(57)【要約】  本発明は、ｉ）産生細胞を破砕し、かつ引き続きｉｉ）細胞断片を、連続的に運転するジェット式分離装置を用いて、ポリヒドロキシアルカノエート粒子から分離することを特徴とする、産生細胞からポリヒドロキシアルカノエートを単離する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
産生細胞からポリヒドロキシアルカノエートを単離する方法において、
ｉ）産生細胞を破砕し、かつ引き続き
ｉｉ）連続的に運転するジェット式分離装置を用いて、ポリヒドロキシアルカノエート粒子から細胞断片を分離する
ことを特徴とする、産生細胞からポリヒドロキシアルカノエートを単離する方法。
【請求項２】
工程ｉ）において高圧ホモジナイズ装置を用いて産生細胞を破砕することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ホモジナイズ装置が、
ａ）少なくとも１の入口ノズルを有するオリフィス板と、少なくとも１の出口ノズルを有するオリフィス板とからなり、その際、前記オリフィス板の間の中空部において、場合によりさらに機械的なエネルギー導入を行うか、または
ｂ）少なくとも１の入口ノズルを有するオリフィス板と、衝突板とからなり、その際、オリフィス板と衝突板との間の中空部において、場合により機械的なエネルギー導入を行う
ことを特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項４】
産生細胞が、組み換え有機体であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項５】
ポリヒドロキシアルカノエートが、ポリ−３−ヒドロキシブチレート（Ｐ−３ＨＢ）、ポリ−３−ヒドロキシ−ブチレート／コ−３−ヒドロキシバレリアネート（Ｐ−３ＨＢ−コ−３ＨＶ）、ポリ−３−ヒドロキシブチレート／コ−４−ヒドロキシブチレート（Ｐ−３ＨＢ−コ−４ＨＢ）、ポリ−３−ヒドロキシブチレート／コ−３−ヒドロキシヘキサノエート（Ｐ−３ＨＢ−コ−３ＨＨｘ）またはポリ−３−ヒドロキシブチレート／コ−３−ヒドロキシオクタノエート（Ｐ−３ＨＢ−コ−３ＨＯ）であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項６】
産生細胞をホモジナイズ前に死滅させることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、産生細胞からポリヒドロキシアルカノエートを単離する方法に関する。
【０００２】
ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、たとえばポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）は、細菌を用いて合成することができる。たとえばＢｉｏｐｏｌｙｍｅｒ、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、２００２年には、このような生物工学的な方法が記載されている。
【０００３】
ＰＨＢは、発酵の終了時に細菌細胞中で、タンパク質外被に被覆されている粒子の形で存在している（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８９年、２６４（６）、第３２８６〜３２９１頁）。十分に純粋なＰＨＢを得るためには、ＰＨＢを細菌細胞から分離しなくてはならない。
【０００４】
生物工学的に製造された原料は、所望のポリヒドロキシアルカノエート以外に、ポリヒドロキシアルカノエートを産生した微生物（産生細胞、バイオマスまたはポリヒドロキシアルカノエート以外の物質）を含有している。バイオマスからのポリヒドロキシアルカノエートの単離は、ａ）バイオマスの溶解により、ｂ）適切な抽出剤中でのポリヒドロキシアルカノエートの抽出により、またはｃ）バイオマス（産生細胞）の機械的な破砕および引き続きポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）粒子からの細胞断片の分離により行うことができる。
【０００５】
このために最も頻繁な方法は、バイオマスからの溶剤を用いたＰＨＡ粒子の抽出である。ポリヒドロキシアルカノエートのために適切な溶剤として、塩素化化合物が使用される（方法ｂ））。その例は、ＥＰ０１２４３０９および該文献で引用されている文献に記載されている。溶剤の使用は、結果として一連の欠点をもたらす。溶剤の取り扱いおよび回収のために、高価でコストの高い基盤施設に投資することが強いられる。抽出後のバイオマスから、肥料または飼料としてのその後の使用の前に、溶剤の残分を除去しなくてはならない。ＰＨＢは多くの溶剤中での溶解度が不十分であるため、必要とされる溶剤の量は極めて大量である。
【０００６】
バイオマスの分解および溶解（後処理ａ））のために、たとえば酵素または化学的な方法を使用することができる。さらに、界面活性化合物を添加することができる。複数の方法の組み合わせが可能である。
【０００７】
ＥＰ０１４５２３３には、酵素によるバイオマスの分解が記載されている。
【０００８】
ＷＯ９４／２４３０２には、酵素と過酸化水素とによるバイオマスの分解が記載されている。
【０００９】
ＵＳ５１１０９８０には、次亜塩素酸塩によるバイオマスの分解が記載されており、この分解によって高い分子量を有するポリヒドロキシアルカノエートが得られる。次亜塩素酸塩を用いた処理の間の種々のパラメータ、たとえば温度、時間またはｐＨが試験されている。希釈した酸を用いたポリヒドロキシアルカノエートの精製は記載されていない。
【００１０】
形成されたポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）を遺伝子工学的に変性された大腸菌の細胞から放出させるためのもう１つの方法が記載されている（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２００５、１５６、第８６５〜８７３頁）。ここでは自己分解が後接続されている。正確な自己分解条件は記載されていない。自己分解は、細胞が自身の酵素によって自己溶解するプロセスである。この製造法は、次の欠点を有している。自己分解は不完全に進行し、かつ細胞断片ならびにＰＨＢ粒子はなお相互に付着しているので、形成されたＰＨＢの約８０％が放出されるのみである。
【００１１】
従って課題は、産生細胞の細胞断片を、形成されたポリヒドロキシアルカノエート粒子から完全に分離する方法を見いだすことである。
【００１２】
慣用の遠心分離による試験は失敗に終わったが、意外なことに、連続的に運転されるジェット式分離装置を用いて、ポリヒドロキシアルカノエート粒子から細胞断片を極めて効果的に分離することができることが判明した。ポリヒドロキシアルカノエート粒子からなるペレットは、ノズルによって常時連行され、他方、細胞断片は常に上澄み（本来の清澄液(Klarlauf））中で効果的に分離される。ドラムを開放して中身をあけることはなく、このことによって、損失、渦流および効果的な分離の負荷となる類似の不安定性も存在しない。さらに高い純度を達成するために、ＰＨＡ粒子に清澄な水を添加し、かつ改めて遠心分離することができる。このようにして高純度のＰＨＡ粒子の水性懸濁液が得られ、次いで該懸濁液を公知の方法で、たとえば噴霧乾燥によって乾燥させることができる。生じた生成物は、熱可塑性プラスチックへとさらに加工するために適切である。溶剤の使用は不要である。
【００１３】
従って本方法は、従来の方法に対して、高い効率、経済性および優れたプロセス性能によって優れている。
【００１４】
ジェット式分離装置もまた、Ｗｅｓｔｆａｌｉａ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒの概念の下で公知である。詳細な記載は、たとえばｗｗｗ．ｇｅａ−ｗｅｓｔｆａｌｉａ．ｄｅで入手可能である。たとえばＶｉｓＣｏｎ（登録商標）システムが挙げられるが、この場合、ノズルは粘度制御されている。このことにより、供給条件を変更する際の分離装置のパラメータ（中身をあける時間）の適合は省略され、その結果、固体の排出濃度が一定に維持される。ＶｉｓＣｏｎ（登録商標）システムの場合、ノズルはドラムの周縁部に存在するのではなく、ドラム内のそれより小さい直径上に存在する。水力気密性の(hydrohermetisch)供給部による導入ならびにノズルを介した排出により、分離された細胞の細胞活性が高まる。
【００１５】
必要とされる装置は、工業的に入手可能であり、かつ任意でアップスケール可能であるので、本方法を工業的な規模に問題なく転用することができる。
【００１６】
本発明による方法の特別な実施態様は、工程ｉ）において、産生細胞を機械的に破砕することである。化学薬品不含の破砕は利点を有する。ＰＨＢ産生細菌であるアルカリゲネス・ユートロフスの細胞を、ホモジナイザーを用いて破砕することができることは記載されている（Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  １９９１、２、第１５５〜１６６頁）。細胞中に存在するＰＨＢ粒子は、ホモジナイザーを数回経由した後にほぼ完全に、細胞から抽出することができた。細胞懸濁液は、このタイプのホモジナイザーの場合、バルブを通って押し出される。バルブコーンと弁座との間の間隙の幅を調整することによって乱流が生じる。するとバルブから排出される懸濁液はスチール板に衝突する。従ってこの機械の圧力は、１５００バールまでに限定されている。
【００１７】
高い圧力を発生させるためには大量の電流が必要とされる。ホモジナイザーを用いた細胞の破砕は特に、細胞が１回通過した後に完全に破砕されている場合に経済的である。Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  １９９１、２、第１５５〜１６６頁に記載されている方法は、ホモジナイザーを４回通過しなくてはならないという欠点を有している。
【００１８】
我々は意外なことに、特にアルカリゲネス・ユートロフスのＰＨＡ含有細胞は、たとえば以下に記載するように、高圧ホモジナイザーを用いて極めて良好に破砕することができることを確認した。この場合、２０００バール以上の圧力で高圧ホモジナイザーを１回通過すると、細胞の９９％以上が破砕され、かつＰＨＡはほぼ完全に放出される。従って本発明の対象は、２０００バール気圧以上の圧力で作業される高圧ホモジナイザーを用いた破砕でもある。該ホモジナイザーはたとえば以下の装置を有する：
適切なホモジナイズ装置のための例は、以下のとおりである：
ａ）少なくとも１の入口ノズルを有するオリフィス板と、少なくとも１の出口ノズルを有するオリフィス板とからなり、その際、前記オリフィス板の間の中空部において、場合によりさらに機械的なエネルギー導入を行うか、または
ｂ）少なくとも１の入口ノズルを有するオリフィス板と、衝突板とからなり、その際、オリフィス板と衝突板との間の中空部において、場合により機械的なエネルギー導入を行う。
【００１９】
実施態様ａ）
ポリヒドロキシアルカノエートを単離するためのホモジナイズ装置は、たとえば少なくとも１の入口ノズルを有するオリフィス板と、少なくとも１の出口ノズルを有するオリフィス板とからなり、その際、これらのノズルは相互に軸方向に配置されている。これらのオリフィス板の間の中空部には、スタチックミキサーが存在していてよい。場合により、該中空部においてさらに、機械的なエネルギー導入が行われる。
【００２０】
本発明による方法により使用可能なオリフィス板は、少なくとも１の開口部、つまり少なくとも１のノズルを有する。この場合、両方のオリフィス板はそれぞれ任意の数の開口部を有しているが、しかし有利にはそれぞれ５を超えない開口部を有し、特に有利にはそれぞれ３を超えない開口部を有し、とりわけ有利にはそれぞれ２を超えない開口部を有し、かつ殊にはそれぞれ１を超えない開口部を有する。両方のオリフィス板は、異なった数の、または同じ数の開口部を有するが、有利には両方のオリフィス板は同じ数の開口部を有する。一般にこれらのオリフィス板は、それぞれ少なくとも１つの開口部を有する穿孔されたプレートである。
【００２１】
本発明による方法のもう１つの有利な実施態様では、第二のオリフィス板が、ふるいによって代用されている、つまり第二のオリフィス板は、多数の開口部もしくはノズルを有している。使用可能なふるいは広い範囲の孔の大きさを有していてよく、通常、孔の大きさは０．１〜２５０μｍ、有利には０．２〜２００μｍ、特に有利には０．３〜１５０μｍ、およびとりわけ有利には０．５〜１００μｍである。
【００２２】
開口部もしくはノズルは、それぞれ考えられる幾何学的形状を有していてよく、これらはたとえば円形、楕円形、場合によっては丸みを有していてもよい、任意の数の角を有する多角形であるか、または星形であってもよい。有利には開口部は円形を有する。
【００２３】
入口ノズルの開口部は通常、０．０５ｍｍ〜１ｃｍ、有利には０．０８ｍｍ〜０．８ｍｍ、特に有利には０．１〜０．５ｍｍおよびとりわけ０．２〜０．４ｍｍの直径を有している。出口オリフィス板の開口部は通常、０．５ｍｍ〜１ｃｍ、有利には５ｍｍ〜５０ｍｍ、特に有利には１０〜２０ｍｍの直径を有している。
【００２４】
両方のオリフィス板は有利には、開口部もしくはノズルが相互に軸方向に配置されているように構成されている。軸方向の配置とは、ノズル開口部の形状寸法により生じる流れ方向が両方のオリフィス板において同一であることと理解すべきである。入口ノズルおよび出口ノズルの開口部の方向は、このために、１つの線上に存在していてはならず、たとえば上記の記載から明らかであるように、平行してずれた位置に配置されていてもよい。有利にはオリフィス板は平行して配置されている。
【００２５】
しかし、その他の形状、特に平行でないオリフィス板または入口ノズルおよび出口ノズルの異なった開口部の方向が可能である。２オリフィス板システム（入口および出口オリフィス板）では、上記のとおり、より大きな開口部を有する出口ノズルを有する。このことにより乱流が沈静化される。この場合、衝突板は不要である。
【００２６】
オリフィス板の厚さは任意であってよい。有利にはオリフィス板は、０．１〜１００ｍｍ、有利には０．５〜３０ｍｍおよび特に有利には１〜１０ｍｍの範囲の厚さを有している。この場合、オリフィス板の厚さ（Ｉ）は、開口部の直径（ｄ）と、厚さ（Ｉ）とからの商が、１：１、有利には１：１．５および特に有利には１：２の範囲であるように選択されている。
【００２７】
両方のオリフィス板の間の中空部は、任意の長さであってよく、通常、中空部の長さは１〜５００ｍｍ、有利には１０〜３００ｍｍおよび特に有利には２０〜１００ｍｍである。
【００２８】
オリフィス板の間の中空部には、スタチックミキサーが存在していてもよく、該ミキサーは両方のオリフィス板の間の区間全体にわたっていても、または部分的であってもよい。有利にはスタチックミキサーは両方のオリフィス板の間の中空部の間の全長さにわたって延びている。スタチックミキサーは当業者に公知である。これは、たとえばバルブ式ミキサーであってよいし、穿孔を有するスタチックミキサーであっても、波形の円板からなるか、もしくは相互にかみ合うリブからなるミキサーであってもよい。さらに、らせん形もしくはＮ型のスタチックミキサーであるか、または加熱もしくは冷却可能な混合部材を有するミキサーであってもよい。
【００２９】
スタチックミキサーに加えて、両方のオリフィス板の間の中空部で、さらに機械的なエネルギー導入を行うことができる。エネルギーはたとえば機械的な揺動、超音波または回転エネルギーの形で導入することができる。このことにより乱流が生じ、この乱流によって中空部の粒子が凝集しなくなる。
【００３０】
実施態様ｂ）
この第一の変法に代えて、混合装置は、少なくとも１の入口ノズルを有するオリフィス板および衝突板からなっていてもよく、その際、オリフィス板と衝突板との間の中空部には、場合によりスタチックミキサーが存在している。スタチックミキサーに代えて、またはスタチックミキサーに加えて、中空部で機械的エネルギーの導入を行うことができる。
【００３１】
入口ノズルを有するオリフィス板、スタチックミキサーを有する中空部および機械的なエネルギー導入部に関しては上記が該当する。
【００３２】
この変法では、第二のオリフィス板が衝突板によって代用されている。衝突板は通常、衝突板が設置されている場所では、管の直径よりも０．５〜２０％、有利には１〜１０％小さい直径を有する。
【００３３】
一般に、衝突板は任意の形状寸法を有していてよく、有利であるのは円形の板の形であり、従って前面からみるとリング形のギャップがみられる。たとえばスリットまたは流路の形も考えられる。
【００３４】
衝突板は、第二のオリフィス板と同様に、上記の方法では第一のオリフィス板に対して異なった間隔で配置されていてもよい。このことにより、オリフィス板と衝突板との間の中空部は、任意の長さであり、中空部の長さは通常１〜５００ｍｍ、有利には１０〜３００ｍｍおよび特に有利には２０〜１００ｍｍである。
【００３５】
本発明による方法は、従来技術から公知の方法に対して、いくつかの利点を有している。というのも、高い分子量を有するポリヒドロキシアルカノエートの特に高い収率が得られるからである。特に５００００〜２００００００、およびとりわけ１０００００〜２０００００のＭｎを有するポリヒドロキシアルカノエートをこの後処理変法によって実現することができる。
【００３６】
本発明による方法によって粗エマルションから微細なエマルションへの乳化を行う温度は、通常０〜１５０℃、有利には５〜８０℃、特に有利には２０〜４０℃である。この場合、装置中で使用される全ての均質化装置は温度調整可能である。
【００３７】
均質化は通常、大気圧より高い圧力で、つまり＞１バールで実施される。しかしこの場合、圧力は１００００バールの値を超えることはなく、従って有利には均質化圧力を＞１バール〜１００００バール、有利には５〜２５００バールおよび特に有利には１００〜２０００バールに調整する。
【００３８】
本発明による方法において使用される産生細胞の濃度は、約２０〜３００ｇ／Ｌ、有利には５０〜２２０ｇ／Ｌである。
【００３９】
この場合、産生細胞とは、任意の種類の細胞または細胞層をいう。特に動物、植物または微生物に由来する細胞である。同様に有利であるのは、組み換え有機体の産生細胞である。特に好適な産生細胞は、原核生物（古細菌を含む）であるか、または真核生物、特に好塩性細菌およびメタノコッカス属を含む細菌、真菌、昆虫細胞、植物細胞および哺乳動物の細胞、特に有利であるのはアルカリゲネス・ユートロフス、大腸菌、枯草菌、巨大菌、麹菌、アスペルギルス・ニジュランス、黒色麹菌、ピチア・パストリス、シュードモナス種、乳酸菌、ハンゼヌラ・ポリモルファ、トリコデルマ・レーセイ、ＳＦ９（もしくは類似の細胞）である。特に有利であるのは微生物アルカリゲネス・ユートロフスである。
【００４０】
産生細胞は、培養（たとえば発酵）後に直接、本発明による方法において使用することができる。しかし、産生細胞をまず、たとえば滅菌により死滅させ、かつ場合により細胞材料を培地の濾過により富化することも可能である。
【００４１】
ポリヒドロキシアルカノエートとは、生物工学的に製造したポリマーであると理解される。これらは特に、ポリ−３−ヒドロキシブチレート（Ｐ−３ＨＢ）、ポリ−３−ヒドロキシ−ブチレート／コ−３−ヒドロキシバレリアネート（Ｐ−３ＨＢ−コ−３ＨＶ）、ポリ−３−ヒドロキシブチレート／コ−４−ヒドロキシブチレート（Ｐ−３ＨＢ−コ−４ＨＢ）、ポリ−３−ヒドロキシブチレート／コ−３−ヒドロキシヘキサノエート（Ｐ−３ＨＢ−コ−３ＨＨｘ）またはポリ−３−ヒドロキシブチレート／コ−３−ヒドロキシオクタノエート（Ｐ−３ＨＢ−コ−３ＨＯ）であると理解すべきである。
【００４２】
使用される装置：
実施例では、産生細胞を破砕するための高圧ホモジナイザーとして、以下の装置Ｉを選択した。入口ノズルとして、１４×０．２ｍｍの大きさの穿孔を有するオリフィス板を使用した。発酵ブロスは懸濁液として存在し、かつ約２０００気圧の圧力で、オリフィス板を通って押し出された。中空部（長さ１５ｍｍおよび直径８ｍｍ）では懸濁液が、出口ノズルとして機能する第二のオリフィス板へ移動する前に乱流を形成する。細胞懸濁液は円すい形の穿孔を通過して出口オリフィス板へと案内され、次いでオリフィス板ブロックの単一の穿孔（直径１．５ｍｍ）から排出される。出口オリフィス板は、入口ノズルの穿孔に対して中心部に配置されている。
【００４３】
ジェット式分離装置として、ＧＥＡ  Ｗｅｓｔｆａｌｉａ社のＨＦＣ−１５タイプの装置を使用した。
【００４４】
例１：アルカリゲネス・ユートロフス産生細胞からの３−ヒドロキシ−ポリヒドロキシブチレート（３−ＰＨＢ）の単離
ｉ）アルカリゲネス・ユートロフス産生細胞中での３−ヒドロキシポリヒドロキシブチレートの発酵：
発酵は、Ｋｉｍ、Ｌｅｅ、Ｌｅｅ、Ｃｈａｎｇ、ＣｈａｎｇおよびＷｏｏ著のＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第４３巻、第８９２〜８９８頁（１９９４）に記載されているとおりに行った。
【００４５】
ｉｉ）細胞の破砕および３−ＰＨＢ粒子の分離：
バイオドライマス９０ｇ／ｌ（うちＰＨＢ８０％）の含有率を有するアルカリゲネス・ユートロフス発酵ブロス３３００リットルを、発酵の完了後に発酵槽中で２℃に冷却した。次いで該ブロスを高圧ホモジナイザーにより圧力２０００バールで処理した。圧力は最初に構成しなくてはならなかったので、ブロスの最初の１リットルを別に回収し、かつ発酵槽へ返送した。発酵ブロスは完全に高圧ホモジナイザーで処理した。
【００４６】
細胞破砕の有効性は、適切な培地上での発酵ブロスの平板培養により、破砕の前および後に測定した。生細胞数は、破砕前に５×１０10ｃｆｕ／ｍｌ（＝１００％）であった。細胞破砕後に、生細胞数を同様に測定した。その数は、５×１０6ｃｆｕ／ｍｌであった。これは、９９．９９％の高圧での破砕の効率に相応した。
【００４７】
次いで細胞ホモジネートをＧＥＡ  Ｗｅｓｔｆａｌｉａ社のＨＦＣ−１５タイプのジェット式分離装置により処理した。遠心分離力により分離された材料（濃縮物）は、分離されなかった細胞片（オーバーフロー）から分離して回収した。全乾燥物質およびＰＨＢ濃度をそれぞれ測定した（結果は表の下欄を参照）。濃縮物を脱塩水で当初の出発体積まで希釈し、改めて遠心分離した。この過程を再度繰り返した。
【００４８】
ｉｉｉ）３−ＰＨＢ−粒子の乾燥
ｉｉ）から得られた３−ＰＨＢ懸濁液を、慣用の噴霧乾燥器中で噴霧乾燥させた。乾燥ガスは窒素であり、ガス入口温度は２００℃であり、ガス出口温度は９０℃であった。ＰＨＢ懸濁液を、二流体ノズルにより噴霧した。乾燥生成物をスターホイールロックによりガス流から分離した。試験結果は以下の表に記載されている。
【００４９】
【表１】
2009537161.tif 000002
【国際調査報告】
2009537161.tif 000003
2009537161.tif 000004
2009537161.tif 000005
2009537161.tif 000006
2009537161.tif 000007
2009537161.tif 000008