(57)【要約】  改変インターロイキン-12(IL-12)p40ポリペプチドを開示する。改変ポリペプチドは、そのIL-12p40サブユニット内に位置Lys260とArg261の間のプロテアーゼ部位を除去するための変化を有する。本発明の改変IL-12p40ポリペプチドは、野生型の成熟ヒトIL-12p40ポリペプチドに比べて改良された安定性を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
IL-12 p40 D3ドメインの変種であって、野生型ヒトIL-12 p40 D3ドメインと少なくとも85%の配列同一性を有し、かつ親の成熟ヒトIL-12 p40の位置258〜266の残基に対応する1つ以上の位置にアミノ酸変化を含む、前記変種。
【請求項２】
変化が、Lys260とArg261の間のプロテアーゼ部位を除去する、請求項1記載の変種。
【請求項３】
変化が置換又は欠失である、請求項1又は2記載の変種。
【請求項４】
変化が、Lys258、Lys260、Lys263、及びLys264から成る群より選択される置換である、請求項3記載の変種。
【請求項５】
以下のアミノ酸置換：
Lys258Gln、
Lys260Ala、Lys260Asn、Lys260Gln、Lys260Gly、
Lys263Gly、Lys263Ser、及び
Lys264Gly
の1つ以上が選択される、請求項4記載の変種。
【請求項６】
置換が少なくとも位置Lys260にある、請求項4又は5記載の変種。
【請求項７】
置換が、塩基性アミノ酸を、Ala、Asn、Gln、又はGlyから成る群より選択される非塩基性アミノ酸と置き換える、請求項4〜6のいずれか1項記載の変種。
【請求項８】
さらに位置Ser259、Arg261又はArg266に1つ以上の置換を含む、請求項6又は7記載の変種。
【請求項９】
置換がSer259及びArg261である、請求項8記載の変種。
【請求項１０】
置換がSer259Asp、Lys260Asn、及びArg261Thrである、請求項9記載の変種。
【請求項１１】
さらに置換Lys264Glyを含む、請求項10記載の変種。
【請求項１２】
さらに残基Lys263及びAsp265の一方又は両方が欠失している、請求項11記載の変種。
【請求項１３】
Lys263、Lys264、Asp265、及びArg266に対応する1つ以上の残基が欠失している、請求項9又は10記載の変種。
【請求項１４】
以下の置換：
Lys263、Lys264、Asp265、及びArg266
から成る群より選択される1つ以上の置換をさらに含んでなり、
対応する元のアミノ酸残基が非塩基性アミノ酸で置き換えられる、
請求項9又は10記載の変種。
【請求項１５】
以下の置換：
Lys258、Ser259、Arg261、Lys263及びLys264
から成る群より選択される1つ以上の置換をさらに含む、請求項6又は7記載の変種。
【請求項１６】
置換がLys258Gln、Ser259Asp、Lys260Gln、及びArg261Aspである、請求項15記載の変種。
【請求項１７】
置換Lys263Ser及びLys264Glyをさらに含む、請求項16記載の変種。
【請求項１８】
(i)以下の置換：Ser259Asp、Lys260Asn、及びArg261Thr、かつ
(ii)以下の欠失：Lys263、Lys264及びAsp265
を含んでなり、
前記位置は未改変の野生型分子と対応しており、その結果、
該変種の位置258〜263に配列Lys−Asp−Asn−Thr−Glu−Argが形成されている、請求項3記載の変種。
【請求項１９】
(i)以下の置換：Ser259Asp、Lys260Asn、Arg261Thr、及びLys264Gly、かつ
(ii)以下の欠失：Lys263及びAsp265
を含んでなり、
前記位置は未改変の野生型分子と対応しており、その結果
該変種の位置258〜264に配列：Lys−Asp−Asn−Thr−Glu−Gly−Argが形成されている、請求項3記載の変種。
【請求項２０】
以下の置換：
Lys258Gln、Ser259Asp、Lys260Gln、Arg261Aspを含むことによって、
該変種の位置258〜265に配列：Gln−Asp−Gln−Asp−Glu−Lys−Lys−Argが形成されている、請求項3記載の変種。
【請求項２１】
以下の置換：
Lys258Gln、Ser259Asp、Lys260Gln、Arg261Asp、Lys263Ser、Lys264Glyを含むことによって、
該変種の位置258〜265に配列：Gln−Asp−Gln−Asp−Glu−Ser−Gly−Argが形成されている、請求項3記載の変種。
【請求項２２】
請求項1〜21のいずれか1項の変種を含有するIL-12タンパク質、又はその断片。
【請求項２３】
請求項1〜21のいずれか1項記載の変種を含有するIL-23タンパク質、又はその断片。
【請求項２４】
請求項1〜21のいずれか1項記載の変種、又は請求項22若しくは23のタンパク質、及び抗体又はその活性部分を含んでなる融合タンパク質。
【請求項２５】
変種又はタンパク質が抗体又は抗体部分のC-末端に融合している、融合タンパク質。
【請求項２６】
請求項1〜21のいずれか1項記載の変種、又は請求項22若しくは23記載のタンパク質、又は請求項24若しくは25記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項２７】
請求項26記載の核酸を含んでなる発現ベクター。
【請求項２８】
請求項1〜21のいずれか1項記載の変種、請求項22若しくは23記載のタンパク質、又は請求項24若しくは25記載の融合タンパク質を産生する宿主細胞であって、請求項27の発現ベクターを含んでなる前記宿主細胞。
【請求項２９】
IL-12又はIL-23誘発疾患の治療に適した医薬組成物であって、薬理学的に有効な量で請求項22〜25のいずれか1項記載のタンパク質を含んでなり、任意に医薬的に許容しうる担体希釈剤又は賦形剤を一緒に含んでよい、医薬組成物。
【請求項３０】
請求項29記載の医薬組成物の、癌又は自己免疫疾患の治療用薬物の製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、改変されて安定性が改良されたIL-12p40タンパク質に関し、改変されて安定性が改良されたIL-12p40を含有する融合タンパク質も包含する。特に、本発明のIL-12p40タンパク質は、そのp40サブユニット内のLys260及びArg261の領域のタンパク質分解部位が除去されている。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン-12(IL-12)は、感染に応答して免疫系の種々の細胞によって産生される炎症性サイトカインである。前記細胞としては貪食細胞、B細胞及び活性化樹状細胞が挙げられる(Colombo and Trinchieri (2002), Cytokine & Growth Factor Reviews, 13: 155168)。IL-12は、免疫系の先天的部門と適応部門の相互作用の媒介、T-細胞とナチュラルキラー(NK)細胞に対する作用、細胞傷害性リンパ球の増殖と活性の増強及び他の炎症性サイトカイン、特にインターフェロン-γ(IFN-γ)の産生に不可欠な役割を果たす。
IL-12は、ジスルフィド架橋によってα鎖(p35サブユニット、IL-12p35)とβ鎖(p40サブユニット、IL-12p40)が共有結合して生物学的に活性な74kDaのヘテロダイマーを形成しているヘテロダイマー分子である。成熟(野生型)ヒトIL-12のIL-12p35及びIL-12p40のアミノ酸配列は、それぞれ図1(配列番号1)及び図2(配列番号2)に示される。
インターロイキン-23(IL-23)は、IL-12と同じβ鎖IL-12p40を有する点でIL-12と密接に関連するジスルフィド架橋へテロダイマー分子であるが、固有のα鎖(p19サブユニット、IL-23p19)を有する(Oppmann et al., (2000), Immunity, 13: 715-725)。IL-12と同様に、IL-23は貪食細胞及び活性化樹状細胞によって産生され、かつ一連の炎症性細胞の補充及び活性化に関与すると考えられている(Langrish et al., (2004) Immunol. Rev., 202: 96-105)。成熟ヒトIL-23のIL-23p19のアミノ酸配列は図3(配列番号3)に示される。
【０００３】
免疫細胞が生物学的に活性なIL-12又はIL-23ヘテロダイマーを分泌するためには、同一細胞におけるα及びβサブユニットの同時発現が必要である。単独のIL-12p35又はIL-23p19の免疫細胞による分泌は観察されていないが、生物学的に活性なIL-12又はIL-23へテロダイマーを産生する細胞は該へテロダイマーより10〜100倍過剰な遊離型のp40サブユニットを分泌する(D'Andrea et al. (1992), J. Exp. Med., 176: 1387-98, Oppmann et al., (2000), Immunity, 13: 715-725)。さらに、マウスではαサブユニットの非存在下でさえ、細胞が生物学的に活性なIL-12p40ホモダイマーを産生しうることが観察されている(Hikawa et al. (2004), Neuroscience, 129: 75-83)。
内因性IL-12の存在は、広範な病原、並びに移植及び化学的に誘発される腫瘍に対する免疫抵抗に必要であることが分かっている(Gateley et al. (1998), Annu. Rev. Immunol., 16: 495-521)。IL-12は、IFN-γの誘導及びCD8+ T-細胞やNK細胞等のエフェクター細胞の活性化に基づく強力な抗-腫瘍活性を有することが実証されている(Brunda et al. (1993), J. Exp. Med., 178: 1223-30)。その実証された抗-腫瘍活性の結果として、IL-12は種々多様な癌（腎臓癌、結腸癌、卵巣癌、メラノーマ及びT-細胞リンパ腫が挙げられる）の治療のための免疫療法薬として(Atkins et al. (1997), Clin. Cancer Res., 3: 409-17; Gollob et al. (2000), Clin. Cancer Res., 6: 1678-92; and Hurteau et al. (2001), Gynecol. Oncol., 82: 7-10)、及び癌ワクチン用アジュバントとして(Lee et al. (2001), J. Clin. Oncol. 19: 3836-47)ヒト臨床実験で検査されている。
IL-12又はIL-23では、その正確に折りたたまれ、かつ生物学的に活性なへテロダイマー型の組換えタンパク質の産生は、産生性細胞系内におけるαサブユニットとIL-12p40の両方の同時発現を要する。しかし、精製組換えタンパク質は、IL-12p40のC-末端領域内のタンパク質分解切断に起因するある程度の異質性を示す。IL-12又はIL-23タンパク質の不安定性は、その生産及び治療薬としての臨床用途で問題を引き起こしうる。従って、タンパク質分解に対してより高い抵抗性の同種タンパク質を産生する改良された組換えIL-12又はIL-23変種が技術上要望されている。
【発明の開示】
【０００４】
〔発明の概要〕
本発明は、野生型IL-12 p40タンパク質に比べて改良された安定性を有するヒトIL-12 p40サブユニットの変種(p40変種)を提供する。これらのp40変種では、普通はタンパク質分解切断に感受性であるC-末端領域が操作されてプロテアーゼによる消化に対してより抵抗性になっている。具体的には、本発明のp40変種は、該変種タンパク質を免疫原性にし、かつヒト内で抗体反応を誘発する可能性のあるT-細胞エピトープの生成を回避する目的でそのD3ドメイン内に操作されたアミノ酸変化を含む。結果として、本発明のp40変種は、その生産、製剤化、及び薬物動態に関し、治療薬として野生型のIL-12p40タンパク質を超える改良された特性を有する。
従って、一局面では、本発明は、ヒトIL-12 p40 D3ドメインの変種(D3変種)を提供し、該D3変種は、野生型ヒトIL-12p40 D3ドメインと少なくとも85%の同一性を有し、かつ成熟ヒトIL-12 p40の残基258〜266に対応する少なくとも1つ以上の位置にアミノ酸変化を含む。本発明の特定の実施形態は、部分的に、本発明のアミノ酸変化が、Lys260とArg261の間のタンパク質分解部位を除去することの特別な利益を有するという認識に基づいている。
本発明では、残基258〜266に対応する少なくとも1つ以上の位置へのアミノ酸変化は、欠失、置換、又は挿入でよい。さらに、塩基性アミノ酸を非塩基性アミノ酸と置き換えるアミノ酸置換を用いて本発明の変種を生成することができる。
特に、本発明のD3変種は、Lys258、Ser259、Lys260、Arg261、Lys263、Lys 264、Asp265、及びArg266から成る群より選択される位置に1つ以上のアミノ酸置換を含みうる。このようなアミノ酸変化を単独で又は組み合わせて用いて上述した構造変化及び/又は機能変化を生じさせうる。例えば、D3変種は、以下の置換の1、2、3、4又はそれより多くを組み入れることができる：Lys258Gln、Ser259Asp、Lys260Ala、Lys260Asn、Lys260Gln、Lys260Gly、Arg261Ala、Arg261Asp、Arg261Thr、Lys263Gly、Lys263Ser、及び/又はLys264Gly。
【０００５】
いくつかの実施形態では、置換は位置Lys260である。置換はLys260を非塩基性アミノ酸、例えば、Ala、Asn、Gln、又はGlyと置き換えうる。Lys260に加えてさらなる置換がSer259及びArg261で起こりうる。特に、本発明のいくつかのD3変種は、置換Ser259Asp、Lys260Asn、及びArg261Thrを含む。さらなる実施形態では、本発明のD3変種は置換Ser259Asp、Lys260Asn、Arg261Thr及びLys264Glyを含み、一方、場合によりLys263及びAsp265を欠失している。或いは、本発明のD3変種は、置換Ser259Asp、Lys260Asn、Arg261Thr、及びLys264Glyを含み、一方Lys263、Lys264及びAsp265を欠失している。
本発明の他の実施形態では、Lys260を置き換える置換を含むD3変種は、これとは別に、Lys258、Ser259、Arg261、Lys263、及びLys264の1つ以上でさらなる置換を含む。例えば、一実施形態では、D3変種は置換Lys258Gln、Ser259Asp、Lys260Gln、Arg261Aspを含み、かつ任意にLys263Ser及びLys264Glyを含みうる。
さらなる実施形態では、Ser259、Lys260、及びArg261における置換に加え、Lys263、Lys264、Asp265、及びArg266に対応する1つ以上の残基が欠失し、別の実施形態では、Lys263、Lys264、Asp265、及びArg266の1つ以上が非塩基性アミノ酸で置換されている。さらなる実施形態では、Lys264における置換がLys264Glyであり、場合によりLys263とAsp265が欠失しうる。本発明の他のD3変種は置換Ser259Asp、Lys260Asn、Arg261Thr、及びLys264Glyを含み、場合により、Lys263、Asp265及びArg266に対応する残基の欠失を含みうる。
当業者には、ここで述べたようなD3変種を組み入れるp40変種とその活性部分は本発明の範囲内であることが分かるだろう。同様に、p40変種を含有するIL-12タンパク質及びその活性部分(IL-12変種)も本発明の範囲内である。本発明は、さらに、本発明のIL-12変種と、抗体成分、非-IL-12サイトカイン、又はその活性部分から成る群より選択される成分とを含む融合タンパク質を包含する。
同様に、p40変種を含有するIL-23タンパク質とその活性部分(IL-23変種)も本発明の範囲内である。本発明は、さらに、本発明のIL-23変種と、抗体成分、非-IL-23サイトカイン、又はその活性部分から成る群より選択される成分とを含む融合タンパク質を包含する。
【０００６】
別の局面では、本発明は、本発明のD3変種、p40変種、IL-12変種、及びIL-23変種のいずれかをコードする核酸に関する。本発明は、さらに、該核酸を含む細胞、例えば、原核生物細胞を包含する。
本発明は、該D3変種、p40変種、IL-12変種、IL-23変種及びこれらの成分を含有する融合タンパク質の製造方法をも特徴とする。
さらに別の局面では、本発明は、本発明の変種及び該変種をコードする核酸の使用方法を提供する。例えば、本発明は、治療的に有効量の本発明のp40変種又はその活性部分を患者に投与することを含む、患者の治療方法を包含する。
本発明の前記及び他の特徴及び利点並びに本発明自体は、以下の図面、説明、及び特許請求の範囲からさらに完全に理解されるだろう。
【０００７】
要約すると、本発明は以下に関する：
・野生型ヒトIL-12 p40 D3ドメインと少なくとも85%の配列同一性を有し、かつ親の成熟ヒトIL-12 p40の位置258〜266の残基に対応する1つ以上の位置にアミノ酸変化を含む、IL-12 p40 D3ドメインの変種。
・前記変化がLys260とArg261の間のプロテアーゼ部位を除去する、対応する変種。
・前記変化が置換又は欠失である、対応する変種。
・前記変化が、Lys258、Lys260、Lys263、及びLys264から成る群より選択される置換である、対応する変種。
・以下のアミノ酸置換の1つ以上が選択される、対応する変種：
Lys258Gln、
Lys260Ala、Lys260Asn、Lys260Gln、Lys260Gly、
Lys263Gly、Lys263Ser、及び
Lys264Gly。
・前記置換が少なくとも位置Lys260にある、対応する変種。
・前記置換が塩基性アミノ酸を、Ala、Asn、Gln、又はGlyから成る群より選択される非塩基性アミノ酸と置き換える、対応する変種。
・さらに、位置Ser259、Arg261又はArg266における1つ以上の置換を含む、対応する変種。
・前記置換がSer259及びArg261である、対応する変種。
・前記置換がSer259Asp、Lys260Asn、及びArg261Thrである、対応する変種。
・さらに置換Lys264Glyを含んでなる対応する変種。
・さらに残基Lys263及びAsp265の一方又は両方が欠失している、対応する変種。
・Lys263、Lys264、Asp 265、及びArg266に対応する1つ以上の残基が欠失している、対応する変種。
・さらに以下の置換：
Lys263、Lys264、Asp265、及びArg266
から成る群より選択される1つ以上の置換を含み、
対応する元のアミノ酸残基が非塩基性アミノ酸で置き換えられる、
対応する変種。
・さらに以下の置換：
Lys258、Ser259、Arg261、Lys263及びLys264
から成る群より選択される1つ以上の置換を含んでなる対応する変種。
・前記置換が、
Lys258Gln、Ser259Asp、Lys260Gln、及びArg261Asp
である、対応する変種。
・さらに置換Lys263Ser及びLys264Glyを含んでなる対応する変種。
・特に、
(i)以下の置換：    Ser259Asp、Lys260Asn、及びArg261Thr、かつ
(ii)以下の欠失：Lys263、Lys264及びAsp265
を含んでなり、
前記位置は未改変の野生型分子と対応しており、その結果、
該変種の位置258〜263に配列Lys−Asp−Asn−Thr−Glu−Argが形成されている、対応する変種。
・特に、
(i)以下の置換：Ser259Asp、Lys260Asn、Arg261Thr、及びLys264Gly、かつ
(ii)以下欠失：Lys263及びAsp265
を含んでなり、
前記位置は未改変の野生型分子と対応しており、その結果、
該変種の位置258〜264に配列：Lys−Asp−Asn−Thr−Glu−Gly−Argが形成されている、対応する変種。
・以下の置換：
Lys258Gln、Ser259Asp、Lys260Gln、Arg261Aspを含むことによって、
該変種の位置258〜265に配列：Gln−Asp−Gln−Asp−Glu−Lys−Lys−Argが形成されている、対応する変種。
・以下の置換：
Lys258Gln、Ser259Asp、Lys260Gln、Arg261Asp、Lys263Ser、Lys264Glyを含むことによって、
該変種の位置258〜265に配列：Gln−Asp−Gln−Asp−Glu−Ser−Gly−Argが形成されている、対応する変種。
・上述した及び後述する変種を含有するIL-12タンパク質、又はその断片。
・上述した及び後述する変種を含有するIL-23タンパク質、又はその断片。
・上述した変種、又はIL-12若しくはIL-23タンパク質、及び抗体又はその活性部分を含んでなる融合タンパク質。
・前記変種又は前記タンパク質が前記抗体又は抗体部分のC-末端、好ましくは前記抗体のFc部に融合している（ここで、前記抗体は、腫瘍抗原、例えばKS(EpCam)若しくは14.18、又は腫瘍組織上で過剰発現される受容体、例えばHER2若しくはEGFR若しくはVEGFRを標的とする）、対応融合タンパク質。
・上述した及び後述する変種、又はIL-12若しくはIL-23タンパク質、又は融合タンパク質をコードする核酸又はDNA分子。
・前記核酸を含んでなる発現ベクター。
・上述した変種又はIL-12若しくはIL-23タンパク質又は融合タンパク質を産生する宿主細胞。
・薬理学的に有効な量で変種、IL-12若しくはIL-23タンパク質、或いは該変種又はIL-12若しくはIL-23タンパク質を含んでなる融合タンパク質を含み、場合により医薬的に許容しうる担体希釈剤若しくは賦形剤、又は任意に併用療法における他の薬理学的に有効な薬物を一緒に含んでよい、IL-12又はIL-23誘発疾患の治療に適した医薬組成物。
・前記医薬組成物又はその有効成分の、癌又は自己免疫疾患の治療用薬物の製造のための使用。
【０００８】
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、野生型タンパク質と比較して改良された安定性を有する、サイトカインインターロイキン-12(IL-12)p40サブユニットの変種を開示する。これらの変種では、普通は構造化されておらず、タンパク質分解切断に感受性であるp40サブユニットの領域が変異して、タンパク質分解切断に対してより抵抗性になっている。ドメインD3中、この領域は、成熟ヒトp40のアミノ酸258〜266(p40(258-266))に対応するポリペプチド範囲を包含する、p40サブユニットのC-末端近傍である。
IL-12p40サブユニットは、サイトカインインターロイキン-23(IL-23)の構成サブユニットでもある。IL-23は2つのサブユニット、αサブユニット「p19」とβサブユニット「p4」を有する。IL-23のp40サブユニットはIL-12p40と同じである。従って、IL-12p40サブユニットの変種は、同様にIL-23p40サブユニットの変種である。
ある一般クラスの実施形態では、アミノ酸残基258〜266に対応するp40の領域に変異を導入して、ヒトp40ではLys260とArg261の間の部位に対応する切断部位を除去する。さらなる実施形態では、モデリングによってより密接に折りたたまれた構造を生成する特異的変異をこの領域内に導入する。本発明の別の局面では、導入される変異はさらに、p40サブユニットの操作領域を免疫原性にするのを回避すると予想される。例えば、p40サブユニットの操作領域内のアミノ酸置換を選択して、ヒトにおいて潜在的T-細胞エピトープとして認識され得るペプチドの生成を回避する。
【０００９】
種々のメカニズムによって、アミノ酸残基258〜266に対応するp40の領域に変異を導入することができる。例えば、一実施形態では、あるアミノ酸残基を別のアミノ酸残基との置換によって変異を導入する。さらなる実施形態では、p40サブユニットの1つ以上の残基の欠失によって変異を導入する。さらに別の実施形態では、p40サブユニット中への1つ以上のアミノ酸残基の挿入によって変異を導入する。
一実施形態では、本発明のp40変種は、IL-12タンパク質、IL-12融合タンパク質、IL-23タンパク質、IL-23融合タンパク質又はp40ホモダイマー等のタンパク質構成物に含まれる。例えば、一実施形態では、IL-12タンパク質はp35サブユニットと本発明のp40変種を含有する。別の実施形態では、IL-23タンパク質はp19サブユニットと本発明のp40変種を含有する。さらなる実施形態では、融合タンパク質は、IL-12p40変種を含有するIL-12に融合した抗体部分を含む。なおさらなる実施形態では、融合タンパク質は、IL-12p40変種を含有するIL-23に融合した抗体部分を含む。さらなる実施形態では、融合タンパク質の抗体部分は、インタクトな抗体、抗体のFc領域、sc-Fv、抗原結合部、又は抗体の活性断片である。さらに別の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、非-IL-12若しくは非-IL-23サイトカイン又はその活性部分に融合したIL-12p40変種を含む。
【００１０】
本発明のさらなる局面では、本発明のp40変種の1つを含有するタンパク質構成物は、対応する野生型タンパク質より長い循環半減期を有する。従って、野生型p40サブユニットを含有するIL-12又はIL-23タンパク質に比し、本発明により操作されたp40サブユニットを含むIL-12変種又はIL-23変種は、その生産、製剤化及び薬物動態に関し、治療薬として改良された特性を有する。
さらなる実施形態では、IL-12p40アミノ酸配列に対する変異が、IL-12p40(258-266)領域の外部に導入され、場合によりIL-12p40のIL-12p40 D3ドメインの外部に導入される。このような変異は、IL-12p40のD3ドメイン内のどこかに導入され、また他のドメイン内で導入されうる。例えば、図28は、残基258〜266の外部のアミノ酸配列に変化を有する、IL-12のp40サブユニットの配列を示す。Leong et al., (2003), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:1163-1168（その内容は本明細書で援用される）は、IL-12 p40アミノ酸配列において258〜266の領域を越えて変異導入しうる種々の残基を教示している。さらに、IL-12p40の三次元結晶構造は分かっており(Yoon et al., (2000), EMBO J., 19:3530-3541, この内容は本明細書で援用される)、かつIL-12のp40サブユニットとp35サブユニットの相互作用に必須の残基は分かっているので、当業者は、p40サブユニットの機能性を破壊しないであろう他の変異の選択を決定できる。
【００１１】
〔切断産物の決定〕
本発明は、部分的に、IL-12p40サブユニットが特異的なタンパク質分解切断事象に影響を受けやすいという観察、及び該切断部位を定義する新規な実験結果に基礎を置く。実施例2で述べるようにNS/0細胞内で産生された精製組換えIL-12タンパク質は、還元条件下でSDS-PAGEゲル上の電気泳動によって該組換えタンパク質を分離すると、約6kDの分子量の追加タンパク質バンドとしてはっきりと目に見える、ある程度の異質性を一貫して示すことが分かった。同様の観察を組換えIL-23タンパク質について行った。これは図4に示され、図4は、抗体融合タンパク質として産生されたヒトIL-12タンパク質構成物(パネルA)及びヒトIL-23タンパク質構成物(パネルB)のいくつかの精製バッチについてのSDS-PAGEゲルを示している。
実施例3で述べるようにこの夾雑物を精製し、そのアミノ酸配列を決定すると、Lys260とArg261の間のタンパク質分解切断によって生成される、IL-12p40サブユニット自体のC-末端の46個のアミノ酸断片に対応することが分かった(図5-配列番号4)。Lys260とArg261の間の切断は、該切断部位の周囲の領域内に塩基性アミノ酸が沢山あるにもかかわらず非常に有利なようである(…KSKREKKDR…(図6-配列番号5)、Lys260及びArg261は太字で示される)。しかし、p40サブユニットから切断されるにもかかわらず、C-末端ペプチド断片はp40サブユニットの残部と非共有結合的に結合したままであり、その結果異質性が生じ、該組換えタンパク質をさらに精製してこの異質性を除去することが困難になっている。
【００１２】
〔L-12p40タンパク質〕
成熟ヒトp40サブユニットは、ドメインD1、D2及びD3で構成される可溶性クラスIサイトカイン□受容体に似ている306アミノ酸タンパク質である。切断部位(Lys260とArg261の間)は、D3ドメイン、I211〜S306の領域を包含する96個のアミノ酸のフィブロネクチンIII型ドメイン内にある。成熟ヒトIL-12 p40サブユニットの配列は図2に示される。D3のアミノ酸配列は図2中、イタリック体で示されている。ヒトIL-12ヘテロダイマーの公開されたX-線結晶構造(Yoon et al. (2000), EMBO J., 19: 3530-41)では、D3ドメインのヒトp40(258-266)の領域内のループ部分が解像されていない。理論に拘泥されるつもりはないが、結晶構造の未解像領域は、多くの場合フレキシブルな構造化されていないループの指標であり、タンパク質分解の標的部位を構成しうる。
ヒト；霊長類ヒヒ、アカゲザル及びマンガベー；イヌ；ネコ；ウマ；ブタ；反芻動物ウシ、ヤギ、ヒツジ、シカ、水牛；及びげっ歯類ハムスター、モルモット、コットンラット及びマウスといった種々の哺乳動物種由来の成熟p40サブユニットの一次構造アラインメントは図7-1及び7-2に示される。アラインメント中、p40(258-266)の回りの領域は配列変動性を示し、特にその長さについて配列変動性を示す。特に、いくつかの種、顕著には反芻動物では、該配列は短く、げっ歯類等の他の動物では、該配列が追加の挿入断片を含む場合がある。多くの種では、ヒトp40 K260R261に対応するジペプチドモチーフが保存され、同一又は2つの塩基性アミノ酸を示す。これらの種には、農業的及び商業的に重要な種が含まれ、限定するものではないが、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、及びヒツジが挙げられる。結果として、ヒトIL-12p40の残基258〜266に対応する非ヒトIL-12p40の領域内への、本明細書でヒトIL-12p40に関して教示される変異に類似する1つ以上の変異の導入は、K260R261切断部位における非ヒトIL-12p40のタンパク質分解切断の減少又は除去に有意なことが明らかになるであろう。
原則として、本発明により、ヒト又は他の異種生物において、ヒトIL-12p40 K260R261に対応する正に荷電したジペプチドモチーフを欠く種由来のIL-12p40変種を使用することができる。しかし、本発明の実施では、IL-12p40の非ヒト型をヒトに投与すると一般的に抗-p40抗体をもたらすことに注意することが重要である。より広くは、ある種由来のp40を別の種に投与することは最適でない。さらに、種々の非ヒトp40サブユニットがタンパク質分解切断される可能性は一般に未知である。さらに、ある種由来のp40サブユニットは、p35若しくはp19等のサブユニットとの構築のステップにおいて、又は受容体サブユニットとの相互作用のステップにおいて、別の種においては機能しないかもしれない。
【００１３】
〔変種IL-12p40タンパク質〕
本発明は、安定性が改良された、D3ドメイン内に変異のある変種IL-12p40タンパク質を提供する。本明細書では、用語「D3変種」は、野生型D3に比べて1つ以上のアミノ酸変化を有するヒトp40サブユニットのD3ドメイン、例えば、野生型D3に比べて1つ以上のアミノ酸変化を有するIL-12又はIL-23のヒトp40サブユニットのD3ドメインを意味する。本明細書では、用語「p40変種」は、D3ドメイン内に変異のあるヒトp40サブユニット、例えば、D3ドメイン内に変異のあるIL-12又はIL-23のヒトp40サブユニット、すなわち、D3変種を含有するp40サブユニットを表す。本明細書では、用語「IL-12変種」は、p40変種を含有するヒトIL-12タンパク質を表す。本明細書では、用語「IL-23変種」は、p40変種を含有するヒトIL-23タンパク質を表す。
本発明の一実施形態によれば、p40変種の本D3ドメインは、野生型IL-12p40のD3ドメインと少なくとも70%以上の配列同一性を有する。さらなる実施形態では、p40変種のD3ドメインは、野生型IL-12p40のD3ドメインと少なくとも75%以上の配列同一性を有する。なお別の実施形態では、p40変種のD3ドメインは、野生型IL-12p40のD3ドメインと少なくとも80%以上の配列同一性を有し、さらなる実施形態では、p40変種のD3ドメインは、野生型IL-12p40のD3ドメインと少なくとも81%以上、又は少なくとも82%以上、又は少なくとも83%以上、又は少なくとも84%以上、又は少なくとも85%以上、又は少なくとも86%以上、又は少なくとも87%以上、又は少なくとも88%以上、又は少なくとも89%以上、又は少なくとも90%以上、又は少なくとも91%以上、又は少なくとも92%以上、又は少なくとも93%以上、又は少なくとも94%以上、又は少なくとも95%以上、又は少なくとも96%以上、又は少なくとも97%以上、又は少なくとも98%以上、又は少なくとも99%以上の配列同一性を有する。
別の実施形態によれば、p40変種のアミノ酸配列は、成熟野生型IL-12 p40のアミノ酸配列と少なくとも70%以上の配列同一性を有する。さらなる実施形態では、p40変種のアミノ酸配列は、成熟野生型IL-12 p40のアミノ酸配列と少なくとも75%以上の配列同一性を有する。なお別の実施形態では、p40変種のアミノ酸配列は、成熟野生型IL-12 p40のアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有し、さらなる実施形態では、p40変種のアミノ酸配列は、成熟野生型IL-12 p40のアミノ酸配列と少なくとも81%以上、又は少なくとも82%以上、又は少なくとも83%以上、又は少なくとも84%以上、又は少なくとも85%以上、又は少なくとも86%以上、又は少なくとも87%以上、又は少なくとも88%以上、又は少なくとも89%以上、又は少なくとも90%以上、又は少なくとも91%以上、又は少なくとも92%以上、又は少なくとも93%以上、又は少なくとも94%以上、又は少なくとも95%以上、又は少なくとも96%以上、又は少なくとも97%以上、又は少なくとも98%以上、又は少なくとも99%以上の配列同一性を有する。
【００１４】
2つのアミノ酸配列間の同一性率を決定するため、最適な比較目的のためにこれらの配列を整列させる(例えば、第2のアミノ酸配列との最適アラインメントのため第1のアミノ酸配列の配列にギャップを導入することができる)。2つの配列間の同一性百分率は、これらの配列が共有する同一位置の数の関数である(すなわち、同一性%＝(同一位置の数/位置の総数)×100)。比較する配列の長さが等しくない場合、短い方の配列を用いて位置の総数を決定する。数学アルゴリズムを用いて二配列間の同一性率の決定を達成することもできる。
二配列の比較のために利用する数学アルゴリズムの非限定的な例はKarlin and Altschul, (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-68（Karlin and Altschul, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-77におけるように改変された）のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムはAltschul et al., (1990) J. Mol. Biol., 215:403-10のNBLAST及びXBLASTプログラムに組み込まれている。BLASTヌクレオチド検索をNBLASTプログラムを用いて、スコア=100、ワード長=12で行うことができる。BLASTタンパク質検索をXBLASTプログラムを用いて、スコア=50、ワード長=3で行うことができる。比較目的のギャップ付きアラインメントを得るため、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Research, 25(17):3389-3402で開示されているようにGapped BLASTを利用できる。BLAST及びGapped BLASTプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーターを利用できる(例えば、XBLAST及びNBLAST)。
【００１５】
一実施形態では、本発明は、Lys260とArg261の間のタンパク質分解切断部位を除去する変化を含有するD3変種を提供する。一実施形態では、位置Lys260のアミノ酸を変異させる。より具体的な実施形態では、Lys260を非塩基性アミノ酸と置き換える。非塩基性アミノ酸として、例えばAla、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、又はValが挙げられる。例えば、Lys 260をAla、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、又はValのどれかと置き換える。別の実施形態では、Lys260をセレノシステインと置き換える。Lys260を別のアミノ酸と置き換えたD3変種の例は、図12、13、14、15、16、及び18に示される。
別の実施形態では、Arg261を変異させる。例えば、一実施形態では、Arg261をいずれかの非塩基性アミノ酸と置き換える。例えば、一実施形態では、Arg261をAla、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、又はValと置き換える。別の実施形態では、Arg261をセレノシステインと置き換える。Arg261を別のアミノ酸と置き換えたD3変種の例は、図12、13、17、及び18に示される。さらなる実施形態では、Lys260及びArg261を変異させる。例えば、一実施形態では、Lys260及びArg261をそれぞれ別のアミノ酸と置き換える。例えば、Lys260をGln、Ala、Asn、又はGlyのどれかと置き換え、Arg261をAla、Asp、又はThrのどれかと置き換える。Lys260とArg261の両方を他のアミノ酸と置き換えたD3変種の例は、図13及び18に示される。
さらに、ある実施形態ではLys260及びArg261を欠失させ、さらなる実施形態でLys260とArg261の間にアミノ酸を挿入する。
【００１６】
さらなる実施形態では、Lys258、Ser259、Lys260、Arg261、Lys263、Lys264、又はArg266の1つ以上をそれぞれ別のアミノ酸と置き換えてD3変種を生成する。一実施形態では、Lys258、Ser259、Lys260、Arg261、Lys263、Lys264、又はArg266の1つ以上をそれぞれ非塩基性アミノ酸と置き換える。例えば、一実施形態では、Lys258をGlnと置き換える。別の実施形態では、Ser259をAspと置き換える。別の実施形態では、Lys260をAla、Gly、Asn又はGlnと置き換える。さらなる実施形態では、Arg261をAla、Thr又はAspと置き換える。さらに別の実施形態では、Lys263をSerと置き換える。さらなる実施形態では、Lys264をGlyと置き換える。ある実施形態では、Arg266をGln、Asp、Asn、又はThrと置き換える。さらなる実施形態では、Lys263及びLys264をそれぞれ別のアミノ酸と置き換える。例えば、一実施形態では、各Lys263及びLys264をそれぞれSer及びGlyと置き換える。なお別の実施形態では、Lys258、Ser259、Lys260、Arg261、Lys263、及びLys264をそれぞれGln、Asp、Gln、Asp、Ser及びGlyと置き換える。
【００１７】
さらなる実施形態では、Ser259、Lys260、及びArg261の1つ以上をそれぞれ別のアミノ酸と置き換えてD3変種を生成する。さらなる実施形態では、Ser259、Lys260、及びArg261の1つ以上をそれぞれ非塩基性アミノ酸と置き換える。例えば、ある実施形態では、Ser259、Lys260、及びArg261をそれぞれAsp、Asn、及びThrと置き換える。
別の実施形態では、Lys258、Ser259、Lys260、及びArg261をそれぞれ別のアミノ酸と置き換える。例えば、一実施形態では、Lys258、Ser259、Lys260、及びArg261をそれぞれ非塩基性アミノ酸と置き換える。一実施形態では、Lys258、Ser259、Lys260、及びArg261をそれぞれGln、Asp、Gln、及びAspと置き換える。さらなる実施形態では、Ser259、Lys260、Arg261及びLys264をそれぞれAsp、Asn、Thr、及びGlyと置き換える。なおさらなる実施形態では、Ser259、Lys260、Arg261及びLys264をそれぞれAsp、Asn、Thr、及びGlyと置き換え、同時にLys263、及びAsp265を欠失させる。なお別の実施形態では、Ser259、Lys260、及びArg261をそれぞれAsp、Asn、及びThrと置き換え、同時にLys263、Lys264、及びAsp265を欠失させる。
【００１８】
理論に拘泥するつもりはないが、欠失は、p40(258-266)領域のコンホメーションの柔軟性を減らし、Lys260-Arg261モチーフが関連プロテアーゼによる切断を可能にするコンホメーションをとる能力を減らすという効果を有すると考えられる。従って、一実施形態では、Lys258、Ser259、Lys260、Arg261、Lys263、Lys264、Asp265、又はArg266の一つ以上を欠失させる。
さらなる実施形態では、Lys263、Lys264、Asp265、又はArg266の1つ以上を欠失させてD3変種を生成する。例えば、一実施形態では、Lys263及びAsp265を欠失させ、別の実施形態では、Lys263、Lys264、及びAsp265を欠失させる。別の実施形態では、Lys263、Lys264、及びAsp265を欠失させ、かつ1つ以上の非塩基性アミノ酸と置き換える。さらなる実施形態では、Lys263、Lys264、Asp265、及びArg266を欠失させる。さらなる実施形態では、Lys263、Lys264、Asp265又はArg266の1つ以上を欠失させ、同時にSer259、Lys260、又はArg261の1つ以上を別のアミノ酸と置き換える。例えば、一実施形態では、Ser259、Lys260、及びArg261をそれぞれAsp、Asn、及びThrと置き換え、同時にLys263、Lys264及びAsp265を欠失させる。さらなる実施形態では、Ser259、Lys260、及びArg261をそれぞれAsp、Asn、及びThrと置き換え、同時にLys263、Lys264、Asp265、及びArg266を欠失させる。
【００１９】
他の実施形態では、新しいT-細胞エピトープの生成を回避するようにアミノ酸置換を選択する。T-細胞エピトープを生成する可能性についてペプチド配列を解析する方法は技術上周知である(例えば、米国特許出願第2003/0153043号；国際公開番号WO 00/034317；及びSturniolo et al. (1999), Nature Biotech., 17: 555-61参照)。ある実施形態では、ヒトIL-12p40(258-266)の配列を配列KDNTER(配列番号17)と置き換える。換言すれば、Ser259、Lys260、及びArg261をそれぞれAsp、Asn、及びThrと置き換え、同時にLys263、Lys264、及びAsp265を欠失させて、該変種内の残基258〜263から生じる配列がKDNTERとなるようにした。結果のIL-12p40変種は図8に示される。
別の実施形態では、ヒトIL-12p40(258-266)の配列を配列KDNTEGR(配列番号18)と置き換える。換言すれば、Ser259、Lys260、及びArg261をそれぞれAsp、Asn、及びThrと置き換え、同時にLys263、Lys264及びAsp265を欠失させ、かつGly残基とだけ置き換えて、該変種内の残基から生じる配列がKDNTEGRとなるようにした。結果のIL-12p40変種は図9に示される。
なお別の実施形態では、ヒトIL-12p40(258-266)の配列を配列QDQDEKKDR(配列番号19)と置き換える。換言すれば、Lys258、Ser259、Lys260、及びArg261をそれぞれGln、Asp、Gln、及びAspと置き換えて、該変種内の残基258〜266から生じる配列がQDQDEKKDRとなるようにした。結果のIL-12p40変種は図10に示される。
さらなる実施形態では、ヒトIL-12p40(258-266)を配列QDQDESGDR(配列番号20)と置き換える。換言すれば、Lys258、Ser259、Lys260、Arg261、Lys263、及びLys264をそれぞれGln、Asp、Gln、Asp、Ser、及びGlyと置き換えて、残基258〜266から生じる配列がQDQDESGDRとなるようにした。結果のIL-12p40変種は図11に示される。
【００２０】
さらなる実施形態では、D3変種はIL-12p40サブユニット又はその活性部分内に含まれる。活性部分とは、D3変種を含有するIL-12p40サブユニットが、野生型IL-12p40部分の生物学的活性に比し、一実施形態では少なくとも10%の活性、別の実施形態では少なくとも20%の活性、別の実施形態では少なくとも30%の活性、別の実施形態では少なくとも50%の活性、別の実施形態では少なくとも70%の活性、別の実施形態では少なくとも75%の活性、別の実施形態では少なくとも80%の活性、別の実施形態では少なくとも90%の活性、別の実施形態では少なくとも95%の活性、別の実施形態では少なくとも99%の活性、別の実施形態では少なくとも100%の活性、さらなる実施形態では少なくとも150%の活性、別の実施形態では少なくとも200%の活性、さｒなる実施形態では少なくとも300%の活性、別の実施形態では少なくとも400%の活性、別の実施形態では少なくとも500%の活性、又は別の実施形態では少なくとも1000%の活性を有することを意味する。
【００２１】
〔IL-12p40変種を含有するタンパク質〕
野生型IL-12p40に代えてタンパク質構成物中にIL-12p40変種を導入することができる。IL-12p40を含む生物学的に活性なタンパク質構成物の例はp40ホモダイマー、IL-12及びIL-12融合タンパク質、並びにIL-23及びIL-23融合タンパク質である。本発明の一局面では、IL-12 p35/変種p40ヘテロダイマーは別個のポリペプチド鎖から成る。或いは、IL-12 p35/変種p40へテロダイマーは単一のポリペプチドからなる。本発明の別の局面では、IL-23 p19/変種p40へテロダイマーは別個のポリペプチド鎖から成る。或いは、IL-23 p19/変種p40へテロダイマーは単一のポリペプチド鎖から成る。
本発明の別の局面では、IL-12融合タンパク質の一部として、IL-12融合相手は抗体要素又は抗体要素の一部でよい。有用な抗体要素として、IL-12融合タンパク質を腫瘍環境、例えば腫瘍細胞自体、又は腫瘍の壊死中心若しくはその支持基質に向けるものが挙げられる。本発明の別の実施形態では、融合相手は別のサイトカインである。有用なサイトカインとして、限定するものではないが、IL-2、IL-7、及びIL-15が挙げられる。
本発明の別の局面では、IL-23融合タンパク質の一部として、IL-23融合相手は抗体要素又は抗体要素の一部でよい。有用な抗体要素として、IL-23融合タンパク質を腫瘍環境、例えば腫瘍細胞自体、又は腫瘍の壊死中心若しくはその支持基質に向けるものが挙げられる。本発明の別の実施形態では、融合相手は別のサイトカインである。有用なサイトカインとして、限定するものではないが、IL-2、IL-7、及びIL-15が挙げられる。
【００２２】
〔p40変種をコードする核酸〕
本発明のさらなる局面では、本発明のp40変種を含有するポリペプチドをコードする核酸が考慮される。例えば、当業者が精通しているDNA技術を用いて、本発明のp40変種をコードする核酸を構築することができる。典型的手順は実施例1で分かる。
図19は、成熟ヒトIL-12p40サブユニットをコードする核酸配列を示す。図20〜22は、本発明のp40変種で見られる典型的変異をコードする合成ヌクレオチド断片を示す。
【００２３】
〔p40変種を用いた治療方法〕
本発明のp40変種は、p40変種を含有する融合タンパク質及びIL-12タンパク質又はIL-23タンパク質を含め、実証されたIL-12タンパク質の抗-腫瘍活性に基づき、種々多様な癌の治療のため等の免疫療法薬として有用である。例えば、癌（限定するものではないが、腎臓癌、結腸癌、卵巣癌、メラノーマ及びT-細胞リンパ腫が挙げられる）の治療では、好ましくはp35とのへテロダイマーとして、又は癌ワクチン用アジュバントとして本発明のp40変種を使用できる。p40変種をp40/p40ホモダイマーの一部として用いてTH1応答(例えば、自己免疫疾患と関連するTH1応答)を減らすこともできる。
【００２４】
〔投与〕
本発明のIL-12変種、IL-23変種、及びp40変種を両方とも投与に適した医薬組成物中に組み入れることができる。該組成物は、典型的にIL-12変種又はIL-12変種を含有する融合タンパク質と、医薬的に許容しうる担体とを含む。本明細書では、用語「医薬的に許容しうる担体」は、医薬投与と適合するいずれのかつすべての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等を包含することを意図する。医薬的に活性な物質のためにこのような媒体及び薬剤を使用することは技術上周知である。
本発明の医薬組成物をその意図した投与経路に適合するように製剤化する。投与経路の例として、非経口(例えば静脈内、皮内、皮下)、経口(例えば、吸入)、経皮(局所)、経粘膜、及び直腸投与が挙げられる。非経口、皮内、又は皮下適用で使用する溶液又は懸濁液は以下の成分を含みうる：無菌希釈剤、例えば注射用水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒；抗細菌剤、例えばベンジルアルコール又はメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸；緩衝液、例えば酢酸、クエン酸又はりん酸緩衝液及び浸透圧の調整用薬剤、例えば塩化ナトリウム又はデキストロース。塩酸又は水酸化ナトリウム等の酸又は塩基でpHを調整できる。ガラス又はプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器又は多剤バイアルに非経口製剤を封入しうる。
本発明のIL-12変種、IL-23変種、又はp40変種を含有する薬物は、0.01以下〜100%(w/w)の濃度を有しうるが、該薬物の剤形によってその量は変わる。
投与量は、患者の体重、疾患の重症度、使用するIL-12p40変種の個々の型、及び医師の見解によって決まる。例えば、本発明のIL-12変種では、通常、1日約0.01〜約10mg/kg(体重)、注射の場合約0.02〜約2mg/kg/日、又は約0.5mg/kg/日の投与が推奨される。疾患の重症度及び医師の見解に従い、1日に1回又は数回、前記用量を投与することができる。本発明のIL-12p40を含有する抗体-IL-12融合タンパク質又は抗体-IL23融合タンパク質では、通常、1日約0.001〜約1mg/kg(体重)、注射の場合約0.002〜約0.5mg/kg/日、又は約0.1mg/kg/日の投与が推奨される。疾患の性質と重症度及び医師の見解に従い、2、3又は4週間に1回又は2回、前記用量を投与することができる。
本発明の局面を以下の実施例でさらに説明する。
【００２５】
実施例
実施例1：ヒトIL-12p40サブユニットの変種のクローニング
当業者が精通しているDNA技術を用いて、本発明のp40変種、特にp40V1〜p40V8(配列番号6〜13)をコードする核酸を構築した。本質的に、変異したアミノ酸残基を包含する領域にまたがり、かつ便利な制限部位で挟まれた断片をコードするDNAカセットを新たに合成し(Blue Heron Biotechnology, Bothell, WA)、p40配列を保持する発現プラスミドに含まれる野生型配列の対応断片を置き換えた(例えば米国特許第6,838,260号のpNC-p40参照)。成熟(野生型)ヒトIL-12p40サブユニットをコードする核酸配列は、図19に示される。このようにしてp40変種をコードする発現プラスミドを得た。
特に、p40V1及びp40V2をコードする核酸を以下のように生成した。図20に示されるように、隣接断片として合成されたp40V1及びp40V2 DNAカセットを保持するクローニングベクター(pBHV1V2)をBpu10 I及びEco RI/Sca I又はBbs Iのどちらかで消化し、それぞれEcoR I/Bpu10 I適合性末端を有するEcoR I/Bpu10 I(V1用)及びBbs I/Bpu10 I(V2用)カセットを生成した。同じようなサイズのV2断片を除去すべくSca I消化を含めた。これらの精製断片を、NC-p40から得た適切なBpu10 I/Pvu I及びPvu I/Eco RI断片とのトリプルライゲーションでpNC-p40発現ベクター中にクローン化した。
同アプローチを用いて、図21に示される合成配列から出発して、p40V5及びp40V6をコードする核酸を生成し、かつ図23に示される合成配列から出発して、p40V7及びp40V8をコードする核酸を生成した。
同様に、p40V3及びp40V4をコードする核酸を生成するため、図22に示される合成配列を保持するプラスミド(pBHV3V4)をEcoR I/Bbs I/ScaI(Sca I消化を含めて同じようなサイズのV4断片を除去した)、又はBbs Iのみで消化し、それぞれEcoR I/Bbs I(V3用)及びBbsI(V4用)カセット(それぞれEcoR I/Bbs I消化発現プラスミドpNC-p40と適合性の末端を有する)を生成した。Bbs I制限酵素では認識配列と切断配列が離れているので、複数のBbs I認識部位を含有する配列は異なる配列特異的なオーバーハングを生成しうることに留意されたい。次に、V3及びV4カセットをそれぞれゲル精製し、pNC-p40から得た適切なBbs I/Pvu I及びPvu I/Eco RI断片を用いてトリプルライゲーションで発現プラスミドpNC-p40中に連結した。
同じ一般アプローチを用いて、本発明で想定される他のp40変種をコードするさらなる核酸分子を生成しうる。
【００２６】
実施例2：p40変種の発現及びp40変種を含有する抗体-IL12;融合タンパク質の発現
標準的な方法を用いて本発明のp40変種を発現する細胞株を生成した(米国特許第6,838,260号参照)。p40変種をコードするpNC-p40発現プラスミドを細胞、例えばNS/0細胞中に電気穿孔した。G418-含有培地上に細胞を蒔いて培養し、トランスフェクトされた細胞を選択した。薬物耐性クローン由来の培養上清をELISAでp40の産生についてアッセイし、最高の産生株をサブクローニングし、安定発現について試験した。
本発明のp40変種を有する抗体-IL-12融合タンパク質発現細胞株を生成するため、米国特許第6,838,360号に記載の逐次トランスフェクションアプローチに従った。例えば、p40V1を発現する細胞株をさらに第2のプラスミドpdHL10lambdaDI-NHS-p35（NHS76抗体をコードし、その重鎖定常部はIL-12 p35サブユニットのN-末端に連結している）でトランスフェクトすることによって、融合タンパク質DI-NHS-IL12p40V1を得た。発現プラスミドpdHL10lambdaは、コードされた軽鎖の定常領域がλ鎖である、pdHL7の誘導体である。標準的な方法で、メトトレキセート含有培地上で細胞を選択し、抗体融合タンパク質を発現する安定したトランスフェクタントをクローニングした。
【００２７】
実施例3：p40変種の精製及び特徴づけ
p40変種p40V1、p40V2、p40V3、及びp40V4(配列番号6〜9)の完全性を特徴づけるため、これらの変種を発現する二つ組の一時的にトランスフェクトされたNS-0細胞由来の使用済み細胞培地を収集し、図24に示されるポリクロナール抗-hu-p40抗体によるウェスタンブロット処理した。コントロールとしてコントロール野生型p40サブユニットを含めた(レーン1)。これらの電気泳動条件によって、インタクトなp40種から普通は良く分離される、C-末端の6kDa断片を欠く切断種は試験したいずれの変種にも存在せず、インタクトなp40だけが検出されることが分かった。従って、試験したp40変種は、タンパク質発現の際に存在するタンパク質分解活性に抵抗性であった。
プロテインA捕獲に基づいた標準的技術を用いて、細胞培養上清からIL-12p40変種を含有する抗体融合タンパク質を精製した(米国特許第6,838,260号参照)。
配列番号6〜13に示したp40変種のNS-0安定クローンから精製した抗体融合タンパク質のSDS-PAGEゲル(レーン1〜8)及び非変異コントロールのSDS-PAGEゲル(レーン9)を図25に示す。3つの主バンドの中間は未切断p40サブユニットを表し、少し上の非常に弱いバンドは、よりグリコシル化された種を示す。上方の最も主要なバンドは抗体重鎖とp35サブユニットとの融合タンパク質を表し、下方の主バンドは抗体軽鎖を表す。IL-12p40V5を含有する抗体融合タンパク質のサンプルを除き、6kDaバンドが存在しないことが分かった。IL-12p40V5では、残存する6kDaバンドが観察された(レーン5)。
【００２８】
実施例4：野生型IL-12p40サブユニット内のタンパク質分解切断部位の特徴づけ
混入する約6kDaのタンパク質断片の実体を標準的な方法で決定した。簡単に言えば、精製DI-NHS-IL12タンパク質を6Mグアンジジン/1mM DTT緩衝溶液で55℃にて変性させおよび還元し、C4カラム上で10%〜90%のアセトニトリル勾配を用いる逆相HPLC分離に供した。未同定ペプチド種に対応するフラクションを収集して乾燥させ、再懸濁し、SDS-PAGEゲル上でそれが6kDa断片に相当することを確認する実験を行い、N-末端シークエンシングで該ペプチドの配列を決定した。シークエンシング解析により、Arg261から開始する成熟(野生型)ヒトIL-12p40サブユニット中の配列に対応する配列REKKDRVFTDを有するペプチドが明らかになった。
【００２９】
実施例5：p40変種を含有するIL-12タンパク質の生物活性
ヒトPBMCからのINFγの誘導によって、p40変種を含有するIL-12タンパク質の生物活性を測定した。変種p40V1〜p40V8を含有する抗体融合タンパク質Ab-IL-12を野生型p40を有するAb-IL-12及び組換えヒトIL-12タンパク質と比較した。
基本的にGately et al. (1995), Current Protocols in Immunology, Section 6.16.4、及びKobayashi et al. (1989), J. Exp Med., 170: 827-845に記載されているとおりにIFNγ誘導アッセイを行った。PBMCをPHA-Pと共に3日間培養してから25IU/mlのhu IL-2(R&D Systems, Minneapolis MN)をさらに24時間添加した。細胞を洗浄し、すべての細胞に20IU/mlのIL-2を添加後、IL-12融合タンパク質を(IL-12の該分子に対する相対質量寄与として)20ng/mlから開始して一連の2倍希釈系列で添加した。24時間後、R&D Systemsから購入した抗体対を用いてELISAでIFNγの濃度を測定した。
異なるドナー由来のPBMCを用いた2つの別個の実験の結果を下表1にまとめる。
【００３０】
表1：IFNγ誘導アッセイにおけるAb-IL12変種の生物活性
2009521911.tif 000002
*(n=2)
【００３１】
組換えhu IL-12に比し、野生型p40を有するAb-IL12の活性は約10倍減少した。試験した抗体-IL12変種タンパク質は該タンパク質の活性に有意には作用しないことが分かった。Ab-IL12p40V1〜Ab-IL12p40V8は、対応する野生型の抗体IL-12融合タンパク質に比べていくらか低い活性(約1.5〜3倍低い)を有した。
【００３２】
実施例6：p40変種を含有するIL-12タンパク質の薬物動態
p40変種を含有する抗体融合タンパク質の薬物動態を決定した。当業者が精通している標準的技術を用いて実験を行った。要するに、0.2mlの体積中、変種p40V1、p40V2、p40V3、p40V4、p40V5、p40V6、p40V7及びp40V8を含有する25μgのAb-IL12又はAb-IL12変種をBALB/cマウス(処理群毎にn=3)の尾静脈に静脈内注射又は皮下注射した。24時間まで及び96時間までそれぞれ種々の時点で後眼窩採血によって小量の血液を取り、ヘパリン-コート管に集めて凝固を防止した。細胞を除去するための遠心分離後、抗-ヒトIgG H&L抗血清による捕獲及び抗-ヒトIL-12抗体による検出によって血漿を分析した。注射後30秒(t=0)以内に採取した各マウスの血漿中の初期濃度に対して結果を正規化した。図26は、静脈内投与したタンパク質の薬物動態を評価する代表的実験をまとめたものである。野生型コントロールタンパク質に比し、変種p40V1及びp40V2、p40V3、p40V4、並びにp40V6を含有する抗体-IL-12融合タンパク質は、有意に改良された薬物動態値を有することが分かった。特に、分布相(α相)の半減期は約2倍であり、対応して変種タンパク質のAUCが同様に約2倍であることが分かった。しかし、すべてのAb-IL-12融合タンパク質の排出相(β相)は実質的に同様なままだった。これらの結果は、マウスに皮下投与した場合のこれらのタンパク質の薬物動態と一致した(図27)。図27のパネルAは、p40 V1、p40 V2、p40 V3、及びp40 V4を含有するAb-IL12変種と野生型Ab-IL12の比較を示し、パネルBは、p40 V5、p40 V6、p40 V7、及びp40 V8を含有するAb-IL12変種と野生型Ab-IL12の比較を示す。
【００３３】
実施例7：IL-12p40変種によるヒト患者の治療
以下のように、本発明のIL-12p40変種を用いてヒトの疾患及び障害を予防及び治療する。一般的に、好ましい投与方法は静脈内注入若しくは静脈内注射、又は皮下注射、吸入であるが、経口送達、及び他の方法も可能である。
通常の化学療法による治療経歴のある進行性の転移性前立腺癌の患者を、IL-12p40変種を含有する抗体-IL12融合タンパク質で次のように治療する。治療周期毎の抗体-IL12融合タンパク質の用量は体重1kg当たり約150μgであり、1日で或いは隣接する2又は3日で、点滴注入による投与にて送達される。この治療は患者に適合するように医師が決定する前立腺癌の診療の基準治療と併用してよい。非ステロイド性の抗炎症薬、例えばナプロキセン（Naproxen(登録商標)）も処方される。ほぼ3週間毎に1回治療周期を繰り返す。
ホルモン不応性乳癌の患者を、IL-12p40変種を含有する抗体-IL12融合タンパク質による点滴注入で治療する。非ステロイド性の抗炎症薬、例えばナプロキセンも処方される。
代替治療戦略では、進行性のホルモン不応性前立腺癌又は進行性のホルモン不応性乳癌の患者を、KS-IL2等のIL-2-含有イムノサイトカインと併用して、ほぼ3週間に1回、IL-12p40変種を含有する抗体-IL12融合タンパク質で治療する。これらの2つの薬剤を点滴注入によって当時投与してよい。治療前に、免疫刺激量のシクロホスファミドを患者に投与する。非ステロイド性の抗炎症薬、例えばナプロキセンも処方される。
リウマチ性関節炎の患者を、p40サブユニットがIL-12p40変種である、Fc-p40融合タンパク質で、ほぼ2週間毎に1回、約8mg/kgの用量にて、点滴注入による投与で治療する。疾患改変抗リウマチ薬と比較した場合でさえ、関節破壊の進行が単剤療法で有意に抑制されることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】成熟(野生型)ヒトIL-12のα鎖、すなわちp35サブユニットの成熟アミノ酸配列(配列番号1)を示す。
【図２】成熟(野生型)ヒトIL-12のβ鎖、すなわちp40サブユニットの成熟アミノ酸配列(配列番号2)を示す。位置211-306に対応するドメインD3(配列番号26)をイタリック体にし、位置258〜266に対応するペプチド断片には下線を付し(配列番号5)、Lys260とArg261を太字で強調表示する。
【図３】成熟(野生型)ヒトIL-23のα鎖、すなわちp19サブユニットの成熟アミノ酸配列(配列番号3)を示す。
【図４Ａ】抗体融合タンパク質として産生されたヒトIL-12のいくつかの精製バッチについてのSDS-PAGEゲル(レーン1〜8)を示す。IL-12p35サブユニットは抗体重鎖に共有結合している。6kDのバンドを矢印で示す。マーカーについて分子量(kD)を示す(レーンM)。
【図４Ｂ】抗体融合タンパク質として産生されたヒトIL-23のいくつかの精製バッチについてのSDS-PAGEゲル(レーン1〜3)を示す。IL-23p19サブユニットは抗体重鎖に共有結合している。6kDのバンドを矢印で示す。マーカーについて分子量(kD)を示す(レーンM)。
【図５】成熟(野生型)ヒトIL-12p40サブユニットのC-末端ペプチド断片のアミノ酸配列を示す。断片はArg261から開始する(配列番号4)。
【図６】成熟(野生型)ヒトIL-12p40サブユニットの位置258〜266に対応するペプチド断片のアミノ酸配列を示す(配列番号5)。
【図７−１】ヒト、ヒヒ(Papio anubis)、アカゲザル(Macaca mulatta)、マンガベー(Cercocebus torquatos)、イヌ(Canis familiaris)、ネコ(Felis catus)、ウマ(Equus caballus)、ブタ(Sus scrofa)、ウシ(Bos Taurus)、ヤギ(Capra hircus)、ヒツジ(Ovis aries)、シカ(Cervus elaphus)、水牛(Bubalus bubalis)、ハムスター(Mesocricetus auratus)、モルモット(Cavia porcellus)、コトンラット(Sigmodon hispidus)、ラット(Rattus norvegicus)、及びマウス(Mus musculus)といった種々の哺乳動物由来のIL-12p40サブユニットのアミノ酸配列アラインメントを示す。太字の2つのアミノ酸はタンパク質分解部位を表す。
【図７−２】図７−１の続き。
【図８】本明細書でp40V1と称する、成熟ヒトIL-12p40サブユニットの変種のアミノ酸配列を示す(配列番号6)。操作した配列に下線を付す。
【図９】本明細書でp40V2と称する、成熟ヒトIL-12p40サブユニットの変種のアミノ酸配列を示す(配列番号7)。操作した配列に下線を付す。
【図１０】本明細書でp40V3と称する、成熟ヒトIL-12p40サブユニットの変種のアミノ酸配列を示す(配列番号8)。操作した配列に下線を付す。
【図１１】本明細書でp40V4と称する、成熟ヒトIL-12p40サブユニットの変種のアミノ酸配列を示す(配列番号9)。操作した配列に下線を付す。
【図１２】本明細書でp40V5と称する、成熟ヒトIL-12p40サブユニットの変種のアミノ酸配列を示す(配列番号10)。変化箇所に下線を付す。
【図１３】本明細書でp40V6と称する、成熟ヒトIL-12p40サブユニットの変種のアミノ酸配列を示す(配列番号11)。変化箇所に下線を付す。
【図１４】本明細書でp40V7と称する、成熟ヒトIL-12p40サブユニットの変種のアミノ酸配列を示す(配列番号12)。変化箇所に下線を付す。
【図１５】本明細書でp40V8と称する、成熟ヒトIL-12p40サブユニットの変種のアミノ酸配列を示す(配列番号13)。変化箇所に下線を付す。
【図１６】本明細書でp40V9と称する、成熟ヒトIL-12p40サブユニットの変種のアミノ酸配列を示す(配列番号14)。変化箇所に下線を付す。
【図１７】本明細書でp40V10と称する、成熟ヒトIL-12p40サブユニットの変種のアミノ酸配列を示す(配列番号15)。変化箇所に下線を付す。
【図１８】本明細書でp40V11と称する、成熟ヒトIL-12p40サブユニットの変種のアミノ酸配列を示す(配列番号16)。変化箇所に下線を付す。
【図１９】全長(野生型)ヒトIL-12p40サブユニットをコードする核酸配列を示す(配列番号21)。
【図２０】p40変種p40V1及びp40V2の部分をコードする、本明細書でV1V2と称する、合成ヌクレオチド断片の核酸配列を示す。V1V2断片は、配列番号17をコードする領域(下線)を含むV1断片を包含する。この後、リンカー配列(小文字)が続き、次に、配列番号18をコードする領域(下線)を含むV2断片が続く。
【図２１】p40変種p40V3及びp40V4の部分をコードする、本明細書でV3V4と称する、合成ヌクレオチド断片の核酸配列を示す。V3V4断片は、配列番号19をコードする領域(下線)を含むV3断片を包含する。この後、リンカー配列(小文字)が続き、次に、配列番号20をコードする領域(下線)を含むV4断片が続く。
【図２２】p40変種p40V5及びp40V6の部分をコードする、本明細書でV5V6と称する、合成ヌクレオチド断片の核酸配列を示す。V5V6断片は、Arg261Alaをコードするコドン置換(下線)を含むV5断片を包含する。この後、リンカー配列(小文字)が続き、次に、Lys260Ala及びArg261Alaをコードするコドン置換(下線)を含むV6断片が続く。
【図２３】p40変種p40V7及びp40V8の部分をコードする、本明細書でV7V8と称する、合成ヌクレオチド断片の核酸配列を示す。V7V8断片は、Lys260Alaをコードするコドン置換(下線)を含むV7断片を包含する。この後、リンカー配列(小文字)が続き、次に、 Lys260Glyをコードするコドン置換(下線)を含むV8断片が続く。
【図２４】ポリクロナール抗-hu-p40抗体によるウェスタンブロットである。野生型IL-12p40及びIL-12p40変種(V1〜V4)でトランスフェクトした細胞の上清を収集してSDS-PAGEゲル上で処理した。各IL-12p40変種p40V1、p40V2、p40V3、及びp40V4の2つの独立クローン(a、b)を試験した。矢印は、C-末端断片(レーンp40 wt)を欠いている切断されたIL12p40のバンドを指す。
【図２５】p40変種p40V1、p40V2、p40V3、p40V4、p40V5、p40V6、p40V7、p40V8及び野生型p40を含有する抗体-IL12融合タンパク質のSDS-PAGEゲルを示す(レーン1〜9)。上方の最も主要なバンドは抗体重鎖とp35サブユニットとの融合タンパク質を表し、下方の主バンドは抗体軽鎖を表す。レーン6以外、6kDaバンドはいずれの変種タンパク質のレーンでも検出されなかった。マーカーについて分子量(kD)を示す(レーンM)。
【図２６】静脈内投与した場合、抗体-(野生型)-IL12融合タンパク質と比較したp40変種p40V1〜p40V8を含有する抗体-IL12融合タンパク質の薬物動態データを示す。
【図２７Ａ】皮下投与した場合、抗体-(野生型)-IL12融合タンパク質と比較したp40変種p40V1〜p40V4を含有する抗体-IL12融合タンパク質の薬物動態データを示す。
【図２７Ｂ】皮下投与した場合、抗体-(野生型)-IL12融合タンパク質と比較したp40変種p40V5〜p40V8を含有する抗体-IL12融合タンパク質の薬物動態データを示す。
【図２８】タンパク質のD3領域外に変異を有するIL-12p40変種を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2009521911.tif 000035
2009521911.tif 000036
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