(57)【要約】  本発明は、結核菌群（ＭｔｂＣ）のマイコバクテリウムの特異的で高感度な検出のための、および／または一方のマイコバクテリウム・ツベルクロシスおよびマイコバクテリウム・カネッティの他方の前記ＭｔｂＣのその他の株からの特異的で高感度な識別のための、核酸標的としてのＲＤ９およびＩＳ６１１０の双方の使用に関する。有利に、前記ＭｔｂＣ検出および前記種識別は、単一の増幅工程（マルチプレックスＰＣＲ）にて行うことができる。本発明による手段は、結核の診断のための有利な手段である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
結核菌群（ＭｔｂＣ）のマイコバクテリウムの特異的で高感度な検出のための、および／または一方のマイコバクテリウム・ツベルクロシスおよびマイコバクテリウム・カネッティの他方の前記ＭｔｂＣのその他の株からの特異的で高感度な識別のための、以下の使用：
−少なくとも１つのＩＳ６１１０標的化増幅プライマーペアまたはハイブリダイゼーションプローブ、および
−少なくとも１つのＲＤ９標的化増幅プライマーペアまたはハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項２】
結核のｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断のための、以下の使用：
−少なくとも１つのＩＳ６１１０標的化増幅プライマーペアまたはハイブリダイゼーションプローブ、および
−少なくとも１つのＲＤ９標的化増幅プライマーペアまたはハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項３】
前記ＩＳ６１１０およびＲＤ９がマルチプレックスＰＣＲにおいて標的とされる、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
結核菌群（ＭｔｂＣ）のマイコバクテリウムの特異的なおよび高感度な検出に、および／または一方のマイコバクテリウム・ツベルクロシスおよびマイコバクテリウム・カネッティを他方の前記ＭｔｂＣのその他の菌株からの特異的で感度が高い識別に適した２対のプライマーのセットであって、
ここにおいて、前記２対のプライマーは、マルチプレックスで単一の増幅行程で使用できる一方で、特異的で感度が高い検出および識別をなお提供できる配列を有し、
ここにおいて、前記２対のプライマーは、ＩＳ６１１０フォワードプライマーおよびＩＳ６１１０リバースプライマーから成るＩＳ６１１０プライマーペア、ならびにＲＤ９フォワードプライマーおよびＲＤ９リバースプライマーから成るＲＤ９プライマーペアであり、
ここにおいて、前記ＲＤ９フォワードプライマーは、配列番号８の配列の１０から１８ヌクレオチドの５’末端断片であり、前記５’末端断片は、前記配列番号８のまさに最初の５’ヌクレオチドから開始し、
ここにおいて、前記ＲＤ９リバースプライマーは、前記配列番号８の全長にわたって前記配列番号８に完全に相補的である配列の１０から１８ヌクレオチドの５’末端断片であり、前記５’末端断片は、前記相補的配列のまさに最初の５’ヌクレオチドから開始し、
ここにおいて、前記ＩＳ６１１０フォワードプライマーは、配列番号２の配列の１０から１８ヌクレオチドの５’末端断片であり、前記５’末端断片は、前記配列番号２のまさに最初の５’ヌクレオチドから開始し、
ここにおいて、前記ＩＳ６１１０リバースプライマーは、前記配列番号２の全長にわたって前記配列番号２に完全に相補的である配列の１０から１８ヌクレオチドの５’末端断片であり、前記５’末端断片は、前記相補的配列のまさに最初の５’ヌクレオチドから開始する、
２対のプライマーのセット。
【請求項５】
前記ＲＤ９フォワードプライマーが配列番号１１の配列を含むことを特徴とする、請求項４に記載の２対のプライマーのセット。
【請求項６】
前記ＲＤ９リバースプライマーが配列番号１２の配列を含むことを特徴とする、請求項４に記載の２対のプライマーのセット。
【請求項７】
前記ＩＳ６１１０フォワードプライマーが配列番号５の配列を含むことを特徴とする、請求項４に記載の２対のプライマーのセット。
【請求項８】
前記ＩＳ６１１０リバースプライマーが配列番号５の配列を含むことを特徴とする、請求項４に記載の２対のプライマーのセット。
【請求項９】
請求項４から８の何れか１項に記載の２対のプライマーペアのセットから選択されるプライマーペア。
【請求項１０】
請求項９に記載のプライマーペアから選択されるプライマー。
【請求項１１】
ＲＤ９プライマーであることを特徴とする請求項１０に記載のプライマー。
【請求項１２】
ＩＳ６１１０プライマーであることを特徴とする請求項１０に記載のプライマー。
【請求項１３】
ＩＳ６１１０リバースプライマーであることを特徴とする請求項１２に記載のプライマー。
【請求項１４】
結核菌群（ＭｔｂＣ）のマイコバクテリウムを検出するための、および／または一方のマイコバクテリウム・ツベルクロシスおよびマイコバクテリウム・カネッティを他方の前記ＭｔｂＣのその他の株から識別するための単一の増幅行程のマルチプレックスで使用できるプライマーの設計において、参照テンプレート配列として使用するのに適した２つのポリヌクレオチドのセットであって、
ここにおいて、前記２つの参照テンプレートポリヌクレオチドのうちの１つはＲＤ９の断片であり、他方はＩＳ６１１０の断片であり、
ここにおいて、前記ＲＤ９断片は、配列番号８の配列に、または配列番号８の全長に完全に相補的である配列に存し、
および
ここにおいて、前記ＩＳ６１１０断片は、配列番号２の配列に、または配列番号２の全長に完全に相補的である配列に存する、
２つのポリヌクレオチドのセット。
【請求項１５】
結核菌群（ＭｔｂＣ）のマイコバクテリウムを検出するための、および／または一方のマイコバクテリウム・ツベルクロシスおよびマイコバクテリウム・カネッティを他方の前記ＭｔｂＣのその他の株から識別するための単一の増幅行程のマルチプレックスで使用できるプライマーの設計において、参照テンプレート配列として使用するのに適したポリヌクレオチドであって、
ここにおいて、前記参照テンプレートポリヌクレオチドが、請求項１４のセットから選択される、
ポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項４から８の何れか１項に記載の２つのプライマーペアのセットを、生体試料の増幅プライマーとして用いて得られるＩＳ６１１０アンプリコンであって、
ａ．１９９から２０３のヌクレオチドのサイズを有し、
ｂ．配列番号２の参照配列と、または配列番号２の全長にわたって配列番号２と完全に相補的な配列と、最小で９８％の配列同一性を有する、
ことを特徴とする、アンプリコン。
【請求項１７】
請求項４から８の何れか１項に記載の２つのプライマーペアのセットを、生体試料の増幅プライマーとして用いて得られるＲＤ９アンプリコンであって、
ａ．１７０から１７４のヌクレオチドのサイズを有し、
ｂ．配列番号８の参照配列と、または配列番号８の全長にわたって配列番号８と完全に相補的な配列と、最小で９８％の配列同一性を有する、
ことを特徴とする、アンプリコン。
【請求項１８】
請求項４から８の何れか１項に記載の２つのプライマーペアのセットを、生体試料にて行う増幅反応においてプライマーとして用いて得られるアンプリコンの検出に適したプローブであって、ここにおいて、前記プローブは：
−配列番号８の配列、もしくは配列番号８の全長にわたって配列番号８と完全に相補的である配列、または前記配列番号８の配列もしくは前記相補的配列の少なくとも１５ヌクレオチドかつ２９ヌクレオチド未満の断片、
または
−配列番号２の配列、もしくは配列番号２の全長にわたって配列番号２と完全に相補的である配列、または前記配列番号２の配列もしくは前記相補的配列の少なくとも１５ヌクレオチドかつ２９ヌクレオチド未満の断片
であることを特徴とするプローブ。
【請求項１９】
更に、少なくとも１つのビーコンアームを含む請求項１８に記載のプローブ。
【請求項２０】
ＲＤ９アンプリコンの検出に適した請求項１８に記載のプローブであって、それが、配列番号８に相補的な配列の断片であり、ここにおいて前記断片が配列番号９の配列を含むことを特徴とするアンプリコン。
【請求項２１】
ＩＳ６１１０アンプリコンの検出に適した請求項１８に記載のプローブであって、それが、配列番号３の配列を含む配列番号２の断片であることを特徴とするアンプリコン。
【請求項２２】
請求項１９または２０に記載のプローブであって、それが配列番号１０の配列を有することを特徴とするプローブ。
【請求項２３】
請求項１９または２１に記載のプローブであって、それが配列番号４の配列を有することを特徴とするプローブ。
【請求項２４】
５’末端にフルオロフォアをおよび／または３’末端に消光剤を更に含む、請求項１８から２３の何れか１項に記載のプローブ。
【請求項２５】
少なくとも１つの請求項１８から２４の何れか１項に記載のプローブ、および少なくとも１つの請求項９に記載のプライマーペアから成るＰＣＲセット。
【請求項２６】
結核菌群（ＭｔｂＣ）のマイコバクテリウムの特異的で高感度な検出における内部標準（ＩＣ）としての使用に適した、および／または一方のマイコバクテリウム・ツベルクロシスおよびマイコバクテリウム・カネッティの、他方前記ＭｔｂＣのその他の菌株からの特異的で高感度な識別に適したオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、前記ＩＣオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、以下のものを含むことを特徴とするオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド：
ａ．２つのプライマー結合部位配列；ここにおいて、前記２つのプライマー結合部位配列の他方と関連して５’に位置する前記２つのプライマー結合部位配列の１つが、請求項９に記載のプライマーペアの１メンバーと同一であり、および前記２つのプライマー結合部位配列の他方は、請求項９に記載の同じプライマーペアのその他のメンバーに完全に相補的である；および
ｂ．マイコバクテリウムに関連がなく、前記２つのプライマー結合部位配列の間に位置する配列。
【請求項２７】
請求項２６に記載のＩＣとしての使用に適したオリゴヌクレオチドであって、配列番号１３の配列を有することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項２８】
請求項２７に記載のＩＣオリゴヌクレオチドの検出に特に適合したプローブであって、配列番号１４の配列を有することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
結核菌群（ＭｔｂＣ）のマイコバクテリウムの特異的で高感度な検出のための、および／または一方のマイコバクテリウム・ツベルクロシスおよびマイコバクテリウム・カネッティの、他方の前記ＭｔｂＣのその他の株からの特異的で高感度な識別のためのキットであって、以下のものを含むことを特徴とするキット：
−少なくとも１つの、請求項４から８の何れか１項に記載の２対のプライマーのセット、
−少なくとも１つの、請求項９に記載のプライマーペア、
−少なくとも１つの、請求項１０から１３の何れか１項に記載のプライマー、
−少なくとも１つの、請求項１４に記載の２つの参照テンプレートポリヌクレオチドのセット、
−少なくとも１つの、請求項１５に記載の参照テンプレートポリヌクレオチド、
−少なくとも１つの、請求項１８から２４の何れか１項に記載のプローブ。
【請求項３０】
結核のｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断のためのキットであって、以下の要素の内少なくとも１つを含むことを特徴とするキット：
−少なくとも１つの、請求項４から８の何れか１項に記載の２対のプライマーのセット、
−少なくとも１つの、請求項９に記載のプライマーペア、
−少なくとも１つの、請求項１０から１３の何れか１項に記載のプライマー、
−少なくとも１つの、請求項１４に記載の２つの参照テンプレートポリヌクレオチドのセット、
−少なくとも１つの、請求項１５に記載の参照テンプレートポリヌクレオチド、
−少なくとも１つの、請求項１８から２４の何れか１項に記載のプローブ。
【請求項３１】
請求項２５または２６に記載のＩＣオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、および／または請求項２７に記載のＩＣプローブを更に含む、請求項２９または３０に記載のキット。
【請求項３２】
核酸抽出のための溶解緩衝液を更に含むことを特徴とする、請求項２９から３１の何れか１項に記載のキット。
【請求項３３】
前記溶解緩衝液が二価イオンに結合する陰イオン性レジンを含むことを特徴とする、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
生体試料中の結核菌群（ＭｔｂＣ）のマイコバクテリウムを検出するための、および／または一方のマイコバクテリウム・ツベルクロシスおよびマイコバクテリウム・カネッティの、他方の前記ＭｔｂＣのその他の菌株からの識別のための方法であって、２つの標的核酸配列の検出を含むことを特徴とする方法：
ここにおいて、前記２つの標的配列のうちの１つは、ＩＳ６１１０またはその断片であり、もう一方の標的配列はＲＤ９またはその断片であり、
ここにおいて、前記ＲＤ９標的の存在および前記ＩＳ６１１０標的の存在または非存在の検出は、Ｍ．ツベルクロシスまたはＭ．カネッティの何れかであるＭｔｂＣに属すマイコバクテリウムが前記生体試料中に存在することを表し、
ここにおいて、前記ＲＤ９標的の非存在および前記ＩＳ６１１０標的の存在の検出は、Ｍ．ツベルクロシスでないＭｔｂＣに属すマイコバクテリウムが前記生体試料に存在することを表し、
ここにおいて、前記ＲＤ９標的の非存在および前記ＩＳ６１１０標的の非存在の検出は、ＭｔｂＣに属すマイコバクテリウムが前記生体試料に存在しないことを表す。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法であって、
前記ＲＤ９標的配列は、配列番号８の配列、または配列番号８の全長にわたって配列番号８と完全に相補的である配列に存在し、および
前記ＩＳ６１１０標的配列は、配列番号２の配列、または配列番号２の全長にわたって配列番号２と完全に相補的である配列に存在する。
【請求項３６】
請求項３４または３５に記載の方法であって、前記ＲＤ９標的の存在および前記ＩＳ６１１０標的の非存在の検出は、Ｍ．カネッティまたは先祖型Ｍ．ツベルクロシス株の何れかであるＭｔｂＣに属すマイコバクテリウムが前記生体試料に存在することを表すことを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項３４または３５に記載の方法であって、前記ＲＤ９標的の存在および前記ＩＳ６１１０標的の存在の検出は、Ｍ．カネッティまたは現代型Ｍ．ツベルクロシス株の何れかであるＭｔｂＣに属すマイコバクテリウムが前記生体試料に存在することを表すことを特徴とする方法。
【請求項３８】
請求項３４または３５に記載の方法であって、前記ＲＤ９標的の非存在および前記ＩＳ６１１０標的の存在の検出は、Ｍ．ボビス、Ｍ．アフリカナム、Ｍ．カプラエ、Ｍ．ミクロチ、またはＭ．ピンニペディであるＭｔｂＣに属すマイコバクテリウムが前記生体試料に存在することを表すことを特徴とする方法。
【請求項３９】
ＰＣＲにより実行されることを特徴とする、請求項３４から３８の何れか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＰＣＲがマルチプレックスで実行されることを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
請求項３９または４０に記載の方法であって、前記ＰＣＲが請求項４から８の何れか１項に記載の２対のプライマーを増幅プライマーとして用いて実行されることを特徴とする方法。
【請求項４２】
請求項３９または４１に記載の方法であって、前記ＰＣＲが請求項１８から２４の何れか１項に記載の少なくとも１つのプローブを検出プローブとして用いて実行されることを特徴とする方法。
【請求項４３】
結核の診断のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、  
生体試料のＭｔｂＣのマイコバクテリウムの存在または非存在が、および／または
生体試料のＭ．ツベルクロシスまたはＭ．カネッティ株の存在または非存在が、および／または
生体試料のＭ．ツベルクロシスではないＭｔｂＣのマイコバクテリウムの存在または非存在が、
前記生体試料における、請求項３４から４２の何れか１項に記載の方法の実行によって決定されることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は結核、特に結核の診断に関する。本発明の手段は、結核の診断のための核酸標的としてＲＤ９およびＩＳ６１１０の両者を使用する。本発明は、特に、マイコバクテリウム種間の識別を可能とする。このことは正確な診断を可能とし、それによって適切な治療の選択のための有利な手段を提供する。
【発明の概要】
【０００２】
本発明は結核、特に結核の診断に関する。本発明の手段は、結核の診断のための核酸標的としてＲＤ９およびＩＳ６１１０の両者を使用する。本発明は、それゆえ、結核菌群（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ）（ＭｔｂＣ）に属する、マイコバクテリウムの検出に特に適した手段を提供する。本発明の手段は、更に、一方のＭ．ツベルクロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびＭ．カネッティ（ｃａｎｅｔｔｉ）の、他方のＭｔｂＣのその他の株（例えばＭ．ボビス（ｂｏｖｉｓ））からの識別を可能とする。
【０００３】
有利な特徴によると、本発明は、マルチプレックス−コンプライアント（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ−ｃｏｍｐｌｉａｎｔ）ＲＤ９およびＩＳ６１１０標的を提供し、それは特にマルチプレックスＰＣＲの実行に適しており、そのため前記ＭｔｂＣ検出および前記種識別は単一の増幅行程で達成できる。マルチプレックスＰＣＲの実施態様によれば、本発明の手段は、好都合に、マルチプレックスにおける異なる２つの核酸標的、すなわちＲＤ９標的およびＩＳ６１１０標的の増幅を可能とする。本発明の手段により、ＭｔｂＣに属すマイコバクテリウムの検出、および一方のＭｔｂＣのその他の株からの、他方のＭ．ツベルクロシスおよびＭ．カネッティの識別のために、わずか１度の単一の増幅工程が要求される。本発明の手段は、また、高速で信頼できる性能という長所を有する：患者のサンプルの採取の日と同日に、結果が利用可能となる。それらは、更に、特異的で、感度が高く、および信頼性が高い。
【背景技術】
【０００４】
世界保健機構は、世界の人口の１／３が結核菌に感染していると見積もっており、結核菌に感染する（しかし、ＨＩＶには感染していない）人々の５−１０％は、彼らの人生においてしばしば病気なり、又は感染症になると評価している。２００３年において１，７５０，０００人の死者が結核を原因としていると推定している。ＨＩＶおよび結核菌は、更に、互いに他方の進行を加速させ、致死的な組み合わせを形成する。
【０００５】
抗結核薬に対して天然で抵抗性を有する菌株が、調査を受けたあらゆる国で記録された。例えば、Ｍ．ボビスは、ピラジダミド（ｐｙｒａｚｉｄａｍｉｄｅ）に天然で抵抗性を有する。さらに、主要な抗結核剤に対して抵抗性を獲得した結核菌の菌株が、医療に対する不整合な、不完全な又は不規則な適合を主な原因として出現した。特に危険な薬剤耐性結核の形態は多剤耐性結核であり、これは、少なくとも最も強力な抗結核剤の２つである、イソニアジドおよびリファンピシンに対して耐性を示す結核菌によって生じる疾病として定義される。多剤耐性結核の割合は、一部の国、特に旧ソビエト連邦で高く、結核予防の努力を脅かす。
【０００６】
哺乳類（人間および／または動物）で結核を起こす細菌は、結核菌群（ＭｔｂＣ）として知られるものに分類されるマイコバクテリウムである。結核菌群は、特に以下のマイコバクテリウムを含む：マイコバクテリウム・アフリカナム（ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、マイコバクテリウム・ボビス（弱毒化Ｍ．ボビスＢＣＧ−カルメット−ゲラン杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）−を含む）、マイコバクテリウム・カネッティ、マイコバクテリウム・カプラエ（ｃａｐｒａｅ）、マイコバクテリウム・ミクロチ（ｍｉｃｒｏｔｉ）、マイコバクテリウム・ピンニペディ（ｐｉｎｎｉｐｅｄｉｉ）、マイコバクテリウム・ツベルクロシス。
【０００７】
結核菌群に分類されるマイコバクテリウムは、ヌクレオチドレベルで９９．９％の相同性を有し、同一の１６ＳｒＲＮＡ配列を有することで特徴付けられる。
【０００８】
それらのハウスキーピング遺伝子の保存性は非常に高度であるにもかかわらず、結核菌群のマイコバクテリウムは、宿主の向性、表現型および病原性に関して幅広く異なっている。一部はもっぱらヒトの病原体となり（Ｍ．ツベルクロシス、Ｍ．アフリカナム、Ｍ．カネッティ）、一部はもっぱら齧歯目の病原体となり（Ｍ．ミクロチ）、一方でその他は幅広い宿主の範囲を有することができる（Ｍ．ボビス、Ｍ．カプラエ）。Ｍ．ボビスおよびＭ．カプラエは、人間に加えて、牛またはヤギといった広範囲にわたる家畜または野生動物においても疾病を生じさせ得る。Ｍ．ミクロチは、ハタネズミのような小さい齧歯動物に感染し、より最近ではヒトにも感染することが報告された（Ｎｉｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００  Ｅｍｅｒｇ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  ６：  ５３９−５４２；  Ｋｕｂｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４１  ３０７０−３０７７．）。Ｍ．ピンニペディは、アザラシ（ｓｅａｌ）にする天然の宿主であると思われるが、この生物はまた、モルモット、ウサギ、ヒト、ブラジルバク（タピラス・テレストリス（Ｔａｐｉｒｕｓ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ））およびおそらく、牛の病原体となる（Ｃｏｕｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｓｙｓｔ．  Ｅｖｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ５３，  １３０５−１３１４）。
【０００９】
２から１２．７ｋｂのサイズにわたる１４の差異領域（Ｆｏｕｒｔｅｅｎ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）が同定されており、これは、Ｍ．ボビスＢＣＧには無いが、Ｍ．ツベルクロシスＨ３７Ｒｖゲノムには存在する。それらは、ＲＤ１からＲＤ１４と呼ばれる（Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９，  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３２，  ６４３−６５５；  Ｂｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４，  １５２０−１５２３参照）。本願で使用するＲＤ命名法は、Ｂｒｏｓｃｈらのそれである（Ｂｒｏｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ，  ｅｄｓ．  Ｈａｔｆｕｌｌ，  Ｇ．Ｆ．，  ＆  Ｊａｃｏｂｓ，  Ｗ．Ｒ．，  Ｊｒ．  （Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  ＤＣ），  ｐｐ．  １９−３６）。前記１４のＢＣＧ−Ｈ３７Ｒｖ＋ＲＤ領域のうちの１０は、結核菌群のその他のメンバーに関して、結核菌株の中で非常に保存されている。（ＲＤ１、ＲＤ２、ＲＤ４、ＲＤ７、ＲＤ８、ＲＤ９、ＲＤ１０、ＲＤ１２、ＲＤ１３、ＲＤ１４；  Ｂｒｏｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２，  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，  ９９（６），  ３６８４−３６８９）。
【００１０】
結核菌群のその他のメンバーと比較して、Ｍ．ツベルクロシスＨ３７Ｒｖのゲノムには無い６つの領域が記述された：
−５つのＨ３７Ｒｖ関連欠失（ＲｖＤ１からＲｖＤ５と称される）および
−Ｍ．ツベルクロシス特異的欠失１（ＴｂＤ１）として知られる領域
（Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９，  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３２，  ６４３−６５５；  Ｂｒｏｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９，  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ６７，  ５７６８−５７７４）。
【００１１】
ＴｂＤ１は、特に、ほとんどすべてのＭ．ツベルクロシス菌株のｍｍｐＬ６遺伝子から欠く２，１５３ｂｐ領域として最初に同定された（Ｂｒｏｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２，  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９９：３６８４−３６８９）。ＴｂＤ１領域の有無に基づいて、Ｍ．ツベルクロシス菌株は、「先祖（ａｎｃｅｓｔｒａｌ）」および「現代（ｍｏｄｅｒｎ）」型にそれぞれ分けることができる。大きな流行の原因となる北京、ハールレムおよびアフリカの菌株は、現代型である（Ｋｒｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３７，  ２６０７−２６１８；  Ｂｒｏｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２，  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，  ９９（６），  ３６８４−３６８９）。
【００１２】
結核の臨床徴候および症状は、それ自身でおよびそれ自身の信頼できる結核の診断を構成するのに十分特異的ではない。
【００１３】
診断は、従って、生体試料のマイコバクテリウム分析を通して実行され、ＭｔｂＣに属すマイコバクテリウムの有無の検出を意味する。
【００１４】
様々な生物学的および分子的なマイコバクテリウムの特徴は、ＭｔｂＣ分離株を同定するために利用された。
【００１５】
増殖、表現型および生化学的特性に基づく一連の古典的試験は、ＭｔｂＣのメンバーを区別するために伝統的に使用されてきた（Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３５，  ６６３−６６６；  Ｎｉｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３８，  ３２３１−３２３４）。しかしながら、これらの試験は、遅く、厄介で、不正確で、非再現性で、および時間がかかり得る。それらは更に、あらゆる場合に明白な結果をもたらすわけではなく、それゆえ結核の診断のための手段としての使用を妨げる。
【００１６】
結核診断のための現在の検出手段は、特に以下を含む：
−顕微鏡観察（直接観察および／または細胞染色）、
−細胞培養、
−Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ（登録商標）キット。
【００１７】
マイコバクテリウムは、非運動性の多形性の杆菌である。Ｍ．ボビスのコロニーは滑らかで劣性（すなわち小さいコロニー）であり、一方でＭ．ツベルクロシスコロニーは粗く優性である（すなわち大きいコロニー）。細菌コロニーの直接の観察は、しかしながらあまり特異的でない。また、それは非常に感度が高いわけでもない。というのは、サンプルが比較的高い濃度のマイコバクテリウム細胞（＞１０４／ｍＬ）を含むためである。
【００１８】
マイコバクテリウム属に属す生物は、ミコール酸を含み高い脂質含有量を有する独特の細胞外被を持つ。細胞が疎水性であり、１つにまとまる傾向があるため、それらは通常の染料（例えばグラム染色）を通さない。それらは、その脂質に富んだ細胞外被のために「抗酸性細菌」として知られ、色素がフェノールと組み合わされていない限り、さまざまな塩基性色素に対して比較的不浸透性である。一旦染色されると、細胞は、酸性化有機溶媒による脱色に対して抵抗性をもつため「抗酸性」と言われる。現在、２種類の抗酸性染色が、臨床的マイコバクテリウム研究において行われている。１のタイプはカルボールフクシン（チール−ネールセン［ＺＮ］またはキニョウン（Ｋｉｎｙｏｕｎ）法であり、その他は蛍光色素（オーラミンまたはオーラミン−ローダミン）である。特徴として、それらは、それらは、酸およびアルコールによる連続的なまたは併用的な処理の後、フクシンまたはオーラミン染色を保持する。抗酸性の顕微鏡観察の特異性がマイコバクテリウム種にとって優れているにも関わらず、感度は最適でない。顕微鏡観察の感度は、多数の因子に影響を受ける。例えば、疾病の罹患率および重症度、試料のタイプ、試料収集の品質、試料に存在するマイコバクテリウムの数、処理の方法（直接か濃縮されたか）、遠心分離の方法、染色技術、および試験の品質に影響を受ける。少なくとも１００（低所得国において）および好ましくは３００（先進工業国において）の顕微鏡浸漬視野（ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ  ｖｉｅｗ  ｆｉｅｌｄｓ）（または等価蛍光視野（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｖｉｅｗ  ｆｉｅｌｄｓ））の試験の後にのみ、陰性の結果が報告されることが推奨される。従って、顕微鏡観察が正しく行われるとき、それは時間を要し面倒と成り得る。疲労による偽陰性もまた、感度の低下に寄与する可能性がある。
【００１９】
マイコバクテリウムは、増殖の遅い細菌であり、通常の世代時間は１２〜１８時間である。コロニーは、通常３から１０週のインキュベーション時間後に初めて確認できるようになる。低濃度でマイコバクテリウム細胞を含むサンプルは、更に、幾度かの継代培養を必要とする。特異的な培地におけるマイコバクテリウム培養は、生体試料に含まれる特定のマイコバクテリウム種の同定を可能とする技術である。しかしながら、それは、特に感染工程の開始時にある患者では、時間を要す。
【００２０】
核酸ハイブリダイゼーション試験は、生体試料中のマイコバクテリウムを検出するために開発された。最初の試験は、直接のプローブハイブリダイゼーションを利用した。しかしながら、患者から採取した試料に含まれるマイコバクテリウム細胞の濃度は、通常、陽性のハイブリダイゼーションシグナルを与えるにはあまりに低い。従って、ＰＣＲ増幅を利用する試験が開発された。「増幅マイコバクテリウム・ツベルクロシス直接試験（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ（商標）  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｄｉｒｅｃｔ  ｔｅｓｔ）」キットとして商品化されたＧｅｎ−Ｐｒｏｂｅ（登録商標）キット、またはＭＴＤキット（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ９２１２１，  ＵＳＡ）は、ＭｔｂＣ特異的なｒＲＮＡの増幅（転写媒介増幅（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ））、その後のＧｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  ＨＰＡ法によるアンプリコン検出（ハイブリダイゼーションプロテクションアッセイ）を利用した。ＭＴＤ試験が陽性の場合、試料がＭｔｂＣのマイコバクテリウムを含むことを示す。しかしながら、阻害の問題のために、および不十分な感度のために、ＭＴＤ試験が陰性となっても、試料からＭｔｂＣ生物体が単離される可能性を除外できない。ＭＴＤ試験は、更に、様々なマイコバクテリウム種間での識別を行わない；それは、とりわけ、Ｍ．ボビスとＭ．ツベルクロシスとを識別しない。
【００２１】
ＢＣＧ接種を受けたそれらの人々がＭ．ボビス陽性である（例えば、彼らの尿試料は、Ｍ．ボビス陽性である）という事実のために、結核の診断は更に難しくなる。それ故、結核キャリアでないものの、Ｍ．ボビス陽性となる場合がありうる。このような状況のもと、それは生体試料が、Ｍ．ボビスでなく、とりわけＭ．ツベルクロシスであるＭｔｂＣマイコバクテリウムを含むかどうかの検出は、第１に重要である。
【００２２】
それ故、哺乳類から、とりわけ人間からから採取した試料に適用でき、Ｍ．ツベルクロシスをその他の主なＭｔｂＣ菌株から、とりわけＭ．ボビスから識別することができる診断手段の必要性が存在する。迅速で信頼できるＭｔｂＣ＋診断試験、および、好ましくは生体試料がＭ．ボビスでないＭｔｂＣに属すマイコバクテリウムを含む（ＭｔｂＣ＋Ｍｂ−）疑いがあるかどうかの迅速で信頼できる診断、最も好ましくは生体試料がＭ．ツベルクロシス細胞を含む（Ｍｔ＋）疑いがあるか、またはそれがＭ．ツベルクロシス細胞を含まない（Ｍｔ−）かどうかの迅速で信頼できる診断の必要がある。本発明は、そのような試験および手段を提供する。本発明の手段は、特に増幅に適しており、特にＰＣＲ増幅に適し、有利な特徴としてはマルチプレックスＰＣＲに適している。本発明のマルチプレックスＰＣＲの実施態様によれば、２つの異なる核酸標的は、マルチプレックスで、すなわち単一の増幅行程で増幅することができる：１つの標的はＩＳ６１１０内で適切に選択され、その他の標的はＲＤ９内で適切に選択される。
【００２３】
ＩＳ６１１０およびＲＤ９は当該分野の当業者に既知である。ＩＳ６１１０配列は、パスツール研究所（ＩＮＳＴＩＴＵＴ  ＰＡＳＴＥＵＲ）の名において、ＥＰ  ０  ４９０  ９５１  Ｂ１  （ＵＳ  ５，５９７，９１１；  ＵＳ  ５，８０７，６７２；  ＵＳ  ５，８３７，４５５）  および  ＥＰ  ０  ４６１  ０４５  Ｂ１  （ＵＳ  ５，７７６，６９３）に記載されている。Ｍ．ツベルクロシスＨ３７ＲｖのＩＳ６１１０配列（ＩＳ６１１０参照配列）は、アクセス番号Ｘ１７３４８  Ｍ２９８９９で利用できる。ＲＤ９配列は、例えば、パスツール研究所の名においてＷＯ  ００／５５６３２に記載されている（ＥＰ  １  １６１  ５６２  Ａ１；および対応する米国特許出願）。Ｍ．ツベルクロシスＨ３７ＲｖのＲＤ９配列（ＩＳ６１１０参照配列）は、ｃｏｂＬ、Ｒｖ２０７３ｃ、Ｒｖ２０７４およびＲｖ２０７５ｃ配列を含む。Ｍ．ツベルクロシスＨ３７ＲｖのＲＤ９配列は、Ｍ．ツベルクロシスＨ３７Ｒｖゲノムの位置２５０，２７１から位置２５４，１７６に及ぶ配列に相当し、これはアクセス番号ＢＸ８４２５７８（Ｍ．ツベルクロシスＨ３７Ｒｖゲノムのセグメント７／１３）として利用できる。
【００２４】
出願人の知る限りでは、先行技術は、しかしながら、ＩＳ６１１０の検出とＲＤ９の検出とを組み合わせることを示唆しない；先行技術は、マルチプレックスＰＣＲによるＩＳ６１１０およびＲＤ９の検出に適した手段を開示しない；および、先行技術は、本発明によってマルチプレックス−コンプライアント標的として選択されるＩＳ６１１０およびＲＤ９サブ配列（例えば、本発明による配列番号２および配列番号８）を開示しない。
【００２５】
本発明の手段は、特に、単一の増幅行程における非常に詳細で正確なマイコバクテリウムの情報の供給に適している。本発明は、それにより、結核の診断のための、高速で、信頼でき、特異的で、および高感度な手段を提供する。診断は、このように高速で正確なものとすることができ、このことは患者にとって直接の利点である。本発明の手段は、また、特定の医学的治療が感染症に対する何れかの効果を有す可能性があるか、または有しているかを評価する手段として使用することができる。それらが、Ｍ．ツベルクロシスをその他の主要なＭｔｂＣ菌株から識別するため、とりわけＭ．ツベルクロシスをＭ．ボビスから識別するため、本発明の手段は、更に、抗結核薬剤に対する耐性を十分に考慮に入れ、およびそれにより不適当な治療の適用を回避することを可能とする。それらは、更に、耐性バチルスの結果的な発生を回避する。
【発明の詳細な説明】
【００２６】
本願において、マイコバクテリウム・アフリカナム、マイコバクテリウム・ボビス、マイコバクテリウム・カネッティ、マイコバクテリウム・カプラエ、マイコバクテリウム・ミクロチ、マイコバクテリウム・ピンニペディ、およびマイコバクテリウム・ツベルクロシスのそれぞれは、学名の観点において異なる種を構成すると理解される。Ｍ．ボビスは、Ｍ．ボビス並びにＭ．ボビス由来の弱毒化Ｍ．ボビスＢＣＧ（例えばＭ．ボビス  パスツール、またはＭ．ボビス  トーキョー）を含む。当該分野において広範囲な文献から示されるように、前記種のそれぞれは当業者に既知である（例えば、Ｋｒｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３７，  ２６０７−２６１８；  Ｇｏｈ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３９，  ３７０５−３７０８；  Ｖａｎ  Ｓｏｏｌｉｎｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．  ３６，  １８４０−１８４５参照）。例証となる菌株は、特に、以下を含む：
−ＡＴＣＣ２７２９４、ＡＴＣＣ２５１７７、ＡＴＣＣ５１９１０（Ｍ．ツベルクロシス）；
−ＡＴＣＣ２５４２０、ＡＴＣＣ３５７１１（Ｍ．アフリカナム（サブタイプＩ））；
−ＡＴＣＣ１９４２２、ＡＴＣＣ３５７８２、ＡＴＣＣ１１１５２（Ｍ．ミクロチ）；
−ＡＴＣＣ１９２１０、ＡＴＣＣ３５７２５、ＡＴＣＣ３５７２６、ＡＴＣＣ３５７３０（Ｍ．ボビス）；
−ＡＴＣＣ２７２９０、ＡＴＣＣ３５７３６、ＡＴＣＣ３５７３７（Ｍ．ボビスＢＣＧ）；
−Ｍ．カプラエのＣＩＰ１０５７７６株（パスツール研究所コレクション（ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から利用可能、またはＡＴＣＣからＡＴＣＣ番号  ＢＡＡ  ８２４で利用可能）。  
ＡＴＣＣとは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ  Ｍａｎａｓｓａｓ，  Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０−２２０９）である。パスツール研究所コレクションまたはＣＩＰ（“Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｄｅ  ｌ’Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ”）とは、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｄｅ  ｌ’Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、パスツール研究所（２５−２８  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ，  Ｆ−７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５，  Ｆｒａｎｃｅ）である。
【００２７】
本発明は、２つのマイコバクテリウム核酸、すなわち、ＲＤ９およびＩＳ６１１０の適切な選択および使用に起因する。ＩＳ６１１０およびＲＤ９は当業者に既知である。ＩＳ６１１０はＩＳ様因子であり、これはＭ．ツベルクロシス参考株Ｈ３７Ｒｖでは１３６０ヌクレオチドから成る。Ｍ．ツベルクロシスＨ３７ＲｖのＩＳ６１１０配列は、アクセス番号Ｘ１７３４８  Ｍ２９８９９として利用できる。ＲＤ９は差異領域であり、これはＭ．ツベルクロシス参考株Ｈ３７Ｒｖでは１４６４ヌクレオチドから成る。Ｍ．ツベルクロシスＨ３７ＲｖのＲＤ９配列は、Ｍ．ツベルクロシスＨ３７Ｒｖのゲノム配列の位置２５０，２７１−２５４，１７６に相当し、これはアクセス番号ＢＸ８４２５７８のもとで利用できる（Ｍ．ツベルクロシス  Ｈ３７Ｒｖゲノムのセグメント７／１３）。
【００２８】
本発明によるＲＤ９およびＩＳ６１１０の使用は、一方のＭ．ツベルクロシスおよびＭ．カネッティの、他方のその他のＭｔｂＣからの、とりわけＭ．ボビスからの識別を可能とする。ＲＤ９およびＩＳ６１１０の双方の使用は以下のことを可能にする：
−ＭｔｂＣのマイコバクテリウムの検出、
−一方のＭ．ツベルクロシスおよびＭ．カネッティの、他方のＭｔｂＣその他の菌株からの識別。
【００２９】
本発明は、結核菌群（ＭｔｂＣ）のマイコバクテリウムの特異的で高感度な検出のための、および／または一方のマイコバクテリウム・ツベルクロシスおよびマイコバクテリウム・カネッティの他方の前記ＭｔｂＣのその他の株からの特異的で高感度な識別のための、核酸標的としてのＲＤ９およびＩＳ６１１０の双方の使用に関する。本発明は、結核のｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断のための、核酸標的としてのＲＤ９およびＩＳ６１１０の使用に関する。本発明は、従って、結核菌群（ＭｔｂＣ）のマイコバクテリウムの特異的で高感度な検出のための、および／または一方のマイコバクテリウム・ツベルクロシスおよびマイコバクテリウム・カネッティの、他方の前記ＭｔｂＣのその他の株からの特異的で高感度な識別のための、以下の双方の使用に関する：
−少なくとも１つのＩＳ６１１０標的化増幅プライマーペアまたはハイブリダイゼーションプローブ、および
−少なくとも１つのＲＤ９標的化増幅プライマーペアまたはハイブリダイゼーションプローブ。  
前記使用は、結核のｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断に適している。好ましくは、前記少なくとも１つのＩＳ６１１０標的化増幅プライマーペアまたはハイブリダイゼーションプローブは、ＩＳ６１１０特異的増幅プライマーペアまたはハイブリダイゼーションプローブであり、および前記少なくとも１つのＲＤ９標的化増幅プライマーペアまたはハイブリダイゼーションプローブは、ＲＤ９特異的増幅プライマーペアまたはハイブリダイゼーションプローブである。特異的プライマーペアまたはプローブとは、ここにおいて、その標的（ＩＳ６１１０またはＲＤ９）以外の何れかのマイコバクテリウム核酸とも交差反応せず、好ましくは何れかのヒト核酸とも交差反応しないプライマーペアまたはプローブを意味する。
【００３０】
本発明の手段は、特に、増幅およびとりわけＰＣＲ増幅に適している。有利な特徴として、本発明の手段は、特に、マルチプレックスＰＣＲに適している。本発明は、それ故、核酸標的としてのＲＤ９およびＩＳ６１１０の使用に関し、ここにおいて、前記ＩＳ６１１０およびＲＤ９は、マルチプレックスＰＣＲにおいて標的とされる。本発明のマルチプレックスＰＣＲの実施態様によると、２つの異なる核酸標的は、マルチプレックスにおける増幅、すなわち単一の増幅工程の増幅において、標的とされる：１つの標的は、ＩＳ６１１０核酸内で適切に選択され、その他の標的は、ＲＤ９核酸内で適切に選択される。本発明によって選択される特異的なＲＤ９およびＩＳ６１１０核酸標的は、以下のことを可能にする：
−ＭｔｂＣのマイコバクテリウムの検出、
−一方のＭ．ツベルクロシスおよびＭ．カネッティの、他方のＭｔｂＣのその他の菌株からの識別、および
−マルチプレックスで使用できるプライマー、すなわち、単一のマルチプレックス増幅行程で使用した場合でも特異的で感度が高いプライマーの設計。
【００３１】
本発明によると、生体試料においてＲＤ９およびＩＳ６１１０の存在（＋）または非存在（−）を評価した場合、ＲＤ９−ＩＳ６１１０＋反応は、試料が、Ｍ．ツベルクロシスでない結核菌群のマイコバクテリウムを含むこと（すなわちＭｔｂＣ＋Ｍｔ−）を意味する。ＲＤ９−ＩＳ６１１０−を除く何れかのその他のＲＤ９ＩＳ６１１０反応は、試料が、Ｍ．ツベルクロシスまたはＭ．カネッティである結核菌群のマイコバクテリウムを含む（すなわちＭｔｂＣ＋および（Ｍｔ＋またはカネッティ＋））ことを意味する。
【表１】
2009506782.tif 000002
【００３２】
本発明は、更に、Ｍ．ツベルクロシス種の範囲内における詳細な診断を提供する：
−ＲＤ９＋ＩＳ６１１０−反応は、生体試料が先祖型Ｍ．ツベルクロシス菌株を含むことを意味し、および
−ＲＤ９＋ＩＳ６１１０＋反応は、生体試料が、現代型Ｍ．ツベルクロシス菌株、または非常に希少なＭ．カネッティのどちらかを含むことを意味する。  
本発明は、従って、先祖型Ｍ．ツベルクロシス菌株を現代型Ｍ．ツベルクロシス菌株から識別し、および、先行技術において、ＩＳ６１１０を唯一のマーカーとして使用した場合にしばしば生じた偽陰性の結果の問題を回避する。
【表２】
2009506782.tif 000003
【００３３】
先祖型菌株は、ここにおいて、Ｍ．ツベルクロシスＴｂＤ１＋株として定義され、一方で、現代型Ｍ．ツベルクロシス菌株は、Ｍ．ツベルクロシス  ＴｂＤ１−株として定義される。ＴｂＤ１領域を含む先祖型Ｍ．ツベルクロシス株ｎｏ．７４からの遺伝子ｍｍｐＳ６およびｍｍｐＬ６の配列は、アクセス番号ＡＪ４２６４８６としてＥＭＢＬデータベースに寄託された（ＴｂＤ１の２，１５３ｂｐ、ＡＪ４２６４８６の位置３４０から位置２４９２まで及ぶ）。Ｂｒｏｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２，  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９９：３６８４−３６８９に記述されるＰＣＲ方法およびＴｂＤ１プライマーは、ＴｂＤ１が生体試料に存在するかどうかの評価のために使用することができる；前記Ｂｒｏｓｃｈらの文献のｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  ｍａｔｅｒｉａｌ中の表１を参照（ＴＢＤ１ｉｎｔＳ．ＦおよびＴＢＤ１ｉｎｔＳ．Ｒプライマー（それぞれ、ＣＧＴ  ＴＣＡ  ＡＣＣ  ＣＣＡ  ＡＡＣ  ＡＧＧ  ＴＡ  −  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５−およびＡＡＴ  ＣＧＡ  ＡＣＴ  ＣＧＴ  ＧＧＡ  ＡＣＡ  ＣＣ  −  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６−）、ならびにＴＢＤ１ｆｌａ１−ｆおよびＴＢＤ１ｆｌａ１−Ｒプライマー（それぞれ、ＣＴＡ  ＣＣＴ  ＣＡＴ  ＣＴＴ  ＣＣＧ  ＧＴＣ  ＣＡ  −  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７−およびＣＡＴ  ＡＧＡ  ＴＣＣ  ＣＧＧ  ＡＣＡ  ＴＧＧ  ＴＧ  −  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８−）が記載される）。
【００３４】
現代型Ｍ．ツベルクロシス株の例は、特に、Ｍ．ツベルクロシス単離株Ｈ３７Ｒｖ、およびＭ．ツベルクロシス単離株Ｈ３７Ｒａを含む。Ｍ．ツベルクロシス単離株Ｈ３７Ｒｖの完全なゲノムは、配列決定された（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３９３，  ５３７−５４４）。配列はまた、ＩＤ  ＭＴＢＨ３７ＲＶ（アクセス番号ＡＬ１２３４５６）の下、利用できる。ＴｂＤ１（Ｍ．ツベルクロシス特異的欠失１）は、主要な伝染病（例えばハールレム、北京およびアフリカクラスタ）由来の代表的な菌株を含むＭ．ツベルクロシス株の約８７％にて存在しない（Ｋｒｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３７，  ２６０７−２６１８；  Ｂｒｏｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２，  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，  ９９（６），  ３６８４−３６８９）。
【００３５】
Ｍ．カネッティは、結核様の症状を示すヒト患者の中では希少な罹患率を持つ。それ故、ＲＤ９＋ＩＳ６１１０＋反応は、最も頻繁にＭｔｂＣ＋およびＭｔ＋（すなわち、Ｍ．ツベルクロシスである結核菌群のマイコバクテリウム）を意味する。
【００３６】
にもかかわらず、Ｍ．ツベルクロシスの存在（すなわちＭｔ＋）とＭ．カネッティの存在（すなわちカネッティ＋）とを識別すること望む場合、当業者は適切な手段を利用できる。実際、Ｍ．カネッティは、Ｍ．ツベルクロシスの非常に希少で滑らかな変種であり、普通、アフリカからのまたはアフリカにつながりのある患者から単離される。それは、同一の１６ＳｒＲＮＡ配列をＭ．ツベルクロシス、複合体のその他のメンバーと共有し、全てのＲＤおよびＲｖＤ、ならびにＴｂＤ１領域を含むにも関わらず、Ｍ．カネッティ菌株は、特定のハウスキーピング遺伝子の多形性、ＩＳ１０８１コピー数、コロニーの形態、および細胞壁の脂質含有量を含む多くの点で異なり、特に以下の点で異なる：
ｉ．Ｍ．カネッティは、結核菌群のその他の何れのメンバーにも存在しないＤＲ領域における２６のユニークなスペーサー配列を保持することが示されている（Ｖａｎ  Ｅｍｂｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８２，  ２３９３−２４０１）；
ｉｉ．Ｍ．カネッティは、Ｂｒｏｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２，  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，  ９９（６），  ３６８４−３６８９に記述されるように、特異的なＲＤｃａｎ領域がないことが特徴づけられ、これは部分的にＲＤ１２と重複しており、しばしばＲＤ１２−ｃａｎ欠失と称される。Ｍ．ツベルクロシスＨ３７Ｒｖゲノムと関連して、Ｍ．カネッティ分離株１４００００５９のＲＤ１２−ｃａｎ欠失配列は、アクセス番号ＡＪ５８３８３３でＥＭＢＬデータベースに寄託されている；
ｉｉｉ．Ｍ．カネッティは、単一コピーのＩＳ１０８１挿入配列の存在によって特徴づけられる（Ｍ．ボビスＩＳ１０８１は、アクセス番号Ｘ６１２７０として利用できる）；
ｉｖ．Ｍ．カネッティ細胞は滑らかなコロニーを形成し、一方Ｍ．ツベルクロシス細胞は粗いコロニー形成する。
【００３７】
それ故、当業者がＭ．カネッティからＭ．ツベルクロシスを識別しようとする何れの状況においても、ｉからｉｖの特徴の何れか１つ、または複数を使用することができる。
【００３８】
以下の表３のように要約される。
【表３】
2009506782.tif 000004
【００３９】
上記の表３に示されるパターンは典型的ものであり、すなわち、示された種に属す菌株の、全てではないにしても、大多数において認められる。
【００４０】
本発明は、更に、前記ＲＤ９およびＩＳ６１１０核酸内で選択された核酸標的を提供する。これらの選択されたＲＤ９およびＩＳ６１１０核酸標的は、診断応用に要求される、非常に高いレベルの特異性を備えている：それらの検出は、微生物または哺乳類由来のその他のいかなる核酸との混同が生じることなく、ＲＤ９およびＩＳ６１１０核酸が評価する試料中に存在することを確実に示す。これらの選択された標的は、好都合に、マルチプレックス（すなわち、同じ増幅行程）にて使用できる一方で、非常に感度が高くおよび非常に特異的に維持されるプライマーの設計を可能にする。そのようなプライマーは、交差ハイブリッド形成をもたらさず、そのため要求される特異性を保持し、および試料当り１マイコバクテリウムＣＦＵと同程度の感度を維持する（下記の例参照）。
【００４１】
本発明の選択されたＲＤ９およびＩＳ６１１０核酸標的は、以下の配列を持つ：
−ＩＳ６１１０標的の配列番号２の配列、または前記配列番号２の全長に対して完全に相補的である配列、
−ＲＤ９標的の配列番号８の配列、または前記配列番号８の全長に対して完全に相補的である配列。  
配列番号２のＩＳ６１１０標的は、位置３７２から５７２（開始および終了の位置を含む）の、Ｍ．ツベルクロシスＨ３７Ｒｖ  ＩＳ６１１０（アクセス番号Ｘ１７３４８  Ｍ２９８９９）の断片である：
【化１】
2009506782.tif 000005
【００４２】
配列番号８のＲＤ９標的は、Ｍ．ツベルクロシスＨ３７Ｒｖ  ＲＤ９の断片である。Ｍ．ツベルクロシスＨ３７ＲｖゲノムのＲＤ９配列は、アクセス番号ＢＸ８４２５７８として利用できるＨ３７Ｒｖ配列の位置２５０，２７１から位置２５４，１７６まで及ぶ。Ｍ．ツベルクロシスＨ３７ＲｖのＲＤ９配列の範囲内に含まれるＲｖ２０７５ｃ配列は、アクセス番号ＢＸ８４２５７８の下で利用できるＨ３７Ｒｖ配列の位置２５２，７１３から位置２５４，１７６まで及ぶ。配列番号８のＲＤ９標的は、前記Ｒｖ２０７５ｃ配列の位置３９０から５６１（開始および終了の位置を含む）に及び、すなわち以下の配列である：
【化２】
2009506782.tif 000006
【００４３】
本発明は、従って、結核菌群（ＭｔｂＣ）のマイコバクテリウムを検出するための、および／または一方のマイコバクテリウム・ツベルクロシスおよびマイコバクテリウム・カネッティを他方の前記ＭｔｂＣのその他の株から識別するための単一の増幅行程のマルチプレックスで使用できるプライマーの設計において、参照テンプレート配列として使用するのに適した１組の２ポリヌクレオチドに関し、
ここにおいて、前記２つの参照テンプレートポリヌクレオチドのうちの１つはＲＤ９の断片であり、他方はＩＳ６１１０の断片であり、
ここにおいて、前記ＩＳ６１１０断片は、配列番号２の配列に、または配列番号２の全長に完全に相補的である配列に存し、
および
ここにおいて、前記ＲＤ９断片は、配列番号８の配列に、または配列番号８の全長に完全に相補的である配列に存する。
【００４４】
前記ＩＳ６１１０断片は、好都合に、Ｍ．ツベルクロシス株Ｈ３７ＲｖのＩＳ６１１０配列の位置３７２から５７２にわたる断片（開始および終了の位置を含む）である（Ｍ．ツベルクロシスＨ３７Ｒｖ  ＩＳ６１１０配列は、アクセス番号Ｘ１７３４８  Ｍ２９８９９として利用できる）。前記ＲＤ９断片は、好都合に、Ｍ．ツベルクロシス株Ｈ３７ＲｖのＲＤ９配列の位置３９０から５６１に及ぶ断片（開始および終了の位置を含む）である（Ｍ．ツベルクロシスＨ３７Ｒｖゲノムのセグメント７／１３の配列は、アクセス番号ＢＸ８４２５７８として利用できる；ＲＤ９は、この配列の位置２５２，７１３−２５４，１７６に相当する）。
【００４５】
配列番号２の前記選択されたＩＳ６１１０標的の増幅、および配列番号８の前記選択されたＲＤ９標的の増幅をもたらし得るように、そのような参照テンプレート配列から選択されたプライマーは、なお特異的なおよび感度が高い検出および識別を提供しつつ、単一増幅工程でマルチプレックスで使用できる。
【００４６】
本発明は、また、個々の前記参照テンプレート配列のそれぞれに関し、すなわち、結核菌群（ＭｔｂＣ）のマイコバクテリウムを検出し、および／または一方のマイコバクテリウム・ツベルクロシスおよびマイコバクテリウム・カネッティを他方の前記ＭｔｂＣのその他の菌株から識別するための単一の増幅行程でマルチプレックスで使用できる、プライマーの設計における参照テンプレート配列としての使用に適したポリヌクレオチドに関し、ここにおいて、前記参照テンプレートポリヌクレオチドは、２つのポリヌクレオチドの前記セットから選択される。
【００４７】
本発明は、それゆえ、マルチプレックスで使用されても感度および特性が維持され、それゆえ単一の増幅工程で前記ＭｔｂＣ検出および前記種識別が達成できる、特異的で高感度な増幅プライマーおよびプローブを提供する。これらのプライマーおよびプローブは、有利に、前記ＩＳ６１１０およびＲＤ９標的を参照して設計される。
【００４８】
増幅方法、特にポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）およびＰＣＲに基づく方法は、当該分野において既知である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ；  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，  Ａｌｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．；  ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，  ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ；  Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，  Ｍｕｌｌｉｓ，  Ｆｅｒｒｅ，  ａｎｄ  Ｇｉｂｂｓ，  Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ  Ｂｏｓｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ；  Ｇｅｎｅ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  Ｆｅｒｒｅ，  Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ  Ｂｏｓｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ．）。
【００４９】
本発明は、特に生体試料におけるマルチプレックスＰＣＲ、およびより特に少なくともデュープレックスＰＣＲ（２つの標的、すなわちＩＳ６１１０およびＲＤ９）、最も好ましくは少なくともトリプレックスＰＣＲ（２つの標的、すなわちＩＳ６１１０およびＲＤ９、ならびに１つの内部標準）の実行に適している核酸（オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド）を記述する。
【００５０】
マルチプレックスＰＣＲとは、ここにおいて、１を越える標的の増幅を目的とする何れのＰＣＲ反応と解される。例えば、マルチプレックスＰＣＲは、デュープレックスＰＣＲ（２つの標的）、トリプレックスＰＣＲ（３つの標的）およびより高いマルチプレックスＰＣＲを含む。
【００５１】
当然、本発明による核酸は、また、シンプレックスプロトコール、マルチプレックスプロトコール、エンド−ポイントプロトコール、定性的プロトコール、定量的プロトコール、それらの組合せなどを含むその他のプロトコールに適している。核酸とは、ここにおいて、あらゆる核酸と解される：それは、合成または非合成、組換え型または天然型、直線形または環形と成り得る。これは、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。核酸は、一本鎖または二重鎖または、さらには、３本鎖の何れかと成り得る。それは、様々な生物学的供給源を由来とすることができ、例えば、微生物（細菌など）または高等生物、例えば哺乳類細胞（例えばヒト細胞または非ヒト哺乳類細胞）を由来とすることができる。核酸は、また、全ＤＮＡ、全ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ＢＡＣ  ＤＮＡおよびそれらの混合物を含むことができる。さらに、核酸は様々な状態の純度を考えることができる。試料とは、ここにおいて、天然または非天然の、何れの試料と解される。好ましくは、前記試料は、生物学的起源を由来とする。前記試料は、また、細胞培養上清を由来としてもよい。好ましい実施態様において、前記試料は、気管支の吸引液、気管支の洗浄液、痰、肺組織、脳脊髄液、血液、尿であり、またはそれらを由来とする。前記試料は、また、予備工程から生じてもよい。例えば、前記試料は、精製および／または抽出方法にから入手可能であってもよい。特に、前記試料は、生体試料で行われる分離および／または精製および／または抽出過程に起因してもよい。前記試料は、また、対照試料でありえる。対照試料は、定性的対照、正の対照、負の対照、定量的対照および較正対照としての試料を含む。前記対照は、内部的ならびに外部的でありえる。本発明による何れの試料も、数回存在しうる。例えば、前記試料は、２倍で、３倍で、４倍で、複数倍で提供することができ、このことは定量的実験の場合において有利である。
【００５２】
当業者は、標的テンプレートの概念に精通している。前記標的テンプレートは、その存在が前記方法で評価される何れかの核酸とすることができる。前記標的テンプレートは、おそらく、しかし必然的でなく、前記方法で増幅される核酸（ＰＣＲアンプリコン）である。
【００５３】
ポリヌクレオチドとは、ここにおいて、ヌクレオチドの何れかのポリマーと解され、ここにおいて、ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、変性ヌクレオチドなどと成り得る。前記ヌクレオチドは、好ましくは一本鎖であり、しかしまた、二本鎖でありえる。前記ポリヌクレオチドの長さは、変えることができ、および、好ましくは５００ヌクレオチド（ｎｔ）未満、好ましくは５０−４００ｎｔの範囲、より好ましくは１００−３００ｎｔ、さらにより好ましくは１５０−２５０ｎｔである。例えば、配列番号２の選択されたＩＳ６１１０標的は２０１ｎｔであり、および、配列番号８の選択されたＲＤ９標的は１７２ｎｔである。
【００５４】
オリゴヌクレオチドとは、ここにおいて、ヌクレオチドの何れかの短いポリマーと解され、ここにおいて、ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、変性ヌクレオチドなどでありえる。前記オリゴヌクレオチドは、好ましくは一本鎖である。前記オリゴヌクレオチドの長さは、変えることができ、および、通常１５０ヌクレオチド（ｎｔ）未満、好ましくは１０−１００ｎｔの範囲、より好ましくは１５−６０ｎｔ、さらにより好ましくは１８−５０ｎｔである。前記オリゴヌクレオチドは、例えば放射能、蛍光、ビオチン標識、ｄｉｇラベリングによるタギングまたはマーキングといった、化学修飾を付与することができる。本発明によるオリゴヌクレオチドは、フォワード（センス）またはリバース（アンチセンス）の何れかでありえる。加えて、好ましい機能が、本発明による一部のオリゴヌクレオチドに関連して言及してもよいにもかかわらず、所定のオリゴヌクレオチドに、いくつかの機能を想定してもよく、および本発明による異なるやり方で使用してもよいことが明確であることは強調しなければならない。例えば、オリゴヌクレオチドは、プライマーまたはプローブの何れかとして使用することができる。また、オリゴヌクレオチドが、プローブとして有用であるとして記述されるとき、当業者は、このオリゴヌクレオチドの相補的配列は、同じアンプリコンを標的とするプローブとして等しく有用であることを理解する。さらに、マルチプレックス分析にふさわしいどんなプライマーもまた、本発明の意味の範囲内において、シンプレックスプロトコールに使用することができるということも明らかである。本発明によるオリゴヌクレオチドは、特に、ＰＣＲプライマーおよびプローブを含む。特に明記しない限り、核酸配列は、５’から３’方向で示される。前記オリゴヌクレオチドは、望ましい溶媒および望ましい濃度の溶液／懸濁液中、多くの形態の下で、例えば乾燥した状態の下で存在することができる。当業者は、どの溶媒、濃度、貯蔵条件が、本発明のオリゴヌクレオチドにふさわしいかを知っているだろう。特に、当業者は、前記オリゴヌクレオチドを原液としてどのように作製するかを知っているだろう。本発明によるオリゴヌクレオチドは、また、例えばＨＰＬＣクロマトグラフィーによって当業者が判断できるように、様々な純度の程度を想定することができる。
【００５５】
本適用において、生成物、例えば核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、プライマー、プローブ、アンプリコン、参照テンプレート配列等が、定義された配列を含むと言う場合、そのような表現の範囲は、前記生成物が前記定義された配列にある状況を含むように理解されるべきである。
【００５６】
プライマーまたはＰＣＲプライマーの概念は、当業者に既知である。例えば、それは適切な厳密性条件の下で標的テンプレートにアニールでき、ポリメラーゼ鎖伸長を可能とするオリゴヌクレオチドを含む。プライマーの典型的な長さは、１０−３０ｎｔ、好ましくは１０−１８ｎｔに、最も好ましくは１５−１８ｎｔ、例えば１５、１６、１７または１８ｎｔである。適切な厳密性条件は、特に、高い厳密性の条件を含む。高い厳密性の例証となる条件は、核酸ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄の際に使用される温度およびイオン性の条件である。「非常に厳密な条件」ならびにハイブリダイゼーションの速度に影響を及ぼす因子は、当業者に既知であり、例えばＭａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  １９８２，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに見ることができる。一般に、非常に厳密な条件は、定義されたイオン強度およびｐＨにおいて、オリゴヌクレオチドの熱融点（Ｔｍ）より約５から２０℃低く選択される。Ｔｍは、５０％の相補的な標的配列が、完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする（定義されたイオン強度およびｐＨの下での）温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのために、Ｔｍは、Ｔｍ＝６９．３＋０．４１ｘ（ＣＧ）％−６５０／Ｌの方程式（ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９８４，  １３８：２６７−２８４）で見積もることができる：ここにおいて、Ｌは、ヌクレオチドにおけるプローブの強さである。「非常に厳密な条件」はまた、洗浄方法にも適用される。厳密性のその他の例証となる条件は、後述する例にて示される。
【００５７】
プローブの概念は、また、当業者に既知である。例えば、それは、望ましいハイブリダイゼーション条件の下で標的テンプレートにアニールできるオリゴヌクレオチドを含む。プローブの典型的な長さは、１５−６０ｎｔ、好ましくは１５−４０ｎｔ、より好ましくは１５−３０ｎｔ、最も好ましくは１５−２８ｎｔ、例えば１６−２７ｎｔである。好ましくは、前記プローブは蛍光標識される。しかしながら、特定の状況では、プローブとしてプライマーを使用してよく、およびその逆であってもよいことは当業者に明らかである。さらに、本発明による生成物、特にオリゴヌクレオチドは、とりわけ、ここに言及される意図された使用に限定されず、むしろ示された目的に関わらず広く解釈すべきであることが強調される。例えば、特定の使用のための生成物（オリゴヌクレオチド）に対する請求項は、明示された使用に実際に適した生成物（オリゴヌクレオチド）を意味するよう解釈すべきである。したがって、マルチプレックスプロトコールにおけるプライマーとしての使用に適したオリゴヌクレオチドはまた、本発明の意味の範囲内でシンプレックスプロトコールに明確に適している。Ｔａｑｍａｎ（商標）プローブ（加水分解プローブ）、分子ビーコン（ビーコンプローブまたは分子ビーコンプローブ）およびＳｃｏｒｐｉｏｎ（商標）プローブを含む様々なフォーマット（タイプ）のプローブは当該分野において既知である。核酸プローブは、それらのヌクレオチド配列内における、挿入薬剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）、例えば１または複数の挿入色素を含んでよい。
【００５８】
好ましい実施態様において、本発明によるプローブは、全て合成でき、および分子ビーコンフォーマットに使用できる。分子ビーコンの構造は、以下の通りである。標的配列に無関係な短いヌクレオチド配列（いわゆるビーコンアーム）は、従って、プローブの両端に共有結合する。短い無関係なアームは、従って、プローブの５’に結合し、蛍光成分（すなわち蛍光色素または蛍光マーカー）で標識される。別の、しかしなお無関係なアームは、プローブの３’末端に結合し、蛍光消光成分で標識される。この為、分子ビーコンは、相対する両端にフルオロフォアおよび消光剤を有している。５’ショートアームは、３’のものと完全に相補的であり、それらは一緒にアニールすることができ、従って、溶液中で標的にハイブリダイズしない場合、ヘアピン構造を想定できる。このヘアピン高次構造において、消光剤および蛍光色素は、互いに十分近接しフルオロフォアの効率的な消光が可能となる。しかしながら、プローブが標的分子に遭遇するとき、ビーコンアームＴｍおよびプローブＴｍの値が最適に選択されている場合（理論的には：プローブＴｍ＞ビーコンアームＴｍ＞プライマーＴｍ、ここにおいて、Ｔｍは対象の融解温度である）は、アニーリングはヘアピン高次構造に関して好ましい。フルオロフォアおよび消光剤が互いに遠ざかり、フルオロフォアが適切な光の励起で照らされた場合に、蛍光を発することができる。ＰＣＲの進行に伴い、増幅産物は蓄積し、および何れの所定のサイクルにおける蛍光の量は、その時存在する増幅産物の量に依存する。（例えば、Ｓａｎｊａｙ  Ｔｙａｇｉ  ａｎｄ  Ｆｒｅｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ｋｒａｍｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９６，  ｖｏｌｕｍｅ  １４，  ｐａｇｅｓ  ３０３−３０８；  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９８，  ｖｏｌｕｍｅ  １６，  ｐａｇｅｓ  ４９−５３参照）。もちろん、３’末端にフルオロフォアをつなぎ、一方で５’末端に消光剤を結合することもできる。図式的に、前記プローブは、以下の式（分子ビーコンフォーマット）を有することができる：
５’フルオロフォア−（アーム１）−プローブ（アーム２）−消光剤３’
５’消光剤−（アーム１）−プローブ（アーム２）−フルオロフォア３’
ここにおいて、アーム１およびアーム２は、例えば、３−１０のヌクレオチド、好ましくは５、６、７のヌクレオチドの範囲の、適切な厳密性条件の下でのヘアピン構造形成を可能にする、あらゆる短いヌクレオチド配列とすることができ、すなわち、アーム１およびアーム２は、望ましい厳密性条件の下でアニールするために、完全に相補的である（標準的ＰＣＲ厳密性条件は、例えば５５から６５℃のアニーリング温度および４から８ｍＭのＭｇ濃度を含む）。しかしながら、アーム１およびアーム２は、プローブの標的配列に無関係であり、すなわち、アーム１とアーム２との間のアニーリングによるヘアピン高次構造は、ハイブリダイズしていない状態では、プローブの本質的に唯一の生じうる二次構造である。当業者は、どのように所定のプローブに対するそのようなアームを選択するかを知っているだろう。例えば、考えられるビーコンフォーマットは、以下を含む：
ＣＧＴＧＣＧ−（プローブ配列）−ＣＧＣＡＣＧ
ＡＴＧＣＧＧ−（プローブ配列）−ＣＣＧＣＡＴ。
【００５９】
フルオロフォアとは、ここにおいて、当該分野において既知の何れかの蛍光マーカー／色素と解される。そのような適切な蛍光マーカーの例は、Ｆａｍ、Ｈｅｘ、Ｔｅｔ、Ｊｏｅ、Ｒｏｘ、Ｔａｍｒａ、Ｍａｘ、Ｅｄａｎｓ、Ｃｙ色素（例えばＣｙ５）、フルオレッセイン、クマリン、エオシン、ローダミン、Ｂｏｄｉｐｙ、Ａｌｅｘａ、カスケードブルー（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ）、ヤキマイエロー（Ｙａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗ）、ルシファーイエローおよびテキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）（これら全てが商標である）を含む。消光剤とは、ここにおいて、当該分野で既知の何れか消光剤と解される。そのような消光剤の例は、Ｄａｂｃｙｌ、ダーククエンチャー（Ｄａｒｋ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）、エクリプスダーククエンチャー（Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｄａｒｋ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）、エルクエンチャー（ＥｌｌｅＱｕｅｎｃｈｅｒ）、Ｔａｍｒａ、ＢＨＱおよびＱＳＹ（これら全てが商標である）を含む。当業者は、色素／消光剤のどの組合せが、プローブを設計する際に適していることを知っているだろう。本発明による好ましい実施態様において、前記プローブのスペクトル特性は、互いに干渉しないよう選択することができる。特に、プローブがマルチプレックスで使われるとき、各々の単一のプローブは、互いに分光的に有意に異なる自身のフルオロフォアを有することができ、すなわち、吸収／発光スペクトルは、本質的に非オーバーラップである。これは、好都合に、全ての単一のプローブのために低ノイズマルチプレックス検出を可能とし、検出において個々のシグナルが互いに干渉しないことを確かなものとする。マルチプレックスにて一緒に使用できる色素の例は、ＦａｍとＴａｍｒａ、ＦａｍとＴａｍｒａとテキサスレッドを含む。本発明によれば、全ての提供されるオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、別々に維持され、または部分的に混合され、または完全に混合される状態の何れかとすることができる。前記オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、当業者に判断されるように、乾燥形態で、または適切な溶媒に溶解した状態で提供することができる。適切な溶媒は、ＴＥ、ＰＣＲ等級水などを含む。
【００６０】
本発明は、配列番号２の前記選択されたＩＳ６１１０標的の増幅をもたらし得るように設計されたプライマーペア、および配列番号８の前記選択されたＲＤ９標的の増幅をもたらし得るように設計されたプライマーペアに関する。
【００６１】
本発明は、従って、少なくとも２対のプライマーを含む、一組のプライマーに関する。前記少なくとも２対のプライマーは、結核菌群（ＭｔｂＣ）のマイコバクテリウムの特異的なおよび高感度な検出に、および／または一方のマイコバクテリウム・ツベルクロシスおよびマイコバクテリウム・カネッティを他方の前記ＭｔｂＣのその他の菌株からの特異的で感度が高い識別に適している。前記少なくとも２対のプライマーは、マルチプレックスで単一の増幅行程で使用できる一方で、まだ特異的で感度が高い検出および識別を提供するような配列を有する。前記少なくとも２対のプライマーは、ＩＳ６１１０フォワードプライマーおよびＩＳ６１１０リバースプライマーから成るＩＳ６１１０プライマーペア、ならびにＲＤ９フォワードプライマーおよびＲＤ９リバースプライマーから成るＲＤ９プライマーペアである。前記ＲＤ９フォワードプライマーは、配列番号８の配列の１０〜１８のヌクレオチドの５’末端断片であり、前記５’末端断片は、前記配列番号８のまさに最初の５’ヌクレオチドから開始する。前記ＲＤ９リバースプライマーは、前記配列番号８の全長にわたって前記配列番号８に完全に相補的である配列の１０から１８ヌクレオチドの５’末端断片であり、前記５’末端断片は、前記相補的配列のまさに最初の５’ヌクレオチドから開始する。前記ＩＳ６１１０フォワードプライマーは、配列番号２の配列の１０から１８のヌクレオチドの５’末端断片であり、前記５’末端断片は、前記配列番号２のまさに最初の５’ヌクレオチドから開始する。前記ＩＳ６１１０リバースプライマーは、前記配列番号２の全長にわたって前記配列番号２に完全に相補的である配列の１０から１８ヌクレオチドの５’末端断片であり、前記５’末端断片は、前記相補的配列のまさに最初の５’ヌクレオチドから開始する。前記それぞれのプライマーは、好ましくは、１０から１８ヌクレオチド、１１から１８ヌクレオチド、１２から１８ヌクレオチド、１３から１８ヌクレオチド、１４から１８ヌクレオチド、１５から１８ヌクレオチド、１６から１８ヌクレオチド、１７から１８ヌクレオチド、例えば１７ヌクレオチドの断片である。前記ＲＤ９フォワードプライマーは、好都合に、配列番号１１（ＲＤ３８９プライマー）の配列を含んでもよい。前記ＲＤ９リバースプライマーは、好都合に、配列番号１２（ＲＤ５６１プライマー）の配列を含んでもよい。前記ＩＳ６１１０フォワードプライマーは、好都合に、配列番号５（ＩＳ３６８プライマー）の配列を含んでもよい。前記ＩＳ６１１０リバースプライマーは、好都合に、配列番号６（ＩＳ５６９プライマー）の配列を含んでもよい。好ましくは、前記ＩＳ６１１０フォワードおよびリバースプライマーは、（お互い独立して）１０−１８ヌクレオチド、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８ヌクレオチドである。最も好ましくは、前記ＩＳ６１１０フォワードおよびリバースプライマーは、（お互い独立して）１４−１８ヌクレオチドで、例えば、１５−１８、１５−１７、例えば１５、１６または１７ヌクレオチドである。好ましくは、前記ＲＤ９フォワードおよびリバースプライマーは、（お互い独立して）１０−１８ヌクレオチドであり、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８ヌクレオチドである。最も好ましくは、前記ＲＤ９フォワードおよびリバースプライマーは、（お互い独立して）１４−１８ヌクレオチドであり、例えば１５−１８、１５−１７、例えば１５、１６または１７ヌクレオチドである。本発明はまた、個々の実体として、前記それぞれのプライマーペア、および前記それぞれのプライマーに関する。本発明は、従って、少なくとも２つのプライマーペア（すなわち、ＲＤ９プライマーペアまたはＩＳ６１１０プライマー）の前記セットから選択されるプライマーペア、およびそのようなプライマーペア（すなわち、ＲＤ９フォワードプライマー、ＲＤ９リバースプライマー、ＩＳ６１１０フォワードプライマー、ＩＳ６１１０リバースプライマー）から選択されるプライマーに関する。
【００６２】
Ｍ．ツベルクロシス参考株Ｈ３７Ｒｖと異なるＭｔｂＣマイコバクテリウムを含む生体試料の増幅プライマーとして、配列番号２の前記選択されたＩＳ６１１０標的の増幅ができるように設計されたプライマーペア、および配列番号８の前記選択されたＲＤ９標的の増幅ができるように設計されたプライマーペアを使用することは、ＩＳ６１１０アンプリコンおよび／またはＲＤ９アンプリコンの生成をもたらすと考えられ、それらの配列は、前記試料中に存在する特定のＭｔｂＣマイコバクテリウム菌株の核酸配列に依存して、それぞれ配列番号２および／または配列番号８の参照配列とわずかに異なってもよい。  
例として：
−現代型Ｍ．ツベルクロシスであるＭｔｂＣマイコバクテリウムを含む生体試料で本発明が実行される場合、ＲＤ９およびＩＳ６１１０アンプリコンの両者が得られるだろう、
−先祖型Ｍ．ツベルクロシスであるＭｔｂＣマイコバクテリウムを含む生体試料で本発明が実行される場合、ＲＤ９アンプリコンが得られ、しかしＩＳ６１１０アンプリコンが得られないだろう、
−Ｍ．ツベルクロシスでなく、およびＭ．カネッティでないＭｔｂＣマイコバクテリウムを含む生体試料で本発明が実行される場合、ＩＳ６１１０アンプリコンが得られ、しかしＲＤ９アンプリコンが得られない。  
前記生体試料に含まれるＭｔｂＣマイコバクテリウムがＭ．ツベルクロシスＨ３７Ｒｖでないとすぐに、得られたアンプリコンは、配列番号２および配列番号８の前記ＩＳ６１１０およびＲＤ９参照配列に比較して、変種配列を有してもよい。そのような変種配列は、配列番号２または配列番号８の参照配列とほぼ同じサイズをそれぞれ有しているだろう。例えば、本発明の実行によって入手できるＩＳ６１１０アンプリコンは、１９０から２１０ヌクレオチド、好ましくは１９５から２０５ヌクレオチド、最も好ましくは１９９から２０３ヌクレオチドまでの範囲のサイズを有していると考えられ、ならびに、本発明の実行によって入手できるＲＤ９アンプリコンは、１６０から１８５ヌクレオチド、好ましくは１６５から１８０ヌクレオチド、最も好ましくは１７０から１７４ヌクレオチドまでの範囲のサイズを有している。そのような変種配列は、それぞれ配列番号２または配列番号８の前記参照配列との高度な同一性を示すだろう。例えば、本発明の実行によって入手できるＩＳ６１１０アンプリコンは、配列番号２の参照配列と少なくとも９５％の配列同一性を有し、および本発明の実行によって入手できるＲＤ９アンプリコンは、配列番号８の参照配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するだろう。好ましくは、前記最小限の配列同一性は、９６％、９７％、９８％または９９％であるだろう。前記同一性の％は、それぞれの配列番号２または配列番号８の前記参照配列の全長にわたって算出される。高度な同一性を有すそのような変種配列は、代わりに、非常に厳密な条件の下、それらは、配列番号２の前記ＩＳ６１１０参照配列に、または配列番号８の前記ＲＤ９参照配列にハイブリダイズするという事実によって特徴づけてもよい。「非常に厳密な条件」ならびにハイブリダイゼーションの速度に影響を及ぼす因子は、当業者に既知であり、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  １９８２，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに見ることができる。例証となる「非常に厳密な条件」は、例えば水溶液中６８℃でのまたは５０％ホルムアミド存在下４２℃での６ｘＳＳＣまたは６ｘＳＳＰＥのハイブリダイゼーションを含み、および、室温で２−６０分間の０．１ｘＳＳＣおよび０．２ＳＤＳを含む水溶液中での、前記参照配列とハイブリダイズした前記変種配列の洗浄条件、その後の２−６０分間の、検出されたハイブリッドの算出Ｔｍより約１２−２０℃低い温度での０．１ｘＳＳＣを含む溶液におけるインキュベーションを含む。その他の例証となる非常に厳密な条件は、後述する例に示される。
【００６３】
それ故、本発明はまた、ＭｔｂＣマイコバクテリウム、および特にＭ．ツベルクロシス参考株Ｈ３７Ｒｖと異なるＭｔｂＣマイコバクテリウムを含む生体試料における本発明の実行によって入手できるそのようなＩＳ６１１０および／またはＲＤ９アンプリコンに関する。本発明は、特に以下のものに関する：
−１９０から２１０ヌクレオチドまで、好ましくは１９５から２０５ヌクレオチドまで、最も好ましくは１９９から２０３ヌクレオチドまでに及ぶサイズを有する何れかのポリヌクレオチドであって、
○配列番号２の参照配列と、または、配列番号２の全長にわたって配列番号２に完全に相補的な配列と少なくとも９５％の配列が同一であり（好ましくは、９６％、９７％、９８％または９９％の最小限の配列同一性を有する）、および／または
○非常に厳密な条件の下、配列番号２の参照配列と、または配列番号２の全長にわたって配列番号２と完全に相補的である配列とハイブリダイズするポリヌクレオチド、
ならびに
−１６０から１８５ヌクレオチドまで、好ましくは１６５から１８０ヌクレオチドまで、最も好ましくは１７０から１７４ヌクレオチドまで及ぶサイズを有する何れかのポリヌクレオチドであって、
○配列番号８の参照配列と、または、配列番号８の全長にわたって配列番号８に完全に相補的な配列と少なくとも９５％の配列が同一であり（好ましくは、９６％、９７％、９８％または９９％の最小限の配列同一性を有する）、および／または
○非常に厳密な条件の下、配列番号８の参照配列と、または配列番号８の全長にわたって配列番号８と完全に相補的である配列とハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【００６４】
本発明は、生体試料にて行う増幅反応におけるプライマーとしてＩＳ６１１０プライマーペアおよびＲＤ９プライマーペアを用いて入手可能なアンプリコンの検出に適したプローブに関する。好都合には、前記プローブは、以下のものである：
−配列番号８の配列、もしくは配列番号８の全長にわたって配列番号８と完全に相補的である配列、または前記配列番号８の配列もしくは前記相補的配列の少なくとも１５ヌクレオチドの断片、または
−配列番号２の配列、もしくは配列番号２の全長にわたって配列番号２と完全に相補的である配列、または前記配列番号２の配列もしくは前記相補的配列の少なくとも１５ヌクレオチドの断片。  
好ましくは、前記配列番号２または配列番号８の少なくとも１５ヌクレオチドの前記断片は、３０ヌクレオチド未満であり、最も好ましくは１５−２８ヌクレオチド、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８ヌクレオチドであり、最も好ましくは２０−２５ヌクレオチド、例えば２３ヌクレオチドである。  
本発明は、とりわけ、以下のアンプリコンを標的とするプローブに関する：
−配列番号８の配列、もしくは配列番号８の全長にわたって配列番号８と完全に相補的である配列、または前記配列番号８の配列もしくは前記相補的配列の少なくとも１５ヌクレオチドかつ２９ヌクレオチド未満の断片、または
−配列番号２の配列、もしくは配列番号２の全長にわたって配列番号２と完全に相補的である配列、または前記配列番号２の配列もしくは前記相補的配列の少なくとも１５ヌクレオチドかつ２９ヌクレオチド未満の断片。  
ＲＤ９アンプリコンの検出に適した有利なプローブは、配列番号８と相補的である配列の断片であり、ここにおいて、前記断片は、配列番号９（ＲＤ４４１プローブ）の配列を含む。好ましくは、このＲＤ９を標的とするプローブは、３０ヌクレオチド未満であり、最も好ましくは１５−２８ヌクレオチド、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８ヌクレオチドであり、最も好ましくは２０−２５ヌクレオチド、例えば２３ヌクレオチドである。ＩＳ６１１０アンプリコンの検出に適した有利なプローブは、配列番号３の配列（ＩＳ５０３プローブ）を含む配列番号２の断片であることが特徴付けられる。好ましくは、このＩＳ６１１０を標的とするプローブは、３０ヌクレオチド未満であり、最も好ましくは１５−２８ヌクレオチド、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８ヌクレオチドであり、最も好ましくは２０−２５ヌクレオチド、例えば２３ヌクレオチドである。本発明のプローブは、それらの配列内に１または複数の挿入薬剤、例えば１または複数の挿入色素を含んでよい。本発明のプローブは、少なくとも１つのビーコンアーム、好ましくは２つのビーコンアーム、その末端のそれぞれに１つ（例えば、ＣＧＴＧＣＧ−（プローブ配列）−ＣＧＣＡＣＧ；またはＡＴＧＣＧＧ−（プローブ配列）−ＣＣＧＣＡＴ）を含んでよい。有利なビーコン付加プローブは、特に、配列番号１０のプローブ（それは、ビーコンフォーマットにおいて配列番号９のプローブである）、および配列番号４のプローブ（それは、ビーコンフォーマットにおいて配列番号３のプローブである）を含む。本発明のプローブは、その５’末端にフルオロフォアおよび／またはその３’末端に消光剤を含んでよく、例えば、５’末端にＴａｍｒａまたはＦａｍおよび／または３’末端にＤａｂｃｙｌを含んでよい。
【００６５】
本発明は、また、少なくとも１つの本発明のプライマーペアと、少なくとも１つの本発明のプローブとから成るＰＣＲセットに関する。とりわけ、少なくとも１つの本発明のＲＤ９プライマーペアと、少なくとも１つの本発明のＲＤ９プローブとから成るＰＣＲセット、ならびに少なくとも１つの本発明のＩＳ６１１０プライマーペアと、少なくとも１つの本発明のＩＳ６１１０プローブとから成るＰＣＲセットに関する。
【００６６】
本発明の実行に特に適した適切な内部標準（ＩＣ）もまた提供される。本発明は、結核菌群（ＭｔｂＣ）のマイコバクテリウムの特異的で高感度な検出における内部標準（ＩＣ）としての使用に適した、および／または一方のマイコバクテリウム・ツベルクロシスおよびマイコバクテリウム・カネッティの、他方前記ＭｔｂＣのその他の菌株からの、特異的で高感度な識別に適したオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドに関する。本発明のＩＣオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、好都合に、以下のものを含む：
ａ．２つのプライマー結合部位配列、ここにおいて、前記２つのプライマー結合部位配列の他方と関連して５’に位置する前記２つのプライマー結合部位配列の１つは、本発明のプライマーペア（ＩＳ６１１０プライマーペアまたはＲＤ９プライマーペア）の１メンバーと同一であり、および前記２つのプライマー結合部位配列の他方は、本発明の同じプライマーペアのその他のメンバーに完全に相補的である；および
ｂ．マイコバクテリウムに関連がなく、前記２つのプライマー結合部位配列の間に位置する配列。  
好ましくは、前記マイコバクテリウムに関連のない配列はまた、何れのヒト核酸にも関連がなく、最も好ましくは何れの哺乳類核酸に関連がない。  
例証となるＩＣは、９２塩基であってよい：
−５’末端領域に位置する１７の塩基および３’末端領域に位置する１７の塩基；これらは同一であり、およびそれぞれ、ＩＳ６１１０プライマーに完全に相補的である（それぞれ、配列番号５および６のＩＳ３６８およびＩＳ５６９）；
−マイコバクテリウムに関連のない残りの５８塩基（ランダムな配列）。  
例えば、本発明のキットは、ＩＳ６１１０プライマーペアによって増幅されるＩＣオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、例えば配列番号１３のＩＣオリゴヌクレオチド：を含んでよい。
【００６７】
本発明は、更に、（前記対照配列にアニールすることによる）本発明のＩＣオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの検出に特に適したＩＣプローブを提供する。例証となるＩＣプローブは、配列番号１４（ＳＩＭ  ＡＴＴＯ  ５９０）のプローブである。
【００６８】
本発明はまた、結核菌群（ＭｔｂＣ）のマイコバクテリウムの特異的で高感度な検出に適した、および／または一方のマイコバクテリウム・ツベルクロシスおよびマイコバクテリウム・カネッティの、他方の前記ＭｔｂＣのその他の菌株からの特異的で高感度な識別に適したキットに関し、ならびに結核のｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断のためのキットに関する。本発明のキットは、以下のものを含む：
−少なくとも１セットの本発明による２対のプライマー、および／または
−少なくとも１つの本発明のプライマーペア、および／または
−少なくとも１つの本発明のプライマー、および／または
−少なくとも１セットの本発明による２つの参照テンプレートオリゴヌクレオチド、および／または
−少なくとも１つの発明による参照テンプレートポリヌクレオチド、および／または
−少なくとも１つの本発明の何れか１つのプローブ。  
本発明のキットは、特に、本発明によるＰＣＲセット（すなわち、少なくとも１つの本発明のプライマーペアおよび少なくとも１つの本発明のプローブ）を含んでよい。本発明によるキットにおいて、核酸（プライマー、プローブ）は、個別に維持し、または部分的に混合し、または完全に混合することができる。前記核酸は、当業者が判断するように、乾燥形態、または適した溶媒に溶解した状態で提供することができる。適した溶媒は、ＴＥ、ＰＣＲ等級水などを含む。そのような試薬は、当業者に既知であり、水、例えばヌクレアーゼを含まない水、ＤＮＡｓｅを含まない水、ＰＣＲ等級水；塩、例えばマグネシウム、カリウム；緩衝剤、例えばＴｒｉｓ；酵素、例えば、Ｔａｑ、Ｖｅｎｔ、Ｐｆｕ（これらは全て商標）、活性化可能ポリメラーゼ（ａｃｔｉｖａｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、逆転写酵素などのポリメラーゼを含む；ヌクレオチド、例えば、デオキシヌクレオチド、ジデオキシヌクレオチド、ｄＮＴＰｓ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰ；その他の薬剤、例えばＤＴＴおよび／またはＲＮＡ分解酵素阻害薬；およびポリヌクレオチド、例えば、ｐｏｌｙＴ、ｐｏｌｙｄＴおよびその他のオリゴヌクレオチド（例えばプライマー）を含む。本発明によるキットは、ＰＣＲ対照を含んでもよい。そのような対照は、当該分野で既知であり、および定性的対照、正の対照、負の対照、内部標準（ＩＣ）、定量的対照、内部定量的対照ならびに較正範囲を含む。前記ＰＣＲ工程のための内部標準は、ＰＣＲ工程における標的テンプレートに関連しないテンプレートとすることができる。そのような対照はまた、対照プライマーおよび／または対照プローブを含んでもよい。例えば、ＭｔｂＣマイコバクテリウム検出の場合、内部標準として、その存在が人体由来の試料から除外され（例えば、植物遺伝子由来）、およびそのサイズおよびＧＣ含有量が標的配列のそれらと等しい遺伝子の中から選択されるポリヌクレオチドを使用することが可能である。本発明のキットは、本発明のＩＣオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、および／または本発明のＩＣプローブを含んでよい。本発明によるキットは、生体試料由来、例えば気管支の吸引液、気管支の洗浄液、痰、脳脊髄液、尿、血液、血清、血漿由来の核酸を抽出および／または精製する手段を含んでよい。そのような手段は、当業者に周知である。本発明のキットは、核酸抽出のための溶解緩衝剤、例えば、二価イオンに結合する陰イオン性のレジンを含む溶解緩衝剤を含んでもよい。溶解は、好ましくは、界面活性剤の存在下およびＣｈｅｌｅｘ  Ｘ−１００ビーズといった二価イオンに結合する陰イオン性レジンの存在下で行われる。有利な特徴として、前記陰イオン性レジンはまたカオトトロピック剤（ｃｈａｏｔｏｔｒｏｐｉｃ  ａｇｅｎｔ）である。適切な溶解緩衝剤の例は、Ｔｒｉｓ  １０ｍＭ（Ｓｉｇｍａ，  ｒｅｆ  ：  Ｔ−６７９１）、ＥＤＴＡ  １ｍＭ（Ｓｉｇｍａ，  ｒｅｆ  ：  Ｅ−１６４４）、ｐＨ８．３の緩衝液に、８％のＣｈｅｌｅｘ  Ｘ−１００レジン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，  ｒｅｆ  ：  １４２−１２５３）、０．５％ＮＰ−４０（Ｓｉｇｍａ，  ｒｅｆ  ：  Ｉｇｅｐａｌ  Ｉ−３０２１）、０．５％Ｔｗ���ｅｎ２０（ＶＷＲ，  ｒｅｆ  ：  ２８８２９２９６）を含む溶解緩衝液を含む。本発明によるキットは、その使用のための説明書を含んでもよい。前記説明書は、好都合に、リーフレット、カードなどでありえる。前記説明書は、また、２つの形態として存在しうる：キットおよびその使用に関する徹底的な情報を集めた、場合によっては文献データをも含む、詳細なもの；その使用に必要な基本的な情報を集めた、例えばカードの形のクイックガイド形態またはメモ。好ましい実施態様において、前記キットは、診断キット、特にｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断キット、すなわち結核診断キットである。
【００６９】
本発明はまた、生体試料中の結核菌群（ＭｔｂＣ）のマイコバクテリウムを検出するための、および／または一方のマイコバクテリウム・ツベルクロシスおよびマイコバクテリウム・カネッティの、他方の前記ＭｔｂＣのその他の菌株からの識別のための方法に関する。本発明の方法は、２つの標的核酸配列の検出を含み、
ここにおいて、前記２つの標的配列のうちの１つは、ＩＳ６１１０またはその断片であり、もう一方の標的配列はＲＤ９またはその断片であり、
ここにおいて、前記ＲＤ９標的の存在および前記ＩＳ６１１０標的の存在または非存在の検出は、Ｍ．ツベルクロシスまたはＭ．カネッティであるＭｔｂＣに属すマイコバクテリウムが前記生体試料中に存在することを表し、
ここにおいて、前記ＲＤ９標的の非存在および前記ＩＳ６１１０標的の存在の検出は、Ｍ．ツベルクロシスでないＭｔｂＣに属すマイコバクテリウムが前記生体試料に存在することを表し、
ここにおいて、前記ＲＤ９標的の非存在および前記ＩＳ６１１０標的の非存在の検出は、ＭｔｂＣに属すマイコバクテリウムが前記生体試料に存在しないことを表す。
【００７０】
前記ＲＤ９標的の存在および前記ＩＳ６１１０標的の存在または非存在の検出は、特に、Ｍ．ボビスでないＭｔｂＣに属すマイコバクテリウムが前記生体試料に存在することを表す。
【００７１】
好都合に、本方法のマルチプレックスＰＣＲの実行のために特に、前記ＲＤ９標的配列は、配列番号８の配列、または配列番号８の全長にわたって配列番号８と完全に相補的である配列に存在し、および前記ＩＳ６１１０標的配列は、配列番号２の配列、または配列番号２の全長にわたって配列番号２と完全に相補的である配列に存在する。
【００７２】
前記ＲＤ９標的の存在および前記ＩＳ６１１０標的の非存在の検出は、Ｍ．カネッティまたは先祖型Ｍ．ツベルクロシス株の何れかであるＭｔｂＣに属すマイコバクテリウムが前記生体試料に存在することを表す。前記ＲＤ９標的の存在および前記ＩＳ６１１０標的の存在の検出は、Ｍ．カネッティまたは現代型Ｍ．ツベルクロシス株の何れかであるＭｔｂＣに属すマイコバクテリウムが前記生体試料に存在することを表す。前記ＲＤ９標的の非存在および前記ＩＳ６１１０標的の存在の検出は、Ｍ．ボビス、Ｍ．アフリカナム、Ｍ．カプラエ、Ｍ．ミクロチ、またはＭ．ピンニペディであるＭｔｂＣに属すマイコバクテリウムが前記生体試料に存在することを表す。本発明の有利な特徴によると、本方法はＰＣＲによって実行することができる。本発明の非常に有利な特徴によると、本方法は、特に増幅プライマーとして本発明の少なくとも１つのプライマーペア（少なくとも１つのＩＳ６１１０および／または少なくとも１つのＲＤ９プライマーペア）を用いて、マルチプレックスＰＣＲで実行することができる。本発明の方法は、ハイブリダイゼーションプローブおよび／または検出プローブとしての、本発明の少なくとも１つのプローブの使用を含んでよい。
【００７３】
本発明は、結核の診断のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、  
生体試料のＭｔｂＣのマイコバクテリウムの存在または非存在が、および／または  
生体試料のＭ．ツベルクロシスまたはＭ．カネッティ株の存在または非存在が、および／または  
生体試料のＭ．ツベルクロシスではないＭｔｂＣのマイコバクテリウムの存在または非存在が、  
前記生体試料におけるＭｔｂＣ検出のおよび／またはＭｔｂＣ種識別の前記方法の実行によって決定されることを特徴とする方法に関する。
【００７４】
本発明は、更に、ＭｔｂＣ分析のための生体試料から核酸を抽出する方法を提供する。溶解は、好ましくは、界面活性剤の存在下およびＣｈｅｌｅｘ  Ｘ−１００ビーズといった二価イオンに結合する陰イオン性レジンの存在下で行われる。有利な特徴として、前記陰イオン性レジンはまた、カオトトロピック剤である。適切な溶解緩衝剤の例は、Ｔｒｉｓ  １０ｍＭ（Ｓｉｇｍａ，  ｒｅｆ  ：  Ｔ−６７９１）、ＥＤＴＡ  １ｍＭ（Ｓｉｇｍａ，  ｒｅｆ  ：  Ｅ−１６４４）、ｐＨ８．３の緩衝液に、８％のＣｈｅｌｅｘ  Ｘ−１００レジン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，  ｒｅｆ  ：  １４２−１２５３）、０．５％ＮＰ−４０（Ｓｉｇｍａ，  ｒｅｆ  ：  Ｉｇｅｐａｌ  Ｉ−３０２１）、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＶＷＲ，  ｒｅｆ  ：  ２８８２９２９６）を含む溶解緩衝液を含む。
【実施例】
【００７５】
本発明は下記の例に例示され、これらは、例証の目的としてのみ与えられる。
【００７６】
[例１（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細菌試料−特異性および感度）]
１．材料および方法：
１．１．核酸の抽出：
細菌細胞は、１００の異なる株のカルチャーから収集した（マイコバクテリウム以外の５４細菌株；ＭｔｂＣに属さない２６マイコバクテリウム株；４つのＭ．ボビスＢＣＧを含む、５株のＭ．ボビス；２３株のＭ．ツベルクロシス；Ｍ．ツベルクロシスまたはＭ．ボビス以外であるが、ＭｔｂＣに属す６つの株−Ｍ．ピンニペディ、Ｍ．カプラエ、３株のＭ．アフリカナム、Ｍ．ミクロチ−；１株のＭ．カネッティ）。
【００７７】
溶解は、界面活性剤の存在下およびＣｈｅｌｅｘ  Ｘ−１００ビーズ（すなわち、二価イオンに結合する陰イオン性のレジン）の存在下で行った。有利な特徴として、前記陰イオン性レジンは、カオトトロピック剤である。
【００７８】
溶解緩衝液の組成：Ｔｒｉｓ  １０ｍＭ（Ｓｉｇｍａ，  ｒｅｆ  ：  Ｔ−６７９１）、ＥＤＴＡ  １ｍＭ（Ｓｉｇｍａ，  ｒｅｆ  ：  Ｅ−１６４４）、ｐＨ８．３の緩衝液に、８％のＣｈｅｌｅｘ  Ｘ−１００レジン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，  ｒｅｆ  ：  １４２−１２５３）、０．５％ＮＰ−４０（Ｓｉｇｍａ，  ｒｅｆ  ：  Ｉｇｅｐａｌ  Ｉ−３０２１）、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＶＷＲ，  ｒｅｆ  ：  ２８８２９２９６）を含む。
【００７９】
方法：
−２００μｌの生体試料
−４００μｌの溶解緩衝液
−１０μｌの液体内部標準（ＩＣ）を添加
−３０秒間ボルテックス
−９５℃で１０分間インキュベーション
−８０００ｒｐｍで５分間遠心分離
−上清１０μｌでＰＣＲ。
【００８０】
負の対照は、２００μｌの生体試料を、２００μｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６．８、２５ｍＭ）で置き換えて行った。
【００８１】
ＩＣは抽出段階で添加する。それは、液体の形態とする。１０μｌのＩＣを２００μｌの生体試料に添加する。ＩＣ溶液は９．６  １０４コピーのＩＣを１０μｌ中に含み、そのため、抽出後ＰＣＲ試験当り１．６  １０３コピーが得られる（１／６０希釈）。
【００８２】
１．２．プライマーおよびプローブ：
１．２．１．ＩＳ６１１０システム
ＩＳ６１１０のＥＭＢＬデータ＝
位置  ＭＴＩＳ６１１０    １３６０ｂｐ  ＤＮＡ  ｌｉｎｅａｒ  ＢＣＴ  ０７−ＪＵＬ−２００２
定義  マイコバクテリウム・ツベルクロシス  ＩＳ６１１０  ＩＳ様エレメント
アクセス番号  Ｘ１７３４８  Ｍ２９８９９
バージョン  Ｘ１７３４８．１    ＧＩ：４８６９５
キーワード  挿入エレメント  ＩＳ６１１０；  トランスポゾン
ソース  マイコバクテリウム・ツベルクロシス  Ｈ３７Ｒｖ。
【００８３】
ＩＳ６１１０内で選択されるサブ配列＝
【化３】
2009506782.tif 000007
【００８４】
上記配列番号１における下線は、ＩＳ６１１０システムで使用されるプライマーおよびプローブの配列を表す：
−３７２から３８７まで：ＩＳ３６８フォワードプライマー；
−５０６から５２８まで：ＩＳ５０３プローブ；
−５５６から５７２まで：ＩＳ５６９リバースプライマーの相補的配列。
【００８５】
１本鎖フォーマットにおけるＩＳ６１１０増幅標的配列＝
【化４】
2009506782.tif 000008
【００８６】
ＩＳ６１１０プローブ：
ＩＳ５０３プローブ＝ＣＧＡＣＣＡＣＡＴＣＡＡＣＣＧＧＧＡＧＣＣＣＡ（配列番号３）
分子ビーコン（登録商標）アーム＝ＡＴＧＣＧＧおよびＣＣＧＣＡＴ
レポーター色素および消光薬剤＝Ｔａｍｒａ（登録商標）およびＤａｂｃｙｌ（登録商標）
ビーコン（登録商標）フォーマットにおけるＩＳ５０３：ＩＳ５０３ＭＢプローブ＝５’−Ｔａｍｒａ−ＡＴＧＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＡＴＣＡＡＣＣＧＧＧＡＧＣＣＣＡＣＣＧＣＡＴ−Ｄａｂｃｙｌ−３’（配列番号４）。
【００８７】
ＩＳ６１１０フォワードプライマー：
ＩＳ３６８プライマー＝５’−ＣＡＧＣＡＣＧＣＴＡＡＴＴＡＣＣＣ−３’（配列番号５）。
【００８８】
ＩＳ６１１０リバースプライマー：
ＩＳ５６９プライマー＝５’−ＧＣＴＧＡＴＧＴＧＣＴＣＣＴＴＧＡ−３’（配列番号６）。
【００８９】
１．２．２．ＲＤ９システム：
位置  ＢＸ８４２５７８    １４６４  ｂｐ  ＤＮＡ  ｌｉｎｅａｒ  ＢＣＴ  １０−ＪＵＮ−２００４
定義  マイコバクテリウム・ツベルクロシス  Ｈ３７Ｒｖ  完全ゲノム；  セグメント  ７／１３．
アクセス番号  ＢＸ８４２５７８  ＲＥＧＩＯＮ：  相補  （２５２７１３．．２５４１７６）
位置２５０，２７１から位置２５４，１７６：ＲＤ９の配列
ＢＸ８４２５７８の位置２５２，７１３から位置２５４，１７６：Ｒｖ２０７５ｃの配列（ＲＤ９のサブ配列）。
【００９０】
ＲＤ９内で選択されるサブ配列（ＲＤ９に含まれるＲｖ２０７５ｃ内で選択されるサブ配列）：
【化５】
2009506782.tif 000009
【００９１】
上記配列番号７における下線は、ＲＤ９システムで使用されるプライマーおよびプローブの配列を意味する：
−３９０から４０６：ＲＤ３８９フォワードプライマー；
−４４１から４６４：ＲＤ４４１プローブの相補的配列；
−５４５から５６１：ＲＤ５６１リバースプライマーの相補的配列。
【００９２】
一本鎖フォーマットにおけるＲＤ９増幅標的配列＝
【化６】
2009506782.tif 000010
【００９３】
ＲＤ９プローブ：
ＲＤ４４１プローブ＝ＧＣＴＡＴＴＡＣＧＡＧＧＡＣＴＣＣＡＣＧＣＴＧＧ（配列番号９）
分子ビーコン（登録商標）アーム＝ＣＧＴＧＣＧおよびＣＧＣＡＣＧ
レポーター色素および消光薬剤＝ＦａｍおよびＤａｂｃｙｌ（登録商標）
ビーコン（登録商標）フォーマット下のＲＤ４４１：ＲＤ４４１ＭＢプローブ＝５’−Ｆａｍ−ＣＧＴＧＣＧＧＣＴＡＴＴＡＣＧＡＧＧＡＣＴＣＣＡＣＧＣＴＧＧＣＧＣＡＣＧ−Ｄａｂｃｙｌ−３’（配列番号１０）。
【００９４】
ＲＤ９フォワードプライマー：
ＲＤ３８９＝５’−ＴＡＡＧＣＧＣＣＴＧＣＧＧＡＴＴＧ−３’（配列番号１１）。
【００９５】
ＲＤ９リバースプライマー：
ＲＤ  ５６１＝５’−ＧＧＣＧＴＴＧＡＧＣＴＧＧＡＡＡＧ−３’（配列番号１２）。
【００９６】
１．３．内部標準（ＩＣ）：
内部標準（ＩＣ）は、一本鎖配列で存在する。ＩＣは、増幅標的配列に関連のない配列を含むよう選択され、前記関連のない配列は、ＰＣＲ反応で使用されるプライマーペア（ＩＳ６１１０プライマーペア、またはＲＤ９プライマーペア）のうちの１つに適した標的配列である配列の５’および３’に隣接する。
【００９７】
ＩＣは、その５’末端領域に配列を、およびその３’末端領域に別の配列を含み、ここにおいて、前記３’に含まれる配列は、ＩＳ６１１０プライマーペアの１メンバーとハイブリダイズし、および前記５’に含まれる配列は、同じＩＳ６１１０プライマーペアのその他のメンバーの相補的配列にハイブリダイズする。好ましくは、前記３’に含まれる配列は、ＩＳ６１１０プライマーペアの１メンバーに完全に相補的であり、および前記５’に含まれる配列は、同じＩＳ６１１０プライマーペアのその他のメンバーと同一の配列を有する。あるいは、ＲＤ９プライマーペアは、ＩＳ６１１０プライマーペアの代わりに使用することができる：目的は、ＰＣＲ行程で実行され、しかし前記５’に含まれる配列と３’に含まれる配列との間に、マイコバクテリウムに関連のない配列、好ましくは細菌および哺乳類の核酸に関連のない配列を含むプライマーペアのうちの１つによって増幅したＩＣを有することである。本例のＩＣは、その５’末端領域にＩＳ６１１０プライマーペアの１メンバーと同一の配列を、その３’末端領域に同じＩＳ６１１０プライマーペアのその他のメンバーと完全に相補的な配列を含む。
【００９８】
本例のＩＣは、９２塩基で存在する：
−５’末端領域に位置する１７塩基および３’末端領域に位置する１７塩基；これらは同一であり、それぞれ、Ｓ６１１０プライマーと完全に相補的である（それぞれ、配列番号５および６のＩＳ３６８およびＩＳ５６９）、
−マイコバクテリウムに関連のない残りの５８塩基（ランダムな配列）。  
本例のＩＣは、以下の配列を有する。
【化７】
2009506782.tif 000011
【００９９】
上記配列番号１３内の下線は以下のことを示す（５’から３’方向）：
−ＩＳ３８６（配列番号５のＩＳ６１１０フォワードプライマー）
−ＩＣプローブ
−ＩＳ５６９の標的配列（すなわち、配列番号６のＩＳ６１１０リバースプライマーの相補的配列）。
【０１００】
ＩＣプローブ＝ＳＩＭ  ＡＴＴＯ  ５９０＝ＧＡＣＧＴＧＧＣＡＧＣＣＡＴＧＡＧＡＧＴＧＧＧ（配列番号１４）、この５’および３’末端にビーコンアームが付加される。
【０１０１】
１．４．トリプレックスＰＣＲのための例証となる実験的条件：
試薬：
Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅａｓｅ  Ｑｉａｇｅｎ（５Ｕ／μｌ，ｒｅｆ２０３２０５）（ＰＣＲ緩衝液を含む）
ｄＮＴＰ  ：Ｐｒｏｍｅｇａ  ｒｅｆ  Ｕ１５１ｘ（４Ｘ２５ｍＭ）
ＭｇＣｌ２：  Ｓｉｇｍａ，  ｒｅｆ  Ｍ−２６７０
ＰＶＰ１０  ：  Ｓｉｇｍａ，  ｒｅｆ  ：  ＰＶＰ−１０
グリセロール：  ＶＷＲ，  ｒｅｆ  ：  ２４３８８２９５。
【０１０２】
サーマルサイクラー
ｉＱ１（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）。
【０１０３】
１ｘＰＣＲミックスの組成
１ｘＰＣＲミックス（ビーコンフォーマット中の０．２μＭのＲＤ９プローブ（配列番号１０）、ビーコンフォーマット中の０．２μＭのＩＣプローブ（配列番号１４）、ビーコンフォーマット中の０．４μＭのＩＳ６１１０プローブ（配列番号４）、０．５μＭのそれぞれの前記４つのプライマー、５％グリセロール、０．３％ＰＶＰ１０、２ＵのＴａｑポリメラーゼ、１ｍＭ  ｄＮＴＰおよび終濃度５ｍＭのＭｇＣｌ２を添加）。１０μｌのＤＮＡをこのミックスに添加する。
【０１０４】
熱サイクル
−第１サイクル：９５℃で１５分、
−５０回繰り返し：
第２サイクル：９５℃で３０秒
第３サイクル：５９℃で３０秒
第４サイクル：７２℃で３０秒
−装置を開けるまで２０℃に維持。
【０１０５】
２．結果：
２．１．マルチプレックスで使用した場合のプライマーおよびプローブの特異性：
選択されたＩＳ６１１０およびＲＤ９プライマーおよびプローブは、ＭｔｂＣ特異的である：それらは、ＭｔｂＣマイコバクテリウム以外の核酸との有意な相同性を示さない。好都合に、選択されたＩＳ６１１０およびＲＤ９プライマーおよびプローブは、トリプレックスで使用したときでさえ特異的である。
【０１０６】
これらの「トリプレックス−等級」特異性は、細菌ライセートにて例証できる。ＤＮＡの存在は、１６ＳＤＮＡの効果的な増幅によって確認した。陽性ＩＣ反応は、結核ＰＣＲ分析の妥当性を確認する。トリプレックス結果は、以下の通りであった：
【表４】
2009506782.tif 000012
【０１０７】
詳細な結果は以下の表５−１から表５−４に示される。
【表５−１】
2009506782.tif 000013
【表５−２】
2009506782.tif 000014
【表５−３】
2009506782.tif 000015
【表５−４】
2009506782.tif 000016
２．２．ＰＣＲ感度：
トリプレックスＰＣＲを、予め計測したＭ．ツベルクロシスＨ３７Ｒｖのライセートにて、二重で行った。結果は以下の通りである（表６）。
【表６】
2009506782.tif 000017
【０１０８】
ＰＣＲ検出許容限界：
−ＩＳ６１１０では、１２ＣＦＵ／ｍｌ（ＰＣＲ当り０．１２コピーに相当）
−ＲＤ９では、１２０ＣＦＵ／ｍｌ（ＰＣＲ当り１．２コピーに相当）。
【０１０９】
選択したＩＳ６１１１０およびＲＤ９プライマーは、好都合に、Ｍ．ツベルクロシス（＋非常に稀なＭ．カネッティ）特異性を有し、および、マルチプレックスでの使用でもこの特異性を保持する。それらは、更に、非常に高感度な検出（ほとんど試料当り１コピー程度まで低い）を可能とする。
【０１１０】
[例２（ヒトから採取した試料−比較例）]：
マルチプレックスＰＣＲは、上記の例１に記載されるように行ったが、ヒト患者から採取した試料で行った（パーシー病院（フランス））：
−脳脊髄液（ＣＤＦ）の試料、
−気管支の洗浄液の試料、
−気管支の吸引液の試料、
−唾液の試料。
【０１１１】
分析の前に、呼吸性の試料を、消化−汚染除去の前処理に供す。実際には、マイコバクテリウムの培養に供した大部分の試料は、急速にマイコバクテリウムより増殖できる種々の生物体が混入している。この為、マイコバクテリウムは、ムチンおよび細胞で捕捉されるマイコバクテリウムを放出して、混入する細菌を減少させるまたは除去する方法を用いて、最適に臨床材料から回収される。最も広く使用される消化−汚染除去方法は、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＬＣ）−ＮａＯＨ法である。試料は、標準的手順に沿って、１％（終濃度）水酸化ナトリウム−Ｎ−アセチルシステイン（ｓｏｄｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ）で汚染除去し、および３，０００×ｇで２０分間遠心分離して濃縮した（Ｍｅｔｃｈｏｃｋ，  Ｂ．  Ｇ．，  Ｆ．  Ｓ．  Ｎｏｌｔｅ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｊ．  Ｗａｌｌａｃｅ，  Ｊｒ．  １９９９．  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，  ｐ．  ３９９−４３７．  Ｉｎ  Ｐ．  Ｒ．  Ｍｕｒｒａｙ，  Ｅ．  Ｊ．  Ｂａｒｏｎ，  Ｍ．  Ａ．  Ｐｆａｌｌｅｒ，  Ｆ．  Ｃ．  Ｔｅｎｏｖｅｒ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｈ．  Ｙｏｌｋｅｎ  （ｅｄ．），  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ７ｔｈ  ｅｄ．  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．）。ペレットは、リン酸緩衝液（０．０６７Ｍ、ｐＨ６．８）で再懸濁される。試料は、これにより、顕微鏡観察試験、培養または分子生物学によって分析する準備が整う。脳脊髄液（ＣＤＦ）の試料は直接分析する。
【０１１２】
比較分析は、以下のように行った：
−細菌培養および顕微鏡観察によって、または、
−Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  ＭＴＤ試験によって行う。
【０１１３】
細菌培養は、ＫｅｎｔおよびＫｕｂｉｃａ（“Ｐｕｂｌｉｃ  ｈｅａｌｔｈ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ：  ａ  ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｌｅｖｅｌ  ＩＩＩ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ”，  １９８５，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｐｔ．  ｆ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  Ａｔｌａｎｔａ，  ＧＡ，  ＵＳＡ）、およびＲｏｂｅｒｔｓ、ＫｏｎｅｍａｎおよびＫｉｍ（“Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ”，  １９９１，  ｐａｇｅｓ  ３０４−３３９；  Ｉｎ  Ａ．  Ｂａｒｌｏｗｓ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄ．），  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．，  ＵＳＡ）に記載されるように行った。とりわけ、Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎ−Ｊｅｎｓｅｎ（ＬＪ）培養は、Ｐｅｔｒａｎらが記載するとおり（１９７１．  Ｈｅａｌｔｈ  Ｌａｂ．  Ｓｃｉ．  ８  ：  ２２５−２３０）に行った。ＬＪ培地は、ミネラル塩、馬鈴薯澱粉、グリセリン、マラカイトグリーン（無菌）および卵（アルブミン）を含む。培養は、スクリューキャップチューブで行う。３滴の遠心分離ペレットを、リン酸緩衝液に再懸濁し、ゲローススロープ（ｇｅｌｏｓｅ  ｓｌｏｐｅ）の上部に置く。２〜６チューブ（試料の量に依存）に播種し、３７℃でインキュベートする。チューブはゆるくキャップをし（過剰なあらゆる液体の蒸発を可能にするため）、傾斜した位置でインキュベートする。試料は、少なくとも８週のあいだ、週に一度観察する。週に１度の観察は、共生細菌の混入または、成長の早いマイコバクテリウムの存在の検出を可能とする。コロニーが生ずるとき、培養がマイコバクテリウム陽性であると明言する前に、酸アルコール抵抗性細菌の存在を確認するために、チール-ネールセン染色スメア（Ｚｉｅｈｌ−Ｎｅｅｌｓｅｎ  ｓｔａｉｎｅｄ  ｓｍｅａｒ）を行う。
【０１１４】
顕微鏡観察試験は、ＫｅｎｔおよびＫｕｂｉｃａ（“Ｐｕｂｌｉｃ  ｈｅａｌｔｈ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ：  ａ  ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｌｅｖｅｌ  ＩＩＩ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ”，  １９８５，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｐｔ．  Ｏｆ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  Ａｔｌａｎｔａ，  ＧＡ，  ＵＳＡ）に記載されるように、フクシン染色によって行った。スメア結果を報告する推奨される解釈は、表７に示される。
【表７】
2009506782.tif 000018
【０１１５】
Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  ＭＴＤ試験は、製造者の推奨に従って行った。これは、“Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ（商標）  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｄｉｒｅｃｔ  ｔｅｓｔ”キット（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ９２１２１，  ＵＳＡ）として商品化されるＧｅｎ−Ｐｒｏｂｅ（登録商標）キットで実行する。Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  ＭＴＤ試験は、ＭｔｂＣ特異的ｒＲＮＡの増幅およびの検出を利用する。簡単には、生体試料を超音波処理し、熱変性処理に供し、その後Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  ＴＭＡ法（転写媒介増幅）による増幅に供し、およびＧｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  ＨＰＡ法（ハイブリダイゼーションプロテクションアッセイ）によるアンプリコン検出に供する。陽性のＭＴＤ試験は、試料がＭｔｂＣのマイコバクテリウムを含むことを意味する（阻害および不十分な感度の問題により、陰性のＭＴＤ試験は、しかしながら、試料中のＭｔｂＣ生物体の単離の可能性を除外しない）。
【０１１６】
結果は以下の通りである。
【表８】
2009506782.tif 000019
【０１１７】
表８において、
＊は、Ｍ．ツベルクロシスまたは非常に稀なＭ．カネッティ、
ＮＤ＝検出されず、
ｎｐ＝試験を行わず、
ＭｔまたはＭｃ以外のＭｔｂＣ＝ＭｔｂＣに属すが、Ｍ．ツベルクロシス（Ｍｔ）またはＭ．カネッティ（Ｍｃ）の何れでもないマイコバクテリウム株、
ｂａ＝気管支の吸引液、
ｂｗ＝気管支の洗浄液、
急上昇（ｓｐｉｋｅｄ）＝人工的に感染させた試料、
ＣＳＦ＝脳脊髄液、
を、それぞれ意味する。
【０１１８】
マルチプレックスＰＣＲで実行される本発明のプライマーおよびプローブにより得られる結果は、従来の培養方法およびＧｅｎ−Ｐｒｏｂｅキットで得られるそれらと相関する。本発明は、従来の培養方法よりも非常に迅速である。本発明は、また、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  ＭＴＤ試験よりも正確である：ＭＴＤ試験は、ＭｔｂＣ陽性／ＭｔｂＣ陰性の反応を与えるだけである；ＭＴＤ試験に通常由来するＭ．ツベルクロシスの結論は、患者が、結核のような症状を呈し、ＭＴＤ陽性であり、Ｍ．ツベルクロシス株に感染している可能性が高いという事実に基づく仮説となるのみである。本発明は、直接、菌株がＭ．ツベルクロシス（または、非常に珍しく、容易に同定可能なＭ．カネッティ）であること、およびそれはＭｔｂＣのその他の菌株でないこと、および特に、それがＭ．ボビス（すなわち、ＢＣＧ接種のために試料中に存在し得る菌株）でないことを確認する。本発明は、更に、先祖型Ｍ．ツベルクロシス（ＲＤ９＋ＩＳ６１１０−反応）と現代型Ｍ．ツベルクロシス（ＲＤ９＋ＩＳ６１１０＋反応）との間の識別を可能とする。
【０１１９】
全ての引用される文献または刊行物（特許文献または科学的刊行物の何れも）の内容は本願に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】図１は、Ｍ．ツベルクロシスＨ３７ＲＶのＲＤ９のサブ配列（１４６４ヌクレオチドの配列Ｒｖ２０７５ｃ；配列番号１９）、および、太字にて本発明による配列番号７（Ｒｖ２０７５ｃ内の位置３５１−６００）を示す。本発明の配列番号８のＲＤ９標的配列（Ｒｖ２０７５ｃ内の位置３９０−５６１）は、太字および下線にて示される。
【図２】図２は、Ｍ．ツベルクロシスＨ３７ＲＶのＩＳ６１１０配列（１３６０ヌクレオチド；配列番号２０）を示す。本発明によりＩＳ６１１０内で選択される配列番号１のサブ配列（位置３６１−６００）、は太字で表す。本発明による配列番号２のＩＳ６１１０標的配列（位置３７２−５７２）は、太字および下線で示す。
【図１】
2009506782.tif 000020
【図２】
2009506782.tif 000021
【配列表】
2009506782000001.app
【国際調査報告】
2009506782.tif 000022
2009506782.tif 000023
2009506782.tif 000024