(57)【要約】  本発明は、ポリγグルタミン酸（poly-gamma-glutamic acid: PGA）を有効成分として含む抗凝固剤（anticoagulant）及び血栓予防用組成物に関する。本発明に係るＰＧＡは、血管内に血栓が積もることを防止する抗凝固剤の効能が優秀であり、また、徐放性にも優れており、水溶性、陰イオン性、生分解性及び食用のアミノ酸高分子素材であって、人体に無害し、高付加価値の高い抗凝固剤及び血栓予防用の食飲料用組成物として有用である。
2009522254.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリγグルタミン酸（ＰＧＡ）を有効成分として含む抗凝固剤。
【請求項２】
前記ＰＧＡの分子量は、１ｋＤａないし１５，０００ｋＤａであることを特徴とする請求項１に記載の抗凝固剤。
【請求項３】
ＰＧＡを有効成分として含む血栓予防用の医薬組成物。
【請求項４】
前記ＰＧＡの分子量は、１ｋＤａないし１５，０００ｋＤａであることを特徴とする請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
ＰＧＡを有効成分として含む血栓予防用食品。
【請求項６】
前記食品は緑茶または玄米緑茶であることを特徴とする請求項５に記載の食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリγグルタミン酸（poly-gamma-glutamic acid: PGA）を有効成分として含む抗凝固剤（anticoagulant）及び血栓予防用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液の凝固は、血液の状態が液状からゲル状に切り換わる現象を言い、血止め作用の一つである。生体内で血止め現象は、必ず損傷した血管の周辺でのみ起こり、多くの凝固因子の選択的な結合と、血漿内で存在する様々なタンパク質加水分解の抑制因子及び拮抗的作用を行う一連の酵素反応によって精巧に調節されている(Harlan, J.M. et al., Med. Clin. North Am., 65:855, 1981)。このような精巧な調節にもかかわらず、多様な病的または外部的な原因によって生体内の血液凝固及び溶解の均衡が割れれば、過度な血栓が形成されてしまって、脳卒中や心臓麻痺などが誘発される（Gormez, C.C. et al., Angiologia, 43:241, 1991）。
【０００３】
脳卒中（cerebral apoplexy）は、様々な脳血管疾患によって発生する急激な意識障害及び運動障害などを含む脳神経症侯群であって、韓国では男女共に死亡率第１位を占める重度の疾患である。脳卒中による組織怪死は、その再生が不可能である。したがって、根本的な治療としては、危険因子を取り除くことであり、回生可能な組織に対する治療及び回生の助けが優先されねばならず、怪死以後の脳圧の増加による脳損傷及び神経学的な余病が起こる恐れがあるので、精神的な治療と共に物理的な治療を要する。これを治療するための方法として、虚血部位に血流を充分に供給し、虚血性変化における細胞を保護する抗凝固剤、抗血小板剤、血栓溶解剤、血液粘度降下剤、虚血進行遮断剤などの薬物療法を利用する。
【０００４】
脳卒中を引き起こす要因のうち代表的なものは、高血圧、高脂血症、心臓疾患、血栓症、糖尿などの疾患と、経口避妊薬、喫煙、アルコールなどがある。前記要因のうち高血圧は、最も危険な要因であって、優先的に治療されねばならず（Matlu, N. et al., Arch. Neurol., 8:644, 1963）、脳卒中が問題になる場合には、カルシウム拮抗剤としてジヒドロピリジン（dihydropyridine）系及びアンジオテンシン転換酵素抑制剤などを使用する。高脂血症は、動脈硬化を誘発するので、食餌療法と共に脂肪分解を阻害する効果のあるナイアシン（niacin）、脂質タンパク質リパーゼ（lipoprotein lipase）を活性化させて、トリアシルグリセロール（tracylglycerol）の数値を低めるクロフィブレート（clofibrate）及びゲムフィブロジル（gemfibrozil）、胆汁酸に結合する樹脂であるコレスチラミン（cholestyramine）及びコレスチポール（colestipol）、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元剤（reductase）という酵素を阻害してコレステロールの合成を阻害するロバスタチン（lovastatin）、プラバスタチン（pravastatin）などを使用して治療する。
【０００５】
一方、抗凝固剤（anticoagulants）は、心血管系内の異物（人工弁膜など）や不整脈による血液凝固（血栓症）を予防するための薬物である。抗凝固療法を使用する場合は、深部静脈の血栓治療及び予防、肺塞栓症、心臓疾患、人工心臓弁膜置換術以後の脳栓塞症などが該当するが、このときに使用する薬物としては、硫酸基を有する酸性多糖類の一種として、血液凝固阻止作用の強い物質であるヘパリン（heparin）と、ビタミンＫ拮抗剤（vitamin K antagonist）であるワルファリン（warfarin）が代表的であり、フラキシパリン、エノキサパリンなどもある。ヘパリンは、アンチトロンビン（antithrombin）IIIに結合して、速い抗凝固作用を表す。アンチトロンビンIIIは、ヘパリン補酵素とも言われ、セリン・プロテアーゼ（serine protease）及びトロンビン（thrombin）のような各種の凝固因子を阻害する。ヘパリンの過容量は、むしろアンチトロンビンの活性を低減させるため、血栓症の危険があって、低容量で静脈注射または皮下注射として使用され、患者の血液凝固程度を随時にチェックしつつその投与容量を決定する。
【０００６】
ビタミンＫの拮抗剤としては、ワルファリン及びジクマロール（dicumarol）がある。ワルファリンは、体内の抗凝固因子を抑制する効果を表す経口用抗凝固剤であって、長期間の抗凝固療法に利用されるが、血液凝固に関与するタンパク質の合成に関与する補酵素であるビタミンＫの代わりに作用して凝固因子を不活性化させ、そのような作用を表す時間が長いため、急性には使用しない。
【０００７】
抗凝固剤は、既存に血栓が発生する疾患ではなければ、約３ヶ月間使用した後に他の方法に切り換える。抗凝血作用を有するムコ多糖類であるヘパリンは、高等動物の肝・肺・腎臓・筋肉など、毛細管の多い臓器や血液内に分布されている。動物組織内においてムコタンパク質として存在し、アルカリで抽出して、タンパク質を酵素で取り除けば精製される。分子量は、約１万〜２万であり、化学的にＤ−グルコサミン・Ｄ−グルクロン酸・Ｌ−イズロン酸が鎖状に結合したものである。トロンボプラスチンの生成を防ぎ、トロンビンに対する抗トロムビンの結合率を高めて血液凝固を抑制し、血清のリポタンパク質を分解するリパーゼを誘導・合成して血液掃除作用をも行う。ヘパリンは、静脈血栓症及び肺塞栓症に使用される主薬物であり、血栓症の発作の回数を減少させる。また、手術後の静脈血栓症の予防及び急性心筋梗塞にも使用される。胎盤を通過しないが、妊婦への使用は考慮せねばならない。
【０００８】
一方、フィブリノゲン（fibrinogen）は、水溶性血漿タンパク質の一種であって、分子量が３４０ｋＤａであり、体内には約２．５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在するヘキサプロテイン（hexaprotein）であって、トロンビンによってフィブリンになる（Craik, C.S. et al., Science, 237:909, 1987）。このように生成されたフィブリンは、血液凝固において重要な役目を行い、血栓の基本物質である。プラスミンは、体内で凝固されたフィブリンの分解、２−アンチプラスミン（2-antiplasmin）の阻害、損傷した組織の復元、マクロファージ（macrophage）の活性化などの役目を行う（Daka, M.D. et al., J. Vasc. Interv. Radiol., 6:73, 1995）。プラスミンは、普通プラスミノーゲンというチモーゲン（zymogen）の形態で存在し、Ａｒｇ５６１−Ｖａｌ５６２がプラスミノーゲン活性剤によって分解された場合、活性型に変わって線維素溶解（fibrinolytic）活性を表す（Mullertz, S., Fibrinolysis, 1:3, 1987）。このような線維素溶解システムは、血管内のフィブリンの沈着に対する一種の防御的な機能であって、血栓から生体を保護する機能を行う。このような線維素溶解活性を有する酵素は、プラスミンのようなセリン・プロテアーゼが大部分であり、枯草菌（Bacillus subtilis）などの微生物は、多様な種類のセリン・プロテアーゼを生産する（Kraut, J., Ann. Rev. Biochem., 46:331, 1977）。
【０００９】
これまで血栓症の治療剤として使用されているものは、ストレプトキナーゼ（streptokinase）、ウロキナーゼ（urokinase）、組織型プラスミノーゲン活性剤（tissue-type plasminogen activator, tPA）などがあるが、このようなセリン・プロテアーゼを利用した治療剤は、非経済的であり、半減期が短く、また誤用時に血管出血などの副作用があり、ウロキナーゼを除いては、経口投与が難しいという問題点があった。現在、日本の宮崎医科大学チームは、中風の治療に使用されてきたミミズから６種の血栓溶解酵素（lumbrikinase）を分離して経口用治療剤にしたが、製品の半減期が短く、かつ高価であるという短所があった（Mihara, H. et al., Lubricus rubellus Jan. J. Physiol., 41:461, 1991）。
【００１０】
一方、ポリγグルタミン酸（ＰＧＡ）は、Ｄ,Ｌ−グルタミン酸がγ−グルタミル（γ-glutamyl）と結合された重合体であって、粘液性の物質であり、稲わらを利用した韓国の伝統的な豆発酵食品である清麹醤、日本の伝統的な豆発酵食品である納豆、ネパールの伝統的な豆発酵食品であるキネマなどから分離したバシラス属菌株から生産され、食用、水溶性、陰イオン性、生分解性高分子物質であって、吸湿剤、保湿剤及び化粧品の原料物質として利用可能な天然高分子物質である。
【００１１】
最近、ＰＧＡの生産及び利用に関して難分解性重合体の代替商品素材、エステル化反応による耐熱性プラスチックの開発と、水溶性纎維及び膜生産などへの研究が先進国を中心に活発に行われている。また、ＰＧＡを原料として吸水性、生分解性及び可塑性のある環境にやさしい素材であるヒドロゲル（Hydrogel）の開発及び産業化の研究が推進されているが、化学架橋剤の処理方法で水溶液に放射線を照射すれば、ＰＧＡの分子間に仮橋反応が起こって、吸水性、生分解性及び可塑性を特徴とするＰＧＡ樹脂が得られ、このようなＰＧＡ樹脂は、オムツなどの衛生用品、食品、園芸産業への応用可能性が非常に高い高分子物質である。
【００１２】
また、ＰＧＡの組成、ＰＧＡの生産に及ぶマンガンイオンの影響、超音波分解による水溶性重合体としての利用に対する研究、及びエステル誘導体の合成による低水溶性プラスチックの開発に関する研究（Ito, Y. et al., Biosci, Biotechnol, Biochem, 60:1239, 1996）、枯草菌によるＰＧＡの生産及びカルシウム溶解剤としての骨粗鬆症の治療効果を有する健康食品としての活用（JP 6-32742）、水系のリンの含量を減少させることにより水質汚染を減少させる効果（EP 838160）、ＰＧＡの溶解、沈澱及び乾燥による固形化生分解性纎維や、フィルム及びフィルム成形体としての利用（JP 7-138364、 JP 5-117388）、薬物運搬体用ポリマー（JP 6-92870、 JP 6-256220）などについての報告もある。したがって、ＰＧＡは、低水溶性プラスチック、骨粗鬆症の治療効果を有する健康食品、水質汚染改善剤、生分解性纎維や、フィルム及びフィルム成形体、薬物運搬体用ポリマーなどとして利用可能な非常に有用な天然高分子である。
【００１３】
本発明者らは、高分子量のＰＧＡを生産する耐塩性菌株である  バチルスサブチルスチョングックチャン菌株を使用してＰＧＡを生産する方法に関する特許（韓国登録特許第１０−５００７９６号）を獲得し、その他に、ＰＧＡを含む抗癌組成物、免疫補強剤及び免疫増強剤に対する特許（韓国登録特許第１０−４９６６０６号、韓国登録特許第１０−５１７１１４号、韓国登録特許第１０−４７５４０６号）を獲得した。しかし、ＰＧＡの抗凝固及び／または血栓予防効果についてはまた報告されていない。
【００１４】
そこで、本発明者らは、多様な用途を有するＰＧＡに対する多様な機能を糾明しようと鋭意努力した結果、安価でかつ生体に無毒性であるＰＧＡが、不整脈による血液凝固（血栓症）を予防するための抗凝固効果を有するということを確認するとともに、それによって血栓が蓄積することを予防するだけでなく、優れた吸水性、徐放性、熱安定性及び細胞無毒性の効果を有するということを確認し、本発明を完成するに至った。
【発明の要約】
【００１５】
結局、本発明の主な目的は、ポリγグルタミン酸（ＰＧＡ）を有効成分として含む抗凝固剤を提供するところにある。
【００１６】
本発明の他の目的は、ＰＧＡを有効成分として含む食飲料用の血栓予防用組成物を提供するところにある。
【００１７】
前記目的を解決するために、本発明は、ポリγグルタミン酸（ＰＧＡ）を有効成分として含む抗凝固剤を提供する。
【００１８】
本発明は、また、ＰＧＡを有効成分として含む血栓予防用の医薬組成物を提供する。
【００１９】
本発明は、また、ＰＧＡを有効成分として含む血栓予防用食品を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
本発明の他の特徴及び具現例は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲からさらに明らかになる。
【図１】ポリγグルタミン酸（ＰＧＡ）の抗凝固効果を示す写真である。
【図２】分子量によるＰＧＡの抗凝固効果を示す写真である。
【図３】ＰＧＡの抗凝固効果をヘパリン溶液と比較して示す写真である。
【発明の詳細な説明妻栄及び具体的ば具現例】
【００２１】
本発明は、ポリγグルタミン酸（ＰＧＡ）を有効成分として含む抗凝固剤及び血栓予防用組成物に関する。
【００２２】
本発明のＰＧＡは、抗凝固効果があって、血栓が血管に蓄積することを予防し、吸水性及び徐放性が優秀であり、水溶性、陰イオン性、生分解性及び食用のアミノ酸高分子素材であって、人体に無害である。したがって、本発明のＰＧＡを有効成分として含む抗凝固剤は、経口または非経口で投与可能であり、薬剤学的な利用においては、薬剤学的な分野で公知された方法によって製造されることが可能であり、適切な賦形剤を使用して精製、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁液剤、注射剤などの剤形として利用されることができる。
【００２３】
本発明において、５０ｋＤａ、２，０００ｋＤａ、４，０００ｋＤａ及び１０，０００ｋＤａのＰＧＡがそれぞれ何れも高い抗凝固剤の効果を表し、濃度別の抗凝固効果の様相も類似し、ＰＧＡは、分子量５０ｋＤａないし１０，０００ｋＤａでは分子量にかかわらず高い抗凝固活性を有するということが確認された。したがって、前記ＰＧＡの分子量は、１ｋＤａないし１５，０００ｋＤａであることを特徴とすることができる。
【００２４】
本発明において、ＰＧＡは、化学合成または微生物の醗酵によって生産されたものを使用することができ、好ましくは、微生物の醗酵によって生産されたものを使用することができ、さらに好ましくは、バチルスサブチルスチョングックチャン菌の醗酵によって生産されたものを使用することができる。
【００２５】
本発明に係る前記血栓予防用組成物は、食品組成物であることを特徴とすることができる。本発明のＰＧＡは、毒性及び副作用がほとんどないので、予防の目的として長期間服用時にも安心して使用することができるので、血栓予防用食品の製造時に食品の主成分または添加剤及び補助剤として使用されることができる。
【００２６】
本発明に係るＰＧＡを含む血栓予防用の食品には、本発明のＰＧＡを０．０１〜１００重量％含むことが好ましく、さらに好ましくは、添加される食品群によって異なるが、一般的に飲み物に調製する場合には、０．０１〜５重量％含むことができる。
【００２７】
本発明に係る血栓予防用食品は、本発明のＰＧＡの含まれた緑茶、マンネンタケ、紅茶、アマドコロ、レモン、人参、ナツメ、イチョウの葉、雲きのこ、砂場きのこ、キサマツモドキまたは／及び冬虫夏草を利用した血栓予防用の食品でありうるが、本発明のＰＧＡを有効成分として含んで抗凝固効果が得られるものであれば、それに制限されるものではない。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈されないということは当業者にとっては明らかである。
【００２９】
＜実施例１：ＰＧＡ（poly-gamma-glutamic acid）の製造＞
ＰＧＡは、本発明者らによる先行特許（WO 04/007593）に記載された方法によって製造した。すなわち、基本培地の入っている発酵器にバチルスサブチルスチョングックチャン（Bacillus subtilis var chungkookjang, KCTC 0697BP）菌株の培養液を接種してＰＧＡ含有試料液を修得した後、それを定置させて醗酵液内の多糖類を取り除き、前記ＰＧＡ沈殿物に蒸溜水を加えて溶解させ、タンパク質分解酵素を加えて恒温器で定置反応させて、ＰＧＡ試料に存在する細胞外のタンパク質を分解させた後、十分な量の蒸溜水で透析して遊離されたグルタミン酸を取り除いた後、濃縮して純粋なＰＧＡを得た。このように修得したＰＧＡの平均分子量は１３，０００ｋＤａであり、９５％以上の分子が分子量３，０００ｋＤａないし１５，０００ｋＤａの範囲に属し、また、分子量１ｋＤａないし１５，０００ｋＤａのＰＧＡを確認することができた。
【００３０】
＜実施例２：ＰＧＡの抗凝固効果＞
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血液を採取した後、実施例１で修得したＰＧＡの含まれたＰＧＡ溶液とそれぞれ１：１で混合した。それを常温で約２０分間放置した後、血液を含んだＦＡＣＳ（Fellow of the American College of Surgeons）チューブを９０°に傾けて、流れの程度を比較して血液凝固程度を確認した結果、０．５％で抗凝固能力があるということを確認した（図１）。
【００３１】
＜実施例３：ＰＧＡの分子量による抗凝固効果＞
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血液を採取した後、実施例１で修得した０．５％のＰＧＡの含まれたＰＧＡ溶液とそれぞれ１：１で混合した。それを常温で放置した後、時間経過によって血液を含んだＦＡＣＳチューブを９０°に傾けて、流れの程度を比較して血液凝固程度を確認した結果、５０ｋＤａ、２，０００ｋＤａ、４，０００ｋＤａ及び１０，０００ｋＤａ分子量のＰＧＡで何れも類似した抗凝固効果を表すということを確認した。したがって、ＰＧＡは、分子量にかかわらず５０ｋＤａないし１０，０００ｋＤａの分子量で何れも類似した抗凝固効果を表すということを確認した（図２）。
【００３２】
＜実施例４：ＰＧＡの抗凝固効果の比較＞
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血液を採取した後、実施例１で修得したＰＧＡの含まれたＰＧＡ溶液とヘパリン溶液を濃度別に添加して混合した。それを常温で約２０分間放置した後、血液を含んだＦＡＣＳチューブを９０°に傾けて、流れの程度を比較して血液凝固程度を確認した結果、ＰＧＡの濃度が５ｍｇ／ｍＬでヘパリンと類似した抗凝固能力があるということを確認した（図３）。
【００３３】
以下、本発明の剤形例として、ＰＧＡを含む血栓予防用の食品として緑茶、玄米緑茶を例示しているが、本発明の食飲料組成物を含む剤形はそれに限定されるものではない。
【００３４】
＜剤形例１：ＰＧＡを含む緑茶の製造＞
栽培種のお茶の葉を採取して蒸し茶用の雨前の標準工程によって製茶した粗製茶を緑茶原料とした。前記緑茶を粉れ機で、１．０〜３．０ｍｍ のメッシュサイズに粉碎して粉末の緑茶を得た。実施例１で製造されたＰＧＡ粉末と前記緑茶粉末を乾燥重量比０．２：９．８ないし０．３：９．７でそれぞれ定量してカン飲料用として使用し、また定量された緑茶とＰＧＡを混合機に入れて、それをよく混合してティーバッグ用の血栓予防用緑茶を得た。
【００３５】
＜剤形例２：ＰＧＡを含んだ玄米緑茶の製造＞
本発明で得られた血栓予防用の緑茶は、粉末性ティーバッグ製品として使用する場合、アクを純化し、全体的な香味を調和させるための嗜好性の向上のために玄米を添加することができる。玄米を精選・水洗いした後、１００℃で３０ないし６０分間蒸熟処理してごわごわご飯を作った後、乾燥機用のすだれに伸ばして、乾燥温度８０℃で約３ないし４時間熱風乾燥させる、通常家庭でこしきに蒸す過程のような蒸熟過程によって前処理した後、茶炒り用の釜の温度を１００ないし１８０℃にして前処理した玄米を、焦げないように薄い黄色になるまで炒めた後、それを粉れ機に入れて約１．０ないし３．０ｍｍのメッシュサイズに粉碎してティーバッグ用の玄米粉末を得た。
【００３６】
剤形例１で製造された血栓予防用緑茶と前記玄米粉末を２：１ないし４：１の割合で混合した後、粉末性香料０．０２ないし０．０６％（ｗ／ｗ％）を添加して混合機に入れて３０ないし４０分間よく混合することによって、ティーバッグ用の血栓予防用玄米緑茶を得ることができた。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
前述のように、本発明は、ＰＧＡを有効成分として含む抗凝固剤及び血栓予防用組成物を提供する。本発明に係るＰＧＡ含有組成物は、安価であり、かつ半減期が長く、抗凝固効果が優秀であり、毒性及び副作用がほとんどなく、予防目的として長期服用が可能であり、血栓予防用食飲料の開発に有用であり、食品の攝取を通じて脳卒中、心筋梗塞、血栓症などを未然に予防及び改善させることができるので、ＰＧＡの含まれた食品を長期的に摂取することによって、多様な血管疾患を治療及び予防することができる。
【００３８】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に説明したが、当業者ならば、このような具体的な技術は単に好ましい実施例に過ぎず、それによって本発明の範囲が制限されないということは明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、特許請求の範囲とそれらの等価物によって定義されると言える。
【図１】
2009522254.tif 000003
【図２】
2009522254.tif 000004
【図３】
2009522254.tif 000005
【国際調査報告】
2009522254.tif 000006
2009522254.tif 000007