(57)【要約】  本発明は、新規な抗CD26抗体および他の関連するポリペプチドならびに抗体およびポリペプチドをコードする新規なポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、抗体およびポリペプチドを作製するための方法も提供する。抗体またはポリペプチドを含む組成物および細胞をさらに提供する。細胞増殖を阻害するためのおよびCD26に関連する状態の治療における等の抗体および/またはポリペプチドを使用するための方法もまた提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)(i)配列GX1X2LX3TYGVH(配列番号31)［式中、X1はFまたはYであり、X2はSまたはTであり、X3はT、N、またはSである］を含む重鎖CDR1、(ii)配列VIWGX1GRTDYDX2X3FMS(配列番号32)［式中、X1はGまたはDであり、X2はAまたはSであり、X3はAまたはSである］を含む重鎖CDR2、および(iii)配列X1RHDWFDY(配列番号33)［式中、X1はNまたはSである］を含む重鎖CDR3からなる群から選択される1つまたは複数の重鎖CDR、
(b)(i)配列X1ASQX2IRNX3LN(配列番号34)［式中、X1はSまたはRであり、X2はGまたはDであり、X3はSまたはNである］を含む軽鎖CDR1、(ii)配列YSSNLX1X2(配列番号35)［式中、X1はHまたはQであり、X2はSまたはTである］を含む軽鎖CDR2、および(iii)配列QQSX1KLPX2T(配列番号36)［式中、X1はIまたはNであり、X2はFまたはLである］を含む軽鎖CDR3からなる群から選択される1つまたは複数の軽鎖CDR、または
(a)において示される1つまたは複数の重鎖CDRおよび(b)において示される1つまたは複数の軽鎖CDR、を含むポリペプチドであって、
但し、配列QVKLQESGPGLVQPSQTLSITCTVSGFSLTTYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWGGGRTDYDAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAIYYCVRNRHDWFDYWGQGTTVTVSS(配列番号90)の重鎖可変領域および配列DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCSASQGIRNSLNWYQQKPDGAVKLLIYYSSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFSLTISNLEPEDIATYYCQQSIKLPFTFGSGTKLEIK(配列番号91)の軽鎖可変領域の両方は含まない、ポリペプチド。
【請求項２】
(a)において示される1つまたは複数の重鎖CDRを含む、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項３】
(i)配列GX1X2LX3TYGVH(配列番号31)［式中、X1はFまたはYであり、X2はSまたはTであり、X3はT、N、またはSである］を含む重鎖CDR1、(ii)配列VIWGX1GRTDYDX2X3FMS(配列番号32)［式中、X1はGまたはDであり、X2はAまたはSであり、X3はAまたはSである］を含む重鎖CDR2、および(iii)配列X1RHDWFDY(配列番号33)［式中、X1はNまたはSである］を含む重鎖CDR3、を含む、請求項2に記載のポリペプチド。
【請求項４】
(i)配列X1ASQX2IRNX3LN(配列番号34)［式中、X1はSまたはRであり、X2はGまたはDであり、X3はSまたはNである］を含む軽鎖CDR1、(ii)配列YSSNLX1X2(配列番号35)［式中、X1はHまたはQであり、X2はSまたはTである］を含む軽鎖CDR2、および(iii)配列QQSX1KLPX2T(配列番号36)［式中、X1はIまたはNであり、X2はFまたはLである］を含む軽鎖CDR3、
をさらに含む、請求項3に記載のポリペプチド。
【請求項５】
重鎖CDR1が、GFSLTTYGVH(配列番号55)、GFSLSTYGVH(配列番号56)、およびGYSLTTYGVH(配列番号57)からなる群から選択される配列を含む、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６】
重鎖CDR2が、VIWGDGRTDYDAAFMS(配列番号58)およびVIWGDGRTDYDSSFMS(配列番号59)からなる群から選択される配列を含む、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７】
重鎖CDR3が、配列NRHDWFDY(配列番号60)を含む、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８】
(a)(i)配列GFSLTTYGVH(配列番号55)を含むCDR1、
(ii)配列VIWGDGRTDYDAAFMS(配列番号58)を含むCDR2、および
(iii)配列NRHDWFDY(配列番号60)を含むCDR3、
を含む重鎖CDR、
(b)(i)配列GFSLSTYGVH(配列番号56)を含むCDR1、
(ii)配列VIWGDGRTDYDAAFMS(配列番号58)を含むCDR2、および
(iii)配列NRHDWFDY(配列番号60)を含むCDR3、
を含む重鎖CDR、または
(c)(i)配列GYSLTTYGVH(配列番号57)を含むCDR1、
(ii)配列VIWGDGRTDYDSSFMS(配列番号59)を含むCDR2、および
(iii)配列NRHDWFDY(配列番号60)を含むCDR3、
を含む重鎖CDR、
を含む、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項９】
(a)(i)配列RASQDIRNNLN(配列番号61)を含むCDR1、
(ii)配列YSSNLHS(配列番号64)を含むCDR2、および
iii)配列QQSIKLPLT(配列番号67)を含むCDR3、
を含む軽鎖CDR、
(b)(i)配列RASQGIRNNLN(配列番号62)を含むCDR1、
(ii)配列YSSNLQS(配列番号65)を含むCDR2、および
(iii)配列QQSIKLPFT(配列番号68)を含むCDR3、
を含む軽鎖CDR、または
(c)(i)配列SASQDIRNSLN(配列番号63)を含むCDR1、
(ii)配列YSSNLHT(配列番号66)を含むCDR2、および
(iii)配列QQSNKLPLT(配列番号69)を含むCDR3、
を含む軽鎖CDR、
をさらに含む、請求項8に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
(b)において示される1つまたは複数の軽鎖CDRを含む、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
(i)配列X1ASQX2IRNX3LN(配列番号34)［式中、X1はSまたはRであり、X2はGまたはDであり、X3はSまたはNである］を含む軽鎖CDR1、(ii)配列YSSNLX1X2(配列番号35)［式中、X1はHまたはQであり、X2はSまたはTである］を含む軽鎖CDR2、および(iii)配列QQSX1KLPX2T(配列番号36)［式中、X1はIまたはNであり、X2はFまたはLである］を含む軽鎖CDR3、を含む、請求項10に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
軽鎖CDR1が、RASQDIRNNLN(配列番号61)、RASQGIRNNLN(配列番号62)、およびSASQDIRNSLN(配列番号63)からなる群から選択される配列を含む、請求項10に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
軽鎖CDR2が、YSSNLHS(配列番号64)、YSSNLQS(配列番号65)、およびYSSNLHT(配列番号66)からなる群から選択される配列を含む、請求項10に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
軽鎖CDR3が、QQSIKLPLT(配列番号67)、QQSIKLPFT(配列番号68)、およびQQSNKLPLT(配列番号69)からなる群から選択される配列を含む、請求項10に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
(a)(i)配列RASQDIRNNLN(配列番号61)を含むCDR1、
(ii)配列YSSNLHS(配列番号64)を含むCDR2、および
iii)配列QQSIKLPLT(配列番号67)を含むCDR3、
を含む軽鎖CDR、
(b)(i)配列RASQGIRNNLN(配列番号62)を含むCDR1、
(ii)配列YSSNLQS(配列番号65)を含むCDR2、および
(iii)配列QQSIKLPFT(配列番号68)を含むCDR3、
を含む軽鎖CDR、または
(c)(i)配列SASQDIRNSLN(配列番号63)を含むCDR1、
(ii)配列YSSNLHT(配列番号66)を含むCDR2、および
(iii)配列QQSNKLPLT(配列番号69)を含むCDR3、
を含む軽鎖CDR、
を含む、請求項10に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
(a)において示される1つまたは複数の重鎖CDR、および(b)において示される1つまたは複数の軽鎖CDRを含む、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記ポリペプチドが、
(a)(i)配列EVQLVX1SGX2X3X4X5QPGX6X7LRLX8CX9AS(配列番号37)［式中、X1はEまたはQであり、X2はAまたはGであり、X3はGまたはEであり、X4はLまたはVであり、X5はV、K、またはEであり、X6はGまたはEであり、X7はTまたはSであり、X8はTまたはSであり、X9はTまたはKである］を含む重鎖FR1、(ii)配列WVRQAPGKGLEWX1G(配列番号38)［式中、X1はVまたはMである］を含む重鎖FR2、(iii)配列RVTISX1DX2SKX3TX4YLQX5NSLRAEDTAVYYCX6R(配列番号39)［式中、X1はKまたはRであり、X2はNまたはTであり、X3はSまたはNであり、X4はVまたはAであり、X5はMまたはLであり、X6はV、M、またはTである］を含む重鎖FR3、および(iv)配列WGQGTTVTVSS(配列番号40)を含む重鎖FR4、からなる群から選択される1つまたは複数の重鎖フレームワーク領域、
(b)(i)配列X1IX2X3TQSPSSLSX4X5X6GX7RX8TIX9C(配列番号41)［式中、X1はDまたはEであり、X2はLまたはEであり、X3はMまたはLであり、X4はAまたはVであり、X5はSまたはTであり、X6はL、P、またはAであり、X7はDまたはEであり、X8はVまたはAであり、X9はTまたはSである］を含む軽鎖FR1、(ii)配列WYQQKPGQAPRLLIY(配列番号42)を含む軽鎖FR2、(iii)配列GVPX1RFSGSGSGTDFTLTISRLX2X3EDX4AX5YYC(配列番号43)［式中、X1はS、D、またはAであり、X2はEまたはQであり、X3はPまたはAであり、X4はFまたはVであり、X5はT、A、またはIである］を含む軽鎖FR3、および(iv)配列FGSGTKVEIK(配列番号44)を含む軽鎖FR4、からなる群から選択される1つまたは複数の軽鎖フレームワーク領域、または
(c)(a)において示される1つまたは複数の重鎖フレームワーク領域および(b)において示される1つまたは複数の軽鎖フレームワーク領域、
をさらに含む、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
(a)EVQLVX1SGX2X3X4X5QPGX6X7LRLX8CX9ASGX10X11LX12TYGVHWVRQAPGKGLEWX13GVIWGX14GRTDYDX15X16FMSRVTISX17DX18SKX19TX20YLQX21NSLRAEDTAVYYCX22RX23RHDWFDYWGQGTTVTVSS(配列番号29)［式中、X1はEまたはQであり、X2はAまたはGであり、X3はGまたはEであり、X4はLまたはVであり、X5はV、K、またはEであり、X6はGまたはEであり、X7はTまたはSであり、X8はTまたはSであり、X9はTまたはKであり、X10はFまたはYであり、X11はSまたはTであり、X12はT、N、またはSであり、X13はVまたはMであり、X14はGまたはDであり、X15はAまたはSであり、X16はAまたはSであり、X17はKまたはRであり、X18はNまたはTであり、X19はSまたはNであり、X20はVまたはAであり、X21はMまたはLであり、X22はV、M、またはTであり、X23はNまたはSである］からなるアミノ酸配列、
(b)X1IX2X3TQSPSSLSX4X5X6GX7RX8TIX9CX10ASQX11IRNX12LNWYQQKPGQAPRLLIYYSSNLX13X14GVPX15RFSGSGSGTDFTLTISRLX16X17EDX18AX19YYCQQSX20KLPX21TFGSGTKVEIK(配列番号30)［式中、X1はDまたはEであり、X2はLまたはEであり、X3はMまたはLであり、X4はAまたはVであり、X5はSまたはTであり、X6はL、PまたはAであり、X7はDまたはEであり、X8はVまたはAであり、X9はTまたはSであり、X10はSまたはRであり、X11はGまたはDであり、X12はSまたはNであり、X13はHまたはQであり、X14はSまたはTであり、X15はS、D、またはAであり、X16はEまたはQであり、X17はPまたはAであり、X18はFまたはVであり、X19はT、A、またはIであり、X20はIまたはNであり、X21はFまたはLである］からなるアミノ酸配列、または
(c)(a)において示されるアミノ酸配列および(b)において示されるアミノ酸配列の両方、
を含むポリペプチド。
【請求項１９】
(a)配列番号15〜21からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約80%の同一性を有するアミノ酸配列、
(b)配列番号22〜28からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約80%の同一性を有するアミノ酸配列、または
(c)(a)において示されるアミノ酸配列および(b)において示されるアミノ酸配列、
を含むポリペプチドであって、
但し、配列QVKLQESGPGLVQPSQTLSITCTVSGFSLTTYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWGGGRTDYDAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAIYYCVRNRHDWFDYWGQGTTVTVSS(配列番号90)の重鎖可変領域および配列DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCSASQGIRNSLNWYQQKPDGAVKLLIYYSSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFSLTISNLEPEDIATYYCQQSIKLPFTFGSGTKLEIK(配列番号91)の軽鎖可変領域の両方は含まない、ポリペプチド。
【請求項２０】
(a)配列番号15〜21からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約95%の同一性を有するアミノ酸配列、
(b)配列番号22〜28からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約95%の同一性を有するアミノ酸配列、または
(c)(a)において示されるアミノ酸配列および(b)において示されるアミノ酸配列、
を含む、請求項19に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
(a)配列番号15〜21からなる群から選択されるアミノ酸配列、
(b)配列番号22〜28からなる群から選択されるアミノ酸配列、または
(c)(a)において示されるアミノ酸配列および(b)において示されるアミノ酸配列、
を含む、請求項20に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
(a)配列番号26のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
(b)配列番号22のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号18のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
(c)配列番号28のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号19のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
(d)配列番号23のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号19のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含む、請求項21に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
(a)(i)配列EVQLVX1SGX2X3X4X5QPGX6X7LRLX8CX9AS(配列番号37)［式中、X1はEまたはQであり、X2はAまたはGであり、X3はGまたはEであり、X4はLまたはVであり、X5はV、K、またはEであり、X6はGまたはEであり、X7はTまたはSであり、X8はTまたはSであり、X9はTまたはKである］を含む重鎖FR1、(ii)配列WVRQAPGKGLEWX1G(配列番号38)［式中、X1はVまたはMである］を含む重鎖FR2、(iii)配列RVTISX1DX2SKX3TX4YLQX5NSLRAEDTAVYYCX6R(配列番号39)［式中、X1はKまたはRであり、X2はNまたはTであり、X3はSまたはNであり、X4はVまたはAであり、X5はMまたはLであり、X6はV、M、またはTである］を含む重鎖FR3、および(iv)配列WGQGTTVTVSS(配列番号40)を含む重鎖FR4、からなる群から選択される1つもしくは複数の重鎖フレームワーク領域、
(b)(i)配列X1IX2X3TQSPSSLSX4X5X6GX7RX8TIX9C(配列番号41)［式中、X1はDまたはEであり、X2はLまたはEであり、X3はMまたはLであり、X4はAまたはVであり、X5はSまたはTであり、X6はL、P、またはAであり、X7はDまたはEであり、X8はVまたはAであり、X9はTまたはSである］を含む軽鎖FR1、(ii)配列WYQQKPGQAPRLLIY(配列番号42)を含む軽鎖FR2、(iii)配列GVPX1RFSGSGSGTDFTLTISRLX2X3EDX4AX5YYC(配列番号43)［式中、X1はS、D、またはAであり、X2はEまたはQであり、X3はPまたはAであり、X4はFまたはVであり、X5はT、A、またはIである］を含む軽鎖FR3、および(iv)配列FGSGTKVEIK(配列番号44)を含む軽鎖FR4、からなる群から選択される1つまたは複数の軽鎖フレームワーク領域、または
(c)(a)において示される1つまたは複数の重鎖フレームワーク領域および(b)において示される1つまたは複数の軽鎖フレームワーク領域、
を含むポリペプチドであって、
但し、配列QVKLQESGPGLVQPSQTLSITCTVSGFSLTTYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWGGGRTDYDAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAIYYCVRNRHDWFDYWGQGTTVTVSS(配列番号90)の重鎖可変領域および配列DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCSASQGIRNSLNWYQQKPDGAVKLLIYYSSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFSLTISNLEPEDIATYYCQQSIKLPFTFGSGTKLEIK(配列番号91)の軽鎖可変領域の両方は含まない、ポリペプチド。
【請求項２４】
YSLRWISDHEYLY(配列番号45;ペプチド6)、LEYNYVKQWRHSY(配列番号46;ペプチド35)、TWSPVGHKLAYVW(配列番号47;ペプチド55)、LWWSPNGTFLAYA(配列番号48;ペプチド84)、RISLQWLRRIQNY(配列番号49;ペプチド132)、YVKQWRHSYTASY(配列番号50;ペプチド37)、EEEVFSAYSALWW(配列番号51;ペプチド79)、DYSISPDGQFILL(配列番号52;ペプチド29)、SISPDGQFILLEY(配列番号53;ペプチド30)、およびIYVKIEPNLPSYR(配列番号54;ペプチド63)からなる群から選択される1つまたは複数のペプチドに結合する抗体であって、但し、配列QVKLQESGPGLVQPSQTLSITCTVSGFSLTTYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWGGGRTDYDAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAIYYCVRNRHDWFDYWGQGTTVTVSS(配列番号90)の重鎖可変領域および配列DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCSASQGIRNSLNWYQQKPDGAVKLLIYYSSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFSLTISNLEPEDIATYYCQQSIKLPFTFGSGTKLEIK(配列番号91)の軽鎖可変領域の両方は含まない、抗体。
【請求項２５】
抗体である、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
モノクローナル抗体である、請求項25に記載の抗体。
【請求項２７】
ヒト化抗体である、請求項25に記載の抗体。
【請求項２８】
抗体断片である、請求項25の抗体。
【請求項２９】
抗体断片が、Fab、Fab'、Fab'-SH、Fv、scFv、およびF(ab')2からなる群から選択される、請求項28に記載の抗体。
【請求項３０】
抗体鎖である、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
ネズミモノクローナル抗体ではない、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
単離された、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
CD26に結合する、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
CD26がヒトCD26である、請求項33に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
ヒトCD26に約6nM以下のKDで結合する、請求項34に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
請求項1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３７】
請求項36に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３８】
請求項36に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項３９】
配列番号1〜14からなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項４０】
請求項39に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項４１】
請求項1に記載のポリペプチドおよび薬学的に許容し得る賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項４２】
CD26を発現する細胞の増殖を阻害するための方法であって、該細胞を、請求項1に記載のポリペプチドと接触させることを含む方法。
【請求項４３】
被験体におけるCD26発現に関連する状態を治療する方法であって、請求項1に記載のポリペプチドを含む有効量の組成物を被験体に投与することを含む方法。
【請求項４４】
状態が自己免疫疾患である、請求項43に記載の方法。
【請求項４５】
前記状態が移植片対宿主疾患である、請求項43に記載の方法。
【請求項４６】
前記状態が癌である、請求項43に記載の方法。
【請求項４７】
癌が血液悪性腫瘍である、請求項46に記載の方法。
【請求項４８】
被験体が、CD26を発現する腫瘍を有しているかまたはCD26を発現する腫瘍が除去されている、請求項46に記載の方法。
【請求項４９】
癌が、リンパ腫、腎臓癌、前立腺癌、または肺癌である、請求項46に記載の方法。
【請求項５０】
CD26を発現する腫瘍を有しているかまたはCD26を発現する腫瘍が除去されている被験体における腫瘍成長を阻害する方法であって、請求項1に記載のポリペプチドを含む有効量の組成物を被験体に投与することを含む方法。
【請求項５１】
被験体におけるCD26を発現する癌細胞の転移を阻害するための方法であって、請求項1に記載のポリペプチドを含む有効量の組成物を被験体に投与することを含む方法。
【請求項５２】
被験体がヒトである、請求項43に記載の方法。
【請求項５３】
抗体である、請求項18、19、または23に記載のポリペプチド。
【請求項５４】
CD26に結合する、請求項18、19、または23に記載のポリペプチド。
【請求項５５】
請求項18、19、または23に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５６】
請求項18、19、または23に記載のポリペプチドおよび薬学的に許容し得る賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項５７】
CD26を発現する細胞の増殖を阻害する方法であって、該細胞を、請求項18、19、または23に記載のポリペプチドと接触させることを含む方法。
【請求項５８】
被験体におけるCD26発現に関連する状態を治療するための方法であって、請求項18、19、または23に記載のポリペプチドを含む有効量の組成物を被験体に投与することを含む方法。
【請求項５９】
前記状態が癌である、請求項58に記載の方法。
【請求項６０】
CD26を発現する腫瘍を有しているかまたはCD26を発現する腫瘍が除去されている被験体における腫瘍成長を阻害する方法であって、請求項18、19、または23に記載のポリペプチドを含む有効量の組成物を被験体に投与することを含む方法。
【請求項６１】
被験体におけるCD26を発現する癌細胞の転移を阻害する方法であって、請求項18、19、または23に記載のポリペプチドを含む有効量の組成物を被験体に投与することを含む方法。
【請求項６２】
化学療法、放射線療法、外科手術、ホルモン療法、またはさらなる免疫療法で被験体を治療するステップをさらに含む、請求項46に記載の方法。
【請求項６３】
化学療法、放射線療法、外科手術、ホルモン療法、またはさらなる免疫療法で被験体を治療するステップをさらに含む、請求項59に記載の方法。
【請求項６４】
(a)(i)配列GFSLTTYGVH(配列番号55)を含むCDR1、(ii)配列VIWGDGRTDYDAAFMS(配列番号58)を含むCDR2、および(iii)配列NRHDWFDY(配列番号60)を含むCDR3、を含む重鎖CDR、ならびに
(b)(i)配列RASQGIRNNLN(配列番号62)を含むCDR1、(ii)配列YSSNLQS(配列番号65)を含むCDR2、および(iii)配列QQSIKLPFT(配列番号68)を含むCDR3、を含む軽鎖CDR、
を含む、請求項9に記載のポリペプチド。
【請求項６５】
受託番号PTA-7695として大腸菌中でATCCに寄託されたプラスミドによりコードされた抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2005年7月22日に提出された米国仮出願第60/701,802号の優先権の利益を主張し、本明細書中にその全文が参照によって引用される。
【０００２】
発明の分野
本発明の分野は、概略的には、抗CD26抗体および他のポリペプチド、特には、ヒト化抗CD26抗体ならびにCD26の発現に関連する疾患の治療のための抗体および他のポリペプチドを使用するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
CD26は、広範に分布する110kDaの細胞表面糖タンパク質である。CD26は、当初、T細胞活性化抗原として定義された(Foxら(1984) J. Immunol. 133, 1250-1256、 Fleischer (1987) J. Immunol. 138, 1346-1350、およびMorimotoら(1989) J. Immunol. 143, 3430-3439)。この分子は、その細胞外ドメインにおいてジペプチジルペプチダーゼIV(DPPIV;EC3.4.14.5)活性および広範な組織分布を有することが示された(Hegenら(1990) J. Immunol. 144, 2908-2914およびUlmerら(1990) J. Immunol. 31, 429-435)。CD26は、ヒトT細胞生理機能において多数の機能を有している。たとえば、CD26は、T細胞活性化のための共刺激シグナルを伝えることができるということが証拠により示唆されている(Morimotoら(1994) Immunologist 2: 4-7およびFleischer (1994) Immunol. Today 15: 180-184)。さらに、CD26は、ADA結合タンパク質として同定され、CD26/ADA複合体は免疫系機能を調節する際に重要な役割を果たしている可能性がある(Dongら(1996) J Immunol. 156(4):1349-55、Kameokaら(1993) Science. 261(5120):466-9、およびMorrisonら(1993) J Exp Med. 177(4):1135-43)。CD26および細胞性タンパク質トポイソメラーゼIIαの間の機能的関連もまた報告された(Aytacら(2003) British Journal of Cancer 88:455-462)。
【０００４】
CD26はまた、いくつかの腫瘍の発達における役割を有する可能性もある。たとえば、CD26は、T細胞リンパ芽球性リンパ腫/急性リンパ芽球性白血病およびT細胞CD30+未分化大細胞リンパ腫等のいくつかの高悪性度のT細胞悪性腫瘍の表面上に発現する(Carboneら(1995) Blood 86(12):4617-26およびJonesら(2001) Am J Clin Pathol. 115(6):885-92)。
【０００５】
CD26に結合する様々なネズミ（murine）抗体が報告された(たとえば、Morimotoら(1989) J. Immunol. 143:3430-39、Nam Hong Dangら(1990) J. Immunol. 145(12):3963-71、Nam Hong Dangら(1990) J. Immunol. 144(11):4092-100、PCT国際公開第91/07,985号(Schlossmanら)、PCT国際公開第02/092,127号(Nam Hong Dangら)、および米国特許第6,573,096号(Chenら)を参照されたい)。
【０００６】
CD26に対する生産されたあるマウスモノクローナル抗体は1F7抗体として知られている(たとえば、米国特許第5,120,642号、PCT国際公開第91/07,985号(Schlossmanら)、およびMorimotoら(1989) J. Immunology, 143:3430-3439を参照されたい)。1F7抗体は、ヒトCD4リンパ球およびヒトCD8リンパ球上の110,000ダルトン分子量の糖タンパク質からなり後にCD26として同定された抗原に結合するとして同定され、このCD26は、サプレッサーインデューサー細胞ではなくヘルパーインデューサ細胞上に存在した。したがって、1F7モノクローナル抗体は、ヒトCD4リンパ球集団におけるヘルパーインデューサー細胞とサプレッサーインデューサー細胞を区別することができるとして報告された。
【０００７】
さらに、1F7抗体および他の抗CD26モノクローナル抗体は、いくつかの癌等のCD26を発現する細胞に関連するいくつかの疾患の治療に有用であることが提唱された。(たとえば、米国特許公開第2003/0,031,665号およびPCT国際公開第02/092,127号(Nam Hoang Dangら)を参照されたい)。抗CD26モノクローナル抗体1F7のCD26への結合は、伝えられるところによれば、G1/Sチェックポイントでの細胞周期停止につながり、CD26の関与は、細胞周期調節タンパク質p21の発現の高まりを介して、CD26 Jurkat形質移入体でのG1期停止を誘導した。1F7抗体での治療はまた、マウスモデルにおいて、CD26+腫瘍形成を阻害し、生存を高めることも報告された(Hoら(2001) Clinical Cancer Research, 7:2031-2040)。
【０００８】
同定された他の抗CD26ネズミモノクローナル抗体はラット抗CD26抗体E19およびE26が挙げられる。(たとえば、米国特許第6,573,096号、米国特許公開第2002/0,132,979号、米国特許公開第2002/0,132,979号、米国特許公開第2004/0,115,202号、PCT国際公開第01/74,299号(Chenら)、およびGhersiら(2002) J. Biological Chemistry, 32:29231-29241を参照されたい)。これらの抗体は、伝えられるところによれば、線維芽細胞および傷ついた細胞の、単層からの細胞移動に対する阻害効果、血管チューブ形成に対する阻害効果、ならびにヒト皮膚微小血管内皮細胞の浸潤および毛細血管芽形成に対する阻害効果を示す。癌浸潤および癌血管新生を阻害するための治療における抗体の使用が提唱された。
【０００９】
産生された他のマウス抗CD26モノクローナル抗体は14D10(本明細書中においてCM03とも呼ばれる)である(たとえば、Dongら(1998) Mol Immunol. 35(1):13-21および米国特許公開第2003/0,031,665号を参照されたい)。
【００１０】
CD26の活性の修飾は、様々な病気の治療において役立つと証明されるはずである。抗CD26モノクローナル抗体はCD26の効果を修飾する1つの手段である。
【００１１】
ネズミモノクローナル抗体はヒト療法に試された。しかしながら、ネズミ抗体がヒトにおいて治療上で使用されると、ヒト抗ネズミ抗体(「HAMA」)応答がかなりの数の治療された個体において生じる。HAMA応答において、治療される被験体はマウス抗体に対する抗体を生じる。これは、ネズミモノクローナル抗体療法の有効性を制限するだけでなく、アナフィラキシーをもたらし得るアレルギー反応にもつながる。さらに、ヒトFc領域およびマウスFv領域を含むキメラ抗体でさえ可能性としてHAMA応答を引き起こし得る。
【００１２】
HAMA応答を最小限にするために、何人かの研究者たちが、ヒト免疫系により異物として認識されない抗体を作製しようとした。使用された1つの方法は抗体の「ヒト化」である。これらのヒト化抗体は、実質的にヒト由来であるが、げっ歯類種等の異なる種に由来するいくつかの相補性決定領域(「CDR」)残基および/もしくはフレームワーク領域残基を通常含む配列または純粋に人工的である配列を含んでいてもよい。抗体をヒト化するための様々な異なる方法が当技術分野で知られている。ヒト化の1つの形態は、ヒト免疫グロブリン分子のフレームワーク上に抗原特異性ネズミ相補性決定領域(「CDR」)を「移植する」ことによるものである。他のレベルのヒト化は、ネズミCDRまたは他の可変領域配列を「よりヒト型」とする遺伝子操作を含み、その結果としてHAMA応答を低下させうる。たとえば、ヒト化の他の形態は、マウス等の1つの種からの重鎖可変領域および軽鎖可変領域を、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域上に移植し、次いで、フレームワーク領域(「FR」)中の個々の残基および/または相補性決定領域をヒト抗体に由来する残基および/またはヒトにおいて抗体の免疫原性を低下させるように設計された残基で置換することによるものである。これらの技術はすべて、抗体の結合効果または生物学的効果の有効性を上昇させるための抗体配列の遺伝子操作をさらに含んでいてもよい。
【００１３】
本明細書中に引用される刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、ならびにアクセッション番号/データベース配列(ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の両方を含む)はすべて、あたかも、それぞれの個々の刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、またはアクセッション番号/データベース配列が引用されるために具体的に個々に示されるのと同程度に、それらの全体が実際にこれによって本明細書中に引用される。
【発明の開示】
【００１４】
本発明は、抗CD26抗体、抗CD26抗体の断片、および抗CD26抗体に関する他のポリペプチド等の新規なポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、抗CD26抗体はヒト化抗CD26抗体である。ポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドもまた提供される。ポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞もまた提供される。本発明のポリペプチドを含む医薬組成物等の組成物もまた提供される。ポリペプチドを作製するための方法もまた提供される。さらに、CD26を発現する細胞の増殖を阻害するためのまたはCD26発現に関連する状態の治療もしくは診断におけるポリペプチドまたはポリペプチドを含む組成物を使用するための方法がさらに提供される。
【００１５】
一態様では、本発明は、(a)配列GX1X2LX3TYGVH(配列番号31)、式中、X1はFもしくはYであり、X2はSもしくはTであり、X3はT、N、もしくはSである、を含む重鎖CDR1、(b)配列VIWGX1GRTDYDX2X3FMS(配列番号32)、式中、X1はGもしくはDであり、X2はAもしくはSであり、X3はAもしくはSである、を含む重鎖CDR2、および/または(c)配列X1RHDWFDY(配列番号33)、式中、X1はNもしくはSである、を含む重鎖CDR3を含むポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは抗体である。
【００１６】
他の態様では、本発明は、(a)配列X1ASQX2IRNX3LN(配列番号34)、式中、X1はSもしくはRであり、X2はGもしくはDであり、X3はSもしくはNである、を含む軽鎖CDR1、(b)配列YSSNLX1X2(配列番号35)、式中、X1はHもしくはQであり、X2はSもしくはTである、を含む軽鎖CDR2、および/または(c)配列QQSX1KLPX2T(配列番号36)、式中、X1はIもしくはNであり、X2はFもしくはLである、を含む軽鎖CDR3を含むポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは抗体である。
【００１７】
他の態様では、本発明は、(a)(i)配列GX1X2LX3TYGVH(配列番号31)、式中、X1はFもしくはYであり、X2はSもしくはTであり、X3はT、N、もしくはSである、を含む重鎖CDR1、(ii)配列VIWGX1GRTDYDX2X3FMS(配列番号32)、式中、X1はGもしくはDであり、X2はAもしくはSであり、X3はAもしくはSである、を含む重鎖CDR2、および(iii)配列X1RHDWFDY(配列番号33)、式中、X1はNもしくはSである、を含む重鎖CDR3からなる群から選択される1つもしくは複数の(たとえば1つ、2つ、もしくは3つの)重鎖CDRならびに/または(b)(i)配列X1ASQX2IRNX3LN(配列番号34)、式中、X1はSもしくはRであり、X2はGもしくはDであり、X3はSもしくはNである、を含む軽鎖CDR1、(ii)配列YSSNLX1X2(配列番号35)、式中、X1はHもしくはQであり、X2はSもしくはTである、を含む軽鎖CDR2、および(iii)配列QQSX1KLPX2T(配列番号36)、式中、X1はIもしくはNであり、X2はFもしくはLである、を含む軽鎖CDR3からなる群から選択される1つもしくは複数の(たとえば1つ、2つ、もしくは3つの)軽鎖CDRを含む、抗体等のポリペプチドを提供する。
【００１８】
さらなる態様では、本発明は、(a)(i)GFSLTTYGVH(配列番号55)、GFSLSTYGVH(配列番号56)、およびGYSLTTYGVH(配列番号57)からなる群から選択される重鎖CDR1、(ii)VIWGDGRTDYDAAFMS(配列番号58)およびVIWGDGRTDYDSSFMS(配列番号59)からなる群から選択される重鎖CDR2、ならびに(iii)重鎖CDR3 配列NRHDWFDY(配列番号60)からなる群から選択されるCDRに対して少なくとも約80%の同一性をそれぞれ有する1つもしくは複数の(たとえば1つ、2つ、もしくは3つの)重鎖CDR、ならびに/または(b)(i)RASQDIRNNLN(配列番号61)、RASQGIRNNLN(配列番号62)、およびSASQDIRNSLN(配列番号63)からなる群から選択される軽鎖CDR1、(ii)YSSNLHS(配列番号64)、YSSNLQS(配列番号65)、およびYSSNLHT(配列番号66)からなる群から選択される軽鎖CDR2、ならびに(iii)QQSIKLPLT(配列番号67)、QQSIKLPFT(配列番号68)、およびQQSNKLPLT(配列番号69)からなる群から選択される軽鎖CDR3からなる群から選択されるCDRに対して少なくとも約80%の同一性をそれぞれ有する1つもしくは複数の(たとえば1つ、2つ、もしくは3つの)軽鎖CDRを含む、抗体等のポリペプチドを提供する。
【００１９】
さらなる他の態様では、本発明は、(a)配列EVQLVX1SGX2X3X4X5QPGX6X7LRLX8CX9AS(配列番号37)、式中、X1はEもしくはQであり、X2はAもしくはGであり、X3はGもしくはEであり、X4はLもしくはVであり、X5はV、K、もしくはEであり、X6はGもしくはEであり、X7はTもしくはSであり、X8はTもしくはSであり、X9はTもしくはKである、を含む重鎖FR1、(b)配列WVRQAPGKGLEWX1G(配列番号38)、式中、X1はVもしくはMである、を含む重鎖FR2、(c)配列RVTISX1DX2SKX3TX4YLQX5NSLRAEDTAVYYCX6R(配列番号39)、式中、X1はKもしくはRであり、X2はNもしくはTであり、X3はSもしくはNであり、X4はVもしくはAであり、X5はMもしくはLであり、X6はV、M、もしくはTである、を含む重鎖FR3、および/または(d)配列WGQGTTVTVSS(配列番号40)を含む重鎖FR4を含むポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは抗体である。
【００２０】
さらなる態様では、本発明は、(a)配列X1IX2X3TQSPSSLSX4X5X6GX7RX8TIX9C(配列番号41)、式中、X1はDもしくはEであり、X2はLもしくはEであり、X3はMもしくはLであり、X4はAもしくはVであり、X5はSもしくはTであり、X6はL、P、もしくはAであり、X7はDもしくはEであり、X8はVもしくはAであり、X9はTもしくはSである、を含む軽鎖FR1、(b)配列WYQQKPGQAPRLLIY(配列番号42)を含む軽鎖FR2、(c)配列GVPX1RFSGSGSGTDFTLTISRLX2X3EDX4AX5YYC(配列番号43)、式中、X1はS、D、もしくはAであり、X2はEもしくはQであり、X3はPもしくはAであり、X4はFもしくはVであり、X5はT、A、もしくはIである、を含む軽鎖FR3、および/または(d)配列FGSGTKVEIK(配列番号44)を含む軽鎖FR4を含むポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは抗体である。
【００２１】
さらなる態様では、本発明は、(a)(i)配列EVQLVX1SGX2X3X4X5QPGX6X7LRLX8CX9AS(配列番号37)、式中、X1はEもしくはQであり、X2はAもしくはGであり、X3はGもしくはEであり、X4はLもしくはVであり、X5はV、K、もしくはEであり、X6はGもしくはEであり、X7はTもしくはSであり、X8はTもしくはSであり、X9はTもしくはKである、を含む重鎖FR1、(ii)配列WVRQAPGKGLEWX1G(配列番号38)、式中、X1はVもしくはMである、を含む重鎖FR2、(iii)配列RVTISX1DX2SKX3TX4YLQX5NSLRAEDTAVYYCX6R(配列番号39)、式中、X1はKもしくはRであり、X2はNもしくはTであり、X3はSもしくはNであり、X4はVもしくはAであり、X5はMもしくはLであり、X6はV、M、もしくはTである、を含む重鎖FR3、および(iv)配列WGQGTTVTVSS(配列番号40)を含む重鎖FR4からなる群から選択される1つもしくは複数の(たとえば1つ、2つ、3つ、もしくは4つの)重鎖フレームワーク領域、ならびに/または(b)(i)配列X1IX2X3TQSPSSLSX4X5X6GX7RX8TIX9C(配列番号41)、式中、X1はDもしくはEであり、X2はLもしくはEであり、X3はMもしくはLであり、X4はAもしくはVであり、X5はSもしくはTであり、X6はL、P、もしくはAであり、X7はDもしくはEであり、X8はVもしくはAであり、X9はTもしくはSである、を含む軽鎖FR1、(ii)配列WYQQKPGQAPRLLIY(配列番号42)を含む軽鎖FR2、(iii)配列GVPX1RFSGSGSGTDFTLTISRLX2X3EDX4AX5YYC(配列番号43)、式中、X1はS、D、もしくはAであり、X2はEもしくはQであり、X3はPもしくはAであり、X4はFもしくはVであり、X5はT、A、もしくはIである、を含む軽鎖FR3、および(iv)配列FGSGTKVEIK(配列番号44)を含む軽鎖FR4からなる群から選択される1つもしくは複数の(たとえば1つ、2つ、3つ、もしくは4つの)軽鎖フレームワーク領域を含む、抗体等のポリペプチドを提供する。
【００２２】
他の態様では、本発明は、1つもしくは複数の本明細書中に記載される重鎖CDRおよび/または1つもしくは複数の本明細書中(たとえば、上記または図3および図5中などの本明細書中の他の箇所で)に記載される重鎖FRを含むポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、1つもしくは複数の本明細書中に記載される重鎖CDRおよび/または1つもしくは複数の本明細書中に記載される重鎖FRを含む重鎖可変領域を含むポリペプチドを提供する。さらに、本発明は、1つもしくは複数の本明細書中に記載される軽鎖CDRおよび/または1つもしくは複数の本明細書中に記載される軽鎖FRを含むポリペプチドをさらに提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、1つもしくは複数の本明細書中に記載される軽鎖CDRおよび/または1つもしくは複数の本明細書中に記載される軽鎖FRを含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、(1)1つもしくは複数の本明細書中に記載される重鎖CDRおよび/または1つもしくは複数の本明細書中に記載される重鎖FR、ならびに(2)1つもしくは複数の本明細書中に記載される軽鎖CDRおよび/または1つもしくは複数の本明細書中に記載される軽鎖FRを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、1つもしくは複数の本明細書中に記載される重鎖CDRを含む重鎖可変領域および/または1つもしくは複数の本明細書中に記載される軽鎖CDRを含む軽鎖可変領域を含む。
【００２３】
本発明は、1つもしくは複数の本明細書中に記載される重鎖CDRおよび/または1つもしくは複数の本明細書中に記載される重鎖FRを含む重鎖可変領域をさらに提供する。さらに、本発明は、1つもしくは複数の本明細書中に記載される軽鎖CDRおよび/または1つもしくは複数の本明細書中に記載される軽鎖FRを含む軽鎖可変領域をさらに提供する。
【００２４】
他の態様では、本発明は、アミノ酸配列EVQLVX1SGX2X3X4X5QPGX6X7LRLX8CX9ASGX10X11LX12TYGVHWVRQAPGKGLEWX13GVIWGX14GRTDYDX15X16FMSRVTISX17DX18SKX19TX20YLQX21NSLRAEDTAVYYCX22RX23RHDWFDYWGQGTTVTVSS(配列番号29)、式中、X1はEまたはQであり、X2はAまたはGであり、X3はGまたはEであり、X4はLまたはVであり、X5はV、K、またはEであり、X6はGまたはEであり、X7はTまたはSであり、X8はTまたはSであり、X9はTまたはKであり、X10はFまたはYであり、X11はSまたはTであり、X12はT、N、またはSであり、X13はVまたはMであり、X14はGまたはDであり、X15はAまたはSであり、X16はAまたはSであり、X17はKまたはRであり、X18はNまたはTであり、X19はSまたはNであり、X20はVまたはAであり、X21はMまたはLであり、X22はV、M、またはTであり、X23はNまたはSである、を含むポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは抗体である。
【００２５】
さらなる態様では、本発明は、アミノ酸配列X1IX2X3TQSPSSLSX4X5X6GX7RX8TIX9CX10ASQX11IRNX12LNWYQQKPGQAPRLLIYYSSNLX13X14GVPX15RFSGSGSGTDFTLTISRLX16X17EDX18AX19YYCQQSX20KLPX21TFGSGTKVEIK(配列番号30)、式中、X1はDまたはEであり、X2はLまたはEであり、X3はMまたはLであり、X4はAまたはVであり、X5はSまたはTであり、X6はL、P、またはAであり、X7はDまたはEであり、X8はVまたはAであり、X9はTまたはSであり、X10はSまたはRであり、X11はGまたはDであり、X12はSまたはNであり、X13はHまたはQであり、X14はSまたはTであり、X15はS、D、またはAであり、X16はEまたはQであり、X17はPまたはAであり、X18はFまたはVであり、X19はT、A、またはIであり、X20はIまたはNであり、X21はFまたはLである、を含むポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはアミノ酸配列EVQLVX1SGX2X3X4X5QPGX6X7LRLX8CX9ASGX10X11LX12TYGVHWVRQAPGKGLEWX13GVIWGX14GRTDYDX15X16FMSRVTISX17DX18SKX19TX20YLQX21NSLRAEDTAVYYCX22RX23RHDWFDYWGQGTTVTVSS(配列番号29)、式中、X1はEまたはQであり、X2はAまたはGであり、X3はGまたはEであり、X4はLまたはVであり、X5はV、K、またはEであり、X6はGまたはEであり、X7はTまたはSであり、X8はTまたはSであり、X9はTまたはKであり、X10はFまたはYであり、X11はSまたはTであり、X12はT、N、またはSであり、X13はVまたはMであり、X14はGまたはDであり、X15はAまたはSであり、X16はAまたはSであり、X17はKまたはRであり、X18はNまたはTであり、X19はSまたはNであり、X20はVまたはAであり、X21はMまたはLであり、X22はV、M、またはTであり、X23はNまたはSである、をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは抗体である。
【００２６】
他の態様では、本発明は、ネズミ抗体14D10のヒト化形態である抗体を提供する。
【００２７】
他の態様では、本発明は、YSLRWISDHEYLY(配列番号45;ペプチド6)、LEYNYVKQWRHSY(配列番号46;ペプチド35)、TWSPVGHKLAYVW(配列番号47;ペプチド55)、LWWSPNGTFLAYA(配列番号48;ペプチド84)、RISLQWLRRIQNY(配列番号49;ペプチド132)、YVKQWRHSYTASY(配列番号50;ペプチド37)、EEEVFSAYSALWW(配列番号51;ペプチド79)、DYSISPDGQFILL(配列番号52;ペプチド29)、SISPDGQFILLEY(配列番号53;ペプチド30)、およびIYVKIEPNLPSYR(配列番号54;ペプチド63)からなる群から選択される1つまたは複数のペプチドに結合する、抗体等のポリペプチドを提供する。
【００２８】
さらなる態様では、本発明は、(a)配列番号15〜21からなる群から選択されるアミノ酸配列に対してもしくは配列番号15〜21からなる群から選択されるアミノ酸配列の断片に対して少なくとも約80%の同一性を有するアミノ酸配列、および/または(b)配列番号22〜28からなる群から選択されるアミノ酸配列に対してもしくは配列番号22〜28からなる群から選択されるアミノ酸配列の断片に対して少なくとも約80%の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。他の態様では、本発明は、(a)配列番号15〜21からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約80%の同一性を有するアミノ酸配列、および/または(b)配列番号22〜28からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約80%の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
【００２９】
さらなる態様では、本発明は、図3に示される以下の配列:X376、X377、X378、X379、X380、X381、およびX394(それぞれ配列番号15〜21)からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体等のポリペプチドを提供する。
【００３０】
他の態様では、本発明は、図5に示される以下の配列:X384、X385、X386、X387、X388、X399、およびX420(それぞれ配列番号22〜28)からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、抗体等のポリペプチドを提供する。
【００３１】
さらなる他の態様では、本発明は、図3または図5に示される以下の配列:X376、X377、X378、X379、X380、X381、X394、X384、X385、X386、X387、X388、X399、およびX420(配列番号15〜28)のそれぞれからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、抗体等のポリペプチドを提供する。
【００３２】
さらに他の態様では、本発明は、配列番号217を含むポリペプチド(たとえば抗体)またはその断片もしくはその変異体を提供する。
【００３３】
他の態様では、本発明は、配列番号218を含むポリペプチド(たとえば抗体)またはその断片もしくはその変異体を提供する。
【００３４】
前述の態様のおよび本明細書中に記載される他の態様のそれぞれのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは抗体である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはモノクローナル抗体である。前述の態様のおよび本明細書中に記載される他の態様のそれぞれのいくつかの実施形態では、ポリペプチドはヒト化抗体である。前述の態様のおよび本明細書中に記載される他の態様のそれぞれのいくつかの実施形態では、ポリペプチドはネズミモノクローナル抗体ではない。前述の態様のおよび本明細書中に記載される他の態様のそれぞれのいくつかの実施形態では、ポリペプチドはマウスモノクローナル抗体ではない。前述の態様のおよび本明細書中に記載される他の態様のそれぞれのいくつかの実施形態では、ポリペプチドはネズミモノクローナル抗体14D10ではない。前述の態様のおよび本明細書中に記載される他の態様のそれぞれのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列QVKLQESGPGLVQPSQTLSITCTVSGFSLTTYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWGGGRTDYDAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAIYYCVRNRHDWFDYWGQGTTVTVSS(配列番号90)の重鎖可変領域を含まない。前述の態様のおよび本明細書中に記載された他の態様のそれぞれのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCSASQGIRNSLNWYQQKPDGAVKLLIYYSSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFSLTISNLEPEDIATYYCQQSIKLPFTFGSGTKLEIK(配列番号91)の軽鎖可変領域を含まない。前述の態様のおよび本明細書中に記載された他の態様のそれぞれのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列QVKLQESGPGLVQPSQTLSITCTVSGFSLTTYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWGGGRTDYDAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAIYYCVRNRHDWFDYWGQGTTVTVSS(配列番号90)の重鎖可変領域および配列DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCSASQGIRNSLNWYQQKPDGAVKLLIYYSSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFSLTISNLEPEDIATYYCQQSIKLPFTFGSGTKLEIK(配列番号91)の軽鎖可変領域の両方は含まない。前述の態様のおよび本明細書中に記載される他の態様のそれぞれのいくつかの実施形態では、ポリペプチドはマウスモノクローナル抗体1F7ではない。前述の態様のそれぞれのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは1つまたは複数の以下の特徴を有している。CD26に結合する、CD26活性を調整し、G1/SチェックポイントでのCD26+細胞の細胞周期停止をもたらす、CD26を発現する細胞の増殖を阻害する、および/またはCD26発現に関連する状態(疾患もしくは障害等)の治療に有用である。前述の態様のおよび本明細書中に記載される他の態様のそれぞれのいくつかの実施形態では、ポリペプチドはヒトCD26に結合する。
【００３５】
前述のポリペプチドのそれぞれを作製するための方法もまた提供される。たとえば、本発明は、本明細書中に記載される抗体を生産するための方法であって、宿主細胞において1つまたは複数のポリヌクレオチドを発現させることを含み、抗体の各鎖は、少なくとも1つのポリヌクレオチドによりコードされる方法を提供する。
【００３６】
本発明は、前述のポリペプチドのそれぞれを含むキットをさらに提供する。
【００３７】
本発明は、前述のポリペプチドおよび本明細書中に記載される他のポリペプチドのそれぞれを含む、医薬組成物等の組成物をさらに提供する。医薬組成物または医薬の製造におけるこれらのポリペプチドのそれぞれの使用がさらに提供される。組成物は、本明細書中に記載される任意の方法において使用されてもよい。
【００３８】
本発明は、CD26を発現する細胞の増殖を阻害するための方法であって、細胞を本明細書中に記載されるポリペプチドと接触させる(通常、所望の阻害を達成するのに有効な量のポリペプチドで)ことを含む方法を提供する。さらに、本発明は、被験体におけるCD26発現に関連する状態を治療するための方法であって、本明細書中に記載されるポリペプチドを含む有効量の組成物を被験体に対して投与することを含む方法を提供する。本明細書中に記載される組成物は、移植片対宿主疾患、自己免疫疾患、または癌等の様々な疾患または状態の治療において使用されてもよい。いくつかの実施形態では、癌は血液悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、癌は固形腫瘍である。本発明は、CD26+癌の進行を阻害する、CD26発現腫瘍の成長を阻害する、CD26発現腫瘍の退縮を誘導する、および/またはCD26を発現する癌細胞の転移を阻害するための本明細書中に記載される組成物の使用もまた提供する。
【００３９】
いくつかの態様では、本発明は、本明細書中に記載されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの態様では、本発明は、図2および図4に示される配列(配列番号1〜14)のそれぞれからなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。さらなる態様では、本発明は、図2および図4に示される配列(配列番号1〜14)のそれぞれからなる群から選択される核酸と少なくとも約80%同一である核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。他の態様では、本発明は、図3または図5に示される以下のアミノ酸配列:X376、X377、X378、X379、X380、X381、X394、X384、X385、X386、X387、X388、X399、およびX420(配列番号15〜28)のそれぞれからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドをさらに提供する。前述の態様のそれぞれのポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞もまた提供される。
【００４０】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチド(たとえば抗体)は、本明細書中に記載される除外物を含まない。
【００４１】
アミノ酸置換基を含む本明細書中における配列に関して、当業者にとって明らかなように、各アミノ酸置換基は独立して選択されてもよい。本発明は、1つまたは複数のアミノ酸置換基が脱離した、アミノ酸置換基を含む配列もまた提供する。
【００４２】
本発明の態様または実施形態がマーカッシュグループまたは代替の他のグループ分けによって記載される場合、本発明は、全体として記載される完全なグループだけではなくグループの各メンバーも個々に包含し、メイングループの可能性として考えられるすべてのサブグループだけではなく1つまたは複数のグループメンバーが不在のメイングループもまた包含する。本発明はまた、請求される発明における1つまたは複数の任意のグループメンバーの明白な除外についても想定する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
本発明は、抗CD26抗体の1つもしくは複数のCDRもしくはFRを含むまたは抗CD26抗体の重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域(もしくはその断片)を含むポリペプチドを含む様々な新規なポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはCD26に結合する。特に、ヒト化抗CD26抗体を含むがこれらに限定されない様々な新規な抗CD26抗体が提供される。ポリペプチドを含む、医薬組成物等の組成物もまた提供される。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドならびにポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞もまた提供される。ポリペプチドを作製するおよび使用するための方法もまた提供される。いくつかの例では、本発明のポリペプチドは、たとえばCD26に結合するポリペプチド(抗体等)を作製するための中間体として有用である。
【００４４】
実施形態が、用語「〜を含む(comprising)」を用いて本明細書中において記載されるところはいかなるところでも、「〜からなる(consisting of)」および/または「本質的に〜からなる(consisting essentially of)」によって記載される他の類似する実施形態もまた提供されることが理解される。
【００４５】
一般的な技術
本発明の実施には、特に示されていない限り、分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の当技術分野の技術の範囲内にある従来の技術が用いられることとなる。上記技術は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrookら, 1989) Cold Spring Harbor Press、Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait編, 1984)、Methods in Molecular Biology, Humana Press、Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis編, 1998) Academic Press、Animal Cell Culture (R.I. Freshney編, 1987)、Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. MatherおよびP.E. Roberts, 1998) Plenum Press、Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths,およびD.G. Newell編, 1993-1998) J. Wiley and Sons、Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)、Handbook of Experimental Immunology (D.M. WeirおよびC.C. Blackwell編)、Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. MillerおよびM.P. Calos編, 1987)、Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubelら編, 1987)、PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullisら編, 1994)、Current Protocols in Immunology (J.E. Coliganら編, 1991)、Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)、Immunobiology (C.A. JanewayおよびP. Travers, 1997)、Antibodies (P. Finch, 1997)、Antibodies: a practical approach (D. Catty編, IRL Press, 1988-1989)、Monoclonal antibodies: a practical approach (P. ShepherdおよびC. Dean編, Oxford University Press, 2000)、Using antibodies: a laboratory manual (E. HarlowおよびD. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)、The Antibodies (M. ZanettiおよびJ.D. Capra編, Harwood Academic Publishers, 1995)等の文献において十分に説明される。
【００４６】
定義
「抗体」は、糖質、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等のような標的に、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも1つの抗原認識部位を介して、特異的に結合することができる免疫グロブリン分子である。本明細書中に使用されるように、その用語は、完全なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけではなく、それらの断片(Fab、Fab'、F(ab')2、Fv等)、一本鎖(ScFv)、それらの突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、および任意の他の修飾された配置の、抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、IgG、IgA、もしくはIgM(またはそれらのサブクラス)等の任意のクラスの抗体を含み、抗体はいずれかの特定のクラスである必要はない。その重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンを異なるクラスに指定することができる。5つの主要なクラスの免疫グロブリン:IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス(アイソタイプ)、たとえばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2にさらに分けられうる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューとそれぞれ称される。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元配置はよく知られている。
【００４７】
本明細書中に使用されるように、「モノクローナル抗体」は実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体のことを言う、つまり、集団を構成する個々の抗体は、可能性として考えられる微量に存在する可能性がある自然突然変異を除けば同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。さらに、異なる決定基(エピトープ)に対する抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対するものである。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の特性を示し、任意の特定の方法による抗体の生産を必要とするものとして解釈されないものとする。たとえば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、米国特許第4,816,567号に記載されるような組換えDNA方法により作製されてもよい。モノクローナル抗体はまた、たとえばMcCaffertyら, 1990, Nature, 348:552-554に記載される技術を使用して作製されたファージライブラリーから単離されてもよい。
【００４８】
本明細書中に使用されるように、「ヒト化」抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含む特異的なキメラ免疫グロブリン、キメラ免疫グロブリン鎖、またはそれらの断片(Fv、Fab、Fab'、F(ab')2、または抗体の他の抗原結合部分配列等)である非ヒト(たとえばネズミ)抗体の形態のことを言う。いくつかのヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域(CDR)からの残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギ等の非ヒト種のCDRからの残基(ドナー抗体)により置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基は対応する非ヒト残基により置換される。いくつかのヒト化抗体は、所望の特異性、親和性、および/または能力を有するマウス、ラット、またはウサギ等の非ヒト種(ドナー抗体)に通常由来する少なくとも1つ、通常2つの可変ドメインを含むが、1つまたは複数のFvフレームワーク領域残基および/または1つまたは複数のFv CDR残基は、対応するヒト残基(つまり、ヒト抗体配列に由来する残基)により置換された。最も一般的には、少なくとも複数のFvフレームワーク領域残基が、ヒト化抗体の1つまたは複数の可変ドメインにおいて置換されるであろう。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも移入されたCDR配列またはフレームワーク配列にも認められないが、抗体性能をさらに改良し最適化するために含まれる残基を含んでいてもよい。いくつかのヒト化抗体は、実質的にすべての少なくとも1つ、通常2つの可変ドメインを含むこととなり、すべてのまたは実質的にすべてのCDRは非ヒト免疫グロブリンのCDRに対応し、すべてまたは実質的にすべてのFRはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のFRである。いくつかのヒト化抗体は、実質的にすべての少なくとも1つ、通常2つの可変ドメインを含むこととなり、CDRの大多数のアミノ酸残基は、非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸残基に対応し、FRの1つまたは複数のアミノ酸残基は、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のアミノ酸残基である。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリンの定常領域または定常ドメイン(Fc)、通常、ヒト免疫グロブリンの定常領域または定常ドメインの少なくとも一部分を最適に含むであろう。いくつかのヒト化抗体は、国際公開第99/58,572号に記載されるように修飾されたFc領域を有している。いくつかの形態のヒト化抗体は、本来の抗体に関して変更された1つまたは複数の(たとえば1、2、3、4、5、6つの)CDRを有しており、これらのCDRはまた、本来の抗体からの1つまたは複数のCDR「に由来する」1つまたは複数のCDRと称される。
【００４９】
本明細書中に使用されるように、「ヒト抗体」は、ヒトにより生産された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有し、および/またはヒト抗体の作製のための当技術分野で知られているか本明細書中に開示される任意の技術を使用して作製された抗体を意味する。ヒト抗体のこの定義は、少なくとも1つのヒト重鎖ポリペプチドまたは少なくとも1つのヒト軽鎖ポリペプチドを含む抗体を含む。1つの上記の例は、ネズミ軽鎖ポリペプチドおよびヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で知られている様々な技術を使用して生産することができる。一実施形態では、ヒト抗体はファージライブラリーから選択され、ファージライブラリーはヒト抗体を発現する(Vaughanら, 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314、Sheetsら, 1998, PNAS, (USA) 95:6157-6162、HoogenboomおよびWinter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381、Marksら, 1991, J. Mol. Biol., 222:581)。ヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリン座を、内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に不活性化された形質転換動物、たとえばマウスに導入することにより作製することができる。このアプローチは、米国特許第5,545,807号、5,545,806号、5,569,825号、5,625,126号、5,633,425号、および5,661,016号に記載されている。あるいは、ヒト抗体は、標的抗原に対して指向性である抗体を生産するヒトBリンパ球の不死化により調製されてもよい(上記Bリンパ球は個体から回収されてもよいし、またはin vitroで免疫されてもよい)。たとえば、Coleら, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985), Boernerら, 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95、および米国特許第5,750,373号を参照されたい。いくつかの実施形態では、ヒト抗体は「完全にヒト型」であり、抗体がヒト重鎖ポリペプチドおよびヒト軽鎖ポリペプチドを含むことを意味する。
【００５０】
用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーについて言うために区別なく本明細書中に使用される。ポリマーは直鎖状または分枝していてもよく、ポリマーは修飾されたアミノ酸を含んでいてもよく、ポリマーは非アミノ酸により中断されていてもよい。その用語はまた、自然にまたは介入、たとえばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分とのコンジュゲート等の任意の他の操作または修飾により修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。たとえば、アミノ酸(たとえば、非天然アミノ酸等を含む)の1つまたは複数の類似体を含むポリペプチドおよび当技術分野で知られている他の修飾体もまた定義に含まれる。本発明のポリペプチドは抗体に基づくので、ポリペプチドは一本鎖または結合鎖として生じることができるということが理解される。
【００５１】
「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、本明細書中において区別なく使用されるように、任意の長さのヌクレオチドのポリマーのことを言い、DNAおよびRNAを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドもしくは塩基、および/またはそれらの類似体、あるいはDNAポリメラーゼまたはRNAポリメラーゼによりポリマー中に取り込むことができる任意の基質とすることができる。ポリヌクレオチドは、メチル化されたヌクレオチドおよびそれらの類似体等の修飾されたヌクレオチドを含んでいてもよい。ヌクレオチド構造に対する修飾は、存在する場合、ポリマーの組み立て前または後に与えてもよい。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されていてもよい。ポリヌクレオチドは、重合後に、標識成分とのコンジュゲート等によって、さらに修飾されてもよい。他の種類の修飾は、たとえば、「キャップ」、類似体との、1つまたは複数の天然ヌクレオチドの置換、たとえば、無電荷連結(たとえば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カバメート等)を有するヌクレオチド間修飾および電荷連結(たとえば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等)を有するヌクレオチド間修飾、たとえば、タンパク質(たとえば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ply-L-リシン等)等のペンダント部分を含むヌクレオチド間修飾、インターカレーター(たとえば、アクリジン、ソラレン等)を有するヌクレオチド間修飾、キレート剤(たとえば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化性の金属等)を含むヌクレオチド間修飾、アルキル化剤を含むヌクレオチド間修飾、修飾された連結(たとえば、アルファアノマー核酸等)を有するヌクレオチド間修飾等のヌクレオチド間修飾、ならびにポリヌクレオチドの非修飾形態を含む。さらに、糖にたいてい存在する任意の水酸基は、たとえばホスホネート基およびリン酸基により置換されてもよく、標準的な保護基により保護されてもよく、もしくはさらなるヌクレオチドに対するさらなる連結を準備するために活性化されてもよく、または固体担体にコンジュゲートさせてもよい。5'および3'末端のOHは、リン酸化またはアミンもしくは1〜20個の炭素原子の有機キャッピング基部分と置換することができる。他の水酸基もまた、標準的な保護基に誘導体化されてもよい。ポリヌクレオチドはまた、当技術分野で一般に知られている類似した形態のリボース糖またはデオキシリボース糖を含むこともでき、たとえば、2'-O-メチルリボース、2'-O-アリルリボース、2'-フルオロリボース、または2'-アジドリボース、炭素環式糖類似体、α-アノマー糖、アラビノース、キシロース、またはリキソース等のエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、およびメチルリボシド等の脱塩基ヌクレオシド類似体を含む。1つまたは複数のホスホジエステル連結は代替の連結基と置換されてもよい。これらの代替の連結基は、リン酸が、P(O)S(「チオアート」)、P(S)S(「ジチオアート」)、「(O)NR2(「アミデート」)、P(O)R、P(O)OR'、CO、またはCH2(「フォルムアセタール」)により置換され、式中、各RまたはR'は、独立して、Hまたはエーテル(-O-)連結、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、もしくはアラルキルを任意選択で含む置換もしくは非置換アルキル(1〜20C)である実施形態を含むがこれらに限定されない。ポリヌクレオチドにおけるすべての連結が同一である必要があるとは限らない。先の記載は、RNAおよびDNAを含む本明細書中において言及されるすべてのポリヌクレオチドに対して適用される。
【００５２】
抗体の「可変領域」は、単独のまたは組み合わさった、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を言う。重鎖および軽鎖の可変領域は、それぞれ、超可変領域としても知られている3つの相補性決定領域(CDR)により連結されている4つのフレームワーク領域(FR)からなる。各鎖におけるCDRは、FRにより、他方の鎖からのCDRの近傍に保持されており、抗体の抗原結合部位の形成に貢献している。CDRを決定するための少なくとも2つの技術がある:(1)異種間配列可変性に基づくアプローチ(たとえば、KabatらSequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD))および(2)抗原抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ(Al-lazikaniら(1997) J. Molec. Biol. 273:927-948))。さらに、これらの2つのアプローチの組合せは、CDRを決定するために当技術分野で時に使用される。
【００５３】
抗体の「定常領域」は、単独のまたは組み合わさった、抗体軽鎖の定常領域もしくは抗体重鎖の定常領域を言う。
【００５４】
抗体またはポリペプチドに「優先的に結合する」または「特異的に結合する」(本明細書中において区別なく使用される)エピトープは当技術分野で十分に理解されている用語であり、上記特異的なまたは優先的な結合を決定するための方法はまた、当技術分野でよく知られている。分子が、代替の細胞または物質と反応するよりも、特定の細胞または物質と、より頻繁に、より急速に、より持続して、および/またはより大きな親和性で反応するか結合する場合、分子は「特異的な結合」または「優先的な結合」を示すと表現される。抗体が、他の物質に結合するよりも、より大きな親和性、結合活性で、より容易に、および/またはより持続して結合する場合、抗体は、標的に、「特異的に結合する」または「優先的に結合する」。たとえば、特異的にまたは優先的にCD26エピトープに結合する抗体は、他のCD26エピトープまたは非CD26エピトープに結合するよりも、より大きな親和性、結合活性で、より容易に、および/またはより持続してこのCD26エピトープに結合する抗体である。この定義を解釈することにより、たとえば、第1の標的に特異的にまたは優先的に結合する抗体(または部分またはエピトープ)は、第2の標的に特異的にまたは優先的に結合する可能性もあるか結合しない可能性もあるということが理解される。そのため、「特異的な結合」または「優先的な結合」は、必ずしも排他的な結合を(含むことはできるが)必要としない。一般に、しかし、必須では無いが、結合についての言及は優先的な結合を意味する。
【００５５】
「宿主細胞」は、ポリヌクレオチド挿入断片の取り込みのためのベクターのレシピエントとすることができるかレシピエントとした個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含み、子孫は、自然の、偶発的な、または計画的な突然変異により、本来の親細胞と必ずしも完全に同一ではない可能性がある(形態においてまたはゲノムDNA補体において)。宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドによりin vivoで形質移入された細胞を含む。
【００５６】
「単離された」ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、自然界では見つけられない形態をしたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物である。単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、もはや、自然界で見つけられる形態をしていない程度に精製されたものを含む。いくつかの実施形態では、単離された抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は実質的に純粋である。
【００５７】
本明細書中に使用されるように、「治療」は、有益なまたは所望の臨床結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のために、有益なまたは所望の臨床結果は、疾患に関連する1つまたは複数の症状の軽減、疾患の範囲の減少、疾患の安定化した(つまり悪化していない)状態、疾患進行の遅延または緩徐化、疾患状態の寛解または緩和、および緩解(部分的または全体)を、検出可能または検出不可能のいずれにせよ含むがこれらに限定されない。「治療」はまた、治療を受けていない場合に予想される生存と比較して生存を延長することを意味することもできる。いくつかの実施形態では、疾患の「治療」は、疾患を治癒することを包含することができるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、状態に関する有益なまたは所望の結果は、1つまたは複数の次のものを含むが、これらに限定されない:状態の改善、状態の治癒、状態の重症度の減少、状態の進行の遅延、状態に関連する1つもしくは複数の症状の緩和、状態に罹患しているものの生存の質の上昇および/または生存の延長。本明細書中に記載される組成物が癌の治療のために使用されるそれらの実施形態では、有益なまたは所望の結果は、1つまたは複数の次のものを含むことができるが、これらに限定されない:腫瘍性細胞もしくは癌性細胞の増殖の低下(もしくは破壊)、腫瘍性細胞の転移の阻害、腫瘍のサイズの縮小、腫瘍の成長の阻害、腫瘍の退縮、癌の緩解、癌に起因する症状の減少、癌に罹患するものたちの生存の質の上昇、癌を治療するために必要とされる他の薬剤の用量の減少、癌の進行の遅延、および/または癌を有する患者の生存の延長。
【００５８】
「有効量」は、臨床結果を含む有益なまたは所望の臨床結果を達成するのに十分な量である。有効量は、1回または複数回の投与で投与することができる。本発明の目的のために、本明細書中に記載される抗CD26抗体等のポリペプチドの有効量はCD26発現に関連する状態の進行を寛解させる、安定化する、逆転させる、緩徐化する、および/または遅延させるのに十分な量である。当技術分野で理解されるように、たとえば抗CD26抗体の有効量は、とりわけ、患者病歴ならびに使用される抗CD26抗体の種類(および/または投与量)等の他の要因に依存して、変動してもよい。当業者に対する本開示により明らかなように、これらの原理は、ポリペプチドの実施形態に適用される。
【００５９】
本明細書中において「被験体」とも言われる「個体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物は、家畜(雌ウシ等)、競技動物、ペット(ネコ、イヌ、およびウマ等)、霊長動物、マウス、ならびにラットを含むが、これらに限定されない。
【００６０】
本明細書中に使用されるように、「ベクター」は、構築物を意味し、1つまたは複数の目的の遺伝子または配列を宿主細胞において送達する、好ましくは発現することができる。ベクターの例は、ウイルスベクター、裸のDNAまたはRNAの発現ベクター、プラスミド、コスミドベクターまたはファージベクター、カチオン凝縮剤に関連するDNAまたはRNAの発現ベクター、リポソームおよび生産細胞等のある種の真核細胞中にカプセル化されたDNAまたはRNAの発現ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
本明細書中に使用されるように、「薬学的に許容し得る担体」または「薬学的に許容し得る賦形剤」は、有効成分と組み合わせた場合に、その成分が生物活性を維持するのを可能にし、送達された場合に被験体の免疫系と非反応性であり、被験体に対して無毒性である任意の材料を含む。例として、リン酸緩衝食塩水溶液、水、油/水エマルション等のエマルション、および様々な種類の湿潤剤等の任意の標準的な医薬品の担体が挙げられるが、これらに限定されない。エアロゾルまたは非経口投与のための好ましい希釈剤はリン酸緩衝食塩水または通常の(0.9%)食塩水である。上記担体を含む組成物は、よく知られている従来の方法により処方される(たとえば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro編, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990およびRemington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000を参照されたい)。
【００６２】
用語「koff」は、本明細書中に使用されるように、抗体/抗原複合体からの抗体の解離に対するoff速度定数のことを言うよう意図される。
【００６３】
用語「KD」は、本明細書中に使用されるように、抗体抗原相互作用の解離定数のことを言うよう意図される。
【００６４】
本明細書中に使用されるように、「実質的に純粋な」は、少なくとも50%純粋(つまり混入物がない)、より好ましくは少なくとも90%純粋、より好ましくは少なくとも95%純粋、より好ましくは少なくとも98%純粋、より好ましくは少なくとも99%純粋である材料のことを言う。
【００６５】
ポリペプチド
本発明は、1つまたは複数の重鎖相補性決定領域および/もしくは軽鎖相補性決定領域(CDR)、重鎖フレームワーク領域および/もしくは軽鎖フレームワーク領域(FR)、ならびに/または重鎖可変領域および/もしくは軽鎖可変領域(それぞれVHおよびVL)を含む様々な新規なポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは抗体である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは単離されている。本発明はまた、実質的に純粋なポリペプチドも包含する。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はヒト抗体である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはネズミモノクローナル抗体ではない(つまり、それ以外である)。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはマウスモノクローナル抗体ではない(つまり、それ以外である)。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは14D10抗体ではない(つまり、それ以外である)(Dongら(1998) Mol Immunol. 35(1):13-21および米国特許公開第2003/0,031,665号)。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、14D10抗体のVHもしくはVL(またはVHおよびVLの両方)、あるいは特定のCDR、FR、CDRのセット、またはFRのセットを含まない。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、14D10抗体の1つもしくは複数のCDRおよび/または1つもしくは複数のFRを含まない。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、14D10抗体のCDRのすべておよび/またはFRのすべては含まない。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、14D10抗体のVHおよびVLの両方は含まない。(14D10抗体のVHおよびVL、ならびにCDRおよびFRは、図3ならびに図5において特定されている)。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列QVKLQESGPGLVQPSQTLSITCTVSGFSLTTYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWGGGRTDYDAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAIYYCVRNRHDWFDYWGQGTTVTVSS(CM03 VH;配列番号90)の重鎖可変領域を含まない。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCSASQGIRNSLNWYQQKPDGAVKLLIYYSSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFSLTISNLEPEDIATYYCQQSIKLPFTFGSGTKLEIK(CM03 VL;配列番号91)の軽鎖可変領域を含まない。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列QVKLQESGPGLVQPSQTLSITCTVSGFSLTTYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWGGGRTDYDAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAIYYCVRNRHDWFDYWGQGTTVTVSS(配列番号90)の重鎖可変領域および配列DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCSASQGIRNSLNWYQQKPDGAVKLLIYYSSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFSLTISNLEPEDIATYYCQQSIKLPFTFGSGTKLEIK(配列番号91)の軽鎖可変領域の両方は含まない。前述の態様のおよび本明細書中に記載される他の態様のそれぞれのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、マウスモノクローナル抗体1F7ではない(米国特許第5,120,642号、PCT国際公開第91/07,985号(Schlossmanら)、Morimotoら(1989) J. Immunology, 143:3430-3439)。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、1F7抗体のVHおよびVLの両方は含まない。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、1F7抗体の1つもしくは複数のCDRおよび/または1つもしくは複数のFRを含まない。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、1F7抗体のCDRのすべておよび/またはFRのすべては含まない。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは親和性の成熟した抗体である。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるポリペプチドは、重鎖または軽鎖等の抗体鎖である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは軽鎖可変領域(たとえば、本明細書中に記載される1つもしくは複数の軽鎖CDRおよび/または本明細書中に記載される1つもしくは複数の軽鎖FRを含む軽鎖可変領域)を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは重鎖可変領域(たとえば、本明細書中に記載される1つもしくは複数の重鎖相補性決定領域(CDR)および/または本明細書中に記載される1つもしくは複数の軽鎖フレームワーク領域(FR)を含む重鎖可変領域)を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の両方をそれぞれ含むポリペプチドを包含する。本発明は、抗体または他のCD26結合ポリペプチドの合成における中間体であるポリペプチドをさらに包含する。
【００６６】
いくつかの実施形態では、抗体等の本明細書中に記載されるポリペプチドはCD26に結合する。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるポリペプチドはCD26に優先的に結合する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはヒトCD26に結合する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはヒトCD26に優先的に結合する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ヒトCD26および他の種のCD26と交差反応する。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるポリペプチドは、約200nM以下、約60nM以下、約30nM以下、約12nM以下、約6nM以下、約3nM以下、または約1nM以下のKDでヒトCD26に結合する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、約10nM以下のKDでヒトCD26に結合する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、約6nM以下のKDでヒトCD26に結合する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、約3nM以下のKDでヒトCD26に結合する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、約1nM以下のKDでヒトCD26に結合する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド(たとえば抗体)は、約0.1nM〜約10nM、約0.1nM〜約6nM、約0.1nM〜約3nM、または約0.1nM〜約1nMのKDでヒトCD26に結合する。
【００６７】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるポリペプチド(たとえば抗体)は、YSLRWISDHEYLY(配列番号45;ペプチド6)、LEYNYVKQWRHSY(配列番号46;ペプチド35)、TWSPVGHKLAYVW(配列番号47;ペプチド55)、LWWSPNGTFLAYA(配列番号48;ペプチド84)、RISLQWLRRIQNY(配列番号49;ペプチド132)、YVKQWRHSYTASY(配列番号50;ペプチド37)、EEEVFSAYSALWW(配列番号51;ペプチド79)、DYSISPDGQFILL(配列番号52;ペプチド29)、SISPDGQFILLEY(配列番号53;ペプチド30)、およびIYVKIEPNLPSYR(配列番号54;ペプチド63)からなる群から選択される1つまたは複数のペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるポリペプチドは、1つまたは複数のペプチドに優先的に結合する。これらのペプチドはヒトCD26の領域である。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるポリペプチドは、マウスモノクローナル抗体14D10と同じエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるポリペプチドは、競合アッセイにおいて、マウスモノクローナル抗体14D10のヒトCD26への結合をブロックすることができる。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるポリペプチドは、競合アッセイにおいて、マウスモノクローナル抗体1F7のヒトCD26への結合をブロックすることができる。
【００６８】
親和性を測定するための方法は当技術分野で知られている。たとえば、結合親和性は、BIAcoreバイオセンサー、KinExAバイオセンサー、シンチレーション近接アッセイ、ELISA、ORIGEN免疫測定法(IGEN社)、蛍光消光、蛍光移動、および/または酵母ディスプレイを使用して決定してもよい。結合親和性はまた、適したバイオアッセイを使用してスクリーニングしてもよい。
【００６９】
CD26に対する抗体の結合親和性を決定するための1つの方法は抗体の単官能Fab断片の親和性を測定することによるものである。単官能Fab断片を得るために、抗体、たとえばIgGは、パパインで切断するか組換えで発現させることができる。モノクローナル抗体の抗CD26 Fab断片の親和性は、表面プラズモン共鳴(SPR)システム(BIAcore 3000(商標), BIAcore社, ピスカタウェイ, NJ)により決定することができる。供給者の使用説明書に従ってSAチップ(ストレプトアビジン)を使用する。ビオチン化したCD26を、HBS-EP(100mM HEPES pH7.4、150mM NaCl、3mM EDTA、0.005% P20)中に希釈し、0.005mg/mLの濃度でチップに注入することができる。個々のチップチャネルを横切る可変的な流動時間を使用して、2つの範囲の抗原密度を達成する:詳細な反応速度の研究については10〜20応答ユニット(RU)、濃度については500〜600RU。Pierce社製溶離緩衝液および4M NaCl(2:1)の混合物は結合したFabを効率的に除去し、一方で、200回を超える注射に対してチップ上のCD26の活性を保つ。HBS-EP緩衝液は、ランニング緩衝液としてすべてのBIAcoreアッセイに使用することができる。精製したFab試料の階段希釈溶液(0.1〜10×見積もったKD)を2分間、100μL/分で注入する。30h分までの解離時間が通常考慮に入れられる。Fabタンパク質の濃度は、ELISAおよび/またはSDS-PAGE電気泳働により、既知濃度(アミノ酸分析により決定された)の標準的なFabを使用して決定することができる。反応速度の結合速度(kon)および解離速度(koff)は、1:1 Langmuir結合モデルにデータをフィットさせることにより(Lofas & Johnsson, 1990)、BIAevaluationプログラムを使用して同時に得られる。平衡解離定数(KD)値はkoff/konとして算出される。
【００７０】
いくつかの実施形態では、本発明は、抗体等のポリペプチドを包含し、これらポリペプチドは、CD26を発現する細胞の増殖を阻害する。本発明はまた、ポリペプチドが、CD26発現(たとえばT細胞悪性腫瘍)に関連する状態(疾患または障害等)の治療に有用である実施形態も包含する。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチド(たとえば抗体)は、1つまたは複数の以下の特徴を有していてもよい:(a)CD26に結合する、(b)CD26活性を調整する、(c)G1/SチェックポイントでのCD26+細胞の細胞周期停止をもたらす、(d)CD26を発現する細胞の増殖を阻害する、および/または(e)CD26発現に関連する状態の治療に有用である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、CD26発現腫瘍の成長を阻害する、CD26発現腫瘍の退縮を誘導する、および/またはCD26発現癌細胞の転移を阻害するのに有用である。いくつかの実施形態では、CD26発現に関連する状態は、CD26過剰発現に関連する疾患または障害である。いくつかの実施形態では、CD26発現に関連する状態は、少なくとも部分的にCD26により媒介される。いくつかの実施形態では、CD26発現に関連する状態はCD26を発現する細胞の増殖に関連する状態である。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、癌(たとえば、固形腫瘍癌、膵癌、腎臓癌、もしくはリンパ腫)、自己免疫疾患もしくは自己免疫障害、移植片対宿主疾患(GVHD)、または炎症性疾患もしくは炎症性障害である。
【００７１】
一態様では、本発明は、本明細書中に記載される1つまたは複数の(たとえば、1、2、3、4、5、または6つの)相補性決定領域(CDR)を含むポリペプチドを提供する。他の態様では、本発明は、本明細書中に記載される1つもしくは複数の(たとえば1、2、もしくは3つの)重鎖相補性決定領域(CDR)および/または本明細書中に記載される1つもしくは複数の(たとえば1、2、もしくは3つの)軽鎖CDRを含むポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、本明細書中に記載される1つもしくは複数の(たとえば1、2、3、もしくは4つの)重鎖フレームワーク領域(FR)および/または本明細書中に記載される1つもしくは複数の(たとえば1、2、3、もしくは4つの)軽鎖FRをさらに含む。他の態様では、本発明は、本明細書中に記載される1つもしくは複数の(たとえば1、2、もしくは3つの)重鎖相補性決定領域(CDR)を含む重鎖可変領域および/または本明細書中に記載される1つもしくは複数の(たとえば1、2、もしくは3つの)軽鎖CDRを含む軽鎖可変領域を含むポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、重鎖可変領域は、本明細書中に記載される1つもしくは複数の(たとえば1、2、3、もしくは4つの)重鎖フレームワーク領域(FR)をさらに含むおよび/または軽鎖可変領域は、本明細書中に記載される1つもしくは複数の(たとえば1、2、3、もしくは4つの)軽鎖FRをさらに含む。
【００７２】
「重鎖CDR」または「軽鎖CDR」についての言及は、これらのCDRの実施形態すべてが重鎖または軽鎖にそれぞれ含まれるということを意味しないということが理解される。これらの用語は、それらの由来を示す利便性のために使用される。しかしながら、本発明は、1つまたは複数のCDRが、(a)重鎖可変領域および/もしくは軽鎖可変領域、ならびに/または(b)重鎖および/もしくは軽鎖に含まれる実施形態を含む。同じ原理がフレームワークの名称に対して適用される。
【００７３】
本発明は、(a)(i)GFSLTTYGVH(配列番号55)、GFSLSTYGVH(配列番号56)、およびGYSLTTYGVH(配列番号57)からなる群から選択される重鎖CDR1、(ii)VIWGDGRTDYDAAFMS(配列番号58)およびVIWGDGRTDYDSSFMS(配列番号59)からなる群から選択される重鎖CDR2、ならびに(iii)重鎖CDR3 配列NRHDWFDY(配列番号60)からなる群から選択されるCDRに対してそれぞれ、少なくとも約80%の同一性を有する1つまたは複数の(たとえば1、2、または3つの)重鎖CDR、ならびに/または(b)(i)RASQDIRNNLN(配列番号61)、RASQGIRNNLN(配列番号62)、およびSASQDIRNSLN(配列番号63)からなる群から選択される軽鎖CDR1、(ii)YSSNLHS(配列番号64)、YSSNLQS(配列番号65)、およびYSSNLHT(配列番号66)からなる群から選択される軽鎖CDR2、ならびに(iii)QQSIKLPLT(配列番号67)、QQSIKLPFT(配列番号68)、およびQQSNKLPLT(配列番号69)からなる群から選択される軽鎖CDR3からなる群から選択されるCDRに対してそれぞれ少なくとも約80%の同一性を有する1つまたは複数の(たとえば1、2、または3つの)軽鎖CDRを含む、抗体等のポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、CDRは、示した配列に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはCD26に結合する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはネズミモノクローナル抗体ではない。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、(i)GFSLTTYGVH(配列番号55)に対して少なくとも約80%の同一性を有する重鎖CDR1、(ii)VIWGDGRTDYDAAFMS(配列番号58)に対して少なくとも約80%の同一性を有する重鎖CDR2、および(iii)NRHDWFDY(配列番号60)に対して少なくとも約80%の同一性を有する重鎖CDR3を含む抗体である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、(i)RASQGIRNNLN(配列番号62)に対して少なくとも約80%の同一性を有する軽鎖CDR1、(ii)YSSNLQS(配列番号65)に対して少なくとも約80%の同一性を有する軽鎖CDR2、および(iii)QQSIKLPFT(配列番号68)に対して少なくとも約80%の同一性を有する軽鎖CDR3を含む抗体である。
【００７４】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、1つまたは複数の(たとえば1、2、または3つの)CDRを含み、各CDRは、図5に示される重鎖可変領域(VH)X384、X385、X386、X387、X388、X399、またはX420のCDRを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは1つまたは複数の(たとえば1、2、または3つの)CDRを含み、各CDRは、図3に示される配列X376、X377、X378、X379、X380、X381、またはX394のいずれかの軽鎖可変領域(VL)のCDRを含む。いくつかの実施形態では、1つまたは複数のCDRは、それぞれ図3または図5に示される、軽鎖可変領域または重鎖可変領域のCDR1、CDR2、またはCDR3である(たとえば、CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、および/またはCDR-H3 )。いくつかの実施形態は、図5に示される重鎖可変領域(VH)配列X384、X385、X386、X387、X388、X399、またはX420の1つまたは複数のCDRおよび図3に示される軽鎖可変領域配列X376、X377、X378、X379、X380、X381、またはX394の1つまたは複数のCDRを含むポリペプチド(抗体等)を含む。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本発明は、図5に示される配列X384、X385、X386、X387、X388、X399、もしくはX420のいずれかのVHまたは図3に示される配列X376、X377、X378、X379、X380、X381、もしくはX394のいずれかの軽鎖可変領域(VL)の少なくとも1つのCDR、少なくとも2つのCDR、または少なくとも3つのCDRと少なくとも約80%同一である少なくとも1つのCDRを含む、抗体等のポリペプチドを提供する。他の実施形態は、図5に示される配列X384、X385、X386、X387、X388、X399、もしくはX420のいずれかのVHまたは図3に示される配列X376、X377、X378、X379、X380、X381、もしくはX394のいずれかのVLの少なくとも2つまたは3つのCDRに少なくとも約80%同一である少なくとも2つまたは3つのCDRを含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、図5または図3に示されるVHまたはVLの少なくとも1つのCDR、少なくとも2つ、または少なくとも3つのCDRに実質的に相同の1つまたは複数のCDRは、図5に示される配列X384、X385、X386、X387、X388、X399、もしくはX420のいずれかのまたは図3に示される配列X376、X377、X378、X379、X380、X381、もしくはX394のいずれかにおけるVHまたはVLの少なくとも1つ、少なくとも2つ、または少なくとも3つのCDRに少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%同一である。いくつかの実施形態では、CDRは、CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、および/またはCDR-H3である。
【００７６】
CDRの決定は、十分に当技術分野の技術の範囲内である。いくつかの実施形態では、CDRはKabatのCDRである。他の実施形態では、CDRはChothiaのCDRである。他の実施形態では、1つまたは複数のCDRは、KabatおよびChothiaの定義の組合せにより規定される。
【００７７】
一態様では、本発明は、(a)配列GX1X2LX3TYGVH(配列番号31)、式中、X1はFもしくはYであり、X2はSもしくはTであり、X3はT、N、もしくはSである、を含む重鎖CDR1、(b)配列VIWGX1GRTDYDX2X3FMS(配列番号32)、式中、X1はGもしくはDであり、X2はAもしくはSであり、X3はAもしくはSである、を含む重鎖CDR2、および/または(c)配列X1RHDWFDY(配列番号33)、式中、X1はNもしくはSである、を含む重鎖CDR3を含むポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはCDR1を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはCDR2を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはCDR3を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはCDR1、CDR2、およびCDR3を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、CDR1、CDR2、および/またはCDR3を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは軽鎖可変領域をさらに含む(たとえば、本明細書中に記載される軽鎖可変領域)。
【００７８】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、(i)配列GX1X2LX3TYGVH(配列番号31)、式中、X1はFまたはYであり、X2はSまたはTであり、X3はT、N、またはSである、を含むCDR1、(ii)配列VIWGX1GRTDYDX2X3FMS(配列番号32)、X1はGまたはDであり、X2はAまたはSであり、X3はAまたはSである、を含むCDR2、および(iii)配列X1RHDWFDY(配列番号33)、式中、X1はNまたはSである、を含むCDR3を含む重鎖CDRを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、重鎖CDRを含む重鎖可変領域を含む。
【００７９】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、GFSLTTYGVH(配列番号55)、GFSLSTYGVH(配列番号56)、およびGYSLTTYGVH(配列番号57)からなる群から選択される配列を含む重鎖CDR1を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、VIWGDGRTDYDAAFMS(配列番号58)およびVIWGDGRTDYDSSFMS(配列番号59)からなる群から選択される配列を含む重鎖CDR2を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列NRHDWFDY(配列番号60)を含む重鎖CDR3を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、重鎖CDRを含む重鎖可変領域を含む。
【００８０】
さらに、本発明のいずれかの態様または実施形態がマーカッシュグループまたは代替の他のグループ分けによって本明細書中に記載される場合、本発明は、全体として記載された完全なグループだけではなくグループの各メンバーも個々に包含し、メイングループの可能性として考えられるすべてのサブグループだけではなく1つまたは複数のグループメンバーが不在のメイングループもまた包含する。本発明はまた、請求される発明における1つまたは複数の任意のグループメンバーの明白な除外についても想定する。
【００８１】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、(a)配列GFSLTTYGVH(配列番号55)を含むCDR1、(b)配列VIWGDGRTDYDAAFMS(配列番号58)を含むCDR2、および(c)配列NRHDWFDY(配列番号60)を含むCDR3を含む重鎖CDRを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、(a)配列GFSLSTYGVH(配列番号56)を含むCDR1、(b)配列VIWGDGRTDYDAAFMS(配列番号58)を含むCDR2、および(c)配列NRHDWFDY(配列番号60)を含むCDR3を含む重鎖CDRを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、(a)配列GYSLTTYGVH(配列番号57)を含むCDR1、(b)配列VIWGDGRTDYDSSFMS(配列番号59)を含むCDR2、および(c)配列NRHDWFDY(配列番号60)を含むCDR3を含む重鎖CDRを含む。上記のそれぞれのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、特定のCDR1、CDR2、およびCDR3を含む重鎖可変領域を含む。
【００８２】
他の態様では、本発明は、(a)配列X1ASQX2IRNX3LN(配列番号34)、式中、X1はSもしくはRであり、X2はGもしくはDであり、X3はSもしくはNである、を含む軽鎖CDR1、(b)配列YSSNLX1X2(配列番号35)、式中、X1はHもしくはQであり、X2はSもしくはTである、を含む軽鎖CDR2、および/または(c)配列QQSX1KLPX2T(配列番号36)、式中、X1はIもしくはNであり、X2はFもしくはLである、を含む軽鎖CDR3を含むポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは抗体である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはCDR1を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはCDR2を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはCDR3を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはCDR1、CDR2、およびCDR3を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、CDR1、CDR2、および/またはCDR3を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは重鎖可変領域をさらに含む。(たとえば、本明細書中に記載される重鎖可変領域)。
【００８３】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、(i)配列X1ASQX2IRNX3LN(配列番号34)、式中、X1はSもしくはRであり、X2はGもしくはDであり、X3はSもしくはNである、を含むCDR1、(ii)配列YSSNLX1X2(配列番号35)、式中、X1はHもしくはQであり、X2はSもしくはTである、を含むCDR2、および(iii)配列QQSX1KLPX2T(配列番号36)、式中、X1はIもしくはNであり、X2はFもしくはLである、を含むCDR3を含む軽鎖CDRを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、軽鎖CDRを含む軽鎖可変領域を含む。
【００８４】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、RASQDIRNNLN(配列番号61)、RASQGIRNNLN(配列番号62)、およびSASQDIRNSLN(配列番号63)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、YSSNLHS(配列番号64)、YSSNLQS(配列番号65)、およびYSSNLHT(配列番号66)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、QQSIKLPLT(配列番号67)、QQSIKLPFT(配列番号68)、およびQQSNKLPLT(配列番号69)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、軽鎖CDRを含む軽鎖可変領域を含む。
【００８５】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、(a)配列RASQDIRNNLN(配列番号61)を含むCDR1、(b)配列YSSNLHS(配列番号64)を含むCDR2、および(c)配列QQSIKLPLT(配列番号67)を含むCDR3を含む軽鎖CDRを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、(a)配列RASQGIRNNLN(配列番号62)を含むCDR1、(b)配列YSSNLQS(配列番号65)を含むCDR2、および(c)配列QQSIKLPFT(配列番号68)を含むCDR3を含む軽鎖CDRを含む。いくつかの他の実施形態では、ポリペプチドは、(a)配列SASQDIRNSLN(配列番号63)を含むCDR1、(b)配列YSSNLHT(配列番号66)を含むCDR2、および(c)配列QQSNKLPLT(配列番号69)を含むCDR3を含む軽鎖CDRを含む。上記のそれぞれのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、特定のCDR1、CDR2、およびCDR3を含む軽鎖可変領域を含む。
【００８６】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、(a)配列GFSLTTYGVH(配列番号55)を含むCDR1、(b)配列VIWGDGRTDYDAAFMS(配列番号58)を含むCDR2、および(c)配列NRHDWFDY(配列番号60)を含むCDR3を含む重鎖CDR、ならびに/または(a)配列RASQGIRNNLN(配列番号62)を含むCDR1、(b)配列YSSNLQS(配列番号65)を含むCDR2、および(c)配列QQSIKLPFT(配列番号68)を含むCDR3を含む軽鎖CDRを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは抗体である。
【００８７】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列GX1X2LX3TYGVH(配列番号31)、式中、X1はFもしくはYであり、X2はSもしくはTであり、X3はT、N、もしくはSである、を含む重鎖CDR1、配列VIWGX1GRTDYDX2X3FMS(配列番号32)、式中、X1はGもしくはDであり、X2はAもしくはSであり、X3はAもしくはSである、を含む重鎖CDR2、および/または配列X1RHDWFDY(配列番号33)、式中、X1はNもしくはSである、を含む重鎖CDR3を含み、かつ配列X1ASQX2IRNX3LN(配列番号34)、式中、X1はSもしくはRであり、X2はGもしくはDであり、X3はSもしくはNである、を含む軽鎖CDR1、配列YSSNLX1X2(配列番号35)、式中、X1はHもしくはQであり、X2はSもしくはTである、を含む軽鎖CDR2、および/または配列QQSX1KLPX2T(配列番号36)、式中、X1はIもしくはNであり、X2はFもしくはLである、を含む軽鎖CDR3をさらに含む。たとえば、いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、3つの重鎖CDRであるCDR1、CDR2、およびCDR3ならびに3つの軽鎖CDRであるCDR1、CDR2、およびCDR3を含む。
【００８８】
本発明はまた、本明細書中に記載される1つまたは複数のCDRを含むポリペプチドも包含し、ポリペプチドは、本明細書中に記載される1つまたは複数のFRをさらに含む。
【００８９】
いくつかの実施形態では、CDRおよび/またはFRは逐次の順番となっている。
【００９０】
本発明は、本明細書中に記載される1つまたは複数の(たとえば1、2、または3つの)重鎖CDRを含む重鎖可変領域をさらに提供する。いくつかの実施形態では、重鎖可変領域は、本明細書中に記載される1つまたは複数の(たとえば1、2、3、または4つの)重鎖FRをさらに含む。さらに、本発明はまた、本明細書中に記載される1つまたは複数の(たとえば1、2、または3つの)軽鎖CDRを含む軽鎖可変領域も提供する。いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、本明細書中に記載される1つまたは複数の(たとえば1、2、3、または4つの)軽鎖FRをさらに含む。
【００９１】
他の態様では、本発明は、本明細書中に記載される1つもしくは複数の重鎖フレームワーク領域(FR)および/または本明細書中に記載される1つもしくは複数の軽鎖フレームワーク領域を含むポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、本明細書中に記載される1つもしくは複数の重鎖FRを含む重鎖可変領域および/または本明細書中に記載される1つもしくは複数の軽鎖FRを含む軽鎖可変領域を含む。
【００９２】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは1つまたは複数の(たとえば1、2、3、または4つの)FRを含み、各FRは、図5に示される配列X384、X385、X386、X387、X388、X399、またはX420のいずれかの重鎖可変領域(VH)のFRを含む。いくつかの実施形態では、図5における重鎖可変領域のFRは、FR1、FR2、FR3、またはFR4である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは1つまたは複数の(たとえば1、2、3、または4つの)FRを含み、各FRは、図3に示される配列X376、X377、X378、X379、X380、X381、またはX394のいずれかの軽鎖可変領域(VL)のFRを含む。いくつかの実施形態では、図3における軽鎖可変領域のFRは、FR1、FR2、FR3、またはFR4である。いくつかの実施形態は、図5に示される配列X384、X385、X386、X387、X388、X399、またはX420のいずれかの重鎖可変領域(VH)の1つまたは複数のFRおよび図3に示される配列X376、X377、X378、X379、X380、X381、またはX394のいずれかにおける軽鎖可変領域の1つまたは複数のFRを含むポリペプチド(たとえば抗体)を含む。
【００９３】
いくつかの実施形態では、本発明は、図5に示される配列X384、X385、X386、X387、X388、X399、もしくはX420のいずれかのVHまたは図3に示される配列X376、X377、X378、X379、X380、X381、もしくはX394のいずれかにおけるVLの少なくとも1つのFR、少なくとも2つのFR、少なくとも3つのFR、または少なくとも4つのFRに実質的に相同である少なくとも1つのFRを含むポリペプチド(抗体等)を提供する。いくつかの実施形態では、図5または図3に示されるVHまたはVLの少なくとも1つのFR、少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つのFRに実質的に相同の1つまたは複数のFRは、配列X384、X385、X386、X387、X388、X399、もしくはX420のいずれかの図5に示されるか配列X376、X377、X378、X379、X380、X381、もしくはX394のいずれかの図3に示されるVHまたはVLの少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つのFRに少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%同一である。
【００９４】
さらに他の態様では、本発明は、(a)配列EVQLVX1SGX2X3X4X5QPGX6X7LRLX8CX9AS(配列番号37)、式中、X1はEもしくはQであり、X2はAもしくはGであり、X3はGもしくはEであり、X4はLもしくはVであり、X5はV、K、もしくはEであり、X6はGもしくはEであり、X7はTもしくはSであり、X8はTもしくはSであり、X9はTもしくはKである、を含む重鎖FR1、(b)配列WVRQAPGKGLEWX1G(配列番号38)、式中、X1はVもしくはMである、を含む重鎖FR2、(c)配列RVTISX1DX2SKX3TX4YLQX5NSLRAEDTAVYYCX6R(配列番号39)、式中、X1はKもしくはRであり、X2はNもしくはTであり、X3はSもしくはNであり、X4はVもしくはAであり、X5はMもしくはLであり、X6はV、M、もしくはTである、を含む重鎖FR3、および/または(d)配列WGQGTTVTVSS(配列番号40)を含む重鎖FR4を含むポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはFR1を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはFR2を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはFR3を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはFR1、FR2、FR3、およびFR4を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、FR1、FR2、FR3、および/またはFR4を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは軽鎖可変領域をさらに含む。
【００９５】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列EVQLVESGAGVKQPGGTLRLTCTAS(配列番号70)、EVQLVQSGGGVKQPGETLRLTCTAS(配列番号71)、EVQLVQSGGGLKQPGETLRLSCTAS(配列番号72)、またはEVQLVESGGGVKQPGETLRLTCTAS(配列番号73)を含む重鎖FR1を含む。他の実施形態では、ポリペプチドは、配列WVRQAPGKGLEWVG(配列番号74)またはWVRQAPGKGLEWMG(配列番号75)を含む重鎖FR2を含む。他の実施形態では、ポリペプチドは、配列RVTISKDTSKSTVYLQMNSLRAEDTAVYYCMR(配列番号76)、RVTISKDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCMR(配列番号77)、またはRVTISKDTSKSTAYLQLNSLRAEDTAVYYCTR(配列番号78)を含む重鎖FR3を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列WGQGTTVTVSS(配列番号40)を含む重鎖FR4を含む。
【００９６】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、(a)配列EVQLVESGAGVKQPGGTLRLTCTAS(配列番号70)を含むFR1、(b)配列WVRQAPGKGLEWVG(配列番号74)を含むFR2、(c)配列RVTISKDTSKSTVYLQMNSLRAEDTAVYYCMR(配列番号76)を含むFR3、および(d)配列WGQGTTVTVSS(配列番号40)を含むFR4を含む重鎖フレームワーク領域を含む。他の実施形態では、ポリペプチドは、(a)配列EVQLVQSGGGVKQPGETLRLTCTAS(配列番号71)を含むFR1、(b)配列WVRQAPGKGLEWVG(配列番号74)を含むFR2、(c)配列RVTISKDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCMR(配列番号77)を含むFR3、および(d)配列WGQGTTVTVSS(配列番号40)を含むFR4を含む重鎖フレームワーク領域を含む。さらに他の実施形態では、ポリペプチドは、(a)配列EVQLVQSGGGLKQPGETLRLSCTAS(配列番号72)を含むFR1、(b)配列WVRQAPGKGLEWMG(配列番号75)を含むFR2、(c)配列RVTISKDTSKSTAYLQLNSLRAEDTAVYYCTR(配列番号78)を含むFR3、および(d)配列WGQGTTVTVSS(配列番号40)を含むFR4を含む重鎖フレームワーク領域を含む。いくつかの代替の実施形態では、ポリペプチドは、(a)配列EVQLVESGGGVKQPGETLRLTCTAS(配列番号73)を含むFR1、(b)配列WVRQAPGKGLEWVG(配列番号74)を含むFR2、(c)配列RVTISKDTSKSTVYLQMNSLRAEDTAVYYCMR(配列番号76)を含むFR3、および(d)配列WGQGTTVTVSS(配列番号40)を含むFR4を含む重鎖フレームワーク領域を含む。いくつかの実施形態では、重鎖フレームワーク領域は重鎖可変領域内に含まれる。
【００９７】
さらなる態様では、本発明は、(a)配列X1IX2X3TQSPSSLSX4X5X6GX7RX8TIX9C(配列番号41)、式中、X1はDもしくはEであり、X2はLもしくはEであり、X3はMもしくはLであり、X4はAもしくはVであり、X5はSもしくはTであり、X6はL、P、もしくはAであり、X7はDもしくはEであり、X8はVもしくはAであり、X9はTもしくはSである、を含む軽鎖FR1、(b)配列WYQQKPGQAPRLLIY(配列番号42)を含む軽鎖FR2、(c)配列GVPX1RFSGSGSGTDFTLTISRLX2X3EDX4AX5YYC(配列番号43)、式中、X1はS、D、もしくはAであり、X2はEもしくはQであり、X3はPもしくはAであり、X4はFもしくはVであり、X5はT、A、もしくはIである、を含む軽鎖FR3、および/または(d)配列FGSGTKVEIK(配列番号44)を含む軽鎖FR4を含むポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはFR1を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはFR2を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはFR3を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはFR4を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはFR1、FR2、FR3、およびFR4を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、FR1、FR2、FR3、および/またはFR4を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは重鎖可変領域をさらに含む。
【００９８】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列DILMTQSPSSLSASPGDRVTISC(配列番号79)、DILLTQSPSSLSATPGERATITC(配列番号80)、またはEIEMTQSPSSLSVSAGERATISC(配列番号81)を含む軽鎖FR1を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列WYQQKPGQAPRLLIY(配列番号42)を含む軽鎖FR2を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列GVPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAAYYC(配列番号82)、GVPSRFSGSGSGTDFTLTISRLQPEDVAAYYC(配列番号83)、またはGVPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDVAIYYC(配列番号84)を含む軽鎖FR3を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列FGSGTKVEIK(配列番号44)を含む軽鎖FR4を含む。
【００９９】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、(a)配列DILMTQSPSSLSASPGDRVTISC(配列番号79)を含むFR1、(b)配列WYQQKPGQAPRLLIY(配列番号42)を含むFR2、(c)配列GVPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAAYYC(配列番号82)を含むFR3、および(d)配列FGSGTKVEIK(配列番号44)を含むFR4を含む軽鎖フレームワーク領域を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、(a)配列DILLTQSPSSLSATPGERATITC(配列番号80)を含むFR1、(b)配列WYQQKPGQAPRLLIY(配列番号42)を含むFR2、(c)配列GVPSRFSGSGSGTDFTLTISRLQPEDVAAYYC(配列番号83)を含むFR3、および(d)配列FGSGTKVEIK(配列番号44)を含むFR4を含む軽鎖フレームワーク領域を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、(a)配列EIEMTQSPSSLSVSAGERATISC(配列番号81)を含むFR1、(b)配列WYQQKPGQAPRLLIY(配列番号42)を含むFR2、(c)配列GVPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDVAIYYC(配列番号84)を含むFR3、および(d)配列FGSGTKVEIK(配列番号44)を含むFR4を含む軽鎖フレームワーク領域を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖フレームワーク領域は軽鎖可変領域内に含まれる。
【０１００】
本発明は、本明細書中に記載される1つまたは複数の(たとえば1、2、3、または4つの)重鎖FRを含む重鎖可変領域をさらに提供する。さらに、本発明はまた、本明細書中に記載される1つまたは複数の(たとえば1、2、3、または4つの)軽鎖FRを含む軽鎖可変領域も提供する。
【０１０１】
本発明は、本明細書中に記載される1つもしくは複数の重鎖可変領域および/または本明細書中に記載される軽鎖可変領域のうちの1つを含むポリペプチドをさらに提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、本明細書中に記載される1つもしくは複数の重鎖CDRおよび/または本明細書中に記載される1つもしくは複数の重鎖FRを含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、1つもしくは複数の本明細書中に記載される軽鎖CDRおよび/または1つもしくは複数の本明細書中に記載される軽鎖FRを含む軽鎖可変領域を含む。
【０１０２】
他の態様では、本発明は、アミノ酸配列EVQLVX1SGX2X3X4X5QPGX6X7LRLX8CX9ASGX10X11LX12TYGVHWVRQAPGKGLEWX13GVIWGX14GRTDYDX15X16FMSRVTISX17DX18SKX19TX20YLQX21NSLRAEDTAVYYCX22RX23RHDWFDYWGQGTTVTVSS(配列番号29)、式中、X1はEまたはQであり、X2はAまたはGであり、X3はGまたはEであり、X4はLまたはVであり、X5はV、K、またはEであり、X6はGまたはEであり、X7はTまたはSであり、X8はTまたはSであり、X9はTまたはKであり、X10はFまたはYであり、X11はSまたはTであり、X12はT、N、またはSであり、X13はVまたはMであり、X14はGまたはDであり、X15はAまたはSであり、X16はAまたはSであり、X17はKまたはRであり、X18はNまたはTであり、X19はSまたはNであり、X20はVまたはAであり、X21はMまたはLであり、X22はV、M、またはTであり、X23はNまたはSである、を含むポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列EVQLVX1SGX2X3X4X5QPGX6X7LRLX8CX9ASGX10X11LX12TYGVHWVRQAPGKGLEWX13GVIWGX14GRTDYDX15X16FMSRVTISX17DX18SKX19TX20YLQX21NSLRAEDTAVYYCX22RX23RHDWFDYWGQGTTVTVSS(配列番号29)、式中、X1はEまたはQであり、X2はAまたはGであり、X3はGまたはEであり、X4はLまたはVであり、X5はV、K、またはEであり、X6はGまたはEであり、X7はTまたはSであり、X8はTまたはSであり、X9はTまたはKであり、X10はFまたはYであり、X11はSまたはTであり、X12はT、N、またはSであり、X13はVまたはMであり、X14はGまたはDであり、X15はAまたはSであり、X16はAまたはSであり、X17はKまたはRであり、X18はNまたはTであり、X19はSまたはNであり、X20はVまたはAであり、X21はMまたはLであり、X22はV、M、またはTであり、X23はNまたはSである、を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは抗体である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはさらに軽鎖可変領域を含む。
【０１０３】
以下の配列中の、重鎖可変領域のCDR(CDR1、CDR2、およびCDR3)に下線を引く(また、逐次的順番に位置する):EVQLVX1SGX2X3X4X5QPGX6X7LRLX8CX9ASGX10X11LX12TYGVHWVRQAPGKGLEWX13GVIWGX14GRTDYDX15X16FMSRVTISX17DX18SKX19TX20YLQX21NSLRAEDTAVYYCX22RX23RHDWFDYWGQGTTVTVSS(配列番号29)、式中、X1はEまたはQであり、X2はAまたはGであり、X3はGまたはEであり、X4はLまたはVであり、X5はV、K、またはEであり、X6はGまたはEであり、X7はTまたはSであり、X8はTまたはSであり、X9はTまたはKであり、X10はFまたはYであり、X11はSまたはTであり、X12はT、N、またはSであり、X13はVまたはMであり、X14はGまたはDであり、X15はAまたはSであり、X16はAまたはSであり、X17はKまたはRであり、X18はNまたはTであり、X19はSまたはNであり、X20はVまたはAであり、X21はMまたはLであり、X22はV、M、またはTであり、X23はNまたはSである。重鎖可変領域のCDR2およびCDR3(CDR-H2およびCDR-H3)は、Kabatの定義に従って規定された(Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th edit., National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987))。重鎖可変領域のCDR1(CDR-H1)は、KabatおよびChothiaの定義の組合せに従って規定された(Chothiaら, J. Mol. Biol., 196:901-917)。上記方法は、抗体CDRを規定するための当技術分野で知られている。たとえば、Chenら, J. Mol. Biol., 293:865-881 (1999)およびMullerら, Structure, 6:1153-1167 (1998)を参照されたい。配列番号29において示される配列内において、Kabatの番号付けに基づくと、CDR1の位置はH26〜35であり、CDR2の位置はH50〜65であり、CDR3の位置はH95〜102である。連続した番号付けに従うと、CDR1の位置はH26〜35であり、CDR2の位置はH50〜65であり、CDR3の位置はH98〜105である。(たとえば、選択された例示的な重鎖可変領域配列上の重鎖可変領域のCDRおよびFRの位置の例証については図5を参照されたい。)
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、EVQLVESGAGVKQPGGTLRLTCTASGFSLTTYGVHWVRQAPGKGLEWVGVIWGDGRTDYDAAFMSRVTISKDTSKSTVYLQMNSLRAEDTAVYYCMRNRHDWFDYWGQGTTVTVSS(配列番号22;X384)、EVQLVQSGGGVKQPGETLRLTCTASGFSLTTYGVHWVRQAPGKGLEWVGVIWGDGRTDYDAAFMSRVTISKDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCMRNRHDWFDYWGQGTTVTVSS(配列番号23;X385)、EVQLVQSGGGLKQPGETLRLSCTASGYSLTTYGVHWVRQAPGKGLEWMGVIWGDGRTDYDSSFMSRVTISKDTSKSTAYLQLNSLRAEDTAVYYCTRNRHDWFDYWGQGTTVTVSS(配列番号26;X388)、およびEVQLVESGGGVKQPGETLRLTCTASGFSLSTYGVHWVRQAPGKGLEWVGVIWGDGRTDYDAAFMSRVTISKDTSKSTVYLQMNSLRAEDTAVYYCMRNRHDWFDYWGQGTTVTVSS(配列番号28;X420)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチド(たとえば抗体)は、配列番号22(X384)、配列番号23(X385)、配列番号26(X388)、および配列番号28(X420)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【０１０４】
さらなる態様では、本発明は、配列X1IX2X3TQSPSSLSX4X5X6GX7RX8TIX9CX10ASQX11IRNX12LNWYQQKPGQAPRLLIYYSSNLX13X14GVPX15RFSGSGSGTDFTLTISRLX16X17EDX18AX19YYCQQSX20KLPX21TFGSGTKVEIK(配列番号30)、式中、X1はDまたはEであり、X2はLまたはEであり、X3はMまたはLであり、X4はAまたはVであり、X5はSまたはTであり、X6はL、P、またはAであり、X7はDまたはEであり、X8はVまたはAであり、X9はTまたはSであり、X10はSまたはRであり、X11はGまたはDであり、X12はSまたはNであり、X13はHまたはQであり、X14はSまたはTであり、X15はS、D、またはAであり、X16はEまたはQであり、X17はPまたはAであり、X18はFまたはVであり、X19はT、A、またはIであり、X20はIまたはNであり、X21はFまたはLである、を含むポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、X1IX2X3TQSPSSLSX4X5X6GX7RX8TIX9CX10ASQX11IRNX12LNWYQQKPGQAPRLLIYYSSNLX13X14GVPX15RFSGSGSGTDFTLTISRLX16X17EDX18AX19YYCQQSX20KLPX21TFGSGTKVEIK(配列番号30)のアミノ酸配列、式中、X1はDまたはEであり、X2はLまたはEであり、X3はMまたはLであり、X4はAまたはVであり、X5はSまたはTであり、X6はL、P、またはAであり、X7はDまたはEであり、X8はVまたはAであり、X9はTまたはSであり、X10はSまたはRであり、X11はGまたはDであり、X12はSまたはNであり、X13はHまたはQであり、X14はSまたはTであり、X15はS、D、またはAであり、X16はEまたはQであり、X17はPまたはAであり、X18はFまたはVであり、X19はT、A、またはIであり、X20はIまたはNであり、X21はFまたはLである、を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは抗体である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは重鎖可変領域をさらに含む。
【０１０５】
以下の配列中の、軽鎖可変領域のCDR(CDR1、CDR2、およびCDR3)に下線を引く(また、逐次的順番に位置する):X1IX2X3TQSPSSLSX4X5X6GX7RX8TIX9CX10ASQX11IRNX12LNWYQQKPGQAPRLLIYYSSNLX13X14GVPX15RFSGSGSGTDFTLTISRLX16X17EDX18AX19YYCQQSX20KLPX21TFGSGTKVEIK(配列番号30)、式中、X1はDまたはEであり、X2はLまたはEであり、X3はMまたはLであり、X4はAまたはVであり、X5はSまたはTであり、X6はL、P、またはAであり、X7はDまたはEであり、X8はVまたはAであり、X9はTまたはSであり、X10はSまたはRであり、X11はGまたはDであり、X12はSまたはNであり、X13はHまたはQであり、X14はSまたはTであり、X15はS、D、またはAであり、X16はEまたはQであり、X17はPまたはAであり、X18はFまたはVであり、X19はT、A、またはIであり、X20はIまたはNであり、X21はFまたはLである。示された軽鎖可変領域(それぞれ、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3)のCDR1、CDR2、およびCDR3はKabatの定義に従って規定された(Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th edit., National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987))。軽鎖可変領域におけるCDR1の位置はL24〜34であり、軽鎖可変領域におけるCDR2の位置はL50〜56であり、軽鎖可変領域におけるCDR3の位置はL89〜97である(連続した番号付け方式およびKabatの番号付け方式の両方の下で)。(たとえば、選択された例示的な軽鎖可変領域配列上の軽鎖可変領域のCDRおよびFRの位置の例証については図3を参照されたい。)
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、DILMTQSPSSLSASPGDRVTISCRASQDIRNNLNWYQQKPGQAPRLLIYYSSNLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAAYYCQQSIKLPLTFGSGTKVEIK(配列番号15;X376)、DILLTQSPSSLSATPGERATITCRASQGIRNNLNWYQQKPGQAPRLLIYYSSNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISRLQPEDVAAYYCQQSIKLPFTFGSGTKVEIK(配列番号18;X379)、およびEIEMTQSPSSLSVSAGERATISCSASQDIRNSLNWYQQKPGQAPRLLIYYSSNLHTGVPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDVAIYYCQQSNKLPLTFGSGTKVEIK(配列番号19;X380)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチド(たとえば抗体)は、配列番号15(X376)、配列番号18(X379)、および配列番号19(X380)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、(a)配列番号22(X384)、配列番号23(X385)、配列番号26(X388)、および配列番号28(X420)からなる群から選択されるアミノ酸配列ならびに(b)配列番号15(X376)、配列番号18(X379)、および配列番号19(X380)からなる群から選択されるアミノ酸配列の両方を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチド(たとえば抗体)は、(a)配列番号22(X384)、配列番号23(X385)、配列番号26(X388)、および配列番号28(X420)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ならびに(b)配列番号15(X376)、配列番号18(X379)、および配列番号19(X380)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の両方を含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号26のアミノ酸配列(X388)および配列番号15のアミノ酸配列(X376)を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号22のアミノ酸配列(X384)および配列番号18のアミノ酸配列(X379)を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号28のアミノ酸配列(X420)および配列番号19のアミノ酸配列(X380)を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号23のアミノ酸配列(X385)および配列番号19のアミノ酸配列(X380)を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは抗体である。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号26のアミノ酸配列(X388)を含む重鎖可変領域および配列番号15のアミノ酸配列(X376)を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号22のアミノ酸配列(X384)を含む重鎖可変領域および配列番号18のアミノ酸配列(X379)を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号28のアミノ酸配列(X420)を含む重鎖可変領域および配列番号19のアミノ酸配列(X380)を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号23のアミノ酸配列(X385)を含む重鎖可変領域および配列番号19のアミノ酸配列(X380)を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むポリペプチドは抗体である。
【０１０９】
本発明は、(a)配列番号15〜21からなる群から選択されるアミノ酸配列に対してもしくは配列番号15〜21からなる群から選択されるアミノ酸配列の断片に対して少なくとも約80%の同一性を有するアミノ酸配列、および/または(b)配列番号22〜28からなる群から選択されるアミノ酸配列に対してもしくは配列番号22〜28からなる群から選択されるアミノ酸配列の断片に対して少なくとも約80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗体等のポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、示した配列に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約97%、少なくとも約99%の同一性、または100%の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、(a)配列番号18もしくはアミノ酸配列  配列番号18の断片に対して少なくとも約90%の同一性を有するアミノ酸配列、および/または(b)アミノ酸配列  配列番号22もしくはアミノ酸配列  配列番号22の断片に対して少なくとも約90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、断片は、少なくとも約10個のアミノ酸、少なくとも約25個のアミノ酸、少なくとも約50個のアミノ酸、または少なくとも約100個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはCD26に結合する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはネズミモノクローナル抗体ではない。
【０１１０】
他の態様では、本発明は、図5に示される以下の配列:X384、X385、X386、X387、X388、X399、およびX420(それぞれ、配列番号22〜28)からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約80%の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。本発明はまた、図5に示される以下の配列:X384、X385、X386、X387、X388、X399、およびX420(それぞれ、配列番号22〜28)からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、抗体等のポリペプチドも提供する。たとえば、いくつかの実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号22(X384)に対して少なくとも約80%の同一性を有するアミノ酸配列に対して少なくとも約80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号23(X385)に対して少なくとも約80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号26(X388)に対して少なくとも約80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号28(X420)に対して少なくとも約80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変領域は、図5に示される以下の配列:X384、X385、X386、X387、X388、X399、およびX420(それぞれ、配列番号22〜28)からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約97%、少なくとも約99%の同一性、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。たとえば、いくつかの実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号22〜28からなる群から選択されるアミノ酸配列に対する少なくとも約95%の同一性を含む。他のいくつかの実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号22〜28からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１１１】
さらなる態様では、本発明は、図3に示される以下の配列:X376、X377、X378、X379、X380、X381、およびX394(それぞれ、配列番号15〜21)からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約80%の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。本発明は、図3に示される以下の配列:X376、X377、X378、X379、X380、X381、およびX394(それぞれ、配列番号15〜21)からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体等のポリペプチドをさらに提供する。たとえば、いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号15(X376)のアミノ酸配列に対して少なくとも約80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号18(X379)のアミノ酸配列に対して少なくとも約80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号19(X380)のアミノ酸配列に対して少なくとも約80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、図3に示される以下の配列:X376、X377、X378、X379、X380、X381、およびX394(それぞれ、配列番号15〜21)からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約97%、少なくとも約99%の同一性または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。たとえば、いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号15〜21からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約95%の同一性を含む。他の実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号15〜21からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号22〜28からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号15〜21からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の両方を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号15〜21からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号22〜28からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号15〜28のいずれか1つのアミノ酸配列の少なくとも5つの連続したアミノ酸、少なくとも8つの連続したアミノ酸、少なくとも約10個の連続したアミノ酸、少なくとも約15個の連続したアミノ酸、少なくとも約20個の連続したアミノ酸、少なくとも約30個の連続したアミノ酸、または少なくとも約50個の連続したアミノ酸を含む。
【０１１４】
他の態様では、本発明は、配列番号15〜28からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
【０１１５】
rhuMAb 411の重鎖および軽鎖をコードするプラスミドを含む大腸菌(E. coli)試料は、名称「ヒトCD26に対するヒト化モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖のcDNAが挿入されたプラスミドを有するDH5α大腸菌」で、株の名称「S604069.YST-pABMC148(x411)」で、American Type Culture Collection (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, Virginia, 20108, United States of America (10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209, United States of America)に 、2006年6月30日、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の規定の下で寄託され、受託番号PTA-7695で指定された。したがって、本発明は、「ヒトCD26に対するヒト化モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖のcDNAが挿入されたプラスミドを有するDH5α大腸菌」と命名され、株の名称「S604069.YST-pABMC148(x411)」を有し、American Type Culture Collection(ATCC)に特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の規定の下で寄託された試料中の大腸菌におけるプラスミドによりコードされた抗体の重鎖および/または軽鎖を含むポリペプチドを提供する。本発明は、「ヒトCD26に対するヒト化モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖のcDNAが挿入されたプラスミドを有するDH5α大腸菌」と命名され、株の名称「S604069.YST-pABMC148(x411)」を有し、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の規定の下でATCCに2006年6月30日に寄託され、受託番号PTA-7695で指定される試料中の大腸菌中のプラスミドによりコードされた抗体の重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域を含むポリペプチドをさらに提供する。本発明はまた、受託番号PTA-7695として大腸菌中でATCCに寄託されたプラスミドによりコードされた抗体を提供する。
【０１１６】
本発明は、本明細書中に記載されるポリペプチド配列の断片を含むポリペプチドをさらに提供する(たとえば、配列番号15〜21、配列番号22〜28、配列番号29、または配列番号30のうちのいずれか1つ)。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、本明細書中に記載されるポリペプチド配列の断片を含み、断片は、長さが少なくとも約10個のアミノ酸、長さが少なくとも約25個のアミノ酸、長さが少なくとも50個のアミノ酸、長さが少なくとも75個のアミノ酸、または長さが少なくとも100個のアミノ酸である。
【０１１７】
本発明は、配列番号217(後述の実施例4を参照されたい)を含むポリペプチド(たとえば抗体)またはその断片もしくは変異体をさらに提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは配列番号217を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、シグナル配列を除く配列番号217を含む。(当業者は、いくつかの実施形態において、ポリペプチドのシグナル配列がポリペプチドから切断されることを容易に理解するであろう。)いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号217の可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号217(またはその断片)に対して、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも約98%の同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号217の(またはその可変領域の)断片を含み、断片は、長さが少なくとも約10個のアミノ酸、長さが少なくとも約25個のアミノ酸、長さが少なくとも50個のアミノ酸、長さが少なくとも75個のアミノ酸、または長さが少なくとも100個のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはヒトCD26に結合する。
【０１１８】
本発明は、配列番号218(後述の実施例4を参照されたい)を含むポリペプチド(たとえば抗体)またはその断片もしくは変異体をさらに提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは配列番号218を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、シグナル配列を除く配列番号218を含む。(当業者は、いくつかの実施形態において、ポリペプチドのシグナル配列がポリペプチドから切断されることを容易に理解するであろう。)いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号218の可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号218(またはその断片)に対して、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも約98%の同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号218の(またはその可変領域の)断片を含み、断片は、長さが少なくとも約10個のアミノ酸、長さが少なくとも約25個のアミノ酸、長さが少なくとも50個のアミノ酸、長さが少なくとも75個のアミノ酸、または長さが少なくとも100個のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号218(後述の実施例4を参照されたい)またはその断片もしくは変異体をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはヒトCD26に結合する。たとえば、いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、それぞれがシグナル配列なしの配列番号217を含む少なくとも1つの重鎖(たとえば2つの重鎖)、およびそれぞれがシグナル配列なしの配列番号218を含む少なくとも1つの軽鎖(たとえば2つの軽鎖)を含む抗体である。
【０１１９】
本発明は、配列番号219および/または配列番号220(後述の実施例13に示す)のポリペプチドまたはその断片またはその変異体を含むポリペプチドをさらに提供する。
【０１２０】
他の態様では、本発明は、YSLRWISDHEYLY(配列番号45;ペプチド6)、LEYNYVKQWRHSY(配列番号46;ペプチド35)、TWSPVGHKLAYVW(配列番号47;ペプチド55)、LWWSPNGTFLAYA(配列番号48;ペプチド84)、RISLQWLRRIQNY(配列番号49;ペプチド132)、YVKQWRHSYTASY(配列番号50;ペプチド37)、EEEVFSAYSALWW(配列番号51;ペプチド79)、DYSISPDGQFILL(配列番号52;ペプチド29)、SISPDGQFILLEY(配列番号53;ペプチド30)、およびIYVKIEPNLPSYR(配列番号54;ペプチド63)からなる群から選択される1つまたは複数のペプチドに結合する、抗体等のポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、優先的に1つまたは複数のペプチドに結合する。これらのペプチドはヒトCD26の領域である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、YSLRWISDHEYLY(配列番号45;ペプチド6)、LEYNYVKQWRHSY(配列番号46;ペプチド35)、TWSPVGHKLAYVW(配列番号47;ペプチド55)、LWWSPNGTFLAYA(配列番号48;ペプチド84)、RISLQWLRRIQNY(配列番号49;ペプチド132)、YVKQWRHSYTASY(配列番号50;ペプチド37)、EEEVFSAYSALWW(配列番号51;ペプチド79)、DYSISPDGQFILL(配列番号52;ペプチド29)、SISPDGQFILLEY(配列番号53;ペプチド30)、およびIYVKIEPNLPSYR(配列番号54;ペプチド63)からなる群から選択される1つまたは複数のペプチドに、ヒトCD26の他の領域に対応する1つまたは複数のペプチドに比べて優先的に結合する。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、ポリペプチド(たとえば抗体)は、以下のペプチド:YSLRWISDHEYLY(配列番号45;ペプチド6)、LEYNYVKQWRHSY(配列番号46;ペプチド35)、TWSPVGHKLAYVW(配列番号47;ペプチド55)、LWWSPNGTFLAYA(配列番号48;ペプチド84)、およびRISLQWLRRIQNY(配列番号49;ペプチド132)のそれぞれに結合する。他のいくつかの実施形態では、ポリペプチドは以下のペプチド:YSLRWISDHEYLY(配列番号45;ペプチド6)、TWSPVGHKLAYVW(配列番号47;ペプチド55)、RISLQWLRRIQNY(配列番号49;ペプチド132)、YVKQWRHSYTASY(配列番号50;ペプチド37)、およびEEEVFSAYSALWW(配列番号51;ペプチド79)のそれぞれに結合する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは以下のペプチド:DYSISPDGQFILL(配列番号52;ペプチド29)、SISPDGQFILLEY(配列番号53;ペプチド30)、およびTWSPVGHKLAYVW(配列番号47;ペプチド55)のそれぞれに結合する。他のいくつかの実施形態では、ポリペプチドは以下のペプチド:DYSISPDGQFILL(配列番号52;ペプチド29)、SISPDGQFILLEY(配列番号53;ペプチド30)、TWSPVGHKLAYVW(配列番号47;ペプチド55)、およびIYVKIEPNLPSYR(配列番号54;ペプチド63)のそれぞれに結合する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、特定のペプチドに優先的に結合する。
【０１２２】
競合アッセイは、同一または立体的に重複するエピトープを認識させることにより、2つの抗体が同じエピトープに結合するかどうか決定するために使用することができる。たとえば、Dongら(1998)および後述の実施例における特異性の実験を参照されたい。通常、抗原は、マルチウェルプレート上に固定され、非標識抗体が標識抗体の結合をブロックする性能が測定される。上記競合アッセイについての一般的な標識は放射性標識または酵素標識である。さらに、当業者らに知られているエピトープマッピング技術は、抗体が結合するエピトープを決定するために使用することができる。たとえば、後述の実施例3(e)を参照されたい。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるポリペプチドは1つまたは複数の定常領域を含む。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるポリペプチドはヒト定常領域を含む。いくつかの実施形態では、定常領域は、重鎖の定常領域である。他の実施形態では、定常領域は、軽鎖の定常領域である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ヒト定常領域に対して、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%の同一性を有する定常領域を含む。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるポリペプチド(たとえば抗体)はFc領域を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはヒトFc領域を含む。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるポリペプチドは、ヒトFc領域に対して、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%の同一性を有するFc領域を含む。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される抗体はIgG抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はIgG1抗体である。他のいくつかの実施形態では、抗体はIgG2抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はヒトIgG抗体である。
【０１２５】
本発明は、単量体の形態、二量体の形態、および多価の形態の抗体を提供する。たとえば、少なくとも2つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である二特異性抗体を本明細書中に開示される抗体を使用して調製することができる。二特異性抗体を作製するための方法は当技術分野で知られている(たとえば、Sureshら, 1986, Methods in Enzymology 121:210を参照されたい)。伝統的に、二特異性抗体の組換えによる生産は、2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、2つの重鎖は、異なる特異性を有した(MillsteinおよびCuello, 1983, Nature 305, 537-539)。
【０１２６】
二特異性抗体の作製についての1つのアプローチに従って、所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合する。融合物は、少なくともヒンジの部分、CH2領域、およびCH3領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインを好ましくは有している。軽鎖結合のために必要な部位を含み、融合物の少なくとも一方において存在する第1の重鎖定常領域(CH1)を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物および所望であれば免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAを個別の発現ベクターに挿入し、適した宿主生物中に同時形質移入する。これは、構築において使用される3つのポリペプチド鎖の不均等な比により最適な収量が実現される場合、実施形態における3つのポリペプチド断片の相互の比率を調整する際に多大な柔軟性を提供する。しかしながら、均等な比の少なくとも2つのポリペプチド鎖の発現が高収量をもたらす場合または比が特に重要ではない場合、2つまたは3つすべてのポリペプチド鎖についてのコード配列を1つの発現ベクターに挿入することは可能である。
【０１２７】
1つのアプローチでは、二特異性抗体は、一方のアームにおける第1の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖および他方のアームにおけるハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第2の結合特異性を提供する)から構成される。二特異性分子の半分にのみ免疫グロブリン軽鎖を有するこの非対称構造は、不要な免疫グロブリン鎖の組合せからの所望の二特異性化合物の分離を容易にする。このアプローチは、1994年3月3日に公開されたPCT国際公開第94/04,690号に記載される。
【０１２８】
2つの共有結合した抗体を含むヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲内である。上記抗体は、免疫系細胞を不要な細胞に対して標的として送り込むために(米国特許第4,676,980号)およびHIV感染の治療のために使用された(PCT出願国際公開第91/00,360号および国際公開第92/200,373号、欧州特許第03,089号)。ヘテロコンジュゲート抗体は任意の好都合な架橋方法を使用して作製されてもよい。適した架橋剤および架橋技術は、当技術分野でよく知られており、米国特許第4,676,980号に記載される。
【０１２９】
ある種の実施形態では、本明細書中に記載される抗体は抗体断片である。たとえば、いくつかの実施形態では、抗体は、Fab、Fab'、Fab'-SH、Fv、scFv、およびF(ab')2からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、抗体はFabである。様々な技術が抗体断片の生産のために開発されている。これらの断片は、完全な抗体のタンパク質分解性の消化を介して誘導される(たとえば、Morimotoら, 1992, J. Biochem. Biophys. Methods 24:107-117およびBrennanら, 1985, Science 229:81を参照されたい)または組換え宿主細胞により直接生産することができる。たとえば、Fab'-SH断片は、大腸菌から直接回収し、F(ab')2断片を形成するために化学的にカップルさせることができる(Carterら, 1992, Bio/Technology 10:163-167)。他の実施形態では、F(ab')2は、F(ab')2分子の組み立てを促進するためにロイシンジッパーGCN4を使用して形成される。他のアプローチに従って、Fv、Fab、またはF(ab')2の断片は、組換え宿主細胞培養から直接単離される。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、一本鎖(ScFv)、その突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体線状抗体、一本鎖抗体、および任意の他の修飾された配置の免疫グロブリン分子である。
【０１３１】
一本鎖可変領域断片は、軽鎖可変領域および/または重鎖可変領域を、短い連結ペプチドを使用して連結することにより作製される。Birdら(1988) Science 242:423-426。連結ペプチドの例は(GGGGS)3(配列番号85)であり、一方の可変領域のカルボキシ末端および他方の可変領域のアミノ末端の間の約3.5nmを架橋する。他の配列のリンカーが設計され、使用された。Birdら(1988)。リンカーは、薬物の付加または固体担体に対する付加等、さらなる機能のために同様に修飾することができる。一本鎖変異体は、組換えまたは合成的に生産することができる。scFvの合成的生産については、自動合成機を使用することができる。scFvの組換え生産については、scFvをコードするポリヌクレオチドを含む適したプラスミドを、適した宿主細胞、酵母(yeast)細胞、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞等の真核生物または大腸菌等の原核生物に導入することができる。目的のscFvをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーション等のルーチン的な操作により作製することができる。結果として生じたscFvは、当技術分野で知られている標準的なタンパク質精製技術を使用して単離することができる。
【０１３２】
二重特異性抗体等の一本鎖抗体の他の形態もまた包含される。二重特異性抗体は、VHドメインおよびVLドメインが単一のポリペプチド鎖上で発現する二価の二特異性抗体であるが、同じ鎖上の2つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用しており、そのために、もう1つの鎖の相補的なドメインと対になるようドメインを強制して、2つの抗原結合部位を作り出している(たとえば、Holliger, P.ら(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448、Poljak, R. J.ら(1994) Structure 2:1121-1123を参照されたい)。
【０１３３】
本発明は、本明細書中に記載される抗体または他のポリペプチドに対する修飾を包含し、それらの特性に著しく影響を与えない機能的に等価な抗体および活性が高められたまたは減少した変異体を含む。修飾の原理がポリペプチドおよび抗体に適用されることが理解される。ポリペプチドの修飾は、当技術分野においてルーチン的な操作であり、本明細書中に詳細に記載される必要はない。修飾されたポリペプチドの例は、アミノ酸残基の保存的置換、著しく有害に機能的活性を変化させない1つまたは複数のアミノ酸の除去もしくは付加、または化学的類似体の使用を有するポリペプチドを含む。
【０１３４】
アミノ酸配列の挿入または付加は、長さが1個の残基から100個以上の残基を含むポリペプチドまでのアミノ末端および/またはカルボキシル末端の融合ならびに単一のアミノ酸残基または多数のアミノ酸残基の配列内の挿入を含む。末端の挿入の例は、N末端メチオニル残基を有する抗体またはエピトープタグに融合した抗体を含む。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体の血清半減期を上昇させる、酵素またはポリペプチドの抗体のN末端またはC末端に対する融合を含む。
【０１３５】
置換変異体は、抗体配列または他のポリペプチド配列における少なくとも1つのアミノ酸残基が除去され、その場所に挿入された異なる残基を有する。置換変異誘発について最も興味がもたれる部位にはCDRが含まれるが、FRの変更もまた企図される。保存的置換を、「保存的置換」の表題で表1に示す。そのような置換が生物活性における変化をもたらす場合には、表1における「例示的置換」と称されるかまたはアミノ酸クラスに関してさらに以下に記載される、より実質的な変化を導入し、産物をスクリーニングしてもよい。
【表１】
2009502139.tif 000002
【０１３６】
抗体の生物学的特性における実質的な修飾は、(a)たとえばシートコンホメーションもしくはヘリックスコンホメーションのような、置換のエリアにおけるポリペプチド主鎖の構造、(b)標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または(c)側鎖の体積、の維持に対するそれらの影響において著しく異なる置換の選択により達成される。天然残基は、一般的な側鎖特性に基づき以下のようにグループに分類される:
(1)疎水性:ノルロイシン,Met,Ala,Val,Leu,Ile、
(2)中性親水性:Cys,Ser,Thr、
(3)酸性:Asp,Glu、
(4)塩基性:Asn,Gln,His,Lys,Arg、
(5)鎖配向に影響を及ぼす残基:Gly,Pro、および
(6)芳香族:Trp,Tyr,Phe.
非保存的置換は、これらのクラスの1つのメンバーを他のクラスと交換することによりなされる。より保存的な置換はクラスの1メンバーを同じクラスの他のメンバーと交換することを伴う。
【０１３７】
抗体の適切なコンホメーションを維持するのに関連しない任意のシステイン残基を通常セリンと置換して、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を阻止してもよい。逆に、特に、抗体がFv断片等の抗体断片である場合、システイン結合をその安定性を改善するために抗体に付加してもよい。
【０１３８】
アミノ酸修飾は、1つまたは複数のアミノ酸を変化させるか修飾することから可変領域等の領域の完全な再設計まで及び得る。可変領域における変化は、結合親和性および/または結合特異性を変更することができる。いくつかの実施形態では、1〜5個以下の保存的なアミノ酸置換がCDRドメイン内でなされる。他の実施形態では、1〜3個以下の保存的なアミノ酸置換がCDR3ドメイン内でなされる。さらなる他の実施形態では、CDRドメインはCDRH3および/またはCDR L3である。
【０１３９】
修飾はまた、グリコシル化ポリペプチドおよび非グリコシル化ポリペプチドならびにたとえば、異なる糖でのグリコシル化、アセチル化、およびリン酸化等の他の翻訳後修飾を有するポリペプチドも含む。抗体は、それらの定常領域における保存された位置でグリコシル化される(JefferisおよびLund, 1997, Chem. Immunol. 65:111-128、Wrightならびにorrison, 1997, TibTECH 15:26-32)。免疫グロブリンのオリゴ糖側鎖は、タンパク質の機能(Boydら, 1996, Mol. Immunol. 32:1311-1318、WittweおよびHoward, 1990, Biochem. 29:4175-4180)ならびに糖タンパク質のコンホメーションおよび現れた三次元表面に影響を与え得る糖タンパク質の部分間の分子内相互作用(HefferisおよびLund, 前掲、WyssおよびWagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7:409-416)に影響を与える。オリゴ糖はまた、特異的認識構造に基づき、所定の糖タンパク質をある種の分子に標的として送り込むのに貢献する可能性がある。抗体のグリコシル化はまた、抗体依存性細胞傷害作用(ADCC)に影響を与えることが報告された。特に、二分しているGlcNAcの形成を触媒する糖転移酵素であるβ(1,4)-N-アセチルグルコサミン転移酵素III(GnTIII)のテトラサイクリン調節性の発現を有するCHO細胞はADCC活性を向上させたと報告された(Umanaら, 1999, Nature Biotech. 17:176-180)。
【０１４０】
抗体のグリコシル化は、通常、N-結合型またはO-結合型である。N-結合型は、アスパラギン残基の側鎖に対する糖質部分の付加のことを言う。トリペプチド配列であるアスパラギン-X-セリン、アスパラギン-X-トレオニン、およびアスパラギン-X-システイン（式中、Xはプロリン以外の任意のアミノ酸である）はアスパラギン側鎖への糖質部分の酵素による付加についての認識配列である。したがって、ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は潜在的なグリコシル化部位を作り出す。O-結合型グリコシル化は、糖であるN-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの1つの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはトレオニンへの付加のことを言うが、5-ヒドロキシプロリンまたは5-ヒドロキシリシンが使用されてもよい。
【０１４１】
抗体に対するグリコシル化部位の付加は、抗体が、1つまたは複数の上記トリペプチド配列(N-結合型グリコシル化部位ための)を含むように、アミノ酸配列を変更させることにより好都合に達成される。変更はまた、1つまたは複数のセリン残基またはトレオニン残基による本来の抗体の配列(O-結合型グリコシル化部位のための)に対する付加または置換によりなされてもよい。
【０１４２】
抗体のグリコシル化パターンはまた、基礎をなすヌクレオチド配列を変更せずに変更されてもよい。グリコシル化は、抗体を発現するために使用される宿主細胞に大部分依存する。可能性のある療法として組換え糖タンパク質、たとえば抗体の発現のために使用される細胞型が天然の細胞であることはめったにないので、抗体のグリコシル化パターンにおける変化を予想することができる(たとえば、Hseら, 1997, J. Biol. Chem. 272:9062-9070を参照されたい)。
【０１４３】
宿主細胞の選択の他に、抗体の組換え生産の間にグリコシル化に影響を与える要因は、成長様式、培地形成、培養密度、酸素付加、pH、精製方式等が挙げられる。様々な方法が、特定の宿主生物において達成されたグリコシル化パターンを変更させるために提唱され、オリゴ糖生産に関与するある種の酵素を導入するか過剰発現させることを含んだ(米国特許第5,047,335号、第5,510,261号、および第5,278,299号)。グリコシル化またはある種のグリコシル化は、酵素で、たとえば、エンドグリコシダーゼH(Endo H)を使用して、糖タンパク質から取り除くことができる。さらに、組換え宿主細胞は、ある種の多糖のプロセシングが欠損するように遺伝子操作することができる。これら技術および類似する技術は当技術分野でよく知られている。
【０１４４】
修飾の他の方法は、酵素による手段、酸化的置換、およびキレート化を含むがこれらに限定されない当技術分野で知られているカップリング技術の使用を含む。修飾は、たとえば、免疫測定法のための標識の付加のために使用することができる。修飾されたポリペプチドは、当技術分野で確立された手順を使用して作製され、当技術分野で知られている標準的なアッセイを使用してスクリーニングすることができ、修飾されたポリペプチドのうちのいくつかを以下にかつ実施例において記載する。
【０１４５】
他の抗体修飾は、1999年11月18日に公開されたPCT国際公開第99/58,572号に記載されるように修飾された抗体を含む。これらの抗体は、標的分子に対し指向性である結合ドメインの他に、ヒト免疫グロブリン重鎖の定常ドメインのすべてまたは一部に実質的に相同なアミノ酸配列を有するエフェクタードメインを含む。これらの抗体は、標的の著しい補体依存性の溶解または細胞媒介性の破壊を引き起こさずに標的分子に結合することができる。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、FcRnおよび/またはFcγRIIbに特異的に結合することができる。これらは、通常、2つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖CH2ドメインに由来するキメラドメインに基づく。このように修飾された抗体は、慢性型の抗体療法において使用するに特に適しており、従来の抗体療法に対する炎症および他の有害反応を回避する。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドはコンジュゲートである。たとえば、いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、化学療法剤、放射性核種、免疫療法剤、サイトカイン、ケモカイン、造影剤、毒素、生物学的作用剤、酵素阻害剤、または抗体等の他の作用剤にコンジュゲートされる。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、抗体等のポリペプチドは水溶性のポリマー部分にコンジュゲートされる。ポリペプチドは、ポリエチレングリコール(PEG)、モノメトキシ-PEG、エチレングリコール/プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール等にコンジュゲートしてもよい。ポリペプチドは、ランダムな位置を用いて分子でまたは所定の位置で分子を用いて修飾してもよく、1つ、2つ、または3つ以上の付加された部分を含んでいてもよい。ポリマーは、任意の分子量であってもよく、分枝または非分枝であってもよい。いくつかの実施形態では、部分はリンカーを介してポリペプチドに付加される。いくつかの実施形態では、付加された部分は、動物内でのポリペプチドの循環半減期を上昇させる。抗体を含むポリペプチドにPEG等のポリマーを付加するための方法は当技術分野でよく知られている。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはPEG化された抗体等のPEG化されたポリペプチドである。
【０１４８】
本発明は、親和性の成熟した実施形態を含む。たとえば、親和性成熟抗体は、当技術分野で知られている手順により生産することができる(Marksら, 1992, Bio/Technology, 10:779-783、Barbasら, 1994, Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813、Schierら, 1995, Gene, 169:147-155、Yeltonら, 1995, J. Immunol., 155:1994-2004、Jacksonら, 1995, J. Immunol., 154(7):3310-9、Hawkinsら, 1992, J. Mol. Biol., 226:889-896、および国際公開第2004/058,184号)。候補となる親和性成熟抗体は、BIAcore表面プラズモン共鳴分析を使用したスクリーニングならびにファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、およびリボソームディスプレイを含む当技術分野で知られている選択のための任意の方法を使用した選択を含む当技術分野で知られている任意の方法を使用して、向上したおよび/または変更された結合親和性についてスクリーニングまたは選択されてもよい。
【０１４９】
モノクローナル抗体は、KohlerおよびMilstein, 1975, Nature 256:495により記載されるようなハイブリドーマ法を使用して調製してもよい。ハイブリドーマ法において、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物は、免疫剤に特異的に結合するであろう抗体を生産するか生産することができるリンパ球を誘発するために免疫剤で通常免疫される。あるいは、リンパ球はin vitroで免疫されてもよい。
【０１５０】
本発明のモノクローナル抗体(および他のポリペプチド)はまた、米国特許第4,816,567号に記載される組換えDNA法等の組換えDNA法により作製されてもよい。ポリペプチドおよびモノクローナル抗体を調製するための方法は当技術分野でよく知られている。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体をコードするDNAは、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子またはポリヌクレオチドに特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーの使用による等の従来の手順を使用して、単離され、配列決定され、および/または増幅される。所望の配列の、抗体等のポリペプチドをコードする配列はまた、当技術分野でよく知られている合成DNA法、PCR法、および組換え技術の組合せを使用して容易に調製することが可能である。DNAは単離されるとすぐに、発現ベクター中に配置されてもよく、次いで、発現ベクターは、免疫グロブリンタンパク質を別の方法では生産しない大腸菌細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、または骨髄腫細胞等の宿主細胞に、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を獲得するために形質移入される。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、本発明(たとえば抗体)のポリペプチドは、細菌、酵母、植物、昆虫、および哺乳動物を含むがこれらに限定されない任意の生物、または任意の生物に由来する細胞において発現される。特定の種類の細胞は、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)の細胞、サッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)ならびに他の酵母、大腸菌、枯草菌(Bacillus subtilis)、SF9細胞、HEK-293細胞、アカパンカビ属(Neurospora)、BHK細胞、CHO細胞、COS細胞、HeLa細胞、線維芽細胞、神経線維腫細胞株、不死化哺乳動物の骨髄細胞株ならびにリンパ細胞株、Jurkat細胞、肥満細胞ならびに他の内分泌細胞および外分泌細胞、ならびに神経細胞を含むが、これらに限定されない。
【０１５２】
ポリペプチドの生産に有用な様々なタンパク質発現系、ベクター、および細胞媒介物は、当業者らに知られている。たとえば、国際特許公開第03/054,172号、国際特許公開第04/009,823号、および国際特許公開第03/064,630号、ならびに米国特許公開第2005/0,170,454号、米国特許公開第2005/0,084,928号、および米国特許公開第2006/0,003,405号を参照されたい。それぞれのその全体が本明細書中に引用される。いくつかの実施形態では、グルタミン合成酵素(GS)発現系はポリペプチド(たとえば抗体)の発現に使用される。
【０１５３】
ポリペプチドは、当業者らに知られている方法に従って精製または単離されてもよい。精製方法の例は、電気泳動技術、分子的技術、免疫学的技術、ならびにイオン交換クロマトグラフィー、疎水性親和性クロマトグラフィー、逆相HPLCクロマトグラフィー、およびクロマトフォーカシングを含むクロマトグラフィー技術を含む。必要な精製の程度は、ポリペプチドの使用に依存して変動するであろう。いくつかの例では、精製は必要ではないであろう。
【０１５４】
DNAは、たとえば、免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列のすべてまたは一部を共有結合することにより修飾することができる。そのようにして、本明細書中に開示されるモノクローナル抗体の結合特異性を有する「キメラ」抗体または「ハイブリッド」抗体が調製される。通常、上記非免疫グロブリンポリペプチドで本発明の抗体の定常ドメインを置換するか上記非免疫グロブリンポリペプチドで本発明の抗体の1つの抗原結合部位の可変ドメインを置換して、1つの表面エピトープCD26に対する特異性を有する一方の抗原結合部位および異なる抗原もしくはCD26エピトープに対する特異性を有するもう一方の抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を作り出す。
【０１５５】
本発明はまたヒト化抗体も包含する。治療抗体は、投与された抗体に対して指向性である免疫応答を引き起こすことにより、部分的に、有害効果を誘発することが多い。これは、薬物効力の低下、標的抗原を運ぶ細胞の劣化、および望ましくない炎症反応をもたらし得る。上記を回避するために、組換え抗CD26ヒト化抗体を作製してもよい。抗体のヒト化における一般的な原理は抗体の抗原結合部分の基本的な配列を維持することを伴う一方、少なくとも、抗体の非ヒト残部の部分をヒト抗体配列と取り換える。モノクローナル抗体をヒト化するための4つの伝統的であるが非限定的な一般的なステップは、(1)出発抗体の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインのヌクレオチドおよび予測されるアミノ酸配列を決定すること、(2)ヒト化抗体を設計する、つまり、どの抗体フレームワーク領域もしくは残基および/またはCDR残基をヒト化プロセスの間に使用するのかを決定すること、(3)実際のヒト化する方法論/技術、ならびに(4)ヒト化抗体の形質移入および発現、を含む。定常領域はまた、抗体がヒトにおける臨床治験および臨床治療において使用される場合に免疫応答を回避するために、ヒト定常領域に似るようさらに操作されてもよい。たとえば、米国特許第5,997,867号および第5,866,692号を参照されたい。
【０１５６】
組換えヒト化抗体において、Fcγ部分は、Fcγ受容体および補体免疫系との相互作用を回避するために修飾することができる。上記抗体の調製のための技術は国際公開第99/58,572号に記載される。
【０１５７】
ヒト定常ドメインに融合したげっ歯類V領域およびそれらの関連する相補性決定領域(CDR)を有するキメラ抗体を含む、非ヒト免疫グロブリンに由来する抗原結合部位を含む多くの「ヒト化」抗体分子が記載される。たとえば、WinterらNature 349:293-299 (1991)、LobuglioらProc. Nat. Acad. Sci. USA 86:4220-4224 (1989)、ShawらJ Immunol. 138:4534-4538 (1987)、およびBrownらCancer Res. 47:3577-3583 (1987)を参照されたい。他の参考文献は、適切なヒト抗体定常ドメインとの融合前にヒト支持フレームワーク領域(FR)に移植されたげっ歯類CDRを記載する。たとえば、RiechmannらNature 332:323-327 (1988)、VerhoeyenらScience 239:1534-1536 (1988)、およびJonesらNature 321:522-525 (1986)を参照されたい。もう1つの参考文献は、組換えで覆い隠されたげっ歯類フレームワーク領域に支持されたげっ歯類CDRを記載する。たとえば、欧州特許公開第519,596号を参照されたい。これらの種類の「ヒト化」分子は、ヒトレシピエントにおけるそれらの部分の治療適用の期間および有効性を制限するげっ歯類抗ヒト抗体分子に対する不要な免疫学的応答を最小限にするために設計される。利用されてもよい、抗体をヒト化する他の方法は、DaughertyらNucl. Acids Res., 19:2471-2476 (1991)によりならびに米国特許第6,180,377号、第6,054,297号、第5,997,867号、第5,866,692号、第6,210,671号、第6,350,861号、およびPCT国際公開第01/27,160号中に開示される。
【０１５８】
抗体をヒト化するさらなる例示的な方法は、国際公開第02/084,277号および米国公開第2004/0,133,357号中に記載され、それら両方のそれら全体が本明細書中に引用される。
【０１５９】
さらに他の代替では、完全にヒト型の抗体は、特異的ヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するよう操作された市販されているマウスを使用することにより得られてもよい。より望ましい(たとえば完全にヒト型の抗体)またはより頑強な免疫応答を生じるよう設計された形質転換動物はまた、ヒト化抗体またはヒト抗体の作製に使用されてもよい。上記技術の例は、Abgenix社(フリーモント、CA)からのXenomouse(商標)ならびにMedarex社(プリンストン、NJ)からのHuMAb-Mouse(登録商標)およびTC Mouse(商標)である。
【０１６０】
他の代替では、抗体は、ファージディスプレイ技術により組換えで作製されてもよい。たとえば、米国特許第5,565,332号、第5,580,717号、第5,733,743号および第6,265,150号、ならびにWinterら, Annu. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994)を参照されたい。あるいは、ファージディスプレイ技術(McCaffertyら, Nature 348:552-553 (1990))は、ヒト抗体およびヒト抗体断片を、in vitroで、未免疫ドナーからの免疫グロブリン可変(V)ドメイン遺伝子レパートリーから生産するために使用することができる。この技術によれば、抗体Vドメイン遺伝子は、M13またはfd等の糸状バクテリオファージの主要または少数のコートタンパク質遺伝子内にインフレームでクローニングされ、機能的抗体断片としてファージ粒子の表面上に表示される。糸状粒子がファージゲノムの一本鎖DNAコピーを含むので、抗体の機能的特性に基づく選択はまた、それらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択をももたらす。したがって、ファージは、B細胞の特性のいくつかに似ている。ファージディスプレイは様々な方式で実行することができる;検討のために、たとえば、Johnson, Kevin S.およびChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3, 564-571 (1993)を参照されたい。V遺伝子セグメントのいくつかの供給源がファージディスプレイに使用することができる。Clacksonら, Nature 352:624-628 (1991)は、抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを、免疫されたマウスの脾臓に由来するV遺伝子の小さなランダムコンビナトリアルライブラリーから単離した。未免疫ヒトドナーからのV遺伝子のレパートリーは、構築することができ、多様なアレイの抗原(自己抗原を含む)に対する抗体は、Markら, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)またはGriffithら, EMBO J. 12:725-734 (1993)により記載される技術に本質的に従って単離することができる。本来の免疫応答において、抗体遺伝子は高率で突然変異を蓄積する(体細胞性超変異)。導入された変化のいくつかは高度な親和性を付与することとなり、高度な親和性の表面免疫グロブリンを表示するB細胞は優先的に複製され、続く抗原チャレンジの際に分化する。この本来のプロセスは、「チェインシャフリング」として知られている技術を用いることにより模倣することができる。Marksら, Bio/Technol. 10:779-783 (1992))。この方法において、ファージディスプレイにより得られた「初期の」ヒト抗体の親和性は、重鎖および軽鎖のV領域遺伝子を、未免疫ドナーから得られたVドメイン遺伝子の天然変異体(レパートリー)のレパートリーと順次置換することにより向上させることができる。この技術は、親和性を有する抗体および抗体断片の生産をpM〜nMの範囲で可能にする。非常に多量のファージ抗体レパートリー(「全ライブラリーの母体」としても知られている)を作製するための戦略は、Waterhouseら, Nucl. Acids Res. 21:2265-2266 (1993)により記載された。遺伝子シャフリングもまた、げっ歯類抗体からヒト抗体を誘導するために使用することもでき、ヒト抗体は、出発げっ歯類抗体に類似する親和性および特異性を有している。「エピトープインプリンティング」とも称されるこの方法によれば、ファージディスプレイ技術により得られたげっ歯類抗体の重鎖または軽鎖のVドメイン遺伝子は、ヒトVドメイン遺伝子のレパートリーと置換され、げっ歯類ヒトキメラを作り出す。抗原についての選択は、機能的抗原結合部位��再建することができるヒト可変領域の単離をもたらす、つまり、エピトープは、パートナーの選択を支配する(インプリントする)。残存するげっ歯類Vドメインを置換するためにプロセスを繰り返すと、ヒト抗体が得られる(1993年4月1日に公開されたPCT特許出願国際公開第9306,213号を参照されたい)。CDR移植によるげっ歯類抗体の伝統的なヒト化とは異なり、この技術は、げっ歯類由来のフレームワークまたはCDR残基を有していない完全にヒト型の抗体を提供する。上記の議論はヒト化抗体に関係するものであるが、議論された一般的な原理は、たとえばイヌ、ネコ、霊長動物、ウマ、およびウシでの使用のための抗体のカスタマイズに適用可能であることは明らかである。
【０１６１】
キメラ抗体またはハイブリッド抗体はまた、架橋剤を必要とする方法を含む、合成タンパク質化学の知られている方法を使用して、in vitroで調製されてもよい。たとえば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を使用してまたはチオエーテル結合を形成することにより構築されてもよい。この目的に適した試薬の例はイミノチオラートおよびメチル-4-メルカプトブチルイミデートが挙げられる。
【０１６２】
一本鎖Fv断片はまた、Iliadesら, 1997, FEBS Letters, 409:437-441に記載されるように生産されてもよい。様々なリンカーを使用した、上記一本鎖断片のカップリングは、Korttら, 1997, Protein Engineering, 10:423-433に記載される。抗体の組換え生産および組換え操作についての様々な技術は、当技術分野でよく知られている。
【０１６３】
一態様では、本発明は、本明細書中に記載されるポリペプチドを生産するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、ポリヌクレオチドを宿主細胞において発現させることを含み、ポリヌクレオチドはポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、方法は、抗体を生産するための方法であり、宿主細胞において(たとえば細胞培養において)、1つまたは複数のポリヌクレオチドを発現させることを含み、抗体の各鎖は、少なくとも1つのポリヌクレオチドによりコードされる。いくつかの実施形態では、1つまたは複数のポリヌクレオチドは同じベクター上にある。他の実施形態では、1つまたは複数のポリヌクレオチドは個別のベクター上に位置する。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるポリペプチドを生産するための方法は、ポリペプチドをポリペプチドが発現する宿主細胞(たとえば、宿主細胞が成長する細胞培養から単離された)から単離するステップをさらに含む。
【０１６４】
ポリヌクレオチド、変異体配列、ベクター、および宿主細胞
本発明は、本明細書中に記載される抗体等のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載される重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含むポリペプチドをコードする。ポリヌクレオチドを含む、発現ベクター等のベクターもまた提供される。本発明のベクターおよび/またはポリヌクレオチドを含む宿主細胞がさらに提供される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは単離される。
【０１６５】
一態様では、本発明は、図2および図4に示される配列(配列番号1〜14)のそれぞれからなる群から選択される核酸配列またはその断片を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明は、適度にストリンジェントな条件下で、図2および図4に示されるポリヌクレオチド(配列番号1〜14)からなる群から選択されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドをさらに提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、高度にストリンジェントな条件下で、図2および図4に示されるポリヌクレオチド(配列番号1〜14)にハイブリダイズする。
【０１６６】
他の態様では、本発明は、図3または図5に示される以下の配列:X376、X377、X378、X379、X380、X381、X394、X384、X385、X386、X387、X388、X399、およびX420(配列番号15〜28)のそれぞれからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。
【０１６７】
本発明は、配列番号215および/もしくは配列番号216の配列のポリヌクレオチドまたはその断片を含むポリヌクレオチドをさらに提供する(後述の実施例4を参照されたい)。いくつかの実施形態では、断片は、少なくとも12個、少なくとも20個、少なくとも50個、少なくとも75個、または少なくとも100個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、重鎖をコードする配列番号215の配列を含むポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、軽鎖をコードする配列番号216の配列を含むポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、重鎖をコードする配列番号215の配列の断片を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、軽鎖をコードする配列番号216の断片を含むポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、重鎖可変領域をコードする配列番号215の配列の断片を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、軽鎖可変領域をコードする配列番号216の断片を含むポリヌクレオチドを含む。
【０１６８】
本発明はまた、「ヒトCD26 cDNAに対するヒト化モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖が挿入されたプラスミドを有するDH5α大腸菌」と命名され、株の名称「S604069.YST-pABMC148(x411)」を有し、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の規定の下で、American Type Culture Collection(ATCC)に2006年6月30日に寄託され、受託番号PTA-7695で指定された試料における大腸菌中のプラスミドによりコードされた抗体の重鎖および/または軽鎖を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(たとえば抗体)も提供する。本発明は、「ヒトCD26に対するヒト化モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖のcDNAが挿入されたプラスミドを有するDH5α大腸菌」と命名され、株の名称「S604069.YST-pABMC148(x411)」を有し、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の規定の下で、ATCCに2006年6月30日に寄託され、受託番号PTA-7695で指定された試料における大腸菌中のプラスミドによりコードされた抗体の重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、寄託された配列の重鎖および/または軽鎖のコード配列を含む。
【０１６９】
発現ベクターおよび宿主細胞を含む発現系は、本発明の抗体等のポリペプチドを生産するための方法において使用することができ、宿主細胞は培養され、培養された宿主細胞により生産されたポリペプチドは回収される。本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドはまた、宿主被験体に、宿主被験体の細胞による抗体の発現のために送達することができる。
【０１７０】
任意の上記配列に相補的なポリヌクレオチドもまた本発明により包含される。ポリヌクレオチドは、一本鎖(コードもしくはアンチセンス)また二本鎖であってもよく、DNA分子(ゲノム、cDNA、もしくは合成物)またはRNA分子であってもよい。RNA分子は、イントロンを含みかつ1対1でDNA分子に対応するHnRNA分子およびイントロンを含まないmRNA分子を含む。さらなるコード配列または非コード配列は、本発明のポリヌクレオチド内に存在してもよいが存在する必要はなく、ポリヌクレオチドは、他の分子に連結および/または材料を支持してもよいが、する必要はない。
【０１７１】
本明細書中に記載されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの変異体もまた提供される。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの変異体は1つまたは複数の置換、付加、欠失、および/または挿入を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、変異体は、コードされたポリペプチドのヒトCD26に対する結合が、本来のポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドまたはポリペプチドに比べて実質的に減少しない。コードされたポリペプチドの免疫反応性に対する効果は、通常、本明細書中に記載されるように評価されてもよい。変異体は、好ましくは少なくとも約70%の同一性、より好ましくは少なくとも約80%の同一性、および最も好ましくは少なくとも約90%の同一性を本来の配列またはその部分に対して示す。いくつかの実施形態では、配列がCDRまたは小さな断片と比較される場合、比較ウィンドウは、より小さく、たとえば少なくとも7個のアミノ酸または少なくとも10個のアミノ酸となってもよい。
【０１７２】
以下に記載されるように最大に一致するよう整列させた場合に2つの配列におけるヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が同じであれば、2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列は、「同一」であるか「同一性」を有すると表現される。2つの配列間の比較は、配列類似性の局所的領域を同定して、比較するために、比較ウィンドウにわたり配列を比較することにより通常実行される。本明細書中に使用される「比較ウィンドウ」は、少なくとも約20個の連続した位置、通常30個〜約75個、40個〜約50個のセグメントのことを言い、2つの配列を最適に整列させた後、配列を、同じ番号の連続した位置の基準配列と比較してもよい。
【０１７３】
比較のための配列の最適アラインメントは、Lasergeneの一式のバイオインフォマティクスソフトウェアのMegalignプログラム(DNASTAR社、マディソン、WI)を使用し、デフォルトパラメータを使用して行われてもよい。このプログラムは、以下の参考文献に記載されるいくつかのアラインメント方式を具体化する:Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships。Dayhoff, M.O. (編) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358、Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA、Higgins, D.G.およびSharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153、Myers, E.W.およびMuller W., 1988, CABIOS 4:11-17、Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105、Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425、Sneath, P.H.A.およびSokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA、Wilbur, W.J.およびLipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730において。
【０１７４】
あるいは、(アミノ酸)同一性%は、公的に入手可能なBLASTまたはBLAST-2プログラムの1つを使用して得てもよい。WU-BLAST-2コンピュータプログラム(Altschulら, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996))。(アミノ酸)配列同一性パーセントはまた、配列比較プログラムNCBI-BLAST2を使用して決定してもよい(Altschulら, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997))。BLASTプログラムは、KarlinおよびAltschul. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268 (1990)のアラインメント法に基づき、Altschulら, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)、KarlinおよびAltschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877 (1993)、ならびにAltschulら, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)において議論される。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、「同一性の割合」は、2つの最適に整列した配列を、少なくとも20個の位置の比較のウィンドウにわたり比較することにより決定され、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の部分は、2つの配列の最適アラインメントについての基準配列(付加または欠失を含まない)と比較して、20パーセント以下、通常5〜15パーセント、または10〜12パーセントの付加または欠失(つまりギャップ)を含んでいてもよい。割合は、両方の配列で同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が生じる位置の数を決定して、マッチした位置の数を得、基準配列における位置の総数(つまりウィンドウサイズ)でマッチした位置の数を割り、結果に100を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることにより算出される。いくつかの実施形態では、比較ウィンドウはより小さくてもよい(たとえば7個または10個のアミノ酸)。
【０１７６】
変異体はまた、またはあるいは、本明細書中に記載されるポリヌクレオチド、またはその部分もしくは相補体に実質的に相同である。上記ポリヌクレオチド変異体は、適度にストリンジェントな条件下で、天然の抗体をコードする天然DNA配列(または相補的配列)にハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態では、変異体は、高度にストリンジェントな条件下で、本来の配列にハイブリダイズすることができる。
【０１７７】
適した「適度にストリンジェントな条件」は、5×SSC、0.5%SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)の溶液中で予洗すること、50℃〜65℃、5×SSC、一晩、ハイブリダイズすること、次に、65℃、20分間、0.1%SDSを含む2×、0.5×、および0.2×SSCのそれぞれで2回を洗浄することを含む。
【０１７８】
本明細書中に使用されるように、「高度にストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」は、(1)洗浄に低イオン強度および高温、たとえば、0.015M塩化ナトリウム/0.0015Mクエン酸ナトリウム/0.1%ドデシル硫酸ナトリウム、50℃を使用する、(2)ハイブリダイゼーションの間、ホルムアミド等の変性剤、たとえば、0.1%ウシ血清アルブミンを有する50%(v/v)ホルムアミド/0.1%フィコール/0.1%ポリビニルピロリドン/750mM塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウムを有するpH6.5の50mMリン酸ナトリウム緩衝液、42℃を使用する、または、(3)50%ホルムアミド、5×SSC(0.75M NaCl、0.075Mクエン酸ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH6.8)、0.1%ピロリン酸ナトリウム、5×デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子DNA(50μg/ml)、0.1% SDS、および10%硫酸デキストラン、42℃を使用し、0.2×SSC(塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム)および50%のホルムアミド、55℃中、次に、EDTAを含む0.1×SSCからなる高ストリンジェンシー洗浄液、55℃中、42℃での洗浄を伴う条件である。当業者は、プローブの長さ等のような要因を適応させるのに必要な温度、イオン強度等を調整する方法を認識するであろう。
【０１７９】
遺伝暗号の縮重の結果として、本明細書中に記載されるようなポリペプチドをコードする多数のヌクレオチド配列があることが当業者らに理解されるであろう。それでもなお、コドン使用頻度における差異により変わるポリヌクレオチドが本発明により明確に企図される。
【０１８０】
ポリヌクレオチドは、当技術分野で知られている任意の様々な技術を使用して調製されてもよい。抗体をコードするDNAは、抗体mRNAを発現する組織から調製されたcDNAライブラリーから得てもよい。抗体をコードする遺伝子もまた、ゲノムライブラリーからまたはオリゴヌクレオチド合成により得てもよい。ライブラリーは、目的の遺伝子またはその遺伝子によりコードされたタンパク質を同定するために設計されたプローブ(少なくとも約20〜80塩基の結合パートナーまたはオリゴヌクレオチド等)でスクリーニングすることができる。例示的なライブラリーはヒト肝臓cDNAライブラリー(ヒト肝臓'5ストレッチプラスcDNA、Clontech Laboratories社)およびマウス腎臓cDNAライブラリー(マウス腎臓5'-ストレッチcDNA、Clontech laboratories社)を含む。選択したプローブでのcDNAまたはゲノムライブラリーのスクリーニングは、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989に記載される手順などの標準的な手順を使用して行ってもよい。あるいは、PCR方法論を使用して抗体をコードする遺伝子を単離することができる(Sambrookら, 前掲、Dieffenbachら, PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)。
【０１８１】
ポリヌクレオチド変異体は、化学合成を含む、当技術分野で知られている任意の方法により、たとえば固相ホスホルアミダイト化学合成により、通常、調製されてもよい。ポリヌクレオチド配列における修飾はまた、オリゴヌクレオチド指向性部位特異的変異誘発等の標準的な変異誘発技術を使用して導入されてもよい(Adelmanら, DNA 2:183, 1983を参照されたい)。あるいは、RNA分子は、適したRNAポリメラーゼプロモーター(T7またはSP6等)を有するベクターにDNAが取り込まれるのであれば、抗体またはその部分をコードするDNA配列のin vitroまたはin vivo転写により作製されてもよい。本明細書中に記載されるように、ある部分は、コードされたポリペプチドを調製するために使用されてもよい。さらにまたはあるいは、部分は、コードされたポリペプチドがin vivoで作製されるように患者に投与されてもよい(たとえば、樹状細胞等の抗原提示細胞を、ポリペプチドをコードするcDNA構築物を用いて形質移入し、形質移入した細胞を患者に投与することにより)。
【０１８２】
任意のポリヌクレオチドはまたin vivoでの安定性を上昇させるためにさらに修飾されてもよい。可能性として考えられる修飾は、5'末端および/もしくは3'末端でのフランキング配列の付加、主鎖における、ホスホジエステラーゼ連結ではなくホスホロチオエート連結もしくは2' Oメチル連結の使用、ならびに/またはイノシン、キューオシン、およびワイブトシン等の非伝統的な塩基ならびにアデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンのアセチル-、メチル-、チオ-、および他の修飾形態の包含を含むがこれらに限定されない。
【０１８３】
ヌクレオチド配列は、確立された組換えDNA技術を使用して、様々な他のヌクレオチド配列に結合させることができる。たとえば、ポリヌクレオチドは、プラスミド、ファージミド、ラムダファージ派生物、およびコスミドを含む任意の様々なクローニングベクター中にクローニングされてもよい。特に目的のベクターは、発現ベクター、複製ベクター、プローブ作製ベクター、および配列決定ベクターを含む。一般に、ベクターは、少なくとも1つの生物において機能的な複製開始点、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、および1つまたは複数の選択可能なマーカーを含むであろう。他の要素は所望の使用に依存し、当業者らにとって明らかであろう。
【０１８４】
ある種の実施形態の範囲内では、ポリヌクレオチドは、哺乳動物の細胞に侵入することを可能にし、そこでの発現を可能にするよう製剤化されてもよい。以下に記載されるように、上記製剤化は治療目的に対して特に有用である。ポリヌクレオチドの発現を標的細胞において達成するための多数の方法があり、任意の適した方法を使用してもよいことを当業者らは理解するであろう。たとえば、ポリヌクレオチドは、これらに限定されないがアデノウイルス(adenovirus)、アデノ随伴ウイルス(adeno-associated virus)、レトロウイルス(retrovirus)、またはワクシニアウイルス(vaccinia virus)もしくは他のポックスウイルス(pox virus)(たとえばトリポックスウイルス(avian pox virus))等のウイルスベクター中に取り込まれてもよい。DNAを上記ベクター中に取り込むための技術は当業者らによく知られている。レトロウイルスベクターは、(形質導入された細胞の同定または選択を援助するための)選択可能なマーカーの遺伝子および/またはベクターに標的特異性を与えるための、特異的な標的細胞上の受容体に対するリガンドをコードする遺伝子等の標的指向化部分をさらに移入または取り込んでもよい。標的指向化はまた、抗体を使用し、当業者らに知られている方法により達成されてもよい。
【０１８５】
医薬組成物およびキット
本発明は、本明細書中に記載されるポリペプチド(たとえば抗体)および/またはポリヌクレオチドを含む組成物をさらに提供する。たとえば、本発明は、本明細書中に記載されるポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。ポリペプチドを含むキットもまた提供される。
【０１８６】
本発明の組成物は、非医薬組成物(たとえば、純粋でないまたは非無菌の組成物)および単位剤形の調製に使用することができる医薬組成物(つまり、被験体または患者への投与に適した組成物)の製造に有用である原薬組成物を含む。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書中に記載されるポリペプチドおよび薬学的に許容し得る賦形剤(本明細書中において「薬学的に許容し得る担体」とも言われる)を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物におけるポリペプチドは抗体である。いくつかの実施形態では、医薬組成物におけるポリペプチドはヒト化抗体である。
【０１８８】
本発明の範囲内の医薬組成物はまた、生物学的に活性または不活性であってもよい他の化合物を含んでいてもよい。
【０１８９】
医薬組成物は、ポリペプチドがin situで作製されるように、上記に記載される1つまたは複数のポリペプチドをコードするDNAを含むことができる。上記に述べられたように、DNAは、核酸発現系、細菌発現系、およびウイルス発現系を含む当業者らに知られている任意の様々な送達系内に存在してもよい。Rolland, 1998, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15:143-198およびそこに引用される参考文献により記載される技術等の多数の遺伝子送達技術は当技術分野でよく知られている。適切な核酸発現系は、患者における発現のために必要なDNA配列(適したプロモーターおよび終結シグナル等)を含む。
【０１９０】
好ましい実施形態では、DNAは、ウイルス発現系(たとえばワクシニアウイルスもしくは他のポックスウイルス、レトロウイルス、またはアデノウイルス)を使用して導入されてもよく、非病原性の(欠陥のある)、複製能力のあるウイルスの使用を伴ってもよい。適した系は、たとえば、Fisher-Hochら, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:317-321、Flexnerら, 1989, Ann. N. Y. Acad Sci. 569:86-103、Flexnerら, 1990, Vaccine 8:17-21、米国特許第4,603,112号、第4,769,330号、および第5,017,487号、国際公開第89/01,973号、米国特許第4,777,127号、英国特許第2,200,651号、欧州特許第0,345,242号、国際公開第91/02,805号、Berkner-Biotechniques 6:616-627, 1988、Rosenfeldら, 1991, Science 252:431-434、Kollsら, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215-219、Kass-Eislerら, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11498-11502、Guzmanら, 1993, Circulation 88:2838-2848、ならびにGuzmanら, 1993, Cir. Res. 73:1202-1207において開示される。DNAを上記発現系に取り込むための技術は当業者らによく知られている。DNAはまた、たとえば、Ulmerら, 1993, Science 259:1745-1749に記載され、Cohen, 1993, Science 259:1691-1692により検討されるように「裸」であってもよい。裸のDNAの取り込みは、生分解性のビーズ上にDNAをコーティングすることにより増加させてもよく、それによりビーズは効率的に細胞に運搬される。
【０１９１】
当業者らに知られている任意の適した担体を本発明の医薬組成物中に使用してもよく、担体の種類は、投与の様式に依存して変わるであろう。本発明の組成物は、たとえば、局所投与、経口投与、経鼻投与、静脈内投与、頭蓋内投与、腹腔内投与、皮下投与、または筋肉内投与を含む投与の任意の適切な方法のために処方してもよい。皮下注射等の非経口投与については、担体は、水、食塩水、アルコール、脂肪、ワックス、または緩衝液を好ましくは含む。経口投与については、上記担体の任意のもの、またはマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、および炭酸マグネシウム等の固体担体を使用してもよい。生分解性の微粒子(たとえばポリ乳酸ポリグリコール酸)もまた本発明の医薬組成物のための担体として使用してもよい。適した生分解性の微粒子は、たとえば、米国特許第4,897,268号および第5,075,109号に開示される。
【０１９２】
上記組成物はまた、緩衝液(たとえば中性緩衝食塩水もしくはリン酸緩衝食塩水)、糖質(たとえばグルコース、マンノース、スクロース、もしくはデキストラン)、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドもしくはグリシン等のアミノ酸、酸化防止剤、EDTAもしくはグルタチオン等のキレート剤、アジュバント(たとえば水酸化アルミニウム)、および/または防腐剤を含んでいてもよい。あるいは、本発明の組成物は、凍結乾燥物として製剤化されてもよい。化合物はまた、よく知られている技術を使用してリポソーム内にカプセル化してもよい。
【０１９３】
本明細書中に記載される組成物は、徐放性製剤(つまり、カプセルまたはスポンジ等の、投与に続く化合物の緩徐放出を達成する製剤)の一部として投与されてもよい。上記製剤は、よく知られている技術を使用して通常、調製され、たとえば、経口注入、直腸注入、もしくは皮下注入によりまたは所望の標的部位での注入により投与されてもよい。徐放性製剤は、担体マトリックス中に分散されたおよび/または速度制御膜に囲まれた貯蔵部内に含まれたポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体を含んでいてもよい。上記製剤内での使用のための担体は生体適合性であり、生分解性であってもよく、好ましくは、製剤は、比較的一定のレベルの活性成分の放出を提供する。徐放性製剤内に含まれる活性化合物の量は、注入の部位、放出の速度および予想される期間、ならびに治療する状態の性質に依存する。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドはまた、たとえば、コアセルベーション技術によりもしくは界面重合法により調製されたマイクロカプセル(たとえば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセルもしくはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ(メチルメタクリレート)マイクロカプセル)中に、コロイド状の薬物送達系(たとえば、リポソーム、アルブミン微粒子、マイクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセル)中に、またはマクロエマルション中に閉じ込められてもよい。上記技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro編, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990およびRemington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000に開示される。抗体の血清半減期を増大させるために、たとえば、米国特許第5,739,277号に記載されるように、サルベージ受容体結合エピトープを抗体(特に抗体断片)中に取り込んでもよい。本明細書中に使用されるように、用語「サルベージ受容体結合エピトープ」は、IgG分子のin vivoでの血清半減期を増大させることを担う、IgG分子(たとえば、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4)のFc領域のエピトープのことを言う。
【０１９５】
本明細書中に開示される抗体はまた、免疫リポソームとして製剤化されてもよい。抗体を含むリポソームは、Epsteinら, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688、Hwangら, 1980, Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030、ならびに米国特許第4,485,045号および第4,544,545号に記載されるような当技術分野で知られている方法により調製される。循環時間が高められたリポソームは米国特許第5,013,556号に開示される。特に、有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびPEG誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(PEG-PE)を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法により作製することができる。リポソームを、確定されたポアサイズのフィルターを介して押し出し、所望の直径を有するリポソームを得る。さらに、本発明の抗体のFab'断片は、Martinら, 1982, J. Biol. Chem. 257:286-288に記載されるように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームにコンジュゲートすることができる。
【０１９６】
本明細書中に記載されるポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞を含むキットおよび製品もまた提供される。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、製品は、ラベルを付した容器を含む。適した容器は、たとえば、ビン、バイアル、および試験管を含む。容器は、ガラスまたはプラスチック等の様々な材料から形成されてもよい。いくつかの実施形態では、容器は、CD26を発現する細胞の同定または定量化、CD26を発現する細胞の増殖の阻害、またはCD26の発現に関連する疾患の治療に有用な組成物を収容する。いくつかの実施形態では、容器上のラベルは、組成物は、CD26を発現する細胞の同定または定量化、CD26を発現する細胞の増殖の阻害、またはCD26の発現に関連する疾患の治療に有用であることを示す。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、本発明のキットは、上記に記載される容器を含む。他の実施形態では、本発明のキットは上記に記載される容器および緩衝液を含む第2の容器を含む。いくつかの実施形態では、キットは、キットに含まれるポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞の使用についての使用説明書を有する添付文書を含む。
【０１９９】
ポリペプチドを使用するための方法
本発明のポリペプチド(抗体等)は、診断方法および治療処置方法を含むがこれらに限定されない様々な用途に有用である。CD26を発現する細胞の増殖を阻害するための方法もまた提供される。
【０２００】
本発明の抗体およびポリペプチドは、CD26発現に関連する状態(疾患または障害等)の検出、診断、および/または監視において使用することができる。いくつかの実施形態では、CD26発現に関連する状態は異常なCD26発現に関連する状態である。たとえば、いくつかの実施形態では、CD26発現に関連する状態は変更したまたは異常なCD26発現に関連する状態である(いくつかの実施形態では、上昇または減少したCD26発現(正常試料に比べて)ならびに/あるいはCD26発現を通常欠く組織および/もしくは細胞における発現の存在またはCD26発現を通常有する組織もしくは細胞におけるCD26発現の欠如等の不適切な発現)。いくつかの実施形態では、CD26発現に関連する状態はCD26過剰発現に関連する状態である。CD26の過剰発現は、CD26を通常発現する細胞または組織におけるCD26の発現における、それらの細胞または組織におけるCD26の発現の通常のレベルに比べての増加およびCD26発現を通常欠く組織または細胞におけるCD26の発現の存在を両方含むことが理解される。いくつかの実施形態では、CD26発現に関連する状態は少なくとも部分的にCD26により媒介される。いくつかの実施形態では、CD26発現に関連する状態はCD26を発現する細胞に関連する状態である。いくつかの実施形態では、CD26発現に関連する状態はCD26を発現する細胞の増殖に関連する状態である。いくつかの実施形態では、CD26を発現する細胞の増殖は異常な増殖である。診断方法は、in vitroまたはin vivoであってもよい。
【０２０１】
例示的な言及が、抗体に対する本議論においてなされ、本議論はまた、本発明のポリペプチドにも関係するということが理解される。
【０２０２】
診断用途については、抗体は、放射性同位体、蛍光標識、および様々な酵素基質標識を含むが、これらに限定されない検出可能な部分で通常標識されるであろう。標識を抗体にコンジュゲートするための方法は当技術分野で知られている。本発明の他の実施形態では、本発明の抗体は標識される必要はなく、その存在は、本発明の抗体に結合する標識抗体を使用して検出することができる。
【０２０３】
本発明の抗体は、競合結合アッセイ、直接サンドイッチアッセイおよび間接サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイ等の任意の知られているアッセイ方法において使用されてもよい。Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc. 1987)。
【０２０４】
抗体はまた、in vivo造影等のin vivo診断アッセイに使用されてもよい。通常、抗体は、目的の細胞または組織の場所を免疫シンチグラフィーを使用して突き止めることができるように、放射性核種(111In、99Tc、14C、131I、125I、または3H等)により標識される。
【０２０５】
抗体はまた、染色試薬として、病理学において、当技術分野でよく知られている技術に従って使用されてもよい。
【０２０６】
他の態様では、本発明は、CD26を発現する細胞の増殖を阻害するための方法を提供する。CD26を発現する細胞の増殖の阻害は任意の観察可能なレベルの阻害を包含し、増殖の完全な阻害の一部分を含む。いくつかの実施形態では、細胞の増殖は、少なくとも約10%、少なくとも約25%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約90%、もしくは少なくとも約95%、または最低で約98%、あるいは約100%阻害される。方法は、in vitroまたはin vivoであってもよい。いくつかの実施形態では、方法は、細胞を本明細書中に記載されるポリペプチド(たとえば抗体)と接触させることを含む。通常、細胞は、細胞の増殖を阻害するのに十分な量のポリペプチドと接触するであろう。
【０２０７】
多くの癌細胞はCD26を発現するとして同定された。たとえば、CD26は以下の癌細胞のそれぞれにおいて過剰発現されるとして同定された:T細胞リンパ腫(Ruizら(1998) Cytometry, 34:30-5)、B慢性リンパ性白血病(B-CLL)(Bauvoisら(1999) Br. J. Cancer, 79:1042-8)、甲状腺癌腫(Aratakeら(1991) Am. J. Clin. Pathol., 47:43-7)、基底細胞癌腫(Moehrleら(1995) J. Cutan. Pathol. 22:241-7)、乳癌(Dixonら(1994) Clin. Pathol., 47:43-7)、肝細胞癌腫(Steccaら(1997) 27:337-45)、および肺腫瘍(Sedoら(1991) 40:359-62)。CD26が様々な癌細胞系において発現されることを示す実験結果はまた、後述の特定の実施例、実施例12において提供される。
【０２０８】
本明細書中に記載される態様のいくつかの実施形態では、CD26を発現する細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、CD26を発現する細胞は癌細胞である。いくつかの実施形態では、CD26を発現する細胞は、血液癌細胞、T細胞癌細胞、膵癌細胞、腎臓癌細胞、リンパ腫細胞、B細胞癌細胞、甲状腺癌細胞、乳癌細胞、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、大腸癌細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞、肝臓癌細胞、胃癌細胞、精巣癌細胞、子宮癌細胞、脳癌細胞、リンパ癌細胞、皮膚癌細胞、骨癌細胞、直腸癌細胞、肉腫細胞、T細胞リンパ腫細胞、肺腺癌腫細胞、甲状腺癌腫細胞、B細胞慢性リンパ性白血病細胞、またはB細胞リンパ腫細胞である。いくつかの実施形態では、癌細胞は、リンパ腫細胞、腎臓癌細胞、前立腺癌細胞、または肺癌細胞である。いくつかの実施形態では、CD26を発現する細胞は、固形腫瘍における細胞等の腫瘍細胞である。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞は悪性または良性である。いくつかの実施形態では、CD26を発現する細胞はT細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はヒトT細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は悪性T細胞である。いくつかの実施形態では、CD26を発現する細胞は機能亢進性の免疫細胞である。いくつかの実施形態では、CD26を発現する細胞は活性化されたT細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はヒト型である。いくつかの実施形態では、CD26を発現する癌細胞は同じ種類の非癌性細胞に比べてCD26を過剰発現する。いくつかの実施形態では、CD26を過剰発現する癌細胞は、 乳癌細胞、前立腺癌細胞、結腸直腸癌細胞、卵巣癌細胞、腎臓癌細胞、T細胞リンパ腫、B慢性リンパ性白血病(B-CLL)、基底細胞癌腫、肝細胞癌腫、または肺癌細胞である。
【０２０９】
細胞の増殖の阻害を評価するための方法は当技術分野で知られており、MTTアッセイを含む。(たとえば、Aytacら(2003) British Journal of Cancer 88:455-462、Hoら(2001) Clinical Cancer Research 7:2031-2040、Hansenら(1989) J. Immunol. Methods, 119:203-210、およびAytacら(2001) Cancer Res. 61:7204-7210を参照されたい。)MTTアッセイの実施例はまた、後述の特定の実施例、実施例2(G)、3(D)、および5において提供される。
【０２１０】
本発明は、被験体におけるCD26発現に関連する状態を治療するための方法をさらに提供する。いくつかの実施形態では、被験体におけるCD26発現に関連する状態を治療するための方法は、本明細書中に記載される抗体等のポリペプチドを含む有効量の組成物を被験体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、CD26発現に関連する状態はCD26の異常発現に関連する。いくつかの実施形態では、CD26発現に関連する状態は変更したまたは異常なCD26発現に関連する状態である(いくつかの実施形態では、上昇または減少したCD26発現(正常試料に比べて)ならびに/あるいはCD26発現を通常欠く組織および/もしくは細胞における発現の存在またはCD26発現を通常有する組織もしくは細胞におけるCD26発現の欠如等の不適切な発現)。いくつかの実施形態では、CD26発現に関連する状態はCD26過剰発現に関連する状態である。いくつかの実施形態では、CD26発現に関連する状態は少なくとも部分的にCD26により媒介される。いくつかの実施形態では、CD26発現に関連する状態はCD26を発現する細胞に関連する状態である。いくつかの実施形態では、CD26発現に関連する状態はCD26を発現する細胞の増殖に関連する状態である。いくつかの実施形態では、CD26を発現する細胞の増殖は異常である。いくつかの実施形態では、CD26を発現する細胞はT細胞である。いくつかの実施形態では、CD26を発現する細胞は腫瘍細胞であり、腫瘍細胞は悪性または良性であってもよい。いくつかの実施形態では、CD26発現に関連する状態は、癌細胞がCD26+癌細胞であるかCD26を発現する(つまり、CD26発現癌)癌である(CD26を発現するさらなる細胞は上記に記載される)。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、被験体におけるCD26発現に関連する状態は増殖性障害である。いくつかの実施形態では、被験体におけるCD26発現に関連する状態は癌である。いくつかの実施形態では、癌はCD26+血液悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、癌は、T細胞リンパ腫等のT細胞癌である。たとえば、いくつかの実施形態では、癌は、T細胞リンパ芽球性リンパ腫または急性リンパ芽球性白血病である。他の実施形態では、癌は、T細胞CD30+未分化大細胞リンパ腫である。いくつかの実施形態では、癌は、末梢T細胞リンパ腫、T細胞慢性リンパ性白血病、血管免疫芽細胞性T細胞リンパ腫、血管中心性T細胞リンパ腫、HTLV関連T細胞白血病、または成人T細胞白血病である。いくつかの実施形態では、癌は固形腫瘍である。いくつかの実施形態では、癌は、膵癌、腎臓癌、またはリンパ腫である。いくつかの実施形態では、癌は、B細胞癌、甲状腺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、大腸癌、膀胱癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、脳癌、リンパ癌、皮膚癌、骨癌、直腸癌、肉腫、肺癌、B細胞慢性リンパ性白血病、またはB細胞リンパ腫である。いくつかの実施形態では、癌はCD26の過剰発現に関連する。いくつかの実施形態では、癌は中皮腫ではない。いくつかの実施形態では、癌は黒色腫ではない。いくつかの実施形態では、癌はリンパ腫、腎臓癌、前立腺癌、または肺癌である。いくつかの実施形態では、癌はリンパ腫である。いくつかの実施形態では、癌は腎癌腫である。いくつかの実施形態では、癌は前立腺癌腫である。いくつかの実施形態では、癌は肺癌腫である。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、CD26発現に関連する状態は炎症性疾患または炎症性障害である。いくつかの実施形態では、炎症性疾患はCD26の過剰発現に関連する。
【０２１３】
他の実施形態では、CD26発現に関連する状態は血管新生である。
【０２１４】
さらなる実施形態では、CD26発現に関連する状態は、これらに限定されないが、移植片対宿主疾患および自己免疫疾患または自己免疫障害等の活性化された免疫状態を伴う状態である。いくつかの実施形態では、状態は、アジソン病、脱毛、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、ベーチェット病、慢性疲労症候群、クローン病、潰瘍性大腸炎、糖尿病、線維筋痛、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、狼瘡、メニエール多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、関節リウマチ、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、脈管炎、白斑、またはヴェーゲナー肉芽腫症である。いくつかの実施形態では、活性化された免疫状態を伴う状態は、CD26の過剰発現に関連する。
【０２１５】
一態様では、本発明は、癌を治療するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、癌を有する被験体における癌の進行を阻害するための方法であって、有効量の本明細書中に記載される組成物を被験体に投与することを含む方法を提供する。本発明は、被験体における腫瘍成長を阻害するための方法であって、ポリペプチドを含む有効量の組成物を被験体に投与することを含む方法をさらに提供する。いくつかの実施形態では、被験体はCD26を発現する腫瘍を有しているかCD26を発現する腫瘍が除去されている。いくつかの実施形態では、腫瘍の退縮は誘導される。本発明は、被験体における癌細胞(たとえばCD26発現癌細胞)の転移を阻害するための方法であって、有効量の本明細書中に記載される組成物を被験体に投与することを含む方法をさらに提供する。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される方法は、被験体を療法のさらなる形態を用いて治療するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、療法のさらなる形態はさらなる抗癌療法である。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される方法は、被験体を、化学療法、放射線療法、外科手術、ホルモン療法、および/またはさらなる免疫療法で治療するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、放射線療法は、外部光線放射線療法または遠隔療法である。いくつかの代替の実施形態では、放射線療法は、内科療法または近接照射療法として投与される。いくつかの実施形態では、療法のさらなる形態は、キナーゼの阻害剤等の1つまたは複数の治療剤の投与を含む。いくつかの実施形態では、治療剤は、抗VEGF抗体であるAvastin(登録商標)、抗HER2抗体であるHerceptin(登録商標)(トラスツズマブ)(Genentech社、カリフォルニア)、抗CD25抗体であるZenapax(登録商標)(ダクリズマブ)(Roche Pharmaceuticals社、スイス)、および抗CD20抗体であるRituxan(商標)(IDEC Pharm./Genentech社, Roche/Zettyaku社)等の治療抗体である。いくつかの実施形態では、さらなる治療剤は血管新生阻害剤である。いくつかの実施形態では、さらなる治療剤は細胞傷害性剤である。いくつかの実施形態では、さらなる治療剤は抗癌剤である。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は抗炎症剤である。いくつかの実施形態では、さらなる作用剤は、パクリタキセル(タキソール(登録商標))、ドセタキセル(Taxotere(登録商標))、プレドニゾン、シスプラチン、マイトマイシン、プロゲステロン、クエン酸タモキシフェン、フルオロウサシル(fluorousacil)、および塩酸ドキソルビシンからなる群から選択される薬剤を含む。
【０２１７】
本明細書中に記載される方法(治療方法を含む)は、単一の時点または複数の時点での単一または複数の部位に対する単一の直接の注射により達成することができる。投与はまた、複数の部位へほぼ同時にすることもできる。投与の頻度は、療法の経過にわたり決定され、調整されてもよく、所望の結果の達成に基づく。いくつかの症例では、本発明のポリペプチド(抗体を含む)、ポリヌクレオチド、および医薬組成物の持続性継続的放出製剤は適切である可能性がある。徐放性を達成するための様々な製剤および装置は当技術分野で知られている。
【０２１８】
患者、被験体、または個体は、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、およびヒツジの動物等の哺乳動物を含む。被験体は、好ましくはヒトであり、疾患に罹患していてもよく、罹患していなくてもよく、目下症状を示していてもよい。いくつかの実施形態では、被験体は癌を有する。いくつかの実施形態では、被験体は腫瘍を有しているか腫瘍が除去されている。腫瘍が被験体から除去されたとしても、腫瘍細胞はそれにもかかわらずいくつかの例では被験体に残存する可能性があることが理解される。たとえば、1つの部位からの腫瘍が除去されるかもしれないが、腫瘍は体の他の位置に転移し、広がる可能性がある。また、腫瘍が被験体から除去されたかもしれないが、腫瘍の部分またはいくつかの腫瘍細胞は、外科手術手順等における限界により、不注意にまたは不可避的に被験体に放置される可能性がある。いくつかの実施形態では、被験体は、腫瘍(または癌)を発達させる危険な状態にある。いくつかの実施形態では、被験体は、さらなる治療(たとえば化学療法、外科手術、ホルモン療法、放射線療法、またはさらなる免疫療法)を受けているか受けていた。
【０２１９】
抗体は、哺乳動物に担体、好ましくは薬学的に許容し得る担体中で好ましくは投与される。適した担体およびそれらの製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro編, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990およびRemington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000に記載される。通常、適切な量の薬学的に許容し得る塩は、製剤に等張性を与えるために製剤中に使用される。担体の例は、食塩水、リンガー溶液、およびブドウ糖溶液を含む。溶液のpHは、好ましくは約5〜約8、より好ましくは約7〜約7.5である。さらに担体は、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックス等の徐放性調製物を含み、マトリックスは、造形品、たとえば、フィルム、リポソーム、微小粒子の形態をしている。ある種の担体は、たとえば投与経路および投与されている抗体の濃度に好ましく依存してもよいことは当業者らに明らかであろう。
【０２２０】
抗体は、有効な形態において血流への抗体の送達を確実にする注射(たとえば、全身性、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、門脈内)または注入等の他の方法により哺乳動物に投与することができる。抗体はまた、局所的な治療効果を発揮するために単離組織灌流等の単離灌流技術により投与されてもよい。静脈内注射が好ましい。
【０２２１】
ポリペプチド(たとえば抗体)を投与するための有効投与量およびスケジュールは経験的に決定されてもよく、上記決定をなすことは当技術分野の技術の範囲内である。投与されなければならない抗体の投与量は、たとえば、抗体を受けることとなる哺乳動物、投与経路、使用される特定の種類の抗体、および哺乳動物に投与されている他の薬物に依存して変動するであろうということを当業者らは理解するであろう。抗体の適切な用量の選択についてのガイダンスは抗体の治療上の使用についての文献に提供される、たとえば、Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferroneら編, Noges Publications, Park Ridge, N.J., 1985, ch. 22 and pp. 303-357、Smithら, Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haberら編, Raven Press, New York, 1977, pp. 365-389。単独で使用される抗体の典型的な日々の投与量は、1日当たり体重の約1μg/kgから100mg/kgまでまたはそれ以上であり、上記に述べた要因に依存してもよい。通常、任意の以下の用量を使用してもよい:少なくとも約50mg/体重kg、少なくとも約10mg/体重kg、少なくとも約3mg/体重kg、少なくとも約1mg/体重kg、少なくとも約750μg/体重kg、少なくとも約500μg/体重kg、少なくとも約250μg/体重kg、少なくとも約100μg/体重kg、少なくとも約50μg/体重kg、少なくとも約10μg/体重kg、少なくとも約1μg/体重kg、またはそれ以上の用量が投与される。いくつかの実施形態では、本明細書中に提供されるポリペプチド(たとえば抗体)の用量は、約0.01mg/kgおよび約50mg/kgの間、約0.05mg/kgおよび約40mg/kgの間、約0.1mgおよび約30mg/kgの間、約0.1mgおよび約20mg/kgの間、約0.5mgおよび約15mgの間、または約1mgおよび10mgの間にある。いくつかの実施形態では、用量は、約1mgおよび5mgの間にある。いくつかの代替の実施形態では、用量は、約5mgおよび10mgの間にある。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、1つを超える抗体が存在していてもよい。上記組成物は、本発明の少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つの異なる抗体(ポリペプチドを含む)を含んでいてもよい。
【０２２３】
ポリペプチドはまた、有効量の1つまたは複数の他の治療剤と組み合わせて哺乳動物に投与されてもよい。ポリペプチドは、1つまたは複数の他の治療剤と順次にまたは同時に投与されてもよい。ポリペプチドならびに治療剤の量は、たとえばどのような種類の薬物が使用されるか、治療されている病理学的状態、ならびに投与のスケジューリングおよび経路に依存するが、それぞれが個々に使用される場合よりも通常少ないであろう。
【０２２４】
哺乳動物への抗体の投与に伴って、哺乳動物の生理学的状態は、当業者によく知られている様々な方法でモニターすることができる。
【０２２５】
投与および投与量の上記原理は本明細書中に記載されるポリペプチドに適応させることができる。
【０２２６】
本発明のポリペプチド(抗体を含む)をコードするポリヌクレオチドはまた、所望の細胞における抗体またはポリペプチドの送達および発現に使用されてもよい。発現ベクターは、抗体の発現を指示するために使用することができることは明らかである。発現ベクターは、全身に、腹腔内に、静脈内に、筋肉内に、皮下に、鞘内に、脳室内に、経口的に、経腸的に、非経口的に、経皮的に、鼻腔内に、または吸入により投与することができる。たとえば、発現ベクターの投与は、注射、経口投与、パーティクルガンもしくはカテーテル投与、および局所投与を含む局所的投与または全身性投与を含む。当業者は、in vivoでの外来性タンパク質の発現を獲得するための発現ベクターの投与に精通している。たとえば、米国特許第6,436,908号、第6,413,942号、および第6,376,471号を参照されたい。
【０２２７】
本発明のポリペプチドまたは抗体をコードするポリヌクレオチドを含む治療組成物の標的送達もまた使用することができる。受容体媒介性DNA送達技術は、たとえば、Findeisら, Trends Biotechnol. (1993) 11:202、Chiouら, Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer (J.A. Wolff編) (1994)、Wuら, J. Biol. Chem. (1988) 263:621、Wuら, J. Biol. Chem. (1994) 269:542、Zenkeら, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1990) 87:3655、Wuら, J. Biol. Chem. (1991) 266:338に記載される。ポリヌクレオチドを含む治療組成物は、遺伝子療法プロトコールにおいて局所的投与のために約100ng〜約200mgのDNAの範囲で投与される。約500ng〜約50mg、約1μg〜約2mg、約5μg〜約500μg、および約20μg〜約100μgのDNAの濃度範囲もまた遺伝子療法プロトコールの間に使用することができる。本発明の治療用ポリヌクレオチドおよび治療用ポリペプチドは遺伝子送達ビヒクルを使用して送達することができる。遺伝子送達ビヒクルはウイルス由来または非ウイルス由来とすることができる(一般的に、Jolly, Cancer Gene Therapy (1994) 1:51、Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5:845、Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1:185、およびKaplitt, Nature Genetics (1994) 6:148を参照されたい。)上記コード配列の発現は、内在性哺乳動物プロモーターまたは異種プロモーターを使用して誘導することができる。コード配列の発現は、恒常的とするかまたは調節することができる。
【０２２８】
所望のポリヌクレオチドの送達のためのウイルスベースのベクターおよび所望の細胞における発現は当技術分野でよく知られている。例示的なウイルスベースのビヒクルは、組換えレトロウイルス(たとえば、PCT国際公開第90/07,936号、国際公開第94/03,622号、国際公開第93/25,698号、国際公開第93/25,234号、国際公開第93/11,230号、国際公開第93/10,218号、国際公開第91/02,805号、米国特許第5,219,740号、第4,777,127号、英国特許第2,200,651号、および欧州特許第0,345,242号を参照されたい)、アルファウイルス(alphavirus)ベースのベクター(たとえば、シンドビスウィルス(Sindbis virus)ベクターおよびセムリキ森林熱ウイルス(Semliki forest virus)(ATCC VR-67;ATCC VR-1247)、ロスリバーウイルス(Ross River virus)(ATCC VR-373;ATCC VR-1246)、およびベネズエラウマ脳炎ウイルス(Venezuelan equine encephalitis virus)(ATCC VR-923;ATCC VR-1250;ATCC VR 1249;ATCC VR-532))、ならびにアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター(たとえば、PCT国際公開第94/12,649号、国際公開第93/03,769号、国際公開第93/19,191号、国際公開第94/28,938号、国際公開第95/11,984号、および国際公開第95/00,655号を参照されたい)を含むがこれらに限定されない。Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147に記載される死んだアデノウイルスに連結されたDNAの投与もまた使用することができる。
【０２２９】
非ウイルス送達ビヒクルおよび非ウイルス送達方法もまた使用することができ、死んだアデノウイルスに単独で連結されたまたは連結されていないポリカチオン凝縮DNA(たとえば、Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147を参照されたい)、リガンド連結DNA(たとえば、Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264:16985を参照されたい)、真核細胞送達ビヒクル細胞(たとえば、米国特許第5,814,482号、PCT国際公開第95/07,994号、国際公開第96/17,072号、国際公開第95/30,763号、および国際公開第97/42,338号を参照されたい)、ならびに核電荷中和または細胞膜との融合を含むが、これらに限定されない。裸のDNAもまた使用することができる。例示的な裸のDNA導入方法は、PCT国際公開第90/11,092号および米国特許第5,580,859号に記載される。遺伝子送達ビヒクルとして作用することができるリポソームは、米国特許第5,422,120号、PCT国際公開第95/13,796号、国際公開第94/23,697号、国際公開第91/14,445号、および欧州特許第0,524,968号に記載される。さらなるアプローチは、Philip, Mol. Cell Biol. (1994) 14:2411およびWoffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91:1581に記載される。
【０２３０】
以下の実施例は、本発明を限定するためではなく、例示するために提供される。
【実施例】
【０２３１】
本明細書中に記載される実施例および実施形態は例示的な目的のみのためのものであり、それらを考慮した様々な変更または変化は、当業者に示唆されることとなり、本出願の精神および範囲内に含まれることが理解される。
【０２３２】
実施例１
CM03 Fabの結合親和性およびVHおよびVLの配列
CM03(本明細書中において14D10とも言われる)は、ヒトCD26に対して産生されたマウスモノクローナル抗体である。CM03のVHおよびVLの配列は、後述の実施例における変異体を設計するためのリード物として使用した。マウスモノクローナル抗体CM03のVLおよびVHの配列にそれぞれ対応する軽鎖可変領域(VL)および重鎖可変領域(VH)を含むFabもまた生産した。このCM03 Fabは、本明細書中でしばしば「X369」または「CM03 X369」等と呼ばれる。
【０２３３】
Biacore(登録商標)技術(表面プラズモン共鳴、すなわち「SPR」)はCD26に対するCM03 Fabの親和性を決定するために使用した。一般に、SPRベースのバイオセンサーは表面に近接する生体分子の濃度を測定することにより相互作用をモニターする。その表面は、その上に固定された相互作用するパートナーの一方を有している。他方のパートナーを含む試料がその表面上を流れる。試料由来の分子が、表面に付加された相互作用体と結合すると、SPR応答が測定される。その応答は、表面と結合する分子の質量に比例する。
【０２３４】
これらの親和性測定はメーカーのマニュアルに従って、25℃で行った。R&D Systems社から購入した精製組換えヒトCD26(rhジペプチジルペプチダーゼIV)、カタログ#1180-SE)は、PBS中ストックとして調製し、CM5チップ(BiaCore社、カタログ#BR-1000-14)上に固定する前に、10mM酢酸ナトリウム緩衝液pH5中、約0.05mg/mlの濃度に希釈した。以下に記載される大腸菌において生産されたFabは、PBS中、約0.5μMの濃度にアッセイのために希釈した。典型的な記録は、Fabの3分間の注入、次に15分間の解離を含み、分析は、結合曲線の生データに基づき適宜実行した。
【０２３５】
親和性は、一方の分子がもう一方に単一の部位で結合する強度である。KDは解離定数であり、抗体が抗原から解離する速度の尺度である。一般に、より小さいKDを有する抗体ほど、より高度の親和性を有している。
【０２３６】
Biacore(登録商標)技術は、ヒトCD26抗原に対するCM03 VHおよびVLを含むFabの親和性を決定するために使用した。このデータから、CM03 FabのKD(1.63×10-9)を決定した。これは比較的高度な親和性を示す。CM03 Fabに対するさらなる親和性データは以下の表2に示す。
【表２】
2009502139.tif 000003
【０２３７】
図1は、CM03マウスAbおよびCM03 Fabの重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)の配列を示す。
【０２３８】
実施例２
ヒト化CM03変異体のFab
A.配列
CM03抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をヒト化のために使用し、様々な変異体重鎖可変領域および変異体軽鎖可変領域を生成した。
【０２３９】
ヒト化VL変異体X376(配列番号1)、X377(配列番号2)、X378(配列番号3)、X379(配列番号4)、X380(配列番号5)、X381(配列番号6)、およびX394(配列番号7)の核酸配列を図2に示す。ヒト化VL変異体X376(配列番号15)、X377(配列番号16)、X378(配列番号17)、X379(配列番号18)、X380(配列番号19)、X381(配列番号20)、およびX394(配列番号21)のアミノ酸を図3に示す。
【０２４０】
ヒト化VH変異体X384(配列番号8)、X385(配列番号9)、X386(配列番号10)、X387(配列番号11)、X388(配列番号12)、X399(配列番号13)、およびX420(配列番号14)についての核酸配列を図4に示す。ヒト化VH変異体X384(配列番号22)、X385(配列番号23)、X386(配列番号24)、X387(配列番号25)、X388(配列番号26)、X399(配列番号27)、およびX420(配列番号28)についてのアミノ酸配列を図5に示す。
【０２４１】
図6は、VH変異体およびVL変異体の両方を含むFabを作製するために使用された変異体重鎖可変領域および変異体軽鎖可変領域の選択された対のアミノ酸配列を示す。
【０２４２】
B.発現
大腸菌細胞株は、図7〜10に示される重鎖軽鎖Fab変異体を発現させるために使用した。
【０２４３】
発現については、個々の大腸菌細胞株は、100μg/ml カルベニシリンを含む2×YT培地に接種して37℃でOD600=約1まで増殖させた後にIPTGを最終濃度0.5mMで添加し、次いで、その培養物を、30℃で4〜5時間、Fab生産のために誘導した。細胞を採取し、ペリプラズム抽出物を標準プロトコールに従って調製した(Phage Display, A Laboratory Manual, Carlos Barbas IIIら, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)。粗抽出物を、プロテイン親和性Gカラム(Amerham-Pharmacia社、カタログ#17-0404-01)で、メーカーの使用説明書に従って精製し、0.1MグリシンpH.2.7により溶離し、次に、1M Tris pH8により即時中和を行った。試料は、PBSに対して十分に透析し、Biacore分析および他のアッセイに使用する前にOD280を用いてタンパク濃度を最終的に決定した。
【０２４４】
図7は、大腸菌株TG1で発現されたCM03 VL変異体X376、X377、X378、X379、X380、X381のFabおよびVH変異体X384、X385、X386のFabをプロテインGカラムにより精製した試料がロードされた非還元条件下のSDS-PAGEゲルを示す。VL変異体はFabにおいてCM03 VHと対になっており、VH変異体はFabにおいてCM03 VLと対になっていた。各試料において、タンパク質バンドは50kDaのあたりに見られたが、収量は、X376、X377、X380、X384、X385、およびX386において最も多かった。図8は、大腸菌で発現されたCM03 VL変異体X376、X377、X378、X379、X380、X381のFabおよびFab X369(CM03)のタンパク質の蓄積の定量的な図を示す。試料X376、X377、およびX380は、CM03ネズミFabよりも高レベルのFabタンパク質を有していた。図11は、大腸菌において発現された、CM03 VLと対になったVH変異体X384、X385、X386、X387、またはX388を含むFabの定量的なタンパク質の収量を示す。
【０２４５】
図9は、大腸菌株TG1におけるCM03 VH変異体X387およびX388のFabの発現からのならびに大腸菌HB2151におけるVL変異体およびVH変異体の対をそれぞれ含むFab X389、X390、X391、X392、X393、X395、およびX396の発現からの、プロテインGカラムにより精製された試料がロードされた非還元条件下のSDS-PAGEゲルを示す(X387およびX388 VH変異体はCM03 VLと対であった)。Fab X389、X390、X391、X392、X393、X395、およびX396のVLおよびVHの対を図6に示す。各試料において、タンパク質バンドは50kDaのあたりに見られたが、収量は、X389、X390、X391、X395、およびX396において最も多かった。図10は、大腸菌株HB2151において発現されたFab VH変異体およびVL変異体の対X389、X390、X391、X392、X393、X395、およびX396ならびにCM03 X369からのタンパク質の蓄積の定量的な図を示す。すべての場合において、Fab変異体対の試料はCM03マウスFabよりも高レベルのタンパク質を有していた。
【０２４６】
C.Fab特性
以下の表3は、Fab X369(CM03 VHおよびVL)、X391、X392、X396、ならびにX399の様々な理論的な物理的特性の概要を示す。たとえば、分子量、荷電した残基の数、疎水性残基、等電点、および全体電荷を示す。
【表３】
2009502139.tif 000004
【０２４７】
D.変異体軽鎖可変領域を含むFabの特異性
CM03 Fab X369、およびCM03 VHに連結されたX377 VL変異体を含むFabの特異性分析を行った。データを図12A、12B、および12Cに示す。データは、Biacore(登録商標)技術を使用して作成した。CD26結合パートナーは、以下に記載されるとおりであった。
【０２４８】
図12Aは、ヒトCD26に結合したX369(CM03 Fab)を示す。約800秒でのさらなるCM03の導入後の応答も示す。図12Bは、ヒトCD26に結合したX369(CM03 Fab)を示す。約600秒での、CM03 VHと対になったX377 VL変異体を含むFabの導入後の応答も示す。図12Cは、ヒトCD26に結合したX377 Fab 対 CM03 Fab X369により予め占有されたCD26に結合したX377 Fabを示す。あらかじめX369が結合したCD26と結合するX377 Fabのレベルが、あらかじめ非結合のCD26に結合したX377 Fabと比較して減少したことは、X377 FabおよびCM03 Fab X369が、CD26との相互作用についての類似するか少なくとも重複する部位を有していることを示す。
【０２４９】
E.Fab変異体のヒトCD26に対する親和性
以下の表4は、CM03 X369およびCM03 VL変異体X376、X377、X378、X379、X380、またはX381のそれぞれと組み合わせられたCM03 VHを含むFabの、KDを含む親和性分析の概要を示す。このデータは、Biacore(登録商標)技術を使用して作成した。CD26結合パートナーは、以下に示されるとおりであった。
【表４】
2009502139.tif 000005
【０２５０】
以下の表5は、CM03 X369およびCM03 VH変異体X384、X385、X386、X387、またはX388のうちの1つと対になったCM03 VLを含むFabの、KDを含む親和性分析の概要を示す。
【表５】
2009502139.tif 000006
【０２５１】
図13は、X369 Fab(CM03 VHおよびVL)およびヒト化CM03 VH変異体およびVL変異体の対を含む以下のFab: X389、X390、X391、X392、X393、X395、およびX396の、親和性分析を示す。変異体重鎖可変領域および変異体軽鎖可変領域の対のアミノ酸配列については、図6を参照されたい。分析は、Biacore(登録商標)を使用して、CD26結合パートナーが図に示されるとおりであった以外は、実施例1に記載されるように行った。
【０２５２】
以下の表6は、表4および5の概要ならびに示したFabの発現収量を示す。表6はまた、選択されたFabを作製するために使用された変異体重鎖および変異体軽鎖、KD、収量、ならびにVHおよびVL変異体の対を含む選択されたFabの、CM03 Fabと比較したKDおよび収量の比を示す。
【表６】
2009502139.tif 000007
【０２５３】
F. ヒトCD26に対する変異体VHおよび変異体VLの対を含むFabの結合の特異性
変異体VHおよび変異体VLの配列の対を含む選択されたFabの特異性分析を行った。図14は、CD26に対する結合について、未精製腹水マウスMAb CM03(14D10)と競合したCM03 X369 Fabならびにヒト化CM03 Fab X389、X390、X391、X392、X393、X395、およびX396を示す。CD26に対する14D10の結合を、CM03変異体により予め占有されたC26に対する14D10の結合と比較した。クローン化CM03の組換えFabは陽性対照として使用した。分析は、Biacore(登録商標)を使用して、実施例1に記載されるように行った。Fabはすべて、CD26に対する14D10の結合において少なくとも80%の減少をもたらし、これは、そのFab変異体対が、14D10と類似するか少なくとも重複する結合部位を有することを示す。
【０２５４】
G.生物活性
ヒト化重鎖可変領域およびヒト化軽鎖可変領域の様々な対を含むFabを、細胞増殖を阻害するそれらの性能について分析した。
【０２５５】
様々なFab変異体の効果を、Jurkat CD26+細胞において増殖阻害効果について分析した。当技術分野でよく知られている3-4,5-ジメチルチアゾール-2-イル-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(「MTT」)アッセイを使用した。このアッセイは、細胞増殖を測定するために使用される定量的な方法である。一般に、MTTアッセイは、生細胞からのミトコンドリアデヒドロゲナーゼ酵素の、MTTを切断し濃青色のホルマザン結晶を形成する性能に基づく。生存細胞の数は、作り出されたホルマザン産物のレベルに比例する。その色を単純な比色アッセイを使用して、定量化することができる。
【０２５６】
MTTアッセイを実行するために、簡単にいうと、50μlの対数増殖期のJurkat CD26+細胞をマイクロタイタープレート(50μlウェル中に50,000個の細胞)中に入れた。CM03 Fab X369ならびにFab変異体X389、X390、X391、X392、X393、X395、およびX396(VH変異体およびVL変異体の対を含む)ならびにVL変異体X376およびCM03 VHを含むFabを0.1、0.5、1、5、および10μg/mlで増殖培地に添加し、混合した。細胞を、48時間、密閉したCO2インキュベーター中で37℃でインキュベートした。MTTを約1mg/mlまで添加した。細胞を2時間、37℃でインキュベートした。ホルマザンの抽出を、一晩、CO2インキュベーター中で行った。570nmでの吸光度を測定した。
【０２５７】
図15は、CM03 Fab X369ならびにFab X389、X390、X391、X392、X393、X395、およびX396(VH変異体およびVL変異体の対を含む)ならびにVL変異体X376およびCM03 VHを含むFabによるJKT/CD26+細胞増殖の阻害パーセントを示す。
【０２５８】
Fabはすべて、細胞増殖の阻害をもたらし、5または10μg/mlレベルで最も高度な阻害を示した。
【０２５９】
実施例３
ヒト化CM03 IgG1抗体
A.配列
完全長ヒト化抗体は、選択されたVHおよびVLの対、ヒトIgG1重鎖定常領域、およびヒトκ軽鎖定常領域を使用して作製した。図16は、IgG1鎖間相互作用およびヒンジ領域を示す。図17Aは、重鎖定常領域アミノ酸配列を示す。図17Aはまた、重鎖におけるVH変異体およびリーダー配列の位置を示す。図17Bは、軽鎖定常領域アミノ酸配列を示す。図17Bはまた、軽鎖におけるVL変異体およびリーダー配列の位置を示す。
【０２６０】
以下の表7および表8は、組換えヒト化モノクローナル抗体(rhuMAb)409、410、411、412、420、および429を作製するために使用したVHおよびVLの対の内容（identity）を、以前に試験したFabのうちのいくつかのものと対応させる。VH変異体およびVL変異体の対を含むFabを作製するために使用したVH変異体およびVL変異体を以下の表8に示す。たとえば、本明細書中において「X410」とも言われるrhuMab410は、Fab X391がまさに含むように、X388 VHおよびX376 VLの配列を含む。上記に記載されるように、図6は、X369(CM03 Fab)のアミノ酸配列を除く、変異体重鎖および変異体軽鎖の選択された対のアミノ酸配列を示す。X369(CM03 Fab)のCM03 VHおよびCM03 VLの配列は、rhuMAb409を作製するために使用した。
【表７】
2009502139.tif 000008
【０２６１】
【表８】
2009502139.tif 000009
【０２６２】
B.発現
図18は、HEK293細胞において一過性に発現させ、プロテインA親和性カラム(Procep-A、Millipore社、カタログ#113111827)を通してメーカーのマニュアルに従って精製した完全長組換えヒト化モノクローナル抗体(rhuMAb)409、411、410、および412を示す。抗体は、100mM酢酸ナトリウムpH3.0により溶離し、次に、2M Tris pH9.0による即時中和を行った。次いで、試料を、不溶性材料を除去するためにJS4.2ローターで4,000rpmで30分間回転させ、保管前の滅菌のために0.2μmフィルターを通して濾過した。図18はまた、チャイニーズハムスター卵巣(CHO-DG44)細胞において安定して発現したrhuMAb 411を示す。各場合において、形質移入は、リポフェクトミン(lipofectomin)を介して実行した。
【０２６３】
図18は、還元条件下で実行したクーマシーブルー染色SDSポリアクリルアミドゲルを示す。遊離した重鎖および軽鎖について予想されたものに一致する移動点を示す2つの主要なバンドが見られた。上記の表7は、CHO細胞において発現された様々な示された完全長抗体の収量を示す。
【０２６４】
C.ヒトCD26に対するrhuMAbの親和性
CD26に対するrhuMAb409、410、411、および412のCD26結合親和性を後述の表9に示す。それらの分析は、Biacore(登録商標)を使用して、結合パートナーが上記に述べられたrhuMAbであることを除き、実施例1に記載されるように実行した。rhuMAb 411は、rhuMAb409のKDの3.7倍を有していた。rhuMAb410および412は、rhuMAb409のKDの0.5倍および0.4倍をそれぞれ有していた。
【表９】
2009502139.tif 000010
【０２６５】
図19は、ヒトCD26に特異的に結合したrhuMAb409、411、410、および412を示すデータを示す。図20は、標準プロトコール((Phage Display, A Laboratory Manual, Carlos Barbas IIIら, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)を使用した、さらなる一過性に発現されたrhuMAb変異体のヒトCD26に対する結合を示すELISAのデータを示す(1μg/mlヒトCD26コーティングおよび検出二次抗体としてのヤギ抗ヒトκHRPコンジュゲート(SouthernBiotech社、バーミンガム、アラバマ、カタログ#2060-05))。
【０２６６】
D.生物活性
特定の組換えヒトMAbの抗増殖性効果を、抗体により誘導された凝集を評価した形態学的アッセイでJurkat CD26+細胞において分析した。図21は、対照処理(上の像)と比べた、rhuMAb409(左下の像)およびrhuMAb410(右下の像)で処理した細胞の像を示す。両rhuMAbは、対照処理と比べて、細胞増殖の阻害の証拠を示した。
【０２６７】
図22は、対照(左上の像)と比べた、0.05μg/ml(左下の像)、0.1μg/ml(右下の像)、0.5μg/ml(中央左の像)、2.5μg/ml(中央右の像)、および5μg/ml(右上の像)のrhuMAb 411で処理した結果を示す。細胞増殖の阻害の証拠は、より高レベルの抗体で観察された。阻害効果の証拠は、rhuMAb 411を増加させると、より高度となり、最高阻害の濃度は5μg/mlのrhuMAb 411であった。
【０２６８】
特定の組換えヒトMAbの効果もまた、増殖阻害効果について、MTTアッセイを使用してJurkat CD26+細胞において分析した。rhuMAb 409、410、411、412、420、および429を様々な異なる濃度でそれぞれ試験した。以下の表10は、様々な組換えヒトMabについてMTTアッセイにおいて観察された阻害パーセントを示す。
【表１０】
2009502139.tif 000011
【０２６９】
図23Aおよび23Bはまた、rhuMAb 409、410、411、412、420、および429のMTTアッセイ結果を示す。図23Aは、阻害パーセントの折れ線グラフの図を示し、図23Bはその棒グラフ図を示す。示したすべての抗体での処理が細胞増殖の阻害をもたらした。2.5μg/mlの処理とは対照的に5μg/mlの処理においてわずかな減少を示したrhuMAb420を除き、濃度を上昇させた抗体での処理は、すべての場合において阻害の割合の上昇をもたらした。
【０２７０】
E.エピトープマッピング
エピトープマッピング実験は、CD26に対するヒト化モノクローナル抗体の有望な結合部位を決定するために実行した。エピトープマッピングは、ペプチドマイクロアレイを使用して実行した。
【０２７１】
一般に、このマッピングの方法は、抗原(ここではヒトCD26)のアミノ酸配列のすべてまたは一部に集団的に対応する重複配列のペプチドの合成を必要とする。次いで、そのペプチドを、目的の抗体と反応させる。過剰のまたは非結合の抗体は洗い落とされる。反応したまたは結合した抗体が検出される。反応ピン上の各ペプチドの配列が分かっているので、抗原の反応領域はマイクロアレイ反応プロファイルから推定される。
【０２７２】
マイクロアレイは144個の重複するヒトCD26由来の13アミノ酸長のペプチドから構成された。ヒトCD26(ジペプチジルペプチダーゼIV膜型;配列番号89)の766アミノ酸配列を以下に示す。
【０２７３】
1 MKTPWKVLLG LLGAAALVTI ITVPVVLLNK GTDDATADSR KTYTLTDYLK 
51 NTYRLKLYSL RWISDHEYLY KQENNILVFN AEYGNSSVFL ENSTFDEFGH 
101 SINDYSISPD GQFILLEYNY VKQWRHSYTA SYDIYDLNKR QLITEERIPN 
151 NTQWVTWSPV GHKLAYVWNN DIYVKIEPNL PSYRITWTGK EDIIYNGITD 
201 WVYEEEVFSA YSALWWSPNG TFLAYAQFND TEVPLIEYSF YSDESLQYPK 
251 TVRVPYPKAG AVNPTVKFFV VNTDSLSSVT NATSIQITAP ASMLIGDHYL
301 CDVTWATQER ISLQWLRRIQ NYSVMDICDY DESSGRWNCL VARQHIEMST 
351 TGWVGRFRPS EPHFTLDGNS FYKIISNEEG YRHICYFQID KKDCTFITKG 
401 TWEVIGIEAL TSDYLYYISN EYKGMPGGRN LYKIQLSDYT KVTCLSCELN 
451 PERCQYYSVS FSKEAKYYQL RCSGPGLPLY TLHSSVNDKG LRVLEDNSAL 
501 DKMLQNVQMP SKKLDFIILN ETKFWYQMIL PPHFDKSKKY PLLLDVYAGP 
551 CSQKADTVFR LNWATYLAST ENIIVASFDG RGSGYQGDKI MHAINRRLGT
601 FEVEDQIEAA RQFSKMGFVD NKRIAIWGWS YGGYVTSMVL GSGSGVFKCG 
651 IAVAPVSRWE YYDSVYTERY MGLPTPEDNL DHYRNSTVMS RAENFKQVEY 
701 LLIHGTADDN VHFQQSAQIS KALVDVGVDF QAMWYTDEDH GIASSTAHQH 
751 IYTHMSHFIK QCFSLP
【０２７４】
アミノ酸残基48〜324のみをマイクロアレイ上に示した。13アミノ酸長（mer）は2アミノ酸ずつずらした。したがって、ペプチド1はアミノ酸残基48〜60を表し、ペプチド2はアミノ酸残基50〜62を表し、などであり、アミノ酸残基312〜324を表すペプチド133で終了した。後述の表11は、rhuMAb 409、411、412、および420についてのシグナルデータを示す。表11はまた、図24に示されるそれぞれのペプチド番号により表されたアミノ酸を示す。列134〜144はバックグラウンド対照を表す。
【０２７５】
記載される抗体は、マイクロアレイ中に使用されたアミノ酸配列以外の他のピークと反応する可能性があることに注目されたい。さらに、最も反応性が高いとしては同定されないアミノ酸残基と結合する可能性もある。これは、部分的には、マイクロアレイに結合した短いペプチドの線状の性質および抗原のその完全長状態における三次元構成の間の相違によるものである可能性がある。
【０２７６】
13アミノ酸長を修飾ガラス表面上に固定した。固定されたペプチド誘導体は以下のような一般的な構造を有していた: 修飾ガラス表面-リンカー-13アミノ酸長のペプチド。
【０２７７】
マイクロアレイをブロッキング緩衝液で、4時間室温で前処理し、次に、PBS緩衝液pH7.5および水でそれぞれ3回洗浄した。各前処理したマイクロアレイを、ArrayWorxマイクロアレイスキャナを使用してバックグラウンドシグナルについてスキャンした。シグナルは検出されなかった。
【０２７８】
対照として、1つのマイクロアレイをフルオレセイン標識ヒト抗IgG抗体(SIGMA社#F9512、ヤギで生産された抗ヒトIgG(Fc特異的)FITC抗体)、1:1000)と共に2時間室温でインキュベートし、次に、PBS緩衝液pH7.5および水でそれぞれ3回洗浄した。次いで、マイクロアレイをArrayWorxマイクロアレイスキャナを使用してスキャンした。
【０２７９】
マイクロアレイを、一晩、6℃で、rhuMAB 409、411、412、および420と共に、250μlのアッセイ緩衝液(PBS-T、0.1%NaN3)中、抗体10μgを使用してインキュベートした。一晩のインキュベーションの次に、各PBS緩衝液pH7.5および水で3回洗浄を行った。次いで、マイクロアレイを、ArrayWorxマイクロアレイスキャナを使用してスキャンした。
【０２８０】
SPOT認識ソフトウェアパッケージArrayProをデータ分析に使用した。各マイクロアレイ像上の3つの同一のサブアレイからのシグナル強度の平均値をデータ評価に使用した。以下の表11は、13アミノ酸長ペプチドに対するrhuMAb 409、411、412、および420のシグナル強度データを示す。図24は、rhuMAb 409、411、412、および420についてのシグナルデータの棒グラフ図を示す。
【表１１】
2009502139.tif 000012
2009502139.tif 000013
2009502139.tif 000014
【０２８１】
図24は、rhuMAB 409(CM03 VHおよびVLを含む)が、ペプチド6(YSLRWISDHEYLY(配列番号45))、35(LEYNYVKQWRHSY(配列番号46))、55(TWSPVGHKLAYVW(配列番号47))、84(LWWSPNGTFLAYA(配列番号48))、および132(RISLQWLRRIQNY(配列番号49))に対して最も高い反応性を有していたことを示す。これらのピークのそれぞれが、より小さなピーク群を、重複する13アミノ酸長のペプチド群と関連づけた。
【０２８２】
不連続な配列との反応性は、不連続なまたは立体構造的なエピトープを示唆した。図25は、ヒトCD26_1J2Eの結晶構造のリボン図を示し、上記で同定された反応性のペプチドをより明るい色で示す。ヒトCD26の立体座標は公的に入手可能である(www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/MMDB/mmdb.shtml; Reference: PubMed; MMDB: 25581; PDB: 1J2E; Description: Crystal Structure of Human Dipeptidyl Peptidase IV; Deposition: H.Hiramatsuら)。描かれた三次元構造は、抗原がその三次元状態にある場合に、これらの線状の不連続な配列が互いの近くに配置されることを示した。これは、これがおそらく不連続なまたは立体構造的なエピトープであることをさらに確証する。なおまた、アミノ酸48〜324のみをこれらの実験において示したので、これらの配列以外に他の反応性領域がありうることに注目されたい。
【０２８３】
rhuMAB 411は、ペプチド6(YSLRWISDHEYLY(配列番号45))、37(YVKQWRHSYTASY(配列番号50))、55(TWSPVGHKLAYVW(配列番号47))、79(EEEVFSAYSALWW(配列番号51))、および132(RISLQWLRRIQNY(配列番号49))に対して最も高い反応性を有していた。これらのピークのそれぞれは、より小さなピーク群を、重複する13アミノ酸長のペプチド群と関連づけた。
【０２８４】
不連続な配列との反応性は、同様に、不連続なまたは立体構造的なエピトープを示唆した。図26は、CD26_1J2Eの結晶構造のリボン図を示し、上記で同定された反応性のペプチドをハイライトを付けて示す。示された三次元構造は、抗原がその三次元状態にある場合に、これらの線状の不連続な配列が互いの近くに配置されることを示し、これはこのエピトープの不連続な性質を確証した。
【０２８５】
rhuMAB 412は、ペプチド29(DYSISPDGQFILL(配列番号52))、30(SISPDGQFILLEY(配列番号53))、および55(TWSPVGHKLAYVW(配列番号47))に対して最も高い反応性を有していた。これらのピークのそれぞれは、より小さなピーク群を、重複する13アミノ酸長のペプチド群と関連づけた。図27は、CD26_1J2Eの結晶構造のリボン図を示し、上記で同定された反応性のペプチドをハイライトを付けて示した。示された三次元構造は、抗原がその三次元状態にある場合に、これらの線状の不連続な配列が互いの近くに配置されることを示し、これは不連続なまたは立体構造的なエピトープを示唆した。
【０２８６】
rhuMAB 420は、ペプチド29(DYSISPDGQFILL(配列番号52))、30(SISPDGQFILLEY(配列番号53))、55(TWSPVGHKLAYVW(配列番号47))、および63(IYVKIEPNLPSYR(配列番号54))に対して最も高い反応性を有していた。これらのピークのそれぞれは、より小さなピークを、重複する13アミノ酸長のペプチドと関連づけた。図28は、CD26_1J2Eの結晶構造のリボン図を示し、上記で同定された反応性のペプチドをハイライトを付して示した。示された三次元構造は、抗原がその三次元状態にある場合に、これらの線状の不連続の配列が互いの近くに配置されることを示し、これは同様に不連続なまたは立体構造的なエピトープを示唆した。
【０２８７】
実施例４
例示的な組換え重鎖および組換え軽鎖の抗体配列
X392 FabのVHおよびVLまたは本明細書中に記載される他のVHおよび/もしくはVLの配列を含むヒト化IgG1抗体は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞等の細胞中で当業者らに公知の方法を使用して製造することができる。X392 FabのVHおよびVLを含むヒト化IgG1抗体についてのいくつかの例示的な配列を以下に提供する。
【０２８８】
A.例示的な重鎖および軽鎖をコードするDNA配列
X392 FabのVHおよびVLを含むヒト化抗体の重鎖または軽鎖をコードする例示的なヌクレオチド配列を以下に提供する。コードされたタンパク質は、VHおよびVLの配列に融合したシグナル配列を含む。(シグナル配列をコードする配列は、下線で示し、可変領域をコードする配列は太字のイタリック体で示す。)
重鎖(配列番号215):
2009502139.tif 000015
【０２８９】
軽鎖(配列番号216):
2009502139.tif 000016
【０２９０】
B.例示的な重鎖および軽鎖についてのタンパク質配列
X392 FabのVHおよびVLを含むヒト化抗体の重鎖または軽鎖の例示的なタンパク質配列を以下に提供する。重鎖および軽鎖の配列はシグナル配列に融合されて示される。(シグナル配列は下線で示し、可変領域は太字のイタリック体で示す。)
重鎖(配列番号217):
2009502139.tif 000017
【０２９１】
軽鎖(配列番号218):
2009502139.tif 000018
【０２９２】
実施例５
例示的なMTTアッセイプロトコール
例示的なMTTアッセイプロトコールは以下のとおりである:
Jurkat細胞を、完全長のヒトCD26をコードするプラスミドで形質移入し、200μg/ml G418下で選択する。細胞は、生存可能性を>95%に維持するために、3日毎に1:5で継代する。アッセイ前の約48時間、回転培地は、1100rpm、5分間回転させることにより新鮮な増殖培地(37℃)と完全に置換する。(アッセイ培地は以下の増殖培地と同じである: 87mL RPMI-1640液体培地(Hyclone社:SH30027-02);10mL FCS(56℃、30分間処理済);0.5mLペニシリン/ストレプトマイシン(100μg/mL);2mL G418(Calbiochem社、PBS中100mg/ml);および2mL L-グルタミン(200mM、Hyclone社、#SH30034.01)) このアプローチにより、アッセイを行うときに、細胞生存率を97〜99%とすることができる。細胞生存率は少なくとも95%でなければならない。
【０２９３】
細胞は1100rpmで5分間スピンダウンし(Beckman社製ベンチトップ遠心分離機)、培地は完全に除去する。細胞は、5〜10mlの完全培地中に、T75フラスコ培養のために再懸濁する。0.01mLの細胞懸濁液を0.01mLのトリパンブルー(0.125%(1×)、VWR、#VWb721-0)と混合する。0.01mLを血球計に入れ、合計細胞および死細胞を数える。1ml当たりの細胞数を以下のように算出する: 合計細胞/4×希釈係数×10,000=細胞/mL。生細胞%=(合計細胞−死細胞)/合計細胞×100。次いで、細胞は、完全な増殖培地で1mL当たり約106生細胞に希釈する。種細胞、0.05mL/ウェルを96ウェルプレートの中央の60ウェルに移し、端のウェルは、増殖培地、0.1mL/ウェルで満たす。
【０２９４】
抗体試料は、増殖培地で、合計0.2mL中、0、0.1、0.2、1.0、5、および10μg/mLに希釈する。各プレートについて、陰性対照、抗体製剤緩衝液(通常PBSもしくはPBS-Tまたは他の緩衝液)、および陽性抗体(マウス)対照が三重に含まれる。抗体試料が増殖培地中で10倍を超えて希釈される場合、抗体製剤緩衝液は必要ではない。プレートにおいて均一な微小環境を維持するために、周囲のウェルを増殖培地で満たす。プレートを、5%CO2インキュベーター中で、37℃+/-0.5℃で、湿度90%にて、48時間インキュベートする。
【０２９５】
25μLのMTT溶液(5mg/mL MTT)を各ウェルに添加し、インキュベーションを2時間継続する。(MTT溶液を調製するために、50mgのMTT(テトラゾリウム塩MTT、3-(4,5-ジメチルチアゾリル-2)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド、Calbiochem社、#475989))粉末を10mLのPBS中に室温で溶解し、完全に可溶化した後、0.2μM膜を通して濾過する。)
1ウェル当たり0.1mLの抽出緩衝液を添加し、プレートを37℃で12時間または一晩インキュベートする。(抽出緩衝液を調製するために、20gのSDS(W/V)粉末を量り、50mL MQ水および50mLのN,N-ジメチルホルムアミド中で37℃で溶解する。温度を周囲環境と平衡にした後、pHを1M HClで4.7に調整する。最後に、CHX(シクロヘキシミド、Calbiochem社、239764-100MG)を20μg/mLの最終濃度まで添加する。) プレート中の抽出物は、ピペットで5回上下させ、先端における溶液を完全に放出することにより混合する。プレートを570nmで読み取る。阻害率(腫瘍細胞増殖阻害)は通常以下のように算出される:阻害率(%)=1-(Mab処理ウェルのAb/培地対照ウェルのAb)。
【０２９６】
Hoら, (2001). Clinical Cancer Res. Vol 7, 2031-2040もまた参照されたい。
【０２９７】
実施例６
Karpas299 T細胞リンパ腫異種移植片を有するNCRヌードマウスにおけるrhuMAb 411の効力
この研究の目的は、rhuMAb 411がKarpas 299 T細胞リンパ腫異種移植片の増殖を阻害する能力を検討することであった。腫瘍細胞移植後7日目に、rhuMAb 411のみの効果をタキソール(登録商標)のみおよびタキソール(登録商標)プラスrhuMAb 411と比較した。
【０２９８】
材料:細胞株:Karpas299はヒトCD26陽性T細胞リンパ腫株であり、DSMZ German Collection of Microorganisms and Cell Cultures、ブラウンシュワイク、ドイツから得て、Cell & Molecular Technologies社、フィリップスバーグ、NJに預けられ、そこから輸送された。
【０２９９】
動物:18〜22gの体重を有し、約5〜6週令であるメスNCR無胸腺マウスをTaconic社(ジャーマンタウン、NY)から得た。
【０３００】
rhuMAb 411:BDS(原薬物質)、1.0ml/バイアル、10.3mg/ml。PBS、pH7.0中のロット#D0679はLonza Biologics社、スラウ、UKで製造された。
【０３０１】
培地および緩衝液:RPMI-1640培地(カタログ#15-040-CV)およびリン酸緩衝生理食塩水(PBS、カタログ#21-040-CV)をMediatech社、ハーンドン、VAから購入した。
【０３０２】
パクリタキセル(タキソール(登録商標)、カタログ#T7402)およびジメチルスルホキシド(DMSO、カタログ#D2438)をSigma社、セントルイス、MOから得た。
【０３０３】
方法:100匹の動物の右側側腹部に、100μlのRPMI-1640培地中4〜6×106Karpas299細胞を皮下的に移植した。腫瘍サイズが100mm3に達したら、マウスをグループ化し、以下の100μlの溶液を静脈内（i.v.）投与した:
グループ1にはビヒクル(PBS)を与え、グループ2には、10mg/kgパクリタキセル(20%DMSOを加えたPBS中10mg/mlの溶液として)を与え、グループ3、4、および5には、それぞれ3、10、および30mg/kgのrhuMAb 411抗体を与えた。グループ6には、10mg/kg rhuMAb 411および10mg/kgパクリタキセルの組合せを与えた。各グループの10匹のマウスを、1週間に3回、5週間、尾静脈を介したボーラス静脈内注射により治療した。
【０３０４】
腫瘍体積は、1週間に2回測定し、体重は1週間当たり1回測定した。毒性または苦痛の徴候に注意し、必要であれば、動物を安楽死させた。20%以上の体重減量を示すいかなる動物も動物愛護的目的のために安楽死させた。
【０３０５】
結果:図29に示されるように、rhuMAb 411の投薬は、使用したすべての投与量での腫瘍の縮小および多くの症例において完全な消失をもたらし、一方、着実な腫瘍成長が、対照抗体(ヒトIgG)またはタキソール(登録商標)を投薬された動物、つまり腫瘍学における現行医療標準でルーチン的に使用される治療において観察された。体重は、rhuMAb 411治療の間、維持され、明らかな毒性は観察されなかった(データ掲載せず)。腫瘍のこの死滅はCD26依存性であり、抗体依存性細胞傷害作用(ADCC)、細胞内シグナル伝達経路の誘導を介するアポトーシス(細胞溶解活性)、補体依存性細胞傷害作用(CDC)、またはこれらの機構の組合せにより媒介されるものと仮定される。
【０３０６】
対照的に、rhuMAb 411は、有意なレベルのCD26タンパク質を発現しないヒト黒色腫細胞株であるA375を移植した異種移植片マウスモデルにおいて効力を有していないことが分かった。(データ掲載せず。)
【０３０７】
実施例７
786-O(腎癌腫)異種移植片を保持するSCIDマウスにおけるrhuMAb 411の効力
この研究の目的は、rhuMAb 411が786-O腎癌腫異種移植片の増殖を阻害する能力を検討することであった。rhuMAb 411のみの効果を、PBSならびに典型的な抗癌化合物(シスプラチンおよびタキソール(登録商標))プラスrhuMAb 411と比較した。
材料:細胞株:786-Oは、ヒトCD26陽性腎癌腫株であり、ATCCから得た。
【０３０８】
動物:18〜22gの体重を有し、約5〜6週令であるメスCB17 SCIDマウスをTaconic社(ジャーマンタウン、NY)から得た。
【０３０９】
シスプラチンはSigma社(カタログ#P9394)から購入した。
【０３１０】
マトリゲルはBD Biosciences社(カタログ#356237)から得た。
【０３１１】
HBSSはATCC(カタログ#30-2213)から得た。
【０３１２】
この研究におけるすべての他の材料は実施例6において上記に記載される材料と同じであった。
【０３１３】
方法:70匹の動物の右側側腹部に、100μlのHBSSおよびマトリゲル(HBSS:マトリゲル=1:1)中5×106 786-O細胞を皮下的に移植した。腫瘍サイズが100mm3に達したら、マウスをグループ化し、以下の100μlの溶液を腹腔内（i.p.）投与した:
グループ1にはビヒクル(PBS)を与え、グループ2、3、および4には、3、10、および30mg/kgのrhuMAb 411抗体をそれぞれ与え、グループ5には、30mg/kg rhuMAb 411、10mg/kgパクリタキセル、および2mg/kgシスプラチンの組合せを与えた。シスプラチンを1回のみ与えたこと以外は、各グループの10匹のマウスを3週間にわたり1週間に2回、腹腔内注射(i.p.)により治療した。
【０３１４】
腫瘍体積は、1週間に2回測定し、体重は1週間当たり1回測定した。毒性または苦痛の徴候に注意し、必要であれば、動物を安楽死させた。20%以上の体重減量を示すいかなる動物も動物愛護的目的のために安楽死させた。
【０３１５】
結果:図30に示されるように、786-O腫瘍の成長は、rhuMAb 411治療動物において、ビヒクル治療動物と比較して著しく阻害された。786-O腫瘍は、我々の研究において完全に取り除かれなかったが、rhuMAb 411の治療に伴って著しい成長遅延があった。さらに、高用量のrhuMAb 411(30mg/kg)のみでは、シスプラチンおよびタキソールの組合せでの効果と同じ効果を発揮した。体重は、rhuMAb 411治療の間、維持され、明らかな毒性は観察されなかった。(データ掲載せず。)
【０３１６】
実施例８
Caki-2(腎癌腫)異種移植片を保持するNCRヌードマウスにおけるrhuMAb 411の効力および用量範囲
この研究の目的は、rhuMAb 411がCaki-2腎癌腫異種移植片の増殖を用量依存的に阻害する能力を検討することであった。rhuMAb 411の効果を、ビヒクル対照および化学療法化合物の組合せと比較した。
材料:細胞株:Caki-2はヒトCD26陽性腎癌腫株であり、ATCCから得た。
【０３１７】
動物:18〜22gの体重を有し、約5〜6週令であるメスNCRヌードマウスをTaconic社(ジャーマンタウン、NY)から得た。
【０３１８】
ドセタキセル(カタログ#01885)およびドキソルビシン(カタログ#D515)をSigma社から得た。
【０３１９】
この研究におけるすべての他の材料は実施例6〜7において上記に記載される材料と同じであった。
【０３２０】
方法:100匹の動物の右側側腹部に、100μlのHBSSおよびマトリゲル(HBSS:マトリゲル=1:1)中1×106 Caki2細胞を皮下的に移植した。腫瘍サイズが100mm3に達したら、マウスをグループ化し、以下の100μlの溶液をi.p.投与した:
グループ1にはビヒクル(PBS)を与え、グループ2、3、4、および5には、1、3、10、および30mg/kg rhuMAb 411抗体をそれぞれ与え、グループ6には、30mg/kg rhuMAb 411、10mg/kg パクリタキセル、2mg/kg シスプラチン、2mg/kg ドセタキセル、および8mg/kg ドキソルビシンの組合せを与えた。グループ7にはrhuMAb 411を与えなかったが、他は全てグループ6と同じであった。化学療法化合物(シスプラチン、タキソール、ドセタキセル、およびドキソルビシン)を研究の間、i.p.により1回だけ与えたことを除き、各グループのうちの10匹のマウスを、3週間にわたり1週間に2回、i.p.により治療した。
【０３２１】
腫瘍体積は、1週間に2回測定し、体重は1週間当たり1回測定した。毒性または苦痛の徴候に注意し、必要であれば、動物を安楽死させた。20%以上の体重減量を示すいかなる動物も動物愛護目的のために安楽死させた。
【０３２２】
結果:図31に示されるように、Caki-2腫瘍の成長は、rhuMAb 411治療動物において、ビヒクル治療動物と比較して著しく阻害され、さらに、rhuMAb 411の阻害は、用量依存的であることを示した。図32に示されるように、rhuMAb 411プラス化学療法化合物は、化合物のみと比較すると、非常に強力な阻害効果を示し、これは併用療法を使用した追加的な効力を示唆する。体重は、rhuMAb 411治療の間、維持され、明らかな毒性は観察されなかった。(データ掲載せず。)
【０３２３】
実施例９
PC-3(前立腺癌腫)異種移植片を保持するSCIDマウスにおけるrhuMAb 411の効力
この研究の目的は、rhuMAb 411がPC-3前立腺癌腫異種移植片の成長を阻害する能力を検討することであった。rhuMAb 411の効果を、ビヒクル対照および化学療法化合物の組合せと比較した。
材料:細胞株:PC-3は、ヒトCD26陽性前立腺癌腫株であり、ATCCから得た。
【０３２４】
動物:18〜22gの体重を有し、約5〜6週令であるオスCB17 SCIDマウスをTaconic社(ジャーマンタウン、NY)から得た。
【０３２５】
この研究におけるすべての他の材料は実施例6〜8において上記に記載される材料と同じであった。
【０３２６】
方法:80匹の動物の右側側腹部に、100μlのHBSSおよびマトリゲル(HBSS:マトリゲル=1:1)中3×106 PC3細胞を皮下的に移植した。腫瘍サイズが100mm3に達したら、マウスをグループ化し、以下の100μlの溶液をi.p.投与した:
グループ1にはビヒクル(PBS)を与え、グループ2、3、および4には、3、10、および30mg/kg rhuMAb 411抗体をそれぞれ与え、グループ5には、2mg/kg シスプラチンおよび10mg/kg ドセタキセルの組合せを与えた。グループ6には30mg/kg rhuMAb 411を与えたが、それ以外はすべてグループ5と同じであった。化学療法化合物(シスプラチンおよびドセタキセル)は2週間にわたり1週間に1回のみ、ip.により与えられたことを除き、各グループの10匹のマウスを、3週間にわたり1週間に3回、腹腔内注射(i.p.)により治療した。
【０３２７】
腫瘍体積は、1週間に2回測定し、体重は1週間当たり1回測定した。毒性または苦痛の徴候に注意し、必要であれば、動物を安楽死させた。20%以上の体重減量を示すいかなる動物も動物愛護目的のために安楽死させた。
【０３２８】
結果:図33に示されるように、PC-3腫瘍の成長は、rhuMAb 411治療動物において、ビヒクル治療動物と比較して著しく阻害された。さらに、図34に示されるように、rhuMAb 411プラス化学療法化合物は、化合物のみと比較すると非常に強力な阻害効果を示し、これは併用療法を使用した追加的な効力を示唆する。体重は、rhuMAb 411治療の間、維持され、明らかな毒性は観察されなかった。(データ掲載せず。)
【０３２９】
実施例１０
DU-145(前立腺癌腫)異種移植片を保持するNcrヌードマウスにおけるrhuMAb 411の効力
この研究の目的は、rhuMAb 411がDU-145前立腺癌腫異種移植片の成長を阻害する能力を検討することであった。rhuMAb 411の効果をビヒクル対照と比較した。
材料:細胞株:DU-145は、ヒトCD26陽性前立腺癌腫株であり、ATCCから得た。
【０３３０】
動物:18〜22gの体重を有し、約5〜6週令であるオスNCRヌードマウスをTaconic社(ジャーマンタウン、NY)から得た。
【０３３１】
この研究におけるすべての他の材料は実施例6〜10において上記に記載される材料と同じであった。
【０３３２】
方法:30匹の動物の右側側腹部に、100μlのHBSSおよびマトリゲル(HBSS:マトリゲル=1:1)中3×106 DU145細胞を皮下的に移植した。腫瘍サイズが100mm3に達したら、マウスをグループ化し、以下の100μlの溶液をi.p.投与した:
グループ1にはビヒクル(PBS)を与え、グループ2には、30mg/kg rhuMAb 411抗体を与えた。各グループの10匹のマウスを、3週間にわたり1週間に2回、腹腔内注射(i.p.)により治療した。
【０３３３】
腫瘍体積は、1週間に2回測定し、体重は1週間当たり1回測定した。毒性または苦痛の徴候に注意し、必要であれば、動物を安楽死させた。20%以上の体重減量を示すいかなる動物も動物愛護目的のために安楽死させた。
【０３３４】
結果:図35に示されるように、DU-145腫瘍の成長は、rhuMAb 411治療動物において、ビヒクル治療動物と比較して著しく遅延した。体重は、rhuMAb 411治療の間、維持され、明らかな毒性は観察されなかった。(データ掲載せず。)
【０３３５】
実施例１１
H226肺癌腫転移モデルにおけるrhuMAb 411の効力
この研究の目的は、rhuMAb 411が、肺癌腫細胞株であるH226により誘導された転移を阻害する能力を検討することであった。rhuMAb 411の効果をビヒクル対照と比較した。
材料:細胞株:H226は、ヒトCD26陽性肺癌腫株であり、ATCCから得た。
【０３３６】
動物:18〜22gの体重を有し、約5〜6週令であるメスNCRヌードマウスをTaconic社(ジャーマンタウン、NY)から得た。
【０３３７】
この研究におけるすべての他の材料は実施例6〜10において上記に記載される材料と同じであった。
【０３３８】
方法:16匹の動物に1×104 H226細胞を尾静脈を通じて注入し、次いで、グループ当たり8匹のマウスを有する2グループに分けた。グループ1には100μlビヒクル(PBS)を与え、グループ2には、30mg/kg rhuMAb 411抗体を同量与えた。両グループを、3週間にわたり、1週間に2回、ip注射により治療した。投薬の開始の4週間後、動物を安楽死させ、肺を取り出した。各マウスの両肺における転移の総数を数えた。
結果:図36に示されるように、rhuMAb 411での投薬は、ビヒクル対照と比較して、非常に低い転移発生率をもたらした。平均値は、PBSグループにおける67.25 対 rhuMAb 411治療グループにおける10.5であった。体重は、rhuMAb 411治療の間、維持され、明らかな毒性は観察されなかった。(データ掲載せず。)
【０３３９】
実施例１１
rhuMAb 411の結合親和性
rhuMAb 411は、グルタミン合成酵素発現系(GS系;Lonza Biologics社、スラウ、UK)を用いた哺乳動物細胞(チャイニーズハムスター卵巣)懸濁培養における発酵により生産した。ヒトCD26(hu-CD26)に対するRhuMAb 411の結合親和性を標準的なBiacore(登録商標)プロトコールを使用して決定した。ヒトCD26に対するマウスモノクローナル抗体14D10の結合親和性もまた決定した。これらの結合研究の結果を後述の表12に提示する。
【表１２】
2009502139.tif 000019
細胞結合アッセイ全体において、rhuMAb 411は、Karpas-299の膜中の内在性CD26および可溶性ヒトCD26に類似した親和性で結合することが分かった。(データ掲載せず。)
【０３４０】
実施例１２
癌細胞株におけるCD26の発現
CD26細胞表面発現のレベルおよび割合を様々な癌細胞株においてフローサイトメトリーにより測定した。この研究で試験した癌細胞株を、表13において以下に記載する。
【表１３】
2009502139.tif 000020
【０３４１】
材料および方法:Invitrogen社(カールスバード、カリフォルニア)により提供されたキットを使用して、rhuMAb 411をAlex-488とコンジュゲートさせた。懸濁細胞はそのままで使用し、一方、接着細胞株は酵素なしの試薬で分離させた。細胞はすべて90〜100%コンフルエントであった。細胞は、10%ウシ血清アルブミン(BSA)を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で、遠心分離(1200rpm、5分間)により洗浄した。細胞(100,000個)を、40μlのPBS/BSA、4nM rhuMAb 411-Alexa-488中に重複系で再懸濁させた。陰性対照については、rhuMAb 411-Alexa-488をヒトIgG1と置換した。細胞は、1〜2時間、室温で、穏やかに撹拌しながらインキュベートした。細胞を約500,000個/mlに希釈するために200μlのPBS/BSAを添加した。次いで、96ウェルプレート中の細胞をGuava EasyCyte(商標)フローサイトメーター(Guava Technologies社、ヘイワード、カリフォルニア)により分析した。データ解析は、Guava Express(商標) Plusソフトウェアを用いて実行した。
【０３４２】
結果:Alexa-488コンジュゲート化rhuMAb 411のフロー解析の結果を図37に示す。CD26細胞表面発現の著しいレベルおよび割合がいくつかの癌細胞型、特に腎臓、前立腺、肺、およびKarpas299の癌細胞株において明らかであった。
【０３４３】
実施例１３
rhuMAb 411の生産および精製のためのさらなる例示的な方法
Lonza Biologics社により作り出されたグルタミン合成酵素(GS)発現系を用いた哺乳動物細胞(チャイニーズハムスター卵巣)懸濁培養における発酵による組換え抗体rhuMAb 411の生産およびそれに続く精製の非限定的な実施例を以下に提供する。抗体は、144672ダルトンの分子量を有するIgG1κである。
【０３４４】
配列:rhuMAb 411の重鎖のポリペプチド配列は以下のとおりである:
EVQLVESGAGVKQPGGTLRLTCTASGFSLTTYGVHWVRQAPGKGLEWVGVIWGDGRTDYDAAFMSRVTISKDTSKSTVYLQMNSLRAEDTAVYYCMRNRHDWFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (配列番号219)。
【０３４５】
rhuMAb 411の軽鎖のポリペプチド配列は以下のとおりである:
DILLTQSPSSLSATPGERATITCRASQGIRNNLNWYQQKPGQAPRLLIYYSSNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISRLQPEDVAAYYCQQSIKLPFTFGSGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (配列番号220)。
【０３４６】
ベクターの構築:重鎖単一遺伝子ベクター(SGV)を生産するために、rhuMAb 411の重鎖可変領域を、IgG1za定常領域をコードするcDNA配列と組み合わせた。軽鎖単一遺伝子ベクターを形成するために、軽鎖可変領域をLonza社専売ベクターpConKappa中にクローニングした。rhuMAb 411の完全な重鎖および軽鎖の両方を発現する単一のベクターを作製するために、重鎖ベクター由来の完全な発現カセットを軽鎖ベクター中にライゲーションすることにより二重遺伝子ベクターを構築した。二重遺伝子ベクター(DGV)を大量に調製し、CHO細胞中への形質移入のために制限酵素Pvu Iで線状化した。ベクター内の重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子のクローニングされた断片は、構築物を確認するために配列決定し、予測される配列と合致することが分かった。二重遺伝子ベクターは、CHO細胞を使用した一過性トランスフェクション系における抗体発現について試験され、正確に折り畳まれて分泌された抗体を発現することが示された。二重遺伝子ベクタークローンをさらなる使用のために同定し、pY392/DGV/YsCH1-3と新たに命名した(図38)。
【０３４７】
IgG1/κ抗体rhuMAb 411を発現するGS-CHO細胞株の構築および選択:
Lonza Biologics社(スラウ、UK)のCHOK1SV細胞株であるGS-CHOを抗体rhuMAb 411を生産するために使用した。IgG1抗体rhuMAb 411をコードする重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を含む二重遺伝子ベクターで形質移入したGS-CHO細胞株を構築した。
【０３４８】
CHOK1SV細胞は、二重遺伝子ベクターを用いて電気穿孔法を使用して形質移入され、複数の96ウェルプレートで平板培養した。これらの形質移入のうちの4つは、該タンパク質を含む培地CM25/10%透析ウシ胎児血清(dFCS)(Lonza Biologics社)中で実行した。残りの2つの形質移入は、タンパク質不含の形質移入プロトコールを使用し、化学的に規定された動物成分不含(CDACF)培地CD-CHO中で実行した。形質移入の次の日に、選択薬剤L-メチオニンスルホキシミン(MSX)を、50μMの最終濃度とするように、96ウェルプレートの各ウェルに添加した。
【０３４９】
結果として生じた形質移入体からの上清を、半定量的なELISA法を使用して、組み立てられた抗体についてスクリーニングした。スクリーニングした形質移入体はすべて、検出可能なレベルの抗体を生産した。これらのデータから、形質移入体(タンパク質を含む形質移入およびタンパク質不含の形質移入に由来する)のいくつかを、それらの相対的な抗体濃度の順位および成長の視覚的評価に基づきさらなる評価のために選択した。第2のスクリーニングを生産性データに基づき実行した。28個の、タンパク質を含む形質移入体を、タンパク質不含の培地中で成長するよううまく適応させた。4つの選択されたタンパク質不含の形質移入体はいかなる適応をも必要としなかった。
【０３５０】
供給バッチ振盪フラスコ培養からの成長および生産性のデータを検討した後、以下の選択基準を使用して細胞株を選択した:高い回収抗体濃度、高度な特異的生産速度、および許容し得る成長特徴。精製された抗体の生産品質をSDS-PAGEおよびIEFにより分析した。
【０３５１】
選択した細胞株(「rhuMAb411M」と本明細書中において呼ばれる)におけるrhuMAb 411抗体をコードする遺伝子配列の完全性を、細胞株を構築するのに用いたDNAベクターの遺伝子配列と比較することにより確認した。全RNAを細胞株rhuMAb411Mから単離し、cDNAを合成するための鋳型として使用した。軽鎖(LC)および重鎖(HC)をコードする配列を、鎖コード配列の5'-非翻訳領域(UTR)および3'-UTRにアニールするプライマーを使用するPCR法により特異的に増幅させた。結果として生じたDNA産物は、LCおよびHCのPCR産物の両方のcDNAセグメント全体が順方向および逆方向の両方で配列決定されることを可能にするように選択されたプライマーのセットを使用して配列決定した。細胞株rhuMAb411M中に存在するrhuMAb 411抗体のLCをコードする転写物は、rhuMAb411M細胞株を作製するために使用されたrhuMAb 411コードベクター(pY392/DGV/YsCH1-3)内の配列と同一である。HCについては、検出された主要なRNA種は、rhuMAb 411コードベクター(pY392/DGV/YsCH1-3)中に存在する同一のHC配列をコードした。
【０３５２】
rhuMAb 411の生産方法:
rhuMAb 411は、GS-CHO細胞中のマスター細胞バンクから生産される。十分に規定された培地を使用した生細胞濃度でバイオリアクターに接種し、その発酵を、安定した制御条件下で維持する。回収物を、連続スタックディスク遠心分離機中に供給し、次いで、濾液をバイオプロセス容器(BPC)中に収集し、精製まで4℃で保存する。
【０３５３】
発酵および単離のプロセスは次のものを記載順に含む:アンプルの解凍、振盪フラスコの接種、Wave Bioreactor(登録商標)に接種、エアリフト発酵槽の接種、発酵、発酵回収、ディスクスタック遠心分離(Westfalia SA1)、遠心分離後濾過(2段階のレンズ状濾過)、0.22マイクロメートルの濾過、および精製。
【０３５４】
rhuMAb 411の精製:
抗体精製プロセスは次のものを記載順に含む:プロテインA親和性クロマトグラフィー、ウイルスの不活性化(低pH(pH3.7+/-0.1)で保持)、疎水性相互作用クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、ウイルス低減濾過(Pall DV20)、濃縮およびダイアフィルトレーション、濾過(0.2ミクロン)、ならびに保管(-20℃)用容器への充填。
【０３５５】
実施例１４
rhuMAb 411のさらなる例示的な製剤
rhuMAbの例示的な製剤を以下の表14に提供する。薬剤製品は、患者に容易に投与することができる液体非経口剤形(10mg/mL±1.0mg/mL)で提供することができる。
【表１４】
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【０３５６】
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【図面の簡単な説明】
【０３５７】
【図１】CM03のVH(配列番号90)およびCM03のVL(配列番号91)の配列を示す図である。
【図２】ヒト化VL変異体X376(配列番号1)、X377(配列番号2)、X378(配列番号3)、X379(配列番号4)、X380(配列番号5)、X381(配列番号6)、およびX394(配列番号7)についてのDNA配列を示す図である。
【図３】CM03 VL(配列番号91)およびヒト化VL変異体X376(配列番号15)、X377(配列番号16)、X378(配列番号17)、X379(配列番号18)、X380(配列番号19)、X381(配列番号20)、およびX394(配列番号21)のアミノ酸配列を示す図である。Kabatの番号付け方式および連続した番号付け方式は軽鎖可変領域について同一である。
【図４】ヒト化VH変異体X384(配列番号8)、X385(配列番号9)、X386(配列番号10)、X387(配列番号11)、およびX388(配列番号12)、X399(配列番号13)およびX420(配列番号14)についてのDNA配列を示す図である。
【図５】CM03 VH(配列番号90)およびヒト化VH変異体X384(配列番号22)、X385(配列番号23)、X386(配列番号24)、X387(配列番号25)、およびX388(配列番号26)、X399(配列番号27)およびX420(配列番号28)のアミノ酸配列を示す図である。連続した番号付け方式およびKabatの番号付け方式の両方を示す。Kabatの番号付け方式は82a、82b、および82cを含む。
【図６】選択された変異体VHおよび変異体VL:X389、X390、X391、X392、X393、X394、X395、X396、X399、X420、およびX429を含むFabのVHおよびVLのアミノ酸配列を示す図である。Fab X389は、X384 VH(配列番号22)およびX376 VL(配列番号15)を含み、Fab X390は、X385 VH(配列番号23)およびX376 VL(配列番号15)を含み、Fab X391は、X388 VH(配列番号26)およびX376 VL(配列番号15)を含み、Fab X392は、X384 VH(配列番号22)およびX379 VL(配列番号18)を含み、Fab X393は、X385 VH(配列番号23)およびX379 VL(配列番号18)を含み、Fab X394は、X384 VH(配列番号22)およびX394 VL(配列番号21)を含み、Fab X395は、X384 VH(配列番号22)およびX380 VL(配列番号19)を含み、Fab X396は、X385 VH(配列番号23)およびX380 VL(配列番号19)を含み、Fab X399は、X399 VH(配列番号27)およびX380 VL(配列番号19)を含み、Fab X420は、X420 VH(配列番号28)およびX380 VL(配列番号19)を含み、かつFab X429は、X399 VH(配列番号27)およびX394 VL(配列番号21)を含む。
【図７】大腸菌株TG1において発現された、CM03 VHと対になったCM03 VL変異体X376、X377、X378、X379、X380、またはX381を含むFabおよびCM03 VLと対になったCM03 VH変異体X384、X385、X386を含むFabを含むタンパク質試料をロードしたゲルを示す図である。
【図８】大腸菌において発現された、CM03 VHと対になったCM03 VL変異体X376、X377、X378、X379、X380、またはX381を含むFabならびにFab X369(CM03 VHおよびCM03 VLを含む)を含むタンパク質の蓄積の定量的な図を示す図である。
【図９】大腸菌株TG1において発現されたCM03 VLと対になったCM03 VH変異体X387またはX388を含むFabならびに大腸菌株HB2151において発現されたFab X389、X390、X391、X392、X393、X395、およびX396(VH変異体およびVL変異体の対を含む)を含むタンパク質試料をロードしたゲルを示す図である。
【図１０】CM03 X369のFabならびに大腸菌株HB2151において発現させたCM03 VH変異体およびVL変異体の対を含む以下のFab:X389、X390、X391、X392、X393、X395、およびX396の蓄積の定量的な図を示す図である。
【図１１】大腸菌におけるCM03 VLと対になったCM03 VH変異体X384、X385、X386、X387、またはX388を含むFabの蓄積の定量的な図を示す図である。
【図１２】図12Aは、ヒトCD26に結合したCM03 Fab X369およびさらなるX369の導入後の応答を示す図である。図12Bは、ヒトCD26に結合したCM03 Fab X369ならびにX377 VLおよびCM03 VHを含むFabの導入後の応答を示す図である。図12Cは、ヒトCD26に対するX377 Fabの結合およびあらかじめCM03 Fab X369と結合していたヒトCD26に対するX377 Fabの結合を示す図である。
【図１３】CM03 X369ならびにCM03 VH変異体およびVL変異体を含む以下のFab:X389、X390、X391、X392、X393、X395、およびX396の親和性分析を示す図である。
【図１４】ヒトCD26に対する結合について未精製腹水マウスMAb CM03(14D10)と競合するCM03 X369 Fabならびにヒト化CM03 Fab X389、X390、X391、X392、X393、X395、およびX396を示す図である。
【図１５】CM03 Fab X369およびVH/VL変異体対を含むFab(X389、X390、X391、X392、X393、X395、およびX396)ならびに変異体X376およびCM03 VHを含むFabによるJKT/CD26+細胞増殖の阻害パーセントを示す図である。
【図１６】IgG1鎖間相互作用を含むIgG1抗体の図を示す図である。示したヒンジ配列は配列番号86である。
【図１７】図17Aは、リーダー配列に連結した例示的な重鎖を示す図である。重鎖定常領域アミノ酸配列(ヒトIgG1)を示す(配列番号87)。図17Bは、リーダー配列に連結した例示的な軽鎖を示す図である。軽鎖定常領域アミノ酸配列(ヒトκ)を示す(配列番号88)。
【図１８】HEK細胞において発現した組換えヒト化モノクローナル抗体(rhuMAb)409、410、411、および412ならびにCHO細胞において発現したrhuMAb 411を示す図である。
【図１９】ヒトCD26に特異的に結合するrhuMAb 409、410、411、および412を示す図である。
【図２０】rhuMAb変異体によるCD26結合を示すELISAデータを示す図である。
【図２１】48時間でのJKT/CD26+細胞に対する2.5μg/mlのrhuMAb 409および410の効果を示す図である。
【図２２】48時間でのJKT/CD26+細胞に対する0.05、0.1、0.5、2.5、および5μg/mlのrhuMAb 411の効果を示す図である。
【図２３Ａ】図23Aは、HEK293細胞において生産されたrhuMAb 409、410、411、412、420、および429のMTTデータ(阻害%)を示す図である。
【図２３Ｂ】図23Bは、HEK293細胞において生産されたrhuMAb 409、410、411、412、420、および429のMTTデータ(阻害%)を示す図である。
【図２４】rhuMAb 409、411、412、および420のヒト化抗体と反応性の13アミノ酸長のペプチドを示す図である。
【図２５】ヒトCD26-1J2Eの結晶構造のリボン図を示す図である。rhuMAb 409でのエピトープマッピング実験において最も反応性のペプチドはより明るい色で示す。
【図２６】ヒトCD26-1J2Eの結晶構造のリボン図を示す図である。rhuMAb 411でのエピトープマッピング実験において最も反応性のペプチドはより明るい色で示す。
【図２７】ヒトCD26-1J2Eの結晶構造のリボン図を示す図である。rhuMAb412でのエピトープマッピング実験において最も反応性のペプチドはより明るい色で示す。
【図２８】ヒトCD26-1J2Eの結晶構造のリボン図を示す図である。rhuMAb420でのエピトープマッピング実験において最も反応性のペプチドはより明るい色で示す。
【図２９】rhuMAb 411治療が、マウス異種移植モデルにおけるKarpas299(T細胞リンパ腫)腫瘍退縮を誘導することを示す図である。データは、10匹の平均±SEM値を表す。
【図３０】rhuMAb 411治療が、マウス異種移植モデルにおける786-O(腎癌腫)腫瘍成長を有意に遅延させることを示す図である。データは、10匹の平均±SEM値を表す。
【図３１】rhuMAb 411治療が、Caki-2(腎癌腫)異種移植片の腫瘍成長を用量依存的に低減させることを示す図である。データは、10匹の平均±SEM値を表す。
【図３２】rhuMAb 411治療が、併用療法の使用による追加的な効力により、Caki-2(腎癌腫)異種移植片の腫瘍成長を低減させることを示す図である。データは、10匹の平均±SEM値を表す。
【図３３】rhuMAb 411治療が、SCIDマウスにおけるPC-3(前立腺癌腫)異種移植片の腫瘍成長を低減させることを示す図である。データは、10匹の平均±SEM値を表す。
【図３４】rhuMAb 411が、併用療法の使用による追加的な効力により、PC-3の腫瘍成長を低減させることを示す図である。
【図３５】rhuMAb 411治療が、マウス異種移植モデルにおけるDU-145(前立腺癌腫)の腫瘍成長を遅延させることを示す図である。データは、10匹の平均±SEM値を表す。
【図３６】rhuMAb 411治療が、NCRヌードマウスにおけるH226(肺癌腫)に誘導された肺転移を有意に弱めることを示す図である。各群における線は平均値を表す。
【図３７】様々な癌細胞系におけるCD26細胞表面発現のレベルおよび割合を示す図である。
【図３８】二重遺伝子ベクタークローンpY392/DGV/YsCH1-3を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【国際調査報告】
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