(57)【要約】本発明は、細胞培養物、組織生検、細胞クラスター、組織様構造、原型組織、または類似の試料をインキュベートするためのバイオリアクターを提供する。バイオリアクターは一般的に、微小重力条件下で使用するための回転に適合されており、小容量の内部液量（一般的に１ｍＬ未満）を有するインキュベーションキャビティを具備する。小容量インキュベーションに関連する諸問題を回避するために、バイオリアクターは、湿潤チャンバーまたは脱水を回避するその他の手段、ならびにインキュベーションキャビティに気泡を混入するのを回避するアクセスポートの実質的に液密性の閉鎖機構を含む場合がある。小容量バイオリアクターは、培養物中の組織の分化状態を長期間維持することを可能にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
回転に適合したバイオリアクターであって、前記リアクターが、
−インキュベーションキャビティであって、所定の分子量もしくは分子サイズまでの分子に対して透過性を有する第１の半透性フィルター（Ｆ１）とともに、実質的に閉ざされた境界を提供し、前記インキュベーションチャンバー内の栄養素および液体培地の流入を可能にすると同時に、前記インキュベーションキャビティ内の細胞および細胞凝集体の保持を可能にする、インキュベーションキャビティ、
−平衡チャンバーであって、前記インキュベーションキャビティ内に存在する１つ以上の細胞培養物、組織生検、または細胞クラスターのために栄養素を供給し、老廃物を除去し、酸素および二酸化炭素のような気体を交換するための容量と、そして／またはｐＨ制御物質とを備える、平衡チャンバー、ならびに
−前記半透性フィルター（Ｆ１）から前記平衡チャンバーまで実質的に液密性の導管を提供する導通手段、
を含み、
前記インキュベーションキャビティが、約２５μＬ〜約１ｍＬの内部液量を有する、
バイオリアクター。
【請求項２】
前記インキュベーションキャビティの前記内部液量が、９００μＬ未満、８００μＬ未満、７００μＬ未満、６００μＬ未満、５００μＬ未満、４００μＬ未満、３００μＬ未満、２００μＬ未満、１００μＬ未満、５０μＬ未満、および２５μＬからなる群から選択される、請求項１に記載のバイオリアクター。
【請求項３】
前記インキュベーションキャビティが、実質的に円筒の形状を有する、請求項１に記載のバイオリアクター。
【請求項４】
前記バイオリアクターが、付随する回転手段によって横回転軸を中心に回転するように適合されており、前記回転軸が前記インキュベーションキャビティを通る中心軸と実質的に一致する、請求項３に記載のバイオリアクター。
【請求項５】
前記流体導通手段が、前記回転軸と実質的に平行の部分を有する、請求項４に記載のバイオリアクター。
【請求項６】
前記平衡チャンバーと前記インキュベーションキャビティの間に液体培地を循環させるためのポンプ手段もさらに含む、請求項１に記載のバイオリアクター。
【請求項７】
前記半透性フィルターが、小分子を透過するが、細菌、マイコプラズマまたはその他の生物体の通過は防止することができる、請求項１に記載のバイオリアクター。
【請求項８】
前記導通手段が、約２５μＬ〜約２ｍＬ、約５０μＬ〜約１ｍＬ、および約０．２００ｍＬからなる群から選択される内部液量を有する、請求項１に記載のバイオリアクター。
【請求項９】
前記平衡チャンバーが、約２５μＬ〜約２ｍＬ、約５０μＬ〜約１ｍＬ、および約０．２００ｍＬからなる群から選択される内部液量を有する、請求項１に記載のバイオリアクター。
【請求項１０】
前記半透性フィルターが、０．２μｍ、１００ｎｍ以下、５０ｎｍ以下、および１０ｎｍ以下からなる群から選択される最大孔径を有する、請求項１に記載のバイオリアクター。
【請求項１１】
回転に適合したバイオリアクターであって、前記バイオリアクターが、
−インキュベーションキャビティであって、第１の半透性膜（Ｍ１）とともに、実質的に閉ざされた境界を提供する、インキュベーションキャビティ、
−水性液体を含む湿潤チャンバーであって、前記チャンバーが、水性液体と流体接触して配置される第２の半透性膜（Ｍ２）と第３の半透性膜（Ｍ３）の両方を含み、前記第３の半透性膜（Ｍ３）がさらに、前記バイオリアクターを取り囲む大気との気体交換のために配置される、チャンバー、ならびに
−前記第１の半透性膜（Ｍ１）から前記第２の半透性膜（Ｍ２）まで実質的に気密性の導管を提供する導通手段、
を含み、
前記第１、第２および第３の半透性膜（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３）が、
ａ）前記第１の半透性膜（Ｍ１）および前記湿潤チャンバーを介した前記インキュベーションキャビティの通気、ならびに
ｂ）前記インキュベーションチャンバー内の実質的な保水、
を促進するために、実質的に水を透過せず、かつ実質的に酸素および二酸化炭素を透過する、
バイオリアクター。
【請求項１２】
前記湿潤チャンバーおよび／またはインキュベーションチャンバーから蒸発した水が、少なくとも５０％、少なくとも７０％、および少なくとも９０％からなる群から選択される相対湿度を前記気密性の導管内に提供する、請求項１１に記載のバイオリアクター。
【請求項１３】
前記バイオリアクターが、前記インキュベーションキャビティ内に水溶液または懸濁液が入った状態で３７℃にて操作される時、３日後に少なくとも８０％、少なくとも９０％、および少なくとも９５％からなる群から選択される相対的な保水性を前記インキュベーションキャビティ内に有する、請求項１１に記載のバイオリアクター。
【請求項１４】
前記バイオリアクターが、前記インキュベーションキャビティ内に水溶液または懸濁液が入った状態で３７℃にて操作される時、５日後に少なくとも８０％、少なくとも９０％、および少なくとも９５％からなる群から選択される相対的な保水性を前記インキュベーションキャビティ内に有する、請求項１１に記載のバイオリアクター。
【請求項１５】
前記バイオリアクターが、前記インキュベーションキャビティ内に水溶液または懸濁液が入った状態で３７℃にて操作される時、１０日後に少なくとも８０％、少なくとも９０％、および少なくとも９５％からなる群から選択される相対的な保水性を前記インキュベーションキャビティ内に有する、請求項１１に記載のバイオリアクター。
【請求項１６】
前記インキュベーションキャビティが、実質的に円筒の形状を有する、請求項１１に記載のバイオリアクター。
【請求項１７】
前記バイオリアクターが、付随する回転手段によって横回転軸を中心に回転するように適合されており、前記回転軸が前記インキュベーションキャビティを通る中心軸と実質的に一致する、請求項１６に記載のバイオリアクター。
【請求項１８】
前記インキュベーションキャビティの前記内部液量が、９００μＬ未満、８００μＬ未満、７００μＬ未満、６００μＬ未満、５００μＬ未満、４００μＬ未満、３００μＬ未満、２００μＬ未満、１００μＬ未満、５０μＬ未満、および２５μＬからなる群から選択される、請求項１１に記載のバイオリアクター。
【請求項１９】
前記インキュベーションキャビティが、１つ以上の細胞培養物を含むように適合されており、前記インキュベーションキャビティが、細胞培養に使用され得、かつ細胞の付着をもたらさない非毒性物質で作られていることを特徴とする、請求項１または請求項１１に記載のバイオリアクター。
【請求項２０】
前記インキュベーションキャビティが、種々の種類のガラス、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、およびポリメチルメタクリレートからなる群から選択される物質で作られている、請求項１９に記載のバイオリアクター。
【請求項２１】
前記インキュベーションキャビティが、球体の形状であるか、マイクロキャリアビーズ上にあるか、またはスカフォールド上にある１種類以上の細胞培養物のうちの培養物を含むように適合されている、請求項１７に記載のバイオリアクター。
【請求項２２】
回転に適合したバイオリアクターであって、前記バイオリアクターが、
−第１の半透性膜（Ｍ１２）とともに、実質的に閉ざされた境界を提供する、インキュベーションキャビティ、
−前記第１の半透性膜（Ｍ１２）と流体接触する水性液体を含む湿潤チャンバーであって、前記チャンバーが、前記水性液体と流体接触して配置される第２の半透性膜（Ｍ３）を含み、前記第２の半透性膜（Ｍ３）がさらに、前記バイオリアクターを取り囲む大気との気体交換のために配置される、チャンバー、
を含み、
前記第１および第２の半透性膜（Ｍ１２、Ｍ３）が、実質的に水を透過せず、かつ実質的に酸素および二酸化炭素を透過し、前記第１の半透性膜（Ｍ１２）が、
ａ）前記第１の半透性膜（Ｍ１２）および前記湿潤チャンバーを介した前記インキュベーションキャビティの通気、ならびに
ｂ）前記インキュベーションチャンバー内の実質的な保水、
を促進するために、塩類を透過しない、
バイオリアクター。
【請求項２３】
前記インキュベーションキャビティの前記内部液量が、９００μＬ未満、８００μＬ未満、７００μＬ未満、６００μＬ未満、５００μＬ未満、４００μＬ未満、３００μＬ未満、２００μＬ未満、１００μＬ未満、５０μＬ未満、および２５μＬからなる群から選択される、請求項２２に記載のバイオリアクター。
【請求項２４】
前記インキュベーションキャビティが、実質的に円筒の形状を有する、請求項２２に記載のバイオリアクター。
【請求項２５】
前記バイオリアクターが、付随する回転手段によって横回転軸を中心に回転するように適合されており、前記回転軸が前記インキュベーションキャビティを通る中心軸と実質的に一致する、請求項２４に記載のバイオリアクター。
【請求項２６】
回転に適合したバイオリアクターであって、前記バイオリアクターが、
−半透性膜とともに、実質的に閉ざされた境界を提供する、インキュベーションキャビティ、
を含み、
大気圧で前記半透性膜が、
ａ）前記第１の半透性膜および前記湿潤チャンバーを介した前記インキュベーションキャビティの通気、ならびに
ｂ）前記インキュベーションチャンバー内の実質的な保水、
を促進するために、ほぼ完全に水を透過しないが、酸素および二酸化炭素は実質的に透過する、
バイオリアクター。
【請求項２７】
回転に適合したバイオリアクターであって、前記バイオリアクターが、
−可撓性膜または可撓性フィルター（Ｍ１／Ｆ１）とともに内面を含む、インキュベーションキャビティ、
−前記インキュベーションキャビティの充填に適合した１つ以上の貫通ポートであって、前記インキュベーションキャビティの中心軸から見て異なる角度で方位角により配置される、ポート、ならびに
−１つ以上のインサートであって、各インサートが、対応する貫通ポートに嵌め込んで、各ポートの実質的に液密性のロックを提供するように適合される、インサート、
を含み、
前記１つ以上のインサートが、前記対応するポートに挿入されることで、本質的にゼロ容量のポートを作り出す場合に、前記インキュベーションキャビティの内面と実質的に並んだ端部を有する、
バイオリアクター。
【請求項２８】
前記貫通ポートの１つ以上が外側凹部を含む、請求項２７に記載のバイオリアクター。
【請求項２９】
前記インサートの１つ以上が、ネジ山を有する外側部を含む、請求項２７に記載のバイオリアクター。
【請求項３０】
前記内面の一部が、円筒形、楕円形、球形、および放物形からなる群から選択される形状を有する、請求項２７に記載のバイオリアクター。
【請求項３１】
請求項２７に記載のバイオリアクターを充填する方法であって、前記バイオリアクターが、充填前に開いている少なくとも第１および第２の貫通ポートを含み、前記方法が、
ａ）前記バイオリアクターが、少なくとも前記インキュベーションキャビティ全体に、ならびに前記第１のポートの少なくとも一部におよび前記第２のポートの少なくとも一部に液体を含むように、前記第１のポートを介して前記バイオリアクターに液体を過剰に充填する手順、
ｂ）対応する前記インサートを前記第１のポートに挿入して、前記第１のポートをロックする手順、
ｃ）対応する前記インサートを前記第２のポートに挿入して、前記第２のポートをロックし、それによって前記インキュベーションキャビティ内の前記液体に中程度の過剰圧力をかける手順、ならびに
ｄ）前記可撓性膜が前記過剰圧力を本質的に均等にできるようにする手順、
を含む、
方法。
【請求項３２】
請求項２７に記載のバイオリアクターを充填する方法であって、前記バイオリアクターが、充填前に開いている唯一の貫通ポートを含み、前記方法が、
ａ）前記バイオリアクターが、少なくとも前記インキュベーションキャビティ全体におよび前記ポートの少なくとも一部に液体を含むように、前記ポートを介して前記バイオリアクターに前記液体を過剰に充填する手順、
ｂ）対応する前記インサートを前記ポートに挿入して、前記ポートをロックし、それによって前記インキュベーションキャビティ内の前記液体に中程度の過剰圧力をかける手順、ならびに
ｄ）前記可撓性膜が前記過剰圧力を本質的に均等にできるようにする手順、
を含む、
方法。
【請求項３３】
請求項２７および請求項１に記載のバイオリアクター。
【請求項３４】
請求項２７および請求項１１に記載のバイオリアクター。
【請求項３５】
請求項２７および請求項２２に記載のバイオリアクター。
【請求項３６】
請求項２７および請求項２６に記載のバイオリアクター。
【請求項３７】
１つ以上の細胞培養物をインキュベートするための、請求項１、１１、２２、２６、２７、または３２〜３６のいずれか１項に記載のバイオリアクターの使用。
【請求項３８】
前記１つ以上の細胞培養物が、例えば１週間、２週間、または３週間、好ましくは少なくとも１ヵ月間、例えば２ヵ月間、最も好ましくは少なくとも１０ヵ月間等の長期間にわたりインキュベートされる、請求項３７に記載の使用。
【請求項３９】
１つ以上の細胞培養物をインキュベートする方法であって、
ａ）播種する前記１つ以上の細胞培養物を得る手順、
ｂ）請求項１〜３０または３２〜３６のいずれか１項に記載のバイオリアクターのインキュベーションキャビティに前記１つ以上の細胞培養物を移す手順、
ｃ）前記インキュベーションキャビティに増殖培地を充填する手順、
ｄ）場合により、前記インキュベーションキャビティから空気（気泡）を除去する手順、
ｅ）微小重力条件下で前記細胞培養物をインキュベートし、所望の期間わたりインキュベーションを持続させるために、必要に応じて増殖培地を交換する手順、ならびに
ｆ）場合により、前記培養物を分化させて、細胞間に接着結合または同様の細胞間接着構造または細胞間マトリックスタンパク質を形成する手順、
を含む、
方法。
【請求項４０】
１つ以上の細胞培養物をインキュベートする方法であって、
ａ）播種する前記１つ以上の細胞培養物を得る手順、
ｂ）１ｍＬ未満の内部液量を有する前記インキュベートキャビティ内に相対的な保水手段を具備する微小重力バイオリアクターの前記インキュベーションキャビティに、前記１つ以上の細胞培養物を移す手順、
ｃ）前記インキュベーションキャビティに増殖培地を充填する手順、
ｄ）場合により、前記インキュベーションキャビティから空気（気泡）を除去する手順、
ｅ）微小重力条件下で前記細胞培養物をインキュベートする手順、
ｆ）所望の期間にわたりインキュベーションを持続させるために、必要に応じて増殖培地を交換する手順、ならびに
ｇ）場合により、前記培養物を分化させて、細胞間に接着結合または同様の細胞間接着構造または細胞間マトリックスタンパク質を形成する手順、
を含み、
前記インキュベートキャビティ内の前記相対的な保水性が、２日後に９５％を超える、
方法。
【請求項４１】
１つ以上の細胞培養物をインキュベートする方法であって、
ａ）播種する前記１つ以上の細胞培養物を得る手順、
ｂ）１ｍＬ未満の内部液量を有する前記インキュベートキャビティ内に相対的な保水手段を具備する微小重力バイオリアクターの前記インキュベーションキャビティに、前記１つ以上の細胞培養物を移す手順、
ｃ）前記インキュベーションキャビティに増殖培地を充填する手順、
ｄ）場合により、前記インキュベーションキャビティから空気（気泡）を除去する手順、
ｅ）微小重力条件下で前記細胞培養物をインキュベートする手順、
ｆ）所望の期間にわたりインキュベーションを持続させるために、必要に応じて増殖培地を交換する手順、ならびに
ｇ）場合により、前記培養物を分化させて、細胞間に接着結合または同様の細胞間接着構造または細胞間マトリックスタンパク質を形成する手順、
を含み、
前記インキュベートキャビティ内の前記相対的な保水性が、５日後に９５％を超える、
方法。
【請求項４２】
手順ｂ）で使用される前記インキュベーションキャビティの前記内部液量が、９００μＬ未満、８００μＬ未満、７００μＬ未満、６００μＬ未満、５００μＬ未満、４００μＬ未満、３００μＬ未満、２００μＬ未満、１００μＬ未満、５０μＬ未満、および２５μＬからなる群から選択される、請求項４０または請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記１つ以上の細胞培養物が、球形であるか、マイクロキャリアビーズ上にあるか、またはスカフォールド上にある、請求項３９〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
請求項１１〜２５または３３〜３６のいずれか１項に記載のバイオリアクターの前記湿潤チャンバーが、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％からなる群から選択される相対湿度を気密性の導管内に維持するために、必要に応じて水溶液を補充されるか、交換される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４５】
請求項１１〜３０または３２〜３６のいずれか１項に記載のバイオリアクターの前記インキュベーションキャビティが、前記細胞を前記インキュベーションキャビティに移す前に濡らされる、請求項３９〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
化学組成物の生物学的作用の分子プロファイルを作製する方法であって、
ａ）１つ以上の細胞培養物から単離した集団を化学組成物と接触させる手順、ならびに
ｂ）前記化学組成物の前記生物学的作用の分子プロファイルを作製するために、前記化学組成物に反応する前記１つ以上の細胞培養物の遺伝子発現またはタンパク質発現の変化を記録する手順、
を含み、
前記１つ以上の細胞培養物が、請求項３９〜４２のいずれか１項に記載の方法によってインキュベートされている、
方法。
【請求項４７】
前記１つ以上の細胞培養物から単離した集団を、例えば少なくとも１ヵ月、好ましくは少なくとも２ヵ月、またはより好ましくは少なくとも３ヵ月等の長期間にわたり、前記化学組成物と接触させる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記１つ以上の細胞培養物から単離した集団を、例えば５日未満、好ましくは３日未満、またはより好ましくは１日未満等の短期間にわたり、前記化学組成物と接触させる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記１つ以上の細胞培養物が、肝細胞、脂肪細胞、腎細胞、筋細胞、肝組織、脂肪組織（褐色または白色）、肝生検、腎生検、筋生検、卵胞、ランゲルハンス島、およびそれらに由来するすべての癌細胞からなる群から選択される、請求項４６〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
所定の毒性を有する化学組成物の生物学的作用の分子プロファイルのライブラリーを蓄積する方法であって、
ａ）１つ以上の細胞培養物から単離した集団を、所定の毒性を有する化学組成物と接触させる手順、
ｂ）前記化学組成物の前記生物学的作用の分子プロファイルを作製するために、前記化学組成物に反応する前記１つ以上の細胞培養物の遺伝子発現またはタンパク質発現の変化を記録する手順、ならびに
ｃ）所定の毒性を有する少なくとも２つの化学組成物を使用して手順ａ）およびｂ）を繰り返すことにより、分子プロファイルのライブラリーを蓄積する手順、
を含み、
前記１つ以上の細胞培養物が、請求項３９〜４２のいずれか１項に記載の方法によってインキュベートされている、
方法。
【請求項５１】
前記１つ以上の細胞培養物から単離した集団を、例えば少なくとも１ヵ月、好ましくは２ヵ月、またはより好ましくは３ヵ月等の長期間にわたり、前記化学組成物と接触させる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記１つ以上の細胞培養物から単離した集団を、例えば３日未満、好ましくは２日未満、またはより好ましくは１日未満等の短期間にわたり、前記化学組成物と接触させる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記接触が、請求項３９〜４２のいずれか１項に記載の方法によって、前記化学組成物と前記１つ以上の細胞培養物とを一緒にインキュベートすることにより実施される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記１つ以上の細胞培養物が、肝細胞、脂肪細胞、腎細胞、筋細胞、肝組織、脂肪組織（褐色または白色）、肝生検、腎生検、筋生検、卵胞、ランゲルハンス島、およびそれらに由来するすべての癌細胞からなる群から選択される、請求項５０〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
試験化学組成物の毒性を型別する方法であって、
ａ）請求項４６に記載の試験化学組成物の生物学的作用の分子プロファイルを作製する手順、ならびに
ｂ）手順ａ）の前記分子プロファイルを、請求項３２に記載の方法によって蓄積される所定の毒性を有する化学組成物の生物学的作用の分子プロファイルのライブラリーと比較する手順、
を含み、
前記試験化学組成物の毒性の種類が、手順ｂ）の比較によって判定される、
方法。
【請求項５６】
前記１つ以上の細胞培養物が、肝細胞、脂肪細胞、腎細胞、筋細胞、肝組織、脂肪組織（褐色または白色）、肝生検、腎生検、筋生検、卵胞、ランゲルハンス島、およびそれらに由来するすべての癌細胞からなる群から選択される、請求項５５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、１つ以上の細胞培養物、組織生検、細胞クラスター、組織様構造、「原型組織（ｐｒｏｔｏｔｉｓｓｕｅ）」、または類似の試料のインキュベーション用バイオリアクターまたは培養容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
本質的に平坦な培養容器での「古典的な」細胞培養時には、一般的には細胞が、特に生検が脱分化する傾向がある。見かけ上は、細胞が組織の塊から培養容器の平面支持面の上に移動するにつれて、生検が「溶けたアイスクリームのような作用」を示す。遺伝子発現は、分化した組織の細胞成分としてよりもむしろ単離した細胞として生化学的に反応を示し始める、これらの「移動」細胞内で変わる。脱分化細胞は、インタクトな生物内の対応する細胞によって通常発現されるものとは異なる生化学的経路を発現する。
【０００３】
「古典的な」細胞培養の条件とは対照的に、「微小重力」条件では、培養物中の多くの細胞型の分化状態が維持される。微小重力バイオリアクターは、一般的に円筒状または管状のインキュベーション区画を連続して回転させることによって微小重力条件を維持する。この回転は、細胞をインキュベーションチャンバーの中心に向かって連続して押し進め、最小限のせん断力を使用して液体環境内で細胞を浮遊させる。これにより、細胞は相互作用して、コロニーに凝集するように誘導される。微小重力培養を行うに当たっては、最初に細胞を小さなビーズ（直径約１００μｍ）の上に播種させることが多い（これは微小組織構造の形成を促進させる手順であるが、必須ではない）。これらのビーズの周りに細胞が増殖することによって原型組織が形成されると、ビーズは押し出されるか、あるいは完全に細胞で覆われることが多い。このように形成される原型組織は、成体組織に似るようにきわめて高度に分化される。
【０００４】
微小重力バイオリアクターは、これまで種々の状況で使用されてきた。初期の研究では、微小重力バイオリアクターシステムが、細胞に対するせん断応力を低減させることによって細胞による三次元構造の形成に役立つことが明らかにされている［非特許文献１］。
【０００５】
現在、一連の多くの文献では、微小重力バイオリアクターシステムで増殖した細胞の分化増大が示されている。レビューに関しては、非特許文献２］を参照されたい。例えば、微小重力培養は、神経前駆細胞が細胞クラスターまたは「神経球」を形成するように誘導する。これらの原型組織は、より分化した細胞（βチューブリンＩＩＩ陽性、およびグリア線維酸性タンパク質陽性）の層を取り囲む未成熟な増殖性細胞（ネスティング陽性、および増殖性細胞核抗原陽性）の表層を有する、粗いながらも組織化した構造によって特徴付けられる。これらの「神経球」は、神経移植可能な組織の開発を実現する可能性を秘めている。例えば、非特許文献３；および非特許文献４］を参照されたい。
【０００６】
あるいは、別の例として、多分化能のヒト網膜細胞系の微小重力培養は、ほぼｉｎ  ｖｉｖｏの表現型の発現を誘発した。これは他の条件下で細胞を増殖する時には達成できないものであった［非特許文献５］。
【０００７】
微小重力バイオリアクターの技術的な問題点はいくつか報告されている。例えば、顎関節（ＴＭＪ）円板の組織を、平面培養または微小重力バイオリアクターのいずれかを使用して操作した場合には、肉眼的外観、組織学的構造、およびＩ型およびＩＩ型コラーゲンの分布（バイオリアクター円板はＩＩ型コラーゲンをより多く有する）には顕著な差が見られたものの、全体のマトリックス内容物および圧縮剛性には有意差が見られなかった。そのため、微小重力バイオリアクター培養システムには改善が必要であると、著者等は結論付けている［非特許文献６］。
【０００８】
広く知られ、広範に使用されているものの、現在利用可能な微小重力バイオリアクターには、以下に示す重大な制限がある。
【０００９】
現在、微小重力バイオリアクターの最小容量は約１０ｍＬであるが、多くの場合、貴重な材料の消費を減らし、「高スループット」試験を促進するためには、それよりもはるかに少ない容量が望まれる。例えば、より少容量のバイオリアクターがあれば、種々の濃度および期間で薬学的化合物を試験する際に使用される細胞および化合物のいずれの量も少なくすることができると思われる。材料消費量の削減は、費用と危険性が特に高くなり得る放射性標識実験では特に重要である。実例を挙げると、遺伝子発現またはその他の培養細胞の生体反応に対する新規薬学的組成物の作用を試験する際には、通常、複数の濃度が複数の時点にわたって試験される。統計的検出力の点から、このような解析は、一般的に複数回繰り返される。１０ｍＬのバイオリアクターを使用して１つの組成物を５段階濃度、１０時点、５回の複製で試験する場合、１回の実験では２．５リットルもの細胞が必要となる。放射性標識の代謝取り入れが、例えば１ｍＣｉ／ｍＬで必要とされる場合、このような実験は、２．５Ｃｉの放射脳を必要とする。従って、より大幅に容量の少ないインキュベーション区画を備えた微小重力バイオリアクターを提供するのが有利であると考えられる。
【００１０】
先行技術の微小重力リアクターのもう１つの重大な制限には水分損失があり、これは細胞増殖に影響を及ぼす。インキュベーション時の脱水（わずかに５〜１０％でも）により、ｐＨおよびその他の濃度依存パラメータ（例えば、塩分濃度、栄養素物質等）に変化がもたらされ得る。多くの細胞型は環境の影響をきわめて受けやすい。このような細胞では、このような環境条件がわずかに変化しただけでも細胞増殖や遺伝子発現に影響が及び得る。この問題は、容量のわずかな変化が濃度依存パラメータに比較的大きな変化をもたらし得る小容量バイオリアクターでは特に顕著である。この脱水問題に対して何らかの解決策がなければ、バイオリアクターが使用されるインキュベーター内の加湿条件（１００％相対湿度）を維持しても、小容量バイオリアクターは急速な水分損失をこうむると考えられる。小容量バイオリアクターのこの急速な脱水の傾向、すなわち、相対的容量のこの急速な変化の傾向によって、時間のかかる手動のモニタリングおよび操作（例えば、培地の補充または交換を行う）の必要性がきわめて高くなる。また、この傾向により、小容量バイオリアクターにおいて培地を長期間維持することが事実上非現実的または不可能となる。従って、細胞インキュベーション区画における相対的な保水性がきわめて高い微小重力バイオリアクターを提供するのが有利であると考えられる。
【００１１】
先行技術の微小重力バイオリアクターのさらに別の制限には、細胞および増殖培地を追加または除去するために使用されるアクセスポートが、通常、従来の「ルアーロック」式閉鎖に依存していることである。これらおよび類似の閉鎖は、有限の「死」容量を有し、これは、バイオリアクターの容量が減少するにつれて、比例的に大きくなる。この不利点は、本質的に死容量がないポートを使用することで回避できる。
【００１２】
ルアーロック式閉鎖はまた、インキュベーション区画に気泡が存在することにつながり得る。バイオリアクターは、インキュベーション区画に気泡がないように維持するのが好ましく、維持されない場合は有害な影響がもたらされ、原型組織が崩壊する。この気泡の問題は、１つの気泡が相対的に大きな容量となり得る小容量バイオリアクターでは特に顕著である。気泡の問題に対するいくつかの解決策は、先行技術で知られている。例えば、国際特許公開第９５／０７３４４号は、インキュベーション区画から発生した気泡を捕捉するリザーバーチャンバーを提供する。しかしながら、これらの解決策は、容量の関係上小容量バイオリアクターには全く不適切であると思われる。そのため、より良い解決策は、インキュベーション区画に気泡を混入するあらゆる可能性を排除したアクセスポートの閉鎖機構を提供することである。
【００１３】
従来の「ルアーロック」式および類似の閉鎖はまた、流体乱流も増加させるため、このことにより、原型組織に悪影響を与えるせん断力の増加を招く可能性がある。微小重力バイオリアクターは、分化したまたは分化する細胞および他の組織の微小重力条件を維持するために、インキュベーション区画を連続して回転させることが必要となる。インキュベーション区画の内面が適切に適合してない場合は、乱流を引き起こす可能性がある。このような乱流は、原型組織の引裂きまたはせん断を招く場合がある。従って、乱流を回避するアクセスポートの閉鎖機構を備えた微小重力バイオリアクターを提供するのが有利である。
【００１４】
特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、および特許文献６はそれぞれ、微小重力バイオリアクターの改良を開示している。特許文献７は、肝細胞スフェロイドをインキュベートするための、従来の市販される微小重力バイオリアクターの使用を開示している。しかしながら、これらの特許または公開出願はいずれも、脱水の問題に対応したものではなく、小容量インキュベーション区画またはゼロ容量のアクセスポート閉鎖を有する微小重力バイオリアクターを開示したものでもない。
【特許文献１】国際公開第９５／０７３４４号パンフレット
【特許文献２】米国特許第５，１５３，１３１号明細書
【特許文献３】米国特許第５，４３７，９９８号明細書
【特許文献４】米国特許第５，６６５，５９４号明細書
【特許文献５】米国特許第５，９８９，９１３号明細書
【特許文献６】米国特許第６，６４２，０１９号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２００５／００８４９６５号明細書
【非特許文献１】Ｒｅｄｕｃｅｄ  ｓｈｅａｒ  ｓｔｒｅｓｓ：ａ  ｍａｊｏｒ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｔｏ  ｆｏｒｍ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｔｉｏｎａｌ  ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ  ｉｎ  ｓｉｍｕｌａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｇｒａｖｉｔｙ．Ｇｏｏｄｗｉｎ  ＴＪ，Ｐｒｅｗｅｔｔ  ＴＬ，Ｗｏｌｆ  ＤＡ，Ｓｐａｕｌｄｉｎｇ  ＧＦ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９３  Ｍａｒ；５１（３）３０１−１１
【非特許文献２】Ｇｒｏｗｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｇｒａｖｉｔｙ．Ｕｎｓｗｏｒｔｈ  ＢＲ，Ｌｅｌｋｅｓ  ＰＩ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１９９８  Ａｕｇ；４（８）９０１−７
【非特許文献３】Ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒｍ  ｒｕｄｉｍｅｎｔａｒｙ  ｔｉｓｓｕｅ−ｌｉｋｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｉｎ  ａ  ｒｏｔａｔｉｎｇ−ｗａｌｌ  ｖｅｓｓｅｌ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ．Ｌｏｗ  ＨＰ，Ｓａｖａｒｅｓｅ  ＴＭ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ＷＪ．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ａｎｉｍ．２００１  Ｍａｒ；３７（３）：１４１−７
【非特許文献４】Ｒａｐｉｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＴ２  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｓｅｒｔｏｌｉ−ＮＴ２  ｃｅｌｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ  ｇｒｏｗｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｏｔａｔｉｎｇ  ｗａｌｌ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ．Ｓａｐｏｒｔａ  Ｓ，Ｗｉｌｌｉｎｇ  ＡＥ，Ｓｈａｍｅｋｈ  Ｒ，Ｂｉｃｋｆｏｒｄ  Ｐ，Ｐａｒｅｄｅｓ  Ｄ，Ｃａｍｅｒｏｎ  ＤＦ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｂｕｌｌ．２００４  Ｄｅｃ  １５０；６４（４）：３４７−５６
【非特許文献５】Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ３Ｄ  ｒｅｔｉｎａ−ｌｉｋｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｉｎ  ａ  ＮＡＳＡ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ．Ｄｕｔｔ  Ｋ，Ｈａｒｒｉｓ−Ｈｏｏｋｅｒ  Ｓ，Ｅｌｌｅｒｓｏｎ  Ｄ，Ｌａｙｎｅ  Ｄ，Ｋｕｍａｒ  Ｒ，Ｈｕｎｔ  Ｒ．Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２００３；１２（７）：７１７−３ｌ
【非特許文献６】Ｄｅｔａｍｏｒｅ  ＭＳ，Ａｔｈａｎａｓｉｏｕ  ＫＡ．Ｕｓｅ  ｏｆ  ａ  ｒｏｔａｔｉｎｇ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  ｔｏｗａｒｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｅｍｐｏｒｏｍａｎｄｉｂｕｌａｒ  ｊｏｉｎｔ  ｄｉｓｃ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．２００５  Ｊｕｌ−Ａｕｇ；１１（７−８）：１１８８−９７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
従って、これらの問題に対応した改善された微小重力バイオリアクターを提供するのが有利である。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
発明の要旨
好ましい実施形態において、本発明は、上述の先行技術の問題の１つ以上を軽減する、緩和する、解消する、またはその他の方法で解決するバイオリアクターを提供する。
【００１７】
この目的およびその他いくつかの目的は、回転に適合したバイオリアクターであって、前記リアクターが、
−インキュベーションキャビティであって、所定の分子量もしくは分子サイズまでの分子に対して透過性を有する第１の半透性フィルターとともに、実質的に閉ざされた境界を提供し、前記インキュベーションチャンバー内の栄養素および液体培地の流入を可能にすると同時に、前記インキュベーションキャビティ内の細胞および細胞凝集体の保持を可能にする、インキュベーションキャビティ、
−平衡チャンバーであって、前記インキュベーションキャビティ内に存在する１つ以上の細胞培養物、組織生検、または細胞クラスターのために栄養素および／または酸素、ならびに場合により二酸化炭素および／またはｐＨ制御物質を供給するための容量を備える、平衡チャンバー、ならびに
−前記半透性フィルターから前記平衡チャンバーまで実質的に液密性の導管を提供する導通手段、
を含み、
前記インキュベーションキャビティが、約２５μＬ〜約１ｍＬの内部液量を有する、
リアクターを提供することにより、本発明の第１の態様において得られる。
【００１８】
第２の態様において、本発明の実施形態は、回転に適合したバイオリアクターであって、前記バイオリアクターが、
−インキュベーションキャビティであって、第１の半透性膜とともに、実質的に閉ざされた境界を提供する、インキュベーションキャビティ、
−水性液体を含む湿潤チャンバーであって、前記チャンバーが、水性液体と流体接触して配置される第２の半透性膜と第３の半透性膜の両方を含み、前記第３の半透性膜がさらに、前記バイオリアクターを取り囲む大気との気体交換のために配置される、チャンバー、ならびに
−前記第１の半透性膜から前記第２の半透性膜まで実質的に気密性の導管を提供する導通手段、
を含み、
前記第１、第２および第３の半透性膜が、
ａ）前記第１の半透性膜および前記湿潤チャンバーを介した前記インキュベーションキャビティの通気、ならびに
ｂ）前記イキュベーションチャンバー内の実質的な保水、
を促進するために、実質的に水を透過せず、かつ実質的に酸素および二酸化炭素を透過し、
場合により、前記インキュベーションキャビティが約２５μＬ〜約１ｍＬの内部液量を有する、
バイオリアクターを提供する。
【００１９】
第３の態様において、本発明の実施形態は、回転に適合したバイオリアクターであって、前記バイオリアクターが、
−可撓性膜または可撓性フィルターとともに内面を含む、インキュベーションキャビティ、
−前記インキュベーションキャビティの充填に適合した１つ以上の貫通ポートであって、前記インキュベーションキャビティの中心軸から見て異なる角度で方位角により配置される、ポート、ならびに
−１つ以上のインサートであって、各インサートが、対応する貫通ポートに嵌め込んで、各ポートの実質的に液密性のロックを提供するように適合される、インサート、
を含み、
前記インサートの１つ以上が、前記対応するポートに挿入されることで、本質的にゼロ容量のポートを作り出す場合に、前記インキュベーションキャビティの内面と実質的に並んだ端部を有し、
場合により、前記インキュベーションキャビティが、約２５μＬ〜約１ｍＬの内部液量を有する、
バイオリアクターを提供する。
【００２０】
第４の態様において、本発明の実施形態は、回転に適合したバイオリアクターであって、前記バイオリアクターが、
−半透性膜とともに、実質的に閉ざされた境界を提供する、インキュベーションキャビティ、
を含み、
大気圧で前記半透性膜が、
ａ）前記第１の半透性膜を介した前記インキュベーションキャビティの通気、ならびに
ｂ）前記インキュベーションチャンバー内の実質的な保水、
を促進するために、ほぼ完全に水を透過しないが、酸素および二酸化炭素は実質的に透過し、
場合により、前記インキュベーションキャビティが、約２５μＬ〜約１ｍＬの内部液量を有する、
バイオリアクターを提供する。
【００２１】
第５の態様において、本発明の実施形態は、１つ以上の細胞培養物、組織生検、細胞クラスター、組織様構造、「原型組織」、または類似の試料をインキュベートするためのバイオリアクターの使用を提供する。
【００２２】
第６の態様において、本発明の実施形態は、１つ以上の細胞型組織生検、細胞クラスター、組織様構造、「原型組織」、または類似の試料をインキュベートする方法を提供する。
【００２３】
第７の態様において、本発明の実施形態は、化学組成物の生物学的作用の分子プロファイルを作製する方法を提供する。
【００２４】
第８の態様において、本発明の実施形態は、所定の毒性を有する化学組成物の生物学的作用の分子プロファイルのライブラリーを蓄積する方法を提供する。
【００２５】
第９の態様において、本発明の実施形態は、試験化学組成物の毒性を型別する方法を提供する。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態は、特に（しかしこれに限らないが）、以下を提供する微小重力バイオリアクターを得るのに特に有利であるが、これに限定的に有利なわけではない。
１）インキュベーション区画の容量がより少ないために、それに伴って経費が削減されることで、資源（化学薬品、細胞または組織）の消費を低減。
２）湿潤チャンバーを導入したために、それに伴って長期増殖の培養条件の維持が改善されることで、インキュベーションチャンバー内の保湿を改善。
３）インキュベーションチャンバー内の保湿が改善されたことにより、小容量バイオリアクターで長期間培養物をインキュベートする期間を延長。
４）本質的にゼロ容量のアクセスポートを導入したことにより、流体乱流を低減。
５）いくつかの実施形態では自動ビデオ／カメラ画像技術による、細胞増殖のモニタリングの改善；選択した生検または培養物の試料をより少なくすることによる、増殖因子およびシグナル分子の生物学的閾値の向上；同時に操作できる個別のバイオリアクターの数の増加による、標準サイズのインキュベーターの効率の向上を含めた、その他の小容量バイオリアクターの利点。
【００２７】
本発明の実施形態の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８および第９の態様はいずれも、その他いずれかの態様と組み合わせられる場合がある。本発明のこれらおよびその他の態様は、以下に記載する実施形態により明らかになり、かつそれらを参照して解明されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
詳細な説明
定義
本明細書で使用される以下の用語は、以下の意味を有する：
「半透性フィルター」および「半透性膜」という用語は、すべてではないが一部の化学または生物学的物質によって浸透され得るフィルターまたは膜を指す。これらの用語は交換可能に使用されるが、但し、通常「フィルター」は、水が自由に透過できる所で使用されるのに対し、通常「膜」は、水が自由に透過できない所、および水が自由に透過できる所の両方で使用される。
【００２９】
「インキュベーションキャビティ」という用語は、細胞培養物、組織生検、細胞クラスター、組織様構造、「原型組織」、または類似の試料が増殖、分化、インキュベート、またはその他の方法で培養されるバイオリアクターの部分を指す。「インキュベーションキャビティ」という用語は、「インキュベーションチャンバー」および「インキュベーション区画」と交換可能に使用される。
【００３０】
「実質的に水を透過しない」という用語は、本発明の膜の特徴を説明するために使用され、水、ならびに気体および／または液相中の水様分子の高度な反発力を示す膜を指す。
【００３１】
「ほぼ完全に水を透過しない」という用語は、本発明の膜の特徴を説明するために使用され、１バールでの水流量が０．１ｍＬ／分／ｃｍ２未満である膜を指す。
【００３２】
「実質的に酸素および二酸化炭素を透過する」という用語は、本発明の膜の特徴を説明するために使用され、空気が容易に通過する膜を指す。
【００３３】
「相対保有」という用語は、インキュベーションキャビティ内に水溶液または懸濁液を有する本発明のバイオリアクターを操作することにより生ずる条件を説明するために使用され、最初に存在する残留物質の相対量を指す。例えば、インキュベーションキャビティ（可撓性膜を有する）内の相対的な保水性は、バイオリアクターの操作後のキャビティの容量をバイオリアクターの操作開始時のキャビティの容量で除算することにより算出される場合がある。
【００３４】
「有毒」という用語は、当該技術分野で既知の通常の意味を有する。「有毒」物質は、上に定義するような化学組成物中に存在する量で、細胞、組織または生体の機能を損なうか、あるいはそれらに構造的な損傷を引き起こし得る物質である。
【００３５】
「所定の毒性」という用語は、有毒および非有毒物質の両方に関する。１６世紀にパラケルススが述べたように、「万物は毒であり、毒でないものなどない。ただその用量だけが、毒と薬の区別をもたらす」。物質の毒性の種類は、例えば、アメリカ合衆国の食品医薬品局（ＦＤＡ）の毒性分類基準によって判定される場合がある。この基準によれば、物質の所定の毒性は、毒性Ａ型、Ｂ型等に属する場合もあれば、非毒性である場合もある。
【００３６】
「細胞培養物」という用語は、当該技術分野で既知のいずれかの方法によって得られる、または最初に培養されるいずれかの種類の細胞、組織生検、細胞クラスター、組織様構造、「原型組織」、または類似の試料を指す。
【００３７】
「微小重力バイオリアクター」という用語は、回転に適合したバイオリアクターを指す。
【００３８】
「微小重力条件でインキュベートする」という用語は、液体培地中に１つ以上の細胞培養物を浮遊させる速度で、回転に適合したバイオリアクターを、実質的に平行の中心軸を中心に回転させ、かつ前記１つ以上の細胞培養物を増殖させることができる時間にわたりこのような回転を継続させて、バイオリアクター内で細胞培養物を増殖させることを指す。
【００３９】
「相対的な保水手段」という用語は、バイオリアクターの特徴を説明するために使用され、インキュベーションチャンバー内の相対的な保水性を達成するためにインキュベーションチャンバーを実質的に閉鎖する膜またはフィルターと組み合わせて使用される、灌流以外のいずれかの手段を指すか、あるいは、１バールでの水流量が０．１ｍＬ／分／ｃｍ２未満である膜を通過するインキュベーションチャンバーを実質的に閉鎖するいずれかの単一膜を指す。「化学組成物」という用語は、当該技術分野で既知の通常の意味を有する。これには、小分子、ペプチド、タンパク質、塩基、核酸および脂質等の１つ以上の化学薬品または生物学的作用因子のいずれかの混合物が含まれる場合があるが、これらに限定されず、前記化学薬品または生物学的作用因子は、以下からなる群から選択される１つ以上の細胞型内で遺伝子発現またはタンパク質発現に変化をもたらす。
・角質化上皮細胞（表皮の角化細胞（分化中の表皮細胞）；表皮の基底細胞（幹細胞）；指の爪および足指の爪の角化細胞、爪床の基底細胞（幹細胞）；毛幹細胞の毛髄質；毛幹細胞の毛皮質；毛幹細胞の毛小皮；毛根鞘細胞の鞘小皮；毛根鞘細胞のハックレイ層；毛根鞘細胞のヘンレ層；毛根鞘細胞の外毛根鞘；毛母細胞（幹細胞）を含む）。
・湿潤で重層のバリアの上皮細胞（角膜、舌、口腔、食道、肛門管、遠位尿道、および膣の重層扁平上皮の表面上皮細胞；角膜、舌、口腔、食道、肛門管、遠位尿道、および膣の上皮の基底細胞（幹細胞）；泌尿器の上皮細胞（膀胱および尿管の内表面））。
・外分泌腺分泌上皮細胞（唾液腺粘液細胞（多糖が豊富な液を分泌）を含む）；唾液腺漿液細胞（糖タンパク質酵素が豊富な液を泌物）；舌のフォンエブネル腺細胞（味蕾を洗浄）；乳腺細胞（乳汁を分泌）；涙腺細胞（涙液を分泌）；耳内の耳道腺細胞（耳垢を分泌）；エクリン汗腺暗細胞（糖タンパク質を分泌）；エクリン汗腺明細胞（小分子を分泌）；アポクリン汗腺細胞（芳香性物質を分泌、性ホルモン感受性）；まぶたのモル腺細胞（特殊化した汗腺）；皮脂腺細胞（脂質が豊富な皮脂を分泌）；鼻のボーマン腺細胞（嗅上皮を洗浄）；十二指腸のブルナー腺細胞（酵素およびアルカリ性粘液）；精嚢細胞（精子が泳ぐための果糖を含む精液の成分を分泌）；前立腺細胞（精液の成分を分泌）；尿道球腺細胞（粘液を分泌）；バルトリン腺細胞（膣の潤滑液を分泌）；リトレ腺細胞（粘液を分泌）；子宮内膜細胞（炭水化物を分泌）；気道および消化管の単離された杯細胞（粘液を分泌）；胃内表面の粘膜細胞（粘液を分泌）；胃腺の酵素原細胞（ペプシノゲンを分泌）；胃腺の酸分泌細胞（塩酸を分泌）；膵腺房細胞（重炭酸塩および消化酵素を分泌）；小腸のパネート細胞（リゾチームを分泌）；肺のＩＩ型肺細胞（界面活性物質を分泌）；肺のクララ細胞を含む）。
・ホルモン分泌細胞（下垂体前葉細胞；成長ホルモン産生細胞；乳腺刺激ホルモン分泌細胞；甲状腺刺激ホルモン産生細胞；性腺刺激ホルモン産生細胞；副腎皮質刺激因子；メラニン細胞刺激ホルモンを分泌する下垂体中葉細胞；オキシトシンまたはバソプレシンを分泌する巨細胞性神経分泌細胞；消化管および気道の細胞（以下から１つ以上を分泌：セロトニン、エンドルフィン、ソマトスタチン、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、インスリン、グルカゴン、ボンペシン）；甲状腺細胞；甲状腺上皮細胞；副甲状腺細胞；上皮小体主細胞；好酸性細胞；副腎細胞；クロム親和性細胞（１つ以上のステロイドホルモン鉱質コルチコイドまたは糖質コルチコイドを分泌）；精巣のライディッヒ細胞（テストステロンを分泌）；卵胞の内卵胞膜細胞（エストロゲンを分泌）；破裂卵胞の黄体細胞（プロゲステロンを分泌）；腎傍糸球体装置細胞（レニンを分泌）；腎密集斑細胞；腎極周囲細胞；腎メサンギウム細胞を含む）。
・吸収上皮細胞（消化管、外分泌腺、および尿生殖路）（腸の刷子縁細胞（微繊毛を有する）；外分泌腺の線条管細胞；胆嚢上皮細胞；腎近位尿細管の刷子縁細胞；腎遠位尿細管細胞；精巣輸出管の無線毛細胞；精巣上体の主細胞；精巣上体の基底細胞；代謝および貯蔵細胞；肝細胞（肝細胞）；脂肪細胞（褐色または白色の脂肪細胞）；肝脂肪細胞を含む）。
・バリア機能細胞（肺、消化管、外分泌腺、および尿生殖路）（Ｉ型肺細胞（肺気腔の内表面）；膵導管細胞（腺房中心細胞）；（汗腺、唾液腺、乳腺等の）無線毛の導管細胞；腎糸球体の壁細胞；腎糸球体の足細胞；（腎臓内の）ヘンレ係蹄の細い部分の細胞；腎集合尿細管細胞；（精嚢、前立腺等の）導管細胞を含む）。
・体内で閉じた管腔の内表面の上皮細胞（血管およびリンパ管の内皮有窓細胞；血管およびリンパ管の内皮連続細胞；血管およびリンパ管の内皮脾細胞；滑膜細胞（関節腔の内面を覆い、ヒアルロン酸を分泌）；漿膜細胞（腹膜腔、胸膜腔、および囲心腔の内表面）；扁平細胞（耳の外リンパ腔の内表面）；扁平細胞（耳の内リンパ腔の内表面）；微繊毛を有する内リンパ嚢の円柱細胞（耳の内リンパ腔の内表面）；暗細胞（耳の内リンパ腔の内表面）；前庭膜細胞（耳の内リンパ腔の内表面）；血管条基底細胞（耳の内リンパ腔の内表面）；血管条周辺細胞（耳の内リンパ腔の内表面）；クラウディウス細胞（耳の内リンパ腔の内表面）；ベッチャー細胞（耳の内リンパ腔の内表面）；脈絡叢細胞（脳脊髄液を分泌）；軟膜くも膜の扁平細胞；目の色素毛様体上皮細胞；目の無色素毛様体上皮細胞；角膜内皮細胞）。
・運動機能を有する線毛細胞（気道線毛細胞；卵管線毛細胞（女性）子宮内膜線毛細胞（女性）；精巣網線毛細胞（男性）；精巣輸出管毛細胞（男性）；中枢神経系の線毛上衣細胞（脳腔の内表面））。
・細胞外基質分泌細胞（エナメル芽細胞の上皮細胞（歯のエナメル質を分泌）；耳の前庭器の半月面上皮細胞（プロテオグリカンを分泌）；コルチ器官の歯間上皮細胞（有毛細胞を覆う蓋膜を分泌）；疎性結合組織の線維芽細胞；腱線維芽細胞；骨髄の細網組織線維芽細胞；その他非上皮線維芽細胞；毛細血管の周皮細胞；椎間板の髄核細胞；セメント芽細胞／セメント細胞（歯根の骨様セメント質を分泌）；象牙芽細胞／歯牙細胞（歯の象牙質を分泌）；硝子様軟骨の軟骨細胞；線維軟骨の軟骨細胞；弾性軟骨の軟骨細胞；骨芽細胞／骨細胞；骨細胞前駆細胞（骨芽細胞の幹細胞）；目の硝子体の硝子体細胞：耳の外リンパ腔の星状細胞を含む）。
・収縮性細胞（赤色骨格筋細胞（遅筋）；白色骨格筋細胞（速筋）；中間骨格筋細胞；筋紡錘の核袋細胞；筋紡錘の核鎖細胞；筋衛星細胞（幹細胞）；固有心筋細胞；結節心筋細胞；プルキンエ線維細胞；平滑筋（種々の型）；虹彩の筋上皮細胞；外分泌腺の筋上皮細胞を含む）。
・血液および免疫系の細胞（赤血球；巨核球（血小板前駆体）；単球：結合組織マクロファージ（種々の型）；表皮ランゲルハンス細胞；破骨細胞（骨内）；樹状細胞（リンパ組織内）；小グリア細胞（中枢神経系内）；好中性顆粒球；好酸性顆粒球；好塩基性顆粒球；マスト細胞；ヘルパーＴ細胞；サプレッサＴ細胞；細胞傷害性Ｔ細胞；Ｂ細胞；ナチュラルキラー細胞；メモリ細胞；網状赤血球；血液および免疫系の幹細胞および前駆細胞（種々の型）を含む）。
・感覚変換器細胞（目の光受容器の棹体細胞；目の光受容器の青色感受性錐体細胞；目の光受容器の緑色感受性錐体細胞；目の光受容体の赤色感受性錐体細胞；コルチ器官の聴覚内側有毛細胞；コルチ器官の聴覚外側有毛細胞；耳の前庭器のＩ型有毛細胞（加速および重力）；耳の前庭器のＩＩ型有毛細胞（加速および重力）；Ｉ型味蕾細胞；嗅覚受容体ニューロン；嗅上皮基底細胞（嗅覚ニューロンの幹細胞）；Ｉ型頚動脈小体細胞（血液ｐＨセンサー）；ＩＩ型頚動脈小体細胞（血液ｐＨセンサー）；表皮のメルケル細胞（触覚センサー）；触覚感受性一次知覚性ニューロン（種々の型）；低温感受性一次知覚性ニューロン；熱感受性一次知覚性ニューロン；痛覚感受性一次知覚性ニューロン（種々の型）；固有受容性一次知覚性ニューロン（種々の型）を含む）。
・自律神経ニューロン細胞（コリン作動性神経細胞（種々の型）；アドレナリン作動性神経細胞（種々の型）；ペプチド作動性神経細胞（種々の型）を含む）。
・感覚器官および末梢ニューロンの支持細胞（コルチ器官の内柱細胞；コルチ器官の外柱細胞；コルチ器官の内支持細胞；コルチ器官の外支持細胞；コルチ器官の領域細胞；前庭器の支持細胞；Ｉ型味蕾支持細胞；嗅上皮支持細胞；シュワン細胞；衛星細胞（末梢神経細胞体を被包する）；腸管グリア細胞を含む）。
・中枢神経系ニューロンおよびグリア細胞（ニューロン細胞（多種多様の型があるが、分類は依然として不十分）；アストロサイト（種々の型）；オリゴデンドロサイトを含む）。
・水晶体細胞（前水晶体上皮細胞；クリスタリン含有水晶体線維細胞を含む）。
・色素細胞（メラニン細胞；網膜色素上皮細胞を含む）。
・生殖細胞（卵原細胞／卵母細胞；精細胞；精母細胞；精原細胞（精母細胞の幹細胞）；精子を含む）。
・ナース細胞（卵胞細胞；セルトリ細胞（精巣内の）；胸腺上皮細胞を含む）。
・幹細胞（胚および成体の両由来の全能性、分化全能性、多能性、単能性の幹細胞または前駆体または前駆細胞）。
・上述の細胞型のいずれかに由来するすべての癌細胞（定義不可能な起源の奇形癌腫を含む）。
【００４０】
好ましい実施形態
好ましい実施形態において、本発明で使用される半透性のフィルターは、ある一定の分子量または分子サイズまでの分子を通過させることができる。明確に定義された孔径を有する半透性フィルターは、当業者にとって既知であり、市販されている。本発明の好ましい実施形態において、５０ｋＤａ、１０ＯｋＤａ、１５０ｋＤａ、２００ｋＤａ、または２５０ｋＤａ等の所定の分子量までの分子を透過する場合がある。あるいは、半透性フィルターの透過性は、その孔径によって決定される場合がある。半透性フィルターの孔径は、０．５μｍ以下、例えば０．３μｍ以下、好ましくは０．２μｍ以下、さらにより好ましくは０．１μｍ以下、最も好ましくは０．０５μｍ以下である場合がある。多種多様なフィルターが使用され得る。これらは、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、フッ化ビニリデン樹脂（ＰＶＤＦ）、シリコンゴム、発泡樹脂、放射線処理樹脂、および類似の物質からなる群から選択される（がこれらに限定されない）物質で作られ得る。好ましい一実施形態において、ＷｈａｔｍａｎのＴＥ  ３５フィルターまたはＺｅｆｌｕｏｒフィルター（カタログ番号６６１４２、Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）が使用され得る。
【００４１】
本発明の好ましい実施形態において、「実質的に水を透過せず」、かつ「実質的に酸素および二酸化炭素を透過する」膜を１バールで通過する水流量は、５０ｍＬ／分／ｃｍ２未満、好ましくは４０ｍＬ／分／ｃｍ２未満、より好ましくは３０ｍＬ／分／ｃｍ２未満、さらにより好ましくは２０ｍＬ／分／ｃｍ２未満、最も好ましくは１０ｍＬ／分／ｃｍ２未満である。透水性は、ｍＬ／分／ｃｍ２に変換され得るその他の単位で表され得ることは、当業者によって容易に理解されるであろう。
【００４２】
本発明の好ましい実施形態において、「実質的に水を透過せず」、かつ「実質的に酸素および二酸化炭素を透過する」膜を、３ミリバールで通過する空気流量は、少なくとも５ｍＬ／分／ｃｍ２であり、好ましくは少なくとも１０ｍＬ／分／ｃｍ２であり、より好ましくは少なくとも１５ｍＬ／分／ｃｍ２であり、さらにより好ましくは少なくとも２０ｍＬ／分／ｃｍ２であり、最も好ましくは少なくとも２５ｍＬ／分／ｃｍ２である。空気流の透過性がｍＬ／分／ｃｍ２に変換できるその他の単位で表され得ることは、当業者により容易に理解されるであろう。
【００４３】
多種多様な物質で構成される膜が使用され得る。これらは、「実質的に水を透過せず」、かつ「実質的に酸素および二酸化炭素を透過し」、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、フッ化ビニリデン樹脂（ＰＶＤＦ）、シリコンゴム、発泡樹脂、放射線処理樹脂、および類似の物質で構成される、当該技術分野で周知の膜を含むが、これらに限定されない。適切な膜の一例は、「ＴＥ  ３５（登録商標）」の商標でポリエステル支持体を有するＰＴＦＥ膜がＷｈａｔｍａｎから市販されている。これは、製造業者の説明によると、孔径０．２μＭ、厚さ１９０μＭ、０．９バールでの水流量２０ｍＬ／分／ｃｍ２（エタノールで測定した場合）、３ミリバールでの空気流量１５ｍＬ／分／ｃｍ２、沸点１．４バールの特徴を有する。適切な膜の別の例は、「ＳｕｒｅＶｅｎｔ（登録商標）」の商標でＰＶＤＦ膜がＭｉｌｌｉｐｏｒｅから市販されている。これは、製造業者の説明によると、孔径０．２２μＭ、厚さ１００〜１５０μＭ、４５ミリバールでの水浸透、１０ｐｓｉでの空気流量１  ｓｌｐｍ／ｃｍ２超の特徴を有する。いくつかの実施形態において、膜は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅの０．２２μｍ「Ｄｕｒａｐｅｌ」膜、またはＷｈａｔｍａｎのＴＥ  ３５およびＴＥ  ３６の膜であってもよい。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態において、「ほぼ完全に水を透過しない」が、「実質的に酸素および二酸化炭素を透過する」膜を通過する１バールでの水流量は、０．１ｍＬ／分／ｃｍ２未満、より好ましくは０．０５ｍＬ／分／ｃｍ２未満、さらにより好ましくは０．０４ｍＬ／分／ｃｍ２未満、さらにより好ましくは０．０３ｍＬ／分／ｃｍ２未満、なおより好ましくは０．０２ｍＬ／分／ｃｍ２未満、最も好ましくは０．０１ｍＬ／分／ｃｍ２未満である。透水性がｍＬ／分／ｃｍ２に変換できるその他の単位で表され得ることは、当業者により容易に理解されるであろう。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態において、「ほぼ完全に水を透過しない」が、「実質的に酸素および二酸化炭素を透過する」膜を３ミリバールで通過する空気流量は、少なくとも５ｍＬ／分／ｃｍ２、好ましくは少なくとも１０ｍＬ／分／ｃｍ２、より好ましくは少なくとも１５ｍＬ／分／ｃｍ２、さらにより好ましくは少なくとも２０ｍＬ／分／ｃｍ２、最も好ましくは少なくとも２５ｍＬ／分／ｃｍ２である。
【００４６】
多種多様な物質で構成される膜が使用され得る。これらは、「ほぼ不完全に水を透過しない」が、「実質的に酸素および二酸化炭素を透過し」、最初は限外濾過の目的で調製されたものであるが、例えば低多孔度および高疎水性により大気圧できわめて低い透水性を有する膜を含むが、これに限定されない。このような膜は、「ＹＭ１（登録商標）」の商標でＡｍｉｃｏｎから、「Ｏｍｅｇａ  １Ｋ（登録商標）」の商標でＰａｌｌ  Ｃｏｒｐ．から市販されている。その他の適切な膜には、Ｍｉｃｒｏ−  ａｎｄ  ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｆｉｌｍ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｅｒ  ｅｔｈｅｒ  ｋｅｔｏｎｅ）（ＰＥＥＫ）．Ｓｏｎｎｅｎｓｃｈｅｉｎ  Ｍ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９９  ７４：１１４６に記載の通り、ポリ（エーテルエーテルケトン）（ＰＥＥＫ）およびポリ（フェニレンスルフィド）（ＰＰＳ）等の半結晶物質を熱で誘導する相転換プロセスによって調製される熱可塑性限外濾過膜が含まれる。米国特許第５，５０７，９４９号に開示されるシステム等のように、微小孔、疎水性の固体支持体内に固定された、適切なオリゴマーまたはポリマーの液体膜物質を含む、固定され、安定した支持液膜（ＳＬＭ）も使用され得る。
【００４７】
好ましい実施形態において、本発明によるバイオリアクターのインキュベーションキャビティの内部液量は、１．０ｍＬ未満、９００μＬ未満、８００μＬ未満、７００μＬ未満、６００μＬ未満、５００μＬ未満、４００μＬ未満、３００μＬ未満、２００μＬ未満、１００μＬ未満、５０μＬ未満、または２５μＬであり得る。
【００４８】
多くの異なる細胞組織、組織生検、細胞クラスター、組織様構造、「原型組織」、または類似の試料が、本発明を実施する際に使用される場合がある。細胞培養の種々の方法には、ガラス製および樹脂製の容器（例えば、３Ｄ細胞支持マトリックスを充填した培養フラスコ、細胞工場、または細胞キューブ、および可撓性プラスチック袋（輸液バッグのような）、ローラーボトル、スピナーボトル、発酵槽、または種々の物質の中空糸等）での増殖が含まれるが、これらに限定されない。細胞培養物は、マイクロキャリアビーズ上の球形、またはスカフォールド（例えば、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、またはこの２つの混合物で作られていることが多い、生分解性スカフォールド［Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｋｎｉｔｔｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ｆｏｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｌｉｇａｍｅｎｔ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｇｅ  Ｚ，Ｇｏｈ  ＪＣ，Ｗａｎｇ  Ｌ，Ｔａｎ  ＥＰ，Ｌｅｅ  ＥＨ．Ｊ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ  Ｐｏｌｙｍ  Ｅｄ．２００５；１６（９）：１１７９−９２］および［Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ａｎｄ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋａｂｌｅ  ｐｏｌｙ（ｅｐｓｉｌｏｎ−ｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ  ｆｕｍａｒａｔｅ），ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｆｕｍａｒａｔｅ），ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ，Ｗａｎｇ  Ｓ，Ｌｕ  Ｌ，Ｇｒｕｅｔｚｍａｃｈｅｒ  ＪＡ，Ｃｕｒｒｉｅｒ  ＢＬ，Ｙａｓｚｅｍｓｋｉ  ＭＪ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００５  Ａｕｇ  １２；［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］］）上の細胞等の細胞クラスター、組織もしくは組織生検、または組織オルガノイドの形態である場合がある。本発明は、とりわけ以下の細胞型から１つ以上を使用して実施される場合がある。
・角質化上皮細胞（表皮の角化細胞（分化中の表皮細胞）；表皮の基底細胞（幹細胞）；指の爪および足指の爪の角化細胞、爪床の基底細胞（幹細胞）；毛幹細胞の毛髄質；毛幹細胞の毛皮質；毛幹細胞の毛小皮；毛根鞘細胞の鞘小皮；毛根鞘細胞のハックレイ層；毛根鞘細胞のヘンレ層；毛根鞘細胞の外毛根鞘；毛母細胞（幹細胞）を含む）。
・湿潤で重層のバリアの上皮細胞（角膜、舌、口腔、食道、肛門管、遠位尿道、および膣の重層扁平上皮の表面上皮細胞；角膜、舌、口腔、食道、肛門管、遠位尿道、および膣の上皮の基底細胞（幹細胞）；泌尿器の上皮細胞（膀胱および尿管の内表面））。
・外分泌腺分泌上皮細胞（唾液腺粘液細胞（多糖が豊富な液を分泌）を含む）；唾液腺漿液細胞（糖タンパク質酵素が豊富な液を泌物）；舌のフォンエブネル腺細胞（味蕾を洗浄）；乳腺細胞（乳汁を分泌）；涙腺細胞（涙液を分泌）；耳内の耳道腺細胞（耳垢を分泌）；エクリン汗腺暗細胞（糖タンパク質を分泌）；エクリン汗腺明細胞（小分子を分泌）；アポクリン汗腺細胞（芳香性物質を分泌、性ホルモン感受性）；まぶたのモル腺細胞（特殊化した汗腺）；皮脂腺細胞（脂質が豊富な皮脂を分泌）；鼻のボーマン腺細胞（嗅上皮を洗浄）；十二指腸のブルナー腺細胞（酵素およびアルカリ性粘液）；精嚢細胞（精子が泳ぐための果糖を含む精液の成分を分泌）；前立腺細胞（精液の成分を分泌）；尿道球腺細胞（粘液を分泌）；バルトリン腺細胞（膣の潤滑液を分泌）；リトレ腺細胞（粘液を分泌）；子宮内膜細胞（炭水化物を分泌）；気道および消化管の単離された杯細胞（粘液を分泌）；胃内表面の粘膜細胞（粘液を分泌）；胃腺の酵素原細胞（ペプシノゲンを分泌）；胃腺の酸分泌細胞（塩酸を分泌）；膵腺房細胞（重炭酸塩および消化酵素を分泌）；小腸のパネート細胞（リゾチームを分泌）；肺のＩＩ型肺細胞（界面活性物質を分泌）；肺のクララ細胞を含む）。
・ホルモン分泌細胞（下垂体前葉細胞；成長ホルモン産生細胞；乳腺刺激ホルモン分泌細胞；甲状腺刺激ホルモン産生細胞；性腺刺激ホルモン産生細胞；副腎皮質刺激因子；メラニン細胞刺激ホルモンを分泌する下垂体中葉細胞；オキシトシンまたはバソプレシンを分泌する巨細胞性神経分泌細胞；消化管および気道の細胞（以下から１つ以上を分泌：セロトニン、エンドルフィン、ソマトスタチン、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、インスリン、グルカゴン、ボンペシン）；甲状腺細胞；甲状腺上皮細胞；副甲状腺細胞；上皮小体主細胞；好酸性細胞；副腎細胞；クロム親和性細胞（１つ以上のステロイドホルモン鉱質コルチコイドまたは糖質コルチコイドを分泌）；精巣のライディッヒ細胞（テストステロンを分泌）；卵胞の内卵胞膜細胞（エストロゲンを分泌）；破裂卵胞の黄体細胞（プロゲステロンを分泌）；腎傍糸球体装置細胞（レニンを分泌）；腎密集斑細胞；腎極周囲細胞；腎メサンギウム細胞を含む）。
・吸収上皮細胞（消化管、外分泌腺、および尿生殖路）（腸の刷子縁細胞（微繊毛を有する）；外分泌腺の線条管細胞；胆嚢上皮細胞；腎近位尿細管の刷子縁細胞；腎遠位尿細管細胞；精巣輸出管の無線毛細胞；精巣上体の主細胞；精巣上体の基底細胞；代謝および貯蔵細胞；肝細胞（肝細胞）；脂肪細胞（褐色または白色の脂肪細胞）；肝脂肪細胞を含む）。
・バリア機能細胞（肺、消化管、外分泌腺、および尿生殖路）（Ｉ型肺細胞（肺気腔の内表面）；膵導管細胞（腺房中心細胞）；（汗腺、唾液腺、乳腺等の）無線毛の導管細胞；腎糸球体の壁細胞；腎糸球体の足細胞；（腎臓内の）ヘンレ係蹄の細い部分の細胞；腎集合尿細管細胞；（精嚢、前立腺等の）導管細胞を含む）。
・体内で閉じた管腔の内表面の上皮細胞（血管およびリンパ管の内皮有窓細胞；血管およびリンパ管の内皮連続細胞；血管およびリンパ管の内皮脾細胞；滑膜細胞（関節腔の内面を覆い、ヒアルロン酸を分泌）；漿膜細胞（腹膜腔、胸膜腔、および囲心腔の内表面）；扁平細胞（耳の外リンパ腔の内表面）；扁平細胞（耳の内リンパ腔の内表面）；微繊毛を有する内リンパ嚢の円柱細胞（耳の内リンパ腔の内表面）；暗細胞（耳の内リンパ腔の内表面）；前庭膜細胞（耳の内リンパ腔の内表面）；血管条基底細胞（耳の内リンパ腔の内表面）；血管条周辺細胞（耳の内リンパ腔の内表面）；クラウディウス細胞（耳の内リンパ腔の内表面）；ベッチャー細胞（耳の内リンパ腔の内表面）；脈絡叢細胞（脳脊髄液を分泌）；軟膜くも膜の扁平細胞；目の色素毛様体上皮細胞；目の無色素毛様体上皮細胞；角膜内皮細胞）。
・運動機能を有する線毛細胞（気道線毛細胞；卵管線毛細胞（女性）子宮内膜線毛細胞（女性）；精巣網線毛細胞（男性）；精巣輸出管毛細胞（男性）；中枢神経系の線毛上衣細胞（脳腔の内表面））。
・細胞外基質分泌細胞（エナメル芽細胞の上皮細胞（歯のエナメル質を分泌）；耳の前庭器の半月面上皮細胞（プロテオグリカンを分泌）；コルチ器官の歯間上皮細胞（有毛細胞を覆う蓋膜を分泌）；疎性結合組織の線維芽細胞；腱線維芽細胞；骨髄の細網組織線維芽細胞；その他非上皮線維芽細胞；毛細血管の周皮細胞；椎間板の髄核細胞；セメント芽細胞／セメント細胞（歯根の骨様セメント質を分泌）；象牙芽細胞／歯牙細胞（歯の象牙質を分泌）；硝子様軟骨の軟骨細胞；線維軟骨の軟骨細胞；弾性軟骨の軟骨細胞；骨芽細胞／骨細胞；骨細胞前駆細胞（骨芽細胞の幹細胞）；目の硝子体の硝子体細胞：耳の外リンパ腔の星状細胞を含む）。
・収縮性細胞（赤色骨格筋細胞（遅筋）；白色骨格筋細胞（速筋）；中間骨格筋細胞；筋紡錘の核袋細胞；筋紡錘の核鎖細胞；筋衛星細胞（幹細胞）；固有心筋細胞；結節心筋細胞；プルキンエ線維細胞；平滑筋（種々の型）；虹彩の筋上皮細胞；外分泌腺の筋上皮細胞を含む）。
・血液および免疫系の細胞（赤血球；巨核球（血小板前駆体）；単球：結合組織マクロファージ（種々の型）；表皮ランゲルハンス細胞；破骨細胞（骨内）；樹状細胞（リンパ組織内）；小グリア細胞（中枢神経系内）；好中性顆粒球；好酸性顆粒球；好塩基性顆粒球；マスト細胞；ヘルパーＴ細胞；サプレッサＴ細胞；細胞傷害性Ｔ細胞；Ｂ細胞；ナチュラルキラー細胞；メモリ細胞；網状赤血球；血液および免疫系の幹細胞および前駆細胞（種々の型）を含む）。
・感覚変換器細胞（目の光受容器の棹体細胞；目の光受容器の青色感受性錐体細胞；目の光受容器の緑色感受性錐体細胞；目の光受容体の赤色感受性錐体細胞；コルチ器官の聴覚内側有毛細胞；コルチ器官の聴覚外側有毛細胞；耳の前庭器のＩ型有毛細胞（加速および重力）；耳の前庭器のＩＩ型有毛細胞（加速および重力）；Ｉ型味蕾細胞；嗅覚受容体ニューロン；嗅上皮基底細胞（嗅覚ニューロンの幹細胞）；Ｉ型頚動脈小体細胞（血液ｐＨセンサー）；ＩＩ型頚動脈小体細胞（血液ｐＨセンサー）；表皮のメルケル細胞（触覚センサー）；触覚感受性一次知覚性ニューロン（種々の型）；低温感受性一次知覚性ニューロン；熱感受性一次知覚性ニューロン；痛覚感受性一次知覚性ニューロン（種々の型）；固有受容性一次知覚性ニューロン（種々の型）を含む）。
・自律神経ニューロン細胞（コリン作動性神経細胞（種々の型）；アドレナリン作動性神経細胞（種々の型）；ペプチド作動性神経細胞（種々の型）を含む）。
・感覚器官および末梢ニューロンの支持細胞（コルチ器官の内柱細胞；コルチ器官の外柱細胞；コルチ器官の内支持細胞；コルチ器官の外支持細胞；コルチ器官の領域細胞；前庭器の支持細胞；Ｉ型味蕾支持細胞；嗅上皮支持細胞；シュワン細胞；衛星細胞（末梢神経細胞体を被包する）；腸管グリア細胞を含む）。
・中枢神経系ニューロンおよびグリア細胞（ニューロン細胞（多種多様の型があるが、分類は依然として不十分）；アストロサイト（種々の型）；オリゴデンドロサイトを含む）。
・水晶体細胞（前水晶体上皮細胞；クリスタリン含有水晶体線維細胞を含む）。
・色素細胞（メラニン細胞；網膜色素上皮細胞を含む）。
・生殖細胞（卵原細胞／卵母細胞；精細胞；精母細胞；精原細胞（精母細胞の幹細胞）；精子を含む）。
・ナース細胞（卵胞細胞；セルトリ細胞（精巣内の）；胸腺上皮細胞を含む）。
・幹細胞（胚および成体の両由来の全能性、分化全能性、多能性、単能性の幹細胞または前駆体または前駆細胞）。
・上述の細胞型のいずれかに由来するすべての癌細胞（定義不可能な起源の奇形癌腫を含む）。
【００４９】
本発明の好ましい実施形態において、本発明と状況下で適用され得る細胞は、肝細胞、脂肪細胞、腎細胞、筋細胞、または類似の細胞、肝組織、脂肪組織（褐色または白色）、肝生検、腎生検、筋生検、卵胞、ランゲルハンス島、およびそれらに由来するすべての癌細胞からなる群から選択される。
【００５０】
本発明の特に好ましい実施形態において、本発明の状況下で適用され得る細胞は、肝細胞、特にヒト肝細胞である。
【００５１】
図１は、本発明の第１の態様によるバイオリアクター１０の概略断面図である。バイオリアクター１０は、図１から見た横軸を中心に高度な回転対称を有する。バイオリアクターは、細胞、組織等のインキュベーションを行うためのインキュベーションキャビティ１５を含む。インキュベーションキャビティ１５は、第１の半透性フィルター（無菌フィルターとしても知られる）Ｆ１とともに、細胞等のインキュベーションのために本質的に閉ざされた境界を提供する。栄養分および／または新鮮な液体培地を供給するために、半透性フィルターＦ１は、５０ｋＤａ、１０ＯｋＤａ、１５０ｋＤａ、２００ｋＤａ、または２５０ｋＤａ等の所定の分子量までの分子を透過することができる。標準的な透析膜は、これらの要件を満たし得る。あるいは、半透性フィルターＦ１の透過性は、その孔径によって決定される。半透性フィルターＦ１の孔径は、０．５μｍ以下、例えば０．３μｍ以下、好ましくは０．２μｍ以下、より好ましくは０．１μｍ以下、最も好ましくは０．０５μｍ以下である場合がある。フィルターを通って侵入する感染（例えば、細菌、マイコプラズマ、または酵母）を防ぐ必要があるため、０．０２μｍ以下の孔径が好ましい。この好ましい実施形態において、半透性膜の主な目的は、細胞および細菌のインキュベーションキャビティへの侵入を排除しながら、栄養分および老廃物の交換を可能することである。したがって、種々のフィルターがＦ１に使用され得る。これらは、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、フッ化ビニリデン樹脂（ＰＶＤＦ）、シリコンゴム、発泡樹脂、放射線処理樹脂、または類似の物質から作られ得る。それにより、インキュベーションチャンバーへの栄養分おび液体培地の流入が提供されると同時に、細胞および細胞凝集体の保持、ならびにそれらのインキュベーションキャビティ１５内での外部感染からの保護が提供される。インキュベーションキャビティ１５は、約２５μＬ〜約１ｍＬの内部液量を有する。好ましくは、インキュベーションキャビティ１５の液量は、約５０μＬ〜約０．５ｍＬ、より好ましくは約０．１〜０．４ｍＬである。小型のサイズにより、操作を成功させるために必要な物質（有機および無機の両物質）の使用に係る経費およびその量が著しく低減する。また、小型のサイズにより、細胞のクローズアップモニタリング（例えば、遠隔カメラによる）および自動処理（例えば、非灌流型での培地の交換）も容易になる。
【００５２】
平衡チャンバー（図１に図示なし）は、インキュベーションキャビティ１５に存在する１つ以上の細胞培養物、組織生検、または細胞クラスターの栄養素および／または酸素、ならびに場合により二酸化炭素および／またはｐＨ調整物質を交換するための容量を提供する。導通手段２０（例えばバイオリアクター１０の後部１２内の管および管状キャビティ）は、半透性フィルターＦ１から平衡チャンバーまで実質的に液密性の導管を提供する。白色の矢印は、栄養分を有する新鮮な培地を示し、黒色の矢印は、平衡チャンバー（または廃棄物処理に）に戻される使用済みの液体培地を示す。
【００５３】
図１に示す実施形態において、導通手段２０はまた、導通手段２０とフィルターＦ１の間の液体接触の領域を強化するために、フィルターＦ１の前に培地チャンバーを含み、それによってフィルターＦ１を通過する栄養分および／または新鮮な液体培地の流れを増加させる。培地チャンバー２５は、培地チャンバー２５を囲む特別に設計された環２６によって提供される場合がある。環２６は、バイオリアクター１０の後部１２および前部１１の間を締着する密封Ｏリングであってもよい。同様に、フィルターＦ１は、好ましくは、培地チャンバー２５からインキュベーションキャビティ１５まで液密性かつ気密性の結合を提供する。わかりやすく説明すると、環２６とフィルターＦ１の間、および後部１２の外側部と前部１１の外側部の間に狭い空隙が見えるが、組み立てると、これらの空隙は通常なくなる。なぜなら、液漏れを排除するために、バイオリアクター１０は可能な限り気密にする必要があるためである。
【００５４】
バイオリアクター１０の外側から、例えばカメラを使用して手動または自動で細胞等の培養を監視して、視覚的に評価できるように、バイリアクター１０の前部には透明部分１４がある。この透明部分１４は、透明であって、培養プロセスに対して生物学的かつ化学的に不活性であるガラス、樹脂またはその他の適切な物質で作られ得る。好ましい物質には、種々の種類のガラス、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、およびポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）が含まれるが、これらに限定されない。ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）の適切な変異体は市販されており、これには、Ｐｅｒｓｐｅｘ（登録商標）、Ｐｌｅｘｉｇｌａｓ（登録商標）、Ｌｕｃｉｔｅ（登録商標）、Ａｃｒｙｌｉｔｅ（登録商標）、Ｒｈｏｐｌｅｘ（登録商標）、およびＯｒｏｇｌａｓ（登録商標）の商標／商標名で販売されている製品が含まれる。バイオリアクターのいかなる実施形態も、このような透明物質から全体または一部が作られ得る。
【００５５】
インキュベーションキャビティ１５は、好ましくは、実質的に円筒の形状を有するが、他の形状（例えば、楕円形、球形等）でも可能である。好ましくは、バイオリアクター１０は、キャビティ１５内の細胞の増殖を促進させるために、付随する回転手段（図示なし）によって横回転軸を中心に回転するように適合されている。回転速度は、浮遊培養の細胞または原型組織を維持するように調整される。この速度は、原型組織の大きさが増大するにつれて変更する必要がある。当業者であれば、浮遊培養の細胞または原型組織を維持するために回転速度を調節する方法を認識するであろう。
【００５６】
図２は、本発明の第１の態様によるバイオリアクター１０のより詳細な断面図であり、導通手段２０を介して液体培地を循環させるためのポンプ手段２６．５と、一定環境チャンバー２９に組み込まれた平衡チャンバー２８と、新鮮な培地の導入（すなわち、試験のために化合物を導入する場合は、すでに存在するものと必ずしも同じではない）を可能にするために培地チャンバー２５の液体培地の流入出を調節する制御弁２７と、使用した培地の廃棄物への排出および導通手段２０からの排出とを示す。平衡チャンバー２８を含む一定環境チャンバー２９が、バイオリアクター１０と同時に回転するように適合される場合もあれば、あるいは容器２９が、バイオリアクター１０の隣接する位置に固定される場合もある。後者の場合、導通手段２０のねじれは、簡単に入手可能であり、かつ当業者に周知の回転関節を導通手段２０に完全に組み込むことによって回避されなければならない。全体的な配置の設計を簡単にするため、液体導通手段２０がバイオリアクター１０の回転軸に対して実質的に平行の部分を有することが好ましい場合もある。
【００５７】
前部１１および後部１２を含むバイオリアクター１０は、適切な固定手段（例えば組立てネジ１８を介して）によって基部１７に取り付けられる。適切な回転手段（図示なし）の上に基部１７およびバイオリアクター１０を簡単に取り付けるために、基部１７は、ネジ切りされた端部１７ａを有するのが有利である場合がある。同様に、前部１１および後部１２はさらに、上の説明のように、キャビティ１５との液密性の結合を提供するために、組立てネジ１９によって固定される。わかりやすく説明すると、環２６とフィルターＦ１の間、および後部１２の外側部と前部１１の外側部の間に狭い空隙が見えるが、組み立てると、これらの空隙は通常なくなる。
【００５８】
本発明の一実施形態において、導通手段２０は、約２５μＬ〜約２ｍＬ、好ましくは約５０μＬ〜約１ｍＬ、最も好ましくは約０．１〜０．４ｍＬの内部液量を有する。導通手段２０の容量は最小限にすべきであり、それによってキャビティ１５の容量と同程度になる。さもなければ、本発明によりもたらされる液体培地および／または比較的高価な試薬（例えば、ラジオアイソトープ）の減少が、有意なものにならない場合がある。同様に、平衡チャンバー２８は、約２５μＬ〜約２ｍＬ、好ましくは約５０μＬ〜約１ｍＬ、最も好ましくは約０．１〜０．４ｍＬの内部液量を有するのが有利な場合がある。
【００５９】
図３Ａは、本発明の第２の態様によるバイオリアクター５０の概略断面図である。バイオリクター５０は、図１から見た横軸を中心に高度な回転対称を有する。バイオリアクターは、第１の半透性膜Ｍ１とともに配置されるインキュベーションキャビティ５５を含み、それによって細胞、組織等のインキュベーションが行われる実質的に閉ざされた境界が提供される。細胞のインキュベーションは、バイオリアクター５０の外側から手動または自動で監視され、視覚的に評価される場合がある。透明部分５８は、透明であって、培養プロセスに対して生物学的かつ化学的に不活性であるガラス、樹脂またはその他いずれかの適切な物質製で作られ得る。好ましい物質には、種々の種類のガラス、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、およびポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）が含まれるが、これらに限定されない。ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）の適切な変異体は市販されており、これには、Ｐｅｒｓｐｅｘ（登録商標）、Ｐｌｅｘｉｇｌａｓ（登録商標）、Ｌｕｃｉｔｅ（登録商標）、Ａｃｒｙｌｉｔｅ（登録商標）、Ｒｈｏｐｌｅｘ（登録商標）、およびＯｒｏｇｌａｓ（登録商標）の商標／商標名で販売されている製品が含まれる。
【００６０】
さらに、水性液体を含む湿潤チャンバー６０を備えており、このチャンバー６０はさらに、第２の半透性膜Ｍ２および第３の半透性Ｍ３を含む。後者の膜のＭ２およびＭ３は、いずれも水性液体と液体接触して配置され、図１に示すように、それぞれ右側および左側から液体を封じ込める。第３の半透性膜Ｍ３はさらに、バイオリアクター５０を囲む大気との気体交換のために配置される。バイオリアクター５０の後部５２には、図１に示すように左側から中間キャビティＩＣの気密閉鎖を実質的に提供するために、湿潤チャンバー６０を受容する凹部がある。後部５２はさらに、第１の半透性膜Ｍ１から第２の半透性膜Ｍ２まで実質的に気密性の導管を導通手段に提供する側壁５２ａおよび５２ｂで配置される。したがって、バイオリアクター５０の前部５１および後部５２は、例えば高密度ポリプロピレン（ＨＤＰＰ）等の不活性樹脂で製造される場合がある。好ましい物質には、種々の種類のガラス、ナイロン、樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、およびポリメチルメタクリレートが含まれるが、これらに限定されない。密封手段５３（例えばＯ形状リング）とともに、中間キャビティＩＣを通る空気の流れは、第１の膜Ｍ１（インキュベーションキャビティ５５の部分を形成する）ならびに第２および第３の膜Ｍ２およびＭ３（湿潤チャンバー６０の部分を形成する）を介してのみ効果的に可能である。
【００６１】
第１（Ｍ１）、第２（Ｍ２）、および第３（Ｍ３）の半透性膜は、これらの膜が実質的に水を透過せず、実質的に酸素および二酸化炭素を透過することに特徴がある。それによって、膜Ｍ１、Ｍ２およびＭ３は、第１の半透性膜Ｍ１を介したインキュベーションキャビティ５５の通気、および湿潤チャンバー６０（Ｍ２、水性液体、およびＭ３を通過する）の通気を促進する。さらに、Ｍ１、Ｍ２およびＭ３の３つの膜の不透水性により、インキュベーションチャンバー内での実質的な保水性が達成される。膜Ｍ１、Ｍ２およびＭ３は、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、フッ化ビニリデン樹脂（ＰＶＤＦ）、シリコンゴム、発泡樹脂、放射線処理樹脂、または類似の物質を含むがこれらに限定されない当該技術分野で周知の種々の物質で製造され得る。適切な膜の一例は、「ＴＥ  ３５（登録商標）」の商標でポリエステル支持体を有するＰＴＦＥ膜がＷｈａｔｍａｎから市販されている。これは、製造業者の説明によると、孔径０．２μＭ、厚さ１９０μＭ、０．９バールでの水流量２０ｍＬ／分／ｃｍ２（エタノールで測定した場合）、３ミリバールでの空気流量１５ｍＬ／分／ｃｍ２、沸点１．４バールの特徴を有する。適切な膜の別の例は、「ＳｕｒｅＶｅｎｔ（登録商標）」の商標でＰＶＤＦ膜がＭｉｌｌｉｐｏｒｅから市販されている。これは、製造業者の説明によると、孔径０．２２μＭ、厚さ１００〜１５０μＭ、４５ミリバールでの水浸透、１０ｐｓｉでの空気流量１  ｓｌｐｍ／ｃｍ２超の特徴を有する。その他の例には、Ｚｅｆｌｕｏｒフィルター（カタログ番号６６１４２、Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）である。
【００６２】
これらの物質の高度な疎水性のために、水分子および水様分子は、膜Ｍ１、Ｍ２およびＭ３の表面から高度にはじかれる。しかし、一部の水は、膜Ｍ１、Ｍ２およびＭ３を介して不回避的に浸透する。湿潤チャンバー６０および／またはインキュベーションチャンバー５５から蒸発したこの水は、中間キャビティＩＣによって形成された気密性の導管内に、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相対湿度を提供する。
【００６３】
図３Ｂは、膜Ｍ１およびＭ２ならびに中間キャビティＩＣが、塩類を透過せず、気体および液体は浸透する膜Ｍ１２と置換される場合がある、本発明の第２の態様によるバイオリアクターの他の実施形態を示す。この種類の薄膜の例は、例えば、「Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）」の商標で販売されるポリテトラフルオロエチレン、「Ｔｅｄｌａｒ（登録商標）」の商標で販売されるＦＥＰ膜もしくはフッ化ビニル樹脂フィルム等のＤｕｐｏｎｔから販売されている製品を含め、市販されている。
【００６４】
この実施形態は、図５に示す実施形態よりも構造がより単純であり、湿潤チャンバーがインキュベーションチャンバーと直接接触している。インキュベーションチャンバーで培養される場合がある１つ以上の細胞培養物は、含有する塩類の量を含めたインキュベーションチャンバーの条件の変化にきわめて影響されやすい。従って、インキュベーションチャンバー内の液体量を保持しながら、インキュベーションチャンバーの塩濃度が実質的に一定のままとなるように、膜Ｍ１２が塩類を透過しないことが重要である。
【００６５】
バイオリアクター５０は、通常、インキュベーションキャビティ５５内に水溶液または懸濁液が入った状態で３７℃（ヒト細胞の場合）にて操作され、バイオリアクター５０が、一般的に細胞培養のためのインキュベーター（図示なし）内の、サーモスタットに制御される１つ以上の発熱体により加熱される。図７に示すように、最初の実験では、インキュベーションキャビティ５５内の相対的な保水性が、３日後に、より好ましくは５日後に、さらにより好ましくは１０日後に、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％である場合があることが示されている。予備試験の結果でもまた、細胞培養物、組織生検、細胞クラスター、組織様構造、「原型組織」、または類似の試料が長期間、好ましくは少なくとも１ヵ月間、例えば２ヵ月間、最も好ましくは少なくとも１０ヵ月間インキュベートされる場合があることが示唆されている。従って、本発明の実施により、細胞培養物は、蒸発から生じる水性増殖培養液の濃度依存態様の微小変化で長期間バイオリアクター内に維持され得る。
【００６６】
図４は、本発明の第２の態様によるバイオリアクター５０の湿潤チャンバー６０の平面図（Ａ）および断面図（Ｂ）である。Ａ部の断面図では、半透性膜Ｍ２およびＭ３が、断面図Ａから見て上と下から湿潤チャンバー６０を閉鎖する点線によって示されている。湿潤チャンバーの直径ｃは、インキュベーションキャビティの直径とほぼ同じであるのが好ましく、従って、例えば６、８、１０、１２、１４、１６または１８ｍｍ等の４〜２０ｍｍの範囲内に含まれる。湿潤チャンバー６０の側面部は、ナイロン、樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、およびポリメチルメタクリレート等の不活性で安定した物質で製造される環６２によって構成される。長期間のインキュベーション時に、湿潤チャンバー６０内の液体の補充は、バイオリアクター５０内の古い湿潤チャンバー６０を放出して新しい湿潤チャンバー６０を挿入することで容易に行えるように、環６２は処分できる物質で製造され得る。あるいはまたはさらに、湿潤チャンバー６０は、例えばグラブネジ等で閉じられる充填ポート６１から液体を補充する場合もある。
【００６７】
図５は、本発明の第２の態様によるバイオリアクター５０のより詳細な断面図であり、とりわけ、吸気口６５、ならびに上にバイオリアクターを取り付けることが可能な基部５６を示す。吸気口６５は、後部キャビティＲに新鮮な空気を供給する。場合により、後部キャビティＲ内に制御された大気を供給するために、吸気口６５は気体供給部（図示なし）に接続されるか、組み込まれる。それによってインキュベーションキャビティ５５内の細胞の通気も、湿潤チャンバー６０を通る空気の流れを介して制御される。後部キャビティＲは、基部５６内の凹部および密封手段（例えば、膜Ｍ３上に締着される適切なＯリング）によって構成される。バイオリアクター５０の種々の部分をしっかりと固定するために、適切な締め付け手段が提供される。図５に示すように、貫通組立てネジ７０ａは、前部５１および後部５２（および中間に配置されるシール５３ならびにフィルターＭ１）を固定する。同様に、前部５１および後部５２は、貫通ネジ７０ｂによって基部５６の上に保持される。この場合もやはりわかりやすく説明すると、種々の部分の間（例えば、５７とＭ３の間、５２と５６の間、５１と５２の間、５３とＭ１の間、Ｍ１と５１の間等）に狭い空隙が見えるが、組み立てると、バイオリアクター５０に液密性および気密性の閉鎖を提供するために、これらの空隙は通常なくなる。
【００６８】
図５のインキュベーションキャビティ５５は、キャビティ５５の直径が例えば６、８、１０、１２、１４、１６または１８ｍｍ等の４〜２０ｍｍの範囲内である、実質的に円筒の形状を有する。キャビティ５５の深さは、例えば２．５、３、３．５、４、４．５または５ｍｍ等の２〜６ｍｍの範囲内である場合がある。従って、キャビティ５５の容量は、約０．００３〜２ｍＬの範囲内である。一部の好ましい深さおよび直径の値は、それぞれ４ｍｍおよび１８ｍｍ（液量は約１ｍＬとなる）、３ｍｍおよび１０ｍｍ（液量は約０．２４ｍＬとなる）、ならびに３ｍｍおよび７．５ｍｍ（液量は約０．１５ｍＬとなる）である。
【００６９】
バイオリアクター５５は、付随する回転手段（図示なし）によって横回転軸を中心に回転するように適合されている。基部５６は、このような回転手段への簡単かつ柔軟な取付けを容易にするために、ネジ切りされた部分５６ａを有する。通常、回転軸は、インキュベーションキャビティ５５を通る中心軸と実質的に一致する。
【００７０】
図６は、本発明の第４の態様によるバイオリアクターの概略図である。
【００７１】
図７は、本発明の第２の態様によるバイオリアクター５０の湿潤チャンバー６０をを装着した場合（下部曲線）と装着しなかった場合（上部曲線）それぞれにおける、小容量バイオリアクターのインキュベーションチャンバーからの液体損失を表す。この例では、ＤＭＥＭ培地（細胞なし）を充填した５つの１ｍＬバイオリアクターを、５％ＣＯ２を使用し、３７℃にて標準の加湿したインキュベーター内で回転させ続けた。湿潤チャンバーには純水を充填した。インキュベーターは通常の使用であった（すなわち、通常な細胞培養のために扉を開閉させた）。インキュベーションチャンバーからの水分損失を、以下の２種類の方法で測定した：第１に、バイオリアクター内の総水分量の変化（左軸）、第２に、別の実験での、指標フェノールレッドの吸収（ＤＭＥＭの最大の吸収は５５９ｎＭ；ＤＭＥＭのｐＨに変化はなし；右軸）におけるパーセンテージ変化。図７（平均データを示す）に示すように、インキュベーターの加湿にもかかわらず、小容量バイオリアクターのインキュベーションチャンバーから有意な水分損失が認められる。インキュベーションキャビティ５５の前面に湿潤チャンバー６０がないと、半日後でさえも有意な液体の損失が認められ、５日後にはほぼ４０％に達した。このような著しい液体の損失は、増殖培地を濃縮し、それによって、遺伝子発現に重大な影響をもたらし得る濃度依存パラメータに影響を及ぼす。液体の損失があまりにも急速なために、細胞の長期増殖および／または医薬品または毒性学的な長期実験は、ほぼ一定した手動操作（すなわち、増殖培地の添加）なしで実施することは不可能となる。対照的に、湿潤チャンバーを使用すると、インキュベーションチャンバー５５による相対的な保液性は、２日間で約９５％を超え、５日後でさえも約９０％を超える。従って、本発明の実施によって、細胞培地は、無期限に長期間分化状態で維持され得、インキュベーションチャンバーからの急速な水分損失に対処するためのほぼ持続的な労力を払う必要なく、細胞培地は数日ごとに交換され得、場合により細胞が継代され得る。
【００７２】
図８は、細胞のインキュベーションのためのインキュベーションキャビティ１０５を有する本発明の第３の態様によるバイオリアクター１００の断面図である。キャビティ１０５は内面１１０を有する。図８に示す実施形態において、内面１１０は、インキュベーションキャビティ１０５の中心軸から見て円筒対称を有する。しかし、改良された培養が球形、偏球形状、拡張球形状、およびそれらの組み合わせに由来し得ることが最近認められていることから、本発明の適用はこの形状に限定されることはなく、他の形状に容易に適用される場合がある。特に、全体が参考として本明細書で援用される、米国特許第６，６４２，０１９号を参照されたい。
【００７３】
細胞培養時に、バイオリアクター１００は、通常約５〜１５回／分の回転数（ＲＰＭ）で中心軸を中心にゆっくりと回転する。バイオリアクター部品の取付けおよび締着のために、バイオリアクターは、バイオリアクター１００が培養下で取り付けられ、回転し得る基部部材（図示なし）上に取り付けるために、例えば３、４または５個等の複数の穴１４０を含む。
【００７４】
バイオリアクター１００も、インキュベーションキャビティ１０５の充填に適合した複数の貫通ポート１３０ａおよび１３０ｂを含む。図８に示す実施形態において、バイオリアクター１００は、２つのポート１３０ａおよび１３０ｂを含む。これらの２つのポート１３０ａおよび１３０ｂは、インキュベーションキャビティ１０５の中心軸から見て異なる角度で方位角により配置される。第１のポート１３０ａおよび第２のポート１３０ｂは、図示の実施形態において約６５度の方位角度差で配置される。方位角差には特に制限はないが、好ましくは、この角度は９０度未満、より好ましくは７０〜２０度の間、最も好ましくは３５〜５５度の間である。しかしながら、当業者であれば、本発明の原理を理解すれば、他の角度および数のポート１３０を容易に実施すると考えられる。これらのポートは、等しい大きさである必要はなく、従って、例えば組織生検の挿入のためにインキュベーションチャンバー１０５により簡単にアクセスするため、１つのポートがより大きいこともあり得る。さらなる例として、唯一のポートを有するバイオリアクターの実施形態を図１４に例示する。
【００７５】
ポート１３０を閉鎖するために、複数のインサート１２０が提供される。各インサート１２０は、バイオリアクター１００の操作時に、各ポート１３０に実質的に液密性のロックをもたらすために、対応する貫通ポート１３０に嵌るように適合される。インサート１２０は、ポート１３０に液密性の閉鎖をもたらすために、ナイロン、硬質ゴム、ポリエチレン、ＰＯＭ、金属、またはその他いずれかの適切な非細胞毒性物質で製造される場合がある。好ましくは、インサート１２０はネジ切りされた外側部を有し、同様に、ポート１３０は、図８に示すように、このようなネジ切りされたインサートを受容するように適合される。インサート１２０はさらに、対応するポートに挿入するとインキュベーションキャビティ１０５の内面１１０と実質的に並んだ端部１２１を有することも特徴とする。これについては以下に詳述する。図１０を参照されたい。端部１２１と内面１１０とを並べる目的は、本質的にゼロ容量のポートを作り出すことであり、すなわち、キャビティ１０５からの液体は、ポート１３０に流入できない。さらに、端部１２１と内面１１０とを並べることで、さもなければポート１３０に液体が流入出し、そして最も重要なことにその回転時にキャビティ１０５内で引き起こされ得る乱流が最小限に低減されるか、または解消される。ポート１３０は、バイオリアクター１１０に効率的に充填することを促進するために外側凹部１５０を有し、液体のこぼれを解消する。図１１を参照されたい。
【００７６】
図９は、図８および１４に示す本発明の第３の態様によるバイオリアクター１００のＸ−Ｘ線に沿った断面図である。図９の断面では、１つのポート１３０だけが示されている。ポート１３０は、バイオリアクター１００への充填を容易にするためにキャビティ１０５に接続される。図８では、可撓性フィルターＦ１または可撓性膜Ｍ１が、キャビティ１０５の後部を閉鎖するために取り付けられている。バイオリアクター１００は、好ましくは、可撓性フィルターＦ１または可撓性膜Ｍ１の容易で液密性の固着を促進するために、後部に凹部を有する。通常は、さらなる固着手段（図示なし）が提供される。ポート１３０の１つを介してインキュベーションキャビティに容易に接近できれば、膜Ｍ１またはフィルターＦ１が取り付けられ得る（例えば、バイオリアクター１００に溶接される）。この可撓性部分Ｍ１／Ｆ１の機能は、本発明によるキャビティ１０５の過剰充填により生じるキャビティ１０５内の過度の圧力をほぼ均等にすることである。可撓性膜Ｍ１の好ましい物質には、不透水性は高いが気体は透過するポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、フッ化ビニリデン樹脂（ＰＶＤＦ）、シリコンゴム、放射線処理樹脂、および類似の物質がある。可撓性フィルターＦ１の好ましい物質には、水および気体を透過するポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、フッ化ビニリデン樹脂（ＰＶＤＦ）、シリコンゴム、発泡樹脂、放射線処理樹脂、および類似の物質がある。
【００７７】
バイオリアクター１００の前部には、バイオリアクター１００の外側から手動または自動で細胞等の培養を監視して、視覚的に評価できるように、透明部分１１１が配置されている。この透明部分１１１は、透明であって、培養プロセスに対して生物学的かつ化学的に不活性であるガラス、樹脂またはその他の適切な物質で作られ得る。好ましい物質には、種々の種類のガラス、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、およびポリメチルメタクリレートが含まれるが、これらに限定されない。
【００７８】
キャビティ１０５の幅「ｂ」は、例えば、６、８、１０、１２、１４、１６または１８ｍｍ等の４〜２０ｍｍの範囲内である場合がある。キャビティ１０５の深さ「ａ」は、例えば、２．５、３、３．５、４、４．５または５ｍｍ等、２〜６ｍｍの範囲内である場合がある。従って、キャビティ１０５の容量は、約０．０３〜２ｍＬの範囲内である。「ａ」および「ｂ」の一部の好ましい値は、４ｍｍおよび１８ｍｍ（液量は約１ｍＬとなる）、３ｍｍおよび１０ｍｍ（液量は約０．２４ｍＬとなる）、ならびに３ｍｍおよび７．５ｍｍ（液量は約０．１５ｍＬとなる）である。内部キャビティ１０５の前記寸法は、本発明の第１、第２または第３の態様、あるいはそれらのいずれかの組み合わせによるバイオリアクター１０、５０および／または１００に適用され得る。
【００７９】
図１０は、キャビティ１０５を閉鎖するためのバイオリアクター１００の内面の一部およびインサート１２０の概略図である。図１０は、種々の幅のインサート１２０が、インサート１２０の端部１２１と内面１１０のアライメントにいかに影響を及ぼし得るかを例示する。Ａ部では、幅ｗ１が、内面部１１０の曲率半径に比べて十分に小さく、その結果内面１１０と端部１２１の間に依然として実質的にアライメントが効果的に存在する。しかしながら、図１０のＢ部では、インサート１２０の幅ｗ２が、内面部１１０の曲率半径に匹敵する大きさであり、そのため内面１１０と端部１２１のアライメトは、Ａ部で例示される状態に比べてより低い。にもかかわらず、本出願の状況下で並べられる内面１１０と端部１２１には、アライメントが依然として十分に高い。
【００８０】
数学的な手法では、細胞培養物または組織が裂かれることを回避するために、円形の測定（例えば、曲率半径等）が導入され、乱流の限度を評価するために流体モデルと関連付けられる場合がある。従って、レイノルド数は、特定の内面１１０と端部１２１の構成で乱流の始まりに必要な動作条件を予測するために推定される場合がある。乱流の始まりは、インサート１２０による摂動導入の特性長を使用して算出される遷移レイノルド数によって与えられる。本発明の構成の場合、遷移レイノルド数は、インサート１２０の直径および／または端部１２１と内面１１０のレベル差を使用して推定される場合がある。
【００８１】
実際の手法では、内面１１０に隣接した端部１２１の縁が、内面部１１０と平らにまたは同じ高さになる場合がある。縁上の凹凸は乱流を誘導するため、回避されるべきである。それため、端部１２１の縁は、内面１１０の３ｍｍ以内で、好ましくは２ｍｍ、最も好ましくは１ｍｍ以内で平らになる場合がある。但し、インサート１２０が、短すぎるまたは長過ぎるかのいずれかであり得る場合、両選択は好ましくないことに留意する。
【００８２】
内面１１０と端部１２１のアライメントを改善するために、１３０ポートに挿入される時アライメントを上昇させるように、端部１２１は、それ自体が内側または外側のいずれかの弯曲を有するように設計され得る。ネジ切りされたインサート１２０の場合、インサート１２０が液体をロックする位置まですべてネジ切りされている時は、端部１２１と内面１１０との正確なアライメントを確かなものにするために、もちろん、弯曲はネジ切りの配置と調整される必要がある。
【００８３】
図１１Ａ〜Ｄは、本発明の第３の態様によるバイオリアクター１００を操作する方法を例示する一連の概略図である。バイオリアクターは、少なくとも第１の１３０ａおよび第２の１３０ｂの貫通ポートを含む。バイオリアクター１００に液体２１０を充填するためのシリンジまたはピペット２００も、Ａ部およびＢ部に示されている。Ｄ部のシリンジ２００は、ポート１３０の外側凹部１５０から過剰な液体を取り除くために使用される。
【００８４】
最初に、シリンジ２００は、キャビティ１０５に液体２１０を充填するために適用される。当然ながら、ポート１３０ａおよび１３０ｂは、液体２１０が充填中にバイオリアクター１００から流出できないように配置されなければならない。
【００８５】
Ｂ部に示すように、バイオリアクター１００は、バイオリアクター１００が少なくともインキュベーションキャビティ１０５全体に、および第１のポート１３０ａの少なくとも一部に、および／または第２のポート１３０ｂの少なくとも一部に液体２１０を含むように、第１のポート１３０ａから液体２１０を過剰に充填される。バイオリアクターを充填するこの手法は、バイオリアクターからすべての気泡を効果的に除去することを容易にし得る。対応するインサート１２０ａは、第１のポート１３０ａに挿入され、第１のポート１３０ａを完全にロックする。それによって、第１のポート１３０ａ内に以前に入れた液体２１０は、ポート１３０ａから押し出される。
【００８６】
Ｃ部では、対応するインサート１２０ｂが、第２のポート１３０ｂに挿入され、第２のポートをロックする。このように、インキュベーションキャビティ１０５内の液体２１０に中程度の過剰圧力（Δｐ）がもたらされるが、可撓性膜Ｍ１または可撓性フィルターＦ１（図示なし）の機能によって過剰圧力は、キャビティ１０５から離れて膜またはフィルターを外側に曲げることによって均等にされる。図８を参照されたい。効果的なことに、キャビティ１０５は可変液量を有する。好ましくは、キャビティ１０５内の液量の相対増加は、約２〜１０％である場合がある。過剰圧力（Δｐ）は、２〜１０％の範囲内である場合がある。
【００８７】
図１２は、本発明の第３の態様によるバイオリアクター１００のマウント２２０の断面側面図（Ａ部）および断面正面図（Ｂ部）を示す。Ｂ部では、バイオリアクター１００が、マウント２２０の上に置かれ、好ましくは手動操作によって、バイオリアクター１００の比較的に小さい回転を可能にするために、マウント２２０とバイオリアクター１００は配置される。それによって、使用者は、液体、細胞、栄養分の充填および／または補充、気泡の除去等のためにバイオリアクター１００の準備をより簡単に行える。
【００８８】
本発明の異形は、１つの吸気ポート１３０および１つの対応するインサート１２０（図１４を参照）のみを含む場合がある。
【００８９】
図１３は、本発明の第２の態様による図５に示すバイオリアクターの別の実施形態である。部分５２は、部分５６に直接ネジ込まれるように適合される。この改変により、部分５２および５６を固定するために使用されていた３つのネジが不要となり、従って、バイオリアクター扱う作業が簡素化され、手間が少なくなる。湿気チャンバーは、部分５６の内部に動けるように取り付ける２つのＯリングを使用して適切な位置で支えられ、必要に応じて迅速かつ簡単に交換され得る。
【００９０】
図１４は、バイオリアクター１００の別の構造を示し、単一の貫通ポートを例示する。この種の構造の充填は、増殖培地を注入するために細い針を使用するシリンジを使用し、その針を介してバイオリアクターから空気を押し出すことにより達成することができる。
【００９１】
図１５は、フィルターが機械的磨耗からそれらを保護するために凹みをつけられた湿気チャンバー（図４に示す）の別の構造を示す。この設計も、フィルターを適切な位置でしっかりと固定するために、円環６３と６２のスナップ閉鎖または超音波溶接に適する。
【００９２】
本発明の第５の態様によれば、本発明のバイオリアクターは、１つ以上の細胞培養物、組織生検、細胞クラスター、組織様構造、「原型組織」、または類似の試料のインキュベーションのために使用される場合がある。
【００９３】
特定の実施形態は、例えば１週間、２週間、または３週間、好ましくは少なくとも１ヵ月間、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１ヵ月間、最も好ましくは少なくとも１２ヵ月間等の長期間にわたりインキュベートされる１つ以上の細胞培養物をインキュベートするための、本明細書に記載のバイオリアクターの使用に関する。
【００９４】
１つ以上の細胞培養物をインキュベートするために本発明によるバイオリアクターを使用する１つの利点は、長期間にわたり細胞が高度に分化した状態を維持するか、達成することである。本発明によるバイオリアクターの使用はさらに、バイオリアクターから細胞を得るためにトリプシン処理を使用することも回避する。
【００９５】
本発明の第６の態様によれば、１つ以上の細胞培養物をインキュベートする方法が提供される。好ましい一実施形態において、前記方法は、
ａ）播種する１つ以上の細胞培養物を得る手順、
ｂ）本発明によるバイオリアクターのインキュベーションキャビティに前記１つ以上の細胞培養物を移す手順、
ｃ）前記インキュベーションキャビティに増殖培地を充填する手順、
ｄ）場合により、前記インキュベーションキャビティから空気（気泡）を除去する手順、
ｅ）微小重力条件下で前記細胞培養物をインキュベートする手順、
ｆ）所望の期間わたりインキュベーションを持続させるために、必要に応じて増殖培地を交換する手順、ならびに
ｇ）場合により、ぜんき培養を分化させて、前記細胞間に接着結合または緊密な細胞接触の他の形態を形成する（例えば、細胞間マトリックスタンパク質の分泌によって）手順、
を含む。
【００９６】
別の実施形態において、前記方法は、
ａ）播種する前記１つ以上の細胞培養物を得る手順、
ｂ）１ｍＬ未満の内部液量を有する前記インキュベーションキャビティ内に相対的な保水手段を具備する微小重力バイオリアクターの前記インキュベーションキャビティに、前記１つ以上の細胞培養物を移す手順、
ｃ）前記インキュベーションキャビティに増殖培地を充填する手順、
ｄ）場合により、前記インキュベーションキャビティから空気（気泡）を除去する手順、
ｅ）微小重力条件下で前記細胞培養物をインキュベートする手順、
ｆ）所望の期間わたりインキュベーションを持続させるために、必要に応じて増殖培地を交換する手順、
ｇ）場合により、培養を分化させて、細胞間に接着結合または緊密な細胞接触の他の形態を形成する（例えば、細胞間マトリックスタンパク質の分泌によって）手順、
を含み、
前記インキュベーションキャビティ内の前記相対的な保水性が、２日後に９５％を超えるか、あるいは前記インキュベーションキャビティ内の前記相対的な保水性が、５日後に９５％を超える。
【００９７】
あるいは、手順ｂ）で使用されるバイオリアクターのインキュベーションキャビティは、９００μＬ未満、８００μＬ未満、７００μＬ未満、６００μＬ未満、５００μＬ未満、４００μＬ未満、３００μＬ未満、２００μＬ未満、１００μＬ未満、５０μＬ未満、または２５μＬの内部液量を有する。
【００９８】
手順ｂ）およびｃ）は全体にまたは一部が任意の順序で実施され得ることは、当業者により容易に理解されるであろう。
【００９９】
特定の実施形態において、１つ以上の細胞培養物は、球形であるか、またはマイクロキャリアビーズ上にある。
【０１００】
別の実施形態において、１つ以上の細胞培養物をインキュベートする方法は、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、またはより好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相対湿度を、本発明によるバイリアクターの気密性の導管に維持するために、必要に応じて本発明のバイオリアクターの湿潤チャンバーに水性液体を補充する手順を含む。
【０１０１】
本発明によるバイオリアクターのインキュベーションキャビティ内の気泡の量を低減させるためには、細胞および増殖培地をインキュベーションキャビティに移す前に、インキュベーションキャビティを濡らしておくのが有利である場合がある。従って、本発明による１つ以上の細胞培養物をインキュベートする方法の別の実施形態はさらに、細胞および増殖培地をインキュベーションキャビティに移す前に、本発明によるバイオリアクターのインキュベーションキャビティを濡らす手順も含む。
【０１０２】
本発明の方法によってインキュベートされる細胞は、高レベルの分化を維持する。例えば肝細胞の場合、これは、本発明の方法によってインキュベートされる細胞が、本物の肝臓の反応を模倣することを意味する。これは、例えば、機能する本物の肝臓の反応に一致する毒性学的反応を達成するために、細胞の高度に分化した状態を必要とする毒性学研究では利点となる。多くの異なる濃度でかつ多くの異なる時点での試験を必要とすることが多い毒性学研究で本発明による小型バイオリアクターを使用するさらなる利点としては、有用な結果を得るのにより少ない細胞およびより少量の培地で済むことがある。ヒト組織微細構造の肝臓の小片で毒性を判定できるようにヒト肝細胞を使用する場合には、この利点がさらに有意義である。
【０１０３】
従って、本発明の第６の態様は、化学組成物の生物学的作用の分子プロファイルを作製する方法であって、
ａ）１つ以上の細胞培養物から単離した集団を化学組成物と接触させる手順、ならびに
ｂ）前記化学組成物の前記生物学的作用の分子プロファイルを作製するために、前記化学組成物に反応する前記１つ以上の細胞培養物の遺伝子発現またはタンパク質発現の変化を記録する手順、
を含み、
前記１つ以上の細胞培養物が、上述の方法によってインキュベートされている、
方法に関する。
【０１０４】
化学組成物の毒性は、１つ以上の細胞培養物と接触してからすぐにそれ自体を発現する場合がある（急性毒性）。従って、本発明の特定の実施形態は、上述の化学組成物の生物学的作用の分子プロファイルを作製する方法であって、前記１つ以上の細胞培養物を、例えば、最大限でも７日間、好ましくは３日間未満、またはより好ましくは１日未満等の短期間にわたり前記化学組成物と接触させる、方法に関する。
【０１０５】
あるいは、化学組成物の毒性はまた、１つ以上の細胞培養物と接触してから長期間にわたりそれ自体を発現する場合がある（慢性毒性）。従って、本発明の特定の実施形態は、上述の化学組成物の生物学的作用の分子プロファイルを作製する方法であって、前記１つ以上の細胞培養物を、少なくとも１ヵ月間、好ましくは少なくとも２ヵ月間、またはより好ましくは少なくとも３ヵ月間にわたり前記化学組成物と接触させる、方法に関する。
【０１０６】
上述のように、１つ以上の細胞培養物をインキュベートするために、本発明によるバイオリアクターを利用することは有利である。同様に、化学組成物を１つ以上の細胞培養物と接触させることは、１つ以上の細胞培養物と化学組成物を一緒にインキュベートすることによって実施される場合がある。従って、本発明の好ましい実施形態は、上述の化学組成物の生物学的作用の分子プロファイルを作製する方法であって、前記接触が、本明細書に記載の方法によって化学組成物と１つ以上の細胞培養物を一緒にインキュベートすることにより実施される、方法に関する。
【０１０７】
分子プロファイルを作製することに関する本発明による方法は、いくつかの化合物のために繰り返される場合がある。特に、既知の毒性のいくつかの化学組成物のために繰り返し、それによって分子プロファイルのライブラリーを作成する場合がある。従って、本発明の第７の態様は、所定の毒性を有する化学組成物の生物学的作用の分子プロファイルに関するライブラリーを蓄積する方法であって、
ａ）１つ以上の細胞培養物から単離した集団を、所定の毒性を有する化学組成物と接触させる手順、
ｂ）前記化学組成物の生物学的作用の分子プロファイルを作製するために、前記化学組成物に反応する前記１つ以上の細胞培養物の遺伝子発現またはタンパク質発現の変化を記録する手順、ならびに
ｃ）所定の毒性を有する少なくとも２つの化学組成物を使用して手順ａ）およびｂ）を繰り返すことにより、分子プロファイルのライブラリーまたはデータベースを蓄積する手順、
を含み、
前記１つ以上の細胞培養物が、上述の方法によってインキュベートされている、
方法に関する。
【０１０８】
分子プロファイルのライブラリーまたはデータベースを蓄積する前記方法は、例えば、少なくとも１ヵ月間、好ましくは少なくとも２ヵ月間、もしくはより好ましくは少なくとも３ヵ月間等の長期間（慢性毒性）、または例えば、７日間未満、好ましくは３日間未満、もしくはより好ましくは１日未満等の短期間（急性毒性）にわたり１つ以上の細部培養を化学組成物と接触させることを含む場合がある。好ましい実施形態において、前記接触は、１つ以上の細胞培養物のための本発明の方法によって、前記化学組成物と前記１つ以上の細胞培養物を一緒にインキュベートすることにより実施される。
【０１０９】
分子プロファイルのライブラリーまたはデータベースが所定の毒性の化学組成物に関して蓄積されると、前記ライブラリーまたはデータベースは、未知の毒性の化学組成物のプロファイルと比較される場合がある。これにより、以前には、例えば肝生検等の成人ヒト組織の試料を使用してのみ達成された、化学組成物の毒性を決定する信頼性のある方法が提供される。もちろん、このような成人ヒト組織の試料の入手可能性は、それほど高くない。従って、本発明の第９の態様は、試験化学組成物の毒性を型別する方法であって、
ａ）上述の通り、試験化学組成物の生物学的作用の分子プロファイルを作製する手順、ならびに
ｂ）手順ａ）の前記分子プロファイルを、上述の方法によって蓄積した所定の毒性を有する化学組成物の生物学的作用の分子プロファイルと比較する手順、
を含み、
前記試験化学組成物の毒性の型が、手順ｂ）の比較によって判定される、
方法に関する。
【０１１０】
毒性を型別するために本発明のバイオリアクターを使用することによって、未知の毒性の化学組成物の毒性は、わずか少量の細胞、増殖培地、および化学組成物を使用するだけで判定できる。従って、本発明による毒性を型別する方法により、成人ヒト組織を使用することで達成される信頼性で、しかも大幅に低コストで化学組成物の毒性を型別することが可能である。毒性を型別するための本発明による方法はまた、毒性物学的プロファイルが通常作製されない場合にも適用される場合がある。例えば、個々に非毒性である２つ以上の化合物の化学組成物は、一緒に投与されると、結果的に毒性になることがある（この２つの薬物の間に化学反応は必要ないのだが、この現象は「薬物−薬物」相互作用として知られる）。
【０１１１】
以上において本発明を、特定の実施形態と関連付けて説明してきたが、本発明は、本明細書に記載される特定の形状に限定されるものとして意図されない。むしろ、本発明の適用範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。特許請求の範囲において、「含む」という用語は、他の要素または手順の存在を排除するものではない。さらに、個々の特徴が異なる請求項に含まれる場合があるが、これらは有利に組み合わせられる可能性があり、異なる請求項における包含は、特徴の組み合わせが実施可能でないおよび／または有利でないことを暗示するものではない。さらに、単数形の言及は、複数を排除するものではない。従って、「１つ（ａ、ａｎ）」、「第１」、「第２」等の言及は、複数を排除するものではない。さらに、特許請求の範囲の引用符号は、範囲を限定するものとして解釈されないものとする。
【０１１２】
本明細書で引用される参照文献はいずれも、全体が参考として本明細書で援用される。
【実施例】
【０１１３】
実施例１  長期培養におけるヒト肝細胞の分化状態の維持：細胞タンパク質の発現
完全に分化したヒト肝臓によって発現され、通常の（平面）培養条件下で増殖される肝細胞内では一般的に見られない特異的タンパク質は、本発明のバイオリアクターを使用して培養される細胞に見られる。完全に分化した肝細胞タンパク質は、３０２日後にも依然として培養液中に見られる。
【０１１４】
ヒト肝細胞を、本発明のバイオリアクターで３０２日間増殖させた後、２０時間［３５Ｓ］メチオニンによって標識させた。
【０１１５】
１つ以上の細胞培養物を、上述のように通常の培養条件下（例えば、ヒト細胞の場合は３７℃）で、イーグル、ＤＭＥＭ、またはＲＰＭＩ  １６４０のような培地を使用して培養する。対象となる特定の細胞培養物に応じて、培地を１日おきまたは２日おきに交換する必要がある。肝細胞は、１日おきに新鮮な培地を必要とする。培地の交換は、バイオリアクターの回転を止めて、細胞または原型組織が底の方へ沈むのを待った後、培地の約５０％を新鮮な培地と交換することにより行う。
【０１１６】
最初に、細胞型によって、細胞は２〜３日の倍加時間で急速に増殖するが、細胞が分化するにつれて、倍加時間は長くなり、その結果数週間または数ヵ月にも達することもある。それに応じて、培養物の継代培養が必要となる回数が著しく低下する。最初は継代培養を、最初の１週間後または２週間後に１回、その後はそれよりもかなり長い間隔で（例えば、隔月またはそれよりも長い間隔で）実施する必要がある。これらのバイオリアクター内の継代培養は、単純にバイオリアクターの内容物を２倍から４倍に希釈することによって実施される。トリプシンまたはその他の酵素は使用しない。
【０１１７】
タンパク質を、二次元ゲル電気泳動法および質量分析法によって抽出および分析した。
【０１１８】
タンパク質は、表１の通りタンパク質、受入番号、およびタンパク質の説明によって同定されている。同定したイソ型の番号は、対象となるタンパク質として確実に同定したゲルのスポットの数に関連する。
【０１１９】
表１  培養３０２日後にバイオリアクター培養で認められた完全に分化した肝細胞によって発現され、通常の平面培養条件下で増殖した肝細胞によって一般的に分泌されない、細胞タンパク質
【０１２０】
【表１】
2009521907.tif 000002
。
【０１２１】
実施例２  長期培養におけるヒト肝細胞の分化状態の維持：分泌機序の生存能
完全に分化した正常な成人肝臓によって分泌され、通常の平面培養条件下で増殖した肝細胞によって一般的に分泌されない特異的タンパク質は、本発明のバイオリアクターを使用して微小重力条件下で培養した肝細胞によって分泌される。
【０１２２】
実施例１の組織培養物に由来する増殖培地のアリコートから、タンパク質を沈澱させ、二次元ゲル電気泳動法および質量分析法によって解析した。タンパク質は、表２の通りタンパク質、受入番号、およびタンパク質の説明によって同定されている。同定したイソ型の番号は、対象となるタンパク質として確実に同定したゲルのスポットの数に関連する。
【０１２３】
表２  バイオリアクター培地に見られた完全に分化した肝細胞により分泌され、通常の（平面）培養条件下で増殖した肝細胞によって一般的に分泌されない、タンパク質
【０１２４】
【表２】
2009521907.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
本発明のいくつかの実施形態は、以下の添付の図面で例示される。
【図１】図１は、本発明の第１の態様によるバイオリアクターの概略断面図である。
【図２】図２は、本発明の第１の態様によるより詳細な断面図であり、とりわけポンプ手段を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、本発明の第２の態様によるバイオリアクターの概略断面図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本発明の第２の態様によるバイリアクターの他の実施形態の概略断面図である（この態様では、使用する膜が、塩類は完全に浸透しないものの、気体は依然として浸透する）。
【図４】図４は、本発明の第２の態様によるバイオリアクターの湿潤チャンバーの平面図（Ａ）と断面図（Ｂ）である。
【図５】図５は、本発明の第２の態様によるバイオリアクターのより詳細な断面図であり、とりわけ吸気口を示す。
【図６】図６は、本発明の第４の態様によるバイオリアクターの概略断面図である。
【図７】図７は、本発明の第２の態様によるバイオリアクターの湿潤チャンバーを使用した場合と使用しなかった場合の長期インキュベーションによる液体損失の実験結果を表すグラフである。
【図８】図８は、本発明の第３の態様によるバイオリアクターの断面図である。
【図９】図９は、本発明の第３の態様によるバイオリアクターの別の断面図である。
【図１０】図１０は、バイオリアクターの内面の一部、およびバイオリアクターを閉鎖するインサートの概略図である。
【図１１】図１１Ａ〜Ｄは、本発明の第３の態様によるバイオリアクターを操作する方法を例示する一連の概略図である。
【図１２】図１２は、本発明の第３の態様によるバイオリアクターのマウントの断面側面図（Ａ部）および断面正面図（Ｂ部）をそれぞれ示す。
【図１３】図１３は、本発明の第２の態様によるバイオリアクターの別の断面図である。
【図１４】図１４は、本発明の第３の態様によるバイオリアクターの別の断面図である。
【図１５】図１５は、本発明の第２の態様によるバイオリアクターの平面図（Ａ）ならびに断面図（Ｂ）および（Ｃ）である。
【図１】
2009521907.tif 000004
【図２】
2009521907.tif 000005
【図３Ａ】
2009521907.tif 000006
【図３Ｂ】
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【図４】
2009521907.tif 000008
【図５】
2009521907.tif 000009
【図６】
2009521907.tif 000010
【図７】
2009521907.tif 000011
【図８】
2009521907.tif 000012
【図９】
2009521907.tif 000013
【図１０】
2009521907.tif 000014
【図１１】
2009521907.tif 000015
【図１２】
2009521907.tif 000016
【図１３】
2009521907.tif 000017
【図１４】
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【図１５】
2009521907.tif 000019
【手続補正書】
【提出日】平成20年4月1日(2008.4.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
回転に適合したバイオリアクターであって、前記リアクターが、
−インキュベーションキャビティであって、所定の分子量もしくは分子サイズまでの分子に対して透過性を有する第１の半透性フィルター（Ｆ１）とともに、実質的に閉ざされた境界を提供し、前記インキュベーションチャンバー内の栄養素および液体培地の流入を可能にすると同時に、前記インキュベーションキャビティ内の細胞および細胞凝集体の保持を可能にする、インキュベーションキャビティ、
−平衡チャンバーであって、前記インキュベーションキャビティ内に存在する１つ以上の細胞培養物、組織生検、または細胞クラスターのために栄養素を供給し、老廃物を除去し、酸素および二酸化炭素のような気体を交換するための容量と、そして／またはｐＨ制御物質とを備える、平衡チャンバー、ならびに
−前記半透性フィルター（Ｆ１）から前記平衡チャンバーまで実質的に液密性の導管を提供する導通手段、
を含み、
前記インキュベーションキャビティの内部液量が、５００μL未満である、
バイオリアクター。
【請求項２】
前記インキュベーションキャビティの前記内部液量が、４００μＬ未満、３００μＬ未満、２００μＬ未満、１００μＬ未満、５０μＬ未満、および２５μＬからなる群から選択される、請求項１に記載のバイオリアクター。
【請求項３】
前記インキュベーションキャビティが、実質的に円筒の形状を有する、請求項１に記載のバイオリアクター。
【請求項４】
前記バイオリアクターが、付随する回転手段によって横回転軸を中心に回転するように適合されており、前記回転軸が前記インキュベーションキャビティを通る中心軸と実質的に一致する、請求項３に記載のバイオリアクター。
【請求項５】
前記流体導通手段が、前記回転軸と実質的に平行の部分を有する、請求項４に記載のバイオリアクター。
【請求項６】
前記平衡チャンバーと前記インキュベーションキャビティの間に液体培地を循環させるためのポンプ手段もさらに含む、請求項１に記載のバイオリアクター。
【請求項７】
前記半透性フィルターが、小分子を透過するが、細菌、マイコプラズマまたはその他の生物体の通過は防止することができる、請求項１に記載のバイオリアクター。
【請求項８】
前記導通手段が、約２５μＬ〜約２ｍＬ、約５０μＬ〜約１ｍＬ、および約０．２００ｍＬからなる群から選択される内部液量を有する、請求項１に記載のバイオリアクター。
【請求項９】
前記平衡チャンバーが、約２５μＬ〜約２ｍＬ、約５０μＬ〜約１ｍＬ、および約０．２００ｍＬからなる群から選択される内部液量を有する、請求項１に記載のバイオリアクター。
【請求項１０】
前記半透性フィルターが、０．２μｍ、１００ｎｍ以下、５０ｎｍ以下、および１０ｎｍ以下からなる群から選択される最大孔径を有する、請求項１に記載のバイオリアクター。
【請求項１１】
回転に適合したバイオリアクターであって、前記バイオリアクターが、
−インキュベーションキャビティであって、第１の半透性膜（Ｍ１）とともに、実質的に閉ざされた境界を提供する、インキュベーションキャビティ、
−水性液体を含む湿潤チャンバーであって、前記チャンバーが、水性液体と流体接触して配置される第２の半透性膜（Ｍ２）と第３の半透性膜（Ｍ３）の両方を含み、前記第３の半透性膜（Ｍ３）がさらに、前記バイオリアクターを取り囲む大気との気体交換のために配置される、チャンバー、ならびに
−前記第１の半透性膜（Ｍ１）から前記第２の半透性膜（Ｍ２）まで実質的に気密性の導管を提供する導通手段、
を含み、
前記第１、第２および第３の半透性膜（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３）が、
ａ）前記第１の半透性膜（Ｍ１）および前記湿潤チャンバーを介した前記インキュベーションキャビティの通気、ならびに
ｂ）前記インキュベーションチャンバー内の実質的な保水、
を促進するために、実質的に水を透過せず、かつ実質的に酸素および二酸化炭素を透過し、
前記インキュベーションキャビティの内部液量が５００μＬ未満である、
バイオリアクター。
【請求項１２】
前記湿潤チャンバーおよび／またはインキュベーションチャンバーから蒸発した水が、少なくとも５０％、少なくとも７０％、および少なくとも９０％からなる群から選択される相対湿度を前記気密性の導管内に提供する、請求項１１に記載のバイオリアクター。
【請求項１３】
前記バイオリアクターが、前記インキュベーションキャビティ内に水溶液または懸濁液が入った状態で３７℃にて操作される時、３日後に少なくとも８０％、少なくとも９０％、および少なくとも９５％からなる群から選択される相対的な保水性を前記インキュベーションキャビティ内に有する、請求項１１に記載のバイオリアクター。
【請求項１４】
前記バイオリアクターが、前記インキュベーションキャビティ内に水溶液または懸濁液が入った状態で３７℃にて操作される時、５日後に少なくとも８０％、少なくとも９０％、および少なくとも９５％からなる群から選択される相対的な保水性を前記インキュベーションキャビティ内に有する、請求項１１に記載のバイオリアクター。
【請求項１５】
前記バイオリアクターが、前記インキュベーションキャビティ内に水溶液または懸濁液が入った状態で３７℃にて操作される時、１０日後に少なくとも８０％、少なくとも９０％、および少なくとも９５％からなる群から選択される相対的な保水性を前記インキュベーションキャビティ内に有する、請求項１１に記載のバイオリアクター。
【請求項１６】
前記インキュベーションキャビティが、実質的に円筒の形状を有する、請求項１１に記載のバイオリアクター。
【請求項１７】
前記バイオリアクターが、付随する回転手段によって横回転軸を中心に回転するように適合されており、前記回転軸が前記インキュベーションキャビティを通る中心軸と実質的に一致する、請求項１６に記載のバイオリアクター。
【請求項１８】
前記インキュベーションキャビティの前記内部液量が、９００μＬ未満、８００μＬ未満、７００μＬ未満、６００μＬ未満、５００μＬ未満、４００μＬ未満、３００μＬ未満、２００μＬ未満、１００μＬ未満、５０μＬ未満、および２５μＬからなる群から選択される、請求項１１に記載のバイオリアクター。
【請求項１９】
前記インキュベーションキャビティが、細胞培養に使用され得、かつ細胞の付着をもたらさない非毒性物質で作られていることを特徴とする、請求項１または請求項１１に記載のバイオリアクター。
【請求項２０】
前記インキュベーションキャビティが、種々の種類のガラス、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、およびポリメチルメタクリレートからなる群から選択される物質で作られている、請求項１９に記載のバイオリアクター。
【請求項２１】
前記インキュベーションキャビティが、球体の形状であるか、マイクロキャリアビーズ上にあるか、またはスカフォールド上にある１種類以上の細胞培養物のうちの培養物を含むように適合されている、請求項１７に記載のバイオリアクター。
【請求項２２】
回転に適合したバイオリアクターであって、前記バイオリアクターが、
−第１の半透性膜（Ｍ１２）とともに、実質的に閉ざされた境界を提供する、インキュベーションキャビティ、
−前記第１の半透性膜（Ｍ１２）と流体接触する水性液体を含む湿潤チャンバーであって、前記チャンバーが、前記水性液体と流体接触して配置される第２の半透性膜（Ｍ３）を含み、前記第２の半透性膜（Ｍ３）がさらに、前記バイオリアクターを取り囲む大気との気体交換のために配置される、チャンバー、
を含み、
前記第１および第２の半透性膜（Ｍ１２、Ｍ３）が、実質的に水を透過せず、かつ実質的に酸素および二酸化炭素を透過し、前記第１の半透性膜（Ｍ１２）が、
ａ）前記第１の半透性膜（Ｍ１２）および前記湿潤チャンバーを介した前記インキュベーションキャビティの通気、ならびに
ｂ）前記インキュベーションチャンバー内の実質的な保水、
を促進するために、塩類を透過せず、
前記インキュベーションキャビティの内部液量が５００μＬ未満である、
バイオリアクター。
【請求項２３】
前記インキュベーションキャビティの前記内部液量が、４００μＬ未満、３００μＬ未満、２００μＬ未満、１００μＬ未満、５０μＬ未満、および２５μＬからなる群から選択される、請求項２２に記載のバイオリアクター。
【請求項２４】
前記インキュベーションキャビティが、実質的に円筒の形状を有する、請求項２２に記載のバイオリアクター。
【請求項２５】
前記バイオリアクターが、付随する回転手段によって横回転軸を中心に回転するように適合されており、前記回転軸が前記インキュベーションキャビティを通る中心軸と実質的に一致する、請求項２４に記載のバイオリアクター。
【請求項２６】
回転に適合したバイオリアクターであって、前記バイオリアクターが、
−半透性膜とともに、実質的に閉ざされた境界を提供する、インキュベーションキャビティ、
を含み、
大気圧で前記半透性膜が、
ａ）前記第１の半透性膜および前記湿潤チャンバーを介した前記インキュベーションキャビティの通気、ならびに
ｂ）前記インキュベーションチャンバー内の実質的な保水、
を促進するために、ほぼ完全に水を透過しないが、酸素および二酸化炭素は実質的に透過し、
前記インキュベーションキャビティの内部液量が５００μＬ未満である、
バイオリアクター。
【請求項２７】
回転に適合したバイオリアクターであって、前記バイオリアクターが、
−可撓性膜または可撓性フィルター（Ｍ１／Ｆ１）とともに内面を含む、インキュベーションキャビティ、
−前記インキュベーションキャビティの充填に適合した１つ以上の貫通ポートであって、前記インキュベーションキャビティの中心軸から見て異なる角度で方位角により配置される、ポート、ならびに
−１つ以上のインサートであって、各インサートが、対応する貫通ポートに嵌め込んで、各ポートの実質的に液密性のロックを提供するように適合される、インサート、
を含み、
前記１つ以上のインサートが、前記対応するポートに挿入されることで、本質的にゼロ容量のポートを作り出す場合に、前記インキュベーションキャビティの内面と実質的に並んだ端部を有し、
前記インキュベーションキャビティの内部液量が５００μＬ未満である、
バイオリアクター。
【請求項２８】
前記貫通ポートの１つ以上が外側凹部を含む、請求項２７に記載のバイオリアクター。
【請求項２９】
前記インサートの１つ以上が、ネジ山を有する外側部を含む、請求項２７に記載のバイオリアクター。
【請求項３０】
前記内面の一部が、円筒形、楕円形、球形、および放物形からなる群から選択される形状を有する、請求項２７に記載のバイオリアクター。
【国際調査報告】
2009521907.tif 000020
2009521907.tif 000021
2009521907.tif 000022
2009521907.tif 000023
2009521907.tif 000024