(57)【要約】Ｍ−ＣＳＦに特異的なＲＸ１ベースの抗体またはＲＸ−Ｉ由来の抗体ならびにこのような抗体を含む薬学的組成物、薬学的組成物を含むキット、および骨芽細胞性疾患または骨溶解性疾患を罹患した被験体において骨量減少を防止および治療するかまたはこの被験体において再造形する方法を提供する。一実施形態において、本発明は、Ｍ−ＣＳＦへの結合についてモノクローナル抗体ＲＸ１と７５％超で競合する非マウス抗体を被験体に投与する工程を含み、このモノクローナル抗体ＲＸ１は、配列番号２および４にそれぞれ示す重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工器官周辺の骨量減少または破骨細胞活性の増加および骨芽細胞活性の増加に関連する疾患を罹患した被験体を治療する方法であって、Ｍ−ＣＳＦへの結合についてモノクローナル抗体ＲＸ１と７５％超で競合する非マウス抗体を被験体に投与する工程を含み、前記モノクローナル抗体ＲＸ１が、配列番号２および４にそれぞれ示す重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を含む方法。
【請求項２】
前記非マウス抗体が、モノクローナル抗体ＲＸ１と同一のＭ−ＣＳＦのエピトープに特異的に結合し、前記エピトープが、配列番号１２０または１２１の少なくとも４個の連続する残基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記非マウス抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記非マウス抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト操作（ｈｕｍａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）抗体、ヒト抗体、または単鎖抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記非マウス抗体は、配列番号９のＭ−ＣＳＦに関する親和性Ｋｄを少なくとも１０−８Ｍまたはそれを超えて保持する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記非マウス抗体は、配列番号２４と９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記非マウス抗体が、配列番号２４を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記非マウス抗体が、
（ａ）配列番号１８、２１、２４、２９、３２、および３６からなる群、または
（ｂ）配列番号２１、２４、３２、３６、およびＱＡＳＱＳＩＧＴＳＩＨ（配列番号１３８）からなる群
から選択される少なくとも３つの配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記非マウス抗体が、
（ａ）配列番号１８、２１、２４、２９、３２、および３６、または
（ｂ）配列番号１８、２１、２４、３２、３６、およびＱＡＳＱＳＩＧＴＳＩＨ（配列番号１３８）の全てを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記非マウス抗体が、配列番号１６、１９、２２、２７、３０、３４、１７、２０、２３、２８、３１、３５、１８、２１、２５、２９、３２、３７、１８、２１、２６、２９、３３、または３８からなる群から選択される１つ以上のＣＤＲをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記非マウス抗体がＣＤＲを含み、ＣＤＲ内の少なくとも１つのアミノ酸が別の抗ＭＣＳＦ抗体の対応するＣＤＲの対応する残基に置換されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記非マウス抗体が、ヒト抗体配列の定常領域ならびにヒト抗体配列の１つ以上の重鎖および軽鎖の可変フレームワーク領域を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヒト抗体配列が、個別のヒト配列、ヒトコンセンサス配列、個別のヒト生殖系列配列、またはヒトコンセンサス生殖系列配列である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記非マウス抗体が、ＩｇＧ１定常領域のフラグメントを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
前記非マウス抗体が、抗体依存性細胞傷害活性または補体依存性細胞傷害活性を減少する変異を前記ＩｇＧ１定常領域中に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記非マウス抗体が、ＩｇＧ４定常領域のフラグメントを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１７】
前記非マウス抗体が、半抗体の形成を減少する変異を前記ＩｇＧ４定常領域中に含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記非マウス抗体が、アミノ酸配列
【化３】
2009502952.tif 000029
（Ｘは任意のアミノ酸である）を含む重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記非マウス抗体が、アミノ酸配列
【化４】
2009502952.tif 000030
（Ｘは任意のアミノ酸である）を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記非マウス抗体が、配列番号４１または４３に示す重鎖可変領域配列のいずれか１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記非マウス抗体が、配列番号４５、４７、４８、５１、５３、または１３６に示す軽鎖配列のいずれか１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記非マウス抗体が、配列番号４１または４３に示す重鎖可変アミノ酸配列と少なくとも８０％同一の重鎖可変アミノ酸配列を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項２３】
前記非マウス抗体が、配列番号４５、４７、４８、５１、または５３に示す軽鎖可変アミノ酸配列と少なくとも８０％同一の軽鎖可変アミノ酸配列を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項２４】
第２の治療薬を投与する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗体を、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜３０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
バイアルまたはボトルなどの容器に包装された、治療有効量の請求項１、請求項８、または請求項２２に記載の抗体を含むキットであって、該容器に添付されているかまたは容器と共に包装されたラベルをさらに含み、該ラベルは、該容器の内容物を記載し、そして破骨細胞活性の増加および骨芽細胞活性の増加に関連する疾患を罹患した被験体を治療するための、該容器の該内容物の使用に関する指示および／または説明を提供する、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｍ−ＣＳＦ特異的抗体の被験体への投与による、骨溶解、癌転移、および癌転移に関連する骨量減少または再造形を防止および治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌転移は、癌患者の術後または治療後再発の主な原因である。治療開発に関する取り組みが集中的に行われているにもかかわらず、癌転移は、実質的には依然として治療抵抗性を示す。骨は、種々のヒト癌型（例えば、乳癌、肺癌、前立腺癌、および甲状腺癌）の最も一般的な転移部位の１つである。骨溶解性骨転移の発生は、難治性疼痛、骨折に対する高い感受性、神経圧迫、および高カルシウム血症に起因する重篤な病的状態を引き起こす。これらの臨床的問題の重要性にもかかわらず、癌転移または癌転移に関連する骨再造形に利用可能な治療はほとんどない。
【０００３】
骨芽細胞（骨形成細胞）と破骨細胞（骨溶解細胞）との間の活性の均衡により、一般に、転移性骨病変の表現型が決定され、骨芽細胞および破骨細胞の両方は、直接または間接的に、骨転移に関与している。相対骨形成（骨芽細胞性）表現型を有する骨転移は、癌細胞による相当な骨芽細胞の刺激または破骨細胞の阻害（または両方）の結果であるのに対して、相対的骨溶解（骨溶解性）表現型を有する転移は癌細胞による相当な骨芽細胞機能の阻害または破骨細胞機能の刺激（または両方）を反映する。前立腺癌（そのほとんどが腺癌である）からの転移は、ほぼ常に骨に病変を形成し、この病変は骨溶解性よりも骨芽細胞性であり、対照的に、腎臓癌、肺癌、または乳癌からの骨転移は、より多くの場合は骨溶解性である。しかし、前立腺の比較的一般的ではない神経内分泌腫瘍からの転移も骨溶解性病変を発症する。さらに、患者は、骨芽細胞病変および溶解性病変を有する疾患の混合形態を示し得る。
【０００４】
破骨細胞は骨の再吸着を媒介し、破骨細胞は、造血細胞から分化した多核細胞である。破骨細胞は、不完全な細胞分裂よりもむしろ、骨髄中の造血幹細胞由来の単核細胞前駆体の融合によって形成されるということが一般に認められている（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７）。これらは、単球マクロファージ系列細胞と共通の幹細胞を有する（非特許文献８，非特許文献９）。破骨細胞前駆体の成熟多核破骨細胞への分化には、異なる因子（ホルモン刺激および局所刺激が含まれる）が必要であり（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献７；非特許文献１２）、生きている骨および骨細胞は、破骨細胞の発達で重要な役割を果たすことが示されている（非特許文献１３）。骨芽細胞または骨髄間質細胞はまた、破骨細胞の分化に必要である。破骨細胞形成を補助するこれらの細胞によって産生される因子の１つは、マクロファージコロニー刺激因子Ｍ−ＣＳＦである（非特許文献１４；非特許文献１５）。ＮＦ−κＢ活性化受容体リガンド（ＲＡＮＫＬ（ＴＲＡＮＣＥ、ＯＤＦ、およびＯＰＧＬとしても公知））は別のシグナルであり（非特許文献４）、これにより、骨芽細胞／間質細胞は、破骨細胞および破骨細胞前駆体に存在する受容体ＲＡＮＫ（ＴＲＡＮＣＥＲ）を介して破骨細胞の形成および吸収を刺激する（非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献２１）。骨芽細胞はまた、オステオプロテジェリン（ＯＰＧ、ＯＣＩＦとしても公知）と呼ばれる骨芽細胞形成を強く阻害するタンパク質を分泌する。このタンパク質は、ＲＡＮＫＬのデコイ受容体として作用し、それにより、ＲＡＮＫおよびＲＡＮＫＬを介した破骨細胞と骨芽細胞との間の正のシグナルを阻害する。
【０００５】
破骨細胞は、無機物および有機物の骨基質の両方の溶解を担う（非特許文献２２）。破骨細胞は、特殊化した膜領域およびいくつかの膜ならびに細胞質マーカー（酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９７９）、炭酸脱水酵素ＩＩ（非特許文献２３）、カルシトニン受容体（非特許文献２４）、およびビトロネクチン受容体（非特許文献２５）など）を有する固有の極性形態を発現する最終分化細胞である。多核破骨細胞は、通常、１０個未満の核を含むが、直径が１０μｍと１００μｍとの間の１００個までの核を含み得る（非特許文献２６）。これにより、光学顕微鏡によって比較的容易に同定される。多核破骨細胞は、活性状態の場合に比較的空胞が存在し、多くのミトコンドリアも含み、高い代謝率を示す（非特許文献２７）。破骨細胞は骨溶解性骨代謝および他の骨溶解性疾患（例えば、骨粗鬆症など）で主な役割を果たすので、破骨細胞の刺激および機能を防止するための新規の薬剤および方法が当該分野で必要である。
【０００６】
したがって、骨溶解または癌転移（骨芽細胞性骨転移と骨溶解性骨転移との混合、および破骨細胞活性の増加に関連する骨疾患が含まれる）の防止または治療のための新規の薬剤および方法を同定することが当該分野で要求されている。
【非特許文献１】Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６：１−２５，１９８９
【非特許文献２】Ｇｏｅｔｈｌｉｎｇら、Ｃｌｉｎ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｌａｔ  Ｒ．１２０：２０１−２２８，１９７６
【非特許文献３】Ｋａｈｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５８：３２５−３２７，１９７５
【非特許文献４】Ｓｕｄａら、Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ  １３：６６−８０，１９９２
【非特許文献５】Ｗａｌｋｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １８０：８７５，１９７３
【非特許文献６】Ｗａｌｋｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９０：７８５−７８７，１９７５
【非特許文献７】Ｗａｌｋｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９０：７８４−７８５，１９７５
【非特許文献８】Ａｓｈら、Ｎａｔｕｒｅ  ２８３：６６９−６７０，１９８０
【非特許文献９】Ｋｅｒｂｙら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  ７：３５３−６２，１９９２
【非特許文献１０】Ａｔｈａｎａｓｏｕら、Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  ３：３１７−３３３，１９８８
【非特許文献１１】Ｆｅｌｄｍａｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １０７：１１３７−１１４３，１９８０
【非特許文献１２】Ｚｈｅｎｇら、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２３：１８０−１８８，１９９１
【非特許文献１３】Ｈａｇｅｎａａｒｓら、Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  ６：１７９−１８９，１９８９
【非特許文献１４】Ｗｉｋｔｏｒ−Ｊｅｄｒｚｅｊｃｚａｋら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７：４８２８−４８３２，１９９０
【非特許文献１５】Ｙｏｓｈｉｄａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４５：４４２−４４４，１９９０
【非特許文献１６】Ｌａｃｅｙら、Ｃｅｌｌ  ９３：１６５−１７６，１９９８
【非特許文献１７】Ｔｓｕｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏ  ２３４：１３７−１４２，１９９７
【非特許文献１８】Ｗｏｎｇら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８６：２０７５−２０８０，１９９７
【非特許文献１９】Ｗｏｎｇら、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７２：２５１９０−２５１９４，１９９７
【非特許文献２０】Ｙａｓｕｄａら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３９：１３２９−１３３７，１９９８
【非特許文献２１】Ｙａｓｕｄａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳ  ９５：３５９７−３６０２，１９９８
【非特許文献２２】Ｂｌａｉｒら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １０２：１１６４−１１７２，１９８６
【非特許文献２３】Ｖａｅａｅｎａｅｎｅｎら、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７８：４８１−４８５，１９８３
【非特許文献２４】Ｗａｒｓｈａｆｓｋｙら、Ｂｏｎｅ  ６：１７９−１８５，１９８５
【非特許文献２５】Ｄａｖｉｅｓら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １０９：１８１７−１８２６，１９８９
【非特許文献２６】Ｇｏｔｈｌｉｎｇら、Ｃｌｉｎ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｌａｔ  Ｒ  １２０：２０１−２２８，１９７６
【非特許文献２７】Ｍｕｎｄｙ，Ｐｒｉｍｅｒ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｂｏｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，ｐ．１８−２２，１９９０
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
本発明の材料および方法は、当該分野における上記要求および他の関連する要求を満たす。本発明の１つの実施形態では、図４、１４、および１５にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するマウスモノクローナル抗体ＲＸ１、ＭＣ１、またはＭＣ３のいずれか１つと同一のＭ−ＣＳＦのエピトープに特異的に結合する非マウスモノクローナル抗体（機能的フラグメントが含まれる）を提供する。関連する実施形態では、好ましくは少なくとも１０−７、１０−８、または１０−９、またはそれを超える結合親和性を保持するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ヒト操作（Ｈｕｍａｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標））抗体が含まれる）、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、またはＳＣＡ抗体フラグメント、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、線状抗体（ｌｉｎｅａｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、またはこれら抗体のいずれか１つのムテインからなる群から選択される上記抗体を提供する。図４に示すアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体ＲＸ１、ＭＣ１、および／またはＭＣ３とＭ−ＣＳＦへの結合とを７５％を超えて競合する非マウスモノクローナル抗体（機能的フラグメントが含まれる）も意図する。
【０００８】
別の実施形態では、非マウスモノクローナル抗体（機能的フラグメントが含まれる）を提供し、非マウスモノクローナル抗体またはその機能的フラグメントは図１２のアミノ酸９８〜１０５の少なくとも４、５、６、７、または８個の連続する残基を含むＭ−ＣＳＦのエピトープに結合している。
【０００９】
別の実施形態では、本発明は、非マウスモノクローナル抗体（機能的フラグメントが含まれる）を提供し、非マウスモノクローナル抗体またはその機能的フラグメントは図１２のアミノ酸６５〜７３または１３８〜１４４の少なくとも４、５、６、７、または８個の連続する残基を含むＭ−ＣＳＦのエピトープに結合している。
【００１０】
さらに別の実施形態では、図１２のアミノ酸９８〜１０５を含むＭ−ＣＳＦのエピトープに結合する上記抗体またはフラグメントを提供する。関連する実施形態では、図４ＡのＣＤＲ３を含む上記抗体を提供する。別の実施形態では、図４Ａに示すマウス抗体ＲＸ１の少なくとも１、２、３、４、５または６個のＣＤＲを含む抗体を提供する。マウス抗体ＲＸ１の少なくとも１、２、３、４、または５個のＣＤＲを含むこのような抗体はまた、図１６Ａ〜Ｂに示す抗体５Ｈ４の任意の６個のＣＤＲのうちの少なくとも１、２、３、４、または５個のＣＤＲを含み得る。あるいは、マウス抗体ＲＸ１の少なくとも１、２、３、４、または５個のＣＤＲを含む抗体はまた、図１６Ａ〜Ｂに示す抗体ＭＣ１の任意の６個のＣＤＲのうちの少なくとも１、２、３、４、または５個のＣＤＲを含み得る。さらに別の実施形態では、上記抗体はまた、図１６Ａ〜Ｂに示す抗体ＭＣ３の任意の６個のＣＤＲのうちの少なくとも１、２、３、４、または５個のＣＤＲを含み得る。関連する実施形態では、マウス抗体ＲＸ１の少なくとも１、２、３、４、または５個のＣＤＲを含む抗体は、図１６Ａ〜Ｂに示す抗体ＭＣ１の任意の６個のＣＤＲのうちの少なくとも１、２、３、４、または５個のＣＤＲを含み得ることを提供する。さらに別の関連する実施形態では、上記抗体では、コンセンサスＣＤＲの１つまたは複数の残基は、マウス抗体ＲＸ１、５Ｈ４、ＭＣ１、またはＭＣ３の任意のＣＤＲの対応する残基に置換される。抗体中の１つまたは複数のアミノ酸が変異しているにもかかわらず、例えば、ＣＤＲ中の保存的置換および／または低リスクおよび中程度のリスクの残基の保存的または非保存的変化によって所望の結合親和性を保持することができる。
【００１１】
本発明の別の実施形態では、図４Ａ、１３、１４、または１５に示すアミノ酸配列に少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％相同な可変重鎖アミノ酸配列を含む上記抗体の変異型（ｖａｒｉａｎｔ）を提供する。関連する実施形態では、抗体は、図４Ａ、１３、１４、または１５に示すアミノ酸配列に少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％相同な可変軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００１２】
さらに別の実施形態では、抗体は、ヒト抗体配列の定常領域および１つまたは複数の重鎖および軽鎖の可変フレームワーク領域を含む。関連する実施形態では、抗体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の修飾または未修飾定常領域を含む。好ましい実施形態では、定常領域は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４であり、これらを、一定の性質を増強または減少させるように任意選択的に修飾することができる。ＩｇＧ１の場合、定常領域、特にヒンジまたはＣＨ２領域の修飾により、エフェクター機能（ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性が含まれる）を増加または減少させることができる。他の実施形態では、ＩｇＧ２定常領域を、抗体−抗原凝集体形成を減少させるように修飾する。ＩｇＧ４の場合、定常領域、特にヒンジ領域の修飾により、半抗体（ｈａｌｆ−ａｎｔｉｂｏｄｙ）の形成を減少させることができる。
【００１３】
本発明のさらに別の実施形態では、上記抗体は、Ｋａｂａｔ，ＮＣＢＩ  Ｉｇ  Ｂｌａｓｔ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／ｓｈｏｗＧｅｒｍｌｉｎｅ．ｃｇｉ、Ｋａｂａｔ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／ｓｅｑｔｅｓｔ．ｈｔｍｌ、ＦＴＰ  ｓｉｔｅ  ｆｏｒ  Ｋａｂａｔ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ５．０（１９９２）ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ／ｋａｂａｔ／Ｒｅｌ５．０／、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｄａｔａｂａｓｅ（Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ  Ｆｒａｎｃｅ）ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｎｕｓｃ．ｆｒ：８１０４／、Ｖ−Ｂａｓｅ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ＬＩＳＴ．ｐｈｐ？ｍｅｎｕ＝９０１、Ｚｕｒｉｃｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｚｈ．ｃｈ／〜ａｎｔｉｂｏｄｙ／Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ、Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｏｍｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＴＡＨＨＰ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／〜ｍｒｃ７／ｈｕｍａｎｉｓａｔｉｏｎ／ＴＡＨＨＰ．ｈｔｍｌ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｏｍａｉｎｓ  ｈｔｔｐ：／／ｈｏｗ．ｔｏ／ＡｎａｌｙｓｅＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ／、Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｄｅｓｉｇｎ  ｈｔｔｐ：／／ｐｅｏｐｌｅ．ｃｒｙｓｔ．ｂｂｋ．ａｃ．ｕｋ／〜ｕｂｃｇ０７ｓ／、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ．ｈｔｍｌ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（ｂｙ  ＴＴ  Ｗｕ），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ中のヒトコンセンサス配列、ヒト生殖系列配列、ヒトコンセンサス生殖系列配列、またはヒト抗体配列のいずれか１つに由来するか、これらに基づくか、これらの一部を含む。
【００１４】
本発明の好ましい態様では、上記抗体は、ヒト操作（商標）抗体である。例えば、ヒト操作（商標）抗体配列は、図２３〜２４に示す配列のいずれか１つである。他のヒト操作（商標）抗体またはその変異型を意図する。
【００１５】
例えば、１つの実施形態では、上記ＲＸ１ベースの抗体であって、重鎖可変領域がアミノ酸配列
【００１６】
【化５】
2009502952.tif 000002
（Ｘは任意のアミノ酸である）を含む抗体を提供する。関連する実施形態では、重鎖可変領域がアミノ酸配列
【００１７】
【化６】
2009502952.tif 000003
（Ｘは任意のアミノ酸である）を含む抗体を提供する。
【００１８】
本発明のさらに別の実施形態では、重鎖可変領域がアミノ酸配列
【００１９】
【化７】
2009502952.tif 000004
（Ｘは任意のアミノ酸である）を含む上記抗体を提供する。関連する実施形態では、重鎖可変領域がアミノ酸配列
【００２０】
【化８】
2009502952.tif 000005
（Ｘは任意のアミノ酸である）を含む抗体を提供する。さらに別の実施形態では、重鎖可変領域がアミノ酸配列
【００２１】
【化９】
2009502952.tif 000006
を含む抗体を提供する。さらに別の実施形態では、重鎖可変領域がアミノ酸配列
【００２２】
【化１０】
2009502952.tif 000007
を含む抗体を提供する。
【００２３】
本発明の別の実施形態では、軽鎖可変領域がアミノ酸配列
【００２４】
【化１１】
2009502952.tif 000008
（Ｘは任意のアミノ酸である）を含む上記抗体を提供する。関連する実施形態では、軽鎖可変領域がアミノ酸配列
【００２５】
【化１２】
2009502952.tif 000009
（Ｘは任意のアミノ酸である）を含む抗体を提供する。さらに別の実施形態では、軽鎖可変領域がアミノ酸配列
【００２６】
【化１３】
2009502952.tif 000010
（Ｘは任意のアミノ酸である）を含む抗体を提供する。
【００２７】
本発明の別の実施形態では、軽鎖可変領域がアミノ酸配列
【００２８】
【化１４】
2009502952.tif 000011
（Ｘは任意のアミノ酸である）を含む上記抗体を提供する。関連する実施形態では、軽鎖可変領域がアミノ酸配列
【００２９】
【化１５】
2009502952.tif 000012
（Ｘは任意のアミノ酸である）を含む抗体を提供する。さらに別の実施形態では、軽鎖可変領域がアミノ酸配列
【００３０】
【化１６】
2009502952.tif 000013
を含む抗体を提供する。
【００３１】
本発明のさらに別の実施形態では、軽鎖可変領域がアミノ酸配列
【００３２】
【化１７】
2009502952.tif 000014
を含む上記抗体を提供する。別の実施形態では、軽鎖可変領域がアミノ酸配列
【００３３】
【化１８】
2009502952.tif 000015
を含む抗体を提供する。
【００３４】
本発明の別の実施形態では、少なくとも１つのＸが図４Ａに示すアミノ酸配列内の相当するアミノ酸である上記抗体を提供する。関連する実施形態では、少なくとも１つのＸが図４Ａに示すアミノ酸配列内の相当するアミノ酸の保存的置換（表１に従う）である抗体を提供する。さらに別の関連する実施形態では、少なくとも１つのＸが図４Ａに示すアミノ酸配列内の相当するアミノ酸の非保存的置換（表１に従う）である抗体を提供する。本発明のさらに別の実施形態では、少なくとも１つのＸがヒト抗体配列内の相当するアミノ酸である抗体を提供する。
【００３５】
上記ヒト操作（商標）抗体は、Ｋａｂａｔ，ＮＣＢＩ  Ｉｇ  Ｂｌａｓｔ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／ｓｈｏｗＧｅｒｍｌｉｎｅ．ｃｇｉ、Ｋａｂａｔ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／ｓｅｑｔｅｓｔ．ｈｔｍｌ、ＦＴＰ  ｓｉｔｅ  ｆｏｒ  Ｋａｂａｔ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ５．０（１９９２）ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ／ｋａｂａｔ／Ｒｅｌ５．０／、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｄａｔａｂａｓｅ（Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ  Ｆｒａｎｃｅ）ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｎｕｓｃ．ｆｒ：８１０４／、Ｖ−Ｂａｓｅ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ＬＩＳＴ．ｐｈｐ？ｍｅｎｕ＝９０１、Ｚｕｒｉｃｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｚｈ．ｃｈ／〜ａｎｔｉｂｏｄｙ／Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ、Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｏｍｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＴＡＨＨＰ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／〜ｍｒｃ７／ｈｕｍａｎｉｓａｔｉｏｎ／ＴＡＨＨＰ．ｈｔｍｌ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｏｍａｉｎｓ  ｈｔｔｐ：／／ｈｏｗ．ｔｏ／ＡｎａｌｙｓｅＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ／、Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｄｅｓｉｇｎ  ｈｔｔｐ：／／ｐｅｏｐｌｅ．ｃｒｙｓｔ．ｂｂｋ．ａｃ．ｕｋ／〜ｕｂｃｇ０７ｓ／、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ．ｈｔｍｌ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（ｂｙ  ＴＴ  Ｗｕ），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ中のヒト抗体コンセンサス配列、ヒト生殖系列配列、ヒトコンセンサス生殖系列配列、またはヒト抗体配列のいずれか１つに由来するか、これらに基づくか、これらの一部を含む。
【００３６】
本発明の別の実施形態では、ヒト操作（商標）抗体配列が、図２３〜２４または２９〜３０に示す配列の１つである上記抗体を提供する。別の実施形態では、抗体は、図１９Ｂに示す重鎖アミノ酸配列の１つと少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一の可変重鎖アミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、抗体は、図２０Ｂ〜２２Ｂのいずれかに示す軽鎖アミノ酸配列の１つと少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一の可変軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００３７】
さらに別の実施形態では、図２４Ｃ〜２４Ｅの１つに示す配列を有する５Ｈ４、ＭＣ１、またはＭＣ３などの上記抗体は、低リスク、中程度のリスク、および高リスクの残基を同定するために図２４Ｃ〜２４Ｅに示すＫａｂａｔナンバリングを使用したＳｔｕｄｎｉｃｋａらに付与された米国特許第５，７６６，８８６号および本明細書中の実施例５に示す方法に従ってヒト操作（商標）する。関連する実施形態では、必要に応じて、ヒト基準免疫グロブリン配列と同一の残基となるように重鎖、軽鎖、または両方のいずれかの低リスク残基の全てを修飾した上記抗体を提供する。同様に、本発明の別の実施形態は、必要に応じて、ヒト基準免疫グロブリン配列と同一の残基となるように重鎖、軽鎖、または両方のいずれかの低リスク＋中程度のリスクの残基の全てを修飾した上記抗体を提供する。低リスク残基の全てを修飾した重鎖を、低リスク残基および中程度のリスクの残基の全てを修飾した軽鎖と組み合わせることができ、その逆も同様である。同様に、上記ヒト操作（商標）軽鎖または重鎖を、ヒト化抗体またはキメラ抗体の軽鎖または重鎖と組み合わせることができる。
【００３８】
さらに別の実施形態では、抗体は、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａの方法に従ってヒト操作（商標）したすぐ上に記載の重鎖アミノ酸配列の１つと６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一の可変重鎖アミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、抗体は、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａの方法に従ってヒト操作（商標）したすぐ上に記載の軽鎖アミノ酸配列の１つと６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一の可変軽鎖アミ酸配列を含む。
【００３９】
さらに別の実施形態では、上記の重鎖および上記の軽鎖を含む抗体を提供する。
【００４０】
本発明のさらに別の実施形態では、上記抗体の親和性Ｋｄは少なくとも１０−７である。関連する実施形態では、抗体の親和性Ｋｄは少なくとも１０−９である。
【００４１】
本発明の別の実施形態では、ポリクローナル抗体（ヒト操作（商標）抗体が含まれる）、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、またはＳＣＡ抗体フラグメント、ダイアボディ、線状抗体、またはこれら抗体のいずれか１つのムテインである上記抗体を提供する。関連する実施形態では、モノクローナル抗体は、単離抗体である。
【００４２】
本発明のさらに別の実施形態では、上記抗体の軽鎖をコードする核酸配列を含む単離核酸を提供する。関連する実施形態では、単離核酸は、図４Ａ、１３、１４、または１５に示す重鎖ヌクレオチド配列と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一の重鎖核酸配列を含む。さらに別の関連する実施形態では、単離核酸は、図４Ａ、１３、１４、または１５に示す軽鎖ヌクレオチド配列と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一の軽鎖核酸配列を含む。
【００４３】
別の実施形態では、上記単離核酸を含むベクターを提供する。関連する実施形態では、単離核酸が調節制御配列（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に作動可能に連結された上記ベクターを提供する。さらに別の実施形態では、上記ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００４４】
本発明で多数の方法を意図する。例えば、単離核酸を発現して抗体を産生するように上記宿主細胞を培養する工程を含む、上記抗体の産生方法を提供する。関連する実施形態では、本方法は、宿主細胞培養物から抗体を回収する工程をさらに含む。関連する実施形態では、上記方法によって産生された単離抗体を提供する。
【００４５】
本発明によって上記抗体を分泌するハイブリドーマも提供する。さらに、毒素に接合した上記抗体を提供する。
【００４６】
本発明の別の実施形態では、上記抗体のいずれか１つおよび薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤、または希釈剤を含む薬学的組成物を提供する。関連する実施形態では、薬学的組成物は、第２の治療薬をさらに含む。さらに別の関連する実施形態では、第２の治療薬が癌化学療法薬である薬学的組成物を提供する。さらに別の関連する実施形態では、第２の治療薬がビスホスホネートである薬学的組成物を提供する。別の実施形態では、第２の治療薬は別の抗体である。
【００４７】
本発明の抗体は、疾患および障害の治療のための多数の望ましい特徴を有することが意図される。本発明の１つの実施形態では、抗体が疾患に関連する骨量減少または再造形の重症度を有効に軽減する、骨溶解を生じるか、これに寄与するか、これに起因する疾患を罹患した被験体の防止のためのＭ−ＣＳＦに結合する上記抗体のいずれか１つを提供する。同様に、抗体が疾患に関連する骨量減少または再造形の重症度を有効に軽減する、骨溶解を生じるか、これに寄与するか、これに起因する疾患を罹患した被験体の治療のためのＭ−ＣＳＦに結合する上記抗体のいずれか１つを提供する。
【００４８】
多数の疾患および障害は、本発明の抗体ベースの治療に影響を受けることが意図される。本発明の１つの実施形態では、疾患が、比較的増加した破骨細胞活性または骨再造形に必要な破骨細胞／骨芽細胞過程（破骨細胞活性の増加および骨芽細胞活性の増加の両方に関連する）に関連する骨溶解性疾患（代謝性骨疾患、内分泌障害（高コルチコイド症、性腺機能低下症、原発性または続発性副甲状腺機能亢進症、甲状腺機能亢進症）、高カルシウム血症、欠乏状態（くる病／骨軟化症、壊血病、栄養失調症）、慢性疾患（吸収不良症候群、慢性腎不全（腎性骨異栄養症）、慢性肝臓疾患（肝臓性骨異栄養症））、薬物（糖質コルチコイド（糖質コルチコイド誘導性骨粗鬆症）、ヘパリン、アルコール）、および遺伝性疾患（骨形成不全症、ホモシスチン尿症）、癌、骨粗鬆症、人工器官周辺の骨量減少（例えば、人工器官を使用した骨または関節中の外来インプラントの置換（人工股関節全置換術が含まれる）による）、関節炎および関節リウマチに関連する骨の炎症、歯周疾患、線維性異形成、および／またはパジェット病が含まれる）からなる群から選択される上記抗体を提供する。
【００４９】
関連する実施形態では、骨転移性癌の防止または治療のためのＭ−ＣＳＦに結合する上記の抗体を提供し、転移性癌は、乳癌、肺癌、腎臓癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、前立腺癌、腺癌、血球悪性疾患（白血病およびリンパ腫が含まれる）、頭頸部癌、消化管癌（食道癌、胃癌、結腸癌、腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胆管または胆嚢の癌が含まれる）、女性生殖管の悪性疾患（卵巣癌、子宮内膜癌、膣癌、および子宮頸癌が含まれる）、膀胱癌、脳腫瘍（神経芽細胞腫が含まれる）、肉腫、骨肉種、および皮膚癌（悪性黒色腫または扁平上皮癌が含まれる）である。
【００５０】
本発明の別の実施形態では、転移性腫瘍細胞培地、破骨細胞、および候補抗体を接触させる工程と、破骨細胞の形成、増殖、および／または分化の減少が検出された場合にＭ−ＣＳＦ特異的抗体として候補抗体を同定する工程とを含む、Ｍ−ＣＳＦ特異的抗体のスクリーニング方法を提供する。同様に、転移性腫瘍細胞培地が腫瘍細胞を含む上記方法を提供する。
【００５１】
関連する実施形態では、候補抗体がＭ−ＣＳＦに結合するかどうかを決定する工程をさらに含む上記方法を提供する。同様に、本発明の別の実施形態は、候補抗体がＭ−ＣＳＦとその受容体Ｍ−ＣＳＦＲとの間の相互作用を阻害するかどうかを決定する工程をさらに含む上記方法を提供する。
【００５２】
本発明の別の実施形態では、（ａ）図１２のアミノ酸９８〜１０５の少なくとも４個の連続する残基を含むＭ−ＣＳＦのエピトープへの候補抗体の結合を検出する工程と、（ｂ）候補抗体がインビトロまたはインビボで骨への転移性癌を防止または治療する能力をアッセイする工程とを含む、骨への転移性癌を防止または治療することができるＭ−ＣＳＦ特異的抗体を同定する方法を提供する。
【００５３】
本発明の別の実施形態では、（ａ）（５Ｈ４またはＭＣ３によって認識されるＭ−ＣＳＦエピトープに対応する）図１２のアミノ酸６５〜７３または１３８〜１４４の少なくとも４個の連続する残基を含むＭ−ＣＳＦのエピトープへの候補抗体の結合を検出する工程と、（ｂ）候補抗体がインビトロまたはインビボで骨への転移性癌を防止または治療する能力をアッセイする工程とを含む、骨への転移性癌を防止または治療することができるＭ−ＣＳＦ特異的抗体を同定する方法を提供する。
【００５４】
本発明のさらに別の実施形態では、図４Ａに示すアミノ酸配列のＣＤＲ内のアミノ酸を変化させる工程と、少なくとも１０−７の親和性ＫａでＭ−ＣＳＦに結合する抗体を選択する工程とを含む、図１２のアミノ酸９８〜１０５を含むＭ−ＣＳＦのエピトープに結合する抗体のＣＤＲを変化させる方法を提供する。別の実施形態では、アミノ酸配列
【００５５】
【化１９】
2009502952.tif 000016
中のＸ１〜Ｘ５２のいずれかを変化させる工程と、変化したアミノ酸配列を含む抗体を、図１２のアミノ酸９８〜１０５を含むＭ−ＣＳＦのエピトープへの結合について試験する工程とを含む、図４Ａに示す重鎖アミノ酸配列の６０％までを系統的に変化させる方法を提供する。
【００５６】
関連する実施形態では、アミノ酸配列
【００５７】
【化２０】
2009502952.tif 000017
中のＸ１〜Ｘ５２のいずれかを変化させる工程と、変化したアミノ酸配列を含む抗体を、図１２のアミノ酸９８〜１０５を含むＭ−ＣＳＦのエピトープへの結合について試験する工程とを含む、図４Ａに示す軽鎖アミノ酸配列の６０％までを系統的に変化させる方法を提供する。
【００５８】
本発明のさらに別の実施形態では、図１３、１４、および１５の１つに示すアミノ酸配列のＣＤＲ内のアミノ酸を変化させる工程と、少なくとも１０−７の親和性ＫａでＭ−ＣＳＦに結合する抗体を選択する工程とを含む（５Ｈ４またはＭＣ３によって認識されるＭ−ＣＳＦエピトープに相当する）図１２のアミノ酸６５〜７３または１３８〜１４４を含むＭ−ＣＳＦのエピトープに結合する抗体のＣＤＲを変化させる方法を提供する。別の実施形態では、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａらに付与された米国特許第５，７６６，８８６号および本明細書中の実施例５に示す方法に従い、且つ図２４Ｃ〜２４Ｅに示すＫａｂａｔナンバリングに従って上記配列を変化させる工程と、変化したアミノ酸配列を含む抗体を、（５Ｈ４またはＭＣ３によって認識されるＭ−ＣＳＦエピトープに相当する）図１２のアミノ酸６５〜７３または１３８〜１４４を含むＭ−ＣＳＦのエピトープへの結合について試験する工程とを含む、図１３、１４、および１５の１つに示す重鎖アミノ酸配列の６０％までを系統的に変化させる方法を提供する。関連する実施形態では、低リスク残基の全てを修飾する。同様に、本発明の別の実施形態では、低リスクの残基および中程度のリスクの残基の全てを修飾する。さらに別の実施形態では、プロリンを除く低リスクの残基および中程度のリスクの残基を修飾する。
【００５９】
本発明の別の実施形態では、上記過程によって設計されたＣＤＲを有する抗体を発現する方法を提供する。別の実施形態では、ＭＣＳＦに結合する抗体を含む薬学的組成物であって、抗体が上記方法を使用して作製される、薬学的組成物を提供する。
【００６０】
本発明のさらに別の実施形態では、治療有効量の上記抗体のいずれか１つを、骨溶解を生じるか、これに寄与するか、これに起因する疾患を罹患した被験体に投与する工程と、それにより、疾患に関連する骨量減少または再造形を防止または軽減することとを含む、骨量減少または再造形を防止または軽減する方法を提供する。関連する実施形態では、治療有効量の上記抗体のいずれか１つを被験体に投与する工程と、それにより、疾患に関連する骨量減少または再造形の重症度が軽減することとを含む、骨溶解を生じるか、これに寄与するか、これに起因する疾患を罹患した被験体を治療する方法を提供する。
【００６１】
関連する実施形態では、疾患が、比較的増加した破骨細胞活性または骨再造形に必要な破骨細胞／骨芽細胞過程（破骨細胞活性の増加および骨芽細胞活性の増加の両方に関連する）に関連する骨溶解性疾患（代謝性骨疾患、内分泌障害（高コルチコイド症、性腺機能低下症、原発性または続発性副甲状腺機能亢進症、甲状腺機能亢進症）、高カルシウム血症、欠乏状態（くる病／骨軟化症、壊血病、栄養失調症）、慢性疾患（吸収不良症候群、慢性腎不全（腎性骨異栄養症）、慢性肝臓疾患（肝臓性骨異栄養症））、薬物（糖質コルチコイド（糖質コルチコイド誘導性骨粗鬆症）、ヘパリン、アルコール）、および遺伝性疾患（骨形成不全症、ホモシスチン尿症）、癌、骨粗鬆症、人工器官周辺の骨量減少（例えば、人工器官を使用した骨または関節中の外来インプラントの置換（人工股関節全置換術が含まれる）による）、関節炎および関節リウマチに関連する骨の炎症、歯周疾患、線維性異形成、および／またはパジェット病が含まれる）からなる群から選択される上記方法を提供する。
【００６２】
さらに別の実施形態では、治療有効量の上記抗体のいずれか１つを、転移性癌を罹患した被験体に投与する工程を含む、転移性癌を防止または治療する方法を提供する。関連する実施形態では、転移性癌が、乳癌、肺癌、腎臓癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、前立腺癌、腺癌、血球悪性疾患（白血病およびリンパ腫が含まれる）、頭頸部癌、消化管癌（食道癌、胃癌、結腸癌、腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胆管または胆嚢の癌が含まれる）、女性生殖管の悪性疾患（卵巣癌、子宮内膜癌、膣癌、および子宮頸癌が含まれる）、膀胱癌、脳腫瘍（神経芽細胞腫が含まれる）、肉腫、骨肉種、および皮膚癌（悪性黒色腫または扁平上皮癌が含まれる）である方法を提供する。
【００６３】
本発明のさらに別の実施形態では、治療有効量の上記抗体のいずれか１つを必要とする被験体に投与する工程を含む、骨量減少または腫瘍成長を防止する方法を提供する。
【００６４】
本明細書中に記載の治療方法のいずれか１つには、第２の治療薬を投与する工程を含み得る。さらに別の関連する実施形態では、第２の治療薬が、癌化学療法薬またはビスホスホネートである方法を提供する。さらに別の関連する実施形態では、ビスホネートが、ゼレドロネート（ｚｅｌｅｄｒｏｎａｔｅ）、パルミドロネート、クロドロネート、エチドロネート、チルンドロネート（ｔｉｌｕｎｄｒｏｎａｔｅ）、アレンドロネート、またはイバンドロネートである方法を提供する。さらに別の関連する実施形態では、治療薬が細胞傷害性化学療法薬である上記方法を提供する。別の実施形態では、被験体へのビスホスホネート治療を排除する上記方法を提供する。
【００６５】
さらに別の関連する実施形態では、抗体が治療効果を達成するために必要な第２の治療薬の投薬量を減少させるのに有効である、上記方法を提供する。別の実施形態では、第２の治療薬は、非Ｍ−ＣＳＦコロニー刺激因子（例えば、Ｇ−ＣＳＦ）、抗ＲＡＮＫＬ抗体、または可溶性ＲＡＮＫＬ受容体である。
【００６６】
本発明の別の実施形態では、被験体が哺乳動物である上記方法を提供する。関連する実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【００６７】
別の実施形態では、抗体がＭ−ＣＳＦとその受容体（Ｍ−ＣＳＦＲ）との間の相互作用を阻害する、上記方法を提供する。別の関連する実施形態では、抗体は、腫瘍細胞によって誘導された破骨細胞の増殖および／または分化を阻害する。さらに別の実施形態では、約１．０μｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、２μｇ／ｋｇ体重〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、または０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量の抗体を投与する、上記方法を提供する。
【００６８】
本発明の別の実施形態では、骨溶解または破骨細胞性疾患の症状を示す患者の骨量減少または再造形を防止または軽減するための薬物の製造および骨溶解または破骨細胞性疾患を生じるか、これに寄与するか、これに起因する疾患を罹患した患者の治療のための薬物の製造における本発明の抗体の使用を意図する。疾患が、比較的増加した破骨細胞活性または骨再造形に必要な破骨細胞／骨芽細胞過程に関連する骨溶解性疾患（代謝性骨疾患、内分泌障害（高コルチコイド症、性腺機能低下症、原発性または続発性副甲状腺機能亢進症、甲状腺機能亢進症が含まれる）、高カルシウム血症、欠乏状態（くる病／骨軟化症、壊血病、栄養失調症が含まれる）、慢性疾患（吸収不良症候群、慢性腎不全（腎性骨異栄養症が含まれる）、慢性肝臓疾患（肝臓性骨異栄養症が含まれる）が含まれる）、薬物（糖質コルチコイド（糖質コルチコイド誘導性骨粗鬆症）、ヘパリン、アルコールが含まれる）、および遺伝性疾患（骨形成不全症、ホモシスチン尿症が含まれる）、癌、骨粗鬆症、人工器官周辺の骨量減少（例えば、人工器官を使用した骨または関節中の外来インプラントの置換（人工股関節全置換術が含まれる）による）、関節炎および関節リウマチに関連する骨の炎症、歯周疾患、線維性異形成、ならびに／またはパジェット病）からなる群から選択される上記使用をさらに意図する。
【００６９】
別の実施形態では、転移性癌患者における転移性癌の防止または治療のための薬物の製造における本発明の抗体の使用を意図する。関連する実施形態では、転移性癌は、乳癌、肺癌、腎臓癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、前立腺癌、腺癌、血球悪性疾患（白血病およびリンパ腫が含まれる）、頭頸部癌、消化管癌（食道癌、胃癌、結腸癌、腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胆管または胆嚢の癌が含まれる）、女性生殖管の悪性疾患（卵巣癌、子宮内膜癌、膣癌、および子宮頸癌が含まれる）、膀胱癌、脳腫瘍（神経芽細胞腫が含まれる）、肉腫、骨肉種、または皮膚癌（悪性黒色腫または扁平上皮癌が含まれる）である。
【００７０】
さらに別の実施形態では、癌患者の治療のための薬物の製造における本発明の抗体の使用を意図する。
【００７１】
上記使用のいずれかにおいて、薬物を、第２の治療薬を使用した治療と調和させる。関連する実施形態では、第２の治療薬は、癌化学療法薬である。関連する実施形態では、第２の治療薬は、非Ｍ−ＣＳＦコロニー刺激因子、抗ＲＡＮＫＬ抗体、可溶性ＲＡＮＥＸ受容体、またはビスホスホネートである。関連する実施形態では、ビスホネートは、ゼレドロネート、パルミドロネート、クロドロネート、エチドロネート、チルンドロネート、アレンドロネート、またはイバンドロネートである。
【００７２】
さらに別の実施形態では、被験体へのビスホスホネート治療を排除し、そして／または患者は第２の治療薬で前処置されている、上記使用のいずれかを意図する。関連する実施形態では、第２の治療薬は、癌化学療法薬、非Ｍ−ＣＳＦコロニー刺激因子、抗ＲＡＮＫＬ抗体、可溶性ＲＡＮＫＬ受容体、またはビスホスホネートである。さらに別の関連する実施形態では、ビスホネートは、ゼレドロネート、パルミドロネート、クロドロネート、エチドロネート、チルンドロネート、アレンドロネート、またはイバンドロネートである。さらに別の関連する実施形態では、患者へのビスホスホネート治療を排除する。
【００７３】
本発明の別の実施形態では、薬物を第２の治療薬を使用した治療と調和させた、骨溶解の症状を示す患者の治療薬の調製のための本発明の抗体の相乗的組み合わせ（ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）の使用を意図する。関連する実施形態では、第２の治療薬は、癌化学療法薬、非Ｍ−ＣＳＦコロニー刺激因子、抗ＲＡＮＫＬ抗体、可溶性ＲＡＮＫＬ受容体、またはビスホスホネートである。関連する実施形態では、ビスホネートは、ゼレドロネート、パルミドロネート、クロドロネート、エチドロネート、チルンドロネート、アレンドロネート、またはイバンドロネートである。さらに別の実施形態では、患者へのビスホスホネート治療を排除する。
【００７４】
薬物中の抗体の量が、治療効果を達成するのに必要な第２の治療薬の投薬量を減少させるのに有効な用量である、上記使用のいずれかの実施形態を意図する。癌に関連する骨量減少または再造形に関連する上記実施形態のいずれかでは、薬物中の抗体の量が、腫瘍細胞によって誘導された破骨細胞の増殖および／または分化を阻害するのに有効であることが好ましい。
【００７５】
上記薬物のいずれかにおける抗体の量は、約１．０μｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重または２μｇ／ｋｇ体重〜３０ｍｇ／ｋｇ体重の用量であり得る。関連する実施形態では、薬物中の抗体の量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜３０ｍｇ／ｋｇ体重の用量である。さらに別の実施形態では、薬物中の抗体の量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量である。
【００７６】
キットも本発明で意図する。１つの実施形態では、バイアルまたはボトルなどの容器に包装されているか、シリンジに予め充填された治療有効量の本発明の抗体を含み、容器に添付されているか容器と共に包装されたラベルをさらに含み、ラベルには、容器の内容物が記載され、骨量減少を防止または軽減するための容器の内容物の使用に関する指示および／または説明が備えられているキットを提供する。別の実施形態では、バイアルまたはボトルなどの容器に包装された治療有効量の本発明の抗体を含み、容器に添付されているか容器と共に包装されたラベルをさらに含み、ラベルには、容器の内容物が記載され、指示および／または説明が備えられているキットを提供する。容器は、任意選択的に、第２の治療薬を含む容器および／または凍結乾燥抗体の再構成に適切な溶液を含む容器をさらに含む。ラベルには、例えば、骨溶解または骨再造形を生じるか、これに寄与する疾患を防止または軽減するか、防止または治療するための、罹患患者への容器の内容物の使用に関する説明を備えることができる。関連する実施形態では、疾患が、比較的増加した破骨細胞活性または骨再造形に必要な破骨細胞／骨芽細胞過程に関連する骨溶解性疾患（代謝性骨疾患、内分泌障害（高コルチコイド症、性腺機能低下症、原発性または続発性副甲状腺機能亢進症、甲状腺機能亢進症が含まれる）、高カルシウム血症、欠乏状態（くる病／骨軟化症、壊血病、栄養失調症が含まれる）、慢性疾患（吸収不良症候群、慢性腎不全（腎性骨異栄養症が含まれる）、慢性肝臓疾患（肝臓性骨異栄養症が含まれる）が含まれる）、薬物（糖質コルチコイド（糖質コルチコイド誘導性骨粗鬆症）、ヘパリン、アルコールが含まれる）、遺伝性疾患（骨形成不全症、ホモシスチン尿症が含まれる）、癌、骨粗鬆症、人工器官周辺の骨量減少（例えば、人工器官を使用した骨または関節中の外来インプラントの置換（人工股関節全置換術が含まれる）による）、関節炎および関節リウマチに関連する骨の炎症、歯周疾患、線維性異形成、および／またはパジェット病）からなる群から選択される、キットを提供する。骨への転移性癌に関連するこのような骨溶解性疾患は、乳癌、肺癌、腎臓癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、前立腺癌、腺癌、血球悪性疾患（白血病およびリンパ腫が含まれる）、頭頸部癌、消化管癌（食道癌、胃癌、結腸癌、腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胆管または胆嚢の癌が含まれる）、女性生殖管の悪性疾患（卵巣癌、子宮内膜癌、膣癌、および子宮頸癌が含まれる）、膀胱癌、脳腫瘍（神経芽細胞腫が含まれる）、肉腫、骨肉種、または皮膚癌（悪性黒色腫または扁平上皮癌が含まれる）に起因し得る。
【００７７】
さらに別の実施形態では、バイアルまたはボトルなどの容器に包装されているか、シリンジに予め充填された治療有効量の本発明の抗体を含み、容器に添付されているか容器と共に包装されたラベルをさらに含み、ラベルには、容器の内容物が記載され、骨量減少癌を治療するための容器の内容物の使用に関する指示および／または説明が備えられているキットを提供する。
【００７８】
別の実施形態では、キットは、第２の治療薬をさらに含む。関連する実施形態では、第２の治療薬は、癌化学療法薬、非Ｍ−ＣＳＦコロニー刺激因子、抗ＲＡＮＫＬ抗体、可溶性ＲＡＮＥＸ受容体、またはビスホスホネートである。関連する実施形態では、ビスホネートは、ゼレドロネート、パルミドロネート、クロドロネート、エチドロネート、チルンドロネート、アレンドロネート、またはイバンドロネートである。さらに別の実施形態では、キットは、ビスホスホネート治療を排除した患者を治療するための説明を含む。
【００７９】
別の実施形態では、治療効果を達成するのに必要な第２の治療薬の投薬量を減少させるのに有効な用量の抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を含む上記キットを提供する。別の実施形態では、キットは、第２の治療薬と相乗する用量の抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を含む。さらに別の実施形態では、キットは、腫瘍細胞によって誘導された破骨細胞の増殖および／または分化を阻害するのに有効な用量の抗体を含む。
【００８０】
さらに別の実施形態では、上記キットは、約１．０μｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重または２μｇ／ｋｇ体重〜３０ｍｇ／ｋｇ体重の用量の抗体を含む。別の実施形態では、キットは、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜３０ｍｇ／ｋｇ体重の用量の抗体を含む。さらに別の実施形態では、キットは、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量の抗体を含む。
【００８１】
１つまたは複数の上記抗体を含む薬物および薬物を手術または放射線療法と組み合わせて使用すべきであることが記載された説明書を含む包装、バイアル、予め充填したシリンジまたは容器を含む骨量減少を防止する方法を提供する。別の実施形態では、上記抗体のいずれか１つを被験体に投与する工程および手術または放射線療法で被験体を処置する工程を含む骨への転移性癌を防止または治療する方法を提供する。別の実施形態では、上記抗体のいずれか１つを投与する工程を含む、表面に膜結合Ｍ−ＣＳＦを発現する腫瘍細胞をターゲティングする方法であって、抗体を放射性核種または他の毒素と接合することを含む方法を提供する。さらに別の実施形態では、治療有効量の上記抗体のいずれか１つを投与する工程を含む、癌を罹患した被験体を治療する方法を提供する。
【００８２】
本発明のさらに別の実施形態では、骨溶解を生じるか、これに寄与する疾患を罹患した被験体に被験体の細胞によって産生されたＭ−ＣＳＦを中和するのに有効な量の上記抗体のいずれか１つを投与する工程を含む、骨再造形を防止する方法であって、量が癌細胞によって産生されたＭ−ＣＳＦを中和するのに有効な量を超える方法を提供する。関連する実施形態では、被験体に被験体の細胞によって産生されたＭ−ＣＳＦを中和するのに有効な量の上記抗体のいずれか１つを投与する工程を含む、骨溶解を生じるか、これに寄与する疾患を罹患した被験体を治療する方法であって、量が癌細胞によって産生されたＭ−ＣＳＦを中和するのに有効な量を超える方法を提供する。
【００８３】
本発明の１つの実施形態では、抗体ＲＸ１、５Ｈ４、ＭＣ１、および／もしくはＭＣ３、非マウスＲＸ１、５Ｈ４、ＭＣ１、および／もしくはＭＣ３由来抗体、またはＲＸ１、５Ｈ４、ＭＣ１、および／もしくはＭＣ３競合抗体、ならびに癌治療薬を含む薬学的組成物を提供する。本発明の別の実施形態では、抗体ＲＸ１、５Ｈ４、ＭＣ１、および／もしくはＭＣ３、非マウスＲＸ１、５Ｈ４、ＭＣ１、および／もしくはＭＣ３由来抗体、またはＲＸ１、５Ｈ４、ＭＣ１、および／もしくはＭＣ３競合抗体、ならびに薬物を手術または放射線療法と組み合わせて使用すべきであることが記載された説明書を含む包装、バイアル、または容器を提供する。
【００８４】
本発明のさらに別の実施形態では、癌を含む細胞がＭ−ＣＳＦを分泌せず、上記抗体のいずれか１つを投与する工程を含む、癌を罹患した被験体を治療する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８５】
詳細な説明
転移能力は、癌の明確な特徴である。転移は、癌細胞の身体の他の部分への拡大およびこの拡大によって得られた容態をいう。転移は、複雑な多工程の過程であり、細胞の遺伝物質の変化、変化した細胞の原発性腫瘍への無秩序の増殖、原発性腫瘍のための新規の血液供給、原発性腫瘍由来の細胞による循環系の侵入、原発性腫瘍の小集団の身体の他の部分への分散、およびこの部位中における続発性腫瘍の成長を含む。
【００８６】
骨は、ヒトの乳癌、肺癌、前立腺癌、および甲状腺癌、ならびに他の癌における最も一般的な転移部位の１つであり、剖検において６０％もの癌患者が骨転移していることが見出されている。骨溶解性骨転移は、他の器官への転移で認められない固有の破骨細胞性骨吸収工程を示す。癌転移に関連する骨量減少は、破骨細胞（鉱質化組織を吸収する能力を有する多核巨細胞）によって媒介され、破骨細胞は腫瘍生成物によって活性化されるようである。
【００８７】
マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）としても公知のコロニー刺激因子（ＣＳＦ−１）は、破骨細胞形成に極めて重要であることが見出されている。さらに、Ｍ−ＣＳＦは、他の可溶性因子と調和して成熟破骨細胞の破骨細胞機能、その移動、およびその生存を調整し、破骨細胞および線維芽細胞によって得られる細胞−細胞相互作用を調整することが示されている（Ｆｉｘｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｌｏｒａｎ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １０：３−７，１９９８；Ｍａｒｔｉｎら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ．ｉｎ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ８：１０７−２３（１９９８））。
【００８８】
全長ヒトＭ−ＣＳＦｍＲＮＡは、５５４アミノ酸の前駆タンパク質をコードする。選択的ｍＲＮＡスプライシングおよび差分翻訳後タンパク質処理にもかかわらず、Ｍ−ＣＳＦを、糖タンパク質またはプロテオグリカンを含むコンドロイチン硫酸として循環中に分泌するか、Ｍ−ＣＳＦ産生細胞の表面に膜貫通糖タンパク質として発現することができる。細菌が発現したヒトＭ−ＣＳＦのアミノ末端１５０アミノ酸（全てのインビトロ生物活性に必要な最小の配列）の三次元構造は、このタンパク質が４つのαヘリックス束および逆平行βシートからなる各単量体を有するジスルフィド結合二量体であることを示す（Ｐａｎｄｉｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：１３５８−６２（１９９２））。３つの異なるＭ−ＣＳＦ種を、選択的ｍＲＮＡスプライシングによって産生する。３つのポリペプチド前駆体は、２５６アミノ酸のＭ−ＣＳＦα、５５４アミノ酸のＭ−ＣＳＦβ、および４３８アミノ酸のＭ−ＣＳＦγである。Ｍ−ＣＳＦβは、膜結合形態で生じない分泌タンパク質である。Ｍ−ＣＳＦαは、タンパク質切断によってゆっくり放出される内在性膜タンパク質として発現する。Ｍ−ＣＳＦαは、図１０に示す配列のアミノ酸１９１〜１９７で切断される。Ｍ−ＣＳＦの膜結合形態は、付近の細胞上の受容体と相互作用し、したがって、特異的細胞−細胞接触を媒介することができる。用語「Ｍ−ＣＳＦ」はまた、図１２のアミノ酸３６〜４３８を含み得る。
【００８９】
種々のＭ−ＣＳＦ形態は、標的細胞上でその受容体Ｍ−ＣＳＦＲ（ＣＳＦ−１Ｒとしても公知）への結合によって機能する。Ｍ−ＣＳＦＲは、５つの細胞外免疫グロブリン様ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内断続性（ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ）Ｓｒｃ関連チロシンキナーゼドメインを有する膜貫通分子である。Ｍ−ＣＳＦＲは、ｃ−ｆｍｓ癌原遺伝子によってコードされる。Ｍ−ＣＳＦＲの細胞外ドメインへのＭ−ＣＳＦの結合により、受容体が二量体化して細胞質キナーゼドメインを活性化し、それにより、他の細胞タンパク質が自己リン酸化およびリン酸化する（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｊ．Ａ．，Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ．，６２（２）：１４５−５５（１９９７）；Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｊ，Ａ．，Ｉｍｍｕｎｏ  Ｔｏｄａｙ．，１８（７）：３１３−７（１９９７）。
【００９０】
リン酸化細胞タンパク質は、細胞応答を生じる生物学的事象（有糸分裂、サイトカインの分泌、膜ラフリング、およびその受容体の転写の調節）のカスケードを含む（Ｆｉｘｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｌｏｒａｎ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １０：３２−３７（１９９８））。
【００９１】
Ｍ−ＣＳＦは、間質細胞、骨芽細胞、および他の細胞中に発現する。乳房腫瘍細胞、子宮腫瘍細胞、および卵巣腫瘍細胞中にも発現する。これらの腫瘍中の発現範囲は、高悪性度および予後不良と相関する（Ｋａｃｉｎｓｋｉ  Ａｎｎ．Ｍｅｄ．２７：７９−８５（１９９５）；Ｓｍｉｔｈら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１：３１３−２５（１９９５））。乳癌では、Ｍ−ＣＳＦ発現は、腺管内（前浸潤）癌と対照的に、浸潤性腫瘍細胞中に広がっている（Ｓｃｈｏｌｌら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８６：１２０−６（１９９４））。さらに、Ｍ−ＣＳＦは、乳腺腫瘍の悪性腫瘍への進行を促進することが示されている（Ｌｉｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．９３：７２７−３９（２００１））。乳癌および卵巣癌について、Ｍ−ＣＳＦの産生は、マクロファージの腫瘍への動員を担うようである。前立腺中に生じる癌には、再吸収とは対照的に新規の骨が形成される骨芽細胞性病変が含まれる。さらに、前立腺転移はしばしば混合型であり、骨溶解性病変および骨芽細胞性病変の両方からなる。臨床的に、患者によっては、しばしば骨溶解期が骨芽細胞期に先行する。骨溶解期により、しばしば、骨芽細胞成長因子が放出され、骨芽細胞過程の「誘発」を促し得る。最近、いくつかの研究により、骨粗鬆症および他の骨溶解疾患を防止／治療することが最も一般的に公知のビスホスホネートが骨芽細胞性転移物の成長を有効に防止または阻害することができることが示されている。本発明の１つの実施形態では、抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を使用して、混合型疾患または骨芽細胞性疾患のいずれかを治療する。したがって、本発明は、癌、癌転移、および癌転移に関連する骨再造形を治療または防止するための組成物および方法を提供する。
【００９２】
好ましい抗Ｍ−ＣＳＦ抗体マウスＲＸ１を、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａらのヒト操作（商標）法に基づいて、ヒトの免疫原性が低下するように修飾した。好ましい実施形態では、８〜１２個の重鎖可変領域の表面露出アミノ酸残基および１６〜１９個の軽鎖領域中の表面露出残基を、ヒト環境に関してその免疫原性が減少しながら抗原結合またはタンパク質折り畳みのいずれかに悪影響を及ぼす可能性が低いと判断された位置のヒト残基に対して修飾した。修飾重鎖および／または軽鎖可変領域を含む合成遺伝子を構築し、ヒトγ重鎖および／またはκ軽鎖定常領域に連結した。任意のヒト重鎖および軽鎖定常領域を、ヒト操作（商標）抗体可変領域と組み合わせて使用することができる。ヒト重鎖および軽鎖の遺伝子を哺乳動物細胞に導入し、得られた組換え免疫グロブリン産物を特徴づけた。５Ｈ４、ＭＣ１、またはＭＣ３などの他の例示的な抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を、同様に、ヒト操作（商標）する。
【００９３】
用語「ＲＸ１由来抗体」には、以下のいずれか１つが含まれる。
【００９４】
１）図４に示すアミノ酸配列を有するマウス抗体ＲＸ１のアミノ酸変異型（相同性決定のための類似のアミノ酸を考慮して、図４に示すアミノ酸配列と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％相同な重鎖可変アミノ酸配列および／または図４に示すアミノ酸配列と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％相同な軽鎖可変アミノ酸配列を含む変異型が含まれる）、
２）図４に示すアミノ酸配列を有するマウス抗体ＲＸ１の１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）、好ましくは、ＲＸ１重鎖の少なくともＣＤＲ３、好ましくは、２つまたはそれを超えるか、３つまたはそれを超えるか、４つまたはそれを超えるか、５つまたはそれを超えるか、６つ全てのＣＤＲを含むＭ−ＣＳＦ結合ポリペプチド（マウス抗体ＲＸ１を除く）、
３）図１９Ｂ〜２２Ｂに示す重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を有するヒト操作（商標）抗体または図１９Ｂ〜２２Ｂの元のヒト操作（商標）重鎖または軽鎖と少なくとも６０％のアミノ酸配列が同一、より好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および１００％が含まれる）同一の重鎖または軽鎖を含むその変異型、
４）図１９Ｂ〜２２Ｂのヒト操作（商標）抗体の１つまたは複数のＣＤＲの高リスク残基、好ましくは、２つまたはそれを超えるか、３つまたはそれを超えるか、４つまたはそれを超えるか、５つまたはそれを超えるか、６つ全てのＣＤＲの高リスク残基を含むＭ−ＣＳＦ結合ポリペプチド（マウス抗体ＲＸ１を除く）（ヒト操作（商標）ＲＸ１抗体の例示的なＣＤＲには、配列番号１８、２１、２４、３２、３６およびＱＡＳＱＳＩＧＴＳＩＨ（配列番号１３８）が含まれる）、
５）図４Ｂに示す高リスクアミノ酸残基を保持し、図４Ｂに示す低リスクまたは中程度のリスクの残基において１つまたは複数の変化を含み、
例えば、図４Ｂに示す低リスク残基における１つまたは複数の変化および中程度のリスクの残基における保存的置換を含むか、
例えば、図４Ｂに示す中程度のリスクおよび高リスクのアミノ酸残基を保持し、また、低リスクの残基において１つまたは複数の変化を含む
ヒト操作（商標）抗体または変異型
（ここで、変化には、挿入、欠失、または置換が含まれ、保存的置換であり得るか、ヒト軽鎖または重鎖配列、ヒト生殖系列軽鎖または重鎖配列、コンセンサスヒト軽鎖または重鎖配列、またはコンセンサスヒト生殖系列軽鎖または重鎖配列と配列がより近く、Ｍ−ＣＳＦへの結合能力が保持された操作抗体を生じ得る）。このような抗体は、好ましくは、Ｍ−ＣＳＦと、少なくとも１０−７、１０−８、または１０−９またはそれより高い親和性で結合し、好ましくは、Ｍ−ＣＳＦの所望の生物活性（例えば、Ｍ−ＣＳＦの破骨細胞生成誘導活性）を中和する。
【００９５】
同様に、用語「ＭＣ３由来抗体」には、以下のいずれか１つが含まれる。
【００９６】
１）図１５に示すアミノ酸配列を有するマウス抗体ＭＣ３のアミノ酸変異型（相同性決定のための類似のアミノ酸を考慮して、図１５に示すアミノ酸配列と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％相同な重鎖可変アミノ酸配列および／または図１５に示すアミノ酸配列と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％相同な軽鎖可変アミノ酸配列を含む変異型が含まれる）、
２）図１５に示すアミノ酸配列を有するマウス抗体ＭＣ３の１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）、好ましくは、ＭＣ３重鎖の少なくともＣＤＲ３、好ましくは、２つまたはそれを超えるか、３つまたはそれを超えるか、４つまたはそれを超えるか、５つまたはそれを超えるか、６つ全てのＣＤＲを含むＭ−ＣＳＦ結合ポリペプチド（マウス抗体ＲＸ１を任意選択的に含むか除く）、
３）低リスク、中程度のリスク、および高リスクの残基を同定するための図２４Ｃ〜２４Ｅに示すＫａｂａｔナンバリングを使用して、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａらに付与された米国特許第５，７６６，８８６号および本明細書中の実施例５に示す方法にしたがったマウス配列の変化によって生成されたヒト操作（商標）抗体。このような抗体は、少なくとも１つの以下の重鎖および少なくとも１つの以下の軽鎖を含む：（ａ）必要に応じて、ヒト基準免疫グロブリン配列と同一の残基となるように低リスク残基の全てが修飾されている重鎖、または（ｂ）必要に応じて、ヒト基準免疫グロブリン配列と同一の残基となるように低リスクおよび中程度のリスクの残基の全てが修飾されている重鎖、（ｃ）必要に応じて、ヒト基準免疫グロブリン配列と同一の残基となるように低リスク残基の全てが修飾されている軽鎖、または（ｂ）必要に応じて、ヒト基準免疫グロブリン配列と同一の残基となるように低リスクおよび中程度のリスクの残基の全てが修飾されている軽鎖。
【００９７】
４）元のヒト操作（商標）重鎖または軽鎖と少なくとも６０％のアミノ酸配列が同一、より好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および１００％が含まれる）同一の重鎖または軽鎖を含む前記段落（３）中の上記抗体の変異型、
５）図１５のマウスＭＣ３抗体抗体の１つまたは複数のＣＤＲの高リスク残基、好ましくは、２つまたはそれを超えるか、３つまたはそれを超えるか、４つまたはそれを超えるか、５つまたはそれを超えるか、６つ全てのＣＤＲの高リスク残基を含むＭ−ＣＳＦ結合ポリペプチド（マウス抗体ＲＸ１を任意選択的に含むか除く）、
６）マウスＭＣ３抗体の高リスクアミノ酸残基を保持し、低リスクまたは中程度のリスクの残基において１つまたは複数の変化を含み、
例えば、低リスク残基における１つまたは複数の変化および中程度のリスクの残基における保存的置換を含むか、
例えば、中程度のリスクおよび高リスクのアミノ酸残基を保持し、また、低リスクの残基において１つまたは複数の変化を含む
ヒト操作（商標）抗体または変異型
（ここで、変化には、挿入、欠失、または置換が含まれ、保存的置換であり得るか、ヒト軽鎖または重鎖配列、ヒト生殖系列軽鎖または重鎖配列、コンセンサスヒト軽鎖または重鎖配列、またはコンセンサスヒト生殖系列軽鎖または重鎖配列と配列がより近く、Ｍ−ＣＳＦへの結合能力が保持された操作抗体を生じ得る）。このような抗体は、好ましくは、Ｍ−ＣＳＦと、少なくとも１０−７、１０−８、または１０−９またはそれより高い親和性で結合し、好ましくは、Ｍ−ＣＳＦの所望の生物活性（例えば、Ｍ−ＣＳＦの破骨細胞生成誘導活性）を中和する。
【００９８】
用語「５Ｈ４由来抗体」または「ＭＣ１由来抗体」は、同様に、上記説明に従って定義される。
【００９９】
本明細書中に詳述するように、ＲＸ１、５Ｈ４、ＭＣ１、またはＭＣ３由来の抗体などの抗Ｍ−ＣＳＦ抗体（ヒト操作（商標）抗体または変異型が含まれる）は、アイソタイプが異なり得る（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、またはＩｇＥなど）。ＩｇＧクラスの抗体には、異なる定常領域が含まれ得る。例えば、ＩｇＧ２を、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域を示すように修飾することができる。好ましい実施形態では、本発明は、修飾または未修飾のＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域を含むヒト操作（商標）抗体または変異型を提供する。ＩｇＧ１の場合、定常領域、特にヒンジ領域またはＣＨ２領域の修飾により、エフェクター機能（ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性が含まれる）を増加または減少させることができる。他の実施形態では、ＩｇＧ２定常領域を、抗体−抗原凝集体形成を減少させるように修飾する。ＩｇＧ４の場合、定常領域、特にヒンジ領域の修飾により、半抗体の形成を減少することができる。特定の例示的実施形態では、ＩｇＧ４ヒンジ配列Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−ＣｙｓのＩｇＧ１ヒンジ配列Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓへの変異を提供する。
【０１００】
ＩｇＧ１またはＩｇＧ４の定常領域を含むヒト操作（商標）抗体は、ＩｇＧ２定常領域を含むヒト操作（商標）抗体と比較して改良された性質を有することを本明細書中に示す。ＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＦｃ領域の選択により、結合親和性、ＭＣＳＦ中和活性、および抗破骨細胞活性が改善された。さらに、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＦｃ領域の選択により、親マウス抗体によって形成された抗原−抗体複合体により厳密に類似した抗原−抗体複合体が得られた。
【０１０１】
したがって、ヒンジ領域の可動性は、二量体抗原ＭＣＳＦへの抗体の結合および抗体の中和活性に顕著に影響を及ぼすようである。本発明は、一般に、修飾または未修飾のＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域、特にヒンジおよびＣＨ２ドメイン、好ましくは少なくともヒンジドメインを含む重鎖を含む抗体の調製によって結合親和性が改善され、そして／または二量体抗原からの抗体の解離が遅延することを意図する。
【０１０２】
用語「ＲＸ１競合抗体」には、以下が含まれる：
１）図４に示す完全な軽鎖配列および重鎖配列を有するマウスＲＸ１と同一のＭ−ＣＳＦのエピトープに結合する非マウスまたは非げっ歯類モノクローナル抗体、
２）図１２のＭ−ＣＳＦのアミノ酸９８〜１０５の少なくとも４個の連続するアミノ酸に結合する非マウスまたは非げっ歯類モノクローナル抗体、
３）図４に示す完全な配列を有するマウス抗体ＲＸ１とＭ−ＣＳＦへの結合を、７５％を超えるか、８０％を超えるか、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％を超えて競合する非マウスまたは非げっ歯類モノクローナル抗体。このような抗体は、好ましくは、Ｍ−ＣＳＦと、少なくとも１０−７、１０−８、または１０−９またはそれより高い親和性で結合し、好ましくは、Ｍ−ＣＳＦの所望の生物活性（例えば、Ｍ−ＣＳＦの破骨細胞生成誘導活性）を中和する。
【０１０３】
用語「ＭＣ１競合抗体」、「ＭＣ３競合抗体」、または「５Ｈ４競合抗体」を、それぞれ、図１３、１４、または１５に示す完全な軽鎖配列および重鎖配列を有するマウス５Ｈ４、ＭＣ１、またはＭＣ３抗体ならびに抗体によって結合したＭ−ＣＳＦのエピトープ（例えば、図１２のアミノ酸６５〜７３または１３８〜１４４）（５Ｈ４またはＭＣ３によって認識されるＭ−ＣＳＦエピトープに対応する）に関して同様に定義する。
【０１０４】
任意選択的に、出願日以前に公的に開示されているか出願日以前に提出された出願に開示の任意のキメラ抗体、ヒト抗体、またはヒト化Ｍ−ＣＳＦ抗体を、本発明の範囲から除外する。
【０１０５】
「非げっ歯類」モノクローナル抗体は、げっ歯類ハイブリドーマによって生成された完全にインタクトなげっ歯類モノクローナル抗体ではない本明細書中に広く定義した任意の抗体である。したがって、非げっ歯類抗体には、特に、げっ歯類抗体の変異型、げっ歯類抗体のフラグメント、線状抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト操作（商標）抗体、およびヒト抗体（トランスジェニック動物から産生されたかファージディスプレイテクノロジーによって産生されたヒト抗体が含まれる）が含まれるが、これらに限定されない。同様に、非マウス抗体には、マウス抗体の変異型、マウス抗体のフラグメント、線状抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト操作（商標）抗体、およびヒト抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０６】
本明細書中で使用される、「腫瘍」は、悪性または良性のいずれかにかかわらない全ての新生物性細胞成長および増殖ならびに全ての前癌性および癌性の細胞および組織をいう。
【０１０７】
用語「癌」および「癌性」は、典型的には無秩序の細胞成長によって特徴づけられる哺乳動物における生理学的容態をいい、または説明する。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が含まれるが、これらに限定されない。このような癌のより特定の例には、乳癌、前立腺癌、結腸癌、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、消化管癌、膵臓癌、膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌、および種々の頭頸部癌型が含まれる。
【０１０８】
「処置」は、障害の発症を防止するか病状を変化させることを意図して行われる介入である。したがって、「処置」は、治療上の処置および予防または防止手段をいう。処置を必要とする者には、すでに障害を罹患している者および障害を防止すべき者が含まれる。腫瘍（例えば、癌）の処置では、治療薬は、腫瘍細胞の病状を直接軽減するか、腫瘍細胞を他の治療薬による処置（例えば、照射および／または化学療法）に対してより感受性を高めることができる。疾患の臨床的症状、生化学的症状、放射線学的症状、または自覚症状（骨芽細胞性病変または骨溶解など）を罹患した患者の処置には、このような症状のいくらかまたは全ての緩和または疾患素因の軽減が含まれ得る。癌の「病状」には、患者の健康を危うくする全ての現象が含まれる。これには、異常または制御不可能な細胞成長、転移、周辺細胞の正常な機能の妨害、サイトカインまたは他の分泌生成物の異常なレベルでの放出、炎症反応または免疫応答の抑制または悪化などが含まれるが、これらに限定されない。したがって、処置後に、腫瘍サイズの減少、腫瘍成長速度の減少、既存の腫瘍細胞または転移細胞の破壊、および／または転移のサイズまたは数の減少として改善が認められる。
【０１０９】
処置を目的とする「哺乳動物」は、哺乳動物（ヒト、家畜、および動物園、競技用、またはペットとしての動物（イヌ、ウマ、ネコ、ウシなど）が含まれる）に分類される任意の動物をいう。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【０１１０】
本明細書中で使用される、句「転移性癌」を、身体の他の領域、特に骨に拡大する可能性がある癌と定義する。種々の癌が骨に転移し得るが、最も一般的な転移性癌は、乳癌、肺癌、腎臓癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、および前立腺癌である。例として、骨に転移する可能性がある他の癌には、腺癌、血球悪性疾患（白血病およびリンパ腫が含まれる）、頭頸部癌、消化管癌（食道癌、胃癌、結腸癌、腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胆管または胆嚢の癌が含まれる）、女性生殖管の悪性疾患（卵巣癌、子宮内膜癌、膣癌、および子宮頸癌が含まれる）、膀胱癌、脳腫瘍（神経芽細胞腫が含まれる）、肉腫、骨肉種、および皮膚癌（悪性黒色腫および扁平上皮癌が含まれる）が含まれるが、これらに限定されない。本発明は、特に、骨における腫瘍誘導性骨溶解性病変または混合型骨芽細胞性／骨溶解性病変の防止および治療を意図する。
【０１１１】
本明細書中で使用される、句「薬学的に有効な量」は、本発明の実施形態に適切と考えられ、所望の治療レジメンにしたがって投与した場合に所望の治療または予防効果または応答（このような疾患のいくらかまたは全ての症状の緩和または疾患素因の減少が含まれる）を誘発する治療的または予防的Ｍ−ＣＳＦ抗体の量をいうことを意味する。
【０１１２】
本明細書中で使用される、「ヒトＭ−ＣＳＦ」は、Ｋａｗａｓａｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：２９１（１９８５）、Ｃｅｒｒｅｔｔｉら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２５：７６１（１９８８）、またはＬａｄｎｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６：２６９３（１９８７）（それぞれ、本明細書中で参考により援用される）に記載の成熟ヒトＭ−ＣＳＦα、Ｍ−ＣＳＦβ、またはＭ−ＣＳＦγポリペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列を有するヒトポリペプチドをいう。このような専門用語は、上記のように成熟Ｍ−ＣＳＦが異なるアミノ酸配列を有し、Ｍ−ＣＳＦの活性形態がジスルフィド結合した二量体であることの理解を反映し、したがって、用語「Ｍ−ＣＳＦ」が生物活性形態をいう場合、二量体形態を意図する。「Ｍ−ＣＳＦ二量体」は、二量体化された２つのＭ−ＣＳＦポリペプチド単量体をいい、ホモ二量体（２つの同型のＭ−ＣＳＦ単量体からなる）およびヘテロ二量体（２つの異なる単量体からなる）の両方が含まれる。米国特許第４，９２９，７００号（本明細書中で参考により援用される）に記載のように、Ｍ−ＣＳＦ単量体を、インビトロでＭ−ＣＳＦ二量体に変換することができる。
【０１１３】
抗ＭＣＳＦ抗体
本発明は、Ｍ−ＣＳＦ特異的抗体（ＲＸ１、５Ｈ４、ＭＣ１、および／またはＭＣ３など）、Ｍ−ＣＳＦ特異的抗体（ＲＸ１、５Ｈ４、ＭＣ１、および／またはＭＣ３など）を含む薬学的処方物、薬学的処方物を調製する方法、および薬学的処方物および化合物を使用して患者を治療する方法を提供する。用語「抗体」を、最も広い意味で使用し、完全にアセンブリされた抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗原に結合することができる抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ’（ａｂ）２、Ｆｖ、単鎖抗体、ダイアボディ）、および上記を含む組換えペプチド（所望の生物活性を示す場合に限る）が含まれる。
【０１１４】
本明細書中で使用される、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体集団（すなわち、集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る天然に存在する変異を有する可能性があること以外は同一である）から得た抗体をいう。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、１つの抗原部位に指向する。さらに、典型的には異なる決定基（エピトープ）に指向する異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物と対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原における１つの決定基に指向する。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、均一な培養物によって合成され、異なる特異性および特徴を有する他の免疫グロブリンが夾雑していないと言う点で有利である。
【０１１５】
修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られるという特徴を示し、任意の特定の方法によって抗体が産生される必要がないと解釈される。例えば、本発明で使用されるモノクローナル抗体を、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５［１９７５１に最初に記載のハイブリドーマ法によって作製することができるか、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）によって作製することができる。「モノクローナル抗体」を、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４６２８［１９９１］およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載の技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【０１１６】
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。５つの主なクラス（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）が存在し、これらのいくつかを、サブクラスまたはアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）にさらに分類することができる。異なる免疫グロブリンクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。異なる免疫グロブリンクラスのサブユニット構造および三次元立体配置は周知である。異なるアイソタイプは、異なるエフェクター機能を有する（例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソタイプはＡＤＣＣ活性を有する）。
【０１１７】
「抗体フラグメント」は、インタクトな全長抗体の一部、好ましくは、インタクトな抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント、ダイアボディ、線状抗体（Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５））、単鎖抗体分子、および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が含まれる。抗体のパパイン消化により、それぞれ１つの抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つ同一の抗原結合フラグメントおよび残存する「Ｆｃ」フラグメント（その名称は、３５を容易に結晶化する能力を反映する）が産生される。ペプシン処理により、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む２つの「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体フラグメントを有するＦ（ａｂ’）２フラグメントが得られ、これらのドメインは、１つのポリペプチド鎖中に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、さらに、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に、Ｆｖが抗原結合に望ましい構造を形成することができるポリペプチドリンカーを含む。ｓＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照のこと。
【０１１８】
用語「超可変」領域は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基をいう。超可変領域は、相補性決定領域またはＣＤＲ由来のアミノ酸残基（すなわち、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）に記載の軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、および８９〜９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、および９５〜１０２（Ｈ３））および／または超可変ループ由来の残基（すなわち、［Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）］に記載の軽鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、および９１〜９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、および９６〜１０１（Ｈ３））を含む。
【０１１９】
「フレームワーク」またはＥＲ残基は、超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【０１２０】
用語「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を有する小抗体フラグメントをいい、このフラグメントは、同一のポリペプチド鎖中に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（ＶＨ  ＶＬ）を含む。短すぎて同一鎖上の２つのドメイン間で対合できないリンカーの使用により、ドメインを別の鎖の相補性ドメインと強制的に対合させて２つの抗原結合部位を作製する。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４，０９７号、ＷＯ９３／１１１６１号、および３０  Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）により完全に記載されている。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、多重特異性（例えば、二重特異性）モノクローナル抗体（少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ヒト操作（商標）抗体、または変異抗Ｍ−ＣＳＦ抗体が含まれる）を生成することが望ましいかもしれない。例示的な二重特異性抗体は、Ｍ−ＣＳＦの２つの異なるエピトープに結合することができる。あるいは、抗Ｍ−ＣＳＦアームを、白血球上の誘発分子（ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）（Ｔ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ２またはＣＤ３）など）またはＩｇＧのＦｃ受容体（ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）など）に結合するアームと組み合わせて、Ｍ−ＣＳＦ発現細胞に対する細胞防御機構に集中することができる。二重特異性抗体を使用して、第２の治療薬（例えば、細胞傷害薬）をＭ−ＣＳＦを発現する細胞に局在化することもできる。これらの抗体は、Ｍ−ＣＳＦ結合アームおよび細胞傷害薬（例えば、サポリン、抗インターフェロン６０、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサート、または放射性同位体ハプテン）に結合するアームを有する。二重特異性抗体を、全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製することができる。
【０１２２】
二重特異性抗体の別の作製アプローチによれば、抗体分子対間の界面を、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の比率を最大にするように操作することができる。好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の界面由来の１つまたは複数の小アミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）と置換する。巨大なアミノ酸側鎖をより小さな側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）と置換することによって、巨大側鎖と同一または類似のサイズの補整的「空洞」を第２の抗体分子の界面に作製する。これにより、ホモ二量体などの望ましくない他の最終生成物を超えるヘテロ二量体の収量が増加する機構が得られる。１９９６年９月６日のＷＯ９６／２７０１１号を参照のこと。
【０１２３】
二重特異性抗体には、架橋抗体または「ヘテロ接合体（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」抗体が含まれる。例えば、ヘテロ接合体中の抗体の一方をアビジンにカップリングし、他方をビオチンにカップリングすることができる。ヘテロ接合体抗体を、任意の従来の架橋法を使用して作製することができる。適切な架橋剤は当該分野で周知であり、多数の架橋技術と共に米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
【０１２４】
抗体フラグメントから二重特異性抗体を生成する技術も文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体を、化学結合を使用して調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５）は、インタクトな抗体をタンパク質分解によって切断してＦ（ａｂ’）２フラグメントを生成する手順を記載している。これらのフラグメントを、ジチオール錯化剤である亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して、近接ジチオールを安定化し、分子間ジスルフィド形成を防止する。次いで、生成されたＦａｂ’フラグメントを、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の一方をメルカプトエチルアミンでの還元によってＦａｂ’−チオールに再変換し、等モル量の他方のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して二重特異性抗体を形成する。産生された二重特異性抗体を、酵素の選択的固定のための薬剤として使用することができる。なおさらなる実施形態では、大腸菌から直接回収したＦａｂ’−ＳＨフラグメントをインビトロで化学的にカップリングして、二重特異性抗体を形成することができる（Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２））。
【０１２５】
Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２）は、完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生を記載している。各Ｆａｂ’フラグメントを大腸菌から個別に分泌し、インビトロでの特異的化学結合（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ）に供して、二重特異性抗体を形成した。このようにして形成された二重特異性抗体は、ＨＥＲ２受容体を過剰発現する細胞および正常なヒトＴ細胞に結合し、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活動を誘発することができた。
【０１２６】
組換え細胞培養物から直接的に二重特異性抗体フラグメントを作製および単離するための種々の技術も記載されている。例えば、ロイシンジッパーを使用して、二重特異性抗体が産生されている。（Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２））。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結した。抗体ホモ二量体のヒンジ領域を還元して単量体を形成し、次いで、再酸化して抗体ヘテロ二量体を形成した。この方法を、抗体ホモ二量体の産生のために利用することもできる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）に記載の「ダイアボディ」テクノロジーは、二重特異性抗体フラグメントの別の作製機構を示している。
【０１２７】
フラグメントは、短すぎて同一鎖上の２つのドメイン間で対合できないリンカーの使用によって軽鎖可変領域（ＶＬ）に連結した重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。したがって、一方のフラグメントのＶＨドメインおよびＶＬドメインを、別のフラグメントの相補的ＶＬドメインおよびＶＨドメインと強制的に対合させ、それにより、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用による二重特異性抗体フラグメントの別の作製ストラテジーも報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）を参照のこと。
【０１２８】
あるいは、二重特異性抗体は、Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）に記載のように産生された「線状抗体」であり得る。簡潔に述べれば、これらの抗体は、抗原結合領域対を形成する１つのタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。線状抗体は、二重特異性または単一特異性であり得る。
【０１２９】
２つを超える結合価を有する抗体も意図する。例えば、三重特異性抗体を調製することができる（Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１））。
【０１３０】
一定の実施形態では、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ヒト操作（商標）抗体、または変異抗Ｍ−ＣＳＦ抗体は、抗体フラグメント（ＲＸ１、５Ｈ４、ＭＣ１、またはＭＣ３抗体フラグメントなど）である。抗体フラグメントの産生のための種々の技術が開発されている。伝統的には、これらのフラグメントを、インタクトな抗体のタンパク質消化によって誘導した（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７（１９９２）およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５）を参照のこと）。しかし、現在、これらのフラグメントを、組換え宿主細胞によって直接産生することができる。Ｂｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）は、細菌からの機能的抗体フラグメントの分泌を開示している（例えば、Ｂｅｔｔｅｒら、Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４１（１９８８）を参照のこと）。例えば、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントを大腸菌から直接回収し、化学的にカップリングしてＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成することができる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２））。別の実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２分子のアセンブリを促進するためのロイシンジッパーＧＣＮ４を使用してＦ（ａｂ’）２を形成する。別のアプローチによれば、Ｆｖ、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ’）２フラグメントを、組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。抗体フラグメントの他の産生技術が当業者に明らかである。
【０１３１】
「単離」抗体は、同定され、その天然環境の成分から分離および回収された抗体である。天然環境の夾雑成分は、抗体の診断または治療での使用を妨害するであろう物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質または非タンパク質の溶質が含まれ得る。好ましい実施形態では、抗体を、（１）ローリー法によって決定される抗体の９５重量％超、最も好ましくは、９９重量％超まで、（２）回転カップ（ｓｐｉｎｎｉｎｇ  ｃｕｐ）シークエネーターの使用によってＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または（３）クーマシーブルー染色、好ましくは銀染色を使用した還元条件または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一な程度まで精製する。抗体の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないので、単離抗体には、組換え細胞内にインサイチュで抗体が含まれる。しかし、通常、単離抗体を、少なくとも１つの精製工程によって調製する。
【０１３２】
抗体の構造および生成の詳細な説明については、Ｒｏｔｈ，Ｄ．Ｂ．，ａｎｄ  Ｃｒａｉｇ，ＮＬ．，Ｃｅｌｌ，９４：４１１−４１４（１９９８）および米国特許第６，２５５，４５８号（その全体が本明細書中で参考により援用される）を参照のこと。簡潔に述べれば、重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子をコードするＤＮＡの生成過程により、主にＢ細胞が得られる。種々の免疫グロブリン遺伝子セグメントの再配置および連結前に、Ｖ、Ｄ、Ｊ、および定常（Ｃ）遺伝子セグメントは、一般に、１つの染色体上に比較的近接して見出される。Ｂ細胞分化中、Ｖ、Ｄ、Ｊ（または軽鎖遺伝子の場合、ＶおよびＪのみ）遺伝子セグメントを組み換えて、機能的に再配置された重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子を形成する。この遺伝子セグメントの再配置過程は、逐次的なようである。第１に、重鎖Ｄ−Ｊ連結部を作製し、その後、重鎖Ｖ−ＤＪ連結部および軽鎖Ｖ−Ｊ連結部を作製する。
【０１３３】
機能的重鎖および軽鎖可変領域を形成するための可変領域遺伝子セグメントの組換えは、コンピテントなＶ、Ｄ、およびＪセグメントに組換え的に隣接する組換えシグナル配列（ＲＳＳ）によって媒介される。組換えに必要且つ十分なＲＳＳは、二分子対称七量体、ＡＴリッチ九量体、および１２または２３塩基対の介在スペーサー領域を含む。これらのシグナルは、Ｄ−Ｊ（またはＶ−Ｊ）組換えを行う異なる遺伝子座および種で保存されており、機能的に相互交換可能である。Ｏｅｔｔｉｎｇｅｒ，ら（１９９０），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８，１５１７−１５２３およびその参考文献を参照のこと。七量体は、配列ＣＡＣＡＧＴＧまたはそのアナログを含み、その後に非保存配列のスペーサー、次いで、配列ＡＣＡＡＡＡＡＣＣまたはそのアナログを有する九量体を含む。これらの配列は、Ｊまたは各ＶおよびＤ遺伝子セグメントの下流側で見出される。生殖系列ＤおよびＪセグメントの直前に２つの組換えシグナル配列が再度存在する（第１の九量体およびその後の非保存配列によって分離された七量体が再度存在する）。ＶＬ、ＶＨ、またはＤセグメント後の七量体および九量体配列は、組み換えられたＪＬ、Ｄ、またはＪＨセグメントに先行する七量体および九量体配列と相補的である。七量体配列と九量体配列との間のスペーサーは、１２塩基対長または２２塩基対長と２４塩基対長との間のいずれかである。
【０１３４】
Ｖ、Ｄ、およびＪセグメントの再配置に加えて、軽鎖中のＶおよびＪセグメントが連結し、重鎖のＤおよびＪセグメントが連結する位置での可変領域の組換えによって免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の一次レパートリーにさらなる多様性が生じる。典型的には、Ｖ遺伝子セグメントの最後のコドンおよびＪセグメントの最初のコドン内にこのような軽鎖の変化が生じる。ＤセグメントとＪＨセグメントとの間の重鎖染色体上に連結の類似の不正確さ（ｉｍｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）が生じ、この不正確さは１０ヌクレオチドにもわたって拡大し得る。さらに、いくつかのヌクレオチドを、ゲノムＤＮＡによってコードされないＤ遺伝子セグメントとＪＨ遺伝子セグメントとの間およびＶＨ遺伝子セグメントとＤ遺伝子セグメントとの間に挿入することができる。これらのヌクレオチドの付加は、Ｎ領域の多様性として公知である。
【０１３５】
可変領域の遺伝子セグメント中のこのような再配置およびこのような連結時に生じ得る可変領域の組換えの正味の効果は、一次抗体レパートリーの産生である。
【０１３６】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。この領域は、強固に非共有結合した１つの重鎖可変領域および１つの軽鎖可変領域からなる。この立体配置では、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ  ＶＩ二量体の表面の抗原結合部位が定義される。集合的に、６つのＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、１つの可変ドメイン（または抗原に特異的なたった３つのＣＤＲを含むＦｖの半分）でさえも、全結合部位よりも親和性が低いが、抗原を認識して結合する能力を有する。
【０１３７】
Ｆａｂフラグメントはまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂフラグメントは、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端にいくつかの残基（抗体ヒンジ領域由来の１つまたは複数のシステインが含まれる）が付加されていることがＦａｂ’フラグメントとの違いである。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’についての本明細書中での名称である。その間にヒンジシステインを有するＦａｂフラグメント対としてＦ（ａｂ’）２抗体フラグメントが最初に産生された。
【０１３８】
「中和抗体」は、結合する標的抗原のエフェクター機能を排除するか有意に減少させることができる抗体分子を意味する。したがって、「中和」抗標的抗体は、エフェクター機能（酵素活性、リガンド結合、または細胞内シグナル伝達など）を排除するか有意に減少させることができる。
【０１３９】
本明細書中に提供されるように、骨溶解性疾患（すなわち、破骨細胞活性の増加に関連する疾患）または癌転移および／または癌転移に関連する骨再形成を治療するための組成物および方法は、所望の効果を達成するために、１つまたは複数の抗体を単独で使用するか、他の治療薬と組み合わせて使用することができる。本発明の抗体を、環境抗原との直接的な接触または抗原での免疫化のいずれかの結果として抗体を産生する動物から単離することができる。あるいは、当該分野で周知の抗体発現系の１つを使用した組換えＤＮＡ法によって抗体を産生することができる（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）を参照のこと）。このような抗体には、組換えＩｇＧ、免疫グロブリン由来配列を有するキメラ融合タンパク質、またはヒト操作（商標）抗体が含まれ得、これら全てを本発明の癌転移および／または癌転移に関連する骨再形成の治療のために使用することができる。インタクトな全長分子に加えて、用語「抗体」はまた、そのフラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ）’２フラグメントなど）またはインタクトな分子の多量体もしくは凝集体、および／またはＭ−ＣＳＦ（またはＭ−ＣＳＦＲ）に結合するフラグメントをいう。これらの抗体フラグメントは抗原に結合し、例えば、ガラクトース残基の組み込みによってクリアランスおよび取り込みを促進する構造の特徴を示すように誘導することができる。
【０１４０】
本発明の１つの実施形態では、Ｍ−ＣＳＦモノクローナル抗体を、Ｈａｌｅｎｂｅｃｋらに付与された米国特許第５，４９１，０６５号（１９９７）（本明細書中で参考により援用される）に本質的に記載のように調製することができる。例示的なＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体には、生物活性の中和を伴う組換えまたは未変性の二量体Ｍ−ＣＳＦに関連する見かけ上の高次構造エピトープに結合するものが含まれる。これらの抗体は、Ｍ−ＣＳＦの生物学的に不活性な形態（単量体Ｍ−ＣＳＦおよび化学的に誘導された二量体Ｍ−ＣＳＦが含まれる）と実質的に反応しない。
【０１４１】
本発明の他の実施形態では、ヒト操作（商標）抗Ｍ−ＣＳＦモノクローナル抗体を提供する。句「ヒト操作（商標）抗体」は、非ヒト抗体、典型的にマウスモノクローナル抗体由来の抗体をいう。あるいは、ヒト操作（商標）抗体は、親非ヒト抗体の抗原結合性を保持するか実質的に保持するが、ヒトに投与した場合に親抗体と比較して免疫原性が減少したキメラ抗体に由来し得る。本明細書中で使用される、句「キメラ抗体」は、典型的には、異なる種に由来する２つの異なる抗体由来の配列を含む抗体をいう（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）。最も典型的には、キメラ抗体は、ヒト抗体およびマウス抗体のフラグメント、一般に、ヒト定常領域およびマウス可変領域を含む。
【０１４２】
句「相補性決定領域」または用語「ＣＤＲ」は、共に未変性の免疫グロブリン結合部位の天然のＦｖ領域の結合親和性および特異性を定義するアミノ酸配列をいう（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１  ９１７（１９８７）；Ｋａｂａｔら、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１  ３２４２（１９９１）を参照のこと）。句「定常領域」は、エフェクター機能を付与する抗体分子の一部をいう。本発明では、マウス定常領域を、好ましくは、ヒト定常領域に置換する。本発明の抗体の定常領域は、ヒト免疫グロブリンに由来する。重鎖定常領域を、以下の５つのアイソタイプから選択することができる：α、δ、ε、γ、またはμ。
【０１４３】
本発明の抗体は、抗体が抗原と約１０６Ｍ−１以上、好ましくは約１０７Ｍ−１以上、より好ましくは約１０８Ｍ−１以上、最も好ましくは約１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、または１０１２Ｍ−１以上のＫａで結合する場合に免疫特異的または特異的に結合すると言われる。抗Ｍ−ＣＳＦ抗体は、異なる天然に存在するＭ−ＣＳＦ形態（宿主／被験体の組織によって発現される形態および腫瘍によって発現される形態が含まれる）に結合することができる。本明細書中に開示のモノクローナル抗体（ＲＸ１、５Ｈ４、ＭＣ１、またはＭＣ３抗体など）は、Ｍ−ＣＳＦに対する親和性を有し、少なくとも１０−４Ｍ、好ましくは少なくとも約１０−７Ｍ〜約１０−８Ｍ、より好ましくは少なくとも約１０−８Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、または１０−１２Ｍの解離平衡定数（Ｋｄ）によって特徴づけられる。このような親和性を、従来技術（平衡透析、製造者によって概説された一般的手順を使用したＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００装置の使用、１２５Ｉ標識Ｍ−ＣＳＦを使用した放射免疫アッセイ、または当業者に公知の別の方法など）を使用して容易に決定することができる。アフィニティデータを、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら、Ａｎｎ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，５１：６６０（１９４９）の方法によって分析することができる。したがって、好ましいＭ−ＣＳＦ抗体はＭ−ＣＳＦに対して高い特異性を示し、実質的により低い親和性で他の分子に結合することが明らかである。好ましい抗体は、適切な動物疾患モデルで試験した場合、図４のマウスＲＸ１がＭ−ＣＳＦに結合するのと類似の親和性でＭ−ＣＳＦに結合し、免疫原性が低く、所望の生物活性を示す。他の例示的な抗体は、それぞれ、図１３、１４、または１５のマウス５Ｈ４、ＭＣ１、またはＭＣ３がＭ−ＣＳＦに結合するのと類似の親和性でＭ−ＣＳＦに結合する。
【０１４４】
抗体産生のために使用すべき抗原は、例えば、所望のエピトープを保持し、任意選択的に、エピトープがその未変性高次構造中に提示可能な別のポリペプチドに融合したインタクトなＭ−ＣＳＦまたはＭ−ＣＳＦのフラグメントであり得る。あるいは、その細胞表面にＭ−ＣＳＦを発現する細胞を使用して、抗体を生成することができる。このような細胞は、Ｍ−ＣＳＦを発現するように形質転換することができるか、Ｍ−ＣＳＦを発現する他の天然に存在する細胞であり得る。抗体生成に有用な他のＭ−ＣＳＦ形態は、当業者に明らかである。
【０１４５】
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連抗原およびアジュバントの複数回の皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射によって動物中に惹起される。二価性薬剤（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｇｅｎｔ）または誘導剤（例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基による抱合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基による）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、または当該分野で公知の他の薬剤）を使用した、免疫化される種において免疫原性を示すタンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシンインヒビター）への関連抗原の接合によって改良された抗体応答を得ることができる。
【０１４６】
動物を、例えば、１００μｇまたは５μｇのタンパク質または接合体（それぞれ、ウサギまたはマウスについて）と３体積のフロイント完全アジュバントとの組み合わせおよびこの溶液の複数の部位への皮内注射によって、抗原、免疫原性接合体、または誘導体に対して免疫化する。１ヶ月後、動物に、複数の部位への皮下注射によって元のペプチドまたは接合体の量の１／５〜｛画分（１／１０）｝を含むフロイント完全アジュバントで追加免疫する。追加免疫注射の７〜１４日後、動物を採血し、抗体力価について血清をアッセイする。力価がプラトーになるまで動物を追加免疫する。好ましくは、動物を、同一抗原であるが、異なるタンパク質に接合しているか、及び／または異なる架橋試薬によって接合した接合体で追加免疫する。接合体を、組換え細胞培養物中でタンパク質融合物として作製することもできる。また、ミョウバンなどの凝集剤を適切に使用して、免疫応答を増強する。
【０１４７】
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体を、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法を使用して作製することができるか、組換えＤＮＡ法によって作製することができる。
【０１４８】
ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適切な宿主動物（ハムスターまたはマカクザルなど）を、本明細書中に記載のように免疫化し、免疫化に使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するか産生することができるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球を、インビトロで免疫化することができる。次いで、リンパ球を、適切な融合剤（ポリエチレングリコールなど）を使用して骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。
【０１４９】
このようにした調製されたハイブリドーマ細胞を、好ましくは、融合していない親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１つまたは複数の物質を含む適切な培養培地中に播種し、成長させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマ用の培養培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプレテリン、およびチミジンを含み（ＨＡＴ培地）、これらの物質がＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を防止する。
【０１５０】
好ましい骨髄腫細胞は、効率よく融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベル産生を補助し、培地に感受性を示す骨髄腫細胞である。ヒトモノクローナル抗体産生のためのヒト骨髄腫細胞株およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫（ｈｅｔｅｒｏｍｙｅｌｏｍａ）細胞も記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７））。例示的なマウス骨髄腫株には、ＳａＩｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡから利用可能なＭＯＰ−２１およびＭ．Ｃ．−１１マウス腫瘍ならびにＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．ＵＳＡから利用可能なＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞由来のものが含まれる。
【０１５１】
ハイブリドーマ細胞が成長している培養培地を、抗原に対して指向するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降またはインビトロ結合アッセイ（放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）など）によって決定する。モノクローナル抗体の結合親和性を、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析（Ｍｕｎｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０））によって決定することができる。
【０１５２】
所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞の同定後、クローンを、限界希釈手順によってサブクローニングし、標準的な方法によって成長させることができる（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。この目的に適切な培養培地には、例えば、Ｄ−ＭＥＭ培地またはＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。さらに、ハイブリドーマ細胞を、動物中の腹水腫瘍としてインビボで成長させることができる。サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体を、従来の免疫グロブリン精製手順（例えば、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティクロマトグラフィなど）によって培養培地、腹水、または血清から適切に分離する。
【０１５３】
抗体の組換え産生
従来の手順（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブの使用による）を使用して、モノクローナル抗体をコードするＤＮＡを、ハイブリドーマ細胞から単離および分離することができる。配列決定には、一般に、目的の遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部の単離が必要である。通常、これには、モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ、好ましくはｍＲＮＡ（すなわち、ｃＤＮＡ）のクローニングが必要である。標準的技術を使用してクローニングを行う（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ，Ｖｏｌｓ  １−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（本明細書中で参考により援用される）を参照のこと）。例えば、ｃＤＮＡライブラリーを、ポリＡ＋ｍＲＮＡ、好ましくは膜結合ｍＲＮＡの逆転写によって構築し、ヒト免疫グロブリンポリペプチド遺伝子配列に特異的なプローブを使用してライブラリーをスクリーニングすることができる。しかし、好ましい実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、目的の免疫グロブリン遺伝子セグメント（例えば、軽鎖可変セグメント）をコードするｃＤＮＡ（または全長ｃＤＮＡの一部）を増幅する。増幅した配列を、任意の適切なベクター（例えば、発現ベクター、ミニ遺伝子ベクター、またはファージディスプレイベクター）に容易にクローン化することができる。目的の免疫グロブリンポリペプチドのいくつかの部分の配列を決定することが可能である限り、使用される特定のクローニング法は重要でないと認識されるであろう。本明細書中で使用される、「単離」核酸分子または「単離」核酸配列は、（１）通常は天然の核酸供給源中で会合している少なくとも１つの夾雑核酸分子から同定および分離されているか、（２）目的の核酸配列を決定することができ、単離されたと見なされるようにバックグラウンド核酸からクローン化、増幅、タグ化されているか、そうでなければ区別される核酸分子である。単離核酸分子は、天然で見出される以外の形態または状態である。したがって、単離核酸分子は、天然細胞中で存在する核酸分子と区別される。しかし、単離核酸分子には、例えば、核酸分子が天然細胞と異なる染色体位置に存在する抗体を通常発現する細胞中に含まれる核酸分子が含まれる。
【０１５４】
クローニングおよび配列決定のために使用されるＲＮＡの１つは、トランスジェニックマウスからＢ細胞を得ることおよび不死細胞へのＢ細胞の融合によって産生されたハイブリドーマである。ハイブリドーマを用いる利点は、ハイブリドーマを容易にスクリーニングし、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択することができることである。あるいは、ＲＮＡを、免疫化動物のＢ細胞（または全脾臓）から単離することができる。ハイブリドーマ以外の供給源を使用する場合、特異的結合特性を有する免疫グロブリンまたは免疫グロブリンポリペプチドをコードする配列をスクリーニングすることが望ましいかもしれない。１つのこのようなスクリーニング方法は、ファージディスプレイテクノロジーの使用である。ファージディスプレイは、例えば、Ｄｏｗｅｒら、ＷＯ９１／１７２７１号、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、ＷＯ９２／０１０４７号、およびＣａｔｏｎ  ａｎｄ  Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６４５０−６４５４（１９９０）（それぞれ、本明細書中で参考により援用される）に記載されている。ファージディスプレイテクノロジーを使用する１つの実施形態では、免疫化トランスジェニックマウス由来のｃＤＮＡ（例えば、総脾臓ｃＤＮＡ）を単離し、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、免疫グロブリンポリペプチドの一部（例えば、ＣＤＲ領域）をコードするｃＤＮＡ配列を増幅し、増幅した配列をファージベクターに挿入する。目的のペプチド（例えば、所望の結合特性を有する可変領域のペプチド）をコードするｃＤＮＡを、パニングなどの標準的技術によって同定する。
【０１５５】
次いで、増幅またはクローン化された核酸配列を決定する。典型的には、免疫グロブリンポリペプチドの全可変領域をコードする配列を決定するが、時折、可変領域の一部のみ（例えば、ＣＤＲコード部分）を配列決定することが適切であろう。典型的には、部分配列は、少なくとも３０塩基長、より頻繁には、可変領域の長さの少なくとも約１／３または少なくとも約１／２をコードする塩基（ｂａｓｅｄ）を配列決定する。
【０１５６】
ｃＤＮＡライブラリーから単離したクローンを配列決定するか、ＰＣＲを使用した場合、増幅配列のサブクローニング後に配列決定するか、増幅セグメントの直接ＰＣＲ配列決定によって配列決定することができる。配列決定を、標準的な技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ，Ｖｏｌｓ  １−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＰｒｅｓｓおよびＳａｎｇｅｒ，Ｆ．ら（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３−５４６７（本明細書中で参考により援用される）を参照のこと）を使用して行う。クローン化した核酸の配列とヒト免疫グロブリン遺伝子およびｃＤＮＡの配列との比較により、当業者は、配列決定した領域に応じて、（ｉ）ハイブリドーマ免疫グロブリンポリペプチド（重鎖のアイソタイプが含まれる）の生殖系列セグメントの使用、および（ｉｉ）重鎖および軽鎖の可変領域の配列（Ｎ領域の付加および体細胞変異過程に起因する配列が含まれる）を容易に決定することができる。免疫グロブリン遺伝子配列の１つの情報源は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄである。
【０１５７】
一旦単離されると、ＤＮＡを発現ベクターに配置し、次いで、別の方法で免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、ヒト胚腎臓２９３細胞（例えば、２９３Ｅ細胞）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクションして、組換え宿主細胞中にモノクローナル抗体を合成することができる。抗体の組換え産生は、当該分野で周知である。
【０１５８】
発現調節配列は、特定の宿主生物中で作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列をいう。原核生物に適切な調節配列には、例えば、プロモーター、任意選択的に、オペレーター配列、およびリボゾーム結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを使用することが公知である。
【０１５９】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれた場合に作動可能に連結されている。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与する前タンパク質として発現する場合にポリペプチドのＤＮＡと作動可能に連結されており、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合にコード配列と作動可能に連結されており、または、リボゾーム結合部位は、翻訳を容易にするために配置された場合にコード配列と作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結された」は、連結されるＤＮＡ配列が連続しており、分泌リーダーの場合、連続し、且つリーディングフェーズ（ｒｅａｄｉｎｇ  ｐｈａｓｅ）中に存在することを意味する。しかし、エンハンサーは、連続する必要はない。都合のよい制限部位でのライゲーションによって連結する。このような部位が存在しない場合、従来の作業にしたがって、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用する。
【０１６０】
細胞、細胞株、および細胞培養物を、しばしば、交換可能に使用し、本明細書中の全てのこのような指定には子孫が含まれる。形質転換体および形質転換細胞には、導入数と無関係に本発明の初代細胞およびこれに由来する培養物が含まれる。全ての子孫は意図的または偶然の変異によってＤＮＡの内容が正確に同一でなくてよいとも理解される。最初に形質転換された細胞でスクリーニングしたものと同一の機能または生物活性を有する変異子孫が含まれる。異なる指定を意図する場合、文脈から明らかである。
【０１６１】
別の実施形態では、目的の免疫グロブリンのアミノ酸配列を、直接タンパク質配列決定によって決定することができる。適切なコードヌクレオチド配列を、普遍コドン表にしたがって設計することができる。
【０１６２】
所望の抗体のアミノ酸配列変異型を、コードＤＮＡの適切なヌクレオチドの変化の導入またはペプチド合成によって調製することができる。このような変異型には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失および／または挿入および／または置換が含まれる。最終構築物が所望の特徴を有する場合、欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせによって最終構築物に到達する。アミノ酸の変化により、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ヒト操作（商標）抗体、または変異抗体を変化させることもできる（グリコシル化部位の数または位置の変化など）。
【０１６３】
抗体のアミノ酸配列変異型をコードする核酸分子を、当該分野で公知の種々の方法によって調製する。これらの方法には、天然供給源（天然に存在するアミノ酸配列変異型の場合）からの単離または抗体のより早期に調製された変異型または非変異バージョンのオリゴヌクレオチド媒介性（または部位特異的）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、およびカセット変異誘発による調製が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６４】
本発明はまた、宿主細胞によって認識される調節配列と任意選択的に作動可能に連結された本発明の抗体をコードする単離核酸、核酸を含むベクターおよび宿主細胞、ならびに抗体産生のための組換え技術（核酸が発現されるように宿主細胞を培養する工程と、任意選択的に、宿主細胞培養物または培養培地から抗体を回収する工程とを含み得る）を提供する。
【０１６５】
抗体の組換え産生のために、抗体をコードする核酸を単離し、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のための複製可能なベクターに挿入する。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡを容易に単離し、従来の手順を使用して（抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブの使用によって）配列決定する。多数のベクターが利用可能である。ベクター成分には、一般に、１つまたは複数の以下が含まれるが、これらに限定されない：シグナル配列、複製起点、１つまたは複数の選択マーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列。
【０１６６】
（１）シグナル配列成分
本発明の抗体を、組換えによって直接産生するだけでなく、異種ポリペプチド（好ましくは、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドである）との融合ポリペプチドとして産生することができる。選択されたシグナル配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識および処理（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）されるシグナル配列である。原核生物宿主細胞が未変性抗体シグナル配列を認識および処理しない場合、シグナル配列を、例えば、ペクチン酸リアーゼ（例えば、ｐｅｌＢ）、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択されたシグナル配列と置換することができる。酵母分泌のために、未変性シグナル配列を、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（サッカロミセスおよびクリベロマイセスα因子リーダーが含まれる）、酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．アルビカンスのグルコアミラーゼリーダー、またはＷＯ９０／１３６４６号に記載のシグナルと置換することができる。哺乳動物細胞発現では、哺乳動物シグナル配列およびウイルス分泌リーダー（例えば、単純ヘルペスｇＤシグナル）を利用可能である。
【０１６７】
このような前駆体領域のＤＮＡを、抗体をコードするＤＮＡの読み取り枠内にライゲーションする。
【０１６８】
（２）複製起点成分
発現ベクターおよびクローニングベクターの両方は、１つまたは複数の選択された宿主細胞中でベクターを複製することができる核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターでは、この配列は、宿主染色体ＤＮＡから独立してベクターを複製することができる配列であり、複製起点または自律複製配列が含まれる。このような配列は、種々の細菌、酵母、およびウイルスで周知である。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌に適切であり、２μプラスミド起点は酵母に適切であり、種々のウイルス起点は哺乳動物細胞におけるベクターのクローニングに適切である。一般に、複製起点成分は、哺乳動物発現ベクターに必要ない（初期プロモーターを含むので、典型的には、ＳＶ４０起点のみを使用することができる）。
【０１６９】
（３）選択マーカー成分
発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含み得る。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、テトラサイクリン、Ｇ４１８、ゲネチシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）、ヒスチジノール、またはミコフェノール酸）に対する耐性を付与し、（ｂ）栄養要求性欠損を補完し、（ｃ）天然培地から利用できない極めて重要な栄養素（例えば、バチルスのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）を供給するタンパク質をコードする。
【０１７０】
選択スキームの１つの例は、宿主細胞の成長を停止させる薬物を使用する。異種遺伝子で首尾よく形質転換された細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を産生し、それにより、選択レジメンを生き抜く。このような優性選択（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）の例は、薬物メトトレキサート、ネオマイシン、ヒスチジノール、ピューロマイシン、ミコフェノール酸、およびハイグロマイシンを使用する。
【０１７１】
哺乳動物のための適切な選択マーカーの別の例は、抗体コード核酸を取り込む能力のある細胞を同定することができる選択マーカー（ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−ＩおよびＩＩ、好ましくは、メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなど）である。
【０１７２】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞を、全形質転換体のメトトレキサート（Ｍｔｘ）（ＤＨＦＲの競合性アンタゴニスト）を含む培養培地中での培養によって最初に同定する。野生型ＤＨＦＲを使用する場合に適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性が欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である。
【０１７３】
あるいは、本発明の抗体、野生型ＤＨＦＲタンパク質、およびアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）などの別の選択マーカーで形質転換されたか同時形質転換された宿主細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含む野生型宿主）を、アミノグリコシド抗生物質（例えば、カナマイシン、ネオマイシン、またはＧ１４８）などの選択マーカーのための選択剤を含む培地中での細胞成長によって選択することができる。米国特許第４，９６５，１９９号を参照のこと。
【０１７４】
酵母に適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７中に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９（１９７９））。ｔｒｐ１遺伝子により、トリプトファン中での成長能力を欠く酵母の変異株（例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１）のための選択マーカーが得られる（Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２（１９７７））。次いで、酵母宿主細胞ゲノム中にｔｒｐ１損傷が存在することにより、トリプトファンの不在下での成長による形質転換の検出に有効な環境が得られる。同様に、Ｌｅｕ２欠損酵母株（ＡＴＣＣ  ２０，６２２または３８，６２６）を、Ｌｅｕ２遺伝子を保有する公知のプラスミドによって補足する。Ｕｒａ３欠損酵母株を、ｕｒａ３遺伝子を保有するプラスミドによって補足する。
【０１７５】
さらに、１．６μｍ；の環状プラスミドｐＫＤ１由来のベクターを、クリベロマイセス酵母の形質転換のために使用することができる。あるいは、Ｋ．ラクチスについての組換え仔牛キモシンの大量産生のための発現系が報告されている。Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：１３５（１９９０）。産業用クリベロマイセス株の成熟組換えヒト血清アルブミンの分泌のための安定な多コピー発現ベクターも開示されている。Ｆｌｅｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９６８−９７５（１９９１）。
【０１７６】
（４）プロモーター成分
発現ベクターおよびクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、抗体コード核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む。原核生物宿主との使用に適切なプロモーターには、アラビノース（例えば、ａｒａＢ）プロモーターｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ならびにｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが含まれる。しかし、他の公知の細菌プロモーターが適切である。細菌系で用いるプロモーターはまた、本発明の抗体をコードするＤＮＡに作動可能に連結されたシャイン−ダルカルノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含むであろう。
【０１７７】
真核生物のためのプロモーター配列は公知である。実質的に全ての真核生物遺伝子が、転写開始部位から約２５〜３０塩基上流に存在するＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始部位から７０〜８０塩基上流に見出される別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域（Ｎは任意のヌクレオチドであり得る）である。ほとんどの真核生物遺伝子の３’末端は、ＡＡＴＡＡＡ配列であり、これは、コード配列の３’末端へのポリＡテールの付加のためのシグナルであり得る。これらの全配列を、真核生物発現ベクターに適切に挿入する。
【０１７８】
酵母宿主との使用に適切な促進配列の例には、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素（エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、おいよびグルコキナーゼなど）のプロモーターが含まれる。
【０１７９】
成長条件によって調節される転写のさらなる利点を有する誘導プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用を担う酵素のプロモーター領域である。酵母発現での使用に適切なベクターおよびプロモーターは、欧州特許第７３，６５７号にさらに記載されている。酵母エンハンサーを、酵母プロモーターと共に使用することも有利である。
【０１８０】
哺乳動物宿主細胞中のベクターからの抗体転写を、例えば、ウイルス（エーベルソン白血病ウイルス、ポリオーマウイルス、家禽ポックスウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、最も好ましくはサイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、サルウイルス４０（ＳＶ４０）など）のゲノムから得たプロモーター、異種哺乳動物プロモーター（例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター）、熱ショックプロモーター（このようなプロモーターが宿主細胞系と適合する場合）によって調節する。
【０１８１】
ＳＶ４０ウイルス複製起点も含むＳＶ４０制限フラグメントとしてＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターを得ることが都合がよい。ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限フラグメントとしてヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターを得ることが都合がよい。ベクターとしてウシ乳頭腫ウイルスを使用した哺乳動物宿主におけるＤＮＡの発現系は、米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。この系の修飾は、米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞中のヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現については、Ｒｅｙｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：５９８−６０１（１９８２）を参照のこと。あるいは、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
【０１８２】
（５）エンハンサーエレメント成分
高等真核生物による本発明の抗体をコードするＤＮＡの転写を、しばしば、ベクターへのエンハンサー配列の挿入によって増加する。現在、哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、およびインスリン）由来の多数のエンハンサー配列が公知である。しかし、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。例として、複製起点の後期側（ｂｐ１００〜２７０）のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核生物プロモーターの活性かのための増強エレメントについては、Ｙａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：１７−１８（１９８２）も参照のこと。エンハンサーを、ベクター中にて抗体コード配列の５’位または３’位でスプライシングすることができるが、好ましくは、プロモーターの５’側の部位に存在する。
【０１８３】
（６）転写終結成分
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または有核細胞）中で使用される発現ベクターはまた、転写終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、一般に、真核生物またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’、時折、３’非翻訳領域から利用可能である。これらの領域は、抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分中のポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含む。有用な転写終結成分の１つは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６号およびこれに開示の発現ベクターを参照のこと。別の転写終結成分は、マウス免疫グロブリン軽鎖転写終結因子である。
【０１８４】
（７）宿主細胞の選択および形質転換
本明細書中のベクター中でのＤＮＡのクローニングおよび発現に適切な宿主細胞は、上記の原核生物、酵母、または高等真核細胞である。この目的に適切な原核生物には、グラム陰性生物またはグラム陽性生物などの真正細菌（例えば、腸内細菌科（大腸菌類（例えば、大腸菌、エンテロバクター属、エルウィニア属，クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属（例えば、ネズミチフス菌）、セラチア属（例えば、セラチア・マルセスカンス）、および赤痢菌属など）、ならびに桿菌（枯草菌およびバチルス・リケニホルミス（例えば、１９８９年４月１２日公開のＤＤ２６６，７１０に開示のバチルス・リケニホルミス４１Ｐ）など）、シュードモナス（緑膿菌など）、およびストレプトミセス）が含まれる。１つの好ましい大腸菌クローニング宿主は、大腸菌２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）であるが、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）、および大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）も適切である。これらの例は、本発明を制限するよりもむしろ例示である。
【０１８５】
原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物は、抗体コードベクターに適切なクローニング宿主または発現宿主である。出芽酵母（すなわち、一般的なパン酵母）は、下等真核宿主微生物の間で最も一般的に使用されている。しかし、一般に、多数の他の属、種、および株が本明細書中で利用可能且つ有用である（分裂酵母、クリベロマイセス宿主（クリベロマイセス・ラクチス、Ｋ．フラギリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ  １２，４２４）、Ｋ．ブルガリクス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ  １６，０４５）、Ｋ．ウィケラミイ（Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ  ２４，１７８）、Ｋ．ワルチイ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ  ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ  ３６，９０６）、Ｋ．サーモトレランス、およびＫ．マルキシアヌスなど）、ヤロウイア属（欧州特許第４０２，２２６号）、ピキア・パストリス（欧州特許第１８３，０７０号）、カンジダ属、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ）（欧州特許第２４４，２３４号）、アカパンカビ、シュワニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）（シュワニオミセス・オキシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓなど）、ならびに糸状菌（例えば、アカパンカビ属、アオカビ属、トリポカジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、およびアスペルギルス属の宿主（アスペルギルス・ニデュランスおよびクロコウジカビなど）など）など）。
【０１８６】
グリコシル化抗体の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例として、植物細胞および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株および変異型ならびにヨトウガ（毛虫）、ネッタイシマカ（蚊）、ヒトスジシマカ（蚊）、キイロショウジョウバエ（ショウジョウバエ）、およびカイコなどの宿主由来の対応する承認された昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための種々のウイルス株（オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ−１変異型およびカイコＮＰＶのＢｍ−５株）が公的に利用可能であり、このようなウイルスを、特にヨトウガ細胞のトランスフェクションのための本発明のウイルスとして使用することができる。
【０１８７】
ワタ、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ツクバネアサガオ、トマト、タバコ、アオウキクサ（ｌｅｍｎａ）、および他の植物細胞の植物細胞培養物も宿主として使用することができる。
【０１８８】
しかし、脊椎動物細胞に最も関心が寄せられており、培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖は日常的手順となりつつある。有用な哺乳動物宿主細胞株の例として、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯＫ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、ＤＸＢ−１１、ＤＧ−４４、およびチャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））が含まれる）、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）、ヒト胚腎臓株（２９３細胞または浮遊培養での成長のためにサブクローニングされた２９３細胞（Ｇｒａｈａｍら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））、サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ５  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２，ＨＢ  ８０６５）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、およびヒト肝細胞癌株（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０１８９】
宿主細胞を、抗体産生のための上記発現ベクターまたはクローニングベクターで形質転換またはトランスフェクションし、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適切なように改変した従来の栄養培地中で培養する。さらに、選択マーカーによって分離された転写単位の複数のコピーを有する新規のベクターおよびトランスフェクションした細胞株は、Ｍ−ＣＳＦをターゲティングする抗体の発現に特に有用且つ好ましい。
【０１９０】
（８）縮細胞の培養
本発明の抗体を産生するために使用される宿主細胞を、種々の培地中で培養することができる。ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小基礎培地（ＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ）は、宿主細胞の培養に適切である。さらに、Ｈａｍら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９），Ｂａｒｎｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号、同第４，６５７，８６６号、同第４，９２７，７６２号、同第４，５６０，６５５号、または同第５，１２２，４６９号、ＷＯ９０１０３４３０号、ＷＯ８７／００１９５号、または米国再発行特許第３０，９８５号に記載の任意の培地を、宿主細胞のための培養培地として使用することができる。これらの任意の培地に、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイシン（商標）薬など）、微量元素（通常はマイクロモルレンジの最終濃度で存在する無機化合物として定義）、およびグルコースまたは等価なエネルギー源を補足することができる。任意の他の必要な補助栄養剤を、当業者に公知と考えられる適切な濃度で含めることもできる。温度およびｐＨなどの培養条件は、発現のために選択した宿主細胞と共に使用した培養条件であり、当業者に明らかである。
【０１９１】
（９）抗体の精製
組換え技術を使用する場合、抗体を、細胞膜周辺腔に細胞内に産生するか、培地（微生物培養物が含まれる）に直接分泌することができる。抗体を細胞内に産生する場合、最初の工程として、粒子状デブリ（宿主細胞または溶解フラグメントのいずれか）を、例えば、遠心分離または限外濾過によって除去する。Ｂｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）；ＩＣＳＵ  Ｓｈｏｒｔ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １０：１０５（１９９０）およびＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：４５７−４６１（１９９３）は、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌された抗体の単離手順を記載している（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２）も参照のこと）。
【０１９２】
微生物細胞または哺乳動物細胞から調製した抗体組成物を、例えば、陰イオンヒドロキシアパタイトクロマトグラフィまたはトリ（ａｖｉａｎ）交換クロマトグラフィ、およびアフィニティクロマトグラフィを使用して精製することができ、アフィニティクロマトグラフィが好ましい精製技術である。アフィニティリガンドとしてのプロテインＡの適切性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡを使用して、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖に基づいた抗体を精製することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。全てのマウスアイソタイプおよびヒトγ３にはプロテインＧが推奨される（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。アフィニティリガンドが付着するマトリックスは、ほとんどの場合アガロースであるが、他のマトリックスが利用可能である。多孔性ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）またはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスによって、アガロースよりも速い流速および短い処理時間が可能である。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ．）は精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィ、陰イオンおよび陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）でのヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィ、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿などの他のタンパク質精製技術も、回収されるべき抗体に応じて利用可能である。
【０１９３】
キメラ抗体およびヒト化抗体
キメラ抗体およびヒト化抗体は親マウスモノクローナル抗体よりもヒトにおいて免疫原性が低いので、これらを、過敏症リスクのはるかに低いヒト治療に使用することができる。したがって、これらの抗体は、ヒトへのインビボ投与を含む治療への応用で好ましい場合がある。
【０１９４】
マウスモノクローナル抗体の可変Ｉｇドメインがヒト定常Ｉｇドメインに融合したキメラモノクローナル抗体を、当該分野で公知の標準的手順を使用して生成することができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，ら（１９８４）Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ；Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｒｅｇｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１，６８４１−６８５５およびＢｏｕｌｉａｎｎｅ，Ｇ．Ｌ．，ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２，６４３−６４６（１９８４）を参照のこと）。いくつかのキメラモノクローナル抗体でヒトでの免疫原性の低さが証明されているにもかかわらず、マウス可変Ｉｇドメインは依然として有意にヒト抗マウス応答を示し得る。
【０１９５】
ヒト化抗体を、種々の方法（例えば、（１）ヒトフレームワークへの非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）および定常領域のグラフティング（当該分野で「ＣＤＲグラフティング」によるヒト化と呼ばれる過程）、または（２）全非ヒト可変ドメインを移植するが表面残基の置換によってヒト様表面を「覆うこと（ｃｌｏａｋｉｎｇ）」（当該分野で「ベニア化（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）」と呼ばれる過程）が含まれる）によって得ることができる。本発明では、ヒト化抗体には、「ヒト化」抗体および「ベニア化」抗体の両方が含まれるであろう。これらの方法は、例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２  ５２５（１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１：６８５１  ６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｉ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４：６５  ９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４  １５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９  ４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１（３）：１６９  ２１７（１９９４）；およびＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，ＣＡ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．４（７）：７７３  ８３（１９９１）（それぞれ、本明細書中で参考により援用される）に開示されている。
【０１９６】
特に、ヒトへの単独または接合体としての繰り返しインビボ投与におけるげっ歯類抗体は、げっ歯類抗体に対してレシピエントが免疫応答（いわゆるＨＡＭＡ（ヒト抗マウス抗体）応答）を引き起こす。ＨＡＭＡ応答は、反復投与が必要な場合、医薬品の有効性を制限し得る。抗体の免疫原性を、ポリエチレングリコールなどの親水性ポリマーでの抗体の化学修飾またはよりヒトに類似した抗体結合構造を作製するための遺伝子操作方法によって減少させることができる。例えば、ＣＥＡに結合するげっ歯類抗体の可変ドメインの遺伝子配列をヒト骨髄腫タンパク質の可変ドメインと置換し、それにより、組換えキメラ抗体を産生することができる。これらの手順は、欧州特許第１９４２７６号、欧州特許第０１２０６９４号、欧州特許第０１２５０２３号、欧州特許第０１７１４９６号、欧州特許第０１７３４９４号、およびＷＯ８６／０１５３３号に詳述されている。あるいは、げっ歯類抗体のＣＤＲの遺伝子配列を単離または合成し、相同なヒト抗体遺伝子の対応する配列領域と置換して、元のげっ歯類抗体の特異性を有するヒト抗体を産生することができる。これらの手順は、欧州特許第０２３９４０号、ＷＯ９０／０７８６１号、およびＷＯ９１／０９９６７号に記載されている。あるいは、げっ歯類抗体の可変ドメインの多数の表面残基を、相同なヒト抗体上に通常見出される残基に変化させて、残基の表面「ベニア」を有するげっ歯類抗体を作製することができ、それにより、ヒトの体内によって自己として認識される。このアプローチは、Ｐａｄｌａｎら（１９９１）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８，４８９によって証明されている。
【０１９７】
ＣＤＲグラフティングは、マウス重鎖および軽鎖の可変Ｉｇドメイン由来の６つのＣＤＲの１つまたは複数をヒト可変Ｉｇドメインの適切な４つのフレームワーク領域に導入する工程を含む。この技術（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．，ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２，３２３（１９８８））は、主に抗原と接触するＣＤＲループを支持する足場として保存フレームワーク領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）を使用する。しかし、ＣＤＲグラフティングの欠点は、フレームワーク領域のアミノ酸配列が抗原結合に寄与し、ＣＤＲループのアミノ酸が２つのＩｇ可変領域の会合に影響を及ぼし得るので、元のマウス抗体よりも結合親和性が実質的に低いヒト化抗体を生じ得ることである。ヒト化モノクローナル抗体の親和性を維持するために、ＣＤＲグラフティング技術を、元のマウス抗体のフレームワーク領域と最も密接に類似するヒトフレームワーク領域の選択および抗原結合部位のコンピュータモデリングによって支援されたフレームワークまたはＣＤＲ内の１つのアミノ酸の部位特異的変異誘発によって改良することができる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．，ら（１９９４），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，２９６８−２９７６）。
【０１９８】
１つの抗体のヒト化方法は、非ヒト重鎖および軽鎖配列をヒト重鎖および軽鎖配列と整列させる工程と、このようなアラインメントに基づいて非ヒトフレームワークをヒトフレームワークと置換する工程と、ヒト化配列の高次構造を予想するために分子モデリングを行う工程と、親抗体の高次構造と比較する工程とを含む。この過程の後に、ヒト化配列モデルの予想される高次構造が親非ヒト抗体の非ヒトＣＤＲの高次構造に極めて近似するまでＣＤＲの構造を妨げるＣＤＲ領域中の残基を繰り返し逆変異させる。このよなヒト化抗体を、例えば、アシュウェル受容体を介した取り込みおよびクリアランスを容易にするためにさらに誘導体化することができる（例えば、米国特許第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号（これら特許は本明細書中で参考により援用される）を参照のこと）。
【０１９９】
合理的設計によるマウスモノクローナル抗体の多数のヒト化が報告されている（例えば、２００２年７月１１日公開の２００２００９１２４０号、ＷＯ９２／１１０１８号、および米国特許第５，６９３，７６２号、米国特許第５，７６６，８６６号を参照のこと）。
【０２００】
アミノ酸配列の変異型
Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９）に記載のように、変異誘発に好ましい位置に存在する抗体の一定の残基または領域の有用な同定方法は、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。ここに、標的残基の残基または基（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕなどの荷電残基）を同定し、アミノ酸の抗原との相互作用に影響を及ぼすために中性または負電荷のアミノ酸（最も好ましくは、アラニンまたはポリアラニン）に置換する。次いで、置換に対する機能的感受性が証明されたアミノ酸位置を、置換部位でのさらなるまたは他の変異型の導入によってさらに精巧にする。したがって、アミノ酸配列変異型の導入部位を予め決定するが、変異の性質自体は予め決定する必要はない。例えば、所与の部位での変異の能力を分析するために、標的コドンまたは領域でａｌａスキャニングまたはランダム変異誘発を行い、発現した抗体変異型を所望の活性についてスクリーニングする。
【０２０１】
アミノ酸配列の挿入は、１つの残基から１００個またはそれを超える残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノおよび／またはカルボキシル末端融合ならびに１つまたは複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体またはエピトープタグまたはサルベージ受容体エピトープに融合した抗体（抗体フラグメントが含まれる）が含まれる。抗体分子の他の挿入変異型には、例えば、Ｎ末端またはＣ末端での抗体の血清半減期が増加するポリペプチドへの融合が含まれる。
【０２０２】
用語「エピトープタグ化」は、エピトープタグに融合した抗体をいう。エピトープタグポリペプチドは、抗体を作製することができるエピトープを得るのに十分であるが、抗体の活性を妨害しないように十分に短い残基を有する。エピトープタグは、好ましくは、エピトープに対する抗体が他のエピトープと実質的に交差反応しないように十分に固有である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６個のアミノ酸残基、通常、約８〜５０個のアミノ酸残基（好ましくは、約９〜３０９個の残基）を有する。例には、ｆｌｕ  ＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５（Ｆｉｅｌｄら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：２１５９−２１６５（１９８８））、ｃ−ｍｙｃタグおよびこれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７、および９Ｅ１０抗体（Ｅｖａｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５（１２）：３６１０−３６１６（１９８５））、および単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体（Ｐａｂｏｒｓｋｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ３（６）：５４７−５５３（１９９０））が含まれる。他の例示的なタグは、ニッケルキレート化を使用して標識した化合物を単離可能な一般に６つのヒスチジン残基の周囲のポリヒスチジン配列である。当該分野で周知であり、且つ日常的に使用されている他の標識およびタグ（ＦＬＡＧ（登録商標）タグ（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）が本発明に含まれる。
【０２０３】
本明細書中で使用される、用語「サルベージ受容体結合エピトープ」は、インビボでのＩｇＧ分子の血清半減期の増加を担うＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープをいう。
【０２０４】
別の型の変異型は、アミノ酸置換変異型である。これらの変異型は、取り出された抗体分子中に少なくとも１つのアミノ酸残基およびその場所に挿入された異なる残基を有する。任意の超可変領域、ＣＤＲ領域、またはフレームワーク領域内の置換変異誘発を意図する。保存的置換を表１に示す。ほとんどの保存的置換は、「好ましい置換」の見出し下に見出される。このような置換によって生物活性が全く変化しない場合、表１で「模範的置換」と命名しているか、アミノ酸クラスに関して以下にさらに示すより実質的な変化を導入し、産物をスクリーニングすることができる。
【０２０５】
【化２１】
2009502952.tif 000018
抗体の生物学的性質の実質的な改変を、（ａ）例えば、シートまたはヘリックス高次構造としての置換領域中のポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位の分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩の維持に及ぼすその影響が有意に異なる置換の選択によって行う。天然に存在する残基を、一般的な側鎖の性質に基づいて以下の群に分類する。
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｉｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【０２０６】
保存的置換は、アミノ酸のそのクラスの別のメンバーとの置換を含む。非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーの別のクラスのメンバーとの置換を含む。
【０２０７】
モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ヒト操作（商標）抗体、または変異抗体の適切な高次構造の維持に関与しない任意のシステイン残基を、一般に、セリンと置換して、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を防止することもできる。逆に、システイン結合を抗体に付加して、その安定性を改善することができる（特に、抗体がＦｖフラグメントなどの抗体フラグメントである場合）。
【０２０８】
親和性変異は、親抗体のＣＤＲ内に置換を有する抗体変異型の調製およびスクリーニングならびに、親抗体と比較して結合親和性などの生物学的性質が改良された変異体の選択を含む。このような置換変異型の従来の生成方法は、ファージディスプレイを使用した親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）である。簡潔に述べれば、超可変領域部位（例えば、６〜７部位）を変異させて、各部位に全ての可能なアミノ置換を生成する。このようにして生成された抗体変異型は、各粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物として線状ファージ粒子から１価様式で表示される。次いで、ファージディスプレイされた変異型を、その生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。
【０２０９】
アラニンスキャニング変異誘発を実施して、抗原結合に有意に寄与する超可変領域の残基を同定することができる。あるいは、またはさらに、抗体と抗原との間の接触点を同定するために、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析することが有利であり得る。このような接触残基および隣接残基は、本明細書中に詳述された技術による置換の候補である。一旦このような変異型が生成されると、変異型のパネルを、本明細書中に記載のスクリーニングに供し、１つまたは複数の関連アッセイにおいて優れた性質を有する抗体をさらなる開発のために選択することができる。
【０２１０】
親抗体と比較して改変されたグリコシル化パターン（例えば、抗体中に見出される１つまたは複数の炭水化物部分の欠失および／または抗体中に存在しない１つまたは複数のグリコシル化部位の付加）を有する抗体変異型を産生することもできる。
【０２１１】
抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合またはＯ結合である。Ｎ結合は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付着をいう。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的付着のための認識配列である。ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在により、潜在的なグリコシル化部位が作製される。したがって、Ｎ結合グリコシル化部位を、これらのトリペプチド配列を含むようなアミノ酸配列の変化によって抗体に付加することができる。Ｏ結合グリコシル化は、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つのヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはトレオニンへの付着をいうが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンも使用することができる。元の抗体の配列への１つまたは複数のセリンまたはトレオニン残基の挿入または置換によって、Ｏ結合グリコシル化部位を抗体に付加することができる。例として、図４Ａの４１〜４３位（ＮＧＳ）にＲＸ１のアミノ酸を保持することができる。あるいは、アミノ酸４１および４２（ＮＧ）のみを保持することができる。
【０２１２】
通常、ヒト操作（商標）抗体のアミノ酸変異型は、元のヒト操作（商標）抗体の重鎖または軽鎖のいずれか（例えば、図１９Ｂ〜２２Ｂのいずれかなど）のアミノ酸配列と少なくとも６０％のアミノ酸配列が同一、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％，および１００％が含まれる）のアミノ酸配列が同一のアミノ酸配列を有する。この配列に関する同一性または相同性を、本明細書中で、必要に応じて、最大配列同一率を達成するための、配列同一性の一部としていかなる保存的置換（表１に定義）も考慮しない配列の整列およびギャップの導入後に、ヒト操作（商標）残基と同一の候補配列中のアミノ酸残基の比率と定義する。抗体配列のＮ末端、Ｃ末端が存在しないこと、または内部伸長、欠失、または挿入は、配列の同一性または相同性に影響を及ぼすと解釈されるべきである。したがって、配列同一性を、２つのポリペプチドのアミノ酸位置の類似性を比較するために一般的に使用される標準的方法によって決定することができる。ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡなどのコンピュータプログラムを使用して、２つのポリペプチドを、（一方または両方の配列の全長または一方または両方の配列の予め決定した部分に沿って）その各アミノ酸が至適に適合するように整列させる。プログラムはデフォルトオープニングペナルティおよびデフォルトギャップペナルティを提供し、ＰＡＭ  ２５０（標準的なスコアリング行列、Ｄａｙｈｏｆｆら、ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐ．３（１９７８））を、コンピュータプログラムと組み合わせて使用することができる。例えば、次いで、同一率を、以下のように計算することができる：総同一適合数×１００／適合スパン内のより長い配列の長さおよび２つの配列を整列させるためのより長い配列に導入されたギャップ数の和。
【０２１３】
抗体の他の修飾を意図する。例えば、癌治療において抗体の有効性を増強するためにエフェクター効果に関して本発明の抗体を修飾することが望ましいかもしれない。例えば、システイン残基をＦｃ領域に中に導入し、それにより、この領域中に鎖間ジスルフィド結合を形成させることができる。このようにして生成されたホモ二量体抗体は、内在化能力が改良され、そして／または補体媒介性細胞死滅および抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）が増加し得る。Ｃａｒｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５（１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ，Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照のこと。Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載のように、生物活性が増強されたホモ二量体抗体を、ヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製することもできる。あるいは、二重Ｆｃ領域を有する抗体を操作し、それにより、補体溶解およびＡＤＣＣ能を増強することができる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３：２１９−２３０（１９８９）を参照のこと。さらに、ＣＤＲ内の配列が抗体をＭＨＣクラスＩＩに結合させて望ましくないヘルパーＴ細胞応答を誘発し得ることが示されている。保存的置換により、抗体の結合能力が保持されるにもかかわらず、その望ましくないＴ細胞応答を誘発する能力を喪失させることができる。マウス可変領域がヒトγ１、γ２、γ３、およびγ４定常領域と連結したキメラ抗体を記載したＳｔｅｐｌｅｗｓｋｉら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９８８；８５（１３）：４８５２−６（その全体が本明細書中で参考により援用される）も参照のこと。
【０２１４】
本発明の一定の実施形態では、例えば、組織腫瘍の浸透を増加させるために、インタクトな抗体よりもむしろ抗体フラグメントを使用することが望ましいかもしれない。この場合、その血清半減期を増加させるために抗体フラグメントを修飾することが望ましいかもしれない（例えば、半減期を増加させるためのＰＥＧまたは他の水溶性ポリマー（多糖ポリマーが含まれる）などの分子の抗体フラグメントへの付加）。例えば、抗体フラグメントへのサルベージ受容体結合エピトープの組み込み（例えば、抗体フラグメント中の適切な領域の変異またはエピトープのペプチドタグへの組み込みおよびその後のＤＮＡ合成またはペプチド合成によるいずれかの末端または中ほどでの抗体フラグメントの融合）によってこれを行うことができる（例えば、ＷＯ９６／３２４７８号を参照のこと）。
【０２１５】
サルベージ受容体結合エピトープは、好ましくは、Ｆｃドメインの１つまたは２つのループ由来の任意の１つまたは複数のアミノ酸残基を抗体フラグメントの類似の位置に移入する領域を構成する。さらにより好ましくは、Ｆｃドメインの１つまたは２つのループ由来の３つまたはそれを超える残基を移入する。さらにより好ましくは、（例えば、ＩｇＧの）Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインからエピトープを採取し、抗体のＣＨ１、ＣＨ３、またはＶＨ領域または１つを超えるこのような領域に移入する。あるいは、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインからエピトープを採取し、抗体のＣＬ領域、ＶＬ領域、またはその両方に移入する。Ｆｃ変異型およびそのサルベージ受容体との相互作用を記載している国際出願ＷＯ９７／３４６３１号およびＷＯ９６／３２４７８号も参照のこと。
【０２１６】
したがって、本発明の抗体は、ヒトＦｃ部分、ヒトコンセンサスＦｃ部分、またはＦｃサルベージ受容体と相互作用する能力を保持するその変異型（ジスルフィド結合に関与するシステインが修飾または除去された変異型および／またはＮ末端にｍｅｔが付加され、そして／またはＮ末端２０アミノ酸の１つまたは複数が除去された変異型、および／または補体と相互作用する領域（Ｃ１ｑ結合部位）が除去された変異型、および／またはＡＤＣＣ部位が除去された変異型が含まれる）を含み得る（例えば、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（５）：６３３−９（１９９２）を参照のこと）。
【０２１７】
以前の研究により、主にＩｇＧ残基２３３〜２３９から構成されるより下側のヒンジ領域に対するＦｃＲについてのヒトおよびマウスＩｇＧ上の結合部位がマッピングされた。他の研究では、さらに広いセグメント（例えば、ヒトＦｃ受容体ＩのＧｌｙ３１６〜Ｌｙｓ３３８、ヒトＦｃ受容体ＩＩＩのＬｙｓ２７４〜Ａｒｇ３０１およびＴｙｒ４０７〜Ａｒｇ４１６）が提案されるか、下側のヒンジの外側にいくつかの特異的残基（例えば、マウスＦｃ受容体と相互作用するマウスＩｇＧ２ｂのＡｓｎ２９７およびＧｌｕ３１８）が見出された。ヒトＦｃ受容体ＩＩＩＡを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントの３．２Å結晶構造の報告は、Ｆｃ受容体ＩＩＩＡへの結合に関与するＩｇＧ１残基Ｌｅｕ２３４〜Ｓｅｒ２３９、Ａｓｐ２６５〜Ｇｌｕ２６９、Ａｓｎ２９７〜Ｔｈｒ２９９、およびＡｌａ３２７〜Ｉｌｅ３３２を描写していた。結晶構造に基づいて、下側のヒンジ（Ｌｅｕ２３４〜Ｇｌｙ２３７）、ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインループＦＧ（残基  ３２６〜３３０）、およびＢＣ（残基２６５〜２７１）がＦｃ受容体ＩＩＡへの結合で役割を果たし得ることが示唆されている。Ｓｈｉｅｌｄｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（９）：６５９１−６６０４（２００１）（その全体が本明細書中で参考により援用される）を参照のこと。Ｆｃ受容体結合部位内の残基の変異により、エフェクター機能が変化し得る（ＡＤＣＣもしくはＣＤＣ活性の変化または半減期の変化など）。上記のように、潜在的変異として、１つまたは複数の残基の挿入、欠失、または置換（アラニンとの置換、保存的置換、非保存的置換、または異なるＩｇＧサブクラス由来の同一の位置での対応するアミノ酸残基との置換（例えば、ＩｇＧ１残基のその位置の対応するＩｇＧ２残基との置換）が含まれる）が挙げられる。
【０２１８】
Ｓｈｉｅｌｄｓらは、全ヒトＦｃ受容体への結合に関与するＩｇＧ１残基がヒンジに近接するＣＨ２ドメイン中に存在すると報告しており、その位置を以下のように２つのカテゴリーに分類している：１）全ＦｃＲと直接相互作用し得る残基には、Ｌｅｕ２３４〜Ｐｒｏ２３８、Ａｌａ３２７、およびＰｒｏ３２９（および場合によってＡｓｐ２６５）が含まれる。２）炭水化物の性質または位置に影響を及ぼす位置には、Ａｓｐ２６５およびＡｓｎ２９７が含まれる。Ｆｃ受容体ＩＩへの結合に影響を及ぼすさらなるＩｇＧ１残基は以下である：（最も大きな影響）Ａｒｇ２５５、Ｔｈｒ２５６、Ｇｌｕ２５８、Ｓｅｒ２６７、Ａｓｐ２７０、Ｇｌｕ２７２、Ａｓｐ２８０、Ａｒｇ２９２、Ｓｅｒ２９８、および（より低い影響）Ｈｉｓ２６８、Ａｓｎ２７６、Ｈｉｓ２８５、Ａｓｎ２８６、Ｌｙｓ２９０、Ｇｌｎ２９５、Ａｒｇ３０１、Ｔｈｒ３０７、Ｌｅｕ３０９、Ａｓｎ３１５、Ｌｙｓ３２２、Ｌｙｓ３２６、Ｐｒｏ３３１、Ｓｅｒ３３７、Ａｌａ３３９、Ａｌａ３７８、およびＬｙｓ４１４。Ａ３２７Ｑ、Ａ３２７Ｓ、Ｐ３２９Ａ、Ｄ２６５Ａ、およびＤ２７０Ａによって結合が減少した。全ＦｃＲについて上記で同定された残基に加えて、Ｆｃ受容体ＩＩＩＡへの結合を４０％またはそれを超えて減少させたさらなるＩｇＧ１残基は以下である：Ｓｅｒ２３９、Ｓｅｒ２６７（Ｇｌｙのみ）、Ｈｉｓ２６８、Ｇｌｕ２９３、Ｇｌｎ２９５、Ｔｙｒ２９６、Ａｒｇ３０１、Ｖａｌ３０３、Ｌｙｓ３３８、およびＡｓｐ３７６。ＦｃＲＩＩＩＡへの結合が改良された変異型には、Ｔ２５６Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、およびＡ３３９Ｔが含まれる。Ｌｙｓ４１４は、ＦｃＲＩＩＡおよびＦｃＲＩＬＢの結合を４０％減少させ、Ａｒｇ４１６はＦｃＲＩＬＡおよびＦｃＲＩＩＩＡの結合を３０％減少させ、Ｇｌｎ４１９は、ＦｃＲＩＩＡへの結合を３０％おおよびＦｃＲＩＩＢへの結合を４０％減少させ、Ｌｙｓ３６０はＦｃＲＩＩＩＡへの結合を２３％改善した。Ｐｒｅｓｔａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．（２００１）３０，４８７−４９０も参照のこと。
【０２１９】
例えば、米国特許第６，１９４，５５１号（その全体が本明細書中で参考として援用される）は、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のアミノ酸３２９、３３１、または３２２位（Ｋａｂａｔナンバリングを使用）に変異を有するエフェクター機能が変化した変異型を記載しており、そのいくつかは、Ｃ１ｑ結合またはＣＤＣ活性が減少していた。別の例として、米国特許第６，７３７，０５６号（その全体が本明細書中で参考として援用される）は、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のアミノ酸２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８、または４３９位（Ｋａｂａｔナンバリングを使用）に変異を含むエフェクターまたはＦｃ−γ受容体結合が変化した変異型を記載しており、そのいくつかは、ＡＤＣＣまたはＣＤＣ活性の減少に関連する受容体結合プロフィールを示す。これらのうち、アミノ酸２３８、２６５、２６９、２７０、３２７、または３２９位の変異がＦｃＲＩへの結合を減少させることが述べられており、アミノ酸２３８、２６５、２６９、２７０、２９２、２９４、２９５、２９８、３０３、３２４、３２７、３２９、３３３、３３５、３３８、３７３、３７６、４１４、４１６、４１９、４３５、４３８、または４３９位の変異がＦｃＲＩＩへの結合を減少させることが述べられており、アミノ酸２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２６５、２６８、２６９、２７０、２７２、２７８、２８９、２９３、２９４、２９５、２９６、３０１、３０３、３２２、３２７、３２９、３３８、３４０、３７３、３７６、３８２、３８８、３８９、４１６、４３４、４３５、または４３７位の変異がＦｃＲＩＩＩへの結合を減少させることが述べられている。
【０２２０】
米国特許第５，６２４，８２１号（その全体が本明細書中で参考として援用される）は、マウス抗体のＣ１ｑ結合活性を重鎖のアミノ酸残基３１８、３２０、または３２２の変異によって変化させることができ、残基２９７（Ａｓｎ）の置換によって溶解活性が除去されると報告している。
【０２２１】
米国特許出願公開第２００４０１３２１０１号（その全体が本明細書中で参考として援用される）は、アミノ酸２４０、２４４、２４５、２４７、２６２、２６３、２６６、２９９、３１３、３２５、３２８、もしくは３３２位（Ｋａｂａｔナンバリングを使用）または２３４、２３５、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６９、２９６、２９７、２９８、２９９、３１３、３２５、３２７、３２８、３２９、３３０、もしくは３３２位（Ｋａｂａｔナンバリングを使用）が変異した変異型を記載しており、２３４、２３５、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６９、２９６、２９７、２９８、２９９、３１３、３２５、３２７、３２８、３２９、３３０、または３３２位での変異により、ＡＤＣＣ活性が減少するかＦｃγ受容体への結合が減少し得る。
【０２２２】
Ｃｈａｐｐｅｌら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９１；８８（２０）：９０３６−４０（その全体が本明細書中で参考として援用される）は、ＩｇＧ１の細胞親和活性がその重鎖ＣＨ２ドメインの固有の特性であると報告している。ＩｇＧ１のアミノ酸残基２３４〜２３７のいずれの１つの点変異により、その活性が有意に低下するか消失した。ＩｇＧ２およびＩｇＧ４への全ＩｇＧ１残基２３４〜２３７（ＬＬＧＧ）の置換には、全結合活性を回復させる必要があった。全ＥＬＬＧＧＰ配列（残基２３３〜２３８）を含むＩｇＧ２抗体は、野生型ＩｇＧ１より活性が高いことが認められた。
【０２２３】
Ｉｓａａｃｓら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８；１６１（８）：３８６２−９（その全体が本明細書中で参考として援用される）は、ＦｃγＲ結合に極めて重要なモチーフ内の変異（グルタミン２３３からプロリンへの変異、ロイシン／フェニルアラニン２３４からバリンへの変異、およびロイシン２３５からアラニンへの変異）によって標的細胞の枯渇が完全に防止されると報告している。グルタミン酸３１８からアラニンへの変異により、マウスＩｇＧ２ｂのエフェクター機能が消失し、ヒトＩｇＧ４の効力も減少した。
【０２２４】
Ａｒｍｏｕｒら、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；４０（９）：５８５−９３（その全体が本明細書中で参考として援用される）は、野生型ＩｇＧ１よりも少なくとも１／１０の効率で活性化受容体（ＦｃγＲＩＩａ）と相互作用するが、その阻害受容体（ＦｃγＲＩＩｂ）への結合は１／４しか減少しないＩｇＧ１変異型を同定した。アミノ酸２３３〜２３６の残基および／またはアミノ酸３２７、３３０、および３３１位を変異した。ＷＯ９９／５８５７２号（その全体が本明細書中で参考として援用される）も参照のこと。
【０２２５】
Ｘｕら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９４；２６９（５）：３４６９−７４（その全体が本明細書中で参考として援用される）は、ＩｇＧ１  Ｐｒｏ３３１ｌのＳｅｒへの変異によってＣ１ｑ結合が減少し、溶解活性が実質的に消失することを示している。対照的に、ＩｇＧ４中のＳｅｒ３３１のＰｒｏへの置換により、ＩｇＧ４  Ｐｒｏ３３１変異型に部分的溶解活性（４０％）が付与された。
【０２２６】
Ｓｃｈｕｕｒｍａｎら、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；３８（１）：１−８（その全体が本明細書中で参考として援用される）は、重鎖間結合形成に関与するヒンジシステインの１つ（Ｃｙｓ２２６）のセリンへの変異によってより安定な重鎖間結合が得られることを報告している。ＩｇＧ４ヒンジ配列Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−ＣｙｓのＩｇＧ１ヒンジ配列Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓへの変異はまた、重鎖間の共有結合性相互作用を顕著に安定化する。
【０２２７】
Ａｎｇａｌら、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３；３０（１）：１０５−８（その全体が本明細書中で参考として援用される）は、ＩｇＧ４中のアミノ酸２４１位のセリンのプロリン（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２中のその位置で見出される）への変異によって均一な抗体が産生され、元のキメラＩｇＧ４と比較して半減期が延長し、組織分布が改善されることを報告している。
【０２２８】
ヒトおよびヒト操作（商標）抗体
ヒト操作（商標）
抗体可変ドメインのヒト操作（商標）は、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ（例えば、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａらの米国特許第５，７６６，８８６号、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７：８０５−８１４（１９９４）を参照のこと）によって、抗体分子の結合活性を維持しながら免疫原性を減少させる方法として記載されている。この方法によれば、各可変領域のアミノ酸に置換リスクを割り当てている。アミノ酸置換は、以下の３つのリスクカテゴリーの１つによって区別される：（１）低リスクの変化は、免疫原性が減少する可能性が最も高く、抗原結合が破壊される機会が最も低い変化である；（２）中程度のリスクの変化は、免疫原性がさらに減少するが、抗原結合またはタンパク質折り畳みに影響を及ぼす機会がより多い変化である；（３）高リスクの残基は、抗体構造の結合または維持に重要であり、抗原結合またはタンパク質折り畳みが影響を受けるリスクが最も高い残基である。プロリンの三次元構造における役割のために、プロリンの修飾は、この位置が典型的には低リスクの位置である場合でさえも、一般に、少なくとも中程度のリスクの変化であると見なされる。
【０２２９】
げっ歯類抗体の軽鎖および重鎖の可変領域を以下のようにヒト操作（商標）して、抗原結合またはタンパク質折り畳みのいずれかに悪影響を及ぼす可能性が低いが、ヒト環境において免疫原性を減少させる可能性が高いと判断される位置のヒトアミノ酸を置換する。「低リスク」の位置に存在し、且つ本方法の修飾の候補であるアミノ酸残基を、げっ歯類可変領域のアミノ酸配列とヒト可変領域の配列との整列によって同定する。任意のヒト可変領域（各ＶＨもしくはＶＬ配列、ヒトコンセンサスＶＨもしくはＶＬ配列、または個別またはコンセンサスなヒト生殖系列配列が含まれる）を使用することができる。多数の低リスク位置または全ての低リスク位置のアミノ酸残基を変化させることができる。例えば、整列されたマウスおよびヒトのアミノ酸残基が異なる各低リスク位置で、げっ歯類残基をヒト残基に置換するアミノ酸修飾を導入する。あるいは、全ての低リスク位置および多数の中程度のリスクの位置のアミノ酸残基を変化させることができる。理想的には、免疫原性を最小にするために、全ての低リスクおよび中程度のリスクの位置を、げっ歯類配列からヒト配列に変化させる。
【０２３０】
修飾重鎖および／または軽鎖可変領域を含む合成遺伝子を構築し、ヒトγ重鎖および／またはκ軽鎖の定常領域に連結する。任意のヒト重鎖および軽鎖の定常領域を、ヒト操作（商標）抗体可変領域（ＩｇＡ（任意のサブクラス、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２など）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（任意のサブクラス、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４など）、またはＩｇＭが含まれる）と組み合わせて使用することができる。ヒト重鎖および軽鎖の遺伝子を哺乳動物細胞などの宿主細胞に導入し、得られた組換え免疫グロブリン産物を特徴づける。
【０２３１】
トランスジェニック動物由来のヒト抗体
内因性免疫グロブリンが産生されず、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むように操作されたトランスジェニック動物を使用して、Ｍ−ＣＳＦに対するヒト抗体産生することもできる。例えば、ＷＯ９８／２４８９３号は、内因性重鎖および軽鎖の遺伝子座の不活化のために動物が機能的な内因性免疫グロブリンを産生しないヒトＩｇ遺伝子座を有するトランスジェニック動物を開示する。ＷＯ９１／７４１号はまた、抗体が霊長類定常領域および／または可変領域を有し、内因性免疫グロブリンコード遺伝子座が置換または不活化された、免疫原に対する免疫応答を増加させることができるトランスジェニック非霊長類哺乳動物宿主を開示している。ＷＯ９６／３０４９８号は、定常領域または可変領域の全部または一部を置換して修飾抗体分子を形成するなどのために哺乳動物中の免疫グロブリン遺伝子座を修飾するためのＣｒｅ／Ｌｏｘ系の使用を開示している。ＷＯ９４／０２６０２号は、不活化内因性Ｉｇ遺伝子座および機能的ヒトＩｇ遺伝子座を有する非ヒト哺乳動物宿主を開示している。米国特許第５，９３９，５９８は、マウスが内因性重鎖を欠き、１つまたは複数の異種定常領域を含む外因性免疫グロブリン遺伝子座を発現するトランスジェニックマウスの作製方法を開示している。
【０２３２】
上記のトランスジェニック動物を使用して、選択された抗原分子に対する免疫応答を生じさせ、抗体産生細胞を動物から取り出し、これを使用してヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを産生することができる。免疫化プロトコールおよびアジュバントなどは当該分野で公知であり、例えば、ＷＯ９６／３３７３５号に記載のトランスジェニックマウスの免疫化で使用する。この公報は、種々の抗原分子（ＩＬ６、ＩＬ８、ＴＮＦａ、ヒトＣＤ４、Ｌセレクチン、ｇｐ３９、および破傷風毒素が含まれる）に対するモノクローナル抗体を開示している。モノクローナル抗体を、対応するタンパク質の生物活性または生理学的効果を阻害または中和する能力について試験することができる。ＷＯ９６／３３７３５号は、ＩＬ−８で免疫化したトランスジェニックマウスの免疫細胞由来のＩＬ−８に対するモノクローナル抗体が好中球機能を阻害したことを開示している。トランスジェニック動物を免疫化するために使用した抗原に特異性を有するヒトモノクローナル抗体は、ＷＯ９６／３４０９６号および米国特許出願番号２００３０１９４４０４号および米国特許出願番号２００３００３１６６７号にも開示されている。
【０２３３】
Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｒｍら、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｅ，７：３３（１９９３）；および米国特許第５，５９１，６６９号、米国特許第５，５８９，３６９号、米国特許第５，５４５，８０７号、および米国特許出願番号２００２０１９９２１３号も参照のこと。米国特許出願番号２００３００９２１２５号は、所望のエピトープに対する動物の免疫応答を偏らせる（ｂｉａｓ）方法を記載している。インビトロ活性化Ｂ細胞によってヒト抗体を生成することもできる（米国特許第５，５６７，６１０号および同第５，２２９，２７５号を参照のこと）。
【０２３４】
ファージディスプレイテクノロジー由来のヒト抗体
組換え抗体遺伝子のレパートリーの作製テクノロジーの開発および糸状バクテリオファージの表面上へのコードされた抗体フラグメントの表示により、ヒト抗体の直接的作製手段が得られた。ファージテクノロジーによって産生された抗体を、細菌中に抗原結合フラグメント（通常、ＦｖまたはＦａｂフラグメント）として産生し、それにより、エフェクター機能を欠く。エフェクター機能を、以下の２つのストラテジーのうちの１つによって導入することができる。フラグメントを、例えば、哺乳動物細胞中での完全な抗体またはエフェクター機能を誘発することができる第２の結合部位を有する二重特異性抗体フラグメントのいずれかに操作することができる。
【０２３５】
典型的には、抗体のＦｄフラグメント（ＶＨ−ＣＨ１）および軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）を、ＰＣＲによって個別にクローニングし、組み合わせファージディスプレイライブラリーで無作為に組換え、次いで、特定の抗原への結合について選択することができる。Ｆａｂフラグメントをファージ表面上で発現させる（すなわち、これをコードする遺伝子に物理的に連結する）。したがって、抗原結合によるＦａｂの選択により、Ｆａｂコード配列を同時選択し、その後に増幅することができる。数ラウンドの抗原結合および再増幅（パニングと呼ばれる手順）により、抗原に特異的なＦａｂを富化し、最終的に単離する。
【０２３６】
１９９４年に、「誘導型選択（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる抗体のヒト化アプローチが記載されている。誘導型選択は、マウスモノクローナル抗体のヒト化のためのファージディスプレイ技術の能力（ｐｏｗｅｒ）を使用する（Ｊｅｓｐｅｒｓ，Ｌ．Ｓ．，ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２，８９９−９０３（１９９４）を参照のこと）。これのために、マウスモノクローナル抗体のＦｄフラグメントを、ヒト軽鎖ライブラリーと組み合わせて表示し、次いで、得られたハイブリッドＦａｂライブラリーを、抗原を使用して選択することができる。それにより、マウスＦｄフラグメントが、選択を誘導するためのテンプレートを与える。その後、選択されたヒト軽鎖を、ヒトＦｄフラグメントライブラリーと組み合わせる。得られたライブラリーの選択により、ヒトＦａｂが完全に得られる。
【０２３７】
ファージディスプレイライブラリーからのヒト抗体の誘導のための種々の手順が記載されている（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２２：５８１−５９７（１９９１）；米国特許第５，５６５，３３２号および同第５，５７３，９０５号；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．，ＴＩＢＴＥＣＨ  １２，１７３−１８４（１９９４）を参照のこと）。特に、ファージディスプレイライブラリー由来の抗体のインビトロでの選択および進化は、強力なツールとなりつつある（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｂａｒｂａｓ  ＩＩＩ，Ｃ．Ｆ．，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５７，１９１−２８０（１９９４）；およびＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．，ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２，４３３−４５５（１９９４）；米国特許出願番号２００２０００４２１５号およびＷＯ９２／０１０４７；２０３年１０月９日公開の米国特許出願番号２００３０１９０３１７号および米国特許第６，０５４，２８７号；米国特許第５，８７７，２９３号を参照のこと）。
【０２３８】
Ｗａｔｋｉｎｓ，”Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｈａｇｅ−Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｂｙ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｌｉｆｔ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １７８：１８７−１９３および２００３年３月６日公開の米国特許出願番号２００１２００３００４４７７２号は、キャプチャーリフト（個体支持体上の候補結合分子の免疫化を含む方法）によるファージ発現抗体または他の結合分子のスクリーニング方法を記載されている。
【０２３９】
抗体産物を、本明細書中の「スクリーニング方法」という表題の項に記載の活性または当該分野で公知の任意の適切なアッセイを使用して、本発明の治療方法における活性および安定性をスクリーニングすることができる。
【０２４０】
他の共有結合性修飾
抗体の共有結合性修飾も本発明の範囲内に含まれる。妥当な場合、共有結合性修飾を、抗体の化学合成または酵素的もしくは化学的切断によって作製することができる。抗体の他の共有結合性修飾型を、抗体のターゲティングされたアミノ酸残基と選択された側鎖またはＮ末端もしくはＣ末端残基と反応することができる有機誘導剤との反応によって分子に導入する。
【０２４１】
システイニル残基を、最も一般的には、α−ハロアセテート（および対応するアミン）（クロロ酢酸またはクロロアセトアミドなど）と反応させて、カルボキシル誘導体またはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システイニル残基を、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、リン酸クロロアセチル、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロマーキュリベンゾエート、２−クロロマーキュリ−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によっても誘導する。
【０２４２】
ヒスチジル残基を、ｐＨ５．５〜７．０でのジエチルピロカーボネートとの反応によって誘導する。なぜなら、この薬剤はヒスチジル側鎖に比較的特異性を示すからである。パラブロモフェナシルブロミドも有用である。この反応を、好ましくは、ｐＨ６．０の０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中で行う。
【０２４３】
リジニル残基およびアミノ末端残基を、コハク酸または他の無水カルボン酸と反応させる。これらの薬剤での誘導体化は、リジニル残基の電荷を逆にする効果がある。α−アミノ含有残基の誘導体化のための他の適切な試薬には、メチルピコリニミデートなどのイミドエステル、リン酸ピリドキサール、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオン、および繰りオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応が含まれる。
【０２４４】
アルギニル基を、１つまたはいくつかの従来の試薬（特に、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリン）との反応によって修飾する。アルギニン残基の誘導体化には、グアニジン官能基のｐＫａが高いので、アルカリ条件下で反応を行う必要がある。さらに、これらの試薬は、リジン基およびアルギニンεアミノ基と反応し得る。
【０２４５】
特に興味深いのは、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によるチロシル残基へのスペクトル標識の導入を使用して、チロシル残基の特異的修飾を行うことができる。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾール（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｉｍｉｄｉｚｏｌｅ）およびテトラニトロメタンを使用して、Ｏ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体をそれぞれ形成する。チロシル残基を、１２５Ｉまたは１３１Ｉを使用してヨード化して、放射免疫アッセイで使用するための標識タンパク質を調製する。
【０２４６】
カルボキシル側鎖（アスパルチルまたはグルタミル）を、カルボジイミド（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）（式中、ＲおよびＲ’は異なるアルキル基である）（たとえば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドなど）との反応によって選択的に修飾する。さらに、アスパルチル残基およびグルタミル残基を、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル残基およびグルタミニル残基に変換する。
【０２４７】
グルタミニル残基およびアスパラギニル残基を、頻繁に、対応するグルタミル残基およびアスパルチル残基にそれぞれ脱アミド化する。これらの残基を、中性または塩基性の条件下で脱アミド化する。これらの残基の脱アミド化形態は、本発明の範囲内である。
【０２４８】
他の修飾には、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリル残基またはトレオニル残基の水酸基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６（１９８３））、Ｎ−末端アミンのアセチル化、および任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。
【０２４９】
別の共有結合性修飾は、グリコシドの抗体への化学的または酵素的カップリングを含む。これらの手順は、ＮまたはＯ結合グリコシル化のためのグリコシル化能力を有する宿主細胞中での抗体の酸性が必要でないと言う点で有利である。使用したカップリング様式に依存して、糖を、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）遊離スルフヒドリル基（システインのスルフヒドリル基など）、（ｄ）遊離水酸基（セリンの水酸基など）、（ｅ）芳香族残基（フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンの芳香族基など）、または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合することができる。これらの方法は、１９８７年９月１１日公開のＷＯ８７／０５３３０号およびＡｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｒｉｓｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６（１９８１）に記載されている。
【０２５０】
抗体上に存在する任意のカルボン酸部分の除去を、化学的または酵素的に行うことができる。化学的脱グリコシル化には、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または等価な化合物への抗体の曝露が必要である。この処理により、架橋糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）以外のほとんどまたは全ての糖が切断される一方で、抗体はインタクトなままである。化学的脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ，ら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２（１９８７）およびＥｄｇｅら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１８：１３１（１９８１）に記載されている。Ｔｈｏｔａｋｕｒａら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０（１９８７）に記載のように、抗体上の炭水化物部分の酵素的切断を、種々のエンドグリコシダーゼおよびエクソグリコシダーゼの使用によって行うことができる。
【０２５１】
抗体の別の共有結合性修飾型は、種々の非タンパク質ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール、ポリオキシアルキレン、または多糖ポリマー（デキストランなど））の１つへの抗体の連結を含む。このような方法は当該分野で公知である。例えば、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号、同第４，１７９，３３７号、同第４，７６６，１０６号、同第４，１７９，３３７号、同第４，４９５，２８５号、同第４，６０９，５４６号、または欧州特許第３１５４５６号を参照のこと。
【０２５２】
遺伝子療法
適切な細胞への治療抗体の送達を、当該分野で公知の任意の適切なアプローチの使用によるエキソビボ、インサイチュ、またはインビボでの遺伝子療法（物理的ＤＮＡ移入法（例えば、リポソームまたは化学的処理）の使用またはウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、またはレトロウイルス）の使用が含まれる）によって行うことができる。例えば、インビボ療法のために、所望の抗体をコードする核酸を、単独またはベクター、リポソーム、または沈殿物を被験体に直接注射することができ、いくつかの実施形態では、抗体化合物の発現が望まれる部位に注射することができる。エキソビボ治療のために、被験体の細胞を取り出し、これらの細胞に核酸を導入し、修飾された細胞を被験体に直接戻すか、例えば、多孔質膜内にカプセル化して患者に移植する。例えば、米国特許第４，８９２，５３８号および同第５，２８３，１８７号を参照のこと。生細胞への核酸の導入に利用可能な種々の技術が存在する。技術は、核酸がインビトロで培養細胞に移入されるか、インビボで意図する宿主の細胞に移入するかどうかに応じて変化する。インビトロでの哺乳動物細胞への核酸の移入に適切な技術には、リポソーム、エレクトロポレーション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、およびリン酸カルシウム沈殿の使用が含まれる。核酸のエキソビボ送達のために一般的に使用されるベクターは、レトロウイルスである。
【０２５３】
他のインビボ核酸移入技術には、ウイルスベクター（アデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、またはアデノ随伴ウイルスなど）でのトランスフェクションおよび脂質ベースの系が含まれる。核酸およびトランスフェクション剤を、任意選択的に、微粒子に会合する。例示的なトランスフェクション剤には、リン酸カルシウム共沈または塩化カルシウム供沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、第四級アンモニウム両親媒性物質ＤＯＴＭＡ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬからリポフェクチンとして市販されている（ジオレオイルオキシプロピル）トリメチルアンモニウムブロミド）（Ｆｅｌｇｎｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４，７４１３−７４１７；Ｍａｌｏｎｅら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６  ６０７７−６０８１）、ペンダントトリメチルアンモニウムヘッドを有する親油性グルタミン酸ジエステル（Ｉｔｏら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０２３，１２４−１３２）、カチオン性脂質であるジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ，Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ，Ｐｒｏｍｅｇａ）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミルステルミン（ＤＰＰＥＳ）などの代謝性親脂質（Ｊ．Ｐ．Ｂｅｈｒ（１９８６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２７，５８６１−５８６４；Ｊ．Ｐ．Ｂｅｈｒら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，６９８２−６９８６）、代謝性第四級アンモニウム塩（ＤＯＴＢ、Ｎ−（１−［２，３−ジオレオイルオキシ］プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート（ＤＯＴＡＰ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ジオレオイルエステル、ＣｈｏＴＢ、ＣｈｏＳＣ、ＤＯＳＣ）（Ｌｅｖｅｎｔｉｓら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｉｎｔｅｒ．２２，２３５−２４１）、３β［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）／３β［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロールＤＣ−Ｃｈｏｌの１：１混合物（Ｇａｏら、（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０６５，８−１４）、スペルミン、スペルミジン、リポポリアミン（Ｂｅｈｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ，１９９４，５：３８２−３８９）、親油性ポリリジン（ＬＰＬＬ）（Ｚｈｏｕら、（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ９３９，８−１８）、過剰量のホスファチジルコリン／コレステロールを含む［［（１，１，３，３−テトラメチルブチル）クレ−ゾキシ］エトキシ］エチル］ジメチルベンジルアンモニウムヒドロキシド（ＤＥＢＤＡヒドロキシド）（Ｂａｌｌａｓら、（１９８８）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ９３９，８−１８）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）／ＤＯＰＥ混合物（Ｐｉｎｎａｄｕｗａｇｅら（１９８９）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ９８５，３３−３７）、グルタミン酸のＤＯＰＥ、ＣＴＡＢ、ＤＥＢＤＡ、ジドデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、およびステアリルアミンとの親油性ジエステル（ＴＭＡＧ）のホスファチジルエタノールアミンとの混合物（Ｒｏｓｅら、（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  １０，５２０−５２５）、ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ（ＴｒａｎｓｆｅｃｔＡＣＥ，ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）、およびオリゴガラクトース含有脂質が含まれる。導入効率を増加させる例示的なトランスフェクションエンハンサーには、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリブレン、リソソーム分解性ペプチド（Ｏｈｍｏｒｉ  Ｎ  Ｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｊｕｎ．２７，１９９７；２３５（３）：７２６−９）、コンドロイタン（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔａｎ）ベースのプロテオグリカン、硫酸化プロテオグリカン、ポリエチレンイミン、ポリリジン（Ｐｏｌｌａｒｄ  Ｈら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，１９９８  ２７３（１３）：７５０７−１１）、インテグリン結合タンパク質ＣＹＧＧＲＧＤＴＰ、直鎖デキストランノナサッカリド、グリセロール、オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオシド間結合でつながれたコレステリル基（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．１９８９  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：（１７）：６５５３−６）、リソホスファチド、リソホスファチジルコリン、リソホスファチジルエタノールアミン、および１−オレオイルリソホスファチジルコリンが含まれる。
【０２５４】
場合によっては、標的細胞に核酸含有ベクターを向かわせる薬剤と共に核酸を送達することが望ましいかもしれない。このような「ターゲティング」分子には、標的細胞上の細胞表面膜タンパク質または標的細胞上の受容体のリガンドに特異的な抗体が含まれる。リポソームを使用する場合、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質を、ターゲティングのために使用し、そして／または取り込みを容易にすることができる。このようなタンパク質の例には、特定の細胞型に向性を示すカプシドタンパク質およびそのフラグメント、循環で内在化されるタンパク質の抗体、および細胞内局在をターゲティングして細胞内半減期を増強するタンパク質が含まれる。他の実施形態では、受容体媒介性エンドサイトーシスを使用することができる。このような方法は、例えば、Ｗｕら、１９８７またはＷａｇｎｅｒら、１９９０に記載されている。現在公知の遺伝子作製プロトコールおよび遺伝子治療プロトコールの概説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  １９９２を参照のこと。ＷＯ９３／２５６７３号およびその引例も参照のこと。遺伝子治療テクノロジーのさらなる概説については、Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１２７５−１２８１（１９８９）；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｔｏ  ｖｏｌ．３９２，ｎｏ  ６６７９，ｐｐ．２５−３０（１９９８）；Ｖｅｒｍａ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ：６８−８４（１９９０）；およびＭｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，３５７：４５５４６０（１９９２）を参照のこと。
【０２５５】
スクリーニング法
有効な治療法は、有意な毒性を欠く有効な薬剤の同定に依存する。当該分野で公知の方法によって、抗体を結合親和性についてスクリーニングすることができる。例えば、ゲルシフトアッセイ、ウェスタンブロット、放射性標識競合アッセイ、クロマトグラフィによる同時分画、共沈、架橋、およびＥＬＩＳＡなどを使用することができ、これらは、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
【０２５６】
Ｍ−ＣＳＦ上の所望のエピトープに結合する抗体（例えば、Ｍ−ＣＳＦへのＲＸ１、５Ｈ４、ＭＣ１、および／またはＭＣ３の結合を遮断する抗体）を最初にスクリーニングするために、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）などに記載の日常的な架橋アッセイを行うことができる。本発明のＭ−ＣＳＦ特異的抗体へのＭ−ＣＳＦの結合を阻害する能力によって未知の抗体を特徴づける日常的競合結合アッセイも使用することができる。インタクトなＭ−ＣＳＦ、そのフラグメント、または線状エピトープ（図１２のＭ−ＣＳＦのアミノ酸９８〜１０５または図１２のアミノ酸６５〜７３または１３８〜１４４（５Ｈ４またはＭＣ３によって認識されるＭ−ＣＳＦエピトープに対応）によって示されるものなど）を使用することができる。エピトープマッピングは、Ｃｈａｍｐｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３８８−１３９４（１９９５）に記載されている。
【０２５７】
次に抗体を破骨細胞生成に及ぼす影響について試験し、動物に投与することがさらに意図される。癌転移に関連する骨再造形の防止または治療に潜在的に有用な化合物を、種々のアッセイを使用してスクリーニングすることができる。例えば、培養細胞系中の候補アンタゴニストを最初に特徴づけて、誘導された破骨細胞生成においてＭ−ＣＳＦを中和する能力を決定することができる。このような系には、マウス頭蓋冠骨芽細胞および脾臓細胞の共培養（Ｓｕｄａら、Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１３：６６  ８０，１９９２；Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｕｄａｇａｗａ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．９：６−１２，１９９８）、マウス間質細胞株（例えば、ＭＣ３Ｔ３−Ｇ２／ＰＡ６およびＳＴ２）およびマウス脾臓細胞の共培養（Ｕｄａｇａｗａら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２５：１８０５  １３，１９８９）、およびＳＴ２細胞および骨髄細胞、末梢血単核球または肺胞マクロファージの共培養（Ｕｄａｇａｗａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：７２６０４，１９９０；Ｓａｓａｋｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：４６２  ７，１９９８；Ｍａｎｃｉｎｏら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．１００：１８−２４，２００１）が含まれ得る。任意のＭ−ＣＳＦアンタゴニストの不在下で、このような共培養で形成された多核細胞は、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ、破骨細胞のマーカー酵素）活性、カルシトニン受容体、ｐ６０Ｃ−ＳＴＣ、ビトロネクチン受容体、ならびに骨および象牙スライス（ｄｅｎｔｉｎｅ  ｓｌｉｃｅ）上で吸収窩（ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｐｉｔ）を形成する能力などの破骨細胞の主な基準を満たす。有効なＭ−ＣＳＦアンタゴニストの存在は、このような多核細胞の形成を阻害する。
【０２５８】
上記共培養系では、破骨細胞生成の阻害における候補Ｍ−ＣＳＦ抗体の能力を、無間質細胞系または無破骨細胞系でアッセイすることができる。破骨細胞生成に必要なＭ−ＣＳＦを、同時培養した転移性癌細胞（例えば、ＭＤＡ２３１）またはこれらの癌細胞由来の馴化培地（Ｍａｎｃｉｎｏら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．０：１８−２４，２００１）、または精製Ｍ−ＣＳＦの付加によって得ることができる。
【０２５９】
癌転移に関連する骨再造形の防止または治療における所与のＭ−ＣＳＦ抗体の有効性も、当業者によく知られている任意の動物骨転移モデル系で使用することができる。このようなモデル系には、骨髄腔（Ｉｎｇａｌｌ，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，１１７：８１９−２２，１９６４；Ｆａｌａｓｋｏ，Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．１６９：２０  ７，１９８２）、ラット副大動脈（Ｐｏｗｌｅｓら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２８：３１６２１，１９７３）、マウス外側尾静脈（ｌａｔｅｒａｌ  ｔａｉｌ  ｖｅｉｎ）、またはマウス左心室（Ａｕｇｕｅｌｌｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：６８７６  ８１，１９８８）への腫瘍細胞の直接注射が含まれる。有効なＭ−ＣＳＦアンタゴニストの不在下で、注射した腫瘍細胞から形成された骨溶解性骨転移を、放射線写真（骨溶解性骨病変領域）または組織学または免疫組織化学（骨および軟組織）によって決定することができる。Ｓａｓａｋｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：３５５１  ７，１９９５；Ｙｏｎｅｄａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：２５０９  １７，１９９７．Ｃｌｏｈｉｓｙ  ａｎｄ  Ｒａｍｎａｒａｉｎｅ，Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｓ．１６：６６０  ６，１９９８．Ｙｉｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３：１９７  ２０６，１９９９。有効なＭ−ＣＳＦ抗体の存在下で、骨溶解性骨転移を防止または阻害して、転移をより少数および／または小さくすることができる。
【０２６０】
本発明のＭ−ＣＳＦ抗体はまた、癌転移の防止または治療で有用であり得る。Ｆｉｌｄｅｒｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５２：３６６１６，１９９２に記載のように、癌転移の防止または治療における候補Ｍ−ＣＳＦ抗体の有効性を、ヒト羊水基底膜侵入モデルを使用してスクリーニングすることができる。さらに、種々の癌型の転移のための任意の動物モデル系を使用することもできる。このようなモデル系には、Ｗｅｎｇｅｒら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  １９：１６９  ７３，２００２；Ｙｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２：９１７  ２３，２００２；Ｔｓｕｔｓｕｍｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ  １６９：７７−８５，２００１；Ｔｓｉｎｇｏｔｊｉｄｏｕら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２１：９７１  ８，２００１；Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉら、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ５９：７５  ８０，２０００；Ｇｕｌｐ  ａｎｄ  Ｋｏｇｅｒｍａｎ，Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．３：Ｄ６７２  ８３，１９９８；Ｒｕｎｇｅら、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｒａｄｉｏｌ．３２：２１２  ７；Ｓｈｉｏｄａら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．６４：１２２  ６，１９９７；Ｍａら、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．３７：２２９３  ３０１，１９９６；Ｋｕｒｕｐｐｕら、Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ．１１：２６  ３２，１９９６に記載のモデル系が含まれるが、これらに限定されない。有効なＭ−ＣＳＦ抗体の存在下で、癌転移を防止または阻害して、転移をより少なく、および／または小さくすることができる。
【０２６１】
特定のＭ−ＣＳＦ抗体またはＭ−ＣＳＦ抗体の組み合わせの生物活性を、適切な動物モデルを使用してインビボで評価することができる。例えば、ヒトリンパ腫細胞を免疫無防備動物に導入した異種リンパ腫癌モデル（ヌードマウスまたはＳＣＩＤマウスなど）。腫瘍形成、および腫瘍の退行または転移などを測定するアッセイを使用して有効性を予想することができる。
【０２６２】
インビトロアッセイの１つの変形形態では、本発明は、（ａ）固定化Ｍ−ＣＳＦを候補抗体と接触させる工程と、（ｂ）候補抗体のＭ−ＣＳＦへの結合を検出する工程とを含む方法を提供する。別の実施形態では、候補抗体を固定化し、Ｍ−ＣＳＦの結合を検出する。当該分野で周知の任意の方法（支持体、ビーズ、またはクロマトグラフ樹脂への共有結合、抗体結合などの非共有結合性抗親和性相互作用、または固定化化合物がビオチン部分を含むストレプトアビジン／ビオチン結合の使用が含まれる）を使用して固定化を行う。（ｉ）固定化されていない化合物上の放射性標識、（ｉｉ）非固定化化合物上の蛍光標識、（ｉｉｉ）非固定化化合物に免疫原性を示す抗体、（ｉｖ）固定化化合物が付着した蛍光支持体を励起する非固定化化合物上の標識、ならびに当該分野で周知且つ日常的に実施される他の技術を使用して、結合を検出することができる。
【０２６３】
Ｍ−ＣＳＦの活性または発現を調整する（すなわち、増加、減少、または遮断）抗体を、推定モジュレーターのＭ−ＣＳＦを発現する細胞とのインキュベーションおよびＭ−ＣＳＦの活性または発現に及ぼす推定モジュレーターの影響の決定によって同定することができる。Ｍ−ＣＳＦポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性を調整する抗体の選択性を、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドまたはポリヌクレオチドに及ぼす影響または他の関連化合物に及ぼす影響の比較によって評価することができる。選択的モジュレーターとして、例えば、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドまたはＭ−ＣＳＦポリペプチドをコードする核酸に特異的に結合する抗体および他のタンパク質、ペプチド、または有機分子が挙げられる。Ｍ−ＣＳＦ活性のモジュレーターは、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドの正常または異常な活性が関与する疾患および生理学的容態の治療で治療的に有用であろう。
【０２６４】
本発明はまた、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドの生物活性と相互作用するか阻害する（すなわち、酵素活性、結合活性などを阻害する）抗体を同定するための高処理スクリーニング（ＨＴＳ）アッセイを理解している。ＨＴＳアッセイにより、有効な様式で大量の化合物をスクリーニング可能である。細胞ベースのＨＴＳ系は、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドとその結合パートナーとの間の相互作用を調査することを意図する。ＨＴＳアッセイを、所望の性質を有する「ヒット」または「リード化合物」が同定されるように設計し、このアッセイは、所望の性質が改良されるように修飾を設計することができる。「ヒット」または「リード化合物」の化学修飾は、しばしば、「ヒット」とＭ−ＣＳＦポリペプチドとの間の同定可能な構造／活性関係に基づく。
【０２６５】
本発明の別の態様は、Ｍ−ＣＳＦを抗体と接触させる工程と、抗体がＭ−ＣＳＦ活性を改変するかどうかを決定する工程とを含むＭ−ＣＳＦ活性を調整する（すなわち、減少させる）抗体を同定する方法に関する。試験抗体の存在下での活性を、試験抗体の不在下での活性と比較する。試験抗体を含むサンプルの活性が試験抗体を欠くサンプルの活性よりも低い場合、抗体は活性を阻害している。
【０２６６】
種々の異種系を、当業者に周知の組換えポリペプチドの機能的発現に利用可能である。このような系には、細菌（Ｓｔｒｏｓｂｅｒｇ，ら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９２）１３：９５−９８）、酵母（Ｐａｕｓｃｈ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９７）１５：４８７−４９４）、数種の昆虫細胞（Ｖａｎｄｅｎ  Ｂｒｏｅｃｋ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌｏｇｙ（１９９６）１６４：１８９−２６８）、両生類細胞（Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９７）８：６２９−６３４）、いくつかの哺乳動物細胞（ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳなど、Ｇｅｒｈａｒｄｔ，ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（１９９７）３３４：１−２３を参照のこと）が含まれる。これらの例は、他の可能な細胞発現系（線虫から得た細胞株（ＰＣＴ出願ＷＯ９８／３７１７７号）が含まれる）の使用を排除しない。
【０２６７】
本発明の１つの実施形態では、Ｍ−ＣＳＦ活性を調整する抗体をスクリーニングする方法は、試験抗体をＭ−ＣＳＦポリペプチドと接触させる工程と、抗体とＭ−ＣＳＦとの間の複合体の存在をアッセイする工程とを含む。このようなアッセイでは、典型的には、リガンドを標識する。適切なインキュベーション後、結合形態で存在する遊離リガンドを分離し、遊離標識または非結合標識の量は、特定の抗体がＭ−ＣＳＦまたはＭ−ＣＳＦポリペプチドに結合する能力の基準である。
【０２６８】
本発明の別の実施形態では、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドに対して適切な結合親和性を有する抗体フラグメントまたはＣＤＲの高処理スクリーニングを使用する。簡潔に述べれば、多数の異なる小ペプチドの試験化合物を固体基質上で合成する。ペプチド試験抗体を、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドと接触させ、洗浄する。次いで、結合したＭ−ＣＳＦポリペプチドを、当該分野で周知の方法によって検出する。本発明の精製抗体を、上記薬物スクリーニング技術で使用するためのプレート上に直接コーティングすることもできる。さらに、非中和抗体を使用して、固体支持体上でタンパク質を補足し、これを固定することができる。
【０２６９】
併用療法
動物モデルで有効な１つを超えるＭ−ＣＳＦ抗体が同定されると、２つまたはそれを超えるＭ−ＣＳＦ抗体を混合して、骨量減少または癌転移および／または癌転移に関連する骨再造形に対する有効性をさらに改善することがさらに有利であり得る。１つまたは複数のＭ−ＣＳＦ抗体を含む組成物を、骨量減少または癌転移および／または癌転移に関連する骨再造形を罹患しているか罹患しやすいヒトまたは哺乳動物に投与することができる。薬剤がその治療効果を発揮する間に重複する限り、２つの治療薬の併存的（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ）投与は薬剤を同時または同経路で投与する必要ない。異なる日数または週数での投与である場合、同時投与または連続的投与を意図する。
【０２７０】
Ｍ−ＣＳＦ抗体療法が全ての癌病期に有用であり得るが、抗体療法は、進行癌または転移癌で特に適切であり得る。抗体療法と化学療法または放射線療法との組み合わせは、化学療法を受けてない患者で好ましい場合があるのに対して、抗体療法を使用した治療は、１つまたは複数の化学療法薬を受けた患者に適応することができる。さらに、抗体療法はまた、特に化学療法薬の毒性に十分に耐えられない患者において付随する化学療法薬の使用量を減少させることができる。
【０２７１】
本発明の方法は、単一の抗Ｍ−ＣＳＦ抗体または異なる抗体の組み合わせ（すなわち、「カクテル」）の投与を意図する。このような抗体カクテルは、異なるエフェクター機構を活用するか、細胞傷害性抗体を免疫エフェクター機能性に依存する抗体と直接組み合わせる抗体を含むので、一定の利点を有し得る。このような組み合わせ抗体は、相乗的治療効果を示し得る。
【０２７２】
ＲＸ１またはＲＸ１抗体のヒト操作（商標）誘導体の他の治療薬との組み合わせは、破骨細胞性疾患および／または腫瘍成長もしくは転移を経験した患者に影響を及ぼし得る。例えば、骨溶解性疾患を罹患した患者の治療薬の製造において、抗ＲＡＮＫＬ抗体、可溶性ＲＡＮＫＬ受容体、他のＲＡＮＫＬインヒビター、またはビスホスホネート（例えば、アレディア、ゾメタ、クロドロネート）を使用した治療と調和させたＲＸ１抗体を使用することができる。あるいは、骨溶解性疾患を罹患した患者の治療薬の製造において、ＲＸ１抗体またはＲＸ１抗体のヒト操作誘導体を使用した治療と調和させた抗ＲＡＮＫＬ抗体またはビスホスホネートを使用することができる。組み合わせは、治療患者において相乗効果も有し得る。ＲＸ１抗体および他の治療薬を、同時に投与する必要はない。ＲＸ１またはヒト操作変異型および他の治療薬を、１日以内、１週間以内、２週間以内、４週間以内、２ヶ月以内、３ヶ月以内、６ヶ月以内、１年以内、または２年以内に互いに投与することができる。
【０２７３】
本発明はまた、骨溶解性疾患を罹患した患者の治療薬の製造におけるＲＸ１抗体またはＲＸ１抗体のヒト操作（商標）誘導体の使用を意図し、この治療薬を、抗ＲＡＮＫＬ抗体またはビスホスホネートで前処置した患者に使用する。「前処置」は、患者が、ＲＸ１またはＲＸ１のヒト操作（商標）変異型での処置の２年前、１年前、６ヶ月前、３ヶ月前、２ヶ月前、１ヶ月前、２週間前、１週間前、または少なくとも１日前に処置することを意味する。
【０２７４】
ＲＸ１抗体またはヒト操作（商標）変異型を、他の癌治療薬と組み合わせて使用することができる。例えば、癌疾患を罹患した患者の治療薬の製造において、他の治療薬および／または手順（種々の化学療法薬、アンドロゲン遮断薬、および免疫変調物質（ｉｍｍｕｎｅ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）（例えば、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＬＣ）、ビスホスホネート（例えば、アレディア、ゾメタ、クロドロネート）、手術、照射、細胞傷害性化学療法、ホルモン療法（例えば、タモキシフェン、抗アンドロゲン療法）、抗体療法（例えば、ＲＡＮＫＬ／ＲＡＮＫ中和抗体、ＰＴＨｒＰ中和抗体、抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ４０抗体、ＣＤ２２抗体、ＶＥＧＦ抗体、ＩＧＦＲ−１抗体、ＥｐｈＡ２抗体、ＨＡＡＨ抗体、ＴＭＥＦＦ２抗体、ＣＡＩＸ抗体）、治療タンパク質療法（例えば、可溶性ＲＡＮＫＬ受容体、ＯＰＧインヒビター、ＰＤＧＦインヒビター、およびＭＭＰインヒビター）、小分子薬物療法（例えば、Ｓｒｃ−キナーゼインヒビター）、成長因子受容体のキナーゼインヒビター（すなわち、ＲＡＮＫＬインヒビター）、オリゴヌクレオチド療法（例えば、ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＫ、またはＰＴＨｒＰアンチセンス）、遺伝子療法（例えば、ＲＡＮＫＬまたはＲＡＮＫインヒビター）、ペプチド療法（例えば、ＲＡＮＫＬのムテイン）、ならびに本明細書中に記載のタンパク質、ペプチド、化合物、および小分子が含まれるが、これらに限定されない）を使用した治療と調和させて、ＲＸ１抗体またはヒト操作（商標）変異型を使用することができる。混合型骨溶解性／骨芽細胞性病変の治療には、ＲＸ１抗体および骨芽細胞生成を阻害する別の治療薬（例えば、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）アンタゴニスト（ＢＭＰ−２アンタゴニストなど）、形質転換成長因子−β１（ＴＧＦβ１）アンタゴニスト、形質転換成長因子−β２（ＴＧＦβ２）アンタゴニスト、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）アンタゴニスト、インスリン様成長因子２（ＩＧＦ２）アンタゴニスト、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）アンタゴニスト、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）アンタゴニスト、ＷＮＴアンタゴニスト（ＤＩＣＫＫＯＰＦ−１（ＤＫＫ−１）など）、β−カテニンアンタゴニスト、オステリックスアンタゴニスト、コア結合因子１（ＲＵＮＸ２）アンタゴニスト、およびエンドセリン受容体アンタゴニスト（アントラセンタン（ａｔｒａｓｅｎｔａｎ）など）が含まれ得る。
【０２７５】
ＲＸ１およびヒト操作（商標）変異型を、上記治療薬で前処置した患者の治療薬の製造において使用することができる。
【０２７６】
細胞傷害薬は、細胞の機能を阻害または防止し、そして／または細胞破壊生じさせる物質をいう。この用語は、放射性同位体（例えば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、およびＲｅ１８６）、化学療法薬、および毒素（細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素活性毒素および合成毒素またはそのフラグメントなど）が含まれることが意図される。非細胞傷害薬は、細胞の機能を阻害または防止せず、そして／または細胞破壊生じさせない物質をいう。非細胞傷害薬には、細胞傷害性に活性化することができる薬剤が含まれ得る。非細胞傷害薬には、ビーズ、リポソーム、マトリックス、または粒子が含まれ得る（例えば、米国特許出願２００３／００２８０７１号および同２００３／００３２９９５号（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。このような薬剤を、本発明の抗体と接合、カップリング、連結、または会合することができる。
【０２７７】
癌化学療法薬には、アルキル化剤（カルボプラチンおよびシスプラチン、ナイトロジェンマスタードアルキル化剤、ニトロソ尿素アルキル化剤（カルムスチン（ＢＣＮＵ）など）など）、代謝拮抗物質（メトトレキサートなど）、フォリン酸、プリンアナログ代謝拮抗物質、メルカプトプリン、ピリミジンアナログ代謝拮抗物質（フルオロウラシル（５−ＦＵ）およびゲムシタビン（ジェムザール（登録商標））など）、ホルモン抗新生物薬（ゴセレリン、ロイプロリド、およびタモキシフェンなど）、天然抗新生物薬（アルデスロイキン、インターロイキン−２、ドセタキセル、エトポシド（ＶＰ−１６）、インターフェロンα、パクリタキセル（タキソール（登録商標））、およびトレチノイン（ＡＴＲＡ）など）；抗生物質天然抗新生物薬（ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、およびマイトマイシン（マイトマイシンＣが含まれる）など）およびビンカアルカロイド天然抗新生物薬（ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンなど）、ヒドロキシ尿素、アセグラトン、アドリアマイシン、イフォスファミド、エノシタビン、エピチオスタノール、アクラルビシン、アンシタビン、ニムスチン、塩酸プロカルバジン、カルボコン、カルボプラチン、カルモフール、クロモマイシンＡ３、抗腫瘍性多糖類、抗腫瘍性血小板因子、シクロホスファミド（サイトトキシン（登録商標））、シゾフィラン、シタラビン（シトシンアラビノシド）、ダカルバジン、チオイノシン、チオテパ、テガフール、ドラスタチン、ドラスタチンアナログ（オーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）など）、ＣＰＴ−１１（イリノテカン）、ミトザントロン（ｍｉｔｏｚａｎｔｒｏｎｅ）、ビノレルビン、テニポシド、アミノプテリン、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、エスペラミシン（例えば、米国特許第４、６７５、１８７号を参照のこと）、ネオカルチノスタチン、ＯＫ−４３２、ブレオマイシン、フルツロン、ブロクスウリジン、ブスルファン、ホンバン、ぺプロマイシン、ベスタチン（ウベニメクス（登録商標））、インターフェロン−β、メピチオスタン、ミトブロニトール、メルファラン、ラミニンペプチド、レンチナン、カワラタケ抽出物、テガフール／ウラシル、エストラムスチン（エストロゲン／メクロレタミン）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２７８】
さらに、癌患者の治療薬として使用されるさらなる薬剤には、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ガンシクロビル、抗生物質、ロイプロリド、メペリジン、ジドブジン（ＡＺＴ）、インターロイキン１〜１８（変異体およびアナログが含まれる）、インターフェロンまたはサイトカイン（インターフェロンα、βおよびγなど）、ホルモン（黄体形成ホルモン形成ホルモン（ＬＨＲＨ）およびアナログならびに性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）など）、成長因子（形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、成長ホルモン放出因子（ＧＨＲＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子相同因子（ＦＧＦＨＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、およびインスリン成長因子（ＩＧＦ）など）、腫瘍壊死因子−αおよびβ（ＴＮＦ−αおよびβ）、浸潤阻害因子−２（ＩＩＦ−２）、骨形成タンパク質１〜７（ＢＭＰ１〜７）、ソマトスタチン、サイモシン−α−１、γ−グロブリン、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、補体因子、抗血管形成因子、抗原性物質、およびプロドラッグが含まれる。
【０２７９】
プロドラッグは、親薬物と比較して腫瘍細胞に対して細胞傷害性が低いか細胞傷害性が無く、酵素的に活性化するか、より活性の高い親形態に変換することができる薬学的に活性な物質の前駆体または誘導体をいう。例えば、Ｗｉｌｍａｎ，”Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，１４，ｐｐ．３７５−３８２，６１５ｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｂｅｌｆａｓｔ（１９８６）およびＳｔｅｌｌａら、”Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：Ａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｂｏｒｃｈａｒｄｔら、（ｅｄ．），ｐｐ．２４７−２６７，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５）を参照のこと。プロドラッグには、リン酸塩含有プロドラッグ、チオリン酸塩含有プロドラッグ、硫酸塩含有プロドラッグ、、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸改変プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、任意選択的に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ、または任意選択的に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシンおよびより活性の高い細胞傷害性遊離薬に変換することができる他の５−フルオロウリジンプロドラッグが含まれるが、これらに限定されない。本明細書中で使用するためのプロドラッグ形態に誘導体化することができる細胞傷害薬の例には、上記の化学療法薬が含まれるが、これらに限定されない。
【０２８０】
投与および調製
本発明の方法の実施において使用される抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を、所望の送達法に適切なキャリアを含む薬学的組成物に処方することができる。適切なキャリアには、抗Ｍ−ＣＳＦ抗体と組み合わせた場合に所望の抗体活性を維持し、被験体の免疫系と反応しない任意の物質が含まれる。例には、多数の標準的な薬学的キャリア（滅菌リン酸緩衝化生理食塩水および静菌水など）のいずれかが含まれるが、これらに限定されない。種々の水性キャリア（例えば、水、緩衝液、０．４％生理食塩水、および０．３％グリシンなど）を使用することができ、穏やかな化学修飾などに供された安定性を増強する他のタンパク質（アルブミン、リポタンパク質、グロブリンなど）を含み得る。
【０２８１】
保存用の抗体治療処方物を、所望の純度を有する抗体と任意選択的な生理学的に許容可能なキャリア、賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））との混合によって、凍結乾燥処方物または水溶液の形態で調製する。許容可能なキャリア、賦形剤、または安定剤は、使用される投薬量および濃度でレシピエントに無毒であり、これらには、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液、抗酸化剤（アスコルビン酸およびメチオニンが含まれる）、防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルアルコール、またはベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチルパラベンまたはプロピルパラベンなど）、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、およびｍ−クレゾールなど）、低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなど）、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）、アミノ酸（グリシン、グルタミン酸、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなど）、単糖類、二糖類、または他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンなど）、キレート剤（ＥＤＴＡなど）、糖（スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトールなど）、塩形成対イオン（ナトリウムなど）、金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）、および／または非イオン性界面活性剤（ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）が含まれる。
【０２８２】
本明細書中の処方物はまた、必要に応じて、処置される特定の適応症のための１つを超える化合物（好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない補助的活性を有する化合物）を含み得る。このような分子は、意図する目的に有効な量で組み合わせて存在することが適切である。
【０２８３】
有効成分を、例えば、コアセルベーション技術または界面重合によって調製したマイクロカプセル（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ（エチルメタクリレート）マイクロカプセル）、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセル）、またはマクロエマルションに捕捉することもできる。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【０２８４】
インビボ投与のために使用される処方物は、無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜での濾過によって行われる。
【０２８５】
抗体を、任意の適切な手段（非経口、皮下、腹腔内、肺内、および鼻腔内、局所治療が望ましい場合、病変内への投与が含まれる）によって投与する。非経口注入には、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、または皮下への投与が含まれる。さらに、抗体を、特に漸減用量の抗体のパルス注入によって適切に投与する。好ましくは、注射、最も好ましくは静脈内注射または皮下注射によって投与する。他の投与方法（局所、特に、所望の部位付近に配置したカテーテルによる経皮、経粘膜、直腸、経口、または局所投与）が意図される。
【０２８６】
鼻腔内投与のために、薬学的処方物および薬物は、適切な溶媒および任意選択的に他の化合物（安定剤、抗菌薬、抗酸化剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、生物学的利用能調整剤（ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）、およびこれらの組み合わせなどであるが、これらに限定されない）噴霧またはエアゾールであり得る。エアゾール処方物のための噴射剤には、圧縮空気、窒素、二酸化炭素、または炭化水素ベースの低沸点溶媒が含まれる。
【０２８７】
注射用投薬形態には、一般に、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して調製することができる水性懸濁液または油性懸濁液が含まれる。注射用形態は、溶媒または希釈剤を使用して調製される液相または懸濁液の形態であり得る。許容可能な溶媒またはビヒクルには、滅菌水、リンゲル液、または等張性生理食塩水が含まれる。あるいは、溶媒または懸濁剤として滅菌油を使用することができる。好ましくは、油または脂肪酸は、不揮発性であり、天然油、合成油、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、またはトリグリセリドが含まれる。
【０２８８】
注射のために、薬学的処方物および／または薬物は、上記の適切な溶液での再構成に適切な粉末であり得る。これらの例として、凍結乾燥粉末、回転乾燥粉末、または噴霧乾燥粉末、非晶質粉末、顆粒、沈殿物、または粒子が挙げられるが、これらに限定されない。注射のために、処方物は、任意選択的に、安定剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、生物学的利用能調整剤、およびこれらの組み合わせを含み得る。
【０２８９】
徐放性調製物を調製することができる。徐放性調製物の適切な例には、抗体を含み、成型物（ｓｈａｐｅｄ  ａｒｔｉｃｌｅ）（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）である固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれる。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレンビニルアセテート、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（Ｌｕｐｒｏｎ  Ｄｅｐｏｔ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射用ミクロスフェア）など）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸などが含まれる。エチレン酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーが１００日にわたって分子を放出することができる一方で、一定のヒドロゲルは、タンパク質をより短い期間放出する。カプセル化抗体を体内に長期間保持する場合、３７℃の水分への曝露の結果としてカプセル化抗体が変性または凝集し、それにより、生物活性が喪失し、免疫原性が変化する可能性があり得る。関連する機構に応じて、安定化するための妥当なストラテジーを考案することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換による分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが発見された場合、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、適切な添加物を使用した含水量の調節、および特定のポリマーマトリックス組成物の開発によって安定化することができる。当該分野で公知の他のストラテジーを使用することができる。
【０２９０】
本明細書中に記載のように、本発明の処方物を、短期作用性、急速放出性、長期作用性、または徐放性となるように設計することができる。したがって、制御放出または遅延放出のための薬学的処方物を処方することもできる。
【０２９１】
本発明の組成物はまた、例えば、ミセル、リポソーム、または他のカプセル化形態を含み得るか、長期保存および／または送達効果を得るための長期放出形態で投与することができる。したがって、薬学的処方物および薬物を、ペレットまたは注射筒に圧縮し、デポー注射またはステントなどのインプラント（ｉｍｐｌａｎｔ）として筋肉内または皮下に移植することができる。このようなインプラントは、シリコーンおよび生分解性ポリマーなどの公知の不活性材料を使用することができる。
【０２９２】
上記の代表的投薬形態に加えて、薬学的に許容可能な賦形剤およびキャリアは、当業者に一般に公知であり、したがって、本発明に含まれる。このような賦形剤およびキャリアは、例えば、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９１）（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
【０２９３】
特定の投薬量を、疾患、被験体の年齢、体重、一般的な健康状態、遺伝子型、性別、および食事、投与間隔、投与経路、排泄率、および薬物の組み合わせに応じて調整することができる。有効量を含む任意の上記投薬形態は、十分に日常的実験の範囲内であり、したがって、十分に本発明の範囲内である。
【０２９４】
しばしば、他の天然に存在する免疫グロブリンや他の生体分子を実質的に含まない骨溶解性疾患（骨への癌転移およびこのような疾患に関連する骨再造形が含まれる）の治療薬として有用なＭ−ＣＳＦ抗体を調製する。好ましいＭ−ＣＳＦ抗体はまた、骨溶解性疾患を罹患しているか罹患しやすい哺乳動物に投与した場合に最小の毒性を示す。
【０２９５】
本発明の組成物を、従来の周知の滅菌技術によって滅菌することができる。得られた溶液を、使用するために包装するか、滅菌条件下で濾過して凍結乾燥し、凍結乾燥調製物を、投与前に滅菌溶液と組み合わせる。組成物は、適切な生理学的条件に必要な薬学的に許容可能な補助剤（ｐＨ調整剤および緩衝剤、および等張化剤（例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム）、および安定剤（例えば、１２０％マルトースなど）など）を含み得る。
【０２９６】
本発明のＭ−ＣＳＦ抗体を、リポソームを介して投与することもできる。リポソームは、種々の型の脂質および／またはリン脂質および／または薬物（本明細書中に開示の抗体、および、任意選択的に、化学療法薬など）の送達に有用な界面活性剤から構成される小胞である。リポソームとして、乳濁液、フォーム、ミセル、不溶性単層、リン脂質分散液、およびラメラ層が挙げられ、Ｍ−ＣＳＦ抗体を特定の組織にターゲティングし、組成物の半減期を増加させるためのビヒクルとしての機能を果たし得る。米国特許第４，８３７，０２８号および同第５，０１９，３６９号（これらの特許は、本明細書中で参考として援用される）に記載のように、リポソームの調製に種々の方法が利用可能である。
【０２９７】
抗体を含むリポソームを、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４０３０（１９８０）；ならびに米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号などに記載の当該分野で公知の方法によって調製する。循環時間が増加したリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に記載されている。特に有用なリポソームを、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ由来ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を使用した逆相蒸発法によって生成することができる。リポソームを所定の孔サイズのフィルターから押し出し、所望の直径のリポソームを得る。Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載のように、本発明の抗体のＦａｂ’フラグメントを、ジスルフィド交換反応によってリポソームに接合することができる。化学療法薬（ドキソルビシンなど）を、任意選択的にリポソーム内に含める（例えば、Ｇａｂｉｚｏｎら、Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８１（１９）：１４８４（１９８９）を参照のこと）。
【０２９８】
これらの組成物中のＭ−ＣＳＦ抗体の濃度は、広範囲にわたって変化し得る（すなわち、約１０重量％未満（通常、少なくとも約２５重量％）から７５重量％または９０重量％まで）。この濃度を、選択された特定の投与様式にしたがって、主に液量、粘度などによって選択する。経口、局所、および非経口に投与可能な組成物の実際の調製方法は当業者に公知であるか明らかであり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９５）（本明細書中で参考として援用される）に詳述されている。
【０２９９】
患者の疾患の治療のための本発明の組成物の有効量を、当該分野で周知の標準的な経験的方法によって決定することができる。例えば、Ｃｅｎｃｉら、Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０５５：１２７９−８７，２０００に記載のように、所与の投薬量のＭ−ＣＳＦ抗体で処置した被験体由来の血清のインビボ中和活性を、インビトロで血清がマウス単球（高レベルのＭ−ＣＳＦ受容体を発現するＣＤ１１ｂ＋細胞、ＣＤ１１細胞のサブセット）のＭ−ＣＳＦ誘導性増殖および生存を遮断する能力を決定するアッセイを使用して評価することができる。
【０３００】
本発明の組成物を、骨溶解性疾患（骨への癌転移およびこのような疾患に関連する骨再造形が含まれる）を既に罹患しているか、罹患する傾向があるか、リスクのある哺乳動物に、疾患を防止するか、疾患の進行を少なくとも部分的に停止させるのに十分な量で投与する。これを達成するのに適切な量を、「治療有効用量」と定義する。Ｍ−ＣＳＦ抗体の有効量は治療を受ける患者の疾患の重症度、体重、および一般的症状に依存して変化し、一般に、約１．０μｇ／ｋｇ体重から約１００ｍｇ／ｋｇ体重までの範囲である。例示的用量は、適用あたり約１０μｇ／ｋｇ体重から約３０ｍｇ／ｋｇまで、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重から約２０ｍｇ／ｋｇまで、または約１ｍｇ／ｋｇ体重から約１０ｍｇ／ｋｇまでの範囲であり得る。抗体を、体表面積（例えば、４．５ｇ／ｍ２）に従って投与することもできる。抗体の単回投与での他の例示的用量には、全部で８ｇ（体重８０ｋｇまたは体表面積１．８ｍ２と仮定して）が含まれる。
【０３０１】
当該分野で公知の任意の手段によって投与することができる。例えば、抗体を、１つまたは複数の個別のボーラス投与、例えば、５、１０、１５、３０、６０、９０、１２０分またはそれ以上にわたる短期または長期注入によって投与することができる。最初の治療期間後、患者の応答を維持することが必要な場合、患者の応答および治療耐性に応じて、例えば、毎週、２週間毎、３週間毎、４週間毎、毎月、２ヶ月毎、３ヶ月毎、または６ヶ月毎に維持量を投与することができる。所望の疾患症状の抑制が起こるまでより頻繁な投与が必要であり得、必要に応じて投薬量を調整することができる。この治療の進行を、従来の技術およびアッセイによって容易にモニタリングする。所定の期間治療を行うか、疾患が進行するか死亡するまで、多年にわたって慢性的に継続することができる。
【０３０２】
治療を行う医師によって選択された投与レベルおよびパターンを使用して、組成物を単回投与または複数回投与することができる。疾患の防止または治療のために、抗体の適切な投薬量は、上記定義の治療される疾患の型、疾患の重症度および経過、抗体を防止目的または治療目的のいずれのために投与するのか、以前の治療、患者の病歴および抗体に対する応答、ならびに担当医の判断に依存する。抗体を、１回または一連の治療にわたって患者に適切に投与する。
【０３０３】
いずれにしても、処方物により、骨溶解性疾患（骨への癌転移およびこのような疾患に関連する骨再造形が含まれる）を有効に防止するか重症度を最小にするのに十分な量のＭ−ＣＳＦ抗体が長期間得られるべきである。本発明の組成物を、単独で投与するか、このような疾患の治療のための当該分野で公知の他の治療薬と組み合わせた補助療法として投与することができる。
【０３０４】
抗体組成物を、良好な医療行為と一致する様式で処方、服用、および投与する。この文脈における考慮要因には、治療を受ける特定の障害、治療を受ける特定の哺乳動物、各患者の臨床症状、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与レジメン、および医師に公知の他の要因が含まれる。投与すべき抗体の治療有効量は、このような検討材料によって左右され、Ｍ−ＣＳＦ媒介性疾患、容態、または障害を防止、改善、または治療するのに必要な最少量である。このような量は、好ましくは、宿主に有毒であるか、宿主が感染に対して有意により感受性を示す量よりも低い。
【０３０５】
抗体を、問題の障害を防止または治療するために現在使用されている１つまたは複数の薬剤と配合する必要はないが、任意選択的に配合する。このような他の薬剤の有効量は、処方物中に存在する抗体の量、疾患、容態、障害、または処置の型、および上記で考察された他の要因に依存する。これらを、一般に、上記と同一の投薬量および投与経路または前記で使用した投薬量の約１〜９９％で使用する。
【０３０６】
本発明の別の実施形態では、骨溶解性疾患（骨への癌転移およびこのような疾患に関連する骨再造形が含まれる）の治療に有用な材料を含む製品を提供する。製品は、容器およびラベルを含む。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管が含まれる。容器を、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成することができる。容器は、容態の治療に有効な組成物が保持されており、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって突き刺すことができるストッパーを有する静脈注射用溶液のバッグまたはバイアルであり得る）。溶媒中の活性成分（ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）は、本発明の抗体である。容器上または容器に添付したラベルは、組成物を最適な容態の治療のために使用することを示す。製品は、第２の治療薬（本明細書中で考察されているか当該分野で公知の骨溶解性疾患のための任意の第２の治療薬が含まれる）を含む第２の容器をさらに含み得る。製品は、薬学的に許容可能な緩衝液（凍結乾燥した抗体処方物を再構成するためのリン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル液、またはデキストロース容器など）を含む別の容器をさらに含み得る。製品は、商業的または使用者の立場から望ましい他の物質（他の緩衝液、希釈剤、フィルター、ニードル、シリンジ、および使用説明書を含む添付文書が含まれる）さらに含み得る。
【０３０７】
免疫療法
癌患者の治療で有用な抗Ｍ−ＣＳＦ抗体には、腫瘍に対して強い免疫応答を引き起こすことができる抗Ｍ−ＣＳＦ抗体および細胞傷害性を指示することができる抗Ｍ−ＣＳＦ抗体が含まれる。これに関して、抗Ｍ−ＣＳＦ抗体は、補体媒介性細胞傷害性または抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）機構のいずれかによって腫瘍細胞溶解を誘発することができる。これらの機構は共にエフェクター細胞のＦｃ受容体部位または補体タンパク質との相互作用のための免疫グロブリン分子のインタクトなＦｃ部分が必要である。さらに、腫瘍成長に対して直接的な生物学的効果を発揮する抗Ｍ−ＣＳＦ抗体は、本発明の実施に有用である。このような直接的細胞傷害性抗体が作用することができる潜在的機構として、細胞成長の阻害、細胞分化の調整、腫瘍血管新生因子プロフィールの調整、およびアポトーシスの誘導が挙げられる。特定の抗Ｍ−ＣＳＦ抗体が抗腫瘍効果を発揮する機構を、当該分野で一般的に公知のＡＤＣＣ、ＡＤＭＭＣ、および補体媒介性細胞溶解などを決定するために設計された多数のインビトロアッセイを使用して評価することができる。
【０３０８】
１つの実施形態では、Ｍ−ＣＳＦの分泌形態よりもＭ−ＣＳＦの膜結合形態（Ｍ−ＣＳＦα）に対して高い親和性を有する抗体を使用して免疫療法を行う。例えば、Ｍ−ＣＳＦの切断部位または切断部位周囲または膜近傍のＭ−ＣＳＦαの一部に特異的に結合する抗体を調製することができる。このような抗体はまた、Ｍ−ＣＳＦαの可溶性活性部分の切断または放出を有利に阻害することもできる。
【０３０９】
抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を、その「裸の（ｎａｋｅｄ）」形態または非接合形態で投与することができるか、またはこれらに接合した治療薬を有し得る。１つの実施形態では、抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を、放射線増感剤として使用する。このような実施形態では、抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を、放射線増感剤に接合する。本明細書中で使用される、用語「放射線増感剤」は、電磁波放射線に対して放射線増感される細胞の感度を増加させ、そして／または電磁波放射線で治療可能な疾患の治療を促進するために治療有効量で動物に投与される分子、好ましくは低分子量の分子と定義する。電磁波放射線で治療可能な疾患には、新生物疾患、良性および悪性の腫瘍、および癌細胞が含まれる。
【０３１０】
本明細書中で使用される、用語「電磁波放射線」および「放射線」には、１０−２０〜１００ｍの波長を有する放射線が含まれるが、これらに限定されない。本発明の好ましい実施形態は、γ線放射（１０−２０〜１０−１３ｍ）、Ｘ線放射（１０−１２〜１０−９ｍ）、紫外光（１０ｎｍ〜４００ｎｍ）、可視光（４００ｎｍ〜７００ｎｍ）、赤外線（７００ｎｍ〜１．０ｍｍ）、およびマイクロ波放射（１ｍｍ〜３０ｃｍ）を使用する。
【０３１１】
放射線増感剤は、電磁波放射線の毒作用に対する癌細胞の感受性を増加させることが公知である。多くの癌治療プロトコールは、現在、Ｘ線の電磁波放射線によって活性化される放射線増感剤を使用している。Ｘ線活性化放射線増感剤の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：メトロニダゾール、ミソニダゾール、デスメチルミソニダゾール、ピモニダゾール（ｐｉｍｏｎｉｄａｚｏｌｅ）、エタニダゾール、ニモラゾール、マイトマイシンＣ、ＲＳＵ１０６９、ＳＲ４２３３、ＥＯ９、ＲＢ６１４５、ニコチンアミド、５−ブロモデオキシウリジン（ＢＵｄＲ）、５−ヨードデオキシウリジン（ＩＵｄＲ）、ブロモデオキシシチジン、フルオロデオキシウリジン（ＦＵｄＲ）、ヒドロキシ尿素、シスプラチン、ならびにこれらの治療有効アナログおよび誘導体。
【０３１２】
癌の光力学療法（ＰＤＴ）は、放射線増感剤の放射線アクチベーターとして可視光を使用する。光力学的放射線増感剤の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：ヘマトポルフィリン誘導体、フォトフリン（登録商標）、ベンゾポルフィリン誘導体、ＮＰｅ６、スズエチオポルフィリン（ＳｎＥＴ２）、フェノボルビド−ａ（ｐｈｅｏｂｏｒｂｉｄｅ−ａ）、細菌クロロフィル−ａ、ナフタロシアニン、フタロシアニン、亜鉛フタロシアニン、およびこれらの治療有効アナログおよび誘導体。
【０３１３】
別の実施形態では、抗体を、腫瘍のプレターゲティングで使用するための受容体（ストレプトアビジンなど）に接合することができ、この抗体−受容体接合体を患者に投与し、その後に透徹薬（ｃｌｅａｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（例えば、放射線核種）に接合したリガンド（例えば、アビジン）を投与する。
【０３１４】
本発明は、さらに、検出可能に標識された形態での上記抗体を提供する。抗体を、放射性同位体、親和性標識（ビオチン、アビジンなど）、酵素標識（西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、蛍光標識、発光標識、または生物発光標識（ＦＩＴＣまたはローダミンなど）、および常磁性原子などの使用によって検出可能に標識することができる。このような標識の手順は当該分野で周知であり、例えば、（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ，Ｌ．Ａ．ら、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１８：３１５（１９７０）；Ｂａｙｅｒ，Ｅ．Ａ．ら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．６２：３０８（１９７９）；Ｅｎｇｖａｌ，Ｅ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９：１２９（１９７２）；Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１３：２１５（１９７６））を参照のこと。
【０３１５】
「標識」は、抗体に直接または間接的に接合する検出可能な化合物または組成物をいう。標識自体を、単独で検出することができるか（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）、酵素標識の場合、検出可能な基質化合物または組成物の化学的変化を触媒することができる。あるいは、標識は、単独で検出することができないが、検出可能な別の薬剤（例えば、同位体タグまたはビオチン−アビジンなどの結合パートナーの１つ）に結合するエレメントであり得る。したがって、抗体は、その単離を容易にする標識またはタグを含み得る。本発明の抗体を同定する方法は、標識またはタグとの相互作用によってＭ−ＣＳＦ／抗体を単離する工程を含む。
【０３１６】
例示的治療免疫接合体は、細胞傷害薬（化学療法薬、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素活性毒素またはそのフラグメント）、または放射性同位体（すなわち、放射性接合体（ｒａｄｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ））など）に接合した本明細書中に記載の抗体を含む。融合タンパク質は、以下により詳細に記載されている。
【０３１７】
免疫接合体の産生は、米国特許第６，３０６，３９３号に記載されている。免疫接合体を、治療薬の抗体成分への直接的接合によって調製することができる。一般的技術は、Ｓｈｉｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４１：８３２−８３９（１９８８）；Ｓｈｉｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４６：１１０１−１１０６（１９９０）；およびＳｈｉｈらの米国特許第５，０５７，３１３号に記載されている。一般的方法は、酸化炭水化物部分を有する抗体成分を少なくとも１つの遊離アミン官能基を有し、且つ複数の薬物、毒素、キレート剤、ホウ素添加物（ｂｏｒｏｎ  ａｄｄｅｎｄ）、または他の治療薬を負荷したキャリアポリマーとの反応を含む。この反応により、最初のシッフ塩基（イミン）結合が得られ、これを、第二級アミンへの還元によって安定化して最終接合体を形成することができる。
【０３１８】
キャリアポリマーは、好ましくは、アミノデキストランまたは少なくとも５０アミノ酸残基のポリペプチドであるが、他の実質的に等価なポリマーキャリアを使用することもできる。好ましくは、容易な投与および治療で使用するための有効なターゲティングのための最終免疫接合体は、水溶液（哺乳動物血清など）に可溶である。したがって、キャリアポリマーの溶解機能は、最終免疫接合体の血清溶解性を増強する。特に、アミノデキストランが好ましい。
【０３１９】
アミノデキストランキャリアを使用した免疫接合体の調製過程は、デキストランポリマー、有利には、平均分子量が約１０，０００〜１００，０００のデキストランから開始する。デキストランを酸化剤と反応させて、その炭水化物環の一部の酸化の調節に影響を及ぼし、それにより、アルデヒド基が生成される。従来の手順によってＮａＩＯ４などの解糖化学試薬を使用して都合よく酸化させる。
【０３２０】
次いで、酸化デキストランを、ポリアミン、好ましくはジアミン、より好ましくは、モノヒドロキシジアミンまたはポリヒドロキシジアミンと反応させる。適切なアミンには、エチレンジアミンまたはプロピレンジアミンなど、ポリメチレンジアミンまたはジエチレントリアミンなど、ポリアミン、または１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンなど、およびヒドロキシル化ジアミンまたはポリアミンなどが含まれる。デキストランのアルデヒド基に反応性を示す過剰なアミンを使用して、アルデヒド感応基のシッフ塩基基への完全な変換を確実にする。
【０３２１】
ＮａＢＨ４またはＮａＢＨ３ＣＮなどの還元剤を使用して、得られたシッフ塩基中間体の還元的安定化を行う。得られた付加物を、従来のサイジングカラムに通して架橋デキストランを除去することによって精製することができる。
【０３２２】
アミン官能基を導入するためにデキストランを誘導体化する他の従来の方法（例えば、臭化シアンとの反応およびその後のジアミンとの反応）を使用することもできる。
【０３２３】
次いで、アミノデキストランを、例えば、ジクロロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）またはその水溶性変異型を使用して従来の手段によって調製した活性化形態の負荷すべき特定の薬物、毒素、キレート剤、免疫調節薬、ホウ素添加物、または他の治療薬の誘導体（好ましくは、カルボキシル活性化誘導体）と反応させて、中間体付加物を形成する。
【０３２４】
あるいは、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質またはリシンＡ鎖などのポリペプチド毒素を、グルタルアルデヒド縮合またはアミノデキストランにおけるアミンとの活性化カルボキシル基の反応によってアミノデキストランにカップリングすることができる。
【０３２５】
放射性金属または磁気共鳴エンハンサーのためのキレート剤は、当該分野で周知である。典型的なキレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびジエチレントリアミノ五酢酸（ＤＴＰＡ）の誘導体である。これらのキレート剤は、典型的には、キレート剤をキャリアに結合することができる側鎖上の基を有する。このような基には、例えば、ＤＴＰＡまたはＥＤＴＡをキャリアのアミン基にカップリングすることができるベンジルイソチオシアネートが含まれる。あるいは、キレート剤上のカルボキシル基またはアミン基を、全て周知の手段により、活性化によってキャリアにカップリングするか、誘導体化後にカップリングすることができる。
【０３２６】
カルボランなどのホウ素添加物を、従来の方法によって抗体成分に結合することができる。例えば、当該分野で周知のように、ペンダント側鎖上のカルボキシル基を使用してカルボランを調製することができる。このようなキャリア（例えば、デキストラン）へのカルボランの結合を、カルボランのカルボキシル基活性化およびキャリア上のアミンとの縮合によって行い、中間接合体を生成することができる。次いで、下記のように、このような中間接合体を抗体成分に結合させて、治療に有用な免疫接合体を生成する。
【０３２７】
アミノデキストランの代わりにポリペプチドキャリアを使用することができるが、ポリペプチドキャリアは、鎖中に少なくとも５０アミノ酸残基、好ましくは１００〜５０００アミン酸残基を有するべきである。少なくともいくつかのアミノ酸残基は、リジン残基、グルタミン酸残基、またはアスパラギン酸残基であるべきである。リジン残基のペンダントアミンならびにグルタミンおよびアスパラギン酸のペンダントカルボキシレートは、薬物、毒素、免疫調節薬、キレート剤、ホウ素添加物、または他の治療薬への結合に都合がよい。適切なポリペプチドキャリアの例には、得られた負荷キャリアおよび免疫接合体に望ましい溶解性を付与するためのポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、そのコポリマー、これらのアミノ酸および他のアミノ酸（例えば、セリン）の混合ポリマーが含まれる。
【０３２８】
中間接合体の抗体成分との接合を、抗体成分の炭水化物部分の酸化および薬物、毒素、キレート剤、免疫調節薬、ホウ素添加物、または他の治療薬の負荷後の得られたアルデヒド（およびケトン）カルボニルとキャリア上に残存するアミン基との反応によって行う。あるいは、中間接合体を、治療薬の負荷後に中間接合体中に導入したアミン基を介して酸化抗体成分に結合することができる。ＮａＩＯ４または他の解糖試薬を使用して化学的に酸化するか、例えば、ノイラミニダーゼおよびガラクトースオキシダーゼを使用して酵素的に酸化することが都合がよい。アミノデキストランキャリアの場合、アミノデキストランの全てのアミンを治療薬の負荷に使用するわけではない。アミノデキストランの残存アミンを、酸化抗体成分と縮合して、シッフ塩基付加物を形成し、次いで、通常、ホウ化水素還元剤を使用して還元的に安定化する。
【０３２９】
類似の手順を使用して、本発明にしたがって他の免疫接合体を生成する。負荷したポリペプチドキャリアは、好ましくは、抗体成分の酸化炭水化物部分との縮合のための残存する遊離リジン残基を有する。ポリペプチドキャリア上のカルボキシルを、必要に応じて、例えば、ＤＣＣでの活性化および過剰なジアミンとの反応によってアミンに変換することができる。
【０３３０】
最終免疫接合体を、従来の技術（ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００によるサイジングクロマトグラフィまたは１つもしくは複数のＣＤ８４Ｈｙエピトープを使用したアフィニティクロマトグラフィなど）を使用して精製する。
【０３３１】
あるいは、抗体成分の治療薬との直接接合によって免疫接合体を調製することができる。一般的手順は、治療薬を酸化抗体成分に直接結合すること以外は間接的接合方法に類似する。例えば、半減期を延長するために、抗体の炭水化物部分を、ポリエチレングリコールに結合することができる。
【０３３２】
本明細書中に記載のキレート剤を他の治療薬と置換することができると認識される。当業者は、過剰に実験することなく接合スキームを開発することができるであろう。
【０３３３】
さらなる説明として、治療薬を、ジスルフィド結合形成を介して還元抗体成分のヒンジ領域に結合することができる。例えば、破傷風毒素ペプチドを１つのシステイン残基を使用して構築し、これを使用して、抗体成分にペプチドを結合することができる。代替として、このようなペプチドを、Ｎ−スクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロピロネート（ＳＰＤＰ）などのヘテロ二官能性架橋剤を使用して抗体成分に結合することができる。Ｙｕら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５６：２４４（１９９４）。このような一般的接合技術は、当該分野で周知である。例えば、Ｗｏｎｇ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）；Ｕｐｅｓｌａｃｉｓら、”Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，”ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｒｃｈら（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  １８７−２３０（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）；Ｐｒｉｃｅ，”Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｒｉｔｔｅｒら（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  ６０−８４（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）を参照のこと。
【０３３４】
抗体と細胞傷害薬との接合体を、種々の二官能性タンパク質カップリング剤（Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（塩酸ジメチルアジピミデートなど）、活性エステル（ジスクシニミジル基質など）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−イミダゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トリエン２，６−ジイソシアネートなど）、およびビス活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）など）を使用して作製する。例えば、リシン免疫毒素を、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７）に記載のように調製することができる。１４Ｃ標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性核種の接合のための例示的キレート剤である（例えば、ＷＯ９４／１１０２６号を参照のこと）。
【０３３５】
上記のように、抗体のＦｃ領域中の炭水化物部分を使用して、治療薬を接合することができる。しかし、抗体フラグメントを免疫接合体の抗体成分として使用する場合にＦｃ領域が存在し得る。それにもかかわらず、炭水化物部分を抗体の軽鎖可変領域または抗体フラグメントに導入することが可能である。例えば、Ｌｅｕｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５９１９（１９９５）；Ｈａｎｓｅｎらの米国特許第５，４４３，９５３号を参照のこと。次いで、操作炭水化物部分を、治療薬に結合する。
【０３３６】
さらに、当業者は、接合方法の多数の可能な変形形態を認識している。例えば、炭水化物部分を使用してポリエチレングリコールに結合し、血液、リンパ、または他の細胞外液中のインタクトな抗体またはその抗原結合フラグメントの半減期を延長することができる。さらに、炭水化物部分および遊離スルフヒドリル基に治療薬を結合させることによって「２価免疫接合体」を構築することが可能である。このような遊離スルフヒドリル基を、抗体成分のヒンジ領域中に配置することができる。
【０３３７】
抗Ｍ−ＣＳＦ抗体融合タンパク質
本発明は、１つまたは複数の抗Ｍ−ＣＳＦ抗体部分および別のポリペプチド（免疫調節薬または毒素部分など）を含む融合タンパク質の使用を意図する。抗体融合タンパク質の作製方法は、当該分野で周知である。例えば、米国特許第６，３０６，３９３号を参照のこと。インターロイキン−２部分を含む抗体融合タンパク質は、Ｂｏｌｅｔｉら、Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．６：９４５（１９９５）、Ｎｉｃｏｌｅｔら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：１６１（１９９５），Ｂｅｃｋｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：７８２６（１９９６）、Ｈａｎｋら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２：１９５１（１９９６）、およびＨｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：４９９８（１９９６）に記載されている。さらに、Ｙａｎｇら、Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ６：１２９（１９９５）は、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントおよび腫瘍壊死因子α部分を含む融合タンパク質を記載している。
【０３３８】
組換え分子が１つまたは複数の抗体成分および毒素または化学療法薬を含む抗体−毒素融合タンパク質の作製方法も当業者に公知である。例えば、抗体−シュードモナス外毒素Ａ融合タンパク質は、Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：３９４（１９８９），Ｂｒｉｎｋｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８６１６（１９９１），Ｂａｔｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５８６７（１９９２），Ｆｒｉｅｄｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：３０５４（１９９３），Ｗｅｌｓら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎ．６０：１３７（１９９５），Ｆｏｍｉｎａｙａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１０５６０（１９９６），Ｋｕａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：２８７２（１９９６）、およびＳｃｈｍｉｄｔら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎ．６５：５３８（１９９６）に記載されている。ジフテリア毒素部分を含む抗体−毒素融合タンパク質は、Ｋｒｅｉｔｍａｎら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ７：５５３（１９９３），Ｎｉｃｈｏｌｌｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：５３０２（１９９３），Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２８０３７（１９９５）、およびＶａｌｌｅｒａら、Ｂｌｏｏｄ  ８８：２３４２（１９９６）に記載されている。Ｄｅｏｎａｒａｉｎら、Ｔｕｍｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  １：１７７（１９９５）は、ＲＮアーゼ部分を有する抗体−毒素融合タンパク質を記載している一方で、Ｌｉｎａｒｄｏｕら、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４−２５：２４３（１９９４）は、ＤＮアーゼＩ成分を含む抗体−毒素融合タンパク質を生成している。Ｗａｎｇら、Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ２０９ｔｈ  ＡＣＳ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ａｎａｈｅｉｍ，Ｃａｌｉｆ，Ａｐｒ．２−６，１９９５，Ｐａｒｔ  １，ＢＩＯＴ００５の抗体−毒素融合タンパク質中の毒素部分としてゲロニンを使用した。さらなる例として、Ｄｏｈｌｓｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：８９４５（１９９４）は、ブドウ球菌エンテロトキシンＡを含む抗体−毒素融合タンパク質を報告している。
【０３３９】
このような接合体の調製で適切に使用される毒素の例は、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、およびシュードモナス内毒素である。例えば、Ｐａｓｔａｎら、Ｃｅｌｌ  ４７：６４１（１９８６）およびＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，ＣＡ−Ａ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ  ４４：４３（１９９４）を参照のこと。他の適切な毒素は、当業者に公知である。
【０３４０】
本発明の抗体を、プロドラッグに変換されるプロドラッグ活性化酵素（例えば、ペプチジル化学療法薬、ＷＯ８１／０１１４５号を参照のこと）への抗体の接合によってＡＤＥＰＴ中で使用することもできる。例えば、ＷＯ８８／０７３７８号および米国特許第４，９７５，２７８号を参照のこと。
【０３４１】
ＡＤＥＰＴに有用な免疫接合体の酵素生物には、そのより活性な細胞傷害性形態に変化するような方法で、プロドラッグに対して作用することができる任意の酵素が含まれる。
【０３４２】
本発明の方法で有用な酵素には、リン酸塩含有プロドラッグの遊離薬への変換に有用なアルカリホスファターゼ、硫酸塩含有プロドラッグの遊離薬への変換に有用なアリールスルファターゼ、非毒性５−フルオロシトシンの抗癌薬５−フルオロウラシルへの変換に有用なシトシンデアミナーゼ、ペプチド含有プロドラッグの遊離薬への変換に有用なプロテアーゼ（セラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ、およびカテプシン（カテプシンＢおよびＬなど）など）、Ｄ−アミノ酸置換基を含むプロドラッグへの変換に有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ、グリコシル化プロドラッグの遊離薬への変換に有用な炭水化物切断酵素（β−ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼなど）、β−ラクタムを使用して誘導体化した薬物の遊離薬への変換に有用なβ−ラクタマーゼ、それぞれフェノキシアセチルまたはフェニルアセチル基を使用してアミン窒素で誘導体化した薬物の遊離薬への変換に有用なペニシリンアミダーゼ（ペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼなど）が含まれるが、これらに限定されない。あるいは、酵素活性を有する抗体もアブザイムとして公知であり、これを使用して、本発明のプロドラッグを遊離活性薬に変換することができる（例えば、Ｍａｓｓｅｙ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：４５７−４５８（１９８７）を参照のこと）。抗体−アブザイム接合体を、腫瘍細胞集団へのアブザイムの送達について本明細書中に記載のように調製することができる。
【０３４３】
本発明の酵素を、当該分野で周知の技術（上記で考察のヘテロ二官能性架橋試薬の使用など）によって抗体に共有結合することができる。あるいは、本発明の抗体の少なくとも機能活性部分に連結した本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を含む融合タンパク質を、当該分野で周知の組換えＤＮＡ技術を使用して構築することができる（例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８（１９８４））。
【０３４４】
非治療用途
本発明の抗体を、Ｍ−ＣＳＦのアフィニティ精製として、またはＭ−ＣＳＦタンパク質の診断アッセイ（例えば、特定の細胞、組織、または血清中での発現の検出）で使用することができる。抗体を、インビボ診断アッセイのために使用することもできる。一般に、これらの目的のために、メンエキシンチオグラフィを使用して局在化することができるように、抗体を放射線核種（１１１Ｉ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、３Ｈ、３２Ｐ、または３５Ｓなど）で標識する。
【０３４５】
本発明の抗体を、任意の抗体のアッセイ方法（競合結合アッセイ、ＥＬＩＳＡなどの直接および間接的サンドイッチアッセイ、および免疫沈降アッセイ）で使用することができる。Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７）。免疫組織化学において当該分野で公知の方法を使用して腫瘍サンプルを標識するために抗体を使用することもできる。
【０３４６】
便宜上、本発明の抗体を、キット中で提供することができる（すなわち、診断アッセイ実施のための説明書と共に包装された所定量の試薬の組み合わせ）。抗体を酵素で標識する場合、キットは、酵素によって必要とされる基質および補因子（例えば、検出可能な発色団またはフルオロフォアが得られる基質前駆体）を含む。さらに、緩衝液（すなわち、ブロッキング緩衝液または溶解緩衝液）などの他の添加物を含めることができる。相対量の種々の試薬を、アッセイの感度を実質的に最適にする試薬溶液中の濃度が得られるように広範に変化させることができる。特に、通常は凍結乾燥された乾燥粉末試薬（溶解時に適切な濃度の試薬溶液が得られる賦形剤が含まれる）を提供することができる。
【０３４７】
本発明を以下の実施例によって説明するが、本発明を制限することを決して意図していない。
【実施例】
【０３４８】
実施例１
本実施例は、Ｍ−ＣＳＦ抗体であるＲＸ１および５Ａ１が種特異的であり、抗体ＲＸ１、ＭＣ１、およびＭＣ３がヒトＭ−ＣＳＦ活性を中和することを示す。ＲＸ１は、市販の抗体であり、本願の出願日の１年以上前から利用可能であった。例示的な販売者は、マウス抗ヒトＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体クローン１１６、６９２、および２１（Ａｎｏｇｅｎ）、抗ヒトＭ−ＣＳＦ抗体クローン２１１１３．１３１、２６７３０、および２６７８６（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、ならびに抗ヒトＭ−ＣＳＦ抗体クローンＭ１６（Ａｎｔｉｇｅｎｉｘ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．）が含まれるが、これらに限定されない。
【０３４９】
ＲＸ１および５Ａ１の中和活性を試験するために、Ｍ−ＮＦＳ−６０細胞株の増殖アッセイを使用した（ＡＴＣＣ  ｉｎ  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡから利用可能なＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１８３８、Ｃａｓ−Ｂｒ−ＭｕＬＶ野生マウスエコトロピックレトロウイルスで誘導された骨髄性白血病由来であり、インターロイキン３およびＭ−ＣＳＦの両方に応答し、レトロウイルスの組み込みに起因する短縮ｃ−ｍｙｂ癌原遺伝子を含む）。Ｍ−ＮＦＳ−６０の増殖には、用量依存様式で活性なＭ−ＣＳＦが必要である。アッセイでは、Ｍ−ＮＦＳ−６０細胞を洗浄し、１０％ＦＢＳ、３０００Ｕ／ｍｌのＭ−ＣＳＦ、および１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含むＲＰＭＩ１６４０培地中にプレートした。ヒトまたはマウスに特異的な組換えヒトＭ−ＣＳＦ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）を、種々の濃度の抗体と、インキュベーター中、５％ＣＯ２にて３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、混合物を、９６ウェルプレート中のＭ−ＮＦＳ−６０培地に添加した。ウェルあたりの総アッセイ体積は１００μｌであり、１０ｎｇ／ｍｌ  Ｍ−ＣＳＦを含み、抗体濃度を図５に示した。細胞を、５％ＣＯ２下にて３７℃で７２時間インキュベートし、その後、細胞数をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって定量した。上記アッセイを、抗体ＭＣ３およびＭＣ１のために繰り返した。
【０３５０】
図５に示すように、Ｍ−ＣＳＦ抗体であるＲＸ１および５Ａ１は種特異的である。細胞増殖を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏアッセイからの蛍光の読み取りとして示し、この読み取りは、細胞数に比例する。ＲＸ１および５Ａ１の種特異的中和活性を、そのヒトまたはマウスＭ−ＣＳＦのいずれかの存在下でＭ−ＮＦＳ−６０を阻害する能力によって示す。最後に、図５Ｂに示すように、抗体ＭＣ３およびＭＣ１はまた、ヒトＭ−ＣＳＦ活性の有効なインヒビターである。
【０３５１】
実施例２
本実施例は、抗体ＲＸ１が５ｍｇ／ｋｇの用量で、ヒト異種移植片モデルで骨溶解を阻害することを示す。４〜７週齢で平均体重が約２０ｇであるの雌ヌードマウスを、本研究に使用した。１０μｌ生理食塩水中に懸濁した腫瘍細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、３×１０５）を、骨髄腔の右脛骨に注射した。ベースライン画像を得て、注射に起因する骨折をチェックするために腫瘍接種から１日後に後肢のＸ線写真を撮影した。マウスを、群あたり１０匹のマウスで、５ｍｇ／ｋｇのＰＢＳおよびＲＸ１を１週間に１回６週間ｉ．ｐ．注射する治療群に無作為に分類した。研究終了後、後肢のＸ線写真を再度撮影し、骨損傷についてベースラインと比較した。腫瘍に起因する骨損傷の程度を、図６に示すように定義した。ＲＸ１  ５ｍｇ／ｋｇの処置群は、腫瘍に起因する障害からの骨の統計的に有意な防御を示した。
【０３５２】
実施例３
本実施例は、抗体ＲＸ１をヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１保有ヌードマウスに５ｍｇ／ｋｇの濃度で投与した場合に転移数が減少することを示す。
【０３５３】
４〜７週齢で平均体重が約２０ｇである雌ヌードマウスを本研究に使用した。１０μｌ生理食塩水中に懸濁した腫瘍細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、３×１０５）を、骨髄腔の右脛骨に注射した。ベースライン画像を得て、注射に起因する骨折をチェックするために腫瘍接種から１日後に後肢のＸ線写真を撮影した。マウスを、５ｍｇ／ｋｇのＰＢＳおよびＲＸ１を１週間に１回６週間ｉ．ｐ．注射する治療群に無作為に分類した。研究終了後、各治療群の肺を採取し、転移性肺小結節の計数のためにブアン液中で固定した。
【０３５４】
図７に示すように、抗体ＲＸ１を５ｍｇ／ｋｇの用量でヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１保有ヌードマウスに投与した場合に転移数が減少する。
【０３５５】
実施例４
本実施例は、ＲＸ１抗体のヒト化手順を示す。５Ｈ４、ＭＣ１、およびＭＣ３を、類似の手順を使用してヒト化する。
【０３５６】
ヒト化ＲＸ１軽鎖および重鎖の遺伝子設計
マウスＲＸ１のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図４Ｂに示す。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅまたは類似のデータベースを使用して同定したヒト抗体の配列を使用して、ヒト化抗体のフレームワークを得る。ヒト化抗重鎖配列を選択するために、マウスＲＸ１重鎖配列を、ヒト抗体重鎖配列と整列させる。各位置では、ヒト抗体アミノ酸をヒト化抗体について選択し、位置が以下に定義の４つのカテゴリーのいずれか１つに分類されない場合、マウスＲＸ１アミノ酸を選択する：
（１）この位置は、Ｋａｂａｔ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２５，９６１−９６９（１９８０）に定義の相補性決定領域（ＣＤＲ）内に含まれるか；
（２）ヒト抗体アミノ酸は、この位置でヒト重鎖には稀であるのに対して、マウスＲＸ１アミノ酸はこの位置のヒト重鎖と共通であるか；
（３）位置は、マウスＲＸ１重鎖のアミノ酸配列中のＣＤＲに直接隣接しているか；または
（４）マウスＲＸ１抗体の三次元モデリングにより、アミノ酸が抗原結合領域に物理的に近いことが示唆される。
【０３５７】
ヒト化抗軽鎖配列を選択するために、マウスＲＸ１軽鎖配列をヒト抗体軽鎖配列と整列させる。各位置では、ヒト化抗体のためにヒト抗体アミノ酸を選択し、位置が上記カテゴリーの１つに分類されない場合、以下を繰り返す：
（１）ＣＤＲ；
（２）ヒト抗体よりも典型的なマウスＲＸ１アミノ酸；
（３）ＣＤＲへの隣接；または
（４）結合領域に対する可能な三次元近接性。
【０３５８】
重鎖および軽鎖の遺伝子の実際のヌクレオチド配列を、以下のように選択する：
（１）ヌクレオチド配列は、上記のように選択したアミノ酸配列をコードする；
（２）コード配列の５’のヌクレオチド配列は、リーダー（シグナル）配列をコードする。これらのリーダー配列を、典型的な抗体として選択した；
（３）コード配列の３’のヌクレオチド配列は、マウスＲＸ１配列の一部であるマウス軽鎖Ｊ５セグメントおよびマウス重鎖Ｊ２セグメントが後に続く配列である。スプライスドナーシグナルを含むので、これらの配列が含まれる；そして
（４）各末端で、配列は、ＸｂａＩ部位で切断され、ベクターのＸｂａＩ部位にクローニングするＸｂａＩ部位である。
【０３５９】
ヒト化軽鎖および重鎖遺伝子の構築
重鎖を合成するために、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３８０ＢＤＮＡ合成機を使用して４つのポリヌクレオチドを合成する。これらのオリゴヌクレオチドのうちの２つは、重鎖の各鎖の一部であり、各オリゴヌクレオチドはアニーリングするために約２０ヌクレオチドまで次の１つと重複している。まとめると、オリゴヌクレオチドは全ヒト重鎖可変領域をカバーし、各末端にＸｂａＩ部位で切断するためのいくつかの過剰なヌクレオチドを有する。オリゴヌクレオチドは、ポリアクリルアミドから精製する。
【０３６０】
各オリゴヌクレオチドを、標準的な手順によってＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用してリン酸化する（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））。リン酸化オリゴヌクレオチドをアニーリングするために、これらを、４０μｌのＴＡ（３３ｍＭ  Ｔｒｉｓ酢酸、ｐＨ７．９、６６ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム）中にそれぞれ約３．７５μＭの濃度で互いに懸濁し、９５℃で４分間加熱し、４℃にゆっくり冷却する。各オリゴヌクレオチドの反対の鎖の合成によってオリゴヌクレオチドから完全な遺伝子を合成するために、以下の成分を添加し、最終体積を１００μｌにする。
【０３６１】
１０μｌ            アニーリングしたオリゴヌクレオチド
０．１６ｍＭ        各デオキシリボヌクレオチド
０．５ｍＭ          ＡＴＰ
０．５ｍＭ          ＤＴＴ
１００μｇ／ｍｌ    ＢＳＡ
３．５μｇ／ｍｌ    Ｔ４ｇ４３タンパク質（ＤＮＡポリメラーゼ）
２５μｇ／ｍｌ      Ｔ４ｇ４４／６２タンパク質（ポリメラーゼアクセサリータンパク質）
２５μｇ／ｍｌ      ４５タンパク質（ポリメラーゼアクセサリータンパク質）
混合物を、３７℃で３０分間インキュベートする。１０μのＴ４ＤＮＡリガーゼを添加し、再度３７℃で３０分間インキュベートした。ポリメラーゼおよびリガーゼを、７０℃で１５分間の反応物のインキュベーションによって活性化する。ＸｂａＩで遺伝子を消化するために、２００μｇ／ｍｌのＢＳＡ、１ｍＭのＤＴＴ、４３μｌの水、および５μｌの５０μのＸｂａＩを含む５０μｌの２×ＴＡを反応物に添加する。反応物を３７℃で３時間インキュベートし、ゲルで精製する。ゲルからＸｂａＩフラグメントを精製し、標準的な方法によってプラスミドｐＵＣ１９のＸｂａＩ部位にクローニングする。プラスミドを標準的な技術を使用して精製し、ジデオキシ法を使用して配列決定する。
【０３６２】
ヒト化軽鎖および重鎖を発現するためのプラスミドを、挿入されたｐＵＣ１９プラスミドからの軽鎖および重鎖のＸｂａＩフラグメントの単離およびその後の適切な宿主細胞にトランスフェクションした場合に高レベルの完全な重鎖を発現する適切な発現ベクターのＸｂａＩ部位への挿入によって構築する。
【０３６３】
ヒト化抗体の合成および親和性
発現ベクターを、マウスＳｐ２／０細胞にトランスフェクションし、プラスミドに組み込んだ細胞を、標準的方法によって発現ベクターに付与された選択マーカーに基づいて選択する。Ｍ−ＣＳＦに結合する抗体を分泌するこれらの細胞を検証するために、細胞由来の上清を、Ｍ−ＣＳＦを発現することが公知の細胞とインキュベートする。洗浄後、細胞を、フルオレセイン接合ヤギ抗ヒト抗体とインキュベートし、洗浄し、ＦＡＣＳＡＮサイトフルオロメーターによって蛍光について分析する。
【０３６４】
次の実験のために、ヒト化抗体を産生する細胞をマウスに注射し、得られた腹水を回収する。ヒト化抗体を、標準的技術にしたがってＡｆｆｉｇｅｌ−１０支持体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｃａｌｉｆ．）にて調製したヤギ抗ヒト免疫グロブリン抗体のアフィニティカラムの通過によって腹水から実質的に均一に精製する。元のマウスＲＸ１抗体と比較してヒト化抗体の親和性を決定するために、当該分野で公知の技術にしたがって、競合結合実験を行う。
【０３６５】
実施例５
本実施例は、ヒト操作（商標）ＲＸ１抗体のクローニングおよび発現、ならびにこのような抗体の精製および結合活性の試験を記載する。ヒト操作（商標）５Ｈ４、ＭＣ１、およびＭＣ３抗体を、類似の手順を使用して調製する。
【０３６６】
ヒト操作（商標）配列の設計
抗体可変ドメインのヒト操作（商標）は、抗体分子の結合活性を維持しながら免疫原性を減少させる方法としてＳｔｕｄｎｉｃｋａ（例えば、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、米国特許第５，７６６，８８６号；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７：８０５−８１４（１９９４））に記載されている。本方法によれば、各可変領域のアミノ酸に置換リスクを割り当てた。アミノ酸置換を、以下の３つのリスクカテゴリーのうちの１つによって区別する：（１）免疫原性を減少させる可能性が最も低く、且つ抗原結合が破壊される機会が最も少ない低リスクの変化；（２）免疫原性をさらに減少させるであろうが、抗原結合またはタンパク質折り畳みに影響を及ぼす機会がより多い中程度のリスク変化；（３）高リスク残基は、結合または抗体構造の維持に重要であり、且つ抗原結合またはタンパク質折り畳みに影響を及ぼすリスクが最も高い残基である。プロリンの三次元構造における役割のために、プロリンの修飾は、この位置が典型的には低リスクの位置である場合でさえも、一般に、少なくとも中程度のリスクの変化であると見なされる。実質的な変化が好ましいが、挿入および欠失も可能である。図４Ｂおよび４Ｃは、それぞれ高リスク、中程度のリスク、または低リスクの変化として分類したマウスＲＸ１軽鎖および重鎖の各アミノ酸残基についてのリスク割り当てを示す。
【０３６７】
マウスＲＸ１抗体の軽鎖および重鎖の可変領域を、この方法を使用してヒト操作（商標）した。この方法による低リスクの位置での修飾の候補であるアミノ酸残基を、マウス可変領域のアミノ酸配列とヒト可変領域の配列との整列によって同定した。任意のヒト可変領域を使用することができ、これには、各ＶＨもしくはＶＬ配列またはヒトコンセンサスＶＨもしくはＶＬ配列が含まれる。多数の低リスクの位置または全ての低リスクの位置のアミノ酸残基を変化させることができる。図１９Ａ〜Ｂ中のヒト操作「低リスク」重鎖配列のために、ヒトコンセンサスＶｈ２（Ｋａｂａｔに基づく）をテンプレートとして使用し、マウスおよびヒトアミノ酸残基が低リスク位置で異なる各位置のために、マウス残基をヒト残基置換したアミノ酸修飾を導入した。図２０Ａ〜Ｂ中のヒト操作（商標）「低リスク」鎖配列のために、ヒトコンセンサスκ３（Ｋａｂａｔに基づく）をテンプレートとして使用し、マウスおよびヒトアミノ酸残基が低リスク位置で異なる各位置のために、マウス残基をヒト残基置換したアミノ酸修飾を導入した。全部で軽鎖に対して１６のアミノ酸低リスク修飾を行い、重鎖に対して８つの低リスク修飾を行った。
【０３６８】
同様に、全ての低リスク位置および中程度のリスク位置での本方法による修飾の候補であるアミノ酸残基を、マウス可変領域のアミノ酸配列とヒト可変領域の配列との整列によって同定した。多数の低リスク位置もしくは中程度のリスクの位置または全ての低リスク位置もしくは中程度のリスクの位置のアミノ酸残基を変化させることができる。図１９Ａ〜Ｂ中のヒト操作（商標）重鎖配列のために、ヒトコンセンサスＶｈ２（Ｋａｂａｔに基づく）をテンプレートとして使用し、マウスおよびヒトアミノ酸残基が低リスク位置および中程度のリスクの位置で異なる各位置のために、マウス残基をヒト残基置換したアミノ酸修飾を導入した。図２０Ａ〜Ｂ中のヒト操作（商標）軽鎖配列のために、ヒトコンセンサスκ３（Ｋａｂａｔに基づく）をテンプレートとして使用し、マウスおよびヒトアミノ酸残基が低リスク位置または中程度のリスクの位置で異なる各位置のために、マウス残基をヒト残基置換したアミノ酸修飾を導入した。全部で軽鎖に対して１９の低リスクおよび中程度のリスクのアミノ酸修飾を行い、重鎖に対して１２の低リスクおよび中程度のリスクの修飾を行った。
【０３６９】
図２１Ａ〜Ｂに示すように、５４位での修飾をマウスに戻す「別の低リスク」軽鎖配列も調製した。図２１Ａ〜Ｂに示すように、５４〜５６位の修飾をマウスに戻す「別の低リスク＋中程度のリスク」軽鎖配列も調製した。
【０３７０】
最後に、図２２Ａ〜Ｂに示すように、テンプレートとしてヒト生殖系列ＶＫ６亜群２−１−（１）Ａ１４を使用して、ヒト操作（商標）「低リスク＋中程度のリスク」軽鎖Ｖ領域配列も産生した。
【０３７１】
本発明は、グリコシル化部位を示す図４Ａの残存アミノ酸４１〜４３（ＮＧＳ）も意図する。あるいは、２つのアミノ酸４１〜４３（例えば、ＮＧ）の１つのみを保持することができる。
【０３７２】
恒久的細胞株開発のための発現ベクターの調製
抗体由来シグナル配列と共に上記重鎖および軽鎖のＶ領域配列をそれぞれコードするＤＮＡフラグメントを、合成的ヌクレオチド合成を使用して構築した。上記の軽鎖Ｖ領域アミノ酸配列をそれぞれコードするＤＮＡを、ヒトκ軽鎖定常領域を含むベクターｐＭＸＰ１０に挿入した。上記の重鎖Ｖ領域アミノ酸配列をそれぞれコードするＤＮＡを、ヒトγ−２重鎖定常領域を含むベクターｐＭＸＰ６に挿入した。図２９Ａ、２９ｂ、および３０に示す配列を有するヒトγ−１（ｃＤＮＡ）およびγ−４（ゲノムおよびｃＤＮＡ）定常領域に融合した重鎖Ｖ領域アミノ酸配列を含むさらなるベクターを構築した。これら全てのベクターは、ｈＣＭＶプロモーターおよびマウスκ軽鎖３’非翻訳領域ならびにＧ４１８またはヒスチジノール耐性トランスフェクタントの選択のためのｎｅｏまたはｈｉｓなどの選択マーカー遺伝子を含む。軽鎖および重鎖ベクターを、表２および３にそれぞれ記載する。
【０３７３】
【化２２】
2009502952.tif 000019
次いで、所望のヒト操作（商標）軽鎖遺伝子＋重鎖遺伝子を含むベクター（γ−１、γ−２、およびγ−４）を構築した。これらの「２−遺伝子」ベクターは、ｈＣＭＶプロモーターの調節下で各抗体鎖（重鎖および軽鎖）をコードする遺伝子、ＣＭＶスプライスドナー、ＳＶ４０１６Ｓスプライスアクセプター、およびポリＡ部位を含むマウスκ軽鎖３’非翻訳ＤＮＡを含む。これらはまた、ｎｅｏまたはｈｉｓなどの選択マーカー遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子を含む。重鎖および軽鎖の遺伝子を含むベクターを、表４に記載する。軽鎖および重鎖の各遺伝子の２つのコピーを含むベクター（４つの遺伝子ベクター）を構築することもできる。
【０３７４】
【化２３】
2009502952.tif 000020
【０３７５】
【化２４】
2009502952.tif 000021
一過性発現のための発現ベクターの調製
上記の軽鎖および重鎖の遺伝子のいずれかを含むベクターも一過性トランスフェクションのために構築した。これらのベクターは、ｎｅｏまたはｈｉｓ遺伝子のかわりにベクターがエプスタイン−バーウイルス核抗原を発現するＨＥＫ２９３細胞中の複製のためのエプスタイン−バーウイルスｏｒｉＰを含むこと以外は上記の恒久的トランスフェクションのためのベクターと類似している。一過性トランスフェクションのためのベクターを、表５および６に記載する。
【０３７６】
【化２５】
2009502952.tif 000022
ＨＥＫ２９３Ｅ細胞におけるヒト操作ＲＸ１の一過性発現
上記のエプスタイン−バーウイルス由来のｏｒｉＰおよび軽鎖および重鎖の遺伝子をそれぞれ含む個別のベクターを、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞に一過性にトランスフェクションした。一過性にトランスフェクションした細胞を、１０日間までインキュベートし、その後、上清を回収し、プロテインＡクロマトグラフィを使用して抗体を精製した。２９３Ｅ細胞の一過性トランスフェクションによって産生された抗体を、以下の表７に記載する。
【０３７７】
【化２６】
2009502952.tif 000023
恒久的にトランスフェクションされたＣＨＯ−Ｋ１細胞の開発
軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子の１つの各コピーを共に含む上記ベクター（表４）を、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ３０２適合ＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクションする。Ｅｘ−Ｃｅｌｌ３０２培地中での浮遊培養に適合したＣＨＯ−Ｋ１細胞を、典型的には、４０μｇの線状化ベクターを使用してエレクトロポレーションを行う。あるいは、線状化ＤＮＡを、線状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と複合体化し、トランスフェクションに使用することができる。細胞を、１％ＦＢＳおよびＧ４１８を補足したＥｘ−Ｃｅｌｌ３０２培地を含む９６ウェルプレート中にプレートする。９６ウェルプレート中でクローンをスクリーニングし、各トランスフェクション由来の約１０％のクローンを、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ３０２培地を含む２４ウェルプレートに移す。
【０３７８】
７日間および１４日間成長させた培養物について、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ３０２培地を含む２４ウェルプレート中で産生性試験を行い、この時点で、培養上清をＩｇＧについての免疫グロブリンＥＬＩＳＡアッセイによって分泌抗体レベルを試験する。
【０３７９】
上部のクローンを、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ３０２培地を含む震盪フラスコに移す。細胞を浮遊培養での成長に適合させるとすぐに、これらのクローンを含むＥｘ−Ｃｅｌｌ３０２培地を使用して震盪フラスコ試験を行う。細胞を、２５ｍｌの培地を含む１２５ｍｌのエルレンマイヤーフラスコで１０日間まで成長させる。フラスコを、ガス交換のためにインキュベーション期間の少なくとも１日おきに開け、インキュベーション期間の終了時に培養培地中の免疫グロブリンポリペプチドレベルを、ＩｇＧＥＬＩＳＡによって決定する。２つまたは３つの多単位転写ベクターでの同一細胞株の複数の連続的トランスフェクションにより、免疫グロブリン産生レベルが、好ましくは３００μｇ／ｍｌまたはそれを超えてさらに増加するクローンおよび細胞株が得られる。
【０３８０】
精製
本発明によるベクターおよび全株からの免疫グロブリンポリペプチドの精製過程を設計することができる。当該分野で周知の方法によれば、当該分野で周知の方法にしたがって、細胞を、終了後の濾過によって取り出す。濾過物を、プロテインＡカラムにロードする（必要に応じて、複数回通過させる）。カラムを洗浄し、次いで、発現および分泌した免疫グロブリンポリペプチドを、カラムから溶離する。抗体生成物の調製のために、プロテインＡのプールを、ウイルス不活化工程として低ｐＨ（最短で３０分間および最長で１時間ｐＨ３にする）に保持する。次いで、吸着陽イオン交換工程を使用して、生成物をさらに精製する。吸着分離カラムからの溶離物を、ウイルス保持フィルターに通して、潜在的なウイルス粒子のさらなる清浄化を行う。濾過物を、生成物が結合しない陰イオン交換カラムへの通過によってさらに精製する。最後に、ダイアフィルトレーションによってフォームレーション緩衝液（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）に生成物を移すことによって精製過程を終了する。保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を、少なくとも１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度に調整し、安定剤を添加する。
【０３８１】
結合活性
組換えヒト操作（商標）抗体のＭＣＳＦ結合活性を評価する。プロテインＡカラムの通過およびその後のＡ２８０での濃度の決定によって、震盪フラスコ培養上清からタンパク質を精製する。上記の実施例１および下記の実施例１３に記載のように、結合アッセイを行う。マイクロプレートに固定するために、ＩｍｍｕｌｏｎＩＩプレートに、ＰＢＳコーティング液中で予め希釈したｓＭ−ＣＳＦ抗原でプレコーティングする。０．２５〜２０μｇ／ｍｌの範囲の種々の試験濃度のＭ−ＣＳＦを５０μｌ／ウェルで添加し、４℃で一晩インキュベートする。次いで、プレートを、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄する。ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ１％ＢＳＡ中への添加およびその後の３７℃でのインキュベーションによってブロッキングする。免疫グロブリンポリペプチドの希釈物を、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ１％ＢＳＡ溶液中に調製する。２倍または３倍連続希釈物を調製し、二連または三連で添加する（１００μｌ／ウェル）。３７℃で９０分のインキュベーション後、マイクロプレートを、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄する。シグナル発生のために、ペルオキシダーゼに接合したヤギ抗ヒトＩｇＧ（γまたはＦｃ特異的）二次抗体を各ウェルに添加し、３７℃で６０分間インキュベートし、その後、０．４ｍｇ／ｍｌのＯＰＤを含むクエン酸緩衝液＋０．０１２％Ｈ２Ｏ２を添加する。室温で５〜１０分後、１００μｌの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４の添加によってアッセイを停止させ、４９０ｎｍでプレートを読み取る。ヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ特異的）およびヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体の両方を使用した。
【０３８２】
実施例６
以下の実施例は、ＲＸ−１由来抗体またはＲＸ１競合抗体などのＭ−ＣＳＦ特異的抗体（修飾または未修飾のＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域を有するＲＸ１ヒト操作（商標）抗体が含まれる）を使用したヒトの治療手順を設計する。ＭＣ１由来抗体もしくはＭＣ３由来抗体またはＭＣ１競合抗体もしくはＭＣ３競合抗体もこの手順に従い得る。予想される有効な投与範囲は、２μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。この評価は、実験データによって立証された以下の論理的証拠に基づく。
【０３８３】
ヒト血漿（健常者および乳癌患者の両方）中の測定されたＭ−ＣＳＦレベルは、約１ｎｇ／ｍｌである。Ｍ−ＣＳＦ中和抗体ＲＸ１のＥＣ５０の測定値は、１ｎｇ／ｍｌのヒトＭ−ＣＳＦに対して２μｇ／ｍｌである。したがって、ヒト血漿中の有効な抗体濃度は、そのＥＣ５０の１０〜５０，０００倍であると予想される（すなわち、ヒト血漿中に２０ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの抗体）。ＰＫ研究に基づいて、ヒト患者においてこの濃度を達成するために、２０ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの血漿中の抗体濃度を達成するために２μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの投与が必要である。
【０３８４】
実施例７
本実施例は、皮下モデルにおける抗Ｍ−ＣＳＦモノクローナル抗体の抗癌活性の評価のための手順を設定する。上記の実施例２は、抗Ｍ−ＣＳＦモノクローナル抗体治療により、骨髄中の腫瘍成長によって誘導された骨量減少が有意に阻害されることを示した。本研究の目的は、抗体が軟組織中の腫瘍成長を阻害することもできるかどうかを評価することである。
【０３８５】
１０週齢で平均体重が約２０ｇの雌マウスを本研究で使用する。研究開始の少なくとも７日前に、マウスに馴化期間を与える。０日目に、ヌードマウスの右側に、ルイス肺癌細胞またはＣＴ２６癌細胞を５×１０６細胞／マウス／１００μｌで皮下注射する。腫瘍体積が１００〜２００ｍｍ３に到達した時（通常、腫瘍接種から１週間後）、マウスを群あたり１０匹ずつ以下の５つの群に無作為に分ける。
【０３８６】
１）ＰＢＳ
２）ＲＸ１
３）５Ａ１
４）ｍＩｇＧ１＋ｒＩｇＧ１アイソタイプＡｂコントロール
５）５Ａ１＋ＲＸ１
マウスを、１０ｍｐｋの指定した抗体で１週間に１回を４週間腹腔内処置する。腫瘍体積が２０００ｍｍ３に到達した時、研究を終了した。あるいは、以下の状況のいずれかに遭遇した場合にも動物を安楽死させる：腫瘍表面の潰瘍形成が総腫瘍表面積の３０％を超えた場合、体重が有意に減少した場合（２０％未満）、脱水症、および瀕死の状態。全マウスから全血を採取し、潜在的代理マーカーとして単球集団を分析する。腫瘍の幅および長さを測定して、腫瘍体積を計算する。上記実験の結果として腫瘍成長が阻害されると予想される。
【０３８７】
実施例８
以下の実施例は、癌転移に関連する重症骨溶解性疾患の治療および防止のための併用療法の評価手順を設定する。
【０３８８】
実験設計。実施例２または３に記載の研究を、以下の例外を除き、本質的に記載のように繰り返す。以下の治療群で設計した抗体または抗体の組み合わせに加えて、動物に以下のさらなる処置の１つを施す。
【０３８９】
１．ビスホスホネート（例えば、アレディア、ゾメタ、クロドロネート）、
２．手術
３．照射
４．化学療法
５．ホルモン療法（例えば、タモキシフェン、抗アンドロゲン療法）
６．抗体療法（例えば、ＲＡＮＫＬ／ＲＡＮＫ中和抗体、ＰＴＨｒＰ中和抗体）
７．治療タンパク質両方（例えば、可溶性ＲＡＮＫＬ受容体、ＯＰＧ、ならびにＰＤＧＦおよびＭＭＰインヒビター）
８．小分子薬物療法（例えば、Ｓｒｃ−キナーゼインヒビター）
９．オリゴヌクレオチド療法（例えば、ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＫ、またはＰＴＨｒＰアンチセンス）
１０．遺伝子療法（例えば、ＲＡＮＫＬまたはＲＡＮＫインヒビター）
１１．ペプチド療法（例えば、ＲＡＮＫＬのムテイン）
処置群は以下である。上記のさらなる処置を、「＋療法Ｘ」として以下に示す。
【０３９０】
１．ＰＢＳのみ
２．療法Ｘのみでの処置
３．ラットＩｇＧ１アイソタイプコントロール
４．マウスＩＧ１アイソタイプコントロール
５．ＲＸ１抗ヒトＭＣＳＦのみ
６．５Ａ１ラットＩｇＧ１抗マウスＭＣＳＦのみ
７．ラットＩｇＧ１とマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロールとの組み合わせ
８．ＲＸ１と５Ａ１との組み合わせ
９．ラットＩｇＧ１アイソタイプコントロール＋療法Ｘ
１０．マウスＩＧ１アイソタイプコントロール＋療法Ｘ
１１．ＲＸ１抗ヒトＭＣＳＦ＋療法Ｘ
１２．５Ａ１ラットＩｇＧ１抗マウスＭＣＳＦ＋療法Ｘ
１３．ラットＩｇＧ１とマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロールとの組み合わせ＋療法Ｘ
１４．ＲＸ１と５Ａ１との組み合わせ＋療法Ｘ
用量：０．１〜３０ｍｇ／ｋｇの各抗体を、各動物への投与に使用する。好ましい用量は１０ｍｇ／ｋｇである。投与経路は、ＩＶ、ＩＰ、ＳＣであり得る。好ましい経路はＩＰである。上記の実施例６に記載のように、腫瘍細胞注射の翌日から処置を開始する。
【０３９１】
測定。種々の処置群間の骨溶解の重症度を評価するために、各マウスに、腫瘍細胞注射の翌日にベースラインＦａｘｉｔｒｏｎ画像を撮影した。研究終了時（８週間）にもＦａｘｉｔｒｏｎ画像を撮影する。腫瘍細胞はルシフェラーゼを安定して発現するので、Ｘｅｎｏｇｅｎシステムを使用して腫瘍成長を同時に測定する。癌転移に関連する重症骨溶解疾患の治療および防止のための併用療法は抗体療法のみと比較して改良されていると予想される。
【０３９２】
実施例９
以下の実施例は、例えば、蛍光標示式細胞分取器を使用した乳癌細胞（細胞株ＭＤＡ２３１）または多発性骨髄腫癌細胞（細胞株ＡＲＨ７７）に結合するＭ−ＣＳＦ特異的抗体の能力の評価のためのプロトコールを提供する。
【０３９３】
細胞を、最初に、ＰＢＳ（Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋無し）で２回洗浄した。各１０ｃｍのプレートに、２ｍｌの３ｍＭ  ＥＤＴＡを添加し、細胞が円形になり、且つ皿から分離し始めるまでプレートを３７℃で２〜３分間インキュベートした。次に、１０ｍｌの緩衝液Ａ（ＰＢＳ＋５％ＦＢＳ）を添加し、混合した。その時点で細胞をペレット化し、ＰＢＳ＋５％ＦＢＳ中に約５×１０６細胞／ｍｌに再懸濁し、細胞を、１００μｌ／サンプルで細管に入れた。
【０３９４】
この時点で、０．１〜１０μｇ／ｍｌの一次抗体（表示の濃度のＭ−ＣＳＦ抗体またはコントロール抗体で使用）を添加した。必要に応じて、５％ＦＢＳ／ＰＢＳ中で希釈した。次いで、混合物を、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション期間後、細胞を、４００ｇで５分間の遠心分離によって３回洗浄し、細胞をＰＢＳ中に再懸濁した。
【０３９５】
ＦＩＴＣまたはＰＥ標識抗ＩｇＧ抗体（０．２５μｇ／サンプル）を、１％ＢＳＡ／ＰＢＳにて適切な希釈率に希釈し、細胞をこの溶液に再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。次に、細胞を、上記のように３回洗浄した。細胞洗浄後、細胞を、０．５ｍｌ／サンプルＰＩ−ＰＢＳで再懸濁した（必要に応じて、死細胞を生細胞と区別するため）。その後の分析のために、細胞を固定することもできる（細胞を０．１％ホルムアルデヒドで固定した場合、細胞は約３日間持続する）。次に、標準的な手順を使用した蛍光標示式ＦＡＣＳにおいて細胞を分析した。
【０３９６】
図８Ａおよび８Ｂに示すように、表示の種々の抗体濃度のＭＣＳＦ特異的抗体ＲＸ１を、乳癌細胞株ＭＤＡ２３１または多発性骨髄腫癌細胞株ＡＲＨ７７に結合させた。
【０３９７】
実施例１０
以下の実施例は、Ｍ−ＣＳＦが多数の癌細胞表面上に蔓延していることを示す。Ｍ−ＣＳＦの免疫組織化学的染色を、以下のようにＭ−ＣＳＦ特異的抗体ＲＸ１を使用して行った。
【０３９８】
最初は、スライドをオーブン中にて５０〜６０℃で１時間加熱し、２〜３分間冷却した。以下の脱蝋および再水和パラメーターを使用した。
【０３９９】
ａ．キシレン                      ３×５分間
ｂ．１００％アルコール試薬        ２×５分間
ｃ．９５％アルコール試薬          ２×４分間
ｄ．７５％アルコール試薬          ２×３分間
ｅ．５０％アルコール試薬          １×３分間
ｇ．ｄＩＨ２Ｏ                    ２〜３回の短時間のリンス
ペルオキシドブロッキング工程前に、１×Ｂｉｏｇｅｎｅｘ  Ｃｉｔｒａ  Ｐｌｕｓを使用して抗原の取り出しを行った。溶液を、最初に電子レンジにて全出力で沸騰させた。一旦溶液が沸騰すると、電子レンジを迅速に出力レベル２にさらに１３分間設定し、処理前に冷却した。ペルオキシドブロッキング工程を、以下のように行った。スライドを、３％Ｈ２Ｏ２（３０％の２５ｍｌ〜２５０ｍｌのｄＩＨ２Ｏ）に浸漬し、室温に１０分間置いた。次に、スライドをｄＩＨ２Ｏで２回洗浄し、１×ＰＢＳ２×２分間で洗浄した。
【０４００】
アビジン／ビオチンブロッキング手順を以下のように行った。スライドを金属性の棚に平らに置いた。組織周囲にＢｌｕｅＰＡＰペン（疎水性スライドマーカー）を使用した。次に、２滴のＺｙｍｅｄアビジン（試薬Ａ）（組織被覆に十分な量）を添加し、スライドを室温で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、スライドを以下のように洗浄した。
【０４０１】
１×ＰＢＳでの２×３分間の洗浄
室温で１０分間の２滴のＺｙｍｅｄビオチン（試薬Ｂ）の添加
１×ＰＢＳでの２×３分間の洗浄
タンパク質ブロッキング手順を以下のように行った。第１に、１０％血清（最終濃度２％）の二次抗体種を添加した。次に、ＢｉｏＧｅｎｅｘ  ＰｏｗｅｒＢｌｏｃｋを、ｄＩＨ２Ｏで１倍に希釈した。スライドのラックを、ＰｏｗｅｒＢｌｏｃｋ中に室温で８分間浸漬させ、スライドを１×ＰＢＳで２回リンスした。
【０４０２】
一次抗体（ＲＸ１）の添加のために、スライドを金属性のラックに平らに置いた。各切片を覆うように抗体を添加し（約３５０μｌ）、抗体を、組織を擦ることなく（必要に応じて）ピペットチップで広げた。次いで、スライドを、室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、スライドを、１×ＰＢＳでそれぞれ３〜５分間３回洗浄した。この時点で、ＢｉｏＧｅｎｅｘ  Ｍｕｌｔｉ−Ｌｉｎｋを切片に適用し、室温で１０〜１１分間インキュベートした。次いで、切片を、毎回３分間洗浄した。
【０４０３】
ＢｉｏＧｅｎｅｘＨＲＰ標識の切片への適用によって標識を行い、次いで、室温で１０〜１１分間インキュベートし、１×ＰＢＳ３×３分間で洗浄した。次に、切片にＢｉｏＧｅｎｅｘ  Ｈ２Ｏ２基質を添加し（２．５ｍｌＨ２Ｏ２毎に１滴のＡＥＣ）、室温で１０分間インキュベートした。次いで、切片をｄＩＨ２Ｏで数回リンスした。対比染色工程を、以下のように行った。切片をヘマトキシリンを用いて室温で１分間染色した。次に、切片をＨ２Ｏで２回洗浄し、次いで、１×ＰＢＳで１分間インキュベートした。次いで、切片をＨ２Ｏで十分にリンスして、ＰＢＳを除去した。切片を、切片への１滴のＢｉｏＧｅｎｅｘ  ＳｕｐｅｒＭｏｕｎｔの適用によってマウントし、次いで、室温で一晩風乾した。
【０４０４】
図９に示すように、Ｍ−ＣＳＦは、多数の癌細胞表面上に蔓延している。表示の癌細胞型の切片を、以下のようにスコアリングした。
【０４０５】
０  染色されず
１  染色がバックグラウンドと類似していた
２  陽性であるが、弱い染色
３  陽性且つ有意な染色
４  陽性且つ強い染色
実施例１１
以下の実施例は、抗体ＭＣ１およびＭＣ３の産生手順を示す。ＭＣ１およびＭＣ３は、ヒトＭ−ＣＳＦ抗体を中和し、ヒトＭ−ＣＳＦに結合する２つのモノクローナルマウス抗体である。これらの抗体のアミノ酸配列を、それぞれ、図１４および１５に示す。これらは、ａ）組換えヒトＭ−ＣＳＦでＢａｌｂ  Ｃマウスを免疫化する工程、ｂ）ＥＬＩＳＡ形式においてヒトＭ−ＣＳＦに結合する抗体を産生する陽性クローンをスクリーニングする工程、ｃ）陽性クローンをサブクローニングして安定なハイブリドーマクローンを生成する工程、ｄ）細胞培養物をスケールアップして大量の抗体を産生する工程、ｅ）前述の実施例に記載のようにアフィニティ分析、細胞結合、および中和活性アッセイにおいて抗体を精製および特徴づける工程を含む一連の工程によって同定した。
【０４０６】
図１６Ａおよび１６Ｂは、抗体ＲＸ１、５Ｈ４、ＭＣ１、およびＭＣ３のそれぞれ重鎖および軽鎖のＣＤＲのアラインメントを示す。
【０４０７】
ヒト化およびヒト操作（商標）異形（ｖｅｒｓｉｏｎ）を、上記実施例に記載のように生成する。
【０４０８】
実施例１２
本実施例は、Ｍ−ＣＳＦ抗体ＲＸ１および５Ｈ４ならびにそのフラグメントが異なる中和活性を有することを示す。以下の実施例はまた、抗体ＲＸ１、５Ｈ４、およびＭＣ３がＭ−ＣＳＦに対して種々の親和性を有することを示す。本実施例は、上記のインタクトな抗体の親和性が上記抗体のＦａｂフラグメントと比較して高いことを証明する。
【０４０９】
インタクトなＲＸ１および５Ｈ４対ＲＸ１および５Ｈ４のＦａｂフラグメントの中和活性を、種々の濃度の抗体の存在下でのＭ−ＣＳＦ依存性細胞増殖の測定にによって決定した。化学発光色素によって細胞増殖を決定した。図１７に示すように、インタクトなＲＸ１は最も高い効力を有する一方で、ＲＸ１のＦａｂフラグメントはその効力が失われ、５Ｈ４および５Ｈ４Ｆａｂフラグメントのように挙動する。
【０４１０】
上記抗体の結合性を、Ｂｉａｃｏｒｅ分析を使用して分析した。Ｍ−ＣＳＦに対するＲＸ１、５Ｈ４、およびＭＣ３の相対親和性を決定するために、ウサギ抗マウスＦｃを、アミンカップリングによってＣＭ５バイオセンサチップ上に固定した。次いで、１．５μｇ／ｍｌの上記抗体を、抗マウスＦｃ／ＣＭ５バイオセンサチップ上に２μｌ／ｍｌで３分間捕捉した。ＭＣＳＦを、種々の濃度（Ｒｍａｘ約１５）で修飾バイオセンサ表面上に流した。抗体および抗原を、０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％サーファクタントＰ２０（ＨＢＳ−ＥＰ）中で希釈した。全実験を、２５℃で行った。速度定数および親和性定数を、１：１相互作用モデル／全体的適合（ｇｌｏｂａｌ  ｆｉｔ）を使用したＢｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して決定した。以下の表８に示すように、ＲＸ１は、５Ｈ４およびＭＣ３と比較して、Ｍ−ＣＳＦと最も高い親和性で結合する。
【０４１１】
【化２７】
2009502952.tif 000024
ＲＸ１、５Ｈ４、およびＭＣ３のインタクトなＭａｂおよびＦａｂフラグメントの結合親和性の相対的相違を決定するために、Ｂｉａｃｏｒｅ分析の別の設定を使用した。具体的には、Ｍ−ＣＳＦを、アミンカップリングによってＣＭ５バイオセンサチップ上に固定した。０．０５μｇ／ｍｌ  Ｍ−ＣＳＦを含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）を、１μｌ／分で５分間注入して、ＲＬ＝６〜１２ＲＵを達成した。試験抗体（またはＦａｂフラグメント）を、種々の濃度で修飾バイオセンサ上に流した。試験抗体を、０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ  ＮａＣＬ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％サーファクタントＰ２０（ＨＢＳ−ＥＰ）中で希釈し、全実験を２５℃で行った。速度定数および親和性定数を、１：１相互作用モデル／全体的適合（ｇｌｏｂａｌ  ｆｉｔ）を使用したＢｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して決定した。以下の表９に示すように、ＲＸ１は、他の試験抗体と比較して、Ｍ−ＣＳＦと最も高い親和性で結合する。ＲＸ１のＦａｂフラグメントは、ＲＸ１ホロタンパク質と比較して有意に低い親和性でＭ−ＣＳＦと結合する。
【０４１２】
【化２８】
2009502952.tif 000025
結合親和性および中和データは、ＲＸ１の中和活性は主にその顕著に高いＭ−ＣＳＦに対する親和性に起因し、この高い親和性は、少なくとも一部がＭ−ＣＳＦ二量体に同時に結合するための抗体の両アームの能力に起因し得ることを示す。
【０４１３】
実施例１３
以下の実施例は、抗体ＲＸ１、５Ｈ４、およびＭＣ３によって認識されるＭ−ＣＳＦ上の線状エピトープ（すなわち、アミノ酸配列）を明らかにする。
【０４１４】
最初に、抗体ＲＸ１、５Ｈ４、およびＭＣ３がＭ−ＣＳＦ内の線状エピトープまたは高次構造エピトープを認識するかどうかを決定するために、エピトープマッピングストラテジーを設計した。したがって、抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を、還元条件下および非還元条件下で０．１μｇのＭ−ＣＳＦに対して試験した。Ｍ−ＣＳＦの非還元形態のみが各抗体によって認識され、認識されたエピトープが事実上不連続であることが示唆された。
【０４１５】
次に、各抗体についてのＭ−ＣＳＦの線状エピトープを決定した。具体的には、目的のＭ−ＣＳＦフラグメント配列（１アミノ酸オフセットを使用して合成した１０量体の重複ペプチド）をセルロース膜支持体上に負荷したＳＰＯＴ膜（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ）を調製した。次いで、これらの膜を上記抗体で探索し、反応性ＳＰＯＴを同定した。次いで、ペプチド配列を膜上のその対応する位置によって同定し、陽性反応ペプチド内の重複アミノ酸をエピトープと同定した。図１８に示すように、ＲＸ１は５Ｈ４およびＭＣ３よりも異なる線状エピトープに結合し、これを、Ｍ−ＣＳＦ上の異なる位置にマッピングする。ＲＸ１は、ＲＦＲＤＮＴＰＮ（配列番号１２０）またはＲＦＲＤＮＴＡＮ（配列番号１２１）（図１２のＭ−ＣＳＦのアミノ酸９８〜１０５）によって示される線状エピトープに結合する。５Ｈ４は、ＩＴＦＥＦＶＤＱＥ（配列番号１２２）（図１２のＭ−ＣＳＦのアミノ酸６５〜７３）に結合する。ＭＣ３は、（１）ＩＴＦＥＦＶＤＱＥ（配列番号１２２）（図１２のＭ−ＣＳＦのアミノ酸６５〜７３）および（２）ＦＹＥＴＰＬＱ（配列番号１２３）（図１２のＭ−ＣＳＦのアミノ酸１３８〜１４４）によって示される２つの線状エピトープに結合する。
【０４１６】
実施例１４
上記の実施例５に記載のように調製したＲＸ１抗体のヒト操作（商標）異形の結合親和性を決定した。本実施例は、異なるＩｇＧサブクラス定常領域を有するヒト操作（商標）ＲＸ１抗体がインビトロで異なる親和性にてＭ−ＣＳＦに結合することを示す。Ｂｉａｃｏｒｅ分析によるインタクトな抗体の結合親和性の相対的相違を決定するために、Ｍ−ＣＳＦを、アミンカップリングによってＣＭ５バイオセンサチップ上に固定した。０．０５μｇ／ｍｌ  Ｍ−ＣＳＦを含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）を、１μｌ／分で５分間注入して、ＲＬ＝６〜１２ＲＵを達成した。試験抗体またはＦａｂフラグメントを、１００ｍＭから１．５ｎＭまでの種々の濃度にて２倍希釈で修飾バイオセンサ上に流した。試験抗体を、０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ  ＮａＣＬ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％サーファクタントＰ２０（ＨＢＳ−ＥＰ）中で希釈し、全実験を２５℃で行った。各濃度点および緩衝液ブランクを三連で実施し、３分間の会合および８分間の解離に関するデータを収集した。速度定数および親和性定数を、１：１相互作用モデル／全体的適合を使用したＢｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して決定した。以下の表１０に示すように、ｈｅＲＸ１−１．Ｇ１およびｈｅＲＸ１−１．Ｇ４は、マウスＲＸ１−Ｍ−ＣＳＦ結合親和性と最も密接に類似する親和性でＭ−ＣＳＦに結合する。
【０４１７】
【化２９】
2009502952.tif 000026
対照的に、以下の表１１に示すように、結合親和性にいくらかのばらつきがあるが、全γ−２構築物は、親マウス抗体と比較して結合親和性が少なくとも１／７に減少した。
【０４１８】
【化３０】
2009502952.tif 000027
実施例１５
本実施例は、異なるＩｇＧサブクラス定常領域を有するヒト操作（商標）ＲＸ１抗体がインビボで異なる中和活性を有することを示す。Ｍ−ＣＳＦ抗体の中和活性を試験するために、Ｍ−ＮＦＳ−６０細胞株の増殖アッセイを使用した（ＡＴＣＣ  ｉｎ  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡから利用可能なＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１８３８、Ｃａｓ−Ｂｒ−ＭｕＬＶ野生マウスエコトロピックレトロウイルスで誘導された骨髄性白血病由来であり、この細胞株はインターロイキン３およびＭ−ＣＳＦの両方に応答し、レトロウイルスの組み込みに起因する短縮ｃ−ｍｙｂ癌原遺伝子を含む）。Ｍ−ＮＦＳ−６０の増殖には、用量依存様式で活性なＭ−ＣＳＦが必要である。アッセイでは、Ｍ−ＮＦＳ−６０細胞を洗浄し、１０％ＦＢＳおよび１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含むＲＰＭＩ１６４０培地中にプレートした。組換えヒトＭ−ＣＳＦ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ、３０００Ｕ／ｍｌのＭ−ＣＳＦ活性に等価）を、１μｇ／ｍｌから０．５ｎｇ／ｍｌ（連続２倍希釈）までの範囲の種々の濃度の抗体と、インキュベーター中５％ＣＯ２にて３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、混合物を、９６ウェルマイクロタイタープレート中のＭ−ＮＦＳ−６０培地に添加した。ウェルあたりの総アッセイ体積は１００μｌであり、１０ｎｇ／ｍｌ  Ｍ−ＣＳＦ（示した抗体濃度）を含む。細胞を、５％ＣＯ２下にて３７℃で７２時間インキュベートし、その後、細胞数をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって定量した。各抗体を、翌日に繰り返して三連で試験した（抗体あたり全部で６回アッセイする）。各抗体のＩＣ５０を、カーブフィッティングによって分析した。
【０４１９】
ヒトＭＣＳＦを含む血清、ＭＤＡ２３１馴化培地（Ｍ−ＣＳＦを含む）、カニクイザルＭＣＳＦを含む血清、およびカニクイザル組換えＭＣＳＦを使用してアッセイを繰り返した。結果を、細胞数に比例するＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏアッセイからの蛍光の読み取りとして、図２５（組換えＭＣＳＦ）、２６（ヒトＭＣＳＦを含む血清）、および２７（ＭＤＡ２３１馴化培地）に示す。抗体の中和活性を、Ｍ−ＮＦＳ−６０細胞増殖の阻害として示す。
【０４２０】
これらの結果は、ｈｅＲＸ１−１−ＩｇＧ１およびｈｅＲＸ１−１−ＩｇＧ４のＩＣ５０は組換えマウス親ＲＸ１抗体とほぼ同一である一方で、ｈｅＲＸ１−１−ＩｇＧ２のＩＣ５０は約２〜４倍であったことを示す。
【０４２１】
以下の表１２は、上記の実施例５に記載のように調製した種々のＩｇＧ２構築物の相対的ＩＣ５０（ＩＣ５０の減少倍率に関して）を示す。これらの構築物のうち、ｈｅＲＸ１−１．Ｇ２およびｈｅＲＸ１−１０．Ｇ２は最も小さいＩＣ５０の減少を示した。
【０４２２】
【化３１】
2009502952.tif 000028
実施例１６
本実施例は、異なるＩｇＧサブクラス定常領域を有するヒト操作（商標）ＲＸ１抗体によってインビボ破骨細胞生成アッセイで異なるＴＲＡＰ活性が得られることを示す。
【０４２３】
ヒト骨髄ＣＤ３４＋細胞（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒカタログ番号２Ｍ−１０１  Ａ、３×１０５細胞／バイアル）を、本明細書中に記載の実験条件下で破骨細胞に分化するように誘導した。１日目に、ＣＤ３４＋細胞を、１つの凍結バイアルから１０ｍｌの培地（１０％ＦＣＳ、１×Ｐｅｎ  Ｓｔｒｅｐ、および１×ファンギゾンを含むＡｌｐｈａＥＭＥ）に解凍した。細胞を１回洗浄し、２ｍｌの培地中に再懸濁し、１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに入れた。２日目に、元の培地を除去することなく、各ウェルに５０μｌの４×ＣＳＦ−１を３０ｎｇ／ｍｌの最終濃度まで添加し、５０μｌの４×ＲＡＮＫＬ（ｓＲＡＮＫＬ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎカタログ番号ＧＦ０９１、１０μｇ／パッケージ）を１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度まで添加した。７日目に、５０μｌの５×ＲＡＮＫＬを１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度まで各ウェルに添加した。１７日目に、細胞をＴＲＡＰ活性について染色し（ＴＲＡＰ染色のための白血球酸ホスファターゼキット、Ｓｉｇｍａカタログ番号３８７−Ａ）、顕微鏡下で試験した。
【０４２４】
アッセイ２日目にＭ−ＣＳＦ中和抗体を添加する。図２８に示すように、抗体は、用量依存様式で破骨細胞分化を阻害する。破骨細胞分化アッセイにおける抗体の阻害活性を、アッセイ１７日目の生きている破骨細胞の欠乏として示す。
【０４２５】
実施例１７
異なるＩｇＧサブクラス定常領域を有するヒト操作（商標）ＲＸ１抗体を、さらに特徴づけた。
【０４２６】
ＭＣＳＦを使用して形成した種々のヒト操作（商標）ＲＸ１抗体、抗原−抗体複合体を、緩衝液中での等モル比でのＭ−ＣＳＦと抗体との組み合わせ、その後のサイズ排除クロマトグラフィまたは光散乱を使用した抗原−抗体複合体のサイズの分析によって研究した。結果は、マウス親ＲＸ１が約２０ｋＤａのＭＣＳＦとの１：１複合体を形成するようであることを示した。ｈｅＲＸ１−９．Ｇ２または１−１０．Ｇ２抗体は、約４００ｋＤａのＭＣＳＦと２：１または２：２複合体を形成するようであった。ｈｅＲＸ１−１．Ｇ２は、２×１０６Ｄａを超えるＭＣＳＦと巨大な格子凝集体を形成するようであった。ＩｇＧ１およびＩｇＧ４構築物は、マウス親ＲＸ１に類似の小複合体を形成した。
【０４２７】
ｈｅＲＸ１−１．Ｇ４の変性還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、予想通り、ＩｇＧ４異形が半抗体を形成するようであることを示した。
【０４２８】
実施例１８
本実施例は、インビトロでの破骨細胞生成に及ぼすヒト操作（商標）抗体または他の抗Ｍ−ＣＳＦ抗体の影響を示す。一次ヒト破骨細胞前駆体（Ｃａｍｂｒｅｘ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ．カタログ番号２Ｔ−１１０）を、３０ｎｇ／ｍｌヒトＭ−ＣＳＦおよび１００ｎｇ／ｍｌ  ＲＡＮＫＬを含む０．２ｍｌ／ウェルの細胞培養培地に１０，０００細胞／ウェルで播種した。細胞プレーティングと同日に、試験抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を表示の濃度でウェルに添加した。細胞を、５％ＣＯ２の加湿大気中にて３７℃でインキュベートした。７日目に、破骨細胞を、位相差顕微鏡法によって通常は巨大な多核細胞として同定することができる。栄養補給しながらさらに１週間培養を継続することができ、その間に、破骨細胞のサイズが増加し続ける。培養終了後、細胞を、酒石酸耐性酸ホスファターゼについて染色し、その陽性染色は、破骨細胞の存在を示す。各ウェル中の破骨細胞数を同定し、光学顕微鏡下で計数し、顕微鏡の視野の観察による平均破骨細胞としてグラフに示すことができる。
【０４２９】
マウス抗ＭＣＳＦ抗体５Ｈ４の試験結果を、図３１に示す。
【０４３０】
実施例１９
以下の実施例は、抗Ｍ−ＣＳＦ抗体が混合型骨芽細胞／破骨細胞性骨病変の影響を軽減する能力を評価するための脛骨内モデルを設計する。
【０４３１】
４〜５週齢で平均体重が１５〜１８ｇの雄ＳＣＩＤマウスを使用する。同定のためにマウスにチップを埋め込み、試験開始日前に７日間の馴化期間を与える。細胞移植の３０分前に、マウスにフルニキシン（２．５ｍｐｋ）をｓ．ｃ．注射する。次いで、マウスをイソフルラン吸入によって麻酔し、その右後肢を７０％エタノールで清浄化し、５０または１００ｍｌのマイクロシリンジを使用して、腫瘍細胞（２．５×１０５／１０μｌ生理食塩水）を右脛骨の骨髄腔に注射した。全部で２０匹のマウスに接種する。
【０４３２】
腫瘍細胞注射の翌日に、Ｆａｘｉｔｒｏｎ装置によってマウスの画像を撮影してベースライン測定値を確立し、注射が骨に損傷を与えなかったことを確実にする。処置群（処置を２日目から開始する）を以下に示す。
【０４３３】
−マウス／ヒトＩｇＧアイソタイプコントロール：それぞれ１０ｍｐｋ、ｉ．ｐ．、１週間に１回を５週間
−抗ＭＣＳＦ（ラット抗マウスＩｇＧ１  ５Ａ１およびマウス抗ヒトＩｇＧ１  ５Ｈ４）：それぞれ１０ｍｐｋ、ｉ．ｐ．、１週間に１回を５週間
骨損傷（コントロール群の第１のマウスの骨損傷が第３期に到達するまでＦａｘｉｔｒｏｎ分析によって１週間目から１回／週で評価し、その時点でＦａｘｉｔｒｏｎ分析を１週間に２回行う）をモニタリングし、１週間毎に体重を計測する。研究終了まで、マウスの窮迫の臨床的徴候を毎日観察する。重篤な臨床的徴候（１５％を超える体重減少、猫背の姿勢、右脚に加重できないこと、非移動性、触ると冷たい、脚の腫脹）を示すか、第４期に到達したマウスを安楽死させる。研究終了時に、最終画像化、研究における全２０匹の動物からの心臓穿刺による採血、脛骨採取（組織学のための各群由来の３つの右脛骨、３つの正常な左側の脛骨）を行う。
【０４３４】
実施例２０
本実施例は、抗Ｍ−ＣＳＦ抗体の存在下で前立腺周囲の骨量減少を評価するためのインビボ手順を設定する。磨耗屑、特にポリエチレン粒子の生成および生物学的影響は、関節全置換の寿命に及ぼす影響の理由から医師の大きな懸念である。粒子状デブリは、破骨細胞の分化および成熟の促進および骨芽細胞機能の阻害によって骨の正常なホメオスタシス機構を妨害する多数の要因を誘導する。正味の影響は、人工器官周辺の骨床（ｂｏｎｅ  ｂｅｄ）を脆弱化する骨量減少である（Ｇｏｏｄｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，６５Ａ：４５４−４６１（２００３））。この手順では、薬物試験室（ｄｒｕｇ  ｔｅｓｔ  ｃｈａｍｂｅｒ）（ＤＴＣ）を、ウサギの四肢内の骨に外科的に埋め込み、骨内で組み合わせる。その後、薬物を含むか含まないポリエチレン粒子を腔内に注入し、骨組織を定期的に取り出して、骨形成を評価する。
【０４３５】
薬物試験室（ＤＴＣ）
ＤＴＣは、骨採取室（ｂｏｎｅ  ｈａｒｖｅｓｔ  ｃｈａｍｂｅｒ）に類似のウサギの近位内側脛骨骨幹端中の皮質レベルで埋め込まれるチタンデバイスである。長さ１ｍｍで直径０．２５ｍｍの拡散毛細管を介して１×１×５ｍｍの内部成長管（ｉｎｇｒｏｗｔｈ  ｃａｎａｌ）に連結した液体リザーバとして作用する１０μＬの腔を有するＤＴＣの可撤性コアを提供する。連続注入のために、２つの管をリザーバに接続する。一方の管を、皮下浸透圧ミニポンプ（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）に接続する。他方の管を、皮下組織に開き、それにより、リザーバの排液管として機能する。これにより、リザーバを介して液体がゆっくりと連続的に流れ、拡散毛細管に沿って濃度勾配が作製される。リザーバが皮下組織に排液するので、拡散毛細管を介した溶媒の骨への浸出は最小である。したがって、内部成長組織を、溶媒の流れを妨害することなく溶液で局所的に治療することができる。各治療後、１ｃｍの小さな切開により、室を曝露して分解し、骨内でインタクトな外側のオッセオインテグレーティッドシリンダーをそのままにした。内部コアを一過性に取り出し、室中の組織を露出させ、その後の分析のために採取した。次いで、室部分を、次の治療のために再度組み立てる。同時に、別の小切開により、ミニポンプおよび管類（注入すべき新規の溶液を含む）を置換する。
【０４３６】
外科的手順
前に記載のように、一般的な麻酔下で好ましくは６〜１２月齢で体重が３．５〜４．５ｋｇの成熟雄ニュージーランドシロウサギにＤＴＣを最初に埋め込む。感染予防としてセファロスポリン抗生物質を１回投与する。オッセオインテグレーション（ｏｓｓｅｏｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）の６週間後、室の内容物を採取し、破棄する。次いで、ＤＴＣをポリビニル管類を介してＡｌｚｅｔ浸透圧拡散ポンプ（モデル番号２００４、Ａｌｚａ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）に接続する。拡散ポンプは、２００μＬの液体を含み、送達速度は０．２５μＬ／時である。キャリア溶液のみ（すなわち、Ｍ−ＣＳＦ抗体、希釈剤、ヘパリン硫酸、およびＢＳＡなどを含まない処方溶液）を、３週間注入し、その後に採取する。
【０４３７】
全ウサギにＭ−ＣＳＦ抗体治療を連続的に行う（表１を参照のこと）。抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を、ポリエチレン粒子の不在下で、０、０．５、５、５０、または５００ｎｇ／日の投薬量で３週間最初に注入する。各処置後に室の内容物を採取し、拡散ポンプおよび管類を、適切な溶液を含む別のものと交換する。次いで、低用量（５．８×１０１１粒子／ｍＬ）または高用量（１．７×１０１２粒子／ｍＬ）の超高分子量のポリエチレン粒子を、ＤＴＣ中に入れ、５０ｎｇ／日の抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を３週間注入するか注入しない。各処置後に室の内容物を採取し、新規の拡散ポンプおよび適切な溶液を含む管類をウサギに配置する。
【０４３８】
組織の処理および免疫組織化学
採取した試料を、最適な切断培地（ｃｕｔｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）（ＯＣＴ）に入れ、液化窒素中で瞬間冷凍し、処理まで−７０℃で保存する。６μｍの連続切片を、クリオスタット（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｂｕｆｆａｌｏ，ＮＹ）を使用して切断し、顕微鏡用スライド上にマウントする。一般的な形態の特徴について、試料の中心由来の５つまたはそれを超える切片を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色する。上記の中心切片の両側の連続切片を、モノクローナル抗体を使用した免疫ペルオキシダーゼ染色のために使用し、ビトロネクチン受容体を発現する細胞（破骨細胞様細胞）を同定する。
【０４３９】
凍結切片を、４℃の無水アセトン中で固定する。スライドをアセトンで１０分間固定し、風乾し、アセトンでさらに１０分間処置する。次いで、スライドを、４５分間風乾し、密封容器に入れ、処理まで−７０℃で保存する。解凍後、切片を、ビトロネクチン受容体を示す破骨細胞様細胞を同定するためのモノクローナル抗体（ＣＤ５１、インテグリンαＶβ３に対するマウス抗ヒトモノクローナル抗体、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）と室温でインキュベートする。このモノクローナル抗体（破骨細胞に特異的ではないが）は、破骨細胞様細胞を同定するために以前に使用されており、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ染色と強く相関する。さらに、ＣＤ５１陽性細胞は、より濃縮された染色を示し、酒石酸耐性酸性ホスファターゼで染色した細胞よりも容易に計数される。次いで、切片を、ビオチン化ウサギ抗マウス免疫グロブリンおよびＡＢＣ溶液（Ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）とインキュベートする。各工程後に切片をリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄する。陽性染色細胞を、ジアミノベンジジン、０．０１％Ｈ２Ｏ２、０．３％アジ化ナトリウムを含む０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．６）で視覚化する。スライドを、トルイジンブルーで対比染色し、脱水し、マウントする。
【０４４０】
評価および統計的分析
試料の全長をスライド上で視覚化することができるヘマトキシリンおよびエオシンで染色した複数の（最少＝５）連続する長手方向の切片の組織形態学的分析を行う。これらの切片を、細胞成分、間質、および存在する骨の型について４０〜４００倍の範囲の倍率を使用して定性的に試験する。ＭａｃＩｎｔｏｓｈ  Ｑｕａｄｒａコンピュータ（Ａｐｐｌｅ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）およびリアルタイムビデオ光学顕微鏡システムと連動させたＮＩＨ  Ｉｍａｇｅを使用したコンピュータ化双方向性画像分析システムを使用して、形態計測分析を行う。ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した試料の中心由来の１つの全切片を、１００倍の倍率を使用した骨内部成長についての形態計測分析に使用する。全切片上の測定領域を、コンピュータおよび組織学画像を含むテレビ画面に接続したマウスパッドを使用して手作業で輪郭を描く。ＣＤ５１陽性および陰性細胞を、免疫組織化学によって処理した適切な切片を使用して、４００倍の倍率で計数する。全測定を、処置を知らずに盲検で行う。
【０４４１】
組織形態学的分析を行って総組織領域、総骨領域、総領域で割った骨領域の比を決定し、比率、全切片中の骨に隣接するビトロネクチン−受容体陽性細胞の総数、および全切片中の骨から離れたビトロネクチン−受容体陽性細胞の総数として示す。
【０４４２】
ＳｔａｔＶｉｅｗソフトウェアプログラム（Ａｂａｃｕｓ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）を使用して統計的分析を行う。骨内部成長率の評価のためにパラメトリック統計学（連続的３週間処置を比較するための分散分析が含まれる）を使用する。事後検定（ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｔｅｓｔ）は、同一動物で行った異なる処置を比較する対応のあるｔ検定を使用することができる。細胞計数データを、クラスカル・ワリス検定および符合付順位検定を使用して分析する。０．０５の有意レベルを使用する。
【０４４３】
上記手順を使用して、骨形成が及ぼす抗Ｍ−ＣＳＦ抗体の影響を容易に分析することができる。抗Ｍ−ＣＳＦ抗体の添加によって正味の骨形成が増加し、それにより、例えば、無セメントインプラントのオッセオインテグレーションの増強手段が得られると予想される。
【０４４４】
本明細書中で言及され、そして／または出願データシートに列挙された上記米国特許、米国特許公開公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【０４４５】
上記から、例証を目的として本発明の特定の実施形態を本明細書中に記載しているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の修飾を行うことができると認識される。
【図面の簡単な説明】
【０４４６】
【図１】図１は、短縮二量体Ｍ−ＣＳＦ中のジスルフィド結合を示すトポロジー図である。
【図２】図２は、１０残基毎に標識し、非結晶学的回転軸を点線で示したＭ−ＣＳＦのＣ−α骨格の立体図である。
【図３】図３は、精製Ｍ−ＣＳＦとＭＤＡ２３１細胞およびＭＣＦ７細胞由来の馴化培地（ＣＭ）との間の破骨細胞誘導活性の比較である。
【図４Ａ】図４Ａは、Ｍ−ＣＳＦ特異的マウス抗体ＲＸ１（配列番号２および４）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡにＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−６１１３で寄託されたプラスミドのｃＤＮＡインサートによってコードされる）および対応する核酸配列（配列番号１および３）を示す。ＣＤＲ領域に番号を付け、太字で示す。
【図４Ｂ】図４Ｂおよび４Ｃは、Ｍ−ＣＳＦ特異的マウス抗体ＲＸ１の軽鎖（配列番号５）および重鎖（配列番号６）のアミノ酸配列をそれぞれ示す。Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、ＷＯ９３／１１７９４号にしたがって同定した高リスク（太字）、中程度のリスク（下線）、および低リスクの残基を含む。
【図４Ｃ】図４Ｂおよび４Ｃは、Ｍ−ＣＳＦ特異的マウス抗体ＲＸ１の軽鎖（配列番号５）および重鎖（配列番号６）のアミノ酸配列をそれぞれ示す。Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、ＷＯ９３／１１７９４号にしたがって同定した高リスク（太字）、中程度のリスク（下線）、および低リスクの残基を含む。
【図５Ａ】図５Ａは、Ｍ−ＣＳＦ抗体であるＲＸ１および５Ａ１が種特異的であることを示す。図５Ｂは、抗体ＭＣ１およびＭＣ３のＭ−ＣＳＦ中和活性を示す。
【図５Ｂ】図５Ａは、Ｍ−ＣＳＦ抗体であるＲＸ１および５Ａ１が種特異的であることを示す。図５Ｂは、抗体ＭＣ１およびＭＣ３のＭ−ＣＳＦ中和活性を示す。
【図６】図６は、抗体ＲＸ１が５ｍｇ／ｋｇの濃度でヒト異種移植片モデルにおける骨溶解を阻害することを示す。
【図７】図７は、抗体ＲＸ１を５ｍｇ／ｋｇの濃度でヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１保有ヌードマウスに投与した場合に転移数が減少することを示す。
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、Ｍ−ＣＳＦ特異的抗体が乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１または多発性骨髄腫癌細胞株ＡＲＨ７７に結合したことを示す。
【図９】図９は、Ｍ−ＣＳＦが多数の癌細胞表面に存在することを示す。
【図１０】図１０は、Ｍ−ＣＳＦαのアミノ酸配列（配列番号７）である。
【図１１】図１１は、Ｍ−ＣＳＦβのアミノ酸配列（配列番号８）である。
【図１２】図１２は、Ｍ−ＣＳＦγのアミノ酸配列（配列番号９）である。ＤＮＡ配列中の多数の多形性により、アミノ酸が異なり得る。例えば、共通の多形性により、１０４位でＰｒｏよりもむしろＡｌａが得られる。
【図１３】図１３、１４、および１５は、ＭＣＳＦ特異的マウス抗体５Ｈ４（配列番号１０および１１）、ＭＣ１（配列番号１２および１３）（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−６２６３で寄託されたハイブリドーマによって産生）、およびＭＣ３（配列番号１４および１５）（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−６２６４で寄託されたハイブリドーマによって産生）をそれぞれ示す。
【図１４】図１３、１４、および１５は、ＭＣＳＦ特異的マウス抗体５Ｈ４（配列番号１０および１１）、ＭＣ１（配列番号１２および１３）（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−６２６３で寄託されたハイブリドーマによって産生）、およびＭＣ３（配列番号１４および１５）（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−６２６４で寄託されたハイブリドーマによって産生）をそれぞれ示す。
【図１５】図１３、１４、および１５は、ＭＣＳＦ特異的マウス抗体５Ｈ４（配列番号１０および１１）、ＭＣ１（配列番号１２および１３）（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−６２６３で寄託されたハイブリドーマによって産生）、およびＭＣ３（配列番号１４および１５）（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−６２６４で寄託されたハイブリドーマによって産生）をそれぞれ示す。
【図１６Ａ】図１６ＡおよびＢは、ヒトＭ−ＣＳＦ特異的マウス抗体ＲＸ１、５Ｈ４、ＭＣ１、およびＭＣ３の重鎖および軽鎖アミノ酸配列のＣＤＲ領域（配列番号１６〜３８）のアラインメントである。
【図１６Ｂ】図１６ＡおよびＢは、ヒトＭ−ＣＳＦ特異的マウス抗体ＲＸ１、５Ｈ４、ＭＣ１、およびＭＣ３の重鎖および軽鎖アミノ酸配列のＣＤＲ領域（配列番号１６〜３８）のアラインメントである。
【図１７】図１７は、ＲＸ１対５Ｈ４についてのインタクト対Ｆａｂフラグメントの中和活性を示す。
【図１８】図１８は、強調したＲＸ１、５Ｈ４、およびＭＣ３エピトープ（配列番号１２０、１２２、および１２３）を有するＭ−ＣＳＦの構造を示す。
【図１９Ａ】図１９Ａは、（ａ）マウスＲＸ１重鎖のリスクライン（Ｈ＝高リスク、Ｍ＝中程度のリスク、Ｌ＝低リスク）、（ｂ）ＲＸ１重鎖アミノ酸配列（配列番号６）、（ｃ）ＲＸ１と整列させた最も近いヒトコンセンサス配列（ＫａｂａｔＶｈ２コンセンサス）のアミノ酸配列（配列番号３９）、および（ｄ）２つの例示的ヒト操作（商標）配列（配列番号４１および４３）を産生するために作製した変化を示す。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、「低リスク」および「低リスク＋中程度のリスク」と命名された２つの例示的重鎖ヒト操作（商標）配列（配列番号４１および４３）のアミノ酸配列ならびに対応する核酸配列（配列番号４０および４２）を示す。
【図２０Ａ】図２０Ａは、（ａ）マウスＲＸ１軽鎖のリスクライン（Ｈ＝高リスク、Ｍ＝中程度のリスク、Ｌ＝低リスク）、（ｂ）ＲＸ１軽鎖アミノ酸配列（配列番号５）、（ｃ）ＲＸ１と整列させた最も近いヒトコンセンサス配列（ＫａｂａｔＶｋ３コンセンサス）のアミノ酸配列（配列番号４９）、および（ｄ）２つの例示的ヒト操作（商標）配列（配列番号４５および４７）を産生するために作製した変化を示す。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、「低リスク」および「低リスク＋中程度のリスク」と命名された２つの例示的軽鎖ヒト操作（商標）配列（配列番号４５および４７）のアミノ酸配列ならびに対応する核酸配列（配列番号４４および４６）を示す。
【図２１Ａ】図２１Ａは、（ａ）マウスＲＸ１軽鎖のリスクライン（Ｈ＝高リスク、Ｍ＝中程度のリスク、Ｌ＝低リスク）、（ｂ）ＲＸ１軽鎖アミノ酸配列（配列番号５）、（ｃ）ＲＸ１と整列させた最も近いヒトコンセンサス配列（ＫａｂａｔＶｋ３コンセンサス）のアミノ酸配列（配列番号４９）、および（ｄ）５４〜５６位が変化していない（すなわち、マウス配列が残存している）別の例示アミノ酸配列（配列番号４８）を示す。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、２つの例示的な別の軽鎖ヒト操作（商標）配列（配列番号４８、１３６）のアミノ酸配列ならびに対応する核酸配列（配列番号１３７および１３５）を示す。
【図２２Ａ】図２２Ａは、（ａ）マウスＲＸ１軽鎖のリスクライン（Ｈ＝高リスク、Ｍ＝中程度のリスク、Ｌ＝低リスク）、（ｂ）ＲＸ１軽鎖アミノ酸配列（配列番号５）、（ｃ）ＲＸ１と整列させた最も近いヒトコンセンサス配列（ＫａｂａｔＶｋ６亜群２−１−（１）Ａ１４）のアミノ酸配列（配列番号５０）、および（ｄ）２つの例示的ヒト操作（商標）配列（配列番号５１および５３）を産生するために作製した変化を示す。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、「低リスク」および「低リスク＋中程度のリスク」と命名された２つの例示的軽鎖ヒト操作（商標）配列（配列番号５１および５３）のアミノ酸配列ならびに対応する核酸配列（配列番号５２）を示す。
【図２３Ａ】図２３Ａおよび２３Ｂは、Ｋａｂａｔナンバリングシステム（「ＰＯＳ」と命名したライン中に示したアミノ酸ナンバリング）を使用したマウスＲＸ１軽鎖アミノ酸配列（配列番号５４）と種々のヒトコンセンサス配列およびヒト生殖系列コンセンサス配列（配列番号５５〜８２）とのアラインメントを示す。
【図２３Ｂ】図２３Ａおよび２３Ｂは、Ｋａｂａｔナンバリングシステム（「ＰＯＳ」と命名したライン中に示したアミノ酸ナンバリング）を使用したマウスＲＸ１軽鎖アミノ酸配列（配列番号５４）と種々のヒトコンセンサス配列およびヒト生殖系列コンセンサス配列（配列番号５５〜８２）とのアラインメントを示す。
【図２４Ａ】図２４Ａおよび２４Ｂは、Ｋａｂａｔナンバリングシステム（「ＰＯＳ」と命名したライン中に示したアミノ酸ナンバリング）を使用したマウスＲＸ１重鎖アミノ酸配列（配列番号８３）と種々のヒトコンセンサス配列およびヒト生殖系列コンセンサス配列（配列番号８４〜１１２）とのアラインメントを示す。
【図２４Ｂ】図２４Ａおよび２４Ｂは、Ｋａｂａｔナンバリングシステム（「ＰＯＳ」と命名したライン中に示したアミノ酸ナンバリング）を使用したマウスＲＸ１重鎖アミノ酸配列（配列番号８３）と種々のヒトコンセンサス配列およびヒト生殖系列コンセンサス配列（配列番号８４〜１１２）とのアラインメントを示す。
【図２４Ｃ】図２４Ｃ〜２４Ｅは、抗体５Ｈ４、ＭＣ１、およびＭＣ３のアミノ酸残基がどのようにしてＫａｂａｔナンバリングシステムに対応しているか（それぞれ、配列番号１０および１１、配列番号１２および１３、配列番号１４および１５）を示す。
【図２４Ｄ】図２４Ｃ〜２４Ｅは、抗体５Ｈ４、ＭＣ１、およびＭＣ３のアミノ酸残基がどのようにしてＫａｂａｔナンバリングシステムに対応しているか（それぞれ、配列番号１０および１１、配列番号１２および１３、配列番号１４および１５）を示す。
【図２４Ｅ】図２４Ｃ〜２４Ｅは、抗体５Ｈ４、ＭＣ１、およびＭＣ３のアミノ酸残基がどのようにしてＫａｂａｔナンバリングシステムに対応しているか（それぞれ、配列番号１０および１１、配列番号１２および１３、配列番号１４および１５）を示す。
【図２５】図２５は、ｒｍＲＸ１と標識される組換えマウスＲＸ１抗体、およびｈｅＲＸ１−１．Ｇ１、ｈｅＲＸ１−１．Ｇ２、およびｈｅＲＸ１−１．Ｇ４と標識される、それぞれ異なる定常領域（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４）を有するヒト操作（商標）ＲＸ−１−１抗体の３つの異形（ｖｅｒｓｉｏｎ）（全て低リスクに変化している）による組換えヒトＭ−ＣＳＦの中和の比較を示す。
【図２６】図２６は、ｒｍＲＸ１と標識される組換えマウスＲＸ１抗体、およびＲＸ２、ＲＸ１−１−ＩｇＧ２、ＲＸ１−１−ＩｇＧ１、ＲＸ１−１−ＩｇＧ１、ＲＸ１−１−ＩｇＧ４、ＲＸ−ａ−ＩｇＧ４と標識される、それぞれ異なる定常領域（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４）を有するｈｅＲＸ１−１のいくつかの異形（全て低リスクに変化している）によるヒト血清の中和の比較を示す。
【図２７】図２７は、組換えマウスＲＸ１抗体（ｒｍＲＸ１）およびＲＸ２、ＲＸ１−１−ＩｇＧ２、ＲＸ１−１−ＩｇＧ１、ＲＸ１−１−ＩｇＧ１、ＲＸ１−１−ＩｇＧ４、ＲＸ−ａ−ＩｇＧ４と標識される、それぞれ異なる定常領域（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４）を有するｈｅＲＸ１−１のいくつかの異形（全て低リスクに変化している）によるＭＤＡ２３１（乳癌細胞株）媒体の中和の比較を示す。
【図２８】図２８は、組換えマウスＲＸ１抗体（ｒｍＲＸ１）ならびにｈｅＲＸ１−１．ＩｇＧ１およびｈｅＲＸ１−１．ＩｇＧ２と標識される、それぞれ異なる定常領域（ＩｇＧ１またはＩｇＧ２）を有するｈｅＲＸ１−１の２つの異なる異形の破骨細胞生成（ｏｓｔｅｏｃａｌｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）（ＴＲＡＰ活性によって測定）に及ぼす影響を示す。
【図２９Ａ】図２９Ａは、低リスクのアミノ酸が変化したｈｅＲＸ１−１．ＩｇＧ１のアミノ酸配列（配列番号１１４）およびヌクレオチド配列（配列番号１１３）を示す。
【図２９Ｂ】図２９Ｂは、低リスク＋中程度のリスクのアミノ酸が変化したｈｅＲＸ１−１．ＩｇＧ１のアミノ酸配列（配列番号１１６）およびヌクレオチド配列（配列番号１１５）を示す。
【図３０】図３０は、低リスクのアミノ酸が変化したｈｅＲＸ１−１．ＩｇＧ４のアミノ酸配列（配列番号１１９）およびヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ（配列番号１１８）およびゲノムＤＮＡ（配列番号１１７））を示す。
【図３１】図３１は、５Ｈ４の破骨細胞生成に及ぼす影響を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２４Ｅ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2009502952.tif 000077
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