(57)【要約】  抗体もしくは抗体断片標的化カチオン性免疫リポソームもしくはポリマー複合体を製造する方法であって、(a) 抗体または抗体断片を製造し;(b) 該抗体または抗体断片をカチオン性リポソームと混合してカチオン性免疫リポソームを形成するか、またはカチオン性ポリマーと混合してポリプレックス(polyplex)を形成し;そして、(c) 該カチオン性免疫リポソームまたは該ポリプレックスを治療もしくは診断剤と混合して該抗体もしくは抗体断片標的化カチオン性免疫リポソームもしくはポリマー複合体を形成する工程を含む、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体もしくは抗体断片標的化カチオン性免疫リポソーム複合体を製造する方法であって、
(a) 抗体または抗体断片を製造し;
(b) 該抗体または抗体断片をカチオン性リポソームと混合してカチオン性免疫リポソームを形成し(ここで、該抗体または抗体断片は、化学的に、該カチオン性リポソームと結合しない);そして、
(c) 該カチオン性免疫リポソームを小分子と混合して該抗体もしくは抗体断片標的化カチオン性免疫リポソーム複合体を形成すること
を含む、方法。
【請求項２】
抗体を該カチオン性リポソームと混合する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
抗体断片を該カチオン性リポソームと混合する、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
該抗体断片が、一本鎖Fv断片である、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
該抗体断片が、抗トランスフェリン受容体一本鎖Fv(TfRscFv)である、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
該抗体または抗体断片が、抗HER-2抗体もしくは抗体断片である、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
該抗体断片が、該カチオン性リポソームと混合される前に、カルボキシ末端にシステイン部分を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
該カチオン性リポソームが、1個またはそれ以上のカチオン性脂質および1個またはそれ以上の中性もしくはヘルパー脂質の混合物を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
該抗体または抗体断片を、約1:20から約1:40(w:w)の範囲の比率で該カチオン性リポソームと混合する、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
該カチオン性リポソームが、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンとジオレオイルトリメチルアンモニウムホスフェートおよび/またはコレステロールの混合物;またはジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイドとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび/またはコレステロールの混合物を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
該カチオン性免疫リポソームを、約0.2:7から約14:7(小分子:免疫リポソーム)の範囲のモル比で該小分子と混合する、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
該カチオン性免疫リポソームを、約7:7(小分子:免疫リポソーム)のモル比で該小分子と混合する、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
該小分子が、約5000ダルトン未満の分子量を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
該小分子が、約1000ダルトン未満の分子量を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
該小分子が、約300から約700ダルトンの分子量を有する、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
該小分子が、約2から約9の範囲の少なくとも1個のpKaを有する、請求項1に記載の方法。
【請求項１７】
該小分子が、抗癌小分子である、請求項1に記載の方法。
【請求項１８】
該小分子が、GMC-5-193、YK-3-250、メシル酸イマチニブ、塩酸エルロチニブ、リンゴ酸スニチニブ、ゲフィチニブ、ならびにその類似体および誘導体からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項１９】
請求項1に記載の方法により製造されたカチオン性免疫リポソーム。
【請求項２０】
カチオン性リポソーム、抗体または抗体断片、および小分子を含み、ここで、該抗体または抗体断片は、化学的に、該カチオン性リポソームに結合しない、抗体もしくは抗体断片標的化カチオン性免疫リポソーム複合体。
【請求項２１】
該小分子が、該カチオン性リポソームに封入された、請求項20に記載のカチオン性免疫リポソーム複合体。
【請求項２２】
該小分子が、該カチオン性リポソームの炭化水素鎖領域内に含まれる、請求項20に記載のカチオン性免疫リポソーム複合体。
【請求項２３】
該小分子が、該カチオン性リポソームの内部もしくは外部単層と結合する、請求項20に記載のカチオン性免疫リポソーム複合体。
【請求項２４】
該抗体断片が、一本鎖Fv断片である、請求項20に記載のカチオン性免疫リポソーム複合体。
【請求項２５】
該抗体断片が、抗トランスフェリン受容体一本鎖Fv(TfRscFv)である、請求項20に記載のカチオン性免疫リポソーム複合体。
【請求項２６】
該抗体または抗体断片が、抗HER-2抗体もしくは抗体断片である、請求項20に記載のカチオン性免疫リポソーム複合体。
【請求項２７】
該カチオン性リポソームが、1個またはそれ以上のカチオン性脂質および1個またはそれ以上の中性もしくはヘルパー脂質の複合体を含む、請求項20に記載のカチオン性免疫リポソーム複合体。
【請求項２８】
該抗体または抗体断片および該カチオン性リポソームが、約1:20から約1:40(w:w)の範囲の比率で存在する、請求項20に記載のカチオン性免疫リポソーム複合体。
【請求項２９】
該カチオン性リポソームが、ジオレオイルトリメチルアンモニウムホスフェートとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび/またはコレステロールの混合物;またはジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイドとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび/またはコレステロールの混合物を含む、請求項20に記載のカチオン性免疫リポソーム複合体。
【請求項３０】
該小分子および該カチオン性免疫リポソームが、約0.2:7から約14:7(小分子:免疫リポソーム)の範囲のモル比で存在する、請求項20に記載のカチオン性免疫リポソーム複合体。
【請求項３１】
小分子および該カチオン性免疫リポソームが、約7:7(小分子:免疫リポソーム)のモル比で存在する、請求項20に記載のカチオン性免疫リポソーム複合体。
【請求項３２】
該小分子が、約5000ダルトン未満の分子量を有する、請求項20に記載のカチオン性免疫リポソーム複合体。
【請求項３３】
該小分子が、約1000ダルトン未満の分子量を有する、請求項32に記載のカチオン性免疫リポソーム複合体。
【請求項３４】
該小分子が、約300から約700ダルトンの分子量を有する、請求項33に記載のカチオン性免疫リポソーム複合体。
【請求項３５】
該小分子が、約2から約9の範囲の少なくとも1個のpKaを有する、請求項20に記載のカチオン性免疫リポソーム複合体。
【請求項３６】
該小分子が、抗癌小分子である、請求項20に記載のカチオン性免疫リポソーム複合体。
【請求項３７】
該小分子が、GMC-5-193、YK-3-250、メシル酸イマチニブ、塩酸エルロチニブ、リンゴ酸スニチニブ、ゲフィチニブ、ならびにその類似体および誘導体からなる群から選択される、請求項20に記載のカチオン性免疫リポソーム複合体。
【請求項３８】
請求項19または20に記載のカチオン性免疫リポソーム複合体を患者に投与することを含む、疾患状態を患う患者を処置する方法。
【請求項３９】
該投与が、静脈内投与である、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
請求項19または20に記載のカチオン性免疫リポソーム複合体を患者に投与することを含む、癌を患う患者を処置する方法。
【請求項４１】
該投与が、静脈内投与である、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
該投与が、腫瘍内、病巣内、エアロゾル、経皮、内視鏡、局所、経口、および皮下投与からなる群から選択される経路による投与を含む、請求項40に記載の方法。
【請求項４３】
さらに、化学療法剤を患者に投与することを含む、請求項40に記載の方法。
【請求項４４】
該小分子が、GMC-5-193、YK-3-250、メシル酸イマチニブ、塩酸エルロチニブ、リンゴ酸スニチニブ、ゲフィチニブ、ならびにその類似体および誘導体からなる群から選択され、該化学療法剤が、ドキソルビシン、シスプラチン、ミトキサントロン、タキソテールおよびCDDPからなる群から選択される、請求項43に記載の方法。
【請求項４５】
該化学療法剤を、カチオン性免疫リポソーム複合体後に送達する、請求項43に記載の方法。
【請求項４６】
該化学療法剤を、カチオン性免疫リポソーム複合体の少なくとも12時間後に送達する、請求項45に記載の方法。
【請求項４７】
該化学療法剤を、カチオン性免疫リポソーム複合体前に送達する、請求項43に記載の方法。
【請求項４８】
該化学療法剤を、カチオン性免疫リポソーム複合体の少なくとも12時間前に送達する、請求項47に記載の方法。
【請求項４９】
化学療法剤と共に、請求項19または20に記載のカチオン性免疫リポソーム複合体を患者に投与することを含む、化学療法剤の効果を高める方法。
【請求項５０】
該小分子が、GMC-5-193、YK-3-250、メシル酸イマチニブ、塩酸エルロチニブ、リンゴ酸スニチニブ、ゲフィチニブ、ならびにその類似体および誘導体からなる群から選択され、該化学療法剤が、ドキソルビシン、シスプラチン、ミトキサントロン、タキソテールおよびCDDPからなる群から選択される、請求項49に記載の方法。
【請求項５１】
該化学療法剤が、カチオン性免疫リポソーム複合体後に送達される、請求項49に記載の方法。
【請求項５２】
該化学療法剤が、カチオン性免疫リポソーム複合体の少なくとも12時間後に送達される、請求項51に記載の方法。
【請求項５３】
該化学療法剤が、カチオン性免疫リポソーム複合体前に送達される、請求項49に記載の方法。
【請求項５４】
該化学療法剤が、カチオン性免疫リポソーム複合体の少なくとも12時間前に送達される、請求項53に記載の方法。
【請求項５５】
さらに、放射線治療を患者に施すことを含む、請求項40に記載の方法。
【請求項５６】
該小分子が、GMC-5-193、YK-3-250、メシル酸イマチニブ、塩酸エルロチニブ、リンゴ酸スニチニブ、ゲフィチニブ、ならびにその類似体および誘導体からなる群から選択され、該放射線治療が、γ線、X線、紫外線、マイクロ波および電子放出からなる群から選択される、請求項55に記載の方法。
【請求項５７】
該放射線治療が、カチオン性免疫リポソーム複合体後に送達される、請求項55に記載の方法。
【請求項５８】
該放射線治療が、カチオン性免疫リポソーム複合体の少なくとも12時間後に送達される、請求項57に記載の方法。
【請求項５９】
該放射線治療が、カチオン性免疫リポソーム複合体前に送達される、請求項55に記載の方法。
【請求項６０】
該放射線治療が、カチオン性免疫リポソーム複合体の少なくとも12時間前に送達される、請求項59に記載の方法。
【請求項６１】
放射線治療と共に、請求項19または20に記載のカチオン性免疫リポソーム複合体を患者に投与することを含む、放射線治療の効果を高める方法。
【請求項６２】
該小分子が、GMC-5-193、YK-3-250、メシル酸イマチニブ、塩酸エルロチニブ、リンゴ酸スニチニブ、ゲフィチニブ、ならびにその類似体および誘導体からなる群から選択され、該放射線治療が、γ線、X線、紫外線、マイクロ波および電子放出からなる群から選択される、請求項61に記載の方法。
【請求項６３】
該放射線治療が、カチオン性免疫リポソーム複合体後に送達される、請求項61に記載の方法。
【請求項６４】
該放射線治療が、カチオン性免疫リポソーム複合体の少なくとも12時間後に送達される、請求項63に記載の方法。
【請求項６５】
該放射線治療が、カチオン性免疫リポソーム複合体前に送達される、請求項61に記載の方法。
【請求項６６】
該放射線治療が、カチオン性免疫リポソーム複合体の少なくとも12時間前に送達される、請求項65に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、疾患を処置するための分子の全身送達のために有用な抗体もしくは抗体断片標的化免疫リポソームおよび抗体もしくは抗体断片標的化ポリマーを製造する方法を提供する。リポソームおよびポリマー複合体は、小分子の送達、および標的化遺伝子送達ならびに全身投与後の有効な遺伝子発現を行うために有用である。送達システムの特異性は、標的化抗体もしくは抗体断片に由来する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術
癌のための理想的な治療は、腫瘍表現型に関与する細胞経路を選択的に標的化するものであり、正常細胞に非毒性であるものである。今日まで、理想的な治療はまだ実現していない。遺伝子治療を含む癌処置は、かなりの見込みを有しているが、この見込みが実現し得る前に取り組むべき多くの問題が存在する。おそらく、巨大分子処置と関連する最大の問題は、治療分子のそれらが必要とされる身体部位への有効な送達である。理想的な送達ビヒクルは、全身的に投与された後、腫瘍細胞が体内の何処に発生しているかにかかわりなく常に当該腫瘍細胞を標的とするものであろう。ウイルスおよびリポソームを含むさまざまな送達系(“ベクター”)が試みられている。ウイルスを送達ベクターとして魅力的なものにする感染性は、また、最大の欠点を引き起こす。残りのウイルスエレメントは、免疫原性があるか、細胞変性的であるか、または組換え的であり得る。感染のための新規標的を有する新規ウイルスの産生は、また、いったん患者に投与すると、これらのウイルスが、遺伝子変化により、新規ヒト病原体に形質転換し得るという理論上の可能性を生じる。結果として、多くの注目は、分子治療の送達のための非ウイルスベクターに向けられている。リポソーム法は、遺伝子送達に関して、ウイルス方法論を超えた多くの利点を提供する。最も重要なのは、それらが免疫原性を欠いているということである。さらに、リポソームは、自己複製が可能な感染性薬剤ではないので、それらは、新種の感染性ヒト病原体を進化させる危険を生じない。
【０００３】
リポソームにより癌細胞を標的とすることは、リポソームを修飾することにより達成し得て、その結果、それらは、選択的に、それらのペイロード(引受荷物)を腫瘍細胞に送達し得る。表面分子は、腫瘍細胞の外部に存在する分子が正常細胞のそれらとは異なるので、腫瘍細胞にリポソームを標的化し得る。例えば、リポソームが、タンパク質トランスフェリン(Tf)またはその表面にトランスフェリン受容体(TfR)を認識する抗体を有するとき、それは、より高レベルのTfRを有する癌細胞を標的化するであろう。腫瘍を標的化するように設計されたそのようなリポソームは、それらの標的を探索できる“スマート”爆弾と形容される。
【０００４】
治療に対する応答の失敗は、前立腺癌を含む多くの型の癌において、満たされていない医療の必要性を示す。しばしば、癌が再発すると、腫瘍は、放射線または化学療法剤に対する増加した耐性を獲得している。現在使用されている癌治療への放射線-/化学-感受性を生じる新規構成要素の組み込みは、多大な臨床妥当性を有するであろう。そのような感受性を達成し得る1つの方法は、遺伝子治療による(すなわち、発現が増加した感受性を生じさせる遺伝子の送達)。PCT特許出願WO 00/50008(2000年8月31日に公開された)(それは、引用により本明細書の一部とする)では、我々は、抗トランスフェリン受容体一本鎖抗体(TfRscFv)が、化学的に、カチオン性リポソームに結合し得るという概念の検証を提供した。さらに、このTfRscFvに向けられたリポソーム送達系は、遺伝子および他の分子を、全身的および特異的に、腫瘍に送達し得る。
【０００５】
遺伝子送達ビヒクルとしての免疫リポソームおよびカチオン性ポリマー
上記したとおり、ウイルスベクターを用いることに関連するいくつかの問題は、非ウイルス送達ベクターにより回避し得る。インビボでのヒト治療のための遺伝子の医薬製剤、とりわけ、カチオン性リポソーム仲介遺伝子送達系(31、32)の開発が進行している。カチオン性リポソームは、正電荷脂質二重層からなり、脂質およびDNAの単純混合により負電荷の裸DNAと複合体を形成し得て、その結果、生じた複合体は正味の正電荷を有する。複合体は、培養細胞に結合し、適度なトランスフェクション効率で取り込まれ得る(33)。カチオン性リポソームを多用途にし、DNA送達のために魅力的なものにするそれらの特徴は、下記を含む:製造の容易さ;大量のDNAと複合体を形成する能力;DNAまたはRNAの型および大きさでの使用における多用途性;非分裂細胞を含む多くの異なる細胞型にトランスフェクトする能力;および、免疫原性またはバイオハザード活性の欠如(34、35を参照のこと)。ヒト癌治療の展望からより重要なのは、カチオン性リポソームが、インビボでの遺伝子送達に関して、安全で有効であることが証明されていることである(33、34、36)。少なくとも99の臨床試験の症例が、遺伝子送達のためにカチオン性リポソームを用いて承認されていて(37)、小分子治療薬(例えば、抗真菌剤)の送達のためのリポソームは、既に上市している。
【０００６】
研究者はまた、インビボでの治療剤の送達のための送達ベクターとして、カチオン性ポリマーの適合性を考えている。例えば、ポリエチレンイミン(PEI)は、最大の正電荷密度ポテンシャルを有する有機巨大分子であり、インビトロおよびインビボにおける遺伝子およびオリゴヌクレオチド送達のための他用途ベクターである(最初、Boussif et alにより報告された(66))。それ以来、このポリカチオンおよび遺伝子治療におけるその役割を目的とした多くの研究が行われてきた(73)。細胞結合リガンドを、1) 特定の細胞型を標的とし、2) 標的細胞に結合後の細胞内吸収を促進するために、ポリカチオンに導入し得る(13)。Erbacher et al. (67)は、インテグリン結合ペプチド9-mer RGDをジスルフィド架橋により結合させ、全身遺伝子送達のために関心のある物理的特性を示した。
【０００７】
カチオン性リポソームおよびPEIのようなカチオン性ポリマーのトランスフェクション効率は、それらが細胞表面受容体に認識されるリガンドを有するとき、劇的に増加し得る。受容体仲介エンドサイトーシスは、真核細胞に存在する高効率の内在化経路を示す(38、39)。リポソーム上のリガンドの存在は、細胞表面上の受容体による最初のリガンド結合、およびその後の、結合複合体の内在化により、細胞へのDNAの導入を促進する。トランスフェリン受容体(TfR)レベルは、非限定的に、乳癌、膵臓癌、頭頸部癌、および前立腺癌(40)、ならびに、さらに、ヒトリンパ節および骨転移に由来する前立腺癌細胞株(40-43)を含むさまざまな癌細胞型で高められる。高められたTfRレベルはまた、腫瘍細胞の悪性度または増殖能と相関関係がある(44)。したがって、TfRは、悪性細胞増殖の治療における薬剤送達のための潜在的な標的である(45、46)。我々の研究室で、我々は、SCCHNで60%-70%の腫瘍細胞トランスフェクション効率を有する(リガンドなしのカチオン性リポソームでは、わずか5-20%のトランスフェクション効率)トランスフェリン-複合体化カチオン性リポソームを製造した(47)。また、公開PCT特許出願WO 00/50008を参照のこと。
【０００８】
腫瘍細胞上の受容体により認識されるリガンドの使用に加えて、特異的抗体をまた、リポソーム表面に結合させ得て(48)、それらが特異的腫瘍表面抗原(非限定的に、受容体を含む)に向けられるのを可能にする(49)。これらの“免疫リポソーム”、とりわけ、立体的に安定した免疫リポソームは、治療剤を特異的標的細胞集団に送達し得る(50)。Parks et al.(51)は、リポソームに結合した抗HER-2モノクローナル抗体(MAb)Fab断片が、HER-2を過剰発現している乳癌細胞株、SK-BR-3に特異的に結合し得ることを発見した。免疫リポソームは、被覆ピット経路による受容体仲介エンドサイトーシスにより、およびまた、考え得る膜融合により、効率的に内在化されることが見出された。さらに、抗HER-2 Fab断片の固定は、それらの阻害効果を高めた。より最近、Park et al. (23)は、抗HER-2モノクローナル抗体scFv断片と化学的に結合した長い循環(circulating)リポソームからなる抗HER-2免疫リポソームを使用し、HER-2が過剰発現していなかったとしても、乳癌腫瘍にドキソルビシンを送達した。リポソーム、特に、立体的に安定したリポソームに結合した腫瘍特異的抗原に対する抗体を使用し、インビトロまたはインビボで、プロドラッグおよび薬剤の送達のために腫瘍細胞を標的化する、多くの他の研究が公開された(52-56)。これらの研究は、腫瘍標的化薬剤送達のための免疫リポソームの有用性を証明した。カチオン性リポソーム遺伝子送達および免疫リポソーム技術の組合せは、標的化遺伝子治療のための有望な系であるように思われ、本願の課題である。
【０００９】
バイオテクノロジーの進歩は、MAb由来の特定の認識ドメインの誘導を可能にした(57)。重鎖および軽鎖の可変領域の組換えおよびそれらの一本鎖ポリペプチドへの統合は、標的化目的のために、一本鎖抗体誘導体(scFvと呼ばれる)を使用する可能性を提供する。したがって、抗TfR MAb 5E9 (52)に基づくscFvは、このMAbにより認識されるTfRのエピトープのための完全な抗体結合サイトを、分子量およそ26,000の一本鎖ポリペプチドとして含む。このTfRscFvは、適当な計画的ポリペプチドと共に、重鎖および軽鎖由来の構成要素VHおよびVLの可変領域ドメインをそれぞれ結合することにより形成される。ペプチドは、第1可変領域のC末端および第2加減領域のN末端を架橋し、VH-ペプチド-VLまたはVL-ペプチド-VHとして並べる。scFvの結合サイトは、その親抗体の結合サイトの親和性および特異性を複製し得る。
【００１０】
TfRscFvは、多くの理由のために、Tf分子自身または全MAbさえ超えて、ヒトでの使用で利点を有し、リポソームまたはカチオン性ポリマーを高められたレベルのTfRを有する癌細胞に標的化する。第1に、scFvの大きさ(〜28 kDa)は、Tf分子(〜80 kDa)または親MAb(〜150 kDa)よりもずっと小さい。scFv-リポソーム-治療剤複合体またはscFv-ポリマー-治療剤複合体は、したがって、固形腫瘍に特徴的な小毛細血管へのよりよい浸透を示し得る。第2に、より小さなscFvは、また、組換えタンパク質としてのその生産に関連して、実用的な利点を有する。TfRscFvの大規模産生は、最終的な臨床試験に入るために本発明で想定される治療のために必要とされる。第3は、scFvは組換え分子であり(Tfのように血液産生ではない)、したがって、潜在的な血液感染病原体での汚染に関連する問題は存在しない。TfRscFvを使用することのさらなる利点は、Tfは、リガンドが鉄を搭載したときのみ、高い親和性をもってTfRと相互作用するという事実に関する。鉄搭載Tfを含むリポソームの大規模産生は、実用的な課題を生じる。したがって、TfRscFvの使用は、腫瘍細胞TfRが、鉄(それ自身、癌に関与する(58))を含まないリポソーム治療複合体により標的化されることを可能にする。第4は、MAbのFc領域がないので、Fc受容体を介した非抗原特異的結合の問題を除去する(57)。
【００１１】
p53腫瘍抑制遺伝子および前立腺癌の発症
腫瘍抑制遺伝子p53は、DNA損傷、例えば、DNA修復、細胞周期の制御およびプログラムされた細胞死(アポトーシス)に応答して活性化される経路を含む、種々の細胞経路で重要な役割を果たす(1)。これらの重要な細胞経路の以上は、腫瘍形成の過程と関連している。ヒト癌の60%以上に関連している機能的なp53の欠損は、p53遺伝子自身の突然変異を介して(最も一般的な事象)、またはMDM-2遺伝子の増幅(ある特定の肉腫、および他の癌で見出される)、もしくはp53のヒトパピローマウイルスのE6タンパク質との結合(子宮頸癌で役割を果たし得る)のような他のメカニズムを介して生じ得る(2)。
【００１２】
p53機能の欠失は、多くの癌型と関連しており、非機能性p53は、例えば、15-50%の乳癌、25-70%の転移性前立腺癌、25-75%の肺癌、および33-100%の頭頸部癌と関連している(3)。突然変異p53の存在はまた、肺癌、大腸癌、および乳癌を含む多くのヒト癌のための好ましくない予後と関連しており(3)、突然変異p53は、最も治癒可能な癌の形態のいくつかで、例えば、ウィルムス腫瘍、網膜芽細胞腫、精巣癌および急性リンパ芽球性白血病で、めったに見出されない(4)。さらにp53タンパク質は、固形腫瘍成長のために必要な過程である血管新生に関与する遺伝子を、転写的に制御する(5)。Volpert et al.は、これらの腫瘍に関する血管新生表現型の発達が、p53アレルの両方の欠失を必要とすることを提案した(6)。
【００１３】
多くの抗癌剤はアポトーシスを減少させるように働くので(20)、この経路の変化の阻害は、治療レジメンの失敗を生じうる。p53の突然変異と細胞毒性癌処置(化学-および放射線治療の両方(21))に対する耐性の直接的な関連が提案された。p53機能の欠失が、いくつかの腫瘍細胞で観察される抗癌剤への交差耐性に関与することが、また示された(22)。
【００１４】
p53機能の回復は、したがって、原発性前立腺癌および転移癌でさえ、放射線-/化学-療法への感受性を生じる。wtp53の導入は、インビトロおよびマウス異種移植片モデルにおいて、さまざまな型の悪性腫瘍、例えば、前立腺癌(23、24)、頭頸部癌(25、26)、大腸癌(27)、頸部癌(28)および肺癌(15、29)細胞の増殖を抑制することが報告されている。しかしながら、p53のみでは、部分的に腫瘍成長を阻害できるが、確立された腫瘍を除去できることは示されていない。しかしながら、重要なことに、我々は、全身送達リポソーム-p53および放射線が、確立した頭頸部異種移植片腫瘍の完全な長期間腫瘍退行を生じることを証明した(25、30)。
【００１５】
要約すると、ヒト癌の重要な画分におけるp53遺伝子の関与は、それを癌遺伝子治療のための第1候補の一つにする。p53機能に関する増えている証拠に基づき、腫瘍細胞におけるこれらの機能の有効な回復は、正常な細胞成長制御を再確立し、DNA損傷剤(例えば、化学療法および放射線療法)に対する適当な応答を回復し、血管新生を妨げることが期待され得る。
【００１６】
化学療法および放射線への腫瘍の増感は、抗癌様式の両型の有効投与量を減らし、したがって、しばしば、これらの処置と関連する重篤な副作用を減らし得る。現在まで、多くのp53遺伝子治療プロトコールは、wtp53遺伝子置換のみを使用している。現在の文献および我々のデータに基づき(30、59)、wtp53遺伝子置換のみでは、ある程度まで腫瘍成長を阻害できるが、長期間、腫瘍を除去するのには不十分である。したがって、標準的な治療および標的化遺伝子治療を含むコンビナトリアル法は、癌処置のための新規なおよびより有効な臨床様式として、かなり有望であるように思われる。さらに、我々の全身送達リガンド-リポソームwtp53複合体の証明された腫瘍細胞選択性は、多くの前立腺癌死の最大要因である遠位の微小転移にさえ感受性を有する本方法の潜在性を示す。
【００１７】
非限定的に、受容体チロシンキナーゼ(RTK)および非受容体チロシンキナーゼ(非RTK)を含む細胞内シグナル伝達経路の構成要素は、細胞増殖、分化、移動、血管新生、細胞周期制御などを含む多くの重要亜経路のメディエーターである(Baselga, Science 312, 1175-1178 (2006), Arora and Scholar, J Pharmacol Exp Ther 315, 971-979 (2005), Krause and Van Etten N Eng J Med 353, 172-187 (2005))。これらの重要な経路の多くが、癌細胞で無秩序である。したがって、RTKおよび非RTKは、癌治療のためのよい標的である。そのような治療剤の1つのクラスは、非限定的に、増殖因子受容体を標的とするものを含む小分子であり、したがって、これらのシグナル伝達経路に影響を与える(Imai and Takoka, Nature Reviews: Cancer 6, 714-727 (2006))。これらの阻害剤は、ATPと競合し(ATP模倣剤)、キナーゼ活性を阻害する。最初の成功した小分子阻害剤の1つは、メシル酸イマチニブ(GLEEVEC(登録商標))である。この小分子は、CMLでBCR-ABL融合タンパク質のキナーゼ活性を不活化し(Druker Trends in Molecular Medicine 8, S14-S18 (2002))、フィラデルフィア染色体陽性CMLを有する患者の処置において顕著な効果を示した。また、KITおよびPDGFRαおよびPDGFRβ KITを含む他のTKの阻害剤は、転移性GISTに関与しており、2つの血小板由来増殖因子受容体は、膠芽細胞腫および隆起性皮膚線維肉腫のような腫瘍に関与している。それは、EGFスーパーファミリーのメンバーであるので、EGFRはまた、小分子阻害剤のための当然の標的である。ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))(Herbst et al Nature reviews Cancer 4, 9560965 (2004))およびエルロチニブ(TARCEVA(登録商標))(Minna and Dowell Nature Reviews Drug Discovery Suppl. S14-S15 (2005))は、選択的にEGFRを阻害し、EGFR発現癌、例えば、NSCLCおよび頭頸部扁平上皮癌に対する有効性を示した。それらはまた、化学療法剤と組み合わせて、フェーズII臨床試験で有効性を示した。エルロチニブと化学療法剤ゲムシタビン(抗代謝剤)の組合せは、進行性膵臓癌の処置での使用のために承認された。ゲフィチニブのいくつかのフェーズIII臨床試験が進行している(Chai and Grandis Current Treat Opin Oncol 7, 3-11 (2006))。
【００１８】
小分子は、細胞膜を介してトランスロケートし、細胞表面受容体の細胞内ドメインおよび細胞内シグナル伝達分子と相互作用し得る。したがって、RASプレニル化、RAF-MEKキナーゼ、PI3キナーゼ、mTOR経路(ラパマイシンのほ乳類標的、およびまた熱ショックタンパク質9)を阻害することにより癌細胞増殖および生存に影響を与える小分子が、また、開発される。小分子による血管内皮増殖因子(VEGF)の阻害は、また、腫瘍の血管新生を阻害し得る。
【００１９】
小分子剤の新型であるソラフェニブ(Nexavar)は、その阻害効果を、RAFセリンキナーゼの異なるアイソフォームおよびさまざまなRTK(VEGF、EGFR、およびPDGF)に対して及ぼす(Arora and Scholar, J Pharmacol Exp Ther 315, 971-979 (2005))。この“二重作用”キナーゼ阻害剤は、増殖および血管新生を阻害することにより、広範囲の抗腫瘍活性を示す(Marx Science 308, 1248-1249 (2005))。リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))は、また、VEGF、PDGFR、KITおよびFLIT3(Marx Science 308, 1248-1249 (2005))の複数標的化TK阻害剤である。小分子剤の潜在的な標的は、また、細胞周期停止およびアポトーシス(プログラムされた細胞死)で重要なユビキチン-プロテアソーム経路で同定された。26Sプロテアソームにおけるキモトリプシンプロテアーゼの選択的、可逆的阻害剤であるボルテゾミブ(Velcade)は、ざまざま癌、とりわけ、血液悪性腫瘍に対して有効であることが報告されている。
【００２０】
抗EGFR TK阻害剤は、経口投与される〜500Daの合成化学薬品であり、(IRESSA(登録商標))のために〜46時間の、およびTARCEVA(登録商標)のために〜36時間の半減期を有する。それらは、静脈内ではなく経口で投与されるので、小分子治療の同投与量での血漿濃度は、患者間で変わり得る(Dancy and Sausville Nature Rev Drug Discov 2, 116-124 (2003))。これは、現在使用されているこれらの薬剤の欠点である。したがって、常に同様量で静脈内投与し得る腫瘍標的化送達複合体中に小分子剤を封入すること、例えば、本発明のそれはは、治療剤としてのそれらの使用を改善する。さらに、そのようなリガンド-リポソーム複合体への封入は、小分子剤を分解から保護し、さらに、それらの効果を高めるであろう。非標的化経口投与小分子剤は、腫瘍細胞に非特異的であり、実際に、正常細胞毒性および逆の副作用を増加させる。これらの副作用は、一般に穏やかであるが(例えば、発疹、にきび、乾燥肌および掻痒)、胃腸毒性(吐き気、嘔吐、食欲不振および特定の下痢)は、投与量を制限し得る。最も一般的な副作用である皮疹は、表皮の標的キナーゼにおける非特異的効果によるものであり得る(Herbst et al Clin Lung Caner 4, 366-369 (2003))。したがって、腫瘍細胞特異的剤による送達は、この問題を減らし得る。今日までに報告された最も重篤な毒性は、IRESSA(登録商標)(ゲフィチニブ)を用いた: 非感染性炎症および下気道線維症により特徴づけられる肺炎の形態である間質性肺炎である。170人を超える患者が、IRESSA(登録商標)での処置後、この疾患で亡くなった(Arora and Scholar, J Pharmacol Exp Ther 315, 971-979 (2005))。最近、胸部CTおよび放射線画像システムは、ゲフィチニブ関連間質性肺疾患が、慣用的な抗癌剤により引き起こされる肺障害に類似しており、直接的な細胞毒性効果を有し得ることを示した。したがって、IRESSA(登録商標)、またはあらゆる小分子剤を送達するための腫瘍細胞特異的薬剤の使用は、間質性肺炎および他の副作用の問題の解決を提供し得る。さらに、本発明の方法による脳を含む必要な部位(原発性および転移性疾患)への直接的な送達は、また、効果的な処置のために必要とされる投与量の減少を生じ、さらに、現在は可能ではない利点を生じ得る。
【発明の概要】
【００２１】
発明の簡単な要約
本発明にしたがって、ヒト疾患を処置することにおける使用のためにさまざまな型の治療分子の腫瘍標的化全身送達を可能にするさまざまな免疫リポソームおよびポリマーを構築している。抗体もしくは抗体断片標的化免疫リポソームもしくはポリマー複合体を、単純で有効な非化学的結合法により製造する。これらの複合体は、抗体もしくは抗体断片のリポソームもしくはポリマー複合体との化学的結合により製造された複合体と均しく有効であるか、またはより有効である。抗体断片を使用すると、得られた複合体は、完全な抗体分子を有する同じリポソーム治療剤またはポリマー治療剤複合体よりも、ずっと高いレベルのトランスフェクション効率を引き起こすことができる。
【００２２】
本発明にしたがって、一本鎖タンパク質は、化学的に、リポソームまたはポリマーに結合しない。それどころか、抗体もしくはscFvリポソーム治療もしくは診断剤複合体または抗体もしくはscFvポリマー治療もしくは診断剤複合体は、一定の比率および順序で、構成要素の単純な混合により形成される。抗体または抗体断片は、直接、リポソームと複合体を形成する(例えば、荷電−荷電相互作用により結合する)。1つの態様では、抗体または一本鎖タンパク質は、最初、約1:20から約1:40(w:w)の範囲のタンパク質:脂質比率で、または約0.1:1から約10:1(モル比)の範囲のタンパク質:ポリマー比率で、カチオン性リポソームまたはポリマーと混合する。抗体もしくは抗体断片リポソームまたは抗体もしくは抗体断片ポリマーを、次いで、望む治療もしくは診断剤、例えば、核酸と、約1:10から1:20(μg、治療もしくは診断剤:nmole、全脂質)または約1:1から1:40(μg、治療もしくは診断剤:nmole、ポリマー)の範囲の比率で混合し、室温で10-15分間、インキュベートする。治療もしくは診断剤が小分子である態様では、抗体もしくは抗体断片リポソームまたは抗体もしくは抗体断片ポリマーを、約0.2:7から約14:7(小分子:免疫リポソーム)の範囲のモル比で、適当には、約2.8:7から約7:7(小分子:リポソーム/ポリマー複合体)の範囲のモル比で、小分子と混合する。
【００２３】
得られた治療もしくは診断剤-抗体-リポソームもしくは治療剤-抗体-ポリマー複合体を、ほ乳類身体の標的細胞に薬剤を送達するために、ほ乳類に、好ましくは、ヒトに投与し得る。望ましくは、複合体は、関心のある部位に標的化され、それは、癌細胞または非癌細胞を含む細胞であり得る。標的化剤は、抗体または抗体断片であり、それは、1つの典型的な態様では、トランスフェリン受容体に結合し、標的細胞は、関心のある標的部位を発現するか、またはそれを含む細胞である。抗体または抗体断片がトランスフェリン受容体に結合するとき、標的細胞は、トランスフェリン受容体を発現する細胞である。治療剤は、DNA分子を含む、小分子、核酸であり得て、適当には、野生型p53分子、Rb分子またはアポプチン分子をコードするDNA分子またはアンチセンスHER-2であり得る。複合体は、例えば、治療組成物において、全身的に、好ましくは、静脈内に投与し得る。
【００２４】
さらなる態様では、本発明は、抗体または抗体断片を製造し;抗体または抗体断片をカチオン性リポソームと混合してカチオン性免疫リポソームを形成し(ここで、抗体または抗体断片は、化学的に、該カチオン性リポソームと結合しないが、直接リポソームと複合体を形成するか、結合する);そして、カチオン性免疫リポソームを小分子と混合して該抗体もしくは抗体断片標的化カチオン性免疫リポソーム複合体を形成することを含む、抗体もしくは抗体断片標的化カチオン性免疫リポソーム複合体を製造する方法を提供する。適当な態様では、抗体断片は、一本鎖Fv断片、例えば、抗トランスフェリン受容体一本鎖Fv(TfRscFv)である。
【００２５】
本発明の小分子含有カチオン性免疫リポソーム複合体を製造するのに有用な適当な脂質は、1個またはそれ以上のカチオン性脂質および1個またはそれ以上の中性もしくはヘルパー脂質の混合物を含む。適当には、抗体または抗体断片を、約1:20から約1:40(w:w)の範囲の比率で該カチオン性リポソームと混合する。態様では、カチオン性リポソームは、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび/またはコレステロールを含むジオレオイルトリメチルアンモニウムホスフェートの混合物;または、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび/またはコレステロールを含むジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイドの混合物を含む。さらなる態様では、カチオン性免疫リポソームを、約0.2:7から約14:7(小分子:免疫リポソーム)の範囲のモル比で、適当には、約1:7から約12:7、約1:7から約10:7、約2:7から約9:7、約4:7から約8:7、約5:7から約8:7または約7:7(小分子:免疫リポソーム)のモル比で、小分子と混合する。
【００２６】
本発明の実施における使用のための小分子は、約5000ダルトン未満、より適当には、約1000ダルトン未満、例えば、約300から約700ダルトンの分子量を有する。さらなる態様では、小分子は、約2から約9の範囲の少なくとも1個のpKaを有する。本発明の実施で使用するための適当な小分子は、非限定的に、GMC-5-193、YK-3-250、メシル酸イマチニブ、塩酸エルロチニブ、リンゴ酸スニチニブ、ゲフィチニブ、ならびにその類似体および誘導体を含む、抗癌小分子を含む。さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載した方法で製造する小分子含有カチオン性免疫リポソーム複合体を提供する。
【００２７】
さらなる態様では、本発明は、カチオン性リポソーム、抗体または抗体断片、および小分子を含み、ここで、該抗体または抗体断片は、化学的に、該カチオン性リポソームに結合しない(が、リポソームと直接結合するか/複合体を形成する)、抗体もしくは抗体断片標的化カチオン性免疫リポソーム複合体を提供する。小分子は、カチオン性リポソームに封入され、カチオン性リポソームの炭化水素鎖領域内に含まれ、カチオン性リポソームの内部もしくは外部単層(頭部基を含む)と結合し得て、またはそのあらゆる組合せであり得る。
【００２８】
本発明はまた、本発明の小分子含有カチオン性免疫リポソーム複合体を患者に投与することを含む、疾患状態、例えば非限定的に、癌を患うか、またはその素因がある患者を処置する方法を提供する。適当には、複合体を、静脈内投与により投与する。あるいは、複合体を、他の投与経路、例えば、腫瘍内、病巣内、エアロゾル、経皮、内視鏡的、局所、経口、または皮下投与により、送達し得る。患者が癌を患うか、またはその素因がある態様では、本発明の方法はさらに、カチオン性免疫リポソーム複合体の投与前、間、もしくは後に(例えば、少なくとも12時間前、少なくと12時間後、または同時に)、放射線または化学療法剤を患者に投与することを含み得る。適当な化学療法剤は、非限定的に、ドキソルビシン、シスプラチン、ミトキサントロン、タキソテールおよびCDDPを含む。本発明はまた、化学療法剤の有効性を高める方法を提供し、カチオン性免疫リポソーム複合体の投与前、間、もしくは後に(例えば、少なくとも12時間前、少なくと12時間後、または同時に)、化学療法剤と組み合わせて、本発明の小分子含有カチオン性免疫リポソームを患者に投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図1は、タンパク質/脂質およびDNA/脂質のさまざまな比率でのDU145細胞における、単純な混合により製造したTfRscFv-リポソーム-DNA複合体の結合を示す、ELISAアッセイの結果を示す。
【００３０】
【図２】図2は、DU145細胞で、TfRscFv:脂質の異なる混合比率を用いたインビトロトランスフェクションアッセイの結果を示す(ルシフェラーゼアッセイ)。
【００３１】
【図３】図3は、ラットC6細胞で、TfRscFv:脂質の異なる混合比率を用いたインビトロトランスフェクションアッセイの結果を示す(ルシフェラーゼアッセイ)。
【００３２】
【図４】図4は、TfRscFvの>95%が、単純な混合後、リポソームまたはリポソーム-p53に結合することを証明する非変性ポリアクリルアミドゲルを示す。
【００３３】
【図５Ａ】図5Aは、単純混合で製造したTfRscFv-リポソーム-p53で処理したDU145細胞で誘導されるGEMZAR(登録商標)の化学的感受性を示すXTT細胞毒性アッセイの結果を示す。
【００３４】
【図５Ｂ】図5Bは、単純混合で製造したTfRscFv-リポソーム-p53で処理したDU145細胞で誘導されるミトキサントロンの化学的感受性を示すXTT細胞毒性アッセイの結果を示す。
【００３５】
【図６】図6Aおよび6Bは、単純混合で製造したTfRscFv-リポソーム-p53で処理した膵臓癌細胞株(Colo 357およびPanc I)で誘導されるGEMZAR(登録商標)の化学的感受性を示すXTT細胞毒性アッセイの結果を示す。
【００３６】
【図７Ａ】図7Aは、DNA:脂質のさまざまな比率で単純混合により製造した、全身投与したTfRscFv-リポソーム-EGFP複合体のインビトロ腫瘍標的化能力を示す。
【００３７】
【図７Ｂ】図7Bは、4つの異なる腫瘍で、複数のTfRscFvタンパク質のバッチを用いて、単純混合により製造した全身投与したTfRscFv-リポソーム-EGFP複合体のインビボ腫瘍標的化能力を示す。
【００３８】
【図８】図8は、DU145ヒト異種移植片前立腺癌における、単純混合により製造した全身投与したTfRscFv-リポソームA-p53と放射線の組合せ効果を示す。
【００３９】
【図９】図9は、TfRscFv-リポソーム-AS HER-2 ODNで処理したPanc I細胞で誘導されるGEMZAR(登録商標)に対する化学感受性を示す、XTT細胞毒性アッセイの結果を示す。
【００４０】
【図１０Ａ】図10Aは、Panc Iヒト異種移植片膵臓癌における、全身投与したTfRscFv-リポソームA-AS HER-2 ODNとGEMZAR(登録商標)の組合せ効果を示す。
【００４１】
【図１０Ｂ】図10Bは、MDA-MB-435ヒト異種移植片乳癌における、全身投与したTfRscFv-リポソームA-AS HER-2 ODNとタキソテールの組合せ効果を示す。
【００４２】
【図１１】図11は、TfRscFv-リポソーム-MAGNEVIST(登録商標)複合体の全身投与から生じる、高められた腫瘍イメージングを示す。
【００４３】
【図１２】図12は、MDA-MB-435細胞で、立体的に安定したTfRscFv-PEG-リポソームA-pLucのインビトロトランスフェクションアッセイの結果を示す(ルシフェラーゼアッセイ)。
【００４４】
【図１３】図13は、DU145ヒト前立腺癌細胞における、GMC-5-193とLipA-HoKCのモル比の最適化、およびGMC-5-193とLipA-HoKCの異なる比率でのTfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193複合体の効果を示す。
【００４５】
【図１４】図14は、異なる細胞株でのTfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193複合体の効果を示す。
【００４６】
【図１５Ａ】図15Aは、遊離GMC-5-193と比較してTfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193複合体を用いたドキソルビシンに対するMDA-MB-435ヒト黒色腫細胞の増感におけるGMC-5-193の腫瘍標的化リポソーム送達の効果を示す。
【００４７】
【図１５Ｂ】図15Bは、遊離GMC-5-193と比較してTfRscFv/LipA/GMC-5-193複合体を用いたドキソルビシンに対するMDA-MB-435ヒト黒色腫細胞の増感におけるGMC-5-193の腫瘍標的化リポソーム送達の効果を示す。
【００４８】
【図１５Ｃ】図15Cは、1.25 μM GMC-5-193濃度で遊離GMC-5-193と比較したシスプラチンに対するB16/F10マウス黒色腫細胞の増感におけるGMC-5-193(TfRscFv/LipA/GMC-5-193複合体)の腫瘍標的化リポソーム送達の効果を示す。
【００４９】
【図１５Ｄ】図15Dは、2 μM GMC-5-193濃度で遊離GMC-5-193と比較したシスプラチンに対するB16/F10マウス黒色腫細胞の増感におけるGMC-5-193(TfRscFv/LipA/GMC-5-193複合体)の腫瘍標的化リポソーム送達の効果を示す。
【００５０】
【図１５Ｅ】図15Eは、2.5 μM GMC-5-193濃度で遊離GMC-5-193と比較したシスプラチンに対するB16/F10マウス黒色腫細胞の増感におけるGMC-5-193(TfRscFv/LipA/GMC-5-193複合体)の腫瘍標的化リポソーム送達の効果を示す。
【００５１】
【図１６Ａ】図16Aは、TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193複合体を用いたドキソルビシンに対する正常なヒト肺線維芽細胞IMR-90の増感におけるGMC-5-193の腫瘍標的化リポソーム送達の効果を示す。
【００５２】
【図１６Ｂ】図16Bは、TfRscFv/LipA/GMC-5-193複合体を用いたドキソルビシンに対する正常なヒト肺線維芽細胞IMR-90の増感におけるGMC-5-193の腫瘍標的化リポソーム送達の効果を示す。
【００５３】
【図１６Ｃ】図16Cは、TfRscFv/LipA/GMC-5-193複合体を用いたミトキサントロンに対する正常なヒト肺線維芽細胞IMR-90の増感におけるGMC-5-193の腫瘍標的化リポソーム送達の効果を示す。
【００５４】
【図１７Ａ】図17Aは、タキソテールに対するDU145ヒト前立腺癌細胞の増感におけるGMC-5-193(TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193複合体)の腫瘍標的化リポソーム送達の効果を示す。
【００５５】
【図１７Ｂ】図17Bは、ミトキサントロンに対するDU145ヒト前立腺癌細胞の増感におけるGMC-5-193(TfRscFv/LipA/GMC-5-193複合体)の腫瘍標的化リポソーム送達の効果を示す。
【００５６】
【図１７Ｃ】図17Cは、タキソテールに対するMDA-MB-435ヒト黒色腫細胞の増感におけるGMC-5-193(TfRscFv/LipA/GMC-5-193複合体)の腫瘍標的化リポソーム送達の効果を示す。
【００５７】
【図１８】図18は、CDDPに対するB16/F10マウス黒色腫細胞の増感におけるGMC-5-193の腫瘍標的化リポソーム送達の効果を示す。
【００５８】
【図１９Ａ】図19Aは、MDA-MB-435細胞での遊離GMC-5-193もしくはTfRscFv/LipA/GMC-5-193複合体吸収のインビトロ比較を示す。
【００５９】
【図１９Ｂ】図19Bは、MDA-MB-435細胞での遊離GMC-5-193もしくはTfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193複合体吸収のインビトロ比較を示す。
【００６０】
【図２０Ａ】図20Aは、TfRscFv/LipA/GMC-5-193(scL-GMC)複合体への蛍光小分子の組み込みによる全身投与後の高められた腫瘍特異的吸収を示す。
【００６１】
【図２０Ｂ】図20Bは、TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193複合体への蛍光小分子の組み込みによる全身投与後の高められた腫瘍特異的吸収を示す。
【００６２】
【図２０Ｃ】図20Cは、TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193複合体を用いた蛍光GMC-5-193の組み込みによる全身投与後の高められた腫瘍特異的吸収を証明する追加のデータを示す。
【００６３】
【図２１Ａ】図21Aは、遊離GMC-5-193、TfRscFv/LipA/GMC-5-193(scL-GMC)およびTfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193(scLHK-GMC)複合体で処理した後のB16/F10肺腫瘍を有する同系マウスでの腫瘍増殖の阻害を示す。
【００６４】
【図２１Ｂ】図21Bは、シスプラチンの有無で、TfRscFv/LipA/GMC-5-193(scL-GMC)およびTfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193(scLHK-GMC)複合体の組合せで処理した後のB16/F10肺腫瘍を有する同系マウスでの腫瘍増殖の阻害を示す。
【００６５】
【図２１Ｃ】図21Cは、CDDPの有無で、TfRscFv/LipA/GMC-5-193およびTfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193複合体の組合せで処理した後のB16/F10肺腫瘍を有する同系マウスでの腫瘍増殖の阻害を示す。
【００６６】
【図２２】図22は、CDDPの有無で、TfRscFv/LipA/GMC-5-193およびTfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193複合体の組合せで処理した後のB16/F10肺腫瘍を有する同系マウスの血清中の切断カスパーゼ-3を示す。
【００６７】
【図２３Ａ】図23Aは、MDA-MB-435細胞で、YK-3-250とLipAの異なる比率でのTfRscFv/LipA/Yk-3-250複合体の効果の比較を示す。
【００６８】
【図２３Ｂ】図23Bは、MDA-MB-435細胞における遊離および複合体YK-3-250の効果の比較を示す。
【００６９】
【図２４Ａ】図24Aは、ヒト前立腺癌細胞におけるリポソーム複合体により送達したメシル酸イマチニブ(GLEEVEC(登録商標))および遊離メシル酸イマチニブ(GLEEVEC(登録商標))の効果の比較を示す。
【００７０】
【図２４Ｂ】図24Bは、ヒト黒色腫細胞におけるリポソーム複合体により送達したメシル酸イマチニブ(GLEEVEC(登録商標))および遊離メシル酸イマチニブ(GLEEVEC(登録商標))の効果の比較を示す。
【００７１】
【図２４Ｃ】図24Cは、B16-F10細胞におけるメシル酸イマチニブ(GLEEVEC(登録商標))の効果の比較を示す。
【００７２】
【図２５Ａ】図25Aは、タキソテールに対するMDA-MB-435ヒト黒色腫細胞の増感におけるメシル酸イマチニブ(GLEEVEC(登録商標))(20μM)のリポソーム複合体送達の効果を示す。
【００７３】
【図２５Ｂ】図25Bは、タキソテールに対するMDA-MB-435ヒト黒色腫細胞の増感におけるメシル酸イマチニブ(GLEEVEC(登録商標))(30μM)のリポソーム複合体送達の効果を示す。
【００７４】
【図２６Ａ】図26Aは、ミトキサントロンに対するDU145ヒト前立腺癌細胞の増感におけるメシル酸イマチニブ(GLEEVEC(登録商標))(20μM)のリポソーム複合体送達の効果を示す。
【００７５】
【図２６Ｂ】図26Bは、ミトキサントロンに対するDU145ヒト前立腺癌細胞の増感におけるメシル酸イマチニブ(GLEEVEC(登録商標))(30μM)のリポソーム複合体送達の効果を示す。
【００７６】
【図２７Ａ】図27Aは、ゲムシタビンに対するPANC-1ヒト膵臓癌細胞の増感におけるメシル酸イマチニブ(GLEEVEC(登録商標))(20μM)のリポソーム複合体送達の効果を示す。
【００７７】
【図２７Ｂ】図27Bは、ゲムシタビンに対するPANC-1ヒト膵臓癌細胞の増感におけるメシル酸イマチニブ(GLEEVEC(登録商標))(30μM)のリポソーム複合体送達の効果を示す。
【００７８】
【図２８Ａ】図28Aは、シスプラチン(CDDP)に対するB16/F10マウス黒色腫細胞の増感におけるメシル酸イマチニブ(GLEEVEC(登録商標))(20μM)のリポソーム複合体送達の効果を示す。
【００７９】
【図２８Ｂ】図28Bは、シスプラチン(CDDP)に対するB16/F10マウス黒色腫細胞の増感におけるメシル酸イマチニブ(GLEEVEC(登録商標))(30μM)のリポソーム複合体送達の効果を示す。
【００８０】
【図２９Ａ】図29Aは、ダカルバジン(DTIC)24時間インキュベーションに対するB16/F10マウス黒色腫細胞の増感におけるメシル酸イマチニブ(GLEEVEC(登録商標))(15μM)のリポソーム複合体送達の効果を示す。
【００８１】
【図２９Ｂ】図29Bは、ダカルバジン(DTIC)24時間インキュベーションに対するB16/F10マウス黒色腫細胞の増感におけるメシル酸イマチニブ(GLEEVEC(登録商標))(20μM)のリポソーム複合体送達の効果を示す。
【００８２】
【図２９Ｃ】図29Cは、ダカルバジン(DTIC)48時間インキュベーションに対するB16/F10マウス黒色腫細胞の増感におけるメシル酸イマチニブ(GLEEVEC(登録商標))(15μM)のリポソーム複合体送達の効果を示す。
【００８３】
【図２９Ｄ】図29Dは、ダカルバジン(DTIC)48時間インキュベーションに対するB16/F10マウス黒色腫細胞の増感におけるメシル酸イマチニブ(GLEEVEC(登録商標))(20μM)のリポソーム複合体送達の効果を示す。
【００８４】
【図３０Ａ】図30Aは、ミトキサントロンに対する正常なヒト繊維芽細胞株H500の増感におけるメシル酸イマチニブ(GLEEVEC(登録商標))(TfRscFv/LipA/メシル酸イマチニブ(scL-GLEEVEC(登録商標)))の腫瘍標的化リポソーム送達の効果を示す。
【００８５】
【図３０Ｂ】図30Bは、タキソテールに対する正常なヒト繊維芽細胞株H500の増感におけるメシル酸イマチニブ(GLEEVEC(登録商標))(TfRscFv/LipA/メシル酸イマチニブ(scL-GLEEVEC(登録商標)))の腫瘍標的化リポソーム送達の効果を示す。
【００８６】
【図３１】図31は、TfRscFv/LipA/メシル酸イマチニブ(scL-GLEEVEC(登録商標))＋CDDPの組合せによるB16/F10肺腫瘍増殖の阻害を示す。
【００８７】
【図３２Ａ】図32Aは、ヒト前立腺癌細胞(DU145)におけるリガンド-リポソーム複合体(TfRscFv/LipA/エルロチニブ(scL-TARCEVA(登録商標)))により送達したエルロチニブ(TARCEVA(登録商標))および遊離エルロチニブの効果の比較を示す。
【００８８】
【図３２Ｂ】図32Bは、ヒト膵臓癌細胞(PANC-1)におけるリガンド-リポソーム複合体(TfRscFv/LipA/エルロチニブ(scL-TARCEVA(登録商標)))により送達したエルロチニブ(TARCEVA(登録商標))および遊離エルロチニブの効果の比較を示す。
【００８９】
【図３２Ｃ】図32Cは、ヒト黒色腫細胞(MDA-MB-435)におけるリガンド-リポソーム複合体(TfRscFv/LipA/エルロチニブ(scL-TARCEVA(登録商標)))により送達したエルロチニブ(TARCEVA(登録商標))および遊離エルロチニブの効果の比較を示す。
【００９０】
【図３３Ａ】図33Aは、遊離エルロチニブ(TARCEVA(登録商標))と比較したミトキサントロンに対するヒト前立腺癌細胞株DU145の増感における3.75μMの濃度でのエルロチニブのTfRscFv/LipA(scL)複合体送達の効果を示す。
【００９１】
【図３３Ｂ】図33Bは、遊離エルロチニブ(TARCEVA(登録商標))と比較したミトキサントロンに対するヒト前立腺癌細胞株DU145の増感における7.5μMの濃度でのエルロチニブのTfRscFv/LipA(scL)複合体送達の効果を示す。
【００９２】
【図３４Ａ】図34Aは、遊離エルロチニブ(TARCEVA(登録商標))と比較したドセタキセル(タキソテール)に対するヒト黒色腫細胞の増感における3.75μMの濃度でのエルロチニブのTfRscFv/LipA(scL)複合体送達の効果を示す。
【００９３】
【図３４Ｂ】図34Bは、遊離エルロチニブ(TARCEVA(登録商標))と比較したドセタキセル(タキソテール)に対するヒト黒色腫細胞の増感における7.5μMの濃度でのエルロチニブのTfRscFv/LipA(scL)複合体送達の効果を示す。
【００９４】
【図３５】図35は、遊離エルロチニブ(TARCEVA(登録商標))と比較したゲムシタビン(GEMZAR(登録商標))に対するヒト膵臓癌細胞PANC-1の増感における7.5μMの濃度でのエルロチニブのTfRscFv/LipA(scL)複合体送達の効果を示す。
【００９５】
【図３６Ａ】図36Aは、ミトキサントロンに対する正常なヒト繊維芽細胞株H500の増感におけるエルロチニブ(TARCEVA(登録商標))(TfRscFv/LipA/エルロチニブ(scL-TARCEVA(登録商標)))の腫瘍標的化リポソーム送達の効果を示す。
【００９６】
【図３６Ｂ】図36Bは、タキソテールに対する正常なヒト繊維芽細胞株H500の増感におけるエルロチニブ(TARCEVA(登録商標))(TfRscFv/LipA/エルロチニブ(scL-TARCEVA(登録商標)))の腫瘍標的化リポソーム送達の効果を示す。
【００９７】
【図３６Ｃ】図36Cは、ゲムシタビン(GEMZAR(登録商標))に対する正常なヒト繊維芽細胞株H500の増感におけるエルロチニブ(TARCEVA(登録商標))(TfRscFv/LipA/エルロチニブ(scL-TARCEVA(登録商標)))の腫瘍標的化リポソーム送達の効果を示す。
【００９８】
【図３７】図37は、遊離スニチニブと比較したDU145ヒト前立腺癌細胞におけるTfRscFv/LipA/スニチニブ複合体中のスニチニブ(SUTENT(登録商標))/LipAの異なる比率の効果を示す。
【００９９】
【図３８Ａ】図38Aは、ヒト前立腺癌細胞(DU145)におけるリガンド-リポソーム複合体(TfRscFv/LipA/スニチニブ(scL-SUTENT(登録商標)))により送達されるスニチニブ(SUTENT(登録商標))および遊離スニチニブの効果の比較を示す。
【０１００】
【図３８Ｂ】図38Bは、ヒト膵臓癌細胞(PANC-1)におけるリガンド-リポソーム複合体(TfRscFv/LipA/スニチニブ(scL-SUTENT(登録商標)))により送達されるスニチニブ(SUTENT(登録商標))および遊離スニチニブの効果の比較を示す。
【０１０１】
【図３９Ａ】図39Aは、遊離スニチニブ(SUTENT(登録商標))と比較したドセタキセル(タキソテール)に対するヒト黒色腫細胞株MDA-MB-435の増感における2.5μMの濃度でのスニチニブのTfRscFv/LipA(scL)複合体送達の効果を示す。
【０１０２】
【図３９Ｂ】図39Bは、遊離スニチニブ(SUTENT(登録商標))と比較したドセタキセル(タキソテール)に対するヒト黒色腫細胞株MDA-MB-435の増感における5μMの濃度でのスニチニブのTfRscFv/LipA(scL)複合体送達の効果を示す。
【０１０３】
【図４０】図40は、遊離スニチニブ(SUTENT(登録商標))と比較したミトキサントロンに対するヒト前立腺癌細胞株DU145の増感における5μMの濃度でのスニチニブのTfRscFv/LipA(scL)複合体送達の効果を示す。
【０１０４】
【図４１】図41は、遊離スニチニブ(SUTENT(登録商標))と比較したゲムシタビン(GEMZAR(登録商標))に対するヒト膵臓癌細胞株PANC-1の増感における2.5μMの濃度でのスニチニブのTfRscFv/LipA(scL)複合体送達の効果を示す。
【０１０５】
【図４２Ａ】図42Aは、ミトキサントロンに対する正常なヒト繊維芽細胞株H500の増感におけるスニチニブ(SUTENT(登録商標))(TfRscFv/LipA/スニチニブ(scL-SUTENT(登録商標)))の腫瘍標的化リポソーム送達の効果を示す。
【０１０６】
【図４２Ｂ】図42Bは、ドセタキセル(タキソテール)に対する正常なヒト繊維芽細胞株H500の増感におけるスニチニブ(SUTENT(登録商標))(TfRscFv/LipA/スニチニブ(scL-SUTENT(登録商標)))の腫瘍標的化リポソーム送達の効果を示す。
【０１０７】
【図４２Ｃ】図42Cは、ゲムシタビン(GEMZAR(登録商標))に対する正常なヒト繊維芽細胞株H500の増感におけるスニチニブ(SUTENT(登録商標))(TfRscFv/LipA/スニチニブ(scL-SUTENT(登録商標)))の腫瘍標的化リポソーム送達の効果を示す。
【０１０８】
【図４３Ａ】図43Aは、ミトキサントロンに対する正常なヒト肺線維芽細胞株IMR90の増感におけるスニチニブ(SUTENT(登録商標))(TfRscFv/LipA/スニチニブ(scL-SUTENT(登録商標)))の腫瘍標的化リポソーム送達の効果を示す。
【０１０９】
【図４３Ｂ】図43Bは、ドセタキセル(タキソテール)に対する正常なヒト肺線維芽細胞株IMR90の増感におけるスニチニブ(SUTENT(登録商標))(TfRscFv/LipA/スニチニブ(scL-SUTENT(登録商標)))の腫瘍標的化リポソーム送達の効果を示す。
【０１１０】
【図４３Ｃ】図43Cは、ゲムシタビン(GEMZAR(登録商標))に対する正常なヒト肺線維芽細胞株IMR90の増感におけるスニチニブ(SUTENT(登録商標))(TfRscFv/LipA/スニチニブ(scL-SUTENT(登録商標)))の腫瘍標的化リポソーム送達の効果を示す。
【０１１１】
【図４４】図44は、ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))と比較したMDA-MB-231ヒト乳癌細胞におけるTfRscFv/LipA/ゲフィチニブ複合体中のゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))/LipAの異なる比率の効果を示す。
【０１１２】
【図４５Ａ】図45Aは、ヒト乳癌細胞(MDA-MB-231)におけるリガンド-リポソーム複合体(TfRscFv/LipA/ゲフィチニブ(scL-ゲフィチニブ))により送達されるゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))および遊離ゲフィチニブの効果の比較を示す。
【０１１３】
【図４５Ｂ】図45Bは、ヒト黒色腫細胞(MDA-MB-435)におけるリガンド-リポソーム複合体(TfRscFv/LipA/ゲフィチニブ(scL-ゲフィチニブ))により送達されるゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))および遊離ゲフィチニブの効果の比較を示す。
【０１１４】
【図４５Ｃ】図45Cは、ヒト前立腺癌細胞(DU145)におけるリガンド-リポソーム複合体(TfRscFv/LipA/ゲフィチニブ(scL-ゲフィチニブ))により送達されるゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))および遊離ゲフィチニブの効果の比較を示す。
【０１１５】
【図４６Ａ】図46Aは、遊離ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))と比較したドセタキセル(タキソテール)に対するヒト乳癌細胞株MDA-MB-231の増感における12μMの濃度でのゲフィチニブのTfRscFv/LipA(scL)複合体送達の効果を示す。
【０１１６】
【図４６Ｂ】図46Bは、遊離ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))と比較したドセタキセル(タキソテール)に対するヒト黒色腫細胞の増感における15μMの濃度でのゲフィチニブのTfRscFv/LipA(scL)複合体送達の効果を示す。
【０１１７】
【図４６Ｃ】図46Cは、遊離ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))と比較したドセタキセル(タキソテール)に対するヒト前立腺癌細胞株(DU145)の増感における8μMの濃度でのゲフィチニブのTfRscFv/LipA(scL)複合体送達の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１１８】
発明の詳細な説明
本発明にしたがって、抗体もしくは抗体断片標的化カチオン性リポソームもしくはカチオン性ポリマー複合体は、望む混合物の構成要素を、一定の比率で、および一定の順序で、一緒に混合する、単純で有効な非化学的結合法により製造する。予想外に、得られた複合体は、抗体または抗体断片がリポソームまたはポリマーと化学的に結合する類似の複合体と均しく有効であるか、またはより有効である。
【０１１９】
全抗体または抗体断片を、本発明の複合体を製造するために使用し得る。典型的な態様では、抗体断片を使用する。適当には、抗体断片は、抗体の一本鎖Fv断片である。1つの典型的な抗体は、抗TfRモノクローナル抗体であり、適当には、抗体断片は、抗TfRモノクローナル抗体に基づくscFvである。適当な抗TfRモノクローナル抗体は、5E9である。この抗体に基づくscFvは、適当な分子量26,000の一本鎖ポリペプチドとして、このMAbにより認識されるTfRのエピトープのための完全な抗体結合サイトを含む。cFvは、各々、重鎖および軽鎖からの構成要素VHおよびVL可変領域ドメインを、第1可変領域のC末端と第2可変領域のN末端を架橋する適当な設計ペプチドと結合させることにより形成し、VH-ペプチド-VLまたはVL-ペプチド-VHとして並ぶ。他の典型的な抗体は、抗HER-2モノクローナル抗体であり、他の好ましい抗体断片は、抗HER-2モノクローナル抗体に基づくscFvである。
【０１２０】
好ましい態様では、システイン部分が、scFvのC末端に加えられる。理論に縛られることは望まないが、遊離スルフヒドリル基を提供するシステインは、抗体とリポソーム間の複合体の形成を促進し得ると考えられている。実施例で下記に詳述したとおり、システインの有無で、タンパク質をE.coli封入体で発現させ得て、次いで、リフォールドし、不活性な形態で抗体断片を産生し得る。
【０１２１】
複合体の形成において、立体的に安定した免疫リポソームを使用することを望まないとき、複合体を製造する第1工程は、好適なカチオン性リポソームまたはリポソームもしくは小分子ポリマーの組合せを抗体または抗体断片と混合することを含む。さまざまなカチオン性リポソームが、本発明の複合体の製造において有用である。公開されたPCT出願WO99/25320は、いくつかのカチオン性リポソームの製造を開示する。望ましいリポソームの例は、ジオレオイルトリメチルアンモニウムホスフェート(DOTAP)およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)および/またはコレステロール(chol)の混合物、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド(DDAB)およびDOPEおよび/またはcholの混合物を含むものを含む。脂質の比率は、特定の標的細胞型のための治療分子の吸収効率を最適化するように変え得る。リポソームは、1個またはそれ以上のカチオン性脂質および1個またはそれ以上の中性もしくはヘルパー脂質の混合物を含み得る。カチオン性脂質と中性もしくはヘルパー脂質の望ましい比率は、約1:(0.5-3)、好ましくは、1:(1-2)(モル比)である。さらに、リポソームはまた、エンドソーム破壊ペプチド、例えば、Sigma-Genosys(The Woodlands, TX)により製造されたK[K(H)KKK]5-K(H)KKC (HoKC)(配列番号2)ペプチドを含み得る。エンドソーム破壊ペプチドHoKCは、細胞の細胞質で、薬剤の放出を助け得る。
【０１２２】
適当なポリマーは、DNA圧縮を仲介でき、また、エンドソーム放出を仲介し得る、DNA結合カチオン性ポリマーである。好ましいポリマーは、ポリエチレンイミンである。他の有用なポリマーは、ポリジン、プロタミンおよびポリアミドアミンデンドリマーを含む。
【０１２３】
抗体または抗体断片は、標的細胞の表面に、および好ましくは、標的細胞に特異的に発現する受容体に結合するものである。抗体または抗体断片を、約1:20から約1:40(w:w)の範囲のタンパク質:脂質比率で、または約0.1:1から約10:1(モル比)の範囲のタンパク質:ポリマー比率で、カチオン性リポソームまたはポリマーと、室温で混合する。
【０１２４】
抗体または抗体断片およびリポソームまたはポリマーを、室温で短時間、典型的には、約10-15分、インキュベートし、次いで、混合物を、選択した治療もしくは診断剤と混合する。抗体およびリポソームと複合体を形成し得る治療分子もしくは薬剤の例は、遺伝子、高分子量DNA(ゲノムDNA)、プラスミドDNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、ペプチド、リポザイム、核酸、小分子、ウイルス粒子、免疫調節剤、タンパク質、造影剤および化学剤を含む。好ましい治療分子は、p53、Rb94またはアポプチンをコードする遺伝子を含む。RB94は、網膜芽腫抑制遺伝子の変異型である。アポプチンは、腫瘍細胞でのみアポトーシスを誘導する遺伝子である。他の好ましい態様では、薬剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、HER-2である。好ましいHER-2アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列5'-TCC ATG GTG CTC ACT-3'(配列番号1)を有する。好ましい薬剤の第3の型は、診断造影剤、例えば、MRI造影剤、例えば、Gd-DTPA剤である。薬剤がDNA、例えば、p53のコード領域であるとき、それは、強い構成的プロモーター、例えば、RSVまたはCMVプロモーターの制御下に位置し得る。
【０１２５】
抗体または抗体断片およびリポソームの組合せを、約1:10から1:20(薬剤のμg:全脂質のnmole)または約1:10から1:40(薬剤のμg:全ポリマーのnmole)の範囲の比率で治療もしくは診断剤と混合し、室温で短時間、典型的には、約10から15分、インキュベートする。リポソーム複合体の大きさは、典型的には、Malvern ZETASIZER(登録商標)3000を用いて動的光散乱により測定したとおり、約50-500 nmの範囲内である。
【０１２６】
本発明の1つの態様では、複合体を形成するために使用するリポソームは、立体的に安定したリポソームである。立体的に安定したリポソームは、親水性ポリマー、例えば、PEG、ポリ(2-アクリル酸エチル)、またはポリ(n-イソプロピルアクリルアミド(PNIPAM)を統合したリポソームである。そのような修飾リポソームは、それらが、細網内皮系により、ほとんど修飾されていない比較リポソームほど早くは血流から除去されないので、治療もしくは診断剤と複合体を形成するとき、特に有用であり得る。本発明の立体的に安定したリポソームを製造するために、抗体もしくは抗体断片、リポソームおよび治療もしくは診断剤を混合する順序を、上記した順序から逆転させる。最初の工程で、上記のカチオン性リポソームを、最初に、約1:10から1:20(薬剤のμg:脂質のnmole)の範囲の比率で、上記の治療もしくは診断剤と混合する。このリポプレックス(lipoplex)に、生理学的に許容されるバッファー中、PEGポリマーの溶液を加え、得られた溶液を、ポリマーがリポソーム複合体に統合されるのに十分な時間、室温でインキュベートする。抗体もしくは抗体断片を、次いで、室温で、約1:5から約1:30(w:w)の範囲のタンパク質:脂質比率で、安定したリポソーム複合体と混合する。
【０１２７】
本発明にしたがって製造したリポソームもしくはポリマー複合体を、インビボ投与のための薬学的に許容される製剤として、製剤し得る。複合体を、薬学的に許容されるビヒクルまたは担体と結合させ得る。組成物は、例えば、治療もしくは診断分子の複合体の投与により利益を受けるヒト患者への静脈内投与のために製剤し得る。複合体は、おおよそ、それらが、点滴の投与後に体中に分布するような大きさである。或は、複合体を、他の投与経路により、例えば、腫瘍内、経口、病巣内、エアロゾル、経皮、内視鏡的、局所、腹腔内または皮下投与により送達し得る。
【０１２８】
1つの態様では、抗体もしくは抗体断片標的化リポソーム(またはポリマー)および治療剤複合体を含む組成物は、ヒト遺伝子治療を有効にするために投与される。複合体の治療剤構成要素は、適当な制御配列の制御下にある治療剤を含む。さまざまな形態のヒト癌のための遺伝子治療は、wt p53をコードした核酸を含む抗体もしくは抗体断片標的化リポソームもしくはポリマー複合体の全身送達により達成し得る。複合体は、インビトロおよびインビボで、腫瘍細胞(原発性および転移性腫瘍)を、放射線および/または化学療法に対して特異的に標的化し、増感し得る。
【０１２９】
複合体は、脂質の選択および比率、抗体または抗体断片とリポソームの比率、抗体または抗体断片およびリポソームと治療もしくは診断剤の比率、ならびに抗体もしくは抗体断片および治療もしくは診断剤の選択をとおして、標的細胞型のために最適化し得る。
【０１３０】
1つの態様では、標的細胞は癌細胞である。悪性細胞増殖を有するあらゆる組織を処置し得るが、頭頸部癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、膠芽細胞腫、腎臓癌、肝臓癌、子宮頸部癌、肺癌、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、絨毛腫、黒色腫、網膜芽細胞腫、卵巣癌、胃癌および結腸直腸癌が、好ましい標的である。
【０１３１】
本発明の方法により製造した複合体は、また、治療分子の送達のために、非腫瘍細胞を標的として使用し得る。あらゆる正常細胞を標的とし得るが、好ましい細胞は、樹状細胞、血管内皮細胞、肺細胞、乳腺細胞、骨髄細胞、脾臓細胞、胸腺細胞、鼻腔の細胞および肝細胞である。望ましくないが良性の細胞、例えば、良性前立腺肥大細胞、過剰活性化甲状腺細胞、脂肪腫細胞、および自己免疫疾患に関連する細胞、例えば、関節炎、狼瘡、重症筋無力症、扁平上皮化生、異形成症状などに関与する抗体を産生するB細胞を処置し得る。
【０１３２】
複合体は、他の治療剤、例えば、放射線または化学療法剤と組み合わせて投与し得る。治療剤、または治療剤の組合せは、複合体の投与の前後に、例えば、約12時間から約7日以内に、投与し得る。化学療法剤は、非限定的に、例えば、ドキソルビシン、5-フルオロウラシル(5FU)、シスプラチン(CDDP)、ドセタキセル、ゲムシタビン、パクリタキセル、ビンブラスチン、エトポシド(VP-16)、カンプトテシン、アクチノマイシンD、ミトキサントロン、およびマイトマイシンCを含む。放射線治療は、γ線、X線、紫外線、マイクロ波、電子放出などを含む。
【０１３３】
診断剤はまた、リポソームまたはポリマー複合体により、標的細胞に送達し得る。投与後、インビボで検出し得る薬剤を使用し得る。典型的な診断剤は、電子密度の高い物質、核磁気共鳴造影剤および放射性医薬品を含む。イメージングのために有用な放射性核種は、同位体64Cu、67Cu、111In、99mTc、67Gaまたは68Gaを含む、銅、ガリウム、インジウム、レニウムおよびテクネチウムの放射性同位体を含む。米国特許第5,688,488号でLow et al.により開示された造影剤は、本発明に有用であり、それは、引用により本明細書の一部とする。
【０１３４】
本発明の方法にしたがって製造した複合体は、複合体による治療分子の全身送達における使用のためのキットの形態で提供し得る。適当なキットは、別々に、適当な容器、リポソーム、抗体または抗体断片、および治療もしくは診断剤を含み得る。化合物を、適当な順序で、滅菌状態で混合し得て、合理的な時間範囲、一般には、調整後、約30分から約24時間、患者に投与し得る。キット構成要素は、好ましくは、溶液としてか、または乾燥粉末として提供する。溶液型で提供される化合物は、好ましくは、適当な緩衝液、浸透圧調節剤などと共に、注射のための滅菌水で製剤される。
【０１３５】
さらなる態様では、本発明は、リポソーム複合体を提供し、ここで、診断および/または治療剤は、リポソームの内部に封入され、二重層の炭化水素鎖領域内に含まれ、内部および/または外部単層と複合体を形成するか/結合し、またはこれらの可能性の任意のもしくはすべての組合せである、1個またはそれ以上の小分子である。本明細書で使用するとき、“小分子”なる用語は、一般に、約10 kD、適当には、約5000ダルトン未満、およびより適当には、約1000ダルトン未満、例えば、約100から約900ダルトン、約200から約800ダルトン、約300から約700ダルトン、約400から約600ダルトン、または約500ダルトンの分子量を有する低分子量医薬、治療および/または新断剤(後者の例は、マーカー、染料など)、およびエステル、ならびにそのような化合物の薬学的に許容される形態のことを言う。
【０１３６】
小分子の例は、非限定的に、癌(例えば、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、肺癌、白血病、リンパ腫、大腸癌、胃腸癌、膵臓癌、膀胱癌、腎臓癌、骨癌、神経系の癌、頭頸部癌、皮膚癌、肉腫、ならびに線種、癌腫および骨髄腫); 感染性疾患(例えば、細菌疾患、真菌疾患、寄生性疾患およびウイルス疾患(例えば、ウイルス性肝炎、カルディオトロピクウイルスにより生じる疾患; HIV/AIDS、flu、SARSなど)); および遺伝的疾患(例えば、貧血症、好中球減少症、血小板減少症、血友病、小人症および重症複合型免疫不全症(“SCID”); 自己免疫疾患(例えば、乾癬、全身性エリテマトーデスおよび関節リウマチ)ならびに神経変性疾患(例えば、さまざまな形態および段階の多発性硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、アルツハイマー病など)を含むあらゆる疾患状態を患うか、またはその素因がある患者を処置するのに有用である化合物を含む。
【０１３７】
典型的な癌の処置のための有用な小分子(すなわち、抗癌小分子)は、非限定的に、チューブリン重合を阻害する小分子、抗血管新生小分子、キナーゼ阻害剤などを含む。本発明における使用のための小分子は、約2から約9のpKaを有し、多くの場合には、この範囲内のいくつかのpKa(すなわち、2、3、4など)を有する。本発明の実施における使用のための小分子は、水可溶性、わずかな可溶性、または水難溶性(水に溶けない化合物を含む)であり得る。
【０１３８】
適当な態様では、本発明の実施で使用するための小分子は、非限定的に、チューブリン重合阻害剤、例えば、GMC-5-193(およびその類似体)およびYK-3-250(およびその類似体)を含む。
【０１３９】
GMC-5-193(およびその類似体)は、いくつかの癌細胞株で、抗微小管および抗血管新生効果を有するサリドマイド類似体である。GMC-5-193は、抗増殖活性で、ヒト癌細胞増殖を阻害する。この分子の有効性は、既知の抗分裂剤であるビンクレスチンの有効性に類似している。いくつかの研究は、抗増殖効果が、いくつかの型の癌細胞で、チューブリンの重合の阻害によるものであり得ることを示す。これらの類似体は、癌細胞で分裂蓄積および異常な分裂スピンドルの形成を開始した。
【０１４０】
x線構造から、GMC-5-193は、βIIIヒトチューブリンのタキソールおよびコルヒチン結合サイト近くの最大のアミノ酸差異領域に適当にドッキングすることを確認した。しかしながら、インビボ効果を調べると、この小分子の水難溶性がその投与を妨げる。不溶性はさらに薬剤有効性を制限し、増加した用量のための次の必要性は患者の耐用性を脅かすので、溶解性は、全身薬剤バイオアベイラビリティの観点で重要な検討材料である。この問題を回避するために、腫瘍標的化リガンド(TfRscFv)およびHoKC、合成pH感受性ヒスチジン化(histidylated)オリゴリジンと結合した(または、結合しない)カチオン性リポソームを用いた、この分子のための腫瘍標的化リポソーム送達系を利用した。HoKCは、標的複合体の抗癌効果を改善するために複合体中に含まれ、エンドソーム回避を助けるように設計した。該薬剤は、細胞質に拡散することが予期され、そこで、それは、核に移動してその細胞毒性効果を及ぼすか、または細胞外コンパートメントに放出され、そこで、それは、他の腫瘍細胞における細胞毒性効果を有し得る(バイスタンダー効果)。
【０１４１】
本発明の実施のためのさらなる小分子は、チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、非限定的に、下記を含む:
【０１４２】
メシル酸イマチニブ(GLEEVEC(登録商標)):
【化１】
2009537526.tif 000002
C29H31N7O (MW=589.7)、pKa=7.5, 3.0, 2.7;
【０１４３】
塩酸エルロチニブ(TARCEVA(登録商標)):
【化２】
2009537526.tif 000003
C22H23N3O4HCl (MW=429.90、pKa=5.42);
【０１４４】
リンゴ酸スニチニブ(SU11248、SUTENT(登録商標)): 
【化３】
2009537526.tif 000004
C22H27FN4O2・C4H6O5 (MW= 532.6, pKa=8.95);および
【０１４５】
ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標)):
【化４】
2009537526.tif 000005
C22H24CIFN4O3 (MW=446.9、pKa=5.4 & 7.2)。
【０１４６】
本発明の実施における使用のためのさらなる小分子は、医薬化合物、およびマーカー染料ならびに診断のための他の分子を含む。そのような小分子の例は既知であり、当業者により容易に同定され、多くは、Pharmabase(National Center for Research Sources, National Institutes of Health)のようなデーターベースに見出し得る。本発明の実施において使用し得る医薬小分子の一般的なクラスは、非限定的に、膜輸送を制御することに関与する化合物(例えば、チャネル、ポンプ、受容体、トランスポーター); 代謝に関与する化合物(例えば、ATP阻害剤、電子伝達コントローラー、アミノ酸もしくは脂肪酸合成の阻害剤、セラミド類似体など); 細胞内メッセンジャー(例えば、キナーゼ阻害剤など); 細胞シグナル伝達を制御することに関与する化合物; 細胞領域を制御することに関与する化合物; ならびに他の既知の小分子クラスを含む。小分子クラスおよび化合物のさらなる例は、米国特許第7,041,651号、第7,033,775号、第7,005,255号および第6,900,198号をとおして見出し得て、その各々は、それらの全体を引用により本明細書の一部とする。
【０１４７】
本明細書で使用するとき、小分子は、適当には、単純に、加工の間に、1個またはそれ以上の小分子をリポソームと結合させることにより、本発明のリポソーム複合体に封入されるか、含まれるか、または複合体を形成するか/結合する。小分子:リポソーム複合体の適当な比率は、当業者により、容易に決定し得る。例えば、小分子とリポソーム複合体のモル比は、適当には、約0.2:7から約14:7(小分子:免疫リポソーム)の範囲内、適当には、約1:7から約12:7、約1:7から約10:7、約2:7から約9:7、約4:7から約8:7、約5:7から約8:7、約2.8:7または約7:7(小分子:免疫リポソーム)のモル比である。本明細書をとおして記載したとおり、小分子の送達のための望ましいカチオン性リポソームの例は、ジオレオイルトリメチルアンモニウムホスフェート(DOTAP)およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)および/またはコレステロール(chol)の混合物、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド(DDAB)およびDOPEおよび/またはcholの混合物を含むものを含む。脂質の比率は、特定の標的細胞型のための治療分子の吸収効率を最適化するように変え得る。リポソームは、1個またはそれ以上のカチオン性脂質および1個またはそれ以上の中性もしくはヘルパー脂質の混合物を含み得る。リポソームは、1個またはそれ以上のカチオン性脂質および1個またはそれ以上の中性もしくはヘルパー脂質の混合物を含み得る。カチオン性脂質と中性もしくはヘルパー脂質の望ましい比率は、約1:(0.5-3)、好ましくは、約1:(1-2)(モル比)である。さまざまな脂質の比率の例は、非限定的に、下記である:
【表１】
2009537526.tif 000006
(DOTAP = ジオレオイルトリメチルアンモニウムホスフェート、DDAB = ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド; DOPE = ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン; chol = コレステロール)。
【０１４８】
さらなる態様では、本発明は、抗体または抗体断片を製造し;抗体または抗体断片をカチオン性リポソームと混合してカチオン性免疫リポソームを形成し(ここで、抗体または抗体断片は、化学的に、該カチオン性リポソームと結合しない);そして、カチオン性免疫リポソームを小分子と混合して該抗体もしくは抗体断片標的化カチオン性免疫リポソーム複合体を形成することを含む、小分子含有抗体もしくは抗体断片標的化カチオン性免疫リポソーム複合体を製造する方法を提供する。抗体または抗体断片は、化学的に、カチオン性リポソームに結合しないが、それは、免疫リポソームを形成するために、例えば、荷電−荷電、もしくは他の非化学的結合相互作用により、リポソームと直接結合するか、または複合体を形成する。
【０１４９】
適当な態様では、抗体断片は、一本鎖Fv断片、例えば、抗トランスフェリン受容体一本鎖Fv(TfRscFv)である。小分子含有カチオン性免疫リポソームを製造することでの使用のための適当な脂質の例は、本明細書に記載したとおりであり、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび/またはコレステロールを含むジオレオイルトリメチルアンモニウムホスフェートの混合物;および、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび/またはコレステロールを含むジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイドの混合物を含む。適当には、カチオン性免疫リポソームを、約0.2:7から約14:7(小分子:免疫リポソーム)の範囲のモル比で、適当には、約1:7から約12:7、約1:7から約10:7、約2:7から約9:7、約4:7から約8:7、約5:7から約8:7、約2.8:7または約7:7(小分子:免疫リポソーム)のモル比で、小分子と混合する。本発明の実施における使用のための典型的な小分子は、本明細書に記載したもの、および当業者に既知であり、当業者により容易に同定されるさらなる小分子を含む。適当には、小分子は、抗癌小分子、例えば、非限定的に、GMC-5-193、YK-3-250、メシル酸イマチニブ、塩酸エルロチニブ、リンゴ酸スニチニブ、ゲフィチニブ、ならびにその類似体および誘導体、ならびに本明細書に記載した他のものであり、それは、当業者に既知である。さらなる態様では、本発明は、本明細書で記載した方法により製造される小分子含有カチオン性免疫リポソーム複合体を提供する。
【０１５０】
さらなる態様では、本発明は、カチオン性リポソーム、抗体または抗体断片、および小分子を含む抗体もしくは抗体断片標的化カチオン性免疫リポソーム複合体を提供し、ここで、抗または抗体断片は、カチオン性リポソームと化学的に結合しない。小分子を、カチオン性リポソームに封入し、カチオン性リポソームの炭化水素鎖領域と共に含まれ、カチオン性リポソームの内部または外部単層(頭部基領域を含む)と結合し、またはその任意の組合せであり得る。適当には、本発明のカチオン性免疫リポソームは、いくつかの求心性二重層を含む多重膜リポソームを、また、使用し得るが、単層リポソーム(すなわち、単一二重層)である。本発明の単一二重層カチオン性免疫リポソームは、薬剤(例えば、小分子)(適当には、水溶性薬剤)を封入し得る内部水性容積を含む。それらはまた、薬剤(例えば、小分子)(適当には、脂溶性薬剤)を含み得る、炭化水素鎖領域(すなわち、脂質の脂質鎖領域)を有する単一二重層を含む。さらに、薬剤(例えば、小分子)は、リポソーム膜の内部単層/外部単層(すなわち、脂質の頭部基領域)の両方と複合体を形成するか、または結合し得る。さらなる態様では、薬剤(例えば、小分子)を、本発明のカチオン性免疫リポソーム複合体のこれらの領域のいずれか、またはすべてで、封入/結合/複合体化し得る。
【０１５１】
またさらなる態様では、本発明は、本発明の小分子含有カチオン性免疫リポソーム複合体を患者に投与することを含む、疾患状態を患うか、またはその素因がある患者を処置する方法を提供する。免疫リポソーム複合体は、非限定的に、静脈内、経口、局所、吸入による、筋肉内注射、腫瘍内注射、病巣内注射、エアロゾル、経皮、内視鏡的、局所、腹腔内、もしくは皮下投与または他の投与経路を含む、あらゆる望む経路により投与し得る。本明細書で使用するとき、患者なる用語は、非限定的に、動物患者(例えば、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジなどのようなほ乳類)およびヒトの両方を含む。
【０１５２】
適当には、本発明の方法は、癌を患うか、またはその素因がある患者を処置するために使用する。さらなる態様では、癌を患うか、またはその素因がある患者を処置する方法は、さらに、小分子含有免疫リポソーム複合体の投与に加えて、化学療法剤を患者に投与することを含み得る。適当な態様では、本発明の方法は、ドキソルビシン、シスプラチン、ミトキサントロン、タキソテールおよびCDDPからなる群から選択される化学療法剤と共に、GMC-5-193、YK-3-250、メシル酸イマチニブ、塩酸エルロチニブ、リンゴ酸スニチニブ、ゲフィチニブ、ならびにその類似体および誘導体からなる群から選択される小分子を含む免疫リポソーム複合体を投与することを含む。小分子含有免疫リポソーム複合体および化学療法剤は、同時に投与し得るか、または異なる時(例えば、互いの前または後)に投与し得る。適当には、化学療法剤は、小分子含有免疫リポソーム複合体の前または後に投与し得る(例えば、カチオン性免疫リポソーム複合体を投与する、少なくとも6時間前または後、少なくとも12時間前または後、少なくとも24時間前または後、少なくとも48時間前または後など)。さらなる態様では、化学療法剤および小分子含有免疫リポソーム複合体は、患者に同時に投与される。小分子含有免疫リポソーム複合体および化学療法剤の適当な投与用量もしくは時期は、本明細書に含まれた情報および当業者が容易に利用できる情報に基づいて、当業者により容易に決定し得る。
【０１５３】
さらなる態様では、本発明は、化学療法剤と組み合わせて、本発明のカチオン性免疫リポソーム複合体(例えば、カチオン性免疫リポソーム複合体含有小分子)を患者に投与することを含む、化学療法剤の効果を高める方法を提供する。適当な小分子および化学療法剤は、本明細書に記載したものおよび当業者に既知のものを含む。小分子含有免疫リポソーム複合体および化学療法剤は、同時に投与し得るか、または異なる時に投与し得る。適当な化学療法剤は、小分子含有免疫リポソーム複合体の前または後に投与される(例えば、カチオン性免疫リポソーム複合体を投与する、少なくとも6時間前または後、少なくとも12時間前または後、少なくとも24時間前または後、少なくとも48時間前または後など)。さらなる態様では、化学療法剤および小分子含有免疫リポソーム複合体は、患者に同時に投与される。
【０１５４】
他の適当な修飾ならびに本明細書に記載した方法および出願への適用は、本発明の範囲またはそのあらゆる態様から離れることなく製造し得ることは、関連する分野の当業者に容易に明らかである。今まで、本発明を詳細に説明してきたので、同様に、下記の実施例を参照してより明確に理解され、それは、例示のみの目的のために本明細書に包含されるものであり、本発明の限定を意図するものではない。
【実施例】
【０１５５】
実施例1
3'システインを有するTfRscFvの構築および精製
プラスミド発現ベクターpDFH2T-vecOKは、Dr. David Fitzgerald, NCIから入手した。このベクターは、5E9抗体のための一本鎖断片をコードし、それは、ヒトトランスフェリン受容体(CD71)を認識する。VH-リンカー-Vκ TfRscFvは、望む断片のPCR増幅により得た。システイン部分を、TfRscFvタンパク質の3'末端に加えた。このベクターの2つの形態を構築した。最初の形態は、ペリプラスム空間への輸送のためのpelBリーダーシグナル配列、およびHis Tagを含む。His Tagの存在は、タンパク質の検出を助け、したがって、精製プロトコールの開発を単純化する。この形態は、最初の試験のために使用されるが、FDAガイドラインは、外部配列が臨床試験での使用のために存在しないことを薦めている。したがって、これらの配列の両方が存在しない第2形態を製造した。
【０１５６】
PCR増幅を用いて、システイン残基およびNotI制限サイトのためのヌクレオチド配列を、3'末端に導入した。同様に、5' NcoIもまた、導入した。PCR産物を、市販のベクターpET26b(+)(Novagen)のNcoIおよびNotIサイトにクローン化し、pelBリーダーシグナル配列およびHis Tagの両方を含むタンパク質産物を産生した。IPTGを含む細菌培養での増殖により、およそ100倍の一本鎖タンパク質発現の増加を産生し、それは、IPTGの誘導のおよそ10時間後に最大であった。このタンパク質は、最初、不可溶性画分に見出された(封入体)。
【０１５７】
上記構築体を、また、最終タンパク質産物でHis TagおよびpelB配列を除去するために修飾した。これを達成するために、pET26b(+)ベクターを、pelB配列の5' Nde I酵素サイトで切り出した。PCR増幅により、TfR配列のためのVH-リンカー-Vκ scFvの5'末端にNde Iサイトを導入した。3'末端のシステイン残基およびNotI制限サイトのためのヌクレオチド配列に加えて、DNAストップコドンを、システイン配列の隣に、およびNotIサイトの前に導入した。PCR産物を、市販の発現ベクターpET26b(+)(Novogen)のNdeIおよびNotIサイトにクローン化した。したがって、この構築体のタンパク質産物は、pelB配列またはHisタグの両方を含まない。
【０１５８】
多くのcys-TfRscFvタンパク質(およそ90%)は、可溶性ではなく、封入体に含まれていた。したがって、上記の構築体からのタンパク質を、超音波処理、6 M グアニジン-HCl、200 mM NaCl(6 M GuHCl緩衝液)を用いた処理により封入体から単離し、Sephacryl S-200ゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより精製した。cys-TfRscFvタンパク質のリフォールディングは、4℃で、減少した濃度のグアニジン-HClに対する透析により達成した。あるいは、cys-TfRscFvタンパク質は、Triton X-100を用いた超音波処理、およびその後の6 M グアニジン-HCl、0.1M トリス-HCl pH=8.0、2 mM EDTA pH= 8.0およびジチオエリトリットでの可溶化による、封入体の単離により製造した。リフォールディングは、0.1 M Tris-HCl pH=8.0、0.5M L-アルギニン-HCl、2mM EDTAおよび0.9mMグルタチオニンからなる緩衝液と混合し、4℃で36-48時間、保持し、その後、4℃で20-24時間、20 mM Tris-HCl(pH=9.0)、100 mM Urea、および2mM EDTA(pH=8.0)に対する透析により達成した。透析後、cys-TfRscFvを、Q-セファロースを用いたイオン交換クロマトグラフィーにより精製し、その後、濃縮し(Amicon限外ろ過装置を用いる)、4℃で30時間、PBS(pH=7.4)＋0.06 M 塩化ナトリウムに対する透析を行った。精製後、SDS-PAGEは、およそ28-30 kDaの正確な分子量を有する、可溶性、リフォールドcys-TfRscFvタンパク質の単一バンドを示した(WO 00/50008に記載したとおりである)。cys-TfRscFvタンパク質は、-80℃で貯蔵する。
【０１５９】
実施例2
単純混合によるcys-TfRscFv-リポソームの製造
引用により本明細書の一部とする公開されたPCT出願WO 99/25320は、いくつかのカチオン性リポソームの製造を開示する。製造されたカチオン性リポソームは、透明溶液であり、それらの組成および比率は、下記のとおりである:
【表２】
2009537526.tif 000007
(DOTAP = ジオレオイルトリメチルアンモニウムホスフェート、DDAB  = ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド; DOPE = ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン; chol = コレステロール)。
【０１６０】
結合したTfRscFv-免疫リポソームがその免疫学的活性を保持することは、当業者に既知である。我々は、cys-TfRscFvをリポプレックスに化学的に結合させ(PCT出願WO 00/50008)、インビトロおよびインビボで、ヒト前立腺癌細胞に効率的にトランスフェクトし得ることを確立した。一本鎖抗体断片をさまざまな化学結合法を用いてリポソームに結合させることは、一般に行われている。我々は、化学結合の変わりにcys-TfRscFvおよびカチオン性リポソーム(マレイミドDOPEのような還元基または任意の還元基を有するあらゆる脂質を含まない)の単純混合が、免疫学的に活性な複合体の形成を生じ、なお、腫瘍細胞に結合し、トランスフェクトされ得るか否かを決定する研究を行った。一連のcys-TfRscFv-免疫リポソーム複合体を、1/25から1/36(w/w)の範囲の単一鎖タンパク質とリポソームの一定の比率で、cys-TfRscFvをリポソームAと混合することにより製造した。結合したcys-TfRscFv複合体を用いたELISAデータに基づき、混合複合体中のDNAとnmoles 全脂質の比率は、また、1/8から1/18で変わった。複合体の製造は、下記の一般的な手順にしたがった:適当な量の2mMリポソーム(上記したA-H)を、望む容積を与えるのに必要な任意の水と混合し、倒置して、混合する。リポソーム-水に、望む比率を生じるように適当な量のcys-TfRscFvを加え、5-10秒間、穏やかな倒置により混合する。この混合物を、10分間、室温で維持する(およそ5分後、再び、5-10秒間、穏やかに倒置させる)。同時に、適当な量のDNAを、望む容積を生じるのに必要な任意の水と、5-10秒間、倒置により混合する。典型的には、インビトロアッセイでの使用のために、DNAの濃度が、ウェルあたり約0.01 μgから約2 μgの範囲内にあることが好ましく; インビボ使用のために、注射あたり約5 μgから約100 μgのDNAを提供することが好ましい。DNA溶液を、cys-TfRscFv-リポソーム溶液に素早く加え、混合物を、5-10秒間、倒置させる。最終混合物を、室温で10分間、維持し、およそ5分後、再び、5-10秒間、倒置させる。インビボでの使用のために、50% デキストロースまたは50% スクロースを、5-10% (V:V)の最終濃度で加え、5-10秒間、穏やかな倒置により混合する。1:30(cys-TfRscFv:リポソーム、w:w)および1:14(μg DNA:n mole 全脂質)の好ましい比率での特定の例は、下記のとおりである:最終容量800 μl中、40 μgのDNAのために、183 μlの水を280 μlの2mM リポソーム溶液と混合する。34 μlのcys-TfRscFvを加える(0.4 μg/mlの濃度で)。183 μlの水を40 μlの1 μg/1 μl DNAと混合する。80 μlの50% デキストロースを最終工程として加える。
【０１６１】
本発明の方法により製造された最終複合体の大きさは、Malvern Zetasizer 3000を用いた動的光散乱により決定したとおり、25から35の間のゼータ電位を有し、100から400の間(数値)にある。この大きさは、腫瘍毛細血管床を通過し、腫瘍細胞に到達するのに十分有効であるほど小さい。
【０１６２】
混合複合体のヒト前立腺癌DU145細胞への結合能力を評価するためのELISAアッセイを行った。比較のために、結合免疫リポソームを用いて製造した複合体も、また、アッセイに含んだ。図1で示した結果は、cys-TfRscFvタンパク質とカチオン性リポソームの単純混合により製造した免疫リポソーム複合体が、少なくとも、結合を介して製造したものと同程度に、DU145細胞に結合することをはっきりと証明する。結合複合体と同様に、タンパク質と脂質の1/30の比率およびDNAと脂質の1/14の比率が、最も高い結合能力を有することが見出された。また、以前に結合複合体で観察されたとおり、結合は、DNA用量依存的な方法で減少した。これらの結果は、構成要素の単純混合が、その免疫学的活性を保持する複合体を形成し得ることを示す。同一の最適比率は、トランスフェクション効率を評価するためにルシフェラーゼアッセイを用いたヒト前立腺DU145細胞、およびRAT C6細胞で(図2および3)、ならびに、高められた緑色蛍光タンパク質(EGFP)を用いたヒト膵臓癌細胞株Panc I(表I、II)で見出された。
【０１６３】
表I
単純混合により製造したPanc I細胞でのcys-TfRscFv-リポソームAのトランスフェクション効率を、EGFPレポーター遺伝子Iを用いて評価した。
【表３】
2009537526.tif 000008
cys-TfRscFv:リポソームの比率は、1:3(w:w)であった。
【０１６４】
表II
単純混合により製造したPanc I細胞でのcys-TfRscFv-リポソームAのトランスフェクション効率を、EGFPレポーター遺伝子IIを用いて評価した。
【表４】
2009537526.tif 000009
【０１６５】
単純混合によるcys-TfRscFvとリポソーム複合体の結合効率を確立するために、非変性ポリアクリルアミドゲルを用いた。混合したcys-TfRscFv-リポソームA-p53複合体およびp53 DNAなしのcys-TfRscFv-リポソームAを、複合体を製造するのに使用したcys-TfRscFvの1/5または1/10量に等しい量で、遊離cys-TfRscFvと共にゲルに載せた。複合体は、1:30 (w:w)のcys-TfRscFv:リポソームおよび1:14(μg:n mol 全脂質)のDNA:全脂質の比率を用いて製造した。非変性条件下では、複合体はゲルに入れず、遊離、非結合cys-TfRscFvのみがゲルに移動できるので、遊離cys-TfRscFv複合体を定量標準として使用する。メンブレンへトランスファー後、ゲルを、ECLウエスタンブロット検出キット(Amersham)を用いて、抗cys-TfRscFv抗体で探索した。図4で示した2個の複合体(p53 DNAの有無)の低シグナルレベルと遊離cys-TfRscFv標準からのシグナルとの比較は、95%以上のcys-TfRscFvが、構成要素の単純混合により複合体に組み込まれることを示す。
【０１６６】
実施例3
cys-TfRscFv-免疫リポソーム送達wtp53によるヒト癌細胞株のインビトロ化学増感
単純混合により製造したcys-TfRscFv-リポソーム-p53複合体が、現在、前立腺癌の処置のために使用されている薬剤GEMZAR(登録商標)(Eli Lilly and Co.により製造されたゲムシタビンHCl)およびNOVANTRONE(登録商標)(ミトキサントロン、Immunex Corp.)に対して、前立腺癌細胞を増感させるのにいかに有効であるかを決定する実験を行った。突然変異p53を有する前立腺癌細胞株DU145を、これらの研究で使用した。XTT細胞毒性アッセイ(66)を、本発明のcys-TfRscFv-リポソーム-p53複合体により誘導される化学増感のレベルを確立するのに使用した。5 x 103 DU145細胞を、96ウェルプレートのウェルにプレートした。24時間後、細胞を、混合したcys-TfRscFv-リポソーム-p53複合体でトランスフェクトした。cys-TfRscFv-リポソーム-p53複合体は、1:30(w:w)(cys-TfRscFv:リポソームA)および1:14(μg p53 DNA: nmoles 全脂質)の比率での混合により製造した。トランスフェクションの1日後、抗癌剤を、増加した濃度で加えた(3回)。XTTアッセイをおよそ3日後に行い、0%増殖阻害を産生する薬剤濃度であるIC50値を計算した。図5Aで示したとおり、cys-TfRscFv-リポソーム-p53複合体を用いた処理は、GEMZAR(登録商標)への細胞の増感を、8倍まで増加させた。図5Aに関して、IC50値(nM)は、下記のとおりである:cys-TfRscFv-LipA-p53: 0.5; cys-TfRscFv-LipA: 4.0; cys-TfRscFv-LipA-Vec: 4.0; 非トランスフェクト: 5.0。Vecとp53の倍率増感(fold sensitization)は、8であり、UTとp53の倍率増感は、10である。
【０１６７】
同様に、DU145細胞は、薬剤ミトキサントロンに対して17.5倍まで増感させた(図5B)。図5Bに関して、IC50値(ng/ml)は、下記のとおりであった: cys-TfRscFv-LipA-p53: 0.08; cys-TfRscV-LipA: 1.20; cys-TfRscFv-LipA-Vec: 1.40および非トランスフェクション: 1.80。Vecとp53の倍率増感は、17.5であり、UTとp53は、22.5であった。同様の研究は、ヒト膵臓癌細胞株Panc Iを用いて行った。ウェルあたり4x103 Panc I細胞をプレートし、XTTアッセイを上記のとおり行った。1:30(cys-TfRscFv:リポソームA w:w)および1:14(μg p53 DNA : nmoles 全脂質)の好ましい比率を、また、本明細書で使用した。DU145と同様に、化学療法剤に対して腫瘍細胞のかなりの増感が存在した(図6AおよびB)。0.06 μg/ウェルのp53 DNA濃度では、混合したcys-TfRscFv-リポソームDNA複合体(図6A)を用いて、GEMZAR(登録商標)に対する増感で23.8倍の増加が存在した。図6Aに関して、IC50値は、下記のとおりであった: cys-TfRscFvLipA-p53: 0.21nM; cys-TfRscFvLipA-Vec: 5.00nMおよびTfLipA-p53: 0.30nM。cys-TfRscFrLipA-p53のcys-TfRscFvLipA-Vec/IC50のIC50は、23.8であった。p53の代わりに空ベクターを用いたとき、増感は観察されなかった。0.08 μg DNA/ウェル(図6B)のp53 DNA濃度で、Panc I細胞に対する応答の劇的な増加が見られた。ここでは、ほぼ200倍の増感の増加が観察された。図6Bに関して、IC50値は、下記のとおりであった: cys-TfRscFvLipA-p53: 1.8nM; cys-TfRscFvLipA-Vec: 350nM; およびcys-TfRscFvLipA: 600nM。cys-TfRscFvLipA-p53のcys-TfRscFvLipA-Vec/IC50のIC50は、194.44であった。したがって、これらのインビトロ研究は、単純混合により製造したcys-TfRscFv-リポソームが、wtp53を効率的に前立腺癌細胞にトランスフェクトし、それらを、慣用的な化学療法剤に増感させ得ることを証明する。
【０１６８】
実施例4
単純混合により製造したcys-TfRscFv-LipA-EGFPによるインビボ腫瘍標的化
DU145腫瘍を、メス無胸腺ヌードマウス(NCR nu/nu)で、皮下で誘導した。マウスを、32 μg DNA/注射で、1/30のscFv:リポソーム比率(DNA:全脂質のさまざまな比率(1/10、1/11、1/12、1/13、1/14)で、単純混合により製造したcys-TfRscFv-LipA-EGFP(高められた緑色蛍光タンパク質)(TfRscFvII)で、24時間に3回、尾静脈に注射した。比較のために、結合法により製造した1/30、1/14の複合体(図7BのTfRscFv III)および1/30、1/14の単一鎖の異なるバッチ(図7BのTfRscFv I)を、また、マウスに注射した。注射の60時間後、マウスを殺し、腫瘍および肺を収集し、タンパク質を、抗EGFP抗体を用いたウエスタンブロット解析のために単離した。非リガンドLipA-EGFP複合体(UL)、Tf-LipA-EGFP複合体(Tf)およびBSA-LipA-EGFP複合体(BSA)を、コントロールとして注射した。図7A - DU145腫瘍で示したとおり、EGFPバンドは、ポジティブコントロールTf、TfRscFvIII、およびTfRscFvIで観察される。より重要なのは、強いEGFPシグナルが、DNAと脂質の比率が1/14で見出された。対照に、非常に弱いレベルのEGFP発現のみが、正常な肺組織で明らかであった。したがって、単純混合により製造したcys-TfRscFv-Lipoplexは、全身投与後、有効に、腫瘍を標的化し得る。
【０１６９】
混合の再現性を評価するために、異なるバッチのcys-TfRscFv(IからV)を、1:30(scFv:リポソーム w:w)および1:14 (μg DNA:nmoles 全脂質)の好ましい比率で、単純混合によりLiposome A-EGFPと複合体化させた。ヒト前立腺DU145、膀胱HTB-9、乳房MDA-MB-435および頭頸部JSQ-3異種移植片腫瘍を、上記のとおり、皮下で誘導した。複合体を、また、24時間に3回、尾静脈に注射した。Tf-LipA-EGFP(Tf)および非リガンドLipA-EGFP複合体(UL)をコントロールとして使用した。注射の60時間後、マウスを殺し、腫瘍および肝臓を収集し、上記のとおり解析した。標的化は、4個の腫瘍型で、混合した複合体のすべてで明らかである(図7B)。しかしながら、正常な組織(肝臓)では、ほとんどシグナルが存在しない。同一の膜は、等しいローディングを示すようにアクチンレベルで探索した。
【０１７０】
実施例5
単純混合により製造した、全身に投与したcys-TfRscFv-リポソーム-p53によるヒト異種移植片腫瘍の放射線/化学増感
本発明のcys-TfRscFv-免疫リポソーム複合体が、インビボで腫瘍細胞に結合し、wtp53を効果的に送達する能力をさらに確認するために、有効性研究を行った。およそ60-90 mm3の皮下DU145腫瘍を有するマウスに、cys-TfRscFv-リポソーム-p53を、週3回(全10回の注射)、尾静脈に注射した。この複合体は、1/30(cys-TfRscFv:リポソームA、w:w)および1/14(μg DNA/nmoles 全脂質)の比率で、単純混合により製造した。腫瘍領域を、選択的に、γ放射線の1日の分割線量2.0 Gy(全体で32 Gyまで)に曝した(図8)。cys-TFRscFv-リポソームA複合体＋放射線の組合せで処理した動物は、かなりの腫瘍成長阻害を有した。同様の結果が、また、抗癌剤Gemzar(登録商標)およびヒト膀胱癌異種移植片腫瘍(HTB-9)に腫瘍抑制遺伝子Rb94を送達する本発明のcys-TFRscFv-免疫リポソームの組合せを用いて、およびGEMZAR(登録商標)およびアポトーシスを誘導する他の遺伝子(アポプチン)またはp53を有するcys-TFRscFv-リポソームで処理したPanc I異種移植片で、観察された。
【０１７１】
これらの結果は、本発明の方法により製造した複合体が、治療処置として、インビボで癌細胞に効果的に送達されるために、さまざまな遺伝子(プラスミドベクターに組み込まれた)を含み得ることを証明する。
【０１７２】
実施例6
単純混合により製造したcys-TFRscFv-リポソームAにより送達されるアンチセンスHER-2オリゴヌクレオチドによるインビトロでの膵臓癌細胞の化学増感
この例は、治療処置のために、遺伝子以外の分子を腫瘍細胞に効果的に送達する本発明の有用性を証明する。複合体は、実施例2のとおり製造したが、ここで封入したDNAは、HER-2遺伝子の開始コドンに向けられた18 merのホスホロチオエートオリゴヌクレオチド(ODN)(AS HER-2)であった(51)。使用した比率は、プラスミドDNAのために上記したとおり、1:30(cys-TfRscFv:リポソーム、w:w)および1:14(nmoles ODN: n mole 全脂質)であった。Panc I細胞を、4x103細胞/ウェルで、96ウェルプレートに播種した。細胞を、24時間後、本発明の方法により製造したcys-TfRscFv-LipA-AS HER-2でトランスフェクトした。Tf-LipA-AS HER-2およびcys-TfRscFv-LipA-SC ODNをコントロールとして使用した。SC ODNは、AS HER-2 ODNと同じヌクレオチド組成を有するが、ランダムな順序であるスクランブルODNである。図9で示したとおり、本発明の方法により製造したcys-TfRscFv-Lip A-AS HER-2複合体は、化学療法剤 GEMZAR(登録商標)の効果に対して膵臓癌細胞株Panc Iを増感させることができた(11倍以上)。この感受性の増加は、ポジティブコントロールTf-LipA-AS HER2複合体でのトランスフェクションから生じたものと同一である。図9に関して、IC50値は、下記のとおりであった: TfRscFv-LipA3-AS-HER-2: 16nM; Tf-LipAe-AS-HER-2: 14nMおよびTfR-scFv-LipAe-SC: 200nM。TfR-scFv-LipAe-AS-HER-2のTfR-scFv-LipAe-SC/IC50のIC50 - 12.5。
【０１７３】
実施例7
単純混合により製造した全身送達cys-TFRscFv-LipA-AS HER-2 ODNによるヒト異種移植片腫瘍のインビボ化学増感
この例では、本発明の方法により製造したcys-TfRscFv-リポソーム-DNA複合体が、全身送達後、インビボでアンチセンス分子を腫瘍細胞に送達する能力を証明する。この送達系の普遍性を示すために、2個の異なるヒト異種移植片マウス腫瘍モデル(膵臓癌および乳癌)を使用した。最初(図10A)のPanc I皮下異種移植片では、腫瘍を、メス無胸腺ヌード(NCR nu/nu)マウスで誘導した。腫瘍の大きさが100-200mm3であるとき、動物に、化学療法剤 GEMZAR(登録商標)(腹腔内)および本発明の方法により製造したcys-TfRscFv-LipA AS HER-2(静脈注射)を注射した。複合体は、1:30(cys-TfRscFv:リポソーム、w:w)および1:15 (n mole ODN: n mole 全脂質)の比率を用いて製造した。静脈注射に加えて、上記の複合体をまた、腫瘍内に注射した。動物の第1集団は、GEMZAR(登録商標)のみを受け、第2コントロール集団は、GEMZAR(登録商標)＋空ベクターを有する複合体を受けた。GEMZAR(登録商標)のみを用いた処理は、ほとんど膵臓癌の増殖を阻害できなかった。対照に(図10A)、GEMZAR(登録商標)および本発明の方法により製造したcys-TfRscFv-Lip A複合体により送達したAS-HER-2 ODNの組合せは、腫瘍増殖をかなり阻害し、腫瘍退行を生じた。
【０１７４】
ヒト乳癌異種移植片腫瘍のかなりの腫瘍成長阻害は、また、薬剤TAXOTERE(登録商標)(ドセタキセル; Aventis Pharmaceuticals, Collegeville, PAにより製造された)および静脈投与された本発明の方法により製造したcys-TfRscFv-LipB AS HER-2の組合せで観察された(図10B)。リポソーム製剤Bを乳癌に使用したが、Panc Iに関して上記した同じ比率を用いた。
【０１７５】
実施例8
単純混合により製造したcys-TFRscFv-Liposomeによる、造影剤MAGNEVIST(登録商標)の送達によるMRIイメージの増強
この例は、本発明の方法により、MRI造影剤を封入し、cys-TfRscFv-リポソーム造影剤を形成する能力を証明する。本発明の方法により製造した複合体を、静脈内に投与して、原発性腫瘍および転移腫瘍のための腫瘍イメージの増強を生じ得る。これらの造影剤は、非限定的に、MAGNEVIST(登録商標)(Gd-DTPA)(Schering AG)を含み得る。単純混合により複合体を形成するために使用する比率は、1:30(cys-TfRscFv:リポソーム、w:w)および1:14 (ug 造影剤:nmoles 脂質)の好ましい比率である。これらの研究では、16 μlのMAGNEVIST(登録商標)を複合体中に使用した。
【０１７６】
図11は、頭頸部(上部パネル)、乳房(中間パネル)または前立腺(下部パネル)起源の皮下異種移植片を有するマウスへ、本発明の方法により製造したcys-TfRscFv-LipA- MAGNEVIST(登録商標)の1回の静脈注射からの結果を示す。より高レベルの造影剤増強は、遊離MAGNEVIST(登録商標)を受けたときと比較して、cys-TfRscFv-LipA- MAGNEVIST(登録商標)を受けた腫瘍で明らかであり、本発明の方法により製造した複合体を用いて造影剤を投与することの利点を証明する。他の実験では、周囲の正常な組織と比較して、腫瘍での増加した吸収が、また、観察された。
【０１７７】
同様の増強がまた、同生(syngenetic)マウス肺転移モデルを用いて観察された。B16/F10マウス黒色腫細胞を、C57BL/6マウスに静脈内注射した。これらの細胞は、マウス肺で腫瘍結節を形成する。cys-TfRscFv-リポソーム-MAGNEVIST(登録商標)複合体を、また、1:30および1:14の好ましい比率を用いて、本発明の方法により製造した。複合体を静脈注射で投与し、腫瘍結節を、MRIで撮像した。遊離MAGNEVIST(登録商標)と比較して、封入した造影剤はまた、複合体とのピーク増強が遊離MAGNEVIST(登録商標)のそれよりも後であるので、腫瘍での延長した吸収を有する。
【０１７８】
実施例9
単純混合による立体的に安定した免疫リポソームの製造
リポソーム複合体は、細網内皮系により、血流から素早く除去される。この循環時間を延長するために、リポソーム複合体に組み込まれた親水性ポリマー、例えば、PEGを有する立体的に安定したリポソームを製剤した。PEG-リポソーム複合体中に、標的化リガンド、例えば、抗体または抗体断片を含む、さまざまな方法が考え出された。これらの方法論のすべてではないが、その多くは、抗体または抗体断片をPEGに結合させるために、化学的結合工程を含む。複合体を形成するために使用するそのような激しい化学反応および方法は、抗体活性の欠失または遮蔽を生じ得る。この例では、我々は、cys-TfRscFvタンパク質が、単純結合によりPEG-リポソーム分子に結合し得て、得られた複合体は、ヒト腫瘍細胞にトランスフェクトするのにより有効であり得ることを証明する。
【０１７９】
この複合体を形成するために、実施例2に記載したカチオン性脂質製剤の1個からなるリポプレックスを、実施例2に記載したとおり、1:14の比率で(μg DNA:nmoles 脂質)、核酸と混合した。このリポプレックスに、25 mM HEPEバッファー(pH 7.2)中、市販で入手可能なNHS-PEG-MALポリマー(2%)を加えた。溶液を、3-5秒間穏やかに倒置し、室温で1.5時間、インキュベートした。cys-TfRscFv-PEG-リポソーム-DNA複合体を形成するために、cys-TfRscFvタンパク質を、1:8(cys-TfRscFv:リポソーム、w:w)の比率でPEG-リポプレックスに加え、穏やかに倒置し、室温で、10分から1時間維持し、次いで、インビトロで細胞をトランスフェクトするために使用した。1:5から1:30(cys-TfRscFv:リポソーム、w:w)の他の比率は、また、複合体を形成するために使用し得る。インビボ使用のために、50%デキストロースを、5%の最終濃度で加え、インキュベーション後、倒置により穏やかに混合し、動物に注射した。あるいは、最終混合物を、4℃で一晩(12-18時間)、貯蔵し得た。
【０１８０】
本明細書に示した実験で、核酸は、ホタルルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミドDNAであるpLucであった。ヒト黒色腫細胞MDA-MB-435を、5x104細胞/ウェルでプレートした。それらを、実施例3に記載したcys-TfRscFv-PEG-LipA-pLucでトランスフェクトした24時間後、トランスフェクション効率を、ルシフェラーゼ活性のレベルにより評価した。図12で示したとおり、本発明の方法により製造したcys-TfRscFv-PEG-LipA-pLuc複合体は、標的化cys-TfRscFタンパク質なしのPEG-LipA-pLucよりも、より効率的に標的細胞にトランスフェクトできた。
【０１８１】
したがって、本明細書に記載した単純混合の方法は、また、立体的に安定した標的化免疫リポソームを製造する、単純な、非破壊的手段として使用し得る。
【０１８２】
実施例10
単純混合による小分子(GMC-5-193)含有免疫リポソームの製造および特徴付け
小分子GMC-5-193のインビトロおよびインビボでの抗癌効果を改善するために、小分子を含む腫瘍標的化リポソーム複合体を製造した。TfRscFv/LipA複合体に加えて、エンドソーム破壊ペプチド(LipA-HoKC)と結合したカチオン性リポソームもまた、製造した。エンドソーム破壊ペプチドHoKCは、細胞の細胞質でのGMC-5-193の放出を助け、細胞質でのチューブリン重合に影響を与え得る。リガンド-リポソーム複合体は、選択的に、それらの表面上の相当する受容体の高められたレベルにより、腫瘍細胞を標的化する。リガンド-リポソーム送達遺伝子の高レベルの発現は、原発性腫瘍および転移腫瘍で明らかであるが、正常組織、例えば、肝臓、肺、骨髄、および腸陰窩では明らかではない。この例では、トランスフェリン受容体一本鎖(TfRscFv)を含む本発明のリポソーム複合体を、インビトロおよびインビボで癌細胞にGMC-5-193を送達するために使用し、GMC-5-193を含むリポプレックスのインビトロおよびインビボでの生物有効性を評価した。
【０１８３】
材料および方法
1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DOTAP)、トリメチルアンモニウムプロパン(DOPE)、およびN-マレイミド-フェニルブチレートDOPE(MPB-DOPE)は、Avanti Polar Lipids(Alabaster, AL)から購入した。K[K(H)KKK]5-K(H)KKC (HoKC)(配列番号2)ペプチドは、Sigma-Genosys(The Woodlands, TX)により製造された。
【０１８４】
GMC-5-193の合成
化合物GMC-5-193を、バージニア大学の化学学科で合成した。それは、359.4 Daの分子量を有し、その構造は、質量分析およびNMRにより確認した。アミドプロトンおよびアミンプロトンのpKa値は、それぞれ、15および9であった。化合物の2.5 mg/mLストック溶液を、DMSOで製造した。
【０１８５】
細胞株および培養
ヒト前立腺癌細胞株DU145(HTB-81)およびマウス黒色腫細胞株B16/F10(CRL-6475)は、American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA)から取得した。DU145は、10% 熱不活性化ウシ胎児血清(FBS)、2mM L-グルタミン、および各50 μg/mLのペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを補充したEarls塩(EMEM)を含むイーグル最少必須培地で培養した。B16/F10(ATCC, CRL-6475)は、10% 熱不活性化FBS、2mM L-グルタミン、および各50 μg/mLのペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを補充したダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)で培養した。ヒト黒色腫細胞株MDA-MB-435、ヒト乳癌細胞株MDA-MB-231、およびヒト膵臓癌細胞株PANC-1は、10% 熱不活性化FBS、2mM L-グルタミン、および各50 μg/mLのペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを補充した改良したMEM(IMEM)で培養した。転移性細胞株MDA435/LCC6は、MDA-MB-435腹水から開発した。MDA435/LCC6は、5% 熱不活性化FBS、2mM L-グルタミン、および各50 μg/mLのペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを補充したIMEMで培養した。Dr. I. Panyutin (Nuclear Medicine Department, National Institutes of Health, Bethesda, MD)から贈られた正常なヒト肺線維芽細胞IMR-90は、10% 熱不活性化FBS、2mM L-グルタミン、0.1 mM 非必須アミノ酸、1 mM ピルビン酸ナトリウム、および各50 μg/mLのペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを補充したEMEMで培養した。正常な(非癌性)皮膚線維芽細胞株H500は、1mM ピルビン酸ナトリウム、1mM 非必須アミノ酸＋10% 熱不活性化ウシ胎児血清、2mM L-グルタミンおよび各50 μg/mLのペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを補充したEMEMで培養した。EMEMは、MediaTech (Herndon, VA)から購入し、他の細胞培養培地および成分は、Biofluids (Rockville, MD)から取得した。
【０１８６】
TfRscFv/LipA /GMC-5-193複合体の製造
カチオン性リポソーム製剤LipA(1:1から1:2のモル比でのDOTAP: DOPEまたはDDAB:DOPE)は、本明細書に記載した、および米国特許出願第09/914,046号に記載したエタノール注入法を用いて製造し、その開示は、引用によりその全体を本明細書の一部とする。TfRscFv/LipA/GMC-5-193複合体を、下記のとおり製造した。室温で、回転または撹拌を用いて、LipAとTfRscFvの混合物(1:1から1:40(wt/wt)、より適当には、1:10から1:30 wt/wtのTfRscFvとLipAの比率)のインキュベーションの10分後、適当な濃度でのGMC-5-193を加え、倒置または撹拌により混合し、室温で、10分間、インキュベートした。動物注射のために、デキストロースまたはスクロースを、1%から20%、より適当には、5-10%の最終濃度で、各サンプルに加えた。GMC-5-193とリポソームのモル比は、0.2:7から14:7まで、より適当には、2:7から8:7、最も適当には、7:7または2.8:7であった。複合体の大きさは、ZETASIZER(登録商標) 3000HSシステム(Malvern, United Kingdom)を用いて、25℃での動的光散乱により決定した。
【０１８７】
TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193複合体の製造
HoKCペプチドおよびLipA-MPB(1:1:0.1から1:2:0.1のモル比での、DOTAP: DOPE: MPB-DOPE またはDDAB:DOPE:MPB-DOPE)を用いた使用のためのカチオン性リポソーム製剤を、エタノール注入法を用いて製造した。LipA-HoKCリポソームを、次いで、以前記載したとおり、マレイミド基を有するカチオン性リポソームと末端システイン基を有するペプチド間のカップリング反応を用いて製造した。Yu, W., et al., “Enhanced transfection efficiency of a systemically delivered tumor-targeting immunolipoplex by inclusion of a pH-sensitive histidylated oligolysine peptide.” Nucleic Acids Research 32:e48 (2004)。システイン上に遊離チオール基を有する0.1 mmolのペプチドのアリコートを、10 mM HEPES(pH 7.4)溶液中、2 mmolのLipA-MPBに加え、室温で2時間、回転させた。生じたLipA-HoKCは、1.4 mMの脂質濃度を有した。TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193複合体は、下記のとおり製造した。室温で、回転または撹拌を用いて、LipA-HoKCとTfRscFvの混合物(1:1から1:40(wt/wt)、より適当には、1:10から1:30 wt/wtのTfRscFvとLipA-HoKCの比率)のインキュベーションの10分後、適当な濃度でのGMC-5-193を、室温で、倒置による混合または撹拌により加え、10分間、インキュベートした。動物注射のために、デキストロースまたはスクロースを、1%から20%、より適当には、5-10%の最終濃度で、各サンプルに加えた。GMC-5-193とリポソームのモル比は、0.2:7から14:7まで、より適当には、2:7から8:7、最も適当には、7:7または2.8:7であった。複合体の大きさは、ZETASIZER(登録商標) 3000HSシステム(Malvern, United Kingdom)を用いて、25℃での動的光散乱により決定した。
【０１８８】
TfRscFv/LipA/GMC-5-193またはTfRscFv/リポソーム-HoKC/GMC-5-193複合体のインビトロ細胞生存および最適化
インビトロ細胞毒性研究のために、100 μLの適当な増殖培地中、各細胞株の5から5.5 × 103細胞/ウェルを、96ウェルプレートにプレートした。24時間後、細胞を無血清培地で洗浄し、無血清培地中、増加した濃度で、100 μLのTfRscFv/リポソーム/GMC-5-193複合体(所望により、TfRscFv/LipA/GMC-5-193またはTfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193)または遊離GMC-5-193を入れ、4-6時間、適当には、5時間、インキュベートし、次いで、FBSを補充した。細胞を、次いで、さらに、24-72時間、適当には、48時間、5% CO2を含む湿気のある環境中、37℃でインキュベートした。その後、ウェルを、フェノールレッドを含まないIMEMで洗浄し、細胞生存XTTに基づくアッセイを、製造者のプロトコールにしたがって行った(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)。電子カップリング剤XTTの存在で、生細胞のミトコンドリアでのデヒドロゲナーゼにより、ナトリウム3'-[1-(フェニルアミノ-カルボニル)-3, 4-テトラゾリウム]-ビス(4-メトキシ-6-ニトロ)ベンゼンスルホネートを、オレンジホルマザンに変換する。生存細胞の数に相関するホルマザン吸光度を、マイクロプレートリーダー (Molecular Devices, Menlo Park, CA)を用いて、450 nmで測定した。50%増殖阻害を産生するIC50値を、薬剤濃度と生存細胞の割合のlogグラフから補間した。
【０１８９】
インビトロ化学増感
化学増感研究のために、100 μL中、4〜5 × 103 細胞/ウェルを、96ウェルプレートに播種した。24時間後、細胞を無血清培地で洗浄し、100 μLのTfRscFv/リポソーム/GMC-5-193複合体(所望により、TfRscFv/LipA/GMC-5-193もしくはTfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193)または遊離GMC-5-193を、GMC-5-193として1.25〜2.5 μMで入れ、4-6時間、適当には、5時間インキュベートし、次いで、FBSを各ウェルに加えた。細胞を、さらに、24-72時間、適当には、19時間インキュベートし、その後、漸増濃度での化学治療剤の有無で適当な補充培地を添加し、インキュベーションを、およそ24-72時間、適当には、48時間続けた。使用する化学治療剤は、ドキソルビシン(Bedford Labs, Bedford, OH)、ドセタキセル(Taxotere; Aventis Pharmaceuticals, Bridgewater, NJ)、ミトキサントロン(NOVANTRONE(登録商標), Immunex Corp., Seattle WA)およびシスプラチン(CDDP; Bedford Labs, Bedford, OH)であった。XTTアッセイを、化学治療剤に対する増感の程度を評価するために行い、各細胞のIC50値を計算した。倍率増感は、下記に等しい: IC50非トランスフェクト/IC50各複合体。
【０１９０】
インビトロ共焦点像
共焦点像のために、5.0 × 104細胞/ウェルのMDA-MB-435を、24ウェルプレートのガラス上に播種し、24時間後、無血清培地で洗浄し、TfRscFv/リポソーム/GMC-5-193複合体(所望により、TfRscFv/LipA/GMC-5-193もしくはTfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193)または遊離GMC-5-193で処理し、6時間インキュベートした。処理の6時間後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回洗浄し、PBS中、4%パラホルムアルデヒドで固定し、再び、PBSで洗浄した。次いで、細胞を、PROLONG(登録商標) Antifade Kit (Molecular Probes, Eugene, OR)を用いて、スライドガラス上に載せた。核染色のために、固定した細胞のためのSelect FX Nuclear Labeling Kitでの青色蛍光対比染色であるDAPI(Molecular Probes)を、製造者のプロトコールにしたがって使用した。イメージングのために、GUMC Microscopyに置かれたOlympus FLUOVIEW(登録商標)-300レーザー走査共焦点システムおよびImaging Shared Resource (MISR)を使用した。
【０１９１】
インビボ腫瘍標的化
PBSに懸濁したヒト転移性細胞MDA435/LCC6(8×106)を、無胸腺ヌードマウスの尾静脈に注射した。MDA-MB-435/LCC6異種移植片腫瘍を有するマウスを、マウスあたり9 mg/kg GMC-5-193で、遊離GMC-5-193、TfRscFv/LipA/GMC-5-193、TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193またはLipA/GMC-5-193(非リガンド複合体)を用いて、静脈注射した。これは、2.8:7のモル比である(小分子:リポソーム)。各複合体中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。注射の3時間後、肝臓、肺および任意の他の可視腫瘍を切り取り、蛍光顕微鏡(Nikon SMZ-1500 EPI-Fluorescence立体鏡システム)下で調べた。
【０１９２】
インビボ有効性研究
PBSで懸濁したマウス黒色腫細胞B16/F10(1×105)を、C57BL/6マウスの尾静脈に注射した。B16/F10腫瘍を有するマウスを、遊離GMC-5-193のみ、またはTfRscFv/リポソーム/GMC-5-193複合体(所望により、TfRscFv/LipA/GMC-5-193もしくはTfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193)のみまたはCDDPとの組合せを用いて、3 mg/kg GMC-5-193/注射の用量で、週に2、3回、全体で7回、静脈注射した。各複合体中のGMC-5-193とLipAまたはLipA-HoKCのモル比は、7:7であった。各複合体中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。ある集団はまた、CDDPのみを、週2回の注射、全体で6回の注射を受けた。最初の2回のCDDP注射は、2.5 mg/kgであった。あらゆる次の注射は、2 mg/kgであった。処理の3週間後、マウスを殺し、肺を切り取り、各マウスから血液を回収した。器官を、10% ホルムアルデヒドで固定し、撮影前に、70% エタノールで保存した。
【０１９３】
マウス血清由来の切断されたカスパーゼ-3のウエスタンブロット解析
マウスの逆眼窩血脈洞(retroorbital sinus)から収集した血液を、室温で1時間凝固させた後、室温で10分間、1,000 rpmで遠心分離した。血清を、新しいチューブに移し、再び、10,000gで20分間、遠心分離した。上清を、P-30 Micro-Bio-Spin Chromatography Column (BIORAD, Hercules, CA)を用いて精製した。画分の15マイクロリットルを、4%から12%の勾配NuPAGEゲル(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)に載せ、10kDaのタンパク質がゲルを流れきるまで流した(およそ、1.5から2時間)。電気泳動後、タンパク質を、Protran BA 85ニトロセルローストランスファーメンブレン(Schleicher and Schuell, BioScience, Keene, NH)に移した。最後に、切断されたカスパーゼ-3のウエスタンブロット解析を、切断カスパーゼ-3(17 kD)抗体を用いて行った。非特異的結合を妨害するために、メンブレンを、150 mM NaClおよび0.05 % Tween 20 (TBST)を含む10 mM Tris-HClバッファー、pH 8.0中、5 % 脱脂乾燥ミルクを用いて、室温で1時間、インキュベートした。ブロットを、5%ミルクTBSTで1:1000希釈の切断カスパーゼ-3ウサギ一次抗体(Cell Signaling Technology, Beverly, MA)を用いて、4℃で一晩、プローブし、次いで、TBSTで、3回洗浄した(各15分)。タンパク質を、ヤギ抗ウサギ二次抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)、ECLウエスタンブロッティング検出剤、およびHyperfilm ECL (Amersham, Piscataway, NJ)を用いて検出した。
【０１９４】
結果
TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193複合体のモル比のインビトロ最適化
TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193複合体を、上記で詳述したとおり製造し、TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193複合体中の小分子とリポソームのモル比を最適化した。DU145ヒト前立腺癌細胞におけるGMC-5-193とLipA-HoKCの異なる比率での複合体GMC-5-193の細胞毒性効果を調べた。5.5 x 103細胞/ウェルを、96ウェルプレートに播種し、24時間後、TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193複合体または遊離GMC-5-193で処理した。XTTアッセイは、細胞毒性を評価するために処理の48時間後に行い、IC50(50% 成長阻害を産生する薬剤濃度)値を、濃度-細胞生存曲線から計算した。図13は、各複合体で処理したDU145細胞のIC50値を示す。各複合体中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。2:7〜7:7のGMC-5-193とリポソームのモル比の範囲で、IC50値の減少は、遊離GMC-5-193で処理した細胞と比較して、複合体GMC-5-193で処理した細胞で観察され、IC50値を、7.7±0.9 μMから2.2±5 μMまで減少させた。8:7のGMC-5-193とリポソームのモル比で。複合体もしくは遊離GMC-5-193でトランスフェクトした細胞のIC50値は、類維持していた。2:7〜7:7のGMC-5-193とリポソームのモル比の範囲で、複合体GMC-5-193で処理したDU145細胞のIC50値の有意な差異が存在しなかったので、7:7のGMC-5-193とリポソームのモル比でのGMC-5-193複合体を、さらなる実験のために選択した。7:7(すなわち、1:1)のGMC-5-193とリポソームのモル比での複合体GMC-5-193の粒子サイズは、5 % デキストロース中、約300 nmであった。
【０１９５】
異なる細胞株での細胞殺傷(感受性)における遊離もしくは複合体GMC-5-193の効果
図14は、異なる細胞株(DU145、MDA-MB-435、MDA435/LCC6、B16/F10)での複合体GMC-5-193および遊離GMC-5-193の細胞殺傷のレベルの比較を示す。ここで、4〜5.5 x 103細胞/ウェルを、96ウェルプレートに播種し、24時間後、TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193複合体、遊離GMC-5-193で処理した。GMC-5-193の濃度は、50 nM〜31.25 μMであった。複合体中のGMC-5-193とLipA-HoKCのモル比は、1:1であった。各複合体中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。XTTアッセイを、細胞毒性を評価するために処理の48時間後に行い、IC50値を計算した。TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193で処理したDU145、MDA435/LCC6およびB16/F10細胞のIC50値は、遊離GMC-5-193で処理したものよりも低く、この分子に対する増加した増感を示した。MDA-MB-435は、TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193複合体または遊離GMC-5-193に対して類似の増感を示した。遊離および複合体GMC-5-193間の増感における最大の差異は、DU145細胞(遊離で7.9μMから複合体で3.2μMまで、IC50値を減らした)およびB16/F10細胞(6.6 ± 0.8 μMから4.2 ± 0.0 μMまでの範囲でIC50値を減少させた)で見られた。
【０１９６】
下記の表IIIは、遊離GMC-5-193およびTfRscFv/LipA/GMC-5-193複合体を比較して行った類似の実験結果を示す。
表III. XTT生存アッセイで取得したIC50値(μM)*
【表５】
2009537526.tif 000010
*3回の測定の平均 ± S.D.
したがって、GMC-5-193を本発明のTfRScFv/LipA-HoKCと複合体化させることは、現在、当業者に使用されている遊離小分子に対する応答と比較して、小分子に対する複数のヒトおよびマウス細胞株の応答を増加させる。
【０１９７】
TfRscFv/リポソーム/GMC-5-193複合体によるインビトロ化学増感
GMC-5-193は、微小管破壊および抗血管新生効果を有する。遊離およびリガンド/リポソーム複合体GMC-5-193の慣用的な化学治療剤との組合せの効果を、慣用的な化学治療剤の抗癌効果を高めるか否かを決定し、遊離小分子と比較した複合体小分子の増強のレベルを比較するために研究した。ドキソルビシンに対してMDA-MB-435ヒト黒色腫細胞を増感させるリガンド/リポソーム/GMC-5-193(TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193)複合体の能力を調べ、結果を、図15Aに示す。ここで、4.5 x 103細胞/ウェルを、96ウェルプレートに播種し、24時間後、TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193複合体、遊離GMC-5-193またはLipA-HoKCのみで処理した。GMC-5-193の濃度は、ウェルあたり1.25μMであった。複合体内のGMC-5-193とLipA-HoKCのモル比は、1:1であった。各複合体内の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。24時間後、ドキソルビシンを、2.07〜2070 ng/mLの増加した濃度で加えた。48時間後、XTTアッセイを、処理に応答する細胞生存を評価するために行った。図15Aの各点は、3回のサンプルの平均±標準偏差を表す。IC50値は、50%増殖阻害を生じる薬剤濃度を示す。UT = 非トランスフェクション。アントラサイクリン系抗生物質であるドキソルビシンは、それが、最も一般的な化学治療剤の1つであり、乳癌のために、微小管標的化チュームリン重合剤との組合せ療法で使用されていたので選択した。IC50値を計算した。GMC-5-193なしのLipA-HoKCでトランスフェクションした細胞は、非トランスフェクション細胞と類似したIC50を示し、それは、リポソーム自身が非毒性であることを示す。遊離GMC-5-193で処理した細胞は、IC50のわずかな減少を示したが、有意な差異はなく、これは、遊離GMC-5-193が、細胞増殖を効率的に阻害しないことを示す。しかしながら、増感のかなりの増加(〜50倍)が、遊離GMC-5-193で処理した細胞と比較して、複合体GMC-5-193で処理した細胞で観察され、IC50値を、300から8 ng/mLまで減少させた。
【０１９８】
ドキソルビシンのみ、ドキソルビシン＋遊離GMC-5-193(GMC)およびドキソルビシン＋TfRscFv/LipA/GMC-5-193(scL-GMC)複合体(すなわち、HoKCペプチドなしのカチオン性免疫リポソーム)の効果を調べた同様の研究結果を、図15Bに示す。複合体中のGMC-5-193とLipAのモル比は、1:1であった。各複合体中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。増感の〜10倍の増加が、ドキソルビシンのみおよびドキソルビシン＋遊離GMC-5-193で処理した細胞と比較して、複合体GMC-5-193で処理した細胞で観察された。
【０１９９】
B16/F10細胞におけるシスプラチン(CDDP)に対する増感に関する、遊離もしくはTfRscFv/LipA/GMC-5-193複合体を投与したGMC-5-193の漸増用量の効果の研究は、図15C-Eに示す。GMC-5-193の濃度は、各々、1.25、2および2.5 uMであった。複合体中のGMC-5-193とLipAのモル比は、1:1であった。各複合体中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。図15Cでは、GMC-5-193の濃度は、ウェルあたり1.25 μMであり、XTTアッセイは、9時間インキュベートした。図15Dでは、GMC-5-193の濃度は、ウェルあたり2 μMであり、XTTアッセイは、7時間インキュベートした。図15Eでは、GMC-5-193の濃度は、ウェルあたり2.5μMであり、XTTアッセイは、9時間インキュベートした。GMC-5-193の最も低い濃度で、遊離もしくは複合体GMC-5-193の両方は、CDDPに対する応答を高めなかった(図15C)。しかしながら、GMC-5-193の用量として感受性の増加の程度は、2μMから2.5UμMまで増加する。両方の場合に、複合体小分子は、CDDPのみおよび遊離GMC-5-193と比較して、細胞に対する増加した効果を有する。この差は、2μM用量で最も顕著である。したがって、この処理プロトコール下で、感受性の増加は、同じ濃度で、遊離GMC-5-193で処理した細胞と比較して、複合体GMC-5-193で処理した細胞で観察され、これは、複合体を用いた送達の有益な効果を証明する。したがって、複合体送達GMC-5-193を用いた用量依存性の感受性増加が存在する。
【０２００】
上記の一連の実験はまた、TfRscFv/LipA-HoKCまたはTfRscFv/LipAが、小分子を送達するのに使用されるとき得られることを証明する。
【０２０１】
本発明の複合体の一部として含まれるときの小分子の効果の特異性を、正常な肺線維芽細胞株IMR-90を用いて、図16A-Cで示す。B16/F10およびMDA-MB-435を用いた上記の増感結果は、同じ条件下で、正常な肺線維芽細胞IMR-90を用いた結果と劇的に異なる。4.5 x 103細胞/ウェルを、96ウェルプレートに播種し、24時間後、TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193複合体、遊離GMC-5-193またはLipA-HoKCのみで処理した(図16A)。GMC-5-193の濃度は、ウェルあたり1.25 μMであった。複合体中のGMC-5-193とLipA-HoKCのモル比は、1:1であった。各複合体中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。24時間後、ドキソルビシンを、2.07 ng/mL〜2070 ng/mLの漸増濃度で加えた。48時間後、XTTアッセイを、処理に対する応答での細胞生存を評価するために行った。各点は、3回のサンプルの平均 ± 標準偏差を示す。IC50値は、50%増殖阻害の薬剤濃度を示す。UT = 非トランスフェクション。IMR-90細胞で、LipA-HoKCのみ、遊離GMC-5-193、および複合体GMC-5-193の倍率増感は、統計学的に異なり、これは、単独で、またはTfRscFv/Lip-HoKCとの複合体で投与したとしても、正常細胞におけるGMC-5-193の影響はほとんどないことを示す。これはさらに、IMR-90で、複合体GMC-5-193を用いたIC50は、MDA-MB-435細胞での8 ng/mLと比較して200 ng/mLであったので、正常細胞および腫瘍細胞株間の25倍の差異を示すことを証明する。相対的に、遊離GMC-5-193での処理後、2つの細胞株間のIC50値は、1.1倍のみであった。したがって、GMC-5-193は、遊離GMC-5-193で投与するときよりも、TfRscFv/LipA-HoKC複合体の構成要素として送達されたとき、腫瘍細胞においてより有効である。
【０２０２】
ドキソルビシンに対する正常なヒト肺線維芽細胞IMR-90の増感に関して、GMC-5-193のTfRscFV/LipA(HoKCなし)送達の効果を調べる同様の実験の結果を、図16Bに示す。再び、複合体を用いた小分子の投与は、化学療法剤に対して正常細胞を増感させなかった。
【０２０３】
同様に、IMR-90および異なる化学療法剤を用いた研究で、ミトキサントロンに対する増感に関して、GMC-5-193の腫瘍標的化リポソーム送達(TfRscFv/LipA/GMC-5-193)の効果を調べた(図16C)。ここでまた、小分子を複合体化させることは、ミトキサントロンに対して正常細胞の応答に影響を与えなかった。
【０２０４】
タキソテールに対する他のヒト腫瘍細胞であるDU145ヒト前立腺癌の増感に関する複合体の効果を、また、調べた(図17A)。4.5 x 103細胞/ウェルを、96ウェルプレートに播種し、24時間後、TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193複合体で処理した。GMC-5-193の濃度は、ウェルあたり1.25 μMであった。複合体中のGMC-5-193とLipA-HoKCのモル比は、1:1であった。各複合体中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。24時間後、タキソテールを、0.08 nMから〜82.7 nMの漸増濃度で加えた。48時間後、XTTアッセイを、処置における応答での細胞生存を評価するために行った。各点は、3回のサンプルの平均 ± 標準偏差を示す。IC50値は、50%増殖阻害の薬剤濃度を示す。UT = 非トランスフェクション。タキソテールは、高レベルの臨床活性を及ぼすことが証明された微小管標的化チューブリン重合剤である。この薬剤は、前立腺癌のための組合せ療法で使用される第1選択化学治療剤の1つであるので、選択された。LipA-HoKCのみ、遊離GMC-5-193、およびTfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193での処理後、タキソテールに対するDU145細胞の倍率増感は、各々、1.1、1.2、および47.1であり、これは、タキソテールに対する応答のレベルが、複合体GMC-5-193で処理した細胞で非常に高められたことを示す。
【０２０５】
DU145ヒト前立腺癌細胞で、遊離GMC-5-193、LipAのみおよびTfRscFv/LipA/GMC-5-193複合体によるミトキサントロンに対する増感の程度を比較した、異なる化学療法剤を用いた同様の研究結果を、図17Bに示す。複合体中のGMC-5-193とLipAのモル比は、1:1であった。各複合体中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。〜3倍の増感が、トキサントロンのみで処理した細胞と比較して、複合体GMC-5-193で処理した細胞で観察され、一方で、1.7倍のみの増加が、遊離GMC-5-193で見られた。倍率増感は、複合体を用いると2倍になる。
【０２０６】
MDA-MB-435ヒト黒色腫細胞で、遊離GMC-5-193 (GMC)、LipAのみおよびTfRscFv/LipA/GMC-5-193複合体によるタキソテールに対する増感の程度を比較したさらなる研究結果を、図17Cに示す。複合体中のGMC-5-193とLipAのモル比は、1:1であった。各複合体中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。〜10倍の増感が、タキソテールのみで処理した細胞と比較して、複合体GMC-5-193で処理した細胞で観察され、遊離GMC-5-193の2倍であった。
【０２０７】
次に、マウス同型転移モデルで、複合体GMC-5-193およびCDDPを用いた処理の効果の比較を調べた。図18は、遊離GMC-5-193と比較して、CDDPに対するB16/F10細胞の増感に関する複合体の効果を示す。3.5 x 103細胞/ウェルを、96ウェルプレートに播種し、24時間後、LipA-HoKCのみ、遊離GMC-5-193およびTfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193複合体でトランスフェクションした。GMC-5-193の濃度は、ウェルあたり2 μMであった。複合体中のGMC-5-193とLipA-HoKCのモル比は、1:1であった。各複合体中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。24時間後、CDDPを、0.4 μM〜200 μMの漸増濃度で加えた。XTTアッセイを、CDDP処理の48時間後に行い、CDDPに対する増感の程度を評価した。各点は、3回のサンプルの平均±標準偏差である。IC50値は、50%増殖阻害を産生する薬剤濃度である。UT = 非トランスフェクション。遊離GMC-5-193を超えた複合体 GMC-5-193による感受性の増加を観察し、IC50値を、42から20 μMまで減少させた。複合体の倍率増感は、2.6であり、再び、遊離GMC-5-193の2倍になった。したがって、上記のインビトロ実験のすべてからの結果は、標的化リポソーム(TfRscFv/LipAおよびTfRScFv/LipA-HoKC)と複合体を形成したGMC-5-193は、現在、当業者により用いられている遊離GMC-5-193で送達したときよりも、慣用的な化学治療剤に対して、より有効に腫瘍細胞を増感させるという観察を支持する。
【０２０８】
インビトロ共焦点像
共焦点像は、遊離GMC-5-193として送達したときと、標的化リポソーム(HoKCペプチドの有無)と複合体を形成したときのGMC-5-193の内在化を比較するために使用し、GMC-5-193の固有の蛍光を利用した。MDA-MB-435細胞を、遊離GMC-5-193または複合体GMC-5-193に6時間曝し、次いで、PBSで洗浄し、PBS中、4%パラホルムアルデヒドで固定し、共焦点顕微鏡で視覚化した。図19Aは、遊離GMC-5-193の吸収とTfRscFv/LipA/GMC-5-193複合体により細胞に送達された吸収間の比較を示し; 図19Bは、遊離GMC-5-193の吸収とTfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193 (scLHK-GMC)複合体により送達された吸収間の比較を示す。5 x 104細胞/ウェルを、24ウェルプレート中のスライドガラスに播種し、24時間後、TfRscFv/リポソーム/GMC-5-193複合体または遊離GMC-5-193で処理した。複合体中のGMC-5-193とLipAまたはLipA-HoKCのモル比は、1:1であった。各複合体中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。処理の6時間後、細胞を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、PBS中、4% パラホルムアルデヒドで固定し、スライドガラスに載せた。Olympus FLUOVIEW(登録商標)-300レーザー走査共焦点システムを、蛍光を視覚化するために用いた。細胞によるかなりの増加した蛍光吸収は、遊離GMC-5-193で処理した細胞と比較して、小分子GMC-5-193を、本発明のTfRScFv/LipAもしくはTfRScFv/LipA-HoKC複合体と複合体化させるとき、観察された。
【０２０９】
GMC-5-193蛍光分布様式を、複合体GMC-5-193で処理した細胞において、細胞質および核を含む細胞全体をとおして観察した。DIC像は、GMC-5-193複合体で処理した細胞の形態が、遊離GMC-5-193で処理した細胞とは異なることを明らかにした。前者は、相対的に丸くなった細胞を示し、後者は、未処理細胞で観察されたものと同様に、伸長した、より拡張した細胞を示した。これらの結果は、TfRscFv/LopAとの複合体の形成後、またはTfRScFv/LipA-HoKC GMC-5-193は、より効率的に癌細胞に吸収され得て、そのより強い証拠は、細胞殺傷を意図することを示す。さらに調べるために、核を核特異的染色DAPI(青色蛍光)で染色し、像を解析した。撮影した細胞の三次元アニメーションから、GMC-5-193緑色蛍光は、GMC-5-193複合体のどちらかで処理した細胞で、細胞の全体をとおして等しく分布し、一方で、遊離GMC-5-193で処理した細胞では、緑色蛍光は、細胞質よりも核でより観察されることが明らかになった。
【０２１０】
GMC-5-193を有するリガンド/リポソーム複合体によるインビボ腫瘍標的化
腫瘍保有動物を作製するために、PBSに懸濁したMDA435/LCC6ヒト黒色腫細胞(8×106)を、無胸腺ヌードマウスの尾静脈に注射した。
【０２１１】
TfRscFv/LipA/GMC-5-193の使用:
主に肺にMDA435/LCC6異種移植片腫瘍を有するマウスに、遊離GMC-5-193、非標的化LipA/GMC-5-193(L-GMC)またはTfRscFv/LipA/GMC-5-193(scL-GMC)を、マウスあたり9 mg GMC-5-193/kgで、静脈注射した。複合体中のGMC-5-193とLipAのモル比は、1:2.5(2.8:7と同等である)であった。各複合体中の一本鎖抗体断片の比率は、1:30(w:w)であった。注射の3時間後、肝臓および肺を切り取り、蛍光顕微鏡下で調べた。転移は、微小なものから小さな可視転移まで大きさが変わった。図20Aは、明視野および蛍光での同じ視野撮影を示す。TfRscFv/LipA-GMC-5-193複合体が、GMC-5-193を肺の腫瘍細胞へ特異的に送達できることがはっきりと見られる。遊離GMC-5-193で処理したマウスの明視野像で、巨大な腫瘍が肺の周辺で観察できる(肝臓への転移を伴う)。しかしながら、蛍光像は、すべての組織で非常に弱い蛍光を示す。非標的化複合体(LipA/GMC-5-193 (L-GMC))は、肺および肝臓で非常に弱いシグナルを示し、腫瘍特異性を示さなかった。対照に、TfRscFv/LipA/GMC-5-193複合体(scL-GMC)を注射したマウスでは、GMC-5-193の蛍光シグナルが、肺転移でずっと強かった(正常な肺組織のより明るい泡状外観と比較して、より密集した外観による明視野像で区別可能である)。さらに、非常に弱いバックグランドシグナルが、複合体GMC-5-193で処理したマウスの正常な肝臓で観察され、再び、腫瘍特異性を証明する。これらの結果は、全身投与後のGMC-5-193の腫瘍特異的吸収が、GMC-5-193がTfRscFv/LipA複合体に組み込まれるとき高められることを示す。
【０２１２】
TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193の使用
主に肺にMDA-MB-435/LCC6 異種移植片腫瘍を有するマウスに、遊離GMC-5-193(図20B(パネルB))またはTfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193(図20B(パネルA))を、マウスあたり9 mg GMC-5-193/kgで、静脈注射した。複合体中のGMC-5-193とLipA-HoKCのモル比は、1:2.5(2.8:7と同等である)であった。各複合体中の一本鎖抗体断片の比率は、1:30(w:w)であった。注射の3時間後、肝臓および肺を切り出し、蛍光顕微鏡下で調べた。転移は、微小なものから小さな可視転移まで大きさが変わった。同じ視野を、明視野および蛍光で撮影する。リガンド-リポソーム複合体が、GMC-5-193を肺の腫瘍細胞へ特異的に送達できることがはっきりと見られる(図20B(左手パネル))。遊離GMC-5-193で処理したマウスの明視野像で(図20B(右手パネル))、巨大な腫瘍が肺の周辺で観察できる(肝臓への転移を伴う)。しかしながら、蛍光像は、すべての組織で非常に弱い蛍光を示し、肝臓の転移で蛍光を示さなかった。これらの結果は、全身投与後のGMC-5-193の腫瘍特異的吸収が、GMC-5-193がTfRscFv/LipA-HoKC複合体に組み込まれるとき高められることを示す。
【０２１３】
TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193複合体を用いて送達した蛍光GMC-5-193の腫瘍特異的組み込みを示したさらなる結果を図20Cで示す。複合体中のGMC-5-193とLipA-HoKCのモル比は、1:2.5(2.8:7と同等である)であった。各複合体中の一本鎖抗体断片の比率は、1:30(w:w)であった。ここでまた、TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193の静脈内投与を受けたマウスと遊離GMC-5-193の静脈内投与を受けたマウス間の差異は、劇的であった。肝臓および背骨周辺における巨大な腫瘍が、遊離GMC-5-193を受けたマウスで存在した。しかしながら、これらの腫瘍では、ほとんど蛍光が見られなかった。対照に、蛍光シグナルは、複合体GMC-5-193を受けたマウスからの肺転移および分離した腫瘍でずっと強かった。これらの上記の実験は、明らかに、本発明のリガンド/リポソーム(HoKCペプチドの有無で)複合体と複合体を形成したとき、全身投与されたGMC-5-193の有効な腫瘍標的化および送達を証明する。
【０２１４】
インビボ有効性研究
B16/F10腫瘍を有するC57BL/6マウスを、CDDPまたはTfRscFv/リポソーム/GMC-5-193複合体(TfRscFv/LipA/GMC-5-193もしくはTfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193)のみまたはCDDPとの組合せで注射した。複合体中のGMC-5-193とLipAまたはLipA-HoKCのモル比は、1:1であった。各複合体中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。図21A-21Cは、処理の3週間後の各マウスの肺の写真を示す。B16/F10の多発性転移を、処理を受けなかった(UT)マウスの肺で観察した。図21Aでは、マウスは、GMC-5-193の静脈注射を、3 mg GMC-5-193/kg/注射で、週に2、3回、計7回受けた。これらの結果は、複合体GMC-5-193(HoKCペプチドの有無)が、単一薬剤処理としての遊離GMC-5-193よりもよいことを示す。図21Bおよび21Cでは、マウスはまた、GMC-5-193の静脈注射を、3 mg GMC-5-193/kg/注射で、週に2、3回、計7回受けた。CDDPを受けた集団では、CDDPを週に2回、全体で6回の注射で投与した。CDDPの最初の投与は、2.5mg/kgであったが、すべての次の投与は、2.0mg/kgであった。TfRscFv/リポソーム/GMC-5-193(TfRscFv/LipA/GMC-5-193)複合体＋CDDPの組合せを用いて処理したマウスは、肺転移の数のかなりの減少を示した(図21B)。図21Cでは、TfRscFv/LipA/GMC-5-193(scL-GMC)またはTfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193(scL-HK-GMC)複合体＋シスプラチンの組合せで処理したマウスは、単一薬剤処理(複合体またはCDDP)と比較して、肺転移の数のかなりの減少を示した。
【０２１５】
図21Bの結果は、アポトーシスのマーカーとして、切断カスパーゼ-3のウエスタンブロット解析の結果と相関する(図22)。未処理マウスまたはTfRscFv/リポソーム/GMC-5-193複合体(HoKCの有無)のみで処理したマウスの血清で、カスパーゼ-3は検出されず、これは、アポトーシスが存在せず、小分子治療の効果をほとんど表さないことを示す。切断カスパーゼ-3は、CDDPのみを受けたマウスの血清で、わずかな弱いバンドとして検出された。最も重要なのは、複合体GMC-5-193(TfRscFv/LipA/GMC-5-193またはTfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193)＋CDDPの組合せで処理したマウスは、高レベルの切断カスパーゼ-3を示し、それは、組合せ治療によるプログラムされた細胞死の増加を示す。
【０２１６】
考察
DU145細胞、B16/F10細胞、およびより少ない程度に、MDA435/LCC6細胞は、遊離GMC-5-193で処理した細胞と比較して、TfRscFv/LipA/GMC-5-193またはTfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193複合体で処理した細胞の高められた感受性を示した(図14)。GMC-5-193の複合体化はまた、さまざま化学療法剤に対する複数の腫瘍細胞株(ヒトおよびマウス)の増感を生じた。共焦点像は、GMC-5-193が、遊離GMC-5-193よりも複合体GMC-5-193でより効率的にMDA-MB-435細胞に吸収されることを明らかにした(図19Aおよび19B)。より強い緑色蛍光は、遊離GMC-5-193で処理した細胞と比較してGMC-5-193複合体で処理した細胞で観察された。興味深いことに、GMC-5-193緑色蛍光は、GMC-5-193複合体で処理した細胞で、細胞全体にわたって等しく観察されたが、遊離GMC-5-193で処理した細胞では、緑色蛍光は、細胞質よりも核でより観察された。リガンド化したリポソーム複合体へのGMC-5-193の組み込みは、細胞吸収を高め、細胞内のGMC-193の局在様式を変えた。
【０２１７】
GMC-5-193は、細胞質のチューブリンに結合することにより抗癌効果を示し;したがって、細胞質での小分子の存在は、抗癌効果を予期するのに好ましい。さらに、細胞質への薬剤放出の後、次の、細胞外コンパートメントへの放出を示し、それは、バイスタンダー効果を生じ得る。このために、複合体GMC-5-193で処理した細胞における高められた抗癌活性を調べた。
【０２１８】
ドキソルビシンに対するヒト黒色腫細胞MDA-MB435のインビトロ化学増感の結果として、増感のかなりの増加が、遊離GMC-5-193で処理した細胞と比較して、複合体GMC-5-193で処理した細胞で観察された(図15A-15B)。これらの増感結果は、同じ条件下で、正常なヒト肺線維芽細胞IMR-90の結果と劇的に異なり、そこでは、遊離もしくは複合体GMC-5-13は、実質的に影響を及ぼさなかった(図16A-16B)。癌細胞でのIC50値間の増加した倍率相違は、遊離GMC-5-193で処理した細胞と比較して、細胞を複合体GMC-5-193で処理したとき観察された。これらの結果は、TfRscFvが、細胞毒性を増加させるために、正常細胞ではなく癌細胞に複合体を標的化させ、効率的に送達することを示し、これは、複合体GMC-5-193との組合せ治療が治療インデックスを増加させ得ることを証明する。タキソテールに対するDU145ヒト前立腺癌細胞の同様の化学増感が観察された(図17A-17B)。CDDPに対するB16/F10転移生マウス黒色腫細胞の倍率増感は、また、細胞が複合体で処理されたとき2.6倍高かった(図18)。
【０２１９】
インビトロ実験からのすべての結果は、標的リポソームと複合体を形成したGMC-5-193が、遊離GMC-5-193で送達したときと比較して、慣用的な化学治療剤に対してより効果的に癌細胞を増感させるという観察を支持する。
【０２２０】
この研究での1つの興味は、全身送達後のGMC-5-193の腫瘍標的化送達にあった。TfRscFv/LipA/GMC-5-193またはTfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193を、主に肺にMDA-MB-435/LCC6異種移植片腫瘍を有する無胸腺ヌードマウスに静脈内投与すると、リガンド-リポソーム複合体が、肺の腫瘍細胞に特異的に、GMC-5-193を送達することがはっきりと見られ得る(図20A-20C)。肺転移におけるGMC-5-193の緑色蛍光シグナルは、遊離GMC-5-193で処理したマウスよりもこれらのマウスでより強かった。全身投与後のGMC-5-193の腫瘍特異的吸収は、小分子が、構成要素の単純混合により製造した本発明のリガンド化リポソーム複合体に組み込まれると高められる。これらの結果から、本発明のTfRScFv/LipAまたはTfRScFV/LipA-HoKC複合体への小分子の包含は、それらが原発性腫瘍であるか、転移性腫瘍であるかにかかわらず、腫瘍細胞に特異的な小分子の吸収を高める。
【０２２１】
この腫瘍標的化能力を、インビボ有効性研究で示した。B16/F10細胞は、我々が上記したとおり、複合体GMC-5-193で処理したとき、高められた感受性を示した。したがって、B16/F10腫瘍を有するC57BL/6マウスは、有効性研究のための動物モデルとして選択された。上記したとおり、TfRscFv/リポソーム/GMC-5-193複合体(HoKCペプチドの有無)＋CDDPの組合せで処理したマウスは、CDDPまたはTfRscFv/リポソーム/GMC-5-193複合体のみで処理したマウスと比較して、肺転移のかなりの減少および高められたレベルの切断カスパーゼ-3を示した。
【０２２２】
アポトーシスに関与するカスパーゼは、2つの集団に分類される: カスパーゼ-2、-8、-9、および-10を含むイニシエーターカスパーゼ、およびカスパーゼ-3、-6、および-7を含むエフェクターカスパーゼ。イニシエーターカスパーゼによるエフェクターカスパーゼの活性化は、アクチン、ラミン、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ(PARP)、およびデオキシリボヌクレアーゼの阻害剤(例えば、DFF45またはICAD)を含む細胞内基質のタンパク質分解的切断に関与する。それらの基質の切断は、アポトーシスの間、染色体をヌクレオソーム断片に分解する。カスパーゼ-3は、プロテアーゼカスケード経路におけるその局在のために、最も直接的にアポトーシスに関連すると考えられている。カスパーゼ-3は、32-kD前駆体として合成され、切断されると、中間体20-kDおよび12-kDサブユニットを介して、17-kDのサブユニットからなる成熟型を産生する 34-36。17-kDの高められたレベルの切断カスパーゼ-3は、プログラムされた細胞死のマーカーであると考えられている。
【０２２３】
したがって、抗癌小分子GMC-5-193の特異的および効率的標的化薬剤送達を達成した。これらの結果は、TfRscFvが、インビトロおよびインビボで、腫瘍細胞にカチオン性リポソーム-GMC-5-193複合体(HoKCの有無)を標的化し、インビトロおよびインビボで、慣用的な化学治療剤の抗癌効果を促進することを示す。特に、それらの毒性効果を減少させることを伴いながら、慣用的な化学療法剤の有効量を減らすことが証明された。
【０２２４】
実施例11
単純混合による小分子(YK-3-250)含有免疫リポソームの製造および特徴付け
小分子YK-3-250(微小間破壊化合物)のインビトロおよびインビボでの抗癌効果を改善するために、小分子を含む腫瘍標的化リポソーム複合体を製造した。TfRscFv/LipA複合体に加えて、エンドソーム破壊ペプチドを結合したカチオン性リポソームをまた、本明細書に記載したとおり、製造および研究した。エンドソーム破壊ペプチドHoKCは、細胞の細胞質でのYK-3-250の放出を助け、細胞質でのチューブリンの重合に影響を与え得る。リガンド-リポソーム複合体は、それらの表面上の相当する受容体の高められたレベルにより、腫瘍分子を選択的に標的化する。リガンド-リポソーム送達遺伝子の高レベルの発現は、肝臓、肺、骨髄、および腸陰窩のような正常な組織ではなく、原発腫瘍および転移で明らかであった。本実施例では、トランスフェリン受容体一本鎖(TfRscFv)を含む本発明のリポソーム複合体を、YK-3-250を癌細胞に送達するのに使用し、YK-3-250を含むリポソーム複合体のインビトロ生物学的効果を評価した。
【０２２５】
材料および方法
1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DOTAP)、トリメチルアンモニウムプロパン(DOPE)、およびN-マレイミド-フェニルブチレートDOPE(MPB-DOPE)は、Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL)から購入した。K[K(H)KKK]5-K(H)KKC (HoKC)(配列番号2)ペプチドは、Sigma-Genosys (The Woodlands, TX)により製造された。
【０２２６】
細胞株および培養
ヒト黒色腫細胞株MDA-MB-435は、10% 熱不活性化FBS、2 mM L-グルタミン、ならびに各50 μg/mLのペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを補充した改良型MEM(IMEM)で培養した。EMEMは、MediaTech (Herndon, VA)から購入し、他の細胞培養培地および成分は、Biofluids (Rockville, MD)から取得した。
【０２２７】
TfRscFv/LipA/YK-3-250複合体の製造
カチオン性リポソーム製剤LipA(1:1から1:2モル比のDOTAP: DOPEまたはDDAB:DOPE)を、本明細書に記載したエタノール注入法を用いて製造した。濃度は、2mMである。TfRscFv/LipA/YK-3-250複合体は、下記のとおり製造した:室温で、回転または撹拌を用いて、LipAとTfRscFvの混合物(1:1から1:40(wt/wt)、より適当には、1:10から1:30(wt/wt)のTfRscFvとLipAの比率)のインキュベーションの10分後、適当な濃度でのYK-3-250を加え、倒置または撹拌により混合し、好ましくは、室温で10分間、インキュベートした。YK-3-250とリポソームのモル比は、0.2:7から14:7、より適当には、2:7から8:7、最も適当には、7:7であった。複合体の大きさは、ZETASIZER(登録商標)3000HSシステム(Malvern, United Kingdom)を用いた25℃での動的光散乱により決定した。
【０２２８】
TfRscFv/LipA-HoKC/YK-3-250複合体の製造
カチオン性リポソーム製剤およびLipA-MPB(1:1:0.1から1:2:0.1のモル比でのDOTAP: DOPE: MPB-DOPEまたはDDAB:DOPE:MPB-DOPE)を、エタノール注入法を用いて製造し得る。LipA-HoKCを、次いで、本明細書に上記したとおり、マレイミド基を有するカチオン性リポソームとペプチド含有末端システイン基間のカップリング反応を用いて製造する。システイン上に遊離チオール基を有する0.1 mmolのペプチドのアリコートを、10 mM HEPES (pH 7.4)溶液中、2 mmolのLipA-MPBに加え、室温で2時間、回転させた。生じたLipA-HoKCは、1.4 mMの脂質濃度を有する。好ましくは、室温で、回転または撹拌を用いて、LipA-HoKCとTfRscFvの混合物(1:1から1:40(wt/wt)、より適当には、1:10から1:30(wt/wt)のTfRscFvとLipA-HoKCの比率)のインキュベーションの10分後、適当な濃度でのGMC-5-193を加え、倒置または撹拌により混合し、室温で10分間、インキュベートした。動物注射のために、デキストロースまたはスクロースを、1%から20%、より適当には、5-10%の最終濃度で、各サンプルに加えた。YK-3-2503とリポソームのモル比は、0.2:7から14:7まで、より適当には、2:7から8:7、最も適当には、7:7であった。複合体の大きさは、ZETASIZER(登録商標)3000HSシステム(Malvern, United Kingdom)を用いて、25℃での動的光散乱により決定する。
【０２２９】
TfRscFv/リポソーム/YK-3-250複合体のインビトロ細胞生存および最適化
インビトロ細胞毒性研究のために、100 μLの各細胞株の適当な増殖培地中、5から5.5 × 103細胞/ウェルを、96ウェルプレートにプレートした。24時間後、細胞を無血清培地で洗浄し、漸増濃度で、無血清培地中、100 μLのTfRscFv/LipA/YK-3-250、Lip Aのみまたは遊離YK-3-250を入れ、4-6時間、好ましくは、5時間インキュベートし、次いで、FBSを補充した。細胞を、次いで、さらに、5% CO2を含む湿気のある環境中、37℃で24-72時間、好ましくは、48時間インキュベートした。その後、細胞をフェノールレッドを含まないIMEMで洗浄し、細胞生存XTTに基づくアッセイを、製造者のプロトコールにしたがって行った(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)。電子カップリング剤XTTの存在で、生細胞のミトコンドリアでのデヒドロゲナーゼにより、ナトリウム3'-[1-(フェニルアミノ-カルボニル)-3, 4-テトラゾリウム]-ビス(4-メトキシ-6-ニトロ)ベンゼンスルホネートを、オレンジホルマザンに変換する。生存細胞の数に相関するホルマザン吸光度を、マイクロプレートリーダー (Molecular Devices, Menlo Park, CA)を用いて、450 nmで測定した。50%増殖阻害を産生するIC50値を、薬剤濃度と生存細胞の割合のlogグラフから補間した。
【０２３０】
結果
TfRscFv/LipA/YK-3-250複合体のモル比のインビトロ最適化
TfRscFv/LipA/YK-3-250複合体を製造し、TfRscFv/LipA/YK-3-250複合体中の小分子とリポソームのモル比を最適化した。MDA-MB-435癌細胞において、YK-3-250とLipAの異なる比率での複合体および遊離YK-3-250の細胞殺傷効果を比較した。TfRscFvとLipAの比率は、1:1から1:40(wt/wt)、より適当には、1:10から1:30(wt/wt)であった。5.5 x 103細胞/ウェルを、96ウェルプレートに播種し、24時間後、TfRscFv/LipA/YK-3-250複合体、LipAのみまたは遊離YK-3-250で処理した。XTTアッセイを、細胞毒性を評価するために処理の48時間後に行い、IC50値(50%増殖阻害を産生する薬剤濃度)を、濃度-細胞生存曲線から計算した。図23Aは、各処理のためのMDA-MB-435のIC50値を示す。6:7〜8:7のYK-3-250とリポソームのモル比の範囲で、IC50値の減少は、遊離YK-3-250、または遊離LipAを用いて処理した細胞と比較して、複合体YK-3-250で処理した細胞で観察され、IC50値を、>300nMから16 nMまで減少させた(7:7のYK-3-250とリポソームのモル比では、8 nMまで減少した)。
【０２３１】
図23Bは、7:7(また、1:1と同等である)のYK-3-205とリポソーム複合体(LipA)モル比を用いて、MDA-MB-435細胞における遊離YK-3-250とTfRscFv/LipA/YK-3-250(scL-YK-3-250)複合体の効果の比較を示す。遊離小分子と比較した複合体YK-3-250の細胞殺傷レベルの比較は、本発明の複合体を用いると、〜2倍の有効性の増加を示す。
【０２３２】
実施例12
単純混合による小分子(メシル酸イマチニブ(GLEEVEC(登録商標)))含有免疫リポソームの製造および特徴付け
以前、STI-571として既知のGLEEVEC(登録商標)(メシル酸イマチニブ; Novartis Pharmaecuticals Corp., East Hanover, NJ)は、腫瘍細胞の成長および増殖のシグナルを伝達する経路を妨害する抗増殖剤(シグナル伝達阻害剤)である。メシル酸イマチニブは、Bcr-Abl、c-KITおよびPDGF受容体αおよびβを含む受容体チロシンキナーゼのグループを選択的に阻害し、細胞増殖の破壊および最終的には細胞死を生じる。
【０２３３】
メシル酸イマチニブは、この疾患で異常であり、細胞に継続して増殖および分裂するシグナルを伝達するチロシンキナーゼタンパク質であるBcr-Ablの活性を阻害することにおいて有効性が示され、KIT(CD117)陽性切除不能および/または転移生悪性腫瘍 Gastrointestinal Stromal Tumors (GIST)(c-KITチロシンキナーゼの活性に関与する癌の相対的に稀な型である)を患う患者の処置のために承認されている。
【０２３４】
プロテインキナーゼは、細胞内シグナル伝達カスケードで重要な役割を果たし、したがって、癌を含む多くの疾患に直接関与するので、キナーゼ阻害剤は、新規クラスの抗癌治療剤の開発の焦点になった。現在、30以上の他のキナーゼ阻害剤が、臨床試験にある。メシル酸イマチニブはまた、多くの他の癌、とりわけ、PDGF受容体αおよびβを含むメシル酸イマチニブにより標的とされることが示されたチロシンキナーゼの異常な活性を示す癌の処置において利用され得る。最初の結果は、有望であったが、これらの薬剤は、毒性副作用を有する。メシル酸イマチニブに関して、これらは、造血抑制、腎臓毒性および体液貯留(眼または脚周辺の膨張)、下痢、吐き気、嘔吐、疲労、筋けいれん、筋肉痛または骨痛、腹痛、ならびに発疹を含む。これらの副作用の減少は、患者の生活の質のかなりの改善を生じるであろう。しかしながら、これらの毒性の減少は、重要ではあるが、腫瘍細胞における増加した治療剤の濃度は、治療効果に関してより重要である。本明細書に記載した実験は、本発明の免疫リポソームへのメシル酸イマチニブの封入、ならびにヒト乳癌、前立腺癌および膵臓癌モデルでの作用を実証する。
【０２３５】
材料および方法
1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DOTAP)、トリメチルアンモニウムプロパン(DOPE)、およびN-マレイミド-フェニルブチレートDOPE(MPB-DOPE)は、Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL)から購入した。
【０２３６】
細胞株および培養
ヒト前立腺癌細胞株DU145(HTB-81)およびマウス黒色腫細胞株B16/F10(CRL-6475)は、American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA)から入手した。DU145は、10% 熱不活性化ウシ胎児血清(FBS)、2mM L-グルタミン、および各50 μg/mLのペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを補充したEarls塩(EMEM)を含むイーグル最少必須培地で培養した。B16/F10(ATCC、CRL-6475)は、10% 熱不活性化FBS、2mM L-グルタミン、および各50 μg/mLのペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを補充したダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)で培養した。ヒト黒色腫細胞株MDA-MB-435およびヒト膵臓癌細胞株PANC-1は、10% 熱不活性化FBS、2mM L-グルタミン、および各50 μg/mLのペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを補充した改良したMEM(IMEM)で培養した。正常な(非癌性)皮膚線維芽細胞株H500は、1mM ピルビン酸ナトリウム、1mM 非必須アミノ酸＋10% 熱不活性化ウシ胎児血清、2mM L-グルタミンおよび各50 μg/mLのペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを補充したEMEMで培養した。EMEMは、MediaTech (Herndon, VA)から購入し、他の細胞培養培地および成分は、Biofluids (Rockville, MD)から取得した。
【０２３７】
TfRscFv/LipA/メシル酸イマチニブ(GLEEVEC(登録商標))複合体の製造
カチオン性リポソーム製剤LipA(1:1から1:2のモル比でのDOTAP:DOPEまたはDDAB:DOPE)は、本明細書に記載したエタノール注入法を用いて製造した。TfRscFv/LipA/メシル酸イマチニブ複合体は、下記のとおり製造した。室温で、回転または撹拌を用いて、LipAとTfRscFvの混合物(1:1から1:40(wt/wt)、より適当には、1:10から1:30(wt/wt)のTfRscFvとLipAの比率)のインキュベーションの10分後、適当な濃度でのメシル酸イマチニブを加え、倒置または撹拌により混合し、室温で10分間、インキュベートした。動物注射のために、デキストロースまたはスクロースを、1%から20%、より適当には、5-10%の最終濃度で、各サンプルに加えた。メシル酸イマチニブとリポソームのモル比は、0.2:7から14:7まで、より適当には、2:7から8:7、最も適当には、7:7であった。複合体の大きさは、ZETASIZER(登録商標)3000HSシステム(Malvern, United Kingdom)を用いて、25℃での動的光散乱により決定した。
【０２３８】
TfRscFv/LipA/メシル酸イマチニブ複合体を用いたインビトロ細胞生存
インビトロ毒性研究のために、100 μの各細胞株の適当な増殖培地中、2.5から5.5 × 103細胞/ウェルを、96ウェルプレートにプレートした。24時間後、細胞を無血清培地で洗浄し、漸増濃度で無血清培地中、100 μLのTfRscFv/LipA/メシル酸イマチニブ複合体または遊離メシル酸イマチニブを入れ、4-6時間、適当には、5時間インキュベートし、FBSを補充した。細胞を、次いで、5% CO2を含む湿気のある環境中、37℃で、さらに、24-72時間、適当には、48時間インキュベートした。その後、細胞を、フェノールレッドを含まないIMEMで洗浄し、細胞生存XTTに基づくアッセイを、製造者のプロトコールにしたがって行った(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)。電子カップリング剤XTTの存在で、生細胞のミトコンドリアでのデヒドロゲナーゼにより、ナトリウム3'-[1-(フェニルアミノ-カルボニル)-3, 4-テトラゾリウム]-ビス(4-メトキシ-6-ニトロ)ベンゼンスルホネートを、オレンジホルマザンに変換する。生存細胞の数に相関するホルマザン吸光度を、マイクロプレートリーダー (Molecular Devices, Menlo Park, CA)を用いて、450 nmで測定した。50%増殖阻害を産生するIC50値を、薬剤濃度と生存細胞の割合のlogグラフから補間した。
【０２３９】
インビトロ化学増感
化学増感研究のために、100 μL中、2.5〜5.5×103細胞/ウェルを、96ウェルプレートに播種した。24時間後、細胞を無血清培地で洗浄し、100 μLのTfRscFv/LipA/メシル酸イマチニブ複合体または遊離メシル酸イマチニブを、15から30 μMメシル酸イマチニブで載せ、4-6時間、適当には、5時間インキュベートし、次いで、FBSを各ウェルに加えた。細胞を、さらに、24-72時間、適当には、19時間インキュベートし、その後、漸増濃度で、化学治療剤の有無で適当な補充培地を添加し、インキュベーションをおよそ24-72時間、適当には、48時間続けた。使用する化学治療剤は、ドキソルビシン(Bedford Labs, Bedford, OH)、ドセタキセル(Taxotere; Aventis Pharmaceuticals, Bridgewater, NJ)、ミトキサントロン(NOVANTRONE(登録商標), Immunex Corp., Seattle WA)、シスプラチン(CDDP; Bedford Labs, Bedford, OH)、ゲムシタビン(GEMZAR(登録商標), Eli Lilly and Co., Indianapolis IN)およびダカルバジン(DTIC)(Mayne Pharmaceuticals, Paramus NJ)であった。XTTアッセイを、化学治療剤に対する増感の程度を評価するために行い、各細胞のIC50値を計算した。倍率増感は、下記に等しい: IC50非トランスフェクション/IC50各複合体。
【０２４０】
インビボ有効性研究
PBSに懸濁したマウス黒色腫細胞B16/F10(1×105)を、C57BL/6マウスの尾静脈に注射した。4日後、B16/F10腫瘍を有するマウスに、遊離メシル酸イマチニブ;CDDPのみまたはCDDPと組み合わせたTfRscFv/LipA/メシル酸イマチニブを、0.5 mg/kgメシル酸イマチニブの用量で、静脈注射した。注射は、週に3回、全体で9回行った。混合物中のメシル酸イマチニブとLipAのモル比は、7:7であった。各混合物中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。ある集団はまた、CDDPのみを受けた。CDDPを週2回、2mg/kgで、全体で6回注射した。処理の3週間後、マウスを殺し、肺を切り取った。器官を、10% ホルムアルデヒドで固定し、撮影前に70%エタノールで保存した。
【０２４１】
結果
封入および遊離メシル酸イマチニブの比較
細胞生存に関して、遊離メシル酸イマチニブ(GLEEVEC(登録商標))と比較したTfRscFv/LipA/メシル酸イマチニブ(GLEEVEC(登録商標))の有効性を、ヒト前立腺癌細胞株(DU145)(図24A)およびヒト黒色腫細胞株(MDA-MB-435)(図24B)、およびマウス黒色腫細胞株(B16/F10)(図24C)で、XTTアッセイにより評価した(本明細書に記載したとおりである)。各複合体中のメシル酸イマチニブとLipAのモル比は、7:7であった。各複合体中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。メシル酸イマチニブを、DMSOまたは水に溶解させた。図24Aで証明したとおり、リポソーム複合体送達メシル酸イマチニブを用いたDU145細胞の処理は、DMSOまたは水に溶解させた遊離メシル酸イマチニブと比較して、細胞殺傷の5倍以上の増加を示した。
【０２４２】
同様に、ヒト黒色腫細胞で(図24B)、リポソーム複合体により送達したメシル酸イマチニブは、‘遊離’型で送達したときよりも、細胞殺傷でかなり大きな効果を有した。遊離小分子を超えて、TfRscFv/LipA/メシル酸イマチニブを用いると、3倍の改善を示した。結果は、Gleevecが水またはDMSOのどちらに溶解しているかに関わらず、同一であった。したがって、次の実験は、水に溶解させたGleevecを利用した。
【０２４３】
遊離もしくはTfRScFv/LipA複合体メシル酸イマチニブ(scL-Gleevec)の効果を、B16/F10マウス黒色腫細胞で比較したとき、遊離Gleevecを超えて、scL-Gleevecを用いると3倍増加した細胞殺傷が観察された(図24C)。
【０２４４】
TfRscFv/LipA/メシル酸イマチニブ(scL-Gleevec)による化学増感
第1選択化学療法剤に対して腫瘍細胞(ヒトおよびマウス)を増感させるために、‘遊離’またはリポソーム複合体により送達したメシル酸イマチニブの能力を、また、XTTアッセイで評価した。ヒト黒色腫細胞株MDA-MB-435を、20μMまたは30μMの遊離もしくは複合体メシル酸イマチニブで処理し、その後、漸増用量のタキソテールを加えた。各複合体中のメシル酸イマチニブとLipAのモル比は、7:7であった。各複合体中一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。図25Aで示したとおり、20μMのメシル酸イマチニブ濃度で、遊離メシル酸イマチニブを投与したときと比較して、メシル酸イマチニブをリポソーム複合体(scL- GLEEVEC(登録商標))により送達するとき、化学療法剤に対するほぼ50倍の増加が存在する。この用量で、遊離メシル酸イマチニブは、タキソテールに対して細胞を増感させない。さらに、用量依存性化学感受性の増加が観察された。30μMのメシル酸イマチニブで、遊離メシル酸イマチニブは、およそ4倍の増感を示したが、リポソーム複合体メシル酸イマチニブを用いた応答は、非常に劇的であり、IC50値は、決定できなかった(図25B)。
【０２４５】
同様に、ヒト前立腺癌細胞(DU145)では、20 μMでリポソーム複合体により送達したメシル酸イマチニブ(scL-GLEEVEC(登録商標))は、遊離メシル酸イマチニブと比較して、ミトキサントロンに対する細胞の応答を〜4倍高めた(図26A)。ここでまた、用量応答が存在し、30 μMで、TfRscFv/LipA/メシル酸イマチニブ複合体(scL-GLEEVEC(登録商標))を用いて決定できなかった(図26B)。各複合体中のメシル酸イマチニブとLipAのモル比は、7:7であった。各複合体中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。
【０２４６】
メシル酸イマチニブのリポソーム複合体送達の効果を、また、ヒト膵臓癌細胞株PANC-1で評価した。各複合体中のメシル酸イマチニブとLipAのモル比は、7:7であった。各複合体中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。他の腫瘍細胞で観察されたのと同様に、メシル酸イマチニブを、本発明のリポソーム複合体(scL-GLEEVEC(登録商標))により送達したとき、化学療法剤GEMZAR(登録商標)(ゲムシタビンHCl)に対する用量応答およびその感受性のレベルの劇的な増加が見られた(図27AおよびB)。20 μMで、遊離メシル酸イマチニブで見られたものを超えて、リポソーム複合体メシル酸イマチニブを用いると、ゲムシタビンに対するPANC-1の100倍増加した応答を示した(図27A)。上記したとおり、30 μMで、IC50値は、決定できなかった(図27B)。対照的に、遊離メシル酸イマチニブを用いたIC50値は、用量を増加させてもほとんど変化しなかった。
【０２４７】
マウス黒色腫細胞株B16/F10での結果は、ヒト腫瘍細胞での結果に酷似している。遊離およびTfRscFv/LipA/メシル酸イマチニブ複合体(scL-GLEEVEC(登録商標))による化学増感における効果の比較は、個の別々の化学療法剤シスプラチン(CDDP)およびダカルバジン(DTIC)を用いて、用量および時間依存的であることが示された。各複合体中のメシル酸イマチニブとLipAのモル比は、7:7であった。各複合体中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。CDDPを用いると、20μMの濃度で、TfRscFv/LipA/メシル酸イマチニブ複合体(scL-GLEEVEC(登録商標))を用いたトランスフェクションは、遊離メシル酸イマチニブと比較して、2倍の感受性の増加を生じた(図28A)。ここで再び、30μMのメシル酸イマチニブ濃度で、CDDPに対する増感のレベルは、非常に強く、〜10%の細胞のみが、最も低いメシル酸イマチニブの用量で生存した(図28B)。
【０２４８】
同様の実験を、遊離もしくは複合体メシル酸イマチニブにより、他の化学療法剤、ダカルバジン(DTIC)に対するB16/F10細胞の増感を比較するために行った。各複合体中のメシル酸イマチニブとLipAのモル比は、7:7であった。各複合体中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。ここでまた、遊離小分子では見られないTfRscFv/LipA/メシル酸イマチニブを用いた増感の用量依存的増強に加えて、また、化学療法剤を加える前のトランスフェクション後のインキュベーション時間を増やす倍率増感の増加が存在した(図29AからD)。インキュベーションの24時間後、15μMのメシル酸イマチニブ濃度で、複合体メシル酸イマチニブは、遊離メシル酸イマチニブと比較して、DTICに対する2.1倍増加した応答を生じた(図29A)。これは、小分子の濃度を20μMまで増加させたとき、遊離メシル酸イマチニブを超えて、本発明の化合物による増感が4.2倍まで倍化した(図29B)。より長いインキュベーション時間(48時間)では、遊離メシル酸イマチニブと比較して、TfRscFv/LipA/メシル酸イマチニブを用いた感受性の増加は(濃度 = 15μM)、5.7倍であり(図29C)、一方、20μMの濃度、48時間で、応答が非常に大きく、IC50は得られなかった(図29D)。したがって、ここで再び、我々は、複数の腫瘍細胞型およびさまざまな化学療法剤で、小分子メシル酸イマチニブの送達および有効性が、本発明の複合体に封入されたとき高められることを示した。メシル酸イマチニブ。
【０２４９】
リガンド/リポソーム/メシル酸イマチニブ誘導化学増感の腫瘍細胞特異的性質は、図30AおよびBで示す。正常な(非癌性)皮膚線維芽細胞(H500)を、上記したとおり、化学療法剤ミトキサントロン(図30A)またはタキソテール(図30B)の添加前に、LipAのみ、遊離メシル酸イマチニブおよびTfRscFv/LipA/メシル酸イマチニブ(scL-GLEEVEC(登録商標))(20μMの濃度で)でトランスフェクトした。各複合体中のメシル酸イマチニブとLipAのモル比は、7:7であった。各複合体中の一本鎖抗体断片の比率は、1:30(w:w)であった。両実験で、化学療法剤に対する増感の有意な増加は、観察されなかった。すべてのIC50値は、コントロールのそれと同じ範囲にあった(ミトキサントロンのために>100ng/mlおよびタキソテールのために>100nM)。
【０２５０】
TfRscFv/LipA/メシル酸イマチニブ複合体のインビボ有効性: 高められた腫瘍増殖阻害
PBSに懸濁した1×105 B16/F10マウス黒色腫細胞を、C57BL/6マウスの尾静脈に注射した。4日後、B16/F10肺転移を有するマウスに、シスプラチン(CDDP)のみ、シスプラチンと組み合わせた遊離メシル酸イマチニブもしくはTfRscFv/LipA/メシル酸イマチニブ(scL-GLEEVEC(登録商標))複合体を注射した。各複合体中のメシル酸イマチニブとLipAのモル比は、7:7であった。各複合体中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。マウスは、0.5 mg メシル酸イマチニブ/マウス/注射で、週3回、全体で9回の遊離メシル酸イマチニブまたはscL-GLEEVEC(登録商標)複合体の注射を受けた。CDDPを、2 mg/kgの用量で、週2回、全体で6回、腹腔内注射した。処理の3週間後、マウスを、人道的に安楽死させ、肺を切り取り、撮影した。
【０２５１】
図31で示したとおり、単剤処理を受けた動物からのものと比較して、TfRScFv/Lipa/メシル酸イマチニブ＋CDDPの組合せを受けたマウスの肺において、かなりの腫瘍細胞増殖阻害を示した。したがって、これは、特に、化学療法剤と組み合わせて使用するとき、本発明のリガンド/リポソーム/小分子複合体の抗癌剤としての使用を支持する。
【０２５２】
結論
メシル酸イマチニブは、フィラデルフィア染色体陽性(Ph+)慢性骨髄性白血病(CML)およびKIT(CD117)陽性切除不能および/または転移生悪性腫瘍 Gastrointestinal Stromal Tumors (GIST)を患う患者の処置のために承認されている。それは、Bcr-Abl、c-KITならびにPDGF受容体αおよびβを含む多くのチロシンキナーゼをインビトロで阻害することが示された。したがって、該薬剤は、これらのキナーゼを発現する他の癌の処置のための潜在性を有する。これらの研究で、我々は、腫瘍細胞死(乳癌、前立腺癌および膵臓癌で)を誘導し、第1選択化学療法剤に対するそれらの応答を増加させるメシル酸イマチニブの有効性が、本発明の標的化リポソーム送達複合体により細胞を送達するとき劇的に改善されることを証明した。これらの結果は、メシル酸イマチニブの効果を大いに増加させるナノ複合体の能力を証明する。
【０２５３】
実施例13
単純混合による小分子(エルロチニブ(TARCEVA(登録商標)))含有免疫リポソームの製造および特徴付け
TARCEVA(登録商標)(エルロチニブ、Genentech Inc, So. San Francisco CA)は、1型ヒト上皮成長因子受容体/上皮成長因子受容体(HER1/EGFR)チロシンキナーゼ阻害剤である。このチロシンキナーゼは、非小細胞肺癌および膵臓癌での細胞増殖に重要な因子の1つである。
【０２５４】
上皮増殖因子受容体(EGFR)は、HER(human epidermal growth factor receptor)シグナル伝達経路の構成要素である。該経路は、少なくとも4個の細胞受容体からなる:EGFR/HER1、HER2、HER3、およびHER4。およそ11個の異なる因子が、ある様式で、これらの受容体に結合し、活性化することが既知である。HERシグナル伝達は、細胞成長、増殖、移動の正常な制御、および仲介過程、例えば、創傷治癒、組織修復、および皮膚の維持において役割を果たす。正常な細胞の成長を制御するその役割に加えて、HERシグナル伝達経路は、癌細胞の成長、増殖、移動、および生存にかなりの影響を与えることを示した。
【０２５５】
EGFRおよびHERシグナル伝達経路の他の構成要素は、細胞成長を制御するために、複合体で、堅く制御された方法で相互作用する。HERファミリーメンバーの量または活性の変化は、不適当な細胞成長を引き起こすか、または支持し、癌細胞の増殖、移動、および生存を生じ得る。シグナル伝達経路は、各工程で増殖シグナルを増幅するカスケードとして働くので、EGFRの量または活性の小さな変化が、細胞増殖および転移(細胞移動)を促進し、アポトーシス(プログラムされた細胞死)を阻害することにより、癌の発生、または進行をかなり誘導し得る。さらに、いくつかの研究は、正常な細胞および組織修復の重要なレギュレーターであるHERシグナル伝達が、いくつかの化学療法剤および放射線を含む、細胞および組織に損傷を与えるさまざまな癌治療に応答して活性化されることを示した。これらの研究は、EGFRを含むHER経路の活性化が、処置耐性癌の発生に関与し得ることを示す。 
【０２５６】
TARCEVA(登録商標)は、細胞内のHER1シグナル伝達経路のチロシンキナーゼ活性を阻害するように設計される。TARCEVA(登録商標)は、経口投与錠剤である。エルロチニブは、化学名N-(3-ethynylphenyl)-6,7-ビス(2-メトキシエトキシ)-4-キナゾリンアミンを有するキナゾリンアミンである。TARCEVA(登録商標)は、塩酸塩として、エルロチニブを含む。エルロチニブは、上皮増殖因子受容体(EGFR)と結合したチロシンキナーゼの細胞内リン酸化を阻害する。他のチロシンキナーゼ受容体に関する阻害の特異性に関しては、十分に特徴づけられていない。EGFRは、正常細胞および癌細胞の細胞表面に発現する。2004年11月に、米国食品医薬品局(FDA)は、化学療法レジメンにより先に、少なくとも1つの失敗をした後、局部的に進行した転移性非小細胞肺癌(NSCLC)を患う患者の処置のためにTARCEVA(登録商標)(150 mg)を承認した。局所進行性もしくは転移性NSCLCを患う第1選択患者で行われた2施設プラセボ制御無作為第3相臨床試験の結果から、白金に基づく化学療法とTARCEVA(登録商標)の共投与で臨床利点を示さず、その使用は、その設定では推薦されない。この点に関して、本発明の方法、すなわち、小分子を腫瘍標的化リガンドリポソーム複合体と単純結合により結合させることを介したエルロチニブ(TARCEVA(登録商標))による、複数の腫瘍細胞株でのさまざまな化学療法剤に対する感受性の増加は、ほとんど予期されない。TARCEVA(登録商標)単剤療法150 mgを受けたNSCLCを患う患者での最も一般的な副作用は、穏やかな発疹および下痢であった。グレード3/4発疹および下痢は、それぞれ、TARCEVA(登録商標)処置患者の9%および6%で生じ、各々は、1%の患者の単剤第3相臨床試験の中断を生じた。NSCLC、膵臓癌または他の進行性固形腫瘍の処置のためにTARCEVA(登録商標)を受けた患者において、死亡を含む重篤なInterstitial Lung Disease(ILD)様事象の報告はほとんど存在しなかった。NSCLC単剤試験では、ILD様事象の発生は、稀であり(0.8%)、治療群の間で等しく分布していた。
【０２５７】
2005年11月に、FDAは、先の化学療法を受けていない患者で、局所進行性手術不能もしくは転移性膵臓癌の処置のために、ゲムシタビン化学療法と組合せたTARCEVA(登録商標)(100 mg)を承認した。膵臓癌の第3相試験では、報告された最も一般的な有害事象は、疲労、発疹、吐き気、食欲不振および下痢であった。発疹は、TARCEVA(登録商標)＋ゲムシタビンを受けた患者の69%で、ゲムシタビン＋プラセボを受けた患者の30%で報告された。下痢は、Tarceva＋ゲムシタビンを受けた患者の48%で、ゲムシタビン＋プラセボを受けた患者の36%で報告された。各発疹および下痢は、2%の患者で用量減少を生じ、その結果、TARCEVA(登録商標)＋ゲムシタビンを受けた患者の1%までで試験が中断された。さらに、重篤な、および潜在的に致死の有害事象は、TARCEVA(登録商標)＋ゲムシタビンを受けた患者の間質性肺疾患様合併症、心筋梗塞もしくは虚血、脳血管障害、および血小板減少症に付随する微小血管症性溶血性貧血を含んだ。
【０２５８】
材料および方法
1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DOTAP)、トリメチルアンモニウムプロパン(DOPE)、およびN-マレイミド-フェニルブチレートDOPE(MPB-DOPE)は、Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL)から購入した。
【０２５９】
細胞株および培養
ヒト前立腺癌細胞株DU145 (HTB-81)は、American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA)から入手した。DU145は、10% 熱不活性化ウシ胎児血清(FBS)、2mM L-グルタミン、および各50 μg/mLのペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを補充したEarls塩(EMEM)を含むイーグル最少必須培地で培養した。ヒト黒色腫細胞株MDA-MB-435およびヒト膵臓癌細胞株PANC-1は、10% 熱不活性化FBS、2mM L-グルタミン、および各50 μg/mLのペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを補充した改良したMEM(IMEM)で培養した。正常な(非癌性)皮膚線維芽細胞株H500は、1mM ピルビン酸ナトリウム、1mM 非必須アミノ酸＋10% 熱不活性化ウシ胎児血清、2mM L-グルタミンおよび各50 μg/mLのペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを補充したEMEMで培養した。EMEMは、MediaTech (Herndon, VA)から購入し、他の細胞培養培地および成分は、Biofluids (Rockville, MD)から取得した。
【０２６０】
TfRscFv/LipA/エルロチニブ(TARCEVA(登録商標))複合体の製造
カチオン性リポソーム製剤LipA(1:1から1:2のモル比でのDOTAP: DOPEまたはDDAB:DOPE)を、本明細書に記載したとおり、エタノール注入法を用いて製造した。TfRscFv/LipA/エルロチニブ複合体は、下記のとおり製造した: 室温で、回転または撹拌を用いて、LipAとTfRscFvの混合物(1:1から1:40(wt/wt)、より適当には、1:10から1:30 wt/wtのTfRscFvとLipAの比率)のインキュベーションの10分後、適当な濃度でのエルロチニブを加え、倒置または撹拌により混合し、室温で、10分間、インキュベートした。動物注射のために、デキストロースまたはスクロースを、1%から20%、より適当には、5-10%の最終濃度で、各サンプルに加えた。エルロチニブとリポソームのモル比は、0.2:7から14:7まで、より適当には、2:7から8:7、最も適当には、7:7であった。複合体の大きさは、ZETASIZER(登録商標)3000HSシステム(Malvern, United Kingdom)を用いて、25℃での動的光散乱により決定した。
【０２６１】
TfRscFv/LipA/エルロチニブ複合体を用いたインビトロ細胞生存
インビトロ細胞毒性研究のために、100 μLの各細胞株の適当な増殖培地中、2.5から3.5 × 103細胞/ウェルを、96ウェルプレートにプレートした。24時間後、細胞を無血清培地で洗浄し、漸増濃度で、無血清培地中、100 μLのTfRscFv/LipA/エルロチニブ複合体または遊離エルロチニブを入れ、4-6時間、適当には、5時間インキュベートし、次いで、FBSを補充した。細胞を、次いで、5% CO2を含む湿気のある環境中、37℃で、さらに、24-72時間、適当には、48時間インキュベートした。その後、ウェルを、フェノールレッドを含まないIMEMで洗浄し、細胞生存XTTに基づくアッセイを、製造者のプロトコールにしたがって行った(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)。電子カップリング剤XTTの存在で、生細胞のミトコンドリアでのデヒドロゲナーゼにより、ナトリウム3'-[1-(フェニルアミノ-カルボニル)-3, 4-テトラゾリウム]-ビス(4-メトキシ-6-ニトロ)ベンゼンスルホネートを、オレンジホルマザンに変換する。生存細胞の数に相関するホルマザン吸光度を、マイクロプレートリーダー (Molecular Devices, Menlo Park, CA)を用いて、450 nmで測定した。50%増殖阻害を産生するIC50値を、薬剤濃度と生存細胞の割合のlogグラフから補間した。
【０２６２】
インビトロ化学増感
化学増感研究のために、100 μL中、2.5〜3.5 × 103 細胞/ウェルを、96ウェルプレートに播種した。24時間後、細胞を無血清培地で洗浄し、100 μLのTfRscFv/LipA/エルロチニブ複合体または遊離エルロチニブを、3から8μMのエルロチニブで入れ、4-6時間、適当には、5時間インキュベートし、次いで、FBSを各ウェルに加えた。細胞を、さらに、24-72時間、適当には、19時間インキュベートし、その後、漸増濃度での化学治療剤の有無で適当な補充培地を添加し、インキュベーションを、およそ24-72時間、適当には、48時間続けた。使用する化学治療剤は、ドセタキセル(Taxotere; Aventis Pharmaceuticals, Bridgewater, NJ)、ミトキサントロン(NOVANTRONE(登録商標), Immunex Corp., Seattle WA)およびゲムシタビン(GEMZAR(登録商標), Eli Lilly and Co., Indianapolis IN )であった。XTTアッセイを、化学治療剤に対する増感の程度を評価するために行い、各細胞のIC50値を計算した。倍率増感は、下記に等しい: IC50非トランスフェクト/IC50各複合体。
【０２６３】
結果
封入および遊離エルロチニブ(TARCEVA(登録商標))の比較
細胞生存に関して、遊離エルロチニブ(TARCEVA(登録商標))と比較したTfRscFv/LipA/エルロチニブ(TARCEVA(登録商標))の有効性を、ヒト前立腺癌細胞株(DU145)(図32A)、ヒト膵臓癌細胞株(PANC-1)(図32B)およびヒト黒色腫細胞株(MDA-MB-435)(図32C)で、XTTアッセイ(本明細書に記載したとおりである)により評価した。各複合体におけるエルロチニブ(TARCEVA(登録商標))とLipAのモル比は、7:7であった。各複合体における一本鎖抗体断片とリポソームの比は、1:30(w:w)であった。エルロチニブ(TARCEVA(登録商標))を、水に溶解させた。図32Aで証明したとおり、リポソーム複合体送達エルロチニブ(TARCEVA(登録商標))を用いたDU145の処理は、遊離エルロチニブ(TARCEVA(登録商標))と比較したとき、5倍以上の細胞殺傷を生じた。
【０２６４】
同様に、ヒト膵臓癌細胞では(図32B)、リポソーム複合体により送達されるエルロチニブ(TARCEVA(登録商標))は、‘遊離’形で送達したときよりも、かなり強い殺傷効果を示した。遊離小分子と比較して、TfRscFv/LipA/エルロチニブ(TARCEVA(登録商標))を用いると、約10倍の改善を示した。
【０２６５】
遊離もしくはTfRScFv/LipA複合体化エルロチニブ(TARCEVA(登録商標))(scL-Tarceva)の効果をヒト黒色腫細胞(MDA-MB-435)で比較すると、遊離Tarcevaを用いたときよりもscL-TARCEVA(登録商標)を用いたとき、細胞殺傷の2倍の増加が観察された(図32C)。
【０２６６】
TfRscFv/LipA/エルロチニブ(scL-TARCEVA(登録商標))による化学増感
第1選択化学療法剤に対して腫瘍細胞を増感させる、遊離’またはリポソーム複合体(scL-SUTENT(登録商標))により送達されるエルロチニブ(TARCEVA(登録商標))の能力を、また、XTTアッセイにより評価した。ヒト黒色腫細胞株MDA-MB-435を、3.75μMまたは7.5μMの遊離もしくは複合体エルロチニブ(scL-TARCEVA(登録商標))で処理し、その後、漸増用量のミトキサントロンを加えた。各複合体中のエルロチニブ(scL-TARCEVA(登録商標))とLipAのモル比は、7:7(1:1と同等である)であった。各複合体中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30 (w:w)であった。図33Aで示したとおり、3.75μM エルロチニブ(scL-TARCEVA(登録商標))の濃度で、遊離エルロチニブ(scL-TARCEVA(登録商標))を投与したときと比較して、エルロチニブ(scL-TARCEVA(登録商標))を、リポソーム複合体(scL-SUTENT(登録商標))で送達したとき、化学療法剤に対する応答がほぼ13倍増加した。この用量では、遊離エルロチニブは、ミトキサントロンに対して細胞を増感させない。さらに、化学増感の用量依存増加は、エルロチニブ(scL-TARCEVA(登録商標))を本発明の方法により送達したときおよび遊離エルロチニブ(TARCEVA(登録商標))として送達されたとき観察された。7.5μM エルロチニブ(TARCEVA(登録商標))で、scL-TARCEVA(登録商標)を用いた処理後のミトキサントロンに対するDU145細胞の増感のレベルは、遊離エルロチニブ(TARCEVA(登録商標))のそれよりも34倍高かった(図33B)。対照に、この高い用量においてさえ、遊離エルロチニブ(TARCEVA(登録商標))は、化学療法剤に対する応答効果を示さなかった。
【０２６７】
ヒト黒色腫細胞(MDA-MB-435)と同様に、3.75 μMでリポソーム複合体(scL-TARCEVA(登録商標))により送達したエルロチニブ(TARCEVA(登録商標))は、遊離エルロチニブ(TARCEVA(登録商標))と比較して、タキソテールに対する細胞の応答を〜4倍高めた(図34A)。ここでまた、scL送達小分子を用いたときのみ用量応答が存在した。7.5μMで、増感のレベルは非常に強く、IC50値は、TfRscFv/LipA/エルロチニブ(TARCEVA(登録商標))複合体(scL-TARCEVA(登録商標))で決定できなかったが(図34B)、遊離エルロチニブと比較した倍率増感は、>140倍であると概算される。対照的に、遊離エルロチニブの最少効果のみが存在した。各複合体中のエルロチニブ(TARCEVA(登録商標))とLipAのモル比は、7:7であった。各複合体中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。
【０２６８】
エルロチニブ(TARCEVA(登録商標))のリポソーム複合体送達の効果は、また、ヒト膵臓癌細胞株PANC-1で評価した。各複合体中のメシル酸イマチニブとLipAのモル比は、7:7であった。各複合体中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。他の腫瘍細胞で観察されたとおり、エルロチニブ(TARCEVA(登録商標))が本発明のリポソーム複合体(scL-TARCEVA(登録商標))により送達されたとき、化学療法剤GEMZAR(登録商標)(ゲムシタビンHCl)に対する感受性レベルの劇的な増加が見られた(図35)。7.5 μMで、遊離エルロチニブで見られたものを超えて、リポソーム複合体エルロチニブ(TARCEVA(登録商標))を用いると、驚くべきことに、ゲムシタビンに対するPANC-1の545倍増加した応答が見られた。遊離TARCEVA(登録商標) が標準的な化学治療剤の効果を高めなかった臨床試験で見出されたものを考慮すると、標準的な化学治療剤に対するそのような劇的な効果は、全く予期せぬものである。
【０２６９】
したがって、ここで再び、上記の実施例での他の小分子と同様に、我々は、複数の腫瘍細胞型で、さまざまな化学療法剤を用いて、小分子エルロチニブの送達および効果が、本発明の複合体に封入されるとき高められることを示した。
【０２７０】
リガンド/リポソーム/エルロチニブ(TARCEVA(登録商標))誘導化学増感の腫瘍細胞特異的性質を、図36A-Cで示す。正常な(非癌性)皮膚線維芽細胞(H500)を、上記したとおり、化学療法剤ミトキサントロン(図36A)、タキソテール(図36B)またはゲムシタビン(GEMZAR(登録商標))(図36C)の添加前に、LipAのみ、遊離エルロチニブ(TARCEVA(登録商標)のみ)およびTfRscFv/LipA/エルロチニブ(TARCEVA(登録商標))(scL- TARCEVA(登録商標))(7.5μMの濃度で)でトランスフェクトした。各複合体中のエルロチニブ(TARCEVA(登録商標))とLipAのモル比は、7:7であった。各複合体中の一本鎖抗体断片の比率は、1:30(w:w)であった。3つすべての実験で、化学療法剤に対する増感の有意な増加は、観察されなかった。すべてのIC50値は、コントロールのそれと同じ範囲にあった。
【０２７１】
したがって、ここで再び、上記の実施例での他の小分子と同様に、我々は、複数の腫瘍細胞型で、さまざまな化学療法剤を用いて、小分子エルロチニブの送達および効果が、本発明の複合体に封入されるとき高められることを示した。
【０２７２】
実施例14
単純混合による小分子リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))含有免疫リポソームの製造および特徴付け
腎細胞癌(RCC)および消化管間質腫瘍(GIST)を含む多くの癌は、単一のよく定義された突然変異または異常とは反対に、複数のシグナル伝達経路における突然変異または他の異常から生じる。これらの変化は、最終的には、癌増殖に重要な過程を可能にし、それは、下記を含む:増殖シグナルの自律性、増殖阻害シグナルへの非感受性、プログラムされた細胞死(アポトーシス)の回避、無制限の複製潜在性、持続した血管新生、ならびに組織浸潤および転移。リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))は、RCCおよびGIST進行に関与するいくつかの受容体キナーゼを同時に阻害する、経口複数キナーゼ阻害剤である。リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))は、腫瘍細胞増殖および血管新生の両方で役割を果たすあらゆる既知のPDGFおよびVEGF受容体を同時に阻害する。SUTENT(登録商標)は、PDGF、VEGF、およびKIT受容体を同時に阻害する最初の複数キナーゼGIST療法である。SUTENT(登録商標)は、RCCおよびGISTにおける前臨床試験で、周皮細胞においてPDGF受容体および内皮細胞においてVEGF受容体を阻害することによる血管新生活性を証明した。SUTENT(登録商標)は、前臨床試験で、腫瘍退行を誘導し、血管新生および転移進行を阻害した。SUTENT(登録商標)は、したがって、複数のシグナル伝達経路を阻害し、その結果、二重の抗増殖および抗血管新生効果を生じる。
【０２７３】
SUTENT(登録商標)は、メシル酸イマチニブに対する疾患の進行またはそれに対する不寛容後、消化管間質腫瘍(GIST)の処置のために、および進行した腎細胞癌(RCC)の処置のために望ましい。進行したRCCのための承認は、部分応答率および応答の持続に基づく。無作為SUTENT(登録商標)臨床試験は、RCCで、増加した生存または疾患関連症状の改善のような臨床利点を証明しない。
【０２７４】
材料および方法
1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DOTAP)、トリメチルアンモニウムプロパン(DOPE)、およびN-マレイミド-フェニルブチレート DOPE (MPB-DOPE)は、Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL)から購入した。
【０２７５】
細胞株および培養
ヒト前立腺癌細胞株DU145(HTB-81)は、American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA)から取得した。DU145は、10% 熱不活性化ウシ胎児血清(FBS)、2mM L-グルタミン、および各50 μg/mLのペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを補充したEarls塩(EMEM)を含むイーグル最少必須培地で培養した。ヒト黒色腫細胞株MDA-MB-435およびヒト膵臓癌細胞株PANC-1は、10% 熱不活性化FBS、2mM L-グルタミン、および各50 μg/mLのペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを補充した改良したMEM(IMEM)で培養した。Dr. I. Panyutin (Nuclear Medicine Department, National Institutes of Health, Bethesda, MD)から贈られた正常なヒト肺線維芽細胞IMR-90は、10% 熱不活性化FBS、2mM L-グルタミン、0.1 mM 非必須アミノ酸、1 mM ピルビン酸ナトリウム、および各50 μg/mLのペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを補充したEMEMで培養した。正常な(非癌性)皮膚線維芽細胞株H500は、1mM ピルビン酸ナトリウム、1mM 非必須アミノ酸＋10% 熱不活性化ウシ胎児血清、2mM L-グルタミンおよび各50 μg/mLのペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを補充したEMEMで培養した。EMEMは、MediaTech (Herndon, VA)から購入し、他の細胞培養培地および成分は、Biofluids (Rockville, MD)から取得した。
【０２７６】
TfRscFv/LipA/リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))複合体の製造
カチオン性リポソーム製剤LipA(1:1から1:2モル比でのDOTAP:DOPEまたはDDAB:DOPE)は、本明細書に記載したとおり、エタノール注入法を用いて製造した。TfRscFv/LipA/リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))複合体は、下記のとおり製造した: 室温で、回転または撹拌を用いて、LipAとTfRscFvの混合物(1:1から1:40(wt/wt)、より適当には、1:10から1:30 wt/wtのTfRscFvとLipAの比率)のインキュベーションの10分後、適当な濃度でのリンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))を加え、倒置または撹拌により混合し、室温で、10分間、インキュベートした。動物注射のために、デキストロースまたはスクロースを、1%から20%、より適当には、5-10%の最終濃度で、各サンプルに加えた。リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))とリポソームのモル比は、0.2:7から14:7、より適当には、3:7から11:7、最も適当には、7:7であった。複合体の大きさは、ZETASIZER(登録商標)3000HSシステム(Malvern, United Kingdom)を用いて、25℃で、動的光散乱により決定した。
【０２７７】
TfRscFv/LipA/リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))複合体を用いたインビトロ細胞生存
インビトロ毒性研究のために、100 μの各細胞株の適当な増殖培地中、2.5から3.5 × 103細胞/ウェルを、96ウェルプレートにプレートした。24時間後、細胞を無血清培地で洗浄し、漸増濃度で無血清培地中、100 μLのTfRscFv/LipA/リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))複合体または遊離リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))を入れ、4-6時間、適当には、5時間インキュベートし、FBSを補充した。細胞を、次いで、5% CO2を含む湿気のある環境中、37℃で、さらに、24-72時間、適当には、48時間インキュベートした。その後、細胞を、フェノールレッドを含まないIMEMで洗浄し、細胞生存XTTに基づくアッセイを、製造者のプロトコールにしたがって行った(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)。電子カップリング剤XTTの存在で、生細胞のミトコンドリアでのデヒドロゲナーゼにより、ナトリウム3'-[1-(フェニルアミノ-カルボニル)-3, 4-テトラゾリウム]-ビス(4-メトキシ-6-ニトロ)ベンゼンスルホネートを、オレンジホルマザンに変換する。生存細胞の数に相関するホルマザン吸光度を、マイクロプレートリーダー (Molecular Devices, Menlo Park, CA)を用いて、450 nmで測定した。50%増殖阻害を産生するIC50値を、薬剤濃度と生存細胞の割合のlogグラフから補間した。
【０２７８】
インビトロ化学増感
化学増感研究のために、100 μL中、2.5〜3.5 × 103 細胞/ウェルを、96ウェルプレートに播種した。24時間後、細胞を無血清培地で洗浄し、100 μLのTfRscFv/LipA/リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))複合体または遊離リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))を、2から6μMのリンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))で入れ、4-6時間、適当には、5時間インキュベートし、次いで、FBSを各ウェルに加えた。細胞を、さらに、24-72時間、適当には、19時間インキュベートし、その後、漸増濃度での化学治療剤の有無で適当な補充培地を添加し、インキュベーションを、およそ24-72時間、適当には、48時間続けた。使用する化学治療剤は、ドセタキセル(Taxotere; Aventis Pharmaceuticals, Bridgewater, NJ)、ミトキサントロン(NOVANTRONE(登録商標), Immunex Corp., Seattle WA)およびゲムシタビン(GEMZAR(登録商標), Eli Lilly and Co., Indianapolis IN )であった。XTTアッセイを、化学治療剤に対する増感の程度を評価するために行い、各細胞のIC50値を計算した。倍率増感は、下記に等しい: IC50非トランスフェクト/IC50各複合体。
【０２７９】
結果
TfRscFv/LipA/リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))複合体のモル比のインビトロ最適化
TfRscFv/LipA/リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))複合体を製造し、TfRscFv/LipA/リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))複合体の小分子とリポソームのモル比を最適化した。DU1455ヒト前立腺癌細胞で、リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))とLipAの異なる比率で、複合体および遊離リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))の細胞殺傷効果を比較した。TfRscFvとLipAの比率は、1:30(wt/wt)であった。3 x 103 細胞/ウェルを96ウェルプレートに播種し、24時間後、TfRscFv/LipA/リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))複合体、または遊離リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))を用いて、処理した。XTTアッセイは、細胞毒性を評価するために、処理後72時間で行い、IC50(50%成長阻害を産生する薬剤濃度)は、濃度-細胞生存曲線から計算した。図37は、各比率のためのIC50値を示す。3:5〜7:7のリンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))とリポソームのモル比の範囲で、IC50値の減少が、遊離リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))で処理した細胞と比較して、複合体リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))で処理した細胞で観察された。
【０２８０】
封入および遊離リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))の比較
細胞生存に関して、遊離リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))と比較したTfRscFv/LipA/リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))の有効性は、ヒト前立腺癌細胞株(DU145)(図38A)、およびヒト膵臓癌細胞株(PANC-1)(図38B)で、XTTアッセイ(本明細書に記載したとおり)により評価した。各複合体中のリンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))とLipAのモル比は、7:7(1:1と同等である)であった。各複合体中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。図38Aで証明したとり、リポソーム複合体送達リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))を用いたDU145細胞の処置は、遊離リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))と比較して、かなりの細胞殺傷の増加を生じた。
【０２８１】
同様に、ヒト膵臓癌細胞では(図38B)、リポソーム複合体により送達したリンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))は、‘遊離’型で送達したときよりも、細胞殺傷においてかなり大きな効果を有した。遊離小分子と比較して、TfRscFv/LipA/リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))を用いると、4倍の改善を示した。
【０２８２】
TfRscFv/LipA/リンゴ酸スニチニブ(scL-SUTENT(登録商標))による化学増感
第1選択化学療法剤に対して腫瘍細胞を増感させる、遊離’またはリポソーム複合体(scL-SUTENT(登録商標))により送達されるリンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))の能力を、また、XTTアッセイにより評価した。ヒト黒色腫細胞株MDA-MB-435を、2.5μMまたは5μMの遊離もしくは複合体リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))で処理し、その後、漸増用量のタキソテールを加えた。各複合体中のリンゴ酸スニチニブ (SUTENT(登録商標))とLipAのモル比は、7:7(1:1と同等である)であった。各複合体中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30 (w:w)であった。図39Aで示したとおり、2.5uM リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))の濃度で、遊離リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))と比較して、リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))リポソーム複合体(scL-SUTENT(登録商標))で送達したとき、化学療法剤に対する応答が8倍以上増加した。さらに、化学増感の用量依存増加は、リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))を本発明の方法により送達したとき、観察された。5μM リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))で、増感のレベルは非常に高く、IC50値には影響しなかったが、scL-SUTENT(登録商標)での処理後、タキソテールに対するMDA-MB-435細胞の増感レベルは、遊離リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))のレベルの300倍以上であることが見積もられた(図39B)。
【０２８３】
同様に、ヒト前立腺癌細胞(DU145)では、5 μMで、リポソーム複合体(scL-SUTENT(登録商標))により送達したリンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))は、遊離リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))と比較して(ここでは、化学療法剤に対して、前立腺癌細胞の増感における最小限の効果のみが存在した)、ミトキサントロンに対する細胞の応答を>400倍まで高めた(図40)。各複合体中のリンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))とLipAのモル比は、7:7であった。各複合体中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。
【０２８４】
リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))のリポソーム複合体送達の効果は、また、膵臓癌細胞株PANC-1で評価した。各複合体中のリンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))とLipAのモル比は、7:7であった。各複合体中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。他の腫瘍細胞で観察されたとおり、リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))が本発明のリポソーム複合体(scL- SUTENT(登録商標))により送達されたとき、化学療法剤GEMZAR(登録商標)(ゲムシタビンHCl)に対する増感のレベルが劇的に増加した(図41)。2.5 μMで、遊離リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))で見られたものよりもリポソーム複合体リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))を用いて、ゲムシタビン(GEMZAR(登録商標))に対する6倍増加したPANC-1の応答が見られた。
【０２８５】
リガンド/リポソーム/リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))誘導化学増感の腫瘍細胞特異的性質を、図42(A-C)および43(A-C)で示す。正常な(非癌性)皮膚線維芽細胞株H500を、上記したとおり、化学療法剤ミトキサントロン(図42A)、タキソテール(図42B)またはゲムシタビン(GEMZAR(登録商標))(図42C)の添加前に、LipAのみ、遊離リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))のみおよびTfRscFv/LipA/リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))(scL-SUTENT(登録商標))(2.5または5μMの濃度で)でトランスフェクトした。各複合体中のリンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))とLipAのモル比は、7:7であった。各複合体中の一本鎖抗体断片の比率は、1:30(w:w)であった。3つすべての実験で、化学療法剤に対する増感の有意な増加は、観察されなかった。すべてのIC50値は、コントロールのそれと同じ範囲にあった。
【０２８６】
同様の結果が、正常なヒト肺線維芽細胞(IMR-90)に、上記したとおり、化学療法剤ミトキサントロン(図43A)、タキソテール(図43B)またはゲムシタビン(GEMZAR(登録商標))(図43C)の添加より前に、LipAのみ、遊離リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))のみおよびTfRscFv/LipA/リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))(scL-SUTENT(登録商標))(2.5 μMの濃度で)でトランスフェクトしたとき、観察された。各複合体中のリンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))とLipAのモル比は、7:7であった。各複合体中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。3つすべての実験で、化学療法剤に対する増感の有意な増加は、観察されなかった。すべてのIC50値は、コントロールのそれと同じ範囲にあった。
【０２８７】
したがって、ここで再び、以前の実験における他の小分子と同様に、我々は、複数の腫瘍細胞型で、さまざまな化学療法剤を用いて、小分子リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))の送達および有効性が、本発明の複合体に封入されると高められることを示した。遊離リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))と比較して、本発明に記載したとおりに複合体化させたとき、リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))に対してかなりの増感を示す本実施例で示された3つの腫瘍型は、この小分子の使用が有用であることが見出されていた腫瘍型ではないので、これらの腫瘍が本発明に非常に良く応答することは、予期せぬ発見である。
【０２８８】
実施例15
単純混合による小分子(ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標)))含有免疫リポソームの製造および特徴付け
ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))は、上皮増殖因子受容体チロシンキナーゼ(EGFR-TK)阻害剤として既知である最初の新規クラス抗癌剤であり、市場の承認を得て、現在では、世界36カ国で、進行した非小細胞肺癌(NSCLC)の処置のために認可されている。癌細胞を含む多くの細胞は、それらの表面に、上皮増殖因子(EGF)のために、正常に身体で産生され、細胞の成長および増殖を促進するタンパク質である受容体を有する。EGFが上皮増殖因子受容体(EGFR)に結合すると、チロシンキナーゼと呼ばれる酵素が細胞内で活性化される。チロシンキナーゼは、癌細胞を含む細胞が、成長し、増殖し、拡張する化学過程を誘導する。ゲフィチニブは、EGFRに結合し、それにより、EGFの結合およびチロシンキナーゼの活性を妨害する。癌細胞が成長および増殖するのを止めるメカニズムは、化学療法およびホルモン療法のメカニズムとは非常に異なる。ゲフィチニブは、2003年5月にFDAにより承認された。ゲフィチニブは、ある型の肺癌、すなわち、非小細胞肺癌(NSCLC)を患う患者の処置のためにのみ(単剤療法)使用される。
【０２８９】
承認は、2つの第2相試験(IDEAL 1および2)に基づき、それは、IRESSAが、以前処置された進行性NSCLCを患う多くの患者のために有効な処置であることを示した。IDEAL試験でのおよそ50%の患者が、腫瘍の縮小またはそれらの腫瘍の安定を達成し、該薬剤が、一般に、十分に耐用であることが見出された(最も一般に報告される薬剤副作用反応は、穏やかな皮膚発疹および下痢であった)。しかしながら、突然発症し得るInterstitial Lung Disease (ILD)が、IRESSAを受けた患者で観察され、いくつかの症例では、致死的であった。同時の特発性肺線維症/間質性肺炎/塵肺/放射線肺炎/薬剤性肺炎を患う患者は、この状況から、増加した死亡率を有することが観察された。
【０２９０】
2004年12月に、AstraZenecaは、1つまたは2つの先の化学療法レジメンに失敗した進行性NSCLCを患う患者において、プラセボでのIRESSA(登録商標)と比較した第3相ISEL(IRESSA(登録商標) Survival Evaluation in Lung Cancer)試験の結果を公表した。ISELは、全体の集団で、または腺癌を患う患者で、IRESSA(登録商標)を用いた生存のいくつかの改善を示したが、これは、プラセボと比較して、統計学的な有意に達しなかった。先に計画された(Pre-planned)亜集団解析は、アジア起源の患者で、および非喫煙であった患者で、プラセボと比較して、IRESSA(登録商標)を用いた生存の統計学的に有意な増加を示した。さらに、ISELからのバイオマーカーデータの予備解析は、高EGFRコピー数が、前処理した進行性NSCLCで、IRESSA(登録商標)を用いた利点の強い予測因子であることを示した。
【０２９１】
ISELデータの公表後、AstraZenecaは、IRESSA(登録商標)に関する欧州申請(European submission)を取り下げ、米国およびカナダの監督官庁は、すでに該薬剤から恩恵を受けていた患者へのIRESSA(登録商標)の使用を制限した。アジア太平洋領域では、肺癌の分子差異のために、IRESSA(登録商標)は、前処理した進行性NSCLCの確立した治療になっており、第1選択進行設定(advanced setting)における薬剤の使用が、現在、IPASS研究として知られる大規模な第3相汎アジア臨床試験で研究されている。
【０２９２】
ISELの結果、および広い臨床試験から、IRESSA(登録商標)は、いくつかの進行したNSCLC患者のための有効な処置であることは明らかである。AstraZenecaは、現在、最も該薬剤から恩恵を受けるNSCLC患者を同定することに焦点をあてている。
【０２９３】
IRESSA(登録商標)は、多くの固形腫瘍の増殖において重要な役割を果たすように思われるシグナル伝達経路を標的とするので、したがって、それは、広い範囲の癌の治療潜在性を有し得る。本潜在性の進行中の研究は、頭頸部癌および乳癌における臨床試験を含む。
【０２９４】
材料および方法
1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DOTAP)、トリメチルアンモニウムプロパン(DOPE)、およびN-マレイミド-フェニルブチレートDOPE(MPB-DOPE)は、Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL)から購入した。
【０２９５】
細胞株および培養
ヒト前立腺癌細胞株DU145(HTB-81)は、American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA)から取得した。DU145は、10% 熱不活性化ウシ胎児血清(FBS)、2mM L-グルタミン、および各50 μg/mLのペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを補充したEarls塩(EMEM)を含むイーグル最少必須培地で培養した。ヒト黒色腫細胞株MDA-MB-435およびヒト乳癌細胞株MDA-MB-231は、10% 熱不活性化FBS、2mM L-グルタミン、および各50 μg/mLのペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを補充した改良したMEM(IMEM)で培養した。EMEMは、MediaTech (Herndon, VA)から購入し、他の細胞培養培地および成分は、Biofluids (Rockville, MD)から取得した。
【０２９６】
TfRscFv/LipA/ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))複合体の製造
カチオン性リポソーム製剤LipA(1:1から1:2モル比でのDOTAP:DOPEまたはDDAB:DOPE)は、本明細書に記載したとおり、エタノール注入法を用いて製造した。TfRscFv/LipA/ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))複合体は、下記のとおり製造した。室温で、回転または撹拌を用いて、LipAとTfRscFvの混合物(1:1から1:40(wt/wt)、より適当には、1:10から1:30 wt/wtのTfRscFvとLipAの比率)のインキュベーションの10分後、適当な濃度でのゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))を加え、倒置または撹拌により混合し、室温で、10分間、インキュベートした。動物注射のために、デキストロースまたはスクロースを、1%から20%、より適当には、5-10%の最終濃度で、各サンプルに加えた。ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))とリポソームのモル比は、0.2:7から14:7、より適当には、3.5:7から7:7、最も適当には、7:7であった。複合体の大きさは、ZETASIZER(登録商標)3000HSシステム(Malvern, United Kingdom)を用いて、25℃で、動的光散乱により決定した。
【０２９７】
TfRscFv/LipA/ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))複合体を用いたインビトロ細胞生存
インビトロ細胞毒性研究のために、100 μLの各細胞株の適当な増殖培地中、2.5から3.5 × 103 細胞/ウェルを、96ウェルプレートにプレートした。24時間後、細胞を無血清培地で洗浄し、漸増濃度で、無血清培地中、100 μLのTfRscFv/LipA/ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))複合体または遊離ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))を入れ、4-6時間、適当には、5時間インキュベートし、次いで、FBSを補充した。細胞を、次いで、5% CO2を含む湿気のある環境で、さらに、24-72時間、適当には、72時間、インキュベートした。その後、ウェルを、フェノールレッドを含まないIMEMで洗浄し、細胞生存XTTに基づくアッセイを、製造者のプロトコールにしたがって行った(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)。電子カップリング剤XTTの存在で、生細胞のミトコンドリアでのデヒドロゲナーゼにより、ナトリウム3'-[1-(フェニルアミノ-カルボニル)-3, 4-テトラゾリウム]-ビス(4-メトキシ-6-ニトロ)ベンゼンスルホネートを、オレンジホルマザンに変換する。生存細胞の数に相関するホルマザン吸光度を、マイクロプレートリーダー (Molecular Devices, Menlo Park, CA)を用いて、450 nmで測定した。50%増殖阻害を産生するIC50値を、薬剤濃度と生存細胞の割合のlogグラフから補間した。
【０２９８】
インビトロ化学増感
化学増感研究のために、100 μL中、2.5〜3.5× 103 細胞/ウェルを、96ウェルプレートに播種した。24時間後、細胞を無血清培地で洗浄し、100 μLのTfRscFv/LipA/ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))複合体または遊離ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))を、8から15μMのゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))で入れ、4-6時間、適当には、5時間インキュベートし、次いで、FBSを各ウェルに加えた。細胞を、さらに、24-72時間、適当には、19時間インキュベートし、その後、漸増濃度での化学治療剤の有無で適当な補充培地を添加し、インキュベーションを、およそ24-72時間、適当には、48時間続けた。使用する化学治療剤は、ドセタキセル(Taxotere; Aventis Pharmaceuticals, Bridgewater, NJ)、およびミトキサントロン(Novantrone(登録商標), Immunex Corp., Seattle WA)であった。XTTアッセイを、化学治療剤に対する増感の程度を評価するために行い、各細胞のIC50値を計算した。倍率増感は、下記に等しい: IC50非トランスフェクト/IC50各複合体。
【０２９９】
結果
TfRscFv/LipA/ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))複合体のモル比のインビトロ最適化
TfRscFv/LipA/ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))複合体を製造し、TfRscFv/LipA/ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))の小分子とリポソームのモル比を最適化した。MDA-MB-231ヒト乳癌細胞で、ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))とLipAの異なる比率で、複合体および遊離ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))の細胞殺傷効果を比較した。TfRscFvとLipAの比率は、1:30(wt/wt)であった。3 x 103 細胞/ウェルを96ウェルプレートに播種し、24時間後、TfRscFv/LipA/ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))複合体、または遊離ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))を用いて、処理した。XTTアッセイは、細胞毒性を評価するために、処理後72時間で行い、IC50(50%成長阻害を産生する薬剤濃度)は、濃度-細胞生存曲線から計算した。図44は、各比率のためのIC50値を示す。3:5〜7:7のゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))とリポソームのモル比の範囲で、IC50値の減少が、遊離ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))で処理した細胞と比較して、複合体ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))で処理した細胞で観察された。
【０３００】
封入および遊離ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))の比較
細胞生存における、遊離ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))と比較したTfRscFv/LipA/ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))の有効性は、ヒト乳癌細胞株(MDA-MB-231)(図45A)、ヒト黒色腫細胞株(MDA-MB-435)(図45B)、およびヒト前立腺癌細胞株(DU145)(図45C)で、XTTアッセイ(本明細書に記載したとおりである)により評価した。各複合体のゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))とLipAのモル比は、7:7(1:1に等しい)であった。各複合体の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。図45Aで証明したとおり、リポソーム複合体送達ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))を用いたMDA-MB-231細胞の処理は、遊離ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))と比較して、2倍の細胞殺傷の増加を生じた。
【０３０１】
さらに、MDA-MB-435細胞では、遊離ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))(図45B)と比較して、ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))が本発明の複合体の一部(scL-IRESSA(登録商標))として送達されたとき、1.5倍の応答の増加が観察された。
【０３０２】
同様に、ヒト前立腺癌細胞では(図45C)、リポソーム複合体により送達したゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))は、‘遊離’形で送達したときと比べて、かなり高い殺傷効果を示した。遊離小分子と比較して、TfRscFv/LipA/ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))を用いると、1.7倍の改善を示した。
【０３０３】
TfRscFv/LipA/ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))による化学増感
‘遊離’もしくはリポソーム複合体(scL-IRESSA(登録商標))を送達するゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))の第1選択化学療法剤に対して腫瘍細胞を増感させる能力を、また、XTTアッセイにより評価した(図46A-C)。3つの異なるヒト癌細胞株を、8-15μMの遊離もしくは複合体ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))で処理し、その後、漸増用量の化学療法剤を添加した。各複合体中のゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))とLipAのモル比は、7:7(1:1と同等である)であった。各複合体中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。図46Aで示したとおり、12μMのゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))濃度で、遊離ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))を投与したときと比較して、ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))リポソーム複合体(scL-IRESSA(登録商標))により送達されたとき、化学療法剤タキソテールに対する2倍以上の応答を示す。
【０３０４】
ヒト黒色腫細胞(MDA-MB-435)と同様に、15 μMで、リポソーム複合体(scL-IRESSA(登録商標))で送達されたゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))は、化学療法剤に対して全く細胞を増感させなかった遊離ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))と比較して、タキソテールに対する細胞の応答を2.2倍まで高めた(図46B)。各複合体中のゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))とLipAのモル比は、7:7であった。各複合体中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。
【０３０５】
ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))のリポソーム複合体送達の効果は、また、ヒト前立腺癌細胞株DU145で評価した。各複合体中のゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))とLipAのモル比は、7:7であった。各複合体中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。他の腫瘍細胞で観察されたのと同様に、ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))を、本発明のリポソーム複合体(scL-IRESSA(登録商標))により送達したとき、化学療法剤ミトキサントロンに対する増感のレベルをかなり増加させた(図46C)。8 μMで、遊離ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))で見られたものよりもリポソーム複合体ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))を用いたとき、ミトキサントロンに対するDU145の応答を約5倍増加させた。
【０３０６】
したがって、ここで再び、上記の実施例の他の小分子と同様に、我々は、複数の腫瘍細胞型で、さまざまな化学療法剤で、それを本発明の複合体中に封入したとき、小分子ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))の送達および効果を促進することを示した。本発明に記載したとおり複合体化させると、遊離ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))と比較して、ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))に対してより増感作用がある本実施例で示した3つの腫瘍型は、この小分子の使用が有効に見出されていた腫瘍型ではないので、これらの腫瘍細胞が本発明に非常によく応答することは、予期されない発見である。
【０３０７】
参照
1. Tseng, S., Pak, G., Washenik, K., Pomeranz, M. K., and Shupack, J. L. Rediscovering thalidomide: a review of its mechanism of action, side effects, and potential uses. (Review). Journal of the American Academy of Dermatology, 35: 969-979, 1996.
2. Vogelsang, G. B., Hess, A. D., Gordon, G., and Santos, G. W. Treatment and prevention of acute graft-versus-host disease with thalidomide in a rat model. Transplantation, 41: 644-647, 1986.
3. McCarthy, D. M., Kanfer, E. J., and Barrett, A. J. Thalidomide for the therapy of graft-versus-host disease following allogeneic bone marrow transplantation. (Review). Biomedicine & Pharmacotherapy, 43: 693-697, 1989.
4. Forsyth, C. J., Cremer, P. D., Torzillo, P., Iland, H. J., and Young, G. A. Thalidomide responsive chronic pulmonary GVHD. Bone Marrow Transplantation, 17: 291-293, 1996.
5. Reyes-Teran, G., Sierra-Madero, J. G., Martinez, d. C., V, Arroyo-Figueroa, H., Pasquetti, A., Calva, J. J., and Ruiz-Palacios, G. M. Effects of thalidomide on HIV-associated wasting syndrome: a randomized, double-blind, placebo-controlled clinical trial. AIDS, 10: 1501-1507, 1996.
【０３０８】
6. Jacobson, J. M., Greenspan, J. S., Spritzler, J., Ketter, N., Fahey, J. L., Jackson, J. B., Fox, L., Chernoff, M., Wu, A. W., MacPhail, L. A., Vasquez, G. J., and Wohl, D. A. Thalidomide for the treatment of oral aphthous ulcers in patients with human immunodeficiency virus infection. National Institute of Allergy and Infectious Diseases AIDS Clinical Trials Group. New England Journal of Medicine, 336: 1487-1493, 1997.
7. D'Amato, R. J., Loughnan, M. S., Flynn, E., and Folkman, J. Thalidomide is an inhibitor of angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 91: 4082-4085, 1994.
8. Bauer, K. S., Dixon, S. C., and Figg, W. D. Inhibition of angiogenesis by thalidomide requires metabolic activation, which is species-dependent. Biochemical Pharmacology, 55: 1827-1834, 1998.
9. Kenyon, B. M., Browne, F., and D'Amato, R. J. Effects of thalidomide and related metabolites in a mouse corneal model of neovascularization. Experimental Eye Research, 64: 971-978, 1997.
10. Ng, S. S., Gutschow, M., Weiss, M., Hauschildt, S., Teubert, U., Hecker, T. K., Luzzio, F. A., Kruger, E. A., Eger, K., and Figg, W. D. Antiangiogenic activity of N-substituted and tetrafluorinated thalidomide analogues. Cancer Research, 63: 3189-3194, 2003.
【０３０９】
11. Dredge, K., Marriott, J. B., Macdonald, C. D., Man, H. W., Chen, R., Muller, G. W., Stirling, D., and Dalgleish, A. G. Novel thalidomide analogues display anti-angiogenic activity independently of immunomodulatory effects. British Journal of Cancer, 87: 1166-1172, 2002.
12. Lima, L. M., Castro, P., Machado, A. L., Fraga, C. A., Lugnier, C., de Moraes, V. L., and Barreiro, E. J. Synthesis and anti-inflammatory activity of phthalimide derivatives, designed as new thalidomide analogues. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 10: 3067-3073, 2002.
13. Dredge, K., Marriott, J. B., and Dalgleish, A. G. Immunological effects of thalidomide and its chemical and functional analogs. (Review). Critical Reviews in Immunology, 22: 425-437, 2002.
14. Capitosti, S. M., Hansen, T. P., and Brown, M. L. Thalidomide analogues demonstrate dual inhibition of both angiogenesis and prostate cancer. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 12: 327-336, 2004.
15. Hamel, E., Lin, C. M., Plowman, J., Wang, H. K., Lee, K. H., and Paull, K. D. Antitumor 2,3-dihydro-2-(aryl)-4(1H)-quinazolinone derivatives. Interactions with tubulin. Biochemical Pharmacology, 51: 53-59, 1996.
【０３１０】
16. Hour, M. J., Huang, L. J., Kuo, S. C., Xia, Y., Bastow, K., Nakanishi, Y., Hamel, E., and Lee, K. H. 6-Alkylamino- and 2,3-dihydro-3'-methoxy-2-phenyl-4-quinazolinones and related compounds: their synthesis, cytotoxicity, and inhibition of tubulin polymerization. Journal of Medicinal Chemistry, 43: 4479-4487, 2000.
17. Rowinsky, E. K. and Donehower, R. C. Paclitaxel (taxol)(erratum appears in N Engl J Med 1995 Jul 6;333(1):75). (Review). New England Journal of Medicine, 332: 1004-1014, 1995.
18. Miller, K. D. and Sledge, G. W., Jr. Taxanes in the treatment of breast cancer: a prodigy comes of age.(see comment). (Review). Cancer Investigation, 17: 121-136, 1999.
19. Marinina, J., Shenderova, A., Mallery, S. R., and Schwendeman, S. P. Stabilization of vinca alkaloids encapsulated in poly(lactide-co-glycolide) microspheres. Pharmaceutical Research, 17: 677-683, 2000.
20. Sachdeva, M. S. Drug targeting systems for cancer chemotherapy. Expert Opin Investig Drugs, 7 (11):1849-1864,1998.
【０３１１】
21. Sapra, P., Moase, E. H., Ma, J., and Allen, T. M. Improved therapeutic responses in a xenograft model of human B lymphoma (Namalwa) for liposomal vincristine versus liposomal doxorubicin targeted via anti-CD19 IgG2a or Fab' fragments. Clinical Cancer Research, 10: 1100-1111, 2004.
22. Mastrobattista, E., Koning, G. A., Storm, G. Immunoliposomes for the targeted delivery of antitumor drugs. Adv Drug Deliv Rev. 40 (1-2):103-127, 1999.
23. Xu, L., Tang, W. H., Huang, C. C., Alexander, W., Xiang, L. M., Pirollo, K. F., Rait, A., and Chang, E. H. Systemic p53 gene therapy of cancer with immunolipoplexes targeted by anti-transferrin receptor scFv. Molecular Medicine, 7: 723-734, 2001.
24. Xu, L., Pirollo, K. F., and Chang, E. H. Tumor-targeted p53-gene therapy enhances the efficacy of conventional chemo/radiotherapy. (Review). Journal of Controlled Release, 74: 115-128, 2001.
25. Xu, L., Huang, C. C., Huang, W., Tang, W. H., Rait, A., Yin, Y. Z., Cruz, I., Xiang, L. M., Pirollo, K. F., and Chang, E. H. Systemic tumor-targeted gene delivery by anti-transferrin receptor scFv-immunoliposomes. Molecular Cancer Therapeutics, 1: 337-346, 2002.
【０３１２】
26. Yu, W., Pirollo, K. F., Yu, B., Rait, A., Xiang, L., Huang, W., Zhou, Q., Ertem, G., and Chang, E. H. Enhanced transfection efficiency of a systemically delivered tumor-targeting immunolipoplex by inclusion of a pH-sensitive histidylated oligolysine peptide. Nucleic Acids Research, 32: e48, 2004.
27. Zignani, M., Drummond, D. C., Meyer, O., Hong, K., and Leroux, J. C. In vitro characterization of a novel polymeric-based pH-sensitive liposome system. Biochimica et Biophysica Acta, 1463: 383-394, 2000.
28. Venugopalan, P., Jain, S., Sankar, S., Singh, P., Rawat, A., and Vyas, S. P. pH-sensitive liposomes: mechanism of triggered release to drug and gene delivery prospects. (Review). Pharmazie, 57: 659-671, 2002.
29. Turk, M. J., Reddy, J. A., Chmielewski, J. A., and Low, P. S. Characterization of a novel pH-sensitive peptide that enhances drug release from folate-targeted liposomes at endosomal pHs. Biochimica et Biophysica Acta, 1559: 56-68, 2002.
30. Mattioli, R., Lippe, P., Massacesi, C., Cappelletti, C., Nacciarriti, D., Bisonni, R., Graziano, F., Menichetti, E. T., Imperatori, L., Testa, E., Laici, G., Balletra, A., Silva, R.R.. Long-survival in responding patients with metastatic breast cancer treated with doxorubicin-docetaxel combination. A multicentre phase II trial. Anticancer Res. 24 (5B):3257-3261, 2004.
【０３１３】
31. Lee, Y.J., Doliny, P., Gomez-Fernandez, C., Powell, J., Reis, I., Hurley, J. Docetaxel and cisplatin as primary chemotherapy for treatment of locally advanced breast cancers. Clin Breast Cancer. 5 (5):371-376, 2004. 
32. Nguyen, M., Tran, C., Barsky, S. et al. Thalidomide and chemotherapy combination: preliminary results of preclinical and clinical studies. Int J Oncol, 10: 965-969, 1997.
33. Heere-Ress, E., Boehm, J., Thallinger, C., Hoeller, C., Wacheck, V., Birner, P., Wolff, K., Pehamberger, H., Jansen, B., Thalidomide enhances the anti-tumor activity of standard chemotherapy in a human melanoma xenotransplantation model. J Invest Dermatol, 125 (2) : 201-206, 2005.
34. Nicholson, D. W., Ali, A., Thornberry, N. A., Vaillancourt, J. P., Ding, C. K., Gallant, M., Gareau, Y., Griffin, P. R., Labelle, M., and Lazebnik, Y. A. Identification and inhibition of the ICE/CED-3 protease necessary for mammalian apoptosis. Nature, 376: 37-43, 1995.
35. Tewari, M., Quan, L. T., O'Rourke, K., Desnoyers, S., Zeng, Z., Beidler, D. R., Poirier, G. G., Salvesen, G. S., and Dixit, V. M. Yama/CPP32 beta, a mammalian homolog of CED-3, is a CrmA-inhibitable protease that cleaves the death substrate poly(ADP-ribose) polymerase. Cell, 81: 801-809, 1995.
36. Fernandes-Alnemri, T., Litwack, G., and Alnemri, E. S. CPP32, a novel human apoptotic protein with homology to Caenorhabditis elegans cell death protein Ced-3 and mammalian interleukin-1 beta-converting enzyme. Journal of Biological Chemistry, 269: 30761-30764, 1994
【０３１４】
追加の引用文献
Felgner, P.L., Tsai Y.J., Sukhu, L., Wheeler, C.J., Manthorpe M., Marshall, J. and Cheng S.H., Ann NY Acad. Sci., 772, 126-139 (1995).
Lewis, J.G., Lin, K.Y., Kothavale, A., Flanagan, W.M., Matteucci, M.D., DePrince, R.B., Mook, R.A., Hendren, R.W., and Wagner, R.W., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 93, 3176-3181 (1996).
Aoki, K., Yoshida, T., Sugimura, T. and Terada, Cancer Res., 55, 3810-3816 (1997).
Clark, P.R., Hersh, E.M., Curr. Opin Mol. Ther, 1, 158-176 (1999). 
Thierry, A.R., Lunardi-Iskandar, Y., Bryant, J.L., Rabinovich, P., Gallo, R.C. and Mahan, L.C., Proc Natl. Acad Sci, 92, 9742-9746 (1997).
The Journal of Gene Medicine Clinical Trials Database, http://www.wiley.co.uk/wileychi/genmed/clinical, Sept, (2001).
Cristiano, R.J. and Curiel, D.T., Cancer Gene Ther, 3(1), 49-57 (1996).
Cheng, P.W., Hum Gene Ther, 7, 275-282 (1996).
Keer, H.N., Kozlowski, J.M. and Tsai, M.C., J. Urol 143, 381-385 (1990).            
Chackal-Roy, M., Niemeyer, C and Moore, M., J. Clin. Invest., 84, 43-50 (1989).
Rossi, M.C. and Zetter, B.R., PNAS, 89, 6197-6201 (1992).
【０３１５】
Grayhack, J.T., Wendel, E.F. and Oliver, L., J. Urol. 121, 295-299 (1979).
Elliott, R.L., Elliott, M.C., Wang, F. and Head, J.F., Ann NY Acad Sci, 698, 159-166 (1993).
Miyamoto, T., Tanaka, N., Eishi, Y. and Amagasa, T., Int. J. Oral Maxillofac Surg 23, 430-433 (1994).
Thorstensen, K. and Romslo, I., Scad J. Clin Lab Invest. Suppl., 215, 113-120 (1993).
Xu, L., Pirollo, K.F. and Chang, E.H., Hum Gen Ther, 8, 467-475 (1997)
Xu, L., Pirollo, K.F., Tang, W-H., Rait, A., and Chang, E.H., Human Gene Therapy, 10, 2941-2952 (1999).
Xu, L., Frederik, P., Pirollo, K.F., Tang, W-H, Rait, A., Xiang, L-M, Huang, W., Cruz, I., Yin, Y. and Chang, E.H., Human Gene Therapy, 13, 1-13 (2002).
Allen, T.M., Hansen, C.B. & Zalipsky, S., Stealth Liposomes, 233-44 (1995).
Allen, T.M., Biochim Biophys Acta, 1237, 99-108 (1995).
Lasic, D.D., Vallner, J.J. and Working, P.K., Current Opinions in Molecular Therapeutics, 1, 177-185 (1999).
Park, J.W., Hong, K., Carter, P., Asgari, H., Guo, L.Y., Keller, G.A., Wirth, C., Shalaby, R., Kotts, C., Wood, W.I., Papahadjopoulos, D and Benz, C.C., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 92, 1327-1331 (1995).
Park, J.W., Kirpotin, D.B., Hong, K., Shalaby, R., Shao, Y., Nielson, U.B., Marks, J.D., Papahadjopoulos, D., Benz, C.C., J. Control Release, 74 (1-3), 95-113 (2001).
【０３１６】
Koning, G.A., Gorter, A., Scherphof, G.L. and Kamps, J.A., British Journal of Cancer, 80, 1718-1725 (1999).
Koning, G.A., Morselt, H.W., Velinova, M.J., Donga, J., Gorter, A., Allen, T.M., Zalipsky, S., Kamps, J.A. and Scherphof, G.L., Biochemica et Biophysica Acta, 1420, 153-167 (1999).
Nam, S.M., Kim, H.S., Ahn, W.S. and Park, Y.S., Oncology Research 11, 9-16 (1999).
Pagnan, G., Montaldo, P.G., Pastorino, F., Raffaghello, L., Kirchmeier, M., Allen, T.M. and Ponzoni, M., International Journal of Cancer, 81, 268-274 (1999).
Ng, K., Zhao, L., Liu, Y and Mahapatro, M., International Journal of Pharmaceutics, 193, 157-166 (2000).
Pirollo, K.F., Xu, L., Chang, E.H., Immunoliposomes: a targeted delivery tool for cancer treatment.  In:  Vector Targeting for Therapeutic Gene Delivery, D. Curiel (Ed.); Wiley Press (2002) In Press
Poon, R.Y., in Biotechnology International: International Developments in the Biotechnology Industry (eds. Fox F and Connor, T.H.) 113-128 (Universal Medical Press, Inc., San Francisco, CA, 1997).
Weinberg, E.D., Biol. Trace Elements Res., 34, 123-140 (1992).
Reviews: p.53.  In:  Oncogene Reviews. Jenkins, J.R., Banks L.M. (Eds), Stockton Press, London (1999): 18, 7617-777.
Sidransky, D., Hollstein, M., Annual Review of Medicine, 1996, 47, 285-301.
Ruley, H.E., In: Important Advances in Oncology 1996. Edited by DeVita, V.T., Hellman, S and S.A. Rosenberg, Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers; 1996: 37-56.
Bristow, R.G., Benchimol, S., Hill, R.P.,: Radiotherapy & Oncology, 40, 1996, 197-223.
【０３１７】
Chiarugi, V., Magnelli, L., Gallo, O., Int. J. Mol. Med., 2, 715-719, 1998.
Volpert, O.V., Dameron, K.M., Bouck, N., Oncogene, 1997, 14, 1495-1502.
Kerr, J.F., Winterford, C.M. and Harmon, B.V., Cancer, 73, 1994, pp. 2013-2026.
Lowe, S.W., Curr. Opin Oncol., 7, 547-553 (1995).
Johnson, P., Gray, D., Mowat, M. and Benchimol, J.S., Mol. Cell Biol., 11, 1-11 (1991).
Yang, C., Cirielli, C., Capogrossi, M.C. and Passaniti, A., Cancer Res., 55, 4210-4213 (1995).
Srivastava, S., Katayose, D., Tong, Y.A., Craig, C.R., McLeod, D.G., Moul, J.W., Cowan, K.H. and Seth, P., Urology, 46, 843-848 (1995).
Pirollo, K.F., Zhengmei, H., Rait, A., Jang, Y.J., Fee, W.E., Ray, P., Chiang, Y. and Chang, E.H., Oncogene, 14, 1735-1746 (1997).
Liu, T.J., Zhang, W.W., Taylor, D.L., Roth, J.A., Goepfert, H. and Clayman, G.L., Cancer Res., 54, 3662-3667 (1994).
Miyashita, T., Krajewski, S., Krajewska, M., Wang, H.G., Lin, H.K., Liebermann, D.A., Hoffman, B. & Reed, J.C., Oncogene, 9(6), 1799-1805 (1994).
【０３１８】
Hamada, K., Alemany, R., Zhang, W.W., Hittelman, W.N., Lotan, R., Roth, J.A. and Mitchell, M.F., Cancer Res., 56 (3), 3047-3054 (1996).
Fujiwara, T., Grimm, E.A., Mukhopadhyay, T., Zhang, W.W., Owen-Schaub, L.B. and Roth, J.A., Cancer Res, 54, 2287-2291 (1994).
Fujiwara, T., Grimm, E.A., Mukhopadhyay, T., Cai, D.W., Owen-Schaub, L.B. and Roth, J.A., Cancer Res, 53, 4129-4133 (1993).
Xu, L., Pirollo, K.F., Rait, A., Murray, A.L. and Chang, D.H., Tumor Targeting, 4, 92-104 (1999).
Xu, L., Pirollo, K.F., Tang, W., Rait, A. and Chang, E.H., Human Gene Therapy, 10, 2941-2952 (1999),
Rait, A., Pirollo, K., Rait, V., Krkygier, J., Xiang, L. and Chang, E.H., Cancer Gene Therapy 8, 728-739 (2001).
Yazdi, P.T., Wenning, L.A. and Murphy, R.M., Cancer Res., 55, 3763-3771 (1995).
Dube'D, Francis, M., Leroux J-C and Winnik, F.M., Bioconjugate Chemistry 10, On line article, 2002.
【０３１９】
本明細書に記載したすべての公開、特許および特許出願は、本発明が属する分野における当業者の技術レベルを示すものであり、各々の公開、特許または特許出願が、特におよび個々に、引用により組み込まれるのと同じ程度に、引用により本明細書の一部とする。
【図１】
2009537526.tif 000011
【図２】
2009537526.tif 000012
【図３】
2009537526.tif 000013
【図４】
2009537526.tif 000014
【図５Ａ】
2009537526.tif 000015
【図５Ｂ】
2009537526.tif 000016
【図６Ａ】
2009537526.tif 000017
【図６Ｂ】
2009537526.tif 000018
【図７Ａ】
2009537526.tif 000019
【図７Ｂ】
2009537526.tif 000020
【図８】
2009537526.tif 000021
【図９】
2009537526.tif 000022
【図１０Ａ】
2009537526.tif 000023
【図１０Ｂ】
2009537526.tif 000024
【図１１】
2009537526.tif 000025
【図１２】
2009537526.tif 000026
【図１３】
2009537526.tif 000027
【図１４】
2009537526.tif 000028
【図１５Ａ】
2009537526.tif 000029
【図１５Ｂ】
2009537526.tif 000030
【図１５Ｃ】
2009537526.tif 000031
【図１５Ｄ】
2009537526.tif 000032
【図１５Ｅ】
2009537526.tif 000033
【図１６Ａ】
2009537526.tif 000034
【図１６Ｂ】
2009537526.tif 000035
【図１６Ｃ】
2009537526.tif 000036
【図１７Ａ】
2009537526.tif 000037
【図１７Ｂ】
2009537526.tif 000038
【図１７Ｃ】
2009537526.tif 000039
【図１８】
2009537526.tif 000040
【図１９Ａ】
2009537526.tif 000041
【図１９Ｂ】
2009537526.tif 000042
【図２０Ａ】
2009537526.tif 000043
【図２０Ｂ】
2009537526.tif 000044
【図２０Ｃ】
2009537526.tif 000045
【図２１Ａ】
2009537526.tif 000046
【図２１Ｂ】
2009537526.tif 000047
【図２１Ｃ】
2009537526.tif 000048
【図２２】
2009537526.tif 000049
【図２３Ａ】
2009537526.tif 000050
【図２３Ｂ】
2009537526.tif 000051
【図２４Ａ】
2009537526.tif 000052
【図２４Ｂ】
2009537526.tif 000053
【図２４Ｃ】
2009537526.tif 000054
【図２５Ａ】
2009537526.tif 000055
【図２５Ｂ】
2009537526.tif 000056
【図２６Ａ】
2009537526.tif 000057
【図２６Ｂ】
2009537526.tif 000058
【図２７Ａ】
2009537526.tif 000059
【図２７Ｂ】
2009537526.tif 000060
【図２８Ａ】
2009537526.tif 000061
【図２８Ｂ】
2009537526.tif 000062
【図２９Ａ】
2009537526.tif 000063
【図２９Ｂ】
2009537526.tif 000064
【図２９Ｃ】
2009537526.tif 000065
【図２９Ｄ】
2009537526.tif 000066
【図３０Ａ】
2009537526.tif 000067
【図３０Ｂ】
2009537526.tif 000068
【図３１】
2009537526.tif 000069
【図３２Ａ】
2009537526.tif 000070
【図３２Ｂ】
2009537526.tif 000071
【図３２Ｃ】
2009537526.tif 000072
【図３３Ａ】
2009537526.tif 000073
【図３３Ｂ】
2009537526.tif 000074
【図３４Ａ】
2009537526.tif 000075
【図３４Ｂ】
2009537526.tif 000076
【図３５】
2009537526.tif 000077
【図３６Ａ】
2009537526.tif 000078
【図３６Ｂ】
2009537526.tif 000079
【図３６Ｃ】
2009537526.tif 000080
【図３７】
2009537526.tif 000081
【図３８Ａ】
2009537526.tif 000082
【図３８Ｂ】
2009537526.tif 000083
【図３９Ａ】
2009537526.tif 000084
【図３９Ｂ】
2009537526.tif 000085
【図４０】
2009537526.tif 000086
【図４１】
2009537526.tif 000087
【図４２Ａ】
2009537526.tif 000088
【図４２Ｂ】
2009537526.tif 000089
【図４２Ｃ】
2009537526.tif 000090
【図４３Ａ】
2009537526.tif 000091
【図４３Ｂ】
2009537526.tif 000092
【図４３Ｃ】
2009537526.tif 000093
【図４４】
2009537526.tif 000094
【図４５Ａ】
2009537526.tif 000095
【図４５Ｂ】
2009537526.tif 000096
【図４５Ｃ】
2009537526.tif 000097
【図４６Ａ】
2009537526.tif 000098
【図４６Ｂ】
2009537526.tif 000099
【図４６Ｃ】
2009537526.tif 000100
【配列表】
2009537526000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成21年1月8日(2009.1.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2009537526000001.app
【国際調査報告】
2009537526.tif 000102
2009537526.tif 000103