(57)【要約】  少なくとも１３アミノ酸残基を有し、ヒスチジン及び１つ又は複数の疎水性アミノ酸残基を含み、Ｃ末端でエステル化若しくはアミド化及び／又はＮ末端でアシル化されていてもよく、正味の正電荷が＋１を超えるジアステレオマーペプチド及びその環状誘導体を提供する。上記ペプチドは、非天然アミノ酸を含めた他のアミノ酸残基を含有していてもよい。上記ペプチドは癌の治療に特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１３アミノ酸残基を有し、ヒスチジン及び１つ又は複数の疎水性アミノ酸残基を含み、Ｃ末端でエステル化若しくはアミド化及び／又はＮ末端でアシル化されていてもよく、配列番号４５〜５２に記載のペプチドを除外した、正味の正電荷が＋１を超えるジアステレオマーペプチド及びその環状誘導体。
【請求項２】
前記１つ又は複数の疎水性アミノ酸残基が、天然に存在する又は存在しない疎水性アミノ酸に由来する、請求項１に記載のジアステレオマーペプチド。
【請求項３】
前記１つ又は複数の疎水性アミノ酸残基が、アラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン又はバリンから選択される天然に存在するα−アミノ酸に由来する、請求項２に記載のジアステレオマーペプチド。
【請求項４】
前記１つ又は複数の疎水性アミノ酸残基が、アラニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、又はバリン残基から選択される、請求項３に記載のジアステレオマーペプチド。
【請求項５】
配列番号２から８までに記載のペプチドから選択される、請求項４に記載のジアステレオマーペプチド。
【請求項６】
１つ又は複数の塩基性アミノ酸残基を含む、請求項１に記載のジアステレオマーペプチド。
【請求項７】
前記１つ又は複数の塩基性アミノ酸残基が、天然に存在する又は存在しない塩基性アミノ酸に由来する、請求項６に記載のジアステレオマーペプチド。
【請求項８】
前記１つ又は複数の塩基性アミノ酸残基がリシン、アルギニン又はオルニチン残基から選択される、請求項７に記載のジアステレオマーペプチド。
【請求項９】
配列番号９から２６までに記載のペプチドから選択される、請求項８に記載のジアステレオマーペプチド。
【請求項１０】
疎水性アミノ酸残基又は塩基性アミノ酸残基以外の天然に存在する又は存在しないアミノ酸残基を、好ましくはＮ末端及び／又はＣ末端に含む、請求項１に記載のジアステレオマーペプチド。
【請求項１１】
前記アミノ酸残基が、Ｎ末端又はＣ末端のアスパラギン酸又はグルタミン酸である、請求項１０に記載のジアステレオマーペプチド。
【請求項１２】
前記アミノ酸残基が、アスパラギン、グルタミン、グリシン、セリン、トレオニンから選択され、好ましくはＮ末端及び／又はＣ末端にある、請求項１０に記載のジアステレオマーペプチド。
【請求項１３】
配列番号２７〜３３に記載のペプチドから選択される、請求項１２に記載のジアステレオマーペプチド。
【請求項１４】
前記ペプチドが、環状である、請求項１に記載のジアステレオマーペプチド。
【請求項１５】
前記環状ペプチドが配列番号３４〜３５に記載のペプチドから選択される、請求項１４に記載のジアステレオマーペプチド。
【請求項１６】
前記ペプチドが、少なくとも２個の炭素原子を有するアシル基によってＮ末端でアシル化されている、請求項１に記載のジアステレオマーペプチド。
【請求項１７】
前記アシル基が、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、ペンタノイル基、ヘキサノイル基、及び少なくとも８個の炭素原子の飽和又は不飽和脂肪酸のアシル基から選択される、請求項１６に記載のジアステレオマーペプチド。
【請求項１８】
前記脂肪酸が、オクタン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、リグノセリン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、トランス−ヘキサデカン酸、エライジン酸、ラクトバシル酸、ツベルクロステアリン酸、及びセレブロン酸から選択される、請求項１７に記載のジアステレオマーペプチド。
【請求項１９】
前記アシル化ペプチドが配列番号３６〜３９に記載のペプチドから選択される、請求項１７に記載のジアステレオマーペプチド。
【請求項２０】
一方のアミノ酸残基のα−アミノ及びもう一方のアミノ酸残基のα−カルボキシを介して共有結合によってＮ末端アミノ酸、Ｃ末端アミノ酸、及び／又は前記ペプチドの配列中にある２アミノ酸残基に連結された疎水性アミノ−カルボン酸部分を含む、請求項１に記載のジアステレオマーペプチド。
【請求項２１】
前記疎水性アミノ−カルボン酸が少なくとも４個の炭素原子のα−アミノ−カルボン酸である、請求項２０に記載のジアステレオマーペプチド。
【請求項２２】
前記α−アミノ−カルボン酸が好ましくは前記ペプチドのＣ末端に連結されたα−アミノヘキサン酸である、請求項２１に記載のジアステレオマーペプチド。
【請求項２３】
配列番号４０に記載のペプチドから成る、請求項２２に記載のジアステレオマーペプチド。
【請求項２４】
前記疎水性アミノ−カルボン酸が少なくとも４個の炭素原子のω−アミノ−カルボン酸である、請求項２０に記載のジアステレオマーペプチド。
【請求項２５】
前記ω−アミノ−カルボン酸が、４−アミノ−酪酸、６−アミノ−ヘキサン酸、８−アミノ−オクタン酸、１０−アミノ−デカン酸、１２−アミノ−ドデカン酸、１４−アミノ−ミリスチン酸、１６−アミノ−パルミチン酸、１８−アミノ−ステアリン酸、１８−アミノ−オレイン酸、１６−アミノ−パルミトレイン酸、１８−アミノ−リノール酸、１８−アミノ−リノレン酸、又は２０−アミノ−アラキドン酸から選択される、請求項２４に記載のジアステレオマーペプチド。
【請求項２６】
前記ω−アミノ−カルボン酸が６アミノヘキサン酸又は８アミノオクタン酸である、請求項２５に記載のジアステレオマーペプチド。
【請求項２７】
配列番号４１から４３までに記載のペプチドから選択される、請求項２６に記載のジアステレオマーペプチド。
【請求項２８】
少なくとも４個の炭素原子のα−アミノ−カルボン酸部分及びω−アミノ−カルボン酸部分の両方を含む、請求項２０に記載のジアステレオマーペプチド。
【請求項２９】
前記α−アミノ−カルボン酸がα−アミノオクタン酸であり、及び前記ω−アミノ−カルボン酸が８−アミノ−オクタン酸である、請求項２８に記載のジアステレオマーペプチド。
【請求項３０】
配列番号４４に記載のペプチドから成る、請求項２９に記載のジアステレオマーペプチド。
【請求項３１】
ホーミングドメインに結合している、請求項１に記載のジアステレオマーペプチド。
【請求項３２】
前記ホーミングドメインが、インテグリンホーミングドメインＲＧＤ又はホルモン残基を含むペプチドから選択される、請求項３１に記載のジアステレオマーペプチド。
【請求項３３】
１３、１４、１５、又は１６のアミノ酸残基を有する、請求項１に記載のジアステレオマーペプチド。
【請求項３４】
請求項１から３３までのいずれか一項に記載のジアステレオマーペプチド及び、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項３５】
癌治療用の、請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記癌が固形及び非固形腫瘍、原発腫瘍、又は転移癌から選択される、請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
前記癌が、前立腺癌、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、結腸直腸癌、頭頚部癌、精巣癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、肝臓癌、腎癌、消化器癌、骨癌、内分泌系癌、リンパ系癌、黒色腫、基底及び扁平細胞癌、星状細胞腫、乏突起細胞腫、髄膜腫、神経芽腫、グリア芽腫、上衣細胞腫、神経鞘腫、神経線維肉腫、神経芽腫、髄芽腫、線維肉腫、類表皮癌、皮膚癌、及び白血病から選択される、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
局所適用のための、請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
ざ瘡；ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）による慢性胃粘膜感染、腸細菌感染、抗生物質耐性細菌、例えば化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）及びメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）によって引き起こされる感染を含む細菌感染など、病原体によって引き起こされる局所感染；爪真菌、カンジダアルビカンスなどの酵母によって引き起こされる感染、頭皮の真菌感染を含む真菌感染；手術又は外傷性の損傷に関連した真菌又は細菌感染；糖尿病患者の足の潰瘍など、慢性又は治癒が不十分な皮膚病変；腟感染症（腟炎）；眼及び耳の感染症；熱傷創；口及び咽頭の感染；並びに嚢胞性繊維症、肺気腫、及び喘息における慢性肺感染などの限局性感染の局所治療用の、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
細菌又は真菌感染治療用の、請求項３９に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
溶液、コロイド分散、クリーム、ローション、ゲル、フォーム、乳剤、スプレー、エアゾール、又は鼻若しくは肺適用のための他の製剤の形態の、請求項３４から４０までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
細胞培養物中のマイコプラズマ感染を制御するため、食品保存のため、又は食品補助剤として使用するための、請求項１から３３までのいずれか一項に記載のジアステレオマーペプチドを含む組成物。
【請求項４３】
請求項１から３３までのいずれか一項に記載のジアステレオマーペプチドを含む獣医学組成物。
【請求項４４】
癌治療用の医薬組成物を調製するための、請求項１から３３までのいずれか一項に記載のジアステレオマーペプチドの使用。
【請求項４５】
細菌又は真菌感染治療用の医薬組成物を調製するための、請求項１から３３までのいずれか一項に記載のジアステレオマーペプチドの使用。
【請求項４６】
請求項１に記載のジアステレオマーペプチドの治療有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む癌の治療方法。
【請求項４７】
請求項１に記載のジアステレオマーペプチドの治療有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む感染の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒスチジン含有ジアステレオマーペプチドと、それらを含む医薬組成物とに関する。
【背景技術】
【０００２】
化学抗癌剤は、非特異的であり、その結果、健全な組織も破損する。したがって、早期検出、及びその初期段階での疾患の積極的治療での進歩が報告されているにもかかわらず、総合的な死亡率は低下していないようである。これによって、新規な作用機序を有し、固有の耐性を克服する可能性のある新薬の探索が刺激されてきた。
【０００３】
１つのアプローチは、アポトーシスを制御するポリペプチドを開発することである。それに代わるアプローチは、細胞溶解性のペプチドを用いることである。この観点から、細胞溶解性ペプチドの大ファミリーに属するサブ集団である抗菌ペプチドが、様々な型の癌細胞に対してインビトロで作用することがいくつかの研究によって報告された（Ｂａｋｅｒら、１９９３年；Ｅｌｌｅｒｂｙら、１９９９年；Ｃｈｅｎら、２００１年；Ｍａｉら、２００１年）。これらのペプチドは、昆虫、両生類、及び哺乳動物を含めた全ての生物の自然免疫における中心的役割を有することが知られている（Ｂｏｍａｎ、１９９５年）。例には、ヒトデフェンシン（Ｂｉｒａｇｙｎら、２００１年；Ｙａｎｇら、２００２年；Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍら、２００３年）、セクロピン（Ｈｕｉら、２００２年）、セクロピン−マガイニンハイブリッド（Ｓｈｉｎら、２００１年；Ｐａｒｋら、２００３年）、マゲイニン（Ｂａｋｅｒら、１９９３年）、ホーミングドメイン結合ペプチド（Ｅｌｌｅｒｂｙら、１９９９年；Ｃｈｅｎら、２００１年；Ｍａｉら、２００１年）、プロペプチド（Ｗａｒｒｅｎら、２００１年）、及び他のもの（Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒら、２００３年；Ｗａｎｇ及びＷａｎｇ、２００４年）が含まれる。これらのペプチドは、細菌細胞質膜の主要成分である負電荷のリン脂質膜に選択的に結合し、破壊する。しかし、何故それらの一部が、正常細胞と比較して、いくつかの型の癌細胞により強固に結合して死滅させるのかは明らかでない（Ｃｈａｎら、１９９８年；Ｐａｐｏ及びＳｈａｉ、２００３年）。
【０００４】
インビトロにおける、これらのペプチドの強力な抗癌活性にもかかわらず、全てがＬ−アミノ酸である天然の抗菌ペプチドの使用に関するインビボでの研究は、主として血清中でのそれらの活性の減失のため極めて限定的であり、これは主として、それらが血清成分に結合すること、及びそれらの酵素的分解に起因する。これらの研究には、（ｉ）特定の組織への指向性を有するホーミングドメインに結合したアポトーシスペプチド（Ｅｌｌｅｒｂｙら、１９９９年；Ｃｈｅｎら、２００１年）、並びに（ｉｉ）卵巣癌に対して腹腔内（ｉ．ｐ．）注射されたマガイニン由来の抗菌ペプチド及び全てがＤ−アミノ酸であるその類似体（Ｂａｋｅｒら、１９９３年）が含まれる。
【０００５】
本発明者らは、非細胞選択的な溶解ペプチドにＤ−アミノ酸を導入することによって、細胞に対する選択的な殺作用活性を有するジアステレオマーペプチドが生じたことを以前に示した（Ｏｒｅｎ及びＳｈａｉ、１９９６年）。細胞は、それらの外表面で、負電荷のリン脂質に富んでいる。さらに、これらのペプチドは、細菌に対して有効であり、それらの一部は癌細胞に対しても活性であったことも示した（Ｐａｐｏ及びＳｈａｉ、２００３年）。最も重要なことは、このファミリーのペプチドが血清中でそれらの活性を保持し、それらの酵素的分解が制御できたことである。これらのペプチドの１つである、ロイシン、アルギニン、及びリシン残基で構成された１５アミノ酸のジアステレオマーは、マウス黒色腫及び肺癌細胞系に対して活性であり、検出可能な副作用なしに、マウスでの肺転移形成を有意に抑制することが最近示された（Ｐａｐｏら、２００３年）。
【０００６】
同一出願者による国際公開第９７／３１０１９号、第９８／３７０９０号、及び第０２／０４０５２９号パンフレットは、正味の正電荷が＋１より大きい、Ｌ−アミノ酸及びＤ−アミノ酸残基の両方を含むペプチドについて記載している。国際公開第９８／３７０９０号パンフレットは、様々な比率の少なくとも１種類の疎水性アミノ酸及び少なくとも１種類の正電荷のアミノ酸で構成され、その配列中少なくとも１アミノ酸残基がＤ−アミノ酸である非天然の合成ペプチドについて記載する。６から３０アミノ酸残基を含むいくつかのジアステレオマーが、国際公開第９８／３７０９０号パンフレットに開示されているが、生物活性が試験されたのは、一部の６量体、８量体、及び１２量体ペプチドのみであった。様々な比率のロイシン及びリシンのみで構成され、その中で配列の１／３がＤ−アミノ酸から成る一部の短鎖モデルペプチド（長さ１２アミノ酸）がさらに研究され、それらの一部は溶血活性を低減したことが判明した（Ｈｏｎｇら、１９９９年；Ｏｒｅｎら、１９９７年）。
【０００７】
国際公開第０２／０４０５２９号パンフレットは、少なくとも１５アミノ酸残基を有し、様々な比率の疎水性アミノ酸ロイシン、正電荷アミノ酸リシン、及び任意選択でアルギニンで構成されたペプチドについて記載している。上記ペプチドの一部は、抗菌、抗真菌、抗マイコプラズマ、及び抗癌活性を示すことが示された。しかし、抗癌活性を示すペプチドは、癌の治療に用いられたものよりわずかに（３０％〜１００％）高い濃度で既に、試験された動物に毒性であることが示され、リポソーム内に封入された場合にのみ、より高濃度、かつより有効な濃度で投与することができた。
【０００８】
本発明者らによるいくつかの刊行物（Ｍａｌｉｎａ及びＳｈａｉ、２００５年；Ａｖｒａｈａｍｉ及びＳｈａｉ、２００４年；Ａｖｒａｈａｍｉ及びＳｈａｉ、２００３年）は、Ｄ−アミノ酸及びＬ−アミノ酸の両方を含有する生物学的に不活性な陽イオン性ペプチドのＮ末端に、様々な長さ（１０、１２、１４、又は１６炭素原子）の脂肪族酸を付加することが、その結果生じるリポペプチドに様々な細胞に対する分解活性を与えるのに十分であることを開示するものである。国際公開第２００４／１１０３４１号パンフレットは、脂肪酸に結合したペプチドを含むそのような親油性結合体を開示し、上記ペプチドは、最大１２アミノ酸残基を有し、ヒスチジン残基及びＤ−アミノ酸残基を含有し得る。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、少なくとも１３アミノ酸残基を有し、ヒスチジン及び１つ又は複数の疎水性アミノ酸残基を含み、Ｃ末端でエステル化若しくはアミド化及び／又はＮ末端でアシル化されていてもよく、配列番号４５〜５２に記載のペプチドを除外した、正味の正電荷が＋１を超えるジアステレオマーペプチド及びその環状誘導体に関する。
【００１０】
本発明のジアステレオマーペプチドは、好ましくは１３又は１４アミノ酸残基、より好ましくは１５又は１６アミノ酸残基、環状ペプチドでは１７アミノ酸残基を含有する。それらは、任意の数、例えば１から１０のヒスチジン残基を含み得る。その配列中のアミノ酸残基のいずれもが、Ｈｉｓ又は別の残基のいずれかのＤ−アミノ酸残基であり得る。Ｄ−アミノ酸残基の数は様々であり得、１から１０残基、好ましくは３、７、９残基であり得、より好ましくは配列中の５残基がＤ−アミノ酸残基（ペプチドが１５量体の場合にはその残基の１／３）である。
【００１１】
上記１つ又は複数の疎水性アミノ酸残基は、天然に存在する又は存在しない疎水性アミノ酸に由来するものであり得る。好ましい一実施形態では、上記疎水性アミノ酸残基が、アラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、又はバリンから選択される天然に存在するα−アミノ酸に由来する。好ましい実施形態では、配列番号２から８までに記載のペプチドによって例示されるように、上記疎水性アミノ酸残基が、アラニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、又はバリン残基から選択される。
【００１２】
一実施形態では、配列中、５アミノ酸残基（１／３）がＤ−アミノ酸残基である、配列番号２の１４量体ペプチド及び配列番号３〜４に記載の１５量体ペプチドによって例示されるように、上記ペプチドがＨｉｓと、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｔｒｐ又はＩｌｅから選択される疎水性アミノ酸残基とで構成されており、かつＣ末端でアミド化されたものであり得る。別の実施形態では、配列中、３から９アミノ酸残基がＤ−アミノ酸残基である、配列番号５〜８の４種の１５量体ペプチドによって例示されるように、上記ペプチドがＨｉｓ及びＬｅｕのみで構成されており、かつＣ末端でアミド化されたものであり得る。
【００１３】
本発明のジアステレオマーペプチドは、天然に存在する又は存在しない塩基性アミノ酸に由来するものであり得る１つ又は複数の塩基性アミノ酸残基を含み得る。好ましい実施形態では、配列番号９から２６までに記載のペプチドによって例示されるように、上記塩基性アミノ酸残基がリシン、アルギニン、又はオルニチン残基から選択される。
【００１４】
一実施形態では、上記ジアステレオマーペプチドがヒスチジン、リシン、及び疎水性アミノ酸残基で構成され、上記疎水性アミノ酸残基は、ロイシン及びイソロイシン（配列番号９）、又はロイシン及びバリン（配列番号１０）、又はロイシン、バリン及びトリプトファン（配列番号１１）である。別の好ましい実施形態では、上記ペプチドがヒスチジン、ロイシン、及びリシン残基のみで構成される。そのようなペプチドの例は、配列番号１２〜１７の１５量体ペプチドである。
【００１５】
別の実施形態では、本発明のジアステレオマーペプチドが、ヒスチジン、リシン、アルギニン、並びに１つ又は複数の疎水性アミノ酸残基、例えばＬｅｕ及びＶａｌ（配列番号１８）、又はＩｌｅ、Ｌｅｕ、及びＶａｌ（配列番号１９）で構成される。本発明による、より好ましいジアステレオマーペプチドは、ヒスチジン、リシン、アルギニン、及びロイシンのみで構成されたペプチドである。そのようなペプチドの例は、配列番号２０から２５の１５量体ペプチド及び１６量体ペプチドである。別の好ましい実施形態では、配列番号２６のペプチドによって例示されるように、上記ジアステレオマーペプチドがヒスチジン、リシン、ロイシン、及びオルニチンのみで構成される。
【００１６】
さらに別の実施形態では、本発明のジアステレオマーペプチドは、ヒスチジン以外に、１つ又は複数の疎水性アミノ酸残基と、可能性として１つ又は複数の塩基性アミノ酸残基と、疎水性又は塩基性アミノ酸残基以外の天然に存在する又は存在しないアミノ酸残基に由来する追加残基とを含み得る。この追加のアミノ酸は、上記ペプチドの配列中にも位置し得るが、好ましくはそれはＮ末端及び／又はＣ末端に位置する。上記アミノ酸が、アスパラギン酸又はグルタミン酸のように負電荷である場合、それは常にＮ末端又はＣ末端に位置する。上記追加アミノ酸残基がアスパラギン、グルタミン、グリシン、セリン、又はトレオニンである場合、それは、上記配列中に位置し得るが、好ましくはＮ末端及び／又はＣ末端に位置するであろう。そのようなジアステレオマーペプチドの例は、配列番号２７〜３３に記載のペプチドである。
【００１７】
上記追加アミノ酸は非天然アミノ酸でもあり得る。本明細書で使用される場合、上記追加アミノ酸又は塩基性アミノ酸残基に関する、「非天然アミノ酸」という用語は、化学的誘導体、例えば、ヒドロキシプロリン、α−カルボキシグルタミン酸、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム、及びＯ−ホスホセリン；Ｎ−アルキル、好ましくはＮ−メチルアミノ酸、例えば、Ｎ−メチル−バリン、Ｎ−メチル−イソロイシン、Ｎ−メチル−ロイシン、Ｎ−メチル−アラニン；アミノ酸骨格にメチレン残基が付加された化合物、例えば、ホモセリン、ホモロイシン、ホモイソロイシン、ホモリシン、又はアミノ酸骨格からメチレン残基が除去されている化合物、例えば、ノルバリン（Ｎｖａ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）；オルニチン（２，５−ジアミノペンタン酸）、シトルリン（２−アミノ−５−（カルバモイルアミノ）ペンタン酸）、ジアミノ酪酸（ＤＡＢ）、２−メチル−アラニンなど、改変された天然のα−アミノ酸を指す。好ましい一実施形態では、上記非天然アミノ酸が、塩基性アミノ酸であるオルニチンである。
【００１８】
本発明の一実施形態では、上記ジアステレオマーペプチドは、配列番号２７から３０及び３１〜３３のペプチドで例示されるように、Ｎ末端にグルタミン、アスパラギン、又はトレオニンなどの追加アミノ酸を有するか、又は配列番号３１のペプチドのように、Ｃ末端にグリシンを有するか、又はＮ末端のトレオニン及びＣ末端のグリシン（配列番号３２）、若しくはＮ末端のアスパラギン及びＣ末端のセリン（配列番号３３）を有する。
【００１９】
別の実施形態では、上記ジアステレオマーペプチドは、配列番号２７のペプチドのように、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、及びＬｙｓ残基と、Ｃ末端のオルニチン残基とを含有する。
【００２０】
さらに別の実施形態では、本発明は、上記ジアステレオマーペプチドの環状誘導体に関する。環状誘導体は、当技術分野で知られている方法で形成することができる。そのような環状ペプチドの例には、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、及びＬｙｓ残基と、環状誘導体を形成するための２つの末端システイン残基とを含有する、配列番号３４及び３５の１７量体ペプチドが含まれる。
【００２１】
さらに別の実施形態では、本発明のジアステレオマーペプチドは、少なくとも２個の炭素原子を有するアシル基によってＮ末端でアシル化されたものであり得る。上記アシル基は、最大６個の炭素原子のアルカン酸に由来するものであり得、例えば、アセチル、プロピオニル、ブチリル、ペンタノイル、若しくはヘキサノイル、又は少なくとも８個の炭素原子の飽和若しくは不飽和脂肪酸のアシル基であり得る。脂肪酸の例には、オクタン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、リグノセリン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、トランス−ヘキサデカン酸、エライジン酸、ラクトバシル酸、ツベルクロステアリン酸、及びセレブロン酸が含まれる。
【００２２】
好ましい実施形態では、上記ペプチドは、配列番号３６の１５量体Ｌｅｕ−Ｈｉｓペプチドによって例示されるようにアセチル基によって、又は配列番号３７の１５量体Ｌｅｕ−Ｈｉｓペプチドによって例示されるようにヘキサノイル基によって、又は配列番号３８の１５量体Ｌｅｕ−Ｈｉｓペプチドによって例示されるようにオクタノイル基によって、又は配列番号３９の１５量体Ｌｅｕ−Ｈｉｓペプチドによって例示されるようにデカノイル基によってアシル化される。
【００２３】
上記ペプチドは、Ｎ末端が疎水性Ｃ２〜Ｃ２０アルキル若しくはアルケニルで置換されていてもよく、かつ／又はＣ末端がアミド化若しくはエステル化されていてもよい。上記エステルは疎水性Ｃ２〜Ｃ２０脂肪族アルコール、好ましくはＣ５〜Ｃ１８脂肪族アルコールとの反応によって取得することが好ましく、及び上記アミドはアンモニア又はアルキルアミンとの反応によって取得し、ここで上記アルキルはＣ２〜Ｃ２０アルキル基、好ましくはＣ５〜Ｃ１８アルキル基である。
【００２４】
「Ｃ２〜Ｃ２０アルキル」という用語は、本明細書で使用される場合、２〜２０個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐アルキル基を指し、これには、例えば、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、第三−ブチル、ｎ−ヘプチル、ｎ−ヘキシル、−Ｃ１０Ｈ２１、−Ｃ１５Ｈ３１、−Ｃ１６Ｈ３３、−Ｃ１７Ｈ３５、−Ｃ１８Ｈ３７、及び−Ｃ２０Ｈ４１などが含まれる。「Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル」という用語は、２〜２０個の炭素原子と、末端二重結合などの１又は複数の二重結合を有する直鎖状又は分岐炭化水素基を指し、これには、例えば、ビニル、プロプ−２−エン−１−イル、ブト−３−エン−１−イル、ペント−４−エン−１−イル、ヘキシ−５−エン−１−イル、−Ｃ１６Ｈ３１、及びＣ１８Ｈ３５が含まれる。
【００２５】
さらに別の実施形態では、本発明のジアステレオマーペプチドは、一方のアミノ酸残基のα−アミノ及びもう一方のアミノ酸残基のα−カルボキシを介して、共有結合によってＮ末端アミノ酸、Ｃ末端アミノ酸、及び／又は上記ペプチドの配列中にある２個のアミノ酸残基に連結されていてもよい疎水性アミノ−カルボン酸部分を含む。上記ペプチドのＣ末端の疎水性アミノ−カルボン酸残基はアミド化されていてもよい。
【００２６】
上記疎水性アミノ−カルボン酸のアミノ基は、上記分子の任意の位置に位置し得る。一実施形態では、上記疎水性のアミノ−カルボン酸は、限定されるものではないが、α−アミノ−ヘキサン酸などの少なくとも４個の炭素原子のα−アミノ−カルボン酸である。そのようなペプチドの一例が、配列番号４０に記載のアシル化Ｌｅｕ−Ｈｉｓジアステレオマーペプチドであり、上記ペプチド中では、配列中、α−アミノ−ヘキサン酸部分がＨｉｓ残基とＬｅｕ残基との間に挿入されている。
【００２７】
別の好ましい実施形態では、上記疎水性アミノ−カルボン酸が、限定されるものではないが、４−アミノ−酪酸、６−アミノ−ヘキサン酸、８−アミノ−オクタン酸、１０−アミノ−デカン酸、１２−アミノ−ドデカン酸、１４−アミノ−ミリスチン酸、１６−アミノ−パルミチン酸、１８−アミノ−ステアリン酸、１８−アミノ−オレイン酸、１６−アミノ−パルミトレイン酸、１８−アミノ−リノール酸、１８−アミノ−リノレン酸、又は２０−アミノ−アラキドン酸などの、少なくとも４個の炭素原子のω−アミノ−カルボン酸である。
【００２８】
本発明による好ましいω−アミノ−カルボン酸は、６−アミノ−ヘキサン酸（６−アミノ−カプロン酸）及び８−アミノ−オクタン酸（８−アミノ−カプリル酸）である。そのようなペプチドの例には、８−アミノ−オクタン酸部分がＣ末端にあり、かつアミド化されている配列番号４１記載のアシル化Ｌｅｕ−Ｈｉｓジアステレオマーペプチドと、配列中、６−アミノ−ヘキサン酸部分がＨｉｓ残基とＬｅｕ残基との間に挿入されている配列番号４２記載のアシル化Ｌｅｕ−Ｈｉｓジアステレオマーペプチドと、配列中、８−アミノ−オクタン酸部分がＨｉｓ残基とＬｅｕ残基との間に挿入されている配列番号４３記載のアシル化Ｌｅｕ−Ｈｉｓジアステレオマーペプチドとがある。
【００２９】
別の実施形態では、上記ジアステレオマーペプチドがα−アミノ−カルボン酸部分及びω−アミノ−カルボン酸部分の両方を含有し得る。そのような実施形態の一例が、配列番号４４のＬｅｕ−Ｈｉｓペプチドであり、上記ペプチド中では、配列中、α−アミノ−オクタン酸部分がＬｅｕ残基とＨｉｓ残基との間に挿入されており、８−アミノ−オクタン酸部分がＨｉｓ残基とＬｅｕ残基との間に挿入されている。
【００３０】
本発明のさらに別の実施形態では、上記ジアステレオマーペプチドは、限定されるものではないが、当技術分野でよく知られている通り、インテグリンホーミングドメインＲＧＤ又はホルモン残基を含むペプチドなど、ホーミングドメインと結合したものであり得る。
【００３１】
上述の通り、同一出願者による国際公開第２００４／１１０３４１号パンフレットは、広範には、＋１以上の電荷を有し、かつヒスチジン残基及びＤ−アミノ酸を含有し得るアシル化ペプチドを開示するものである。しかし、前記公報で開示されたペプチドは、最多で１２アミノ酸を有するものであり、本発明から除外される。
【００３２】
同一出願者による上述の国際公開第９８／３７０９０号パンフレットは、ヒスチジン及び疎水性アミノ酸を含むジアステレオマーペプチドのいくつかの配列を開示する（４６頁、ペプチド６７〜７２及び７９〜８０を参照）ものであるが、これは合成及び試験されていない。配列番号４５〜５２のこれらのペプチドは、請求項１における但し書によって本発明から除外されている。
【００３３】
本発明のジアステレオマーペプチドは、固形及び非固形腫瘍の癌の両方、及び原発腫瘍及び転移の両方の癌の治療に有用である。
【００３４】
本発明のペプチドで治療できる癌の例には、前立腺癌、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、結腸直腸癌、頭頚部癌、精巣癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、肝臓癌、腎癌、消化器癌、骨癌、内分泌系癌、リンパ系癌、黒色腫、基底及び扁平細胞癌、星状細胞腫、乏突起細胞腫、髄膜腫、神経芽腫、グリア芽腫、上衣細胞腫、神経鞘腫、神経線維肉腫、神経芽腫、髄芽腫、線維肉腫、類表皮癌、皮膚癌、及び白血病が含まれるが、これらに限定されない。
【００３５】
したがって、別の態様では、本発明は、本明細書中上記に定義した本発明のジアステレオマーペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００３６】
一実施形態では、本発明は、本発明のジアステレオマーペプチドを含む癌治療用の医薬組成物を提供する。好ましい実施形態では、上記癌が前立腺癌、乳癌、及び転移癌である。
【００３７】
一実施形態では、本発明は、例えば、細菌感染、とりわけ抗生物質に対して耐性を有する細菌によって引き起こされる感染、及び病原性の真菌によって引き起こされる感染など、病原体によって引き起こされる局所感染を治療するための、局所適用のための医薬組成物を提供する。そのような医薬組成物の使用の例には、ざ瘡；ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）による慢性胃粘膜感染、腸細菌感染、抗生物質耐性細菌、例えば化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）及びメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）によって引き起こされる感染を含む細菌感染など、病原体によって引き起こされる局所感染；爪真菌、カンジダアルビカンスなどの酵母によって引き起こされる感染、頭皮の真菌感染を含む真菌感染；手術又は外傷性の損傷に関連した真菌又は細菌感染；糖尿病患者の足の潰瘍など、慢性又は治癒が不十分な皮膚病変；腟感染症（腟炎）；眼及び耳の感染症；熱傷創；口及び咽頭の感染；並びに嚢胞性繊維症、肺気腫、及び喘息における慢性肺感染などの限局性感染の局所治療が含まれる。
【００３８】
上記医薬組成物は、溶液、コロイド分散、クリーム、ローション、ゲル、フォーム、乳剤、スプレー、エアゾール、又は鼻若しくは肺適用のための他の製剤の形態であり得る。
【００３９】
本発明のジアステレオマーペプチドは、マイコプラズマに対して有効であり、さらに、前記ジアステレオマーペプチドで細胞培養物を処置するステップを含む方法で、細胞培養物中のマイコプラズマ感染を制御／排除するのに使用できる。
【００４０】
したがって、本発明は、細胞培養物中のマイコプラズマ感染を制御するため、食品保存のため、又は食品補助剤として使用するための、本発明のジアステレオマーペプチドを含む組成物にも関する。
【００４１】
別の実施形態では、本発明は、本発明のジアステレオマーペプチドを含む獣医学組成物に関する。
【００４２】
本発明はさらに、細菌又は真菌感染治療用の局所適用のための医薬組成物を調製するため、或いは癌治療用の医薬組成物を調製するための、本発明のジアステレオマーペプチドの使用に関する。
【００４３】
本発明はさらに、局所適用によって治療できる、病原体によって引き起こされる感染を治療する方法に関し、この方法は、それを必要とする個体に、本発明のジアステレオマーペプチドを局所的に投与するステップを含む。
【００４４】
別の実施形態では、本発明は、悪性腫瘍を治療する方法に関し、この方法は、それを必要とする個体に、本発明のジアステレオマーペプチドを治療有効量投与するステップを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
本発明の少なくとも１３アミノ酸残基のジアステレオマーペプチドは、１又は複数のヒスチジン残基を含むことを特徴とし、それゆえに国際公開第０２／０４０５２９号パンフレットに開示されている１５量体ペプチドとは異なる。それらは、上述の国際公開第９８／３７０９０号及び国際公開第０２／０４０５２９号パンフレットに開示されておらず、国際公開第０２／０４０５２９号パンフレットに開示されている最も近いジアステレオマー（ペプチド４）との比較で、強化されているか、又は類似した癌治療活性を示す。
【００４６】
本発明のジアステレオマーペプチドは、ここで動物モデルによって評価されている通り、非常に低い毒性の細胞溶解物質である。マウスで行った急性毒性試験において、本発明のペプチドは、それらの抗癌活性に必要な濃度よりかなり高い濃度で投与された場合でも、死亡が観測されなかったが、本明細書ではペプチド１（配列番号１）と名付けられている、国際公開第０２／０４０５２９号パンフレットに記載の１５量体ペプチド４は、これらの高濃度で投与された場合、死亡率１００％が観測された。
【００４７】
毒性を低減するため、またジアステレオマーペプチドの細胞溶解活性を改善するために、ジアステレオマーペプチドの長さ、両親媒性構成、正電荷アミノ酸の多様性、Ｄ−アミノ酸の位置及び数、Ｎ末端及びＣ末端における追加アミノ酸残基、並びに／又はＮ末端及びＣ末端への疎水性鎖の付加、並びに極性など、いくつかの重要因子のジアステレオマーペプチドの効力、選択性、及び活性スペクトラムへの影響を調べた。このため、本発明者らは、様々な比率のロイシン及びヒスチジンを基本的に含み、さらに、リシン及びアルギニン残基、並びに好ましくはＮ末端及び／又はＣ末端における追加アミノ酸残基を任意選択で含有する一連の直鎖状及び環状ジアステレオマーを合成し構造的及び機能的に性質決定した。上記ペプチドはその後、病原性の癌細胞、及びＮＩＨ−３Ｔ３正常線維芽細胞系などの正常哺乳類細胞に対する、それらの生物活性に関して性質決定され、それらの毒性がインビボで試験された。
【００４８】
本発明の新規ジアステレオマーの効力及び選択性は、抗癌アッセイでここに実証する。本明細書で開示したジアステレオマーは、いくつかの悪性細胞に対して、国際公開第０２／０４０５２９号パンフレットに開示されたペプチド１の活性と同様な活性を示し、他の細胞に対してはさらに活性である。さらに、それらは、それらがＮＩＨ−３Ｔ３正常線維芽細胞に対して作用する濃度より２〜８倍低い濃度で悪性細胞に対して活性である。加えて、それらは、国際公開第０２／０４０５２９号パンフレットに記載のペプチド１と比較して、マウスに対する毒性が有意に弱い。
【００４９】
したがって、本発明の新規ジアステレオマーペプチドは、抗癌剤として有用であり、限定されるものではないが、黒色腫、並びに基底及び扁平細胞癌に加えて、乳癌、前立腺癌、肺癌、腎癌、及び大腸癌などの固形腫瘍、並びに白血病などの非固形腫瘍の治療に使用できる。本明細書の実施例に示す通り、様々な悪性細胞に対する正電荷ジアステレオマーペプチドの高い効力が観測されたことは、それらの作用に共通の標的が存在することを示す。悪性細胞膜は負電荷のホスファチジルセリンを正常哺乳類細胞より高レベルで発現することが示されており（Ｕｔｓｕｇｉら、１９９１年）、この標的は悪性細胞膜である可能性が最も高い。
【００５０】
好ましい一実施形態では、本発明は、本発明のジアステレオマーペプチドを含む、癌治療用の医薬組成物を提供する。本明細書の実施例ではそれぞれペプチド５、８、１２〜１６、３６〜３９、４２、及び４４と命名されている配列番号５、８、１２〜１６、３６〜３９、４２、及び４４のペプチドに関して本明細書で示すように、本発明の全てのペプチドが悪性腫瘍の治療に有用であると企図されている。とりわけ、ペプチド１２、１３、３７〜３９、４２、及び４４は、前立腺腫瘍に対して有効であることがインビトロ実験で示された。
【００５１】
本発明のモデルジアステレオマーの効力の高さ及びインビボ毒性の低さは、局所的感染における広範な病原体に対する局所適用においても、それらの使用への道を開くものであり、上記局所適用には、限定されるものではないが、エアゾール、又は鼻若しくは肺適用のための他の製剤で治療できる、ざ瘡、頭皮の真菌感染、手術又は外傷性の損傷に関連した真菌又は細菌感染、慢性又は治癒が不十分な皮膚病変（特に糖尿病患者において）、腟感染症（腟炎）、眼及び耳の感染症、並びに熱傷創、口及び咽頭の感染、並びに嚢胞性繊維症、肺気腫又は喘息における慢性肺感染などの限局感染の治療が含まれる。観測された、タンパク質分解に対するジアステレオマーの耐性は、それらが完全な形態で消化系に到達し、ピロリ菌による慢性胃粘膜感染、及び腸内細菌感染などの細菌感染をそこで排除するのを可能にし得るものである。本明細書で使用される場合、「局所」という用語は、「特定の表面領域に関係する」ことを意味し、前記表面の特定領域に適用された局所薬は、それが適用されている領域のみに影響を与えるであろう。したがって、上記ペプチドが局所的に作用し、血液循環を経由しないありとあらゆる適用が本発明に包含される。
【００５２】
全身投与用には、いかなる追加の担体もなく、上記ペプチドをそのまま投与してもよく、又は一般的には、緩衝された水性組成物が採用される。代替の組成物はリポソーム担体を利用するものである。上記溶液は、ハンクの溶液、リンゲル液、又はリン酸緩衝液などの従来の緩衝剤を用いて望ましいｐＨに緩衝する。安定化する量のタンパク質、例えば、血清アルブミン、低密度又は高密度リポタンパク（それぞれＬＤＬ及びＨＤＬ）など、上記ペプチドの活性を妨げない他の構成成分も含まれ得る。
【００５３】
全身用製剤は、静脈内（ｉ．ｖ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、筋肉内、又は皮下（ｓ．ｃ．）注射などの注射によって投与でき、或いは膜内外又は経皮技法によって投与できる。
【００５４】
局所適用のために、様々な美容的及び／又は薬学的に許容される担体と共に活性成分を処方できる。経皮又は膜内外投与に適した製剤には、皮膚浸透剤を含有するスプレー及び坐剤が含まれ、上記皮膚浸透剤はしばしば界面活性剤であり得る。
【００５５】
「薬学的に許容される担体」という用語は、ヒト又は他のレシピエント生物に有害とならずに、意図された標的に活性成分を送達する媒体を指す。本明細書で使用される場合、「医薬品」は、ヒト用及び動物用医薬品の両方を包含すると理解されるであろう。有用な担体には、例えば、水、アセトン、エタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブタン−１，３−ジオール、イソプロピルミリステート、イソプロピルパルミテート、又はミネラルオイルが含まれる。上記担体は、送達様式に適したいかなる形態のものでもよく、例えば、溶液、コロイド分散液、乳剤（水中油又は油中水型）、懸濁液、クリーム、ローション、ゲル、フォーム、ムース、及びスプレーなどでよい。医薬組成物を製剤する方法及び成分は周知であり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編集、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社、ペンシルベニア州イーストン（Ｅａｓｔｏｎ）所在、１９９０年で見出すことができる。
【００５６】
上記製剤は、担体及び抗癌成分に加えて、上記製剤の担体及び／又は意図された使用に応じて選択できる他のオプション物質を含むことができる。追加成分には、酸化防止剤、キレート化剤、乳剤安定化剤、例えばカルボマー、保存剤、例えばメチルパラベン、芳香剤、湿潤剤、例えばグリセリン、防水剤、例えばポリビニルピロリドン／エイコセン共重合体、水溶性膜形成剤、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース、油溶性膜形成剤、及び陽イオン性又は陰イオン性重合体などが含まれるが、これらに限定されない。
【００５７】
本発明のジアステレオマーは、食品保存用に、獣医学組成物中のフードサプリメントとして、動物栄養物用の抗生物質の代替物として、組織培養培地中の抗マイコプラズマ薬、抗菌薬、及び抗真菌薬として、また所望のＤＮＡ又はＲＮＡ分子を用いた標的細胞の形質転換／形質移入用試薬としても使用できる。
【００５８】
これより、以下の非限定的実施例を参照して、本発明を説明する。
【実施例】
【００５９】
物質及び方法
（ｉ）物質
４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂（ＢＨＡ）及びブチロキシカルボニル（Ｂｏｃ）アミノ酸は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社（米国カリフォルニア州ラホーヤ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）所在）から購入した。ペプチド合成に使用した他の試薬には、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、Ｓｉｇｍａ社）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、Ｓｉｇｍａ社）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、Ｆｌｕｋａ社）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１−ＨＯＢＴ、Ｐｉｅｒｃｅ社）、及びジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、ペプチド合成グレード、Ｂｉｏｌａｂ社、米国イリノイ州所在）が含まれる。細胞毒性アッセイ用のＸＴＴ反応液及びｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）は、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社（イスラエル国ベイトヘメック（Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ）所在）から購入した。他の全ての試薬は分析グレードのものであった。緩衝液は再蒸留水で調製した。
【００６０】
（ｉｉ）細胞培養
ＣＬ１ヒト前立腺癌（ＰＣ）細胞系は、ＬＮＣａＰ細胞系のアンドロゲン非依存性（ＡＩ）サブクローンであり、これは、記載（Ｐａｔｅｌら、２０００年）の通り、チャコール処理済み（ｃｈａｒｃｏａｌ−ｓｔｒｉｐｐｅｄ）アンドロゲン依存性（ＡＤ）血清中でＡＤ  ＬＮＣａＰ細胞を培養することによって生成させた。２２ＲＶ１ヒトＰＣ細胞は、ＡＤ前立腺腺癌ＣＷＲ２２異種移植片のＡＩサブクローンである（Ｓｒａｍｋｏｓｋｉら、１９９９年）。ＣＬ１及び２２ＲＶ１（ＡＴＣＣ、米国所在）は、１０％ＦＣＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社、イスラエル国ベイトヘメック所在）を補足したＲＰＭＩ−１６４０で培養した。ＰＣ３及びＤＵ１４５は、アンドロゲン非感受性（ＡＩ）（非反応性）の侵襲性ヒト前立腺癌細胞系である。ＮＩＨ−３Ｔ３マウス繊維芽細胞細胞系（ＡＴＣＣ、米国所在）は、１０％ＢＳを補足したＤＭＥＭ中で培養した。マウスＬｅｗｉｓ肺癌（ＬＬＣ）細胞系も、１０％ウシ胎児血清及び抗生物質を補足したＤＭＥＭ培地中で、上記のものと同じ条件下に培養した。
【００６１】
（ｉｉｉ）ペプチド合成及び精製
ペプチドは、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂（ＢＨＡ）（０．０５ミリ当量）上で固相法によって合成した（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら、１９８２年；Ｓｈａｉら、１９９０年）。樹脂に結合したペプチドは、フッ化水素（ＨＦ）によって樹脂から切り出し、ＨＦを蒸発させ、無水エーテルで洗浄した後、５０％アセトニトリル／水で上記ペプチドを抽出した。ＢＨＡ樹脂に結合したペプチドのＨＦ切断は、その結果Ｃ末端がアミド化されたペプチドを生じた。各粗分画ペプチドは１つの主要ピークを含有し、これが重量比で純度６０〜８０％のペプチドであったことが、ＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相高速液体クロマトグラフィー）で明らかになった。上記合成ペプチドを、Ｃ１８（Ｓｕｐｌｅｃｏ社）逆相Ｂｉｏ−Ｒａｄ準調製用カラム（２５０×１０ｍｍ、孔径３００ｎｍ、粒径５μｍ）でのＲＰ−ＨＰＬＣによってさらに精製した。上記ＲＰ−ＨＰＬＣは、共に０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を含有する、水中に３０〜５０％のアセトニトリルの直線勾配を用い、１．５［１．８］ｍｌ／分の流速で３０分間行った。精製されたペプチドは、分析的ＨＰＬＣによって均質（約９５％）であることが示され、それらの組成及び分子量を確認するために、アミノ酸分析及びエレクトロスプレー質量スペクトルで分析した。
【００６２】
Ｎ−アシル化は、ペプチド合成のために保護アミノ酸を結合させるのに使用されるものと同じプロトコールを用いて行った。
【００６３】
（ｉｖ）環状ジアステレオマーの合成
環状ペプチドは、ペプチドのＮ末端及びＣ末端の両方にシステイン残基を有するものも、有さないものも、上記セクション（ｉｉｉ）に記載の通り、固相法によって合成した。システインなしの環化は、Ｎ末端を保護し、Ｃ末端を活性化し、その後Ｎ末端を脱保護し、樹脂に結合させたままＣ末端基とＮ末端基とを反応させることによって行う。ペプチドがＮ末端及びＣ末端の両方にシステイン残基を含有する場合、ＨＦ切断及びＲＰ−ＨＰＬＣ精製の後に、上記ペプチドをＰＢＳ（ｐＨ７．３）中に低濃度で可溶化させ、１２時間後に環化が完成する。環状ペプチドは、ＲＰ−ＨＰＬＣでさらに精製し、それらの組成物を確認するためにアミノ酸分析を行い、それらが単量体の状態にあることを確認するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う。
【００６４】
（実施例１）
Ｈｉｓ含有ジアステレオマーペプチドの合成
以下に示す１５量体ペプチド１と、１３〜１７量体Ｃ−アミド化ジアステレオマーペプチド２〜４４（配列番号２〜４４）とを、物質及び方法、セクション（ｉｉｉ）に記載の通り合成し、環状ペプチド３４及び３５をセクション（ｉｖ）に記載の通りに調製した。ペプチド２〜４４は、Ｈｉｓと、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、及びＴｒｐから選択された１若しくは複数種の疎水性アミノ酸、又は別の非天然疎水性アミノ酸、任意選択で正電荷アミノ酸Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、及び／又はＡｒｇ、並びに／或いはＮキャップアミノ酸Ｇｌｎ及びＡｓｎで構成され、さらに任意選択でＮ末端でアシル化されており、３〜９のＤ−アミノ酸残基を含有する。ペプチド１は、上述の国際公開第０２／０４０５２９号パンフレットに記載の１５量体ジアステレオマーであり、ここでは比較を目的として使用されている。これらのペプチドは、以下、太字の数字及び配列同定番号（配列番号）によって表されるであろう。
【００６５】
太字で下線されたアミノ酸はＤ−アミノ酸である。
【化１−１】
2009521522.tif 000002
【化１−２】
2009521522.tif 000003
【化１−３】
2009521522.tif 000004
【化１−４】
2009521522.tif 000005
【００６６】
代表的な例として、ペプチド１３及び１の分析データを示す。ペプチド１３は、ＨＰＬＣによる測定で純度≧９８％の白色粉末として得られた。アミノ酸含量：Ｈｉｓ−２、Ｌｅｕ−９、及びＬｙｓ−３．８５。質量分析スペクトル分析による分子量：１８２２．５。ペプチド１は、純度≧９９％、分子量１８０４．５の白色粉末として得られた。アミノ酸含量：Ｌｅｕ−９及びＬｙｓ−５．８０。
【００６７】
（実施例２）
細胞毒性アッセイ（ＸＴＴ増殖アッセイ）
ジアステレオマー１、５、１１〜１６、３６〜３９、４２、及び４４の抗癌活性は、ヒトＣＬ１前立腺癌、マウスＬＬＣ（Ｌｅｗｉｓ肺癌）、ＤＵ１４５、及びＰＣ３細胞系に対して試験した。ジアステレオマーペプチドの細胞選択性は、ＮＩＨ−３Ｔ３正常マウス繊維芽細胞細胞系へのそれらの影響を試験することによっても調査した。
【００６８】
ＸＴＴ増殖アッセイには、９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ社）を用いた。癌細胞は、５％ＣＯ２及び９５％空気の加湿雰囲気内における、１０％ウシ胎児血清及び抗生物質を補足したＲＰＭＩ−１６４０培地中、３７℃で２４時間（１日目）培養し（ＬＬＣ、ＣＬ１、２２ＲＶＩ、ＤＵ１４５、及びＰＣ３はそれぞれ５×１０３、７×１０３、１×１０４、及び７×１０３細胞／１００μｌ）、その結果、増殖培地ｐＨは７．４となった。ＮＩＨ−３Ｔ３線維芽細胞細胞（１×１０４細胞／１００μｌ）は、１０％ウシ胎児血清及び抗生物質を補足したＤＭＥＭ培地中で、癌細胞に関して上述したのと同じ条件下に培養した。横最終２列のウェルは、それぞれ、ブランク（培地のみ、培地のバックグランドカラー測定用）及び１００％生存対照（細胞及び培地のみ、無処置）として使用する。
【００６９】
２日目に、上記ペプチドを無菌ＰＢＳ中に２００μＭ（又は５００μＭ）の濃度に溶解させた。アッセイウェル中の培地を１００μｌの無血清培地で置換した。ｐＨ６でのアッセイには、培地は最初、濃縮（×５又は×１０）されており、その後、再蒸留水で希釈し、炭酸ナトリウムを添加した。正しい希釈率に到達する前に、培地をｐＨ６に調整し、その後最終希釈率に到達するようにさらに水を添加した。細胞は生理的ｐＨで培養し、酸性ｐＨは、ペプチドとの２４時間インキュベーション中にのみ用いた。正しい酸性の徴候は、培地の薄黄色であった。プレートの列Ａには、最初のペプチド濃度が５００μＭであった場合、１６０μｌの無血清培地を添加した。
【００７０】
ペプチドの最終濃度が１００μＭ、容積が２００μｌとなるように、列Ａの各アッセイウェルに１００μｌ（又は４０μｌ）のペプチド溶液を添加した。ウェル中の培地をマルチチャネルピペットで５回混合し、そのうち１００μｌを次の横列（列Ｂ）のウェルに移し、５０μＭのペプチド濃度にする。ペプチドの二倍希釈を同じ方法でプレートの下流へと続けた。その後、プレートを２４時間インキュベートした。
【００７１】
３日目に、活性化溶液（３’−［１−（フェニル−アミノカルボニル）−３，４−テトラゾリウム］−ビス（４−メトキシ−６−ニトロ）ベンゼンスルホン酸ナトリウム水和物及びＮ−メチルジベンゾピラジン硫酸メチル；５０：１の割合で混合）（光から保護し、−２０℃に保つ）の１００μｌアリコートに基質を添加することによって、ＸＴＴ反応液を調製した。５０μｌのＸＴＴ反応液を各ウェルに添加し、プレートを２時間インキュベートした（３７℃、及び５％ＣＯ２＋９５％空気。インキュベーションが発色に十分でない場合には、最長２４時間までそれを延長した）。光学濃度は、ＥＬＩＳＡプレートリーダー中で波長４５０ｎｍを測定した。細胞生存率は対照と比較して測定し、最終結果を記録した。結果は、少なくとも３回の独立した実験における再現実験を用いて確認した。各ペプチドのＬＣ５０は、ペプチド濃度に対する細胞生存率のカーブから取得し、細胞生存率が５０％であった濃度から取った。表１に示すデータは、ただ１回の実験のものであるが、全ての再現実験を代表している。
【００７２】
ヒト細胞に関しては、ペプチド５、８、及び１２〜１６の結果は、本発明のジアステレオマー１２及び１３が、ｐＨ６．０でヒトＣＬ１細胞系に対して、既知な１５量体ジアステレオマー１と同等かそれより有意に効果的であり、ペプチド１２は、ｐＨ６及びｐＨ７．４の両方でＬＬＣに対してペプチド１より活性であったことを示す。さらに、ペプチド８、１２、１３、１４、１６、３６、４２、及び４４は、それらがＮＩＨ−３Ｔ３正常マウス繊維芽細胞に対して作用する濃度より２〜８倍低い濃度のときに、ｐＨ７．４でＣＬ１及びＬＬＣに対して活性であった。ｐＨ７．４では、ペプチド１４は、それがＮＩＨ−３Ｔ３細胞に対して活性であった濃度より８倍低い濃度のときに、ＣＬ１に対して活性であった。しかし、それは、ＣＬ１及び２２ＲＶＩに対してペプチド１の半分活性であった。ジアステレオマー５、８、１２、１３、１４、１６、３６〜３９、４２、及び４４は、ｐＨ６で２２ＲＶＩ細胞に対してペプチド１より有意に効果的であった。特にペプチド３９及び４４は、１と比較して８及び１６倍活性が高かった。加えて、ペプチド５、１４、及び１６は、それらが同じｐＨでＮＩＨ−３Ｔ３細胞に対して作用する濃度より少なくとも２倍低い濃度のときにＣＬ１細胞に対して活性であった。特に高い活性は、３８、３９、４２、及び４４で、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞と比較して、２２ＲＶＩ及びＬＬＣ細胞に対してｐＨ６で観測された。
【００７３】
ペプチド１０及び１１は、他の細胞に対するそれらの活性と比較して、ｐＨ７．４及び６の両方でＤＵ１４５細胞に対して、ｐＨ７．４でＰＣ３細胞に対して有意に効果が弱かった。
【００７４】
これらの結果は、本発明の新規ジアステレオマーペプチドが既知なジアステレオマー１よりさらに選択的かつ効果的であることを明確に明らかにしている。
【００７５】
【表１】
2009521522.tif 000006
【００７６】
（実施例３）
マウスでの急性毒性試験
ペプチド１、１３、及び１６の急性毒性は、それぞれ、３、９、１５、２０、及び３０ｍｇ／ｋｇ体重のペプチド１、１３又は１６を含有する０．５ｍｌの溶液を１日あたり１用量で２日間マウス（ｎ＝３）に静脈内注射することによって試験した。３ｍｇ／ｋｇ及び９ｍｇ／ｋｇで投与された全てのペプチドで死亡が観測されなかった。１５及び２０ｍｇ／ｋｇ体重では、従来技術のペプチド１のみで１００％死亡率が観測され、本発明のペプチド１３及び１６では死亡が観測されなかった。３０ｍｇ／ｋｇでの本発明のペプチド１６では、死亡が観測されなかった。
【００７７】
ペプチドを注射した１週間後に、生き残ったマウスから血液試料を採取した。全ての鑑別試験及び生化学試験は正常値の範囲にあった（すなわち、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、クレアチンホスホキナーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、及びクレアチニン）。したがって、本発明のペプチド１３及び１６は、それらの抗癌活性に必要な濃度よりかなり高濃度で投与した場合にさえ、毒性でない。
【００７８】
（実施例４）
インビボにおけるペプチドの抗癌活性
（ｉ）ヒト前立腺癌異種移植における腫瘍増殖の抑制。
マウスにおけるヒトＰＣ細胞の皮下（ｓ．ｃ．）移植は、Ｇａｖｉｓｈら（Ｇａｖｉｓｈら、２００２年）の以前の記載に従って行った。簡潔には、体重２０〜２５ｇ、５〜６週齢の雄性ヌードマウス（Ｈａｒｌｅｎ社、イスラエル国所在）の背面に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ中の０．１ｍｌ  ＡＩ  ＣＬ１又は２２ＲＶ１ヒトＰＣ細胞（５×１０６細胞）をｓ．ｃで接種した。細胞皮内移植の２週間後に、腫瘍直径が≧５ｍｍに達し（１日目として定める）、ジアステレオマー１３及びその全てＬ−アミノ酸の類似体ペプチド（１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍＭ）、又は溶媒（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を、１週間に３回、合計９用量、腫瘍内（投与容積２．５ｍｌ／ｋｇ）に注射した。腫瘍サイズをカリパスによって測定し、週に２回、２８日の期間にわたって記録した。マウスの体重を計量し、腫瘍の重さ（ｍｇ）は、比重を１と仮定して、長さ×幅×深さ（ｍｍ３）×０．５２の式を用いて推算した。処置の最後に、マウスを屠殺し、腫瘍を取り出して、写真の撮影及び重さの計量を行った。動物実験は、施設内動物管理使用委員会の規則に従って行った。
【００７９】
血清ＰＳＡレベル。最初の処置の４週間後に、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）のレベルを測定するために、２２ＲＶ１を接種されたマウスから採血した。血液試料は、ヘパリンを含有している管内に直接採取し、遠心分離し、上清を−２０℃で保存した。ＣａｎＡｇ  ＰＳＡ  ＥＩＡキット（ＣａｎＡｇ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いて、マウス血漿中の総ＰＳＡを測定した（Ｇａｖｉｓｈら、２００２年）。腫瘍の重さ及びＰＳＡレベルは平均±ＳＥで表したが、これらは、生データから計算し、その後スチューデントのｔ検定で分析した。Ｐ＜０．０５の値を統計的に有意であるとした。
【００８０】
異種移植のタイプに非依存的に、ペプチド１３によって処置されたマウスでは、腫瘍の重さの有意な減少が観測されたが、類似体Ｌ−ジアステレオマーで処置されたマウスでは観測されなかった。一部のマウスでは、腫瘍が完全に消失した。さらに、ＰＳＡ分泌性の２２ＲＶ１異種移植では、腫瘍の重さの減少に、ＰＳＡ血清レベルの顕著な減少が伴った。ペプチド１３での処置は、溶媒で処置した対照群と比較して、動物体重の増大を示した。対照的に、Ｌ−ジアステレオマーは、両方の異種移植モデルで無効であった。
【００８１】
ジアステレオマーペプチド１３とは対照的に全てＬ−アミノ酸の類似体が活性でなかった理由を検査するため、両ペプチドをＭａｔｒｉｇｅｌマトリックスと１時間混合し、ＲＰ−ＨＰＬＣ及び質量分光分析法を用いてその溶液を分析した。活性の約５０％を保持したペプチド１３とは対照的に、全てＬ−アミノ酸の類似体ペプチドは、Ｍａｔｒｉｇｅｌマトリックスとの相互作用によって完全に不活性化された。
【００８２】
（ｉｉ）前立腺腫瘍由来の肺転移形成の抑制
２２ＲＶ１前立腺腫瘍は転移性なので、本発明者らは、予め細胞を全身注射されたＣＤ１ヌードマウスで、全身投与されたペプチド１３が前立腺癌由来の肺転移の形成を抑制する能力を分析した。実験中は、毒性の臨床徴候に関して、マウスを継続的モニターした。ペプチド１３で処置された動物は、アッセイ時間を通して、良い状態にあり、衰弱のいかなる徴候も示さなかったことが観察された。実験の最後に、本発明者らは、ペプチド１３で処置された動物では、未処置の対照と比較して、肺転移が完全に消失していることを見出した。さらに、ペプチド１３で処置されたマウスは、溶媒で処置された対照群と比較して、体重の有意な増大も示した。
【００８３】
（ｉｉｉ）乳癌異種移植における腫瘍増殖の抑制
以前の記載（Ｄａｄｉａｎｉら、２００４年）に従って、８週齢の雌性ＳＣＩＤ／ＮＣｒマウス（ＮＣＩ、米国所在）の左乳房脂肪パッドに、ＲＦＰ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌（ＢＣ）細胞を注射した（０．１ｍｌＰＢＳ中に５×１０６細胞）。細胞皮内移植の１週間後に、腫瘍直径が約５ｍｍに到達し、１０匹のマウスに、ペプチド１３（５ｍｇ／ｋｇ、０．１４ｍＭ）又は溶媒（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）を１週間に３回、合計９用量、全身注射した（投与容積２２ｍｌ／ｋｇ）。４５日の期間にわたって週に２回、マウスの体重を計量し、腫瘍容積をカリパスによって測定した（重量単位（ｍｇ）で表した）（Ｐａｐａら、２００３年）。
【００８４】
固形乳房腫瘍及びそれに由来する転移のモニタリングは、インビボ蛍光法によって行った。腫瘍蛍光強度は、インビボ光学画像処理システム（ＩＶＩＳ）を用いて、リアルタイムでモニターし、３８日の期間にわたって週に１回記録した。
【００８５】
腫瘍サイズの大きな減少はカリパス測定値から記録した。腫瘍サイズの減少には、ＩＶＩＳによるインビボ光学画像処理から記録された腫瘍蛍光の著しい低下が伴った。しかし、蛍光検出の精度及び感受性はカリパス測定よりはるかに高いので、腫瘍蛍光の低下は、はるかに早く観測された。ペプチド１３での処置は、溶媒で処置された対照群と比較して、動物体重の増大ももたらした。
【００８６】
ペプチド１３で処置された動物は、アッセイ期間中に良い状態であり、衰弱のいかなる徴候も示さなかった。
【００８７】
（ｉｖ）乳癌由来の肺及びリンパ節転移の形成の抑制
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳房腫瘍細胞は転移性であったので、全身投与されたペプチド１３が、ＳＣＩＤ／ＮＣｒマウスのリンパ節及び肺における転移の形成を抑制する能力を分析した。実験中は、毒性の臨床徴候に関して、マウスを継続的モニターした。
【００８８】
乳房腫瘍に由来する固形転移のモニタリングは、上記（ｉｉｉ）に記載の通り、ＩＶＩＳを用いたインビボ蛍光法によって行った。処置の最後（３８日目）に、マウスを屠殺し、肺及びリンパ節を取り出し、乳癌由来の転移の蛍光をモニターした。転移の定量化には、肺及び右リンパ節を切り出し、４％の緩衝ホルムアルデヒドで固定した。パラフィン包埋された５μｍ切片をＨ＆Ｅで染色した。総断面積における転移性腫瘍細胞領域の割合は、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  ｐｌｕｓ  ４．１ソフトウェアを用いて計算した。
【００８９】
ペプチド１３で処置された後のマウスで、リンパ節転移蛍光強度の有意な減少が観測された。未処置マウスから摘出された肺及びリンパ節のイメージも分析した。それらは、処置されたものと比較して強い蛍光を示した。
【００９０】
摘出された肺及びリンパ節は組織学によって分析した。対照の未処置マウスにおける肺及びリンパ節には、有意により多くの癌細胞が存在していたが、上記１５量体で処置されたマウスでは、はるかに小さい密度で腫瘍が存在していた。転移の定量化は、各臓器の３つの異なった切片からの面積に従って行った（Ｐ＜０．００５）。
【００９１】
（実施例５）
タンパク質分解に対するジアステレオマーの耐性
それらの標的に達するためには、ジアステレオマーは、それらが投与された後、それらが標的部位に達するまでの時間に起こり得るプロテアーゼのタンパク質分解に耐性でなければならない。ペプシン（ブタ胃粘液由来、Ｓｉｇｍａ社）、トリプシン（ウシ膵臓由来、Ｓｉｇｍａ社）、及びエラスターゼ（ヒト白血球由来、Ｓｉｇｍａ社）によるタンパク質分解に対するペプチド１３及び１４の感受性を逆相ＨＰＬＣで評価した。陰性対照として、全てＬ−アミノ酸の類似体ペプチドを用いた。等量のペプチドを最終濃度１４０μＭでＰＢＳ（３５ｍＭリン酸緩衝液／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）中に溶解させ、それに２５μＭのプロテアーゼを添加した。撹拌しながら、３７℃で３０分間、試料をインキュベートした。反応を停止させるために適切なプロテアーゼ阻害剤を添加した後、アリコートをＣ１８カラムに注入し、完全なペプチド１３及び１４、並びにそれらの全てＬ型の類似体の量を、２１５ｎｍにおけるそれらの吸光度を用いて評価した。本発明のジアステレオマーは、プロテアーゼ消化に対する感受性が有意に弱かった（２時間後で約５０％）が、全てＬ型の類似体は３０分後に完全に分解されていた。
【００９２】
（実施例６）
ジアステレオマーペプチドのリポソーム封入
リポソームは、生理活性分子の好都合な送達媒体として役立つ。親水性薬物は内側の水性区画内に封入でき、一方、疎水性薬物は脂質二重層に結合させるか、組み込むことができる。この実験では、ペプチドの毒性をさらに低下させ、かつそれらの選択性を増大させるために、リポソーム化ジアステレオマーペプチドを調製した。
【００９３】
様々な比率のホスファチジルコリン（ＰＣ）／ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）（９：１；４：１；１：１  ｗ／ｗ）又はホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）／ＰＧ（９：１；４：１；１：１  ｗ／ｗ）で構成されたリポソームを調製した。簡潔には、無水脂質混合物をＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（２／１、ｖ／ｖ）中に溶解させた。溶媒を窒素気流下で蒸発させ、上述した組成の脂質混合物をボルテックス混合によってＰＢＳ中に再懸濁した。この脂質懸濁液を、３種類の異なったポリカーボネートフィルター（孔径１μｍ、０．２μｍ、及び０．１μｍのフィルター、それぞれ１５回）に通して押出した。最後に、この結果得られた大単ラメラ小胞（ＬＵＶ）の懸濁液を、それぞれ、５０：１；３０：１；１０：１、ｗ／ｗの脂質／ペプチド比が得られるように、様々な濃度の本発明のペプチドに添加した。これらの混合物を２分間超音波処理し、使用するまでリポソームを４℃で保存した。
【００９４】
この結果得られたリポソーム化ジアステレオマーペプチド調製物の抗癌活性を上記実施例２に記載の通りに試験した。様々な脂質組成及びペプチド／脂質比（上述の通り）におけるリポソーム化ペプチド５及び１２〜１６、又は添加されたリポソーム若しくはペプチド単独と等価な脂質組成のリポソームのＬＣ５０を、ＬＣ１、ＬＬＣ、及び２２ＲＶＩ細胞系を用いて測定した。リポソーム化ペプチドは、ペプチド単独のものと同様なＬＣ５０結果を示した。これは、リポソーム内に封入された本発明のペプチドが、それらの抗癌活性を維持できることを示している。しかし、この活性は、リポソームの脂質組成及び脂質／ペプチド比に依存している。
【００９５】
インビトロ試験の結果に基づき、最良の抗癌活性を与えたリポソーム組成を用いて、リポソーム化ペプチド調製物のインビボ毒性を試験した。動物隔離飼育器（ＩＶＣラック）中、２４±１℃、特定病原体不在（ＳＰＦ）条件下で飼育された、体重２４〜２７ｇのＣＤ１雄性マウス（５週齢）５匹からなる複数の群を用いた。１０ｍｌ／ｋｇの投与量容積のＰＢＳ中に溶解した１２ｍｇ／ｋｇリポソーム化ペプチド又はペプチド単独を、マウス尾部静脈を介した１回のｉ．ｖ．ボーラス注射で投与した。平行して、１０ｍｌ／ｋｇの投与量容積中にある同等なリポソーム単独又はＰＢＳを対照群にｉ．ｖ．注射した。
【００９６】
上記リポソーム化ペプチドは、それらの活性を維持していたが、毒性が弱くなっており、それゆえ、マウスの死亡率の低下をもたらした。ＰＢＳ又はリポソーム単独のｉ．ｖ．注射の後には、死亡事例は起こらなかった。
【００９７】
（参考文献）
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2009521522.tif 000009
2009521522.tif 000010
【配列表】
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【国際調査報告】
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2009521522.tif 000012
2009521522.tif 000013
2009521522.tif 000014
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