(57)【要約】  本発明は、乳清タンパク質または乳清タンパク質の加水分解物を含む調製物であって、インビトロにおいてリポ多糖刺激マクロファージでのTNFα発現を阻害できる調製物に関する。筋損傷によって生じる筋肉機能の低下を軽減するため、および/または筋損傷からの回復を高めるため、および/または筋肉が力を発生する能力を高めるための調製物の使用ならびにこの調製物の生成方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳清タンパク質または乳清タンパク質の加水分解物を含む調製物であって、グルタミン、分枝鎖アミノ酸、ビタミンEまたはビタミンCの1つを含有せず、インビトロにおいてリポ多糖刺激マクロファージにおけるTNFα発現を阻害できる調製物。
【請求項２】
乳清タンパク質の加水分解物である、請求項1に記載の調製物。
【請求項３】
前記加水分解物が酵素加水分解物である、請求項2に記載の調製物。
【請求項４】
前記酵素が細菌由来である、請求項3に記載の調製物。
【請求項５】
前記酵素が真菌由来である、請求項3に記載の調製物。
【請求項６】
前記酵素がメタロプロテイナーゼである、請求項3から5のいずれか一項に記載の調製物。
【請求項７】
前記酵素が、IUBMB酵素命名法による酵素番号EC3.4.24.28であるか、またはIUBMB酵素命名法による酵素番号EC.3.4.21.62の酵素である、請求項3から5のいずれか一項に記載の調製物。
【請求項８】
前記酵素が、ニュートラーゼ(登録商標)、アルカラーゼ(登録商標)、サブチリシンA(VIII型)、コロラーゼN、オプチマーゼまたはプロテアーゼN「Amano」である、請求項7に記載の調製物。
【請求項９】
IUBMB酵素命名法による酵素番号EC.3.4.24.28の酵素、またはIUBMB酵素命名法による酵素番号EC.3.4.21.62の酵素で酵素処理することによって生成した乳清タンパク質の加水分解物を含む調製物であって、前記酵素はアルカラーゼまたはニュートラーゼではなく、インビトロにおいてリポ多糖刺激マクロファージにおけるTNFα発現を阻害できる調製物。
【請求項１０】
前記酵素が、サブチリシンA(VIII型)、コロラーゼN、オプチマーゼまたはプロテアーゼN「Amano」である、請求項9に記載の調製物。
【請求項１１】
前記乳清タンパク質が乳清タンパク質単離物または乳清タンパク質濃縮物である、請求項1から10のいずれか一項に記載の調製物。
【請求項１２】
請求項1から11のいずれか一項に記載の調製物を含む栄養補助調製物。
【請求項１３】
筋損傷によって生じる筋肉機能の低下を軽減するため、および/または筋損傷からの回復を高めるため、および/または筋肉が力を発生する能力を高めるために使用するときの、請求項12に記載の栄養補助調製物。
【請求項１４】
筋損傷によって生じる筋肉機能の低下を軽減するため、および/または筋損傷からの回復を高めるため、および/または筋肉が力を発生する能力を高めるための、請求項1から13のいずれかに記載の調製物の使用。
【請求項１５】
前記筋損傷が、運動誘発筋損傷である、請求項14に記載の使用。
【請求項１６】
筋損傷によって生じる筋肉機能の低下を軽減するため、および/または筋損傷からの回復を高めるため、および/または筋肉が力を発生する能力を高めるための方法であって、被験者に請求項1から12のいずれか一項に記載の調製物を投与する工程を含む方法。
【請求項１７】
前記筋損傷が、運動誘発筋損傷である、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
乳清タンパク質または加水分解物を少なくとも50mg/kg体重から1500mg/kg体重で提供するために前記調製物を投与する、請求項14に記載の使用または請求項16に記載の方法。
【請求項１９】
前記調製物を運動直後に投与する、請求項14に記載の使用または請求項16に記載の方法。
【請求項２０】
前記調製物を運動から20分から2時間後に投与する、請求項14に記載の使用または請求項16に記載の方法。
【請求項２１】
前記調製物が経口投与用である、請求項14に記載の使用または請求項16に記載の方法。
【請求項２２】
請求項14に記載の使用のため、または請求項16の方法で使用するための、請求項1から13のいずれか一項に記載の調製物を含む食品、飲料、錠剤またはカプセル。
【請求項２３】
筋損傷によって生じる筋肉機能の低下を軽減するため、および/または筋損傷からの回復を高めるため、および/または筋肉が力を発生する能力を高めるための調製物の調製方法であって、乳清タンパク質加水分解物を含む調製物を生成するために乳清タンパク質を加水分解する工程を含む方法。
【請求項２４】
前記乳清タンパク質加水分解物が乳清タンパク質の酵素加水分解によって生成される、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
前記調製物が、請求項2から9のいずれか一項に記載の調製物と一致する、請求項23に記載の方法。
【請求項２６】
前記加水分解物の正味加水分解度が0.5%と10%との間である、請求項23に記載の方法または請求項2に記載の調製物。
【請求項２７】
前記加水分解物の正味加水分解度が0.5%と4%との間である、請求項23に記載の方法または請求項2に記載の調製物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に運動後の筋肉回復を高めるための調製物に関する。より具体的には、乳清タンパク質および加水分解物を含有するこのような調製物に関する。
【背景技術】
【０００２】
強い運動、特に伸張運動の間に骨格筋が受ける強い機械的力は、機械的損害をもたらし、次いで急性炎症応答、疼痛の発症および力を発生する能力の欠損を引き起こす。
【０００３】
筋損傷および/または炎症を抑制するか、または組織修復を促進することができる処置は、運動後の筋力発生の回復を早める可能性を有する。病後の筋肉回復を補助することもできる。
【特許文献１】米国特許出願第11/083662号(米国特許出願公開第2005/0164340号)
【特許文献２】PCT/AU2006/001323
【非特許文献１】Lee K S、Drescher D G.、「Fluorometric amino-acid analysis with ophthaldialdehyde (OPA)」、Int. J. Biochem.、1978年、9(7)、457〜467頁
【非特許文献２】Huskinsson, E.、「Visual analogue scales, in Pain measurement and assessment」R. Melzack編、1983年、Raven Press: New York. 33〜37頁
【非特許文献３】Megeney他(1996)、Genes Dev. 10: 1173〜1183頁
【非特許文献４】Ohkawa他、The EMBO Journal (2006)25、490〜501頁
【非特許文献５】Roth他、Experimental Biology and Medicine 228:706〜709頁(2003)
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
第1の態様では、乳清タンパク質または乳清タンパク質の加水分解物を含む調製物であって、インビトロにおいて、リポ多糖刺激マクロファージにおけるTNFα発現を阻害できる調製物を提供する。
【０００５】
別の態様では、乳清タンパク質の加水分解物を含む調製物であって、インビトロにおいて、リポ多糖刺激マクロファージにおけるTNFα発現を阻害できる調製物を提供する。
【０００６】
一実施形態では、この調製物は栄養補助調製物である。
【０００７】
これらの前述の態様の特定の実施形態では、加水分解物は酵素加水分解物である。特定の実施形態では、この酵素は、細菌または真菌由来で、好ましくはメタロプロテイナーゼである。いくつかの実施形態では、この酵素は、ニュートラーゼ(登録商標)、プロテアーゼN「Amano」およびコロラーゼNを含むIUBMB酵素命名法による酵素番号EC3.4.24.28の酵素ならびにアルカラーゼ(登録商標)、サブチリシンA(VIII型)およびオプチマーゼを含むIUBMB酵素命名法による酵素番号EC.3.4.21.62の酵素からなる群から選択される。
【０００８】
さらに別の態様は、筋損傷によって生じる筋肉機能の低下を軽減するため、および/または筋損傷からの回復を高めるため、および/または筋肉が力を発生する能力を高めるための、乳清タンパク質の加水分解物を含む調製物の使用を提供する。
【０００９】
前記の態様のいずれかのある実施形態では、調製物は本質的に乳清タンパク質の加水分解物からなる。
【００１０】
別の態様は、筋損傷によって生じる筋肉機能の低下を軽減するため、および/または筋損傷からの回復を高めるための栄養補助薬剤の調製における乳清タンパク質の加水分解物の使用、ならびに筋肉が力を発生する能力を高めるための栄養補助薬剤の調製における乳清タンパク質の加水分解物の使用を提供する。
【００１１】
筋損傷によって生じる筋肉機能の低下を軽減するため、および/または筋損傷からの回復を高めるため、および/または筋肉が力を発生する能力を高めるための調製物の調製方法であって、乳清タンパク質加水分解物を含む調製物を生成するために乳清タンパク質を加水分解する工程を含む方法も提供する。
【００１２】
以下の実施例において、以下の添付図面を参照にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明者らは、様々なミルク画分によってもたらされる生物学的活性を調べた。
【００１４】
本発明者らは、乳清タンパク質単離物(WPI)、すなわち、チーズホエイおよび酸/カゼインホエイを含む乳清タンパク質を含有し、様々な原料から入手できるミルク画分が、TNFα発現阻害のインビトロアッセイによって確認されるように、抗炎症活性を有することを確認した。WPIの特定の加水分解物が、予期せぬことに、この抗炎症活性を増加させることも確認した。WPIのある種の加水分解物は、WPIと比較して、線維芽細胞の増殖を刺激する能力も増大していた。
【００１５】
本発明者らはさらに、WPIおよびWPIのある種の酵素による加水分解物を投与すると、筋損傷の症状を軽減し、筋肉を損傷する運動の後、被験者における筋肉機能の回復を促進することができることを確認した。これによって、運動選手は、運動後、より迅速に競技または訓練に復帰することが可能である。加水分解物の活性は、WPIの対応する非加水分解型が有する活性よりも大きい。ある種のWPI加水分解物はまた、筋肉を損傷する運動を行った被験者の筋力を発揮する能力を高めることができる。
【００１６】
一実施形態では、WPIは、
水分                            5.0%
脂肪                            0.5%
pH(5%溶液)                     6.3%
灰分                            3.7%
乳糖                            0.5%
タンパク質(TN×6.38)            90.0%
リン                            0.3%
カルシウム                      0.15%
を含む。
【００１７】
特定の実施形態では、WPIまたはWPIの加水分解物を含む調製物はまた、グルタミンを含有しない。別の実施形態では、この調製物はまた、イソロイシン、ロイシンおよびバリンなどのいかなる他の分枝鎖アミノ酸(BCAA)も含有しない。別の実施形態では、この調製物はまた、カルニチン、アルギニン、チロシンまたはヒスチジンなどの遊離の、もしくは高濃度のアミノ酸を含有しない。別の実施形態では、この調製物はまた、他の非乳清由来の脂質を含有しない。別の実施形態では、この調製物はまた、ダイズタンパク質、コメタンパク質、エンドウタンパク質、イナゴマメタンパク質、オート麦タンパク質、それらの加水分解物および/またはそれらの混合物などのミルク由来ではない他のタンパク質源を含有しない。別の実施形態では、この調製物はまた、1種または複数の他のタンパク質源を含有しない。
【００１８】
ミルクは、数多くのポリペプチド、脂質および脂肪ならびに炭水化物を含む、分子の複合した混合物である。ポリペプチド成分は、カゼインが大部分を占めているが、α-ラクトアルブミン、β-ラクトグロブリン、イムノグロブリンおよびカゼイノグリコマクロペプチドなどの異なる機能を有するその他多くのタンパク質を含有する。
【００１９】
明細書を通じて、「ミルク画分」という用語は、最終的にミルク由来であり、全乳中に見出される少なくとも1種または複数の成分に富んだ調製物を意味する。本明細書に関して、「ミルク画分」は、ミルクに見出される非カゼインタンパク質を含有するものである。乳清または「乳漿」は、「凝固(curdling)」工程によって全乳または脱脂乳からカゼインおよびミルク脂肪成分のほとんどを除去した後残存する一般的なミルク画分である。
【００２０】
「ミルク画分」には、ミルクの特定の成分または成分の組み合わせが豊富な画分が含まれる。このミルク画分、例えば、「乳清タンパク質単離物」(WPI)は、全乳と比較したとき、ミルクの非カゼインタンパク質成分が豊富な画分である。
【００２１】
「乳清タンパク質」は、乳清中に見出され、加水分解されたとき、本明細書で記載した所望する生物学的活性を有する1種または複数のタンパク質を含む。乳清タンパク質の様々な原料が考慮される。特に、スイートホエイまたは酸ホエイから生じる乳清タンパク質はいずれも類似の活性を有することが示された。例えば、様々な形態のチーズを製造する間に生じる副産物として、またはカゼイン製造方法の副産物として、乳清を生成するためには数多くの方法があり、これらのそれぞれはいくらか異なる調製物を有する乳清を生じる。
【００２２】
乳清中に見出される主要なタンパク質は、α-ラクトアルブミンおよびβ-ラクトグロブリンおよびカゼイノグリコマクロペプチド(CGMP)で、後者はチーズ乳清WPIに存在するタンパク質の約25%を構成する。これらのタンパク質の1種または複数を含有するミルク画分は、本明細書で記載した加水分解法の開始物質として使用するために企図されているが、これらのタンパク質を含有しない画分は、開始物質の可能性のある原料として明白には除外されない。
【００２３】
本明細書で提供した例示的方法は、加水分解の開始物質としてWPIを利用しているが、その他のミルク画分または乳清もしくはWPIに見出されるミルクの成分も含有する全乳を、最終産物が備える所望する生物学的特性を著しく変更することなくWPIの代わりに置換できることを理解されたい。例えば、全乳またはミルクタンパク質濃縮物は、より希釈された形態ではあるが、タンパク質を含む、乳清中に見出される同一成分を含有する。乳清中に見出される成分はまた、より希釈された形態である可能性はあるが、非乳清ミルク画分にも見出すことができる。
【００２４】
例えば、生物学的に活性のある成分の特異的活性を高めるために、ミルクまたはミルクタンパク質濃縮物の特定の成分を除去または減少させることが望ましいことを示すことができる。ミルク製品の水分、脂肪、乳糖および「灰分」(ミルクの無機質成分を含む)の含量を減少させる技術は当業界では周知であり、これらの技術は、所望する生物学的活性成分の特異的活性を高めると予想される。
【００２５】
いくつかの実施形態では、ミルクタンパク質画分中に存在するカゼインの含量を減少させることが望ましいことも示すことができる。カゼインは、もし存在すると、乳清から得られる生物学的活性が希釈される可能性があり、加水分解中に酵素の不活性化工程があるならば、凝固が形成される可能性がある。ミルク製品からカゼインを除去するための技術、例えば、酸との等電沈殿を使用した、またはレンネットなどの酵素を使用した凝固は、当業界では周知である。
【００２６】
同様に、乳清タンパク質は、WPIの沈殿に限定しない様々な方法、例えば、市販の乳清タンパク質濃縮物(WPC)を調製するために使用される方法によって濃縮することができる。WPCは、WPIに見出される成分の多くを様々な割合ではあるが含有しており、したがって、WPCもWPIで示された活性を有することが予想される。WPIを製造する工程の中間産物を含むWPIの任意の前駆体は、加水分解の開始物質となり得るが、比活性はWPIより低く、得られた加水分解物はその後精製工程が必要であり得る。
【００２７】
特定の実施形態では、加水分解の開始物質として使用されるミルク画分は、ミルク中に存在するカゼイノグリコマクロペプチド成分、プロテオースペプトン、α-ラクトアルブミン、β-ラクトグロブリン、血清アルブミンおよびミルク中に存在するイムノグロブリン画分の1種または複数を含む。少量で存在し、いまだに明確に同定または定量されていないその他の多くのタンパク質も存在する。
【００２８】
乳清中に見出されるタンパク質の一部を含有するその他のミルク画分はまた、本明細書で説明した所望する生物学的活性を有することができる。当業者は、実施例で説明したインビトロおよびインビボの方法を使用することによって、任意の特定のミルク画分が加水分解に対して所望する活性を有するかどうかを容易に測定することができよう。
【００２９】
加水分解WPIにおいて示される生物学的活性は、WPI製造に必要な条件、例えば、陰イオン交換、ダイアフィルトレーションおよび噴霧乾燥を耐えることができる。
【００３０】
さらに、加水分解WPI中で示される生物学的活性は、加水分解工程に必要な特異的酵素消化および酵素不活性化に関与する条件を耐えることができる。したがって、これらの工程のいずれかまたは全てはまた、ミルク画分の調製に使用することができ、所望する生物学的活性は保持されるものと予測される。WPI中に存在する物質が、ミルクおよびWPI製造中の乳清のように殺菌されるとき、WPI中に存在する生物学的活性はまた、殺菌の工程を耐えることができる。
【００３１】
本発明の実施例は牛乳の乳清タンパク質を利用するが、家畜の有するミルクは比較的類似した組成であるので、ヒツジ、ヤギ、ウマおよびバッファローを含むその他の動物のミルクも開始物質の適切な原料となることが予測される。例えば、新生児に投与するための調製乳の調製においては、ヒト由来の乳清タンパク質を使用することも有利であり得る。
【００３２】
本明細書で使用したように、「加水分解」という用語は、タンパク質またはポリペプチドをより短いポリペプチド、オリゴペプチド、あるいは大きさの小さい成分アミノ酸に分解することを意味する。
【００３３】
加水分解は、化学的手段、例えば、酸を使用して、または酵素処理によって実施することができる。化学的処理による加水分解、例えば、酸加水分解は、所望する生物学的活性が保持されるならば、加水分解物を製造する方法となり得る。
【００３４】
加水分解の条件は、加水分解前の開始物質と比較したとき、得られた加水分解物が(以下の実施例で説明したようなインビトロの方法を使用して)TNFαの発現を阻害し、かつ/または(以下の実施例で説明したインビボの方法を使用して)筋力の発生能力を増加させる強い活性を有するように制御することができる。
【００３５】
開始物質と比較したとき、加水分解物の比活性に影響を及ぼす可能性がある条件には、インキュベーション温度および酵素不活性化温度、反応および不活性化のpH、加水分解時間の長さおよび使用した酵素の種類が含まれる。
【００３６】
特定の実施形態では、加水分解物は酵素加水分解物である。好ましい酵素は、微生物由来、特に細菌由来もしくは真菌由来のプロテイナーゼである。酵素は、基質特異性および必須金属イオンの利用性を制御することによって酵素を不活性化する能力の両方に関して、メタロプロテイナーゼであることが有利であり得る。
【００３７】
中性pH近辺、特にpH3.5からpH8.5でプロテイナーゼ活性を有するプロテイナーゼを使用することが有利であり得る。
【００３８】
本明細書で例示したようなWPIの加水分解は、市販の調製物「ニュートラーゼ(登録商標)」(Novozymes)に見出されるプロテイナーゼ酵素活性を使用して実施した。この製品は、バチルス  アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)の選択された菌種を液内発酵することによって産生された中性プロテイナーゼ成分を含有する。このプロテイナーゼは、ほとんどのタンパク質をより小さいペプチドに中等度から高度に分解することができるメタロ(Zn)エンドプロテイナーゼである。
【００３９】
WPIまたはその他のミルク画分の加水分解が可能なその他のプロテイナーゼはまた、本発明者らによって確認された高い生物学的活性を生じることが予測される。
【００４０】
IUBMB酵素命名法による酵素番号EC3.4.24.28のメタロプロテイナーゼ(バチロリシン、バチルス  メタロエンドペプチダーゼ、バチルス  ズブチリス(Bacillus subtilis)の中性プロテイナーゼ、アニロザイムP10、バチルス  メタロプロテイナーゼ、バチルス中性プロテイナーゼ、メガテリオペプチダーゼとしても知られている)は、ニュートラーゼ(登録商標)と類似のタンパク質分解活性を有することがわかっており、任意の1種または複数は加水分解で使用するために企図される。例えば、この種類の酵素の一構成要素でもある細菌由来の中性メタロプロテイナーゼ「プロテアーゼN「Amano」」(Amano Enzyme, Inc.)および「コロラーゼN」(AB Enzymes)は、本発明者らによって、インビトロにおいてニュートラーゼ(登録商標)を使用した場合と類似の高い抗炎症効果を生じることが示されており、したがって、これらの酵素を使用して生じた加水分解物はまた、ニュートラーゼ(登録商標)によって生じる加水分解物が示すインビボでの高い生物学的活性を有することが予測される。
【００４１】
同様に、IUBMB命名法による酵素番号EC3.4.21.62の酵素(サブチリシン、アルカラーゼ(登録商標)、アルカラーゼ0.6L、アルカラーゼ2.5L、コロラーゼN、ALK-酵素、バシロペプチダーゼA、バシロペプチダーゼB、バチルス  ズブチリスアルカリプロテイナーゼビオプラーゼ、ビオプラーゼAL15、ビオプラーゼAPL30、コリスチナーゼ、サブチリシンJ、サブチリシンS41、サブチリシンセンダイ、サブチリシンGX、サブチリシンE、サブチリシンBL、サブチリシンA(VIII型)、ジェネナーゼI、エスペラーゼ、マキサターゼ、サーモアーゼPC10、プロテアーゼXXVII、サーモアーゼ、スーパーアーゼ、サブチリシンDY、スブチロペプチダーゼ、SP266、サビナーゼ8.0L、サビナーゼ4.0T、カズサーゼ、プロテアーゼVIII、オプチマーゼ、オプチクリーン、バチルス  ズブチリスアルカリプロテイナーゼ、プロチンA  3L、サビナーゼ、サビナーゼ16.0L、サビナーゼ32.OL  EX、オリエンターゼ10B、プロテアーゼSおよび類似のセリンエンドペプチダーゼとしても知られている)は、加水分解に潜在的に適している酵素候補である。この種類のアルカラーゼの使用は、本発明者らによって、ニュートラーゼ(登録商標)を使用した場合と類似のインビトロにおける抗炎症効果を生じることが示されており、したがって、これらの種類の1種または複数の酵素を使用して生じた加水分解物はまた、ニュートラーゼ(登録商標)によって生じる加水分解物が示すインビボでの生物学的活性を有することが予測される。
【００４２】
IUBMB酵素命名法による酵素番号EC3.4.24.28またはEC3.4.21.62の特定の酵素が所望する高い生物学的活性を生じることができるかどうかは、本明細書の実施例3で説明したインビトロの方法および/または実施例4で説明したインビボの方法を使用して容易に決定することができる。
【００４３】
WPIをトリプシン、トリプシンおよびデビトラーゼDBP20、ならびにトリプシンおよびコロラーゼLAPで加水分解した後では、インビトロにおいて高い生物学的活性は示されないので、本発明者らによって確認された高い生物学的活性は、乳清タンパク質の酵素加水分解の形態全てから得られるとは考えられない。したがって、一実施形態では、加水分解物は、トリプシン消化によっては得られない。その他の実施形態では、加水分解物は、マルチフェクトP3000、S Amano、P Amano 6、サボラーゼMFF、デビトラーゼHWY20、A Amano 2、フレーバーザイム500L、プロタメックス、コロラーゼ(登録商標)LAP、デビトラーゼDBP20、ビオプロテアーゼN100L、M Amano、ペプチダーゼR、P Amano 6およびデビトラーゼDBP20、P Amano 6およびコロラーゼLAP、A Amano 2およびデビトラーゼDBP20、A Amano 2およびコロラーゼLAP、S AmanoおよびデビトラーゼDBP20、S AmanoおよびコロラーゼLAP、マルチフェクトP3000およびデビトラーゼDBP20、またはマルチフェクトP3000およびコロラーゼLAPのいずれか1種または複数によっては得られない。
【００４４】
使用する酵素が備えていてよい所望する特性がいくつかある。加水分解用のプロテアーゼは、広範囲の濃度にわたって非毒性であることが望ましい。好ましくは、この酵素は、被験者に摂取されたとき、許容される。加水分解物中に存在する所望する生物学的活性を不活性化しない条件によって、例えば、軽い加熱によって、この酵素が容易に不活性化できるならば、および/または、例えば、酵素を固相支持物に固定することによって、もしくは、酵素を保持し、一方で加水分解物の活性成分を通過させ収集する限外濾過によって、加水分解物から容易に分離することができるならば、有利であり得る。酵素を高い比活性で開始物質を提供することができるならば、加水分解物を製造することは有利であり得る。酵素がミルクもしくはミルク画分のpHおよびイオン式などの物理的条件によって不活性化されないならば、あるいはミルク画分または全乳中に見出される成分によって不活性化されないならば、有利であり得る。特定の実施形態では、この酵素は、中性近辺のpHでプロテイナーゼ活性を有し、特定の実施形態では、pH5.5から8.5の範囲内、さらに特に6.3から8.0の範囲内に最適な酵素活性を有する。
【００４５】
乳清タンパク質の酵素加水分解方法およびこれらの反応を制御する技術は、例えば、本明細書に全体の内容を相互参照として組み込んだ米国特許出願第11/083662号(米国特許出願公開第2005/0164340号)に詳細に記載されている。開始物質の加水分解度はまた、生成する加水分解物の活性に関与し得る。開始物質および加水分解された物質両方の加水分解度は、全体の内容を本明細書に相互参照として組み込んだOPA法(Lee K S、Drescher D G.、「Fluorometric amino-acid analysis with ophthaldialdehyde (OPA)」、Int. J. Biochem.、1978年、9(7)、457〜467頁)によって測定することができる。
【００４６】
本明細書で例示した加水分解条件は、比較的弱く、したがって、開始物質を完全に加水分解することは生物学的活性の増強には必要ないと予測される。したがって、「加水分解」という用語は、乳清タンパク質の少なくとも部分的な加水分解を包含するものとする。加水分解度が約0.5%から約20%の乳清タンパク質加水分解物は、遊離アミノ酸を約5%未満、分子量1000Da未満のペプチドを約15%から約55%、分子量1000Daから5000Daのペプチドを約20%から約55%、分子量が5000Daを上回るペプチドを約15%から約35%含有する。一実施形態では、正味加水分解度(%)は、0.5%から10%の間、より好ましくは0.5%から4%の間である。
【００４７】
「加水分解物」という用語は、完全なタンパク質またはポリペプチド、より短いポリペプチド、およびオリゴペプチドおよび加水分解によって生じる成分アミノ酸の混合物を意味する。
【００４８】
伸張運動が筋損傷および炎症を引き起こすことは良く認識されている。この筋損傷は、損傷を受けた筋肉が力を発生する能力(トルク)を、損傷を受ける前の筋肉と比較することによって、容易に確認することができる。以下の実施例で説明した方法を使用すると、筋肉トルクは通常、損傷後7日までに損傷前のレベルまで回復することはない。本発明者らは、乳清タンパク質から生成した加水分解物を経口投与すると、最大活動を反復することによって生じる筋損傷を引き起こす筋肉トルクの損失が劇的に軽減し、本発明の実施例では、筋損傷後24時間以内に正常な等尺性ピークトルクレベルまで劇的に急速に回復することが可能であることを示した。さらに、加水分解物を投与すると、運動後24時間以内に損傷前の基準レベルを上回る筋肉組織の筋力発生能力の改善が認められた。筋肉トルクのこの増加は、偽薬もしくは非加水分解WPIを投与された被験者では示されなかった。
【００４９】
筋肉機能の損失は、様々な有害な刺激が引き金となり得るので、加水分解物はまた、筋損傷の様々な原因、例えば、打撲および/または外傷から生じる筋力発生能力の損失を軽減できることも考えられる。
【００５０】
この活性は、以下に説明したマクロファージ培養物で示したようなインビトロにおいてTNFα産生を下方制御するWPIの能力に関与することができ、WPI加水分解物の能力にはさらに大きな程度で関与することができる。本発明者らによるミルク画分に関する以前の研究に基づいて、インビトロの結果から、運動誘発性損傷後に生じる筋肉中の1種または複数の炎症マーカーを下方制御する加水分解物の活性を予測することができる。したがって、WPIおよびWPI加水分解物は、筋損傷によって生じる炎症を軽減する活性、例えば、損傷を受けた筋肉組織におけるjun-Bおよびc-fos遺伝子発現を上方制御する活性を有することが予測される。
【００５１】
さらに、マクロファージにおけるTNFα遺伝子発現のインビトロアッセイは、生物学的活性を最大限にするために、加水分解物生成をモニターするために便利に使用することができる。
【００５２】
したがって、本明細書で使用した「所望する生物学的活性」という用語は、被験者における筋損傷後の筋力発生能力の損失の軽減、基準レベルを上回る筋力発生能力の増加、本明細書で説明したインビトロアッセイにおけるマクロファージ中のTNFα発現の下方制御および筋損傷、例えば、運動誘発性筋損傷後の筋肉中の炎症マーカー発現の軽減の任意の1種または複数を意味する。筋力発生能力の損失の軽減には、損傷後の表れるトルク損失の抑制および/またはトルクの損傷前のレベルへの回復の加速が含まれる。
【００５３】
いかなる提案機構にも結びつけることは望まないが、インビトロにおける予備的結果によって、WPIおよびWPIの加水分解物、例えば、ニュートラーゼ(登録商標)またはアルカラーゼ(登録商標)によって生成された加水分解物は、線維芽細胞の増殖を刺激できることが示唆され、加水分解物は筋肉の増殖または修復を刺激できることが示唆され、加水分解物によって筋肉を修復することができるか、または非加水分解WPIより多くに応用することができることが示唆される。
【００５４】
加水分解物は、筋損傷を誘発する運動の直後に被験者に投与すると、筋肉機能損失の軽減および筋肉が力を発生する能力の改善に効果的であることが示された。等尺性ピークトルクおよび伸張性ピークトルクの結果はまた、運動によって誘発された筋損傷の6時間後および22時間後にさらに加水分解物を投与すると、筋損傷後少なくとも24時間は筋を発生する能力の改善が維持されることを示唆している。したがって、加水分解物は、本明細書で示したように運動後に投与するか、または運動後24時間より長い期間投与することができ、その一方で運動前に追加的に、または選択的に投与できることが予測される。したがって、例えば、激しい運動が筋損傷を引き起こす可能性があることが予測される状況では、加水分解物は予防的に使用することができ、または損傷によって生じる筋肉応答を軽減するために運動後に治療的に使用することができると考えられる。
【００５５】
本発明者らは、経口投与した加水分解物は、非加水分解WPIとは異なり、運動して24時間後に、基準点(損傷前)を上回る筋力発生能力の増加を誘導することができることを示した。加水分解物は、筋力発生能力の増加を刺激するために、長期間規則的または間歇的に、好ましくは規則的または間歇的な運動と組み合わせて投与できると考えられる。このような使用はまた、筋肉を鍛えることを希望する被験者または、高齢者もしくは虚弱な人などの筋肉疲労を起こしやすい、もしくは筋肉疲労の危険性がある被験者において検討される。
【００５６】
乳清タンパク質および加水分解物は、栄養補助食品として適していることが知られている乳清などのよく特徴づけられたミルク製品から得られるので、栄養補助調製物として有利に投与することができる。本発明者らは、WPI加水分解物の形態の乳清タンパク質の加水分解物は、甘味剤と混合し、液体形態で被験者に投与すると十分に許容され、美味しいことを示した。
【００５７】
加水分解物は、栄養補助調製物として投与することができると予測される。本明細書で定義した「栄養補助食品」とは、食品、この場合はミルクから単離もしくは精製された食用製品であって、生理学的に有益であるか、または経口投与したとき急性もしくは慢性の疾患もしくは損傷の保護もしくは軽減をもたらすことが示されている製品を表す。したがって、栄養補助食品は、単独で、または食用食品もしくは飲料と混合して、食品補助物の形態中に存在させることができる。
【００５８】
栄養補助調製物は、任意の適切な形態であってよい。例えば、栄養調製物は、可溶性の粉末、液体またはそのまま飲める調製物の形態であってよい。あるいは、栄養調製物は、固形、例えば、そのまま食べられるバーまたは朝食シリアルの形態であってよい。様々な矯臭剤、線維、甘味剤およびその他の添加物も存在させてよい。
【００５９】
この調製物は、経鼻胃管、空腸管によって、または患者に飲ませるか、もしくは食べさせて患者に与えることができる。
【００６０】
栄養補助調製物は、従来通り製造することができる。例えば、この調製物は、乳清タンパク質または加水分解物およびその他の添加物と一緒にブレンドすることによって調製することができる。使用できるならば、乳化剤もこのブレンドに含めることができる。さらに、ビタミンおよび無機質をこの時点で添加することができるが、通常、熱分解を回避するために後で添加する。
【００６１】
粉末栄養補助調製物を製造することが所望される場合、乳清タンパク質または加水分解物は、粉末形態の他の成分と混合することができる。粉末の水分含量は約5重量%未満であるべきである。次に、水、好ましくは逆浸透を行った水を混合して、液体混合物を形成することができる。
【００６２】
この栄養補助調製物をそのまま消費できる液体携帯で提供する場合、細菌汚染を抑えるために加熱することができる。液体栄養補助調製物を製造することが所望される場合、液体混合物は適切な容器に無菌的に充填することが好ましい。容器の無菌充填は、当業界で通常利用可能な技術を使用して実施することができる。この状態の無菌充填を実施するための適切な装置は、市販されている。
【００６３】
投与する乳清タンパク質またはその加水分解物の最適な投与量は、被験者および所望する適用に左右されることが予測される。被験者には、体重1kg当たり1日当たり少なくとも50mgから1500mgの加水分解タンパク質、いくつかの実施形態では、体重1kg当たり1日当たり50mgから1100mgの加水分解タンパク質、特定の実施形態では、体重1kg当たり1日当たり50mgから600mgの加水分解タンパク質を投与するために十分な量で調製物を投与することが予測される。この量を被験者に投与するために、調製物を1日に複数回投薬して摂取させてよい。
【００６４】
特定の実施形態では、用量は、WPIまたは加水分解物として50mgから1500mg/kgである。特定の実施形態では、平均70kgの成人男性に、体重1kg当たり1日当たりおよそ50、350、570、1100または1500mgの用量の加水分解タンパク質を、好ましくは1日用量で投与する。このような用量は、WPIまたは加水分解粉末4、25、40、75または100gによってもたらされ得る。
【００６５】
調製物は、1回用量または2〜3回に分割した用量で投与することができる。好ましい実施形態では、調製物は運動直後または運動後20分から2時間以内に投与する。
【００６６】
本明細書で説明した例は、ヒト被験者に対する栄養補助食品の投与に限定しているが、同様または類似の調製物を類似の有益な生理学的応答が所望される非ヒト哺乳類に投与することもできることは明らかに理解されよう。例えば、筋損傷に対する有害な応答を最小限に抑え、速度および最適な筋肉強度が所望される哺乳類、例えば競走馬またはグレーハウンドの筋力発生能力を増加させ、あるいは、ウシ、ブタやヒツジなどの食肉として使用される家畜において筋肉量を最適にすることが明らかに所望される。
【００６７】
本明細書では、言語または必要な意味を表すことによって特記することが必要な場合を除いて、「含む」という用語または「含む」もしくは「含んでいる」などの変種は、包括的な意味で、すなわち、記載した特徴の存在を述べるが、本発明の様々な実施形態において他の特徴の存在または付加を排除しないために使用される。
【００６８】
本明細書で使用したように、言語または必要な意味を表すことによって特記することが必要な場合を除いて、「本質的に構成される」という用語は、他の要素が付加されてもよいが、これらの他の要素が記載した特性または特性類の基本的および新規の特徴にあまり影響を及ぼさないことを表すものとする。WPIまたはWPIの加水分解物の基本的および新規の特徴にあまり影響を及ぼさない他の要素の例には、限定はしないが、矯臭剤、甘味剤、保存剤、溶媒および希釈剤が含まれる。
【００６９】
本明細書で使用したように、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈で特に明確に記載していなければ、複数の態様を含む。したがって、例えば、乳清タンパク質を参照にする場合、1種または複数の乳清タンパク質を含む。
【００７０】
本発明について、以下の非限定的実施例を参照にしてここで説明する。
【００７１】
＜実施例１＞
乳清タンパク質単離物の調製
WPI工程の目的は、その他の乳清成分、例えば、水分、乳糖、脂肪および灰分(リン、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムおよびその他の金属などのミルクの無機質成分を含む)を除去することによって、残存する物質の乳清タンパク質が90%になるまで(試料をベースにして)、乳清タンパク質を濃縮することである。WPIを製造するために商用に通常使用される工程には、陰イオン交換クロマトグラフィー分離、限外濾過(UF)および噴霧乾燥が含まれる。
【００７２】
WPI工程は、陰イオン交換クロマトグラフィーの原理に基づいて、粘稠な物質でも速い流速が得られる大きな直径の樹脂を使用して行われる。開始物質は、レニン凝固によって生じるスイートホエイまたは酸を添加することによってカゼインを除去して生じる酸ホエイであってよい。その他の方法、例えば、超遠心、精密濾過またはエタノール沈殿によって生成される乳清も適していることが予測される。WPI生成の開始物質は、灰分および乳糖を除去するために生ホエイを限外濾過することによって生じた一般的生成物である、WPC35(乳清タンパク質濃度35重量%タンパク質/固形物)が理想的である。この工程は、乳製品業界の当業者には広く知られている。非常に類似した製品は、乳清の代わりに脱脂乳を使用しても製造される。
【００７３】
樹脂に主に負に荷電した(乳清のpHが6.5である)乳清成分を添加するために、陰イオン交換カラム(GibcoCel CR201)に開始物質を導入する。結合していない物質を除去するためにカラムを水で濯ぎ、結合した乳清成分を溶出し、塩化ナトリウム0.75Mおよび塩化カリウム0.75Mを含有する混合物でカラムを再生し、その後、残存する塩素を除去するためにカラムを濯ぐ。
【００７４】
CSEPから溶出した乳清成分を脱塩し、低温で、低分子量のスパイラル型限外濾過膜でダイアフィルトレーションすることによって濃縮する。この工程でタンパク質は保持されるが、塩、灰成分および乳糖は除去される。この工程の間に、全固形物量は、4%から25%に上昇し、タンパク質濃度は全固形物量の50%から全固形物量の90%超まで上昇する。
【００７５】
乾燥機の目的は、製品中に残存する水分の大部分を、残存する水分が最大5%になるまで除去することである。乾燥機は、熱風を充填した室内でWPI濃縮物を微粒子化することによってこれを実施する。得られたWPI粉末は、その後、加水分解用に調製された水で再構成するので、この工程から乾燥工程を排除することは可能であり得る。
【００７６】
本発明者らは、チーズホエイおよび酸ホエイから生成したWPIの加水分解物を調べた。いずれも、酵素消化に対して類似の生物活性を含有し、したがって、WPIの種類は、WPI加水分解物によって引き起こされる生物学的活性をあまり変更しないことが予測される。
【００７７】
スイートホエイおよび酸ホエイWPIのそれぞれから得られたWPIは、インビトロで試験した加水分解物を製造するために使用したが、スイートホエイWPI加水分解物だけはインビボで試験した。スイートホエイWPIおよび酸ホエイWPIから生成した加水分解物がインビトロアッセイで示した差は非常にわずかであったので、スイートホエイWPI加水分解物についてのインビボでの結果は、酸ホエイ加水分解物に適用することができるものと予測される。
【００７８】
＜実施例２＞
WPIの加水分解
この実施例で使用したプロテアーゼ溶液は、市販の製品「ニュートラーゼ」(登録商標)(Novozymes)である。
【００７９】
加水分解反応の標的pHは、pH6.5であった。加水分解中のpH変化は限定されており、したがって、pH6.6で加水分解を開始し、反応中pHを再調整しないことが実用的であった。最終pHは、約6.4であった。
【００８０】
実施例1にしたがって調製したWPI3キログラムを、水27lで復元し、10%(w/v)固形物溶液30lを作製した。50℃まで加熱する前に、pHをNaOH4Mで6.6に調整した。
【００８１】
一旦加熱を開始したら、溶液は連続的に撹拌した。
【００８２】
ニュートラーゼ(登録商標)1.5MG(Novozyme)4.5gを水45mlに溶解し、10%溶液を調製し、次にWPI溶液に添加した。pHは、継続的にモニターし、pHが6.4未満に低下したときのみ調整した。加水分解工程は、pHの低下によって実時間でモニターすることができる。生じた加水分解の実際量は、o-フタルアルデヒドに基づく方法(例えば、Lee他、1978年、前述)を使用して、「加水分解度」を測定することによって後で測定することができる。前述した条件下で生じた加水分解の実際量は、あまり多くなく、測定された正味加水分解度(%)は0.3と3.0の間であった。
【００８３】
加水分解して60分後、溶液をHCl4MでpH4.0に調節し、温度を50℃に30分間維持してニュートラーゼ(登録商標)を不活性化した。得られた加水分解物を25℃まで冷却して、pHを≧pH6.5、理想的にはpH7.0に再調節した。
【００８４】
次に、この加水分解物を乾燥して、理想的には35℃で凍結乾燥した。
【００８５】
WPIまたは乳清タンパク質を含有するその他のミルク画分の加水分解物は、その他のプロテイナーゼ酵素を使用して生成し、マクロファージにおけるTNFα発現を阻害するか、または本明細書の実施例3で説明したインビトロ法において線維芽細胞増殖を刺激するそれらの活性をスクリーニングする。これらの加水分解物はまた、以下に説明した方法を使用して、筋損傷の症状の軽減および被験者の筋肉収縮力の増強におけるそれらの活性をスクリーニングした。
【００８６】
＜実施例３＞
マクロファージにおけるTNFα発現の変更およびインビトロにおける線維芽細胞の細胞分割の刺激
TNFα放出
RAW264.7マクロファージを96ウェルプレートに熱不活性化牛胎児血清(FBS)10%を含有するDMEM培地で細胞2×104個の密度で接種した。次に、細胞を37℃で48時間培養維持した。最適な細胞密度に達したら、血清を含有する培地を除去し、媒体対照(0.9%生理食塩水)または試験乳製品試料2mg/mlいずれかの存在下で、細菌性リポ多糖(エシェリキア  コリ(Escherichia coli)055:B5)50ng/mlと共に37℃で6時間、無血清条件下において細胞を刺激した。試料は全て甘味剤および矯臭剤を含有し、偽薬試料はその他の化合物を含有せず、WPI試料は実施例1で説明した方法によって得られたWPIを含有し、加水分解WPI試料は実施例2で説明した方法によって生成した2種類の異なるニュートラーゼ(登録商標)加水分解バッチから採取し、カゼイン試料は市販のカゼイン(酸カゼイン、Murray Goulburn Co-Operative)を含有した。
【００８７】
6時間の刺激期間後、細胞条件培地中に存在するTNFαのレベルは高特異的TNFαサンドイッチELISAを使用して測定し、データは(媒体単独で前処理した細胞に対する) TNFα放出の%阻害として表した。細胞生存率は、アラマーブルー染色によって評価した。
【００８８】
線維芽細胞増殖
BalbC3T3線維芽細胞を96ウェルプレートに牛胎児血清(FBS)10%を含有するDMEM培地中0.8×104細胞の密度で接種し、37℃で一晩培養を維持した。一晩培養後、血清を含有する培地を除去し、媒体対照(0.9%生理食塩水)または試験試料2mg/mlのいずれかを含有する血清を含まないDMEM培地中において細胞を刺激した。試験試料は全て甘味剤および矯臭剤を含有しており、偽薬試料はその他の化合物を含有しておらず、WPI試料は実施例1の方法によって生成したWPIを含有しており、加水分解WPI試料は実施例2の方法によって2種類の異なるニュートラーゼ(登録商標)加水分解バッチから採取した。
【００８９】
細胞は、さらに48時間培養して維持し、その後培地を吸引して、細胞増殖をアラマーブルー染色によって定量した。データは、(媒体対照で処理した細胞を上回る)%増殖として表した。
【００９０】
これらの実験の結果を図4および図5に示す。
【００９１】
試験した試料全てのうち、ニュートラーゼ(登録商標)で加水分解したWPIがLPS刺激マクロファージによるTNFα発現の阻害においても、線維芽細胞増殖の刺激においても最も高い活性を有していた。
【００９２】
＜実施例４＞
運動誘発性筋損傷の変化
以下に説明した研究は、無作為化二重盲検プラセボ対照平行デザインを使用した。右脚大腿四頭筋の強度、力および局所的筋偽重力ならびに炎症による筋肉痛および炎症の血液マーカーの評価は、最大伸張運動の実行によって誘導された筋損傷の誘導前、筋損傷の誘導直後、ならびに1、2、6および24時間後に評価した。
【００９３】
筋損傷の誘導直後、被験者が、風味および甘味を付けた水(対照)250mlまたは(実施例2によって調製した)ニュートラーゼ(登録商標)処理WPI25g、(実施例1によって調製した)WPI25gもしくはカゼイン(酸カゼイン、Murray Goulburn Co-operative Ltd)25gを含有する風味および甘味を付けた水250mlを消費するように無作為に割り当てた。これらの試験試料は、筋損傷の誘導直後の筋肉機能および炎症を評価した直後に消費され、ならびに6時間後、次いで22時間後の評価後(すなわち、最終評価の2時間前)に再度消費された。
【００９４】
試験前24時間および介入期間24時間中の食事摂取は、食事日記を使用して評価した。以下の図1は、実験計画を示す。被験者は、以下の場合参加させなかった。
・体力向上および維持のために週1回を上回る規則的な身体活動に関与している。
・この研究に予定通り参加する前の3ヶ月間に大腿四頭筋の筋力トレーニングを受けた。
・筋肉痛を引き起こすために必要な運動を実行する能力を妨害する可能性がある膝、大腿四頭筋もしくはその他の骨格筋または医学的問題を有している。
・この研究に予定通り参加する前の3ヶ月間に大腿四頭筋の深刻な遅発性筋肉痛(DOMS)を経験した。
・乳製品タンパク質に対して今までになんらかのアレルギー応答または過敏応答を示した。
【００９５】
被験者は、市販薬、「風邪および流感」治療薬、鎮痛剤、アスピリンまたはその他の抗炎症製剤を試験期間前少なくとも7日間は摂取せず、試験期間前の48時間および試験期間中はアルコール飲料を控えるように指示された。
【００９６】
筋損傷は、Kin-Com等速性筋力計(Chattecx、TN、USA)で右脚の大腿四頭筋の最大自発的等速性伸張性収縮を100回実施することによって引き起こした。DOMSを引き起こすために、各被験者は、弱い抵抗で10回準備運動を繰り返し、次いで、膝伸筋の角速度40°/秒、可動域80°の最大自発的伸張性筋収縮を100回行った。被験者は、各伸張性収縮の開始前に、筋力計レバーアームに対して約1秒間最大等尺性収縮を実施し、継続的な最大努力で、膝伸筋の強制延長に抵抗した。膝伸筋は、伸張性収縮終了時に弛緩させ、回復期間中、弛緩した脚は実験者が開始位置に戻した。体位、膝関節のおよその回転軸および筋力計レバーアームの長さは、各被験者に一致させ、伸縮中はいつも言葉による激励を行った。
【００９７】
筋肉痛の程度は、筋損傷誘導の直前および運動完了の直後に再度、発表された技術(Huskinsson, E.、「Visual analogue scales, in Pain measurement and assessment」R. Melzack編、1983年、Raven Press: New York. 33〜37頁)を使用した100mm視覚的アナログスケール(VAS)を使用して、さらに運動して1、2、6および24時間後にVASを用いて評価した。
【００９８】
VASは、端から端までが100mmの水平線および左の「痛みなし」から右手末端の「可能な最大の痛さ」からなる基準点から構成された。被験者は腰掛けて、膝を伸ばすように(したがって、脚が水平になるように)要求され、痛みは足首からつり下げた5kgのおもりで評価した。被験者は、脚の大腿四頭筋の痛みの感覚に対応してVASの点に印を付けた。筋肉痛の程度は、この連続体の左手末端から被験者によって付けられた印までの測定距離(mm)を表すことによって定量した。
【００９９】
得られたVASデータによって、筋肉痛は全群において伸張性収縮後増加し、研究中は高いまま維持され、群間で統計学的な有意差はないことが示された。
【０１００】
右脚の大腿四頭筋の筋肉強度、伸張性および短縮性収縮筋力および筋持久力は、等速性筋力計(Kin-Com 125AP、Chattecx Corporation、Tennessee、USA)を使用して評価した。等尺性筋肉強度は、90°に屈曲した膝の最大等尺性収縮3回によって達成されたピークトルクによって決定した。伸張性筋肉トルクは、膝伸筋を角速度40°/秒、可動域80°で最大伸張性筋肉収縮を3回行う間に達成されたピークトルクから決定した。短縮性筋力および筋持久力は、角速度40°/秒、可動域80°で15回連続して最大等速性膝伸展手技を行うことによって評価した。
【０１０１】
運動に対する筋損傷および炎症応答の評価を行った。血清クレアチニンキナーゼ活性および炎症マーカーを評価するために、血液試料を基準点、筋肉の伸張性収縮を100回行った直後、運動して1、2、6および24時間後に収集した。運動前後の血液試料は、クレアチンキナーゼアッセイのためには血清試験管に入れ、炎症マーカーのアッセイのためにはEDTA試験管に入れた。次に、試料を遠心器で遠心し、血清および血漿を分析するまで-80℃で保存した。
【０１０２】
クレアチンキナーゼ活性は、伸張運動を実行して24時間後から48時間後に増加を示し、伸張運動後の筋損傷のマーカーとして通常使用する。
【０１０３】
伸張運動に応答して上昇を示したいくつかの炎症誘発性サイトカインの血漿濃度を測定する。腫瘍壊死因子α(TNFα)は、運動終了時にピーク値到達を示し、インターロイキン(IL)-1β(IL-1β)およびIL-6は運動後24時間まで増加した。
【０１０４】
血液試料は、これらのサイトカインそれぞれの市販キットを使用して分析した。
【０１０５】
二重盲検試験の被験者は、前述の4群の1つに無作為に割り当てた。各群は、研究中同一試験試料を消費した。補助物は、補助物および甘味剤を含有する予め重量を測定したサシェに入れて与え、消費前に水に添加し、十分に混合した。補助物サシェは、A、B、CおよびDの表示をして、研究中およびその後の結果分析中実験者にコードは知らせなかった。補助物「A」は偽薬であり、「B」はWPI加水分解物補助物であり、「C」はWPI補助物であり、「D」はカゼイン含有補助物であった。
【０１０６】
試験試料は、伸張運動を使用して筋損傷を誘導した後、6時間後に再度、22時間後(すなわち、最終評価の2時間前)再々度行った筋肉機能試験および血液サンプリングの直後に消費した。
【０１０７】
試験前の24時間および介入期間の24時間中の食物摂取は、Foodworks(Xyris software、Brisbane)およびオーストラリア栄養データベース(NUTTAB)を使用するその後の分析のために食事日記に記録した。
【０１０８】
4種類の補助物群の基準パラメータは、一元配置分散分析(ANOVA)を使用して比較した。等尺性ピークトルクおよび伸張性ピークトルクに対する様々な処置の経時的な効果は、繰り返し測定するANOVAを使用して比較した。ANOVAが有意な主要効果を示した場合、最小有意差の試験を使用して平均間の差を測定するためにpost-hoc分析を遂行した。統計学的有意は、αレベルp<0.05に設定した。全データは、平均±SEMで示す。
【０１０９】
結果-等尺性ピークトルク
等尺性ピークトルクの結果を図2に示す。等尺性ピークトルクは、基準点では群間に差はなかった。ANOVAによって、測定時間(P<0.001)および処置と時間の間の相互作用(P<0.01)には有意な効果があったが、処置には有意な効果はなかった(P=0.06)。post-hoc分析によって、この相互作用の効果は、WPI加水分解試験試料を摂取した被験者におけるトルクの有意な増加によるもので、したがって、トルクは24時間後まで基準点よりも有意に高く(P=0.03)、カゼイン試験試料を摂取した被験者ではトルクに変化はなく(P>0.12)、偽薬およびWPI試験試料を摂取した被験者ではトルクは有意に減少する(P<0.05)ことが示された。しかし、カゼイン試験試料を消費した被験者ではトルクに有意な減少はなかったが、この応答は、偽薬またはWPIを消費した被験者における応答とは有意差がなかった。WPI加水分解物を消費した被験者における24時間後までのトルクの増加は、基準点から14.4±8.9%の増加を示し、カゼイン試験試料を摂取した被験者における4.3±7.6%の減少(有意な減少ではない)、偽薬を摂取した被験者における31.0±3.0%の減少およびWPIを摂取した被験者における21.3±8.8%の減少とは対照的である。
【０１１０】
結果-伸張性ピークトルク
伸張性ピークトルクの結果を図3に示す。伸張性ピークトルクは、基準点では群間に差はなかった。ANOVAでは、処置(P=0.26)または相互作用(P=0.79)には有意な効果は示されなかったが、運動直後では全処理群のトルクの全体的な減少の結果として有意な時間効果が見られ、トルクは24時間の研究期間中基準点より低く維持された(P<0.001)。
【０１１１】
WPI加水分解試験試料を消費した被験者における伸張性ピークトルクの被験者間の変動は、その他の群の約2倍で、したがって、この変動を抑えるために、データは基準点に対する伸張力ピークのパーセント変化を用いて表した。この分析を使用して、ANOVAによって、有意な相互作用効果はないが(処置×時間、P=0.97)、大腿四頭筋の最大伸張性収縮を100回行った後の最初の1時間でトルクが減少し(P<0.001)、その後の24時間の研究期間中抑制されたままであるため、統計学的に有意な時間効果があったこと(P=0.001)が示された。しかし、重要なことであるが、WPI加水分解物を消費した被験者ではトルクの減少が少ないため、トルクのパーセント減少では治療効果の傾向があった(P=0.17)。
【０１１２】
このデータ分析によって、WPI加水分解物は最大伸張性筋肉収縮を繰り返し実行した後に生じる等尺性および伸張性ピークトルクの軽減を防御するだけでなく、その他の3種類の試験試料と比較して大腿四頭筋の等尺性筋力発生能力を有意に増加させることが示唆される。
【０１１３】
筋肉痛は全群で増加しており、群の間で筋肉痛には統計学的有意差はなかった。筋損傷および炎症のマーカーについてのデータは現在利用できないが、伸張運動が筋損傷および炎症を引き起こし、筋肉組織が力を発生する能力の損失を引き起こすことは認識されている。加水分解WPIを消費した被験者において力を発生する能力の損失が軽減し、等尺性ピーク筋力が基準点を約14%上回って増加することは、この特定の試験試料が、筋肉が受けた損傷のその収縮機能に対する影響を減少させるだけでなく、筋肉組織が力を発生する能力を高めることを示している。
【０１１４】
これらの被験者における筋力発生能力の増加の根本となる正確な機構は明確に確認されていないが、筋肉が力を発生する能力は、運動単位動員を調節する神経機構および収縮性タンパク質含量によって媒介されることが知られている。以前の研究のデータは、本研究で認められた筋肉機能の改善は、炎症を抑えると同時に、いかなる神経作用よりも、収縮性タンパク質含量の増加によって媒介される可能性が高いことを示唆する傾向がある。
【０１１５】
＜実施例５＞
筋肉炎症マーカー発現の変更
被験者は、絶食状態で研究室に到着し、外側広筋の静止筋の生検を受ける。
【０１１６】
静止生検後、被験者は最大脚伸展運動12回を3度行うことからなる一連の強い抵抗運動を実施した。運動直後、実施例4で説明した試験試料を投与するために被験者を無作為に割り当てた。被験者および試験官いずれも投与した補助物については知らせない。
【０１１７】
他の筋肉試料は運動後2回および4回収集する。3度目の生検の後、被験者は最初と同一の補助物の2回目を摂取する。
【０１１８】
運動して24時間後に、4度目および最終的な筋肉生検のために被験者は再度絶食状態で研究室に戻る。
【０１１９】
収集した筋肉生検からRNAを抽出し、筋肉肥大のマーカーおよび筋肉炎症のマーカーの発現変化を分析する。
【０１２０】
筋肉回復の2種類の特徴、(1)運動後の筋肉内で顕著な炎症の程度、および(2)大きさの増加(肥大)によって筋肉が適応する能力を調べる。
【０１２１】
c-FosおよびJunBは集合的に転写因子複合体AP-1を形成する。AP-1複合体は、強い、または損傷を与える運動の後の炎症に関与する遺伝子の調節に重要である。c-FosおよびJunB遺伝子の発現は、強い運動の後迅速に誘導され、筋肉内の早期炎症応答の有用なマーカーとなる。筋肉生検におけるc-FosおよびJunB発現は、市販のキットを使用して測定する。
【０１２２】
骨格筋肥大は、部分的に、筋原性制御因子(MRF)の塩基性ループヘリックスファミリーの活性によって制御される。MRFの構成要素MyoDおよびミオゲニンは、抵抗運動に対する骨格筋の適応応答において重要であることが既に確認されている。筋肉増殖の他の重要な調節因子は、ミオスタチンである。高レベルのミオスタチンは筋肉増殖を阻害し、ミオスタチン遺伝子発現の抑制は、強い抵抗運動後顕著である。したがって、MyoDおよびミオゲニンおよびミオスタチン遺伝子発現は、筋肉肥大のマーカーとして選択される。これらの遺伝子の発現は、発表された方法を使用して測定される(例えば、Megeney他(1996)、Genes Dev. 10: 1173〜1183頁、Ohkawa他、The EMBO Journal (2006)25、490〜501頁およびRoth他、Experimental Biology and Medicine 228:706〜709頁(2003))。
【０１２３】
＜実施例６＞
他のWPI加水分解物の生成
実施例1で生成したようなWPIの酵素加水分解は、生物活性が実施例2によって生成されたニュートラーゼ(登録商標)消化物に特異的ではないことを確認するために、2種類の指定したEC番号それぞれの3例について実施した。
【０１２４】
EC 3.4.24.28の例:
-ニュートラーゼ(登録商標)
-プロテアーゼN「Amano」
-コロラーゼN
【０１２５】
EC 3.4.21.62の例:
-アルカーゼ(登録商標)
-サブチリシンA(VIII型)
-オプチマーゼ
【０１２６】
製造方法(実験室規模)
実施例1にしたがって生成したWPI3キログラムを、1600hで水に溶解し、10%(w/v)WPI溶液1Lを生成した。このWPIを4℃で一晩保存した。翌日、1400hで、WPIを含有する1L瓶をゆっくり50℃まで加熱し、2M  NaOHを注意深く添加してpHをpH6.6に調節した。WPI溶液1Lを6本の瓶に、それぞれが10%(w/v)WPI溶液100mLを含有するように小分けした。
【０１２７】
酵素(ニュートラーゼ(登録商標)、プロテアーゼN「Amano」、コロラーゼN、アルカラーゼ(登録商標)、サブチリシンA(VIII型)またはオプチマーゼ)約50mgをWPIに添加し、次にWPI溶液を50℃で1時間インキュベートした。
【０１２８】
pHは定期的に測定したが、1時間のインキュベート中は調節しなかった。残存する酵素は、HCl2Mを添加して、加水分解したWPI溶液をpH4.0に調節し、50℃で30分間インキュベートすることによって不活性化した。
【０１２９】
次に、2M  NaOHを添加することによって溶液を中和した(pH5.5)。この試料を1mBarの真空中で48時間凍結乾燥し、一方で45℃で加熱した。
【０１３０】
試料を0.2mg/mlおよび1mg/mlで測定する以外は実施例3で既に説明したように生物活性を測定するために、粉末をTGR Biosciencesに送った。
【０１３１】
結果は図6に示す。サブチリシンA(VIII型)1mg/mlは、LPS刺激マクロファージによるTNFα発現の最も優れた阻害剤であるが、その他の加水分解物も全て0.2mg/mlおよび1.0mg/mlで非加水分解WPIよりも阻害活性が高かった。
【０１３２】
この結果は図4の発見を裏付ける。
【０１３３】
＜実施例７＞
LPS刺激マクロファージにおけるTNFα発現の変更-競争対照
実施例3で実施した実験を対照として市販のミルク画分製品で繰り返し、本発明の加水分解物がTNFα発現に関して当業界で公知の製剤とは異なった作用をすることを示した。
【０１３４】
試験した試料は、
A 「iso100」Dymatize製 (タンパク質89%)
B 「Gold standard」Optimum製(タンパク質81.63%)
C 「HP100」ASN製(タンパク質89%)
D 「VP2」AST製(タンパク質85.7%)
E 「Hydroxyphase」Max製(タンパク質90%)
F  WPI 実施例1参照(タンパク質89%)
G 実施例2によって生成したようなWPIのニュートラーゼ消化物(タンパク質88%)であった。
nWGFE乳清成長因子抽出物は、PCT/AU2006/001323によって生成した。
【０１３５】
実施例7で示した結果は、LPS刺激マクロファージのTNFα発現を阻害する本発明による加水分解物の能力を、ほとんどがTNFα発現を刺激するその他の試料と比較して例示している。
【０１３６】
従来技術のいくつかの出版物を本明細書で参照したが、これらの書類のいずれかがいずれかの国において当業界の一般的知識の一部を形成することをこの参照が許可するものではないことは明確に理解されよう。
【０１３７】
幅広く記載した本発明の精神および範囲を逸脱することなく、特定の実施形態で示したような本発明に数多くの変化および/または変更を行うことができることは当業者には理解されよう。したがって、本発明の実施形態はいずれも、例示であって、制限するものではないと考えるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】実施例4で説明した実験の計画を明示した概略図である。この計画図は、各被験者から試料を採取する時間および運動による筋損傷の誘導に対して筋肉機能を評価する時間を示す。この計画図は、各被験者に補助物を投与した時間も示している。
【図２】実施例4で説明した筋肉の等尺性ピークトルク試験の結果をグラフで示した図である。「A」は偽薬補助物を表し、「B」はWPI加水分解物補助物を表し、「C」はWPI補助物を表し、「D」はカゼイン含有補助物を表す。この結果は、加水分解WPIを補給した被験者が、その他の処置のいずれかを受けた被験者よりも有意に高い等尺性ピーク筋力を発揮し、24時間後、加水分解WPIを補給した被験者は、基準値よりも有意に高い等尺性ピーク筋力を発揮したことを示している。基準点(0時間)、100回の最大伸張性収縮の直後、ならびに1、2、6および24時間後に評価した等尺性ピークトルク。*基準点(P=0.03)およびその他のいずれの処理(P<0.001)とも有意に異なる。†補助物AおよびCについて基準点とは有意に異なる(P<0.05)。
【図３】実施例4で説明した筋肉の伸張性ピークトルク試験の結果をグラフで示した図である。「A」は偽薬補助物を表し、「B」はWPI加水分解物補助物を表し、「C」はWPI補助物を表し、「D」はカゼイン含有補助物を表す。基準点(0時間)、100回の最大伸張性収縮の直後、ならびに1、2、6および24時間後に評価した伸張性ピークトルク。*基準点と有意に異なる(P<0.001)。
【図４】LPS刺激マクロファージ細胞系における炎症誘発性サイトカインTNFαの発現に影響を及ぼす試験試料の能力についてのインビトロ試験の結果をグラフで示した図である。
【図５】線維芽細胞増殖に影響を及ぼす試験試料の能力についてのインビトロ試験の結果をグラフで示した図である。「FBS」は、牛胎児血清を表す。
【図６Ａ】LPS刺激マクロファージ細胞系における炎症誘発性サイトカインTNFαの発現に影響を及ぼす試料の能力についてのインビトロ試験の結果をグラフで示した図で、Aは1mg/ml w/vである。
【図６Ｂ】LPS刺激マクロファージ細胞系における炎症誘発性サイトカインTNFαの発現に影響を及ぼす試料の能力についてのインビトロ試験の結果をグラフで示した図で、Bは0.2mg/ml w/vである。
【図７】LPS刺激マクロファージ細胞系における炎症誘発性サイトカインTNFαの発現に影響を及ぼす試料1、2、4および8mg/ml w/vの能力についてのインビトロ試験の結果をグラフで示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年4月3日(2008.4.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳清タンパク質の加水分解物を含む調製物の使用であって、筋損傷によって生じる筋肉機能の低下を軽減するため、および/または筋損傷からの回復を高めるため、および/または筋肉が力を発生する能力を高めるために、前記加水分解物が、IUBMB酵素命名法による酵素番号EC3.4.21.62またはEC3.4.24.28の酵素で酵素処理することによって生成されており、正味加水分解度が0.5%から10%である使用。
【請求項２】
筋損傷によって生じる筋肉機能の低下を軽減するため、および/または筋損傷からの回復を高めるため、および/または筋肉が力を発生する能力を高めるための方法であって、被験者に乳清タンパク質の加水分解物を含む調製物を投与する工程を含み、前記加水分解物が、IUBMB酵素命名法による酵素番号EC3.4.21.62またはEC3.4.24.28の酵素で酵素処理することによって生成されており、正味加水分解度が0.5%から10%である方法。
【請求項３】
前記筋損傷が、運動誘発筋損傷である、請求項1に記載の使用または請求項2に記載の方法。
【請求項４】
乳清タンパク質または加水分解物を少なくとも50mg/kg体重から1500mg/kg体重で提供するために前記調製物を投与する、請求項1に記載の使用または請求項2に記載の方法。
【請求項５】
前記調製物を運動直後に投与する、請求項1に記載の使用または請求項2に記載の方法。
【請求項６】
前記調製物を運動から20分から2時間後に投与する、請求項1に記載の使用または請求項2に記載の方法。
【請求項７】
前記調製物が経口投与用である、請求項1に記載の使用または請求項2に記載の方法。
【請求項８】
前記酵素が、ニュートラーゼ(登録商標)、アルカラーゼ(登録商標)、サブチリシンA(VIII型)、コロラーゼN、オプチマーゼまたはプロテアーゼN「Amano」である、請求項1に記載の使用または請求項2に記載の方法。
【請求項９】
前記乳清タンパク質が乳清タンパク質単離物または乳清タンパク質濃縮物である、請求項1に記載の使用または請求項2に記載の方法。
【請求項１０】
筋損傷によって生じる筋肉機能の低下を軽減するため、および/または筋損傷からの回復を高めるため、および/または筋肉が力を発生する能力を高めるための調製物の調製方法であって、正味加水分解度が0.5%から10%である乳清タンパク質加水分解物を含む調製物を生成するための条件下で、乳清タンパク質をIUBMB酵素命名法による酵素番号EC3.4.21.62またはEC3.4.24.28の酵素で加水分解する工程を含む方法。
【請求項１１】
前記加水分解物の正味加水分解度が0.5%と4%との間である、請求項10に記載の方法または請求項2に記載の調製物。
【国際調査報告】
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