(57)【要約】  本発明は、単一RNA鎖であって、3'末端から5'末端まで、以下：  (i) C型肝炎ウイルス、又はRNA-依存的RNAポリメラーゼによって複製する別のRNAウイルスのゲノムRNA（(+)鎖）の非-コーディング領域5'（5'UTR）に対する相補的核酸配列、ここで、そのうちの核酸配列は、C型肝炎ウイルスの複製複合体によって前記単一RNA鎖分子の複製を許容する；(ii) リボゾームの内部挿入部位（IRES）由来の対応する核酸配列の相補的核酸配列；(iii) 自殺遺伝子、又はVHCウイルス、もしくはRNA-依存的RNAポリメラーゼによって複製する別のRNAウイルスの複製を妨害するタンパク質をコードする遺伝子の相補的核酸配列、を含む前記単一RNA鎖；前記単一RNA鎖分子の転写を許容するADN分子；前記の核酸分子を含む核酸のベクター；及び前記核酸分子又は前記の核酸のベクターを含む医薬化合物、に関する。
2009538610.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一鎖RNA分子であって、3'末端から5'末端まで、以下：
(i) RNA-依存的RNAポリメラーゼによって複製するRNAウイルスのRNA(+)鎖の5'非-コーディング領域（5'UTR）のすべて又は一部の相補的核酸配列、ここで、該相補的核酸配列は、該ウイルスの複製複合体を介して該単一鎖RNA分子の複製を許容する；
(ii) おそらく、リボゾームの内部挿入部位（IRES）に対応する核酸配列の相補的核酸配列；
(iii) 自殺遺伝子、又は該ウイルスの複製を妨害するタンパク質をコードする遺伝子、の核酸配列の相補的核酸配列；及び
(iv) おそらく、該ウイルスのRNAの非-コーディング3'領域（3'UTR）に相補的な核酸配列、
を含む、前記分子。
【請求項２】
前記のRNA依存的RNAポリメラーゼによって複製するRNAウイルスが、フラビビリダエ（Flaviviridae）、シストビリダエ（Cystoviridae）、ビルナビリダエ（Birnaviridae）、レオビリダエ（Reoviridae）、コロナビリダエ（Coronaviridae）、トガビリダエ（Togaviridae）、アルテリウイルス（Arterivirus）、アストロビリダエ（Astroviridae）、カリシビリダエ（Caliciviridae）、ピコーナビリダエ（Picornaviridae）、ポチビリダエ（Potyviridae）、オルソミクソビリダエ（Orthomyxovirida）、フィロビリダエ（Filoviridae）、パラミクソビリダ エ（Paramyxoviridae）、ラブドビリダエ（Rhabdoviridae）、アレナビリダエ（Arenaviridae）及びブニャビリダエ（Bunyaviridae）からなる群より選ばれる、請求項１記載の単一鎖RNA分子。
【請求項３】
前記のRNA依存的RNAポリメラーゼによって複製するRNAウイルスが、デングウイルス、黄熱病ウイルス、ウエストナイルウイルス及びウシ下痢ウイルスからなる群より選ばれる、請求項１又は２記載の単一鎖RNA分子。
【請求項４】
3'末端から5'末端まで、以下：
(i) C型肝炎（HCV）のゲノムRNA（(+)鎖）の非-コーディング5'領域（又は5'UTR）のすべて又は一部に相補的な核酸配列、ここで、該相補的核酸配列は、該HCVの複製複合体を介して該単一鎖RNA分子の複製を許容する；
(ii) リボゾームの内部挿入部位（IRES）に対応する核酸配列の相補的核酸配列；
(iii) 自殺遺伝子、又は該HCVウイルスの複製を妨害するタンパク質をコードする遺伝子の核酸配列の相補的核酸配列；及び
(iv) おそらく、HCVのゲノムスRNA（(+)鎖）の非-コーディング3'領域（3'UTR）に相補的な核酸配列、
を含む、請求項１記載の単一鎖RNA分子。
【請求項５】
前記相補的核酸配列が、前記5'UTR領域のステムループドメインＩ及びＩＩ（5'UTR-dI及び5'UTR-dII）を含む配列の少なくとも相補的配列、好ましくは前記5'UTR領域のステムループドメインＩ、ＩＩ及びＩＩＩ（5'UTR-dI、5'UTR-dII及び5'UTR-dIII）を含む配列の少なくとも相補的配列を含む、請求項４記載の単一鎖RNA分子。
【請求項６】
前記相補的核酸配列が、C型肝炎ウイルスのゲノムRNA（(+)鎖）の位置1〜120の配列の少なくとも相補的配列、好ましくはC型肝炎ウイルスのゲノムRNA（(+)鎖）の位置1〜150の配列の少なくとも相補的配列、及び特好ましくはC型肝炎ウイルスのゲノムRNA（(+)鎖）の位置1〜341の配列の少なくとも相補的配列を含む、請求項４又は５記載の単一鎖RNA分子。
【請求項７】
前記5'UTR領域が、遺伝子型1、2、3、4、5又は6のC型肝炎ウイルスのゲノムRNAの5'UTR領域、又それから得られる配列、好ましくは遺伝子型1のC型肝炎ウイルスのゲノムRNAの5'UTR領域に相当する、請求項４〜６のいずれか１項記載の単一鎖RNA分子。
【請求項８】
前記相補的核酸配列が、配列番号1の位置1〜120の配列の少なくとも相補的配列、好ましくは配列番号1の位置1〜150の配列の少なくとも相補的配列、特に好ましくは配列番号1の位置1〜341の配列の少なくとも相補的配列、又はそれから得られる配列である、請求項６記載の単一鎖RNA分子。
【請求項９】
前記のリボゾームの内部挿入部位（IRES）に相当する核酸配列が、真核生物起源又はウイルス起源である、請求項１〜８のいずれか１項記載の単一鎖RNA分子。
【請求項１０】
前記のリボゾームの内部挿入部位（IRES）に相当する核酸配列が、C型肝炎のゲノムRNA（(+)鎖）の5'UTR領域のステムループドメインＩＩ〜ＩＶ（5'UTR-dII〜5'UTR-dIV）を含む、好ましくはC型肝炎のIRES配列に相当するウイルス起源である、請求項９記載の単一鎖RNA分子。
【請求項１１】
前記IRES配列が、C型肝炎のIRES配列であり、そして、C型肝炎のゲノムRNA（(+)鎖）の位置30〜355の配列、好ましくはC型肝炎のゲノムRNA（(+)鎖）の位置25〜370の配列、特に好ましくはC型肝炎のゲノムRNA（(+)鎖）の位置20〜385の配列を含む、請求項１０記載の単一鎖RNA分子。
【請求項１２】
前記5'UTR領域が、遺伝子型1、2、3、4、5又は6のC型肝炎ウイルスのゲノムRNA（(+)鎖）のIRES配列、又それから得られる配列、好ましくは遺伝子型1のC型肝炎ウイルスのIRES配列に相当する、請求項１１記載の単一鎖RNA分子。
【請求項１３】
前記のC型肝炎ウイルスのIRES部位に相補的核酸配列が、配列番号1の位置30〜355、好ましくは配列番号1の位置25〜370及び特に好ましくは配列番号1の位置20〜386に相補的な配列、又はそれから得られる配列に相当する、請求項１１記載の単一鎖RNA分子。
【請求項１４】
C型肝炎ウイルスのゲノムRNA（(+)鎖）の位置1〜355、好ましくは位置1〜370の配列に相補的な配列を含む、請求項４〜８及び１１〜１３のいずれか１項記載の単一鎖RNA分子。
【請求項１５】
前記のC型肝炎ウイルスのゲノムRNA（(+)鎖）の配列が、遺伝子型1、2、3、4、5又は6のC型肝炎ウイルスの配列、又それから得られる配列に相当する、請求項１４記載の単一鎖RNA分子。
【請求項１６】
前記の単一鎖RNA分子の配列が、配列番号1の位置1〜355、好ましくは位置1〜370及び特に好ましくは位置1〜386の配列の相補的配列、又はそれから得られる配列を含む、請求項１４記載の単一鎖RNA分子。
【請求項１７】
前記自殺遺伝子が、薬物の存在下又は非存在下で細胞死を引き起こすタンパク質産物をコードする、請求項１〜１６のいずれか１項記載の単一鎖RNA分子。
【請求項１８】
前記自殺遺伝子が、HSVチマジンキナーゼ（HSV1tk）又はシトシンデアミナーゼ（CD）の遺伝子のような薬物の存在下で細胞死を引き起こすタンパク質産物をコードする、請求項１７記載の単一鎖RNA分子。
【請求項１９】
前記自殺遺伝子が、細菌外毒素、真菌毒素、そこから得られるタンパク質の真核生物起源、野菜起源又はウイルス起源の毒素のような細胞死を引き起こすタンパク質毒素をコードする、請求項１７記載の単一鎖RNA分子。
【請求項２０】
前記自殺遺伝子が、RIP（リボゾーム-不活性化タンパク質）ファミリーのタンパク質毒素をコードする、請求項１９記載の単一鎖RNA分子。
【請求項２１】
前記自殺遺伝子が、2型RIPファミリーのタンパク質毒素、好ましくはリシン、アブリン、モデシン、ボルケンシン、ビスクミン及びシガ毒素のような2型RIPファミリーのタンパク質毒素のA鎖をコードする、請求項２０記載の単一鎖RNA分子。
【請求項２２】
前記自殺遺伝子が、配列番号2の配列又は誘導される配列に相当する、請求項２１記載の単一鎖RNA分子。
【請求項２３】
ウイルスの複製を妨害するタンパク質をコードする遺伝子が、インターフェロン-制御因子をコードする、請求項１〜１６のいずれか１項記載の単一鎖RNA分子。
【請求項２４】
前記の3'UTR領域に相補的な核酸配列が、配列番号3の配列の相補的配列、又はそれから得られる配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項記載の単一鎖RNA分子。
【請求項２５】
配列番号4の配列の相補的配列又はそれから得られる配列に相当する、請求項１〜２４のいずれか１項記載の単一鎖RNA分子。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか１項記載の核酸分子を含む核酸ベクター。
【請求項２７】
請求項１〜２５のいずれか１項記載の核酸分子、又は請求項２６記載のベクターを含む医薬組成物。
【請求項２８】
RNA-依存型RNAポリメラーゼによって複製するRNAウイルスによる感染を予防又は治療するための医薬を製造するための、請求項１〜２５のいずれか１項記載の核酸分子、又は請求項２６記載のベクターの使用。
【請求項２９】
患者におけるC型肝炎ウイルスによる感染を予防又は治療するための、請求項１〜２５のいずれか１項記載の核酸分子、又は請求項２６記載のベクターの使用。
【請求項３０】
前記医薬が、局所的又は非経口的経路、特に筋肉内、皮内、肝内又は皮下的注射によって投与される、請求項２８又は２９記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸分子、かかる核酸分子を含む医薬組成物、及びRNA-依存型RNAポリメラーゼによって複製するRNAウイルスによる感染、特に、C型肝炎ウイルスによる感染を治療又は予防するための医薬を製造するためのかかる核酸分子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
C型肝炎ウイルス（HCV）は、今日、それによる感染の高い罹患及び続いて約80%の慢性肝炎への発症の高い危険性の点から、公衆衛生における主な問題を呈している。このことは、C型肝炎ウイルス（HCV）が集団の約3%に感染し、慢性感染の約1億7000万のケースの原因になっているからである。かかる慢性感染に罹患している患者は、一次感染の20年後に、20〜30%の推定危険性で、肝臓癌に発症することがある肝硬変を発症する傾向がある。一次感染は、一般的に症状がなく、感染は慢性感染に関する合併症が現れるときに診断される。
【０００３】
HCVは、1989年にカイロン社によって発見されたフラビビリダエ（Flaviviridae）のファミリーに属する正の極性のRNAウイルスである（Kuo et al, Science, vol 244 (4902), p.362-4, 1989）。精錬された分子分析は、HCVの約6つの異なった遺伝子型が存在し、該遺伝子型は多くのサブタイプに分類されることを証明した。HCV感染に関して、それらのほとんどは遺伝子型1に関連している。
【０００４】
HCVのゲノムRNAは、5'非-コーディング配列（5'UTR）及び3'（3'UTR）のよってフレーム化された単一のオープン・リーディング相を含む。5'UTR配列が、研究された遺伝子型がどんなものでも高保存を示す場合には、その部分の3'UTR配列は、研究された遺伝子型に従ってその最初の30ヌクレオチドにおいて高変化を示す。同時に、新規ビリオンの複製及び形態形成に関連する少なくとも10個の成熟ウイルスタンパク質を産生するために、オープン・リーディング相は、細胞及びウイルスのプロテアーゼによって翻訳と同時に及び翻訳後に開裂される3008〜3037アミノ酸のポリタンパク質について考慮される遺伝子型に従ってコードする。より具体的には、構造的タンパク質は、前記ポリタンパク質及び非-構造的タンパク質のアミノ末端の3番目に位置しており、その中にはポリタンパク質のカルボキシ末端部分において複製複合体を形成するものもある。
【０００５】
5'UTR領域は、ビリオンの内在化後に、キャップ-非依存的方法で翻訳されることになるウイルスゲノム（(+)鎖）を可能にするリボゾーム内部挿入部位を含む。ポリタンパク質の翻訳及び成熟の後に、複製複合体は集積し、次いでRNA-依存的RNAポリメラーゼ（NS5B）はRNA複製を開始する。HCVの複製複合体は、そのため、感染細胞のすべての中に存在する。
【０００６】
より一般的な用語では、その複製のための逆転写酵素を使用するレトロビリダエを除いて、ウイルスは、複製中間体として機能する対極のRNAをゲノムRNAから合成するRNA-依存的RNAポリメラーゼ（RdRp）によって複製するRNAゲノムを有する。この中間体複製RNAは、ゲノムRNAを再生するために、順に、RNA-依存的RNAポリエラーゼによってコピーされる。
【０００７】
このRdRpは、上記ウイルスによってコードされ、複製複合体内でその活性を生じる。そのタンパク質の中には、該ウイルスによってコードされているものもある。ウイルスゲノムによって運ばれる配列は、RdRpによって反対のRNA鎖の合成に先行する複製複合体を固定するために必須である。この複製複合体は、正のゲノム鎖から負の鎖を合成するために、ウイルスゲノムの3'に位置する非-翻訳部位に固定される。RNA-依存的RNAポリメララーゼによって複製するRNAゲノムを有するウイルスの複製複合体は、そのため、感染細胞のすべての中に存在する。
【０００８】
HCVの単一-鎖ゲノムRNAの複製は、正の極性（(+)鎖）のゲノムRNAの合成のためのマトリックスとして働くことになる、「負の極性の抗-ゲノム」鎖（(-)鎖）の合成に対応する中間ステップを必要とする。
【０００９】
HCVのゲノムRNAの複製のこのステップのために、2つの5'UTR及び3'UTR配列が必須である。3'UTR配列は、(+)鎖から(-)鎖の合成のために必要である。同時に、5'UTR配列は、(-)鎖から(+)鎖の合成のために必要である。
【００１０】
5'UTR領域は、約340ヌクレオチド長を有する。この5'UTR領域は、ステム/ループ型（ドメイン5'UTR-dI〜5'UTR-dIV）の構造を有する4つのドメインを含む。最後のドメイン5'UTR-dIVは、ポリタンパク質のカプシドタンパク質に相当するコーディング相の第1ヌクレオチドと重複する。この5'UTR領域は、ヌクレオチド配列のレベル及び構造的レベルでHCVの様々な株間でかなり保存されている。ゲノムの複製におけるその役割に加えて、5'UTR領域はまた、ポリタンパク質の翻訳の開始に関連する。複製が起こるための5'UTR領域の最少ドメインは、ドメイン5'UTR-dI及び5'UTR-dII（Friebe et al, J Virol, vol 75 (24), p.1204-57, 2001）、及びそこでモデュレータの役割を果たすドメイン5'UTR-dIIIを含む（Reusken et al, J Gen Virol, vol 84, p.1761-69, 2003）。
【００１１】
HCVの翻訳のための最少ドメインは、リボゾームが直接に固定され（Honda et al, Virology, vol 222 (1), p.31-32, 1996）、キャップ-非依存的翻訳の開始を許容する、リボゾームの内部挿入部位（IRES）に相当する。5'UTR-dIドメインを構築するステム-ループを除いて、ドメイン5'UTR-dII〜5'UTR-dIVは、翻訳の開始のために必要である。しかしながら、IRESの3'末端の位置が検討されている。異なったレポーター遺伝子（SEAP、CAT）の上流に位置する異なった長さを有するHCVゲノムの5'部位の断片からの翻訳の開始, 効率の評価は、ある著者に、開始AUGの下流に直接位置するカプシドタンパク質Cをコードする配列の5'部分がIRESの最適な効率を得るために必要であることを結論付けた（Reynolds et al, RNA, vol 2 (9), p.867-78, 1996; Lu et al, Proc Natl Acad Sci USA, vol 93 (4), p.1412-7, 1996）。これは、他の著者によって異議が唱えられてきた（Rijnbrand et al, FEBS Lett, vol 365 (2-3), p.115-9, 1955）。
【００１２】
抗ウイルス治療を開発する点での主な困難の1つは、HCVの感染及び複製を可能にする細胞培養系がないことが原因となっているが、HCVによる感染に敏感な実験的な動物モデルにすぎないチンパンジーに代わる小サイズの動物モデルがないことも原因となっている。
【００１３】
第1の主な前進は、Huh-7肝細胞株において複製することができるHCVの２シストロン性サブ-ゲノムRNA（レプリコン）の開発によって達成されてきた（Lohmann et al, Science, vol 285 (5424), p.110-3, 1999）。しかしながら、現在までに、その系についてなされた多くの改良にもかかわらず、HCVの構造的及び非-構造的タンパク質のすべてをコードするゲノムレプリコンがウイルス-粒子を生じ得る、ことをそのチームも示してはいない。加えて、遺伝子型1a、1b及び近年の遺伝子型2aのレプリコンのみ（Kato et al, Gastroenterology, vol 125 (6), p.1808-17, 2003）が、この系において研究されてきた。この細胞系は、しかしながら、ウイルス複製を研究するための及び新規かつより効果的な抗ウイルス剤を開発するための偏向のモデルを維持している。
【００１４】
現在までに、HCVによる感染を治療するために様々な治療が開発されており、最も効果的な現在の抗ウイルス治療は、PEG化αインターフェロン及びヌクレオシドアナログであるリバビリンの併用に基づく二重療法から成る。しかしながら、この療法の効力は、感染の原因となるウイルスの遺伝子型に部分的に依拠するようである。このことは、この療法が、遺伝子型1のHCV株によって慢性的に感染された患者の約40%〜50%についてのみ効果的であるが、遺伝子型2又は3のHCVによって感染した患者の80%についてはほとんど治癒している、からである。遺伝子型1が世界のほとんどで支配的であるので（感染の60%〜90%）、新規抗ウイルス剤及び/又はワクチンを開発する必要性は重要な必要性を構成する。更に、この療法でのインターフェロンの使用は、非常に高価であり、患者によって十分に支持されないことが多い。
【００１５】
HCVによる感染の治療を改良するために、非常に多くの研究がなされて、HCVのウイルスサイクルのステップを特異的に阻害する新規分子が発見されている。開発された方法では、(1) 細胞ホモログ、特にRNA-依存的RNAポリメラーゼ（NS5B）又はNS3ウイルスプロテアーゼ、を有さないウイルス酵素を特異的にタンパク質レベルで標的することを目的としたものと、(2) HCVのゲノムを標的とする方法とを、区別することができる。
【００１６】
この第2の方法に関連して、特に、RNAi、アプタマー又はアンチセンス核酸のリボザイムのような多くの分子がウイルス複製を阻害するために開発されている。しかしながら、HCVゲノムが複製されるときに、HCV（NS5B）のRNAポリメラーゼの不誠実の結果、これらの方法のために開発された化合物は、HCVの偉大な遺伝子的可変性に突き当たってきた。このことは、これらの分子がHCVゲノムの配列を特異的に標的するので、ウイルスゲノム内の単一変異が、HCVの複製を阻害するそれらの活性を減じるか又は失わせることさえあるからである。加えて、HCVの様々な遺伝子型間に存在する有用性は、通常、HCVの異なった遺伝子型による感染を治療するために同一分子の使用を避ける。
【００１７】
そのため、現在、HCVの多くの変異体を標的とするくらいに十分に広い特異性を有するが、同時に異なった変異体に対して多大な効力を維持する、新規分子を特定するための多大な必要性が存在する。
【発明の概要】
【００１８】
驚くべきことに、本発明者らは、HCVによって感染された細胞（HCV複製複合体を発現する細胞）中でのみ正の極性のキメラゲノムRNAの形態の自殺ベクターであって、該正の極性のキメラゲノムRNAが、その発現がHCVによって感染された細胞死を引き起こす毒素タンパク質の翻訳を可能にする、前記ベクターを開発することに成功している。
【００１９】
従って、本発明によれば、負の極性キメラゲノムRNAは、先に記載した問題、特に抗-HCV分子の遺伝子型に従う先行技術の変動する治療効率、及び抗ウイルス剤に対する耐性に基づく多大な遺伝子的可変性なしに実施することができる。
【００２０】
従って、本発明の第1の目的は、単一鎖RNA分子であって、3'末端から5'末端まで、以下：
(i) RNA-依存的RNAポリメラーゼによって複製するRNAウイルスのRNA(+)鎖の5'非-コーディング部位（5'UTR）のすべて又は一部の相補的核酸配列、ここで、該相補的核酸配列は、該ウイルスの複製複合体を介して該単一鎖RNA分子の複製を許容する；
(ii) おそらく、リボゾームの内部挿入部位（IRES）に対応する核酸配列の相補的核酸配列；
(iii) 自殺遺伝子、又は該ウイルスの複製を妨害するタンパク質をコードする遺伝子の核酸配列の相補的核酸配列；及び
(iv) おそらく、該ウイルスのRNAの非-コーディング3'部位（3'UTR）に相補的な核酸配列、
を含む、前記分子に対応する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１のＡは、ベクタープラスミドpGEM-T/5UTR-EGFP-3UTRの構築を示す。Ｂは、プラスミドpGEM-T/5UTR-H2AEP-3UTRの構築を示す。Ｃは、プラスミドpGEM-T/5UTR-Ric-3UTRを示す。
【図２】図２のＡは、転写24、48及び72時間後の、Huh（斜線）、Huh7/NS3-5B（黒色）及びHuh7/Rep5.1（灰色、3参照）のトランスフェクト細胞の蛍光パーセンテージを示す。Ｂは、HuhとHuh7/NS3-5B（黒色）トランスフェクト細胞の蛍光比、及びHuhとHuh7/Rep5.1（灰色、3参照）トランスフェクト細胞の蛍光比に相当する蛍光指標を示す。
【図３】図３は、クローニング部位（太字及び斜体）及び5’UTR（上）領域と3’UTR（下）領域によってフレームされたリシンA-鎖配列（下線）を有する、正の極性ゲノムRNAの配列を示す。
【図４】図４は、負の極性（黒色）又は正の極性（灰色）の最少ゲノムRNAによってHuh7、Huh7/Rep5.1又はHuh7/NS3-5B細胞の転写後48時間の毒性を示す。
【図５】図５は、正の極性の最少ゲノムRNAの細胞毒性パーセンテージをトランスフェクション対照（100%）とした、負の極性の最少ゲノムRNAの細胞毒性パーセンテージの標準化に対応する。
【図６】図６のＡは、培養48時間後の総RNAのμg当たりについてリアルタイムで報告された定量的RT-PCRによって測定されたレプリコンのRNAコピー数を示している。Ｂは、最少ゲノムRNAの5UTR-EGFP-3UTRを複製対照として採用することによって計算された、Rep5.1レプリコンの複製の阻害パーセンテージを示している。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明に従う単一鎖RNA分子は、非-コーディングである。従って、該単一鎖RNA分子は、複製複合体が発現されない対象ウイルスによって感染されない細胞中に存在する場合に、自殺遺伝子の転写物及びその結果として生じる翻訳物を得ることができず、そのため細胞死を招く。
【００２３】
一方、本発明に従う単一鎖RNA分子は、複製複合体を発現する対象ウイルスによって感染された細胞中に存在するときに、IRES配列で開始されるその翻訳が自殺遺伝子のタンパク質の合成を引き起こし次いで細胞死を引き起こす相補鎖として複製される。
【００２４】
好ましくは、本発明に従うRNA分子は、リボゾームの内部挿入部位（IRES）に対応する核酸配列の相補的核酸配列を含む。しかしながら、この配列は、翻訳のためにIRESを必要としないウイルスのために必須ではない。当業者は、本発明に従うRNA分子がリボゾームの内部挿入部位（IRES）に対応する核酸配列の相補的核酸配列を必要としない。
【００２５】
好ましくは、正の極性のRNAウイルスによって、相補的配列（i）及び（iv）を得ることができるRNAは、ゲノムRNAである。
【００２６】
「正の極性のRNAウイルス」は、そのゲノムRNAが直接コードしているウイルスを意味する。
【００２７】
「ゲノムRNA」は、ウイルス粒子においてカプシに包まれたRNAに相当するRNA鎖を意味する。
【００２８】
好ましい態様では、本発明の第1の目的は、C型肝炎（HCV）の負の極性キメラゲノムRNA（（-)RNA）に対応する、単一鎖RNA分子であって、以下：
(i) C型肝炎（HCV）のゲノムRNA（(+)鎖）の非-コーディング5'領域（又は5'UTR）のすべて又は一部に相補的な核酸配列、ここで、該相補的核酸配列は、該HCVの複製複合体を介して該単一鎖RNA分子の複製を許容する；
(ii) リボゾームの内部挿入部位（IRES）に対応する核酸配列の相補的核酸配列；
(iii) 自殺遺伝子、又は該HCVウイルスの複製を妨害するタンパク質をコードする遺伝子の核酸配列の相補的核酸配列；及び
(iv) おそらく、HCVのゲノムスRNA（(+)鎖）の非-コーディング3'部位（3'UTR）に相補的な核酸配列、
を含む、ことを特徴とする前記単一鎖RNA分子に相当する。
【００２９】
好ましい態様では、本発明に従うRNA分子は、C型肝炎（HCV）のゲノムRNA（(+)鎖）の非-コーディング5'部位（5'UTR）に相補的な核酸配列であって、HCVの複製複合体によって該単一鎖RNA分子の複製を許容する、前記核酸配列を含む。
【００３０】
本発明に従う単一鎖RNA分子は、非-コーディングである。従って、該単一鎖RNA分子は、HCVの複製複合体が発現されないHCVによって感染されない細胞中に存在するときに、自殺遺伝子の転写物、及びその結果としての翻訳物を得ることができず、そのため細胞死を引き起こす。
【００３１】
一方、本発明に従う単一鎖RNA分子は、複製複合体を発現する対象ウイルスによって感染された細胞中に存在するときに、IRES配列で開始されるその翻訳が自殺遺伝子のタンパク質の合成を引き起こし次いで細胞死を引き起こす相補鎖（(+)鎖）として複製される。
【００３２】
C型肝炎ウイルスの負の極性キメラゲノムRNA（(-)鎖）に対応する単一鎖RNA分子の使用は、正の極性キメラゲノムRNA（(+)鎖）と異なり、（-）鎖としてその複製を得るために（+）鎖の3'UTR配列の認識を必要とする複製ステップを省略することができる。この3'UTR領域の最初の30ヌクレオチドは、5'UTR領域と比べて様々な遺伝子型間でほとんど保存されないので、正の極性キメラゲノムRNAの使用は、負の極性キメラゲノムRNAと比べて、治療される細胞、組織又は患者を感染するC型肝炎のウイルスの遺伝子型に従って効力が非常に変動することが明らかである。
【００３３】
RNA-依存型RNAポリメラーゼによって複製するRNAウイルスの中で、以下のものが挙げられる：C型肝炎ウイルス、並びに、フラビビリダエ（Flaviviridae）、シストビリダエ（Cystoviridae）、ビルナビリダエ（Birnaviridae）、レオビリダエ（Reoviridae）、Coronaviridae（コロナビリダエ）、トガビリダエ（Togaviridae）、アルテリウイルス（Arterivirus）、アストロビリダエ（Astroviridae）、カリシビリダエ（Caliciviridae）、ピコーナビリダエ（Picornaviridae）、ポチビリダエ（Potyviridae）、オルソミクソビリダエ（Orthomyxovirida）、フィロビリダエ（Filoviridae）、パラミクソビリダ エ（Paramyxoviridae）、ラブドビリダエ（Rhabdoviridae）、アレナビリダエ（Arenaviridae）及びブニャビリダエ（Bunyaviridae）のファミリーに属するすべてのウイルス。
【００３４】
特に好ましい態様では、RNA-依存型RNAポリメラーゼによって複製するRNAウイルスは、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、ウエストナイル熱ウイルス及びウシ下痢ウイルスを含む群より選ばれる。
【００３５】
有利なことに、本発明に従う単一鎖RNA分子は、修飾又は非修飾のリボヌクレオチド、好ましくは、該単一鎖RNA分子は、非-修飾リボヌクレオチドを含む。
【００３６】
修飾リボヌクレオチドは、ヌクレオチドの合成アナログによって置換される天然リボヌクレオチドを意味する。該合成リボヌクレオチドアナログは、好ましくは核酸分子の3'又は5'に位置する。
【００３７】
好ましいヌクレオチドの合成アナログは、糖基又は修飾された炭素基を有するリボヌクレオチドから選択される。好ましくは、修飾された糖基を有するリボヌクレオチドは、ハロゲン原子、OR、R、SH、SR、NH2、NHR、NR2又はCN基（Rは炭素数1〜6のアルキル、アルケニル又はアルキニル基であり、ハロゲンはフッ素、塩素、臭素又はヨウ素である）から選ばれる基によって置換される2'-OH基を有する。好ましくは、修飾炭素基を有するリボヌクレオチドは、ホスホチオエート基のような修飾基によって置換される、隣接リボヌクレオチドに結合されたそのリン酸エステル基を有する。しかしながら、修飾プリン又はピリミジン塩基を有するリボヌクレオチドを使用することもできる。このような修飾塩基の例として、5-(2-アミノ)プロピルウリジン及び5-ブロモウリジンのような位置5が修飾されたウリジン又はシタジン、7-ジアザ-アデニシンのような位置8が修飾されたアデノシン及びグアノシン、N6-メチルアデノシンのようなN-及びO-アルキル化ヌクレオチドが挙げられる。これらの様々な修飾体を組み合わせてもよい。
【００３８】
「HCVのゲノムRNA（(+)鎖）の非-コーディング5'領域（5'UTR）に相補的な核酸配列であって、該相補的核酸配列はHCVの複製複合体によって単一鎖RNAの複製を許容する」とは、5'UTR領域のステム-ループドメインＩ及びＩＩ（5'UTR-dI及び5'UTR-dII）を含む配列の少なくとも相補的配列を含む核酸配列、好ましくは、5'UTR領域のステム-ループドメインＩ、ＩＩ及びＩＩＩ（5'UTR-dI、5'UTR-dII及び5'UTR-dIII）を含む配列の少なくとも相補的配列を含む核酸配列を意味する。
【００３９】
一般常識の点から、当業者は、所与の遺伝子型又は所与のサブタイプさえもそのHCVウイルスの5'UTR領域の様々なステム-ループドメインの配列を容易に決定することができる。HCVに関連する当業者の一般常識及びこれらのドメインの位置は、特に、サイトhttp://euhcvdb.ibcp.fr/euHCVdv/.に説明されている。
【００４０】
例として、5'UTR-dIドメインは、遺伝子型1aについてはアクセッション番号M62321、M67463又はAF009606を有する配列のヌクレオチド5〜20まで；遺伝子1bについてはアクセッション番号D90208を有する配列のヌクレオチド1〜8まで、又はM58335を有する配列のヌクレオチド1〜11まで；遺伝子1cについてはアクセッション番号D14853又はAY051292を有する配列のヌクレオチド5〜20まで；遺伝子型2aについてはアクセッション番号D00944又はAB047639を有する配列のヌクレオチド5〜19まで；遺伝子2bについてはアクセッション番号D10988又はAB030907を有する配列のヌクレオチド5〜20まで；遺伝子2cについてはアクセッション番号D50409を有する配列のヌクレオチド5〜19まで；遺伝子2kについてはアクセッション番号AB031663を有する配列のヌクレオチド6〜20まで；遺伝子3aについてはアクセッション番号D17763又はD28917を有する配列のヌクレオチド5〜18まで；遺伝子3bについてはアクセッション番号D49374を有する配列のヌクレオチド5〜18まで；遺伝子3kについてはアクセッション番号D63821を有する配列のヌクレオチド5〜18まで；遺伝子6bについてはアクセッション番号D84262を有する配列のヌクレオチド5〜19まで；遺伝子6dについてはアクセッション番号D84263を有する配列のヌクレオチド5〜18まで；遺伝子6gについてはアクセッション番号D63822を有する配列のヌクレオチド5〜18まで；遺伝子6hについてはアクセッション番号D84265を有する配列のヌクレオチド5〜18まで；遺伝子6kについてはアクセッション番号D84264を有する配列のヌクレオチド5〜18まで、及ぶ。
【００４１】
例として、5'UTR-dIIドメインは、遺伝子型1aについてはアクセッション番号M62321、M67463又はAF009606を有する配列のヌクレオチド44〜108まで；遺伝子1bについてはアクセッション番号M58335を有する配列のヌクレオチド35〜109まで、又はD90208を有する配列のヌクレオチド32〜106まで；遺伝子1cについてはアクセッション番号D14853又はAY051292を有する配列のヌクレオチド44〜118まで；遺伝子型2aについてはアクセッション番号D00944又はAB047639を有する配列のヌクレオチド43〜117まで；遺伝子2bについてはアクセッション番号D10988又はAB030907を有する配列のヌクレオチド44〜118まで；遺伝子2cについてはアクセッション番号D50409を有する配列のヌクレオチド43〜117まで；遺伝子2kについてはアクセッション番号AB031663を有する配列のヌクレオチド44〜118まで；遺伝子3aについてはアクセッション番号D17763又はD28917を有する配列のヌクレオチド42〜116まで；遺伝子3bについてはアクセッション番号D49374を有する配列のヌクレオチド42〜116まで；遺伝子3kについてはアクセッション番号D63821を有する配列のヌクレオチド42〜116まで；遺伝子6aについてはアクセッション番号AY859526を有する配列のヌクレオチド1〜72まで；遺伝子6bについてはアクセッション番号D84262を有する配列のヌクレオチド42〜116まで；遺伝子6dについてはアクセッション番号D84263を有する配列のヌクレオチド41〜115まで；遺伝子6gについてはアクセッション番号D63822を有する配列のヌクレオチド41〜115まで；遺伝子6hについてはアクセッション番号D84265を有する配列のヌクレオチド41〜115まで；遺伝子6kについてはアクセッション番号D84264を有する配列のヌクレオチド41〜115まで、及ぶ。
【００４２】
例として、5'UTR-dIIIドメインは、遺伝子型1aについてはアクセッション番号M62321、M67463又はAF009606を有する配列のヌクレオチド125〜323まで；遺伝子1bについてはアクセッション番号M58335を有する配列のヌクレオチド116〜314まで、又はD90208を有する配列のヌクレオチド113〜311まで；遺伝子1cについてはアクセッション番号D14853又はAY051292を有する配列のヌクレオチド125〜323まで；遺伝子型2aについてはアクセッション番号D00944又はAB047639を有する配列のヌクレオチド124〜322まで；遺伝子2bについてはアクセッション番号D10988又はAB030907を有する配列のヌクレオチド125〜323まで；遺伝子2cについてはアクセッション番号D50409を有する配列のヌクレオチド124〜322まで；遺伝子2kについてはアクセッション番号AB031663を有する配列のヌクレオチド125〜323まで；遺伝子3aについてはアクセッション番号D17763又はD28917を有する配列のヌクレオチド123〜321まで；遺伝子3bについてはアクセッション番号D49374を有する配列のヌクレオチド123〜321まで；遺伝子3kについてはアクセッション番号D63821を有する配列のヌクレオチド123〜321まで；遺伝子4aについてはアクセッション番号Y11604を有する配列のヌクレオチド63〜261まで；遺伝子5aについてはアクセッション番号AF064490を有する配列のヌクレオチド30〜228まで；遺伝子6aについてはアクセッション番号AY859526を有する配列のヌクレオチド79〜277まで；遺伝子6bについてはアクセッション番号D84262を有する配列のヌクレオチド123〜324まで；遺伝子6dについてはアクセッション番号D84263を有する配列のヌクレオチド122〜320まで；遺伝子6gについてはアクセッション番号D63822を有する配列のヌクレオチド122〜320まで；遺伝子6hについてはアクセッション番号D84265を有する配列のヌクレオチド122〜320まで；遺伝子6kについてはアクセッション番号D84264を有する配列のヌクレオチド122〜320まで、及ぶ。
【００４３】
有利なことに、「HCVのゲノムRNA（(+)鎖）の非-コーディング5’領域（5'UTR）に相補的な核酸配列であって、該相補的核酸配列はHCVの複製複合体によって単一鎖RNAの複製を許容する」とは、HCVのゲノムRNA（(+)鎖）の位置1〜120の配列の相補的核酸配列、好ましくはHCVのゲノムRNA（(+)鎖）の位置1〜150の配列を含む相補的核酸配列、特に好ましくはHCVのゲノムRNA（(+)鎖）の位置1〜341の配列を含む相補的核酸配列を意味する。
【００４４】
位置1は、完全C型肝炎ウイルスのRNA（(+)鎖）の第1ヌクレオチドに対応する。
【００４５】
HCVのゲノムRNA（(+)鎖）の5'UTR領域は、遺伝子型1、2、3、4、5又は6のC型肝炎ウイルス（HCV）のゲノムRNAの5'UTR領域、又はそれから得られる配列を意味する。
【００４６】
得られる配列は、遺伝子型1、2、3、4、5又は6のC型肝炎ウイルス（HCV）のゲノムRNAの5'UTR領域の配列と少なくとも80%の同一性、好ましくは少なくとも85%、特に少なくとも90%、及び特に好ましくは少なくとも95%の同一性を有する配列を意味する。
【００４７】
好ましくは、HCVのゲノムRNAの5'UTR領域の配列は、遺伝子型1のC型肝炎ウイルス（HCV）のゲノムRNAのゲノムの5'UTR領域の配列に相当する。
【００４８】
特に好ましい態様では、HCVのゲノムRNAの5'UTR領域の配列は、配列番号1の配列の位置1〜120、好ましくは配列番号1の配列の位置1〜150、特に好ましくは配列番号1の配列の位置1〜341の配列、又はそれから得られる配列に相当する。
【００４９】
当業者は、困難なく、当業者の一般的知識に照らして、リボゾームの内部挿入部位（IRES）に対応する核酸配列を同定することができるだろう。かかるIRES配列は真核生物起源でも又はウイルス起源でもよい。
【００５０】
真核生物起源のIRES配列の例として、FGF（線維芽細胞増殖因子）ファミリー、コネクシンファミリー、サイクリン-依存型キナーゼ-阻害タンパク質p 27、BCL 2、HSP 101、HS P70、プロト-癌遺伝子c-myc、L-myc、n-nyc、又はMnt転写レプレッサ＾を含む群から選ばれるタンパク質をコードする転写物のIRES配列が挙げられる。
【００５１】
ウイルス起源のIRES配列の例として、灰白髄炎ウイルス、脳心筋炎ウイルス（EMCV）、GBV-Aウイルス、GBV-Bウイルス、GBV-Cウイルス、C型肝炎ウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス（BVDV）、A型ウマ鼻炎ウイルス及びB型ウマ鼻炎ウイルス（ERAV及びERBV）、ZAM、アイデフィックス（Idefix）及びジプシー型レトロエレメント、又はHIV、のIRES配列が挙げられる。
【００５２】
好ましくは、IRES配列はウイルス起源のものであり、特に好ましくは、該IRES配列はHCVのゲノムRNA（(+)鎖）の5'UTR領域のステム-ループドメインＩＩ〜ＩＶ（5'UTR-dII〜5'UTR-dIV）に相当する、HCVのIRES配列に対応する。
【００５３】
例えば、HCVのIRES配列は、遺伝子型1aについては、アクセション番号M62321、M67463又はAF009606を有する配列のヌクレオチド44〜354；遺伝子型1bについては、アクセション番号M58335を有する配列の35〜345、又はアクセション番号D90208を有する配列のヌクレオチド32〜342；遺伝子型1cについては、アクセション番号D14853又はAY051292を有する配列のヌクレオチド44〜345；遺伝子型2aについては、アクセション番号D00944又はAB047639を有する配列のヌクレオチド43〜353；遺伝子型2bについては、アクセション番号AB030907又はD10988を有する配列のヌクレオチド44〜354；遺伝子型2cについては、アクセション番号D50409を有する配列のヌクレオチド43〜353；遺伝子型2kについては、アクセション番号AB031663を有する配列のヌクレオチド44〜354；遺伝子型3aについては、アクセション番号D17763又はD28917を有する配列のヌクレオチド42〜352；遺伝子型3bについては、アクセション番号D49374を有する配列のヌクレオチド42〜352；遺伝子型3kについては、アクセション番号D63821を有する配列のヌクレオチド42〜352；遺伝子型6aについては、アクセション番号AY859526を有する配列のヌクレオチド1〜308；遺伝子型6bについては、アクセション番号D84262を有する配列のヌクレオチド42〜355；遺伝子型6dについては、アクセション番号D84263を有する配列のヌクレオチド41〜351；遺伝子型6gについては、アクセション番号D63822を有する配列のヌクレオチド41〜351；遺伝子型6hについては、アクセション番号D84265を有する配列のヌクレオチド41〜351；遺伝子型6kについては、アクセション番号D84264を有する配列のヌクレオチド41〜351に及ぶ。
【００５４】
有利なことに、「HCVのIRES配列」は、HCVのゲノムRNA（(+)鎖）の位置30〜355の配列
好ましくはHCVのゲノムRNA（(+)鎖）の位置25〜370の配列及び特に好ましくは位置20〜385の配列を意味する。
【００５５】
HCVのIRES配列は、遺伝子型1、2、3、4、5又は6のC型肝炎ウイルス（HCV）のゲノムRNA（(+)鎖）のIRES配列、又はそれから得られる配列、好ましくは遺伝子型1のC型肝炎ウイルス（HCV）のゲノムRNA（(+)鎖）のIRES配列を意味する。
【００５６】
得られる配列は、遺伝子型1、2、3、4、5又は6のC型肝炎ウイルス（HCV）のゲノム（(+)鎖）RNAのIRES配列の配列と少なくとも80%の同一性、好ましくは少なくとも85%、特に少なくとも90%、及び特に好ましくは少なくとも95%の同一性を有する配列を意味する。
【００５７】
特に好ましい態様では、HCVのIRES配列は、配列番号1の配列の位置30〜355、好ましくは配列番号1の配列の位置25〜370、特に好ましくは配列番号1の配列の位置20〜386の配列、又はそれから得られる配列に相当する。
【００５８】
好ましい態様によれば、本発明に従う単一-鎖RNA分子は、HCVのゲノムRNA（(+)鎖）の位置1〜355の配列の相補的配列、好ましくはHCVのゲノムRNA（(+)鎖）の位置1〜370の配列及び特に好ましい態様ではHCVのゲノムRNA（(+)鎖）の位置1〜385の配列の相補的配列を含む。
【００５９】
HCVのゲノムRNA（(+)鎖）の配列は、遺伝子型1、2、3、4、5又は6のC型肝炎ウイルス（HCV）配列、又はそれから得られる配列、及び好ましくは遺伝子型1のC型肝炎ウイルス（HCV）のゲノムRNA（(+)鎖）配列を意味する。
【００６０】
得られる配列は、遺伝子型1、2、3、4、5又は6のC型肝炎ウイルス（HCV）のゲノム（(+)鎖）RNAの配列と少なくとも80%の同一性、好ましくは少なくとも85%、特に少なくとも90%、及び特に好ましくは少なくとも95%の同一性を有する配列を意味する。
【００６１】
好ましくは、本発明に従う単一-鎖RNA分子は、配列番号1の配列の位置1〜355の配列の相補的配列、好ましくは配列番号1の配列の位置1〜370の配列及び特に好ましい態様では配列番号1の配列の位置1〜386の配列の相補的配列、又はそれから得られる配列を含む。
【００６２】
当業者は、困難なく、当業者の一般的知識に照らして、本発明に従う分子のために使用され得る自殺遺伝子の核酸配列を決定することができるだろう。
【００６３】
当業者は、当業者の一般的知識に照らして、HCVウイルスの複製を妨害するタンパク質をコードする遺伝子を容易に同定することができるだろう。HCVの複製を妨害するタンパク質の例として、αインターフェロン、βインターフェロン及びγインターフェロンが挙げられ、好ましくはαインターフェロン、特に好ましくはα2a及びα2bインターフェロンである。
【００６４】
RNA-依存型RNAポリメラーゼによって複製するRNAウイルス、特にC型肝炎ウイルス、の複製を妨害するタンパク質をコードする遺伝子の例として、インターフェロン調節因子（IRF）をコードする遺伝子も挙げられる。
【００６５】
自殺遺伝子は、薬物の存在下又は非存在下で細胞死を引き起こすタンパク質産物をコードする遺伝子を意味する。
【００６６】
具体的態様によれば、自殺遺伝子は、特定の「薬物」の存在下で細胞死を引き起こす細菌性又はウイルス性酵素をコードする。
【００６７】
より具体的には、前記酵素は、例えば核酸の合成阻害によって、ある環境に存在する薬物（プロドラッグ）の不活性形態を、細胞死を引き起こすその活性な毒性形態に変換する。
【００６８】
当業者は、困難なく、当業者の一般的知識のみに照らして、好適な自殺遺伝子を同定することができるだろう。
【００６９】
このような自殺遺伝子の例として、それぞれガンシクロビル、5-FUと共に使用される、HSVチミジンキナーゼ（HSVltk）又はシトシンデアミナーゼ（CD）の遺伝子が挙げられる（国際出願PCT WO 2005092374、第11及び12頁）。
【００７０】
別の具体的態様によれば、自殺遺伝子は、細胞死を引き起こすタンパク質毒素をコードする。
【００７１】
使用され得るタンパク質の例として、細菌性外毒素、真菌毒素、真核生物起源、野菜起源又はウイルス起源の毒素、又はそれから得られるタンパク質が挙げられる。
【００７２】
得られるタンパク質は、細菌性外毒素、真菌毒素、真核生物起源、野菜起源又はウイルス起源の毒素と少なくとも80%の同一性、好ましくは少なくとも85%、特に少なくとも90%、及び特に好ましい態様では少なくとも約95%の同一性を有するタンパク質を意味する。
【００７３】
再度、有利なことに、細胞死を引き起こすタンパク質毒素は、RIP（リボゾーム-不活性化タンパク質）に属し、該タンパク質毒素は、多くの種の植物、細菌又は真菌に存在する（Van Damme et al., Crit Rev Plant Sci, vol 20, p: 395-465, 2001; Sandvug and Van Deurs, FEBS Lett, vol 529, p: 49-53, 2002）。RIPファミリーのタンパク質は、レクチンファミリーに類似するが、その毒性は後者よりも非常に高い。RIPファミリーのタンパク質は、その分子構造に従って2種に分類される。
【００７４】
Ｉ型は、約30 kDaの単一ポリペプチド鎖を含むタンパク質を含み、細胞表面に固定させることができるレクチン活性を欠く、このことは確実な毒性をタンパク質に与える。
【００７５】
ＩＩ型は、異なった活性を有する2つのポリペプチド鎖A及びBを含むタンパク質を含む。ハプトマー又は鎖B（結合）は、レクチンドメインを含み、細胞表面上の糖又はグリコシル化化合物と相互作用し、細胞におけて鎖Aの挿入を促進する。エフェクトマー（effectomer）又は鎖A（活性）は、毒性活性を運ぶ。最もよく知られたこれらの毒性は、リシン（Ricinus communis由来）であるが、アブリン（Abrus precatorius由来）、モデクシン（Adenai digitata由来）、フォルケンシン（Adenai volkensii由来）、及びビスキュミン（Viscum album由来）のような他の植物毒素も同一の性質を有する。この群内には、細菌性毒素、例えば、シゲラ・ダイセントリアによって産生されるシガ毒素、並びに大腸菌、シトロバクター・フレウンディ（Citrobactor freundii）、アエロモナス・ハイドロヒィーラ（Aeromonas hydrophilia）、アエロモナス・キャビエ（Aeromonas caviae）及びエンテロバクター・クロアカエ（Enterobactor cloacae）のある株によって分泌される類似の毒素（シガ様毒素又はSLTT）（STEC、それらがベロ細胞に対して細胞毒性であるためにVTECとも呼ばれる）も含む。２型のRIPは、１型のRIPよりもかなり効力がある；これは、無細胞調製物内のタンパク質合成の強力な阻害剤であるが、１型RIP（DL50：1〜40 mg/kg）が２型RIP（リシンのDL50：2μg/kg）よりもマウスにおいて毒性が非常に低いためである。
【００７６】
有利なことに、自殺遺伝子は、２型RIPファミリー内のタンパク質毒素又はそれから得られるタンパク質をコードし、好ましくは、リシン、アブリン、モデクシン、フォルケンシン、ビスキュミン及びシガ毒素のような２型RIPファミリーのタンパク質毒素の鎖Aをコードし、特に好ましい態様ではリシンの鎖Aをコードする。
【００７７】
特に好ましい態様では、自殺遺伝子は、配列番号2の配列又は得られた配列に相当する。
【００７８】
得られた配列は、配列番号2の配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、特に少なくとも90%、及び特に好ましい態様では少なくとも95%の同一性を有する配列を意味する。
【００７９】
当業者は、当業者の一般知識に照らして、所与の遺伝子型又は所与のサブタイプでさえもそのC型肝炎ウイルス（HCV）のゲノムRNA（(+)鎖）の非-コーディング3'領域（3'UTR）の相補的核酸配列を容易に決定することができるだろう。HCVに関連する当業者の一般常識及びこれらの領域の位置は、特に、サイトhttp://euhcvdb.ibcp.fr/euHCVdv/.に説明されている。
【００８０】
例として、3'UTR領域は、遺伝子型1aについてはアクセション番号AF009606を有する配列のヌクレオチド9378〜9646；遺伝子型2aについては、アクセション番号AB047639を有する配列のヌクレオチド9443〜9678；遺伝子型2bについては、アクセション番号AB030907を有する配列のヌクレオチド9444〜9654；遺伝子型6bについては、アクセション番号D84262を有する配列のヌクレオチド9403〜9628；遺伝子型6dについては、アクセション番号D84263を有する配列のヌクレオチド9381〜9615；遺伝子型6kについては、アクセション番号D84264を有する配列のヌクレオチド9387〜9621に及ぶ。
【００８１】
HCVのゲノムRNA（(+)鎖）の3'UTR領域は、遺伝子型1、2、3、4、5又は6のC型肝炎ウイルス（HCV）のゲノムRNAの3'UTR領域、あるいはそれから得られる配列、好ましくは遺伝子型1のC型肝炎ウイルスのゲノムRNAの3'UTR領域を意味する。
【００８２】
得られた配列は、遺伝子型1、2、3、4、5又は6のC型肝炎ウイルス（HCV）のゲノムRNAの3'UTR領域の配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、特に少なくとも90%、及び特に好ましい態様では少なくとも95%の同一性を有する配列を意味する。
【００８３】
好ましくは、HCVのゲノムRNAの3'UTR領域の配列は、配列番号3の配列又はそれから得られる配列に相当する。
【００８４】
本発明に従う単一-鎖RNA分子は、化学合成法又は分子生物的法、特に組換え微生物から単離されたDNAマトリクス又はプラスミドを用いる転写によって得られる。好ましくは、この転写ステップは、RNAポリメラーゼT7、T3又はSP6のようなファージRNAポリメラーゼを用いる。
【００８５】
第2の好ましい態様に従って、本発明に従う単一-鎖RNA分子は、配列番号4の相補的配列又はそれから得られる配列に相当する。
【００８６】
得られる配列は、配列番号4の配列と少なくとも80%の同一性、好ましくは少なくとも85%、特に少なくとも90%、及び特に好ましい態様では少なくとも95%の同一性を有する配列を意味する。
【００８７】
本発明の第2の目的は、DNA分子、好ましくは二重鎖DNAに相当し、これは、先に記載したように単一-鎖RNA分子の転写を許容する。
【００８８】
有利なことに、前記DNA分子は、先に記載した単一-鎖RNA分子の核酸配列に相補的な核酸配列を含む。該第3の相補的核酸配列は、真核生物又は原核生物細胞、好ましくは真核生物細胞においてその転写を許容する、核酸配列に作動可能に結合されており、よって、先に記載した単一-鎖RNA分子が取得される。
【００８９】
従って、前記DNA分子は、負の極性キメラゲノムRNAに直接相当し、かつ正の極性キメラゲノムRNAの転写及びその複製の連続ステップを経ることなく、単一-鎖RNA分子を得ることを可能にする。
【００９０】
転写を許容する核酸配列は、プロモートする配列又は活性化する配列、好ましくはプロモートする配列のような任意の転写調節配列を意味する。
【００９１】
前記プロモートする配列は、例えば、細胞プロモーター又はウイルスプロモーターに相当してもよいし、構成的又は誘導性プロモーターに相当してもよい。哺乳動物を構成するプロモーターの例として、以下の遺伝子のプロモーターが非-限定的に挙げられる：ヒポキサンチン、ホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPTR）、アデノシンデアミナーゼ、ピルヒビン酸キナーゼ、β-アクチン、筋クレアチンキナーゼ及びヒト伸張因子。哺乳動物細胞内で構成的発現を有するウイルスプロモーターの例として、以下のウイルスプロモーターが非-限定的に挙げられる：SV40、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、サイトメガロウイルス（CMV）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）及びB型肝炎ウイルス（HBV）。他の構成的プロモーターは、当業者に周知である。有用なプロモート配列は、誘導配列、及び誘導剤の添加の際に転写を生じさせるものも含む。例として、その転写がある金属イオンの存在下で誘導されるメタロチオニンファミリー内の遺伝子プロモーターが挙げられる。他の誘導プロモーターは、その一般的知識に照らして、当業者によって容易に同定することができる。
【００９２】
一般的に、プロモート配列は、TATAボックスのような転写の開始に関連する非-転写5'配列を含む。
【００９３】
本発明の別の目的は、先に記載の核酸分子、特にRNA又はDNA分子、を含む核酸ベクターからなる。
【００９４】
「核酸ベクター」は、細胞内への、好ましくはC型肝炎によって潜在的に感染された細胞内への、前記RNA又はDNA分子の導入を促進するための任意の支持体を意味する。好ましくは、本発明に従うベクターは、前記核酸分子を導入し、同時にベクターの非存在下にその導入に関してその低下を制限することができる。ベクターは、先に記載のプロモート配列を含むことができる。使用されるベクターの例として、プラスミド、ファージミド、ウイルス及びウイルス又は細菌起源の他の得られたベクターが非-制限的に挙げられる。好ましいウイルスベクターは、非常に多数の種及び細胞種に感染することができるアデノウイルス（修飾型）、レンチウイルス（特に、所望の親和性が得られるようにエンベロープタンパク質の修飾によって修飾された）、又は肝臓細胞を特異的に感染することができるA型及びB型肝炎ウイルス（修飾型）を含む。好ましい非-ウイルスベクターは、先行技術に広く記載されているプラスミドベクターを含む（特に、Sanbrook et al., “Molecular  Cloning: A Laboratory Manual,” Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989参照）。プラスミドは、多くの方法、特に局所的又は非経口的に投与され得る。例えば、プラスミドは、筋肉内、皮内、肝内又は皮下的方法によって注入され得る。本発明に従う核酸ベクターは、真核生物及び/又は原核生物細胞における活性選択マーカーを含むことができる。
【００９５】
本発明の別の目的は、核酸分子、RNA又はDNA、あるいは先に記載のベクターを含む、医薬組成物にある。
【００９６】
有利なことに、前記医薬組成物は薬学的に許容される支持体を含む。
【００９７】
薬学的に許容される支持体の例として、本発明に従う医薬組成物は、エマルジョン、マイクロエマルジョン、水中油型又は油中水型エマルジョン、あるいは他の種類のエマルジョンを含むことができる。該組成物は、1以上の添加剤、例えば希釈剤、賦形剤、又は安定剤（特に、Ullman’s Encyclopaedia of Industrial Chemistry, 6th Ed, 1989-1998, Marcel Dekker; nsel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Willaims & Wilkins, 1994参照）を含んでもよい。
【００９８】
該組成物は、水又は溶解緩衝剤を含むことができる。該緩衝剤は、非-限定的に、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、Ca++/Mg++無しのリン酸緩衝生理食塩水、生理的血清（150 mM NaCl水溶液）又はトリス緩衝液を含む。
【００９９】
本発明の別の目的は、患者におけるRNA-依存型RNAポリメラーゼによって複製するRNAウイルスを予防又は治療することを意図した医薬組成物を調製するための、先に記載の核酸分子又はベクターの使用にある。
【０１００】
本発明の別の目的は、患者におけるC型肝炎ウイルス（HCV）による感染を予防又は治療することを意図した医薬組成物を調製するための、先に記載の核酸分子又はベクターの使用にある。
【０１０１】
「患者」は、哺乳動物、好ましくはヒトを意味する。
【０１０２】
本発明に従う組成物は、治療的に有効な量で、局所的又は非経口的に、特に筋肉内、皮内、肝内、又は皮下的注入によって、好ましくは肝内注入によって投与され得る。
【０１０３】
本発明に従う組成物の投与は、当業者に知られた遺伝子導入によって達成され得る。
【０１０４】
一般的な遺伝子導入法は、リン酸カルシウム、DEAE-デキストラン、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ウイルス法及びカチオンリポソームを含む（Graham and Van Der Eb, Virol, vol 52, p: 456, 1976; McCuthan and Pagano, J Natl Cancer Inst, Vol 41, 9: 351, 1968; Chu et al., Nucl Acids Res, vol 15, p: 1311; Fraley et al., J Biol Chem, vol 255, p: 10431, 1980; Capecchi et al., Cell, vol 22, p: 479, 1980; Felgner et al., Proc Natl Acad Sci USA, vol 84, p: 7413, 1988）。
【０１０５】
患者に投与される核酸分子の有効量は、当業者によって容易に決定され得る。例として、核酸分子の有効量は、治療される患者の0.001 mg〜10 g/kg、好ましくは0.01 mg〜1 g/kg、特に好ましい態様では0.1 mg〜100 mg/kgの範囲である。
【０１０６】
本発明の他の特徴は、本発明を限定する構成を含むことなく、以下の実施例に示す。
【実施例】
【０１０７】
１）HCVから得られるゲノムRNAの発現を許容する細胞系の構築
本発明に従うキメラゲノムRNAの複製力を分析するために、HCVの複製複合体を構成的に合成する細胞系は、Huh7肝臓癌細胞株の細胞のゲノムにおいてHCV（NS3-NS5B）の非-構造的タンパク質を挿入することによって開発されてきた。
【０１０８】
この目的のために、前記非-構造的タンパク質をコードするベクターpcDNA3.1/NS3-5B（2884R/G）を以下のように構築した。
【０１０９】
・NS3からNS5Bまでをカバーする非-構造的タンパク質をコードするタンパク質を、ポリメラーゼ・ヘルキュラーゼ（登録商標）（STRATEGENE）を用いて、遺伝子型1aの株であるHCVの感染単離物J4L6（Yanagi et al., Virology, vol 244(2), p: 161-72, 1998）、並びにプライマーNS3-開始（配列番号5：ACACACTGGCCAATGGCGCCCATCACGGCCTACTCC）及びNS5B-停止（配列番号6：GTGTGTTCTAGATCATCGGTTGGGGAGCAGGTA）を用いて増幅した。
【０１１０】
・次いで、プラスミドpcDNA3.1（INVITROGEN）のEcoRVとXBaIとの間にフラグメントNS3-5Bを挿入し、ベクターpcDNA3.1/NS3-5Bを作製した。
【０１１１】
・次いで、位置2884での残基GlyからArgへの変異（Pietschmann et al.）は、プライマーNS5B2884S（配列番号7：TCATTGAAGGGCTCCATGGTCTTAGCGCATTTACAC）及びNS5B2884AS（配列番号8：TAAGACCATGGAGCCCTTCAATGATCTGAGGTAGGTC）並びにDNAポリメラーゼTaq Phusion（登録商標）（OZTME）を用いる直接的変異によって導入した。PCR反応は、ベクターpcDNA3.1/NS3-5Bで行い、得られたPCR産物は酵素Dpn 1（PROMEGA）によって消化し、直接、エシェリシア・コリH5α菌の培養中で増幅した。最後に、変異配列を含むプラスミドpcDNA3.1/NS3-5B（2884R/G）をシークエンシングによって選択した。
【０１１２】
次いで、百万個のHuh7細胞を、供給者の教示に従って加えた試薬（INVITROGEN）と共にリポフェクチン（登録商標）を用いて、2.5μgのベクタープラスミドpcDNA3.1/NS3-5B（2884R/G）によってトランスフェクトした。
【０１１３】
次いで、5%CO2の雰囲気下、37℃で、10%ウシ胎児血清（FCS；熱によって不活性化）及び抗生物質G418（1 mg/ml）で補充したダルベッコ改変培地中で該細胞を培養した。
【０１１４】
プラスミドpcDNA3.1/NS3-5B（2884R/G）の発現は、G418抗生物質に耐性の様々なクローンでウェスタンブロット法によって分析した（Huh7/NS3-5B）。
【０１１５】
この事実は、NS5Bタンパク質が構成的に発現し、予想された分子量を有することを示した。これは、NS3-5Bポリタンパク質がNS3プロテアーゼによって正確に成熟させられたことを示すものである。
【０１１６】
２）細胞株Huh7/NS3-5BにおけるHCVから得られる負の極性の最小ゲノムRNAの複製能力
2-1：HCV由来の負の極性の最小ゲノムRNAの構築：
細胞株Huh7/NS3-5Bの複製活性を評価するために、5UTR-H2AE-3UTRと称される最小複製配列を構築した。
【０１１７】
この配列5UTR-H2AE-3UTRは、HCVの5'UTR領域、ハイグロマイシン耐性タンパク質の配列からなるポリタンパク質をコードする配列、アフター熱ウイルス（EMDV）の2Aタンパク質及びEGFPタンパク質から形成し、次いで、HCVの3'NC領域を構築した。
【０１１８】
配列5UTR-H2AE-3UTRをコードするベクターの構築は以下の2ステップで行った：
ステップ1：
ベクタープラスミドpGEM-T/5UTR-EGFP-3UTRの構築（図１のＡ）は、各々単離物con1及び株H77から得られる5'UTR及び3'UTR領域（又は非-コーディング領域）、並びにEGFP（増強緑色蛍光タンパク質）の遺伝子の増幅によって行った。カプシドタンパク質（Cタンパク質）をコードする最初の27ヌクレオチドにまで及ぶ5'NC配列は、マトリックス（EMBL X61596）として、con1単離物のプライマー：5NC-開始（配列番号9：GCCAGCCCCCGATTGGGGGCG）及び5NC-Bam（配列番号10：ATAGGATCCGGTGTTACGTTTGGTTTTTC）の方法によって増幅し、配列EGFPは、プライマー：EGFP-Bam（配列番号11：TATGGATCCGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG）及びEGFP-Xba（配列番号12：CGCTCAGTTGGAATTCTAGAGTC）の方法によってポリメラーゼTaq Gold（登録商標）（ROCHES）によって増幅した。次いで、得られタンパク質フラグメントを制限酵素Bam HIによって開裂し、16℃で終夜、リガーゼT4 DNA（PROMEGA）の方法によって連結し、次いでプライマー：5NC-開始（配列番号9）及びEGFP-Xba（配列番号12）を用いて再度増幅した。これは、フラグメント5UTR-EGFPを生成した。3'NC領域は、株VHC H77（EMLB AF011753）のプライマー：3NC-Xba（配列番号13：ATATATTCTAGAACGGGGAGCTAAACACTCCAG）及び3NC-停止（配列番号14：ACTTGATCTGCAGAGAGGCCAG）を用いるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって得た。増幅産物及び5UTR-EGFPフラグメントを酵素XbaIによって消化し、上記の条件下で連結し、得られた連結産物をプライマー：5NC-開始及び5NC-停止を用いて増幅した。最後に、得られたフラグメントを、ベクターpGEM-T/5UTR-EGFP-3UTRを製造するベクタープラスミドpGEM-T（PROMEGA）に挿入した。得られたベクターpGEM-T/5NC-EGFP-3NCの配列はシークエンシングによって確認した。
【０１１９】
ステップ2：
プラスミドpGEM-T/5UTR-H2AEP-3UTRの構築（図１のＢ）は、ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ（HygroR）の配列及びアフター熱ウイルス（FMDV、蹄疫ウイルスを意味する）の2Aタンパク質をコードする配列を、ベクターpGEM-T/5UTR-EGFP-3UTRの5'UTR領域とEGFP配列との間に挿入することによって行った。
【０１２０】
ハイグロマイシン配列は、プライマー；Hygro-Bam（配列番号15：ATATATGGATCCAAAAAGCCTGAACTCACCGCG）及びHygro2A-Bam（配列番号16：ATATATGGATCCGGGCCCAGGGTTGGACTCGACGTCTCCCGCAAGCTTAAG AAGTTCCTTTGCCCTCGGACGAG）を用いるベクタープラスミドpsiSTRIKETM（PROMEGA）のPCRによる増幅によって得た。前記プライマーHygro2A-Bamは、タンパク質2A配列の42ヌクレオチドを含む。次いで、ベクターpGEM-T/5UTR-H2AE-3UTRを得るために、得られた増幅産物を、プラスミドpGEM-T/5UTR-EGFP-3UTRのBamHI部位に挿入した。最後に、得られたベクターpGEM-T/5UTR-H2AE-3UTRの配列は、シークエンシングによって確認した。
【０１２１】
転写に必要なファージT7のプロモーターは、PCRによって導入した。(+)鎖を転写するために、プライマー：T7-5UTR（配列番号17：TAATACGACTCACTATAGGGCCAGCCCCCTGATGGGGGCG）及び3UTR-停止（配列番号18：ACTTGATCTGCAGAGAGGCCAG）を用いた。(-)鎖を転写するために、プライマー：T7-3UTR（配列番号19：TAATACGACTCACTATAGGACTTGATCTGCAGAGAGGCCAG）及び5UTR-開始（配列番号20：GCCAGCCCCCGATTGGGGGCG）を用いた。最後に、製造者の教示に従って、ポリメラーゼT7（PROMEGA）を用いる1μgのPCR産物の転写によって負の極性の最小ゲノムRNAを得た。最後に、製造者の教示に従ってRNeasy（登録商標）キットによって、RNAを精製した。
【０１２２】
2-2：細胞株Huh7/NS3-5Bにおける負の極性由来のHCVの最小ゲノムRNAの複製：
105 Huh7/NS3-5B細胞/ウェルの割合で24-ウェル培養プレートに播き、37℃で24時間インキュベートした。次いで、製造者の教示に従って、得られた細胞を、3μlのDMRIE-C（INVITROGEN）と混合された1μgの正の極性の5UTR-H2AE-3UTR転写物を用いてトランスフェクトした。このようにしてトランスフェクトした細胞を、トランスフェクトされた転写物を複製する細胞を選択するために、様々な濃度のハイグロマイシンの存在下で培養した。
【０１２３】
異なった濃度のハイグロマイシンの存在下での細胞増殖及びミニ-ゲノムの複製活性を1ケ月間、同時に分析した。
【０１２４】
一定間隔をおいて、5UTR-H2AE-3UTR転写物によって及び異なったハイグロマイシン濃度下でトランスフェクトされた又はされないHuh7/NS3-5B細胞は、2 mM EDTAリン酸緩衝液中、0.5x106〜1x106細胞/mlの濃度の懸濁液中で、トリプシン処理（tripsinated）し、もとに戻した。
【０１２５】
次いで、EGFPの発現を検出するために、FACSCalibur（登録商標）装置（BECKTON）を用いて、得られた懸濁液を488 nmのフローサイトメトリで分析した。
【０１２６】
図２のＡは、転写24、48及び72時間後の、Huh（斜線）、Huh7/NS3-5B（黒色）及びHuh7/Rep5.1（灰色、3参照）のトランスフェクト細胞の蛍光パーセンテージを示す。
【０１２７】
図２のＢは、HuhとHuh7/NS3-5B（黒色）トランスフェクト細胞の蛍光比、及びHuhとHuh7/Rep5.1（灰色、3参照）トランスフェクト細胞の蛍光比に相当する蛍光指標を示す。
【０１２８】
この結果は、ハイグロマイシン耐性を示す細胞のパーセンテージが、EGFPを発現する細胞のパーセンテージと相関し（図２のＡ及びＢ）、前記パーセンテージは、培養月数に伴って増加する、ことを示している。
【０１２９】
結論として、Huh7-NS3-5B細胞株の細胞は、NS3-5Bポリタンパク質を構成的に発現し、ミニ-ゲノムの複製のための効果的な複製複合体の産生を許容する。
【０１３０】
３）感染細胞株におけるHCVから得られる負の極性の最小ゲノムRNAの複製能力
感染細胞における複製を研究するために現在使用されている試験モデルは、レプリコンの試験モデルである。この分析との関連で、我々は、遺伝子型1bのHCVのレプリコンRep5.1を発現するHuh7細胞株由来の細胞を使用した（Huh7/Rep5.1; Kreiger et al., J Virol, vol 75, p: 4614-4624）。
【０１３１】
Huh7/Rep5.1及びHuh7細胞は、2-2に記載のプロトコールに従って、1μgの正の極性の5UTR-H2AE-3UTR転写物によってトランスフェクトした。
【０１３２】
EGFPタンパク質の発現は、フローサイトメトリによって24、48及び72時間後に分析した（図２のＡ）。翻訳効率の変化を考慮するために、EGFPタンパク質の発現は、Huh7細胞の発現レベルに関して、Huh7/Rep5.1細胞によるEGFPの発現パーセンテージとして示す。
【０１３３】
この結果は、培養48時間後にEGFPタンパク質の産生が減少することを示している（図２のＡ）。このことは、該細胞による転写物の分解を示唆している。しかしながら、この減少は、Huh7細胞に比較して、Huh7/Rep5.1細胞及びHuh7/NS3-5B細胞の場合には低く、このことは、HCVの複製複合体によるRNAの複製を示唆している。
【０１３４】
Huh7/Rep5.1又はHuh7/NS3-5B細胞におけるEGFPの発現レベルに関して得られた結果を、Huh7細胞で得られたEDFPの発現レベルに関して標準化した（100%；図２のＢ）。100%より高い値は、Huh7細胞で観察された分解が、Huh7/Rep5.1及びHuh7/NS3-5B細胞において最小ゲノムRNAの複製によって補償され、このことは、レプリコンから生じる複製複合体が効果的に機能していることを示唆している、ことを示している。この結果はまた、EGFPの発現レベルがレプリコンを発現する細胞において206から238%まで最初の3日間に減少するが、Huh7/NS3-5B細胞においては、発現レベルが、最初の2日間で123から203%まで増加し、次いで3日目に減少する、ことを示している。
【０１３５】
Huh7/Rep5.1細胞は、Huh7/NS3-5B細胞とは異なり、淘汰圧の下で培養されるので、これらの2つの細胞株間のEGFPの発現の差は、おそらく、事前の淘汰圧の非存在下で、より少ないHuh7/NS3-5B細胞の細胞許容性を反映している。
【０１３６】
結論として、この結果は、遺伝子型1bのHCVの複製複合体を発現する、試験した2つの細胞株、Huh7/Rep5.1細胞及びHuh7/NS3-5B細胞において、最小ゲノムRNAが効果的に複製することを示している。
【０１３７】
４）最小ゲノムRNAに対応する自殺ベクターの効力の評価
上記の実験は、HCV由来の負の極性ゲノムRNAが、レプリコンを宿している（hosting）細胞において複製することができたことを示している。HCVによって感染された細胞を破壊する、このような負の極性ゲノムRNAの能力を試験するために、既に述べたように、転移遺伝子が、EGFPに対応するのではなく、HCVの5'UTR及び3'UTR領域によってフレームされたリシンのA鎖をコードする遺伝子に対応するように、キメラゲノムRNAを構築した（5UTR-Ric-3UTR）。
【０１３８】
リシンのA鎖の遺伝子は、HCVによって感染された標的細胞の真核生物リボゾームに対するその高い毒性に基づいて自殺遺伝子として選択され（Eiklid et al., Exp Cell Res, vol 126(2), p: 321-6, 1981; Olsnes and Kozlov, toxicon, vol 39 (11), p: 1723-1728, 2001）、B鎖の非存在下ではその非-拡散性のために、HCVの複製複合体を発現しない健康な周辺細胞を維持する。
【０１３９】
4.1：HCV由来の負の極性の最小ゲノムRNAに対応する自殺ベクターの構築：
ベクタープラスミドpGEM-T/5UTR-Ric-3UTRは以下のように構築した：
・リシンのA鎖をコードする遺伝子は、プライマー：Ric＿開始（配列番号21：CACACAGGATCCATATTTCCCAAACAATACCCAATC）及びRic＿停止（配列番号22：ATATATTCTAGATTACTAAAACTGTGAGCTCGG）を用いてPCR増幅によって得た。
・リシンのA鎖をコードする遺伝子は、EGFPの遺伝子を、リシンのA鎖をコードする遺伝子及び部位BamHIとXbaIと交換することによってプラスミドpGEM-T/5UTR-EFFP-3UTRに導入し、プラスミドpGEM-T/5UTR-Ric-3UTRを作製した（図１のＣ）。転写に必要なファージT7のプロモーターは、PCRによって導入した。(+)鎖を転写するために、プライマーT7-5UTR（配列番号17）及び3UTR-停止（配列番号18）を使用した。(-)鎖を転写するために、プライマーT7-3UTR（配列番号19）及び5UTR-開始（配列番号20）を使用した。
【０１４０】
最後に、製造者の教示に従って、負の極性の最少ゲノムRNAは、T7ポリメラーゼ（AMBION）を用いて1μgのPCR産物の転写によって得た。
【０１４１】
得られた負の極性の最少ゲノムRNAは、HCV（3'UTR）の非-コーディング領域3'、リシンA配列、カプシドタンパク質をコードする配列の最初の27ヌクレオチド、及び最後にHCVの非-コーディング領域5'の相補的配列によって、5'末端から3'末端まで形成される。
【０１４２】
正の極性の最少ゲノムRNAは、製造者の教示に従って、同一のプロトコール及びT3ポリメラーゼ（AMBION）によるin vitro転写に従っても作製した。
【０１４３】
図３は、クローニング部位（太字及び斜体）及び5'UTR（上）領域と3'UTR（下）領域によってフレームされたリシンA-鎖配列（下線）を有する、正の極性ゲノムRNAの配列を示す。
【０１４４】
4.2：Huh7/Rep5.1（感染細胞のためのモデル）及びHuh7/NS3-5B細胞株にける自殺ベクターの複製：
Huh7/Rep5.1及びHuh7/NS3-5B細胞は、2-2に記載されてプロトコールに従って、4-1で得られた負の極性の最少ゲノムRNAによってトランスフェクトした。
【０１４５】
対照として、Huh7細胞を、同一のプロトコールの従って、4-1で得られた負の極性の最少ゲノムRNAによってトランスフェクトした。
【０１４６】
また、対照として、4-1で得られた正の極性の最少ゲノムRNAを用いて同一のトランスフェクション実験を行った。
【０１４７】
前記の負の極性の最少ゲノムRNAが正の極性鎖におけるC型肝炎のRNA-依存型RNAポリメラーゼによって複製されることになる場合には、リシン（A鎖の産生）は、HCVの5'UTR領域内に存在しかつ正の極性鎖に存在するIRES配列によって得た。
【０１４８】
図４は、負の極性（黒色）又は正の極性（灰色）の最少ゲノムRNAによってHuh7、Huh7/Rep5.1又はHuh7/NS3-5B細胞の転写後48時間の毒性を示した。
【０１４９】
この結果は、前記負の極性の最少ゲノムRNAのトランスフェクションがHuh7/Rep5.1細胞の細胞死（38%）及びHuh7/NS3-5B細胞の細胞死（36%）を引き起こし、一方Huh7は、前記負の極性の最少ゲノムRNAによってわずかに細胞死が引き起こされた（4%が死細胞である）（図４）、ことを示す。
【０１５０】
図５は、正の極性の最少ゲノムRNAの細胞毒性パーセンテージをトランスフェクション対照（100%）とした、負の極性の最少ゲノムRNAの細胞毒性パーセンテージの標準化に対応する。
【０１５１】
その結果の標準化は、負の極性の最少ゲノムRNAがトランスフェクトされたHuh7/Rep5.1細胞の59%の細胞死及びトランスフェクトされたHuh7/NS3-5B細胞の54%の細胞死を起こすが、感染されたHuh7細胞の9%のみが細胞死を起こす、ことを示している（図５）。
【０１５２】
結論として、この結果は、HCV由来であって負の極性のRNA分子に対応する開発された自殺ベクターが、遺伝型1bのHCVの複製複合体を発現する細胞を標的化し及び破壊するために有効である、ことを示している。
【０１５３】
発明者らはまた、開発された同一の自殺ベクターが、遺伝子型2aのHCVウイルスによって感染されたHuh7細胞を標的化及び破壊する（90%に近い）ために有効である、ことを示すことができた（JFH-1, Zhong et al., Proc Natl Acad Sci, USA, vol 102(26), p: 9294-9, 2005）。
【０１５４】
５）最小ゲノムRNAに対応する抗ウイルス細胞応答を刺激するベクターの効力の評価
かかる負の極性ゲノムRNAの抗ウイルス応答を誘導する能力を試験するために、転移遺伝子が、HCVの5'UTR及び3'UTR領域（5UTR-Ric-3UTR）によって、インテーフェロンα（IFN-α）又は制御因子インテーフェロン（IRF-1）のいずれかをコードする遺伝子に対応するキメラゲノムRNAを、先に記載されたように構築した。
【０１５５】
5-1：HCV由来の負の極性の最少ゲノムRNAに対応するベクターの構築：
ベクタープラスミドpGEM-T/5UTR-IFN-3UTR及びpGEM-T/5UTR-IRF1-3UTRを以下のように構築した：
プライマー：IFN-Bam（配列番号23：ATATATGGATCCGCCCTGTCCTTTTCTTTACTGATGG）及びIRF1-Xba（配列番号24：ATATATTCTAGATCAATCCTTCCTCCTTAATATTTTTTGC）を用いてPCR増幅によってIFN-αをコードする遺伝子を得た。
【０１５６】
・IRF-1をコードする遺伝子を、プライマー：IRF1-Bam（配列番号25：ATATATGGATCCCCCATCACTCGGATGCGCATG）及びIRF1-Xba（配列番号26：ATATATTCTAGACTACGGTGCACAGGGAATGGC）を用いてPCR増幅によって得た。
【０１５７】
・IFN-α及びIRF-1をコードする遺伝子をプラスミドpGEM-T/5UTR-EGFP-3UTRの部位BamHI及びXbaIに導入して、プラスミドpGEM-T/5UTR-IFNα-3UTR及びpGEM-T/5UTR-IRF1-3UTRを作製した。転写に必要なT7ファージのプロモーターは、PCRによって導入した。(+)鎖を転写するために、プライマーT7-5UTR（配列番号17）及び3UTR-停止（配列番号18）を使用した。(-)鎖を転写するために、プライマーT7-3UTR（配列番号19）及び5UTR-開始（配列番号20）を使用した。
【０１５８】
最後に、製造者の教示に従って、負の極性の最少ゲノムRNAは、T7ポリメラーゼ（AMBION）を用いて1μgのPCR産物の転写によって得た。
【０１５９】
得られた負の極性の最少ゲノムRNAは、HCV（3'UTR）の非-コーディング領域3'、IFN-α又はIRF-1の配列、カプシドタンパク質をコードする配列の最初の27ヌクレオチド、及び最後にHCVの非-コーディング領域5'の相補的配列によって、5'末端から3'末端まで形成される。
【０１６０】
正の極性の最少ゲノムRNAは、製造者の教示に従って、同一のプロトコール及びT3ポリメラーゼ（AMBION）によるin vitro転写に従っても作製した。
【０１６１】
5-2：Huh7/Rep5.1（感染細胞のためのモデル）における抗ウイルス細胞応答を刺激するベクターの複製：
Huh7/Rep5.1及びHuh7/NS3-5B細胞は、2-2に記載されてプロトコールに従って、4-1で得られた負の極性の最少ゲノムRNAによってトランスフェクトした。
【０１６２】
対照として、Huh7細胞を、同一のプロトコールの従って、4-1で得られた負の極性の最少ゲノムRNAによってトランスフェクトした。
【０１６３】
また、対照として、4-1で得られた正の極性の最少ゲノムRNAを用いて同一のトランスフェクション実験を行った。
【０１６４】
前記の負の極性の最少ゲノムRNAが正の極性鎖としてC型肝炎ウイルスのRNA-依存型RNAポリメラーゼによって複製される場合には、IFN-α又はIRF-1の産生は、HCVの5'UTR領域内に存在しかつ正の極性鎖に存在するIRES配列によって得られるだろう。
【０１６５】
図６は、Rep5.1レプリコンに対するミニ-ゲノムIFN及びTRFの効果を示す。Huh7/Rep5.1細胞は、IFN-α又はIRF-1を発現する正の極性(+)又は負の極性(-)の最少ゲノムRNAによってトランスフェクトされた。
【０１６６】
図６のＡは、培養48時間後の総RNAのμg当たりについてリアルタイムで報告された定量的RT-PCRによって測定されたレプリコンのRNAコピー数を示している。最少ゲノムRNAの5UTR-EGFP-3UTRは、対照としてトランスフェクトされた。100 UIのIFN-αを、陽性対照として細胞培養（IFN 100 UI）に加えた。
【０１６７】
図６のＢは、最少ゲノムRNAの5UTR-EGFP-3UTRを複製対照として採用することによって計算された、Rep5.1レプリコンの複製の阻害パーセンテージを示している。
【０１６８】
この結果は、前記負の極性の最少ゲノムRNAが、レプリコンのゲノムRNAのコピー数を、IFN-αを発現する(+)RNAについては86%、IFN-αを発現する(-)RNAについては62%、IRF-1を発現する(+)RNAについては83%、及びIRF-1を発現する(-)RNAについては60%減少させる（図６のＢ）、ことを示している。
【０１６９】
結論として、こ結果は、HCV由来のRNAの分子又は負の極性の分子に相当する抗ウイルス細胞応答を刺激するベクターが、HCVの複製複合体を発現する細胞を標的し、及びレプリコンのゲノムRNA数を減少させるために有効である、ことを示している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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