(57)【要約】  主題発明は、タンパク質産生のための真核細胞株を生成するための、部位特異的組込みシステムおよび方法を提供する。提供されるシステムは、第１の部位特異的に組み込む標的ベクターと、該当する遺伝子を有する第２の部位特異的に組み込むドナーベクターとを含む。また、主題方法ならびにシステムによって産生される哺乳類細胞株、および主題システムを含むキットも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
部位特異的に組み込む標的ベクターであって、
（ａ）第１の一方向性の部位特異的リコンビナーゼの存在下で、ゲノム組換え部位と再結合する第１のベクター組換え部位と、
（ｂ）前記第１の一方向性の部位特異的リコンビナーゼとは異なる第２の一方向性の部位特異的リコンビナーゼの存在下で、ドナー組換え部位と再結合する第２のベクター組換え部位と、
（ｃ）前記第２のベクター組換え部位の３’端と隣り合う第１の選択可能なマーカーの第１の部分と、
（ｄ）前記第１の選択可能なマーカーとは異なる第２の選択可能なマーカーと、を有することを特徴とする部位特異的に組み込む標的ベクター。
【請求項２】
前記ゲノム組換え部位は、哺乳類ゲノムの組換え部位であることを特徴とする請求項１に記載の標的ベクター。
【請求項３】
前記第１のベクター組換え部位は、細菌ゲノムの組換え部位（ａｔｔＢ）またはファージゲノムの組換え部位（ａｔｔＰ）であることを特徴とする請求項１に記載の標的ベクター。
【請求項４】
前記第１のベクター組換え部位は細菌ゲノムの組換え部位（ａｔｔＢ）であり、前記ゲノム組換え部位は偽性ファージゲノムの組換え部位（偽性ａｔｔＰ）であることを特徴とする請求項１に記載の標的ベクター。
【請求項５】
前記第１のベクター組換え部位はファージゲノムの組換え部位（ａｔｔＰ）であり、前記ゲノム組換え部位は偽性細菌ゲノムの組換え部位（偽性ａｔｔＢ）であることを特徴とする請求項１に記載の標的ベクター。
【請求項６】
前記第１のベクター組換え部位は、偽性細菌ゲノムのベクター組換え部位（偽性ａｔｔＢ）または偽性ファージゲノムの組換えａｔｔＰ部位（偽性ａｔｔＰ）であることを特徴とする請求項１に記載の標的ベクター。
【請求項７】
前記第２のベクター組換え部位は、細菌ゲノムの組換え部位（ａｔｔＢ）またはファージゲノムの組換え部位（ａｔｔＰ）であることを特徴とする請求項１に記載の標的ベクター。
【請求項８】
前記第２のベクター組換え部位は、偽性細菌ゲノムのベクター組換え部位（偽性ａｔｔＢ）または偽性ファージゲノムの組換えａｔｔＰ部位（偽性ａｔｔＰ）であることを特徴とする請求項１に記載の標的ベクター。
【請求項９】
前記第１の一方向性の部位特異的リコンビナーゼは、φＣ３１ファージのリコンビナーゼ、ＴＰ９０１−１ファージのリコンビナーゼ、Ｒ４ファージのリコンビナーゼ、φＦＣ１ファージのリコンビナーゼ、φＲｖ１ファージのリコンビナーゼ、またはφＢＴ１ファージのリコンビナーゼであることを特徴とする請求項１に記載の標的ベクター。
【請求項１０】
前記第１の一方向性の部位特異的リコンビナーゼは、φＣ３１ファージのリコンビナーゼであることを特徴とする請求項１に記載の標的ベクター。
【請求項１１】
前記第２の一方向性の部位特異的リコンビナーゼは、Ｒ４ファージのリコンビナーゼであることを特徴とする請求項１に記載の標的ベクター。
【請求項１２】
真核細胞のゲノム中の該当するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、部位特異的に組み込む方法であって、
（ａ）請求項１に記載の標的ベクターを、第１の一方向性の部位特異的リコンビナーゼを含む哺乳類細胞に導入し、前記第１のベクター組換え部位と前記ゲノム組換え部位との間の前記第１の一方向性の部位特異的リコンビナーゼによって媒介される組換えイベントに十分な条件下で前記哺乳類細胞を維持し、前記標的ベクターを前記哺乳類細胞の前記ゲノムに部位特異的に組み込むステップと、
（ｂ）ドナーベクターであって、該当するタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドおよびドナー組換え部位を含むドナーベクターを、第２の一方向性の部位特異的リコンビナーゼを含む標的細胞に導入し、前記標的細胞の前記ドナー組換え部位と前記第２のベクター組換え部位との間の前記第２の一方向性の部位特異的リコンビナーゼによって媒介される組換えイベントに十分な条件下で前記標的細胞を維持し、該当するタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドを、前記哺乳類細胞の前記ゲノムに部位特異的に組み込むステップと、を備え、
前記第１の一方向性の部位特異的リコンビナーゼは、前記第２の一方向性の部位特異的リコンビナーゼとは異なることを特徴とする方法。
【請求項１３】
該当するタンパク質を発現する細胞を選択するステップをさらに備えることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１のベクター組換え部位は、細菌ゲノムの組換え部位（ａｔｔＢ）またはファージゲノムの組換え部位（ａｔｔＰ）であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１のベクター組換え部位は細菌ゲノムの組換え部位（ａｔｔＢ）であり、該ゲノム組換え部位は偽性ファージゲノムの組換え部位（偽性ａｔｔＰ）であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１のベクター組換え部位はファージゲノムの組換え部位（ａｔｔＰ）であり、該ゲノム組換え部位は偽性細菌ゲノムの組換え部位（偽性ａｔｔＰ）であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１のベクター組換え部位は、偽性細菌ゲノムのベクター組換え部位（偽性ａｔｔＢ）または偽性ファージゲノムの組換えａｔｔＰ部位（偽性ａｔｔＰ）であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記第２のベクター組換え部位は、細菌ゲノムの組換え部位（ａｔｔＢ）またはファージゲノムの組換え部位（ａｔｔＰ）であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２のベクター組換え部位は、偽性細菌ゲノムのベクター組換え部位（偽性ａｔｔＢ）または偽性ファージゲノムの組換えａｔｔＰ部位（偽性ａｔｔＰ）であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記ドナー組換え部位は、細菌ゲノムの組換え部位（ａｔｔＢ）またはファージゲノムの組換え部位（ａｔｔＰ）であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
前記ドナー組換え部位は、偽性細菌ゲノムの組換え部位（偽性ａｔｔＢ）または偽性ファージゲノムの組換えａｔｔＰ部位（偽性ａｔｔＰ）であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１の一方向性の部位特異的リコンビナーゼは、φＣ３１ファージのリコンビナーゼ、ＴＰ９０１−１ファージのリコンビナーゼ、Ｒ４ファージのリコンビナーゼ、φＦＣ１ファージのリコンビナーゼ、φＲｖ１ファージのリコンビナーゼ、またはφＢＴ１ファージのリコンビナーゼであることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項２３】
前記第２の一方向性の部位特異的リコンビナーゼは、φＣ３１ファージのリコンビナーゼ、ＴＰ９０１−１ファージのリコンビナーゼ、Ｒ４ファージのリコンビナーゼ、φＦＣ１ファージのリコンビナーゼ、φＲｖ１ファージのリコンビナーゼ、またはφＢＴ１ファージのリコンビナーゼであることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１の一方向性の部位特異的リコンビナーゼは、φＣ３１ファージのリコンビナーゼであることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項２５】
前記第２の一方向性の部位特異的リコンビナーゼは、Ｒ４ファージのリコンビナーゼであることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項２６】
前記タンパク質は、分泌されたタンパク質であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項２７】
前記分泌されたタンパク質は抗体であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞は哺乳類細胞であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項２９】
前記哺乳類細胞はげっ歯類細胞であることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記げっ歯類細胞はＣＨＯ細胞であることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記哺乳類細胞はヒト細胞であることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記ヒト細胞はＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞であることを特徴とする請求項請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
単離された真核細胞であって、
（ａ）一方向性の部位特異的リコンビナーゼの存在下で、ドナー組換え部位と再結合するベクター組換え部位と、
（ｂ）前記ベクター組換え部位の３’端と隣り合う第１の選択可能なマーカーの第１の部分と、
（ｃ）前記第１の選択可能なマーカーとは異なる第２のマーカーと、
に隣接する第１のハイブリッド組換え部位および第２のハイブリッド組換え部位を有する、
ゲノムに組み込まれたポリヌクレオチドのカセットを有することを特徴とする単離された真核細胞。
【請求項３４】
前記ベクター組換え部位は、細菌ゲノムの組換え部位（ａｔｔＢ）またはファージゲノムの組換え部位（ａｔｔＰ）であることを特徴とする請求項３３に記載の単離された真核細胞。
【請求項３５】
前記ドナー組換え部位は、細菌ゲノムの組換え部位（ａｔｔＢ）またはファージゲノムの組換え部位（ａｔｔＰ）であることを特徴とする請求項３３に記載の単離された真核細胞。
【請求項３６】
前記一方向性の部位特異的リコンビナーゼは、φＣ３１ファージのリコンビナーゼ、ＴＰ９０１−１ファージのリコンビナーゼ、Ｒ４ファージのリコンビナーゼ、φＦＣ１ファージのリコンビナーゼ、φＲｖ１ファージのリコンビナーゼ、またはφＢＴ１ファージのリコンビナーゼであることを特徴とする請求項３３に記載の単離された真核細胞。
【請求項３７】
前記細胞は哺乳類細胞であることを特徴とする請求項３３に記載の単離された真核細胞。
【請求項３８】
前記哺乳類細胞はげっ歯類細胞であることを特徴とする請求項３７に記載の単離された真核細胞
【請求項３９】
前記げっ歯類細胞はＣＨＯ細胞であることを特徴とする請求項３８に記載の単離された真核細胞。
【請求項４０】
前記哺乳類細胞はヒト細胞であることを特徴とする請求項３７に記載の単離された真核細胞。
【請求項４１】
前記ヒト細胞はＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞であることを特徴とする請求項４０に記載の単離された真核細胞。
【請求項４２】
ポリヌクレオチドを、体外で細胞のゲノムに部位特異的に組み込むために使用するキットであって、
（ａ）請求項１に記載のベクターと、
（ｂ）（ｉ）マルチクローニング部位と、
（ｉｉ）ドナー組換え部位と、
（ｉｉｉ）前記ドナー組換え部位の５’端と隣り合う第１の選択可能なマーカーの第２の部分と、を含むドナーベクターと、
を含むことを特徴とするキット。
【請求項４３】
第１の一方向性の部位特異的リコンビナーゼ、またはそれをコードする核酸をさらに含むことを特徴とする請求項４２に記載のキット。
【請求項４４】
前記第１の一方向性の部位特異的リコンビナーゼとは異なる第２の一方向性の部位特異的リコンビナーゼ、またはそれをコードする核酸をさらに含むことを特徴とする請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
前記第１の一方向性の部位特異的リコンビナーゼは、φＣ３１ファージのリコンビナーゼ、ＴＰ９０１−１ファージのリコンビナーゼ、Ｒ４ファージのリコンビナーゼ、φＦＣ１ファージのリコンビナーゼ、φＲｖ１ファージのリコンビナーゼ、またはφＢＴ１ファージのリコンビナーゼであることを特徴とする請求項４３に記載のキット。
【請求項４６】
前記第２の一方向性の部位特異的リコンビナーゼは、φＣ３１ファージのリコンビナーゼ、ＴＰ９０１−１ファージのリコンビナーゼ、Ｒ４ファージのリコンビナーゼ、φＦＣ１ファージのリコンビナーゼ、φＲｖ１ファージのリコンビナーゼ、またはφＢＴ１ファージのリコンビナーゼであることを特徴とする請求項４４に記載のキット。
【請求項４７】
細胞内でタンパク質を産生するのに使用されるキットであって、
（ａ）請求項４３に記載の単離された真核細胞と、
（ｂ）（ｉ）マルチクローニング部位と、
（ｉｉ）ドナー組換え部位と、
（ｉｉｉ）前記ドナー組換え部位の５’端と隣り合う第１の選択可能なマーカーの第２の部分と、を含むドナーベクターと、
を含むことを特徴とするキット。
【請求項４８】
一方向性の部位特異的リコンビナーゼまたはそれをコードする核酸をさらに含むことを特徴とする請求項４７に記載のキット。
【請求項４９】
前記一方向性の部位特異的リコンビナーゼは、φＣ３１ファージのリコンビナーゼ、ＴＰ９０１−１ファージのリコンビナーゼ、Ｒ４ファージのリコンビナーゼ、φＦＣ１ファージのリコンビナーゼ、φＲｖ１ファージのリコンビナーゼ、またはφＢＴ１ファージのリコンビナーゼであることを特徴とする請求項４８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００６年５月２２日に出願された米国特許仮出願第６０／８０２，７１９号の利益を主張するものであり、参照することによりその全体を本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００２】
抗体のようなタンパク質が、様々な疾患に対する治療上および／または予防上の選択肢として浮上してきている。例えば、治療抗体の投与は、癌を罹患する個体、またはウイルス性病原体に曝露された、もしくは感染した個体の、治療および／または予防法に重要なストラテジーを提供する。
【０００３】
しかしながら、抗体のような高レベルの組換えタンパク質を産生する細胞株を生成する現在のプロセスには、労働集約的なクローニングおよびスクリーニングのステップが必要である。高収率のタンパク質を産生することができる細胞株の同定は、何百という細胞株のスクリーニングを必要とする、単調で時間のかかるプロセスである。この選択プロセスは、治療または予防の候補となる数多くのタンパク質をスクリーニングする可能性の妨げとなる。さらに、上記選択プロセスは、適時かつ費用効率の高いタンパク質の製造を遅らせることになる。
【０００４】
抗体のような治療タンパク質を発現する今日の哺乳類細胞株の大半は、タンパク質をコードする導入遺伝子のランダムなゲノムの組込みによって開発される。しかしながら、ランダムな組込みによるアプローチには重大な欠点がある。例えば、導入遺伝子の発現は、組み込まれる部位の染色体の量に依存するため、望ましくない位置における導入遺伝子の組込みは、導入遺伝子の発現が比較的低くなるという結果をもたらす。また、組込みは、「永続的に」形質移入された細胞が継代する最中に除去される傾向がある。さらに、導入遺伝子の発現は、染色体の望ましくない位置における導入遺伝子のランダムな組込みの結果として、「発現停止される」ことが多い。
【０００５】
したがって、治療薬および診断薬として用いられる高レベルの組換えタンパク質を産生することができる、安定した細胞株を迅速に生成および同定するための方法が必要である。本発明は、この必要性に対応する。
関連文献
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２１，３９２６−３４（２００１）
【非特許文献２】Ｇｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７，５９９５−６０００（２０００）
【非特許文献３】Ｇｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ  ３３５，６６７−７８（２００４）
【非特許文献４】Ｏｌｉｖａｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０，１１２４−８（２００２）
【非特許文献５】Ｏｒｔｉｚ−Ｕｒｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ８，１１６６−７０（２００２）
【非特許文献６】Ｏｒｔｉｚ−Ｕｒｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １４，９２３−８（２００３）
【非特許文献７】Ｏｒｔｉｚ−Ｕｒｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１１，２５１−５（２００３）
【非特許文献８】Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏ  ３０８，９９−１０６（２００５）
【非特許文献９】Ｏｌｉｖａｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２７８，１６７−７６（２００１）
【非特許文献１０】Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７７，４２１６−２０（１９８０）
【非特許文献１１】Ｔｒａｇｇｉａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ１０，８７１−５（２００４）
【非特許文献１２】Ｗｕｒｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２，１３９３−８（２００４）；Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １３，１１７−２３（２００２）
【非特許文献１３】Ｗｉｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ７３，４１９−２６（１９８８）
【非特許文献１４】Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ５８，７３−８４（１９９８）
【非特許文献１５】Ｇａｎｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ３７７，２９０−４（１９９５）
【非特許文献１６】Ｋｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６０，４４２−８（２００２）
【非特許文献１７】Ｃｏｑｕｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ８９，２１５−２５（１９９７）
【非特許文献１８】Ｓｔａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ５７，９０１−８（１９８９）
【非特許文献１９】Ｗｕｒｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ７８２，７０−８（１９９６）
【非特許文献２０】Ｗｕｒｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ２２，９５−１０２（１９９４）
【非特許文献２１】Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ  １７，６９−７５（２００１）
【非特許文献２２】Ｃｈａｐｐｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８，３３７９３−８００（２００３）
【非特許文献２３】Ｏｗｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８，１４７１−６（２００１）
【非特許文献２４】Ｃｈａｐｐｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９７，１５３６−１５４１（２０００）
【非特許文献２５】Ｗｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２，１４４０−４（２００４）
【非特許文献２６】Ｗｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂ  Ｅｎｇ  ７，１７４−８１（２００５）
【非特許文献２７】Ｃｈａｌｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ，３５７，２８−４８（２００６）
【非特許文献２８】Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ  １９，１６３−８（２００３）
【非特許文献２９】Ｍａｒｋｓ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ  ２２２，５８１−９７（１９９１）
【非特許文献３０】Ｓｂｌａｔｔｅｒｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ  ３，２７１−８（１９９８）
【非特許文献３１】Ｙａｍａｎａｋａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １１７，１２１８−２７（１９９５）
【発明の概要】
【０００７】
発明の開示
主題発明は、タンパク質産生のための真核細胞株を生成するための部位特異的組込みシステムおよび方法を提供する。提供されるシステムは、第１の部位特異的に組み込む標的ベクターと、該当する遺伝子を有する第２の部位特異的に組み込むドナーベクターとを含む。また、主題方法ならびにシステムによって産生される哺乳類細胞株、および主題システムを含むキットも提供される。
【０００８】
本発明の特徴は、第１の一方向性の部位特異的リコンビナーゼの存在下で、ゲノム組換え部位と再結合する第１のベクター組換え部位と；第１の一方向性の部位特異的リコンビナーゼとは異なる第２の一方向性の部位特異的リコンビナーゼの存在下で、ドナー組換え部位と再結合する第２のベクター組換え部位と；第２のベクター組換え部位の３’端と隣り合う第１の選択可能なマーカーの第１の部分と；上記第１の選択可能なマーカーとは異なる第２のマーカーとを含む、部位特異的に組み込む標的ベクターを提供する。
【０００９】
一部の実施形態においては、ゲノム組換え部位は真核ゲノムの組換え部位である。一部の実施形態においては、第１のベクター組換え部位は、細菌ゲノムの組換え部位（ａｔｔＢ）またはファージゲノムの組換え部位（ａｔｔＰ）である。他の実施形態においては、第１のベクター組換え部位は細菌ゲノムの組換え部位（ａｔｔＢ）であり、該ゲノム組換え部位は偽性ファージゲノムの組換え部位（偽性ａｔｔＰ）である。ある実施形態においては、第１のベクター組換え部位はファージゲノムの組換え部位（ａｔｔＰ）であり、該ゲノム組換え部位は偽性細菌ゲノムの組換え部位（偽性ａｔｔＢ）である。他の実施形態においては、第１のベクター組換え部位は、偽性細菌ゲノムのベクター組換え部位（偽性ａｔｔＢ）または偽性ファージゲノムの組換えａｔｔＰ部位（偽性ａｔｔＰ）である。一部の実施形態においては、第２のベクター組換え部位は、細菌ゲノムの組換え部位（ａｔｔＢ）またはファージゲノムの組換え部位（ａｔｔＰ）である。一部の実施形態においては、第２のベクター組換え部位は、偽性細菌ゲノムのベクター組換え部位（偽性ａｔｔＢ）または偽性ファージゲノムの組換えａｔｔＰ部位（偽性ａｔｔＰ）である。
【００１０】
一部の実施形態においては、第１の一方向性の部位特異的リコンビナーゼは、φＣ３１ファージのリコンビナーゼ、ＴＰ９０１−１ファージのリコンビナーゼ、Ｒ４ファージのリコンビナーゼ、φＦＣ１ファージのリコンビナーゼ、φＲｖ１ファージのリコンビナーゼ、またはφＢＴ１ファージのリコンビナーゼである。ある実施形態においては、第１の一方向性の部位特異的リコンビナーゼはφＣ３１ファージのリコンビナーゼである。ある実施形態においては、第２の一方向性の部位特異的リコンビナーゼはＲ４ファージのリコンビナーゼである。ある実施形態においては、φＣ３１ファージのリコンビナーゼは改変されたφＣ３１ファージのリコンビナーゼを含み、ＴＰ９０１−１ファージのリコンビナーゼは改変されたＴＰ９０１−１ファージのリコンビナーゼを含み、Ｒ４ファージのリコンビナーゼは改変されたＲ４ファージのリコンビナーゼを含む。
【００１１】
本発明の別の特徴は、標的ベクターを細胞のゲノムに部位特異的に組み込むために、第１の一方向性の部位特異的リコンビナーゼを含む真核細胞に標的ベクターを導入し、該細胞を、第１のベクター組換え部位とゲノム組換え部位との間の、第１の一方向性の部位特異的リコンビナーゼに媒介される組換えイベントに十分な条件下で維持すること；第２の一方向性の部位特異的リコンビナーゼを含む標的細胞に、該当するタンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびドナー組換え部位を含むドナーベクターを導入し、標的細胞を、標的細胞のドナー組換え部位と第２のベクター組換え部位との間の第２の一方向性の部位特異的リコンビナーゼによって媒介される組換えイベントに十分な条件下で維持することにより、真核細胞のゲノム中の該当するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを部位特異的に組み込む方法を提供すし、第１の一方向性の部位特異的リコンビナーゼは、第２の一方向性の部位特異的リコンビナーゼとは異なる。さらなる実施形態においては、上記方法は、該当するタンパク質を発現する細胞を選択することを含む。
【００１２】
一部の実施形態においては、第１のベクター組換え部位は、細菌ゲノムの組換え部位（ａｔｔＢ）またはファージゲノムの組換え部位（ａｔｔＰ）である。他の実施形態においては、第１のベクター組換え部位は細菌ゲノムの組換え部位（ａｔｔＢ）であり、該ゲノム組換え部位は偽性ファージゲノムの組換え部位（偽性ａｔｔＰ）である。ある実施形態においては、第１のベクター組換え部位はファージゲノムの組換え部位（ａｔｔＰ）であり、該ゲノム組換え部位は偽性細菌ゲノムのベクター組換え部位（偽性ａｔｔＢ）である。他の実施形態においては、第１のベクター組換え部位は、偽性細菌ゲノムのベクター組換え部位（偽性ａｔｔＢ）または偽性ファージゲノムの組換えａｔｔＰ部位（偽性ａｔｔＰ）である。一部の実施形態においては、第２のベクター組換え部位は、細菌ゲノムの組換え部位（ａｔｔＢ）またはファージゲノムの組換え部位（ａｔｔＰ）である。他の実施形態においては、第２のベクター組換え部位は、偽性細菌ゲノムのベクター組換え部位（偽性ａｔｔＢ）または偽性ファージゲノムの組換えａｔｔＰ部位（偽性ａｔｔＰ）である。一部の実施形態においては、ドナー組換え部位は、細菌ゲノムの組換え部位（ａｔｔＢ）またはファージゲノムの組換え部位（ａｔｔＰ）である。一部の実施形態においては、ドナー組換え部位は、偽性細菌ゲノムのベクター組換え部位（偽性ａｔｔＢ）または偽性ファージゲノムの組換えａｔｔＰ部位（偽性ａｔｔＰ）である。
【００１３】
一部の実施形態においては、第１の一方向性の部位特異的リコンビナーゼは、φＣ３１ファージのリコンビナーゼ、ＴＰ９０１−１ファージのリコンビナーゼ、Ｒ４ファージのリコンビナーゼ、φＦＣ１ファージのリコンビナーゼ、φＲｖ１ファージのリコンビナーゼ、またはφＢＴ１ファージのリコンビナーゼである。ある実施形態においては、第１の一方向性の部位特異的リコンビナーゼは、φＣ３１ファージのリコンビナーゼである。ある実施形態においては、第２の一方向性の部位特異的リコンビナーゼは、Ｒ４ファージのリコンビナーゼである。一部の実施形態においては、タンパク質は、栄養素の産生もしくは化学物質における酵素反応を行うために使用することができる酵素であるか、あるいは、栄養素として、またはヒトもしくは動物の疾患の治療もしくはその予防に有用かつ貴重なポリペプチド（例えばホルモン、免疫調節活性、抗ウイルス性および／または抗腫瘍性を有するポリペプチド（例えば、マスピン）、抗体、ウイルス抗原、ワクチン、凝固因子、酵素阻害剤、食品成分等）である。ある実施形態においては、タンパク質は、抗体のような分泌されたタンパク質である。一部の実施形態においては、細胞は哺乳類細胞である。一部の実施形態においては、哺乳類細胞はＣＨＯのようなげっ歯類細胞であるか、またはＤＧ４４のようなジヒドロ葉酸還元酵素欠損ＣＨＯ由来細胞株である。他の実施形態においては、哺乳類細胞はＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞のようなヒト細胞である。
【００１４】
本発明のさらに別の特徴は、一方向性の部位特異的リコンビナーゼの存在下で、ドナー組換え部位と再結合するベクター組換え部位と；ベクター組換え部位の３’端と隣り合う第１の選択可能なマーカーの第１の部分と；前記第１の選択可能なマーカーとは異なる第２のマーカーと、に隣接する第１のハイブリッド組換え部位および第２のハイブリッド組換え部位を有する、ゲノムに組み込まれたポリヌクレオチドのカセットを含む、単離された真核細胞を提供する。
【００１５】
一部の実施形態においては、ベクター組換え部位は、細菌ゲノムの組換え部位（ａｔｔＢ）またはファージゲノムの組換え部位（ａｔｔＰ）である。一部の実施形態においては、ドナー組換え部位は、細菌ゲノムの組換え部位（ａｔｔＢ）またはファージゲノムの組換え部位（ａｔｔＰ）である。一部の実施形態においては、一方向性の部位特異的リコンビナーゼは、φＣ３１ファージのリコンビナーゼ、ＴＰ９０１−１ファージのリコンビナーゼ、またはＲ４ファージのリコンビナーゼである。一部の実施形態においては、細胞は哺乳類細胞である。一部の実施形態においては、哺乳類細胞はＣＨＯのようなげっ歯類細胞であるか、またはＤＧ４４のようなジヒドロ葉酸還元酵素欠損ＣＨＯ由来細胞株である。他の実施形態においては、哺乳類細胞はＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞のようなヒト細胞である。
【００１６】
本発明のさらに別の特徴は、標的ベクターと；２つのプロモーター、該当するタンパク質が分泌される場合には２つのシグナル配列、遺伝子発現を制御するための２つの遺伝子調節スイッチ、発現を増加させるための２つの翻訳エンハンサー、２つのマルチクローニング部位、ドナー組換え部位、およびドナー組換え部位の５’端と隣り合う第１の選択可能なマーカー（例えば、プロモーター）の第２の部分を含むドナーベクターと、を含むポリヌクレオチドを体外で細胞のゲノムに部位特異的に組み込むために使用するキットを提供する。一部の実施形態においては、キットは、第１の一方向性の部位特異的リコンビナーゼ、またはそれをコードする核酸をさらに含む。さらなる実施形態においては、キットは、第１の一方向性の部位特異的リコンビナーゼとは異なる第２の一方向性の部位特異的リコンビナーゼ、またはそれをコードする核酸も含む。
【００１７】
一部の実施形態においては、第１の一方向性の部位特異的リコンビナーゼは、φＣ３１ファージのリコンビナーゼ、ＴＰ９０１−１ファージのリコンビナーゼ、Ｒ４ファージのリコンビナーゼ、φＦＣ１ファージのリコンビナーゼ、φＲｖ１ファージのリコンビナーゼ、またはφＢＴ１ファージのリコンビナーゼである。一部の実施形態においては、第２の一方向性の部位特異的リコンビナーゼは、φＣ３１ファージのリコンビナーゼ、ＴＰ９０１−１ファージのリコンビナーゼ、Ｒ４ファージのリコンビナーゼ、φＦＣ１ファージのリコンビナーゼ、φＲｖ１ファージのリコンビナーゼ、またはφＢＴ１ファージのリコンビナーゼである。
【００１８】
本発明のさらに別の特徴は、一方向性の部位特異的リコンビナーゼの存在下で、ドナー組換え部位と再結合するベクター組換え部位と、ベクター組換え部位の３’端と隣り合う第１の選択可能なマーカーの第１の部分と、第１の選択可能なマーカーとは異なる第２のマーカーと、に隣接する第１のハイブリッド組換え部位および第２のハイブリッド組換え部位を有するゲノムに組み込まれたポリヌクレオチドのカセットと；マルチクローニング部位と、ドナー組換え部位と、ドナー組換え部位の５’端と隣り合う第１の選択可能なマーカー（例えば、プロモーター）の第２の部分とを有するドナーベクターと、を有する単離された真核細胞を含む、真核細胞中にタンパク質を産生するのに使用されるキットを提供する。
【００１９】
一部の実施形態においては、キットは、一方向性の部位特異的リコンビナーゼ、またはそれをコードする核酸も含む。一部の実施形態においては、一方向性の部位特異的リコンビナーゼは、φＣ３１ファージのリコンビナーゼ、ＴＰ９０１−１ファージのリコンビナーゼ、Ｒ４ファージのリコンビナーゼ、φＦＣ１ファージのリコンビナーゼ、φＲｖ１ファージのリコンビナーゼ、またはφＢＴ１ファージのリコンビナーゼである。
【００２０】
以下でより十分に説明するように、本発明の詳細を読めば、当業者には、これらおよびその他の本発明の目的、利点、および特徴が明白になるであろう。
【００２１】
定義
「リコンビナーゼ」は、リコンビナーゼによって認識される特異的なＤＮＡ配列間の部位特異的組換えを媒介する、酵素のファミリーである（Ｅｓｐｏｓｉｔｏ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｓｃｏｃｃａ，Ｊ．Ｊ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５，３６０５−３６１４（１９９７）；Ｎｕｎｅｓ−Ｄｕｂｙ，Ｓ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２６，３９１−４０６（１９９８）；Ｓｔａｒｋ，Ｗ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８，４３２−４３９（１９９２））。このグループには、「インテグラーゼ」またはチロシンリコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅおよびλインテグラーゼを含む）および「リゾルバーゼ／インベルターゼ」またはセリンリコンビナーゼ（例えば、φＣ３１インテグラーゼ、Ｒ４インテグラーゼ、およびＴＰ−９０１インテグラーゼ）を含む、いくつかのサブファミリーがある。この用語は、例えば米国特許公報第２００２００９４５１６号に記載されるように（参照することにより、その開示全体が本願に援用される）、野生型と比較して改変されたリコンビナーゼも含む。
【００２２】
「一方向性の部位特異的リコンビナーゼ」は、φＣ３１インテグラーゼのような自然発生するリコンビナーゼ、一方向性や部位特異的組換え活性を保持する、変異したもしくは改変されたφＣ３１インテグラーゼのような変異したもしくは改変されたリコンビナーゼ、または、双方向性になるように修飾されたｃｒｅリコンビナーゼのような、双方向性になるように修飾された双方向性のリコンビナーゼである。
【００２３】
「改変されたリコンビナーゼ」および「変異リコンビナーゼ」は、起始生体に見られる天然の野生型リコンビナーゼ遺伝子が、親リコンビナーゼと比較して１つ以上の位置が変異したリコンビナーゼ酵素を指して（例えば、親リコンビナーゼと比較して改変されたリコンビナーゼにおいて、１つ以上のアミノ酸の改変をもたらす可能性がある１つ以上のヌクレオチドにおいて）、本明細書において交換可能に用いられる。「親リコンビナーゼ」は、改変されたリコンビナーゼが生成されるリコンビナーゼのヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列を指して用いられる。親リコンビナーゼは、自然発生する酵素（すなわち、天然または野生型の酵素）であっても、または非自然的に発生する酵素（例えば、遺伝子改変された酵素）であってもよい。本発明において該当する改変されたリコンビナーゼは、野生型酵素もしくは他の親酵素とは異なるＤＮＡ結合特異性および／または活性レベルを呈する。かかる改変された結合特異性は、リコンビナーゼが親酵素とは異なる所与のＤＮＡ配列と反応することを可能にし、改変された活性レベルは、リコンビナーゼがより高いまたは低い効率で反応することを可能にする。典型的には、リコンビナーゼの反応は、認識配列への結合ならびに協調的な切断および連結を行うことを含み、組み替えられる２つの認識部位の間で鎖交換反応をもたらす。
【００２４】
本明細書で用いられる「部位特異的組込み」または「部位特異的に組み込む」とは、典型的にはリコンビナーゼによって媒介される、第１の核酸と第２の核酸との配列特異的な組換えおよび組込みを指す。概して、部位特異的組換えまたは組込みは、リコンビナーゼによって認識される特定の定義された配列で生じる。ランダムな組込みとは対照的に、部位特異的組込みは、特定の配列（例えば、リコンビナーゼ付着部位）においてより高い効率で生じる。
【００２５】
ファージφＣ３１（すなわち、バクテリオファージφＣ３１）の天然のａｔｔＢおよびａｔｔＰ認識部位は、概して３４〜４０ヌクレオチド長である（Ｇｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：５９９５−６０００（２０００））。これらの部位は、典型的には次のように配置される：ａｔｔＢは、５’〜３’の相対順序ａｔｔＢ５’‐コア領域‐ａｔｔＢ３’で、第１のＤＮＡ配列ａｔｔＢ５’、コア領域、および第２のＤＮＡ配列ａｔｔＢ３’を含む。ＡｔｔＰは、５’〜３’の相対順序ａｔｔＰ５’‐コア領域‐ａｔｔＰ３’で、第１のＤＮＡ配列ａｔｔＰ５’、コア領域、および第２のＤＮＡ配列ａｔｔＰ３’を含む。φＣ３１のａｔｔＰおよびａｔｔＢのコア領域は、配列５’‐ＴＴＧ‐３’を有する。その他のファージインテグラーゼ（Ｒ４ファージインテグラーゼ等）およびそれらの認識配列も、本発明における使用に適している。
【００２６】
酵素反応はインテグラーゼの有効な基質ではない核酸の組換え産物を産生するので、これらの認識部位におけるインテグラーゼの作用は一方向性である。これは、検出可能なリコンビナーゼ媒介による除去がほとんどまたは全くない安定した組込み、すなわち「一方向性」の組換えという結果をもたらす。認識部位の対におけるインテグラーゼ作用の組換え産物は、例えば、５’〜３’の順序で、ａｔｔＢ５’‐組換え産物の部位配列‐ａｔｔＰ３’、およびａｔｔＰ５’‐組換え産物の部位配列‐ａｔｔＰ３’を含む。よって、標的ベクターがａｔｔＢ部位を含み、標的ゲノムがａｔｔＰ配列を含む場合は、典型的な組換え産物は配列（５’〜３’）：ａｔｔＰ５’‐ＴＴＧ‐ａｔｔＢ３’｛ベクター配列を標的とする｝ａｔｔＢ５’‐ＴＴＧ‐ａｔｔＰ３’を含む。ａｔｔＢおよびａｔｔＰ部位は異なる配列であるため、組換えの結果、ａｔｔＢ配列またはａｔｔＰ配列でもないハイブリッド部位特異的な組換え部位（ａｔｔＬまたはａｔｔＲを左および右に指定）がもたらされ、関連する一方向性の部位特異的リコンビナーゼのための部位特異的な組換え部位（例えば、ａｔｔＢまたはａｔｔＰ）として機能的に認識不能であるため、一方向性の部位特異的リコンビナーゼが、第１の組換え反応を逆転させるａｔｔＬとａｔｔＲとの間の第２の組換え反応を触媒するという可能性を排除することになる。
【００２７】
本明細書で用いられる「天然の認識部位」とは、細胞のゲノム中で自然に発生する認識部位（すなわち、例えば組換え手段によって、部位がゲノムに導入されていない）を意味する。
【００２８】
本明細書で用いられる「野生型組換え部位」は、インテグラーゼまたはリコンビナーゼによって通常用いられる組換え部位を意味する。例えば、λは、大腸菌に感染する溶原性バクテリオファージである。ファージは組換えのための１つの付着部位（ａｔｔＰ）を有し、大腸菌の細菌ゲノムは組換えのための１つの付着部位（ａｔｔＢ）を有する。これらの部位は両方ともλインテグラーゼのための野生型組換え部位である。本発明の文脈において、野生型組換え部位は、相同性のファージ／細菌システム内で生じる。したがって、野生型組換え部位は、相同性のシステムに由来して異種性の配列と関連していてもよく、例えば、ａｔｔＢ部位は、インテグラーゼのための基質としての役割を果たすために、他のシステムに留置することができる。
【００２９】
本明細書で用いられる「偽性部位」または「偽性組換え部位」とは、リコンビナーゼ酵素によって結合した認識部位を含むＤＮＡ配列を意味し、該認識部位は、野生型リコンビナーゼの認識酵素と比べて１つ以上のヌクレオチドにおいて異なり、および／または、リコンビナーゼのための野生型認識配列が属するゲノムの配列とは異なるゲノム中に、内在性の配列として存在する。所与のリコンビナーゼについては、偽性組換え配列が、野生型組換え配列と機能的に同等であり、リコンビナーゼが自然に認められる生体以外の生体に生じるため、野生型組換え配列に関連した配列多様性を有する可能性がある。一部の実施形態においては、「偽性ａｔｔＰ部位」または「偽性ａｔｔＢ部位」は、ファージφＣ３１のようなファージのインテグラーゼ酵素の、それぞれ野生型ファージ（ａｔｔＰ）または細菌の（ａｔｔＢ）付着部位配列のための認識部位に類似する偽性部位を指す。本発明の多くの実施形態において、偽性ａｔｔＰ部位は宿主細胞のゲノム中に存在し、野生型ａｔｔＢ部位は本発明のシステム内の標的ベクター上に存在する。「偽性ａｔｔ部位」は、偽性ａｔｔＰ部位または偽性ａｔｔＢ部位のいずれをも指すことができる、より一般的な用語である。ａｔｔ部位または偽性ａｔｔ部位は、線形または環状の核酸分子上に存在してもよいことが理解されよう。ある実施形態においては、標的細胞のゲノム中の「偽性組換え部位」は、組換え部位をゲノムに導入する必要がない。
【００３０】
本明細書で用いられる「ハイブリッド組換え部位」は、野生型および／または偽性組換え部位の一部から構築される組換え部位を指す。例として、野生型組換え部位は、パリンドロームと隣接する短いコア領域を有する可能性がある。「ハイブリッド組換え部位」の一実施形態においては、ハイブリッド組換え部位のコア領域配列の５’配列は、偽性組換え部位に一致し、ハイブリッド組換え部位のコアの３’配列は、野生型組換え部位に一致する。代替の実施形態においては、ハイブリッド組換え部位は、野生型ａｔｔＢ部位からのコアの５’領域および野生型ａｔｔＰ組換え部位からのコアの３’領域を含んでもよく、またはその逆であってもよい。かかるハイブリッド組換え部位のその他の組み合わせは、本明細書の教示を考慮すれば、当業者には明らかであろう。
【００３１】
「該当する核酸断片」とは、ゲノムへの挿入に適した任意の核酸断片を意味する。該当する核酸断片の好適な例は、プロモーター要素、治療遺伝子、マーカー遺伝子、制御領域、形質を生成する断片、遺伝子破壊を実現するための核酸要素等を含む。
【００３２】
細胞に形質移入する方法は、当該技術分野において周知である。「形質移入された」とは、外来性の核酸（通常はＤＮＡ）の取り込みに起因する、細胞内における改変を意味する。「形質移入」という用語の使用は、異質な核酸をいずれかの特定の方法への導入に制限することを意図するものではない。好適な方法は、ウイルス感染、抱合、電気穿孔、パーティクルガン法、リン酸カルシウム沈殿、直接微量注入等を含む。方法の選択は、概して、形質移入される細胞の種類、および形質移入が起こる状況（すなわち、体外、生体外、または体内）に依存する。これらの方法に関する一般的な考察は、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９５に見ることができる。
【００３３】
「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」という用語は、交換可能に用いられ、デオキシヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはその類似体である、任意の長さのヌクレオチドの重合体形態を指す。ポリヌクレオチドは、いずれの３次元構造であってもよく、既知または未知のいずれの機能を果たしてもよい。ポリヌクレオチドの制限されない例として、遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、制御領域、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーが挙げられる。核酸分子は線形および円形であってもよい。
【００３４】
ポリヌクレオチドは、典型的には４つのヌクレオチド塩基であるアデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；およびチミン（Ｔ）（ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合は、チミン（Ｔ）の代わりにウラシル（Ｕ））の特定の配列から成る。つまり、ポリヌクレオチド配列という用語は、ポリヌクレオチド分子のアルファベットで表したものである。このアルファベット表示は、中央処理装置を有するコンピュータ内のデータベースに入力して、機能的ゲノムおよびホモロジー検索のような生物学的な応用に用いることができる。
【００３５】
「コード配列」または選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、例えば、適切な調節配列（または「制御要素」）の制御下に置かれた場合に、体内で、ポリペプチドに転写された（ＤＮＡの場合）、およびポリペプチド翻訳された（ｍＲＮＡの場合）核酸分子である。コード配列の境界は、典型的には、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列は、ウイルス、原核生物または真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ；ウイルスまたは原核生物のＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列；および合成ＤＮＡ配列さえも含むが、これらに限定されない。転写終止配列は、コード配列の３’に位置していてもよい。その他の「制御要素」も、コード配列と関連している可能性がある。ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、所望のポリペプチドをコードする配列のＤＮＡ複製物を表すために、選択された細胞に好まれるコドンを用いることにより、選択された細胞における発現について最適化することができる。
【００３６】
「〜によってコードされる」は、ポリペプチド配列をコードする核酸配列を指し、ポリペプチド配列またはその一部は、核酸配列によってコードされたポリペプチドからの少なくとも３〜５のアミノ酸、より好ましくは少なくとも８〜１０のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも１５〜２０のアミノ酸の、アミノ酸配列を含有する。また、該配列によってコードされたポリペプチドで免疫学的に同定可能なポリペプチド配列も、包含される。
【００３７】
「作用可能に連結した」は、そのように記載された構成要素が、それらの通常の機能を果たすように構成された要素の配置を指す。よって、コード配列（例えば、レポーター発現カセット）に作用可能に連結した所与のプロモーターは、適切な酵素が存在する場合には、コード配列の発現に影響を与えることができる。プロモーターまたはその他の制御要素は、その発現を管理するために機能する限り、コード配列と接触する必要はない。例えば、未翻訳ではあるが転写された介在する配列がプロモーター配列とコード配列との間に存在してもよく、プロモーター配列はコード配列にさらに「作用可能に連結」しているとみなすことができる。
【００３８】
「ゲノムドメイン」とは、典型的には転写の最中にｍＲＮＡを産生するためにエクソンがスプライスされており、ｍＲＮＡはタンパク質産物（例えば、治療タンパク質等）をコードすることが多い、１つ以上の、典型的には複数のエクソンを含むゲノム領域を意味する。多くの実施形態において、ゲノムドメインは、所与の遺伝子のエクソンを含み、本明細書においては「遺伝子」と称されてもよい。標的化されたゲノムドメインの少なくともいくらかの転写が制御下で起こる場合には、主題方法に従ったゲノムドメインの転写の調整は、標的化されたゲノムドメインの転写を、対照と比較して少なくとも２倍、時には少なくとも５倍、またある時には少なくとも１０倍調整（例えば、増加または減少）する結果をもたらす。例えば、所与のゲノムドメインが、修飾されていない標的細胞（対照として用いられる）において低レベルでのみ発現させられる状況では、対照と比較して少なくとも２倍の増加を転写において得るために、表題方法が用いられてもよい。転写レベルは、任意の簡便なプロトコルを用いて決定することができ、転写レベルを決定するための代表的なプロトコルとして、ＲＮＡブロット法のハイブリダイゼーション、ＲＴ‐ＰＣＲ法、リボヌクレアーゼプロテクション法等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
「核酸構築物」とは、自然では共に認められない１つ以上の機能単位を構成するために構築された核酸配列を意味する。例として、環状、線形、二本鎖、染色体外ＤＮＡ分子（プラスミド）、コスミド（λファージからのＣＯＳ配列を含有するプラスミド）、外来の核酸配列を含むウイルスゲノム等が挙げられる。
【００４０】
「ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞に移入することができる。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、および「遺伝子移入ベクター」は、該当する遺伝子の発現を管理することができ、遺伝子配列を標的細胞に移入することができる、任意の核酸構築物を意味する。よって、この用語は、クローニング、発現ビヒクル、および組込みベクターを含む。
【００４１】
「発現カセット」は、該当する遺伝子／コード配列の発現を管理することができる、任意の核酸構築物を含む。かかるカセットは、発現カセットを標的細胞に移入するために、「ベクター」、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、または「遺伝子移入ベクター」内に構築されてもよい。よって、この用語は、クローニング、発現ビヒクル、およびウイルスベクターを含む。
【００４２】
本発明において、リコンビナーゼが「ファージに由来する」場合、リコンビナーゼはファージ自体から明示的に産生される必要はなく、ファージは単にリコンビナーゼおよびそのコード配列の本来の源とみなされる。リコンビナーゼは、例えば、当該技術分野で既知である方法によって、組換えでまたは合成的に産生されてもよく、またあるいは、リコンビナーゼは、ファージ感染した細菌培養液から精製されてもよい。
【００４３】
「実質的に精製された」は、概して、その物質（化合物、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、ポリペプチド組成物）が存在するサンプルの大半の割合を構成するような物質の単離を指す。サンプルにおいて典型的には、実質的に精製された構成要素は、サンプルの５０％、好ましくは８０％〜８５％、より好ましくは９０〜９５％を構成する。該当するポリヌクレオチドおよびポリペプチドを精製するための技術は、当該技術分野において周知であり、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、および密度による沈降法が挙げられる。
【００４４】
本明細書で定義される「外来性」という用語は、本明細書に定義されるＤＮＡ構築物等を用いて、本発明の方法によって細胞に導入されたＤＮＡとして定義される。外来性ＤＮＡは、形質移入前の細胞内に存在する外来性ＤＮＡと同等である、またはそれとは異なる配列を所有することができる。
【００４５】
「導入遺伝子」または「遺伝子導入要素」とは、人工的に導入された、宿主生体のゲノム中に存在する、染色体に組み込まれた核酸配列を意味する。
【００４６】
「遺伝子導入動物」という用語は、動物の１つ以上の細胞のゲノムに組み込まれた遺伝子導入要素を有する、ヒト以外の動物を意味する。本明細書で用いられる「遺伝子導入動物」は、よって、すべてまたはほぼすべての細胞が遺伝子修飾を含む動物（例えば、完全に遺伝子導入された動物、具体的には遺伝性の導入遺伝子を有する遺伝子導入された動物）、および動物の細胞のサブセットがゲノム的に組み込まれた導入遺伝子を含有するように修飾されたキメラ動物、遺伝子導入動物を包含する。
【００４７】
本明細書で用いられる「標的細胞」は、遺伝子の修飾が所望される細胞を指す。標的細胞は単離されていてもよく（例えば、培養液中に）、または多細胞生物中（例えば、胚盤胞中、胎児中、出生後の動物中等）にあってもよい。本願において特に該当する標的細胞は、ＣＨＯ細胞、幹細胞（例えば、胚性幹細胞（例えば、胚性幹細胞表現型を有する細胞）、成体幹細胞、多能性幹細胞、造血幹細胞、間充織幹細胞等）を含む培養された哺乳類細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
発明を実施するための最良の形態
主題発明は、タンパク質産生のための真核細胞株を生成するための、部位特異的組込みシステムおよび方法を提供する。提供されるシステムは、第１の部位特異的に組み込む標的ベクターと、該当する遺伝子を有する第２の部位特異的に組み込むドナーベクターとを含む。また、主題方法およびシステムによって産生される真核細胞株、ならびに主題システムを含むキットも提供される。
【００４９】
本発明について説明する前に、本発明は、説明される特定の実施形態に制限されるものではなく、当然変化してもよいということを理解されたい。また、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるため、本明細書で用いられる専門用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のものではあっても、制限されることを意図するものではないことを理解されたい。
【００５０】
値域が提供される場合には、文脈に別途明記されない限り下限の単位の１０分の１まで、その値域の上限と下限との間の各値も明確に開示されることを理解されたい。記載された任意の値または記載された値域の間にある任意の値と、記載されたその他の任意の値またはその記載された値域の間にある任意の値との間の、それぞれの小さな値域が本発明に包含される。これらの小さな値域の上限および下限は、独立して該値域に含まれてもまたは含まれなくてもよく、限界のいずれかまたは両方が小さな値域に含まれる、またはどちらも含まれない各値域も本発明に包含され、その記載された値域のいかなる特定の除外された限界ともなり得る。記載された値域が、限界の１つまたは両方を含む場合は、これらの除外された限界のいずれかまたは両方を含まない値域も、本発明に含まれるものとする。
【００５１】
別途定義されない限り、本明細書において用いられるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に説明されるものと類似するまたは同等であるいかなる方法および物質が、本発明の実践または試験において用いられてもよいが、いくつかの潜在的かつ好ましい方法および物質をここに説明する。本明細書に記載されるすべての出版物は、引用される出版物が関連する方法および／または物質を開示および説明するために、参照することにより本明細書に援用される。矛盾がある場合には、本開示が、援用された出版物のいかなる開示にも優先することを理解されたい。
【００５２】
本明細書および添付された特許請求の範囲において用いられる場合、文脈に別途明記されない限りは、単数形の単語は複数形の指示対象をも含むことに留意しなければならない。よって、例えば「細胞」という表現は、複数のかかる細胞を含み、「ベクター」とう表現は、１つ以上のベクターおよび当業者に既知であるその等価物を含む。
【００５３】
本明細書において論じられる出版物は、本願の出願日より前の開示についてのみ提供される。本明細書に記載されるいずれの記載事項も、本発明が、従来の発明によってかかる出版物に先行する権利がないことを認めると解釈されるべきではない。さらに、提供される出版日は、実際の出版日とは異なる可能性があり、個々に確認する必要がある場合もある。
【００５４】
概要
概して、本発明は、タンパク質の産生が可能な哺乳類細胞株の生成において用いられる、第１の部位特異的に組み込む標的ベクターと、該当する遺伝子を有する第２の部位特異的に組み込むドナーベクターを提供する。第１の一方向性の部位特異的インテグラーゼが、標的ベクター上に存在する第１のベクター部位特異的組換え部位および標的細胞のゲノム中のゲノム部位特異的組換え部位を認識して、第２の一方向性の部位特異的インテグラーゼのための標的部位特異的組換え部位が、標的細胞のゲノム中に有する標的ベクターに組込まれるように、標的ベクターの要素が選択される。
【００５５】
結果として得られた、第２の一方向性の部位特異的インテグラーゼのための標的部位特異的組換え部位を有する細胞株は、所望のタンパク質を産生することができる細胞株を効率的に生成するために用いることができる。該当するタンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび第２の一方向性の部位特異的インテグラーゼのためのドナー部位特異的組換え部位を有するドナーベクターが細胞株を導入することができ、ドナーベクターが標的細胞のゲノムに組み込まれる。導入遺伝子の組込みは、部位特異的な様式で管理することができるので、本発明は、望ましい位置での導入遺伝子の組込みを提供するため、また望ましくない位置での組込みによる導入遺伝子の低発現を回避するために、有用である。
【００５６】
ここより、本発明をさらに詳細に説明する。
【００５７】
ベクター
上述の通り、システムは、部位特異的組換え部位を標的細胞のゲノムに組み込むための標的ベクターと、該当するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、導入された部位特異的組換え部位に組み込むためのドナーベクターとを含む。ベクターは、典型的には環状であり、選択可能なマーカー、複製の起点、およびプロモーター、プロモーター‐エンハンサー配列、選択マーカー配列、複製の起点、誘導性の要素配列、エピトープタグ配列等、その他の要素も含有してもよい。例えば、米国特許第６，６３２，６７２号を参照（参照することにより、その開示のすべてを本明細書に援用する）。
【００５８】
本発明は、（ａ）第１の一方向性の部位特異的リコンビナーゼの存在下で、真核細胞のゲノム中のゲノム組換え部位と再結合することができる、第１のベクター部位特異的組換え部位と；（ｂ）第２の一方向性の部位特異的リコンビナーゼの存在下で、ドナーベクター上のドナー部位特異的組換え部位と再結合することができる、第２のベクター部位特異的組換え部位と；（ｃ）第２のベクター部位特異的組換え部位の３’側と隣り合う第１の選択可能なマーカーの第１の部分（例えば、プロモーターレスの第１の選択可能なマーカー）と；（ｄ）第１の選択可能なマーカーとは異なる第２の選択可能なマーカーおよび第２の一方向性の部位特異的リコンビナーゼとは異なる第１の一方向性の部位特異的リコンビナーゼとを含む、標的ベクターを提供する。例示的な標的ベクターを、図１に提供する。
【００５９】
本発明は、（ａ）マルチクローニング部位と；（ｂ）第２の一方向性の部位特異的リコンビナーゼの存在下で、標的ベクターの第２のベクター部位特異的組換え部位と再結合することができるドナー部位特異的組換え部位と；（ｃ）ドナー部位特異的組換え部位の５’側と隣り合う第１の選択可能なマーカー（例えば、プロモーター）の第２の部分とを含む、ドナーベクターも提供する。ある実施形態においては、ドナーベクターは、マルチクローニング部位に存在する、該当するタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。例示的なドナーベクターを、図２に提供する。
【００６０】
細菌および単細胞酵母からの一方向性の部位特異的リコンビナーゼの主要な２つのファミリーが説明されてきた。インテグラーゼまたはチロシンリコンビナーゼのファミリーは、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、Ｒ、およびλインテグラーゼ（Ａｒｇｏｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：４３３−４４０，（１９８６））を含み、リゾルバーゼ／インテグラーゼまたはセリンリコンビナーゼのファミリーは、ファージφＣ３１、Ｒ４、およびＴＰ９０１−１のような一部のファージを含む（Ｈａｌｌｅｔ  ａｎｄ  Ｓｈｅｒｒａｔｔ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２１：１５７−１７８（１９９７））。さらなる好適な部位特異的リコンビナーゼの記載については、米国特許第６，６３２，６７２号および米国特許公報第２００３００５０２５８号を参照（参照することにより、その開示のすべてを本明細書に援用する）。
【００６１】
ある実施形態においては、一方向性の部位特異的リコンビナーゼはセリンリコンビナーゼである。体外および体内での組換えに有用である可能性を持つセリンリコンビナーゼには、ファージφＣ３１、Ｒ４、ＴＰ９０１−１、ｐｈｉＢＴ１、Ｂｘｂｌ、ＲＶ−１、Ａ１１８、Ｕ１５３、およびｐｈｉＦＣ１からのインテグラーゼ、ならびに大きなセリンインテグラーゼファミリーの他のインテグラーゼ（Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｔｉｌｌ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８５：５３２０−５３２３（２００３）；Ｇｒｏｔｈ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．３３５：６６７−６７８（２００４）；Ｇｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ９７：５９９５−６０００（２０００）；Ｏｌｉｖａｒｅｓ，Ｈｏｌｌｉｓ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ，Ｇｅｎｅ  ２７８：１６７−１７６（２００１）；Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｐｅ，Ｍｏｌｅｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４：１２２−１２９（２００２）；Ｓｔｏｌｌ，Ｇｉｎｓｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８４：３６５７−３６６３（２００２））を含むが、これらに限定されない。これらの野生型インテグラーゼの他に、突然変異を生む改変されたインテグラーゼが産生されてきた（Ｓｃｌｉｍｅｎｔｉ，Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ，ＮＡＲ，２９：５０４４−５０５１（２００１））。これらのインテグラーゼは、野生型と比較して活性または特異性が改変されており、また、体外での組換え反応および真核生物ゲノムへの組込み反応に有用である。
【００６２】
代表的な実施形態において、第１の一方向性の部位特異的リコンビナーゼと、第２の一方向性の部位特異的リコンビナーゼとは異なるものである。それぞれの一方向性の部位特異的リコンビナーゼは、他方の一方向性の部位特異的リコンビナーゼの付着部位とは再結合しない、別々の部位特異的組換え部位（ａｔｔ部位または付着部位）を有する。２つの異なる一方向性の部位特異的リコンビナーゼを配列内に用いることにより（一方は標的ベクターの組込みのため、他方はドナーベクターの組込みのため）、標的ベクターのゲノム組込みのための付着部位と、ドナーベクターの組込みに用いられる付着部位との間の初期の標的ベクター内で、望まれない分子内組換えが起こる可能性がない。標的細胞のゲノムに組み込むことができないハイブリッド部位を形成するだけでなく、標的ベクターの重要な配列要素の消失をもたらす可能性があるため、かかる望まれない分子内組換えイベントを回避することが望ましい。
【００６３】
したがって、第１および第２の一方向性の部位特異的リコンビナーゼは、例えば、φＣ３１、Ｒ４、ＴＰ９０１−１、ｐｈｉＢＴ１、Ｂｘｂ１、ＲＶ−１、Ａ１１８、Ｕ１５３、およびｐｈｉＦＣ１等の異なるファージに由来するべきであるか、または、対応する野生型の一方向性の部位特異的リコンビナーゼによって認識される部位特異的組換え部位とは異なる部位特異的組換え部位を認識するファージと同一のファージに由来してもよいが、第１および第２の一方向性の部位特異的リコンビナーゼのうちの少なくとも１つは、改変された一方向性の部位特異的リコンビナーゼであってもよい。
【００６４】
概して、細菌ゲノム中の部位特異的リコンビナーゼによって認識される部位特異的組換え部位は、指定されたバクテリア付着部位（「ａｔｔＢ」）であり、バクテリオファージ中に存在する対応する部位特異的組換え部位は、指定されたファージ付着部位（「ａｔｔＰ」）である。これらの部位は、最短で約３４〜４０塩基対（ｂｐ）の長さである（Ｇｒｏｔｈ，Ａ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７，５９９５−６０００（２０００））。これらの部位は、典型的には次のように配置される：ａｔｔＢは、ａｔｔＢ５’‐コア領域‐ａｔｔＢ３’の相対順序で、第１のＤＮＡ配列ａｔｔＢ５’、コア領域、および第２のＤＮＡ配列ａｔｔＢ３’を含み；ａｔｔＰは、ａｔｔＰ５’‐コア領域‐ａｔｔＰ３’の相対順序で、第１のＤＮＡ配列（ａｔｔＰ５’）、コア領域、および第２のＤＮＡ配列（ａｔｔＰ３’）を含む。
【００６５】
例えば、ファージφＣ３１  ａｔｔＰ（ファージ付着部位）については、コア領域は５’−ＴＴＧ−３’であり、いずれかの側に隣接する配列は本明細書においてａｔｔＰ５’およびａｔｔＰ３’として表され、ａｔｔＰ組換え部位の構造は、したがって、ａｔｔＰ５’‐ＴＴＧ‐ａｔｔＰ３’である。それに対応して、天然の細菌ゲノム標的部位（ａｔｔＢ）は、コア領域は５’−ＴＴＧ−３’であり、いずれかの側に隣接する配列は本明細書においてａｔｔＢ５’およびａｔｔＢ３’として表され、ａｔｔＢ組換え部位の構造は、したがって、ａｔｔＢ５’‐ＴＴＧ‐ａｔｔＢ３’である。
【００６６】
ａｔｔＢ部位とａｔｔＰ部位は異なる配列であるため、ａｔｔＢ配列でもａｔｔＰ配列のいずれでもなく、関連する一方向性の部位特異的リコンビナーゼに対する部位特異的組換え部位（例えば、ａｔｔＢまたはａｔｔＰ）として機能的に認識不可能であるハイブリッドの部位特異的組換え部位（左および右に対して指定されたａｔｔＬまたはａｔｔＲ）をもたらし、よって、一方向性の部位特異的リコンビナーゼが、第１の組換え反応を逆行させるａｔｔＬとａｔｔＲとの間の第２の組換え反応を触媒する可能性を除外する。例えば、単一部位（φＣ３１インテグラーゼ媒介）の組換えイベントが起こった後には、以下の組換え産物がもたらされる：ａｔｔＢ５’‐ＴＴＧ‐ａｔｔＰ３’｛φＣ３１ベクター配列｝ａｔｔＰ５’‐ＴＴＧ‐ａｔｔＢ３’。典型的には、組換え後には、組換え後の組換え部位は、もはやφＣ３１リコンビナーゼのための基質としての役割を果たすことはできない。このことは、リコンビナーゼ媒介による除去がほとんどまたは全くない安定した組込みをもたらす。
【００６７】
天然の組換え部位が必ずしも野生型組換え配列（所与のリコンビナーゼのための）と同等のヌクレオチド配列を有すとは限らない、様々な生体のゲノムに天然の組換え部位が存在すると認められてきたが、それにもかかわらず、かかる天然の組換え部位は、リコンビナーゼによって媒介される組換えを促進するために十分である。かかる組換え部位配列は、本明細書において「偽性組換え配列」と称される。所与のリコンビナーゼについては、偽性組換え配列は、野生型組換え配列と機能的に同等であり、リコンビナーゼが自然に認められる生体以外の生体中で生じ、野生型組換え配列と関連した配列多様性を有する可能性がある。
【００６８】
偽性組換え配列の同定は、例えば、問い合わせ配列が該当する組換え部位（例えば、ａｔｔＰおよび／またはａｔｔＢ）である場合、配列アラインメントおよび分析を用いることにより、実現することが可能である。
【００６９】
標的細胞のゲノムに対して、所与のリコンビナーゼ、例えば、φＣ３１またはＲ４のａｔｔＰおよび／またはａｔｔＢのために選択された組換え部位に対する配列相同性を有する配列を検索することもできる。例えば、コンピュータを用いて核酸配列のデータベースを検索してもよい。Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ、ウィスコンシン州マジソン所在）が開発したＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０のＦｉｎｄＰａｔｔｅｒｎｓアルゴリズムは、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおけるすべての配列をスクリーニングするために用いられるプログラムの例である（Ｂｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６，１−７）。この点において、標的細胞内の偽性組換え部位を選択する際に、特定のリコンビナーゼまたは改変されたリコンビナーゼのいずれかに関連したａｔｔＰまたはａｔｔＢの配列を用いて、標的細胞のゲノム配列に対して好適な偽性組換え部位を検索することができる。これらの偽性組換え配列内で耐え得る異種性の機能的サイズおよび量は、例えば、改変された本発明のリコンビナーゼを用いて、標的にする構築物の組込み効率を評価することにより、経験的に評価することができる（組込みイベントを評価するための例示的な方法については、２０００年３月２日に発行されたＷＯ００／１１１５５を参照）。
【００７０】
機能的な偽性部位も、経験的に探すことができる。例えば、本発明を支持して行われた実験で、ヒト細胞のプラスミド保有φＣ３１  ａｔｔＢおよびネオマイシン耐性遺伝子に同時形質移入した後で、φＣ３１インテグラーゼを発現するプラスミドと共に、ａｔｔＢまたはインテグラーゼ遺伝子のいずれかが脱落した同時形質移入と比較して、ネオマイシン耐性コロニーの数の増加が認められた。これらのコロニーの大半は、天然の偽性ａｔｔＰ部位への組込みを反映した。かかる部位は、例えばプラスミドレスキューによって回収され、ＤＮＡ配列レベルで分析されて、例えば、ヒトゲノムからの偽性ａｔｔＰ部位のＤＮＡ配列を産生する。この偽性部位同定のための経験的な方法は、たとえリコンビナーゼ認識部位およびそれらに結合するリコンビナーゼの性質に関する詳細情報が未知である場合であっても、用いることができる。
【００７１】
一部の実施形態においては、標的ベクターの第１のベクター組換え部位は、第１の部位特異的リコンビナーゼに認識される細菌ゲノムの組換え部位（ａｔｔＢ）またはファージゲノムの組換え部位（ａｔｔＰ）である。かかる実施形態において、標的細胞のゲノムに存在するゲノム組換え部位は、対応する偽性組換え部位である。例えば、標的ベクターの第１のベクター組換え部位が細菌ゲノムの組換え部位（ａｔｔＢ）である場合、標的細胞のゲノム中に存在するゲノムの偽性組換え部位は、偽性ファージゲノムの組換え部位（偽性ａｔｔＰ）である。同じように、標的ベクターの第１のベクター組換え部位がファージゲノムの組換え部位（ａｔｔＰ）である場合、標的細胞のゲノム中に存在するゲノムの偽性組換え部位は、偽性細菌ゲノムのベクター組換え部位（偽性ａｔｔＢ）である。
【００７２】
一方向性の部位特異的リコンビナーゼの中には、偽性ファージ組換え部位（例えば、偽性ａｔｔＰ）よりも、偽性細菌組換え部位（例えば、偽性ａｔｔＢ）に優先的に組み込まれるものがある。これらの場合には、標的ベクターはファージ組換え部位（ａｔｔＰ）を保有し、偽性ａｔｔＢ部位に組み込まれる。この優先性を持つ酵素の例は、ｐｈｉＢＴ１インテグラーゼおよびＡ１１８インテグラーゼである。かかる実施形態において、標的ベクターの第１のベクター組換え部位はａｔｔＰ部位であり、標的細胞のゲノム中のゲノム組換え部位は、偽性ａｔｔＢ部位である。φＣ３１およびＲ４のような、その他の一方向性の部位特異的リコンビナーゼは、偽性細菌組換え部位（例えば、偽性ａｔｔＢ部位）よりも、偽性ファージ組換え部位（例えば、偽性ａｔｔＰ部位）に組み込まれることを好むため、標的ベクターはａｔｔＢ部位を保有し、偽性ａｔｔＰ部位（Ｇｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ，２０００；Ｏｌｉｖａｒｅｓ，Ｈｏｌｌｉｓ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ  ２００１）に組み込まれる。かかる実施形態において、標的ベクターの第１のベクター組換え部位はａｔｔＢ部位であり、標的細胞のゲノム中のゲノム組換え部位は偽性ａｔｔＰ部位である。
【００７３】
さらに、ある実施形態においては、標的ベクターの第１のベクター組換え部位は偽性組換え部位であり、標的細胞のゲノム中に存在するゲノム組換え部位は、第１の部位特異的リコンビナーゼによって認識される、対応する偽性組換え部位である。例えば、標的ベクターのベクター組換え部位が偽性細菌ゲノムのベクター組換え部位（偽性ａｔｔＢ）である場合、標的細胞のゲノム中に存在する偽性組換え部位は偽性ファージゲノムの組換え部位（偽性ａｔｔＰ）である。同じように、標的ベクターの第１のベクター組換え部位が偽性ファージゲノムの組換え部位（偽性ａｔｔＰ）である場合、標的細胞のゲノム中に存在する偽性組換え部位は偽性細菌ゲノムのベクター組換え部位（偽性ａｔｔＢ）である。
【００７４】
一部の実施形態においては、標的ベクターの第２のベクター組換え部位は、第２の部位特異的リコンビナーゼによって認識される細菌ゲノムの組換え部位（ａｔｔＢ）またはファージゲノムの組換え部位（ａｔｔＰ）である。かかる実施形態において、ドナーベクター上のドナー組換え部位は、対応する組換え部位である。例えば、標的ベクターの第２のベクター組換え部位が細菌ゲノムの組換え部位（ａｔｔＢ）である実施形態において、ドナーベクター上に存在するドナー組換え部位はファージゲノムの組換え部位（ａｔｔＰ）である。同じように、標的ベクターの第２のベクター組換え部位がファージゲノムの組換え部位（ａｔｔＰ）である場合、ドナーベクター上に存在するドナー組換え部位は細菌ゲノムの組換え部位（ａｔｔＢ）である。
【００７５】
上述したように、標的ベクターは、第２のベクター組換え部位の３’側に隣り合う第１の選択可能なマーカーの第１の部分を含み、ドナーベクターは、ドナー組換え部位の５’側に隣り合う第１の選択可能なマーカーの第２の部分を含む。第２の一方向性の部位特異的リコンビナーゼの存在下において、標的ベクター上の第２のベクター組換え部位は、ハイブリッド組換え部位を産生するためにドナーベクター上に存在するドナー組換え部位と再結合する。組換えの結果として、ターゲットベクター上の選択可能なマーカーの第１の部分と、ドナーベクター上の選択可能なマーカーの第２の部分とが近接し、再構成された機能的な第１の選択可能なマーカーを提供する。したがって、第１の選択マーカーを用いた選択は、標的細胞のゲノムに存在する標的ベクターと、該当するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを有するドナーベクターとの間の、成功した組換えイベントをスクリーニングするために用いることができる。
【００７６】
再構成された第１の選択可能なマーカー遺伝子の一実施形態においては、プロモーターはドナーベクターによって提供され、選択可能なマーカー遺伝子およびポリアデニル化シグナルのためのコード領域は標的ベクターによって提供される。再構成された選択可能なマーカー遺伝子の別の実施形態においては、ドナーベクターはプロモーター、コード領域のＮ末端部、およびイントロンの５’側半分を含有してもよく、標的ベクターはイントロンの３’側半分、コード領域のＣ末端部、およびポリアデニル化シグナルを含有してもよい。再構成された選択可能なマーカー遺伝子のさらなる実施形態においては、ドナーベクターはプロモーターおよびコード領域のＮ末端部を含有してもよく、標的ベクターはコード領域のＣ末端部およびポリアデニル化シグナルを含有してもよい。さらに別の実施形態においては、ドナーベクターはプロモーターを含み、標的ベクターはプロモーターレスの選択可能なマーカーを含む。再構成された選択可能なマーカー遺伝子のこれらすべての実施形態においては、別個の標的およびドナーベクター内に存在する遺伝子の要素は、互いに独立して薬物耐性を付与することができないということが、重要な特徴である。しかしながら、ドナーベクターが、完全な機能的遺伝子発現カセットを構築した標的ベクターに組み込まれた場合、かかる構造を含有する細胞は、再構成された選択可能なマーカー遺伝子の存在を選択するために用いられる薬物に対して耐性を示す。
【００７７】
プロモーターおよびプロモーター‐エンハンサー配列は、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を開始するＤＮＡ配列である。プロモーターは、どの鎖が転写されるかを特定することによって、転写の極性を決定する。特定のシグマ因子およびＲＮＡポリメラーゼによって結合される転写開始に関連して、細菌プロモーターは共通配列‐３５および‐１０ヌクレオチドから構成される
【００７８】
真核生物のプロモーターは、より複雑である。発現ベクターにおいて利用される真核生物プロモーターの大半は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写される。基本転写因子（ＧＴＦＳ）は、まず転写開始部位の近くの特定の配列に結合してから、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの結合を漸加する。これらの最小プロモーター要素のほかにも、所与のプロモーターの活性を調節する、モジュール構造を持つＤＮＡ結合トランス活性化タンパク質（例えば、ＡＰ−１およびＳＰ−１）によって、小さな配列要素が特異的に認識される。ウイルスプロモーターは、細菌または真核生物プロモーターと同じ機能を果たし、いずれも経細胞因子（例えば、細菌中のバクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ）または補充細胞因子、およびＲＮＡポリメラーゼＩＩ（真核細胞中の）中のプロモーター特異的ＲＮＡポリメラーゼを必要とする。ウイルスプロモーター（例えば、ＳＶ４０、ＲＳＶ、およびＣＭＶプロモーター）は、概して特に強いプロモーターであるので、好まれる可能性がある。
【００７９】
プロモーターは、さらに恒常的または調節可能のいずれかであってもよい。恒常的プロモーターは、該当する遺伝子を絶えず発現する。反対に、調節可能なプロモーター（すなわち、抑制解除が可能または誘導可能）は、制御することができる特定の条件下においてのみ、該当する遺伝子を発現する。抑制解除が可能な要素は、プロモーターと共に作用してリプレッサー（例えば、大腸菌中のｌａｃＯ／ｌａｃＩｑリプレッサーシステム）に結合するＤＮＡ配列要素である。誘導可能な要素は、プロモーターと共に作用してインデューサー（例えば、酵母中のｇａｌ１／ｇａｌ４インデューサーシステム）と結合するＤＮＡ配列要素である。いずれの場合も、環境条件の変化（例えば、ＩＰＴＧをｌａｃＯ／ｌａｃＩｑシステムに添加、またはガラクトースをｇａｌ１／ｇａｌ４システムに添加）によってプロモーターが抑制解除または誘導されるまで、つまり転写が「再開」される時点まで、転写は事実上「停止」される。
【００８０】
調節されたプロモーターの別の種類は、初めに遺伝子を発現させて、環境条件を変化させることにより発現を停止させる「抑制可能」なプロモーターである。抑制可能なシステムにおいては、リプレッサーが小さな調節分子に結合するまで、つまり転写が「停止」されるまで、転写が恒常的に行われる。この種のプロモーターの例は、テトラサイクリン／テトラサイクリンリプレッサーシステムである。このシステムでは、テトラサイクリンがテトラサイクリンリプレッサーに結合すると、リプレッサーがプロモーター中のＤＮＡ要素に結合して遺伝子発現を停止させる。
【００８１】
恒常的な原核生物プロモーターの例として、バクテリオファージλのｉｎｔプロモーター、ｐＢＲ３２２のβラクタマーゼ遺伝子配列のｂｌａプロモーター、ｐＰＲ３２５のクロラムフェニコールアセチル基転移酵素遺伝子配列のＣＡＴプロモーター等が挙げられる。
【００８２】
誘導可能な原核生物プロモーターの例として、バクテリオファージの主要な左右のプロモーター（ＰＬおよびＰＲ）；大腸菌のｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ｌａｃＺ、ＡｒａＣおよびｇａｌプロモーター；枯草菌のαアミラーゼ（Ｕｌｍａｎｅｎ  Ｅｔｔ  ａｔ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６２：１７６−１８２，１９８５）およびシグマ２８特異的プロモーター（Ｇｉｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ３２：１１−２０（１９８４））；桿菌のバクテリオファージのプロモーター（Ｇｒｙｃｚａｎ，Ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂａｃｉｌｌｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９８２））；ストレプトマイセスプロモーター（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｔ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０３：４６８−４７８，１９８６）等が挙げられる。例示的な原核生物プロモーターは、グリック（Ｇｌｉｃｋ）（Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｔｉｏｔ．１：２７７−２８２，１９８７）；セナティエンポ（Ｃｅｎａｔｉｅｍｐｏ）（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ６８：５０５−５１６，１９８６）；およびゴッテスマン（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ）（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：４１５−４４２，１９８４）によって検討されている。
【００８３】
例示的な恒常的な真核生物プロモーターの例として以下が挙げられるが、これらに限定されない：マウスメタロチオネインＩ遺伝子配列のプロモーター（Ｈａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３−２８８，１９８２）；ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｃｅｌｌ  ３１：３５５−３６５，１９８２）；ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２９０：３０４−３１０，１９８１）；酵母ｇａｌｌ遺伝子配列プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７９：６９７１−６９７５，１９８２）；Ｓｉｌｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８１：５９５１−５９ＳＳ，１９８４）；ＣＭＶプロモーター；ＥＦ−１プロモーター。
【００８４】
誘導可能な真核生物プロモーターの例として以下が挙げられるが、これらに限定されない：エクジソン応答プロモーター、テトラサイクリン応答プロモーター、転写因子の２つの部分を結び付ける「二量体化因子（ｄｉｍｅｒｉｚｅｒ）」によって制御されたプロモーター、エストロゲン応答プロモーター、プロゲステロン応答プロモーター、リボスイッチで調節されたプロモーター、抗生物質で調節されたプロモーター、アセトアルデヒドで調節解除されたプロモーター等。
【００８５】
いくつかの調節されたプロモーターは、抑制および活性の両方を媒介することができる。例えば、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈシステムにおいて、タンパク質（ＲｈｅｏＲｅｃｅｐｔｏｒ）はプロモーター中のＤＮＡ要素（上流活性化配列（ＵＡＳ））と結合して抑制を媒介する。しかしながら、特定のエクジソン様インデューサーの存在下においては、別のタンパク質（ＲｈｅｏＡｃｔｉｖａｔｏｒ）がインデューサーに結合する。インデューサーと結合したＲｈｅｏＡｃｔｉｖａｔｏｒは、ＤＮＡと結合したＲｈｅｏＲｅｃｅｐｔｏｒに結合することができる。その後、ＲｈｅｏＲｅｃｅｐｔｏｒ／インデューサー／ＲｈｅｏＡｃｔｉｖａｔｏｒは、遺伝子発現を活性化することができる。
【００８６】
一般的な選択可能なマーカー遺伝子は、抗生物質に対する耐性のためのアンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、ブレオマイシン、ストレプトマイシン、ハイグロマイシン、ネオマイシン、ピューロマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ブラストサイジン、ゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標））を含む。選択可能な栄養要求性遺伝子として、例えば、ヒスチジノールの存在下において、ヒスチジンフリー培地における成長を可能にするｈｉｓＤが挙げられる。
【００８７】
発現ベクターにおいて有用なさらなる要素は、複製の起点である。複製起点は、多量体の起点結合タンパク質によって認識される複数の短い反復配列を含有する独特のＤＮＡ断片であり、起点部位でＤＮＡ複製酵素を構築するのに重要な役割を果たす。本明細書で用いられる発現ベクターにおける使用のために好適な複製の起点は、大腸菌ｏｒｉＣ、ＣｏｌＥ１プラスミド起点、２μおよびＡＲＳ（どちらも酵母システムにおいて有用）、ｓｆ１、ＳＶ４０、ＥＢＶ  ｏｒｉＰ（哺乳類システムのような真核生物システムにおいて有用）を含む。
【００８８】
上述の通り、ドナーベクターはマルチクローニング部位またはポリリンカーを含む。マルチクローニング部位またはポリリンカーは、ドナーベクターに挿入された一連の制限エンドヌクレアーゼ認識部位をコードする合成ＤＮＡであり、該当するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、特定の位置にあるドナーベクターに簡便にクローニングすることを可能にする。
【００８９】
本発明の組成物および方法を用いて産生することができる有用なタンパク質は、例えば、栄養素の産生および化学物質における酵素反応を行うために用いることができる酵素、あるいは、栄養素として、またはヒトもしくは動物の疾患の治療もしくはその予防に有用かつ貴重なポリペプチド（例えば、ホルモン、免疫調節活性、抗ウイルス性および／または抗腫瘍性を有するポリペプチド（例えば、マスピン）、抗体、ウイルス抗原、ワクチン、凝固因子、酵素阻害剤、食品成分等）である。本発明の方法を用いて産生することができるその他の有用なポリペプチドは、例えば、セクレチン、チモシン、レラキシン、黄体ホルモン、副甲状腺ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、βリポトロピン、ウロガストロンまたはインスリンのようなホルモン；上皮増殖因子、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）（例えば、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、マスト細胞増殖因子、神経成長因子、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）のような増殖因子；またはＴＧＦ−αもしくはＴＧＦ−β（例えば、ＴＧＦ−β１、β２またはβ３）のようなトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）；ヒトまたはウシ成長因子のような成長ホルモン；インターロイキン１または２のようなインターロイキン；ヒトマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）；ヒトαインターフェロン（例えば、インターフェロンαＡ、αＢ、αＤまたはαＦ）、αインターフェロン、γインターフェロンまたはハイブリッドインターフェロン（例えば、αＡ‐αＤ‐またはαＢ‐αＤ‐ハイブリッドインターフェロン、特にハイブリッドインタ−フェロンＢＤＢＢ）のようなインターフェロン；α１‐アンチトリプシン、ＳＬＰＩ、α１‐アンチキモトリプシン、Ｃ１阻害剤のようなプロテアーゼ阻害剤；Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原もしくはコア抗原、またはＡ型肝炎ウイルス抗原、または非Ａ非Ｂ型肝炎（すなわち、Ｃ型肝炎）ウイルス抗原などの肝炎ウイルス抗原；組織プラスミノーゲンアクチベーターまたはウロキナーゼのようなプラスミノーゲンアクチベーター；腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−β）；ソマトスタチン；レニン；βエンドルフィン；軽鎖および／または重鎖の免疫グロブリンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、もしくはＭ、またはヒト‐マウスハイブリッド免疫グロブリンのような免疫グロブリン；免疫グロブリンＥ結合因子（例えば、ｓＣＤ２３等）のような免疫グロブリン結合因子；カルシトニン；ヒトカルシトニン関連ペプチド；因子ＩＸまたはＶＩＩＩｃのような血液凝固因子；エリスロポエチン；エグリンＣのようなエグリン；デスルファトヒルジンのバリアントＨＶｌ、ＨＶ２またはＰＡのようなデスルファトヒルジン；ヒトスーパーオキシドジスムターゼ；ウイルスチミジンキナーゼ；βラクタマーゼ；グルコースイソメラーゼ；ヒトプラズマタンパク質（例えば、血清アルブミンおよびトランスフェリン）のような輸送タンパク質、をコードするポリペプチドである。上記の融合タンパク質も、本発明の方法を用いて産生することができる。
【００９０】
さらに、発現した該当するタンパク質のレベルは、ベクター増幅により増加させることができる（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ，”Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ”ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｖｏｌ．３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７参照）。タンパク質を発現するベクターシステム中のマーカーが増幅可能である場合、そのマーカーの阻害剤のレベルにおける増加は、宿主細胞の培養液に存在する場合に、マーカー遺伝子の複製物の数を増加させる。増幅された領域はタンパク質コード遺伝子と関連しているので、該当するタンパク質の産生が同時に増加する（Ｃｒｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，３：２５７）。例示的な増幅システムには、その阻害剤であるメトトレキサートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）を含むが、それに限定されない。その他の好適な増幅システムは、グルタミン合成酵素（およびその阻害剤メチオニンスルホキシミン）、チミジン合成酵素（およびその阻害剤５−フルロウリジン）、カルバミルリン酸合成酵素／アスパラギン酸カルバモイル基転移酵素／ジヒドロオロターゼ（およびその阻害剤Ｎ‐（ホスホンアセチル）‐Ｌ‐アスパラギン酸）、リボヌクレオシド還元酵素（およびその阻害剤ヒドロキシ尿素）、オルニチン脱炭酸酵素（およびその阻害剤ジフルオロメチルオルニチン）、アデノシンデアミナーゼ（およびその阻害剤デオキシコフォルマイシン）を含むが、これらに限定されない。
【００９１】
これらの各システムは、増幅されるマーカー遺伝子が欠損する細胞株の使用を必要とする。例えば、増幅可能な遺伝子としてのＤＨＦＲ遺伝子の使用には、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞（例えば、ＤＧ４４）のようなＤＨＦＲ欠損細胞株を用いる。かかるマーカー遺伝子欠損細胞株を単離するための方法が入手可能である。マーカー遺伝子欠損細胞株を使用しない遺伝子増幅システムは、アデノ随伴ウイルス２型（ＡＡＶ−２）Ｒｅｐタンパク質およびＲｅｐタンパク質結合部位を使用するシステムである。
【００９２】
増幅可能なマーカー遺伝子の大半は、選択可能なマーカー遺伝子としても用いることができる。例えば、ＤＨＦＲ遺伝子の存在は、グリシン、チミジン、およびヒポキサンチンの不足した細胞増殖培地を用いることによって、ＤＨＦＲ欠損細胞において選択することができる。グルタミン合成酵素遺伝子の存在は、グルタミン等の不足した培地を用いることによって、グルタミン合成酵素欠損細胞において選択することができる。このようにして、特にいずれの遺伝子増幅手順の前に、遺伝子増幅を媒介するために増幅可能なマーカー遺伝子が存在することを確認できる。
【００９３】
したがって、ある実施形態においては、標的ベクターは、選択可能かつ増幅可能なマーカー遺伝子ＤＨＦＲをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。ＤＨＦＲを含む例示的な標的ベクターを、図５に提供する。かかる実施形態において、標的細胞のゲノムに組み込まれた標的ベクターは、次第に濃度の増加するメトトレキサートを用いて増幅される。標的ベクターは、ドナーベクター組込みのための第２の部位特異的組換え部位を含むので、標的細胞中のゲノムにおける標的ベクター配列の増幅は、標的細胞のゲノムに存在する第２の部位特異的組換え部位の数の増幅をもたらす。これは、ドナーベクターが組み込まれることのできる複数の位置を提供する。
【００９４】
他の実施形態においては、ドナー発現ベクターは、次第に濃度の増加するメトトレキサートに曝露される前に、任意選択的に標的‐ＤＨＦＲベクターに組み込まれる。かかる実施形態において、ドナー発現ベクター上に位置する該当するタンパク質をコードする遺伝子は、標的‐ＤＨＦＲベクター上に位置するＤＨＦＲ遺伝子に密接に（およそ４，０００塩基対内）連結する。メトトレキサートに曝露した結果として、次第に濃度の増加するメトトレキサート中の細胞を選択することによって、該当するタンパク質をコードする遺伝子の複製物の数が増幅される。
【００９５】
従来の遺伝子増幅の方法では、ＤＨＦＲ遺伝子がタンパク質発現ベクターと共に過剰に（通常１００倍）同時形質移入されるため、通常はタンパク質発現ベクターと連結するが、それは細胞の機構によって両方のベクターが断片化および連結した後にのみ起こる。従来の遺伝子増幅の方法とは対照的に、この任意選択的な方法は、メトトレキサートへの曝露前に、タンパク質発現遺伝子と関連したＤＨＦＲ遺伝子の配置、組成、および位置を制御することができるという利点を提供する。結果として、これが、より高い頻度の遺伝子増幅の成功を提供し、該当する遺伝子を発現しない、または該当する遺伝子の発現が長期に渡り不十分である、不安定な細胞株の数を減らすことになる。
【００９６】
あるいは、他の実施形態においては、該当するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを有するドナーベクターは、選択可能かつ増幅可能なマーカー遺伝子ＤＨＦＲをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。ＤＨＦＲを含む例示的なドナーベクターを、図６に提供する。かかる実施形態において、該当するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、ゲノムに組み込まれた配列全体が、次第に濃度の増加するメトトレキサートを用いて増幅される。
【００９７】
ある実施形態においては、ドナーベクターは、該当するタンパク質の転写開始部位と翻訳開始コドンとの間に位置する配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含む。ＩＲＥＳを含む例示的なドナーベクターを、図７に提供する。かかるベクターは、それらが翻訳エンハンサーである場合は、遺伝子発現の増加を可能にし、または、ＩＲＥＳが該当する各コード領域の５’に位置する限り、単一の転写から複数の該当するタンパク質を産生することもできる。
【００９８】
本明細書に記載されるベクターは、分子生物学の技術分野で既知である方法論を用いて（例えば、ＡｕｓｕｂｅｌまたはＭａｎｉａｔｉｓ参照）、本明細書の教示を考慮して構成することができる。好適な制御配列（例えば、プロモーター）を含むポリヌクレオチドを取得する例示的な方法は、ＰＣＲ法である。ＰＣＲ法の一般的な手順は、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，ＰＣＲ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ，（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９９１））に教示されている。それぞれの適用反応に対するＰＣＲ条件は、経験的に決定することができる。パラメータの数が反応の成功に影響する。これらのパラメータには、アニーリング温度および時間、伸長時間、ＭＧ２＋およびＡＴＰ濃度、ｐＨ、ならびにプライマー、テンプレート、およびデオキシリボヌクレオチドの相対濃度がある。増幅した後で、得られた断片は、アガロースゲル電気泳動、次いで臭化エチジウム染色およびＵＶ照射を用いた可視化によって、検出することができる。
【００９９】
方法
本発明は、該当するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、哺乳類細胞のような真核細胞のゲノムに部位特異的に組み込むことにより、該当するタンパク質を産生する細胞株を生成する方法も提供する。該して当該方法は、標的ベクターを細胞のゲノムに部位特異的に組み込むために、本明細書に記載されているように、まず第１の一方向性の部位特異的リコンビナーゼを利用して標的ベクターを真核細胞に導入して、第１のベクター組換え部位とゲノム組換え部位との間の、第１の一方向性の部位特異的リコンビナーゼに媒介される組換えイベントに十分な条件下に維持することを伴う。第１の一方向性の部位特異的リコンビナーゼによって媒介される標的ベクターの組込みイベントの成功は、標的ベクター上に存在する選択可能なマーカー遺伝子を用いることにより選択することができる。
【０１００】
該当するタンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびドナー組換え部位を含むドナーベクターは、第２の一方向性の部位特異的リコンビナーゼを利用して、第２の標的細胞に導入される。その後、標的細胞は、第２の一方向性の部位特異的リコンビナーゼによって媒介される組換えイベントを生じさせるのに十分な条件下で維持される。結果として、標的ベクターのドナー組換え部位と第２のベクター組換え部位との間の組換えイベントは、該当するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの、細胞のゲノムへの部位特異的組込みを可能にする。第２の一方向性の部位特異的リコンビナーゼによって媒介されるドナーベクターの組込みイベントの成功は、再構成された第１の選択可能なマーカー遺伝子を用いることにより選択することができる。再構成された第１の選択可能なマーカー遺伝子の一実施形態においては、プロモーターはドナーベクターおよび選択可能なマーカー遺伝子のためのコード領域によって提供され、ポリアデニル化シグナルは、標的ベクターによって提供される。再構成された選択可能なマーカー遺伝子の別の実施形態においては、ドナーベクターはプロモーター、コード領域のＮ末端部、およびイントロンの５’側半分を含有してもよく、標的ベクターはイントロンの３’側半分、コード領域のＣ末端部、およびポリアデニル化シグナルを含有してもよい。再構成された選択可能なマーカー遺伝子のさらなる実施形態においては、ドナーベクターはプロモーターおよびコード領域のＮ末端部を含有しても良く、標的ベクターはコード領域のＣ末端部およびポリアデニル化シグナルを含有してもよい。さらに別の実施形態においては、ドナーベクターはプロモーターを含み、標的ベクターはプロモーターレスの選択可能マーカーを含む。再構成された選択可能なマーカー遺伝子のこれらすべての実施形態においては、別個の標的およびドナーベクター内に存在する遺伝子の要素は、互いに独立して薬物耐性を付与することができないということが、重要な特徴である。しかしながら、ドナーベクターが、完全な機能的遺伝子発現カセットを集めた標的ベクターに組み込まれた場合、かかる構造を含有する細胞は、再構成された選択可能なマーカー遺伝子の存在を選択するために用いられる薬物に対して耐性を示す。
【０１０１】
概して、部位特異的組換え部位を有する一方向性の部位特異的インテグラーゼの相互作用は、一方向性の部位特異的インテグラーゼのための有効な基質としての役割を果たす配列を含有しない組換え産物を産生する。よって、主題方法において用いられる組込みイベントは一方向性であり、一方向性の部位特異的インテグラーゼによって媒介される、導入された核酸の検出可能な除去がほとんどまたは全くない。この特徴は、双方向性の部位特異的リコンビナーゼによって提供され得る（例えば、ｌｏｘ／ｃｒｅ組込みシステム）、または該当するタンパク質をコードする遺伝子の消失をもたらす可能性のある、直接的な反復配列（例えば、末端反復配列）を含有する（例えば、レトロウイルスもしくはレンチウイルス組込みシステムにおいて）、他の組込みシステムと比較して、該当するタンパク質の発現のより高い安定性を保証する。
【０１０２】
ベクターは、本発明の細胞株を産生するために当業者によって実践される任意の標準的手段を用いて、宿主細胞に導入される。核酸ベクターは、例えば、陽イオン性脂質で（Ｇｏｄｄａｒｄ，ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，４：１２３１‐１２３６，１９９７；Ｇｏｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ４：９８３−９９２，１９９７；Ｃｈａｄｗｉｃｋ，ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ４：９３７−９４２，１９９７；Ｇｏｋｈａｌｅ，ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ４：１２８９−１２９９，１９９７；Ｇａｏ，ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ２：７１０−７２２，１９９５，（参照することによりそのすべてを本明細書に援用する））、ウイルスベクターを用いて（Ｍｏｎａｈａｎ，ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ４：４０‐４９，１９９７；Ｏｎｏｄｅｒａ，ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ９１：３０−３６，１９９８，（参照することによりそのすべてを本明細書に援用する））、「裸のＤＮＡ」の取り込みによって、科学的手段（例えば、リン酸カルシウム）、電気泳動手段等を用いて、送達することができる。
【０１０３】
本発明の実施に用いられる第１および第２の一方向性の部位特異的リコンビナーゼは、標的ベクターまたはドナーベクターの導入の前に、導入と同時に、または導入の後で、標的細胞に導入することができる。第１および第２の一方向性の部位特異的リコンビナーゼは、一方向性の部位特異的リコンビナーゼをコードするＤＮＡの形態で（Ｏｌｉｖａｒｅｓ，Ｈｏｌｌｉｓ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ，Ｇｅｎｅ，２７８：１６７−１７６（２００１）；Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．ＭＣＢ  ２１：３９２６−３９３４（２００１））、一方向性の部位特異的リコンビナーゼをコードするｍＲＮＡの形態で（Ｇｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．ＪＭＢ  ３３５：６６７−６７８（２００４）；Ｈｏｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｐｒ．Ｂｉｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．１：７９（２００３））、または一方向性の部位特異的リコンビナーゼタンパク質として、導入することができる。
【０１０４】
第１および第２の一方向性の部位特異的リコンビナーゼの発現は、典型的には一過性であるように設計される。これは、リコンビナーゼの長期に渡る発現が、ゲノム中の様々な位置に存在する、偽性ａｔｔ部位間の組換えを促進する可能性があるからである。そうすると、染色体再構築がもたらされ、最終的には細胞死が引き起こされる。したがって、リコンビナーゼの一過性発現を提供するベクターおよび方法が、本発明の実施において好ましい。しかしながら、第１および第２の一方向性の部位特異的リコンビナーゼの安定した発現は、例えば、リコンビナーゼの発現を調節可能なプロモーター（すなわち、その発現が選択的に誘導または抑制され得るプロモーター）の制御下に置くことによって、制御された場合には、許容できる可能性がある。
【０１０５】
第１および第２の一方向性の部位特異的リコンビナーゼをタンパク質として導入することには、いくつかの利点がある。タンパク質の半減期は短いため、細胞を一方向性の部位特異的リコンビナーゼに曝露するには時間に限りがある。さらに、一方向性の部位特異的リコンビナーゼ遺伝子をゲノムに組み込む機会がない。一方向性の部位特異的リコンビナーゼの転写または翻訳の限界が回避され、反応速度がより迅速になる可能性がある。タンパク質の細胞への導入は、ＤＮＡの導入よりも概して毒性が低い。したがって、真核細胞に、ファージの一方向性の部位特異的リコンビナーゼをタンパク質として導入することが好ましい可能性がある。
【０１０６】
ファージの一方向性の部位特異的リコンビナーゼのようなタンパク質は、電気穿孔、ペプチドトランスポーター（Ｓｉｐｒａｓｈｖｉｌｉ，Ｒｅｕｔｅｒ  ａｎｄ  Ｋｈａｖａｒｉ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，９：７２１−７２８（２００４））、または単純ヘルペスウイルスＶＰ２２のタンパク質に由来するようなタンパク質形質導入ドメインの付着、アンテナペディア由来ペプチド、様々なアルギニンリッチペプチド、またはヒト免疫不全症ウイルスｔａｔタンパク質を含む多くの手段によって、細胞内に導入することができる。一方向性の部位特異的リコンビナーゼをコードするＤＮＡまたはＲＮＡも、電気穿孔、トランスポーター分子との静電相互作用のような科学物質との複合、またはエンドサイトーシスを含む多くの手段によって、細胞内に導入することができる。
【０１０７】
本発明の主題方法に用いるために好適な細胞は、概して哺乳類細胞や酵母細胞のような任意の高度な真核細胞である。一部の実施形態においては、上記細胞は、容易に操作可能な、容易に培養される哺乳類細胞株である。他の実施形態においては上記細胞は、容易に操作可能な、容易に培養される酵母細胞株である。組換えＤＮＡ分子を発現することが可能な好適な細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＢＨＫ細胞、ＳＰ２／０細胞およびＮＳ−０骨髄腫細胞を含むマウス細胞等のげっ歯類細胞；ＣＯＳおよびＶｅｒｏ細胞等の霊長類細胞；ＭＤＣＫ細胞；ＢＲＬ  ３Ａ細胞；雑種細胞；腫瘍細胞；不死化原発細胞；Ｗ１３８、ＨｅｐＧ２、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＨＴ１０８０、またはＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）等のヒト細胞等の哺乳類細胞を含むが、これらに限定されない。
【０１０８】
一部の実施形態においては、細胞はＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞である。他の実施形態においては、細胞はＣＨＯ細胞またはＤＧ４４細胞のようなジヒドロ葉酸還元酵素欠損細胞である。ＣＨＯ細胞は、生物製剤タンパク質および診断目的のタンパク質を生成するために常用される、簡便な産生システムになった。数多くの特徴が、ＣＨＯ細胞を、宿主細胞として好適なものにしている。ＣＨＯ細胞において到達することができる産生レベルは極めて高い。その細胞株は、感染病原体や感染性ウイルス粒子を含まない、安全な産生システムを提供する。ＣＨＯ細胞は、幅広い特徴を持ち、バイオリアクター内で高密度に達するまで、無血清培地を用いて懸濁液中で増殖することが可能であり、ＣＨＯ細胞のＤＨＦＲ欠損変異体（ＤＧ−４４  ｃｌｏｎｅ．Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．３３（２）：４０５−１２（１９８３））が、外来性ＤＨＦＲ遺伝子を導入してその存在を選択し、その後で、次第に増加する濃度のメトトレキサートを用いて、十分に制御されたＤＨＦＲ遺伝子および該当する任意の遺伝子の段階的増幅を行うことによって、容易な選択および増幅システムを得るために開発されてきた。
【０１０９】
細胞株
本発明は、上述の標的ベクターを標的細胞のゲノム組換え部位に組み込むことにより生成された細胞株も提供する。したがって、主題細胞は、一方向性の部位特異的リコンビナーゼの存在下でドナー組換え部位と再結合するベクター組換え部位と隣接する、第１のハイブリッド組換え部位および第２のハイブリッド組換え部位と；ベクター組換え部位の３’端と隣り合うプロモーターレスの第１の選択可能なマーカーと；第１の選択可能なマーカーとは異なる第２の選択可能なマーカーとを含む、ゲノム的に組み込まれたポリヌクレオチドのカセットを有する。
【０１１０】
一部の実施形態においては、ベクター組換え部位は細菌ゲノムの組換え部位（ａｔｔＢ）またはファージゲノムの組換え部位（ａｔｔＰ）である。一部の実施形態においては、ドナー組換え部位は細菌ゲノムの組換え部位（ａｔｔＢ）またはファージゲノムの組換え部位（ａｔｔＰ）である。一部の実施形態においては、一方向性の部位特異的リコンビナーゼはφＣ３１ファージのリコンビナーゼ、ＴＰ９０１−１ファージのリコンビナーゼ、またはＲ４ファージのリコンビナーゼである。一部の実施形態においては、哺乳類細胞はげっ歯類細胞である。他の実施形態においては、哺乳類細胞はＣＨＯ細胞である。さらに他の実施例において、哺乳類細胞はＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞である。
【０１１１】
キット
上述したように、主題方法を実施するためのキットも主題発明によって提供される。ある実施形態においては、主題キットは、上述のように標的ベクターおよびドナーベクターを少なくとも１つ以上、そして通常はすべて含む。一部の実施形態においては、キットは第１および第２の一方向性の部位特異的リコンビナーゼの構成要素をさらに含み、該リコンビナーゼの構成要素は、任意の好適な形態（例えば、標的細胞への導入のために調製されたタンパク質として、または標的細胞への導入に続いて、所望のリコンビナーゼの発現を提供するリコンビナーゼのベクター中）で提供されてもよい。
【０１１２】
他の実施形態においては、主題キットは、上述のように組み込まれた標的ベクターおよびドナーベクターを有する単離された細胞株を少なくとも１つ以上、そして通常はすべて含む。一部の実施形態においては、該キットは第１および第２の一方向性の部位特異的リコンビナーゼの構成要素をさらに含み、該リコンビナーゼの構成要素は、任意の好適な形態（例えば、標的細胞への導入のために調製されたタンパク質として、または標的細胞への導入に続いて、所望のリコンビナーゼの発現を提供するリコンビナーゼのベクター中）で提供されてもよい。
【０１１３】
キットのその他の任意選択的な構成要素は、制限酵素、対照プラスミド、バッファ、ベクターを細胞に導入するための物質等を含む。キットの様々な構成要素は別個の容器に存在してもよいか、または、ある相溶性の構成要素は、必要に応じて単一の容器内で事前に混合されてもよい。
【０１１４】
上記の構成要素のほかに、主題キットは、典型的には、主題方法を実施するためにキットの構成要素を使用するための説明書をさらに含む。主題方法を実施するための説明書は、概して好適な記録媒体に記録されている。例えば、説明書は、紙またはプラスチック等の基板上に印刷されていてもよい。説明書自体は、添付文書としてキット内に、キットまたはその構成要素の容器の表示内（すなわち、包装または副包装に関連して）等に存在していてもよい。他の実施形態においては、説明書は、好適な機械可読な記憶媒体上（例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、ディスケット等）に存在する電子記憶データファイルとして存在する。さらに他の実施例においては、実際の説明書はキット内に存在しないが、例えば、インターネットを介して、遠隔源から説明書を取得する手段が提供される。この実施形態の例は、説明書が閲覧できる、および／または、そこから説明書をダウンロードできる、ウェブアドレスを含むキットである。説明書に関しては、この説明書取得のための手段は好適な基板に記録されている。
【０１１５】
本発明は、添付の図面と共に以下の詳細な説明を読むことにより、最もよく理解される。一般の慣行に従って、図面の様々な形状は原寸に比例していないことを強調しておく。反対に、様々な形状の寸法は、明確にするために任意に拡大または縮小されている。図面には以下の図が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】図１は、例示的な標的ベクターの略図である。例示的な標的ベクターは、第１のベクター組換え部位（例えば、φＣ３１  ａｔｔＢ部位）、第２のベクター組換え部位（例えば、Ｒ４  ａｔｔＰ部位）、Ｒ４  ａｔｔＰ部位の下流に位置する第１の選択可能なマーカーの第１の部分（例えば、プロモーターレスの第１の選択可能なマーカー（例えば、ゼオシン耐性遺伝子））、および第２の選択可能なマーカー（例えば、ハイグロマイシン耐性遺伝子）を含む。
【図２】図２は、例示的なドナーベクターの略図である。例示的なドナーベクターは、ドナー組換え部位（例えば、Ｒ４  ａｔｔＢ部位）、該当する遺伝子、およびＲ４  ａｔｔＢ部位のすぐ上流に位置するプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）を含む。
【図３】図３は、標的ベクター上に存在するφＣ３１  ａｔｔＢ部位と、標的細胞のゲノム中に存在するφＣ３１偽性ａｔｔＰ部位との間の、例示的な初期の部位特異的組込みイベントの略図である。組込みイベントは、φＣ３１インテグラーゼによって媒介される。
【図４】図４は、ドナーベクター上に存在するＲ４  ａｔｔＢ部位と、標的ベクターの組込みの結果として細胞ゲノムに組み込まれたＲ４  ａｔｔＰとの間の、例示的な部位特異的組込みイベントの略図である。第２の部位特異的組込みイベントは、Ｒ４インテグラーゼによって媒介される。
【図５】図５は、例示的なＤＨＦＲ‐標的ベクターの略図である。例示的なＤＨＦＲ‐標的ベクターは、Ｒ４  ａｔｔＰ部位、φＣ３１  ａｔｔＢ部位、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ＤＨＦＲ遺伝子、およびＲ４  ａｔｔＰ部位の下流に位置するゼオシン耐性遺伝子の第１の部分（例えば、プロモーターレス）を含む。
【図６】図６は、例示的なＤＨＦＲ‐ドナーベクターの略図である。例示的なドナーベクターは、Ｒ４  ａｔｔＢ部位、該当する遺伝子、ＤＨＦＲ遺伝子、およびＲ４  ａｔｔＢ部位のすぐ上流に位置するＣＭＶプロモーターを含む。
【図７】図７は、例示的なＩＲＥＳ‐ドナーベクターの略図である。例示的なドナーベクターは、Ｒ４  ａｔｔＢ部位、該当する遺伝子、Ｒ４  ａｔｔＢ部位のすぐ上流に位置するＣＭＶプロモーター、および該当する遺伝子の転写開始部位とコード領域との間のＩＲＥＳを含む。
【図８】図８は、標的ベクターｐＲ１の略図である。標的ベクターｐＲ１は、第１のベクター組換え部位（例えば、Ｒ４  ａｔｔＢ  ２９５部位）、第２のベクター組換え部位（例えば、φＣ３１  ａｔｔＰ  １０３部位）、φＣ３１  ａｔｔＰ  １０３部位の下流に位置する第１の選択可能なマーカーの第１の部分（例えば、プロモーターレスの選択可能なマーカー（例えば、ピューロマイシン耐性遺伝子））、および完全な第２の選択可能なマーカー（例えば、ハイグロマイシン耐性遺伝子カセット）を含む。また、該ベクターは、それぞれ大腸菌内での維持および選択のために、ＤＮＡ複製のＣｏｌＥ１起点およびアンピシリン耐性遺伝子カセットも含む。アスタリスクは、固有の制限酵素部位を示す。
【図９】図９は、ドナー発現ベクターの骨格（ｐＨＰＣ−４）の例示的な略図である。例示的なドナー発現ベクターの骨格は、ドナー組換え部位（例えば、φＣ３１  ａｔｔＢ  ２８５  ＡＡＡ部位）、２つのＣＭＶプロモーター、タンパク質分泌のための２つのシグナル配列、該当する遺伝子を挿入するための２つのポリリンカー、およびウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルを２つ含む。該骨格は、ドナー発現ベクターの標的ベクターへの組込みを選択するためのφＣ３１  ａｔｔＢ  ２８５  ＡＡＡ  部位のすぐ上流に位置する、弱いプロモーター（例えば、ＳＶ４０プロモーター）も含む。また、該ベクターは、それぞれ大腸菌内での維持および選択のために、ＤＮＡ複製のＣｏｌＥ１起点およびアンピシリン耐性遺伝子カセットも含む。アスタリスクは、固有の制限酵素部位を示す。
【図１０】図１０は、例示的なドナー発現ベクター（ｐＤ１‐ＤＴＸ‐１）の略図である。例示的なドナー発現ベクターは、ドナー組換え部位（例えば、φＣ３１  ａｔｔＢ  ２８５  ＡＡＡ部位）、２つのＣＭＶプロモーター、２つのシグナル配列、抗ジフテリア毒素抗体の重鎖および軽鎖、およびウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルを２つ含む。該ベクターは、ドナー発現ベクターの標的ベクターへの組込みを選択するためのφＣ３１  ａｔｔＢ  ２８５  ＡＡＡ部位のすぐ上流に位置する、弱いプロモーター（例えば、ＳＶ４０プロモーター）も含む。また、該ベクターは、それぞれ大腸菌内での維持および選択のために、ＤＮＡ複製のＣｏｌＥ１起点およびアンピシリン耐性遺伝子カセットも含む。
【図１１】図１１は、高レベルのタンパク質産生のための細胞株を生成するために使用される４つのベクターそれぞれの機能を検証するために用いられる、迅速試験手順の略図である。第１のステップは、標的ベクターのＲ４偽性ａｔｔＰ部位への組込みを媒介するために、Ｒ４インテグラーゼ発現ベクターによってコードされたＲ４（例えば、ｐＣＭＶ  ｓｒｅ）インテグラーゼを含む。選択（例えば、ハイグロマイシン選択）を行わずに組込みを生じさせるために、４８時間経過させる。  第２のステップは、ドナーベクターの標的ベクターへの組込みを媒介するために、φＣ３１変異インテグラーゼ発現ベクター（例えば、ｐＣＳ−Ｍ３Ｊ）によってコードされたφＣ３１変異インテグラーゼを用いる。組込みを生じさせるために４８時間経過させた後で、安定した細胞プールを単離するためにピューロマイシン選択が用いられる。これらの細胞はタンパク質の発現について分析される。高レベルのタンパク質発現は、使用される４つのプラスミドそれぞれの適切な機能に依存する。第１のステップにおいて、標的ベクターがＲ４偽性ａｔｔＰ部位でランダムに組み込まれるか、または部位特異的に組み込まれるかどうかは、Ｒ４インテグラーゼ発現ベクターを用いて、または用いずに実験を行うことにより評価することができる。Ｒ４インテグラーゼ発現ベクターが脱落した場合、組み込まれなかったベクターは、実験の間に分裂する細胞として希釈されるため（＞１７日間）、タンパク質発現のレベルは、実質的に低くなる。
【図１２】図１２は、標的ベクター上に存在するＲ４  ａｔｔＢ  ２９５部位と、標的細胞のゲノム中に存在するＲ４偽性ａｔｔＰ部位との間の、例示的な第１の部位特異的組込みイベントの略図である。組込みイベントは、Ｒ４インテグラーゼによって媒介され、プラスミドｐＣＭＶ  ｓｒｅにコードされる。ハイグロマイシン選択は、Ｒ４偽性ａｔｔＰ部位で組み込まれた標的ベクターを有する安定したクローン（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６‐φＣ３１  ａｔｔＰまたはＤＧ４４‐φＣ３１  ａｔｔＰ細胞株）を単離するために用いられる。
【図１３】図１３は、ドナーベクター上に存在するφＣ３１  ａｔｔＢ  ２８５  ＡＡＡ  部位と、標的ベクターの組込みの結果として細胞ゲノムに組み込まれたφＣ３１  ａｔｔＰ  １０３部位との間のφＣ３１  ａｔｔＰ細胞株で生じる、例示的な第２の部位特異的組込みイベントの略図である。第２の組込みイベントは、φＣ３１変異インテグラーゼ（例えば、プラスミドｐＣＳ−Ｍ３Ｊにコードされた変異φＣ３１インテグラーゼ）によって媒介される。再構成された薬物耐性発現カセットは、ドナー発現ベクターが標的ベクターに組み込まれた組み込み体を有利に選択するために、またドナーベクターがφＣ３１偽性ａｔｔＰ部位に組み込まれたこれらの細胞株を不利に選択するために、用いられる。
【図１４】図１４は、φＣ３１  ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、およびａｔｔＬ  ８８部位の配列を示す図である。野生型φＣ３１  ａｔｔＢおよびφＣ３１  ａｔｔＰの配列を上半分に示す。上半部の下線を引いた配列は、組換え後にａｔｔＬ部位を形成するａｔｔＢおよびａｔｔＰからの配列を示す。慣例により、ａｔｔＬは、ａｔｔＢから由来した組換えの乗換え点の側によって名づけられる。例えばａｔｔＬでは、組換えのための乗換え点の左側にある配列は、ａｔｔＢの組換えのための乗換え点の左（５’）側にある配列に由来する。組換えのための乗換え点の右側にあるａｔｔＬ配列は、ａｔｔＰの組換えのための乗換え点の右（３’）側にある配列に由来する。  図の下半分は、標的ベクターおよびドナーベクターそれぞれの上で用いられたφＣ３１  ａｔｔＰ  １０３部位およびφＣ３１  ａｔｔＢ  ２８５  ＡＡＡ部位を作製するために、ａｔｔＢおよびａｔｔＰ配列がどのように改変されたかを図示している。また、ドナーベクター中のφＣ３１  ａｔｔＢ  ２８５  ＡＡＡ部位が、標的ベクター中のφＣ３１  ａｔｔＰ  １０３部位に組み込まれた後のφＣ３１  ａｔｔＬ  ８８部位の配列も示す。
【図１５】図１５は、例示的な標的‐ＤＨＦＲベクター（ｐＲ１‐ＤＨＦＲ）の略図である。例示的な標的‐ＤＨＦＲベクターは、φＣ３１  ａｔｔＰ  １０３部位、Ｒ４  ａｔｔＢ  ２９５部位、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ＤＨＦＲ遺伝子、およびφＣ３１  ａｔｔＰ  １０３部位の下流に位置する（例えば、プロモーターレス）ピューロマイシン耐性遺伝子の第１の部分を含む。該ベクターは、それぞれ大腸菌内での維持および選択のために、ＤＮＡ複製のＣｏｌＥ１起点およびアンピシリン耐性遺伝子カセットも含む。
【図１６】図１６は、例示的なドナー‐ＤＨＦＲ発現ベクター（ｐＤ１‐ＤＨＦＲ）の略図である。例示的なドナー‐ＤＨＦＲ発現ベクターは、ドナー組換え部位（例えば、φＣ３１  ａｔｔＢ  ２８５  ＡＡＡ部位）、２つのＣＭＶプロモーター、２つのシグナル配列、抗ジフテリア毒素抗体の重鎖および軽鎖、ウシ成長ホルモンの２つのポリアデニル化シグナル、ＤＨＦＲ発現カセット、および、ドナーベクターの標的ベクターへの組込みを選択するためのφＣ３１  ａｔｔＢ  ２８５  ＡＡＡ部位のすぐ上流に位置するプロモーター（例えば、ＳＶ４０プロモーター）を含む。該ベクターは、それぞれ大腸菌内での維持および選択のために、ＤＮＡ複製のＣｏｌＥ１起点およびアンピシリン耐性遺伝子カセットも含む。
【図１７】図１７は、例示的なＩＲＥＳ‐ドナー発現ベクター（ｐＤ１−ＩＲＥＳ）の略図である。例示的なＩＲＥＳ‐ドナー発現ベクターは、ドナー組換え部位（例えば、φＣ３１  ａｔｔＢ  ２８５  ＡＡＡ部位）、２つのＣＭＶプロモーター、５’非翻訳領域内の２つの内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、２つのシグナル配列、抗ジフテリア毒素抗体の重鎖および軽鎖、ウシ成長ホルモンの２つのポリアデニル化シグナル、および、ドナーベクターの標的ベクターへの組込みを選択するためのφＣ３１  ａｔｔＢ  ２８５  ＡＡＡ部位のすぐ上流に位置するプロモーター（例えば、ＳＶ４０プロモーター）を含む。該ベクターは、それぞれ大腸菌内での維持および選択のために、ＤＮＡ複製のＣｏｌＥ１起点およびアンピシリン耐性遺伝子カセットも含む。
【図１８】図１８は、例示的な調節を行う標的ベクター（ｐＲ１ｒｅｇ）の略図である。例示的な調節を行う標的ベクターは、第１のベクター組換え部位（例えば、Ｒ４  ａｔｔＢ  ２９５部位）、第２のベクター組換え部位（例えば、φＣ３１  ａｔｔＰ  １０３  ｓｉｔｅ）、φＣ３１  ａｔｔＰ  １０３部位の下流に位置する第１の選択可能なマーカーの第１の部分（例えば、プロモーターレスの選択可能なマーカー（例えば、ピューロマイシン耐性遺伝子））、完全な第２の選択可能なマーカー（例えば、ハイグロマイシン耐性遺伝子カセット）、および調節できるように構成される遺伝子を有する調節可能なドナー発現ベクター（例えば、ｐＤ１ｒｅｇ）上に存在する１つ以上の遺伝子に、制御可能な遺伝子調節を付与することができるタンパク質をコードするカセット（例えば、ＲｈｅｏＡｃｔｉｖａｔｏｒおよびＲｈｅｏＲｅｃｅｐｔｏｒ）を含む。該ベクターは、それぞれ大腸菌内での維持および選択のために、ＤＮＡ複製のＣｏｌＥ１起点およびアンピシリン耐性遺伝子カセットも含む。
【図１９】図１９は、例示的な、調節を行う標的‐ＤＨＦＲベクター（ｐＲ１ｒｅｇ‐ＤＨＦＲ）の略図である。例示的な、調節を行う標的‐ＤＨＦＲベクターは、第１のベクター組換え部位（例えば、Ｒ４  ａｔｔＢ  ２９５部位）、第２のベクター組換え部位（例えば、φＣ３１  ａｔｔＰ  １０３部位）、φＣ３１  ａｔｔＰ  １０３部位の下流に位置する第１の選択可能なマーカーの第１の部分（例えば、プロモーターレスの選択可能なマーカー（例えば、ピューロマイシン耐性遺伝子））、完全な第２の選択可能なマーカー（例えば、ハイグロマイシン耐性遺伝子カセット）、ＤＨＦＲ遺伝子、および調節できるように構成される遺伝子を有する調節可能なドナー発現ベクター（例えば、ｐＤ１ｒｅｇ）上に存在する１つ以上の遺伝子に、制御可能な遺伝子調節を付与することができるタンパク質をコードするカセット（例えば、ＲｈｅｏＡｃｔｉｖａｔｏｒおよびＲｈｅｏＲｅｃｅｐｔｏｒ）を含む。該ベクターは、それぞれ大腸菌内での維持および選択のために、ＤＮＡ複製のＣｏｌＥ１起点およびアンピシリン耐性遺伝子カセットも含む。
【図２０】図２０は、例示的な調節可能なドナー発現ベクターの骨格（ｐＤ１ｒｅｇ）の略図である。例示的な調節可能なドナー発現ベクターの骨格は、ドナーベクター組換え部位（例えば、φＣ３１  ａｔｔＢ  ２８５  ＡＡＡ部位）、遺伝子調節配列への読み過ごし転写を防ぐための２つの配列（例えば、ＳＶ４０ポリアデニル化領域）、遺伝子調節を媒介する２つの配列（例えば、５ｘ  ＧＡＬ４  ＵＡＳ、ＴＡＴＡボックス、および５’ＵＴＲ）、２つのシグナル配列、該当する遺伝子を挿入するための２つのポリリンカー、ウシ成長ホルモンの２つのポリアデニル化シグナル、およびドナーベクターの標的ベクターへの組込みを選択するためのφＣ３１  ａｔｔＢ  ２８５  ＡＡＡ部位のすぐ上流に位置するプロモーター（例えば、ＳＶ４０プロモーター）を含む。該ベクターは、それぞれ大腸菌内での維持および選択のために、ＤＮＡ複製のＣｏｌＥ１起点およびアンピシリン耐性遺伝子カセットも含む。アスタリスクは、固有の制限酵素部位を示す。
【図２１】図２１は、例示的な選択可能なドナー発現ベクター（ｐＤ１−ＤＴＸｌ−Ｇ４１８）の略図である。例示的な選択可能なドナー発現ベクターは、ドナー発現ベクター（図１０）のすべての要素を含むだけでなく、完全な選択可能なマーカー遺伝子（例えば、Ｇ４１８）も含む。
【図２２】図２２は、一過性形質移入後の、ドナー発現ベクターの標的ベクターとの部位特異的組換えを表す図である。
【図２３】図２３は、Ｒ４インテグラーゼを用いて標的ベクターが部位特異的に組み込まれた細胞から単離された、Ｒ４偽性ａｔｔ部位の配列を示す図である。組換えが生じるＲ４コア配列は大文字で示す。
【図２４】図２４は、ドナー発現ベクターが標的ベクターに部位特異的に組み込まれたＤＧ４４細胞から単離された、ハイブリッドφＣ３１ａｔｔ部位の配列を示す図である。パネルＡはハイブリッドａｔｔＬ部位を示し、パネルＢはハイブリッドａｔｔＲ部位を示す。上部の核酸配列はドナー発現ベクター領域の予測される配列を示し、次いでａｔｔＬ、および標的ベクターから生じるピューロマイシン耐性配列を示す。下部の配列は、細胞株からの実際の配列である。図に示されるように、実際の核酸配列は、予測配列と正確に一致する。
【図２５】図２５は、ドナー発現ベクターが標的ベクターに部位特異的に組み込まれたＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞から単離された、ハイブリッドφＣ３１  ａｔｔ部位を示す図である。パネルＡはハイブリッドａｔｔＬ部位を示し、パネルＢはハイブリッドａｔｔＲ部位を示す。上部の核酸配列はドナー発現ベクター領域の予測される配列を示し、次いでａｔｔＬ、および標的ベクターから生じるピューロマイシン耐性配列を示す。下部の配列は、細胞株からの実際の配列である。図に示されるように、実際の核酸配列は、予測される配列と正確に一致する。
【図２６】図２６は、部位特異的に組み込まれたドナー発現ベクターを有するゲノムＤＮＡからのａｔｔＢ（パネルＡ）およびａｔｔＲ（パネルＢ）部位の、ポリメラーゼ連鎖反応の媒介による増幅を示す図である。
【図２７−１】図２７Ａは、部位特異的なドナー発現ベクター組込み後の、ＣＨＯ  ｄｈｆｒプールのクローンからの抗体の発現を示す図である。
【図２７−２】図２７Ｂは、部位特異的なドナー発現ベクター組込み後の、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）プールのクローンからの抗体の発現を示す図である。
【図２８】図２８Ａおよび図２８Ｂは、部位特異的に組み込まれたドナー発現ベクターを含有するＣＨＯ  ｄｈｆｒプール２Ｇ７番の単一細胞クローンからの抗体の発現を示す図である。
【図２９】図２９は、ドナー発現ベクターがＤＨＦＲ‐標的ベクターに部位特異的に組み込まれ、細胞集団が濃度の増加するメトトレキサートに曝露された細胞プールからの、抗体の発現（ｐｇ／細胞／日）を示す図である。
【図３０】図３０は、例示的なレポータードナー発現ベクター（ｐＤ３−ＤＴＸｌ）の略図である。例示的なレポータードナー発現ベクターは、ドナー発現ベクター（図１０）のすべての要素を含むだけでなく、緑色蛍光タンパク質のような、レポーター分子をコードする遺伝子も含む。レポーター遺伝子の存在により、該当するタンパク質を発現する個々の細胞を容易に同定することが可能になる。
【図３１】図３１は、ＤＧ４４細胞およびＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞において発現した抗ジフテリア毒素抗体の、比較可能な特異的結合活性を示す図である。
【図３２】図３２は、抗体遺伝子がクローンされたヒトＢ細胞株（Ｄ２．２）と比較した、ＤＧ４４細胞またはＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞から発現した抗ジフテリア毒素抗体の、生物学的な体外での中和活性を示す図である。
【図３３】図３３Ａ〜図３３Ｂは、ｐＲ１ベクターの核酸配列を示す図である。
【図３４】図３４Ａ〜図３４Ｃは、ｐＤ１−ＤＴＸ−１ベクターの核酸配列を示す図である。
【図３５】図３５Ａ〜図３５Ｃは、ｐＲ１−ＤＨＦＲベクターの核酸配列を示す図である。
【図３６】図３６Ａ〜図３６Ｄは、ｐＤ１−ＤＴＸ１−Ｇ４１８ベクターの核酸配列を示す図である。
【図３７】図３７Ａ〜図３７Ｄは、ｐＤ３−ＤＴＸ１ベクターの核酸配列を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１１７】
実施例
以下の実施例は、本発明の生成方法および使用方法の完全な開示ならびに説明を当業者に提供するために提示されており、本発明者らの発明に関する範囲を限定することを意図せず、以下の実験が、すべてである、または、実施した実験のみであることを示すことを意図していない。使用された数字（例えば、量、温度等）に関する正確性を確保する努力がなされているが、ある程度の実験誤差および偏差が考慮されるべきである。特に示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、および圧力は大気圧またはその付近である。
【０１１８】
実施例１
標的およびドナーベクターの構築
導入遺伝子の高レベル発現は、組込みのランダム性および組み込まれた導入遺伝子に対する関連する染色体の文脈効果のために、ＣＨＯ細胞および他の哺乳類細胞株中で一貫して達成することは難しかった。ファージφＣ３１およびＲ４からの部位特異的インテグラーゼを使用して、部位特異的組込みベクターが、哺乳類細胞のゲノム中の関心遺伝子をコードする発現カセットの部位特異的組込みを提供するために産生され得る。
【０１１９】
φＣ３１およびＲ４組込みシステムは、強い遺伝子発現によっても特徴付けられるゲノム中の比較的少ない数の位置に組込みを提供することによって、ランダムな組込みの多くの制限を取り除く。φＣ３１またはＲ４インテグラーゼでの導入遺伝子の組込みにより、導入遺伝子の安定な高レベル発現を示す哺乳類細胞株を生成する容易な方法が得られる。したがって、産生細胞株を生成するためのファージインテグラーゼの使用は、タンパク質産生に適したクローンを単離するのに必要とされる時間と労力を削減する。したがって、組込みは、開いたクロマチンまたは減少したメチル化を伴う染色体上の場所で最も好都合に発生すると考えられるため、かかる場所は、高レベル持続遺伝子発現のためにも最も好都合である。
【０１２０】
標的ベクター
細胞株のゲノム中の部位特異的インテグラーゼ付着部位を導入するために用いられる例示的な標的ベクターの概略図を図１および図８Ａに与える。概して、標的ベクターは、第１の部位特異的インテグラーゼに対する第１の付着部位と第２の部位特異的インテグラーゼ（例えば、より高い組込み効率を有する変化した部位特異的インテグラーゼ）に対する第２の付着部位を含み、第１および第２の部位特異的インテグラーゼは異なる。また、標的ベクターは、ベクターを含有する原核細胞の選択を提供する細菌選択可能なマーカー（例えば、アンピシリン耐性をコードするβ−ラクタマーゼ）等のさらなる要素を含んでもよい。加えて、ベクターは、ゲノムにうまく組み込まれた標的ベクターと、大腸菌等の細菌細胞中のベクター複製（例えば、ＤＮＡ複製のＣｏｌＥ１起点）の起点とを有する哺乳類細胞を選択するための哺乳類細胞特異的選択可能なマーカー（例えば、薬剤ハイグロマイシン耐性をコードするハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子）を含んでもよい。
【０１２１】
図１２および図１３に示すように、標的ベクターは、哺乳類細胞等の細胞のゲノム中にφＣ３１  ａｔｔＰ  １０３部位をコードする核酸配列を導入するために使用される。組み込まれ次第、このφＣ３１  ａｔｔＰ  １０３部位は、関心遺伝子およびφＣ３１  ａｔｔＢ  ２８５ＡＡＡ部位をコードする核酸配列のための発現カセットを含むドナープラスミドを部位特異的に組み込むために使用される。初期標的ベクターは、２つの異なる部位特異的インテグラーゼへの２つの異なるａｔｔ部位のための核酸配列を含む。特に、標的ベクターは、Ｒ４ａｔｔＢ２９５部位をコードする核酸配列を含む。Ｒ４  ａｔｔＢ  ２９５部位は、哺乳類細胞ゲノム中の偽性ａｔｔＰ（Ｒ４  Ψ  ａｔｔＰ）部位への標的ベクターの組込みを媒介する。通常の哺乳類ゲノムには約１００のＲ４  Ψ  ａｔｔＰ部位があると推定される。標的ベクターは、φＣ３１  ａｔｔＰ  １０３部位をコードする核酸配列も含む。φＣ３１  ａｔｔＰ  １０３部位は、関心遺伝子の発現を指示するように設計された発現カセットを含むドナーベクターの組込みに対する標的部位としての機能を果たす。
【０１２２】
ここで選択された組込みの順序、すなわち、Ｒ４インテグラーゼ媒介による組込みと、それに続くφＣ３１変異インテグラーゼ媒介による組込みは、２つの理由から選択される。哺乳類ゲノムにおいて、Ｒ４  Ψ  ａｔｔＰ部位はφＣ３１  Ψ  ａｔｔＰ部位よりも少ないため、φＣ３１インテグラーゼ媒介による組込みではなく、Ｒ４インテグラーゼ媒介による組込みが最初のステップとして選択された。したがって、組込みが生じる部位の数は少なく、最も高いレベルのタンパク質発現を伴うものを同定するために、より少ないクローンがスクリーニングされる必要がある。ドナーベクターの組込み後に高レベルのタンパク質発現をもたらす第１の組込み部位が同定され次第、できるだけ有効なドナーベクターの組込みを有することが望ましため、φＣ３１変異インテグラーゼ媒介による組込みが第２のステップとして選択される。したがって、変異体φＣ３１インテグラーゼが使用される。組み込まれたベクター（標的ベクターに含有されるもの等）に含有される野生型ａｔｔＰ部位で生じる最大７５％の組込みイベントをもたらすφＣ３１インテグラーゼの変異体が同定され、一方、残りの２５％は様々なφＣ３１Ψ  ａｔｔＰ部位で生じる。２９３、Ｄ４０７、およびＨｅｐＧ２細胞等のヒト細胞中に、約３７０（９５％信頼区間での範囲＝２０２−７６４）のφＣ３１Ψ  ａｔｔＰ部位があると推定される（Ｃｈａｌｂｅｒｇら、２００６）。組込みが最も頻繁に起こる部位は、異なる細胞によって様々であり得るが、典型的には組込み部位としての機能を果たすことができる部位の合計数の＜５〜１０％である。偽性ａｔｔＰ部位よりも野生型ａｔｔＰ部位に対して低度の選択性を有した、有効性の低いインテグラーゼが使用された場合、組み込まれた標的ベクター中の所望の野生型ａｔｔＰ部位よりも多くの組込みがφＣ３１  Ψ  ａｔｔＰ部位で生じる。
【０１２３】
さらに、標的ベクターは、ゲノム的に組み込まれた標的ベクターを有するハイグロマイシン耐性クローンを選択するために使用される、選択可能なマーカーハイグロマイシンをコードする核酸配列も有する。標的ベクターは、ピューロマイシンコード領域の第１の部分（例えば、プロモーターレス）およびφＣ３１  ａｔｔＰ  １０３部位をコードするＳＶ４０ポリＡシグナル下流を有する。ドナーベクターの組込み後、ＳＶ４０プロモーターは、ピューロマイシン遺伝子の上流に導入され、それにより選択可能なマーカーの発現を提供することができる完全な遺伝子発現カセットを再構成する。したがって、再構成されたピューロマイシン選択可能なマーカーは、ドナーベクター上のφＣ３１  ａｔｔＢ部位（例えば、φＣ３１  ａｔｔＢ  ２８５  ＡＡＡ部位）と標的ベクター上に存在するφＣ３１  ａｔｔＰ部位（例えば、φＣ３１  ａｔｔＰ  １０３部位）間の良好な組換えイベントを効果的に選択するために使用され得る。
【０１２４】
選択のためのより弱いプロモーター（例えば、ＳＶ４０）および有毒な薬剤（例えば、ピューロマイシン）は、所望のドナーベクター組込みイベントに対してより強い選択を提供するために、選択のためのより強いプロモーター（例えば、ＣＭＶ）および弱い薬剤（例えば、Ｇ４１８）に対立させて選択される。このステップ、組み込まれた標的ベクターへのドナーベクターの組込みは、関心遺伝子のための発現カセットを含有するドナーベクターの部位特異的組込みを可能にする、本発明の重要なステップである。しかしながら、ドナーベクター上の多種多様なプロモーター（コード領域を有さない）は効果的なように機能してもよい。さらに、標的ベクター上に存在する薬剤耐性遺伝子（プロモーターを有さない）のための多種多様なコード領域も効果的なように機能してもよい。ＳＶ４０プロモーターおよびピューロマイシンコード領域を使用するここに示される実施例は、限定的なものではない。
【０１２５】
同様の方法において、比較的弱いプロモーター（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）は、標的ベクター上の薬剤耐性マーカー（ハイグロマイシン）の発現を駆動するために使用される。共に選択されたマーカーは、連鎖関心遺伝子のより高い発現をもたらすことができることが一部報告されている。
【０１２６】
標的ベクターの構築
標的ベクター（ｐＲ１、図８）を構築するために、以下のステップを行った。ｐＲ１ベクターの配列を図３３Ａ−図３３Ｂに与える。Ｒ４  ａｔｔＢ  部位（Ｒ４  ａｔｔＢ  ２９５）を含有する２９５ｂｐ断片は、Ｏｌｉｖａｒｅｓら、２００１により説明されるように、プライマー５’−ＣＧＴＧＧＧＧＡＣＧＣＣＧＴＡＣＡＧ−３’（配列番号０１）および５’−ＣＣＣＧＧＴＣＡＡＣＡＴＣＣＡＧＴＡＣＡＣＣＴ−３’（配列番号０２）を使用して、再水和されたストレプトミセスパルブルス細胞（ＡＴＣＣ１２４３４）からＰＣＲで増幅し、ｐＴＡ−Ｒ４ａｔｔＢを生成するためにｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローン化した。Ｒ４  ａｔｔＢ  ２９５は、ＥｃｏＲＩによる消化でｐＴＡ−Ｒ４ａｔｔＢから単離した。この断片は、Ｋｌｅｎｏｗ  ＤＮＡポリメラーゼで末端を充填することによって平滑末端化し、次いで、ベクターｐＴＫ−Ｒ４Ｂを生成するために、Ｋｌｅｎｏｗ  ＤＮＡポリメラーゼで末端を充填することによって平滑末端化したＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位でｐＴＫ−Ｈｙｇ（ＴａＫａＲａ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）内に連結した。ＤＮＡ配列決定は、ｐＴＫ−Ｒ４が正しい配列を有しているか、また、Ｒ４  ａｔｔＢ  ２９５部位が図８に示す配向にあるか、つまりＲ４  ａｔｔＢコア組換え部位の右側（三角形の矢印点で示す）がハイグロマイシン耐性カセットに最も近かったかを確認するために使用した。
【０１２７】
２つのポリメラーゼ連鎖反応は、φＣ３１  ａｔｔＰ  １０３およびピューロマイシン耐性コード領域を別々に増幅するために行った。次いで、第３のＰＣＲを使用してそれらを正確に共に融合した。ＰＣＲ条件は、変性を９５℃で１分間、アニールを６０℃で１５秒間、および重合を７２℃で４５秒間であった。反応は、平滑末端化されたＰＣＲ産物を生成する校正酵素（Ｐｆｕ  Ｕｌｔｒａ）を用いて行った。
【０１２８】
機能的ａｔｔＰ部位をコートすることで知られる配列を含有するφＣ３１  ａｔｔＰ部位（φＣ３１  ａｔｔＰ  １０３）の１０３ｂｐ領域は、プライマーＣ３１−ａｔｔＰ−１（５’−ＡＡＡＡＡＡＧＡＡＴＴＣＧＴＡＣＴＧＡＣＧＧＡＣＡＣＡＣＣＧＡＡＧＣＣＣＣ−３’（配列番号０３）およびＣ３１−ａｔｔＰ−２（５’−ＣＡＣＧＧＴＡＧＧＣＴＴＧＴＡＣＴＣＧＧＴＣＡＴＧＧＴＧＧＣＧＡＣＣＣＴＡＣＧＣＣＣＣＣＡＡＣＴＧ−３’）（配列番号０４）を使用してｐＴＡ−ａｔｔＰ（Ｏｌｉｖａｒｅｓら、２００１によって記述される）から増幅し、１８６ｂｐ産物を得た。プライマーＣ３ｌ−ａｔｔＰ−２の５’末端は、ピューロマイシン耐性ＯＲＦの５’末端から２４の塩基を有する。
【０１２９】
ＳＶ４０からのポリアデニル化シグナルと共にピューロマイシン耐性コード領域を、プライマーＰｕｒｏｌ（５’−ＣＡＧＴＴＧＧＧＧＧＣＧＴＡＧＧＧＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＧＡＧＴＡＣＡＡＧＣＣＣＡＣＧＧＴＧ−３’）（配列番号０５）およびＳＶ４０ポリＡ（５’−ＡＡＡＡＡＡＣＣＴＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴＡＡＧＡＴＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＴＴＴＧＧ−３’）（配列番号０６）を使用してｐＰＵＲ（ＴａＫａＲａ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＰＣＲで増幅し、１００１ｂｐ産物を得た。プライマーＰｕｒｏｌの５’末端は、φＣ３１  ａｔｔＰの３’末端から２４の塩基を有しており、ＳＶ４０ポリＡの３’末端は、Ｂｂｓ  Ｉ制限酵素認識部位を有する。最初の１０サイクルのＰＣＲ条件は、変性を９５℃で１分間、アニールを４７℃で３０秒間、および重合を７２℃で７５秒間であった。次の１５サイクルのＰＣＲ条件は、変性を９５℃で１分間、アニールを６０℃で３０秒間、および重合を７２℃で７５秒間であった。反応は、平滑末端化されたＰＣＲ産物を生成する校正酵素（Ｐｆｕ  Ｕｌｔｒａ）を用いて行った。
【０１３０】
φＣ３１  ａｔｔＰ  １０３を含有するＤＮＡを、ピューロマイシン耐性コード領域およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含有するＤＮＡに融合するために、それらの別々のＰＣＲの産物を等モル比で混合し、プライマーＣ３１−ａｔｔＰ−１およびＳＶ４０ポリＡを用いてＰＣＲで増幅し、１１３８ｂｐ産物を得た。ＰＣＲ条件は、変性を９５℃で３０秒間、アニールを６０℃で２０秒間、および重合を７２℃で９０秒間であった。反応は、平滑末端化されたＰＣＲ産物を生成する校正酵素（Ｐｆｕ  Ｕｌｔｒａ）を用いて行った。
【０１３１】
φＣ３１  ａｔｔＰ  １０３、ピューロマイシン耐性オープンリーディングフレーム、およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含有する１１３８ｂｐＰＣＲ産物を、Ｂｂｓ  Ｉで消化し、Ｓｗａ  ＩおよびＢｂｓ  Ｉで消化されたｐＴＫ−Ｒ４Ｂ内にクローン化した。これにより、標的ベクターｐＲ１を生じた。ｐＲ１中のφＣ３１  ａｔｔＰ  １０３、ピューロマイシン耐性オープンリーディングフレーム、およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルの配列および適切な配向をＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１３２】
φＣ３１  ａｔｔＰ  １０３−ピューロマイシンコード領域融合の設計の重要な特徴は、図１４に図表化する。ｐＴＡ−ａｔｔＰに存在する２２１塩基対の長さのφＣ３１  ａｔｔＰ  ２２１部位は、φＣ３１  ａｔｔＬ部位を作成するために、ドナーベクターが標的ベクター内に組み込まれると、ピューロマイシンコード領域の上流で終わるＡＴＧを有する。通常、正当なコード領域の上流であるＡＴＧ配列（潜在的な翻訳開始部位）は、遺伝子発現に悪影響を及ぼす。したがって、ピューロマイシンコード領域にφＣ３１  ａｔｔＰ  １０３を融合するＰＣＲ産物において、そのＡＴＧは、ピューロマイシンコード領域の開始コドンを生成された。さらに、そのＡＴＧの前に、２つの塩基はより最適な共通翻訳開始（Ｋｏｚａｋ）配列（ＧＣＣＡＣＣ）を作成するように変化した。図１４に示すように、これらの変化は、最小だが完全に機能的なＧｒｏｔｈら、２０００によって同定されたφＣ３１  ａｔｔＰ部位への少なくとも１８の塩基３’である。したがって、標的ベクター中のφＣ３１  ａｔｔＰ  １０３部位に組み込むために、ドナーベクター中のφＣ３１  ａｔｔＢ  ２８５  ＡＡＡ部位の能力に影響を及ぼさないはずである。標的ベクターへのドナーベクターの組込み後、８８塩基の長さのφＣ３１  ａｔｔＬ部位（φＣ３１  ａｔｔＬ  ８８）は、ピューロマイシンコード領域の直前の５’非翻訳領域に位置付けられる。前述のφＣ３１  ａｔｔＬ  ８８は、ＳＶ４０初期プロモーター５’非翻訳領域（ＳＶ４０初期プロモーターによって指示される転写は、３つの異なる部位で開始）に由来する５７、６２、または７４の塩基であってもよい。
【０１３３】
ドナーベクター
例示的なドナー発現ベクターの図式を図２および図１０に与える。例示的なドナー発現ベクターは、φＣ３１  ａｔｔＢ  ２８５  ＡＡＡ部位をコードする核酸配列と、ヒト抗体の重鎖および軽鎖をコードするカセット等の関心遺伝子をコードする核酸発現カセットとを含有する。また、ドナーベクターは、φＣ３１  ａｔｔＢ  ２８５  ＡＡＡ部位をコードする核酸配列のＳＶ４０プロモーター上流を含有する。ドナーベクター上に存在するφＣ３１  ａｔｔＢ  ２８５  ＡＡＡと標的ベクター中に存在するφＣ３１  ａｔｔＰ  １０３と間で部位特異的組換えによって媒介される、以前に組み込まれた標的ベクターへのドナーベクターの組込み後、ＳＶ４０プロモーターは、ピューロマイシン遺伝子の発現を駆動する（図１３）。したがって、再構成されたピューロマイシン耐性遺伝子は、関心タンパク質を発現させるためにドナーベクター上の遺伝子を組み込んだ細胞クローンを選択するために使用することができる。
【０１３４】
この選択ステップは、ドナーベクター上のφＣ３１  ａｔｔＢ  ２８５  ＡＡＡ部位が推定３７０の染色体上の位置（Ｃｈａｌｂｅｒｇら、２００６）で発見されたφＣ３１  Ψ  ａｔｔＰ部位にも組み込むことができるため、高効率な方法を達成するために重要である。しかしながら、φＣ３１  Ψ  ａｔｔＰ部位内に組み込むすべての例示的なドナー発現ベクターは、ＳＶ４０プロモーターのみを含有し、機能的なピューロマイシン耐性遺伝子を再構成しない。また、一部のピューロマイシン耐性細胞は、インテグラーゼ単独で発現される場合に、ａｔｔＰ標的ベクタークローン内で発現される（つまり、ドナー発現ベクターが存在しない）。理論に固執することなく、これが生じる機構は、標的ベクター中にａｔｔＰ  １０３部位を有する細胞プロモーターの付近にあるΨ  ａｔｔＢ部位の組換えを伴ってもよい。発現ベクターを有さない細胞は、選択可能なドナー発現ベクター上の完全な選択可能な薬剤耐性遺伝子に耐性がないため、選択可能なドナー発現ベクターおよび第２のインテグラーゼ発現ベクターでのａｔｔＰ細胞株の形質移入はこの懸念に対処する。さらに、必要に応じて、染色体標的ベクターへのドナーベクターの所望の組込みは、段落「細胞株特徴付けの方法」で後述されるφＣ３１  Ψ  ａｔｔＰ部位へのドナーベクターの所望されないランダムな組込みまたは組込みと容易に区別することができる。
【０１３５】
ドナー発現ベクターの構築
ドナー発現ベクター（ｐＤ１−ＤＴＸ−１）は、Ｊｏｎｅｓら、２００３によって説明されるｐｃＤＮＡ３００２ｎｅｏに基づいている。ｐｃＤＮＡ３００２ｎｅｏは、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）に基づいている。ｐｃＤＮＡ３００２ｎｅｏは、哺乳類細胞におけるタンパク質の発現のための２つのウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルが続く２つのＣＭＶプロモーターを含有する。また、ｐｃＤＮＡ３００２ｎｅｏは、大腸菌の維持および選択のためのＣｏｌＥ１起点およびアンピシリン耐性遺伝子も含む。最後に、ｐｃＤＮＡ３００２ｎｅｏベクターは、ＳＶ４０プロモーターを使用して発現されたＧ４１８耐性遺伝子とＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを有する。ｐＤ１−ＤＴＸ−１ベクターの配列を図３４Ａ〜図３４Ｃに与える。
【０１３６】
ｐＤ１−ＤＴＸ−１を構築するため、６つの挿入断片を、以下を含有するｐｃＤＮＡ３００２ｎｅｏ内にクローン化した。１）８塩基対の長さの認識配列内で切断する３つの制限酵素のための認識部位を有するポリリンカー、２）φＣ３１  ａｔｔＢ  ２８５  ＡＡＡ領域、３）ヒト抗体の重鎖等のタンパク質の分泌を媒介し、固有の制限酵素部位を含有する第１のシグナル配列、４）ヒト抗体の軽鎖等のタンパク質の分泌を媒介し、別の固有の制限酵素部位を含有する第２のシグナル配列、５）ジフテリア毒素に対して特異的なヒト抗体の重鎖等の第１のタンパク質のためのコード領域、および６）ジフテリア毒素に対して特異的なヒト抗体の軽鎖等の第２のタンパク質のためのコード領域。
【０１３７】
ｐｃＤＮＡ３００２ｎｅｏは、そのＣＭＶプロモーターのうちの１つに続く有用なポリリンカーを欠く。したがって、ドナーベクターｐＤ１を作成するための第１のステップとして、３つの発生することがほとんどない制限酵素部位を有するポリリンカーを挿入した。２つの合成オリゴヌクレオチド（ＢａｍＢｓｔ−ＡおよびＢａｍＢｓｔ−Ｂ）をアニールした。ＢａｍＢｓｔ−Ａの配列は、５’−ＧＡＴＣＣＡＡＡＡＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡＡＡＡＡＡＡＣＡＣＣＧＧＣＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＡＴＣＧＣＡＡＡＡＡＡＣＣＡＧＴＧＴＧ−３’（配列番号０７）である。ＢａｍＢｓｔ−Ｂの配列は、５’−ＣＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＣＧＡＴＣＧＣＴＴＴＴＴＴＣＧＣＣＧＧＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＴＴＴＴＧ−３’（配列番号０８）である。ＢａｍＢｓｔ−ＡおよびＢａｍＢｓｔ−Ｂがアニールされると、それらは、それぞれの５’および３’末端でＢａｍ  ＨＩおよびＢｓｔ  ＸＩ相補的配列をそれぞれ含有し、Ｂａｍ  ＨＩ／Ｂｓｔ  ＸＩ消化されたｐｃＤＮＡ３００２ｎｅｏへの連結を可能にする。また、配列は、Ｐａｃ  Ｉ、ＳｇｒＡ  Ｉ、およびＡｓｉＳ  Ｉに対する（５’から３’の順序）制限酵素認識部位も含有する。６つのアデノシンのスペーサー配列は、必要に応じて２つの隣り合う部位での効率的な消化を可能にするために、各制限酵素部位を分離する。２つの合成オリゴヌクレオチドをそのままの状態（つまり、非リン酸化）でアニールした。ｐｃＤＮＡ３００２ｎｅｏを３７℃でＢａｍ  ＨＩで消化し、次いで、５５℃でＢｓｔ  ＸＩで消化した。消化されたベクターを、アニールされたポリリンカーに連結し、連結はＸＬ−１０Ｇｏｌｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）大腸菌細胞に形質転換した。結果として生じたベクターは、ｐＨＰＣ−１と称した。
【０１３８】
ドナーベクターｐＤ１内の重大な配列要素は、φＣ３１  ａｔｔＢ  ２８５  ＡＡＡ部位である。φＣ３１  ａｔｔＢ  ２８５  ＡＡＡ部位を、Ｏｌｉｖａｒｅｓら、２００１によって説明されるベクターｐＴＡ−ａｔｔＢからＰＣＲで増幅した。５’プライマーは、Ｃ３１ａｔｔＢ−５’と称され、５’−ＧＴＣＧＡＣＧＡＡＡＴＡＧＧＴＣＡＣＧＧＴＣＴＣ−Ｓ’（配列番号０９）の配列を有する。３’プライマーは、Ｃ３１ａｔｔＢ−３’と称され、５’−ＴＡＣＧＴＣＧＡＣＡＴＧＣＣＣＧＣＣＧＴＧＡＣＣ−３’（配列番号１０）の配列を有する。ＰＣＲ条件は、変性を９５℃で１分間、アニールを６０℃で１５秒間、およびＰｆｕ  Ｕｌｔｒａポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使って７２℃で３０秒間伸長した。他の反応構成要素の濃度は、標準ＰＣＲ（例えば、２００μＭ  ｄＮＴＰ、１μＭ各プライマー、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）のものと同じであった。
【０１３９】
５’プライマーは、ｐＴＡ−ａｔｔＢにおけるφＣ３１  ａｔｔＢ部位の５’末端で、ＡＴＧ配列をＡＡＡ配列に変化させた。この理由は、φＣ３１  ａｔｔＰ  １０３部位に対して上述したものと同様であり、図１４に図表化する。ｐＴＡ−ａｔｔＰ内に存在するφＣ３１  ａｔｔＢ  ２８５部位の５’末端は、φＣ３１  ａｔｔＬ  ８８部位を作成するために、ドナーベクターが標的ベクターに組み込まれると、ピューロマイシンコード領域の上流で終わるＡＴＧを有する。通常、正当なコード領域の上流であるＡＴＧ配列（潜在的な翻訳開始部位）は、遺伝子発現に悪影響を及ぼす。したがって、φＣ３１  ａｔｔＢの５’末端のＡＴＧは、ＡＡＡに変化された。ＡＵＧのすべて１つの塩基変異体は、代替的な翻訳開始コドンとして機能することが分かっている。しかしながら、代替的な翻訳開始コドンとして機能することを示す塩基変異体は２つとない。したがって、φＣ３１  ａｔｔＢ内の５’ＡＴＧを翻訳開始コドンとして使用することを防ぎ、同時に、φＣ３１  ａｔｔＢの配列に最小数の変化を導入するために、ＡＴＧはＡＡＡに変化された。このＡＴＧは、ｐＴＡ−ａｔｔＢに含有されるφＣ３１  ａｔｔＢ領域の５’末端付近にあるため、φＣ３１  ａｔｔＢ配列をｐＴＡ−ａｔｔＢからＰＣＲするために使用されたプライマーに、ＡＡＡ変化するＡＴＧを取り込むことが最も便利であった。
【０１４０】
プライマーＣ３ｌａｔｔＢ−５’およびＣ３１ａｔｔＢ−３’を用いたＰＣＲでのｐＴＡ−ａｔｔＢの増幅は、φＣ３１  ａｔｔＢ  ２８５  ＡＡＡと称される２８５塩基対の長さの産物をもたらした。ｐＨＰＣ−１をＳｍａ  ＩおよびＢｓｔ  Ｚ１７  Ｉを用いて消化し、１１３０ｂｐおよび５７１８ｂｐ断片を得た。φＣ３１ａｔｔＢ  ２８６  ＡＡＡ  ＰＣＲ産物を５７１８ｂｐ断片に連結した。これは、ｐＨＰＣ−２と称されるプラスミドを産生した。ａｔｔＢの左側がＳＶ４０プロモーターに隣接するような配向にあるφＣ３１  ａｔｔＢ  ２８６  ＡＡＡ配列を有するプラスミドは、ｐＨＰＣ−２（＋）と称し、一方、逆の配向にあるφＣ３１  ａｔｔＢ  ２８６  ＡＡＡ配列を有するプラスミドは、ｐＨＰＣ−２（−）と称した。
【０１４１】
ｐＨＰＣ２（＋）およびｐＨＰＣ−２（−）は、分泌されないタンパク質をコードする遺伝子を組込み、発現するベクターとして有用である。しかしながら、抗体、出血性因子、増殖因子、血清因子、または可溶性受容体等のタンパク質を分泌するため、分泌のためのシグナル配列を含有するドナーベクターが望ましいであろう。したがって、固有の制限酵素部位を有するために、ヒトＴ細胞受容体α鎖からシグナル配列（ＨＡＶＴ２０；Ｂｏｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０００  Ｍａｙ  ２６；２３９（ｌ−２）：１５３−６６）を修飾した。固有のＰｍｌ  Ｉ部位を有する一バージョンをｐＨＰＣ２（＋）における２つのポリリンカーのうちの一方で挿入し、固有のＰｓｐＸ  Ｉ部位を有する別のバージョンをｐＨＰＣ２（＋）における他方のポリリンカーで挿入した。いずれのバージョンもＨＡＶＴ２０シグナル配列のアミノ酸配列を変化させることなく、また変化は、よく使われるヒトコドンを利用した。Ｐｍｌ  ＩおよびＰｓｐＸ  Ｉ部位は両方とも、シグナル配列切断部位の直前で生じる。したがって、ＨＡＶＴ２０シグナル配列における切断部位と、関心タンパク質のコード領域間との間の正確な融合は、関心遺伝子のコード領域を増幅するために、適切なＰＣＲプライマーを設計することによって容易に達成される。あるいは、ＨＡＶＴ２０シグナル配列を除去し（例えば、一方のクローニング部位でＢａｍＨ  Ｉ／Ｐａｃ  Ｉを使用し、他方のクローニング部位でＡｓｃ  Ｉ／Ｎｏｔ  Ｉを使用して）、他のシグナル配列を挿入することが可能である。それらの配列は、非相同（例えば、ＩＬ−２シグナル配列）または相同（例えば、ヒトＩｇＧｌシグナル配列）であり得る。
【０１４２】
一つのＨＡＶＴ２０シグナル配列をｐＨＰＣ−２（＋）に挿入するため、５’末端のＢａｍ  ＨＩ部位、最適な共通Ｋｏｚａｋ配列、Ｐｍｌ  Ｉ部位を有するＨＡＶＴ２０シグナル配列、および３’末端のＰａｃ  Ｉ部位をコードする二本鎖ＤＮＡを、２つのオリゴヌクレオチド、ＨＡＶＴ２０−Ｌ−ｔｏｐ（５’−ＣＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＴＧＣＣＣＴＧＧＣＴＴＣＣＴＧＴＧＧＧＣＡＣＴＴＧＴＧＡＴＣＴＣＣＡＣＣＴＧＣＣＴＣＧＡＧＴＴＴＴＣＣＡＴＧＧＣＴＣＧ−３’）（配列番号  １１）およびＨＡＶＴ２０−Ｌ−ｂｏｔ（３’−ＧＧＴＧＧＴＡＣＣＧＴＡＣＧＧＧＡＣＣＧＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＧＴＧＡＡＣＡＣＴＡＧＡＧＧＴＧＧＡＣＧＧＡＧＣＴＣＡＡＡＡＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣ−５’）（配列番号１２）をアニールすることによって生成した。このアニールされたカセットを、Ｂａｍ  ＨＩおよびＰａｃ  Ｉで消化されたｐＨＰＣ２（＋）に連結した。結果として生じたプラスミドは、ｐＨＰＣ−３を称した。
【０１４３】
第２のＨＡＶＴ２０シグナル配列をｐＨＰＣ−３に挿入するため、５’末端のＡｓｃ  Ｉ部位、最適な共通Ｋｏｚａｋ配列、ＰｓｐＸ  Ｉ部位を有するＨＡＶＴ２０シグナル配列、および平滑３’末端をコードする二本鎖ＤＮＡを、２オリゴヌクレオチド、ＨＡＶＴ２０−Ｈ−ｔｏｐ（５’−ＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＴＧＣＣＣＴＧＧＣＴＴＣＣＴＧＴＧＧＧＣＡＣＴＴＧＴＧＡＴＣＴＣＣＡＣＧＴＧＴＣＴＴＧＡＡＴＴＴＴＣＣＡＴＧＧＣＴＴＴＡＡＴ−３’）（配列番号１３）およびＨＡＶＴ２０−Ｈ−ｂｏｔ（３’−ＧＣＧＧＴＧＧＴＡＣＣＧＴＡＣＧＧＧＡＣＣＧＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＧＴＧＡＡＣＡＣＴＡＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＧＡＡＣＴＴＡＡＡＡＧＧＴＡＣＣＧＡＡＡＴ−５’）（配列番号１４）をアニールすることによって生成した。このアニールされたカセットを、Ａｓｃ  ＩおよびＥｃｏ  ＲＶで消化されたｐＨＰＣ３に連結した。結果として生じたプラスミドは、とりわけ、プロモーター等の容易に交換できる種々の遺伝子発現要素に使用されてもよいドナー発現ベクターの骨格である。このドナー発現ベクターの骨格をｐＨＰＣ−４と称した（図９）。
【０１４４】
ヒトＩｇＧ遺伝子を単離するため、ジフテリア毒素を連結する抗体を分泌するＥＢＶ形質転換されたヒトＢ−細胞株を、Ｔｒａｇｇｉａｉら、２００４によって説明されるように抽出した。高親和性を持つ一抗体は、サブタイプされ、ヒトＩｇＧｌ重鎖およびκ軽鎖を有することが分かった。ＲＮＡは、この抗体を産生する細胞から調製し、重鎖および軽鎖抗体遺伝子をコードするｃＤＮＡを生成するために、ＲＴ−ＰＣＲ反応に用いた。増幅に使用したプライマーは、末端がサブクローニングを可能にする適切な制限酵素部位を有したことを除いて、Ｍａｒｋｓ，ｅｔ  ａｌ．（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１９９１  Ａｕｇ；５２（２）：３４０−５），Ｓｂｌａｔｔｅｒｏ，ｅｔ  ａｌ．（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９８  Ｊａｎ；３（４）：２７１−８），およびＹａｍａｎａｋａ，ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ），１９９５  Ｊｕｎ；１１７（６）：１２１８−２７）により記載されるものと同様であった。軽鎖ｃＤＮＡは、ｐＢＫ−ＣＭＶ−ＤＴＸ−Ｌを作成するために、ｐＢＫ−ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＮｏｔ  Ｉ／Ｘｂａ  Ｉ部位にクローン化した。重鎖ｃＤＮＡは、ｐＡＢＭＣ１０３を作成するために、ｐＢＫ−ＣＭＶ−ＤＴＸ−ＬのＨｉｎｄ  ＩＩＩ／Ｓａｌ  Ｉ部位にクローン化した。ｃＤＮＡｓを配列決定し、ヒトＩｇＧ１κとしてのそれらのアイデンティティを確認した。
【０１４５】
抗ジフテリア毒素抗体遺伝子をｐＨＰＣ−４にサブクローン化するため、重鎖遺伝子全体を、鋳型としてｐＡＢＭＣ１０３を使用して、プライマー５’−ＡＡＡＡＡＡＣＡＣＧＴＧＴＣＴＴＧＡＡＴＴＴＴＣＣＡＴＧＧＣＴＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧ−３’（配列番号１５）および５’−ＡＡＡＡＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧ−３’（配列番号１６）を用いてＰＣＲにより増幅した。結果として生じた重鎖ＰＣＲ産物は、ｐＨＰＣ４−ＤＴＸ−Ｈを作成するために、ＢｂｒＰ  Ｉ（Ｐｍｌ  Ｉのイソ制限酵素）で消化し、ＢｂｒＰ  ＩおよびＰａｃ  Ｉで消化されたｐＨＰＣ−４にクローン化した。軽鎖遺伝子全体は、鋳型としてｐＡＢＭＣ１０３を使用して、プライマー５’−ＡＡＡＡＣＣＴＣＧＡＧＴＴＴＴＣＣＡＴＧＧＣＴＧＡＡＡＣＧＡＣＡＣＴＣＡＣＧＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧ３’（配列番号１７）および５’−ＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＴＧ−３’（配列番号１８）を用いて増幅した。結果として生じた軽鎖ＰＣＲ産物は、ｐＤ１−ＤＴＸ−１を作成するために、ＰｓｐＸ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉで消化し、ＰｓｐＸ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉで消化されたｐＨＰＣ４−ＤＴＸ−Ｈにクローン化した。両抗体鎖遺伝子の配列は、両方のストランドに対して確認した。
【０１４６】
ｐＨＰＣ−２、ｐＨＰＣ−４、およびｐＤ１−ＤＴＸ−１は、サブクローニングベクターおよび発現ベクターであり得る。２つのＣＭＶプロモーター、ＨＡＶＴ２０シグナル配列、およびウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルのそれぞれの配列はほぼ同一であるが、それらは、配列が異なるポリリンカーによって分離される。したがって、各発現カセットに挿入される遺伝子を配列決定することができる特異的な配列決定のプライマーを設計している。例えば、プライマー５’−ＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＧＡＴＣＣ−３’（配列番号１９）は、一方のシグナル配列のＰｍｌＩ部位の後ろに挿入される抗体可変領域を配列決定するために使用することができ、プライマー５’−ＧＡＡＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＧＧＴＧＡＡＴＴＣＧＧ−３’（配列番号２０）は、他方のシグナル配列のＰｓｐＸ  Ｉ部位の後ろに挿入される抗体可変領域を配列決定するために使用することができる。したがって、発現のためにそれらをｐＨＰＣ−２、ｐＨＰＣ−４またはｐＤ１−ＤＴＸ−１にクローン化する前に、関心遺伝子を他のベクターにクローン化する必要はない。
【０１４７】
さらに、任意の要素（例えば、プロモーター、シグナル配列、可変抗体鎖、定常抗体鎖、コード領域、ポリアデニル化部位、φＣ３１ａｔｔＢ部位）を、他の同様の要素で容易に除去し、置換することができるように、ｐＨＰＣ−４またはｐＤ１−ＤＴＸ−１内のあらゆる要素は、固有の制限酵素部位によって隣接される。
【０１４８】
例えば、Ｐｍｌ  Ｉ／Ｘｈｏ  ＩでｐＤ１−ＤＴＸ−１を消化し、他の重鎖可変領域で抗ジフテリア毒素抗体重鎖可変領域を置換することによって、重鎖可変領域を交換することができる。軽鎖可変領域は、ＰｓｐＸ  Ｉ／ＢｓｉＷ  ＩでｐＤ１−ＤＴＸ−１を消化し、他の軽鎖可変領域で抗ジフテリア毒素抗体軽鎖可変領域を置換することによって交換することができる。
【０１４９】
同様に、ＩｇＧ１重鎖定常領域は、ＡｐａＩ／ＰａｃＩ制限断片を交換することによって、他の抗体サブタイプ（例えば、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）または他の免疫グロブリンクラス（例えば、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ）からのものと交換することができる。ｐＤ１−ＤＴＸｌにおけるκ軽鎖定常領域は、ＢｓｉＷ  Ｉ／Ｎｏｔ  Ｉ制限断片を交換することによって、λκ軽鎖定常領域と交換することができる。
【０１５０】
一方のＣＭＶプロモーターは、Ｍｆｅ  Ｉ／ＢａｍＨ  Ｉ制限断片を交換することによって、別のプロモーターで置換することができ、他方のＣＭＶプロモーターは、ＢｓｔＺ１７  Ｉ／Ａｓｃ  Ｉ制限断片を交換することによって置換することができる。一方のＨＡＶＴ２０シグナル配列は、ＢａｍＨ  Ｉ／Ｐｍｌ  Ｉ制限断片を交換することによって置換することができ、他方は、Ａｓｃ  Ｉ／ＰｓｐＸ  Ｉ制限断片を交換することによって置換することができる。一方のウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルは、ＡｓｉＳ  Ｉ／ＮｇｏＭ  ＩＶ制限断片を交換することによって置換することができ、他方は、Ｃｌａ  Ｉ／Ｐｃｉ  Ｉ制限断片を交換することによって置換することができる。φＣ３１  ａｔｔＢ部位は、Ｓｔｕ  Ｉ／ＢｓｔＺ１７  Ｉ制限断片を交換することによって、別の部位特異的セリンインテグラーゼにより認識されるａｔｔＢ部位で置換することができる。
【０１５１】
標的−ＤＨＦＲベクターの構築
標的−ＤＨＦＲベクター（ｐＲ１−ＤＨＦＲ）は、ＳＶ４０プロモーター、マウスＤＨＦＲコード領域、マウスＤＨＦＲ  ｃＤＮＡの３’ＵＴＲ、およびＭｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ：ＭＬＶ）ポリアデニル化シグナルから成るマウスＤＨＦＲ発現カセットを標的ベクターｐＲ１にクローニングすることによって構築した。ｐＲ１−ＤＨＦＲベクターの配列を図３５Ａ〜図３５Ｃに与える。
【０１５２】
ＳＶ４０プロモーター、マウスＤＨＦＲコード領域、およびマウスＤＨＦＲ  ｃＤＮＡの３’ＵＴＲの一部を含有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から１，０７４塩基対ＤＮＡ断片を、プライマー５’−ＣＧＡＡＴＣＡＧＣＡＣＧＧＧＧＴＧＧＣＧＣＧＣＣＣＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＴＧＴＣＡＧＴＴＡＧＧ−３’（配列番号２１）および５’−ＣＧＡＡＴＣＡＧＣＡＣＧＡＡＧＴＧＣＡＣＣＧＧＴＧＴＴＴＡＡＡＣＴＴＡＡＴＴＡＡＡＧＡＴＣＴＡＡＡＧＣＣＡＧＣＡＡＡＡＧＴＣＣＣＡＴＧＧＴ−３’（配列番号２２）を使用してＰＣＲで増幅した。ＰＣＲに用いた条件は、Ｐｆｕ  ポリメラーゼを使用して、９５℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で９０秒を１０サイクル、次いで、９５℃で３０秒および７２℃で９０秒を１５サイクルであった。次いで、ＰＣＲ産物をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、Ｄｒａ  ＩＩＩで消化し、ならびに１０５０塩基対の断片を単離して、ゲル精製した。ｐＲ１は、Ｖａｎ９１  Ｉ（ＰｆｌＭ  Ｉのイソ制限酵素）で消化し、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲクリーンアップキットを使用して精製した。Ｄｒａ  ＩＩＩ断片は、ｐＲ１−ｄＨＦＲ（ｎｏｌｔｒ）を生成するために、Ｖａｎ９１  Ｉ切断ｐＲ１に連結した。
【０１５３】
ポリアデニル化シグナルを含有する５９４ｂｐ長のＭＬＶ末端反復配列は、プライマー５’−ＡＡＡＡＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡＡＡＴＧＡＡＡＧＡＣＣＣＣＡＣＣＴＧＴＡＧＧＴＴＴＧＧ−５’（配列番号２３）および５’−ＡＡＡＡＡＡＣＡＣＣＧＧＴＧＡＡＡＧＴＴＴＡＡＡＣＡＡＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＡＴＧＡＡＡＧＡＣＣＣＣＣＧＣＴＧＡＣＧＧＧＴＡＧ−３’（配列番号２４）を使用して、ｐＬＮＸＨ（ＴａＫａＲａ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＰＣＲで増幅した。用いたＰＣＲ条件は、Ｐｆｕポリメラーゼを使用して９５℃で３０秒、５６℃で３０秒、および７２℃で４５秒の１５サイクルを含む。次いで、平滑末端化されたＰＣＲ産物は、ｐＣＲ−ｐＬＴＲを作成するために、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯにクローン化した。ＭＬＶ  ＬＴＲは、ＥｃｏＲＩを使用してｐＣＲ−ｐＬＴＲから切断し、Ｋｌｅｎｏｗで平滑末端化して、ゲル精製した。ｐＲ１−ｄＨＦＲ（ｎｏｌｔｒ）は、ＰｍｅＩで消化し、ＣＩＰで処置した。ＭＬＶポリＡシグナルを含有するＭＬＶ  ＬＴＲ断片は、ｐＲ１−ＤＨＦＲを作成するために、Ｐｍｅ  Ｉ消化されたベクターに連結した。挿入断片の配向および正確な配列は、制限酵素での消化およびＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１５４】
ドナー−ＤＨＦＲ発現ベクターの構築
ドナー−ＤＨＦＲ発現ベクター（ｐＤ１−ＤＨＦＲ）は、ＳＶ４０プロモーター、マウスＤＨＦＲコード領域、マウスＤＨＦＲ  ｃＤＮＡの３’ＵＴＲ、およびＭｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ：ＭＬＶ）ポリアデニル化シグナルから成るマウスＤＨＦＲ発現カセットをドナー発現ベクターｐＤ１−ＤＴＸ−１にクローニングすることによって構築することができる。この１６２６塩基対の発現カセットは、プライマーＤＨＦＲ−Ｉ（５’−ＴＴＴＴＴＴＧＡＡＧＡＣＧＡＡＡＧＧＣＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＴＧＴＣＡＧＴＴＡＧＧＧＴＧＴＧＧＡ−３’）（配列番号２５）およびＬＴＲ−２（５’−ＡＡＡＡＡＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＡＴＧＡＡＡＧＡＣＣＣＣＣＧＣＴＧＡＣＧＧＧＴＡＧ−３’）（配列番号２６）を使用して、標的−ＤＨＦＲベクターｐＲ１−ＤＨＦＲからＰｆｕポリメラーゼを使用してＰＣＲで増幅し、ならびに図１６に示す配向においてｐＤ１−ＤＴＸ−１のＢｓｔＺ１７  Ｉ部位に平滑末端化された断片としてクローン化する。
【０１５５】
ＩＲＥＳ−ドナーベクターの構築
ＩＲＥＳ−ドナーベクター（ｐＤ１−ＩＲＥＳ、図１７）は、同じＩＲＥＳ（翻訳エンハンサー要素（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｅｌｅｍｅｎｔ：ＴＥＥ）としても知られる）の２つのコピーを固有のＢａｍＨＩまたはｐＤ１−ＤＴＸ−１のＡｓｃ  Ｉ部位のいずれか一方にクローニングすることによって構築することができる。マウスＧｔｘホメオドメイン遺伝子（Ｃｈａｐｐｅｌｌら、２０００）から然発生のＧｔｘ  ＩＲＥＳ、マウスＲｂｍ３  ｍＲＮＡ中の自然発生のＩＲＥＳ（Ｃｈａｐｐｅｌｌら、２００３）、またはＦＡＣＳベースの濃縮スキーム（Ｏｗｅｎｓら、２００１）で選択されたＩＣＳｌ−２３ｂもしくはＩＣＳ２−１７．２等の合成ＩＲＥＳ等のいくつかのＩＲＥＳを選択することができる。一部のＩＲＥＳの多量体バージョンは、単量体バージョンよりも何倍か良く翻訳を高めることが多い。多量体でさえも、ＩＲＥＳの配列は短く、ならびにそれらをコードする合成オリゴヌクレオチドによってｐＤ１様ベクターに容易に挿入される。
【０１５６】
多量体のＩＣＳ１−２３ｂ  ＩＲＥＳは、２つの合成オリゴヌクレオチドをアニールすることによって構築される。ＢａｍＨ  Ｉ制限酵素部位に相補的な末端を有する一対は、配列５’−ＧＡＴＣＣＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＡＧＣＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＡＧＣＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＡＧＣＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＡＧＣＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＡＧＣＧＧＡＣＴＣＡＣＡＡＣＣＣＣＡＧＡＡＡＣＡＧＡＣＡＴＧ−３’（配列番号２７）および５’−ＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＴＧＴＴＴＣＴＧＧＧＧＴＴＧＴＧＡＧＴＣＣＧＣＴＣＧＴＴＴＣＣＧＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧＣＴＣＧＴＴＴＣＣＧＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧＣＴＣＧＴＴＴＣＣＧＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧＣＴＣＧＴＴＴＣＣＧＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧＣＴＣＧＴＴＴＣＣＧＣＴＧ−Ｓ’（配列番号２８）から成り、Ａｓｃ  Ｉ制限酵素部位に相補的な末端を有する別の対は５’−ＣＧＣＧＣＣＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＡＧＣＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＡＧＣＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＡＧＣＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＡＧＣＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＡＧＣＧＧＡＣＴＣＡＣＡＡＣＣＣＣＡＧＡＡＡＣＡＧＡＣＡＴＧＧ−３’（配列番号２９）および配列５’−ＣＧＣＧＣＣＡＴＧＴＣＴＧＴＴＴＣＴＧＧＧＧＴＴＧＴＧＡＧＴＣＣＧＣＴＣＧＴＴＴＣＣＧＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧＣＴＣＧＴＴＴＣＣＧＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧＣＴＣＧＴＴＴＣＣＧＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧＣＴＣＧＴＴＴＣＣＧＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧＣＴＣＧＴＴＴＣＣＧＣＴＧＧ−Ｓ’（配列番号３０）から成る。これらの配列は、１５塩基長のＩＣＳ１−２３ｂ  ＩＲＥＳの５つのコピーを含有する。それぞれは、９塩基長のポリＡスペーサーの４つのコピーによって分離される。最後に、３’末端は、マウスβ−グロビンコード領域（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｊ００４１３）の直前の２５塩基配列を含有する。これらのアニールされたオリゴヌクレオチドは、ＩＲＥＳ−ドナーベクターｐＤ１−ＩＲＥＳを作成するために、ＢａｍＨ  ＩおよびｐＤ１−ＤＴＸ−１のＡｓｃ  Ｉ部位にクローン化される。クローンは、正確な配向および配列を有するものを同定するために配列決定される。
【０１５７】
調節可能な標的ベクターの構築
一部のタンパク質がそれらを商業的に有用にするために必要なレベルで発現される場合、それらは有毒であり得、ならびに緩徐な細胞増殖または細胞死さえももたらし得る。したがって、大量に産生する必要があるまで、それらの発現を抑圧することが有用であり得る。遺伝子を調節するためのいくつかの方法が利用可能である。一部の実施形態においては、タンパク質発現カセットが細胞内に導入される前に、遺伝子を調節するシステムを細胞に導入することが望ましい。このようにして、遺伝子調節システムが確立し、発現ベクターが導入される前に遺伝子発現を抑圧する。したがって、ドナーベクターではなく標的ベクターｐＲ１上に遺伝子調節システムを有することが所望され得る。
【０１５８】
ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈシステム（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）は、広い発現範囲に渡って遺伝子調節を提供する。ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈシステムによる遺伝子調節は、２つのタンパク質によって媒介される。ＲｈｅｏＲｅｃｅｐｔｏｒは、昆虫エストロゲン核内受容体の配位子結合ドメインに融合された酵母ＧＡＬ４タンパク質から成る。ＲｈｅｏＲｅｃｅｐｔｏｒは、ＴＡＴＡボックスの上流に位置付けられた酵母ＧＡＬ４遺伝子に由来する上流活性化配列（ｕｐｓｔｒｅａｍ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＵＡＳ）に結合する。ＲｈｅｏＡｃｔｉｖａｔｏｒは、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６転写活性化ドメインに融合されたハイブリッド昆虫／哺乳類ＲＸＲ配位子結合受容体から成る。エクジソン類似体は、ＲｈｅｏＲｅｃｅｐｔｏｒおよびＲｈｅｏＡｃｔｉｖａｔｏｒを二量体化することができ、これが生じる場合、ＧＡＬ４  ＵＡＳ  ＤＮＡ結合要素に適切に連結された遺伝子が活性化される。さらに、二量体化因子が存在しない場合、ＲｈｅｏＲｅｃｅｐｔｏｒはＵＡＳ配列に結合し、遺伝子発現の抑圧を媒介する。最終的な結果として、このシステムを使用する発現の基礎レベルは非常に低く、達成することができる誘導のレベルは高い。
【０１５９】
ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈシステム（ＲｈｅｏＲｅｃｅｐｔｏｒおよびＲｈｅｏＡｃｔｉｖａｔｏｒ）の２つのタンパク質構成要素をコードする発現カセットは、ｐＮＥＢＲ−Ｒ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）からＰＣＲで増幅することができる。ＲｈｅｏＲｅｃｅｐｔｏｒおよびＲｈｅｏＡｃｔｉｖａｔｏｒのコード領域がピューロマイシンコード領域のものと同じ配向となるように、それらを図１８に示すような配向でクローン化する。この構成は、ｐＮＥＢＲ−Ｒ１（それらが逆の配向にある）における構成とは異なり、このような理由でＲｈｅｏＲｅｃｅｐｔｏｒおよびＲｈｅｏＡｃｔｉｖａｔｏｒ遺伝子カセットはｐＲ１に別々にクローン化される。
【０１６０】
より具体的には、配列５’−ＡＡＡＡＡＡＡＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧＧＣＣＴＣＣＧＣＧＣＣＧＧＧＴＴＴＴＧＧＣＧＣＣＴ−３’（配列番号３１）および５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＣＡＣＣＧＧＴＧＣＴＴＡＴＣＧＧＡＴＴＴＴＡＣＣＡＣＡＴＴＴＧ−３’（配列番号３２）から成るＰＣＲ  プライマーを、ＲｈｅｏＡｃｔｉｖａｔｏｒ遺伝子発現カセット（ユビキチンＣ（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  Ｃ：ＵｂＣ）プロモーター、ＲｈｅｏＡｃｔｉｖａｔｏｒコード領域、およびＳＶ４０後期領域ポリアデニル化シグナル配列から成る）を増幅するために使用する。２４８１塩基対の長さの産物は、ｐＲ１−ＲＡを作成するために、Ｓｂｆ  ＩおよびＳｇｒＡ  Ｉで消化し、ｐＲ１−ＰＬｌの固有のＳｂｆ  Ｉ／ＳｇｒＡ  Ｉ部位にクローン化する。
【０１６１】
配列５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＣＡＣＣＧＧＴＧＣＣＧＡＴＡＴＣＧＧＧＴＧＣＣＡＣＧＣＣＧＴＣＣＣＧ−３’（配列番号３３）および５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＧＣＣＡＧＡＡＡＴＣＣ−３’（配列番号３４）から成るＰＣＲプライマーを、ＲｈｅｏＲｅｃｅｐｔｏｒ遺伝子発現カセット（ユビキチンＢ（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  Ｂ：ＵｂＢ）プロモーター、ＲｈｅｏＲｅｃｅｐｔｏｒコード領域、およびＴＫポリアデニル化シグナル配列から成る）を増幅するために使用する。３６８０塩基対の長さの産物は、ｐＲ１ｒｅｇを作成するために、ＳｇｒＡ  ＩおよびＳｒｆ  Ｉで消化し、ｐＲ１−ＲＡの固有のＳｇｒＡ  Ｉ／Ｓｒｆ  Ｉ部位にクローン化する。
【０１６２】
調節可能な標的−ＤＨＦＲベクターの構築
ドナーベクター中の遺伝子を調節することができる遺伝子増幅を受けることができる標的ベクターを構築するため、調節標的−ＤＨＦＲベクター（図１９）を構築する。ＲｈｅｏＡｃｔｉｖａｔｏｒおよびＲｈｅｏＲｅｃｅｐｔｏｒから成るｐＲ１ｒｅｇからの遺伝子調節カセットを、プライマー５’−ＡＡＡＡＡＡＡＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧＧＣＣＴＣＣＧＣＧＣＣＧＧＧＴＴＴＴＧＧＣＧＣＣＴ−３’（配列番号３５）および５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＧＣＣＡＧＡＡＡＴＣＣ−３’（配列番号３６）を使用して、ｐＲ１ｒｅｇ  からＰＣＲで増幅し、Ｓｂｆ  ＩおよびＳｆｒ  Ｉで消化し、ｐＲ１−ＤＨＦＲのＳｂｆ  ＩおよびＳｆｒ  Ｉ部位にクローン化し、調節標的−ＤＨＦＲベクターｐＲ１ｒｅｇ−ＤＨＦＲを構築する。
【０１６３】
調節可能なドナー発現ベクターの骨格の構築
調節可能なドナー発現ベクターの骨格（図２０）は、関心タンパク質に対するコード領域のｐＲ１ｒｅｇクローン化された上流によってコードされる遺伝子調節システムのタンパク質構成要素（例えば、ＲｈｅｏＲｅｃｅｐｔｏｒ）によって認識されるＤＮＡ配列を有する。ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈシステムの場合において、ＲｈｅｏＲｅｃｅｐｔｏｒが結合するＤＮＡ要素は、ＧＡＬ４  上流活性化配列（ｕｐｓｔｒｅａｍ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：ＵＡＳ）である。順番に、制限酵素部位（ＢｓｔＺ１７  Ｉの３’半分、ＥｃｏＲ  Ｉ）、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル領域（調節領域への潜在性の転写を予防するため）、５つのＧＡＬ４  ＵＡＳ要素、およびＴＡＴＡボックスをコードする７２２塩基対の長さのＤＮＡ配列は、プライマー５’−ＴＡＣＧＡＡＴＴＣＡＴＣＡＧＣＣＡＴＡＴＣＡＣＡＴＴＴＧＴＡＧＡＧ−３’（配列番号３７）および５’−ＴＴＡＴＡＴＡＣＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＴＣＣＧＣＴＣＧＧＡ−３’（配列番号３８）を使用して、ｐＮＥＢＲ−Ｘ１Ｈｙｇｒｏ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）からＰＣＲで増幅することができる。
【０１６４】
３’末端上に異なる制限酵素部位を有するＣＭＶ初期プロモーター５’非翻訳領域（５’ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ：５’ＵＴＲ）の２つのバージョンをコードする２つの１７３または１７８塩基対の長さのＤＮＡ配列を、２セットの重複オリゴヌクレオチドをアニールし、Ｋｌｅｎｏｗ  ＤＮＡポリメラーゼを使用してそれらを３’末端内で充填することによって生成する。１７３塩基長のバージョンは、５’−ＣＣＧＡＧＣＧＧＡＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣＧＴＣＡＧＡＴＣＧＣＣＴＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＧＣＴＧＴＴＴＴＧＡＣＣＴＣＣＡＴＡＧＡＡＧＡＣ−３’（配列番号３９）および５’−ＡＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＡＡＧＣＴＴＣＣＡＡＴＧＣＡＣＣＧＴＴＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＧＧＣＴＧＧＡＴＣＧＧＴＣＣＣＧＧＴＧＴＣＴＴＣＴＡＴＧＧＡＧＧＴＣＡＡＡＡ−３’（配列番号４０）をアニールし、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼで充填することによって生成する。１７８塩基長のバージョンは、５’−ＣＣＧＡＧＣＧＧＡＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣＧＴＣＡＧＡＴＣＧＣＣＴＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＧＣＴＧＴＴＴＴＧＡＣＣＴＣＣＡＴＡＧＡＡＧＡＣ−３’（配列番号４１）および５’−ＡＡＡＡＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＧＡＡＴＴＣＡＣＣＧＧＴＡＣＣＡＡＧＣＴＴＣＣＡＡＴＧＣＡＣＣＧＴＴＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＧＧＣＴＧＧＡＴＣＧＧＴＣＣＣＧＧＴＧＴＣＴＴＣＴＡＴＧＧＡＧＧＴＣＡＡＡＡ−３’（配列番号４２）をアニールし、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼで充填することによって生成する。次いで、それらを、７２２塩基対のＰＣＲ産物（ＳＶ４０ポリＡシグナル、５つのＧＡＬ４  ＵＡＳ、およびＴＡＴＡボックスを含有する）で別々に混合し、２セットのＰＣＲプライマー５’−ＴＡＣＧＡＡＴＴＣＡＴＣＡＧＣＣＡＴＡＴＣＡＣＡＴＴＴＧＴＡＧＡＧ−３’（配列番号４３）および５’−ＡＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＡＡＧＣＴＴＣＣＡＡＴＧＣＡＣＣＧＴＴＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＧＧＣＴＧＧＡＴＣＧＧＴＣＣＣＧＧＴＧＴＣＴＴＣＴＡＴＧＧＡＧＧＴＣＡＡＡＡ−３’（配列番号４４）または５’−ＴＡＣＧＡＡＴＴＣＡＴＣＡＧＣＣＡＴＡＴＣＡＣＡＴＴＴＧＴＡＧＡＧ−３’（配列番号４５）および５’−ＡＡＡＡＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＧＡＡＴＴＣＡＣＣＧＧＴＡＣＣＡＡＧＣＴＴＣＣＡＡＴＧＣＡＣＣＧＴＴＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＧＧＣＴＧＧＡＴＣＧＧＴＣＣＣＧＧＴＧＴＣＴＴＣＴＡＴＧＧＡＧＧＴＣＡＡＡＡ−３’（配列番号４６）のいずれか一方でＰＣＲ増幅する。
【０１６５】
このようにしてＳＶ４０ポリアデニル化シグナル領域（調節領域への潜在性の転写を予防するため）、５つのＧＡＬ４  ＵＡＳ要素、ＴＡＴＡボックス、およびＣＭＶ初期プロモーターからの５’ＵＴＲを含有する２つのカセットを構築する。一方は、ｐＨＰＣ−４ｒｅｇを作成するために、ＥｃｏＲ  ＩおよびＢａｍＨ  Ｉで消化し、ｐＨＰＣ−４のＭｆｅ  Ｉ／ＢａｍＨ  Ｉ部位にクローン化する。他方は、ｐＤ１ｒｅｇを作成するために、Ａｓｃ  Ｉで消化し、ｐＨＰＣ−４ｒｅｇのＢｓｔＺ１７  Ｉ／Ａｓｃ  Ｉ部位にクローン化する。これらのクローニングステップのどちらも、調節された発現を妨げる可能性があるｐＨＰＣ−４における２つの恒常的ＣＭＶプロモーターを除去する。上記のように、種々の関心遺伝子は、それらを標的ベクターに組み込むことができ、それらの発現を調節することができるように、ｐＤ１ｒｅｇのポリリンカー領域に挿入することができる。
【０１６６】
遺伝子調節システム（例えば、ｐＤ１、ｐＤ１−ＤＨＦＲ、ｐＤ１−ＩＲＥＳ）の構成要素を含有しないドナーベクターのバージョンを使用して可能な高レベルの遺伝子発現を維持するために重要であり得るｐＤ１ｒｅｇの構築に関する２つの特徴がある。第１に、遺伝子調節システムからのＴＡＴＡボックスを、ｐＤ１のＣＭＶプロモーターからのＴＡＴＡボックスに正確に融合した。第２に、ＣＭＶプロモーターの５’ＵＴＲを再構成した。最終的な結果として、ｐＤ１ｒｅｇのＴＡＴＡボックスと翻訳開始コドン（つまり、転写開始部位および５’ＵＴＲ）間の配列は、それらがｐＤ１にある場合と同じである。しかしながら、ｐＤ１ｒｅｇ中のＴＡＴＡボックス前の配列は、ｐＲ１ｒｅｇによってコードされる遺伝子調節システムのタンパク質構成要素によって媒介される遺伝子調節を得るために必要なそれらのＤＮＡ配列から成る。
【０１６７】
選択可能なドナーベクターの構築
選択可能なドナー発現ベクター（図２１）は、プロモーターレスの第１の選択可能なマーカー遺伝子および標的ベクター上の第２の機能的選択可能なマーカー遺伝子の両方と異なる完全な薬剤耐性遺伝子も含むことを除いて、Ｄｏｎｏｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒと同様である。一例として、完全なＧ４１８耐性遺伝子（ｐＤ１−ＤＴＸ１−Ｇ４１８、図２１）を用いた選択可能なドナー発現ベクターの構築を説明する。ｐＤ１−ＤＴＸ１−Ｇ４１８ベクターの配列を図３６Ａ〜図３６Ｄに与える。
【０１６８】
選択可能なドナー発現ベクターｐＤ１−ＤＴＸ１−Ｇ４１８は、ポリメラーゼ連鎖反応ならびにプライマー５’−ＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＣＣＡＣＧＣＧＴＣＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＴＧＴＣＡＧＴＴＡＧＧＧ−３’（配列番号４７）および５’−ＧＡＧＡＧＡＧＡＡＴＴＣＴＣＴＡＧＡＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴＡＡＧＡＴＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＴＴＴＧ−３’（配列番号４８）を用いて、ｐｃＤＮＡ３００２ｎｅｏ（Ｃｒｕｃｅｌｌ）から完全な機能的Ｇ４１８薬剤耐性カセットを増幅することによって構築した。結果として生じたＰＣＲ産物は、ＳＶ４０プロモーター、Ｇ４１８耐性遺伝子、およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含有する。ＰＣＲ産物は、制限酵素ＢａｍＨ  ＩおよびＥｃｏＲ  Ｉで消化し、ＢｇＩ  ＩＩおよびＭｆｅ  Ｉで消化されたドナー発現ベクターｐＤ１−ＤＴＸ−１に連結した。連結は、ベクターの骨格単独の連結を減少させるためにＢｇｌ  ＩＩおよびＭｆｅ  Ｉ（挿入断片の連結によって破壊される）で消化し、ＸＬ−１０Ｇｏｌｄウルトラコンピテント大腸菌細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した。所望の配向で挿入断片を有するクローンは、ＰＣＲおよび制限酵素での消化によって同定した。Ｇ４１８耐性遺伝子全体の正確なＤＮＡ配列は、配列決定によって確認した。
【０１６９】
レポータードナー発現ベクターの構築
レポータードナー発現ベクター（図３０）は、例えば、蛍光顕微鏡または蛍光標示式細胞分取器のいずれか一方によって個々の細胞内で検出可能なレポーター遺伝子も含有することを除いて、Ｄｏｎｏｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒと同様である。概して、レポータードナー発現ベクター上のレポーター遺伝子の発現レベルは、同じレポータードナー発現ベクター上の関心タンパク質の発現レベルと相関する。したがって、レポータードナー発現ベクターでの標的ベクタークローンの形質移入後、高レベルでレポーター遺伝子を発現するクローンを同定することによって、タンパク質の高レベル発現をもたらす標的ベクタークローンを任意に同定することができる。蛍光標示式細胞分取器等のハイスループット機器を使用することによって、手動のクローンピッキング方法よりもより多い数の標的ベクタークローン（つまり、組込み部位）を、発現のためにスクリーニングすることができる。
【０１７０】
そのような任意のスキームにおいて、標的ベクタークローンの多数のプールを生成する。例えば、細胞を標的ベクターおよび第１のインテグラーゼ発現ベクターで形質移入する。安定なコロニーを選択する。（例えば、ハイグロマイシン耐性によって）。例えば、プレート当たり１００コロニーで１００プレートもの数（つまり、１０，０００標的ベクタークローン）を生成することができる。次いで、標的ベクタークローンの各プールをレポーターおよび第２のインテグラーゼ発現ベクターで別々に形質移入する。標的ベクターへのレポータードナー発現ベクターの安定な組込みを選択する（例えば、ピューロマイシン耐性によって）。レポータードナーベクタークローンの各個々のプールを、蛍光標示式細胞分取器を使用して分類し、最も高いレポーター遺伝子発現を伴う各プールからの単細胞を収集する。次いで、関心タンパク質の高レベル発現を確認する。次いで、最も高いレポーター遺伝子発現を伴う細胞内の標的ベクターの組込み部位を、プラスミドレスキューまたはＰＣＲ技術を用いて決定する。標的ベクター特異的ＰＣＲプライマーを、標的ベクター組込み部位に特異的であるように設計する。次いで、最も高レベルの発現を提供する標的ベクタークローンのプールはクローン化された単細胞であり、標的ベクター特異的ＰＣＲプライマーは、どの個々の標的ベクタークローンがレポーターおよび第２のインテグラーゼ発現ベクターでの形質移入後に最も高レベルの発現を生じさせるかを同定するために使用する。毎回大規模の発現スクリーニングを行うのではなく、非常に高レベルのタンパク質発現をもたらす小数の標的ベクタークローンを単離することによって、他のドナー発現ベクターは、種々の他のタンパク質を発現する同定されたクローンに形質移入することができる。
【０１７１】
組込み部位のハイスループットスクリーニングのための上述の任意の使用に加えて、レポーターは、蛍光顕微鏡を使用して、形質移入された細胞の検査によるリアルタイムでのレポータードナーベクター組込みの時間経過、頻度、および安定性を監視するための単純で早急な方法を提供する。一例として、緑色蛍光タンパク質遺伝子（ｐＤ３−ＤＴＸ１、図３０）でのレポーターの構築を説明する。
【０１７２】
レポーターｐＤ３−ＤＴＸ１は、まず、ポリメラーゼ連鎖反応ならびにプライマー５’−ＴＴＴＴＣＡＣＴＧＣＡＴＴＣＧＡＣＡＡＴＴＧＴＣＡＴＣＣＣＣＴＣＡＧＧＡＴＡＴＡＧＴＡＧＴＴＴＣ−３’（配列番号４９）および５’−ＧＡＣＣＡＧＣＡＣＧＴＴＧＣＣＣＡＧＧＡＧＴＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＣＣＡＡＴＧＴＧＧＴＧ−３’（配列番号５０）を使用して、プラスミドｐＬＸＲＮ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＲｏｕｓ  Ｓａｒｃｏｍａ  Ｖｉｒｕｓプロモーター（ｐＲＳＶ）を増幅することによって構築した。ヒト化ウミシイタケ緑色蛍光タンパク質（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ｈｒＧＦＰ）コード領域およびヒト成長ホルモン（ｈｕｍａｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ：ｈＧＨ）遺伝子ポリアデニル化シグナルを含有するＤＮＡは、プライマー５’−ＣＡＣＣＡＣＡＴＴＧＧＴＧＴＧＣＡＣＣＴＣＣＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＣＴＧＧＴＣ−３’（配列番号５１）および５’−ＧＡＧＡＧＡＧＣＴＡＧＣＡＴＴＴＡＡＡＴＡＡＧＧＡＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＡＧＣＡＧＴＧＧ−３’（配列番号５２）を使用して、ｐＡＡＶ  ｈｒＧＦＰ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からＰＣＲで増幅した。２つのＰＣＲ産物を混合し、Ｒｏｕｓ  Ｓａｒｃｏｍａ  ＶｉｒｕｓプロモーターをｈｒＧＦＰコード領域およびｈＧＨ遺伝子ポリアデニル化シグナルに融合するために、プライマー５’−ＴＴＴＴＣＡＣＴＧＣＡＴＴＣＧＡＣＡＡＴＴＧＴＣＡＴＣＣＣＣＴＣＡＧＧＡＴＡＴＡＧＴＡＧＴＴＴＣ−３’（配列番号５３）および５’−ＧＡＧＡＧＡＧＣＴＡＧＣＡＴＴＴＡＡＡＴＡＡＧＧＡＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＡＧＣＡＧＴＧＧ−３’（配列番号５４）で増幅した。結果として生じた平滑末端化されたＰＣＲ産物は、ドナー発現ベクターｐＤ１−ＤＴＸ１の平滑Ｐｓｉ  Ｉ部位に連結した。挿入断片を有するクローンを、プライマー５’−ＴＴＴＴＣＡＣＴＧＣＡＴＴＣＧＡＣＡＡＴＴＧＴＣＡＴＣＣＣＣＴＣＡＧＧＡＴＡＴＡＧＴＡＧＴＴＴＣ−３’（配列番号５３）および５’−ＧＡＧＡＧＡＧＣＴＡＧＣＡＴＴＴＡＡＡＴＡＡＧＧＡＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＡＧＣＡＧＴＧＧ−３’（配列番号５４）を使用してＰＣＲで同定し、挿入断片の配向を制限酵素での消化によって決定した。ｐＲＳＶ−ｈｒＧＦＰ−ｈＧＨポリＡ挿入断片全体の正確なＤＮＡ配列を確認した。ｐＤ３−ＤＴＸ１ベクターの配列を図３７Ａ〜図３７Ｄに与える。
【０１７３】
ベクターのテスト
個々の標的ベクター、ドナー発現ベクター、およびインテグラーゼ発現ベクターの機能をテストした。例えば、ＤＧ４４細胞またはＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞のいずれか一方への標的ベクターの形質移入は、ハイグロマイシン耐性を与えることができる。Ｒ４インテグラーゼを発現するベクターまたはφＣ３１インテグラーゼを発現するベクターいずれか一方が標的ベクターと伴に形質移入される場合、いずれか一方のインテグラーゼ発現を示す標的ベクター単独の形質移入と比べて約５倍の数のハイグロマイシン耐性コロニーをもたらすことは、安定なクローン数の減少に繋がることができる。ドナー発現ベクター単独の一過性の形質移入は、ＤＧ４４細胞中３００ｎｇ／ｍｌ抗体およびＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）中１μｇ／ｍｌの産生をもたらした（図３１）。
【０１７４】
実証する別の重要な機能は、ドナー発現ベクター中のφＣ３１  ａｔｔＢ部位と再結合するための標的ベクター中のφＣ３１  ａｔｔＰ部位の能力である。これは、標的ベクターおよびドナーベクター両方におけるａｔｔ部位が、本明細書に記載する発現システムの要求を満たすように変異または切断されるため、特に当てはまる。１０ｃｍプレート上のＤＧ４４細胞（３ｅ６）は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００ＣＤを使用してφＣ３１インテグラーゼを発現するベクター（ｐＣＳ−Ｍ３Ｊ）の４０００ｎｇの存在下または非存在下において、５００ｎｇの標的ベクター（ｐＲ１）および５００ｎｇのドナー発現ベクター（ｐＤ１−ＤＴＸ−１）で形質移入した。形質移入から４８時間後に、細胞をトリプシン処理し、プラスミドＤＮＡをＱＩＡｐｒｅｐ  ＳｐｉｎミニプレップＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して単離した。ＤＮＡは、ＰＣＲプライマー５’−ＴＧＣＣＣＣＧＧＧＧＣＴＴＣＡＣＧＴＴＴＴＣＣ−３’（配列番号５５）（φＣ３１  ａｔｔ  Ｐから）および５’−ＧＣＣＣＧＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＣＧＡＧＡＡＣ−３’（配列番号５６）（φＣ３１  ａｔｔ  Ｂから）で増幅し、次いで、プライマー５’−ＣＡＧＧＴＣＡＧＡＡＧＣＧＧＴＴＴＴＣＧＧＧＡＧ−３’（配列番号５７）（φＣ３１  ａｔｔ  Ｐから）および５’−ＣＣＧＣＴＧＡＣＧＣＴＧＣＣＣＣＧＣＧＴＡＴＣ−３’（配列番号５８）（φＣ３１  ａｔｔ  Ｂから）で増幅し、これらのすべては、ドナー発現ベクター中のφＣ３１  ａｔｔＢ部位との標的ベクター中のφＣ３１  ａｔｔＰ部位のφＣ３１インテグラーゼ媒介による組換えからのみ生じ得るａｔｔＲ産物を特異的に増幅するように設計された。陽性対照として、より長い野生型φＣ３１  ａｔｔ部位配列を含有するプラスミドｐＴＡ−ａｔｔＢおよびｐＴＡ−ａｔｔＰのそれぞれ５００ｎｇを、φＣ３１インテグラーゼベクター（ｐＣＳ−Ｍ３Ｊ）の４０００ｎｇの存在下または非存在下で形質移入した。ｐＴＡ−ａｔｔＢおよびｐＴＡ−ａｔｔＰは、φＣ３１  ａｔｔＢ部位およびφＣ３１  ａｔｔＰ部位からそれぞれ２８５および２２１塩基対の長さの領域を有する。陰性対象として、形質移入されていない細胞を使用した。図２２から分かるように、ｐＲ１およびｐＤ１−ＤＴＸ−１は、φＣ３１インテグラーゼが存在する場合にのみ、ａｔｔＲ部位を生成するように再結合することができる。
【０１７５】
標的ベクター、ドナーベクター、および両インテグラーゼ発現ベクターの機能は、多数の個々の安定細胞株が生成される前に、図１１に図表化したようなＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）またはＤＧ４４細胞の形質移入および選択によって一斉にテストした。この実験は、例えば、標的、ドナー、またはインテグラーゼプラスミドの変異体が構築された場合、方法論を開発する過程でまたは必要に応じて一度だけ行う。その後、関心タンパク質の発現をテストし、ドナーベクターが発現できることを確認するために、他の関心タンパク質をコードするドナー発現ベクターのみを一過性に形質移入する。
【０１７６】
標的ベクターｐＲ１は、製造業者の使用説明書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００ＣＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたリポフェクションによって、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）またはＤＧ４４細胞内にＲ４インテグラーゼ（ｐＣＭＶ−ｓｒｅ）を発現するプラスミドで同時形質移入した。次いで、標的ベクター上に存在するＲ４  ａｔｔＢ  ２９５部位と染色体内に存在する偽性Ｒ４  ａｔｔＰ部位との間で部位特異的組込みを媒介するＲ４インテグラーゼタンパク質の発現を可能にするため、細胞を４８時間インキュベートした（図３および図１１）。次いで、組み込まれた標的ベクターを含有するコロニーをハイグロマイシン含有培地（例えば、ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎仔血清、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）およびＦ−１２に対する１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５％ウシ胎仔血清、ＤＧ４４に対する３０μＭチミジン）内で選択した。単一のハイグロマイシン耐性コロニーをピューロマイシン感受性のために単離およびスクリーニングした。
【０１７７】
ハイグロマイシン耐性、ピューロマイシン感受性の標的ベクタークローンを、φＣ３１  ａｔｔＢ  ２８５  ＡＡＡ部位およびジフテリア毒素に特異的なヒト抗体の重鎖および軽鎖等の関心遺伝子をコードする発現カセットを含有するドナーベクター（例えば、ｐＤ１−ＤＴＸ−１）、ならびに変化したφＣ３１インテグラーゼ（例えば、ｐＣＳ−Ｍ３Ｊ）をコードする発現プラスミドで再び同時形質移入した。変化したφＣ３１インテグラーゼタンパク質は、ドナーベクター上に存在するφＣ３１  ａｔｔＢ  ２８５ＡＡＡ部位と標的ベクターを使用して染色体内に操作されたφＣ３１  ａｔｔＰ  １０３部位との間で部位特異的組込みを媒介する（図４および図１１）。
【０１７８】
ピューロマイシン耐性細胞の安定なプールを以下の通りに単離する。第２の形質移入から４８時間後に、通常の細胞増殖培地を、ピューロマイシン（ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）に対する１μｇ／ｍｌ、ＤＧ４４に対する１０μｇ／ｍｌ）を含有する細胞増殖培地と交換した。ピューロマイシン含有培地は、７日（ＤＧ４４細胞）または１４〜２１日（ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞）の間２〜３日おきに、または成長するコロニーの数が安定するまで交換した。
【０１７９】
この時点で、すべてのコロニーをトリプシン処理し、プールした。細胞を再度撒き、２４時間付着させた。ピューロマイシン耐性に対する選択は、組み込まれていない発現ベクターが希釈されることを可能にするため、少なくとも合計２１日継続した。次いで、両インテグラーゼ発現ベクターならびに標的ベクターおよびドナーベクターの機能を確認するために、関心タンパク質（例えば、抗体をコードする）の発現レベルをアッセイした。抗体発現を測定するために、ヒトＩｇＧ（例えば、Ｅａｓｙ  Ｔｉｔｅｒ  ＩｇＧ  Ａｓｓａｙ，Ｐｉｅｒｃｅ，Ｉｎｃ．）に特異的なアッセイを使用した。
【０１８０】
標的ベクターはＲ４偽性ａｔｔＰ部位以外の位置で組み込まなくてもよくまたはランダムに組み込んでもよい。これらの場合においてさえも、ドナーベクターは、依然、完全なピューロマイシン耐性遺伝子を再構成するために標的ベクターに組み込むことができる。これらのイベントによって生じると予想されるピューロマイシンコロニーの数は、Ｒ４インテグラーゼを使用して部位特異的に組み込まれた標的ベクター内への、ドナーベクターの組込みを受けて生じるものよりもはるかに少ない。これは、組み込まれていないベクターが長期に渡る選択過程中に失われるためである。標的ベクターのランダムな組込みは、Ｒ４インテグラーゼによって媒介された部位特異的組込みよりもはるかに少ない頻度で生じる。この実験において測定されたタンパク質発現レベルが、主として標的ベクターの最初の部位特異的組込みの結果であることをさらに立証するために、Ｒ４インテグラーゼ発現ベクターが除外される対照実験を行う。
【０１８１】
ピューロマイシン耐性選択ステップは、部位特異的にドナー発現ベクターを組み込むことへのカギとなるため、確実に機能するようにそのステップを行うことが望ましい。標的ベクター上のφＣ３１  ａｔｔＰ部位への、ドナーベクター上のφＣ３１  ａｔｔＢ部位の組込みは、この特定の実施例において８８塩基長であるφＣ３１  ａｔｔＬ部位の作成をもたらす。このさらなる配列は、ピューロマイシン耐性をコードするｍＲＮＡの５’非翻訳領域内に存在する。転写、ｍＲＮＡ安定性、翻訳、したがって最終的に、達成されうるピューロマイシン耐性のレベルに対するこのさらなる配列の効果は、単に核酸配列から予測することはできないため、再構成されたピューロマイシン耐性カセットの機能を、ドナーベクターが受容ベクターに組み込まれた細胞の効果的な選択を可能にする程度にまで確実にするために、上述のようにベクターをテストすべきである。
【０１８２】
実施例２
タンパク質を発現する細胞株の構築
タンパク質を発現する細胞株の構築のために以下の手順に従った。ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞（例えば、ＤＧ４４細胞およびＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞）を以下の通りに１０ｃｍプレート上のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００ＣＤを使用して形質移入した。
１．最初の形質移入は、１０ｃｍプレート毎に５００ｎｇの標的ベクターｐＲ１−ＤＨＦＲおよび５０００ｎｇのＲ４インテグラーゼプラスミドｐＣＭＶ−ｓｒｅ（図１１）で行った。
２．細胞を通常の培地（Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２、５％ウシ胎仔血清、３０μＭチミジン）で４８時間増殖させた。
３．その後、細胞をトリプシン処理し、４００μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢを含有する通常の培地であった、選択的な培地の９６ウェルプレート上に蒔いた。これらの条件下で、約３０の単細胞クローンが９６ウェルプレートのそれぞれで増殖した。
４．コロニーを最初に眼で見ることができる形質移入から約７〜８日後に、個々のクローンをトリプシン処理し、最小数の９６ウェルプレートに移動した。合計１６５のクローンを選択し、２つの９６ウェルプレート上に統合した。
５．選択されたコロニーを３セットの９６ウェルプレート上に展開した。１セットは維持のためであった。１セットを凍結し、液体窒素の気相中に保存した。第３のセットは、第２の形質移入のためのものであった。
６．１セットのＣＨＯコロニーを２４ウェルプレートに展開し、１５ｎｇのｐＤ１−ＤＴＸｌ−Ｇ４１８、選択可能なドナー発現ベクター、および１５０ｎｇのｐＣＳ−Ｍ３Ｊ、変異φＣ３１インテグラーゼプラスミド（図１１）で同時形質移入した。
７．細胞を４００μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢを含有する通常の培地で４８時間増殖した。
８．その後、細胞を１０μｇ／ｍｌピューロマイシンを含有する選択的な培地で増殖した。選択の７〜２１日後、どの親ａｔｔＰ細胞株が形質移入されたかによって、様々な数のコロニーが増殖した。
９．その後、コロニーをトリプシン処理し、プールした。半分を１０μｇ／ｍｌピューロマイシンを含有する培地に蒔き、半分を１０μｇ／ｍｌピューロマイシンおよび４００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を含有する培地に蒔いた。
１０．選択的な培地は、ウェルが集密的になるまで２〜３日毎に交換した。ピューロマイシンおよびＧ４１８で増殖されたクローンのプールは、６ウェルプレートに展開し、ＩｇＧ産生性（ｐｇ  ＩｇＧ産生／細胞／日）のテストを行った。
１１．１６５の親ＤＨＦＲ−標的ベクタークローンのうち、１３２がピューロマイシン感受性であり、第２の形質移入に使用した。これらのうち９６は、ピューロマイシン耐性クローンを産生し、ＩｇＧ産生に対するテストを行った。９６クローンのうち、１４は検出可能なレベルでＩｇＧを産生した。
１２．最も高いレベルの発現を（〜８ｐｇ／細胞／日）伴うプール（２Ｇ７−Ｇ）を、ＤＨＦＲ遺伝子および選択可能なドナー発現ベクター（ＭＥＭα−、７％透析されたウシ胎仔血清、４００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８）の両方に対して選択的な培地中で６日間増殖し、次いで、クローンを単離するために、ウェル当たり１細胞で２つの９６ウェルプレート上に蒔いた。
１３．合計５６のクローンを得、これらのＩｇＧ産生性を測定した。結果を図２８Ａおよび図２８Ｂに示す。ハイエンド（つまり、＞３０ｐｇ／細胞／ｄａｙ）であると考えられる平均レベルの産生性を有する３つのクローンを同定した。
１４．ＤＨＦＲ遺伝子がプラスミドレスキュー方法によって抗体遺伝子に連結されたことが示された別のプール（２Ｈ９−Ｇ）は、ＤＨＦＲ遺伝子増幅を受けた。細胞は、ＤＨＦＲ遺伝子および選択可能なドナー発現ベクター（ＭＥＭα−、７％透析されたウシ胎仔血清、４００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８）の両方に対して選択的な培地で増殖した。次いで、ＤＨＦＲ遺伝子は、増加量のメトトレキサートを培地に加えることによって増幅した。開始濃度は２ｎＭであり、濃度は、典型的には約１０〜１４日毎に２〜３倍増加した。
１５．種々の濃度のメトトレキサートで選択された２Ｈ９−ＧプールのＩｇＧ産生性を測定し、結果を図２９に示す。２００ｎＭメトトレキサートで、最も高度に発現する２Ｇ７−Ｇクローンのものと等しいレベルまでの産生性における劇的な増加が観察された。しかしながら、部位特異的組込みを使用して、最も高度に発現する２Ｇ７−Ｇクローンを単離するには約１ヶ月かかり、一方、遺伝子増幅を使用して、高度に発現する２Ｈ９−Ｇプールを単離するには約４ヶ月かかる。
【０１８３】
第１の組込み
タンパク質発現ベクターの組込みに特異的な固有の部位を作成し、タンパク質の高レベル、再現性のある産生に適した細胞株のゲノムにおいてＲ４  Ψ  ａｔｔＰ部位を同定するため、標的ベクターｐＲ１またはＤＨＦＲ−標的ベクターｐＲ１−ＤＨＦＲのいずれか一方を、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）およびＤＧ４４細胞中の多数の異なるＲ４  Ψ  ａｔｔＰ部位で組み込んだ。標的ベクターまたはＤＨＦＲ−標的ベクターは、Ｒ４インテグラーゼ発現ベクターｐＣＭＶ−ｓｒｅと混合し、製造業者の使用説明書に従ってリポフェクションによってＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）およびＤＧ４４細胞に形質移入した。リポフェクションに適したリポソーム試薬は、Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００ＣＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）等を含む。インテグラーゼの発現を可能にし、Ｒ４  Ψ  ａｔｔＰ部位へのｐＲ１またはｐＲ１−ＤＨＦＲのいずれか一方の組込みを生じさせるために、細胞を４８時間インキュベートした。次いで、通常の細胞増殖培地を、４００μｇ／ｍｌ（ＤＧ４４細胞に対して）ハイグロマイシンＢ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の１００ｕｇ／ｍｌ（ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞に対して）を含有する選択的な増殖培地と交換した。細胞増殖培地は、７〜１４日の間２〜３日毎に、または最大数のコロニーが目に見えるまで交換した。約５０の異なるＲ４  Ψ  ａｔｔＰ部位を示すと推定される合計１００コロニーを採取し、第２の組込みのために展開した。このステップにおいて単離された各細胞クローンは、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）  ａｔｔＰ細胞株またはＤＧ  ４４  ａｔｔＰ細胞株と称する。
【０１８４】
組み込まれた標的ベクターに隣り合う配列は、それらがＲ４インテグラーゼ媒介による機構によって組み込まれたことを示すために決定した。これを行うために、以下のステップを含む“プラスミドレスキュー”方法を使用した。ゲノムＤＮＡは、標的ベクタークローンから調製し、Ａｆｌ  ＩＩＩまたはＮｓｉ  Ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化した。これらの酵素は、複製の起点付近の標的ベクターを切断するが、しかし複製の起点とΨ  Ｒ４  ａｔｔＬ部位との間のいかなる他の部位も切断しない（図１２参照）。最も重要なことは、それらは、大腸菌における良好なプラスミドレスキューに必要とされる、複製の起点およびアンピシリン耐性遺伝子の範囲内で切断しないことである。消化されたＤＮＡは、低濃度（〜１０ｎｇ／ｍｌ）で連結し、次いで、ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に電気穿孔した。ミニプレップＤＮＡは、得られた配列がピューロマイシンコード領域からφＣ３１  ａｔｔＰ部位を介してΨ  Ｒ４  ａｔｔＬ部位に伸展するように、結果として生じたコロニーから単離し、ピューロマイシンコード領域のアンチセンス鎖に対応するプライマーで配列決定した。図２３に示すように、２つの標的ベクタークローンからレスキューされたプラスミドは、Ｒ４  ａｔｔ部位コア配列までの配列を含有し、次いで、染色体ＤＮＡ内に伸展した。Ｒ４  ａｔｔ部位コア配列は、セリンインテグラーゼが野生型ａｔｔ部位をΨ  ａｔｔ部位と再結合する時によく生じるように、いずれの場合にも欠失された。
【０１８５】
また、セミランダムなＰＣＲ方法は、標的ベクターと染色体ＤＮＡとの間の接合部で配列を決定するために使用することができる。例えば、ＤＮＡ  Ｗａｌｋｉｎｇ  ＳｐｅｅｄＵｐ  Ｋｉｔ（Ｓｅｅｇｅｎｅ）をこの目的のために使用することができる。“標的特異的プライマー”は、Ｒ４  Ψ  ａｔｔＬ部位を含有する配列を単離するためにピューロマイシン耐性遺伝子内に、またはＲ４  Ψ  ａｔｔＲ部位を含有する配列を単離するためにＨＳＫ  ＴＫポリＡ領域内に位置付けられる。
【０１８６】
あるいは、“インバースＰＣＲ”方法を使用することができる。これらの方法において、ゲノムＤＮＡを関心領域において切断しない制限酵素で消化する。ＤＮＡは、環状ＤＮＡを形成するために連結する。次いで、連結されたＤＮＡを既知の配列におけるネステッドプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する。プライマーの配向は、連結点に渡る配列を増幅することができるように、それらが通常のＰＣＲにおいてあるであろうものに関して反転される。
【０１８７】
第２の組込みに先立って、ａｔｔＰ細胞株をピューロマイシン感受性のためにスクリーニングする。ピューロマイシン耐性選択は、第２の組込みステップを選択するために使用され、したがって、第１の組込みで得られた標的ベクターまたはＤＨＦＲ−標的ベクタークローンがピューロマイシン感受性であることを確かにするために有用である。標的ベクターまたはＤＨＦＲ−標的ベクタークローンの最大約１０％が、細胞株次第で、ピューロマイシン感受性であり得ることが分かった。ピューロマイシン耐性クローンが形質移入された場合、組込みの効率は、約０．１〜１％であるため、細胞の０．１〜１％のみが関心タンパク質を発現することが予想され、ならびに、細胞はすでにピューロマイシン耐性であったため、タンパク質を発現する細胞を濃縮することは不可能であろう。標的ベクタークローンを、第１の形質移入後にピューロマイシン感受性のためにスクリーニングすることの他に、この課題を回避するための別のアプローチは、第２の形質移入において選択可能なドナー発現ベクターを使用することであろう。
【０１８８】
第２の組込み
高レベルのタンパク質発現を可能にするために、第１の組込みにおいて標的ベクターが組み込まれた各Ｒ４  Ψ  ａｔｔＰ部位の能力をテストするため、ドナー発現ベクターの第２の組込みを行う。抗ジフテリア毒素抗体（ｐＤ１−ＤＴＸ−１）をコードするドナーベクターは、φＣ３１変異インテグラーゼ発現ベクター（ｐＣＳ−Ｍ３Ｊ）と混合し、製造業者の使用説明書に従って、第１の形質移入時にリポフェクションによって生成された各ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）ａｔｔＰまたはＤＧ４４  ａｔｔＰ細胞株内に形質移入した。リポフェクションに適したリポソーム試薬は、Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００ＣＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）等を含む。細胞は、φＣ３１変異インテグラーゼの発現を可能にし、標的ベクターへのｐＤ１−ＤＴＸ−１の組込みを生じさせるために、４８時間インキュベートした。次いで、通常の増殖培地を、１μｇ／ｍｌ（ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）に対して）または１０μｇ／ｍｌ（ＤＧ４４に対して）ピューロマイシン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を含有する選択的な増殖培地と交換した。ピューロマイシンを含有する細胞増殖培地は、７〜１４日の間２〜３日毎に、または最大数のコロニーが目に見えるまで交換した。各形質移入から生じるコロニーをトリプシン処理し、展開し、液体窒素気相保存のために凍結した。
【０１８９】
標的およびドナー発現ベクターの接合部周囲の配列は、それらがφＣ３１インテグラーゼ媒介による機構によって再結合されたことを示すように決定した。これを行うため、以下のステップを含む“プラスミドレスキュー”方法を使用した。ゲノムＤＮＡは、ドナーおよびφＣ３１変異インテグラーゼ発現ベクターで形質移入されたプールから調製した。ＤＮＡは、Ｔｆｉ  Ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化した。この酵素は、重鎖抗体遺伝子内の発現ベクターと複製の起点付近の標的ベクターを切断するが、しかしこれらの領域の間のいかなる他の部位も切断しない（図１３参照）。最も重要なことは、Ｔｆｉ  Ｉは、大腸菌における良好なプラスミドレスキューに必要とされる、複製の起点およびアンピシリン耐性遺伝子の範囲内で切断しないことである。消化されたＤＮＡは、低濃度（〜１０ｎｇ／ｍｌ）で連結し、次いで、ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に電気穿孔した。ミニプレップＤＮＡは、得られた配列がピューロマイシンコード領域（標的ベクターから）からφＣ３１  ａｔｔＬ８８部位（再結合された標的とドナーベクターとの間の接合部）を介して、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナル（ドナーベクターから）に伸展するように、結果として生じたコロニーから単離し、ピューロマイシンコード領域のアンチセンス鎖に対応するプライマーで配列決定した。図２４Ａおよび図２５Ａに示すように、ＤＧ４４およびＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞からレスキューされたプラスミドの配列は、φＣ３１インテグラーゼが、ドナー発現ベクターを標的ベクター内に正確に組み込んだ場合、予想された通りであった。φＣ３１  ａｔｔＲ部位周囲の配列は、同様の方法で決定され、また、まさに予想されたようであることが分かった（図２４Ｂおよび図２５Ｂ）。
【０１９０】
また、クローンもしくはクローンのプール内に存在し得る組込みの種類の早急な決定を可能にするため、ＰＣＲベースの方法を開発した。ドナー発現ベクターの組込みに関しては、ランダム、標的ベクター、またはΨ  ａｔｔ部位の３種類の組込みが可能である。ランダムな組込みを検出するため、ドナー発現ベクター内のφＣ３１  ａｔｔＢ部位に特異的なＰＣＲ  プライマーを設計した。ランダムな組込みの多くの場合において、小さな（２８５塩基対）ａｔｔＢ部位はインタクトであり、一方では、標的ベクターまたはΨ  ａｔｔ部位へのドナーベクターの組込みが生じた場合、ａｔｔＢ部位は破壊される。ドナーベクターが組み込まれたクローンの６つのプールからのゲノムＤＮＡを調製した。１マイクログラムのＤＮＡは、プライマー５’−ＣＡＴＣＴＣＡＡＴＴＡＧＴＣＡＧＣＡＡＣＣＡＴＡＧＴＣ−３’（配列番号５９）および５’−ＡＡＧＣＴＣＴＡＧＣＴＡＧＡＧＧＴＣＧＡＣＧＧＴＡ−３’（配列番号６０）を使用して、３０サイクルのポリメラーゼ連鎖反応を受け、次いで、１％のその反応ＤＮＡは、プライマー５’−ＧＴＣＧＡＣＧＡＡＡＴＡＧＧＴＣＡＣＧＧＴＣＴＣ−３’（配列番号６１）および５’−ＴＡＣＧＴＣＧＡＣＡＴＧＣＣＣＧＣＣＧＴＧＡＣＣ−３’（配列番号６２）を使用して、さらに３０サイクルのポリメラーゼ連鎖反応受けた。ＰＣＲ産物を４％アガロースゲル上で分離し、結果を図２６Ａに示す。ドナー発現ベクターのランダムな組込みの証拠は、２つのプール（２Ｇ７、２Ｈ１０）に存在しなかったが、しかし４つのプール（２Ｂ１１、２Ｇ１１、２Ｈ９Ｇ、２Ｈ９Ｐ）に存在したことである。
【０１９１】
標的ベクターへの組込みの存在を検出するため、ハイブリッドφＣ３１  ａｔｔＲ部位を含有する領域をＰＣＲで細胞上に直接増幅した。２Ｈ９Ｇプールからの様々な数のトリプシン処理した細胞を使用した。細胞の２Ｈ９Ｇプールは、ドナー発現ベクター（ｐＤ１−ＤＴＸ１−Ｇ４１８）およびφＣ３１変異インテグラーゼベクター（ｐＣＳ−Ｍ３Ｊ）で、ＤＧ４４標的ベクター（ｐＲ１−ＤＨＦＲ）クローン（２Ｈ９）を形質移入することによって得られた。細胞は、１ヶ月間ピューロマイシン中で選択され、次いで１ヶ月間Ｇ４１８中で選択された。トリプシン処理された細胞は、プライマー５’−ＴＧＣＣＣＣＧＧＧＧＣＴＴＣＡＣＧＴＴＴＴＣＣ−３’（配列番号６４）および５’−ＧＣＣＣＧＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＣＧＡＧＡＡＣ−３’（配列番号６５）を使用して３０サイクルのＰＣＲ増幅を受け、次いで、その反応ＤＮＡの１％は、プライマー５’−ＣＡＧＧＴＣＡＧＡＡＧＣＧＧＴＴＴＴＣＧＧＧＡＧ−３’（配列番号６３）および５’−ＣＣＧＣＴＧＡＣＧＣＴＧＣＣＣＣＧＣＧＴＡＴＣ−３’（配列番号６６）を使用して、さらに３０サイクルのＰＣＲ増幅を受けた。ＰＣＲ産物を４％アガロースゲル上で分離し、結果を図２６Ｂに示す。１０２、１０３、または１０４細胞を使用した場合、正確なサイズの特異的シグナルを増幅した。
【０１９２】
セミランダムなＰＣＲ方法は、ドナーベクターがΨ  φＣ３１  ａｔｔ部位に組み込まれたかどうかを判断するために使用することができる。例えば、ＤＮＡ  Ｗａｌｋｉｎｇ  ＳｐｅｅｄＵｐ  Ｋｉｔ（Ｓｅｅｇｅｎｅ）をこの目的のために使用することができる。あるいは、インバースＰＣＲ方法を使用することができる。
【０１９３】
抗体産生レベルを以下の通りにテストした。既知の数の細胞を、ＣＨＯ  ＤＨＦＲ−細胞またはＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に対する７％透析されたウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０％ウシ胎仔血清（ＪＲＨ）、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞に対する１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を伴ういずれかのＭＥＭα−培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の６ウェルディッシュに蒔いた。細胞を１〜４日間増殖させた。培地を回収し、同時に最終的な数の細胞を決定した。
【０１９４】
細胞数は、血球計数器を使用して決定した。あるいは、ＭＴＴベースのアッセイキット（Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６  ｋｉｔ、Ｐｒｏｍｅｇａ）または同様のキットを、プレート上の細胞数を決定するために使用することができる。プレート上の接着細胞の数を測定することができるＶｉａＣｏｕｎｔ  Ａｓｓａｙ（Ｇｕａｖａ）等の機器も利用可能である。
【０１９５】
培地の中ＩｇＧの濃度は、ヒトＩｇＧのすべてのクラスを特異的に測定するＥａｓｙ−Ｔｉｔｅｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｇ（Ｈ＋Ｌ）Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して決定した。原単位（ピコグラム抗体／細胞／日）は、以下の式から計算した。
回収された培地のｐｇ／ｍｌ抗体Ｘｍｌ
（最終的な細胞数＋最初の細胞数）／２
抗体が産生された日数
【０１９６】
１００のＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）ａｔｔＰ細胞株および１００のＤＧ４４  ａｔｔＰ細胞株をスクリーニングした結果を図２７Ａおよび図２７Ｂにそれぞれ示す。１６のＤＧ４４  ａｔｔＰ細胞株が、検出可能な発現を伴うピューロマイシン耐性クローンのプールを生じさせ、最も良いプールは約８ｐｇ抗体／細胞／日を産生した（図２７Ａ）。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）ａｔｔＰ細胞株のスクリーニングは、検出可能な発現を伴うピューロマイシン耐性クローンのプールを生じさせ、最も良いプールは約４ｐｇ抗体／細胞／日を産生した（図２７Ｂ）。
【０１９７】
クローンのプールは、タンパク質発現に関して大いに様々である細胞を含有することが多い。したがって、高レベルのタンパク質発現を提供するプール内の特異的細胞株を同定するために、高産生のプールをサブクローン化した。最も高い発現レベル（２Ｇ７）を呈したドナー発現ベクターでのＤＧ４４  ａｔｔＰ細胞株の形質移入に由来するプールを、９６ウェルプレート上の希釈を制限することによって、その後クローン化し、ならびに上記のように抗体産生性のためにアッセイした。結果を図２８に示す。７．６ｐｇ／細胞／日を産生したプール内に０．２から３８ｐｇ／細胞／日まで産生性が異なるクローンがある。これらのクローンは３０ｐｇ／細胞／ｄａｙより多く産生した。
【０１９８】
非常に高レベルのタンパク質を発現する細胞は、増殖の面で不利な立場にあることが多く、したがって、プールの一部として上記のように展開された時に失われるまたは提示不足である場合がある。この課題を回避するための方法は、以下の通りである。ドナー発現ベクターおよびφＣ３１インテグラーゼベクターでの形質移入後、組込みを生じさせるために、細胞を４８時間インキュベートした。次いで、形質移入された細胞をトリプシン処理し、単一コロニーがウェルの約３０％に増殖するように、９６ウェルプレート上に蒔く。ウェル毎に蒔かれる形質移入された細胞の数は、プレーティング効率およびナーベクター組込み効率次第である。概して、９６ウェルプレート上の単細胞クローンの最大数を得るために、１００％生存率を有する約０．３細胞をウェル毎に蒔く。したがって、例えば、細胞のプレーティング効率が５０％であり、０．１％の細胞が、ピューロマイシン耐性細胞をもたらす組込みイベントを受ける場合、クローンを得るためには、形質移入後にウェル当たり０．３／０．５／０．００１＝６０００細胞を蒔く。組込み効率が非常に高い場合、より少ない細胞を形質移入する必要があり得る。
【０１９９】
最も高いタンパク質発現レベルを有する最も多い数のクローンをもたらす親ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）ａｔｔＰまたはＤＧ４４  ａｔｔＰ細胞株は、他のドナー発現ベクターを組込み、他のタンパク質を高レベルで産生するためのａｔｔＰ細胞株として使用するために選択する。それらの細胞株は繰り返し使用し、小数（＜５０）のクローンを、最も高い発現レベルを有するものを同定するために生成およびスクリーニングする。このスキームは、種々のタンパク質の発現に対して機能し、１つの部位での組込みによって高発現レベルを達成する能力が、抗体発現に特異的でないことを示す。この方法は、何百または何千ものクローンを、異なるタンパク質が産生される度にスクリーニングする必要があり得る現在使用されている方法と比べて、かなりの時間を節約する。さらに、毎回同じ座位で発現カセットを組み込むことによって、遺伝子の安定性およびそれらの遺伝子によってコードされたタンパク質の発現は、遺伝子およびタンパク質発現の安定性が非常に可変性であり、その結果、有用であるように十分に安定なそれらの細胞株を同定するために、追加のクローンのスクリーニングおよび時間のかかるアッセイが必要となり得る現在使用されている方法と比べてより予測可能である。また、この方法は、高レベルのタンパク質発現を有する細胞株が得られない場合に、発現を促進するためによく使用される遺伝子増幅を排除する。ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子またはグルタミンシンテターゼ遺伝子を利用するもの等のかかる遺伝子増幅方法は、高発現レベルを達成するために３〜６ヶ月かかることが多く、多くの場合において発現は不安定な場合がある。
【０２００】
ドナーベクターが標的ベクターに組み込まれた時に生じる染色体構成のいくつかの機能を注目すべきである（図１１〜図１３）。第１に、遺伝子発現を減少させる場合があるアンチセンス転写およびｓｉＲＮＡの生成を避けるために、すべてのプロモーターが同じまたは反対の配向にある。第２に、二重ＣＭＶプロモーター構成は、抗体の重鎖および軽鎖の発現を同等化する。これは、重鎖または軽鎖の発現に不均衡がある場合に、適切な構築が生じないまたはそれらが分解されるために重要である。第３に、φＣ３１  ａｔｔＢ  ２８５  ＡＡＡおよびφＣ３１  ａｔｔＰ  １０３部位は、それらが上流翻訳開始コドンを含有しない短い８８塩基長のφＣ３１  ａｔｔＬ部位を再結合する時に発生するように消化される。ピューロマイシン耐性をコードするｍＲＮＡの５’ＵＴＲ内に存在する短い長さのφＣ３１  ａｔｔＬ  ８８は、ピューロマイシン耐性の発現への妨害を最小化する。
【０２０１】
別の例示的な構成は、φＣ３１  ａｔｔＬ部位がイントロン内に最終的に位置付けられる構成を含む。この構成を生成するため、ドナーベクターを、（順番に）プロモーター、薬剤耐性遺伝子のコード領域のＮ末端半分、およびφＣ３１  ａｔｔＢ部位に先行するイントロンの５’半分を含有するように構築する。次いで、標的ベクターを、（順番に）イントロンの３’半分、薬剤耐性遺伝子のコード領域のＣ末端半分、およびφＣ３１  ａｔｔＰ部位の後にくるポリＡシグナルを含有するように構築する。かかる標的ベクターへのかかるドナーベクターの組込み後、プロモーター、薬剤耐性遺伝子の完全なコード領域、およびポリＡシグナルから成る完全に機能的な薬剤耐性発現カセットを再構成する。φＣ３１  ａｔｔＬ部位はイントロン内に存在する。
【０２０２】
イントロン内のヌクレオチド配列が、適切なスプライシング発生に必要とされる広範囲な情報が利用可能である。例えば、５’および３’エクソン／イントロン接合部付近の配列ならびにイントロンの３０塩基５’から３’末端の周りに典型的には位置付けられるポリピリミジン路は、効率的なスプライシング発生に必要である。したがって、上記の構成において、ドナーベクター中のａｔｔＢおよび標的ベクター中のａｔｔＰは、結果として生じるａｔｔＬ部位が、適切なスプライシング発生に重要である任意のヌクレオチド配列から離れたイントロンの中央に存在するように、イントロンのいずれか一方端から少なくとも１００塩基のイントロンの中央に配置される。これは、結果として生じたａｔｔＬ部位がスプライシングを妨害する可能性が非常に少ないことを確かにする。さらに、イントロンは、ａｔｔＬ部位がスプライシングを妨害する可能性をさらに最小化する長さ（＞１ｋｂｐ）であり得る。
【０２０３】
細胞株特徴付けのための方法
存在する遺伝子カセットおよび上記の方法を用いて得られた細胞株によって産生されるタンパク質を特徴付けるために、いくつかの手順を行うことができる。遺伝子カセットは、組み込まれたカセットの場所を判断すること、ならびに予測構造が存在し、経時的に安定であることを確実にすることを特徴とする。また、細胞株によって産生されているタンパク質は、存在し、活性であること、ならびに高レベル産生が経時的に安定であることを確実にすることを特徴とする。
【０２０４】
組込み部位の数およびそれらの位置を特徴付けるために、多くの方法が利用可能である。一部の実施形態においては、蛍光インサイツハイブリダイゼーション法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ：ＦＩＳＨ）は、ゲノム全体における組込み部位の数を決定するために使用される。組込み部位の位置は、組み込まれたカセットに隣接する染色体ＤＮＡを単離および配列決定することによって決定され、ヒトゲノムの配列と比較される（例えば、Ｃｈａｌｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．，２００６参照）。
【０２０５】
組み込まれたカセット全体は、レトロスペクティブ分析を行うことが望ましい場合にカセットが記録として保存されるように、毎月“プラスミドレスキュー”方法によって２つの断片に単離される。つまり、プラスミドレスキューは、ＤＮＡ断片が複製の起点および大腸菌の維持および選択に適した選択可能なマーカーを有するように、細胞株からゲノムＤＮＡを調製することと、それを組み込まれたカセットにおいて一度およびゲノムＤＮＡにおいて一度切断する制限酵素で消化することとを含む。消化されたＤＮＡは連結され、大腸菌を形質転換するために使用される。複製の大腸菌起点（例えば、ＣｏｌＥ１）および選択可能なマーカー（例えば、アンピシリン耐性）を含有する任意のＤＮＡは、複製し、ひいては “レスキュー”される。Ψ  Ｒ４  ａｔｔＰ  部位への標的ベクターの組込み、次いで、組み込まれた標的ベクターへのドナーベクターｐＤ１のその後の組込みに起因するＤＮＡカセットは、複製の２つの大腸菌起点および２つの選択可能なマーカーを有する。いくつかの制限酵は、これらの配列間を一度切断し、したがって、標的およびドナーベクターを別々に含有するＤＮＡのレスキューを可能にする。この方法を使用することによって、発現カセットの完全性および経時的な安定性を決定することができる。例えば、カセット全体（〜１４ｋｂｐ）は、それが対象とする配列およびＤＮＡ要素の配置を有することを確認するために配列決定することができる。
【０２０６】
染色体ＤＮＡ中の制限酵素部位が、組み込まれたカセットから遠く離れていて、大腸菌で複製されるのに十分に小さいＤＮＡを生成できない場合、プラスミドレスキューは不成功となる場合がある。そのような実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応は、組み込まれたカセットを分析するために使用される。〜１４ｋｂｐの組み込まれたカセット全体を増幅し、さらなるクローニングなく現状のままで保存することができるように、いくつかの酵素および条件が利用可能である。隣接染色体ＤＮＡの配列を得ることが望ましい場合、インバースＰＣＲ、または隣接染色体配列を増幅するためにランダムなプライマーを使用するアプローチ等の多くの方法が利用可能である。
【０２０７】
どの遺伝子が存在するかを決定することに加えて、インテグラーゼベクターがゲノムに組み込まれていないことを確実にすることも望ましい。これは、インテグラーゼの持続的発現が、ゲノム中に存在するΨ  ａｔｔ部位間の組換えを媒介することによって、組み込まれた標的およびドナーベクターカセットの不安定性または染色体ＤＮＡの不安定性を導き得るためである。安定なインテグラーゼベクターは、一過性の形質移入後に観察されたが、しかしまれである。しかしながら、一部の実施形態においては、細胞株におけるインテグラーゼベクターの存在を排除することが望ましい場合がある。サザンブロット法またはポリメラーゼ連鎖反応等の、特異的核酸の存在または非存在を検出するための任意の適切な方法は、インテグラーゼベクターが存在するかどうかを決定するために使用することができる。あるいは、インテグラーゼタンパク質の存在を検出するウエスタンブロット法またはＥＬＩＳＡ等の方法を使用することができる。
【０２０８】
タンパク質産生の特徴付け
組み込まれた遺伝子カセットの特徴付けに加えて、タンパク質産生（例えば、抗体産生）の質、安定性、およびレベルも特徴付けられる。最初に、第２の組込みからの多数のプールされた細胞株（＞１００）を、９６ウェルプレートにおけるタンパク質産生のためにスクリーニングした。抗体のための種々の適当な方法を使用することができる。例えば、ＥＬＩＳＡは、存在する抗体の総量を測定するために使用する。生成される抗体のレベルが適当なレベルで産生される場合、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルは、産生レベルをスクリーニングするためにも使用する。細胞が無血清培地で増殖する場合、細胞培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に直接負荷することが可能である。細胞が血清含有培地で増殖する場合、抗体は、例えば、ウエスタンブロット法またはＥＬＩＳＡ．によって特異的に検出するこができ、定量化することができる。
【０２０９】
細胞によって産生される抗体の特異的結合活性
ＤＧ４４またはＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）をｐＤ１−ＤＴＸｌ（別項に記述したようなＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００ＣＤを使用）で形質移入した。形質移入から２４時間後に培地を回収した。総ＩｇＧは、（特許の他の箇所において記述したような）Ｅａｓｙ−Ｔｉｔｅｒ（Ｈ＋Ｌ）ＩｇＧアッセイキットを使用して決定した。抗ジフテリア毒素ＩｇＧは、製造業者の使用説明書に厳密に従って、Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡキット（ＩＢＬ  Ｈａｍｂｕｒｇ）を使用して決定した。
【０２１０】
図３１は、ＤＧ４４細胞またはＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞に発現された抗ジフテリア毒素抗体の特異的結合活性を示す。各細胞から産生された抗体は、同じ特異的結合活性を有する。さらに、結果は、両細胞株からの抗体は正確な抗原特異性を有し、〜２５０ｍｇのこの抗体は、通常の１０，０００ＩＵ用量に必要とされることを示す。
【０２１１】
細胞によって産生された抗体の生物活性
また、中和アッセイは、抗体の機能活性を測定するために使用することができる。例えば、炭疽毒素ならびにジフテリア毒素等の他の毒素は、培養された細胞を死滅させる。したがって、抗ジフテリア毒素抗体の活性は、精製されたジフテリア毒素の細胞死滅特性を中和するその能力を測定することによって決定することができる。総タンパク質の機能活性の比率（特異的活性）は、活性抗体または特定の細胞株が産生する他の分泌タンパク質のレベルを測定するのに有用である。
【０２１２】
ＤＧ４４またはＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）から産生された抗ジフテリア毒素抗体の中和活性を決定し、抗ジフテリア毒素抗体遺伝子がクローン化されたＤ２．２細胞株からの抗体と比較した。ＤＧ４４またはＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）からの抗体は、別項に記述したようなＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００ＣＤを使用して、細胞の一過性の形質移入によって生成した。Ｄ２．２細胞または形質移入されたＤＧ４４およびＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞からの上清中に存在する抗体の量は、抗原としての純ジフテリア毒素を使用してＥＬＩＳＡによって決定した。次いで、種々の量の抗体を１０ｎｇ／ｍｌジフテリア毒素に加えた。３７℃での１５分のインキュベーション後、抗体／毒素混合物を、ジフテリア毒素による死滅に対して感受性があるＪｕｒｋａｔ細胞に加えた。細胞分裂は３Ｈ−チミジン取り込みによって測定した。結果を図３２に示す。有意な３Ｈ−チミジン取り込みの不足によって示唆されるように、毒素のみの抗体なしで処置された対照細胞は死亡する。Ｄ２．２、ＤＧ４４、またはＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞によって産生された増加量の抗ジフテリア毒素抗体で処置された細胞は生存した。ジフテリア毒素による死滅からＪｕｒｋａｔ細胞を保護するためのＥＣ５０は、Ｄ２．２、ＤＧ４４、またはＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞に対してそれぞれ５、８、および１１ｎｇ／ｍｌであった。
【０２１３】
最も高いレベルの抗体を小規模に産生する約１０の細胞株は、より大規模（例えば、１００ｍｌ〜１リットル）で無血清浮遊培養に適応する。一部のクローンが適応、急速な増殖、または高レベルの抗体発現レベルを保持しない場合があるため、いくつかのクローンが適応される。浮遊培養への細胞株の適応後、抗体産生レベルを再度テストした。実験室規模での例示的な抗体産生は、１日当たり培地の約１０〜１００ｍｇ／Ｌまたは１リットル当たり１ｘ１０９細胞の最大細胞密度と仮定すれば、約１０〜１００ｐｇ／細胞／日である。
【０２１４】
大規模なヒトＩｇＧ抗体精製のための種々の方法が説明されている。典型的には、少なくとも３つのクロマトグラフィー樹脂が使用される。タンパク質Ａカラムは、そのＦｃ領域に結合することによってＩｇＧを捕獲するための第１の親和性ステップとして使用される。第２のカラムは、内毒素、残存する細胞タンパク質、および第１のカラムから浸出したあらゆるタンパク質Ａを除去するように設計される。例示的な樹脂は、ヒドロキシアパタイト、疎水性相互作用、または第２のクロマトグラフィーステップに使用することができる陽イオン交換樹脂を含む。陰イオン交換カラムは、ＤＮＡを除去するための第３のステップとして使用される。
【０２１５】
約１００ｍｇの抗体を精製し、適当な活性アッセイでテストした。抗ジフテリア毒素抗体に対する適当なインビボアッセイは、モルモットで行った皮膚試験である。抗体を精製されたジフテリア毒素と混合し、皮膚内に注入した。中和されていない毒素は、炎症反応をもたらす。抗ジフテリア毒素抗体に対する適当なインビトロアッセイは、Ｖｅｒａ細胞を使用するものである。ジフテリア毒素（Ｓｉｇｍａ）のわずか１分子が、伸長因子−２（ＥＦ−２）リボソームアクセサリータンパク質の共有結合性ＡＤＰ−リボシル化を介して細胞を死滅させることができると考えられる。結果として、細胞内のすべてのタンパク質合成は阻害され、細胞は死亡する。したがって、ＭＴＴベースのアッセイ等の細胞生存率または細胞代謝を測定する任意のアッセイは、一定量の精製されたジフテリア毒素に対する抗体の力価を決定するために使用される。かかるアッセイは、有効期間を確率し、精製された抗体の安定性を検討するために１２ヶ月の間毎月行う。
【０２１６】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを、抗体の一部の基本的な特徴を評価するために使用する。例えば、還元された抗体試料のＳＤＳゲル電気泳動は、重鎖（〜５０ｋＤａｌ）および軽鎖（〜２５ｋＤａｌ）の量、純度、および正確な分子量を確認するために使用することができるが、しかしさらに重要なことに、重鎖の軽鎖に対する比率が約１：１であることを確認するために使用することができる。変性であるが非還元性の試料のＳＤＳゲル電気泳動は、抗体が主に単量体または多量体であるかどうかを決定するために使用される。これは、凝集性抗体の存在が産生または精製課題を示す場合があるために重要である。凝集性抗体は、ヒト治療学として使用される場合に、腎毒性等の所望されない効果を有し得る。最後に、凝集性抗体は、所望の生物活性に関して不活性なことも多い。他の生物分析方法も、光散乱またはゲル濾過を含む抗体の凝集状態を評価するために使用することができる。
【０２１７】
実施例３
選択可能なドナー発現ベクターを使用するタンパク質産生のためのＣＨＯ細胞株
φＣ３１変異インテグラーゼ発現ベクターｐＣＳ−Ｍ３Ｊ単独での、ＤＧ４４  ｐＲ１−ＤＨＦＲ細胞クローンの形質移入は、ドナー発現ベクターを形質移入することなくピューロマイシン耐性細胞をもたらし得ることが分かった。これは、ピューロマイシン耐性遺伝子への領域５’における、組み込まれたｐＲ１−ＤＨＦＲプラスミドへの、染色体ＤＮＡのφＣ３１インテグラーゼ媒介による再配置の結果であるように思われる。かかる転位置された染色体ＤＮＡは、ピューロマイシン耐性の発現を駆動するプロモーターを含有してもよい。一部の実験において、これらのイベントの数は、ドナー発現ベクターが標的ベクター内に組み込まれる所望の組込みイベントの数の最大３０％であった。
【０２１８】
この課題を回避するための一方法は、ドナー発現ベクター上のＧ４１８耐性をコードするもの等の完全に機能的な薬剤耐性遺伝子を有することであった。Ｇ４１８遺伝子含有のドナー発現ベクターおよびφＣ３１インテグラーゼベクターでの形質移入と、それに続くピューロマイシンのための選択後、２つのクラスの組み込み体が存在する。一方のクラスにおいて、標的ベクター中の野生型ａｔｔＰ部位へのドナー発現ベクターの組換えが生じることになり、別のクラスにおいて、標的ベクターへの染色体ＤＮＡの再配置が生じることになる。しかしながら、Ｇ４１８選択がピューロマイシン選択後に適用された場合、完全なドナー発現ベクターとの組換えのみが残る。標的ベクターへの染色体ＤＮＡの再配置が生じた細胞は、Ｇ４１８−ドナー発現ベクターを含有せず、排除される。
【０２１９】
ここで留意すべきは薬剤耐性選択の順序が重要であることである。Ｇ４１８選択が最初に行われた場合、次いで、標的ベクターに、ならびにΨ  ａｔｔ部位にランダムに組み込まれたＧ４１８−ドナー発現ベクターを有する細胞が取得される場合がある。次に、ピューロマイシン選択がその後行われた場合、ランダムなまたはΨ  ａｔｔ部位組込みを有する細胞は排除されるが、しかし、標的ベクターへの染色体再配置は、標的ベクターへのドナー発現ベクター組込みが生じなかった細胞等において依然生じ得る。同様の理由により、ピューロマイシンおよびＧ４１８選択を同時に行うことは望ましくない。
【０２２０】
ピューロマイシン選択後にＧ４１８選択を行うことが有益であったかどうかを決定するため、実施例２で説明したように、ｐＤ１−ＤＴＸｌ−Ｇ４１８をＤＧ４４  Ｒ１−ＤＨＦＲクローン１Ａ１、２Ｂ１１、２Ｅ８、２Ｇ７、２Ｈ１、２Ｈ９に形質移入した。形質移入後２日目に、細胞を７日間１０μｇ／ｍｌピューロマイシンにおいて選択した。次いで、コロニーを、１０μｇ／ｍｌピューロマイシンのみか、または１０μｇ／ｍｌピューロマイシンおよび４００μｇ／ｍｌＧ４１８どちらも含有するいずれかの増殖培地に分けた。これらの条件下での選択は２１日間継続した。次いで、抗体産生に対して培地をアッセイした。これらのアッセイの結果を表１に示す。Ｇ４１８選択は、４例において原単位を７３倍まで３０増加させ、２例において効果がなかった。Ｇ４１８選択が効果を有したかどうかは、各的ベクタークローン中のドナー発現ベクター組込みの効率と、また、ピューロマイシン耐性をもたらす発現ベクター非依存性のイベントの頻度に依存し得る。
【表１】
2009538144.tif 000002
【０２２１】
Ｇ４１８耐性をコードするもの以外の完全な薬剤耐性遺伝子は、選択可能なドナー発現ベクターに任意に取り込まれることができる。唯一の制限は、標的ベクター組込み（例えば、ハイグロマイシン耐性）を選択、ドナーベクター組込み（例えば、ピューロマイシン耐性）を選択、または標的ベクター（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素）のコピー数を増幅するために使用されるものとは異ならなければならないことである。したがって、例えば、ゼオシンまたはブラストサイジン耐性をコードする遺伝子が利用され得る。
【０２２２】
選択可能なドナー発現ベクターを使用する別の利点は、ｐＲ１−ＤＨＦＲ等の、標的ベクターへの選択可能なドナー発現ベクターのφＣ３１媒介による組込み後に、選択可能な遺伝子が、抗体重鎖および軽鎖のコード領域間に位置付けられることである。したがって、継続的な選択は、重鎖または軽鎖コード領域のいずれか一方の欠失をもたらし得る発現ベクター（例えば、プロモーター、シグナル配列、ポリアデニル化シグナル）の反復要素間での相同組換えを予防する。
【０２２３】
実施例４
高収率タンパク質産生のための操作されたＣＨＯ細胞株
ＣＨＯ細胞を培養および形質移入する方法は、Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，３０８：９９−１０６（２００５）に記載されるような手順に従う。つまり、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞（例えば、ＤＧ４４細胞）は、２４ウェルプレートにおいてＦｕｇｅｎｅ６を使用して形質移入される。以下のプロトコルに従う。
１．第１の形質移入は、標的ベクターおよびφＣ３１インテグラーゼプラスミドで行われる（図３）。
２．形質移入から２４時間後に、細胞を１００ｍｍディッシュに移す。
３．形質移入から４８時間後に、細胞をハイグロマイシン耐性のクローン対して選択する。
４．形質移入から約１２〜１４日後に、十分に形成されているコロニーが現れた時、個々のコロニーを採取し、２４ウェルプレートに移す。φＣ３１インテグラーゼを使用した以前の経験より、３０〜５０のコロニーのみが高度発現クローンを得るためにスクリーニングされる必要がある。
５．選択されたコロニーは、２セットの２４ウェルプレート中で維持される。１セットは維持のためのものである。もう１つはスクリーニングのためのものである。
６．２４ウェルプレート中のＣＨＯコロニーのスクリーニングセットは、レポーター遺伝子（例えば、ＣＩＰ、ＧＦＰまたはルシフェラーゼ）を発現するドナーベクターとＲ４インテグラーゼプラスミドで同時形質移入される（図４）。
７．第２の形質移入から４８時間後に、非選択的な培地をプレートから除去し、ゼオシンを含有する培地を約２週間数回適用する。
８．その後、細胞を適当なレポーター遺伝子アッセイのために回収する。
９．最も高いレベルのレポーター遺伝子を発現する３〜５のクローンを選択し、対応するクローンを維持セットから展開する。
１０．Ｒ４インテグラーゼファージ付着部位（ａｔｔＰ）を含有する、結果として生じる細胞株をＣＨＯ−Ｒ４ａｔｔＰ細胞と称する。
【０２２４】
ＣＨＯ−Ｒ４ａｔｔＰ細胞株のテスト
ＳＡＲＳまたは炭疽抗体を、ＣＨＯ−Ｒ４ａｔｔＰ細胞株をテストするために使用する。ほとんどのＳＡＲＳおよび炭疽抗体はＩｇＧｌである。抗体のＶＨおよびＶＬ可変領域をクローン化し、次いで、全長抗体を産生するため、ＩｇＧ１定常領域を含有するベクター中に構築した。重鎖および軽鎖に対するｃＤＮＡは、２つの同一または２つの異なるプロモーターによって駆動される２つの別々のドナープラスミドまたは単一ドナープラスミドのいずれかにタンデムにクローン化することができる。ファージインテグラーゼを使用することの利点は、関心遺伝子へのサイズ制限がないことである。２つのプラスミドシステムおよび１つのプラスミドシステムの両方が全長抗体を発現するために使用される。
【０２２５】
研究規模での単クローン抗体の発現は、（Ｗｕｒｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２，１３９３−８（２００４）；Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １３，１１７−２３（２００２）；Ｗｉｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ７３，４１９−２６（１９８８）；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ５８，７３−８４（１９９８）；Ｇａｎｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ３７７，２９０−４（１９９５）；およびＫｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６０，４４２−８（２００２））に広範囲に記載されている。これらの一般的な手順は、ＣＨＯ−Ｋ４ａｔｔＰ細胞株に関して従われる。無血清培地および細胞培養工程は、大規模発酵のための抗体産生を最適化するために開発される。
【０２２６】
親細胞株、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−のサブクローンを、無血清培地において高収率の３０−５０ｐｇ／細胞／日でタンパク質を産生するために選択する。操作されたＣＨＯ−Ｒ４  ａｔｔＰ細胞株を使用する予想産生率は、無血清培地中少なくとも約３０ｐｇ／細胞／日である。細胞株およびドナーベクターが発達すると、任意の関心抗体遺伝子は、ドナーベクターの発現カセットに簡便にクローン化することができる（図２）。高レベル発現クローンのスクリーニングには３０〜５０コロニーのスクリーニングが必要なだけであるため、高レベルの抗体を発現する安定な細胞株を、対費用効率の高い方法で早急に生成することができる。
【０２２７】
ＣＨＯ−Ｒ４ａｔｔＰ細胞株の特徴付け
ＣＨＯ−Ｒ４ａｔｔＰ細胞株を特徴付けるために、ＦＤＡのＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＢＥＲ）によって公開された覚書「Ｐｏｉｎｔｓ  ｔｏ  Ｃｏｎｓｉｄｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  Ｕｓｅｄ  ｔｏ  Ｐｒｏｄｕｃｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（１９９３）」に従う。
【０２２８】
さらに、Ｒ４  ａｔｔＰ組込み部位は、例えばＦＩＳＨ、サザンブロット法、ＰＣＲ、およびＤＮＡ配列決定等の従来の方法によって、例えば、組込みのコピーおよび座位の数に関して完全に特徴付けられる。関心遺伝子の将来の組込みは、染色体内へ以前に操作されたＲ４  ａｔｔＰ部位に特異的に標的されるため、各個々の関心遺伝子の組込み部位の特徴付けは些細なものである。その結果、関心遺伝子を発現する安定な細胞株の将来の特徴付けは、著しく単純化され、時間および費用が節約される。
【０２２９】
実施例５
高収率タンパク質産生のための操作されたＤＨＦＲ増幅可能なＣＨＯ細胞株
ＤＨＦＲ増幅システムは、ＤＨＦＲに関連した発現カセットのコピー数を増加させるために、ＣＨＯ発現システムにおいて広く使用される。発現システムは、選択可能なマーカーとしての形質移入されたＤＨＦＲ遺伝子と連結して、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）欠乏性のＣＨＯ宿主細胞を利用する。システムは、遺伝子およびＤＨＦＲに連結された配列を増幅し、向上されたレベルのタンパク質発現に繋がる（Ｗｕｒｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２，１３９３−８（２００４））。形質移入された細胞は、メトトレキサート（ＭＴＸ）耐性、ＤＨＦＲ阻害剤、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅を介し、最大１００〜１０，０００キロベースの周囲領域を発達させる（Ｃｏｑｕｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ８９，２１５−２５（１９９７）；およびＳｔａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ５７，９０１−８（１９８９））。ＭＴＸへの曝露から２〜３週間後、細胞の大部分が死亡する。しかしながら、生存している細胞は、多くの場合数百から数千コピーの組み込まれたプラスミドを含有する（Ｗｕｒｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ７８２，７０−８（１９９６）；およびＷｕｒｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ２２，９５−１０２（１９９４））。「増幅された」細胞の多くは、最大１０〜２０倍多い組換えタンパク質（Ｗｉｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ７３，４１９−２６（１９８８））を産生する。いくつかのサイクルの遺伝子増幅が頻繁に行われ、典型的には、メトトレキサートの濃度は、各遺伝子増幅サイクル後に３〜５倍増加する。代替的な選択肢を最適なＤＨＦＲ増幅に対してテストする。
【０２３０】
関心遺伝子のＤＨＦＲ増幅が、タンパク質発現の増加を可能にするかどうかをテストするために、ＤＨＦＲ遺伝子を標的ベクター上に配置した。ＤＨＦＲ遺伝子を含む標的ベクターの略図を図１５に与える。結果として生じるベクターの配列を図３５Ａ〜図３５Ｃに与える。図２９は、ドナー発現ベクターがＤＨＦＲ−標的ベクター内に部位特異的に組み込まれ、次いで細胞集団がメトトレキサートの増加する濃度に曝露された細胞のプールからの抗体の発現（ｐｇ／細胞／日）を示す。
【０２３１】
ＤＨＦＲ遺伝子を標的ベクター上のＲ４  ａｔｔＰ部位に連結する利点は少なくとも３つある。第１に、ＤＨＦＲ増幅後、染色体は、Ｒ４  ａｔｔＰ部位の多数のコピーも有する。ドナーベクターがＣＨＯ−Ｒ４ａｔｔＰ（ＤＨＦＲ）細胞株に形質移入された後、関心遺伝子は、Ｒ４インテグラーゼによって媒介された多数の受け取りＲ４  ａｔｔＰ部位に組み込まれてもよい。第２に、以前に増幅されたＣＨＯ−Ｒ４ａｔｔＰ（ＤＨＦＲ）細胞株が、十分に高レベルの関心遺伝子を発現する能力をすでに有する場合、第２のＤＨＦＲ増幅は、関心遺伝子の形質移入後に要求されない場合があり、したがって、著しい時間と努力が節約される。第３に、ＣＨＯ−Ｒ４ａｔｔＰ（ＤＨＦＲ）細胞株は十分に特徴付けられているため、ドナーベクターからの関心遺伝子の組込み後、関心遺伝子を産生する発現細胞株は別の長いＤＨＦＲ増幅およびさらなる特徴付けを必要としない場合があり、著しい量の時間と費用が節約される。
【０２３２】
第２の実施例において、ＤＨＦＲ遺伝子は、ドナーベクター上に存在する。ＤＨＦＲ遺伝子を含むドナーベクターの略図を図６に与える。第３の実施例において、ＤＨＦＲ遺伝子は、標的ベクター上（図５）およびドナーベクター上（図６）に存在する。ＤＨＦＲ増幅後、操作されたＣＨＯ−Ｒ４ａｔｔＰ（ＤＨＦＲ）細胞株は、無血清培地中３０ｐｇタンパク質／細胞／日を優に上回る収率を産生することが予想される。
【０２３３】
実施例６
ＩＲＥＳを使用する増強された翻訳での、収率タンパク質産生のための操作されたＣＨＯ細胞株
また、発現レベルをさらに増加させるために、最適化されたＩＲＥＳ要素をφＣ３１インテグラーゼと一緒に使用する可能性および必要性をテストする。最適化されたＩＲＥＳ要素を、ドナーベクター、関心タンパク質のためのコード領域の上流および転写開始部位の下流にクローン化する（図７）。このＩＲＥＳ要素は、標的ｍＲＮＡの翻訳効率を増強させることによってタンパク質産生を著しく増加させる（Ｃｈａｐｐｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８，３３７９３−８００（２００３）；Ｏｗｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８，１４７１−６（２００１）；およびＣｈａｐｐｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９７，１５３６−１５４１）。
【０２３４】
多量の治療用タンパク質および抗体を得るため、例えば、強いプロモーター、染色体複製、および高度に発現する細胞株の選択を介して、標的遺伝子ｍＲＮＡの量を増加させる従来の転写ベースの方法を使用して可能なものよりも、より高いレベルのタンパク質産生が可能である新規の翻訳ベースの技術を使用する過剰発現細胞株が開発される。
【０２３５】
翻訳エンハンサーは、翻訳機構を漸加し、翻訳開始を促進する内部リボソーム侵入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ：ＩＲＥＳ）として機能する短ＲＮＡ配列を使用して現在開発されている。個々のＩＲＥＳ要素の活性は比較的弱いが、ＩＲＥＳ活性は、特定のＩＲＥＳ要素が一緒に連結された場合、相乗的に増加し得ることが分かった（Ｏｗｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８，１４７１−６（２００１）；およびＣｈａｐｐｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９７，１５３６−１５４１）。これらの研究において、合成ＩＲＥＳは、第２のシストロンの翻訳を増強するそれらの能力に対するジシストロニックなｍＲＮＡのシストロン間の領域でテストした。しかしながら、これらのＩＲＥＳのうちの１つは、モノシストロニックなｍＲＮＡの５’リーダー内に配置された時に、強力な翻訳エンハンサーとしても機能し得ることが最近分かった。この合成ＩＲＥＳは、ＧｔｘホメオドメインｍＲＮＡの５’リーダーから、９−ｎｔ  ＩＲＥＳモジュールの多数の連結されたコピーを含有した。
【０２３６】
目標は、ＣＨＯ細胞で効率的に機能する合成翻訳エンハンサーを生成するために、ＣＨＯ細胞で効率的に機能し、これらの個々の要素を使用するＩＲＥＳ要素を同定することである。また、大規模な産生に使用されるヒトハイブリッドおよびヒト細胞株で効率的に機能する翻訳エンハンサーも開発される。
【０２３７】
これらの細胞株で効率的に機能する個々のＩＲＥＳ要素は、１８のランダムなヌクレオチドを含有するカセットが、選択ベクターにクローン化され、関心細胞株に形質移入される選択方法論を使用して取得される（Ｏｗｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８，１４７１−６（２００１））。選択実験は、ＧＦＰ／ＣＦＰジシストロニックなレトロウイルスベクターを使用して行う。活性ＩＲＥＳ要素を含有する細胞は、ＦＡＣＳによって選択する。選択した配列は、別の状況において機能し、ならびにそれらを選択するために使用されるＧＦＰ／ＣＦＰベクター中に存在する配列に依存せず、影響されないＩＲＥＳを示すために、レニラ／フォチナス（Ｒｅｎｉｌｌａ／Ｐｈｏｔｉｎｕｓ：ＲＰｈ）二重ルシフェラーゼベクターにおいて回復および再テストを行った。種々のＩＲＥＳ要素を、同じまたは異なるＩＲＥＳ要素の多数のコピーを一緒に連結させることによって活性に相乗作用を与える能力に対してテストする。増強されたＩＲＥＳ活性を示す要素の組み合わせは、モノシストロニックなレポーターＲＮＡの５’リーダーにおいて翻訳エンハンサーとして機能する能力に対してテストする。
【０２３８】
次に、再生される合成翻訳エンハンサーを、どのエンハンサー／遺伝子の組み合わせが最も効率的に機能するかを判断するために、治療用タンパク質または抗体をコードするｍＲＮＡの５’リーダーにおいてテストする。特に効率的な組み合わせが同定され次第、構築物は、大規模な培養条件でテストされ、抗体産生を最大にする必要がある場合にさらに最適化される。
【０２３９】
実施例７
高収率誘導性タンパク質産生のための操作されたＣＨＯ細胞株
スケールアップおよび製造に適した細胞株は、早急な増殖と高度特異的な産生性との組み合わせた能力を有する必要がある。発現ベクターの高発現レベルに起因して、産生細胞は、高レベルの異種タンパク質を発現する時に増殖が困難な場合があり、または異種タンパク質は、長期の増殖期の間に凝集し得る。この困難に遭遇した場合、関心遺伝子の誘導性発現を提供するために、オンオフスイッチをドナーベクターに加える。そのようなものとして、要素は、細胞増殖時に導入遺伝子発現をオフにし、細胞が臨界量まで増殖して、タンパク質産生の準備ができている時にのみ発現をオンにするように機能する。これらのスイッチは、条件的に転写を妨害または活性化する適当な受容体システムと相互作用する配位子によって作動される。いくつかの専売スイッチは、遺伝子治療研究のために開発されており、ＡＲＧＥＮＴシステム、ＧＥＮＥ  ＳＷＩＴＣＨシステム、リボスイッチ、亜鉛フィンガータンパク質、エクジソン受容体ベースのシステム等を含むがこれらに限定されない想定された産生システムで使用することができる。さらに、テトラサイクリン誘導性およびガス誘導性のシステムも利用することができる（Ｗｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２，１４４０−４（２００４）；およびＷｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｅｔａｂ  Ｅｎｇ  ７，１７４−８１（２００５））。
【０２４０】
実施例８
高収率タンパク質産生のための操作されたＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞株
ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞を培養および形質移入する方法は、Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，３０８：９９−１０６（２００５）に記載されるような手順に従う。簡潔に言えば、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞は、２４ウェルプレート中のＦｕｇｅｎｅ６を使用して形質移入される。以下のプロトコルに従う。
１．第１の形質移入を標的ベクターおよびφＣ３１インテグラーゼプラスミドで行う（図３）。
２．形質移入から２４時間後に、細胞を１００ｍｍディッシュに移す。
３．形質移入から４８時間後に、ハイグロマイシン耐性のクローンに対して細胞を選択する。
４．十分に形成されているコロニーが出現する形質移入から約２１日後に、個々のクローンを採取し、２４ウェルプレートに移す。φＣ３１インテグラーゼを使用した以前の経験により、３０〜５０のクローンのみを、高度発現クローンを得るためにスクリーニングする必要がある。
５．次いで、選択されたコロニーを２セットの２４ウェルプレートで維持する。１セットは維持のためのものである。もう１セットはスクリーニングのためのものである。
６．２４ウェルプレート中のＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）コロニーのスクリーニングセットは、レポーター遺伝子（例えば、ＳＥＡＰ、ＣＩＰ、ＧＦＰまたはルシフェラーゼ）を発現するドナーベクターとＲ４インテグラーゼプラスミドで同時形質移入される（図４）。
７．第２の形質移入から４８時間後に、非選択的な培地をプレートから除去し、ゼオシンを含有する培地を約３週間数回適用する。
８．その後、細胞を適当なレポーター遺伝子アッセイのために回収する。
９．最も高いレベルのレポーター遺伝子を発現する３〜５のクローンを選択し、対応するクローンを維持セットから展開する。
１０．Ｒ４インテグラーゼファージ付着部位（ａｔｔＰ）を含有する、結果として生じる細胞株をＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＲＡａｔｔＰ細胞と称する。
【０２４１】
ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−Ｒ４ａｔｆＰ細胞株のテスト
ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＲＡａｔｔＰ細胞株をテストおよび特徴付けるためにＳＡＲＳまたは炭疽抗体を使用する。ほとんどのＳＡＲＳおよび炭疽抗体はＩｇＧｌである。抗体のＶＨおよびＶＬ可変領域をクローン化し、次いで、ＩｇＧｌ定常領域を含有するベクター内で構築して全長抗体を得る。重鎖および軽鎖のためのｃＤＮＡは、２つの同一なまたは２つの異なるプロモーターによって駆動される、２つの別々のドナープラスミドまたは単一ドナープラスミドのいずれかにタンデムにクローン化することができる。ファージインテグラーゼを使用することの利点は、関心遺伝子へのサイズ制限がないことである。２つのプラスミドシステムおよび１つのプラスミドシステムの両方が全長抗体を発現するために使用される。
【０２４２】
研究規模での単クローン抗体の発現は、（Ｗｕｒｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２，１３９３−８（２００４）；Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １３，１１７−２３（２００２）；Ｗｉｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ７３，４１９−２６（１９８８）；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ５８，７３−８４（１９９８）；Ｇａｎｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ３７７，２９０−４（１９９５）；およびＫｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６０，４４２−８  （２００２））に広範囲に記載され、ならびに、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７７，４２１６−２０（１９８０））においても記載されている。これらの一般的な手順は、ＣＨＯ−Ｒ４ａｔｔＰ細胞株に関して従われる。無血清培地および細胞培養工程は、大規模発酵のための抗体産生を最適化するために開発される。
【０２４３】
操作されたＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−Ｒ４ａｔｔＰ細胞株を使用する予想産生率は、無血清培地中少なくとも約３０ｐｇ／細胞／日である。細胞株およびドナーベクターが発達すると、任意の関心抗体遺伝子は、ドナーベクターの発現カセットに簡便にクローン化することができる（図２）。高レベル発現クローンのスクリーニングには３０〜５０コロニーのスクリーニングが必要なだけであるため、高レベルの抗体を発現する安定な細胞株を、対費用効率の高い方法で早急に生成することができる。
【０２４４】
ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−Ｒ４ａｔｔＰ細胞株の特徴付け
ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−Ｒ４ａｔｔＰ細胞株を特徴付けるために、ＦＤＡのＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＢＥＲ）によって公開された覚書「Ｐｏｉｎｔｓ  ｔｏ  Ｃｏｎｓｉｄｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  Ｕｓｅｄ  ｔｏ  Ｐｒｏｄｕｃｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（１９９３）」に従う。
【０２４５】
さらに、Ｒ４  ａｔｔＰ組込み部位は、例えばＦＩＳＨ、サザンブロット法、ＰＣＲ、およびＤＮＡ配列決定等の従来の方法によって、例えば、組込みのコピーおよび座位の数に関して完全に特徴付けられる。関心遺伝子の将来の組込みは、染色体内へ以前に操作されたＲ４  ａｔｔＰ部位に特異的に標的されるため、各個々の関心遺伝子の組込み部位の特徴付けは些細なものである。その結果、関心遺伝子を発現する安定な細胞株の将来の特徴付けは、著しく単純化され、時間および費用が節約される。
【０２４６】
実施例９
ＩＲＥＳを使用する増強された翻訳での、収率タンパク質産生のための操作されたＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞株
また、発現レベルをさらに増加させるために、最適化されたＩＲＥＳ要素をφＣ３１インテグラーゼと一緒に使用する可能性および必要性をテストする。最適化されたＩＲＥＳ要素を、ドナーベクター、プロモーターの下流および関心タンパク質のためのコード領域の上流および転写開始部位の下流にクローン化する（図７）。このＩＲＥＳ要素は、標的ｍＲＮＡの翻訳効率を増強させることによってタンパク質産生を著しく増加させる（Ｃｈａｐｐｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８，３３７９３−８００（２００３）；Ｏｗｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８，１４７１−６（２００１）；およびＣｈａｐｐｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９７，１５３６−１５４１）。
【０２４７】
多量の治療用タンパク質および抗体を得るため、例えば、強いプロモーター、染色体複製、および高度に発現する細胞株の選択を介して、標的遺伝子ｍＲＮＡの量を増加させる従来の転写ベースの方法を使用して可能なものよりも、より高いレベルのタンパク質産生が可能である新規の翻訳ベースの技術を使用する過剰発現細胞株が開発される。
【０２４８】
翻訳エンハンサーは、翻訳機構を漸加し、翻訳開始を促進する内部リボソーム侵入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ：ＩＲＥＳ）として機能する短ＲＮＡ配列を使用して現在開発されている。個々のＩＲＥＳ要素の活性は比較的弱いが、ＩＲＥＳ活性は、特定のＩＲＥＳ要素が一緒に連結された場合、相乗的に増加し得ることが分かった（Ｏｗｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８，１４７１−６（２００１）；およびＣｈａｐｐｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９７，１５３６−１５４１）。これらの研究において、合成ＩＲＥＳは、第２のシストロンの翻訳を増強するそれらの能力に対するジシストロニックなｍＲＮＡのシストロン間の領域でテストした。しかしながら、これらのＩＲＥＳのうちの１つは、モノシストロニックなｍＲＮＡの５’リーダー内に配置された時に、強力な翻訳エンハンサーとしても機能し得ることが最近分かった。この合成ＩＲＥＳは、ＧｔｘホメオドメインｍＲＮＡの５’リーダーから９−ｎｔ  ＩＲＥＳモジュールの多数の連結コピーを含有した。
【０２４９】
目標は、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞で効率的に機能する合成翻訳エンハンサーを生成するために、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞で効率的に機能し、これらの個々の要素を使用するＩＲＥＳ要素を同定することである。また、大規模な産生に使用されるヒトハイブリッドおよびヒト細胞株で効率的に機能する翻訳エンハンサーも開発される。
【０２５０】
これらの細胞株で効率的に機能する個々のＩＲＥＳ要素は、１８のランダムなヌクレオチドを含有するカセットが、選択ベクターにクローン化され、関心細胞株に形質移入される選択方法論を使用して取得される（Ｏｗｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８，１４７１−６（２００１））。選択実験は、ＧＦＰ／ＣＦＰジシストロニックなレトロウイルスベクターを使用して行う。活性ＩＲＥＳ要素を含有する細胞は、ＦＡＣＳによって選択する。選択した配列は、別の状況において機能し、ならびにそれらを選択するために使用されるＧＦＰ／ＣＦＰベクター中に存在する配列に依存せず、影響されないＩＲＥＳを示すために、レニラ／フォチナス（Ｒｅｎｉｌｌａ／Ｐｈｏｔｉｎｕｓ：ＲＰｈ）二重ルシフェラーゼベクターにおいて回復および再テストを行った。種々のＩＲＥＳ要素を、同じまたは異なるＩＲＥＳ要素の多数のコピーを一緒に連結させることによって活性に相乗作用を与える能力に対してテストする。増強されたＩＲＥＳ活性を示す要素の組み合わせは、モノシストロニックなレポーターＲＮＡの５’リーダーにおいて翻訳エンハンサーとして機能する能力に対してテストする。
【０２５１】
次に、再生される合成翻訳エンハンサーを、どのエンハンサー／遺伝子の組み合わせが最も効率的に機能するかを判断するために、治療用タンパク質または抗体をコードするｍＲＮＡの５’リーダーにおいてテストする。特に効率的な組み合わせが同定され次第、構築物は、大規模な培養条件でテストされ、抗体産生を最大にする必要がある場合にさらに最適化される。
【０２５２】
実施例１０
高収率誘導性タンパク質産生のための操作されたＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞株
スケールアップおよび製造に適した細胞株は、早急な増殖と高度特異的な産生性との組み合わせた能力を有する必要がある。発現ベクターの高発現レベルに起因して、産生細胞は、高レベルの異種タンパク質を発現する時に増殖が困難な場合があり、または異種タンパク質は、長期の増殖期の間に凝集し得る。この困難に遭遇した場合、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞株中の関心遺伝子の誘導性発現を提供するために、オンオフスイッチをドナーベクターに加える。そのようなものとして、要素は、細胞増殖時に導入遺伝子発現をオフにし、細胞が臨界量まで増殖して、タンパク質産生の準備ができている時にのみ発現をオンにするように機能する。これらのスイッチは、条件的に転写を妨害または活性化する適当な受容体システムと相互作用する配位子によって作動される。いくつかの専売スイッチは、遺伝子治療研究のために開発されており、ＡＲＧＥＮＴシステム、ＧＥＮＥ  ＳＷＩＴＣＨシステム、リボスイッチ、亜鉛フィンガータンパク質、エクジソン受容体ベースのシステム等を含むがこれらに限定されない想定された産生システムで使用することができる。さらに、テトラサイクリン誘導性およびガス誘導性のシステムも利用することができる（Ｗｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２，１４４０−４（２００４）；およびＷｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂ  Ｅｎｇ  ７，１７４−８１（２００５））。
【０２５３】
前述は本発明の原則を例証するにすぎない。当業者は、本明細書に明確に説明または示されていないが、本発明の原則を具体化し、その精神と範囲内に含まれる種々の配列を考案することができることを理解されたい。さらに、本明細書に引用されるすべての実施例および条件付き言語は、読者が、本発明の原理および技術を促進するために本発明者らによって寄与された概念を理解するのを助けるためのものであり、かかる具体的に引用された実施例および条件は制限されないものとして解釈される。さらに、本発明の原理、側面、および実施形態を説明する本明細書のすべての言明、ならびにそれらの特定の実施例は、それらの構造上および機能上の均等物の両方を包含することが意図されている。また、そのような均等物は、現在知られている均等物と将来開発される均等物の両方、すなわち、構造に関わらず同じ機能を行う任意の開発された要素を含むことが意図されている。したがって、本発明の範囲は、本明細書に示され、記述された例示的な実施形態に限定されることを意図しない。むしろ本発明の範囲および精神は、添付の請求項によって具体化される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３−１】
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【図３３−２】
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【図３４−１】
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【図３４−２】
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【図３４−３】
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【図３５−１】
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【図３５−２】
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【図３５−３】
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【図３６−１】
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【図３６−２】
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【図３６−３】
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【図３６−４】
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【図３７−１】
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【図３７−２】
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【図３７−３】
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【図３７−４】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年3月11日(2009.3.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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