛋白質も提供する。そのような融合蛋白質において、免疫グロブリン部位はヒトＦｃ断片のような免疫グロブリン重鎖定常領域であってよい。本発明は、さらに、そのような融合蛋白質をコードする単離された核酸分子を含む。
【００３７】
また、本発明は、可溶性受容体を含めた、モノマー、ホモダイマー、ヘテロダイマーおよびマルチマー受容体のようなｐＧ６ｂ細胞外ドメインを含むポリペプチドに結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を提供する。
【００３８】
もう１つの態様において、Ｂおよび／またはＴリンパ球を、ｐＧ６ｂ活性を変調することができる生物活性剤を含むリンパ球活性を変調するための方法が提供される。１つの実施形態において、生物活性剤は、例えば、ｐＧ６ｂまたはｐＧ６Ｂカウンター受容体遮断薬のようなｐＧ６ｂ活性のアンタゴニストを含み、その結果、陰性ｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達を妨げることによってリンパ球活性のアップレギュレーションまたは増加がもたらされる。代替実施形態において、生物活性剤は、例えば、ｐＧ６ｂまたはｐＧ６Ｂカウンター受容体模倣剤のようなｐＧ６ｂ活性のアゴニストを含み、その結果、ｐＧ６ｂ−媒介陰性シグナル伝達を置き換え、または増大させることによって、リンパ球活性のダウンレギュレーションがもたらされる。
【００３９】
更なる態様において、Ｂおよび／またはＴリンパ球と、ｐＧ６ｂおよびｐＧ６ｂカウンター受容体の相互作用を変調することができる生物活性剤を接触させることを含むリンパ球活性を変調する方法が提供される。１つの実施形態において、例えば、ｐＧ６ｂカウンター受容体またはｐＧ６ｂ遮断薬のような、ｐＧ６ｂおよびｐＧ６Ｂカウンター受容体の天然相互作用に緩衝することができる生物活性剤を使用して、リンパ球の活性および増殖を増加させる。代替実施形態において、例えば、ｐＧ６ｂカウンター受容体またはｐＧ６ｂ模倣剤のような、ｐＧ６ｂおよびｐＧ６Ｂカウンター受容体の天然相互作用を増大させ、または置き換えることができる生物活性剤を使用して、リンパ球の活性および増殖を阻害する。
【００４０】
可溶性ｐＧ６ｂ遮断薬は、可溶性ｐＧ６ｂポリペプチドおよび融合蛋白質、ｐＧ６ｂの細胞外ドメインの少なくとも一部に結合し、ｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達に干渉することができる抗−ｐＧ６ｂ抗体、そのリガンドとのｐＧ６ｂ受容体相互作用の小分子阻害剤等を含む、またはそれよりなる群から選択することができる代替ｐＧ６ｂアンタゴニストは、さらに、ｐＧ６ｂ核酸配列、阻害性ＲＮＡ配列、ｐＧ６ｂ発現および／または細胞内シグナル伝達の小分子阻害剤等に向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
【００４１】
同様に、好適なｐＧ６ｂカウンター受容体遮断薬は、ｐＧ６ｂカウンター受容体の細胞外ドメインの少なくとも一部に結合し、ｐＧ６ｂカウンター受容体およびｐＧ６ｂの相互作用に干渉することができる抗−ｐＧ６ｂ−カウンター受容体抗体、ｐＧ６ｂカウンター受容体およびｐＧ６ｂの間の相互作用の小分子阻害剤、可溶性ｐＧ６ｂカウンター受容体ポリペプチド、およびｐＧ６ｂカウンター受容体およびｐＧ６ｂの相互作用に干渉するように、かつｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達を活性化できない、修飾されたｐＧ６ｂカウンター受容体アミノ酸配列を有する融合蛋白質等を含む、またはそれよりなる群から選択することができる。代替ｐＧ６ｂカウンター受容体アンタゴニストは、ｐＧ６ｂカウンター受容体核酸配列、阻害性ＲＮＡ分子、ｐＧ６ｂカウンター受容体発現の小分子阻害剤等に向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
【００４２】
好適なｐＧ６ｂ模倣剤は、ｐＧ６ｂの細胞外ドメインの少なくとも一部に結合し、ｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達を刺激することができる機能−活性化抗−ｐＧ６ｂ抗体、機能的ｐＧ６ｂ分子を細胞内で組換えにより生産することができる遺伝子療法ベクター、ｐＧ６ｂ発現および／またはｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達の小分子増強剤等を含む、またはそれよりなる群から選択することができる。同様に、好適なｐＧ６ｂカウンター受容体模倣剤は、可溶性ｐＧ６ｂカウンター受容体ポリペプチド、およびｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達を活性化することができる融合蛋白質、ｐＧ６ｂカウンター受容体およびｐＧ６ｂ間の相互作用の小分子増強剤、ならびにｐＧ６ｂカウンター受容体発現の増強剤、機能的ｐＧ６ｂカウンター受容体分子を細胞内で組換えにより生産することができる遺伝子療法ベクター等を含む、またはそれよりなる群から選択することができる。
【００４３】
かくして、より特別な実施形態において、ＢまたはＴリンパ球をｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達アンタゴニストと接触させることを含むリンパ球活性を刺激し、増大させおよび／または増加させる方法が提供され、該アンタゴニストは可溶性ｐＧ６ｂポリペプチド、可溶性ｐＧ６ｂ融合蛋白質、ｐＧ６ｂの細胞内ドメインの少なくとも一部に結合し、ｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達に干渉することができる抗−ｐＧ６ｂ抗体、ｐＧ６ｂ発現および／またはｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達の小分子阻害剤、ｐＧ６ｂカウンター受容体の細胞外ドメインの少なくとも一部に結合し、ｐＧ６ｂカウンター受容体およびｐＧ６ｂの相互作用に干渉することができる抗−ｐＧ６ｂカウンター受容体抗体、ｐＧ６ｂカウンター受容体およびｐＧ６ｂの間の相互作用の小分子阻害剤、可溶性ｐＧ６ｂカウンター受容体ポリペプチド、およびｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達を活性化することができる、かつＲＮＡ配列に干渉することができないｐＧ６ｂカウンター受容体融合蛋白質よりなる群から選択される少なくとも１つの生物活性剤を含む。
【００４４】
特に好ましい実施形態において、ｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達の上述したアンタゴニストの少なくとも１つを宿主に投与することを含む、抗原性刺激に対する宿主免疫応答を増加させるための方法が提供される。望ましくは、抗原刺激は病原体抗原、ワクチン抗原、および／または腫瘍抗原であってよい。特別な実施形態において、癌患者に主題のアンタゴニストまたは遮断薬の少なくとも１つを投与して、ｐＧ６ｂ−媒介陰性シグナル伝達を阻害し、それにより、癌性組織に存在するｐＧ６ｂカウンター受容体以外の腫瘍抗原に対して向けられたＴ細胞応答を増加させることを含む、ｐＧ６ｂカウンター受容体以外の腫瘍抗原に対する細胞免疫応答を刺激する方法が提供される。
【００４５】
さらなる特別な実施形態において、ＢまたはＴリンパ球をｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達のアゴニストと接触させることを含む、リンパ球の活性を阻害し、減衰させ、および／または減少させる方法が提供され、該アゴニストは可溶性ｐＧ６ｂカウンター受容体ポリペプチド、およびｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達を活性化することができるｐＧ６ｂカウンター受容体融合蛋白質、ｐＧ６ｂの細胞外ドメインの少なくとも一部に結合し、ｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達を刺激することができる機能−活性化抗−ｐＧ６ｂ抗体、機能的ｐＧ６ｂ分子を分子内で組換えにより生産することができる遺伝子療法ベクター、ｐＧ６ｂ発現および／またはｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達の小分子増強剤、ｐＧ６ｂカウンター受容体およびｐＧ６ｂ間の相互作用の小分子増強剤、ｐＧ６ｂカウンター受容体発現の小分子増強剤、および機能的ｐＧ６ｂカウンター受容体分子を分子内で組換えにより生産することができる遺伝子療法ベクターよりなる群から選択される。
【００４６】
特に好ましい実施形態において、ｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達の上述のアゴニストの少なくとも１つを宿主に投与することを含む抗原刺激に対する宿主免疫応答を抑制する方法が提供される。望ましくは、抗原刺激は自己免疫疾患との関係で、または移植された器官および組織に存在するドナー抗原からの自己抗原であってよい。
【００４７】
代替態様において、本発明は、ｐＧ６ｂ−カウンター受容体−発現細胞およびｐＧ６ｂ−発現リンパ球の相互作用を変調するための生物活性剤および方法を提供する。好ましい実施形態において、ｐＧ６ｂ−カウンター受容体−陽性腫瘍細胞とＴ細胞との相互作用に干渉するための生物活性剤および方法が提供され、その結果、陰性ｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達が阻害される。特に好ましい実施形態において、Ｔ細胞はＣＤ４＋細胞またはＣＤ８＋細胞である。さらなる実施形態において、ＣＤ４＋Ｔ細胞はＴｈ１細胞である。
【００４８】
もう１つの好ましい実施形態において、ｐＧ６ｂ−カウンター受容体−陽性で、非−腫瘍で、非−リンパ系細胞とｐＧ６ｂ−陽性Ｔ細胞との相互作用を模倣し、または増強するための生物活性剤および方法が提供され、それにより、Ｔ細胞活性を減少させる。特に好ましい実施形態において、Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。好ましい実施形態において、ＣＤ４＋Ｔ細胞はＴｈ１細胞である。
【００４９】
さらなる態様において、ｐＧ６ｂ−カウンター受容体−発現腫瘍細胞の存在によって特徴付けられる癌を治療する方法が提供される。１つの実施形態において、これらの方法は、単独で、あるいは代替癌免疫療法、化学療法および／または放射線療法プロトコルと組合せて、本明細書中に開示されたｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達のアンタゴニストの少なくとも１つを哺乳動物対象に投与することを含む。好ましい実施形態において、少なくとも１つのｐＧ６ｂまたはｐＧ６ｂカウンター受容体遮断薬を、ｐＧ６ｂ−カウンター受容体−陽性腫瘍細胞を有する対象に投与され、ここに、該遮断薬はｐＧ６ｂおよびｐＧ６ｂカウンター受容体の相互作用に干渉することができ、かつｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達を阻害することができる好ましくは、該遮断薬の投与は、腫瘍細胞上のｐＧ６ｂカウンター受容体以外の腫瘍抗原に向けられたＴ細胞活性を増加させるのに、特に細胞傷害性Ｔ細胞活性を増加させるのに有効である。なおより好ましくは、主代のアンタゴニストの投与は、ｐＧ６ｂ−カウンター受容体−発現腫瘍細胞の成長を阻害するのに有効である。
【００５０】
また、本明細書中で提供される主題のｐＧ６ｂおよび／またはｐＧ６ｂカウンター受容体ブロックは、その開示をここに明示的に引用して援用する、米国特許第５，８１１，０９７および６，０５１，２２７号、および国際公開ＷＯ  ００／３２２３１に開示されたようにＣＴＬＡ−４ブロックとの相乗的な組合わせを見出すであろう。
【００５１】
さらなる態様において、自己免疫攻撃に付された非腫瘍非リンパ系宿主細胞におけるｐＧ６ｂカウンター受容体の存在しないまたは異常な発現によって特徴付けられる自己免疫障害を治療するための方法が提供される。１つの実施形態において、これらの方法は、単独で、または代替免疫療法および／または免疫抑制プロトコルと組合せて、本明細書中に開示されたｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達のアゴニストの少なくとも１つを哺乳動物対象に投与することを含む。好ましい実施形態において、少なくとも１つのｐＧ６ｂまたはｐＧ６ｂカウンター受容体模倣剤を自己反応性ｐＧ６ｂ−陽性リンパ球を有する対象に投与され、ここに、該模倣剤はｐＧ６ｂまたはｐＧ６ｂカウンター受容体の相互作用を置き換え、および／または増大させ、かつｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達を置換えまたは増加させることができる。好ましくは、該模倣剤の投与は、非−腫瘍非−リンパ系宿主細胞に対して向けられた自己反応性リンパ球活性、特に自己反応性ＣＤ８＋ＣＴＬおよびＣＤ４＋Ｔｈ１活性、およびＢ細胞活性を減少させるのに有効である。
【００５２】
なおさらなる態様において、器官および組織移植の結果を改善し、および移植片生存を延長するための方法が提供される。１つの実施形態において、これらの方法は、単独で、あるいは代替免疫療法および／または免疫抑制プロトコルと組合せて、本明細書中に開示されたｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達のアゴニストの少なくとも１つを移植体受容者に投与することを含む。好ましい実施形態において、少なくとも１つのｐＧ６ｂまたはｐＧ６ｂカウンター受容体模倣剤が移植体受容者に投与され、ここに、該模倣剤はｐＧ６ｂまたはｐＧ６ｂカウンター受容体の相互作用を置き換え、および／または増大させ、およびｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達を置き換え、または増加させることができる。好ましくは、該模倣剤の投与は、移植片に存在する抗原に対するドナー抗原に対する受容者免疫応答、特に、細胞溶解ＣＴＬ応答およびＴ細胞応答を減少させるのに有効である。なおより好ましくは、主題の模倣剤の投与は、本明細書中においてより詳細に記載するように、Ｔヘルパー細胞応答を不都合なＴｈ−１タイプの応答からより好都合なＴｈ−２タイプの応答へ偏らせるのに有効である。
【００５３】
また、本発明は、自己免疫応答を阻害するための組成物および方法を提供する。好ましい実施形態において、自己抗原を特異的に認識する自己反応性ＴおよびＢ細胞の活性を阻害するための組成物および方法が提供される。望ましくは、これらの組成物および方法を用いて、１つ以上の自己抗原によって媒介される非−腫瘍細胞の殺傷を阻害することができる。
【００５４】
自己免疫疾患の治療で用いる好ましい組成物は、例えば、上述した模倣剤を含めた本明細書中に記載されたｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達のアゴニストを含む。特に好ましい剤はｐＧ６ｂ細胞外ドメイン（配列番号３）、またはその部分を含むｐＧ６ｂ蛋白質断片；ｐＧ６ｂ細胞外ドメイン（配列番号３）、またはその部分を含むｐＧ６ｂ―Ｉｇ融合蛋白質；機能−活性化抗−ｐＧ６ｂ抗体；ｐＧ６ｂを模倣するペプチドまたはカウンター受容体（ミメティクス）；およびｐＧ６ｂとそのカウンター受容体との天然相互作用を模倣する小細胞化学組成物を含む。また、好ましいのは、架橋様式で、またはポリクローナル混合物としての、ｐＧ６ｂに結合することができる組成物である。
【００５５】
また、本発明においては、自己免疫疾患に対する遺伝子的手法が考えられる。特に、遺伝子療法を用いて、Ｔ細胞上のｐＧ６ｂ発現のレベルを増加させ、および／または自己反応性リンパ球による攻撃にさらされる非−リンパ系細胞上でのそのカウンター受容体の発現レベルを増加させることができる。上昇した特異的活性を呈するｐＧ６ｂのイソ形態または変種の使用も考えられ、各方法の目的はＴ細胞活性化に対して抑制的なシグナル伝達を増強させることである。
【００５６】
また、本発明は、癌を治療するための、特に、腫瘍細胞に対するｐＧ６ｂ−陽性−Ｔリンパ球の活性を増加させるための組成物および方法を提供する。実施形態いくつかの実施形態において、該方法は、ｐＧ６ｂカウンター受容体を発現する腫瘍細胞に対するｐＧ６ｂ−陽性Ｔリンパ球の活性を増加させるためのものである。望ましくは、これらの組成物および方法を用いて、例えば、ｐＧ６ｂカウンター受容体を発現することができる腫瘍細胞のような腫瘍細胞の成長を阻害することができる。
【００５７】
癌の治療で用いられる好ましい組成物は、例えば、ｐＧ６ｂ遮断薬を含めた本明細書中に記載されたｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達のアンタゴニストである。特に好ましい剤は抗−ｐＧ６ｂ抗体；ｐＧ６ｂ細胞外ドメイン、またはその部分含む蛋白質断片；ｐＧ６ｂ細胞外ドメイン、またはその部分を含むｐＧ６ｂ―Ｉｇ融合蛋白質；機能−ブロッキング抗−ｐＧ６ｂ抗体；ｐＧ６ｂを模倣するペプチド（ミメティクス）；およびｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の天然相互作用に干渉する小分子化学組成物を含む。
【００５８】
また、本発明においては、癌の治療に対する遺伝子的手法が考えられる。特に、遺伝子療法を用いて、Ｔ細胞上でのｐＧ６ｂ発現のレベルを減少させ、および／または腫瘍細胞上でのｐＧ６ｂまたはそのカウンター受容体の発現のレベルを減少させることができる。優性陰性活性を呈するｐＧ６ｂのイソ形態の使用もまた考えられ、各方法の目的は、Ｔ細胞活性化に対して通常抑制的であるシグナル伝達を阻害することである。遺伝子的手法は、組織および細胞特異的プロモーターを用いて、各々、ｐＧ６ｂ優性陰性変種、アンチセンス核酸、または小細胞阻害性ＲＮＡをＴ細胞および腫瘍細胞に標的化することを含むことができる。該方法は、加えて、腫瘍−標的化ウイルス、または腫瘍細胞を特異的に認識する他の送達媒体の使用を含む。該方法は、加えて、Ｔ細胞−標的化ウイルス、またはＴ細胞を特異的に認識する他の送達媒体の使用を含むことができる。
【００５９】
特に好ましいのは、腫瘍細胞に選択的に標的化し、非−腫瘍細胞におけるｐＧ６ｂ発現のレベルを有害なレベルまで低下させることなく腫瘍細胞におけるｐＧ６ｂ発現の減少を行うことができる剤である。かなり好ましいのは、前駆体形態を有する剤である。これらの「プロドラッグ」は、典型的には、腫瘍の近傍にその分布が制限された酵素活性によって、腫瘍組織の近傍においてそれらの活性な形態に変換される。
【００６０】
また、かなり好ましいのは、剤を腫瘍へ選択的に送達する標的化部位と組み合わせることができる剤である。これらの標的化部位は、腫瘍組織の近傍において剤の高い局所的濃度を供し、所望の応答を行うには投与しなければならない剤の量を定価させる。
【００６１】
また、本発明においては、上述したように、癌を治療するための組合せ療法の使用が考えられる。
【００６２】
好ましい実施形態において、免疫化を行って、腫瘍−特異的Ｔ細胞免疫応答を促進する。本実施形態においては、ｐＧ６ｂ活性化を阻害する生物活性剤を、腫瘍−関連抗原と組合せて投与する。腫瘍−関連抗原およびｐＧ６ｂ−阻害性／カウンター受容体機能的−ミメティックの組合せは、腫瘍特異的Ｔ細胞応答を促進し、ここに、Ｔ細胞は、生物活性剤の非存在下において腫瘍組織によって発揮されるよりも阻害のより低いレベルに遭遇する。
【００６３】
１つの態様において、本発明は、癌の治療用の医薬を提供する。
【００６４】
また、本発明は、ＴおよびＢ細胞活性が関連する正常であるが望ましくない免疫応答を変調するための組成物および方法を提供する。好ましい実施形態において、移植された組織および器官に対する宿主リンパ球応答を阻害するための組成物および方法が提供される。望ましくは、これらの組成物および方法を用いて、移植された組織の生存を延長することができる。急性および／または慢性移植片拒絶の予防で用いるための好ましい組成物は、例えば、上述した模倣剤を含めた本明細書中に記載されたｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達のアゴニストを含む。特に好ましい剤はｐＧ６ｂ細胞外ドメイン（配列番号３）、またはその部分を含むｐＧ６ｂポリペプチド；ｐＧ６ｂ細胞外ドメイン（配列番号３）、またはその部分を含むｐＧ６ｂ−Ｉｇ融合蛋白質；機能−活性化抗−ｐＧ６ｂ抗体；そのカウンター受容体を模倣するペプチド（ミメティックス）；ｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の天然相互作用を模倣する小分子化学組成物を含む。一般的な免疫抑制戦略でのそれらの使用に加えて、本明細書中に記載されたｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達の主題のアゴニストは、不都合なＴｈ−１−タイプ応答から離れ、かつより好都合なＴｈ−２−タイプの応答に向けて、受容者Ｔヘルパー細胞免疫応答を偏らせることによって、組織および器官の移植において許容される誘導についての重要な関連性も有することができる。
【００６５】
１つの態様において、本発明は、移植および免疫抑制で用いるための医薬を提供する。
【００６６】
また、上述したｐＧ６ｂおよび／またはｐＧ６ｂカウンター受容体遮断薬の少なくとも１つ、ならびにｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達の他のアンタゴニストを含むアジュバント組成物も提供される。上述したｐＧ６ｂおよび／またはｐＧ６ｂカウンター受容体模倣剤の少なくとも１つ、ならびにｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達の他のアゴニストを含む免疫抑制組成物も提供される。
【００６７】
さらに、主題の組成物および方法は、他のＴ細胞共刺激性経路の変調に基づいた免疫療法と、および特にＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４および／またはＢＴＬＡ変調と相乗的に組み合わせることができると考えられる。
【００６８】
代替態様において、本発明は、Ｔ細胞活性化を変調するのに有用な生物活性剤についてスクリーニングする方法を提供する。本明細書中で提供されるスクリーニング方法によって同定された生物活性剤を用いて、ｐＧ６ｂカウンター受容体−発現細胞またはｐＧ６ｂ−発現細胞と反応させて、ｐＧ６ｂ−発現Ｂおよび／またはＴ細胞およびｐＧ６ｂ−カウンター受容体−発現非−リンパ球細胞の間の相互作用に干渉し、それにより、ｐＧ６ｂ／ｐＧ６ｂカウンター受容体−相互作用の機能に拮抗することができる。別法として、生物活性剤を用いて、ｐＧ６ｂ−カウンター受容体−発現細胞またはｐＧ６ｂ−発現細胞と反応して、ｐＧ６ｂカウンター受容体／ｐＧ６ｂ相互作用を模倣し、ｐＧ６ｂ／ｐＧ６ｂカウンター受容体相互作用の非存在下においてＴ細胞阻害を行うことができる。別法として、生物活性剤を用いて、いくつかの方法において、天然ｐＧ６ｂ／ｐＧ６ｂカウンター受容体相互作用を修飾して、会合を増加させ、および阻害シグナルを増大させることができる。
【００６９】
代替態様において、本発明は、本明細書中に開示された単離されたｐＧ６ｂおよび／またはｐＧ６ｂカウンター受容体核酸配列を含む発現ベクター、本明細書中に開示された組換え核酸分子を含む組換え宿主細胞、および該宿主細胞を培養し、次いで、所望により、それにより生産されたポリペプチドを単離することを含む、ｐＧ６ｂおよび／またはｐＧ６ｂカウンター受容体ポリペプチドを生産する方法を提供する。
【００７０】
さらなる態様において、本明細書中に開示されたｐＧ６ｂまたはｐＧ６ｂカウンター受容体蛋白質をコードする核酸を含むトランスジェニック非−ヒト哺乳動物が提供される。ｐＧ６ｂまたはｐＧ６ｂカウンター受容体分子を、増加した循環レベルを含むことができる、ｐＧ６ｂまたはｐＧ６ｂカウンター受容体ポリペプチドのレベルの増加した発現を可能とするように哺乳動物に導入される。別法として、ｐＧ６ｂまたはｐＧ６ｂカウンター受容体核酸断片を用いて、内因性ｐＧ６ｂまたはｐＧ６ｂカウンター受容体対立遺伝子を標的化して、内因性ｐＧ６ｂまたはｐＧ６ｂカウンター受容体核酸の発現を妨げることができる（すなわち、ｐＧ６ｂまたはｐＧ６ｂカウンター受容体蛋白質遺伝子ノックアウトを保有するトランスジェニック動物を作成する）。該トランスジェニック動物は、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ラットまたはマウスのようなげっ歯類である。
【００７１】
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の詳細な記載を参照して明らかとなるであろう。加えて、種々の文献が以下で同定され、引用してその全体を援用する。
【００７２】
２．定義
他の定義がされるのでなければ、本明細書中で用いる全ての技術および科学用語は、記載した方法および組成物が属する分野における当業者によって通常理解されるのと同一の意味を有する。本明細書中で用いるとき、以下の用語およびフレーズは、特に断りのない限り、それらに帰される意味を有する。
【００７３】
本明細書中で用いるとき、「核酸」または「核酸分子」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によって生じた断片、および連結、切断、エンドヌクレアーゼ作用、およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生じた断片をいう。核酸分子はＤＮＡおよびＲＮＡ、または天然に生じるヌクレオチドの類似体（例えば、天然に生じるヌクレオチドのα−エナンチオマー形態）、または双方の組合せのような天然に生じるヌクレオチドであるモノマーから構成され得る。修飾されたヌクレオチドは、糖部位において、および／またはピリミジンまたはプリン塩基部位において改変を有することができる。糖修飾は、例えば、１つ以上のヒドロキシル基の、ハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基での置換を含み、あるいは糖をエーテルまたはエステルとして機能性化することができる。さらに、全糖部位を、アザ−糖および炭素環糖類似体のような、立体的におよび電子的に同様な構造で置き換えることができる。塩基部位における修飾の例はアルキル化プリンおよびピリミジン、アシル化プリンまたはピリミジン、または他のよく知られた複素環置換を含む。核酸モノマーはホスホジエステル結合、またはそのような結合の類似体によって連結することができる。ホスホジエステル結合の類似体はホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホルアミデート等を含む。用語「核酸分子」は、ポリアミド骨格に結合した天然に生じるまたは修飾された核酸塩基を含むいわゆる「ペプチド核酸」も含む。核酸は一本鎖または二本鎖いずれかであり得る。
【００７４】
用語「核酸分子の相補体」とは、参照ヌクレオチド配列と比較して相補的なヌクレオチド配列および逆の向きを有する核酸分子をいう。
【００７５】
用語「縮重ヌクレオチド配列」は、ポリペプチドをコードする参照核酸分子と比較して、１つ以上の縮重コドンを含むヌクレオチドの配列を示す。縮重コドンはヌクレオチドの異なるトリプレットを含有するが、同一アミノ酸残基をコードする（すなわち、ＧＡＵおよびＧＡＣトリプレットは、各々、Ａｓｐをコードする）。
【００７６】
用語「構造遺伝子」とは、次いで、特異的ポリペプチドに特徴的なアミノ酸配列に翻訳されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写される核酸分子をいう。
【００７７】
「単離された核酸分子」は、生物のゲノムＤＮＡに取り込まれていない核酸分子である。例えば、細胞のゲノムＤＮＡから分離されている成長因子をコードするＤＮＡ分子は単離されたＤＮＡ分子である。単離された核酸分子のもう１つの例は、生物のゲノムに取り込まれていない化学的に合成された核酸分子である。特定の種から単離されている核酸分子は、その種核の染色体の完全なＤＮＡ分子よりも小さい。
【００７８】
「核酸分子構築体」は、天然には存在しない配置で組み合わされ、および並置された核酸のセグメントを含有するようにヒト介入を通じて修飾されている一本鎖または二本鎖の核酸分子である。
【００７９】
「線状ＤＮＡ」は、遊離５’および３’末端を有する非−環状ＤＮＡ分子を示す。線状ＤＮＡは、酵素消化または物理的破壊によってプラスミドのような閉じた環状ＤＮＡ分子から調製することができる。
【００８０】
「相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）」は、酵素逆転写酵素によってｍＲＮＡ鋳型から形成された一本鎖ＤＮＡ分子である。典型的には、ｍＲＮＡの部分に対して相補的なプライマーを、逆転写の開始で使用する。当業者であれば、一本鎖ＤＮＡ分子およびその相補的ＤＮＡストランドよりなる二本鎖ＤＮＡ分子をいうのに用語「ｃＤＮＡ」も用いる。用語「ｃＤＮＡ」は、ＲＮＡ鋳型から合成されたｃＤＮＡ分子のクローンもいう。
【００８１】
「プロモーター」は、構造遺伝子の転写を支持するヌクレオチド配列である。典型的には、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位に対して基部側にある遺伝子の５’非−コーディング領域に位置する。転写の開始で機能するプロモーター内の配列エレメントは、しばしば、コンセンサスヌクレオチド配列によって特徴付けられる。これらのプロモーターエレメントは結合部位、ＴＡＴＡ配列、ＣＡＡＴ配列、分化−特異的エレメント（ＤＳＥ；ＭｃＧｅｈｅｅら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．７：５５１（１９９３））、環状ＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）、血清応答エレメント（ＳＲＥ；Ｔｒｅｉｓｍａｎ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．１：４７（１９９０））、グルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）、およびＣＲＥ／ＡＴＦ（Ｏ‘Ｒｅｉｌｌｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１９９３８（１９９２））、ＡＰ２（Ｙｅら、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５７２８（１９９４））、ＳＰ１、ｃＡＭＰ応答エレメント結合蛋白質（ＣＲＥＢ；Ｌｏｅｋｅｎ，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒ．３：２５３（１９９３）））および八量体因子（一般に、Ｗａｔｓｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，４ｔｈ  ｅｄ．（Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ  １９８７）、およびＬｅｍａｉｇｒｅ  ａｎｄ  Ｒｌｕｓｓｅａｕ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０３：１（１９９４））のような他の転写因子のための結合部位を含む。もしプロモーターが誘導性プロモーターであるならば、転写の速度は誘導剤に応答して増加する。対照的に、転写の速度は、もしプロモーターが構成的プロモーターであれば、誘導剤によって調節されない。抑制性プロモーターも知られている。
【００８２】
「コア」プロモーターは、ＴＡＴＡボックスおよび転写の開始を含めたプロモーター機能のための必須のヌクレオチド配列を含有する。この定義によると、コアプロモーターは、活性を増強でき、または組織特異的活性を付与できる特異的配列の非存在下において検出可能な活性を有しても有さなくてもよい。
【００８３】
「調節エレメント」は、コアプロモーターの活性を変調するヌクレオチド配列である。例えば、調節エレメントは、特定の細胞、組織またはオルガネラにおいて専らまたは優先的に転写を可能とする細胞因子と結合するヌクレオチド配列を含有することができる。これらのタイプの調節エレメントは、「細胞−特異的」、「組織−特異的」、または「オルガネラ−特異的」に発現される遺伝子と通常会合している。
【００８４】
「エンハンサー」は、転写の開始部位に対するエンハンサーの距離または向きとは無関係に、転写の効率を増加させることができる調節エレメントのタイプである。
【００８５】
「異種ＤＮＡ」とは、与えられた宿主細胞内では天然に存在しないＤＮＡ分子、またはＤＮＡ分子の集団をいう。宿主ＤＮＡが非−宿主ＤＮＡ（すなわち、外因性ＤＮＡ）と合わされている限り、特定の宿主細胞に対して異種のＤＮＡ分子は宿主細胞腫に由来するＤＮＡ（すなわち、内因性ＤＮＡ）を含有することができる。例えば、転写プロモーターを含む宿主ＤＮＡセグメントに操作可能に連結されたポリペプチドをコードする非−宿主ＤＮＡセグメントを含有するＤＮＡ分子は、異種ＤＮＡ分子であると考えられる。逆に、異種ＤＮＡ分子は、外因性プロモーターに操作可能に連結された内因性遺伝子を含むことができる。もう１つの例として、野生型細胞に由来する遺伝子を含むＤＮＡ分子は、もしそのＤＮＡ分子が野生型遺伝子を欠如する突然変異体細胞に取り込まれたならば、異種ＤＮＡと考えられる。
【００８６】
「ポリペプチド」は、天然にまたは合成により生産されたかを問わず、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基のポリマーである。約１０アミノ酸未満の残基のポリペプチドは、通常、「ペプチド」といわれる。
【００８７】
「蛋白質」は、１つ以上のポリペプチド鎖を含むマクロ分子である。蛋白質は炭水化物基のような非−ペプチド性成分を含むこともできる。炭水化物および他の非−ペプチド性置換は、蛋白質が生産される細胞によって蛋白質に付加することができ、細胞のタイプで変化するであろう。蛋白質は、本明細書中においては、それらのアミノ酸骨格構造の点で定義され；炭水化物基のような置換基は一般的に特定されないが、それにもかかわらず、存在させてもよい。
【００８８】
非−宿主ＤＮＡ分子によってコードされるペプチドまたはポリペプチドは「異種」ペプチドまたはポリペプチドである。
【００８９】
「クローニングベクター」は、宿主細胞において自律的に複製する能力を有するプラスミド、コスミド、またはバクテリオファージのような核酸分子である。クローニングベクターは、典型的には、ベクターの必須の生物学的機能の喪失なくして決定可能に核酸分子の挿入を可能とする１または少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、ならびにクローニングベクターで形質転換された細胞の同定および選択で用いるのに適したマーカー遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含有する。マーカー遺伝子は、典型的には、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性を供する遺伝子を含む。
【００９０】
「発現ベクター」は、宿主細胞において発現される遺伝子をコードする核酸分子である。典型的には、発現ベクターは転写プロモーター、遺伝子、および転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は、プロモーターの制御下に通常は置かれ、そのような遺伝子はプロモーターに「操作可能に連結されている」といわれる。同様に、調節エレメントおよびコアプロモーターは、もし調節エレメントがコアプロモーターの活性を変調するならば、操作可能に連結されている。
【００９１】
「組換え宿主」は、クローニングベクターまたは発現ベクターのような、異種核酸分子を含有する細胞である。この関係において、組換え宿主の例は発現ベクターからｐＧ６ｂを生じる細胞である。対照的に、ｐＧ６ｂは、ｐＧ６ｂの「天然源」であって、発現ベクターを欠如する細胞によって生産され得る。
【００９２】
「組込み形質転換体」は、異種ＤＮＡが細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれたようになっている組換え宿主細胞である。
【００９３】
「融合蛋白質」は、少なくとも２つの遺伝子のヌクレオチド配列を含む核酸分子によって発現されたハイブリッド蛋白質である。例えば、融合蛋白質は、親和性マトリックスに結合するポリペプチドと融合したｐＧ６ｂポリペプチドの少なくとも一部を含むことができる。そのような融合蛋白質は、アフィニティークロマトフラフィーを用いて大量のｐＧ６ｂを単離する手段を提供する。
【００９４】
用語「受容体」は、「カウンター受容体」と呼ばれる生体活性分子に結合する細胞−会合蛋白質を示す。この相互作用は、細胞上のカウンター受容体の効果を媒介する。受容体は膜結合、細胞質または核；モノマー（例えば、甲状腺刺激ホルモン受容体、ベータ−アドレナリン作動性受容体）またはマルチマー（例えば、ＰＤＧＦ受容体、成長ホルモン受容体、ＩＬ−３受容体、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、Ｇ−ＣＳＦ受容体、エリスロポエチン受容体およびＩＬ−６受容体）であり得る。膜−結合受容体は、細胞外カウンター受容体−結合ドメイン、および典型的にはシグナル変換に関与する細胞内エフェクタードメインを含むマルチ−ドメイン構造によって特徴付けられるある膜−結合受容体において、細胞外カウンター受容体−結合ドメインおよび細胞内エフェクタードメインは、完全な機能的受容体を含む別々のポリペプチドに位置する。
【００９５】
一般に、カウンター受容体の受容体への結合の結果、受容体において立体配座変化が起こり、これは細胞中でエフェクタードメインおよび他の分子の間の相互作用を引き起こし、これは、今度は、細胞の代謝の変化に導く。受容体−カウンター受容体相互作用にしばしば関連する代謝事象は、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、環状ＡＭＰ生産の増加、細胞カルシウムの動員、膜脂質の動員、細胞接着、イノシトール脂質の加水分解、およびリン脂質の加水分解を含む。
【００９６】
「可溶性受容体」は、最も普通には、細胞膜に結合していない受容体ポリペプチドである。可溶性受容体は膜貫通および細胞質ドメイン、およびグルコホスホイノシトール（ｇｐｉ）を介するよう細胞膜への他の結合を欠如するカウンター受容体−結合受容体ポリペプチドである。可溶性受容体は、ポリペプチドの精製を供し、またはポリペプチドの基質への結合のための部位を供するアフィニティー標識、または免疫グロブリン定常領域配列のようなさらなるアミノ酸残基を含むことができる。多くの細胞−表面受容体は、蛋白質分解によって生産され、あるいは交互にスプライシングされたｍＲＮＡから翻訳された天然に生じる可溶性カウンターパートを有する。可溶性受容体はモノマー、ホモダイマー、ヘテロダイマー、またはマルチマーとすることができ、マルチマー受容体は、一般には、９を超えるサブユニットを含まず、好ましくは６を超えるサブユニットを含まず、最も好ましくは３を超えるサブユニットを含まない。受容体ポリペプチドは、それらが各々、膜アンカリングまたはシグナル変換を供するにはこれらのセグメントの十分な部分を欠如している場合、膜貫通および細胞内ポリペプチドセグメントを実質的に含まないといわれる。クラスＩおよびクラスＩＩのサイトカイン受容体の可溶性受容体は、一般には、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含まない細胞外サイトカイン結合ドメインを含む。例えば、ｐＧ６ｂに対する代表的な可溶性受容体は、例えば、配列番号３に示された可溶性受容体を含む。公知のＢ７ファミリーメンバーのいずれの配列が膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含まない細胞外ドメインを含むかを思い描くのは十分に当業者のレベル内のものである。さらに、遺伝子コードを用いる当業者であれば、そのような可溶性受容体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを容易に決定することができる。
【００９７】
用語「分泌シグナル配列」は、より大きなポリペプチドの成分として、それが合成される細胞の分泌経路を通るより大きなポリペプチドを指令するペプチド（「分泌ペプチド」）をコードするＤＮＡ配列を示す。より大きなポリペプチドは、通常切断されて、分泌経路を通過の間に分泌ペプチドを除去する。
【００９８】
「単離されたポリペプチド」は、炭水化物、脂質、または天然でポリペプチドと会合している他のタンパク質性不純物のような汚染性細胞成分を本質的に含まないポリペプチドである。典型的には、単離されたポリペプチドの調製物は、高度に精製された形態の、すなわち、少なくとも約８０％純度、少なくとも約９０％純度、少なくとも約９５％純度、９６％、９７％、または９８％以上の純度のような９５％純度を超える純度または９９％を超える純度のポリペプチドを含有する。特定の蛋白質調製物が単離されたポリペプチドを含有することを示す１つの方法は、蛋白質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気詠動、およびゲルのクーマシーブリリアントブルー染色後の単一バンドの外観によるものである。しかしながら、「単離された」は、ダイマーあるいはグリコシル化または誘導体化形態のような別の物理的形態の同一ポリペプチドの存在を排除しない。
【００９９】
用語「アミノ−末端」および「カルボキシル−末端」は、ポリペプチド内の位置を示すのに本明細書中で用いられる。文脈が許せば、これらの用語は、隣接または相対的位置を示すのにポリペプチドの特定の配列または部分に言及して用いられる。例えば、ポリペプチド内で参照配列に対してカルボキシル−末端側に位置するある配列は参照配列のカルボキシル末端に対して基部側に位置するが、必ずしも、完全なポリペプチドのカルボキシル末端におけるものではない。
【０１００】
用語「発現」とは、遺伝子産物の生合成をいう。例えば、構造遺伝子の場合には、発現は、ｍＲＮＡへの構造遺伝子の転写、および１つ以上のポリペプチドへのｍＲＮＡへの翻訳も含む。
【０１０１】
用語「スプライス変種」は、遺伝子から転写されたＲＮＡのオルタナティブ形態を示すのに本明細書中では用いられる。スプライス変動は、天然では、転写されたＲＮＡ分子内の、またはより普通ではないが別々に転写されたＲＮＡ分子内のオルタナティブスプライシング部位の使用を介して生起し、同一遺伝子から転写されたいくつかのｍＲＮＡをもたらし得る。スプライス変種は改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。用語スプライス変種は、遺伝子から転写されたｍＲＮＡのスプライス変種によってコードされるポリペプチドを示すのにも本明細書中で用いられる。
【０１０２】
本明細書中で用いるとき、用語「免疫モジュレーター」は、サイトカイン、幹細胞成長因子、リンホトキシン、共−刺激分子、造血分子等、これらの分子の合成類似体を含む。
【０１０３】
用語「相補体／抗−相補体対」は、好適な条件下で非共有結合的に会合した安定な対を形成する非−同一部位を示す。例えば、ビオチンおよびアビジン（またはストレプトアビジン）は、相補体／抗−相補体対のプロトタイプメンバーである。他の例示的な相補体／抗−相補体対は、受容体／カウンター受容体対、抗体／抗原（またはハプテンまたはエピトープ）対、センス／アンチセンスポリヌクレオチド対等を含む。相補体／抗−相補体対の引き続いての解離が望ましい場合、相補体／抗−相補体対は、好ましくは、１０９Ｍ−１未満の結合親和性を有する。
【０１０４】
本明細書中で用いるとき、用語「抗体」とは、免疫グロブリンポリペプチドおよび免疫グロブリンポリペプチドの免疫学的に活性な部分、すなわち、特定の抗原（例えば、ｐＧ６ｂの細胞外ドメイン）に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する免疫グロブリンファミリーのポリペプチド、またはその断片をいう。
【０１０５】
「抗−イディオタイプ抗体」は、免疫グロブリンの可変領域ドメインと結合する抗体である。この関係で、抗−イディオタイプ抗体は抗−ｐＧ６ｂ抗体の可変領域と結合し、かくして、抗−イディオタイプ抗体はｐＧ６ｂのエピトープを模倣する。
【０１０６】
「抗体断片」は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ等のような抗体の部分である。構造にかかわらず、抗体断片は、無傷抗体によって認識される同一抗原と結合する。例えば、抗−ｐＧ６ｂモノクローナル抗体断片はｐＧ６ｂのエピトープと結合する。
【０１０７】
用語「抗体断片」は、軽鎖可変領域よりなるポリペプチド、重鎖および軽鎖の可変領域よりなる「Ｆｖ」断片、軽鎖および重鎖可変領域がペプチドリンカーによって連結された組換え単一鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖ蛋白質」）、および超可変領域を模倣するアミノ酸残基よりなる最小認識単位のような、特定の抗原に結合する合成、または遺伝子光学により作製されたポリペプチドも含む。
【０１０８】
「キメラ抗体」は、可変ドメインおよびげっ歯類抗体に由来する相補性決定領域を含有する組換え蛋白質であり、他方、抗体分子の残りはヒト抗体に由来する。
【０１０９】
「ヒト化抗体」は、モノクローナル抗体のネズミ相補性決定領域が、ネズミ免疫グロブリンの可変重鎖および軽鎖からヒト可変ドメインに移された組換え蛋白質である。ヒト蛋白質に結合する、またはそれを中和するもののような、ネズミ抗体に由来するヒトで治療的に用いられるヒト化抗体の構築は、当業者の技量内のものである。
【０１１０】
本明細書中で用いるとき、「治療剤」は、抗体部位にコンジュゲートして、療法で有用なコンジュゲートを生じる分子または原子である治療剤の例は薬物、トキシン、免疫モジュレーター、キレーター、ホウ素化合物、光活性剤または色素、および放射性同位体を含む。
【０１１１】
「検出可能な標識」は、抗体部位にコンジュゲートして、診断で有用な分子を生じさせることができる分子または原子である。検出可能な標識の例はキレーター、光活性剤、放射性同位体、蛍光剤、常磁性イオン、または他のマーカー部位を含む。
【０１１２】
用語「アフィニティー標識」は、第二のポリペプチドに結合して、第二のポリペプチドの精製または検出を供する、または第二のポリペプチドの基質への結合用の部位を供するポリペプチドセグメントを示すのに本明細書中では用いられる。原理的には、抗体または他の特異的結合部位が利用可能ないずれのペプチドまたは蛋白質もアフィニティー標識として用いることができる。アフィニティー標識はポリヒスチジントラクト、プロテインＡ（Ｎｉｌｓｓｏｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．４：１０７５（１９８５）；Ｎｉｌｓｓｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８：３（１９９１））、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇｅｎｅ  ６７：３１  （１９８８））、Ｇｌｕ−Ｇｌｕアフィニティー標識（Ｇｒｕｓｓｅｎｍｅｙｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：７９５２（１９８５））、サブスタンスＰ、ＰＬＡＧペプチド（Ｈｏｐｐら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４（１９８８））、ストレプトアビジン結合ペプチド、または他の抗原性エピトープまたは結合ドメインを含む。一般には、Ｆｏｒｄら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ２：９５（１９９１）参照。アフィニティー標識をコードするＤＮＡ分子は商業的供給業者（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手可能である。
【０１１３】
「裸の抗体」は、治療剤とコンジュゲートしていない、抗体断片とは反対に、完全な抗体である。裸の抗体はポリクローナルおよびモノクローナル双方の抗体、ならびにキメラおよびヒト化抗体のようなある種の組換え抗体を含む。
【０１１４】
用語「モノクローナル抗体」とは、いずれかの真核生物または原核生物細胞クローン、またはファージクローンを含めた単一細胞クローンに由来する抗体をいい、それが生産される方法をいわない。かくして、本明細書中で用いる用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマー技術を介して生産された抗体に限定されない。
【０１１５】
本明細書中で用いるとき、用語「抗体成分」は、完全な抗体および抗体断片を共に含む。
【０１１６】
「免疫抱合体」は、抗体成分と治療剤または検出可能な標識とのコンジュゲートである。
【０１１７】
本明細書中で用いるとき、用語「抗体融合蛋白質」は、抗体成分およびｐＧ６ｂポリペプチド成分を含む組換え分子をいう。抗体融合蛋白質の例は、ｐＧ６ｂ細胞外ドメイン、およびＦｃドメインもしくは抗原−結合領域いずれかを含む蛋白質を含む。
【０１１８】
「標的ポリペプチド」または「標的ペプチド」は、少なくとも１つのエピトープを含み、かつ腫瘍細胞、または感染剤抗原を運ぶ細胞のような標的細胞上に発現されたアミノ酸配列である。Ｔ細胞は標的ポリペプチドまたは標的ペプチドに対して主要組織適合性複合体分子によって提示されたポリペプチドエピトープを認識し、典型的には、標的細胞を溶解し、あるいは他の免疫細胞を標的細胞の部位へ動員し、それにより、標的細胞を殺傷する。
【０１１９】
「抗原性ペプチド」は、主要組織適合性複合体分子に結合して、Ｔ細胞によって認識され、それにより、Ｔ細胞への提示に際して細胞傷害性リンパ球応答を誘導するＭＨＣ−ペプチド複合体を形成するペプチドである。かくして、抗原性ペプチドは、好適な主要組織適合性複合体分子に結合でき、かつ細胞溶解、あるいは抗原に結合し、またはそれを発現する標的細胞に対する特異的サイトカイン放出のような細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導することができる。抗原性ポリペプチドは、抗原提示細胞上の、または標的細胞上の、クラスＩまたはクラスＩＩ主要組織適合性複合体分子の関係で結合することができる。
【０１２０】
真核生物においては、ＲＮＡポリメラーゼＩＩは構造遺伝子の転写を触媒して、ｍＲＮＡを生じる。核酸分子は、ＲＮＡ転写体が特異的ｍＲＮＡのそれに対して相補的である配列を有するＲＮＡポリメラーゼＩＩ鋳型を含有するように設計することができる。ＲＮＡ転写体は「アンチセンスＲＮＡ」といい、アンチセンスＲＮＡをコードする核酸分子は「アンチセンス遺伝子」といわれる。アンチセンスＲＮＡ分子はｍＲＮＡ分子に結合することができ、その結果、ｍＲＮＡ翻訳の阻害がもたらされる。
【０１２１】
「ｐＧ６ｂに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド」または「ｐＧ６ｂアンチセンスオリゴヌクレオチド」は、（ｂ）ｐＧ６ｂ遺伝子の部分とで安定なトリプレックスを形成でき、または（ｂ）ｐＧ６ｂ遺伝子のｍＲＮＡ転写体の部分とで安定なデュプレックスを形成できる配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【０１２２】
「リボザイム」は、触媒中心を含有する核酸分子である。該用語はＲＮＡ酵素、自己−スプライシングＲＮＡ、自己−切断ＲＮＡ、およびこれらの触媒機能を実行する核酸分子を含む。リボザイムをコードする核酸分子は「リボザイム遺伝子」といわれる。
【０１２３】
「外部ガイド配列」は、内因性リボザイム、ＲＮａｓｅＰを細胞内ｍＲＮＡの特定の種に向け、その結果、ＲＮａｓｅＰによるｍＲＮＡの切断がもたらされる核酸分子である。外部ガイド配列をコードする核酸分子を「外部ガイド配列遺伝子」という。
【０１２４】
用語「変種ｐＧ６ｂ遺伝子」とは、配列番号２の修飾であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子をいう。そのような変種はｐＧ６ｂ遺伝子の天然に生じる多形、ならびに配列番号２のアミノ酸配列の保存的アミノ酸置換を含有する合成遺伝子を含む。ｐＧ６ｂ遺伝子のさらなる変種形態は、本明細書中に記載されたヌクレオチド配列の挿入または欠失を含む核酸分子である。変種ｐＧ６ｂ遺伝子は、例えば、ストリンジェントな条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子、またはその相補体と遺伝子がハイブリダイズするか否かを決定することによって同定することができる。
【０１２５】
あるいは、変種ｐＧ６ｂ遺伝子は配列比較によって同定することができる。２つの核酸配列は、もし２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基が最大対応性について整列させた場合に同一であれば、「１００％アミノ酸配列同一性」を有する。同様に、２つのヌクレオチド配列は、もし２つのヌクレオチド配列のヌクレオチド残基が最大対応性につき整列させた場合に同一であれば、「１００％ヌクレオチド配列同一性」を有する。配列比較は、ＤＮＡＳＴＡＲ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）によって作製されたＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティックス計算スイートに含まれるもののような標準的なソフトウエアプログラムを用いて実行することができる。最適整列を決定することによって２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列を比較するための他の方法は当業者に周知である（例えば、Ｐｅｒｕｓｋｉ  ａｎｄ  Ｐｅｒｕｓｋｉ，Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎｅｔ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９７），Ｗｕら（ｅｄｓ．），“Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｔｉｏｎ  Ｓｕｐｅｒｈｉｇｈｗａｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｄａｔａｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐａｇｅｓ  １２３−１５１（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９７）およびＢｉｓｈｏｐ（ｅｄ．），Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９８）参照）。配列同一性を決定するための特別な方法を以下に記載する。
【０１２６】
変種ｐＧ６ｂ遺伝子または変種ｐＧ６ｂポリペプチドを同定するのに用いる特定の方法にかかわらず、変種遺伝子、または変種遺伝子によってコードされたポリペプチドは、抗−ｐＧ６ｂ抗体に特異的に結合する能力によって機能的に特徴付けることができる。変種ｐＧ６ｂ遺伝子または変種ｐＧ６ｂポリペプチドは、本明細書中に記載された生物学的または生化学的アッセイを用い、そのカウンター受容体またはカウンター受容体に結合する能力によって機能的に特徴付けることもできる。
【０１２７】
用語「対立遺伝子変種」は、同一染色体遺伝子座を占める遺伝子の２つ以上のオルタナティブ形態のいずれかを示すのに本明細書中で用いる。対立遺伝子変位は突然変異を通じて天然で生起し、その結果、集団内に表現型多形が生じ得る。遺伝子突然変異はサイレントである（コードされたポリペプチドに変化なし）か、あるいは改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしてもよい。用語対立遺伝子変種は、遺伝子の対立遺伝子変種によってコードされた蛋白質を示すのに本明細書中でも用いられる。
【０１２８】
用語「オルソログ」は、異なる種からのポリペプチドまたは蛋白質の機能的カウンターパートである１つの種から得られたポリペプチドまたは蛋白質を示す。オルソログの間の配列の差は、スペシエーションの結果である。
【０１２９】
「パラログ」は、生物によって作られた区別されるが構造的に関連する蛋白質である。パラログは遺伝子複製を通じて生起すると考えられている。例えば、α−グロビン、β−グロビン、およびミオグロビンは相互のパラログである。
【０１３０】
本明細書中で用いるとき、用語「免疫応答」は、Ｔおよび／またはＢ細胞応答、すなわち、細胞および／または液性免疫応答の双方を含む。１つの実施形態において、本明細書中で開示される組成物および方法を用いて、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）応答、より好ましくはＴｈ１細胞応答を低下させ、または増強することができる。もう１つの実施形態において、本明細書中で開示された組成物および方法を用いて、細胞傷害性Ｔ細胞（Ｔｃ）応答を低下させ、または増強することができる。特許請求される方法を用いて、一次および二次双方の免疫応答およびエフェクター機能（例えば、細胞溶解活性、サイトカインおよび抗体の生産、および抗原提示）を低下させ、または増強することができる。対象の免疫応答は、例えば、抗体生産、免疫細胞増殖、サイトカインの放出、細胞表面マーカーの発現、細胞傷害性等についてアッセイすることによって、当該分野で良く知られた方法を用いて当業者によって容易に決定され得る。
【０１３１】
「ｐＧ６ｂシグナル伝達」、「ｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達」、「ｐＧ６ｂ−媒介陰性シグナル伝達」およびその変形とは、その対応するリガンドによるｐＧ６ｂ受容体の結合および／または活性化によって引き起こされ、その結果、リンパ球活性の減衰および／またはダウンレギュレーションをもたらす細胞内シグナル伝達を意味する。１つの態様において、ｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達はＳＨＰ−１および／またはＳＨＰ−２の活性化を含む。
【０１３２】
本明細書中で用いる「リンパ球活性」とは、ＢおよびＴ細胞の活性化、増殖、分化、および生存の免疫学的プロセス、ならびに細胞溶解活性（Ｔｃ細胞）、サイトカイン生産（Ｔｈ細胞）、抗体生産（Ｂ細胞）、および抗原提示（Ｂ細胞）を含めたリンパ球細胞における関連エフェクター免疫機能をいう。上述したように、限定されるものではないが、本明細書中で提供された実施例に記載されたアッセイを含めた、そのようなプロセスを検出し、および／またはモニタリングするための当業者によく知られた多数のアッセイがある。
【０１３３】
本明細書中で用いるとき、フレーズ「ｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の相互作用」とは、機能的ｐＧ６ｂカウンター受容体分子と、リンパ球上の機能的ｐＧ６ｂ受容体の直接的物理的相互作用（例えば、結合）および／または他の間接的相互作用をいい、その結果、ｐＧ６ｂ受容体および関連分子内ｐＧ６ｂシグナル伝達が刺激される。同様に、フレーズ「ｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の天然相互作用」とは、機能的かつ内因的に発現されたカウンター受容体分子と、リンパ球上の機能的かつ内因的に発現されたｐＧ６ｂ受容体との直接的物理的相互作用（例えば、結合）および／または他の間接的相互作用をいい、その結果、ｐＧ６ｂ受容体および関連分子内Ｇ６ｂシグナル伝達が刺激される。
【０１３４】
本明細書中で用いるとき、用語「遮断薬」は、ｐＧ６ｂおよびカウンター受容体の相互作用に干渉する、および／または例えば、サイトカインの生産および／または増殖によって測定して、リンパ球活性を阻害するカウンター受容体の能力に干渉する剤を含む。用語「遮断薬」は、さらに、天然リガンドに結合するｐＧ６ｂの能力を阻害する、および／またはＴ細胞活性を阻害するｐＧ６ｂの活性に干渉する剤を含む。例示的な剤は機能−ブロッキング抗体、ならびにｐＧ６ｂとそのカウンター受容体との結合をブロックするが、リンパ球においてｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達を刺激しないペプチド（例えば、ｐＧ６ｂ融合蛋白質）、ペプチドミメティックス、小分子等を含む。好ましい遮断薬は、ｐＧ６ｂとＳＨＰ−１および／またはＳＨＰ−２との誘導性会合、またはＳＨＰ−１および／またはＳＨＰ−２とｐＧ６ｂとの相互作用に由来するシグナル変換を阻害することができる剤を含む。
【０１３５】
本明細書中で用いるとき、用語「模倣剤」は、ｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の相互作用を模倣し、および／またはリンパ球活性を阻害するｐＧ６ｂおよび／またはそのカウンター受容体の能力を増大させ、増強し、または増加させる剤を含む。例示的な剤は、機能−活性化抗体、ならびにそのカウンター受容体と結合するｐＧ６ｂ、またはｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達を刺激するカウンター受容体の役割に対する代替物の能力を増大させ、または増強するペプチド（例えば、カウンター受容体融合蛋白質）、ペプチドミメティックス、小分子等を含む。
【０１３６】
用語「阻害する」または「の阻害」とは、本明細書中で用いるとき、測定可能な量だけ低下させ、あるいは完全に妨げることを意味する。
【０１３７】
用語「マイクロビーズ」または「ビーズ」とは、本明細書中で用いるとき、いずれかの与えられた軸に沿って約１μ〜約１０μｍ間を測定する固相粒子、典型的には約１μｍ〜約１μｍ間、あるいは典型的には約１μｍ〜約６μｍ間（例えば、４．５μｍまたは５μｍ）直径を有する実質的には球形粒子をいう。マイクロビーズの例はラテックス、および典型的には免疫学的アッセイで用いられるもの（例えば、トシル活性化ビーズ）のような常磁性ビーズを含む。
【０１３８】
本発明は、ｐＧ６ｂ遺伝子の機能的断片を含む。本発明の文脈内では、ｐＧ６ｂ遺伝子の「機能的断片」とは、本明細書中に記載されたドメインである、あるいは抗−ｐＧ６ｂ抗体に少なくとも特異的に結合するｐＧ６ｂポリペプチドの部分をコードする核酸分子をいう。
【０１３９】
標準的な解析方法の不正確さのため、ポリマーの分子量および長さは近似値であると理解される。そのような値が「約」Ｘまたは「ほぼ」Ｘとして表される場合、Ｘの述べられた値は±１０％まで正確であると理解されるであろう。
【０１４０】
３．ｐＧ６ｂポリヌクレオチドまたは遺伝子の生産
ヒトｐＧ６ｂ遺伝子をコードする核酸分子は、配列番号１に基づくポリヌクレオチドプローブを用いてヒトｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。これらの技術は標準的であってよく確立されており、商業的供給業者によって入手可能なクローニングキットを用いて達成することができる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（ｅｄｓ．），Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９５；Ｗｕら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９７；Ａｖｉｖ  ａｎｄ  Ｌｅｄｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：１４０８（１９７２）；Ｈｕｙｎｈら、“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｃＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｉｎ  λｇｔ１０  ａｎｄ  λｇｔ１１，”ｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｖｏｌ．Ｉ，Ｇｌｏｖｅｒ（ｅｄ．），ｐａｇｅ  ４９（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８５）；Ｗｕ（１９９７）ａｔ  ｐａｇｅｓ  ４７−５２参照。
【０１４１】
ヒトｐＧ６ｂ遺伝子をコードする核酸分子もまた、ｐＧ６ｂ遺伝子またはｃＤＮＡの核酸配列に基づくヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーでのポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を用いて得ることもできる。ＰＣＲでライブラリーをスクリーニングする一般的方法は、例えば、Ｙｕら、“Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｐｈａｇｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，”ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５：ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｗｈｉｔｅ（ｅｄ．），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９３によって供される。さらに、関連遺伝子を単離するためにＰＣＲを用いる技術は、例えば、Ｐｒｅｓｔｏｎ，“Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｉｍｅｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅ  Ｇｅｎｅ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｍｅｍｂｅｒｓ，”ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５：ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｗｈｉｔｅ（ｅｄ．），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９３に記載されている。別法として、ｐＧ６ｂ遺伝子は、相互にプライミングする長いオリゴヌクレオチド、および本明細書中に記載されたヌクレオチド配列を用いて核酸分子を合成することによって得ることができる。ポリメラーゼ鎖反応を用いる確立された技術は、長さが少なくとも２キロベースのＤＮＡ分子を合成する能力を提供する（Ａｄａｎｇら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１：１１３１（１９９３），Ｂａｍｂｏｔら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ２：２６６（１９９３），Ｄｉｌｌｏｎら、“Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｇｅｎｅｓ，”ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５：ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｗｈｉｔｅ（ｅｄ．），ｐａｇｅｓ  ２６３−２６８，（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９３），ａｎｄ  Ｈｏｌｏｗａｃｈｕｋら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．４：２９９（１９９５））。ポリヌクレオチド合成に関するレビューについては、例えば、Ｇｌｉｃｋ  ａｎｄ  Ｐａｓｔｅｒｎａｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ（ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ  １９９４），Ｉｔａｋｕｒａら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３（１９８４），ａｎｄ  Ｃｌｉｍｉｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：６３３（１９９０）参照。
【０１４２】
４．ｐＧ６ｂ遺伝子変種の生産
本発明は、本明細書中に開示されたｐＧ６ｂポリペプチドをコードするＤＮＡおよびＲＮＡ分子を含めた種々の核酸分子を提供する。当業者であれば、遺伝子コードの縮重に鑑み、かなりの配列変動がこれらのポリヌクレオチド分子の間で可能であることを容易に認識するであろう。さらに、本発明は、配列番号２の受容体ポリペプチドに実質的に相同な少なくとも１つのｐＧ６ｂ受容体サブユニットを含む単離された可溶性のモノマー、ホモダイマー、ヘテロダイマーおよびマルチマー受容体ポリペプチドも提供する。かくして、本発明では、配列番号１の縮重ヌクレオチドを含むｐＧ６ｂポリペプチドをコードする核酸分子、およびそれらのＲＮＡ同等体が考えられる。
【０１４３】
表１は縮重ヌクレオチド位置を示すための１文字コードを記載する。「分解能」はコード文字によって示されるヌクレオチドである。「相補体」は、相補的ヌクレオチドについてのコードを示す。例えば、コードＹはＣまたはＴいずれかを示し、その相補体ＲはＡまたはＧを示し、ＡはＴに相補的であり、およびＧはＣに相補的である。
【０１４４】
【表１】
2009538830.tif 000003
与えられたアミノ酸についての全ての可能なコドンを含む縮重コドンを表２に記載する。
【０１４５】
【表２】
2009538830.tif 000004
当業者であれば、アミノ酸をコードする全ての可能なコドンの代表である縮重コドンを決定するにおいていくらか曖昧さが導入されるのを認識するであろう。例えば、セリン（ＷＳＮ）についての縮重コドンは、ある状況では、アルギニン（ＡＧＲ）をコードし、およびアルギニン（ＭＧＮ）についての縮重コドンは、ある状況においては、セリン（ＡＧＹ）をコードする。同様な関係がフェニルアラニンおよびロイシンをコードするコドンの間に存在する。かくして、縮重配列によって含まれるいくつかのポリヌクレオチドは変種アミノ酸配列をコードするかも知れないが、当業者であれば、配列番号２のアミノ酸配列に対する言及によってそのような変種配列を容易に同定することができる。変種配列は本明細書中に記載したように機能性について容易にテストすることができる。
【０１４６】
異なる種は「優先的なコドン用法」を呈することができる。一般に、Ｇｒａｎｔｈａｍら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８：１８９３（１９８０），Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：３１５（１９９６），Ｗａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎら、Ｇｅｎｅ  １３：３５５（１９８１），Ｇｒｏｓｊｅａｎ  ａｎｄ  Ｆｉｅｒｓ，Ｇｅｎｅ  １８：１９９（１９８２），Ｈｏｌｍ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：３０７５（１９８６），Ｉｋｅｍｕｒａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５８：５７３（１９８２），Ｓｈａｒｐ  ａｎｄ  Ｍａｔａｓｓｉ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．４：８５１（１９９４），Ｋａｎｅ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：４９４（１９９５），ａｎｄ  Ｍａｋｒｉｄｅｓ，Ｍｉｃｔｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６０：５１２（１９９６）参照。本明細書中で用いるとき、用語「選択的コドン使用頻度」または「選択的コドン」は、ある種の細胞で最も頻繁に使用される蛋白質翻訳コドンをいう技術用語であり、かくして、各アミノ酸をコードする可能なコドンの１または数個の代表に好都合である（表２参照）。例えば、アミノ酸スレオニン（Ｔｈｒ）はＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、またはＡＣＴによってコードすることができるが、哺乳動物細胞においては、ＡＣＣは最も普通に用いられるコドンであり；他の種、例えば、昆虫細胞、酵母、ウイルスまたは細菌においては、異なる。コドンは優先的であってよい。特定の種についての優先コドンは、当該分野で知られた種々の方法によって本発明のポリペプチドに導入することができる。優先コドン配列の組換えＤＮＡへの導入は、例えば、特定の細胞タイプまたは種内で蛋白質翻訳をより効率的とすることによって蛋白質の生産を増強することができる。したがって、本明細書中に開示された縮重コドン配列は、当該分野で通常に用いられ、かつ本明細書中に開示された種々の細胞型および種においてポリヌクレオチドの発現を最適化するための鋳型として働く。優先コドンを含有する配列をテストし、種々の種における発現について最適化することができ、本明細書中に開示された機能性についてテストすることができる。
【０１４７】
ｐＧ６ｂ−コーディングｃＤＮＡは完全なまたは部分的なヒトｃＤＮＡで、または開示された配列に基づく縮重プローブの１つ以上の組でプローブする等の種々の方法によって単離することができる。ｃＤＮＡは、本明細書中に開示された代表的なヒトｐＧ６ｂ配列から設計されたプライマーでのポリメラーゼ鎖反応を用いてクローン化することもできる。加えて、ｃＤＮＡライブラリーを用いて、宿主細胞を形質転換し、またはトランスフェクトすることができ、および注目するｃＤＮＡの発現はｐＧ６ｂポリペプチドに対する抗体で検出することができる。
【０１４８】
当業者であれば、配列番号１に開示された配列はヒトｐＧ６ｂの単一対立遺伝子を表し、対立遺伝子変位およびオルタナティブスプライシングが怒ると予測されることを認識するであろう。この配列の対立遺伝子変種は、標準的な処方に従って異なる個体からのｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをプローブすることによってクローン化することができる。サイレント突然変異を含有するもの、および突然変異の結果、アミノ酸配列が変化するものを含めた、本明細書中に開示されたヌクレオチド配列の対立遺伝子変種は、本明細書中に開示されたアミノ酸配列の対立遺伝子変種である蛋白質のように、本発明の範囲内のものである。ｐＧ６ｂポリペプチドの特性を保有する別にスプライスされたｍＲＮＡから生じたｃＤＮＡ分子は、そのようなｃＤＮＡおよびｍＲＮＡによってコードされたポリペプチドのように、本発明の範囲内に含まれる。これらの配列の対立遺伝子変種およびスプライス変種は、当該分野で知られた標準的な手法に従って異なる個体または組織からのｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをプローブすることによってクローン化することができる。
【０１４９】
先に議論した方法を用い、当業者であれば、配列番号２に実質的に相同である、または配列番号３または４のアミノ酸、またはその対立遺伝子変種をコードし、および野生型ｐＧ６ｂ受容体のカウンター受容体−結合特性を保有する可溶性ｐＧ６ｂ受容体を含む種々のポリペプチドを調製することができる。そのようなポリペプチドは、本明細書中において一般的に開示されたさらなるポリペプチドセグメントを含むこともできる。
【０１５０】
本発明の特定の実施形態内では、単離された核酸分子は、ストリンジェントな条件下で、本明細書中に開示されたヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズすることができる。例えば、そのような核酸分子は、ストリンジェントな条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸分子に、あるいは配列番号１に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子、あるいはその断片にハイブリダイズすることができる。
【０１５１】
一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにおける特定の配列についての熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低く選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする（規定されたイオン強度およびｐＨ下での）温度である。ハイブリダイゼーションに続き、核酸分子を洗浄して、ストリンジェントな条件下で、あるいは高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズしていない核酸分子を除去することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら、（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ（ｅｄｓ．），Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７）；およびＷｅｔｍｕｒ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：２２７（１９９０）参照。ＯＬＩＧＯ  ６．０（ＬＳＲ；Ｌｏｎｇ  Ｌａｋｅ，ＭＮ）およびＰｒｉｍｅｒ  Ｐｒｅｍｉｅｒ  ４．０  （Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｂｉｏｓｏｆｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）のような配列解析ソフトウエアならびにインターネットのサイトは、ユーザーが規定した基準に基づいて与えられた配列を解析し、Ｔｍを計算する利用可能なツールである。特定のポリヌクレオチドハイブリッドでの使用のためのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件に適合させるのは十分に当業者の能力内のものである。
【０１５２】
本発明は、配列番号２または３のポリペプチドに対する実質的に同様な配列同一性を有する単離されたｐＧ６ｂポリペプチド、またはそれらのオルソログも提供する。用語「実質的に同様な配列同一性」は、配列番号３に示された配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９６％、９７％、９８％、のような少なくとも９５％、または９５％を超える配列同一性を有するポリペプチド、またはそれらのオルソログを示すのに本明細書中で用いる。例えば、変種およびオルソロガスｐＧ６ｂ受容体を用いて、免疫応答を生じさせ、およびヒトｐＧ６ｂに対する交差−反応性抗体を生起させることができる。そのような抗体は本明細書中に開示されたようにヒト化し、および修飾することができ、および乾癬、乾癬性関節炎、ＩＢＤ、結腸炎、内毒素血症を治療するのに、ならびに本明細書中に記載された他の治療的適用において治療的に用いることができる。
【０１５３】
本発明では、２つの基準：コードされたポリペプチドと配列番号２のアミノ酸配列との間の同様性の決定、およびハイブリダイゼーションアッセイを用いて同定することができるｐＧ６ｂ変種核酸分子も考えられる。そのようなｐＧ６ｂ変種は（１）洗浄ストリンジェンシーが５５〜６５℃における０．１％ＳＤＳを含む０．５ｘ−２ｘＳＳＣと同等なストリンジェントな洗浄条件下で配列番号１のヌクレオチド配列（またはその相補体）を有する核酸分子にハイブリダイズしたままであり、および（２）配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９６％、９７％、９８％、または９９％のような９５％を超える配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含む。別法として、ｐＧ６ｂ変種は（１）洗浄ストリンジェンシーが５０℃〜６５℃において０．１％ＳＤＳを含む０．１×−０．２×ＳＳＣと同等である高度にストリンジェントな洗浄条件下で配列番号１の核酸配列（またはその相補体）を有する核酸分子とハイブリダイズしたままであり、および（２）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９６％、９７％、９８％、または９９％のような９５％以上のような９５％を超える配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子として特徴付けることができる。
【０１５４】
パーセント配列同一性は慣用的な方法によって決定される。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｂｕｌｌ．Ｍａｔｈ．Ｂｉｏ．４８：６０３（１９８６）、およびＨｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（１９９２）参照。簡単に述べれば、２つのアミノ酸配列は、表３に示すように、１０のギャップ開始ペナルティ、１のギャップ伸長ペナルティおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（ｉｂｉｄ．）の「ＢＬＯＳＵＭ６２」ソーティングマトリックスを用いて整列スコアを最適化するように整列させる（アミノ酸は標準１文字コードによって示される）。次いで、パーセント同一性は（［同一マッチの合計数］／［より長い配列の長さ＋２つの配列を整列させるためにより長い配列に導入されたギャップの数］）（１００）として計算される。
【０１５５】
【表３】
2009538830.tif 000005
当業者であれば、２つのアミノ酸配列を整列させるのに利用可能な多くの確立されたアルゴリズムがあることを認識する。ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの「ＦＡＳＴＡ」同様性サーチアルゴリズムは、本明細書中に開示されたアミノ酸配列および推定ｐＧ６ｂ変種のアミノ酸配列によって共有された同一性のレベルを調べるための好適な蛋白質整列方法である。ＦＡＳＴＡアルゴリズムはＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）によって、およびＰｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３（１９９０）によって記載されている。簡単に述べれば、ＦＡＳＴＡは、保存的アミノ酸置換、挿入、または欠失なくして、クエリー配列（例えば、配列番号２または配列番号３）および（ｋｔｕｐ変数が１であれば）同一性の最高密度または（もしｋｔｕｐ＝２であれば）同一性の対いずれかを有するテスト配列によって共有された領域を同定することによって最初に配列同様性を特徴付ける。次いで、アミノ酸置換マトリックスを用いて全ての対合したアミノ酸の同様性を比較することによって、同一性の最高密度を持つ１０の領域を記録し、領域の端部を「整えて」、最高のスコアに寄与する残基のみを含める。もし（配列の長さおよびｋｔｕｐ値に基づいて所定の式によって計算された）「カットオフ」値よりも大きなスコアを持ついくつかの領域があれば、整えた最初の領域を調べて、該領域を連結させて、ギャップを持つ近似的な整列を形成することができるか否かを決定する。最後に、２つのアミノ酸配列の最高スコアリング領域を、アミノ酸の挿入および欠失を可能とする、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ−Ｓｅｌｌｅｒｓアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４（１９７０）；Ｓｅｌｌｅｒｓ，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２６：７８７（１９７４））の修飾を用いて整列させる。ＦＡＳＴＡ解析についての例示的なパラメーターは：ｋｔｕｐ＝１、ギャップ開始ペナルティ＝１０、ギャップ伸長ペナルティ＝１、および置換マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２である。Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３（１９９０）の添付文書２に説明されているように、スコアリングマトリックスファイル（「ＳＭＡＲＴＲＩＸ」）を修飾することによって、これらのパラメーターをＦＡＳＴＡプログラムに導入することができる。
【０１５６】
ＦＡＳＴＡを用いて、上述で開示した比率を用いて核酸分子の配列同一性を決定することもできる。ヌクレオチド配列の比較では、ｋｔｕｐ値は、他のパラメーターを上述したように設定して、１〜１０、好ましくは３〜６の範囲、最も好ましくは３とすることができる。
【０１５７】
本発明は、本明細書中に開示されたアミノ酸配列と比較して、保存的アミノ酸変化を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含む。例えば、配列番号２の１つ以上のアミノ酸置換を含有する変種を得ることができ、そこでは、アルキルアミノ酸がｐＧ６ｂアミノ酸配列中のアルキルアミノ酸に代えて置換されており、芳香族アミノ酸がｐＧ６ｂアミノ酸配列中の芳香族アミノ酸に代えて置換されており、硫黄−含有アミノ酸がｐＧ６ｂアミノ酸配列中の硫黄−含有アミノ酸に代えて置換されており、ヒドロキシ−含有アミノ酸がｐＧ６ｂアミノ酸配列中のヒドロキシ−含有アミノ酸に代えて置換されており、酸性アミノ酸がｐＧ６ｂアミノ酸配列中のアミノ酸に代えて置換されており、塩基性アミノ酸がｐＧ６ｂアミノ酸配列中の塩基性アミノ酸に代えて置換されており、あるいは二塩基性モノカルボキシリックアミノ酸がｐＧ６ｂアミノ酸配列中の二塩基性モノカルボキシリックアミノ酸に代えて置換されている。共通のアミノ酸の中で、例えば、「保存的アミノ酸置換」は、以下の群の各々内でアミノ酸の間での置換によって示される：（１）グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、（２）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、（３）セリンおよびスレオニン、（４）アスパルテートおよびグルタメート、（５）グルタミンおよびアスパラギン酸、および（６）リシン、アルギニン、およびヒスチジン。ＢＬＯＳＵＭ６２表は、関連蛋白質の５００を超える群の高度に保存された領域を表す蛋白質配列セグメントの約２，０００局所複数整列に由来するアミノ酸置換マトリックスである（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（１９９２））。従って、ＢＬＯＳＵＭ６２置換頻度を用いて、本発明のアミノ酸配列に導入することができる保存的アミノ酸置換を規定することができる。（先に議論したように）化学的特性のみに基づいたアミノ酸置換を設計することが可能であるが、用語「保存的アミノ酸置換」とは、好ましくは、−１を超えるＢＬＯＳＵＭ６２値によって表される置換をいう。例えば、アミノ酸置換は、もし置換が０、１、２、または３のＢＬＯＳＵＭ６２値によって特徴付けられるならば保存的である。このシステムに従うと、好ましい保存的アミノ酸置換は少なくとも１（例えば、１，２または３）のＢＬＯＳＵＭ６２値によって特徴付けられ、他方、より好ましい保存的アミノ酸置換は少なくとも２（例えば、２または３）のＢＬＯＳＵＭ６２値によって特徴付けられる。ｐＢ６ｂの特定の変種は、対応するアミノ酸配列（例えば、胚列番号：３）に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９６％、９７％、９８％、または９９％以上のような９５％を超える配列同一性を有することによって特徴付けられ、ここに、アミノ酸配列における変動は１つ以上の保存的アミノ酸置換によるものである。
【０１５８】
ｐＧ６ｂ遺伝子の保存的アミノ酸変化は、例えば、配列番号１に引用されたヌクレオチドに代えてヌクレオチドを置換することによって導入することができる。そのような「保存的アミノ酸」変種は、オリゴヌクレオチド−特異的突然変異誘発、リンカー−スキャンニング突然変異誘発、ポリメラーゼ鎖反応を用いる突然変異誘発等によって得ることができる（Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）；ａｎｄ  ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（ｅｄ．），Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）参照）。変種ｐＧ６ｂポリペプチドは、抗−ｐＧ６ｂ抗体に特異的に結合する能力によって同定することができる。
【０１５９】
本発明の蛋白質は天然に生じないアミノ酸残基を含むこともできる。天然に生じないアミノ酸は、限定されるものではないが、トランス−３−メチルプロリン、２，４−メタノプロリン、シス−４−ヒドロキシプロリン、トランス−４−ヒドロキシプロリン、Ｎ−メチルグリシン、アロ−スレオニン、メチルスレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン三、知アゾリンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−および４−メチルプロリン、３，３−ジメチルプロリン、ｔｅｒｔ−ロイシン、ノルバリン、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン、および４−フルオロフェニルアラニンを含む。いくつかの方法が、天然に生じないアミノ酸残基を蛋白質に取り込むために当業者に知られている。例えば、インビトロ系を使用することができ、ここに、化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡを用いて抑制される。アミノ酸を合成し、ｔＲＮＡをアミノアシル化する方法は当該分野で知られている。ナンセンス突然変異を含むプラスミドの転写および翻訳は、典型的には、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｓ３０抽出物、および商業的に入手可能な酵素および他の試薬を含む無細胞系で行われる。蛋白質はクロマトフラフィーによって精製される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：２７２２（１９９１），Ｅｌｌｍａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０２：３０１（１９９１），Ｃｈｕｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：８０６（１９９３），およびＣｈｕｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１０１４５（１９９３）参照。
【０１６０】
第二の方法において、突然変異したｍＲＮＡおよび化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡのマイクロインジェクションによって、翻訳をアフリカツメガエル卵母細胞中で行う（Ｔｕｒｃａｔｔｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１９９９１（１９９６））。第三の方法内で、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞は、置き換えるべき天然アミノ酸（例えば、フェニルアラニン）の非存在下で、および所望の天然に生じないアミノ酸（例えば、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン、または４−フルオロフェニルアラニン）の存在下で培養する。天然に生じないアミノ酸は、その天然カウンターパートの代わりに蛋白質に取り込まれる。Ｋｏｉｄｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３：７４７０（１９９４）参照。天然に生じるアミノ酸残基は、インビトロ化学修飾によって天然に生じない種に変換することができる。化学的修飾を部位−特異的突然変異誘発と組み合わせて、置換の範囲をさらに拡大することができる（Ｗｙｎｎ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２：３９５（１９９３））。
【０１６１】
限定された数の非−保存的アミノ酸、遺伝子コードによってコードされないアミノ酸、天然に生じないアミノ酸、および異常なアミノ酸はｐＧ６ｂアミノ酸残基に代えて置換することができる。
【０１６２】
本発明のポリペプチド中の必須アミノ酸は、部位−特異的突然変異誘発またはアラニン−スキャンニング突然変異誘発のような当該分野で知られた手法に従って同定することができる（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１（１９８９），Ｂａｓｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：４４９８（１９９１），Ｃｏｏｍｂｓ  ａｎｄ  Ｃｏｒｅｙ，“Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，”ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ（ｅｄ．），ｐａｇｅｓ  ２５９−３１１（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９８））。後者の技術において、単一のアラニン突然変異を分子中の残基毎に導入し、得られた突然変異体分子を、生物学的活性についてテストして、分子の活性にとって臨界的であるアミノ酸残基を同定する。また、Ｈｉｌｔｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４６９９（１９９６）参照。
【０１６３】
配列解析を用いて、ｐＧ６ｂカウンター受容体結合領域をさらに規定することができるが、ｐＧ６ｂのそのカウンター受容体またはカウンター受容体への、または抗−ｐＧ６ｂ抗体への結合のような）ｐＧ６ｂ結合活性において役割を演じるアミノ酸は、推定接触部位アミノ酸の突然変異と組み合わせて、核磁気共鳴、結晶学、電子回折または光親和性標識のような技術によって測定して、構造の物理的解析によって決定することもできる。例えば、ｄｅ  Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６（１９９２），Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９（１９９２），およびＷｌｏｄａｖｅｒら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０９：５９（１９９２）参照。
【０１６４】
多数のアミノ酸置換は、Ｒｅｉｄｈａａｒ−ＯｌｓｏｎおよびＳａｕｅｒ  （Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：５３（１９８８））またはＢｏｗｉｅおよびＳａｕｅｒ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２１５２（１９８９））によって開示されたもののような、突然変異誘発およびスクリーニングの公知の方法を用いて作り出し、およびテストすることができる。簡単に述べれば、これらの著者は、ポリペプチド中の２つ以上の位置を同時にランダム化し、機能的ポリペプチドについて選択し、次いで、突然変異誘発したポリペプチドを配列決定して、各位置において許容される置換のスペクトルを決定する方法を開示する。用いることができる他の方法は、ファージディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：１０８３２，１９９１，Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，２２３，４０９号，Ｈｕｓｅ，国際公開番号  ＷＯ  ９２／０６２０４）、および領域−特異的突然変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅら、Ｇｅｎｅ  ４６：１４５，１９８６，ａｎｄ  Ｎｅｒら、ＤＮＡ  ７：１２７，１９８８）を含む。さらに、ビオチンまたはＦＩＴＣで標識されたｐＧ６ｂを、ｐＧ６ｂカウンター受容体の発現クローニングで用いることができる。
【０１６５】
開示されたｐＧ６ｂヌクレオチドおよびポリペプチド配列の変種は、Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９（１９９４），Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１０７４７，１９９４、および国際公開番号ＷＯ  ９７／２００７８によって開示されたＤＮＡシャッフリングを通じて生じさせることもできる。簡単に述べれば、変種ＤＮＡ分子が、親ＤＮＡのランダム断片化、続いての、ランダムに導入された点突然変異をもたらすＰＣＲを用いる再組立てによってインビトロ相同組換えによって生じさせる。この技術は、異なる種からの対立遺伝子変種またはＤＮＡ分子のような親ＤＮＡ分子のファミリーを用いることによって修飾して、さらなる多様性をプロセスに導入することができる。所望の活性についての選択またはスクリーニング、続いての、突然変異およびアッセイのさらなる反復は、同時に有害な変化に対して選択しつつ、望ましい突然変異について選択することによって配列の迅速な「進化」を提供する。
【０１６６】
本明細書中に開示された突然変異誘発方法を高−スループット自動スクリーニング方法と組合せて、宿主細胞におけるクローン化された突然変異誘発ポリペプチドの活性を検出することができる。生物学的に活性なポリペプチド、あるいは抗−ｐＧ６ｂ抗体に結合するポリペプチドをコードする突然変異誘発ＤＮＡ分子を宿主細胞から回収し、近代の機器を用いて迅速に配列決定することができる。これらの方法は注目するポリペプチド中のここのアミノ酸残基の重要性の迅速な決定を可能とし、未知の構造のポリペプチドに適用することができる。
【０１６７】
本発明は、ｐＧ６ｂポリペプチドの「機能的断片」、およびそのような機能的断片をコードする核酸分子も含む。核酸分子のルーチン的欠失解析を行って、ｐＧ６ｂポリペプチドをコードする核酸分子の機能的断片を得ることができる。説明として、配列番号１のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子をＢａｌ３１ヌクレアーゼで消化して、一連のネステッド欠失を得ることができる。次いで、断片を発現ベクターに適切なリーディングフレームにて挿入し、発現されたポリペプチドを単離し、抗−ｐＧ６ｂ抗体に結合する能力についてテストする。エンドヌクレアーゼ消化に対する１つの代替法は、オリゴヌクレオチド−特異的突然変異誘発を用いて、欠失または停止コドンを導入して、所望の断片の生産を特定することである。別法として、ｐＧ６ｂ遺伝子の特定の断片は、ポリメラーゼ鎖反応を用いて合成することができる。
【０１６８】
この一般的な手法はインターフェロンのいずれかまたは双方の末端における切形についての研究によって例示され、Ｈｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｄｉ  Ｍａｒｃｏ，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．６６：５０７（１９９５）によってまとめられている。さらに、蛋白質の機能的合成についての標準的技術は、例えば、Ｔｒｅｕｔｅｒら、Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４０：１１３，１９９３，Ｃｏｎｔｅｎｔら、“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ４２  ｋＤａ  ２−５Ａ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ，”ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ＩＳＩＲ−ＴＮＯ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｎ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｎｔｅｌｌ（ｅｄ．），ｐａｇｅｓ  ６５−７２（Ｎｉｊｈｏｆｆ  １９８７），Ｈｅｒｓｃｈｍａｎ，“Ｔｈｅ  ＥＧＦ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，”  ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１，Ｂｏｙｎｔｏｎら、（ｅｄｓ．）  ｐａｇｅｓ  １６９−１９９（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５），Ｃｏｕｍａｉｌｌｅａｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２９２７０，１９９５；Ｆｕｋｕｎａｇａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２５２９１，１９９５；Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５０：１２９５，１９９５，およびＭｅｉｓｅｌら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．３０：１，１９９６によって記載されている。
【０１６９】
本発明では、本明細書中に開示されたアミノ酸配列と比較して、アミノ酸変化を有するｐＧ６ｂ遺伝子の機能的断片も考えられる。変種ｐＧ６ｂ遺伝子は、先に議論したように、開示されたヌクレオチドおよびアミノ酸配列との同一性のレベルを決定することによって構造に基づいて同定することができる。構造に基づいて変種遺伝子を同定する別の手法は、潜在的変種ｐＧ６ｂ遺伝子をコードする核酸分子が、配列番号１のようなヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズできるか否かを決定することである。
【０１７０】
本発明は、ｐＧ６ｂポリペプチドの機能的断片、抗原性エピトープ、ｐＧ６ｂポリペプチドのエピトープ担持部分、およびそのような機能的断片、抗原性エピトープｐＧ６ｂポリペプチドのエピトープ−担持部分をコードする核酸分子の使用も含む。そのような断片を用いて、Ｂ７受容体の活性に作動させ、それに結合し、それをブロックし、阻害し、増加させ、低下させ、または中和する抗体および結合パートナーを作るのに用いられるポリペプチドを作り出す。本明細書中で定義された「機能的」ｐＧ６ｂポリペプチドまたはその断片は、炎症、増殖または分化活性をブロックし、阻害し、低下し、拮抗しまたは中和するその能力によって、特殊化された細胞機能を誘導し、または阻害するその能力によって、または抗−ｐＧ６ｂ抗体、細胞、またはＢ７カウンター受容体に特異的に結合するその能力によって特徴付けられる。本明細書中において先に記載したように、ｐＧ６ｂは、本明細書中に記載されたその受容体構造およびドメインによってＢ７ファミリーメンバーとして特徴付けられる。かくして、本発明では、さらに：（ａ）上述した１つ以上のドメインを含むポリペプチド分子；および（ｂ）これらのドメインの１つ以上を含む機能的断片を含む融合蛋白質の使用が考えられる。融合蛋白質の他のポリペプチド部分は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、ＰＤ−１またはＢＴＬＡのようなもう１つのＣＤ２８ファミリー受容体によって、または融合蛋白質の分泌を容易とする無関係な分泌シグナルペプチドによって寄与され得る。
【０１７１】
また、本発明は、本明細書中に記載されたｐＧ６ｂポリペプチドのエピトープ−担持部分を含むポリペプチド断片またはペプチドも提供する。そのような断片またはペプチドは、完全な蛋白質が免疫原として用いられた場合に抗体反応を誘導する蛋白質の部分である「免疫原性エピトープ」を含むことができる。免疫原性エピトープ−担持ペプチドは、標準的な方法を用いて同定することができる（例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３９９８，１９８３）。
【０１７２】
対照的に、ポリペプチド断片またはペプチドは、抗体が特異的に結合することができる蛋白質の分子の領域である「抗原性エピトープ」を含むことができる。ある種のエピトープはアミノ酸の線状または連続的ストレッチよりなり、そのようなエピトープの抗原性は変性剤によって破壊されない。蛋白質のエピトープを模倣することができる比較的短い合成ペプチドを用いて、蛋白質に対する抗体の生産を刺激することができるのは当該分野で知られている（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１９：６６０，１９８３）。従って、本発明の抗原性エピトープ−担持ペプチド、抗原性ペプチド、エピトープ、およびポリペプチドは、本明細書中に記載されたポリペプチドと結合する抗体を生起させるのに、ならびに中和性である、およびそのカウンター受容体の活性に作動し、結合し、ブロックし、阻害し、低下させ、拮抗し、または中和することができる抗−ｐＧ６ｂモノクローナル抗体を同定し、スクリーニングするのに有用である。本発明のそのような中和モノクローナル抗体はｐＧ６ｂ抗原エピトープに結合することができる。Ｈｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ親水性プロフィールを用いて、配列番号３内の最も抗原能力を有する領域を決定することができる（Ｈｏｐｐら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：３８２４−３８２８，１９８１；Ｈｏｐｐ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．８８：１−１８，１９８６およびＴｒｉｑｕｉｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１：１５３−１６９，１９９８）。プロフィールは、スライドする６−残基ウィンドウに基づく。埋もれたＧ、Ｓ、およびＴ残基および露出されたＨ、Ｙ、およびＷ残基は無視した。ｐＧ６ｂにおいては、これらの領域は当業者によって決定され得る。さらに、例えば、ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｐｒｏｔｅａｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いてＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆプロットによって予測される配列番号２内のｐＧ６ｂ抗原エピトープは好ましい抗原エピトープとして働き、当業者によって決定され得る。そのような抗原エピトープは、（１）配列番号２のアミノ酸残基２１〜３１；（２）配列番号２のアミノ酸残基５５〜６１；（３）配列番号２のアミノ酸残基１１０〜１１６；（４）配列番号２のアミノ酸残基１８４〜２０６；および（５）配列番号２のアミノ酸残基１９１〜１９７を含む。好ましい実施形態において、本発明の中和抗体が結合する抗原エピトープは、カウンター受容体結合で重要である配列番号２の残基（および配列番号３の対応する残基）を含有するであろう。
【０１７３】
抗原エピトープ−担持ペプチドおよびポリペプチドは、少なくとも４〜１０のアミノ酸、少なくとも１０〜１５のアミノ酸、または約１５〜約３０アミノ酸の本明細書中に開示されたアミノ酸配列を含有することができる。そのようなエピトープ−担持ペプチドおよびポリペプチドは、本明細書中に記載されたように、ｐＧ６ｂポリペプチドを断片化することによって、または化学ペプチド合成によって生産することができる。さらに、エピトープはランダムペプチドライブラリーのファージディスプレイによって選択することができる（例えば、Ｌａｎｅ  ａｎｄ  Ｓｔｅｐｈｅｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２６８，１９９３；およびＣｏｒｔｅｓｅら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７：６１６，１９９６参照）。エピトープを同定し、エピトープを含む小さなペプチドから抗体を生産する標準的な方法は、例えば、Ｍｏｌｅ，“Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ”ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１０，Ｍａｎｓｏｎ  （ｅｄ．），ｐａｇｅｓ  １０５−１１６（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９２），Ｐｒｉｃｅ，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｒｉｔｔｅｒ  ａｎｄ  Ｌａｄｙｍａｎ（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  ６０−８４（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５），およびＣｏｌｉｇａｎら（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｐａｇｅｓ  ９．３．１−９．３．５  ａｎｄ  ｐａｇｅｓ  ９．４．１−９．４．１１（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９７）によって記載されている。
【０１７４】
変種および融合蛋白質を含めたいずれのｐＧ６ｂポリペプチドについても、当業者であれば、上述の表１および２に記載された情報を用いてその変種をコードする十分に縮重したポリヌクレオチド配列を容易に作り出すことができる。さらに、当業者であれば、本明細書中に記載されたヌクレオチドおよびアミノ酸配列に基づいてｐＧ６ｂ変種を工夫するための標準的なソフトウェアを用いることができる。
【０１７５】
５．ｐＧ６ｂポリペプチドの生産
全長ポリペプチド；安定なモノマー、ホモダイマー、ヘテロダイマーおよびマルチマー受容体；全長受容体；受容体断片（例えば、カウンター受容体−結合断片および抗原エピトープ）；機能性断片；および融合蛋白質を含めた本発明のポリペプチドは、慣用的な技術に従って組換え宿主細胞において生産することができる。ｐＧ６ｂ遺伝子を発現させるためには、ポリペプチドをコードする核酸分子は、発現ベクターにおける転写発現を制御する調節配列に操作可能に連結されていなければならず、次いで、宿主細胞に導入されなければならない。プロモーターおよびエンハンサーのような転写調節配列に加えて、発現ベクターは、翻訳調節配列、および発現ベクターを運ぶ細胞の選択に適したマーカー遺伝子を含むことができる。
【０１７６】
真核生物細胞における外来性蛋白質の生産に適した発現ベクターは、典型的には、（１）細菌複製起点をコードする原核生物ＤＮＡエレメント、および細菌宿主における発現ベクターの成長および選択を供するための抗生物質耐性マーカー；（２）プロモーターのような転写の開始を制御する真核生物ＤＮＡエレメント；および（３）転写終止／ポリアデニル化配列のような転写体のプロセッシングを制御するＤＮＡエレメントを含有する。先に議論したように、発現ベクターは、宿主細胞の分泌経路へ異種ポリペプチドを向ける分泌配列をコードするヌクレオチド配列を含むこともできる。例えば、ｐＧ６ｂ発現ベクターはｐＧ６ｂ遺伝子、およびいずれかの分泌された遺伝子に由来する分泌配列を含むことができる。
【０１７７】
本発明のｐＧ６ｂ蛋白質は哺乳動物細胞において発現させることができる。好適な哺乳動物宿主細胞の例はアフリカミドリザル腎臓細胞（Ｖｅｒｏ；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５８７）、ヒト胚腎臓細胞（２９３−ＨＥＫ；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５７３）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ−２１，ＢＨＫ−５７０；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ８５４４，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０３１４）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１；ＣＨＯ  ＤＧ４４（Ｃｈａｓｉｎら、Ｓｏｍ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１２：５５５，１９８６））、ラット下垂体細胞（ＧＨ１；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８２）、ＨｅＬａ  Ｓ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２．２）、ラット肝臓腫細胞（Ｈ−４−ＩＩ−Ｅ；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５４８）、ＳＶ４０−形質転換サル腎臓細胞（ＣＯＳ−１；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）およびネズミ胚細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５８）を含む。
【０１７８】
哺乳動物宿主については、転写および翻訳調節シグナルは哺乳動物ウイルス源、例えば、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、シミアンウイルスなどに由来してよく、ここに、調節シグナルは、高レベルの発現を有する特定の遺伝子に関連する。好適な転写および翻訳調節配列は哺乳動物遺伝子、例えば、アクチン、コラーゲン、ミオシン、およびメタロチオネイン遺伝子からも由来することができる。
【０１７９】
転写調節配列は、ＲＮＡ合成の開始を指令するのに十分なプロモーター領域を含む。好適な真核生物プロモーターはマウスメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター（Ｈａｍｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：２７３，１９８２）、ヘルペスウイルスのＰＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｃｅｌｌ  ３１：３５５，１９８２）、ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４，１９８１）、ラウス肉腫ウイルスプロモーター（Ｇｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：６７７７，１９８２）、サイトメガロウイルスプロモーター（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ  ４５：１０１，１９８０）、およびマウス乳頭腫瘍ウイルスプロモーター（一般に、Ｅｔｃｈｅｖｅｒｒｙ，“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，”ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｃｌｅｌａｎｄら（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  １６３−１８１（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９６）参照）を含む。
【０１８０】
別法として、バクテリオファージＴ３  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのような原核生物プロモーターを用いて、もし原核生物プロモーターが真核生物プロモーターによって調節されるならば、哺乳動物細胞においてｐＧ６ｂ遺伝子発現を制御することができる（Ｚｈｏｕら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：４５２９，１９９０；ａｎｄ  Ｋａｕｆｍａｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４４８５，１９９１）。
【０１８１】
特定の実施形態において、ｐＧ６ｂ可溶性受容体ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、またはｐＧ６ｂポリペプチドの断片は、一般に、発現ベクター内の、転写プロモーターおよびターミネーターを含めたその発現に必要な他の遺伝子エレメントに操作可能に連結している。ベクターは１つ以上の選択マーカーおよび１つ以上の複製起点を通常も含有するが、当業者であれば、ある系内では、選択マーカーは別のベクターにて供することができ、および外来性ＤＮＡの複製は宿主細胞ゲノムへの組み込みによって供することができるのを認識するであろう。プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベクターおよび他のエレメントの選択は、当業者のレベル内のルーチン的設計事項である。多くのそのようなエレメントは文献に記載されており、商業的供給業者を通じて入手可能である。可溶性受容体複合体の多数の成分は、個々の発現ベクターに共−トランスペクトすることができ、あるいは単一発現ベクターに含ませることができる。蛋白質複合体の多数の成分を発現させるそのような技術は当該分野で周知である。
【０１８２】
発現ベクターは、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポソーム−媒介トランスフェクション、マクロプロジェクタイル−媒介送達エレクトロポレーションなどを含めた種々の標準的技術を用いて宿主細胞に導入することができる。トランスフェクトされた細胞を選択し、増殖させて、宿主細胞ゲノムに安定に組み込まれた発現ベクターを含む組換え宿主細胞を供することができる。ベクターを真核生物細胞に導入するための技術、および優性選択マーカーを用いてそのような安定な形質転換体を選択するための技術は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）によって、およびＭｕｒｒａｙ（ｅｄ．），Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）によって記載されている。
【０１８３】
例えば、１つの好適な選択マーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する耐性を供する遺伝子である。この場合、選択は、Ｇ−４１８などのようなネオマイシン−タイプの薬物の存在下で行う。選択系を用いて、注目する遺伝子の発現レベルを増加させることもでき、これは、「増幅」と言われるプロセスである。増幅は、低レベルの選択剤の存在下でトランスフェクタントを培養し、次いで、選択剤の量を増加させて、導入された遺伝子の高レベルの産物を生産する細胞について選択することによって行う。好適な増幅可能な選択マーカーは、メトトレキサートに対する耐性を付与するジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）である。他の薬物耐性遺伝子（例えば、ヒブロマイシン耐性、多薬物耐性、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）を用いることもできる。別法として、緑色蛍光蛋白質、またはＣＤ４、ＣＤ８、クラスＩ  ＭＩＣ、胎盤アルカリ性ホスファターゼのような細胞表面蛋白質のような改変された表現型を導入するマーカーを用いて、ＦＡＣＳソーティング、または磁性ビーズ分離技術のような手段によってトランスフェクトされた細胞をトランスフェクトされていない細胞から分類することができる。
【０１８４】
ｐＧ６ｂポリペプチドは、ウイルス送達系を用いて培養された哺乳動物細胞によって生産することができる。この目的での例示的なウイルスはアデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、およびアデノ−関連ウイルス（ＡＡＶ）を含む。二本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノウイルスは、現在、異種核酸の送達のための最も研究された遺伝子導入ベクターである（レビューについては、Ｂｅｃｋｅｒら、Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４３：１６１，１９９４；およびＤｏｕｇｌａｓ  ａｎｄ  Ｃｕｒｉｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４：４４，１９９７参照）。アデノウイルス系の利点は、比較的大きなＤＮＡインサートの収容、高い力価まで成長する能力、広い範囲の哺乳動物細胞型を感染させる能力、および異なるプロモーターを含有する非常に多数の入手可能なベクターでの使用を可能とする柔軟性を含む。
【０１８５】
アデノウイルスゲノムの部分を形質転換することによって、異種ＤＮＡのより大きなインサート（７ｋｂまで）を収容することができる。これらのインサートは直接的連結によって、あるいは共―トランスフェクトされたプラスミドでの相同組換えによってウイルスＤＮＡに取り込むことができる。選択肢としては、ウイルスベクターから必須のＥ１遺伝子を欠失させることであり、これは、Ｅ１遺伝子が宿主細胞によって供されるのでなければ、複製する無能力をもたらす。アデノウイルスベクター−感染ヒト２９３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５７３，４４５０４，４５５０５）は、例えば、比較的高い細胞密度にて、接着性細胞として、または懸濁培養において成長させて、かなりの量の蛋白質を生産することができる（Ｇａｒｎｉｅｒら、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：１４５，１９９４参照）。
【０１８６】
ｐＧ６ｂは鳥類、真菌、昆虫、酵母、または植物細胞のような他の高等真核生物細胞において発現させることができる。バキュロウイルス系は、クローン化されたｐＧ６ｂ遺伝子を昆虫細胞に導入するための有効な手段を提供する。そのような発現ベクターはＡｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ多重核多角体ウイルス（ＡｃＭＮＰＹ）に基づくものであり、ショウジョウバエ熱ショック蛋白質（ｈｓｐ）７０プロモーター、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ多重核多角体ウイルス即時型遺伝子プロモーター（ｉｅ−１）および遅延初期３９Ｋプロモーター、バキュロウイルスｐ１０プロモーター、およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎプロモーターを含有する。組換えバキュロウイルスを作製する第二の方法は、Ｌｕｃｋｏｗ（Ｌｕｃｋｏｗら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４５６６，１９９３）によって記載されたトランスポゾン−ベースの系を利用する。導入ベクターを利用するこの系はＢＡＣ−ｔｏ−ＢＡＣキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）にて販売されている。この系は、Ｔｎ７トランスポゾンを含有する導入ベクターＰＦＡＳＴＢＡＣ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を利用して、ｐＧ６ｂポリペプチドをコードするＤＮＡを、「バクミド」と呼ばれる大きなプラスミドとしてＥ．ｃｏｌｉにおいて維持されたバキュロウイルスゲノムに移動させる。Ｈｉｌｌ−Ｐｅｒｋｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｏｓｓｅｅ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：９７１，１９９０；Ｂｏｎｎｉｎｇら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１５５１，１９９４；およびＣｈａｚｅｎｂａｌｋ  ａｎｄ  Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１５４３，１９９５参照。加えて、導入ベクターは、発現されたｐＧ６ｂポリペプチドのＣ−またはＮ−末端におけるエピトープ標識、例えば、Ｇｌｕ−Ｇｌｕエピトープ標識（Ｇｒｕｓｓｅｎｍｅｙｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：７９５２，１９８５）をコードするＤＮＡとのイン−フレーム融合を含むことができる。当該分野で技術を用い、ｐＧ６ｂ遺伝子を含有する導入ベクターをＥ．ｃｏｌｉに形質転換し、組換えバキュロウイルスを示す中断されたｌａｃＺ遺伝子を含有するバクミドについてスクリーニングする。次いで、通常の技術を用い、組換えバキュロウイルスゲノムを含有するバクミドＤＮＡを単離する。
【０１８７】
例示的ＰＦＡＳＴＢＡＣベクターをかなりの程度まで修飾することができる。例えば、ポリヘドリンプロモーターを除去し、バキュロウイルス感染の初期に発現され、分泌蛋白質を発現するのに有利であることが知られている（Ｐｃｏｒ、ｐ６．９またはＭＰプロモーターとしても知られた）バキュロウイルス塩基性蛋白質プロモーターで置き換えることができる（例えば、Ｈｉｌｌ−Ｐｅｒｋｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｏｓｓｅｅ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：９７１，１９９０；Ｂｏｎｎｉｎｇら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１５５１，１９９４；およびＣｈａｚｅｎｂａｌｋ  ａｎｄ  Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１５４３，１９９５参照）。そのような導入ベクター構築体においては、塩基性蛋白質プロモーターの短いまたは長いバージョンを用いることができる。さらに、天然ｐＧ６ｂ分泌シグナル配列を昆虫蛋白質に由来する分泌シグナル配列で置き換える導入ベクターを構築することができる。例えば、エクジステロイドグリコシルトランスフェラーゼ（ＥＧＴ）、ミツバチメリチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、またはバキュロウイルスｐｇ６７（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ：Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からの分泌シグナル配列を構築体で用いて、天然ｐＧ６ｂ分泌シグナル配列を置き換えることができる。
【０１８８】
組換えウイルスまたはバクミドを用いて宿主細胞をトランスフェクトする。好適な昆虫宿主細胞はＩＰＬＢ−Ｓｆ−２１、Ｓｆ９（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７１１）、Ｓｆ２１ＡＥ、およびＳｆ２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のようなＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａサナギ卵巣細胞系、ならびにＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ−２細胞、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉｓ  ｎｉに由来するＨＩＧＨ  ＦＩＶＥＯ細胞系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（米国特許第５，３００，４３５号）を含む。商業的に入手可能な無血清培地を用いて細胞を成長さえ、維持することができる。好適な培地はＳｆ９細胞のためのＳｆ９００  ＩＩＴＭ  （Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＥＳＦ  ９２１ＴＭ  （Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；およびＴ．ｎｉ細胞のためのＥｘｃｅｌｌＯ４０５ＴＭ  （ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ）またはＥｘｐｒｅｓｓ  ＦｉｖｅＯＴＭ  （Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。組換えウイルスを用いる場合、細胞は、典型的には、ほぼ２〜５ｘ１０５細胞の接種密度から、１〜２ｘ１０６細胞の密度まで成長させ、その時点で、組換えウイルスストックを０．１〜１０、より典型的には３近くの感染多重度（ＭＯＩ）で加える。
【０１８９】
バキュロウイルス系において組換え蛋白質を生産するための確立された技術はＢａｉｌｅｙら、“Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，”  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ７：Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｕｒｒａｙ（ｅｄ．），ｐａｇｅｓ  １４７−１６８（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９１）によって、Ｐａｔｅｌら、“Ｔｈｅ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ，”  ｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｌｏｖｅｒら（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  ２０５−２４４（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）によって、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）  ａｔ  ｐａｇｅｓ  １６−３７  ｔｏ  １６−５７によって、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ（ｅｄ．），Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）によって、およびＬｕｃｋｎｏｗ，“Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｃｌｅｌａｎｄら（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  １８３−２１８（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９６）によって供される。
【０１９０】
酵母細胞を含めた真菌細胞を用いて、本明細書中に記載された遺伝子を発現させることもできる。この点に関して特に注目する酵母種はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、およびＰｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａを含む。酵母における発現のための好適なプロモーターはＧＡＬ１（ガラクトース）、ＰＧＫ（ホスホグリセレートキナーゼ）、ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）、ＡＯＸ１（アルコールオキシダーゼ）、ＨＩＳ４（ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ）などからのプロモーターを含む。多くの酵母クローニングベクターが設計されており、容易に入手可能である。これらのベクターはＹＩｐ５のようなＹＩｐ−ベースのベクター、ＹＲｐ１７のようなＹＲｐベクター、ＹＥｐ１３のようなＹＥｐベクターおよびＹＣｐ１９のようなＹＣｐベクターを含む。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を外来性ＤＮＡで形質転換し、それから組換えポリペプチドを生産する方法は、例えば、Ｋａｗａｓａｋｉ，米国特許第４，５９９，３１１号，Ｋａｗａｓａｋｉら、米国特許第４，９３１，３７３号，Ｂｒａｋｅ，米国特許第４，８７０，００８号，Ｗｅｌｃｈら、米国特許第５，０３７，７４３号およびＭｕｒｒａｙら、米国特許第４，８４５，０７５号によって開示されている。形質転換された細胞は、選択マーカー、通常は薬物耐性、または特定の栄養素（例えば、ロイシン）の非存在下で成長する能力によって決定された表現型によって選択される。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで用いる好適なベクター系は、グルコース−含有培地中での成長によって形質転換細胞が選択されるのを可能とする、Ｋａｗａｓａｋｉら（米国特許第４，９３１，３７３号）によって開示されたＰＯＴ１ベクター系である。酵母で用いるさらなる好適なプロモーターおよびターミネーターは、解糖酵素遺伝子（例えば、Ｋａｗａｓａｋｉ，米国特許第４，５９９，３１１号，Ｋｉｎｇｓｍａｎら、米国特許第４，６１５，９７４号，およびＢｉｔｔｅｒ，米国特許第４，９７７，０９２号参照）、およびアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子からのものを含む。また、米国特許第４，９９０，４４６号、第５，０６３，１５４号、第５，１３９，９３６号、および第４，６６１，４５４号参照。
【０１９１】
Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉおよびＣａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａを含めた他の酵母のための形質転換系は当該分野で知られている。例えば、Ｇｌｅｅｓｏｎら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９（１９８６）、およびＣｒｅｇｇ，米国特許第４，８８２，２７９号参照。Ａｓｐｅｒｇｌｌｕｓ細胞は、ＭｃＫｎｉｇｈｔら、米国特許第４，９３５，３４９号の方法に従って利用することができる。Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍを形質転換する方法はＳｕｍｉｎｏら、米国特許第５，１６２，２２８号によって開示されている。Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａを形質転換する方法はＬａｍｂｏｗｉｔｚ，米国特許第４，４８６，５３３号によって開示されている。
【０１９２】
例えば、組換え蛋白質の生産のための宿主としてのＰｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａの使用は、Ｒａｙｍｏｎｄ，米国特許第５，７１６，８０８号，Ｒａｙｍｏｎｄ，米国特許第５，７３６，３８３号，Ｒａｙｍｏｎｄら、Ｙｅａｓｔ  １４：１１−２３（１９９８）によって、および国際公開番号ＷＯ  ９７／１７４５０、ＷＯ  ９７／１７４５１、ＷＯ  ９８／０２５３６、およびＷＯ  ９８／０２５６５において開示されている。Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａを形質転換するのに用いるＤＮＡ分子は、通常、好ましくは形質転換に先立って線状化される二本鎖環状プラスミドとして調製される。Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａにおけるポリペプチド生産のためには、プラスミド中のプロモーターおよびターミネーターはＰ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａアルコール資化遺伝子（ＡＵＧ１またはＡＵＧ２）のようなＰ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ遺伝子のそれとすることができる。他の有用なプロモーターはジヒドロキシアセトンシンターゼ（ＤＨＡＳ）、ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＭＤ）、およびカタラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子のそれを含む。宿主染色体へのＤＮＡの組み込みを容易とするためには、宿主ＤＮＡ配列によって双方の端部において近接挟まれたプラスミドの完全な発現セグメントを有するのが好ましい。Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａで用いられる好適な選択マーカーはＰ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ  ＡＤＥ２遺伝子であり、これはホスホリボシル−５−アミノイミダゾールカルボキシラーゼ（ＡＩＲＣ；ＥＣ  ４．１．１．２１）をコードし、およびａｄｅ２宿主細胞がアデニンの非存在下で成長するのを可能とする。メタノールの利用を最小化するのが望ましい大規模な工業的プロセスでは、双方のメタノール資化遺伝子（ＡＵＧ１およびＡＵＧ２）が欠失された宿主細胞を用いることができる。分泌された蛋白質の生産では、宿主細胞は空胞プロテアーゼ遺伝子（ＰＥＰ４およびＰＲＢ１）が欠乏し得る。エレクトロポレーションを用いて、注目するポリペプチドをコードするＤＮＡを含有するプラスミドのＰ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ細胞への導入を容易とする。Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ細胞は、２．５〜４．５ｋＶ／ｃｍ、好ましくは約３．７５ｋＶ／ｃｍの場強度、および１〜４０ミリ秒、最も好ましくは約２０ミリ秒の時定数（ｔ）を有する指数関数的に減衰するパルス電場を用いるエレクトロポレーションによって形質転換することができる。
【０１９３】
発現ベクターは植物プロトプラスト、無傷植物組織、または単離された植物細胞に導入することもできる。発現ベクターを植物組織に導入するための方法は、植物組織のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓでの直接的感染または共−培養、マイクロプロジェクタイル−媒介送達、ＤＮＡ感染、エレクトロポレーションなどを含む。例えば、Ｈｏｒｓｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７：１２２９，１９８５；Ｋｌｅｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：２６８，１９９２；ａｎｄ  Ｍｉｋｉら、“Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｆｏｒｅｉｎｇ  ＤＮＡ  ｉｎｔｏ  Ｐｌａｎｔｓ，”ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｌｉｃｋら（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  ６７−８８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３）参照。
【０１９４】
別法として、ｐＧ６ｂ遺伝子は原核生物宿主細胞において発現させることができる。原核生物宿主細胞においてｐＧ６ｂポリペプチドを発現するのに用いることができる好適なプロモーターは当業者によく知られており、Ｔ４、Ｔ３、Ｓｐ６およびＴ７ポリメラーゼを認識することができるプロモーター、バクテリオファージラムダのＰＲおよびＰＬプロモーター、ｔｒｐ、ｒｅｃＡ、熱ショック、ｌａｃＵＶ５、ｔａｃ、ｌｐｐ−ｌａｃＳｐｒ、ｐｈｏＡ、およびＥ．ｃｏｌｉのｌａｃＺプロモーター、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのプロモーター、Ｂａｃｉｌｌｕｓのバクテリオファージのプロモーター、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプロモーター、バクテリオファージラムダのｉｍｔプロモーター、ｐｂｒ３２２のｂｌａプロモーター、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモーターを含む。原核生物プロモーターはＧｌｉｃｋ，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：２７７（１９８７），Ｗａｔｓｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，４ｔｈ  Ｅｄ．（Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｃｕｍｍｉｎｓ  １９８７）によって、およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９５）によってレビューされている。
【０１９５】
好適な原核生物宿主はＥ．ｃｏｌｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｕｓを含む。Ｅ．ｃｏｌｉの好適な株はＢＬ２１（ＤＥ３），ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ，ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ，ＤＨ１，ＤＨ４Ｉ，ＤＨ５，ＤＨ５Ｉ，ＤＨ５ＩＭＣＲ，ＤＨ１０Ｂ，ＤＨ１０Ｂ／ｐ３，ＤＨ１１Ｓ，Ｃ６００，ＨＢ１０１，ＪＭ１０１，ＪＭ１０５，ＪＭ１０９，ＪＭ１１０，Ｋ３８，ＲＲ１，Ｙ１０８８，Ｙ１０８９，ＣＳＨ１８，ＥＲ１４５１，およびＥＲ１６４７（例えば、Ｂｒｏｗｎ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｆａｘ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）参照）を含む。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｕｓの好適な株はＢＲ１５１，ＹＢ８８６，ＭＩ１１９，ＭＩ１２０，およびＢ１７０（例えば、Ｈａｒｄｙ，“Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，”ｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｇｌｏｖｅｒ  （ｅｄ．）（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）参照）を含む。
【０１９６】
ｐＧ６ｂポリペプチドをＥ．ｃｏｌｉのような細菌において発現する場合、ポリペプチドは、典型的には、不溶性顆粒として細胞質に保持することができ、あるいは細菌分泌配列によってペリプラズム空間に向けることができる。前者の場合において、細胞は溶解され、顆粒は回収され、例えば、グアニジンイソチオシアネートまたは尿素を用いて変性する。次いで、変性されたポリペプチドを再度折畳み、尿素の溶液、および還元および酸化グルタチオンの組合せに対する透析、続いて、緩衝化生理食塩水に対する透析のような変性剤を希釈することによってダイマー化することができる。後者の場合、ポリペプチドは、（例えば、音波処理または浸透圧ショックによって）細胞を破壊して、ペリプラズム空間の内容物を放出し、蛋白質を回収し、それにより、変性および再折畳みに対する必要性を軽減することによって可溶性および機能性形態でペリプラズム空間から回収することができる。
【０１９７】
原核生物宿主において蛋白質を発現する方法は当業者に周知である（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ，“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｕｓｉｎｇ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”ｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｌｏｖｅｒら（ｅｄｓ．），ｐａｇｅ  １５（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５），Ｗａｒｄら、“Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅ  １３７（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５），ａｎｄ  Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，”ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｃｌｅｌａｎｄら（ｅｄｓ．），ｐａｇｅ  １０１（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９６）参照）。
【０１９８】
発現ベクターを細菌、酵母、昆虫および植物細胞に導入するための標準的方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）によって供される。
【０１９９】
哺乳動物細胞系によって生産された外来性蛋白質を発現し、および回収する一般的方法は、例えば、Ｅｔｃｈｅｖｅｒｒｙ，“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，”ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｃｌｅｌａｎｄら（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  １６３（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９６）によって供される。細菌系によって生産される蛋白質を回収するための標準的技術は、例えば、Ｇｒｉｓｓｈａｍｍｅｒら、“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｖｅｒ−ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃｅｌｌｓ，”ｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｌｏｖｅｒら（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  ５９−９２（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）によって供される。バキュロウイルス系から組換え蛋白質を単離するための確立された方法は、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ（ｅｄ．），Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）によって記載されている。
【０２００】
代替法として、本発明のポリペプチドは排除固相合成、部分的固相方法、断片凝縮または古典的な溶液合成によって合成することができる。これらの合成方法は、当業者に周知である（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９（１９６３），Ｓｔｅｗａｒｔら、“Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．１９８４），Ｂａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｒａｐｐ，Ｃｈｅｍ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．３：３（１９８６），Ａｔｈｅｒｔｏｎら、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９），Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｌｏｗｉｃｋ，“Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  ２８９（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７），ａｎｄ  Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９７）参照）。「天然化学連結」および「発現された蛋白質の連結」のような全化学的合成戦略の変形も標準的である（例えば、Ｄａｗｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７７６，１９９４；Ｈａｃｋｅｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：７８４５，１９９７；Ｄａｗｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２８７：３４，１９９７；Ｍｕｉｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：６７０５，１９９８；ａｎｄ  Ｓｅｖｅｒｉｎｏｖ  ａｎｄ  Ｍｕｉｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１６２０５，１９９８参照）。
【０２０１】
本発明のペプチドおよびポリペプチドは、配列番号２の少なくとも６つ、少なくとも９つ、または少なくとも１５連続アミノ酸残基を含む。例として、ポリペプチドは配列番号２の少なくとも６つ、少なくとも９つ、または少なくとも１５の連続アミノ酸残基を含むことができる。本発明の特定の実施形態内では、ポリペプチドはこれらのアミノ酸配列の２０、３０、４０、５０、１００以上の連続残基を含む。そのようなペプチドおよびポリペプチドをコードする核酸分子は、ポリメラーゼ鎖反応プライマーおよびプローブとして有用である。
【０２０２】
さらに、ｐＧ６ｂポリペプチドおよびその断片は、高等真核生物細胞内でモノマー、ホモダイマー、ヘテロダイマー、またはマルチマーとして発現させることができる。そのような細胞を用いて、少なくとも１つのｐＧ６ｂポリペプチドを含むｐＧ６ｂモノマー、ホモダイマー、ヘテロダイマーおよびマルチマー受容体ポリペプチド（「ｐＧ６ｂ−を含む受容体」または「ｐＧ６ｂ−を含む受容体ポリペプチド」）を生産することができ、あるいはスクリーニング系においてアッセイ細胞として用いることができる。本発明の１つの態様内で、ｐＧ６ｂ細胞外ドメインを含む本発明のポリペプチドは培養された細胞によって生産され、該細胞を用いて、天然カウンター受容体を含めた受容体に対するカウンター受容体、ならびに天然カウンター受容体のアゴニストおよびアンタゴニストについてスクリーニングする。該手法をまとめると、該受容体をコードするｃＤＮＡまたは遺伝子を、その発現に必要な他の遺伝子エレメント（例えば、転写プロモーター）と合わせ、得られた発現ベクターを宿主細胞に挿入する。ＤＮＡを発現し、および機能的受容体を生産する細胞を、種々のスクリーニング系内で選択し、用いる。モノマー、ホモダイマー、ヘテロダイマーおよびマルチマー受容体複合体の各成分を同一細胞において発現させることができる。さらに、モノマー、ホモダイマー、ヘテロダイマーおよびマルチマー受容体複合体の成分を膜貫通ドメインまたは他の膜融合部位に融合させて、上述したように複合体組み立ておよびトランスフェクタントのスクリーニングを可能とすることもできる。
【０２０３】
本発明のｐＧ６ｂアゴニストおよび／またはアンタゴニストポリペプチドおよび抗体をアッセイするためには、ｐＧ６ｂ−を含む受容体を発現させ、および受容体−媒介シグナルを変換するのに用いるのに好適な哺乳動物細胞は、ｐＧ６ｂ（またはｐＧ６ｂＲＡ）とで機能的複合体を形成することができる他の受容体サブユニットを発現する細胞を含む。好ましい実施形態内で、細胞は、その増殖についての外来的に供給された造血成長因子に依存する。このタイプの好ましい細胞系はヒトＴＦ−１細胞系（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２００３）およびＡＭＬ−１９３細胞系（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−９５８９）であり、これらはＧＭ−ＣＳＦ−依存性ヒト白血病細胞、およびＩＬ−３依存性ネズミｐｒｅ−Ｂ細胞系であるＢａＦ３（Ｐａｌａｃｉｏｓ  ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ，Ｃｅｌｌ  ４１：７２７−７３４，１９８５）である。他の細胞系はＢＨＫ，ＣＯＳ−１，およびＣＨＯ細胞を含む。好適な宿主細胞を作製して、所望の細胞応答に必要とされる必要な受容体サブユニットまたは他の細胞成分を生産することができる。この手法は有利である。なぜならば、細胞系を作製して、いずれかの種から受容体サブユニットを発現することができ、それにより、主特異性から生じる潜在的な制限を克服する。ヒト受容体ｃＤＮＡの種オルソログをクローン化し、ＢａＦ３細胞系におけるマウスｃＤＮＡのような同一種からの細胞系内で用いることができる。
【０２０４】
機能的受容体を発現する細胞はスクリーニングアッセイ内で用いる。種々の好適なアッセイは当該分野で知られている。これらのアッセイは、標的細胞における生物学的応答の検出に基づく。１つのそのようなアッセイは細胞増殖アッセイである。細胞はテスト化合物の存在下または非存在下で培養し、細胞増殖は、例えば、滴定されたチミジンの取込みを測定することによって、または臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）の代謝分解に基づく比色アッセイによって検出される（Ｍｏｓｍａｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６５：５５−６３，（１９８３））。代替アッセイ様式は、さらにレポーター遺伝子を発現するように作製された細胞を用いる。レポーター遺伝子は受容体−連結経路に対して応答的であるプロモーターエレメントに連結され、および該アッセイはレポーター遺伝子の転写の活性化を検出する。この点に関して好ましいプロモーターエレメントは血清応答エレメントまたはＳＲＥである。例えば、Ｓｈａｗら、Ｃｅｌｌ  ５６：５６３−５７２，１９８９参照。好ましいそのようなレポーター遺伝子はルシフェラーゼ遺伝子（ｄｅ  Ｗｅｔら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：７２５，１９８７）である。ルシフェラーゼ遺伝子の発現は、当該分野で公知の方法を用いてルミネセンスによって検出される（例えば、Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２９０９４−２９１０１，１９９４；Ｓｃｈｅｎｂｏｒｎ  ａｎｄ  Ｇｏｉｆｆｉｎ，Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｎｏｔｅｓ  ４１：１１，１９９３）。ルシフェラーゼ活性アッセイキットは、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから商業的に入手可能である。このタイプの標的細胞系を用いて、化学物質のライブラリー、細胞−条件培養基、真菌ブロス、土壌試料、水試料等をスクリーニングすることができる。例えば、細胞−条件培地中倍致死量のバンクを標的細胞についてアッセイして、カウンター受容体を生産する細胞を同定することができる。次いで、陽性細胞を用いて、哺乳動物発現ベクター中にｃＤＮＡライブラリーを生じさせ、これをプールに分割し、宿主細胞にトランスフェクトし、発現させる。次いで、トランスフェクトされた細胞からの培地試料をアッセイし、引き続いてプールを分割し、再度トランスフェクションし、継代培養し、および陽性細胞を再度アッセイして、カウンター受容体をコードするクローン化ｃＤＮＡを単離する。
【０２０５】
いくつかのｐＧ６ｂ応答性細胞系は当該分野で知られているか、あるいは構築することができる。例えば、Ｂａｆ３／ＤＩＲＳ１／ｃｙｔｏＲ１１細胞系（ＷＩＰＯ公開番号ＷＯ  ０２／０７２６０７）。さらに、いくつかのＩＬ−２２応答細胞は知られており（Ｄｕｍｏｎｔｉｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１８１４−１８１９，２０００；Ｄｕｍｏｕｔｉｅｒ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．９７：１０１４４−１０１４９，２０００；Ｘｉｅ  ＭＨら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３１３３５−３１３３９，２０００；Ｋｏｔｅｎｋｏ  ＳＶら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２７２５−２７３２，２００１）、ならびにＩＬ−２２受容体サブユニットｐＧ６ｂを発現するものが知られている。例えば、以下の細胞はＩＬ−２２に応答性である：ＴＫ−１０（Ｘｉｅ  ＭＨら、ｓｕｐｒａ）（ヒト腎臓癌腫）；ＳＷ４８０（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２２８）（ヒト結腸腺癌）；ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−８０６５）（ヒト肝臓腫）；ＰＣ１２（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１７２１）（ネズミニューロン細胞モデル；ラット褐色細胞腫）；およびＭＥＳ１３（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１９２７）（ネズミ腎臓メサンギウム細胞系）。加えて、ｐＧ６ｂ（ＩＬ−２２受容体）を発現するいくつかの細胞系もまた、ＩＬ−２２に対する応答性細胞系の候補である：Ａ５４９（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１８５）（ヒト胚癌腫）；Ｇ−３６１（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１４２４）（ヒトメラノーマ）；およびＣａｋｉ−１（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−４６）（ヒト腎臓癌腫）。加えて、ＩＬ−２２−応答性細胞系を構築することができる。例えば、本明細書中に記載されたＢａｆ３／ｃｙｔｏＲ１１／ＣＲＦ２−４細胞系（ＷＩＰＯ公開番号ＷＯ  ０２／１２３４５）。これらの細胞をアッセイで用いて、ｐＧ６ｂまたはＩＬ−２２アンタゴニストまたは抗−炎症因子としてのｐＧ６ｂの機能性を評価することができる。
【０２０６】
６．ｐＧ６ｂ融合蛋白質およびコンジュゲートの生産
ｐＧ６ｂ類似体の１つの一般的なクラスは、本明細書中に開示されたアミノ酸配列の突然変異であるアミノ酸配列を有する変種である。ｐＧ６ｂ類似体のもう１つの一般的クラスは、以下に記載された、抗−イディオタイプ抗体およびその断片によって供される。さらに、抗−イディオタイプ可変ドメインを含む組換え抗体は類似体として用いることができる（例えば、Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉら、Ｐｒｏｃ．Ａｓｓｏｃ．Ａｍ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  １０８：４２０，１９９６）。抗−イディオタイプｐＧ６ｂ抗体の可変ドメインはｐＧ６ｂを模倣するので、これらのドメインはｐＧ６ｂ結合活性を供することができる。抗−イディオタイプ触媒抗体の方法は当業者に知られている（例えば、Ｊｏｒｏｎら、Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６７２：２１６，１９９２；Ｆｒｉｂｏｕｌｅｔら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４７：２２９，１９９４；ａｎｄ  Ａｖａｌｌｅら、Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６４：１１８，１９９８参照）。
【０２０７】
ｐＧ６ｂ類似体を同定するためのもう１つの手法は、コンビナトーリアルライブラリーの使用によって供される。ファージディスプレイおよび他のコンビナトーリアルライブラリーを構築し、スクリーニングする方法は、例えば、Ｋａｙら、Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９６），Ｖｅｒｄｉｎｅ，米国特許第５，７８３，３８４号，Ｋａｙ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，７４７，３３４号，ａｎｄ  Ｋａｕｆｆｍａｎら、米国特許第５，７２３，３２３号によって供される。
【０２０８】
ｐＧ６ｂポリペプチドはインビボおよびインビトロ双方の用途を有する。例として、ｐＧ６ｂの可溶性形態を細胞培養基に加えて、培養した細胞によって生産されたｐＧｔ６ｂカウンター受容体の効果を阻害することができる。
【０２０９】
ｐＧ６ｂの融合蛋白質を用いて、組換え宿主においてｐＧ６ｂを発現させ、および生産されたｐＧ６ｂを単離することができる。以下に記載するように、特定のｐＧ６ｂ融合蛋白質もまた、診断および治療において用途を有する。融合蛋白質の１つのタイプは組換え宿主細胞からのｐＧ６ｂポリペプチドをガイドするポリペプチドを含む。ｐＧ６ｂポリペプチドを、真核生物宿主細胞の分泌経路に向けるためには、（シグナルペプチド、リーダー配列、プレプロ配列またはプレ配列としても知られた）分泌シグナル配列をｐＧ６ｂ発現ベクター中に供する。分泌シグナル配列がｐＧ６ｂから誘導できる場合、好適なシグナル配列もまた、もう１つの分泌蛋白質から誘導してもよく、デ・ノボ合成してもよい。分泌シグナル配列は、２つの配列が正しいリーディングフレームにて連結され、位置させて、新しく合成されたポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に向けるように、ｐＧ６ｂ−コーディング配列に操作可能に連結される。分泌シグナル配列は、通常、注目するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して５’側に位置させるが、ある種の分泌シグナル配列は注目するヌクレオチド配列中の他の箇所に位置させてもよい（例えば、Ｗｅｌｃｈら、米国特許第５，０３７，７４３号；Ｈｏｌｌａｎｄら、米国特許第５，１４３，８３０号参照）。
【０２１０】
ｐＧ６ｂ、または哺乳動物細胞によって生産されたもう１つの蛋白質の分泌シグナル配列（例えば、米国特許第５，６４１，６５５号に記載された組織−タイププラスミノーゲンアクチベーターのシグナル配列）は組換え哺乳動物宿主におけるｐＧ６ｂの発現で有用であるが、酵母シグナル配列が酵母細胞における発現では好ましい。好適な酵母シグナル配列の例は、（ＮＦα１遺伝子によってコードされた）酵母接合フェロモンα−因子、（ＳＵＣ２遺伝子によってコードされた）インベルターゼ、または（ＰＨＯ５遺伝子によってコードされた）酸ホスファターゼから由来するものである。例えば、Ｒｏｍａｎｏｓら、“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ，”ｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｌｏｖｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｍｅｓ  （ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  １２３−１６７（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）参照。
【０２１１】
ｐＧ６ｂ可溶性ポリペプチドは、細胞外ドメイン、例えば、配列番号２を含有するポリペプチド、または非−ヒト受容体の対応する領域をコードする切形ＤＮＡを発現させることによって調製することができる。細胞外ドメインポリペプチドは、膜貫通および細胞内ポリペプチドセグメントを実質的に含まない形態にて調製される。宿主細胞からの受容体ドメインの輸出を指令するためには、受容体ＤＮＡを、ｔ−ＰＡ分泌ペプチドのような分泌ペプチドをコードする第二のＤＮＡセグメントに連結する。分泌した受容体ドメインの精製を容易とするためには、ポリ−ヒスチジン標識、サブスタンスＰ、ＦｌａｇＴＭ  ペプチド（Ｈｏｐｐら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４−１２１０，（１９８８）；Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴから入手可能）のようなＣ−末端延長、あるいは抗体またはもう１つの特異的結合剤がそれについて入手可能なもう１つのポリペプチドまたは蛋白質を受容体ポリペプチドに融合することができる。さらに、細胞外サイトカイン結合ドメインからのｐＧ６ｂ抗原エピトープもまた上述したように調製される。
【０２１２】
代替手法において、ｐＧ６ｂの受容体細胞外ドメイン、または他のＢ７受容体成分は、免疫グロブリン重鎖定常領域との融合、典型的には、２つの定常領域ドメインおよびヒンジ領域を含有するが、可変領域を欠如するＦｃ断片として発現させることができる（Ｓｌｅｄｚｉｅｗｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，０１８，０２６号および第５，７５０，３７５号参照）。本発明の可溶性ｐＧ６ｂポリペプチドは、そのような融合を含む。そのような融合は、典型的には、マルチマー分子として分泌され、ここに、Ｆｃ部分は相互に結合したジスルヒドであって、２つの受容体ポリペプチドは相互に密接に近接して配置される。このタイプの融合を用いて、カウンター受容体を特異的に滴定することによってインビトロにてシグナルをブロックし、阻害し、または低下させるためのインビトロアッセイツールとして、および循環カウンター受容体に結合し、それを循環から除去するためにそれらを非経口投与することによるインビボアンタゴニストとして、溶液からの同族カウンター受容体をアフィニティー精製することができる。カウンター受容体を精製するためには、ｐＧ６ｂ−Ｉｇキメラを、受容体−カウンター受容体結合を容易とする条件（典型的には、生理学的に近い温度、ｐＨ、およびイオン強度）下で、カウンター受容体を含有する試料（例えば、細胞−条件培養基または組織抽出物）に加える。次いで、キメラ−カウンター受容体複合体を、固体支持体（例えば、不溶性樹脂ビーズ）に固定化されたプロテインＡを用いて混合物によって分離する。次いで、塩またはｐＨグラジエントによる等して、慣用的な化学技術を用いてカウンター受容体を溶出させる。別法として、キメラ自体を固体支持体に結合させることができ、上述したように結合および溶出を行う。キメラをインビボで用いて、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、Ｃ−反応性蛋白質（ＣＲＰ）のような急性相応答を含めた、炎症応答を調節することができる。高い結合親和性を持つキメラは、（例えば、筋肉内、皮下または静脈注射によって）非経口投与される。循環分子はカウンター受容体に結合し、通常の生理学的プロセスによって循環から除去される。アッセイで用いるためには、キメラはＦｃ領域を介して支持体に結合させ、ＥＬＩＳＡ様式で用いる。
【０２１３】
本発明の抗−ｐＧ６ｂおよび結合パートナーを単離するのを助けるために、カウンター受容体−結合受容体（または抗体、相補体／抗−相補体対の１つのメンバー）、またはその結合断片、および商業的に入手可能なバイオセンサー機器（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いるアッセイシステムを有利に使用することができる。そのような受容体、抗体、相補体／抗−相補体対のメンバー、または断片は受容体チップの表面に固定化される。この機器の使用はＫａｒｌｓｓｏｎ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １４５：２２９−４０，１９９１）およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３４：５５４−６３，１９９３）によって開示されている。受容体、抗体、メンバーまたは断片は、アミンまたはスルフヒドリル化学を用いて、フローセル内の金フィルムに付着されたデキストラン繊維に共有結合させる。テスト試料は該セルを通す。もしカウンター受容体、エピトープ、または相補体／抗−相補体対の反対メンバーが試料中に存在すれば、それは、各々、固定された受容体、抗体またはメンバーに結合し、媒体の屈折率の変化を引き起こし、これは金フィルムの表面プラズモン共鳴の変化として検出される。このシステムはオン−およびオフ−率の決定を可能とし、それから、結合親和性を計算することができ、および結合の化学量論の評価を可能とする。別法として、カウンター受容体／受容体結合は、ＳＥＬＤＩ（ＴＭ）技術（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて解析することができる。さらに、上述したＢＩＡＣＯＲＥ技術を用いて、競合実験で用いて、異なるモノクローナル抗体がｐＧ６ｂポリペプチド上の同一または異なるエピトープに結合するかを決定することができ、およびそれ自体を用いて、本発明の抗体のエピトープマッピングを助けることができる。
【０２１４】
カウンター受容体−結合受容体ポリペプチドは、当該分野で知られた他のアッセイシステム内で用いることもできる。そのようなシステムは、結合親和性の決定のためのスキャッチャード解析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０−７２，１９４９参照）、および比色アッセイ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：５４５−４８，１９９１；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５：８２１−２５，１９９１）を含む。
【０２１５】
本発明は、さらに、種々の他のポリペプチド融合、および１つ以上のポリペプチド融合を含む関連マルチマー蛋白質を提供する。例えば、可溶性ｐＧ６ｂ受容体は、米国特許第５，１，５５，０２７号および第５，５６７，５８４号に開示されたように二量体化蛋白質への融合として調製することができる。この点に関して好ましい二量体化蛋白質は免疫グロブリン定常領域ドメイン、例えば、ＩｇＧγ１、およびヒトκ軽鎖を含む。免疫グロブリン−可溶性ｐＧ６ｂ融合は、遺伝子工学により作成された細胞において発現させて、種々のマルチマーｐＧ６ｂ受容体類似体を生産することができる。補助的ドメインを可溶性ｐＧ６ｂ受容体に融合させて、それらを特異的細胞、組織、またはマクロ分子（例えば、コラーゲン、またはｐＧ６ｂカウンター受容体を発現する細胞）に標的化することができる。ｐＧ６ｂポリペプチドは、精製のためのアフィニティー標識、および標的化ドメインのような２つ以上の部位に融合することができる。ポリペプチド融合は、特にドメインの間の１つ以上の切断部位を含むことができる。Ｔｕａｎら、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３４：１−９，１９９６参照。
【０２１６】
細菌細胞においては、異種蛋白質を融合蛋白質として発現させて、毒性を減少させて、安定性を増加させ、および発現された蛋白質の回収を高めるのがしばしば望ましい。例えば、ｐＧ６ｂは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼポリペプチドを含む融合蛋白質として発現することができる。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合蛋白質は、典型的には、可溶性であって、固定化グルタチオンカラム上のＥ．ｃｏｌｉ溶解物から容易に精製できる。同様な手法において、マルトース結合蛋白質ポリペプチドを含むｐＧ６ｂ融合蛋白質はアミロース樹脂カラムで単離することができ、他方、切形されたプロテインＡ遺伝子のＣ−末端を含む融合蛋白質は、ＩｇＧ−セファロースを用いて精製することができる。細菌細胞において融合蛋白質として異種ポリペプチドを発現させるための確立された技術は、例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓら、“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｏｒｅｉｇｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”  ｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｌｏｖｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｍｅｓ（Ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  １５−５８（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）によって記載されている。加えて、商業的に入手可能な発現系が利用できる。例えば、ＰＩＮＰＯＩＮＴ  Ｘａ蛋白質精製系（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）は、アビジンを含む樹脂での発現の間にビオチニル化するようになるポリペプチドを含む融合蛋白質を単離する方法を提供する。
【０２１７】
原核生物または真核生物細胞によって発現された異種ポリペプチドを単利するのに有用なペプチド標識は、（ニッケル−キレーティング樹脂に対して神話性を有する）ポリヒスチジン標識、ｃ−ｍｙｃ標識、（カルモジュリンアフィニティークロマトグラフィーで単離された）カルモジュリン結合蛋白質、サブスタンスＰ、（抗−ＲＹＩＲＳ抗体と結合する）ＰＹＩＲＳ標識、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ標識、および（抗−ＦＬＡＧ抗体と結合する）ＦＬＡＧ標識を含む。例えば、Ｌｕｏら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３２９：２１５，１９９６；Ｍｏｒｇａｎｔｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３：６７，１９９６，ａｎｄ  Ｚｈｅｎｇら、Ｇｅｎｅ  １８６：５５，１９９７参照。そのようなペプチド標識をコードする核酸分子は、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手可能である。
【０２１８】
融合蛋白質のもう１つの形態は、ｐＧ６ｂポリペプチド、および免疫グロブリン重鎖定常領域、典型的には、２または３の定常領域ドメインおよびヒンジ領域を含有するが、可変領域を欠如するＦｃ断片を含む。その例として、Ｃｈａｎｇら、米国特許第５，７２３，１２５号は、ヒトインターフェロンおよびヒト免疫グロブリンＦｃ断片を含む融合蛋白質を記載する。インターフェロンのＣ−末端は、ペプチドリンカー部位によってＦｃ断片のＮ−末端に連結される。ペプチドリンカーの例は、主として、免疫学的に不活性なＴ細胞不活性配列を含むペプチドである。この融合蛋白質においては、例示的なＦｃ部位は、溶液中で安定であって、補体活性化活性をほとんどまたは全く有しないヒトγ４鎖である。従って、本発明では、ｐＧ６ｂ部位およびヒトＦｃ断片を含むｐＧ６ｂ融合蛋白質が考えられ、ここに、ｐＧ６ｂ部位のＣ−末端はペプチドリンカーを介してＦｃ断片のＮ−末端に結合している。ｐＧ６ｂ部位はｐＧ６ｂ分子またはその断片であり得る。例えば、融合蛋白質は配列番号３のアミノ酸およびＦｃ断片（例えば、ヒトＦｃ断片）を含むことができる。
【０２１９】
もう１つの変形において、ｐＧ６ｂ融合蛋白質は、ＩｇＧ配列、該ＩｇＧ配列のアミノ末端に共有結合したｐＧ６ｂ部位、および該ｐＧ６ｂ部位のアミノ末端に共有結合したシグナルペプチドを含み、ここに、該ＩｇＧ配列は以下の順序の以下のエレメント：ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインよりなる。従って、ＩｇＧ配列はＣＨ１ドメインを欠如する。ｐＧ６ｂ部位は、ｐＧ６ｂカウンター受容体と結合する能力のような、本明細書中に記載された、ｐＧ６ｂ活性を呈する。抗体および非抗体部分双方を含む融合蛋白質を生産するこの一般的手法は、ＬａＲｏｃｈｅｌｌｅら、ＥＰ７４２８３０（ＷＯ  ９５／２１２５８）によって記載されている。
【０２２０】
ｐＧ６ｂ部位およびＦｃ部位を含む融合蛋白質は、例えば、インビトロアッセイツールとして用いることができる、例えば、生物学的試料中のｐＧ６ｂカウンター受容体の存在は、ｐＧ６ｂ−免疫グロブリン融合蛋白質を用いて検出することができ、そこでは、ｐＧ６ｂ部位を用いてカウンター受容体に結合させ、プロテインＡまたは抗−Ｆｃ抗体のようなマクロ分子を用いて、融合蛋白質を固体支持体に結合させる。そのような系を用いて、ｐＧ６ｂのそのカウンター受容体への結合に干渉するアゴニストおよびアンタゴニストを同定することができる。
【０２２１】
抗体融合蛋白質の多の例は、抗原−結合ドメイン、およびｐＧ６ｂ細胞外ドメインを含有するｐＧ６ｂ断片を含むポリペプチドを含む。そのような分子を用いて、ｐＧ６ｂ結合活性の利点のために特別な組織を標的化することができる。
【０２２２】
本発明は、さらに、種々の他のポリペプチド融合を提供する。例えば、生物学的機能を付与するドメインの一部または全てを、本発明のｐＧ６ｂと、サイトカイン受容体ファミリーのもう１つのメンバーからの機能的に同等なドメインとの間で交換することができる。ポリペプチド融合は組換え宿主細胞において発現させて、種々のｐＧ６ｂ融合類似体を生産することができる。ｐＧ６ｂポリペプチドは、精製のためのアフィニティー標識および標的化ドメインのような２つ以上の部位またはドメインに融合させることができる。ポリペプチド融合は、特に、ドメインの間に１つ以上の切断部位を含むこともできる。例えば、Ｔｕａｎら、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３４：１，１９９６参照。
【０２２３】
融合蛋白質は、融合蛋白質の各成分を調製し、それらを化学的にコンジュゲートすることによって当業者に知られた方法によって調製することができる。別法として、好適なリーディングフレームにおいて融合蛋白質の双方の成分をコードするポリヌクレオチドは、公知の技術を用いて作成し、本明細書中に記載された方法によって発現させることができる。融合蛋白質の酵素的および化学的切断のための一般的方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）  ａｔ  ｐａｇｅｓ１６−１９  ｔｏ  １６−２５によって記載されている。
【０２２４】
ｐＧ６ｂ結合ドメインは、さらに、ｐＧ６ｂカウンター受容体アゴニストの推定定常部位アミノ酸の突然変異と組み合わせて、核磁気共鳴、結晶学、電子回折または光親和性標識のような技術によって測定して、構造の物理的解析によって特徴付けることができる。ｄｅ  Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６，１９９２；Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９，１９９２；ａｎｄ  Ｗｌｏｄａｖｅｒら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０９：５９，１９９２参照。
【０２２５】
本発明では、ｐＧ６ｂポリペプチドがポリマーで連結された化学的に修飾されたｐＧ６ｂ組成物も考えられる。例示的なｐＧ６ｂポリペプチドは、アミノ酸残基配列番号３よりなるポリペプチドのような、機能的膜貫通ドメインを欠如する可溶性ポリペプチドである。典型的には、該ポリマーは、ｐＧ６ｂコンジュゲートが生理学的環境のような水性環境に参画しないように水溶性である。好適なポリマーの例は、アシル化のための活性エステル、またはアルキル化のためのアルデヒドのような単一反応性基を有するように修飾されているものである。このように、重合の程度を制御することができる。反応性アルデヒドの例はポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、またはモノ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ、またはそのアリールオキシ誘導体である（例えば、Ｈａｒｒｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，２５２，７１４号参照）。ポリマーは分岐していてもまたは分岐していなくてもよい。さらに、ポリマーの混合物を用いて、ｐＧ６ｂコンジュゲートを生産することができる。
【０２２６】
療法で用いるｐＧ６ｂコンジュゲートは、医薬上許容される水溶性ポリマー部位を含むことができる。好適な水溶性ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシ−ＰＲＧ、モノ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−ＰＥＧ、アリールオキシ−ＰＥＧ、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ＰＥＧ、トレキシルブチルメトキシＰＥＧ、ＰＥＧプロピオンアルデヒド、ビス−スクシンイミジルカルボネートＰＥＧ、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキサイド／エチレンオキサイドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、デキストラン、セルロース、または他の炭水化物−ベースのポリマーを含む。好適なＰＥＧは、例えば、５，０００、１２，０００、２０，０００および２５，０００を含めた、約６００〜約６０，０００の分子量を有することができる。ｐＧ６ｂコンジュゲートはそのような水溶性ポリマーの混合物を含むことができる。
【０２２７】
ｐＧ６ｂコンジュゲートの１つの例はｐＧ６ｂ部位、および該ｐＧ６ｂ部位のＮ−末端に結合したポリアルキルオキサイド部位を含む。ＰＥＧは１つの好適なポリアルキルオキサイドである。その例として、ｐＧ６ｂはＰＥＧで修飾することができる。「ＰＥＧ化」として知られたプロセスである。ｐＧ６ｂのＰＥＧ化は、当該分野で知られたＰＥＧ化反応のいずれかによって行うことができる（例えば、ＥＰ  ０  １５４  ３１６，Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ９：２４９（１９９２），Ｄｕｎｃａｎ  ａｎｄ  Ｓｐｒｅａｆｉｃｏ，Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．２７：２９０（１９９４），およびＦｒａｎｃｉｓら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ６８：１（１９９８）参照）。例えば、ＰＥＧ化は、アシル化反応によって、または反応性ポリエチレングリコール分子とのアルキル化反応によって行うことができる。別の手法において、ｐＧ６ｂコンジュゲートは活性化されたＰＥＧを縮合することによって形成され、そこでは、ＰＥＧの末端ヒドロキシまたはアミノ基は活性化されたリンカーによって置き換えられている（例えば、Ｋａｒａｓｉｅｗｉｃｚら、米国特許第５，３８２，６５７号参照）。
【０２２８】
アシル化によるＰＥＧ化は、典型的には、ＰＥＧの活性エステル誘導体をｐＧ６ｂポリペプチドと反応させることができることを必要とする。活性化されたＰＥＧエステルの例は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドにエステル化されたＰＥＧである。本明細書中で用いるとき、用語「アシル化」は、ｐＧ６ｂおよび水溶性ポリマーの間の結合の以下のタイプを含む：アミド、アルバメート、ウレタン等。アシル化によってＰＥＧ化ｐＧ６ｂを調製するための方法は、典型的には、（ａ）ｐＧ６ｂポリペプチドを、１つ以上のＰＥＧ基がｐＧ６ｂに結合する条件下で、（ＰＥＧのアルデヒド誘導体の反応性エステルのような）ＰＥＧと反応させ、次いで、（ｂ）反応産物を得る工程を含む。一般には、アシル化反応のための最適な反応条件は、公知のパラメーターおよび所望の結果に基づいて決定される。例えば、ＰＥＧ：ｐＧ６ｂの比率がより大きければ、ポリＰＥＧ化ｐＧ６ｂ産物の割合は大きくなる。
【０２２９】
アシル化によるＰＥＧ化の産物は、典型的には、ポリＰＥＧ化ｐＧ６ｂ産物であり、ここに、リシンε−アミノ基はアシル連結基を介してＰＥＧ化されている。連結結合の例はアミドである。典型的には、得られたｐＧ６ｂは少なくとも９５％モノ−、ジ−、またはトリ−ＰＥＧ化されているが、より高い程度のＰＥＧ化を持ついくつかの種が反応条件に依存して形成できる。ＰＥＧ化種は、透析、限外濾過、イオン交換クロマトフラフィー、アフィニティークロマトフラフィー等のような標準的精製方法を用いてコンジュゲートされていないｐＧ６ｂポリペプチドから分離することができる。
【０２３０】
アルキル化によるＰＥＧ化は、一般には、還元剤の非存在下でＰＥＧの末端アルデヒド誘導体をｐＧ６ｂと反応させることができることを含む。ＰＥＧ基は、−ＣＨ２−ＮＨ基を介してポリペプチドに結合させることができる。
【０２３１】
さらに、本発明の抗−ｐＧ６ｂ抗体または抗体断片は、当該分野における、および本明細書中に記載された方法を用いてＰＥＧ化することができる。
【０２３２】
モノＰＥＧ化産物を生産するための還元的アルキル化を介する誘導体化は、誘導体化で利用できる異なるタイプの第一級アミノ基の異なる反応性を利用する。典型的には、反応は、リシン残基のε−アミノ基および蛋白質のＮ−末端残基のα−アミノ基の間のｐＫａ差を利用するのを可能とするｐＨで行う。そのような選択的誘導体化によって、アルデヒドのような反応性基を含有する水溶性ポリマーの蛋白質への結合が制御される。ポリマーとのコンジュゲーションは、リシン側鎖アミノ基のような他の反応性基の有意な修飾なくして蛋白質のＮ−末端において圧倒的に起こる。本発明は、ｐＧ６ｂモノポリマーコンジュゲートの実質的に均一な調製を提供する。
【０２３３】
モノポリマーｐＧ６ｂコンジュゲート分子の実質的に均一な集団を生産するための還元的アルキル化は：（ａ）ｐＧ６ｂのアミノ末端におけるα−アミノ基の選択的修飾を可能とするのに好適なｐＨにおける還元的アルキル化条件下でｐＧ６ｂポリペプチドを反応性ＰＥＧと反応させ、次いで、（ｂ）反応産物を得る工程を含むことができる。還元的アルキル化で用いる還元剤は水溶液中で安定であって、還元的アルキル化の最初のプロセスで形成されたシッフ塩基のみを還元できるべきである。例示的な還元剤はホウ水素化ナトリウム、シアノホウ水素化ナトリウム、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボラン、およびピリジンボランを含む。
【０２３４】
モノポリマーｐＧ６ｂコンジュゲートの実質的に均一な集団では、還元的アルキル化反応条件は、水溶性ポリマー部位のｐＧ６ｂのＮ−末端への選択的結合を可能とするものである。そのような反応条件は、一般には、リシンアミノ基およびＮ−末端におけるα−アミノ基の間のｐＫａの差を供する。ｐＨは用いるべき蛋白質に対するポリマーの比率にも影響する。一般には、ｐＨがより低ければ、蛋白質に対するかなり過剰のポリマーが望ましい。なぜならば、Ｎ−末端α−基の反応性がより低ければ、より多くのモノマーが最適な条件を達成するのに必要だからである。もしｐＨがより高ければ、ポリマー：ｐＧ６ｂは大きい必要はない。なぜならば、より反応性の基が利用できるからである。典型的には、ｐＨは３〜９、または３〜６の範囲内に入る。この方法は、ｐＧ６ｂ−を含むホモダイマー、ヘテロダイマー、またはマルチマー可溶性受容体コンジュゲートを作製するために使用することができる。
【０２３５】
考慮すべきもう１つの因子は、水溶性ポリマーの分子量である。一般には、ポリマーの分子量がより高ければ、蛋白質に結合させることができるポリマー分子の数はより少ない。ＰＥＧ化反応では、典型的な分子量は約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、または約１２ｋＤａ〜約２５ｋＤａである。ｐＧ６ｂに対する水溶性ポリマーのモル比率は、一般には、１：１〜１００：１の範囲にあるであろう。典型的には、ｐＧ６ｂに対する水溶性ポリマーのモル比率は、ポリＰＥＧ化については１：１〜２０：１、およびモノＰＥＧ化では１：１〜５：１である。
【０２３６】
ポリペプチドおよび水溶性ポリマー部位を含むコンジュゲートを生産するための一般的方法は当該分野で知られている。例えば、Ｋａｒａｓｉｅｗｉｃｚら、米国特許第５，７３８，８４６号，Ｎｉｅｆｏｒｔｈら、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．５９：６３６（１９９６），Ｍｏｎｋａｒｓｈら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４７：４３４（１９９７）参照。この方法は、ｐＧ６ｂ−を含むホモダイマー、ヘテロダイマー、またはマルチマー可溶性受容体コンジュゲートを作成するのに使用することができる。
【０２３７】
本発明では、本明細書中に記載された可溶性受容体または抗体のようなペプチドまたはポリペプチドを含む組成物が考えられる。そのような組成物は、さらに、担体を含むことができる。担体は慣用的な有機または無機担体であり得る。担体の例は水、緩衝溶液、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油等を含む。
【０２３８】
７．ｐＧ６ｂポリペプチドの単離
本発明のポリペプチドは、汚染マクロ分子、特に他の蛋白質および核酸に対して少なくとも約８０％純度まで、少なくとも約９０％純度まで、少なくとも約９５％純度まで、あるいは９６％、９７％、９８％のような９５％を超える純度まで、または９９％を超える純度まで、かつ感染剤およびパイロジェン剤を含まないまで精製することができる。本発明のポリペプチドは、９９．９％純度を超える医薬的に純粋な状態まで精製することもできる。ある調製においては、精製されたポリペプチドは他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に含まない。
【０２３９】
分画および／または慣用的な精製方法を用いて、天然源（例えば、ヒト組織源）から精製されたｐＧ６ｂ、合成ｐＧ６ｂポリペプチド、および組換えｐＧ６ｂポリペプチド、および組換え宿主細胞から精製された融合ｐＧ６ｂポリペプチドを得ることができる。一般に、硫酸アンモニウム沈殿、および酸またはカオトロープ抽出を試料の分画で用いることができる。例示的な精製工程はヒドロキシアパタイト、サイズ排除、ＦＰＬＣおよび逆相高速液体クロマトグラフィーを含むことができる。そのようなクロマトフラフィー媒体は誘導体化されたデキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、特殊シリカ等を含む。ＰＥＩ，ＤＥＡＥ，ＱＡＥおよびＱ誘導体が好適である。例示的なクロマトフラフィー媒体は、フェニル−セファロースフェニルＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌブチル６５０ブチル（Ｔｏｓｏ  Ｈａａｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）、オクチル−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等のような、またはオクチル基で誘導体化した媒体；またはＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍ  ＣＧ７１（Ｔｏｓｏ  Ｈａａｓ）等のようなポリアクリル樹脂を含む。好適な固体支持体は、用いられる条件下で不溶性であるガラスビーズ、シリカ−ベースの樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋されたアガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋されたポリアクリルアミド樹脂等を含む。これらの支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルヒドロリキ、ヒドリルキおよび／または炭水化物部位による蛋白質の結合を可能とする反応性基で修飾することができる。
【０２４０】
カップリング化学の例は臭化シアン活性化、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド活性化、およびカルボジイミドカップリング化学のためのカルボキシルおよびアミノ誘導体を含む。これらの、および他の固体媒体はよく知られており、かつ当該分野で広く用いられており、商業的供給業者から入手可能である。ポリペプチドの単離および精製のための特別な方法の選択はルーチン的な設計事項であって、選択された支持体の特性によって部分的には決定される。例えば、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍｏｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ＆  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９８８）およびＤｏｏｎａｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  １９９６）参照。
【０２４１】
ｐＧ６ｂの単離および精製におけるさらなる変形は、当業者が工夫することができる。例えば、以下に記載するようにして得られた抗−ｐＧ６ｂ抗体を用いて、イムノアフィニティー精製によって多量の蛋白質を単離することができる。
【０２４２】
本発明のポリペプチドは、特定の性質の開発によって単離することもできる。例えば、固定化金属イオン吸着（ＩＭＡＣ）クロマトフラフィーを用いて、ポリヒスチジン標識を含むものを含めた、ヒスチジンがリッチな蛋白質を精製することができる。簡単に述べれば、ゲルを、まず、二価金属イオン荷電して、キレートを形成させる（Ｓｕｌｋｏｗｓｋｉ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．３：１，１９８５）。ヒスチジンがリッチな蛋白質は、用いる金属イオンに依存して、異なる親和性でもってこのマトリックスに吸着され、競合的溶出、ｐＨの降下、または強力なキレート化剤の使用によって溶出される。精製の他の方法は、レクチンアフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトフラフィーによるグリコシル化蛋白質の精製を含む（Ｍ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，（ｅｄ．），Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：５２９，１９９０）。本発明のさらなる実施形態なくして、注目するポリペプチドおよびアフィニティー標識（例えば、マルトース−結合蛋白質、免疫グロブリンドメイン）の融合を構築して、精製を容易とすることができる。さらに、ｐＧ６ｂ細胞外ドメインのカウンター受容体−結合統制は、例えば、好適なカウンター受容体はカラムに結合され、かつｐＢ６ｂ−を含む受容体が結合され、引き続いて、標準的なクロマトフラフィー方法を用いて溶出されるアフィニティークロマトグラフィーを用いることによって、ｐＢ６ｂ−を含む可溶性受容体の精製のために開発することができる。
【０２４３】
ｐＢ６ｂポリペプチドまたはその断片は、上述したように、化学的合成を介して調製することもできる。ｐＢ６ｂポリペプチドはモノマーまたはマルチマーであってよく；グリコシル化されていても、またはグリコシル化されていなくてもよく；ＰＥＧ化されていても、またはＰＥＧ化されていなくてもよく；および最初のメチオニンアミノ酸残基を含んでも含まなくてもよい。
【０２４４】
８．ｐＧ６ｂ蛋白質に対する抗体の生産
ｐＧ６ｂに対する抗体は、例えば、ｐＧ６ｂ発現ベクターの産物、または抗原としての天然源から単離されたｐＢ６ｂを用いて得ることができる。特に有用な抗−ｐＧ６ｂ抗体はｐＧ６ｂに「特異的に結合」する。抗体は、もし該抗体が以下の２つの特性の内の少なくとも１つを呈すれば特異的に結合すると考えられる：（１）抗体は結合活性の閾値レベルでもってｐＧ６ｂに結合する、および（２）抗体はｐＧ６ｂに関連するポリペプチドと有意に交差−反応しない。
【０２４５】
最初の特徴に関しては、もし１０６Ｍ−１以上、好ましくは１０７Ｍ−１以上、より好ましくは１０８Ｍ−１以上、最も好ましくは１０９Ｍ−１以上の結合親和性（Ｋａ）でもってｐＢ６ｂポリペプチド、ペプチドまたはエピトープに結合するならば、抗体は特異的に結合する。抗体の結合親和性が、例えば、スキャッチャード解析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０，１９４９）によって当業者が容易に決定することができる。第二の特徴に関しては、例えば、もしｐＧ６ｂを検出するが、標準的なウェスタンブロット解析を用いて現在知られているポリペプチドを検出しないならば、抗体は関連ポリペプチド分子と有意に交差−反応しない。公知の関連ポリペプチドの例は公知のサイトカイン受容体を含む。
【０２４６】
抗−ｐＧ６ｂ抗体は、抗原性ｐＧ６ｂエピトープ−担持ペプチドおよびポリペプチドを用いて生産することができる。本発明の抗原性エピトープ−担持ペプチドおよびポリペプチドは、配列番号２または本明細書中に開示されたもう１つのアミノ酸配列内に含有される少なくとも９、または１５〜約３０の間のアミノ酸の配列を含有する。しかしながら、３０〜５０アミノ酸を含有する本発明のアミノ酸配列のより大きな部分、あるいは本発明のポリペプチドの完全なアミノ酸配列までのいずれかの長さ、および完全なアミノ酸配列を含むより大きな部分を含むペプチドまたはポリペプチドもまた、ｐＧ６ｂに結合する抗体を誘導するのに有用である。エピトープ−担持ペプチドのアミノ酸配列は、水性溶媒中の実質的溶解性を供するように選択される（すなわち、配列は比較的親水性ンの残基を含み、他方疎水性残基は典型的には回避される）。さらに、プロリン残基を含有するアミノ酸配列もまた、抗体生産で望ましいであろう。
【０２４７】
例として、ｐＧ６ｂにおける潜在的抗原部位は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ（ＤＮＡＳＴＡＲ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＰＲＯＴＥＡＮプログラム（バージョン３．１４）によって実施される、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ方法、Ｊａｍｅｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗｏｌｆ，ＣＡＢＩＯＳ  ４：１８１，（１９８８）を用いて同定される。デフォルトパラメーターをこの解析で用いる。
【０２４８】
Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ方法は、蛋白質構造の予測のために６つの主なサブルーチンを組合せる事によって可能な抗原決定基を予測する。簡単に述べると、Ｈｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓ方法、Ｈｏｐｐら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：３８２４（１９８１）をまず用いて、最大の局所的親水性の領域を表すアミノ酸配列を同定した（パラメーター：平均して７残基）。第二の工程において、Ｅｍｉｎｉの方法、Ｅｍｉｎｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５５：８３６（１９８５）を用いて、表面確率を計算した（パラメーター：表面決定閾値（０．６）＝１）。第三に、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｔｚの方法、Ｋａｒｐｌｕｓ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｈａｆｔｅｎ  ７２：２１２（１９８５）を用いて、骨格鎖の柔軟性を予測した（パラメーター：柔軟性閾値（０．２）＝１）。解析の第四および第五の工程において、二次構造の予測を、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ，Ｃｈｏｕ、“Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｃｌａｓｓｅｓ  ｆｒｏｍ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ，”ｉｎ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｆａｓｍａｎ（ｅｄ．），ｐａｇｅｓ  ５４９−５８６（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９９０）、およびＧａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ，Ｇａｒｎｉｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２０：９７（１９７８）の方法を用いてデータに適用した（Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎパラメーター：立体配座表＝６４蛋白質；α領域閾値＝１０３；β領域閾値＝１０５；Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎパラメーター：αおよびβ決定定数＝０）。第六のサブルーチンにおいて、柔軟性パラメーターおよびヒドロパシー／溶媒接近性因子を組合せて、「抗原性指標」として設計された表面輪郭値を決定した。最後に、ピークを広げる関数を抗原性指標に適用し、これは、各ピーク値の２０、４０、６０、または８０％を加えることによって主な表面ピークを広げて、内部領域に対する表面領域の移動性に由来するさらなる自由エネルギーを説明する。しかしながら、ヘリックス領域は柔軟性が低い傾向があるため、この計算はヘリックス領域に存在するいずれの主なピークにも適用しなかった。というのは、ヘリックス領域である。
【０２４９】
この解析の結果は、配列番号２の以下のアミノ酸配列は好適な抗原性ペプチドを提供し：Ｈｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ親水性プロフィールを用いて、配列番号３内の最も抗原性のポテンシャルを有する領域を決定することができることを示した（Ｈｏｐｐら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：３８２４−３８２８，１９８１；Ｈｏｐｐ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．８８：１−１８，１９８６  ａｎｄ  Ｔｒｉｑｕｉｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１：１５３−１６９，１９９８）。該プロフィールは６−残基ウィンドウをスライドさせることに基づく。埋もれたＧ、ＳおよびＴ残基および露出したＨ、ＹおよびＷ残基は無視した。さらに、例えば、ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｐｒｏｔｅａｎプログラム（（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いてＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆプロットによって予測された配列番号２内のｐＧ６ｂ抗原性エピトープは好ましい抗原性エピトープとして働き、当業者によって決定できる。そのような抗原性エピトープは（１）配列番号２のアミノ酸残基２１〜３１；（２）配列番号２のアミノ酸残基５５〜６１；（３）配列番号２のアミノ酸残基１１０〜１１６；（４）配列番号２のアミノ酸残基１８４〜２０６；および（５）配列番号２のアミノ酸残基１９１〜１９７を含む。本発明では、ｐＧ６ｂに対する抗体を生じさせるための抗原性ペプチド１〜５のいずれか１つの使用、または本発明の中和モノクローナル抗体をスクリーニングし、または同定するためのツールとしての使用が考えられる。本発明では、ｐＧ６ｂに対する抗体を生じさせるための、ならびにｐＧ６ｂカウンター受容体の活性に結合し、作動し、ブロックし、阻害し、低下させ、増加させ、拮抗しまたは中和することができる抗−ｐＧ６ｂモノクローナル抗体を同定し、およびスクリーニングするための本明細書中に記載されたいずれかの抗原性ペプチドまたはエピトープの使用が考えられる。
【０２５０】
組換えｐＧ６ｂ蛋白質に対する、または天然源から単離されたｐＧ６ｂに対するポリクローナル抗体は、当業者に周知の方法を用いて調製することができる。例えば、Ｇｒｅｅｎら、“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｓｅｒａ，”ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍａｎｓｏｎ，ｅｄ．），Ｐａｇｅｓ  １−５（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  １９９２）、およびＷｉｌｌｉａｍｓら、“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｕｓｉｎｇ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”ｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｌｏｂｅｒら（ｅｄｓ．），ｐａｇｅ  １５（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）参照。ｐＧ６ｂポリペプチドの免疫原生は、ミョウバン（水酸化アルミニウム）あるいはフロイントの完全または不完全アジュバントのようなアジュバントの使用を介して増加させることができる。免疫化で有用なポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドとの、またはマルトース結合蛋白質との、ｐＧ６ｂまたはその部分の融合のような融合ポリペプチドも含む。ポリペプチド免疫原は全長分子またはその部分（例えば、ｐＧ６ｂの細胞外ドメイン、またはその抗原性断片）であってよい。もしポリペプチド部分が「ハプテン−様」であれば、そのような部分は、有利には、免疫化のために、（キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）または破傷風トキソイドのような）マクロ分子担体に連結または結合することができる。
【０２５１】
ポリクローナル抗体は、典型的には、ウマ、ウシ、イヌ、ニワトリ、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、ヤギ、またはヒツジのような動物において生起されるが、本発明の抗−ｐＧ６ｂ抗体はサブヒト霊長類抗体から誘導することもできる。ヒヒにおいて診断的にかつ治療的に有用な抗体を生起させるための一般的技術は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇら、の国際特許公開番号ＷＯ  ９１／１１４６５において、およびＬｏｓｍａｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４６：３１０（１９９０）において見出すことができる。
【０２５２】
別法として、モノクローナル抗−ｐＧ６ｂ抗体を作り出すことができる。特異的抗原に対するげっ歯類モノクローナル抗体は、当業者に知られた方法によって得ることができる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５，１９７５；Ｃｏｌｉｇａｎら（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，ｐａｇｅｓ  ２．５．１−２．６．７（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９１）［“Ｃｏｌｉｇａｎ”］；Ｐｉｃｋｓｌｅｙら、“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ，”ｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｌｏｖｅｒら（ｅｄｓ．），ｐａｇｅ  ９３（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）参照）。
【０２５３】
簡単に述べれば、モノクローナル抗体は、ｐＧ６ｂ遺伝子産物を含む組成物をマウスに注射し、血清試料を取り出すことによって抗体の生産の存在を確認し、脾臓を取り出して、Ｂ−リンパ球を入手し、Ｂ−リンパ球をミエローマ細胞と融合して、ハイブリドーマーを生産し、ハイブリドーマーをクローン化し、該抗原に対する抗体を生産する陽性クローンを選択し、抗原に対する抗体を生産するクローンを培養し、次いで、ハイブリドーマー培養から抗体を単離することによって得ることができる。抗−ｐＧ６ｂ抗体の生産のための特に好適な免疫原性組成物は、ｐＧ６ｂの細胞外ドメインを含むポリペプチド（例えば、配列番号３）ならびにその抗原性断片を含む。
【０２５４】
加えて、本発明の抗−ｐＧ６ｂ抗体は、ヒトモノクローナル抗体から誘導することができる。ヒトモノクローナル抗体は、抗原攻撃に応答して特異的火と抗体を生産するように作製されたトランスジェニックマウスから得られる。この技術において、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座のエレメントを、内因性重鎖および軽鎖遺伝子座の標的化破壊を含む胚幹細胞系から由来するマウスの株に導入する。トランスジェニックマウスはヒト抗原に対して特異的なヒト抗体を合成することができ、該マウスを用いて、ヒト抗体−分泌ハイブリドーマーを生産することができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、例えば、Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  ７：１３，１９９４；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６，１９９４；ａｎｄ  Ｔａｙｌｏｒら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９，１９９４によって記載されている。
【０２５５】
モノクローナル抗体は、種々のよく確立された技術によって、ハイブリドーマー培養から単離し、精製することができる。そのような単離技術はプロテイン−Ａセハロースでのアフィニティークロマトフラフィー、サイズ−排除クロマトグラフィー、およびイオン−交換クロマトフラフィーを含む（例えば、Ｃｏｌｉｇｅｎ  ａｔ  ｐａｇｅｓ  ２．７．１−２．７．１２  および  ｐａｇｅｓ  ２．９．１−２．９．３；Ｂａｉｎｅｓら、“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ（ＩｇＧ），”ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１０，ｐａｇｅｓ  ７９−１０４（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９２参照）。
【０２５６】
特別な使用のためには、抗−ｐＧ６ｂ抗体の断片を調製するのが望ましいであろう。そのような抗体断片は、例えば、抗体の蛋白質分解加水分解によって得ることができる。抗体断片は、慣用的な方法によって、全抗体のペプシンまたはパパイン消化によって得ることができる。例として、抗体断片は、Ｆ（ａｂ’）２で示される５Ｓ断片を供するための抗体のペプシンでの酵素切断によって生産することができる。この断片は、さらに、チオール還元剤を用いて切断して、３．５Ｓ  Ｆａｂ’一価断片を生じさせることができる。所望により、切断反応は、ジスルヒド結合の切断に由来するスルフヒドリル基の代わりにブロッキング基を用いて行うことができる。例として、ペプシンを用いる酵素切断は、２つの一価Ｆａｂ断片およびＦｃ断片を直接的に生じる。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，米国特許第４，３３１，６４７，Ｎｉｓｏｎｏｆｆら、Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０，１９６０；Ｐｏｒｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．７３：１１９，１１９，１９５９；Ｅｄｅｌｍａｎら、ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１，ｐａｇｅ  ４２２（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９６７），および  ｂｙＣｏｌｉｇａｎ  ａｔ  ｐａｇｅｓ２．８．１−２．８．１０および２．１０．−２．１０．４によって記載されている。
【０２５７】
一価軽鎖−重鎖断片を形成するための重鎖の分離、断片のさらなる切断、または他の酵素、化学的または遺伝子的技術のような抗体を切断する他の方法も、断片が無傷抗体によって認識される抗原に結合する限りは用いることもできる。
【０２５８】
例えば、Ｆｖ断片はＶＨおよびＶＬ鎖の会合を含む。この会合は、Ｉｎｂａｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６２：２６５９，１９７２によって記載されているように非共有結合であり得る。別法として、可変鎖は分子間ジスルヒド結合によって連結することができるか、あるいはグルタルアルデヒドのような化学物質によって架橋することができる（例えば、Ｓａｎｄｈｕ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：４３７，１９９２参照）。
【０２５９】
Ｆｖ断片は、ペプチドリンカーによって連結されるＶＨおよびＶＬ鎖を含むことができる。これらの単一−鎖抗原結合蛋白質（ｓｃＦｖ）は、オリゴヌクレオチドによって連結されたＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。構造遺伝子は発現ベクターに挿入され、これは、引き続いて、Ｅ．ｃｏｌｉのような宿主細胞に導入される。組換え宿主細胞は、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドで単一ポリペプチド鎖を合成する。ｓｃＦｖｓを生産する方法は、例えば、Ｗｈｉｔｌｏｗら、Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２：９７，１９９１によって記載されている（また、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３，１９８８；Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第４，９４６，７７８号；Ｐａｃｋら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１２７１，１９９３，およびＳａｎｄｈｕ，ｓｕｐｒａも参照）。
【０２６０】
例として、ｓｃＦｖは、リンパ球をｐＧ６ｂポリペプチドにインビトロで暴露し、次いで、（例えば、固定化されたまたは標識されたｐＧ６ｂ蛋白質またはペプチドの使用を通じて）ファージまたは同様なベクター中の抗体ディスプレイライブラリーを選択することによって得ることができる。潜在的ｐＧ６ｂポリペプチド結合ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージに（ファージディスプレイ）、またはＥ．ｃｏｌｉのような細菌にディスプレイされるランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ランダム突然変異およびランダムポリヌクレオチド合成を介するような多数の方法で得ることができる。これらのランダムペプチドディスプレイライブラリーを用いて、カウンター受容体または受容体のような蛋白質またはポリペプチド、生物学的合成マクロ分子、または有機または無機物質であり得る公知の標的と相互作用するペプチドについてスクリーニングすることができる。そのようなランダムペプチドディスプレイライブラリーを作り出し、およびスクリーニングするための技術は当該分野で知られており（Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，２２３，４０９号、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第４，９４６，７７８号、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，４０３，４８４号，Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，５７１，６９８号およびＫｅｙら、Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９６））、およびランダムペプチドディスプレイライブラリーおよびそのようなライブラリーをスクリーニングするためのキットは、例えば、ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ  ＭＡ）、およびＰｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から商業的に入手可能である。ランダムペプチドディスプレイライブラリーは、本明細書中に開示されたｐＧ６ｂ配列を用いてスクリーニングして、ｐＧ６ｂに結合する蛋白質を同定することができる。
【０２６１】
抗体断片のもう１つの形態は、単一相補性−決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）は、注目する抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。そのような遺伝子は、例えば、抗体−生産細胞のＲＮＡから可変領域を合成するポリメラーゼ鎖反応を用いることによって調製される（例えば、Ｌａｒｒｉｃｋら、Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２：１０６（１９９１），Ｃｏｕｒｔｅｎａｙ−Ｌｕｃｋ，“Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｇｅｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｒｉｔｔｅｒら、（ｅｄｓ．），ｐａｇｅ  １６６（Ｃａｍｂｒｉｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５），およびＷａｒｄら、“Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｒｃｈら、（ｅｄｓ．），ｐａｇｅ  １３７（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）参照）。
【０２６２】
別法として、抗−ｐＧ６ｂ抗体は、「ヒト化」モノクローナル抗体に由来することができる。ヒト化モノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンの可変重鎖および軽鎖からのマウス相補性決定領域をヒト可変ドメインに導入することによって生産される。次いで、ヒト抗体の典型的な残基をネズミカウンターパートのフレームワーク領域において置換する。ヒト化モノクローナル抗体に由来する抗体成分の使用は、ネズミ定常領域の免疫原性に関連した潜在的問題を軽減する。ネズミ免疫グロブリン可変ドメインをクローン化するための一般的技術は、例えば、Ｏｒｌａｎｄｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：３８３３，１９８９によって記載されている。ヒト化モノクローナル抗体を生産するための技術が、例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２，１９８６；Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２８５，１９９２；Ｓａｎｄｈｕ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：４３７，１９９２；Ｓｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１５０：２８４４，１９９３；Ｓｕｄｈｉｒ（ｅｄ．）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５），Ｋｅｌｌｅｙ，“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｃｌｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  ３９９−４３４（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９６）によって、およびＱｕｅｅｎら、米国特許第５，６９３，７６２号（１９９７）によって記載されている。
【０２６３】
本発明の特別な実施形態において、抗−ｐＧ６ｂ抗体は以下の特徴によって特徴付けられる：
（ａ）抗体はｐＧＢ６の細胞外ドメインに特異的に結合する；および
（ｂ）抗体は、マイクロビーズに共有結合によりカップリングして抗体の固定化された形態を生じる場合、インビトロにてＴ細胞におけるＴｃＲ−媒介活性化を阻害することができ、ここに、ＴｃＲ−媒介活性化は、Ｔ細胞を、マイクロビーズともカップリングした作動性抗−ＣＤ３抗体と接触させる工程を含む。
【０２６４】
典型的には、抗−ｐＧ６ｂ抗体はヒトｐＧ６ｂ（配列番号３）またはマウスｐＧ６ｂ（配列番号６）の細胞外ドメインに結合する。ある変形において、抗−ｐＧ６ｂ抗体は、さらに、抗体の固定化された形態は、抗−ｐＧ６ｂ抗体の非存在下においてマイクロビーズに共有結合によりカップリングされた抗−ＣＤ３と接触させた対照Ｔ細胞と比較して、少なくとも約５０％ＴｃＲ−媒介活性化を阻害することができる点で特徴付けられる。なお他の変形において、抗−ｐＧ６ｂ抗体は、さらに、抗体の固定化された形態が、Ｔ細胞を、マイクロビーズに共有結合された抗−ＣＤ３抗体、および可溶性の作動性抗−ＣＤ２８抗体と接触させる工程を含むＴｃＲ−媒介活性化を阻害することができる点で特徴付けられる。特別な変形において、抗−ｐＧ６ｂ抗体は、ビーズ−カップルド抗−ＣＴＬＡ−４ｍＡ（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ｃｌｏｎｅ＃４８８１５，カタログ番号ＭＡＢ３２５）について観察されたものにほぼ同等なビーズにカップリングされた場合のＴ細胞阻害活性を有する。Ｔ細胞活性化は、例えば、特定のＴ細胞サブ集団、典型的にはＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞に関して評価することができる。Ｔ細胞活性化を評価するための抗体の共有結合カップリングのための好適なマイクロビーズは、例えば、ラテックスまたは常磁性ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＳＡ（Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙから商業的に入手可能なトシル活性化ビーズ）を含む。
【０２６５】
他の実施形態において、抗−ｐＧ６ｂ抗体は以下の特性によって特徴付けられる：
（１）抗体はｐＧ６ｂ蛋白質の細胞外ドメインに特異的に結合する；および
（２）抗体は、可溶性形態において、
（ｉ）インビトロにてＴ細胞におけるＴｃＲ−媒介活性化を阻害することができ、ここに、ＴｃＲ−媒介活性化は、ＣＤ２８−媒介共−刺激の非存在下においてＴ細胞を可溶性の作動性抗−ＣＤ３抗体と接触させる工程を含み；および／または
（ｉｉ）インビトロにてＴ細胞におけるＴｃＲ−媒介活性化を増強することができ、ここに、ＴｃＲ−媒介活性化は、Ｔ細胞を、抗−ＣＤ３抗体および可溶性の作動性抗−ＣＤ２８抗体と接触させる工程を含む。
【０２６６】
典型的な変形において、抗−ｐＧ６ｂ抗体はヒトｐＧ６ｂ（配列番号３）またはマウスｐＧ６ｂ（配列番号６）の細胞外ドメインに結合する。特定の実施形態において、抗体は上述した（ｉ）および（ｉｉ）双方によって特徴付けられる。好ましくは、抗体の可溶性形態が、インビトロにて抗−ＣＤ３−刺激Ｔ細胞においてＴｃＲ−媒介活性化を阻害できる場合、可溶性抗体は、ＣＤ２８−媒介共−刺激の非存在下において、および抗−ｐＧ６ｂ抗体の非存在下において、可溶性抗−ＣＤ３抗体と接触される対照Ｔ細胞と比較して、少なくとも約５０％ＴｃＲ−媒介活性化を阻害することができ；例えば、特別な変形において、ＴｃＲ−媒介活性化の阻害は約５０％〜約９０％間であって、特別な実施形態において、阻害は約９０％である。さらに、可溶性抗体がインビトロにて抗−ＣＤ３／抗−ＣＤ２８−刺激Ｔ細胞におけるＴｃＲ−媒介活性化を増強させることができ、ＴｃＲ−媒介活性化がＴ細胞を可溶性抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８抗体と接触させる工程を含む場合、可溶性抗−ｐＧ６ｂ抗体は、典型的には、抗−ｐＧ６ｂ抗体の非存在下において、抗−ＣＤ３抗体および抗−ＣＤ２８抗体双方と接触される対照Ｔ細胞と比較して、少なくとも約２０％ＴｃＲ−媒介活性化を増強させることができ；例えば、いくつかの変形において、ＴｃＲ−媒介活性化の増強は約２０％〜約３０％間であって、特別な実施形態において、増強は約３０％である。Ｔ細胞活性化は、例えば、特定のＴ細胞サブ集団、典型的にはＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞に対して評価することができる。
【０２６７】
そのような抗−ｐＧ６ｂ抗体の特徴を評価するための好適なインビトロＴ細胞活性化アッセイは、本明細書中にさらに記載されたＴ細胞増殖アッセイを含めた当該分野で良く知られたＴ細胞増殖アッセイを含む。ＴｃＲおよびＣＤ２８シグナル伝達経路を刺激するための作動性抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８抗体もまた当該分野で良く知られており、商業的に入手可能であって、例えば、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからの抗−ＣＤ３  ｍＡｂ（５５５３２９）および抗−ＣＤ２８  ｍＡｂ（５５５７２５）を含む。抗−ｐＧ６ｂ抗体特徴についての例示的なＴ細胞増殖アッセイは後に実施例５においてさらに記載される。
【０２６８】
上述したインビトロ生物学的特性を有する抗−ｐＧ６ｂ抗体は、例えば、ｐＧ６ｂ細胞外ドメイン（例えば、配列番号３に記載されたヒトｐＧ６ｂの細胞外ドメイン）を含むポリペプチドを（本明細書中で議論したような抗体生産のための方法を用いて）ポリクローナルまたはモノクローナル抗体の生産用の免疫原として用い、次いで、本明細書中で議論した、例えば、Ｔ細胞増殖アッセイのようなインビトロＴ細胞活性化アッセイで生じた抗体をスクリーニングして、所望の特性を有する抗体を同定することによって容易に得ることができる。ヒトｐＧ６ｂ（配列番号３）の細胞外ドメインで特異的に結合する抗体を生じさせる例示的方法は、さらに、後記実施例３に記載される。インビトロ機能的特徴を評価するには、アッセイは、抗−ＣＤ３  ｍＡｂと一緒にビーズ（例えば、Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＳＡ（Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）から商業的に入手可能なトシル活性化ビーズ）に対するｐＧ６ｂ抗体の共有結合カップリングを含んで、抗−ＣＤ３および／または抗−ＣＤ３／抗−ＣＤ２８−誘導Ｔ細胞活性化に対する阻害降下を有する抗体についてスクリーニングすることができる。別法として、可溶性抗−ｐＢ６ｂ抗体を、ＣＤ２８共−刺激の非存在下において抗−ＣＤ３−誘導Ｔ細胞活性化に対する阻害降下について、および／または抗−ＣＤ３／抗−ＣＤ２８−誘導Ｔ細胞活性化の増強についてテストすることができる。抗−ｐＧ６ｂ抗体の阻害および／または刺激効果を評価するための、かつ所望の特徴を有する抗−ｐＧ６ｂ抗体を容易に同定するのに用いることができる例示的なインビトロアッセイは、さらに、後記実施例５に記載される。
【０２６９】
本発明の抗−ｐＧ６ｂ抗体または抗体断片は、当該分野における、および本明細書中に記載された方法を用いてＰＥＧ化することができる。
【０２７０】
さらに、ポリクローナル抗−イディオタイプ抗体は、標準的な技術を用い、動物を抗−ｐＧ６ｂ抗体または抗体断片で免疫化することによって調製することができる。例えば、Ｇｒｅｅｎら、“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｓｅｒａ，”ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍａｎｓｏｎ（ｅｄ．），ｐａｇｅｓ  １−１２（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  １９９２）参照。また、Ｃｏｌｉｇａｎ  ａｔ  ｐａｇｅｓ  ２．４．１−２．４．７参照。別法として、モノクローナル抗−イディオタイプ抗体は、上述した技術にて、免疫原として抗−ｐＧ６ｂ抗体または抗体断片を用いて調製することができる。もう１つの別のヒト化抗−イディオタイプ抗体またはサブヒト霊長類抗−イディオタイプ抗体は上述した技術を用いて調製することができる。抗−イディオタイプ抗体を生産する方法は、例えば、Ｉｒｉｅ，米国特許第５，２０８，１４６号，Ｇｒｅｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，６３７，６７７号およびＶａｒｔｈａｋａｖｉ  ａｎｄ  Ｍｉｎｏｃｈａ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７７：１８７５，１９９６によって記載されている。
【０２７１】
抗−ｐＧ６ｂ抗体は検出可能な標識とコンジュゲートさせて、抗−ｐＧ６ｂ免疫抱合体を形成することができる。好適な検出可能な標識は、例えば、放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識、生物発光標識またはコロイド状金を含む。そのような検出可能に標識された免疫抱合体を作製し、検出する方法は当業者によく知られており、以下により詳細に記載される。
【０２７２】
検出可能な標識は、オートラジオグラフィーによって検出される放射性同位体であり得る。本発明の目的で特に有用な同位体は３Ｈ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、および１４Ｃである。
【０２７３】
抗−ｐＧ６ｂ免疫抱合体は蛍光化合物で標識することもできる。蛍光標識された抗体の存在は、免疫抱合体を好適な波長の光に暴露し、得られた蛍光を検出することによって決定される。蛍光標識化合物はフルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒドおよびフルオレスカミンを含む。
【０２７４】
別法として、抗−ｐＧ６ｂ免疫抱合体は、抗体成分を化学発光化合物にカップリングさせることによって検出可能に標識することができる。化学発光−標識化免疫コンジュゲートの存在は、化学反応のコースの間に生起するルミネセンスの存在を検出することによって決定する。化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびオキサレートエステルを含む。
【０２７５】
同様に、生物発光化合物を用いて、本発明の抗−ｐＧ６ｂ免疫抱合体を標識することができる。バイオルミネセンスは、触媒蛋白質が化学発光反応の効率を増加させる生物学的系において見出されるケミルミネセンスのタイプである。生物発光蛋白質の存在は、ルミネセンスの存在を検出することによって決定される。標識で有用な生物発光化合物はルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンを含む。
【０２７６】
別法として、抗−ｐＧ６ｂ免疫抱合体は、抗−ｐＧ６ｂ抗体成分を酵素に連結させることによって検出可能に標識することができる。抗−ｐＧ６ｂ−酵素コンジュゲートを好適な基質の存在下でインキュベートする場合、酵素部位は基質と反応して、化学部位を生じ、これは、例えば、分光光学、フルオロメトリーまたは肉眼手段によって検出することができる。多特異的免疫抱合体を検出可能に標識するのに用いることができる酵素の例は、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼを含む。
【０２７７】
当業者であれば、本発明に従って使用することができる他の好適な標識を知っているであろう。抗−ｐＧ６ｂ抗体へのマーカー部位の結合は、当該分野で知られた標準的な技術を用いて達成することができる。この点に関して典型的な方法は、Ｋｅｎｎｅｄｙら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ７０：１（１９７６），Ｓｃｈｕｒｓら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ  ８１：１（１９７７），Ｓｈｉｈら、Ｉｎｔ‘ｌ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４６：１１０１（１９９０），Ｓｔｅｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：１３３０（１９９０），およびＣｏｌｉｇａｎ，ｓｕｐｒａによって記載されている。
【０２７８】
さらに、免疫化学検出の便宜および多様性は、アビジン、ストレプトアビジン、およびビオチンとコンジュゲートされている抗−ｐＧ６ｂ抗体を用いることによって増強させることができる（例えば、Ｗｉｌｃｈｅｋら、（ｅｄｓ．），“Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８４（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９０）、およびＢａｙｅｒら、“Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ａｖｉｄｉｎ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１０，Ｍａｎｓｏｎ（ｅｄ．），ｐａｇｅｓ  １４９−１６２（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９２）参照）。
【０２７９】
イムノアッセイを行うための方法はよく確立されている。例えば、Ｃｏｏｋ  ａｎｄ  Ｓｅｌｆ，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，”ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｒｉｔｔｅｒ  ａｎｄ  Ｌａｄｙｍａｎ（ｅｄｓ．），  ｐａｇｅｓ  １８０−２０８，（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５），Ｐｅｒｒｙ，“Ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｅｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｒｃｈ  ａｎｄ  Ｌｅｎｎｏｘ（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  １０７−１２０（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５），ａｎｄ  Ｄｉａｍｏｎｄｉｓ，Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ａｃａｄｉｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．Ｉｎｃ．１９９６）参照。
【０２８０】
本発明では、ｐＧ６ｂ遺伝子発現のための免疫学的診断アッセイを行うためのキットが考えられる。そのようなキットは、抗−ｐＧ６ｂ抗体、または抗体断片を含む少なくとも１つの容器を含む。キットはｐＧ６ｂ抗体または抗体断片の存在を示すことができる１つ以上の試薬を含む第二の容器も含むことができる。そのようなインジケーター試薬の例は放射性標識、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識、生物発光標識、コロイド状金等のような検出可能な標識を含む。キットは、ｐＧ６ｂ抗体または抗体断片を用いてｐＧ６ｂ蛋白質を検出するユーザーに運ぶための手段も含むことができる。例えば、書面による指示書は、入れられた抗体または抗体断片を用いてｐＧ６ｂを検出することができることを述べることができる。書面による材料は容器に直接的に適用することができ、あるいは書面による材料は添付文書の形態で供することができる。
【０２８１】
９．そのカウンター受容体へのｐＧ６ｂ結合に作動し、または拮抗する抗−ｐＧ６ｂ抗体の使用
本明細書中で有用な抗体を作り出し、または選択するための別の技術は、抗原エピトープのような可溶性ｐＧ６ｂ受容体ポリペプチドまたはその断片に対するリンパ球のインビトロ暴露、および（例えば、抗原エピトープのような、固定化されたまたは標識された可溶性ｐＧ６ｂ受容体ポリペプチドまたはその断片の使用を介する）ファージまたは同様なベクター中の抗体ディスプレイライブラリーの選択を含む。抗原エピトープのような、可溶性ｐＧ６ｂ受容体ポリペプチドまたはその断片のような潜在的結合ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージ上に（ファージディスプレイ）またはＥ．ｃｏｌｉのような細菌上にディスプレイされたランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ランダム突然変異誘発およびランダムポリヌクレオチド合成を介するような、多数の方法で得ることができる。これらのランダムペプチドディスプレイライブラリーを用いて、カウンター受容体または受容体のような蛋白質またはポリペプチド、生物学的または合成マクロ分子、または有機または無機物質であり得る公知の標的と相互作用するペプチドについてスクリーニングすることができる。そのようなランダムペプチドディスプレイライブラリーを作り出し、スクリーニングするための方法は当該分野で知られており（Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，２２３，４０９号；Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第４，９４６，７７８号，Ｌａｄｎｅｒら、５，４０３，４８およびＬａｄｎｅｒら、米国特許第５，５７１，６９８号）、およびランダムペプチドディスプレイライブラリー、およびそのようなライブラリーをスクリーニングするためのキットは、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）およびＰｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から商業的に入手可能である。ランダムペプチドディスプレイライブラリーは、本明細書中に開示された抗原エピトープポリペプチド配列のような可溶性ｐＧ６ｂ受容体ポリペプチドまたはその断片を用いてスクリーニングして、ｐＧ６ｂ−を含む受容体ポリペプチドに結合する蛋白質を同定することができる。可溶性ｐＧ６ｂ−を含む受容体ポリペプチドと相互作用するこれらの「結合ポリペプチド」は細胞を標識化するために；アフィニティー精製によりホモログポリペプチドを単離するために用いることができ；それらは、薬物、トキシン、放射性核種等に直接的にまたは間接的にコンジュゲートさせることができる。これらの結合ポリペプチドは、発現ライブラリーをスクリーニングするのに、および活性に作動するおよび／または中和するのに、例えば、ｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の間の相互作用に結合し、ブロックし、阻害し、低下させ、拮抗し、または中和するのに、のように解析方法において用いることもできる。結合ポリペプチドは、可溶性ｐＧ６ｂ−を含む受容体ポリペプチドの循環レベルを検出するのに；基礎となる病理学または��気のマーカーとしての可溶性または非−可溶性ｐＧ６ｂ−を含む受容体を検出し、または計量するのに診断アッセイで用いることもできる。これらの結合ポリペプチドは、（例えば、カウンター受容体への）膜−結合ｐＧ６ｂモノマー受容体、またはｐＧ６ｂホモポリマー、ヘテロダイマーまたはマルチマーポリペプチド結合、およびインビトロおよびインビボでのシグナル変換をブロックし、または阻害するための「アンタゴニスト」として作用することもできる。再度、これらの結合ポリペプチドは抗−ｐＧ６ｂモノマー受容体、または抗−ｐＧ６ｂホモダイマー、ヘテロダイマーまたはマルチマーポリペプチドとして働き、ｐＧ６ｂ活性、ならびにｐＧ６ｂカウンター受容体活性または蛋白質−結合を阻害するのに有用である。本発明の天然受容体複合体に対して生起された抗体、およびｐＧ６ｂ−エピトープ−結合抗体、および抗−ｐＧ６ｂ中和モノクローナル抗体は好ましい実施形態であろう。というのは、それらはｐＧ６ｂに対してより特異的に作用でき、そのカウンター受容体へのその結合を阻害できるからである。さらに、本発明の抗体の作動、拮抗および結合活性は、本明細書中に記載されたｐＧ６ｂ増殖、シグナルトラップ、そのカウンター受容体またはいずれかの他のＢ７ファミリー受容体、およびｐＧ６ｂ−を含む可溶性受容体の存在下におけるルシフェラーゼまたは結合アッセイ、および他の生物学的または生化学的アッセイにおいてアッセイすることができる。
【０２８２】
抗原エピトープのような、ｐＧ６ｂ受容体ポリペプチドに対する抗体（例えば、配列番号２に対する抗体）、またはその断片は、慢性関節リウマチ、乾癬、アトピー性皮膚炎、炎症性皮膚疾患、内毒素血症、関節炎、喘息、ＩＢＤ、結腸炎、乾癬性関節炎、多発性硬化症、または他の炎症疾患に対する治療用途でインビボにてｐＧ６ｂの炎症効果を阻害するのに；ｐＧ６ｂ受容体を発現する細胞を標識化するのに；アフィニティー精製によって可溶性ｐＧ６ｂ−を含む受容体ポリペプチドを単離するのに；可溶性ｐＧ６ｂ−を含む受容体ポリペプチドの循環レベルを検出するのに診断アッセイのために；基礎となる病理学または病気のマーカーとしての可溶性ｐＧ６ｂ−を含む受容体を検出し、または定量するのに；ＦＡＣＳを使用する解析方法において；ｐＧ６ｂアゴニストとして作用できる抗−イディオタイプ抗体を生じさせるのに；および中和抗体として、またはｐＧ６ｂ受容体機能に結合し、ブロックし、阻害し、低下させ、または拮抗する、あるいはインビトロ、エクスビボ、およびインビボにてｐＧ６ｂ活性に結合し、ブロックし、阻害し、低下させ、拮抗し、または中和するアンタゴニストとして用いることができる。好適な直接的標識または標識は放射性核種、酵素、基質、補因子、ビオチン、阻害剤、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁性粒子等を含み；間接的標識または標識は中間体としてもビオチン−アビジンまたは他の相補体／抗−相補体対の使用をその特徴とできる。抗体は、本明細書中においては、薬物、トキシン、放射性核種等に直接的にまたは関節的にコンジュゲートすることもでき、これらのコンジュゲートはインビボにて、または治療適用で用いることができる。さらに、可溶性ｐＧ６ｂ−を含む受容体ポリペプチド、またはその断片に対する抗体は、インビトロにて、アッセイ、例えば、ウエスタンブロット、または当該分野で公知の他のアッセイにおいて、変性または非−変性ｐＧ６ｂを含む受容体ポリペプチドまたはその断片を検出するのに用いることができる。
【０２８３】
可溶性ｐＧ６ｂ受容体または可溶性ｐＧ６ｂホモダイマー、ヘテロデアイマー、またはマルチマー受容体ポリペプチドに対する抗体は、受容体ポリペプチドの循環レベルを検出するための診断アッセイ、蛍光−活性化細胞ソーティングを使用する解析方法内部、対応する受容体を発現する細胞を標識化し、およびそれらの発現レベルをアッセイするのに有用である。さらに、二価抗体、および抗−イディオタイプ抗体は、ｐＧ６ｂの効果を模倣するアゴニストとして用いることができる。
【０２８４】
本明細書中において、抗体は薬物、トキシン、放射性核種等に直接的にまたは間接的にコンジュゲートさせることもでき、これらのコンジュゲートはインビボ診断または治療的適用で用いることができる。例えば、可溶性ｐＧ６ｂ受容体または可溶性ｐＧ６ｂホモダイマー、ヘテロダイマーまたはマルチマー受容体ポリペプチドを認識する抗体または結合ポリペプチドを用いて、対応する抗−相補性分子（すなわち、ｐＧ６ｂ−を含む可溶性または膜−結合受容体）を発現する組織または器官を同定し、または治療することができる。より詳しくは、可溶性ｐＧ６ｂ−を含む受容体ポリペプチド、またはその生体活性で断片または部分に対する抗体を検出可能なまたは細胞傷害性分子にカップリングさせ、ｐＧ６ｂ−発現癌のようなｐＧ６ｂ−を含む受容体を発現する細胞、組織または器官を有する哺乳動物に送達することができる。
【０２８５】
好適な検出可能な分子は、（上述で開示した結合ペプチドを含めた）「結合ポリペプチド」のようなｐＧ６ｂ−を含む受容体ポリペプチドに結合するポリペプチド、抗体、またはその生体活性断片または部分に直接的にまたは間接的に結合することができる。好適な検出可能な分子は放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁性粒子等を含む。可溶性細胞傷害性分子はポリペプチドまたは抗体に直接的にまたは間接的に結合することができ、細菌または植物トキシン（例えば、ジフテリアトキシン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエキソトキシン、リシン、アブリン等）、ならびに（ポリペプチドまたは抗体に直接的に結合した、または例えば、キレート化部位の手段を通じて間接的に結合した）ヨウ素−１３１、レニウム−１８８またはイットリウム−９０のような治療放射性核種を含む。結合ポリペプチドまたは抗体はアドリアマイシンのような細胞傷害性薬物にコンジュゲートすることもできる。検出可能なまたは細胞傷害性分子の間接的結合のためには、検出可能なまたは細胞傷害性分子は相補性／抗相補性対のメンバーとコンジュゲートすることができ、ここに、他のメンバーは結合ポリペプチドまたは抗体部分に結合する。これらの目的で、ビオチン／ストレプトアビジンは例示的な相補性／抗相補性対である。
【０２８６】
もう１つの実施形態において、結合ポリペプチド−トキシン融合蛋白質または抗トキシン融合蛋白質は、（例えば、癌細胞または組織を治療するのに）標的細胞または組織の阻害または除去で用いることができる。別法として、もし結合ポリペプチドが多重機能ドメイン（すなわち、活性化ドメインまたはカウンター受容体結合ドメイン、＋標的化ドメイン）を有するならば、標的化ドメインのみを含む融合蛋白質は、検出可能な分子、細胞傷害性分子または相補性分子を注目する細胞または組織タイプに向けるのに適しているであろう。単一ドメインのみを含む融合蛋白質が相補性分子を含む場合、抗−相補性分子は検出可能なまたは細胞傷害性分子にコンジュゲートすることができる。かくして、そのようなドメイン−相補性分子融合蛋白質は、総括的抗−相補的−検出可能な／細胞傷害性分子コンジュゲートの細胞／組織−特異的送達のための総括的標的化媒体を表す。
【０２８７】
別法として、本明細書中に記載されたｐＧ６ｂ受容体結合ポリペプチドまたは抗体融合蛋白質は、ｐＧ６ｂ受容体−変調アポトーシス経路を直接的に刺激し、その結果、ｐＧ６ｂ−を含む受容体を発現する過剰増殖細胞の細胞死滅をもたらすことによって、標的組織のインビボ殺傷を増強させるのに用いることができる。
【０２８８】
１０．ｐＧ６ｂ活性を有するポリペプチド、またはｐＧ６ｂに対する抗体の治療的使用
可溶性ｐＧ６ｂ活性を有するアミノ酸配列を用いて、ｐＧ６ｂカウンター受容体を結合し、かくして、ｐＧ６ｂカウンター受容体と内因性ｐＧ６ｂ受容体との結合を妨げることによって、免疫系を変調することができる。抗−ｐＧ６ｂ抗体のようなｐＧ６ｂアンタゴニストを用いて、ｐＧ６ｂカウンター受容体と内因性ｐＧ６ｂ受容体との結合を阻害することによって、免疫系を変調することもできる。したがって、本発明は、適切な量のこのポリペプチドを欠如する、または過剰のｐＧ６ｂカウンター受容体を生産する対象に対する、（可溶性ｐＧ６ｂポリペプチド、ｐＧ６ｂポリペプチド断片、ｐＧ６ｂ類似体（例えば、抗−ｐＧ６ｂ抗−イディオタイプ抗体）、およびｐＧ６ｂ融合蛋白質のような）ｐＧ６ｂ活性を有する蛋白質、ポリペプチドおよびペプチドの使用を含む。また、ｐＧ６ｂアンタゴニスト（例えば、抗−ｐＧ６ｂ抗体）を用いて、過剰のｐＧ６ｂカウンター受容体またはｐＧ６ｂいずれかを生産する対象を治療することもできる。好適な対象はヒトのような哺乳動物を含む。
【０２８９】
例えば、ある態様において、ｐＧ６ｂアンタゴニストは癌の治療で有用である。いずれかの特定の作用メカニズムに拘束されるつもりはないが、Ｔリンパ球活性の陰性レギュレーターとして、ｐＧ６ｂは、Ｔ細胞を十分に活性化し、それにより、ある種の腫瘍の貧弱な免疫原性に潜在的に寄与するのに必要な１つ以上の刺激性シグナルを阻害するように作用すると考えられる。従って、拮抗的抗−ｐＧ６ｂ抗体を用いるような、阻害性ｐＧ６ｂ−誘導シグナルのブロックは、癌の治療において腫瘍細胞に対して宿主免疫系を増加させるのに有用であり得る。Ｔ細胞活性のもう１つの陰性レギュレーター、（ＣＤ２８ファミリーメンバーでもある）ＣＴＬＡ−４のブロックでの癌のそのような治療は従前に示されており（例えば、Ｌｅａｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７１：１７３４−１７３６，１９９６参照）、および癌の治療のためのブロッキング抗−ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂの使用は現在臨床試験を受けている。
【０２９０】
従って、具体的な態様において、インビボにてブロッキング効果を供するのに有用な抗体は、インビトロにてビーズに共有結合によりカップリングした場合に、Ｔ細胞に対して阻害性活性を示す本発明の抗−ｐＧ６ｂ抗体を含む。この点に関して、本発明者らは、ある種の抗−ｐＧ６ｂモノクローナル抗体が、抗−ＣＴＬＡ−４ｍＡｂで観察された阻害性活性と同様に、およびいくつかの場合には、それとほぼ同等な、ビーズに共有結合した場合に、Ｔ細胞に対してインビトロ阻害活性を呈したことを見出した（実施例５および図７、８および９参照）。抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ３／抗−ＣＤ２８−誘導Ｔ細胞活性化に対するそのような阻害性活性を有する抗−ＣＴＬＡ−４抗体は、そのようなＴＬＡ−４  ｍＡｂが（例えば、ビーズ上の固定化のような）架橋条件下で提示された場合には、抗−ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂが非−架橋形態に提示されるある種の条件下でブロックを介してＴ細胞活性化も増強することが示された（例えば、Ｋｒｕｍｍｅｌ  ａｎｄ  Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：４５９−４６５，１９９５参照）。かくして、共有結合によりカップリングされた抗−ｐＧ６ｂ抗体に関して観察されたインビトロ結果は、Ｔ細胞活性化におけるｐＧ６ｂについての陰性調節役割と合致し、さらに、そのような抗体はインビボにて阻害性ｐＧ６ｂ活性をブロックするように作用して、癌に対する宿主免疫応答を増強させるように、陽性Ｔ細胞共−刺激を増強させることを示す。
【０２９１】
本発明の他の抗体は、癌に対するように、宿主免疫応答を増大させるのにも有用であり、例えば、可溶性形態でＴ細胞に提示された場合、抗−ＣＤ３／抗−ＣＤ２８−誘導Ｔ細胞活性化の増強を呈する抗−ｐＧ６ｂ抗体を含む。
【０２９２】
他の態様において、作動性ｐＧ６ｂポリペプチドおよび抗−ｐＧ６ｂ抗体は、Ｔ細胞活性化のｐＧ６ｂ−媒介阻害を誘導することによって、免疫応答をダウンレギュレートするのに有用である。従って、特定の実施形態において、そのようなポリペプチドおよび抗体は、例えば、乾癬、アトピー性皮膚炎、炎症性皮膚疾患、乾癬性関節炎、関節炎、内毒素血症、喘息、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、結腸炎、および本明細書中に開示された他の炎症性疾患を含めた、自己免疫または炎症病の治療で有用である。
【０２９３】
従って、いくつかの変形において、本発明は、特に、ｐＧ６ｂのインビボアゴニストの剤を投与することによって乾癬を治療する方法である。実施形態いくつかの実施形態において、ｐＧ６ｂのアゴニストは、ｐＧ６ｂに結合して、ｐＧ６ｂおよびｐＧ６ｂカウンター受容体の相互作用を模倣し、または増大させる抗−ｐＧ６ｂ抗体である。そのようなアゴニストは、単独で、あるいは滑沢剤、ケラチン溶解剤、局所コルチコステロイド、局所ビタミンＤ誘導体、アントラリン、メトトレキサートのような前進抗代謝産物剤、プソラレン−紫外線療法（ＰＵＶＡ）、エトレチネート、イソトレチノイン、サイクロスポリン、および局所ビタミンＤ３誘導体カルシポトリオールのような他の確立された療法と組合せて投与することができる。さらに、そのようなアゴニストは、アンタゴニストを含有するクリームまたは経皮パッチを用い、個体に皮下、静脈内または経皮投与することができる。もし皮下投与するならば、アゴニストは１つ以上の乾癬プラークに注射することができる。もし経皮投与するならば、アゴニストは、アゴニストを含有するクリーム、軟膏、膏薬または溶液を用い、プラーク上に直接的に投与することができる。
【０２９４】
ｐＧ６ｂに対するアゴニストは、喘息、気管支炎または嚢胞性線維症、または炎症性肺病を有する個人に投与して、該病気を治療することもできる。アゴニストは、静脈内、皮下、気管支洗浄を含めたいずれかの好適な方法、およびアンタゴニストを含有する吸入剤の使用によって投与することができる。
【０２９５】
かくして、本発明の特別な実施形態は、乾癬、乾癬性関節炎、アトピー性皮膚炎、炎症性皮膚疾患、慢性関節リウマチ、炎症成長疾患（ＩＢＤ）、クローン病、憩室病、喘息、膵臓炎、Ｉ型糖尿病（ＩＤＤＭ）、膵臓癌、膵臓炎、グラデ病、自己免疫疾患、敗血症、器官または骨髄移植体のような炎症および免疫病または疾患；内毒素血症、外傷、外科的処置または感染による炎症；脾腫；移植片−対−宿主病；において、および炎症の阻害、免疫抑制、造血系、免疫系、炎症またはリンパ系細胞、マクロファージ、（Ｔｈ１およびＴｈ２細胞を含めた）Ｔ−細胞の増殖の低下、抗原に対する免疫応答の抑制、またはｐＧ６ｂ−誘導阻害シグナルが望まれる場合に、ｐＧ６ｂアゴニストとしての抗−ｐＧ６ｂ抗体の使用に向けられる。
【０２９６】
さらに、本明細書中に記載したｐＧ６ｂポリペプチドに結合する抗体または結合性ポリペプチド、およびｐＧ６ｂポリペプチドそれ自体は以下で有用である：
（１）急性炎症、外傷、組織負傷、外科的処置、敗血症または感染の結果としての炎症、および喘息、炎症成長疾患（ＩＢＤ）、慢性結腸炎、脾腫、慢性関節リウマチ、再発性急性炎症エピソード（例えば、結核）のような慢性炎症病の治療、およびアミロイドーシス、およびアテローム性動脈硬化症、ガッスルマン病、喘息、および急性−相応答の誘導に伴う他の病気の治療において、ｐＧ６ｂを介するシグナル伝達をブロックし、阻害し、低下させ、拮抗し、または中和すること。
【０２９７】
（２）ＩＤＤＭ、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、重症筋無力症、慢性関節リウマチ、およびＩＢＤのような免疫疾患の治療においてｐＧ６ｂを介するシグナル伝達をブロックし、阻害し、低下させ、拮抗し、または中和して、ｐＧ６ｂを介する免疫細胞（例えば、リンパ球、単球、白血球）におけるシグナル伝達を予防し、または阻害すること（Ｈｕｇｈｅｓ  Ｃら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５３：３３１９−３３２５，１９９４）。別法として、ｐＧ６ｂに対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）のような抗体をアンタゴニストとして用いて、望まない免疫細胞を枯渇させて、自己免疫疾患を治療することもできる。喘息、アレルギーおよび他のアトピー性病は、例えば、可溶性ｐＧ６ｂ可溶性受容体に対するＭＡｂで治療して、免疫応答を阻害し、または有害な細胞を枯渇させることができる。本発明のポリペプチドおよび抗体を用いるｐＢ６ｂを介するシグナル伝達のブロッキング、阻害、低下または拮抗もまた、膵臓、腎臓、下垂体およびニューロン細胞の病気に有益であり得る。ＩＤＤＭ、ＮＩＤＤＭ、膵臓炎、および膵臓癌腫にも有益であり得る。ｐＧ６ｂは、拮抗性ＭＡｂが癌の成長を阻害し、免疫−媒介殺傷を標的化する場合、癌のｍＡｂ療法に対する標的として働くことができる（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：１０１５−１０１６，１９９８）。可溶性ｐＧ６ｂに対するＭａｂは、糸球体硬化症、膜神経障害、（他の組織の中でも腎臓にも影響する）アミロイドーシス、腎臓アテローム性動脈硬化症、種々の起源の糸球体腎炎、腎臓の繊維増殖病、ならびにＳＬＥ、ＩＤＤＭ、ＩＩ型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、腎臓腫瘍および他の病気に関連する腎臓機能不全のような腎臓障害を治療するのにも有用であり得る。
【０２９８】
（３）ＩＤＤＭ、ＭＳ、ＳＬＥ、重症筋無力症、慢性関節リウマチ、およびＩＢＤのような自己免疫疾患の治療においてｐＧ６ｂを介するシグナル伝達に拮抗し、増強し、増加させ、または開始すること。抗−ｐＧ６ｂ中和およびモノクローナル抗体はリンパ球または他の免疫細胞にシグナルを与えて、分化させ、増殖を改変し、またはサイトカイン、もしくは自己免疫性を軽減する細胞表面蛋白質の生産を変化させることができる。具体的には、Ｔ−細胞応答の変調は、自己免疫応答を逸脱させて、病気を緩和することができる（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：４８４１−４８４９，１９９８）。同様に、作動性抗−ｐＧ６ｂモノクローナル抗体を用いて、慢性関節リウマチ、喘息、アレルギーおよびアトピー性疾患に関与する免疫細胞にシグナルを送り、枯渇させて、逸脱させることができる。ｐＧ６ｂを介するシグナル伝達は、膵臓、腎臓、下垂体およびニューロン細胞の病気にも有益であり得る。ＩＤＤＭ、ＮＩＤＤＭ、膵臓炎、および膵臓癌腫にも有益であり得る。ｐＧ６ｂは、シグナル伝達ＭＡｂが癌の成長を阻害し、免疫−媒介殺傷を標的化する膵臓癌のＭＡｂ療法について標的として働くことができる（Ｔｕｔｔ，ＡＬら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：３１７５−３１８５，１９９８）。同様に、腎臓細胞癌腫は、本発明のｐＧ６ｂ−を含む可溶性受容体に対するモノクローナル抗体で治療することができる。
【０２９９】
本明細書中に記載された可溶性ｐＧ６ｂポリペプチドを用いて、上述した自己免疫疾患、アトピー性疾患、ＮＩＤＤＭ、膵臓炎および腎臓機能不全の治療において、単独で、または一緒にして、ｐＧ６ｂ活性に結合し、それをブロックし、阻害し、低下させ、拮抗し、または中和することができる。ｐＧ６ｂの可溶性形態を用いて、Ｔｈ細胞によって媒介される抗体応答を促進し、および／またはリンパ球または他の免疫細胞によるＩＬ−４または他のサイトカインの生産を促進することができる。
【０３００】
さらに、炎症は、侵入剤をかわすための生物による保護応答である。炎症は、多くの細胞性および液性メディエーターが関連するカスケーディング事象である。一方において、炎症応答の抑制は宿主を免疫寛容のままとすることができ；しかしながら、もしチェックせずに放置すれば、炎症は、慢性炎症病（例えば、乾癬、関節炎、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、炎症性腸疾患等）、敗血症ショックおよび多発性器官不全を含めた深刻な合併症に導き得る。重要なことには、これらの多様な病気状態は共通する免疫メディエーターを共有する。炎症によって特徴付けられる集合的病気は、ヒトの有病率および死亡率に対して大きなインパクトを有する。従って、ｐＧ６ｂ、そのカウンター受容体、および抗−ｐＧ６ｂ抗体のような免疫応答の共刺激および／または阻害に親密に関与する分子は、喘息およびアレルギーから自己免疫および敗血症ショックまでの膨大な数のヒトおよび動物病気に対して非常に重要な治療的能力を有することができるのは明らかである。
【０３０１】
１．関節炎
変形性関節炎、慢性関節リウマチ、負傷等の結果としての関節炎関節を含めた関節炎は、本発明のｐＧ６ｂポリペプチドのような抗−炎症蛋白質の治療的使用が有益である普通の炎症疾患である。例えば、慢性関節リウマチ（ＲＡ）は、全身に影響する全身病であって、関節炎の最も普通の形態の１つである。それは、疼痛、凝り、温かさ、発赤および腫れを引き起こす、関節内膜の炎症によって特徴付けられる。炎症細胞は、骨および軟骨を消化し得る酵素を放出する。慢性関節リウマチの結果として、膨張した関節内面である滑膜は、骨および軟骨を冒し、それを損傷しかねず、生理学的効果の中でも関節の破壊および酷い疼痛に導く。関連する関節はその形状および整列を失いかねず、疼痛および運動の喪失をもたらす。
【０３０２】
慢性関節リウマチ（ＲＡ）は、酷い無能力および増大した死亡率に導く炎症および引き続いての組織損傷によって特に特徴付けられる免疫−媒介病である。種々のサイトカインがリウマチ関節において局所的に生産される。多数の研究が、ＩＬ−１およびＴＮＦ−アルファ、２つのプロトタイプのプロ−炎症サイトカインは、滑膜炎症に、および進行性関せ悦は会に関与するメカニズムにおいて重要な役割を演じることを示している。事実、ＲＡを持つ患者におけるＴＮＦ−アルファおよびＩＬ−１阻害剤の投与は、炎症の臨床的および生物学的兆候の劇的な改善、および骨侵食および軟骨破壊の放射線学的兆候の低下に導いた。しかしながら、これらの楽観的結果にかかわらず、患者のかなりの割合がこれらの剤に応答せず、これは、他のメディエーターもまた関節炎の病理生理学に関与することを示唆する（Ｇａｂａｙ，Ｅｘｐｅｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．２（２）：１３５−１４９，２００２）。それらのメディエーターの１つはｐＧ６ｂまたはそのカウンター受容体であり得るが、それ自体、ｐＧ６ｂポリペプチド、または抗−ｐＧ６ｂ抗体、または結合パートナーのような、ｐＧ６ｂに結合し、またはその活性を阻害する分子は、慢性関節リウマチおよび他の関節病において炎症を低下させる価値ある治療剤として働き得る。
【０３０３】
当該分野で知られた慢性関節リウマチに対するいくつかの動物モデルがある。例えば、コラーゲン−誘導関節炎（ＣＩＡ）モデルにおいては、マウスは、ヒト慢性関節リウマチによく似た慢性炎症性関節炎を発症する。ＣＩＡはＲＡと共に同様な免疫学的および病理学的特徴を共有するので、これは、それを、潜在的ヒト抗−炎症化合物をスクリーニングするための理想的モデルとする。ＣＩＡモデルは、免疫応答、および炎症応答の双方に依存して起こるマウスにおけるよく知られたモデルである。免疫応答は、抗原として与えられた、コラーゲンに対してＢ−細胞およびＣＤ４＋Ｔ−細胞の相互作用を含み、抗−コラーゲン抗体の生産に導く。炎症相は、マウスの天然コラーゲンに交差反応し、補体カスケードを活性化するこれらの抗体のいくつかの結果として、炎症のメディエーターからの組織応答の結果である。ＣＩＡモデルを用いる利点は、病理の基本的メカニズムが知られていることである。ＩＩ型コラーゲンでの関連Ｔ−細胞およびＢ−細胞エピトープが同定されており、および免疫−媒介関節炎に関連する種々の免疫学的（例えば、遅延型過敏および抗−コラーゲン抗体）および炎症（例えば、サイトカイン、ケモカイン、およびマトリックス−分解酵素）パラメーターは決定されており、かくして、それを用いて、ＣＩＡモデルにおいてテスト化合物の効果を評価することができる（Ｗｏｏｌｅｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｒｈｅｕｍ．３：４０７−２０，１９９９；Ｗｉｌｌｉａｍら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．８９：９７８４−７８８，１９９２；Ｍｙｅｒｓら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６１：１８６１−７８，１９９７；ａｎｄ  Ｗａｎｇら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．９２：８９５５−９５９，１９９５）。
【０３０４】
２．内毒素血症
内毒素血症は、通常、細菌および他の感染症剤のような感染剤、敗血症、毒ショック症候群に由来し、あるいは日和見感染等に従う免疫寛容患者における酷い疾患である。本発明のｐＧ６ｂポリペプチドおよび抗体のような治療的に有用な抗−炎症蛋白質は、ヒトおよび動物において内毒素血症を予防し治療するのを助けることができる。ｐＧ６ｂポリペプチド、抗−ＩＬ２２ＲＡ抗体、または抗−ＩＬ−２２抗体または結合パートナーは、価値ある治療剤として働いて、内毒素血症において炎症および病理学的効果を低下させることができよう。
【０３０５】
リポ多糖（ＬＰＳ）誘導内毒素血症は、感染症における病理学的効果を生じるプロ炎症メディエーターの多くを連動しており、げっ歯類におけるＬＰＳ誘導内毒素血症は、潜在的プロ−炎症または免疫変調剤の薬理学的効果を研究するための広く用いられている許容されるモデルである。グラム−陰性菌で生産されたＬＰＳは敗血症ショックの病理学における主な病因である（Ｇｌａｕｓｎｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ  ３３８：７３２，１９９１）。ショック−様状態は、事実、ＬＰＳの動物への単一注射によって実験的に誘導することができる。ＬＰＳに応答する細胞によって生産された分子は病因を直接的にまたは間接的に標的化することができる。これらの生物学的応答が侵入する病因に対して宿主を保護するが、それらもまた害を引起し得る。かくして、酷いグラム−陰性菌感染の結果として起こる生来の免疫のかなりの刺激は、サイトカインおよび他の分子の過剰な生産、および発熱、低血圧、播種性、血管内凝固、および多発性器官不全によって特徴付けられる致命的症候群、敗血症ショック症候群の発生に導く（Ｄｕｍｉｔｒｕら、Ｃｅｌｌ  １０３：１０７１−１０８３，２０００）。
【０３０６】
ＬＰＳのこれらの毒性効果は、多数の炎症メディエーターの放出に導くマクロファージの活性に最も関連する。これらのメディエーターの中でも、ＴＮＦは、中和抗−ＴＮＦ抗体の投与によってＬＰＳ毒性の予防により示されるように、非常に重要な役割を演じるように見える（Ｂｅｕｔｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８６９，１９８５）。Ｅ．ｃｏｌｉのＬＰＳのＣ５７Ｂ１／６マウスへの１ｕｇ注射の結果、注射からほぼ２時間後に、循環ＩＬ−６、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１、および急性期蛋白質（例えば、ＳＡＡ）の有意な増加をもたらすであろうことはよく確立されている。ＬＰＳの毒性は、これらのサイトカインによって媒介されるように見える。というのは、これらのメディエーターに対する受動免疫化の結果、死亡率の減少がもたらされ得るからである（Ｂｅｕｔｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８６９，１９８５）。敗血症ショックの予防および／または治療のための潜在的免疫介入戦略は、抗−ＴＮＦ  ｍＡｂ、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、ＬＩＦ、ＩＬ−１０、およびＧ−ＣＳＦを含む。
【０３０７】
抗−ｐＧ６ｂ抗体または他のｐＧ６ｂ可溶性および融合蛋白質のこれらのＬＰＳ−誘導モデルへの投与を用いて、ｐＧ６ｂの使用を評価して、兆候を緩和し、およびＬＰＳ−誘導病のコースを変化させることができる。
【０３０８】
３．炎症性腸疾患（ＩＢＤ）
合衆国においてほぼ５００，０００人の人々が、結腸および直腸いずれか（潰瘍性結腸炎）、または小腸および大腸双方（クローン病）に影響し得る炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に罹っている。これらの病気の病因は不明瞭であるが、それらは影響された組織の慢性炎症に関連する。ｐＧ６ｂポリペプチド、抗−ｐＧ６ｂ抗体または都合ポートナーは、価値ある治療剤として働いて、ＩＢＤおよび関連する病気において炎症および病理学的効果を低下させることができよう。
【０３０９】
潰瘍性結腸炎（ＵＣ）は、結腸の粘膜または最も内面の炎症および潰瘍によって特徴付けられる、通常は結腸と呼ばれる大腸の炎症性疾患である。この炎症は結腸が頻繁に空となるようにし、下痢を引き起す。兆候は便の軟化および関連する腹部痙攣、発熱および体重喪失を含む。ＵＣの正確な原因は未知であるが、最近の研究は、身体の自然の防御が、身体外来性と考える身体中の蛋白質に対して作用していることを示唆する（「自己免疫反応」）。おそらくは、それらは腸中の細菌蛋白質に似ているので、これらの蛋白質は、結腸の内面を破壊し始める炎症プロセスを引き起こし、または刺激し得る。結腸の内面が破壊されるにつれ、潰瘍が形成され、粘膜、膿および血液を放出する。該病気は、通常、直腸領域で開始し、結局は全大腸を通じて拡大する。炎症の反復したエピソードは、瘢痕組織を持つ腸および直腸の壁の厚化に導く。結腸組織の死滅または敗血症が酷い病気と共に起こり得る。潰瘍性結腸炎の兆候は、重症度が変化し、それらの開始は徐々にであるか、または突然であり得る。攻撃は、呼吸器系感染またはストレスを含めた多くの因子によって誘発され得る。
【０３１０】
現在、利用できるＵＣに対する治癒はないが、治療は、結腸内面における異常な炎症プロセスを抑制することに焦点が当てられている。コルチコステロイド免疫抑制剤（例えば、アザチオプリン、メルカプトプリン、およびメトトレキサート）、およびアミノサリシレートを含めた治療が病気を治療するのに利用できる。しかしながら、コルチコステロイドおよびアザチオプリンのような免疫抑制剤の長期の使用の結果、骨の薄くなる変化、白内障、感染、および肝臓および骨髄効果を含めた酷い副作用をもたらしかねない。現在の療法が成功しない患者においては、外科的処置は任意である。外科的処置は全結腸および直腸の除去を含む。
【０３１１】
慢性潰瘍性結腸炎を部分的に模倣することができるいくつかの動物モデルがある。最も広く用いられるモデルは２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸／エタノール（ＴＮＢＳ）誘導結腸炎モデルであり、これは結腸において慢性炎症および潰瘍を誘導する。ＴＮＢＳが直腸内着用を介して罹患性マウスの結腸に導入される場合、それは結腸粘膜においてＴ−細胞媒介免疫応答を誘導し、この場合、大腸の全壁を通じてのＴ−細胞およびマクロファージの密な浸潤によって特徴付けられる多大な粘膜炎症に導く。さらに、この組織病理学的図写真には、進行性体重喪失（廃棄）、血の混じった下痢直腸脱出、および大腸壁厚化の臨床的様相が伴う（Ｎｅｕｒａｔｈら、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：５１−６２，２０００）。
【０３１２】
もう１つの結腸モデルはデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を用い、これは、血が混じった下痢、体重喪失、結腸の単化および好中球浸潤を伴う粘膜潰瘍によって発現される急性結腸炎を誘導する。ＤＳＳ−誘導結腸炎はリンパ過剰形成、局限性陰窩損傷、および上皮潰瘍と共に、固有層への炎症細胞の浸潤によって組織学的に特徴付けられる。これらの変化は上皮へのＤＳＳの毒性効果により、および固有層細胞のファゴサイトーシス、およびＴＮＦ−アルファおよびＩＦＮ−ガンマの生産によって発生すると考えられる。その通常の使用にもかかわらず、ヒト病気に対する還元性についてのＤＳＳのメカニズムに関するいくつかの論点は未解決のままである。ＤＳＳは、Ｔ細胞−非依存性モデルとして見なされる。なぜならば、それはＳＣＩＤマウスのようなＴ細胞−欠乏動物において観察されるからである。
【０３１３】
抗−ｐＧ６ｂ抗体または他の可溶性ｐＧ６ｂおよび融合蛋白質のこれらのＴＮＢＳまたはＤＳＳモデルへの投与を用いて、兆候を緩和し、および胃腸病のコースを改変するｐＧ６ｂの使用を評価することができる。さらに、ｐＧ６ｂによるＴ細胞シグナル伝達の阻害を示す結果は、ｐＧ６ｂまたはそれに対する抗体のような他のｐＧ６ｂアンタゴニストを用いて、結腸炎／ＰＩＢＤモデルにおける兆候を緩和し、および病気のコースを改変することもできるという概念の証拠を提供する。
【０３１４】
４．乾癬
乾癬は、７００万人を超えるアメリカ人を冒す慢性皮膚疾患である。乾癬は、新しい皮膚細胞が異常に成長し、その結果、炎症を起こし、腫れおよびうろこ状の皮膚のパッチがもたらされる場合に起こり、そこでは、古い皮膚は迅速に十分剥がれている。最も普通の形態であるプラーク乾癬は、銀色がかった白色うろこが頂部にある皮膚の炎症を起こしたパッチ（「病巣」」によって特徴付けられる。乾癬は少数のプラークに制限され得、または皮膚の中程度〜広範な領域が関与し、頭皮、膝、肘および導体で最も普通に出現する。それはかなり目に見えるが、乾癬は接触感染性病気ではない。該病気の病因は侵された組織の慢性炎症を含む。ｐＧ６ｂポリペプチド、抗−ｐＧ６ｂ抗体、または抗ＩＬ−２２および抗−ｐＧ６ｂ抗体または結合パートナーは、乾癬、他の炎症性皮膚病、皮膚および粘膜アレルギー、および関連病において炎症および病理学的効果を低下させる価値ある治療剤として働くことができる。
【０３１５】
乾癬は、かなりの不快感を引き起し得る皮膚のＴ−細胞媒介炎症障害である。それは、治癒しない病気であり、全ての年齢の人々を冒す。乾癬は、欧州および北米の人口のほぼ２パーセントを冒す。温和な乾癬に罹った個体は、しばしば、局所剤でその病気を制御できるが、世界中の１００万人を超える患者は紫外線または前進免疫抑制剤療法を必要とする。あいにくと、紫外線照射の不便および危険性、および多くの療法の毒性はその長期使用を制限する。さらに、患者は、通常、乾癬の再発を有し、いくつかの場合において、免疫抑制剤療法を停止して間もなくリバウンドが起こる。
【０３１６】
さらに、本発明の抗−ｐＧ６ｂ抗体およびｐＧ６ｂ可溶性受容体を、本明細書中に記載された多数の炎症病に関連する体重喪失に対する、ならびに、癌（例えば、化学療法および悪液質）、および感染症のための予防および治療で用いることができる。例えば、酷い体重喪失は、敗血症、ＭＳ、ＲＡについてのモデル、および腫瘍モデルについての鍵となるマーカーである。加えて、体重喪失は、癌、感染症、および炎症病を含めた多くの腓と病気についての鍵となるパラメーターである。本発明の可溶性ｐＧ６ｂ受容体およびそれに対する抗体のような抗−ｐＧ６ｂ抗体およびｐＧ６ｂアンタゴニストは、本明細書中に記載されたｐＧ６ｂアデノウイルスで注射したマウスにおいて体重喪失を予防し、および治療するその能力についてテストすることができる。そのようなｐＧ６ｂアンタゴニストのための予防的または治療的用法を決定する方法は当該分野で知られており、本明細書中で記載した方法を用いて、決定することができる。
【０３１７】
ｐＧ６ｂ可溶性受容体ポリペプチドおよびそれに対する抗体は、循環レベルのｐＧ６ｂまたはｐＧ６ｂカウンター受容体の検出用の診断システム内で、および急性期炎症応答に関連するｐＧ６ｂの検出において用いることもできる。関連する実施形態内で、本発明のｐＧ６ｂ可溶性受容体に特異的に結合する抗体または他の剤を用いて、循環受容体ポリペプチドを検出することができ、逆にｐＧ６ｂ受容体それ自体を用いて、循環するまたは局所的に作用するｐＧ６ｂポリペプチドを検出することができる。ｐＧ６ｂカウンター受容体またはｐＧ６ｂポリペプチドの上昇したまたは降下したレベルは、炎症または癌を含めた病理学的疾患を示すことができる。さらに、ｐＧ６ｂのような急性期蛋白質または分子の検出は、ある種の病気状態（例えば、乾癬、慢性関節リウマチ、結腸炎、ＩＢＤ）における慢性炎症疾患を示すことができる。そのような疾患の検出は病気診断において助けるように働き、ならびに適切な療法を選択するにおいて医師を助けるように働く。
【０３１８】
本明細書中に記載された他の病気モデルに加えて、ヒト感染病巣に由来する炎症組織に対する抗−ｐＧ６ｂ抗体の活性は、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスモデルを用いてインビボで測定することができる。いくつかのマウスモデルが開発されており、そこでは、ヒト細胞が免疫欠陥マウスに移植されている（集合的に、異種移植片モデルという）；例えば、Ｃａｔｔａｎ  ＡＲ，Ｄｏｕｇｌａｓ  Ｅ，Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．１８：５１３−２２，  １９９４  ａｎｄ  Ｆｌａｖｅｌｌ，ＤＪ，Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １４：６７−８２，１９９６参照。乾癬についてのインビボ異種移植片モデルとして、ヒト感染皮膚組織をＳＣＩＤマウスモデルに移植し、好適なアンタゴニストで攻撃する。さらに、当該分野における他の乾癬動物モデルを用いて、ＡＧＲ１２９マウスモデルに移植されたヒト感染皮膚移植片のようなｐＧ６ｂアンタゴニストを評価することができ、および好適なアンタゴニストで調製することができる（例えば、引用してここに援用するＢｏｙｍａｎ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｏｎｌｉｎｅ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ＃２００３１４８２，２００４）。ｐＧ６ｂの活性に結合し、ブロックし、阻害し、低下させ、拮抗し、または中和する抗ｐＧ６ｂ抗体は好ましいアンタゴニストであるが、（単独で、または他のＢ７アンタゴニストと組み合わせた）抗−ｐＧ６ｂ抗体、可溶性ｐＧ６ｂ、ならびに他のｐＧ６ｂアンタゴニストをこのモデルで用いることができる。同様に、ヒト結腸炎、ＩＢＤ、関節炎、または他の炎症病巣に由来する組織または細胞をＳＣＩＤモデルで用いて、本明細書中に記載されたｐＧ６ｂアンタゴニストの抗−炎症特性を評価することができる。
【０３１９】
抗−ｐＧ６ｂ抗体またはその誘導体、アゴニスト、コンジュゲートまたは変種を用いて炎症をなくし、遅らせ、または低下させるように設計された療法は、抗−ｐＧ６ｂ抗体または可溶性ｐＧ６ｂ化合物を、ヒト炎症組織（例えば、乾癬病巣等）を担うＳＣＩＤマウス、または本明細書中に記載された他のモデルに投与することによってテストすることができる。当該分野で良く知られた方法を用い、経時的に、治療した集団内で、治療の効果を増大した抗−炎症効果として測定し、統計学的に評価する。いくつかの例示的な方法は、限定されるものではないが、例えば、乾癬モデルにおいて、表皮の厚み、上部真皮中の炎症細胞の数、および錯角化のグレードを測定することを含む。そのような方法は当該分野で知られており、本明細書中に記載される。例えば、Ｚｅｉｇｌｅｒら、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ  ８１：１２５３，２００１；Ｚｏｌｌｎｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０９：６７１，２００２；Ｙａｍａｎａｋａら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：５０７，２００１；Ｒａｙｃｈａｕｄｈｕｒｉら、Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１４４：９３１，２００１；Ｂｏｅｈｎｃｋｅら、Ａｒｃｈ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｒｅｓ．２９１：１０４，１９９９；Ｂｏｅｈｎｃｋｅら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１６：５９６，２００１；Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４６：５８０，１９９５；Ｂｏｅｈｎｃｋｅら、Ｊ．Ｃｕｔａｎ．Ｐａｔｈｏｌ．２４：１，１９９７；Ｓｕｇａｉら、Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｃｉ．１７：８５，１９９８；およびＶｉｌｌａｄｓｅｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１２：１５７１，２００３参照。炎症が、フローサイトメトリー（またはＰＣＲ）のような周知の方法を用いて経時的にモニターして、試料に存在する炎症または病巣細胞の数、ＩＢＤについてのスコア（体重喪失、下痢、直腸出血、結腸の長さ）、手足病スコア、およびＣＩＡ  ＲＡモデルについての炎症スコアを定量することもできる。例えば、そのようなモデルにおいてテストするのに好適な治療的戦略は、ｐＧ６ｂとｐＧ６ｂカウンター受容体との相互作用の模倣または増大に基づき、あるいは抗−ｐＧ６ｂ抗体またはその誘導体、アゴニスト、コンジュゲートまたは変種のために、（単独でまたは他のＢ７アンタゴニストと共に）抗−ｐＧ６ｂ抗体、他のｐＧ６ｂアゴニスト、または関連コンジュゲートまたはアゴニストを用い直接的治療を含む。
【０３２０】
さらに、乾癬は、ＣＤ４＋記憶Ｔ細胞、好中球およびマクロファージを含めた、過形成表皮ケラチノサイトおよび浸潤性単核細胞に関連する慢性炎症皮膚病である（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓ，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１０：１９９，１９９６）。現在、環境抗原は、病気の病理学を開始し、それに寄与する重要な役割を演じていると考えられている。しかしながら、乾癬の病理学を媒介すると考えられるのは自己−抗原に対する許容性の喪失である。受動細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞は、病理学に導く免疫応答を媒介する抗原提示および認識において重要な役割を演じていると考えられる。我々は、最近、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢ導入モデルに基づく乾癬のモデルを開発した（Ｄａｖｅｎｐｏｒｔら、Ｉｎｔｅｒｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．２：６５３−６７２）。本発明の抗−ｐＧ６ｂ抗体、または可溶性ｐＧ６ｂをマウスに投与する。病気阻害のスコア（皮膚病巣、炎症性サイトカイン）は、乾癬におけるｐＧ６ｂアゴニスト、例えば、抗−ｐＧ６ｂ抗体の有効性を示す。
【０３２１】
５．アトピー性皮膚炎
ＡＤは、ヘルパーＴ細胞サブセット２（Ｔｈ２）の過剰活性化サイトカインによって特徴付けられる通常の慢性炎症病である。ＡＤの正確な病因は未知であるが、過剰活性Ｔｈ２免疫応答、自己免疫、感染、アレルゲン、および遺伝的素因を含めた、多数の因子が関連付けられている。病気の鍵となる特徴は乾燥症（皮膚の乾燥状態）、掻痒（皮膚の痒み）、結膜炎、炎症性皮膚病巣、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｓｕｓ  ａｕｒｅｕｓ感染、上昇した血液好酸球増加症、血清ＩｇＥおよびＩｇＧ１の上昇、およびＴ細胞、脾臓細胞、マクロファージを伴う慢性皮膚炎、および好酸球浸潤を含む。Ｓ．ａｕｒｅｕｓの集落化またはそれでの感染は、ＡＤを悪化させ、および皮膚病の慢性性を永続させると認められている。
【０３２２】
ＡＤは、しばしば、喘息およびアレルギーセ鼻炎を持つ患者で見出されており、頻繁には、アレルギー病の最初の発現である。西欧国における人工の約２０％はこれらのアレルギー病に罹っており、発展国におけるＡＤの発生率は未知の理由で上昇している。ＡＤは、典型的には、子供時代に開始し、しばしば、青春期から成人期を通じて執拗に存在し得る。ＡＤについての現在の治療は局所コルチコイド、経口サイクロスポリンＡ、タクロリムス（軟膏形態のＦＫ５０６）のような非−コルチコステロイド免疫抑制剤、およびインターフェロン−ガンマを含む。ＡＤについての多様な治療にもかかわらず、多くの患者の兆候は改善されず、あるいはそれらは投薬に対して有害な反応を有し、他のより効果的な治療剤の探索を必要とする。本発明の可溶性ｐＧ６ｂポリペプチドおよび抗−ｐＧ６ｂ抗体は、アトピー性皮膚炎、炎症性皮膚疾患、および本明細書中に開示された他の炎症疾患のような特異適否と病気の治療で用いることができる。
【０３２３】
医薬的使用では、本発明の可溶性ｐＧ６ｂまたは抗−ｐＧ６ｂ抗体は、慣用的な方法に従って、非経口、特に静脈内または皮下送達用に処方される。静脈内投与は、例えば、ミニ−ポンプまたは他の好適な技術を用いるボーラス注射、制御された放出によるものであり、または１〜数時間の典型的な時間にわたる注入によるものである。一般に、医薬処方は、セーライン、緩衝化セーライン、水中の５％デキストロース等のような医薬上許容される媒体と組み合わせた造血系蛋白質を含む。処方は、さらに、ウイルス表面の蛋白質喪失を妨げるための１つ以上の賦形剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤、アルブミンを含むことができる。そのような組合せ療法を利用する場合、サイトカインを単一処方に組み合わせてもよく、あるいは別々の処方で投与してもよい。処方の方法は当該分野で良く知られており、例えば、ここに引用して援用するＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ，１９９０に開示されている。治療用量は、一般には、１日当たり０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ患者体重の範囲、好ましくは、１日当たり０．５〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲であり、正確な用量は、治療すべき疾患の性質および重症度、患者の傾向等を考慮し、認められた標準に従って医師が決定する。用量の決定は当業者のレベル内である。蛋白質は、化学療法または骨髄移植から２８日までの期間にわたって、あるいは＞２０，０００／ｍｍ３、好ましくは＞５０，０００／ｍｍ３の血小板カウントが達成されるまで、通常投与される。最も普通には、蛋白質は１週間以内にわたって、しばしば、１〜３日の期間にわたって投与される。一般には、本発明の治療上有効量の可溶性ｐＧ６ｂまたは抗−ｐＧ６ｂ抗体は、成熟細胞（例えば、血小板または好中球）の循環レベルの増大として発現される、リンパ系またはミエロイド先祖細胞の増殖および／または分化の臨床的に有意な増加を生じるのに十分な量である。かくして、血小板障害の治療は、少なくとも２０，０００／ｍｍ３、好ましくは５０，０００／ｍｍ３の血小板カウントに到達されるまで継続する。本発明の可溶性ｐＧ６ｂまたは抗−ｐＧ６ｂ抗体もまた、ＩＬ−３、−６および−１１のような他のサイトカイン；幹細胞因子；エリスロポエチン；Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦと組合せて投与することもできる。組合せ療法の養生法内で、他のサイトカインの日用量は、一般には：ＥＰＯ，１５０Ｕ／ｋｇ；ＧＭ−ＣＳＦ，５−１５  ｌｇ／ｋｇ；ＩＬ−３，１−５  ｌｇ／ｋｇ；およびＧ−ＣＳＦ，１−２５  ｌｇ／ｋｇであろう。ＥＰＯとの組合せ療法は、例えば、低ＥＰＯレベルを持つ貧血患者において示される。
【０３２４】
一般に、投与される可溶性ｐＧ６ｇｂ（またはｐＧ６ｂ類似体または融合蛋白質）または抗−ｐＧ６ｂ抗体の用量は、患者の年齢、体重、背の高さ、性別、一般的医学的疾患および従前の医学的履歴のような因子に依存して変化するであろう。典型的には、約１ｐｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ（剤／患者の体重の量）の範囲にある可溶性ｐＧ６ｂまたは抗−ｐＧ６ｂ抗体の用量を受容者に供するのが望ましいが、より低いまたはより高い用量を状況が指令すれば投与してもよい。
【０３２５】
可溶性ｐＧ６ｂまたは抗−ｐＧ６ｂ抗体の対象への投与は静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、鞘内、領域的カテーテルを通じる灌流により、または直接的病巣内注射によるものであり得る。注射によって治療蛋白質を投与する場合、投与は連続的注入によって、または単一または多数のボーラスによるものであってよい。
【０３２６】
投与のさらなる経路は経口、粘膜、肺および経皮を含む。経口送達はポリエステルマイクロスフェア、ゼインマイクロスフェア、蛋白質様マイクロスフェア、ポリシアノアクリレートマイクロスフェア、および脂質−ベースの系に適している（例えば、ＤｉＢａｓｅ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｅｌ，”Ｏｒａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｒｅｎ（ｅｄｓ．）ｐａｇｅｓ  ２５５５−２８８（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ１９９７）参照）。鼻腔内送達の脂溶性はインスリン投与のそのような態様によって例示される（例えば、Ｈｉｎｃｈｃｌｉｆｆｅ  ａｎｄ  Ｉｌｌｕｍ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．３５：１９９（１９９９）参照）。ｐＧ６ｂを含む乾燥または液体粒子を調製し、乾燥−粉末ディスパーサー、液体アエロゾル発生器、またはネビュライザーの助けを借りて吸入することができる（例えば、Ｐｅｔｔｉｔ  ａｎｄ  Ｇｏｍｂｏｔｚ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １６：３４３，１９９８；Ｐａｔｔｏｎら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ３５：２３５，１９９９）。この手法はＡＤＲＸ糖尿病管理システムによって示され、これは、アエロゾル化インスリンを肺に送達する手で握ったエレクトロニック吸入器である。研究は、４８，０００ｋＤａのように多量の蛋白質が、経皮投与の脂溶性を示す低周波数超音波の助けを借りて治療濃度で皮膚を横切って送達されてきたことを示す（Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：８５０，１９９５）。エレクトロポレーションを用いる経皮送達は、ｐＧ６ｂ結合活性を有する分子を投与するもう１つの手段を提供する（Ｐｏｔｔｓら、Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：２１３，１９９７）。
【０３２７】
可溶性ｐＧ６ｂまたは抗−ｐＧ６ｂ抗体を含む医薬組成物は、公知の方法に従って処方して、医薬上有用な組成物を調製することができ、それにより、治療蛋白質は医薬上許容される担体との混合物に合わされる。もしその投与が受容者患者によって許容されるならば、組成物は「医薬上許容される担体」であるといわれる。滅菌リン酸−緩衝化セーラインは医薬上許容される担体の１つの例である。他の好適な担体は当業者に周知である。例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ１９９５）参照。
【０３２８】
療法の目的では、可溶性ｐＧ６ｂまたは抗−ｐＧ６ｂ抗体分子および医薬上許容される担体は治療上有効量にて患者に投与される。本発明の治療分子および医薬上許容される担体の組合せは、もし投与される量が生理学的に重要であるならば、「治療上有効量」で投与されるといわれる。もしその存在の結果、受容者患者の生理学の検出可能な変化がもたらされるならば、剤は生理学的に重要である。例えば、炎症を治療するのに用いる剤は、もしその存在が炎症応答を軽減するならば、生理学的に重要である。
【０３２９】
ｐＧ６ｂ（またはｐＧ６ｂ類似体または融合蛋白質）または抗−ｐＧ６ｂ抗体を含む医薬組成物は、液体形態、エアロゾル、または固体形態で仕上げることができる。液体形態は、注射溶液および経口懸濁液によって示される。例示的な固体形態は、カプセル、錠剤、および制御放出形態を含む。後者の形態はミニ浸透圧ポンプおよびインプラントによって示される（Ｂｒｅｍｅｒら、Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：２３９，１９９７；Ｒａｎａｄｅ，”Ｉｍｐｌａｎｔｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒａｎａｄｅ  ａｎｄ  Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  ９５−１２３（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）；Ｂｒｅｍｅｒら、”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｗｉｔｈ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｐｕｍｐｓ，”ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｒｅｎ（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  ２３９−２５４（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７）；Ｙｅｗｅｙら、”Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｉｍｐｌａｎｔ，”ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｒｅｎ（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  ９３−１１７（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７））。
【０３３０】
リポソームは、治療ポリペプチドを対象に静脈内、腹腔内、鞘内、筋肉内、皮下、または経口投与、吸入または鼻腔ない投与を介して送達する１つの手段を提供する。リポソームは、水性区画を囲う１つ以上の脂質二層よりなる巨視的小胞である（一般には、Ｂａｋｋｅｒ−Ｗｏｕｄｅｎｂｕｅｒｇら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１２（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ６１，１９９３；Ｋｉｍ，Ｄｒｕｇｓ  ４６：６１８，１９９３；およびＲａｎａｄｅ，”Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ａｓ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ，”ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒａｎａｄｅ  ａｎｄ  Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  ３−２４（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）参照）。リポソームは組成が細胞膜と同様であり、その結果、リポソームは安全に投与でき、生分解性である。調製の方法に応じて、リポソームは一層または多層であってよく、リポソームはサイズを変化させることができ、直径は０．０２μｍ〜１０μｍを超える範囲である。種々の剤はリポソームにカプセル化することができ：二層中の疎水性剤分配、および親水性剤の分配は内部水性空間内である（例えば、Ｍａｃｈｙら、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｌｉｂｂｅｙ  １９８７）、およびＯｓｔｒｏら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊ．Ｈｏｓｐ．Ｐｈｅｒｍ．４６：１５７６（１９８９）参照）。さらに、リポソームのサイズ、二層の数、脂質の組成、ならびにリポソームの電荷および表面特徴を変化させることによってカプセル化された剤の治療利用性を制御するのが可能である。
【０３３１】
リポソームは実質的にいずれのタイプの細胞にも吸着させることができ、次いで、ゆっくりとカプセル化剤を放出させることができる。別法として、吸収されたリポソームは食細胞である細胞によるエンドサイトーシスに付され得る。エンドサイトーシスに続いて、リポソーム脂質のリソソーム内分解、およびカプセル化剤の放出がある（Ｓｃｈｅｒｐｈｏｆら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．４４６：３６８，１９８５）。静脈内投与後に、小さなリポソーム（０．１〜１．０μｍ）は、主として肝臓および脾臓に局所化させる、網内皮細胞系の細胞によって取られ、他方、３．０μｍよりも大きなリポソームは肺に入れられる。網内皮細胞系の細胞によるより小さなリポソームのこの優先的取込みは、化学療法剤をマクロファージおよび患者の主要に送達するのに用いられてきた。
【０３３２】
網内皮細胞系は、大きな用量のリポソーム粒子での飽和、または薬理学的手段による選択的マクロファージ不活化を含めたいくつかの方法によって迂回することができる（Ｃｌａａｓｓｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ８０２：４２８，１９８４）。加えて、糖脂質−またはポリエチレングリコールまたは誘導体化リン脂質のリポソーム膜への取込みは、網内皮細胞系によるかなり低下した取込みをもたらすことが示されている（Ａｌｌｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０６８：１３３，１９９１；Ａｌｌｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１５０：９，１９９３）。
【０３３３】
リポソームは、リン脂質組成を変化させることによって、または受容体−カウンター受容体をリポソームに挿入することによって、特定の細胞または器官を標的化するように調製することもできる。例えば、高い含有量の非イオン性界面活性剤で調製されたリポソームは肝臓を標的化するのに用いられてきた（Ｈａｙａｋａｗａら、Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｐａｔｅｎｔ  ０４−２４４，０１８；Ｋａｔｏら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１６：９６０，１９９３）。これらの処方は、メタノール中でダイズホスファチジルコリン、α−トコフェロール、およびエトキシル化水素化ヒマシ油（ＨＣＯ−６０）を混合し、混合物を真空下で濃縮し、次いで、混合物を水で復元することによって調製した。大豆−由来ステテリルグリコシド混合物（ＳＧ）およびコレステロール（ＣＨ）とジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）とのリポソーム処方もまた肝臓を標的化することが示されてきた（Ｓｈｉｍｉｚｕら、ＢＩｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２０：８８１，１９９７）。
【０３３４】
別法として、抗体、抗体断片、炭水化物、ビタミンおよび輸送蛋白質のような種々の標的化カウンター受容体はリポソームの表面に結合させることができる。例えば、リポソームを分岐型ガラクトシル脂質誘導体で修飾して、専ら肝臓細胞の表面で発現されるアシアロ糖蛋白質（ガラクトース）受容体を標的化することができる（Ｋａｔｏ  ａｎｄ  Ｓｕｇｉｙａｍａ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．１４：２８７，１９９７；Ｍｕｒａｈａｓｈｉら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ２０：２５９，１９９７）。同様に、Ｗｕら（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２７：７７２，１９９８）は、アシアロフェツインでのリポソームの標識は短縮されたリポソーム血漿中半減期に導き、肝臓細胞によるアシアロフェツイン−標識リポソームの取込みを大いに高めたことを示している。他方、分岐型ガラクトシル脂質誘導体を含むリポソームの肝臓蓄積は、アシアロフェツインのプレ注射によって阻害することができる（Ｍｕｒａｈａｓｈｉら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２０：２５９，１９９７）。ポリアコニチル化ヒト血清アルブミンリポソームは、リポソームを肝臓細胞に標的化するためのもう１つの手法を提供する（Ｋａｍｐｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１１６８１，１９９７）。さらに、Ｇｅｈｏ，ｅｔ  ａｌ．米国特許第４，６０３，０４４号は、肝臓細胞−指向性リポソーム小胞送達系を記載しており、これは、肝臓の特殊化された代謝細胞に関連する肝胆汁性受容体に対する特異性を有する。
【０３３５】
組織標的化に対するより一般的な手法において、標的細胞を、該標的細胞によって発現されるカウンター受容体に特異的なビオチニル化抗体で予め標識する（Ｈａｒａｓｙｍら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．３２：９９，１９９８）。遊離抗体の血漿排除後に、ストレプトアビジン−コンジュゲーテッドリポソームが投与される。もう１つの手法において、標的化抗体はリポソームに直接的に付着される（Ｈａｒａｓｙｍ  ｅｔ  ａ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．３２：９９，１９９８）。
【０３３６】
ポリペプチドおよび抗体は、蛋白質マイクロカプセル化の標準的な技術を用いてリポソーム内にカプセル化することができる（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３１：１０９９，１９８１；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：１８５３，１９９０；Ｃｏｈｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １６３：９５，１９９１；Ａｌｖｉｎｇら、”Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ，”ｉｎ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．ＩＩＩ，Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｅｓ（ｅｄ．），ｐａｇｅ  ３１７（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９３）；Ｗａｓｓｅｆら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４９：１２４，１９８７参照）。上述したように、治療上有用なリポソームは種々の成分を含有することができる。例えば、リポソームはポリ（エチレングリコール）の脂質誘導体を含むことができる（Ａｌｌｅｎら、ＢＩｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１５０：９，１９９３）。
【０３３７】
分解可能ポリマーマイクロスフェアは、治療蛋白質の高い前進レベルを維持するように設計されてきた。マイクロスフェアはポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）、ポリアンヒドリド、ポリ（オルトエステル）のような分解性ポリマー、蛋白質がポリマーに捕獲されている非生分解性エチルビニルアセテートポリマーから調製される（Ｇｏｍｂｏｔｚ  ａｎｄ  Ｐｅｔｔｉｔ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．６：３３２，１９９５；Ｒａｎａｄｅ，”Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒａｎａｄｅ  ａｎｄ  Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  ５１−９３（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）；Ｒｏｓｋｏｓ  ａｎｄ  Ｍａｋｉｅｗｉｃｚ，”Ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｕｓｅｆｕｌ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｅｒｅｎ（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  ４５−９２（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７）；Ｂａｒｔｕｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１１６１，１９９８；Ｐｕｔｎｅｙ  ａｎｄ  Ｂｕｒｋｅ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：１５３，１９９８；Ｐｕｔｎｅｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：５４８，１９９８）。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−被覆ナノ粒子もまた、治療蛋白質の静脈内投与用の担体を提供することができる（例えば、Ｇｒｅｆら、Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：１６７，１９９７参照）。
【０３３８】
また、本発明では、ｐＧ６ｂモノマー、ホモダイマー、ヘテロダイマー、またはマルチマー化陽性受容体、およびｐＧ６ｂアンタゴニスト、例えば、抗−ｐＧ６ｂ抗体または結合ポリペプチド、または中和抗−ｐＧ６ｂ抗体のような結合ｐＧ６ｂ活性を有する化学的に修飾されたポリペプチドも考えられ、そのポリペプチドは先に議論したようにポリマーと連結される。
【０３３９】
他の投与形態は、例えば、Ａｎｓｅｌ  ａｎｄ  Ｐｏｐｏｖｉｃｈ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｌｅａ  ＆  Ｆｅｂｉｇｅｒ  １９９０），Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９５），およびＲａｎａｄｅ  ａｎｄ  Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ１９９６）によって示されているように当業者によって工夫できる。
【０３４０】
例として、医薬組成物は、ｐＧ６ｂ細胞外ドメインを持つポリペプチド、例えば、ｐＧ６ｂモノマー、ホモダイマー、ヘテロダイマーまたはマルチマー可溶性受容体、またはｐＧ６ｂアンタゴニスト（例えば、ｐＧ６ｂポリペプチドに結合する抗体または抗体断片、または中和抗−ｐＧ６ｂ抗体）を含む容器を含むキットとして用いることができる。治療ポリペプチドは、単一または多数の用量のための注射溶液の形態で、あるいは注射前に復元される滅菌粉末として供することができる。別法として、そのようなキットは、治療ポリペプチドの投与用の乾燥−粉末ディスパーサー、液体エアロゾル発生器、またはネビュライザーを含むことができる。そのようなキットは、さらに、適用症、および医薬組成物の用法についての書面による情報を含むことができる。さらに、そのような情報は、ｐＧ６ｂ組成物はｐＧ６ｂに対する既知の過敏を持つ患者において禁忌されるという陳述を含むことができる。
【０３４１】
抗−ｐＧ６ｂ抗体または結合パートナーまたは抗−ｐＧ６ｂ抗体断片、抗体融合、ヒト化抗体等）、またはｐＧ６ｂ可溶性受容体を含む医薬組成物は、液体形態、エアロゾル、固体形態で仕上げることができる。液体形態は、注射溶液、エアロゾル、液滴、トポロジー溶液および経口懸濁液によって示される。例示的な固体形態はカプセル、錠剤、および制御−放出形態を含む。後者の形態はミニ浸透圧ポンプおよびインプラントによって示される（Ｂｒｅｍｅｒら、Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：２３９，１９９７；Ｒａｎａｄｅ，”Ｉｍｐｌａｎｔｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒａｎａｄｅ  ａｎｄ  Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  ９５−１２３（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）；Ｂｒｅｎｅｒら、”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｗｉｔｈ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｐｕｍｐｓ，”ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｒｅｎ（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ２３９−２５４（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７）；Ｙｅｗｅｙら、”Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｉｍｐｌａｎｔ，”ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｒｅｎ（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  ９３−１１７（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７））。他の固体形態はクリーム、ペースト、他のトポロジー適用等を含む。
【０３４２】
リポソームは、治療ポリペプチドを対象に静脈内、腹腔内、鞘内、筋肉内、皮下、または経口投与、吸入または鼻腔ない投与を介して送達する１つの手段を提供する。リポソームは、水性区画を囲う１つ以上の脂質二層よりなる巨視的小胞である（一般に、Ｂａｋｋｅｒ−Ｗｏｕｄｅｎｂｅｒｇら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１２（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ６１，１９９３  Ｋｉｍ，Ｄｒｕｇｓ  ４６：６１８，１９９３；およびＲａｎａｄｅ，”Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ａｓ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ，”ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒａｎａｄｅ  ａｎｄ  Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ（ｅｄ．），ｐａｇｅｓ３−２４（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）参照）。リポソームは組成が細胞膜に似ており、その結果、リポソームは安全に投与でき、および生分解性である。調製の方法に依存し、リポソームは一層または多層であってよく、リポソームはサイズが変化することができ、直径は０．０２μｍ〜１０μｍを超える範囲である。種々の剤をリポソームにカプセル化することができ：二層中の疎水性剤分配、および親水性剤分配は内部水性空間内である（例えば、Ｍａｃｈｙら、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｌｉｂｂｅｙ  １９８７）、およびＯｓｔｒｏら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊ．Ｈｏｓｐ．Ｐｈａｒｍ．４６：１５７６，１９８９参照）。さらに、リポソームのサイズ、二層の数、脂質の組成、ならびにリポソームの電荷および表面特徴を変化させることによって、カプセル化された剤の治療的入手可能性を制御するのが可能である。
【０３４３】
リポソームは実質的にいずれのタイプの細胞にも吸着させることができ、次いで、ゆっくりとカプセル化された剤を放出することができる。別法として、吸収されたリポソームは食細胞である細胞によってエンドサイトーシスされ得る。エンドサイトーシスに続いて、リポソーム脂質のリソソーム内分解、およびカプセル化された剤の放出が起こる（Ｓｃｈｅｒｐｈｏｆら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．４４６：３６８，１９８５）。静脈内投与後に、小さなリポソーム（０．１〜１．０μｍ）は、典型的には、主として肝臓および脾臓に局所化した、網内皮細胞系の細胞によって取り込まれ、他方、３．０μｍを超えるリポソームは肺に入る。網内皮細胞系の細胞によるより小さなリポソームのこの優先的取込みは、化学療法剤をマクロファージにおよび患者の腫瘍に送達枢要に用いられてきた。
【０３４４】
網内皮細胞系は、リポソーム粒子の大容量での飽和、または薬理学的手段による選択的マクロファージ不活化を含めたいくつかの方法によって迂回することができる（Ｃｌａａｓｓｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ８０２：４２８，１９８４）。加えて、糖脂質−またはポリエチレングリコール−誘導体化リン脂質のリポソーム膜への取込みは、網内皮細胞系による有意に低下した取込みをもたらすことが示されている（Ａｌｌｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０６８：１３３，１９９１；Ａｌｌｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１５０：９，１９９３）。
【０３４５】
リポソームは、リン脂質組成を変化させることによって、あるいは受容体またはカウンター受容体をリポソームに挿入することによって、特定の細胞または器官を標的化するように調製することもできる。例えば、高含有量の非イオン性界面活性剤で調製されたリポソームは、肝臓を標的化するのに用いられてきた（Ｈａｙａｋａｗａら、Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｐａｔｅｎｔ  ０４−２４４，０１８；Ｋａｔｏら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１６：９６０，１９９３）。これらの処方はメタノール中でダイズホスファチジルコリン、α−トコフェロール、およびエトキシル化水素化ヒマシ油（ＨＣＯ−６０）を混合し、混合物を真空下で濃縮し、次いで、混合物を水で復元することによって調製した。ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）と、ダイズ−由来ステリルグリコシド混合物（ＳＧ）およびコレステロール（Ｃｈ）とのリポソーム処方もまた、肝臓を標的化することが示されている（Ｓｈｉｍｉｚｕら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２０：８８１，１９９７）。
【０３４６】
別法として、抗体、抗体断片、炭水化物、ビタミンおよび輸送蛋白質のような種々の標的化カウンター受容体をリポソームの表面に結合させることができる。例えば、リポソームは、分岐型ガラクトシル脂質誘導体で修飾して、専ら肝臓細胞の表面で発現されるアシアロ糖蛋白質（ガラクトース）受容体を標的化することができる（Ｋａｔｏ  ａｎｄ  Ｓｕｇｉｙａｍａ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．１４：２８７，１９９７；Ｍｕｒａｈａｓｈｉら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２０：２５９，１９９７）。同様に、Ｗｕら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２７：７７２，１９９８は、アシアロフェツインでのリポソームの標識は短縮されたリポソーム血漿中半減期に導き、肝臓細胞によるアシアロフェツイン−標識リポソームの摂取を大いに増強した。他方、分岐型ガラクトシル脂質誘導体を含むリポソームの肝臓蓄積は、アシアロフェツインのプレ注射によって阻害することができる（Ｍｕｒａｈａｓｈｉら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２０：２５９，１９９７）。ポリアコニチル化ヒト血清アルブミンリポソームは、リポソームを肝臓細胞に標的化するためのもう１つの手法を提供する（Ｋａｍｐｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１１６８１，１９９７）。さらに、Ｇｅｈｏ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，６０３，０４４号は、肝臓の特殊化された代謝細胞に関連する肝胆汁性受容体に対する特異性を有する肝臓細胞−指向性リポソーム小胞送達系を記載する。
【０３４７】
組織標的化に対するより一般的な手法において、標的細胞を、該標的細胞によって発現されるカウンター−受容体に対して特異的なビオチニル化抗体で予め標識する（Ｈａｒａｓｙｍら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．３２：９９，１９９８）。遊離抗体の血漿排除後、ストレプトアビジン−コンジュゲーテッドリポソームを投与する。もう１つの手法において、標的化抗体はリポソームに直接的に付着される（Ｈａｒａｓｙｍら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．３２：９９，１９９８）。
【０３４８】
抗−ｐＧ６ｂ中和抗体、およびｐＧ６ｂ結合活性を持つ結合パートナー、またはｐＧ６ｂ可溶性受容体を、蛋白質マイクロカプセル化の標準的技術を用いてリポソーム内にカプセル化することができる（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３１：１０９９，１９８１；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：１８５３，１９９０；Ｃｏｈｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１０６３：９５，１９９１；Ａｌｖｉｎｇら、  “Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ，”  ｉｎ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｖｏｌ．  ＩＩＩ，  Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ  （ｅｄ．），  ｐａｇｅ  ３１７  （ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９３）；  Ｗａｓｓｅｆら、  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １４９：１２４，  １９８７）。上述したように、治療的に有用なリポソームは種々の成分を含有することができる。例えば、リポソームはポリ（エチレングリコール）の脂質誘導体を含むことができる（Ａｌｌｅｎら、  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ    １１５０：９，１９９３）。
【０３４９】
分解性ポリマーマイクロスフェアは、治療蛋白質の高い前進レベルを維持するように設計されてきた。マイクロスフェアは、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）、ポリアンヒドリド、ポリ（オルトエステル）、非生分解性エチルビニルアセテートポリマーのような分解性ポリマーから調製され、ここに、蛋白質はポリマー中に捕獲されている（Ｇｏｍｂｏｔｚ  ａｎｄ  Ｐｅｔｔｉｔ，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ６：３３２，  １９９５；  Ｒａｎａｄｅ，  “Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”  ｉｎ  Ｄｒｕｇ    Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｒａｎａｄｅ  ａｎｄ  Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  （ｅｄｓ．），  ｐａｇｅｓ  ５１−９３  （ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）；  Ｒｏｓｋｏｓ  ａｎｄ  Ｍａｓｋｉｅｗｉｃｚ，  “Ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｕｓｅｆｕｌ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｓａｎｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｒｅｎ  （ｅｄｓ．），  ｐａｇｅｓ  ４５−９２  （Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７）；  Ｂａｒｔｕｓら、  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１１６１，  １９９８；  Ｐｕｔｎｅｙ  ａｎｄ  Ｂｕｒｋｅ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：１５３，  １９９８；  Ｐｕｔｎｅｙ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ２：５４８，  １９９８）。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）被覆ナノスフィアーもまた、治療蛋白質の静脈内投与用の担体を提供することができる（例えば、Ｇｒｅｆら、  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １０：１６７，  １９９７参照）。
【０３５０】
また、本発明では、先に議論したように、ポリマーと連結された、化学的に修飾された抗−ｐＧ６ｂ抗体または結合パートナー、例えば、抗−ｐＧ６ｂ抗体またはｐＧ６ｂ可溶性受容体が考えられる。
【０３５１】
他の投与形態は、例えば、Ａｎｓｅｌ  ａｎｄ  Ｐｏｐｏｖｉｃｈ，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  ５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｌｅａ  ＆  Ｆｅｂｉｇｅｒ  １９９０），  Ｇｅｎｎａｒｏ  （ｅｄ．），  Ｒｅｍｉｎｇｓｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９５）によって、および  Ｒａｎａｄｅ  ａｎｄ  Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  （ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９６）によって示されているように、当業者が工夫することができる。
【０３５２】
本発明では、抗−ｐＧ６ｂ抗体の組成物、および本明細書中に開示された抗体、ペプチドまたはポリペプチドを含む方法および治療的使用が考えられる。そのような組成物はさらに担体を含むことができる。担体は慣用的な有機または無機担体であり得る。担体の例は水、緩衝溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油等を含む。
【０３５３】
１１．トランスジェニックマウスの生産
ｐＧ６ｂまたはその修飾された形態をコードする核酸を用いて、トランスジェニック動物または「ノックアウト」動物を交代で作り出すこともでき、それは、治療に有用な試薬の開発およびスクリーニングで有用である。トランスジェニック動物（例えば、マウスまたはラット）は導入遺伝子を含有する細胞を有する動物であり、その導入遺伝子は誕生前、例えば、胚段階において動物または動物の先祖に導入された。導入遺伝子は、トランスジェニック動物がそれから発生した細胞のゲノムに組み込まれるＤＮＡである。１つの実施形態において、ｐＧ６ｂ蛋白質をコードするｃＤＮＡを用いて、確立された技術に従ってｐＧ６ｂ蛋白質をコードするゲノムＤＮＡをクローン化することができ、ゲノム配列を用いて、望まれるＤＮＡを発現する細胞を含有するトランスジェニック動物を作り出すことができる。トランスジェニック動物、特にマウスまたはラットのような動物を作り出す方法は当該分野で慣用的になっており、例えば、米国特許番号４，７３６，８８６号および４，８７０，００９号に記載されている。
【０３５４】
別法として、ｐＧ６ｂの非−ヒトホモログを用いて、動物の胚細胞に導入された、内因性遺伝子、およびｐＧ６ｂをコードする改変されたゲノムＤＮＡの間の相同組換えの結果としてｐＧ６ｂ蛋白質をコードする欠陥があるまたは改変された遺伝子を有する「ノックアウト」動物を構築することができる。例えば、ｐＧ６ｂ蛋白質をコードするｃＤＮＡを用いて、確立された技術に従って、ｐＧ６ｂ蛋白質をコードするゲノムＤＮＡをクローン化することができる。ｐＧ６ｂ蛋白質をコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失させ、あるいは組込未をモニターするのに用いることができる選択マーカーをコードする遺伝子のようなもう１つの遺伝子に置き換えることができる。典型的には、数キロベースの（５’および３’末端双方における）改変されていないフランキングＤＮＡをベクターに含ませる。例えば、Ｔｈｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｃａｐｅｃｃｈｉ，  Ｃｅｌｌ  ５１：５０３，  １９８７参照。ベクターは、（例えば、エレクトロポレーションによって）胚幹細胞系に導入し、次いで、導入されたＤＮＡが内因性ＤＮＡで相同組換えされた細胞を選択する。例えば、Ｌｉら、  Ｃｅｌｌ  ６９：９１５，  １９９２参照。次いで、選択された細胞を動物（例えば、マウスまたはラット）の胚盤胞に注射して、凝集キメラを形成する。例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，  ｉｎ  Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｅ．  Ｊ．  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，  ｅｄ．（ＩＲＬ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  １９８７），  ｐｐ．１１３−１５２参照。次いで、キメラ胚を好適な偽妊娠雌仮親動物に移植することができ、胚を出産まで導いて（ノックアウト）動物を作り出すことができる。その染色細胞において相同組換えＤＮＡを保有する子孫は標準的な技術によって同定し、それを用いて、動物の全ての細胞が相同組換えされたＤＮＡを含む動物を育種することができる。ノックアウト動物は、例えば、ある種の病理学的疾患に対して防御するそれらの能力について、およびｐＧ６ｂ蛋白質の不存在による病理学的疾患のそれらの発生について特徴付けることができる。本明細書中に記載されたモデルを変更することができるのは理解される。例えば、「ノック−イン」モデルを形成し、あるいは該モデルを動物モデルよりはむしろ細胞−ベースのものとすることができる。
【実施例】
【０３５５】
以下の非限定的実施例によって本発明をさらに説明する。
【０３５６】
（実施例１）
Ｂ７／ｍＦｃ２発現構築体
発現構築体ｐＺＭＰ２１  ｈＢ７−Ｈ１／ｍＦｃ２を、Ｂ７−Ｈ１のｃ−末端にＦｃが標識として付着された可溶性バージョンを発現するように調製した。７３４塩基対断片は、Ｂ７−Ｈ１の細胞外ドメインおよび、各々、５’および３’末端にコードされたＥｃｏＲＩおよびＢｇ１ＩＩ部位を持つｍＦｃ（グルタミンおよびプロリン）の最初の２つのアミノ酸を含有するＰＣＲによって作製した。
【０３５７】
ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーからの増幅によって、プライマーｚｃ４８９１４およびｚｃ４８９０８を用いてこのＰＣＲ断片を作製した。ＰＣＲ反応条件は以下の通りであった：１分間の９４℃、１分間の６０℃、および２分間の７２℃の２５サイクル；１０分間の７２℃の１サイクル；続いて４℃に浸漬。６９９塩基対断片は、エフェクター機能マイナスＢＡＬＢ−Ｃ  ＩｇＧ  ガンマ２ａ（ｍＦｃ２）の定常２および定常３ドメインを含有するＰＣＲによって作製した。このＰＣＲ断片は、ｍＦｃ２（ｍＴＡＣＩ／ｍＦｃ２  図＃９９８）を含有する発現ベクターからの増幅によってプライマーｚｃ４８９１１およびａｃ４８９１５を用いて作製した。ＰＣＲ反応条件は以下の通りであった：１分間の９４℃、１分間の６０℃、および２分間の７２℃の２５サイクル；１０分間の７２℃の１サイクル；続いての、４℃浸漬。７３４塩基対Ｂ７−Ｈ１断片および６９９塩基対ｍＦｃ２断片はＱｉａＱｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ：２８７０４）を用いる１％アガロースゲル電気泳動およびバンド精製によって精製した。各々、Ｂ７−Ｈ１およびｍＦｃ２断片についての精製されたバンドの合計の１／５および１／２５を、酵母株ＳＦ８３８−９Ｄアルファを用いて、上述したように、Ｂｇ１ＩＩ消化によって線状化され、バンド精製によって精製されたｐＺＭＰ２１に組み換えた。ウラシル欠乏寒天プレートから成長することができる酵母を溶解させ、エタノール沈殿によってＤＮＡを抽出した。２μｌの連結ミックスを、製造業者の指示に従って、３７μｌ  ＤＨ１０ＢエレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ（Ｇｉｂｃｏ  １８２９７−０１０）においてエレクトロポレーションを行った。形質転換された細胞を４００μｌのＬＢ倍地中で希釈し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢプレートに平板培養した。クローンを制限消化物によって解析し、陽性クローンをＤＮＡ配列決定のために送って、ＰＣＲ精度を確認した（正しい配列＝〜ａｍｆ／ｃｂｒａ．ｄｉｒ／ｐｚｍｐ２１−ｈＢ７Ｈｍｆｃ２−４３２２ｓｅｑ．ｓｅｑ．）。
【０３５８】
次いで、上述した発現ベクターｐＺＭＰ２１  ｈＢ７−Ｈ１／ｍＦｃ２を用いて、一連のｍＦｃ２可溶性キメラ蛋白質を作製した。ｐＧ６ｂ／ｍＦｃ２は、鋳型としてのクローントラック＃１０１６９７と共にオリゴｚｃ５０５９３およびｚｃ５０５９５を用いて４３１塩基対断片をＰＣＲに付すことによって作製した。得られたＰＣＲ産物を上述したようにバンドで精製し、ＥｃｏＲＩおよびＢｇ１ＩＩで消化した。得られた産物を再度バンドで精製した。ＰＺＭＰ２１  ｈＢ７−Ｈ１／ｍＦｃ２もまたＥｃｏＲＩおよびＢｇ１ＩＩで消化し、９７２１塩基対ベクター骨格＋ｍＦｃ２を単離した。ｐＺＭＰ２１  ｈＢ７−Ｈ１／ｍＦｃ２産物の１／５０を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて４３１塩基対断片の３／５０に連結した。製造業者の指示に従い、２μｌの連結ミックスを３７μｌ  ＤＨ１０ＢエレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ  （Ｇｉｂｃｏ  １８２９７−０１０）においてエレクトロポレーションに付した。形質転換された細胞を４００μｌのＬＢ培地に希釈し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢプレートに平板培養した。クローンを制限消化物によって解析し、陽性クローンをＤＮＡ配列決定のために送って、ＰＣＲ精度を確認した。正しい構築体をｈｐＧ６ＺＭＰ２１と命名した。
【０３５９】
２００μｇのｈｐＧ６ＺＭＰ２１構築体の３つの組を、各々、２００単位のＰｖｕ  Ｉで３７℃にて３時間消化し、次いで、ＩＰＡで沈殿させ、１．５ｍＬのミクロ遠心チューブ中で回転して沈降させた。上清をデカントしてペレットとし、ペレットを１ｍＬの７０％エタノールで洗浄し、室温にて５分間インキュベートした。チューブを１４，０００ＲＰＭにおいてミクロ遠心機中で１０分間回転させ、上清をデカントしてペレットとした。次いで、ペレットを、滅菌環境において７５０μｌのＰＦ−ＣＨＯ培地に再懸濁させ、６０℃にて３０分間インキュベートし、室温まで冷却した。５Ｅ６  ＡＰＦＤＸＢ１１細胞を３つのチューブの各々中で回転して沈降させ、ＤＮＡ培地溶液を用いて再懸濁させた。
【０３６０】
ＤＮＡ／細胞混合物を０．４ｃｍギャップキュベット中に入れ、以下のパラメーター：９５０μＦ、高キャパシタンス、および３００Ｖを用いてエレクトロポレーションに付した。次いで、キュベットの内容物を取り出し、プールし、ＰＦ−ＣＨＯ培地２５ｍＬで希釈し、１２５ｍＬ振盪フラスコに入れた。フラスコをシェーカー上のインキュベーターに３７℃、６％ＣＯ２にて入れ、１２０ＲＰＭで振盪した。
【０３６１】
細胞系を栄養選択、続いて、２００ｎＭメトトレキサート（ＭＴＸ）、次いで５００ｎＭＭＴＸまで抗体増幅した。発現をウェスタンブロットによって確認した。
【０３６２】
（実施例２）
ヒトｐＧ６ｂＡｖｉ−ＨｉｓＴａｇｐＺＭＰ２１
ヒトｐＧ６ｂの細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチドを含有する発現プラスミドのテトラマー分子を作製する取り組みにおいてＡｖｉ標識およびＨＩＳ標識を構築した。ヒトｐＧ６ｂの細胞外ドメインのＤＮＡ断片は、プライマーｚｃ５１１２０
【０３６３】
【化２】
2009538830.tif 000006
およびｚｃ５１１２２
【０３６４】
【化３】
2009538830.tif 000007
を用い、ベクター配列、およびヒトｐＧ６ｂ挿入点に近接するＡｖｉ  Ｔａｇ配列の部分に対応する５’および３’末端におけるフランキング領域と共にポリヌクレオ配列：
【０３６５】
【化１】
2009538830.tif 000008
を用いるＰＣＲによって単離した。
【０３６６】
ＰＣＲ反応混合物を、２％アガロースゲルで泳動させ、インサートのサイズに対応するバンドを、ＱＩＡｑｕｉｃｋＴＭゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてゲル−抽出した。プラスミドｐＺＭＰ２１は、ＭＰＳＶプロモーター、コーディング配列の挿入用の多重制限部位、停止コドン、Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点；ＳＶ４０プロモーター、エンハンサーおよび複製起点、ＤＨＦＲ遺伝子およびＳＶ４０ターミネーター含む哺乳動物選択マーカー発現単位；およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ選択および複製で必要なＵＲＡ３およびＣＥＮ−ＡＲＳ配列を有する発現カセットを含む哺乳動物発現ベクターである。それは、（アクセション番号７７１４５下でＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  １０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ  ２０１１０−２２０９に寄託した）ｐＲＳ３１６から取った酵母遺伝子エレメントと共に（アクセション番号９８６６８下でＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  １０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ  ２０１１０−２２０９に寄託した）ｐＺＰ９、ポリオウイルスからの内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）、および膜貫通ドメインのＣ−末端において切形されたＣＤ８細胞外ドメインから構築された。プラスミドｐＺＭＰ２１ＡｖｉＨＩＳをＥｃｏＲ１で消化し、ＰＣＲインサートでの組換えで用いた。
【０３６７】
組換えは、ＢＤ  Ｉｎ−ＦｕｓｉｏｎＴＭ  Ｄｒｙ−Ｄｏｗｎ  ＰＣＲクローニングキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて行った。ＰＣＲ断片および消化されたベクターの１０μｌ中の混合物を凍結乾燥されたクローニング試薬に加え、３７℃にて１５分間、および５０℃にて１５分間インキュベートした。反応は形質転換の準備ができていた。２μｌの組換え反応をワンショットＴＯＰ１０  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｉｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｂａｄ，  ＣＡ）に形質転換し；形質転換は氷上で１０分間インキュベートし、４２℃にて３０秒間熱ショックを与えた。反応を氷上で２分間インキュベートし、（形質転換された細胞が回収されるのを助けた）。２分間のインキュベーション後、３００μｌのＳＯＣ（２％  ＢａｃｔｏＴＭトリプトン（Ｄｉｆｃｏ，  Ｄｅｔｒｏｉｔ，  ＭＩ）、０．５％酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）、１０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、２０ｍＭのグルコース）を加え、形質転換をシェーカーにて３７℃で１時間インキュベートした。全形質転換を１つのＬＢ  ＡＭＰプレート（ＬＢ  （Ｌｅｎｎｏｘ）、１．８％ＢａｃｔｏＴＭ寒天（Ｄｉｆｃｏ）、１００ｍｇ／Ｌアンピシリン）上で平板培養した。
【０３６８】
コロニーを、プライマーｚｃ５１１２０およびｚｃ５１１２２を用いるＰＣＲによってスクリーニングした。陽性クローンを配列決定によって確認した。正しい構築体をｈＰＧ６ｂＡｖｉＨＩＳｐＺＭＰ２１と命名した。
【０３６９】
（実施例３）
Ｐｇ６ｂ抗体
ウサギに、ＢＳＡにコンジュゲートしたｐＧ６ｂ−マウス−Ｆｃ２融合蛋白質を注射した。ｐＧ６ｂに対する陽性血清力価を持つウサギから採血し、血清を収集した。血清をｐＧ６ｂ−Ｆｃ２アフィニティーカラムの使用によって精製した。
【０３７０】
モノクローナル抗体において、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＢＳＡにコンジュゲートしたｐＧ６ｂ−マウス−Ｆｃ２融合蛋白質で免疫化した。細胞発現ヒトｐＧ６ｂに対する陽性血清力価を持つマウスに、可溶性ｐＧ６ｂ−Ｆｃ融合蛋白質の灌流ブーストを与えた。脾臓細胞を１匹の高−力価マウスから収穫し、最適化されたＰＥＧ−媒介融合プロトコル（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）にてＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８／ＡＴＣＣ（マウス）ミエローマ細胞に融合させた。１２日の成長ポスト−融合後に、特異的な抗体−生産ハイブリドーマープールを、ＦＭＡＴ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）スクリーニングを用いて同定した。このアッセイにおいて、受容体提示細胞系（ｐ８１５−ｐＧ６ｂ）を１００μＬ／ウェル、５×１０４細胞／ｍｌにて９６ウェル組織培養プレート中に撒いた（アッセイランの前日に平板培養）。血清の（細胞培養基中の）系列１０倍希釈を、１：１００の初期希釈で開始して調製し、１：１００，０００の範囲までとした。次いで、各希釈の二連試料をアッセイプレートに移した；５μＬ／ウェル。二次抗体、ＦＭＡＴ  アオイロヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ特異的を細胞培養基中で０．２６μｇ／ｍｌまで希釈し、５０μＬ／ウェルを各ウェルに加えた。プレートを室温にて４時間、（ホイルに包んで）暗所でインキュベートした。プレートをＦＭＡＴ８２００細胞検出システムで読んだ。
【０３７１】
交差−反応性をチェックするために、試料を野生型ｐ８１５細胞に対してもチェックした。特異的抗体標的のみに対して陽性のハイブリドーマープールを、さらに、抗体標的としての親ｐ８１５細胞ではなくｐ８１５／ｐＧ６ｂ細胞にＦＡＣＳ解析を介して結合する能力について解析した（図２Ａ〜２Ｄ）。
【０３７２】
ＦＭＡＴアッセイにおいて特異的陽性結果、およびＦＡＣＳアッセイにおいて陽性結果を生じるハイブリドーマープールを、制限希釈によって少なくとも２回クローン化した。
【０３７３】
以下のマスターウェルおよびクローンを収穫し、アッセイで用いるために精製した：マスターウェル３３７．１、３３７．２、３３７．３、３３７．４、３３７．５、３３７．６および３３７．７；およびクローン３３７．８、３３７．１．７、３３７．３．３、３３７．６．５および３３７．８．３５。
【０３７４】
（実施例４）
ヒトＰＢＭＮＣでのｐＧ６ｂ発現
細胞を培養するために、正常な社内提供者からの血液をフィコールグラジエントで分離し、ＰＢＭＮＣ界面を収集し、ＰＢＳ中で洗浄した。細胞をカウントし、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳまたは抗−ＣＤ３＋抗−ＣＤ２８  ｍａｂ（各々、５０ｎｇ／ｍｌおよび１ｕｇ／ｍｌ）いずれかを含む２００ｕｌ培養基中にて２×１０５細胞／ウェルで９６ウェルをラウンド底部プレート中で平板培養した。いくつかの細胞を時刻０時点で保存した。細胞を時刻２４、４８および７２時間において染色のために収集した。
【０３７５】
各時点において、９６ウェルプレート中の細胞を回転させ、培地を軽く叩き、表面系列マーカーに対するフルオル−コンジュゲーテッド抗体の組合せを、５０μｌのＦａｃｓ染色緩衝液（ＣＤ５６−Ａ４８８、ＣＤ１９−ＰＥ、ＣＤ４５ＲＡ−Ｃｙｃｈｒｏｍｅ、ＣＤ４５ＲＯ−ＰＥ−Ｃｙ７、ＣＤ４−Ａ４０５、ＣＤ８−Ａ７００およびＣＤ１４−Ａ７５０）に加えた。該組合せはＡ６４７色素にカップリングさせたｍａｂ抗−ｐＧ６ｂ（３３７．８．３５）、または同様にカップリングさせた対照ｍａｂのいずれかを含んだ。いくつかの実験において、ｍａｂ抗−ｐＧ６ｂの結合を２０倍（ｇ／ｇ）過剰ｐＧ６ｂ受容体と競合させた。各条件を三連ウェル中で染色した。細胞を氷上で染色結合体と共に３０分間インキュベートし、次いで、Ｆａｃｓ緩衝液で１．５回洗浄し、２％パラホルムアルデヒド、１００ｕｌ／ウェルで室温にて１０分間固定した。プレートを回転させ、パラホルムアルデヒドを除去し、細胞を２００ｕｌのＦａｃｓ緩衝液に再懸濁させ、それらをＬＳＲＩＩで読むまで、４℃でホイルで被覆して貯蔵した。
【０３７６】
ＬＳＲＩＩデータをＦａｃｓＤｉｖａソフトウェアを用いて解析した。ＦＳＣ  Ｘ  ＳＳＣドットプロットを用いて、目に見える細胞集団ゲートを決定した。次いで、目に見える細胞を、抗−ｐＧ６ｂ−Ａ６４７−対−特異的系列マーカーのドットプロットを用いて抗−ｐＧ６ｂ結合について解析した。
【０３７７】
結果は、ｐＧ６ｂが休止ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞で発現され（図３Ａ〜３Ｄ参照）、および発現がＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞についての活性化でアップレギュレートされる（図４Ａおよび４Ｂ参照）ことを示した。ＣＤ１９＋に対して検出可能な結合は無く、およびＣＤ１４＋またはＣＤ１１ｃ細胞に対して競合可能な結合は無かった。ｐＧ６ｂの発現は、記憶Ｔ細胞に対してナイーブなＴ細胞ではより高かった（図５Ａおよび５Ｂ参照）。
【０３７８】
（実施例５）
Ｔ−細胞増殖はｐＧ６ｂ抗体によって変調される
ヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）からの精製されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖は、インビトロにてｐＧ６ｂに対する抗体によって阻害された。ＣＤ３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ５５５３２９）に対する抗体はＴ細胞抗原認識を模倣した。抗体によるＣＤ３およびＴ細胞受容体（ＴｃＲ）の侵入機序はシグナルを供して、インビトロにて増殖させた。このシグナルはさらなるシグナルによって増強され、または開始された。トシル活性化４．５μビーズ（Ｄｙｎａｌ  １４０．１３）に共有結合カップリングされたｐＧ６ｂに対する抗体は、５０〜９０％、インビトロにてＴ細胞の抗−ＣＤ３誘導増殖を阻害した（図６Ａ、６Ｂ、７Ａおよび７Ｂ参照）。共−刺激性抗−ＣＤ２８（ＢＤ  Ｂｉｏｓｉｃｅｎｃｅｓ  ５５５７２５）の添加は、抗−ｐＧ６ｂの阻害効果を部分的に克服した（図８Ａおよび８Ｂ参照）。さらに、抗−ｐＧ６ｂは初期活性化マーカーＣＤ６９およびＩＬ−２受容体ＣＤ２５の発現を阻害した（図９Ａ〜９Ｄ参照）。
【０３７９】
抗体を、以下のように、トシル活性化されたＤｙｎａｂｓ  Ｍ−４５０（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＳＡ，  Ｏｓｌｏ，  Ｎｏｒｗａｙ）にカップリングさせた：試料当たり５０μｌ（２×１０７ビーズ）を、２．６ｍｌのエッペンドルフチューブ中で、１ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４ｍ〜８．０で１回洗浄した。チューブを１分間磁石中に置き、上清を除去した。ビーズを、リン酸ナトリウム緩衝液を用いて元の容量中に再懸濁させた。２．５μｇ  抗−ＣＤ３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｉｃｅｎｃｅｓ  ５５５３２９）および１０μｇの抗−ｐＧ６ｂ、マウスＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）または抗−ＣＴＬＡ−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ：クローン＃４８８１５、カタログ番号ＭＡＢ３２５）を２．０ｍｌのエッペンドルフチューブ中で５０μｌの洗浄されたビーズと合わせた。ビーズのみ（抗体なし）の対照を含ませた。チューブを室温にて４８時間、Ｃｌａｙ  Ａｄａｍｓ  Ｎｕｔａｔｏｒミキサー（Ｂｅｃｔｉｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，  ＮＪ）上に置いた。次いで、チューブを磁石中に１分間置き、上清を除去した。次いで、被覆されたビーズを（Ｃａ２＋  およびＭｇ２＋なし）の１ｍｌのＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）および２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４で４回洗浄した。
【０３８０】
トシル活性化されたビーズを固相プラットフォームとして用い、抗−ＣＤ３および抗−ｐＧ６ｂをＴ細胞にケイジした。健康なボランティアからのヒトＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）密度勾配によって収集した。ある実施形態においては、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋を磁気ビーズカラム（（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）によってＰＢＭＣから共−精製した。Ｔ細胞をＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識して、フローサイトメトリーによって増殖を評価した。１×１０５ＣＦＳＥ−標識Ｔ細胞および１×１０５ビーズをＲＰＭＩ「完全」培地（１０％ＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのＮａ−ピルビン酸塩、０．１ｍＭのＮＥＡＡ、０．０５ｍＭのβ−ＭＥ）中でウェル当たり平板培養した。培地を１日間維持して、所期活性化マーカーを評価し、または３日間維持して、５％ＣＯ２において湿潤化インキュベーター中で増殖を評価した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の増殖を、個々の細胞集団でのゲーティング、およびＣＦＳＥ希釈の測定によって、ＬＳＲＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で測定した。特別な実施形態において、抗−ＣＤ２８（ＢＤ  Ｂｉｏｓｉｃｅｎｃｅｓ  ５５５７２５）を１μｇ／ｍｌの最終濃度にて溶液に加えた。
【０３８１】
可溶性抗体を用いる別々の実験において、抗−ｐＧ６ｂポリクローナル血清は、可溶性抗−ＣＤ３で刺激したヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の応答を阻害した（図１０Ａおよび１１Ｂ参照）。ヒトＰＢＭＣを健康なボランティアから調製し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）密度勾配によって収集した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋を磁気ビーズカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）によってＰＢＭＣから共−精製した。Ｔ細胞をＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識して、フローサイトメトリーによって増殖を評価した。１×１０５ＣＦＳＥ−標識Ｔ細胞および１００ｎｇ／ｍｌの抗−ＣＤ３をウェル当たり平板培養した。示された場合、抗−ｐＧ６ｂ、マウスＩｇＧまたは抗−ＣＴＬＡ−４を１μｇ／ｍｌの最終濃度で加えた。培養を３日間維持して、５％ＣＯ２において湿潤化されたインキュベーター中で増殖を評価した。個々の細胞集団でのゲーティング、およびＣＦＳＥ希釈の測定によって、ＣＤ４およびＣＤ８の増殖をＬＳＲＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で測定した。特別な実験において、抗−ＣＤ２８（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、１μｇ／ｍｌの最終濃度にて溶液に加えた。抗−ＣＤ２８を、ポリクローナル抗−ｐＧ６ｂを含有する培養に含めた結果、抗−ＣＤ３単独で観察されたものを超えた増大した増殖応答がもたらされた（図１０Ｂおよび１１Ｂ参照）。
【０３８２】
抗−ｐＧ６ｂの阻害性および刺激性双方の効果は、全てのテストした３／３ドナーが同様な活性を呈した点でドナー特異的ではなかった。
【０３８３】
上述したことから、本発明の特別な実施形態を説明目的でここに記載してきたが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく種々の修飾をなすことができるのは認識されるであろう。したがって、本発明は特許請求の範囲によるのを除いては制限されない。本明細書中で引用した全ての刊行物、特許および特許出願は、ここに引用して全ての目的でその全体を援用する。
【図１】
2009538830.tif 000009
【図２】
2009538830.tif 000010
【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
2009538830.tif 000014
【図１０−１】
2009538830.tif 000015
【図１０−２】
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【図６Ａ】
2009538830.tif 000017
【図６Ｂ】
2009538830.tif 000018
【図７Ａ】
2009538830.tif 000019
【図７Ｂ】
2009538830.tif 000020
【図８Ａ】
2009538830.tif 000021
【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
2009538830.tif 000023
【図９Ｂ】
2009538830.tif 000024
【図９Ｃ】
2009538830.tif 000025
【図９Ｄ】
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【配列表】
2009538830000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年1月23日(2009.1.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
陽性および陰性共刺激性シグナルはＴ細胞活性の変調において重要な役割を果たし、これらのシグナルを媒介する分子は免疫変調剤のための効果的な標的であることが判明している。陽性共刺激は、Ｔ細胞受容体（ＴｃＲ）関与に加えて、天然Ｔ細胞の最適な活性化で必要とされ、他方、陰性共刺激は自己に対する免疫学的許容性の獲得、ならびにエフェクターＴ細胞機能の停止で必要であると考えられている。抗原―提示細胞（ＡＰＣ）の表ｊ面にあるＢ７−１またはＢ７−２との相互作用に際して、ＣＤ２８、プロトタイプＴ細胞共刺激性分子はＴｃＲ関与に対する応答においてＴ細胞の増殖および分化を促進するシグナルを発し、他方、ＣＤ２８ホモログ細胞傷害性Ｔリンパ球抗原―４（ＣＴＬＡ−４）はＴ細胞増殖およびエフェクター機能の阻害を媒介する（非特許文献１；非特許文献２）。
【０００２】
多くの自己免疫障害は自己反応性Ｔ細胞および自己抗体に関係することが知られている。病原体に対して防御する免疫系の能力を危うくすることなく自己反応性リンパ球を阻害し、または排除することができる剤はかなり望ましい。逆に、養子免疫療法のような多くの癌免疫療法は腫瘍―特異的Ｔ細胞集団を拡大し、それらを腫瘍細胞を攻撃し、殺傷するように向ける（非特許文献３；非特許文献２）。腫瘍攻撃を増大させることができる剤がかなり望ましい。加えて、多くの異なる抗原（例えば、微生物抗原または腫瘍抗原）に対する免疫応答は、検出可能な場合、それらの抗原を発現する剤（例えば、乾癬性微生物または腫瘍細胞）によって媒介される病気プロセスに対する保護を供するには頻繁に不十分な大きさである。しばしば、対象に、抗原と組合せて、対象において抗原に対する免疫応答を増強するように働くアジュバントを投与するのがしばしば望ましい。また、ある状況下においては抗原に対する正常な免疫応答も阻害するのが望ましい。例えば、移植体を受けている患者における正常な免疫応答の抑制が望ましく、そのような免疫抑制活性を呈する剤がかなり望ましい。
【０００３】
共刺激シグナル、特に陽性共刺激シグナルは、Ｂ細胞活性の変調においても役割を演じる。例えば、Ｂ細胞活性化および生殖中心Ｂ細胞は、抗原による刺激に加えてＴ細胞―由来シグナルを必要とする。ヘルパーＴ細胞の表面に存在するＣＤ４０カウンター受容体はＢ細胞の表面にあるＣＤ４０と相互作用し、Ｂ細胞における多くのそのようなＴ−細胞依存性効果を媒介する。興味深いことには、ＣＴＬＡ−４に類似する陰性共刺激受容体はＢ細胞では同定されていない。これは、基本的な差が、自己―許容性、ならびに抗体生産のようなＢ細胞エフェクター機能の阻害のメカニズムに対して関連性を有する、Ｔ細胞およびＢ細胞が抗原に応答するように誘導される方法において存在し得ることを示唆する。機能的ＣＴＬＡ−陽分子がＢ細胞で見出されるとすれば、該知見は、Ｂ細胞刺激のメカニズムの我々の理解を劇的にシフトされるであろう。さらに、そのような受容体の同定は、Ｂ細胞活性化および抗体生産を変調することができ、かつ免疫学的応答の変調で有用な新規な治療剤の開発を提供できるであろう。
【０００４】
従って、Ｔ細胞共刺激活性および／またはＢ細胞共刺激活性のいずれかまたは双方を有する、さらなるＣＤ２８ファミリーのメンバー、およびそれに由来する分子の同定に対する要望が当該分野で存在する。この要望は、それらの基本的な生物学的重要性、およびそれらの活性に影響することができる剤の治療的能力に大いに基づく。共刺激シグナルを変調できるそのような剤は、免疫応答の変調において重要な用途を見出し、大いに望ましい。
【０００５】
本発明は、本明細書中の教示から当業者に明らかとなるはずであるこれらおよび他の使用のためのそのようなポリペプチドを提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００１）１９：５６５−５９４
【非特許文献２】Ｅｇｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００２）３：６１１−６１８
【非特許文献３】Ｄｕｄｌｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００２）２９８：８５０−８５４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
１つの態様において、本発明はリンパ球活性を変調する方法を提供する。そのような方法は、一般には、ｐＧ６ｂ−陽性リンパ球を、少なくとも１つのリンパ球活性を変調するのに有効な量のｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達を変調することができる生物活性剤と接触させることを含む。特定の実施形態において、リンパ球はＴリンパ球である。本発明に従って変調することができる典型的なＴリンパ球活性は、例えば、活性化、分化、増殖、生存、細胞溶解活性、およびサイトカイン生産を含む。特別な実施形態において、リンパ球活性は標的抗原（例えば、病原体抗原、ワクチン抗原、またはｐＧ６ｂカウンター受容体以外の腫瘍―関連抗原）に対する宿主免疫応答を含む。
【０００８】
該方法のいくつかの変形において、該剤はリンパ球と該剤との接触がｐＧ６ｂシグナル伝達によって媒介されるリンパ球活性の減衰を阻害するような、ｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達のアンタゴニストを含む。典型的には、アゴニストは、ｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の機能的相互作用を妨害することができる遮断薬を含む。特に好適な遮断薬は、例えば、ｐＧ６ｂ蛋白質（例えば、配列番号３［ヒトｐＧ６ｂの細胞外ドメイン］または配列番号６［マウスｐＧ６ｂの細胞外ドメイン］に記載されたアミノ酸配列に対するもの）、および可溶性ｐＧ６ｂ融合蛋白質の細胞外ドメインに特異的に結合することができる抗−ｐＧ６ｂ抗体を含む。いくつかの実施形態において、リンパ球とｐＧ６ｂ媒介シグナル伝達のアンタゴニストとの接触はリンパ球の活性を増加させる。
【０００９】
他の変形において、該剤は、リンパ球と該剤との接触がリンパ球活性を阻害するような、ｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達のアゴニストを含む。典型的には、該アゴニストはｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の機能的相互作用を模倣し、または増大させることができる模倣剤を含む。特に好適な模倣剤は、例えば、（例えば、配列番号３または配列番号６に記載されたアミノ酸配列に対する）ｐＧ６ｂ蛋白質の細胞外ドメインに特異的に結合することができる抗−ｐＧ６ｂ抗体を含み、ここに、該抗体の結合はｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の機能的相互作用を模倣し、または増大させる。
【００１０】
もう１つの態様において、患者において癌を治療する方法が提供される。一般には、癌を治療する方法は、患者にｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達のアンタゴニストを投与することを含み、ここに、該投与は対象において腫瘍細胞に対する宿主免疫応答を増加させるのに有効なものである。いくつかの実施形態において、患者の腫瘍細胞はｐＧ６ｂカウンター受容体を発現する。典型的には、ｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達のアンタゴニストは、ｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の機能的相互作用を妨害することができる遮断薬を含む。特に好適な遮断薬は、例えば、結合がｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の相互作用を妨害するような、ｐＧ６ｂの細胞外ドメインに特異的に結合することができる抗−ｐＧ６ｂ抗体を含む。
【００１１】
なおもう１つの態様において、本発明は、自己反応性（ａｕｔｏａｃｔｉｖｅ）ｐＧ６ｂ−陽性リンパ球の存在によって特徴付けられる自己免疫疾患を有する患者を治療する方法を提供する。一般に、該方法は患者にｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達のアゴニストを投与することを含み、ここに、該投与はｐＧ６ｂを発現する非−リンパ系の非−腫瘍宿主細胞に対して自己反応性免疫応答を疎外するのに有効なものである。典型的には、該アゴニストはｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の機能的相互作用を模倣し、または増大させることができる模倣剤を含む。特に好適な模倣剤はｐＧ６ｂ蛋白質の細胞外ドメイン（例えば、配列番号３または配列番号６）に特異的に結合することができる抗−ｐＧ６ｂ抗体を含み、ここに、抗体の結合はｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の機能的相互作用を模倣し、または増大させる。
【００１２】
また、単離された抗−ｐＧ６ｂ抗体も提供される。いくつかの実施形態において、本発明の単離された抗−ｐＧ６ｂ抗体は、（ａ）該抗体はｐＧ６ｂ蛋白質の細胞外ドメイン（例えば、配列番号３または配列番号６）に特異的に結合し、かつ（ｂ）該抗体は、マイクロビーズに共有結合によりカップリングして、抗体の固定化された形態を生じる場合、インビトロにてＴ細胞においてＴｃＲ−媒介活性化を刺激することができ、ここに、該ＴｃＲ−媒介活性化は、Ｔ細胞を、マイクロビーズにもカップリングされた作動性抗−ＣＤ３抗体と接触させる工程を含む。ある変形において、該抗―ｐＧ６ｂ抗体は、さらに、抗−ｐＧ６ｂ抗体の非存在下においてマイクロビーズに共有結合によりカップリングされた抗−ＣＤ３に接触される対照Ｔ細胞と比較して、少なくとも約５０％ＴｃＲ−媒介活性化を刺激することができることを特徴とする。なお他の変形において、該抗−ｐＧ６ｂ抗体は、さらに、抗体の固定化された形態が、Ｔ細胞を、マイクロビーズに共有結合によりカップリングされた抗−ＣＤ３抗体、および可溶性の作動性抗−ＣＤ２８抗体と接触させることにより、ＴｃＲ−媒介活性化を阻害することができることを特徴とする。抗−ｐＧ６ｂは例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。
【００１３】
特定の実施形態において、本発明の単離された抗−ｐＧ６ｂ抗体は、（ａ）該抗体はｐＧ６ｂ蛋白質の細胞外ドメインで（例えば、配列番号３または配列番号６）に特異的に結合し、さらに、以下の特性の少なくとも１つを有し；（ｂ）該抗体は、可溶性形態において、インビトロにてＴ細胞におけるＴｃＲ−媒介活性化を阻害することができ、ここに、ＴｃＲ−媒介活性化は、ＣＤ２８−媒介共刺激の非存在下においてＴ細胞を可溶性の作動性抗−ＣＤ３抗体と接触させる工程を含み、および（ｃ）該抗体は、可溶性形態において、インビトロにてＴ細胞におけるＴｃＲ−媒介活性化を増強させることができ、ここに、ＴｃＲ−媒介活性化は第二のＴ細胞を可溶性抗−ＣＤ３抗体および可溶性の作動性抗−ＣＤ２８抗体と接触させる工程を含むことを特徴とする。典型的には、抗―ｐＧ６ｂ抗体の可溶性形態がインビトロにて抗−ＣＤ３−刺激Ｔ細胞においてＴｃＲ−媒介活性化を刺激することができる場合、可溶性抗体は、ＣＤ２８−媒介共−刺激の非存在下において、かつ抗−ｐＧ６ｂ抗体の非存在下において、可溶性抗−ＣＤ３抗体と接触される対照Ｔ細胞と比較して、少なくとも約５０％ＴｃＲ−媒介活性化を阻害することができる。可溶性抗―ｐＧ６ｂがインビトロにて抗―ＣＤ３／抗―ＣＤ２８―刺激Ｔ細胞においてＴｃＲ−媒介活性化を増強させることができ、ＴｃＲ−媒介活性化が、第二のＴ細胞を、可溶性抗―ＣＤ３抗体および可溶性の作動性抗―ＣＤ２８抗体と接触させる工程を含む場合、可溶性抗―ｐＧ６ｂ抗体は、典型的には、抗―ｐＧ６ｂ抗体の非存在下において可溶性抗―ＣＤ３抗体および可溶性抗―ＣＤ２８抗体双方と接触される対照Ｔ細胞と比較して、少なくとも約２０％ＴｃＲ−媒介活性化を増強させることができる。抗―ｐＧ６ｂ抗体は、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。
【００１４】
そのような抗―ｐＧ６ｂ抗体は、例えば、Ｔ細胞活性化を変調する種々の方法において有用である。従って、なおもう１つの態様において、先に議論した抗―ｐＧ６ｂ抗体を用いてＴ細胞活性化を阻害し、または増強する方法が提供される。いくつかの実施形態において、ＴｃＲ−媒介Ｔ細胞活性化を阻害する方法は、Ｔ細胞を、ＣＤ２８−媒介Ｔ細胞で共刺激の非存在下において、有効量の以下の特性を有する抗体と接触させる工程を含む：（ａ）該抗体はｐＧ６ｂ蛋白質の細胞外ドメイン（例えば、配列番号３または配列番号６）に特異的に結合し、かつ（ｂ）該抗体は、可溶性形態において、インビトロにてＴ細胞におけるＴｃＲ−媒介活性化を阻害することができ、ここに、ＴｃＲ−媒介活性化は、ＣＤ２８−媒介共刺激の非存在下において、Ｔ細胞を作動性抗―ＣＤ３抗体と接触させる工程を含む。そのような方法は、例えば、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで行うことができる。いくつかの変形において、該方法は対象において炎症または自己免疫疾患を治療する方法であり；いくつかのそのような変形においては、抗―ｐＧ６ｂ抗体は、例えば、ＣＤ２８／Ｂ７阻害活性を有する第二の剤と組み合わせる等、ＣＤ２８／Ｂ７共刺激経路が抑制される条件下で用いられる。
【００１５】
他の実施形態において、ＴｃＲ−媒介Ｔ細胞活性化を増強する方法は、Ｔ細胞を、ＣＤ２８−媒介Ｔ細胞共刺激の存在下において、有効量の以下の特性を有する抗体と接触させる工程を含む：（ａ）該抗体はｐＧ６ｂ蛋白質の細胞外ドメイン（例えば、配列番号３または配列番号６）に特異的に結合し、かつ（ｂ）該抗体は、可溶性形態において、インビトロにてＴ細胞におけるＴｃＲ−媒介活性化を増強することができ、ここに、ＴｃＲ−媒介活性化は、Ｔ細胞を、抗―ＣＤ３抗体および作動性抗―ＣＤ２８抗体と接触させる工程を含む。そのような方法は、例えば、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで行うことができる。いくつかの変形において、該方法は対象において癌を治療する方法であり；いくつかのそのような変形において、抗―ｐＧ６ｂ抗体はＣＤ２８／Ｂ７刺激活性を有する第二の剤と組み合わせる。そのような変形は、例えば、ｐＧ６ｂカウンター受容体を発現する腫瘍細胞を含めた腫瘍細胞に対して対象の免疫応答を増加させるのに有効である。
【００１６】
なお他の実施形態において、患者において癌を治療する方法は以下の特性を有する抗体を患者に投与することを含み：（ａ）該抗体はｐＧ６ｂの細胞外ドメインに特異的に結合し、かつ（ｂ）該抗体は、マイクロビーズに共有結合によりカップリングして、抗体の固定化された形態を生じる場合、インビトロにてＴ細胞におけるＴｃＲ−媒介活性化を阻害することができ、ここに、ＴｃＲ−媒介活性化は、Ｔ細胞を、マイクロビーズにもカップリングされた作動性抗―ＣＤ３抗体と接触させる工程を含む。ある変形において、抗―ｐＧ６ｂ抗体は、さらに、抗体の固定化された形態が、抗―ｐＧ６ｂ抗体の非存在下においてマイクロビーズに共有結合によりカップリングされた抗―ＣＤ３と接触される対照Ｔ細胞と比較して、少なくとも約５０％ＴｃＲ−媒介活性化を阻害することができる。なお他の変形において、抗―ｐＧ６ｂ抗体は、さらに、抗体の固定化された形態が、Ｔ細胞をマイクロビーズに共有結合によりカップリングされた抗―ＣＤ３抗体および可溶性の作動性抗―ＣＤ２８抗体と接触させることによりＴｃＲ−媒介活性化を阻害することができることを特徴とする。特別な変形において、抗―ｐＧ６ｂは、ビーズ―カップルド抗―ＣＴＬＡ−４抗体のそのようなインビトロＴ細胞変調活性と同様な、またはほぼ同等なＴ細胞活性化に対するビーズ―カップルドインビトロ活性を呈する。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
リンパ球活性を変調するための方法であって、この方法は、ｐＧ６ｂ−陽性リンパ球と、少なくとも１つのリンパ球活性を変調するのに有効な量でｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達を変調することができる生物活性剤とを接触させることを含む、方法。
（項目２）
上記剤がｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達のアンタゴニストを含み、上記接触がｐＧ６ｂシグナル伝達によって媒介されるリンパ球活性の減衰を阻害する、項目１記載の方法。
（項目３）
上記接触がリンパ球活性を増加させる、項目２記載の方法。
（項目４）
上記アンタゴニストが、ｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の機能的相互作用を妨害することができる遮断薬を含む、項目２記載の方法。
（項目５）
上記遮断薬がｐＧ６ｂの細胞外ドメインに特異的に結合することができる抗―ｐＧ６ｂ抗体を含み、上記結合がｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の相互作用を妨害する、項目４記載の方法。
（項目６）
上記遮断薬が可溶性ｐＧ６ｂ蛋白質を含む、項目４記載の方法。
（項目７）
上記剤がｐＧ６ｂ―媒介シグナル伝達のアゴニストを含み、上記接触がリンパ球活性を減少させる、項目１記載の方法。
（項目８）
上記アゴニストがｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の機能的相互作用を模倣または増大させることができる剤を含む、項目７記載の方法。
（項目９）
上記アゴニストがｐＧ６ｂの細胞外ドメインに特異的に結合することができる抗―ｐＧ６ｂ抗体を含み、上記結合がｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の機能的相互作用を模倣または増大させる、項目８記載の方法。
（項目１０）
上記リンパ球がＴリンパ球であって、上記リンパ球活性が活性化、分化、増殖、生存、細胞溶解活性、およびサイトカイン生産よりなる群から選択される、項目１記載の方法。
（項目１２）
上記リンパ球活性が標的抗原に対する宿主免疫応答を含み、上記標的抗原が病原体抗原、ワクチン抗原、およびそのカウンター受容体以外の腫瘍―関連抗原よりなる群から選択される、項目１記載の方法。
（項目１３）
対象において癌を治療するための方法であって、この方法は、この対象にｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達のアンタゴニストを投与することを含み、この投与はこの対象において腫瘍細胞に対する宿主免疫応答を増加させるのに有効である、方法。
（項目１４）
上記アンタゴニストがｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の機能的相互作用を妨害することができる遮断薬を含む、項目１３記載の方法。
（項目１５）
上記遮断薬がｐＧ６ｂの細胞外ドメインに特異的に結合することができる抗―ｐＧ６ｂ抗体を含み、上記結合はｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の相互作用を妨害する、項目１４記載の方法。
（項目１６）
自己反応性ｐＧ６ｂ−陽性リンパ球の存在によって特徴付けられる自己免疫疾患を有する患者を治療するための方法であって、この方法は、この患者にｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達のアゴニストを投与することを含み、この投与がｐＧ６ｂを発現する非―リンパ系非―腫瘍宿主細胞に対する自己反応性免疫応答を阻害するのに有効である、方法。
（項目１７）
上記アゴニストがｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の機能的相互作用を模倣または増大させることができる剤を含む、項目１６記載の方法。
（項目１８）
上記アゴニストがｐＧ６ｂの細胞外ドメイン（配列番号３）に特異的に結合することができる抗―ｐＧ６ｂ抗体を含む、項目１７記載の方法。
（項目１９）
単離された抗―ｐＧ６ｂ抗体であって、以下：
（ａ）この抗体は、ヒトｐＧ６ｂの細胞外ドメイン（配列番号３）に特異的に結合し、かつ（ｂ）この抗体は、マイクロビーズに共有結合によりカップリングして、この抗体の固定化形態を生じる場合、インビトロにてＴ細胞におけるＴｃＲ―媒介活性化を阻害することができ、このＴｃＲ−媒介活性化は、このＴ細胞を、このマイクロビーズにもカップリングした作動性抗―ＣＤ３抗体と接触させる工程を含むことを特徴とする、抗体。
（項目２０）
さらに、上記抗体の固定化形態が、上記抗―ｐＧ６ｂ抗体の非存在下において第二のマイクロビーズに共有結合によりカップリングされた抗―ＣＤ３と接触させる対照Ｔ細胞と比較して、少なくとも約５０％上記ＴｃＲ−媒介活性化を阻害することができることを特徴とする、項目１９記載の抗―ｐＧ６ｂ抗体。
（項目２１）
さらに、上記抗体の固定化形態がインビトロにて第二のＴ細胞において第二のＴｃＲ―媒介活性化を阻害することができ、この第二のＴｃＲ―媒介活性化は、このＴ細胞を、上記マイクロビーズに共有結合によりカップリングされた抗―ＣＤ３抗体、および可溶性の作動性抗―ＣＤ２８抗体と接触させる工程を含むことを特徴とする、項目１９記載の抗―ｐＧ６ｂ抗体。
（項目２２）
モノクロ−ナル抗体である、項目１９記載の抗―ｐＧ６ｂ抗体。
（項目２３）
単離された抗―ｐＧ６ｂ抗体であって、以下：
（ａ）この抗体はヒトｐＧ６ｂの細胞外ドメイン（配列番号３）に特異的に結合し、かつ（ｂ）可溶性形態のこの抗体がインビトロにてＴ細胞におけるＴｃＲ―媒介活性化を阻害することができ、このＴｃＲ―媒介活性化が、ＣＤ２８―媒介共刺激の非存在下において、このＴ細胞を、可溶性の作動性抗―ＣＤ３抗体と接触させる工程を含むことを特徴とする、抗体。
（項目２４）
さらに、上記抗―ｐＧ６ｂ抗体の可溶性形態が、ＣＤ２８―媒介共刺激の非存在下において、かつこの抗体―ｐＧ６ｂ抗体の非存在下において、上記可溶性抗―ＣＤ３抗体と接触させる対照Ｔ細胞と比較して、少なくとも約５０％上記ＴｃＲ―媒介活性化を阻害することができることを特徴とする、項目２３記載の抗―ｐＧ６ｂ抗体。
（項目２５）
さらに、（ｃ）上記抗―ｐＧ６ｂ抗体の可溶性形態がインビトロにて第二のＴ細胞における第二のＴｃＲ―媒介活性化を増強させることができ、この第二のＴｃＲ―媒介活性化は、この第二のＴ細胞を、上記可溶性抗―ＣＤ３抗体および可溶性の作動性抗―ＣＤ２８抗体と接触させる工程を含むことを特徴とする、項目２３記載の抗―ｐＧ６ｂ抗体。
（項目２６）
さらに、上記抗―ｐＧ６ｂ抗体の可溶性形態が、上記抗―ｐＧ６ｂ抗体の非存在下において、上記可溶性抗―ＣＤ３抗体および上記可溶性抗―ＣＤ２８抗体双方と接触される対照Ｔ細胞と比較して、少なくとも約２０％上記第二のＴｃＲ−媒介活性化を増強させることができることを特徴とする、項目２５記載の抗―ｐＧ６ｂ抗体。
（項目２７）
モノクロ−ナル抗体である、項目２３または２５記載の抗体。
（項目２８）
Ｔ細胞活性化を阻害する方法であって、この方法は、Ｔ細胞を、有効量の項目２３記載の抗体と接触させる工程を含み、この接触工程はＣＤ２８―媒介Ｔ細胞共−刺激の非存在下で行われ、およびこのＴ細胞のＴｃＲ−媒介活性化が阻害される、方法。
（項目２９）
Ｔ細胞の活性化を増強させる方法であって、この方法は、Ｔ細胞を、有効量の項目２５記載の抗体と接触させる工程を含み、この接触工程はＣＤ２８−媒介Ｔ細胞共−刺激の存在下で行われ、およびこのＴ細胞のＴｃＲ−媒介活性化が増強される、Ｔ細胞の活性化を増強させる方法。
（項目３０）
上記抗体がモノクローナル抗体である、項目２８または２９記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１はエクソンパターンおよびエクソンフェージングを含めたＣＤ２８ファミリーメンバー遺伝子構造のプロファイリングを示す。「Ｓ」はシグナルまたはリーダー配列をコードする第一のエクソンを示し；「ＩｇＶ」はＩｇＶドメインをコードする第二のエクソンを示し；および「ＴＭＤ」は膜貫通ドメインをコードする第三のエクソンを示す。「Ｃ１」および「Ｃ２」は、各々、細胞質ドメインをコードする第四および任意の第五のエクソンを示す。数字０および２はエクソンの間のエクソンフェージングを示す。
【図２】図２Ａ〜２ＤはｐＧ６ｂ−トランスフェクトＰ８１５細胞でのｐＧ６ｂ発現を示す。ＥＬＩＳＡ抗体におけるｐＧ６ｂ−ｍＦｃに対する特異的結合について陽性であるハイブリドーマプールを、ＦＩＴＣ−コンジュゲーテッドラット抗―マウス２次抗体を用いて親ｐ８１５細胞（２Ｂおよび２Ｄ）ではなくｐ８１５／ｐＧ６ｂ細胞（２Ａおよび２Ｃ）に対してＦＡＣＳ解析を介して結合する能力について解析した。相対的ｐＧ６ｂ発現レベルは平均蛍光強度（２Ａおよび２Ｂ）、または抗―ｐＧ６ｂ結合に対して陽性である細胞の割合（２Ｃおよび２Ｄ）いずれかとしてｙ−軸上に示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｄは、二つの異なるドナー（ドナー＃１−３Ａおよび３Ｂ；ドナー＃２−３Ｃおよび３およびＤ）に由来するヒトＰＢＭＣにおける休止ＣＤ４＋細胞（３Ａおよび３Ｃ）およびＣＤ８＋細胞（３Ｂおよび３Ｄ）でのｐＧ６ｂ発現を示す。
【図４Ａ】図４はＴ細胞活性化によるｐＧ６ｂ発現の増加を示す。ヒトＰＢＭＣを抗−ＣＤ３＋抗−ＣＤ２８モノクローナル抗体で刺激し、ｍＡｂ抗―ｐＧ６ｂ（３３７．８．３５）またはＡ６４７染料にカップリングした対照ＩｇＧ  ｍＡｂでのＦＡＣＳによって２４．４８および７２時間においてＣＤ４＋細胞（４Ａ）およびＣＤ８＋細胞（４Ｂ）でのｐＧ６ｂ発現について解析した。未処理細胞は０の時点としてＦＡＣＳによって同様に解析した。
【図４Ｂ】図４はＴ細胞活性化によるｐＧ６ｂ発現の増加を示す。ヒトＰＢＭＣを抗−ＣＤ３＋抗−ＣＤ２８モノクローナル抗体で刺激し、ｍＡｂ抗―ｐＧ６ｂ（３３７．８．３５）またはＡ６４７染料にカップリングした対照ＩｇＧ  ｍＡｂでのＦＡＣＳによって２４．４８および７２時間においてＣＤ４＋細胞（４Ａ）およびＣＤ８＋細胞（４Ｂ）でのｐＧ６ｂ発現について解析した。未処理細胞は０の時点としてＦＡＣＳによって同様に解析した。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、ＣＤ４＋記憶細胞（ＣＤ４５ＲＯ＋；図５Ａ）に対する（ＣＤ４５ＲＡ＋；図５Ｂ）ナイーブ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋；図５Ｂ）でのｐＧ６ｂの増大した発現を示す。ＣＤ４＋ナイーブ細胞は、ＣＤ４＋記憶細胞の２３％と比較してｐＧ６ｂ発現について３７％要請であった。
【図６Ａ】図６Ａおよび６Ｂは、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するビーズ―カップルド抗―ｐＧ６ｂ抗体の効果を示す。抗−ｐＧ６ｂ抗体を抗−ＣＤ３  ｍＡｂと共にトシル活性化４．５μビーズに共有結合によりカップリングさせた。対照ＩｇＧ１は、各々、抗−ＣＤ３と一緒にビーズにもカップリングさせた。Ｔ細胞を抗体―カップルドビーズの存在下で、可溶性ＣＤ２８  ｍＡｂの非存在下（６Ａ）または存在下（６Ｂ）いずれかで培養し、ＬＳＲＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で３日のちに増殖について評価した。抗−ｐＧ６ｂ  ｍＡｂ（３３７．１、３３７．２、３３７．３、３３７．４、３３７．５、３３７．６、３３７．１．７、３３７．３．３、）ならびに抗−ｐＧ６ｂポリクローナル抗体Ｅ９１９４は抗−ＣＤ３−誘導増殖を阻害した（図６Ａ）抗−ｐＧ６ｂ  ｍＡｂは抗−ＣＤ３／ＣＤ２８／誘導増殖も阻害し、他方、抗−ｐＧ６ｂポリクローナル抗体Ｅ９１９４はこれらの条件下で増殖をわずかに増強させた（図６Ｂ）。
【図６Ｂ】図６Ａおよび６Ｂは、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するビーズ―カップルド抗―ｐＧ６ｂ抗体の効果を示す。抗−ｐＧ６ｂ抗体を抗−ＣＤ３  ｍＡｂと共にトシル活性化４．５μビーズに共有結合によりカップリングさせた。対照ＩｇＧ１は、各々、抗−ＣＤ３と一緒にビーズにもカップリングさせた。Ｔ細胞を抗体―カップルドビーズの存在下で、可溶性ＣＤ２８  ｍＡｂの非存在下（６Ａ）または存在下（６Ｂ）いずれかで培養し、ＬＳＲＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で３日のちに増殖について評価した。抗−ｐＧ６ｂ  ｍＡｂ（３３７．１、３３７．２、３３７．３、３３７．４、３３７．５、３３７．６、３３７．１．７、３３７．３．３、）ならびに抗−ｐＧ６ｂポリクローナル抗体Ｅ９１９４は抗−ＣＤ３−誘導増殖を阻害した（図６Ａ）抗−ｐＧ６ｂ  ｍＡｂは抗−ＣＤ３／ＣＤ２８／誘導増殖も阻害し、他方、抗−ｐＧ６ｂポリクローナル抗体Ｅ９１９４はこれらの条件下で増殖をわずかに増強させた（図６Ｂ）。
【図７Ａ】図７Ａおよび７Ｂは、ＣＤ４＋（７Ａ）およびＣＤ８＋（７Ｂ）Ｔ細胞に対するビーズ―カップルド抗−ｐＧ６ｂ抗体の効果を示す。抗−ｐＧ６ｂ  ｍＡｂ  ３３７．１．７および３３７．８．３５．３およびｐＡｂ  Ｅ９１９４を、各々、抗−ＣＤ３  ｍＡｂと共にトシル活性化４．５μビーズに共有結合よりカップリングさせた。ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂおよび対照ＩｇＧ１を、各々、抗−ＣＤ３と一緒にビーズにもカップリングさせた。３つの異なるドナーからのＴ細胞を抗体―カップルドビーズの存在下で培養し、３日のちにＬＳＲＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で増殖について評価した。抗−ｐＧ６ｂ抗体は対照マウスＩｇＧ１に対してＴ細胞増殖を阻害し、ｍＡｂ  ３３７．１はｍＡｂ  ３３７．８．３５．３およびｐＡｂ  Ｅ９１９４よりも大きな効果および抗−ＣＴＬＡ４  ｍＡｂで観察されたのとほぼ同等な効果を示す。
【図７Ｂ】図７Ａおよび７Ｂは、ＣＤ４＋（７Ａ）およびＣＤ８＋（７Ｂ）Ｔ細胞に対するビーズ―カップルド抗−ｐＧ６ｂ抗体の効果を示す。抗−ｐＧ６ｂ  ｍＡｂ  ３３７．１．７および３３７．８．３５．３およびｐＡｂ  Ｅ９１９４を、各々、抗−ＣＤ３  ｍＡｂと共にトシル活性化４．５μビーズに共有結合よりカップリングさせた。ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂおよび対照ＩｇＧ１を、各々、抗−ＣＤ３と一緒にビーズにもカップリングさせた。３つの異なるドナーからのＴ細胞を抗体―カップルドビーズの存在下で培養し、３日のちにＬＳＲＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で増殖について評価した。抗−ｐＧ６ｂ抗体は対照マウスＩｇＧ１に対してＴ細胞増殖を阻害し、ｍＡｂ  ３３７．１はｍＡｂ  ３３７．８．３５．３およびｐＡｂ  Ｅ９１９４よりも大きな効果および抗−ＣＴＬＡ４  ｍＡｂで観察されたのとほぼ同等な効果を示す。
【図８Ａ】図８Ａおよび８Ｂは、ＣＤ４＋（８Ａ）およびＣＤ８＋（８Ｂ）Ｔ細胞に対するビーズ―カップルド抗−ｐＧ６ｂ抗体の効果を示す。抗−ｐＧ６ｂ  ｍＡｂ  ３３７．１．７および３３７．８．３５．３およびｐＡｂ  Ｅ９１９４を、各々、抗−ＣＤ３  ｍＡｂと共にトシル活性化４．５μビーズに共有結合によりカップリングさせた。ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂおよび対照ＩｇＧ１を、各々、抗−ＣＤ３と共にビーズにもカップリングさせた。三つの異なるドナーからのＴ細胞を抗体―カップルドビーズおよび可溶性抗−ＣＤ２８  、ｍＡｂの存在下で培養し、３日後に、ＬＳＲＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で増殖について評価した。抗−ｐＧ６ｂ  ｍＡｂ  ３３７．１．７および３３７．８．３５．３は、対照マウスＩｇＧ１に対してＴ細胞増殖を阻害し、ｍＡｂ  ３３７．１は、ｍＡｂ  ３３７．８．３５．３よりもやや大きな効果、および抗−ＣＴＬＡ４  ｍＡｂで観察されたものとほぼ同等な効果を示す。ｐＡｂ  Ｅ９１９４は対照ＩｇＧ１に対してＴ細胞増殖を増強した。
【図８Ｂ】図８Ａおよび８Ｂは、ＣＤ４＋（８Ａ）およびＣＤ８＋（８Ｂ）Ｔ細胞に対するビーズ―カップルド抗−ｐＧ６ｂ抗体の効果を示す。抗−ｐＧ６ｂ  ｍＡｂ  ３３７．１．７および３３７．８．３５．３およびｐＡｂ  Ｅ９１９４を、各々、抗−ＣＤ３  ｍＡｂと共にトシル活性化４．５μビーズに共有結合によりカップリングさせた。ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂおよび対照ＩｇＧ１を、各々、抗−ＣＤ３と共にビーズにもカップリングさせた。三つの異なるドナーからのＴ細胞を抗体―カップルドビーズおよび可溶性抗−ＣＤ２８  、ｍＡｂの存在下で培養し、３日後に、ＬＳＲＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で増殖について評価した。抗−ｐＧ６ｂ  ｍＡｂ  ３３７．１．７および３３７．８．３５．３は、対照マウスＩｇＧ１に対してＴ細胞増殖を阻害し、ｍＡｂ  ３３７．１は、ｍＡｂ  ３３７．８．３５．３よりもやや大きな効果、および抗−ＣＴＬＡ４  ｍＡｂで観察されたものとほぼ同等な効果を示す。ｐＡｂ  Ｅ９１９４は対照ＩｇＧ１に対してＴ細胞増殖を増強した。
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｄは、ＣＤ４＋（９Ａおよび９Ｂ）およびＣＤ８＋（９Ｃおよび９Ｄ）Ｔ細胞上での初期活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５の発現に対するビーズ―カップルド抗−ｐＧ６ｂ抗体の効果を示す。上述した図７Ａおよび７Ｂについて記載されたように処理されたＴ細胞を、ＦＡＣＳによってＣＤ６９およびＣＤ２５発現について解析した。抗−ｐＧ６ｂ  ｍＡｂ  ３３７．１．７および３３７．８．３５．３は、対照マウスＩｇＧ１に対するＣＤ２５（図９Ａ［ＣＤ４＋］および９Ｃ［ＣＤ８＋］）およびＣＤ６９（図９Ｂ［ＣＤ４＋］および９Ｄ［ＣＤ８＋］の抗−ＣＤ３−誘導発現を阻害し、ｍＡｂ  ３３７．１は、ｍＡｂ  ３３７．８．３５．３よりもいくつかのドナーにおけるやや大きな効果、および抗−ＣＴＬＡ４  ｍＡｂで観察されたのとほぼ同等な効果を示す。
【図９Ｂ】図９Ａ〜９Ｄは、ＣＤ４＋（９Ａおよび９Ｂ）およびＣＤ８＋（９Ｃおよび９Ｄ）Ｔ細胞上での初期活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５の発現に対するビーズ―カップルド抗−ｐＧ６ｂ抗体の効果を示す。上述した図７Ａおよび７Ｂについて記載されたように処理されたＴ細胞を、ＦＡＣＳによってＣＤ６９およびＣＤ２５発現について解析した。抗−ｐＧ６ｂ  ｍＡｂ  ３３７．１．７および３３７．８．３５．３は、対照マウスＩｇＧ１に対するＣＤ２５（図９Ａ［ＣＤ４＋］および９Ｃ［ＣＤ８＋］）およびＣＤ６９（図９Ｂ［ＣＤ４＋］および９Ｄ［ＣＤ８＋］の抗−ＣＤ３−誘導発現を阻害し、ｍＡｂ  ３３７．１は、ｍＡｂ  ３３７．８．３５．３よりもいくつかのドナーにおけるやや大きな効果、および抗−ＣＴＬＡ４  ｍＡｂで観察されたのとほぼ同等な効果を示す。
【図９Ｃ】図９Ａ〜９Ｄは、ＣＤ４＋（９Ａおよび９Ｂ）およびＣＤ８＋（９Ｃおよび９Ｄ）Ｔ細胞上での初期活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５の発現に対するビーズ―カップルド抗−ｐＧ６ｂ抗体の効果を示す。上述した図７Ａおよび７Ｂについて記載されたように処理されたＴ細胞を、ＦＡＣＳによってＣＤ６９およびＣＤ２５発現について解析した。抗−ｐＧ６ｂ  ｍＡｂ  ３３７．１．７および３３７．８．３５．３は、対照マウスＩｇＧ１に対するＣＤ２５（図９Ａ［ＣＤ４＋］および９Ｃ［ＣＤ８＋］）およびＣＤ６９（図９Ｂ［ＣＤ４＋］および９Ｄ［ＣＤ８＋］の抗−ＣＤ３−誘導発現を阻害し、ｍＡｂ  ３３７．１は、ｍＡｂ  ３３７．８．３５．３よりもいくつかのドナーにおけるやや大きな効果、および抗−ＣＴＬＡ４  ｍＡｂで観察されたのとほぼ同等な効果を示す。
【図９Ｄ】図９Ａ〜９Ｄは、ＣＤ４＋（９Ａおよび９Ｂ）およびＣＤ８＋（９Ｃおよび９Ｄ）Ｔ細胞上での初期活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５の発現に対するビーズ―カップルド抗−ｐＧ６ｂ抗体の効果を示す。上述した図７Ａおよび７Ｂについて記載されたように処理されたＴ細胞を、ＦＡＣＳによってＣＤ６９およびＣＤ２５発現について解析した。抗−ｐＧ６ｂ  ｍＡｂ  ３３７．１．７および３３７．８．３５．３は、対照マウスＩｇＧ１に対するＣＤ２５（図９Ａ［ＣＤ４＋］および９Ｃ［ＣＤ８＋］）およびＣＤ６９（図９Ｂ［ＣＤ４＋］および９Ｄ［ＣＤ８＋］の抗−ＣＤ３−誘導発現を阻害し、ｍＡｂ  ３３７．１は、ｍＡｂ  ３３７．８．３５．３よりもいくつかのドナーにおけるやや大きな効果、および抗−ＣＴＬＡ４  ｍＡｂで観察されたのとほぼ同等な効果を示す。
【図１０−１】図１０Ａ〜１０Ｄは、ＣＤ４＋（１０Ａおよび１０Ｂ）およびＣＤ８＋（１０Ｃおよび１０Ｄ）Ｔ細胞に対する可溶性抗−ｐＧ６ｂ抗体の効果を示す。Ｔ細胞を、可溶性で抗−ＣＤ２８  ｍＡｂの存在下（１０Ａおよび１０Ｃ）または非存在下（１０Ｂおよび１０Ｄ）いずれかにて、可溶性抗―ＣＤ３  ｍＡｂと共に、可溶性抗−ｐＧ６ｂ  ｍＡｂ（３３７．１、３３７．２、３３７．３、３３７．４、３３７．５、３３７．６、３３７．７、３３７．１．７、３３７．３．３、）およびｐＡｂ  Ｅ９１９４で別々に処理した。３日後に、増殖をＬＳＲＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で評価した。抗―ｐＧ６ｂ  ｐＡｂ  Ｅ９１９４は、可溶性抗−ＣＤ３（図１０Ａおよび１１Ｂ）で刺激されたヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の応答を刺激した。ポリクローナル抗−ｐＧ６ｂ  Ｅ９１９４を含有する培養に対して抗−ＣＤ２８を含めると、抗−ＣＤ３単独で観察されたのを超えて増加した増殖応答がもたらされた（図１０Ｂおよび１１Ｂ）。
【図１０−２】図１０Ａ〜１０Ｄは、ＣＤ４＋（１０Ａおよび１０Ｂ）およびＣＤ８＋（１０Ｃおよび１０Ｄ）Ｔ細胞に対する可溶性抗−ｐＧ６ｂ抗体の効果を示す。Ｔ細胞を、可溶性で抗−ＣＤ２８  ｍＡｂの存在下（１０Ａおよび１０Ｃ）または非存在下（１０Ｂおよび１０Ｄ）いずれかにて、可溶性抗―ＣＤ３  ｍＡｂと共に、可溶性抗−ｐＧ６ｂ  ｍＡｂ（３３７．１、３３７．２、３３７．３、３３７．４、３３７．５、３３７．６、３３７．７、３３７．１．７、３３７．３．３、）およびｐＡｂ  Ｅ９１９４で別々に処理した。３日後に、増殖をＬＳＲＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で評価した。抗―ｐＧ６ｂ  ｐＡｂ  Ｅ９１９４は、可溶性抗−ＣＤ３（図１０Ａおよび１１Ｂ）で刺激されたヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の応答を刺激した。ポリクローナル抗−ｐＧ６ｂ  Ｅ９１９４を含有する培養に対して抗−ＣＤ２８を含めると、抗−ＣＤ３単独で観察されたのを超えて増加した増殖応答がもたらされた（図１０Ｂおよび１１Ｂ）。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
詳細な説明
１．概観
本発明は、一般には、リンパ球受容体のＣＤ２８ファミリーのメンバーとしてのｐＧ６ｂの同定および特徴づけに向けられる。かくして、本発明は、Ｔリンパ球上に発現されるＣＤ２８ファミリーのメンバーとして新しく同定された受容体を提供する。本発明の受容体は「ｐＧ６ｂ」と命名され、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、ＰＤ−１、およびＢＴＬＡから区別される。例えば、ｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体カウンター受容体の天然相互作用を変調するような、ｐＧ６ｂ−媒介リンパ球シグナル伝達を変調するための方法および組成物も提供され、それは、免疫学的許容性、自己免疫、免疫抑制、および癌免疫療法を含めた免疫療法のための多数の治療的適用を有する。
【００１９】
ｐＧ６ｂは、少なくとも部分的には、ＣＤ２８ファミリー遺伝子プロファイリングに基づいてＣＤ２８ファミリーメンバーとして本発明者らによって同定された。本発明者らは、ＣＤ２８ファミリー遺伝子構造は特徴的なエクソンパターンを含むことを認識し、そこでは、第一のエクソンはリーダー配列をコードし、第二のエクソンはＩｇＶドメインをコードし、第三のエクソンは膜貫通ドメインをコードし、１つのまたは２つのエクソンは細胞質ドメインをコードする（図１参照）。ＣＤ２８ファミリー遺伝子構造のもう１つの特徴はエクソンのフェージングであり、エクソン１および２の間、およびエクソン２および３の間に２の保存されたフェージング；エクソン３および４の間に０または２のフェージング；ここに、エクソン５が存在し、エクソン４および５の間に０の保存されたフェージングがある（上述参照）。
【００２０】
本明細書中において初めて開示するように、ｐＧ６ｂはＴ細胞上に発現され、Ｔリンパ球活性の陰性レギュレーターとして作用し、ここに、ｐＧ６ｂによって媒介されるシグナル伝達の結果、ｐＧ６ｂ−陽性リンパ球活性の阻害がもたらされる。ｐＧ６ｂ−陽性Ｔ細胞において、ｐＧ６ｂシグナル伝達は、例えば、細胞周期進行、分化、生存、サイトカイン生産および細胞溶解活性化のようなＴｃＲ−誘導Ｔ細胞応答を阻害することができる。さらに、ｐＧ６ｂ−陽性Ｂ細胞においては、ｐＧ６ｂシグナル伝達は、細胞周期進行、分化、生存、抗原提示および抗体生産のようなＢ細胞抗原受容体−誘導Ｂ細胞応答を阻害することができる。これらの知見は、疾患の中でも、癌および自己免疫疾患を治療する目的でリンパ球活性を変調する、ｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の相互作用に緩衝し、またはそれを模倣することができる治療剤の使用を可能とする。
【００２１】
従って、本発明は、ｐＧ６ｂアゴニストまたはアンタゴニストのようなｐＧ６ｂモジュレーターのための新しい使用を提供する。これらのモジュレーターは、可溶性受容体、またはｐＧ６ｂまたはその受容体に対する抗体であり得る。また、本発明は、ヒト炎症および自己免疫疾患で用いるための可溶性ｐＧ６ｂポリペプチド断片および融合蛋白質も提供する。本発明のｐＧ６ｂ抗体および可溶性ｐＧ６ｂ受容体を用いて、慢性関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、関節炎、内毒素血症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、結腸炎、多発性硬化症、および本明細書中で開示された他の炎症疾患のような具体的なヒト病気の治療において、ｐＧ６ｂまたはそのカウンター受容体いずれかの活性を変調し、作動し、ブロックし、増加させ、阻害し、低下させ、拮抗し、または中和することができる。
【００２２】
（ｐＧ６ｂｘ１としても相互交換的に調べている）ヒトｐＧ６ｂをコードする例示的なヌクレオチド配列は配列番号１によって提供され；コードされたポリペプチドは配列番号２に示される。ｐＧ６ｂをコードするヒトｃＤＮＡクローン（配列番号１）の解析は、ほぼ１２５アミノ酸残基（（配列番号２；配列番号３）の残基１８〜１４２）の細胞ドメイン、ほぼ２３アミノ酸残基（（配列番号２）の残基１４３〜１６５）の膜貫通ドメインおよびほぼ７６アミノ酸残基（（配列番号２）の残基１６６〜２４１）の細胞内ドメインを含む２４２アミノ酸をコードするオープンリーディングフレーム（配列番号２）を明らかとした。ｐＧ６ｂはほぼ１０２アミノ酸残基（（配列番号２）の残基２２〜１２３）のＩｇＶドメインも有する。ｐＧ６ｂ内では、二つのＩＴＩＭドメイン、ＬＬＹＡＤＬ（（配列番号２）のアミノ酸残基２０９〜２１４）およびＴＩＹＡＶＶ（アミノ酸残基２３５〜２４０）がある。ＩＴＩＭドメインの存在は、ｐＧ６ｂが阻害効果を有することができることを示す。ｐＧ６ｂ内には、４つのＳＨ−３−キナーゼ結合ドメイン、ＰＰＱＰ（配列番号２のアミノ酸残基１７０〜１７３）、ＰＩＲＰ（配列番号２のアミノ酸残基１７３〜１７６）、ＰＱＲＰ（配列番号２のアミノ酸残基１８８〜１９１）およびＰＫＩＰ（アミノ酸残基１９９〜２００）もある。
【００２３】
変種可溶性受容体を配列番号７に示す。
【００２４】
ネズミｐＧ６ｂをコードする例示的なヌクレオチド配列は配列番号４によって提供される；コードされたポリペプチドは配列番号５に示される。細胞外ドメインは配列番号６に示される。
【００２５】
従って、本発明の１つの態様において、本発明は、Ｔリンパ球活性の変調において、および自己免疫疾患、炎症、乾癬、ＩＢＤ、潰瘍性結腸炎およびＳＬＥを含めた免疫障害の治療において有用な、ｐＧ６ｂポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。
【００２６】
また、本発明は、配列番号２または３のアミノ酸配列の少なくとも１５連続アミノ酸残基を含む単離されたポリペプチドおよびエピトープを提供する。例示的なポリペプチドは、配列番号３を含む、またはそれよりなるポリペプチド、その抗原性エピトープ、またはその機能的ｐＧ６ｂ結合断片を含む。さらに、本発明は、ｐＧ６ｂの活性を作動させ、それに結合し、ブロックし、阻害し、低下させ、増加させ、拮抗し、または中和する上述にて開示した単離されたポリペプチドも提供する。
【００２７】
本発明は、さらに、そのようなポリペプチドに特異的に結合する抗体および抗体断片を提供する。例示的な抗体は抗体、中和抗体、ポリクローナル抗体、ネズミモノクローナル抗体に由来するヒト化抗体、およびヒトモノクローナル抗体を含む。例示的な抗体断片はＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、および最小認識単位を含む。中和抗体は、好ましくは、そのカウンター受容体または複数のカウンター受容体とのその相互作用が、ブロックされ、阻害され、低下され、拮抗され、または中和されるようなｐＧ６ｂに結合し；そのカウンター受容体または複数−受容体とのその相互作用がブロックされ、阻害され、低下され、拮抗され、または中和されるような抗−ｐＧ６ｂ中和抗体もまた本発明に含まれる。本発明は、さらに、単体、およびペプチド、ポリペプチド、または本明細書中に記載された抗体を含む組成物を含む。
【００２８】
かくして、１つの実施形態において、Ｔ細胞活性化および、恐らくは、Ｂ細胞活性化を増加するためのｐＧ６ｂシグナル伝達のアンタゴニストが提供される。好ましい実施形態において、そのようなアンタゴニストがそのカウンター受容体または複数カウンター受容体とのｐＧ６ｂの天然相互作用に緩衝することができる遮断薬を含む、それにより、ｐＧ６ｂ−媒介陰性シグナル伝達を阻害し、およびリンパ球活性化、および増殖およびエフェクター機能の増加がもたらされる。
【００２９】
代替実施形態において、Ｔ細胞活性化および、恐らくは、Ｂ細胞活性化を阻害するためのｐＧ６ｂシグナル伝達のアゴニストが提供される。好ましい実施形態において、そのような生物活性剤は、ｐＧ６ｂに結合し、ｐＧ６ｂとそのカウンター受容体または複数のカウンター受容体との天然相互作用を模倣し、および／または増加させることができ、それにより、Ｔ細胞活性化（および恐らくはＢ細胞）および増殖およびエフェクター機能の阻害がもたらされる模倣剤を含む。
【００３０】
１つの実施形態において、ＢおよびＴ細胞活性を増加させ、および／またはアップレギュレートするための生物活性剤および方法が提供される。好ましい実施形態において、そのような生物活性剤はｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達のアンタゴニストを含む。特に好ましい実施形態において、そのような生物活性剤は本明細書中に記載された遮断薬を含み、特別は実施形態においては、そのような遮断薬はｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の相互作用に干渉することができる。更なる実施形態において、ｐＧ６ｂ遮断薬およびｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達の他のアンタゴニストを利用するアジュバント組成物が提供される。
【００３１】
代替実施形態において、ＢおよびＴ細胞活性を阻害し、および／またはダウンレギュレートするための生物活性剤および方法が提供される。好ましい実施形態において、そのような生物活性剤はｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達のアゴニストを含む。特に好ましい実施形態においては、そのような生物活性剤は本明細書中に記載された模倣剤を含みおよび、特別な実施形態においては、そのような模倣剤はｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の相互作用を置き換え、および／または増加させることができる。更なる実施形態において、ｐＧ６ｂ模倣剤、およびｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達の他のアゴニストを利用する免疫抑制組成物が提供される。
【００３２】
更なる実施形態において、Ｂ細胞による免疫グロブリン生産を変調するための方法および組成物が提供される。
【００３３】
本明細書中に記載された方法および組成物は、例えば、自己免疫、免疫抑制、癌免疫療法および免疫アジュバントを含めた免疫療法において有利な用途を見出すであろう。
【００３４】
加えて、本発明は、医薬上許容される単体、およびそのような発現ベクター、またはそのような発現ベクターを含む組換えウイルスの少なくとも１つを含む医薬組成物も提供する。本発明は、さらに、医薬上許容される担体、および本明細書中に記載されたポリペプチドまたは抗体を含む医薬組成物を含む。
【００３５】
また、本発明では、配列番号２または３のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその断片に特異的に結合する抗体または抗体断片に特異的に結合する抗−イディオタイプ抗体、または抗−イディオタイプ抗体断片も考えられる。例示的な抗−イディオタイプ抗体は、配列番号３よりなるポリペプチドに特異的に結合する抗体に結合する。
【００３６】
また、本発明は、ｐＧ６ｂポリペプチドおよび免疫グロブリン部位を含む融合蛋白質も提供する。そのような融合蛋白質において、免疫グロブリン部位はヒトＦｃ断片のような免疫グロブリン重鎖定常領域であってよい。本発明は、さらに、そのような融合蛋白質をコードする単離された核酸分子を含む。
【００３７】
また、本発明は、可溶性受容体を含めた、モノマー、ホモダイマー、ヘテロダイマーおよびマルチマー受容体のようなｐＧ６ｂ細胞外ドメインを含むポリペプチドに結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を提供する。
【００３８】
もう１つの態様において、Ｂおよび／またはＴリンパ球を、ｐＧ６ｂ活性を変調することができる生物活性剤を含むリンパ球活性を変調するための方法が提供される。１つの実施形態において、生物活性剤は、例えば、ｐＧ６ｂまたはｐＧ６Ｂカウンター受容体遮断薬のようなｐＧ６ｂ活性のアンタゴニストを含み、その結果、陰性ｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達を妨げることによってリンパ球活性のアップレギュレーションまたは増加がもたらされる。代替実施形態において、生物活性剤は、例えば、ｐＧ６ｂまたはｐＧ６Ｂカウンター受容体模倣剤のようなｐＧ６ｂ活性のアゴニストを含み、その結果、ｐＧ６ｂ−媒介陰性シグナル伝達を置き換え、または増大させることによって、リンパ球活性のダウンレギュレーションがもたらされる。
【００３９】
更なる態様において、Ｂおよび／またはＴリンパ球と、ｐＧ６ｂおよびｐＧ６ｂカウンター受容体の相互作用を変調することができる生物活性剤を接触させることを含むリンパ球活性を変調する方法が提供される。１つの実施形態において、例えば、ｐＧ６ｂカウンター受容体またはｐＧ６ｂ遮断薬のような、ｐＧ６ｂおよびｐＧ６Ｂカウンター受容体の天然相互作用に緩衝することができる生物活性剤を使用して、リンパ球の活性および増殖を増加させる。代替実施形態において、例えば、ｐＧ６ｂカウンター受容体またはｐＧ６ｂ模倣剤のような、ｐＧ６ｂおよびｐＧ６Ｂカウンター受容体の天然相互作用を増大させ、または置き換えることができる生物活性剤を使用して、リンパ球の活性および増殖を阻害する。
【００４０】
可溶性ｐＧ６ｂ遮断薬は、可溶性ｐＧ６ｂポリペプチドおよび融合蛋白質、ｐＧ６ｂの細胞外ドメインの少なくとも一部に結合し、ｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達に干渉することができる抗−ｐＧ６ｂ抗体、そのリガンドとのｐＧ６ｂ受容体相互作用の小分子阻害剤等を含む、またはそれよりなる群から選択することができる代替ｐＧ６ｂアンタゴニストは、さらに、ｐＧ６ｂ核酸配列、阻害性ＲＮＡ配列、ｐＧ６ｂ発現および／または細胞内シグナル伝達の小分子阻害剤等に向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
【００４１】
同様に、好適なｐＧ６ｂカウンター受容体遮断薬は、ｐＧ６ｂカウンター受容体の細胞外ドメインの少なくとも一部に結合し、ｐＧ６ｂカウンター受容体およびｐＧ６ｂの相互作用に干渉することができる抗−ｐＧ６ｂ−カウンター受容体抗体、ｐＧ６ｂカウンター受容体およびｐＧ６ｂの間の相互作用の小分子阻害剤、可溶性ｐＧ６ｂカウンター受容体ポリペプチド、およびｐＧ６ｂカウンター受容体およびｐＧ６ｂの相互作用に干渉するように、かつｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達を活性化できない、修飾されたｐＧ６ｂカウンター受容体アミノ酸配列を有する融合蛋白質等を含む、またはそれよりなる群から選択することができる。代替ｐＧ６ｂカウンター受容体アンタゴニストは、ｐＧ６ｂカウンター受容体核酸配列、阻害性ＲＮＡ分子、ｐＧ６ｂカウンター受容体発現の小分子阻害剤等に向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
【００４２】
好適なｐＧ６ｂ模倣剤は、ｐＧ６ｂの細胞外ドメインの少なくとも一部に結合し、ｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達を刺激することができる機能−活性化抗−ｐＧ６ｂ抗体、機能的ｐＧ６ｂ分子を細胞内で組換えにより生産することができる遺伝子療法ベクター、ｐＧ６ｂ発現および／またはｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達の小分子増強剤等を含む、またはそれよりなる群から選択することができる。同様に、好適なｐＧ６ｂカウンター受容体模倣剤は、可溶性ｐＧ６ｂカウンター受容体ポリペプチド、およびｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達を活性化することができる融合蛋白質、ｐＧ６ｂカウンター受容体およびｐＧ６ｂ間の相互作用の小分子増強剤、ならびにｐＧ６ｂカウンター受容体発現の増強剤、機能的ｐＧ６ｂカウンター受容体分子を細胞内で組換えにより生産することができる遺伝子療法ベクター等を含む、またはそれよりなる群から選択することができる。
【００４３】
かくして、より特別な実施形態において、ＢまたはＴリンパ球をｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達アンタゴニストと接触させることを含むリンパ球活性を刺激し、増大させおよび／または増加させる方法が提供され、該アンタゴニストは可溶性ｐＧ６ｂポリペプチド、可溶性ｐＧ６ｂ融合蛋白質、ｐＧ６ｂの細胞内ドメインの少なくとも一部に結合し、ｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達に干渉することができる抗−ｐＧ６ｂ抗体、ｐＧ６ｂ発現および／またはｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達の小分子阻害剤、ｐＧ６ｂカウンター受容体の細胞外ドメインの少なくとも一部に結合し、ｐＧ６ｂカウンター受容体およびｐＧ６ｂの相互作用に干渉することができる抗−ｐＧ６ｂカウンター受容体抗体、ｐＧ６ｂカウンター受容体およびｐＧ６ｂの間の相互作用の小分子阻害剤、可溶性ｐＧ６ｂカウンター受容体ポリペプチド、およびｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達を活性化することができる、かつＲＮＡ配列に干渉することができないｐＧ６ｂカウンター受容体融合蛋白質よりなる群から選択される少なくとも１つの生物活性剤を含む。
【００４４】
特に好ましい実施形態において、ｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達の上述したアンタゴニストの少なくとも１つを宿主に投与することを含む、抗原性刺激に対する宿主免疫応答を増加させるための方法が提供される。望ましくは、抗原刺激は病原体抗原、ワクチン抗原、および／または腫瘍抗原であってよい。特別な実施形態において、癌患者に主題のアンタゴニストまたは遮断薬の少なくとも１つを投与して、ｐＧ６ｂ−媒介陰性シグナル伝達を阻害し、それにより、癌性組織に存在するｐＧ６ｂカウンター受容体以外の腫瘍抗原に対して向けられたＴ細胞応答を増加させることを含む、ｐＧ６ｂカウンター受容体以外の腫瘍抗原に対する細胞免疫応答を刺激する方法が提供される。
【００４５】
さらなる特別な実施形態において、ＢまたはＴリンパ球をｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達のアゴニストと接触させることを含む、リンパ球の活性を阻害し、減衰させ、および／または減少させる方法が提供され、該アゴニストは可溶性ｐＧ６ｂカウンター受容体ポリペプチド、およびｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達を活性化することができるｐＧ６ｂカウンター受容体融合蛋白質、ｐＧ６ｂの細胞外ドメインの少なくとも一部に結合し、ｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達を刺激することができる機能−活性化抗−ｐＧ６ｂ抗体、機能的ｐＧ６ｂ分子を分子内で組換えにより生産することができる遺伝子療法ベクター、ｐＧ６ｂ発現および／またはｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達の小分子増強剤、ｐＧ６ｂカウンター受容体およびｐＧ６ｂ間の相互作用の小分子増強剤、ｐＧ６ｂカウンター受容体発現の小分子増強剤、および機能的ｐＧ６ｂカウンター受容体分子を分子内で組換えにより生産することができる遺伝子療法ベクターよりなる群から選択される。
【００４６】
特に好ましい実施形態において、ｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達の上述のアゴニストの少なくとも１つを宿主に投与することを含む抗原刺激に対する宿主免疫応答を抑制する方法が提供される。望ましくは、抗原刺激は自己免疫疾患との関係で、または移植された器官および組織に存在するドナー抗原からの自己抗原であってよい。
【００４７】
代替態様において、本発明は、ｐＧ６ｂ−カウンター受容体−発現細胞およびｐＧ６ｂ−発現リンパ球の相互作用を変調するための生物活性剤および方法を提供する。好ましい実施形態において、ｐＧ６ｂ−カウンター受容体−陽性腫瘍細胞とＴ細胞との相互作用に干渉するための生物活性剤および方法が提供され、その結果、陰性ｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達が阻害される。特に好ましい実施形態において、Ｔ細胞はＣＤ４＋細胞またはＣＤ８＋細胞である。さらなる実施形態において、ＣＤ４＋Ｔ細胞はＴｈ１細胞である。
【００４８】
もう１つの好ましい実施形態において、ｐＧ６ｂ−カウンター受容体−陽性で、非−腫瘍で、非−リンパ系細胞とｐＧ６ｂ−陽性Ｔ細胞との相互作用を模倣し、または増強するための生物活性剤および方法が提供され、それにより、Ｔ細胞活性を減少させる。特に好ましい実施形態において、Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。好ましい実施形態において、ＣＤ４＋Ｔ細胞はＴｈ１細胞である。
【００４９】
さらなる態様において、ｐＧ６ｂ−カウンター受容体−発現腫瘍細胞の存在によって特徴付けられる癌を治療する方法が提供される。１つの実施形態において、これらの方法は、単独で、あるいは代替癌免疫療法、化学療法および／または放射線療法プロトコルと組合せて、本明細書中に開示されたｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達のアンタゴニストの少なくとも１つを哺乳動物対象に投与することを含む。好ましい実施形態において、少なくとも１つのｐＧ６ｂまたはｐＧ６ｂカウンター受容体遮断薬を、ｐＧ６ｂ−カウンター受容体−陽性腫瘍細胞を有する対象に投与され、ここに、該遮断薬はｐＧ６ｂおよびｐＧ６ｂカウンター受容体の相互作用に干渉することができ、かつｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達を阻害することができる好ましくは、該遮断薬の投与は、腫瘍細胞上のｐＧ６ｂカウンター受容体以外の腫瘍抗原に向けられたＴ細胞活性を増加させるのに、特に細胞傷害性Ｔ細胞活性を増加させるのに有効である。なおより好ましくは、主代のアンタゴニストの投与は、ｐＧ６ｂ−カウンター受容体−発現腫瘍細胞の成長を阻害するのに有効である。
【００５０】
また、本明細書中で提供される主題のｐＧ６ｂおよび／またはｐＧ６ｂカウンター受容体ブロックは、その開示をここに明示的に引用して援用する、米国特許第５，８１１，０９７および６，０５１，２２７号、および国際公開ＷＯ  ００／３２２３１に開示されたようにＣＴＬＡ−４ブロックとの相乗的な組合わせを見出すであろう。
【００５１】
さらなる態様において、自己免疫攻撃に付された非腫瘍非リンパ系宿主細胞におけるｐＧ６ｂカウンター受容体の存在しないまたは異常な発現によって特徴付けられる自己免疫障害を治療するための方法が提供される。１つの実施形態において、これらの方法は、単独で、または代替免疫療法および／または免疫抑制プロトコルと組合せて、本明細書中に開示されたｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達のアゴニストの少なくとも１つを哺乳動物対象に投与することを含む。好ましい実施形態において、少なくとも１つのｐＧ６ｂまたはｐＧ６ｂカウンター受容体模倣剤を自己反応性ｐＧ６ｂ−陽性リンパ球を有する対象に投与され、ここに、該模倣剤はｐＧ６ｂまたはｐＧ６ｂカウンター受容体の相互作用を置き換え、および／または増大させ、かつｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達を置換えまたは増加させることができる。好ましくは、該模倣剤の投与は、非−腫瘍非−リンパ系宿主細胞に対して向けられた自己反応性リンパ球活性、特に自己反応性ＣＤ８＋ＣＴＬおよびＣＤ４＋Ｔｈ１活性、およびＢ細胞活性を減少させるのに有効である。
【００５２】
なおさらなる態様において、器官および組織移植の結果を改善し、および移植片生存を延長するための方法が提供される。１つの実施形態において、これらの方法は、単独で、あるいは代替免疫療法および／または免疫抑制プロトコルと組合せて、本明細書中に開示されたｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達のアゴニストの少なくとも１つを移植体受容者に投与することを含む。好ましい実施形態において、少なくとも１つのｐＧ６ｂまたはｐＧ６ｂカウンター受容体模倣剤が移植体受容者に投与され、ここに、該模倣剤はｐＧ６ｂまたはｐＧ６ｂカウンター受容体の相互作用を置き換え、および／または増大させ、およびｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達を置き換え、または増加させることができる。好ましくは、該模倣剤の投与は、移植片に存在する抗原に対するドナー抗原に対する受容者免疫応答、特に、細胞溶解ＣＴＬ応答およびＴ細胞応答を減少させるのに有効である。なおより好ましくは、主題の模倣剤の投与は、本明細書中においてより詳細に記載するように、Ｔヘルパー細胞応答を不都合なＴｈ−１タイプの応答からより好都合なＴｈ−２タイプの応答へ偏らせるのに有効である。
【００５３】
また、本発明は、自己免疫応答を阻害するための組成物および方法を提供する。好ましい実施形態において、自己抗原を特異的に認識する自己反応性ＴおよびＢ細胞の活性を阻害するための組成物および方法が提供される。望ましくは、これらの組成物および方法を用いて、１つ以上の自己抗原によって媒介される非−腫瘍細胞の殺傷を阻害することができる。
【００５４】
自己免疫疾患の治療で用いる好ましい組成物は、例えば、上述した模倣剤を含めた本明細書中に記載されたｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達のアゴニストを含む。特に好ましい剤はｐＧ６ｂ細胞外ドメイン（配列番号３）、またはその部分を含むｐＧ６ｂ蛋白質断片；ｐＧ６ｂ細胞外ドメイン（配列番号３）、またはその部分を含むｐＧ６ｂ―Ｉｇ融合蛋白質；機能−活性化抗−ｐＧ６ｂ抗体；ｐＧ６ｂを模倣するペプチドまたはカウンター受容体（ミメティクス）；およびｐＧ６ｂとそのカウンター受容体との天然相互作用を模倣する小細胞化学組成物を含む。また、好ましいのは、架橋様式で、またはポリクローナル混合物としての、ｐＧ６ｂに結合することができる組成物である。
【００５５】
また、本発明においては、自己免疫疾患に対する遺伝子的手法が考えられる。特に、遺伝子療法を用いて、Ｔ細胞上のｐＧ６ｂ発現のレベルを増加させ、および／または自己反応性リンパ球による攻撃にさらされる非−リンパ系細胞上でのそのカウンター受容体の発現レベルを増加させることができる。上昇した特異的活性を呈するｐＧ６ｂのイソ形態または変種の使用も考えられ、各方法の目的はＴ細胞活性化に対して抑制的なシグナル伝達を増強させることである。
【００５６】
また、本発明は、癌を治療するための、特に、腫瘍細胞に対するｐＧ６ｂ−陽性−Ｔリンパ球の活性を増加させるための組成物および方法を提供する。実施形態いくつかの実施形態において、該方法は、ｐＧ６ｂカウンター受容体を発現する腫瘍細胞に対するｐＧ６ｂ−陽性Ｔリンパ球の活性を増加させるためのものである。望ましくは、これらの組成物および方法を用いて、例えば、ｐＧ６ｂカウンター受容体を発現することができる腫瘍細胞のような腫瘍細胞の成長を阻害することができる。
【００５７】
癌の治療で用いられる好ましい組成物は、例えば、ｐＧ６ｂ遮断薬を含めた本明細書中に記載されたｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達のアンタゴニストである。特に好ましい剤は抗−ｐＧ６ｂ抗体；ｐＧ６ｂ細胞外ドメイン、またはその部分含む蛋白質断片；ｐＧ６ｂ細胞外ドメイン、またはその部分を含むｐＧ６ｂ―Ｉｇ融合蛋白質；機能−ブロッキング抗−ｐＧ６ｂ抗体；ｐＧ６ｂを模倣するペプチド（ミメティクス）；およびｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の天然相互作用に干渉する小分子化学組成物を含む。
【００５８】
また、本発明においては、癌の治療に対する遺伝子的手法が考えられる。特に、遺伝子療法を用いて、Ｔ細胞上でのｐＧ６ｂ発現のレベルを減少させ、および／または腫瘍細胞上でのｐＧ６ｂまたはそのカウンター受容体の発現のレベルを減少させることができる。優性陰性活性を呈するｐＧ６ｂのイソ形態の使用もまた考えられ、各方法の目的は、Ｔ細胞活性化に対して通常抑制的であるシグナル伝達を阻害することである。遺伝子的手法は、組織および細胞特異的プロモーターを用いて、各々、ｐＧ６ｂ優性陰性変種、アンチセンス核酸、または小細胞阻害性ＲＮＡをＴ細胞および腫瘍細胞に標的化することを含むことができる。該方法は、加えて、腫瘍−標的化ウイルス、または腫瘍細胞を特異的に認識する他の送達媒体の使用を含む。該方法は、加えて、Ｔ細胞−標的化ウイルス、またはＴ細胞を特異的に認識する他の送達媒体の使用を含むことができる。
【００５９】
特に好ましいのは、腫瘍細胞に選択的に標的化し、非−腫瘍細胞におけるｐＧ６ｂ発現のレベルを有害なレベルまで低下させることなく腫瘍細胞におけるｐＧ６ｂ発現の減少を行うことができる剤である。かなり好ましいのは、前駆体形態を有する剤である。これらの「プロドラッグ」は、典型的には、腫瘍の近傍にその分布が制限された酵素活性によって、腫瘍組織の近傍においてそれらの活性な形態に変換される。
【００６０】
また、かなり好ましいのは、剤を腫瘍へ選択的に送達する標的化部位と組み合わせることができる剤である。これらの標的化部位は、腫瘍組織の近傍において剤の高い局所的濃度を供し、所望の応答を行うには投与しなければならない剤の量を定価させる。
【００６１】
また、本発明においては、上述したように、癌を治療するための組合せ療法の使用が考えられる。
【００６２】
好ましい実施形態において、免疫化を行って、腫瘍−特異的Ｔ細胞免疫応答を促進する。本実施形態においては、ｐＧ６ｂ活性化を阻害する生物活性剤を、腫瘍−関連抗原と組合せて投与する。腫瘍−関連抗原およびｐＧ６ｂ−阻害性／カウンター受容体機能的−ミメティックの組合せは、腫瘍特異的Ｔ細胞応答を促進し、ここに、Ｔ細胞は、生物活性剤の非存在下において腫瘍組織によって発揮されるよりも阻害のより低いレベルに遭遇する。
【００６３】
１つの態様において、本発明は、癌の治療用の医薬を提供する。
【００６４】
また、本発明は、ＴおよびＢ細胞活性が関連する正常であるが望ましくない免疫応答を変調するための組成物および方法を提供する。好ましい実施形態において、移植された組織および器官に対する宿主リンパ球応答を阻害するための組成物および方法が提供される。望ましくは、これらの組成物および方法を用いて、移植された組織の生存を延長することができる。急性および／または慢性移植片拒絶の予防で用いるための好ましい組成物は、例えば、上述した模倣剤を含めた本明細書中に記載されたｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達のアゴニストを含む。特に好ましい剤はｐＧ６ｂ細胞外ドメイン（配列番号３）、またはその部分を含むｐＧ６ｂポリペプチド；ｐＧ６ｂ細胞外ドメイン（配列番号３）、またはその部分を含むｐＧ６ｂ−Ｉｇ融合蛋白質；機能−活性化抗−ｐＧ６ｂ抗体；そのカウンター受容体を模倣するペプチド（ミメティックス）；ｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の天然相互作用を模倣する小分子化学組成物を含む。一般的な免疫抑制戦略でのそれらの使用に加えて、本明細書中に記載されたｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達の主題のアゴニストは、不都合なＴｈ−１−タイプ応答から離れ、かつより好都合なＴｈ−２−タイプの応答に向けて、受容者Ｔヘルパー細胞免疫応答を偏らせることによって、組織および器官の移植において許容される誘導についての重要な関連性も有することができる。
【００６５】
１つの態様において、本発明は、移植および免疫抑制で用いるための医薬を提供する。
【００６６】
また、上述したｐＧ６ｂおよび／またはｐＧ６ｂカウンター受容体遮断薬の少なくとも１つ、ならびにｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達の他のアンタゴニストを含むアジュバント組成物も提供される。上述したｐＧ６ｂおよび／またはｐＧ６ｂカウンター受容体模倣剤の少なくとも１つ、ならびにｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達の他のアゴニストを含む免疫抑制組成物も提供される。
【００６７】
さらに、主題の組成物および方法は、他のＴ細胞共刺激性経路の変調に基づいた免疫療法と、および特にＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４および／またはＢＴＬＡ変調と相乗的に組み合わせることができると考えられる。
【００６８】
代替態様において、本発明は、Ｔ細胞活性化を変調するのに有用な生物活性剤についてスクリーニングする方法を提供する。本明細書中で提供されるスクリーニング方法によって同定された生物活性剤を用いて、ｐＧ６ｂカウンター受容体−発現細胞またはｐＧ６ｂ−発現細胞と反応させて、ｐＧ６ｂ−発現Ｂおよび／またはＴ細胞およびｐＧ６ｂ−カウンター受容体−発現非−リンパ球細胞の間の相互作用に干渉し、それにより、ｐＧ６ｂ／ｐＧ６ｂカウンター受容体−相互作用の機能に拮抗することができる。別法として、生物活性剤を用いて、ｐＧ６ｂ−カウンター受容体−発現細胞またはｐＧ６ｂ−発現細胞と反応して、ｐＧ６ｂカウンター受容体／ｐＧ６ｂ相互作用を模倣し、ｐＧ６ｂ／ｐＧ６ｂカウンター受容体相互作用の非存在下においてＴ細胞阻害を行うことができる。別法として、生物活性剤を用いて、いくつかの方法において、天然ｐＧ６ｂ／ｐＧ６ｂカウンター受容体相互作用を修飾して、会合を増加させ、および阻害シグナルを増大させることができる。
【００６９】
代替態様において、本発明は、本明細書中に開示された単離されたｐＧ６ｂおよび／またはｐＧ６ｂカウンター受容体核酸配列を含む発現ベクター、本明細書中に開示された組換え核酸分子を含む組換え宿主細胞、および該宿主細胞を培養し、次いで、所望により、それにより生産されたポリペプチドを単離することを含む、ｐＧ６ｂおよび／またはｐＧ６ｂカウンター受容体ポリペプチドを生産する方法を提供する。
【００７０】
さらなる態様において、本明細書中に開示されたｐＧ６ｂまたはｐＧ６ｂカウンター受容体蛋白質をコードする核酸を含むトランスジェニック非−ヒト哺乳動物が提供される。ｐＧ６ｂまたはｐＧ６ｂカウンター受容体分子を、増加した循環レベルを含むことができる、ｐＧ６ｂまたはｐＧ６ｂカウンター受容体ポリペプチドのレベルの増加した発現を可能とするように哺乳動物に導入される。別法として、ｐＧ６ｂまたはｐＧ６ｂカウンター受容体核酸断片を用いて、内因性ｐＧ６ｂまたはｐＧ６ｂカウンター受容体対立遺伝子を標的化して、内因性ｐＧ６ｂまたはｐＧ６ｂカウンター受容体核酸の発現を妨げることができる（すなわち、ｐＧ６ｂまたはｐＧ６ｂカウンター受容体蛋白質遺伝子ノックアウトを保有するトランスジェニック動物を作成する）。該トランスジェニック動物は、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ラットまたはマウスのようなげっ歯類である。
【００７１】
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の詳細な記載を参照して明らかとなるであろう。加えて、種々の文献が以下で同定され、引用してその全体を援用する。
【００７２】
２．定義
他の定義がされるのでなければ、本明細書中で用いる全ての技術および科学用語は、記載した方法および組成物が属する分野における当業者によって通常理解されるのと同一の意味を有する。本明細書中で用いるとき、以下の用語およびフレーズは、特に断りのない限り、それらに帰される意味を有する。
【００７３】
本明細書中で用いるとき、「核酸」または「核酸分子」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によって生じた断片、および連結、切断、エンドヌクレアーゼ作用、およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生じた断片をいう。核酸分子はＤＮＡおよびＲＮＡ、または天然に生じるヌクレオチドの類似体（例えば、天然に生じるヌクレオチドのα−エナンチオマー形態）、または双方の組合せのような天然に生じるヌクレオチドであるモノマーから構成され得る。修飾されたヌクレオチドは、糖部位において、および／またはピリミジンまたはプリン塩基部位において改変を有することができる。糖修飾は、例えば、１つ以上のヒドロキシル基の、ハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基での置換を含み、あるいは糖をエーテルまたはエステルとして機能性化することができる。さらに、全糖部位を、アザ−糖および炭素環糖類似体のような、立体的におよび電子的に同様な構造で置き換えることができる。塩基部位における修飾の例はアルキル化プリンおよびピリミジン、アシル化プリンまたはピリミジン、または他のよく知られた複素環置換を含む。核酸モノマーはホスホジエステル結合、またはそのような結合の類似体によって連結することができる。ホスホジエステル結合の類似体はホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホルアミデート等を含む。用語「核酸分子」は、ポリアミド骨格に結合した天然に生じるまたは修飾された核酸塩基を含むいわゆる「ペプチド核酸」も含む。核酸は一本鎖または二本鎖いずれかであり得る。
【００７４】
用語「核酸分子の相補体」とは、参照ヌクレオチド配列と比較して相補的なヌクレオチド配列および逆の向きを有する核酸分子をいう。
【００７５】
用語「縮重ヌクレオチド配列」は、ポリペプチドをコードする参照核酸分子と比較して、１つ以上の縮重コドンを含むヌクレオチドの配列を示す。縮重コドンはヌクレオチドの異なるトリプレットを含有するが、同一アミノ酸残基をコードする（すなわち、ＧＡＵおよびＧＡＣトリプレットは、各々、Ａｓｐをコードする）。
【００７６】
用語「構造遺伝子」とは、次いで、特異的ポリペプチドに特徴的なアミノ酸配列に翻訳されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写される核酸分子をいう。
【００７７】
「単離された核酸分子」は、生物のゲノムＤＮＡに取り込まれていない核酸分子である。例えば、細胞のゲノムＤＮＡから分離されている成長因子をコードするＤＮＡ分子は単離されたＤＮＡ分子である。単離された核酸分子のもう１つの例は、生物のゲノムに取り込まれていない化学的に合成された核酸分子である。特定の種から単離されている核酸分子は、その種核の染色体の完全なＤＮＡ分子よりも小さい。
【００７８】
「核酸分子構築体」は、天然には存在しない配置で組み合わされ、および並置された核酸のセグメントを含有するようにヒト介入を通じて修飾されている一本鎖または二本鎖の核酸分子である。
【００７９】
「線状ＤＮＡ」は、遊離５’および３’末端を有する非−環状ＤＮＡ分子を示す。線状ＤＮＡは、酵素消化または物理的破壊によってプラスミドのような閉じた環状ＤＮＡ分子から調製することができる。
【００８０】
「相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）」は、酵素逆転写酵素によってｍＲＮＡ鋳型から形成された一本鎖ＤＮＡ分子である。典型的には、ｍＲＮＡの部分に対して相補的なプライマーを、逆転写の開始で使用する。当業者であれば、一本鎖ＤＮＡ分子およびその相補的ＤＮＡストランドよりなる二本鎖ＤＮＡ分子をいうのに用語「ｃＤＮＡ」も用いる。用語「ｃＤＮＡ」は、ＲＮＡ鋳型から合成されたｃＤＮＡ分子のクローンもいう。
【００８１】
「プロモーター」は、構造遺伝子の転写を支持するヌクレオチド配列である。典型的には、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位に対して基部側にある遺伝子の５’非−コーディング領域に位置する。転写の開始で機能するプロモーター内の配列エレメントは、しばしば、コンセンサスヌクレオチド配列によって特徴付けられる。これらのプロモーターエレメントは結合部位、ＴＡＴＡ配列、ＣＡＡＴ配列、分化−特異的エレメント（ＤＳＥ；ＭｃＧｅｈｅｅら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．７：５５１（１９９３））、環状ＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）、血清応答エレメント（ＳＲＥ；Ｔｒｅｉｓｍａｎ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．１：４７（１９９０））、グルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）、およびＣＲＥ／ＡＴＦ（Ｏ‘Ｒｅｉｌｌｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１９９３８（１９９２））、ＡＰ２（Ｙｅら、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５７２８（１９９４））、ＳＰ１、ｃＡＭＰ応答エレメント結合蛋白質（ＣＲＥＢ；Ｌｏｅｋｅｎ，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒ．３：２５３（１９９３）））および八量体因子（一般に、Ｗａｔｓｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，４ｔｈ  ｅｄ．（Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ  １９８７）、およびＬｅｍａｉｇｒｅ  ａｎｄ  Ｒｌｕｓｓｅａｕ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０３：１（１９９４））のような他の転写因子のための結合部位を含む。もしプロモーターが誘導性プロモーターであるならば、転写の速度は誘導剤に応答して増加する。対照的に、転写の速度は、もしプロモーターが構成的プロモーターであれば、誘導剤によって調節されない。抑制性プロモーターも知られている。
【００８２】
「コア」プロモーターは、ＴＡＴＡボックスおよび転写の開始を含めたプロモーター機能のための必須のヌクレオチド配列を含有する。この定義によると、コアプロモーターは、活性を増強でき、または組織特異的活性を付与できる特異的配列の非存在下において検出可能な活性を有しても有さなくてもよい。
【００８３】
「調節エレメント」は、コアプロモーターの活性を変調するヌクレオチド配列である。例えば、調節エレメントは、特定の細胞、組織またはオルガネラにおいて専らまたは優先的に転写を可能とする細胞因子と結合するヌクレオチド配列を含有することができる。これらのタイプの調節エレメントは、「細胞−特異的」、「組織−特異的」、または「オルガネラ−特異的」に発現される遺伝子と通常会合している。
【００８４】
「エンハンサー」は、転写の開始部位に対するエンハンサーの距離または向きとは無関係に、転写の効率を増加させることができる調節エレメントのタイプである。
【００８５】
「異種ＤＮＡ」とは、与えられた宿主細胞内では天然に存在しないＤＮＡ分子、またはＤＮＡ分子の集団をいう。宿主ＤＮＡが非−宿主ＤＮＡ（すなわち、外因性ＤＮＡ）と合わされている限り、特定の宿主細胞に対して異種のＤＮＡ分子は宿主細胞腫に由来するＤＮＡ（すなわち、内因性ＤＮＡ）を含有することができる。例えば、転写プロモーターを含む宿主ＤＮＡセグメントに操作可能に連結されたポリペプチドをコードする非−宿主ＤＮＡセグメントを含有するＤＮＡ分子は、異種ＤＮＡ分子であると考えられる。逆に、異種ＤＮＡ分子は、外因性プロモーターに操作可能に連結された内因性遺伝子を含むことができる。もう１つの例として、野生型細胞に由来する遺伝子を含むＤＮＡ分子は、もしそのＤＮＡ分子が野生型遺伝子を欠如する突然変異体細胞に取り込まれたならば、異種ＤＮＡと考えられる。
【００８６】
「ポリペプチド」は、天然にまたは合成により生産されたかを問わず、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基のポリマーである。約１０アミノ酸未満の残基のポリペプチドは、通常、「ペプチド」といわれる。
【００８７】
「蛋白質」は、１つ以上のポリペプチド鎖を含むマクロ分子である。蛋白質は炭水化物基のような非−ペプチド性成分を含むこともできる。炭水化物および他の非−ペプチド性置換は、蛋白質が生産される細胞によって蛋白質に付加することができ、細胞のタイプで変化するであろう。蛋白質は、本明細書中においては、それらのアミノ酸骨格構造の点で定義され；炭水化物基のような置換基は一般的に特定されないが、それにもかかわらず、存在させてもよい。
【００８８】
非−宿主ＤＮＡ分子によってコードされるペプチドまたはポリペプチドは「異種」ペプチドまたはポリペプチドである。
【００８９】
「クローニングベクター」は、宿主細胞において自律的に複製する能力を有するプラスミド、コスミド、またはバクテリオファージのような核酸分子である。クローニングベクターは、典型的には、ベクターの必須の生物学的機能の喪失なくして決定可能に核酸分子の挿入を可能とする１または少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、ならびにクローニングベクターで形質転換された細胞の同定および選択で用いるのに適したマーカー遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含有する。マーカー遺伝子は、典型的には、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性を供する遺伝子を含む。
【００９０】
「発現ベクター」は、宿主細胞において発現される遺伝子をコードする核酸分子である。典型的には、発現ベクターは転写プロモーター、遺伝子、および転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は、プロモーターの制御下に通常は置かれ、そのような遺伝子はプロモーターに「操作可能に連結されている」といわれる。同様に、調節エレメントおよびコアプロモーターは、もし調節エレメントがコアプロモーターの活性を変調するならば、操作可能に連結されている。
【００９１】
「組換え宿主」は、クローニングベクターまたは発現ベクターのような、異種核酸分子を含有する細胞である。この関係において、組換え宿主の例は発現ベクターからｐＧ６ｂを生じる細胞である。対照的に、ｐＧ６ｂは、ｐＧ６ｂの「天然源」であって、発現ベクターを欠如する細胞によって生産され得る。
【００９２】
「組込み形質転換体」は、異種ＤＮＡが細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれたようになっている組換え宿主細胞である。
【００９３】
「融合蛋白質」は、少なくとも２つの遺伝子のヌクレオチド配列を含む核酸分子によって発現されたハイブリッド蛋白質である。例えば、融合蛋白質は、親和性マトリックスに結合するポリペプチドと融合したｐＧ６ｂポリペプチドの少なくとも一部を含むことができる。そのような融合蛋白質は、アフィニティークロマトフラフィーを用いて大量のｐＧ６ｂを単離する手段を提供する。
【００９４】
用語「受容体」は、「カウンター受容体」と呼ばれる生体活性分子に結合する細胞−会合蛋白質を示す。この相互作用は、細胞上のカウンター受容体の効果を媒介する。受容体は膜結合、細胞質または核；モノマー（例えば、甲状腺刺激ホルモン受容体、ベータ−アドレナリン作動性受容体）またはマルチマー（例えば、ＰＤＧＦ受容体、成長ホルモン受容体、ＩＬ−３受容体、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、Ｇ−ＣＳＦ受容体、エリスロポエチン受容体およびＩＬ−６受容体）であり得る。膜−結合受容体は、細胞外カウンター受容体−結合ドメイン、および典型的にはシグナル変換に関与する細胞内エフェクタードメインを含むマルチ−ドメイン構造によって特徴付けられるある膜−結合受容体において、細胞外カウンター受容体−結合ドメインおよび細胞内エフェクタードメインは、完全な機能的受容体を含む別々のポリペプチドに位置する。
【００９５】
一般に、カウンター受容体の受容体への結合の結果、受容体において立体配座変化が起こり、これは細胞中でエフェクタードメインおよび他の分子の間の相互作用を引き起こし、これは、今度は、細胞の代謝の変化に導く。受容体−カウンター受容体相互作用にしばしば関連する代謝事象は、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、環状ＡＭＰ生産の増加、細胞カルシウムの動員、膜脂質の動員、細胞接着、イノシトール脂質の加水分解、およびリン脂質の加水分解を含む。
【００９６】
「可溶性受容体」は、最も普通には、細胞膜に結合していない受容体ポリペプチドである。可溶性受容体は膜貫通および細胞質ドメイン、およびグルコホスホイノシトール（ｇｐｉ）を介するよう細胞膜への他の結合を欠如するカウンター受容体−結合受容体ポリペプチドである。可溶性受容体は、ポリペプチドの精製を供し、またはポリペプチドの基質への結合のための部位を供するアフィニティー標識、または免疫グロブリン定常領域配列のようなさらなるアミノ酸残基を含むことができる。多くの細胞−表面受容体は、蛋白質分解によって生産され、あるいは交互にスプライシングされたｍＲＮＡから翻訳された天然に生じる可溶性カウンターパートを有する。可溶性受容体はモノマー、ホモダイマー、ヘテロダイマー、またはマルチマーとすることができ、マルチマー受容体は、一般には、９を超えるサブユニットを含まず、好ましくは６を超えるサブユニットを含まず、最も好ましくは３を超えるサブユニットを含まない。受容体ポリペプチドは、それらが各々、膜アンカリングまたはシグナル変換を供するにはこれらのセグメントの十分な部分を欠如している場合、膜貫通および細胞内ポリペプチドセグメントを実質的に含まないといわれる。クラスＩおよびクラスＩＩのサイトカイン受容体の可溶性受容体は、一般には、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含まない細胞外サイトカイン結合ドメインを含む。例えば、ｐＧ６ｂに対する代表的な可溶性受容体は、例えば、配列番号３に示された可溶性受容体を含む。公知のＢ７ファミリーメンバーのいずれの配列が膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含まない細胞外ドメインを含むかを思い描くのは十分に当業者のレベル内のものである。さらに、遺伝子コードを用いる当業者であれば、そのような可溶性受容体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを容易に決定することができる。
【００９７】
用語「分泌シグナル配列」は、より大きなポリペプチドの成分として、それが合成される細胞の分泌経路を通るより大きなポリペプチドを指令するペプチド（「分泌ペプチド」）をコードするＤＮＡ配列を示す。より大きなポリペプチドは、通常切断されて、分泌経路を通過の間に分泌ペプチドを除去する。
【００９８】
「単離されたポリペプチド」は、炭水化物、脂質、または天然でポリペプチドと会合している他のタンパク質性不純物のような汚染性細胞成分を本質的に含まないポリペプチドである。典型的には、単離されたポリペプチドの調製物は、高度に精製された形態の、すなわち、少なくとも約８０％純度、少なくとも約９０％純度、少なくとも約９５％純度、９６％、９７％、または９８％以上の純度のような９５％純度を超える純度または９９％を超える純度のポリペプチドを含有する。特定の蛋白質調製物が単離されたポリペプチドを含有することを示す１つの方法は、蛋白質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気詠動、およびゲルのクーマシーブリリアントブルー染色後の単一バンドの外観によるものである。しかしながら、「単離された」は、ダイマーあるいはグリコシル化または誘導体化形態のような別の物理的形態の同一ポリペプチドの存在を排除しない。
【００９９】
用語「アミノ−末端」および「カルボキシル−末端」は、ポリペプチド内の位置を示すのに本明細書中で用いられる。文脈が許せば、これらの用語は、隣接または相対的位置を示すのにポリペプチドの特定の配列または部分に言及して用いられる。例えば、ポリペプチド内で参照配列に対してカルボキシル−末端側に位置するある配列は参照配列のカルボキシル末端に対して基部側に位置するが、必ずしも、完全なポリペプチドのカルボキシル末端におけるものではない。
【０１００】
用語「発現」とは、遺伝子産物の生合成をいう。例えば、構造遺伝子の場合には、発現は、ｍＲＮＡへの構造遺伝子の転写、および１つ以上のポリペプチドへのｍＲＮＡへの翻訳も含む。
【０１０１】
用語「スプライス変種」は、遺伝子から転写されたＲＮＡのオルタナティブ形態を示すのに本明細書中では用いられる。スプライス変動は、天然では、転写されたＲＮＡ分子内の、またはより普通ではないが別々に転写されたＲＮＡ分子内のオルタナティブスプライシング部位の使用を介して生起し、同一遺伝子から転写されたいくつかのｍＲＮＡをもたらし得る。スプライス変種は改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。用語スプライス変種は、遺伝子から転写されたｍＲＮＡのスプライス変種によってコードされるポリペプチドを示すのにも本明細書中で用いられる。
【０１０２】
本明細書中で用いるとき、用語「免疫モジュレーター」は、サイトカイン、幹細胞成長因子、リンホトキシン、共−刺激分子、造血分子等、これらの分子の合成類似体を含む。
【０１０３】
用語「相補体／抗−相補体対」は、好適な条件下で非共有結合的に会合した安定な対を形成する非−同一部位を示す。例えば、ビオチンおよびアビジン（またはストレプトアビジン）は、相補体／抗−相補体対のプロトタイプメンバーである。他の例示的な相補体／抗−相補体対は、受容体／カウンター受容体対、抗体／抗原（またはハプテンまたはエピトープ）対、センス／アンチセンスポリヌクレオチド対等を含む。相補体／抗−相補体対の引き続いての解離が望ましい場合、相補体／抗−相補体対は、好ましくは、１０９Ｍ−１未満の結合親和性を有する。
【０１０４】
本明細書中で用いるとき、用語「抗体」とは、免疫グロブリンポリペプチドおよび免疫グロブリンポリペプチドの免疫学的に活性な部分、すなわち、特定の抗原（例えば、ｐＧ６ｂの細胞外ドメイン）に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する免疫グロブリンファミリーのポリペプチド、またはその断片をいう。
【０１０５】
「抗−イディオタイプ抗体」は、免疫グロブリンの可変領域ドメインと結合する抗体である。この関係で、抗−イディオタイプ抗体は抗−ｐＧ６ｂ抗体の可変領域と結合し、かくして、抗−イディオタイプ抗体はｐＧ６ｂのエピトープを模倣する。
【０１０６】
「抗体断片」は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ等のような抗体の部分である。構造にかかわらず、抗体断片は、無傷抗体によって認識される同一抗原と結合する。例えば、抗−ｐＧ６ｂモノクローナル抗体断片はｐＧ６ｂのエピトープと結合する。
【０１０７】
用語「抗体断片」は、軽鎖可変領域よりなるポリペプチド、重鎖および軽鎖の可変領域よりなる「Ｆｖ」断片、軽鎖および重鎖可変領域がペプチドリンカーによって連結された組換え単一鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖ蛋白質」）、および超可変領域を模倣するアミノ酸残基よりなる最小認識単位のような、特定の抗原に結合する合成、または遺伝子光学により作製されたポリペプチドも含む。
【０１０８】
「キメラ抗体」は、可変ドメインおよびげっ歯類抗体に由来する相補性決定領域を含有する組換え蛋白質であり、他方、抗体分子の残りはヒト抗体に由来する。
【０１０９】
「ヒト化抗体」は、モノクローナル抗体のネズミ相補性決定領域が、ネズミ免疫グロブリンの可変重鎖および軽鎖からヒト可変ドメインに移された組換え蛋白質である。ヒト蛋白質に結合する、またはそれを中和するもののような、ネズミ抗体に由来するヒトで治療的に用いられるヒト化抗体の構築は、当業者の技量内のものである。
【０１１０】
本明細書中で用いるとき、「治療剤」は、抗体部位にコンジュゲートして、療法で有用なコンジュゲートを生じる分子または原子である治療剤の例は薬物、トキシン、免疫モジュレーター、キレーター、ホウ素化合物、光活性剤または色素、および放射性同位体を含む。
【０１１１】
「検出可能な標識」は、抗体部位にコンジュゲートして、診断で有用な分子を生じさせることができる分子または原子である。検出可能な標識の例はキレーター、光活性剤、放射性同位体、蛍光剤、常磁性イオン、または他のマーカー部位を含む。
【０１１２】
用語「アフィニティー標識」は、第二のポリペプチドに結合して、第二のポリペプチドの精製または検出を供する、または第二のポリペプチドの基質への結合用の部位を供するポリペプチドセグメントを示すのに本明細書中では用いられる。原理的には、抗体または他の特異的結合部位が利用可能ないずれのペプチドまたは蛋白質もアフィニティー標識として用いることができる。アフィニティー標識はポリヒスチジントラクト、プロテインＡ（Ｎｉｌｓｓｏｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．４：１０７５（１９８５）；Ｎｉｌｓｓｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８：３（１９９１））、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇｅｎｅ  ６７：３１  （１９８８））、Ｇｌｕ−Ｇｌｕアフィニティー標識（Ｇｒｕｓｓｅｎｍｅｙｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：７９５２（１９８５））、サブスタンスＰ、ＰＬＡＧペプチド（Ｈｏｐｐら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４（１９８８））、ストレプトアビジン結合ペプチド、または他の抗原性エピトープまたは結合ドメインを含む。一般には、Ｆｏｒｄら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ２：９５（１９９１）参照。アフィニティー標識をコードするＤＮＡ分子は商業的供給業者（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手可能である。
【０１１３】
「裸の抗体」は、治療剤とコンジュゲートしていない、抗体断片とは反対に、完全な抗体である。裸の抗体はポリクローナルおよびモノクローナル双方の抗体、ならびにキメラおよびヒト化抗体のようなある種の組換え抗体を含む。
【０１１４】
用語「モノクローナル抗体」とは、いずれかの真核生物または原核生物細胞クローン、またはファージクローンを含めた単一細胞クローンに由来する抗体をいい、それが生産される方法をいわない。かくして、本明細書中で用いる用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマー技術を介して生産された抗体に限定されない。
【０１１５】
本明細書中で用いるとき、用語「抗体成分」は、完全な抗体および抗体断片を共に含む。
【０１１６】
「免疫抱合体」は、抗体成分と治療剤または検出可能な標識とのコンジュゲートである。
【０１１７】
本明細書中で用いるとき、用語「抗体融合蛋白質」は、抗体成分およびｐＧ６ｂポリペプチド成分を含む組換え分子をいう。抗体融合蛋白質の例は、ｐＧ６ｂ細胞外ドメイン、およびＦｃドメインもしくは抗原−結合領域いずれかを含む蛋白質を含む。
【０１１８】
「標的ポリペプチド」または「標的ペプチド」は、少なくとも１つのエピトープを含み、かつ腫瘍細胞、または感染剤抗原を運ぶ細胞のような標的細胞上に発現されたアミノ酸配列である。Ｔ細胞は標的ポリペプチドまたは標的ペプチドに対して主要組織適合性複合体分子によって提示されたポリペプチドエピトープを認識し、典型的には、標的細胞を溶解し、あるいは他の免疫細胞を標的細胞の部位へ動員し、それにより、標的細胞を殺傷する。
【０１１９】
「抗原性ペプチド」は、主要組織適合性複合体分子に結合して、Ｔ細胞によって認識され、それにより、Ｔ細胞への提示に際して細胞傷害性リンパ球応答を誘導するＭＨＣ−ペプチド複合体を形成するペプチドである。かくして、抗原性ペプチドは、好適な主要組織適合性複合体分子に結合でき、かつ細胞溶解、あるいは抗原に結合し、またはそれを発現する標的細胞に対する特異的サイトカイン放出のような細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導することができる。抗原性ポリペプチドは、抗原提示細胞上の、または標的細胞上の、クラスＩまたはクラスＩＩ主要組織適合性複合体分子の関係で結合することができる。
【０１２０】
真核生物においては、ＲＮＡポリメラーゼＩＩは構造遺伝子の転写を触媒して、ｍＲＮＡを生じる。核酸分子は、ＲＮＡ転写体が特異的ｍＲＮＡのそれに対して相補的である配列を有するＲＮＡポリメラーゼＩＩ鋳型を含有するように設計することができる。ＲＮＡ転写体は「アンチセンスＲＮＡ」といい、アンチセンスＲＮＡをコードする核酸分子は「アンチセンス遺伝子」といわれる。アンチセンスＲＮＡ分子はｍＲＮＡ分子に結合することができ、その結果、ｍＲＮＡ翻訳の阻害がもたらされる。
【０１２１】
「ｐＧ６ｂに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド」または「ｐＧ６ｂアンチセンスオリゴヌクレオチド」は、（ｂ）ｐＧ６ｂ遺伝子の部分とで安定なトリプレックスを形成でき、または（ｂ）ｐＧ６ｂ遺伝子のｍＲＮＡ転写体の部分とで安定なデュプレックスを形成できる配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【０１２２】
「リボザイム」は、触媒中心を含有する核酸分子である。該用語はＲＮＡ酵素、自己−スプライシングＲＮＡ、自己−切断ＲＮＡ、およびこれらの触媒機能を実行する核酸分子を含む。リボザイムをコードする核酸分子は「リボザイム遺伝子」といわれる。
【０１２３】
「外部ガイド配列」は、内因性リボザイム、ＲＮａｓｅＰを細胞内ｍＲＮＡの特定の種に向け、その結果、ＲＮａｓｅＰによるｍＲＮＡの切断がもたらされる核酸分子である。外部ガイド配列をコードする核酸分子を「外部ガイド配列遺伝子」という。
【０１２４】
用語「変種ｐＧ６ｂ遺伝子」とは、配列番号２の修飾であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子をいう。そのような変種はｐＧ６ｂ遺伝子の天然に生じる多形、ならびに配列番号２のアミノ酸配列の保存的アミノ酸置換を含有する合成遺伝子を含む。ｐＧ６ｂ遺伝子のさらなる変種形態は、本明細書中に記載されたヌクレオチド配列の挿入または欠失を含む核酸分子である。変種ｐＧ６ｂ遺伝子は、例えば、ストリンジェントな条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子、またはその相補体と遺伝子がハイブリダイズするか否かを決定することによって同定することができる。
【０１２５】
あるいは、変種ｐＧ６ｂ遺伝子は配列比較によって同定することができる。２つの核酸配列は、もし２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基が最大対応性について整列させた場合に同一であれば、「１００％アミノ酸配列同一性」を有する。同様に、２つのヌクレオチド配列は、もし２つのヌクレオチド配列のヌクレオチド残基が最大対応性につき整列させた場合に同一であれば、「１００％ヌクレオチド配列同一性」を有する。配列比較は、ＤＮＡＳＴＡＲ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）によって作製されたＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティックス計算スイートに含まれるもののような標準的なソフトウエアプログラムを用いて実行することができる。最適整列を決定することによって２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列を比較するための他の方法は当業者に周知である（例えば、Ｐｅｒｕｓｋｉ  ａｎｄ  Ｐｅｒｕｓｋｉ，Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎｅｔ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９７），Ｗｕら（ｅｄｓ．），“Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｔｉｏｎ  Ｓｕｐｅｒｈｉｇｈｗａｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｄａｔａｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐａｇｅｓ  １２３−１５１（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９７）およびＢｉｓｈｏｐ（ｅｄ．），Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９８）参照）。配列同一性を決定するための特別な方法を以下に記載する。
【０１２６】
変種ｐＧ６ｂ遺伝子または変種ｐＧ６ｂポリペプチドを同定するのに用いる特定の方法にかかわらず、変種遺伝子、または変種遺伝子によってコードされたポリペプチドは、抗−ｐＧ６ｂ抗体に特異的に結合する能力によって機能的に特徴付けることができる。変種ｐＧ６ｂ遺伝子または変種ｐＧ６ｂポリペプチドは、本明細書中に記載された生物学的または生化学的アッセイを用い、そのカウンター受容体またはカウンター受容体に結合する能力によって機能的に特徴付けることもできる。
【０１２７】
用語「対立遺伝子変種」は、同一染色体遺伝子座を占める遺伝子の２つ以上のオルタナティブ形態のいずれかを示すのに本明細書中で用いる。対立遺伝子変位は突然変異を通じて天然で生起し、その結果、集団内に表現型多形が生じ得る。遺伝子突然変異はサイレントである（コードされたポリペプチドに変化なし）か、あるいは改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしてもよい。用語対立遺伝子変種は、遺伝子の対立遺伝子変種によってコードされた蛋白質を示すのに本明細書中でも用いられる。
【０１２８】
用語「オルソログ」は、異なる種からのポリペプチドまたは蛋白質の機能的カウンターパートである１つの種から得られたポリペプチドまたは蛋白質を示す。オルソログの間の配列の差は、スペシエーションの結果である。
【０１２９】
「パラログ」は、生物によって作られた区別されるが構造的に関連する蛋白質である。パラログは遺伝子複製を通じて生起すると考えられている。例えば、α−グロビン、β−グロビン、およびミオグロビンは相互のパラログである。
【０１３０】
本明細書中で用いるとき、用語「免疫応答」は、Ｔおよび／またはＢ細胞応答、すなわち、細胞および／または液性免疫応答の双方を含む。１つの実施形態において、本明細書中で開示される組成物および方法を用いて、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）応答、より好ましくはＴｈ１細胞応答を低下させ、または増強することができる。もう１つの実施形態において、本明細書中で開示された組成物および方法を用いて、細胞傷害性Ｔ細胞（Ｔｃ）応答を低下させ、または増強することができる。特許請求される方法を用いて、一次および二次双方の免疫応答およびエフェクター機能（例えば、細胞溶解活性、サイトカインおよび抗体の生産、および抗原提示）を低下させ、または増強することができる。対象の免疫応答は、例えば、抗体生産、免疫細胞増殖、サイトカインの放出、細胞表面マーカーの発現、細胞傷害性等についてアッセイすることによって、当該分野で良く知られた方法を用いて当業者によって容易に決定され得る。
【０１３１】
「ｐＧ６ｂシグナル伝達」、「ｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達」、「ｐＧ６ｂ−媒介陰性シグナル伝達」およびその変形とは、その対応するリガンドによるｐＧ６ｂ受容体の結合および／または活性化によって引き起こされ、その結果、リンパ球活性の減衰および／またはダウンレギュレーションをもたらす細胞内シグナル伝達を意味する。１つの態様において、ｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達はＳＨＰ−１および／またはＳＨＰ−２の活性化を含む。
【０１３２】
本明細書中で用いる「リンパ球活性」とは、ＢおよびＴ細胞の活性化、増殖、分化、および生存の免疫学的プロセス、ならびに細胞溶解活性（Ｔｃ細胞）、サイトカイン生産（Ｔｈ細胞）、抗体生産（Ｂ細胞）、および抗原提示（Ｂ細胞）を含めたリンパ球細胞における関連エフェクター免疫機能をいう。上述したように、限定されるものではないが、本明細書中で提供された実施例に記載されたアッセイを含めた、そのようなプロセスを検出し、および／またはモニタリングするための当業者によく知られた多数のアッセイがある。
【０１３３】
本明細書中で用いるとき、フレーズ「ｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の相互作用」とは、機能的ｐＧ６ｂカウンター受容体分子と、リンパ球上の機能的ｐＧ６ｂ受容体の直接的物理的相互作用（例えば、結合）および／または他の間接的相互作用をいい、その結果、ｐＧ６ｂ受容体および関連分子内ｐＧ６ｂシグナル伝達が刺激される。同様に、フレーズ「ｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の天然相互作用」とは、機能的かつ内因的に発現されたカウンター受容体分子と、リンパ球上の機能的かつ内因的に発現されたｐＧ６ｂ受容体との直接的物理的相互作用（例えば、結合）および／または他の間接的相互作用をいい、その結果、ｐＧ６ｂ受容体および関連分子内Ｇ６ｂシグナル伝達が刺激される。
【０１３４】
本明細書中で用いるとき、用語「遮断薬」は、ｐＧ６ｂおよびカウンター受容体の相互作用に干渉する、および／または例えば、サイトカインの生産および／または増殖によって測定して、リンパ球活性を阻害するカウンター受容体の能力に干渉する剤を含む。用語「遮断薬」は、さらに、天然リガンドに結合するｐＧ６ｂの能力を阻害する、および／またはＴ細胞活性を阻害するｐＧ６ｂの活性に干渉する剤を含む。例示的な剤は機能−ブロッキング抗体、ならびにｐＧ６ｂとそのカウンター受容体との結合をブロックするが、リンパ球においてｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達を刺激しないペプチド（例えば、ｐＧ６ｂ融合蛋白質）、ペプチドミメティックス、小分子等を含む。好ましい遮断薬は、ｐＧ６ｂとＳＨＰ−１および／またはＳＨＰ−２との誘導性会合、またはＳＨＰ−１および／またはＳＨＰ−２とｐＧ６ｂとの相互作用に由来するシグナル変換を阻害することができる剤を含む。
【０１３５】
本明細書中で用いるとき、用語「模倣剤」は、ｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の相互作用を模倣し、および／またはリンパ球活性を阻害するｐＧ６ｂおよび／またはそのカウンター受容体の能力を増大させ、増強し、または増加させる剤を含む。例示的な剤は、機能−活性化抗体、ならびにそのカウンター受容体と結合するｐＧ６ｂ、またはｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達を刺激するカウンター受容体の役割に対する代替物の能力を増大させ、または増強するペプチド（例えば、カウンター受容体融合蛋白質）、ペプチドミメティックス、小分子等を含む。
【０１３６】
用語「阻害する」または「の阻害」とは、本明細書中で用いるとき、測定可能な量だけ低下させ、あるいは完全に妨げることを意味する。
【０１３７】
用語「マイクロビーズ」または「ビーズ」とは、本明細書中で用いるとき、いずれかの与えられた軸に沿って約１μ〜約１０μｍ間を測定する固相粒子、典型的には約１μｍ〜約１μｍ間、あるいは典型的には約１μｍ〜約６μｍ間（例えば、４．５μｍまたは５μｍ）直径を有する実質的には球形粒子をいう。マイクロビーズの例はラテックス、および典型的には免疫学的アッセイで用いられるもの（例えば、トシル活性化ビーズ）のような常磁性ビーズを含む。
【０１３８】
本発明は、ｐＧ６ｂ遺伝子の機能的断片を含む。本発明の文脈内では、ｐＧ６ｂ遺伝子の「機能的断片」とは、本明細書中に記載されたドメインである、あるいは抗−ｐＧ６ｂ抗体に少なくとも特異的に結合するｐＧ６ｂポリペプチドの部分をコードする核酸分子をいう。
【０１３９】
標準的な解析方法の不正確さのため、ポリマーの分子量および長さは近似値であると理解される。そのような値が「約」Ｘまたは「ほぼ」Ｘとして表される場合、Ｘの述べられた値は±１０％まで正確であると理解されるであろう。
【０１４０】
３．ｐＧ６ｂポリヌクレオチドまたは遺伝子の生産
ヒトｐＧ６ｂ遺伝子をコードする核酸分子は、配列番号１に基づくポリヌクレオチドプローブを用いてヒトｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。これらの技術は標準的であってよく確立されており、商業的供給業者によって入手可能なクローニングキットを用いて達成することができる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（ｅｄｓ．），Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９５；Ｗｕら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９７；Ａｖｉｖ  ａｎｄ  Ｌｅｄｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：１４０８（１９７２）；Ｈｕｙｎｈら、“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｃＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｉｎ  λｇｔ１０  ａｎｄ  λｇｔ１１，”ｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｖｏｌ．Ｉ，Ｇｌｏｖｅｒ（ｅｄ．），ｐａｇｅ  ４９（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８５）；Ｗｕ（１９９７）ａｔ  ｐａｇｅｓ  ４７−５２参照。
【０１４１】
ヒトｐＧ６ｂ遺伝子をコードする核酸分子もまた、ｐＧ６ｂ遺伝子またはｃＤＮＡの核酸配列に基づくヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーでのポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を用いて得ることもできる。ＰＣＲでライブラリーをスクリーニングする一般的方法は、例えば、Ｙｕら、“Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｐｈａｇｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，”ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５：ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｗｈｉｔｅ（ｅｄ．），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９３によって供される。さらに、関連遺伝子を単離するためにＰＣＲを用いる技術は、例えば、Ｐｒｅｓｔｏｎ，“Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｉｍｅｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅ  Ｇｅｎｅ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｍｅｍｂｅｒｓ，”ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５：ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｗｈｉｔｅ（ｅｄ．），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９３に記載されている。別法として、ｐＧ６ｂ遺伝子は、相互にプライミングする長いオリゴヌクレオチド、および本明細書中に記載されたヌクレオチド配列を用いて核酸分子を合成することによって得ることができる。ポリメラーゼ鎖反応を用いる確立された技術は、長さが少なくとも２キロベースのＤＮＡ分子を合成する能力を提供する（Ａｄａｎｇら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１：１１３１（１９９３），Ｂａｍｂｏｔら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ２：２６６（１９９３），Ｄｉｌｌｏｎら、“Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｇｅｎｅｓ，”ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５：ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｗｈｉｔｅ（ｅｄ．），ｐａｇｅｓ  ２６３−２６８，（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９３），ａｎｄ  Ｈｏｌｏｗａｃｈｕｋら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．４：２９９（１９９５））。ポリヌクレオチド合成に関するレビューについては、例えば、Ｇｌｉｃｋ  ａｎｄ  Ｐａｓｔｅｒｎａｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ（ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ  １９９４），Ｉｔａｋｕｒａら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３（１９８４），ａｎｄ  Ｃｌｉｍｉｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：６３３（１９９０）参照。
【０１４２】
４．ｐＧ６ｂ遺伝子変種の生産
本発明は、本明細書中に開示されたｐＧ６ｂポリペプチドをコードするＤＮＡおよびＲＮＡ分子を含めた種々の核酸分子を提供する。当業者であれば、遺伝子コードの縮重に鑑み、かなりの配列変動がこれらのポリヌクレオチド分子の間で可能であることを容易に認識するであろう。さらに、本発明は、配列番号２の受容体ポリペプチドに実質的に相同な少なくとも１つのｐＧ６ｂ受容体サブユニットを含む単離された可溶性のモノマー、ホモダイマー、ヘテロダイマーおよびマルチマー受容体ポリペプチドも提供する。かくして、本発明では、配列番号１の縮重ヌクレオチドを含むｐＧ６ｂポリペプチドをコードする核酸分子、およびそれらのＲＮＡ同等体が考えられる。
【０１４３】
表１は縮重ヌクレオチド位置を示すための１文字コードを記載する。「分解能」はコード文字によって示されるヌクレオチドである。「相補体」は、相補的ヌクレオチドについてのコードを示す。例えば、コードＹはＣまたはＴいずれかを示し、その相補体ＲはＡまたはＧを示し、ＡはＴに相補的であり、およびＧはＣに相補的である。
【０１４４】
【表１】
2009538830.tif 000027
与えられたアミノ酸についての全ての可能なコドンを含む縮重コドンを表２に記載する。
【０１４５】
【表２】
2009538830.tif 000028
当業者であれば、アミノ酸をコードする全ての可能なコドンの代表である縮重コドンを決定するにおいていくらか曖昧さが導入されるのを認識するであろう。例えば、セリン（ＷＳＮ）についての縮重コドンは、ある状況では、アルギニン（ＡＧＲ）をコードし、およびアルギニン（ＭＧＮ）についての縮重コドンは、ある状況においては、セリン（ＡＧＹ）をコードする。同様な関係がフェニルアラニンおよびロイシンをコードするコドンの間に存在する。かくして、縮重配列によって含まれるいくつかのポリヌクレオチドは変種アミノ酸配列をコードするかも知れないが、当業者であれば、配列番号２のアミノ酸配列に対する言及によってそのような変種配列を容易に同定することができる。変種配列は本明細書中に記載したように機能性について容易にテストすることができる。
【０１４６】
異なる種は「優先的なコドン用法」を呈することができる。一般に、Ｇｒａｎｔｈａｍら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８：１８９３（１９８０），Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：３１５（１９９６），Ｗａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎら、Ｇｅｎｅ  １３：３５５（１９８１），Ｇｒｏｓｊｅａｎ  ａｎｄ  Ｆｉｅｒｓ，Ｇｅｎｅ  １８：１９９（１９８２），Ｈｏｌｍ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：３０７５（１９８６），Ｉｋｅｍｕｒａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５８：５７３（１９８２），Ｓｈａｒｐ  ａｎｄ  Ｍａｔａｓｓｉ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．４：８５１（１９９４），Ｋａｎｅ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：４９４（１９９５），ａｎｄ  Ｍａｋｒｉｄｅｓ，Ｍｉｃｔｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６０：５１２（１９９６）参照。本明細書中で用いるとき、用語「選択的コドン使用頻度」または「選択的コドン」は、ある種の細胞で最も頻繁に使用される蛋白質翻訳コドンをいう技術用語であり、かくして、各アミノ酸をコードする可能なコドンの１または数個の代表に好都合である（表２参照）。例えば、アミノ酸スレオニン（Ｔｈｒ）はＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、またはＡＣＴによってコードすることができるが、哺乳動物細胞においては、ＡＣＣは最も普通に用いられるコドンであり；他の種、例えば、昆虫細胞、酵母、ウイルスまたは細菌においては、異なる。コドンは優先的であってよい。特定の種についての優先コドンは、当該分野で知られた種々の方法によって本発明のポリペプチドに導入することができる。優先コドン配列の組換えＤＮＡへの導入は、例えば、特定の細胞タイプまたは種内で蛋白質翻訳をより効率的とすることによって蛋白質の生産を増強することができる。したがって、本明細書中に開示された縮重コドン配列は、当該分野で通常に用いられ、かつ本明細書中に開示された種々の細胞型および種においてポリヌクレオチドの発現を最適化するための鋳型として働く。優先コドンを含有する配列をテストし、種々の種における発現について最適化することができ、本明細書中に開示された機能性についてテストすることができる。
【０１４７】
ｐＧ６ｂ−コーディングｃＤＮＡは完全なまたは部分的なヒトｃＤＮＡで、または開示された配列に基づく縮重プローブの１つ以上の組でプローブする等の種々の方法によって単離することができる。ｃＤＮＡは、本明細書中に開示された代表的なヒトｐＧ６ｂ配列から設計されたプライマーでのポリメラーゼ鎖反応を用いてクローン化することもできる。加えて、ｃＤＮＡライブラリーを用いて、宿主細胞を形質転換し、またはトランスフェクトすることができ、および注目するｃＤＮＡの発現はｐＧ６ｂポリペプチドに対する抗体で検出することができる。
【０１４８】
当業者であれば、配列番号１に開示された配列はヒトｐＧ６ｂの単一対立遺伝子を表し、対立遺伝子変位およびオルタナティブスプライシングが怒ると予測されることを認識するであろう。この配列の対立遺伝子変種は、標準的な処方に従って異なる個体からのｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをプローブすることによってクローン化することができる。サイレント突然変異を含有するもの、および突然変異の結果、アミノ酸配列が変化するものを含めた、本明細書中に開示されたヌクレオチド配列の対立遺伝子変種は、本明細書中に開示されたアミノ酸配列の対立遺伝子変種である蛋白質のように、本発明の範囲内のものである。ｐＧ６ｂポリペプチドの特性を保有する別にスプライスされたｍＲＮＡから生じたｃＤＮＡ分子は、そのようなｃＤＮＡおよびｍＲＮＡによってコードされたポリペプチドのように、本発明の範囲内に含まれる。これらの配列の対立遺伝子変種およびスプライス変種は、当該分野で知られた標準的な手法に従って異なる個体または組織からのｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをプローブすることによってクローン化することができる。
【０１４９】
先に議論した方法を用い、当業者であれば、配列番号２に実質的に相同である、または配列番号３または４のアミノ酸、またはその対立遺伝子変種をコードし、および野生型ｐＧ６ｂ受容体のカウンター受容体−結合特性を保有する可溶性ｐＧ６ｂ受容体を含む種々のポリペプチドを調製することができる。そのようなポリペプチドは、本明細書中において一般的に開示されたさらなるポリペプチドセグメントを含むこともできる。
【０１５０】
本発明の特定の実施形態内では、単離された核酸分子は、ストリンジェントな条件下で、本明細書中に開示されたヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズすることができる。例えば、そのような核酸分子は、ストリンジェントな条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸分子に、あるいは配列番号１に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子、あるいはその断片にハイブリダイズすることができる。
【０１５１】
一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにおける特定の配列についての熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低く選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする（規定されたイオン強度およびｐＨ下での）温度である。ハイブリダイゼーションに続き、核酸分子を洗浄して、ストリンジェントな条件下で、あるいは高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズしていない核酸分子を除去することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら、（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ（ｅｄｓ．），Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７）；およびＷｅｔｍｕｒ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：２２７（１９９０）参照。ＯＬＩＧＯ  ６．０（ＬＳＲ；Ｌｏｎｇ  Ｌａｋｅ，ＭＮ）およびＰｒｉｍｅｒ  Ｐｒｅｍｉｅｒ  ４．０  （Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｂｉｏｓｏｆｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）のような配列解析ソフトウエアならびにインターネットのサイトは、ユーザーが規定した基準に基づいて与えられた配列を解析し、Ｔｍを計算する利用可能なツールである。特定のポリヌクレオチドハイブリッドでの使用のためのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件に適合させるのは十分に当業者の能力内のものである。
【０１５２】
本発明は、配列番号２または３のポリペプチドに対する実質的に同様な配列同一性を有する単離されたｐＧ６ｂポリペプチド、またはそれらのオルソログも提供する。用語「実質的に同様な配列同一性」は、配列番号３に示された配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９６％、９７％、９８％、のような少なくとも９５％、または９５％を超える配列同一性を有するポリペプチド、またはそれらのオルソログを示すのに本明細書中で用いる。例えば、変種およびオルソロガスｐＧ６ｂ受容体を用いて、免疫応答を生じさせ、およびヒトｐＧ６ｂに対する交差−反応性抗体を生起させることができる。そのような抗体は本明細書中に開示されたようにヒト化し、および修飾することができ、および乾癬、乾癬性関節炎、ＩＢＤ、結腸炎、内毒素血症を治療するのに、ならびに本明細書中に記載された他の治療的適用において治療的に用いることができる。
【０１５３】
本発明では、２つの基準：コードされたポリペプチドと配列番号２のアミノ酸配列との間の同様性の決定、およびハイブリダイゼーションアッセイを用いて同定することができるｐＧ６ｂ変種核酸分子も考えられる。そのようなｐＧ６ｂ変種は（１）洗浄ストリンジェンシーが５５〜６５℃における０．１％ＳＤＳを含む０．５ｘ−２ｘＳＳＣと同等なストリンジェントな洗浄条件下で配列番号１のヌクレオチド配列（またはその相補体）を有する核酸分子にハイブリダイズしたままであり、および（２）配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９６％、９７％、９８％、または９９％のような９５％を超える配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含む。別法として、ｐＧ６ｂ変種は（１）洗浄ストリンジェンシーが５０℃〜６５℃において０．１％ＳＤＳを含む０．１×−０．２×ＳＳＣと同等である高度にストリンジェントな洗浄条件下で配列番号１の核酸配列（またはその相補体）を有する核酸分子とハイブリダイズしたままであり、および（２）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９６％、９７％、９８％、または９９％のような９５％以上のような９５％を超える配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子として特徴付けることができる。
【０１５４】
パーセント配列同一性は慣用的な方法によって決定される。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｂｕｌｌ．Ｍａｔｈ．Ｂｉｏ．４８：６０３（１９８６）、およびＨｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（１９９２）参照。簡単に述べれば、２つのアミノ酸配列は、表３に示すように、１０のギャップ開始ペナルティ、１のギャップ伸長ペナルティおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（ｉｂｉｄ．）の「ＢＬＯＳＵＭ６２」ソーティングマトリックスを用いて整列スコアを最適化するように整列させる（アミノ酸は標準１文字コードによって示される）。次いで、パーセント同一性は（［同一マッチの合計数］／［より長い配列の長さ＋２つの配列を整列させるためにより長い配列に導入されたギャップの数］）（１００）として計算される。
【０１５５】
【表３】
2009538830.tif 000029
当業者であれば、２つのアミノ酸配列を整列させるのに利用可能な多くの確立されたアルゴリズムがあることを認識する。ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの「ＦＡＳＴＡ」同様性サーチアルゴリズムは、本明細書中に開示されたアミノ酸配列および推定ｐＧ６ｂ変種のアミノ酸配列によって共有された同一性のレベルを調べるための好適な蛋白質整列方法である。ＦＡＳＴＡアルゴリズムはＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）によって、およびＰｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３（１９９０）によって記載されている。簡単に述べれば、ＦＡＳＴＡは、保存的アミノ酸置換、挿入、または欠失なくして、クエリー配列（例えば、配列番号２または配列番号３）および（ｋｔｕｐ変数が１であれば）同一性の最高密度または（もしｋｔｕｐ＝２であれば）同一性の対いずれかを有するテスト配列によって共有された領域を同定することによって最初に配列同様性を特徴付ける。次いで、アミノ酸置換マトリックスを用いて全ての対合したアミノ酸の同様性を比較することによって、同一性の最高密度を持つ１０の領域を記録し、領域の端部を「整えて」、最高のスコアに寄与する残基のみを含める。もし（配列の長さおよびｋｔｕｐ値に基づいて所定の式によって計算された）「カットオフ」値よりも大きなスコアを持ついくつかの領域があれば、整えた最初の領域を調べて、該領域を連結させて、ギャップを持つ近似的な整列を形成することができるか否かを決定する。最後に、２つのアミノ酸配列の最高スコアリング領域を、アミノ酸の挿入および欠失を可能とする、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ−Ｓｅｌｌｅｒｓアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４（１９７０）；Ｓｅｌｌｅｒｓ，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２６：７８７（１９７４））の修飾を用いて整列させる。ＦＡＳＴＡ解析についての例示的なパラメーターは：ｋｔｕｐ＝１、ギャップ開始ペナルティ＝１０、ギャップ伸長ペナルティ＝１、および置換マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２である。Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３（１９９０）の添付文書２に説明されているように、スコアリングマトリックスファイル（「ＳＭＡＲＴＲＩＸ」）を修飾することによって、これらのパラメーターをＦＡＳＴＡプログラムに導入することができる。
【０１５６】
ＦＡＳＴＡを用いて、上述で開示した比率を用いて核酸分子の配列同一性を決定することもできる。ヌクレオチド配列の比較では、ｋｔｕｐ値は、他のパラメーターを上述したように設定して、１〜１０、好ましくは３〜６の範囲、最も好ましくは３とすることができる。
【０１５７】
本発明は、本明細書中に開示されたアミノ酸配列と比較して、保存的アミノ酸変化を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含む。例えば、配列番号２の１つ以上のアミノ酸置換を含有する変種を得ることができ、そこでは、アルキルアミノ酸がｐＧ６ｂアミノ酸配列中のアルキルアミノ酸に代えて置換されており、芳香族アミノ酸がｐＧ６ｂアミノ酸配列中の芳香族アミノ酸に代えて置換されており、硫黄−含有アミノ酸がｐＧ６ｂアミノ酸配列中の硫黄−含有アミノ酸に代えて置換されており、ヒドロキシ−含有アミノ酸がｐＧ６ｂアミノ酸配列中のヒドロキシ−含有アミノ酸に代えて置換されており、酸性アミノ酸がｐＧ６ｂアミノ酸配列中のアミノ酸に代えて置換されており、塩基性アミノ酸がｐＧ６ｂアミノ酸配列中の塩基性アミノ酸に代えて置換されており、あるいは二塩基性モノカルボキシリックアミノ酸がｐＧ６ｂアミノ酸配列中の二塩基性モノカルボキシリックアミノ酸に代えて置換されている。共通のアミノ酸の中で、例えば、「保存的アミノ酸置換」は、以下の群の各々内でアミノ酸の間での置換によって示される：（１）グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、（２）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、（３）セリンおよびスレオニン、（４）アスパルテートおよびグルタメート、（５）グルタミンおよびアスパラギン酸、および（６）リシン、アルギニン、およびヒスチジン。ＢＬＯＳＵＭ６２表は、関連蛋白質の５００を超える群の高度に保存された領域を表す蛋白質配列セグメントの約２，０００局所複数整列に由来するアミノ酸置換マトリックスである（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（１９９２））。従って、ＢＬＯＳＵＭ６２置換頻度を用いて、本発明のアミノ酸配列に導入することができる保存的アミノ酸置換を規定することができる。（先に議論したように）化学的特性のみに基づいたアミノ酸置換を設計することが可能であるが、用語「保存的アミノ酸置換」とは、好ましくは、−１を超えるＢＬＯＳＵＭ６２値によって表される置換をいう。例えば、アミノ酸置換は、もし置換が０、１、２、または３のＢＬＯＳＵＭ６２値によって特徴付けられるならば保存的である。このシステムに従うと、好ましい保存的アミノ酸置換は少なくとも１（例えば、１，２または３）のＢＬＯＳＵＭ６２値によって特徴付けられ、他方、より好ましい保存的アミノ酸置換は少なくとも２（例えば、２または３）のＢＬＯＳＵＭ６２値によって特徴付けられる。ｐＢ６ｂの特定の変種は、対応するアミノ酸配列（例えば、胚列番号：３）に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９６％、９７％、９８％、または９９％以上のような９５％を超える配列同一性を有することによって特徴付けられ、ここに、アミノ酸配列における変動は１つ以上の保存的アミノ酸置換によるものである。
【０１５８】
ｐＧ６ｂ遺伝子の保存的アミノ酸変化は、例えば、配列番号１に引用されたヌクレオチドに代えてヌクレオチドを置換することによって導入することができる。そのような「保存的アミノ酸」変種は、オリゴヌクレオチド−特異的突然変異誘発、リンカー−スキャンニング突然変異誘発、ポリメラーゼ鎖反応を用いる突然変異誘発等によって得ることができる（Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）；ａｎｄ  ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（ｅｄ．），Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）参照）。変種ｐＧ６ｂポリペプチドは、抗−ｐＧ６ｂ抗体に特異的に結合する能力によって同定することができる。
【０１５９】
本発明の蛋白質は天然に生じないアミノ酸残基を含むこともできる。天然に生じないアミノ酸は、限定されるものではないが、トランス−３−メチルプロリン、２，４−メタノプロリン、シス−４−ヒドロキシプロリン、トランス−４−ヒドロキシプロリン、Ｎ−メチルグリシン、アロ−スレオニン、メチルスレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン三、知アゾリンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−および４−メチルプロリン、３，３−ジメチルプロリン、ｔｅｒｔ−ロイシン、ノルバリン、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン、および４−フルオロフェニルアラニンを含む。いくつかの方法が、天然に生じないアミノ酸残基を蛋白質に取り込むために当業者に知られている。例えば、インビトロ系を使用することができ、ここに、化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡを用いて抑制される。アミノ酸を合成し、ｔＲＮＡをアミノアシル化する方法は当該分野で知られている。ナンセンス突然変異を含むプラスミドの転写および翻訳は、典型的には、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｓ３０抽出物、および商業的に入手可能な酵素および他の試薬を含む無細胞系で行われる。蛋白質はクロマトフラフィーによって精製される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：２７２２（１９９１），Ｅｌｌｍａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０２：３０１（１９９１），Ｃｈｕｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：８０６（１９９３），およびＣｈｕｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１０１４５（１９９３）参照。
【０１６０】
第二の方法において、突然変異したｍＲＮＡおよび化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡのマイクロインジェクションによって、翻訳をアフリカツメガエル卵母細胞中で行う（Ｔｕｒｃａｔｔｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１９９９１（１９９６））。第三の方法内で、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞は、置き換えるべき天然アミノ酸（例えば、フェニルアラニン）の非存在下で、および所望の天然に生じないアミノ酸（例えば、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン、または４−フルオロフェニルアラニン）の存在下で培養する。天然に生じないアミノ酸は、その天然カウンターパートの代わりに蛋白質に取り込まれる。Ｋｏｉｄｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３：７４７０（１９９４）参照。天然に生じるアミノ酸残基は、インビトロ化学修飾によって天然に生じない種に変換することができる。化学的修飾を部位−特異的突然変異誘発と組み合わせて、置換の範囲をさらに拡大することができる（Ｗｙｎｎ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２：３９５（１９９３））。
【０１６１】
限定された数の非−保存的アミノ酸、遺伝子コードによってコードされないアミノ酸、天然に生じないアミノ酸、および異常なアミノ酸はｐＧ６ｂアミノ酸残基に代えて置換することができる。
【０１６２】
本発明のポリペプチド中の必須アミノ酸は、部位−特異的突然変異誘発またはアラニン−スキャンニング突然変異誘発のような当該分野で知られた手法に従って同定することができる（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１（１９８９），Ｂａｓｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：４４９８（１９９１），Ｃｏｏｍｂｓ  ａｎｄ  Ｃｏｒｅｙ，“Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，”ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ（ｅｄ．），ｐａｇｅｓ  ２５９−３１１（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９８））。後者の技術において、単一のアラニン突然変異を分子中の残基毎に導入し、得られた突然変異体分子を、生物学的活性についてテストして、分子の活性にとって臨界的であるアミノ酸残基を同定する。また、Ｈｉｌｔｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４６９９（１９９６）参照。
【０１６３】
配列解析を用いて、ｐＧ６ｂカウンター受容体結合領域をさらに規定することができるが、ｐＧ６ｂのそのカウンター受容体またはカウンター受容体への、または抗−ｐＧ６ｂ抗体への結合のような）ｐＧ６ｂ結合活性において役割を演じるアミノ酸は、推定接触部位アミノ酸の突然変異と組み合わせて、核磁気共鳴、結晶学、電子回折または光親和性標識のような技術によって測定して、構造の物理的解析によって決定することもできる。例えば、ｄｅ  Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６（１９９２），Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９（１９９２），およびＷｌｏｄａｖｅｒら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０９：５９（１９９２）参照。
【０１６４】
多数のアミノ酸置換は、Ｒｅｉｄｈａａｒ−ＯｌｓｏｎおよびＳａｕｅｒ  （Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：５３（１９８８））またはＢｏｗｉｅおよびＳａｕｅｒ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２１５２（１９８９））によって開示されたもののような、突然変異誘発およびスクリーニングの公知の方法を用いて作り出し、およびテストすることができる。簡単に述べれば、これらの著者は、ポリペプチド中の２つ以上の位置を同時にランダム化し、機能的ポリペプチドについて選択し、次いで、突然変異誘発したポリペプチドを配列決定して、各位置において許容される置換のスペクトルを決定する方法を開示する。用いることができる他の方法は、ファージディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：１０８３２，１９９１，Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，２２３，４０９号，Ｈｕｓｅ，国際公開番号  ＷＯ  ９２／０６２０４）、および領域−特異的突然変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅら、Ｇｅｎｅ  ４６：１４５，１９８６，ａｎｄ  Ｎｅｒら、ＤＮＡ  ７：１２７，１９８８）を含む。さらに、ビオチンまたはＦＩＴＣで標識されたｐＧ６ｂを、ｐＧ６ｂカウンター受容体の発現クローニングで用いることができる。
【０１６５】
開示されたｐＧ６ｂヌクレオチドおよびポリペプチド配列の変種は、Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９（１９９４），Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１０７４７，１９９４、および国際公開番号ＷＯ  ９７／２００７８によって開示されたＤＮＡシャッフリングを通じて生じさせることもできる。簡単に述べれば、変種ＤＮＡ分子が、親ＤＮＡのランダム断片化、続いての、ランダムに導入された点突然変異をもたらすＰＣＲを用いる再組立てによってインビトロ相同組換えによって生じさせる。この技術は、異なる種からの対立遺伝子変種またはＤＮＡ分子のような親ＤＮＡ分子のファミリーを用いることによって修飾して、さらなる多様性をプロセスに導入することができる。所望の活性についての選択またはスクリーニング、続いての、突然変異およびアッセイのさらなる反復は、同時に有害な変化に対して選択しつつ、望ましい突然変異について選択することによって配列の迅速な「進化」を提供する。
【０１６６】
本明細書中に開示された突然変異誘発方法を高−スループット自動スクリーニング方法と組合せて、宿主細胞におけるクローン化された突然変異誘発ポリペプチドの活性を検出することができる。生物学的に活性なポリペプチド、あるいは抗−ｐＧ６ｂ抗体に結合するポリペプチドをコードする突然変異誘発ＤＮＡ分子を宿主細胞から回収し、近代の機器を用いて迅速に配列決定することができる。これらの方法は注目するポリペプチド中のここのアミノ酸残基の重要性の迅速な決定を可能とし、未知の構造のポリペプチドに適用することができる。
【０１６７】
本発明は、ｐＧ６ｂポリペプチドの「機能的断片」、およびそのような機能的断片をコードする核酸分子も含む。核酸分子のルーチン的欠失解析を行って、ｐＧ６ｂポリペプチドをコードする核酸分子の機能的断片を得ることができる。説明として、配列番号１のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子をＢａｌ３１ヌクレアーゼで消化して、一連のネステッド欠失を得ることができる。次いで、断片を発現ベクターに適切なリーディングフレームにて挿入し、発現されたポリペプチドを単離し、抗−ｐＧ６ｂ抗体に結合する能力についてテストする。エンドヌクレアーゼ消化に対する１つの代替法は、オリゴヌクレオチド−特異的突然変異誘発を用いて、欠失または停止コドンを導入して、所望の断片の生産を特定することである。別法として、ｐＧ６ｂ遺伝子の特定の断片は、ポリメラーゼ鎖反応を用いて合成することができる。
【０１６８】
この一般的な手法はインターフェロンのいずれかまたは双方の末端における切形についての研究によって例示され、Ｈｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｄｉ  Ｍａｒｃｏ，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．６６：５０７（１９９５）によってまとめられている。さらに、蛋白質の機能的合成についての標準的技術は、例えば、Ｔｒｅｕｔｅｒら、Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４０：１１３，１９９３，Ｃｏｎｔｅｎｔら、“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ４２  ｋＤａ  ２−５Ａ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ，”ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ＩＳＩＲ−ＴＮＯ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｎ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｎｔｅｌｌ（ｅｄ．），ｐａｇｅｓ  ６５−７２（Ｎｉｊｈｏｆｆ  １９８７），Ｈｅｒｓｃｈｍａｎ，“Ｔｈｅ  ＥＧＦ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，”  ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１，Ｂｏｙｎｔｏｎら、（ｅｄｓ．）  ｐａｇｅｓ  １６９−１９９（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５），Ｃｏｕｍａｉｌｌｅａｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２９２７０，１９９５；Ｆｕｋｕｎａｇａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２５２９１，１９９５；Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５０：１２９５，１９９５，およびＭｅｉｓｅｌら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．３０：１，１９９６によって記載されている。
【０１６９】
本発明では、本明細書中に開示されたアミノ酸配列と比較して、アミノ酸変化を有するｐＧ６ｂ遺伝子の機能的断片も考えられる。変種ｐＧ６ｂ遺伝子は、先に議論したように、開示されたヌクレオチドおよびアミノ酸配列との同一性のレベルを決定することによって構造に基づいて同定することができる。構造に基づいて変種遺伝子を同定する別の手法は、潜在的変種ｐＧ６ｂ遺伝子をコードする核酸分子が、配列番号１のようなヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズできるか否かを決定することである。
【０１７０】
本発明は、ｐＧ６ｂポリペプチドの機能的断片、抗原性エピトープ、ｐＧ６ｂポリペプチドのエピトープ担持部分、およびそのような機能的断片、抗原性エピトープｐＧ６ｂポリペプチドのエピトープ−担持部分をコードする核酸分子の使用も含む。そのような断片を用いて、Ｂ７受容体の活性に作動させ、それに結合し、それをブロックし、阻害し、増加させ、低下させ、または中和する抗体および結合パートナーを作るのに用いられるポリペプチドを作り出す。本明細書中で定義された「機能的」ｐＧ６ｂポリペプチドまたはその断片は、炎症、増殖または分化活性をブロックし、阻害し、低下し、拮抗しまたは中和するその能力によって、特殊化された細胞機能を誘導し、または阻害するその能力によって、または抗−ｐＧ６ｂ抗体、細胞、またはＢ７カウンター受容体に特異的に結合するその能力によって特徴付けられる。本明細書中において先に記載したように、ｐＧ６ｂは、本明細書中に記載されたその受容体構造およびドメインによってＢ７ファミリーメンバーとして特徴付けられる。かくして、本発明では、さらに：（ａ）上述した１つ以上のドメインを含むポリペプチド分子；および（ｂ）これらのドメインの１つ以上を含む機能的断片を含む融合蛋白質の使用が考えられる。融合蛋白質の他のポリペプチド部分は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、ＰＤ−１またはＢＴＬＡのようなもう１つのＣＤ２８ファミリー受容体によって、または融合蛋白質の分泌を容易とする無関係な分泌シグナルペプチドによって寄与され得る。
【０１７１】
また、本発明は、本明細書中に記載されたｐＧ６ｂポリペプチドのエピトープ−担持部分を含むポリペプチド断片またはペプチドも提供する。そのような断片またはペプチドは、完全な蛋白質が免疫原として用いられた場合に抗体反応を誘導する蛋白質の部分である「免疫原性エピトープ」を含むことができる。免疫原性エピトープ−担持ペプチドは、標準的な方法を用いて同定することができる（例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３９９８，１９８３）。
【０１７２】
対照的に、ポリペプチド断片またはペプチドは、抗体が特異的に結合することができる蛋白質の分子の領域である「抗原性エピトープ」を含むことができる。ある種のエピトープはアミノ酸の線状または連続的ストレッチよりなり、そのようなエピトープの抗原性は変性剤によって破壊されない。蛋白質のエピトープを模倣することができる比較的短い合成ペプチドを用いて、蛋白質に対する抗体の生産を刺激することができるのは当該分野で知られている（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１９：６６０，１９８３）。従って、本発明の抗原性エピトープ−担持ペプチド、抗原性ペプチド、エピトープ、およびポリペプチドは、本明細書中に記載されたポリペプチドと結合する抗体を生起させるのに、ならびに中和性である、およびそのカウンター受容体の活性に作動し、結合し、ブロックし、阻害し、低下させ、拮抗し、または中和することができる抗−ｐＧ６ｂモノクローナル抗体を同定し、スクリーニングするのに有用である。本発明のそのような中和モノクローナル抗体はｐＧ６ｂ抗原エピトープに結合することができる。Ｈｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ親水性プロフィールを用いて、配列番号３内の最も抗原能力を有する領域を決定することができる（Ｈｏｐｐら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：３８２４−３８２８，１９８１；Ｈｏｐｐ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．８８：１−１８，１９８６およびＴｒｉｑｕｉｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１：１５３−１６９，１９９８）。プロフィールは、スライドする６−残基ウィンドウに基づく。埋もれたＧ、Ｓ、およびＴ残基および露出されたＨ、Ｙ、およびＷ残基は無視した。ｐＧ６ｂにおいては、これらの領域は当業者によって決定され得る。さらに、例えば、ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｐｒｏｔｅａｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いてＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆプロットによって予測される配列番号２内のｐＧ６ｂ抗原エピトープは好ましい抗原エピトープとして働き、当業者によって決定され得る。そのような抗原エピトープは、（１）配列番号２のアミノ酸残基２１〜３１；（２）配列番号２のアミノ酸残基５５〜６１；（３）配列番号２のアミノ酸残基１１０〜１１６；（４）配列番号２のアミノ酸残基１８４〜２０６；および（５）配列番号２のアミノ酸残基１９１〜１９７を含む。好ましい実施形態において、本発明の中和抗体が結合する抗原エピトープは、カウンター受容体結合で重要である配列番号２の残基（および配列番号３の対応する残基）を含有するであろう。
【０１７３】
抗原エピトープ−担持ペプチドおよびポリペプチドは、少なくとも４〜１０のアミノ酸、少なくとも１０〜１５のアミノ酸、または約１５〜約３０アミノ酸の本明細書中に開示されたアミノ酸配列を含有することができる。そのようなエピトープ−担持ペプチドおよびポリペプチドは、本明細書中に記載されたように、ｐＧ６ｂポリペプチドを断片化することによって、または化学ペプチド合成によって生産することができる。さらに、エピトープはランダムペプチドライブラリーのファージディスプレイによって選択することができる（例えば、Ｌａｎｅ  ａｎｄ  Ｓｔｅｐｈｅｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２６８，１９９３；およびＣｏｒｔｅｓｅら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７：６１６，１９９６参照）。エピトープを同定し、エピトープを含む小さなペプチドから抗体を生産する標準的な方法は、例えば、Ｍｏｌｅ，“Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ”ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１０，Ｍａｎｓｏｎ  （ｅｄ．），ｐａｇｅｓ  １０５−１１６（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９２），Ｐｒｉｃｅ，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｒｉｔｔｅｒ  ａｎｄ  Ｌａｄｙｍａｎ（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  ６０−８４（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５），およびＣｏｌｉｇａｎら（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｐａｇｅｓ  ９．３．１−９．３．５  ａｎｄ  ｐａｇｅｓ  ９．４．１−９．４．１１（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９７）によって記載されている。
【０１７４】
変種および融合蛋白質を含めたいずれのｐＧ６ｂポリペプチドについても、当業者であれば、上述の表１および２に記載された情報を用いてその変種をコードする十分に縮重したポリヌクレオチド配列を容易に作り出すことができる。さらに、当業者であれば、本明細書中に記載されたヌクレオチドおよびアミノ酸配列に基づいてｐＧ６ｂ変種を工夫するための標準的なソフトウェアを用いることができる。
【０１７５】
５．ｐＧ６ｂポリペプチドの生産
全長ポリペプチド；安定なモノマー、ホモダイマー、ヘテロダイマーおよびマルチマー受容体；全長受容体；受容体断片（例えば、カウンター受容体−結合断片および抗原エピトープ）；機能性断片；および融合蛋白質を含めた本発明のポリペプチドは、慣用的な技術に従って組換え宿主細胞において生産することができる。ｐＧ６ｂ遺伝子を発現させるためには、ポリペプチドをコードする核酸分子は、発現ベクターにおける転写発現を制御する調節配列に操作可能に連結されていなければならず、次いで、宿主細胞に導入されなければならない。プロモーターおよびエンハンサーのような転写調節配列に加えて、発現ベクターは、翻訳調節配列、および発現ベクターを運ぶ細胞の選択に適したマーカー遺伝子を含むことができる。
【０１７６】
真核生物細胞における外来性蛋白質の生産に適した発現ベクターは、典型的には、（１）細菌複製起点をコードする原核生物ＤＮＡエレメント、および細菌宿主における発現ベクターの成長および選択を供するための抗生物質耐性マーカー；（２）プロモーターのような転写の開始を制御する真核生物ＤＮＡエレメント；および（３）転写終止／ポリアデニル化配列のような転写体のプロセッシングを制御するＤＮＡエレメントを含有する。先に議論したように、発現ベクターは、宿主細胞の分泌経路へ異種ポリペプチドを向ける分泌配列をコードするヌクレオチド配列を含むこともできる。例えば、ｐＧ６ｂ発現ベクターはｐＧ６ｂ遺伝子、およびいずれかの分泌された遺伝子に由来する分泌配列を含むことができる。
【０１７７】
本発明のｐＧ６ｂ蛋白質は哺乳動物細胞において発現させることができる。好適な哺乳動物宿主細胞の例はアフリカミドリザル腎臓細胞（Ｖｅｒｏ；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５８７）、ヒト胚腎臓細胞（２９３−ＨＥＫ；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５７３）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ−２１，ＢＨＫ−５７０；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ８５４４，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０３１４）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１；ＣＨＯ  ＤＧ４４（Ｃｈａｓｉｎら、Ｓｏｍ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１２：５５５，１９８６））、ラット下垂体細胞（ＧＨ１；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８２）、ＨｅＬａ  Ｓ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２．２）、ラット肝臓腫細胞（Ｈ−４−ＩＩ−Ｅ；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５４８）、ＳＶ４０−形質転換サル腎臓細胞（ＣＯＳ−１；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）およびネズミ胚細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５８）を含む。
【０１７８】
哺乳動物宿主については、転写および翻訳調節シグナルは哺乳動物ウイルス源、例えば、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、シミアンウイルスなどに由来してよく、ここに、調節シグナルは、高レベルの発現を有する特定の遺伝子に関連する。好適な転写および翻訳調節配列は哺乳動物遺伝子、例えば、アクチン、コラーゲン、ミオシン、およびメタロチオネイン遺伝子からも由来することができる。
【０１７９】
転写調節配列は、ＲＮＡ合成の開始を指令するのに十分なプロモーター領域を含む。好適な真核生物プロモーターはマウスメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター（Ｈａｍｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：２７３，１９８２）、ヘルペスウイルスのＰＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｃｅｌｌ  ３１：３５５，１９８２）、ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４，１９８１）、ラウス肉腫ウイルスプロモーター（Ｇｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：６７７７，１９８２）、サイトメガロウイルスプロモーター（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ  ４５：１０１，１９８０）、およびマウス乳頭腫瘍ウイルスプロモーター（一般に、Ｅｔｃｈｅｖｅｒｒｙ，“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，”ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｃｌｅｌａｎｄら（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  １６３−１８１（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９６）参照）を含む。
【０１８０】
別法として、バクテリオファージＴ３  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのような原核生物プロモーターを用いて、もし原核生物プロモーターが真核生物プロモーターによって調節されるならば、哺乳動物細胞においてｐＧ６ｂ遺伝子発現を制御することができる（Ｚｈｏｕら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：４５２９，１９９０；ａｎｄ  Ｋａｕｆｍａｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４４８５，１９９１）。
【０１８１】
特定の実施形態において、ｐＧ６ｂ可溶性受容体ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、またはｐＧ６ｂポリペプチドの断片は、一般に、発現ベクター内の、転写プロモーターおよびターミネーターを含めたその発現に必要な他の遺伝子エレメントに操作可能に連結している。ベクターは１つ以上の選択マーカーおよび１つ以上の複製起点を通常も含有するが、当業者であれば、ある系内では、選択マーカーは別のベクターにて供することができ、および外来性ＤＮＡの複製は宿主細胞ゲノムへの組み込みによって供することができるのを認識するであろう。プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベクターおよび他のエレメントの選択は、当業者のレベル内のルーチン的設計事項である。多くのそのようなエレメントは文献に記載されており、商業的供給業者を通じて入手可能である。可溶性受容体複合体の多数の成分は、個々の発現ベクターに共−トランスペクトすることができ、あるいは単一発現ベクターに含ませることができる。蛋白質複合体の多数の成分を発現させるそのような技術は当該分野で周知である。
【０１８２】
発現ベクターは、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポソーム−媒介トランスフェクション、マクロプロジェクタイル−媒介送達エレクトロポレーションなどを含めた種々の標準的技術を用いて宿主細胞に導入することができる。トランスフェクトされた細胞を選択し、増殖させて、宿主細胞ゲノムに安定に組み込まれた発現ベクターを含む組換え宿主細胞を供することができる。ベクターを真核生物細胞に導入するための技術、および優性選択マーカーを用いてそのような安定な形質転換体を選択するための技術は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）によって、およびＭｕｒｒａｙ（ｅｄ．），Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）によって記載されている。
【０１８３】
例えば、１つの好適な選択マーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する耐性を供する遺伝子である。この場合、選択は、Ｇ−４１８などのようなネオマイシン−タイプの薬物の存在下で行う。選択系を用いて、注目する遺伝子の発現レベルを増加させることもでき、これは、「増幅」と言われるプロセスである。増幅は、低レベルの選択剤の存在下でトランスフェクタントを培養し、次いで、選択剤の量を増加させて、導入された遺伝子の高レベルの産物を生産する細胞について選択することによって行う。好適な増幅可能な選択マーカーは、メトトレキサートに対する耐性を付与するジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）である。他の薬物耐性遺伝子（例えば、ヒブロマイシン耐性、多薬物耐性、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）を用いることもできる。別法として、緑色蛍光蛋白質、またはＣＤ４、ＣＤ８、クラスＩ  ＭＩＣ、胎盤アルカリ性ホスファターゼのような細胞表面蛋白質のような改変された表現型を導入するマーカーを用いて、ＦＡＣＳソーティング、または磁性ビーズ分離技術のような手段によってトランスフェクトされた細胞をトランスフェクトされていない細胞から分類することができる。
【０１８４】
ｐＧ６ｂポリペプチドは、ウイルス送達系を用いて培養された哺乳動物細胞によって生産することができる。この目的での例示的なウイルスはアデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、およびアデノ−関連ウイルス（ＡＡＶ）を含む。二本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノウイルスは、現在、異種核酸の送達のための最も研究された遺伝子導入ベクターである（レビューについては、Ｂｅｃｋｅｒら、Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４３：１６１，１９９４；およびＤｏｕｇｌａｓ  ａｎｄ  Ｃｕｒｉｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４：４４，１９９７参照）。アデノウイルス系の利点は、比較的大きなＤＮＡインサートの収容、高い力価まで成長する能力、広い範囲の哺乳動物細胞型を感染させる能力、および異なるプロモーターを含有する非常に多数の入手可能なベクターでの使用を可能とする柔軟性を含む。
【０１８５】
アデノウイルスゲノムの部分を形質転換することによって、異種ＤＮＡのより大きなインサート（７ｋｂまで）を収容することができる。これらのインサートは直接的連結によって、あるいは共―トランスフェクトされたプラスミドでの相同組換えによってウイルスＤＮＡに取り込むことができる。選択肢としては、ウイルスベクターから必須のＥ１遺伝子を欠失させることであり、これは、Ｅ１遺伝子が宿主細胞によって供されるのでなければ、複製する無能力をもたらす。アデノウイルスベクター−感染ヒト２９３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５７３，４４５０４，４５５０５）は、例えば、比較的高い細胞密度にて、接着性細胞として、または懸濁培養において成長させて、かなりの量の蛋白質を生産することができる（Ｇａｒｎｉｅｒら、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：１４５，１９９４参照）。
【０１８６】
ｐＧ６ｂは鳥類、真菌、昆虫、酵母、または植物細胞のような他の高等真核生物細胞において発現させることができる。バキュロウイルス系は、クローン化されたｐＧ６ｂ遺伝子を昆虫細胞に導入するための有効な手段を提供する。そのような発現ベクターはＡｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ多重核多角体ウイルス（ＡｃＭＮＰＹ）に基づくものであり、ショウジョウバエ熱ショック蛋白質（ｈｓｐ）７０プロモーター、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ多重核多角体ウイルス即時型遺伝子プロモーター（ｉｅ−１）および遅延初期３９Ｋプロモーター、バキュロウイルスｐ１０プロモーター、およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎプロモーターを含有する。組換えバキュロウイルスを作製する第二の方法は、Ｌｕｃｋｏｗ（Ｌｕｃｋｏｗら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４５６６，１９９３）によって記載されたトランスポゾン−ベースの系を利用する。導入ベクターを利用するこの系はＢＡＣ−ｔｏ−ＢＡＣキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）にて販売されている。この系は、Ｔｎ７トランスポゾンを含有する導入ベクターＰＦＡＳＴＢＡＣ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を利用して、ｐＧ６ｂポリペプチドをコードするＤＮＡを、「バクミド」と呼ばれる大きなプラスミドとしてＥ．ｃｏｌｉにおいて維持されたバキュロウイルスゲノムに移動させる。Ｈｉｌｌ−Ｐｅｒｋｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｏｓｓｅｅ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：９７１，１９９０；Ｂｏｎｎｉｎｇら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１５５１，１９９４；およびＣｈａｚｅｎｂａｌｋ  ａｎｄ  Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１５４３，１９９５参照。加えて、導入ベクターは、発現されたｐＧ６ｂポリペプチドのＣ−またはＮ−末端におけるエピトープ標識、例えば、Ｇｌｕ−Ｇｌｕエピトープ標識（Ｇｒｕｓｓｅｎｍｅｙｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：７９５２，１９８５）をコードするＤＮＡとのイン−フレーム融合を含むことができる。当該分野で技術を用い、ｐＧ６ｂ遺伝子を含有する導入ベクターをＥ．ｃｏｌｉに形質転換し、組換えバキュロウイルスを示す中断されたｌａｃＺ遺伝子を含有するバクミドについてスクリーニングする。次いで、通常の技術を用い、組換えバキュロウイルスゲノムを含有するバクミドＤＮＡを単離する。
【０１８７】
例示的ＰＦＡＳＴＢＡＣベクターをかなりの程度まで修飾することができる。例えば、ポリヘドリンプロモーターを除去し、バキュロウイルス感染の初期に発現され、分泌蛋白質を発現するのに有利であることが知られている（Ｐｃｏｒ、ｐ６．９またはＭＰプロモーターとしても知られた）バキュロウイルス塩基性蛋白質プロモーターで置き換えることができる（例えば、Ｈｉｌｌ−Ｐｅｒｋｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｏｓｓｅｅ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：９７１，１９９０；Ｂｏｎｎｉｎｇら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１５５１，１９９４；およびＣｈａｚｅｎｂａｌｋ  ａｎｄ  Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１５４３，１９９５参照）。そのような導入ベクター構築体においては、塩基性蛋白質プロモーターの短いまたは長いバージョンを用いることができる。さらに、天然ｐＧ６ｂ分泌シグナル配列を昆虫蛋白質に由来する分泌シグナル配列で置き換える導入ベクターを構築することができる。例えば、エクジステロイドグリコシルトランスフェラーゼ（ＥＧＴ）、ミツバチメリチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、またはバキュロウイルスｐｇ６７（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ：Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からの分泌シグナル配列を構築体で用いて、天然ｐＧ６ｂ分泌シグナル配列を置き換えることができる。
【０１８８】
組換えウイルスまたはバクミドを用いて宿主細胞をトランスフェクトする。好適な昆虫宿主細胞はＩＰＬＢ−Ｓｆ−２１、Ｓｆ９（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７１１）、Ｓｆ２１ＡＥ、およびＳｆ２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のようなＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａサナギ卵巣細胞系、ならびにＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ−２細胞、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉｓ  ｎｉに由来するＨＩＧＨ  ＦＩＶＥＯ細胞系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（米国特許第５，３００，４３５号）を含む。商業的に入手可能な無血清培地を用いて細胞を成長さえ、維持することができる。好適な培地はＳｆ９細胞のためのＳｆ９００  ＩＩＴＭ  （Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＥＳＦ  ９２１ＴＭ  （Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；およびＴ．ｎｉ細胞のためのＥｘｃｅｌｌＯ４０５ＴＭ  （ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ）またはＥｘｐｒｅｓｓ  ＦｉｖｅＯＴＭ  （Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。組換えウイルスを用いる場合、細胞は、典型的には、ほぼ２〜５ｘ１０５細胞の接種密度から、１〜２ｘ１０６細胞の密度まで成長させ、その時点で、組換えウイルスストックを０．１〜１０、より典型的には３近くの感染多重度（ＭＯＩ）で加える。
【０１８９】
バキュロウイルス系において組換え蛋白質を生産するための確立された技術はＢａｉｌｅｙら、“Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，”  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ７：Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｕｒｒａｙ（ｅｄ．），ｐａｇｅｓ  １４７−１６８（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９１）によって、Ｐａｔｅｌら、“Ｔｈｅ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ，”  ｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｌｏｖｅｒら（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  ２０５−２４４（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）によって、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）  ａｔ  ｐａｇｅｓ  １６−３７  ｔｏ  １６−５７によって、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ（ｅｄ．），Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）によって、およびＬｕｃｋｎｏｗ，“Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｃｌｅｌａｎｄら（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  １８３−２１８（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９６）によって供される。
【０１９０】
酵母細胞を含めた真菌細胞を用いて、本明細書中に記載された遺伝子を発現させることもできる。この点に関して特に注目する酵母種はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、およびＰｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａを含む。酵母における発現のための好適なプロモーターはＧＡＬ１（ガラクトース）、ＰＧＫ（ホスホグリセレートキナーゼ）、ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）、ＡＯＸ１（アルコールオキシダーゼ）、ＨＩＳ４（ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ）などからのプロモーターを含む。多くの酵母クローニングベクターが設計されており、容易に入手可能である。これらのベクターはＹＩｐ５のようなＹＩｐ−ベースのベクター、ＹＲｐ１７のようなＹＲｐベクター、ＹＥｐ１３のようなＹＥｐベクターおよびＹＣｐ１９のようなＹＣｐベクターを含む。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を外来性ＤＮＡで形質転換し、それから組換えポリペプチドを生産する方法は、例えば、Ｋａｗａｓａｋｉ，米国特許第４，５９９，３１１号，Ｋａｗａｓａｋｉら、米国特許第４，９３１，３７３号，Ｂｒａｋｅ，米国特許第４，８７０，００８号，Ｗｅｌｃｈら、米国特許第５，０３７，７４３号およびＭｕｒｒａｙら、米国特許第４，８４５，０７５号によって開示されている。形質転換された細胞は、選択マーカー、通常は薬物耐性、または特定の栄養素（例えば、ロイシン）の非存在下で成長する能力によって決定された表現型によって選択される。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで用いる好適なベクター系は、グルコース−含有培地中での成長によって形質転換細胞が選択されるのを可能とする、Ｋａｗａｓａｋｉら（米国特許第４，９３１，３７３号）によって開示されたＰＯＴ１ベクター系である。酵母で用いるさらなる好適なプロモーターおよびターミネーターは、解糖酵素遺伝子（例えば、Ｋａｗａｓａｋｉ，米国特許第４，５９９，３１１号，Ｋｉｎｇｓｍａｎら、米国特許第４，６１５，９７４号，およびＢｉｔｔｅｒ，米国特許第４，９７７，０９２号参照）、およびアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子からのものを含む。また、米国特許第４，９９０，４４６号、第５，０６３，１５４号、第５，１３９，９３６号、および第４，６６１，４５４号参照。
【０１９１】
Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉおよびＣａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａを含めた他の酵母のための形質転換系は当該分野で知られている。例えば、Ｇｌｅｅｓｏｎら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９（１９８６）、およびＣｒｅｇｇ，米国特許第４，８８２，２７９号参照。Ａｓｐｅｒｇｌｌｕｓ細胞は、ＭｃＫｎｉｇｈｔら、米国特許第４，９３５，３４９号の方法に従って利用することができる。Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍを形質転換する方法はＳｕｍｉｎｏら、米国特許第５，１６２，２２８号によって開示されている。Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａを形質転換する方法はＬａｍｂｏｗｉｔｚ，米国特許第４，４８６，５３３号によって開示されている。
【０１９２】
例えば、組換え蛋白質の生産のための宿主としてのＰｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａの使用は、Ｒａｙｍｏｎｄ，米国特許第５，７１６，８０８号，Ｒａｙｍｏｎｄ，米国特許第５，７３６，３８３号，Ｒａｙｍｏｎｄら、Ｙｅａｓｔ  １４：１１−２３（１９９８）によって、および国際公開番号ＷＯ  ９７／１７４５０、ＷＯ  ９７／１７４５１、ＷＯ  ９８／０２５３６、およびＷＯ  ９８／０２５６５において開示されている。Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａを形質転換するのに用いるＤＮＡ分子は、通常、好ましくは形質転換に先立って線状化される二本鎖環状プラスミドとして調製される。Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａにおけるポリペプチド生産のためには、プラスミド中のプロモーターおよびターミネーターはＰ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａアルコール資化遺伝子（ＡＵＧ１またはＡＵＧ２）のようなＰ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ遺伝子のそれとすることができる。他の有用なプロモーターはジヒドロキシアセトンシンターゼ（ＤＨＡＳ）、ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＭＤ）、およびカタラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子のそれを含む。宿主染色体へのＤＮＡの組み込みを容易とするためには、宿主ＤＮＡ配列によって双方の端部において近接挟まれたプラスミドの完全な発現セグメントを有するのが好ましい。Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａで用いられる好適な選択マーカーはＰ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ  ＡＤＥ２遺伝子であり、これはホスホリボシル−５−アミノイミダゾールカルボキシラーゼ（ＡＩＲＣ；ＥＣ  ４．１．１．２１）をコードし、およびａｄｅ２宿主細胞がアデニンの非存在下で成長するのを可能とする。メタノールの利用を最小化するのが望ましい大規模な工業的プロセスでは、双方のメタノール資化遺伝子（ＡＵＧ１およびＡＵＧ２）が欠失された宿主細胞を用いることができる。分泌された蛋白質の生産では、宿主細胞は空胞プロテアーゼ遺伝子（ＰＥＰ４およびＰＲＢ１）が欠乏し得る。エレクトロポレーションを用いて、注目するポリペプチドをコードするＤＮＡを含有するプラスミドのＰ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ細胞への導入を容易とする。Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ細胞は、２．５〜４．５ｋＶ／ｃｍ、好ましくは約３．７５ｋＶ／ｃｍの場強度、および１〜４０ミリ秒、最も好ましくは約２０ミリ秒の時定数（ｔ）を有する指数関数的に減衰するパルス電場を用いるエレクトロポレーションによって形質転換することができる。
【０１９３】
発現ベクターは植物プロトプラスト、無傷植物組織、または単離された植物細胞に導入することもできる。発現ベクターを植物組織に導入するための方法は、植物組織のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓでの直接的感染または共−培養、マイクロプロジェクタイル−媒介送達、ＤＮＡ感染、エレクトロポレーションなどを含む。例えば、Ｈｏｒｓｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７：１２２９，１９８５；Ｋｌｅｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：２６８，１９９２；ａｎｄ  Ｍｉｋｉら、“Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｆｏｒｅｉｎｇ  ＤＮＡ  ｉｎｔｏ  Ｐｌａｎｔｓ，”ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｌｉｃｋら（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  ６７−８８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３）参照。
【０１９４】
別法として、ｐＧ６ｂ遺伝子は原核生物宿主細胞において発現させることができる。原核生物宿主細胞においてｐＧ６ｂポリペプチドを発現するのに用いることができる好適なプロモーターは当業者によく知られており、Ｔ４、Ｔ３、Ｓｐ６およびＴ７ポリメラーゼを認識することができるプロモーター、バクテリオファージラムダのＰＲおよびＰＬプロモーター、ｔｒｐ、ｒｅｃＡ、熱ショック、ｌａｃＵＶ５、ｔａｃ、ｌｐｐ−ｌａｃＳｐｒ、ｐｈｏＡ、およびＥ．ｃｏｌｉのｌａｃＺプロモーター、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのプロモーター、Ｂａｃｉｌｌｕｓのバクテリオファージのプロモーター、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプロモーター、バクテリオファージラムダのｉｍｔプロモーター、ｐｂｒ３２２のｂｌａプロモーター、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモーターを含む。原核生物プロモーターはＧｌｉｃｋ，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：２７７（１９８７），Ｗａｔｓｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，４ｔｈ  Ｅｄ．（Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｃｕｍｍｉｎｓ  １９８７）によって、およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９５）によってレビューされている。
【０１９５】
好適な原核生物宿主はＥ．ｃｏｌｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｕｓを含む。Ｅ．ｃｏｌｉの好適な株はＢＬ２１（ＤＥ３），ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ，ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ，ＤＨ１，ＤＨ４Ｉ，ＤＨ５，ＤＨ５Ｉ，ＤＨ５ＩＭＣＲ，ＤＨ１０Ｂ，ＤＨ１０Ｂ／ｐ３，ＤＨ１１Ｓ，Ｃ６００，ＨＢ１０１，ＪＭ１０１，ＪＭ１０５，ＪＭ１０９，ＪＭ１１０，Ｋ３８，ＲＲ１，Ｙ１０８８，Ｙ１０８９，ＣＳＨ１８，ＥＲ１４５１，およびＥＲ１６４７（例えば、Ｂｒｏｗｎ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｆａｘ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）参照）を含む。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｕｓの好適な株はＢＲ１５１，ＹＢ８８６，ＭＩ１１９，ＭＩ１２０，およびＢ１７０（例えば、Ｈａｒｄｙ，“Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，”ｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｇｌｏｖｅｒ  （ｅｄ．）（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）参照）を含む。
【０１９６】
ｐＧ６ｂポリペプチドをＥ．ｃｏｌｉのような細菌において発現する場合、ポリペプチドは、典型的には、不溶性顆粒として細胞質に保持することができ、あるいは細菌分泌配列によってペリプラズム空間に向けることができる。前者の場合において、細胞は溶解され、顆粒は回収され、例えば、グアニジンイソチオシアネートまたは尿素を用いて変性する。次いで、変性されたポリペプチドを再度折畳み、尿素の溶液、および還元および酸化グルタチオンの組合せに対する透析、続いて、緩衝化生理食塩水に対する透析のような変性剤を希釈することによってダイマー化することができる。後者の場合、ポリペプチドは、（例えば、音波処理または浸透圧ショックによって）細胞を破壊して、ペリプラズム空間の内容物を放出し、蛋白質を回収し、それにより、変性および再折畳みに対する必要性を軽減することによって可溶性および機能性形態でペリプラズム空間から回収することができる。
【０１９７】
原核生物宿主において蛋白質を発現する方法は当業者に周知である（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ，“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｕｓｉｎｇ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”ｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｌｏｖｅｒら（ｅｄｓ．），ｐａｇｅ  １５（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５），Ｗａｒｄら、“Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅ  １３７（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５），ａｎｄ  Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，”ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｃｌｅｌａｎｄら（ｅｄｓ．），ｐａｇｅ  １０１（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９６）参照）。
【０１９８】
発現ベクターを細菌、酵母、昆虫および植物細胞に導入するための標準的方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）によって供される。
【０１９９】
哺乳動物細胞系によって生産された外来性蛋白質を発現し、および回収する一般的方法は、例えば、Ｅｔｃｈｅｖｅｒｒｙ，“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，”ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｃｌｅｌａｎｄら（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  １６３（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９６）によって供される。細菌系によって生産される蛋白質を回収するための標準的技術は、例えば、Ｇｒｉｓｓｈａｍｍｅｒら、“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｖｅｒ−ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃｅｌｌｓ，”ｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｌｏｖｅｒら（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  ５９−９２（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）によって供される。バキュロウイルス系から組換え蛋白質を単離するための確立された方法は、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ（ｅｄ．），Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）によって記載されている。
【０２００】
代替法として、本発明のポリペプチドは排除固相合成、部分的固相方法、断片凝縮または古典的な溶液合成によって合成することができる。これらの合成方法は、当業者に周知である（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９（１９６３），Ｓｔｅｗａｒｔら、“Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．１９８４），Ｂａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｒａｐｐ，Ｃｈｅｍ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．３：３（１９８６），Ａｔｈｅｒｔｏｎら、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９），Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｌｏｗｉｃｋ，“Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  ２８９（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７），ａｎｄ  Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９７）参照）。「天然化学連結」および「発現された蛋白質の連結」のような全化学的合成戦略の変形も標準的である（例えば、Ｄａｗｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７７６，１９９４；Ｈａｃｋｅｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：７８４５，１９９７；Ｄａｗｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２８７：３４，１９９７；Ｍｕｉｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：６７０５，１９９８；ａｎｄ  Ｓｅｖｅｒｉｎｏｖ  ａｎｄ  Ｍｕｉｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１６２０５，１９９８参照）。
【０２０１】
本発明のペプチドおよびポリペプチドは、配列番号２の少なくとも６つ、少なくとも９つ、または少なくとも１５連続アミノ酸残基を含む。例として、ポリペプチドは配列番号２の少なくとも６つ、少なくとも９つ、または少なくとも１５の連続アミノ酸残基を含むことができる。本発明の特定の実施形態内では、ポリペプチドはこれらのアミノ酸配列の２０、３０、４０、５０、１００以上の連続残基を含む。そのようなペプチドおよびポリペプチドをコードする核酸分子は、ポリメラーゼ鎖反応プライマーおよびプローブとして有用である。
【０２０２】
さらに、ｐＧ６ｂポリペプチドおよびその断片は、高等真核生物細胞内でモノマー、ホモダイマー、ヘテロダイマー、またはマルチマーとして発現させることができる。そのような細胞を用いて、少なくとも１つのｐＧ６ｂポリペプチドを含むｐＧ６ｂモノマー、ホモダイマー、ヘテロダイマーおよびマルチマー受容体ポリペプチド（「ｐＧ６ｂ−を含む受容体」または「ｐＧ６ｂ−を含む受容体ポリペプチド」）を生産することができ、あるいはスクリーニング系においてアッセイ細胞として用いることができる。本発明の１つの態様内で、ｐＧ６ｂ細胞外ドメインを含む本発明のポリペプチドは培養された細胞によって生産され、該細胞を用いて、天然カウンター受容体を含めた受容体に対するカウンター受容体、ならびに天然カウンター受容体のアゴニストおよびアンタゴニストについてスクリーニングする。該手法をまとめると、該受容体をコードするｃＤＮＡまたは遺伝子を、その発現に必要な他の遺伝子エレメント（例えば、転写プロモーター）と合わせ、得られた発現ベクターを宿主細胞に挿入する。ＤＮＡを発現し、および機能的受容体を生産する細胞を、種々のスクリーニング系内で選択し、用いる。モノマー、ホモダイマー、ヘテロダイマーおよびマルチマー受容体複合体の各成分を同一細胞において発現させることができる。さらに、モノマー、ホモダイマー、ヘテロダイマーおよびマルチマー受容体複合体の成分を膜貫通ドメインまたは他の膜融合部位に融合させて、上述したように複合体組み立ておよびトランスフェクタントのスクリーニングを可能とすることもできる。
【０２０３】
本発明のｐＧ６ｂアゴニストおよび／またはアンタゴニストポリペプチドおよび抗体をアッセイするためには、ｐＧ６ｂ−を含む受容体を発現させ、および受容体−媒介シグナルを変換するのに用いるのに好適な哺乳動物細胞は、ｐＧ６ｂ（またはｐＧ６ｂＲＡ）とで機能的複合体を形成することができる他の受容体サブユニットを発現する細胞を含む。好ましい実施形態内で、細胞は、その増殖についての外来的に供給された造血成長因子に依存する。このタイプの好ましい細胞系はヒトＴＦ−１細胞系（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２００３）およびＡＭＬ−１９３細胞系（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−９５８９）であり、これらはＧＭ−ＣＳＦ−依存性ヒト白血病細胞、およびＩＬ−３依存性ネズミｐｒｅ−Ｂ細胞系であるＢａＦ３（Ｐａｌａｃｉｏｓ  ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ，Ｃｅｌｌ  ４１：７２７−７３４，１９８５）である。他の細胞系はＢＨＫ，ＣＯＳ−１，およびＣＨＯ細胞を含む。好適な宿主細胞を作製して、所望の細胞応答に必要とされる必要な受容体サブユニットまたは他の細胞成分を生産することができる。この手法は有利である。なぜならば、細胞系を作製して、いずれかの種から受容体サブユニットを発現することができ、それにより、主特異性から生じる潜在的な制限を克服する。ヒト受容体ｃＤＮＡの種オルソログをクローン化し、ＢａＦ３細胞系におけるマウスｃＤＮＡのような同一種からの細胞系内で用いることができる。
【０２０４】
機能的受容体を発現する細胞はスクリーニングアッセイ内で用いる。種々の好適なアッセイは当該分野で知られている。これらのアッセイは、標的細胞における生物学的応答の検出に基づく。１つのそのようなアッセイは細胞増殖アッセイである。細胞はテスト化合物の存在下または非存在下で培養し、細胞増殖は、例えば、滴定されたチミジンの取込みを測定することによって、または臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）の代謝分解に基づく比色アッセイによって検出される（Ｍｏｓｍａｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６５：５５−６３，（１９８３））。代替アッセイ様式は、さらにレポーター遺伝子を発現するように作製された細胞を用いる。レポーター遺伝子は受容体−連結経路に対して応答的であるプロモーターエレメントに連結され、および該アッセイはレポーター遺伝子の転写の活性化を検出する。この点に関して好ましいプロモーターエレメントは血清応答エレメントまたはＳＲＥである。例えば、Ｓｈａｗら、Ｃｅｌｌ  ５６：５６３−５７２，１９８９参照。好ましいそのようなレポーター遺伝子はルシフェラーゼ遺伝子（ｄｅ  Ｗｅｔら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：７２５，１９８７）である。ルシフェラーゼ遺伝子の発現は、当該分野で公知の方法を用いてルミネセンスによって検出される（例えば、Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２９０９４−２９１０１，１９９４；Ｓｃｈｅｎｂｏｒｎ  ａｎｄ  Ｇｏｉｆｆｉｎ，Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｎｏｔｅｓ  ４１：１１，１９９３）。ルシフェラーゼ活性アッセイキットは、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから商業的に入手可能である。このタイプの標的細胞系を用いて、化学物質のライブラリー、細胞−条件培養基、真菌ブロス、土壌試料、水試料等をスクリーニングすることができる。例えば、細胞−条件培地中倍致死量のバンクを標的細胞についてアッセイして、カウンター受容体を生産する細胞を同定することができる。次いで、陽性細胞を用いて、哺乳動物発現ベクター中にｃＤＮＡライブラリーを生じさせ、これをプールに分割し、宿主細胞にトランスフェクトし、発現させる。次いで、トランスフェクトされた細胞からの培地試料をアッセイし、引き続いてプールを分割し、再度トランスフェクションし、継代培養し、および陽性細胞を再度アッセイして、カウンター受容体をコードするクローン化ｃＤＮＡを単離する。
【０２０５】
いくつかのｐＧ６ｂ応答性細胞系は当該分野で知られているか、あるいは構築することができる。例えば、Ｂａｆ３／ＤＩＲＳ１／ｃｙｔｏＲ１１細胞系（ＷＩＰＯ公開番号ＷＯ  ０２／０７２６０７）。さらに、いくつかのＩＬ−２２応答細胞は知られており（Ｄｕｍｏｎｔｉｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１８１４−１８１９，２０００；Ｄｕｍｏｕｔｉｅｒ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．９７：１０１４４−１０１４９，２０００；Ｘｉｅ  ＭＨら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３１３３５−３１３３９，２０００；Ｋｏｔｅｎｋｏ  ＳＶら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２７２５−２７３２，２００１）、ならびにＩＬ−２２受容体サブユニットｐＧ６ｂを発現するものが知られている。例えば、以下の細胞はＩＬ−２２に応答性である：ＴＫ−１０（Ｘｉｅ  ＭＨら、ｓｕｐｒａ）（ヒト腎臓癌腫）；ＳＷ４８０（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２２８）（ヒト結腸腺癌）；ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−８０６５）（ヒト肝臓腫）；ＰＣ１２（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１７２１）（ネズミニューロン細胞モデル；ラット褐色細胞腫）；およびＭＥＳ１３（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１９２７）（ネズミ腎臓メサンギウム細胞系）。加えて、ｐＧ６ｂ（ＩＬ−２２受容体）を発現するいくつかの細胞系もまた、ＩＬ−２２に対する応答性細胞系の候補である：Ａ５４９（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１８５）（ヒト胚癌腫）；Ｇ−３６１（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１４２４）（ヒトメラノーマ）；およびＣａｋｉ−１（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−４６）（ヒト腎臓癌腫）。加えて、ＩＬ−２２−応答性細胞系を構築することができる。例えば、本明細書中に記載されたＢａｆ３／ｃｙｔｏＲ１１／ＣＲＦ２−４細胞系（ＷＩＰＯ公開番号ＷＯ  ０２／１２３４５）。これらの細胞をアッセイで用いて、ｐＧ６ｂまたはＩＬ−２２アンタゴニストまたは抗−炎症因子としてのｐＧ６ｂの機能性を評価することができる。
【０２０６】
６．ｐＧ６ｂ融合蛋白質およびコンジュゲートの生産
ｐＧ６ｂ類似体の１つの一般的なクラスは、本明細書中に開示されたアミノ酸配列の突然変異であるアミノ酸配列を有する変種である。ｐＧ６ｂ類似体のもう１つの一般的クラスは、以下に記載された、抗−イディオタイプ抗体およびその断片によって供される。さらに、抗−イディオタイプ可変ドメインを含む組換え抗体は類似体として用いることができる（例えば、Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉら、Ｐｒｏｃ．Ａｓｓｏｃ．Ａｍ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  １０８：４２０，１９９６）。抗−イディオタイプｐＧ６ｂ抗体の可変ドメインはｐＧ６ｂを模倣するので、これらのドメインはｐＧ６ｂ結合活性を供することができる。抗−イディオタイプ触媒抗体の方法は当業者に知られている（例えば、Ｊｏｒｏｎら、Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６７２：２１６，１９９２；Ｆｒｉｂｏｕｌｅｔら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４７：２２９，１９９４；ａｎｄ  Ａｖａｌｌｅら、Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６４：１１８，１９９８参照）。
【０２０７】
ｐＧ６ｂ類似体を同定するためのもう１つの手法は、コンビナトーリアルライブラリーの使用によって供される。ファージディスプレイおよび他のコンビナトーリアルライブラリーを構築し、スクリーニングする方法は、例えば、Ｋａｙら、Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９６），Ｖｅｒｄｉｎｅ，米国特許第５，７８３，３８４号，Ｋａｙ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，７４７，３３４号，ａｎｄ  Ｋａｕｆｆｍａｎら、米国特許第５，７２３，３２３号によって供される。
【０２０８】
ｐＧ６ｂポリペプチドはインビボおよびインビトロ双方の用途を有する。例として、ｐＧ６ｂの可溶性形態を細胞培養基に加えて、培養した細胞によって生産されたｐＧｔ６ｂカウンター受容体の効果を阻害することができる。
【０２０９】
ｐＧ６ｂの融合蛋白質を用いて、組換え宿主においてｐＧ６ｂを発現させ、および生産されたｐＧ６ｂを単離することができる。以下に記載するように、特定のｐＧ６ｂ融合蛋白質もまた、診断および治療において用途を有する。融合蛋白質の１つのタイプは組換え宿主細胞からのｐＧ６ｂポリペプチドをガイドするポリペプチドを含む。ｐＧ６ｂポリペプチドを、真核生物宿主細胞の分泌経路に向けるためには、（シグナルペプチド、リーダー配列、プレプロ配列またはプレ配列としても知られた）分泌シグナル配列をｐＧ６ｂ発現ベクター中に供する。分泌シグナル配列がｐＧ６ｂから誘導できる場合、好適なシグナル配列もまた、もう１つの分泌蛋白質から誘導してもよく、デ・ノボ合成してもよい。分泌シグナル配列は、２つの配列が正しいリーディングフレームにて連結され、位置させて、新しく合成されたポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に向けるように、ｐＧ６ｂ−コーディング配列に操作可能に連結される。分泌シグナル配列は、通常、注目するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して５’側に位置させるが、ある種の分泌シグナル配列は注目するヌクレオチド配列中の他の箇所に位置させてもよい（例えば、Ｗｅｌｃｈら、米国特許第５，０３７，７４３号；Ｈｏｌｌａｎｄら、米国特許第５，１４３，８３０号参照）。
【０２１０】
ｐＧ６ｂ、または哺乳動物細胞によって生産されたもう１つの蛋白質の分泌シグナル配列（例えば、米国特許第５，６４１，６５５号に記載された組織−タイププラスミノーゲンアクチベーターのシグナル配列）は組換え哺乳動物宿主におけるｐＧ６ｂの発現で有用であるが、酵母シグナル配列が酵母細胞における発現では好ましい。好適な酵母シグナル配列の例は、（ＮＦα１遺伝子によってコードされた）酵母接合フェロモンα−因子、（ＳＵＣ２遺伝子によってコードされた）インベルターゼ、または（ＰＨＯ５遺伝子によってコードされた）酸ホスファターゼから由来するものである。例えば、Ｒｏｍａｎｏｓら、“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ，”ｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｌｏｖｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｍｅｓ  （ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  １２３−１６７（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）参照。
【０２１１】
ｐＧ６ｂ可溶性ポリペプチドは、細胞外ドメイン、例えば、配列番号２を含有するポリペプチド、または非−ヒト受容体の対応する領域をコードする切形ＤＮＡを発現させることによって調製することができる。細胞外ドメインポリペプチドは、膜貫通および細胞内ポリペプチドセグメントを実質的に含まない形態にて調製される。宿主細胞からの受容体ドメインの輸出を指令するためには、受容体ＤＮＡを、ｔ−ＰＡ分泌ペプチドのような分泌ペプチドをコードする第二のＤＮＡセグメントに連結する。分泌した受容体ドメインの精製を容易とするためには、ポリ−ヒスチジン標識、サブスタンスＰ、ＦｌａｇＴＭ  ペプチド（Ｈｏｐｐら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４−１２１０，（１９８８）；Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴから入手可能）のようなＣ−末端延長、あるいは抗体またはもう１つの特異的結合剤がそれについて入手可能なもう１つのポリペプチドまたは蛋白質を受容体ポリペプチドに融合することができる。さらに、細胞外サイトカイン結合ドメインからのｐＧ６ｂ抗原エピトープもまた上述したように調製される。
【０２１２】
代替手法において、ｐＧ６ｂの受容体細胞外ドメイン、または他のＢ７受容体成分は、免疫グロブリン重鎖定常領域との融合、典型的には、２つの定常領域ドメインおよびヒンジ領域を含有するが、可変領域を欠如するＦｃ断片として発現させることができる（Ｓｌｅｄｚｉｅｗｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，０１８，０２６号および第５，７５０，３７５号参照）。本発明の可溶性ｐＧ６ｂポリペプチドは、そのような融合を含む。そのような融合は、典型的には、マルチマー分子として分泌され、ここに、Ｆｃ部分は相互に結合したジスルヒドであって、２つの受容体ポリペプチドは相互に密接に近接して配置される。このタイプの融合を用いて、カウンター受容体を特異的に滴定することによってインビトロにてシグナルをブロックし、阻害し、または低下させるためのインビトロアッセイツールとして、および循環カウンター受容体に結合し、それを循環から除去するためにそれらを非経口投与することによるインビボアンタゴニストとして、溶液からの同族カウンター受容体をアフィニティー精製することができる。カウンター受容体を精製するためには、ｐＧ６ｂ−Ｉｇキメラを、受容体−カウンター受容体結合を容易とする条件（典型的には、生理学的に近い温度、ｐＨ、およびイオン強度）下で、カウンター受容体を含有する試料（例えば、細胞−条件培養基または組織抽出物）に加える。次いで、キメラ−カウンター受容体複合体を、固体支持体（例えば、不溶性樹脂ビーズ）に固定化されたプロテインＡを用いて混合物によって分離する。次いで、塩またはｐＨグラジエントによる等して、慣用的な化学技術を用いてカウンター受容体を溶出させる。別法として、キメラ自体を固体支持体に結合させることができ、上述したように結合および溶出を行う。キメラをインビボで用いて、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、Ｃ−反応性蛋白質（ＣＲＰ）のような急性相応答を含めた、炎症応答を調節することができる。高い結合親和性を持つキメラは、（例えば、筋肉内、皮下または静脈注射によって）非経口投与される。循環分子はカウンター受容体に結合し、通常の生理学的プロセスによって循環から除去される。アッセイで用いるためには、キメラはＦｃ領域を介して支持体に結合させ、ＥＬＩＳＡ様式で用いる。
【０２１３】
本発明の抗−ｐＧ６ｂおよび結合パートナーを単離するのを助けるために、カウンター受容体−結合受容体（または抗体、相補体／抗−相補体対の１つのメンバー）、またはその結合断片、および商業的に入手可能なバイオセンサー機器（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いるアッセイシステムを有利に使用することができる。そのような受容体、抗体、相補体／抗−相補体対のメンバー、または断片は受容体チップの表面に固定化される。この機器の使用はＫａｒｌｓｓｏｎ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １４５：２２９−４０，１９９１）およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３４：５５４−６３，１９９３）によって開示されている。受容体、抗体、メンバーまたは断片は、アミンまたはスルフヒドリル化学を用いて、フローセル内の金フィルムに付着されたデキストラン繊維に共有結合させる。テスト試料は該セルを通す。もしカウンター受容体、エピトープ、または相補体／抗−相補体対の反対メンバーが試料中に存在すれば、それは、各々、固定された受容体、抗体またはメンバーに結合し、媒体の屈折率の変化を引き起こし、これは金フィルムの表面プラズモン共鳴の変化として検出される。このシステムはオン−およびオフ−率の決定を可能とし、それから、結合親和性を計算することができ、および結合の化学量論の評価を可能とする。別法として、カウンター受容体／受容体結合は、ＳＥＬＤＩ（ＴＭ）技術（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて解析することができる。さらに、上述したＢＩＡＣＯＲＥ技術を用いて、競合実験で用いて、異なるモノクローナル抗体がｐＧ６ｂポリペプチド上の同一または異なるエピトープに結合するかを決定することができ、およびそれ自体を用いて、本発明の抗体のエピトープマッピングを助けることができる。
【０２１４】
カウンター受容体−結合受容体ポリペプチドは、当該分野で知られた他のアッセイシステム内で用いることもできる。そのようなシステムは、結合親和性の決定のためのスキャッチャード解析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０−７２，１９４９参照）、および比色アッセイ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：５４５−４８，１９９１；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５：８２１−２５，１９９１）を含む。
【０２１５】
本発明は、さらに、種々の他のポリペプチド融合、および１つ以上のポリペプチド融合を含む関連マルチマー蛋白質を提供する。例えば、可溶性ｐＧ６ｂ受容体は、米国特許第５，１，５５，０２７号および第５，５６７，５８４号に開示されたように二量体化蛋白質への融合として調製することができる。この点に関して好ましい二量体化蛋白質は免疫グロブリン定常領域ドメイン、例えば、ＩｇＧγ１、およびヒトκ軽鎖を含む。免疫グロブリン−可溶性ｐＧ６ｂ融合は、遺伝子工学により作成された細胞において発現させて、種々のマルチマーｐＧ６ｂ受容体類似体を生産することができる。補助的ドメインを可溶性ｐＧ６ｂ受容体に融合させて、それらを特異的細胞、組織、またはマクロ分子（例えば、コラーゲン、またはｐＧ６ｂカウンター受容体を発現する細胞）に標的化することができる。ｐＧ６ｂポリペプチドは、精製のためのアフィニティー標識、および標的化ドメインのような２つ以上の部位に融合することができる。ポリペプチド融合は、特にドメインの間の１つ以上の切断部位を含むことができる。Ｔｕａｎら、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３４：１−９，１９９６参照。
【０２１６】
細菌細胞においては、異種蛋白質を融合蛋白質として発現させて、毒性を減少させて、安定性を増加させ、および発現された蛋白質の回収を高めるのがしばしば望ましい。例えば、ｐＧ６ｂは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼポリペプチドを含む融合蛋白質として発現することができる。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合蛋白質は、典型的には、可溶性であって、固定化グルタチオンカラム上のＥ．ｃｏｌｉ溶解物から容易に精製できる。同様な手法において、マルトース結合蛋白質ポリペプチドを含むｐＧ６ｂ融合蛋白質はアミロース樹脂カラムで単離することができ、他方、切形されたプロテインＡ遺伝子のＣ−末端を含む融合蛋白質は、ＩｇＧ−セファロースを用いて精製することができる。細菌細胞において融合蛋白質として異種ポリペプチドを発現させるための確立された技術は、例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓら、“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｏｒｅｉｇｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”  ｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｌｏｖｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｍｅｓ（Ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  １５−５８（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）によって記載されている。加えて、商業的に入手可能な発現系が利用できる。例えば、ＰＩＮＰＯＩＮＴ  Ｘａ蛋白質精製系（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）は、アビジンを含む樹脂での発現の間にビオチニル化するようになるポリペプチドを含む融合蛋白質を単離する方法を提供する。
【０２１７】
原核生物または真核生物細胞によって発現された異種ポリペプチドを単利するのに有用なペプチド標識は、（ニッケル−キレーティング樹脂に対して神話性を有する）ポリヒスチジン標識、ｃ−ｍｙｃ標識、（カルモジュリンアフィニティークロマトグラフィーで単離された）カルモジュリン結合蛋白質、サブスタンスＰ、（抗−ＲＹＩＲＳ抗体と結合する）ＰＹＩＲＳ標識、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ標識、および（抗−ＦＬＡＧ抗体と結合する）ＦＬＡＧ標識を含む。例えば、Ｌｕｏら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３２９：２１５，１９９６；Ｍｏｒｇａｎｔｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３：６７，１９９６，ａｎｄ  Ｚｈｅｎｇら、Ｇｅｎｅ  １８６：５５，１９９７参照。そのようなペプチド標識をコードする核酸分子は、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手可能である。
【０２１８】
融合蛋白質のもう１つの形態は、ｐＧ６ｂポリペプチド、および免疫グロブリン重鎖定常領域、典型的には、２または３の定常領域ドメインおよびヒンジ領域を含有するが、可変領域を欠如するＦｃ断片を含む。その例として、Ｃｈａｎｇら、米国特許第５，７２３，１２５号は、ヒトインターフェロンおよびヒト免疫グロブリンＦｃ断片を含む融合蛋白質を記載する。インターフェロンのＣ−末端は、ペプチドリンカー部位によってＦｃ断片のＮ−末端に連結される。ペプチドリンカーの例は、主として、免疫学的に不活性なＴ細胞不活性配列を含むペプチドである。この融合蛋白質においては、例示的なＦｃ部位は、溶液中で安定であって、補体活性化活性をほとんどまたは全く有しないヒトγ４鎖である。従って、本発明では、ｐＧ６ｂ部位およびヒトＦｃ断片を含むｐＧ６ｂ融合蛋白質が考えられ、ここに、ｐＧ６ｂ部位のＣ−末端はペプチドリンカーを介してＦｃ断片のＮ−末端に結合している。ｐＧ６ｂ部位はｐＧ６ｂ分子またはその断片であり得る。例えば、融合蛋白質は配列番号３のアミノ酸およびＦｃ断片（例えば、ヒトＦｃ断片）を含むことができる。
【０２１９】
もう１つの変形において、ｐＧ６ｂ融合蛋白質は、ＩｇＧ配列、該ＩｇＧ配列のアミノ末端に共有結合したｐＧ６ｂ部位、および該ｐＧ６ｂ部位のアミノ末端に共有結合したシグナルペプチドを含み、ここに、該ＩｇＧ配列は以下の順序の以下のエレメント：ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインよりなる。従って、ＩｇＧ配列はＣＨ１ドメインを欠如する。ｐＧ６ｂ部位は、ｐＧ６ｂカウンター受容体と結合する能力のような、本明細書中に記載された、ｐＧ６ｂ活性を呈する。抗体および非抗体部分双方を含む融合蛋白質を生産するこの一般的手法は、ＬａＲｏｃｈｅｌｌｅら、ＥＰ７４２８３０（ＷＯ  ９５／２１２５８）によって記載されている。
【０２２０】
ｐＧ６ｂ部位およびＦｃ部位を含む融合蛋白質は、例えば、インビトロアッセイツールとして用いることができる、例えば、生物学的試料中のｐＧ６ｂカウンター受容体の存在は、ｐＧ６ｂ−免疫グロブリン融合蛋白質を用いて検出することができ、そこでは、ｐＧ６ｂ部位を用いてカウンター受容体に結合させ、プロテインＡまたは抗−Ｆｃ抗体のようなマクロ分子を用いて、融合蛋白質を固体支持体に結合させる。そのような系を用いて、ｐＧ６ｂのそのカウンター受容体への結合に干渉するアゴニストおよびアンタゴニストを同定することができる。
【０２２１】
抗体融合蛋白質の多の例は、抗原−結合ドメイン、およびｐＧ６ｂ細胞外ドメインを含有するｐＧ６ｂ断片を含むポリペプチドを含む。そのような分子を用いて、ｐＧ６ｂ結合活性の利点のために特別な組織を標的化することができる。
【０２２２】
本発明は、さらに、種々の他のポリペプチド融合を提供する。例えば、生物学的機能を付与するドメインの一部または全てを、本発明のｐＧ６ｂと、サイトカイン受容体ファミリーのもう１つのメンバーからの機能的に同等なドメインとの間で交換することができる。ポリペプチド融合は組換え宿主細胞において発現させて、種々のｐＧ６ｂ融合類似体を生産することができる。ｐＧ６ｂポリペプチドは、精製のためのアフィニティー標識および標的化ドメインのような２つ以上の部位またはドメインに融合させることができる。ポリペプチド融合は、特に、ドメインの間に１つ以上の切断部位を含むこともできる。例えば、Ｔｕａｎら、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３４：１，１９９６参照。
【０２２３】
融合蛋白質は、融合蛋白質の各成分を調製し、それらを化学的にコンジュゲートすることによって当業者に知られた方法によって調製することができる。別法として、好適なリーディングフレームにおいて融合蛋白質の双方の成分をコードするポリヌクレオチドは、公知の技術を用いて作成し、本明細書中に記載された方法によって発現させることができる。融合蛋白質の酵素的および化学的切断のための一般的方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）  ａｔ  ｐａｇｅｓ１６−１９  ｔｏ  １６−２５によって記載されている。
【０２２４】
ｐＧ６ｂ結合ドメインは、さらに、ｐＧ６ｂカウンター受容体アゴニストの推定定常部位アミノ酸の突然変異と組み合わせて、核磁気共鳴、結晶学、電子回折または光親和性標識のような技術によって測定して、構造の物理的解析によって特徴付けることができる。ｄｅ  Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６，１９９２；Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９，１９９２；ａｎｄ  Ｗｌｏｄａｖｅｒら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０９：５９，１９９２参照。
【０２２５】
本発明では、ｐＧ６ｂポリペプチドがポリマーで連結された化学的に修飾されたｐＧ６ｂ組成物も考えられる。例示的なｐＧ６ｂポリペプチドは、アミノ酸残基配列番号３よりなるポリペプチドのような、機能的膜貫通ドメインを欠如する可溶性ポリペプチドである。典型的には、該ポリマーは、ｐＧ６ｂコンジュゲートが生理学的環境のような水性環境に参画しないように水溶性である。好適なポリマーの例は、アシル化のための活性エステル、またはアルキル化のためのアルデヒドのような単一反応性基を有するように修飾されているものである。このように、重合の程度を制御することができる。反応性アルデヒドの例はポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、またはモノ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ、またはそのアリールオキシ誘導体である（例えば、Ｈａｒｒｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，２５２，７１４号参照）。ポリマーは分岐していてもまたは分岐していなくてもよい。さらに、ポリマーの混合物を用いて、ｐＧ６ｂコンジュゲートを生産することができる。
【０２２６】
療法で用いるｐＧ６ｂコンジュゲートは、医薬上許容される水溶性ポリマー部位を含むことができる。好適な水溶性ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシ−ＰＲＧ、モノ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−ＰＥＧ、アリールオキシ−ＰＥＧ、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ＰＥＧ、トレキシルブチルメトキシＰＥＧ、ＰＥＧプロピオンアルデヒド、ビス−スクシンイミジルカルボネートＰＥＧ、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキサイド／エチレンオキサイドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、デキストラン、セルロース、または他の炭水化物−ベースのポリマーを含む。好適なＰＥＧは、例えば、５，０００、１２，０００、２０，０００および２５，０００を含めた、約６００〜約６０，０００の分子量を有することができる。ｐＧ６ｂコンジュゲートはそのような水溶性ポリマーの混合物を含むことができる。
【０２２７】
ｐＧ６ｂコンジュゲートの１つの例はｐＧ６ｂ部位、および該ｐＧ６ｂ部位のＮ−末端に結合したポリアルキルオキサイド部位を含む。ＰＥＧは１つの好適なポリアルキルオキサイドである。その例として、ｐＧ６ｂはＰＥＧで修飾することができる。「ＰＥＧ化」として知られたプロセスである。ｐＧ６ｂのＰＥＧ化は、当該分野で知られたＰＥＧ化反応のいずれかによって行うことができる（例えば、ＥＰ  ０  １５４  ３１６，Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ９：２４９（１９９２），Ｄｕｎｃａｎ  ａｎｄ  Ｓｐｒｅａｆｉｃｏ，Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．２７：２９０（１９９４），およびＦｒａｎｃｉｓら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ６８：１（１９９８）参照）。例えば、ＰＥＧ化は、アシル化反応によって、または反応性ポリエチレングリコール分子とのアルキル化反応によって行うことができる。別の手法において、ｐＧ６ｂコンジュゲートは活性化されたＰＥＧを縮合することによって形成され、そこでは、ＰＥＧの末端ヒドロキシまたはアミノ基は活性化されたリンカーによって置き換えられている（例えば、Ｋａｒａｓｉｅｗｉｃｚら、米国特許第５，３８２，６５７号参照）。
【０２２８】
アシル化によるＰＥＧ化は、典型的には、ＰＥＧの活性エステル誘導体をｐＧ６ｂポリペプチドと反応させることができることを必要とする。活性化されたＰＥＧエステルの例は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドにエステル化されたＰＥＧである。本明細書中で用いるとき、用語「アシル化」は、ｐＧ６ｂおよび水溶性ポリマーの間の結合の以下のタイプを含む：アミド、アルバメート、ウレタン等。アシル化によってＰＥＧ化ｐＧ６ｂを調製するための方法は、典型的には、（ａ）ｐＧ６ｂポリペプチドを、１つ以上のＰＥＧ基がｐＧ６ｂに結合する条件下で、（ＰＥＧのアルデヒド誘導体の反応性エステルのような）ＰＥＧと反応させ、次いで、（ｂ）反応産物を得る工程を含む。一般には、アシル化反応のための最適な反応条件は、公知のパラメーターおよび所望の結果に基づいて決定される。例えば、ＰＥＧ：ｐＧ６ｂの比率がより大きければ、ポリＰＥＧ化ｐＧ６ｂ産物の割合は大きくなる。
【０２２９】
アシル化によるＰＥＧ化の産物は、典型的には、ポリＰＥＧ化ｐＧ６ｂ産物であり、ここに、リシンε−アミノ基はアシル連結基を介してＰＥＧ化されている。連結結合の例はアミドである。典型的には、得られたｐＧ６ｂは少なくとも９５％モノ−、ジ−、またはトリ−ＰＥＧ化されているが、より高い程度のＰＥＧ化を持ついくつかの種が反応条件に依存して形成できる。ＰＥＧ化種は、透析、限外濾過、イオン交換クロマトフラフィー、アフィニティークロマトフラフィー等のような標準的精製方法を用いてコンジュゲートされていないｐＧ６ｂポリペプチドから分離することができる。
【０２３０】
アルキル化によるＰＥＧ化は、一般には、還元剤の非存在下でＰＥＧの末端アルデヒド誘導体をｐＧ６ｂと反応させることができることを含む。ＰＥＧ基は、−ＣＨ２−ＮＨ基を介してポリペプチドに結合させることができる。
【０２３１】
さらに、本発明の抗−ｐＧ６ｂ抗体または抗体断片は、当該分野における、および本明細書中に記載された方法を用いてＰＥＧ化することができる。
【０２３２】
モノＰＥＧ化産物を生産するための還元的アルキル化を介する誘導体化は、誘導体化で利用できる異なるタイプの第一級アミノ基の異なる反応性を利用する。典型的には、反応は、リシン残基のε−アミノ基および蛋白質のＮ−末端残基のα−アミノ基の間のｐＫａ差を利用するのを可能とするｐＨで行う。そのような選択的誘導体化によって、アルデヒドのような反応性基を含有する水溶性ポリマーの蛋白質への結合が制御される。ポリマーとのコンジュゲーションは、リシン側鎖アミノ基のような他の反応性基の有意な修飾なくして蛋白質のＮ−末端において圧倒的に起こる。本発明は、ｐＧ６ｂモノポリマーコンジュゲートの実質的に均一な調製を提供する。
【０２３３】
モノポリマーｐＧ６ｂコンジュゲート分子の実質的に均一な集団を生産するための還元的アルキル化は：（ａ）ｐＧ６ｂのアミノ末端におけるα−アミノ基の選択的修飾を可能とするのに好適なｐＨにおける還元的アルキル化条件下でｐＧ６ｂポリペプチドを反応性ＰＥＧと反応させ、次いで、（ｂ）反応産物を得る工程を含むことができる。還元的アルキル化で用いる還元剤は水溶液中で安定であって、還元的アルキル化の最初のプロセスで形成されたシッフ塩基のみを還元できるべきである。例示的な還元剤はホウ水素化ナトリウム、シアノホウ水素化ナトリウム、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボラン、およびピリジンボランを含む。
【０２３４】
モノポリマーｐＧ６ｂコンジュゲートの実質的に均一な集団では、還元的アルキル化反応条件は、水溶性ポリマー部位のｐＧ６ｂのＮ−末端への選択的結合を可能とするものである。そのような反応条件は、一般には、リシンアミノ基およびＮ−末端におけるα−アミノ基の間のｐＫａの差を供する。ｐＨは用いるべき蛋白質に対するポリマーの比率にも影響する。一般には、ｐＨがより低ければ、蛋白質に対するかなり過剰のポリマーが望ましい。なぜならば、Ｎ−末端α−基の反応性がより低ければ、より多くのモノマーが最適な条件を達成するのに必要だからである。もしｐＨがより高ければ、ポリマー：ｐＧ６ｂは大きい必要はない。なぜならば、より反応性の基が利用できるからである。典型的には、ｐＨは３〜９、または３〜６の範囲内に入る。この方法は、ｐＧ６ｂ−を含むホモダイマー、ヘテロダイマー、またはマルチマー可溶性受容体コンジュゲートを作製するために使用することができる。
【０２３５】
考慮すべきもう１つの因子は、水溶性ポリマーの分子量である。一般には、ポリマーの分子量がより高ければ、蛋白質に結合させることができるポリマー分子の数はより少ない。ＰＥＧ化反応では、典型的な分子量は約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、または約１２ｋＤａ〜約２５ｋＤａである。ｐＧ６ｂに対する水溶性ポリマーのモル比率は、一般には、１：１〜１００：１の範囲にあるであろう。典型的には、ｐＧ６ｂに対する水溶性ポリマーのモル比率は、ポリＰＥＧ化については１：１〜２０：１、およびモノＰＥＧ化では１：１〜５：１である。
【０２３６】
ポリペプチドおよび水溶性ポリマー部位を含むコンジュゲートを生産するための一般的方法は当該分野で知られている。例えば、Ｋａｒａｓｉｅｗｉｃｚら、米国特許第５，７３８，８４６号，Ｎｉｅｆｏｒｔｈら、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．５９：６３６（１９９６），Ｍｏｎｋａｒｓｈら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４７：４３４（１９９７）参照。この方法は、ｐＧ６ｂ−を含むホモダイマー、ヘテロダイマー、またはマルチマー可溶性受容体コンジュゲートを作成するのに使用することができる。
【０２３７】
本発明では、本明細書中に記載された可溶性受容体または抗体のようなペプチドまたはポリペプチドを含む組成物が考えられる。そのような組成物は、さらに、担体を含むことができる。担体は慣用的な有機または無機担体であり得る。担体の例は水、緩衝溶液、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油等を含む。
【０２３８】
７．ｐＧ６ｂポリペプチドの単離
本発明のポリペプチドは、汚染マクロ分子、特に他の蛋白質および核酸に対して少なくとも約８０％純度まで、少なくとも約９０％純度まで、少なくとも約９５％純度まで、あるいは９６％、９７％、９８％のような９５％を超える純度まで、または９９％を超える純度まで、かつ感染剤およびパイロジェン剤を含まないまで精製することができる。本発明のポリペプチドは、９９．９％純度を超える医薬的に純粋な状態まで精製することもできる。ある調製においては、精製されたポリペプチドは他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に含まない。
【０２３９】
分画および／または慣用的な精製方法を用いて、天然源（例えば、ヒト組織源）から精製されたｐＧ６ｂ、合成ｐＧ６ｂポリペプチド、および組換えｐＧ６ｂポリペプチド、および組換え宿主細胞から精製された融合ｐＧ６ｂポリペプチドを得ることができる。一般に、硫酸アンモニウム沈殿、および酸またはカオトロープ抽出を試料の分画で用いることができる。例示的な精製工程はヒドロキシアパタイト、サイズ排除、ＦＰＬＣおよび逆相高速液体クロマトグラフィーを含むことができる。そのようなクロマトフラフィー媒体は誘導体化されたデキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、特殊シリカ等を含む。ＰＥＩ，ＤＥＡＥ，ＱＡＥおよびＱ誘導体が好適である。例示的なクロマトフラフィー媒体は、フェニル−セファロースフェニルＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌブチル６５０ブチル（Ｔｏｓｏ  Ｈａａｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）、オクチル−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等のような、またはオクチル基で誘導体化した媒体；またはＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍ  ＣＧ７１（Ｔｏｓｏ  Ｈａａｓ）等のようなポリアクリル樹脂を含む。好適な固体支持体は、用いられる条件下で不溶性であるガラスビーズ、シリカ−ベースの樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋されたアガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋されたポリアクリルアミド樹脂等を含む。これらの支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルヒドロリキ、ヒドリルキおよび／または炭水化物部位による蛋白質の結合を可能とする反応性基で修飾することができる。
【０２４０】
カップリング化学の例は臭化シアン活性化、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド活性化、およびカルボジイミドカップリング化学のためのカルボキシルおよびアミノ誘導体を含む。これらの、および他の固体媒体はよく知られており、かつ当該分野で広く用いられており、商業的供給業者から入手可能である。ポリペプチドの単離および精製のための特別な方法の選択はルーチン的な設計事項であって、選択された支持体の特性によって部分的には決定される。例えば、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍｏｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ＆  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９８８）およびＤｏｏｎａｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  １９９６）参照。
【０２４１】
ｐＧ６ｂの単離および精製におけるさらなる変形は、当業者が工夫することができる。例えば、以下に記載するようにして得られた抗−ｐＧ６ｂ抗体を用いて、イムノアフィニティー精製によって多量の蛋白質を単離することができる。
【０２４２】
本発明のポリペプチドは、特定の性質の開発によって単離することもできる。例えば、固定化金属イオン吸着（ＩＭＡＣ）クロマトフラフィーを用いて、ポリヒスチジン標識を含むものを含めた、ヒスチジンがリッチな蛋白質を精製することができる。簡単に述べれば、ゲルを、まず、二価金属イオン荷電して、キレートを形成させる（Ｓｕｌｋｏｗｓｋｉ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．３：１，１９８５）。ヒスチジンがリッチな蛋白質は、用いる金属イオンに依存して、異なる親和性でもってこのマトリックスに吸着され、競合的溶出、ｐＨの降下、または強力なキレート化剤の使用によって溶出される。精製の他の方法は、レクチンアフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトフラフィーによるグリコシル化蛋白質の精製を含む（Ｍ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，（ｅｄ．），Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：５２９，１９９０）。本発明のさらなる実施形態なくして、注目するポリペプチドおよびアフィニティー標識（例えば、マルトース−結合蛋白質、免疫グロブリンドメイン）の融合を構築して、精製を容易とすることができる。さらに、ｐＧ６ｂ細胞外ドメインのカウンター受容体−結合統制は、例えば、好適なカウンター受容体はカラムに結合され、かつｐＢ６ｂ−を含む受容体が結合され、引き続いて、標準的なクロマトフラフィー方法を用いて溶出されるアフィニティークロマトグラフィーを用いることによって、ｐＢ６ｂ−を含む可溶性受容体の精製のために開発することができる。
【０２４３】
ｐＢ６ｂポリペプチドまたはその断片は、上述したように、化学的合成を介して調製することもできる。ｐＢ６ｂポリペプチドはモノマーまたはマルチマーであってよく；グリコシル化されていても、またはグリコシル化されていなくてもよく；ＰＥＧ化されていても、またはＰＥＧ化されていなくてもよく；および最初のメチオニンアミノ酸残基を含んでも含まなくてもよい。
【０２４４】
８．ｐＧ６ｂ蛋白質に対する抗体の生産
ｐＧ６ｂに対する抗体は、例えば、ｐＧ６ｂ発現ベクターの産物、または抗原としての天然源から単離されたｐＢ６ｂを用いて得ることができる。特に有用な抗−ｐＧ６ｂ抗体はｐＧ６ｂに「特異的に結合」する。抗体は、もし該抗体が以下の２つの特性の内の少なくとも１つを呈すれば特異的に結合すると考えられる：（１）抗体は結合活性の閾値レベルでもってｐＧ６ｂに結合する、および（２）抗体はｐＧ６ｂに関連するポリペプチドと有意に交差−反応しない。
【０２４５】
最初の特徴に関しては、もし１０６Ｍ−１以上、好ましくは１０７Ｍ−１以上、より好ましくは１０８Ｍ−１以上、最も好ましくは１０９Ｍ−１以上の結合親和性（Ｋａ）でもってｐＢ６ｂポリペプチド、ペプチドまたはエピトープに結合するならば、抗体は特異的に結合する。抗体の結合親和性が、例えば、スキャッチャード解析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０，１９４９）によって当業者が容易に決定することができる。第二の特徴に関しては、例えば、もしｐＧ６ｂを検出するが、標準的なウェスタンブロット解析を用いて現在知られているポリペプチドを検出しないならば、抗体は関連ポリペプチド分子と有意に交差−反応しない。公知の関連ポリペプチドの例は公知のサイトカイン受容体を含む。
【０２４６】
抗−ｐＧ６ｂ抗体は、抗原性ｐＧ６ｂエピトープ−担持ペプチドおよびポリペプチドを用いて生産することができる。本発明の抗原性エピトープ−担持ペプチドおよびポリペプチドは、配列番号２または本明細書中に開示されたもう１つのアミノ酸配列内に含有される少なくとも９、または１５〜約３０の間のアミノ酸の配列を含有する。しかしながら、３０〜５０アミノ酸を含有する本発明のアミノ酸配列のより大きな部分、あるいは本発明のポリペプチドの完全なアミノ酸配列までのいずれかの長さ、および完全なアミノ酸配列を含むより大きな部分を含むペプチドまたはポリペプチドもまた、ｐＧ６ｂに結合する抗体を誘導するのに有用である。エピトープ−担持ペプチドのアミノ酸配列は、水性溶媒中の実質的溶解性を供するように選択される（すなわち、配列は比較的親水性ンの残基を含み、他方疎水性残基は典型的には回避される）。さらに、プロリン残基を含有するアミノ酸配列もまた、抗体生産で望ましいであろう。
【０２４７】
例として、ｐＧ６ｂにおける潜在的抗原部位は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ（ＤＮＡＳＴＡＲ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＰＲＯＴＥＡＮプログラム（バージョン３．１４）によって実施される、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ方法、Ｊａｍｅｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗｏｌｆ，ＣＡＢＩＯＳ  ４：１８１，（１９８８）を用いて同定される。デフォルトパラメーターをこの解析で用いる。
【０２４８】
Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ方法は、蛋白質構造の予測のために６つの主なサブルーチンを組合せる事によって可能な抗原決定基を予測する。簡単に述べると、Ｈｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓ方法、Ｈｏｐｐら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：３８２４（１９８１）をまず用いて、最大の局所的親水性の領域を表すアミノ酸配列を同定した（パラメーター：平均して７残基）。第二の工程において、Ｅｍｉｎｉの方法、Ｅｍｉｎｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５５：８３６（１９８５）を用いて、表面確率を計算した（パラメーター：表面決定閾値（０．６）＝１）。第三に、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｔｚの方法、Ｋａｒｐｌｕｓ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｈａｆｔｅｎ  ７２：２１２（１９８５）を用いて、骨格鎖の柔軟性を予測した（パラメーター：柔軟性閾値（０．２）＝１）。解析の第四および第五の工程において、二次構造の予測を、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ，Ｃｈｏｕ、“Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｃｌａｓｓｅｓ  ｆｒｏｍ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ，”ｉｎ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｆａｓｍａｎ（ｅｄ．），ｐａｇｅｓ  ５４９−５８６（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９９０）、およびＧａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ，Ｇａｒｎｉｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２０：９７（１９７８）の方法を用いてデータに適用した（Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎパラメーター：立体配座表＝６４蛋白質；α領域閾値＝１０３；β領域閾値＝１０５；Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎパラメーター：αおよびβ決定定数＝０）。第六のサブルーチンにおいて、柔軟性パラメーターおよびヒドロパシー／溶媒接近性因子を組合せて、「抗原性指標」として設計された表面輪郭値を決定した。最後に、ピークを広げる関数を抗原性指標に適用し、これは、各ピーク値の２０、４０、６０、または８０％を加えることによって主な表面ピークを広げて、内部領域に対する表面領域の移動性に由来するさらなる自由エネルギーを説明する。しかしながら、ヘリックス領域は柔軟性が低い傾向があるため、この計算はヘリックス領域に存在するいずれの主なピークにも適用しなかった。というのは、ヘリックス領域である。
【０２４９】
この解析の結果は、配列番号２の以下のアミノ酸配列は好適な抗原性ペプチドを提供し：Ｈｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ親水性プロフィールを用いて、配列番号３内の最も抗原性のポテンシャルを有する領域を決定することができることを示した（Ｈｏｐｐら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：３８２４−３８２８，１９８１；Ｈｏｐｐ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．８８：１−１８，１９８６  ａｎｄ  Ｔｒｉｑｕｉｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１：１５３−１６９，１９９８）。該プロフィールは６−残基ウィンドウをスライドさせることに基づく。埋もれたＧ、ＳおよびＴ残基および露出したＨ、ＹおよびＷ残基は無視した。さらに、例えば、ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｐｒｏｔｅａｎプログラム（（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いてＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆプロットによって予測された配列番号２内のｐＧ６ｂ抗原性エピトープは好ましい抗原性エピトープとして働き、当業者によって決定できる。そのような抗原性エピトープは（１）配列番号２のアミノ酸残基２１〜３１；（２）配列番号２のアミノ酸残基５５〜６１；（３）配列番号２のアミノ酸残基１１０〜１１６；（４）配列番号２のアミノ酸残基１８４〜２０６；および（５）配列番号２のアミノ酸残基１９１〜１９７を含む。本発明では、ｐＧ６ｂに対する抗体を生じさせるための抗原性ペプチド１〜５のいずれか１つの使用、または本発明の中和モノクローナル抗体をスクリーニングし、または同定するためのツールとしての使用が考えられる。本発明では、ｐＧ６ｂに対する抗体を生じさせるための、ならびにｐＧ６ｂカウンター受容体の活性に結合し、作動し、ブロックし、阻害し、低下させ、増加させ、拮抗しまたは中和することができる抗−ｐＧ６ｂモノクローナル抗体を同定し、およびスクリーニングするための本明細書中に記載されたいずれかの抗原性ペプチドまたはエピトープの使用が考えられる。
【０２５０】
組換えｐＧ６ｂ蛋白質に対する、または天然源から単離されたｐＧ６ｂに対するポリクローナル抗体は、当業者に周知の方法を用いて調製することができる。例えば、Ｇｒｅｅｎら、“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｓｅｒａ，”ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍａｎｓｏｎ，ｅｄ．），Ｐａｇｅｓ  １−５（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  １９９２）、およびＷｉｌｌｉａｍｓら、“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｕｓｉｎｇ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”ｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｌｏｂｅｒら（ｅｄｓ．），ｐａｇｅ  １５（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）参照。ｐＧ６ｂポリペプチドの免疫原生は、ミョウバン（水酸化アルミニウム）あるいはフロイントの完全または不完全アジュバントのようなアジュバントの使用を介して増加させることができる。免疫化で有用なポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドとの、またはマルトース結合蛋白質との、ｐＧ６ｂまたはその部分の融合のような融合ポリペプチドも含む。ポリペプチド免疫原は全長分子またはその部分（例えば、ｐＧ６ｂの細胞外ドメイン、またはその抗原性断片）であってよい。もしポリペプチド部分が「ハプテン−様」であれば、そのような部分は、有利には、免疫化のために、（キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）または破傷風トキソイドのような）マクロ分子担体に連結または結合することができる。
【０２５１】
ポリクローナル抗体は、典型的には、ウマ、ウシ、イヌ、ニワトリ、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、ヤギ、またはヒツジのような動物において生起されるが、本発明の抗−ｐＧ６ｂ抗体はサブヒト霊長類抗体から誘導することもできる。ヒヒにおいて診断的にかつ治療的に有用な抗体を生起させるための一般的技術は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇら、の国際特許公開番号ＷＯ  ９１／１１４６５において、およびＬｏｓｍａｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４６：３１０（１９９０）において見出すことができる。
【０２５２】
別法として、モノクローナル抗−ｐＧ６ｂ抗体を作り出すことができる。特異的抗原に対するげっ歯類モノクローナル抗体は、当業者に知られた方法によって得ることができる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５，１９７５；Ｃｏｌｉｇａｎら（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，ｐａｇｅｓ  ２．５．１−２．６．７（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９１）［“Ｃｏｌｉｇａｎ”］；Ｐｉｃｋｓｌｅｙら、“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ，”ｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｌｏｖｅｒら（ｅｄｓ．），ｐａｇｅ  ９３（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）参照）。
【０２５３】
簡単に述べれば、モノクローナル抗体は、ｐＧ６ｂ遺伝子産物を含む組成物をマウスに注射し、血清試料を取り出すことによって抗体の生産の存在を確認し、脾臓を取り出して、Ｂ−リンパ球を入手し、Ｂ−リンパ球をミエローマ細胞と融合して、ハイブリドーマーを生産し、ハイブリドーマーをクローン化し、該抗原に対する抗体を生産する陽性クローンを選択し、抗原に対する抗体を生産するクローンを培養し、次いで、ハイブリドーマー培養から抗体を単離することによって得ることができる。抗−ｐＧ６ｂ抗体の生産のための特に好適な免疫原性組成物は、ｐＧ６ｂの細胞外ドメインを含むポリペプチド（例えば、配列番号３）ならびにその抗原性断片を含む。
【０２５４】
加えて、本発明の抗−ｐＧ６ｂ抗体は、ヒトモノクローナル抗体から誘導することができる。ヒトモノクローナル抗体は、抗原攻撃に応答して特異的火と抗体を生産するように作製されたトランスジェニックマウスから得られる。この技術において、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座のエレメントを、内因性重鎖および軽鎖遺伝子座の標的化破壊を含む胚幹細胞系から由来するマウスの株に導入する。トランスジェニックマウスはヒト抗原に対して特異的なヒト抗体を合成することができ、該マウスを用いて、ヒト抗体−分泌ハイブリドーマーを生産することができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、例えば、Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  ７：１３，１９９４；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６，１９９４；ａｎｄ  Ｔａｙｌｏｒら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９，１９９４によって記載されている。
【０２５５】
モノクローナル抗体は、種々のよく確立された技術によって、ハイブリドーマー培養から単離し、精製することができる。そのような単離技術はプロテイン−Ａセハロースでのアフィニティークロマトフラフィー、サイズ−排除クロマトグラフィー、およびイオン−交換クロマトフラフィーを含む（例えば、Ｃｏｌｉｇｅｎ  ａｔ  ｐａｇｅｓ  ２．７．１−２．７．１２  および  ｐａｇｅｓ  ２．９．１−２．９．３；Ｂａｉｎｅｓら、“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ（ＩｇＧ），”ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１０，ｐａｇｅｓ  ７９−１０４（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９２参照）。
【０２５６】
特別な使用のためには、抗−ｐＧ６ｂ抗体の断片を調製するのが望ましいであろう。そのような抗体断片は、例えば、抗体の蛋白質分解加水分解によって得ることができる。抗体断片は、慣用的な方法によって、全抗体のペプシンまたはパパイン消化によって得ることができる。例として、抗体断片は、Ｆ（ａｂ’）２で示される５Ｓ断片を供するための抗体のペプシンでの酵素切断によって生産することができる。この断片は、さらに、チオール還元剤を用いて切断して、３．５Ｓ  Ｆａｂ’一価断片を生じさせることができる。所望により、切断反応は、ジスルヒド結合の切断に由来するスルフヒドリル基の代わりにブロッキング基を用いて行うことができる。例として、ペプシンを用いる酵素切断は、２つの一価Ｆａｂ断片およびＦｃ断片を直接的に生じる。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，米国特許第４，３３１，６４７，Ｎｉｓｏｎｏｆｆら、Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０，１９６０；Ｐｏｒｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．７３：１１９，１１９，１９５９；Ｅｄｅｌｍａｎら、ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１，ｐａｇｅ  ４２２（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９６７），および  ｂｙＣｏｌｉｇａｎ  ａｔ  ｐａｇｅｓ２．８．１−２．８．１０および２．１０．−２．１０．４によって記載されている。
【０２５７】
一価軽鎖−重鎖断片を形成するための重鎖の分離、断片のさらなる切断、または他の酵素、化学的または遺伝子的技術のような抗体を切断する他の方法も、断片が無傷抗体によって認識される抗原に結合する限りは用いることもできる。
【０２５８】
例えば、Ｆｖ断片はＶＨおよびＶＬ鎖の会合を含む。この会合は、Ｉｎｂａｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６２：２６５９，１９７２によって記載されているように非共有結合であり得る。別法として、可変鎖は分子間ジスルヒド結合によって連結することができるか、あるいはグルタルアルデヒドのような化学物質によって架橋することができる（例えば、Ｓａｎｄｈｕ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：４３７，１９９２参照）。
【０２５９】
Ｆｖ断片は、ペプチドリンカーによって連結されるＶＨおよびＶＬ鎖を含むことができる。これらの単一−鎖抗原結合蛋白質（ｓｃＦｖ）は、オリゴヌクレオチドによって連結されたＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。構造遺伝子は発現ベクターに挿入され、これは、引き続いて、Ｅ．ｃｏｌｉのような宿主細胞に導入される。組換え宿主細胞は、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドで単一ポリペプチド鎖を合成する。ｓｃＦｖｓを生産する方法は、例えば、Ｗｈｉｔｌｏｗら、Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２：９７，１９９１によって記載されている（また、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３，１９８８；Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第４，９４６，７７８号；Ｐａｃｋら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１２７１，１９９３，およびＳａｎｄｈｕ，ｓｕｐｒａも参照）。
【０２６０】
例として、ｓｃＦｖは、リンパ球をｐＧ６ｂポリペプチドにインビトロで暴露し、次いで、（例えば、固定化されたまたは標識されたｐＧ６ｂ蛋白質またはペプチドの使用を通じて）ファージまたは同様なベクター中の抗体ディスプレイライブラリーを選択することによって得ることができる。潜在的ｐＧ６ｂポリペプチド結合ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージに（ファージディスプレイ）、またはＥ．ｃｏｌｉのような細菌にディスプレイされるランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ランダム突然変異およびランダムポリヌクレオチド合成を介するような多数の方法で得ることができる。これらのランダムペプチドディスプレイライブラリーを用いて、カウンター受容体または受容体のような蛋白質またはポリペプチド、生物学的合成マクロ分子、または有機または無機物質であり得る公知の標的と相互作用するペプチドについてスクリーニングすることができる。そのようなランダムペプチドディスプレイライブラリーを作り出し、およびスクリーニングするための技術は当該分野で知られており（Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，２２３，４０９号、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第４，９４６，７７８号、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，４０３，４８４号，Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，５７１，６９８号およびＫｅｙら、Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９６））、およびランダムペプチドディスプレイライブラリーおよびそのようなライブラリーをスクリーニングするためのキットは、例えば、ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ  ＭＡ）、およびＰｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から商業的に入手可能である。ランダムペプチドディスプレイライブラリーは、本明細書中に開示されたｐＧ６ｂ配列を用いてスクリーニングして、ｐＧ６ｂに結合する蛋白質を同定することができる。
【０２６１】
抗体断片のもう１つの形態は、単一相補性−決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）は、注目する抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。そのような遺伝子は、例えば、抗体−生産細胞のＲＮＡから可変領域を合成するポリメラーゼ鎖反応を用いることによって調製される（例えば、Ｌａｒｒｉｃｋら、Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２：１０６（１９９１），Ｃｏｕｒｔｅｎａｙ−Ｌｕｃｋ，“Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｇｅｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｒｉｔｔｅｒら、（ｅｄｓ．），ｐａｇｅ  １６６（Ｃａｍｂｒｉｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５），およびＷａｒｄら、“Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｒｃｈら、（ｅｄｓ．），ｐａｇｅ  １３７（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）参照）。
【０２６２】
別法として、抗−ｐＧ６ｂ抗体は、「ヒト化」モノクローナル抗体に由来することができる。ヒト化モノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンの可変重鎖および軽鎖からのマウス相補性決定領域をヒト可変ドメインに導入することによって生産される。次いで、ヒト抗体の典型的な残基をネズミカウンターパートのフレームワーク領域において置換する。ヒト化モノクローナル抗体に由来する抗体成分の使用は、ネズミ定常領域の免疫原性に関連した潜在的問題を軽減する。ネズミ免疫グロブリン可変ドメインをクローン化するための一般的技術は、例えば、Ｏｒｌａｎｄｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：３８３３，１９８９によって記載されている。ヒト化モノクローナル抗体を生産するための技術が、例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２，１９８６；Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２８５，１９９２；Ｓａｎｄｈｕ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：４３７，１９９２；Ｓｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１５０：２８４４，１９９３；Ｓｕｄｈｉｒ（ｅｄ．）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５），Ｋｅｌｌｅｙ，“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｃｌｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  ３９９−４３４（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９６）によって、およびＱｕｅｅｎら、米国特許第５，６９３，７６２号（１９９７）によって記載されている。
【０２６３】
本発明の特別な実施形態において、抗−ｐＧ６ｂ抗体は以下の特徴によって特徴付けられる：
（ａ）抗体はｐＧＢ６の細胞外ドメインに特異的に結合する；および
（ｂ）抗体は、マイクロビーズに共有結合によりカップリングして抗体の固定化された形態を生じる場合、インビトロにてＴ細胞におけるＴｃＲ−媒介活性化を阻害することができ、ここに、ＴｃＲ−媒介活性化は、Ｔ細胞を、マイクロビーズともカップリングした作動性抗−ＣＤ３抗体と接触させる工程を含む。
【０２６４】
典型的には、抗−ｐＧ６ｂ抗体はヒトｐＧ６ｂ（配列番号３）またはマウスｐＧ６ｂ（配列番号６）の細胞外ドメインに結合する。ある変形において、抗−ｐＧ６ｂ抗体は、さらに、抗体の固定化された形態は、抗−ｐＧ６ｂ抗体の非存在下においてマイクロビーズに共有結合によりカップリングされた抗−ＣＤ３と接触させた対照Ｔ細胞と比較して、少なくとも約５０％ＴｃＲ−媒介活性化を阻害することができる点で特徴付けられる。なお他の変形において、抗−ｐＧ６ｂ抗体は、さらに、抗体の固定化された形態が、Ｔ細胞を、マイクロビーズに共有結合された抗−ＣＤ３抗体、および可溶性の作動性抗−ＣＤ２８抗体と接触させる工程を含むＴｃＲ−媒介活性化を阻害することができる点で特徴付けられる。特別な変形において、抗−ｐＧ６ｂ抗体は、ビーズ−カップルド抗−ＣＴＬＡ−４ｍＡ（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ｃｌｏｎｅ＃４８８１５，カタログ番号ＭＡＢ３２５）について観察されたものにほぼ同等なビーズにカップリングされた場合のＴ細胞阻害活性を有する。Ｔ細胞活性化は、例えば、特定のＴ細胞サブ集団、典型的にはＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞に関して評価することができる。Ｔ細胞活性化を評価するための抗体の共有結合カップリングのための好適なマイクロビーズは、例えば、ラテックスまたは常磁性ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＳＡ（Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙから商業的に入手可能なトシル活性化ビーズ）を含む。
【０２６５】
他の実施形態において、抗−ｐＧ６ｂ抗体は以下の特性によって特徴付けられる：
（１）抗体はｐＧ６ｂ蛋白質の細胞外ドメインに特異的に結合する；および
（２）抗体は、可溶性形態において、
（ｉ）インビトロにてＴ細胞におけるＴｃＲ−媒介活性化を阻害することができ、ここに、ＴｃＲ−媒介活性化は、ＣＤ２８−媒介共−刺激の非存在下においてＴ細胞を可溶性の作動性抗−ＣＤ３抗体と接触させる工程を含み；および／または
（ｉｉ）インビトロにてＴ細胞におけるＴｃＲ−媒介活性化を増強することができ、ここに、ＴｃＲ−媒介活性化は、Ｔ細胞を、抗−ＣＤ３抗体および可溶性の作動性抗−ＣＤ２８抗体と接触させる工程を含む。
【０２６６】
典型的な変形において、抗−ｐＧ６ｂ抗体はヒトｐＧ６ｂ（配列番号３）またはマウスｐＧ６ｂ（配列番号６）の細胞外ドメインに結合する。特定の実施形態において、抗体は上述した（ｉ）および（ｉｉ）双方によって特徴付けられる。好ましくは、抗体の可溶性形態が、インビトロにて抗−ＣＤ３−刺激Ｔ細胞においてＴｃＲ−媒介活性化を阻害できる場合、可溶性抗体は、ＣＤ２８−媒介共−刺激の非存在下において、および抗−ｐＧ６ｂ抗体の非存在下において、可溶性抗−ＣＤ３抗体と接触される対照Ｔ細胞と比較して、少なくとも約５０％ＴｃＲ−媒介活性化を阻害することができ；例えば、特別な変形において、ＴｃＲ−媒介活性化の阻害は約５０％〜約９０％間であって、特別な実施形態において、阻害は約９０％である。さらに、可溶性抗体がインビトロにて抗−ＣＤ３／抗−ＣＤ２８−刺激Ｔ細胞におけるＴｃＲ−媒介活性化を増強させることができ、ＴｃＲ−媒介活性化がＴ細胞を可溶性抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８抗体と接触させる工程を含む場合、可溶性抗−ｐＧ６ｂ抗体は、典型的には、抗−ｐＧ６ｂ抗体の非存在下において、抗−ＣＤ３抗体および抗−ＣＤ２８抗体双方と接触される対照Ｔ細胞と比較して、少なくとも約２０％ＴｃＲ−媒介活性化を増強させることができ；例えば、いくつかの変形において、ＴｃＲ−媒介活性化の増強は約２０％〜約３０％間であって、特別な実施形態において、増強は約３０％である。Ｔ細胞活性化は、例えば、特定のＴ細胞サブ集団、典型的にはＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞に対して評価することができる。
【０２６７】
そのような抗−ｐＧ６ｂ抗体の特徴を評価するための好適なインビトロＴ細胞活性化アッセイは、本明細書中にさらに記載されたＴ細胞増殖アッセイを含めた当該分野で良く知られたＴ細胞増殖アッセイを含む。ＴｃＲおよびＣＤ２８シグナル伝達経路を刺激するための作動性抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８抗体もまた当該分野で良く知られており、商業的に入手可能であって、例えば、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからの抗−ＣＤ３  ｍＡｂ（５５５３２９）および抗−ＣＤ２８  ｍＡｂ（５５５７２５）を含む。抗−ｐＧ６ｂ抗体特徴についての例示的なＴ細胞増殖アッセイは後に実施例５においてさらに記載される。
【０２６８】
上述したインビトロ生物学的特性を有する抗−ｐＧ６ｂ抗体は、例えば、ｐＧ６ｂ細胞外ドメイン（例えば、配列番号３に記載されたヒトｐＧ６ｂの細胞外ドメイン）を含むポリペプチドを（本明細書中で議論したような抗体生産のための方法を用いて）ポリクローナルまたはモノクローナル抗体の生産用の免疫原として用い、次いで、本明細書中で議論した、例えば、Ｔ細胞増殖アッセイのようなインビトロＴ細胞活性化アッセイで生じた抗体をスクリーニングして、所望の特性を有する抗体を同定することによって容易に得ることができる。ヒトｐＧ６ｂ（配列番号３）の細胞外ドメインで特異的に結合する抗体を生じさせる例示的方法は、さらに、後記実施例３に記載される。インビトロ機能的特徴を評価するには、アッセイは、抗−ＣＤ３  ｍＡｂと一緒にビーズ（例えば、Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＳＡ（Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）から商業的に入手可能なトシル活性化ビーズ）に対するｐＧ６ｂ抗体の共有結合カップリングを含んで、抗−ＣＤ３および／または抗−ＣＤ３／抗−ＣＤ２８−誘導Ｔ細胞活性化に対する阻害降下を有する抗体についてスクリーニングすることができる。別法として、可溶性抗−ｐＢ６ｂ抗体を、ＣＤ２８共−刺激の非存在下において抗−ＣＤ３−誘導Ｔ細胞活性化に対する阻害降下について、および／または抗−ＣＤ３／抗−ＣＤ２８−誘導Ｔ細胞活性化の増強についてテストすることができる。抗−ｐＧ６ｂ抗体の阻害および／または刺激効果を評価するための、かつ所望の特徴を有する抗−ｐＧ６ｂ抗体を容易に同定するのに用いることができる例示的なインビトロアッセイは、さらに、後記実施例５に記載される。
【０２６９】
本発明の抗−ｐＧ６ｂ抗体または抗体断片は、当該分野における、および本明細書中に記載された方法を用いてＰＥＧ化することができる。
【０２７０】
さらに、ポリクローナル抗−イディオタイプ抗体は、標準的な技術を用い、動物を抗−ｐＧ６ｂ抗体または抗体断片で免疫化することによって調製することができる。例えば、Ｇｒｅｅｎら、“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｓｅｒａ，”ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍａｎｓｏｎ（ｅｄ．），ｐａｇｅｓ  １−１２（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  １９９２）参照。また、Ｃｏｌｉｇａｎ  ａｔ  ｐａｇｅｓ  ２．４．１−２．４．７参照。別法として、モノクローナル抗−イディオタイプ抗体は、上述した技術にて、免疫原として抗−ｐＧ６ｂ抗体または抗体断片を用いて調製することができる。もう１つの別のヒト化抗−イディオタイプ抗体またはサブヒト霊長類抗−イディオタイプ抗体は上述した技術を用いて調製することができる。抗−イディオタイプ抗体を生産する方法は、例えば、Ｉｒｉｅ，米国特許第５，２０８，１４６号，Ｇｒｅｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，６３７，６７７号およびＶａｒｔｈａｋａｖｉ  ａｎｄ  Ｍｉｎｏｃｈａ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７７：１８７５，１９９６によって記載されている。
【０２７１】
抗−ｐＧ６ｂ抗体は検出可能な標識とコンジュゲートさせて、抗−ｐＧ６ｂ免疫抱合体を形成することができる。好適な検出可能な標識は、例えば、放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識、生物発光標識またはコロイド状金を含む。そのような検出可能に標識された免疫抱合体を作製し、検出する方法は当業者によく知られており、以下により詳細に記載される。
【０２７２】
検出可能な標識は、オートラジオグラフィーによって検出される放射性同位体であり得る。本発明の目的で特に有用な同位体は３Ｈ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、および１４Ｃである。
【０２７３】
抗−ｐＧ６ｂ免疫抱合体は蛍光化合物で標識することもできる。蛍光標識された抗体の存在は、免疫抱合体を好適な波長の光に暴露し、得られた蛍光を検出することによって決定される。蛍光標識化合物はフルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒドおよびフルオレスカミンを含む。
【０２７４】
別法として、抗−ｐＧ６ｂ免疫抱合体は、抗体成分を化学発光化合物にカップリングさせることによって検出可能に標識することができる。化学発光−標識化免疫コンジュゲートの存在は、化学反応のコースの間に生起するルミネセンスの存在を検出することによって決定する。化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびオキサレートエステルを含む。
【０２７５】
同様に、生物発光化合物を用いて、本発明の抗−ｐＧ６ｂ免疫抱合体を標識することができる。バイオルミネセンスは、触媒蛋白質が化学発光反応の効率を増加させる生物学的系において見出されるケミルミネセンスのタイプである。生物発光蛋白質の存在は、ルミネセンスの存在を検出することによって決定される。標識で有用な生物発光化合物はルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンを含む。
【０２７６】
別法として、抗−ｐＧ６ｂ免疫抱合体は、抗−ｐＧ６ｂ抗体成分を酵素に連結させることによって検出可能に標識することができる。抗−ｐＧ６ｂ−酵素コンジュゲートを好適な基質の存在下でインキュベートする場合、酵素部位は基質と反応して、化学部位を生じ、これは、例えば、分光光学、フルオロメトリーまたは肉眼手段によって検出することができる。多特異的免疫抱合体を検出可能に標識するのに用いることができる酵素の例は、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼを含む。
【０２７７】
当業者であれば、本発明に従って使用することができる他の好適な標識を知っているであろう。抗−ｐＧ６ｂ抗体へのマーカー部位の結合は、当該分野で知られた標準的な技術を用いて達成することができる。この点に関して典型的な方法は、Ｋｅｎｎｅｄｙら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ７０：１（１９７６），Ｓｃｈｕｒｓら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ  ８１：１（１９７７），Ｓｈｉｈら、Ｉｎｔ‘ｌ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４６：１１０１（１９９０），Ｓｔｅｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：１３３０（１９９０），およびＣｏｌｉｇａｎ，ｓｕｐｒａによって記載されている。
【０２７８】
さらに、免疫化学検出の便宜および多様性は、アビジン、ストレプトアビジン、およびビオチンとコンジュゲートされている抗−ｐＧ６ｂ抗体を用いることによって増強させることができる（例えば、Ｗｉｌｃｈｅｋら、（ｅｄｓ．），“Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８４（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９０）、およびＢａｙｅｒら、“Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ａｖｉｄｉｎ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１０，Ｍａｎｓｏｎ（ｅｄ．），ｐａｇｅｓ  １４９−１６２（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９２）参照）。
【０２７９】
イムノアッセイを行うための方法はよく確立されている。例えば、Ｃｏｏｋ  ａｎｄ  Ｓｅｌｆ，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，”ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｒｉｔｔｅｒ  ａｎｄ  Ｌａｄｙｍａｎ（ｅｄｓ．），  ｐａｇｅｓ  １８０−２０８，（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５），Ｐｅｒｒｙ，“Ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｅｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｒｃｈ  ａｎｄ  Ｌｅｎｎｏｘ（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  １０７−１２０（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５），ａｎｄ  Ｄｉａｍｏｎｄｉｓ，Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ａｃａｄｉｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．Ｉｎｃ．１９９６）参照。
【０２８０】
本発明では、ｐＧ６ｂ遺伝子発現のための免疫学的診断アッセイを行うためのキットが考えられる。そのようなキットは、抗−ｐＧ６ｂ抗体、または抗体断片を含む少なくとも１つの容器を含む。キットはｐＧ６ｂ抗体または抗体断片の存在を示すことができる１つ以上の試薬を含む第二の容器も含むことができる。そのようなインジケーター試薬の例は放射性標識、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識、生物発光標識、コロイド状金等のような検出可能な標識を含む。キットは、ｐＧ６ｂ抗体または抗体断片を用いてｐＧ６ｂ蛋白質を検出するユーザーに運ぶための手段も含むことができる。例えば、書面による指示書は、入れられた抗体または抗体断片を用いてｐＧ６ｂを検出することができることを述べることができる。書面による材料は容器に直接的に適用することができ、あるいは書面による材料は添付文書の形態で供することができる。
【０２８１】
９．そのカウンター受容体へのｐＧ６ｂ結合に作動し、または拮抗する抗−ｐＧ６ｂ抗体の使用
本明細書中で有用な抗体を作り出し、または選択するための別の技術は、抗原エピトープのような可溶性ｐＧ６ｂ受容体ポリペプチドまたはその断片に対するリンパ球のインビトロ暴露、および（例えば、抗原エピトープのような、固定化されたまたは標識された可溶性ｐＧ６ｂ受容体ポリペプチドまたはその断片の使用を介する）ファージまたは同様なベクター中の抗体ディスプレイライブラリーの選択を含む。抗原エピトープのような、可溶性ｐＧ６ｂ受容体ポリペプチドまたはその断片のような潜在的結合ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージ上に（ファージディスプレイ）またはＥ．ｃｏｌｉのような細菌上にディスプレイされたランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ランダム突然変異誘発およびランダムポリヌクレオチド合成を介するような、多数の方法で得ることができる。これらのランダムペプチドディスプレイライブラリーを用いて、カウンター受容体または受容体のような蛋白質またはポリペプチド、生物学的または合成マクロ分子、または有機または無機物質であり得る公知の標的と相互作用するペプチドについてスクリーニングすることができる。そのようなランダムペプチドディスプレイライブラリーを作り出し、スクリーニングするための方法は当該分野で知られており（Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，２２３，４０９号；Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第４，９４６，７７８号，Ｌａｄｎｅｒら、５，４０３，４８およびＬａｄｎｅｒら、米国特許第５，５７１，６９８号）、およびランダムペプチドディスプレイライブラリー、およびそのようなライブラリーをスクリーニングするためのキットは、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）およびＰｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から商業的に入手可能である。ランダムペプチドディスプレイライブラリーは、本明細書中に開示された抗原エピトープポリペプチド配列のような可溶性ｐＧ６ｂ受容体ポリペプチドまたはその断片を用いてスクリーニングして、ｐＧ６ｂ−を含む受容体ポリペプチドに結合する蛋白質を同定することができる。可溶性ｐＧ６ｂ−を含む受容体ポリペプチドと相互作用するこれらの「結合ポリペプチド」は細胞を標識化するために；アフィニティー精製によりホモログポリペプチドを単離するために用いることができ；それらは、薬物、トキシン、放射性核種等に直接的にまたは間接的にコンジュゲートさせることができる。これらの結合ポリペプチドは、発現ライブラリーをスクリーニングするのに、および活性に作動するおよび／または中和するのに、例えば、ｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の間の相互作用に結合し、ブロックし、阻害し、低下させ、拮抗し、または中和するのに、のように解析方法において用いることもできる。結合ポリペプチドは、可溶性ｐＧ６ｂ−を含む受容体ポリペプチドの循環レベルを検出するのに；基礎となる病理学または��気のマーカーとしての可溶性または非−可溶性ｐＧ６ｂ−を含む受容体を検出し、または計量するのに診断アッセイで用いることもできる。これらの結合ポリペプチドは、（例えば、カウンター受容体への）膜−結合ｐＧ６ｂモノマー受容体、またはｐＧ６ｂホモポリマー、ヘテロダイマーまたはマルチマーポリペプチド結合、およびインビトロおよびインビボでのシグナル変換をブロックし、または阻害するための「アンタゴニスト」として作用することもできる。再度、これらの結合ポリペプチドは抗−ｐＧ６ｂモノマー受容体、または抗−ｐＧ６ｂホモダイマー、ヘテロダイマーまたはマルチマーポリペプチドとして働き、ｐＧ６ｂ活性、ならびにｐＧ６ｂカウンター受容体活性または蛋白質−結合を阻害するのに有用である。本発明の天然受容体複合体に対して生起された抗体、およびｐＧ６ｂ−エピトープ−結合抗体、および抗−ｐＧ６ｂ中和モノクローナル抗体は好ましい実施形態であろう。というのは、それらはｐＧ６ｂに対してより特異的に作用でき、そのカウンター受容体へのその結合を阻害できるからである。さらに、本発明の抗体の作動、拮抗および結合活性は、本明細書中に記載されたｐＧ６ｂ増殖、シグナルトラップ、そのカウンター受容体またはいずれかの他のＢ７ファミリー受容体、およびｐＧ６ｂ−を含む可溶性受容体の存在下におけるルシフェラーゼまたは結合アッセイ、および他の生物学的または生化学的アッセイにおいてアッセイすることができる。
【０２８２】
抗原エピトープのような、ｐＧ６ｂ受容体ポリペプチドに対する抗体（例えば、配列番号２に対する抗体）、またはその断片は、慢性関節リウマチ、乾癬、アトピー性皮膚炎、炎症性皮膚疾患、内毒素血症、関節炎、喘息、ＩＢＤ、結腸炎、乾癬性関節炎、多発性硬化症、または他の炎症疾患に対する治療用途でインビボにてｐＧ６ｂの炎症効果を阻害するのに；ｐＧ６ｂ受容体を発現する細胞を標識化するのに；アフィニティー精製によって可溶性ｐＧ６ｂ−を含む受容体ポリペプチドを単離するのに；可溶性ｐＧ６ｂ−を含む受容体ポリペプチドの循環レベルを検出するのに診断アッセイのために；基礎となる病理学または病気のマーカーとしての可溶性ｐＧ６ｂ−を含む受容体を検出し、または定量するのに；ＦＡＣＳを使用する解析方法において；ｐＧ６ｂアゴニストとして作用できる抗−イディオタイプ抗体を生じさせるのに；および中和抗体として、またはｐＧ６ｂ受容体機能に結合し、ブロックし、阻害し、低下させ、または拮抗する、あるいはインビトロ、エクスビボ、およびインビボにてｐＧ６ｂ活性に結合し、ブロックし、阻害し、低下させ、拮抗し、または中和するアンタゴニストとして用いることができる。好適な直接的標識または標識は放射性核種、酵素、基質、補因子、ビオチン、阻害剤、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁性粒子等を含み；間接的標識または標識は中間体としてもビオチン−アビジンまたは他の相補体／抗−相補体対の使用をその特徴とできる。抗体は、本明細書中においては、薬物、トキシン、放射性核種等に直接的にまたは関節的にコンジュゲートすることもでき、これらのコンジュゲートはインビボにて、または治療適用で用いることができる。さらに、可溶性ｐＧ６ｂ−を含む受容体ポリペプチド、またはその断片に対する抗体は、インビトロにて、アッセイ、例えば、ウエスタンブロット、または当該分野で公知の他のアッセイにおいて、変性または非−変性ｐＧ６ｂを含む受容体ポリペプチドまたはその断片を検出するのに用いることができる。
【０２８３】
可溶性ｐＧ６ｂ受容体または可溶性ｐＧ６ｂホモダイマー、ヘテロデアイマー、またはマルチマー受容体ポリペプチドに対する抗体は、受容体ポリペプチドの循環レベルを検出するための診断アッセイ、蛍光−活性化細胞ソーティングを使用する解析方法内部、対応する受容体を発現する細胞を標識化し、およびそれらの発現レベルをアッセイするのに有用である。さらに、二価抗体、および抗−イディオタイプ抗体は、ｐＧ６ｂの効果を模倣するアゴニストとして用いることができる。
【０２８４】
本明細書中において、抗体は薬物、トキシン、放射性核種等に直接的にまたは間接的にコンジュゲートさせることもでき、これらのコンジュゲートはインビボ診断または治療的適用で用いることができる。例えば、可溶性ｐＧ６ｂ受容体または可溶性ｐＧ６ｂホモダイマー、ヘテロダイマーまたはマルチマー受容体ポリペプチドを認識する抗体または結合ポリペプチドを用いて、対応する抗−相補性分子（すなわち、ｐＧ６ｂ−を含む可溶性または膜−結合受容体）を発現する組織または器官を同定し、または治療することができる。より詳しくは、可溶性ｐＧ６ｂ−を含む受容体ポリペプチド、またはその生体活性で断片または部分に対する抗体を検出可能なまたは細胞傷害性分子にカップリングさせ、ｐＧ６ｂ−発現癌のようなｐＧ６ｂ−を含む受容体を発現する細胞、組織または器官を有する哺乳動物に送達することができる。
【０２８５】
好適な検出可能な分子は、（上述で開示した結合ペプチドを含めた）「結合ポリペプチド」のようなｐＧ６ｂ−を含む受容体ポリペプチドに結合するポリペプチド、抗体、またはその生体活性断片または部分に直接的にまたは間接的に結合することができる。好適な検出可能な分子は放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁性粒子等を含む。可溶性細胞傷害性分子はポリペプチドまたは抗体に直接的にまたは間接的に結合することができ、細菌または植物トキシン（例えば、ジフテリアトキシン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエキソトキシン、リシン、アブリン等）、ならびに（ポリペプチドまたは抗体に直接的に結合した、または例えば、キレート化部位の手段を通じて間接的に結合した）ヨウ素−１３１、レニウム−１８８またはイットリウム−９０のような治療放射性核種を含む。結合ポリペプチドまたは抗体はアドリアマイシンのような細胞傷害性薬物にコンジュゲートすることもできる。検出可能なまたは細胞傷害性分子の間接的結合のためには、検出可能なまたは細胞傷害性分子は相補性／抗相補性対のメンバーとコンジュゲートすることができ、ここに、他のメンバーは結合ポリペプチドまたは抗体部分に結合する。これらの目的で、ビオチン／ストレプトアビジンは例示的な相補性／抗相補性対である。
【０２８６】
もう１つの実施形態において、結合ポリペプチド−トキシン融合蛋白質または抗トキシン融合蛋白質は、（例えば、癌細胞または組織を治療するのに）標的細胞または組織の阻害または除去で用いることができる。別法として、もし結合ポリペプチドが多重機能ドメイン（すなわち、活性化ドメインまたはカウンター受容体結合ドメイン、＋標的化ドメイン）を有するならば、標的化ドメインのみを含む融合蛋白質は、検出可能な分子、細胞傷害性分子または相補性分子を注目する細胞または組織タイプに向けるのに適しているであろう。単一ドメインのみを含む融合蛋白質が相補性分子を含む場合、抗−相補性分子は検出可能なまたは細胞傷害性分子にコンジュゲートすることができる。かくして、そのようなドメイン−相補性分子融合蛋白質は、総括的抗−相補的−検出可能な／細胞傷害性分子コンジュゲートの細胞／組織−特異的送達のための総括的標的化媒体を表す。
【０２８７】
別法として、本明細書中に記載されたｐＧ６ｂ受容体結合ポリペプチドまたは抗体融合蛋白質は、ｐＧ６ｂ受容体−変調アポトーシス経路を直接的に刺激し、その結果、ｐＧ６ｂ−を含む受容体を発現する過剰増殖細胞の細胞死滅をもたらすことによって、標的組織のインビボ殺傷を増強させるのに用いることができる。
【０２８８】
１０．ｐＧ６ｂ活性を有するポリペプチド、またはｐＧ６ｂに対する抗体の治療的使用
可溶性ｐＧ６ｂ活性を有するアミノ酸配列を用いて、ｐＧ６ｂカウンター受容体を結合し、かくして、ｐＧ６ｂカウンター受容体と内因性ｐＧ６ｂ受容体との結合を妨げることによって、免疫系を変調することができる。抗−ｐＧ６ｂ抗体のようなｐＧ６ｂアンタゴニストを用いて、ｐＧ６ｂカウンター受容体と内因性ｐＧ６ｂ受容体との結合を阻害することによって、免疫系を変調することもできる。したがって、本発明は、適切な量のこのポリペプチドを欠如する、または過剰のｐＧ６ｂカウンター受容体を生産する対象に対する、（可溶性ｐＧ６ｂポリペプチド、ｐＧ６ｂポリペプチド断片、ｐＧ６ｂ類似体（例えば、抗−ｐＧ６ｂ抗−イディオタイプ抗体）、およびｐＧ６ｂ融合蛋白質のような）ｐＧ６ｂ活性を有する蛋白質、ポリペプチドおよびペプチドの使用を含む。また、ｐＧ６ｂアンタゴニスト（例えば、抗−ｐＧ６ｂ抗体）を用いて、過剰のｐＧ６ｂカウンター受容体またはｐＧ６ｂいずれかを生産する対象を治療することもできる。好適な対象はヒトのような哺乳動物を含む。
【０２８９】
例えば、ある態様において、ｐＧ６ｂアンタゴニストは癌の治療で有用である。いずれかの特定の作用メカニズムに拘束されるつもりはないが、Ｔリンパ球活性の陰性レギュレーターとして、ｐＧ６ｂは、Ｔ細胞を十分に活性化し、それにより、ある種の腫瘍の貧弱な免疫原性に潜在的に寄与するのに必要な１つ以上の刺激性シグナルを阻害するように作用すると考えられる。従って、拮抗的抗−ｐＧ６ｂ抗体を用いるような、阻害性ｐＧ６ｂ−誘導シグナルのブロックは、癌の治療において腫瘍細胞に対して宿主免疫系を増加させるのに有用であり得る。Ｔ細胞活性のもう１つの陰性レギュレーター、（ＣＤ２８ファミリーメンバーでもある）ＣＴＬＡ−４のブロックでの癌のそのような治療は従前に示されており（例えば、Ｌｅａｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７１：１７３４−１７３６，１９９６参照）、および癌の治療のためのブロッキング抗−ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂの使用は現在臨床試験を受けている。
【０２９０】
従って、具体的な態様において、インビボにてブロッキング効果を供するのに有用な抗体は、インビトロにてビーズに共有結合によりカップリングした場合に、Ｔ細胞に対して阻害性活性を示す本発明の抗−ｐＧ６ｂ抗体を含む。この点に関して、本発明者らは、ある種の抗−ｐＧ６ｂモノクローナル抗体が、抗−ＣＴＬＡ−４ｍＡｂで観察された阻害性活性と同様に、およびいくつかの場合には、それとほぼ同等な、ビーズに共有結合した場合に、Ｔ細胞に対してインビトロ阻害活性を呈したことを見出した（実施例５および図７、８および９参照）。抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ３／抗−ＣＤ２８−誘導Ｔ細胞活性化に対するそのような阻害性活性を有する抗−ＣＴＬＡ−４抗体は、そのようなＴＬＡ−４  ｍＡｂが（例えば、ビーズ上の固定化のような）架橋条件下で提示された場合には、抗−ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂが非−架橋形態に提示されるある種の条件下でブロックを介してＴ細胞活性化も増強することが示された（例えば、Ｋｒｕｍｍｅｌ  ａｎｄ  Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：４５９−４６５，１９９５参照）。かくして、共有結合によりカップリングされた抗−ｐＧ６ｂ抗体に関して観察されたインビトロ結果は、Ｔ細胞活性化におけるｐＧ６ｂについての陰性調節役割と合致し、さらに、そのような抗体はインビボにて阻害性ｐＧ６ｂ活性をブロックするように作用して、癌に対する宿主免疫応答を増強させるように、陽性Ｔ細胞共−刺激を増強させることを示す。
【０２９１】
本発明の他の抗体は、癌に対するように、宿主免疫応答を増大させるのにも有用であり、例えば、可溶性形態でＴ細胞に提示された場合、抗−ＣＤ３／抗−ＣＤ２８−誘導Ｔ細胞活性化の増強を呈する抗−ｐＧ６ｂ抗体を含む。
【０２９２】
他の態様において、作動性ｐＧ６ｂポリペプチドおよび抗−ｐＧ６ｂ抗体は、Ｔ細胞活性化のｐＧ６ｂ−媒介阻害を誘導することによって、免疫応答をダウンレギュレートするのに有用である。従って、特定の実施形態において、そのようなポリペプチドおよび抗体は、例えば、乾癬、アトピー性皮膚炎、炎症性皮膚疾患、乾癬性関節炎、関節炎、内毒素血症、喘息、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、結腸炎、および本明細書中に開示された他の炎症性疾患を含めた、自己免疫または炎症病の治療で有用である。
【０２９３】
従って、いくつかの変形において、本発明は、特に、ｐＧ６ｂのインビボアゴニストの剤を投与することによって乾癬を治療する方法である。実施形態いくつかの実施形態において、ｐＧ６ｂのアゴニストは、ｐＧ６ｂに結合して、ｐＧ６ｂおよびｐＧ６ｂカウンター受容体の相互作用を模倣し、または増大させる抗−ｐＧ６ｂ抗体である。そのようなアゴニストは、単独で、あるいは滑沢剤、ケラチン溶解剤、局所コルチコステロイド、局所ビタミンＤ誘導体、アントラリン、メトトレキサートのような前進抗代謝産物剤、プソラレン−紫外線療法（ＰＵＶＡ）、エトレチネート、イソトレチノイン、サイクロスポリン、および局所ビタミンＤ３誘導体カルシポトリオールのような他の確立された療法と組合せて投与することができる。さらに、そのようなアゴニストは、アンタゴニストを含有するクリームまたは経皮パッチを用い、個体に皮下、静脈内または経皮投与することができる。もし皮下投与するならば、アゴニストは１つ以上の乾癬プラークに注射することができる。もし経皮投与するならば、アゴニストは、アゴニストを含有するクリーム、軟膏、膏薬または溶液を用い、プラーク上に直接的に投与することができる。
【０２９４】
ｐＧ６ｂに対するアゴニストは、喘息、気管支炎または嚢胞性線維症、または炎症性肺病を有する個人に投与して、該病気を治療することもできる。アゴニストは、静脈内、皮下、気管支洗浄を含めたいずれかの好適な方法、およびアンタゴニストを含有する吸入剤の使用によって投与することができる。
【０２９５】
かくして、本発明の特別な実施形態は、乾癬、乾癬性関節炎、アトピー性皮膚炎、炎症性皮膚疾患、慢性関節リウマチ、炎症成長疾患（ＩＢＤ）、クローン病、憩室病、喘息、膵臓炎、Ｉ型糖尿病（ＩＤＤＭ）、膵臓癌、膵臓炎、グラデ病、自己免疫疾患、敗血症、器官または骨髄移植体のような炎症および免疫病または疾患；内毒素血症、外傷、外科的処置または感染による炎症；脾腫；移植片−対−宿主病；において、および炎症の阻害、免疫抑制、造血系、免疫系、炎症またはリンパ系細胞、マクロファージ、（Ｔｈ１およびＴｈ２細胞を含めた）Ｔ−細胞の増殖の低下、抗原に対する免疫応答の抑制、またはｐＧ６ｂ−誘導阻害シグナルが望まれる場合に、ｐＧ６ｂアゴニストとしての抗−ｐＧ６ｂ抗体の使用に向けられる。
【０２９６】
さらに、本明細書中に記載したｐＧ６ｂポリペプチドに結合する抗体または結合性ポリペプチド、およびｐＧ６ｂポリペプチドそれ自体は以下で有用である：
（１）急性炎症、外傷、組織負傷、外科的処置、敗血症または感染の結果としての炎症、および喘息、炎症成長疾患（ＩＢＤ）、慢性結腸炎、脾腫、慢性関節リウマチ、再発性急性炎症エピソード（例えば、結核）のような慢性炎症病の治療、およびアミロイドーシス、およびアテローム性動脈硬化症、ガッスルマン病、喘息、および急性−相応答の誘導に伴う他の病気の治療において、ｐＧ６ｂを介するシグナル伝達をブロックし、阻害し、低下させ、拮抗し、または中和すること。
【０２９７】
（２）ＩＤＤＭ、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、重症筋無力症、慢性関節リウマチ、およびＩＢＤのような免疫疾患の治療においてｐＧ６ｂを介するシグナル伝達をブロックし、阻害し、低下させ、拮抗し、または中和して、ｐＧ６ｂを介する免疫細胞（例えば、リンパ球、単球、白血球）におけるシグナル伝達を予防し、または阻害すること（Ｈｕｇｈｅｓ  Ｃら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５３：３３１９−３３２５，１９９４）。別法として、ｐＧ６ｂに対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）のような抗体をアンタゴニストとして用いて、望まない免疫細胞を枯渇させて、自己免疫疾患を治療することもできる。喘息、アレルギーおよび他のアトピー性病は、例えば、可溶性ｐＧ６ｂ可溶性受容体に対するＭＡｂで治療して、免疫応答を阻害し、または有害な細胞を枯渇させることができる。本発明のポリペプチドおよび抗体を用いるｐＢ６ｂを介するシグナル伝達のブロッキング、阻害、低下または拮抗もまた、膵臓、腎臓、下垂体およびニューロン細胞の病気に有益であり得る。ＩＤＤＭ、ＮＩＤＤＭ、膵臓炎、および膵臓癌腫にも有益であり得る。ｐＧ６ｂは、拮抗性ＭＡｂが癌の成長を阻害し、免疫−媒介殺傷を標的化する場合、癌のｍＡｂ療法に対する標的として働くことができる（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：１０１５−１０１６，１９９８）。可溶性ｐＧ６ｂに対するＭａｂは、糸球体硬化症、膜神経障害、（他の組織の中でも腎臓にも影響する）アミロイドーシス、腎臓アテローム性動脈硬化症、種々の起源の糸球体腎炎、腎臓の繊維増殖病、ならびにＳＬＥ、ＩＤＤＭ、ＩＩ型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、腎臓腫瘍および他の病気に関連する腎臓機能不全のような腎臓障害を治療するのにも有用であり得る。
【０２９８】
（３）ＩＤＤＭ、ＭＳ、ＳＬＥ、重症筋無力症、慢性関節リウマチ、およびＩＢＤのような自己免疫疾患の治療においてｐＧ６ｂを介するシグナル伝達に拮抗し、増強し、増加させ、または開始すること。抗−ｐＧ６ｂ中和およびモノクローナル抗体はリンパ球または他の免疫細胞にシグナルを与えて、分化させ、増殖を改変し、またはサイトカイン、もしくは自己免疫性を軽減する細胞表面蛋白質の生産を変化させることができる。具体的には、Ｔ−細胞応答の変調は、自己免疫応答を逸脱させて、病気を緩和することができる（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：４８４１−４８４９，１９９８）。同様に、作動性抗−ｐＧ６ｂモノクローナル抗体を用いて、慢性関節リウマチ、喘息、アレルギーおよびアトピー性疾患に関与する免疫細胞にシグナルを送り、枯渇させて、逸脱させることができる。ｐＧ６ｂを介するシグナル伝達は、膵臓、腎臓、下垂体およびニューロン細胞の病気にも有益であり得る。ＩＤＤＭ、ＮＩＤＤＭ、膵臓炎、および膵臓癌腫にも有益であり得る。ｐＧ６ｂは、シグナル伝達ＭＡｂが癌の成長を阻害し、免疫−媒介殺傷を標的化する膵臓癌のＭＡｂ療法について標的として働くことができる（Ｔｕｔｔ，ＡＬら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：３１７５−３１８５，１９９８）。同様に、腎臓細胞癌腫は、本発明のｐＧ６ｂ−を含む可溶性受容体に対するモノクローナル抗体で治療することができる。
【０２９９】
本明細書中に記載された可溶性ｐＧ６ｂポリペプチドを用いて、上述した自己免疫疾患、アトピー性疾患、ＮＩＤＤＭ、膵臓炎および腎臓機能不全の治療において、単独で、または一緒にして、ｐＧ６ｂ活性に結合し、それをブロックし、阻害し、低下させ、拮抗し、または中和することができる。ｐＧ６ｂの可溶性形態を用いて、Ｔｈ細胞によって媒介される抗体応答を促進し、および／またはリンパ球または他の免疫細胞によるＩＬ−４または他のサイトカインの生産を促進することができる。
【０３００】
さらに、炎症は、侵入剤をかわすための生物による保護応答である。炎症は、多くの細胞性および液性メディエーターが関連するカスケーディング事象である。一方において、炎症応答の抑制は宿主を免疫寛容のままとすることができ；しかしながら、もしチェックせずに放置すれば、炎症は、慢性炎症病（例えば、乾癬、関節炎、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、炎症性腸疾患等）、敗血症ショックおよび多発性器官不全を含めた深刻な合併症に導き得る。重要なことには、これらの多様な病気状態は共通する免疫メディエーターを共有する。炎症によって特徴付けられる集合的病気は、ヒトの有病率および死亡率に対して大きなインパクトを有する。従って、ｐＧ６ｂ、そのカウンター受容体、および抗−ｐＧ６ｂ抗体のような免疫応答の共刺激および／または阻害に親密に関与する分子は、喘息およびアレルギーから自己免疫および敗血症ショックまでの膨大な数のヒトおよび動物病気に対して非常に重要な治療的能力を有することができるのは明らかである。
【０３０１】
１．関節炎
変形性関節炎、慢性関節リウマチ、負傷等の結果としての関節炎関節を含めた関節炎は、本発明のｐＧ６ｂポリペプチドのような抗−炎症蛋白質の治療的使用が有益である普通の炎症疾患である。例えば、慢性関節リウマチ（ＲＡ）は、全身に影響する全身病であって、関節炎の最も普通の形態の１つである。それは、疼痛、凝り、温かさ、発赤および腫れを引き起こす、関節内膜の炎症によって特徴付けられる。炎症細胞は、骨および軟骨を消化し得る酵素を放出する。慢性関節リウマチの結果として、膨張した関節内面である滑膜は、骨および軟骨を冒し、それを損傷しかねず、生理学的効果の中でも関節の破壊および酷い疼痛に導く。関連する関節はその形状および整列を失いかねず、疼痛および運動の喪失をもたらす。
【０３０２】
慢性関節リウマチ（ＲＡ）は、酷い無能力および増大した死亡率に導く炎症および引き続いての組織損傷によって特に特徴付けられる免疫−媒介病である。種々のサイトカインがリウマチ関節において局所的に生産される。多数の研究が、ＩＬ−１およびＴＮＦ−アルファ、２つのプロトタイプのプロ−炎症サイトカインは、滑膜炎症に、および進行性関せ悦は会に関与するメカニズムにおいて重要な役割を演じることを示している。事実、ＲＡを持つ患者におけるＴＮＦ−アルファおよびＩＬ−１阻害剤の投与は、炎症の臨床的および生物学的兆候の劇的な改善、および骨侵食および軟骨破壊の放射線学的兆候の低下に導いた。しかしながら、これらの楽観的結果にかかわらず、患者のかなりの割合がこれらの剤に応答せず、これは、他のメディエーターもまた関節炎の病理生理学に関与することを示唆する（Ｇａｂａｙ，Ｅｘｐｅｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．２（２）：１３５−１４９，２００２）。それらのメディエーターの１つはｐＧ６ｂまたはそのカウンター受容体であり得るが、それ自体、ｐＧ６ｂポリペプチド、または抗−ｐＧ６ｂ抗体、または結合パートナーのような、ｐＧ６ｂに結合し、またはその活性を阻害する分子は、慢性関節リウマチおよび他の関節病において炎症を低下させる価値ある治療剤として働き得る。
【０３０３】
当該分野で知られた慢性関節リウマチに対するいくつかの動物モデルがある。例えば、コラーゲン−誘導関節炎（ＣＩＡ）モデルにおいては、マウスは、ヒト慢性関節リウマチによく似た慢性炎症性関節炎を発症する。ＣＩＡはＲＡと共に同様な免疫学的および病理学的特徴を共有するので、これは、それを、潜在的ヒト抗−炎症化合物をスクリーニングするための理想的モデルとする。ＣＩＡモデルは、免疫応答、および炎症応答の双方に依存して起こるマウスにおけるよく知られたモデルである。免疫応答は、抗原として与えられた、コラーゲンに対してＢ−細胞およびＣＤ４＋Ｔ−細胞の相互作用を含み、抗−コラーゲン抗体の生産に導く。炎症相は、マウスの天然コラーゲンに交差反応し、補体カスケードを活性化するこれらの抗体のいくつかの結果として、炎症のメディエーターからの組織応答の結果である。ＣＩＡモデルを用いる利点は、病理の基本的メカニズムが知られていることである。ＩＩ型コラーゲンでの関連Ｔ−細胞およびＢ−細胞エピトープが同定されており、および免疫−媒介関節炎に関連する種々の免疫学的（例えば、遅延型過敏および抗−コラーゲン抗体）および炎症（例えば、サイトカイン、ケモカイン、およびマトリックス−分解酵素）パラメーターは決定されており、かくして、それを用いて、ＣＩＡモデルにおいてテスト化合物の効果を評価することができる（Ｗｏｏｌｅｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｒｈｅｕｍ．３：４０７−２０，１９９９；Ｗｉｌｌｉａｍら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．８９：９７８４−７８８，１９９２；Ｍｙｅｒｓら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６１：１８６１−７８，１９９７；ａｎｄ  Ｗａｎｇら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．９２：８９５５−９５９，１９９５）。
【０３０４】
２．内毒素血症
内毒素血症は、通常、細菌および他の感染症剤のような感染剤、敗血症、毒ショック症候群に由来し、あるいは日和見感染等に従う免疫寛容患者における酷い疾患である。本発明のｐＧ６ｂポリペプチドおよび抗体のような治療的に有用な抗−炎症蛋白質は、ヒトおよび動物において内毒素血症を予防し治療するのを助けることができる。ｐＧ６ｂポリペプチド、抗−ＩＬ２２ＲＡ抗体、または抗−ＩＬ−２２抗体または結合パートナーは、価値ある治療剤として働いて、内毒素血症において炎症および病理学的効果を低下させることができよう。
【０３０５】
リポ多糖（ＬＰＳ）誘導内毒素血症は、感染症における病理学的効果を生じるプロ炎症メディエーターの多くを連動しており、げっ歯類におけるＬＰＳ誘導内毒素血症は、潜在的プロ−炎症または免疫変調剤の薬理学的効果を研究するための広く用いられている許容されるモデルである。グラム−陰性菌で生産されたＬＰＳは敗血症ショックの病理学における主な病因である（Ｇｌａｕｓｎｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ  ３３８：７３２，１９９１）。ショック−様状態は、事実、ＬＰＳの動物への単一注射によって実験的に誘導することができる。ＬＰＳに応答する細胞によって生産された分子は病因を直接的にまたは間接的に標的化することができる。これらの生物学的応答が侵入する病因に対して宿主を保護するが、それらもまた害を引起し得る。かくして、酷いグラム−陰性菌感染の結果として起こる生来の免疫のかなりの刺激は、サイトカインおよび他の分子の過剰な生産、および発熱、低血圧、播種性、血管内凝固、および多発性器官不全によって特徴付けられる致命的症候群、敗血症ショック症候群の発生に導く（Ｄｕｍｉｔｒｕら、Ｃｅｌｌ  １０３：１０７１−１０８３，２０００）。
【０３０６】
ＬＰＳのこれらの毒性効果は、多数の炎症メディエーターの放出に導くマクロファージの活性に最も関連する。これらのメディエーターの中でも、ＴＮＦは、中和抗−ＴＮＦ抗体の投与によってＬＰＳ毒性の予防により示されるように、非常に重要な役割を演じるように見える（Ｂｅｕｔｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８６９，１９８５）。Ｅ．ｃｏｌｉのＬＰＳのＣ５７Ｂ１／６マウスへの１ｕｇ注射の結果、注射からほぼ２時間後に、循環ＩＬ−６、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１、および急性期蛋白質（例えば、ＳＡＡ）の有意な増加をもたらすであろうことはよく確立されている。ＬＰＳの毒性は、これらのサイトカインによって媒介されるように見える。というのは、これらのメディエーターに対する受動免疫化の結果、死亡率の減少がもたらされ得るからである（Ｂｅｕｔｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８６９，１９８５）。敗血症ショックの予防および／または治療のための潜在的免疫介入戦略は、抗−ＴＮＦ  ｍＡｂ、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、ＬＩＦ、ＩＬ−１０、およびＧ−ＣＳＦを含む。
【０３０７】
抗−ｐＧ６ｂ抗体または他のｐＧ６ｂ可溶性および融合蛋白質のこれらのＬＰＳ−誘導モデルへの投与を用いて、ｐＧ６ｂの使用を評価して、兆候を緩和し、およびＬＰＳ−誘導病のコースを変化させることができる。
【０３０８】
３．炎症性腸疾患（ＩＢＤ）
合衆国においてほぼ５００，０００人の人々が、結腸および直腸いずれか（潰瘍性結腸炎）、または小腸および大腸双方（クローン病）に影響し得る炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に罹っている。これらの病気の病因は不明瞭であるが、それらは影響された組織の慢性炎症に関連する。ｐＧ６ｂポリペプチド、抗−ｐＧ６ｂ抗体または都合ポートナーは、価値ある治療剤として働いて、ＩＢＤおよび関連する病気において炎症および病理学的効果を低下させることができよう。
【０３０９】
潰瘍性結腸炎（ＵＣ）は、結腸の粘膜または最も内面の炎症および潰瘍によって特徴付けられる、通常は結腸と呼ばれる大腸の炎症性疾患である。この炎症は結腸が頻繁に空となるようにし、下痢を引き起す。兆候は便の軟化および関連する腹部痙攣、発熱および体重喪失を含む。ＵＣの正確な原因は未知であるが、最近の研究は、身体の自然の防御が、身体外来性と考える身体中の蛋白質に対して作用していることを示唆する（「自己免疫反応」）。おそらくは、それらは腸中の細菌蛋白質に似ているので、これらの蛋白質は、結腸の内面を破壊し始める炎症プロセスを引き起こし、または刺激し得る。結腸の内面が破壊されるにつれ、潰瘍が形成され、粘膜、膿および血液を放出する。該病気は、通常、直腸領域で開始し、結局は全大腸を通じて拡大する。炎症の反復したエピソードは、瘢痕組織を持つ腸および直腸の壁の厚化に導く。結腸組織の死滅または敗血症が酷い病気と共に起こり得る。潰瘍性結腸炎の兆候は、重症度が変化し、それらの開始は徐々にであるか、または突然であり得る。攻撃は、呼吸器系感染またはストレスを含めた多くの因子によって誘発され得る。
【０３１０】
現在、利用できるＵＣに対する治癒はないが、治療は、結腸内面における異常な炎症プロセスを抑制することに焦点が当てられている。コルチコステロイド免疫抑制剤（例えば、アザチオプリン、メルカプトプリン、およびメトトレキサート）、およびアミノサリシレートを含めた治療が病気を治療するのに利用できる。しかしながら、コルチコステロイドおよびアザチオプリンのような免疫抑制剤の長期の使用の結果、骨の薄くなる変化、白内障、感染、および肝臓および骨髄効果を含めた酷い副作用をもたらしかねない。現在の療法が成功しない患者においては、外科的処置は任意である。外科的処置は全結腸および直腸の除去を含む。
【０３１１】
慢性潰瘍性結腸炎を部分的に模倣することができるいくつかの動物モデルがある。最も広く用いられるモデルは２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸／エタノール（ＴＮＢＳ）誘導結腸炎モデルであり、これは結腸において慢性炎症および潰瘍を誘導する。ＴＮＢＳが直腸内着用を介して罹患性マウスの結腸に導入される場合、それは結腸粘膜においてＴ−細胞媒介免疫応答を誘導し、この場合、大腸の全壁を通じてのＴ−細胞およびマクロファージの密な浸潤によって特徴付けられる多大な粘膜炎症に導く。さらに、この組織病理学的図写真には、進行性体重喪失（廃棄）、血の混じった下痢直腸脱出、および大腸壁厚化の臨床的様相が伴う（Ｎｅｕｒａｔｈら、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：５１−６２，２０００）。
【０３１２】
もう１つの結腸モデルはデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を用い、これは、血が混じった下痢、体重喪失、結腸の単化および好中球浸潤を伴う粘膜潰瘍によって発現される急性結腸炎を誘導する。ＤＳＳ−誘導結腸炎はリンパ過剰形成、局限性陰窩損傷、および上皮潰瘍と共に、固有層への炎症細胞の浸潤によって組織学的に特徴付けられる。これらの変化は上皮へのＤＳＳの毒性効果により、および固有層細胞のファゴサイトーシス、およびＴＮＦ−アルファおよびＩＦＮ−ガンマの生産によって発生すると考えられる。その通常の使用にもかかわらず、ヒト病気に対する還元性についてのＤＳＳのメカニズムに関するいくつかの論点は未解決のままである。ＤＳＳは、Ｔ細胞−非依存性モデルとして見なされる。なぜならば、それはＳＣＩＤマウスのようなＴ細胞−欠乏動物において観察されるからである。
【０３１３】
抗−ｐＧ６ｂ抗体または他の可溶性ｐＧ６ｂおよび融合蛋白質のこれらのＴＮＢＳまたはＤＳＳモデルへの投与を用いて、兆候を緩和し、および胃腸病のコースを改変するｐＧ６ｂの使用を評価することができる。さらに、ｐＧ６ｂによるＴ細胞シグナル伝達の阻害を示す結果は、ｐＧ６ｂまたはそれに対する抗体のような他のｐＧ６ｂアンタゴニストを用いて、結腸炎／ＰＩＢＤモデルにおける兆候を緩和し、および病気のコースを改変することもできるという概念の証拠を提供する。
【０３１４】
４．乾癬
乾癬は、７００万人を超えるアメリカ人を冒す慢性皮膚疾患である。乾癬は、新しい皮膚細胞が異常に成長し、その結果、炎症を起こし、腫れおよびうろこ状の皮膚のパッチがもたらされる場合に起こり、そこでは、古い皮膚は迅速に十分剥がれている。最も普通の形態であるプラーク乾癬は、銀色がかった白色うろこが頂部にある皮膚の炎症を起こしたパッチ（「病巣」」によって特徴付けられる。乾癬は少数のプラークに制限され得、または皮膚の中程度〜広範な領域が関与し、頭皮、膝、肘および導体で最も普通に出現する。それはかなり目に見えるが、乾癬は接触感染性病気ではない。該病気の病因は侵された組織の慢性炎症を含む。ｐＧ６ｂポリペプチド、抗−ｐＧ６ｂ抗体、または抗ＩＬ−２２および抗−ｐＧ６ｂ抗体または結合パートナーは、乾癬、他の炎症性皮膚病、皮膚および粘膜アレルギー、および関連病において炎症および病理学的効果を低下させる価値ある治療剤として働くことができる。
【０３１５】
乾癬は、かなりの不快感を引き起し得る皮膚のＴ−細胞媒介炎症障害である。それは、治癒しない病気であり、全ての年齢の人々を冒す。乾癬は、欧州および北米の人口のほぼ２パーセントを冒す。温和な乾癬に罹った個体は、しばしば、局所剤でその病気を制御できるが、世界中の１００万人を超える患者は紫外線または前進免疫抑制剤療法を必要とする。あいにくと、紫外線照射の不便および危険性、および多くの療法の毒性はその長期使用を制限する。さらに、患者は、通常、乾癬の再発を有し、いくつかの場合において、免疫抑制剤療法を停止して間もなくリバウンドが起こる。
【０３１６】
さらに、本発明の抗−ｐＧ６ｂ抗体およびｐＧ６ｂ可溶性受容体を、本明細書中に記載された多数の炎症病に関連する体重喪失に対する、ならびに、癌（例えば、化学療法および悪液質）、および感染症のための予防および治療で用いることができる。例えば、酷い体重喪失は、敗血症、ＭＳ、ＲＡについてのモデル、および腫瘍モデルについての鍵となるマーカーである。加えて、体重喪失は、癌、感染症、および炎症病を含めた多くの腓と病気についての鍵となるパラメーターである。本発明の可溶性ｐＧ６ｂ受容体およびそれに対する抗体のような抗−ｐＧ６ｂ抗体およびｐＧ６ｂアンタゴニストは、本明細書中に記載されたｐＧ６ｂアデノウイルスで注射したマウスにおいて体重喪失を予防し、および治療するその能力についてテストすることができる。そのようなｐＧ６ｂアンタゴニストのための予防的または治療的用法を決定する方法は当該分野で知られており、本明細書中で記載した方法を用いて、決定することができる。
【０３１７】
ｐＧ６ｂ可溶性受容体ポリペプチドおよびそれに対する抗体は、循環レベルのｐＧ６ｂまたはｐＧ６ｂカウンター受容体の検出用の診断システム内で、および急性期炎症応答に関連するｐＧ６ｂの検出において用いることもできる。関連する実施形態内で、本発明のｐＧ６ｂ可溶性受容体に特異的に結合する抗体または他の剤を用いて、循環受容体ポリペプチドを検出することができ、逆にｐＧ６ｂ受容体それ自体を用いて、循環するまたは局所的に作用するｐＧ６ｂポリペプチドを検出することができる。ｐＧ６ｂカウンター受容体またはｐＧ６ｂポリペプチドの上昇したまたは降下したレベルは、炎症または癌を含めた病理学的疾患を示すことができる。さらに、ｐＧ６ｂのような急性期蛋白質または分子の検出は、ある種の病気状態（例えば、乾癬、慢性関節リウマチ、結腸炎、ＩＢＤ）における慢性炎症疾患を示すことができる。そのような疾患の検出は病気診断において助けるように働き、ならびに適切な療法を選択するにおいて医師を助けるように働く。
【０３１８】
本明細書中に記載された他の病気モデルに加えて、ヒト感染病巣に由来する炎症組織に対する抗−ｐＧ６ｂ抗体の活性は、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスモデルを用いてインビボで測定することができる。いくつかのマウスモデルが開発されており、そこでは、ヒト細胞が免疫欠陥マウスに移植されている（集合的に、異種移植片モデルという）；例えば、Ｃａｔｔａｎ  ＡＲ，Ｄｏｕｇｌａｓ  Ｅ，Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．１８：５１３−２２，  １９９４  ａｎｄ  Ｆｌａｖｅｌｌ，ＤＪ，Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １４：６７−８２，１９９６参照。乾癬についてのインビボ異種移植片モデルとして、ヒト感染皮膚組織をＳＣＩＤマウスモデルに移植し、好適なアンタゴニストで攻撃する。さらに、当該分野における他の乾癬動物モデルを用いて、ＡＧＲ１２９マウスモデルに移植されたヒト感染皮膚移植片のようなｐＧ６ｂアンタゴニストを評価することができ、および好適なアンタゴニストで調製することができる（例えば、引用してここに援用するＢｏｙｍａｎ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｏｎｌｉｎｅ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ＃２００３１４８２，２００４）。ｐＧ６ｂの活性に結合し、ブロックし、阻害し、低下させ、拮抗し、または中和する抗ｐＧ６ｂ抗体は好ましいアンタゴニストであるが、（単独で、または他のＢ７アンタゴニストと組み合わせた）抗−ｐＧ６ｂ抗体、可溶性ｐＧ６ｂ、ならびに他のｐＧ６ｂアンタゴニストをこのモデルで用いることができる。同様に、ヒト結腸炎、ＩＢＤ、関節炎、または他の炎症病巣に由来する組織または細胞をＳＣＩＤモデルで用いて、本明細書中に記載されたｐＧ６ｂアンタゴニストの抗−炎症特性を評価することができる。
【０３１９】
抗−ｐＧ６ｂ抗体またはその誘導体、アゴニスト、コンジュゲートまたは変種を用いて炎症をなくし、遅らせ、または低下させるように設計された療法は、抗−ｐＧ６ｂ抗体または可溶性ｐＧ６ｂ化合物を、ヒト炎症組織（例えば、乾癬病巣等）を担うＳＣＩＤマウス、または本明細書中に記載された他のモデルに投与することによってテストすることができる。当該分野で良く知られた方法を用い、経時的に、治療した集団内で、治療の効果を増大した抗−炎症効果として測定し、統計学的に評価する。いくつかの例示的な方法は、限定されるものではないが、例えば、乾癬モデルにおいて、表皮の厚み、上部真皮中の炎症細胞の数、および錯角化のグレードを測定することを含む。そのような方法は当該分野で知られており、本明細書中に記載される。例えば、Ｚｅｉｇｌｅｒら、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ  ８１：１２５３，２００１；Ｚｏｌｌｎｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０９：６７１，２００２；Ｙａｍａｎａｋａら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：５０７，２００１；Ｒａｙｃｈａｕｄｈｕｒｉら、Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１４４：９３１，２００１；Ｂｏｅｈｎｃｋｅら、Ａｒｃｈ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｒｅｓ．２９１：１０４，１９９９；Ｂｏｅｈｎｃｋｅら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１６：５９６，２００１；Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４６：５８０，１９９５；Ｂｏｅｈｎｃｋｅら、Ｊ．Ｃｕｔａｎ．Ｐａｔｈｏｌ．２４：１，１９９７；Ｓｕｇａｉら、Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｃｉ．１７：８５，１９９８；およびＶｉｌｌａｄｓｅｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１２：１５７１，２００３参照。炎症が、フローサイトメトリー（またはＰＣＲ）のような周知の方法を用いて経時的にモニターして、試料に存在する炎症または病巣細胞の数、ＩＢＤについてのスコア（体重喪失、下痢、直腸出血、結腸の長さ）、手足病スコア、およびＣＩＡ  ＲＡモデルについての炎症スコアを定量することもできる。例えば、そのようなモデルにおいてテストするのに好適な治療的戦略は、ｐＧ６ｂとｐＧ６ｂカウンター受容体との相互作用の模倣または増大に基づき、あるいは抗−ｐＧ６ｂ抗体またはその誘導体、アゴニスト、コンジュゲートまたは変種のために、（単独でまたは他のＢ７アンタゴニストと共に）抗−ｐＧ６ｂ抗体、他のｐＧ６ｂアゴニスト、または関連コンジュゲートまたはアゴニストを用い直接的治療を含む。
【０３２０】
さらに、乾癬は、ＣＤ４＋記憶Ｔ細胞、好中球およびマクロファージを含めた、過形成表皮ケラチノサイトおよび浸潤性単核細胞に関連する慢性炎症皮膚病である（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓ，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１０：１９９，１９９６）。現在、環境抗原は、病気の病理学を開始し、それに寄与する重要な役割を演じていると考えられている。しかしながら、乾癬の病理学を媒介すると考えられるのは自己−抗原に対する許容性の喪失である。受動細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞は、病理学に導く免疫応答を媒介する抗原提示および認識において重要な役割を演じていると考えられる。我々は、最近、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢ導入モデルに基づく乾癬のモデルを開発した（Ｄａｖｅｎｐｏｒｔら、Ｉｎｔｅｒｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．２：６５３−６７２）。本発明の抗−ｐＧ６ｂ抗体、または可溶性ｐＧ６ｂをマウスに投与する。病気阻害のスコア（皮膚病巣、炎症性サイトカイン）は、乾癬におけるｐＧ６ｂアゴニスト、例えば、抗−ｐＧ６ｂ抗体の有効性を示す。
【０３２１】
５．アトピー性皮膚炎
ＡＤは、ヘルパーＴ細胞サブセット２（Ｔｈ２）の過剰活性化サイトカインによって特徴付けられる通常の慢性炎症病である。ＡＤの正確な病因は未知であるが、過剰活性Ｔｈ２免疫応答、自己免疫、感染、アレルゲン、および遺伝的素因を含めた、多数の因子が関連付けられている。病気の鍵となる特徴は乾燥症（皮膚の乾燥状態）、掻痒（皮膚の痒み）、結膜炎、炎症性皮膚病巣、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｓｕｓ  ａｕｒｅｕｓ感染、上昇した血液好酸球増加症、血清ＩｇＥおよびＩｇＧ１の上昇、およびＴ細胞、脾臓細胞、マクロファージを伴う慢性皮膚炎、および好酸球浸潤を含む。Ｓ．ａｕｒｅｕｓの集落化またはそれでの感染は、ＡＤを悪化させ、および皮膚病の慢性性を永続させると認められている。
【０３２２】
ＡＤは、しばしば、喘息およびアレルギーセ鼻炎を持つ患者で見出されており、頻繁には、アレルギー病の最初の発現である。西欧国における人工の約２０％はこれらのアレルギー病に罹っており、発展国におけるＡＤの発生率は未知の理由で上昇している。ＡＤは、典型的には、子供時代に開始し、しばしば、青春期から成人期を通じて執拗に存在し得る。ＡＤについての現在の治療は局所コルチコイド、経口サイクロスポリンＡ、タクロリムス（軟膏形態のＦＫ５０６）のような非−コルチコステロイド免疫抑制剤、およびインターフェロン−ガンマを含む。ＡＤについての多様な治療にもかかわらず、多くの患者の兆候は改善されず、あるいはそれらは投薬に対して有害な反応を有し、他のより効果的な治療剤の探索を必要とする。本発明の可溶性ｐＧ６ｂポリペプチドおよび抗−ｐＧ６ｂ抗体は、アトピー性皮膚炎、炎症性皮膚疾患、および本明細書中に開示された他の炎症疾患のような特異適否と病気の治療で用いることができる。
【０３２３】
医薬的使用では、本発明の可溶性ｐＧ６ｂまたは抗−ｐＧ６ｂ抗体は、慣用的な方法に従って、非経口、特に静脈内または皮下送達用に処方される。静脈内投与は、例えば、ミニ−ポンプまたは他の好適な技術を用いるボーラス注射、制御された放出によるものであり、または１〜数時間の典型的な時間にわたる注入によるものである。一般に、医薬処方は、セーライン、緩衝化セーライン、水中の５％デキストロース等のような医薬上許容される媒体と組み合わせた造血系蛋白質を含む。処方は、さらに、ウイルス表面の蛋白質喪失を妨げるための１つ以上の賦形剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤、アルブミンを含むことができる。そのような組合せ療法を利用する場合、サイトカインを単一処方に組み合わせてもよく、あるいは別々の処方で投与してもよい。処方の方法は当該分野で良く知られており、例えば、ここに引用して援用するＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ，１９９０に開示されている。治療用量は、一般には、１日当たり０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ患者体重の範囲、好ましくは、１日当たり０．５〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲であり、正確な用量は、治療すべき疾患の性質および重症度、患者の傾向等を考慮し、認められた標準に従って医師が決定する。用量の決定は当業者のレベル内である。蛋白質は、化学療法または骨髄移植から２８日までの期間にわたって、あるいは＞２０，０００／ｍｍ３、好ましくは＞５０，０００／ｍｍ３の血小板カウントが達成されるまで、通常投与される。最も普通には、蛋白質は１週間以内にわたって、しばしば、１〜３日の期間にわたって投与される。一般には、本発明の治療上有効量の可溶性ｐＧ６ｂまたは抗−ｐＧ６ｂ抗体は、成熟細胞（例えば、血小板または好中球）の循環レベルの増大として発現される、リンパ系またはミエロイド先祖細胞の増殖および／または分化の臨床的に有意な増加を生じるのに十分な量である。かくして、血小板障害の治療は、少なくとも２０，０００／ｍｍ３、好ましくは５０，０００／ｍｍ３の血小板カウントに到達されるまで継続する。本発明の可溶性ｐＧ６ｂまたは抗−ｐＧ６ｂ抗体もまた、ＩＬ−３、−６および−１１のような他のサイトカイン；幹細胞因子；エリスロポエチン；Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦと組合せて投与することもできる。組合せ療法の養生法内で、他のサイトカインの日用量は、一般には：ＥＰＯ，１５０Ｕ／ｋｇ；ＧＭ−ＣＳＦ，５−１５  ｌｇ／ｋｇ；ＩＬ−３，１−５  ｌｇ／ｋｇ；およびＧ−ＣＳＦ，１−２５  ｌｇ／ｋｇであろう。ＥＰＯとの組合せ療法は、例えば、低ＥＰＯレベルを持つ貧血患者において示される。
【０３２４】
一般に、投与される可溶性ｐＧ６ｇｂ（またはｐＧ６ｂ類似体または融合蛋白質）または抗−ｐＧ６ｂ抗体の用量は、患者の年齢、体重、背の高さ、性別、一般的医学的疾患および従前の医学的履歴のような因子に依存して変化するであろう。典型的には、約１ｐｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ（剤／患者の体重の量）の範囲にある可溶性ｐＧ６ｂまたは抗−ｐＧ６ｂ抗体の用量を受容者に供するのが望ましいが、より低いまたはより高い用量を状況が指令すれば投与してもよい。
【０３２５】
可溶性ｐＧ６ｂまたは抗−ｐＧ６ｂ抗体の対象への投与は静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、鞘内、領域的カテーテルを通じる灌流により、または直接的病巣内注射によるものであり得る。注射によって治療蛋白質を投与する場合、投与は連続的注入によって、または単一または多数のボーラスによるものであってよい。
【０３２６】
投与のさらなる経路は経口、粘膜、肺および経皮を含む。経口送達はポリエステルマイクロスフェア、ゼインマイクロスフェア、蛋白質様マイクロスフェア、ポリシアノアクリレートマイクロスフェア、および脂質−ベースの系に適している（例えば、ＤｉＢａｓｅ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｅｌ，”Ｏｒａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｒｅｎ（ｅｄｓ．）ｐａｇｅｓ  ２５５５−２８８（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ１９９７）参照）。鼻腔内送達の脂溶性はインスリン投与のそのような態様によって例示される（例えば、Ｈｉｎｃｈｃｌｉｆｆｅ  ａｎｄ  Ｉｌｌｕｍ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．３５：１９９（１９９９）参照）。ｐＧ６ｂを含む乾燥または液体粒子を調製し、乾燥−粉末ディスパーサー、液体アエロゾル発生器、またはネビュライザーの助けを借りて吸入することができる（例えば、Ｐｅｔｔｉｔ  ａｎｄ  Ｇｏｍｂｏｔｚ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １６：３４３，１９９８；Ｐａｔｔｏｎら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ３５：２３５，１９９９）。この手法はＡＤＲＸ糖尿病管理システムによって示され、これは、アエロゾル化インスリンを肺に送達する手で握ったエレクトロニック吸入器である。研究は、４８，０００ｋＤａのように多量の蛋白質が、経皮投与の脂溶性を示す低周波数超音波の助けを借りて治療濃度で皮膚を横切って送達されてきたことを示す（Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：８５０，１９９５）。エレクトロポレーションを用いる経皮送達は、ｐＧ６ｂ結合活性を有する分子を投与するもう１つの手段を提供する（Ｐｏｔｔｓら、Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：２１３，１９９７）。
【０３２７】
可溶性ｐＧ６ｂまたは抗−ｐＧ６ｂ抗体を含む医薬組成物は、公知の方法に従って処方して、医薬上有用な組成物を調製することができ、それにより、治療蛋白質は医薬上許容される担体との混合物に合わされる。もしその投与が受容者患者によって許容されるならば、組成物は「医薬上許容される担体」であるといわれる。滅菌リン酸−緩衝化セーラインは医薬上許容される担体の１つの例である。他の好適な担体は当業者に周知である。例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ１９９５）参照。
【０３２８】
療法の目的では、可溶性ｐＧ６ｂまたは抗−ｐＧ６ｂ抗体分子および医薬上許容される担体は治療上有効量にて患者に投与される。本発明の治療分子および医薬上許容される担体の組合せは、もし投与される量が生理学的に重要であるならば、「治療上有効量」で投与されるといわれる。もしその存在の結果、受容者患者の生理学の検出可能な変化がもたらされるならば、剤は生理学的に重要である。例えば、炎症を治療するのに用いる剤は、もしその存在が炎症応答を軽減するならば、生理学的に重要である。
【０３２９】
ｐＧ６ｂ（またはｐＧ６ｂ類似体または融合蛋白質）または抗−ｐＧ６ｂ抗体を含む医薬組成物は、液体形態、エアロゾル、または固体形態で仕上げることができる。液体形態は、注射溶液および経口懸濁液によって示される。例示的な固体形態は、カプセル、錠剤、および制御放出形態を含む。後者の形態はミニ浸透圧ポンプおよびインプラントによって示される（Ｂｒｅｍｅｒら、Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：２３９，１９９７；Ｒａｎａｄｅ，”Ｉｍｐｌａｎｔｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒａｎａｄｅ  ａｎｄ  Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  ９５−１２３（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）；Ｂｒｅｍｅｒら、”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｗｉｔｈ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｐｕｍｐｓ，”ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｒｅｎ（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  ２３９−２５４（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７）；Ｙｅｗｅｙら、”Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｉｍｐｌａｎｔ，”ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｒｅｎ（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  ９３−１１７（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７））。
【０３３０】
リポソームは、治療ポリペプチドを対象に静脈内、腹腔内、鞘内、筋肉内、皮下、または経口投与、吸入または鼻腔ない投与を介して送達する１つの手段を提供する。リポソームは、水性区画を囲う１つ以上の脂質二層よりなる巨視的小胞である（一般には、Ｂａｋｋｅｒ−Ｗｏｕｄｅｎｂｕｅｒｇら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１２（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ６１，１９９３；Ｋｉｍ，Ｄｒｕｇｓ  ４６：６１８，１９９３；およびＲａｎａｄｅ，”Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ａｓ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ，”ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒａｎａｄｅ  ａｎｄ  Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  ３−２４（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）参照）。リポソームは組成が細胞膜と同様であり、その結果、リポソームは安全に投与でき、生分解性である。調製の方法に応じて、リポソームは一層または多層であってよく、リポソームはサイズを変化させることができ、直径は０．０２μｍ〜１０μｍを超える範囲である。種々の剤はリポソームにカプセル化することができ：二層中の疎水性剤分配、および親水性剤の分配は内部水性空間内である（例えば、Ｍａｃｈｙら、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｌｉｂｂｅｙ  １９８７）、およびＯｓｔｒｏら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊ．Ｈｏｓｐ．Ｐｈｅｒｍ．４６：１５７６（１９８９）参照）。さらに、リポソームのサイズ、二層の数、脂質の組成、ならびにリポソームの電荷および表面特徴を変化させることによってカプセル化された剤の治療利用性を制御するのが可能である。
【０３３１】
リポソームは実質的にいずれのタイプの細胞にも吸着させることができ、次いで、ゆっくりとカプセル化剤を放出させることができる。別法として、吸収されたリポソームは食細胞である細胞によるエンドサイトーシスに付され得る。エンドサイトーシスに続いて、リポソーム脂質のリソソーム内分解、およびカプセル化剤の放出がある（Ｓｃｈｅｒｐｈｏｆら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．４４６：３６８，１９８５）。静脈内投与後に、小さなリポソーム（０．１〜１．０μｍ）は、主として肝臓および脾臓に局所化させる、網内皮細胞系の細胞によって取られ、他方、３．０μｍよりも大きなリポソームは肺に入れられる。網内皮細胞系の細胞によるより小さなリポソームのこの優先的取込みは、化学療法剤をマクロファージおよび患者の主要に送達するのに用いられてきた。
【０３３２】
網内皮細胞系は、大きな用量のリポソーム粒子での飽和、または薬理学的手段による選択的マクロファージ不活化を含めたいくつかの方法によって迂回することができる（Ｃｌａａｓｓｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ８０２：４２８，１９８４）。加えて、糖脂質−またはポリエチレングリコールまたは誘導体化リン脂質のリポソーム膜への取込みは、網内皮細胞系によるかなり低下した取込みをもたらすことが示されている（Ａｌｌｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０６８：１３３，１９９１；Ａｌｌｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１５０：９，１９９３）。
【０３３３】
リポソームは、リン脂質組成を変化させることによって、または受容体−カウンター受容体をリポソームに挿入することによって、特定の細胞または器官を標的化するように調製することもできる。例えば、高い含有量の非イオン性界面活性剤で調製されたリポソームは肝臓を標的化するのに用いられてきた（Ｈａｙａｋａｗａら、Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｐａｔｅｎｔ  ０４−２４４，０１８；Ｋａｔｏら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１６：９６０，１９９３）。これらの処方は、メタノール中でダイズホスファチジルコリン、α−トコフェロール、およびエトキシル化水素化ヒマシ油（ＨＣＯ−６０）を混合し、混合物を真空下で濃縮し、次いで、混合物を水で復元することによって調製した。大豆−由来ステテリルグリコシド混合物（ＳＧ）およびコレステロール（ＣＨ）とジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）とのリポソーム処方もまた肝臓を標的化することが示されてきた（Ｓｈｉｍｉｚｕら、ＢＩｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２０：８８１，１９９７）。
【０３３４】
別法として、抗体、抗体断片、炭水化物、ビタミンおよび輸送蛋白質のような種々の標的化カウンター受容体はリポソームの表面に結合させることができる。例えば、リポソームを分岐型ガラクトシル脂質誘導体で修飾して、専ら肝臓細胞の表面で発現されるアシアロ糖蛋白質（ガラクトース）受容体を標的化することができる（Ｋａｔｏ  ａｎｄ  Ｓｕｇｉｙａｍａ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．１４：２８７，１９９７；Ｍｕｒａｈａｓｈｉら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ２０：２５９，１９９７）。同様に、Ｗｕら（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２７：７７２，１９９８）は、アシアロフェツインでのリポソームの標識は短縮されたリポソーム血漿中半減期に導き、肝臓細胞によるアシアロフェツイン−標識リポソームの取込みを大いに高めたことを示している。他方、分岐型ガラクトシル脂質誘導体を含むリポソームの肝臓蓄積は、アシアロフェツインのプレ注射によって阻害することができる（Ｍｕｒａｈａｓｈｉら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２０：２５９，１９９７）。ポリアコニチル化ヒト血清アルブミンリポソームは、リポソームを肝臓細胞に標的化するためのもう１つの手法を提供する（Ｋａｍｐｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１１６８１，１９９７）。さらに、Ｇｅｈｏ，ｅｔ  ａｌ．米国特許第４，６０３，０４４号は、肝臓細胞−指向性リポソーム小胞送達系を記載しており、これは、肝臓の特殊化された代謝細胞に関連する肝胆汁性受容体に対する特異性を有する。
【０３３５】
組織標的化に対するより一般的な手法において、標的細胞を、該標的細胞によって発現されるカウンター受容体に特異的なビオチニル化抗体で予め標識する（Ｈａｒａｓｙｍら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．３２：９９，１９９８）。遊離抗体の血漿排除後に、ストレプトアビジン−コンジュゲーテッドリポソームが投与される。もう１つの手法において、標的化抗体はリポソームに直接的に付着される（Ｈａｒａｓｙｍ  ｅｔ  ａ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．３２：９９，１９９８）。
【０３３６】
ポリペプチドおよび抗体は、蛋白質マイクロカプセル化の標準的な技術を用いてリポソーム内にカプセル化することができる（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３１：１０９９，１９８１；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：１８５３，１９９０；Ｃｏｈｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １６３：９５，１９９１；Ａｌｖｉｎｇら、”Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ，”ｉｎ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．ＩＩＩ，Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｅｓ（ｅｄ．），ｐａｇｅ  ３１７（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９３）；Ｗａｓｓｅｆら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４９：１２４，１９８７参照）。上述したように、治療上有用なリポソームは種々の成分を含有することができる。例えば、リポソームはポリ（エチレングリコール）の脂質誘導体を含むことができる（Ａｌｌｅｎら、ＢＩｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１５０：９，１９９３）。
【０３３７】
分解可能ポリマーマイクロスフェアは、治療蛋白質の高い前進レベルを維持するように設計されてきた。マイクロスフェアはポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）、ポリアンヒドリド、ポリ（オルトエステル）のような分解性ポリマー、蛋白質がポリマーに捕獲されている非生分解性エチルビニルアセテートポリマーから調製される（Ｇｏｍｂｏｔｚ  ａｎｄ  Ｐｅｔｔｉｔ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．６：３３２，１９９５；Ｒａｎａｄｅ，”Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒａｎａｄｅ  ａｎｄ  Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  ５１−９３（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）；Ｒｏｓｋｏｓ  ａｎｄ  Ｍａｋｉｅｗｉｃｚ，”Ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｕｓｅｆｕｌ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｅｒｅｎ（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  ４５−９２（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７）；Ｂａｒｔｕｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１１６１，１９９８；Ｐｕｔｎｅｙ  ａｎｄ  Ｂｕｒｋｅ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：１５３，１９９８；Ｐｕｔｎｅｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：５４８，１９９８）。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−被覆ナノ粒子もまた、治療蛋白質の静脈内投与用の担体を提供することができる（例えば、Ｇｒｅｆら、Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：１６７，１９９７参照）。
【０３３８】
また、本発明では、ｐＧ６ｂモノマー、ホモダイマー、ヘテロダイマー、またはマルチマー化陽性受容体、およびｐＧ６ｂアンタゴニスト、例えば、抗−ｐＧ６ｂ抗体または結合ポリペプチド、または中和抗−ｐＧ６ｂ抗体のような結合ｐＧ６ｂ活性を有する化学的に修飾されたポリペプチドも考えられ、そのポリペプチドは先に議論したようにポリマーと連結される。
【０３３９】
他の投与形態は、例えば、Ａｎｓｅｌ  ａｎｄ  Ｐｏｐｏｖｉｃｈ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｌｅａ  ＆  Ｆｅｂｉｇｅｒ  １９９０），Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９５），およびＲａｎａｄｅ  ａｎｄ  Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ１９９６）によって示されているように当業者によって工夫できる。
【０３４０】
例として、医薬組成物は、ｐＧ６ｂ細胞外ドメインを持つポリペプチド、例えば、ｐＧ６ｂモノマー、ホモダイマー、ヘテロダイマーまたはマルチマー可溶性受容体、またはｐＧ６ｂアンタゴニスト（例えば、ｐＧ６ｂポリペプチドに結合する抗体または抗体断片、または中和抗−ｐＧ６ｂ抗体）を含む容器を含むキットとして用いることができる。治療ポリペプチドは、単一または多数の用量のための注射溶液の形態で、あるいは注射前に復元される滅菌粉末として供することができる。別法として、そのようなキットは、治療ポリペプチドの投与用の乾燥−粉末ディスパーサー、液体エアロゾル発生器、またはネビュライザーを含むことができる。そのようなキットは、さらに、適用症、および医薬組成物の用法についての書面による情報を含むことができる。さらに、そのような情報は、ｐＧ６ｂ組成物はｐＧ６ｂに対する既知の過敏を持つ患者において禁忌されるという陳述を含むことができる。
【０３４１】
抗−ｐＧ６ｂ抗体または結合パートナーまたは抗−ｐＧ６ｂ抗体断片、抗体融合、ヒト化抗体等）、またはｐＧ６ｂ可溶性受容体を含む医薬組成物は、液体形態、エアロゾル、固体形態で仕上げることができる。液体形態は、注射溶液、エアロゾル、液滴、トポロジー溶液および経口懸濁液によって示される。例示的な固体形態はカプセル、錠剤、および制御−放出形態を含む。後者の形態はミニ浸透圧ポンプおよびインプラントによって示される（Ｂｒｅｍｅｒら、Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：２３９，１９９７；Ｒａｎａｄｅ，”Ｉｍｐｌａｎｔｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒａｎａｄｅ  ａｎｄ  Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  ９５−１２３（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）；Ｂｒｅｎｅｒら、”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｗｉｔｈ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｐｕｍｐｓ，”ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｒｅｎ（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ２３９−２５４（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７）；Ｙｅｗｅｙら、”Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｉｍｐｌａｎｔ，”ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｒｅｎ（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  ９３−１１７（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７））。他の固体形態はクリーム、ペースト、他のトポロジー適用等を含む。
【０３４２】
リポソームは、治療ポリペプチドを対象に静脈内、腹腔内、鞘内、筋肉内、皮下、または経口投与、吸入または鼻腔ない投与を介して送達する１つの手段を提供する。リポソームは、水性区画を囲う１つ以上の脂質二層よりなる巨視的小胞である（一般に、Ｂａｋｋｅｒ−Ｗｏｕｄｅｎｂｅｒｇら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１２（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ６１，１９９３  Ｋｉｍ，Ｄｒｕｇｓ  ４６：６１８，１９９３；およびＲａｎａｄｅ，”Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ａｓ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ，”ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒａｎａｄｅ  ａｎｄ  Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ（ｅｄ．），ｐａｇｅｓ３−２４（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）参照）。リポソームは組成が細胞膜に似ており、その結果、リポソームは安全に投与でき、および生分解性である。調製の方法に依存し、リポソームは一層または多層であってよく、リポソームはサイズが変化することができ、直径は０．０２μｍ〜１０μｍを超える範囲である。種々の剤をリポソームにカプセル化することができ：二層中の疎水性剤分配、および親水性剤分配は内部水性空間内である（例えば、Ｍａｃｈｙら、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｌｉｂｂｅｙ  １９８７）、およびＯｓｔｒｏら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊ．Ｈｏｓｐ．Ｐｈａｒｍ．４６：１５７６，１９８９参照）。さらに、リポソームのサイズ、二層の数、脂質の組成、ならびにリポソームの電荷および表面特徴を変化させることによって、カプセル化された剤の治療的入手可能性を制御するのが可能である。
【０３４３】
リポソームは実質的にいずれのタイプの細胞にも吸着させることができ、次いで、ゆっくりとカプセル化された剤を放出することができる。別法として、吸収されたリポソームは食細胞である細胞によってエンドサイトーシスされ得る。エンドサイトーシスに続いて、リポソーム脂質のリソソーム内分解、およびカプセル化された剤の放出が起こる（Ｓｃｈｅｒｐｈｏｆら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．４４６：３６８，１９８５）。静脈内投与後に、小さなリポソーム（０．１〜１．０μｍ）は、典型的には、主として肝臓および脾臓に局所化した、網内皮細胞系の細胞によって取り込まれ、他方、３．０μｍを超えるリポソームは肺に入る。網内皮細胞系の細胞によるより小さなリポソームのこの優先的取込みは、化学療法剤をマクロファージにおよび患者の腫瘍に送達枢要に用いられてきた。
【０３４４】
網内皮細胞系は、リポソーム粒子の大容量での飽和、または薬理学的手段による選択的マクロファージ不活化を含めたいくつかの方法によって迂回することができる（Ｃｌａａｓｓｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ８０２：４２８，１９８４）。加えて、糖脂質−またはポリエチレングリコール−誘導体化リン脂質のリポソーム膜への取込みは、網内皮細胞系による有意に低下した取込みをもたらすことが示されている（Ａｌｌｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０６８：１３３，１９９１；Ａｌｌｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１５０：９，１９９３）。
【０３４５】
リポソームは、リン脂質組成を変化させることによって、あるいは受容体またはカウンター受容体をリポソームに挿入することによって、特定の細胞または器官を標的化するように調製することもできる。例えば、高含有量の非イオン性界面活性剤で調製されたリポソームは、肝臓を標的化するのに用いられてきた（Ｈａｙａｋａｗａら、Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｐａｔｅｎｔ  ０４−２４４，０１８；Ｋａｔｏら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１６：９６０，１９９３）。これらの処方はメタノール中でダイズホスファチジルコリン、α−トコフェロール、およびエトキシル化水素化ヒマシ油（ＨＣＯ−６０）を混合し、混合物を真空下で濃縮し、次いで、混合物を水で復元することによって調製した。ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）と、ダイズ−由来ステリルグリコシド混合物（ＳＧ）およびコレステロール（Ｃｈ）とのリポソーム処方もまた、肝臓を標的化することが示されている（Ｓｈｉｍｉｚｕら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２０：８８１，１９９７）。
【０３４６】
別法として、抗体、抗体断片、炭水化物、ビタミンおよび輸送蛋白質のような種々の標的化カウンター受容体をリポソームの表面に結合させることができる。例えば、リポソームは、分岐型ガラクトシル脂質誘導体で修飾して、専ら肝臓細胞の表面で発現されるアシアロ糖蛋白質（ガラクトース）受容体を標的化することができる（Ｋａｔｏ  ａｎｄ  Ｓｕｇｉｙａｍａ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．１４：２８７，１９９７；Ｍｕｒａｈａｓｈｉら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２０：２５９，１９９７）。同様に、Ｗｕら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２７：７７２，１９９８は、アシアロフェツインでのリポソームの標識は短縮されたリポソーム血漿中半減期に導き、肝臓細胞によるアシアロフェツイン−標識リポソームの摂取を大いに増強した。他方、分岐型ガラクトシル脂質誘導体を含むリポソームの肝臓蓄積は、アシアロフェツインのプレ注射によって阻害することができる（Ｍｕｒａｈａｓｈｉら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２０：２５９，１９９７）。ポリアコニチル化ヒト血清アルブミンリポソームは、リポソームを肝臓細胞に標的化するためのもう１つの手法を提供する（Ｋａｍｐｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１１６８１，１９９７）。さらに、Ｇｅｈｏ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，６０３，０４４号は、肝臓の特殊化された代謝細胞に関連する肝胆汁性受容体に対する特異性を有する肝臓細胞−指向性リポソーム小胞送達系を記載する。
【０３４７】
組織標的化に対するより一般的な手法において、標的細胞を、該標的細胞によって発現されるカウンター−受容体に対して特異的なビオチニル化抗体で予め標識する（Ｈａｒａｓｙｍら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．３２：９９，１９９８）。遊離抗体の血漿排除後、ストレプトアビジン−コンジュゲーテッドリポソームを投与する。もう１つの手法において、標的化抗体はリポソームに直接的に付着される（Ｈａｒａｓｙｍら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．３２：９９，１９９８）。
【０３４８】
抗−ｐＧ６ｂ中和抗体、およびｐＧ６ｂ結合活性を持つ結合パートナー、またはｐＧ６ｂ可溶性受容体を、蛋白質マイクロカプセル化の標準的技術を用いてリポソーム内にカプセル化することができる（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３１：１０９９，１９８１；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：１８５３，１９９０；Ｃｏｈｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１０６３：９５，１９９１；Ａｌｖｉｎｇら、  “Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ，”  ｉｎ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｖｏｌ．  ＩＩＩ，  Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ  （ｅｄ．），  ｐａｇｅ  ３１７  （ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９３）；  Ｗａｓｓｅｆら、  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １４９：１２４，  １９８７）。上述したように、治療的に有用なリポソームは種々の成分を含有することができる。例えば、リポソームはポリ（エチレングリコール）の脂質誘導体を含むことができる（Ａｌｌｅｎら、  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ    １１５０：９，１９９３）。
【０３４９】
分解性ポリマーマイクロスフェアは、治療蛋白質の高い前進レベルを維持するように設計されてきた。マイクロスフェアは、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）、ポリアンヒドリド、ポリ（オルトエステル）、非生分解性エチルビニルアセテートポリマーのような分解性ポリマーから調製され、ここに、蛋白質はポリマー中に捕獲されている（Ｇｏｍｂｏｔｚ  ａｎｄ  Ｐｅｔｔｉｔ，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ６：３３２，  １９９５；  Ｒａｎａｄｅ，  “Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”  ｉｎ  Ｄｒｕｇ    Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｒａｎａｄｅ  ａｎｄ  Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  （ｅｄｓ．），  ｐａｇｅｓ  ５１−９３  （ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）；  Ｒｏｓｋｏｓ  ａｎｄ  Ｍａｓｋｉｅｗｉｃｚ，  “Ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｕｓｅｆｕｌ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｓａｎｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｒｅｎ  （ｅｄｓ．），  ｐａｇｅｓ  ４５−９２  （Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７）；  Ｂａｒｔｕｓら、  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１１６１，  １９９８；  Ｐｕｔｎｅｙ  ａｎｄ  Ｂｕｒｋｅ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：１５３，  １９９８；  Ｐｕｔｎｅｙ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．
Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ２：５４８，  １９９８）。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）被覆ナノスフィアーもまた、治療蛋白質の静脈内投与用の担体を提供することができる（例えば、Ｇｒｅｆら、  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １０：１６７，  １９９７参照）。
【０３５０】
また、本発明では、先に議論したように、ポリマーと連結された、化学的に修飾された抗−ｐＧ６ｂ抗体または結合パートナー、例えば、抗−ｐＧ６ｂ抗体またはｐＧ６ｂ可溶性受容体が考えられる。
【０３５１】
他の投与形態は、例えば、Ａｎｓｅｌ  ａｎｄ  Ｐｏｐｏｖｉｃｈ，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  ５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｌｅａ  ＆  Ｆｅｂｉｇｅｒ  １９９０），  Ｇｅｎｎａｒｏ  （ｅｄ．），  Ｒｅｍｉｎｇｓｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９５）によって、および  Ｒａｎａｄｅ  ａｎｄ  Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  （ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９６）によって示されているように、当業者が工夫することができる。
【０３５２】
本発明では、抗−ｐＧ６ｂ抗体の組成物、および本明細書中に開示された抗体、ペプチドまたはポリペプチドを含む方法および治療的使用が考えられる。そのような組成物はさらに担体を含むことができる。担体は慣用的な有機または無機担体であり得る。担体の例は水、緩衝溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油等を含む。
【０３５３】
１１．トランスジェニックマウスの生産
ｐＧ６ｂまたはその修飾された形態をコードする核酸を用いて、トランスジェニック動物または「ノックアウト」動物を交代で作り出すこともでき、それは、治療に有用な試薬の開発およびスクリーニングで有用である。トランスジェニック動物（例えば、マウスまたはラット）は導入遺伝子を含有する細胞を有する動物であり、その導入遺伝子は誕生前、例えば、胚段階において動物または動物の先祖に導入された。導入遺伝子は、トランスジェニック動物がそれから発生した細胞のゲノムに組み込まれるＤＮＡである。１つの実施形態において、ｐＧ６ｂ蛋白質をコードするｃＤＮＡを用いて、確立された技術に従ってｐＧ６ｂ蛋白質をコードするゲノムＤＮＡをクローン化することができ、ゲノム配列を用いて、望まれるＤＮＡを発現する細胞を含有するトランスジェニック動物を作り出すことができる。トランスジェニック動物、特にマウスまたはラットのような動物を作り出す方法は当該分野で慣用的になっており、例えば、米国特許番号４，７３６，８８６号および４，８７０，００９号に記載されている。
【０３５４】
別法として、ｐＧ６ｂの非−ヒトホモログを用いて、動物の胚細胞に導入された、内因性遺伝子、およびｐＧ６ｂをコードする改変されたゲノムＤＮＡの間の相同組換えの結果としてｐＧ６ｂ蛋白質をコードする欠陥があるまたは改変された遺伝子を有する「ノックアウト」動物を構築することができる。例えば、ｐＧ６ｂ蛋白質をコードするｃＤＮＡを用いて、確立された技術に従って、ｐＧ６ｂ蛋白質をコードするゲノムＤＮＡをクローン化することができる。ｐＧ６ｂ蛋白質をコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失させ、あるいは組込未をモニターするのに用いることができる選択マーカーをコードする遺伝子のようなもう１つの遺伝子に置き換えることができる。典型的には、数キロベースの（５’および３’末端双方における）改変されていないフランキングＤＮＡをベクターに含ませる。例えば、Ｔｈｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｃａｐｅｃｃｈｉ，  Ｃｅｌｌ  ５１：５０３，  １９８７参照。ベクターは、（例えば、エレクトロポレーションによって）胚幹細胞系に導入し、次いで、導入されたＤＮＡが内因性ＤＮＡで相同組換えされた細胞を選択する。例えば、Ｌｉら、  Ｃｅｌｌ  ６９：９１５，  １９９２参照。次いで、選択された細胞を動物（例えば、マウスまたはラット）の胚盤胞に注射して、凝集キメラを形成する。例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，  ｉｎ  Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｅ．  Ｊ．  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，  ｅｄ．（ＩＲＬ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  １９８７），  ｐｐ．１１３−１５２参照。次いで、キメラ胚を好適な偽妊娠雌仮親動物に移植することができ、胚を出産まで導いて（ノックアウト）動物を作り出すことができる。その染色細胞において相同組換えＤＮＡを保有する子孫は標準的な技術によって同定し、それを用いて、動物の全ての細胞が相同組換えされたＤＮＡを含む動物を育種することができる。ノックアウト動物は、例えば、ある種の病理学的疾患に対して防御するそれらの能力について、およびｐＧ６ｂ蛋白質の不存在による病理学的疾患のそれらの発生について特徴付けることができる。本明細書中に記載されたモデルを変更することができるのは理解される。例えば、「ノック−イン」モデルを形成し、あるいは該モデルを動物モデルよりはむしろ細胞−ベースのものとすることができる。
【実施例】
【０３５５】
以下の非限定的実施例によって本発明をさらに説明する。
【０３５６】
（実施例１）
Ｂ７／ｍＦｃ２発現構築体
発現構築体ｐＺＭＰ２１  ｈＢ７−Ｈ１／ｍＦｃ２を、Ｂ７−Ｈ１のｃ−末端にＦｃが標識として付着された可溶性バージョンを発現するように調製した。７３４塩基対断片は、Ｂ７−Ｈ１の細胞外ドメインおよび、各々、５’および３’末端にコードされたＥｃｏＲＩおよびＢｇ１ＩＩ部位を持つｍＦｃ（グルタミンおよびプロリン）の最初の２つのアミノ酸を含有するＰＣＲによって作製した。
【０３５７】
ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーからの増幅によって、プライマーｚｃ４８９１４およびｚｃ４８９０８を用いてこのＰＣＲ断片を作製した。ＰＣＲ反応条件は以下の通りであった：１分間の９４℃、１分間の６０℃、および２分間の７２℃の２５サイクル；１０分間の７２℃の１サイクル；続いて４℃に浸漬。６９９塩基対断片は、エフェクター機能マイナスＢＡＬＢ−Ｃ  ＩｇＧ  ガンマ２ａ（ｍＦｃ２）の定常２および定常３ドメインを含有するＰＣＲによって作製した。このＰＣＲ断片は、ｍＦｃ２（ｍＴＡＣＩ／ｍＦｃ２  図＃９９８）を含有する発現ベクターからの増幅によってプライマーｚｃ４８９１１およびａｃ４８９１５を用いて作製した。ＰＣＲ反応条件は以下の通りであった：１分間の９４℃、１分間の６０℃、および２分間の７２℃の２５サイクル；１０分間の７２℃の１サイクル；続いての、４℃浸漬。７３４塩基対Ｂ７−Ｈ１断片および６９９塩基対ｍＦｃ２断片はＱｉａＱｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ：２８７０４）を用いる１％アガロースゲル電気泳動およびバンド精製によって精製した。各々、Ｂ７−Ｈ１およびｍＦｃ２断片についての精製されたバンドの合計の１／５および１／２５を、酵母株ＳＦ８３８−９Ｄアルファを用いて、上述したように、Ｂｇ１ＩＩ消化によって線状化され、バンド精製によって精製されたｐＺＭＰ２１に組み換えた。ウラシル欠乏寒天プレートから成長することができる酵母を溶解させ、エタノール沈殿によってＤＮＡを抽出した。２μｌの連結ミックスを、製造業者の指示に従って、３７μｌ  ＤＨ１０ＢエレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ（Ｇｉｂｃｏ  １８２９７−０１０）においてエレクトロポレーションを行った。形質転換された細胞を４００μｌのＬＢ倍地中で希釈し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢプレートに平板培養した。クローンを制限消化物によって解析し、陽性クローンをＤＮＡ配列決定のために送って、ＰＣＲ精度を確認した（正しい配列＝〜ａｍｆ／ｃｂｒａ．ｄｉｒ／ｐｚｍｐ２１−ｈＢ７Ｈｍｆｃ２−４３２２ｓｅｑ．ｓｅｑ．）。
【０３５８】
次いで、上述した発現ベクターｐＺＭＰ２１  ｈＢ７−Ｈ１／ｍＦｃ２を用いて、一連のｍＦｃ２可溶性キメラ蛋白質を作製した。ｐＧ６ｂ／ｍＦｃ２は、鋳型としてのクローントラック＃１０１６９７と共にオリゴｚｃ５０５９３およびｚｃ５０５９５を用いて４３１塩基対断片をＰＣＲに付すことによって作製した。得られたＰＣＲ産物を上述したようにバンドで精製し、ＥｃｏＲＩおよびＢｇ１ＩＩで消化した。得られた産物を再度バンドで精製した。ＰＺＭＰ２１  ｈＢ７−Ｈ１／ｍＦｃ２もまたＥｃｏＲＩおよびＢｇ１ＩＩで消化し、９７２１塩基対ベクター骨格＋ｍＦｃ２を単離した。ｐＺＭＰ２１  ｈＢ７−Ｈ１／ｍＦｃ２産物の１／５０を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて４３１塩基対断片の３／５０に連結した。製造業者の指示に従い、２μｌの連結ミックスを３７μｌ  ＤＨ１０ＢエレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ  （Ｇｉｂｃｏ  １８２９７−０１０）においてエレクトロポレーションに付した。形質転換された細胞を４００μｌのＬＢ培地に希釈し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢプレートに平板培養した。クローンを制限消化物によって解析し、陽性クローンをＤＮＡ配列決定のために送って、ＰＣＲ精度を確認した。正しい構築体をｈｐＧ６ＺＭＰ２１と命名した。
【０３５９】
２００μｇのｈｐＧ６ＺＭＰ２１構築体の３つの組を、各々、２００単位のＰｖｕ  Ｉで３７℃にて３時間消化し、次いで、ＩＰＡで沈殿させ、１．５ｍＬのミクロ遠心チューブ中で回転して沈降させた。上清をデカントしてペレットとし、ペレットを１ｍＬの７０％エタノールで洗浄し、室温にて５分間インキュベートした。チューブを１４，０００ＲＰＭにおいてミクロ遠心機中で１０分間回転させ、上清をデカントしてペレットとした。次いで、ペレットを、滅菌環境において７５０μｌのＰＦ−ＣＨＯ培地に再懸濁させ、６０℃にて３０分間インキュベートし、室温まで冷却した。５Ｅ６  ＡＰＦＤＸＢ１１細胞を３つのチューブの各々中で回転して沈降させ、ＤＮＡ培地溶液を用いて再懸濁させた。
【０３６０】
ＤＮＡ／細胞混合物を０．４ｃｍギャップキュベット中に入れ、以下のパラメーター：９５０μＦ、高キャパシタンス、および３００Ｖを用いてエレクトロポレーションに付した。次いで、キュベットの内容物を取り出し、プールし、ＰＦ−ＣＨＯ培地２５ｍＬで希釈し、１２５ｍＬ振盪フラスコに入れた。フラスコをシェーカー上のインキュベーターに３７℃、６％ＣＯ２にて入れ、１２０ＲＰＭで振盪した。
【０３６１】
細胞系を栄養選択、続いて、２００ｎＭメトトレキサート（ＭＴＸ）、次いで５００ｎＭＭＴＸまで抗体増幅した。発現をウェスタンブロットによって確認した。
【０３６２】
（実施例２）
ヒトｐＧ６ｂＡｖｉ−ＨｉｓＴａｇｐＺＭＰ２１
ヒトｐＧ６ｂの細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチドを含有する発現プラスミドのテトラマー分子を作製する取り組みにおいてＡｖｉ標識およびＨＩＳ標識を構築した。ヒトｐＧ６ｂの細胞外ドメインのＤＮＡ断片は、プライマーｚｃ５１１２０
【０３６３】
【化２】
2009538830.tif 000030
およびｚｃ５１１２２
【０３６４】
【化３】
2009538830.tif 000031
を用い、ベクター配列、およびヒトｐＧ６ｂ挿入点に近接するＡｖｉ  Ｔａｇ配列の部分に対応する５’および３’末端におけるフランキング領域と共にポリヌクレオ配列：
【０３６５】
【化１】
2009538830.tif 000032
を用いるＰＣＲによって単離した。
【０３６６】
ＰＣＲ反応混合物を、２％アガロースゲルで泳動させ、インサートのサイズに対応するバンドを、ＱＩＡｑｕｉｃｋＴＭゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてゲル−抽出した。プラスミドｐＺＭＰ２１は、ＭＰＳＶプロモーター、コーディング配列の挿入用の多重制限部位、停止コドン、Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点；ＳＶ４０プロモーター、エンハンサーおよび複製起点、ＤＨＦＲ遺伝子およびＳＶ４０ターミネーター含む哺乳動物選択マーカー発現単位；およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ選択および複製で必要なＵＲＡ３およびＣＥＮ−ＡＲＳ配列を有する発現カセットを含む哺乳動物発現ベクターである。それは、（アクセション番号７７１４５下でＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  １０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ  ２０１１０−２２０９に寄託した）ｐＲＳ３１６から取った酵母遺伝子エレメントと共に（アクセション番号９８６６８下でＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  １０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ  ２０１１０−２２０９に寄託した）ｐＺＰ９、ポリオウイルスからの内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）、および膜貫通ドメインのＣ−末端において切形されたＣＤ８細胞外ドメインから構築された。プラスミドｐＺＭＰ２１ＡｖｉＨＩＳをＥｃｏＲ１で消化し、ＰＣＲインサートでの組換えで用いた。
【０３６７】
組換えは、ＢＤ  Ｉｎ−ＦｕｓｉｏｎＴＭ  Ｄｒｙ−Ｄｏｗｎ  ＰＣＲクローニングキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて行った。ＰＣＲ断片および消化されたベクターの１０μｌ中の混合物を凍結乾燥されたクローニング試薬に加え、３７℃にて１５分間、および５０℃にて１５分間インキュベートした。反応は形質転換の準備ができていた。２μｌの組換え反応をワンショットＴＯＰ１０  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｉｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｂａｄ，  ＣＡ）に形質転換し；形質転換は氷上で１０分間インキュベートし、４２℃にて３０秒間熱ショックを与えた。反応を氷上で２分間インキュベートし、（形質転換された細胞が回収されるのを助けた）。２分間のインキュベーション後、３００μｌのＳＯＣ（２％  ＢａｃｔｏＴＭトリプトン（Ｄｉｆｃｏ，  Ｄｅｔｒｏｉｔ，  ＭＩ）、０．５％酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）、１０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、２０ｍＭのグルコース）を加え、形質転換をシェーカーにて３７℃で１時間インキュベートした。全形質転換を１つのＬＢ  ＡＭＰプレート（ＬＢ  （Ｌｅｎｎｏｘ）、１．８％ＢａｃｔｏＴＭ寒天（Ｄｉｆｃｏ）、１００ｍｇ／Ｌアンピシリン）上で平板培養した。
【０３６８】
コロニーを、プライマーｚｃ５１１２０およびｚｃ５１１２２を用いるＰＣＲによってスクリーニングした。陽性クローンを配列決定によって確認した。正しい構築体をｈＰＧ６ｂＡｖｉＨＩＳｐＺＭＰ２１と命名した。
【０３６９】
（実施例３）
Ｐｇ６ｂ抗体
ウサギに、ＢＳＡにコンジュゲートしたｐＧ６ｂ−マウス−Ｆｃ２融合蛋白質を注射した。ｐＧ６ｂに対する陽性血清力価を持つウサギから採血し、血清を収集した。血清をｐＧ６ｂ−Ｆｃ２アフィニティーカラムの使用によって精製した。
【０３７０】
モノクローナル抗体において、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＢＳＡにコンジュゲートしたｐＧ６ｂ−マウス−Ｆｃ２融合蛋白質で免疫化した。細胞発現ヒトｐＧ６ｂに対する陽性血清力価を持つマウスに、可溶性ｐＧ６ｂ−Ｆｃ融合蛋白質の灌流ブーストを与えた。脾臓細胞を１匹の高−力価マウスから収穫し、最適化されたＰＥＧ−媒介融合プロトコル（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）にてＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８／ＡＴＣＣ（マウス）ミエローマ細胞に融合させた。１２日の成長ポスト−融合後に、特異的な抗体−生産ハイブリドーマープールを、ＦＭＡＴ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）スクリーニングを用いて同定した。このアッセイにおいて、受容体提示細胞系（ｐ８１５−ｐＧ６ｂ）を１００μＬ／ウェル、５×１０４細胞／ｍｌにて９６ウェル組織培養プレート中に撒いた（アッセイランの前日に平板培養）。血清の（細胞培養基中の）系列１０倍希釈を、１：１００の初期希釈で開始して調製し、１：１００，０００の範囲までとした。次いで、各希釈の二連試料をアッセイプレートに移した；５μＬ／ウェル。二次抗体、ＦＭＡＴ  アオイロヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ特異的を細胞培養基中で０．２６μｇ／ｍｌまで希釈し、５０μＬ／ウェルを各ウェルに加えた。プレートを室温にて４時間、（ホイルに包んで）暗所でインキュベートした。プレートをＦＭＡＴ８２００細胞検出システムで読んだ。
【０３７１】
交差−反応性をチェックするために、試料を野生型ｐ８１５細胞に対してもチェックした。特異的抗体標的のみに対して陽性のハイブリドーマープールを、さらに、抗体標的としての親ｐ８１５細胞ではなくｐ８１５／ｐＧ６ｂ細胞にＦＡＣＳ解析を介して結合する能力について解析した（図２Ａ〜２Ｄ）。
【０３７２】
ＦＭＡＴアッセイにおいて特異的陽性結果、およびＦＡＣＳアッセイにおいて陽性結果を生じるハイブリドーマープールを、制限希釈によって少なくとも２回クローン化した。
【０３７３】
以下のマスターウェルおよびクローンを収穫し、アッセイで用いるために精製した：マスターウェル３３７．１、３３７．２、３３７．３、３３７．４、３３７．５、３３７．６および３３７．７；およびクローン３３７．８、３３７．１．７、３３７．３．３、３３７．６．５および３３７．８．３５。
【０３７４】
（実施例４）
ヒトＰＢＭＮＣでのｐＧ６ｂ発現
細胞を培養するために、正常な社内提供者からの血液をフィコールグラジエントで分離し、ＰＢＭＮＣ界面を収集し、ＰＢＳ中で洗浄した。細胞をカウントし、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳまたは抗−ＣＤ３＋抗−ＣＤ２８  ｍａｂ（各々、５０ｎｇ／ｍｌおよび１ｕｇ／ｍｌ）いずれかを含む２００ｕｌ培養基中にて２×１０５細胞／ウェルで９６ウェルをラウンド底部プレート中で平板培養した。いくつかの細胞を時刻０時点で保存した。細胞を時刻２４、４８および７２時間において染色のために収集した。
【０３７５】
各時点において、９６ウェルプレート中の細胞を回転させ、培地を軽く叩き、表面系列マーカーに対するフルオル−コンジュゲーテッド抗体の組合せを、５０μｌのＦａｃｓ染色緩衝液（ＣＤ５６−Ａ４８８、ＣＤ１９−ＰＥ、ＣＤ４５ＲＡ−Ｃｙｃｈｒｏｍｅ、ＣＤ４５ＲＯ−ＰＥ−Ｃｙ７、ＣＤ４−Ａ４０５、ＣＤ８−Ａ７００およびＣＤ１４−Ａ７５０）に加えた。該組合せはＡ６４７色素にカップリングさせたｍａｂ抗−ｐＧ６ｂ（３３７．８．３５）、または同様にカップリングさせた対照ｍａｂのいずれかを含んだ。いくつかの実験において、ｍａｂ抗−ｐＧ６ｂの結合を２０倍（ｇ／ｇ）過剰ｐＧ６ｂ受容体と競合させた。各条件を三連ウェル中で染色した。細胞を氷上で染色結合体と共に３０分間インキュベートし、次いで、Ｆａｃｓ緩衝液で１．５回洗浄し、２％パラホルムアルデヒド、１００ｕｌ／ウェルで室温にて１０分間固定した。プレートを回転させ、パラホルムアルデヒドを除去し、細胞を２００ｕｌのＦａｃｓ緩衝液に再懸濁させ、それらをＬＳＲＩＩで読むまで、４℃でホイルで被覆して貯蔵した。
【０３７６】
ＬＳＲＩＩデータをＦａｃｓＤｉｖａソフトウェアを用いて解析した。ＦＳＣ  Ｘ  ＳＳＣドットプロットを用いて、目に見える細胞集団ゲートを決定した。次いで、目に見える細胞を、抗−ｐＧ６ｂ−Ａ６４７−対−特異的系列マーカーのドットプロットを用いて抗−ｐＧ６ｂ結合について解析した。
【０３７７】
結果は、ｐＧ６ｂが休止ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞で発現され（図３Ａ〜３Ｄ参照）、および発現がＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞についての活性化でアップレギュレートされる（図４Ａおよび４Ｂ参照）ことを示した。ＣＤ１９＋に対して検出可能な結合は無く、およびＣＤ１４＋またはＣＤ１１ｃ細胞に対して競合可能な結合は無かった。ｐＧ６ｂの発現は、記憶Ｔ細胞に対してナイーブなＴ細胞ではより高かった（図５Ａおよび５Ｂ参照）。
【０３７８】
（実施例５）
Ｔ−細胞増殖はｐＧ６ｂ抗体によって変調される
ヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）からの精製されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖は、インビトロにてｐＧ６ｂに対する抗体によって阻害された。ＣＤ３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ５５５３２９）に対する抗体はＴ細胞抗原認識を模倣した。抗体によるＣＤ３およびＴ細胞受容体（ＴｃＲ）の侵入機序はシグナルを供して、インビトロにて増殖させた。このシグナルはさらなるシグナルによって増強され、または開始された。トシル活性化４．５μビーズ（Ｄｙｎａｌ  １４０．１３）に共有結合カップリングされたｐＧ６ｂに対する抗体は、５０〜９０％、インビトロにてＴ細胞の抗−ＣＤ３誘導増殖を阻害した（図６Ａ、６Ｂ、７Ａおよび７Ｂ参照）。共−刺激性抗−ＣＤ２８（ＢＤ  Ｂｉｏｓｉｃｅｎｃｅｓ  ５５５７２５）の添加は、抗−ｐＧ６ｂの阻害効果を部分的に克服した（図８Ａおよび８Ｂ参照）。さらに、抗−ｐＧ６ｂは初期活性化マーカーＣＤ６９およびＩＬ−２受容体ＣＤ２５の発現を阻害した（図９Ａ〜９Ｄ参照）。
【０３７９】
抗体を、以下のように、トシル活性化されたＤｙｎａｂｓ  Ｍ−４５０（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＳＡ，  Ｏｓｌｏ，  Ｎｏｒｗａｙ）にカップリングさせた：試料当たり５０μｌ（２×１０７ビーズ）を、２．６ｍｌのエッペンドルフチューブ中で、１ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４ｍ〜８．０で１回洗浄した。チューブを１分間磁石中に置き、上清を除去した。ビーズを、リン酸ナトリウム緩衝液を用いて元の容量中に再懸濁させた。２．５μｇ  抗−ＣＤ３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｉｃｅｎｃｅｓ  ５５５３２９）および１０μｇの抗−ｐＧ６ｂ、マウスＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）または抗−ＣＴＬＡ−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ：クローン＃４８８１５、カタログ番号ＭＡＢ３２５）を２．０ｍｌのエッペンドルフチューブ中で５０μｌの洗浄されたビーズと合わせた。ビーズのみ（抗体なし）の対照を含ませた。チューブを室温にて４８時間、Ｃｌａｙ  Ａｄａｍｓ  Ｎｕｔａｔｏｒミキサー（Ｂｅｃｔｉｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，  ＮＪ）上に置いた。次いで、チューブを磁石中に１分間置き、上清を除去した。次いで、被覆されたビーズを（Ｃａ２＋  およびＭｇ２＋なし）の１ｍｌのＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）および２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４で４回洗浄した。
【０３８０】
トシル活性化されたビーズを固相プラットフォームとして用い、抗−ＣＤ３および抗−ｐＧ６ｂをＴ細胞にケイジした。健康なボランティアからのヒトＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）密度勾配によって収集した。ある実施形態においては、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋を磁気ビーズカラム（（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）によってＰＢＭＣから共−精製した。Ｔ細胞をＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識して、フローサイトメトリーによって増殖を評価した。１×１０５ＣＦＳＥ−標識Ｔ細胞および１×１０５ビーズをＲＰＭＩ「完全」培地（１０％ＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのＮａ−ピルビン酸塩、０．１ｍＭのＮＥＡＡ、０．０５ｍＭのβ−ＭＥ）中でウェル当たり平板培養した。培地を１日間維持して、所期活性化マーカーを評価し、または３日間維持して、５％ＣＯ２において湿潤化インキュベーター中で増殖を評価した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の増殖を、個々の細胞集団でのゲーティング、およびＣＦＳＥ希釈の測定によって、ＬＳＲＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で測定した。特別な実施形態において、抗−ＣＤ２８（ＢＤ  Ｂｉｏｓｉｃｅｎｃｅｓ  ５５５７２５）を１μｇ／ｍｌの最終濃度にて溶液に加えた。
【０３８１】
可溶性抗体を用いる別々の実験において、抗−ｐＧ６ｂポリクローナル血清は、可溶性抗−ＣＤ３で刺激したヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の応答を阻害した（図１０Ａおよび１１Ｂ参照）。ヒトＰＢＭＣを健康なボランティアから調製し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）密度勾配によって収集した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋を磁気ビーズカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）によってＰＢＭＣから共−精製した。Ｔ細胞をＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識して、フローサイトメトリーによって増殖を評価した。１×１０５ＣＦＳＥ−標識Ｔ細胞および１００ｎｇ／ｍｌの抗−ＣＤ３をウェル当たり平板培養した。示された場合、抗−ｐＧ６ｂ、マウスＩｇＧまたは抗−ＣＴＬＡ−４を１μｇ／ｍｌの最終濃度で加えた。培養を３日間維持して、５％ＣＯ２において湿潤化されたインキュベーター中で増殖を評価した。個々の細胞集団でのゲーティング、およびＣＦＳＥ希釈の測定によって、ＣＤ４およびＣＤ８の増殖をＬＳＲＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で測定した。特別な実験において、抗−ＣＤ２８（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、１μｇ／ｍｌの最終濃度にて溶液に加えた。抗−ＣＤ２８を、ポリクローナル抗−ｐＧ６ｂを含有する培養に含めた結果、抗−ＣＤ３単独で観察されたものを超えた増大した増殖応答がもたらされた（図１０Ｂおよび１１Ｂ参照）。
【０３８２】
抗−ｐＧ６ｂの阻害性および刺激性双方の効果は、全てのテストした３／３ドナーが同様な活性を呈した点でドナー特異的ではなかった。
【０３８３】
上述したことから、本発明の特別な実施形態を説明目的でここに記載してきたが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく種々の修飾をなすことができるのは認識されるであろう。したがって、本発明は特許請求の範囲によるのを除いては制限されない。本明細書中で引用した全ての刊行物、特許および特許出願は、ここに引用して全ての目的でその全体を援用する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンパ球活性を変調するための組成物であって、該組成物は、ｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達を変調することができる生物活性剤を含み、該組成物を、ｐＧ６ｂ−陽性リンパ球と接触させて、少なくとも１つのリンパ球活性を変調することを特徴とする、組成物。
【請求項２】
前記剤がｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達のアンタゴニストを含み、前記組成物がｐＧ６ｂシグナル伝達によって媒介されるリンパ球活性の減衰を阻害する、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物がリンパ球活性を増加させる、請求項２記載の組成物。
【請求項４】
前記アンタゴニストが、ｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の機能的相互作用を妨害することができる遮断薬を含む、請求項２記載の組成物。
【請求項５】
前記遮断薬がｐＧ６ｂの細胞外ドメインに特異的に結合することができる抗―ｐＧ６ｂ抗体を含み、前記結合がｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の相互作用を妨害する、請求項４記載の組成物。
【請求項６】
前記遮断薬が可溶性ｐＧ６ｂ蛋白質を含む、請求項４記載の組成物。
【請求項７】
前記剤がｐＧ６ｂ―媒介シグナル伝達のアゴニストを含み、前記組成物がリンパ球活性を減少させる、請求項１記載の組成物。
【請求項８】
前記アゴニストがｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の機能的相互作用を模倣または増大させることができる剤を含む、請求項７記載の組成物。
【請求項９】
前記アゴニストがｐＧ６ｂの細胞外ドメインに特異的に結合することができる抗―ｐＧ６ｂ抗体を含み、前記結合がｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の機能的相互作用を模倣または増大させる、請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
前記リンパ球がＴリンパ球であって、前記リンパ球活性が活性化、分化、増殖、生存、細胞溶解活性、およびサイトカイン生産よりなる群から選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項１１】
前記リンパ球活性が標的抗原に対する宿主免疫応答を含み、前記標的抗原が病原体抗原、ワクチン抗原、およびそのカウンター受容体以外の腫瘍―関連抗原よりなる群から選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項１２】
対象において癌を治療するための組成物であって、該組成物は、ｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達のアンタゴニストを含み、該組成物は、該対象において腫瘍細胞に対する宿主免疫応答を増加させるために該対象に投与されることを特徴とする、組成物。
【請求項１３】
前記アンタゴニストがｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の機能的相互作用を妨害することができる遮断薬を含む、請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】
前記遮断薬がｐＧ６ｂの細胞外ドメインに特異的に結合することができる抗―ｐＧ６ｂ抗体を含み、前記結合はｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の相互作用を妨害する、請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
自己反応性ｐＧ６ｂ−陽性リンパ球の存在によって特徴付けられる自己免疫疾患を有する患者を治療するための組成物であって、該組成物は、ｐＧ６ｂ−媒介シグナル伝達のアゴニストを含み、該組成物は、ｐＧ６ｂを発現する非―リンパ系非―腫瘍宿主細胞に対する自己反応性免疫応答を阻害するために該患者に投与されることを特徴とする、組成物。
【請求項１６】
前記アゴニストがｐＧ６ｂおよびそのカウンター受容体の機能的相互作用を模倣または増大させることができる剤を含む、請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
前記アゴニストがｐＧ６ｂの細胞外ドメイン（配列番号３）に特異的に結合することができる抗―ｐＧ６ｂ抗体を含む、請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
単離された抗―ｐＧ６ｂ抗体であって、以下：
（ａ）該抗体は、ヒトｐＧ６ｂの細胞外ドメイン（配列番号３）に特異的に結合し、かつ（ｂ）該抗体は、マイクロビーズに共有結合によりカップリングして、該抗体の固定化形態を生じる場合、インビトロにてＴ細胞におけるＴｃＲ―媒介活性化を阻害することができ、該ＴｃＲ−媒介活性化は、該Ｔ細胞を、該マイクロビーズにもカップリングした作動性抗―ＣＤ３抗体と接触させる工程を含むことを特徴とする、抗体。
【請求項１９】
さらに、前記抗体の固定化形態が、前記抗―ｐＧ６ｂ抗体の非存在下において第二のマイクロビーズに共有結合によりカップリングされた抗―ＣＤ３と接触させる対照Ｔ細胞と比較して、少なくとも約５０％前記ＴｃＲ−媒介活性化を阻害することができることを特徴とする、請求項１８記載の抗―ｐＧ６ｂ抗体。
【請求項２０】
さらに、前記抗体の固定化形態がインビトロにて第二のＴ細胞において第二のＴｃＲ―媒介活性化を阻害することができ、該第二のＴｃＲ―媒介活性化は、該Ｔ細胞を、前記マイクロビーズに共有結合によりカップリングされた抗―ＣＤ３抗体、および可溶性の作動性抗―ＣＤ２８抗体と接触させる工程を含むことを特徴とする、請求項１８記載の抗―ｐＧ６ｂ抗体。
【請求項２１】
モノクロ−ナル抗体である、請求項１８記載の抗―ｐＧ６ｂ抗体。
【請求項２２】
単離された抗―ｐＧ６ｂ抗体であって、以下：
（ａ）該抗体はヒトｐＧ６ｂの細胞外ドメイン（配列番号３）に特異的に結合し、かつ（ｂ）可溶性形態の該抗体がインビトロにてＴ細胞におけるＴｃＲ―媒介活性化を阻害することができ、該ＴｃＲ―媒介活性化が、ＣＤ２８―媒介共刺激の非存在下において、該Ｔ細胞を、可溶性の作動性抗―ＣＤ３抗体と接触させる工程を含むことを特徴とする、抗体。
【請求項２３】
さらに、前記抗―ｐＧ６ｂ抗体の可溶性形態が、ＣＤ２８―媒介共刺激の非存在下において、かつ該抗体―ｐＧ６ｂ抗体の非存在下において、前記可溶性抗―ＣＤ３抗体と接触させる対照Ｔ細胞と比較して、少なくとも約５０％前記ＴｃＲ―媒介活性化を阻害することができることを特徴とする、請求項２２記載の抗―ｐＧ６ｂ抗体。
【請求項２４】
さらに、（ｃ）前記抗―ｐＧ６ｂ抗体の可溶性形態がインビトロにて第二のＴ細胞における第二のＴｃＲ―媒介活性化を増強させることができ、該第二のＴｃＲ―媒介活性化は、該第二のＴ細胞を、前記可溶性抗―ＣＤ３抗体および可溶性の作動性抗―ＣＤ２８抗体と接触させる工程を含むことを特徴とする、請求項２２記載の抗―ｐＧ６ｂ抗体。
【請求項２５】
さらに、前記抗―ｐＧ６ｂ抗体の可溶性形態が、前記抗―ｐＧ６ｂ抗体の非存在下において、前記可溶性抗―ＣＤ３抗体および前記可溶性抗―ＣＤ２８抗体双方と接触される対照Ｔ細胞と比較して、少なくとも約２０％前記第二のＴｃＲ−媒介活性化を増強させることができることを特徴とする、請求項２４記載の抗―ｐＧ６ｂ抗体。
【請求項２６】
モノクロ−ナル抗体である、請求項２２または２４記載の抗体。
【請求項２７】
Ｔ細胞活性化を阻害するための、請求項２２記載の抗体を含む組成物であって、該抗体は、ＣＤ２８―媒介Ｔ細胞共−刺激の非存在下でＴ細胞と接触し、ここで該Ｔ細胞のＴｃＲ−媒介活性化が阻害されることを特徴とする、組成物。
【請求項２８】
Ｔ細胞の活性化を増強させるための、請求項２４記載の抗体を含む組成物であって、該抗体は、ＣＤ２８−媒介Ｔ細胞共−刺激の存在下でＴ細胞と接触し、ここで該Ｔ細胞のＴｃＲ−媒介活性化が増強されることを特徴とする、組成物。
【請求項２９】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２７または２８記載の組成物。
【国際調査報告】
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