(57)【要約】本発明は、ヒト胚性幹細胞から、高効率で、神経前駆細胞、神経細胞及びドーパミン神経細胞への分化を誘導する方法に関し、培養液の変化と物理的な方法を通じた段階的な神経系細胞群の選別方法を特徴とする。本発明は、神経前駆細胞、神経細胞及びドーパミン神経細胞への分化を誘導する既存の研究方法に比べて、最高の効率を有し、費用及び時間を短縮するという効果があり、長期間安定的に神経前駆細胞を維持することができるという長所を有しており、パーキンソン病やその他の神経系疾患のための治療に有用な細胞を安定的に供給することができる。
2009539369.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）５乃至２１日間培養された胚様体のうち、嚢胞性の胚様体を除いた残りを、マトリゲル、ラミニン、またはＬ−ポリオルニチンがコートされた培養皿に付着した後、５乃至７日間、０．５ Ｘ Ｎ−２添加剤を添加した培地で培養し、神経系以外の細胞の成長を抑制させる段階と、
（ｂ）Ｎ−２及びｂＦＧＦを添加した培地で、３乃至７日間増殖された胚様体由来細胞群からニューロン特異的な構造物を切除及び分離する段階と、
（ｃ）前記切除されたニューロン特異的な構造物から作られた球状神経前駆細胞を培養する過程において発生する線維芽細胞様細胞と嚢胞構造を除去し、球状神経前駆細胞内で増殖されたニューロン特異的な構造物のみを分離する段階と、
（ｄ）前記（ｃ）の過程を最小４回以上繰り返し、球状神経前駆細胞の純度を高め、増殖する段階とを含むヒト胚性幹細胞から、高収率及び高純度で、神経前駆細胞の分化を誘導し、これを増殖させる方法。
【請求項２】
（ａ）及び（ｂ）段階の培地が、血清や血清代替物を排除した２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１％ 非必須アミノ酸、０．５％ ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）または０．１ｍＭ β−メルカプトエタノールが含まれたＤＭＥＭ／Ｆ１２のいずれか一つである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）及び（ｂ）段階の培地が、０．１ｍＭ β−メルカプトエタノールが含まれたＤＭＥＭ／Ｆ１２である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（ｂ）または（ｃ）段階の切除または分離方法が、ガラスパスツールピペットを用いた機械的な方法である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
（ｄ）段階において、（ｃ）の過程を４回乃至１０回繰り返すことである請求項１に記載の方法
【請求項６】
請求項１に記載の方法で作られた神経前駆細胞を分離した後、１乃至２日間Ｎ−２及びｂＦＧＦを添加した培地で培養し、３乃至７日間Ｎ−２及びＢ２７を添加した培地で培養することにより、神経細胞への分化を誘導する方法。
【請求項７】
神経前駆細胞の分離の際に、化学的処理を介さず、ガラスパスツールピペットを用いた機械的な方法で球状神経前駆細胞を切除、分離することにより、細胞の生存率を高める請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項６に記載の方法で作られた神経細胞にＳＨＨ及びＦＧＦ８を処理し、２乃至４日間培養した後、これに、ＳＨＨ、ＦＧＦ８及びアスコルビン酸を投与してから、３乃至７日間追加培養することにより、ドーパミン神経細胞を誘導する方法。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれか一項に記載の方法により分化された細胞及び／又は該細胞の子孫。
【請求項１０】
下記の特徴の４つ以上を有する請求項９に記載の細胞及び／又はその子孫：
（ａ）ｎｅｓｔｉｎの発現；
（ｂ）βＩＩＩ−チューブリンとＮｅｕＮの同時発現；
（ｃ）βＩＩＩ−チューブリンとＡ２Ｂ５の同時発現；
（ｄ）βＩＩＩ−チューブリンとｎｅｓｔｉｎの同時発現；
（ｅ）−６０ｍＡ〜２０ｍＡのニューロン特異的な細胞膜の活動電位；
（ｆ）βＩＩＩ−チューブリンとシナプトフィジン（ＳＹＰ）の同時発現；及び
（ｇ）神経細胞培養液からドーパミンの分泌。
【請求項１１】
下記の特徴の５つ以上を有する請求項９に記載の細胞及び／又はその子孫：
（ａ）βＩＩＩ−チューブリンとＴＨ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）の同時発現；
（ｂ）ＴＨとＡＡＤＣの同時発現；
（ｃ）ＴＨとＥｎ１の同時発現；
（ｄ）ＴＨとＰＮＭＴの同時発現の減少または不在；
（ｅ）ＴＨとＤｂＨの同時発現の減少または不在；
（ｆ）ＴＨとＧＡＢＡの同時発現の減少または不在；
（ｇ）神経前駆細胞（ＳＮＭ）でのＰａｘ６、Ｓｏｘ１、及び／又はＮｕｒｒ１の発現；
（ｈ）神経前駆細胞（ＳＮＭ）でのＯｃｔ４、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３、及び／又はＤＢＨの発現の減少または不在；
（ｉ）ドーパミン神経細胞（ＤＡ）でのＰａｘ６、Ｓｏｘ１、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１及び／又はＰｔｘ３の発現；及び
（ｊ）ドーパミン神経細胞（ＤＡ）でのＯｃｔ４及び／又はＤＢＨの発現の減少または不在。
【請求項１２】
約８０％以上の細胞が、下記の特徴を有する請求項１１に記載の細胞及び／又はその子孫：
（ａ）βＩＩＩ−チューブリンとＴＨの同時発現；
（ｂ）ＴＨとＡＡＤＣの同時発現；
（ｃ）ＴＨとＥｎ１の同時発現；
（ｄ）ドーパミン神経細胞（ＤＡ）でのＰａｘ６、Ｓｏｘ１、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１及び／又はＰｔｘ３の発現；
（ｅ）ドーパミン神経細胞（ＤＡ）でのＯｃｔ４及び／又はＤＢＨの発現の減少または不在。
【請求項１３】
前記遺伝子の発現の増加または減少は、前記遺伝子がコードするタンパク質に対する抗体及び／又はＲＴ−ＰＣＲで検出可能である請求項９乃至１２のいずれか一項に記載の細胞及び／又はその子孫。
【請求項１４】
請求項９乃至１２のいずれか一項に記載の細胞及び／又はその子孫を含む脳または神経系疾患に対する治療用組成物。
【請求項１５】
前記神経系疾患が、パーキンソン病、神経痛、関節炎、頭痛、統合失調症、てんかん、脳卒中、不眠症、認知症、うつ病、ジスキネジア、アルツハイマー病、レヴィー小体認知症、ハンチントン病、トゥレット・シンドローム、不安、学習及び記憶障害、神経変性病よりなる群から選ばれるいずれか一つ以上である請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記神経系疾患が、パーキンソン病である請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１３に記載の細胞及び／又はその子孫を含む脳または神経系疾患に対する治療用組成物。
【請求項１８】
前記神経系疾患が、パーキンソン病、神経痛、関節炎、頭痛、統合失調症、てんかん、脳卒中、不眠症、認知症、うつ病、ジスキネジア、アルツハイマー病、レヴィー小体認知症、ハンチントン病、トゥレット・シンドローム、不安、学習及び記憶障害、神経変性病よりなる群から選ばれるいずれか一つ以上である請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記神経系疾患が、パーキンソン病である請求項１７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト胚性幹細胞から、効率的に、神経前駆細胞、神経細胞及び機能性ドーパミン神経細胞への分化を誘導する方法に関し、科学技術部の２１世紀フロンティア事業の細胞応用研究事業団の支援課題（ＳＣ２１６０）として行われた。
【背景技術】
【０００２】
難病として知られたパーキンソン病は、中脳の黒質部位のドーパミンを分泌する神経細胞の消滅により引き起こされる病気であり、発病頻度が高く、運動障害が慢性的に徐々に進行する致命的な老人病として、治療法の開発が急である。現在、知られた治療法としては、いくつかの類似薬物を用いた薬物治療と、脳深部刺激装置の設置等の手術的療法等があるが、薬物治療の場合、短期的であり、持続的な投与による副作用のため適用が容易ではなく、手術的療法も、身体的、経済的な負担が大きく、代替治療法が切望されている。
【０００３】
最近、疾患により破壊または損傷した細胞を外部から供給する細胞代替療法が効果的な治療法として提示されている。特に、ヒト幹細胞の研究が急速に進行すると共に、これを用いて、損傷後の復旧が困難である組織や細胞を再生させようとする研究が広範囲に行われているが、その中でも、成体幹細胞の確保及び供給が容易ではない脳・神経組織の場合、胚性幹細胞から損傷した部分を代替可能な脳・神経細胞への分化研究が盛んに進行されている。胚性幹細胞は、受精卵の発達過程中、胚盤胞段階の内細胞塊から得られ、特定の分化環境が与えられない限り、未分化状態で分裂し続けることができ、条件に応じて、殆ど全ての組織の細胞に分化することができるという特性を有しているので、全ての組織の細胞治療を可能にする細胞供給源となり得る細胞である。
【０００４】
パーキンソン病に適用するための細胞代替治療の研究は、従来多く行われてきたが、ヒト胚性幹細胞を用いた研究は、最近になって初めて行われ、現在、韓国内外の多くの研究  機関が競争的に研究を始める段階にある。
−２００１年、Ｓｕ−Ｃｈｕｎ Ｚｈａｎｇ等の研究チームは、初めてヒト胚性幹細胞から神経前駆細胞及び各種の神経細胞への分化を誘導して発表した。
−２００４年、アメリカ・コロラド大学のＫｉｍｂｅｒｌｅｙ等は、ヒト胚性幹細胞をＰＡ６細胞と共培養した後、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を添加することにより、ドーパミン神経細胞の収率を高めることができたとの研究結果を発表した。
【０００５】
−２００４年、アメリカ・Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｎ Ｄｒｕｇ ＡｂｕｓｅのＺｅｎｇ等は、ヒト胚性幹細胞を間質細胞であるＰＡ６細胞と共培養して、８０％以上の胚性幹細胞集合体からドーパミン神経細胞が現れ、これらがドーパミンニューロン特異的なマーカーを発現することを確認した。しかし、移植後は、ごく一部の細胞だけがドーパミン神経細胞であり、残りは、他種の細胞が生き残るという問題を有すると報告した。
−２００４年、ＢｒｅｓａＧｅｎ Ｉｎｃ．のＳｃｈｕｌｚ等の研究チームは、胚性幹細胞集合体を他の誘導因子無しに、無血清培地で自然に浮遊培養してドーパミンを分泌しながら電気生理学的作用を有する神経細胞に誘導し、移植後、ドーパミンを発現する細胞を確認した。
−２００４年、Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＰｅｒｒｉｅｒ等は、さらに他の間質細胞であるＭＳ５細胞を用いて、ヒト胚性幹細胞から神経前駆細胞塊を形成した後、様々な成長因及び分化誘導因子を添加することにより、神経細胞の７０％以上をドーパミン神経細胞に分化するのに成功した。
【０００６】
−２００４年、イスラエル・Ｈａｄａｓｓａｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ＨｏｓｐｉｔａｌのＴａｍｉｒ等は、ヒト胚性幹細胞から分化された神経前駆細胞をラットに移植し、自発的に分化されるドーパミン神経細胞がごく一部分であっても、パーキンソン病による行動障害を多く好転させることができたと発表した。
−韓国の場合、ヒト胚性幹細胞からドーパミン神経細胞を分化させて発表した研究チームは多くないが、２００４年Ｍａｒｉａ Ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ＨｏｓｐｉｔａｌのＳｅｐｉｌｌ Ｐａｒｋ等は、ヒト胚性幹細胞から様々な分化誘導因子を処理して神経細胞を分化させ、２０％近くまでドーパミン神経細胞が分化されたと発表した。しかし、分化された細胞の機能性や他のマーカーの確認が足りなく、他の研究結果に比べて収率に劣るという問題があり、移植後の生存率等は報告されていない。
【０００７】
−韓国・Ｈａｎｙａｎｇ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＳａｎｇｈｏｏｎ Ｌｅｅ等の研究チームは、ヒト胚性幹細胞をＰＡ６間質細胞と共培養して神経前駆細胞への分化を誘導した後、球状神経前駆細胞または単一細胞形態で、多くの分化因子を組み合わせて培養することにより、ドーパミン神経細胞への分化を誘導した。しかし、分化収率や移植後の結果は悪かった。
現在まで、韓国内外の研究チームの多くの研究にもかかわらず、実際に、全体細胞から純粋なドーパミン神経細胞が得られる収率は、未だ低いレベルにとどまっており、移植後の生存率、機能性に劣るという問題等を有している。そこで、本発明者等は、胚性幹細胞から８０％以上の高収率で神経前駆細胞、神経細胞、及び純粋なドーパミン神経細胞が得られる方法を定立し、神経前駆細胞段階の細胞を、継代培養により多量の前駆細胞、神経細胞、及びドーパミン神経細胞として供給可能にして、本発明を完成した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明では、胚性幹細胞から神経前駆細胞、神経細胞、及びドーパミン神経細胞への分化を誘導する方法を提供しようとする。
既存の分化方法が、効率面において実用化し難い問題点を有していたので、本発明では、実用化が可能に、分化効率性と機能性、及び量的確保のための実用性を画期的に高めようとした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一つの態様として、本発明は、ヒト胚性幹細胞から高収率で神経前駆細胞、神経細胞、及び機能性ドーパミン神経細胞を分化させる方法に関する。具体的に、本発明の方法は、ヒト胚性幹細胞から胚様体を作った後、嚢胞性の胚様体を除去し、神経系への分化のために、一次的に神経系細胞を選択的に生存及び分裂させ、二次的に神経細胞の特異的構造のみを機械的に分離し、球状神経前駆細胞を作った後、継代培養する課程において、球状神経前駆細胞以外の他の構造物を繰り返して除去する過程を通じて、高純度の球状神経前駆細胞を作り、これを選択的培地の使用により、神経細胞とドーパミン神経細胞への分化を誘導することを特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ヒト胚性幹細胞から神経前駆細胞、神経細胞、及びドーパミン神経細胞への段階的分化を要約した模式図であって、図１のａは、胚性幹細胞コロニーが培養される形態学的特徴を示す図であり、図１のｂは、胚性幹細胞コロニーから分化された後、選別された胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ、ＥＢ）の形態学的特徴を示す図である。図１のｃ及びｄは、胚様体を付着培養して選択と増殖培養を行った後に現れるニューロン特異的な構造物である神経性ロゼット及び神経管の形態学的特徴を示す図であり、図１のｅは、ニューロン特異的な構造物を機械的に切った後、浮遊培養したときに作られる球状神経前駆細胞の形態学的特徴を示す図であり、図１のｆ、ｇ及びｈは、それぞれ球状神経前駆細胞を機械的に切開して付着し、段階別に培養した後に現れる神経細胞の形態学的特徴を示す図である。
【図２】図２は、ヒト胚性幹細胞コロニーを浮遊培養したときに現れる胚様体の形態学的特徴を示す図である。
【図３】図３は、胚様体を貼り付けて培養して、選択と増殖過程を経た後、増殖された細胞が神経前駆細胞の特異的マーカーを発現することを免疫蛍光染色法で確認した図である。
【図４】図４は、ヒト胚性幹細胞から分化された細胞が、神経細胞の特異的マーカーを発現していることを免疫蛍光染色法で確認した図である。
【図５】図５は、分化された神経細胞が神経細胞の機能をうまく行うかを調べるために、ニューロン特異的な電気生理学的性質と神経伝達物質の分泌に関与する物質を発現するか、または、ドーパミン神経細胞としてドーパミンを分泌するかを確認した図であって、図５のａは、ニューロン特異的な細胞膜の活動電位を測定した図であり、図５のｂは、シナプス形成に関与するニューロン特異的なタンパク質であるシナプトフィジン（ＳＹＰ）が発現していることを示す図であり、図５のｃは、各神経細胞培養液からドーパミンが実際に分泌されるかを確認した図である。
【図６】図６は、ヒト胚性幹細胞から分化された神経細胞の大部分が、ドーパミン神経細胞の特異的マーカーであるチロシン・ヒドロキシラーゼ（ＴＨ）を一緒に発現することを免疫蛍光染色法で確認した図である。
【図７】図７は、ヒト胚性幹細胞から分化された細胞が、ドーパミン神経細胞の多くの特異的マーカーを現われ得るかを、免疫蛍光染色法及びＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ＰＣＲ）で確認した図であって、図７のａは、大部分のチロシン・ヒドロキシラーゼ（ＴＨ）を発現する細胞が、ドーパミン神経細胞のさらに他のマーカー（ＡＡＤＣ， Ｅｎ１）を発現するのに対して、アドレナリン作動性ニューロン（ＰＮＭＴ）とノルアドレナリン作用性ニューロン（ＤｂＨ）またはＧＡＢＡニューロン（ＧＡＢＡ）のマーカーは発現せず、またはごく一部だけが発現することを確認した図である。また、図７のｂは、各分化段階の細胞から得たｍＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲにより、未分化胚幹細胞マーカー（Ｏｃｔ−４）、神経マーカー（Ｐａｘ６、Ｓｏｘ１）、ドーパミン神経細胞マーカー（Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３）、及びノルアドレナリン作用性ニューロン（ＤｂＨ）マーカーの発現がいかに異なるかを確認した図である。
【図８】図８は、蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーを用いて、ヒト胚性幹細胞から分化された神経細胞がドーパミン神経細胞に分化された程度を調べるために、神経細胞のマーカーとドーパミン神経細胞のマーカーを同時に発現する細胞の比率を分析した図である。
【図９】図９は、ヒト胚性幹細胞をドーパミン神経細胞に分化させた後、パーキンソン病に類似した動物モデルの脳に移植した後、動物の脳中において、移植した細胞が消失した脳機能を復元させることができるかを調べるために、ステッピングテストした結果を示す図である。
【図１０】図１０は、ヒト胚性幹細胞をドーパミン神経細胞に分化させた後、パーキンソン病に類似した動物モデル（ラット）の脳に移植した後、動物の脳中において、移植した細胞が消失した脳機能を復元させることができるかを調べるために、薬物投与後の回転運動検査の結果を示す図である。図１０のａは、アポモルヒネを処理したときの結果であり、図１０のｂは、アンフェタミンを処理したときの結果である。これらの薬物は、ドーパミン神経が損傷した動物モデルにおいて、一方向への回転を誘導するのに細胞治療効果がある場合、回転数の減少を示す。Ｙ軸は、動物モデルを作った後、細胞移植前の回転数に対する変化する回転数を％で示した数値である。
【図１１】図１１は、ヒト胚性幹細胞をドーパミン神経細胞に分化させた後、パーキンソン病に類似した動物モデルの脳に移植した後、動物の脳中において、移植した細胞が生きており、ドーパミン神経細胞の特異抗体を発現していることを免疫蛍光染色で確認した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
一つの具体的な態様として、本発明のヒト胚性幹細胞から高収率・高純度で神経前駆細胞の分化を誘導し、これを増殖させる方法は、
（ａ）最小５日から最大２１日間培養された胚様体のうち、嚢胞性の胚様体を除いた残りを、マトリゲル（Matrigel（登録商標））、ラミニン、またはＬ−ポリオルニチンがコートされた培養皿に付着した後、最小５日から最大７日間、０．５ Ｘ Ｎ−２添加剤を添加した培地で培養し、神経系以外の細胞の成長を抑制させる段階と、
（ｂ）Ｎ−２及びｂＦＧＦを添加した培地で、最小３日から最大７日間増殖された胚様体由来細胞群からニューロン特異的な構造物を切除及び分離する段階と、
（ｃ）前記切除、分離されたニューロン特異的な構造物から作られた球状神経前駆細胞を培養する過程において発生する線維芽細胞様細胞と嚢胞構造を除去し、球状神経前駆細胞内で増殖されたニューロン特異的な構造物のみを分離する段階と、
（ｄ）前記（ｃ）の過程を最小４回以上繰り返し、球状神経前駆細胞の純度を高め、球状神経前駆細胞を増殖する段階とを含む。
本発明で用いられる用語の「胚性幹細胞」とは、受精卵の発達過程中、胚盤胞段階の内細胞塊から得られ、特定の分化環境が与えられない限り、未分化状態で分裂し続けることができ、条件に応じて、殆ど全ての組織の細胞に分化することができる特性を有する細胞のことをいう。
【００１２】
前記（ａ）段階は、本発明で用いられる胚性幹細胞を、選別された胚様体及び球状神経前駆細胞に分化誘導する段階である。より具体的に、前記段階は、一定期間の間充分に培養された胚性幹細胞から分化されて選択された胚様体を、マトリゲル、ラミニン、またはＬ−ポリオルニチンの一つでコートした培養皿に貼り付けて培養し、神経前駆細胞のみを選択的に生存及び分裂を誘導するために、０．５ Ｘ Ｎ−２添加剤を添加した培地で培養する段階である。前記マトリゲル、ラミニン、またはＬ−ポリオルニチン、及び０．５ Ｘ Ｎ−２が含まれた培地により、神経前駆細胞のみが選択的に生存するようになる。
【００１３】
前記（ｂ）段階は、（ａ）段階で特異的に選別されて培養された胚様体由来細胞群、すなわち神経前駆細胞のみを、特定の培地で３乃至５日間培養し、これらの神経前駆細胞からニューロン特異的な構造物を切除及び分離する段階である。前記段階において、選別された細胞の増殖及び前記段階以降の神経前駆細胞が作られた後、これを継代培養する間は、１ Ｘ Ｎ−２及び２０ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）が含まれた培地で培養することを特徴とする。前記（ａ）及び（ｂ）段階により、目的とする球状神経前駆細胞のみを選別して培養することができる。
【００１４】
本発明の前記ニューロン特異的な構造物とは、神経性ロゼット及び神経管の形態学的特徴を有する構造物のことをいう。
本発明で用いられた前記切除方法は、球状神経前駆細胞からニューロン特異的な構造物のみを分離するものであって、これは、公知の様々な方法により行われ得る。本発明の具体的な実施において、好ましい前記切除方法は、機械的な方法、特にガラスパスツールピペットを用いて機械的に分離する方法である。前記ガラスパスツールピペットを用いた機械的な方法は、パスツールピペットの細い部分を加熱して引っ張ることにより、一端を髪の毛程度の厚さに作り、これを用いて顕微鏡下で所望の部位を切り出す方法である。
【００１５】
前記（ｃ）及び（ｄ）段階は、（ｂ）段階で分離されたニューロン特異的な構造物を有する球状神経前駆細胞のみを増殖培養する段階である。すなわち、前記段階で作られた球状神経前駆細胞は、前記切除方法、好ましくは機械的な方法により、５乃至８個の小片に作った後、１ Ｘ Ｎ−２及びｂＦＧＦが添加された培地で、１乃至２週間培養して増殖させることができ、このような過程を一定の継代以上、好ましくは４継代以上、より好ましくは４乃至１０継代行うことにより、神経分化能を維持したまま、球状神経前駆細胞の純度及び数字を増やすことができる。
【００１６】
本発明の前記（ａ）乃至（ｄ）段階で用いた培地は、ヒト胚性幹細胞培養用培地を用いることができ、好ましくは２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１％ 非必須アミノ酸、０．５％ ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）または０．１ｍＭ β−メルカプトエタノールが含まれたＤＭＥＭ／Ｆ１２倍地を用いる。本発明の具体的な実施では、０．１ｍＭ β−メルカプトエタノールが含まれたＤＭＥＭ／Ｆ１２倍地を用いた。
他の具体的な態様として、本発明は、上述した方法で作られた神経前駆細胞を分離し、１乃至２日間Ｎ−２及びｂＦＧＦを添加した培地で培養し、これを３乃至７日間Ｎ−２及びＢ２７を添加した培地でさらに培養することにより、神経細胞への分化を誘導する方法に関する。
【００１７】
前記方法において、神経前駆細胞の分離培養の際に、化学的処理を介さず、ガラスパスツールピペットを用いた機械的な方法で球状神経前駆細胞を切除、分離することにより、細胞の生存率を高めることができ、Ｎ−２及びｂＦＧＦを添加した特定の培地で一定の期間１次培養し、Ｎ−２及びＢ２７を添加した特定の培地で一定の期間２次培養することにより、高効率で神経細胞への分化を誘導することができる。
前記特定の培地は、ヒト胚性幹細胞培養用培地を用いることができ、好ましくは２０％のノックアウト血清代替物（Ｋ／ＳＲ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１％ 非必須アミノ酸、０．５％ ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）または０．１ｍＭ β−メルカプトエタノールが含まれたＤＭＥＭ／Ｆ１２倍地を用いる。
【００１８】
さらに他の具体的な態様として、本発明は、上述した方法で分化誘導された神経細胞にＳＨＨ（ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ）及びＦＧＦ８（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ８）を処理し、２乃至４日間培養した後、これに、ＳＨＨ、ＦＧＦ８及びアスコルビン酸（ＡＡ）を投与してから、３乃至７日間追加培養することにより、ドーパミン神経細胞に分化誘導する方法に関する。
前記方法により効率的に前記神経細胞からドーパミン神経細胞への分化を誘導することができ、前記培養培地は、ヒト胚性幹細胞培養用培地を用いることができ、好ましくは、２０％のノックアウト血清代替物（Ｋ／ＳＲ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１％ 非必須アミノ酸、０．５％ ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）または０．１ｍＭ β−メルカプトエタノールが含まれたＤＭＥＭ／Ｆ１２を好適に用いることができる。
【００１９】
さらに他の態様として、本発明は、さらに、前記ヒト胚性幹細胞の分化を誘導する方法により分化された細胞及び／又は前記細胞の子孫に関するものである。
本発明者等は、本発明の方法でヒト胚性幹細胞を神経前駆細胞及び神経細胞に分化誘導する場合、神経前駆細胞特異的マーカーであるｎｅｓｔｉｎの発現、ニューロン特異的なマーカーであるβＩＩＩ−チューブリンとＮｅｕＮの同時発現、βＩＩＩ−チューブリンとＡ２Ｂ５の同時発現、及びβＩＩＩ−チューブリンとｎｅｓｔｉｎの同時発現、ニューロン特異的な細胞膜の活動電位（−６０ｍＶ〜２０ｍＶ）の確認、βＩＩＩ−チューブリンとシナプトフィジン（ＳＹＰ）の同時発現、及び神経細胞培養液からドーパミンの分泌を確認することができる。
【００２０】
したがって、本発明により分化された前記分化細胞及び／又はその子孫は、神経前駆細胞特異的マーカーであるｎｅｓｔｉｎの発現、ニューロン特異的なマーカーであるβＩＩＩ−チューブリンとＮｅｕＮの同時発現、βＩＩＩ−チューブリンとＡ２Ｂ５の同時発現、βＩＩＩ−チューブリンとｎｅｓｔｉｎの同時発現、ニューロン特異的な細胞膜の活動電位（−６０ｍＶ〜２０ｍＶ）の確認、βＩＩＩ−チューブリンとシナプトフィジン（ＳＹＰ）の同時発現、及び神経細胞培養液からドーパミンの分泌を含む、上述した多数の特性を有することができる。
前記タンパク質に対する抗体または前記タンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定するＲＴ−ＰＣＲ等の当業者によく知られた方法を用いて、本発明により分化誘導された神経前駆細胞または神経細胞の特性を確認することができる。特定細胞中に存在する前記特性が多いほど、神経前駆細胞または神経細胞としてさらに特徴付けられ得る。前記特性の３以上、好ましくは４以上、より好ましくは５以上を有する細胞及び／又はその子孫が好ましい。本発明の方法で分化誘導された細胞の約４０％、６０％、８０％、９０％、９５％または９８％以上が、目的とする特性を有する細胞であることが好ましく、これらの数値が大きいほどさらに好ましい。
【００２１】
また、本発明者は、本発明の上述した方法により、ヒト胚性幹細胞からドーパミン神経細胞に分化誘導する場合、ドーパミン神経細胞の特異的マーカーであるβＩＩＩ−チューブリンとＴＨ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）の同時発現、ＴＨとＡＡＤＣ（ａｒｏｍａｔｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）の同時発現、ＴＨとＥｎ１（Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−１）の同時発現、ＴＨとＰＮＭＴの同時発現の減少または不在、ＴＨとＤｂＨ（１，３−ｄｉｂｒｏｍｏ−５，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｈｙｄａｎｔｏｉｎ）の同時発現の減少または不在、ＴＨとＧＡＢＡ（γ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）の同時発現の減少または不在、球状神経前駆細胞（ＳＮＭ）でのＰａｘ６、Ｓｏｘ１及び／又はＮｕｒｒ１の発現、球状神経前駆細胞（ＳＮＭ）でのＯｃｔ４、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３及び／又はＤＢＨの発現の減少または不在、ドーパミン神経細胞（ＤＡ）でのＰａｘ６、Ｓｏｘ１、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１及び／又はＰｔｘ３の発現、及びドーパミン神経細胞（ＤＡ）でのＯｃｔ４、ＤＢＨの発現の減少または不在を確認することができた。
【００２２】
したがって、本発明により分化された前記分化細胞またはその子孫は、βＩＩＩ−チューブリンとＴＨの同時発現、ＴＨとＡＡＤＣの同時発現、ＴＨとＥｎ１の同時発現、ＴＨとＰＮＭＴの同時発現の減少または不在、ＴＨとＤｂＨの同時発現の減少または不在、ＴＨとＧＡＢＡの同時発現の減少または不在、球状神経前駆細胞（ＳＮＭ）でのＰａｘ６、Ｓｏｘ１及び／又はＮｕｒｒ１の発現、球状神経前駆細胞（ＳＮＭ）でのＥｎ１、Ｐｔｘ３、ＤＢＨ及び／又はＯｃｔ４の発現の減少または不在、ドーパミン神経細胞（ＤＡ）でのＰａｘ６、Ｓｏｘ１、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１及び／又はＰｔｘ３の発現、及びドーパミン神経細胞（ＤＡ）でのＯｃｔ４、ＤＢＨの発現の減少または不在を含む、上述した多数の特性を有することができる。
【００２３】
前記タンパク質に対する抗体または前記タンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定するＲＴ−ＰＣＲ等の当業者によく知られた方法を用いて、本発明により分化誘導されたドーパミン神経細胞の特性を確認することができる。特定の細胞中に存在する前記特性が多いほど、ドーパミン神経細胞としてさらに特徴付けられ得る。前記特性の４以上、好ましくは５以上、より好ましくは７以上を有する細胞及び／又はその子孫が好ましい。本発明の方法で分化誘導した細胞の約４０％、６０％、８０％、９０％、９５％または９８％以上が、目的とする特性を有する細胞であることが好ましく、これらの数値が大きいほどさらに好ましい。
他の態様として、本発明は、本発明の方法で分化誘導され、上記で提供される、ヒト胚性幹細胞から分化誘導された細胞及び／又はその子孫、具体的には、神経前駆細胞、神経細胞及び／又は機能性ドーパミン神経細胞を含む脳または神経系疾患に対する治療用組成物に関する。
【００２４】
本発明で作られた神経前駆細胞とは、神経前駆細胞のマーカーを有し、分化後に神経細胞を生成することができる細胞をいい、神経細胞とは、神経細胞のマーカー及びニューロン特異的な電気生理学的性質を有する細胞をいい、機能性ドーパミン神経細胞とは、ドーパミン神経細胞のマーカーを有し、培地内にドーパミンを分泌し、動物モデルに移植したときに機能回復を示す細胞をいう。
前記脳または神経系疾患は、パーキンソン病、神経痛、関節炎、頭痛、統合失調症、てんかん、脳卒中、不眠症、認知症、うつ病、ジスキネジア、アルツハイマー病、レヴィー小体認知症、ハンチントン病、トゥレット・シンドローム、不安、学習及び記憶障害、神経変性病等の神経系の機能減少または異常により、脳または神経系に現れる疾患をいう。本発明の具体的な実施において、本発明の前記組成物が神経系疾患中の一つであるパーキンソン病の治療に有用に適用され得ることを確認した。
【００２５】
本発明の治療用組成物は、投与方式により許容可能な担体を含めて適切な製剤に製造され得る。投与方式に適合した製剤は公知されており、典型的に膜透過性の、移動を容易にする製剤を含むことができる。
また、本発明の治療用組成物は、一般的な医薬品製剤の形態で使用され得る。非経口製剤としては、滅菌した水溶液、非水溶液、懸濁剤、乳剤、または凍結乾燥剤、経口投与の際は、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、サスペンション、シロップ、またはウエハー等の形態で製造することができ、注射剤の場合は、単回投与アンプルまたは複数回投与の形態で製造することができる。また、本発明の治療用組成物は、薬学的に許容される担体と一緒に投与されてもよい。例えば、経口投与の際は、結合剤、滑剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素剤、または香料等を用いることができ、注射剤の場合は、緩衝剤、保存剤、鎮痛剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤等を混合して用いることができ、局所性投与用の場合は、基剤、賦形剤、滑剤、保存剤等を用いることができる。
【００２６】
また、本発明の治療用組成物を用いて脳または神経系疾患を治療する方法は、適切な方法で、患者に所定の物質が導入される一般の経路を通じて投与することを含んでもよい。前記投与方法としては、腹腔内投与、静脈内投与、筋内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所性投与、鼻内投与、肺内投与、及び直腸投与があるが、これらに制限されない。しかし、経口投与の際に細胞が消化され得るので、経口用組成物は、活性成分をコートし、または消化されることを防止するために剤形化することが好ましい。
【００２７】
また、製薬組成物は、活性成分が標的細胞に移動することができる任意の装置により投与されてもよい。好ましい投与方式及び製剤は、静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、または点滴注射剤等である。注射剤は、生理食塩溶液またはリンガー溶液等の水溶液、植物油、高級脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチル等）、アルコール類（例えば、エタノール、ベンジルアルコール、プロピレングリコールまたはグリセリン等）等の非水溶液等を用いて製造することができ、変質防止のための安定化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＢＨＡ、トコフェロール、ＥＤＴＡ等）、乳化剤、ｐＨ調節のための緩衝剤、抗菌性保存剤（例えば、硝酸フェニル水銀、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、フェノール、クレゾール、ベンジルアルコール等）等の薬剤学的担体を含んでもよい。好ましくは、本発明の治療用組成物を用いて脳または神経系疾患を治療する方法は、本発明の治療用組成物を薬学的有効量で投与することを含む。前記薬学的有効量は、疾患の種類、患者の年齢、体重、健康、性別、患者の薬物に対する敏感度、投与経路、投与方法、投与回数、治療期間、配合または同時使用される薬物等の医学分野においてよく知られた要素に応じて、当業者により容易に決定され得る。
以下、実施例を通じて本発明をより詳述する。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されるものではない。
【００２８】
実施例１．ヒト胚性幹細胞の培養
未分化ヒト胚性幹細胞株（ＳＮＵｈＥＳ１、ＳＮＵｈＥＳ３、ＳＮＵｈＥＳ１６）の継代及び維持のために、未分化胚性幹細胞をマイトマイシン−Ｃが処理された支持細胞（マウス胎児線維芽細胞株、ＳＴＯ）上で培養し、培養液は、２０％ ノックアウト血清代替物（ＳＲ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、０．４ｎｇ／ｍｌ 塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、１％ 非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、０．５％ ペニシリン−ストレプトマイシン、０．１ｍＭ β−メルカプトエタノールが含まれたＤＭＥＭ／Ｆ１２倍地を用いた。７日間培養後、増殖された胚性幹細胞（図１のａ）を２００乃至３００個の細胞を有する塊となるように機械的に分割した後、これをさらに支持細胞上で培養した。
【００２９】
実施例２．神経前駆細胞への分化
２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅＩＶ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を３７℃で４０分間処理し、胚性幹細胞コロニーを切り離した後、これらを微生物培養用培養皿に入れ、ｂＦＧＦを除去した胚性幹細胞培養培地で７乃至２１日間浮遊培養し、胚様体（図１のｂ）を作った。胚様体のうち嚢胞性の胚様体（図２のｂ）を除去した後、残りの胚様体をマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）；ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）が処理された培養皿に付着した後、１ Ｘ Ｎ−２添加剤が添加された胚性幹細胞培養培地で５日間培養し、神経前駆細胞を選択培養した。以降、１ Ｘ Ｎ−２添加剤及びｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）が添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２倍地で４日間培養し、神経前駆細胞を増殖させた（図３）。その結果、神経前駆細胞の特異的マーカーであるｎｅｓｔｉｎの発現を確認することができた。
【００３０】
前記増殖された神経前駆細胞からなるニューロン特異的な構造物（神経性ロゼット及び神経管）（図１のｃ及びｄ）を、火造りのパスツールピペットを用いて機械的に切断した後、同じ培地で１週間培養して球状神経前駆細胞を形成し、１週間の間隔で３乃至４回継代しながら充分に形成された球状神経前駆細胞（図１のｅ）を選別した。選別された球状神経前駆細胞は、上述した道具を用いて機械的方法で、大きさに応じて４乃至８片ずつ切り出し、継代培養を続けることにより増殖させた。
【００３１】
実施例３．成熟した神経細胞への分化
選別された球状神経前駆細胞を機械的な方法で３０乃至８０個の小片に分けた後、マトリゲル（５０ｕｇ／ｍｌ）が処理された３５ｍｍの培養皿に入れ、１乃至２日間１ Ｘ Ｎ−２、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）を添加した倍地で培養し、１ Ｘ Ｎ−２、１ Ｘ Ｂ２７ (Ｇｉｂｃｏ)を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２倍地で４日間培養し、神経突起を有する神経細胞への分化を誘導した（図１のｆ及び図４）。その結果、ニューロン特異的なマーカーであるβＩＩＩ−チューブリンとＮｅｕＮの同時発現、βＩＩＩ−チューブリンとＡ２Ｂ５の同時発現、βＩＩＩ−チューブリンとｎｅｓｔｉｎの同時発現を確認することができた。
【００３２】
実施例４．機能性神経細胞の確認
分化した神経細胞が神経細胞の機能をうまく行うがどうかを調べるために、ニューロン特異的な電気生理学的性質と神経伝達物質の分泌に関与する物質を発現するかを観察した。
ニューロン特異的な電気生理学的性質と確認するために、“ｄｉａｌｙｚｅｄ”ホールセル記録法を用いて細胞膜の活動電位を測定し、その結果、本発明の方法で分化誘導された細胞が、ニューロン特異的な細胞膜の活動電位（−６０ｍＶ〜２０ｍＶ）を示すことを確認した（図５のａ）。
また、シナプス形成に関与するニューロン特異的なタンパク質であるシナプトフィジン（ＳＹＰ）抗体を用いて免疫蛍光染色法を行い、βＩＩＩ−チューブリンとシナプトフィジン（ＳＹＰ）の同時発現を確認した（図５のｂ）。
【００３３】
また、ドーパミン神経細胞で発現するドーパミンが実際に分泌されるかどうかを調べるために、分化１４日後２４時間培養した培養液と、以降に５０ ｍＭ ＫＣｌで脱分化させた後の培養液をもって、逆相ＨＰＬＣを行い、ドーパミンの分泌程度を測定し、その結果、神経細胞培養液からドーパミンが実際に分泌されたことが確認された（図５のｃ）。
上記した結果から、本発明の分化誘導方法で分化誘導された細胞が神経細胞の特徴を有していることが確認された。
【００３４】
実施例５．ドーパミン神経細胞への分化
実施例１乃至３のような過程で生成された神経細胞にソニック・ヘッジホッグ（（ＳＨＨ）、２００ ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ）、線維芽細胞増殖因子８（ＦＧＦ８、１００ ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ＮＪ、ＵＳＡ）を処理して４日間培養した後、これにＳＨＨ、ＦＧＦ８、及びアスコルビン酸（２００ｕＭ；Ｓｉｇｍａ）を投与して６日間さらに培養することにより、ドーパミン神経細胞への分化を誘導した。その結果、ドーパミン神経細胞の特異的マーカーであるＴＨとβＩＩＩ−チューブリンの同時発現が確認された（図６）。
【００３５】
実施例６．神経細胞とドーパミン神経細胞の生成の有無及び効率、機能性の確認
ニューロン特異的なマーカーと各種のカテコールアミン神経のサブタイプ特異的なマーカーに対する抗体を用いて、免疫組織学的な方法で確認し、その結果、ＴＨとＡＡＤＣの同時発現、ＴＨとＥｎ１の同時発現、ＴＨとＰＮＭＴの同時発現の減少または不在、ＴＨとＤｂＨの同時発現の減少または不在、ＴＨとＧＡＢＡの同時発現の減少または不在が確認された（図７のａ）。
また、ヒト胚性幹細胞から分化された細胞が、ドーパミン神経細胞の多くの特異的なマーカーを示すかをＲＴ−ＰＣＲで確認し、神経前駆細胞（ＳＮＭ）のｍＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲの結果、Ｐａｘ６、Ｓｏｘ１、及びＮｕｒｒ１の発現、Ｏｃｔ４、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３、及びＤｂＨの減少または不在を確認し、本発明の方法で最終分化されたドーパミン神経細胞（ＤＡ）のｍＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲの結果、Ｐａｘ６、Ｓｏｘ１、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、及びＰｔｘ３の発現、Ｏｃｔ４及びＤｂＨの減少または不在を確認することができた（図７のａ）。
【００３６】
上記した結果から、本発明の分化誘導方法で分化誘導された細胞がドーパミン神経細胞の特徴を有していることが確認された。
本発明の方法で分化誘導された神経細胞がドーパミン神経細胞に分化される分化効率を比較するために、ＳＨＨとＦＧＦ８が処理された群（図８の左側及び右側ａ）と処理されていない群（図８の右側ｂ）から得られた神経細胞を、ドーパミン神経細胞の特異的酵素に対する抗体（抗−ＴＨ抗体）を貼り付け、免疫組織学的染色後、共焦点顕微鏡を用いて、陽性で染色された細胞の比率を測定し、８６％以上のドーパミン神経細胞への分化誘導率が示されることを確認し（図８の左側）、蛍光フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）で、神経細胞のマーカーであるβＩＩＩ−チューブリンとドーパミン神経細胞のマーカーであるＴＨを同時発現する細胞の比率を確認した結果、免疫組織学的染色結果に類似するように、神経細胞の８４％以上がドーパミン神経細胞に分化されること（図８の右側）を確認した。上記した結果から、神経前駆細胞が神経細胞、特にドーパミン神経細胞に分化され、これを脳、神経系疾患の治療用組成物に製造できることが確認された。
【００３７】
実施例７．免疫組織学的方法、ＲＴ−ＰＣＲ条件及び蛍光フローサイトメトリー
７．１．免疫組織学的方法
試料を先ず順次に８０％−、９０％−、１００％のエタノールでそれぞれ１０分ずつ固定させた。１０分間含水した後、リン酸緩衝液に保管し、または３％ホルマリン溶液に２０分間処理後、リン酸緩衝液に保管した。抗体を処理する前に、試料を１日間ブロッキング溶液（２％ウシ血清アルブミン、Ｓｉｇｍａ）で処理し、１次抗体に１時間、２次抗体に１時間反応させた後、蛍光保存液で封じた後、共焦点顕微鏡（ニコン、日本）で観察した。
免疫学的染色のために用いられた１次抗体は、次の通りである。Ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ｎｅｓｔｉｎ（１：２００）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−βＩＩＩ−ｔｕｂｕｌｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ（１：１００）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｍａｍｍａｌｉａｎ ｇａｍｍａ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ（ＧＡＢＡ、１：１００）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ（１：１００）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ＴＨ（１：２００）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−Ａ２Ｂ５（１：１００）、ｒａｂｂｉt ａｎｔｉ−ｐｈｅｎｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＰＮＭＴ、１：２００）、ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−ａｒｏｍａｔｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（ＡＡＤＣ、１：１０００）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＮｅｕＮ、１：１００）、ｓｈｅｅｐ ａｎｔｉ−ｄｏｐａｍｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ（ＤＢＨ、１：４００）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ｎｕｃｌｅｉ（１：５０）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ（１：５０、以上、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）；ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ＴＨ（１：２００、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）；ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−ＴＨ（１：５００）、ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｍｏｎｏａｍｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ２（ＶＭＡＴ２、１：５００、以上、Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ）；ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−Ｅｎ１ ａｎｔｉｂｏｄｙ（１：５０、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ、Ｉｏｗａ Ｃｉｔｙ、ＩＡ． ＵＳＡ）。
【００３８】
また、これらに対する２次抗体としては、次のようなものが用いられた。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩｇＧ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４ ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ５９４ ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔＩｇＧ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４ ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ−ｇｏａｔ ＩｇＧ（１：２００、以上、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、ＵＳＡ）、及びｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−ｓｈｅｅｐ ＩｇＧ（１：１００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）。
【００３９】
７−２．ＲＴ−ＰＣＲ条件
転写レベルでの発現に対するＲＴ−ＰＣＲ分析を次のように行った。
ＲＮＡを製造者のマニュアルにより、ＲＮＡｅａｓｙ Ｋｉｔ ＴＭ（Ｔｒｉｚｏｌ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いて細胞から抽出した後、最終産物をＤＮａｓｅで分解させ、汚染性ゲノムＤＮＡを除去した。１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２及び５ｍＭ ＤＤＴを含有する緩衝液に、ＲＮＡガード（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｕｐｊｏｈｎ）、ＤＮＡｓｅＩ（ＰｈａｒｍａｃｉａＵｐｊｏｈｎ）及び前記抽出したＲＮＡを入れ、３７℃、３０〜４５分間反応を行った。結果物からタンパク質を除去するために、フェノールクロロホルム抽出を行い、３Ｍ酢酸ナトリウム、及び１００％低温エタノールでＲＮＡを沈殿させた。前記沈殿されたＲＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄した後、これを風乾及びＤＥＰＣ処理水に再懸濁した。
【００４０】
逆転写酵素との反応のために、１μｍの全体ＲＮＡを最終濃度１×Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｇｉｂｃｏ）、２０ｍＭ ＤＤＴ、及び２５μｇ／ｍＬ ｒａｎｄｏｍ ｈｅｘａｍｅｒ（ＰｈａｒｍａｃｉａＵｐｊｏｈｎ）と配合した。前記ＲＮＡを７０℃で１０分間変性させた後、室温で１０分間アニールさせた。ｄＮＴＰを０．５μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ ＲＴ（Ｇｉｂｃｏ）と共に、１ｍＭの最終濃度で添加した後、これを４２℃で５０分間反応を行い、８０℃で１０分間加熱不活性化させた。次いで、ＰＣＲ分析のために、サンプルを−２０℃で貯蔵した。
【００４１】
標準ＰＣＲは、目的とするマーカーに特異的なプライマーを用いて、次の反応混合物中で行い、選択されたマーカー及びプライマー配列は、下記表１の通りである；ｃＤＮＡ  １．０μｌ、１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｇｉｂｃｏ）２．５μｌ、１０×ＭｇＣｌ２  ２．５μｌ、２．５ｍＭｄＮＴＰ ３．０μｌ、５μＭ ３’ｐｒｉｍｅｒ１．０μｌ、５μＭ ５’ｐｒｉｍｅｒ １．０μｌ、Ｔａｑ０．４μｌ、ＤＥＰＣ−ｔｒｅａｔｅｄ ｗａｔｅｒ １３．６μｌ。
【００４２】
【表１】
2009539369.tif 000003
【００４３】
７−３．蛍光フローサイトメトリー
ヒト胚性幹細胞から分化された神経前駆細胞、神経細胞及びドーパミン神経細胞の比率をフローサイトメトリーで測定して分化効率を調べた。神経前駆細胞の検出のためにｎｅｓｔｉｎ抗体を、神経細胞の検出のためにはβＩＩＩ−チューブリン抗体を、ドーパミン神経細胞の検出のためにはチロシン・ヒドロキシラーゼ（ＴＨ）抗体を用いた。各細胞は、リン酸緩衝液で洗浄後、３７℃で５分間０．０５％トリプシン／０．１％ＥＤＴＡ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を処理して単細胞化した。細胞表面抗原ではない場合は、ｐｅｒｆｏｒａｔｉｏｎｓｏｌｕｔｉｏｎ（０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１％ ＢＳＡ、０．１ Ｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ｐＨ ７．２）で５分間処理した後、１次抗体で３０分間反応させ、蛍光標識された２次抗体で３０分間反応させた後、リン酸緩衝液で洗浄した。これを、ＦＡＣＳｃａｎ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）を用いて、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ ｐｒｏ ｐｒｏｇｒａｍ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で分析した。用いられた１次抗体は、次の通りである；ｍｏｕｓｅａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ｎｅｓｔｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ（１：５０， Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｔｕｂｕｌｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ（１：５０， Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、及びｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＴＨ ａｎｔｉｂｏｄｙ（１：２００、Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ）。１次抗体の蛍光標識のために用いられた２次抗体は、次の通りである；ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８ ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４ ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（１：２００、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）。
【００４４】
実施例８．機能性分析のための動物モデルへの移植及び検定
２００−２３０ｇの雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、パーキンソン病の症状を有するモデルに作製するのに用いた。実験群は、次のように３群に分けた：（i）正常群、（ii）パーキンソン病モデルのうち、細胞を処理しなかった群、（iii）パーキンソン病モデルのうち、胚性幹細胞から分化された細胞を処理した群。
モデルを作るために、神経毒素である６−ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｐａｍｉｎｅ（６−ＯＨＤＡ）ｈｙｄｒｏｂｒｏｍｉｄｅ（８μｇｆｒｅｅ ｂａｓｅ、０．２％ ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄが含まれた２μｌ水溶液）を、内側前脳束（ＭＦＢ）に次のような脳手術座標に従って注入した：ＭＦＢ；ブレグマに対して前後−４．４ｍｍ、内外側１．２ｍｍ、及び硬膜に対して背腹側面−７．８ｍｍ。ノルアドレナリン作用性ニューロンの破壊を防ぐために、６−ＯＨＤＡを注入する３０分前に、１２．５ｍｇ／ｋｇのデシプラミンを腹腔内注射（ｉ．ｐ．）で処理した。６−ＯＨＤＡを処理してから２週間後、ドーパミン受容体作用薬であるアポモルヒネ（０．１ｍｇ／ｋｇｉ．ｐ．ｉｎ ｓａｌｉｎｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ ａｔ ２ｍｇ／ｍｌ）による旋回運動を観察した。１週間後、ヒト胚性幹細胞から分化された細胞をａｃｃｕｔａｓｅで単一細胞化した後、１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／μｌ濃度、４μｌの体積で微量注射器（Ｈａｍｉｌｔｏｎ社製）に連結された滅菌したステンレス鋼針（０．３ｍｍＯ．Ｄ．）を用いて、動物モデルの同側性線条体に［ＡＰ；＋０．２ｍｍ、Ｍ−Ｌ；３．０ｍｍ、Ｄ−Ｖ；４．５ｍｍ（２μｌ）及び５．５ｍｍ（２μｌ）］４分にわたって移植した。移植後４分間細胞が沈着される時間を与えてから、針を除去した。動物モデルは、移植２４時間前、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ：１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を投与し、解剖するまで処理し続けた。行動検査は、ｆｏｒｅｐａｗａｄｊｕｓｔｉｎｇ ｓｔｅｐｐｉｎｇ ｔｅｓｔ（図９、Ｃｈａｎｇ ＪＷ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ａｎａｔｏｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｅｐａｗ ａｄｊｕｓｔｉｎｇ ｓｔｅｐｓ ｉｎ ｒａｔ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ：ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｍｅｄｉａｌ ｆｏｒｅｂｒａｉｎ ｂｕｎｄｌｅ ａｎｄ ｓｔｒｉａｔａｌ ｌｅｓｉｏｎｓ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．１９９９８８：６１７−６２８）及びｄｒｕｇ−ｉｎｄｕｃｅｄｔｕｒｎｉｎｇ ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ｔｅｓｔ（図１０、Ｃｈｏ ＹＨ．，ｅｔ ａｌ．Ｄｏｐａｍｉｎｅ ｎｅｕｒｏｎｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｉｎｄｕｃｅ ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｉｎ ａ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉａｎ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００６３４１：６−１２）を一緒に行い、移植後２、４、６及び８週の際に連続して行い（図９及び図１０のａ）、９週間後にアンフェタミン（３ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）による旋回運動検査を行った（図１０のｂ）。分化させた細胞を移植したモデル（ｈＥＳ）は、培地のみを入れたモデル（ｓｈａｍ）と比較するとき、顕著にステッピングが向上し、回転数は減少した。
【００４５】
前記結果（図９及び図１０の結果）から、本発明の方法で分化誘導したドーパミン神経細胞が、パーキンソン病に類似した動物モデル脳に移植され、消失した脳機能を復元させることが確認され、したがって、ヒト胚性幹細胞から、本発明の方法で分化誘導したドーパミン神経細胞がパーキンソン病の治療に有用であることが確認された。
本実施例では、ヒト胚性幹細胞から本発明の方法で分化誘導したドーパミン神経細胞を、パーキンソン病の治療目的で移植したが、脳、神経系疾患として、消失した脳機能を復元させて疾病を治療することができるものであれば、これに制限されない。
【００４６】
実施例９．移植後ドーパミン神経細胞の生存確認のための組織学的検査
移植１０週後、動物モデルをＰＢＳバッファに溶かした２５％ウレタンで麻酔させた後、１２４ｍｌの生理食塩水と２５０ｍｌの冷えた４％パラホルムアルデヒドで心臓かん流させた。脳を摘出して、４％パラホルムアルデヒド溶液で固定させ、これを、３０％スクロースで４８時間処理して、凍結ガラス化を防止した後、凍ったまま、３０μｍの厚さに切り、組織サンプルを作った。脳切片は、ｒａｂｂｉｔａｎｔｉ−ｔｙｒｏｘｉｎｅｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ（ＴＨ）、ｒａｂｂｉｔａｎｔｉ−βＩＩＩ−ｔｕｂｕｌｉｎ、ｍｏｕｓｅａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ｎｕｃｌｅｉ、またはｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａの１次抗体で４℃で１２時間処理し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４ ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧとＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧの２次抗体を連続的に処理し、４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２ ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）を含む包埋液で包埋した後、共焦点顕微鏡で観察した（図１１）。
【００４７】
結果として、ヒト特異的なミトコンドリアと核を有する細胞、すなわち、移植された細胞が動物モデルでうまく生存しており（図１１のａ及びｂ）、これらの多くが神経細胞のマーカーであるβＩＩＩ−チューブリンを発現し（図１１のｅ及びｆ）、ドーパミン神経細胞のマーカーであるチロシン・ヒドロキシラーゼ（ＴＨ）も発現していること（図１１のｃ及びｄ）が観察された。
上記した結果から、本発明の方法で分化誘導したドーパミン神経細胞が移植後も生きており、ドーパミン神経細胞の特異的な抗体を発現しており、パーキンソン病の治療に有用であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明のヒト胚性幹細胞から、効率的に、神経前駆細胞及びドーパミン神経細胞への分化を誘導する方法は、胚性幹細胞を適切な条件下で、機能性を有するドーパミン神経細胞に分化させることができ、これにより、パーキンソン病の原因となる損傷したドーパミン神経細胞を再生することにより、パーキンソン病の細胞代替治療に有用に用いることができる。また、神経前駆細胞を球状神経前駆細胞の形態に維持することにより、他の脳、神経系疾患に用いることができ、臨床的に使用するだけの量的問題と、必要に応じて、直ちに使用可能な時間的問題を解決することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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