(57)【要約】  本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び突然変異誘発反応を含む、核酸複製のための組成物、方法及びキットに関する。より高濃度のＤＮＡポリメラーゼを使用することを可能にし、増幅産物のより大きな収量とより迅速な反応速度をもたらす緩衝液組成物が提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸複製のための組成物であって、無機塩と硫酸アンモニウムを含み、無機塩：硫酸アンモニウムモル比が５：１〜２４０：１の範囲内である組成物。
【請求項２】
前記無機塩：硫酸アンモニウムのモル比が５：１〜８０：１の範囲内である請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記無機塩濃度が５０ｍＭ〜１２０ｍＭの範囲内である請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記無機塩濃度が８０ｍＭ〜１００ｍＭの範囲内である請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記硫酸アンモニウム濃度が１ｍＭ〜５ｍＭの範囲内である請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記無機塩濃度が５０ｍＭ〜１２０ｍＭの範囲内であり、かつ前記硫酸アンモニウム濃度が１ｍＭ〜５ｍＭの範囲内である請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
硫酸マグネシウムをさらに含む請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
硫酸マグネシウム濃度が１ｍＭ〜３ｍＭの範囲内である請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記硫酸マグネシウム濃度が２ｍＭである請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
トリス硫酸緩衝液をさらに含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記トリス硫酸濃度が１５ｍＭ〜５０ｍＭの範囲内である請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記トリス硫酸濃度が３０ｍＭである請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記緩衝液のｐＨが８〜１１の範囲内である請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
前記緩衝液のｐＨが１０である請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記緩衝液のｐＨが９である請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記無機塩濃度が５０ｍＭ〜１２０ｍＭの範囲内であり、前記硫酸アンモニウム濃度が１ｍＭ〜５ｍＭの範囲内であり、１ｍＭ〜３ｍＭの範囲内の濃度の硫酸マグネシウムと１５ｍＭ〜５０ｍＭの範囲内の濃度のトリス硫酸緩衝液をさらに含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記無機塩の濃度が５０ｍＭであり、前記硫酸アンモニウムの濃度が１ｍＭであり、ｐＨ１０．０に調整された３０ｍＭトリス硫酸と、２ｍＭ硫酸マグネシウムと、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とをさらに含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記無機塩の濃度が８０ｍＭであり、前記硫酸アンモニウムの濃度が１．５ｍＭであり、ｐＨ１０．０に調整された３０ｍＭトリス硫酸と、２ｍＭ硫酸マグネシウムと、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とをさらに含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記無機塩の濃度が１００ｍＭであり、前記硫酸アンモニウムの濃度が２ｍＭであり、ｐＨ１０．０に調整された３０ｍＭトリス硫酸と、２ｍＭ硫酸マグネシウムと、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とをさらに含む請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
基本的に陰イオンの全てが硫酸イオンである請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
１つ又は複数のヌクレオチドをさらに含む請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
１つ又は複数のＤＮＡポリメラーゼをさらに含む請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ＤＮＡポリメラーゼがエキソ−Ｐｆｕ−Ｓｓｏ７ｄ又はエキソ−Ｐｆｕ  Ｖ９３Ｒ−Ｓｓｏ７ｄである請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ＤＮＡポリメラーゼを１単位／５０μｌより高い濃度で含む請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ＤＮＡポリメラーゼ濃度が少なくとも３単位／５０μｌである請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記ＤＮＡポリメラーゼ濃度が少なくとも４単位／５０μｌである請求項２４に記載の組成物。
【請求項２７】
前記ＤＮＡポリメラーゼ濃度が少なくとも５単位／５０μｌである請求項２４に記載の組成物。
【請求項２８】
前記ＤＮＡポリメラーゼ濃度が少なくとも６単位／５０μｌである請求項２４に記載の組成物。
【請求項２９】
前記ＤＮＡポリメラーゼ濃度が少なくとも１０単位／５０μｌである請求項２４に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ＤＮＡポリメラーゼ濃度が少なくとも２０単位／５０μｌである請求項２４に記載の組成物。
【請求項３１】
前記ＤＮＡポリメラーゼ濃度が３〜２５単位／５０μｌの範囲内である請求項２４に記載の組成物。
【請求項３２】
核酸鋳型をさらに含む請求項１に記載の組成物。
【請求項３３】
プライマーをさらに含む請求項１に記載の組成物。
【請求項３４】
重合促進因子をさらに含む請求項１に記載の組成物。
【請求項３５】
１つ又は複数のヌクレオチドと、１つ又は複数の核酸ポリメラーゼと、核酸鋳型と、プライマーとをさらに含む請求項１に記載の組成物。
【請求項３６】
ＤＮＡポリメラーゼ反応溶液を調製するための緩衝液濃縮物であって、２倍から２０倍の範囲の割合で希釈することにより請求項１に記載の組成物を生じる緩衝液濃縮物。
【請求項３７】
５倍から１０倍の範囲の割合で希釈することにより請求項１に記載の組成物を生じる請求項３６に記載の緩衝液濃縮物。
【請求項３８】
５倍から１０倍の希釈により請求項１６に記載の組成物を生じる請求項３６に記載の緩衝液濃縮物。
【請求項３９】
５倍から１０倍の希釈により請求項１７に記載の組成物を生じる請求項３６に記載の緩衝液濃縮物。
【請求項４０】
５倍から１０倍の希釈により請求項１８に記載の組成物を生じる請求項３６に記載の緩衝液濃縮物。
【請求項４１】
１つ又は複数のヌクレオチドをさらに含む請求項３６に記載の緩衝液濃縮物。
【請求項４２】
１つ又は複数の核酸ポリメラーゼをさらに含む請求項３６に記載の緩衝液濃縮物。
【請求項４３】
前記ＤＮＡポリメラーゼがＰｆｕ−Ｓｓｏ７ｄ又はエキソ−Ｐｆｕ  Ｖ９３Ｒ−Ｓｓｏ７ｄである請求項４２に記載の緩衝液濃縮物。
【請求項４４】
前記ＤＮＡポリメラーゼがパイロコッカスＧＢ−Ｄ−フリオサス−Ｓｓｏ７ｄである請求項４２に記載の緩衝液濃縮物。
【請求項４５】
Ｆｅｎヌクレアーゼをさらに含む請求項３６に記載の緩衝液濃縮物。
【請求項４６】
核酸鋳型をさらに含む請求項３６に記載の緩衝液濃縮物。
【請求項４７】
プライマーをさらに含む請求項３６に記載の緩衝液濃縮物。
【請求項４８】
重合促進因子をさらに含む請求項３６に記載の緩衝液濃縮物。
【請求項４９】
請求項１に記載の組成物を使用してＤＮＡポリメラーゼ反応を実施することを含むＤＮＡを複製する方法。
【請求項５０】
請求項３６に記載の緩衝液濃縮物の希釈物を使用してＤＮＡポリメラーゼ反応を実施することを含む核酸を複製する方法。
【請求項５１】
前記核酸が増幅される請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
ＰＣＲが実施される請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
ＲＴ−ＰＣＲが実施される請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
ＱＰＣＲが実施される請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
突然変異誘発が実施される請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
前記突然変異誘発がランダム突然変異である請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記突然変異誘発が部位指定突然変異である請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記反応における前記ＤＮＡポリメラーゼの濃度が少なくとも２単位／１００μｌである請求項４９に記載の方法。
【請求項５９】
前記反応における前記ＤＮＡポリメラーゼの濃度が少なくとも３単位／１００μｌである請求項４９に記載の方法。
【請求項６０】
前記反応における前記ＤＮＡポリメラーゼの濃度が少なくとも４単位／１００μｌである請求項４９に記載の方法。
【請求項６１】
前記反応における前記ＤＮＡポリメラーゼの濃度が少なくとも５単位／１００μｌである請求項４９に記載の方法。
【請求項６２】
前記反応における前記ＤＮＡポリメラーゼの濃度が少なくとも６単位／１００μｌである請求項４９に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＤＮＡポリメラーゼが熱安定性である請求項４９に記載の方法。
【請求項６４】
前記反応が少なくとも７０℃の温度で実施される請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記反応が少なくとも９０℃の温度で実施される請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＤＮＡポリメラーゼがＰｆｕ又はＴａｑポリメラーゼである請求項４９に記載の方法。
【請求項６７】
請求項４１に記載の緩衝液濃縮物と、そのための包装材料とを含む核酸試料の複製のためのキット。
【請求項６８】
１つ又は複数のヌクレオチド、１つ又は複数の核酸ポリメラーゼ、Ｆｅｎヌクレアーゼ、１又は複数のプライマー、核酸鋳型、又は重合促進因子をさらに含む請求項６７に記載のキット。
【請求項６９】
前記無機塩が、硫酸カリウム、塩化カリウム、硝酸カリウム、塩化セシウム、及び硝酸セシウムからなる群より選択される請求項１に記載の組成物。
【請求項７０】
前記無機塩が硫酸カリウムである請求項６９に記載の組成物。
【請求項７１】
前記無機塩が、硫酸カリウム、塩化カリウム、硝酸カリウム、塩化セシウム、及び硝酸セシウムからなる群より選択される塩の混合物である請求項１に記載の組成物。
【請求項７２】
前記組成物の前記無機塩成分の陽イオン濃度が５０ｍＭ〜１２０ｍＭの範囲内である請求項１に記載の組成物。
【請求項７３】
前記ＤＮＡポリメラーゼがＰｆｕ−Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ−Ｓｓｏ７ｄである請求項２２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２００６年１月６日出願の米国特許仮出願第６０／７５７，１２０号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、核酸配列の複製、増幅又は突然変異誘発のための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの増幅手法の感受性と反応速度は、従来の緩衝液を使用して、ＤＮＡポリメラーゼの濃度を上昇させると反応を促進することができない、又は増幅産物の収率を増加させることができないという事実によって制限される。試料物質が限られている又は標的配列が低いコピー数で存在する状況では、この制限は重大な問題である。特に、増幅がバックグラウンド核酸の存在下で実施され、標的が低レベルで存在し得る、すなわち１コピーの場合さえあり得る診断ＰＣＲ適用においては、より大きな産物収量でより迅速な核酸複製速度を可能にする条件を使用することが有益である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、核酸複製、増幅及び突然変異誘発のための新規組成物及び方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、核酸複製のために有用な組成物を提供する。組成物は、硫酸カリウムなどの無機塩と硫酸アンモニウムを含み、５：１〜２４０：１の無機塩：硫酸アンモニウムモル比を有する。一部の実施形態では、無機塩濃度は５０ｍＭ〜１２０ｍＭの範囲であり、及び硫酸アンモニウム濃度は１〜５ｍＭの範囲である。緩衝液混合物中の無機塩成分の総陽イオン濃度は約５０ｍＭ〜１２０ｍＭの範囲内であることが好ましい。組成物のある実施形態はまた、硫酸マグネシウム、トリス硫酸及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む。一部の実施形態では、組成物は基本的に塩化物及びクエン酸陰イオンを含まない。一部の実施形態では、基本的に組成物中の陰イオンの全てが硫酸イオンである。組成物の一部の実施形態は、１以上のヌクレオチド、１以上の核酸ポリメラーゼ、核酸鋳型又はプライマーのいずれかを含む。
【０００６】
本発明のもう１つの態様は、ＤＮＡポリメラーゼ反応溶液を調製するための緩衝液濃縮物である。２倍から２０倍の範囲の割合での緩衝液濃縮物の希釈は、無機塩（例えば硫酸カリウム）と硫酸アンモニウムを含み、５：１〜２４０：１の無機塩：硫酸アンモニウムモル比を有する溶液を生じる。緩衝液濃縮物の一部の実施形態は、１以上のヌクレオチド、１以上の核酸ポリメラーゼ、核酸鋳型又はプライマーのいずれかを含む。
【０００７】
本発明の付加的な態様では、核酸複製のための組成物又はＤＮＡポリメラーゼ反応溶液を調製するための緩衝液濃縮物はキットの一部である。キットは、場合により１以上のＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、プライマー又は核酸鋳型などの付加的な試薬と共に、組成物又は緩衝液濃縮物及び包装を提供する。
【０００８】
本発明はまた、ＰＣＲを含む、核酸複製反応を実施するための方法を提供する。本方法は、無機塩と硫酸アンモニウムを含み、かつ５：１〜２４０：１の無機塩：硫酸アンモニウムモル比を有する組成物を使用してＤＮＡポリメラーゼ反応を実施することを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、核酸の複製を実施するための新規組成物及び方法を提供する。一定範囲の化学組成を有する組成物は、阻害を伴わずに、使用されるＤＮＡポリメラーゼのはるかに高い濃度を可能にし、はるかに大きな産物収量をもたらす。本発明の組成物はまた、ＰＣＲを含むＤＮＡポリメラーゼ反応における反応時間を短縮するためにも使用できる。
【００１０】
（一般的定義）
本明細書で使用する、「無機塩」という用語は、明確な、しかし一般には固定されない化学組成と規則正しい原子配置を備えた天然に生じる均質な固体の塩を指す。本発明に従った塩として使用できる無機物は元素周期表で金属と分類されるものであり、無機塩は、従って、本発明に従って金属塩（例えば金属元素の塩形態）とも称され得る。無機物の例は、カリウム、セシウム、マグネシウム、カルシウム、ナトリウム、及び当業者に公知であり、一般に元素周期表で金属と分類される他の無機物を含むが、これらに限定されない。「塩」は、生成物が中性であるように陽イオンと陰イオンからなるイオン化合物を指す。本発明において有用な無機塩は、硫酸カリウム、塩化カリウム、硝酸カリウム、塩化マグネシウム、塩化セシウム及び硝酸セシウムを含むが、これらに限定されない。
【００１１】
本明細書で使用する、「ポリヌクレオチド」は、１個のヌクレオチドのペントースの３’位置がホスホジエステル基によって次のペントースの５’位置に連結されているヌクレオチドの共有結合配列（すなわちＲＮＡについてはリボヌクレオチド及びＤＮＡについてはデオキシリボヌクレオチド）を指す。「ポリヌクレオチド」という用語は、限定を伴わずに、一本鎖及び二本鎖ポリヌクレオチドを含む。ここで使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、化学的、酵素的又は代謝的に修飾された形態のポリヌクレオチドを包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、しばしばオリゴヌクレオチドと称される短いポリヌクレオチド（例えばプライマー又はプローブ）を包含する。ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドホスホジエステル結合が置換基モノヌクレオチドのペントース環の５’炭素と３’炭素に起こるので、「５’末端」及び「３’末端」を有する。新たな結合が５’炭素に対してであるポリヌクレオチドの末端は、その５’末端ヌクレオチドである。新たな結合が３’炭素に対してであるポリヌクレオチドの末端は、その３’末端ヌクレオチドである。本明細書で使用する末端ヌクレオチドは、３’又は５’末端の末端位置のヌクレオチドである。本明細書で使用する、「ポリヌクレオチド配列」は、より大きなポリヌクレオチドの内部（例えばポリヌクレオチド内の配列領域）である場合も、やはり５’及び３’末端を有すると称される。
【００１２】
本明細書で使用する、「オリゴヌクレオチド」という用語は、短いポリヌクレオチド、典型的には１５０以下のヌクレオチド長（例えば５〜１５０の範囲内、好ましくは１０〜１００の範囲内、より好ましくは１５〜５０ヌクレオチド長の範囲内）を指す。しかし、ここで使用するこの用語はまた、より長い又はより短いポリヌクレオチド鎖を包含することが意図されている。「オリゴヌクレオチド」は、他のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができ、従ってポリヌクレオチド検出のためのプローブとして又はポリヌクレオチド鎖伸長のためのプライマーとして役立つ。
【００１３】
本明細書で使用する、「相補的」という用語は、２本のポリヌクレオチド鎖の領域の間又は同じポリヌクレオチド鎖の２つの領域の間の配列相補性の概念を指す。第一ポリヌクレオチド領域のアデニン塩基が、第一領域に逆平行である第二ポリヌクレオチド領域の塩基と、その塩基がチミン又はウラシルである場合は、特異的水素結合を形成できる（「塩基対合」）ことは公知である。同様に、第一ポリヌクレオチド鎖のシトシン塩基が、第一鎖に逆平行である第二ポリヌクレオチド鎖の塩基と、その塩基がグアニンである場合は、塩基対合できることは公知である。２つの領域を逆平行に配置したとき、第一領域の少なくとも１つのヌクレオチドが第二領域の塩基と塩基対合できる場合、ポリヌクレオチドの第一領域は同じ又は異なるポリヌクレオチドの第二領域に相補的である。従って、２つの相補的ポリヌクレオチドがあらゆるヌクレオチド位置で塩基対合する必要はない。「相補的」とは、第二ポリヌクレオチドに１００％又は「十分に（ｆｕｌｌｙ）」相補的であり、従ってあらゆるヌクレオチド位置で塩基対を形成する第一ポリヌクレオチドを指す。「相補的」はまた、１００％相補的ではなく（例えば９０％又は８０％又は７０％相補的）、１以上のヌクレオチド位置にミスマッチヌクレオチドを含有する第一ポリヌクレオチドを指す。１つの実施形態では、２つの相補的ポリヌクレオチドは、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で互いにハイブリダイズすることができる。例えば膜ハイブリダイゼーション（例えばノーザンハイブリダイゼーション）に関しては、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、１％ＳＤＳ中６５℃での放射性標識プローブとのインキュベーションと定義される。膜ハイブリダイゼーションのためのストリンジェント洗浄は以下のように実施される。膜を２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中室温で及び０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中６５℃で、各洗浄につき１０分間、洗浄して、フィルムに暴露する。
【００１４】
本明細書で使用する、「ハイブリダイゼーション」又は「結合」という用語は、相補的（部分的に相補的を含む）ポリヌクレオチド鎖の対合に関して使用される。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの強度（すなわちポリヌクレオチド鎖の間の結合の強さ）は、ポリヌクレオチドの間の相補性の程度、塩の濃度などの条件によって影響される、関与する条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）、他の成分の存在（例えばポリエチレングリコールの存在又は不在）、ハイブリダイズする鎖のモル濃度及びポリヌクレオチド鎖のＧ：Ｃ含量を含む、当分野で周知の多くの因子によって影響される。
【００１５】
本明細書で使用するように、１つのポリヌクレオチドがもう１つのポリヌクレオチドに「ハイブリダイズする」と称されるとき、それは、２つのポリヌクレオチドの間にある程度の相補性が存在すること、又は２つのポリヌクレオチドが高ストリンジェンシー条件下でハイブリッドを形成することを意味する。１つのポリヌクレオチドがもう１つのポリヌクレオチドにハイブリダイズしないと称されるとき、それは、２つのポリヌクレオチドの間に配列相補性が存在しないこと、又は高ストリンジェンシー条件下で２つのポリヌクレオチドの間にハイブリッドが形成されないことを意味する。
【００１６】
本明細書で使用する、「鋳型」という用語は、そこから相補的核酸鎖が核酸ポリメラーゼによって合成される核酸分子の鎖を指す。本明細書で使用する、「鋳型依存的に」という用語は、プライマー分子の鋳型依存性伸長を含む過程（たとえばＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成）を指すことが意図されている。「鋳型依存的に」という用語は、新たに合成されるポリヌクレオチドの鎖の配列が相補的塩基対合の周知の規則によって決定される、ＲＮＡ又はＤＮＡのポリヌクレオチド合成を指す（例えばＷａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ．４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．（１９８７）参照）。
【００１７】
本明細書で使用する、「合成」は、鋳型依存的にポリヌクレオチドの新しい鎖を作製する又は既存のポリヌクレオチド（すなわちＤＮＡ又はＲＮＡ）を伸長するためのインビトロ法を指す。合成は、本発明によれば、ポリメラーゼの使用によりポリヌクレオチド鋳型配列のコピー数を増加させる増幅を含む。ポリヌクレオチド合成（例えば増幅）は、ポリヌクレオチド（すなわちプライマー）へのヌクレオチドの結合を生じさせ、それによってポリヌクレオチド鋳型に相補的な新しいポリヌクレオチド分子を形成する。形成されるポリヌクレオチド分子及びその鋳型は、さらなるポリヌクレオチド分子を合成するための鋳型として使用され得る。
【００１８】
本明細書で使用する、「核酸ポリメラーゼ」は、ヌクレオチドの重合を触媒する酵素を指す。一般に、酵素は、核酸鋳型配列にアニーリングするプライマーの３’末端で合成を開始させ、鋳型鎖の５’末端方向へと進行する。「ＤＮＡポリメラーゼ」はデオキシヌクレオチドの重合を触媒する。公知のＤＮＡポリメラーゼは、例えばパイロコッカス・フリオサス（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｎｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｇｅｎｅ，１０８：１）、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｌｅｃｏｍｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｕｂｌｅｄａｙ，１９８３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：７５０５）、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：３１１２）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｇｅｌｆａｎｄ  １９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：７６６１）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｅｎｅｓｈ  ａｎｄ  ＭｃＧｏｗａｎ，１９７７，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ４７５：３２）、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）  （Ｔｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼとも称される、Ｃａｒｉｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１９：４１９３）、９°Ｎｍ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓからの中止された製品）、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄｉａｚ  ａｎｄ  Ｓａｂｉｎｏ，１９９８  Ｂｒａｚ  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ，３１：１２３９）、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｈｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７６，Ｊ．Ｂａｃｔｅｏｒｉｏｌ，１２７：１５５０）、パイロコッカス・コダカラエンシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：４５０４）、ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼ（特許出願第ＷＯ０１３２８８７号）、  及びパイロコッカスＧＢ−Ｄ（ＰＧＢ−Ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｊｕｎｃｏｓａ−Ｇｉｎｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１６：８２０）を含む。本発明に従ったポリメラーゼは、キメラポリメラーゼ又は突然変異型ポリメラーゼであり得る。本発明に従ったキメラポリメラーゼの一例は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００４／０２１４１９４号に述べられているＰｆｕとＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔポリメラーゼの間のキメラである。キメラＤＮＡポリメラーゼの付加的な例は、キメラポリメラーゼと融合ポリメラーゼ（融合は以下でさらに説明する）の組合せを含み得る。例えばＰｆｕとＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔの間のキメラはまた、配列非特異的ＤＮＡ結合タンパク質である、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕ���ｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｕｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）からのＳｓｏ７ｄ又はＳａｃ７ｄへの１つ又は両方のポリメラーゼの融合物を含み得る。そのような融合物は、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開広報第ＷＯ０１／９２５０１号に述べられている。
【００１９】
上記酵素のいずれかのポリメラーゼ活性は、当分野で公知の方法によって測定できる。例えばＨｏｇｒｅｆｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｖｏｌ．３３４，ｐｐ．９１−１１６（２００１））のヌクレオチド組込みアッセイが使用できる。簡単に述べると、ポリメラーゼ活性を活性化サケ精子ＤＮＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉａより購入した；活性化プロトコールについては、Ｃ．Ｃ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｐｒｏｃｅｅｄｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．（Ｃａｎｔｏｎｉ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｅｓ，ｅｄｓ．），ｐ．２６３−２７６（１９６６）ａｔ  ｐ．２６４参照）への３２Ｐ−ｄＣＴＰの組込みの割合として測定することができる。反応緩衝液は、例えば５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、５０μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び４％（ｖ／ｖ）グリセロールであり得る。ヌクレオチド基質とＤＮＡを大きく過剰で、典型的には検定するポリメラーゼについてのＫｍの少なくとも１０倍で、例えばｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＧＴＰの各々２００μＭ、ｄＣＴＰ１９５μＭプラス標識ｄＣＴＰ  ５μＭ、及び活性化ＤＮＡ２５０μｇ／ｍｌで使用する。反応を氷上でクエンチし、反応混合物のアリコートをイオン交換フィルター（例えばＷｈａｔｍａｎ  ＤＥ８１）にスポットする。組み込まれなかったヌクレオチドを洗い流し、次いで組み込まれた放射能を測定するためにシンチレーション計数する。
【００２０】
ＤＮＡポリメラーゼ活性１単位は、本発明によれば、最適温度（例えばＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼについては７２℃）で３０分間に全ｄＮＴＰ  １０ｎｍｏｌｅの重合形態への組込みを触媒する酵素の量と定義される。
【００２１】
本明細書で定義する「ＤＮＡポリメラーゼ融合物」は、ＤＮＡポリメラーゼの１以上の活性を調節するポリペプチドを定義する第二アミノ酸配列に連結された、野生型又は突然変異型ＤＮＡポリメラーゼを含む第一アミノ酸配列（タンパク質）であり、前記ＤＮＡポリメラーゼ活性は、プロセッシビティー（合成持続性）、塩耐性、ＤＮＡ結合、鎖置換活性、ポリメラーゼ活性、ヌクレオチド結合及び認識、３’〜５’又は５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性、プルーフリーディング、忠実度及び／又は室温でのＤＮＡ重合低下を含むが、これらに限定されず、第一アミノ酸配列と第二アミノ酸配列は、天然では同じ関係で認められない。本発明に従った「融合物」は、新たな機能性タンパク質を形成するように連結された、無関係なタンパク質からの２以上のアミノ酸配列（例えば野生型又は突然変異型ＤＮＡポリメラーゼとプロセッシビティー及び／又は塩耐性を上昇させるポリペプチドをコードする配列）を含む。本発明に従った融合物において使用される供給源配列は、天然ポリペプチド配列、天然ポリペプチド配列の一部、又は天然ポリペプチド配列の全部又は一部の突然変異体であり得る。本発明に従った融合物は、第一ポリメラーゼ種からの第一アミノ酸配列（例えばＰｆｕ  Ｎ末端）及び第二ポリメラーゼ種からの第二アミノ酸配列（例えばＫＯＤ  Ｃ末端）を含み得る。本発明の融合物は、第一ポリメラーゼに由来する第一アミノ酸配列及びポリメラーゼではないポリペプチドに由来する第二アミノ酸配列を含み得る。ポリメラーゼではないポリペプチドに由来するアミノ酸配列は、酵素活性を欠如し得る。ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡトポイソメラーゼＶからのへリックス−ヘアピン−へリックスＤＮＡ結合モチーフにインフレームで融合され、高いプロセッシビティー、塩耐性及び熱安定性を有することが認められた（Ｐａｖｌｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９９：１３５１０−１３５１５）。Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼへのチオレドキシン結合ドメインの融合は、国際公開広報第ＷＯ９７／２９２０９号、米国特許第５，９７２，６０３号及びＢｅｄｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：４７９−４８４（１９９７）に述べられているように、チオレドキシンの存在下でＤＮＡポリメラーゼ融合物のプロセッシビティーを増強する。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼへの古細菌ＰＣＮＡ結合ドメインの融合は、ＰＣＮＡの存在下で高いプロセッシビティーを有するＤＮＡポリメラーゼ融合物を生じさせ、より高い収量のＰＣＲ増幅ＤＮＡを生産する（Ｍｏｔｚ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２  Ｍａｙ  ３；２７７（１８）；１６１７９−８８）。また、Ｐｆｕ又はＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼへの、配列非特異的ＤＮＡ結合タンパク質であるスルホロブス・ソルファタリカスからのＳｓｏ７ｄ又はＳａｃ７ｄの融合は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開広報第ＷＯ０１／９２５０１  Ａｌに開示されているように、これらのＤＮＡポリメラーゼのプロセッシビティーを大きく上昇させることが示された。Ｓｓｏ７ｄ又はＳａｃ７ｄなどのＤＮＡ結合タンパク質の全部又は一部を含む融合物は、本発明に関する使用のために好ましい。天然Ｓｓｏ７ｄ又はＳａｃ７ｄ配列又はその一部と９０％未満の配列同一性を有するＳｓｏ７ｄ又はＳａｃ７ｄのいずれかの突然変異体は特に好ましい。ＤＮＡポリメラーゼの全部又は一部の、異なるＤＮＡポリメラーゼの対応ドメインによるドメイン置換も記述されている（米国特許出願第２００２／０１１９４６１号）。ＤＮＡポリメラーゼを作製し、使用することのさらなる詳細は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５／００４８５３０号に認められる。
【００２２】
ＰＣＲ促進因子はまた、増幅の効率を改善するためにも使用し得る。本明細書で使用する、「ＰＣＲ促進因子」又は「ポリメラーゼ促進因子」（ＰＥＦ）は、ポリヌクレオチドポリメラーゼ促進活性を有する複合体又はタンパク質を指す（どちらも参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｏｇｒｅｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  １０：９３−９６；及び米国特許第６，１８３，９９７号）。Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼに関して、ＰＥＦは、天然形態（Ｐ５０とＰ４５の複合体として）又は組換えタンパク質としてのＰ４５を含む。Ｐｆｕ  Ｐ５０とＰ４５の天然複合体では、Ｐ４５だけがＰＣＲ促進活性を示す。Ｐ５０タンパク質は、構造に関して細菌フラボタンパク質に類似する。Ｐ４５タンパク質は、構造的にｄＣＴＰデアミナーゼ及びｄＵＴＰアーゼに類似するが、ｄＵＴＰをｄＵＭＰとピロリン酸に変換するｄＵＴＰアーゼとしてのみ機能する。ＰＥＦはまた、本発明によれば、以下からなる群より選択され得る。古細菌供給源（例えばパイロコッカス・フリオサス）から得られる単離又は精製された天然に生じるポリメラーゼ促進タンパク質；Ｐｆｕ  Ｐ４５と同じアミノ酸配列を有する完全又は部分的合成タンパク質、又はポリメラーゼ促進活性を有するその類似体；前記の天然に生じるあるいは完全又は部分的合成タンパク質の１以上のポリメラーゼ促進混合物；前記の天然に生じるあるいは完全又は部分的合成タンパク質の１以上のポリメラーゼ促進タンパク質複合体；又は前記の天然に生じるタンパク質の１以上を含有するポリメラーゼ促進性部分精製細胞抽出物（米国特許第６，１８３，９９７号、前出）。ＰＥＦのＰＣＲ促進活性は当分野で周知の手段によって定義される。ＰＥＦについての単位定義はＰＥＦ（Ｐ４５）のｄＵＴＰアーゼ活性に基づき、これは、ｄＵＴＰからのピロリン酸（ＰＰｉ）の生産を観測することによって測定される。例えばＰＥＦを、ＰＥＦがｄＵＴＰをｄＵＭＰとＰＰｉに加水分解する間、ｄＵＴＰ（１×クローン化Ｐｆｕ  ＰＣＲ緩衝液中１０ｍＭ  ｄＵＴＰ）と共にインキュベートする。形成されるＰＰｉの量を、Ｓｉｇｍａから市販されている共役酵素アッセイシステム（Ｎｏ．Ｐ７２７５）を使用して定量する。活性１単位は、１時間当たりに形成される（８５℃で）ＰＰｉ  ４．０ｎｍｏｌｅと機能的に定義される。ＤＭＳＯも、本発明に従ったポリメラーゼ反応混合物に添加することができる；ＤＭＳＯは、特にＧ−Ｃに富む鋳型に関して、ポリメラーゼ活性を促進し得る。
【００２３】
本明細書で使用する、「５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性」又は「５’→３’エキソヌクレアーゼ活性」は、鋳型特異的核酸ポリメラーゼの活性、例えばモノヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドをポリヌクレオチドの５’末端から連続的に除去するか（すなわち大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩはこの活性を有するが、クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９７０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６５：１６８）フラグメントはこの活性を有さない（Ｋｌｅｎｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９７１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２：３７１））、又は５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性に固有に存在し得るエンドヌクレアーゼ分解活性によってポリヌクレオチドを５’末端から除去する、伝統的に一部のＤＮＡポリメラーゼに関連する５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を指す。
【００２４】
ＦＥＮ−１は、５’一本鎖フラップ鎖の骨格を特異的に認識し、二重鎖ＤＮＡの２本の鎖が一本鎖の腕と隣接する接合部に位置する切断部位へと誘導する約４０ｋＤａの二価金属イオン依存性エキソ及びエンドヌクレアーゼである。エンド及びエキソヌクレアーゼ分解活性の両方が、フラップ又はニックの最も５’側の位置の塩基に対してほとんど感受性を示さない。ＦＥＮ−１エンド及びエキソヌクレアーゼ分解性基質結合及び切断は上流のオリゴヌクレオチド（フラップ隣接鎖又はプライマー）によって刺激される。これはまた、大腸菌ポルＩ型の場合にも当てはまる。酵素のエンドヌクレアーゼ活性は５’フラップの長さに依存せず、１ヌクレオチドの小さな５’フラップも切断する。エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼ活性は基質の化学的性質に対して非感受性であり、ＤＮＡとＲＮＡの両方を切断する。
【００２５】
本発明において有用なＦＥＮ−１酵素をコードするｆｅｎ−１遺伝子は、マウスｆｅｎ−１、ヒトｆｅｎ−１、ラットｆｅｎ−１、キセノパス・ラエビス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）ｆｅｎ−１、及び４つの古細菌、アーケオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、メタノコッカス・ヤナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、パイロコッカス・フリオサス及びパイロコッカス・ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）に由来するｆｅｎ−１遺伝子を含む。ＦＥＮ−１酵素をコードするｃＤＮＡクローンは、ヒト（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ．ｓｕｂ．−−００４１１１及びＬ３７３７４）、マウス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｌ２６３２０）、ラット（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＡ８１９７９３）、キセノパス・ラエビス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｕ６８１４１及びＵ６４５６３）、及びＰ．フリオサス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ０１３４９７）から単離された。Ｐ．ホリコシフラップエンドヌクレアーゼについての完全なヌクレオチド配列も決定されている（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＢ００５２１５）。ＦＥＮ−１ファミリーはまた、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＲＡＤ２７遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｚ２８１１３  Ｙ１３１３７）及びサッカロミセス・ポンベ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）ＲＡＤ２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｘ７７０４１）を含む。メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｌｕｍ）の古細菌ゲノムも配列決定された。ＦＥＮ−１と原核生物及びウイルス５’〜３’エキソヌクレアーゼの間の配列類似性は低いが、真核生物界の中でのＦＥＮ−１はアミノ酸レベルで高度に保存され、ヒトとＳ．セレビシエタンパク質は６０％同一であり、７８％類似する。３つの古細菌ＦＥＮ−１タンパク質も、真核生物ＦＥＮ−１酵素に高度に相同である（Ｍａｔｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：１８２９７，Ｈｏｓｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８ｂ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：２７１５４及びＬｉｅｂｅｒ，１９９７，ＢｉｏＥｓｓａｙｓ，１９：２３３）。
【００２６】
本発明に従ったＦＥＮヌクレアーゼは、好ましくは熱安定性である。熱安定性ＦＥＮヌクレアーゼは、４つの古細菌を含む様々な熱安定性生物から単離され、特徴付けされた。Ｐ．フリオサスフラップエンドヌクレアーゼについてのｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ０１３４９７）及びアミノ酸配列（Ｈｏｓｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８ａ，前出及びＨｏｓｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８ｂ）が決定されている。Ｐ．ホリコシフラップエンドヌクレアーゼについての完全なヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＢ００５２１５）及びアミノ酸配列（Ｍａｔｓｕｉ  ｅｔａｌ．，前出）も決定された。Ｍ．ヤナシ（Ｈｏｓｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８ｂ及びＭａｔｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９、前出）及びＡ．フルギダス（Ｈｏｓｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８ｂ）フラップエンドヌクレアーゼについてのアミノ酸配列も決定された。
【００２７】
本明細書で使用する、「プライマー」は、上記で定義した「オリゴヌクレオチド」の長さ制限を有する又は含有する、及び標的ポリヌクレオチドに相補的な配列を有する又は含有する、ヌクレオチドをオリゴヌクレオチドプライマーに組み込む伸長（延長）反応を開始させるために塩基対合を通して標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドの１つの種類を指す。開始及び伸長のための条件は、適切な緩衝液中（「緩衝液」は、補因子であるか又はｐＨ、イオン強度等に影響を及ぼす置換基を含む）及び適切な温度で、４つの異なるデオキシリボヌクレオシド三リン酸及びＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素などの重合誘導剤の存在を含む。プライマーは、好ましくは増幅における最大効率のために一本鎖である。本発明において有用な「プライマー」は、一般に約１０〜１００ヌクレオチド長の範囲内、好ましくは約１７〜５０ヌクレオチド長の範囲内、最も好ましくは約１７〜４５ヌクレオチド長の範囲内である。「増幅プライマー」は、プライマー伸長による標的配列の増幅のためのプライマーである。増幅反応を駆動するために特別な配列又は構造は必要ないので、ＰＣＲのための増幅プライマーは標的結合配列だけからなり得る。「プライマー領域」は、ヌクレオチドをオリゴヌクレオチドプライマーに組み込む伸長反応を開始させるために塩基対合を通して標的核酸にハイブリダイズする「オリゴヌクレオチドプローブ」又は「架橋オリゴヌクレオチドプローブ」上の領域である。
【００２８】
「プライマー伸長反応」又は「プライマー伸長を合成すること」は、組み込まれたヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドの対応するヌクレオチドに相補的であるようにプライマーの３’末端へのヌクレオチドの付加を生じさせる、標的プライマーハイブリッドとヌクレオチドの間の反応を意味する。プライマー伸長試薬は、典型的には（ｉ）ポリメラーゼ酵素；（ｉｉ）緩衝液；及び（ｉｉｉ）１以上の伸長可能なヌクレオチドを含む。
【００２９】
本明細書で使用する、「ポリメラーゼ連鎖反応」又は「ＰＣＲ」は、特定ポリヌクレオチド鋳型配列を増幅するためのインビトロ法を指す。ＰＣＲ反応は、反復される一連の温度サイクルを含み、典型的には５０〜１００μｌの容量で実施される。反応混合物は、ｄＮＴＰ（４つのデオキシヌクレオチド、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの各々）、プライマー、緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼ及びポリヌクレオチド鋳型を含む。１つのＰＣＲ反応は、ポリヌクレオチド分子の変性と合成の５〜１００「サイクル」からなり得る。ＰＣＲ過程は、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，６８３，１９５号及び同第４，６８３，２０２号に述べられている。
【００３０】
本明細書で使用する、「標的核酸」は、増幅領域を含有する核酸を指す。本明細書で使用する、「増幅領域」は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって合成又は増幅される核酸の領域である。例えば核酸鋳型の増幅領域は、２つのＰＣＲプライマーがそれに対して相補的である２つの配列の間に存する。
【００３１】
本明細書で使用する、「増幅産物」は、ＰＣＲ増幅反応終了時の二本鎖ポリヌクレオチド集団を指す。増幅産物は、もとのポリヌクレオチド鋳型及びＰＣＲ反応の間にポリヌクレオチド鋳型を使用してＤＮＡポリメラーゼによって合成されるポリヌクレオチドを含有する。
【００３２】
「野生型」という用語は、天然に生じる供給源から単離されたとき、その遺伝子又は遺伝子産物の特徴を有する遺伝子又は遺伝子産物を指す。これに対し、「修飾」又は「突然変異型」という用語は、野生型遺伝子又は遺伝子産物と比較したとき変化した特徴を示す遺伝子又は遺伝子産物を指す。例えば本発明における突然変異型ＤＮＡポリメラーゼは、低いウラシル検出活性を示すＤＮＡポリメラーゼである。
【００３３】
本明細書で使用する、「試料」という用語は、その天然環境から単離された、ポリヌクレオチドを含有する生物学的物質を指す。本発明に従った「試料」は、精製又は単離されたポリヌクレオチドからなり得るか、又は組織試料、生体液試料又はポリヌクレオチドを含む細胞試料などの生物学的試料を含み得る。生体液は、血液、血漿、痰、尿、脳脊髄液、洗浄液及び白血球泳動法試料を含む。本発明の試料は、標的ポリヌクレオチドを含有する植物、動物、細菌又はウイルス材料であり得る。本発明の有用な試料は、例えば種々の個体、同じか又は異なる個体の種々の発生段階、種々の疾患個体、正常個体、同じか又は異なる個体の種々の病気、種々の疾患治療に供された個体、種々の環境因子に供された個体、疾病に対する素因を有する個体、感染症（例えばＨＩＶ）に暴露された個体を含むが、これらに限定されない、種々の供給源から入手し得る。有用な試料はまた、インビトロで培養された組織、細胞、又は他のポリヌクレオチド含有供給源から入手し得る。培養試料は、種々の培地及び条件（例えばｐＨ、圧又は温度）で培養された培養物（例えば組織又は細胞）、種々の長さの期間培養された培養物（例えば組織又は細胞）、種々の因子又は試薬（例えば薬剤候補物質又は調節剤）で処理された培養物（例えば組織又は細胞）、又は種々の型の組織又は細胞の培養物を含むが、これらに限定されない供給源から採取し得る。
【００３４】
本明細書で使用する、試料から「単離された」ポリヌクレオチドは、その正常細胞（例えば染色体）環境から取り出されたその試料中の天然に生じるポリヌクレオチド配列である。従って、「単離された」ポリヌクレオチドは、無細胞溶液中に存在し得るか又は異なる細胞環境に置かれ得る。
【００３５】
本明細書で使用する「量」という用語は、例えばμｇ、μｍｏｌ又はコピー数で測定される試料中の標的ポリヌクレオチドの量を指す。本発明におけるポリヌクレオチドの存在率は、そのようなポリヌクレオチドによって放出される蛍光強度によって測定され、標準ポリヌクレオチド、すなわち公知量を有するポリヌクレオチドによって放出される蛍光強度と比較される。
【００３６】
（核酸複製のための組成物及びそれらの使用）
ＰＣＲなどの核酸複製のための従来の反応緩衝液は、トリス又はトリシンなどの緩衝液を含有し、通常７．５〜９．５のｐＨ範囲を有する。従来の緩衝液は、１〜１０ｍＭの範囲内のＭｇ２＋（例えばＭｇＣｌ２又はＭｇＳＯ４）をさらに含有し、しばしば約２０ｍＭまでの濃度のＫＣｌも含有する。さらに、１％までの濃度の１以上の非イオン界面活性剤（例えばＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０又はＮＰ４０）を含んでもよく、また時として１〜１００μｇ／ｍｌの範囲内のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む。
【００３７】
本発明によると、反応物中のＤＮＡポリメラーゼ濃度を生産的に上昇させることを可能にする、新しい緩衝液製剤を使用すれば、産物の収量を増大させ、反応速度をより迅速にすることができる。非常に高い量のＤＮＡポリメラーゼを使用できることは、複製反応からのＤＮＡ産物収量の劇的な増加及び／又は通常の反応緩衝液を用いてより少量のＤＮＡポリメラーゼによって達成され得るよりも迅速な反応時間を可能にする。
【００３８】
本発明によれば、ＤＮＡポリメラーゼ反応のために使用される緩衝液は、５：１〜２４０：１の範囲内の無機塩対硫酸アンモニウムのモル比で、無機塩（例えば硫酸カリウム（Ｋ２ＳＯ４））及び硫酸アンモニウム（ＮＨ４ＳＯ４）の両方を含有する。無機塩対硫酸アンモニウムのモル比はまた、例えば５：１〜８０：１、５：１〜５０：１、５：１〜４５：１又は１０：１〜４０：１であり得る。塩対硫酸アンモニウムのモル比はまた、約１０：１、約１５：１、約２０：１、約２５：１、約３０：１、約３５：１、約４０：１、約４５：１、約５０：１、約６０：１、約６５：１、約７０：１、約７５：１又は約２４０：１であり得る。無機塩の濃度は、５０ｍＭ〜１２０ｍＭの範囲内であり得、好ましくは８０ｍＭ〜１００ｍＭの範囲内である。硫酸アンモニウム濃度は、１ｍＭ〜５ｍＭの範囲内であり得る。前記のいずれかの実施形態では、無機塩成分中の総陽イオン濃度は５０〜１２０ｍＭの範囲内であることが好ましい。
【００３９】
本発明に従った緩衝液は、１〜１０ｍＭの範囲内、例えば２ｍＭの濃度のＭｇ２＋を、好ましくはＭｇＳＯ４の形態で含有し得る。緩衝液は、トリス又はトリシンなどのｐＨ緩衝剤を、好ましくはＳＯ４２−を対イオンとして使用して、好ましくは３０ｍＭなどの１５〜５０ｍＭの範囲内の濃度で、及び好ましくはｐＨ１０又はｐＨ９などの８〜１１の範囲内のｐＨで含有し得る。緩衝液はまた、０．１％などの０．０１〜１．０％の範囲内の濃度で、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００などの界面活性剤を含有し得る。
【００４０】
本発明の緩衝液組成物の例は、５０ｍＭ無機塩、１ｍＭ硫酸アンモニウム、ｐＨ１０．０に調整された３０ｍＭ（トリス硫酸＋トリス塩基）、２ｍＭ硫酸マグネシウム及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する溶液を含む。もう１つの例は、８０ｍＭ無機塩、１．５ｍＭ硫酸アンモニウム、ｐＨ１０．０に調整された３０ｍＭ（トリス硫酸＋トリス塩基）、２ｍＭ硫酸マグネシウム及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む溶液である。さらにもう１つの例は、１００ｍＭ無機塩、２ｍＭ硫酸アンモニウム、ｐＨ１０．０に調整された３０ｍＭ（トリス硫酸＋トリス塩基）、２ｍＭ硫酸マグネシウム及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む溶液である。
【００４１】
本発明の緩衝液組成物は、ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素と共に使用できる。好ましくは、それらはＤＮＡポリメラーゼ融合物と共に使用される。例えばＤＮＡポリメラーゼ融合物は、Ｐｆｕ−Ｓｓｏ７ｄ融合物（野生型Ｓｓｏ７ｄに９０％未満のアミノ酸配列同一性を有するＳｓｏ７ｄの突然変異型が好ましい）、例えば、３’〜５’エキソヌクレアーゼを欠き、ウラシル非感受性であるエキソ−Ｐｆｕ  Ｖ９３Ｒ−Ｓｓｏ７ｄであり得る。本発明の緩衝液組成物との使用に適するＤＮＡポリメラーゼ融合物のさらなる例については、米国特許出願公開第２００５／００４８５３０号参照。本発明の緩衝液組成物はまた、ポリメラーゼ促進因子、Ｆｅｎヌクレアーゼ又はＤＭＳＯを含有し得る。
【００４２】
本発明に従った緩衝液組成物は、従来よりも高い濃度のＤＮＡポリメラーゼと共に使用できる。例えば従来のＰＣＲ反応は、反応物５０μｌ当たり１単位までのＤＮＡポリメラーゼ融合物、又は反応物５０μｌ当たり５単位までの非融合ＤＮＡポリメラーゼを使用できる；より高濃度のポリメラーゼは、従来の緩衝液と共に使用した場合、産物収量又は反応速度を上昇させない。しかし、本発明の緩衝液組成物と共に使用すれば、産物収量の対応する増加を伴って、ポリメラーゼ濃度を２倍から２５倍に、例えば３倍、４倍、５倍、６倍又は８倍に、生産的に上昇させることができる。例えばここで述べる緩衝液組成物と共に使用するとき、１５０単位までのポリメラーゼ濃度が使用できる。好ましくは、ポリメラーゼ濃度は５０〜１００単位の範囲内であるが、５０〜１５０単位であり得る。反応速度も、同じ範囲の高いポリメラーゼ濃度によってより迅速にすることができる。逆転写酵素は、ＤＮＡポリメラーゼの場合と同様の濃度範囲内で本発明に従った緩衝液組成物と組み合わせて使用できる。
【００４３】
本発明に従った緩衝液組成物は、ＤＮＡポリメラーゼ反応プロトコールにおいて、例えばＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ及びＱＰＣＲを含む）又は部位指定突然変異誘発のために、反応条件に他の変化を施すことなく使用できる。そのような方法のための反応時間と温度、熱サイクリングプロトコール、プライマーの配列と濃度、ヌクレオチド混合物及び濃度、ハイブリダイゼーションプローブ、及び染料は、一般に変化を加えずに本発明の緩衝液組成物と共に使用できる。本発明の緩衝液組成物又はその濃縮形態は、１以上のヌクレオチド、核酸ポリメラーゼ、プライマー、核酸鋳型、染料、ハイブリダイゼーションプローブ又は重合促進因子を含み得る。
【００４４】
硫酸イオンは、本発明の緩衝液組成物における陰イオン種として好ましい。塩化物又はクエン酸塩による硫酸塩の置換は、例えば硫酸塩に対する多少の量の阻害を生じさせる。一部の実施形態では、本発明の緩衝液組成物は、基本的に塩化物イオン及びクエン酸イオンを含まない；他の実施形態では、塩化物及びクエン酸イオンの濃度は最小限に、例えば５ｍＭ未満又は１ｍＭ未満に保持される。ある実施形態では、緩衝液組成物中の基本的に全ての陰イオン（核酸、ヌクレオチド基質、染料、酵素、タンパク質、界面活性剤等を除く）が硫酸イオンである。
【００４５】
本発明の緩衝液組成物は、核酸複製反応の分野における一般慣例であるように、酵素及び基質を含む、他の試薬の添加に適合するために濃縮保存溶液として調製され得る。緩衝液組成物は、全ての成分が所望最終濃度よりも２倍から２０倍高い濃度で、例えば５倍高い又は１０倍高い濃度で存在する濃縮物として調製できる。
【００４６】
本発明の緩衝液濃縮物の例は、２５０ｍＭ無機塩、５ｍＭ硫酸アンモニウム、ｐＨ１０．０に調整された１５０ｍＭ（トリス硫酸＋トリス塩基）、１０ｍＭ硫酸マグネシウム及び０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む溶液を含む。もう１つの例は、４５０ｍＭ無機塩、１０ｍＭ硫酸アンモニウム、ｐＨ１０．０に調整された１５０ｍＭ（トリス硫酸＋トリス塩基）、１０ｍＭ硫酸マグネシウム及び０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む溶液である。さらにもう１つの例は、５００ｍＭ無機塩、１０ｍＭ硫酸アンモニウム、ｐＨ１０．０に調整された１５０ｍＭ（トリス硫酸＋トリス塩基）、１０ｍＭ硫酸マグネシウム及び０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む溶液である。
【００４７】
本発明は、核酸複製反応を実施する方法を提供する。この方法は、産物の収量又は反応速度を上昇させるために、核酸増幅、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＱＰＣＲ、ランダム突然変異誘発及び部位指定突然変異誘発を含む、ＤＮＡポリメラーゼを使用する核酸複製反応に適用できる。そのような反応は、本発明の緩衝液組成物を使用して、例えば反応溶液を調製するために本発明の緩衝液濃縮物を使用することによって実施される。
【００４８】
本発明の緩衝液組成物と共に使用できるより高濃度のＤＮＡポリメラーゼは、より迅速な反応速度を可能にする。従って本発明の方法は、一般にこれまでの方法と比較して反応時間の短縮を可能にする。例えば本発明の緩衝液組成物を使用してＰＣＲを実施するとき、各々のサイクルの伸長期が短縮され得るので、サイクル時間を短縮することができる。
【００４９】
（無機塩）
本発明において有用な無機塩は、明確な、しかし一般には固定されない化学組成と規則正しい原子配置を備え、一般に地質学的過程によって生産される、天然に生じる無機の均質な固体の塩を含む。本発明において有用な典型的金属塩は、周期表からの金属元素の塩を含む。本発明に従って塩形態で使用できる無機物又は金属の例は、カリウム、セシウム、マグネシウム、ナトリウム及びカルシウムを含むが、これらに限定されない。好ましくは、無機塩はカリウム又はセシウムの塩であるが、リチウム、アルミニウム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、亜鉛等の塩を含み得る。無機塩はまた、当業者に公知の金属元素の重炭酸塩、硫酸塩、塩化物、炭酸塩、硝酸塩、亜硝酸塩、臭化物、クエン酸塩、酢酸塩、シアン化物、酸化物又はリン酸塩を含み得る。より好ましくは、無機塩は、塩化カリウム（ＫＣｌ）、硫酸カリウム（Ｋ２ＳＯ４）、硝酸カリウム（ＫＮＯ３）、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）又は硝酸セシウム（ＣｓＮＯ３）である。加えて、本発明において有用な無機塩は、無機塩の混合物又はブレンドを含み得る。本発明において使用できる無機塩のブレンドは、ＫＣｌとＫ２ＳＯ４、ＫＣｌとＫＮＯ３、ＫＣｌとＣｓＣｌ、ＫＣｌとＣｓＮＯ３、Ｋ２ＳＯ４とＫＮＯ３、Ｋ２ＳＯ４とＣｓＣｌ、Ｋ２ＳＯ４とＣｓＮＯ３、ＫＮＯ３とＣｓＣｌ、ＫＮＯ３とＣｓＮＯ３、及びＣｓＣｌとＣｓＮＯ３を含む。前記無機塩は、５０〜１２０ｍＭの範囲内、好ましくは８０〜１００ｍＭの範囲内の濃度で本発明に従って使用し得る。
【００５０】
ここで述べる反応緩衝液において使用される特定無機塩種にかかわりなく、無機塩成分中の総陽イオン濃度は、約５０〜１２０ｍＭの範囲内、好ましくは５０〜１２０ｍＭの範囲内、より好ましくは８０〜１００ｍＭの範囲内であることが好ましい。
【００５１】
（ポリメラーゼ）
本発明において使用される核酸ポリメラーゼは、中温性又は好熱性であり得、好ましくは好熱性である。好ましい中温性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウフラグメントＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ等を含む。本発明の方法において使用し得る好ましい熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｐｆｕ、Ｔｆｌ、Ｔｔｈ、Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメント、ＶＥＮＴ（商標）及びＤＥＥＰＶＥＮＴ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、及びそれらの突然変異体、変異体及び誘導体を含む（米国特許第５，４３６，１４９号；米国特許第４，８８９，８１８号；米国特許第４，９６５，１８Ｓ号；米国特許第５，０７９，３５２号；米国特許第５，６１４，３６５号；米国特許第５，３７４，５５３号；米国特許第５，２７０，１７９号；米国特許第５，０４７，３４２号；米国特許第５，５１２，４６２号；国際公開広報第ＷＯ９２／０６１８８号；国際公開広報第ＷＯ９２／０６２００号；国際公開広報第ＷＯ９６／１０６４０号；Ｂａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｍ．，Ｇｅｎｅ  １１２：２９−３５（１９９２）；Ｌａｗｙｅｒ，Ｆ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈ．Ａｐｐｌ．２：２７５−２８７（１９９３）；Ｆｌａｍａｎ，Ｊ．−Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２（１５）：３２５９−３２６０（１９９４））。長い核酸分子（例えば約３〜５Ｋｂ長より長い核酸分子）の増幅のためには、少なくとも２つのＤＮＡポリメラーゼが典型的に使用され、一方は３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠き、他方は３’エキソヌクレアーゼ活性を有する。それらの開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４３６，１４９号；米国特許第５，５１２，４６２号；Ｆａｍｅｓ，Ｗ．Ｍ．，Ｇｅｎｅ  １１２：２９−３５（１９９２）；及び２０００年１２月２１日出願の同時係属中の米国特許出願第０９／７４１，６６４号参照。３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠くＤＮＡポリメラーゼの例は、Ｔａｑ、Ｔｎｅ（エキソ−）、Ｔｍａ（エキソ−）、Ｐｆｕ（エキソ−）、Ｐｗｏ（エキソ−）及びＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、及びそれらの突然変異体、変異体及び誘導体を含む。本発明において有用なＤＮＡポリメラーゼはまた、キメラポリメラーゼ又は突然変異型ポリメラーゼを含む。本発明に従ったキメラポリメラーゼの一例は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００４／０２１４１９４号に述べられているＰｆｕとＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔポリメラーゼの間のキメラである。
【００５２】
本明細書で使用する、「濃縮（ｐａｃｋｅｄ）ポリメラーゼ」は、酵素を安定化する又は活性化するために適切な濃縮緩衝液を使用しなければ、ポリメラーゼ活性の損失が生じるような、十分に高い濃度の１以上の核酸ポリメラーゼ酵素を含有する溶液を指す。
【００５３】
本明細書で使用する、「熱安定性」は、例えば類似の活性を有する酵素の非熱安定性形態と比較して、好ましくは約９０〜１００℃の範囲内、より好ましくは約７０〜９８℃の範囲内の高い温度で安定であり、活性である酵素を指す。例えばＰ．フリオサス、Ｍ．ヤナシ、Ａ．フルギダス又はＰ．ホリコシなどの好熱生物に由来する熱安定性核酸ポリメラーゼは、大腸菌からの核酸ポリメラーゼと比較して高温でより安定であり、活性である。Ｐ．フリオサス（Ｐｆｕ）から単離された代表的な熱安定性核酸ポリメラーゼが、Ｌｕｎｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｇｅｎｅ．１０８：１−６に述べられている。さらなる代表的な温度安定性ポリメラーゼは、例えば好熱菌、サーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）、サーマス・ルバー（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ）、サーマス・サーモフィルス、バチルス・ステアロサーモフィルス（列挙する他の細菌よりも幾分低い最適温度を有する）、サーマス・ラクテウス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｌａｃｔｅｕｓ）、サーマス・ルーベンス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｎｓ）、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）から、又は好熱古細菌、サーモコッカス・リトラリス、及びメタノサーマス・フェルビズス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｅｒｖｉｄｕｓ）から抽出されるポリメラーゼを含む。
【００５４】
ＰＣＲ増幅のために、本発明において使用される酵素は、好ましくは熱安定性である。本明細書で使用する、「熱安定性」は、熱に対して安定であり、耐熱性であり、及び高温で、例えば５０〜９０℃で機能する酵素を指す。本発明に従った熱安定性酵素は、増幅反応のために有効であるという１つの判定基準を満たさねばならない。すなわち酵素は、二本鎖ポリヌクレオチドの変性を生じさせるために必要な時間高温に供されたとき、不可逆的に変性（不活性化）してはならない。これに関して使用される「不可逆的変性」により、永続的で完全な酵素活性の喪失をもたらす過程が意味される。変性のために必要な加熱条件は、例えば緩衝液塩濃度及び変性されるポリヌクレオチドの長さとヌクレオチド組成に依存するが、典型的には、短いポリヌクレオチドに関する８５℃から１０５℃までの範囲であり、主として温度とポリヌクレオチド長に依存する時間、典型的には短いポリヌクレオチドに関する０．２５分間からより長いＤＮＡ断片に関する４．０分間までの時間である。緩衝液塩濃度及び／又はポリヌクレオチドのＧＣ組成が上昇すると共により高い温度が耐容され得る。好ましくは、酵素は９０〜１００℃で不可逆的に変性しない。不可逆的に変性しない酵素は、本発明によれば、増幅反応の間少なくとも１０％、又は少なくとも２５％、又は少なくとも５０％以上の機能又は活性を保持する。
【００５５】
本明細書で使用する、「古細菌」ＤＮＡポリメラーゼは、ファミリーＢ／ポルＩ型群（例えばＰｆｕ、ＫＯＤ、Ｐｆｘ、Ｖｅｎｔ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ、Ｔｇｏ、Ｐｗｏ）又はポルＩＩ型群（例えばパイロコッカス・フリオサスＤＰ１／ＤＰ２  ２サブユニットＤＮＡポリメラーゼ）のいずれかに属するＤＮＡポリメラーゼを指す。「古細菌」ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲにおいて有用な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを指し、パイロコッカス種（フリオサス、ＧＢ−Ｄ種、ウーゼイ（ｗｏｅｓｉｉ）、アビシ（ａｂｙｓｉｉ）、ホリコシ）、サーモコッカス種（コダカラエンシスＫＯＤ１、リトラリス、９  ｄｅｇｒｅｅｓ  Ｎｏｒｔｈ−７種、ＪＤＦ−３種、ゴルゴナリウス（ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ））、ピロディクティウム・オクルタム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ  ｏｃｃｕｌｔｕｍ）及びアーケオグロブス・フルギダスから単離されたＤＮＡポリメラーゼを含むが、これらに限定されない。適切な古細菌は、＞８０〜８５℃の最大増殖温度又は＞７０〜８０℃の最適増殖温度を示すと推定される。Ｐｆｕ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＫＯＤ（Ｔｏｙｏｂｏ）、Ｐｆｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、Ｔｇｏ（Ｒｏｃｈｅ）及びＰｗｏ（Ｒｏｃｈｅ）を含む、古細菌ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ群からの適切なＰＣＲ酵素が市販されている。上記に列挙するものに関連する付加的な古細菌は、Ａｒｃｈａｅａ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｒｏｂｂ，Ｆ．Ｔ．ａｎｄ  Ｐｌａｃｅ，Ａ．Ｒ．，ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９９５に述べられている。
【００５６】
本明細書で使用する、有用な「Ｔａｑ」ＤＮＡポリメラーゼは、野生型ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ及び低い忠実度を有する突然変異形態のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（例えば参照により本明細書に組み込まれる、Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：５０４４）を含む。
【００５７】
一部の天然に生じる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、酵素的に活性な３’〜５’エキソヌクレアーゼドメインを有し、天然のプルーフリーディング能力を提供し、従ってＴａｑＤＮＡポリメラーゼよりも高い忠実度を示す。しかし、これらのＤＮＡポリメラーゼはまた、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼと比較したとき、より緩慢なＤＮＡ伸長速度と全体的に低いプロセッシビティーを示す。
【００５８】
多酵素集合体もＰＣＲにおいて使用でき、例えばＴａｑポリメラーゼと、Ｐｆｕポリメラーゼ又はＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼなどのプルーフリーディング酵素を組み合わせることができる。そのような多酵素混合物は、Ｔａｑポリメラーゼ単独と比較したとき、より高いＰＣＲ効率と低い誤り率を示す（Ｂａｒｎｅｓ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９１：２２１６−２２２０（１９９４））。
【００５９】
Ｔａｑポリメラーゼの有用な変異型は、欠失／切断手法を通して開発された。Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメントは、例えば、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの５４４アミノ酸のＣ末端切断であり、酵素的に活性な５’〜３’ポリメラーゼドメインを有するが、３’〜５’エキソヌクレアーゼ及び５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く。他の市販の熱安定性ポリメラーゼは突然変異によって開発された。例は、天然に生じるポリメラーゼの点突然変異である、Ｖｅｎｔ（エキソ−）及びＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（エキソ−）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を含む。
【００６０】
ＤＮＡポリメラーゼに関して本明細書で使用する、ＤＮＡポリメラーゼという用語は、「その機能的フラグメント」を含む。「その機能的フラグメント」は、ポリメラーゼの全アミノ酸配列未満を包含し、少なくとも一組の条件下で、ポリヌクレオチドの重合を触媒する能力を保持する、野生型又は突然変異型ＤＮＡポリメラーゼの一部を指す。そのような機能的フラグメントは、別個の実体として存在し得るか、又は融合タンパク質などのより大きなポリペプチドの構成成分であり得る。
【００６１】
本明細書で使用する、「プルーフリーディング」活性は、ＤＮＡポリメラーゼの３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性を指す。「非プルーフリーディング」酵素は、「３’〜５’エキソヌクレアーゼ欠損」又は「３’〜５’エキソ−」であるＤＮＡポリメラーゼを指す。本明細書で使用する、「３’〜５’エキソヌクレアーゼ欠損」又は「３’〜５’エキソ−」は、組み込まれたヌクレオチドをＤＮＡポリマーの３’末端から除去する能力を実質的に欠く酵素を指す。ファミリーＢポリメラーゼのメンバーによって例示される３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性などのＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性は、突然変異を通して失われることがあり、エキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼを生じる。本明細書で使用する、３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性欠損であるＤＮＡポリメラーゼは、３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠く。「実質的に欠く」は、親酵素に比べて、例えば０．０３％、０．０５％、０．１％、１％、５％、１０％、２０％、５０％の活性の欠如、さらにはエキソヌクレアーゼ活性の完全な欠如を包含する。３’〜５’エキソヌクレアーゼＤＮＡポリメラーゼを作製し、特徴付けるために使用される方法並びに３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性を低下させる又は排除する突然変異は、係属中の米国特許出願第０９／６９８，３４１号（Ｓｏｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ；２０００年１０月２７日出願）に開示されている。３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性を低下させる又は排除する付加的な突然変異は当分野において公知であり、ここで考慮される。
【００６２】
様々な市販のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼがあり、その一部は５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性を低下させる又は排除するように改変されている。ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼの５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性を排除するために使用される方法は、突然変異誘発（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６８：２８４及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ，７：４６８に述べられている）；タンパク質分解消化によるＮ末端切断（Ｋｌｅｎｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９７１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２：３７１に述べられている）；又はクローニングとＣ末端フラグメントとしての発現によるＮ−切断（Ｌａｗｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．，２：２７５に述べられている）を含む。
【００６３】
本発明はまた、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，３３３，１５８号及び国際公開広報第ＷＯ０１／０９３４７  Ａ２号に述べられている、アクセサリー因子と組み合わせたＤＮＡポリメラーゼを考慮する。
【００６４】
（ポリメラーゼ連鎖反応）
ＰＣＲの手法は、ＰＣＲ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍ．Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１），ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｂｙ  Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）及びＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を含む、数多くの出版物の中で説明されている。ＰＣＲはまた、各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，６８３，２０２号；同第４，８００，１５９号；同第４，９６５，１８８号；同第４，８８９，８１８号；同第５，０７５，２１６号；同第５，０７９，３５２号；同第５，１０４，７９２号；同第５，０２３，１７１号；同第５，０９１，３１０号；及び同第５，０６６，５８４号を含む、多くの米国特許に記述されている。
【００６５】
核酸増幅は、核酸（例えばＤＮＡ）分子又はプライマーへのヌクレオチドの組込みを生じさせ、それによって核酸鋳型に相補的な新しい核酸分子を形成する。形成された核酸分子及びその鋳型は、さらなる核酸分子を合成するための鋳型として使用できる。本明細書で使用する１つの増幅反応は、多くの回数の核酸合成からなり得る。増幅反応は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；Ｍｕｌｌｉｓ  ａｎｄ  Ｆａｌｏｏｎａ，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５５：３３５）を含む。１つのＰＣＲ反応は、核酸分子の変性と合成の５〜１００「サイクル」からなり得る。エキソ−ＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲ増幅は、本質的に、突然変異した増幅産物の生成を生じさせる。
【００６６】
ＰＣＲ反応は、反復される一連の温度サイクルを含み、典型的には１０〜１００μｌの容量で実施される。反応混合物は、ｄＮＴＰ（４つのデオキシヌクレオチド、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの各々）、プライマー、緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼ及び核酸鋳型を含む。ＰＣＲ反応は、第一プライマーが核酸鋳型配列の１本の鎖内の領域に相補的な配列を含み、相補的ＤＮＡ鎖の合成を開始させ、及び第二プライマーが標的核酸配列の２番目の鎖内の領域に相補的な配列を含み、相補的ＤＮＡ鎖の合成を開始させる、オリゴヌクレオチドプライマーのセットを提供すること、及び（ｉ）増幅のために必要なプライマーの、鋳型配列内に含有される標的核酸配列へのアニーリング、（ｉｉ）核酸ポリメラーゼがプライマー伸長産物を合成する、プライマーの伸長、というＰＣＲサイクリング工程を可能にする条件下で、核酸ポリメラーゼを鋳型依存性重合剤として使用して核酸鋳型配列を増幅することを含む。「オリゴヌクレオチドプライマーのセット」又は「ＰＣＲプライマーのセット」は、２、３、４以上のプライマーを含み得る。
【００６７】
ＰＣＲプライマーは、核酸鋳型にハイブリダイズして、２番目の核酸鎖の酵素的合成を開始することができる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子であり得る。本発明に従って有用なＰＣＲプライマーは、１０〜１００ヌクレオチド長、好ましくは１７〜５０ヌクレオチド長、より好ましくは１７〜４５ヌクレオチド長の範囲内である。
【００６８】
プローブ及びプライマーは、典型的には生物学的又は化学合成によって調製されるが、生物学的精製又は分解、例えばエンドヌクレアーゼ消化によっても調製できる。
【００６９】
本発明において使用されるプローブ及びプライマーのような短い配列については、化学合成が生物学的合成と比較してしばしばより経済的である。より長い配列に関しては、Ｍｅｓｓｉｎｇ，１９８３，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：２０−７８によって述べられているような一本鎖ＤＮＡのためのＭ１３の使用などの、分子生物学的において用いられる標準的複製方法ができる。ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド合成の化学的方法は、ホスホトリエステル及びホスホジエステル法（Ｎａｒａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９７９）６８：９０）及び支持体上での合成（Ｂｅａｕｃａｇｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．（１９８１）２２：１８５９−１８６２）並びにホスホルアミデート手法（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８８）１５４：２８７−３１４（１９８８）、及び「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ」，Ｓ．Ａ．Ｎａｒａｎｇ，ｅｄｉｔｏｒ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７及びその中に含まれる引用文献に述べられている他の方法を含む。
【００７０】
一般に標的ポリヌクレオチドの増幅、例えばＰＣＲによる増幅と組み合わせた標識プローブの使用は、その全てが参照により本明細書に組み込まれる、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）などの多くの参考文献に述べられている。一部の実施形態では、プローブの結合部位は、標的ポリヌクレオチドを増幅するために使用されるＰＣＲプライマーの間に位置する。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブ複合体がプライマーとして働く。もう１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブ複合体は、アンプリコンに組み込まれたプライマー内に存在する標的核酸に結合する。好ましくは、ＰＣＲはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＡｍｐｌｉｔａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．）又は等価の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用して実施され、ＰＣＲのアニーリング温度は、使用されるオリゴヌクレオチドプローブの融解温度より低い約５℃〜１０℃である。
【００７１】
本明細書で使用する、「１以上の付加的なその後のＰＣＲ増幅反応を反復すること」という用語は、核酸鋳型、少なくとも２個のＰＣＲプライマー、誤りがちなＤＮＡポリメラーゼを、核酸鋳型の増幅を可能にする条件下でインキュベートすることを含む、１以上の付加的なＰＣＲ増幅反応の後続実施を指す。後続ＰＣＲ反応は、その前のＰＣＲ増幅のＰＣＲ増幅された産物を鋳型として使用する、前記インキュベーション工程を含む。その前のＰＣＲ増幅反応の増幅産物は、後続ＰＣＲ反応のための鋳型として使用する前に、当分野で公知の手段によって、例えばフェノール抽出／エタノール沈殿又はカラム精製によって精製し得る。後続ＰＣＲ増幅反応のための鋳型は、その前のＰＣＲ増幅の全増幅産物の一部であり得る。各々の後続ＰＣＲ増幅について、新鮮な試薬（例えば反応緩衝液、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー）を反応混合物に添加する。その前のＰＣＲ増幅の増幅産物の一部を使用する場合、後続ＰＣＲ反応の容量は先のＰＣＲ反応と同じであり得る。先のＰＣＲ反応の全増幅産物を鋳型として使用する場合、後続ＰＣＲ反応は先のＰＣＲ反応よりも大きな容量を有する。
【００７２】
ＰＣＲ反応は、反復される一連の温度サイクルを含み、典型的には１０〜１００μｌの容量で実施される。反応混合物は、ｄＮＴＰ（４つのデオキシヌクレオチド、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの各々）、プライマー、緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼ及びポリヌクレオチド鋳型を含む。ＰＣＲは、増幅しようとする二本鎖標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズする２個のプライマーを必要とする。ＰＣＲでは、この二本鎖標的配列を変性し、１個のプライマーが変性された標的の各々の鎖にアニーリングする。プライマーは、互いから離れた部位で、１個のプライマーの伸長産物が、その相補物から分離されたとき、他方のプライマーにハイブリダイズすることができる方向で、標的ポリヌクレオチドにアニーリングする。ひとたび所与のプライマーが標的配列にハイブリダイズすれば、ＤＮＡポリメラーゼの作用によってプライマーが伸長される。次に、伸長産物を標的配列から変性し、この過程を反復する。
【００７３】
この過程の連続的なサイクルにおいて、先のサイクルで生産された伸長産物はＤＮＡ合成のための鋳型として役立つ。２番目のサイクルから始まって、増幅の産物は対数的速度で蓄積し始める。増幅産物は、第一プライマーの配列を含有し、場合により２番目のプライマーに相補的な配列が続く第一鎖、及び第一鎖に相補的な第二鎖を含む、別個の二本鎖ＤＮＡ分子である。
【００７４】
ＰＣＲ過程によって可能となる膨大な増幅は、高いＤＮＡレベルを有する試料、陽性対照鋳型又は先の増幅からの小さなレベルのＤＮＡキャリーオーバーは、意図的に添加される鋳型ＤＮＡがない場合でも、ＰＣＲ産物を生じ得る。可能な場合は、全ての反応混合物は、ＰＣＲ産物分析及び試料調製とは別の区域に設置される。ＲＮＡ／ＤＮＡ調製、反応物混合及び試料分析のための専用の又は使い捨ての容器、溶液及びピペット（好ましくは容積式ピペット）の使用は交差汚染を最小限に抑える。参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｉｇｕｃｈｉ  ａｎｄ  Ｋｗｏｋ，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ，３３９：２３７−２３８及びＫｗｏｋ  ａｎｄ  Ｏｒｒｅｇｏ，ｉｎ：Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，１９９０，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．も参照のこと。
【００７５】
ＰＣＲ促進因子も、増幅の効率を改善するために使用し得る。本明細書で使用する、「ＰＣＲ促進因子」又は「ポリメラーゼ促進因子」（ＰＥＦ）は、ポリヌクレオチドポリメラーゼ促進活性を有する複合体又はタンパク質を指す（どちらも参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｏｇｒｅｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  １０：：９３−９６；及び米国特許第６，１８３，９９７号）。Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼに関して、ＰＥＦは、天然形態（Ｐ５０とＰ４５の複合体として）又は組換えタンパク質としてのＰ４５を含む。Ｐｆｕ  Ｐ５０とＰ４５の天然複合体では、Ｐ４５だけがＰＣＲ促進活性を示す。Ｐ５０タンパク質は、構造に関して細菌フラボタンパク質に類似する。Ｐ４５タンパク質は、構造的にｄＣＴＰデアミナーゼ及びｄＵＴＰアーゼに類似するが、ｄＵＴＰをｄＵＭＰとピロリン酸に変換するｄＵＴＰアーゼとしてのみ機能する。ＰＥＦはまた、本発明によれば、以下からなる群より選択され得る。古細菌供給源（例えばパイロコッカス・フリオサス）から得られる単離又は精製された天然に生じるポリメラーゼ促進タンパク質；Ｐｆｕ  Ｐ４５と同じアミノ酸配列を有する完全又は部分的合成タンパク質、又はポリメラーゼ促進活性を有するその類似体；前記の天然に生じるあるいは完全又は部分的合成タンパク質の１以上のポリメラーゼ促進混合物；前記の天然に生じるあるいは完全又は部分的合成タンパク質の１以上のポリメラーゼ促進タンパク質複合体；又は前記の天然に生じるタンパク質の１以上を含むポリメラーゼ促進性部分精製細胞抽出物（米国特許第６，１８３，９９７号、前出）。ＰＥＦのＰＣＲ促進活性は当分野で周知の手段によって定義される。ＰＥＦについての単位定義はＰＥＦ（Ｐ４５）のｄＵＴＰアーゼ活性に基づき、これは、ｄＵＴＰからのピロリン酸（ＰＰｉ）の生産を観測することによって測定される。例えばＰＥＦを、ＰＥＦがｄＵＴＰをｄＵＭＰとＰＰｉに加水分解する間、ｄＵＴＰ（１×クローン化Ｐｆｕ  ＰＣＲ緩衝液中１０ｍＭ  ｄＵＴＰ）と共にインキュベートする。形成されるＰＰｉの量を、Ｓｉｇｍａから市販されている共役酵素アッセイシステム（Ｎｏ．Ｐ７２７５）を使用して定量する。活性１単位は、１時間当たりに形成される（８５℃で）ＰＰｉ  ４．０ｎｍｏｌｅと機能的に定義される。
【００７６】
他のＰＣＲ添加剤も、ＰＣＲ反応の精度と特異性に影響を及ぼし得る。０．５ｍＭ未満のＥＤＴＡが増幅反応混合物中に存在してもよい。Ｔｗｅｅｎ２０（商標）及びＮｏｎｉｄｅｔ（商標）Ｐ−４０などの界面活性剤が酵素希釈緩衝液中に存在する。約０．１％以下の非イオン界面活性剤の最終濃度が適切であるが、０．０１〜０．０５％が好ましく、ポリメラーゼ活性に干渉しない。同様に、グリセロールがしばしば酵素製剤中に存在し、一般に反応混合物中１〜２０％の濃度に希釈される。グリセロール（５〜１０％）、ホルムアミド（１〜５％）又はＤＭＳＯ（２〜１０％）が、高いＧＣ含量を有する又は長い（例えば＞１ｋｂ）鋳型ＤＮＡのためにＰＣＲに添加できる。これらの添加剤は、プライマー鋳型のハイブリダイゼーション反応のＴｍ（融解温度）及びポリメラーゼ酵素の熱安定性を変化させる。ＢＳＡ（０．８μｇ／μｌまで）はＰＣＲ反応効率を改善し得る。ベタイン（０．５〜２Ｍ）も、ＤＮＡの高いＧＣ含量及び長いフラグメントのためにＰＣＲに有用である。塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ、＞５０ｍＭ）、塩化テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡＣ）及びトリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＮＯ）も使用し得る。上記の各添加剤の最適濃度を決定するために試験ＰＣＲを実施し得る。
【００７７】
本発明は、抗体（ホットスタートＰＣＲのため）及びｓｓｂ（一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質；より高い特異性）を含むが、これらに限定されない添加剤を提供する。本発明はまた、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，３３３，１５８号及び国際公開広報第ＷＯ０１／０９３４７  Ａ２号に述べられている、アクセサリー因子と組み合わせた突然変異型古細菌ＤＮＡポリメラーゼを考慮する。
【００７８】
様々な特異的ＰＣＲ増幅適用が当分野において使用可能である（総説については、例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｒｌｉｃｈ，１９９９，Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ，１：１２７−３４；Ｐｒｅｄｉｇｅｒ  ２００１，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６０：４９−６３；Ｊｕｒｅｃｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：３１６−２１；Ｔｒｉｇｌｉａ，２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３０：７９−８３；ＭａＣｌｅｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．４：Ｓ６６−８１；Ａｂｒａｍｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍｙｅｒｓ，１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：４１−４７参照）。
【００７９】
本発明は、以下を含むが、これらに限定されないＰＣＲ適用において使用できる。（ｉ）非特異的増幅を低減するホットスタートＰＣＲ。（ｉｉ）外部セットのプライマーと内部セットのプライマーを使用してより信頼し得る産物を合成する入れ子ＰＣＲ。（ｉｉｉ）公知の配列に隣接する領域の増幅のための逆ＰＣＲ。この方法では、ＤＮＡを消化し、所望のフラグメントを連結によって環化して、その後外向きに伸長する公知配列に相補的なプライマーを使用したＰＣＲを実施する。（ｉｖ）ＡＰ−ＰＣＲ（恣意的開始（ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ  ｐｒｉｍｅｄ）／ＲＡＰＤ（ランダム増幅多型ＤＮＡ）。これらの方法は、恣意的オリゴヌクレオチドを用いて増幅することにより、ほとんど知られていない標的配列を有する種からゲノムフィンガープリントを作製する。（ｖ）ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば逆転写酵素）を使用してｃＤＮＡを合成し、次にそれをＰＣＲのために使用する、ＲＴ−ＰＣＲ。この方法は、組織又は細胞における特定配列の発現を検出するために極めて感受性が高い。ｍＲＮＡ転写産物を定量するためにも使用し得る。（ｖｉ）ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅法）。これは、ＤＮＡ／タンパク質配列についての情報が限られている場合に使用される。この方法は、ｃＤＮＡの３’又は５’末端を増幅し、各々１個の特異的プライマー（プラス１個のアダプタープライマー）だけを有するｃＤＮＡのフラグメントを生成する。次に、オーバーラップするＲＡＣＥ産物を組み合わせて完全長ｃＤＮＡを作製することができる。（ｖｉｉ）異なる組織において区別的に発現される遺伝子を同定するために使用されるＤＤ−ＰＣＲ（ディファレンシャル・ディスプレイＰＣＲ）。ＤＤ−ＰＣＲにおける最初の工程はＲＴ−ＰＣＲを含み、次に、短い、故意に非特異的なプライマーを使用して増幅を実施する。（ｖｉｉｉ）同じ標本中のＤＮＡ配列の２以上のユニーク標的を同時に増幅するマルチプレックスＰＣＲ。１つのＤＮＡ配列を、ＰＣＲの質を確認するための対照として使用できる。（ｉｘ）同じセットのプライマーに対して標的ＤＮＡと競合する（競合的ＰＣＲ）内部対照ＤＮＡ配列（しかし異なる大きさの）を使用するＱ／Ｃ−ＰＣＲ（定量的比較）。（ｘ）遺伝子を合成するために使用される反復性ＰＣＲ。この方法で使用されるオリゴヌクレオチドは、一続きの遺伝子（＞８０塩基）に対して、センス鎖とアンチセンス鎖に交互に相補的であり、重複する（約２０塩基）末端を有する。（ｘｉ）アシンメトリックＰＣＲ。（ｘｉｉ）インサイチューＰＣＲ。（ｘｉｉｉ）部位指定ＰＣＲ突然変異誘発。
【００８０】
本発明はいかなる特定増幅システムにも限定されない。他のシステムが開発されるとき、それらのシステムは本発明の実施によって利益を得る可能性がある。
【００８１】
温度安定性ポリメラーゼは、二本鎖核酸がＰＣＲサイクルの間に高温（約９５℃）への暴露によって変性する熱サイクリング過程において好ましい。
【００８２】
当業者はまた、合成／増幅反応の忠実度を高めるために他のＰＣＲパラメータを使用し得る。ＰＣＲの忠実度は、ｄＮＴＰ濃度の変化、反応当たりに使用される酵素の単位数、ｐＨ、及び反応物中に存在するＭｇ２＋対ｄＮＴＰの比率などの因子によって影響され得ることが報告された（Ｍａｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１、前出）。
【００８３】
Ｍｇ２＋濃度は、プライマー鋳型相互作用を安定化することによって鋳型ＤＮＡへのオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリングに影響を及ぼし、同時に鋳型プライマーとポリメラーゼの複製複合体を安定化する。従って、非特異的アニーリングを上昇させ、望ましくないＰＣＲ産物を生産し得る（ゲルにおいて多数のバンドを生じる）。非特異的増幅が起こるときは、増幅の精度と特異性を高めるためにＭｇ２＋を低下させる必要があるか又はＭｇ２＋をキレート化するためにＥＤＴＡを添加することができる。
【００８４】
Ｍｎ２＋又はＣｏ２＋などの他の二価陽イオンもＤＮＡ重合に影響を及ぼし得る。各々のＤＮＡポリメラーゼのための適切な陽イオンは当分野において公知である（例えばＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、前出において）。二価陽イオンは、ＭｇＳＯ４又はＭｎＳＯ４などの塩の形態で供給される。トリス緩衝液中で使用可能な陽イオン濃度は、ＭｎＳＯ４については０．５〜７ｍＭ、好ましくは０．５〜２ｍＭの範囲内であり、ＭｇＳＯ４については０．５〜１０ｍＭである。
【００８５】
ＤＮＡポリメラーゼによって必要とされる一価陽イオンは、カリウム、ナトリウム、アンモニウム又はリチウムによって、好ましくは陰イオンとしての硫酸塩と共に、供給され得る。ＫＳＯ４については、濃度は１〜２００ｍＭの範囲内であり、好ましくは４０〜１００ｍＭの範囲内であるが、最適濃度は、反応において使用されるポリメラーゼに依存して異なり得る。
【００８６】
デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）は、二ナトリウム又はリチウム塩などの、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰ及びｄＴＴＰの塩の溶液として添加される。本発明の方法では、各々１μＭ〜２ｍＭの範囲内の最終濃度が適切であり、１００〜６００μＭが好ましいが、ヌクレオチドの最適濃度は、ＰＣＲ反応において、総ｄＮＴＰ及び二価金属イオン濃度、及び緩衝液、塩、特定プライマー及び鋳型に依存して異なり得る。より長い産物、すなわち１５００ｂｐ超に関しては、トリス緩衝液を使用するとき、各々のｄＮＴＰ  ５００μＭが好ましいと考えられる。
【００８７】
ｄＮＴＰは二価陽イオンをキレート化する；従って、使用される二価陽イオンの量は、反応物中のｄＮＴＰの濃度に応じて変化させる必要があり得る。過剰量のｄＮＴＰ（例えば１．５ｍＭ超）は誤り率を上昇させ、おそらくＤＮＡポリメラーゼを阻害し得る。ｄＮＴＰを低下させることは（例えば１０〜５０μＭに）誤り率を低減し得る。より大きなサイズの鋳型を増幅するためのＰＣＲ反応は、より多くのｄＮＴＰを必要とし得る。
【００８８】
ＰＣＲはＤＮＡ増幅のための非常に強力なツールであり、従ってごくわずかな鋳型ＤＮＡしか必要としない。しかし、一部の実施形態では、誤りの可能性を低減するために、より高いＤＮＡ濃度を使用し得る。しかし、あまりに多すぎる鋳型は夾雑物の量を増加させ、効率を低下させ得る。
【００８９】
通常、３μＭまでのプライマーを使用し得るが、プライマー対鋳型の高い比率は非特異的増幅及びプライマー二量体形成を生じさせ得る。従って通常は、プライマー二量体形成を回避するためにプライマー配列を確認する必要がある。
【００９０】
変性時間は、鋳型のＧＣ含量が高ければ上昇し得る。高いＧＣ含量を有するプライマー又はより長いプライマーに関しては、より高いアニーリング温度が必要であり得る。勾配ＰＣＲはアニーリング温度を決定する有用な方法である。より大きなＰＣＲ産物増幅については伸長時間を延長すべきである。しかし、ポリメラーゼへの損傷を制限するために、可能な場合は常に伸長時間を低減することが必要であり得る。鋳型数が非常に少ない場合はサイクル数を増加させ、鋳型数が多い場合はサイクル数を減少させ得る。
【００９１】
本明細書で使用する、「突然変異型」ポリメラーゼは、ＤＮＡ重合活性、塩基類似体検出活性、逆転写酵素活性、プロセッシビティー、塩耐性、ＤＮＡ結合、鎖置換活性、ヌクレオチド結合及び認識、３’〜５’又は５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性、プルーフリーディング、忠実度を含むが、これらに限定されないＤＮＡポリメラーゼの１以上の活性を変化させる、又は室温でＤＮＡ重合を低下させる、１以上の突然変異を含むＤＮＡポリメラーゼを指す。ここで定義する「突然変異型」ポリメラーゼは、１以上のアミノ酸置換、１以上のアミノ酸挿入、切断、又は内部欠失を含むポリメラーゼを含む。ここで定義する「突然変異型」ポリメラーゼは、非キメラ及びキメラポリメラーゼを含む。
【００９２】
真正細菌ＤＮＡポリメラーゼの３つのクラス、ポルＩ型、ＩＩ型及びＩＩＩ型が存在する。ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼファミリーの酵素は５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性を有し、一部のメンバーは３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性も示す。ポルＩＩ型ＤＮＡポリメラーゼは、天然では５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くが、３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性を示す。ポルＩＩＩ型ＤＮＡポリメラーゼは、細胞の主要な複製型ＤＮＡポリメラーゼであり、多数のサブユニットからなる。ポルＩＩＩ型触媒サブユニットは５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くが、一部の場合には３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性が同じポリペプチド内に位置する。真正細菌ポルＩＩ型及びポルＩＩＩ型ＤＮＡポリメラーゼは市販されていない。ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼは様々なものが市販され、その一部は５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性を低減する又は排除するように改変されている。
【００９３】
ポリメラーゼ突然変異誘発は、新しい有用な核酸ポリメラーゼ変異体を開発するために使用されてきた。例えば、天然に生じるＤＮＡポリメラーゼはヌクレオチド類似体の組込みを強力に判別する。この性質はＤＮＡ複製の忠実度と修復に寄与する。しかし、ヌクレオチド類似体の組込みは、多くのＤＮＡ合成適用、特にＤＮＡ塩基配列決定のために有用である。従って、結合されたエキソヌクレアーゼ活性、５’ヌクレアーゼ活性又は３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性のいずれかを欠くＤＮＡポリメラーセは、ＤＮＡ配列に好ましい。低いヌクレオチド識別を備える熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを作製するために、部位指定突然変異誘発試験が開始され、ＤＮＡ配列決定に適した必要な活性を有する突然変異形態の多くの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの同定をもたらした（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４６６，５９１号）。
【００９４】
ＤＮＡポリメラーゼの性質を改変するためのもう１つのアプローチは、必要な活性を有する１以上のタンパク質ドメインがＤＮＡポリメラーゼと結合しているＤＮＡポリメラーゼ融合物を作製することである。ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐａｖｌｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９９：１３５１０−１３５１５に述べられているように、ＤＮＡトポイソメラーゼＶからのへリックス−ヘアピン−へリックスＤＮＡ結合モチーフにインフレームで融合され、キメラＤＮＡポリメラーゼのプロセッシビティー、塩耐性及び熱安定性を上昇させることが示された。Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼへのチオレドキシン結合ドメインの融合は、国際公開広報第ＷＯ９７／２９２０９号、米国特許第５，９７２，６０３号及びＢｅｄｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：４７９−４８４（１９９７）に述べられているように、チオレドキシンの存在下でＤＮＡポリメラーゼ融合物のプロセッシビティーを増強する。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼへの古細菌ＰＣＮＡ結合ドメインの融合は、ＰＣＮＡの存在下で高いプロセッシビティーを有し、より高い収量のＰＣＲ増幅ＤＮＡを生産するＤＮＡポリメラーゼ融合物を生じさせる（Ｍｏｔｚ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２  Ｍａｙ  ３；２７７（１８）；１６１７９−８８）。また、Ｐｆｕ又はＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼへの、配列非特異的ＤＮＡ結合タンパク質であるスルホロブス・ソルファタリカスからのＳｓｏ７ｄ又はＳａｃ７ｄの融合は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開広報第ＷＯ０１／９２５０１  Ａｌに開示されているように、これらのＤＮＡポリメラーゼのプロセッシビティーを大きく上昇させることが示された。ここで述べる緩衝液組成物と組み合わせて有用なＤＮＡポリメラーゼ融合物は、ＤＮＡ結合タンパク質Ｓｓｏ７ｄに融合したＰｆｕ（又はそのＤＮＡ結合ドメイン；Ｐｆｕ−Ｓｓｏ７ｄ融合物）、エキソ−Ｐｆｕ−Ｓｓｏ７ｄ融合物、又はＰｆｕのアミノ酸Ｖ９３が突然変異しているエキソ−Ｐｆｕ−Ｓｓｏ７ｄ融合物（エキソ−Ｐｆｕ−Ｖ９３Ｒ−Ｓｓｏ７ｄ融合物）を含む。他の融合物は、融合物とキメラＤＮＡポリメラーゼの組合せであり得る。例えば好ましいキメラ／融合物は、Ｐｆｕと、ＤＮＡ結合タンパク質Ｓｓｏ７Ｄ又はそのＤＮＡ結合ドメインに融合したパイロコッカス種ＧＢ−Ｄの間のキメラを含む。ＤＮＡポリメラーゼの全部又は一部の、異なるＤＮＡポリメラーゼの対応ドメインによるドメイン置換も記述されている（米国特許出願第２００２／０１１９４６１号）。
【００９５】
様々な生物からのＤＮＡポリメラーゼの直接比較は、これらの酵素のドメイン構造が高度に保存され、多くの場合、酵素の広く定義されたドメインに特定機能を割り当てることが可能であることを示唆する。例えば約３４０アミノ酸にわたる６つの最も保存されたＣ末端領域は、同じ線状配置に位置し、金属とｄＮＴＰの結合部位及びＤＮＡ鋳型を保持するためのクレフトを形成し、従って重合機能のために必須である高度に保存されたモチーフを含有する。もう１つの例では、金属結合、一本鎖ＤＮＡ結合及び３’〜５’エキソヌクレアーゼ反応の触媒作用に関与する大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩにおける決定的に重要な残基を含む３つのアミノ酸領域は、いくつかの原核及び真核生物ＤＮＡポリメラーゼにおいてアミノ末端側の半分に同じ線状配置で位置する。これらの保存された領域の位置は、所望機能、例えば鋳型認識を保存しながら、改変された活性を有する突然変異型ＤＮＡポリメラーゼを調製するための遺伝子修飾を導く有用なモデルを提供する。
【００９６】
例えば突然変異型ＤＮＡポリメラーゼは、遺伝子修飾によって（例えば野生型ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ配列を修飾することによって）作製できる。ＤＮＡ配列のランダム突然変異並びに標的突然変異を可能にする多くの方法が当分野で公知である（例えばＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５）３ｒｄ  Ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）。加えて、従来の方法とＰＣＲに基づく方法の両方を含む、部位指定突然変異誘発のための多くのキットが市販されている。例は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより入手可能なＥＸＳＩＴＥ（商標）ＰＣＲベースの部位指定突然変異誘発キット（カタログ番号２００５０２）及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（商標）部位指定突然変異誘発キット（カタログ番号２００５１８）、及び同じくＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのＣＨＡＭＥＬＥＯＮ（登録商標）二本鎖部位指定突然変異誘発キット（Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．２００５０９）を含む。
【００９７】
当分野で公知の部位指定突然変異誘発のより古い方法は、一本鎖ＤＮＡ鋳型の単離を可能にする、Ｍ１３バクテリオファージベクターなどのベクターへの、突然変異させる配列のサブクローニングに基づく。これらの方法では、突然変異誘発性プライマー（すなわち突然変異させる部位にアニーリングすることができるが、突然変異させる部位に１以上のミスマッチヌクレオチドを担持するプライマー）を一本鎖鋳型にアニーリングし、その後、突然変異誘発性プライマーの３’末端から始まる鋳型の相補物を重合させる。生じる二重鎖を、次に、宿主細菌に形質転換し、プラークを所望突然変異に関してスクリーニングする。
【００９８】
最近では、部位指定突然変異誘発は、一本鎖鋳型を必要としないという利点を有するＰＣＲ法が使用されてきた。加えて、サブクローニングを必要としない方法が開発された。ＰＣＲに基づく部位指定突然変異誘発を実施するときには、いくつかの問題を考慮しなければならない。第一に、これらの方法では、ポリメラーゼによって導入される望ましくない突然変異の拡大を防ぐためにＰＣＲサイクルの数を抑えることが望ましい。第二に、反応物中に残存する非突然変異親分子の数を低減するために選択を用いなければならない。第三に、単一ＰＣＲプライマーセットの使用を可能にするために伸長ＰＣＲ法が好ましい。そして第四に、一部の熱安定性ポリメラーゼの非鋳型依存性末端伸長活性のために、しばしば、ＰＣＲで生成された突然変異産物の平滑末端連結の前に末端ポリッシング工程を手順に組み込むことが必要である。
【００９９】
１以上のランダムに位置する突然変異を担持する突然変異体のパネルを生じさせる、ランダム突然変異誘発の方法が当分野に存在する。そのような突然変異体のパネルを、その後、低いＤＮＡ重合活性、３’〜５’エキソヌクレアーゼ欠損、又は野生型ポリメラーゼと比較したプロセッシビティーを含むがこれらに限定されない性質を示すもののような、所望活性に関してスクリーニングし得る（例えばｄＵＴＰ  ２００μＭの存在下に所与のＤＮＡポリメラーゼについての最適温度で３０分後のｄＮＴＰ  １０ｎｍｏｌｅの重合形態への組込みを測定することによって）。ランダム突然変異誘発のための方法の一例は、いわゆる「誤りがちなＰＣＲ法」である。その名称が示すように、この方法は、ＤＮＡポリメラーゼが高い忠実度の組込みを支持しない条件下で所与の配列を増幅する。種々のＤＮＡポリメラーゼに関して誤りがちな組込みを促進する条件は多様であるが、当業者は所与の酵素に関してそのような条件を決定し得る。増幅の忠実度において多くのＤＮＡポリメラーゼにとっての鍵となる変数は、例えば緩衝液中の二価金属イオンの種類と濃度である。マンガンイオンの使用及び／又はマグネシウム又はマンガンイオン濃度の変化は、従って、ポリメラーゼの誤り率に影響を及ぼすために適用され得る。
【０１００】
突然変異誘発によって作製される所望突然変異型ＤＮＡポリメラーゼについての遺伝子は、突然変異の部位及び数を同定するために配列決定され得る。２以上の突然変異を含む突然変異体については、所与の突然変異の作用は、特定突然変異体によって担持されるその他の突然変異から単離された部位指定突然変異誘発による野生型遺伝子への同定突然変異の導入によって評価され得る。そのようにして生成された単一突然変異体のスクリーニングアッセイは、その後、その突然変異単独の作用の決定を可能にする。
【０１０１】
典型的には、５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性、３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性、識別活性、及び忠実度は、典型的には異なる性質を有するアミノ酸の置換によって影響され得る。例えばＡｓｐなどの酸性アミノ酸を、塩基性、中性又は極性であるが無電荷のアミノ酸、例えばＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ（塩基性）；Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ（中性）；又はＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ又はＧｌｎ（極性であるが電荷を有さない）に変更し得る。Ｇｌｕは、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ又はＧｌｎに変更し得る。
【０１０２】
ＤＮＡポリメラーゼの効率を測定する方法は、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９９５，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｈａ  ａｎｄ  Ｔｈｉｌｌｙ，ｐｐ．３７−５１に述べられている。鋳型長増幅能力を測定する方法は、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，２００２，９９：５９６−６０１及びＪ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００１，８８：１４１−１４９に述べられている。ＤＮＡポリメラーゼの特異性を測定する方法は、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ），１９９９，１２６：７６２−８に述べられている。ＤＮＡポリメラーゼの熱安定性を測定する方法は、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ，２００２，２１７：８９−９４に記述されている。ヌクレオチド結合及び認識を測定する方法は、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００２，３２２：７１９−７２９及びＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２００２，３０：６０５−１３に述べられている。
【０１０３】
（キット）
本発明は、ＰＣＲ及び突然変異誘発などの核酸複製反応のための新規組成物及び方法を提供する。本発明はまた、対象組成物の１以上の容器を有し、一部の実施形態では、ＰＣＲにおける合成を含む、ポリヌクレオチド合成のために使用される様々な試薬の容器を含む包装単位を含むキット形式を考慮する。キットはまた、以下の品目の１以上を含有し得る。重合酵素、ポリヌクレオチド前駆体（例えばヌクレオチド）、プライマー、鋳型、プローブ、重合促進因子、染料、緩衝液、指示書及び対照。キットは、本発明に従った方法を実施するために適切な比率で混合された試薬の容器を含み得る。試薬容器は、好ましくは本発明の方法を実施するときの計量工程を省く単位量の試薬を含有する。本発明に従った１つのキットはまた、染色ゲルからのＰＣＲ産物収量の定量のためのＤＮＡ収量標準品を含有する。
【０１０４】
以下の実施例は限定ではなく、単に本発明の様々な態様と特徴を代表するものである。ここで言及する全ての特許、特許公報及び他の引用の内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例１】
【０１０５】
５×濃縮ＰＣＲ反応緩衝液を以下の表に従って調製した。
【表１】
2009521954.tif 000003
トリス硫酸１Ｍ保存溶液は、１０．０のｐＨが得られるように１Ｍトリス塩基（Ｓｉｇｍａ、超高純度）の溶液を適量の１Ｍトリス硫酸溶液（Ｓｉｇｍａ、超高純度）と混合することによって調製される。
【０１０６】
６ｋｂ  ＤＮＡ標準品（ヒトβグロビン）の増幅を、１×濃度の最終反応溶液を得るために５×濃縮ＰＣＲ反応緩衝液を使用して実施した。最終濃度又は反応物５０μｌ当たりの試薬の量は、４つのデオキシリボヌクレオシド三リン酸の各々２００μＭ、ヒトゲノムＤＮＡ鋳型１００ｎｇ、各プライマー０．２μＭ、ＰＥＦ  ２Ｕ及びＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ  ＯＹ（Ｅｓｐｏｏ，Ｆｉｎｌａｎｄ））２−６Ｕであった。増幅を以下のように実施した。９５℃、２分間、１サイクル；９５℃、２０秒間、５８℃、２０秒間、７２℃、１分３０秒間、３０サイクル；７２℃、３分間、１サイクル。熱サイクリングは、ＭＪ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＰＴＣ−２００  ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ又はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００のいずれかで実施した。増幅産物を１％アガロースゲルで泳動させ、臭化エチジウムを用いて染色した。比較のためにＨＦ緩衝液（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ  ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｆ−５１８）及びＧＣ緩衝液（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ  ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｆ−５１９）を使用して平行反応を実施した。ＨＦ及びＧＣ緩衝液は、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼとの使用のためにＦｉｎｎｚｙｍｅｓにより市販され、緩衝液組成は特許保護されている。結果は図１に提示され、ＤＮＡポリメラーゼ融合物の濃度を反応物５０μｌ当たり２〜６Ｕの範囲にわたって上昇させると、濃縮緩衝液中の産物収量は増加するが、ＨＦ又はＧＣ緩衝液では収量が増加しないことを示す。
【実施例２】
【０１０７】
反応緩衝液中の塩の最適濃度を決定するため、濃縮ＤＮＡポリメラーゼを使用して種々の無機塩に関して実験を行った。反応は、いくつかの点を除いて、実施例１で上述したように実施した。試験した無機塩は、ＣｓＣｌ、ＫＮＯ３及びＣｓＮＯ３であった。実験で使用した各々の無機塩の濃度の範囲は以下の通りであった。ＣｓＣｌ：５０〜１２０ｍＭ；ＫＮＯ３：１５〜１１０ｍＭ；及びＣｓＮＯ３：３０〜１００ｍＭ。加えて、各々の無機塩を、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ−Ｓｓｏ７ｄポリメラーゼ融合物）２０Ｕを使用して熱サイクリング反応において試験した。結果は、無機塩の濃度を反応当たり５０〜１２０ｍＭの範囲にわたって上昇させると、ＤＮＡポリメラーゼ２０Ｕによる反応において産物収量が増加することを明らかにする。結果はまた、濃縮緩衝液組成物における無機塩の最適濃度範囲が８０〜１００ｍＭの範囲内であることを明らかにする。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】ＰＣＲ実験におけるＤＮＡポリメラーゼ濃度の濃度依存性への種々の緩衝液の作用を示す。臭化エチジウム染色を伴うゲル電気泳動は、各々の条件下での増幅産物の収量を明らかにする。本発明の緩衝液だけが、ＤＮＡポリメラーゼ濃度の上昇と共に産物の量を増加させる。詳細については実施例１参照。
【図１】
2009521954.tif 000004
【国際調査報告】
2009521954.tif 000005