(57)【要約】【解決課題】対象内のＨＩＶ感染の治療のための方法および組成物に関する。【解決手段】抗ＨＩＶ抗体または抗体断片等の、ＨＩＶ抗原に対する標的となる分子を含み、前記抗ＨＩＶ抗体または断片は、ドキソルビシン等の様々な細胞毒性薬と合成させることができる。好適には、抗体または断片はＰ４／Ｄ１０である。また、診断用薬剤と合成された抗ＨＩＶ抗体または断片を用いて、対象内のＨＩＶ感染の画像化、検知、または診断の方法。さらに、治療薬に合成された担体の分子の投与前、少なくとも１つのＨＩＶ抗原の結合部位と、少なくとも１つの担体の分子の結合部位とを有する二重特異性抗体を投与することができる。【選択図】図１Ａ、Ｂ
2009538284.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶ表面エンベロープの抗原に対して、治療薬に合成された抗体またはその断片を対象に投与するステップを含む、前記対象のＨＩＶ感染を治療する方法であって、前記合成された抗体または断片への曝露は、ＨＩＶ感染を減少、根絶、または予防するために、または生体内においてＨＩＶが未感染の細胞へ細胞間感染するのを予防するために有効である、方法。
【請求項２】
前記治療薬は、細胞毒性薬、ウイルス静止剤、毒素、放射性同位体、オリゴヌクレオチド、免疫賦活剤、サイトカイン、ケモカイン、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記治療薬はドキソルビシンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記合成抗体または断片はドキソルビシン―Ｐ４／Ｄ１０である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体または断片はＰ４／Ｄ１０である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記対象はヒト対象である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体または断片は、キメラの、ヒト化した、またはヒト抗体あるいは断片である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記合成抗体または断片は、認識されているまたは潜在的なＨＩＶ感染の後で前記対象に投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
認識されているまたは潜在的な感染から、前記対象への合成抗体または断片の投与の間の期間は、１時間未満、１時間から５時間、１２時間未満、１日未満、２日未満、１週間未満または１ヶ月未満である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記合成抗体または断片の投与は、前記対象におけるＨＩＶ感染をブロックするために有効である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記合成抗体または断片は、前記対象が抗レトロウィルス療法（ＡＲＴ）によって治療された後で前記対象に投与される、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記治療薬は、アピリジン、アザリビン、アナストロゾール、アザシチジン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブリオスタチン−１、ブスルファン、カリケアマイシン、カンプトセシン、１０ヒドロキシカプリン酸、カルムスチン、セレブレックス、クロラムブシル、シスプラチン、イリノテカン（ＣＰＴ―１１）、ＳＮ―３８、カルボプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノマイシングルクノニド、ダウノルビシン、ドキソルビシン、２―ピロリノドキソルビシン（ｐｙｒｒｏｌｉｎｏｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎｅ）（２Ｐ−ＤＯＸ）、シアノ―モルホリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エピルビシングルクロニド、エストラムスチン、エトポシド、エトポシドグルクノニド、リン酸エトポシド、フロクスウリジン（ＦＵｄＲ）、３’，５’―Ｏ―ジオレオイル−ＦｕｄＲ（ＦＵｄＲ−ｄＯ）、フルダラビン、フルタミド、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、Ｌ−アスパラギナーゼ、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、フェニル酪酸塩、プロカルバジン、パクリタキセル、ペントスタチン、ＰＳＩ―３４１、セムスチン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、タキサン、タクソール、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、ベルケイド、ビンブラスチン、酒石酸ビノレルビン、ビンクリスチン、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ、オンコナーゼ、ｒａｐＬＲｌ、ＤＮａｓｅ  Ｉ、ブドウ球菌性エンテロトキシン−Ａ、ヤマゴボウ抗ウイルス性タンパク質、ゲロニン、ジフテリアトキシン、シュードモナスエクソトキシン、シュードモナスエンドトキシン、アンチセンスオリゴヌクレオチド、干渉ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アグリゾーム阻害物質またはその組み合わせである、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記放射性同位体は、２２５Ａｃ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、１４Ｃ、５１Ｃｒ、３６Ｃｌ、４５Ｔｉ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、１６６Ｄｙ、１５２Ｅｕ、１８Ｆ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１９５ｍＨｇ、１６６Ｈｏ、３Ｈ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１１、５２Ｆｅ、５９Ｆｅ  １７７Ｌｕ、１９１Ｏｓ、２１２Ｐｂ、３２Ｐ、３３Ｐ、１４２Ｐｒ、１９５ｍＰｔ、２２３Ｒａ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、４７Ｓｃ、７５Ｓｅ１１１Ａｇ、１５３Ｓｍ、８９Ｓｒ、３５Ｓ、１６１Ｔｂ、９４ｍＴｃ、９９ｍＴｃ、８６Ｙ、９０Ｙおよび８９Ｚｒから成る群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体または断片は、二重特異性抗体、二重特異性抗体断片、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ統合、一本鎖抗体、二重抗体、三重抗体または四重抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＡＲＴはＨＡＡＲＴ（高活性抗レトロウィルス療法）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗レトロウィルス療法は、エファビレンツ、ジドブジン、テノホビル、ラミブジン、エムトリシタビン、ディダノシン、アバカビル、スタブジン、ネビラピン、ロピナビル、リトナビル、アタザナビル、ホスアンプレナビル、インディナビル、ネルフィナビル、サクイナビル、またはその組み合わせによる治療を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体または断片は、中和抗体または断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記免疫賦活剤は、サイトカイン、幹細胞成長因子、リンホトキシン、造血因子、インターロイキン、コロニー刺激因子、インターフェロン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン―γ、「Ｓｌ因子」ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１およびＴＮＦ−αと呼ばれる幹細胞成長因子から成る群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項１９】
前記サイトカインは、リンフォカイン、モノカイン、成長因子、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、サイロキシン、インシュリン、プロインシュリン、レラキシン、プロレラキシン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、肝成長因子、プロスタグランジン、繊維芽細胞成長因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、ＯＢタンパク質、腫瘍壊死因子―ｅｘ、腫瘍壊死因子―β、ミューラー阻害物質、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、インヒビン、アクティビン、血管内皮性成長因子、インテグリン、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、ＮＧＦ−β、血小板成長因子、変換成長因子（ＴＧＦ）、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、インシュリン様成長因子―Ｉおよび−ＩＩ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、骨誘導因子、インターフェロン―α、インターフェロン―β、インターフェロン―γ、コロニー刺激因子、マクロファージ―ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球―マクロファージ―ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球―ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）、ＩＬ−Ｉ、ＩＬ−ｌα、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＬＩＦ、キット―配位子、ＦＬＴ―３、アンギオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子およびＬＴで成る群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ケモカインは、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＭｌＰｌ―アルファ、ＭＩＰｌ―ベータおよびＩＰ―１０で成る群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項２１】
前記投与は、経口、経鼻、口腔、吸入、直腸、経膣、局所、同所、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、動脈内、髄腔内、または静脈内である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記放射性同位体は、アルファエミッタまたはオーガー電子エミッタである、請求項２に記載の方法。
【請求項２３】
前記アルファエミッタは、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、２２３Ｒａまたは２２５Ａｃ、あるいは、前記オーガー電子エミッタは１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、６７Ｇａ、１９１Ｏｓ、１９３ｍＰｔ、１９５ｍＰｔまたは１９５ｍＨｇである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
対象におけるＨＩＶ感染を画像化、検知、または診断するための方法であって、
ａ）前記対象に対して、ＨＩＶ表面エンベロープ抗原に対する画像化剤に合成された抗体または抗体断片を投与するステップと、
ｂ）ＨＩＶ感染した細胞に結合された、合成抗体または断片の存在を検知するステップであって、前記合成抗体または断片の前記ＨＩＶ感染した細胞への結合が、前記対象におけるＨＩＶ感染の存在の画像化、診断、または検知に有効である、ステップとを含む、方法。
【請求項２５】
前記画像化剤は、放射性同位体、酵素、感光ラベル、造影剤、超音波ラベル、または常磁性ラベルである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記画像化剤は、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、エルビウム（ＩＩＩ）、ランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）およびビスマス（ＩＩＩ）から成る群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記画像化剤は、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、４５Ｔｉ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４−１５８Ｇｄ、１７７Ｌｕ、３２Ｐまたは１８８Ｒｅである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記画像化剤は、Ａｌｅｘａ３５０、Ａｌｅｘａ４３０、ＡＭＣＡ、アミノアクリジン、ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ―ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ―Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ―ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ―ＴＲＸ、５―カルボキシ―４’，５’―ジクロロ―２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、５―カルボキシ―２’，４’，５’，７’―テトラクロルエチレン、５―カルボキシフルオレセイン、５―カルボキシローダミン、６―カルボキシローダミン、６―カルボキシテトラメチルアミノ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、６―ＦＡＭ、塩化ダンシル、フルオレセイン、ＨＥＸ、６−ＪＯＥ、ＮＢＤ（７―ニトロベンズ―２―オクサ―ｌ，３―ジアゾール）、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ５００、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ５１４、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、フタル酸、テレフタル酸塩、イソフタル酸、クレシルファストバイオレット、クレシルブルーバイオレット、ブリリアントクレシルブルー、パラアミノ安息香酸、エリトロシン、フタロシアニン、アゾメチン、シアニン、キサンチン、スクニシルフルオレセイン、希土類金属クリプタート、ユーロピウムトリスビピリジンジアミン、ユーロピウムクリプタートまたはキレート、ジアミン、ジシアン、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ青色色素、アロフィコシアニン、アロフィコシアニンＢ、フィコシアニンＣ、フィコシアニンＲ、チアミン、フィコエリトロシアニン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｏｃｙａｎｉｎ）、フィコエリトリンＲ、ＲＥＧ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ、ローダミンイソチオシアネート、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅｄ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、ＴＲＩＴ（テトラメチルローダミンイソチオール）、テトラメチルローダミン、またはＴｅｘａｓ  Ｒｅｄである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
対象におけるＨＩＶ感染を治療するための方法であって、
ａ）前記対象に対して、二重特異抗体またはその抗体断片を投与するステップであって、前記二重特異抗体は、ＨＩＶ表面エンベロープの抗原に特異な１つ以上の結合部位と担体の１つ以上の結合部位とを含む、ステップと、
ｂ）任意に、前記対象にクリア剤を投与するステップと、
ｃ）前記対象に対して、治療薬に合成された担体を投与するステップであって、前記担体の前記投与は  ＨＩＶ感染を減少、根絶、または予防するために、または前記対象内においてＨＩＶが未感染の細胞へ細胞間感染するのを予防するために有効である、ステップとを含む、方法。
【請求項３０】
前記治療薬は、細胞毒性薬、ウイルス静止剤、毒素、放射性同位体、オリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または酵素である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記治療薬はドキソルビシンである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記対象はヒト対象である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗体または断片は、キメラの、ヒト化した、またはヒト抗体または断片である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗体または断片、オプションのクリア剤および担体は、前記対象が抗レトロウィルス療法によって治療された後で、前記対象に投与される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記治療薬は、アピリジン、アザリビン、アナストロゾール、アザシチジン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブリオスタチン−１、ブスルファン、カリケアマイシン、カンプトセシン、１０ヒドロキシカプリン酸、カルムスチン、セレブレックス、クロラムブシル、シスプラチン、イリノテカン（ＣＰＴ―１１）、ＳＮ―３８、カルボプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノマイシングルクノニド、ダウノルビシン、ドキソルビシン、２―ピロリノドキソルビシン（ｐｙｒｒｏｌｉｎｏｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎｅ）（２Ｐ−ＤＯＸ）、シアノ―モルホリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エピルビシングルクロニド、エストラムスチン、エトポシド、エトポシドグルクノニド、リン酸エトポシド、フロクスウリジン（ＦＵｄＲ）、３’，５’―Ｏ―ジオレオイル−ＦｕｄＲ（ＦＵｄＲ−ｄＯ）、フルダラビン、フルタミド、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、Ｌ―アスパラギナーゼ、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、６―メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、フェニル酪酸塩、プロカルバジン、パクリタキセル、ペントスタチン、ＰＳＩ−３４１、セムスチン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、タキサン、タクソール、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、ベルケイド、ビンブラスチン、酒石酸ビノレルビン、ビンクリスチン、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ、オンコナーゼ、ｒａｐＬＲｌ、ＤＮａｓｅ  Ｉ、ブドウ球菌性エンテロトキシン−Ａ、ヤマゴボウ抗ウイルス性タンパク質、ゲロニン、ジフテリアトキシン、シュードモナスエクソトキシン、シュードモナスエンドトキシン、アンチセンスオリゴヌクレオチド、干渉ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アグリゾーム阻害物質またはその組み合わせである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記放射性同位体は、２２５Ａｃ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、１４Ｃ、５１Ｃｒ、３６Ｃｌ、４５Ｔｉ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、１６６Ｄｙ、１５２Ｅｕ、１８Ｆ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１９５ｍＨｇ、１６６Ｈｏ、３Ｈ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１１、５２Ｆｅ、５９Ｆｅ  １７７Ｌｕ、１９１Ｏｓ、２１２Ｐｂ、３２Ｐ、３３Ｐ、１４２Ｐｒ、１９５ｍＰｔ、２２３Ｒａ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、４７Ｓｃ、７５Ｓｅ１１１Ａｇ、１５３Ｓｍ、８９Ｓｒ、３５Ｓ、１６１Ｔｂ、９４ｍＴｃ、９９ｍＴｃ、８６Ｙ、９０Ｙおよび８９Ｚｒから成る群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
前記二重特異性抗体または二重特異性抗体断片は、少なくとも１つのｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ―Ｆｃ統合、一本鎖抗体、二重抗体、三重抗体または四重抗体を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３８】
前記二重特異性抗体または断片は、少なくとも１つのＰ４／Ｄ１０抗体または断片を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３９】
前記担体は１つ以上のＨＳＧ（ヒスタミン―スクシニル―グリシン）部分を含み、前記二重特異性抗体または断片はＨＳＧに結合される、請求項２９に記載の方法。
【請求項４０】
前記二重特異性抗体または断片は、ＨＳＧに結合される１つ以上の６７９抗体または抗体断片を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項４１】
前記担体は、ＤＯＴＡ−Ｄ−Ｃｙｓ（３−ＳＰ−Ｇｌｙ−２０−Ｏ−ＳＮ３８）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２（ＩＭＰ−４１１）である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記二重特異性抗体または断片は、ドックアンドロック（ＤＮＬ）構造を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項４３】
治療薬に合成された抗ＨＩＶ抗体またはその断片を含む組成物であって、前記合成された抗体またはその断片は、ＨＩＶ感染を減少、根絶、または予防するために、または対象に投与された場合に、ＨＩＶが未感染の細胞へ細胞間感染するのを予防するために有効である、組成物。
【請求項４４】
前記対象はヒト対象である、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
前記合成抗体または断片は、キメラの、ヒト化した、またはヒト抗体あるいは断片である、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４６】
前記抗体または断片はＰ４／Ｄ１０である、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４７】
前記合成抗体または抗体の断片はドキソルビシンＰ４／Ｄ１０である、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
前記抗体または断片は、アピリジン、アザリビン、アナストロゾール、アザシチジン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブリオスタチン―１、ブスルファン、カリケアマイシン、カンプトセシン、１０ヒドロキシカプリン酸、カルムスチン、セレブレックス、クロラムブシル、シスプラチン、イリノテカン（ＣＰＴ―１１）、ＳＮ―３８、カルボプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノマイシングルクノニド、ダウノルビシン、ドキソルビシン、２―ピロリノドキソルビシン（ｐｙｒｒｏｌｉｎｏｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎｅ）（２Ｐ−ＤＯＸ）、シアノ―モルホリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エピルビシングルクロニド、エストラムスチン、エトポシド、エトポシドグルクノニド、リン酸エトポシド、フロクスウリジン（ＦＵｄＲ）、３’，５’―Ｏ―ジオレオイル−ＦｕｄＲ（ＦＵｄＲ−ｄＯ）、フルダラビン、フルタミド、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、Ｌ―アスパラギナーゼ、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、６―メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、フェニル酪酸塩、プロカルバジン、パクリタキセル、ペントスタチン、ＰＳＩ−３４１、セムスチン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、タキサン、タクソール、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、ベルケイド、ビンブラスチン、酒石酸ビノレルビン、ビンクリスチン、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ、オンコナーゼ、ｒａｐＬＲｌ、ＤＮａｓｅ  Ｉ、ブドウ球菌性エンテロトキシン−Ａ、ヤマゴボウ抗ウイルス性タンパク質、ゲロニン、ジフテリアトキシン、シュードモナスエクソトキシン、シュードモナスエンドトキシン、アンチセンスオリゴヌクレオチド、干渉ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アグリゾーム阻害物質またはその組み合わせに合成されている、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４９】
前記抗体または断片は、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、８９Ｓｒ、９０Ｙ、１１１Ａｇ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｈｏ、１６６Ｄｙ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、６７Ｇａ、１９１Ｏｓ、１９３ｍＰｔ、１９５ｍＰｔまたは１９５ｍＨｇに合成されている、請求項４３に記載の組成物。
【請求項５０】
前記抗体または断片は、二重特異性抗体、二重特異性抗体断片、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ統合、一本鎖抗体、二重抗体、三重抗体または四重抗体である、請求項４３に記載の組成物。
【請求項５１】
前記抗体または断片は、中和抗体である、請求項４３に記載の組成物。
【請求項５２】
各抗体または断片はＨＩＶ表面エンベロープ抗原に結合されている、前記対象に対して２つまたは３つの前記抗体または断片を投与するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５３】
前記２つまたは３つの抗体または断片は、同じ前記ＨＩＶ表面エンベロープ抗原に結合されている、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記２つまたは３つの抗体または断片は、異なるＨＩＶ表面エンベロープ抗原に結合されている、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記２つまたは３つの抗体または断片は、ＨＩＶのアクセス可能なエピトープの不可変、および可変部分に結合されている、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
前記抗体または抗体の断片は、４Ｅ１０、２Ｆ５、３Ｄ６、Ｃ３７、１ＡＣＹ、１Ｆ５８、１ＧＧＧＣ、２Ｇ１２およびＸ５で成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５７】
前記抗体または断片は、キメラの、ヒト化した、またはヒト抗体または断片である、請求項５６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、感染対象のヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）を治療し、さらに好適な実施形態においては排除するための、方法および組成物に関する。
本発明は、その全内容が本明細書に参照として組み込まれている、２００６年５月１５日に出願された、仮出願シリアル番号第６０／８００，３４２号に対し、３５  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１１９（ｅ）において、その利益を請求する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、感染対象のヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）を治療し、さらに好適な実施形態においては処置するための、方法および組成物に関する。特定の実施形態では、組成物および方法は、例えば、ＨＩＶエンベロープ抗原の、ＨＩＶ抗原に対する抗体または抗体断片等の標的となる分子に関する。さらなる特定の実施形態において、抗体または抗体断片は、ドキソルビシン等の化学療法薬を含むがこれに限定されない、治療薬、診断薬、ウイルス静止剤および／または細胞毒性薬等の１つ以上の薬剤と併用することができる。別の実施形態において、ＨＩＶ抗原のための１つ以上の結合部位および細胞毒性、ウイルス静止性またはその他の治療用薬剤および／または診断用薬剤が結合可能な担体分子のための親和性を有する１つ以上の結合部位と共に、二重特異性または複数特異性抗体あるいはその断片を利用することができる。
【０００３】
抗レトロウィルス治療（ＡＲＴ）によるヒト免疫不全ウイルス―１（ＨＩＶ―１）の治療における有望な進歩にもかかわらず、末梢血およびリンパ節の分析によって、治療が終了して何年も自然に活発化することがある潜在的なプロウィルスが存在する静止Ｔ細胞の持続的貯蔵庫の存在が文書で発表されている（Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  １９９８、９５：１１５１１―１１５１３；Ｂｌａｎｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ  ２００２，５３：５５７―５９３）。
【０００４】
結合抗体および中和抗体は、遊離型ウイルスの細胞受容体への結合を防ぐことができ、これらはウイルス表面に結合でき、また補体を介した遊離型ビリオンのｖｉｒｏｌｙｓｉｓ（Ｐａｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＡＩＤＳ  １９９９、１３［Ｓｕｐｐｌ  Ａ］：Ｓ１３７―１６２）を誘発できる。抗体はさらに、ＮＫ細胞を、感染した標的細胞と結合することにより、抗体依存の細胞の細胞毒性（ＡＤＣＣ）によって、感染した細胞の根絶に仲介的な働きをすることができる（Ｂｒｏｌｉｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １９９０、６４：９３６―９４０）。しかし、抗ウイルスの抗体のみをＨＩＶに感染した患者の免疫療法の一部に利用することが、その当初の目的をかなえるものではない（Ｈｉｎｋｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ａｃｑｕｉｒ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃ  Ｓｙｎｄｒ  １９９４、７：９４０―９５１；Ｔｒｋｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００５、１１：６１５―６２２）。
【０００５】
様々なウイルスのまたは細胞の成分を、ＨＩＶ感染細胞に対する治療薬剤の抗体送達の標的として使用するための試みがなされている（Ｄａｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １９９４、１７０：１１８０―１１８８；Ｐｉｎｃｕｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３、１７０：２２３６―２２４１；Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １９９４、１７０：１００９―１０１３；Ｓａａｖｅｄｒａ―Ｌｏｚａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ２００４、１０１：２４９４―２４９９）。同様の抗毒素が、癌患者に有効であることが証明されている（ＷｕおよびＳｅｎｔｅｒ、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００５、２３：１１３７―１１４６）。しかし、ＨＩＶ感染した細胞の治療のためのより有用な方法および組成物に対するニーズが存在している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＨＩＶ感染細胞を阻害、抑制、検出、同定、位置特定、および／または排除するための方法および組成物を提供することにより、当分野の未解決のニーズを実現する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
特定の実施形態において、組成物および／または方法は、ＨＩＶ抗原に対して標的となる分子に関する場合がある。こうした標的となる分子は、ペプチド、抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体または任意のこうした抗体、および／または抗体の類似体の断片を含むことができるが、これに限定されない。特定の実施形態において、標的の分子は、例えば「裸の」抗体または抗体断片等、非共役にすることができる。別の実施形態において、標的の分子は、１つ以上の治療用および／または診断用薬剤に共役することができる。こうした薬剤は、薬物、プロ薬物、ウイルス静止剤、毒素、酵素、オリゴヌクレオチド、放射性同位体、放射性核種、免疫賦活剤、サイトカイン、ラベル、蛍光ラベル、発光ラベル、常磁性ラベル、ＭＲＩラベル、ミセル、リポゾーム、ナノ粒子、またはその組み合わせを含むが、これに限定されない。特定の実施形態において、共役の抗ＨＩＶ抗体または断片を、ＨＩＶ感染が判断されているまたは感染が疑われている患者に対して、生体内に投与する。こうした投与により、患者の細胞のＨＩＶ感染をブロックまたは予防し、患者内のＨＩＶ感染細胞を低減または排除し、および／またはその他の公知の抗レトロウィルスの療法よりも以前におよび／または同時に治療された患者内のＨＩＶ感染した細胞の残留病巣を低減または排除することができる。
【０００８】
別の実施形態は、ＨＩＶ、ＳＩＶ、その他のレトロウィルスに感染した対象等の対象を治療するための方法および／または組成物に関する。対象には、ヒト、動物、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、および哺乳類が含まれるが、これに限定されない。方法および組成物には、対象に投与される１つ以上の裸または共役の標的の分子を含むことができる。好適な実施形態において、標的の分子は、キメラの、ヒト化またはヒト抗体または断片の任意のバリエーションを含む、抗体または抗体断片である。投与は、経口、経鼻、口腔、吸入、直腸、経膣、または局所等の、当分野で公知の任意の経路にすることができる。または、投与は、同所、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、動脈内、髄腔内または静脈内にすることができる。
【０００９】
当業者には、共役または非共役の、１つ以上のＨＩＶの標的の分子は、単体で、またはアジドチミジン、その他のヌクレオシド／ヌクレオチド逆転写酵素阻害薬、非核酸逆転写酵素阻害薬、ＨＩＶタンパク質分解酵素阻害剤および／または融合阻害薬等の、ＨＩＶ感染のためのその他の公知の治療と共に、投与することができることが理解されよう。特定の実施形態において、共役ＨＩＶ標的の分子は、ＨＡＡＲＴ（高活性抗レトロウィルス療法）と共に使用することができる。多くの抗ＨＩＶ治療薬が当分野において公知であり、エファビレンツ、ジドブジン、テノホビル、ラミブジン、エムトリシタビン、ディダノシン、アバカビル、スタブジン、ネビラピン、ロピナビル、リトナビル、アタザナビル、ホスアンプレナビル、インディナビル、ネルフィナビル、サクイナビルを、単体または組み合わせたものを含むがこれに限定されない、任意のこうした公知の薬剤を使用することができる。
【００１０】
いくつかの実施形態において、抗ＨＩＶ抗体または断片は、ハプテンまたは担体分子等の、ＨＩＶ抗原の少なくとも１つの結合部位および第２の標的の第２の結合部位を有する二重特異性または複数特異性抗体複合体の一部として、投与することができる。別の実施形態において、抗ＨＩＶ抗体または断片は、共有して結合する、または抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、Ｆｃ断片、Ｆｃ結合タンパク質または抗体結合タンパク質を有する融合タンパク質として提供することができる。
様々な実施形態において、抗ＨＩＶ抗体または断片は、共有架橋試薬の使用等、当分野で公知の方法によって、様々な部分に、共有でまたは非共有で接続することができる。カルボジイミド、ビスイミデート、スベリン酸のＮ―ヒドロキシスクシニミドエステル、ジメチル―３，３’―ジチオ―ビスプロピオンイミデート、アジドグリオキサール、ｌ，５―ジフルオロ―２，４―（ジニトロベンゼン）等の多くのこうした薬剤、およびタンパク質および／またはペプチドに使用する公知のその他の架橋剤を使用できる。
【００１１】
別の実施形態において、抗ＨＩＶ抗体または断片は、診断および／または画像化の標的のために付加物として使用できる。例えば、抗ＨＩＶ抗体または断片は、任意の公知の造影剤または検知剤と共にタグを付けたり、またはＥＬＩＳＡ等の公知のメソドロジを使って検知することができる。抗ＨＩＶ抗体または断片は、残留ＨＩＶ感染を検知するために、例えば、組織部分の免疫組織化学法により、生体外で使用することができる。または、抗ＨＩＶ抗体または断片を、ＨＩＶ感染組織の生体内の検知のため、対象に投与することができる。こうした組成物および方法は、ＨＩＶ感染の存在を検知および／または診断するために、治療後の残留ＨＩＶ感染を監視するために、および／または抗ＨＩＶ療法の有効性を監視するために、使用することができる。
【００１２】
以下の図面は、本発明の一部を形成するものであり、本発明の特定の実施形態の特定の態様をさらに説明するために含まれている。この実施形態は、本明細書に記載されている詳細な説明と共に、１つ以上のこれらの図面を参照することで、より良く理解される。
【００１３】
特許、特許出願、記事、書籍、および学術論文を含むがこれに限定されない、本発明で言及されている文書全体、または文書の一部が、本明細書によって、その全体を参照として明示的に組み込まれている。
【００１４】
定義
本明細書において、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、項目が１つではなく、１つ以上のという意味になり得る。
【００１５】
本明細書において、「および」と「または」という用語は、接続または選言的に意味するために使用され得る。すなわち両用語は、特に説明されているのでない限り、「および／または」に相当するものとして理解すべきである。
【００１６】
本明細書において、「約」は、ある数のプラスまたはマイナス１０パーセント以内を意味する。例えば、「約１００」は、９０および１１０の間の任意の数を意味する。
【００１７】
「抗体」は、本明細書で記載されているように、完全な長さの（すなわち、自然に生ずる、または通常の免疫グロブリン遺伝子の断片の組み換え過程によって形成される）免疫グロブリン分子（例：ＩｇＧ抗体）または免疫学的に活性化された（すなわち、特異的に結合する）部分または抗体断片のような免疫グロブリン分子の類似体を指す。
【００１８】
「抗体断片」は、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ等の抗体の一部である。構造に関係なく、抗体断片は、操作されていない抗体によって認識される同じ抗原と結合する。「抗体断片」という用語は、複合体を形成するために特定の抗原に結合することによって抗体様の働きをする、任意の合成または遺伝子的に操作されたタンパク質をさらに含む。例えば、抗体断片は、重鎖および軽鎖の可変領域で成る「Ｆｖ」断片、軽いおよび重い可変領域がペプチドのリンカー（「ｓｃＦｖタンパク質」）で接続されている遺伝子組み換え一本鎖ポリペプチド分子、および超可変領域に類似したアミノ酸残基で成る最小認識（ＣＤＲ）単位等の、可変領域で成る分離断片を含む。
【００１９】
「治療薬剤」とは、病気の治療に有効である原子、分子、または化合物である。治療薬の例には、抗体、抗体断片、薬物、ウイルス静止剤、毒素、酵素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫賦活剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮ（ｓｉＲＮＡ）、キレート剤、ボロン化合物、感光剤、着色料、および放射性同位体が含まれる。その他の例示的な治療薬および使用法は、それぞれ本明細書に参照として組み込まれている、米国特許出願文書第２００５０００２９４５号、第２００４００１８５５７号、第２００３０１４８４０９号、および第２００５００１４２０７号に開示されている。
【００２０】
「中和抗体」または「中和抗体断片」は、本明細書では、感染性因子（ウィルス等の）と反応する抗体または断片を指すために用いられており、伝染力および／または毒性を無効化および阻害する。
【００２１】
「診断薬剤」とは、病気の診断に有用な原子、分子または化合物である。有用な診断薬には、放射性同位体、着色料（ビオチン―ストレプトアビジン複合体等の）、造影剤、蛍光化合物または分子および（例：常磁性イオン）磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）のための造影剤を含むが、これに限定されない。
【００２２】
「免疫抱合体」は、原子、分子、またはより高次の構造（例：担体、治療薬、または診断薬を有する）を有する結合分子（例：抗体成分）の共役である。
【００２３】
「裸抗体」とは、任意のその他の薬剤に共役されていない抗体である。
【００２４】
「担体」とは、標的細胞へのこうした薬剤の送達を促進するための治療用または診断用薬剤に関連付けることができる原子、分子またはより高次の構造である。担体は、脂質（例：より高次の構造を形成することができる両親和性脂質）、多糖類（デキストラン等）、タンパク質、ペプチド、ペプチド類似物質、ペプチド誘導体またはミセル、リポゾーム、またはナノ粒子等のその他のより高次の構造を含むことができる。特定の実施形態において、担体は、例えばタンパク質またはペプチド内の自然発生的なＬ―アミノ酸にＤ―アミノ酸を置き換えることによって、タンパク質分解のまたはその他の酵素の分解が起きにくいように設計することができる。
【００２５】
本明細書において、「抗体融合タンパク質」という用語は、同一または異なる特異性を有する２つ以上の同一または異なるｓｃＦｖまたは抗体断片がリンクされている、遺伝子組み換えで生成される抗原結合分子を指す。融合タンパク質の価数は、単一の抗原またはエピトープに対して融合タンパク質が有する結合アームまたは部位の数、すなわち、一価、二価、三価または多価を示す。抗体融合タンパク質の価の高さは、抗原に対する結合において複数の相互作用を利用できる、つまり、抗原に対する結合の親和力が強いことを示す。特異性は、抗体融合タンパク質が結合可能な抗原またはエピトープの数、すなわち、単一特異性、二重特異性、三重特異性、複数特異性を示す。これらの定義を用いると、自然抗体（例：ＩｇＧ）は２つの結合アームを有するため二価であるが、１つのエピトープに結合されるため単一特異性である。単一特異的、多価の融合タンパク質はエピトープの１つよりも多い結合部位を有するが、１つのこうしたエピトープに結合するにすぎない、例えば二重抗体は、同じ抗原に反作用を示す２つの結合部位を有する。融合タンパク質は、単一の抗体成分、多価または異なる抗体成分の複数特異性の組み合わせ、または複数の同じ抗体成分複製を含むことができる。融合タンパク質はさらに、抗体または抗体断片および治療薬を含むことができる。こうした融合タンパク質に適した治療薬の例には、免疫賦活剤（「抗体―免疫賦活剤融合タンパク質」）および毒素（「抗体―毒素融合タンパク質」）が含まれる。１つの好適な毒素にはリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、好適には遺伝子組み換えＲＮａｓｅが含まれる。
【００２６】
「二重特異性抗体」とは、異なる構造の２つの標的に対して同時に結合することができる抗体である。この二重特異性抗体および二重特異性抗体断片は、例えば、ＨＩＶエンベロープタンパク質に特異的に結合する少なくとも１つのアーム、および治療のまたは診断薬を伝達する標的にすることが可能な共役に特異的に結合する少なくとも１つのその他のアームを有する。
【００２７】
本明細書に記載されている抗体または免疫抱合体の生成、または組成物は、投与量が生理的に意義がある場合に「治療有効量」で投与されると言われている。その存在により服用者の哺乳類の生理機能に検知可能な変化が表れる場合、薬剤は生理的な意義を持つ。特に、その存在によって、ＨＩＶ感染細胞が低減、阻害、または排除される、または非感染細胞のＨＩＶ感染が低減、阻害または排除される場合、抗ＨＩＶ抗体調剤は生理的な意義を持つ。
【００２８】
その投与が服用した患者に耐えられる場合、組成物は「薬剤的に容認可能な担体」であると言われる。無菌リン酸緩衝生理食塩水は、薬剤的に容認可能な担体の一例である。その他の適した担体が、当業者に公知である。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ‘Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、１９ｔｈ  Ｅｄ．（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．１９９５）、およびＧｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  ＴＨＥ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＢＡＳＩＳ  ＯＦ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ（Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｄｓ．Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８０  ａｎｄ  ２００１  ｅｄｉｔｉｏｎｓ）を参照されたい。
【００２９】
用いられている略称は以下の通りである。
ＡＢＳ、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含有する酢酸ナトリウム緩衝液
ＡＤＣＣ、抗体依存の細胞の細胞毒性
ＤＴＴ、ジチオスレイトール
ＥＬＩＳＡ、酵素結合免疫吸着剤アッセイ
ＡＲＴ、抗レトロウィルス療法
ＨＩＶ、ヒト免疫不全ウイルス
Ｍａｂ、モノクローナル抗体
ＭｕＬＶ、マウス白血病ウイルス
ＰＢＭＣ、末梢血単核細胞
ＴＣＩＤ５０、５０％組織培養感染量
【００３０】
抗体
様々な実施形態は、ＨＩＶの１つ以上の抗原またはエピトープに対する抗体リガンドに関する。好適な実施形態において、抗原またはエピトープは、ＨＩＶエンベロープタンパク質等のＨＩＶ感染した細胞の表面に露曝しているものである。様々な抗体を基にした構造および断片を作成および使用する技術が、当分野で公知である。抗体を作成および特性化する手段がさらに、当分野で公知である（例：Ｈａｒｌｏｗｅ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照）。使用する抗体はさらに幅広い様々な公知の提供元から市販されているものを入手可能である。例えば、様々な抗体分泌ハイブリドーマ系が、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から市販されている。
【００３１】
モノクローナル抗体
好適な実施形態はＰ４／Ｄ１０抗体の使用に関するものにすることができるが、その他の抗ＨＩＶ抗体を入手、作成および／または使用することができる。ＨＩＶに対する様々な抗体が報告されており、特定の実施形態において、任意のこうした公知の抗ＨＩＶ抗体を利用することができる。例えば、それぞれ本明細書に参照として組み込まれている、４Ｅ１０（Ｒｏｓａ  ｅｔ  ａｌ、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２：１６３―７３、２００５）、２Ｆ５（Ｂｒｙｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、８：４１３―１８、２００１）、３Ｄ６（Ｒｕｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６４６：２１２―１９、１９９１）、Ｃ３７（Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．、ＤＮＡおよびＣｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１２：８３６―４１、２００４）、ＩＡＣＹ、１Ｆ５８、ＩＧＧＧＣ（Ｂｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、４５：２８１―８２、２００１）、２Ｇ１２（Ａｒｍｂｒｕｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５４：９１５―２０、２００４）である。別の実施形態において、モノクローナル抗体は、米国特許第４，１９６，２６５号に例示されているもの等の、公知の技術の利用によって、容易に産生することができる。典型的には、この技術には、選択した免疫原組成物への適した動物の免疫付与が含まれる。マウスおよびラット等のげっ歯類の細胞が好適である。マウスはより好適であり、これは最も日常的に使用されており、概して、より高い割合の安定した融合が得られるため、ＢＡＬＢ／ｃマウスが最も好適である。
【００３２】
免疫付与後、抗体を生成することのできる体細胞、詳細にはＢリンパ球（Ｂ細胞）が、Ｍａｂ生成プロトコルで使用されるように選択される。これらの細胞は、生検を行った脾臓、扁桃腺またはリンパ節、または末梢血サンプルから入手可能である。多くの場合、一群の動物が免疫付与され、最も高い抗体力価を有する動物の脾臓は除去され、脾臓のリンパ球が、注射器によって、脾臓を均質化することで入手される。典型的には、免疫付与されたマウスの脾臓は、約５×１０７から２×１０８のリンパ球を含む。
【００３３】
免疫付与された動物からの抗体生成Ｂリンパ球は、次に、不滅の骨髄腫細胞の細胞と、概して、同じ種の１つを、免疫付与された動物として融合される。ハイブリドーマ生成融合手順において使用するために適している骨髄腫細胞系は、好適には、非抗体産生であり、高い融合効率および、所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの成長を支持する特定の選択培地における成長ができない、酵素欠乏を有する。
【００３４】
当業者に公知であるように、多くの骨髄腫細胞の任意の１つを使用することができる。例えば、免疫付与された動物はマウスにすることができ、Ｐ３―Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３―Ｘ６３―Ａｇ８．６５３、ＮＳｌ／ｌ．Ａｇ  ４  １、Ｓｐ２１０―Ａｇｌ４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ―１ｌ、ＭＰＣ１１―Ｘ４５―ＧＴＧ  １．７およびＳ１９４／５ＸＸ０  Ｂｕｌを使用することができ、ラットには、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３―Ａｇ  １．２．３、ＩＲ９８３Ｆおよび４Ｂ２１０およびＵ―２６６、ＧＭ１５００―ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ―ＬＯＮ―ＨＭｙ２を使用することができ、ＵＣ７２９―６は、細胞融合との結合に全て有用である。
【００３５】
抗体産生の脾臓またはリンパ節細胞および骨髄腫細胞のハイブリッドを生成する方法には、通常、２：１の比率で体細胞と骨髄腫細胞を混在させているが、細胞膜の融合を促進する薬剤（化学的または電気的）が存在する場合にそれぞれ、比率は、約２０：１から約１：１に変化させることができる。Ｓｅｎｄａｉウイルスを使用した融合方法、および３７％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ等のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用した融合方法について記載されている。また、電気的に誘導される融合方法の使用も適切である。
【００３６】
融合手順は、通常、約１×１０−６から１×１０−８の低い周波数において実行可能なハイブリッドを産生する。しかし、実現可能な融合ハイブリッドは、選択培地に培養されることによって、親の非融合細胞（特に、通常無限に分裂を続ける非融合の骨髄腫細胞）と区別されているため、これによって問題は生じない。選択培地は、一般的に、組織の培地のヌクレオチドの新規の合成物質をブロックする薬剤を含むものである。例示的な薬剤は、アミノプテリン、メトトレキサート、およびアザセリンである。アミノプテリンおよびメトトレキサートは、プリンおよびピリミジンの双方の新規の合成物質をブロックし、一方で、アザセリンはプリン合成物質のみをブロックする。アミノプテリンまたはメトトレキサートが使用される場合、培地は、ヌクレオチド（ＨＡＴ培地）のソースとしてヒポキサンチンおよびチミジンで強化される。アザセリンを使用している場合、培地はヒポキサンチンで強化される。
【００３７】
好適な選択培地はＨＡＴである。ヌクレオチドのサルベージ経路を操作することのできる細胞のみが、ＨＡＴ培地において生存することができる。骨髄腫細胞は、サルベージ経路の主要な酵素、例えばヒポキサンチンホスホリボシル転移酵素（ＨＰＲＴ）において欠陥があり、生存することができない。Ｂ細胞はこの経路を操作することができるが、培地における寿命は限られており、一般的に、２週間以内で死滅してしまう。従って、選択培地において生存する細胞は、骨髄腫およびＢ細胞から形成されるハイブリッドのみである。
【００３８】
この培養により、特定のハイブリドーマが選択されたハイブリドーマの個体数が得られる。典型的には、ハイブリドーマの選択は、所望の反応度のために個々のクローン上清を試験した後（約２、３週間後）、マイクロタイタープレートにおける１回の希釈によって、細胞を培養することで実行される。アッセイは、ラジオイミュノアッセイ、酵素免疫アッセイ、細胞毒性アッセイ、血小板アッセイ、ドット免疫結合アッセイ等、高感度、単純かつ素早くすべきである。
【００３９】
次に選択されたハイブリドーマは、連続的に希釈し、個々の抗体産生細胞系に複製され、こうして複製はＭａｂｓを提供するために無限に増殖することが可能である。細胞系は、２つの基本的な方法でＭａｂを産生するために利用することができる。ハイブリドーマのサンプルを、（多くの場合、腹腔に）本来の融合のために体および骨髄腫細胞を提供するために使用された種類の組織適合の動物に注入することができる。注入された動物は、融合された細胞雑種によって産生されるモノクローナル抗体に特異な腫瘍の分泌を発現させる。血清または腹水等の動物の体液は、次に、高い濃度のＭａｂｓを提供するために液体を出すことができる。個々の細胞系はさらに生体内で培養され、こうして、高い濃度で容易に入手することができる培地へと、Ｍａｂｓが自然に分泌される。各手段によって産生されたＭａｂｓは、好適には、ＨＰＬＣまたは親和性クロマトグラフィー等のろ過、遠心分離、および様々なクロマトグラフ法を用いて、さらに純化することができる。
【００４０】
抗体断片の産生
請求された方法および／または組成物のいくつかの実施形態は、抗体断片に関する場合がある。こうした抗体断片は、従来の方法による抗体全体のペプシンまたはパパインによる消化によって得られる。例えば、抗体断片は、Ｆ（ａｂ’）２と示される５Ｓ断片を提供するためにペプシンによって抗体の酵素の分裂によって産生することができる。この断片は、さらにチオール還元剤、また、任意に、３．５ＳＦａｂ’一価断片を産生するために、ジスルフィド結合の分裂によって生じたスルフヒドリル基の保護基を使って、分裂させることができる。または、ペプシンを用いた酵素の分裂によって、２つの一価Ｆａｂ断片およびＦｃ断片が産生される。抗体断片を産生するための例示的な方法が、米国特許番号第４，０３６，９４５号、米国特許番号第４，３３１，６４７号、Ｎｉｓｏｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ、１９６０、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、８９：２３０；Ｐｏｒｔｅｒ、１９５９、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、７３：１１９；Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９６７、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、４２２ページ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、およびＣｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）、１９９１、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）に開示されている。
【００４１】
無傷の抗体によって認識される抗原へと断片が結合される限り、一価軽鎖―重鎖の断片を形成するための重鎖の分断等の、抗体を切断するその他の方法、さらに断片またはその他の酵素の分断、化学または遺伝子技術を、さらに使用することができる。例えば、Ｆｖ断片はＶＨおよびＶＬ鎖の関連を含む。この関連は、Ｉｎｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６９：２６５９に記載されているように、非共有にすることができる。または、可変鎖を、分子間ジスルフィド結合によってリンクする、またはグルタルアルデヒド等化学的に架橋することができる。Ｓａｎｄｈｕ，１９９２，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１２：４３７を参照されたい。
【００４２】
好適には、Ｆｖ断片は、ペプチドリンカーによって接続されるＶＨおよびＶＬ鎖を含む。これらの単一の鎖の抗原結合タンパク質（ｓＦｖ）は、オリゴヌクレオチドリンカー配列によって接続されるＤＮＡ配列塩コーディングＶＨおよびＶＬ領域を含む構造的遺伝子を構築することによって生成される。構造的遺伝子は、大腸菌等の宿主細胞にそれ以降導入される発現ベクターに挿入される。遺伝子組み換え宿主細胞は、２つのＶ領域を架橋するリンカーペプチドによって、単一のポリペプチド鎖を合成する。ｓＦｖｓを産生する方法が当分野で公知である。Ｗｈｉｔｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１、Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２：９７；Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３；米国特許番号第４，９４６，７７８号；Ｐａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．、１９９３、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１：１２７１、およびＳａｎｄｈｕ、１９９２、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１２：４３７を参照されたい。
【００４３】
その他の形態の抗体断片は、補体決定領域（ＣＤＲ）のためのペプチドコーディングである。ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）は、対象の抗体の遺伝子塩コーディングＣＤＲを構築することで得られる。こうした遺伝子を、例えば、抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成するためのポリメラーゼ鎖反応を使用することによって、生成することができる。Ｌａｒｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１、Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２：１０６；Ｒｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）、１９９５、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ、ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＡＮＤ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ、１６６―１７９ページ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｂｉｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．、（ｅｄｓ．）、１９９５、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：  ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ、１３７―１８５ページ（Ｗｉｌｅｙ―Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．）を参照されたい。
【００４４】
キメラおよびヒト化抗体
キメラ抗体は、例えば、ヒト抗体の可変領域を、例えば、マウスの抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、マウスの抗体の可変領域によって置き換えた、遺伝子組み換えタンパク質である。キメラ抗体は、対象に投与される場合に、免疫原性の減少、および安定性の向上がもたらされる。キメラ抗体を構成するための方法が、当分野で公知である（例：Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １３：４６９）。
【００４５】
キメラモノクローナル抗体を、マウスのＣＤＲをマウスの免疫グロブリンの重軽可変鎖からヒト抗体の対応する可変領域へと移動させることによってヒト化することができる。キメラモノクローナル抗体のマウスのフレームワーク領域（ＦＲ）はさらに、ヒトのＦＲ配列で置き換えられる。ヒト化モノクローナルの安定性および抗原特異性を保存するために、１つ以上のヒトのＦＲ残基を、マウスの相当する残基で置き換えることができる。ヒト化モノクローナル抗体は、対象の療法的な治療に利用することができる。標的のためのヒト化抗体の親和性は、さらに、ＣＤＲ配列（ＷＯ００２９５８４Ａ１）の選択された修正によって向上させることができる。ヒト化モノクローナル抗体の産生のための技術が、当分野で公知である。（例：Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、１９８８、３３２：３２３；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ‘ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４２８５；Ｓａｎｄｈｕ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１９９２、１２：４３７；Ｔｅｍｐｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：２６６；Ｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．、１９９３、１５０：２８４４．を参照。）
【００４６】
別の実施形態は、ヒト以外の霊長類の抗体に関することができる。例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．、ＷＯ  ９１／１１４６５（１９９１）、およびＬｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４６：  ３１０（１９９０）において、ヒヒの治療的に有用な抗体を生成するための一般的な技術が示されている。
【００４７】
ヒト抗体
別の実施形態において、抗体はヒトのモノクローナル抗体にすることができる。こうした抗体は、抗原的な問題に対して特異的なヒト抗体を賛成するために操作されている遺伝子組み換えマウスから得ることができる。この技術において、ヒトの重鎖および軽鎖の遺伝子座のエレメントが、内生の重鎖および軽鎖の遺伝座の標的の崩壊を含む、胚幹細胞系に由来するマウスのストレインに導入される。遺伝子組み換えマウスは、ヒトの抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、マウスを、ヒト抗体分泌ハイブリドーマを産生するために用いることができる。遺伝子組み換えマウスからヒト抗体を得るための方法が、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ  ７：１３（１９９４）、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６（１９９４）、およびＴａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９（１９９４）に記載されている。
【００４８】
組み合わせ法またはヒト免疫グロブリン遺伝座によって変形された遺伝子組み換え動物を用いて、ヒト抗体を完全に産生する方法が、当分野で公知である（例：それぞれ本明細書に参照として組み込まれている、Ｍａｎｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００４、Ｎｅｗ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２７：３１５―２８、Ｃｏｎｒａｄ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｌｌｅｒ、２００５、Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ。８：１１７―２６、Ｂｒｅｋｋｅ  ａｎｄ  Ｌｏｓｅｔ、２００３、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ＰＨａｍａｃｏｌ．３：５４４―５０）。こうした完全なヒト抗体は、キメラまたはヒト抗体よりも副作用が少なく、また、本質的に内生のヒトの交代として生体内で機能すると考えられている。特定の実施形態において、請求される方法および手順は、こうした技術によって産生されるヒトの交代を利用することができる。
【００４９】
ある別の実施形態において、ファージ提示技術を、ヒト抗体を生成するために使用できる（例：本明細書に参照として組み込まれている、Ｄａｎｔａｓ―Ｂａｒｂｏｓａ  ｅｔ  ａｌ、２００５、Ｇｅｎｅｔ．Ｍｏｌ．Ｒｅｓ．４：１２６―４０）。ヒト抗体を、通常のヒト、またはＨＩＶ感染またはＡＩＤＳ等の特定の病状を抱えるヒトから生成することができる。病気の個人からヒト抗体を生成する利点は、循環抗体の範囲を病気に関連する抗原に対する抗体へとバイアスすることができる、ということである。
【００５０】
この方法論の１つの非制限的な例において、Ｄａｎｔａｓ―Ｂａｒｂｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）は、骨肉種患者から、ヒトのＦａｂ抗体断片のファージ提示ライブラリを生成した。概して、循環血リンパ球（Ｉｄ．）から全ＲＮＡが得られた。遺伝子組み換えＦａｂは、μ、γおよびκ鎖抗体の範囲からクローン化され、ファージ提示ライブラリ（Ｉｄ．）に挿入された。ＲＮＡは、ｃＤＮＡに変換され、重鎖および軽鎖の免疫グロブリン配列に対する特異的なプライマーを用いて、Ｆａｂ  ｃＤＮＡライブラリを作成する（本明細書に参照として組み込まれている、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１―９７）。ライブラリ構築は、Ａｎｄｒｉｓ―Ｗｉｄｈｏｐｆ  ｅｔ  ａｌ．によって行われた。（本明細書に参照として組み込まれている、２０００，Ｉｎ：Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  ９．１から９．２２ページ）最終的なＦａｂ断片は、制限エンドヌクレアーゼによって消化され、ファージ提示ライブラリを作成するためにバクテリオファージゲノムに挿入された。こうしたライブラリは、バイオパニング等の標準的なファージ提示方法によってスクリーニングすることができる。当業者は、この技術は例示的であるにすぎないこと、また、ファージ提示によってヒト抗体または抗体断片を作成およびスクリーニングするための任意の公知の方法を利用できることが理解されよう。
【００５１】
別の実施形態において、ヒト抗体を産生するために遺伝子的に操作された遺伝子組み換え動物を使って、上記で述べた標準的な免疫付与プロトコルを使った任意の免疫原の標的に対する抗体を生成することができる。こうした系統の非制限的な例は、Ａｂｇｅｎｉｘ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）によるＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）（例：Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１―２３）である。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）および同様の動物において、マウスの抗体遺伝子は不活性化され、機能的ヒト抗体遺伝子で置き換えられているが、マウスの免疫系のその他の部分は操作されていない。
【００５２】
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）は、付属遺伝子および調節塩基配列に沿って大部分の可変領域配列を含む、ヒトＩｇＨおよびＩｇｋａｐｐａ遺伝子座の部分を含有する、生殖細胞で構成されたＹＡＣ（酵母人工染色体）によって変換された。ヒトの可変領域の範囲を使用して、公知の技術によるハイブリドーマに処理可能な抗体産生Ｂ細胞を生成することができる。標的抗原によって免疫を付与されたＸｅｎｏ  Ｍｏｕｓｅ（登録商標）は、上述した標準的な技術によって得られるおよび／または生成することができる通常の免疫反応によって、ヒト抗体を生成する。それぞれ、様々な分類の抗体を産生することができる、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）の様々なストレインが利用可能である。こうしたヒト抗体は、化学的な架橋のまたはその他の公知の方法論によって、他の分子に結合可能である。通常のヒト抗体の薬物動態的な性質を保持しつつも治療の可能性を有するよう、遺伝子組み換えにより産生されたヒト抗体が示されている（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。当業者は、請求される組成物および方法はＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系の使用に制限されず、ヒト抗体を生成するために遺伝子的に操作された任意の遺伝子組み換え動物を利用することができることを、理解されるであろう。
【００５３】
中和抗体
特定の実施形態において、ＨＩＶの感染力および／または毒性を壊滅または阻害することができる中和抗体またはその断片が好適である。様々なＨＩＶ中和抗体が当分野で公知であり、Ｐ４／Ｄ１０、２Ｇ１２（例：Ｊｏｏｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ２００６、５０：１７７３―７９）、４Ｅ１０（Ｊｏｏｓ  ｅｔ  ａｌ．、２００６）、２Ｆ５（Ｊｏｏｓ  ｅｔ  ａｌ．、２００６）、ｂｌ２（例：Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ２００６、８０：２５８５）、Ｘ５（Ｍｏｕｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ２００２、９９：６９１３―１８）または任意のその組み合わせを含むがこれに限定されない、これらの任意の公知の抗体またはその断片を使用できる。複数特異性抗体または断片が使用される場合、当業者は、同じまたは異なるＨＩＶエピトープに結合される複数の抗体または断片を組み合わせることができることを理解されるであろう。ＨＩＶエンベロープタンパク質（ｇｐｌ２０）および／またはｇｐ４１に対する抗体は好適であるが、当業者は、ＨＩＶ感染した細胞を標的にする抗体またはその断片を発現させるためにその他のＨＩＶ標的抗原を利用できることが理解されよう。一部の場合では、Ｔ細胞抗原（例：ＣＤ４、ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４）と組み合わせられた１つ以上のＨＩＶ抗原に結合する抗体または断片を利用できる。
【００５４】
融合タンパク質
様々な実施形態が、融合タンパク質に関する。これらの分子は、一般的に、第２のポリペプチドまたはタンパク質の全てまたは一部へと、ＮまたはＣ末端でリンクされる、ペプチドの全てのまたは重要な部分を有する。例えば、融合は、異種宿主のタンパク質の遺伝子組み換え発現を可能にするため、その他の種からのリーダー配列を利用することができる。別の有用な融合には、ペプチドまたはタンパク質毒性または酵素等の治療用薬剤への、抗体または断片等の免疫学的に活性化した領域の結合が含まれる。しかし、その他の有用な形態の融合には、ＦＬＡＧエピトープ等の、生成のために使用する部分の結合を含むことができる（Ｐｒｉｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ、１９８９、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７：５８０―５８９、Ｃａｓｔｒｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ、１９９２、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６６：４６４７―４６５３）。融合タンパク質を生成する方法が当業者に公知である。例えば、二官能価の架橋試薬を使った化学的結合、完全融合タンパク質の新規の合成、または操作されていない融合タンパク質の発現後の、第１のタンパク質またはペプチドをエンコーディングするＤＮＡ配列の第２のペプチドまたはタンパク質をエンコーディングするＤＮＡ配列への結合によって、こうしたタンパク質を生成することができる。
【００５５】
二重特異性抗体
特定の実施形態において、二重特異性または複数特異性抗体または断片を利用可能である。こうした抗体または断片は、例えば、治療用のおよび／または診断用の薬、サイトカイン、細胞表面受容体またはその他の抗原に共役された担体分子に対して、ＨＩＶに関連する抗原の少なくとも１つの結合部位および少なくとも１つのその他の結合部位を含む。
【００５６】
一般的に、遺伝子組み換えＤＮＡ技術によって生成された抗体の別々のＶＨおよびＶＬ領域は、結合能力を有するダイマー（遺伝子組み換えＦｖ断片）を形成するために、互いに対になることができる（米国特許番号第４，６４２，３３４号）。しかし、こうした、非共有で関連する分子は、任意の実用的な利用を得るための生理的な条件下において十分に安定していない。同族のＶＨおよびＶＬ領域を、結合作用を有する単一の―鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を形成するために、適切な組成物および長さ（通常、１２よりも多いアミノ酸残基で成る）のペプチドリンカーによって結合することができる。ｓｃＦｖｓの生成方法は、米国特許番号第４，９４６，７７８号および米国特許番号第５，１３２，４０５号に開示されている。ペプチドリンカーの長さを１２アミノ酸残基未満に縮小することにより、同じ鎖上のＶＨおよびＶＬの領域の対が予防され、別の鎖において相補的な領域を有するＶＨおよびＶＬの領域の対が強制されることになり、こうして、機能的多重結合体が形成される。３から１２のアミノ酸残基の間のリンカーによって結合されるＶＨおよびＶＬの領域のポリペプチド鎖によって、圧倒的多数のダイマーが形成される（二重抗体といわれる）。０および２のアミノ酸残基の間にリンカーがある場合、トリマー（三重抗体といわれる）およびテトラマー（四重抗体といわれる）が好適であるが、オリゴマー化の正確なパターンは、組成物、および、リンカー長さに加えて、Ｖ領域（ＶＨ―リンカー―ＶＬまたはＶＬ―リンカー―ＶＨ）の方向に依存しているようである。
【００５７】
複数の価数を有する単一特異的二重抗体、三重抗体、および四重抗体を、５アミノ酸残基またはそれ未満を含むペプチドリンカーを使用して得た。それぞれｓｃＦｖが短いペプチドリンカーによって接続されている１つの抗体から、その他の抗体のＶＬ領域へのＶＨ領域を構成している、本明細書中では２つの異なるｓｃＦｖｓのダイマーである二重特異性二重抗体は、さらに、ＶＨ１―リンカー―ＶＬ２を含むあるシストロン遺伝子組み換え遺伝子構造においてシストロン発現ベクターを、また、ＶＨ２―リンカー―ＶＬ１を含む第２の遺伝子組み換え遺伝子構造において他のシストロン発現ベクターを含むジシストロン発現ベクターを使って、生成されている（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ、ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９３；９０：６４４４―６４４８；Ａｔｗｅｌｌ、ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６；３３：１３０１―１３０２；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ、ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７；１５：６３２―６３１；Ｈｅｌｆｒｉｃｈ、ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．１９９８；７６：２３２―２３９；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ、ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．１９９８；７７：７６３―７７２；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ、ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９９；５９：２９０９―２９１６）。
【００５８】
より最近になって、二重の特異性を有する四価タンデム二重抗体（ｔａｎｄａｂと呼ばれる）も報告されている（Ｃｏｃｈｌｏｖｉｕｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０００；６０：４３３６−４３４１）。二重特異性ｔａｎｄａｂは、自己関連において２つの異なる特異性のそれぞれについて、２つの可能性のある結合部位の形成に役立つような向きにリンクされた２つの異なる抗体（ＶＨ１、ＶＬ１、ＶＨ２、ＶＬ２）の４つの可変領域をそれぞれが含む、２つの同一のポリペプチドのダイマーである。
【００５９】
リンカー長さを変更することによる、多価および複数特異性のｓｃＦｖベースの薬剤の製造方法が、米国特許番号第５，８４４，０９４号、米国特許番号第５，８３７，２４２号、および第ＷＯ９８／４４００１号に開示されている。１つは少なくとも２つの抗体からのＶＨ領域を含み、もう一方は対応するＶＬ領域を含む、２つのポリペプチド鎖を構成することによる、多価および複数特異性のｓｃＦｖベースの薬剤の製造方法が、米国特許番号第５，９８９，８３０号および米国特許番号第６，２３９，２５９号に開示されている。ＣＨｌのｃ末端およびＦＶのＣＬは、それぞれ同じまたは異なるモノクローナル抗体に由来するｓｃＦｖに融合される、遺伝子組み換えにより生成された二重特異性または三重特異性の抗体が、米国特許番号第６，８０９，１８５号に開示されている。
【００６０】
二重特異性および複数特異性抗体の構築および利用のための方法が、例えば、２００４年１１月２日に出願された、その全文が本明細書に参照として組み込まれている、米国特許出願文書番号第２００５０００２９４５号に開示されている。二重特異性抗体および抗体断片を生成するために様々な遺伝子組み換え方法を使用することができる。例えば、遺伝子組み換えした家畜のミルクにおいて二重特異性抗体および抗体断片を生成することができる。（例：それぞれ本明細書に参照として組み込まれている、Ｃｏｌｍａｎ、Ａ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｓｙｍｐ．、６３：１４１―１４７、１９９８、米国特許番号第５，８２７，６９０号を参照。）それぞれ、ＤＮＡ断片のコーディングが免疫グロブリン重鎖および軽鎖の対となっている、２つのＤＮＡ構成が生成される。その断片は、哺乳類の上皮細胞に優先的に発現するプロモーター配列を含む発現ベクターにクローン化される。例には、ウサギ、ウシおよびヒツジのカゼインの遺伝子、ウシのアルファラクトグロブリン遺伝子、ヒツジのベータラクトグロブリン遺伝子、およびマウスのホエイ酸タンパク質遺伝子からのプロモーターが含まれるが、これに限定されない。好適には、挿入された断片は、哺乳類に特異的な遺伝子の同族ゲノム配列によって、その３’の側面に位置する。これにより、ポリアデニル化部位および転写安定化配列がもたらされる。この発現カセットは、受精した哺乳類の卵子の前核に注入され、こうして、受精したメスの子宮に移植され、妊娠させられる。誕生後、その子孫は、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分析によって、両トランス遺伝子の存在をスクリーニングされる。抗体が存在するようにするには、重鎖および軽鎖遺伝子の双方を同じ細胞において同時に発現させる必要がある。遺伝子組み換えしたメスからのミルクは、当分野で公知の標準的な免疫論理方法を用いて、抗体または抗体断片の存在および機能性について分析される。抗体は、当分野で公知の標準的な方法を用いて、ミルクから精製することができる。
【００６１】
事前標的
二重特異性抗体で使用するためのある戦略に、二重特異性抗体が投与された後でエフェクター分子を対象に投与する事前標的の方法論が含まれる。ＨＩＶ抗原の結合部位および１つ以上のエフェクター分子に共役される担体の結合部位を含む二重特異性抗体は、病変組織の位置を特定し、病変組織へのエフェクターの局所化の特異性を増大させる（米国特許出願第２００５０００２９４５号）。エフェクター分子を、二重特異性抗体よりもずっと素早く循環からクリアにすることができるため、エフェクター分子が病変標的抗体に直接リンクしている場合よりも、事前標的の戦略が使用されている場合に通常の組織は、エフェクター分子に対する曝露を少なくすることができる。
【００６２】
事前標的の方法が、検知薬または治療薬の標的バックグラウンド比率を向上させるために開発されている。事前標的のおよびビオチン／アビジンのアプローチの例が、例えば、その全てが本明細書に参照として組み込まれている、Ｇｏｏｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ、米国特許番号第４，８６３，７１３号、Ｇｏｏｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２９：２２６、１９８８、Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２８：１２９４、１９８７、Ｏｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２９：７２８、１９８８、Ｋｌｉｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２９：１９５１、１９８８、Ｓｉｎｉｔｓｙｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３０：６６、１９８９、Ｋａｌｏｆｏｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３１：１７９１、１９９０、Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４８：１６７、１９９１、Ｐａｇａｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：５９６０、１９９１、Ｐａｇａｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２：２１１、１９９１、米国特許番号第５，２５６，３９５号、Ｓｔｉｃｋｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：６６５０、１９９１、Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：３１１９、１９９１、米国特許番号第６，０７７，４９９号、米国シリアル番号第０９／５９７，５８０号、米国シリアル番号第１０／３６１，０２６号、米国シリアル番号第０９／３３７，７５６号、米国シリアル番号第０９／８２３，７４６号、米国シリアル番号第１０／１１６，１１６号、米国シリアル番号第０９／３８２，１８６号、米国シリアル番号第１０／１５０，６５４号、米国特許番号第６，０９０，３８１号、米国特許番号第６，４７２，５１１号、米国シリアル番号第１０／１１４，３１５号、米国仮出願番号第６０／３８６，４１１号、米国仮出願番号第６０／３４５，６４１号、米国仮出願番号第６０／３３２８，８３５号、￥米国仮出願番号第６０／４２６，３７９号、米国シリアル番号第０９／８２３，７４６号、米国シリアル番号第０９／３３７，７５６、および米国仮出願番号第６０／３４２，１０３号に記載されている。
【００６３】
特定の実施形態において、病変組織の治療および／または画像化において、例えば、それぞれ本明細書に参照として組み込まれている、米国特許第６，１２６，９１６号、第６，０７７，４９９号、第６，０１０，６８０号、第５，７７６，０９５号、第５，７７６，０９４号、第５，７７６，０９３号、第５，７７２，９８１号、第５，７５３，２０６号、第５，７４６，９９６号、第５，６９７，９０２号、第５，３２８，６７９号、第５，１２８，１１９号、第５，１０１，８２７号および第４，７３５，２１０号に記載された方法の使用において、二重特異性抗体および標的可能な構成を使用することができる。さらなる方法が、１９９９年６月２２日に出願された、米国出願シリアル第０９／３３７，７５６号、および２００１年４月３日に出願された、米国出願シリアル第０９／８２３，７４６号に記載されている。
【００６４】
ドックおよびロック（ＤＮＬ）
特定の実施形態において、二重特異性の抗体または断片、または抗体または断片の共役を、公知の技術を用いて、ドックおよびロック（ＤＮＬ）として組み立てることができる。ＤＮＬ技術のさらなる詳細は、それぞれ、全文が本明細書に参照として組み込まれている、２００５年３月２４日に出願された米国特許出願シリアル第１１／３８９，３５８号、２００６年３月２８日に出願された第１１／３９１，５８４号、２００６年６月２９日に出願された第１１／４７８，０２１号、２００７年６月２１日に出願された第１１／６３３，７２９号、および２００６年１１月６日に出願された米国仮特許出願シリアル第６０／８６４，５３０号に説明されている。
【００６５】
要約すると、ＤＮＬ技術は、例えば、ｃ―ＡＭＰ依存のタンパク質キナーゼＡ、および、ＰＫＡのＲサブユニットとの関連を媒介する様々なＡ―キナーゼ固着タンパク質（ＡＫＡＰ）内で見られる固着領域の標準的サブユニットの、ダイマー化およびドッキング領域（ＤＤＤ）等の２つ以上の相補配列間の標的の結合を含む。しかし、当業者には、その他のダイマー化およびドック領域および固着領域が公知であり、任意のこうした公知の領域を、請求される対象事項の範囲内で利用できることが理解されよう。その他の例示的な４らせんバンドルタイプのＤＤＤ領域を、ｐ５３、ＤＣｏＨ（プテリン４アルファカルビノラミン脱水酵素／肝細胞核因子１アルファ（ＴＣＦｌ）のダイマー化共因子）およびＨＮＦ―Ｉ（肝細胞核因子１）から得ることができる。利用が可能なその他のＡＤ配列が、全文が本明細書に参照として組み込まれている、特許出願シリアル番号第ＵＳ２０００３／０２３２４２０Ａ１号に記載されている。
【００６６】
これらの相補結合対は、決定された特異性および活性の治療用または診断用の複合物を形成する、抗体または抗体断片等の様々な機能的ユニットに、または治療用または診断用の薬に対して、共有結合することができる。当業者は、例えばＡＤまたはＤＤＤの配列を、公知の結合特異性と共にＦａｂ、Ｆａｂ’、ＩｇＧ、ｓｃＦｃまたはその他の抗体または断片を含む融合タンパク質に組み込むことにより、こうした複合体を形成できる複数の方法が存在することを理解されるであろう。例えば、二重特異性複合体を、ＡＤおよびＤＤＤ配列を２つの異なる標的抗原に特異な抗体または断片に組み込むことで、形成することができる。または、ＤＤＤまたはＡＤの部分に結合する抗体または断片を、相補的なＡＤまたはＤＤＤの部分に結合する、ホルモン、酵素、リボヌクレアーゼ、オンコナーゼまたはその他の薬剤等の治療用タンパク質またはペプチドと組み合わせることができる。多くのこうした可能性のある複合体が、上記の患者の応用例において記載されており、任意のこうした公知の複合体を利用することができる。
【００６７】
抗ＨＩＶ抗体への、治療薬または診断薬の共役
様々な実施形態において、治療薬を、ＨＩＶ感染細胞の送達のために、抗ＨＩＶ抗体、断片またはその他の標的となる分子に共役することができる。使用する治療薬には、アピリジン、アザリビン、アナストロゾール、アザシチジン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブリオスタチン−１、ブスルファン、カリケアマイシン、カンプトセシン、１０―ヒドロキシカプリン酸、カルムスチン、セレブレックス、クロラムブシル、シスプラチン、イリノテカン（ＣＰＴ―１１）、ＳＮ―３８、カルボプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノマイシングルクノニド、ダウノルビシン、ドキソルビシン、２―ピロリノドキソルビシン（ｐｙｒｒｏｌｉｎｏｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎｅ）（２Ｐ−ＤＯＸ）、シアノ―モルホリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エピルビシングルクロニド、エストラムスチン、エトポシド、エトポシドグルクノニド、リン酸エトポシド、フロクスウリジン（ＦＵｄＲ）、３’，５’―Ｏ―ジオレオイル−ＦｕｄＲ（ＦＵｄＲ−ｄＯ）、フルダラビン、フルタミド、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、Ｌ−アスパラギナーゼ、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、フェニル酪酸塩、プロカルバジン、ペントスタチン、ＰＳＩ―３４１、セムスチン、ストレプトゾシン、タキサン、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、ベルケイド、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンクリスチン、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ、オンコナーゼ、ｒａｐＬＲｌ、ＤＮａｓｅ  Ｉ、ブドウ球菌性エンテロトキシン−Ａ、ヤマゴボウ抗ウイルス性タンパク質、ゲロニン、ジフテリアトキシン、シュードモナスエクソトキシン、シュードモナスエンドトキシン、アンチセンスオリゴヌクレオチド、干渉ＲＮＡまたはその組み合わせを含むことができる。
【００６８】
さらなる部分を、本明細書に記載されているＨＩＶ標的の分子に共役にすることができる。例えば、薬物、毒素、放射線化合物、酵素、ホルモン、細胞毒性タンパク質、キレート、サイトカイン、およびその他の機能薬剤を、ＨＩＶ標的の分子に対して共役にすることができる。共役は、例えば、その側鎖においてアミン基、カルボキシル基、チオール基またはヒドロキシル基を含むアミノ酸残基へ共有結合によるものにすることができる。例えば、ジイソシアネート、ジイソチオシアネート、ビス（ヒドロキシスクシニミド）エステル、カルボジイミド、マレイミド―ヒドロキシスクシニミドエステル、グルタルアルデヒド等の、様々な従来のリンカーをこの目的のために使用できる。ＨＩＶ標的の分子への薬剤の共役は、好適には、非組み換え構造に比較して、結合活性または特異性に大きな影響を及ぼさない。さらに、細胞毒性および／またはウイルス静止剤は、まずはポリマー担体に結合することができ、次にＨＩＶ標的の分子に共役する。この方法については、本明細書に参照として組み込まれている、Ｒｙｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７５：３８６７―３８７０、１９７８、米国第４，６９９，７８４号および米国第４，０４６，７２２号を参照されたい。
【００６９】
本明細書に記載されている共役は、抗体を脂質、炭水化物、タンパク質、放射性核種、またはその他の原子および分子にリンクさせるための公知の方法によって、生成することができる。例えば、本明細書に記載されているＨＩＶ標的の分子は、共有で、非共有で、またはその他の方法で、治療用のまたは診断用の薬を組み込むことができる共役を形成するために、本明細書に記載されている１つ以上の担体（例：脂質、ポリマー、リポゾーム、ミセル、またはナノ粒子）にリンクさせることができる。または、任意の本明細書に記載されているＨＩＶ標的の分子は、本明細書に記載されている１つ以上の治療用のまたは診断用の薬と直接共役にすることができる。
【００７０】
例えば、ＨＩＶ標的の分子は、１３１Ｉで標識化することができ、また、脂質に共役し、生じた共役でリポゾームが形成されるようにすることができる。リポゾームは、１つ以上の治療の（例：ＦＵｄＲ―ｄＯ等の薬）または診断の薬を組み込むことができる。リポゾームおよびミセルの形成は当分野で公知である。例：Ｗｒｏｂｅｌ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  ＢｉｏｐＨｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（１９９５）、１２３５：２９６―３０４；Ｌｕｎｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９９）、５１：１０９９―１１０５；Ｌｕｎｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｔ．Ｊ．ＰＨａｒｍ．（２０００）、２０５：１０１―１０８；Ｌｕｎｄｂｅｒｇ、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．（１９９４）、８３：７２―７５；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．（２００２）、１：３３７―３４６；Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．（２００３）、１００：６０３９―６０４４；Ｕ．Ｓ．５，５６５，２１５；Ｕ．Ｓ．６，３７９，６９８、およびＵ．Ｓ．２００３／００８２１５４を参照されたい。
【００７１】
薬物の送達または画像化に有用な、ポリマー、シリカ、または金属から形成されるナノ粒子またはナノカプセルについても、記載されている。例：Ｗｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ、Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｔｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０００）、１１：２１５―２１７、Ｕ．Ｓ．５，６２０，７０８、Ｕ．Ｓ．５，７０２，７２７、およびＵ．Ｓ．６，５３０，９４４を参照されたい。治療のまたは診断薬のための標的の担体を形成するための、リポゾームへの抗体または結合分子の共役が説明されている。例：Ｂｅｎｄａｓ、Ｂｉｏｄｒｕｇｓ（２００１）、１５：２１５―２２４、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ（２００２）、１：３３７―３４６；Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．（２００３）、１００：６０３９―６０４４、Ｂａｌｌｙ、ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．（１９９８）、８：２９９―３３５、Ｌｕｎｄｂｅｒｇ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．（１９９４）、１０９：７３―８１、Ｌｕｎｄｂｅｒｇ、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９７）、４９：１６―２１；Ｌｕｎｄｂｅｒｇ、Ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ（１９９８）、１３：４５３―４６１を参照されたい。さらに、１９９９年６月９日に出願された、米国番号第６，３０６，３９３号、米国シリアル番号第１０／３５０，０９６号、米国シリアル番号第０９／５９０，２８４号、および米国シリアル番号第６０／１３８，２８４号を参照されたい。これらの全ての参照は本明細書に参照として組み込まれている。
【００７２】
幅広い様々な診断用のおよび治療用の薬は、ＨＩＶ標的の分子の共役を形成するために有利に利用することができるか、またはＨＩＶ標的の分子における認識部位に結合するハプテンにリンクさせることができる。診断用薬剤には、放射性同位体、ＭＲＩに使用する造影剤または超音波画像化のための造影剤、および蛍光化合物を含むことができる。多くの適切な画像化剤が、タンパク質またはペプチドへの結合のための方法として、当分野で公知である（共に本明細書に参照として組み込まれている、例：米国特許第５，０２１，２３６号および第４，４７２，５０９号を参照）。特定の結合方法には、例えば、有機キレート剤タンパク質またはペプチドに結合したこうしたＤＴＰを使用する金属キレート複合体の使用を含む（米国特許第４，４７２，５０９号）。
【００７３】
ＨＩＶ標的の分子に放射性金属または常磁性イオンを取り込むためには、放射性金属または常磁性イオンを結合するためのキレート基の複数の複製が結合している担体で、これと最初に反応することが必要になる場合がある。こうした担体は、この目的で有用であることが公知の、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ポルフィリン、ポリアミド、クラウンエーテル、ビス―チオセミカルバゾン、ポリオキシム等の、ポリリシン、多糖類、またはキレート基を結合可能なペンダント基を有する誘導体化あるいは誘導体化可能なポリマー物質にすることができる。キレートを含有する担体は、免疫反応の凝集および損失を最小限にするように、標準的な化学的方法を使用して、ＨＩＶ標的分子に結合される。
【００７４】
こうした共役の生成のために適用可能な、その他の、より変わった方法および試薬が、その全体が参照として本明細書に組み込まれている、米国第４，８２４，６５９号に開示されている。特に、有用な金属とキレートの組み合わせには、６０から４，０００ｋｅＶの一般的なエネルギー範囲で診断用の同位元素と共に使用される、２―ベンジル―ＤＴＰおよびそのモノメチルおよびシクロヘキシル類似体が含まれる。いくつかの有用な診断的な核種には、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４Ｔｃ、９４ｍＴｃ、９９ｍＴｃ、または１１１Ｉｎを含むことができる。本明細書に記載されているＨＩＶ標的の分子および担体と共に使用する場合、マンガン、鉄およびガドリニウム等の非放射性金属と複合された同じキレートが、ＭＲＩで有用である。ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、およびＴＥＴＡ等の大環状のキレートが、様々な金属および放射能金属と共に、特にそれぞれ、ガリウム、イットリウムおよび銅の放射性核種と共に使用される。こうした金属とキレートの複合体は、対象となる金属の輪の大きさに合わせて調整されることによって、非常に安定させることができる。２２３Ｒａを複合させるための大環状のポリエーテル等のその他の輪タイプのキレートを使用できる。
【００７５】
治療薬は、例えば、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、エピポドフィロトキシン、タキサン、代謝拮抗物質、アルキル化剤、抗生物質、Ｃｏｘ―２阻害物質、抗有糸分裂剤、抗血管由来およびアポトーシス誘導剤等の化学的治療薬、特にドキソルビシン、メトトレキサート、タクソール、ＣＰＴ―１ｌ、カンプトテシン、ならびにこれらのおよびその他の細胞毒性薬の分類のその他のものが含まれる。その他の細胞毒性薬には、ナイトロジェンマスタード、アルキルスルフォン酸塩、ニトロソウレア、トリアジン、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、プラチナ配位錯体等が含まれる。適した細胞毒性薬は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ‘Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、１９ｔｈ  Ｅｄ．（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．１９９５）、およびＧＯＯＤＭＡＮ  ＡＮＤ  ＧＩＬＭＡＮ’Ｓ  ＴＨＥ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＢＡＳＩＳ  ＯＦ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ、７ｔｈ  Ｅｄ．（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．１９８５）、およびこれらの文書の改訂版に記載されている。実験的薬剤等のその他の適した細胞毒性薬が当業者に公知であり、当分野で公知の方法を用いて、本明細書に記載されたＨＩＶ標的の分子に共役することができる。
【００７６】
その他の治療薬分類は、α粒子（２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ等）、β粒子（３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、８９Ｓｒ、９０Ｙ、１１１ＡＡ  ｇ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｈｏ、１６６Ｄｙ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ，１８９Ｒｅ等）またはオーガー電子（１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、６７Ｇａ、１９１Ｏｓ、１９３ｍＰｔ、１９５ｍＰｔ、１９５ｍＨｇ等）を発する放射性核種から成る。ＨＩＶ標的の分子は、診断用薬について説明しているように、方法を使って上記の１つ以上の放射性核種で標識化することができる。
【００７７】
特定の実施形態において、使用する治療薬は、１つ以上のアグリゾーム阻害物質を含むことができる。アグリゾームは、異常な折りたたみ構造のタンパク質に対して形成すると考えられている大きな細胞間複合体である（例：Ｈｅａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５３：４４９―５５、２００１、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４３：１８８３―９８、１９９８、Ｗｉｌｅｍａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１２：８７５―７８、２００６を参照）。より最近では、アグリゾームはウイルスの粒子（Ｈｅａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．、２００１、Ｗｉｌｅｍａｎ、２００６）の組み立てにおいて働くことができることが示唆されている。従って、アグリゾーム阻害物質は、ＨＩＶまたはその他のウイルスに感染した細胞からの新たな感染性ウイルスの粒子の形成をブロックまたは阻害するよう機能する。様々なアグリゾーム阻害物質は、ＡＬＬＮ、ノコダゾール、コルヒチンおよびビンブラスチン（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８）、その他の微小管阻害物質（ＧｅｒｄｅｓおよびＫａｔｓａｎｉｓ、Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１４：Ｒ２９１―３００、２００５）、ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ）（Ｃａｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ  １０８：３４４１―４９、２００６）、ｔｕｂａｃｉｎ、ヒストン脱アセチル化酵素阻害物質（Ｃｏｒｃｏｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１４：４８８―９２、２００４）等が公知であり、任意のこうした公知のアグリゾームは阻害するか、または使用することができる。
【００７８】
様々な実施形態において、１つ以上の免疫賦活剤を、患者への投与のために抗ＨＩＶ抗体または断片へ共役することができるか、または、患者に同時投与することができる。本明細書において、「免疫賦活剤」という用語は、インターロイキン、コロニー刺激因子、インターフェロン（例：インターフェロンα、βおよびγ）等のサイトカイン、幹細胞成長因子、リンパ毒素および造血因子、「Ｓｌ因子」と呼ばれる幹細胞成長因子を含む。適した免疫賦活剤の部分の例には、ＩＬ―２、ＩＬ―６、ＩＬ―１０、ＩＬ―１２、ＩＬ―１８、ＩＬ―２１、インターフェロン―ガンマ、ＴＮＦ―アルファ等が含まれる。
【００７９】
「サイトカイン」という用語は、細胞間媒介物質としてその他の細胞上で作用する１つの細胞集団によって放出されるタンパク質またはペプチドを指す遺伝子用語である。本明細書で幅広く用いられているように、サイトカインの例には、リンフォカイン、モノカイン、成長因子および従来のポリペプチドホルモンが含まれる。サイトカインには、ヒトの成長ホルモン、Ｎ―メチオニルのヒトの成長ホルモン、およびウシの成長ホルモン等の成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、チロキシン、インシュリン、プロインシュリン、レラキシン、プロレラキシン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）等の糖タンパク質ホルモン、肝臓成長因子、プロスタグランジン、繊維芽細胞成長因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、ＯＢタンパク質、腫瘍壊死因子―αおよび―β、ミューラー阻害物質、マウスのゴナドトロピン関連ペプチド、インヒビン、アクティビン、血管内皮性成長因子、インテグリン；トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、ＮＧＦ―β等の神経成長因子、血小板成長因子、ＴＧＦ―αおよびＴＧＦ―β等の変換成長因子（ＴＧＦ）、インシュリン様成長因子―Ｉおよび―ＩＩ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、骨誘導因子、インターフェロン―α、インターフェロン―β、インターフェロン―γ等のインターフェロン、マクロファージ―ＣＳＦ（Ｍ―ＣＳＦ）、顆粒球―マクロファージ―ＣＳＦ（ＧＭ―ＣＳＦ）、顆粒球―ＣＳＦ（Ｇ―ＣＳＦ等のコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、ＩＬ―１、ＩＬ―ｌα、ＩＬ―２、ＩＬ―３、ＩＬ―４、ＩＬ―５、ＩＬ―６、ＩＬ―７、ＩＬ―８、ＩＬ―９、ＩＬ―１０、ＩＬ―１ｌ、ＩＬ―１２；ＩＬ―１３、ＩＬ―１４、ＩＬ―１５、ＩＬ―１６、ＩＬ―１７、ＩＬ―１８、ＩＬ―２１、ＬＩＦ、Ｇ―ＣＳＦ、ＧＭ―ＣＳＦ、Ｍ―ＣＳＦ、ＥＰＯ、キット―配位子またはＦＬＴ―３等のインターロイキン（ＩＬ）、アンギオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子およびＬＴ等が含まれる。本明細書において、サイトカインという用語には、自然源からのまたは遺伝子組み換え細胞培養によるタンパク質および元の配列のサイトカインの生物学的に活性な同等物が含まれる。
【００８０】
ケモカインは、一般的に、免疫エフェクター細胞をケモカイン発現部位に編成するために、化学的誘引物質として働く。治療部位に対する他の免疫系構成要素の編成を強化するために、例えば、サイトカイン遺伝子と組み合わせて、特定のケモカイン遺伝子を発現させることが有利である場合がある。ケモカインは、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＭＩＰ１アルファ、ＭＩＰ１ベータ、およびＩＰ１０を含むが、これに限定されない。当業者は、特定のサイトカインはさらに、化学的誘引物質の効果を有し、ケモカインという用語で分類することもできることを理解されよう。同様に、免疫賦活剤およびサイトカインは、各員において重複する。
【００８１】
検知可能なラベル（例：蛍光分子）、またはウイルス静止性および／または細胞毒性薬、（例：放射性ヨウ素）を含む適したペプチドは、共有で、非共有で、またはＨＩＶ標的の分子と関連するようにすることができる。例えば、感光剤または着色剤をＨＩＶ標的の分子に組み込むことにより、治療的に有用な共役を得ることができる。適切な光を病巣に当てることによって病巣を検知および治療するため、フルオロクロム等の蛍光組成物、およびその他の色原体、または可視光に反応するポルフィリン等の着色料が使用されている。治療において、これは、光線照射、光線療法、または光線力学療法と呼ばれている。Ｊｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）、ＰＨＯＴＯＤＹＮＡＭＩＣ  ＴＨＥＲＡＰＹ  ＯＦ  ＴＵＭＯＲＳ  ＡＮＤ  ＯＴＨＥＲ  ＤＩＳＥＡＳＥＳ（Ｌｉｂｒｅｒｉａ  Ｐｒｏｇｅｔｔｏ  １９８５）、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇｈ、Ｃｈｅｍ．Ｂｒｉｔａｉｎ（１９８６）、２２：４３０を参照されたい。さらに、モノクローナル抗体は、光線療法を実行するための光活性化した着色料と結合されている。Ｍｅｗ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８３），１３０：１４７３、ｉｄｅｍ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９８５）、４５：４３８０；Ｏｓｅｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ（１９８６）、８３：８７４４、ｉｄｅｍ．、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．（１９８７）、４６：８３、Ｈａｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．（１９８９）、２８８：４７１、Ｔａｔｓｕｔａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｌａｓｅｒｓ  Ｓｕｒｇ．Ｍｅｄ．（１９８９）、９：４２２；Ｐｅｌｅｇｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ（１９９１）、６７：２５２９を参照されたい。
【００８２】
アプタマー
別の実施形態において、開示された組成物および方法は、アプタマー等の、抗体または抗体断片に対する別の形態の結合分子を利用することができる。アプタマーは典型的には、選択された標的分子に抗体様の結合親和性および特異性を提供する３次元構造を適用可能な合成オリゴヌクレオチドである。アプタマーの結合特徴を構成および決定する方法が分野で公知である。例えば、こうした技術は、本明細書に参照として組み込まれている、米国特許第５，５８２，９８１号、第５，５９５，８７７号および第５，６３７，４５９号に記載されている。
【００８３】
アプタマーは、合成、遺伝子組み換え、および精製方法を含む任意の公知の方法で作成することができ、単体で、同じ標的に特定のその他のリガンドと共に、使用することができる。一般的に、特異的な結合を有効にするために、少なくとも約３のヌクレオチド、好適には少なくとも５のヌクレオチドが必要である。１０、２０、３０または４０のヌクレオチドのアプタマーが好適であるが、１０塩基よりも短い配列のアプタマーが適している場合がある。
【００８４】
アプタマーは結合特異性を与える配列を含む必要があるが、側面領域に延伸することができる、またそうでない場合には被膜することができる。好適な実施形態において、アプタマーの結合配列はプライマー結合配列によって挟むことができ、これは、ＰＣＲまたはその他の増幅技術によるアプタマーの増幅に役立つ。さらなる実施形態において、側面配列には、基質へのアプタマーの固定化を強化させるための部分を優先的に認識または結合する特異的な配列を含むことができる。
【００８５】
アプタマーは、従来のＤＮＡまたはＲＮＡ分子として、分離、配列、および／または増殖または合成することができる。または、対象のアプタマーは組み換えを行ったオリゴマーを含むことができる。通常、アプタマー内に存在する任意のヒドロキシル基は、ホスホン酸基、リン酸基によって置換したり、標準的な保護基で保護したり、またはその他のヌクレオチドへのさらなる結合を生成するよう活性化されたり、あるいは固体支持に共役するようにすることができる。１つ以上のリン酸ジエステル結合を、Ｐ（Ｏ）Ｓ、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ、またはＣＮＲ２で置換したＰ（Ｏ）Ｏ等の別の結合基で置換することができる、ここでＲはＨまたはアルキル（１―２０Ｃ）およびＲ’はアルキル（１―２０Ｃ）であり、さらに、この基はＯまたはＳによって隣接するヌクレオチドに結合可能である。オリゴマーの全ての結合を同一にする必要はない。
【００８６】
それぞれ参照として組み込まれている、例えば米国特許番号第５，４７５，０９６号および米国特許番号第５，２７０，１６３号等の、特定の対象となる標的に結合するアプタマーの生成およびスクリーニングの方法が公知である。技術には概して、候補アプタマーの混合および結合の段階的な反復、非結合アプタマーからの分離、および増殖からの選択を含む。最も高い親和性のアプタマーに相当する少数の配列のみ（恐らくはアプタマーの１つの分子のみ）が混合物内に存在するため、混合物内のアプタマーの高い容量（約５―５０％）が、分離時においても保持されるよう、分割基準を設定することが一般的に望ましい。各サイクルによって、標的のための高い親和性を有するアプタマーが濃縮される。高い親和力および標的に対する特異性を持って結合する、３から６つの選択および増殖のサイクルの繰り返しを用いることができる。アプタマーは、当分野で公知の標準的な核酸標識化技術によって治療薬に共役することができる。
【００８７】
アビマー
特定の実施形態において、開示されている組成物または方法は、１つ以上のアビマー配列を利用することができる。アビマーは、様々な標的分子に対する親和性および特異性において抗体と類似した結合タンパク質の一種類である。これは、生体内のエキソンシャッフリングおよびファージ提示法によって、ヒトの細胞外受容体領域から成長する。（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００５、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２３：１４９３―９４；Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００６、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ。  ２４：２２０。）生成された複数領域タンパク質は、単一エピトープ結合タンパク質と比較して高い親和力（場合によってはサブナノモル）および特異性を示すことができる、複数の結合領域を含むことができる。（Ｉｄ．）様々な実施形態において、アビマーは、本明細書に記載されている標準的なタンパク質架橋または標識化の技術を用いた、請求されている方法および組成物で使用する治療薬に結合することができる。例えば、それぞれ、例のセクションが本明細書に参照として組み込まれている、米国特許出願文書番号第２００４０１７５７５６号、第２００５００４８５１２号、第２００５００５３９７３号、第２００５００８９９３２号および第２００５０２２１３８４号において、アビマーの構築および利用の方法に関するさらなる詳細が開示されている。
【００８８】
処方および投与
その共役を含む、ＨＩＶ標的の分子はさらに、１つ以上の薬剤的に適した賦形剤、１つ以上のさらなる構成要素、またはこれらのいくつかの組み合わせを含む組成物を得るように編成できるこれらは薬剤的に有用な用量を生成するために公知の方法によって行うことができ、これにより、活性構成要素（すなわち、ＨＩＶ標的の分子または共役）は、１つ以上の薬剤的に適した賦形剤と共に混合物中に混合される。無菌リン酸緩衝生理食塩水は、薬剤的に適した賦形剤の一例である。その他の適した賦形剤が当業者に公知である。例：Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ、５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｌｅａ  ＆  Ｆｅｂｉｇｅｒ  １９９０）  ａｎｄ  Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．）、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ‘Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９０）、およびその改訂版を参照されたい。
【００８９】
本明細書に記載の組成物のある投与経路は、非経口注入である。非経口投与において、その組成物は、薬剤的に容認可能な溶液、懸濁液またはエマルジョン等の注入可能な形態の単位用量で、賦形剤に関連して、編成される。こうした賦形剤は、本質的に、非毒性および非治療的であるこうした賦形剤の例は、生理食塩水、Ｒｉｎｇｅｒの溶液、デキストロース溶液、およびＨａｎｋの溶液である。揮発性油、オレイン酸エチル等の非水性の賦形剤も使用できる。好適な賦形剤は、生理食塩水に５パーセントのデキストロースを混合したものである。賦形剤は、緩衝液および保存剤を含む、等張性および化学的安定性を向上させる物質等の、少量の添加物を含むことができる。経口投与を含む、その他の投与方法も検討されている。
【００９０】
ＨＩＶ標的分子を含む編成された組成物を、例えば、ボーラス注入または継続的注入による静脈内投与のために使用できる。注入のための組成物は、防腐剤を加え、アンプルまたは複数用量容器において、単位用量形態で示すことができる。油性または水性の賦形剤における懸濁液、溶液またはエマルジョンの形態を取ることもでき、懸濁化剤、安定剤および／または分散剤等の形成用の薬剤を含むことができる。あるいは、使用前に無菌の発熱物質なしの水等の適切な賦形剤によって、組成物は、構成のために粉状にすることができる。
【００９１】
組成物は、溶液で投与することができる。溶液のｐＨは、ｐＨ５から９．５の範囲に、好適にはｐＨ６．５から７．５の範囲にするべきである。溶液の編成は、リン酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン―ＨＣｌまたはクエン酸等の適切な薬剤的に容認可能な緩衝液を有する溶液にするべきである。緩衝液濃度は１から１００ｍＭの範囲にするべきである。編成された溶液はさらに、濃度５０から１５０ｍＭの塩化ナトリウムまたは塩化カリウム等の塩を含有することもできる。グリセロール、アルブミン、グロブリン、浄化剤、ゼラチン、プロタミンまたはプロタミン塩をさらに含有することができる。編成された組成物の全身への投与は、ヒト化の形態の抗体をＨＩＶ標的の分子のテンプレートとして使用する場合、典型的には、２日または３日ごとに、または１週間に１回行われる。または、毎日の投与が有用である。通常、投与は、筋肉内注入または血管内注入によるものである。
【００９２】
組成物は、哺乳類の皮下に、またはその他の非経口経路によって、投与することができる。さらに、投与は、継続注入または一回のみまたは複数回のボーラス注入にすることができる。抗体または免疫抱合体に有効な方法を、本明細書に記載の組成物に適用することができる。一般的に、投与する免疫抱合体、融合タンパク質、またはヒトの裸抗体の用量は、患者の年齢、体重、身長、性別、一般的な健康状態および過去の病歴等の因子によって変動する。状況によってはよりの低用量または高用量も投与可能であるが、典型的に、１回の静脈内注入として、１ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇの範囲の活性材料の用量を被験者に与えることが望ましい。この用量を、例えば、４週から１０週間にわたって週一回、好適には８週間にわたって週一回、およびより好適には、４週間にわたって週一回等、必要に応じて繰り返すことができる。さらに、数ヶ月間にわたって一週間おき等の、より低い頻度で与えることもできる。用量は、用量およびスケジュールの適切な調節を行って、様々な非経口の経路で与えることができる。
【００９３】
免疫抱合体または抗体の作用の期間を制御するために使用される薬剤の方法を、本明細書に記載されている形成された組成物に適用することができる。注入制御による生成は、複合体への生体適合性のあるポリマーの使用によって行うことができ、または、例えば、ポリ（エチレン―共―ビニルアセテート）の基質およびステアリン酸ダイマーポリ無水物コポリマーおよびセバシン酸の基質等の、免疫抱合体または裸抗体を吸収する。Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）、１０：１４４６を参照されたい。こうした基質からの免疫抱合体または抗体の注入速度は、免疫抱合体または抗体の分子重量、免疫抱合体の量、基質内の抗体、および分散粒子の大きさに依存する。上記のＳａｌｔｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ（１９８９）、５５：１６３；Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい。その他の固体用量の形態が、Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ、５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｌｅａ  ＆  Ｆｅｂｉｇｅｒ  １９９０）、およびＧｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．）、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９０）およびその改訂版に記載されている。
【００９４】
治療のために、治療有効量の組成物を哺乳類に投与する。非ヒトの動物の対象もさらに検討されるが、本明細書に開示されている治療用および診断用の方法に適した対象は通常ヒトである。
【００９５】
肺への局所的送達を行うために、組成物を噴霧器によって投与することができる。水性の噴霧器または非水分の（例：過フッ化炭化水素噴射）懸濁液のいずれかを使用することができる。ソニック噴霧器は、好適には、剪断する組成物におけるＨＩＶ標的分子の曝露を最小限にするためにエアロゾルを作成するために使用され、これによって、活性の低下および消失がもたらされる可能性がある。
【００９６】
放射性核種にリンクされているＨＩＶ標的分子は、治療に有効な場合がある。対象において１つ以上の感染部位にＨＩＶ標的の分子が配置されたと判断された後で、標識化された組成物のより高用量、一般的に、それぞれ７０ｋｇの患者の体重を基にした、１３１Ｉの各用量につき２０ｍＣｉから１５０ｍＣｉ、９０Ｙの各用量につき５ｍＣｉから３０ｍＣｉ、または１８６Ｒｅの各用量につき５ｍＣｉから２０ｍＣｉが注入される。注入は静脈内、動脈内、リンパ内、髄腔内、または腔内（すなわち、非経口）にすることができ、繰り返すことができる。複数の、分割された用量を投与すると、通常の組織の曝露においてそれに伴う増加に通常、影響せずに、より高い中毒量を提供できるため、いくつかの療法に有利である場合がある。
【００９７】
また別の実施形態では、抗ＨＩＶ抗体または断片を、ＩｇＧｌのＦｃ（例３―７を参照）等の特定のタンパク質に共役することにより、経口または吸入投与のために操作することができる。ペプチドＦｃ共役の生成および利用の方法が、それぞれ本明細書に参照として組み込まれている、例えば、Ｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（２００５、Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．２０：１８０５―１３）およびＤｕｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００５、Ｊ．Ａｅｒｏｓｏｌ．Ｍｅｄ．１８：２９４―３０３）に開示されている。Ｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）は、ＣＨＯ細胞における遺伝子組み換え発現を使った、一本鎖におけるＩｇＧｌのＦｃ領域へのＦＳＨのアルファおよびベータのサブユニットまたはヘテロダイマーの形態の共役を開示している。Ｆｃ共役されたペプチドは、新生児のＦｃ受容体が媒介となる伝達系によって、肺または腸の上皮細胞を通って吸収された。Ｆｃで共役されたペプチドは、本来のペプチドと比較して、生体内の安定性および吸収性が向上した。さらに、ヘテロダイマー共役は、一本鎖の形態よりも活性が高いことが観察された。エリスロポエチン等のより大きいタンパク質は、さらに、Ｆｃ共役（Ｄｕｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）を使って、吸入によって有効に送達することができる。
【００９８】
治療および診断への利用：事前標的を含まない応用例
ＨＩＶ標的の分子にリンクされている、放射性および非放射性診断薬の利用が検討されてきた。適した非放射性診断薬とは、磁気共鳴画像装置（ＭＲＩ）で使用されるもの、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）または超音波で使用されるものである。ＭＲＩ用薬剤には、例えば、２―ベンジル―ＤＴＰＡの適したキレートと複合されているマンガン、鉄およびガドリニウムおよびそのモノメチルおよびシクロヘキシル類似体等の非放射性金属が含まれる。その全てが参照として組み込まれている、２００１年１０月１０日に出願された、米国シリアル第０９／９２１，２９０号を参照されたい。
【００９９】
ＨＩＶ標的の分子は、診断用の画像化に有用な放射性同位体によって標識化することができる。適した放射性同位体は、６０から４，０００ＫｅＶのエネルギー範囲のもの、またはより詳細には、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ  ９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、４５Ｔｉ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４−１５８Ｇｄ、１７７Ｌｕ、３２Ｐ、１８８Ｒｅ等またはその組み合わせを含むことができる。例：米国特許出願「Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇａｌｌｉｕｍ―６８”―Ｉｎｖｅｎｔｏｒｓ  Ｇ．Ｌ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ａｎｄ  Ｗ．Ｊ．ＭｃＢｒｉｄｅ」、および、画像化の目的のための１８Ｆ、６８Ｇａ、９４ｍＴｃ等の陽電子エミッタを開示する米国仮出願番号第６０／３４２，１０４号（本明細書に参照として組み込まれている）を参照されたい。例えば、単一光子発射のコンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）または陽電子発射断層撮影（ＰＥＴ）によって、検知を行うことができる。
【０１００】
別の実施形態において、ＨＩＶ標的の分子は、β―エミッタ（３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、８９Ｓｒ、９０Ｙ、１１１Ａｇ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｈｏ、１６６Ｄｙ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ等）、オーガー電子エミッタ（１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、６７Ｇａ、１９１Ｏｓ、１９３ｍＰｔ、１９５ｍＰｔ、１９５ｍＨｇ等）、α―エミッタ（２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ等）、またはその組み合わせを含む、ＨＩＶ感染した細胞を壊滅させるために有用な１つ以上の放射性同位元素でラベルすることができる。
【０１０１】
ＨＩＶ標的の分子を、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、エルビウム（ＩＩＩ）で成る群から選択された金属の複合体を含むことができる、１つ以上の画像処理剤にリンクさせることによって、ＭＲＩに使用することができる。同様に、ＨＩＶ標的の分子は、現在市販されている１つ以上の画像処理剤に結合させることによって超音波画像化に使用することができる。米国特許番号第６，３３１，１７５号は、ＭＲＩ技術およびＭＲＩ造影剤に対する共役された抗体の生成について記載しており、その全てが参照として組み込まれている。
【０１０２】
毒素等の機能タンパク質は、いくつかの方法で、ＨＩＶ標的の分子に存在することができる。例えば、機能タンパク質は、標準的な分子生物学的技術を使って、融合タンパク質として、抗ＨＩＶ抗体または断片に直接結合することができる。または、機能タンパク質は、公知の化学的架橋法によって、抗ＨＩＶ抗体または断片に共有で共役することができる。これに関して使用される毒素には、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅ  Ｉ、ブドウ球菌エンテロトキシン―Ａ、ヤマゴボウ抗ウイルスのタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス  外毒素、およびシュードモナス内毒素が含まれる。（それぞれ本明細書に参照として組み込まれている、例：Ｐａｓｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ（１９８６）、４７：６４１、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、ＣＡ―Ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ（１９９４）、４４：４３、Ｓｈａｒｋｅｙ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．５６：２２６（２００６）を参照）。本明細書の利用に適したさらなる毒素は、当業者に公知であり、その全てが参照として組み込まれている、米国第６，０７７，４９９号に開示されている。対象となるその他の機能タンパク質には、様々なサイトカイン、酵素、および蛍光タンパク質が含まれる。
【０１０３】
治療および診断への利用：事前標的を含む応用例
事前標的は、通常の組織、特に、骨髄への望ましくない毒の一因となっている、本来は、直接抗体を標的にする遅い血クリアランスを解決するために開発された、複数ステップのプロセスである。事前標的では、放射性核種またはその他の治療薬が、血から数分以内にクリアされる小型の複合物に接続される。標的抗体に加えて、小型の放射能で標識化された化合物を認識することができる事前標的をまず投与し、後で、事前標的剤が血から十分にクリアになると、放射能で標識化された化合物が投与される。
【０１０４】
対象において病気または不調を治療または診断するための事前標的の方法は、（１）上述したように、二重特異性のＨＩＶ標的分子を対象に投与し、ここでは、少なくとも１つの抗原結合部位がＨＩＶマーカーに向けられており、その他の抗原結合部位は二価ハプテンを含む価標的可能な構造に向けられており、（２）任意に対象に対してクリア組成物を投与し、組成物が循環から結合構造をクリアさせるようにし、（３）二価ハプテンを含む標的可能な構成を対象に投与し、この構成はさらに、１つ以上のキレートのまたは化学結合した治療薬または診断薬を含むことにより、提供される。様々なクリア剤および方法が当分野で公知であり、その他の薬剤と合成することができるＨＩＶ標的抗体（単糖結合抗体等）に対して、タグまたはラベル（例：単糖）のＨＩＶ標的抗体または結合によって合成される抗イディオタイプ抗体等を事前標的するために使用できる。クリア方法へのアビジン―ビオチンの結合相互作用の利用が、さらに当分野で公知である。
【０１０５】
さらに、抗体依存の酵素プロ薬物療法（ＡＤＥＰＴ）の方法も、ｂｙ（１）上記のようにＨＩＶ標的の分子を患者に投与し、構造にはプロ薬物を活性化できる共有で結合された酵素を含み、（２）対象に対しクリア組成物を任意に投与し、組成物によって循環から結合構造をクリアするようにし、（３）患者にプロ薬物を投与することによって、提供される。
【０１０６】
ＩＭＰ４１１標的可能構造
好適な実施形態において、標的とできる構造は１つ以上のヒスタミン―スクシニル―グリシン（ＨＳＧ）の部分を含むことができ、抗原結合部位は、６７９抗体または断片等の、ＨＳＧ結合抗体または断片に関連付けることができる（本明細書に参照として組み込まれている、例：米国特許番号第６，９６２，７０２を参照）。標的とできる構造は、公知の事前標的の技術（例：米国特許番号第６，９６２，７０２号）を用いて、任意の公知の診断用のおよび／または治療薬に共役にすることができる。２つのＨＳＧ部分を含む、ＩＭＰ４１１として公知の、例示的な標的とできる構成は、ＤＯＴＡ―Ｄ―Ｃｙｓ（３―ＳＰ―Ｇｌｙ―２０―Ｏ―ＳＮ３８）―Ｄ―Ａｌａ―Ｄ―Ｌｙｓ（ＨＳＧ）―Ｄ―Ｔｙｒ―Ｄ―Ｌｙｓ（ＨＳＧ）―ＮＨ２の式を有する。上記の式に示されているように、ＩＭＰ４１１は、例えば、ＳＮ３８化学療法薬にリンクすることができる。または、その他の治療用のまたは診断薬は、同じペプチド基幹に組み込む、または共役にすることができる。
【０１０７】
さらなる利用
特定の実施形態において、ＨＩＶ標的の分子は、例えば、それぞれ本明細書に参照として組み込まれている、米国特許第６，１２６，９１６号、第６，０７７，４９９号、第６，０１０，６８０号、第５，７７６，０９５号、第５，７７６，０９４号、第５，７７６，０９３号、第５，７７２，９８１号、第５，７５３，２０６号、第５，７４６，９９６号、第５，６９７，９０２号、第５，３２８，６７９号、第５，１２８，１１９号、第５，１０１，８２７号、および第４，７３５，２１０号に記載されている方法を用いて、ＨＩＶ感染した組織の治療および／または画像化に使用できる。さらなる方法が、１９９９年、６月２２日に出願された米国出願シリアル第０９／３３７，７５６号および２００１年４月３日に出願された米国出願シリアル第０９／８２３，７４６号に記載されている。こうした画像化は、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ」（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、２００６  ２４：８２３―３４）に記載されているように、ＨＩＶ標的の分子の直接のラベリング、または事前標的画像化方法によって実施することができ、さらに、それぞれ本明細書に参照として組み込まれている、米国特許文書第２００５０００２９４５号、第２００４００１８５５７号、第２００３０１４８４０９号、および第２００５００１４２０７号を参照されたい。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示および請求されているＨＩＶ標的の分子を、放射性核種療法または放射線免疫療法に使用することができる（それぞれ本明細書に参照として組み込まれている、例：Ｇｏｖｉｎｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００５、Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、４：３７５―９１；Ｓｈａｒｋｅｙ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、２００５、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４６：１１５Ｓ―１２７Ｓ；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００６、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２４：８２３―３４を参照）。
【０１０９】
別の実施形態では、放射線感受性増強物質を、裸のまたは共役されたＨＩＶ標的分子、抗体、または断片と組み合わせて使用することができる。例えば、放射線感受性増強物質を、放射線で標識化されたＨＩＶ標的分子と組み合わせて使用することができる。放射線感受性増強物質を追加すると、放射線で標識化されたＨＩＶ標的分子のみによる治療と比較して、効能を向上させることができる。放射線感受性増強物質は、本明細書に参照として組み込まれている、Ｄ．Ｍ．Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ（ｅｄ．），ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ  ＷＩＴＨ  ＲＡＤＩＯＬＡＢＥＬＥＤ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）に記載されている。
【０１１０】
任意の請求される方法で使用されるＨＩＶ標的分子は、サイトカインおよび免疫変調成分に関連付けるまたはこれと共に投与することができる。これらのサイトカインおよび免疫変調成分は、少なくとも、アルファ、ベータ、ガンマのインターフェロンとコロニー刺激因子とを含む。しかし、ＩＬ―Ｉ、ＩＬ―２、ＩＬ―３、ＩＬ―６、ＩＬ―１０、ＩＬ―１２、ＩＬ―１８、ＴＮＦ―α、幹細胞成長因子、リンパ毒素、エリスロポエチン、トロンボポイエチン、Ｇ―ＣＳＦ、ＧＭ―ＣＳＦ、Ｓｌ因子またはその組み合わせ等の、その他の免疫変調成分が公知であり、これを使用することができる。
【０１１１】
別の実施形態は、有効量のＨＩＶ標的の分子および標的可能な構造を投与することによる、対象内のＨＩＶ感染組織の血管内識別のための方法に関する。ＨＩＶ標的の分子は、ＨＩＶ抗原に特異的に結合する少なくとも１つのＡＢＳ、および、標的可能な構造に特異的に結合する少なくとも１つのＡＢＳを含む。
【０１１２】
キット
いくつかの実施形態は、請求された方法を実施するためのキットに関する。キットには、ＨＩＶ標的分子を含めることができる。標的の分子は、上記の任意の薬剤で標識化することができる。さらに、標的の分子はラベルを取り除くことができるが、キットは、ラベル標的の分子に対する試薬への標識化を含むことができる。試薬の標識化は、含まれる場合には、ラベルおよび架橋剤を含むことができる。キットはさらに、ＨＩＶ抗原に特異な少なくとも１つの抗体、および担体に特異な少なくとも１つの抗体を含むＨＩＶ標的の分子を含むことができる。キットは、任意に、ＨＩＶ標的の分子を循環から取り除くためのクリア組成物を含むことができる。
【０１１３】
キットの構成要素は一括して包装するか、または２つ以上の別々の容器に分けることができる。いくつかの実施形態において、容器は、再構成に適した組成物の無菌、凍結乾燥した構成を含むバイアルとすることができる。キットはさらに、その他の試薬の再構成および／または希釈に適した１つ以上の緩衝液を含むことができる。使用することのできるその他の容器には、袋、トレイ、箱、管等が含まれるが、これに限定されない。キットの構成要素は、容器内において無菌状態で包装および保持することができる。含むことができるその他の構成要素は、その利用のためのキットの使用者への説明書である。
【０１１４】
病変組織の検査、診断、および画像化方法
生体内診断
抗ＨＩＶ抗体または断片は、生体内診断に利用されている。標識Ｍａｂを用いた画像診断法は、周知である。例えば、抗ＨＩＶ抗体は、免疫シンチグラフィー技術で、ガンマ線放射性同位体で標識化され、患者に導入される。ガンマカメラが、ガンマ線放射性同位体の位置および分布の検知に使用される。例えば、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  （ｅｄ．），  ＲＡＤＩＯＬＡＢＥＬＥＤ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＦＯＲ  ＩＭＡＧＩＮＧ  ＡＮＤ  ＴＨＥＲＡＰＹ（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９８８）、Ｃｈａｓｅ，  “Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅｓ，”  ｉｎ  ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，  １８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  ｐｐ．  ６２４−６５２  （Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  １９９０）、およびＢｒｏｗｎ，  “Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”  ｉｎ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＰＨＡＲＭＡＣＹ  ２２７−４９，  Ｐｅｚｚｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．）  （Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ  １９９３）を参照されたい。５１１ｋｅＶのエネルギー等の、フッ素−１８（１８Ｆ）、ガリウム−６８（６８Ｇａ）、およびヨウ素−１２４（１２４Ｉ）等の陽電子放出核種（ＰＥＴアイソトープ）の使用もまた好ましい。このような画像化は、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ２４：８２３−３４で述べられているように、抗ＨＩＶ抗体または断片の直接標識により、または事前標的画像化法により、行われることが可能であり、また米国特許公報第２００５０００２９４５号、第２００４００１８５５７号、第２００３０１４８４０９号、および第２００５００１４２０７号も参照されたく、それぞれは参照として本明細書に組み込まれる。
【０１１５】
画像診断のために、放射性同位体は、媒介官能基を使用して直接または間接的のいずれかで、抗ＨＩＶ抗体または断片に結合されてよい。有用な媒介官能基には、エチレンジアミン４酢酸およびジエチレントリアミン５酢酸等のキレート剤が挙げられる。例えば、上記のＳｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．、および米国特許第５，０５７，３１３号を参照されたい。
【０１１６】
患者に投与される放射線量は、検知および正確な測定を可能にする、最小限の半減期、最小限の体内での保持、および最小限のアイソトープ量の、最良の組み合わせのための、アイソトープ選択を通して、可能な限り低いレベルに維持される。抗ＨＩＶ抗体に結合することができ、かつ画像診断に適した放射性同位体の例には、９９ｍＴｃおよび１１１Ｉｎが挙げられる。
【０１１７】
また抗ＨＩＶ抗体またはその断片は、生体内診断のために、常磁性イオンおよび多種の放射線造影剤でも標識化され得る。磁気共鳴映像法に特に有用な造影剤は、ガドリニウム、マンガン、ジスプロシウム、ランタン、または鉄イオンを含む。追加物質には、クロム、銅、コバルト、ニッケル、レニウム、ユウロピウム、テルビウム、ホルミウム、またはネオジムが挙げられる。また抗ＨＩＶ抗体またはその断片は、超音波造影／強化剤に合成することも可能である。例えば、超音波造影剤の１つには、ヒト化抗ＨＩＶＩｇＧまたはその断片を含む、リポソームがある。また、超音波造影剤には、ガスが充填されたリポソームが好ましい。
【０１１８】
好適な実施形態では、二重特異性抗体が、造影剤に合成され得る。例えば、二重特異性抗体は、超音波画像診断で使用するための、１つ以上の画像増強剤を含んでよい。好適な実施形態では、造影剤は、リポソームである。好ましくは、リポソームは、リポソームの外表面に共有結合した、二価ＤＴＰＡペプチドを含む。さらに好ましいのは、リポソームがガスで充填されていることである。
【０１１９】
画像化剤および放射性同位体
特定の実施形態では、請求の範囲に記載のペプチドまたはタンパク質は、多種の罹病器官、組織、細胞種類の画像化および診断に有用である、画像化剤に付着されてよい。多くの適した画像化剤が、タンパク質またはペプチドへのそれらの付着方法同様、技術的に既知である（例えば、米国特許第５，０２１，２３６号および第４，４７２，５０９号を参照されたく、共に参照として本明細書に組み込まれる）。特定の付着方法は、例えば、タンパク質またはペプチドに付着されたＤＴＰＡのような、有機キレート剤を用いる、金属キレート錯体の使用を伴う（米国特許第４，４７２，５０９号）。またタンパク質またはペプチドは、グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩等の共役剤の存在下で酵素と反応させてもよい。フルオレセインマーカーとの合成物は、これらの共役剤の存在下で、またはイソチオシアネートとの反応により、調製される。
【０１２０】
画像化剤として潜在的に有用である常磁性イオンの非限定的な例には、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、およびエルビウム（ＩＩＩ）を含み、ガドリニウムが特に好ましい。Ｘ線画像化等の他の状況で有用なイオンには、ランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）および特にビスマス（ＩＩＩ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２１】
画像化剤または治療薬として潜在的に有用な放射性同位体には、アスタチン２１１、１４炭素、５１クロム、３６塩素、５７コバルト、５８コバルト、銅６２、銅６４、銅６７、１５２Ｅｕ、フッ素１８、ガリウム６７、ガリウム６８、３水素、ヨウ素１２３、ヨウ素１２４、ヨウ素１２５、ヨウ素１３１、インジウム１１１、５２鉄、５９鉄、３２リン、３３リン、レニウム１８６、レニウム１８８、Ｓｃ４７、７５セレン、銀１１１、３５硫黄、テクニシウム９４ｍ、テクニシウム９９ｍ、イットリウム８６、およびイットリウム９０が挙げられる。１２５Ｉ、しばしば特定の実施形態での使用に好ましく、テクニシウム９９ｍおよびインジウム１１１もまた、その低エネルギーおよび長期の検知に対する適合性のため、しばしば好ましい。
【０１２２】
放射活性物質で標識したタンパク質またはペプチドは、当該技術分野において周知の方法により産生されてよい。例えばそれらは、ヨウ化ナトリウムもしくはカリウム、および次亜塩素酸ナトリウム等の化学的酸化剤、またはラクトペルオキシダーゼ等の酵素による酸化剤との接触により、ヨウ素化され得る。タンパク質またはペプチドは、例えば、過テクネチウム酸をスズ溶液で還元し、還元したテクニシウムをセファデックスのカラム上でキレートし、そしてペプチドをこのカラムに適用する、配位子交換工程により、または、例えば、過テクネチウム酸、ＳＮＣｌ２等の還元剤、ナトリウム−カリウムフタル酸エステル溶液等の緩衝溶液、およびペプチドを培養する直接標識技術により、テクニシウム９９ｍで標識化されてよい。金属イオンとして存在する放射性同位体を、ペプチドに結合するためにしばしば使用される媒介官能基には、ジエチレントリアミン５酢酸（ＤＴＰＡ）、ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、ポルフィリンキレート剤、およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が挙げられる。同様に使用を検討されるものには、ローダミン、フルオレセインイソチオシアネート、およびレノグラフィン（ｒｅｎｏｇｒａｐｈｉｎ）を含む蛍光標識がある。
【０１２３】
特定の実施形態では、抗ＨＩＶ抗体または断片は、発色性基質と接触すると着色産物を生成する、第２の結合配位子または酵素（酵素タグ）に連結されてよい。好適な酵素の例には、ウレアーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、（セイヨウワサビ）過酸化水素、およびブドウ糖酸化酵素が挙げられる。好ましい第２の結合配位子は、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン化合物である。このような標識の使用は当業者には周知であり、例えば米国特許第３，８１７，８３７号、第３，８５０，７５２号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６，３４５号、第４，２７７，４３７号、第４，２７５，１４９号、および第４，３６６，２４１号に記載され、それぞれ参照として本明細書に組み込まれる。これらの蛍光標識は、生体外での使用に好適であるが、生体内の適用、特に内視鏡によるまたは血管内の検知手順においてもまた実用的であり得る。
【０１２４】
別の実施形態では、抗ＨＩＶ抗体または断片は、蛍光マーカーでタグ付けされてよい。感光ラベルの非限定的な例には、Ａｌｅｘａ３５０、Ａｌｅｘａ４３０、ＡＭＣＡ、アミノアクリジン、ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ―ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ―Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ―ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ―ＴＲＸ、５―カルボキシ―４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、５―カルボキシ―２’，４’，５’，７’―テトラクロルエチレン、５―カルボキシフルオレセイン、５―カルボキシローダミン、６―カルボキシローダミン、６―カルボキシテトラメチルアミノ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５，６―ＦＡＭ、塩化ダンシル、フルオレセイン、ＨＥＸ、６−ＪＯＥ、ＮＢＤ（７―ニトロベンズ―２―オクサ―ｌ，３―ジアゾール）、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ５００、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ５１４、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、フタル酸、テレフタル酸塩、イソフタル酸、クレシルファストバイオレット、クレシルブルーバイオレット、ブリリアントクレシルブルー、パラアミノ安息香酸、エリトロシン、フタロシアニン、アゾメチン、シアニン、キサンチン、スクニシルフルオレセイン、希土類金属クリプタート、ユーロピウムトリスビピリジンジアミン、ユーロピウムクリプタートまたはキレート、ジアミン、ジシアン、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ青色色素、アロフィコシアニン、アロフィコシアニンＢ、フィコシアニンＣ、フィコシアニンＲ、チアミン、フィコエリトロシアニン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｏｃｙａｎｉｎ）、フィコエリトリンＲ、ＲＥＧ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ、ローダミンイソチオシアネート、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅｄ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、ＴＲＩＴ（テトラメチルローダミンイソチオール）、テトラメチルローダミン、およびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄを含む。これらおよび他の発光ラベルは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）等の商業的供給源から入手されてよい。
【０１２５】
有用な化学発光法による標識化合物には、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびシュウ酸エステル、またはルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびエクオリン等の生物発光化合物を挙げることができる。
【０１２６】
様々な実施形態で、有用なラベルは、金属ナノ粒子を含んでよい。ナノ粒子の調製方法は既知である。（例えば、米国特許第６，０５４，４９５号、第６，１２７，１２０号、第６，１４９，８６８号、Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｍｅｉｓｅｌ，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．８６：３３９１−３３９５，１９８２を参照されたい。）ナノ粒子もまた、商業的供給源（例えば、Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｙａｐｈａｎｋ，ＮＹ；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）から入手されてよい。修飾ナノ粒子は、Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｙａｐｈａｎｋ，ＮＹ）からのＮａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）ナノ粒子等が、市販されている。タンパク質またはペプチドへの合成に有用な官能性ナノ粒子は、市販のものが入手されてよい。
【０１２７】
架橋剤
いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ抗体もしくは断片または他のＨＩＶ標的分子が、同一二価、異種二価および／または光活性化することが可能な架橋試薬等、当該技術分野において既知である様々な架橋試薬を使用して標識化されてよい。そのような試薬の非限定的な例には、ビスイミデート（ｂｉｓｉｍｉｄａｔｅ）、ｌ，５−ジフルオロ−２，４−（ジニトロベンゼン）、スベリン酸のＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステル、酒石酸ジサクシンイミジル、ジメチル−３，３’−ジチオ−ビスプロピオンイミデート（ｂｉｓｐｒｏｐｉｏｎｉｍｉｄａｔｅ）、Ｎ−サクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸塩、４−（ブロモアミノエチル）−２−ニトロフェニルアジド、および４−アジドグリオキサールが挙げられる。典型的な実施形態では、ＤＣＣＤまたはＥＤＣ等のカルボジイミド架橋剤は、酸性残基をアミノまたは他の基に架橋するために使用されてよい。このような試薬は、蛍光標識等の多種のラベルを付着するよう修正されてよい。
【０１２８】
二官能性架橋試薬は、様々な目的に広く使用されている。２つの同一官能基を運ぶ同一二価試薬は、同一および異なる巨大分子または巨大分子のサブユニット間の架橋、およびポリペプチド配位子のそれら固有の結合部位への連結の誘発に、非常に効率的であることが判明した。異種二価試薬は、２つの異なる官能基を含有する。架橋は、２つの異なる官能基の微分反応性を利用して、選択的および連続的の双方で制御され得る。二価の架橋試薬は、例えば、アミノ、スルフヒドリル、グアニジノ、インドール、カルボキシル特定基等の、それらの官能基の特異性にしたがって分類され得る。これらの中で、遊離アミノ基を対象とした試薬は、市販されていること、合成の容易さ、それらが適用される反応条件の緩やかさから、特によく知られている。異種二価架橋試薬の大半は、第１級アミン反応基およびチオール反応基を含む。
【０１２９】
別の実施形態では、異種二価架橋試薬および架橋試薬の使用方法が記載されている（米国特許第５，８８９，１５５号、参照として本明細書に組み込まれる）。架橋試薬は、求核ヒドラジド残基を求電子マレイミド残基と組み合わせ、一例では、アルデヒドから遊離チオールへの共役を可能にする。架橋試薬は、様々な官能基の架橋用に修正され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１３０】
以下の実施例は、本発明の好適な実施形態を明示するために含まれる。以下の実施例で開示される技術は、本発明の実施に際し、上手く機能すると見出された技術を表しており、従って、その実施のための好適な態様を成すと考慮され得ることが、当業者には認識されるはずである。しかしながら、当業者は、本開示を踏まえて、開示される具体的な実施形態に、多くの変更を加えることが可能であり、それにもかかわらず、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、同等または類似した結果が得られることを認識すべきである。
【実施例１】
【０１３１】
合成抗ＨＩＶ抗体を使用した、生体外および生体内のＨＩＶ感染の阻害
概要
ＨＩＶ−１に対する免疫抱合体の有効性を実証するため、ＨＩＶのエンベロープ抗原に対するマウスモノクローナル抗体（Ｍａｂ）（Ｐ４／Ｄ１０）は、従来の抗癌剤、ドキソルビシンと合成され、感染性ウイルスおよび感染細胞に対して、生体外および生体内の双方で試験された。Ｐ４／Ｄ１０抗体は、遊離ウイルス（中和）またはＨＩＶ感染細胞（阻害）で培養され、得られた感染は、ｐ２４捕捉酵素免疫測定法で測定された。ＨＩＶ−１／ＭｕＬＶマウス攻撃モデルで、生体内の感染を阻害する接合能が測定された。
【０１３２】
ドキソルビシン合成されたＰ４／Ｄ１０は、ＨＩＶ−ｌＩＩＩＢを中和し、感染したジャーカット細胞における生体外の細胞間伝播およびＨＩＶ複製を排除した。またそれは、遊離抗体に必要とされるものより８倍低い濃度で、ＨＩＶ−１ＩΠＢ／ＭｕＬＶでの攻撃からマウスを防御し、一方、遊離型薬物または不適切な合成対照には、影響は観察されなかった。
【０１３３】
これらの結果は、ドキソルビシンが、Ｐ４／Ｄ１０抗体によりＨＩＶ感染細胞に集中され、ＨＩＶ排除に有意に（ｐ＝０．０００１）寄与したことを実証している。同一組成物および方法が、ＡＲＴ（抗レトロウイルス療法）による治療を受ける患者における、残留する抗原発現Ｔ細胞の根絶に役立つ。
【０１３４】
本研究において、我々は、ドキソルビシン、アントラサイクリン系抗癌剤を、患者における既知の薬理学、毒物学、および抗腫瘍活性を用いて、ＨＩＶ−１の外側エンベロープｇｐｌ２０（第３可変ループ部位）に対して発達した、中和およびＡＤＣＣ媒介モノクローナル抗体（Ｍａｂ）に、合成した。
【０１３５】
ドキソルビシンに合成されたＰ４／Ｄ１０抗体は、非感染細胞間、およびマウスモデルにおける、ＨＩＶ−１感染細胞排除の有効性について、ＨＩＶ−１／ＭｕＬＶ（マウス白血病ウイルス）感染同系細胞を腹腔から除去し、生体外で試験された。抗ｇｐｌ２０抗体であるＰ４／Ｄ１０は、ＨＩＶ−１ウイルスを中和し、ＡＤＣＣを媒介する（Ｂｒｏｌｉｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９０）。またそれは、末期のＨＩＶ−１感染者に対する第１相臨床試験において、非合成型でも使用され、ＨＩＶ抗原を長期間減少させた（Ｈｉｎｋｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。本研究は、同様にドキソルビシンと合成された、遊離Ｍａｂ、遊離型薬物および不適切な抗体ｈＲＳ７（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＩｎｔＪ  Ｃａｎｃｅｒ  １９９３，５５：９３８−９４６）、およびｈＬＬｌ  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００３，９：６５６７−６５７１；Ｓａｐｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００５，１１：５２５７−５２６４）と比較して、臨床ＨＩＶモデルにおいて、Ｐ４／Ｄ１０の組み合わせを薬物合成型で詳細に調べた最初のものである。
【０１３６】
材料および方法
抗体および薬物合成。ドキソルビシンの、ＩｇＧｌκ抗ｇｐｌ２０抗体Ｐ４／Ｄ１０（Ｂｒｏｌｉｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）および対照抗体との合成は、マレイミド基との、二官能性のドキソルビシンヒドラゾン誘導体の調製と同様、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（２００３）に従って行った。簡潔に、最終濃度約９ｍｇ／ｍｌの、抗体Ｐ４／Ｄ１０、ｈＬＬｌ（ヒト化抗ＣＤ７４）、およびｈＲＳ７（ヒト化抗ＥＧＰ−１）は、該抗体に対して３８倍モル過剰の還元体に相当する、約２．２ｍＭの最終ＤＴＴ濃度を用い、５ｍＭのＥＤＴＡを含む、ＰＢＳ（ｐＨ７．５）中のＤＴＴ（ジチオスレイトール）で軽度に還元した。溶液を、３７℃で４０分間培養した。還元されたＭａｂを、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび２ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ５．３）を含有する、５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液中で、セファデックスのスピンカラムＧ５０／８０上で、した。抗体上で生成されたチオール基数は、エルマン法で測定した。合成には、６．５ｍｇ／ｍｌで軽度に還元された抗体を、二官能性ドキソルビシンと混合した。培養物を、氷上で１５分間保ち、０．１Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ６．５）中で、スピンカラムＧ５０／８０上で精製し、次いで、同一の緩衝液で平衡化された、Ｂｉｏ−Ｂｅａｄｓ  ＳＭ２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）のショートカラムを通過させた。産生物を、吸光度の測定により、ドキソルビシン／Ｍａｂ置換率を分析した。サイズ排除ＨＰＬＣ分析を、ＢｉｏＳｉｌ２５０分析カラムで行った。
【０１３７】
ＨＩＶ感染患者からの、ＩｇＧのＧＭＰ製造ロット（ＨＩＶＩｇＧ）（Ｇｕａｙ  ｅｔ  ａｌ．ＡＩＤＳ  ２００２，１６：１３９１−１４００）を、陽性対照として、またＨＩＶ陰性の個人からの血清が陰性対照として、使用した。遊離ドキソルビシン、およびドキソルビシンと同様に合成された抗癌ヒト化Ｍａｂ、ＬＬｌおよびＲＳ７を、合成Ｐ４／Ｄ１０抗体の対照として含めた。
【０１３８】
ＨＩＶ−１中和アッセイ。ドキソルビシンＰ４／Ｄ１０、非標識Ｐ４／Ｄ１０、ＨＩＶ免疫グロブリン（ＨＩＶＩｇＧ）、およびＨＩＶ陰性血清を、ＨＩＶ−１分離株、ＨＩＶ−１ＩＩＩＢ（ＬＡＩ）と混合した、３７℃で１時間培養し、５０，０００ジャーカットＴ細胞／ウェルを加えた。１時間培養後、細胞を培地で洗浄し、新しい完全な培地を加えた（２００μｌ／ウェル）。７日間の培養後、産生されたｐ２４の量を、ｐ２４捕捉ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）で測定し、ＨＩＶ−１ｐ２４産生の阻害割合を計算した。
【０１３９】
生体外ＨＩＶ−１阻害ジャーカットＴ細胞を、５〜１０×１０６細胞を１００×ＴＣＩＤ５０のＨＩＶ−ｌＩＩＩＢと混合し、３７℃で１時間培養して、ＨｌＶ−ｌＩＩＩＢと感染させた。細胞を培地で洗浄し、３７℃で培養した。２日おきに、培地を変え、上清のｐ２４産生を確認した。細胞の１００％近くが感染した際、異なる割合のＨＩＶ−ｌＩＩＩＢ感染細胞を、非感染細胞と混合した。細胞は、抗体、血清、または遊離ドキソルビシンの連続希釈で、１００〜０．００００１μｇ／ｍｌに処理された。３７℃で７日間培養した後、ＨＩＶ−１ｐ２４阻害を測定し、０．１〜１０μｇ／ｍｌのドキソルビシン−Ｐ４／Ｄ１０、非合成Ｐ４／Ｄ１０、および０．０５〜０．５ｍｇ／ｍｌのＨＩＶ陰性血清で予め処理された細胞からの上を採取し、未使用のジャーカットＴ細胞に移し、培養開始後３、７、１０、１２、および１５日目に、感染性ＨＩＶが同定されるかどうかを、ｐ２４ＥＬＩＳＡで試験した。
【０１４０】
ＨＩＶ−１／ＭｕＬＶ攻撃モデル。ヒトＴ細胞株、ＣＥＭ−ＩＢを、遺伝子的に統合されたＭｕＬＶゲノムと共に、ＨＩＶ−１ΠＩＢに感染させ、ＨＩＶ−１ゲノムおよびＭｕＬＶエンベロープでの擬似ウイルスの産生に至った（Ａｄａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  １９９９，９６：１２７４９−７５３；Ｈｉｎｋｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌｓ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  Ｏｒｇａｎｓ  ２００４，１７７：１６９−１８４）。これらのウイルスの上清を、ＨＬＡ−Ａ２０１遺伝子導入のＣ５７Ｂｌ／６ｘＤＢＡ  Ｆｌ  Ｋｂ／ｄマウスからの脾細胞を感染させるために使用した。同系マウスを、腹腔内で、ＨＩＶ−１ＩΠＢ／ＭｕＬＶ感染脾細胞で攻撃し、合成抗体、遊離抗体、または遊離ドキソルビシンを腹腔内に直ちに与えた。攻撃の１０日後、マウスを致死させ、腹膜細胞が採取した。腹膜細胞を、ペレット化し、１×１０６のＨＩＶ感受性ジャーカットＴ細胞または２４ウェルプレートで成長させたヒトＰＢＭＣに加えた。これらの二次培養から、上清を除去し、未使用の培地を３〜４日毎に加えた。感染性ＨＩＶ上清中で回収された感染性ＨＩＶ量を、ｐ２４ＥＬＩＳＡで３週間測定した。
【０１４１】
統計的分析。抗ｇｐｌ２０Ｍａｂおよび対照抗体の生体内ＨＩＶ−１中和能を比較するために、スチューデントｔ検定およびノンパラメトリックのクラスカル・ワーリス検定を使用した。異なる抗体で処理された群間の統計比較を、ノンパラメトリックの、マン・ホイットニーのＵ検定およびクラスカル・ワーリス検定を使用して行った。＜０．０５の確率値が得られた時、差異は有意であるとみなされた。ノンパラメトリックの一元配置分散分析検定を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍの４．０ａ版（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して行い、試験群間のＨＩＶ−１分離およびｐ２４抗原の陽性率の比較に使用した。
【０１４２】
結果
軽度の還元により、それぞれの抗体上に生成されたチオール基の数は、最終的に精製された合成物中のドキソルビシン／Ｍａｂ置換率と同様、８．８（Ｐ４／Ｄ１０、ｈＲＳ７）〜９．４（ｈＬＬｌ）に及び、ＩｇＧ当たり約９薬物分子の比率が出た。高圧液体クロマトグラフィー分析は、該合成物および天然Ｍａｂが、ゼロから最少の凝集と共に、類似した保持時間を持つことを示した（データ示さず）。
【０１４３】
ドキソルビシン合成Ｐ４／Ｄ１０Ｍａｂと、非合成Ｐ４／Ｄ１０ＭａｂまたはＨＩＶＩｇＧ抗体のいずれかとの間には、遊離ＨＩＶ−１ウイルスのＨＩＶ−１中和能における有意な差異は示され得なかった（図ＩＡ）。しかしながら、全ての抗ＨＩＶ−１特定抗体は、ＨＩＶ−１ＩΠＢの中和において、陰性の対照血清よりも有意に優れていた（ｐ＝０．００１）。
【０１４４】
３％ＨＩＶ−１ＩΠＢ感染ジャーカッタ細胞が、９７％非感染細胞と混合されると、ドキソルビシン−Ｐ４／Ｄ１０は、遊離Ｐ４／Ｄ１０、ドキソルビシン合成対照抗体、ｈＬＬｌ、または０．５もしくは０．０５μｇ／ｍｌ濃度の遊離ドキソルビシンよりも、ＨＩＶ−１感染の細胞間伝播の有意に（ｐ＝０．００２）強力な阻害を媒介した（図１Ｂ）。感染および非感染細胞の他の全ての濃度で、類似した結果が見られた。感染の細胞間伝播が、中和剤としてのドキソルビシン−Ｐ４／Ｄ１０で得られた効果よりさらに強く阻害されたように思われることが、特に興味を引いた。また、これらの細胞培養物から非感染ジャーカッタ細胞へ上清を移した後は、ｐ２４の産生は検知されなかったため、高用量のドキソルビシン−Ｐ４／Ｄ１０で処理された培養物には、感染ウイルスは発見され得なかった（データ示さず）。ドキソルビシン−Ｐ４／Ｄ１０と非合成Ｐ４／Ｄ１０との間の効果における有意な差異は、遊離ＨＩＶ−１ウイルスの中和についての結果からは、予測され得なかった（図１Ａ）。
【０１４５】
ドキソルビシン−Ｐ４／Ｄ１０抗体の有効性を生体内で試験するために、マウスは腹腔内に、合成物とともに、同系のＨＩＶ／ＭｕＬＶ感染細胞を与えられた。腹膜細胞を、１０日後に採取し、感染ＨＩＶは、過去の研究（Ｈｉｎｋｕｌａ  ｅｔ  ａｌ，  ２００４）と同様、全ての対照で実証された。ドキソルビシン−Ｐ４／Ｄ１０抗体は、ＨＩＶ−１感染一次リンパ細胞での攻撃から、完全にマウスを防御した（ｐ＝０．０００１）（図２）。１００μｇのドキソルビシン−Ｐ４／Ｄ１０抗体での攻撃および処理後、腹膜細胞から感染ＨＩＶは回収されなかった。マウスが１００μｇの非合成Ｐ４／Ｄ１０抗体で処理された場合は、全てｐ２４産生に陽性であった。用量が８倍の、１マウス当たり８００μｇまで非合成Ｐ４／Ｄ１０を増加された場合のみ、抗体のみによる完全な防御が見られた。用量１００〜２００μｇでは、いずれのドキソルビシン合成対照抗体（ｈＬＬｌまたはｈＲＳ７）も防御をもたらさず、用量１００〜４００μｇの遊離ドキソルビシンでももたらさなかった。
【０１４６】
考察
前述の結果は、ＨＩＶ−１のエンベロープを対象とした、抗体の総合的なウイルス阻害特性が、ドキソルビシンへの共役により有意に増幅され得たことを示す。ドキソルビシン−Ｐ４／Ｄ１０は、生体外で、また実験的な生体内攻撃モデルで、ＨＩＶ−１感染細胞を根絶することができた。非合成Ｐ４／Ｄ１０Ｍａｂの、ＨＩＶ−１感染標的細胞に対するＡＤＣＣ媒介能は、ＨＩＶ−１の中和と同様（Ｂｒｏｌｉｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｈｉｎｋｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）無毒な方法で、薬物免疫抱合体としての有効性を増進する可能性がある。
【０１４７】
同様にドキソルビシンと合成された抗癌の抗−ＣＤ７４Ｍａｂ、ＬＬｌは、非常に低い容量で、生体外および非ホジキンリンパ腫または多発性骨髄腫のヒト異種移植モデルで、顕著な活性を示した（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ，２００３；Ｓａｐｒａ  ｅｔ  ａｌ，２００５）。これらの研究は、サルにおける毒物学同様、非常に高用量の免疫抱合体のみが、骨髄抑制の証拠であるという結果になったが、ドキソルビシンに関連した心毒性は観察されなかったと示している（Ｓａｐｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。ウイルス脱出を避けるため、ＨＩＶの接触しやすいエピトープの、保存および可変部位の両方を対象とした抗体は、共に試験されるべきである（Ｔｒｋｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｆｅｒｒａｎｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２００４，１８９：２１６７−２１７３）。
【０１４８】
過去の生体外研究では、緑膿菌外毒素Ａ（ＰＥ４０）に合成されたＨＩＶ−１特有の免疫抱合体が、ＨＩＶ−１感染細胞を除去した（Ｐｉｎｃｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ａｓｈｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９０，８７：８８８９−８８９３）。しかしながら臨床試験において、ＣＤ４細胞に共役したＰＥ４０は、免疫原性および肝細胞毒性であることが判明した（Ｄａｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。従って、副作用がほとんど、または全く無い、ドキソルビシン−Ｍａｂ合成物の有効性を示す本結果は、驚くべき、予期せぬものである。高ウイルス量の非ＡＲＴ治療患者において高濃度で存在する、ＰＥ４０−ＣＤ４の毒性は、遊離ｇｐｌ２０との有毒な複合体の形成により説明され得る（Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。高ウイルス量に関連する潜在的な毒性問題を避けるため、好ましくは、ＨＩＶエンベロープ特有エピトープを標的とする分子は、ＡＲＴ中、ＨＩＶ感染の初期、またはさらにＨＩＶ感染に既知または潜在的な暴露後間もなく等、ウイルス負荷が低い周囲環境で使用されるべきである。例えば、ＨＩＶで汚染された、または潜在的に汚染された、血液または他の流体に針刺し事故で暴露された医療従事者は、本開示方法による合成抗体での治療が可能である。ドキソルビシンＰ４／Ｄ１０合成体の抗細胞活性の結果、ＡＲＴによる治療を受ける患者への薬物合成物の追加は、抗原運搬細胞および遊離ビリオンを根絶することができ、従ってさらにウイルス量を減少させる。当業者は、請求の範囲に記載の組成物および方法は、Ｐ４／Ｄ１０のドキソルビシン合成物に限られず、むしろＰ４／Ｄ１０に、または既知の他の抗ＨＩＶ抗体に合成された、既知の他の細胞毒性薬を利用することができることを理解するであろう。
【０１４９】
他の実施形態では、非特異的毒性を避けるため、抗体照準法および毒物の送達は、分離される、二重特異抗体および他の事前標的戦略，が使用され得る（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。本戦略は、癌の前臨床および臨床試験双方において、期待できる結果を示した（Ｆｏｒｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００４，１０４：２２７−２３６；Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００５，１１：７１２２ｓ−７１２９ｓ）。人を対象とした生体内使用については、繰り返される臨床用途の、ヒト抗体またはヒト化された形の抗体が好ましい。
【実施例２】
【０１５０】
ＡＲＴ後のＨＩＶ感染患者の治療
４７歳男性患者は、ＨＩＶに対して血清反応陽性であると判断された。該患者のＣＤ４数は、２００／ｍｍ３未満であった。該患者は、非核酸系逆転写酵素阻害物質ネビラピンの標準療法による治療を受けた。ＣＤ４細胞数は、３００／ｍｍ３まで改善したが、該患者は依然としてＨＩＶに対して血清反応陽性であった。該患者は、ヒト化ドキソルビシン−Ｐ４／Ｄ１０抗体による治療を受けた。該患者のＣＤ４数は、３５０／ｍｍ３超過まで改善し、該患者は、もはやＨＩＶに対して血清反応陽性ではなくなった。１年後、該患者は、無症状のままであり、検出可能なＨＩＶ感染は存在しない。
【実施例３】
【０１５１】
針刺し事故後の医療従事者の治療
３０歳の臨床看護師は、ＨＩＶ陽性血液の付着した針刺し事故に遭った。１時間以内に、該対象は、ヒト化ドキソルビシン−Ｐ４／Ｄ１０抗体による治療を受けた。１年後、該対象にＨＩＶ感染の兆候は見られない。
【実施例４】
【０１５２】
その他の細胞毒素および／または抗体による治療
２８歳男性患者は、ＨＩＶに対して血清反応陽性であると判断された。該患者のＣＤ４数は、２００／ｍｍ３未満であった。該患者は、非核酸系逆転写酵素阻害物質ネビラピンの標準療法による治療を受けた。ＣＤ４細胞数は、３００／ｍｍ３まで改善したが、該患者は依然としてＨＩＶに対して血清反応陽性であった。該患者は、ヒト化４Ｅ１０Ｆａｂ−７３４ｓｃＦｖを含み、米国特許第７，０５２，８７２号（参照として組み込まれる）に開示される方法を使用して調製された二重特異性抗体による治療を受けた。注入後、遊離二重特異性抗体を循環から除去するために、２４時間の培養を行い、続いて標的ペプチドＩＭＰ−１５６（Ｉｄ．）に合成された５−フルオロウラシルを注入した。該患者のＣＤ４数は、３５０／ｍｍ３超過まで改善し、該患者は、もはやＨＩＶに対して血清反応陽性ではなくなった。１年後、該患者は、無症状のままであり、検出可能なＨＩＶ感染は存在しない。
【実施例５】
【０１５３】
ＩＭＰ４１１による事前標的
３５歳男性患者は、ＨＩＶに対して血清反応陽性であると判断された。該患者のＣＤ４数は、１８０／ｍｍ３未満であった。該患者は、非核酸系逆転写酵素阻害物質ネビラピンの標準療法による治療を受けた。ＣＤ４細胞数は、２５０／ｍｍ３まで改善したが、該患者は依然としてＨＩＶに対して血清反応陽性であった。該患者は、参照として本明細書に組み込まれる、米国特許出願シリアル番号第１１／３８９，３５８号、第１１／３９１，５８４号、第１１／４７８，０２１号、および第１１／６３３，７２９号に開示される方法を使用するＤＮＬ技術によって調製された、抗ｇｐｌ２０  Ｐ４／Ｄ１０  ＩｇＧｌ  ｘ  Ｆａｂ−６７９を含む二重特異性抗による治療を受けた。注入後、遊離二重特異性抗体を循環から除去するために、２４時間の培養を行い、続いて標的としているペプチドＩＭＰ−４１１に合成されたＳＮ３８を注入した。該患者のＣＤ４数は、３２５／ｍｍ３超過まで改善し、該患者は、もはやＨＩＶに対して血清反応陽性ではなくなった。１年後、該患者は、無症状のままであり、検出可能なＨＩＶ感染は存在しない。
【実施例６】
【０１５４】
抗ＨＩＶ抗体のヒト化
ＨＩＶエンベロープタンパク質に対するマウスモノクローナル抗体のＶＬおよびＶＨ部位を符号化するｃＤＮＡは、分離され、組み換えによって、それぞれ別個に、カッパおよびＩｇＧ１定常部位をそれぞれ符号化する遺伝子を含む、ヒト抗体の哺乳類発現ベクターにサブクローニングされる。これら２つの組み換えＤＮＡを有する哺乳類細胞の同時トランスフェクションは、親マウスＭａｂと同一の結合および治療特性を有するヒト化Ｍａｂの発現を生じる。
【０１５５】
ＶＫおよびＶＨ  ＤＮＡのＣＤＲは、組み換えによって、ヒトＶＫおよびＶＨ部位の骨格（ＦＲ）配列にそれぞれ連結され、それらは結果として、哺乳類細胞を発現するために、ヒトカッパおよびＩｇＧ１定常部位にそれぞれ連結される。一般に、本明細書で記載されるように、「キメラ」ＭａｂはマウスＶＫおよびＶＨ部位を、それぞれヒト定常軽鎖および重鎖に結合するか、またはサブクローニングすることによって形成され、一方、「ヒト化」Ｍａｂは、キメラＭａｂ内のマウス骨格（ＦＲ）配列を、対応するヒトＦＲ配列で置換することによって、さらに誘導体化される。以下に記載されるように、ヒト化Ｍａｂは、ヒトＦＲアミノ酸、特にＣＤＲアミノ酸残基に接触している、または近いＦＲ残基の１つ以上を、対応するマウスＦＲアミノ酸で置換することによって、さらに最適化されてもよい。
【０１５６】
様々な実施形態では、コンピュータモデリングによって、抗体可変領域をモデル化することができる（例えば、本明細書に参照として組み込まれる、Ｄｉｏｎ，「Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」ｉｎ  Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｗｉｔｈ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｈ．１９，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＩａ．，１９９４を参照）。一般に、Ｍａｂの３Ｄ構造は、相同性、好ましくは以下の、置換されるマウスＦＲ配列と高い（７５％を上回る、好ましくは８５％を上回る、より好ましくは９０％を上回る、より好ましくは９５％を上回る）相同性を示すヒトＦＲ配列の指標によって、最良の形でモデル化される。ＣαとＣβとの間のねじれ角を維持するために、可能な限り、側基の置換を行うべきである。エネルギー最小化は、収束法を使用する、ＡＭＢＥＲ力場（Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０６：７６５，１９８４）によって達成されてもよい。軽および重可変鎖を最初にモデル化することによって、決定的に重要となる可能性のあるＦＲ−ＣＤＲ相互作用を判断することができる。従って、それぞれのＣＤＲ内の半径が４．５オングストローム内のすべての原子内のすべてのマウスＦＲ残基を特定し、ヒト化抗体の最終設計モデル内に保持することができる。
【０１５７】
一度ＶＫおよびＶＨ領域の配列が設計されると、ＣＤＲ移植は、長い合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドをテンプレートとして使用し、短いオリゴヌクレオチドをＰＣＲ反応におけるプライマーとして使用する遺伝子合成によって、達成され得る。多くの場合、ＶＫまたはＶＨ領域を符号化するＤＮＡは、おそよ３５０ｂｐ長となる。コドン縮重の利点を利用することによって、符号化されたアミノ酸を変更することなく、Ｖ遺伝子ＤＮＡ配列の中央の近くの部位に、固有の制限部位を容易に導入できる可能性がある。制限部位の上流および下流が約１５０ｂｐである、２つの長い非重複単鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、自動ＤＮＡオリゴヌクレオチド合成装置（Ｃｙｃｌｏｎｅ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ，Ｍｉｌｌｉｇｅｎ−Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）で生成することができる。全長ＤＮＡオリゴヌクレオチドの産出率が低いと予想される場合、ＰＣＲ反応における２組のフランキングプライマーによって、それらを増幅することができる。
【０１５８】
プライマーは、配列サブクローニングを促進するために必要な制限部位で設計することができる。オリゴＡおよびオリゴＢのプライマーは、オリゴＡおよびＢの結果として生じるＰＣＲ生成物が、それぞれ、制限部位で枠内に結合され、ＶＨ領域を符号化する、全長ＤＮＡ配列（約３５０ｂｐ）を形成できるように、制限部位に重複配列を含むべきである。
【０１５９】
オリゴＡおよびＢに対するＰＣＲ生成物の連結反応、およびそれらの適切な足場（ｓｔａｇｉｎｇ）ベクターの制限部位へのサブクローニングは、単一３断片連結反応ステップで完了され得る。正しい配列の足場（ｓｔａｇｉｎｇ）ベクターへのサブクローニングは、最初に、制限消化分析によって分析され、続いてＳａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３（１９７７）による、配列反応配列反応によって確認され得る。
【０１６０】
Ｉｇプロモーター、リーダー配列、およびＶＨ配列を含む制限断片を、足場（ｓｔａｇｉｎｇ）ベクターから切除し、ヒトＩｇＧ定常部位のゲノム配列、Ｉｇエンハンサー、ｇｐｔ選択マーカーを含み、最終発現ベクターを形成する、ｐＳＶｇｐｔ系ベクター内の対応する部位にサブクローニングすることができる。ＶＫ配列の構成に、同様な方法を採用することができる。
【０１６１】
Ｉｇプロモーター、リーダー配列、および抗ＨＩＶ  ＶＫ配列を含むＤＮＡ配列を、適切なエンドヌクレアーゼで処理することによって、足場（ｓｔａｇｉｎｇ）ベクターから切除することができ、ｐＳＶｈｙｇ系ベクター、ヒトカッパ鎖定常部位のゲノム配列を含むｐＫｈ、ハイグロマイシン選択マーカー、Ｉｇ、およびカッパエンハンサーの対応する部位にサブクローニングし、最終発現ベクターを形成することができる。
【０１６２】
ヒト化は、結果として抗体親和力が減少またはさらには損失する場合があることから、元の親和力を回復するために、さらなる修正が必要となる場合がある（例えば、参照として組み込まれる、Ｔｅｍｐｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：２６６（１９９１）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４（１９８８）を参照）。一般に、キメラ抗ＨＩＶのＭａｂを調製するために、ＤＮＡ生成物およびプライマーを使用する、ＰＣＲクローニングによって、抗ＨＩＶのＭａｂのＶＨおよびＶＫ鎖を得ることができる。Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，１９８９，８６：３８３３）、およびＬｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９３，１５：２８６）。上記に記載されるように、ＶＫ  ＰＣＲプライマーを、ｐＢＲ３２７系足場（ｓｔａｇｉｎｇ）ベクター（ＶＫｐＢＲ）にサブクローニングしてもよい。ＶＨ  ＰＣＲ生成物を、類似するｐブルースクリプト系足場（ｓｔａｇｉｎｇ）ベクター（ＶＨｐＢＳ）にサブクローニングしてもよい。プロモーターおよびシグナルペプチド配列に加え、ＶＫおよびＶＨ配列を含む断片を、適切な制限エンドヌクレアーゼを使用して、足場（ｓｔａｇｉｎｇ）ベクターから切除することができる。従来通り、ＶＫ断片（約６００ｂｐ）を、哺乳類発現ベクター（例えば、ｐＫｈ）にサブクローニングすることができる。ＰＫｈは、ヒトカッパ定常部位のゲノム配列、Ｉｇエンハンサー、カッパエンハンサー、およびハイグロマイシン耐性遺伝子を含む、ｐＳＶｈｙｇ系発現ベクターである。同様に、約８００ｂｐのＶＨ断片を、ヒトＩｇＧｌ定常部位のゲノム配列、Ｉｇエンハンサー、およびキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）遺伝子を運ぶ、ｐＳＶｇｐｔ系発現ベクターであるｐＧｌｇにサブクローニングすることができる。２つのプラスミドは、エレクトロポレーションによって、Ｓｐ２／Ｏ−−Ａｇｌ４細胞等の哺乳類発現細胞にトランスフェクションされ、ハイグロマイシン耐性のために選択されてもよい。選択後に生存するコロニーを拡大し、ＥＬＩＳＡ法によって、上清のキメラ抗ＨＩＶ  Ｍａｂの生成を監視する。トランスフェクション効率が約１〜１０×１０６の細胞が望ましい。本システムでは、抗体発現レベル０．１０〜２．５μｇ／ｍｌを期待できる。
【０１６３】
ＲＮＡ分離、ｃＤＮＡ合成、および増幅を、以下のように行うことができる。約１０７個の細胞を使用し、参照として組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に従い、抗ＨＩＶハイブリドーマ細胞株からトータル細胞ＲＮＡを調製することができる。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用する等によって、従来通り、トータルＲＮＡから第１の鎖ｃＤＮＡを逆転写することができる。簡潔に、反応量２０μｌにおいて、１０Ｘ合成緩衝液［２００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５００ｍＭのＫＣｌ、２５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ］が２μｌ、１０ｍＭのｄＮＴＰミックスが１μｌ、０．１ＭのＤＴＴが２μｌ、および２００ユニットのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐ逆転写酵素が存在する下で、５０ｎｇのランダムプライマーを５μｇのＲＮＡにアニールすることができる。伸長ステップは、最初に、室温で１０分間進行され、続いて４２℃で５０分間の培養が行われる。反応混合物を９０℃で５分間加熱することによって、反応を終了させることができる。
【０１６４】
キメラまたはヒト抗ＨＩＶ  ＭａｂのＶＫおよびＶＨ配列は、参照として組み込まれる、Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ，（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６：３８３３（１９８９））に記載されるように、ＰＣＲによって増幅することができる。ＶＫ配列は、プライマーＣＫ３ＢＨおよびＶＫ５−３（参照として組み込まれる、Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１５：２８６（１９９３））を使用して増幅されてもよく、一方、ＶＨ配列は、マウスＩｇＧのＣＨｌ部位、およびＶＨＩＢＡＣＫ（Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）をアニールするプライマーＣＨｌＢを使用して、増幅することができる。第１の鎖ｃＤＮＡ生成物を１０μｌ、１０ＸのＰＣＲ緩衝液［５００ｍＭのＫＣｌ、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭのＭｇＣ１２、および０．０１％（ｗ／ｖ）のゼラチン］（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．）を９μｌ、含むＰＣＲ反応混合物に、３０サイクルのＰＣＲを行うことができる。それぞれのＰＣＲサイクルは、好ましくは、９４℃で１分間の変性、５０℃で１．５分間のアニーリング、および７２°Ｃで１．５分間の重合からなる。増幅されたＶＫおよびＶＨ断片を、２％のアガローズ（ＢｉｏＲａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｃａｌｉｆ）で精製することができる。
ＶＫのためのＰＣＲ生成物を、Ｉｇプロモーター、シグナルペプチド配列、およびＶＫ  ＰＣＲ生成物の枠内連結反応を促進するために適宜な制限部位を含む、ｐＢＲ３２７系足場（ｓｔａｇｉｎｇ）ベクターＶＫｐＢＲ等の足場（ｓｔａｇｉｎｇ）ベクターにサブクローニングすることができる。ＶＨに対するＰＣＲ生成物を、ブルースクリプト系ＶＨｐＢＳ等の類似の足場（ｓｔａｇｉｎｇ）ベクターにサブクローニングすることができる。個別のＰＣＲ生成物を含む個々のクローンは、例えば、参照として組み込まれる、Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７４：５４６３（１９７７）の方法によって、配列されてもよい。
【０１６５】
適切な細胞、例えば、骨髄腫Ｓｐ２／Ｏ−−Ａｇｌ４、ハイグロマイシン耐性のために選択されるコロニー、および、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイによってキメラまたはヒト化抗ＨＩＶ抗体の生成が監視される上清に、２つのプラスミドを同時トランスフェクションすることができる。
【０１６６】
抗体分泌クローンのトランスフェクションおよびアッセイは、以下のように実行することができる。参照として組み込まれる、Ｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４８：１１４９（１９９２）による、エレクトロポレーション（ＢｉｏＲａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｃａｌｉｆ．）による、５×１０６ＳＰ２／Ｏ骨髄腫細胞のトランスフェクションに、約１０μｇの軽鎖発現ベクターおよび２０μｇの重鎖発現ベクターを使用することができる。トランスフェクションに続き、完全ＨＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）内の９６ウェルマイクロタイタープレート内で、３７°Ｃ、５％のＣＯ２で、細胞を成長させてもよい。選択プロセスは、ハイグロマイシンの最終濃度５００μｇ／ｍｌでハイグロマイシン選択培地（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を添加することによって、２日後に開始することができる。典型的にコロニーは、エレクトロポレーション後、２〜３週間で出現する。次いで、さらなる分析のために、培養物を拡大することができる。
【０１６７】
キメラまたはヒト化重鎖の分泌に陽性のトランスフェクトーマクローンは、ＥＬＩＳＡアッセイによって特定することができる。簡潔に、トランスフェクトーマ培養からの上清試料（１００μｌ）を、ヤギ抗ヒト（ＧＡＨ）−ＩｇＧ，Ｆ（ａｂ’）２断片特異抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，Ｐａ．）でプレコートされたＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートに３回に分けて添加する。プレートを、室温で１時間培養する。洗浄緩衝液（０．０５％のポリソルベート２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄することによって、非結合タンパク質を除去する。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）共役ＧＡＨ−ＩｇＧ、Ｆｃ断片特異抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を、ウェル（１０４倍に希釈し、最終濃度１．０μｇ／ｍｌまで非共役抗体を追加した、１００μｌの抗体ストック）に添加する。１時間の培養に続き、典型的には３回、プレートを洗浄する。反応溶液［１００μｌ、ＰＢＳ中、１６７μｇのオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、０．０２５％の過酸化水素を含む］を、ウェルに添加する。暗所に３０分間置くことによって、色が発現する。５０μｌの４ＮＨＣｌ溶液をそれぞれのウェルに添加することによって、反応を停止し、自動ＥＬＩＳＡリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，Ｖｔ．）で４９０ｎｍでの吸光度を測定する。次いで結合キメラ抗体は、不適切なキメラ抗体標準（Ｓｃｏｔｇｅｎ，Ｌｔｄ．，Ｅｄｉｎｂｕｒｇ，Ｓｃｏｔｌａｎｄから入手可能）と関連して判断される。
【０１６８】
抗体は、以下のように、細胞培養培地から分離される。トランスフェクトーマ培養液を無血清培地に適合させる。キメラ抗体を生成するために、ＨＳＦＭを使用し、５００ｍｌの培養液として、ローラーボトル内で細胞を成長させる。培養液を遠心分離し、０．２ミクロンの薄膜を通して、上清を濾過する。流速１ｍｌ／ｍｉｎでタンパク質Ａカラム（１×３ｃｍ）に濾過した培地を通す。次いで約１０カラム容量のＰＢＳで樹脂を洗浄し、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍのグリシン緩衝液（ｐＨ３．５）で、カラムからタンパク質Ａ結合抗体を溶出する。１．０ｍｌのフラクションが、３ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．６）を１０μｌ含むチューブに回収され、タンパク質濃度が２８０／２６０ｎｍでの吸光度から測定される。ピークフラクションをプールし、ＰＢＳを透析し、例えば、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ３０（Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で抗体を凝縮する。抗体濃度は、ＥＬＩＳＡで測定し、従来のように、ＰＢＳを使用して、その濃度を約１ｍｇ／ｍｌに調整する。防腐剤として、０．０１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを適宜試料に添加する。
【０１６９】
このように単離されたマウス、キメラ、およびヒト化抗体の比較結合親和力は、直接ラジオイムノアッセイによって、測定することができる。キメラおよびヒト化抗ＨＩＶ抗体は、マウスＭａｂと同一の結合特異性および親和力を有すると判断される。
【０１７０】
本明細書で開示され、主張されるすべての組成物および方法は、本開示を考慮し、過度の実験を行うことなく作製および実施することができる。組成物および方法は、好ましい実施形態の点から説明されているが、本発明の概念、精神、および範囲を逸脱することなく、本明細書に記載される組成物および方法、ならびに方法のステップまたはステップの順序に変形が適用されてもよいことが、当業者には明らかである。より具体的には、同一または類似の結果が達成される間、化学的および生理的に関連する特定の薬剤が、本明細書に記載される薬剤と置き換えられてもよい。当業者に明らかなすべてのそのような置換えおよび修正は、添付の請求の範囲で定義される、本発明の精神、範囲、および概念内であると見なされる。
【図面の簡単な説明】
【０１７１】
【図１Ａ】ＨＩＶ−１ＩＩＩＢ  ＨＩＶ感染の生体内中和。ＨＩＶ―１ＩＩＩＢを有する異なる濃度の免疫グロブリンを培養し、ＨＩＶに感染しやすいジャーカットＴ細胞のウイルス感染を分析することで、免疫グロブリンの中和能力を試験した。１０μｇ／ｍｌのドキソルビシンとＰ４／Ｄ１０および非ラベルのＰ４／Ｄ１０の双方により、ＨＩＶ陰性血清（ｐ＝０．００１）よりも大幅に良好に、ＨＩＶ―１ＩＩＩＢを中和した。
【図１Ｂ】ＨＩＶ−１ＩＩＩＢ  生体外におけるＨＩＶ感染の細胞間伝播の阻害。免疫グロブリンがＨＩＶ―１感染ジャーカットＴ細胞の細胞間の拡散を制限することができるかどうかを試験するため、０．２％、１％、３％、および５％感染の、および９９．８％、９９％、９７％、および９５％非感染の細胞の割合で混合した。異なる濃度の免疫グロブリンによる、ＨＩＶ―１ＩＩＩＢ感染した３％のジャーカットＴ細胞および９７％の未感染細胞の処理後のＨＩＶ―１  ｐ２４の産生を示す。結果を、培養７日後のｐ２４産生の阻害％にて示す。ドキソルビシン―Ｐ４／Ｄ１０では、未ラベルのＰ４／Ｄ１０、対照抗体ドキソルビシン―ＬＬｌ、遊離型ドキソルビシンおよび濃度０．５または０．０５μｇ／ｍｌ（ｐ＝０．００２）のＨＩＶ陰性血清と比較して、ＨＩＶ―１ｐ２４の生成における阻害効果が大幅に上昇した。
【図２】生体内におけるＨＩＶ―１／ＭｕＬＶ感染に対する保護。マウス（６―１２／群）について、ＨＩＶ―１／ＭｕＬＶ感染した脾細胞によって腹腔内にて調査され、モノクローナル抗体（Ｍａｂ）または遊離型ドキソルビシンによって直ちに処置された。非共役Ｐ４／Ｄ１０Ｍａｂが、マウス当たり１００―８００μｇ遊離型ドキソルビシン１００―４００μｇおよび非関連ドキソルビシン―ｈＲＳ７１００―２００μｇで滴定された。その他全ての治療が、マウス当たり１００μｇで与えられた。調査から１０日後、腹膜細胞を回収し、ＨＩＶに感染しやすいジャーカットＴ細胞と共に混合された。これらの細胞培養におけるＨＩＶｐ２４の産生が、１８日間で３、４日ごとに計測された。１００μｇのＭａｂまたは遊離型ドキソルビシンによる処置後のｐ２４陽性細胞培養によるマウスのパーセントを示す。１００μｇのドキソルビシン―Ｐ４／Ｄ１０で処理したマウスからの細胞のみが、その他の全ての群とは大幅に異なり（ｐ＝０．０００１）、感染性ＨＩＶを含んでいなかった。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【国際調査報告】
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