(57)【要約】  ヒドラジドチオール・リンカーを使用して２つの分子のコンジュゲートを作成する方法が開示される。特定の作業実施態様では、Ｆｃ特異的抗体−酵素コンジュゲートが、本方法を使用して作成され、そして免疫組織化学的およびインサイチューハイブリダイゼーションアッセイにおいて先例のない染色感度および特異性を提供することが例証された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒドラジドチオール・リンカーをヒドラジド反応性基を有する第１の分子と反応させて、チオール化された第１の分子を形成する工程であって、かつ、ヒドラジドチオール・リンカーと第１の分子との反応、ヒドラジドチオール・リンカーのチオール基が、実質的に、その中性酸形態において存在する条件下で反応させることを含む、工程；および
チオール化された第１の分子を第２の分子、チオール反応性基を有する第２の分子と反応させて、コンジュゲートを形成する工程：
を含んでなる、２種以上の分子のコンジュゲートを形成する方法。
【請求項２】
第１の分子が特異的結合分子を含み、そして第２の分子が検出可能な標識を含む、請求項１の方法。
【請求項３】
ヒドラジドチオール・リンカー化合物のチオール基が、実質的に、その中性酸形態において存在する条件下での反応が、約７未満のｐＨにおける反応を含む、請求項１の方法。
【請求項４】
ヒドラジドチオール・リンカー化合物のチオール基が、実質的に、その中性酸形態において存在する条件下での反応が、約ｐＨ＝３〜約ｐＨ＝７における反応を含む、請求項１の方法。
【請求項５】
ヒドラジドチオール・リンカー化合物のチオール基が、実質的に、その中性酸形態において存在する条件下での反応が、約ｐＨ＝４〜約ｐＨ＝６における反応を含む、請求項１の方法。
【請求項６】
第１の分子のヒドラジド反応性基がアルデヒド基を含む、請求項１の方法。
【請求項７】
第１の分子がグリコシル化された分子を含み、そしてアルデヒド基が、第１の分子のグリコシル化部分の酸化によって第１の分子に導入される、請求項６の方法。
【請求項８】
グリコシル化された分子が抗体を含み、そしてアルデヒド基が抗体のＦｃ部に導入される、請求項７の方法。
【請求項９】
第２の分子のチオール反応性基が第２の分子に導入されたマレイミド基を含む、請求項１の方法。
【請求項１０】
第２の分子に導入されたマレイミド基が、ＮＨＳ−ＰＥＧ−マレイミド・リンカーを使用して導入される、請求項９の方法。
【請求項１１】
第２の分子が検出可能な標識を含む、請求項９の方法。
【請求項１２】
ヒドラジドチオール・リンカー化合物が、１種以上のＭＢＨ、ＭＢＣＨ、ＭＡＭＢＨ、ＴＨＭＢＨ、ＢＴＡＬ、ＢＴＨＬ、ＴＡＧＤ、ＴＨＧＤ、ＰＥＧに基づくヒドラジドチオール・リンカー、多官能性ヒドラジドチオール・リンカー、ＰＥＧに基づく多官能性ヒドラジドチオール・リンカーおよびポリアクリルアミドヒドラジド・リンカーである、請求項１の方法。
【請求項１３】
ヒドラジドチオール・リンカー化合物が、１種以上のＭＢＨ、ＭＢＣＨまたはメルカプト−ｄＰＥＧ−ヒドラジド・リンカーである、請求項１２の方法。
【請求項１４】
ヒドラジドチオール・リンカー化合物が、式：
【化１】
2009521405.tif 000034
［式中、ｎ＝１，２または３；そしてＲ１は、Ｈ、−ＣＯＮＨＮＨ２または−ＣＯ−Ａ−ＣＯＮＨＮＨ２であり、ここで、Ａは、１〜１００個の炭素原子を有する二価の基である］を有する、請求項１の方法。
【請求項１５】
ヒドラジドチオール・リンカー化合物が、式：
【化２】
2009521405.tif 000035
［式中、ｍ＝２〜５０、Ｒ２は、Ｈ、−ＣＯＮＨＮＨ２または−ＣＯ−Ａ−ＣＯＮＨＮＨ２であり、ここで、Ａは、１〜１００個の炭素原子を有する二価の基であり、そしてＸおよびＹは、独立して、結合、または１〜２０個の炭素を有する二価の基である］
を有する、請求項１の方法。
【請求項１６】
請求項１の方法にしたがって製造されるコンジュゲート。
【請求項１７】
ヒドラジドチオール・リンカーが、１種以上のＭＢＨ、ＭＢＣＨ、ＭＡＭＢＨ、ＴＨＭＢＨ、ＢＴＡＬ、ＢＴＨＬ、ＴＡＧＤ、ＴＨＧＤ、ＰＥＧに基づくヒドラジドチオール・リンカー、多官能性ヒドラジドチオール・リンカー、ＰＥＧに基づく多官能性ヒドラジドチオール・リンカーおよびポリアクリルアミドヒドラジド・リンカーであり、リンカーのヒドラジド基が抗体のＦｃ部に共有結合される、ヒドラジドチオール・リンカーを介して検出可能な標識に共有結合された抗体を含んでなるコンジュゲート。
【請求項１８】
ヒドラジドチオール・リンカーが、ＰＥＧに基づくヒドラジドチオール・リンカーを含む、請求項１７のコンジュゲート。
【請求項１９】
ＰＥＧに基づくヒドラジドチオール・リンカーが、メルカプト−ｄＰＥＧ−ヒドラジド・リンカーを含む、請求項１８のコンジュゲート。
【請求項２０】
ヒドラジドチオール・リンカーが、ＭＢＨまたはＭＢＣＨを含む、請求項１７のコンジュゲート。
【請求項２１】
検出可能な標識が、酵素、蛍光分子、ハプテンまたは蛍光ナノ粒子を含む、請求項１７のコンジュゲート。
【請求項２２】
検出可能な標識が酵素を含む、請求項２１のコンジュゲート。
【請求項２３】
検出可能な標識が、アルカリホスファターゼおよびセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼからなる群から選ばれる酵素を含む、請求項２２のコンジュゲート。
【請求項２４】
検出可能な標識がアルカリホスファターゼを含む、請求項２３のコンジュゲート。
【請求項２５】
アルカリホスファターゼが、架橋されたアルカリホスファターゼを含む、請求項２４のコンジュゲート。
【請求項２６】
抗体が抗ハプテン抗体を含む、請求項１７のコンジュゲート。
【請求項２７】
抗体が抗抗体抗体を含む、請求項１７のコンジュゲート。
【請求項２８】
式：
【化３】
2009521405.tif 000036
［式中、Ｒ１は、Ｈまたは−ＣＯＮＨＮＨ２であり、そしてｎ＝１，２または３である］
を有する、ヒドラジドチオール・リンカー。
【請求項２９】
式：
【化４】
2009521405.tif 000037
［式中、Ｒ１は、Ｈまたは−ＣＯＮＨＮＨ２であり、そしてｎ＝１，２または３である］
を有するヒドラジドチオール・リンカー；および
請求項１の方法を実施するための説明書；
を含んでなるキット。
【請求項３０】
式：
Ｈ２Ｎ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｔ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＨ
［式中、ｔ＝２〜５０］
を有するヒドラジドチオール・リンカー；および
請求項１の方法を実施するための説明書；
を含んでなるキット。
【発明の詳細な説明】
【関連出願データ】
【０００１】
本出願は、２００５年１１月２３日提出の米国暫定特許出願第６０／７３９，７９４号の利益を請求するものであり、この出願は引用によって本明細書に組み入れられている。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、分子コンジュゲート（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、そのようなコンジュゲートを作成するためのリンカー、コンジュゲートおよびリンカーの作成方法、ならびにコンジュゲートを使用する方法に関する。より具体的には、本発明は、Ｆｃ特異的抗体コンジュゲート、Ｆｃ特異的コンジュゲートを作成するためのヒドラジドチオール・リンカー、Ｆｃ特異的コンジュゲートを作成する方法、ならびにＦｃ特異的抗体コンジュゲートを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
分子を一緒に結合してコンジュゲートを形成するために広範な種類の方法が開発されている。特に興味があるのは生物分子コンジュゲートであって、これは、典型的には、結合される分子の官能基を組み合わせて１つの構築物になるように作成される。生物分子コンジュゲートの１つのタイプは、その他の分子に特異的に結合する生物分子（例えば核酸、抗体、レクチンまたはアビジン）と、検出可能な標識（例えば蛍光標識、蛍光ナノ粒子または酵素）とを組み合わせる。
【０００４】
抗体と検出可能な標識のコンジュゲート（抗体コンジュゲート）は、生物学的サンプルにおける特異的な標的分子を検出するためのイムノアッセイにおいて使用することができる。そのようなコンジュゲートの抗体部分は、サンプル中の標的に特異的に結合し、そして検出可能な標識が利用されて、標的の存在および／または位置を指示する検出可能なシグナルを提供する。特に免疫組織化学的分析のために、広く使用されるようになったコンジュゲートの１つのタイプは、抗体と酵素のコンジュゲート（抗体−酵素コンジュゲート）である。検出可能なシグナルは、抗体部分がその標的に結合される部位において、抗体−酵素コンジュゲートの酵素部分が基質を検出可能な生産物（例えば着色、異なる着色または蛍光生産物）に変換する条件下で、サンプルに基質を添加することによって生成される。
【０００５】
抗体コンジュゲートは、典型的には、反応性基の一方が抗体における官能基と反応され、そして反応性基の他方が検出可能な標識における官能基と反応される、少なくとも２つの反応性基を有することを特徴とするカップリング試薬を使用して作成される。しかしながら、カップリングは、抗体および検出可能な標識の一方または両方の失活をもたらすことがある。特に、カップリングは、立体効果によるか、あるいはカップリング試薬が、特異性および／または触媒活性のために決定的である抗体および／または酵素の部分に置かれる官能基と反応するので、抗体−酵素コンジュゲートを脱活性化（ｄｅａｃｔｉｖａｔｅ）することがある。さらにまた、若干のカップリングスキームは、水溶解度を低下したコンジュゲートをもたらす。
【０００６】
抗体の特異性および／または酵素の活性の損傷の低い抗体−酵素コンジュゲートを提供できるカップリングスキームが所望され、そして免疫化学的アッセイ、例えば免疫組織化学的アッセイにおいて達せられる感度をより大きくさせる。より大きな感度は、さらなる増幅段階が望ましくない自動工程のためには特に重要である。
【発明の開示】
【０００７】
概要
ヒドラジドチオール・リンカーを含む分子コンジュゲートが開示される。１つの態様では、抗体のＦｃ部分に共有結合されたヒドラジドチオール・リンカーを含む抗体−検出可能な標識コンジュゲートが提供される。この態様のＦｃ特異的コンジュゲートは改良された検出感度を提供し、それによって、標的分子の免疫組織化学的検出を、自動化および大量迅速処理用途に一層適合させる。
【０００８】
また、ヒドラジドチオール・リンカーを使用してコンジュゲートを作成する方法が開示される。１つの態様では、チオール基が実質的にその中性酸形態において存在し、したがって実質的に不反応性である条件下でリンカーが第１の分子と反応されるので、リンカーのチオール基の保護基は必要とされない。そのような条件下では、共有結合は、リンカー化合物のヒドラジド基と第１の分子との間で形成することができ、その間、第２の分子のチオール反応性基との続く反応のためのチオール基を実質的に維持している。
【０００９】
ヒドラジドチオール・リンカーおよびヒドラジドチオール・リンカーを作成する方法がまた開示される。さらに、開示されたコンジュゲートを使用して、組織切片または細胞学的サンプルのようなサンプルにおける標的分子を検出する方法が記述される。標的分子を検出する方法は、開示されたコンジュゲートによって示される改善された感度によって容易に自動化することができる。ある種の実施態様では、開示されたコンジュゲートを使用する多重送信（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ）アッセイ、例えば、検出可能な標識として蛍光分子または蛍光ナノ粒子を有する開示された抗体コンジュゲートを用いる多重送信アッセイが提供される。
【００１０】
図面の簡単な説明
図１は、開示されたＦｃ特異的抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲートおよびストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートを用いる扁桃組織におけるＫａｐｐａの検出のための染色パターンを示す一連の画像である。
図２は、開示されたＦｃ特異的抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲートおよびストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートを用いる扁桃組織におけるＬａｍｂｄａの検出のための染色パターンを示す一連の画像である。
図３は、開示されたＦｃ特異的抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲートおよびストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートを用いる肺組織におけるＣＭＶの検出のための染色パターンを示す一連の画像である。
図４は、開示されたＦｃ特異的抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲートおよびストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートを用いる脾臓組織におけるＥＢＥＲの検出のための染色パターンを示す一連の画像である。
図５は、開示されたＦｃ特異的抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲートおよびストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートを用いるＣａＳｋｉ異種移植組織におけるＨＰＶの検出のための染色パターンを示す一連の画像である。
図６は、開示されたＦｃ特異的抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲートおよびストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートを用いるＨｅＬａ異種移植組織におけるＨＰＶの検出のための染色パターンを示す一連の画像である。
図７は、開示されたＦｃ特異的抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲートおよびストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートを用いるＳｉＨａ異種移植組織におけるＨＰＶの検出のための染色パターンを示す一連の画像である。
図８は、開示されたＦｃ特異的抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲートおよびストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートを用いる細胞学的サンプルにおけるＨＰＶの検出のための染色パターンを示す一連の画像である。
図９は、開示されたＦｃ特異的抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲートおよびストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートを用いる筋肉組織におけるアクチンの検出のための染色パターンを示す一連の画像である。
図１０は、開示された抗体−酵素コンジュゲートの感度の相互の比較、および開示された抗体−酵素コンジュゲートの感度と他の方法によって作成された抗体−体（ｂｏｄｙ）酵素コンジュゲートの感度との比較を示す一連の画像である。
【００１１】
いくつかの具体的に説明する実施態様の詳細な記述
本発明のさらなる態様は、次の限定されるものではない記述および実施例によって具体的に説明され、これらは以下の略語および用語に関して進行する。
【００１２】
Ｉ．略語
Ａｂ  −  抗体
（Ａｂ−ＡＰ）  −  抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲート
ＡＰ  −  アルカリホスファターゼ
ＢＳＡ  −  ウシ血清アルブミン
ＣＭＶ  −  サイトメガロウイルス
ＥＢＥＲ  −  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス初期ＲＮＡ
ＤＬ  −  検出可能な標識
Ｆｃ  −  結晶化可能なフラグメント
ＨＲＰ  −  セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ
ＩＨＣ  −  免疫組織化学
ＩＳＨ  −  インサイチュー・ハイブリダイゼーション
ＭＡＬ  −  マレイミド
ＭＢＣＨ  −  メルカプト酪酸カルボヒドラジド
ＭＢＨ  −  メルカプト酪酸ヒドラジド
ＮＨＳ  −  Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド
ＰＥＧ  −  ポリエチレングリコール
ＳＢＭ  −  特異的結合分子
【００１３】
ＩＩ．用語
用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文章が明白に他に指示しない限り、単数および複数の両指示語を含む。
【００１４】
本明細書で使用されるように、用語「アミノ化」はアルデヒドまたはケトンのカルボニル基とアミン基との反応を指し、ここで、アミンまたはヒドラジドのようなアミン含有化合物はアルデヒドまたはケトンと反応して最初にＳｈｉｆｆ塩基を形成し、これが次に、より安定な形態物に可逆的に転位されてもよく、あるいは場合によっては反応の反転を防ぐために還元されてもよい。「還元的アミノ化」条件は、還元剤の添加、より典型的には温和な還元剤、例えばシアノホウ水素化（ｃｙａｎｏｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）ナトリウム、またはそのｃｏ−ｇｅｎｅｒｓの１種、例えばトリアセトキシホウ水素化ナトリウムの添加を含む。使用されてもよい他の温和な還元剤は種々のアミンボランを含む。
【００１５】
用語「抗体」は、集合的には、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様分子（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、ならびにいずれかの生物体、例えばヒト、ヤギ、ウサギおよびマウスのような哺乳動物における免疫応答の間に産生される類似の分子を含む）、またはそのフラグメントを指し、これらは、他の分子への結合を実質的に排除して標的（または高度に類似する標的群）に特異的に結合する。若干の実施態様では、抗体は、サンプル中の他の分子の結合定数よりも少なくとも１０３Ｍ−１高い、１０４Ｍ−１高いまたは１０５Ｍ−１高い結合定数により標的に特異的に結合する。他の実施態様では、抗体は、１０−６Ｍ以下、例えば１０−９Ｍ以下または実に１０−１２Ｍ以下の次数で存在する抗原決定基（例えばハプテンまたはエピトープ）に対する結合のＫｄ値を有する。Ｋｄ値は、例えば、競合的ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）によるか、またはＢｉａｃｏｒｅＴ１００（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪから得られる）のような表面プラズモン共鳴装置を使用して決定することができる。抗体フラグメントは、タンパク質分解抗体フラグメント［例えば、当該技術分野において既知であるＦ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントおよびＦａｂフラグメント］、組み換え抗体フラグメント（例えば、当該技術分野において既知であるｓＦｖフラグメント、ｄｓＦｖフラグメント、二重特異性ｓＦｖフラグメント、二重特異性ｄｓＦｖフラグメント、ｄｉａｂｏｄｙおよびｔｒｉａｂｏｄｙ）、およびｃａｍｅｌｉｄ抗体（参照、例えば、米国特許第６，０１５，６９５号；同第６，００５，０７９号；同第５，８７４，５４１号；同第５，８４０，５２６号；同第５，８００，９８８号および同第５，７５９，８０８号）を含む。抗体は、モノクローナルおよびポリクローナル両抗体調製物を含む。開示されるコンジュゲートの抗体は、いかなる特定の分子またはいかなる特定の高度に類似する分子群にも特異的に結合できるけれども、特定の実施態様では、本抗体は、抗ハプテン抗体（例えば、興味ある核酸配列に対向されるハプテン標識されたプローブ配列を検出するために使用できる）を含む。特定の実施態様では、抗体は、イムノアッセイにおいて２次抗体として使用できる抗−抗体抗体を含む。例えば、抗体は、抗ＩｇＧ抗体、例えば抗マウスＩｇＧ抗体、抗ウサギＩｇＧ抗体または抗ヤギＩｇＧ抗体を含んでもよい。
【００１６】
句「ヒドラジドチオール・リンカーのチオール基がその中性酸形態において実質的に存在する条件」は、リンカーのチオール基（−ＳＨ；プロトン付加された中性の酸形態物）の約１％未満がその共役塩基形態物（−Ｓ；プロトン未付加の、負電荷形態物）において存在するｐＨの条件のような、条件を指す。例えば、そのような条件下では、リンカーの約０．１％未満、約０．０１％未満またはわずか約０．００１％未満が共役塩基形態物において存在できる。ヒドラジドチオール・リンカー化合物のチオール基がその中性酸形態において実質的に存在する条件は、約７未満のｐＨ、例えば、約５．５未満のｐＨのような約６未満のｐＨを含む。特定の実施態様では、そのような条件は、ｐＨの範囲、例えば約３のｐＨ〜約７のｐＨ、約４のｐＨ〜約７のｐＨ、約４のｐＨ〜約６のｐＨ、約４．５のｐＨ〜約５．５のｐＨ、またはこれらの各範囲のすべてのサブ範囲を含む。他の実施態様では、特定のリンカーのチオール基がその中性酸形態（共役塩基形態物として存在しているチオール基の１％未満）において実質的に存在するｐＨ範囲の下限は、７以上、例えば８のｐＨであってもよい。当業者は、特定のチオール基がその中性酸形態において実質的に存在できるｐＨ範囲の上限を、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ−Ｈａｓｓｅｌｂａｃｈの式およびリンカーのチオール基のｐＫａ値を用いて容易に決定することができる。なおその他の実施態様では、特定のリンカーのチオール基は、正確なｐＨが決定できない溶媒系中で、その中性酸形態物において実質的に存在することができ、そして当業者は、水より低い極性である溶媒系が比較的高い見かけのｐＨにおいてその中性酸形態物でチオール基を保持するのを助けることを認識できる。特定の条件下で、リンカーのチオール基がその中性酸形態において実質的に存在するか否かの実験的決定は、チオールがその他の分子において存在するジスルフィド結合を還元できるか否かを決定することによって実施することができる。例えば、決定は、ｐＨの特定の条件（または非水性系のための推定ｐＨ）下のリンカーとの接触によってジスルフィドを有する分子（例えば免疫グロブリン）中に導入される遊離チオール基の数について（例えば、Ｅｌｌｍａｎ’ｓ試薬を使用して）実施できる。時期間（例えば１時間以上）にわたる過剰量のヒドラジドチオール・リンカー（例えば５０倍以上の過剰）付加に続いて、分子中に導入された遊離チオールの平均数の決定が実施できる。遊離チオールが相当な程度（例えば１免疫グロブリン分子当たり導入された平均２個超のチオール）まで生成される場合、それは、リンカーのチオールが試験された条件下でその中性酸形態においては実質的に存在しないことを示している。例えば、約７のｐＨでは、免疫グロブリンに対して１００倍過剰量のリンカーＭＢＨは、１免疫グロブリン分子当たり平均約２個のチオールを生成できる。より低いｐＨ５では、１０００倍過剰量のＭＢＨリンカーが、平均して、２４時間で１免疫グロブリン当たり実質的に１未満のチオールを生成できる。これらの結果は、リンカーＭＢＨでは、ｐＨが低下されるにつれて、中性酸形態とその共役塩基との間の平衡が中性酸形態へと一層シフトされるので、チオール基が、約７以下のｐＨでその中性酸形態において実質的に存在することを例証している。
【００１７】
「コンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」は、より大きな構築物になるように共有結合されている、２種以上の分子（および／またはナノ粒子のような材料）を指す。若干の実施態様では、コンジュゲートは、１種以上の他の分子、例えば１種以上の他の生物分子に共有結合される１種以上の生物分子（例えばペプチド、核酸、タンパク質、酵素、糖、多糖、脂質、糖タンパク質およびリポタンパク質）を含む。他の実施態様では、コンジュゲートは、１種以上の検出可能な標識（例えば蛍光分子、蛍光ナノ粒子、ハプテン、酵素およびそれらの組み合わせ物）に共有結合される１種以上の特異的結合分子（例えば抗体および核酸配列）を含む。
【００１８】
「検出可能な標識」は、サンプル中の標識の存在および／または濃度を指示する検出可能な（例えば可視的、電子的または他の方法で）シグナルを発生することができる分子または材料である。特異的結合分子に複合された場合、検出可能な標識は、特異的結合分子が対向される標的の位置を指示し、そして／またはそれを定量するために使用することができる。それによって、サンプル中の標的の存在および／または濃度が、検出可能な標識によって生成されるシグナルを検出することによって検出できる。検出可能な標識は、直接的または間接的に検出されてもよく、そして異なる特異的結合分子に複合されたいくつかの異なる検出可能な標識が、１種以上の標的の検出と組み合わせて使用することができる。例えば、第１の検出可能な標識、例えば標的に対して特異的な核酸プローブまたは抗体に複合されたハプテンは、第１の検出可能な標識を特異的に結合する分子に複合されている第２の検出可能な標識の使用をとおして間接的に検出することができる。別々に検出することができる多数の検出可能な標識が、サンプル中の多数の標的の同時検出を提供できる多重送信アッセイを提供するために、異なる標的を特異的に結合する異なる特異的結合分子に複合されてもよい。検出可能なシグナルは、光子（高周波、マイクロ波、赤外、可視光および紫外周波数を含む）の吸収、放出および／または散乱を含むすべての既知またはこれまでに発見されたメカニズムによって生成することができる。検出可能な標識は、着色、蛍光、リン光およびルミネセンス分子および材料、１つの物質をその他の物質に変換して（例えば無色物質を着色物質にまたはその逆に変換することによって、あるいは沈殿物を生成するか、またはサンプル濁度を増強することによって）検出可能な差異を提供する触媒（例えば酵素）、さらなる検出可能に標識された抗体コンジュゲートを用いる抗体−ハプテン結合相互作用をとおして検出できるハプテン、ならびに常磁性および磁性分子または材料を含む。検出可能な標識の特定の例は、酵素、例えばセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼまたはβ−ラクタマーゼ；蛍光分子、例えばフルオレセイン、クマリン、ＢＯＤＩＰＹ染料、レソルフィン（ｒｅｓｏｒｕｆｉｎｓ）およびローダミン（蛍光分子の多くのさらなる例は、Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ−Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲにおいて見出だすことができる）；ナノ粒子、例えば量子ドット（ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔｓ）（例えば、ＱｕａｎｔｕｍＤｏｔ  Ｃｏｒｐ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡから得られる；また参照、米国特許第６，８１５，０６４号、同第６，６８２，５９６号および同第６，６４９，１３８号、これらの各特許は、引用によって本明細書に組み入れられている）；金属キレート、例えばＧｄ３＋のような放射性または常磁性金属イオンのＤＯＴＡおよびＤＰＴＡキレート；ならび���リポソーム、例えば、捕捉された蛍光分子を含有するリポソーム；を含む。検出可能な標識が酵素を含む場合、検出可能な基質、例えば色原体、蛍光発生（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ）化合物、または発光性（ｌｕｍｉｎｏｇｅｎｉｃ）化合物が、検出可能なシグナルを生成する酵素と組み合わされて使用されてもよい（広範な種類のそのような化合物が、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅｕｇｅｎｅ  ＯＲから市販されている）。色原体化合物の特定の例は、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、リン酸４−ニトロフェニル（ｐＮＰＰ）、ｆａｓｔ  ｒｅｄ、リン酸ブロモクロロインドリル（ＢＣＩＰ），ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、ｆａｓｔ  ｒｅｄ、ＡＰ  Ｏｒａｎｇｅ、ＡＰ  ｂｌｕｅ、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、２，２’−アジノ−ジ−［３−エチルベンゾチアゾリンスルホネート］（ＡＢＴＳ）、ｏ−ジアニシジン、４−クロロナフトール（４−ＣＮ）、ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）、メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＭＵ−Ｇａｌ）、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＰＮＰ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、フクシン、ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）、テトラゾリウムブルーおよびテトラゾリウムバイオレットを含む。あるいはまた、酵素は、金属組織学的検出スキームにおいて使用することができる。金属組織学的検出法は、水溶性金属イオンおよび酵素のレドックス不活性（ｒｅｄｏｘ−ｉｎａｃｔｉｖｅ）基質と組み合わせて、アルカリホスファターゼのような酵素を使用することを含む。基質は、酵素によってレドックス活性（ｒｅｄｏｘ−ａｃｔｉｖｅ）作用物に変換され、そしてレドックス活性作用物は金属イオンを還元して、それが検出可能な沈殿物を形成するようにさせる。（参照、例えば、２００４年１２月２０日提出の同時係属出願米国特許第１１／０１５，６４６号、ＰＣＴ公開２００５／００３７７７および米国特許公開第２００４／０２６５９２２号；これらの各々は、引用によって本明細書に組み入れられている）。金属組織学的検出法は、水溶性金属イオン、酸化剤および還元剤とともにオキシドレダクターゼ酵素（例えばセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ）を用いて、再び検出可能な沈殿物を形成させることを含む。（参照、例えば、引用によって本明細書に組み入れられている米国特許第６，６７０，１１３号）。ハプテンは、抗体によって特異的に結合される小分子であるが、それ自体では、それらは動物における免疫応答を惹起できず、そして最初に比較的大きい担体分子、例えばタンパク質またはポリ核酸に結合されて免疫応答を生成しなければばらない。ハプテンの例は、ジ−ニトロフェノール、ビオチン、ジゴキシゲニンおよびフルオレセインを含む。オキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ニトロアリール、ベンゾフラン、トリペルペン、尿素、チオ尿素、ロテノイド、クマリンおよびシクロリグナンハプテンのさらなる例が、２００６年１１月１日提出の同時係属米国暫定特許出願第６０／８５６１３３号において開示されており、これは引用によって本明細書に組み入れられている。
【００１９】
本明細書で使用されるような用語「Ｆｃ−特異的コンジュゲート」は、免疫グロブリン（またはそのフラグメント）のコンジュゲートを指し、これには、第２の分子（例えば検出可能な標識）が免疫グロブリンのグリコシル化部分（またはグリコシル化部分を保持する免疫グロブリンのフラグメント）に共有結合されている。免疫グロブリンのグリコシル化部分はＦｃ部に見出だされ、これは免疫グロブリンの特異的結合活性に関与している免疫グロブリンの部分の外側の位置における免疫グロブリンの重鎖に置かれている免疫グロブリンの領域である。
【００２０】
用語「ヒドラジド基」は、ヒドラジド基（−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ２）；カルボヒドラジド基（−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ２）；セミカルバジド基（−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ２）；チオセミカルバジド基（−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−ＮＨ２）；チオカルバジド基（−ＮＨ−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−ＮＨ２）；炭酸ジヒドラジン基（−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ２）またはその硫黄含有誘導体；またはヒドラジンカルボキシレート基（−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ２）またはその硫黄含有誘導体を指す。
【００２１】
用語「ヒドラジド反応性基」は、ヒドラジド基と反応し、そしてヒドラジド基に対して共有結合を形成できる原子の１群を指す。アルデヒドおよびケトン基はヒドラジド反応性基の例である。ヒドラジド反応性基は、分子の固有部分であってもよく、または分子に導入されてもよい。多糖および糖タンパク質中にアルデヒド基（ヒドラジド反応性基）を導入する１つの方法は、近接ジオールの過ヨウ素酸媒介酸化のような酸化による方法である。さらに、不飽和脂肪酸およびセラミドにおける二重結合は、四酸化オスミウムによってジオールに転化され、次いで過ヨウ素酸塩によってアルデヒドに酸化することができる。さらにまた、ペプチドおよびタンパク質のＮ末端セリンおよびトレオニン残基は、過ヨウ素酸塩によってアルデヒド基に選択的に酸化されて、コルチコトロフィンおよびβ−ラクタマーゼのようなある種のタンパク質の選択的修飾を可能にする。過ヨウ素酸−酸化された抗体の修飾は典型的には抗体を不活性にしない。酸化反応において過ヨウ素酸ナトリウムの濃度を変えることは、修飾される糖残基の種類に関して若干の特異性を与える。例えば、０℃における１ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウムは、典型的には、シアル酸残基の炭素原子７、８および９の間の隣接ヒドロキシルにおいてのみ開裂させ、それによって与えられた多糖上に多くのアルデヒドを生成する。適当な一般的プロトコールは、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、”Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，”Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，１９９６，ＩＳＢＮ  ０−１２−３４２３３６−８によって記述されており、これは引用によって本明細書に組み入れられている。生物分子中にアルデヒドを導入するその他の方法は、特異的な糖オキシダーゼ、例えば、ガラクトースオキシダーゼの使用によるものであり、これは、特に糖タンパク質において、末端ガラクトース残基をアルデヒドに酸化する酵素である。ガラクトース残基がシアル酸残基に対して終わりから２番目にある場合、ノイラミニダーゼが使用されてシアル酸残基を除去し、そして末端残基としてガラクトースを露出することができる。ノイラミニダーゼと、ガラクトース残基を酸化するガラクトースオキシダーゼとの組み合わせ物を用いて反応性のアルデヒド基を提供するプロトコールは、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、”Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，”Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，１９９６，ＩＳＢＮ  ０−１２−３４２３３６−８において提供されており、これは引用によって本明細書に組み入れられている。また、アルデヒドは、分子のアミノ基をＮＨＳ−アルデヒド、例えばスクシンイミヂルｐ−ホルミルベンゾエート（ＳＦＢ）またはスクシンイミヂルｐ−ホルミルフェノキシアセテート（ＳＦＰＡ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）と反応させることによって分子に導入することができる。あるいはまた、ビス−アルデヒド化合物、例えばグルタルアルデヒドは、アミン基を改変するために使用されてアルデヒド基を提供することができる。また、適当なプロトコールは、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、”Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，”Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓ���，ＳａｎＤｉｅｇｏ，１９９６，ＩＳＢＮ  ０−１２−３４２３３６−８において提供されており、これは引用によって本明細書に組み入れられている。
【００２２】
用語「ヒドラジドチオール・リンカー」は、１個以上の連結原子を介して共有的に結合された１個以上のヒドラジド基と１個以上のチオール基（−ＳＨ）とを含む分子を指す。ヒドラジドチオール・リンカーのヒドラジド基とチオール基は、メチレン基（−ＣＨ２−）、分枝アルキレン基、さらなるヒドラジド基、芳香族基、ヘテロ芳香族基、脂環式基、ポリアルキレングリコール基（例えばエチレンオキシド基；−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−）、アミド基（−ＣＯＮＨ−）、アミン基（−ＮＨ−）、エーテル基（−Ｏ−）およびそれらの組み合わせ物を含む１個以上の種々の原子を介して結合されてもよい。「ＰＥＧに基づく（ＰＥＧ−ｂａｓｅｄ）ヒドラジドチオール・リンカー」は、その構造物の一部として１個以上のエチレングリコール基を含むリンカーを指す。「多官能性ヒドラジドチオール・リンカー」は、少なくとも１個のヒドラジド基、少なくとも１個のチオール基、および少なくとも１個のさらなる反応性基、例えばさらなるヒドラジド基、さらなるチオール基、または分子コンジュゲートを作成するために有用なすべての他の基を有する分枝リンカーを指す。若干の実施態様では、ＰＥＧに基づくヒドラジドチオール・リンカーは、別のＰＥＧ（ｄＰＥＧ）リンカーを含み、これは、米国特許出願公開第２００６００２０１３４号において開示されているようなｄＰＥＧ材料から作成されてもよく、そしてＱｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ（Ｐｏｗｅｌｌ，ＯＨ）から購入されてもよい。多官能性ヒドラジド−チオール・リンカーに含まれてもよいさらなる反応性基の例は、マレイミド基および活性エステル、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、およびヒドロキシ基（−ＯＨ）を含む。反応性基のさらなる例は、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、”Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，”Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，１９９６，ＩＳＢＮ  ０−１２−３４２３３６−８において見出だすことができ、これは引用によって本明細書に組み入れられている。
【００２３】
用語「サンプル」は、標的が存在してもよいすべての液状、半固形または固形物質（または材料）を指す。特に、サンプルは生物学的サンプルまたは生物学的材料から得られるサンプルであってもよい。生物学的サンプルの例は組織サンプルおよび細胞サンプルを含む。
【００２４】
用語「特異的結合分子」は、第２の分子に特異的に結合する分子を指す。「特異的に結合する」は、特異的結合分子が、サンプル中に存在する他の分子を実質的に排除して第２の分子に結合することを意味する（例えば、特異的結合分子の結合定数は、サンプル中の他の分子に対する結合定数を超えて少なくとも１０２Ｍ−１高い、１０３Ｍ−１高い、１０４Ｍ−１高いまたは１０５Ｍ−１高い）。特異的結合分子の例は、核酸、受容体、抗体、酵素、レクチンおよびアビジンを含む。特異的結合分子が関与できる特異的結合相互作用の例は、核酸配列の二重らせんおよび三重らせんの形成、受容体−リガンド相互作用（例えば、葉酸−葉酸受容体相互作用）、抗体−抗原相互作用、酵素−基質相互作用、レクチン−糖相互作用およびアビジン−ビオチン相互作用（例えばストレプトアビジン−ビオチン相互作用）を含む。
【００２５】
用語「標的」は、存在、位置および／または濃度が決定されているか、または決定することができるすべての分子を指す。標的分子の例は、タンパク質、核酸配列およびハプテン、例えば核酸配列またはタンパク質に共有結合されたハプテンを含む。標的分子は、典型的には、特異的結合分子および検出可能な標識の１種以上のコンジュゲートを使用して検出される。
【００２６】
用語「チオール反応性基」は、チオール基と反応し、それと共有結合を形成することができる原子を指す。チオール反応性基は、分子の固有部分であってもよく、または１種以上の他の分子との反応をとおして分子に導入されてもよい。チオール反応性基の例は、非重合性Ｍｉｃｈａｅｌアクセプター（ａｃｃｅｐｔｏｒ）、ハロアセチル基（例えばブロモアセチルおよびヨードアセチル基）、ハロゲン化アルキル、マレイミド、アジリジン、アクリロイル基、ビニルスルホン、ベンゾキノン、求核置換を受けることができる芳香族基、例えばフルオロベンゼン基（例えばテトラおよびペンタフルオロベンゼン基）、およびジスルフィド基、例えばピリジルジスルフィド基およびＥｌｌｍａｎ’ｓ試薬により活性化されるチオールを含む。これらの各基の種類のさらなる例は、当業者には明らかであろう。１種類の反応性基をその他と交換してチオール反応性基を付加するための反応条件および方法に関するさらなる例および情報は、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、”Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，”Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，１９９６，ＩＳＢＮ  ０−１２−３４２３３６−８において提供され、これは引用によって本明細書に組み入れられている。特定の実施態様では、ヘテロ二官能性（ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）リンカー分子が、分子に結合されてチオール反応性基が導入される。例えば、マレイミド基およびヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基を有するリンカーは、ＮＨＳ基を介して分子のアミン基に結合することができ、それによって、その他の分子上のチオール基と反応されて、コンジュゲートを形成することができるチオール反応性マレイミド基をもつ分子（例えば、ヒドラジドチオール・リンカーおよび開示される方法を用いて導入されるもの）を提供する。
【００２７】
ＩＩＩ．概観
当業者は、開示された方法が、ヒドラジドチオール・リンカーと反応することができる官能基を有する分子のすべての組み合わせ物を結合するために使用できることを認識できる。次に示す限定されるものではない記述は、抗体コンジュゲート、より具体的には抗体−酵素コンジュゲートに焦点を合わせるが、本発明の範囲を限定するものと考えるべきではない。具体的に開示されるコンジュゲートは抗体−酵素コンジュゲートであるけれども、他の生物分子（例えば核酸配列）と他の検出可能な標識（例えば、ハプテン、蛍光標識、蛍光ナノ粒子および蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質）との間のコンジュゲートも意図されており、そして本発明の範囲内に入る。
【００２８】
したがって、１つの態様では、方法は、２種以上の分子のコンジュゲートを形成するために開示される。この方法は、ヒドラジドチオール・リンカーをヒドラジド反応性基（例えばアルデヒド）を有する第１の分子（例えば抗体）と反応させて、チオール化された第１の分子を形成することを含む。反応は、ヒドラジドチオール・リンカーのチオール基が、実質的に、その中性酸（プロトン付加された）形態において存在する条件下で実施される。チオール化された第１の分子は、次に、チオール反応性基（例えば、第２の分子に導入されるマレイミド基）を有する第２の分子と反応されて、コンジュゲートを形成することができる。特定の実施態様では、第１の分子のリンカーとの反応は、約ｐＨ＝４〜約ｐＨ＝７のｐＨにおいて実施される。他の特定の実施態様では、ヒドラジドチオール・リンカーは、ＰＥＧに基づくヒドラジドチオール・リンカー、多官能性ヒドラジドチオール・リンカーまたはＰＥＧに基づく多官能性ヒドラジドチオール・リンカーであってもよい。
【００２９】
その他の実施態様では、方法は、特異的結合分子を検出可能な標識に共有結合するために使用されてもよい。より特定の実施態様では、方法は、グリコシル化部分を有する第１の分子をその他の分子に結合するために使用されてもよい。この実施態様では、グリコシル化部分は、最初に酸化されて、ヒドラジドチオール・リンカーと反応することができるアルデヒド基を生成する。なおより特定の実施態様では、グリコシル化された第１の分子は、グリコシル化Ｆｃ部を有する抗体であってもよい。Ｆｃ特異的チオール化抗体は、ヒドラジドチオール・リンカーとの反応によって形成され、そしてＦｃ特異的チオール化抗体は、チオール反応性基を有する検出可能な標識と反応することができる。
【００３０】
その他の態様では、同じものを作成するための種々のヒドラジドチオール・リンカーおよび方法は、次に示す合成の概観および特定の実施例において概説されるように提供される。さらなる態様は、開示されたリンカーにより作成されるコンジュゲートである。さらなる態様では、コンジュゲートを作成するために開示された方法を実施するための開示されたリンカーおよび方法を含むキットが開示される。また、開示されたコンジュゲートを用いてサンプル中の標識を検出するための方法が開示される。
【００３１】
ＩＶ．合成の概観
Ａ．ヒドラジドチオール・リンカーの作成
いかなるヒドラジドチオール・リンカーも、コンジュゲートを作成する開示された方法において使用されてもよいが、１つの実施態様では、ヒドラジドチオール・リンカーは、下記スキーム１にしたがって、チオールラクトンと、ヒドラジン、カルボヒドラジドまたはジヒドラジドとを反応させることによって提供されてもよい。式中、ｎ＝１、２または３、Ｒ１は、Ｈ、−ＣＯＮＨＮＨ２または−ＣＯ−Ａ−ＣＯＮＨＮＨ２であり、ここで、Ａは、１〜１００個の炭素原子を有する二価の基であり、これは、１個以上のヘテロ原子（例えば、Ｏ，ＮまたはＳ）によって中断されていてもよく、そして例えば、１個以上のアルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、アシル、カルボキシ、ハロゲン、スルホネート、オキソ、ホスホネートおよび／またはアミン基により置換されていてもよい。より特定の実施態様では、Ａは、１〜１０個のメチレン基（−ＣＨ２−）および／または１〜２４個のエチレンオキシド（−ＣＨ−ＣＨ２−Ｏ−）基からなる二価の基である。なおより特定の実施態様では、Ａは、１〜６個のメチレン基または４〜１２個のエチレンオキシド基からなる二価の基である。
【００３２】
【化１】
2009521405.tif 000002
【００３３】
開示される方法において使用できる広範なヒドラジドチオール・リンカーはまた、下記スキーム２にしたがって提供されてもよい。このスキームにおいて、Ｚは、１〜１００個の炭素原子を有する二価の基であり、ここで、二価の基は１個以上のヘテロ原子（例えば、Ｏ，ＮまたはＳ）によって中断されていてもよく、そして例えば、１個以上のヒドロキシル、アルコキシ、アシル、カルボキシ、ハロゲン、スルホネート、オキソ、ホスホネートおよび／またはアミン基により置換されていてもよい。より特定の実施態様では、Ｚは、１〜１０個のメチレン基（−ＣＨ２−）および／または１〜２４個のエチレンオキシド（−ＣＨ−ＣＨ２−Ｏ−）基からなる二価の基である。なおより特定の実施態様では、Ｚは、１〜６個のメチレン基または４〜１２個のエチレンオキシド基からなる二価の基である。Ｒ２は、Ｈ、−ＣＯＮＨＮＨ２または−ＣＯ−Ａ−ＣＯＮＨＮＨ２であり、ここで、Ａは、１〜１００個の炭素原子を有する二価の基であり、これは、１個以上のヘテロ原子（例えば、Ｏ，ＮまたはＳ）によって中断されていてもよく、そして例えば、１個以上のアルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、アシル、カルボキシ、ハロゲン、スルホネート、オキソ、ホスホネートおよび／またはアミン基により置換されていてもよい。
【００３４】
【化２】
2009521405.tif 000003
【００３５】
若干の実施態様では、開示される方法において使用できるＰＥＧに基づくヒドラジドチオール・リンカーは、スキーム３にしたがって提供され、そして作成される。スキーム３において、ｍ＝２〜５０；Ｒ３は、Ｈ、−ＣＯＮＨＮＨ２または−ＣＯ−Ａ−ＣＯＮＨＮＨ２であり、ここで、Ａは、１〜１００個の炭素原子を有する二価の基であり、これは、１個以上のヘテロ原子（例えば、Ｏ，ＮまたはＳ）によって中断されていてもよく、そして例えば、１個以上のアルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、アシル、カルボキシ、ハロゲン、スルホネート、オキソ、ホスホネートおよび／またはアミン基により置換されていてもよく；そしてＸおよびＹは、独立して、結合、または１〜２０個の炭素原子を有する二価の基である。より特定の実施態様では、Ａは、１〜１０個のメチレン基（−ＣＨ２−）および／または１〜２４個のエチレンオキシド（−ＣＨ−ＣＨ２−Ｏ−）基からなる二価の基である。なおより特定の実施態様では、Ａは、１〜６個のメチレン基または４〜１２個のエチレンオキシド基からなる二価の基である。ＸおよびＹの二価の基は、１個以上のヘテロ原子（例えば、Ｏ，ＮまたはＳ）によって中断されていてもよく、そして例えば、１個以上のアルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、アシル、カルボキシ、ハロゲン、スルホネート、オキソ、ホスホネートおよび／またはアミン基により置換されていてもよい。より特定の実施態様では、ＸおよびＹは、独立して、結合、または−（ＣＨ２）ｐ−［式中、ｐ＝１〜３］である。カップリング反応において使用されるカルボジイミドは、スキームにしたがって所望のカップリングを提供するいかなるカルボジイミドであってもよい。適当なカルボジイミドの例は、ＤＣＣ（Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド）およびＤＩＣ（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド）を含む。以下で議論される作業実施態様では、ＤＣＣが使用されてカップリングが実施される。
【００３６】
【化３】
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【００３７】
他の実施態様では、開示される方法において使用されてもよい多官能性ヒドラジドチオール・リンカーが提供される。下記スキーム４ａ，４ｂ，４ｃおよび４ｄは、ホモシステイン、リジン、グルタミン酸およびホモセリンのそれぞれから多官能性リンカーを作成する一般的方法を示す。スキーム４ａ，４ｂ，４ｃおよび４ｄにおいて、Ｄは、１〜１００個の炭素原子を有する二価の基であり、ここで、二価の基は１個以上のヘテロ原子（例えば、Ｏ，ＮまたはＳ）によって中断されていてもよく、そして例えば、１個以上のアルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、アシル、カルボキシ、ハロゲン、スルホネート、オキソ、ホスホネートおよび／またはアミン基により置換されていてもよい。より特定の実施態様では、Ｄは、１〜１０個のメチレン基（−ＣＨ２−）および／または１〜２４個のエチレンオキシド（−ＣＨ−ＣＨ２−Ｏ−）基からなる二価の基である。なおより特定の実施態様では、Ｄは、１〜６個のメチレン基または４〜１２個のエチレンオキシド基からなる二価の基である。また、スキーム４ａ，４ｂ，４ｃおよび４ｄにおいて、Ｒ４は、Ｈ、−ＣＯＮＨＮＨ２または−ＣＯ−Ａ−ＣＯＮＨＮＨ２であり、ここで、Ａは、１〜１００個の炭素原子を有する二価の基であり、これは、１個以上のヘテロ原子（例えば、Ｏ，ＮまたはＳ）によって中断されていてもよく、そして例えば、１個以上のアルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、アシル、カルボキシ、ハロゲン、スルホネート、オキソ、ホスホネートおよび／またはアミン基により置換されていてもよい。より特定の実施態様では、Ａは、１〜１０個のメチレン基（−ＣＨ２−）および／または１〜２４個のエチレンオキシド（−ＣＨ−ＣＨ２−Ｏ−）基からなる二価の基である。なおより特定の実施態様では、Ａは、１〜６個のメチレン基または４〜１２個のエチレンオキシド基からなる二価の基である。
【００３８】
【化４】
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【００３９】
【化５】
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【００４０】
【化６】
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【００４１】
【化７】
2009521405.tif 000008
【００４２】
他の特定の実施態様では、開示される方法において使用できるＰＥＧに基づく多官能性ヒドラジドチオール・リンカーが提供される。スキーム５ａ，５ｂおよび５ｃは、そのようなリンカーを提供するために使用できる一般的合成スキームを具体的に説明している。これらのスキームにおいて、ｐ＝２〜５０であり、そしてＲ５は、Ｈ、−ＣＯＮＨＮＨ２または−ＣＯ−Ａ−ＣＯＮＨＮＨ２であり、ここで、Ａは、１〜１００個の炭素原子を有する二価の基であり、これは、１個以上のヘテロ原子（例えば、Ｏ，ＮまたはＳ）によって中断されていてもよく、そして例えば、１個以上のアルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、アシル、カルボキシ、ハロゲン、スルホネート、オキソ、ホスホネートおよび／またはアミン基により置換されていてもよい。より特定の実施態様では、Ａは、１〜１０個のメチレン基（−ＣＨ２−）および／または１〜２４個のエチレンオキシド（−ＣＨ−ＣＨ２−Ｏ−）基からなる二価の基である。なおより特定の実施態様では、Ａは、１〜６個のメチレン基または４〜１２個のエチレンオキシド基からなる二価の基である。Ｒ７はＨ、アルキルまたは保護基であってもよい。
【００４３】
【化８】
2009521405.tif 000009
【００４４】
【化９】
2009521405.tif 000010
【００４５】
【化１０】
2009521405.tif 000011
【００４６】
Ｂ．Ｆｃ特異的抗体コンジュゲートの作成
１つの実施態様では、ヒドラジドチオール・リンカーを含むコンジュゲートは、抗体および検出可能な標識のコンジュゲートを含む。特定の実施態様では、コンジュゲートは、抗体および検出可能な標識のＦｃ特異的コンジュゲートを含む。より特定の実施態様では、コンジュゲートは、抗体および酵素、例えばアルカリホスファターゼのＦｃ特異的コンジュゲートを含む。スキーム６は、Ｆｃ特異的様式においてヒドラジドチオール・リンカーを抗体に付加する方法を具体的に説明している。
【００４７】
【化１１】
2009521405.tif 000012
【００４８】
スキーム６では、グリコシル化Ｆｃ部を有する抗体が、部位特異的に酸化されて、グリコシル化Ｆｃ部の糖部分において１個以上のアルデヒド基を生成する。アルデヒド基は、次いで、ヒドラジドチオール・リンカーのチオール基が実質的にプロトン付加される条件下で（実質的に、その中性酸形態において）ヒドラジドチオール・リンカーと反応される。そのような条件下で、リンカーのヒドラジド基は、抗体のＦｃ部に共有結合されるが、一方、チオール基は実質的に未反応で（例えば、抗体におけるジスルフィド結合と実質的に反応せずに）残され、その結果、チオール反応性基を有する第２の分子、例えばチオール反応性基を有する検出可能な標識、とのその後の反応のために保持される。反応は、望ましくは、より安定なヒドラゾンを形成するための温和な還元体（ｒｅｄｕｃｔａｎｔ）とのさらなる反応（還元的アミノ化の例）を含む。チオール化された抗体とチオール反応性基（例えばマレイミド基）を有する検出可能な標識とのカップリングはスキーム７において具体的に説明される。
【００４９】
【化１２】
2009521405.tif 000013
【００５０】
Ｆ．実施例
作業実施態様の次の限定されるものではない例は、本発明のある種の態様をさらに具体的に説明するために提供される。
【００５１】
例１−メルカプト酪酸ヒドラジド（ＭＢＨ）の合成
特定の作業実施態様では、ヒドラジドチオール・リンカーは、スキーム８にしたがってγ−ブチロチオラクトンから製造された。
【００５２】
【化１３】
2009521405.tif 000014
【００５３】
特に、ヒドラジン１水和物（２．４３ｍｌ，５０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液にγ−ブチロチオラクトン（０．４３ｍｌ，５ｍｍｏｌ）を徐々に添加した。４時間後、過剰のヒドラジンを真空除去した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，１：１９ＭｅＯＨ／ＭｅＣＮ）によって精製して、無色のオイルとして所望の生成物を得た。収量：５９９ｍｇ（８９％）：１ＨＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７．５６（ｓ，１Ｈ），３．８９（ｓ，２Ｈ），２．５６−２．４７（ｑ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），２．２８−２．２２（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），１．９４−１．８３（ｐ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），１．３５−１．２９（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（６２．９ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １７３．０２、３２．３８、２９．１６、２３．９４；ＥＳＩ−ＨＲＭＳ  ｍ／ｚ  １３５．０５９５５（Ｍ＋Ｈ＋，Ｃ４Ｈ１１Ｎ２ＯＳ  ｃａｌ’ｄ  １３５．０５９２１）．
【００５４】
例２−メルカプト酪酸カルボヒドラジド（ＭＢＣＨ）の合成
その他の特定の作業実施態様では、カルボヒドラジドチオール・リンカーは、スキーム９にしたがってγ−ブチロチオラクトンから製造された。
【００５５】
【化１４】
2009521405.tif 000015
【００５６】
特に、γ−ブチロチオラクトン（０．４３ｍｌ，５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（５ｍｌ）中に希釈し、次いで、脱イオン水（５ｍｌ）中カルボヒドラジド（２．２５ｇ，２５ｍｍｏｌ）の溶液に徐々に添加した。反応液を４０℃で１８時間撹拌し、次いで、真空濃縮した。粗生成物をアセトニトリルを用いる濾過およびフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，１：１９ＭｅＣＮ／ＭｅＯＨ）によって除去して、白色固体として生成物を得た。収量：６７２ｍｇ（７０％）：１ＨＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ  ２．６２−２．５６（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），２．４７−２．４１（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），１．９８−１．８７（ｍ，２Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（６２．９ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ  １７９．１４、１６３．９４、３４．８６、３１．７４，２５．９１；ＥＳＩ−ＨＲＭＳ  ｍ／ｚ  ２１５．０５８１８（Ｍ＋Ｎａ＋，Ｃ５Ｈ１２Ｎ４ＮａＯ２Ｓ  ｃａｌ’ｄ  ２１５．２５７８７）．
【００５７】
例３−メルカプト−ｄＰＥＧ４−ヒドラジドの合成
なおその他の特定の作業実施態様では、ＰＥＧに基づくヒドラジドチオール・リンカーは、スキーム１０にしたがって製造されて、メルカプト−ｄＰＥＧヒドラジドを提供した。
【００５８】
【化１５】
2009521405.tif 000016
【００５９】
アセチル−Ｓ−ｄＰＥＧ４ＴＭ−ＮＨＳエステル（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，Ｐｏｗｅｌｌ，ＯＨ；５８０ｍｇ，１．３８ｍｍｏｌ）を無水ヒドラジン（１０ｍｌ）に徐々に添加し、そして周囲温度で１８時間撹拌した。反応液を真空濃縮して、粗生成物を得た。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，１９９：１ＭｅＣＮ／ＡｃＯＨ）により無色固体として生成物を得た。収量：２４０ｍｇ（５９％）：１ＨＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ８．０４（ｓ，１Ｈ），３．８８（ｓ，２Ｈ），３．６８−３．５２（ｍ，１７Ｈ），２．６５−２．６０（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），２．４３−２．３９（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（６２．９ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １７１．９４、７２．７４，７０．５２，７０．４９，７０．３８，７０．１５，７０．０９，６６．７２，３５．１７，２４．１２；ＥＳＩ−ＨＲＭＳ  ｍ／ｚ  ３１９．１３０７３（Ｍ＋Ｎａ＋，Ｃ１１Ｈ２４Ｎ２ＮａＯ５Ｓ  ｃａｌ’ｄ  ３１９．１３０３６）．アセチル−Ｓ−ｄＰＥＧ８ＴＭ−ＮＨＳエステルはまた、Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ（Ｐｏｗｅｌｌ，ＯＨ）から市販されている。一般に、メルカプト−ｄＰＥＧ−ヒドラジドは、式Ｈ２Ｎ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｔ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＨ［式中、ｔ＝２〜５０である］を有する。
【００６０】
例４−ＩｇＧおよびアルカリホスファターゼのコンジュゲートの合成
Ｆｃ特異的チオール化免疫グロブリンをスキーム１１にしたがって製造した。
【００６１】
【化１６】
2009521405.tif 000017
【００６２】
具体的には、ポリクローナル抗体の溶液（１．５ｍｌ，３．０ｍｇ／ｍｌ）に、過ヨウ素酸ナトリウム（０．５ｍｌ，脱イオン水中１０ｍｇ／ｍｌ）を添加して、１１．７ｍＭの最終過ヨウ素酸濃度を得た。反応溶液を２時間撹拌し、その後ＰＤ−１０脱塩用カラム（０．１ＭＮａＯＡｃ，１ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ＝５．０）を通過させて過剰の過ヨウ素酸塩を除去した。ヒドラジドチオール・リンカー（ＭＢＨ，ＡＭＢＨ，ＭＢＣＨまたはメルカプト−ｄＰＥＧ４−ヒドラジド）を抗体に対して１０００倍モル過剰で添加し、続いてシアノホウ水素化ナトリウム（３．１４ｍｇ，５０μｍｏｌ）を添加し、そして反応液を１８時間撹拌し、その後１ｍｌの最終容量まで濃縮した。サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００；０．１ＭＮａＯＡｃ，ｐＨ＝５．０）により精製チオール化抗体を得た。チオール数は、改変Ｅｌｌｍａｎ’ｓアッセイにより定量された（参照、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、”Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，”Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，１９９６，ＩＳＢＮ  ０−１２−３４２３３６−８、これは引用によって本明細書に組み入れられている）。この操作において１抗体当たり平均３〜５個のチオール基を得た。
【００６３】
免疫グロブリンのＦｃ部に導入されたアルデヒド基とヒドラジドチオール・リンカーの反応は、温和な酸性ｐＨ、例えば、ｐＨほぼ５のような４〜６のｐＨにおいて有利に実施される。理論に捕らわれなければ、そのような温和な酸性ｐＨでは、アルデヒド基は、アルデヒド酸素のプロトン付加によって求電子的に活性化され、そして同時に、ヒドラジド基（ｐＫａ約４）は実質的にプロトン付加されず、高度に求核性のままであり、それによってアルデヒド基とヒドラジド基の間の反応を促進すると考えられる。そのような温和な酸性条件は、また、チオール基の硫黄が実質的にプロトン付加される（実質的に中性酸形態において存在する）条件を表し、かくして免疫グロブリンの重鎖および軽鎖を結んでいるジスルフィドとは反応できないので、反応は容易であり、そして免疫グロブリンの構造をほとんど破壊しないであろう。さらにまた、遊離チオール基は、コンジュゲートを形成するさらなる反応のために維持される。
【００６４】
チオール反応性マレイミド基をスキーム１２にしたがってアルカリホスファターゼに導入した。
【００６５】
【化１７】
2009521405.tif 000018
【００６６】
具体的には、Ｔｒｉｓを含有する反応バッファーにおいて受領したアルカリホスファターゼ（Ｂｉｏｚｙｍｅ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を、ＰＤ−１０カラムを通過させて非反応バッファー（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛、ｐＨ＝７．５）中のＡＰへと換えた。次いで、アルカリホスファターゼの溶液（０．８ｍｌ，１７．５ｍｇ／ｍｌ）に、ＮＨＳ−ｄＰＥＧ１２−ＭＡＬ（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，Ｐｏｗｅｌｌ，ＯＨ）の１００倍過剰量を添加し、そして反応液を１時間撹拌した。サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００；０．１ＭＴｒｉｓ，１ｍＭＭｇＣｌ２，０．１ｍＭＺｎＣｌ２，ｐＨ＝７．５）により精製マレイミド−アルカリホスファターゼを得た。マレイミド数は、改変Ｅｌｌｍａｎ’ｓアッセイを用いて定量され（参照、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、”Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，”Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，１９９６，ＩＳＢＮ  ０−１２−３４２３３６−８、これは引用によって本明細書に組み入れられている）、そして平均１７〜２５個のマレイミド基において各アルカリホスファターゼ酵素に導入された。
【００６７】
次いで、チオール化Ａｂと反応性ＡＰの最終的複合をｐＨ７以上において実施したが、これは、この例では、ＡＰ上のチオール（より高いｐＨにおいて、より高度に共役塩基チオール塩形態において存在する）と、アルカリホスファターゼに導入したチオール反応性マレイミド基との反応によるコンジュゲートの迅速な形成を可能にした。下記スキーム１３はチオール化Ａｂとチオール反応性ＡＰの最終コンジュゲートを示している。
【００６８】
【化１８】
2009521405.tif 000019
【００６９】
具体的には、精製マレイミド−アルカリホスファターゼを、精製チオール化抗体と１：１モル比で合わせ、そして１８時間撹拌した。サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００；０．１ＭＴｒｉｓ，１ｍＭＭｇＣｌ２，０．１ｍＭＺｎＣｌ２，ｐＨ＝７．５）により精製コンジュゲートを得て、これを、ＳｔａｂｉｌｚｙｍｅＴＭＡＰ酵素安定化希釈液（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ，Ｅｄｅｎ  Ｐｒａｉｒｉｅ，ＭＮ）の１：１希釈液中にＡ２８０＝０．００８７まで希釈し、そして次に示す実施例において記述されるように組織において分析した。得られるコンジュゲートは、次に示す実施例において示されるように、種々の組織において先例のない染色感度を示した。
【００７０】
この操作にしたがうＡｂ−ＡＰコンジュゲートの合成は、約２７０ｋＤａの中央分子量を有する１：１コンジュゲートを生成する。これは、コンジュゲートを調製するために使用された抗体（例えばヤギ抗マウスＩｇＧ、ヤギ抗ウサギＩｇＧおよびウサギ抗ＤＮＰ抗体）には無関係に事実である。複合後に得られた粗クロマトグラムは、生成物と出発材料（１４５ｋＤａの中央分子量）との間で重複部分を示し、これは、精製工程中を考慮に入れることができる。
【００７１】
例５−扁桃組織におけるＫａｐｐａの検出
この実施例では、例４の操作にしたがってＭＢＨを用いて製造されたＡｂ−ＡＰコンジュゲートの性能を、その検出感度についてインサイチューハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）アッセイにおいて評価した。利用される操作は、ＢｅｎｃｈＭａｒｋＴＭ自動スライド染色装置（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）において利用できる標準ＩＳＨプロトコールから適合された。自動染色プロトコールは次のとおりであった。
【００７２】
スライド上のパラフィン包埋扁桃組織サンプルを、４分間７５℃に加熱し、そして７５℃においてＥＺＰｒｅｐＴＭ容積アジャスト（ｖｏｌｕｍｅ  ａｄｉｕｓｔ）（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）により２回処理し、その後ＬｉｑｕｉｄＣｏｖｅｒｓｌｉｐＴＭ（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）をＥＺＰｒｅｐＴＭ容積アジャストとともに適用した。７５℃で４分後、スライドを洗浄し、そしてＥＺＰｒｅｐＴＭ容積アジャストをＬｉｑｕｉｄＣｏｖｅｒｓｌｉｐＴＭとともに添加して、７６℃で４分間脱パラフィンを行った。ＬｉｑｕｉｄＣｏｖｅｒｓｌｉｐをＥＺ−Ｐｒｅｐを覆うために分配した。次いで、スライドを４分間９０℃に加熱し、そして洗浄後に３７℃まで冷却した。ＩＳＨ−Ｐｒｏｔｅａｓｅ−１（１００μｌ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を添加し、２分間インキュベートし、次いで洗浄し、その後フルオレセイン標識したｋａｐｐａ核酸プローブ（１００μｌ，ＩＮＦＯＲＭＴＭＫａｐｐａ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を添加した。４分間インキュベートした後、スライドを１２分間８５℃に加熱し、次いで４７℃に冷却し、そしてさらに６４分間インキュベートした。スライドを４回洗浄した後、マウス抗フルオレセイン１次抗体（１００μｌ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を添加し、これを２０分間インキュベートし、次いで２回洗浄した。この時点で、２次抗体（さらなる増幅のために）を自動的に添加するか、あるいはＡｂ−ＡＰコンジュゲートを手動で添加または自動的に分配器から添加した。増幅されたスライドでは、ウサギ抗マウス抗体（１００μｌ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を添加し、８分間インキュベートし、次いでスライドを２回洗浄した。いずれの場合でも、Ａｂ−ＡＰコンジュゲート（２次抗体を含有するサンプルおよび含有しないサンプルについて、ヤギ抗ウサギまたはウサギ抗マウスＩｇＧコンジュゲート、それぞれ；１００μｌ）をスライドに適用した後、スライドを１６分間インキュベートし、そしてスライドを２回洗浄した。ｉＶｉｅｗＴＭＢｌｕｅ  Ｅｎｈａｎｃｅエンハンサー（１００μｌ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を適用した後、４分間インキュベートし、そしてｉＶｉｅｗＴＭＢｌｕｅ  ＮＢＴ（１００μｌ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）およびｉＶｉｅｗＴＭＢｌｕｅ  ＢＣＩＰ（１００μｌ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）の両方を適用した。アルカリホスファターゼの基質であるＢＣＩＰは不溶性の暗青色／紫色沈殿を生成し、そしてＮＢＴはＢＣＩＰの着色を増進する。次いで、スライドを３２分間インキュベートし、２回洗浄し、そしてＣｏｕｎｔｅｒｓｔａｉｎ  ＮＦＲ（１００μｌ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．���Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を添加した。６分間対比染色剤（ｃｏｕｎｔｅｒｓｔａｉｎ）とともにインキュベートした後、スライドを再び洗浄し、装置からはずした。スライドを洗剤液で処理し、その後一連のエタノール、アセトン、次いでキシレンにより脱水した。カバースリップをスライドに添加し、スライドを顕微鏡をとおして観察し、そして写真撮影した。また、ｋａｐｐａプローブで処理しなかったネガティブ対照を同様の方式で調製した。
【００７３】
比較のために、参照扁桃組織サンプルを、ｋａｐｐａプローブの検出のためのＳＡ−ＡＰコンジュゲートを用いる類似操作を使用して染色した（この操作は、前記２次抗体の添加と、それに続く余分の増幅段階を含み、ここで、ビオチン化抗ＩｇＧ抗体の自動添加が、Ａｂ−ＡＰコンジュゲートの適用の代わりに実施され、次いで、ＳＡ−ＡＰコンジュゲートの添加が実施された）。ビオチン標識抗体およびＳＡ−ＡＰコンジュゲートの使用は、自動ＩＳＨ染色方法における検出のための工業規準であり、Ａｂ−ＡＰコンジュゲートの相対性能を決定するために参照として役立った。また、ｋａｐｐａプローブで処理されないネガティブ対照スライドを、ＳＡ−ＡＰ検出を使用して類似の方式で作成した。カバースリップをスライドに添加し、そしてそのスライドを明視野顕微鏡をとおして４０Ｘで観察し、写真撮影した。
【００７４】
図１は、抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲートおよびＳＡ−ＡＰコンジュゲートを使用する扁桃組織におけるｋａｐｐａＩＳＨ検出のために観察された所望の染色およびバックグラウンド染色を比較する一組の顕微鏡写真である。図１Ａでは、２次抗体によって与えられる増幅のない、そして開示される抗体コンジュゲートを使用するｋａｐｐａの染色が示される。図１Ｂは、コンジュゲートにより処理されたネガティブ対照スライドを示す。図１Ｃは、ＳＡ−ＡＰを使用するｋａｐｐａの染色を示し、そして図１Ｄは、同一物についてのネガティブ対照を示す。図１Ａと１Ｃの比較は、抗体コンジュゲートによるより明確な染色を例証し（より少ない増幅段階が使用されたとしても）、そして図１Ｂと１Ｄの比較は、抗体コンジュゲートによって与えられるより低いバックグラウンドを例証している。これらの結果は、抗体コンジュゲートによって可能とされた非ビオチン検出スキームの優位性を具体的に説明している。
【００７５】
例６−扁桃組織におけるＬａｍｂｄａの検出
例５において記述された自動染色方法（使用されたフルオレセイン標識核酸プローブは、Ｌａｍｂｄａ；ＩＮＦＯＲＭＴＭＬａｍｂｄａ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ、に特異的であり；そしてＩＳＨ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  １は４分間インキュベートされたことを除いて）を、扁桃組織におけるＬａｍｂｄａの検出についてＡｂ−ＡＰコンジュゲートの性能を評価するために使用した。Ａｂ−ＡＰコンジュゲートを２次抗体増幅段階なしに使用し、そして例４に記述されたようにＭＢＨを使用して作成した。比較のためには、参照スライドを例４に記述されたＳＡ−ＡＰコンジュゲート検出スキームを使用して作成した。
【００７６】
結果は図２において示される。具体的には、図２Ａおよび２Ｂは、Ｌａｍｂｄａ特異的核酸プローブの、それぞれ添加および無添加（ネガティブ対照）の下でＡｂ−ＡＰコンジュゲートを使用して得られた染色パターンを示す。図２Ｃおよび２Ｄは、Ｌａｍｂｄａプローブの、それぞれ添加および無添加（ネガティブ対照）の下でＳＡ−ＡＰコンジュゲートを使用して得られた染色パターンを示す。図２Ａと２Ｃの比較は、Ａｂ−ＡＰコンジュゲートを使用して得られた染色パターンが、Ａｂ−ＡＰコンジュゲートについて使用された方法が１つ少ない増幅段階を伴うにも拘わらず、ＳＡ−ＡＰコンジュゲートを用いて見られるパターンと少なくとも同じ強度であることを示している。図２Ｂと２Ｄの比較は、Ａｂ−ＡＰコンジュゲートでは、より弱いバックグラウンド染色（組織の比較的暗い全体的染色によって証明される）が存在することを例証している。再び、これらの結果は、開示されたＡｂ−ＡＰコンジュゲートが用いられる場合に見られるバックグラウンドの有益な低下を例証している。
【００７７】
例７−肺組織におけるＣＭＶの検出
例５において記述された自動染色方法（使用されたフルオレセイン標識核酸プローブは、ＣＭＶ；ＩＮＦＯＲＭＴＭＣＭＶ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ、に特異的であり；そしてＩＳＨ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  １は４分間インキュベートされたことを除いて）を、肺組織におけるＣＭＶの検出についてＡｂ−ＡＰコンジュゲートの性能を評価するために使用した。Ａｂ−ＡＰコンジュゲートを２次抗体増幅段階なしに使用し、そして例４に記述されたようにＭＢＨを使用して作成した。比較のためには、参照スライドを例４に記述されたＳＡ−ＡＰコンジュゲート検出スキームを使用して作成した。
【００７８】
結果は図３において示される。具体的には、図３Ａは、プローブの存在下でＡｂ−ＡＰコンジュゲートを使用して得られた染色パターンを示し、図３Ｂは、プローブの不在下でＡｂ−ＡＰコンジュゲートを使用して得られた染色パターンを示し、図３Ｃは、プローブの存在下でＳＡ−ＡＰコンジュゲートを使用して得られた染色パターンを示し、そして図３Ｄは、プローブの不在下でＳＡ−ＡＰコンジュゲートを使用する染色パターンを示す。図３Ａと３Ｃの比較は、Ａｂ−ＡＰコンジュゲートによる染色が、ＳＡ−ＡＰコンジュゲートによって与えられた染色よりも明確であり、そしてそれと少なくとも同じ強度（１つ少ない増幅段階を有するにも拘わらず）であることを示している。さらにまた、より弱いバックグラウンド染色がＡｂ−ＡＰコンジュゲートについて見られる。また、Ａｂ−ＡＰコンジュゲートによって提供されるバックグラウンドにおける低下は、図３Ｂと３Ｄの比較からも立証される。
【００７９】
例８−脾臓組織におけるＥＢＥＲの検出
例５において記述された自動染色方法（使用されたフルオレセイン標識核酸プローブは、ＥＢＥＲ；ＩＮＦＯＲＭＴＭＥＢＥＲ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ、に特異的であり；そしてＩＳＨ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  １は４分間インキュベートされたことを除いて）を、脾臓組織におけるＥＢＥＲの検出についてＡｂ−ＡＰコンジュゲートの性能を評価するために使用した。Ａｂ−ＡＰコンジュゲートを２次抗体増幅段階なしに使用し、そして例４に記述されたようにＭＢＨを使用して作成した。比較のためには、参照スライドを例４に記述されたＳＡ−ＡＰコンジュゲート検出スキームを使用して作成した。
【００８０】
結果は図４において示される。具体的には、図４Ａは、プローブの存在下でＡｂ−ＡＰコンジュゲートを使用して得られた染色パターンを示し、図４Ｂは、プローブの不在下でＡｂ−ＡＰコンジュゲートを使用して得られた染色パターンを示し、図４Ｃは、プローブの存在下でＳＡ−ＡＰコンジュゲートを使用して得られた染色パターンを示し、そして図４Ｄは、プローブの不在下でＳＡ−ＡＰコンジュゲートを使用する染色パターンを示す。図４Ａと４Ｃの比較は、Ａｂ−ＡＰコンジュゲートによる染色が、ＳＡ−ＡＰコンジュゲートによって与えられた染色よりも明確であり、そしてそれと少なくとも同じ強度（１つ少ない増幅段階を有するにも拘わらず）であることを示している。さらにまた、より弱いバックグラウンド染色がＡｂ−ＡＰコンジュゲートについて見られる。また、Ａｂ−ＡＰコンジュゲートによって提供されるバックグラウンドにおける低下は、図４Ｂと４Ｄの比較からも立証される。
【００８１】
例９−組織の異種移植片におけるＨＰＶの検出
この実施例では、例４の操作にしたがってＭＢＨを用いて製造されたＡｂ−ＡＰコンジュゲートの性能を、それが、ＩＳＨによるＨＰＶ配列の検出のために必要な段階の数において、さらなる減少を可能にするような十分な感度を提供するか否かを決定するために、一部評価した。結果は、検出のために必要な段階の数における減少を達成することが可能であり、それによって、段階の数における減少が、処理時間と同時にアッセイコストにおける有意な減少をもたらす自動工程のために、開示されたＡｂ−ＡＰコンジュゲートを非常に有用なものにさせることを示す。
【００８２】
スキーム１４〜１６として以下に提示される３種の検出スキームは、自動または半自動方式で実施された。これらのスキームの各々において、ＨＰＶ核酸配列の少なくとも一部分に特異的に結合するＤＮＰ標識核酸プローブが、最初にサンプルに添加される。これらのスキームにおいて描かれる続いての段階は、ＨＰＶ核酸に結合されたプローブの存在を検出するために使用される段階である。
【００８３】
【化１９】
2009521405.tif 000020
【００８４】
【化２０】
2009521405.tif 000021
【００８５】
【化２１】
2009521405.tif 000022
【００８６】
スキーム１４では、抗ＤＮＰ抗体が最初にプローブに結合される。抗ＩｇＧ抗体が次に添加される（最初の増幅段階）。第２の増幅段階では、ビオチン化抗ＩｇＧ抗体が添加される。ＳＡ−ＡＰコンジュゲートが添加され、これがビオチン化抗体に結合し、そして染色は、ＡＰによって作用される色原体基質の添加により実施される。スキーム１５では、第２の増幅段階は除外され、そしてＡＰに複合された抗ＩｇＧ抗体が、ＳＡ−ＡＰコンジュゲートよりもむしろ染色前に添加される。スキーム１６では、両増幅段階が除外され、そしてＤＮＰ標識プローブが、ＡＰに複合された抗ＤＮＰ抗体によって直接検出される。
【００８７】
ＳＣＩＤマウスにおける異種移植片において増殖された種々の細胞系におけるＨＰＶの検出を、ＢｅｎｃｈＭａｒｋＴＭ自動染色装置（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）のための標準ＩＳＨプロトコールを改良された次の操作にしたがって実施した。スライド上のパラフィン包埋組織を、４分間７５℃に加熱し、次いで７５℃においてＥＺＰｒｅｐＴＭ容積アジャスト（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）により２回処理し、その後ＬｉｑｕｉｄＣｏｖｅｒｓｌｉｐＴＭ（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）をＥＺＰｒｅｐＴＭ容積アジャストとともに適用した。７５℃で４分後、スライドを洗浄し、そしてＥＺＰｒｅｐＴＭ容積アジャストを添加して、７６℃で４分間、組織を脱パラフィンさせた。ＬｉｑｕｉｄＣｏｖｅｒｓｌｉｐをＥＺＰｒｅｐＴＭを覆うために分配した。Ｃｅｌｌ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｒ  ＃２、細胞条件付け（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）溶液（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を添加し、スライドを４分間９０℃に加熱し、そして８分間インキュベートした。この後、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｒ  ＃２のさらなる添加および９０℃で１２分間のさらなるインキュベーションを実施した。スライドをＲｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を用いて洗浄し、３７℃まで冷却し、そしてＩＳＨ−Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ３（１００μｌ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を添加した。４分間のインキュベーション後、スライドを３回洗浄し、その後、ハイブリダイゼーションバッファー（ｉＶｉｅｗＴＭ＋ＨｙｂＲｅａｄｙＴＭＳｏｌｕｔｉｏｎ，１００μｌ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を適用し、４分間インキュベートした。ＤＮＰ標識ＨＰＶ核酸プローブ（ＨＰＶ  ＨＲ  Ｐｒｏｂｅ，２００μｌ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を添加し、その後、３７℃で４分間、９５℃で１２分間および５２℃で１２４分間インキュベートした。次いで、スライドを２回洗浄し、７２℃に加温した。この最後の段階をさらに２回反復した後、スライドを３７℃まで冷却し、次いで、その後の検出スキームに応じて、そのようなスライドを、３方法の１つにおいて自動または半自動方式で処理した。
【００８８】
スキーム１４に描かれたような１つの例では、ｉＶｉｅｗＴＭ＋抗ＤＮＰ（１００μｌ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）１次抗体を適用し、そして２０分間インキュベートした。次いでスライドを２回洗浄し、その後、ｉＶｉｅｗＴＭ＋Ａｍｐ（１００μｌ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）２次抗体を添加した。コンジュゲートのインキュベーションを８分間実施し、その後スライドを洗浄した。ｉＶｉｅｗＴＭ＋Ｂｉｏｔｉｎ−Ｉｇ（１００μｌ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を添加し、続いて１２分間インキュベートし、そしてｉＶｉｅｗＴＭ＋ＳＡ−ＡＰ（１００μｌ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を添加した。スライドを３回洗浄し、その後ｉＶｉｅｗＴＭ＋Ｅｎｈａｎｃｅ（１００μｌ，ＶＭＳＩ）を適用し、その後、これを４分間インキュベートし、そしてｉＶｉｅｗＴＭ＋ＮＢＴ（１００μｌ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）およびｉＶｉｅｗＴＭ＋ＢＣＩＰ（１００μｌ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）の両方を適用した。次いで、スライドを２４分間インキュベートし、３回洗浄し、そしてＣｏｕｎｔｅｒｓｔａｉｎ  ＮＦＲ（１００μｌ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を添加した。４分間対比染色剤とともにインキュベートした後、スライドをさらに３回洗浄し、装置からはずした。スライドを洗剤液で処理し、その後一連のエタノール、アセトン、次いでキシレンにより脱水した。カバースリップをスライドに適用し、次いで、スライドを明視野顕微鏡をとおして観察し、そして写真撮影した。
【００８９】
スキーム１５に描かれたようなその他の例では、ウサギ抗ＤＰＮ１次抗体を添加した（ｉＶｉｅｗＴＭ＋抗ＤＮＰ１次抗体、１００μｌ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）。１次抗体を２０分間インキュベートし、次いでスライドを２回洗浄し、その後、アルカリホスファターゼに複合された抗ウサギＩｇＧ抗体（１００μｌ）を手動で添加した（この段階はまた自動化されて、操作を完全に自動化させることができる）。コンジュゲートのインキュベーションを１６分間実施し、その後スライドを４回洗浄した。ｉＶｉｅｗＴＭ＋Ｅｎｈａｎｃｅ（１００μｌ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を適用し、その後、４分間インキュベートし、そして発色のためのＮＢＴおよびＢＣＩＰ（ｉＶｉｅｗＴＭ＋ＮＢＴおよびｉＶｉｅｗＴＭ＋ＢＣＩＰ、１００μｌ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）の両方を適用した。次いで、スライドを２４分間インキュベートし、３回洗浄し、そしてＣｏｕｎｔｅｒｓｔａｉｎ  ＮＦＲ（１００μｌ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を添加した。４分間対比染色剤とともにインキュベートした後、スライドをさらに３回洗浄し、装置からはずした。スライドを洗剤液で処理し、その後エタノール、アセトンおよびキシレンにより脱水した。カバースリップを適用した後、スライドを顕微鏡をとおして観察し、そして明視野顕微鏡を使用して４０Ｘで写真撮影した。
【００９０】
スキーム１６に描かれたような、なおその他の例では、スライドを、アルカリホスファターゼ・ウサギ抗ＤＰＮコンジュゲート（１００μｌ）により直接処理した。スライドを２０分間インキュベートし、次いで２回洗浄し、その後、ｉＶｉｅｗＴＭ＋Ｅｎｈａｎｃｅ（１００μｌ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を適用した。その後、これを４分間インキュベートし、そして同時に、ｉＶｉｅｗＴＭ＋ＮＢＴ（１００μｌ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）およびｉＶｉｅｗＴＭ＋ＢＣＩＰ（１００μｌ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）の両方を適用した。次いで、スライドを２４分間インキュベートし、３回洗浄し、そしてＣｏｕｎｔｅｒｓｔａｉｎ  ＮＦＲ（１００μｌ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を添加した。４分間対比染色剤とともにインキュベートし、スライドをさらに３回洗浄し、装置からはずした。スライドを洗剤液で処理し、その後エタノール、アセトンおよびキシレンにより脱水した。カバースリップをスライドに添加し、そしてそれを明視野顕微鏡使用して４０Ｘで観察し、そして写真撮影した。
【００９１】
図５〜７は、３種の異なる異種移植片組織タイプにおけるＨＰＶ検出の結果を示している。図５Ａ，５Ｂおよび５Ｃでは、スキーム１４、１５および１６の各々にしたがうＣａＳｋｉ異種移植片組織におけるＨＰＶ検出に関する染色パターンがそれぞれ示される。図６Ａ，６Ｂおよび６Ｃでは、スキーム１４、１５および１６の各々にしたがうＨｅＬａ異種移植片組織におけるＨＰＶ検出に関する染色パターンがそれぞれ示される。図７Ａ，７Ｂでは、スキーム１４および１５の各々にしたがうＳｉＨａ異種移植片組織における単コピーＨＰＶ検出（矢印で指示される）に関する染色パターンがそれぞれ示される。
【００９２】
図５Ａと５Ｂの比較は、スキーム１５にしたがう検出によって与えられた染色強度が、スキーム１５が２つ少ない増幅段階を含むにも拘わらず、スキーム１４にしたがって与えられた強度よりも強いことを例証している。図５Ｃは、ＨＰＶ検出が、例４にしたがって作成されたＡｂ−ＡＰコンジュゲートによる直接検出（スキーム１６）を使用して増幅なしに実施できることを例証している。また、図６Ａと６Ｂの比較は、スキーム１５にしたがう検出によって与えられた染色強度が、スキーム１５が２つ少ない増幅段階を含むにも拘わらず、スキーム１４にしたがって与えられた強度よりも強いことを例証している。図６Ｃは、ＨＰＶ検出が、例４にしたがって作成されたＡｂ−ＡＰコンジュゲートによる直接検出（スキーム１６）を使用して増幅なしに実施できることを例証している。図７Ａと７Ｂの比較は、ＨＰＶ核酸配列の単コピーでさえ、スキーム１５の検出方法により検出できることを示している。全般的に、結果は、開示されたＦｃ特異的Ａｂ−ＡＰにより与えられる優れた感度が、組織サンプルにおけるＨＰＶを検出するために必要な段階の数を減少させることによって自動検出を可能にすることを例証している。スキーム１４と１５の間の段階数の減少は、総自動染色工程時間を１５％（６．５時間から５．５時間まで）低下させることができる。工程時間のさらなる低下はスキーム１６の使用によって実現できる。
【００９３】
ＤＮＰ標識プローブおよび抗体の特定の種類がこの実施例において記述されたが、当業者は、多数の他のハプテン（例えばフルオレセイン、ジゴキシゲニンおよびビオチン）が核酸配列を標識するために使用でき、そして各々異なるハプテン標識を有する、種々の標的に対する多数の核酸プローブの使用が、多重送信検出を可能にする（例えば、種々の異なる波長の光を発する異なる蛍光ナノ粒子に複合された異なる検出抗体により）ために使用できることを評価できる。さらにまた、当業者は、他のタイプの抗体および記述されたもの以外の種からの抗体、他の検出可能な標識、および検出可能なシグナルを生成するための他の試薬が、他の標的を検出するための類似アッセイにおいて使用できることを認識できる。
【００９４】
例１０−液体に基づく調製物におけるＨＰＶの検出
液体に基づくｐｒｅｐＨＰＶアッセイのためのスライドを、ＴｈｉｎＰｒｅｐＴＭ２０００  Ｓｙｓｔｅｍスライド作成システム（Ｃｙｔｙｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）を使用して作成した。膣擦過により得られた細胞をメタノールに基づく緩衝化保存溶液（ＴｈｉｎＰｒｅｐＴＭＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｃｙｔｙｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）内に入れ、次いで、この機器によってガラススライド上に塗布した。
【００９５】
次に示すものは、Ｖｅｎｔａｎａ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋＴＭ装置より適合された操作である：液体に基づくｐｒｅｐスライドを、１２分間６５℃に加熱し、その後７５℃においてさらに４分間加熱し、そして７５℃でＲｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を用いて２回洗浄し、その後、ＬｉｑｕｉｄＣｏｖｅｒｓｌｉｐ（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を適用した。次いでスライドをＲｉｎｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）の０．９ｍｌにより洗浄し、その後、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｒ  ＃２、細胞条件付け（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）溶液（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を適用し、そしてスライドを９０℃に加熱し、そして１６分間インキュベートした。スライドをＲｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを用いて洗浄し、３７℃まで冷却し、そしてＩＳＨ−Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ３（１００μｌ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を添加した。４分間のインキュベーション後、スライドを３回洗浄し、その後、ｉＶｉｅｗＴＭ＋ＨｙｂＲｅａｄｙ（１００μｌ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を適用し、これを４分間インキュベートした。ＨＰＶ  ＨＲ  Ｐｒｏｂｅ（２００μｌ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を添加し、その後、３７℃で４分間、９５℃で１２分間および５２℃で１２４分間インキュベートした。次いで、スライドを２回洗浄し、７２℃に加温した。この最後の段階をさらに２回反復した後、スライドを３７℃まで冷却し、そしてｉＶｉｅｗＴＭ＋抗ＤＮＰ（１００μｌ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を添加した。
【００９６】
標準ＳＡ−ＡＰ検出（前記スキーム１４にしたがう）では、１次抗体を２０分間インキュベートし、次いでスライドを２回洗浄し、その後、ｉＶｉｅｗＴＭ＋Ａｍｐ２次抗体（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ，１００μｌ）を添加した。抗体のインキュベーションを８分間実施し、その後洗浄した。ｉＶｉｅｗＴＭ＋Ｂｉｏｔｉｎ−ＩｇＧ抗体コンジュゲート（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ，１００μｌ）を添加し、続いて１２分間インキュベートし、そして洗浄した。最後に、ｉＶｉｅｗＴＭ＋ＳＡ−ＡＰ（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ，１００μｌ）を添加し、そして８分間のインキュベーション後、スライドを３回Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した。２次抗体としてＡｂ−ＡＰコンジュゲートを使用する検出（前記スキーム１５にしたがう）では、１次抗体を２０分間インキュベートし、次いでスライドを２回洗浄し、その後、ＡＰ−ＩｇＧコンジュゲート（１００μｌ）を添加した。コンジュゲートのインキュベーションを８分間実施し、その後Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄した。Ａｂ−ＡＰコンジュゲートを用いる標識プローブの直接検出では、コンジュゲートを２０分間インキュベートし、その後スライドをＲｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄した。
【００９７】
すべて３回の場合において、前記段階の後、ｉＶｉｅｗＴＭ＋Ｅｎｈａｎｃｅ（１００μｌ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を適用し、その後、４分間インキュベートし、そしてｉＶｉｅｗＴＭ＋ＮＢＴ（１００μｌ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）およびｉＶｉｅｗＴＭ＋ＢＣＩＰ（１００μｌ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）の両方を適用した。次いで、スライドを２４分間インキュベートし、３回洗浄し、そしてＣｏｕｎｔｅｒｓｔａｉｎ  ＮＦＲ（１００μｌ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を添加した。４分間対比染色剤とともにインキュベートした後、スライドをさらに３回洗浄し、装置からはずした。スライドを洗剤液で処理し、その後エタノール、アセトンおよびキシレンにより脱水し、続いて、カバースリップをスライドに適用し、この後、スライドを顕微鏡をとおして観察した。
【００９８】
図８Ａと８Ｂの比較は、例４の操作にしたがってＭＢＨを使用して作成されたＡｂ−ＡＰコンジュゲートを用いる、スキーム１５にしたがう検出（参照、例９）が、スキーム１４にしたがうＳＡ−ＡＰコンジュゲートを用いる検出（参照、例９）によって与えられるよりも強い染色を提供することを示している。図８Ｂと８Ｃの比較は、スキーム１６にしたがう抗ＤＮＰ  Ａｂ−ＡＰコンジュゲートを用いる直接検出（参照、例９）が、スキーム１４にしたがうＳＡ−ＡＰコンジュゲートによって与えられるシグナルに匹敵するシグナルを提供することを例証している。これらの結果は、例４にしたがうＦｃ特異的Ａｂ−ＡＰにより与えられる検出感度が、十分なシグナルを与えるために必要な段階の数における低下を可能にすることを例証している。
【００９９】
例１１−筋肉組織におけるＡｃｔｉｎの検出
この実施例では、ＭＢＨリンカーを用いて例４における記述のように作成されたＡｂ−ＡＰコンジュゲートを使用するタンパク質標的（アクチン）の免疫組織化学的検出が、ＳＡ−ＡＰコンジュゲートの性能と比較された。
【０１００】
次に示すものは、Ｖｅｎｔａｎａ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋＴＭ装置より適合された操作である：スライド上のパラフィン被覆組織を、７５℃に４分間加熱し、そしてＥＺＰｒｅｐＴＭ容積アジャスト（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）により７５℃で２回処理し、その後ＬｉｑｕｉｄＣｏｖｅｒｓｌｉｐ（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）をＥＺＰｒｅｐＴＭ容積アジャストにより適用した。７６℃でさらに４分後、スライドを洗浄し、そしてＤｅｐａｒ容積アジャスト（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）をＬｉｑｕｉｄＣｏｖｅｒｓｌｉｐに沿って添加して、組織を脱パラフィンした。次いで、スライドを２分間４２℃に冷却し、その後最終温度３７℃に到達させた。次いで、１次抗体（１００μｌ，抗筋肉アクチン、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を添加し、そしてスライドを１６分間３７℃でインキュベートした。次いで、スライドを２回洗浄し、そしてアルカリホスファターゼ複合ヤギ抗マウス材料（１００μｌ）を添加し、そして１６分間３７℃でインキュベートした。スライドを１回洗浄し、その後、Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｖ−Ｒｅｄ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ（１００μｌ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）およびＥｎｈａｎｃｅ  Ｎａｐｈｔｈｏｌ（１００μｌ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を同時に添加し、そして再び、４分間３７℃でインキュベートした。この後、Ｅｎｈａｎｃｅ  Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ  Ａ（１００μｌ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を添加し、そして８分間インキュベートし、そしてＥｎｈａｎｃｅ  Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ  Ｂ（１００μｌ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）して最後に８分間インキュベートした。着色の発色後、スライドを洗剤液で処理し、その後エタノール、アセトンおよびキシレンにより脱水し、そしてカバースリップをスライドに適用し、この後、スライドを顕微鏡をとおして観察した。
【０１０１】
結果は図９において提示される。具体的には、図９Ａは、Ａｂ−ＡＰコンジュゲートおよび単一増幅段階を用いる検出が、ＳＡ−ＡＰコンジュゲートおよび２つの増幅段階を用いる検出（図９Ｂ）よりも優れていることを示している。これらの結果は、再び、開示によるＦｃ特異的抗体によって与えられる優れた検出感度を例証している。
【０１０２】
例１２−抗体リンカーの長さおよび型の変化
この実施例では、コンジュゲート組成物および染色特性に及ぼすリンカーの長さおよび型の影響が決定された。例４の方法にしたがったが、種々のヒドラジドチオール・リンカーを使用して数種のコンジュゲートを作成した、具体的には、チオ−ＰＥＧ４−ヒドラジドリンカー、メルカプト酪酸ヒドラジド（ＭＢＨ）リンカーおよびメルカプト酪酸カルボヒドラジド（ＭＢＣＨ）リンカーを使用してコンジュゲートを作成した。これらのコンジュゲートは、互いに比較され、そして免疫グロブリンジスルフィドの還元によるチオールの生成をとおして作成されたコンジュゲート、具体的には、ＤＴＴ還元によるチオールの生成と、それに続くＰＥＧに基づくマレイミド−ＮＨＳ二官能性リンカーを用いる複合を伴う、同時係属米国暫定特許出願第６０／６７５７５９号に記述された方法によって作成されたＡｂ−ＡＰコンジュゲートと比較された。また、比較のためには、市販されるアセトアミドメルカプト酪酸ヒドラジド（ＡＭＢＨ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）リンカーを例４の方法において使用して、Ａｂ−ＡＰコンジュゲートを生成した。さらに、マレイミド−ヒドラジド（ＥＭＣＨ；Ｎ［  −マレイミド酪酸］ヒドラジド、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）により製造者の指示を使用して作成したＡｂ−ＡＰコンジュゲートを作成し、比較のための染色プロトコールにおいて使用した。さらにまた、シスタミンを用いる米国特許第５，１９１，０６６号に記述されたＦｃ特異的複合方法を使用して、比較のためのＦｃ特異的Ａｂ−ＡＰコンジュゲートを提供した。
【０１０３】
Ｅｉｉｍａｎ’ｓアッセイの結果は、３〜５チオール／Ａｂが、ＭＢＨおよびＰＥＧに基づくヒドラジドチオール・リンカーによる付加を介して免疫グロブリンに付加され、ＡＭＢＨおよびＭＢＣＨリンカーでは５〜７チオール／Ａｂが、そしてＤＴＴ還元法では８〜１２チオール／Ａｂが付加されたことを示した。免疫グロブリンに導入または生成されたチオールのマレイミド誘導化ＡＰへのカップリングの後、サイズ排除クロマトグラムが得られた。
【０１０４】
サイズ排除クロマトグラムは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ１０／３００  ２００ＧＬカラムおよび移動相として０．１ＭＴｒｉｓ、１ｍＭＭｇＣｌ２、０．１ｍＭＺｎＣｌ２、ｐＨ＝７．５を使用するＡＫＴＡ  Ｐｕｒｕｆｉｅｒ  ＬＣ（ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して得られた。サイズ排除クロマトグラムから、コンジュゲートの最良収量がＡＭＢＨを用いて得られることが決定された。しかしながら、２〜８℃で４８時間保存した場合、それは溶液から沈殿し始めた。他のリンカーはすべて、類似のサイズ排除プロフィルを有するコンジュゲートを生成した。
【０１０５】
図１０は、２次抗体としてコンジュゲートを使用する扁桃組織におけるＫａｐｐａの例６に概説されたような染色を比較している。図１０Ａは、ＥＭＣＨにより作成されたＡｂ−ＡＰコンジュゲートについて見られた染色パターンを示す。図１０Ｂは、米国特許第５，１９１，０６６号のＦｃ特異的シスタミン法について見られた染色パターンを示す。図１０Ｃは、ｄＰＥＧに基づく二官能性リンカーを利用した、２００６年４月２７日提出の米国特許出願第１１／４１３，４１８号にしたがうＤＴＴ還元法によって作成されたＡｂ−ＡＰコンジュゲートについて見られた染色パターンを示す。図１０Ｄは、Ｆｃ特異的複合の開示された方法を使用して市販のＡＭＢＨリンカーにより作成されたＡｂ−ＡＰコンジュゲートについて見られた染色パターンを示す。図１０Ｅは、例１の開示されたＭＢＨリンカーを用いて開示されたＦｃ特異的複合法にしたがって作成されたＡｂ−ＡＰコンジュゲートについて見られた染色パターンを示す。図１０Ｆは、例３の開示されたｄＰＥＧ４ヒドラジドチオール・リンカーを用いて開示されたＦｃ特異的複合法にしたがって作成されたＡｂ−ＡＰコンジュゲートについて見られた染色パターンを示す。図１０Ｇは、例２の開示されたＭＢＣＨヒドラジドチオール・リンカーを用いて開示されたＦｃ特異的複合法にしたがって作成されたＡｂ−ＡＰコンジュゲートについて見られた染色パターンを示す。染色パターンの比較は、コンジュゲートによって与えられた染色強度について次に示す傾向を表している：
ＥＭＣＨ＜Ｃｙｓｔａｍｉｎｅ＜ＡＭＢＨ＜ＭＢＣＨ＜ＰＥＧ４＝ＤＴＴ＜ＭＢＨ
画像は、開示された方法および種々の開示されたリンカーおよび市販のヒドラジドチオール・リンカーを用いて、酵素のＦｃ特異的複合によって得ることができる優れた感度を具体的に説明している。また開示された方法は、シスタミンＦｃ特異的方法およびＥＭＣＨとのカップリングより優れているコンジュゲートを生成する。ＤＴＴ媒介の複合方法のみが、類似の特異性および感度を与えるコンジュゲートを提供する。
【０１０６】
例１３−ＭＢＨリンカー過剰量の変化
この実施例では、過剰量のヒドラジドチオール・リンカーに対するコンジュゲート組成物および染色特性の依存性が決定された。ＡＰ−ＩｇＧコンジュゲートのＭＢＨリンカーによる合成を、例４の操作にしたがって実施したが、ＭＢＨリンカーのモル過剰量を、５０００倍過剰量から５０倍過剰量まで変化させた。Ｅｉｉｍａｎ’ｓアッセイからの結果は、次に示す数のチオール／Ａｂを示した：５０００ｘ  −  ９〜１５；１０００ｘ  −  ７〜１０；５００ｘ  −  ３〜５；１００ｘ  −  ２〜４；５０ｘ  −  １〜３。マレイミド誘導化Ａｂとの反応後のコンジュゲート（５０００ｘ，１０００ｘ，５００ｘ，１００ｘ，および５０ｘ）の分析を、サイズ排除クロマトグラフィーによって実施し、そして、より多い過剰量のリンカーを使用して合成したコンジュゲートが、より高い総収量を有することを示した。しかしながら、これらのコンジュゲートの各々についての組織染色（抗マウス−筋肉、筋肉アクチン；抗ウサギ−皮膚、Ｓ１００）は、５００ｘが、最低のバックグラウンド量をもつ最高の強い染色を有することを示した。
【０１０７】
例１４−アルカリホスファターゼリンカーの長さ／型の変化
この実施例では、アルカリホスファターゼにチオール反応性基を付加するために使用されるリンカーの長さと型に対するコンジュゲート組成物および染色特性の依存性が決定された。ＭＢＨリンカーによるＡＰ−ＩｇＧコンジュゲートの合成は、例４の方法にしたがって実施されたが、次のリンカーが、チオール化抗体との反応のためにアルカリホスファターゼを活性化するために使用された：ＬＣ−ＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ），ＭＡＬ−ｄＰＥＧ８−ＮＨＳエステル（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，Ｐｏｗｅｌｌ，ＯＨ）、ＭＡＬ−ｄＰＥＧ４−ＮＨＳエステル（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，Ｐｏｗｅｌｌ，ＯＨ）およびＭＡＬ−ｄＰＥＧ１２−ＮＨＳエステル（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，Ｐｏｗｅｌｌ，ＯＨ）。これらのリンカーの各々を、バッファー系（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１ＭＮａＣｌ、１ｍＭＭｇＣｌ２、０．１ｍＭＺｎＣｌ２、ｐＨ＝７．５）中で１時間、１００倍過剰量におけるＡＰと反応させた。ＬＣ−ＳＭＣＣをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、そしてＡＰに添加する必要があったが、バッファ中ＤＭＦの１０％総容量を超えてはならない。Ｅｌｌｍａｎ’ｓアッセイは、ＰＥＧ１２およびＬＣ−ＳＭＣＣリンカーでは２０／ＡＰ、ＰＥＧ８リンカーでは２７／ＡＰ、そしてＰＥＧ４リンカーでは３０／ＡＰのマレイミド組み入れを示した。Ｆｃチオール化抗体（ＭＢＨにより作成された）へのカップリング後、サイズ排除クロマトグラムを精製により得た。ＰＥＧ１２リンカーが最高のコンジュゲート収量を提供し、続いてＰＥＧ８、ＬＣ−ＳＭＣＣおよびＰＥＧ４リンカーであった。組織染色（抗マウス−筋肉、筋肉アクチン；抗ウサギ−皮膚、Ｓ１００）は、最高の強い染色を与えるＰＥＧ１２コンジュゲートによるコンジュゲート収量を反映させた。
【０１０８】
例１５−ＮＨＳ−ＰＥＧ１２−ＭＡＬリンカー過剰量の変化
この実施例では、アルカリホスファターゼへのチオール反応性基の付加のために使用される過剰量のＮＨＳ−ＰＥＧ１２−ＭＡＬリンカーに対するコンジュゲート組成物および染色特性の依存性が決定された。例４の方法にしたがうＡＰ−ＩｇＧコンジュゲートの合成を実施したが、この場合、ＭＡＬ−ｄＰＥＧ１２−ＮＨＳエステル・リンカーのモル過剰量を、５００倍過剰量から２５倍過剰量まで変化させた。
【０１０９】
Ｅｉｉｍａｎ’ｓアッセイの結果は、５００ｘ  −  ３４マレイミド；２５０ｘ  −  ２９マレイミド；１００ｘ  −  １８〜２０マレイミド；５０ｘ  −  １７マレイミド；２５ｘ  −  １５マレイミドのマレイミド組み入れを示した。サイズ排除クロマトグラフィーを使用する、Ｆｃチオール化Ａｂとの反応後のコンジュゲート（５００ｘ，２５０ｘ，１００ｘ，５０ｘおよび２５ｘ）の分析は、より多い過剰量のリンカーを使用して合成したコンジュゲートが、より高い収量とより高いマレイミド組み入れパーセンテージを有することを示した。コンジュゲートの各々についての組織染色（抗マウス−筋肉、筋肉アクチン；抗ウサギ−皮膚、Ｓ１００）は、１００ｘマレイミドの使用が、もっとも鮮明な最高の強い染色を与えることを示した。
【０１１０】
例１６−ＡＰ／Ａｂモル比の変化
この実施例では、最終反応におけるマレイミド誘導化ＡＰ（ＮＨＳ−ＰＥＧ１２−ＭＡＬリンカー）に対するチオール化抗体（ＭＢＨ−リンカーによって作成された）の比率におけるコンジュゲート組成物および染色特性の依存性が決定された。次の比率（抗体／ＡＰ）を使用した：２：１、１：１、１：２および１：３。サイズ排除クロマトグラフィーのプロフィルは、最高収量がモル比２ＡＰ：１Ａｂである場合に得られることを示した。しかしながら、コンジュゲートの組織染色（抗マウス−筋肉、筋肉アクチン；抗ウサギ−皮膚、Ｓ１００）は、最良のシグナル対ノイズ比が１：１コンジュゲートにより見られることを例証した。
【０１１１】
例１７−架橋されたＡＰの合成
アルカリホスファターゼは二量体タンパク質であり、そしてその安定性は、二量体の解離を防ぐのを助けるよう酵素を架橋することによって増大することができる。アルカリホスファターゼは次の操作を用いて架橋された。アルカリホスファターゼ（Ｂｉｏｚｙｍｅ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ；１７．５ｍｇ，０．１２５μｍｏｌ）は、それが受領されたバッファーと異なるバッファー（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、１．０ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛、ｐＨ＝７．５）に交換し、そしてシアノホウ水素化ナトリウム（１．６ｍｇ，２５μｍｏｌ）の存在下で、再構成され予め酸化されたアルデヒド活性化デキストラン（平均分子量４０，０００；Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ；５ｍｇ，０．１２５μｍｏｌ）に添加した。次いで、反応混合液を室温で１時間撹拌した。過剰量のアルデヒドをエタノールアミン（１５１μｌ，２．５ｍｍｏｌ）によって不活性化し、続いてさらなるシアノホウ水素化ナトリウム（１５７．１ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合液をさらに１時間撹拌した。架橋されたＡＰを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ＧＬ  １０／３００カラム（ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を備えたＡＫＴＡ  Ｐｕｒｕｆｉｅｒ  ＬＣ（ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用するサイズ排除クロマトグラフィーによって単離した。流速は１ｍｌ／ｍｉｎであり、そして水性移動相は０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、１．０ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛、ｐＨ＝７．５であった。反応後に残っているアミン数を、フルオルアルデヒド・アッセイ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して定量し、そして平均８〜１２アミンが架橋後に残っていた。架橋ＡＰをＭＡＬ−ｄＰＥＧ１２−ＮＨＳエステル（残留アミンと反応した）に結合させ、そして例４に記述されたようにＦｃチオール化抗体に複合して、架橋ＡＰ酵素を含むコンジュゲートを生成した。安定性研究では、架橋が、アビジン含有希釈液（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ；Ｐ／Ｎ９５１３０）においてコンジュゲートの安定性を改善したことを示した。具体的には、４５℃で、架橋ＡＰを有するコンジュゲートについての３日目における染色強度の総損失は５０％であったが、これに対して、同じ希釈液中、その温度では、無架橋のＡＰにより作成されたコンジュゲートは１日目にその染色強度の９５％を失った。
【０１１２】
安定性を増大するためにＡＰを架橋する代替法は、Ｂｉｅｎｉａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，９：３９０−３９８，１９９８、Ｂｉｅｎｉａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，９：３９９−４０２，１９９８、および米国特許第５，７８９，２１９号において与えられる。また、これらの方法は、開示されたコンジュゲートにおける使用のための架橋アルカリホスファターゼ酵素に対して使用することができる。
【０１１３】
例１８−アルカリホスファターゼコンジュゲートの分析用ＳＤＳ  ＰＡＧＥ
この実施例では、例４の複合方法のＦｃ特異性が、変性条件下でポリアクリルアミドゲル電気泳動によって例証される。コンジュゲートの６種の異なる調製物、抗マウスＩｇＧ抗体を用いて作成された３種および抗ウサギＩｇＧ抗体を用いて作成された３種が分析された。簡単に言えば、各コンジュゲートの１００〜２００ｎｇ／μｌ溶液の５〜２０μｌを、４Ｘ  ＬＤＳゲル装填バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と混合し、そして２−メルカプトエタノールを１ｍＭの最終濃度まで添加した。サンプル混合液を４８〜５０℃において５分間適度に加熱した。この温度は、酵素と抗体間の共有結合の解離を最小化するように選ばれたが、２−メルカプトエタノールによるコンジュゲートの抗体部分の軽鎖と重鎖を解離することはなお可能であった。次いで、各サンプルを冷却し、そしてポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ製、１．０ｍｍの厚さの、予め形成されたＮｕＰＡＧＥＴＭ４〜２０％ポリアクリルアミドＢｉｓ  Ｔｒｉｓゲル、またはＮｕＰＡＧＥＴＭ３〜８％ポリアクリルアミドＴｒｉｓアセテートゲルのいずれか）の異なるウェルに添加した。使用した分子量標準品は、予備染色されたＭｕｌｉｍａｒｋＴＭおよびＭａｒｋ１２  ｗｉｄｅ  ｒａｎｇｅＴＭ標準品であり、両方ともＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入した。電気泳動を、Ｎｏｖｅｘ  ＸＣｅｌｌ  ＩＩカセットシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して室温で６０〜９０分間７０ｍＡにおいて実施した。展開バッファーは、それぞれ３〜８％および４〜２０％ゲルについてＭＥＳ−ＳＤＳまたはＴｒｉｓアセテート−ＳＤＳバッファーであった。ゲルをカセットから取り出し、そしてＳＤＳおよびバッファーを除去するために脱イオン水中で５分間、２回洗浄した。次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをエタノール／水／酢酸［４０：５０：１０（ｖ：ｖ：ｖ）］中で１時間室温で固定し、そしてメタノール／水／酢酸［５０：４０：１０（ｖ：ｖ：ｖ），Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ］中に溶解したＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ  Ｒ−２５０により染色した。ゲルを最小２時間〜最大一夜、室温で弱く振盪して染色した。脱染色を染色と同じ様式で実施した。脱染色溶液は染色溶液マイナス染料と同一であった。ゲルをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎゲル乾燥キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して乾燥した。ゲルの分析により、コンジュゲートの各々について抗体の軽鎖に対応する分子量におけるバンドの存在が示された。また、各コンジュゲートでは、重鎖およびアルカリホスファターゼの分子量に対応するバンドは実質的に不在であった。その代わりに、より高い分子量における一連のバンドは、アルカリホスファターゼが各コンジュゲートのＩｇＧの重鎖に選択的に結合していたことを示した。免疫グロブリンの重鎖はＦｃ部を含むので、この結果は複合のＦｃ部位特異的性質を示した。
【０１１４】
例１９−Ｆｃ特異的抗体−ＨＲＰコンジュゲートの合成
この実施例では、ＰＥＧに基づくヒドラジドチオール・リンカーを含むＦｃ特異的抗体コンジュゲートの作成が記述される。チオール反応性マレイミド基を次のようにセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼに付加した。４ｍｌアンバーバイアルに、ＭＡＬ−ｄＰＥＧ４ＴＭＮＨＳエステル（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，Ｐｏｗｅｌｌ，ＯＨ）の７．８ｍｇ（１５．２μｍｏｌ，１００ｅｑ．）と、続いてセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ；０．２５ｍｌ，０．１ＭＮａ３ＰＯ４，０．１５ＭＮａＣｌ，ｐＨ＝７．５中２５ｍｇ／ｍｌ）とを添加した。バイアルを周囲温度で１時間暗所で撹拌し、その後、バッファー水溶液（０．１ＭＮａ３ＰＯ４，０．１５ＭＮａＣｌ，ｐＨ＝７．５）を用いてＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を備えたＡｋｔａ  Ｐｕｒｕｆｉｅｒを使用するサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。ＨＲＰ含有フラクションを貯えてＨＲＰ−ＰＥＧ４−マレイミドの溶液を得た。ＨＲＰ濃度を、溶液のＡ２８０（ε２８０＝０．６５２ｍｌｃｍ−１ｍｇ−１）から決定し、そしてマレイミド数を改変Ｅｌｌｍａｎ’ｓアッセイにより定量して、酵素当たり６〜８マレイミドであった。
【０１１５】
精製マレイミド−セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼを精製チオール化抗体（例４にしたがって、ＭＢＨリンカーを用いて作成した）とモル比３：１で合わせ、そして１８時間撹拌した。サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００；０．１ＭＮａ３ＰＯ４，０．１５ＭＮａＣｌ，ｐＨ＝７．５）により精製コンジュゲートを得て、これをＢ５  Ｂｌｏｃｋｅｒを含有するＡｖｉｄｉｎ  Ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）中にＡ２８０＝０．０３７５に希釈し、そして組織において分析した。米国暫定特許出願第６０／６７５，７５９号に記述されるように免疫グロブリンのＤＴＴ還元により作成されたＨＲＰコンジュゲートに対する、この実施例のＨＲＰコンジュゲートを使用する前立腺組織における前立腺特異的抗原の染色の比較は、本実施例のＨＲＰコンジュゲートが、ＤＴＴで作成されたＨＲＰコンジュゲートよりもやや弱いバックグラウンドを表すが、またやや弱い染色強度も表すことを示した。
【０１１６】
例２０−アミノ酸由来の多官能性ヒドラジドチオール・リンカー
若干の実施態様では、開示された方法において使用できる多官能性ヒドラジドチオール・リンカーは、前記スキーム４ａ，４ｂ，４ｃおよび４ｄにしたがってアミノ酸およびアミノ酸類似体から作成される。この実施例では、特定のリンカーへの合成経路が次に示すスキームにおいて概説される。特定のスキーム１７ａ，１７ｂ，１７ｃおよび１７ｄの各々では、アミノ酸またはアミノ酸類似体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、最初に、トリエチルアミン（ＴＥＡ）の存在下でＮ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）と反応させる。スキーム１７ａでは、この最初の反応の生成物をヒドラジンと反応させて、１個のヒドラジド基と２個のチオール基を有する多官能性ヒドラジドチオール・リンカーを得る。スキーム１７ｂでは、ＤＣＣとのカルボジイミド媒介カップリングを使用して、第１の反応の生成物のカルボン酸官能基をもつＮＨＳエステルを形成させ、続いてヒドラジンと反応させて、１個のヒドラジド基と２個のチオール基を有するその他の多官能性ヒドラジドチオール・リンカーを得る。１７ｂにおけると同様に、１７ｃでは、第１の反応の生成物を使用してＮＨＳエステルを形成させ、続いてヒドラジンと反応させて、２個のヒドラジド基と１個のチオール基を有する多官能性ヒドラジドチオール・リンカーを得る。スキーム１７ｄでは、ヒドラジンとの反応によって、１個のヒドラジド基、１個のチオール基および１個のヒドロキシル基を有するその他の多官能性ヒドラジドチオール・リンカーを得る。
【０１１７】
【化２２】
2009521405.tif 000023
【０１１８】
【化２３】
2009521405.tif 000024
【０１１９】
【化２４】
2009521405.tif 000025
【０１２０】
【化２５】
2009521405.tif 000026
【０１２１】
スキーム１７ａ，１７ｂ，１７ｃおよび１７ｄの生成物は、それぞれ、２−メルカプトアセトアミド−メルカプト酪酸ヒドラジド（ＭＡＭＢＨ）、Ｎ，Ｎ’−（６−ヒドラジニルー６−オキソヘキサンー１，５−ジイル）ビス（２−メルカプトアセトアミド）（ＢＴＡＬ）、Ｎ−（１，５−ジヒドラジニルー１，５−ジオキソペンタンー２−イル）−２−メルカプトアセトアミド（ＴＡＧＤ）およびＮ−（１−ヒドラジニルー４−ヒドロキシ−１−オキソブタンー２−イル）−２−メルカプトアセトアミドである。
【０１２２】
特定の実施態様では、ＭＡＭＢＨは次のように合成される。最初に、Ｓ−アセチルチオアセトアミドホモシステインを、アセトニトリル（１０ｍｌ）中トリエチルアミン（０．１５ｍｌ，１．１ｍｍｏｌ）溶液を作成し、これに塩酸ホモシステイン（１５０ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）を添加することによって作成する。得られるスラリーを５分間撹拌し、その後、Ｓ−アセチルチオアセテート（２５０ｍｇ，１．１ｍｍｏｌ）を添加した。反応液を周囲温度で１６時間撹拌し、次いで、真空濃縮した。カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，９：１ＣＨ２Ｃｌ２／Ｅｔ２Ｏ）により無色粉末としての生成物を単離した。収量：１７４ｍｇ（７５％）：１ＨＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ６．６６（ｂｓ，１Ｈ），４．５１−４．４１（ｐ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，１Ｈ），３．６３−３．５０（ｍ，２Ｈ），２．８８−２．８０（ｍ，１Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），２．０１−１．８８（ｍ，１Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（６２．９ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ２０４．３７，１９５．３８，１６８．５９，５９．５１，３２．７４，３１．４３，３０．１８，２７．４３；ＥＳＩ−ＨＲＭＳ  ｍ／ｚ  ２５６．００６９３（Ｍ＋Ｎａ＋，Ｃ８Ｈ１１ＮＮａＯ３Ｓ２  ｃａｌｃｄ  ２５６．００７８０）．次いで、２−メルカプトアセトアミド−メルカプト酪酸ヒドラジド（ＭＡＭＢＨ）を、Ｓ−アセチルチオアセトアミドホモシステイン（３００ｍｇ，１．３ｍｍｏｌ）を、ヒドラジン１水和物（１０ｍｌ）に添加することによって作成する。得られるスラリーを周囲温度で１６時間撹拌し、この時点で溶液は均質になる。ヒドラジンを真空除去し、そして粗生成物を逆相フラッシュクロマトグラフィー（１５％Ｃ８  ＳｉＯ２，１６０：３９：１Ｈ２Ｏ／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ）により精製して、所望の化合物を無色オイルとして得た。収量：２０７ｍｇ（７２％）：１ＨＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ  ４．５２−４．４６（ｍ，１Ｈ），３．２３−３．２１（ｍ，２Ｈ），２．５９−２．５２（ｍ，２Ｈ），２．１０−２．０１（ｍ，２Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（６２．９ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ  １７２．８２，１７２．４３，５２．４９，３７．７２，２１．４２，２０．４９；ＥＳＩ−ＨＲＭＳ  ｍ／ｚ  ２４６．０３２５１（Ｍ＋Ｎａ＋，Ｃ６Ｈ１３Ｎ３ＮａＯ２Ｓ２  ｃａｌｃｄ  ２４６．０３４６９）。
【０１２３】
スキーム１７ａ，１７ｂおよび１７ｃにおけるＳＡＴＡを６−アセチルチオヘキサン酸ＮＨＳエステルに置換することにより、以下に示される対応する化合物ＴＭＢＨ、ＢＴＨＬおよびＴＨＧＤを得る。６−アセチルチオヘキサン酸ＮＨＳエステルは、６−アセチルチオヘキサン酸とＮ−ヒドロキシスクシンイミドとのカルボジイミド媒介カップリングによって作成することができる。
【０１２４】
【化２６】
2009521405.tif 000027
【０１２５】
６−アセチルチオヘキサン酸ＮＨＳエステルは次の構造：
【０１２６】
【化２７】
2009521405.tif 000028
【０１２７】
を有し、そして６−アセチルチオヘキサン酸とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（共にＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから得られる）のカルボジイミド媒介カップリングによって作成される。
【０１２８】
また当業者は、ＰＥＧに基づくＳ−アセチルチオカルボン酸誘導体を、前記スキームにおけるＳＡＴＡの代わりに用いて、開示された複合方法において使用される多官能性ＰＥＧに基づくリンカーを提供できることを認識することができる。例えば、ＰＥＧに基づく多官能性ヒドラジドチオール・リンカーは、前記スキーム１７ａ−ｄにおけるＳＡＴＡの代わりに次の式：
【０１２９】
【化２８】
2009521405.tif 000029
【０１３０】
［式中、ｍ＝２〜５０］の分子を用いることによって作成できる。この式の化合物は、Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ（Ｐｏｗｅｌｌ，ＯＨ）から市販されているか、または対応するカルボン酸から作成することができる。
【０１３１】
例２１−多官能性のＰＥＧに基づくヒドラジドチオール・リンカー
若干の実施態様では、開示された方法において使用できる多官能性のＰＥＧに基づくヒドラジドチオール・リンカーが、前記スキーム５ａ，５ｂおよび５ｃにしたがって作成される。この実施例では、特定のリンカーへの合成経路が次のスキーム１８ａ，１８ｂおよび１８ｃにおいて概説される。また、反応についての特定のプロトコールが提示される。別に記述されない限り、試薬および溶媒は慣用のものであり、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得ることができる。
【０１３２】
【化２９】
2009521405.tif 000030
【０１３３】
スキーム１８ａにしたがって、１０ｍｌの水中Ｔｒｉｓ５．０ｇの溶液に、炭酸ナトリウム（１．３ｅｑ．）、次いでフェノキシアセチルクロリド（１．２ｅｑ．）を添加し、そして反応液を窒素下氷上で１６時間撹拌させる。次に、沈殿したアミノ保護生成物を水で３回洗浄し、そして真空乾燥する。この最初の段階から得られる純粋化合物を、アセトニトリル／Ｈ２Ｏ、５−１００％アセトニトリルにより３０分かけて溶出したＣ１８シリカのカラムにおけるクロマトグラフィーによって得る。次いで、メシレート基を、ＤＭＦ中トリエチルアミン（４．０ｅｑ．）およびメタンスルホニルクロリド（５．０ｅｑ．）による処理によって導入する。ＤＭＦを真空除去し、残渣を乾燥ＤＣＭに採取し、塩を濾過によって除去する。真空下でＤＣＭを除去して粗メシレート２を得て、これを、さらなる精製なしに使用する。乾燥ＤＭＦ中メシレート（０．３ｅｑ．）の溶液に、ＨＯ−ｄＰＥＧ４ＴＭ−ＳＡＴＡ（１．０ｅｑ；Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，Ｐｏｗｅｌｌ，ＯＨ）およびＫ２ＣＯ３（１．５ｅｑ）を添加し、そして反応液を窒素下で１６時間撹拌させる。ＤＭＦを真空除去し、残渣を乾燥ＤＣＭに採取し、塩を濾過によって除去する。真空下でＤＣＭを除去し、続いて、シリカゲルクロマトグラフィーによってペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）中間体を得る。次いで、Ｐａｃ保護基をＥｔＡｃ／ＭｅＯＨの混合液中Ｐｄ／Ｃによる処理によって除去する。次いで、得られる中間体を、最初にカルボニルジイミジゾール（１０ｅｑ）、続いてヒドラジン（１００ｅｑ）により処理してセミカルバジドを完成する（ｅｌａｂｏｒａｔｅ）。
【０１３４】
【化３０】
2009521405.tif 000031
【０１３５】
スキーム１８ｂにしたがって、ＤＣＭ中アルコール（ＨＯ−ｄＰＥＧ４−ＳＡＴＡ，Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，Ｐｏｗｅｌｌ，ＯＨ，１．３ｅｑ）溶液に、ジアゾ−ジイソプロピルジカルボキシレート１．５ｅｑ、続いてトリブチルホスフィン１．８ｅｑを添加し、そして反応液を乾燥窒素下で３０分間撹拌する。得られる懸濁液に、次にＤＣＭ中フェノール１．０ｅｑを添加し、そして反応液を乾燥窒素下で１６時間撹拌し続ける。シリカゲルクロマトグラフィー後に得られるフェノールエーテルを、次いで純ヒドラジンに採取し、そして溶液をマイクロ波処理して多官能性のＰＥＧに基づくヒドラジドチオール・リンカーを得る。
【０１３６】
【化３１】
2009521405.tif 000032
【０１３７】
スキーム１８ｃにしたがって、１０ｍｌの水中Ｔｒｉｓ５．０ｇの溶液に、炭酸カリウム（１．３ｅｑ．）、次いでフェノキシアセチルクロリド（１．２ｅｑ．）を添加し、そして反応液を窒素下氷上で１６時間撹拌放置する。次に、沈殿したアミノ保護生成物を水で３回洗浄し、そして真空乾燥する。次いで、ＤＭＦ中水素化ナトリウム（３．０ｅｑ）および臭化プロパルギル（１０ｅｑ）による処理によって、アルキン基を導入して、シリカゲルクロマトグラフィー後にアルキン中間体１を得る。ＤＣＭ中ＨＯ−ＰＥＧ４−ＳＡＴＡ（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，Ｐｏｗｅｌｌ，ＯＨ）の溶液に、メタンスルホニルクロリド（１．２ｅｑ）、続いてトリエチルアミン（１．４ｅｑ）を添加し、そして反応液を窒素下氷上で１６時間撹拌放置する。次いで、トリエチルアミン塩を濾過によって除去し、メシレート生成物を真空乾燥する。ＤＣＭ中メシル化アルコール溶液に、アジ化ナトリウム（１．２ｅｑ）を添加し、そして反応液を窒素下で１６時間撹拌し、シリカゲルクロマトグラフィー後にアジ化中間体２を得る。硫酸銅（０．２ｅｑ）およびアスコルビン酸ナトリウム（０．５ｅｑ）を含有するｔ−ブタノール／水の１：１溶液に、中間体アルキン１および中間体アジ化物２の各々１当量を添加する。次いで、反応液を窒素下で１６時間撹拌して、シリカゲルクロマトグラフィー後に保護された窒素をもつ中間体を得る。次いで、窒素保護基を、酢酸エチルとメタノールの１：１混合液中１０％Ｐｄ／Ｃによる処理によって除去し、次いで、遊離アミンを酸−塩基処理によって得る。ＤＣＭ中遊離アミンの溶液に、カルボニルジイミジゾール（１０ｅｑ）を添加し、そして反応液を窒素下で４時間撹拌する。続いて反応液を真空濃縮し、残渣を純ヒドラジン中に採取する。次いで、溶液を１００℃１時間マイクロ波処理して多官能性のＰＥＧに基づくヒドラジドチオール・リンカーを得る。
【０１３８】
ＰＥＧに基づく分子がこれらのスキームにおいて他のＳＡＴＡアルコールにより置換されて、さらなる多官能性のＰＥＧに基づくヒドラジドチオール・リンカーを得ることができ、そして種々の長さのＰＥＧ  ＳＡＴＡアルコールが同様に置換されてもよいことは、当業者にとっては容易に理解できる。
【０１３９】
例２２−ポリアクリルアミドヒドラジドチオール・リンカーの合成
この実施例では、重合多価ヒドラジドチオール・リンカーが提供され、このリンカーは下記スキーム１９にしたがって作成することができる。
【０１４０】
【化３２】
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【０１４１】
スキーム１９では、ｘは、例えば１００〜５００であってもよく、そしてｙは、例えば１０〜５０であってもよい。Ｌは、ヒドラジド基の一部分をチオール基に変換するために使用されるチオール化試薬を表す。ポリアクリルアミドヒドラジド（ＰＡＨ）は、公開米国特許出願第２００５０１５８７７０号において提供される方法によって合成することができる。簡単に言えば、凝縮器を備えた１００ｍｌの丸底フラスコ中で、２０ｍｌポリアクリルアミド（１ｍｍｏｌ，水中５０％，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．）を、１０ｍｌ蒸留（ＤＩ）水および２０ｍｌヒドラジン１水和物（４２０ｍｍｏｌ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．）と混合する。反応液を６０分間マイクロ波処理する。室温に冷却後、反応液を等量のメタノールを用いて沈殿させ、遠心し、そしてデカントする。残渣を５０ｍｌのＤＩ水に採取し、そして沈殿を全３回反復する。最終残渣をＤＩ水に溶解し、そして凍結乾燥して微細、白色の吸湿性粉末を得る。適当な溶媒中で、得られるＰＡＨをチオール化剤、例えばチオール−ｄＰＥＧ−ＮＨＳエステル（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，Ｐｏｗｅｌｌ，ＯＨ）またはＴｒａｕｔ’ｓ試薬と反応させて、利用できるヒドラジド（ｚ＝５〜４０）の一部分（例えば、ほぼ５０〜７５％）をチオール化し、そして開示された方法において使用できる重合多官能性ヒドラジドチオール・リンカーを提供する。さらなるチオール化試薬は、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，”Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，”Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９６，ＩＳＢＮ  ０−１２−３４２３３６−８において見出だすことができ、これは引用によって本明細書に組み入れられている。
【０１４２】
２つの方法、すなわち、ポリアクリルアミドヒドラジドチオール・リンカーを最初に合成し、そして開示された複合方法を使用するか、あるいは最初にＰＡＨを１つの分子と反応させ、ＰＡＨをチオール化し、次に、ここでチオール化された最初の分子を第２の分子と反応させるか、いずれか１つにおいてポリアクリルアミドヒドラジドチオール・リンカーを使用／作成することが可能である。
【０１４３】
本発明の原理は、いくつかの図で示された実施態様に関して記述されたけれども、その実施態様の細部がそのような原理から逸脱することなく改変されてもよいことは当業者には明らかである。例えば、詳細な説明は抗体−酵素コンジュゲートに焦点を絞ったけれども、リンカーおよび方法は、抗体と、他の検出可能な標識、例えばナノ粒子（例えば、金属および半導体ナノ粒子、例えばそれぞれ金ナノ粒子および量子ドット（ｄｏｔ））、蛍光分子、蛍光発生（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ）分子、着色分子、発色（ｃｏｌｏｒｏｇｅｎｉｃ）分子および常磁性構築物（例えば常磁性イオンのキレート）とのコンジュゲートを含む、すべての種類のコンジュゲートを作成するために使用することができる。管理（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）療法のための抗体のコンジュゲート（例えば、抗体と薬物分子、毒素および放射性構築物、例えば放射性金属イオンのキレートとのコンジュゲート）もまた意図される。提供される特定の実施例はヒドラジドとカルボヒドラジド基を有するヒドラジドチオール・リンカーの使用を示すけれども、いかなる「ヒドラジド基」も、開示された方法および開示されたコンジュゲートの両方において示されたヒドラジドまたはカルボヒドラジド基の代わりに用いられてもよい。さらにまた、１個以上の単一ヒドラジドチオール・リンカーがコンジュゲートを形成するために使用されてもよいが、また、コンジュゲートを形成するために複数の異なるヒドラジドチオール・リンカーを使用することも可能であることを理解すべきである。開示されたコンジュゲートは、検出可能な標識に結合された特定の結合分子が使用できるいかなる種類のアッセイにおいても、例えば、具体的に説明された免疫組織化学的アッセイに加えていかなる種類のイムノアッセイにおいても、またはいかなる種類のインサイチュー・ハイブリダイゼーションアッセイにおいても使用することができる。検出プロトコールは手動的にまたは自動化方式で実施することができる。さらにまた、開示されたリンカーは、基質に分子を結合させるために表面を修飾するために使用されてもよく、そしてそのような表面修飾反応は開示された方法を使用して実施することができる。本発明は、次に示す請求項の範囲および精神の中にはいるようなすべてのその修飾物、改変物および等価物を含む。
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】開示されたＦｃ特異的抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲートおよびストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートを用いる扁桃組織におけるＫａｐｐａの検出のための染色パターンを示す一連の画像である。
【図２】開示されたＦｃ特異的抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲートおよびストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートを用いる扁桃組織におけるＬａｍｂｄａの検出のための染色パターンを示す一連の画像である。
【図３】開示されたＦｃ特異的抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲートおよびストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートを用いる肺組織におけるＣＭＶの検出のための染色パターンを示す一連の画像である。
【図４】開示されたＦｃ特異的抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲートおよびストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートを用いる脾臓組織におけるＥＢＥＲの検出のための染色パターンを示す一連の画像である。
【図５】開示されたＦｃ特異的抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲートおよびストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートを用いるＣａＳｋｉ異種移植組織におけるＨＰＶの検出のための染色パターンを示す一連の画像である。
【図６】開示されたＦｃ特異的抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲートおよびストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートを用いるＨｅＬａ異種移植組織におけるＨＰＶの検出のための染色パターンを示す一連の画像である。
【図７】開示されたＦｃ特異的抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲートおよびストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートを用いるＳｉＨａ異種移植組織におけるＨＰＶの検出のための染色パターンを示す一連の画像である。
【図８】開示されたＦｃ特異的抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲートおよびストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートを用いる細胞学的サンプルにおけるＨＰＶの検出のための染色パターンを示す一連の画像である。
【図９】開示されたＦｃ特異的抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲートおよびストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートを用いる筋肉組織におけるアクチンの検出のための染色パターンを示す一連の画像である。
【図１０】開示された抗体−酵素コンジュゲートの感度の相互の比較、および開示された抗体−酵素コンジュゲートの感度と他の方法によって作成された抗体−体（ｂｏｄｙ）酵素コンジュゲートの感度との比較を示す一連の画像である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2009521405.tif 000039
【図１Ｃ】
2009521405.tif 000040
【図１Ｄ】
2009521405.tif 000041
【図２Ａ】
2009521405.tif 000042
【図２Ｂ】
2009521405.tif 000043
【図２Ｃ】
2009521405.tif 000044
【図２Ｄ】
2009521405.tif 000045
【図３Ａ】
2009521405.tif 000046
【図３Ｂ】
2009521405.tif 000047
【図３Ｃ】
2009521405.tif 000048
【図３Ｄ】
2009521405.tif 000049
【図４Ａ】
2009521405.tif 000050
【図４Ｂ】
2009521405.tif 000051
【図４Ｃ】
2009521405.tif 000052
【図４Ｄ】
2009521405.tif 000053
【図５Ａ】
2009521405.tif 000054
【図５Ｂ】
2009521405.tif 000055
【図５Ｃ】
2009521405.tif 000056
【図６Ａ】
2009521405.tif 000057
【図６Ｂ】
2009521405.tif 000058
【図６Ｃ】
2009521405.tif 000059
【図７Ａ】
2009521405.tif 000060
【図７Ｂ】
2009521405.tif 000061
【図８Ａ】
2009521405.tif 000062
【図８Ｂ】
2009521405.tif 000063
【図８Ｃ】
2009521405.tif 000064
【図９Ａ】
2009521405.tif 000065
【図９Ｂ】
2009521405.tif 000066
【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
2009521405.tif 000068
【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
2009521405.tif 000070
【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
2009521405.tif 000072
【図１０Ｇ】
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