(57)【要約】種々の局面において、本教示は、タンパク質発現の絶対定量のためのシステム、方法、アッセイ、およびキットを提供する。種々の局面において、本教示は、１つまたはそれ以上の目的のサンプル中の１つまたはそれ以上の目的のタンパク質の濃度を求める方法を提供する。種々の局面において、本教示は、特徴的タンパク質フラグメントの標準サンプルおよび親−娘イオントランジションモニタリング（ＰＤＩＴＭ）を使用して、タンパク質の１つまたはそれ以上のアイソフォームの絶対濃度を求める方法を提供する。種々の実施形態において、１つのサンプル中の生体分子の複数のアイソフォームの絶対濃度、生物学的プロセスや複数のサンプルを組み合わせたものにおける複数のタンパク質の絶対濃度、またはそれらを組み合わせたものを、本教示を使用した複合的な方法で求めることができる。化学物質に対する生物学的システムの応答を評価する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つまたはそれ以上の目的のサンプル中の１つまたはそれ以上の目的のタンパク質の濃度を求める方法であって、
目的の各タンパク質に対する特徴的ペプチドを含む標準サンプルを用意する工程と、
各特徴的ペプチドに対して識別用娘イオンを選択する工程と、
該２つまたはそれ以上の目的のサンプル中の１つまたはそれ以上の目的のタンパク質を、各サンプルに対して異なる化学成分によって標識化することにより、その２つまたはそれ以上の目的のサンプルが差次的に標識化される工程と、
一つ以上の標準サンプルを化学成分によって標識化する工程と、
混合サンプルを作成するため、一つ以上の標識化されたサンプルの少なくとも一部と、二つ以上の差次的に標識化されたサンプルの少なくとも一部とを混合する工程であって、該差次的に標識化されたサンプルは、それらと混合される一つ以上の標識化された標準サンプルと異なる化学成分で標識化されている、工程と、
該混合サンプルの少なくとも一部をクロマトグラフィカラムにかける工程と、
該クロマトグラフィカラムからの溶離液の少なくとも一部を多重反応モニタリングに供する工程であって、各多重反応モニタリングスキャンの通過親イオンのｍ／ｚ範囲は、該特徴的ペプチドのうちの１つまたはそれ以上の標識化された特徴的ペプチドのｍ／ｚ値を含み、各多重反応モニタリングスキャンの通過娘イオンのｍ／ｚ範囲は、通過した標識化された特徴的ペプチドに対応する該選択された識別用娘イオンのうちの１つまたはそれ以上の識別用娘イオンのｍ／ｚ値を含む工程と、
該多重反応モニタリングを使用して、該選択された識別用娘イオンのうちの１つまたはそれ以上の選択された識別用娘イオンのイオンシグナルを測定する工程と、
該目的の２つまたはそれ以上のサンプルのうちの１つまたはそれ以上のサンプル中の目的のタンパク質の濃度を、目的のサンプル由来の該目的のタンパク質に対応する選択された識別用娘イオンの測定されたイオンシグナルと標識化された標準サンプル由来の目的のタンパク質に対応する該選択された識別用娘イオンに対する測定されたイオンシグナルとを少なくとも比較することにより求める工程と、を含む、方法。
【請求項２】
前記各特徴的ペプチドに対して識別用娘イオンを選択する工程は、検出レベル（ＬＯＤ）、定量限界（ＬＯＱ）、濃度の特定のダイナミックレンジにわたる定量の線形性、およびそれらの組み合わせのうちの１つまたはそれ以上に基づいて、識別用娘イオンを選択することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、ここで一つ以上の標準サンプル中の目的のタンパク質を標識化する前記工程が、同位体的にコードされたアフィニティタグで目的のタンパク質を標識化する工程を含み、そしてここで異なるサンプル中の目的のタンパク質を標識化する前記工程が、同位体的にコードされたアフィニティタグで目的のタンパク質を標識化する工程を含む、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、ここで一つ以上の標準サンプル中の目的のタンパク質を標識化する前記工程が、同重核のタグで目的のタンパク質を標識化する工程を含み、そしてここで異なるサンプル中の目的のタンパク質を標識化する前記工程が、同重核のタグで目的のタンパク質を標識化する工程を含む、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、ここで一つ以上の標準サンプル中の目的のタンパク質を標識化する前記工程が、質量差タグで目的のタンパク質を標識化する工程を含み、そしてここで異なるサンプル中の目的のタンパク質を標識化する前記工程が、質量差タグで目的のタンパク質を標識化する工程を含む、方法。
【請求項６】
２つまたはそれ以上のサンプルのうちの１つまたはそれ以上のサンプル中の２つまたはそれ以上のタンパク質の絶対濃度を、少なくとも、１つ以上の標準サンプル中の２つ以上の対応するタンパク質の濃度と比較することにより、化学物質に対する生物学的システムの応答を評価する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記化学物質は、医薬品、医薬組成物、代謝産物、毒素、またはそれらの組み合わせのうちの１つまたはそれ以上を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記生物学的システムは、生物体全体、生物体全体のサブユニット、生物学的プロセス、生化学的プロセス、病態、細胞系、またはそれらのモデル、またはそれらの組み合わせのうちの１つまたはそれ以上を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、２つ以上のサンプルのうちの１つ以上における２つ以上のタンパク質の絶対濃度と、１つ以上の標準サンプルにおける２つ以上の対応するタンパク質の濃度の少なくとも比較に基づいて、生物学的システムの病態を評価する工程をさらに含む、方法。
【請求項１０】
前記生物学的システムは、生物体全体、生物体全体のサブユニット、生物学的プロセス、生化学的プロセス、病態、細胞系、またはそれらのモデル、またはそれらの組み合わせのうちの１つまたはそれ以上を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記１つ以上の標準サンプルが、プールされた参照サンプルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
クロマトグラフィカラムに混合サンプルの少なくとも一部をかける工程に先立って、消化された混合サンプルを生成するため、該混合サンプルの少なくとも一部を消化に供する工程をさらに含み、そしてここで該クロマトグラフィカラム上の混合サンプルの一部は、消化された混合サンプルの全てまたは一部である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記消化が、化学的消化を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記消化が、酵素的消化を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
２つ以上の標識化された目的のサンプルとの混合に先立って、１つ以上の標準サンプルの１つ以上が消化に供される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記消化が、化学的消化を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記消化が、酵素的消化を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の方法であって、ここで前記目的のタンパク質の濃度を決定する工程が、該目的のタンパク質の絶対濃度を決定する工程を含む、方法。
【請求項１９】
請求項１に記載の方法であって、目的のタンパク質の濃度を決定する工程が、目的のタンパク質の相対濃度を決定する工程を含み、ここで前記標識化された標準サンプルがプールされた参照サンプルを含む、方法。
【請求項２０】
２つ以上のセットのサンプルにおける１つ以上の目的のタンパク質の相対濃度を決定する方法であって、サンプルの各セットは２つ以上の目的のサンプルを含み、以下：
２つ以上のセットのサンプル由来の目的の各サンプルの一部を含む標準サンプルを提供する工程、
目的の各タンパク質に対する各特徴的ペプチドのための識別用娘イオンを選択する工程、
２つ以上のセットのサンプル中の１つ以上の目的のタンパク質を、一セットの標識に属する１つ以上の化学成分で標識化する工程、
２つ以上のセットのサンプルで用いた該１つ以上の化学成分と異なる該一セットの標識からの化学成分で該標準サンプルを標識化する工程、
第一の混合サンプルを生成するため、標識化標準サンプルの少なくとも一部を、２つ以上のセットのサンプルの第一のセットにおける目的の各標識化サンプルと混合する工程、
該第一の混合サンプルの少なくとも一部をクロマトグラフィカラムにかける工程、
第一の混合サンプルに対する該クロマトグラフィカラムからの溶離液の少なくとも一部を、多重反応モニタリングに供する工程であって、各多重反応モニタリングスキャンの通過親イオンのｍ／ｚ範囲は、該標識化特徴的ペプチドのうちの１つまたはそれ以上の特徴的ペプチドのｍ／ｚ値を含み、各多重反応モニタリングスキャンの通過娘イオンのｍ／ｚ範囲は、通過した標識化特徴的ペプチドに対応する該選択された識別用娘イオンのうちの１つまたはそれ以上の識別用娘イオンのｍ／ｚ値を含む工程、
および該多重反応モニタリングを使用して、該選択された識別用娘イオンの１つまたはそれ以上の識別用娘イオンのイオンシグナルを測定する工程、
第二の混合サンプルを生成するため、標識化標準サンプルの少なくとも一部と、２つ以上のセットのサンプルの第一のセットにおける目的の各標識化サンプルを混合する工程、
該第二の混合サンプルの少なくとも一部をクロマトグラフィカラムにかける工程、
第二の混合サンプルに対する該クロマトグラフィカラムからの溶離液の少なくとも一部を、多重反応モニタリングに供する工程であって、各多重反応モニタリングスキャンの通過親イオンのｍ／ｚ範囲は、該標識化特徴的ペプチドのうちの１つまたはそれ以上の特徴的ペプチドのｍ／ｚ値を含み、各多重反応モニタリングスキャンの通過娘イオンのｍ／ｚ範囲は、通過した標識化特徴的ペプチドに対応する該選択された識別用娘イオンのうちの１つまたはそれ以上の識別用娘イオンのｍ／ｚ値を含む工程と、該多重反応モニタリングを用いて１つ以上の選択された識別用娘イオンのイオンシグナルを測定する工程、および、
第一のセットのサンプルにおける１つ以上の目的のサンプル中の目的のタンパク質の濃度を、第ニのセットにおける１つ以上の目的のサンプル中の目的のタンパク質の濃度に関連して、該目的のタンパク質に対応する選択された識別用娘イオンの測定されたイオンシグナルと、標識化標準サンプル由来の目的のタンパク質に対応する選択された識別用娘イオンに対する測定されたイオンシグナルとを少なくとも比較することにより求める工程、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００４年５月１９日に出願された米国仮特許出願第６０／５７２８２６号（発明の名称「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」）の利益および優先権を主張する２００５年５月１９日に出願された同時係属中の米国特許出願第１１／１３４，８５０号（発明の名称「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」）の一部継続出願であり、そして利益および優先権を主張し、その両方の開示内容は、参照することによりすべて本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
タンパク質の発現を理解することは、生物学的システムを理解することにとって重要である。使い捨てのメッセンジャーとして働くにすぎないｍＲＮＡとは異なり、タンパク質は、制御された生物学的機能のほぼすべてを実行しており、結果として、正常な細胞活動、疾患過程、および薬物応答等の機能に不可欠である。しかしながら、タンパク質の発現は、確実に予想できるものではない。第一に、ｍＲＮＡの転写レベルとタンパク質レベルとは必ずしも強い相関関係にあるとは限らないため、タンパク質の発現は、ｍＲＮＡの発現地図からは予想できない。第二に、タンパク質は、生物学的システムにおいて、遺伝情報からは予想できない方法で、環境要因により動的に修飾される。
【０００３】
さらに、タンパク質の機能は、その存在量（ａｂｕｎｄａｎｃｅ）と修飾の程度により調節され得る。タンパク質の発現（又は濃度）およびタンパク質の修飾の程度の変化は、細胞内基質分解過程や生合成経路等の活性、細胞周期、または生物体全体における単一細胞の機能に大きな影響を与え得る。結果として、タンパク質濃度の変化は、例えば、分子レベルでの生物学的状態、可能性のある薬剤標的、薬剤の毒性、薬剤が危険な代謝産物を生成する可能性等に関する情報を提供したり、ある病態に対するバイオマーカーや特殊な薬物療法に対する肯定応答の見込みを予想するマーカーとしての役割を果たしたりすることができる可能性がある。
【０００４】
一般に、タンパク質発現を定量化するための手法は、相対定量と絶対定量との２つの種類に分類される。概して、絶対定量は相対定量と比べてより多くの情報を提供するが、従来から実施することがより難しかった。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の開示）
本教示は、タンパク質発現の絶対定量のためのシステム、方法、アッセイ、およびキットを提供する。種々の局面において、特徴的タンパク質フラグメントの標準サンプルおよび親−娘イオントランジションモニタリング（ＰＤＩＴＭ）を使用して、タンパク質の１つまたはそれ以上のアイソフォームの絶対濃度を求める方法を提供する。種々の実施形態において、前記タンパク質アイソフォームは、１つまたはそれ以上のイソ酵素、１つまたはそれ以上の異性体、またはそれらの組み合わせからなる。種々の実施形態において、１つのサンプル中の生体分子の複数のアイソフォームの絶対濃度、生物学的プロセス（例えば、バイオマーカー群や生物学的経路等を対象とするため）や複数のサンプルを組み合わせたものにおける複数のタンパク質の絶対濃度、またはそれらを組み合わせたものを、例えば、そのサンプル（または混合サンプル）をクロマトグラフィカラムに１回かけた後ＰＤＩＴＭを行うといった複合的な方法により求めることができる。
【０００６】
「親−娘イオントランジションモニタリング（ｐａｒｅｎｔ−ｄａｕｇｈｔｅｒ  ｉｏｎ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）」または「ＰＤＩＴＭ」という用語は、例えば、第１の質量分離器（しばしば、質量分析の第１局面と呼ばれる）の通過質量電荷比（ｍ／ｚ）範囲（ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ  ｍａｓｓ−ｔｏ−ｃｈａｒｇｅ  ｒａｎｇｅ）を選択し、分子イオン（しばしば、「親イオン」または「プレカーサイオン」と呼ばれる）をイオンフラグメンター（例えば、コリジョンセル、光解離領域等）に送ってフラグメントイオン（しばしば、「娘イオン」と呼ばれる）を生成し、第２の質量分離器（しばしば、質量分析の第２局面と呼ばれる）の通過ｍ／ｚ範囲を選択し、１つまたはそれ以上の娘イオンをその娘イオンの信号を測定する検出器へ送る質量分析法を使用した測定のことを言う。モニターされた親イオンと娘イオンの質量の組み合わせを、モニターされた「親−娘イオントランジション（ｐａｒｅｎｔ−ｄａｕｇｈｔｅｒ  ｉｏｎ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）」と呼ぶことがある。モニターされた任意の親イオン−娘イオンの組み合わせに対する検出器における娘イオンシグナルを、「親−娘イオントランジション信号（ｐａｒｅｎｔ−ｄａｕｇｈｔｅｒ  ｉｏｎ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ）」と呼ぶことがある。本教示において、親イオンが特徴的ペプチド（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ）であって、識別用娘イオン（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｄａｕｇｈｔｅｒ  ｉｏｎ）のイオンシグナルが測定された場合、モニターされた任意の特徴的ペプチドイオン−識別用娘イオンの組み合わせに対する検出器における当該識別用娘イオンの信号を、「特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジション信号（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｄａｕｇｈｔｅｒ  ｉｏｎ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ）」と呼ぶことがある。
【０００７】
例えば、親−娘イオントランジションモニタリングのひとつの実施形態は、多重反応モニタリング（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）（ＭＲＭ）（選択反応モニタリング（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）とも言う）である。ＭＲＭの種々の実施形態において、任意の親−娘イオントランジションのモニタリングは、目的の親イオンが通過するように目的の親イオンのｍ／ｚに置かれた第１の四重極を第１の質量分離器として使用することと、目的の娘イオンが通過するように目的の娘イオンのｍ／ｚに置かれた第２の四重極を第２の質量分離器として使用することと、からなる。種々の実施形態において、ＰＤＩＴＭは、例えば、第１の質量分離器を目的の親イオンのｍ／ｚに置いて親イオンを通過させ、第２の質量分離器を目的の娘イオンのｍ／ｚ値を含むｍ／ｚ範囲にわたって走査し、例えば、スペクトルからイオン強度プロフィールを抽出することにより行うことができる。
【０００８】
例えば、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）装置、または、より一般的には、多次元質量分析（ＭＳｎ）装置を使用することにより、ＰＤＩＴＭ、例えば、ＭＲＭを行うことができる。
【０００９】
種々の実施形態において、目的の１つまたはそれ以上のタンパク質は、例えば、識別用娘イオンシグナルの標準化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）、第１のサンプル中のタンパク質の濃度の第２のサンプル中の濃度に対する標準化（例えば、濃度比を標準化する）、データ信頼性の評価、複数のサンプル間の開始サンプル量の評価、またはそれらの組み合わせのために使用することができる。ここで、このようなタンパク質を標準化タンパク質（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）と言う。したがって、種々の実施形態において、「標準化タンパク質（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」という用語は、２つまたはそれ以上のサンプルのうちの２つまたはそれ以上のサンプル中で実質的に同じ濃度を有することが予想されるタンパク質、サンプルの化学物質による処理によって実質的に影響を受けない濃度を有することが予想されるタンパク質、またはその両方を意味する。例えば、種々の実施形態において、目的のタンパク質は、複数のサンプル間で実質的に同じ濃度を有することが知られているタンパク質とすることができる。種々の実施形態において、標準化タンパク質の特徴的ペプチドの信号レベルの変化を使用して、１つまたはそれ以上の目的のタンパク質の特徴的ペプチドの信号レベルを標準化することができる。種々の実施形態において、２つのサンプル間の標準化タンパク質の特徴的ペプチドの信号レベルの違いを使用して、データ信頼性を評価することができる。例えば、標準化タンパク質に関連する特徴的ペプチド信号が複数のサンプル間でかなりの量異なる場合、これらのサンプルのうちの１つまたは両方のサンプルに関連するデータは信頼できないものとして排除する。種々の実施形態において、標準化タンパク質の絶対濃度を求める必要はない。なぜなら、例えば、１つのサンプル中の標準化タンパク質に関連する特徴的ペプチド信号ともう１つのサンプル中のそれとの比を使用することにより、１つまたはそれ以上の目的のタンパク質の複数の特徴的ペプチドの信号レベルの標準化、１つのサンプル中の目的のタンパク質の濃度のもう１つのサンプル中のそれに対する標準化、複数のサンプル間の開始サンプル量の評価、データの信頼性の評価、またはそれらの組み合わせを行うことができるからである。
【００１０】
種々の実施形態において、１つまたはそれ以上のサンプル中の１つまたはそれ以上の目的のタンパク質の濃度を求める方法であって、
（ａ）１つまたはそれ以上の目的のタンパク質のそれぞれに対して、対応する目的のタンパク質に対する特徴的ペプチドからなる標準サンプルを用意する工程と、
（ｂ）各標準サンプルの少なくとも１つの特徴的ペプチドに対して、１つまたはそれ以上の特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジションを選択する工程と、
（ｃ）各選択された特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジションに対する濃度曲線を作成する工程と、
（ｄ）前記１つまたはそれ以上のサンプル中の１つまたはそれ以上の目的のタンパク質を化学成分（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｉｅｔｙ）で標識化する工程と、
（ｅ）前記１つまたはそれ以上の各標識化サンプルの少なくとも一部をクロマトグラフィカラムにかける工程と、
（ｆ）前記クロマトグラフィカラムからの溶離液の少なくとも一部を質量分析システムに導く工程と、
（ｇ）前記選択された特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジションのうちの１つまたはそれ以上の特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジションの特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジション信号を測定する工程と、
（ｈ）前記標識化サンプルのうちの１つまたはそれ以上の標識化サンプル中の目的のタンパク質の絶対濃度を、当該目的のタンパク質に対応する測定された特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジション信号とその特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジションに対する濃度曲線とを少なくとも比較することにより求める工程と、からなる方法を提供する。種々の実施形態において、前記方法は、前記２つまたはそれ以上のサンプルのうちの１つまたはそれ以上のサンプル中の２つまたはそれ以上のタンパク質の絶対濃度を少なくとも比較することにより、化学物質に対する生物学的システムの応答を評価する工程、または生物学的システムの病態を評価する工程、またはそれら両方の工程を含む。種々の実施形態において、前記評価工程は、第１のサンプル中の目的のタンパク質の濃度を第２のサンプル中の当該目的のタンパク質の濃度に対して比較することにより、目的のタンパク質の２つのサンプル間の濃度比を求めることと、前記第１のサンプル中の標準化タンパク質の濃度を前記第２のサンプル中の当該標準化タンパク質の濃度に対して比較することにより、標準化タンパク質の２つのサンプル間の濃度比を求めることと、前記標準化タンパク質の濃度比を使用して、前記目的のタンパク質の濃度比を標準化することと、からなる。
【００１１】
種々の実施形態において、１つまたはそれ以上のサンプル中の１つまたはそれ以上の目的のタンパク質の濃度を求める方法であって、
（ａ）対応する目的のタンパク質のそれぞれに対する特徴的ペプチドからなる標準サンプルを用意する工程と、
（ｂ）各特徴的ペプチドに対して１つまたはそれ以上の特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジションを選択する工程と、
（ｃ）前記１つまたはそれ以上のサンプル中の１つまたはそれ以上の目的のタンパク質を化学成分によって標識化して１つまたはそれ以上の標識化サンプルを作成する工程と、
（ｄ）１つまたはそれ以上の標準サンプルを化学成分によって標識化する工程と、
（ｅ）前記１つまたはそれ以上の標識化標準サンプルの少なくとも一部と、当該１つまたはそれ以上の標識化標準サンプルとは異なる化学成分で標識化された１つまたはそれ以上の標識化サンプルの少なくとも一部とを混合して混合サンプルを作成する工程と、
（ｆ）前記１つまたはそれ以上の各混合サンプルの少なくとも一部をクロマトグラフィカラムにかける工程と、
（ｇ）前記クロマトグラフィカラムからの溶離液の少なくとも一部を質量分析システムに導く工程と、
（ｈ）前記選択された特徴的ぺプチド−識別用娘イオントランジションのうちの１つまたはそれ以上の特徴的ぺプチド−識別用娘イオントランジションの特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジション信号を測定する工程と、
（ｉ）前記標識化サンプルのうちの１つまたはそれ以上の標識化サンプル中の目的のタンパク質の絶対濃度を、当該目的のタンパク質に対する測定された特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジション信号と標識化標準サンプルに対する測定された特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジション信号とを少なくとも比較することにより求める工程と、からなることを特徴とする方法を提供する。種々の実施形態において、前記方法は、前記２つまたはそれ以上のサンプルのうちの１つまたはそれ以上のサンプル中の２つまたはそれ以上のタンパク質の絶対濃度を少なくとも比較することにより、化学物質に対する生物学的システムの応答を評価する工程、または生物学的システムの病態を評価する工程、またはそれら両方の工程を含む。種々の実施形態において、前記評価工程は、第１のサンプル中の目的のタンパク質の濃度を第２のサンプル中の当該目的のタンパク質の濃度に対して比較することにより、目的のタンパク質の２つのサンプル間の濃度比を求めることと、前記第１のサンプル中の標準化タンパク質の濃度を前記第２のサンプル中の当該標準化タンパク質の濃度に対して比較することにより、標準化タンパク質の２つのサンプル間の濃度比を求めることと、前記標準化タンパク質の濃度比を使用して、前記目的のタンパク質の濃度比を標準化することと、からなる。
【００１２】
種々の実施形態において、１つまたはそれ以上のサンプル中の１つまたはそれ以上の目的のタンパク質の濃度を求める方法であって、
（ａ）１つまたはそれ以上の目的のタンパク質のそれぞれに対して、対応する目的のタンパク質に対する特徴的ペプチドからなる標準サンプルを用意する工程と、
（ｂ）各標準サンプルの少なくとも１つの特徴的ペプチドに対して、１つまたはそれ以上の特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジションを選択する工程と、
（ｃ）各選択された特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジションに対して濃度曲線を作成する工程と、
（ｄ）前記１つまたはそれ以上のサンプル中の１つまたはそれ以上の目的のタンパク質を化学成分によって標識化する工程と、
（ｅ）１つまたはそれ以上の標準サンプルを化学成分によって標識化する工程と、
（ｆ）前記１つまたはそれ以上の標識化標準サンプルの少なくとも一部と、当該１つまたはそれ以上の標識化標準サンプルとは異なる化学成分で標識化された１つまたはそれ以上の標識化サンプルの少なくとも一部とを混合して混合サンプルを作成する工程と、
（ｇ）前記１つまたはそれ以上の各混合サンプルの少なくとも一部をクロマトグラフィカラムにかける工程と、
（ｈ）前記クロマトグラフィカラムからの溶離液の少なくとも一部を質量分析システムに導く工程と、
（ｉ）前記選択された特徴的ぺプチド−識別用娘イオントランジションのうちの１つまたはそれ以上の特徴的ぺプチド−識別用娘イオントランジションの特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジション信号を測定する工程と、
（ｊ）前記標識化サンプルのうちの１つまたはそれ以上の標識化サンプル中の目的のタンパク質の絶対濃度を、当該目的のタンパク質に対応する測定された特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジション信号と、その特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジションに対する濃度曲線および標識化標準サンプルに対する測定された特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジション信号のうちの１つまたはそれ以上とを少なくとも比較することにより求める工程と、からなる方法を提供する。種々の実施形態において、前記方法は、前記２つまたはそれ以上のサンプルのうちの１つまたはそれ以上のサンプル中の２つまたはそれ以上のタンパク質の絶対濃度を少なくとも比較することにより、化学物質に対する生物学的システムの応答を評価する工程、または生物学的システムの病態を評価する工程、またはそれら両方の工程を含む。種々の実施形態において、前記評価工程は、第１のサンプル中の目的のタンパク質の濃度を第２のサンプル中の当該目的のタンパク質の濃度に対して比較することにより、目的のタンパク質の２つのサンプル間の濃度比を求めることと、前記第１のサンプル中の標準化タンパク質の濃度を前記第２のサンプル中の当該標準化タンパク質の濃度に対して比較することにより、標準化タンパク質の２つのサンプル間の濃度比を求めることと、前記標準化タンパク質の濃度比を使用して、前記目的のタンパク質の濃度比を標準化することと、からなる。
【００１３】
種々の実施形態において、２つまたはそれ以上のサンプル中の１つまたはそれ以上のタンパク質の濃度を求める方法であって、
（ａ）１つまたはそれ以上の目的のタンパク質のそれぞれに対して、対応する目的のタンパク質に対する特徴的ペプチドからなる標準サンプルを用意する工程と、
（ｂ）各標準サンプルの少なくとも１つの特徴的ペプチドに対して、１つまたはそれ以上の特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジションを選択する工程と、
（ｃ）各選択された識別用娘イオンに対して濃度曲線を作成する工程と、
（ｄ）前記２つまたはそれ以上のサンプル中の１つまたはそれ以上の目的のタンパク質を、各サンプルに対して異なる化学成分によって標識化することにより、それら２つまたはそれ以上のサンプルを差次的に標識化する工程と、
（ｅ）それらの差次的に標識化されたサンプルの少なくとも一部を混合することにより混合サンプルを作成する工程と、
（ｆ）前記混合サンプルの少なくとも一部をクロマトグラフィカラムにかける工程と、
（ｇ）前記クロマトグラフィカラムからの溶離液の少なくとも一部を質量分析システムに導く工程と、
（ｈ）前記選択された特徴的ぺプチド−識別用娘イオントランジションのうちの１つまたはそれ以上の特徴的ぺプチド−識別用娘イオントランジションの特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジション信号を測定する工程と、
（ｉ）前記差次的に標識化されたサンプルのうちの１つまたはそれ以上のサンプル中の目的のタンパク質の絶対濃度を、当該目的のタンパク質に対する測定された特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジション信号とその特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジションに対する濃度曲線とを少なくとも比較することにより求める工程と、からなる方法を提供する。種々の実施形態において、前記方法は、前記２つまたはそれ以上のサンプルのうちの１つまたはそれ以上のサンプル中の２つまたはそれ以上のタンパク質の絶対濃度を少なくとも比較することにより、化学物質に対する生物学的システムの応答を評価する工程、または生物学的システムの病態を評価する工程、またはそれら両方の工程を含む。種々の実施形態において、前記評価工程は、第１のサンプル中の目的のタンパク質の濃度を第２のサンプル中の当該目的のタンパク質の濃度に対して比較することにより、目的のタンパク質の２つのサンプル間の濃度比を求めることと、前記第１のサンプル中の標準化タンパク質の濃度を前記第２のサンプル中の当該標準化タンパク質の濃度に対して比較することにより、標準化タンパク質の２つのサンプル間の濃度比を求めることと、前記標準化タンパク質の濃度比を使用して、前記目的のタンパク質の濃度比を標準化することと、からなる。
【００１４】
種々の実施形態において、２つまたはそれ以上のサンプル中の１つまたはそれ以上の目的のタンパク質の濃度を求める方法であって、
（ａ）１つまたはそれ以上の目的のタンパク質のそれぞれに対して、対応する目的のタンパク質に対する特徴的ペプチドからなる標準サンプルを用意する工程と、
（ｂ）各標準サンプルの少なくとも１つの特徴的ペプチドに対して、１つまたはそれ以上の特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジションを選択する工程と、
（ｃ）前記２つまたはそれ以上のサンプル中の１つまたはそれ以上の目的のタンパク質を、各サンプルに対して異なる化学成分によって標識化することにより、それら２つまたはそれ以上のサンプルを差次的に標識化する工程と、
（ｄ）１つまたはそれ以上の標準サンプルを化学成分によって標識化する工程と、
（ｅ）前記１つまたはそれ以上の標識化標準サンプルの少なくとも一部と、当該１つまたはそれ以上の標識化標準サンプルとは異なる化学成分で標識化された２つまたはそれ以上の差次的に標識化されたサンプルの少なくとも一部とを混合することにより混合サンプルを作成する工程と、
（ｆ）前記混合サンプルの少なくとも一部をクロマトグラフィカラムにかける工程と、
（ｇ）前記クロマトグラフィカラムからの溶離液の少なくとも一部を質量分析システムに導く工程と、
（ｈ）前記選択された特徴的ぺプチド−識別用娘イオントランジションのうちの１つまたはそれ以上の特徴的ぺプチド−識別用娘イオントランジションの特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジション信号を測定する工程と、
（ｉ）前記差次的に標識化されたサンプルのうちの１つまたはそれ以上のサンプル中の目的のタンパク質の絶対濃度を、当該目的のタンパク質に対する測定された特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジション信号と標識化標準サンプルに対する測定された特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジション信号とを少なくとも比較することにより求める工程と、からなる方法を提供する。種々の実施形態において、前記方法は、前記２つまたはそれ以上のサンプルのうちの１つまたはそれ以上のサンプル中の２つまたはそれ以上のタンパク質の絶対濃度を少なくとも比較することにより、化学物質に対する生物学的システムの応答を評価する工程、または生物学的システムの病態を評価する工程、またはそれら両方の工程を含む。種々の実施形態において、前記評価工程は、第１のサンプル中の目的のタンパク質の濃度を第２のサンプル中の当該目的のタンパク質の濃度に対して比較することにより、目的のタンパク質の２つのサンプル間の濃度比を求めることと、前記第１のサンプル中の標準化タンパク質の濃度を前記第２のサンプル中の当該標準化タンパク質の濃度に対して比較することにより、標準化タンパク質の２つのサンプル間の濃度比を求めることと、前記標準化タンパク質の濃度比を使用して、前記目的のタンパク質の濃度比を標準化することと、からなる。
【００１５】
種々の実施形態において、２つまたはそれ以上のサンプル中の１つまたはそれ以上の目的のタンパク質の濃度を求める方法であって、
（ａ）１つまたはそれ以上の目的のタンパク質のそれぞれに対して、対応する目的のタンパク質に対する特徴的ペプチドからなる標準サンプルを用意する工程と、
（ｂ）各標準サンプルの少なくとも１つの特徴的ペプチドに対して、１つまたはそれ以上の特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジションを選択する工程と、
（ｃ）各選択された識別用娘イオンに対して濃度曲線を作成する工程と、
（ｄ）前記２つまたはそれ以上のサンプル中の１つまたはそれ以上の目的のタンパク質を、各サンプルに対して異なる化学成分によって標識化することにより、それら２つまたはそれ以上のサンプルを差次的に標識化する工程と、
（ｅ）１つまたはそれ以上の標準サンプルを化学成分によって標識化する工程と、
（ｆ）前記１つまたはそれ以上の標識化標準サンプルの少なくとも一部と、当該１つまたはそれ以上の標識化標準サンプルとは異なる化学成分で標識化された２つまたはそれ以上の差次的に標識化されたサンプルの少なくとも一部とを混合することにより混合サンプルを作成する工程と、
（ｇ）前記混合サンプルの少なくとも一部をクロマトグラフィカラムにかける工程と、
（ｈ）前記クロマトグラフィカラムからの溶離液の少なくとも一部を質量分析システムに導く工程と、
（ｉ）前記選択された特徴的ぺプチド−識別用娘イオントランジションのうちの１つまたはそれ以上の特徴的ぺプチド−識別用娘イオントランジションの特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジション信号を測定する工程と、
（ｊ）前記標識化サンプルのうちの１つまたはそれ以上のサンプル中の目的のタンパク質の絶対濃度を、当該目的のタンパク質に対応する測定された特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジション信号と、その特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジションに対する濃度曲線および標識化標準サンプルに対する測定された特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジション信号のうちの１つまたはそれ以上とを少なくとも比較することにより求める工程と、からなる方法を提供する。種々の実施形態において、前記方法は、前記２つまたはそれ以上のサンプルのうちの１つまたはそれ以上のサンプル中の２つまたはそれ以上のタンパク質の絶対濃度を少なくとも比較することにより、化学物質に対する生物学的システムの応答を評価する工程、または生物学的システムの病態を評価する工程、またはそれら両方の工程を含む。種々の実施形態において、前記評価工程は、第１のサンプル中の目的のタンパク質の濃度を第２のサンプル中の当該目的のタンパク質の濃度に対して比較することにより、目的のタンパク質の２つのサンプル間の濃度比を求めることと、前記第１のサンプル中の標準化タンパク質の濃度を前記第２のサンプル中の当該標準化タンパク質の濃度に対して比較することにより、標準化タンパク質の２つのサンプル間の濃度比を求めることと、前記標準化タンパク質の濃度比を使用して、前記目的のタンパク質の濃度比を標準化することと、からなる。
【００１６】
対応する目的のタンパク質に対する特徴的ペプチドからなる前記標準サンプル（ここでは「特徴的ペプチド標準サンプル（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓａｍｐｌｅ）」とも言う）は、種々の実施形態において、各特徴的ペプチドに対する濃度曲線を作成するために使用され、種々の実施形態において、未知のサンプルを測定する際の内部標準として機能し得る。種々の実施形態において、これら標準ペプチドは、未知のサンプルを測定する際に、濃度標準化標準として機能し得る。種々の実施形態において、標準サンプルは、標準化タンパク質に対する特徴的ペプチドからなる。
【００１７】
本教示において、標準サンプルは、種々の方法で提供され得る。種々の実施形態において、標準サンプルは合成ペプチドとして提供され得、その合成ペプチドは標識化され、そして内部標準を提供するため、調査中のサンプルに既知の濃度で加えられる。種々の実施形態において、標準サンプルは、一つ以上の目的のタンパク質を含むコントロールサンプルから提供される。該コントロールサンプルは、タグで標識化される前または後に、フラグメンテーション（例えば、消化）に供され得る。タグは、一つ以上の目的のタンパク質中で、一つ以上の特徴的ペプチドを標識化するために用いられ得る。標識化されたコントロールサンプルは、内部標準を提供するために、調査中のサンプルに加えられ得る。種々の実施形態において、標識化されたコントロールサンプルは、既知の濃度で加えられ得、そして調査中のサンプルにおける一つ以上の目的のタンパク質の絶対濃度を決定するために用いられ得る。種々の実施形態において、標識化されたコントロールサンプルは、固定された量で一セットのサンプルに加えられ、そして調査中のサンプルのセット間で、一つ以上の目的のタンパク質の相対的な濃度を決定するために用いられ得る。
【００１８】
コントロールサンプルは、多様な方法で提供され得る。例えば、コントロールサンプルは、例えば、正常サンプル、分析される全てまたはいくつかのサンプル由来のプールされた参照標準物、またはそれらの組み合わせを含み得る。例えば、種々の実施形態において、コントロールサンプルは、調査中のサンプルが正常サンプルと異なるか決定するための内部標準として役立ち得、そしてそれゆえに、例えば、疾患の状態について疾患の段階の有力な表示を提供する、通常の患者サンプルを含む。種々の実施形態において、コントロールサンプルは、実質的に固定された割合で、分析される全てのサンプル中に混合される。種々の実施形態において、約１：１の固定された割合が用いられ、そして例えば、アップレギュレートまたはダウンレギュレートされる両方のペプチド、タンパク質またはその両者の観察を容易にし得る。
【００１９】
種々の実施形態において、前記目的のタンパク質は、シトクロムＰ４５０アイソフォームからなり、それらの例としては、これらに限定されないが、Ｃｙｐ１ａ１、Ｃｙｐ１ａ２、Ｃｙｐ１ｂ１、Ｃｙｐ２ａ４、Ｃｙｐ２ａ１２、Ｃｙｐ２ｂ６、Ｃｙｐ２ｂ１０、Ｃｙｐ２ｃ８、Ｃｙｐ２ｃ９、Ｃｙｐ２ｃ１９、Ｃｙｐ２ｃ２９／Ｃｙｐ２ｃ３７、Ｃｙｐ２ｃ３９、Ｃｙｐ２ｃ４０、Ｃｙｐ２ｄ６、Ｃｙｐ２ｄ９、Ｃｙｐ２ｄ２２／Ｃｙｐ２ｄ２６、Ｃｙｐ２ｅ１、Ｃｙｐ２ｆ２、Ｃｙｐ２ｊ５、Ｃｙｐ３ａ４、Ｃｙｐ３ａ１１、Ｃｙｐ４ａ１０／Ｃｙｐ４ａ１４、およびこれらの組み合わせのうちの１つまたはそれ以上が挙げられる。種々の実施形態において、前記特徴的ペプチドは、ＣＩＧＥＴＩＧＲ（配列番号１）、ＣＩＧＥＩＰＡＫ（配列番号２）、ＣＩＧＥＥＬＳＫ（配列番号３）、ＹＣＦＧＥＧＬＡＲ（配列番号４）、ＦＣＬＧＥＳＬＡＫ（配列番号５）、ＩＣＬＧＥＳＩＡＲ（配列番号６）、ＩＣＡＧＥＧＬＡＲ（配列番号７）、ＶＣＡＧＥＧＬＡＲ（配列番号８）、ＩＣＶＧＥＳＬＡＲ（配列番号９）、ＳＣＬＧＥＡＬＡＲ（配列番号１０）、ＳＣＬＧＥＰＬＡＲ（配列番号１１）、ＶＣＶＧＥＧＬＡＲ（配列番号１２）、ＬＣＬＧＥＰＬＡＲ（配列番号１３）、ＡＣＬＧＥＱＬＡＫ（配列番号１４）、ＮＣＬＧＭＲ（配列番号１５）、ＮＣＩＧＫ（配列番号１６）、ＹＩＤＬＬＰＴＳＬＰＨＡＶＴＣＤＩＫ（配列番号１７）、ＩＣＶＧＥＧＬＡＲ（配列番号１８）、ＡＣＬＧＥＰＬＡＲ（配列番号１９）、ＣＩＧＥＶＬＡＫ（配列番号２０）、ＧＦＣＭＦＤＭＥＣＨＫ（配列番号２１）、ＩＣＬＧＥＧＩＡＲ（配列番号２２）、ＬＣＱＮＥＧＣＫ（配列番号２３）、ＧＣＰＳＬＳＥＬＷＲ（配列番号２４）、ＥＥＣＡＬＥＩＩＫ（配列番号２５）、ＧＣＰＳＬＡＥＨＷＫ（配列番号２６）、およびＶＦＡＮＰＥＤＣＡＦＧＫ（配列番号２７）のうちの１つまたはそれ以上からなる。
【００２０】
種々の実施形態において、本教示は、抗体を含む治療上の候補化合物の同定および細胞免疫療法を促進する。種々の実施形態において、本教示は、薬物代謝酵素（例えば、シトクロムＰ４５０、ウリジン５’−トリフォスフェートグルクルノシルトランスフェラーゼ等）の研究を促進する。例えば、モノオキシゲナーゼのシトクロムＰ４５０タンパク質ファミリーは、肝臓における薬物消失の調整および毒性のある薬物代謝産物の形成の役割を担っている。Ｐ４５０アイソフォームには、約２５の異なるアイソフォームを有する４つの主なファミリーが存在し、それぞれ、異なる薬物または薬品によって誘導される異なる基質特異性を有する。この酵素的挙動により、この種のタンパク質は薬物開発において重要となる。例えば、様々なＰ４５０タンパク質の発現の変化により、様々な薬剤の毒性や危険な薬物代謝産物形成の可能性に関する情報を得ることができる。多数のＰ４５０アイソフォームのスクリーニングのシステム、方法、またはアッセイは、特にそれが個々のアイソフォームに対する発現の変化に関する定量的データをもたらす場合には、薬物開発において価値があるであろう。
【００２１】
種々の局面において、化学物質に対する生物学的システムの応答を評価する方法であって、
（ａ）  化学物質に曝露されていない生物学的サンプル中の２つまたはそれ以上のタンパク質の絶対濃度を求める工程と、
（ｂ）  前記化学物質に曝露された生物学的サンプル中の２つまたはそれ以上のタンパク質の絶対濃度を求める工程と、
（ｃ）  工程（ａ）で求めた絶対濃度のうちの１つまたはそれ以上の絶対濃度と工程（ｂ）で求めた絶対濃度のうちの１つまたはそれ以上の絶対濃度とを少なくとも比較することにより、前記化学物質に対する生物学的システムの応答を評価する工程と、からなる方法を提供する。種々の実施形態において、生物学的システム（例えば、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）、コンピュータ内（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）、またはそれらの組み合わせ）の例としては、これらに限定されないが、生物体全体（例えば、哺乳動物、バクテリア、ウイルス等）、生物体全体の１つまたはそれ以上のサブユニット（例えば、器官、組織、細胞等）、生物学的または生化学的プロセス、病態、細胞系、それらのモデル、およびそれらの組み合わせが挙げられる。種々の実施形態において、前記化学物質は、１つまたはそれ以上の医薬品、医薬組成物、またはそれらの組み合わせからなる。
【００２２】
種々の実施形態において、前記の化学物質に対する生物学的システムに対する応答を評価する方法において絶対濃度を求めることは、１つまたはそれ以上のサンプル中の１つまたはそれ以上の目的のタンパク質の濃度を求める本明細書に記載の方法のうちの１つまたはそれ以上の方法、または２つまたはそれ以上のサンプル中の１つまたはそれ以上の目的のタンパク質の濃度を求める本明細書に記載の方法のうちの１つまたはそれ以上の方法、またはそれらの組み合わせからなる。
【００２３】
種々の局面において、１つまたはそれ以上のサンプル中の２つまたはそれ以上の目的のタンパク質の発現レベルを求めることを目的としたアッセイを提供する。当該アッセイは、例えば、エンドポイントアッセイ（ｅｎｄｐｏｉｎｔ  ａｓｓａｙ）、カイネティックアッセイ（ｋｉｎｅｔｉｃ  ａｓｓａｙ）、またはそれらの組み合わせとすることができる。当該アッセイは、例えば、疾患または病状の診断、疾患または病状の予想、またはその両方を行うことができる。種々の実施形態において、本教示の方法を使用して１つまたはそれ以上のサンプル中の２つまたはそれ以上のタンパク質の発現レベルを求めるアッセイであって、１つまたはそれ以上のサンプル中の１つまたはそれ以上の目的のタンパク質の濃度を求める本明細書に記載の方法のうちの１つまたはそれ以上の方法、または２つまたはそれ以上のサンプル中の１つまたはそれ以上の目的のタンパク質の濃度を求める本明細書に記載の方法のうちの１つまたはそれ以上の方法、またはそれらの組み合わせからなるアッセイを提供する。
【００２４】
種々の局面において、本教示の方法、アッセイ、またはそれら両方を行うためのキットを提供する。種々の実施形態において、キットは、２つまたはそれ以上の特徴的ペプチド標準サンプルからなり、当該２つまたはそれ以上の特徴的ペプチド標準サンプルのうちの２つまたはそれ以上の特徴的ペプチド標準サンプルの特徴的ペプチドは、異なるタンパク質の特徴的ペプチドである。種々の実施形態において、キットは、５つまたはそれ以上の特徴的ペプチド標準サンプルからなり、当該５つまたはそれ以上の特徴的ペプチド標準サンプルのうちの１０またはそれ以上の特徴的ペプチド標準サンプルの特徴的ペプチドは、異なるシトクロムＰ４５０アイソフォームの特徴的ペプチドである。種々の実施形態において、キットは、１０またはそれ以上の特徴的ペプチド標準サンプルからなり、当該１０またはそれ以上の特徴的ペプチド標準サンプルのうちの１０またはそれ以上の特徴的ペプチド標準サンプルの特徴的ペプチドは、異なるシトクロムＰ４５０アイソフォームの特徴的ペプチドである。
【００２５】
種々の実施形態において、キットは、１つまたはそれ以上の標準化タンパク質に対する１つまたはそれ以上の特徴的ペプチド標準サンプルからなる。例えば、種々の実施形態において、キットは、標準化タンパク質に対する１つまたはそれ以上の標識化された特徴的ペプチド標準サンプルからなり、その特徴的ペプチドは、ＬＣＱＮＥＧＣＫ（配列番号２３）、ＥＥＣＡＬＥＩＩＫ（配列番号２５）、ＧＣＰＳＬＡＥＨＷＫ（配列番号２６）、およびＶＦＡＮＰＥＤＣＡＦＧＫ（配列番号２７）のうちのひとつまたはそれ以上からなる。
【００２６】
種々の実施形態において、キットは、標準化タンパク質（コルチコステロイド  １１−ベータデヒドロゲナーゼ  イソ酵素１、トリグリセリド転移タンパク質、およびミクロソームグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）のうちの１つまたはそれ以上の標準化タンパク質の特徴的ペプチドに対する特徴的ペプチド標準サンプルからなる。
【００２７】
種々の実施形態において、本教示の方法、アッセイ、またはそれら両方をマウス由来の１つまたはそれ以上のサンプルに対して行うキットは、標準化タンパク質（コルチコステロイド  １１−ベータデヒドロゲナーゼ  イソ酵素１、トリグリセリド転移タンパク質、およびミクロソームグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）のうちの１つまたはそれ以上の標準化タンパク質の特徴的ペプチドに対する特徴的ペプチド標準サンプルからなる。
【００２８】
種々の実施形態において、サンプルはミクロソーム細胞由来である。ミクロソーム細胞由来のサンプルに対する好適な標準化タンパク質の例としては、これらに限定されないが、コルチコステロイド  １１−ベータデヒドロゲナーゼ  イソ酵素１、トリグリセリド転移タンパク質、およびミクロソームグルタチオンＳ−トランスフェラーゼが挙げられ、種々の実施形態において、その特徴的ペプチドは、それぞれ、ＬＣＱＮＥＧＣＫ（配列番号２３）、ＥＥＣＡＬＥＩＩＫ（配列番号２５）、ＧＣＰＳＬＡＥＨＷＫ（配列番号２６）、ＶＦＡＮＰＥＤＣＡＦＧＫ（配列番号２７）（例えば、マウス用）、またはＬＣＱＮＥＧＣＫ（配列番号２３）、ＧＣＰＳＬＳＥＬＷＲ（配列番号２４）、ＥＥＣＡＬＥＩＩＫ（配列番号２５）（例えば、ヒト用）、ＬＣＱＮＥＧＣＫ（配列番号２３）、ＥＥＣＡＬＥＩＩＫ（配列番号２５）（例えば、マウスおよびヒト用）である。
【００２９】
種々の実施形態において、キットは、シトクロムＰ４５０アイソフォーム：Ｃｙｐ２ａ４、Ｃｙｐ２ａ１２、Ｃｙｐ２ｂ１０、Ｃｙｐ２ｃ２９／Ｃｙｐ２ｃ３７、およびＣｙｐ２ｃ４０の特徴的ペプチドに対する特徴的ペプチド標準サンプルからなる。種々の実施形態において、キットは、標識化された複数の特徴的ペプチドサンプルからなり、その特徴的ペプチドは、ＹＣＦＧＥＧＬＡＲ（配列番号４）、ＦＣＬＧＥＳＬＡＫ（配列番号５）、ＩＣＬＧＥＳＩＡＲ（配列番号６）、ＩＣＡＧＥＧＬＡＲ（配列番号７）、およびＩＣＶＧＥＳＬＡＲ（配列番号９）からなる。種々の実施形態において、キットは、シトクロムＰ４５０アイソフォーム（Ｃｙｐ１ａ１、Ｃｙｐ１ａ２、Ｃｙｐ１ｂ１、Ｃｙｐ２ａ４、Ｃｙｐ２ａ１２、Ｃｙｐ２ｂ６、Ｃｙｐ２ｂ１０、Ｃｙｐ２ｃ８、Ｃｙｐ２ｃ９、Ｃｙｐ２ｃ１９、Ｃｙｐ２ｃ２９／Ｃｙｐ２ｃ３７、Ｃｙｐ２ｃ３９、Ｃｙｐ２ｃ４０、Ｃｙｐ２ｄ６、Ｃｙｐ２ｄ９、Ｃｙｐ２ｄ２２／Ｃｙｐ２ｄ２６、Ｃｙｐ２ｅ１、Ｃｙｐ２ｆ２、Ｃｙｐ２ｊ５、Ｃｙｐ３ａ４、Ｃｙｐ３ａ１１、Ｃｙｐ４ａ１０／Ｃｙｐ４ａ１４、およびこれらの組み合わせ）のうちの１つまたはそれ以上のシトクロムＰ４５０アイソフォームの特徴的ペプチドに対する特徴的ペプチド標準サンプルからなる。種々の実施形態において、前記特徴的ペプチドは、ＣＩＧＥＴＩＧＲ（配列番号１）、ＣＩＧＥＩＰＡＫ（配列番号２）、ＣＩＧＥＥＬＳＫ（配列番号３）、ＹＣＦＧＥＧＬＡＲ（配列番号４）、ＦＣＬＧＥＳＬＡＫ（配列番号５）、ＩＣＬＧＥＳＩＡＲ（配列番号６）、ＩＣＡＧＥＧＬＡＲ（配列番号７）、ＶＣＡＧＥＧＬＡＲ（配列番号８）、ＩＣＶＧＥＳＬＡＲ（配列番号９）、ＳＣＬＧＥＡＬＡＲ（配列番号１０）、ＳＣＬＧＥＰＬＡＲ（配列番号１１）、ＶＣＶＧＥＧＬＡＲ（配列番号１２）、ＬＣＬＧＥＰＬＡＲ（配列番号１３）、ＡＣＬＧＥＱＬＡＫ（配列番号１４）、ＮＣＬＧＭＲ（配列番号１５）、ＮＣＩＧＫ（配列番号１６）、ＹＩＤＬＬＰＴＳＬＰＨＡＶＴＣＤＩＫ（配列番号１７）、ＩＣＶＧＥＧＬＡＲ（配列番号１８）、ＡＣＬＧＥＰＬＡＲ（配列番号１９）、ＣＩＧＥＶＬＡＫ（配列番号２０）、ＧＦＣＭＦＤＭＥＣＨＫ（配列番号２１）、ＩＣＬＧＥＧＩＡＲ（配列番号２２）、ＬＣＱＮＥＧＣＫ（配列番号２３）、ＧＣＰＳＬＳＥＬＷＲ（配列番号２４）、ＥＥＣＡＬＥＩＩＫ（配列番号２５）、ＧＣＰＳＬＡＥＨＷＫ（配列番号２６）、ＶＦＡＮＰＥＤＣＡＦＧＫ（配列番号２７）、およびそれらの組み合わせのうちの１つまたはそれ以上からなる。
【００３０】
図に関連して以下の説明からより十分に正しく理解されるように、本教示の種々の実施形態は、バイオマーカーの発見、証明および／または確認を促進する方法；基礎生物学および細胞のシグナル伝達の解明を促進する方法；薬物の発見を促進する方法、またはそれらの組み合わせを提供し得る。
【００３１】
種々の実施形態において、本教示は、例えば、経路に関与するタンパク質の量を定量的に測定する能力を助長することにより（例えば、標識したコントロール標準を「休息状態」のサンプルから生成し、そして標識した摂動した状態のサンプルに加えることで、休息状態と摂動状態間のタンパク質発現の変化の定量的な測定を容易にすることにより）、基礎生物学および細胞のシグナル伝達の解明をし得る。
【００３２】
種々の実施形態において、本教示は、例えば、薬剤により影響される生物学的経路の決定を促進することにより、薬物の発見を促進し得る。例えば、本教示の種々の実施形態が、良好な、または可能性のある薬物標的であることを示すタンパク質のパネルを調べるために用いられ得る。その方法は、いずれかの経路が影響されたか（例えば、有利に影響されたか、不利に影響されたか（例えば、毒性効果）、または両方である）決定するため、候補薬物で処理されたサンプルを分析するために用いられ得る。種々の実施形態において、タンパク質のパネルは、広い範囲の細胞の経路をカバーするように選択され得、そして例えば、タンパク質発現における定性的な変化および／または定量的な変化が、治療用物質の候補の作用の様式、実際の標的等のよりよい理解を得るために用いられる。
【００３３】
本教示の前述およびその他の局面、実施形態、および特徴は、添付の図面とともに下記の説明からより十分理解され得る。その種々の図面を通して、図面中の同じ参照番号は、概して同じ特徴および構造要素を指す。それらの図面は、必ずしも原寸に比例しているとは限らず、むしろ本教示の原理を示すことに重点を置く。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
種々の実施形態の詳細な説明
図１Ａおよび図１Ｂを参照すると、種々の実施形態において、サンプル中のタンパク質の絶対濃度を求める方法は、１つまたはそれ以上のサンプル中の各目的のタンパク質に対して、特徴的ペプチド標準サンプルを用意する（ステップ１１０）。例えば、各目的のタンパク質アイソフォームに対して、その個々のアイソフォームに実質的に特有のペプチドを、当該アイソフォームに対する特徴的ペプチドとして選択する。種々の実施形態において、任意の１つのアイソフォームに対して複数の特徴的ペプチドを選択することができ、そのアイソフォームに対して選択された特徴的ペプチドそれぞれに対して、特徴的ペプチド標準サンプルを調製することができる（例えば、１つのタンパク質に対して複数の特徴的ペプチドを使用することにより、そのタンパク質に対する種々の特徴的ペプチド標準サンプルを使用して求めた濃度の相互検証が可能となる）。前記特徴的ペプチド標準サンプルは、例えば、実験条件によって変化しないことが知られているおよび／または予想されるタンパク質から得ることができる。例えば、特徴的ペプチド標準は、一つ以上の目的のタンパク質を含むコントロールサンプル（例えば、通常の患者サンプル、既知の濃度サンプル等のような）から得られる。前記特徴的ペプチド標準サンプルは、非標識化または化学成分により標識化され得る。
【００３５】
各目的のアイソフォームに対する特徴的ペプチドのサンプルは、合成により調製し得、そして化学成分で標識され得る。それぞれのアイソフォームのための特徴的ペプチドのサンプルは、一つ以上のサンプル中での該アイソフォームの消化に先立って、または消化後に一つ以上のサンプル中の化学成分非合成アイソフォームで標識化することにより調製され得る。標識化のために適切な化学成分の例としては、同位体コードアフィニティタグ（例えば、ＩＣＡＴ（商標）試薬）や同重核（同質量）タグ（例えば、ｉＴＲＡＱ（登録商標）試薬）、質量差タグ（ｍａｓｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｔａｇ）（例えば、ｍＴＲＡＱ（登録商標）商標試薬）等の化学成分で標識化することが挙げられるが、それらに限定されない。各標識化された特徴的ペプチドサンプル中の特徴的ペプチドの濃度は、例えば、当該サンプルの一部に対するアミノ酸分析（ＡＡＡ）により求めることができる。種々の実施形態において、前記特徴的ペプチド標準サンプルは、当該標識化された特徴的ペプチドサンプル中の特徴的ペプチドの濃度を求める前に、（例えば、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣ、交換分別等、およびそれらの組み合わせにより、例えば、妨害サンプル、干渉人工産物等を、例えば、除去するために）浄化される。種々の実施形態において、前記特徴的ペプチド標準サンプルは、分析される前記サンプルのうちの１つまたはそれ以上のサンプルに適用されるものと実質的に同じ化学成分で標識化される。種々の実施形態において、前記特徴的ペプチド標準サンプルは、前記サンプルのうちの１つまたはそれ以上のサンプルに適用されるものと異なる化学成分で標識化される（例えば、特徴的ペプチド標準サンプルが内部標準として使用される場合等）。例えば、種々の実施形態において、標準サンプルは、標準化タンパク質に対する特徴的ペプチドからなる。
【００３６】
特徴的ペプチド標準サンプルの少なくとも一部をＰＤＩＴＭスキャン（例えばＭＲＭスキャン）に供することにより、その特徴的ペプチドに対して１つまたはそれ以上の識別用娘イオンを選択し（ステップ１２０）、当該標準サンプルの特徴的ペプチドに対する特徴的ペプチド−娘イオントランジションを選択することができる。なお、異なる複数の特徴的ペプチドに対して同じ識別用娘イオン（例えば、同じ質量や同じ構造等を有する）を選択してもよいことを理解されたい。種々の実施形態において、前記特徴的ペプチド標準サンプルは、識別用娘イオンの選択に使用される前に、（例えば、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣ、交換分別等、およびそれらの組み合わせにより、例えば、妨害サンプル、干渉人工産物等を、例えば、除去するために）浄化される。特徴的ペプチドに対する識別用娘イオンは、例えば、それらの検出レベル（ＬＯＤ）、定量限界（ＬＯＱ）、信号対雑音（Ｓ／Ｎ）比、他の特徴的ペプチドの他の娘イオンとの質量相似性、および濃度の特定のダイナミックレンジにわたる定量の線形性のうちの１つまたはそれ以上のものに基づいて選択することができる。種々の実施形態において、目的の濃度のダイナミックレンジは、例えば、使用する質量分析システムによるが、約３ないし約４桁である。種々の実施形態において、前記ＬＯＱは、当該ＬＯＱを約３ないし約４桁上回るダイナミックレンジで、１マイクログラム（μｇ）のサンプルあたり、約アトモルレベル（１０−１８モル）ないし約フェムトモルレベル（１０−１５モル）の範囲である。
【００３７】
識別用娘イオンを選択するために使用した同じ特徴的ペプチド標準サンプル部分、または特徴的ペプチド標準サンプルの他の部分を使用して、質量分析システムのための親−娘イオントランジションモニタリング条件を求めることができる。例えば、質量分析システムが、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）部分を含む場合、前記特徴的ペプチド標準サンプルを使用してクロマトグラフィの保持時間を求めることができる。種々の実施形態において、前記特徴的ペプチド標準サンプルを使用して、サンプル中の特徴的ペプチドの様々な条件下でのイオン源におけるそのイオン化効率とイオンフラグメンターにおけるそのフラグメンテーション効率とを求めることができる。
【００３８】
再び図１Ａおよび図１Ｂを参照すると、種々の実施形態において、特徴的ペプチド標準サンプルの識別用娘イオンを選択するために使用した同じ部分または他の部分をＰＤＩＴＭに供し、対応する識別用娘イオンに対するイオンシグナルに基づいて、前記選択された特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジションに対する１つまたはそれ以上の濃度曲線を作成する（ステップ１３０）。前記識別用娘イオンに対するイオンシグナルは、例えば、識別用娘イオンピークの強度（平均、中央、最大等）、識別用娘イオンピークの面積、またはそれらの組み合わせに基づかせることができる。種々の実施形態において、濃度曲線の作成には、例えば、濃度測定をし易くしたり、注入体積の違いを明らかにしたりするために、前記特徴的ペプチド標準サンプルの少なくとも一部に含まれる１つまたはそれ以上の内部標準を使用することができる。
【００３９】
種々の実施形態において、濃度曲線は、ＰＤＩＴＭを使用して、対応する特徴的ペプチド標準サンプルに関連する識別用娘イオンのイオンシグナルを測定し、濃度ゼロが識別用娘イオンシグナルゼロに相当するように、測定した濃度の線形外挿により濃度曲線を作成することにより作成できる。種々の実施形態において、濃度曲線は、ＰＤＩＴＭを使用して、２つまたはそれ以上の既知濃度において、対応する特徴的ペプチド標準サンプルに関連する識別用娘イオンのイオンシグナルを測定し、関数をその測定した識別用娘イオンシグナルにフィットさせることにより濃度曲線を作成することにより作成できる。好適なフィッティング関数は、例えば、検出器の応答（例えば、検出器の飽和、非線形性など）に左右されうる。種々の実施形態において、前記フィッティング関数は線形関数である。
【００４０】
種々の実施形態において、サンプル調製および特徴的ペプチド標準サンプル調製は、化学成分（例えば、タグ）でタンパク質、ペプチド、またはその両者を標識化する。本教示においては、種々の化学成分および標識手法を用いることができる。例えば、ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ００／１１２０８（その開示内容は参照によりすべて本明細書に組み込まれる）に記載されている、差次的に同位体的に標識化されたタンパク質反応性試薬を使用して、１つまたはそれ以上の特徴的ペプチドを化学成分で標識化することができる。種々の実施形態において、例えば、ｍＴＲＡＱ商標試薬法のような質量差試薬（ｍａｓｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｅａｇｅｎｔ）が用いられ得る。種々の実施形態において、例えば、ＩＣＡＴ（商標）試薬法等の同位体的にコードされた親和性試薬によるタンパク質の標識化を使用することができる。種々の実施形態において、同重核（ｉｓｏｂａｒｉｃ）試薬（例えば、ｉＴＲＡＱ（登録商標）試薬法のような、同じ質量の標識を提供するが、例えば、衝突誘起解離（ＣＩＤ）による標識化親イオンフラグメンテーションに続いて異なる信号を発生する試薬）を使用することができる。種々の実施形態において、ＭＳにおいてはクロマトグラフ的に同一で区別できないが、ＣＩＤに続いて強い低質量のＭＳ／ＭＳシグニチャイオン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｉｏｎｓ）を生成するアミン誘導体ペプチドを生じる同重核（同質量）試薬のセットを使用することができる。種々の実施形態において、１つまたはそれ以上の同重核試薬で、１つまたはそれ以上のサンプルの１つまたはそれ以上のタンパク質、ペプチド、またはその両方を標識化する前、後、または前と後の両方に、それらに対してアフィニティ分離を行うことができる。
【００４１】
種々の実施形態において、前記同位体コード親和性標識化タンパク質反応性試薬は、３つの部分を有している：同位体的に標識化されたリンカーを含む切断可能リンカー基（Ｌ）を介してタンパク質反応性基（ＰＲＧ）に共有結合された親和性標識（Ａ）。前記リンカーは、前記タンパク質反応性基（ＰＲＧ）に直接結合することができる。前記親和性標識化タンパク質反応性試薬は以下の式を有し得る：
Ａ−Ｌ−ＰＲＧ
前記リンカーは、例えば、当該リンカー中の１つまたはそれ以上の原子をその安定同位体で置換することにより、差次的に同位体的に標識化することができる。例えば、水素は重水素（２Ｈ）と置換可能、および／または、１２Ｃは１３Ｃと置換可能である。１３Ｃの利用は、逆相クロマトグラフィにおいて、重同位体と軽同位体の共溶出を促進する。
【００４２】
前記親和性標識（Ａ）は、サンプル中の反応タンパク質（ＰＲＧで標識化されている）と未反応タンパク質（ＰＲＧで標識化されていない）とを分離する手段として機能し得る。種々の実施形態において、前記親和性標識はビオチンからなる。前記試薬のＰＲＧ部分がタンパク質と反応した後、アフィニティクロマトグラフィを使用してサンプルの標識化および非標識化成分を分離することができる。アフィニティクロマトグラフィは、標識化および非標識化タンパク質、当該タンパク質の標識化および非標識化消化産物（すなわち、ペプチド）、またはその両方を分離するために使用することができる。その後、前記切断可能リンカー（Ｌ）の切断を、例えば、化学的に、酵素的に、熱的に、または光化学的に行うことにより、単離された物質が質量分析のために放出されうる。種々の実施形態において、前記リンカーは酸により切断可能であってもよい。
【００４３】
種々の実施形態において、前記ＰＲＧは、下記式で示すように、固体担体（Ｓ）に組み込み可能である：
Ｓ−Ｌ−ＰＲＧ
前記固体担体は、例えば、切断可能リンカーおよびタンパク質反応性基が付着するポリスチレンまたはガラスで構成することができる。前記固体担体は、ペプチド分離およびサンプル濃縮の手段として（例えば、カラム状のクロマトグラフィ媒体として）使用することができる。非標識化消化産物は、例えば、前記修飾固体担体に前記ＰＲＧを介して結合し、標識化され、その後その固体担体から種々の手段（例えば、化学的または酵素的）により放出されうる。
【００４４】
質量分析に先立って、結合タンパク質を消化することにより、質量分析法により分析可能な結合ペプチドを含むペプチドを形成することができる。タンパク質消化工程は、前記切断可能リンカーの切断に先立ってまたは後に続いて行うことができる。いくつかの実施形態においては、例えば、タンパク質が比較的小さい場合は、消化工程（例えば、酵素的切断）は必要ない場合がある。種々の実施形態において、酸切断可能なリンカーの挿入により、より小さくより安定な標識を得られる。より小さくより安定したリンカーは、例えば、ＣＩＤにおいてイオンフラグメンテーションをより向上させることができる。
【００４５】
ＰＲＧ基の例としては、これらに限定されないが、（ａ）タンパク質官能基と選択的に反応し、特定の部位でタンパク質をタグ化する共有結合または非共有結合を形成する基、および（ｂ）例えば、酵素に対する基質であって、タンパク質の作用により形質転換されるものが挙げられる。種々の実施形態において、ＰＲＧは、スルフヒドリル基に対する特異性のような、特定のタンパク質基に対する特異的反応性を有する基とすることができる。そのようなＰＲＧは、例えば、複合混合物中でタンパク質を選択的にタグ化するのに一般的に有用である。例えば、スルフヒドリルに特異的な試薬は、システインを含むタンパク質をタグ化する。
【００４６】
種々の実施形態において、ペプチドにおいて典型的に検出される特定の基（例えば、スルフヒドリル基、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、ラクトン基）と選択的に反応するＰＲＧ基を、タンパク質を含む混合物に導入することができる。種々の実施形態において、前記ＰＲＧとの反応の後、前記複合混合物中のタンパク質は、例えば、酵素的に、多くのペプチドに切断される。
【００４７】
図１Ａおよび図１Ｂを再度参照すると、１つまたはそれ以上のサンプル中の１つまたはそれ以上のタンパク質の絶対濃度の測定は、当該サンプルのうちの１つまたはそれ以上のサンプル中の当該タンパク質のうちの１つまたはそれ以上のタンパク質の化学成分による標識化（ステップ１４０）を進める。種々の実施形態において、この標識化工程は、２つまたはそれ以上のサンプル中の１つまたはそれ以上のタンパク質の差次的な標識化を含み、異なるサンプル中のタンパク質を標識化するために、異なる化学成分が使用される。様々な化学成分を使用して標識化、差次的標識化、またはその両方を行うことができ、その例としては、これに限定されないが、上記および本明細書中の他の場所に記載されたものが挙げられる。例えば、同位体的に異なる標識、異なる同重核試薬、またはそれらの組み合わせを使用して、差次的にサンプルを標識化することができる。様々なサンプルを使用することができるが、その例としては、これに限定されないが、生物学的流体、および細胞または組織の溶解物が挙げられる。これらのサンプルは、異なる供給源または条件のものであってよく、例えば、コントロール対実験、異なる時点の複数のサンプル（例えば、配列を形成するため）、病態対正常、実験対病態等である。
【００４８】
種々の実施形態において、差次的標識化は多重化のために使用され、１回の実験操作で、例えば、種々のサンプル（例えば、コントロール、処理済）からの多数の異なるアイソフォームの比較、多数の突然変異株の野生型との比較、多数の投与量レベルのベースラインに対する時間経過シナリオにおける評価、分離された種々の癌組織の正常組織に対する評価、または１回の実験操作におけるそれらの組み合わせを行うことができる。種々の実施形態において、ペプチドのサブクラスに対する差次的標識化（例えば、リン酸化）を使用して翻訳後修飾（ＰＴＭ）を明らかにすることができる。
【００４９】
種々の実施形態において、標識化された複数のサンプル、標識化された複数の特徴的ペプチド標準サンプル、またはその両方の少なくとも一部を混合し（ステップ１５０）、その混合サンプルの少なくとも一部をクロマトグラフィカラム（例えば、ＬＣカラム、ガスクロマトグラフィ（ＧＣ）カラム、またはその組み合わせ）にかける（ステップ１６０）。種々の実施形態において、標識化された複数のサンプル、標識化された複数の特徴的ペプチド標準サンプル、またはその両方を、下記の１つまたはそれ以上の事項に従って混合し（ステップ１５０）混合サンプルを作成する：
（ｉ）  標識化された１つのサンプル（例えば、コントロールサンプル、実験サンプル）を、１つまたはそれ以上の特徴的ペプチド標準サンプル（当該標準サンプルの特徴的ペプチドは、１つまたはそれ以上の目的のタンパク質の特徴的ペプチドに対応している）と混合する；
（ｉｉ）  標識化された１つのサンプル（例えば、コントロールサンプル、実験サンプル）を、１つまたはそれ以上の標識化された特徴的ペプチド標準サンプル（当該標準サンプルの特徴的ペプチドは、１つまたはそれ以上の目的のタンパク質の特徴的ペプチドと対応しており、当該標識化された特徴的ペプチドサンプルは、前記標識化サンプルに対して差次的に標識化されている）と混合する；
（ｉｉｉ）２つまたはそれ以上の差次的に標識化されたサンプル（例えば、コントロールと実験サンプル；実験サンプル＃１と実験サンプル＃２；複数のコントロールと複数の実験サンプル等）を混合する；
（ｉｖ）  ２つまたはそれ以上の差次的に標識化されたサンプルを、１つまたはそれ以上の特徴的ペプチド標準サンプルを混合する；
（ｖ）  ２つまたはそれ以上の差次的に標識化されたサンプルを、１つまたはそれ以上の標識化された特徴的ペプチド標準サンプル（当該標識化された特徴的ペプチド標準サンプルは、前記の差次的に標識化されたサンプルに対して、差次的に標識化されている）と混合する；および／または
（ｖｉ）  それらの組み合わせ。
【００５０】
例えば、特徴的ペプチド標準サンプルの添加は、対応する特徴的ペプチドに対する内部標準の機能を果たしうる。種々の実施形態において、特徴的ペプチド標準サンプルは、標準化タンパク質に対する特徴的ペプチドからなる。サンプルと混合された特徴的ペプチド標準サンプルは、「特徴的ペプチド内部標準サンプル（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓａｍｐｌｅ）」と言うことがある。したがって、種々の実施形態において、サンプル中の目的の各タンパク質に対する特徴的ペプチド標準サンプルは、クロマトグラフィカラムに注入される前に、当該サンプルと混合される。種々の実施形態において、異なるサンプルは、ほぼ同じ量混合される。
【００５１】
例えば、種々の実施形態において、標識化された特徴的ペプチド標準サンプルを生成するため、標識化試薬のセット（例えば、ｉＣＡＴ商標試薬、ｉＴＲＡＱ商標試薬、ｍＴＲＡＱ商標試薬等）由来の標識からの一つの試薬で標識化されたコントロール標準が提供され得る。この標準の、標識化された特徴的ペプチドは、例えば、消化に供されるまでは、より大きいタンパク質のなお一部であり得ると理解される。この標識化されたコントロール標準が、分析される標識化されたサンプルのそれぞれに加えられ得、結合したサンプルを生成する。標識化されたサンプルは、標識化されたコントロール標準の生成において用いられた標識とは異なる標識を用いて標識化される。
【００５２】
タンパク質消化工程（ステップ１６５）は、前記混合工程（ステップ１５０）の前、後、または前と後の両方に、行うことができる。種々の実施形態において、サンプル、前記混合したサンプル、またはその両方のタンパク質は、酵素的に消化され（タンパク分解され）、ペプチドが生成される（ステップ１６５）。いくつかの実施形態においては、消化工程（例えば、酵素的切断）は、例えば、タンパク質が比較的小さい場合は、必要でない場合がある。
【００５３】
次に、前記クロマトグラフィカラムからの溶離液の少なくとも一部は、質量分析システムに導かれ、１つまたはそれ以上の選択された特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジションの特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジション信号がＰＤＩＴＭ（例えば、ＭＲＭ）により測定される（ステップ１７０）。当該質量分析システムは、第１の質量分離器、イオンフラグメンター、および第２の質量分離器からなる。ＰＤＩＴＭスキャンの通過親イオンのｍ／ｚ範囲（前記第１の質量分離器によって選択される）は、前記特徴的ペプチドのうちの１つまたはそれ以上の特徴的ペプチドのｍ／ｚ値を含むように選択され、ＰＤＩＴＭスキャンの通過娘イオンのｍ／ｚ範囲（前記第２の質量分離器によって選択される）は、通過した特徴的ペプチドに対応する前記選択された識別用娘イオンのうちの１つまたはそれ以上の選択された識別用娘イオンのｍ／ｚ値を含むように選択される。
【００５４】
次に、サンプル中の目的のタンパク質の絶対濃度を求める（ステップ１８０）。種々の実施形態において、目的のタンパク質の絶対濃度は、対応する特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジションの測定されたイオンシグナル（特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジション信号）と次の（ｉ）〜（ｉｖ）のうちの１つまたはそれ以上とを比較することにより求められる：
（ｉ）  その特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジションに対する濃度曲線；
（ｉｉ）  特徴的ペプチド内部標準サンプルに対する特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジション信号；
（ｉｉｉ）  その特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジションに対する濃度曲線と特徴的ペプチド内部標準サンプルに対する特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジション信号；および／または
（ｉｖ）  それらの組み合わせ。
【００５５】
種々の実施形態において、１つまたはそれ以上の目的のタンパク質は、例えば、識別用娘イオンシグナルの標準化、第１のサンプル中のタンパク質の濃度の第２のサンプル中の濃度に対する標準化（例えば、濃度比を標準化する）、データ信頼性の評価、複数のサンプル間の開始サンプル量の評価、またはそれらを組み合わせたもののために用いることができる。したがって、種々の実施形態において、１つまたはそれ以上の目的のタンパク質は、例えば、２つまたはそれ以上のサンプルのうちの２つまたはそれ以上のサンプルにおいて、実質的に同じ濃度を有することが予想される、または、化学物質を用いたサンプルの処理によって実質的に影響を受けない濃度を有することが予想される、または、その両方である標準化タンパク質である。例えば、種々の実施形態において、目的のタンパク質は、複数のサンプル間で実質的に同じ濃度を有することが知られているタンパク質とすることができる。
【００５６】
種々の実施形態において、標準化タンパク質の特徴的ペプチドの信号レベルの変化を使用して、１つまたはそれ以上の目的のタンパク質の特徴的ペプチドの信号レベルを標準化することができる。種々の実施形態において、２つのサンプル間の標準化タンパク質の特徴的ペプチドの相対信号レベルを使用して、２つのサンプル間の目的のタンパク質の相対濃度を標準化する。例えば、種々の実施形態において、前記方法は、前記２つまたはそれ以上のサンプルのうちの１つまたはそれ以上のサンプル中の２つまたはそれ以上のタンパク質の絶対濃度を少なくとも比較することにより、化学物質に対する生物学的システムの応答を評価する工程、または生物学的システムの病態を評価する工程、またはそれら両方の工程を含む。種々の実施形態において、前記評価工程は、第１のサンプル中の目的のタンパク質の濃度を第２のサンプル中の当該目的のタンパク質の濃度に対して比較することにより、目的のタンパク質の２つのサンプル間の濃度比を求めることと、前記第１のサンプル中の標準化タンパク質の濃度を前記第２のサンプル中の当該標準化タンパク質の濃度に対して比較することにより、標準化タンパク質の２つのサンプル間の濃度比を求めることと、前記標準化タンパク質の濃度比を使用して前記目的のタンパク質の濃度比を標準化することと、からなる。例えば、種々の実施形態において、２つのサンプル間（例えば、コントロール対実験、異なる時点からの複数のサンプル（例えば、配列を作成するため）、病態対正常、実験対病態等）の標準化特徴的ペプチド信号の比が１：１と異なる場合、そのような変化は、例えば、２つのサンプル間の開始時の量の違い、サンプル処理エラー、またはその他の系統誤差または偶然誤差を示唆している。種々の実施形態において、２つのサンプル間の標準化特徴的ペプチド信号の比を使用して、これら２つのサンプルの目的のタンパク質の濃度比を標準化する。種々の実施形態において、標準化タンパク質に対する比率は中央比（ｍｅｄｉａｎ  ｒａｔｉｏ）として使用され、１つまたはそれ以上の目的のタンパク質の濃度比はこの中央値（ｍｅｄｉａｎ）に修正される。
【００５７】
種々の実施形態において、２つのサンプル間の標準化タンパク質の特徴的ペプチド信号レベルの違いを使用することにより、データ信頼性を評価することができる。例えば、標準化タンパク質に関連する特徴的ペプチド信号が、サンプル間で著しい量異なる場合は、これらのサンプルのうちの１つまたは両方のサンプルに関連するデータは信頼できないものとして除外される。種々の実施形態において、約１を超える標準偏差分の変動は有意とみなされる。種々の実施形態において、約２を超える標準偏差分の変動は有意とみなされる。種々の実施形態において、２つサンプル間の標準化特徴的ペプチド信号の比が、１：１から大きく外れる場合、それらのサンプルのうちの１つまたは両方のサンプルに関連するデータは信頼できないものとみなされる。種々の実施形態において、１つのサンプル中の標準化タンパク質の識別用娘イオンシグナルの変動が、もう１つのサンプル中の当該識別用娘イオンシグナルと比較して約±１０％を超える場合、このような変動は有意とみなされる。種々の実施形態において、１つのサンプル中の標準化タンパク質の識別用娘イオンシグナルの変動が、もう１つのサンプル中の当該識別用娘イオンシグナルと比較して約±２０％を超える場合、このような変動は有意とみなされる。種々の実施形態において、１つのサンプル中の標準化タンパク質の識別用娘イオンシグナルの変動が、もう１つのサンプル中の当該識別用娘イオンシグナルと比較して約±５０％を超える場合、このような変動は有意とみなされる。
【００５８】
種々の実施形態において、標準サンプルは、標識化され、プールされた参照標準を含む。プールされた参照サンプルは、多様な方法で（例えば、プールされた参照サンプルは共通の特性（全て特定の疾患の状態を欠いている、全て特定の疾患状態有す、全て特定の年齢より低い等）を共有する多数の患者サンプルから提供され得、調査中の一つ以上のサンプルの部分、およびそれらの組み合わせで）生成され得る。したがって、種々の実施形態において、プールされた参照サンプルは、実質的にその成分において目的のサンプルと類似する。例えば、プールされた参照サンプルが、調査中のそれぞれのサンプルの一部を混合することにより提供される場合、目的の標識化されたサンプル中のどのペプチドも、標識化された標準サンプルにおける対応する標識化されたペプチドを有す。
【００５９】
種々の実施形態において、標識化されプールされた参照サンプル由来の目的のタンパク質に対応する選択された識別用の娘イオンについて測定されたイオンシグナルは、等しい割合で加えられた同一のプールされた参照標準を有す多くのサンプルすべてにわたって、ペプチド／タンパク質濃度における相対的な変化を比較するために用いられ得る。したがって、種々の実施形態において、プールされた参照サンプルは、標準化サンプルとして用いられ得る。この比較は、存在するタンパク質の絶対量を反映し得ないが、異なる機器、異なる条件下等で分析されたタンパク質のサンプル間の相対的な差異を決定するために用いられ得る。
【００６０】
本教示において、一般的に、標準化タンパク質の絶対濃度は求める必要はない。なぜなら、例えば、１つのサンプル中の標準化タンパク質に関連する特徴的ペプチド信号ともう１つのサンプル中のそれとの比を使用することにより、１つまたはそれ以上の目的のタンパク質の特徴的ペプチドの信号レベルの標準化、識別用娘イオンシグナルの標準化、第１のサンプル中のタンパク質の濃度の第２のサンプル中の濃度に対する標準化（例えば、濃度比の標準化する）、データ信頼性の評価、複数のサンプル間の開始サンプル量の評価、またはそれらの組み合わせを行うことができるからである。
【００６１】
種々の実施形態において、絶対濃度を測定することにより、野生型またはコントロールサンプルまたはサンプル集団中の目的のタンパク質の基本的発現レベルを知ることができる。種々の実施形態において、絶対濃度の測定は、細胞、組織、または生物学的流体において差次的発現を示すタンパク質の選別や同定に適用することができる。種々の実施形態において、絶対濃度を測定することにより、化学物質に対する生物学的システムの応答を評価することができる（ステップ１９２）。例えば、絶対濃度を使用することにより、患者やモデル（例えば、動物、疾患、細胞、生化学的モデル等）の、医薬品や医薬組成物による治療、生物（例えば、ウイルス、細菌）や環境汚染物（例えば、毒素、汚染物質）への曝露等に対する応答を明らかにすることができる。
【００６２】
本教示においては、様々な質量分析システムを使用してＰＤＩＴＭを行うことができる。好適な質量分析システムは、２つの質量分離器と、その２つの質量分離器の間のイオン飛行経路に設けられたイオンフラグメンターとを備えている。好適な質量分離器の例としては、これに限定されないが、四重極型、高周波多重極型、イオントラップ型、飛行時間型（ＴＯＦ）、時限式イオン選別器（ｔｉｍｅｄ  ｉｏｎ  ｓｅｌｅｃｔｏｒ）を併用したＴＯＦなどが挙げられる。好適なイオンフラグメンターの例としては、これに限定されないが、衝突誘起解離（ＣＩＤ、衝突支援解離（ＣＡＤ）とも言う）、光誘起解離（ＰＩＤ）、表面誘起解離（ＳＩＤ）、ポストソース分解、またはこれらを組み合わせた原理に従って動作するものが挙げられる。
【００６３】
前記質量分析器用の好適な質量分析システムの例としては、これに限定されないが、三連四重極や四重極−線形イオントラップを含むシステム、四重極ＴＯＦシステム、ＴＯＦ−ＴＯＦシステム等が挙げられる。
【００６４】
前記質量分析システム用の好適なイオン源の例としては、これに限定されないが、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、マトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）等が挙げられる。例えば、ＥＳＩイオン源は、ＬＣカラムから生じたイオン化サンプルを質量分離装置へ導入する手段として機能し得る。ＥＳＩのいくつかの好ましい特徴のうちのひとつは、クロマトグラフィカラムからのフラクションが、そのカラムからＥＳＩイオン源へ直接進むことができることである。
【００６５】
種々の実施形態において、前記質量分析システムは、親イオンを選択しそのフラグメント娘イオンを検出するための三連四重極質量分析器からなる。種々の実施形態において、第１の四重極は、親イオンを選択する。第２の四重極は、十分に高い圧力と電圧に維持され、そのため多重低エネルギー衝突が起こり、一部の親イオンがフラグメント化する。第３の四重極は、選択された娘イオンを検出器に送るために選択される。種々の実施形態において、三連四重極質量分析器は、イオン源と三連四重極の間に設けられたイオントラップを有することができる。このイオントラップは、イオン（例えば、すべてのイオン、特定のｍ／ｚ範囲のイオン等）を収集するように設定可能であり、充填時間（ｆｉｌｌ  ｔｉｍｅ）の後、エンド電極にパルスを印加することにより、それらの選択されたイオンが当該イオントラップから排出されて第１の四重極へ送られる。好適な充填時間は、例えば、イオン数、イオントラップ内の電荷密度、異なる特徴的ペプチドの溶出間隔、デューティサイクル、励起状態種または多価イオンの崩壊定数、またはそれらの組み合わせに基づいて決定することができる。
【００６６】
種々の実施形態において、三連四重極質量分析器の１つまたはそれ以上の四重極は、リニアイオントラップに設定可能である（例えば、複数のエンド電極を追加することにより、四重極内に実質的に細長い筒形のトラップ容積を設ける）。種々の実施形態において、第１の四重極は、親イオンを選択する。第２の四重極は、十分に高い衝突ガス圧力と電圧に維持され、そのため多重低エネルギー衝突が起こり、親イオンの一部がフラグメント化する。第３の四重極は、フラグメントイオンをトラップするために選択され、充填時間の後、エンド電極にパルスを印加することにより、それらの選択された娘イオンが当該イオントラップから排出されて検出器へ送られる。好適な充填時間は、例えば、フラグメントイオン数、イオントラップ内の電荷密度、異なる特徴的ペプチドの溶出間隔、デューティサイクル、励起状態種または多価イオンの崩壊定数、またはそれらの組み合わせに基づいて決定することができる
種々の実施形態において、前記質量分析システムは、親イオンを選択しそのフラグメント娘イオンを検出するための２つの四重極質量分離器とＴＯＦ質量分析器とからなる。種々の実施形態において、第１の四重極は、親イオンを選択する。第２の四重極は、十分に高い圧力と電圧に維持され、それにより多重低エネルギー衝突が起こり、イオンの一部がフラグメント化する。ＴＯＦ質量分析器は、例えば、目的の娘イオンを包含する質量範囲にわたるイオンおよび作成された抽出イオンクロマトグラムのモニタリング、選択された娘イオンのタイムウィンドウ（ｔｉｍｅ  ｗｉｎｄｏｗ）の外側に現れるイオンの検出器からの偏向、選択された娘イオンの到達タイムウィンドウに対する検出器への時間ゲート、またはそれらの組み合わせにより、検出のための娘イオンを選択する。
【００６７】
種々の実施形態において、前記質量分析システムは、２つのＴＯＦ質量分析器とイオンフラグメンター（例えば、ＣＩＤ、ＳＩＤ等）とからなる。種々の実施形態において、第１のＴＯＦは、イオンフラグメンターへ導入する親イオンを（例えば、選択された親イオンのタイムウィンドウの外側に現れるイオンをフラグメンターからそらすことにより）選択し、第２のＴＯＦ質量分析器は、例えば、目的の娘イオンを包含する質量範囲にわたるイオンおよび作成された抽出イオンクロマトグラムのモニタリング、選択された娘イオンのタイムウィンドウの外側に現れるイオンの検出器からの偏向、選択された娘イオンの到達タイムウィンドウに対する検出器への時間ゲート、またはそれらの組み合わせにより、検出のための娘イオンを選択する。当該ＴＯＦ分析器は、リニア型または反射型分析器とすることができる。
【００６８】
種々の実施形態において、前記質量分析システムは、飛行時間質量分析器とイオン反射器とからなる。このイオン反射器は、ＴＯＦのフィールドフリードリフト領域の末端に配置され、イオンの飛行経路を修正することにより、初期運動エネルギー分散の影響を補償するために用いられる。種々の実施形態において、イオン反射器は、加速電圧よりも若干大きい程度まで高まるポテンシャルによりバイアスが掛かった一連のリングからなる。作動中は、イオンが反射器に侵入すると、電界方向におけるこれらのイオンの速度は、ゼロになるまで減速される。速度がゼロのポイントにおいて、当該イオンは、方向を逆転させて反射器を通り再び加速される。当該イオンは、それらの侵入エネルギーと同等のエネルギーの状態で反射器を出るが、それらの速度は方向が逆である。より大きいエネルギーを持つイオンはより深く反射器に侵入するため、反射器により長い時間留まる。反射器で使用されるポテンシャルは、イオンの飛行経路を修正するように選択され、その結果、同等の質量と電荷のイオンがほぼ同じ時間に検出器に到達する。
【００６９】
種々の実施形態において、前記質量分析システムは、目的の親イオンを選択するための時限式イオン選別器を有する第１のフィールドフリードリフト領域と、娘イオンを生成するためのフラグメンテーション室（イオンフラグメンター）と、選択された娘イオンを通過させ検出するための質量分離器とからなるタンデム型ＭＳ−ＭＳ装置からなる。種々の実施形態において、前記時限式イオン選別器は、パルスイオン偏向器からなる。種々の実施形態において、前記イオン偏向器は、パルスイオン偏向器として使用することができる。前記質量分離器は、イオン反射器を有することができる。種々の実施形態において、前記フラグメンテーション室は、イオンをフラグメント化させるとともに引き出しを遅らせるように設計された衝突セル（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  ｃｅｌｌ）である。種々の実施形態において、前記フラグメンテーション室は、飛行時間型質量分析によるフラグメントイオンの分析のための遅延引き出しイオン源を兼ねることができる。
【００７０】
種々の実施形態において、前記質量分析システムは、パルスイオン源により生成された多数のイオンの経路に沿って配置された第１、第２、および第３のＴＯＦ質量分離器を有するタンデム型ＴＯＦ−ＭＳからなる。第１の質量分離器は、パルスイオン源により生成された多数のイオンを収容するために配置されている。第１の質量分離器は、パルスイオン源により生成された多数のイオンを加速し、その多数のイオンをそれらの質量対電荷比に応じて分離し、その多数のイオンから第１グループのイオンをそれらの質量対電荷比に基づいて選択する。また、第１の質量分離器は、その第１グループのイオンの少なくとも一部をフラグメント化する。第２の質量分離器は、前記第１の質量分離器によって生成された前記第１グループのイオンおよびそのフラグメントを収容するために配置されている。第２の質量分離器は、前記第１グループのイオンおよびそのフラグメントを加速し、当該第１グループのイオンおよびそのフラグメントをそれらの質量対電荷比に応じて分離し、当該第１グループのイオンおよびそのフラグメントから第２グループのイオンをそれらの質量対電荷比に基づいて選択する。また、第２の質量分離器は、その第２グループのイオンの少なくとも一部をフラグメント化する。第１および／または第２の質量分離器は、イオンガイド（ｉｏｎ  ｇｕｉｄｅ）、イオン収束装置（ｉｏｎ−ｆｏｃｕｓｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔ）、および／または、イオンステアリング装置（ｉｏｎ−ｓｔｅｅｒｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔ）を有していてもよい。種々の実施形態において、第２のＴＯＦ質量分離器は、前記第１グループのイオンおよびそのフラグメントを減速させる。種々の実施形態において、第２のＴＯＦ質量分離器は、フィールドフリー領域と、実質的に第２の所定範囲内の質量対電荷比を有するイオンを選択するイオン選別器とを含む。種々の実施形態において、第１および第２のＴＯＦ質量分離器のうち少なくとも１つは、フラグメント化されたイオンを選択する時限式イオン選別器を含む。種々の実施形態において、第１および第２の質量分離器のうち少なくとも１つは、イオンフラグメンターを含む。第３の質量分離器は、前記第２の質量分離器によって生成された前記第２グループのイオンおよびそのフラグメントを収容するために配置されている。第３の質量分離器は、第２グループのイオンおよびそのフラグメントを加速し、当該第２グループのイオンおよびそのフラグメントを、それらの質量対電荷比に応じて分離する。種々の実施形態において、第３の質量分離器は、パルス加速によって、第２グループのイオンおよびそのフラグメントを加速する。種々の実施形態において、前記第２グループのイオンおよびそのフラグメントを収容するために、イオン検出器が配置される。種々の実施形態において、前記第１または第２グループのイオンおよびそのフラグメントのうちの少なくとも１つが前記イオン検出器に到達する前にそのエネルギーを修正するために、フィールドフリー領域にイオン反射器が配置される。
【００７１】
種々の実施形態において、前記質量分析システムは、多数の飛行経路、時間的に同時に行うことが可能な多数の操作モード、またはその両方を有するＴＯＦ質量分析器からなる。このＴＯＦ質量分析器は、当該質量分析器に入るサンプルイオンのパケットから選択されたイオンを、第１、第２、または第３イオン経路のいずれかに沿って導く経路選択イオン偏向器（ｐａｔｈ  ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ  ｉｏｎ  ｄｅｆｌｅｃｔｏｒ）を含む。いくつかの実施形態においては、さらに多くのイオン経路を用いてもよい。種々の実施形態において、第２のイオン偏向器を経路選択イオン偏向器として使用することができる。時間依存性の電圧が経路選択イオン偏向器にかけられると、使用可能なイオン経路からイオン経路が選択され、所定の質量対電荷比範囲内の質量対電荷比を有するイオンはその選択されたイオン経路に沿って伝播する。
【００７２】
例えば、種々の実施形態の多数の飛行経路を有するＴＯＦ質量分析器の操作において、第１の所定の質量対電荷比範囲に対応する第１の所定時間の間、前記経路選択イオン偏向器に第１の所定電圧をかけると、第１の質量対電荷比範囲内のイオンが第１のイオン経路に沿って伝播する。種々の実施形態において、この第１の所定電圧はゼロであり、そのためイオンは初期の経路に沿って伝播し続ける。第２の所定の質量対電荷比範囲に対応する第２の所定時間の間、前記経路選択イオン偏向器に第２の所定電圧をかけると、第２の質量対電荷比範囲内のイオンが第２のイオン経路に沿って伝播する。第３、第４等を含む更なる時間範囲および電圧を用いることにより、特別な測定に必要なだけのイオン経路を提供することができる。前記第１の所定電圧の振幅および極性は、イオンが第１のイオン経路に偏向するように選択され、前記第２の所定電圧の振幅および極性は、イオンが第２のイオン経路に偏向するように選択される。前記第１の時間間隔は、第１の所定の質量対電荷比範囲内のイオンが、経路選択イオン偏向器を経て伝播する時間に対応するように選択され、前記第２の時間間隔は、第２の所定の質量対電荷比範囲内のイオンが、経路選択イオン偏向器を経て伝播する時間に対応するように選択される。第１のＴＯＦ質量分離器は、第１のイオン経路に沿って伝播する第１の質量対電荷比範囲内のイオンパケットを収容するために配置される。この第１のＴＯＦ質量分離器は、第１の質量対電荷比範囲内のイオンを、それらの質量に応じて分離する。第１の検出器は、第１のイオン経路に沿って伝播している第１グループのイオンを収容するために配置される。第２のＴＯＦ質量分離器は、第２のイオン経路に沿って伝播するイオンパケットの一部を収容するために配置される。この第２のＴＯＦ質量分離器は、第２の質量対電荷比範囲内のイオンを、それらの質量に応じて分離する。第２の検出器は、第２のイオン経路に沿って伝播している第２グループのイオンを収容するために配置される。いくつかの実施形態においては、第３、第４等を含む更なる質量分離器および検出器を配置して、対応する経路に沿って導かれたイオンを収容してもよい。ある実施形態においては、第３のイオン経路を用いて、第３の所定の質量範囲内のイオンを切り捨てる。前記第１および第２の質量分離器は、どのようなタイプのものであってもよい。例えば、第１および第２の質量分離器のうちの少なくとも１つは、フィールドフリードリフト領域、イオン加速器、イオンフラグメンター、または時限式イオン選別器を有することができる。第１および第２の質量分析器は、多重質量分離器を有することもできる。種々の実施形態において、イオン反射器を第１グループのイオンを収容するために備えて配置することにより、第１グループのイオンに対するＴＯＦ質量分析器の分解能が向上する。種々の実施形態において、イオン反射器を第２グループのイオンを収容するために備えて配置することにより、第２グループのイオンに対するＴＯＦ質量分析器の分解能が向上する。
【００７３】
下記の実施例は、２つの異なるサンプル中のシトクロムＰ４５０の多数のアイソフォームの絶対濃度を、複合的な方法で求める実験について説明する。本実施例の教示は、包括的なものではなく、これらの実験または本教示の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００７４】
（実施例１）  Ｐ４５０アイソフォーム
本実施例では、一連の１６個のＰ４５０アイソフォームの絶対定量を示す。本実施例は、例えば、多数のＰ４５０アイソフォームに対して１回の実験操作で行うことができるアッセイ提供する。個々のＰ４５０アイソフォームに特異的なペプチドを合成し、安定同位体タグ（軽い切断可能ＩＣＡＴ試薬）で標識化し、ＨＰＬＣにより精製することにより標識化された特徴的ペプチド標準サンプルを用意した。これらのペプチド標準サンプルを使用して、定量的な多重反応モニタリング（ＭＲＭ）スキャンにより濃度曲線を作成した。次に、マウスの肝臓ミクロソームサンプル、すわなち、コントロール（ＣＴ）サンプルとフェノバルビタール誘導（ＩＮＤ）サンプルとを重い切断可能ＩＣＡＴ試薬で標識化した。フェノバルビタール（ＰＢ）は、しばしば工業用溶剤や殺虫剤等のために代表的な化学薬品として使用され、サブファミリー２ａ、２ｂ、２ｃ、および３ａのいくつかのＰ４５０遺伝子を誘導することが知られている。コントロールサンプルおよび誘導サンプルは、別々にクロマトグラフィカラムにかけた。コントロールサンプルおよび誘導サンプルをカラムにかける前に、それらを、各特徴的ペプチドに対する特徴的ペプチド内部標準サンプル（軽い切断可能なＩＣＡＴ試薬で標識化さている）と混合した。混合サンプル中の軽いペプチド（内部標準）と重いペプチド（サンプル）のクロマトグラフ面積を濃度曲線と比較することにより、コントロールサンプル中で調べられた各Ｐ４５０のレベルおよびフェノバルビタールによって処理したときの発現の変化に関する定量的情報が提供された。１６個の異なるＰ４５０タンパク質を表す１６個の異なる標識化合成ペプチドが、本実験でモニターされた。表１の第１列目に、本実験で検討したこの１６個のＰ４５０タンパク質を列挙する。
【００７５】
【表１】
2009538430.tif 000002
本実施例で使用した物質および方法は概ね以下の通りである。
【００７６】
（標識化された合成ペプチド標準の選択、調製、および定量）
本実験で使用したＰ４５０タンパク質ファミリーのすべてのメンバーのタンパク質配列を調べた。システイン残基を含む複数のトリプシンペプチド配列が見つかり、それにより一意的に各タンパク質のアイソフォームを同定した。これらの配列の合成ペプチドを作成し、Ｃ０切断可能ＩＣＡＴ（商標）試薬で標識化した。ペプチドは、Ｆｍｏｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（アプライドバイオシステムズ  ４３３Ａ  ペプチドシンセサイザー、  アプライドバイオシステムズ社、  フォスターシティー、  カリフォルニア）を用いて合成し、切断可能ＩＣＡＴ（商標）試薬を用いて誘導体化し、ＨＰＬＣにより精製し、それらの濃度をアミノ酸分析（アプライドバイオシステムズ  ４２１Ａ  デリバタイザー（Ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｒ））により定量した。本実験の１６個のＰ４５０アイソフォームを、表１の第１列目に列挙する。表１の第２列目には、本実験において、対応するＰ４５０アイソフォームに対して選択された特徴的ペプチドを列挙する。
【００７７】
（質量分析システム）
液体クロマトグラフィ（ＬＣ）質量分析（ＭＳ）システムを使用して、前記標準サンプル、およびコントロールおよびフェノバルビタール誘導の両方の複数のマウスからの未知のサンプルを分析した。サンプルは、Ｇｅｎｅｓｉｓ  Ｃ１８ＡＱカラム（７５μｍ×１０ｃｍ、Ｖｙｄａｃ）を使用した逆相ＨＰＬＣにより、１０分グラジエント（０．１％ギ酸中で１５〜４５％アセトニトリル）で分離した。ＭＲＭ分析は、４０００ＱＴＲＡＰ（商標）システム（アプライドバイオシステムズ社、フォスターシティー、カリフォルニア）（Ｑ１−３ダルトン（Ｄａ）マスウィンドウ（ｍａｓｓ  ｗｉｎｄｏｗ）、Ｑ３−１Ｄａマスウィンドウ）のＮａｎｏＳｐｒａｙ（登録商標）イオン源を備えた質量分析システムを用いて行った。当該質量分析システムの簡略化した概略図を図２に示す。
【００７８】
図２を参照すると、ＭＲＭスキャンは、例えば、第１の質量分離器２０１（使用した装置において、第１の質量分離器は四重極である）を設置して、目的の特徴的ペプチド（すなわち、親イオン２０２、例えば、特徴的ペプチドの質量をほぼ中心とした約３質量単位の幅のマスウィンドウ内のイオンを通過させるように第１の質量分離器を設置することにより）を通過させることにより行うことができる。種々の実施形態において、衝突エネルギーは、イオンフラグメンターにおいて、このペプチドの選択された識別用荷電フラグメント（選択された識別用娘イオン）を生成しやすいように選択することができ（ここで、このイオンフラグメンターは、例えば、イオンフラグメント２０４の収集およびフラグメントイオンの送達が容易になるように、ＣＩＤを行うための衝突ガスと四重極２０３とを備える）；第２の質量分離器２０５（使用した装置において、第２の質量分離器はリニアイオントラップとして設定可能な四重極である）を設置することにより、目的の識別用娘イオン（または複数のイオン）２０６を（例えば、識別用娘イオンの質量をほぼ中心とした約１質量単位の幅のマスウィンドウ内のイオンを通過させるように第２の質量分離器を設置することにより）検出器２０８へ送り、この送られた識別用娘イオン（または複数のイオン）のイオンシグナルを生成する。これらの実験においては、第２の質量分離器は、四重極モードで操作した。
【００７９】
各特徴的ペプチドに対するＭＲＭのパラメータは、その特徴的ペプチドに関連する選択された識別用娘イオン（または複数のイオン）に対する信号を最適化しやすいように選択した。本実験において、前記質量分析器に対して用いられたドウェル時間（２５〜１００ミリ秒）とＭＲＭトランジションを急速に変化させる能力とにより、１回のＬＣ−ＭＳ操作で混合物中の複数の成分をモニターすることができた。これらの実験においては、ドウェル時間を約２５ミリ秒ないし１００ミリ秒としたが、実験条件に応じて約１０ミリ秒ないし約２００ミリ秒とすることができる。例えば、１回のＬＣ／ＭＳ操作で５０ないし１００の異なる成分をモニターすることができる。各特徴的ペプチドに対するＭＲＭ設定、すなわち親イオンのｍ／ｚおよび娘イオンのｍ／ｚ（これらの設定は１価のイオンの通過は想定しない）を表１の第３列目に列挙し、各特徴的ペプチドに対するおおよそのカラム保持時間（分）を表１の第４列目に列挙する。
【００８０】
（濃度曲線の作成）
本実施例において、１回の操作で一連の１６個の合成ペプチドを定量し、それらの濃度曲線を作成するために、軽いＩＣＡＴ（商標）試薬で標識化された形態のそれらのペプチドを使用したＭＲＭアッセイを開発した。ドウェル時間が４５ミリ秒で４０の異なるトランジションを観測すると、サイクル時間はわずか２秒であった。１５〜３５％アセトニトリルの１０分グラジエントによりＰ４５０ペプチドを時間により分離した。得られた各特徴的ペプチドのオンカラム３．２  ｆｍｏｌのＭＲＭクロマトグラムを図３に示す。図３のｙ軸は、図３に示したＰ４５０タンパク質の特徴的ペプチドに対応する識別用娘イオンの質量分析システムの検出器信号（秒あたりのカウント（ｃｐｓ））に相当する。図３のｘ軸は、当該システムのＬＣ部分における、特徴的ペプチドの保持時間（分）に相当する。図３のクロマトグラムには、それらに対応するＰ４５０アイソフォームに従って標識化されている。なお、ＭＲＭ応答は、異なる特徴的ペプチド配列に対して変化する。
【００８１】
特徴的ペプチド標準サンプルは、各ペプチドに対する濃度曲線を作成するために使用した。未知のサンプルを測定する際は、特徴的ペプチド標準サンプルは内部標準の役割を果たす。
【００８２】
濃度曲線は、軽いＩＣＡＴ（商標）試薬により標識化された各合成ペプチドに対して測定した。当該濃度曲線は、重いＩＣＡＴ（商標）試薬により標識化されたミクロソームタンパク質の存在下で作成し、バックグラウンドとイオン抑制を制御した。図４に、本実験で作成された濃度曲線の例を、特徴的ペプチド濃度（フェトモル  オンカラム）（ｘ軸）の関数としての識別用娘イオンシグナルの面積（ｙ軸）のグラフとして示す。図４は、本実験において、種々のＰ４５０アイソフォームに対して選択された種々の特徴的ペプチドの識別用娘イオンに対する濃度曲線４００を示しており、そこに記入された記号４０４は、実測値を示している。種々のアイソフォームに対する濃度曲線の例として、Ｃｙｐ２ｄ９  ４０６、Ｃｙｐｌａｌ  ４０８、Ｃｙｐ２ｂ１０  ４１０、Ｃｙｐ２ｊ５  ４１２、Ｃｙｐ２ｄ２２／Ｃｙｐ２ｄ２６  ４１４、Ｃｙｐ３ａｌｌ  ４１６、Ｃｙｐ１ｂ１  ４１８、Ｃｙｐ２ｆ２  ４２０、Ｃｙｐ２ａ１２  ４２２、Ｃｙｐ２ｃ２９／Ｃｙｐ２ｃ３７  ４２４、Ｃｙｐ４ａ１０／Ｃｙｐ４ａ１４  ４２６、Ｃｙｐ２ｃ３９  ４２８、Ｃｙｐｌａ２  ４３０、Ｃｙｐ２ａ４  ４３２、およびＣｙｐ２ｄ９  ４３２を示す。
【００８３】
（マウスの肝臓ミクロソームの標識化）
マウスの肝臓ミクロソームのタンパク質を抽出し、そのタンパク質抽出物を重い切断可能ＩＣＡＴ（商標）試薬で標識化し、サンプルをアプライドバイオシステムズのＩＣＡＴ（商標）試薬キットの標準プロトコル（例えば、アプライドバイオシステムズ  Ｐａｒｔ  Ｎｏ．  ４３３３３７３  Ｒｅｖ．  Ａ）に従って処理した。
【００８４】
（発現の定量）
コントロール（ＣＴ）サンプルと誘導（ＩＮＤ）サンプルとの両方に対する本実験のＰ４５０アイソフォームの絶対発現は、例えば、コントロールサンプルのＭＲＭピーク面積と、対応する特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジションに対する濃度曲線とを比較することにより求めることができる。
【００８５】
表２は、本実験で調べられた１６個のＰ４５０アイソフォームに対して得られた濃度比を示す。表２において、第１列目はＰ４５０アイソフォーム、第２列目はそのアイソフォームに対して選択された特徴的ペプチド、第３列目は本実験におけるコントロールサンプルを１マイクログラム（μｇ）のミクロソームタンパク質あたりのフェムトモル数で示したＰ４５０アイソフォームの絶対量、第４列目は誘導（ＩＮＤ）サンプルのコントロール（ＣＴ）サンプルに対する発現の比、第５列目はＣＴに対してＩＮＤサンプル中のタンパク質が上昇したかどうかの定性的表示、第６列および７列目は、それぞれ、第４列目の対応する入力の９５％信頼区間の上限と下限とを示す。種々の実施形態において、変化しないことが知られているサンプル中の１つまたはそれ以上のタンパク質（例えば、肝臓ミクロソームを使用したこれらの実験においては、肝臓タンパク質）が選択され、使用されたそれらのタンパク質のうちの１つまたはそれ以上のタンパク質の特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジションは、コントロールサンプルと実験サンプルとの間の標準化ファクターを提供する。
【００８６】
コントロールのマウス肝臓ミクロソーム中の各タンパク質発現の基礎レベルを測定し、それらモニターされたタンパク質は、約１．３８ないし約５５．８４  ｆｍｏｌ／μｇミクロソームタンパク質の基礎発現を示した。フェノバルビタールで処理された複数のマウスからのミクロソームタンパク質も検討し、各タンパク質発現のその薬剤に対する変化を求めた。４つの別々の実験の比を平均化し、９５％信頼区間を算出した。狭い９５％ＣＩの値によって示されるように、複数の実験にわたってよい再現性が得られた。Ｐ４５０タンパク質、すなわち、Ｃｙｐ２ｂ１０は、薬剤処理により発現が増加し、コントロールの約６倍となった。Ｃｙｐ２ｃ２９／Ｃｙｐ２ｃ３７およびＣｙｐ３ａｌｌもまた少量（約３倍）の発現増加を示した。それに対し、Ｃｙｐ２ｄ９は若干の発現低減を示した。
【００８７】
【表２】
2009538430.tif 000003
（実施例２）  Ｐ４５０アイソフォーム
本実施例においては、一連の１６個のＰ４５０アイソフォームの絶対定量を示し、コントロールサンプルと誘導サンプルとを混合し（特徴的ペプチド内部標準サンプルは添加しない）、クロマトグラフィカラムにかけた。また、本実施例は、例えば、１回の実験操作で実施可能な多数のＰ４５０アイソフォームに対するアッセイも提供する。本実施例は、標識化する前の実施例１と同じコントロールサンプルおよび誘導サンプルの一部を使用した。実施例２で使用した標識化された特徴的ペプチドサンプルは、実施例１で使用したものと同じであった。
【００８８】
実施例２では、マウスの肝臓ミクロソームサンプル、すなわちコントロール（ＣＴ）サンプルおよびフェノバルビタール誘導（ＩＮＤ）サンプルは、それぞれ、軽い切断可能ＩＣＡＴ試薬および重い切断可能ＩＣＡＴ試薬で標識化した。サンプル中の軽いペプチドおよび重いペプチドのクロマトグラムの面積を濃度曲線に対して比較することにより、コントロールサンプル中で調べられた各Ｐ４５０のレベルおよびフェノバルビタールによって処理したときの発現の変化に関する定量的情報が提供された。本実験では、１６個の異なるＰ４５０タンパク質を表す１６個の異なる標識化された合成ペプチドがモニターされた。実施例２で検討したこれら１６個のＰ４５０タンパク質を表１の第１列目に列挙する。表１の第２列目には、本実験において、対応するＰ４５０アイソフォームに対して選択された特徴的ペプチドを列挙する。
【００８９】
本実施例で使用した物質および方法は、実施例１で使用したものと、以下のものを除いて実質的に同じであった。
【００９０】
（質量分析システム）
液体クロマトグラフィ（ＬＣ）質量分析（ＭＳ）システムを使用して、前記標準サンプル、およびコントロールおよびフェノバルビタール誘導の両方の複数のマウスからの未知のサンプルを分析した。コントロールサンプルおよび誘導サンプルを混合、消化し、混合サンプルとしてクロマトグラフィカラムにかけた。この混合サンプルには、特徴的ペプチド内部標準サンプルは添加しなかった。サンプルは、Ｇｅｎｅｓｉｓ  Ｃ１８ＡＱカラム（７５μｍ×１０ｃｍ、Ｖｙｄａｃ）を使用した逆相ＨＰＬＣにより、１０分グラジエント（０．１％ギ酸中で１５〜４５％アセトニトリル）で分離した。実施例１で記載したように、ＭＲＭ分析を行った。
【００９１】
（濃度曲線の作成）
実施例１で説明した濃度曲線と同じものを実施例２においても使用した。
【００９２】
（マウスの肝臓ミクロソームの標識化）
マウスの肝臓ミクロソームからのタンパク質を抽出し、そのタンパク質抽出物を切断可能ＩＣＡＴ（商標）試薬（ＩＮＤには重いＩＣＡＴ（商標）試薬を、ＣＴには軽いＩＣＡＴ（商標）試薬を使用した）で標識化した。サンプルは、アプライドバイオシステムのＩＣＡＴ（商標）試薬キットの標準プロトコル（例えば、アプライドバイオシステム  Ｐａｒｔ  Ｎｏ．  ４３３３３７３  Ｒｅｖ．  Ａ）に従って処理した。
【００９３】
（発現の定量）
ＣＴサンプルとＩＮＤサンプルとの両方に対する本実験のＰ４５０アイソフォームの絶対発現は、例えば、コントロールサンプルのＭＲＭピーク面積と対応する特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジションに対する濃度曲線とを比較することにより求めることができる。例えば、図５は、コントロールサンプル５０２およびフェノバルビタール誘導サンプル５０４の両方からの信号を有する、実施例２のＩＣＬＧＥＳＩＡＲペプチド（Ｐ４５０のＣｙｐ２ｂ１０アイソフォームに対して選択された特徴的ペプチド）の識別用娘イオンのＭＲＭクロマトグラム５００を示す。ＣＴおよびＩＮＤサンプル中のＩＣＬＧＥＳＩＡＲペプチド、したがってＣＴおよびＩＮＤサンプル中の対応する特異的なＰ４５０アイソフォームの濃度は、例えば、コントロールサンプルの信号５０２のＭＲＭピーク面積を、合成ペプチドから作成した対応する濃度曲線（例えば、図４）に対して比較することにより求めることができる。例えば、本実験のコントロールの肝臓ミクロソーム中では、Ｃｙｐ２ｂ１０は、約２．４  ｆｍｏｌ／μｇミクロソームタンパク質にて発現した。また、誘導サンプル信号５０４およびコントロールサンプル信号５０２からのＩＣＬＧＥＳＩＡＲペプチドに対する濃度曲線から算出された濃度の比較、またはそれぞれのＭＲＭピーク面積の比較により、Ｐ４５０Ｃｙｐ２ｂ１０アイソフォームの発現は、フェノバルビタール処理により約７倍上昇することが示される。
【００９４】
種々の実施形態において、同じサブファミリー内の高度に相同なタンパク質の発現の変化を確認することができる。例えば、Ｃｙｐ２Ｃサブファミリーからの４つのアイソフォーム（Ｃｙｐ２ｃ４０、Ｃｙｐ２ｃ２９、Ｃｙｐ２ｃ３７、およびＣｙｐ２ｃ３９）は、約８０％の配列相同性を有している。種々の実施形態において、例えば、ＭＲＭ法の特定性を使用して個々の定量情報を得ることができる。図６を参照すると、コントロールサンプルおよびフェノバルビタール誘導サンプルのＭＲＭマイクログラム６００が示されており、それらのアイソフォームのうちの２つ（Ｃｙｐ２ｃ４０  ６０２  およびＣｙｐ２ｃ３９  ６０４）は、実質的にはフェノバルビタール誘導性ではなかった。しかしながら、Ｃｙｐ２ｃ２９／Ｃｙｐ２ｃ３７  ７０アイソフォームは、ＭＲＭピーク面積によれば、誘導サンプル６０６は、コントロールサンプル６０８に対し、約３倍の発現増加を示した。
【００９５】
種々の実施形態において、例えば、タンパク質出発物質またはサンプル調製品の量の実験上の小さい変動を明らかにするために、標準化タンパク質として機能する１つまたはそれ以上のタンパク質を選択することができる。標準化ファクターとして役割を果たすように選択されたタンパク質は、誘導方法（例えば、薬剤誘導）にかかわらず不変であるべきであり、それらのタンパク質のペプチドフラグメントは、実験において内部標準としての役割を果たすために、通常のサンプル調整のあとに観測されるべきである。
【００９６】
表３は、実施例２において、Ｐ４５０イソ酵素の定量に使用した標準化タンパク質と特徴的ペプチドを示す。種々の実施形態において、標準化タンパク質は、ミクロソームタンパク質である。種々の実施形態において、標準化タンパク質の特徴的ペプチドは、単離されたトリプシンフラグメントである。種々の実施形態において、特徴的ペプチドは、約４ないし約３０アミノ酸残基長、または約６ないし約１５アミノ酸残基長、または約１６ないし約３０アミノ酸残基長、または約８ないし約１６アミノ酸残基長、または約１０ないし約１５アミノ酸残基長である。
【００９７】
【表３】
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図７は、Ｐ４５０タンパク質のサブファミリーのうちの４つのサブファミリー：Ｃｙｐｌａｌ  ７０２、Ｃｙｐｌａ２  ７０４、Ｃｙｐ２ｅｌ  ７０６、およびＣｙｐ３ａ４  ７０８のウェスタンブロット分析の結果７００を示す。Ｐ４５０タンパク質のサブファミリーのうちの４つのサブファミリーに対する市販の抗体を入手し使用することにより、コントロールサンプル７１０およびフェノバルビタール誘導サンプル７１２の両方のサンプル中の発現したタンパク質レベルを分析した。Ｃｙｐｌａｌタンパク質は、どちらのサンプルにおいてもほとんど観測されなかった。Ｃｙｐｌａ２、Ｃｙｐ２ｅｌ、およびＣｙｐ３ａ４タンパク質は、両方のサンプルにおいて、同等の発現レベルで観測された。
【００９８】
本教示を具体的な実施形態を参照して詳細に説明してきたが、本教示の趣旨および範囲を逸脱することなく、形態および詳細について種々の変更が可能であることを理解されたい。例えば、開示した種々の標識化手法、ＰＤＩＴＭ手法、濃度曲線、および質量分析システムのいずれかを組み合わせることにより、１つのサンプルまたは複数のサンプル中の１つのタンパク質または複数のタンパク質の絶対濃度を求める方法を提供することができる。したがって、本教示の趣旨および範囲に入るすべての実施形態およびそれに同等のものを主張する。本教示の方法、システム、およびアッセイの説明および図は、その趣旨の記述がない限り、説明した構成要素の順序に限定されるように解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】サンプル中のタンパク質の絶対濃度を求める方法の種々の実施形態の概略図である。
【図２】実施例１および２で使用された質量分析システムの簡略化した概略図である。
【図３】実施例１および２の各標識化された合成特徴的ペプチドのオンカラムで３．２  ｆｍｏｌのＭＲＭクロマトグラムである。
【図４】実施例１および２のＩＣＬＧＥＳＩＡＲペプチド（Ｐ４５０のＣｙｐ２ｂ１０アイソフォームに対して選択された特徴的ペプチド）の識別用娘イオンに対して作成された濃度曲線である。
【図５】実施例１のコントロールおよびフェノバルビタール誘導サンプルの両方のＩＣＬＧＥＳＩＡＲペプチド（Ｐ４５０のＣｙｐ２ｂ１０アイソフォームに対して選択された特徴的ペプチド）の識別用娘イオンに対するＭＲＭクロマトグラムである。
【図６】同じサブファミリー内のＰ４５０タンパク質の定量のためのＭＲＭスキャンデータを示す。
【図７】Ｐ４５０タンパク質のサブファミリーのうちの４つのサブファミリー：Ｃｙｐ１ａ１、Ｃｙｐ１ａ２、Ｃｙｐ２ｅ１、およびＣｙｐ３ａ４のウェスタンブロット分析の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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