(57)【要約】  本発明は尋常性魚鱗癬（ＩＶ）、アトピー及び潜在的にフィラグリン遺伝子配列の機能喪失変異と関連した他の疾患の予防／治療に関する。この予防／療法は該フィラグリン遺伝子の突然変異対立遺伝子内に見られるナンセンス突然変異を宿主の翻訳機構がリードスルー出来るようにする薬剤の使用に基づく。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＶ及び／又は関連する疾患を治療する薬剤の製造のための、フィラグリン遺伝子内の機能喪失変異のリードスルーを可能にすることが出来る薬剤の使用。
【請求項２】
フィラグリン遺伝子内の機能喪失変異のリードスルーを可能にすることが出来る薬剤を患者に投与する工程を含む、ＩＶ及び／又は他の関連する疾患を予防又は治療する方法。
【請求項３】
前記方法が美容上の処置と考えられる請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記機能喪失変異がナンセンス突然変異である前記請求項のいずれかに記載の使用又は方法。
【請求項５】
前記突然変異が１５０１Ｃ＞Ｔ（開始ＡＴＧからの番号付け）であり、これがシチジンのチミジンによる置換と、アルギニンから終止コドンへのポジション５０１における対応するアミノ酸の変化（Ｒ５０１Ｘ）とをもたらす請求項４記載の使用又は方法。
【請求項６】
前記患者が新生児、小児又は成人である前記請求項のいずれかに記載の方法の使用。
【請求項７】
前記薬剤がアミノグリコシド系抗生物質である前記請求項のいずれかに記載の使用又は方法。
【請求項８】
前記アミノグリコシドがゲンタマイシン、パロモマイシン、ネオマイシン又はトブラマイシンである請求項７記載の使用又は方法。
【請求項９】
前記薬剤がネガマイシン又は突然変異ｔＲＮＡである請求項１ないし６のいずれか１項に記載の使用又は方法。
【請求項１０】
ａ）突然変異フィラグリン遺伝子／レポーター遺伝子コンストラクトを提供し；
ｂ）試験薬剤を前記コンストラクトと接触させ；並びに
ｃ）前記試験薬剤が前記突然変異フィラグリン遺伝子のリードスルー及びレポーター遺伝子の発現を生じさせることが出来るか否かを検出する；
工程を含む、ナンセンス突然変異をリードスルーする能力に関して薬剤を試験する方法。
【請求項１１】
前記フィラグリン核酸配列が１０−１０００ｂｐ長である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記突然変異フィラグリン遺伝子／レポーター遺伝子コンストラクトが、３’レポーター遺伝子配列にインフレームで結合した５’突然変異フィラグリン核酸配列を含む、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記コンストラクトがさらに追加のポジティブコントロールレポーター遺伝子を前記フィラグリン配列の５’に含んでいる請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子；β−ガラクトシダーゼ遺伝子；緑色蛍光タンパク質等の蛍光遺伝子；クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ；β−グルクロニダーゼ等である請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記コンストラクトが図１に模式的に示されている請求項１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は尋常性魚鱗癬（ＩＶ）、アトピー及び潜在的にフィラグリン遺伝子配列の機能喪失変異と関連した他の疾患の予防／治療に関する。この予防／療法は該フィラグリン遺伝子の突然変異対立遺伝子内に見られるナンセンス突然変異を宿主の翻訳機構がリードスルー出来るようにする薬剤の使用に基づく。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
尋常性魚鱗癬（ＩＶ；ＯＭＩＭ＃  １４６７００）は最も一般的な角化の遺伝性疾患であり、ヒトにおいて最も多い単一遺伝子病の一つである。最も広く引用される発生率は、６０５１個体の健康なイギリス人学童の調査に基づく、２５０人中１人という数字である1。ＩＶのアトピー体質への関与はよく立証されている；ＩＶの人々のうち３７−５０％がアトピー性疾患、特にアトピー性皮膚炎（湿疹）を有し1,15、また逆に約８％のアトピー性皮膚炎患者がＩＶの古典的特徴を有する1,16。
【０００３】
ＩＶの表現型の特徴としては、手掌部ハイパーリニアリティ（ｐａｌｍａｒ  ｈｙｐｅｒｌｉｎｅａｒｉｔｙ）、毛孔性角化症；並びに下腹部、上肢及び下肢にわたって最も顕著に見られる細かい鱗屑などがある2。フィラグリン（Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ）（フィラメント凝集タンパク質（ｆｉｌａｍｅｎｔ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ））は、角質層の形成において重要である3-5。毛包間表皮の顆粒層におけるケラトヒアリン顆粒は主に４００ｋＤａのタンパク質であるプロフィラグリンからなる。短い固有のＮ末端ドメインに続き、プロフィラグリン分子の多くは、３２４アミノ酸のフィラグリン配列の１０−１２回リピートからなる6。顆粒細胞の最終分化の際、プロフィラグリンはタンパク質分解により〜３７ｋＤａのフィラグリンペプチドとＳ１００様カルシウム結合ドメインを含むＮ末端ドメインとに開裂する。フィラグリンは急速にケラチン細胞骨格を凝集させ、顆粒細胞を崩壊させて平らな無核扁平細胞にする。この凝縮した細胞骨格は周辺帯（ｃｏｒｎｉｆｉｅｄ  ｃｅｌｌ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  （ＣＣＥ））の形成中にトランスグルタミナーゼによって架橋される。ＣＣＥは皮膚の最外障壁層であり、水分の喪失を防ぐだけでなく、アレルゲンや病原菌の侵入をも妨げる7。従ってフィラグリンは表皮分化を促進し、障壁機能を維持することにおいて重要なタンパク質である。
【０００４】
イムノブロッティング分析において、フィラグリンタンパク質はＩＶ患者の皮膚及び／又はケラチノサイト中に存在しなかったか又は著しく減少していたことが示されている8-10。また、フィラグリンｍＲＮＡの減少がＩＶの個体の一部において示されている11。マウス劣性突然変異体であるｆｌａｋｙ  ｔａｉｌ（ｆｔ）はヒトＩＶに見られる組織学的及び超微細構造的な特徴を有しており12、齧歯類フィラグリン遺伝子座（ＦＬＧ）に対し強い遺伝的連鎖が得られている17,18。生化学的分析においてｆｔ／ｆｔホモ接合体におけるプロフィラグリンの不完全なプロセシングが示されてはいるが12、ＦＬＧ遺伝子におけるゲノム突然変異はこれまでに全く同定されていない。
【発明の開示】
【０００５】
本発明者らは、フィラグリンをコードする遺伝子のある機能喪失変異を発見し、その結果として起こるフィラグリンの減少／喪失がＩＶ並びにアトピー性皮膚炎（湿疹）、喘息、乾癬及び／又はアレルギー等の他の疾患の発症と関連していることを発見した。この研究は印刷中のいくつかの論文（Ｓｍｉｔｈ  Ｆ．Ｊ．Ｄ．ほか，２００６；Ｐａｌｍｅｒ  Ｃ．Ｎ．Ａ．ほか，２００６）及び同時継続中の特許出願第ＧＢ０５２５４９２．５号のテーマである。
【０００６】
遺伝子治療の適用による潜在的な治療以外にも、同定された前記フィラグリン突然変異の少なくとも一部を克服するように設計された小分子薬を用いてＩＶが治療され得ることが望ましい。
【０００７】
従って、ＩＶ及び他の関連する疾患を予防及び／又は治療するための手段を提供することが本発明の目的に含まれる。
【０００８】
発明の概要
本発明は一部、特定の薬剤が前記フィラグリン遺伝子の機能喪失変異をリードスルーさせる能力と関連した本発明者らによる研究に基づく。
【０００９】
第１の局面において、本発明はＩＶ及び／又は関連する疾患の治療薬製造のための、フィラグリン遺伝子内の機能喪失変異のリードスルーを可能にする能力がある薬剤の使用を提供する。
【００１０】
さらなる局面においては、フィラグリン遺伝子内の機能喪失変異のリードスルーを可能にする能力がある薬剤を患者に投与する工程を含んだ、ＩＶ及び／又は他の関連する疾患を治療する方法が提供される。
【００１１】
本発明はＩＶの治療を、及び／又はＩＶを発症し易い動物患者、特にヒト患者の治療を可能にするものであると理解される。また、重症型又は軽症型ＩＶが他の疾患と関連性を示すことから、該治療はアトピー性皮膚炎（湿疹）、喘息、乾癬又は接触性アレルギー及び食物アレルギー（たとえばピーナッツアレルギー）等のアレルギーを患いやすいと思われる、又は患っている患者に使用され得る。皮膚の状態に関しては、フィラグリン発現が低水準であることによって軽症の及び／又は準臨床的な疾患の発症がもたらされることがある。このように、本発明は前記の軽症の及び／又は準臨床的な形態の疾患の予防及び／又は治療にも関し得る。実際、多くの皮膚状態が診断未確定となり、治療がむしろ美容上の処置として考えられることがある。従って、本発明は任意のこのような化粧療法にも及ぶ。
【００１２】
克服しうる機能喪失変異は一般的にナンセンス突然変異である。このような突然変異は典型的には中途終止コドン（即ちＴＧＡ、ＴＡＧ又はＴＡＡ）を結果として生ずる単一塩基の変異である。本発明者らは前記フィラグリン遺伝子内に機能喪失をもたらす多数の突然変異を同定したが、一つは特に中途終止コドンをフレーム内で生ずるものである。この突然変異は前記ＦＬＧ遺伝子のポジション１５０１における１塩基置換である。該突然変異は１５０１Ｃ＞Ｔ（開始ＡＴＧからの番号付け）であり、これはシチジンのチミジンによる置換と、アルギニンから終止コドンへのポジション５０１における対応するアミノ酸の変化（Ｒ５０１Ｘ）とをもたらす。この突然変異は第１フィラグリンリピート内で生じ、結果として終止コドンを生成するため、フィラグリンペプチドの機能的なコピーは産生されない。本発明者らは前記フィラグリン遺伝子内に他の突然変異も同定したが、これはこれまでのところ欧州の白人集団において最も一般的に観察されているものであり、該突然変異の克服は本発明の好ましい局面である。
【００１３】
前記患者は予防的又は治療的に処置することが必要などのような患者でもよく、適切に新生児又は胎児でさえあってもよい。該患者はしかしどのような世代であってもよく、従って新生児、小児及び成人を含む。
【００１４】
ナンセンス突然変異のリードスルーを誘導することが出来る公知の薬剤は多数存在する。薬剤の一つの種類は一部のアミノグリコシド系抗生物質であり、ゲンタマイシン、パロモマイシン、ネオマイシン及びトブラマイシンを含む（Ｂｉｄｏｕ  Ｌ．ほか，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １１：６１９−６２７，２００４；Ｈｏｗａｒｄ  ＭＴ．ほか，Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ，５５：４２２−４２６，２００４）。
【００１５】
ネガマイシンを含む別の種類の薬剤は、ＵＳ２００５／００１４８３５に記載されており、参照により本明細書に組み入れられたものとする。最後に、変異したｔＲＮＡがナンセンス突然変異のサプレッサーとして生成されうる。これらはナンセンス突然変異によって生じたコドンをリードスルーする能力を有するように改変されたアンチコドンを有するｔＲＮＡを結果として生成する突然変異ｔＲＮＡ遺伝子から生成される。これは、例えばＰａｎｃｈａｌ  ＲＧほか，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  １０：２２０９−２２１９（１９９９）に記載されている。
【００１６】
上述の同定された薬剤以外にも他の適した突然変異サプレッサーが存在し得るため、本発明はこのようなサプレッサーを同定する方法も提供する。
【００１７】
従って、さらなる局面においては、
ａ）突然変異フィラグリン遺伝子／レポーター遺伝子コンストラクトを提供し、
ｂ）試験薬剤を前記コンストラクトと接触させ；並びに
ｃ）前記試験薬剤が前記突然変異フィラグリン遺伝子のリードスルー及びレポーター遺伝子の発現を生じさせることが出来るか否かを検出する
工程を含む、ナンセンス突然変異をリードスルーする能力に関して薬剤を試験する方法が提供される。
【００１８】
適した任意の同定された薬剤は、ＩＶ及び／若しくは本明細書で述べられている他の関連する疾患の治療において、又は実際にナンセンス突然変異によって引き起こされたどのような疾患／遺伝的状態においても有用であり得る。
【００１９】
前記コンストラクトはプロモーター及びターミネーター配列等の適当な転写制御因子の制御下にあると理解される。さらに、内部ナンセンス配列を有するフィラグリン核酸配列が該コンストラクト中に存在する。フィラグリン核酸配列は全体を用いる必要は無く、一部のみが必要である。都合良くは、該フィラグリン核酸配列は１０−１０００ｂｐ長、より好ましくは１５−２００ｂｐ長であってよい。
【００２０】
典型的な突然変異フィラグリン遺伝子／レポーター遺伝子コンストラクトはインフレームで３’レポーター遺伝子配列に結合した５’突然変異フィラグリン核酸配列を含む。ここで、該レポーター遺伝子配列の発現が少しでも起こるためには、該５’フィラグリン配列内に位置するナンセンス／終止コドンがリードスルーされる必要がある。
【００２１】
好ましいコンストラクトはさらに追加のポジティブコントロールレポーター遺伝子を前記フィラグリン配列の５’に含む。全ての配列はインフレームで互いに結合していると理解される。このようなコンストラクトにおいて、前記の５’ポジティブコントロールレポーターは、使用者が該コンストラクトが適切に機能していることを確認出来るように提供される。前記フィラグリン遺伝子のリードスルーが起こらなかった場合は、ポジティブレポーターのみが検出可能なシグナルをもたらす。しかし、該フィラグリン遺伝子のリードスルーが起こった場合、該ポジティブコントロールレポーター及び前記フィラグリン配列の３’の前記レポーター遺伝子がともに検出可能なシグナルをもたらす。又は、前記ポジティブレポーターは別のプロモーターの制御下で前記コンストラクト内に存在しているか、若しくは該ポジティブレポーターはコトランスフェクトされる別のプラスミドによってコードされていてもよい。
【００２２】
前記レポーター遺伝子又はポジティブコントロールレポーター遺伝子の使用のための適したレポーター遺伝子は当業者に周知であり、例えばルシフェラーゼ遺伝子；β−ガラクトシダーゼ遺伝子；緑色蛍光タンパク質等の蛍光遺伝子；クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ；β−グルクロニダーゼ等を含む。さらに、個々の遺伝子の様々な型を生物の様々な種から得ることが出来る。
【００２３】
特に好ましいコンストラクトは、図１に模式的に示すように、ポジティブコントロールレポーターとしてのウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子、突然変異フィラグリン核酸配列及び前記レポーター遺伝子としてのホタルルシフェラーゼ遺伝子を、例えばＨＳＶ−ＴＫプロモーター及びＳＶ４０−ポリＡ終結シグナルを用いた適当な転写制御の下に含む。しかし、多数の他の適したコンストラクトも想定することが出来、前記レポーターは細胞が特定の増殖培地中でそのレポーターが発現した際にのみ生存することが出来るようにするレポーターであってもよい。
【００２４】
任意の個々のレポーターの発現の検出は当業者に周知の技法により行うことが出来る。
【００２５】
第１ラウンドのスクリーニングに続き、任意の有用であり得る薬剤を試験することが適当であり得、これは該薬剤が前記突然変異のリードスルーを引き起こすことが出来ることを解明／確認するために、ナンセンス突然変異と関連した疾患を患う患者から得た細胞又は細胞株に対して該薬剤を試験することにより行われる。
本方法は公知の細胞を用いた又は無細胞の系で行うことが出来ると理解される。
【００２６】
以下、本発明を実施例に基づき、次の図を参照しながらさらに説明する。
図１にフィラグリンナンセンス突然変異リードスルー薬剤のアッセイのためのコンストラクトを示す。Ａ：ｐＲＬ−ＴＫ内のＲ−ＬｕｃのＴＡＡ終止コドンを２ｂｐの欠失により変異させて無くしたもの、並びにＦＬＧ及びｆ−Ｌｕｃに対してインフレームで配置したＸｂａＩサイト；Ｂ：ｐＳＰ−ｌｕｃ＋ＮＦのＮｃｏＩサイトにクローニングしたＦＬＧオリゴカセット；Ｃ：‘リーキー（ｌｅａｋｙ）な’発現を減らすためにｆ−ＬｕｃのＡＴＧコドンを変異させて無くしたもの。
【００２７】
図２にｐＳＰ−ｌｕｃ＋へのクローニングのためのＦＬＧオリゴヌクレオチドカセットを示す；
【００２８】
図３にＴＲ３コンストラクトを示す：染色体６ｐ２２．１からのヒトＡｒｇ（ＣＧＡ）  ｔＲＮＡ遺伝子；
【００２９】
図４にＴＲ４Ｂコンストラクトを示す：染色体１５ｑ２６．１からのヒトｔＲＮＡ−Ａｒｇ（ＴＣＧ）遺伝子；
【００３０】
図５に予想されるＴＲ３及びＴＲ４ＢサプレッサーｔＲＮＡの二次構造を示し、変異させたアンチコドンループを示す。該アンチコドンループを太字で示し、これがＴＧＡコドンと対を形成することを可能にするＧ＞Ａ変異をマークで示す。示された塩基はＤＮＡから予測されるものであり、転写後修飾を説明するものではない；
【００３１】
図６に前記フィラグリンＲ５０１Ｘ突然変異のリードスルーを示す。（ａ）上皮細胞株２９３をｐＲＬＦ−ＦＬＧ−ＷＴ又はｐＲＬＦ−ＦＬＧ−５０１Ｘレポータープラスミドで一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を溶解し、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｄｕａｌルシフェラーゼアッセイシステムを製造者のプロトコルに従って用いてルシフェラーゼをアッセイした。
【００３２】
トランスフェクトされていない細胞はウミシイタケのシグナルもホタルのシグナルも示さなかった。前記野生型フィラグリン配列を含む前記ポジティブコントロールコンストラクトｐＲＬＦ−ＦＬＧ−ＷＴはポジティブなウミシイタケ及びホタルのシグナルを示した。一方、前記ｐＲＬＦ−ＦＬＧ−５０１Ｘコンストラクトは同等のウミシイタケのシグナルを示したが、リードスルー薬剤の不在下では検出可能なホタルのシグナルを示さなかった。これは、このｐＲＬＦ−ＦＬＧ−５０１Ｘコンストラクトが‘リーキー’ではなく、従ってアッセイ又はリードスルー薬剤に適していることを示している。
【００３３】
（ｂ）ウミシイタケ及びホタルルシフェラーゼ遺伝子の間にインフレームでクローニングされたＲ５０１Ｘ突然変異を有するヒトフィラグリン遺伝子断片を含んだｐＲＬＦ−ＦＬＧ−５０１Ｘコレポーター（ｃｏｒｅｐｏｒｔｅｒ）で前記２９３細胞株を一過性にトランスフェクトした。
【００３４】
リードスルー活性はウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して標準化したホタルルシフェラーゼ活性として測定した。読み取りは四回行い、平均をとった。
【００３５】
サプレッサーｔＲＮＡであるＴＲ３及びＴＲ４ＢｓｕｐＴＧＡはフィラグリンＲ５０１Ｘナンセンス突然変異のリードスルーを可能にする。ゲンタマイシンは用量依存的な様式で該フィラグリンＲ５０１Ｘ突然変異のリードスルーを可能にする；
【００３６】
図７は、ゲンタマイシンが尋常性魚鱗癬個体（ＦＬＧ  Ｒ５０１Ｘホモ接合体）からのケラチノサイト中のフィラグリンの再発現を誘導することを示す。
【００３７】
初代ケラチノサイトを無血清ＫＧＭ中で培養し、低カルシウム培地（０．０９ｍＭ）から高カルシウム培地（１．８９ｍＭ）に移すことにより層形成（分化）を誘導した。培養物をメタノール／アセトンを用いて固定し、ヒトフィラグリンリピート配列に対するＮｏｖｏｃａｓｔｒａモノクローナル抗体１５Ｃ１０を用いて間接免疫蛍光法により染色した。１ｍｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）を用いて核酸を対比染色した；（ａ）正常なコントロールケラチノサイトは分化するとフィラグリンを発現する、（ｂ）Ｒ５０１Ｘホモ接合体ケラチノサイトは分化してもフィラグリンを発現しない、（ｃ）Ｒ５０１Ｘホモ接合体ケラチノサイトは分化すると６００μｇ／ｍｌのゲンタマイシン存在下（薬剤とともに９６時間インキュベート）でフィラグリンを発現する；並びに
【００３８】
図８にゲンタマイシン治療後のＲ５０１Ｘ患者からのフィラグリンの発現を示す。顕著な尋常性魚鱗癬を有するＲ５０１Ｘホモ接合体患者からの皮膚生検材料を器官培養中で６００μｇ／ｍｌのゲンタマイシンと共に９６時間インキュベートするとフィラグリン発現が回復する（矢印）。その後、生検材料をホルマリン固定し、パラフィン包埋し、Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ抗ヒトフィラグリンリピートモノクローナル抗体１５Ｃ１０を免疫ペルオキシダーゼ検出とともに用いる免疫組織化学用に処理した；Ａ：非処理生検材料；Ｂ：ゲンタマイシン処理。
【００３９】
材料及び結果
[実施例１]
リードスルー薬剤のアッセイのためのコレポーター遺伝子コンストラクト
前記ヒトフィラグリン遺伝子の塩基番号１４８０−１５２３（ＦＬＧ；ＡＴＧ開始コドンからのコード配列の番号付け；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２０１６．１）に相当するオリゴヌクレオチドカセットをプラスミドベクターｐＳＰ−ｌｕｃ＋ＮＦ（Ｐｒｏｍｅｇａ）内のホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｆ−Ｌｕｃ）のＡＴＧコドンにかかる特有のＮｃｏＩ制限サイトにクローニングした。図２に示す該オリゴカセットはＮｃｏＩの付着末端に対応するように付加されたオーバーハングを有していた。これらのカセットは、一般的なＲ５０１Ｘ突然変異のサイトであるコドン５０１を含んだヒトＦＬＧ遺伝子の領域に相当する。野生型及びＲ５０１Ｘ突然変異型の両者が作成された。正しい向きのインサートを有するクローンをＤＮＡ配列決定によって同定および確認した。前記ＦＬＧカセット挿入物に続くＡＴＧコドン、即ち前記ｆ−Ｌｕｃ遺伝子の本来の開始コドンを次のプレイマーを用いた部位特異的突然変異誘発によりＡＧＧアルギニンコドンに変異させた：ＦＬｍｕｔ１  ５’  ＡＧＧ  ＣＡＴ  ＴＣＡ  ＧＣＣ  ＡＧＧ  ＧＴＣ  ＡＣＣ  ＧＡＣ  ＧＣＣ  ３’及びＦＬｍｕｔ２  ５’  ＧＧＣ  ＧＴＣ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＣＣＴ  ＧＧＣ  ＴＧＡ  ＡＴＧ  ＣＣＴ  ３’（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ｓｙｓｔｅｍ）。これは、ＴＧＡ又は他の終止コドンを含んだ前記ＦＬＧカセットの存在下においてもホタルルシフェラーゼの‘リーキーな’発現をもたらし得る、本来の開始コドンの起こり得る使用を防止するためであった。クローンはＤＮＡ配列決定により確認した。これらのクローンは、前記の野生型及び突然変異型にそれぞれ対応してｐＳＰ−Ｒ５０１及びｐＳＰ−Ｘ５０１と命名した。
【００４０】
プラスミドベクターｐＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ）内のウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ遺伝子（Ｒ−Ｌｕｃ）のＴＡＡ終止コドンを２ｂｐ（ＴＡ）の欠失により変異させた。これは次のプレイマーを用いた部位特異的突然変異誘発により行った：ｐＲＬ．Ｍ１  ５’  ＴＣＡ  ＡＡＡ  ＡＴＧ  ＡＡＣ  ＡＡＡ  ＴＴＣ  ＴＡＧ  ＡＧＣ  ＧＧＣ  Ｃ  ３’及びｐＲＬ．Ｍ２  ５’  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＡＴＴ  ＴＧＴ  ＴＣＡ  ＴＴＴ  ＴＴＧ  Ａ  ３’（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ｓｙｓｔｅｍ）。この変異させたクローン（ｐＲＬ−Ｍ１と命名）を完全に配列決定した。
【００４１】
完成したコレポーターコンストラクトを作成するため、ＦＬＧ−ｆ−Ｌｕｃ融合遺伝子全体を含むＮｈｅＩ−ＸｂａＩ断片をｐＳＰ−Ｒ５０１及びｐＳＰ−Ｘ５０１から切り出した。これらをｐＲＬ−Ｍ１の特有のＸｂａＩサイトにクローニングしたが、これはＮｈｅＩ及びＸｂａＩが互換性のある付着末端を有することから可能であった。正しい向きの野生型及びＲ５０１Ｘ突然変異クローンをＤＮＡ配列決定によって選択した。該野生型及びＲ５０１Ｘ突然変異体コレポーターコンストラクトをそれぞれｐＲＬＦ−ＦＬＧ−ＷＴ及びｐＲＬＦ−ＦＬＧ−５０１Ｘと命名した（図１）。
【００４２】
[実施例２]
ＴＧＡナンセンス突然変異のためのヒトサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子の生成
ヒトゲノムはＣＧＡ−アルギニンｔＲＮＡの多数の遺伝子を有している。これらは非常にコンパクトな遺伝子であり、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのための遺伝子内プロモーターを含んでいる（Ｌｅｗｉｎ  Ｂ．，  Ｉｎ：  Ｇｅｎｅｓ  ＶＩＩ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２０００，  ｐｐ．６２４−６２６）。これらの遺伝子のうち２つ（便宜上ＴＲ３及びＴＲ４Ｂと命名）がヒトゲノムの最新アセンブリ（ＨＧ１７；ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ）で同定され、正常なヒトコントロールＤＮＡから増幅された。ＴＲ３は染色体６ｐ２２．１に、ＴＲ４Ｂは染色体１５ｑ２６．１に位置している。具体的には該ＴＲ３遺伝子は、プライマーＴＲ３．Ｆ  ５’  ＣＧＡ  ＴＧＣ  ＡＧＡ  ＣＡＡ  ＴＡＴ  ＧＣＡ  ＧＡ  ３’及びＴＲ３．Ｒ  ５’  ＣＴＡ  ＡＧＣ  ＣＴＡ  ＣＡＡ  ＡＡＣ  ＣＧＡ  ＡＡ  ３’を用いて、前記ヒトゲノムのＨＧ１７アセンブリにおける塩基番号ｃｈｒ６：２６，４０７，５５５−２６，４０８，２８４に対応する６６８ｂｐの断片として増幅された。前記ＴＲ４Ｂ遺伝子は、ＴＲ４Ｂ．Ｆ  ５’  ＧＡＣ  ＴＴＣ  ＴＧＧ  ＧＴＧ  ＧＧＣ  ＴＣＴ  ＣＣ  ３’及びＴＲ４Ｂ．Ｒ  ５’  ＣＣＣ  ＴＣＣ  ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＡＣＴ  ＴＴＣ  ＣＴ  ３’を用いて、４６５ｂｐの断片として増幅された。この断片は前記ヒトゲノムのＨＧ１７アセンブリにおける塩基番号ｃｈｒ１５：８７，６７９，１６４−８７，６７９，６２８に対応する。ＰＣＲはＨｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）を用い、次の条件で行った：（９４℃  ２分間）ｘ１；（９４℃  ３０秒間、Ｘ℃  ３０秒間、７２℃  ６０秒間）ｘ３５；（７２℃  ５分間）ｘ１。ＴＲ３についてはアニール温度Ｘ＝５５℃；ＴＲ４ＢについてはＸ＝５８℃。これらの断片をｐＣＲ２．１ベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、複数のクローンを配列決定してＰＣＲクローニングによるアーティファクトの無い各コンストラクトのクローンを得た。完全なコンストラクトの注釈付き配列を図３及び４に示す。得られたｔＲＮＡ分子の予想される二次構造を図５に示す。これらｔＲＮＡ遺伝子のアンチコドンループを変異させ、これらがＴＧＡ終止コドンをＣＧＡアルギニンコドンの代わりに認識するようにした：即ち、該遺伝子の該アンチコドンループを５’ＴＣＧ３’から５’ＴＣＡ３’へと変異させた。前記ＴＲ３遺伝子においては、これは突然変異Ｇ３５１Ａ（プライマーＴＲ３．Ｆ（上記）の第１塩基からの任意の番号付け）に相当する。ＴＲ４Ｂにおいては、この突然変異はプライマーＴＲ４Ｂ．Ｆ（上記）の第１塩基からの番号付けに基づくとＧ１８０Ａに相当する。
【００４３】
[実施例３]
ＦＬＧリードスルーのための二重（Ｄｕａｌ）ルシフェラーゼアッセイ
コレポーターコンストラクトｐＲＬＦ−ＦＬＧ−ＷＴ及びｐＲＬＦ−ＦＬＧ−５０１Ｘを、９６穴プレート内でＦｕｇｅｎｅ−６システム（Ｒｏｃｈｅ）を用いた２９３細胞（形質転換ヒト腎臓上皮細胞株）への一過性トランスフェクションにより試験した。トランスフェクション後４８時間の時点で、細胞をＤｕａｌルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）にかけた。該システムはウミシイタケ及びホタルの両者のルシフェラーゼレポーター遺伝子に対応する特異的ルシフェラーゼシグナルを検出する。前記野生型コレポーターｐＲＬＦ−ＦＬＧ−ＷＴでは、図６ａに示すように、ウミシイタケ及びホタルの両者ルシフェラーゼに強いシグナルが得られた。一方、ｐＲＬＦ−ＦＬＧ−５０１Ｘコンストラクトではウミシイタケのシグナルだけが得られ、このコンストラクト中の前記ＦＬＧカセット内に存在する前記Ｒ５０１Ｘ中途終止コドン突然変異がホタルルシフェラーゼの発現の完全な喪失をもたらすことが示された（図６ａ）。
【００４４】
[実施例４]
ＦＬＧナンセンス突然変異のためのリードスルーアッセイ
２９３細胞の一過性トランスフェクションを、ｐＲＬＦ−ＦＬＧ−５０１Ｘを用い、０ないし２０００μｇ／ｍｌのゲンタマイシン濃度の範囲で上記のように９６穴プレート内にて行った。ポジティブコントロールのトランスフェクションをｐＲＬＦ−ＦＬＧ−ＷＴを用いて並行して行った。フィラグリンナンセンス突然変異リードスルー活性をＤｕａｌルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて上記のように測定した。図６ｂでは、ゲンタマイシンが前記Ｒ５０１Ｘ中途終止コドン突然変異のリードスルーを用量依存的な様式で可能にし、この実験においては２０００μｇ／ｍｌの濃度で最大のリードスルーとなることを示す。前記Ｒ５０１Ｘ突然変異のリードスルーのためにアミノグリコシド類を用いる代わりに、ヒトサプレッサートランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）種ＴＲ３ｓｕｐＴＧＡ及びＴＲ４ＢｓｕｐＴＧＡを試験した（実施例２参照）。これらを２９３細胞に上記のｐＲＬＦ−ＦＬＧ−５０１Ｘレポータープラスミドと共にＦｕｇｅｎｅ−６一過性トランスフェクションシステム（Ｒｏｃｈｅ）を用いてコトランスフェクトした。これにより試験した両者のサプレッサーｔＲＮＡ種が強いリードスルーシグナルを生じたことが示された（図６ｂ）。
【００４５】
[実施例５]
ケラチノサイト培養におけるフィラグリン発現の再活性化
初代のケラチノサイト培養を重度のＩＶを有する個体から確立した。この個体はＳｍｉｔｈ  ＦＪＤほか，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２００６，  ｉｎ  ｐｒｅｓｓに記載されているように前記フィラグリンＲ５０１Ｘ突然変異のホモ接合体であることが示されていた。フィラグリンは後期分化特異的タンパク質であるため、通常の初代ケラチノサイトはフィラグリンを検知可能な量にまでは発現しない。しかし、これらの細胞は培養を高カルシウム培地に移すことによりフィラグリンを発現するように誘導することが出来、これによってケラチノサイトの層形成及び分化が引き起こされ、フィラグリン遺伝子の発現がもたらされる（Ｓｍｉｔｈ  ＦＪＤほか，  ２００６  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ）。正常なコントロールケラチノサイトの分化により、十分に層形成した細胞のコロニー内でプロフィラグリンの発現がもたらされる（図７）。該タンパク質は、前記ヒトフィラグリンリピートペプチド内のエピトープに対するモノクローナル抗体１５Ｃ１０（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ）を用いた間接免疫蛍光法によって染色した。一方、前記Ｒ５０１Ｘホモ接合体患者からの十分に層形成した培養物はプロフィラグリンの発現に失敗した（図７、Ｓｍｉｔｈ  ＦＪＤほか，  ２００６，  ｉｎ  ｐｒｅｓｓも参照のこと）。しかし、該Ｒ５０１Ｘホモ接合体患者からの分化した該培養物を６００μｇ／ｍｌのゲンタマイシンで処理すると、十分に層形成した細胞のコロニーが９６時間の時点で正常コントロールに匹敵する水準でプロフィラグリンを発現することが見いだされた（図７）。さらに、該プロフィラグリンはコントロールケラチノサイトにおいて見られたものと類似した細胞質顆粒の形態で存在していた。従って、ゲンタマイシンは培養細胞において前記Ｒ５０１Ｘフィラグリン突然変異のリードスルーを促進することが出来る。
【００４６】
[実施例６]
器官培養における表皮フィラグリン発現の再活性化
顕著なＩＶを有するフィラグリンＲ５０１Ｘ／Ｒ５０１Ｘホモ接合体患者からの皮膚生検材料の３ｍｍキューブを、ダルベッコ改変イーグル培地中で４日間、６００μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを加えた（ｐｌｕｓ）又は加えない（ｍｉｎｕｓ）培養液を用いてインキュベートした。その後、該生検材料を組織学及び免疫組織化学のために固定及び包埋した。非処理の前記生検材料は前記ヒトフィラグリンリピートペプチド内のエピトープに対するモノクローナル抗体１５Ｃ１０（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ）で染色した際に完全にネガティブであり（図８）、フィラグリンヌル突然変異のホモ接合体（Ｓｍｉｔｈ  ＦＪＤほか，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓの論文，  ２００６，  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ）と一致していた。一方、ゲンタマイシンと共にインキュベートした前記生検材料は前記顆粒細胞層の強い染色を示した（図８）。組織学的に同定可能なケラトヒアリン顆粒が存在しないことがホモ接合体又は複合ヘテロ接合体フィラグリンヌル突然変異による重度のＩＶの特徴である（Ｓｍｉｔｈ  ＦＪＤほか，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓの論文，  ２００６，  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ）。重要なことに、ここで見られたゲンタマイシン処理によるフィラグリン染色の回復は、ケラトヒアリン顆粒の新規出現をもたらしている（図８）。さらには、フィラグリン染色が特に強い前記顆粒層において高い部分にあるいくつかの細胞では、その細胞の形態がより扁平になっていることが見いだされる（図８）。従って、回復したタンパク質発現は表皮の正確な最終分化を促進しているようであり、フィラグリンタンパク質機能の完全な回復と矛盾しない。
【００４７】
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【００４８】
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【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】フィラグリンナンセンス突然変異リードスルー薬剤のアッセイのためのコンストラクトを示す。
【図２】ｐＳＰ−ｌｕｃ＋へのクローニングのためのＦＬＧオリゴヌクレオチドカセットを示す。
【図３】ＴＲ３コンストラクトを示す。
【図４】ＴＲ４Ｂコンストラクトを示す。
【図５】予想されるＴＲ３及びＴＲ４ＢサプレッサーｔＲＮＡの二次構造を示し、変異させたアンチコドンループを示す。
【図６】前記フィラグリンＲ５０１Ｘ突然変異のリードスルーを示す。
【図７】ゲンタマイシンが尋常性魚鱗癬個体（ＦＬＧ  Ｒ５０１Ｘホモ接合体）からのケラチノサイト中のフィラグリンの再発現を誘導することを示す。
【図８】ゲンタマイシン治療後のＲ５０１Ｘ患者からのフィラグリンの発現を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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