(57)【要約】  本発明は、嚢胞性線維症の治療のための治療標的を開示する。非リソソームグルコシルセラミダーゼ（ＧＢＡ２）の阻害が、一般的ｄｅｌＦ５０８−ＣＦＴＲ突然変異を保持するＣＦ患者由来の細胞においてクロライド電流を十分に回復させることが判明した。膜二重層面の最上部に位置する酵素の触媒中心（４）とともに、特に強力な阻害剤が、膜二重層に挿入できる基を有するデオキシノジリマイシン誘導体に認められる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
嚢胞性線維症の治療用薬剤の調製のためのＧＢＡ２阻害剤の使用。
【請求項２】
前記阻害剤が、膜二重層に挿入できる基に結合したイミノ糖部分を含み、前記基が６個〜４０個の炭素原子を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
膜二重層に挿入できる前記基が、１個の窒素原子が存在する６員環を含む前記イミノ糖に結合する、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
膜二重層に挿入できる前記基が、前記イミノ糖の前記６員環の前記窒素原子に結合する、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記イミノ糖が、デオキシノジリマイシン又はその誘導体である、請求項２から４までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記デオキシノジリマイシンが、グルコピラノースの立体配置を有する、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
６個〜４０個の炭素原子を含む前記基が、疎水性部分を含み、前記疎水性部分が、環を含有する３個以上の炭素原子を含み、前記環が、別の環と２個以上の炭素原子を共有する、請求項２から６までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記疎水性部分がコレステロール、β−コレスタノール、フェナントレン及びアダマンタンから選択される、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
６個〜４０個の炭素原子を含む前記基が、三級ブチル又はネオペンチル基を含む、請求項２から６までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
前記阻害剤が、Ｎ−［５’−（アダマンタン−１’−イル−メトキシ）−ペンタン］−１−デオキシノジリマイシン、Ｎ−［５’−（アダマンタン−１’−イル−メトキシ）−ペンタン］−Ｌ−イド−１−デオキシノジリマイシン、Ｎ−［５’−ネオペンチルオキシ−ペンタン］−１−デオキシノジリマイシン及びＮ−［５’−ネオペンチルオキシ−ペンタン］−Ｌ−イド−１−デオキシノジリマイシンから選択される、請求項２に記載の使用。
【請求項１１】
アルキルが、４個〜１２個の炭素原子を有するアルキレン基を意味する、Ｎ−［５’−ネオペンチルオキシ−アルキル］−１−デオキシノジリマイシン又はＮ−［５’−ネオペンチルオキシ−アルキル］−Ｌ−イド−１−デオキシノジリマイシン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、嚢胞性線維症の分野にある。特に、嚢胞性線維症の治療の治療標的及び適切な化合物が提供される。
【背景技術】
【０００２】
嚢胞性線維症（ＣＦ）は、身体の各種部分、特に肺及び消化器系を侵す遺伝性の状態である。ＣＦは、白人に最も一般的な遺伝性疾患で、出生児２，５００人当たり約１人が罹患する。ＣＦの乳児５人中約１人は、出生時に診断され、その場合、当該乳児の腸管が特に濃厚な胎便によって閉塞される。この状態は、手術を要する場合がある。ＣＦの人々のうち、半数をわずかに上回る人々は、年令相応の成長や体重増加を示していないので、乳児として診断される。これは、膵臓が十分な脂肪分解酵素を産生しておらず、食物中の脂肪の最適以下の吸収を起こし、カロリー摂取減少及び成長遅滞を生じるためである。未治療のＣＦ患者は、油状の排便、腹痛及び体重増加の問題を示し続ける。便秘も、頻発する症状である。時には、腸管は、完全に閉塞され、激しい胃痛を生じる。
【０００３】
ＣＦは、肺の罹患も特徴とする。健康な者では、肺の気道表面に一定の粘液流があり、これが、残渣及び細菌を除去する。ＣＦでは、粘液は、過剰の粘着性があり、細菌増殖に理想的な環境を提供する。ＣＦ患者は、胸部細菌感染及び肺炎の危険がある。当該患者が早期に、適切に治療されなければ、これらは治癒が非常に困難である。症状は、持続性咳嗽、喀痰（唾液及び粘液）の過剰産生、喘鳴、普通の活動に伴う息切れを含む。ＣＦに伴う他の問題が確認されている。
【０００４】
ＣＦは、劣性遺伝し、罹患（ＣＦＴＲ）遺伝子は、第７染色体に位置する。当該遺伝子は、クロライドチャネルＣＦＴＲをコードする。嚢胞性線維症（ＣＦ）では、最も一般的な突然変異ｄｅｌＦ５０８は、ＣＦ遺伝子タンパク質、クロライドチャネルＣＦＴＲ、の活性及び細胞表面発現を減少させる。英国における白人集団の２２人中約１人は、第７染色体対の一方にｄｅｌＦ５０８突然変異を保持する（キャリア）。
【０００５】
現在、ＣＦＴＲへの有効な治療は存在せず、治療法は、症状の鎮静化に限られる。ＣＦ患者は、粘着性粘液を緩める手助けとなる強いマッサージを含む毎日の胸部理学療法を必要とする。患者は、どの胸部感染症も抗生物質で速やかに治療されることも必要である。ＭＭＲ（はしか、おたふく風邪及び風疹）及びＤＴＰ（ジフテリア、破傷風及び百日咳）などの通常の小児期ワクチン接種は、ＣＦの人々にとって重要であり、胸部感染症予防に役立てるために、流感及び肺炎球菌（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）に対するワクチン接種も受けるべきである。大半のＣＦ患者は、それぞれの食事又はスナックとともに、失われた膵臓酵素を供給し、適正な消化を可能にするカプセルの服用を必要とする。追加療法は、肺感染症に対抗する抗生物質の連日経口投与又は吸入、吸入抗喘息療法、副腎皮質ホルモン錠、特にビタミンＡ及びＤの食事でのビタミン補給剤、喀痰の粘着性を減少させる薬物（パルモザイム）の吸入、便秘を緩和する、又は酵素補助剤の活性を改善する薬物、ＣＦ関連糖尿病用のインスリン、ＣＦ関連肝臓疾患用薬物、呼吸を助け、不妊問題克服に役立てる酸素を含むことができる。
【０００６】
最も一般的なＣＦ突然変異ｄｅｌＦ５０８は、ＥＲに若干非効率的に折り畳まれた変異タンパク質を生じ、細胞表面発現減少、及びクロライド電流容量減少を起こす。ＣＦには、複数の治療アプローチが考えられる。１つのアプローチは、遺伝子治療に基づく（適正なＣＦＴＲ  ｃＤＮＡの導入）。或いは、内因性変異ＣＦＴＲ活性の増加が、治療手段として考えられる。一般に、ｄｅｌＦ５０８  ＣＦＴＲのクロライドコンダクタンスのわずかな増加が、治療手段になると考えられている。そのため、ＥＲ中の変異ＣＦＴＲタンパク質の折畳みの薬理学的改善、変異ＣＦＴＲタンパク質の細胞表面発現の薬理学的増強、及び当該変異ＣＦＴＲタンパク質によるクロライドコンダクタンスの薬理学的増強が検討されている。現在、これらのアプローチはいずれも、ＣＦ患者の主要な問題を是正する有効な薬剤を生み出していない。
【０００７】
ＣＦの是正は、基礎となる欠損の是正、即ち、上皮細胞の頂側膜のクロライドチャネルＣＦＴＲの活性低下の是正が必要になる。ＣＦ患者の過半数は、変異ｄｅｌＦ５０８−ＣＦＴＲタンパク質を保持している。したがって、解決すべき問題は、特に、ｄｅｌＦ５０８−ＣＦＴＲ保持患者の上皮細胞のクロライド電流を増加させることである。効率的な治療的是正に関しては、これらの個体のクロライドコンダクタンス容量の部分的改善のみで十分であると考えられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＣＦＴＲタンパク質は、上皮細胞の頂側膜のスフィンゴ糖脂質に富む脂質ラフトに位置することが確認された。クロライドチャネルＣＦＴＲの活性は、スフィンゴ糖脂質及びセラミドを含有するその微小環境に影響される。これを考慮して、セラミドの選択的局所減少が、クロライドチャネル（ｄｅｌＦ５０８）−ＣＦＴＲの活性への主要な有益刺激作用を有し、したがって、ＣＦの治療手段になると想定された。これを念頭において、ＣＦＴＲタンパク質のスフィンゴ脂質微小環境を制御するタンパク質／酵素を同定し、それによって、ＣＦ治療法開発に標的を提供することが、本発明の目的であった。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上皮細胞頂側膜にも位置する酵素である非リソソームグルコシルセラミダーゼを発見することによってこの目的を達成した。この酵素は、グルコシルセラミドのセラミドへの変換を触媒し、したがって、脂質ラフトの組成に影響を与える。対応する遺伝子及びタンパク質の同定により、当該酵素が、ＧＢＡ２（グルコシダーゼ、ベータ（胆汁酸）２）と同一であることが判明し、したがって、ＧＢＡ２が、ＣＦＴＲによるクロライドコンダクタンスの調節において、その脂質ラフト微小環境を変化させることによって重要な役割を果たすことが認められた。
【００１０】
この非リソソームグルコシルセラミダーゼを標的として同定することによって、ＣＦの治療法が、ＧＢＡ２の、好ましくは選択的な阻害にあることが判明した。当該酵素の阻害は、クロライド電流を増加させ、ＣＦ罹患患者、特にｄｅｌＦ５０８  ＣＦＴＲ保持患者において治療効果を発揮するはずである。
【００１１】
したがって、本発明は、嚢胞性線維症の治療法であって、前記方法が、治療有効量のＧＢＡ２阻害剤を、当該阻害剤を必要とする対象に投与する段階を含む治療法に関する。又は、言い換えれば、本発明は、嚢胞性線維症の治療用薬剤の調製のためのＧＢＡ２阻害剤の使用に関する。
【００１２】
最近、ミグルスタット（Ｎ−ブチル−１−デオキシノジリマイシン）のＣＦに対する有益な効果が報告されている（Ｎｏｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５８０（２００６）２０８１〜２０８６）。しかし、この刊行物では、異なる作用機序が提案されており、つまり、小胞体アルファ−グルコシダーゼの阻害である。本発明は、この刊行物とは逆に、ＣＦに対するはるかに有効で特異的な治療薬である化合物の生成を可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
非リソソームグルコシルセラミダーゼは、グルコシルセラミダーゼをセラミドに効率的に変換できる酵素である。当該酵素の機能を洞察するため、本発明者らは、非リソソームグルコシルセラミダーゼの存在について、各種の組織及び細胞型を分析した。従来のアッセイ、５ｍＭコンジュリトールＢ−エポキシドの存在下での４−メチルウンベリフェリル−ベータ−グルコシドの加水分解の測定が使用された。これらの条件下では、リソソームグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ１）による基質の分解は、コンジュリトールＢ−エポキシドの共有結合によって不可逆的に阻害される。
【００１４】
本発明者らは、前記非リソソームグルコシルセラミダーゼが上皮細胞に特に豊富で、その頂側膜に位置することを認めた。上皮細胞からの単離頂側膜中の非リソソームグルコシルセラミダーゼの富化は、約４５０倍である。したがって、非リソソームグルコシルセラミダーゼは、クロライドチャネルＣＦＴＲに類似した膜分画に位置する。
【００１５】
培養上皮細胞の頂側膜分画中のタンパク質の分析後、非リソソームグルコシルセラミダーゼの分子の性質が特定された。分析は、二次元ゲル電気泳動及びタンパク質染色によって実施された。候補となる１００ｋＤａタンパク質が同定された。当該候補タンパク質は、トリプシンで部分消化され、トリプシン消化ペプチドのアミノ酸配列がＭＳ／ＭＳ分析によって決定された。確定されたアミノ酸配列の、タンパク質データベースとの比較から、前記ＧＢＡ２遺伝子が、非リソソームグルコシルセラミダーゼをコードし得ることが示唆された。
【００１６】
ＧＢＡ２が実際に非リソソームグルコシルセラミダーゼをコードすることを実証するために、細胞にＧＢＡ２  ｃＤＮＡを発現させた。細胞溶解物の分析は、非リソソームグルコシルセラミダーゼ活性が、ＧＢＡ２  ｃＤＮＡの発現時に増加することを示した。逆に、ＧＢＡ２  ｓｉＲＮＡの発現は、非リソソームグルコシルセラミダーゼ活性の減少を招いた。ＧＢＡ２遺伝子産物は、膜に及ぶ１００ｋＤａタンパク質であり、その推定触媒部位が膜の最上部にあると推測される。図を参照されたい。アミノ酸９７２個のタンパク質（分子量１０４ｋＤａ）であるＧＢＡ２の以下の特徴が、図に示されている。即ち、（１）サイトゾルドメイン（ａａ７０６〜９２７）は、ＰＭ／エンドソーム／リソソームの選別用ジロイシンモチーフを含有する；（２）１個の膜貫通ドメイン；（３）システインに富む内腔ドメイン（ａａ１〜６９０）；（４）膜内腔面最上部の予測触媒中心である。
【００１７】
この構造予測は、膜に結合し、膜二重層に挿入されながら、スフィンゴ糖脂質基質を分解する、酵素の既知の特徴に完全に一致する。
【００１８】
本発明者らは、ＧＢＡ２が上皮細胞の頂側膜中でのセラミド生成を司るという発見に従って、ＧＢＡ２の阻害剤は、ＣＦに有益な効果を有するはずである、と考えた。したがって、一般に、ベータ−グルコシダーゼ阻害剤が適しているはずである。本発明の一実施形態では、ＣＦの治療にベータ−グルコシダーゼ阻害剤が使用される。一実施形態では、本発明による阻害剤は、イミノ糖部分を含む。イミノ糖部分は、窒素原子が、モノサッカライド中に通常存在する環内酸素に取って代わっているモノサッカライドの構造類似物として定義される。好ましい実施形態では、当該イミノ糖は、少なくとも１個の窒素原子が存在する５員又は６員環を含む。好ましくは、残りの４個又は５個の環原子は、炭素原子である。一実施形態では、阻害剤は、１個の窒素原子が存在する６員環を有するモノサッカライドを含む。当該イミノ糖部分は、どのモノサッカライド立体配置も有することができる。かかる立体配置は、炭水化物の化学者には既知である。当該イミノ糖は、通常のモノサッカライドから１個又は複数個のＯＨ基が欠損した、例えば、デオキシ−、ジデオキシなどの化合物も包含する。
【００１９】
例えば、ベータ−グルコシダーゼ阻害剤に結合するために、特に挿入を可能にする基であるイミノ糖、即ち、言い換えれば、前記膜二重層中への挿入が可能な基を含むのが有利である。かかる基は、親油性基と称することもできる。イミノ糖の場合、かかる基は、モノサッカライド環のどの原子とも、直接に、又はモノサッカライド環原子でのヒドロキシル置換基の酸素原子を介した共有結合によって結合できる。好ましい実施形態では、膜二重層中に挿入できる基がモノサッカライド環の不特定又は特定の窒素原子に結合する。膜二重層に挿入できるように、イミノ糖に結合した基が、当該二重層脂質環境と正の相互作用を行うのに十分に疎水性である、即ち、言い換えれば、親油性であるのが好ましい。基が少なくとも６個の炭素原子を含む場合、当該基は、十分に疎水性又は親油性である。好ましくは、当該基は、４０個未満の炭素原子を含む。したがって、一実施形態では、イミノ糖は、６個〜４０個の炭素原子を含む基で置換される。かかる基は、直鎖又は分枝状であることができるアルキル鎖であると考えられ、Ｏ、Ｓ及びＮなどの１個又は複数個のヘテロ原子で遮断可能であり、また、当該アルキル鎖は、１個又は複数個の不飽和基、例えば二重又は三重炭素−炭素結合を含有することもできる。例えば、オレイル鎖（好ましくはシス型の二重結合１個を有するＣ１８）は、脂質二重層と良好に相互作用することが既知である。分枝しているか、かかるアルキル鎖に置換基を含有する炭素原子であるかを考慮せずに、３０個未満の炭素原子のアルキル鎖に相当する、又は、２４個以下の炭素原子のアルキル鎖にも相当する長さが、通常、膜二重層との有益な相互作用には十分である。
【００２０】
或いは、６個〜４０個の炭素原子を含む基を、疎水性部分を含む基と見なすこともできる。疎水性部分の適切な説明は、膜二重層に挿入できる環状基を含有する炭素原子である。適切には、当該環状基は、環を含有する２個の炭素原子を含み、又は、好ましくは、環を含有する３個以上もの炭素原子を含む。有利には、かかる多環構造では、少なくとも２個の環、好ましくは少なくとも３個以上の環、好ましくはすべての環が、別の環と２個以上の炭素原子を共有する。かかる基の適切な例は、コレステロール、β−コレスタノール、フェナントレン、アダマンタンなどである。かかる基を、ヒドロキシル官能基を介してアルキル鎖に結合し、当該アルキル鎖を、イミノ糖、好ましくは当該イミノ糖の環内窒素に結合するのが有利である。疎水性部分とイミノ糖を結合するアルキル鎖は、好ましくは、少なくとも２個、好ましくは少なくとも３個の炭素原子を含む。大型疎水性部分が阻害剤に含まれる場合、当該疎水性部分とイミノ糖を結合するアルキル鎖は、好ましくは、１２個以下、好ましくは１０個以下の炭素原子を、又は９個又は８個以下の炭素原子も含む。当該アルキル鎖は、少なくとも１個のヘテロ原子、例えばＯ原子を含むことができ、それを介して、疎水性部分がアルキル鎖に結合できる。
【００２１】
特に、強力な非リソソームグルコシルセラミダーゼ阻害剤は、デオキシノジリマイシン部分を含有することが既知である。例えば、デオキシノジリマイシン部分に結合するために、膜二重層中への挿入を可能にする基を含むのが有利である。ある既知の強力なＧＢＡ２阻害剤は、Ｏｖｅｒｋｌｅｅｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９８，ｖｏｌ．２７３，ｎｏ．４１，ｐｐ２６５２２〜２６５２７に公表されているＮ−［５’−（アダマンタン−１’−イル−メトキシ）−ペンタン］−１−デオキシノジリマイシン（ＡＭＰ−ＤＮＭ）である。この構造は、ＧＢＡ２に対して、約１ｎＭのＩＣ５０を有する。
【００２２】
ｄｅｌＦ５０８−ＣＦＴＲ含有上皮ＣＦ細胞の、ＡＭＰ−ＤＮＭとのインキュベーション時のクロライド電流は、治療効果を有すると見なされるレベルまで回復した。ｄｅｌＦ５０８−ＣＦＴＲ保持マウスの状態改善によっても明らかなように、クロライドコンダクタンスの大幅な矯正を得るには、クロライドコンダクタンス容量の部分回復で十分である。
【００２３】
したがって、クロライドチャネルｄｅｌＦ５０８−ＣＦＴＲに対する有益な効果には、ＧＢＡ２の阻害が必要となる。ＡＭＰ−ＤＮＭは、治療可能性を有する、強力なＧＢＡ２阻害剤である。この種の化合物は、選択性を高めることによって改良可能である。疎水性デオキシノジリマイシンは、グルコシルセラミドシンターゼの既知阻害剤でもある。一実施形態では、当該化合物は、グルコシルセラミドシンターゼ（ＧＣＳ）の同時阻害をできる限り防止するのに特に有用であると考えられる。糖立体配置の変化及びアルキル鎖の変化及び／又は前記疎水性部分の変化、並びに、疎水性基が糖部分に結合する形若しくは手段の変化、特に、前記疎水性部分及びイミノ糖部分に結合するアルキル鎖の変化によって、より選択的な化合物が生成可能である。
【００２４】
一実施形態では、本発明による阻害剤は、デオキシノジリマイシン又はその誘導体であるイミノ糖を含む。誘導体は、各種モノサッカライド立体配置及び／又はモノサッカライドＯＨ基上に置換基を有するデオキシノジリマイシンを包含する。一実施形態では、デオキシノジリマイシンは、グルコピラノースの立体配置を取り、別の実施形態では、デオキシノジリマイシンは、イドピラノースの立体配置を取る。適切には、当該阻害剤は、Ｎ−［５’−（アダマンタン−１’−イル−メトキシ）−ペンタン］−１−デオキシノジリマイシン（ＡＭＰ−ＤＮＭ）又はＮ−［５’−（アダマンタン−１’−イル−メトキシ）−ペンタン］−Ｌ−イド−１−デオキシノジリマイシン（イド−ＡＭＰ−ＤＮＭ）である。
【００２５】
一実施形態では、膜二重層に挿入できる６個〜４０個の炭素原子を含む基は、大きなアルキル基、例えば三級ブチル又はネオペンチル基を含む。適切には、当該ネオペンチル基は、ネオペンチルアルコールの結合から生じる。有利なことに、当該三級ブチル又はネオペンチル基は、６個〜４０個の炭素原子を有する基、特に膜二重層に挿入できるアルキル鎖の末端位にある。本発明による適切な阻害剤は、Ｎ−［５’−ネオペンチルオキシ−ペンタン］−１−デオキシノジリマイシン又はＮ−［５’−ネオペンチルオキシ−ペンタン］−Ｌ−イド−１−デオキシノジリマイシンである。他の適切な阻害剤は、Ｎ−［５’−ネオペンチルオキシ−ペンタン］−１−デオキシノジリマイシンのような類似化合物であるが、その場合、当該ペンタンアルキル鎖は、少なかれ多かれ炭素原子、特にＣＨ２基、例えば、Ｎ−［５’−ネオペンチルオキシ−ブタン］−、−ヘキサン］−、−ヘプタン］−、−オクタン］−、−ノナン］−、−デカン］−１−デオキシノジリマイシンなど、又はＬ−イド化合物を含む。
【００２６】
好ましい実施形態では、本発明による阻害剤は、２５０ｎＭ未満、好ましくは１５０ｎＭ未満の、ＧＢＡ２に対するＩＣ５０を有する。別の実施形態では、当該阻害剤は、１ｍＭよりも高い、好ましくは１００μＭよりも高いＧＣＳへのＩＣ５０を有するのが好ましい。
【００２７】
本発明は、Ｎ−［５’−ネオペンチルオキシ−アルキル］−１−デオキシノジリマイシン又はＮ−［５’−ネオペンチルオキシ−アルキル］−Ｌ−イド−１−デオキシノジリマイシンにも関し、アルキルは、４個〜１２個の炭素原子、好ましくは４個〜１１個、４個〜１０個まで、４個〜９個まで、４個〜８個まで、４個〜７個の炭素原子、好ましくは、４個〜１２個のＣＨ２基、好ましくは４個〜１１個、４個〜１０個、４個〜９個、４個〜８個、４個〜７個の直鎖状のＣＨ２基を有するアルキレン基を意味する。本発明は、医薬品、及びかかる化合物を薬学的に許容可能なキャリアとともに含む医薬組成物としての、かかる化合物の使用にも関する。
【００２８】
重要なことに、本発明による阻害剤の正の効果は、ＥＲアルファ−グルコシダーゼの阻害又はスフィンゴ糖脂質合成の阻害によるｄｅｌＦ５０８−ＣＦＴＲのＥＲの折畳みの改善が原因とは考えられない。したがって、本発明は、全く新規の洞察、即ち、ＧＢＡ２の特異的阻害剤が、嚢胞性線維症の治療への高度に特異的な治療薬であることを提示するものである。
【実施例】
【００２９】
ｄｅｌＦ５０８−ＣＦＴＲ含有上皮ＣＦ細胞におけるｃＡＭＰ−活性化クロライド電流に対するＡＭＰ−ＤＮＭの効果を、以下のアッセイによって検討した：
穿孔全細胞パッチクランプ分析を、ＣＦ１５細胞（ｄｅｌＦ５０８ホモ接合性患者から得られたヒト鼻上皮細胞系）に適用した。細胞内液を満たしたパッチ電極（抵抗３〜４ＭΩ）（ＧＣ１５０−ＴＦ１０，Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ，ＵＳＡ）をＲＫ−４００増幅器（Ｂｉｏｌｏｇｉｃ，Ｆｒａｎｃｅ）にＡｇ／ＡｇＣｌペレットを通して連結した。外部溶液（ｍＭ）：１４５ＮａＣｌ、４ＣｓＣｌ、１ＭｇＣｌ２、１ＣａＣｌ２、５ｄ−グルコース、１０ＴＥＳ（ｐＨ７．４、３１５ｍＯｓｍ）。ピペット内溶液（ｍＭ）：１１３  １−アスパラギン酸、１１３ＣｓＯＨ、２７ＣｓＣｌ、１ＮａＣｌ、１ＥＧＴＡ、１ＭｇＣｌ２、３Ｍｇ−ＡＴＰ（即時）、１０ＴＥＳ（ＣｓＯＨによりｐＨ７．２、２８５ｍＯｓｍ）及びアンホテリシンＢ（１００μｇ／ｍｌ）、２時間ごとに再調製した。インプット抵抗が１５ＭΩの細胞だけを分析した。平均アクセス抵抗及び全細胞キャパシタンスは、１２±０．６ＭΩ及び３５±４．３ｐＦであった（ｎ＝４４）。電流は、−８０ｍＶから＋８０ｍＶまで、２０ｍＶずつ増加させる電圧ステップに対応して得た。データは、ｐＣｌａｍｐ６．０．３パッケージソフトウェア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵＳＡ）を使って収集した。ＣＦＴＲ  Ｃｌ−チャネル活性は、ヨウ素（１２５Ｉ）流出技術によって細胞群についてアッセイした。
【００３０】
上皮細胞の１０ｎＭ  ＡＭＰ−ＤＮＭとのインキュベーションは、ｄｅｌＦ５０８−ＣＦＴＲ含有上皮ＣＦ細胞のｃＡＭＰ−活性化クロライド電流を正常レベルの３０％まで回復することが判明した。かかる矯正度は、治療効果に十分であると考えられる。
【００３１】
ＣＦに対するＧＢＡ２阻害剤の治療可能性を検討するために、さらに、ｄｅｌＦ５０８マウスの回腸粘膜からの腸外植片に対するＡＭＰ−ＤＮＭの効果を分析した。以下のアッセイを使用した：
Ｒｏｔｔｅｒｄａｍ  ｄｅｌＦ５０８／ｄｅｌＦ５０８−ＣＦＴＲマウス（Ｃｆｔｒｔｍｌ  Ｅｕｒ）、その同産仔対照（ＦＶＢ同系交配、１４週齢〜１７週齢、体重２０ｇ〜３０ｇ、無病原体環境下、固形食で飼育）及びＣｆｔｒ−ＫＯマウス（Ｃｆｔｒｔｍ２  Ｃａｍ）を使用した。筋肉剥離回腸粘膜を、インスリン（１０μｇ／ｍｌ）及びデキサメサゾン（２０μｇ／ｍｌ）補充Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅ−Ｇｌｕｔａｍａｘ培地中でインキュベートした。異なる時点で、反復洗浄によって当該化合物を除去し、それに続いて、ミニ−Ｕｓｓｉｎｇチャンバーで短絡電流（Ｉｓｃ）を測定した。ウェスタンブロッティングを実施し、イムノブロットを、モノクローナルマウス抗ＣＦＴＲ抗体（１０μｇ／ｍｌ、ＩｇＧ１Ｍ３Ａ７、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ＵＳＡ）で探査した。タンパク質レベルを、濃度測定値及び対照の百分率として表示した。免疫組織化学検査では、組織を４％（重量／容積）パラホルムアルデヒドに固定した。切片（５μｍ）を、抗体Ｒ３１９５（１：５００）で染色した。
【００３２】
１０ｎＭ  ＡＭＰ−ＤＮＭは、ｄｅｌＦ５０８マウスの回腸粘膜の腸陰窩の成熟及び機能性ｄｅｌＦ５０８−ＣＦＴＲを救済することが認められた。
【００３３】
ＧＢＡ２（ＧＢＡ２含有膜による、過剰のコンジュリトールＢ−エポキシドの存在下、４−メチルウンベリフェリル−ベータグルコシドの加水分解の分析によって測定）に対する化合物の阻害能とクロライド電流への正の効果の間に密接な関連性が存在することが認められた。
【００３４】
構造上の必要条件をさらに検討するために、各種のスペーサーと疎水性基で、化合物を検討した（表１参照）。やはり、ＧＢＡ２の阻害能は、クロライド電流の矯正を良好に予測することが認められた。
【００３５】
表１：膜二重層に挿入できる基のバリエーション
特定アッセイで測定した場合の、クロライド電流及びＧＢＡ２及びＧＣＳに対するＩＣ５０値を改善する能力に関する被験イミノ糖の構造
【表１】
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【００３６】
ＧＣＳと比較したＧＢＡ２阻害の特異性を高めるには、ブタノイル−スペーサー又はヘキシル−スペーサーが有利であることが分かる。疎水基は、変化してもよい。これに関連した例は、Ｎ−［５’−ネオペンチルオキシ−ペンタン］−１−デオキシノジリマイシンである。当該化合物は、ＧＢＡ２に対するＩＣ５０が、ＡＭＰ−ＤＮＭに比較して劣るにもかかわらず、ＧＣＳをほとんど阻害しないので、比較的より特異的な阻害剤である。
【００３７】
ＩＣ５０値の決定
非リソソームグルコシルセラミダーゼ及びグルコシルセラミドシンターゼ（ＧＣＳ）のＩＣ５０値を、酵素調製物を各種の阻害剤希釈物に曝露し、酵素活性が５０％減少する濃度を測定することによって決定した。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７３，２６５２２〜２７（１９９８）の２６５２３ページ、酵素アッセイを見出しとする記述通りに、アッセイを実施した。
【００３８】
デオキシノジリマイシン化合物の合成経路
各種の適切なデオキシノジリマイシン系阻害剤の合成は、他で、例えば、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，１９９８，ｖｏｌ２７３，ｐｐ２６５２２〜２７及び米国特許第６，１７７，４４７号に詳細に記述されている。Ｎ−［５’−ネオペンチルオキシ−ペンタン］−１−デオキシノジリマイシンの合成について、以下に経路を示す。全ての段階は、有機化学者にとって標準的なもので、適切な反応条件は、常法に従って確定できる。
【化１】
2009538276.tif 000004
【図１】
2009538276.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成20年4月24日(2008.4.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
嚢胞性線維症の治療用薬剤の調製のための、膜二重層に挿入できる基に結合したデオキシノジリマイシン部分又はその誘導体を含み、前記基が、６個〜４０個の炭素原子を含む基であるＧＢＡ２阻害剤の使用。
【請求項２】
膜二重層に挿入できる前記基が、前記デオキシノジリマイシン部分の前記窒素原子に結合する、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記デオキシノジリマイシンがグルコピラノースの立体配置を有する、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記デオキシノジリマイシンが、イドピラノースの立体配置を有する、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項５】
６個〜４０個の炭素原子を含む前記基が、疎水性部分を含み、前記疎水性部分が、環を含有する３個以上の炭素原子を含み、前記環が、別の環と２個以上の炭素原子を共有する、請求項１から４までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記疎水性部分がコレステロール、β−コレスタノール、フェナントレン及びアダマンタンから選択される、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
６個〜４０個の炭素原子を含む前記基が、三級ブチル又はネオペンチル基を含む、請求項１から４までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記阻害剤が、Ｎ−［５’−（アダマンタン−１’−イル−メトキシ）−ペンタン］−１−デオキシノジリマイシン、Ｎ−［５’−（アダマンタン−１’−イル−メトキシ）−ペンタン］−Ｌ−イド−１−デオキシノジリマイシ、Ｎ−［５’−ネオペンチルオキシ−ペンタン］−１−デオキシノジリマイシン及びＮ−［５’−ネオペンチルオキシ−ペンタン］−Ｌ−イド−１−デオキシノジリマイシンから選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項９】
アルキルが、４個〜１２個の炭素原子を有するアルキレン基を意味する、Ｎ−［５’−ネオペンチルオキシ−アルキル］−１−デオキシノジリマイシン又はＮ−［５’−ネオペンチルオキシ−アルキル］−Ｌ−イド−１−デオキシノジリマイシン。
【国際調査報告】
2009538276.tif 000006
2009538276.tif 000007
2009538276.tif 000008
2009538276.tif 000009