(57)【要約】本発明は、対象となる生体高分子と相互作用可能な化合物の同定を容易にする組成物および方法を提供する。一態様において、イソシアネートまたはイソチオシアネートの化学を用いて固体支持体に結合した１以上の種類の化合物のアレイを含む組成物を提供し、化合物のアレイの密度は１ｃｍ２あたり少なくとも１０００スポットである。一般に、これらの本発明のアレイは：（１）所望の化合物と相互作用して共有結合を形成可能なイソシアネート部分またはイソチオシアネート部分で官能化された固体支持体を提供する工程と；（２）固体支持体に結合されるべき１以上の種類の化合物の１以上の溶液を提供する工程と；（３）１以上の種類の化合物を固体支持体に送達する工程と；（４）化合物の固体支持体への結合を触媒する工程とにより生成され、それによりアレイが形成され、化合物のアレイは１ｃｍ２あたり少なくとも１０００スポットの密度を有する。
2009522576.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソシアネート由来のリンカーまたはイソチオシアネート由来のリンカーを介して固体支持体に結合した複数の１より多くの種類の化合物を含むアレイであって、該化合物のアレイの密度は１ｃｍ２あたり少なくとも１００スポットを含む、アレイ。
【請求項２】
前記化合物のアレイが低分子のアレイを含む、請求項１に記載のアレイ。
【請求項３】
前記化合物のアレイが非オリゴマー性化合物のアレイを含む、請求項１に記載のアレイ。
【請求項４】
前記化合物のアレイが非ペプチド性化合物および非オリゴマー性化合物のアレイを含む、請求項１に記載のアレイ。
【請求項５】
前記化合物のアレイが２０００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量を有する化合物のアレイを含む、請求項１に記載のアレイ。
【請求項６】
前記化合物のアレイが、ポリヌクレオチドでもペプチドでもタンパク質でもない化合物のアレイを含む、請求項１に記載のアレイ。
【請求項７】
前記化合物のアレイが、細胞溶解産物からの生体分子である化合物のアレイを含む、請求項１に記載のアレイ。
【請求項８】
前記化合物が第一級アルコール、第二級アルコール、フェノール、チオール、アニリン、ヒドロキサム酸、第一級アミド類、脂肪族アミン類、およびスルホンアミド類からなる群から選択される結合用官能基を含む、請求項１に記載のアレイ。
【請求項９】
前記化合物が第一級アルコール類、第二級アルコール類、フェノール類、カルボン酸類、ヒドロキサム酸類、チオール類、およびアミン類からなる群から選択される結合用官能基を含む、請求項１に記載のアレイ。
【請求項１０】
前記結合は、結果的に得られるリンケージが、前記化合物が（１）その後の操作工程の際に不用意に開裂せず、かつ、（２）用いた官能基がその後の操作工程に干渉しないように不活性であるように十分に強固であることを特徴とする、請求項１に記載のアレイ。
【請求項１１】
前記アレイ中の各前記化合物が、イソシアネート部分またはイソチオシアネート部分に対する求核試薬の付加によって生じたリンケージを介して前記固体支持体に結合されている、請求項１に記載のアレイ。
【請求項１２】
前記付加が蒸気によって触媒される、請求項１１に記載のアレイ。
【請求項１３】
前記付加が求核試薬によって触媒される、請求項１１に記載のアレイ。
【請求項１４】
前記蒸気がピリジンである、請求項１２に記載のアレイ。
【請求項１５】
前記蒸気が揮発性の複素環アミンである、請求項１２に記載のアレイ。
【請求項１６】
前記支持体に化合物を結合している前記イソシアネート由来のリンカーが以下の式：
【化１】
2009522576.tif 000079
のものであり、式中、
Ｌは置換または非置換で、分枝または非分枝で、環状または非環状で、脂肪族またはヘテロ脂肪族のリンカーであり；
ＸはＮ、Ｓ、またはＯであり；
Ｒは前記固体支持体に結合されている前記化合物である、請求項１に記載のアレイ。
【請求項１７】
前記支持体に化合物を結合している前記イソチオシアネート由来のリンカーが以下の式：
【化２】
2009522576.tif 000080
のものであり、式中、
Ｌは置換または非置換で、分枝または非分枝で、環状または非環状で、脂肪族またはヘテロ脂肪族のリンカーであり；
ＸはＮ、Ｓ、またはＯであり；
Ｒは前記固体支持体に結合されている前記化合物である、請求項１に記載のアレイ。
【請求項１８】
前記支持体に化合物を結合している前記イソシアネート由来のリンカーが以下の式：
【化３】
2009522576.tif 000081
のものであり、式中、
ｎは１以上１２以下の整数であり；
ＸはＯ、Ｓ、またはＮであり；
Ｒは結合した化合物である、請求項１に記載のアレイ。
【請求項１９】
前記支持体に化合物を結合している前記イソシアネート由来のリンカーが以下の式：
【化４】
2009522576.tif 000082
のものであり、式中、
Ｌは置換または非置換で、分枝または非分枝で、環状または非環状で、脂肪族またはヘテロ脂肪族のリンカーであり；
ｎは１以上１２以下の整数であり；
ＸはＮ、Ｓ、またはＯであり；
Ｒは前記固体支持体に結合されている前記化合物である、請求項１に記載のアレイ。
【請求項２０】
前記支持体に化合物を結合している前記イソシアネート由来のリンカーが以下の式：
【化５】
2009522576.tif 000083
のものであり、式中、
ｎの各出現箇所はそれぞれ独立して１以上２０以下の整数であり；
ｍは１以上２０以下の整数であり；
ＸはＮ、Ｓ、またはＯであり；
Ｒは前記固体支持体に結合されている前記化合物である、請求項１に記載のアレイ。
【請求項２１】
スライドガラスに化合物を結合している前記イソチオシアネート由来のリンカーが以下の式：
【化６】
2009522576.tif 000084
のものであり、式中、
ＸはＯ、Ｓ、またはＮであり；
Ｒは結合した化合物である、請求項１に記載のアレイ。
【請求項２２】
前記固体支持体に化合物を結合している前記リンカーが、以下：
【化７】
2009522576.tif 000085
に示され、式中、
ｎは１以上１２以下の整数であり；
ｍは１以上２００以下の整数であり；
ＸはＯ、Ｓ、またはＮであり；
Ｒは結合した化合物である、請求項１に記載のアレイ。
【請求項２３】
前記固体支持体に化合物を結合している前記リンカーが、以下の式：
【化８】
2009522576.tif 000086
のものであり、式中、ｎは１以上２００以下の整数であり；
Ｒは結合した化合物である、請求項１に記載のアレイ。
【請求項２４】
前記固体支持体がガラスである、請求項１に記載のアレイ。
【請求項２５】
前記固体支持体が誘導体化ガラスである、請求項１に記載のアレイ。
【請求項２６】
前記固体支持体がシリル化ガラスである、請求項１に記載のアレイ。
【請求項２７】
前記固体支持体がγ−アミノプロピルシリル化ガラスである、請求項１に記載のアレイ。
【請求項２８】
前記固体支持体がポリマーである、請求項１に記載のアレイ。
【請求項２９】
前記固体支持体が金属である、請求項１に記載のアレイ。
【請求項３０】
前記固体支持体が金属被覆面である、請求項１に記載のアレイ。
【請求項３１】
前記固体支持体が金被覆面である、請求項１に記載のアレイ。
【請求項３２】
前記アレイの密度が１ｃｍ２あたり少なくとも１０００スポットである、請求項１に記載のアレイ。
【請求項３３】
前記アレイの密度が１ｃｍ２あたり少なくとも２５００スポットである、請求項１に記載のアレイ。
【請求項３４】
前記アレイの密度が１ｃｍ２あたり少なくとも５０００スポットである、請求項１に記載のアレイ。
【請求項３５】
イソシアネート由来のリンカーまたはイソチオシアネート由来のリンカーを介して固体支持体に結合した複数の１つまたはそれより多くの種類の化合物を含むアレイであって、該化合物のアレイの密度は１ｃｍ２あたり少なくとも１００スポットを含む、アレイ。
【請求項３６】
化合物のアレイの形成のための方法であって、
固体支持体を提供する工程であって、該固体支持体は、１より多くの種類の化合物と相互作用して共有結合を形成可能な弱求電子性部分で官能化されている、工程と；
該固体支持体に結合されるべき１より多くの種類の化合物の１つまたはそれより多くの溶液を提供する工程と；
該１より多くの種類の化合物の該１つまたはそれより多くの溶液を該固体支持体に送達し、それによって該化合物はそれぞれ、共有結合性相互作用を介して該固体支持体に結合し、かつ、該化合物のアレイは１ｃｍ２あたり少なくとも１００スポットの密度を有する工程と；
該化合物の該支持体への共有結合を触媒するのに十分な条件下、該固体支持体を蒸気形態の塩基にさらす工程と、
を含む、方法。
【請求項３７】
前記弱求電子性部分がイソシアネート部分である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記弱求電子性部分がイソチオシアネート部分である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記塩基がピリジンである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記化合物の前記支持体への共有結合を触媒するのに十分な前記条件が無水環境で該結合を行う工程を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記化合物の前記支持体への共有結合を触媒するのに十分な前記条件が不活性雰囲気で該結合を行う工程を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
前記不活性雰囲気がアルゴンまたは窒素雰囲気である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
対象となる生体高分子に対する低分子パートナーを同定する方法であって、
請求項１に記載のアレイを提供する工程であって、該アレイはイソシアネート由来のリンカーまたはイソチオシアネート由来のリンカーを介して支持体に結合した低分子のアレイを含み、該低分子のアレイは１ｃｍ２あたり少なくとも１００スポットの密度を有する工程と；
該アレイを対象となる１つまたはそれより多くの種類の生体高分子に接触させる工程と；
特定の低分子−生体高分子パートナーの結合を決定する工程と、
を含む、方法。
【請求項４４】
遺伝子産物に対する低分子パートナーを同定する方法であって、
請求項１に記載のアレイを提供する工程であって、該アレイはイソシアネート由来のリンカーまたはイソチオシアネート由来のリンカーを介して支持体に結合した低分子のアレイを含み、該低分子のアレイは１ｃｍ２あたり少なくとも１００スポットの密度を有する工程と；
該アレイを生体分子のライブラリーに接触させる工程と；
特定の組み換えタンパク質と低分子パートナーとの結合を決定する工程と、
を含む、方法。
【請求項４５】
前記生体分子のライブラリーがタンパク質のライブラリーである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記生体分子のライブラリーが組み換えタンパク質のライブラリーである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記生体分子のライブラリーが細胞溶解産物である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
イソシアネート部分で誘導体化された固体支持体を含む、固体支持体。
【請求項４９】
前記イソシアネート部分が以下の式：
【化９】
2009522576.tif 000087
のものであり、式中、Ｌは置換または非置換で、分枝または非分枝で、環状または非環状で、脂肪族またはヘテロ脂肪族のリンカーである、請求項４８に記載の固体支持体。
【請求項５０】
イソチオシアネート部分で誘導体化された固体支持体を含む、固体支持体。
【請求項５１】
前記イソチオシアネート部分が以下の式：
【化１０】
2009522576.tif 000088
のものであり、式中、Ｌは置換または非置換で、分枝または非分枝で、環状または非環状で、脂肪族またはヘテロ脂肪族のリンカーである、請求項５０に記載の固体支持体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下、２００６年１月３日に出願された米国仮特許出願ＵＳＳＮ６０／７５５，９４６に対する優先権を主張し、この米国仮特許出願は本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（政府援助）
本明細書で記載される研究は、一部、米国国立健康研究所（ＮＩＨ  Ｒ０１−ＡＲ０４９８３２）、米国国立一般医科学研究所（ＧＭ３８６２７）、および米国国立がん研究所の遺伝生化学に対するイニシアチブ（２０ＸＳ１３９Ａ、Ｎ０１−ＣＯ−１２４００）からの助成金によって援助された。米国政府は、本発明における特定の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
対象となる任意のタンパク質または生体分子に対する低分子リガンドを同定する能力は、タンパク質機能の解明および新規の医薬品開発に対して広範囲に影響を及ぼす。天然産物ならびに多様性指向合成（ＤＯＳ）およびコンビナトリアル・ケミストリーの生成物は、豊富な低分子プールを構成し、そこから、対象となるタンパク質または生体分子への特異的リガンドを見つけることができる（非特許文献１；参照により本明細書に引用したものとする）。特に、スプリット−プール合成法の導入（非特許文献２；各々は参照により本明細書に引用したものとする）および適切な標識技術の開発（非特許文献３；参照により本明細書に引用したものとする）により、化学者はポリマー合成ビーズ上に固定化した膨大な天然産物様化合物を今では調製することができる（非特許文献４；参照により本明細書に引用したものとする）。これらのライブラリーは、新規リガンドの発見に対する豊富な分子源を提供する。
【０００４】
このような化合物のライブラリーであれば、これらの化合物をスクリーニングする効率的な方法の可用性が必須になる。広範に使用されている１つの方法はオンビーズ結合アッセイである（非特許文献５；参照により本明細書に引用したものとする）。適切に標識した対象となるタンパク質をライブラリーと混合し、同種リガンドを提示するビーズはその後、発色系または蛍光系アッセイにより同定する（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；各々は参照により本明細書に引用したものとする）。このアプローチの実用性は実証済みであるにもかかわらず、効率的にスクリーニングできるタンパク質の数が少ないため制限される。原理上は、ビーズから１つのタンパク質を剥離し、他のものとビーズを再プローブすることができる；しかしながら、この順次プロセスは遅く、数回の反復のみに制限される。細胞、組織、または有機体における全てのタンパク質に対する特定の低分子リガンドを同定するためには、各化合物を多くの異なるタンパク質に対して平行してスクリーニングすることができるハイスループットアッセイが必要である。Ｂｒｏｗｎら（特許文献１；参照により本明細書に引用したものとする）は、ゲノムの遺伝子および物理的マッピング、遺伝子発現のモニタリング、ＤＮＡ塩基配列決定法、遺伝子診断、有機体の遺伝子型決定法、および研究者へのＤＮＡ試薬の普及など多くの遺伝子用途における大量のハイブリダイゼーションアッセイ用の生体高分子の高密度アレイの形成装置および形成方法を開発したが、ハイスループットスクリーニング用の天然産物様化合物の高密度アレイの開発には至っていない。
【０００５】
近年、低分子マイクロアレイ（ＳＭＭ）は、今まで知られていなかったタンパク質−リガンド相互作用の発見に有用であることが実証されており、タンパク質機能の低分子モジュレータの同定をもたらす（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８；各々は参照により本明細書に引用したものとする）。ＳＭＭを作成するためには、化合物の原液を官能化された顕微鏡用スライドガラスの上にロボット制御でアレイし、その後、対象となるタンパク質または生体分子でインキュベートする。タンパク質と低分子との間の推定相互作用を表すマイクロアレイフィーチャは一般に、蛍光標識抗体および標準蛍光スライドスキャナーを用いて視覚化する。
【０００６】
対象となる生体高分子に対する低分子パートナーを同定するため、ますます多くの複雑な天然産物のようなコンビナトリアルライブラリーに存在する化合物のスクリーニングをハイスループットで行うことができる高密度アレイの生成方法を開発することが望まれているのは明らかである。
【特許文献１】米国特許第５，８０７，５２２号明細書
【非特許文献１】Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，「Ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ｔｈｅ  ｍｉｓｓｉｎｇ  ｌｉｎｋ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｄｏｇｍａ」  Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００５；ｌ（２）：６４−６６
【非特許文献２】Ｆｕｒｋａら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．１９９１，３７，４８７；Ｌａｍら，Ｎａｔｕｒｅ  １９９１，３５４，８２
【非特許文献３】Ｎｅｓｔｌｅｒら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９４，５９，４７２３
【非特許文献４】Ｔａｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８，１２０，８５６５
【非特許文献５】Ｌａｍら，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９７，９７，４１１
【非特許文献６】Ｋａｐｏｏｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８，１２０，２３
【非特許文献７】Ｍｏｒｋｅｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８，１２０，３０
【非特許文献８】Ｓｔ．Ｈｉｌａｒｅら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８，１２０，１３３１２
【非特許文献９】Ｂａｒｎｅｓ−Ｓｅｅｍａｎら  Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｒｏｕｐ  ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ  ｌｉｇａｎｄｓ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２００３；４２（２１）：２３７６−９
【非特許文献１０】Ｆａｚｉｏら  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｓｕｇａｒ  ａｒｒａｙｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ｐｌａｔｅ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００２；１２４（４８）：１４３９７−４０２
【非特許文献１１】Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒら  Ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：  ｃｏｖａｌｅｎｔ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ａｌｃｏｈｏｌ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｏｎ  ｇｌａｓｓ  ｓｌｉｄｅｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０００；１２２：７８４９−５０
【非特許文献１２】Ｈｏｕｓｅｍａｎら  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００２；９（４）：４４３−５４
【非特許文献１３】Ｋａｎｏｈら  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｏｎ  ｇｌａｓｓ  ｓｌｉｄｅｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｐｈｏｔｏａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２００３；４２（４５）：５５８４−７
【非特許文献１４】Ｋｏｈｎら  Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ  ｌｉｇａｔｉｏｎ：  ａ  ｎｅｗ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ａｒｒａｙｓ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２００３；４２（４７）：５８３０−４
【非特許文献１５】ＭａｃＢｅａｔｈら  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｓ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｄｕｌｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｅｎ  ｍａｓｓｅ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １９９９；１２１：７９６７−６８
【非特許文献１６】Ｕｔｔａｍｃｈａｎｄａｎｉら  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｏｆ  ｔａｇｇｅｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｔｒｉａｚｉｎｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ．Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．２００４；６（６）：８６２−８
【非特許文献１７】Ｋｏｅｈｌｅｒら  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｕｓｉｎｇ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ａｎｄ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ−ｏｒｉｅｎｔｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３；１２５（２８）：８４２０−１
【非特許文献１８】Ｋｕｒｕｖｉｌｌａら  Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ−ｏｒｉｅｎｔｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００２；４１６（６８８１）：６５３−７
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
これまで、いくつかの穏やかで選択的なカップリング反応が、ガラス表面上の合成化合物を共有結合的に捕捉し、低分子マイクロアレイを調製するのに使用されている。反応例としては、マイケル付加（ＭａｃＢｅａｔｈら  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｓ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｅｎ  ｍａｓｓｅ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９９；１２１：７９６７−６８；米国特許第６，８２４，９８７号明細書、２００４年１１月３０日に発行；米国特許出願第１０／９９８，８６７号、２００４年１１月２９日に出願、２００５年５月５日に米国特許第２００５／００９５６３９号明細書として公開；各々は参照により本明細書に引用したものとする）、第一級アルコールのシリルクロリドへの付加（Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒら  Ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：  ｃｏｖａｌｅｎｔ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ａｌｃｏｈｏｌ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｏｎ  ｇｌａｓｓ  ｓｌｉｄｅｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０００；１２２：７８４９−５０；参照により本明細書に引用したものとする）、ジアゾベンジリデン媒介によるフェノール類の捕捉（Ｂａｒｎｅｓ−Ｓｅｅｍａｎら  Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｒｏｕｐ  ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ  ｌｉｇａｎｄｓ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２００３；４２（２１）：２３７６−９；米国特許出願第１０／３７０，８８５号、２００３年２月２０日に出願、２００３年１１月２０日に米国特許第２００３／０２１５８７６号明細書として公開；各々は参照により本明細書に引用したものとする）、１，３−双極性付加環化（Ｆａｚｉｏら  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｓｕｇａｒ  ａｒｒａｙｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ｐｌａｔｅ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００２；１２４（４８）：１４３９７−４０２；参照により本明細書に引用したものとする）、ディールス・アルダー反応（Ｈｏｕｓｅｍａｎら  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ２００２；９（４）：４４３−５４；参照により本明細書に引用したものとする）、ホスファン修飾したスライド上のアジド類のストーディンガーライゲーション（Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）（Ｋｏｈｎら  Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ  ｌｉｇａｔｉｏｎ：  ａ  ｎｅｗ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ａｒｒａｙｓ．Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ２００３；４２（４７）：５８３０−４；参照により本明細書に引用したものとする）、およびエポキシド官能化されたガラス上のヒドラジド結合した化合物の捕捉お��びその逆（Ｌｅｅら  Ｆａｃｉｌｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｂｙ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ，  ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ  ｏｎ  ｈｙｄｒａｚｉｄｅ−ｃｏａｔｅｄ  ｇｌａｓｓ  ｓｌｉｄｅｓ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００５；７（１９）：４２６９−７２；Ｌｅｅら  Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｂｙ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ  ｏｎ  Ｅｐｏｘｉｄｅ−Ｃｏａｔｅｄ  Ｇｌａｓｓ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２００５；４４（１９）：２８８１−２８８４；各々は参照により本明細書に引用したものとする）が挙げられる。これらの表面捕捉方法のほとんどは、固相有機合成の一部として導入し、表面上の低分子の配向をバイアスするアルコールまたはアジドなどの官能基を利用する（Ｋｏｈｎら  Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ  ｌｉｇａｔｉｏｎ：ａ  ｎｅｗ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ａｒｒａｙｓ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２００３；４２（４７）：５８３０−４；Ｔａｌｌａｒｉｃｏら  Ａｎ  ａｌｋｙｌｓｉｌｙｌ−ｔｅｔｈｅｒｅｄ，ｈｉｇｈ−ｃａｐａｃｉｔｙ  ｓｏｌｉｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ａｍｅｎａｂｌｅ  ｔｏ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ−ｏｒｉｅｎｔｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｆｏｒ  ｏｎｅ−ｂｅａｄ，ｏｎｅ−ｓｔｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．２００１；３（３）：３１２−８；各々は参照により本明細書に引用したものとする）。非選択的光誘起架橋は、スライドガラス上の１０個の複合天然産物のセットの固定化にも使用されている（Ｋａｎｏｈら  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｏｎ  ｇｌａｓｓ  ｓｌｉｄｅｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｐｈｏｔｏａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ２００３；４２（４５）：５５８４−７；参照により本明細書に引用したものとする）。ペプチド核酸共役のオリゴヌクレオチドアレイへのハイブリダイゼーションなどの非共有結合性アプローチも使用されている（Ｗｉｎｓｓｉｎｇｅｒら  ＰＮＡ−ｅｎｃｏｄｅｄ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ．Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ２００４；ｌｌ（１０）：１３５１−６０；Ｗｉｎｓｓｉｎｇｅｒら  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００２；９９（１７）：１１１３９−４４；各々は参照により本明細書に引用したものとする）。
【０００８】
選択的アプローチを用いて、塩素化スライド上に第一級アルコールを介して捕捉することにより、またはジアゾベンジリデンで官能化されたスライド上にフェノール類の捕捉を介して、多様性指向合成経路の５０，０００個を超える生成物が固定化された（Ｂａｒｎｅｓ−Ｓｅｅｍａｎら  Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｒｏｕｐ  ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ  ｌｉｇａｎｄｓ．Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ２００３；４２（２１）：２３７６−９；Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒら  Ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：  ｃｏｖａｌｅｎｔ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ａｌｃｏｈｏｌ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｏｎ  ｇｌａｓｓ  ｓｌｉｄｅｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０００；１２２：７８４９−５０；Ｋｏｅｈｌｅｒら  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｕｓｉｎｇ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ａｎｄ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ−ｏｒｉｅｎｔｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３；１２５（２８）：８４２０−２１；各々は参照により本明細書に引用したものとする）。上述のアプローチは、第一級アルコールまたはフェノールのいずれかを含む化合物に対して別々のマイクロアレイの使用を要する。さらに、合成化合物はもちろん、必ずしも第一級アルコール類またはフェノール類を有するとは限らない天然源からの化合物もマイクロアレイに含めることが望まれた。新たな捕捉戦略では、合成化合物および天然化合物の両方に存在するいくつかの共通の官能基を固定化することができる。
【０００９】
本発明は、望ましい特性または相互作用を同定するための化合物のハイスループットスクリーニングシステムを提供する。好ましい実施形態において、本発明は、対象となる生体高分子と相互作用可能な化合物の同定を容易化するシステムを提供する。一態様において、本明細書で論じられるようにイソシアネート化学を用いて固体支持体に結合した１より多くの種類の化合物のアレイを含む組成物を提供する。ある実施形態において、化合物のアレイの密度は、１ｃｍ２あたり少なくとも５００スポット、１ｃｍ２あたり少なくとも１０００スポット、１ｃｍ２あたり少なくとも５０００スポット、または１ｃｍ２あたり少なくとも１０，０００スポットである。別の態様において、イソシアネート化学を用いてガラスまたはポリマー支持体に結合した複数の１つまたはそれより多くの種類の非オリゴマー性化合物を含む組成物を提供し、化合物のアレイの密度は、１ｃｍ２あたり少なくとも１０００スポットを含む。特に好ましい実施形態において、化合物は非ペプチド性および非オリゴマー性である。ある実施形態において、化合物は低分子である。ある実施形態において、化合物は天然産物である。ある実施形態において、化合物は化合物の混合物（例えば、粗天然産物の抽出物、低分子の混合物等）である。化合物は、支持体に結合している化合物上の官能基とイソシアネートまたはイソチオシアネート官能化された支持体との間の反応経由で共有結合性相互作用を介して固体支持体に結合されている。特定の実施形態において、化合物は、本明細書で論じられるイソシアネートまたはイソチオシアネート化学を用いてガラス表面（例えば、スライドガラス）に結合している。一般に、本発明のアレイは：（１）固体支持体を提供する工程であって、前記固体支持体は種々の官能基と相互作用可能なイソシアネートまたはイソチオシアネート部分で官能化されて共有結合を形成する工程と；（２）固体支持体に結合される１つまたはそれより多くの種類の化合物の１つまたはそれより多くの溶液を提供する工程と；（３）前記１つまたはそれより多くの種類の化合物を官能化された固体支持体に送達する工程と；（４）スポットした支持体を求核試薬（例えば、ピリジン蒸気）にさらす工程と、により生成され、それにより、支持体に共有結合した化合物のアレイが生成される（図２）。ある実施形態において、アレイは１ｃｍ２あたり少なくとも１０００スポット密度を含む。他の実施形態において、アレイは１ｃｍ２あたり少なくとも５０００スポット、より好ましくは１ｃｍ２あたり少なくとも１０，０００スポットの密度を含む。
【００１０】
一態様において、化合物は下記に示されるようにイソシアネート化学を用いて固体支持体に結合しており：
【００１１】
【化１１】
2009522576.tif 000003
式中、
支持体はガラス表面、スライドガラス、ポリマー支持体、プラスチック支持体、金属支持体などの固体支持体であり；
Ｌは置換または非置換で、分枝または非分枝で、環状または非環状で、脂肪族またはヘテロ脂肪族のリンカー（例えば、ポリエチレングリコールスペーサー、ポリエチレンリンカー、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−；−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、等）であり；
ｎは１以上１２以下の整数であり；
ＸはＮ、Ｓ、またはＯであり；
Ｒは固体支持体に結合されている化合物である。リンケージは、化合物を式の活性化表面と反応させることで生成され：
【００１２】
【化１２】
2009522576.tif 000004
式中、Ｌおよび支持体は上記のように定義される。
【００１３】
ある特定の実施形態において、化合物は下記に示されるようにリンケージを介して固体支持体に結合しており：
【００１４】
【化１３】
2009522576.tif 000005
式中、
支持体はガラス表面、スライドガラス、ポリマー支持体、プラスチック支持体、金属支持体などの固体支持体であり；
Ｌは置換または非置換で、分枝または非分枝で、環状または非環状で、脂肪族またはヘテロ脂肪族のリンカー（例えば、ポリエチレングリコールスペーサー、ポリエチレンリンカー、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−；−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、等）であり；
ｎは１以上１２以下の整数であり；
ＸはＮ、Ｓ、またはＯであり；
Ｒは固体支持体に結合されている化合物である。ある実施形態において、Ｌは
【００１５】
【化１４】
2009522576.tif 000006
であり；ｎは６である。
【００１６】
別の態様において、化合物は下記に示されるようにイソチオシアネート化学を用いて固体支持体に結合しており：
【００１７】
【化１５】
2009522576.tif 000007
式中、
支持体はガラス表面、スライドガラス、ポリマー支持体、プラスチック支持体、金属支持体などの固体支持体であり；
Ｌは置換または非置換で、分枝または非分枝で、環状または非環状で、脂肪族またはヘテロ脂肪族のリンカー（例えば、ポリエチレングリコールスペーサー、ポリエチレンリンカー、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−；−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、等）であり；
ｎは１以上１２以下の整数であり；
ＸはＮ、Ｓ、またはＯであり；
Ｒは固体支持体に結合されている化合物である。リンケージは、化合物を式の活性化表面と反応させることで生成され：
【００１８】
【化１６】
2009522576.tif 000008
式中、Ｌおよび支持体は上記のように定義される。
【００１９】
ある実施形態において、化合物は下記に示されるようにリンケージを介して固体支持体に結合しており：
【００２０】
【化１７】
2009522576.tif 000009
式中、
支持体はガラス表面、スライドガラス、ポリマー支持体、プラスチック支持体、金属支持体などの固体支持体であり；
Ｌは置換または非置換で、分枝または非分枝で、環状または非環状で、脂肪族またはヘテロ脂肪族のリンカー（例えば、ポリエチレングリコールスペーサー、ポリエチレンリンカー、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−；−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、等）であり；
ｎは１以上１２以下の整数であり；
ＸはＮ、Ｓ、またはＯであり；
Ｒは前記固体支持体に結合されている前記化合物である。ある実施形態において、Ｌは
【００２１】
【化１８】
2009522576.tif 000010
であり；ｎは６である。
【００２２】
別の態様において、本発明はイソシアネート官能化された固体支持体を提供する。ある実施形態において、固体支持体上の官能基は以下の式：
【００２３】
【化１９】
2009522576.tif 000011
式中、
支持体はガラス表面、スライドガラス、ポリマー支持体、プラスチック支持体、金属支持体などの固体支持体であり；
Ｌは置換または非置換で、分枝または非分枝で、環状または非環状で、脂肪族またはヘテロ脂肪族のリンカー（例えば、ポリエチレングリコールスペーサー、ポリエチレンリンカー、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−；−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、等）であり；
ｎは１以上１２以下の整数である。ある実施形態において、Ｌは
【００２４】
【化２０】
2009522576.tif 000012
であり；ｎは６である。
【００２５】
別の態様において、本発明はイソチオシアネート官能化された固体支持体を提供する。ある実施形態において、固体支持体上の官能基は以下の式：
【００２６】
【化２１】
2009522576.tif 000013
式中、
支持体はガラス表面、スライドガラス、ポリマー支持体、プラスチック支持体、金属支持体などの固体支持体であり；
Ｌは置換または非置換で、分枝または非分枝で、環状または非環状で、脂肪族またはヘテロ脂肪族のリンカー（例えば、ポリエチレングリコールスペーサー、ポリエチレンリンカー、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−；−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、等）であり；
ｎは１以上１２以下の整数である。ある実施形態において、Ｌは
【００２７】
【化２２】
2009522576.tif 000014
であり；ｎは６である。
【００２８】
別の態様において、本発明は：（１）１つまたはそれより多くの種類の化合物（例えば、より好ましくは、低分子）のアレイを提供する工程と、アレイは１ｃｍ２あたり少なくとも１０００スポットを含む密度を有している；（２）アレイを対象となる１つまたはそれより多くの種類の生体高分子と接触させる工程と；（３）特定の低分子−生体高分子パートナーの相互作用を決定する工程と、を含む、対象となる生体高分子（例えば、タンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド）に対する低分子パートナーを同定するためのこれらのアレイの利用方法を提供する。好ましい実施形態において、対象となる生体高分子は、１つまたはそれより多くのタンパク質またはペプチドの集合体を含む。特に好ましい実施形態において、対象となる生体高分子は１つまたはそれより多くの組み換えタンパク質の集合体を含む。別の好ましい実施形態において、対象となる生体高分子は細胞溶解産物（例えば、細菌細胞溶解産物、酵母菌細胞溶解産物、哺乳類細胞溶解産物、ヒト細胞溶解産物）からの高分子の集合体を含む。別の好ましい実施形態において、対象となる生体高分子はポリヌクレオチドを含む。
【００２９】
（定義）
特記無き場合、下記に定義される語は以下の意味を有する：
「脂肪族」：本明細書で使用する「脂肪族」なる語は、飽和および不飽和の両方、直鎖（すなわち、非分枝状）、分枝状、非環状、環状、または多環脂肪族の炭化水素を含み、これらは、１つまたはそれより多くの官能基で任意に置換される。当業者には当然のことであるが、本明細書で「脂肪族」には、限定的ではないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、およびシクロアルキニル部分を含めるものとする。そのため、本明細書で使用する「アルキル」なる語には、直鎖、分枝、および環状アルキル基が含まれる。同様の規定が、例えば「アルケニル」、「アルキニル」等の他の一般的な用語にも適用される。さらに、本明細書で使用する「アルキル」、「アルケニル」、「アルキニル」等なる語は、置換および未置換基の両方を包含する。ある実施形態において、本明細書で使用する「低級アルキル」は、１〜６個の炭素原子を有するこれらのアルキル基（環状、非環状、置換、未置換、分枝または非分枝）を示すのに使用する。
【００３０】
ある実施形態において、本発明で用いられるアルキル、アルケニル、およびアルキニル基は１〜２０個の脂肪族炭素原子を含む。ある他の実施形態において、本発明で用いられるアルキル、アルケニル、およびアルキニル基は１〜１０個の脂肪族炭素原子を含む。さらに他の実施形態において、本発明で用いられるアルキル、アルケニル、およびアルキニル基は１〜８個の脂肪族炭素原子を含む。さらに他の実施形態において、本発明で用いられるアルキル、アルケニル、およびアルキニル基は１〜６個の脂肪族炭素原子を含む。他の実施形態において、本発明で用いられるアルキル、アルケニル、およびアルキニル基は１〜４個の炭素原子を含む。そのため、脂肪族基の例としては、限定的ではないが、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、−ＣＨ２−シクロプロピル、ビニル、アリル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロブチル、−ＣＨ２−シクロブチル、ｎ−ペンチル、ｓｅｃ−ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、シクロペンチル、−ＣＨ２−シクロペンチル、ｎ−ヘキシル、ｓｅｃ−ヘキシル、シクロヘキシル、−ＣＨ２−シクロヘキシル部分等が挙げられ、これはまた、１つまたはそれより多くの置換基を有してもよい。アルケニル基としては、限定的ではないが、例えば、エテニル、プロペニル、ブテニル、１−メチル−２−ブテン−１−イル等が挙げられる。代表的なアルキニル基としては、限定的ではないが、エチニル、２−プロピニル（プロパルギル）、１−プロピニル等が挙げられる。
【００３１】
「アンチリガンド」：本明細書で使用する「アンチリガンド」なる語は、リガンド／アンチリガンド結合対の対向メンバーのことを言う。アンチリガンドは、例えば、エフェクター／レセプター結合対におけるタンパク質または他の高分子レセプターであってよい。
【００３２】
「化合物」：本明細書で使用する「化合物（ｃｏｕｍｐｏｕｎｄ）」または「化合物（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｕｍｐｏｕｎｄ）」なる語は、有機金属化合物、有機化合物、金属、遷移金属複合体、および低分子を含むことができる。ある好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、化合物の定義から除外される。他の好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドおよびペプチドは化合物の定義から除外される。特に好ましい実施形態において、化合物なる語は、低分子（例えば、好ましくは、非ペプチド性および非オリゴマー性）のことを言い、ペプチド、ポリヌクレオチド、遷移金属複合体、金属、および有機金属化合物は除外する。
【００３３】
「環状」：本明細書で使用する「環状」なる語は、芳香族または非芳香族環系のことを言う。環系は単環または多環（例えば、二環、三環等）であってよい。環は炭素原子のみを含んでよく、または、環はＮ、Ｏ、Ｐ、またはＳなどのヘテロ原子を複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ等）含んでよい。多環の環系において、環は脂肪族またはヘテロ脂肪族リンケージを介して結合してよく、環は共有炭素−炭素結合または炭素−ヘテロ原子結合経由で結合してもよく、環は互いに縮合してもよく、または、環はスピロ結合してもよい。環系は置換されることもできる。
【００３４】
「複素脂肪族」：本明細書で使用する「複素脂肪族」なる語は、例えば、炭素原子の代わりに１つまたはそれより多くの酸素、硫黄、窒素、リン、またはシリコン原子を含む脂肪族部分のことを言う。複素脂肪族部分は、分枝、非分枝、環状または非環状であってよく、かつ、モルホリノ、ピロリジニルなどの飽和および不飽和の複素環を含む。ある実施形態において、複素脂肪族部分は、その部分上にある１つまたはそれより多くの水素原子を、限定的ではないが、脂肪族；複素脂肪族；アリール；ヘテロアリール；アリールアルキル；ヘテロアリールアルキル；アルコキシ；アリールオキシ；ヘテロアルコキシ；ヘテロアリールオキシ；アルキルチオ；アリールチオ；ヘテロアルキルチオ；ヘテロアリールチオ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＯＨ；−ＮＯ２；−ＣＮ；−ＣＦ３；−ＣＨ２ＣＦ３；−ＣＨＣｌ２；−ＣＨ２ＯＨ；−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ；−ＣＨ２ＮＨ２；−ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ３；−Ｃ（Ｏ）Ｒｘ；−ＣＯ２（Ｒｘ）；−ＣＯＮ（Ｒｘ）２；−ＯＣ（Ｏ）Ｒｘ；−ＯＣＯ２Ｒｘ；−ＯＣＯＮ（Ｒｘ）２；−Ｎ（Ｒｘ）２；−Ｓ（Ｏ）２Ｒｘ；−ＮＲｘ（ＣＯ）Ｒｘを含む１つまたはそれより多くの部分で個々に置き換えることで置換され、式中、Ｒｘはそれぞれ独立して、限定的ではないが、脂肪族、複素脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、またはヘテロアリールアルキルを含み、上述および本明細書で述べる脂肪族、複素脂肪族、アリールアルキル、またはヘテロアリールアルキル置換基のいずれも置換または非置換、分枝または非分枝、環状または非環状であってよく、上述および本明細書で述べるアリールまたはヘテロアリール置換基のいずれも置換または非置換であってよい。
【００３５】
「リガンド」：本明細書で使用する「リガンド」なる語は、リガンド／アンチリガンド結合対の１つのメンバーのことを言い、本明細書では「低分子」とも呼ばれる。リガンドまたは低分子は、例えば、エフェクター／レセプター結合対のエフェクター分子であってもよい。
【００３６】
「マイクロアレイ」：本明細書で使用する「マイクロアレイ」なる語は、少なくとも約１０００個／ｃｍ２の離散領域密度を有する、領域の規則的なアレイ、好ましくは低分子化合物のスポットである。
【００３７】
「天然産物様化合物」：本明細書で使用する「天然産物様化合物」なる語は、自然が進化を通して選択してきた複雑な天然産物と同様な化合物のことを言う。一般に、これらの化合物は、１つまたはそれより多くの立体中心、高密度および多様な官能性、および１つの構造体内に原子の多様な選択を含む。この場合、多様な官能性とは、いつくか例を挙げると、化合物に存在する官能基のトポロジー、電荷、サイズ、親水性、疎水性、および反応性が変化することと定義できる。本明細書で使用する「高密度の官能性」なる語は、３つまたはそれ以上の潜在性または活性な多様化可能な官能部分を好ましくは含む任意の分子を定義するのに好ましくは使用することができる。これらの構造特性は、本発明の化合物が特定の生物学的レセプターと特異的に相互作用可能なため、機能的に天然産物のようにもなり得るので、本発明の化合物は機能的に、複雑な天然産物をさらに想起させる場合がある。
【００３８】
「ペプチド」：本発明によれば、「ペプチド」は、ペプチド結合によって互いに結合した一連の少なくとも３つのアミノ酸を含む。ペプチドは個々のペプチドまたはペプチドの集合体のことを言う。本発明のペプチドは天然アミノ酸のみを含むのが好ましいが、当業者には公知のように、非天然アミノ酸（すなわち、自然に発生しないが、ポリペプチド鎖に取り込むことができる化合物）および／またはアミノ酸類似体を代わりに用いてもよい。さらに、本発明のペプチドにおける１つまたはそれより多くのアミノ酸は、例えば、炭水化物基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、共役、官能化、または他の修飾用のリンカーなどのケミカルエンティティの付加によって修飾される。
【００３９】
「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」：ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドはヌクレオチドのポリマーのことを言う。ポリマーは、天然ヌクレオシド（すなわち、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）、ヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−メチルシチジン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、および２−チオシチジン）、化学的修飾塩基、生物学的修飾塩基（例えば、メチル化塩基）、媒介塩基、修飾糖（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）、または修飾リン酸基（例えば、ホスホロチオネートおよび５’−Ｎ−ホスホラミダイトリンケージ）を含むことができる。
【００４０】
「低分子」：本明細書で使用する「低分子」なる語は、研究室で合成されるかまたは天然に見られるいずれかの非ペプチド性、非オリゴマー性有機化合物のことを言う。本明細書で使用する低分子は、「天然産物様」化合物のことを言うが、「低分子」なる語は、「天然産物様」化合物に限定されない。むしろ、低分子はいくつかの炭素炭素結合を含み、かつ、１５００未満の分子量を有することを一般に特徴とするが、この特徴は本発明の目的を限定するものではない。自然に発生する「低分子」の例としては、限定的ではないが、タクソール、ダイネミシン、およびラパマイシンが挙げられる。研究室で合成される「低分子」の例としては、限定的ではないが、Ｔａｎら，（「Ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｏｖｅｒ  Ｔｗｏ  Ｍｉｌｌｉｏｎ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  Ｈａｖｉｎｇ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｆｅａｔｕｒｅｓ  Ｂｏｔｈ  Ｒｅｍｉｎｉｓｃｅｎｔ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｗｉｔｈ  Ｍｉｎｉａｔｕｒｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌ−Ｂａｓｅｄ  Ａｓｓａｙｓ」Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８，１２０，８５６５；参照により本明細書に引用したものとする）、および、その内容全体を参照により本明細書に引用したものとする、係属中の特許出願第０８／９５１，９３０号，「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  Ｒｅｍｉｎｉｓｃｅｎｔ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ」に記載される化合物が挙げられる。ある他の好ましい実施形態において、天然産物様低分子を利用する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
（ある好適な実施形態の説明）
１００万と同等またはそれ以上のメンバーを有する天然産物様化合物の複雑なケミカルライブラリーの生成における近年の進歩により、生物活性に対してこれらの化合物の効率的スクリーニングを容易化するその後の必要性を生じている。この目的のために、本発明は、対象となる望ましい特性を有する非常に多数の化学物質を同定するためそれら化学物質のハイスループットスクリーニングを可能にするシステムを提供する。ある実施形態において、生体高分子と相互作用可能な非常に多くの化学物質を同定するためそれら化学物質のハイスループットスクリーニングを可能にする方法および組成物を提供する。ある実施形態において、本発明のスクリーニングシステムは、対象となる生体高分子の低分子結合パートナーを同定するのに使用される。
【００４２】
一態様において、本発明は、１ｃｍ２あたり少なくとも１０００スポットの密度を有するイソシアネートまたはイソチオシアネート化学を用いて固体支持体に結合した化学物質のアレイを含む組成物およびこれらのアレイの生成方法を提供する。特別な実施形態において、本発明は、スプリットアンドプール合成技術、パラレル合成技術、および従来の１度に１つずつの合成技術から生成される低分子、より好ましくは天然産物様化合物のアレイを提供する。ある実施形態において、低分子は低分子の混合物である。ある実施形態において、低分子は天然産物または天然産物の抽出物である。低分子は精製または部分的に精製されていてよい。さらに、化合物の既存の集合体は、望ましい特性を有する化合物に対してスクリーニング可能な高密度アレイを提供するため、本発明で利用してもよい。別の態様において、本発明は、イソシアネートおよびイソチオシアネート化学に基づいた本発明の化学物質アレイを用いたリガンド（低分子）−アンチリガンド（生体高分子）結合対の同定方法を提供する。アンチリガンドはタンパク質、好ましくは組み換えタンパク質であることが特に好ましく、組み換えタンパク質のライブラリーを検出方法で利用するのがさらに特に好ましい。
【００４３】
他の実施形態において、アンチリガンドは細胞溶解産物からの高分子を含む。任意の細胞を溶解物の調製に使用してよい。例えば、細菌性細胞、ヒト細胞、酵母菌細胞、哺乳類細胞、マウス細胞、線虫細胞、真菌細胞、植物細胞、癌細胞、腫瘍細胞、実験室細胞株からの細胞等。ある実施形態において、ストレプトミセス細胞抽出物を本発明で利用する。ある実施形態において、哺乳類細胞抽出物を本発明で利用する。ある実施形態において、ヒト細胞抽出物を本発明で利用する。溶解物は、例えば、超音波処理、均質化、リゾチーム処理、加圧型細胞破壊装置等の当業界で公知の任意の技術を用いて調製してよい。細胞溶解産物はそのままで使用してもよいかまたは本発明のシステムで使用する前に部分的に精製されていてもよい。ある実施形態において、細胞溶解産物を遠心分離で清澄化する。他の実施形態において、核酸を溶解物の使用前に除去する。ある実施形態において、細胞溶解産物を溶媒で抽出する。ある実施形態において、細胞溶解産物を本発明のスクリーニングシステムに使用する。
【００４４】
低分子プリンティング
前述のように、一態様において、本発明は、本明細書において「低分子プリンティング」と呼ばれる、高密度アレイの生成方法および結果的に得られる組成物を提供し、ここで低分子はイソシアネート化学（例えば、図２に示すように）またはイソチオシアネート化学を用いて固体支持体に結合されている。
【００４５】
本発明の方法によると、化学物質の集合体、または、１種類の化合物は、高密度アレイを生成するため支持体の上に「プリント」される。一般に、この方法は、（１）結合（単数または複数）を形成するため固体支持体を提供する工程と、固体支持体は、所望の化学物質または化学物質の集合体と相互作用可能なイソシアネートまたはイソチオシアネート部分で官能化される；（２）固体支持体に結合される同一または異なる化学物質の１つまたはそれより多くの溶液を提供する工程と；（３）同一または異なる化学物質の１つまたはそれより多くの溶液を固体支持体に送達する工程と；（４）プリントされた支持体を支持体の上の低分子の共有結合捕捉を触媒する求核試薬（例えば、ピリジン蒸気）にさらす工程と、を含み、これにより化合物のアレイを生成し、アレイは１ｃｍ２あたり少なくとも１０００スポットの密度を有する。
【００４６】
当業者には分かるように、固体支持体と結合を形成可能な任意の所望の化学物質を利用することができるが、天然産物様化合物、好ましくは低分子、特にスプリットアンドプールライブラリーまたはパラレル合成から生成された低分子を利用するのが特に好ましい。本発明で利用できる天然産物様化合物のライブラリーの例としては、限定的ではないが、Ｔａｎら（「Ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｏｖｅｒ  Ｔｗｏ  Ｍｉｌｌｉｏｎ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  Ｈａｖｉｎｇ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｆｅａｔｕｒｅｓ  Ｂｏｔｈ  Ｒｅｍｉｎｉｓｃｅｎｔ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｗｉｔｈ  Ｍｉｎｉａｔｕｒｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌ−Ｂａｓｅｄ  Ａｓｓａｙｓ」，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１９９８，１２０，８５６５）に記載されているシキミ酸系ライブラリーが挙げられ、これは参照により本明細書に引用したものとする。当業者が理解するように、スプリットアンドプールライブラリーの使用により、化合物の生成およびスクリーニングをより効率的に行うことが可能になる。しかしながら、パラレル合成方法および従来の方法（１度に１つずつの合成およびこれらの構造の修飾）により合成される低分子は、さらなる合成的修飾をせずに固体支持体に結合することが可能な天然由来の化合物、または化合物の他の集合体、好ましくは非オリゴマー性化合物を利用できるように、本発明の組成物および方法においても利用できる。マイクロアレイに結合する化合物は、アルドリッチ、シグマなどの市販供給元から購入することもできる。
【００４７】
当業者には分かるように、スプリットアンドプール技術において（例えば、Ｆｕｒｋａら，Ａｂｓｔｒ．１４ｔｈ  Ｉｎｔ．Ｃｏｎｇｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｐｒａｇｕｅ，Ｃｚｅｃｈｏｓｌｏｖａｋｉａ，１９８８，５，４７；Ｆｕｒｋａら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．１９９１，３７，４８７；Ｓｅｂｅｓｔｙｅｎら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１９９３，３，４１３を参照すること；各々は参照により本明細書に引用したものとする）、関連化合物の混合物は同一の反応容器で作ることができるため、１００万と同等またはそれ以上のライブラリーメンバーを含む関連化合物の混合物など非常に大きなライブラリーの合成に必要な入れ物の数を大幅に削減する。一例として、固体支持体に結合したスカッフォールド（足場）はｎ個の容器に分割することができ、ここでｎは支持体と結合した足場と反応する試薬Ａの種類の数を表す。反応後、ｎ個の容器からの内容量を組み合わせ、その後、ｍ個の容器に分割し、ここでｍは支持体と結合した足場と反応する試薬Ｂの種類の数を表す。この手順は、所望の数の試薬を足場構造と反応させ、所望の化合物ライブラリーを産生するまで繰り返す。
【００４８】
上述のように、パラレル合成方法の使用もまた適用可能である。パラレル合成技術は従来、それら自身の反応容器中で生成物の別々のアセンブリに関与する。例えば、反応が起こり得る少量の溶媒を保持できる、ｎ行ｍ列の小さなウェルを含むマイクロタイタープレートを利用することができる。そのため、ｎ×ｍ個の化合物ライブラリーを得るために反応物タイプＡのｎ個の変異体を反応物タイプＢのｍ個の変異体と反応させることができる。
【００４９】
その後に、所望の化合物が適切な方法を用いていったん提供されると、所望の化合物の溶液を調製する。好ましい実施形態において、化合物を固体支持体上で合成し、結果的に得られる合成ビーズをその後、ウェルあたり１ビーズの密度でポリプロピレン製マイクロタイタープレートに分配する。しかし、一例において、実施例において以下に論じるように、結合した化合物をその後、これらのビーズから放出し、少量の適当な溶媒中に溶解する。各ビーズに存在する化合物が微少量であるため、その後のアッセイは極度に小型化する必要がある。そのため、特に好ましい実施形態において、高精度の転写アレイロボット（Ｓｃｈｅｎａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９５，２７０，４６７；Ｓｈａｌｏｎら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９６，６，６３９；各々は参照により本明細書に引用したものとする）は、各ウェルから少量の溶解化合物を取り出し、およそ０．１〜１０ｎＬの溶液（例えば、およそ０．０１ｍＭ〜２０ｍＭ）をイソシアネート官能化された一連の顕微鏡用スライドガラス上の規定位置に繰り返し送達するのに使用することができる。化合物は、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、メタノール、ＴＨＦなどの有機溶媒中の溶液として提供できる。これらのイソシアネートまたはイソチオシアネート官能化された顕微鏡用スライドガラスは、実施例に示され、論じられるようにスライドの片面に溶液を均一に塗布できるカスタム・スライドサイズ反応容器を用いて調製するのが好ましい。これにより、スライド上に化合物の微細スポットを形成し、好ましい実施形態において、これらのスポットは直径２００〜２５０μｍである。しかしながら、当業者であれば、本発明は、１ｎＬ容量の溶液の送達に限定されるものではなく、ピコリットルまたはそれよりも少ない容量を送達できる送達の代替手段を使用できることが理解されるであろう。そのため、高精度のアレイロボット（例えば、ＯｍｎｉＧｒｉｄ（登録商標）１００マイクロアレイヤー（ゲノミック・ソリューションズ））に加えて、化合物の他の送達手段を使用することができ、限定的ではないが、インクジェットプリンタ、圧電プリンタ、および少容量ピペッティングロボットが挙げられる。
【００５０】
前述のように、各化合物は支持体表面への結合を介在する共通の官能基を含む。形成された結合は強固であるのが好ましく、そのため、エステル、チオエステル、またはアミドの共有結合の形成が特に好ましい。イソシアネートまたはイソチオシアネート化学は、化学物質の高密度アレイを生成するのに使用する。リンケージのロバスト性に加えて、他に考慮すべきことは、利用する固体支持体と支持体に結合される化合物の特定のクラスが挙げられる。特に好ましい支持体は、限定的ではないが、スライドガラス、ポリマー支持体または他の固体材料支持体、および柔軟膜支持体が挙げられる。
【００５１】
他の実施形態において、実施例１で論じられるように、化合物は、イソシアネートまたはイソチオシアネートなどの求電子試薬にアレイされている化合物の官能基の求核付加によって結合される。イソシアネートまたはイソチオシアネートへの付加に有用であることがわかった官能基としては、第一級アルコール類、第二級アルコール類、フェノール類、チオール類、アニリン類、ヒドロキサム酸、脂肪族アミン類、第一級アミド類、およびスルホンアミド類が挙げられる。ある実施形態において、求核付加反応はピリジンなどの蒸気によって触媒される。他の揮発性求核試薬を使用してもよい。ある実施形態において、求核試薬としては、アミンが挙げられる。ある実施形態において、ヘテロアリール試薬を使用する。例えば、スポットされたスライドは、イソシアネート−またはイソチオシアネート−誘導体化された固体支持体への化学物質の結合を促進するために、乾燥し、その後、無湿環境（例えば、窒素雰囲気、アルゴン雰囲気）でピリジン蒸気にさらすことができる。
【００５２】
スライドはその後、随意的に洗浄し乾燥させる。本発明の方法を用いて調製したスライドはスクリーニング前に数ヵ月間、−２０℃で保存することができる。スライドはデシケーターで調製してもよい。
【００５３】
一実施形態において、化合物は以下の式に示すようにイソシアネート化学を用いて固体支持体に結合しており：
【００５４】
【化２３】
2009522576.tif 000015
式中、
支持体はガラス表面、スライドガラス、ポリマー支持体、プラスチック支持体、金属支持体などの固体支持体であり；
Ｌは置換または非置換で、分枝または非分枝で、環状または非環状で、脂肪族またはヘテロ脂肪族のリンカー（例えば、ポリエチレングリコールスペーサー、ポリエチレンリンカー、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−；−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、等）であり；
ＸはＮ、Ｓ、またはＯであり；
Ｒは固体支持体に結合されている化学物質である。リンケージは、化合物を式の活性化表面と反応させることで生成され：
【００５５】
【化２４】
2009522576.tif 000016
式中、Ｌおよび支持体は上記のように定義される。リンカーは０〜２００の原子の長さ、０〜１００の原子の長さ、０〜５０の原子の長さ、２〜５０の原子の長さ、１０〜３０の原子の長さ、または２０〜３０の原子の長さである。ある実施形態において、リンカーは少なくとも２原子の長さ、少なくとも５原子の長さ、少なくとも１０原子の長さ、または少なくとも２０原子の長さである。ある実施形態において、リンカーは非環状である。他の実施形態において、リンカーは環状部分を含む。例えば、リンカーは、アリール、ヘテロアリール、炭素環、または複素環部分を含むことができる。ある実施形態において、リンカーはフェニル環を含む。ある実施形態において、リンカーは分枝状である。他の実施形態において、リンカーは非分枝状である。ある実施形態において、リンカーはＯ、Ｎ、またはＳを含むヘテロ原子を含む。ある実施形態において、リンカーはヘテロ原子を含まない。ある実施形態において、リンカーは、カルボニル、エステル、チオエステル、アミド、カーボネート、カルバモイル、またはウレア部分を含む。ある実施形態において、リンカーはハロゲン原子を含む。
【００５６】
ある特定の実施形態において、化合物は下記の以下の式に示すようにリンケージを介して固体支持体に結合しており：
【００５７】
【化２５】
2009522576.tif 000017
式中、
支持体はガラス表面、スライドガラス、ポリマー支持体、プラスチック支持体、金属支持体などの固体支持体であり；
Ｌは置換または非置換で、分枝または非分枝で、環状または非環状で、脂肪族またはヘテロ脂肪族のリンカー（例えば、ポリエチレングリコールスペーサー、ポリエチレンリンカー、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−；−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、等）であり；
ｎは１以上１２以下の整数であり；
ＸはＮ、Ｓ、またはＯであり；
Ｒは固体支持体に結合されている化学物質である。ある実施形態において、Ｌは
【００５８】
【化２６】
2009522576.tif 000018
であり、式中、ｍは１以上１００以下の整数である。ある実施形態において、ｍは１以上５０以下、１以上２５以下、１以上２０以下、または１以上１０以下の整数である。ある実施形態において、ｍは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。ある実施形態において、Ｌは
【００５９】
【化２７】
2009522576.tif 000019
である。ある実施形態において、ｎは１以上１００以下の整数である。ある実施形態において、ｎは１以上５０以下、１以上２５以下、１以上２０以下、または１以上１０以下の整数である。ある実施形態において、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。ある実施形態において、ｎは６である。ある実施形態において、リンケージは以下の式：
【００６０】
【化２８】
2009522576.tif 000020
式中、
支持体はガラス表面、スライドガラス、ポリマー支持体、プラスチック支持体、金属支持体などの固体支持体であり；
ｎはそれぞれ１以上２０以下の整数であり；
ｍは１以上２０以下の整数であり；
ＸはＮ、Ｓ、またはＯであり；
Ｒは固体支持体に結合されている化学物質である。ある実施形態において、ｎおよびｍはそれぞれ１以上１０以下の整数である。ある実施形態において、支持体はスライドガラスである。
【００６１】
ある特定の実施形態において、リンケージは以下の式：
【００６２】
【化２９】
2009522576.tif 000021
式中、
支持体はガラス表面、スライドガラス、ポリマー支持体、プラスチック支持体、金属支持体などの固体支持体であり；
ＸはＮ、Ｓ、またはＯであり；
Ｒは固体支持体に結合されている化学物質である。
【００６３】
上記の化合物のアレイは、化合物をイソシアネート部分（すなわち、−ＮＣＯ）で官能化された支持体に結合させることで調製できる。ある実施形態において、イソシアネート部分はリンカー経由で固体支持体に結合する。ある実施形態において、リンカーは上記に示されるものとなる。一態様において、本発明はイソシアネート官能化された固体支持体（例えば、イソシアネート官能化されたスライドガラス）を提供する。
【００６４】
ある実施形態において、固体支持体上の官能基は以下の式：
【００６５】
【化３０】
2009522576.tif 000022
式中、
支持体はガラス表面、スライドガラス、ポリマー支持体、プラスチック支持体、金属支持体などの固体支持体であり；
Ｌは置換または非置換で、分枝または非分枝で、環状または非環状で、脂肪族またはヘテロ脂肪族のリンカー（例えば、ポリエチレングリコールスペーサー、ポリエチレンリンカー、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−；−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、等）であり；
ｎは１以上１２以下の整数である。ある実施形態において、Ｌは
【００６６】
【化３１】
2009522576.tif 000023
であり、式中、ｍは１以上１００以下の整数である。ある実施形態において、ｍは１以上５０以下、１以上２５以下、１以上２０以下、または１以上１０以下の整数である。ある実施形態において、ｍは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。ある実施形態において、Ｌは
【００６７】
【化３２】
2009522576.tif 000024
である。ある実施形態において、ｎは１以上１００以下の整数である。ある実施形態において、ｎは１以上５０以下、１以上２５以下、１以上２０以下、または１以上１０以下の整数である。ある実施形態において、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。
【００６８】
ある実施形態において、固体支持体上の官能基は以下の式：
【００６９】
【化３３】
2009522576.tif 000025
式中、
支持体はガラス表面、スライドガラス、ポリマー支持体、プラスチック支持体、金属支持体などの固体支持体であり；
ｎはそれぞれ独立して１以上１２以下の整数であり；
ｍは１以上１２以下の整数である。
【００７０】
ある特定の実施形態において、リンケージは以下の式：
【００７１】
【化３４】
2009522576.tif 000026
式中、
支持体はガラス表面、スライドガラス、ポリマー支持体、プラスチック支持体、金属支持体などの固体支持体である。
【００７２】
別の態様において、本発明はまた、１，６−ジイソシアナトヘキサンを用いて支持体に共有結合されたアミノ基を官能化する工程を含む、官能化された支持体を調製する方法を提供する。ある実施形態において、γ−アミノプロピルシランスライドガラスはアミノ保護化リンカーで被覆する。保護基を除去し、フリーアミノ基を１，６−ジイソシアナトヘキサンと反応させる。
【００７３】
他の実施形態において、化合物は以下の式に示すようにイソチオシアネート化学を用いて固体支持体に結合しており：
【００７４】
【化３５】
2009522576.tif 000027
式中、
支持体はガラス表面、スライドガラス、ポリマー支持体、プラスチック支持体、金属支持体などの固体支持体であり；
Ｌは置換または非置換で、分枝または非分枝で、環状または非環状で、脂肪族またはヘテロ脂肪族のリンカー（例えば、ポリエチレングリコールスペーサー、ポリエチレンリンカー、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−；−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、等）であり；
ｎは１以上１２以下の整数であり；
ＸはＮ、Ｓ、またはＯであり；
Ｒは固体支持体に結合されている化学物質である。ある実施形態において、Ｌは非環状脂肪族または複素環脂肪族リンカーである。ある実施形態において、Ｌはアリールリンカーである。ある特定の実施形態において、Ｌは置換または非置換されていてよいフェニル部分である。ある実施形態において、Ｌはパラ置換されたフェニル部分である。リンケージは、化合物を式の活性化表面と反応させることで生成され：
【００７５】
【化３６】
2009522576.tif 000028
式中、Ｌおよび支持体は上記のように定義される。リンカーは０〜２００の原子の長さ、０〜１００の原子の長さ、０〜５０の原子の長さ、２〜５０の原子の長さ、１０〜３０の原子の長さ、または２０〜３０の原子の長さである。ある実施形態において、リンカーは少なくとも２原子の長さ、少なくとも５原子の長さ、少なくとも１０原子の長さ、または少なくとも２０原子の長さである。ある実施形態において、リンカーは非環状である。他の実施形態において、リンカーは環状部分を含む。ある実施形態において、リンカーは分枝状である。他の実施形態において、リンカーは非分枝状である。ある実施形態において、リンカーはＯ、Ｎ、またはＳを含むヘテロ原子を含む。ある実施形態において、リンカーはヘテロ原子を含まない。ある実施形態において、リンカーは、カルボニル、エステル、チオエステル、アミド、カーボネート、カルバモイル、またはウレア部分を含む。ある実施形態において、リンカーはハロゲン原子を含む。
【００７６】
ある実施形態において、化合物は下記の以下の式に示すようにリンケージを介して固体支持体に結合しており：
【００７７】
【化３７】
2009522576.tif 000029
式中、
ＸはＯ、Ｓ、またはＮであり；
Ｒは結合した化合物である．
ある特定の実施形態において、化合物は下記の以下の式に示すようにリンケージを介して固体支持体に結合しており：
【００７８】
【化３８】
2009522576.tif 000030
式中、
ＸはＯ、Ｓ、またはＮであり；
Ｒは結合した化合物である。
【００７９】
ある特定の実施形態において、化合物は下記の以下の式に示すようにリンケージを介して固体支持体に結合しており：
【００８０】
【化３９】
2009522576.tif 000031
式中、
支持体はガラス表面、スライドガラス、ポリマー支持体、プラスチック支持体、金属支持体などの固体支持体であり；
Ｌは置換または非置換で、分枝または非分枝で、環状または非環状で、脂肪族またはヘテロ脂肪族のリンカー（例えば、ポリエチレングリコールスペーサー、ポリエチレンリンカー、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−；−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、等）であり；
ｎは１以上１２以下の整数であり；
ＸはＮ、Ｓ、またはＯであり；
Ｒは固体支持体に結合されている化学物質である。ある実施形態において、Ｌは
【００８１】
【化４０】
2009522576.tif 000032
であり、式中、ｍは１以上１００以下の整数である。ある実施形態において、ｍは１以上５０以下、１以上２５以下、１以上２０以下、または１以上１０以下の整数である。ある実施形態において、ｍは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。ある実施形態において、Ｌは
【００８２】
【化４１】
2009522576.tif 000033
である。ある実施形態において、ｎは１以上１００以下の整数である。ある実施形態において、ｎは１以上５０以下、１以上２５以下、１以上２０以下、または１以上１０以下の整数である。ある実施形態において、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。ある実施形態において、ｎは６である。ある実施形態において、リンケージは以下の式：
【００８３】
【化４２】
2009522576.tif 000034
式中、
支持体はガラス表面、スライドガラス、ポリマー支持体、プラスチック支持体、金属支持体などの固体支持体であり；
ｎはそれぞれ１以上２０以下の整数であり；
ｍは１以上２０以下の整数であり；
ＸはＮ、Ｓ、またはＯであり；
Ｒは固体支持体に結合されている化学物質である。ある実施形態において、ｎおよびｍはそれぞれ１以上１０以下の整数である。ある実施形態において、支持体はスライドガラスである。
【００８４】
ある特定の実施形態において、リンケージは以下の：
【００８５】
【化４３】
2009522576.tif 000035
式中、
支持体はガラス表面、スライドガラス、ポリマー支持体、プラスチック支持体、金属支持体などの固体支持体であり；
ＸはＮ、Ｓ、またはＯであり；
Ｒは固体支持体に結合されている化学物質である。
【００８６】
上記の化合物のアレイは化合物をイソチオシアネート部分（すなわち、−ＮＣＳ）で官能化された支持体に結合させることで調製される。ある実施形態において、イソチオシアネート部分はリンカー経由で固体支持体に結合する。ある実施形態において、リンカーは上記に示すものである。一態様において、本発明はイソチオシアネート官能化された固体支持体（例えば、イソチオシアネート官能化されたスライドガラス）を提供する。
【００８７】
ある実施形態において、固体支持体上の官能基は以下の式：
【００８８】
【化４４】
2009522576.tif 000036
式中、
支持体はガラス表面、スライドガラス、ポリマー支持体、プラスチック支持体、金属支持体などの固体支持体であり；
Ｌは置換または非置換で、分枝または非分枝で、環状または非環状で、脂肪族またはヘテロ脂肪族のリンカー（例えば、ポリエチレングリコールスペーサー、ポリエチレンリンカー、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−；−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、等）であり；
ｎは１以上１２以下の整数である。ある実施形態において、Ｌは
【００８９】
【化４５】
2009522576.tif 000037
であり、式中、ｍは１以上１００以下の整数である。ある実施形態において、ｍは１以上５０以下、１以上２５以下、１以上２０以下、または１以上１０以下の整数である。ある実施形態において、ｍは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。ある実施形態において、Ｌは
【００９０】
【化４６】
2009522576.tif 000038
である。ある実施形態において、ｎは１以上１００以下の整数である。ある実施形態において、ｎは１以上５０以下、１以上２５以下、１以上２０以下、または１以上１０以下の整数である。ある実施形態において、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。
【００９１】
ある実施形態において、固体支持体上の官能基は以下の式：
【００９２】
【化４７】
2009522576.tif 000039
式中、
支持体はガラス表面、スライドガラス、ポリマー支持体、プラスチック支持体、金属支持体などの固体支持体であり；
ｎはそれぞれ独立して１以上１２以下の整数であり；
ｍは１以上１２以下の整数である。
【００９３】
ある特定の実施形態において、リンケージは以下の：
【００９４】
【化４８】
2009522576.tif 000040
式中、
支持体はガラス表面、スライドガラス、ポリマー支持体、プラスチック支持体、金属支持体などの固体支持体である。
【００９５】
生物活性の検出方法
当業者であればわかることであるが、極めて高い空間密度を有する化合物のアレイの生成により、特異的なケミカルライブラリーにおける化合物と生体高分子との間に起こる結合および／または活性化事象の検出が容易になる。そのため、本発明は、さらに別の態様において、対象となる生体高分子に対する低分子パートナーの同定方法を提供する。パートナーは、対象となる特定の高分子に結合し、対象となる生体高分子を活性化または阻害することができる化合物であってよい。一般に、この方法は、（１）上述のように、１つまたはそれより多くの種類の化合物のアレイを提供する工程と、低分子のアレイは１ｃｍ２あたり少なくとも１０００スポットの密度を有し；（２）アレイを対象となる１つまたはそれより多くの種類の生体高分子に接触させる工程と；（３）特定の低分子−生体高分子パートナーの相互作用を決定する工程とを含む。
【００９６】
本発明のアレイは、低分子と生体高分子との間の相互作用の検出が可能な種々の方法で利用することができるということも理解されるであろう。１つの特に好ましい実施形態において、表面に結合した化学物質の異なる種類のアレイを利用し、１つかまたは数種類の生体高分子と接触させ、どの化合物が特異的な生体高分子（単数または複数）と相互作用可能かを決定する。当業者であれば分かるように、１より多くの種類の化合物を利用する場合、特異的相互作用を有する化合物を同定できるよう各特定化合物のコード化方法を利用することが望ましい。特定のコード化技術は近年見直され、これらの技術のみならず他の同等または改善された技術を、本発明で利用することができる（Ｃｚａｒｎｉｋ，Ａ．Ｗ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９７，１，６０を参照すること；参照により本明細書に引用したものとする）。あるいは、本発明のアレイは１種類の化学物質を含んでよく、生体高分子のライブラリーは、この１種類の化学物質が種々の生体高分子と相互作用する能力を決定するため、このアレイと接触させることができる。当業者であれば分かるように、この実施形態は支持体の領域を分離する能力が必要であり、パラフィンまたは他の適当な材料を利用することで、アッセイは局在化される。
【００９７】
当業者であれば分かるように、対象となる生体高分子は任意の生体分子を含んでよい。好ましい実施形態において、対象となる生体高分子はタンパク質を含み、アレイは対象となる組み換えタンパク質のライブラリーと接触させるのがより好ましい。さらに別の好ましい実施形態において、対象となる生体分子は、腫瘍関連細胞の生体分子などの細胞溶解産物の形態で提供される。当業者が理解するように、これらのタンパク質は、２〜３例を挙げると、精製タンパク質、精製タンパク質のプール、および細胞溶解産物などの複合混合物、およびその断片を含んでよい。研究する生体高分子の特に好ましい例としては、限定的ではないが、シグナル変換、二量化、遺伝子調節、細胞周期および細胞周期チェックポイント、およびＤＮＡ損傷チェックポイントに関与するものが挙げられる。さらに、対象となる任意の有機体または組織からの発現タンパク質のライブラリーを形成する能力によって、組み換えタンパク質の大きなアレイが生じることになる。対象となる化合物は、対象となる特定生体分子の機能の不活性化または活性化のいずれかを行うことができる。
【００９８】
各生体高分子は、これらの高分子および固定化した化合物の検出を容易化できるように修飾してよい。これは、その後の検出（例えば、２〜３例を挙げると、色形成または光生成が可能な放射性原子、蛍光分子、着色化合物、または酵素で）用に標識された異なるレセプター（例えば、抗体）により直接的または間接的のいずれかで、その後認識されるエピトープで高分子を標識することで達成することができる。あるいは、高分子自身は、適当な検出方法（２〜３例を挙げると、例えば、質量分析、表面プラズモン共鳴、および光学分光）を結合したタンパク質を検出するのに使用する場合、これらの方法の任意の一方または他方を用いて直接標識するかまたは全く標識しなくともよい。
【００９９】
特に好ましい実施形態において、本発明のアレイは、遺伝生化学研究用の化合物を同定するのに利用する。古典的遺伝学において、ＤＮＡ配列における突然変異の不活性化（例えば、欠失または「ノックアウト」）または活性化（例えば、発癌）のいずれかは、これらの遺伝子でコード化されるタンパク質機能の研究に使用する。代わりに、遺伝生化学は、低分子に結合するタンパク質機能を変化させることで、タンパク質機能を不活性化または活性化する低分子の使用に関与する。これは、当然、最近認可された低分子薬剤の作用に基づいている。本発明は、低分子と対象となる特異タンパク質との間の相互作用の速やかな検出を可能にする「ｃｈｉｐ−ｌｉｋｅ」技術の開発に関与する。以下に示される実施例は、本発明の方法および組成物が、遺伝生化学研究に使用される新たな低分子リガンドの同定にどのように使用できるかを示すものである。当業者であれば、本発明の組成物および方法は高密度の化学物質形式を必要とする他の目的用に利用できることが理解されるであろう。
【０１００】
当業者であれば、化学物質のアレイは、化合物と生体高分子以外の分子の代替クラスとの間の相互作用の検出にも有用であることもまた理解されるであろう。例えば、本発明のアレイは、２〜３例を挙げると、触媒および材料研究の分野においても有用である。
【０１０１】
本発明の前述ならびに他の態様は、以下の実施例を検討すればさらに理解されるであろう。実施例は、本発明のある特定の実施形態を説明するものであるが、特許請求の範囲で定義される本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１０２】
実施例１−細胞溶解産物スクリーニング用の強固な低分子マイクロアレイプラットフォーム
ここで、種々の固相有機合成経路および天然産物を含む生物活性化合物から発生するＤＯＳ化合物を捕捉するためのイソシアネート官能化されたスライドガラスの調製および使用を説明する。イソシアネートは、酸性副生成物を残すことなく多くの求核官能基と反応する（Ｖａｎｄｅｎａｂｅｅｌｅ−Ｔｒａｍｂｏｕｚｅら  Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｉｓｏｃｙａｎａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ：  ａｍｉｎｅｓ，  ａｌｃｏｈｏｌｓ，  ｔｈｉｏｌｓ，  ｏｘｉｍｅｓ，  ａｎｄ  ｐｈｅｎｏｌｓ  ｉｎ  ｄｉｌｕｔｅ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００１；６：４５−５５；参照により本明細書に引用したものとする）ことにより、イソシアネート表面には、天然または合成源からの多様な低分子が増加し、単一の低分子マイクロアレイ（ＳＭＭ）の上に固定化することができる。イソシアネートガラス基板を調製し、マイクロアレイ形式でオリゴヌクレオチドを固定化するのに使用した（Ａｍｅｒｉｎｇｅｒら  Ｕｌｔｒａｔｈｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｔａｒ  ＰＥＧ  ｃｏａｔｉｎｇｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００５；６（４）：１８１９−２３；Ｃｈｕｎら  Ｄｉｉｓｏｃｙａｎａｔｅｓ  ａｓ  ｎｏｖｅｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｎｄｅｒｓ  ｆｏｒ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｚｅｏｌｉｔｅ  ｃｒｙｓｔａｌｓ  ｏｎ  ｇｌａｓｓ．Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍｕｎ（Ｃａｍｂ）２００２（１７）：１８４６−７；Ｇｕｏら  Ｄｉｒｅｃｔ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｂｙ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｒｒａｙｓ  ｏｎ  ｇｌａｓｓ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９４；２２（２４）：５４５６−６５；Ｓｏｍｐｕｒａｍら  Ａ  ｗａｔｅｒ−ｓｔａｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ｉｓｏｃｙａｎａｔｅ  ｇｌａｓｓ  ａｒｒａｙ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００４；３２６（ｌ）：５５−６８；各々は参照により本明細書に引用したものとする）。
【０１０３】
カルモデュリン（カルモジュフィリン：ｃａｌｍｏｄｕｐｈｉｌｉｎｓ）（Ｂａｒｎｅｓ−Ｓｅｅｍａｎら  Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｒｏｕｐ  ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ  ｌｉｇａｎｄｓ．Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ２００３；４２（２１）：２３７６−９；参照により本明細書に引用したものとする）、酵母菌転写コレプレッサーＵｒｅ２ｐ（ウレツーパミン：ｕｒｅｔｕｐａｍｉｎｅｓ）（Ｋｕｒｕｖｉｌｌａら  Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ−ｏｒｉｅｎｔｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００２；４１６（６８８１）：６５３−７；参照により本明細書に引用したものとする）、および酵母菌ＨＡＰ転写因子複合体のＨａｐ３ｐサブユニット（ハプタミド：ｈａｐｔａｍｉｄｅｓ）（Ｋｏｅｈｌｅｒら  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｕｓｉｎｇ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ａｎｄ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ−ｏｒｉｅｎｔｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３；１２５（２８）：８４２０−ｌ；参照により本明細書に引用したものとする）用のリガンドを発見するためのＳＭＭの使用を以前に報告した。これらスクリーニングの各々は、ただ１つのＤＯＳライブラリーを所与のスライド上に含んだＳＭＭに関与した。より最近には、１つのアレイ中に種々のＤＯＳ合成経路からのサブライブラリーを含むＳＭＭの調製を探求した。かかるＳＭＭ調製の目標は、研究者が１つのアレイで種々のサブライブラリーをサンプリングし、その後、多様なサブセットからの初期スクリーニング結果に基づく完全ＤＯＳライブラリーのスクリーニングに優先順位をつけることができるようにすることである。本実施例において、同一スライド上で、種々の固相有機合成経路（Ｂｕｒｋｅら  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｓｋｅｌｅｔｏｎｓ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌｌｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００３；３０２（５６４５）：６１３−８；Ｂｕｒｋｅら  Ａ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｙｉｅｌｄｉｎｇ  ｓｋｅｌｅｔａｌｌｙ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌｌｙ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００４；１２６（４３）：１４０９５−１０４；Ｃｈｅｎら  Ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ−ｏｒｉｅｎｔｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｈｙｂｒｉｄｓ．Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ２００５；４４（１５）：２２４９−５２；Ｋｕｍａｒら  Ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｙ．Ｏｒｇ  Ｌｅｔｔ  ２００５；７（１３）：２５３５−８；Ｌｏら  Ａ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  ｓｐｉｒｏｏｘ��ｎｄｏｌｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａ  ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｔｈｒｅｅ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００４；１２６（４９）：１６０７７−８６；Ｓｔａｖｅｎｇｅｒら  Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ−Ｏｒｉｅｎｔｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ４３２０  Ｅｎｃｏｄｅｄ  ａｎｄ  Ｓｐａｔｉａｌｌｙ  Ｓｅｇｒｅｇａｔｅｄ  Ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒａｎｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅｓ．Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ２００１；４０（１８）：３４１７−３４２１；Ｗｏｎｇら  Ｍｏｄｕｌａｒ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｉｖｅｒｓｅ  １，３−ｄｉｏｘａｎｅｓ．Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ２００４；１１（９）：１２７９−９１；各々は参照により本明細書に引用したものとする）および天然産物を含む市販の生物活性化合物から生じるＤＯＳ化合物のいくつかの集合体を含む低分子の「多様性マイクロアレイ」を作るためのイソシアネート官能化されたスライドガラスの使用を報告する（図１）。
【０１０４】
ＳＭＭを用いたリガンド発見を目的とした従来戦略は、対象となる精製タンパク質でインキュベートすることに依存していた。これらのプロトコルの潜在的応用は、巨大タンパク質の発現、溶解度、翻訳後の修飾状態、活性、および収率を伴うタンパク質生化学における課題によって制限されていた。さらに、対象となるタンパク質標的が市販されておらず、タンパク質生化学の専門知識がない研究者はＳＭＭをスクリーニングする能力が制限されてしまう。ここで、精製せずに細胞溶解産物から直接的にエピトープ標識した標的タンパク質を用いて特定のタンパク質−低分子相互作用の検出が可能な、強固で、効率的なＳＭＭスクリーニング方法論の最適化を説明する。新しい付着化学反応（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）は、種々の低分子と細胞溶解物から直接得られたＦＫＢＰ１２との間の公知の相互作用の検出と適合性があることを示す（Ｈａｒｄｉｎｇら  Ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔ  ＦＫ５０６  ｉｓ  ａ  ｃｉｓ−ｔｒａｎｓ  ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｐｒｏｌｙｌ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ  １９８９；３４１（６２４４）：７５８−６０；Ｓｉｅｋｉｅｒｋａら  Ａ  ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔ  ＦＫ５０６  ｈａｓ  ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｐｒｏｌｙｌ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｕｔ  ｉｓ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｆｒｏｍ  ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ  １９８９；３４１（６２４４）：７５５−７；各々は参照により本明細書に引用したものとする）。複合溶解物を用いて特異性相互作用の検出を報告しているこれまでの研究は、公知の精製タンパク質の付加が一般的に関与していた（Ｒｅｄｄｙら  Ｐｒｏｔｅｉｎ  「ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ」  ｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐｅｐｔｏｉｄ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００５；１０２（３６）：１２６７２−７；参照により本明細書に引用したものとする）、または、オリゴヌクレオチドアレイ上で空間的アレイ化する前に、核酸に共役させた共有結合プローブの集束ライブラリーとともに溶液中でのインキュベーションを必要としていた（Ｗｉｎｓｓｉｎｇｅｒら  ＰＮＡ−ｅｎｃｏｄｅｄ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ．Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ２００４；ｌｌ（１０）：１３５１−６０；Ｗｉｎｓｓｉｎｇｅｒら  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００２；９９（１７）：１１１３９−４４；各々は参照により本明細書に引用したものとする）。タンパク質精製せずに細胞溶解物における選択的相互作用を検出する能力は、リガンドの発見、標的の同定、抗体およびタンパク質の特異性プロファイリングのみならず、細胞状態の痕跡の発見および診断ツールの開発など将来的な用途にも魅力的なものである。
【０１０５】
結果
さまざまな反応性を有する求核試薬を含む低分子を、低分子または環境湿度のいずれかとゆっくり反応し、かつ、酸などの潜在的に有害な副生成物を生じない弱求電子性の表面の上にアレイした。図２に示すように、γ−アミノプロピルシランスライド（Ｓ１）を短いポリエチレングリコール（ＰＥＧ）スペーサーで被覆し、尿素結合経由で１，６−ジイソシアナトヘキサンにカップリングさせ、推定イソシアネート官能化されたスライドガラス（Ｓ２）を生成した。化合物原液でプリントされたスライドをその後、乾燥環境下に置き、スライド表面（Ｓ３）上の低分子の共有結合捕捉を触媒するピリジン蒸気にさらした。
【０１０６】
このアプローチを評価するため、イソシアネート誘導体化スライドの上に第一級アルコール（３ａ、３ｏ、３ｐ、３ｑ）、第二級アルコール（３ｂ）、第三級アルコール（３ｃ）、フェノール（３ｄ）、メチルエーテル（３ｅ）、カルボン酸（３ｆ）、ヒドロキサム酸（３ｇ）、メチル（３ｈ）、チオール（３ｉ）、第一級アミン（３ｊ、３ｎ）、第二級アミン（３ｋ）、インドール（３１）、またはアリールアミン（３ｍ）を提供するように誘導体化された一連の合成ＦＫＢＰ１２リガンド（Ｈｏｌｔら  Ｄｅｓｉｇｎ，  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＦＫＢＰ  ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｘ−Ｒａｙ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅｉｒ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｗｉｔｈ  ＦＫＢＰ１２．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １９９３；１１５：９９２５−９９３８；参照により本明細書に引用したものとする）をプリントするためロボット式マイクロアレイヤーを使用した（図３ａ、ｂ）。各ＦＫＢＰ１２リガンドの修飾部位は、３が二量化の化学誘導物質の親構造であるので、置換に耐性があることが以前より示されている（Ｋｅｅｎａｎら  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ＦＫＢＰ１２  ｌｉｇａｎｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  １９９８；６（８）：１３０９−３５；参照により本明細書に引用したものとする）。リガンドは、溶媒としてＤＭＦを用いて順次倍数希釈（１０ｍＭ〜２０μＭ）でプリントした。プリントされたスライドをピリジン蒸気にさらし、エチレングリコールで急冷し、ＤＭＦ、ＴＨＦ、およびメタノールで広範に洗浄した。乾燥させたスライドをＦＫＢＰ１２−ＧＳＴ（Ｈａｒｄｉｎｇら  Ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔ  ＦＫ５０６  ｉｓ  ａ  ｃｉｓ−ｔｒａｎｓ  ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｐｒｏｌｙｌ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ  １９８９；３４１（６２４４）：７５８−６０；Ｓｉｅｋｉｅｒｋａら  Ａ  ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔ  ＦＫ５０６  ｈａｓ  ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｐｒｏｌｙｌ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｕｔ  ｉｓ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｆｒｏｍ  ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ  １９８９；３４１（６２４４）：７５５−７；各々は参照により本明細書に引用したものとする）、続いてＣｙ５（商標）標識の抗ＧＳＴ抗体でプローブし、ＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ  ６．０  ソフトウェア（モレキュラーデバイス、ユニオンシティ、カリフォルニア州）を用いて６３５ｎｍで蛍光スキャンした。図３に示すように、ＦＫＢＰ１２−ＧＳＴに対応する蛍光信号の強度は、結合用に供した官能基およびリガンド濃度の両方にしたがって変えた。フィーチャ直径はリガンド濃度に依存し、より高濃度では、平均直径は２５０μｍであった。第一級アミン類、アリールアミン、およびチオールは最も高い固定化レベルを有するように見える。第一級アルコール類、フェノール、ヒドロキサム酸、第二級ア��ン、およびインドールの蛍光強度も、著しい固定化と一致する。第二級アルコール、カルボン酸、および第三級アルコールは、より少ない量で固定化した。化合物原液の一般的な濃度である１．２５ｍＭで、第一アミド３ｅおよび３ｈの痕跡レベルは検出されたが、Ｎ，Ｎ−置換アミド３ｒ（図３ｄ）は検出されなかった。リガンド（３ｎ〜３ｑ）への可変長のポリエチレングリコールスペーサーの付加は、精製タンパク質でプローブした際、フィーチャ形態または蛍光強度に大きな影響を与えることはなかった。さらに、可変長（ｎ＝０、２、４、８、７０）のポリエチレングリコールスペーサーを表面Ｓ２に付加し、比較した（データは図示せず）。より短いＰＥＧ鎖（ｎ＝２、４、８）を有する表面は同等であり、ＰＥＧがない表面にわたって改善された信号対雑音比を示した。より長いＰＥＧ鎖を有する表面は、結合アッセイでもっとも低い蛍光レベルを示し、ばらばらなスポット形態を生じた。
【０１０７】
ピリジン蒸気を手順から省略すると、蛍光レベルは著しく低下した（図３ｄ）。スライドを３７℃でピリジンにさらすと、固定化レベルはわずかに強化された（データは図示せず）。本捕捉方法のプリンティング用に使用する化合物原液中に存在する湿気への感度を試験するため、９：１のＤＭＦ：ｄｄＨ２Ｏ中のＦＫＢＰ１２リガンド３ａ、３ｂ、３ｃ、および３ｅの１ｍＭ溶液をイソシアネート誘導体化スライドの上に三重にアレイした（図３ｅ）。蛍光強度はＤＭＦから直接プリントされた化合物の蛍光強度と同等であった。ＤＭＦおよびＤＭＳＯ中の化合物原液は、冷凍庫に入れたり出したりして移動する際に、経時的に水気を帯びるように見えるので、水耐性はＳＭＭ調製には重要な要件である（Ｃｈｅｎｇら  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ＤＭＳＯ  ｕｎｄｅｒ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ  ２００３；８（３）：２９２−３０４；参照により本明細書に引用したものとする）。ＤＭＳＯからプリントした低分子はまた、この方法を用いて、ＤＭＦからプリントした化合物（約２５０〜３００μｍ）より小さなフィーチャ直径（約１００〜１５０μｍ）で捕捉した。
【０１０８】
共有結合捕捉用の付属肢と意図的に合成させなかった化合物のプリンティングに対するこのアプローチの適合性を調査するため、３００個を超える市販の生物活性化合物をイソシアネート官能化されたスライドの上にプリントした。コルチコステロン、ジギトキシン、および１７β−エストラジオールに対するウサギ一次抗体、続いてｆｌｕｏｒ標識ヤギ抗ウサギ二次抗体を用いてこれらの生物活性マイクロアレイをスクリーニングした。信号対雑音比（ＳＮＲ）は６３５ｎｍの強度で算出し、複製アレイ上の各フィーチャ用のローカルバックグラウンドを調整して決定し、データを標識二次抗体だけでインキュベートした複製対照アレイと比較した（図４）。信号対雑音比＞３．０を有する６つの生体活性は、標識ポリクローナル二次抗体だけに結合した複製アレイに見つかった。ＰＢＳバッファーだけでプローブしたアレイによって判定した際、どの化合物も６３５ｎｍで自発蛍光しなかった（データは図示せず）。アミノグリコシド系抗生物質であるハイグロマイシンＢは、最も高い調整された信号対雑音比（平均ＳＮＲ４７．６）を生じた。３つのキノロン抗生物質、ノルフロキサシン、シプロフロキサシン、およびピペミド酸は、少なくとも１回の実験で３．０よりも大きい調整された平均蛍光強度を示した。抗コルチコステロン抗体の結合プロファイルにおいて、構造的に関連したコルチコステロイド、ヒドロコルチゾン（平均ＳＮＲ６８．９）、ベクロメタゾン（６３．３）、およびコルチコステロン（５９．２）は、陽性としてスコアした。全て強心性ステロイド配糖体である、ギトキシゲニン（平均ＳＮＲ６２．５）、コンバラトキシン（５２．７）、ラナトシドＣ（２４．０）、ジゴキシン（１７．８）、およびジギトキシン（１５．１）は、複製抗ジギトキシン抗体実験で同様に陽性としてスコアした。捕捉用の反応基数を変えている主要な発情ホルモンである、１７β−エストラジオール（平均ＳＮＲ９．０）、エストリオール（８．７）、およびエストロン（７．３）は、抗１７β−エストラジオール結合プロファイルにおいて陽性としてスコアした。抗体−結合プロファイルは、多数の求核官能基を有する低分子がイソシアネート媒介捕捉を用いてプリントし、検出できることを示す。さらに、これらのデータは低分子の免疫グロブリンの特異性をプロファイリングする簡易な方法を示す。
【０１０９】
低分子と前精製を行うことなく哺乳類細胞で発現した標的タンパク質との間の相互作用の検出を含むため、この方法の範囲を拡張することを目的とした。このような目的で、スクリーニングプロトコルを開発し、それにより、過剰発現した対象となるエピトープ標識タンパク質を含有する細胞溶解物でインキュベートしたＳＭＭは、モックトランスフェクトした細胞溶解物でインキュベートした対照ＳＭＭと比較する（図５ａ）。穏やかに溶解し、遠心分離で清澄化した後、細胞溶解物をＳＭＭ上でインキュベートした。その後、アレイを一次抗エピトープ抗体、およびＣｙ５（商標）共役二次抗体で順次インキュベートした。各インキュベーション後、ＰＢＳＴで簡単に洗浄し、穏やかに攪拌した。蛍光強度を検出し、複製アレイ上の対応するフィーチャに対するＳＮＲを算出し、比較し、平均化した。
【０１１０】
ＦＬＡＧ−ＦＫＢＰ１２を過剰発現するためエンジニアリングした構成体で過渡的にトランスフェクトした哺乳類細胞から調製したＨＥＫ−２９３Ｔ溶解物に対してＡＰ１４９７誘導体のアレイ（図３ｂと同様）をスクリーニングすることでこの方法の研究を行った。最適化実験はプロトコルのロバスト性を最大化するパラメータを同定するために変動を段階的に導入して行った。アレイは同一のプリンティング系から由来し、同一のレーザ出力と光電子増倍管ゲインを用いて蛍光スキャンした。実験変数はデータ図５ｂに示されるように均一に、１．２５ｍＭの標準濃度でアレイしたリガンドの平均ＳＮＲを用いて比較した。全タンパク質濃度がリガンド検出に影響するか否かを決定するため、ＳＭＭは０．１〜１．０ｕｇ／ｕＬで濃度を変えている溶解物でインキュベートした。各フィーチャに対する最大蛍光強度およびＳＮＲは０．３ｕｇ／ｕＬで最適であることを証明した。インキュベーションの阻害は、ＳＭＭを生じるプロトコルで一般的に使用される。細胞溶解物の複雑な環境を考慮すると、試料をインキュベートする前に阻害が必要であるか否かの研究に関心があった。ＢＳＡによる阻害は、ＳＭＭを細胞溶解物でインキュベートする際に、最大信号強度およびバックグラウンド調整信号（ＳＮＲ）の両方を減少させることが分かった。プリントされたリガンドと高分子との間の相互作用は、高分子ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）スペーサーの導入で強化することができる。非特異的バックグラウンド相互作用は、ＰＥＧで被覆したスライド表面で最小化することもできる。蛍光検出およびＳＮＲのスペーサー長の効果を調査するため、ＰＥＧスペーサー長をプリントされたＡＰ１４９７誘導体ＳＭＭで変えた。実質的により短いスペーサー（ｎ＝２）と比べて長い（ｎ〜７０）ＰＥＧスペーサーを有する各プリントされたフィーチャにおいて、ＳＮＲの顕著な減少が観察された。さらなる最適化実験および細胞溶解物を用いたＳＭＭ用の詳細な、最適化スクリーニングプロトコルを以下に示す。
【０１１１】
ＡＰ１４９７のＦＫＢＰ１２に対する高親和性（ＫＤ＝８．８ｎＭ）を認識することで、スクリーニング実験で検出することができるであろう、より低い親和性相互作用を同定するためこの技術の能力評価に関心があった。イソシアネート捕捉方法を用いて、ＦＫＢＰ１２に対して異なる親和性を有する２つのリガンドのフォーカストアレイ（図６Ａ）を対照生体活性とプリントした。最適化スクリーニングプロトコルにより、２．６μＭという高さのＫＤでリガンドの特異的同定が可能となった（図６Ｂ）（ＭａｃＢｅａｔｈら  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｓ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００；２８９（５４８５）：１７６０−３；参照により本明細書に引用したものとする）。この方法により低分子とキメラ蛍光タンパク質との間の低親和性相互作用を検出できるか否かを決定するため、ＳＭＭをＥＧＦＰ−ＦＫＢＰ１２融合タンパク質でコード化するベクターで過渡的にトランスフェクトした哺乳類細胞からの溶解物でインキュベートした。インキュベートしたスライドをＰＢＳＴで軽く洗浄し、４８８ｎｍで蛍光スキャンした。低結合親和性を有するリガンドの同定が、一次抗体および蛍光標識した二次抗体を必要とすることなく観察された（図６Ｃ）。タンパク質発現構成体を有する組織培養における細胞の過渡トランスフェクションは、一般に、上記の実験と同様にタンパク質の過剰発現をもたらす。リガンド発見との関係において、これは望ましいことが判明している；しかしながら、細胞状態のプロファイリングなどＳＭＭのさらなる用途は、標的タンパク質特異性抗体を用いることで内因性発現タンパク質との特異性相互作用の検出を含む。この可能性を研究するため、ＳＭＭを非形質導入の２９３Ｔ細胞からの溶解物でインキュベートした。ＦＫＢＰ１２のＮ末端領域に対して市販のポリクローナル抗体でその後インキュベートし、二次フルオロフォア共役抗体により、２．６μＭという高さのＫＤで、内因性ＦＫＢＰ１２とリガンドとの間の特異性相互作用の検出が可能となった（図６Ｄ）。
【０１１２】
スクリーニング方法論として本発明の最適化溶解物プロトコルのロバスト性を調査するため、多様性指向合成から生じる１０，０００個の生物活性低分子、天然産物、および低分子を含む多様なＳＭＭをプリントした。マイクロアレイはまた、ＦＫＢＰ１２（３〜５）への合成リガンド、免疫抑制剤、およびＦＫＢＰ１２への公知のリガンドである抗癌性天然産物ラパマイシンに対応する２７個のフィーチャを有した。１０個の細胞溶解物（５個の対照および５個のＦｌａｇ−ＦＫＢＰ１２）を別々に調製し、多様性ＳＭＭでインキュベートした。一次抗体およびＣｙ５標識した二次抗体でインキュベーション後、スライドを６３５ｎｍで蛍光スキャンし、ローカルバックグラウンド補正（ＳＮＲ）を算出した。Ｆｌａｇ−ＦＫＢＰ１２−発現溶解物を有する５個の複製ＳＭＭの中で、ラパマイシンおよび低親和性の合成リガンド５を含む、ＦＫＢＰ１２に全部で２７個のプリントされたリガンドを検出した。代表的なアレイを図７ａに示す。
【０１１３】
多様なアレイ上の対象となるタンパク質へのリガンドを同定する本技術の能力を統計学的に検証するため、局所補正したフィーチャ強度（ＳＮＲ６３５）をアレイした溶媒の最大ＳＮＲ強度によって設定した２．２４の閾値強度で二分した。２．２４を超えるＳＮＲ強度を有するフィーチャを陽性として分類した。対照−またはＦｌａｇ−ＦＫＢＰ１２−インキュベートしたアレイからのフィーチャをフィッシャーの正確確率検定を用いて比較し、少なくとも１回の実験でヒットとして現れた１０４溶媒のみのフィーチャに対する分割表を作成した。有意水準０．０５で、２４個の細胞が有意なｐ値を有することが分かった（図７ｂ）。１つのＤＯＳ化合物である、１２７６−Ｍ０８はまた、アッセイ陽性としてスコアした。結合は表面プラズモン共鳴で確認されたが、再合成された、ウェルからの主産物は表面プラズモン共鳴によってＧＳＴおよびＧＳＴ−ＦＫＢＰ１２の両方に結合していることが分かり、これは、分子がＦＫＢＰ１２に対する選択的リガンドではないと思われることを示している。
【０１１４】
議論
ウェルに特徴づけた化学反応（Ｖａｎｄｅｎａｂｅｅｌｅ−Ｔｒａｍｂｏｕｚｅら  Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｉｓｏｃｙａｎａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ：  ａｍｉｎｅｓ，  ａｌｃｏｈｏｌｓ，  ｔｈｉｏｌｓ，  ｏｘｉｍｅｓ，  ａｎｄ  ｐｈｅｎｏｌｓ  ｉｎ  ｄｉｌｕｔｅ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００１；６：４５−５５；Ａｍｅｒｉｎｇｅｒら  Ｕｌｔｒａｔｈｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｔａｒ  ＰＥＧ  ｃｏａｔｉｎｇｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００５；６（４）：１８１９−２３；Ｃｈｕｎら  Ｄｉｉｓｏｃｙａｎａｔｅｓ  ａｓ  ｎｏｖｅｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｎｄｅｒｓ  ｆｏｒ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｚｅｏｌｉｔｅ  ｃｒｙｓｔａｌｓ  ｏｎ  ｇｌａｓｓ．Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍｕｎ（Ｃａｍｂ）２００２（１７）：１８４６−７；Ｇｕｏら  Ｄｉｒｅｃｔ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｂｙ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｒｒａｙｓ  ｏｎ  ｇｌａｓｓ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９９４；２２（２４）：５４５６−６５；Ｓｏｍｐｕｒａｍら  Ａ  ｗａｔｅｒ−ｓｔａｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ｉｓｏｃｙａｎａｔｅ  ｇｌａｓｓ  ａｒｒａｙ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２００４；３２６（１）：５５−６８；各々は参照により本明細書に引用したものとする）を使用し、かつ、天然源および合成源の両方から生じる低分子を含む最初のマイクロアレイを調製できる低分子の共有結合捕捉戦略を使用した。イソシアネート媒介捕捉は、種々の求核官能基を含む化合物に適用可能であり、化合物がアルコールまたはアジドなどの特殊反応性付属肢を含むことを必要とせず（Ｂａｒｎｅｓ−Ｓｅｅｍａｎら  Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｒｏｕｐ  ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ  ｌｉｇａｎｄｓ．Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ２００３；４２（２１）：２３７６−９；Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒら  Ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：  ｃｏｖａｌｅｎｔ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ａｌｃｏｈｏｌ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｏｎ  ｇｌａｓｓ  ｓｌｉｄｅｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０００；１２２：７８４９−５０；Ｋｏｈｎら  Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ  ｌｉｇａｔｉｏｎ：  ａ  ｎｅｗ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ａｒｒａｙｓ．Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ２００３；４２（４７）：５８３０−４；各々は参照により本明細書に引用したものとする）、アレイにおける共有結合捕捉用合成中に導入される。イ���シアネート官能性は、電気陽性の塩素部分を用いた捕捉試薬を含むいくつかの上述の捕捉試薬と対照的に；副生成物を生じない。後者は、低分子の近傍に酸性残基の堆積および凝縮をもたらす結果となり、これは、低分子の部分的分解およびスクリーニング結果の不明化をもたらし得る。多数の求核官能基を含む化合物は、所与のスポットで配向を変えて表示される潜在力も有する。多重モードの表示により、タンパク質が所与のマイクロアレイフィーチャで異なる結合配向をサンプリングすることができる場合がある。しかしながら、イソシアネートスライドはタンパク質結合が必要となる求核試薬と反応する場合があるため、スクリーニングでいくつかの偽陰性につながることがある。プリントされたフィーチャ内の潜在的な異質性という理由から、フォローアップ用の陽性に優先順位をつけるためには、マイクロアレイ蛍光強度よりも表面プラズモン共鳴系二次結合アッセイから生じるデータを使用することが好ましい。このアプローチにより、リアルタイムおよび定量的アッセイで陽性の特性を明らかにするため、ハイスループットのマイクロアレイスクリーニングプラットフォームおよび表面プラズモン共鳴プラットフォームを用いて候補となるリガンドを迅速に同定することが可能になる。
【０１１５】
該捕捉方法により、ＦＤＡの承認を得た薬剤などの天然産物および生物活性化合物と並んで種々の固相合成由来の化合物を含むマイクロアレイを生産することが可能となった。これらのアレイはより多くの化学的多様性を含むため、タンパク質のより大きなパネルに対するスクリーニングにより望ましい。本実験においては、対象となる１つのタンパク質を持つ研究者は個々の合成からの化合物を含む多数のマイクロアレイをスクリーニングすることを好むことが多いが、どのライブラリーをさらにスクリーニングするかについて選択肢を決めるのに役立てるため多様性アレイをスクリーニングすることから始める。
【０１１６】
可変性官能基を有する低分子の複雑な集合体のプリンティングを確認するために、生物活性低分子に対し公知の特異性を有する一連の抗体で多様なＳＭＭをプローブした。これら抗体の公知の標的の構造的類似体も同定した。これは、プリントされた分子の大きく、多様な集合体によって、免疫グロブリンの構造−結合特性を洞察でき得ることを示す。この方法は、フォーカスト炭水化物アレイを用いて既に報告されているように、免疫グロブリンプロファイリングに影響がある（Ｗａｎｇ  Ｄ，  Ｌｉｕ  Ｓ，  Ｔｒｕｍｍｅｒ  ＢＪ，  Ｄｅｎｇ  Ｃ，  Ｗａｎｇ  Ａ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００２；２０（３）：２７５−８１；参照により本明細書に引用したものとする）。重要なのは、本明細書で示されるように、大きく、多様な低分子ライブラリーにおける抗体特異性のプロファイリングは、迅速な診断、治療、中和、および触媒抗体の発見に対して独自の機会を提供することである。
【０１１７】
イソシアネート媒介捕捉の結果として生じるＳＭＭは、細胞溶解産物中で過剰発現し、エピトープ標識したタンパク質を含む全細胞溶解産物に関与する結合スクリーニングとも適合性がある。溶解物から直接的にスクリーニングする能力は、タンパク質精製を回避することでかなりの時間と労力を節約する。この溶解物方法論は、精製における包括的アプローチを回避したタンパク質に対するリガンド発見の可能性を提供する。溶解物スクリーニングは、対象となるいくつかのタンパク質がタンパク質複合体内に存在するかまたは活性のままであるためタンパク質パートナーを必要とする場合があるので、より生物学的に関連している。哺乳類細胞の溶解物から直接得られるタンパク質はまた、適切に折り畳みやすくなり、活性または望ましい三次構造と関連づけた翻訳後修飾を有する。溶解物からのタンパク質は、表面を阻害する働きもできることで、競争力のあるアッセイを生成する。スライドは変性条件下で剥離し、再プローブする（データは図示せず）ことができるので、イソシアネート捕捉を用いて調製した表面への低分子リンケージはまた、溶解物スクリーニング条件下で細胞エステラーゼおよびプロテアーゼに安定的であると考えられる。イソシアネート捕捉を用いた溶解物実験における信号対雑音比は、エステル結合を介して表面にリンケージを伴うよう調製した表面にわたって改善された。したがって、この新たな可能性はＳＭＭ方法における大きな前進であり、対象となるタンパク質に対する低分子パートナーを発見する方法としてその使用を拡大すべきであると考える。プリントされたフィーチャの多様性およびこの溶解物スクリーニングプロトコルとＳＭＭ表面の適合性により、前精製せずに細胞溶解物由来のタンパク質の複合混合物をプロファイリングすることも可能になる。ＳＭＭの溶解物用途の詳細な研究は、研究所にて進行中である。
【０１１８】
１０００個を超える複製多様性ＳＭＭをこれまでプリントしてきた。いくつかの研究室を巻き込んだ協働作業を通して、清澄化した細胞溶解産物から単一の精製タンパク質、精製タンパク質複合体、およびタンパク質を含む５０個を超えるタンパク質を、これらのマイクロアレイに対してスクリーニングした。試験した１００を超える相互作用のうち、８６％は、デキストラン被覆センサ表面上の標的タンパク質の固定化およびさまざまな濃度での化合物の注入を含む二次表面プラズモン共鳴系アッセイで０．５〜２０μＭの推定解離定数を有する結合剤として再試験する（Ｂａｒｎｅｓ−Ｓｅｅｍａｎら  Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｒｏｕｐ  ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ  ｌｉｇａｎｄｓ．Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ２００３；４２（２１）：２３７６−９；参照により本明細書に引用したものとする）。再試験しない化合物は一般的にデキストランに不溶性で、非特異的な結合剤、または偽陽性であると分類する。
【０１１９】
要約すれば、さまざまな求核官能基を含む化合物に適用可能な低分子マイクロアレイの新たな調製方法を開発したことで、マイクロアレイ系結合スクリーニングに対して固定化できる天然または合成源からの化合物の多様性および量の両方が増える。抗体を用いて、選択し、プリントした低分子、および構造的に関連した化合物の存在を検出、確認することができた。最後に、１０，０００個近い低分子を含む多様性ＳＭＭを調製するためこのケミストリーを使用し、表面が任意の精製をせずに細胞溶解物からの全タンパク質を用いた相互作用の検出と適合性があることを実証するためマイクロアレイを使用した。結合選択性および痕跡として低分子結合を用いた細胞状態の変化のプロファイリング用の抗体および溶解物適合性の多様性ＳＭＭの使用にさらなる努力を行うものである。
【０１２０】
実験手順
材料。生物活性低分子および天然産物を市販供給元から購入した。ＤＯＳ分子はＢｒｏａｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒａｍから入手した。化合物３ｓはＪｏｈｎ  Ｔａｌｌａｒｉｃｏ博士から贈与された。化合物２７、２８はＡｒｉａｄ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＴｉｍｏｔｈｙ  Ｃｌａｃｋｓｏｎ博士から入手した。Ｆｌａｇ−ＦＫＢＰ１２哺乳類発現構成体はＰａｕｌ  Ｃｌｅｍｏｎｓ博士から贈与された。ＥＧＦＰ−ＦＫＢＰ１２哺乳類発現ベクターはＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入したＣｒｅａｔｏｒ（商標）クローニングシステムおよびＨａｒｖａｒｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓから入手したＦＫＢＰ１２ライブラリーベクターを用いて作製した。コルチコステロン、エストラジオール、およびジギトキシンに対する抗体はＳｉｇｍａから購入した。マウス抗Ｆｌａｇ（商標）モノクロナール抗体はＳｉｇｍａから購入した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ヤギ抗ウサギ抗体はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。Ｃｙ５（商標）標識ヤギ抗ＧＳＴおよびウサギ抗マウス抗体はＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。スライドは６３５ｎｍおよび５３２ｎｍのレーザを用いて５μｍ分解能のＡｘｏｎ４０００Ｂスキャナーを用いるかまたは４８８ｎｍおよび５３２ｎｍのレーザを用いて５μｍ分解能のＡｘｏｎ４２００Ａスキャナーを用いるかのいずれかでスキャンした。アレイはモレキュラーデバイスから購入したＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ  ６．０  ソフトウェアを用いて分析した。
【０１２１】
一般方法。市販の全ての材料をさらに精製することなく使用した。ＤＭＦを除いた全ての反応溶媒は溶媒精製システムから調剤し、溶媒は充填され、活性化したアルミナカラムを通過させる。ＤＭＦはアルドリッチ無水グレードであった。他の使用のための溶媒は、フィッシャーから購入した市販のＨＰＬＣグレードであった。全ての反応は、陽アルゴン圧下でオーブン乾燥させた標準実験用ガラス器具で行った。反応はＭｅｒｃｋシリカゲル６０Ｆ２５４プレートを用いて薄層クロマトグラフィーで監視した。化合物はＵＶ（２５４ｎｍ）またはリンモリブデン酸で視覚化した。フラッシュカラムクロマトグラフィーを、Ｍｅｒｃｋシリカゲル６０（２３０〜４００メッシュ）を用いて行った。全てのＮＭＲスペクトルを、Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｏｖａ  ＡＳ５００スペクトロメータに記録した。化学シフトは残留溶媒信号に対するｐｐｍで表現した。ＬＣ−ＭＳはＷａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ１８カラムを有するＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９０  ＨＰＬＣシステムで行った。化合物はＷａｔｅｒｓ  ９９６  フォトダイオードアレイ検出器およびＭｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺ（ＥＳＩ）スペクトロメータで検出した。ＣＨ３ＣＮおよび水中で０．１％のギ酸を溶媒として使用した。比率は、直線勾配で、０分で１５％ＣＨ３ＣＮ／８５％水、５分で１００％ＣＨ３ＣＮであり、次に１分の１００％ＣＨ３ＣＮであった。分取ＨＰＬＣはＳｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ１８セミ分取カラムおよび移動相としてアセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸）／水（０．１％トリフルオロ酢酸）を用いて２４８７  Ｄｕａｌ  Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ検出器を有するＷａｔｅｒｓ  Ｄｅｌｔａ  ６００で行った。
【０１２２】
イソシアネートスライド調製用の一般プロトコル。上述したように調製したアミノ官能化されたスライドガラス（ＭａｃＢｅａｔｈ  Ｇ，  Ｋｏｅｈｌｅｒ  ＡＮ，  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ  ＳＬ．Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｓ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｅｎ  ｍａｓｓｅ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １９９９；１２１：７９６７−６８；参照により本明細書に引用したものとする）かまたは市販のγ−アミノプロピルシランＧＡＰＳ（商標）スライド（コーニング）のいずれかを、ＤＭＦ中にＦｍｏｃ−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（１０ｍＭ、ネオシステム）、ＰｙＢＯＰ（１０ｍＭ）、およびｉＰｒ２ＮＥｔ（２０ｍＭ）の溶液で少なくとも４時間インキュベートした。余分なカップリング溶液を除去するためスライドをＤＭＦで洗浄し、ＤＭＦ中に１０％（ｖ／ｖ）ピペリジンの溶液で３０分（室温）インキュベートし、表面からＦｍｏｃ基を除去した。ＤＭＦですすいだ後、スライドをＤＭＦ中に１０％（ｖ／ｖ）１，６−ジイソシアナトヘキサン（アルドリッチ）の溶液で３０分、室温で活性化させた。ＴＨＦで３回軽くすすぐことで、ロボット式マイクロアレイヤープラットフォーム上に配置する前に活性化溶液の完全除去およびスライドを急速乾燥することができる。プリンティングプロセスの長さに応じて、プリントされたスライドをガラス製減圧デシケーターの金属製ラックに配置する前に、少なくとも１０分間（＞２時間のプリント実行）から２時間（短いプリント実行）まで乾燥させた。三叉アダプタを真空ラインおよびおよそ１ｍＬのピリジンを含む丸底フラスコにつながる管を有するデシケーターに取り付けた。デシケーターおよびフラスコを完全に真空にしたら、真空ラインを閉鎖し、触媒ピリジン蒸気により少なくとも４時間、圧力を正常化した。スライドをその後、エチレングリコール（ＤＭＦ中で１Ｍ）と１％（ｖ／ｖ）ピリジンの溶液に１０分間浸水し、表面を急冷した。スライドをＤＭＦで３０分間かけて２回洗浄し、３０分間かけてエタノールで１回洗浄し、遠心分離で乾燥させ、スクリーニング前に−２０℃で保存した。スライドはこれらの条件を用いて６ヵ月まで保存した。
【０１２３】
多様性低分子マイクロアレイの調製。多様性セットからの低分子を、上述したように、ＡｒｒａｙＩｔ（商標）Ｓｔｅａｌｔｈ  ４８−ピンプリントヘッドおよびＳＭＰ３スポッティングピン（テレコム・インターナショナル社）を装備したＯｍｎｉＧｒｉｄ（登録商標）１００  マイクロアレイヤー（ゲノミック・ソリューションズ）を用いてイソシアネート官能化されたスライドガラス上にアレイした（Ｂａｒｎｅｓ−Ｓｅｅｍａｎら  Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｒｏｕｐ  ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ  ｌｉｇａｎｄｓ．Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ２００３；４２（２１）：２３７６−９；参照により本明細書に引用したものとする）。マイクロアレイは、３２０μｍの中心間距離で１５×１５フィーチャの４８個のサブアレイを有する１０，８００個のプリントされたフィーチャを含む。低分子の溶液（ＤＭＦ中で約１ｍＭ）を３８４ウェルポリプロピレンプレート（アブゲン）からプリントした。９，１５２個のＤＯＳ化合物を含む２８枚のプレート（Ｂｕｒｋｅら  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｓｋｅｌｅｔｏｎｓ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌｌｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００３；３０２（５６４５）：６１３−８；Ｂｕｒｋｅら  Ａ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｔｒａｇｅｇｙ  ｙｉｅｌｄｉｎｇ  ｓｋｅｌｅｔａｌｌｙ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌｌｙ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  ２００４；１２６（４３）：１４０９５−１０４；Ｃｈｅｎら  Ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ−ｏｒｉｅｎｔｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｈｙｂｒｉｄｓ．Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ２００５；４４（１５）：２２４９−５２；Ｋｕｍａｒら  Ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｔｒａｇｅｇｙ．Ｏｒｇ  Ｌｅｔｔ  ２００５；７（１３）：２５３５−８；Ｌｏら  Ａ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  ｓｐｉｒｏｏｘｉｎｄｏｌｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａ  ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｔｈｒｅｅ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００４；１２６（４９）：１６０７７−８６；Ｓｔａｖｅｎｇｅｒら  Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ−Ｏｒｉｅｎｔｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ４３２０  Ｅｎｃｏｄｅｄ  ａｎｄ  Ｓｐａｔｉａｌｌｙ  Ｓｅｇｒｅｇａｔｅｄ  Ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒａｎｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅｓ．Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ２００１；４０（１８）：３４１７−３４２１；Ｗｏｎｇら  Ｍｏｄｕｌａｒ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｉｖｅｒｓｅ  １，３−ｄｉｏｘａｎｅ��．Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ２００４；１１（９）：１２７９−９１；各々は参照により本明細書に引用したものとする）、３３６個の生体活性、７２個の対照化合物、およびＤＭＦを含有する１，１９２個の空白ウェルをプリントした。様々な濃度のローダミン誘導体（〜１ｍＭ、ＤＭＦ）を含む２９枚目のプレートの４８個のウェル（ＭａｃＢｅａｔｈら  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｓ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｅｎ  ｍａｓｓｅ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １９９９；１２１：７９６７−６８；参照により本明細書に引用したものとする）を、サブアレイを構成するアレイ上の蛍光マーカーとして機能するため最終ディップ中でプリントした。各ピンをアセトニトリルで５秒間、３回洗浄し、試料のキャリー・オーバー汚染を最小化するため、ウェルから試料を取り出す間に３秒間、真空乾燥した。１００個のアレイを所与のプリント実行でプリントし、１，０００個を超える多様性マイクロアレイのコピーを現在までプリントした。各プリント実行用の品質管理には、スクリーニング前のアレイをスキャンすることおよび種々のｆｌｏｕｒ対照フィーチャのみならず選択した公知のタンパク質−リガンド相互作用を検出するためのスクリーニングの存在または非存在を探すことを含めた。
【０１２４】
精製ＦＫＢＰ１２−ＧＳＴを有するマイクロアレイスクリーニング。マイクロアレイをＰＢＳＴ緩衝液で１μｇ／ｍＬの精製ＦＫＢＰ１２−ＧＳＴ溶液３００μＬで３０分間、室温でインキュベートした（Ｈａｒｄｉｎｇら  Ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔ  ＦＫ５０６  ｉｓ  ａ  ｃｉｓ−ｔｒａｎｓ  ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｐｒｏｌｙｌ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ  １９８９；３４１（６２４４）：７５８−６０；Ｓｉｅｋｉｅｒｋａら  Ａ  ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔ  ＦＫ５０６  ｈａｓ  ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｐｒｏｌｙｌ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｕｔ  ｉｓ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｆｒｏｍ  ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ  １９８９；３４１（６２４４）：７５５−７；各々は参照により本明細書に引用したものとする）。アレイをＰＢＳＴで軽くすすいだ後、軌道式平台震盪器上、ＰＢＳＴで２回洗浄（各洗浄は１分）した。アレイをその後、ＰＢＳＴ中にＣｙ５（商標）標識ヤギ抗ＧＳＴ抗体の０．５μｇ／ｍＬ溶液３００μＬで３０分間、室温でインキュベートした。プローブしたアレイをＰＢＳＴですすぎ、ＰＢＳＴで３回洗浄（各洗浄は２分）し、ＰＢＳで１回洗浄（２分）した。アレイを遠心分離で乾燥させ、Ｇｅｎｅｐｉｘ  ４０００Ｂマイクロアレイスキャナー上、６３５ｎｍで蛍光スキャンした。蛍光信号がプリントされたリガンドへのＦＫＢＰ１２の結合によるものであったことを確実にするため、対照アレイを二次標識抗体、一次抗体、続いて標識二次抗体、およびＧＳＴ、続いて一次抗体および二次抗体の両方でプローブした。リガンド３ａ〜３ｑ（図３ｂ）を含むアレイフィーチャを分析するため、全蛍光強度値を、ＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ  ６．０  ソフトウェアを用いて、各フィーチャに心合わせした直径３００μｍのセットに対して算出した。さまざまな濃度での各リガンドに対する強度をグラフに示す（図３ｃ）。
【０１２５】
天然産物に対する抗体との低分子マイクロアレイプロファイル。マイクロアレイを天然産物でプリントし、生体活性を、特定化合物を検出するため様々な抗体でインキュベートした。第一のインキュベーション工程において、アレイは、以下の１つ：ＰＢＳＴ緩衝液（対照）、ウサギ抗コルチコステロン全抗血清：ＰＢＳＴ＝１：５００の溶液、ウサギ抗１７β−エストラジオール全抗血清：ＰＢＳＴ＝１：５００の溶液の３００μＬで３０分間、室温でインキュベートした。アレイをＰＢＳＴで軽くすすいだ後、ＰＢＳＴで２回洗浄した。全アレイをその後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ヤギ抗マウスポリクローナル二次抗体：ＰＢＳＴ＝１：１０００の溶液３００μＬで３０分間、室温でインキュベートした。プローブしたアレイをＰＢＳＴですすぎ、ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＰＢＳで１回洗浄した。アレイを遠心分離で乾燥させ、６３５ｎｍで蛍光スキャンした。信号対雑音比は、調整した直径を用いて、各フィーチャに対して算出した。
【０１２６】
溶解物からのＦｌａｇ−ＦＫＢＰ１２との多様性マイクロアレイスクリーニング。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞のルーチン培養をペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したＤＭＥＭで行った。Ｆｌａｇ（商標）エピトープ標識ＦＫＢＰ１２コード配列を含有する哺乳類の過剰発現ベクターを有するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞のトランスフェクションをＦｕＧＥＮＥ６脂質トランスフェクション（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）によって行った。細胞を４８時間後に採取し、清澄化溶解物をＭＩＰＰリシスバッファー（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ  ７．２、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、５ｍＭ  ＮａＦ、２５ｍＭ  β−グリセロリン酸、２ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００）でインキュベートし、遠心分離によって調製した。付加的なリシスバッファーを加え、全タンパク質濃度を０．３ｍｇ／ｍＬにし、Ｆｌａｇ（商標）−ＦＫＢＰ１２の過剰発現をウエスタンブロット法で確認した（データは図示せず）。低分子マイクロアレイを清澄化溶解物、抗Ｆｌａｇ（商標）Ｍ５マウスモノクローナル一次抗体、およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ヤギ抗マウスポリクローナル二次抗体で順次インキュベートした。抗体を、１．０％ウシ血清アルブミンを補充したＰＢＳＴで０．５μｇ／ｍＬに希釈した。全てのインキュベーションを４℃で１時間行った。インキュベーション後、スライドをＰＢＳＴで軽く洗浄した。蒸留水で軽くすすいだ後、スライドを遠心分離で乾燥させ、スキャンし、上述のように分析した。
【０１２７】
細胞溶解物とのＳＭＭスクリーニング用プロトコル
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクション
１．７０〜９０％融合するまで、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ＋Ｐ／Ｓ＋Ｇｌｕｔで細胞を成長させる
２．６ウェルプレート２４のウェルごとに５×１０５細胞をメッキする（１ウェル＝１ＳＭＭ）
３．３７℃で２４時間インキュベートする
４．２ｍＬの温かなＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳで培地を交換する
５．脂質トランスフェクション反応を以下の順序で調製する：
ａ．ＯｐｔｉＭＥＭ（インビトロゲン）  １００ｍＬ
ｂ．Ｆｕｇｅｎｅ  ６（ロシュ・ダイアグノスティックス）  ３ｕＬ
ｃ．プラスミドＤＮＡ  ２ｕｇ
６．軽くたたいて混合し、室温で１５分インキュベートする
７．ピペットで優しく１００ｕＬのトランスフェクション反応物をウェルの周りに滴下する
８．３７℃で３６〜４８時間インキュベートする
９．ＥＧＦＰによってトランスフェクション効率を監視および記録する
トランスフェクト細胞の採取
１０．ＥＧＦＰ効率＞７０％で、かつ、強い場合、細胞を採取する
１１．培地を吸引し、捨てる
１２．５００ｕＬの冷却ＰＢＳを各ウェルにピペットする
１３．ＰＢＳの繰り返しピペット操作によって細胞層を穏やかに解放する
１４．１５ｍＬのファルコンチューブで共通の細胞をプールする
１５．ｌ，０００ｇで、４℃×３分スピンする
１６．浮遊物を捨てる
１７．ＰＢＳ中で穏やかに再懸濁する
１８．洗浄工程１５〜１７を全部で３回繰り返す
１９．エッペンドルフチューブで洗浄した細胞懸濁液を等分する
２０．ｌ，０００ｇで、４℃×３分スピンする
２１．浮遊物を慎重に最大限捨てる
２２．ＥｔＯＨ／ドライアイスで細胞ペレットをスナップ凍結する
２３．使用するまで−８０℃で保存する
細胞溶解物の調製
２４．湿り氷上で細胞ペレットを解凍する
２５．プロテアーゼ阻害剤およびＤＴＴ（フレッシュ）でＭＩＰＰリシスバッファーを調製する
２６．ペレットを１００〜２００ｕＬのリシスバッファーで再懸濁する
２７．１５分間、氷上でインキュベートする
２８．ｌ４，０００ｇで、４℃×１０分スピンする
２９．新たな、冷却エッペンドルフチューブに清澄化浮遊物を静かに移す
３０．ブラッドフォードアッセイを行い、タンパク質濃度を評価する
３１．０．３〜１ｕｇ／ｕＬを達成するためリシスバッファーで調整する
プリントされた低分子マイクロアレイのスクリーニング
３２．細胞溶解物をスライド表面に塗布する（方法により決定した容量）：
ａ．Ｈｙｂｅチャンバー  １．４ｍＬ
ｂ．パラフィルム  ０．３ｍＬ
ｃ．カバースリップ  ０．１５ｍＬ
３３．４℃×１時間でインキュベートする
３４．冷却ＰＢＳＴで、４℃で、３×１分間洗浄する
３５．一次抗体を塗布する（ＰＢＳＴ＋１％ＢＳＡで１：１０００希釈）
３６．４℃×１時間でインキュベートする
３７．冷却ＰＢＳＴで、４℃で、３×１分間洗浄する
３８．二次Ｃｙ５標識抗体を塗布する（ＰＢＳＴ＋１％ＢＳＡで１：１０００希釈）
３９．４℃×１時間でインキュベートする
４０．冷却ＰＢＳＴで、４℃で、３×３分間洗浄する
４１．ｄｄＨ２Ｏで軽くすすぐ
４２．１０００ｒｐｍ×１分間、スライドを遠心分離機にかけ、乾燥させる
４３．ＰＭＴ電圧（５００）および１００％出力により６３５でスキャンする
ＭＩＰＰリシスバッファー  １．００Ｌ
ＮａＨ２ＰＯ４２Ｈ２Ｏ  ２０ｍＭ  ３．１２ｇ
Ｎａ３ＶＯ４  １ｍＭ  ０．１８４ｇ
ＮａＦ  ５ｍＭ  ０．０８ｇ（８０ｍｇ）
Ｂ−グリセロリン酸  ２５ｍＭ  ５．４８ｇ
ＥＧＴＡ  ２ｍＭ  ０．７８ｇ
ＥＤＴＡ  ２ｍＭ  ０．７２ｇ
トリトンＸ−１００  ０．５％  ２．５ｍＬ
ＤＴＴ  １ｍＭ  フレッシュ
ｐＨ  ７．２
ＰＢＳＴ＝ＰＢＳ＋０．１％ツイーン２０
統計的方法
１０個のマイクロアレイ（５個の処理および５個の対照）を、ＦＫＢＰ１２含有胞溶解液を有するプリントされた低分子の相互作用を決定するため使用した。各マイクロアレイは、全部で１０，８００個のプリントされたフィーチャを含んでいた。各マイクロアレイ上の１０，８００個のフィーチャのうちで、１５８個のフィーチャは溶媒のみを含んでおり、強度の閾値を確立するために陰性対照として使用した。全ての溶媒細胞（１５８×１０＝１，５８０）に対する最大蛍光強度値（すなわち、閾値）は２．２４３であることが分かった。データを二分するためこの閾値を用いて、フィッシャーの正確確率検定を、処理細胞が対照フィーチャの強度よりも大きな強度を有しているという仮説を評価するために使用した。分割表およびｐ値は、少なくとも１つの細胞が閾値を超える蛍光強度を実証した１０４個の溶媒のみのフィーチャに対して作成した。計算はＳＡＳ（キャリー、ノースカロライナ州）で厳密なオプションを用いて行った。
【０１２８】
表面プラズモン共鳴による１２７６−Ｍ０８の結合評価
ＳＰＲ測定はＢｉａｃｏｒｅ  Ｓ５１装置（ビアコア社（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ）、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージー州）で行った。Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５リサーチグレードセンサーチップ上の各フロー細胞は３つのアドレス可能なスポット：２つのサンプルスポットと１つのリファレンススポットを含む。抗ＧＳＴを１３，０００応答単位（ＲＵ）レベルでスポット１およびスポット２上に固定化した。１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で希釈した抗ＧＳＴをＥＤＣ／ＮＨＳ結合ケミストリーアプリケーションウィザードを用いて固定化した。固定化ケミストリーをエタノールアミンで急冷した。ＧＳＴ標識ＦＫＢＰ１２を１，６００ＲＵレベルでスポット１上に捕捉し、組み換えＧＳＴをスポット２上に捕捉した。
【０１２９】
速度実験を３０μｌ／分の流量でランニングバッファー（２４ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ  ７．４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、０．００５％（ｖ／ｖ）Ｐ２０界面活性剤、および５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ）で行った。化合物を、２．５μＭから開始して１：２希釈した６つの異なる濃度で２回テストした。速度定数および平衡定数をＳｃｒｕｂｂｅｒおよびＣｌａｍｐＸＰソフトウェア（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ、ユタ大学）を用いて算出した。結合データをダブルリファレンス減算し、ＦＫＢＰ１２への合成リガンドで実験的に決めた最大数の結合部位を有する１：１ラングミュア結合モデルを用いて全体的にフィットした。センサーグラムを最大応答がｙ軸上で１００ＲＵに対応するよう正規化した。
【０１３０】
ＦＫＢＰ１２リガンド３ａ〜３ｒの合成
カルボン酸官能化されたＦＫＢＰ１２−リガンド３ｆを以下の刊行物：Ｔｅｒｅｎｃｅ  Ｋｅｅｎａｎ，  Ｄａｖｉｄ  Ｒ．Ｙａｅｇｅｒ，  Ｎａｎｃｙ  Ｌ．Ｃｏｕｒａｇｅ，  Ｃａｒｌ  Ｔ．Ｒｏｌｌｉｎｓ，  Ｍａｒｙ  Ｅｌｌｅｎ  Ｐａｖｏｎｅ，  Ｖｉｃｔｏｒ  Ｍ．Ｒｉｖｅｒａ，  Ｗｕ  Ｙａｎｇ，  Ｔａｏ  Ｇｕｏｙ，  Ｊａｎｅ  Ｆ．Ａｍａｒａ，  Ｔｉｍ  Ｃｌａｃｋｓｏｎ，  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｇｉｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｄｅｎｎｉｓ  Ａ．Ｈｏｌｔ；Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６（１９９８）１３０９−１３３５におけるプロトコルにしたがって合成した。３ｆは他の報告された合成ＦＢＢＰ１２−リガンド（３ａ〜ｅおよび３ｇ〜ｑ）用の共通中間体として機能した。
【０１３１】
一般方法Ａ（アミドカップリング）：２９２ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）のカルボン酸３ｆと４当量（保護されていないジアミンの場合、２０当量）の対応するアミンを５ｍＬの塩化メチレンに溶解した。反応混合物を０Ｃに冷却し、２８６ｍｇ（０．５５ｍｍｏｌ、１．１当量）のＰｙＢｏｐを１ｍＬの塩化メチレンに加えた。反応混合物をこの温度で、全てのカルボン酸が消費されるまで（通常、１時間以内）撹拌した。検査のため、塩化メチレンを加え、有機層を半飽和重炭酸ナトリウム溶液および水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過後、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物を分取ＨＰＬＣで精製した。
【０１３２】
一般方法Ｂ（エステル形成）：１４６ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）のカルボン酸３ｆと４０ｍｇ（０．３ｍｍｏｌ、１．２当量）のＮ，Ｎジメチルアミノピリジンを３ｍＬの塩化メチレンに溶解した。反応混合物を０Ｃに冷却し、６２ｍｇ（０．３ｍｍｏｌ）のジシクロヘキシルカルボジイミドを１ｍＬの塩化メチレンにゆっくり加え、次いで、１０当量（２．５ｍｍｏｌ）の対応するジオールをゆっくり加えた。反応混合物をその後、室温に温め、１時間撹拌した。沈殿物を濾過し、塩化メチレンで洗浄した。有機層を組み合わせ、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をまず、ＩＳＣＯ  ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈシステム（ヘキサン−酢酸エチル、１０％〜１００％勾配の酢酸エチル、２７８ｎｍで検出）上で、シリカで精製し、次いで、分取ＨＰＬＣで精製した。
第一級アルコール３ａ：方法Ａ
第二級アルコール３ｂ：方法Ａ
第三級アルコール３ｃ：方法Ｂ
フェノール３ｄ：方法Ａ
メチルエーテル３ｅ：方法Ａ
ヒドロキサム酸３ｇ：方法Ａ
アルキル３ｈ：方法Ａ
チオール３ｉ：方法Ａ
第一級アミン３ｊ：方法Ａ
第二級アミン３ｋ：方法Ａ
インドール３ｌ：方法Ａ
アニリン３ｍ：方法Ａ
３−ＰＥＧ第一級アミン３ｎ：方法Ａ
２−ＰＥＧ第一級アルコール３ｏ：方法Ｂ
３−ＰＥＧ第一級アルコール３ｐ：方法Ｂ
５−ＰＥＧ第一級アルコール３ｑ：方法Ｂ
【０１３３】
【化４９】
2009522576.tif 000041
Ｎ，Ｎ−ジメチルアミドＡＰ１４９７誘導体３ｒ：１０ｍＬの丸底フラスコを３ｆ（１０ｍｇ、１７．２μｍｏｌ）で満たし、カップリング試薬の付加前に高真空下で乾燥させた。アルゴン雰囲気下で、カップリング試薬（１．４当量のＮ，Ｎ−ジメチルアミン、１．６当量のＰｙＢＯＰ、３ｍＬ無水ＤＭＦで２．８当量のＤＩＰＥＡ）をフラスコに加えた。混合物をアルゴン下、周囲温度で１４時間撹拌し、反応結果をＴＬＣで監視した。完了後、反応混合物を酢酸エチル（１０ｍＬ）で希釈した。有機層を２％ＫＨＳＯ４（含水）、ｄｄＨ２Ｏ、塩水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４下で乾燥させた。濾過液を減圧下で濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝２０：１）により、透明油（１１ｍｇ、９２．３％単離収率）として所望の生成物を得た。
【０１３４】
【化５０】
2009522576.tif 000042
Ｃ３４Ｈ４７Ｎ２Ｏ８Ｎａ（Ｍ＋Ｈ）＋に対するＨＲＭＳ（ＴＯＦ−ＥＳ＋）算出、６１１．３３３２（誤差１．６ｐｐｍ）。
【０１３５】
ＬＣＭＳデータ：
カップリング反応用の出発原料、カルボン酸ＡＰ１４９７誘導体３ｆ：
【０１３６】
【化５１】
2009522576.tif 000043
【０１３７】
【化５２】
2009522576.tif 000044
【０１３８】
【化５３】
2009522576.tif 000045
【０１３９】
【化５４】
2009522576.tif 000046
【０１４０】
【化５５】
2009522576.tif 000047
【０１４１】
【化５６】
2009522576.tif 000048
【０１４２】
【化５７】
2009522576.tif 000049
【０１４３】
【化５８】
2009522576.tif 000050
【０１４４】
【化５９】
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【０１４５】
【化６０】
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【０１４６】
【化６１】
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【０１４７】
【化６２】
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【０１４８】
【化６３】
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【０１４９】
【化６４】
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【０１５０】
【化６５】
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【０１５１】
【化６６】
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【０１５２】
【化６７】
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【０１５３】
【化６８】
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【０１５４】
【化６９】
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【０１５５】
【化７０】
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【０１５６】
【化７１】
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【０１５７】
【化７２】
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【０１５８】
【化７３】
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【０１５９】
【化７４】
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【０１６０】
【化７５】
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【０１６１】
【化７６】
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【０１６２】
【化７７】
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【０１６３】
【化７８】
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【０１６４】
【化７９】
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【０１６５】
【化８０】
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【０１６６】
【化８１】
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【０１６７】
【化８２】
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【０１６８】
【化８３】
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【０１６９】
【化８４】
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【０１７０】
【化８５】
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実施例２−マイクロアレイ形式における多様な低分子の共有結合捕捉およびスクリーニング方法
この実施例では、マイクロアレイ形式における多様な反応性官能基を有する低分子のロバストな共有結合捕捉方法について説明し、対象となるタンパク質を有する低分子マイクロアレイのプローブ手順を概説する。蒸気触媒し、イソシアネート媒介した表面固定化スキームを、多様性指向合成経路由来の生物活性低分子、天然産物、および低分子を結合するのに使用する。さらに、精製タンパク質および細胞溶解物を有する低分子マイクロアレイスクリーニング用の最適化方法論について説明する。最後に市販のソフトウェアと互換性があるデータ分析用の提案モデルを提供する。これらの手順により、免疫グロブリンプロファイリング、細胞状態の比較分析、およびリガンド発見への潜在用途を有する新規の相互作用を発見するためのプラットフォーム能力を可能にする。
【０１７１】
ここで、蒸気触媒し、イソシアネート媒介した技術を用いた低分子の多様集合体を共有結合捕捉するこの方法の段階的な詳細説明を行う。この方法の概略図を図１０に提供する。低分子の原液を３８４ウェルプレート形式にアレイする。保護化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）表面を顕微鏡用スライドガラス上に調製する（図１１）。脱保護後、１，６−ジイソシアナトヘキサンを、反応性イソシアネート表面を確立するためカップリングする。低分子をロボット制御でプリントし、表面への共有結合をその後、ピリジン蒸気によって触媒させる。急冷し、洗浄したスライドをその後、さらなる実験での使用用に乾燥保存した。複雑な天然産物、多様性指向合成の生成物、および医薬品などの生物活性低分子との適合性により、プリントされた低分子フィーチャの量および構造多様性を大幅に改善することを約す。
【０１７２】
この表面は清澄化細胞溶解物を伴うアッセイと実験的に適合性があり、対象となる生化学的精製を行う必要が無くなる場合が多い。精製タンパク質および細胞溶解物を有する低分子マイクロアレイのスクリーニング用の最適化プロトコルについても説明する。少容量のタンパク質または溶解物でインキュベーション後、スライドを洗浄し、その後、一次抗体および標識二次抗体で順次インキュベートした。結合相互作用の検出は、プリントされたオリゴヌクレオチドアレイの分析用に開発された標準の市販ソフトウェアを用いて、三重に収集したデータから定量的に決定する。ここで記載していないが、このプロトコルを用いて発見された候補タンパク質−リガンド相互作用は、蛍光系熱シフトおよび表面プラズモン共鳴を伴う二次結合アッセイを用いて一般的に特徴付けられる。
【０１７３】
この原稿中に記載したプリンティングおよび検出の方法には制約がある。まず、多くの学術環境はスクリーニング用のケミカルライブラリーへのアクセスが制限されている場合がある。機能性ロボットマイクロアレイプリンティングプラットフォームを確立するため必要な資源およびトレーニングの投資も、制度上の課題を招くものでもある。設備に対する＄１５０，０００の初期投資後、ＳＭＭのプリンティングおよびスクリーニングの見積原価は１アレイあたり＄２０未満である。ＳＭＭスクリーニングにおいては、ゲノミクス研究を目的とするマイクロアレイ施設を介して必要な全ての試薬および設備を利用できる研究環境が多くある。
【０１７４】
本明細書で記載されるプロトコルには、保護眼鏡または安全手袋、および適切に換気されるドラフト・チャンバーなどの適切な安全機器を使用することが必要となるいくつかの有機溶媒および材料の使用が含まれる。化学物質安全性データシート（ＭＳＤＳ）からの注釈を選択試薬に備えておく。全ての反応および洗浄は、ドラフト・チャンバーで行う。適切な有機実験室での技術に関するさらなるガイダンスについては、参照文献１７を参照されたい。機器およびソフトウェアは例として提供する。別の機器およびソフトウェアを使用することもできる。マイクロアレイは、適切に密閉し、換気したマイクロアレイヤーのみならず隣接するドラフト・チャンバーを備えるマイクロアレイ施設で調製することができる。低分子マイクロアレイは任意の標準的なマイクロアレイ施設でスクリーニングし、スキャンすることができる。表１において、テストケースとして、免疫抑制天然産物およびタンパク質ＦＫＢＰ１２への公知のリガンドを含むいくつかの市販の染料および低分子のプリンティングを提案している。本プロトコルをこれらのリガンド−タンパク質対に適用することは、本明細書で記載される手順を把握するのに役立つであろう。
【０１７５】
本明細書で記載されるＳＭＭのプリンティングおよびスクリーニング方法論は、新規のタンパク質−リガンド相互作用の発見用の持ち運び可能で、強固な、パラレルプラットフォームの構成に対する青写真を提供する。酵母菌転写因子を標的とする低分子の先行発見は、悪性形質転換などの疾病表現型を媒介する遺伝子調節要素への将来的な応用により、ツール化合物の同定およびさらなる医薬開発に対するリードが可能となることを示唆している。細胞溶解物を有するスライド表面の適合性により、細胞状態または血清免疫グロブリンなどの複合混合物をプロファイルするさらなる機会を生む。
【０１７６】
材料
試薬
・コーニング  ＧＡＰＳ  ＩＩ被覆スライドガラス（フィッシャー、０７−２００−００６）
・Ｆｍｏｃ−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（ＮｅｏＭＰＳ、ＦＡ０３２０２）。可変長のポリエチレングリコールスペーサー（ｎ＝２〜１０のエチレングリコール単位）は、このプロトコルでうまく用いられている。より長い長さのスペーサー（ｎ＞３０）は、より低い蛍光強度値および非一貫性のスポット形態を提供する。
【０１７７】
・（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェイト、ＰｙＢＯＰ（登録商標）（ノババイオケム、０１−６２−００１６）
・ピペリジン、再蒸留（シグマアルドリッチ、４１１０２７）
・１，６−ジイソシアナトヘキサン（アルドリッチ、Ｄ１２４７０２）
・ピリジン（アルドリッチ、２７０９７０）
・エチレングリコール（アクロス・オーガニクス、２９５５３００１０）
・Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ＤＭＦ（フィッシャーケミカル、Ｄ１３１−４）
・Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、ＤＩＰＥＡ（シグマアルドリッチ、５５００４３）
・ジメチルスルホキシド（アクロス・オーガニクス、４１４８８００１０）
・アセトニトリル（フィッシャーケミカル、Ａ９９８−４）
・テトラヒドロフラン、ＴＨＦ、安定化（アクロス・オーガニクス、１６４２４００２５）
・Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）カダベリン（インビトロゲン、Ｔ−２４２５）
・Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）４８８  カダベリン（インビトロゲン、Ｏ−１０４６５）
・Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７  カダベリン（インビトロゲン、Ａ−３０６７９）
・ラパマイシン（ＬＣラボラトリーズ、Ｒ−５０００）
・ＦＫ５０６（ＬＣラボラトリーズ、Ｆ−４９００）
・ＡＰ１４９７は、参照文献１８に記載されているように調製した
・ＦＫＢＰ１２−６ｘＨｉｓは、リファレンス８に記載されているように調製した
・Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７  共役抗５ｘＨｉｓ抗体（キアゲン、３５３７０）
・Ｃｙ５モノ反応性抗体  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｄｙｅ  Ｐａｃｋ（ＧＥヘルスケア、ＰＡ２５００１）
・２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１１２６８）
・Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  トランスフェクション試薬（インビトロゲン、１１６６８−０１９）
・ＯｐｔｉＭＥＭ還元血清、コンポーネント・フリー培地（インビトロゲン、１１０５８）
・参照文献１５に記載されているＦｌａｇ−ＦＫＢＰ１２哺乳類過剰発現構成体
・抗ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ５モノクローナルマウス抗体  （シグマ、Ｆ４０４２）
・抗マウスヤギ二次抗体、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７複合体（インビトロゲン、Ａ−２１２３７）
・抗ウサギヤギ二次抗体、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７複合体（インビトロゲン、Ａ−２１２４６）
・ビオチン（シグマ、Ｂ４５０１）
・ビオチン−ＰＥＧアミン（シグマ、Ｂ９９３１）
・ビオチンカダベリン（インビトロゲン、Ａ−１５９４）
・ストレプトアビジン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７複合体（インビトロゲン、Ｓ−３２３５７）
・ジゴキシン（シグマ、Ｄ６００３）
・抗ジゴキシンマウスモノクロナール抗体、クローンＤＩ−２２、腹水液（シグマ、Ｄ８１５６）
・コルチコステロン（フルカ、２７８４０）
・抗コルチコステロンウサギ抗体、全抗血清（シグマ、Ｃ８７８４）
・プロテアーゼインヒビターカクテルタブレット（ロシュ、１１８３６１７０００１）
・トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ、０．０２５Ｍ  トリスＨＣｌ、０．１３７Ｍ  ＮａＣｌ、０．００３Ｍ  ＫＣｌ、ｐＨ  ７．４）
・ツイーン２０を有するトリス緩衝食塩水（ＴＢＳＴ、０．０２５ＭトリスＨＣｌ、０．１３７Ｍ  ＮａＣｌ、０．００３Ｍ  ＫＣｌ、ｐＨ  ７．４、０．０１％（ｖ／ｖ）ツイーン２０）
・リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、０．０１２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．１３７Ｍ  ＮａＣｌ、０．００３Ｍ  ＫＣｌ、ｐＨ  ７．４）
・ツイーン２０を有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳＴ、０．０１２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．１３７Ｍ  ＮａＣｌ、０．００３Ｍ  ＫＣｌ、ｐＨ  ７．４、０．０１％（ｖ／ｖ）ツイーン２０）
・ＭＩＰＰリシスおよびインキュベーションバッファー（０．０２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．００１Ｍ  Ｎａ３ＶＯ４、０．００５Ｍ  ＮａＦ、０．０２５Ｍ  β−グリセロリン酸、０．００２Ｍ  ＥＧＴＡ、０．００１Ｍ  ＤＴＴ、０．５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００、ｐＨ  ７．２）。ＲＩＰＡリシスおよび抽出バッファー（０．０２５ＭトリスＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１％（ｖ／ｖ）ＮＰ−４０、１％（ｖ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム、０．１％（ｖ／ｖ）ＳＤＳ、ｐＨ  ７．６）の使用は、アッセイ中の信号対雑音を著しく低下させるスライド表面上の自家蛍光フィルムの形成をもたらすため、回避すべきである。
【０１７８】
機器
・ＯｍｎｉＧｒｉｄ  １００  マイクロアレイヤー（ゲノミック・ソリューションズ）
・９４６プリントヘッド（テレコム・インターナショナル、９４６ＰＨ４８）
・９４６マイクロスポッティングピン（テレコム・インターナショナル、９４６ＭＰ３）
・３８４ウェルポリプロピレンナチュラルマイクロアレイプレート、円筒状ウェル（アブゲン、ＡＢ−１０５５）
・熱剥離プレートシール（ベロシティ１１、０６６４３００１）
・デシケーター乾燥保存箱、アクリル（ＶＷＲ、２４９８７−０５３）
・マイクロプレートキャリア付き卓上遠心分離機
・低粒子ニトリルグローブ（ＶＷＲ、４０１０１−２２２）（いくつかの粉付きグローブの使用により、マイクロアレイ上に自家蛍光残留物をもたらすことができる）
・吸水紙（フィッシャー・サイエンティフィック、１１−９９８）
・ステンレス製５０スライドラック（ウィートン・サイエンティフィック、９００４０４）
・ステンレス製蓋付き大型ガラストラフ、５００ｍＬ（レイモンド・ア・ラム、Ｅ１０２−６）
・Ｏリング端付き三叉ガラス真空管（アルドリッチ、Ｚ２７１３３０）
・タイゴンチューブＲ−３６０３（耐真空）
・ガラス製減圧デシケーター（アルドリッチ、Ｚ１１４３４０）
・４ウェル矩形ポリスチレン製皿（ヌンク、２６７０６１）
・正方形ペトリ皿、１００×１００×１５ｍｍ（ヌンク、４０２１）
・パラフィルム（登録商標）Ｍ（フィッシャー・サイエンティフィック、１３−３７４−１０）
・ハイブリスリップ（商標）ハイブリダイゼーションカバー、６０×２２ｍｍ（インビトロゲン、Ｈ−１８２０２）
・エッペンドルフチューブ
・軌道式平台震盪器（ＶＷＲ、８２００４−９５８）
・マイクロアレイ乾燥用２スライド型遠心分離機（スネルジア・メディカル、ＭＳＣ−Ｔ）
・Ｇｅｎｅｐｉｘ  ４２００Ａ  ４レーザースライドスキャナー（モレキュラーデバイス）
・Ｇｅｎｅｐｉｘ  Ｐｒｏ  ６．０  ソフトウェア（モレキュラーデバイス）
試薬準備
低分子：イソシアネート反応性官能基を含むいくつかの低分子を、本方法を評価するため試験分子として提案する（表１）。
【０１７９】
【表１】
2009522576.tif 000078
化合物に対する発注情報は、試薬セクションで提供する。低分子は工程１に記載するようにプリンティング用の１０ｍＭ原液を調製するためＤＭＳＯで希釈しなければならない。
【０１８０】
タンパク質：提案された試験分子は公知のタンパク質または抗体パートナーによって検出することができる（表１）。プリントされたビオチン誘導体は工程２１（方法Ａ）および工程２２（方法Ａ）に記載するように市販のストレプトアビジン−ｆｌｕｏｒ複合体を用いて検出することができる。コルチコステロンおよびジゴキシンは、化合物に対する市販の抗体、続いて、工程２１（方法Ａ）および工程２２（方法Ｂ）に記載するように標識二次抗体を用いて検出することができる。ＡＰ１４９７、ＦＫ５０６、およびラパマイシンはエピトープ標識ＦＫＢＰ１２および工程２１（方法Ａ）および工程２２（方法Ｂ）に記載するようにエピトープ標識に対する標識抗体とのインキュベーションによって検出することができる。最後に、一次抗体および標識二次抗体を用いて、細胞溶解産物からのエピトープ標識ＦＫＢＰ１２を用いたこの相互作用の検出用プロトコルを工程２４〜２９に記載する。各テストケース用の提案するスクリーニング濃度および抗体希釈を表１に提供する。ＴＢＳＴまたはＰＢＳＴなどの標準緩衝液は全ての実験に使用することができる。
【０１８１】
機器セットアップ
カスタマイズされたマイクロアレイヤー洗浄ステーション。標準ＯｍｎｉＧｒｉｄ  １００  セットアップはプリンティングピンの水性洗浄用の超音波処理器を含む。低分子マイクロアレイにおいて、ピンから化合物を洗い流すためアセトニトリルなどの有機溶媒を使用する。超音波処理ステーションは撹拌プレートとアセトニトリルを含む再結晶皿に置き換えている。各洗浄工程の際、プリントヘッドを撹拌アセトニトリル皿に５秒間浸し、その後、真空乾燥ステーションで３秒乾燥させる。各ピンの浸漬において、試料のキャリー・オーバーを最小化するため洗浄乾燥サイクルを３回繰り返す。撹拌棒は、ピンが溶媒と接触しないような深い渦を作らないようにする。確実にピンが効率的に洗浄されるように、溶媒レベルを時折監視する。
【０１８２】
一般的なＧｅｎｅｐｉｘスキャナー設定。画素サイズ：１０μｍ；レーザあたりのＰＭＴ電圧：６３５ｎｍ  ｅｘ．（赤色）＝５００−６００、５９４ｎｍ  ｅｘ．（黄色）＝６００、５３２ｎｍ  ｅｘ．（緑色）＝５００−５５０、４８８ｎｍ  ｅｘ．（青色）＝４００−５００。
【０１８３】
手順
プリンティング用低分子原液の調製
１．対象となる低分子をＤＭＳＯに溶解する。一般に、プリンティングストック濃度は１ｍＭ〜１０ｍＭの範囲である。ＤＭＦは原液調製用の適切な代替溶媒である。原液は−２０℃で保存する。
２．各原液５μＬを３８４ウェルポリプロピレンマイクロアレイプレートの個々のウェルに移す。大量の試料数においては、液体移動ロボットを使用するのが望ましい。密閉ストックプレートを−２０℃で保存し、凍結融解サイクルを１０回まで行った後、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を行い、化合物ストックの安定性を監視する。許容凍結融解サイクル数はプリントされる低分子の性質によることが多い。プリンティングストックプレートの一般的なセットは１２回の凍結融解サイクル後に廃棄する。
【０１８４】
イソシアネート被覆した顕微鏡用スライドガラスの調製
３．１００枚のアミノ官能化されたＧＡＰＳ  ＩＩスライド（コーニング）を２つのステンレス製５０スライドラック中に入れる。各ラックを、フレッシュなＰＥＧ溶液：１ＬのＤＭＦ中にＦｍｏｃ−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（１ｍＭ）、ＰｙＢＯＰ（２ｍＭ）、およびＤＩＰＥＡ（０．５ｍＭ）を含む大型ガラストラフに浸す。溶液はスライドを完全に覆わなければならない。ドラフト・チャンバーで、少なくとも４時間室温で撹拌しながらＰＥＧ溶液中でスライドをインキュベートする。インキュベーションは一般に一晩行う。
４．ＰＥＧ溶液からラックを取り出し、ＤＭＦで軽くすすぐ前にＰＥＧ溶液を滴り落とす。ラックを再びドリップドライし、１ＬのＤＭＦ中に１％（ｖ／ｖ）ピペリジンを含む清浄タンクに入れ、表面からＦｍｏｃ基を除去した。脱保護反応は室温で１０分後に完了する。スライドは一晩、脱保護溶液に放置することができる。
５．ピペリジン溶液からラックを取り出し、ドリップドライし、撹拌しながらＤＭＦで１分間洗浄する。スライドの表面上にイソシアネート基を取り付けるため、脱保護化スライドをＤＭＦ中に１％（ｖ／ｖ）１，６−ジイソシアナトヘキサンを含むトラフに入れる。完全に浸したスライドを室温で３０分間、撹拌しながらこの溶液中でインキュベートする。
６．撹拌しながら活性化スライドをＤＭＦに浸し、３分間洗浄する。フレッシュなＤＭＦで繰り返す。撹拌しながらスライドをＴＨＦに浸し、２分間洗浄する。この洗浄シーケンスにより、余分なイソシアネート試薬をスライドから効率的に除去し、無菌で乾燥したスライドを提供する。スライドは一般に、余分な溶媒および試薬がマイクロアレイヤープラットフォームにさらされないようプリンティング前に乾燥させる。スライドは、ＴＨＦの最終すすぎ後、空気の緩流下で、１分または２分間乾燥させてもよい。あるいは、単にＴＨＦを数分間蒸発させる。
【０１８５】
低分子マイクロアレイのプリンティング
７．化合物ストックプレートを冷凍庫から取り出し、デシケーター乾燥保存箱で解凍させる。
８．乾燥させ、活性化させたスライドをマイクロアレイヤープラットフォームの上に注意深く置く。スライドをバーコードステッカに対して全て共通の方向にすること。
９．ピンの先端に触れないように注意しながら、プリントヘッドに無菌プリンティングピンを装填する。
１０．ＯｍｎｉＧｒｉｄ  １００  ソフトウェアを用いてプリンティング構成を設計する。ＤＭＳＯからのプリンティングは一般に、およそ１５０μｍのスポット直径を有するフィーチャを提供する。３００μｍの中心間距離を用いることにより、１０，８００個のフィーチャを４８個のピンを用いて１５×１５サブアレイに無理なくプリントすることができる。
１１．Ｇｅｎｅｖａｃ  ＨＴ−２４またはマイクロプレートアダプタを有する標準型卓上遠心分離機を用いて１分間、４００ｇで全ての化合物ストックプレートを遠心分離する。全ての原液が確実にウェルの底部に存在するように、プレートを遠心分離しなければならない。
１２．無菌ガラスブロッターを３つのマイクロプレート位置の１つに挿入する。最初の２枚の化合物ストックプレートを残りのマイクロプレートホルダに挿入する。実際のプリンティングシーケンスと理論的プリントシーケンスまたはＧＡＬファイルとの間の不整合を防止するため、全てのストックプレートをマイクロプレートホルダ上にウェルＡ０１に対して適切な方向に戴置する。
１３．所望のアレイ形式で化合物をプリントする。アレイヤーに試料ピックアップごとにブロッター上の中心間距離４００μｍで３０フィーチャを前スポットするように指示する。２枚のプレートごとのプリンティング後、吸水紙およびメタノールでブロッターをきれいにする。活性化スライド上にスポッティングする前にブロッター上のプリンティング溶液により、余分な溶液がプリント実行の最初の数枚のスライド上に大きなスポットを生じるのを防ぐ。
１４．プリント実行が完了後、スライドを少なくとも１０分間、マイクロアレイヤープラットフォーム上に放置し、プリントされた試料を乾燥させる。
１５．プリントされたスライドをステンレス製スライドラックに移す。ラックを換気ケミカルドラフト・チャンバーにタイゴンチューブを介して三叉ガラスバルブに取り付けた減圧デシケーターに入れる。主要な出口は、バルブの一つもまたチューブを介して真空ラインに向けた状態で、チューブを介してデシケーターに向けなければならない。他方の（閉鎖）バルブは、チューブを介して、２ｍＬ無水ピリジンを有するフラスコに向けなければならない。スライドを含むデシケーターを真空排気する。スライドを、任意の余分なプリンティング溶媒の除去を支援するため５分間真空下に保持する。真空ラインを閉鎖し、ピリジンを含有するフラスコにバルブを開く。デシケーター内のプリントされたスライドをその後、ピリジン蒸気に少なくとも２時間さらす。ピリジンはイソシアネートに反応しにくい官能基の共有結合を触媒する。最後に、ピリジンラインを閉鎖し、デシケーターを真空排気し、スライドを乾燥させる。スライドは一般に、一晩インキュベートする際にピリジン蒸気にさらす。
１６．デシケーターからラックを取り出し、乾燥したスライドをＤＭＦ中に５％（ｖ／ｖ）エチレングリコールおよび０．１％（ｖ／ｖ）ピリジンの溶液中に３０分間撹拌しながら浸し、イソシアネート表面を急冷する。
１７．エチレングリコールを急冷後、スライドをＤＭＦですすぐ。スライドをＤＭＦで１時間、撹拌しながら洗浄し、その後、ＴＨＦで２回、それぞれ３分間ずつ軽く洗浄する。スライドを遠心分離で乾燥させる。
１８．乾燥したスライドをパラフィルムで密閉した５枚用スライドボックスに包装する。マイクロアレイは−２０℃で６ヶ月間まで保存できる。アレイは数日間４℃で保持できる。
【０１８６】
品質管理：公知のタンパク質−小相互作用の検出
１９．公知のフルオロフォア（表１に記載）を見て、自家蛍光化合物を同定するため前スキャンする。
２０．４℃で冷却維持されていたＴＢＳＴ緩衝液中の公知のプリントされたリガンド（表１に記載）を検出するため使用されるタンパク質溶液または抗体溶液を調製する。精製したタンパク質および抗体は一般に、０．１〜５．０μｇ  ｍＬ−１の範囲でスクリーニングする。対象となるタンパク質に適当な緩衝液を使用することが重要である。緩衝液は活性または安定性に必要な特異的補因子または試薬を含まなければならない。自家蛍光付加剤を回避するのが最良である。ＴＢＳＴおよびＰＢＳＴを一般に使用し、例として提供する。
２１．希釈したタンパク質をマイクロアレイで、４℃で１時間インキュベートする。２つのインキュベーション方法を以下に述べる。方法Ａは、タンパク質の供給量が制限されていない場合、または、攪拌が望ましい場合（次に続き得る抗体インキュベーションに対する同一のプロトコルを使用）に使用する。廉価な方法Ｂは結合アッセイに使用するタンパク質の量を最小化するため使用する。この方法はカバースリップの代替として使用し、それにより、一貫性の無い結果と、カバースリップの先端を包囲する高バックグラウンド領域をもたらす：
Ａ）皿法
（ｉ）４ウェル矩形皿のウェルに、マイクロアレイを、プリント面を上にして置く。
【０１８７】
（ｉｉ）スライドバーコードステッカの上に３ｍＬタンパク質溶液を穏やかにピペットで移し、スライドの表面を覆うように溶液を広げさせる。あるいは、３枚のスライドを正方形のベトリ皿にプリント面を上にして置いてもよい。
【０１８８】
（ｉｉｉ）皿を蓋で覆い、溶液がスライドの表面にわたって穏やかに撹拌されるようロッキングプラットフォーム上に置く。あるいは、６ｍＬのタンパク質溶液を皿に穏やかにピペットで移し、撹拌する。
【０１８９】
Ｂ）パラフィルム法
（ｉ）パラフィルム片を切り取り、実験用冷蔵庫または冷蔵室への移送用の、冷蔵室内の無菌実験台などの滑らかで平坦な表面上かまたは冷却した平坦な表面上に置く。
【０１９０】
（ｉｉ）パラフィルムの上に３００μＬのタンパク質溶液をピペットで移す。
【０１９１】
（ｉｉｉ）タンパク質溶液が広がりスライド全体を覆うように、小滴の上にマイクロアレイを、プリント面を下にして注意深く置く。スライドのプリントされた表面とパラフィルムとの間に気泡を取り込まないようにする。
２２．マイクロアレイからタンパク質溶液を注意深く除去する。冷却したＴＢＳＴ緩衝液（４℃）を用いて余分なタンパク質溶液をスライドから軽くすすぎ落とす。直接標識蛍光タンパク質を用いたアッセイにおいては、方法Ａに従う。標識抗体を介して検出に関与するアッセイにおいては、方法Ｂに従う。
Ａ）Ｆｌｕｏｒ標識タンパク質の直接検出
蛍光部分（例えば、Ａｌｅｘａ  ６４７、フルオレセイン、ＧＦＰ等）で直接標識するタンパク質においては、プラットフォーム振盪機または揺動機上で、攪拌しながら２分間、３ｍＬ緩衝液中で各スライドを洗浄する。２回繰り返す。冷却したＴＢＳ緩衝液（４℃）で１分間、１回洗浄し、工程２３に進む。
Ｂ）抗体に基づく検出
ｆｌｕｏｒ標識抗体に基づく検出（例えば、抗Ｈｉｓ、抗ＧＳＴ、抗ＦＬＡＧ等）を用いる際には、対象となる希釈抗体をＴＢＳＴまたは別の適当な緩衝液に直ちに塗布し、スライドを４℃で１時間置く。ｆｌｕｏｒ標識抗体溶液をマイクロアレイから注意深く除去する。冷却したＴＢＳＴ緩衝液を用いて余分なタンパク質溶液をスライドから軽くすすぐ。スライドを３ｍＬ緩衝液で２分間、攪拌しながら洗浄する。２回繰り返す。冷却したＴＢＳ緩衝液で２分間、１回洗浄する。
２３．スライド遠心分離機を用いて、遠心分離によりスライドを乾燥させる。プローブしたマイクロアレイは分析する準備が整った状態である。スライドはタンパク質でプローブした直後にスキャンするのが理想的である。乾燥したスライドは、蛍光信号に著しい劣化を起こすことなく、スキャニング前に室温遮光下で２日間まで保存できる。
【０１９２】
細胞溶解産物を用いたタンパク質結合スクリーニング
２４．ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を対象となるエピトープ標識タンパク質をコード化する哺乳類の過剰発現構成体でトランスフェクトする。１つのウェルが１つのＳＭＭインキュベーションにつき必要であることを見越して、１ウェルあたり５×１０５細胞での６ウェルプレートで、細胞をシードする。信頼性の高い、ハイレベルの発現は市販のほとんどの脂質トランスフェクション試薬、それに続いて提供された技術プロトコルにより、この細胞株で達成されている。細胞は一般に、ＥＧＦＰベクターでトランスフェクトしたウェルが安定した、高度の発現を達成する時点で、トランスフェクション後、４８〜７２時間の間に採取する。タンパク質の発現および検出は免疫ブロット法によって確認することができる。実行可能であれば、免疫沈澱タンパク質は、適当な生化学アッセイで、活性に対し評価することができる。
２５．保存または溶解用細胞を採取する。粘着細胞を６ウェルプレートで、冷却ＰＢＳで２回洗浄し、冷却ＰＢＳの１ウェルあたり５００μＬで再懸濁し、標識エッペンドルフチューブに移した。細胞を軽い遠心分離によってペレット化し、浮遊物を捨てる。ペレット化細胞は一般に液体窒素でスナップ凍結し、使用するまで−８０℃で保存する。
２６．インキュベーション用の細胞溶解物を低分子アレイとともに調製する。細胞ペレットを湿り氷上で解凍し、プロテアーゼ阻害剤およびフレッシュＤＴＴ（ソースウェルあたり３００μＬ容量）を補充したＭＩＰＰリシスバッファー内で迅速かつ穏やかに再懸濁する。氷上で１５分間インキュベートする。溶解物をその後、４℃で１０分間、１４，０００ｇの遠心分離によって清澄化する。遠心分離した直後、浮遊物を新しい、冷却エッペンドルフチューブに静かに移す。タンパク質定量化アッセイを行い、０．３μｇ  ｍＬ−１を達成するためリシスバッファーで調整する。ＭＩＰＰリシスバッファーは、前述のように調製したアレイとの自家蛍光を最小化するため決められている。ＴＧＮおよびＲＩＰＡリシスバッファーは、対照実験における信号対雑音を干渉する。
２７．ＳＭＭを溶解物で、工程２１で説明した方法を用いて、４℃で１時間インキュベートする。冷却ＰＢＳＴで１分間、穏やかに回転させながら洗浄し、これを３回繰り返す。
２８．ＳＭＭを一次抗体で１時間、４℃で直ちにインキュベートする。抗ＦＬＡＧまたは抗Ｈｉｓなどのエピトープ標的抗体においては、０．１％ＢＳＡを補充したＰＢＳＴで１：１０００希釈することを提案する。冷却ＰＢＳＴ（４℃）で３分間、穏やかに回転させながら洗浄し、これを３回繰り返す。
２９．ＳＭＭを二次抗体で１時間、４℃で直ちにインキュベートする。１：１０００の希釈が、市販のほとんどのｆｌｕｏｒ標識抗体溶液に対して適している。冷却ＰＢＳＴで３分間、穏やかに回転させながら洗浄し、これを３回繰り返す。蒸留水で軽くすすぎ、スライドを１分間、遠心分離することで乾燥させる。プローブしたスライドは分析する準備が整った状態である。
【０１９３】
データ分析
３０．提案した設定を用いたＧｅｎｅｐｉｘ  ４２００Ａスライドスキャナーを用いてスライドをスキャンする。
３１．マイクロアレイ位置をマイクロプレート位置に翻訳しながら、対応するＧＡＬファイルを、Ｇｅｎｅｐｉｘ  Ｐｒｏ  ６．０  ソフトウェアを用いて各スキャンされた画像にアラインする。各サブアレイのアラインを助けるためプリントされたｆｌｕｏｒマーカーを使用する。各ＧＡＬファイルフィーチャを実際にプリントされたマイクロアレイフィーチャの直径に適切にサイズ変更し、各マイクロアレイに対するＧｅｎｅｐｉｘ  ｒｅｓｕｌｔｓ（ＧＰＲ）ファイルを生成する。
３２．ａ）蛍光染料マーカーが存在するか否か、ｂ）公知のリガンドが存在するか否か、ｃ）マーカー化合物が次の試料へキャリー・オーバーすることにより、隣接するフィーチャに汚染をもたらしているか否か、ｄ）どの化合物が実験波長で自家蛍光であるか、およびｅ）マイクロアレイに塗布したタンパク質または抗体に結合する新たな低分子があるか否か、を評価するためにｒｅｓｕｌｔｓファイルを分析する。
３３．アッセイ陽性を、各ＳＭＭ上に溶媒のみを含むフィーチャによって定められたモック処理分布からの偏差に基づいた３重の実験データからスコアする。ＧｅｎｅＰｉｘソフトウェア内でスポットごとに、蛍光強度をバックグラウンド信号に合わせて調整し、この測定基準を分析において主として使用する。
３４．アッセイ陽性をその後、必要に応じて、対照実験から集めた３重の実験データと比較する。このプラットフォームは低分子と免疫グロブリンとの間の相互作用を検出することが可能なので、緩衝液のみとの比較または対照溶解物の実験に続いて、抗体インキュベートすることが不可欠である。
【０１９４】
結果
このプロトコルで概説した各実験工程は、多くの関心ある研究者によるスクリーニング用アレイの製造に適応するように、能力、収率、および再現性において最適化している。一般に、研究者は、顕微鏡用スライドガラス上にマイクロアレイ形式で１１，０００個近くの多様な化合物の固定化が成功すると予想することができる。この結果に至る途中で、スクリーニング状況においてプラットフォームを確認するためプリンティング工程および公知の高親和性リガンドに対する対照として蛍光リガンドとともにスクリーニングする「アッセイ開発」を推奨する。
【０１９５】
組み換えおよびトランスフェクトタンパク質に対する最適化スクリーニングプロトコルは、前述したように信頼性が高く、かつ、ロバストであることが判明している。しかしながら、新たなタンパク質の試験で、適切なタンパク質折り畳みおよびリシスバッファーの安定性、なおかつ検出用エピトープおよび抗体の選択は多大な影響を及ぼす。低分子マイクロアレイのスクリーニングから予想される結果を示すため、Ｆｌａｇ−ＦＫＢＰ１２を発現しているＨＥＫ−２９３Ｔ細胞からの清澄化細胞溶解物のスクリーニングからのデータを図１２に示す。この実験において、一次および二次抗体検出スキームを上述のように使用した。アレイを５３２ｎｍおよび６３５ｎｍで蛍光スキャンし、この合成画像では、それぞれ、疑似カラー化した緑色および赤色であった。アッセイ陽性は赤色に現れる。これらのデータは、第一級アミンを介してプリントされた低分子リガンドＡＰ１４９７（図１２ａ）と第二級アルコールを介してプリントされた天然産物ラパマイシン（図１２ｂ）の予想された検出を示す。溶媒のみを含有するウェルのローカルバックグラウンドに対して補正した蛍光強度６３５ｎｍの分布を示すヒストグラムを図１２ｃに示し、この実験の低雑音を示している。アレイ上のプリントされた低分子からの同一測定を示すヒストグラムを図１２ｄに示す。この図は、不活性化合物および溶媒からの信号の予期された、比較可能な、低強度の分布を示す。さらに、矢印で強調したデータによって示すように、ＡＰ１４９７誘導体およびラパマイシンは、この分析によってアッセイ陽性としてはっきり現れている。
【０１９６】
要約すると、このプロトコルは、マイクロアレイ形式における多様な低分子のプリンティングおよび精製タンパク質および複合混合物の両方のスクリーニングに対する最適化戦略を詳述している。このプラットフォームを用いて、親和性範囲（２ｎＭ〜５０μＭ）のタンパク質標的に対する低分子結合剤を検出し、表面プラズモン共鳴によって確認した。
【０１９７】
他の実施形態
当業者であれば、前述の内容が、本発明のある好ましい実施形態を単に表していることを容易に理解するであろう。以下の特許請求の範囲に記載される本発明の精神および範囲から逸脱せずに上述の手順および組成物の種々の変更物および修正物を作製することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１９８】
【図１】図１は、生物活性低分子および多様性指向合成の生成物を含む多様性ＳＭＭの概略設計を示す。反応性官能基は色づけされている。多様性アレイにプリントされた代表的な生物活性低分子としては、１ａ．ニゲリシン、１ｂ．バフィロマイシンＡ１、１ｃ．ドキソルビシン、１ｄ．ゲニステイン、１ｅ．ラクタシスチン、１ｆ．ウバオール、１ｇ．Ｄ−エリスロ−スフィンゴシン、１ｈ．ジベレリン酸、１ｉ．インゲノール、１ｊ．アロインが挙げられる。多様性アレイにプリントされたＤＯＳ−低分子に対する代表的なスカッフォールド（足場）としては、２ａ．ジヒドロピランカルボキサミド、２ｂ．アルキリデン−ピラン−３−オン、２ｃ．縮合ピロリジン、２ｄ．セリン由来のペプチド模倣剤、２ｅ．シキミ酸由来の化合物、２ｆ．１，３−ジオキサン、２ｇ．スピロオキシインドール、２ｈ．大環状ラクトン、２ｉ．アンサ−セコステロイド由来の化合物が挙げられる。
【図２】図２は、蒸気触媒による表面固定化スキームを示す。ＧＡＰＳ（γ−アミノプロピルシラン）スライド（Ｓ１）は、短いＦｍｏｃ保護化ポリエチレングリコールスペーサーで被覆する。Ｆｍｏｃ基をピペリジンで除去した後、１，６−ジイソシアナトヘキサンを尿素結合形成経由で表面にカップリングし、推定イソシアネート官能化されたスライドガラス（Ｓ２）を生成する。化合物原液でプリントしたスライドをその後、乾燥環境下に置き、スライド表面（Ｓ３）上の低分子の共有結合捕捉を触媒するピリジン蒸気にさらす。
【図３−１】図３は、イソシアネート官能化されたガラスとの官能基反応性の比較である。（ａ）ＡＰ１４９７誘導体３ａ〜３ｑの親構造。（ｂ）イソシアネート誘導体化スライド上に順次倍数希釈（１０ｍＭ〜２０μＭ）でプリントしたＦＫＢＰ１２リガンド３ａ〜３ｑを有するＡＰ１４９７誘導体アレイ。スライドは、プリントした化合物の結合を触媒するためピリジン蒸気にさらした。洗浄したスライドは、ＦＫＢＰ１２−ＧＳＴ、次に、Ｃｙ５（商標）−標識抗ＧＳＴ抗体でプローブした。６３５ｎｍで蛍光スキャンしたマイクロアレイの画像を示す。表面捕捉用に示した官能基はアレイの一番上に示す。（ｃ）全蛍光強度は、ＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ  ６．０  マイクロアレイ解析ソフトウェアを用いて各マイクロアレイフィーチャを中心とした３００μｍスポット内に算出した。低分子の捕捉はピリジン蒸気の存在下で触媒し、かつ、化合物原液の湿気に耐える。（ｄ）ＤＭＦ中のＦＫＢＰ１２リガンド３ａ、３ｄ、３ｅ、３ｒ、および３ｓ（１ｍＭ）の溶液は表面Ｓ２上に３重に並べ、スライドは窒素雰囲気下（下）またはピリジン蒸気の存在下の窒素雰囲気下（上）のいずれかでインキュベートした。（ｅ）ＤＭＦ（上段）または９：１ＤＭＦ：ｄｄＨ２Ｏ（下段）中のＦＫＢＰ１２リガンド３ａ、３ｄ、３ｈ、および３ｓ（１ｍＭ）の溶液はイソシアネート誘導体化スライドに３重にアレイした。
【図３−２】図３は、イソシアネート官能化されたガラスとの官能基反応性の比較である。（ａ）ＡＰ１４９７誘導体３ａ〜３ｑの親構造。（ｂ）イソシアネート誘導体化スライド上に順次倍数希釈（１０ｍＭ〜２０μＭ）でプリントしたＦＫＢＰ１２リガンド３ａ〜３ｑを有するＡＰ１４９７誘導体アレイ。スライドは、プリントした化合物の結合を触媒するためピリジン蒸気にさらした。洗浄したスライドは、ＦＫＢＰ１２−ＧＳＴ、次に、Ｃｙ５（商標）−標識抗ＧＳＴ抗体でプローブした。６３５ｎｍで蛍光スキャンしたマイクロアレイの画像を示す。表面捕捉用に示した官能基はアレイの一番上に示す。（ｃ）全蛍光強度は、ＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ  ６．０  マイクロアレイ解析ソフトウェアを用いて各マイクロアレイフィーチャを中心とした３００μｍスポット内に算出した。低分子の捕捉はピリジン蒸気の存在下で触媒し、かつ、化合物原液の湿気に耐える。（ｄ）ＤＭＦ中のＦＫＢＰ１２リガンド３ａ、３ｄ、３ｅ、３ｒ、および３ｓ（１ｍＭ）の溶液は表面Ｓ２上に３重に並べ、スライドは窒素雰囲気下（下）またはピリジン蒸気の存在下の窒素雰囲気下（上）のいずれかでインキュベートした。（ｅ）ＤＭＦ（上段）または９：１ＤＭＦ：ｄｄＨ２Ｏ（下段）中のＦＫＢＰ１２リガンド３ａ、３ｄ、３ｈ、および３ｓ（１ｍＭ）の溶液はイソシアネート誘導体化スライドに３重にアレイした。
【図４】図４は、抗体を用いて選択的にプリントした生物活性の検出を示す。プリントした各生物活性のバックグラウンド信号に対する蛍光強度は、（ａ）抗コルチコステロン、（ｂ）抗ジギトキシン、および（ｃ）抗エストラジオール（ウサギ）抗体、続いて、（ｄ）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ａ６４７ウサギ）対照に対するＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ヤギ抗ウサギの結合プロファイル用に示す。６３５ｎｍの信号対雑音比（ＳＮＲ６３５）は、（平均フォアグラウンド−平均バックグラウンド）／（バックグラウンドの標準偏差）で定義する。データは、２つの独立した実験で確認された個々のアレイ上の２重スポットの平均値を表す。ＳＮＲ６３５値が３．０を超える全ての化合物を表示している。
【図５】図５は、細胞溶解物を有する低分子マイクロアレイのスクリーニングを示す。（ａ）方法論の概略。対象となる標的タンパク質を含有するエピトープ標識した発現構成体は、過渡トランスフェクションにより哺乳類細胞株に導入する。４８時間複製した後、低分子マイクロアレイを、清澄化溶解物、一次抗エピトープ抗体、最後にフルオロフォア標識二次抗体で順次インキュベートする。各インキュベーションの後、穏やかな、軽い洗浄をＰＢＳ中で行う。蛍光強度は、ＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ  ６．０  マイクロアレイ解析ソフトウェアを用いて算出し、プリントした各低分子のバックグラウンド信号（ＳＮＲ６３５）に対する強度は、モックトランスフェクトした同一の細胞株からの細胞溶解物でインキュベートした複製対照アレイと比較する。（ｂ）溶解物スクリーニング方法論の最適化。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で過剰発現したＦｌａｇ−ＦＫＢＰ１２および適切な抗体は、図３ｂに記載されている倍数希釈（１０ｍＭ〜２０μＭ）で同一の三重サブアレイとしてパターン化したＦＫＢＰ１２−リガンドアレイとともに（ａ）に示されるように行ったスクリーニング最適化実験用に選択した。プロトコル条件は段階的な方法で順次最適化した。示されたデータは３重サブアレイからのスポットの平均値（ＳＮＲ６３５）を表す。ＦＫＢＰ１２誘導体３ａ〜３ｑ（赤色）に対応するデータは、リファレンスである、全タンパク質濃度を試験する実験用の空白のＤＭＳＯスポット（黒色）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）による阻害効果、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカー長と比較する。
【図６】図６は、細胞溶解物を用いて各種親和性のリガンドへの結合の検出を示す。（ａ）ＦＫＢＰ１２（２７、２８）に対して変動親和性を有するＡＰ１４９７の誘導体を得、対照化合物のカプトプリルおよびグルタチオンとともに４重にプリントした。（ｂ）アレイは、図５ａに示されるようにＦｌａｇ−ＦＫＢＰ１２と適切な抗体を過剰発現しているＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の清澄化溶解物でインキュベートした。６３５ｎｍで蛍光スキャンしたアレイの疑似カラー化した代表的な画像を示す。（ｃ）アレイは、ＥＧＦＰ−ＦＫＢＰ１２を過剰発現しているＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の清澄化溶解物でインキュベートした。４８８ｎｍで蛍光スキャンしたアレイの疑似カラー化した代表的な画像を示す。（ｄ）アレイは、トランスフェクトしていないＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の清澄化溶解物でインキュベートし、ＦＫＢＰ１２に対してポリクローナル抗体でプローブした。６３５ｎｍで蛍光スキャンしたアレイの疑似カラー化した代表的な画像を示す。
【図７】図７は、細胞溶解物でスクリーニングした低分子マイクロアレイの分析を示す。（ａ）１０，８００フィーチャのアレイは、公知の生体活性、天然産物、ＡＰ１４９７誘導体、および多様性指向合成を介して調製した化合物の多様な集合でプリントした。ＤＭＳＯ溶媒（ｎ＝１５８）は、ヒット閾値強度を決定するためプリンティング用に含めた。細胞溶解物を過剰発現しているＦｌａｇ−ＦＫＢＰ１２による５回の実験を、対照である、モックトランスフェクトした溶解物による５回のインキュベーションと比較した。各アレイはその後、抗Ｆｌａｇモノクロナール抗体および二次Ｃｙ５標識抗マウス抗体でインキュベートした。５３２ｎｍ（緑色）および６３５ｎｍ（赤色）で蛍光スキャンしたＦＫＢＰ１２プローブしたアレイのみならず、ＡＰ１４９７誘導体への結合を示しているハイライト領域も示す。（ｂ）ＦＫＢＰ１２結合剤の同定。５つのＦｌａｇ−ＦＫＢＰ１２のＳＮＲ６３５プロファイルと５つの対照アレイを示す。各列は離散アレイ（Ｃ、対照；ＦＫ、Ｆｌａｇ−ＦＫＢＰ１２）上の試料であり、各行はプリントされた低分子である。カラースケールは、ＤＭＳＯ溶媒スポットに対する平均（０）および最大（２．２４）のＳＮＲ６３５を示す。プリントされた溶媒によって確立された閾値を超えたＳＮＲ６３５を有し、かつ、フィッシャーの正確確率検定による有意水準（ｐ≦０．０５）を満たすプリントされた分子を示す。
【図８】図８は、溶解物スクリーニング方法論の最適化、全データを示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で過剰発現したＦｌａｇ−ＦＫＢＰ１２および適切な抗体は、図３ｂに記載されている倍数希釈（１０ｍＭ〜２０μＭ）による同一の三重サブアレイとしてパターン化したＦＫＢＰ１２−リガンドアレイとともに、図５ａに示されるように行った最適化実験のスクリーニング用に選択した。プロトコル条件は、段階的な方法で順次最適化した。示されたデータは、３重サブアレイからのスポットの平均値（ＳＮＲ６３５）を表す。ＦＫＢＰ１２誘導体３ａ〜３ｑ（赤色）に対応するデータは、リファレンスである、全タンパク質濃度を試験する実験用の空白のＤＭＦスポット（青色）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）による阻害効果、ＰＢＳ中の洗浄時間、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカー長と比較する。エステルリンケージ（ＭＡ）経由のプリンティングへの代替的アプローチの比較、検出用標識一次抗体の有用性、および検出用代替エピトープ（ヘマグルチニン：ＨＡ）の有用性も示す。
【図９】図９は、（ａ）１２７６−Ｍ０８の構造、細胞溶解産物からＦＫＢＰ１２に結合することが分かったスピロオキシインドールＤＯＳ化合物である。（ｂ）ＦＫＢＰ１２−ＧＳＴ（左）およびＧＳＴ（右）に結合している１２７６−Ｍ０８のセンサーグラムデータ。
【図１０】図１０は、低分子マイクロアレイ（ＳＭＭ）の製造およびスクリーニングプロセスのフローチャートである。
【図１１】図１１は、低分子のイソシアネート媒介固定化用スキームを示す。γ−アミノプロピルシラン（ＧＡＰＳ）スライドを、短いＦｍｏｃ保護化ポリエチレングリコールスペーサーで被覆する。ピペリジンを用いて脱保護した後、１，６−ジイソシアナトヘキサンを尿素結合形成経由で表面にカップリングし、マイクロアレイプロセス中に使用するイソシアネート被覆スライドを提供する。低分子原液でプリントしたスライドは、低分子マイクロアレイ（ＳＭＭ）表面に分子の共有結合を触媒するために、ピリジン蒸気にさらす。
【図１２】図１２は、細胞溶解物を過剰発現しているＦｌａｇ−ＦＫＢＰ１２でプローブした低分子マイクロアレイを示す。（ａ）第一級アミンを介してプリントされたＡＰ１４９７類似体の認識。（ｂ）第二級アルコールを介して同様にプリントされた天然産物ラパマイシンの認識。（ｃ）ＳＭＭ上の溶媒のみのフィーチャに由来したバックグラウンド調整した６３５ｎｍの蛍光強度データのヒストグラム。（ｄ）ＳＭＭ上のプリントされた低分子フィーチャに由来したバックグラウンド調整した６３５ｎｍの蛍光強度データのヒストグラム。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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