(57)【要約】可溶化形態の膜タンパク質を生産するための、インビトロタンパク質合成システム及び方法の提供に関する。幾つかの態様では、本発明はアポリポタンパク質を含むインビトロタンパク質合成システムを使用してタンパク質を合成する方法を提供し、それによりアポリポタンパク質が存在しない場合よりも可溶性タンパク質の収率が向上する。本発明にとり有用なアポリポタンパク質としては、天然のアポリポタンパク質（野生型アポリポタンパク質の変異配列を含む）及び改変アポリポタンパク質が挙げられる。アポリポタンパク質は、脂質と会合した状態又は脂質と会合しない状態で、インビトロタンパク質合成システムに提供することができる。本発明はまた、可溶化形態のタンパク質合成用の組成物及びキットを提供し、当該組成物及びキットはタンパク質翻訳用の細胞抽出物及び１つ以上のアポリポタンパク質生体分子を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜タンパク質の合成方法であって、細胞抽出物及びアポリポタンパク質を含むインビトロタンパク質合成システムに核酸鋳型を添加することと、核酸鋳型とインビトロタンパク質合成システムをインキュベートして、可溶化形態の膜タンパク質を合成することを含む方法。
【請求項２】
前記膜タンパク質が膜貫通タンパク質、膜内在型タンパク質又は膜表在性タンパク質(peripheral membrane protein)である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記膜タンパク質が可溶化形態において合成される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記細胞抽出物が原核細胞の抽出物である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記細胞抽出物が大腸菌の細胞抽出物である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記細胞抽出物が真核生物の細胞抽出物である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記細胞抽出物が小麦麦芽抽出物、ショウジョウバエ胚抽出物、ウサギ網状赤血球抽出物、ホタテ貝抽出物、マウス脳抽出物、ニワトリヒナ脳抽出物又は培養細胞からの抽出物である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記核酸鋳型がＲＮＡ鋳型である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記核酸鋳型がＤＮＡ鋳型である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記アポリポタンパク質がリン脂質−アポリポタンパク質粒子中に存在する、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記アポリポタンパク質が天然のアポリポタンパク質、天然のアポリポタンパク質の変異体又は改変アポリポタンパク質である、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記アポリポタンパク質がアポリポタンパク質Ａ１又はその変異体である、請求項１４記載の方法。
【請求項１３】
前記アポリポタンパク質が１つ以上の両親媒性のヘリックス状ドメインを含む改変アポリポタンパク質である、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記アポリポタンパク質が１つ以上のアミノ酸配列タグを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記１つ以上のアミノ酸配列タグがＨｉｓタグである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
アポリポタンパク質の配列タグを使用して膜タンパク質を精製することを更に含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
細胞抽出物、１つ以上のエネルギー源及び、アポリポタンパク質を含む、インビトロタンパク質合成システム
【請求項１８】
前記細胞抽出物が原核細胞の抽出物である、請求項１７記載のインビトロタンパク質合成システム。
【請求項１９】
前記インビトロ合成システムが大腸菌の細胞抽出物を含む、請求項１７記載のインビトロタンパク質合成システム。
【請求項２０】
前記細胞抽出物が真核生物の抽出物である、請求項１７記載のインビトロタンパク質合成システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は広義にはインビトロタンパク質合成システム、より詳細には膜タンパク質のインビトロ翻訳システムの提供に関する。
【０００２】
本特許出願は、米国仮特許出願６０／７２１３３９号（発明の名称："Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｈａｔ  Ｉｎｃｌｕｄｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ”、２００５年９月２７日出願）、米国仮特許出願６０／７２４２１３号（発明の名称："Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｈａｔ  Ｉｎｃｌｕｄｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ”、２００５年１０月４日出願）、米国仮特許出願６０／８１５７５０号、発明の名称："Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ”、２００６年６月２１日出願）、及び米国仮特許出願６０／８１５６９５号、発明の名称："Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ”、２００６年６月２１日出願）の優先権を主張し、各々の全開示内容を本願明細書に援用する。
【０００３】
配列表
本特許出願はまた、配列表を包含し、その全開示内容を本願明細書に援用する。
【背景技術】
【０００４】
加齢関連の障害、自己免疫疾患及び癌などの医学的症状を治療するためのストラテジーは、タンパク質の機能を解明することに大きく依存している。大多数の薬物標的はタンパク質であり、タンパク質薬物標的の大半が膜タンパク質であると考えられている。タンパク質及び特に膜タンパク質を効率的に合成し、その構造及び機能の解析に十分な量を確保することは、疾患に対処できる新薬の開発にとりきわめて重要である。
【０００５】
インビトロタンパク質合成システムでは、無細胞抽出物中の核酸鋳型からタンパク質を調製でき、タンパク質の効果的な合成及びそれに続く単離が容易になるため、タンパク質のハイスループットな構造・機能解析が可能となり、薬剤の開発及び探索を加速させる効果が期待できる。
【０００６】
残念なことに、全てのタンパク質が、インビトロ合成システムにおいて、可溶性の形態で合成されるわけではない。膜タンパク質は特に、無細胞翻訳システムで調製した場合には不溶性となることが多く、それらの天然の構造及び活性を解析するためには、変性用の界面活性剤中で当該タンパク質を可溶化し、更にタンパク質の再度のフォールディングを試みる必要がある。これらの試みは煩雑であり、また成功しないことが多い。
【０００７】
Ｂａｙｂｕｒｔらは、界面活性剤で可溶化したアポリポタンパク質Ａ１（「Ａｐｏ  Ａ１」）と、リン脂質とを混合したとき、ナノスケールの脂質−タンパク質粒子が即座に形成されることを報告している（非特許文献１）。界面活性剤を透析除去してナノスケールの脂質−タンパク質粒子を得、それを構造解析した結果、Ａｐｏ  Ａ１タンパク質で取り囲まれた脂質二重層が構成されていることが解明された。Ｂａｙｂｕｒｔ及びＳｌｉｇａｒは、界面活性剤の存在下で、脂質−タンパク質粒子を形成する際のＡｐｏ  Ａ１と同様に機能するＡｐｏ  Ａ１（「足場タンパク質」）の合成変異体について記載している（非特許文献２、特許文献１及び２、全開示内容を本願明細書に援用する）。これらの研究者は、他の膜タンパク質を界面活性剤で可溶化した際、同じセルフアセンブリ用の界面活性剤ミックスに存在させ、更に透析した場合にそれらがナノディスクの脂質二重層に組み込まれることを解明している。
【０００８】
しかしながら、可溶化形態の膜タンパク質を調製するこの技術は未だ、セルフアセンブリ用の界面活性剤ミックス中でナノディスク成分と結合させる前に膜タンパク質を精製し、可溶化するための更なる工夫を必要としている。これらの方法では、特定のタンパク質を個々に区別する必要があり、時間を要し、操作が煩雑で、しばしばタンパク質機能に影響を及ぼしうる過激な変性剤の使用が必要となる場合もある。すなわち、膜タンパク質をインビトロシステムで簡便に発現させるための方法を開発し、可溶性の、天然の形態の、又は実質的に精製されたが若しくはより簡便な精製方法を使用して迅速に精製できる形態のタンパク質を調製することに対するニーズが存在する。
【０００９】
【特許文献１】米国特許第７０４８９４９号
【特許文献２】米国特許出願公開第２００５／０１８２２４３号
【非特許文献１】Ｂａｙｂｕｒｔ，Ｔ．Ｈ．，Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｊ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｓｌｉｇａｒ，Ｓ．Ｇ．（１９９８）”Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ａ  Ｎａｎｏｍｅｔｅｒ−Ｓｉｚｅｄ  Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  Ｂｉｌａｙｅｒ．”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２３，３７−４４．
【非特許文献２】Ｃｉｖｊａｎ，Ｎ．Ｒ．，Ｂａｙｂｕｒｔ，Ｔ．Ｈ．，Ｓｃｈｕｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ  Ｓｌｉｇａｒ，Ｓ．Ｇ．（２００３）"Ｄｉｒｅｃｔ  Ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｌｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  Ｎａｎｏｓｃａｌｅ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｌａｙｅｒｓ．”ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３５，５５６−５６３
【発明の開示】
【００１０】
本発明は、アポリポタンパク質（改変アポリポタンパク質及び天然のアポリポタンパク質の変異型を含む）を含んでなる無細胞インビトロ合成システムにおいてタンパク質を合成するための効率的なシステム及び方法の提供に関する。その様々な態様及び実施形態では、本発明は、無細胞システムにおいて可溶化形態の膜タンパク質を合成するための効率的なシステム及び方法の提供に関する。
【００１１】
本発明の一態様は、インビトロで目的タンパク質を合成する方法の提供に関し、当該方法は、アポリポタンパク質を含有するインビトロタンパク質合成システムに当該目的タンパク質をコードする核酸鋳型を添加し、当該インビトロタンパク質合成システムをインキュベートして目的タンパク質を合成することを含んでなる。幾つかの好ましい実施形態では、当該目的タンパク質は可溶化形態において合成される。幾つかの好ましい実施形態では、本発明の方法を用いて翻訳される目的タンパク質は膜タンパク質である。
【００１２】
例えば、本発明の方法で使用するアポリポタンパク質は、いかなるアポリポタンパク質であってもよく、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、アポリポタンパク質Ａ−Ｖ、アポリポタンパク質Ｂ−１００、アポリポタンパク質Ｂ−４８、アポリポタンパク質Ｃ−Ｉ、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩ、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、アポリポタンパク質Ｄ、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｈ、リポタンパク質（ａ）、アポリフォリン（Ａｐｏｌｉｐｈｏｒｉｎ）Ｉ、アポリフォリンＩＩ又はアポリフォリンＩＩＩ、上述したアポリポタンパク質のあらゆる変異体、又は、天然のアポリポタンパク質の１つ以上のドメインの配列若しくはそれらに実質的に相同な配列を使用して改変されるアポリポタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１３】
本発明の幾つかの実施形態は、アポリポタンパク質の少なくとも１５の一連のアミノ酸を有する、７０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアポリポタンパク質変異体又は改変アポリポタンパク質の使用に関し、かかるタンパク質としては、限定されないが、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、アポリポタンパク質Ａ−Ｖ、アポリポタンパク質Ｂ−１００、アポリポタンパク質Ｂ−４８、アポリポタンパク質Ｃ−Ｉ、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩ、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、アポリポタンパク質Ｄ、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｈ、リポタンパク質（ａ）、アポリフォリンＩ、アポリフォリンＩＩ又はアポリフォリンＩＩＩが挙げられる。
【００１４】
本発明の幾つかの実施形態は、アポリポタンパク質の螺旋形ドメインの少なくとも１０の一連のアミノ酸を有する、９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアポリポタンパク質変異体又は改変アポリポタンパク質の使用に関し、かかるタンパク質としては、限定されないが、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、アポリポタンパク質Ａ−Ｖ、アポリポタンパク質Ｂ−１００、アポリポタンパク質Ｂ−４８、アポリポタンパク質Ｃ−Ｉ、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩ、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、アポリポタンパク質Ｄ、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｈ、リポタンパク質（ａ）、アポリフォリンＩ、アポリフォリンＩＩ又はアポリフォリンＩＩＩが挙げられる。
【００１５】
インビトロ合成システムに添加されるアポリポタンパク質は、野生型アポリポタンパク質のアミノ酸配列に対して１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入又は置換を行い、アミノ酸配列を修飾してもよい。インビトロ合成システムに添加されるアポリポタンパク質は、１つ以上の化学的若しくは酵素的修飾を有してもよい。幾つかの実施形態では、インビトロ合成システムに添加されるアポリポタンパク質は、ラベル又はタグを（例えばペプチドタグ）含んでなる。
【００１６】
幾つかの好ましい実施形態では、本発明の方法を用いて翻訳される目的タンパク質は膜タンパク質であり、インビトロタンパク質合成システムをインキュベートすることにより、アポリポタンパク質の非存在下でタンパク質を翻訳する場合よりも多量の目的タンパク質が可溶化形態で合成される。幾つかの好ましい実施形態では、本発明の方法を用いて翻訳される目的タンパク質は膜タンパク質であり、インビトロタンパク質合成システムをインキュベートすることにより、アポリポタンパク質の非存在下で目的タンパク質を翻訳した場合よりも、合成された全ての目的タンパク質に対してより高いパーセンテージで目的の可溶性タンパク質が得られる。
【００１７】
本発明の方法の幾つかの実施形態では、アポリポタンパク質の存在下での目的タンパク質の合成の後、目的タンパク質はアポリポタンパク質と共に会合する。幾つかの実施形態では、アポリポタンパク質の存在下でインビトロ合成した目的タンパク質は、アポリポタンパク質と共単離する。
【００１８】
本発明の方法の幾つかの実施形態では、インビトロタンパク質合成システムで提供されるアポリポタンパク質は、リン脂質−アポリポタンパク質粒子として存在する。本発明の方法の幾つかの実施形態では、インビトロタンパク質合成システムにおけるアポリポタンパク質はリン脂質−アポリポタンパク質粒子として存在し、当該システムで合成される目的タンパク質はリン脂質−アポリポタンパク質粒子と会合する。幾つかの好ましい実施形態では、リン脂質−アポリポタンパク質粒子を含むインビトロ反応において、合成される目的タンパク質は、リン脂質−アポリポタンパク質粒子と共に単離できる。
【００１９】
本発明の幾つかの実施形態では、当該方法は更に、インビトロ合成混合物から目的タンパク質を単離することを含んでなる。当該単離は、例えば、目的タンパク質の一部であるペプチドタグを用いて行ってもよく、又はインビトロタンパク質合成反応において得られるアポリポタンパク質の一部であるペプチドタグを用いて行ってもよい。
【００２０】
別の態様では、本発明は細胞抽出物及びアポリポタンパク質を含んでなるインビトロタンパク質合成システムの提供に関する。タンパク質合成機構の構成要素を含有する細胞抜粋は従来技術において公知で、原核若しくは真核生物細胞由来であってもよい。本発明の方法で使用するアポリポタンパク質はいかなるアポリポタンパク質であってもよく、限定されないが、本明細書に記載のアポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、アポリポタンパク質Ａ−Ｖ、アポリポタンパク質Ｂ−１００、アポリポタンパク質Ｂ−４８、アポリポタンパク質Ｃ−Ｉ、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩ、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、アポリポタンパク質Ｄ、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｈ、リポタンパク質（ａ）、アポリフォリン（Ａｐｏｌｉｐｈｏｒｉｎ）Ｉ、アポリフォリンＩＩ又はアポリフォリンＩＩＩ、上述したアポリポタンパク質のあらゆる変異体、又は、天然のアポリポタンパク質の１つ以上のドメインの配列若しくはそれらに実質的に相同な配列を使用して改変されるアポリポタンパク質が挙げられる。
【００２１】
インビトロ合成システムにおいて得られるアポリポタンパク質は修飾若しくは誘導体化されたアポリポタンパク質であってもよく、当該修飾若しくは誘導体化されたアポリポタンパク質は１つ以上の化学的修飾がなされている。インビトロ合成システムで提供されるアポリポタンパク質はタグ又はラベルを含んでなってもよい。
【００２２】
インビトロタンパク質合成システムは好ましくは、エネルギーをタンパク質合成に提供するための１つ以上の化学エネルギー供給源を含んでなる。当該エネルギー供給源の非限定的な例としては、ヌクレオチド（例えばＡＴＰ又はＧＴＰ）、解糖中間体、リン酸化された化合物及びエネルギーを発生させる酵素）である。本発明のインビトロタンパク質合成システムは更に、遊離アミノ酸、塩、緩衝化合物、酵素、阻害薬又は補因子を含んでなってもよい。
【００２３】
インビトロタンパク質合成システムは、１つ以上の核酸鋳型を更に含んでなってもよい。当該核酸鋳型は、ＤＮＡ鋳型又はＲＮＡ鋳型であってもよく、インビトロ合成しようとするいかなる目的タンパク質をコードしてもよい。インビトロタンパク質合成システムに存在する核酸鋳型は、複数の目的タンパク質をコードしてもよい。例えば、ＩＶＰＳシステムの核酸鋳型は、固体支持体（例えばビーズ、マトリックス、チップ、アレイ、膜、シート、ディッシュ又はプレート）に結合させてもよい。
【００２４】
本発明のインビトロタンパク質合成システムは、１つ以上の界面活性剤又は１つ以上の脂質（例えば１つ以上のリン脂質）を更に含んでなってもよい。幾つかの例示的実施形態では、本発明のインビトロ合成システムは、１つ以上の脂質と会合したアポリポタンパク質を含んでなってもよい。幾つかの例示的実施形態において、本発明のインビトロ合成システムは、リン脂質−アポリポタンパク質粒子中の１つ以上のリン脂質と会合したアポリポタンパク質を含んでなる。これらの実施形態では、好ましくはインビトロ合成システムにおいて合成される目的タンパク質は、リン脂質−アポリポタンパク質粒子と会合体を形成する。好ましい実施形態では、インビトロ合成システムにおいて合成される目的タンパク質は、リン脂質−アポリポタンパク質粒子と共に単離できる。
【００２５】
更に他の態様では、本発明はインビトロでタンパク質を合成方法の提供に関し、詳細には当該方法は、インビトロ合成システムに、アポリポタンパク質をコードする核酸構築物と、目的タンパク質をコードする核酸構築物を添加し、インビトロタンパク質合成システムをインキュベートし、アポリポタンパク質及び目的タンパク質を合成することを含んでなる。幾つかの好ましい実施形態では、当該目的タンパク質は可溶化形態で合成される。幾つかの好ましい実施形態では、当該目的タンパク質は膜タンパク質である。
【００２６】
幾つかの実施形態では、アポリポタンパク質は第１の核酸構築物に提供され、目的タンパク質は第２の核酸構築物に提供される。本発明の本態様の他の実施形態では、アポリポタンパク質をコードする配列及び目的タンパク質をコードする配列は、同じ核酸構築物上に提供される。アポリポタンパク質をコードする配列、及び目的タンパク質をコードする配列を含むＤＮＡ構築物は、２つの遺伝子配列のためのプロモータを別個に有し、及び／又は２つの遺伝子配列との間にＩＲＥＳ配列を有してもよい。
【００２７】
これらの本発明の態様では、アポリポタンパク質をコードする核酸構築物は、いかなるアポリポタンパク質もコードしてもよく、例えば、本願明細書に記載の、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、アポリポタンパク質Ａ−Ｖ、アポリポタンパク質Ｂ−１００、アポリポタンパク質Ｂ−４８、アポリポタンパク質Ｃ−Ｉ、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩ、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、アポリポタンパク質Ｄ、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｈ、リポタンパク質（ａ）、アポリフォリンＩ、アポリフォリンＩＩ若しくはアポリフォリンＩＩＩ、又は、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、アポリポタンパク質Ａ−Ｖ、アポリポタンパク質Ｂ−１００、アポリポタンパク質Ｂ−４８、アポリポタンパク質Ｃ−Ｉ、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩ、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、アポリポタンパク質Ｄ、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｈ、リポタンパク質（ａ）、アポリフォリンＩ、アポリフォリンＩＩ若しくはアポリフォリンＩＩＩの変異体、これらのアポリポタンパク質のあらゆる変異体、又は天然のアポリポタンパク質との実質的な相同性を有する１つ以上のドメインを有する改変アポリポタンパク質が挙げられる。
【００２８】
アポリポタンパク質をコードする当該核酸構築物は、野生型アポリポタンパク質のアミノ酸配列を修飾したアミノ酸配列を有する、アポリポタンパク質をコードしてもよい。幾つかの実施形態では、アポリポタンパク質又はアポリポタンパク質変異体をコードする核酸構築物は、アポリポタンパク質配列に融合するタグ配列をコードする。
【００２９】
幾つかの好ましい実施形態では、本発明の方法を用いて翻訳される目的タンパク質は膜タンパク質であり、インビトロタンパク質合成システムをインキュベートした後で合成される可溶化形態の目的タンパク質の量は、同じ反応でアポリポタンパク質の翻訳の非存在下で翻訳される目的タンパク質の量よりも大きい。幾つかの好ましい実施形態では、本発明の方法を用いて翻訳される目的タンパク質は膜タンパク質であり、インビトロタンパク質合成システムをインキュベートすることにより、同じ反応でアポリポタンパク質の翻訳の非存在下で目的タンパク質を翻訳した場合よりも、目的の可溶性タンパク質が、目的タンパク質の全量に対するパーセンテージが高い状態で合成される。
【００３０】
幾つかの実施形態では、本発明のインビトロタンパク質合成システムは、目的タンパク質をコードする１つ以上の核酸構築物、及び１つ以上の脂質（例えば１つ以上のリン脂質）を含むアポリポタンパク質を含んでなる。幾つかの実施形態では、本発明の方法は可溶化形態の目的タンパク質を合成する方法に関し、当該方法は、１つ以上の脂質を含むインビトロ合成システムに、アポリポタンパク質をコードする核酸構築物及び目的タンパク質をコードする核酸構築物を添加することと、インビトロタンパク質合成システムをインキュベートし、リン脂質−アポリポタンパク質粒子と、当該アポリポタンパク質粒子と会合した目的タンパク質を合成することを含んでなる。これらの方法では、アポリポタンパク質をコードする核酸配列は、目的タンパク質をコードする配列と同じ核酸分子上に存在してもよく、又は、インビトロタンパク質合成反応において合成されるアポリポタンパク質及び目的タンパク質をコードする配列は、別個の核酸分子上に存在してもよい。
【００３１】
これらの本発明の態様の幾つかの実施形態では、当該方法は更に、インビトロ合成混合物から目的タンパク質を単離することを含んでなる。当該単離は、例えばアポリポタンパク質又は目的タンパク質の配列中に組み込んだタグと結合するアフィニティ試薬を用いて実施できる。
【００３２】
更なる態様では、本発明はまた、細胞抽出物、アポリポタンパク質をコードする核酸鋳型、及び目的タンパク質をコードする核酸鋳型を含んでなるインビトロタンパク質合成システムの提供に関する。ある特定の実施形態では、本発明には、細胞抽出物、アポリポタンパク質をコードする第１の核酸分子、及び目的タンパク質をコードする第２の核酸分子を含んでなるインビトロタンパク質合成システムが包含される。他の実施形態では、細胞抽出物、並びにアポリポタンパク質及び目的タンパク質をコードする核酸鋳型を含んでなるインビトロタンパク質合成システムに関する。
【００３３】
本発明のインビトロシステムにおいて、使用する核酸鋳型によってコードされるアポリポタンパク質はいかなるアポリポタンパク質でもよく、本発明の方法で使用するアポリポタンパク質は、いかなるアポリポタンパク質でもよく、限定されないが例えば、本願明細書に記載の、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、アポリポタンパク質Ａ−Ｖ、アポリポタンパク質Ｂ−１００、アポリポタンパク質Ｂ−４８、アポリポタンパク質Ｃ−Ｉ、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩ、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、アポリポタンパク質Ｄ、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｈ、リポタンパク質（ａ）、アポリフォリンＩ、アポリフォリンＩＩ若しくはアポリフォリンＩＩＩ、これらのアポリポタンパク質のあらゆる変異体、又は天然のアポリポタンパク質に対して実質的な相同性を有する１つ以上のドメインを有する改変アポリポタンパク質が挙げられる。
【００３４】
本発明に係る方法及びインビトロ合成システムにおいて使用する核酸構築物によってコードされるアポリポタンパク質配列は、天然又は野生型配列を修飾した配列であってもよく、野生型アポリポタンパク質配列に１つ以上の欠失、変異又は付加を施した配列であってもよい。アポリポタンパク質をコードする構築物はまた、アポリポタンパク質配列とインフレームの形で融合するアミノ酸タグをコードしてもよい。アポリポタンパク質をコードする核酸鋳型は、ＤＮＡ鋳型又はＲＮＡ鋳型であってもよい。アポリポタンパク質をコードする核酸鋳型は、固体支持体（例えばビーズ、マトリックス、チップ、アレイ、膜、シート、ディッシュ又はプレート）と結合していてもよい。
【００３５】
目的タンパク質をコードする核酸鋳型は、ＤＮＡ鋳型又はＲＮＡ鋳型であってもよく、いかなる目的タンパク質をコードしてもよく、限定されないが例えば、酵素、構造蛋白質、輸送タンパク質、ホルモン、成長因子、阻害剤又は活性剤などが挙げられる。幾つかの好ましい実施形態では、本発明の方法を用いて翻訳される目的タンパク質は膜タンパク質である。目的タンパク質をコードする構築物はまた、目的タンパク質の配列とインフレームで融合するアミノ酸タグをコードしてもよい。
【００３６】
本発明のインビトロタンパク質合成システムに存在させる核酸構築物は、複数の目的タンパク質をコードしてもよい。目的タンパク質をコードする核酸鋳型は、固体支持体（例えばビーズ、マトリックス、チップ、アレイ、膜、シート、ディッシュ又はプレート）と結合していてもよい。
【００３７】
本発明のインビトロ合成システムに存在する単一の核酸構築物上に、アポリポタンパク質及び目的タンパク質がコードされてもよい。これらの実施形態では、本発明は細胞抽出物、エネルギー源、アポリポタンパク質をコードする核酸鋳型、アポリポタンパク質及び目的タンパク質をコードする核酸鋳型を含んでなるインビトロタンパク質合成システムの提供に関する。
【００３８】
本発明のインビトロタンパク質合成システムは、１つ以上の化学的エネルギー供給源、遊離アミノ酸、塩、酵素、阻害剤又は補因子を更に含んでなってもよい。本発明のインビトロタンパク質合成システムは更に、１つ以上の界面活性剤又は１つ以上の脂質（例えば１つ以上のリン脂質）を含んでなってもよい。
【００３９】
本発明はまたキット提供に関し、当該キットは、細胞抽出物及び１つ以上のアポリポタンパク質、又はアポリポタンパク質をコードする１つ以上の核酸を含んでなる。当該キットは更に、１つ以上のアミノ酸溶液、１つ以上のバッファ、１つ以上の塩、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上の酵素、１つ以上の阻害剤、１つ以上のエネルギー源、１つ以上の脂質、１つ以上の界面活性剤、１つ以上の核酸ベクター又は１つ以上の核酸構築物のうちの１つ以上を任意に含んでなってもよい。
【００４０】
本発明のキットの一実施形態では、当該キットはインビトロタンパク質合成用に構成され、細胞抽出物及び１つ以上のアポリポタンパク質を含んでなる。当該アポリポタンパク質は細胞抽出物中に存在してもよく、又は固体若しくは溶液として別個に準備してもよい。本発明の多くの別の実施形態は、細胞抽出物及びアポリポタンパク質をコードする１つ以上の核酸構築物の提供に関する。当該核酸構築物はＲＮＡ構築物又はＤＮＡ構築物であってもよく、固体（親油化品など）、又は溶液として準備してもよい。
【００４１】
本発明のキットの別の実施形態では、当該キットはインビトロタンパク質合成用に構成され、細胞抽出物及び１つ以上のリン脂質−アポリポタンパク質粒子組成物を含んでなる。リン脂質−アポリポタンパク質粒子組成物は、細胞抽出物中に存在してもよく、又は別個に準備してもよい。
【００４２】
本願明細書に記載の本発明は、特定の組成物又は工程段階に限定されず、適宜変化させてもよい。本願明細書に記載のセクション見出しは飽くまで便宜上のものに過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【００４３】
発明の詳細な説明
定義
特に定めのない限り、本願明細書において用いられる全ての技術及び科学用語は、本発明に関連する分野の当業者が従来技術において通常理解するのと同じ意味を有する。本願明細書に記載する以下の用語は、本発明では以下のように定義される。単数形「ある〜」、「その〜」などは、前後関係から特に明示されない限り、対象となる物事の複数形を包含する。すなわち、例えば「リガンド」の用語は複数のリガンドを含み、「抗体」の用語は複数の抗体を含む、など。
【００４４】
本発明では、いかなる数値に関連して、用語「約」又は「およそ」をもちいるときは、ある一定の値の±１０％の値を意味するものとする。例えば、「約５０℃」（又は「およそ５０℃」）とは、４５℃〜５５℃の温度範囲（包括的）を包含する。同様に、「約１００ｍＭ」（又は「およそ１００ｍＭ」）とは、９０ｍＭ〜１１０ｍＭの濃度範囲（包括的）を包含する。
【００４５】
用語「インビトロタンパク質合成」（ＩＶＰＳ）、「インビトロ翻訳」、「無細胞翻訳」、「ＲＮＡ鋳型依存性インビトロタンパク質合成」、「ＲＮＡ鋳型依存性無細胞タンパク質合成」及び「無細胞タンパク質合成」は、本願明細書で交換して用いてもよく、あらゆるタンパク質の無細胞合成方法のことを指すものとする。インビトロ転写−翻訳（ＩＶＴＴ）は、ＩＶＰＳの１つの非限定的な例である。
【００４６】
用語「インビトロ転写」（ＩＶＴ）及び「無細胞転写」は本願明細書で交換して用いてもよく、ＲＮＡからタンパク質の合成のない、あらゆるＤＮＡからＲＮＡを無細胞合成する方法のことを指すものとする。好ましいＲＮＡはタンパク質をコードメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。
【００４７】
用語「インビトロ転写−翻訳」（ＩＶＴＴ）、「無細胞転写−翻訳」、「ＤＮＡ鋳型依存性ｖｉｔｒｏタンパク質合成」及び「無細胞のＤＮＡ鋳型依存性タンパク質合成」は本願明細書で交換して用いてもよく、あらゆるＤＮＡからのｍＲＮＡの（転写）、及びｍＲＮＡ（翻訳）からのタンパク質の無細胞合成方法のことを指すものとする。
【００４８】
本明細書中で使用する場合、「遺伝子」という用語は、ポリペプチド、タンパク質又は翻訳されないＲＮＡ（例えばｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）の発現のために必要な情報を含む核酸を意味する。当該遺伝子がタンパク質をコードするとき、プロモータ及び構造遺伝子のオープンリーディングフレーム配列（ＯＲＦ）、並びにタンパク質の発現に関係する他の配列を含んでなる。遺伝子が翻訳されないＲＮＡをコードするとき、プロモータ及び翻訳されないＲＮＡをコードする核酸を含んでなる。
【００４９】
本発明で使用する用語「核酸分子」とは、あらゆる長さの一連の隣接するヌクレオチド（ｒｉｂｏＮＴＰｓ、ｄＮＴＰｓ、ｄｄＮＴＰｓ又はそれらの組み合わせ）を指す。核酸分子は、全長のポリペプチド又はそのあらゆる長さの断片をコードしてもよく、又は非コード配列であってもよい。本発明では、用語「核酸分子」及び「ポリヌクレオチド」を交換して用いてもよく、ＲＮＡ及びＤＮＡが包含されうる。
【００５０】
「制御可能に連結される」とは、対象となる複数の構成要素が、それらの意図された方法で機能することができる関係において並列していることを指す。例えば、制御配列が制御可能な状態でコード配列に連結するとは、制御配列と適合性を有する状態でコード配列の発現がなされる態様で連結していることを指す。
【００５１】
本発明で使用する「ポリペプチド」の用語は、あらゆる長さの一連の隣接するアミノ酸を指す。用語「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「タンパク質」は、用語「ポリペプチド」と交換して本願明細書に用いることができる。
【００５２】
「突然変異」とは、標準的な野生型配列のゲノムにおいて生じる変化のことを指す。突然変異としてはゲノムの位置における核酸配列の欠失、挿入又は再構成が挙げられ、又は「点突発変異」と呼ばれる、ゲノム位置での一塩基置換を指す場合もある。
【００５３】
本明細書で用いられる「置換」とは、１つ以上のアミノ酸又はヌクレオチドの、それぞれ異なるアミノ酸又はヌクレオチドによる置換のことを指す。
【００５４】
本発明で用いるポリペプチド又はタンパク質の「変異体」とは、対象となるポリペプチド又はタンパク質における、１つ以上のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を意味する。好ましくは、ポリペプチドの変異体はポリペプチドの１つ以上の活性を保持する。好ましくは、ポリペプチドの変異体は、少なくとも１５のアミノ酸配列を有する対象となるタンパク質に対して、少なくとも６０％の同一性を有する。好ましくは、ポリペプチドの変異体は、少なくとも１５のアミノ酸配列を有する対象となるタンパク質に対して、少なくとも７０％の同一性を有する。好ましくは、ポリペプチドの変異体は、少なくとも１５のアミノ酸配列を有する対象となるタンパク質に対して、少なくとも８０％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有する。好ましくは、ポリペプチドの変異体は、少なくとも２０アミノ酸配列を有する対象となるタンパク質に対して、少なくとも８０％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有する。変異体は「保守的」な変異を有する場合もあり、その場合には、置換後のアミノ酸が置換前のアミノ酸と同様の構造若しくは化学的特性（例えばイソロイシンによるロイシンの置換）を有することが多い。変異体は、「非保守的」な置換（例えばトリプトファンによるグリシンの置換）である場合もある。類似する変異としては、アミノ酸の欠失、挿入又はその両方が包含される。生物学的若しくは免疫学的活性を損なうことなく、いずれのアミノ酸残基を置換、挿入、欠失させるかを決定するためのガイドラインとしては、公知技術のコンピュータプログラム（例えばＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア）を使用して検出することができる。
【００５５】
「保存的アミノ酸置換」とは、元のタンパク質の特性を損なうことの非常に少ない置換のことを指し、すなわち、タンパク質の構造及び特に機能が維持され、かかる置換により顕著な変化を受けないことを指す。保守的なアミノ酸置換では通常、（ａ）置換領域におけるポリペプチド骨格の構造（例えばβシート又はαヘリックス構造）、（ｂ）置換部位における分子の荷電又は疎水性、及び／又は（ｃ）側鎖のかさ（バルク）などが維持される。保守的置換としては、例えば負に荷電するアミノ酸の、別の１アミノ酸による置換（負荷電アミノ酸としてはアスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる）、正に荷電するアミノ酸の、別の１アミノ酸による置換（正荷電アミノ酸としてはリシン及びアルギニンが挙げられる）、及び同様の親水性値を有する非荷電の極性基を有するアミノ酸による置換、（同様の疎水性を有するアミノ酸の第１の群としては、ロイシン、イソロイシン及びバリンの群、他の群としてはグリシン及びアラニンの群、第３の群としてはアスパラギン及びグルタミンの群、第４の群としてはセリン及びトレオニンの群、及び第５の群としてはフェニルアラニン及びチロシンの群を挙げることができる）。
【００５６】
「欠失」とは、１つ以上のアミノ酸残基又はヌクレオチドが失われる結果となる、アミノ酸又はヌクレオチド配列の変異のことを指す。
【００５７】
「誘導体」という用語は、化学修飾を施したポリヌクレオチド又はポリペプチドのことを指す。ポリヌクレオチドの化学的処理としては、例えばアルキル基、アシル基、ヒドロキシル基又はアミノ基による水素の置換が挙げられる。誘導体ポリヌクレオチドは、天然分子の１つ以上の生物学的若しくは免疫学的機能を保持するポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドはグリコシル化、ＰＥＧ化、ビオチン化、又は得られるポリペプチドの１つ以上の生物学的若しくは免疫学的機能が保持されるあらゆる同様の方法によって修飾してもよい。
【００５８】
ポリペプチド配列に適用されるにつれて、用語「％同一性」とは、標準化されたアルゴリズムを使用して、少なくとも２つのポリペプチド配列アラインメント間の、マッチする残基のパーセンテージのことを指す。ポリペプチド配列のアラインメント方法は公知である。幾つかのアラインメント方法は、保存的アミノ酸置換に基づく。かかる保守的な置換（上記で更に詳細に説明）では通常、置換部位における荷電及び疎水性が維持されるため、ポリペプチドの構造（すなわち機能）が維持される。％アイデンティティは、例えば特定の配列番号で定義されるような全ての定義済みのポリペプチド配列にわたり測定する場合もあり、又はより短い配列長にわたり測定する場合もある。例えば、長い配列長の定義済みのポリペプチド配列から取り出される断片長としては、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７０又は少なくとも１５０の隣接残基によるフラグメントが挙げられる。かかる長さは典型的なものであり、本願明細書（表、図又は配列表）に示される配列でサポートされるいかなる断片長を用いて、％アイデンティティを測定してもよいと理解される。
【００５９】
ポリペプチド配列間の％アイデンティティは、ＭＥＧＡＬＩＧＮ版３．１２ｅ配列アラインメントプログラム（本発明に記載、上記）に組み込まれているような、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｖアルゴリズムのデフォルトパラメータを使用して算出できる。ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｖを使用したポリペプチド配列のペアワイズ配列用のデフォルトパラメータは、以下の通りに設定されている：
Ｋｔｕｐｌｅ＝１、
ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ＝３、
ｗｉｎｄｏｗ＝５、及び
“ｄｉａｇｏｎａｌｓ  ｓａｖｅｄ”＝５。
ＰＡＭ２５０マトリックスがデフォルトの残基重量テーブルとして選択される。ポリヌクレオチド配列と同様に、％アイデンティティでは、アラインメントされたポリペプチド配列対間の「パーセント類似性」として、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｖにより出力される。
【００６０】
あるいは、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴソフトウェアセットを用いてもよい。例えば、２つのポリペプチド配列のペアワイズ比較を行う場合、「ＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツール、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０．１２（２０００年４月２１日）又は後のバージョンＶｅｒｓｉｏｎ  ２．２．１２（２００５年８月２８日リリース）、２．２．１３（２００５年１２月６日リリース）、又は２．２．１４（２００６年５月７日リリース）を用い、デフォルトパラメータをｂｌａｓｔｐでセットアップして行う。かかるデフォルトパラメータとしては、例えば：
Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ６２、
Ｏｐｅｎ  Ｇａｐ：１１、及び
Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｇａｐ：１  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ、
Ｇａｐ  ｘ  ｄｒｏｐ−ｏｆｆ  ５０、
Ｅｘｐｅｃｔ：１０、
Ｗｏｒｄ  Ｓｉｚｅ：３、
Ｆｉｌｔｅｒ：ｏｎが挙げられる。
【００６１】
「実質的に精製された」とは、ある物質種又は活性が支配的な物質種又は活性である状態（例えば、組成物の他のいかなる個々の種又は活性よりもモルベースで豊富である）のことを指し、好ましくは、実質的に精製されたフラクションとは、その物質種又は活性が、全ての高分子又は活性に対して少なくとも約５０％（モル、重量又は活性ベース）含有する組成物のことを指す。通常、実質的に純粋な組成物とは、全ての高分子種又は活性に対して約８０％以上、好ましくは約８５％以上、９０％以上又は９５％以上存在する組成物のことを指す。
【００６２】
「検出可能的に標識された」「標識された」の用語は本願明細書では交換して使用してもよく、分子（例えば核酸分子、タンパク質、ヌクレオチド、アミノ酸など）が、他の部分、又は様々な検出手段（例えば測定装置、目視、写真撮影、Ｘ線撮影など）により検出可能なシグナルを発生させる分子を付与されている状態のことを指すものとする。かかる場合、共有結合若しくはイオン結合、凝集、アフィニティカップリング（例えば一次及び／又は二次抗体（片方又は両方のいずれかが検出可能な標識を有する）の使用を含む）などの様々な公知の方法によって、シグナル（「ラベル」又は「検出可能なラベル」）を発する分子又は部分を、当該分子に付与する（又は「標識する」）ことができる。本発明に係る標識された、若しくは検出可能に標識された分子の調製に用いられる適切な検出可能なラベルとしては、例えば重同位元素ラベル、重原子ラベル、放射性同位元素ラベル、蛍光ラベル、化学発光ラベル、生物発光ラベル及び酵素ラベル及び他の当業者に公知のものが挙げられる。
【００６３】
本明細書で用いられる「標識」という用語は、（例えばそのスペクトル特性、形態又は活性に基づき）直接若しくは間接的に検出可能な化学基又はタンパク質を意味し、目標又は化合物に結合させて本発明の方法で使用する。当該標識は、直接検出可能（フルオロフォア）であってもよく、間接的に検出可能（ハプテン又は酵素）であってもよい。かかる標識としては、限定されないが、放射線計数装置で測定できる識別用放射性同位元素、分光光度計で視覚的に観察若しくは測定できる色素、染料又は他のクロモゲン、スピンラベルアナライザで測定できるスピンラベル、例えば、Ｘ線結晶構造解析及びＮＭＲにおいて使用される重原子標識、例えば質量解析において使用される重同位元素標識、及び蛍光標識（フルオロフォア）（出力シグナルは、適切な分子アダクトの励起によって発生させることができ、光を色素に吸収させて励起させることによって視覚化でき、又は、例えば標準的な蛍光測定器又は画像処理システムで正確に測定できる）などが挙げられる。当該標識は、化学発光物質（出力シグナルがシグナル化合物の化学的処理によって発生する）、金属含有物質、又は酵素（酵素依存的な二次的なシグナルが発生（例えば無色の基質からの着色生成物の形成）。本発明の用語「標識」には、特別な場合として、天然のアミノ酸（例えばわずかに蛍光性を有する（例えばトリプトファン）か又はＵＶ吸収性のアミノ酸）が包含される。但しかかるアミノ酸は通常、用語「標識」又は「検出可能な標識」に包含されない。用語「標識」にはまた、共役分子と選択的に結合できる「タグ」又はハプテンのことを指す場合もあり、当該共役分子を用いることにより、それを基質の後で添加した場合に、検出可能なシグナルが生成される。例えば、タグとしてビオチンを使用し、更にアビディン又はストレプトアビジンのセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とのコンジュゲートを使用して当該タグと結合させ、更に比色基質（例えばテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ））又は蛍光発生基質（例えばＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ試薬、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社）を用いてＨＲＰの存在を検出することができる。多数の標識が当業者に公知であり、上記「ＲＩＣＨＡＲＤ  Ｐ．ＨＡＵＧＬＡＮＤ（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＢＥＳ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ  ＰＲＯＢＥＳ  ＡＮＤ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ）」（第９版、ＣＤ−ＲＯＭ、２００２年９月）に記載の粒子、フルオロフォア、ハプテン、酵素及びそれらの比色気質、蛍光基質及び化学発光基質、並びにその他の標識が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
「タグ」又は「アミノ酸配列タグ」は、アフィニティ試薬に特異的に結合できる一連のアミノ酸である。タンパク質を捕捉するために組み込むことができるタグ、又はアフィニティ試薬を使用したタンパク質検出の例としては、ヒスチジン多量体（４以上、通常は６）、ＦＬＡＧタグ、ヘマグルチニンタグ、ｍｙｃタグ、グルタチオン−Ｓ−転移酵素、マルトース結合タンパク質、カルモジュリン、キチン質結合タンパク質などのタグが挙げられるが、これらに限定されない。他のアミノ酸配列タグとしてはテトラシステイン含有ｌｕｍｉｏタグが挙げられ、四ヒ素若しくは二ヒ素含有試薬を使用したタンパク質の精製又は検出に使用できる（米国特許第６０５４２７１号、第６００８３７８号、第５９３２４７４号、第６４５１５６９号、国際公開第９９／２１０１３号（参照によって本発明に援用））。
【００６５】
「固体支持体」とは、分子、化合物、細胞又は他の物質と結合するための表面を有する固体材料のことを指す。固体支持体は表面を含むチップ又はアレイであってもよく、例えばガラス、シリコン、ナイロン、ポリマー、プラスチック、セラミック又は金属などが挙げられる。固体支持体は膜（例えばナイロン、ニトロセルロース又はポリマーの膜）又はプレート若しくはディッシュであってもよく、例えばガラス、セラミック、金属又はプラスチックから構成されてもよく、例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート又はポリアロマー製の９６ウェルプレートが挙げられる。固体支持体はビーズ又はいかなる形状の粒子であってもよく、好ましくは球形若しくは球形に近い形態であり、好ましくは当該ビーズ又は粒子は１ｍｍ以下の、好ましくは、０．１〜１００μの直径又は最大幅を有する。かかる粒子又はビーズは、いかなる適切な材料（例えばガラス又はセラミック）、及び／又は１つ以上のポリマー（例えばナイロン、ポリテトラフルオロエチレン、ＴＥＦＬＯＮ（商標）、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、セファロース、アガロース、セルロース、セルロース誘導体又はデキストランなど）、及び／又は金属（特に常磁性金属、例えば鉄）を含んでなってもよい。
【００６６】
本発明では、「会合する」の用語は、直接又は間接的に結合することを意味する。第２の生体分子と会合する第１の生体分子は、１つ以上の捕捉分離方法を使用して、第２の生体分子の結合又は可動性特性に基づき、第２の生体分子と共単離することができる。
【００６７】
「リン脂質−アポリポタンパク質粒子」とは分子複合体の一種であり、１つ以上のアポリポタンパク質及び１つ以上のリン脂質（リン脂質が二重層に配置される）を含んでなり、通常ｎｍ単位（例えば直径約１ｎｍ〜約９９５ｎｍ、より典型的には直径約２〜約７００ｎｍ、又は直径約４〜約６００ｎｍの円板状の形状で存在する。天然及び合成リン脂質−アポリポタンパク質粒子は、例えばＰｏｗｎａｌｌら、（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １７：１１８３−１１８８、Ｐｏｗｎａｌｌら、（１９８１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０：６６３０−６６３５、Ｊｏｎａｓら、（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３６９−６３７５、Ｊｏｎａｓら、（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：４８１８−４８２４、Ｊｏｎａｓら、（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１５９６−１６０２、Ｌｅｒｏｙら、（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：４７９８−４８０５、Ｔｒｉｃｅｒｒｉら、（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：１４６８２−１４６９１、Ｓｅｇａｌｌら、（２００２）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４３：１６８８−１７００、Ｍａｎｃｈｅｋａｒら、（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：３９７５７−３９７６６、Ｐｅａｒｓｏｎら、（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：３８５７６−３８５８２に記載されている。
【００６８】
組換え核酸技術の分野において使用する他の用語、及び本明細書で用いられる分子及び細胞生物学用語は、通常その技術分野の当業者にとり公知若しくは自明である。
【００６９】
ＩＶＰＳシステム
本発明は公知技術のインビトロタンパク質合成システムを使用するが、原核若しくは真核生物細胞の細胞抽出物を含んでなってもよい。当該細胞抽出物は、１つ以上の遺伝子（例えばヌクレアーゼをコードする遺伝子又はプロテアーゼをコードする遺伝子）を変異させた細胞に由来してもよく、又は１つ以上の内在性若しくは外来遺伝子（例えばｔＲＮＡ、ポリメラーゼ、酵素阻害物質などをコードする遺伝子）を発現又は過剰発現させるように改変させた細胞に由来してもよい。細胞抽出物には鋳型の分解を防止できるタンパク質又は他の分子を補充し、転写又は翻訳などを強化してもよい。
【００７０】
本発明の方法及び組成物に使用できるインビトロタンパク質合成（ＩＶＰＳ）システムの非限定的な例としては、例えば以下の文献に記載のものが挙げられるが、これらに限定されない。米国特許第５４７８７３０号、Ａｌａｋｈｏｖら、発明の名称"Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ”、米国特許第５６６５５６３号、第５４９２８１７号及び第５３２４６３７号、Ｂｅｃｋｌｅｒら、発明の名称"Ｃｏｕｐｌｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｅｘｔｒａｃｔ”、米国特許第６３３７１９１号、Ｓｗａｒｔｚら、発明の名称"Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ  ａｓ  ａｎ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｓｏｕｒｃｅ”、米国特許第６５１８０５８号、Ｂｉｒｙｕｋｏｖら、発明の名称"Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｄｅｖｉｃｅ  ｆｏｒ  ｉｔｓ  ｒｅａｌｉｚａｔｉｏｎ”、米国特許第６６７０１７３号、Ｓｃｈｅｌｓら、発明の名称"Ｂｉｏｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｏｄｕｌｅ  ｆｏｒ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ”、米国特許第６７８３９５７号、Ｂｉｒｙｕｋｏｖら、発明の名称"Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ”、米国特許出願公開第２００２／０１６８７０６号、Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、２００２年１１月１４日公開、発明の名称"Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  インビトロ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ”、米国特許第６１６８９３１号、Ｓｗａｒｔｚら、２００２年１月８日登録、発明の名称"Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｕｓｉｎｇ  ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ＡＴＰ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ”、米国特許第６５４８２７６号、Ｓｗａｒｔｚら、２００３年４月１５日登録、発明の名称"Ｅｎｈａｎｃｅｄ  インビトロ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄｓ”、米国特許出願公開第２００４／０１１０１３５号、Ｎｅｍｅｔｚら、２００４年６月１０日公開、発明の名称"Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｌｉｎｅａｒ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  インビトロ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ”、米国特許出願公開第２００４／０２０９３２１号、Ｓｗａｒｔｚら、２００４年１０月２１日公開、発明の名称"Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  インビトロ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”、米国特許出願公開第２００４／０２１４２９２号、Ｍｏｔｏｄａら、２００４年１０月２８日公開、発明の名称"Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ��ｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ”、米国特許出願公開第２００４／０２５９０８１号、Ｗａｔｚｅｌｅら、２００４年１２月２３日公開、発明の名称"Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｔａｒｔｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｌｉｎｅａｒ  ｓｈｏｒｔ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  インビトロ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｗｉｔｈ  ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｌｙｓａｔｅｓ  ｏｒ  ｉｎ  ａ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ”、米国特許出願公開第２００５／０００９０１３号（２００５年１月１３日公開）、及び第２００５／００３２０７８号（２００５年２月１０日）、いずれもＲｏｔｈｓｃｈｉｌｄら、発明の名称"Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ”、米国特許出願公開第２００５／００３２０８６号、Ｓａｋａｎｙａｎら、２００５年２月１０日公開、発明の名称"Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”、国際公開第００／５５３５３号、Ｓｗａｒｔｚら、２０００年３月１５日公開、発明の名称"Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｕｓｉｎｇ  ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ＡＴＰ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ”。これらの特許及び特許出願の全てを本願明細書に援用する。
【００７１】
細胞抽出物の調製は、精製されたｍＲＮＡ転写産物からの、又はインビトロ合成反応の間、ＤＮＡから転写されるｍＲＮＡからのインビトロでタンパク質の合成の基礎となるものであり、それはまた公知である。解析対象のタンパク質を合成するため、翻訳抽出物は、解析対象の遺伝子及びタンパク質に対応するｍＲＮＡによって「プログラム」されることとなる。ｍＲＮＡはＤＮＡから調製してもよく、又は精製された形のｍＲＮＡを外因的に添加してもよい。ＲＮＡは、インビトロ反応において、ＲＮＡポリメラーゼを用いて、クローニングされたＤＮＡから合成して調製することができる。
【００７２】
原核細胞及び真核生物細胞を用いて、本発明のタンパク質及び／又は核酸合成できる（Ｐｅｌｈａｍら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６７：２４７，１９７６）。原核細胞系のシステムを用いて、同時若しくは「カップル」において転写及び翻訳を実施できる。ＩＶＴＴに使用する細胞抽出物は、単一システムにおける転写（ｍＲＮＡを生産）及び翻訳（タンパク質を合成）に必要な成分を含有する。かかるシステムでは、添加する鋳型核酸分子はＤＮＡである。
【００７３】
本願明細書に記載する実施例に示すように、本発明の方法で使用する無細胞抽出液は原核若しくは真核生物の抽出物が使用できる。真核生物のインビトロタンパク質合成（ＩＶＰＳ）抽出物としては、限定されないが、ウサギ網状赤血球溶解物、小麦麦芽溶解物、ショウジョウバエ胚抽出物、ホタテガイ溶解物（Ｓｔｏｒｃｈら、Ｊ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｂ，１７３：６１１−６２０，２００３）、マウス脳（Ｃａｍｐａｇｎｏｎｉら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２８：５８９−  ５９６，１９７７、  Ｇｉｌｂｅｒｔら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２３：８１１−８１８，１９７４）からの抽出物、並びにニワトリのひなの脳（Ｌｉｕら、Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  Ｓｔａｔｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌｕｍｅ  ６８，１９７５）などが挙げられる。ＩＶＰＳ用の真核生物抽出物は、培養細胞からの抽出物であってもよい。培養細胞はいかなるタイプであってもよい。非限定的な例として、ＨｅＬａ又はＣＨＯ細胞抽出物を用いて、インビトロ翻訳システムを実施してもよい。
【００７４】
真核生物抽出物（任意に酵素、基質及び／又は補因子を添加する）を用いて、翻訳後修飾を有するタンパク質として翻訳産物を調製してもよい。翻訳後修飾のための酵素、基質及び／又は補因子を、ＩＶＰＳ用の原核抽出物に添加してもよい。界面活性剤を使用して無細胞抽出液を調製してもよく、溶解物を遠心分離する前に細胞又は細胞可溶化物（米国特許出願公開第２００６／０１１０７８８号（出願番号：１１／２４０，６５１号）に記載、本願明細書に全開示内容を援用する）に添加してもよく、又はインビトロタンパク質合成システム用の組成物中に添加してもよい。例えば、ＣＭＣ濃度か、あるいはそれをわずかに越える濃度で非イオン性又は双性イオン性の界面活性剤を用い、翻訳抽出物の調製を実施することができる。
【００７５】
原核抽出物はいかなる原核細胞であってもよく、グラム陰性及びグラム陽性の細菌であってもよく、限定されないが、エシェリチア属（例えば大腸菌）、クレブシエラ属、ストレプトマイセス属、ストレプトコッカス属、シゲリア属、スタフィロコッカス属、エルウィニア属、クレブシエラ属、バチルス属（例えばＢ．セレウス、Ｂ．ズブティリス及びＢ．メガテリウム）、セラチア属、シュードモナス属（例えばＰ．アエルギノザ及びＰ．シリンガエ）、サルモネラ属（例えばＳ．チフィ及びＳ．チフムリウム）及びロドバクター属などが挙げられる。本発明に適する細菌株及びセロタイプは、大腸菌セロタイプＫ、Ｂ、Ｃ及びＷなどが挙げられる。典型的な原核細胞抽出物は、大腸菌Ｋ−１２株から調製される。細胞抽出物を変異細菌株から調製してもよく、それによりヌクレアーゼ又はプロテアーゼ活性を欠如させることができ、又は精製又は翻訳タンパク質の検出を妨げうる１つ以上のタンパク質の活性を欠如させることができる（本願明細書に全開示内容を援用する米国特許公開第２００５／０１３６４４９号を参照）。
【００７６】
ＩＶＰＳシステムにより、多重化構成（例えばアレイフォーマット）において様々なタンパク質を同時及び迅速に発現させることができ、また多数のタンパク質のスクリーニングにも使用できる。ＤＮＡ鋳型を使用するＩＶＴＴシステムでは、別個にＲＮＡ転写産物を合成し、その後精製する必要がないため、これらのフォーマットの効率が向上する。更に、様々な非天然アミノ酸を用いて、ＩＶＰＳシステムを使用して合成しようとする具体的なタンパク質にそれらを能率的に組み込むこともできる（例えば、Ｎｏｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１８２−１８８、１９８９を参照）
【００７７】
特定の態様では、細胞抽出物又はその抽出物を使用するＩＶＰＳシステムは更に、米国特許出願公開第２００２／０１６８７０６号（全開示内容を本願明細書に援用する）基際の成分のうちのいずれか１つ以上を含んでなる。例えば、当該細胞抽出物は、１つ以上の酵素（例えばヌクレアーゼ、ホスファターゼ及びポリメラーゼからなる群から選択される酵素）の阻害剤の１つ（任意に、当該抽出物は１つ以上の酵素（例えばヌクレアーゼ、ホスファターゼ及びポリメラーゼからなる群から選択される酵素）の活性を減少させるために、天然若しくは野生型の抽出物を修飾してもよい）、及びタンパク質及び／又は核酸合成に対してエネルギーを供給する少なくとも２つのエネルギー源を含有してもよい。特定の態様では、当該抽出物はＧａｍタンパク質を含有する。
【００７８】
翻訳後修飾用の酵素、基質及び／又は補因子は、ＩＶＰＳ用の原核若しくは真核生物抽出物に任意に添加してもよく、又は真核生物細胞抽出物中に元々存在してもよい。
【００７９】
ＩＶＰＳは通常、細胞抽出物に加えて、１つ以上のアミノ酸を含んでなる。ＩＶＰＳは通常、細胞抽出物、１つ以上のアミノ酸及び翻訳をサポートする１つ以上のエネルギー源を含んでなる。インビトロ翻訳システムが転写／翻訳システムである場合、更にポリメラーゼを添加するこが好ましい。インビトロ翻訳システムが転写／翻訳システムである場合、更にポリメラーゼを添加するこが好ましい。インビトロタンパク質合成システムは、それらの製造及び使用方法を含め、公知である。例示的実施形態では、最低２つのアミノ酸及び翻訳のためのエネルギーを提供する１つ以上の化合物を細胞抽出物に添加し、ＩＶＰＳシステムを構成する。幾つかの例示的実施形態では、ＩＶＰＳは、細胞抽出物、２０の天然アミノ酸及びエネルギーを翻訳に提供する１つ以上の化合物を含んでなる。幾つかの好ましい実施形態では、ＩＶＰＳは、翻訳のためのエネルギー源として機能する少なくとも２つの化合物（少なくとも１つが解糖中間体であってもよい）を含む。ＩＶＰＳシステムに提供される少なくとも１つのアミノ酸を任意に標識してもよく、例えば１つ以上のアミノ酸を放射性同位元素で標識し、当該識別アミノ酸を組み込んで翻訳産物としてのタンパク質を検出してもよい。幾つかの実施形態では、１つ以上の追加的なエネルギー源及び追加的なアミノ酸を含む供給溶液を、ＩＶＰＳの第１のインキュベーションの後に添加する。ＩＶＰＳシステム及びそれらの使用法の供給用液は、米国特許出願公開第２００６／０１１０７８８号（本願明細書に援用）に記載されている。
【００８０】
ＩＶＰＳシステム及び他の関連の実施態様に関する幾つかの例として、以下のものが挙げられる：米国特許出願公開第２００２／０１６８７０６号，”Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ”（出願日：２００２年３月７日）、米国特許出願公開第２００５／０１３６４４９号、”Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ，Ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ，ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”（出願日：２００４年１０月１日）、米国特許出願公開第２００６／００８４１３６号、”Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（出願日：２００５年７月１４日）、米国特許出願公開第２００６／０１１０７８８号、”Ｆｅｅｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒｓ，Ｓｙｓｔｅｍｓ，ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（出願日：２００５年１０月１日）、米国特許出願公開第２００６／０１１０７８８号、”Ｆｅｅｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒｓ，Ｓｙｓｔｅｍｓ，ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（出願日：２００５年１０月１日）、及び米国特許出願公開第２００６／０２１１０８３号（出願日：２００６年１月２０日）"Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”（以上の特許出願の全開示内容を本願明細書に援用する）。
【００８１】
幾つかの実施形態では、本発明はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＥＸＰＲＥＳＳＷＡＹ（商標）  インビトロ翻訳システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、ＣＡ）を用い、無細胞Ｓ３０抽出物及び翻訳バッファを含んでなることを特徴とする。当該Ｓ３０抽出物は、完全な細胞から抽出した開始、伸長及び終結因子、リボソーム及びｔＲＮＡなどの、多くの可溶性の翻訳構成要素を含有する。翻訳バッファは、アミノ酸、エネルギー源（例えばＡＴＰ及びＧＴＰ）、ホスホエノールピルビン酸／ピルビン酸キナーゼ、アセチルリン酸／酢酸キナーゼ又はクレアチンリン酸／クレアチンキナーゼなどのエネルギー再生成分及び他の様々な重要なコファクタを含有する（Ｚｕｂａｙ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．７：２６７−８７，１９７３、  Ｐｅｌｈａｍ  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：２４７，１９７６、  ａｎｄ  Ｅｒｉｃｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ｂｌｏｂｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．９６、３８−５０，１９８３）。反応バッファ、メチオニン、Ｔ７酵素Ｍｉｘ及び目的のＤＮＡ鋳型（制御可能な状態でＴ７プロモータに結合）を、大腸菌抽出物と混合する。ＤＮＡ鋳型の転写終了後、ｍＲＮＡの５’末端がリボソームと結合し、翻訳が開始されコードされたタンパク質が合成される。
【００８２】
アポリポタンパク質
本発明は、１つ以上のアポリポタンパク質をインビトロタンパク質合成システム中に存在させることを特徴とする方法及び組成物に関する。アポリポタンパク質は、ＰＯＩをコードする鋳型を添加するときに細胞抽出物に存在させてもよく、又は合成反応の間に添加してもよく、又はアポリポタンパク質はＩＶＰＳシステムに添加した核酸構築物から翻訳されてもよい。
【００８３】
アポリポタンパク質とは、動物の循環系において、脂質を結合させて輸送する機能を有するタンパク質である。種間の配列ホモロジー解析、並びに構造解析及び予測の結果、アポリポタンパク質は同様の構造（幾つかの両親媒性のヘリックス）を共有することが示されている。したがって、本願明細書に提供される変異体アポリポタンパク質又は改変アポリポタンパク質は通常、１つ、あるいは少なくとも２、３、４又はそれ以上の両親媒性のヘリックスを有し、通常は野生型アポリポタンパク質の両親媒性ヘリックスの配列、又はその保守的なアミノ酸置換を含んでなる。更にまた、本発明の方法及び組成物に使用する変異体又は改変アポリポタンパク質は通常、脂質と結合する能力を保持している。
【００８４】
本発明では、用語「アポリポタンパク質」は広義には、脂質と結合するタンパク質を指すのに用いられ、そのフリーの形態、及び脂質と結合した形態の両方においても水溶性を有する。本発明のアポリポタンパク質は１つ以上のヘリックス状ドメインを有し、好ましくは両親媒性ヘリックスを形成するか、又は形成すると予測される。本発明の方法及び組成物で使用するアポリポタンパク質は、好ましくは天然のアポリポタンパク質であってもよく（後述するように、いかなる種起源の、天然のアポリポタンパク質の配列変異体であってもよい）、又は、天然のアポリポタンパク質の１つ以上のヘリックス状ドメインと少なくとも９０％のホモロジーを有する１つ以上のヘリックス状ドメインを有する改変タンパク質であってもよい。本発明の方法及び組成物で使用するアポリポタンパク質は、インビトロタンパク質合成システム（インビトロ翻訳システム）に存在させた場合、可溶性膜タンパク質の収率を少なくとも１０％上昇させる特性を有し、可溶性タンパクの収量（率）は、全合成タンパク質に対する、可溶性タンパク質の合成量、又は可溶性タンパク質のパーセンテージとして算出する。
【００８５】
本発明の方法及び組成物で使用するアポリポタンパク質にはアポリポタンパク質変異体が包含され、少なくとも１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０又は２００の隣接するアミノ酸を有し、あらゆる種の野生型アポリポタンパク質に対して少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８又は９９％の配列同一性を有するタンパク質が包含され、当該変異体をＩＶＰＳシステム中に存在させた場合、ＩＶＰＳシステムで発現される１つ以上のタンパク質の可溶性が少なくとも１０％増加する。特定の態様では、ＩＶＰＳシステムで調製した可溶性タンパク質は、アポリポタンパク質又はその変異体の非存在下でＩＶＰＳシステムにおいて調製した同じタンパク質と比較し、少なくとも１５％、２０％又は２５％増加するか、又は検出可能な態様で増加する。アポリポタンパク質変異体は、天然のアポリポタンパク質に対して１つ以上の配列の欠失又は挿入を有してもよい。非限定的な例として、幾つかのアポリポタンパク質変異体にタグ配列を添加してもよく、あるいは非ヘリックス状ドメインを欠失させてもよい。
【００８６】
特定の態様における変異体アポリポタンパク質は、野生型哺乳類のアポリポタンパク質（特にアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（Ａｐｏ  Ａ−Ｉ）、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ（Ａｐｏ  Ａ−ＩＩ）、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ（Ａｐｏ  Ａ−ＩＶ）、アポリポタンパク質Ａ−Ｖ（Ａｐｏ  Ａ−Ｖ）、アポリポタンパク質Ｂ−１００（Ａｐｏ  Ｂ−１００）、アポリポタンパク質Ｂ−４８（Ａｐｏ  Ｂ−４８）、アポリポタンパク質Ｃ−Ｉ（Ａｐｏ  Ｃ−Ｉ）、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩ（Ａｐｏ  Ｃ−ＩＩ）、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ（Ａｐｏ  Ｃ−ＩＩＩ）、アポリポタンパク質Ｄ（Ａｐｏ  Ｄ）、アポリポタンパク質Ｅ（Ａｐｏ  Ｅ）、アポリポタンパク質Ｈ（Ａｐｏ  Ｈ）又はリポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））の変異体）の変異体である。
【００８７】
幾つかのアポリポタンパク質（交換可能なアポリポタンパク質と呼ばれる）は可逆的に脂質と結合し、脂質と結合したときも、また脂質と結合しないときも、安定な形態を有する。交換可能なアポリポタンパク質は通常約５０ｋＤａ未満のサイズを有し、リポタンパク質粒子の表面と結合すると考えられる可変的な数の両親媒性のαヘリックス型ドメインに基づく構造類似性を共有する（Ｓｅｇｒｅｓｔら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．３３：１４１−１６６（１９９２）、Ｐｅａｒｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０，３８５７６−３８５８２（２００５）、Ｂｏｇｕｓｋｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：８４５７−８４６１（１９８５））。交換可能なアポリポタンパク質としては、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、アポリポタンパク質Ａ−Ｖ、アポリポタンパク質Ｃ−Ｉ、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩ、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、アポリポタンパク質Ｅ及びアポリフォリンＩＩＩが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８８】
本発明の組成物及び方法において使用するアポリポタンパク質はいかなる動物の起源であってもよく、又はいかなる動物種のアポリポタンパク質の配列に基づいて構成されてもよい。幾つかの実施形態では、本発明の方法で使用するアポリポタンパク質は哺乳類のアポリポタンパク質であって、１つ以上の哺乳類のアポリポタンパク質配列に由来する１つ以上のアポリポタンパク質変異体配列を有するものであり、例えばアポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、アポリポタンパク質Ａ−Ｖ、アポリポタンパク質Ｂ−１００、アポリポタンパク質Ｂ−４８、アポリポタンパク質Ｃ−Ｉ、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩ、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、アポリポタンパク質Ｄ、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｈ又はリポタンパク質（ａ）が挙げられる。本発明に用いられるこれらのアポリポタンパク質の同一性は１つ以上の種のものに由来してもよく、多くの場合、当該名称はヒトをタンパク質として称する。例えば、以下のヒトのアポリポタンパク質の配列：ｇｉ３７４９９４６５（ヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉ、配列番号１）、ヒトプロアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（配列番号２）、ヒトアポリポタンパク質Ａ−ＩＩ（ｇｉ２９６６３３、配列番号３）、ヒトアポリポタンパク質Ａ−ＩＶ（ｇｉ１７８７５９、配列番号４）、ヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｖ（ｇｉ６０３９１７２８、配列番号５）、アポリポタンパク質Ｂ−１００、（ｇｉ１１４０１４、配列番号６）、アポリポタンパク質Ｂ−４８（ｇｉ１７８７３２、配列番号７）、アポリポタンパク質Ｃ−Ｉ（ｇｉ３０５８３１２３、配列番号８）、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩ（ｇｉ３７４９９４６９、配列番号９）、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ（ｇｉ５２１２０５、配列番号１０）、アポリポタンパク質Ｄ（ｇｉ５４６６５８４、配列番号１１、ｇｉ１２４６０９６、配列番号１２）、アポリポタンパク質Ｅ（ｇｉ１７８８５３、配列番号１３）、アポリポタンパク質Ｈ（ｇｉ１７８８５７、配列番号１４）、アポリポタンパク質Ｌｐ（ａ）（ｇｉ５０３１８８５、配列番号１５）、並びに、少なくとも１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、又は２００の隣接アミノ酸を有するそれらの変異体であって、少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８又は９９％の配列同一性を有する配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８が、本発明の方法及び組成物に含まれるアポリポタンパク質であるが、これらに限定されない。
【００８９】
但しアポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、アポリポタンパク質Ａ−Ｖ、アポリポタンパク質Ｂ−１００、アポリポタンパク質Ｂ−４８、アポリポタンパク質Ｃ−Ｉ、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩ、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、アポリポタンパク質Ｄ、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｈ又はリポタンパク質（ａ）の呼称はまた、ヒト以外の種（哺乳類、魚類、鳥類、有袋類、爬虫類及び両生類の種が包含されるがこれに限定されない）のこれらのタンパク質アナログのことも指すものとして本願明細書において使用される。ゆえに、ヒトタンパク質として割り当てられた名称として本願明細書に参照される当該タンパク質のアナログは、本発明のアポリポタンパク質として同様に包含される。本発明のかかるアポリポタンパク質、及びヒト以外の種由来のアポリポタンパク質変異体は、他の種と同じ名称を有する場合もあり、又は有しない場合もある。
【００９０】
非限定的な例として、あらゆるアポリポタンパク質Ａ−Ｉ：例えばラット（ｇｉ６９７８５１５）、マウス（ｇｉ２１４５１４１）、ゴールデンハムスター（ｇｉ４０６３８４３）、大西洋サケ（ｇｉ６４３５６）、ゼブラフィッシュ（ｇｉ１８８５８２８１）、カモ（ｇｉ６２７３０１）、フグ（ｇｉ５７１５７７６１）、オランウータン（ｇｉ２３３７９７６８）、チンパンジ（ｇｉ２３３７９７６４）、ゴリラ（ｇｉ２３３７９７６６）、ブタ（ｇｉ４７５２３８５０）、ヒヒ（ｇｉ８６６５３）、ウサギ（ｇｉ７１７９０）又はその変異配列を使用できる。非限定的な例として、あらゆるアポリポタンパク質Ａ−Ｉｌ：例えばラット（ｇｉ２０２９４８）、マウス（ｇｉ７３０４８９７）、マカーク（ｇｉ３８０４９）、ウシ（ｇｉ６２２５０５９）、ウマ（ｇｉ４７１１５６６３）又はその変異配列を使用できる。非限定的な例として、あらゆるアポリポタンパク質Ａ−ＩＶ：例えばラット（ｇｉ８３９２９０９）、マウス（ｇｉ６６８０７０２）、チキン（ｇｉ４５３８４３９２）、ヒヒ（ｇｉ５１０２７６）、ブタ（ｇｉ４７５２３８３０）、チンパンジ（ｇｉ６０１８０１）又はその変異配列を使用できる。非限定的な例として、あらゆるアポリポタンパク質Ａ−Ｖ：例えばラット（ｇｉ１８０３４７７７）、マウス（ｇｉ３１５６０００３）、ウシ（ｇｉ７６６３５２６４）又はイヌ（ｇｉ５７０８６２５３）又はその変異配列を使用できる。
【００９１】
非限定的な例として、あらゆるアポリポタンパク質Ｂ：例えばラット（ｇｉ６１０９８０３１）、チキン（ｇｉ１１４０１３）、ウサギ（ｇｉ１１４０１５）、キツネザル（ｇｉ３１５５８９５８）、ブタ（ｇｉ９５１３７５）、マカーク（ｇｉ９３０１２６）、リス（ｇｉ３１５５８９５６）、ハリラット（ｇｉ３１５５８９５２）又はその変異配列を使用できる。
【００９２】
非限定的な例として、あらゆるアポリポタンパク質Ｃ−Ｉ：例えばラット（ｇｉ６９７８５２１）、マウス（ｇｉ６６８０７０４）、マカーク（ｇｉ１１４０１７）、ウサギ（ｇｉ４１６６２６）又はその変異配列を使用できる。非限定的な例として、あらゆるアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩ：例えばマウス（ｇｉ６７５３１００）、イヌ（ｇｉ５０９７９２３６）、マカーク（ｇｉ３４２０７７）、モルモット（ｇｉ１９１２３９）、ウシ（ｇｉ１１４０１９）フグ（ｇｉ７４０９６４０７）又はその変異配列を使用できる。非限定的な例として、あらゆるアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ：例えばラット（ｇｉ８３９２９１２）、マウス（ｇｉ１５４２１８５６）、イヌ（ｇｉ５０９７９２３０）、ブタ（ｇｉ５０６５７３８６）、ウシ（ｇｉ４７５６４１１９）又はその変異配列を使用できる。
【００９３】
非限定的な例として、あらゆるアポリポタンパク質Ｄ：例えばラット（ｇｉ２８７６５０）、マウス（ｇｉ７５６７７４３７）、チキン（ｇｉ５８６９６４２６）、モルモット（ｇｉ１１１０５５３）又はシカ（ｇｉ８２４６９９１１）又はその変異配列を使用できる。
【００９４】
非限定的な例として、あらゆるアポリポタンパク質Ｅ：例えばラット（ｇｉ２０３０１９５４）、マウス（ｇｉ６７５３１０２）、チンパンジ（ｇｉ５７１１３８９７）、アカゲザル（ｇｉ３９１３０７０）、ヒヒ（ｇｉ１７６５６９）、ブタ（ｇｉ３１１２３３）、ウシ（ｇｉ３１２８９３）又はその変異配列を使用できる。
【００９５】
非限定的な例として、あらゆるアポリポタンパク質Ｈ：例えばラット（ｇｉ５６９７１２７９）、マウス（ｇｉ９４４００７７９）、ウッドチャック（ｇｉ９２１１１５１９）、イヌ（ｇｉ５４７９２７２１）、ウシ（ｇｉ２７８０６７４１）又はその変異配列を使用できる。
【００９６】
幾つかの実施形態では、本発明の方法で使用するアポリポタンパク質は、昆虫由来アポリポタンパク質であるか、又は昆虫アポリポタンパク質の配列に由来する配列（例えばアポリフォリンＩ、アポリフォリンＩＩ又はアポリフォリンＩＩＩ）を有する。かかるタンパク質は、いかなる種（例えばＤｒｏｓｐｏｐｈｉｌａ属の種、Ｍａｎｄｕｃａ属の種、Ｌｏｃｕｓｔａ属の種、Ｌｅｔｈｏｃｅｒｕｓ属の種、Ｏｓｔｒｉｎｉａ属の種、Ｂｏｍｂｙｘ属の種）に由来してもよく、更には他の昆虫若しくは非昆虫種のそれらのアナログであってもよい。例えば、アポリポフォリン（ｇｉ２４９８１４４、配列番号１６）、アポリポフォリンＩＩ（ｇｉ２７４６７２９、配列番号１７）、アポリポフォリンＩＩＩ（ｇｉ１５９４８１、配列番号１８）、並びに、少なくとも１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０又は２００の隣接アミノ酸を有し、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８に対して少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８又は９９％の配列同一性を有するアポリポタンパク質変異体が、本発明の組成物及び方法で使用できるアポリポタンパク質である。
【００９７】
本発明のＩＶＰＳシステムに存在させてもよいアポリポタンパク質はとしては、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、アポリポタンパク質Ａ−Ｖ、アポリポタンパク質Ｂ−１００、アポリポタンパク質Ｂ−４８、アポリポタンパク質Ｃ−Ｉ、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩ、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、アポリポタンパク質Ｄ、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｈ、リポタンパク質（ａ）、アポリフォリンＩ、アポリフォリンＩＩ又はあらゆる種のアポリフォリンＩＩＩアナログ（いかなる種のアナログの変異体も含まれる）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９８】
幾つかの例示的実施形態では、ＩＶＰＳシステムに存在するアポリポタンパク質は交換可能なアポリポタンパク質であり、例えばアポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、アポリポタンパク質Ａ−Ｖ、アポリポタンパク質Ｃ−Ｉ、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩ、アポリポタンパク質Ｃ−ＩｌＩ、アポリポタンパク質Ｅ又はアポリフォリンＩＩＩが挙げられる。
【００９９】
幾つかの実施形態では、本発明の組成物及び方法で使用するアポリポタンパク質は、いかなる種由来のアポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、アポリポタンパク質Ａ−Ｖ、アポリポタンパク質Ｂ−１００、アポリポタンパク質Ｂ−４８、アポリポタンパク質Ｃ−Ｉ、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩ、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、アポリポタンパク質Ｄ、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｈ、リポタンパク質（ａ）、アポリフォリンＩ、アポリフォリンＩＩ又はアポリフォリンＩＩＩなどのアポリポタンパク質の、少なくとも２０の連続的若しくは隣接するアミノ酸に対して、少なくとも７０％の同一性を有する。アポリポタンパク質は、好ましい実施形態では、アポリポタンパク質の少なくとも２０アミノ酸の連続配列、少なくとも３０アミノ酸の連続配列、少なくとも４０アミノ酸の連続配列、少なくとも５０アミノ酸の連続配列、少なくとも６０アミノ酸の連続配列、少なくとも７０アミノ酸の連続配列、少なくとも８０アミノ酸の連続配列、少なくとも９０アミノ酸の連続配列、又は少なくとも１００アミノ酸の連続配列において、アポリポタンパク質に対して少なくとも７０％の同一性を有する。幾つかの好ましい実施態様では、ＩＶＰＳシステム中にアポリポタンパク質を存在させることにより、ＩＶＰＳシステムにおいて合成される１つ以上のタンパク質の可溶性が向上し、アポリポタンパク質の少なくとも２０アミノ酸の連続配列、少なくとも３０アミノ酸の連続配列、少なくとも４０アミノ酸の連続配列、少なくとも５０アミノ酸の連続配列、少なくとも６０アミノ酸の連続配列、少なくとも７０アミノ酸の連続配列、少なくとも８０アミノ酸の連続配列、少なくとも９０アミノ酸の連続配列、又は少なくとも１００アミノ酸の連続配列において、アポリポタンパク質に対して少なくとも７０％の同一性を有する。幾つかの実施形態では、本発明の方法及び組成物において使用するアポリポタンパク質は、ＩＶＰＳシステムにおいて存在させることにより、ＩＶＰＳシステムにおいて合成される１つ以上のタンパク質の可溶性が向上し、あらゆる種のアポリポタンパク質の少なくとも２０アミノ酸の連続配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を有する。
【０１００】
幾つかの実施形態では、本発明の組成物及び方法で使用されるアポリポタンパク質は例えば、交換可能なアポリポタンパク質（例えば限定されないが、あらゆる種のアポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、アポリポタンパク質Ｃ−Ｉ、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩ、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、アポリポタンパク質Ｅ又はアポリフォリンＩＩＩ）の少なくとも２０アミノ酸、少なくとも３０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも７０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸又は少なくとも１００アミノ酸の連続配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を有する。幾つかの実施形態では、本発明の方法及び組成物において使用するアポリポタンパク質は、ＩＶＰＳシステムに存在させることによりＩＶＰＳシステムにおいて合成される１つ以上のタンパク質の可溶性が向上し、いかなる種のアポリポタンパク質の少なくとも２０アミノ酸、少なくとも３０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも７０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸又は少なくとも１００アミノ酸の連続配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する。
【０１０１】
幾つかの実施形態では、アポリポタンパク質は哺乳類のアポリポタンパク質であるか、又は、哺乳類のアポリポタンパク質（例えば限定されないがアポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、アポリポタンパク質Ａ−Ｖ、アポリポタンパク質Ｂ−１００、アポリポタンパク質Ｂ−４８、アポリポタンパク質Ｃ−Ｉ、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩ、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、アポリポタンパク質Ｄ、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｈ又はリポタンパク質（ａ）の少なくとも２０アミノ酸、少なくとも３０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも７０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸又は少なくとも１００アミノ酸の連続配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を有する。
【０１０２】
幾つかの実施形態では、アポリポタンパク質は昆虫アポリポタンパク質（例えばアポリフォリンＩ、アポリフォリンＩＩ又はアポリフォリンＩＩＩ）であるか、又は、昆虫アポリフォリンＩ、アポリフォリンＩＩ若しくはアポリフォリンＩＩＩの少なくとも２０アミノ酸、少なくとも３０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも７０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸又は少なくとも１００アミノ酸の連続配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を有する。
【０１０３】
幾つかの例示的実施形態では、本発明の方法及び組成物に使用されるアポリポタンパク質は、野生型の交換可能なアポリポタンパク質の少なくとも１００の隣接するアミノ酸に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する野生型の交換可能なアポリポタンパク質又は変異体であり、インビトロタンパク質合成反応において細菌ＥｍｒＥタンパク質又はヒトＧＡＢＡ受容体タンパク質の可溶性タンパク質の産生を少なくとも１０％増加させることができる。幾つかの実施形態では、本発明の方法及び組成物に使用するアポリポタンパク質は、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、アポリポタンパク質Ａ−Ｖ、アポリポタンパク質Ｃ−Ｉ、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩ、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、アポリポタンパク質Ｅ又はアポリフォリンＩＩＩ、又は野生型の交換可能なアポリポタンパク質の少なくとも１００の隣接するアミノ酸に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するあらゆる変異体であり、インビトロタンパク質合成反応において細菌ＥｍｒＥタンパク質又はヒトＧＡＢＡ受容体タンパク質の可溶性タンパク質の産生を少なくとも１０％増加させることができる。
【０１０４】
ある具体的実施形態では、本発明の方法及び組成物において使用するアポリポタンパク質は、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、又は野生型アポリポタンパク質Ａ−Ｉの少なくとも１００の隣接するアミノ酸に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアポリポタンパク質Ａ−Ｉの変異体であり、インビトロタンパク質合成反応において細菌ＥｍｒＥタンパク質又はヒトＧＡＢＡ受容体タンパク質の可溶性タンパク質の産生を少なくとも１０％増加させることができる。
【０１０５】
本発明のアポリポタンパク質にはまた、天然のアポリポタンパク質のヘリックス状ドメインの少なくとも１０の残基に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する改変アポリポタンパク質が包含される。本発明には、本願明細書に援用する米国特許出願公開第２００５／０１８２２４３号において開示される改変アポリポタンパク質（「膜足場タンパク質」）が包含され、例えば限定されないが、ヒスチジンタグを付与したＭＳＰ１（配列番号１９）、ＭＳＰ１（配列番号２０）、ＭＳＰ２（Ｈｉｓタグ付き）（配列番号２１）、ＭＳＰ２（Ｈｉｓタグ付き、長いリンカー）（配列番号２２）、ＭＳＰ１Ｄ５Ｄ６（配列番号２３）、ＭＳＰ１Ｄ６Ｄ７（配列番号２４）、ＭＡＰ１Ｔ４（配列番号２５）、ＭＳＰ１Ｔ５（配列番号２６）、ＭＳＰ１Ｔ６（配列番号２７）、ＭＳＰ１Ｎ１（配列番号２８）、ＭＳＰ１Ｅ３ＴＥＶ（配列番号２９）、ＭＳＰ１Ｅ３Ｄ１（配列番号３０）、ＨｉｓＴＥＶ−ＭＳＰ２（配列番号３１）、ＭＳＰ２Ｎ１（配列番号３２）、ＭＳＰ２Ｎ２（配列番号３３）、ＭＳＰ２Ｎ３（配列番号３４）、ＭＳＰ２Ｎ４（配列番号３５）、ＭＳＰ２Ｎ５（配列番号３６）、ＭＳＰ２Ｎ６（配列番号３７）、ＭＳＰ２ＣＰＲ（配列番号３８）、Ｈｉｓ−ＴＥＶ−ＭＳＰ１Ｔ２−ＧＴ（配列番号３９）、ＭＳＰ１ＲＣ１２’（配列番号４０）、ＭＳＰ１Ｋ９０Ｃ（配列番号４１）及びＭＳＰ１Ｋ１５２Ｃ（配列番号４２）などが挙げられる。
【０１０６】
本発明の方法及び組成物で使用するアポリポタンパク質はいかなる給源に由来してもよく、例えば血液、血漿若しくは血清を含む器官若しくは組織から単離してもよく、細胞培養から単離してもよく、又はインビトロ合成システムに添加する前にリコンビナント的に発現させてもおい。好ましくは、インビトロ合成システムに添加する前に少なくとも部分的にアポリポタンパク質を精製する。
【０１０７】
本発明の方法及び組成物で使用するアポリポタンパク質のアミノ酸配列は、その野生型配列に対して１つ以上のアミノ酸の欠失若しくは付加、又はアミノ酸置換を施して野生型アポリポタンパク質の配列を修飾したものであってもよく、それにより、当該アポリポタンパク質をインビトロタンパク質合成反応に存在させた場合に、インビトロタンパク質合成反応で調製される可溶化形態のタンパク質の収率が高まるという特性を有するようになる。
【０１０８】
例えば、本発明の方法又は組成物で使用するアポリポタンパク質は、Ｎ末端又はＣ末端が欠失してもよく、又は野生型アポリポタンパク質配列の内部に１つ以上の欠失又は挿入を有してもよい。本発明の方法及び組成物で使用するアポリポタンパク質は、アポリポタンパク質の多量体又はその部分であってもよく、例えば、リンカーにより結合したアポリポタンパク質の２つ以上のコピー、又は変異体若しくはその部分であってもよい。本発明の方法及び組成物で使用するアポリポタンパク質はキメラアポリポタンパク質であってもよく、２つの異なるアポリポタンパク質（又はその変異体）の配列を含んでなってもよい。更に、アポリポタンパク質は、融合タンパク質の一部として、ペプチド又は他のタンパク質配列と結合してもよい。例えば、当該ペプチド配列は精製及び／又は検出タグであってもよい。
【０１０９】
本発明の幾つかの実施形態では、ＩＶＰＳにおいて使用するアポリポタンパク質は、米国特許第７０４８９４９号Ａ１、米国特許出願公開第２００５／０１８２２４３号Ａ１、第２００５／０１５２９８４号Ａ１、第２００４／００５３３８４号Ａ１及び第２００６／００８８５２４号Ａ１（全開示内容を本願明細書に援用する）において開示されるアポリポタンパク質Ａ−１の配列に基づく膜足場タンパク質（ＭＳＰ）を含む。
【０１１０】
本願明細書に提供されるアポリポタンパク質は、脂質と結合してもよく、又は脂質と結合しないフリーのアポリポタンパク質であってもよい。例えば、アポリポタンパク質は、器官（例えば血液又は血漿）から、培養細胞又は培地から単離してもよく、又は組換えアポリポタンパク質を発現するよう改変された細菌細胞から単離してもよい。単離されたアポリポタンパク質は、公知の技術を使用して脂質と結合させることができる（Ｐｏｗｎａｌｌら、（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １７：１１８３−１１８８、Ｐｏｗｎａｌｌら、（１９８１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０：６６３０−６６３５、Ｊｏｎａｓら、（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３６９−６３７５、Ｊｏｎａｓら、（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：４８１８−４８２４、Ｊｏｎａｓら、（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１５９６−１６０２、Ｔｒｉｃｅｒｒｉら、（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：１４６８２−１４６９１、Ｓｅｇａｌｌら、（２００２）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４３：１６８８−１７００、Ｐｅａｒｓｏｎら、（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：３８５７６−３８５８２，を参照。全開示内容を本願明細書に援用する）。本発明の幾つかの実施形態では、アポリポタンパク質は、１つ以上の脂質（例えば１つ以上のリン脂質）を更に含んだ態様でインビトロタンパク質合成システムに提供してもよい。コレステロール、コレステロールエステル又は１つ以上の他の中性脂質（限定的ではないがステロールエステル、モノ−、ジ−若しくはトリアシルグリセリド、又はアシルグリセロールなど）を任意に添加してもよい。当該脂質は、約１μｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬ、又は約５μｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、又は約１０μｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在させてもよい。１つ以上のリン脂質は、インビトロタンパク質合成システムにおいてアポリポタンパク質と結合してもよい。本発明の幾つかの実施形態では、アポリポタンパク質は、１つ以上の脂質（例えば１つ以上のリン脂質）を含むインビトロタンパク質システムを使用して翻訳される。無細胞システムにおいて合成されるアポリポタンパク質は、翻訳の間、又は翻訳後に１つ以上の脂質と結合することができる。
【０１１１】
リン脂質−アポリポタンパク質粒子
本発明の幾つかの実施形態では、アポリポタンパク質は、リン脂質−アポリポタンパク質粒子としてインビトロタンパク質合成システムに存在してもよく、詳細には、当該粒子はリン脂質を含んでなり、アポリポタンパク質により二重層ディスクとして構成される。リン脂質−アポリポタンパク質粒子の幾つかの例、並びにリン脂質−アポリポタンパク質ディスク（アポリポタンパク質変異体を含むリン脂質アポリポタンパク質ディスクも包含される）の調製方法は従来技術において公知であり、例えば、Ｊｏｎａｓら、（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３６９−６３７５、Ｊｏｎａｓら、（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：４８１８−４８２４、Ｊｏｎａｓら、（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１５９６−１６０２、米国特許第７０４８９４９号、米国特許出願公開第２００５／０１８２２４３号Ａ１、第２００５／０１５２９８４号Ａ１、第２００４／００５３３８４号Ａ１及び第２００６／００８８５２４号Ａ１（本願明細書に全開示内容を援用する）に記載されている。
【０１１２】
本願明細書にリン脂質−アポリポタンパク質粒子又はＰＡＰとして開示されているナノスケールの二重層ディスクは、米国特許第７０４８９４９号、米国特許出願公開第２００５／０１８２２４３号、第２００５／０１５２９８４号、第２００４／００５３３８４号及び国際公開第０２／０４０５０１号（全開示内容を本願明細書に援用する）に記載されており、特にナノスケールのリン脂質二重層ディスク、その成分、その製造及び使用方法に関して開示されている。本発明の方法では、リン脂質−アポリポタンパク質粒子又はナノスケールのリン脂質二重層ディスクに挿入される膜タンパク質が産生される。核酸鋳型を細胞抽出物及びＰＡＰの調製を含むインビトロタンパク質合成システムに添加し、インビトロタンパク質合成システムをインキュベートし可溶化形態の膜タンパク質（可溶化形態の膜タンパク質がＰＡＰに挿入されている）を合成する。
【０１１３】
本発明は、アポリポタンパク質を含むリン脂質二重層粒子若しくはディスクを含んでなる翻訳システム及び方法の提供に関する。好ましくは、リン脂質−アポリポタンパク質として提供されるアポリポタンパク質は、１つ以上の両親媒性のヘリックス状ドメインを有する。アポリポタンパク質は例えば、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、アポリポタンパク質Ａ−Ｖ、アポリポタンパク質Ｂ−１００、アポリポタンパク質Ｂ−４８、アポリポタンパク質Ｃ−Ｉ、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩ、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、アポリポタンパク質Ｄ、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｈ、リポタンパク質（ａ）、アポリポフォリンＩ（アポリポフォリンＩＩ）若しくはアポリポフォリンＩＩＩ、又はその誘導体若しくは変異体（例えばキメラアポリポタンパク質、Ｃ−端末又はＮ末端が欠失したアポリポタンパク質、内部的が欠失したアポリポタンパク質、更なるアミノ酸配列若しくは変異アミノ酸配列を含むアポリポタンパク質）であってもよい。好ましい実施形態では、本発明のＩＶＰＳのリン脂質−アポリポタンパク質粒子は、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＡ−Ｖ、ＡｐｏＣ−Ｉ、ＡｐｏＣ−ＩＩ、ＡｐｏＣ−ＩＩＩ、Ａｐｏ−Ｅ又はアポリポフォリンＩＩＩ又はこれらのいずれかの変異体である。幾つかの実施形態では、アポリポタンパク質の両親媒性のヘリックス状ドメインの長さを適宜調節し、様々な直径を有するリン脂質−アポリポタンパク質粒子の形成を活性化させることもできる。このことは、リン脂質−アポリポタンパク質粒子内に多種類のタンパク質を適切に取り込む際に有利であると考えられる。
【０１１４】
翻訳システムにおいてリン脂質−アポリポタンパク質粒子又はディスクを形成するために用いるリン脂質は、グリセロール又はスフィンゴ脂質ベースであってもよく、例えば、２分子の６〜２０の炭素原子の飽和脂肪酸、及び一般的に用いられるヘッド基（例えばホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルセリン）を含んでなってもよい。ヘッド基は、荷電しなくともよく、正に荷電してもよく、負に荷電してもよく、また双性イオンであってもよい。リン脂質は、天然物（自然界で生じる）若しくは合成物（自然界で生じない）、又は天然物と合成物の混合物であってもよい。リン脂質の非限定的な例としては、ＰＣ（ホスファチジルコリン）、ＰＥ（ホスファチジルエタノールアミン）、ＰＩ（ホスファチジルイノシトール）、ＤＰＰＣ（ジパルミトイル−ホスファチジルコリン）、ＤＭＰＣ（ジミリストイルホスファチジルコリン）、ＰＯＰＣ（１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルコリン）、ＤＨＰＣ（ジヘキサノイルホスファチジルコリン）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルイノシトール、ジヘキサノイルホスファチジルエタノールアミン、ジヘキサノイルホスファチジルイノシトール、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン、又は１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジル基イノシトールが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１５】
従来技術において記載のように、単離されたアポリポタンパク質及びリン脂質を混合し、リン脂質−アポリポタンパク質として凝集させてもよく、その方法は全開示内容を本願明細書に引用する、Ｊｏｎａｓら、（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３６９−６３７５、Ｊｏｎａｓら、（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：４８１８−４８２４、Ｊｏｎａｓら、（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１５９６−１６０２、米国特許第７０４８９４９号、米国特許出願公開第２００５／０１８２２４３号Ａ１、第２００５／０１５２９８４号Ａ１、２００４／００５３３８４号Ａ１及び第２００６／００８８５２４号Ａ１が挙げられる。更にリン脂質−アポリポタンパク質粒子を細胞抽出物又はＩＶＰＳシステム中に添加する。
【０１１６】
幾つかの他の本発明の態様では、アポリポタンパク質をコードする核酸構築物を、１つ以上のリン脂質を含むＩＶＰＳシステム中に添加し、インビトロで翻訳されたアポリポタンパク質がリン脂質と会合し、ＩＶＰＳシステム中でリン脂質−アポリポタンパク質粉末粒子を形成する。
【０１１７】
組換えクローニング
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カールズバッド、ＣＡ）から市販されている、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）組換えクローニングシステム、ベクター、酵素及びキットを含む、ある特定の組換え部位で組換えを利用するクローニングシステムが、１９９８年１０月２３日に出願の米国特許出願第０９／１７７３８７号、２０００年３月２日に出願の米国特許出願第０９／５１７４６６号、並びに米国特許第５８８８７３２号及び第６２７７６０８号（本願明細書に全開示内容を援用する）に記載されている。これらのシステムを用いて、インビトロ翻訳用の発現ベクターにＭＰＯＩのコード配列及び／又はアポリポタンパク質のコード配列をクローニングし、マルチサイトＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）ベクターを用いて、単一の反応において２つ以上のタンパク質の同時翻訳用のマルチオープンリーディングフレームを設けることができる。
【０１１８】
手短に言えば、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）クローニングシステムでは、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はインビトロで所望の核酸分子をクローニングするための１つ以上の組換え部位を含むベクターを利用する。より詳細には、野生型（ａｔｔ０）部位を変異させた、バクテリオファージλシステムに基づく少なくとも２つの異なる部位特異的組換え部位（例えばａｔｔ１及びａｔｔ２）を含むベクターを利用する。各変異部位は、同じタイプのパートナーとしてのａｔｔ部位（例えばａｔｔＰ１に対してはａｔｔＢ１、又はａｔｔＲ１に対してはａｔｔＬ１）に由来するユニークな特性（すなわちその結合パートナー組換え部位）を有し、他の変異体タイプの組換え部位、又は野生型ａｔｔ０部位との交差反応を起こさない。それぞれの部位特異性により、所望の分子の一定方向のクローニング又は結合が可能となり、それによりクローニング分子に所望の方向性が提供される。組換え部位が両端に存在する核酸断片をＧＡＴＥＷＡＹシステムを使用してクローニング及びサブクローニングし、Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎベクターと称される受容側プラスミド分子上のａｔｔ部位が両端に存在する選択マーカー（例えばｃｃｄＢ）を置換する。更にｃｃｄＢ感受性宿主菌株の形質転換し、及び受容体分子上のマーカーを用いたポジティブ選抜により所望のクローンを選抜する。他の生物を用いたネガティブ選択（例えば毒性遺伝子の使用）の場合にも同様のストラテジーを使用でき、例えば哺乳類及び昆虫細胞におけるチミジンキナーゼ（ＴＫ）が利用できる。
【０１１９】
アポリポタンパク質を用いた、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏによるタンパク質合成方法及びシステム
本発明は、膜タンパク質がリン脂質−アポリポタンパク質粒子（ＰＡＰ）の存在下で翻訳されるときに、膜タンパク質がリン脂質−アポリポタンパク質粒子（リン脂質二重層ディスク）に挿入されるという発見に基づく。本願明細書に提供される実施例にて図示するように、ＰＡＰを含むインビトロタンパク質合成（ＩＶＰＳ）システムにおいて、目的の膜タンパク質（ＭＰＯＩ）の合成の結果、ＭＰＯＩがＰＡＰに組み込まれることにより、可溶性の向上したＭＰＯＩの製造がもたらされた。
【０１２０】
発明者は更に、ＰＡＰの一部でないアポリポタンパク質の存在下で膜タンパク質が翻訳でき、アポリポタンパク質の存在下で翻訳されるＭＰＯＩは、アポリポタンパク質の非存在下でインビトロで翻訳される同じＭＰＯＩよりも可溶性が向上することを発見した。すなわち本発明は、アポリポタンパク質の存在下でタンパク質を翻訳するためのインビトロ合成方法及びシステムの提供に関する。本発明は、アポリポタンパク質の存在下でタンパク質を翻訳するためのインビトロ合成方法及びシステムであって、ＩＶＰＳシステム中のアポリポタンパク質がＰＡＰに提供されない当該方法及びシステムに関する。本発明はまた、アポリポタンパク質の存在下でタンパク質を翻訳するためのインビトロ合成方法及びシステムであって、外生のリン脂質がＩＶＰＳシステムに存在しない当該方法及びシステムに関する。
【０１２１】
本発明の更に他の特徴は、アポリポタンパク質を、ＭＰＯＩが翻訳される同じＩＶＰＳシステム中で発現させ、ＭＰＯＩ及びアポリポタンパク質を同じＩＶＰＳ反応において合成させたときに、アポリポタンパク質を含まないか若しくはアポリポタンパク質鋳型を含まないＩＶＰＳ反応において合成させた場合よりも、ＭＰＯＩの可溶性を向上させることができるという発見に基づく。
【０１２２】
すなわち一態様では、本発明はインビトロで目的タンパク質を合成する方法の提供に関し、当該方法は、アポリポタンパク質を含むインビトロタンパク質合成システムに目的タンパク質をコードする核酸鋳型を添加し、インビトロタンパク質合成システムをインキュベートすることにより、目的タンパク質を合成する工程を含んでなる。幾つかの好ましい実施形態では、目的タンパク質の少なくとも一部が可溶化形態において合成される。
【０１２３】
例えば、ＩＶＰＳシステムで発現される目的タンパク質（「ＰＯＩ」）はいかなる目的タンパク質であってもよく、酵素、構造蛋白質、輸送タンパク質、結合タンパク質、抗体、ホルモン、成長因子、レセプタ、阻害剤又は活性剤などが挙げられる。本願明細書に提供される実施例では、ＩＶＰＳ反応におけるアポリポタンパク質の存在が非膜タンパク質の翻訳に有害な影響を及ぼさないことを示す。幾つかの好ましい実施形態では、本発明の方法を用いて翻訳される目的タンパク質は、膜タンパク質（「ＭＰＯＩ」）、又はその天然の状態が生体膜に関連するタンパク質（例えば膜貫通タンパク質、膜内在型タンパク質又は膜表在性タンパク質）である。
【０１２４】
幾つかの好ましい実施形態では、本発明の方法を用いて翻訳される目的タンパク質は膜タンパク質であり、インビトロタンパク質合成システムをインキュベートした後に合成される目的膜タンパク質（ＭＰＯＩ）は、アポリポタンパク質が存在しない場合に翻訳される当該タンパク質よりも、可溶化形態において多く得られる。好ましい実施態様では、ＩＶＰＳ反応にアポリポタンパク質存在しない場合よりも、ＭＰＯＩがアポリポタンパク質の存在下で、例えば少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも１００％多い態様で合成される。幾つかの好ましい実施形態では、ＩＶＰＳシステムをインキュベートした後に、目的の全タンパク質に対する可溶性ＭＰＯＩの量が、アポリポタンパク質の非存在下でＭＰＯＩを翻訳させた場合よりもより高いパーセンテージで合成される。好ましい実施態様では、アポリポタンパク質の存在下でＩＶＰＳ反応においてＭＰＯＩを合成した場合の、全ＭＰＯＩに対する、可溶性ＭＰＯＩのパーセンテージは、アポリポタンパク質の非存在下でＩＶＰＳ反応においてＭＰＯＩを合成した場合の、全ＭＰＯＩに対する可溶性ＭＰＯＩのパーセンテージよりも、例えば少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも１００％増加する。
【０１２５】
本願明細書に記載のように、ＩＶＰＳシステムに提供されるアポリポタンパク質は、天然のアポリポタンパク質（いかなる種起源であってもよい）、天然のアポリポタンパク質の変異配列、又は天然のアポリポタンパク質のヘリックス状ドメインに対して少なくとも９０％のホモロジーを有する１つ以上のヘリックス状ドメインを有する改変タンパク質のいずれかであってもよい。本発明の方法及び組成物で使用するアポリポタンパク質は、膜タンパク質の可溶性収率を少なくとも１０％上昇させる特性を有する。当該可溶性収率は、アポリポタンパク質がＩＶＰＳシステムに提供されるか、又は膜タンパク質も翻訳されるＩＶＰＳにおいて、同時に翻訳された場合における、合成される全タンパク質に対する、合成される可溶性タンパク質の量又は可溶性タンパク質のパーセンテージとして算出する。
【０１２６】
ＩＶＰＳシステムに存在するアポリポタンパク質は、ＭＰＯＩの翻訳を可能にするいかなる濃度で存在してもよい。飽くまでガイドラインであるが、ＩＶＰＳシステムに提供できるアポリポタンパク質は、約０．５μｇ／ｍＬ〜約２ｍｇ／ｍＬ、又は約１μｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬ、又は約５μｇ／ｍＬ〜約５００μｇ／ｍＬ、又は約１０μｇ／ｍＬ〜約２５０μｇ／ｍＬの濃度である。複数のアポリポタンパク質を単一のＩＶＰＳ反応に存在させてもよい。
【０１２７】
１つ以上のアポリポタンパク質は、核酸鋳型を反応に添加した後でＩＶＰＳ反応に添加してもよいが、ＰＯＩをコードする核酸鋳型が添加されているときにＩＶＰＳ反応に存在させるのが好ましい。本発明では、「ＩＶＰＳにシステムを添加する」という用語は、ＩＶＰＳ用に調製された細胞抽出物に添加することを指し、インビトロ合成用の他の成分がすでに添加されていても、又は未だ添加されていなくてもよい。
【０１２８】
すなわち本発明は、別の態様では、本願明細書に記載のように、１つ以上のアポリポタンパク質を含むインビトロ翻訳用の細胞抽出物の提供に関する。インビトロ翻訳用の細胞抽出物には、本願明細書に記載されているそれら全てが包含される。幾つかの実施形態では、本発明には、アポリポタンパク質、細胞抽出物及び化学エネルギー供給源を含んでなるＩＶＰＳシステムが包含される。幾つかの実施形態では、本発明には、アポリポタンパク質、細胞抽出物、化学エネルギー供給源及び１つ以上のアミノ酸を含んでなるＩＶＰＳシステムが包含される。幾つかの実施形態では、本発明には、アポリポタンパク質、細胞抽出物、化学エネルギー供給源、１つ以上のアミノ酸及び核酸鋳型を含んでなるＩＶＰＳシステムが包含される。ＩＶＰＳシステムは、１つ以上の脂質、界面活性剤、塩、緩衝化合物、酵素、阻害剤又は補因子を任意に含んでなってもよい。
【０１２９】
本発明の方法の幾つかの実施形態では、アポリポタンパク質は、１つ以上の脂質（例えば１つ以上のリン脂質）を含むＩＶＰＳシステムに添加される。本発明の方法の幾つかの実施形態では、アポリポタンパク質は１つ以上の脂質を含むＩＶＰＳシステムに添加され、アポリポタンパク質はＩＶＰＳシステムの１つ以上の脂質と会合体を形成する。本発明の方法の幾つかの実施形態では、アポリポタンパク質をＩＶＰＳシステムに添加すると、１つ以上の脂質と会合する。本発明の幾つかの実施形態では、アポリポタンパク質は１つ以上の脂質を含むＩＶＰＳシステムに添加されるか、又はアポリポタンパク質はＩＶＰＳシステムに添加されたときに１つ以上の脂質と会合し、ＩＶＰＳシステムのインキュベーションの間、合成された目的タンパク質が、ＩＶＰＳシステム中のアポリポタンパク質及びその関連する１つ以上の脂質と会合体を形成する。
【０１３０】
本発明の方法の幾つかの実施形態では、ＩＶＰＳシステムに添加されるアポリポタンパク質は、リン脂質−アポリポタンパク質粒子（ＰＡＰ）として添加される。本発明の方法の幾つかの実施形態では、ＩＶＰＳシステムに添加されるアポリポタンパク質はＰＡＰとして添加され、当該システムにおいて合成されるＭＰＯＩがＰＡＰと会合体を形成する。
【０１３１】
ゆえに本発明の更なる態様では、本願明細書に記載のように、リン脂質−アポリポタンパク質粒子（ＰＡＰ）を含有する翻訳用の細胞抽出物が包含される。インビトロ翻訳用の細胞抽出物には、本願明細書に記載されているそれら全てが包含される。幾つかの実施形態では、本発明にはＰＡＰ、細胞抽出物及び化学エネルギー供給源を含むＩＶＰＳシステムが包含される。幾つかの実施形態では、本発明にはＰＡＰ、細胞抽出物、化学エネルギー供給源及び１つ以上のアミノ酸を含むＩＶＰＳシステムが包含される。幾つかの実施形態では、本発明にはＰＡＰ、細胞抽出物、化学エネルギー供給源、１つ以上のアミノ酸及び核酸鋳型を含むＩＶＰＳシステムが包含される。ＩＶＰＳシステムは、１つ以上の脂質、界面活性剤、塩、緩衝化合物、酵素、阻害剤又は補因子を任意に含んでなってもよい。
【０１３２】
上記で詳細に説明したリン脂質−アポリポタンパク質粒子（ＰＡＰ）は、インビトロ翻訳を可能とするいかなる濃度においてＩＶＰＳシステムに添加してもよいが、ＩＶＰＳで翻訳されるＭＰＯＩの可溶性を強化する濃度で添加するのが好ましい。飽くまでガイドラインであるが、ＰＡＰは、約０．５μｇ／ｍＬ〜約２ｍｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ〜約５００μｇ／ｍＬ、又は約１０μｇ／ｍＬ〜約２５０μｇ／ｍＬの濃度で適宜添加してもよい（上記濃度はＰＡＰの蛋白質の含有量に対する濃度）。複数のタイプのＰＡＰを単一のＩＶＰＳ反応中に存在させてもよく、すなわち異なるＰＡＰが異なるアポリポタンパク質及び／又は異なるリン脂質組成物を含有してもよい。
【０１３３】
本発明は、可溶化形態の無細胞システムの膜タンパク質を合成するための効率的なシステム及び方法の提供に関する。当該方法は、膜タンパク質をリン脂質−アポリポタンパク質粒子を含む細胞フリーのシステムで発現させることを含んでなる。
【０１３４】
本発明の幾つかの実施形態では、当該方法は、ＩＶＰＳ混合物から目的タンパク質を単離することを更に含んでなる。単離方法は例えば、アポリポタンパク質の一部としてのペプチドタグを用いるものであってもよく、又は目的タンパク質の一部としてのペプチドタグを用いるものであってもよい。
【０１３５】
アポリポタンパク質は、ＰＯＩを翻訳するＩＶＰＳシステムで翻訳することによって、アポリポタンパク質をＩＶＰＳシステムに提供することができる。ゆえに更に他の態様では、本発明は、インビトロでタンパク質を合成する方法の提供に関し、当該方法は、インビトロ合成システムに、アポリポタンパク質をコードする核酸構築物及び目的タンパク質をコードする核酸構築物を添加し、インビトロタンパク質合成システムをインキュベートし、アポリポタンパク質及び目的タンパク質を合成することを含んでなる。幾つかの好ましい実施形態では、目的タンパク質は可溶化形態で合成される。幾つかの好ましい実施形態では、目的タンパク質は膜タンパク質である。
【０１３６】
幾つかの実施形態では、アポリポタンパク質は第１の核酸構築物により提供され、目的タンパク質は第２の核酸構築物により提供される。本発明の本態様の他の実施形態では、アポリポタンパク質をコードする配列及び目的タンパク質をコードする配列が同じ核酸構築物上に提供される。任意にＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）ベクター及びクローニングシステムを用いて、目的のアポリポタンパク質及びタンパク質の一方又は両方をコードする核酸構築物を作製することができる。幾つかの実施形態では、アポリポタンパク質をコードする配列及び目的タンパク質をコードする配列を含むＤＮＡ構築物は、アポリポタンパク質のコード配列のための第１のプロモータ、及び目的タンパク質のコード配列のための第２プロモータを有する。一変形態様では、アポリポタンパク質をコードする配列及び目的タンパク質をコードする配列を含む核酸構築物は、２つのコード配列の間にＩＲＥＳ配列を有する。
【０１３７】
本発明のこれらの態様では、アポリポタンパク質をコードする核酸構築物は本願明細書に開示されていかなるアポリポタンパク質（天然のアポリポタンパク質、天然のアポリポタンパク質の変異配列、又は天然のアポリポタンパク質のヘリックス状ドメインに対して少なくとも９０％の相同性を有する１つ以上のヘリックス状ドメインを有する改変アポリポタンパク質を含む）をコードしてもよい。アポリポタンパク質をコードする核酸構築物は、野生型アポリポタンパク質のアミノ酸配列に修飾を施したアミノ酸配列を有するアポリポタンパク質をコードしてもよい。幾つかの実施形態では、アポリポタンパク質又はアポリポタンパク質変異体をコードする核酸構築物は、アポリポタンパク質配列に融合するタグ配列をコードする。
【０１３８】
幾つかの好ましい実施形態では、アポリポタンパク質をコードする鋳型及び膜タンパク質をコードする鋳型を含むＩＶＰＳにおいて目的タンパク質は翻訳され、インビトロタンパク質合成システムをインキュベートした後に、同じ反応においてアポリポタンパク質が存在しない又は産生されない条件下で目的の膜タンパク質（ＭＰＯＩ）を翻訳させる場合よりも多い量において、可溶化形態のＭＰＯＩが合成される。幾つかの好ましい実施形態では、本発明の方法を用いて翻訳される目的タンパク質は膜タンパク質であり、ＩＶＰＳシステムをインキュベートした後、同じ反応においてアポリポタンパク質が存在しない又は産生されない条件下で目的のタンパク質を翻訳させる場合よりも高いパーセンテージにおいて、可溶化形態の目的のタンパク質が合成される。
【０１３９】
幾つかの実施形態では、目的タンパク質及びアポリポタンパク質をコードする１つ以上の核酸構築物を含む本発明のインビトロタンパク質合成システムは、１つ以上の脂質（例えば１つ以上のリン脂質）を含んでなる。幾つかの実施形態では、可溶化形態で目的タンパク質を合成することを含んでなる本発明の方法は、１つ以上の脂質を含むインビトロ合成システムに、アポリポタンパク質をコードする核酸構築物及び目的タンパク質をコードする核酸構築物を添加し、インビトロタンパク質合成システムをインキュベートし、アポリポタンパク質粒子及びリン脂質−アポリポタンパク質粒子と会合した目的タンパク質を合成することを含んでなる。
【０１４０】
本発明の更なる態様は、細胞抽出物、アポリポタンパク質をコードする核酸鋳型及び目的タンパク質をコードする核酸鋳型を含んでなるインビトロタンパク質合成システムの提供に関する。ある特定の実施形態では、本発明には、細胞抽出物、アポリポタンパク質をコードする第１の核酸分子及び目的タンパク質をコードする第２の核酸分子を含むインビトロタンパク質合成システムが包含される。他の実施形態では、細胞抽出物及びアポリポタンパク質及び目的タンパク質をコードする核酸鋳型を含むインビトロタンパク質合成システムが包含される。核酸鋳型はＤＮＡ又はＲＮＡのいずれか一方又は両方であってもよい。
【０１４１】
本発明の方法及びインビトロ合成システムに使用する核酸構築物によってコードされるアポリポタンパク質配列は、本願明細書に開示されるいかなるアポリポタンパク質の配列であってもよい。アポリポタンパク質をコードする構築物は、アポリポタンパク質配列とインフレームで融合するアミノ酸タグをコードしてもよい。アポリポタンパク質をコードする核酸鋳型はＤＮＡ鋳型又はＲＮＡ鋳型であってもよい。例えば、アポリポタンパク質をコードする核酸鋳型は固体支持体（ビーズ、マトリックス、チップ、アレイ、膜、シート、ディッシュ又はプレート）に結合していてもよい。
【０１４２】
目的タンパク質をコードする核酸鋳型はＤＮＡ鋳型又はＲＮＡ鋳型であってもよく、いかなる目的のタンパク質（例えば酵素、構造蛋白質、輸送タンパク質、ホルモン、成長因子、阻害剤又は活性剤）をコードしてもよい。幾つかの好ましい実施形態では、本発明の方法を用いて翻訳される目的タンパク質は膜タンパク質である。目的タンパク質をコードする構築物は、目的のタンパク質配列とインフレームで融合するアミノ酸タグをコードしてもよい。
【０１４３】
本発明のインビトロタンパク質合成システムに存在する核酸構築物は、目的の複数のタンパク質をコードすることができる。例えば、目的タンパク質をコードする核酸鋳型は固体支持体（ビーズ、マトリックス、チップ、アレイ、膜、シート、ディッシュ又はプレート）に結合していてもよい。
【０１４４】
本発明はまた、効率的なシステムのための方法、及び可溶性の、かつ容易に精製可能な形態の膜タンパク質をインビトロで合成する方法の提供に関する。これらの方法では、アポリポタンパク質を含むインビトロ翻訳反応においてＭＰＯＩが合成され、アポリポタンパク質は精製タグを有する。精製タグを使用したアポリポタンパク質の捕捉により、アポリポタンパク質の存在下でインビトロ合成された膜タンパク質との共単離が可能となる。アポリポタンパク質がＰＡＰに取り込まれる実施形態では、精製タグを使用したアポリポタンパク質の捕捉により、ＭＰＯＩを含むＰＡＰの単離が可能となる。ＭＰＯＩを組み込んだＰＡＰは多くのアッセイに使用でき、更には構造解析（例えばＮＭＲ又はＸ線結晶解析）に使用できる。
【０１４５】
他の実施形態では、目的の（ＭＰＯＩ）膜タンパク質はアポリポタンパク質の存在下で任意に翻訳されることができ、ＭＰＯＩは合成されたタンパク質を更に識別、単離、結合若しくは精製、又は固定するためにタンパク質タグを結合させてもよい。この場合、アポリポタンパク質は任意にタグを有していてもよい。
【０１４６】
本発明は更に、アポリポタンパク質（ＰＡＰの周囲、又はＰＡＰの周囲でない）を含むＩＶＰＳ反応におけるＰＯＩ（ＭＰＯＩを含む）（タンパク質のアイデンティティは公知でも公知でなくてもよい）のインビトロ合成方法の提供に関し、そこでは多くの反応が並行して（例えばマルチウェルプレートで）行われ、アッセイ用の多くの可溶性タンパク質が得られる。ベクター上の鋳型から当該タンパク質を発現させてもよく、当該ベクターはクローニング部位の付近に転写及び翻訳による発現用の配列を有する。ベクターを用いて、配列のライブラリをクローニングしてもよく、ＰＯＩとインフレームで発現されうるタンパク質タグ配列を任意に含んでなってもよい。
【０１４７】
好ましい実施形態では、ＰＡＰのアポリポタンパク質は、固体支持体（例えばマイクロウェル面、チップ表面、シート、膜、マトリックス又はビーズ）にＭＰＯＩを含むＰＡＰを結合させるのに用いるアフィニティタグ（例えばＨｉｓタグ、グルタチオンタグ、ストレプトアビジンタグなど）を含んでなってもよい。ＰＡＰと共に翻訳されるＭＰＯＩを、結合するＰＡＰへのそれらの挿入を経て、マイクロウェル、チップ表面、シート、膜、マトリックス又はビーズに固定化させてもよい。ＭＰＯＩの翻訳の前若しくは後に、ＰＡＰをＰＡＰの存在下で固体支持体に結合させてもよい。
【０１４８】
すなわち、本発明の方法を用いて膜タンパク質アレイ又はマルチウェルアッセイプレートを作製してもよく、ＰＡＰを含む局所化されたインビトロ翻訳反応により、アレイ上の特異的な部位に挿入された個々のＭＰＯＩを有するＰＡＰの結合が可能となる。かかるアレイを用いて、多くのタイプのスクリーニング及びアッセイ（酵素アッセイ、イオンチャネルアッセイ及び薬物結合試験を含むがこれらに限定されない）を実施できる。後述するような翻訳反応におけるＭＰＯＩの標識化を行い、アレイアッセイを簡便化してもよい。
【０１４９】
アレイ又はマルチウェルアッセイプレートを、アレイ又はプレート上で実施されるインビトロ翻訳反応によって調製してもよい。例えば、アレイ（又はウェル又はプレート）上の各部位に、細胞抽出物、ＰＡＰ及びＭＰＯＩをコードする核酸鋳型を含むＩＶＰＳ反応液を添加してもよい。ＰＡＰは、アポリポタンパク質に改変的に付与したＨｉｓ、グルタチオン、ストレプトアビジン又は他のタグを介してアレイと結合させてもよい。ＭＰＯＩは公知若しくは未知のタンパク質であってもよい。
【０１５０】
別の実施形態では、目的タンパク質のＮ末端又はＣ末端アミノ酸配列としてのタグをコードする配列を提供するベクターに、ＭＰＯＩをクローニングしてもよい。会合するリン脂質なしで調製できるアポリポタンパク質の存在下において、又はＰＡＰとの関連において翻訳されうるタンパク質を、当該タグを用いて更に単離、結合若しくは精製、又は固定してもよい。合成されたタンパク質は例えば、アフィニティ捕捉試薬で処置もしくはコーティングされたウェルの底、又はアレイ中の場所若しくはウェル、又はフィルタ、マトリックス、又はビーズに捕捉することができる。
【０１５１】
本発明にはまた、アポリポタンパク質を含むＩＶＰＳシステムで膜タンパク質を翻訳する方法が包含され、詳細には、ＭＰＯＩを識別用放射性同位元素、重同位元素標識又は蛍光標識（例えばアミノ基にＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬフルオロフォアを有するｔＲＮＡメチオニン（ｆｍｅｔ）（ミスアミノアシル化されている）を用いてＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬフルオロフォアをＮ末端に導入する）などによって翻訳の間に標識することを特徴とする。あるいは、ＭＰＯＩは標識（例えば蛍光標識）と結合できるタグを含む態様で改変されてもよい（非限定的な例として、ＬＵＭＩＯ（商標）テトラシステイン配列モティーフ検出技術（本願明細書に全開示内容を援用するＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡの、例えば米国特許出願公開２００３／００８３３７３号、米国特許第５９３２４７４号、米国特許第６００８３７８号、米国特許第６０５４２７１号、国際公開第９９／２１０１３、又はｈｉｓタグタンパク質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、ＣＡ）用のＰＲＯ−Ｑ（登録商標）Ｓａｐｐｈｉｒｅ  ５３２、３６５又は４８８  ホリゴヒスチジン染色が使用可能である）。当該方法は、アポリポタンパク質及び合成された膜タンパク質に組み込まれうる１つ以上の標識を含むインビトロ合成反応で膜タンパク質を翻訳することを含んでなる。代替的な実施形態では、当該方法は１つ以上のアポリポタンパク質を含むインビトロ合成反応で膜タンパク質を翻訳することを含んでなり、詳細には、翻訳された膜タンパク質が標識と結合できる１つ以上のタグを有する。当該方法におり、可溶化形態の、標識若しくはタグ付きの膜タンパク質の産生が可能となる。好ましい実施態様における当該方法により、可溶性が向上した、タグ付きの及び／又は標識された膜タンパク質の産生が可能となる。
【０１５２】
これらの方法の幾つかの好ましい実施形態では、ＩＶＰＳシステムに存在するアポリポタンパク質はＰＡＰ中に存在する。すなわち本発明には、リン脂質−アポリポタンパク質粒子及び合成された膜タンパク質に組み込まれることができる１つ以上の標識を含むインビトロ合成反応で膜タンパク質を翻訳し、標識された膜タンパク質を調製することが包含される。当該方法は、リン脂質−アポリポタンパク質粒子及び合成された膜タンパク質に組み込まれることができる１つ以上の標識を含むインビトロ合成反応で膜タンパク質を翻訳し、リン脂質−アポリポタンパク質粒子に挿入された状態の標識された膜タンパク質を調製することを含んでなる。代替的な実施形態では、当該方法は、膜タンパク質を１つ以上のリン脂質−アポリポタンパク質粒子を含むインビトロ合成反応で翻訳することを含んでなり、詳細には、翻訳された膜タンパク質内に標識と結合できる１つ以上のタグが含まれることを特徴とする方法である。当該方法は、膜タンパク質をリン脂質−アポリポタンパク質粒子を含むインビトロ合成反応で翻訳することを含んでなり、詳細には、翻訳された膜タンパク質内に標識と結合できる１つ以上のタグが含まれ、リン脂質−アポリポタンパク質粒子に挿入された状態のタグ付きの膜タンパク質が得られることを特徴とする方法である。
【０１５３】
ＰＡＰに挿入される膜タンパク質の標識化により膜タンパク質−リガンド結合の解析が可能となり、特にリガンドの結合により標識されたタンパク質の蛍光特性に影響が及ぶ。関連の実施形態では、リガンドを標識し、ＦＲＥＴなどの蛍光検出方法を用いることにより、リガンド−膜タンパク質結合を評価することが可能となる。すなわち本発明には、ＰＡＰを含むＩＶＰＳシステムで膜タンパク質を翻訳する方法であって、標識と直接又は間接的に結合できる標識又はタグが、翻訳された膜タンパク質に組み込まれる方法が包含される。
【０１５４】
ＰＡＰに挿入される膜タンパク質を標識することにより、限定されないが、タンパク質−タンパク質相互作用が標識されたタンパク質の蛍光特性に影響を及ぼす場合の、膜タンパク質−タンパク質の相互作用の検討（例えば受容体二量体化の検討）など、あらゆるタンパク質−タンパク質間相互作用を検討することも可能となる。タンパク質の一方又は両方を標識してもよい。
【０１５５】
アッセイ（リガンド結合、イオンチャネル活性及びタンパク質−タンパク質相互作用のアッセイを含むがこれに限定されない）をアレイ上で実施してもよく、当該アレイにはＭＰＯＩが挿入されたＰＡＰが含まれる。この場合、膜タンパク質上のアッセイをハイスループットで実施できるため、面倒でかつ定型的な精製工程を省略することができる。
【０１５６】
本発明にはまた、インビトロ翻訳法を使用した、通常のＰＡＰへの、２つ以上の異なる目的の膜タンパク質を組み込む方法が包含される。これらの実施形態では、異なる膜タンパク質を同じ若しくは異なる核酸鋳型分子を使用して、通常のインビトロ反応で発現されることができる。例えば、マルチサイトＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、ＣＡ）を用いて、同じベクター上の少なくとも２つのオープンリーディングフレームにおいてクローニングすることができる。翻訳の間、標識を当該タンパク質に組み込んでもよく、又は別々のタグを有する別々のタンパク質を合成し、別々の標識化試薬との結合に用いてもよい。このようにして、限定的ではないがＦＲＥＴ及びＴＲＥＴなどの蛍光測定を用いて、リン脂質二重層のタンパク質−タンパク質間相互作用、特に多くのタンパク質を有するタンパク質複合体内で生じるタンパク質−タンパク質相互作用をモニターしてもよい。幾つかの本発明の態様では、ＩＶＰＳシステムは細胞抽出物及びナノスケールリン脂質二重層ディスクを含んでもよく、詳細には当該ナノスケールのリン脂質二重層ディスクにはタンパク質転移機構に関与する構成要素が含まれる。タンパク質転移機構に関与する構成要素としてはＳｅｃ  ＹＥＧタンパク質が挙げられ、また哺乳類の相対物、タンパク質移動（ポア形成）タンパク質、ＳＲＰ受容体、リボソーム受容体なども挙げられ、それらにより膜タンパク質の挿入が促進される。他のタンパク質（ＳｅｃＡ、ＳｅｃＢ又はＦｔｓＹ（その中に））を反応系中に外添してもよいと考えられる。シャペロニンを添加して、タンパク質のフォールディング及び膜挿入を促進してもよい。
【０１５７】
タンパク質移動機構を構成する膜タンパク質成分を事前調製したＰＡＰに提供してもよく、その場合には、タンパク質移動に関与する当該タンパク質は、ＰＡＰを調製するための可溶化／透析法により挿入してもよく、又は本願明細書に記載のように、インビトロ翻訳システムを使用してＰＡＰに挿入してもよい。
【０１５８】
本発明にはまた、ＰＡＰ成分（すなわちリン脂質及び可溶化形態のアポリポタンパク質）を含むＩＶＰＳシステム及び方法が包含され、詳細には、ＭＰＯＩがＰＡＰ成分の存在下で翻訳され、ＰＡＰがＭＰＯＩとの反応により会合し、その結果、取り込まれたＭＰＯＩを有するＰＡＰが得られる。ＰＡＰ又は「ナノディスク」の製造方法については、例えば米国特許出願公開第２００５／０１８２２４３号に開示されている。本発明は、可溶化ＰＡＰ成分（アポリポタンパク質など、限定されないが本願明細書、及び米国特許出願公開第２００５／０１８２２４３号に開示）及びリン脂質をＩＶＰＳ反応中に提供し、ＭＰＯＩをコードする核酸鋳型を提供することを含んでなり、それにより、ＭＰＯＩがＰＡＰ成分の存在下で翻訳され、翻訳反応中にＰＡＰ中に取り込まれる。ＰＡＰの凝集は、ＭＰＯＩの翻訳反応の前、翻訳の間、又は翻訳の後に生じうる。
【０１５９】
ＩＶＰＳシステムに成分を提供することによってＰＡＰを調製する方法に、本願明細書に記載の他の実施形態と組み合わせることが可能であり、例えばタグ付きのアポリポタンパク質の使用、アレイ又はマルチウェルプレート上における、ＰＡＰ成分を用いたＭＰＯＩの翻訳、ＰＡＰ成分を用いた２つ以上のＭＰＯＩの翻訳、ＰＡＰ又はＰＡＰ成分を含むＩＶＰＳ反応混合物への、タンパク質転移関連の構成要素の添加、及びＰＡＰ又はＰＡＰ成分を含むＩＶＰＳ反応混合物における、１つ以上のタンパク質転移関連の構成要素の翻訳との組み合わせが挙げられる。
【０１６０】
アポリポタンパク質−膜タンパク質含有組成物
本発明の別の実施態様は、１つ以上のアポリポタンパク質と会合した１つ以上の膜タンパク質を含んでなる組成物の提供に関する。典型的には当該組成物は、１つ以上のアポリポタンパク質と１つ以上の膜タンパク質による、水溶液中の可溶化され、単離された複合体である。当該複合体は脂質（例えばリン脂質）を含んでなってもよい。膜タンパク質及びアポリポタンパク質の複合体は、実施態様によっては実質的に脂質フリーであってもよい。複合体の膜タンパク質は通常、本願明細書に開示されるようにアポリポタンパク質の存在下で、インビトロタンパク質合成システムを使用して合成される。本発明の本実施形態を例示する複合体として、界面活性剤フリーのものが挙げられる。当該複合体は、アポリポタンパク質、膜タンパク質の全長若しくは一部（通常は少なくともＮ末端部分を含む）、１つ以上のリボソーム、及び１つ以上のＲＮＡ分子（例えば膜タンパク質をコードするＲＮＡ分子）を含む無細胞複合体であってもよい。当該複合体は脂質を含有してもよく、又は実質的に脂質フリーであってもよい。当該複合体は単離された複合体であってもよい。当該複合体はアポリポタンパク質か膜タンパク質をコードする核酸鋳型を介して固体支持体に結合してもよく、又はアポリポタンパク質若しくは膜タンパク質（そのいずれかはペプチドタグを任意に含んでなってもよい）を経て結合してもよい。
【実施例】
【０１６１】
以下の実施例は本発明の例示的態様を示すが、本発明をいささかも限定するものではない。
【０１６２】
＜実施例１＞リン脂質−アポリポタンパク質粒子の存在下における非膜タンパク質のインビトロ発現
この実施例は、原核細胞系のインビトロ翻訳システムにおけるナノディスクの存在が非膜タンパク質の翻訳に影響を及ぼすことを示す。
【０１６３】
プラスミドＤＮＡ鋳型を使用するインビトロタンパク質合成反応液を以下の通りに調製した。スタンダードの５０又は１００μＬのＥＸＰＲＥＳＳＷＡＹ（商標）無細胞発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、ＣＡ）による反応液を、製造業者の指示に概ね従い調製し、３７℃でインキュベートした。当該反応液には、Ｓ３０バッファ（０．１％のトリトン−Ｘ１００液中に含まれる１ｍＬあたり２．５μｇのＧａｍタンパク質、８２０ＵのＴ７  Ｅｎｚｙｍｅ、２０ＵのＲＮａｓｅ  Ｏｕｔ、０．５μＬの３５Ｓ−メチオニン、１．２５ｍＭのアミノ酸）を使用して調製した大腸菌抽出物６００〜８００μｇ、及び１×ＩＶＰＳバッファ（５８ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．６）、１．７ｍＭのＤＴＴ、１．２ｍＭのＡＴＰ、０．８８ｍＭのＵＴＰ、０．８８ｍＭのＣＴＰ、０．８８ｍＭのＧＴＰ、３４μｇ／ｍＬのフォリン酸、３０ｍＭのリン酸アセチル、２３０ｍＭのグルタミン酸カリウム、１２ｍＭの酢酸マグネシウム、８０ｍＭのＮＨ４ＯＡｃ、０．６５ｍＭのｃＡＭＰ、３０ｍＭのホスホエノールピルビン酸塩、２％のポリエチレングリコール）中の０．５〜１μｇの鋳型ＤＮＡ（環状若しくは直鎖状）を含有させた。ベクターｐＣＲ２．１中のＣｙｃｌｅ  ３  ＧＦＰ遺伝子を鋳型とした。
【０１６４】
反応液にはまた、膜足場タンパク質及びリン脂質を含むリン脂質−アポリポタンパク質ナノスケール粒子、又は、本願明細書に全開示内容を援用する米国特許出願公開第２００５／０１８２２４３号（米国特許出願番号１１／０３３，４８９号）に記載のような、１μｍｏｌ〜４０μｍｏｌの濃度（蛋白質含有量に基づく）の「ナノディスク」を含有させた。ＭＳＰ１Ｔ２足場タンパク質（米国特許出願公開第２００５／０１８２２４３号）及びＤＯＰＣから構成される２７ｍｇ／ｍＬのＰＡＰストック液を用い、ＰＡＰを添加した。反応は、１．５〜２ｍｌのエッペンドルフ微量遠心管中で、３０℃若しくは３７℃サーモミキサー中で、２〜６時間の中程度に振盪（１０００〜１４００回転／分）で実施した。反応開始の３０分後に、反応液にフィード溶液を１等量（最初の反応ボリュームに対して）添加した。フィード溶液は５７．５ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、２３０ｍＭのグルタミン酸カリウム、１４ｍＭの酢酸マグネシウム、８０ｍＭの酢酸アンモニウム、２ｍＭの塩化カルシウム及び１．７ｍＭのＤＴＴを含有した。フィード溶液はまた、各々のアミノ酸を１．２５ｍＭ（メチオニンの１．５ｍＭを除く）、４５ｍＭのグルコース６リン酸、０．５ｍＭのＮＡＤＨ、１ｍＬあたり３４μｇのフォリン酸及び０．６５ｍＭのｃＡＭＰを含有した。タンパク質の放射性同位元素識別のため、１１７５ｃｉ／ｍｍｏｌｅの特異的な活性を有する３５Ｓ−メチオニン２μＬ（１００μＬの反応液あたり）を反応液に添加した。
【０１６５】
インキュベーション終了後、インビトロタンパク質合成反応は１０，０００×ｇで短時間に回転し、上澄及びペレット画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのレーンに別々にロードした。詳細には、各反応液の上澄５μｌをアセトン沈殿し、ペレット化し、４０μｌの１×ＬＤＳバッファ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、ＣＡ、１ｍＭのＤＴＴ含有）中に懸濁した。この懸濁液１０μｌを４〜１２％のＢｉｓ／トリスＮｕＰＡＧＥゲルにロードした。
【０１６６】
合成されたＧＦＰ及び可溶性ＧＦＰの量を、オートラジオグラフィで測定した（図１）。図１ａは、４μｍｏｌ及び４０μｍｏｌでリン脂質−アポリポタンパク質ナノスケールの粒子を翻訳反応に含有させても、非膜タンパク質の収率に実質的に有害な影響を及ぼさないことを示す、オートラジオグラフィに基づく棒グラフである。図１ｂは、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）４〜１２％のＢｉｓ−トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、ＣＡ）電気泳動に供した、４０μｍｏｌのＰＡＰの存在下（レーン３及び４）及び非存在下（レーン１及び２）において合成された全翻訳産物（レーン１及び３）及び可溶性翻訳産物（レーン２及び４）のオートラジオグラフィを示す。結果は、翻訳反応においてリン脂質−アポリポタンパク質ナノスケールの粒子を存在させても、インビトロで合成される非膜タンパク質（ＧＦＰ）の可溶性フラクションが検出可能な程に増加しないことを示す。
【０１６７】
＜実施例２＞ナノディスクの存在下における膜タンパク質のインビトロ合成
本実施例は、インビトロ翻訳システムにおけるリン脂質−アポリポタンパク質粒子の存在により、原核及び真核生物起源の膜タンパク質の可溶化形態における合成収率が向上することを示す。
【０１６８】
３５Ｓ−メチオニンを用いて、２０μｍｏｌのＰＡＰを含むＥＸＰＲＥＳＳＷＡＹ（商標）無細胞発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、ＣＡ）で反応を行わせ、ＥｍｒＥ（細菌膜タンパク質、多剤耐性タンパク質）を翻訳した。実施例１にて説明したのと同様にインビトロタンパク質合成反応を実施した。インビトロ合成反応から得られた全タンパク質及び可溶性タンパク質を、実施例１にて説明したように電気泳動に供した。翻訳産物を電気泳動に供した後の、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）４〜１２％Ｂｉｓ−トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、ＣＡ）のオートラジオグラフィの結果を図２ａの棒グラフで示す。インビトロ翻訳混合物中におけるＰＡＰの存在により、可溶性ＥｍｒＥタンパク質の収率が少なくとも５倍向上した。
【０１６９】
また翻訳産物をＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ（商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）３〜１２％Ｂｉｓ−トリスゲル電気泳動に供し、オートラジオグラフィを行い、合成されたタンパク質が複合体として存在するか否かを解析した。ＰＡＰの非存在下で翻訳されるＥｍｒＥタンパク質はゲル中に移動せず、むしろウェルの底に残留し、おそらく凝集しているものと考えられた。２０又は２５μｍｏｌのＰＡＰの存在下で合成されるＥｍｒＥタンパク質はゲル中に移動し、ＰＡＰのみ（ＩＶＰＳ反応に由来しない）の場合よりも高分子量範囲に移動していた。ＧＦＰ（可溶性非膜タンパク質）は合成の際のＰＡＰの有無に関係なく、ネイティブゲル中で同様に移動したが、これはＥｍｒＥ（膜タンパク質）のようにＰＡＰに取り込まれないことを示すものである。
【０１７０】
更に、哺乳類の膜タンパク質、ヒトカリウムチャネルサブファミリーＫのメンバー１３タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＮＭ０２２０５４、ｇｉ１６３０６５５４、Ｕｌｔｉｍａｔｅ（商標）ＯＲＦクローンコレクションから入手可能なｃＤＮＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、６つの膜貫通ドメインを有する４５ｋＤａのタンパク質）を、実施例１において説明したＥＸＰＲＥＳＳＷＡＹ（商標）無細胞発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、ＣＡ）を用いて反応させ（反応系中に４μｍｏｌのＰＡＰを含む）、インビトロで翻訳した。ｐＥＸＰ３ベクターを用い、反応液中に、１００μＬの反応液あたり７００ｎｇで鋳型を添加した。インビトロ合成反応から得られた全タンパク質及び可溶性タンパク質を、実施例１にて説明したように電気泳動に供した。翻訳産物を電気泳動に供した後の、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）４〜１２％Ｂｉｓ−トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、ＣＡ）のオートラジオグラフィの結果を、図２ｂの棒グラフに示す。この場合、ＰＡＰの存在により可溶性膜タンパク質の量が２倍以上増加した。
【０１７１】
＜実施例３＞ＩＮ  ＶＩＴＲＯ合成された膜タンパク質の、リン脂質−アポリポタンパク質粒子との共局在化
本実施例は、インビトロ翻訳システムにおけるリン脂質−アポリポタンパク質粒子の存在が、合成された膜タンパク質のＰＡＰへの挿入をもたらすことを示す。
【０１７２】
アポリポタンパク質粒子タンパク質又は足場タンパク質（ＭＳＰ１Ｔ２）にＨｉｓタグを含有させた。ＭＳＰ１Ｔ２  Ｈｉｓタグ付きの足場タンパク質を用いて調製した２０μｍｏｌのＰＡＰを、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を使用して精製できた（図３ａ、クーマシー染色したゲルのレーン５−８、カラム溶出フラクションを含む）。コントロールとして、ＥｍｒＥタンパク質を、実施例１において説明したＥＸＰＲＥＳＳＷＡＹ（商標）無細胞発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、ＣＡ）を用いて、ＰＡＰの非存在下で、３５Ｓ−メチオニンを含む無細胞翻訳反応中で合成させた。ＥｍｒＥ（Ｈｉｓタグなし）はＮｉ−ＮＴＡ樹脂で精製されなかった（図３ｂ、レーン５−８、カラム溶出フラクションを含む）。しかしながら、Ｈｉｓタグ付き改変アポリポタンパク質タンパク質を有するＰＡＰを反応液に添加することにより、ＥｍｒＥ（ＰＡＰのリン脂質結合タンパク質と共精製する）はＮｉ−ＮＴＡ樹脂で精製された（図３ｃ、レーン５−８は、カラム溶離液分数を含む）。すなわち、ＥｍｒＥが精製タグを有するＰＡＰに挿入されたことを示すものである。
【０１７３】
Ｎａｔｉｖｅ  Ｂｌｕｅゲルの解析により結果を評価し、ＰＡＰなしで発現させた、放射性同位元素識別された細菌の膜タンパク質ＥｍｒＥ（約０．３μｇのタンパク質をロード）がゲルの上部で凝集していることが明らかとなった（図５ａ、レーン２、ａｕｔｏｒａｄ）。しかしながら、ＰＡＰを発現反応液に添加したとき、ＥｍｒＥは複合体を形成し（図４ａ、レーン３、４、ａｕｔｏｒａｄ）、それはゲル中に移行し、ＰＡＰより高い分子量で移動した（図４ｂ、レーンＪ、クーマシー染色したゲル）。ＧＦＰ（非膜タンパク質）を、翻訳システムへのＰＡＰの添加の有無に関係なく、同じ分子量を示した（図４ａ、それぞれレーン５及び６）。
【０１７４】
＜実施例４＞Ｈｉｓタグ付きナノディスクによるインビトロ合成した膜タンパク質は、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂で精製できる
本実施例では、インビトロ翻訳システムにおけるナノディスクの存在が、タグ付きのナノディスクを使用して合成された膜タンパク質の精製を可能にすることを示す。
【０１７５】
ＧＦＰ及びＭｓｃＬ遺伝子（細菌機械感受性チャネル（１７ｋＤａ）膜タンパク質）をｐＥＸＰ４ベクターにクローニングした。両方の遺伝子が停止コドンを含むため、発現されたタンパク質のＣ末端はＨｉｓタグが付いていなかった。３５Ｓ−メチオニンを含み、１μｇのＧＦＰ及びＭｓｃＬ鋳型を使用するＥＸＰＲＥＳＳＷＡＹ（商標）無細胞発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、ＣＡ）に、Ｈｉｓ−タグ付足場タンパク質を含むＰＡＰ（４０μｍｏｌ）を添加した（又は添加しなかった）。インキュベート後、反応液をＮｉ−ＮＴＡカラム上へロードした。
【０１７６】
カラム精製の結果を図５に示す（Ｌ＝ロード、ＦＴ＝フロースルー、Ｗ＝洗浄、Ｅ１〜Ｅ４＝溶出）。ナノディスクの翻訳反応（図５ａ及び５ｂ）における存在に関わりなく、ＧＦＰ（膜タンパク質でない）はＮｉ−ＮＴＡカラムを使用して精製できないことを示す。ＭｓｃＬは、ナノディスクが翻訳反応（図５ｃ及び５ｄ）に含まれる場合にのみ、Ｎｉ−ＮＴＡカラムで精製できることが示された。すなわちＭｓｃＬがＰＡＰに挿入されることを示す。
【０１７７】
＜実施例５＞ナノディスクを用いてインビトロ合成された膜タンパク質は、ナノディスクと会合し、可溶性が向上する
本実施例は、インビトロ翻訳システムにおけるリン脂質−アポリポタンパク質粒子の存在により、可溶性が向上した膜タンパク質が合成され、それがＰＡＰに挿入され、可溶性を向上させることを示すものである。
【０１７８】
３５Ｓ−メチオニンを含むＥＸＰＲＥＳＳＷＡＹ（商標）無細胞発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、ＣＡ）に含まれるｐＥＸＰ３ベクターを用い、細菌膜タンパク質ＥｍｒＥ及び哺乳類のＯＲＦｓ“ＩＯＨ５３８４”（ヒト原形質膜プロテオリピド（ｐｌａｓｍｏｌｉｐｉｎ）をコードする）及び“ＩＯＨ２２６６９”（ヒトアドレノメデュリン受容体（ＡＤＭＲ）をコードする）を発現させた。インビトロ合成反応から得た全タンパク質及び可溶性フラクションのアリコートを、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ−トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、ＣＡ）上で泳動させた結果、ＰＡＰをインビトロ合成反応に添加したときに細菌及び哺乳類の膜タンパク質の可溶性が向上することを示したが、ＧＦＰの可溶性はインビトロ合成反応におけるＰＡＰの存在の有無により影響を受けなかった（図６ａ及び６ｂ）。
【０１７９】
図６ｃのブルーネイティブゲルのオートラジオグラフィでは、細菌膜タンパク質ＥｍｒＥ、哺乳類のＯＲＦｓＩＯＨ  ５３８４（ヒト原形質膜プロテオリピド（ｐｌａｓｍｏｌｉｐｉｎ）をコード）、及びＩＯＨ２２６６９（ヒトアドレノメデュリン受容体（ＡＤＭＲ）をコード）がＰＡＰに挿入されることを示す。ＰＡＰを反応液に添加したとき、放射性同位元素識別されたＥｍｒＥ、ＩＯＨ  ５３８４及びＩＯＨ２２６６９は上方へシフトした。ＧＦＰ（非膜タンパク質）は、インビトロ合成反応へのＰＡＰの添加の有無にかかわらず同じ分子量を示した。
【０１８０】
＜実施例６＞挿入された膜タンパク質のＬＵＭＩＯ検出
ＥｍｒＥ（細菌膜タンパク質）の遺伝子は、ＬＵＭＩＯ（商標）テトラシステインのモティーフタグ（ｐＥＸＰ６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、ＣＡ）を含むＮ末端ベクターにクローニングした。ＥｍｒＥ構築物はＨｉｓタグを含まなかった。ＰＡＰ（４０μｍ）をＥＸＰＲＥＳＳＷＡＹ（商標）無細胞発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、ＣＡ）の反応液に添加したか又は添加せず、合成終了後、反応液をＮｉ−ＮＴＡカラム上へロードした（Ｌ＝ロード、ＦＴ＝フロースルー、Ｗ＝洗浄、Ｅ１〜Ｅ４＝溶出）。ＬＵＭＩＯ（商標）検出試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、ＣＡ）を、ＬＵＭＩＯ（商標）グリーンｉｎ−ｇｅｌ検出キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、ＣＡ）の製造業者の指示に従い、４〜１２％ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｂｉｓ−トリスゲルの解析前にサンプルに添加し、当該ゲルをｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒでイメージングした。図７ａにおいて、ＰＡＰを含む翻訳反応液を解析した。Ｎｉ−ＮＴＡカラム（ＰＡＰの足場タンパク質のＨｉｓタグを使用した精製）から溶出したフラクションにおけるＬＵＭＩＯ（商標）配列（ＥｍｒＥ翻訳産物）を検出した。図７ｂにおいて、ＰＡＰを含まない翻訳反応液を解析した。Ｎｉ−ＮＴＡカラムからの溶出フラクションにおいて、ＬＵＭＩＯ（商標）配列（ＥｍｒＥ翻訳産物）は検出されなかった。以上より、膜タンパク質はＰＡＰに取り込まれて可溶化形態においてインビトロで合成でき、ＰＡＰのアポリポタンパク質上のタグを使用して効率的に精製できる。
【０１８１】
＜実施例７＞ナノディスクを含む、真核生物系のインビトロタンパク質合成反応
ＰＡＰを含まないか、又は０．１〜１９μｍｏｌのＰＡＰを含む無細胞ＣＨＯ細胞抽出物において、ルシフェラーゼタンパク質を発現させた。ｍＭｅｓｓａｇｅＭａｃｈｉｎｅ（ＡＭＢＩＯＮ）を使用して、ルシフェラーゼ遺伝子を含むｐＥＸＰ４ベクターからＲＮＡを調製した。翻訳反応において６μｇのＲＮＡを用いた。
【０１８２】
ＣＨＯ細胞抽出物を以下のプロトコルに従って調製した。
細胞数／生存度を測定する。
１．  穏やかに遠心分離（１０分間、８００〜１０００ｒｐｍ）し、細胞を回収する。
２．  バッファＡに４ｍＭ  ＤＴＴを添加する。
３．  ２５０ｍＬのバッファＡで細胞を洗浄する（非常に穏やか。細胞を完全に再懸濁させてはならない）。
４．  ２５０ｍＬのバッファＡで細胞を洗浄する（単にバッファを添加するのみ、細胞を再懸濁しない）。
５．  半ペレットボリュームのバッファＡ（＋１ｍＭ  ＰＭＳＦ）にペレットを再懸濁する。
６．  細胞計数用にアリコートをサンプリングする。
７．  １００ｐｓｉのフレンチプレスを通す。
８．  細胞計数用にアリコートをサンプリングする。
９．  両方のアリコートの細胞数／生存度を測定する。第１のアリコートでは大部分の細胞が正常でなければならない。第２のアリコートでは細胞は＜２０％の生存度でなければならない。
１０．  １５分×１４０００回転／分で遠心分離する（マイクロ遠心分離機で操作）。
１１．  上澄を回収する（更なる使用法のためペレットを−８０℃で保存する）。
１２．  １ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１５Ｕ／μｌのミクロコッカス由来ヌクレアーゼを添加する。
１３．  ５分間、ＲＴでインキュベートする。
１４．  ２ｍＭのＥＧＴＡを添加し反応を停止させる。
１５．  ５０〜８０μｌのサンプルを採取し、急速に液体Ｎ２中で凍結させ、−８０℃で保存する。
１６．  上澄（１／２００希釈）のＡ２６０及びＡ２８０。を測定する。＞１００ユニットでなければならない。
バッファＡ
４０ｍＭのＨｅｐｅｓ  ＫＯＨ（ｐＨ７．８）、
１００ｍＭ  ＫＯＡｃ、
４ｍＭマグネシウム（ＯＡｃ）２、
４ｍＭ  ＤＴＴ（調製直後のものを使用）。
５ｍｇ／ｍｌ（０．５μｌ）クレアチンキナーゼ、Ｂｕｆｆｅｒ  ＃２  Ｐｒｏｔｅｉｏｓ小麦麦芽システム（１．５μｌ）、ＲＮａｓｅＯｕｔ（０．２５μｌ）、Ｂｕｆｆｅｒ  ＃１（０．８５ｕｌ）、Ｓｍｅｔ（０．５μｌ）及びＢＨＫ抽出物（６μｌ）を使用して翻訳した。翻訳反応液を３３℃で１時間にインキュベートした。各翻訳反応液２．５μｌをルシフェラーゼ解析用に用いた。
タンパク質合成反応の終了後、ルシフェラーゼ活性を検出した。図８に示すように、ＰＡＰの存在によってもＣＨＯ細胞抽出物のタンパク質合成において有害な効果が示されなかった。
細菌膜タンパク質ＥｍｒＥ、ヒトＯＲＦ  ２１１３２、小嚢関連のカルモジュリン−結合タンパク質、ヒトＯＲＦ  ２１１４０サイクリン依存性のキナーゼ２（ＣＤＫ２）及びルシフェラーゼを、３５Ｓ−メチオニンを含むウサギ網状赤血球溶解物による転写−翻訳発現システム（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用い、製造業者による指示に従い翻訳した。１つの反応セットにおいて、合成システム中に２７ｍｇ／ｍＬのＰＡＰを１．２５μＬを添加した。第二の反応セットにおいて、合成システム中にＰＡＰを添加しなかった。翻訳産物はＢｌｕｅ  Ｎａｔｉｖｅゲル泳動し、オートラジオグラフィを行った。図９は、膜タンパク質ＥｍｒＥの場合、溶解度の増加（放射性同位元素識別されたタンパク質生成物がゲル中に入り、移動する）が、ＰＡＰの存在下で見られたことを示す。これは、非膜タンパク質  ヒトＯＲＦ  ２１１３２（小嚢関連のカルモジュリン−結合タンパク質）、ヒトＯＲＦ  ２１１４０サイクリン依存性キナーゼ２（ＣＤＫ２）及びルシフェラーゼではそのような現象が見られなかった。図１０は、同じ結果がＣＨＯ細胞抽出物を使用して得られたことを示す。
【０１８３】
＜実施例８＞インビトロ合成反応において、アポリポタンパク質と共発現させた場合の、膜タンパク質の可溶性の向上
この実施例は、ＰＡＰを含まないインビトロ翻訳システムにおけるアポリポタンパク質構築物の存在により、可溶化形態の膜タンパク質の合成が促進されることを示す。
【０１８４】
別個の試験において、細菌膜タンパク質及び哺乳類の膜タンパク質を、無細胞合成システム中でプラスミド構築物から転写、翻訳した。１つの試験セットでは、ベクターｐＥＸＰ５−ＮＴ中に細菌膜タンパク質ＥｍｒＥをコードする遺伝子をクローニングして目的タンパク質（ＰＯＩ）の構築物を作製した。他の試験セットでは、ベクターｐＥＸＰ５−ＮＴ中にヒト膜タンパク質ＧＡＢＡ  Ａ受容体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＵＬＴＩＭＡＴＥ（商標）ＯＲＦコレクション  クローンＩＯＨ１０８８５（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＢＣ０２２４４９、ｇｉ１８４９０２６６）をコードする遺伝子をクローニングし、目的タンパク質又は「第１の」構築物を作製した。両方の実験において、ヒトアポリポタンパク質Ａ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＵＬＴＩＭＡＴＥ（商標）ＯＲＦコレクション  クローンＩＯＨ７３１８、Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＮＭ００８３９、ｇｉ４５５７３２０をコードする構築物、ｐＥＸＰ３−Ａｐｏｌを幾つかのインビトロ合成反応に用い、その結果、Ａｐｏ  Ａ１が目的の膜タンパク質と同じ反応系内で発現した。
【０１８５】
プラスミドＤＮＡ鋳型を使用するインビトロタンパク質合成反応液を以下の通りに調製した：標準的な１００μＬのＥＸＰＲＥＳＳＷＡＹ（商標）の反応液を調製し、基本的に製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバッド、ＣＡ）の指示に従い、３７℃でインキュベートした。１μｇのＤＮＡ構築物を反応の各々に添加した。１．５〜２ｍｌの微量遠心管中、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ中で、２〜６時間の中程度に振とう（１０００〜１４００回転／分）で３０℃若しくは３７℃で反応を実施した。反応開始の３０分後に、製造業者の指示（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｗａｙマニュアル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバッド、ＣＡ）に従って、反応液にフィード溶液を１等量（第１の反応ボリュームに対して）を添加した。タンパク質を放射性同位元素識別するため、３５Ｓ−メチオニンを反応液に添加した。
【０１８６】
目的の膜タンパク質ごとに、ｐＥＸＰ３−Ａｐｏｌの有無において反応を実施した。更に、各反応セットをリン脂質の有無（ＥｍｒＥ翻訳反応の場合、ＤＭＰＣを１００μｇ／ｍＬ、ＧＡＢＡ  Ａ受容体翻訳反応の場合、ＤＰＰＣを１００μｇ／ｍＬ）において実施した。
【０１８７】
インキュベート終了後、インビトロタンパク質合成反応液を１０，０００×ｇで短時間にスピンし、上澄及びペレット画分をＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルのレーンに別個にロードした。各反応の上澄５μｌをアセトン沈殿し、ペレット化し、１×ＬＤＳバッファ（１ｍＭのＤＴＴを含む）４０μｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に懸濁させ、その１０μｌを４〜１２％Ｂｉｓ−トリスＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲルにロードした（図１１）。
【０１８８】
試験の結果、翻訳反応におけるＡｐｏ  Ａ１構築物の存在により、Ａｐｏ  Ａ１構築物（レーン５及び６）の存在しない場合の翻訳と比較して、可溶性ＥｍｒＥの収率が増加した（レーン７及び８、図１１ａ）。可溶性の収率と比較してとき、Ａｐｏ  Ａ１も非常にＧＡＢＡ  Ａ（レーン７及び８、図１１ｂ）の可溶性の歩留まりを改善するＡｐｏ  Ａ１構築物（レーン５及び６）がない場合。オートラジオグラフィにおいても、アポリポタンパク質Ａ１自体が可溶化形態で発現されることが明示された（図１１ａ及び１１ｂのレーン３及び４）。
【０１８９】
＜実施例９＞アポリポタンパク質の存在下における膜タンパク質のインビトロ合成
本実施例は、インビトロ翻訳システムにおけるアポリポタンパク質の存在が、可溶化状態の膜タンパク質の合成収率が向上することを示す。
【０１９０】
ＥｍｒＥ（細菌膜タンパク質）を、前記の実施例で説明したとおりにＥＸＰＲＥＳＳＷＡＹ（商標）インビトロ合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバッド、ＣＡ）で、３５Ｓ−メチオニンを使用して翻訳した。翻訳は２．５〜１５μｇのＡｐｏ  Ａ１タンパク質を含有させた状態で行った。インビトロ合成により調製された全タンパク質及び可溶性タンパク質をゲル電気泳動に供し、オートラジオグラフィを行った。その結果、インビトロ合成反応によりＡｐｏ  Ａ１タンパク質の産生量が増加し、可溶性の膜タンパク質の産生量が増加した（図１２ａ）。
【０１９１】
更に、哺乳類の膜タンパク質（ヒトＧＡＢＡ  Ａ受容体蛋白）を、２．５〜１５μｇのＡｐｏ  Ａ１のタンパク質を含有するインビトロ翻訳システムで翻訳した。この場合も、翻訳システムにおけるＡｐｏ  Ａ１タンパク質の存在により、可溶性膜タンパク質の量が大幅に増加した（図１２ｂ）。
【０１９２】
＜実施例１０＞インビトロ合成システムにおける、アポリポタンパク質と翻訳された膜タンパク質との会合
本実施例は、インビトロ翻訳システム（膜タンパク質が合成される）におけるＡｐｏ  Ａ１タンパク質の存在が、可溶性膜タンパク質の合成を可能とし、Ａｐｏ  Ａ１が翻訳後のタンパク質と会合することを示すものである。本実施例はまた、アポリポタンパク質が存在する場合には、界面活性剤が存在しなくとも、通常界面活性剤の存在時における膜タンパク質の可溶性が維持されることを示すものである。
【０１９３】
総液量１００μＬにおいて、Ｅｘｐｒｅｓｓｗａｙ  インビトロ翻訳反応を実施した。ＥｍｒＥ遺伝子を核酸鋳型として用い、Ｎ末端にＨｉｓタグをコードするｐＥＸＰ５−ＮＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、ＣＡ）中に、インフレームとなるようにクローニングした。ヒト血漿から精製したＡｐｏ  Ａ１をインビトロ合成反応中に含有させた。製造業者の指示に従ってインビトロ合成反応を実施した後、インビトロ合成したＥｍｒＥ（Ｈｉｓタグ付き）を、２０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、２００ｍＭのＮａＣｌを用い、グラビティフローによってＮｉ−ＮＴＡカラムで精製した。ドデシルマルトーシド界面活性剤（通常ＥｍｒＥ可溶性を維持するためにバッファに添加する）を省略した。
【０１９４】
同じトリス−ＮａＣｌバッファ中の１Ｍのイミダゾールを使用してＥｍｒＥタンパク質を溶出した。図１３ａに示されるクーマシーゲルは、タグ無しのＡｐｏ  Ａ１タンパク質（２６ｋＤａ）が、Ｈｉｓタグ付きのＥｍｒＥと共精製されたことを示す（Ｍはタンパク質分子量マーカー、Ｌはロードしたフラクション、ＦＴはフロースルー、Ｗ１及びＷ２は一連のカラム洗浄、Ｅ１〜Ｅ４は一連の溶出フラクションを示す）。オートラジオグラフィにより、精製されたＡｐｏ  Ａ１タンパク質と同じフラクションにＥｍｒＥタンパク質が溶出されていることを確認し（図１３ｂ）、すなわちタンパク質間の物理的な会合を示すものである。
【図面の簡単な説明】
【０１９５】
【図１】ａ）は、４μｍｏｌ及び４０μｍｏｌのＰＡＰの存在下（各対の右カラム）及び非存在下（各対の左カラム）における、ＩＶＰＳ反応で産生されるＧＦＰを表す棒グラフ。ｂ）は、ＰＡＰの存在下及び非存在下における、ＩＶＰＳ反応で産生されるＧＦＰを表すａｕｔｏｒａｄ。
【図２】ａ）は、２０μｍｏｌのＰＡＰの存在下及び非存在下における、細菌ＥｍｒＥの総発現及び可溶性発現を示す棒グラフ。ｂ）は、４μｍｏｌのＰＡＰの存在下及び非存在下における、哺乳類のカリウムチャネルタンパク質の総発現及び可溶性発現を示す棒グラフ。
【図３】ａ）は、Ｈｉｓタグを融合させた改変アポリポタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂で精製し、クーマシー染色したＰＡＰのゲルを表す。レーン５−８は溶出フラクションである。ｂ）は、ＥｍｒＥタンパク質（ＰＡＰなし）の翻訳、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂への結合後の溶出に関し、クーマシー染色したゲルを表す。レーン５−８は溶出フラクションであるｃ）は、ＰＡＰを用いて翻訳されたＥｍｒＥタンパク質のクーマシー染色したゲルを表す。Ｈｉｓタグを融合させた改変アポリポタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂で精製した。レーン５−８は溶出フラクションである。
【図４】ＰＡＰの存在下（レーン３及び４）、及びＰＡＰの非存在下（レーン２）で翻訳されるＥｍｒＥタンパク質、及びＰＡＰの存在下（レーン６）又は非存在下（レーン５）で発現するＧＦＰのオートラジオグラフィである。
【図５】ｈｉｓ−タグ付の改変アポリポタンパク質を有するＰＡＰのａ）存在下及びｂ）非存在下におけるＧＦＰの翻訳産物、並びにｈｉｓ−タグ付の改変アポリポタンパク質を有するＰＡＰのｃ）存在及びｄ）非存在下におけるＭｓｃＬの翻訳産物の、Ｎｉ−ＮＴＡによる精製を示すゲルのａｕｔｏｒａｄｓを示す。
【図６】ＰＡＰの存在下翻訳されたＧＦＰの翻訳産物（ａ及びｂ）、及びＰＡＰの存在下で翻訳されたＥｍｒＥ翻訳産物（ｃ）のゲルのａｕｔｏｒａｄｓを示す。
【図７】ａ）はＰＡＰを含有させた翻訳反応において合成されたｌｕｍｉｏ配列による、ＥｍｒＥのｌｕｍｉｏ検出を示す。ｂ）はＰＡＰを含有させなかった翻訳反応において合成されたｌｕｍｉｏ配列による、ＥｍｒＥのｌｕｍｉｏ検出を示す。
【図８】ＰＡＰの量を増加させてルシフェラーゼの翻訳反応を行わせた場合の、ルシフェラーゼ活性を示す棒グラフ。
【図９】ＰＡＰを含有させた場合、若しくは含有させなかった場合の、ウサギ網状赤血球の翻訳反応産物の、ネイティブゲルのオートラジオグラフィを示す。
【図１０】ＰＡＰを含有させた場合、若しくは含有させなかった場合の、ウサギ網状赤血球の翻訳反応産物の、ネイティブゲルのオートラジオグラフィを示す。
【図１１】Ａｐｏ  Ａ−Ｉを含有するか若しくは含有しない場合の、インビトロタンパク質合成反応の翻訳産物を電気泳動に供した後のゲルのオートラジオグラフィを示す。（Ａ）インビトロタンパク質合成反応において、細菌ＥｍｉΕタンパク質の全収量は、アポリポタンパク質又はリン脂質の存在下で影響を受けない（レーン１−４）が、可溶性のＥｍｒＥタンパク質の収量は、アポリポタンパク質の存在下で強化された（レーン５−８）。（Ｂ）インビトロタンパク質合成反応において、哺乳類のＧＡＢＡ  Ａタンパク質の全収量は、アポリポタンパク質又はリン脂質の存在下で影響を受けない（レーン１−４）が、可溶性のＧＡＢＡ  Ａタンパク質の収量は、アポリポタンパク質の存在下で強化された（レーン５−８）。
【図１２】Ａｐｏ  Ａ-Ｉの非存在下、又はＡｐｏＡ-Ｉの含有量を変えた条件において、インビトロタンパク質合成反応を行い、その翻訳産物を電気泳動に供したときの、ゲルのオートラジオグラフィを示す。（Ａ）インビトロタンパク質合成反応において、細菌ＥｍｒΕタンパク質の全収量は、アポリポタンパク質の存在下で影響を受けない（レーン１−４）が、可溶性のＥｍｒＥタンパク質の収量は、アポリポタンパク質の存在下で強化された（レーン５−８）。（Ｂ）インビトロタンパク質合成反応において、哺乳類のＧＡＢＡ  Ａタンパク質の全収量は、アポリポタンパク質の存在下で影響を受けない（レーン１−４）が、可溶性のＧＡＢＡ  Ａタンパク質の収量は、アポリポタンパク質の存在下で強化された（レーン５−８）。
【図１３】Ａｐｏ Ａ-Ｉを含有するインビトロタンパク質合成反応における、ｈｉｓタグを融合させ、３５ＳラベルしたＥｍｒＥ翻訳産物をＮｉ−ＮＴＡカラムで単離した後、電気泳動に供したときの、ゲル染色及びゲルのオートラジオグラフィを示す。（Ａ）カラムフラクションはＡｐｏ  Ａ１とＥｍｒＥの共溶出を示す。（Ｂ）オートラジオグラフィにより、溶出されたフラクション中におけるＥｍｒＥの存在が確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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