(57)【要約】ヒトrRNAまたはrDNAサブ配列を含む単離された核酸、ならびに関連する組成物および使用の方法を本明細書に提供する。2009504192.tif 000092
2009504192.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトrRNAまたはrDNAヌクレオチド配列中のヌクレオチド配列((G3+)N1-7)3G3+(SEQ ID NO:230)または((C3+)N1-7)3C3+(SEQ ID NO:231)を含む単離された核酸であって、
式中、Gはグアニンであり、Cはシトシンであり、3+は3つまたはそれ以上のヌクレオチドであり、かつNは任意のヌクレオチドであり；
核酸は環状または直線状の核酸であり；かつ
ヌクレオチド配列は100またはそれ未満のヌクレオチド長である、単離された核酸。
【請求項２】
ヌクレオチド配列が50またはそれ未満のヌクレオチド長である、請求項1記載の単離された核酸。
【請求項３】
直線状核酸である、請求項1記載の単離された核酸。
【請求項４】
核酸が100またはそれ未満のヌクレオチド長である、請求項1記載の単離された核酸。
【請求項５】
核酸がDNAである、請求項1記載の単離された核酸。
【請求項６】
ヌクレオチド配列がSEQ ID NO:1の配列である、請求項5記載の単離された核酸。
【請求項７】
ヌクレオチド配列がヒト28SリボソームRNAをコードする、請求項6記載の単離された核酸。
【請求項８】
ヌクレオチド配列が、以下からなる群より選択される1つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、請求項6記載の単離された核酸：
2009504192.tif 000087
。
【請求項９】
ヌクレオチド配列が、以下からなる群より選択される1つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、請求項6記載の単離された核酸：
2009504192.tif 000088
。
【請求項１０】
核酸がRNAである、請求項1記載の単離された核酸。
【請求項１１】
ヌクレオチド配列がSEQ ID NO:1によってコードされる、請求項10記載の単離された核酸。
【請求項１２】
ヌクレオチド配列がヒト28SリボソームRNAに由来する、請求項11記載の単離された核酸。
【請求項１３】
ヌクレオチド配列が、以下からなる群より選択される1つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、請求項11記載の単離された核酸：
2009504192.tif 000089
。
【請求項１４】
ヌクレオチド配列が、以下からなる群より選択される1つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、請求項11記載の単離された核酸：
2009504192.tif 000090
。
【請求項１５】
ヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列
2009504192.tif 000091
の1つまたは複数を含む、請求項11記載の単離された核酸。
【請求項１６】
1つまたは複数のヌクレオチド類似体または誘導体を含む、請求項1記載の単離された核酸。
【請求項１７】
1つまたは複数のヌクレオチド置換を含む、請求項1記載の単離された核酸。
【請求項１８】
ヌクレオチド配列が四重鎖構造を形成する、請求項1記載の単離された核酸。
【請求項１９】
四重鎖構造が分子内四重鎖構造である、請求項18記載の単離された核酸。
【請求項２０】
四重鎖がG-四重鎖である、請求項18記載の単離された核酸。
【請求項２１】
分子内四重鎖が平行型四重鎖である、請求項19記載の単離された核酸。
【請求項２２】
分子内四重鎖が混合平行型四重鎖である、請求項19記載の単離された核酸。
【請求項２３】
請求項1記載の核酸を小分子と組み合わせて含む組成物。
【請求項２４】
小分子がキノロン類似体である、請求項23記載の組成物。
【請求項２５】
請求項1記載の核酸を核酸に結合するタンパク質と組み合わせて含む組成物。
【請求項２６】
タンパク質が、ヌクレオリン、フィブリラリン、RecQ、QPN1、および前記物の機能的断片からなる群より選択される、請求項25記載の組成物。
【請求項２７】
ヒトリボソームヌクレオチド配列を含む核酸に結合する分子を同定する方法であって、
ヒトリボソームヌクレオチド配列を含む核酸および核酸に結合する化合物を、
試験分子と接触させる段階、ここで：
核酸は、ヒトrRNAまたはrDNAヌクレオチド配列中のヌクレオチド配列((G3+)N1-7)3G3+(SEQ ID NO:230)または((C3+)N1-7)3C3+(SEQ ID NO:231)を含み、
Gはグアニンであり、Cはシトシンであり、3+は3つまたはそれ以上のヌクレオチドであり、かつNは任意のヌクレオチドであり；
核酸は環状または直線状の核酸であり；かつ
ヌクレオチド配列は100またはそれ未満のヌクレオチド長であり；ならびに
核酸に結合したかまたは結合しなかった化合物の量を検出する段階
を含み、
それによって、試験分子の非存在下よりも試験分子の存在下においてより少ない化合物が核酸に結合する場合に、試験分子が、ヒトリボソームヌクレオチド配列を含む核酸に結合する分子として同定される、方法。
【請求項２８】
化合物が検出可能な標識と結合している、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
化合物が放射標識されている、請求項27記載の方法。
【請求項３０】
化合物がキノロン類似体である、請求項27記載の方法。
【請求項３１】
核酸が固相と結合している、請求項27記載の方法。
【請求項３２】
リボソーム核酸と、該核酸と相互作用するタンパク質との間の相互作用を調節する分子を同定する方法であって、
タンパク質に結合し得るヒトリボソームヌクレオチド配列を含む核酸およびタンパク質と試験分子を接触させる段階、ここで：
核酸は、ヒトrRNAまたはrDNAヌクレオチド配列中のヌクレオチド配列((G3+)N1-7)3G3+(SEQ ID NO:230)または((C3+)N1-7)3C3+(SEQ ID NO:231)を含み、
Gはグアニンであり、Cはシトシンであり、3+は3つまたはそれ以上のヌクレオチドであり、かつNは任意のヌクレオチドであり；
核酸は環状または直線状の核酸であり；かつ
ヌクレオチド配列は100またはそれ未満のヌクレオチド長であり；ならびに
タンパク質に結合したかまたは結合しなかった核酸の量を検出する段階
を含み、
それによって試験分子の非存在下よりも試験分子の存在下において異なる量の核酸がタンパク質に結合する場合に、試験分子が相互作用を調節する分子として同定される、方法。
【請求項３３】
タンパク質が、ヌクレオリン、フィブリラリン、RecQ、QPN1、および前記物の機能的断片からなる群より選択される、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
タンパク質が検出可能な標識と結合している、請求項32記載の方法。
【請求項３５】
タンパク質が固相と結合している、請求項32記載の方法。
【請求項３６】
核酸が検出可能な標識と結合している、請求項32記載の方法。
【請求項３７】
核酸が固相と結合している、請求項32記載の方法。
【請求項３８】
試験分子がキノロン誘導体である、請求項32記載の方法。
【請求項３９】
核酸がDNAである、請求項32記載の方法。
【請求項４０】
DNAがSEQ ID NO:1由来のヌクレオチド配列を含む、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
核酸がRNAである、請求項32記載の方法。
【請求項４２】
RNAがSEQ ID NO:1によってコードされるヌクレオチド配列を含む、請求項36記載の方法。
【請求項４３】
核酸が四重鎖構造を形成する、請求項32記載の方法。
【請求項４４】
試験分子が核酸中の四重鎖構造に結合する、請求項42記載の方法。
【請求項４５】
四重鎖が混合平行型四重鎖である、請求項42記載の方法。
【請求項４６】
四重鎖がG-四重鎖である、請求項42記載の方法。
【請求項４７】
核酸合成の調節因子を同定する方法であって、
プライマーオリゴヌクレオチドが鋳型核酸にハイブリダイズするのを可能にする条件下で、ヒトリボソームヌクレオチド配列を含む、標的配列を有する鋳型核酸を、鋳型核酸ヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を有する1つまたは複数のプライマーオリゴヌクレオチド、伸長ヌクレオチド、ポリメラーゼ、および試験分子と接触させる段階、ならびに
1つまたは複数のプライマー核酸の伸長によって合成された、標的配列を含む伸長産物の有無または量を検出する段階
を含み、
それによって試験分子の非存在下よりも試験分子の存在下においてより少ない伸長プライマー産物が合成される場合に、試験分子が核酸合成の調節因子として同定される、方法。
【請求項４８】
鋳型核酸がDNAである、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
標的配列がSEQ ID NO:1由来のヒトリボソームヌクレオチド配列を含む、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
鋳型核酸がRNAである、請求項47記載の方法。
【請求項５１】
標的配列がSEQ ID NO:1中のヌクレオチド配列によってコードされる、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
ポリメラーゼがDNAポリメラーゼである、請求項47記載の方法。
【請求項５３】
ポリメラーゼがRNAポリメラーゼである、請求項47記載の方法。
【請求項５４】
ヒトリボソームDNAもしくはRNA中の((G3+)N1-7)3G3+(SEQ ID NO:230)もしくは((C3+)N1-7)3C3+(SEQ ID NO:231)、またはその相補体を含むヌクレオチド配列中の標的配列に特異的にハイブリダイズするプローブオリゴヌクレオチドを含む組成物であって、：
式中、Gはグアニンであり、Cはシトシンであり、3+は3またはそれ以上のヌクレオチドであり、かつNは任意のヌクレオチドであり、かつ
プローブオリゴヌクレオチドが検出可能な標識を含む、組成物。
【請求項５５】
鋳型がDNAである、請求項54記載の組成物。
【請求項５６】
標的配列がSEQ ID NO:1由来のヒトリボソームヌクレオチド配列を含む、請求項55記載の組成物。
【請求項５７】
鋳型がRNAである、請求項54記載の組成物。
【請求項５８】
標的配列がSEQ ID NO:1中のヌクレオチド配列によってコードされる、請求項57記載の組成物。
【請求項５９】
5'から3'へのヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼをさらに含む、請求項54記載の組成物。
【請求項６０】
プローブオリゴヌクレオチドが5'末端で標識される、請求項54記載の組成物。
【請求項６１】
プローブオリゴヌクレオチドが、非核酸の尾部、または標的核酸配列と非相補的であるヌクレオチドの配列をさらに含む、請求項54記載の組成物。
【請求項６２】
プローブオリゴヌクレオチドが第1標識および第2標識を含む、請求項54記載の組成物。
【請求項６３】
第1標識および第2標識が、検出可能なシグナルの発生を消すようにプローブオリゴヌクレオチド上に効果的に位置する相互作用的シグナル発生標識である、請求項62記載の組成物。
【請求項６４】
第1標識がフルオロフォアであり、かつ第2標識が消光剤である、請求項62記載の組成物。
【請求項６５】
第1標識が5'末端に位置し、かつ第2標識が3'末端に位置する、請求項62記載の組成物。
【請求項６６】
プローブオリゴヌクレオチドの3'末端がブロックされている、請求項54記載の組成物。
【請求項６７】
プローブオリゴヌクレオチドが蛍光によって検出可能である、請求項54記載の組成物。
【請求項６８】
プローブオリゴヌクレオチドが特異的結合パートナーを有するリガンドを含む、請求項54記載の組成物。
【請求項６９】
リガンドがビオチン、アビジン、またはストレプトアビジンである、請求項68記載の組成物。
【請求項７０】
標的配列またはその相補体に隣接したヒトリボソーム鋳型DNAまたはRNAに特異的にハイブリダイズする、1つまたは複数のプライマーオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項54記載の組成物。
【請求項７１】
1つまたは複数の伸長ヌクレオチドをさらに含む、請求項70記載の組成物。
【請求項７２】
リボソームRNA(rRNA)合成を調節する分子を同定する方法であって、
細胞を試験分子と接触させる段階、
rRNAを、rRNAの一部を増幅する1つまたは複数のプライマーおよび増幅産物にハイブリダイズする標識プローブと接触させる段階、
標識プローブのハイブリダイゼーションによって増幅産物の量を検出する段階
を含み、
それによって増幅産物の量を減少または増加させる試験分子がrRNA合成を調節する分子として同定される、方法。
【請求項７３】
プライマーを添加し、かつrRNAを増幅させた後に標識プローブを添加する、請求項72記載の方法。
【請求項７４】
標識プローブおよびプライマーを同時に添加する、請求項72記載の方法。
。
【請求項７５】
増幅させるrRNAの部分がrRNAの5'末端である、請求項72記載の方法。
【請求項７６】
試験分子がキノロン類似体である、請求項72記載の方法。
【請求項７７】
rRNAを単離する段階を含む、請求項72記載の方法。
【請求項７８】
rRNAを全RNAと共に単離する、請求項77記載の方法。
【請求項７９】
rRNAの一部を逆転写し、かつ増幅させる、請求項72記載の方法。
【請求項８０】
増幅産物にハイブリダイズしたプローブがエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによって分解される、請求項72記載の方法。
【請求項８１】
プローブの分解によって検出可能なシグナルが発生する、請求項80記載の方法。
【請求項８２】
検出可能なシグナルが蛍光シグナルである、請求項81記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、ヒトリボソームRNA中に同定される選択されたヌクレオチド配列を有する核酸、前記物をコードするDNA配列、ならびに非限定的にアッセイおよび治療を含む関連した使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
細胞内のタンパク質は「翻訳」と称される過程で合成される。タンパク質は、デオキシリボ核酸(DNA)ヌクレオチド配列から転写されたメッセンジャーリボ核酸(mRNA)から翻訳される。各タンパク質はアミノ酸の一本の鎖として合成され、翻訳過程においては、リボソームがmRNAに結合してそれに沿って進み、各アミノ酸を鎖に順次付加していく。mRNAに結合したリボソームは、mRNAに沿って連続して配置されたヌクレオチドトリプレット(すなわちコドン)に従って、tRNAに取り付けられたアミノ酸を選択する。
【０００３】
ヒトリボソームは、60S大サブユニットおよび40S小サブユニットを含む80S粒子である。「80S」、「60S」、および「40S」における「S」という表示は、粒子サイズの沈降尺度である「スベドベリ単位」を指す。各リボソームサブユニットはタンパク質と機能的RNAが集合したものであり、tRNAに取り付けられたアミノ酸のドッキング領域として働く。機能的RNAは「リボソームRNA(rRNA)」と称され、「リボソームDNA(rDNA)」と称されるゲノムDNAの領域を鋳型として用いるポリメラーゼIおよびIII酵素によって合成される。rDNA配列は、ヒトゲノム中で約400回反復されている。リボソームRNAの生合成は47S前駆体rRNAの合成から始まり、これは、様々なエンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、RNAヘリカーゼ、および他のタンパク質因子の協調した作用によって繰り返し切断されて、より小さな成熟18S、5.8S、および28S rRNAとなる。18S rRNAは40Sリボソームサブユニットに組み立てられ、28Sおよび5.8S rRNAは60Sリボソームサブユニットに組み立てられる。ヒトリボソームの生合成は主に、細胞核内の特殊化した区画である核小体で行われる。
【発明の開示】
【０００４】
発明の開示
ヒトゲノムrDNAおよびコードされるrRNA中に、四重鎖ヌクレオチド配列モチーフを有するグアニンリッチヌクレオチド配列が存在することが発見された。これらのヌクレオチド配列は、ヒトrDNAをグアニンリッチヌクレオチド配列((G3+)N1-7)3G3+、式中、Gはグアニンであり、Nは任意のヌクレオチドであり、「G3+」は3つまたはそれ以上のグアニンである、に関して検索することによって発見された。ヌクレオチド配列はまた、ヒトrDNAをシトシンリッチヌクレオチド配列((C3+)N1-7)3C3+、式中、Cはシトシンであり、Nは任意のヌクレオチドであり、「C3+」は3つまたはそれ以上のシトシンである、に関して検索することによって発見された。ヒトゲノムrDNAの代表的なヌクレオチド配列をSEQ ID NO:1に記載する。
【０００５】
したがって、ヒトrRNAまたはrDNAヌクレオチド配列由来のヌクレオチド配列((G3+)N1-7)3G3+もしくは((C3+)N1-7)3C3+、またはその相補体、式中、Gはグアニンであり、Nは任意のヌクレオチドである、を含む単離された核酸を本明細書に提供する。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列は100ヌクレオチド長またはそれよりも短く、場合によってはヌクレオチド配列は50ヌクレオチド長またはそれよりも短い。いくつかの態様において、単離された核酸はプラスミドであってもよく、他の態様においては、場合により直線状核酸である。いくつかの態様において、核酸は100ヌクレオチド長またはそれよりも短くてもよい。核酸はDNAである場合もあればRNAである場合もあり、ヌクレオチド配列は場合により、SEQ ID NO:1の連続した配列である。特定の態様において、核酸はDNAであり、rRNA配列またはその相補体(すなわち、ウラシルがチミンで置換される)を含む。特定の態様において、ヌクレオチド配列はヒト28S rRNA配列をコードしてもよく、いくつかの態様においてはヒト28S rRNA配列であってもよい。
【０００６】
以下は、非rDNAゲノムDNA配列と配列同一性を共有しないrDNAヌクレオチド配列の例である。DNA配列はrDNAのコード鎖(非鋳型鎖、プラス(+)鎖、またはアンチセンス鎖)上のものであり、ヌクレオチド範囲は43 kbヒトリボソームDNA反復単位(アクセッション番号U13369)上の位置を指し、コード鎖またはその逆相補体において、ヒトゲノムのNCBI build 35内に完全な配列一致は同定されなかった。
2009504192.tif 000003
。
【０００７】
以下は、ヒトゲノムDNA中の非rDNA配列と配列同一性を共有するrDNAヌクレオチド配列の例である。DNA配列はrDNAコード鎖中のものであり、ヌクレオチド範囲は43 kbヒトrDNA反復単位(アクセッション番号U13369)上の位置を指す。
2009504192.tif 000004
。
【０００８】
特定のヒトrDNA配列と他の哺乳動物種の配列比較を行った。以下の配列は、他の哺乳動物種と配列同一性をほとんど共有しなかった：
2009504192.tif 000005
。
【０００９】
以下の配列は、別の哺乳動物種(例えば、マウス、ラット、チンパンジー)において顕著な配列類似性を共有した：
2009504192.tif 000006
。
【００１０】
以下の配列はrDNAの非コード鎖におけるGリッチ配列およびCリッチ配列であり、特定の態様において四重鎖構造を形成する可能性がある。
2009504192.tif 000007
2009504192.tif 000008
。
【００１１】
いくつかの態様において、単離された核酸はRNAであり、場合によってはSEQ ID NO:1の配列によってコードされるヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列はヒト28S rRNA配列である。
【００１２】
以下は、rDNA中の特定の領域によってコードされるrRNAおよびrRNA前駆体(pre-rRNA)ヌクレオチド配列の例である。RNA配列はrDNA配列から推測され、注釈づけはアクセッション番号U13369内に見出される。rRNAおよびrRNA前駆体を生成するために転写されるDNA配列に関して、ヒトゲノムのコード鎖(CDS)に沿って、遺伝子内に(Curwen et al., The Ensembl Automatic Gene Annotation System, Genome Res. 2004 May; 14(5):942-950によって同定される)一致は同定されなかった。
rDNA中の5'外部転写スペーサー領域由来のRNA配列
2009504192.tif 000009
；
rDNA中の内部転写スペーサー1領域由来のRNA配列
2009504192.tif 000010
；
rDNA中の内部転写スペーサー2領域由来のRNA配列
2009504192.tif 000011
；
28S rRNA内のRNA配列
2009504192.tif 000012
；
rDNA中の3'外部転写スペーサー領域由来のRNA配列
2009504192.tif 000013
。
【００１３】
以下は、非rDNAから転写されるRNA、およびそれらが転写されるrDNA領域と完全に一致するrRNAおよびrRNA前駆体配列である。
rDNA中の内部転写スペーサー1領域由来のRNA配列
2009504192.tif 000014
；
rDNA中の3'外部転写スペーサー領域由来のRNA配列
2009504192.tif 000015
。
【００１４】
以下はrDNAの転写領域中のCリッチrRNAおよびrRNA前駆体配列であり、特定の態様において四重鎖を形成する可能性がある。
rDNA中の5'外部転写スペーサー領域由来のRNA配列
2009504192.tif 000016
rDNA中の内部転写スペーサー2領域由来のRNA配列
2009504192.tif 000017
28S rRNA内のRNA配列
2009504192.tif 000018
rDNA中の3'外部転写スペーサー領域由来のRNA配列
2009504192.tif 000019
【００１５】
いくつかの態様において、本明細書に記載の単離された核酸は、本明細書に記載の別の核酸および/または本明細書に後述する別の成分(例えば、タンパク質、抗体)と組み合わされる。本明細書に提供する単離された核酸は、場合により、前記ヌクレオチド配列またはそのサブ配列を含み、本質的に前記ヌクレオチド配列もしくはそのサブ配列からなるか、または前記ヌクレオチド配列もしくはそのサブ配列の1つからなる。特定の態様において、核酸は、ペプチド核酸(PNA)類似体または本明細書に記載の他の類似体のような核酸類似体である。いくつかの態様において、核酸中のヌクレオチド配列は、配列モチーフ((G3+)N1-7)3G3+または((C3+)N1-7)3C3+と一致するヌクレオチド配列をもたらす1つまたは複数のヌクレオチド置換を含んでもよく、場合によってヌクレオチドはヌクレオチド類似体と置換される。特定の態様において、核酸またはその一部は、分子内四重鎖構造などの四重鎖構造を形成する。いくつかの態様において、単離された核酸を含む組成物はまた、例えばカリウムイオン(例えば、0.5 mM〜100 mMカリウムイオン)などの四重鎖構造を安定化する1つまたは複数の成分を含む。
【００１６】
特定の態様において、ヒトリボソームヌクレオチド配列またはそれと実質的に同一であるヌクレオチド配列を含む核酸は、四重鎖構造を形成する。核酸は多くの場合に、四重鎖形成を可能にし、かつ場合により四重鎖構造を安定化する他の成分を含む組成物中に存在する。ヒトリボソームヌクレオチド配列または実質的に同一なその変種は場合によりGリッチであり、場合によってはCリッチであり、特定の態様においてはヌクレオチド配列((G3+)N1-7)3G3+または((C3+)N1-7)3C3+と一致する。核酸は場合によりRNAであり、いくつかの態様においてはDNAである。実質的に同一なヌクレオチド配列変種は、場合により、SEQ ID NO:1のヌクレオチド配列またはその相補体と80%もしくはそれ以上、81%もしくはそれ以上、82%もしくはそれ以上、83%もしくはそれ以上、84%もしくはそれ以上、85%もしくはそれ以上、86%もしくはそれ以上、87%もしくはそれ以上、88%もしくはそれ以上、89%もしくはそれ以上、90%もしくはそれ以上、91%もしくはそれ以上、92%もしくはそれ以上、93%もしくはそれ以上、94%もしくはそれ以上、95%もしくはそれ以上、96%もしくはそれ以上、97%もしくはそれ以上、98%もしくはそれ以上、または99%もしくはそれ以上同一である。特定の態様において、ヒトリボソームヌクレオチド配列は、ヒトリボソームヌクレオチド配列またはその相補体の以下の領域の1つに由来する：(a) rDNA(例えば、SEQ ID NO:1)の5'ETS領域、ITS1領域、ITS2領域、28S rRNA領域、3'ETS領域、18S rRNA領域、もしくは5.8S rRNA領域；(b) (a)の相補体；(a)のコード化RNA；または(b)のコード化RNA。
【００１７】
ヒトrRNAコードゲノムDNA中の四重鎖形成配列候補を同定する方法であって、ヒトrRNAコードゲノムDNA中の配列((G3+)N1-7)3G3+または((C3+)N1-7)3C3+、式中、Gはグアニンであり、Cはシトシンであり、「3+」は3またはそれ以上のヌクレオチドであり、Nは任意のヌクレオチドである、を同定する段階を含む方法もまた本明細書に提供する。いくつかの態様において、ヒトrRNAコードゲノムDNAはSEQ ID NO:1である。
【００１８】
本明細書に記載のリボソームヌクレオチド配列の1つまたは複数を用いる方法もまた提供する。例えば、ヒトリボソームヌクレオチド配列を含む核酸に結合する分子を同定する方法であって、(a) 本明細書に記載のヒトリボソームヌクレオチド配列を含む核酸、その核酸に結合する化合物、および試験分子を接触させる段階、ならびに(b) 核酸に結合したかまたは結合しなかった化合物の量を検出する段階を含み、それによって、試験分子の非存在下よりも試験分子の存在下においてより少ない化合物が核酸に結合する場合に、試験分子が核酸に結合する分子として同定される方法を提供する。化合物は場合により検出可能な標識と結合しており、場合によっては放射標識されている。特定の態様において、化合物はキノロン類似体(例えば、本明細書に記載のキノロン類似体)またはポルフィリンである。特定の態様において、核酸は固相に結合していてよい。核酸はDNA、RNA、またはそれらの類似体であってもよく、特定の態様においては上記のヌクレオチド配列を含んでもよい。特定の態様において、核酸は、分子内四重鎖などの四重鎖を形成する可能性がある。
【００１９】
リボソーム核酸と、核酸と相互作用するタンパク質との間の相互作用を調節する分子を同定する方法であって、(a) タンパク質に結合し得るヒトリボソームヌクレオチド配列を含む核酸およびタンパク質を試験分子と接触させる段階、ならびに(b) タンパク質に結合したかまたは結合しなかった核酸の量を検出する段階を含み、それによって、試験分子が相互作用を調節する分子として同定される(例えば、試験分子の非存在下よりも試験分子の存在下において、異なる量の核酸がタンパク質に結合する)方法もまた本明細書に提供する。いくつかの態様において、タンパク質は、ヌクレオリン、フィブリラリン、RecQ、QPN1、および前記物の機能的断片からなる群より選択される。いくつかの態様においては、ヌクレオリン置換を引き起こす分子を同定する方法であって、(a) ヌクレオリンタンパク質に結合し得るヒトリボソームヌクレオチド配列を含む核酸およびヌクレオリンタンパク質を試験分子と接触させる段階、ならびに(b) ヌクレオリンタンパク質に結合したかまたは結合しなかった核酸の量を検出する段階を含み、それによって、試験分子の非存在下よりも試験分子の存在下においてより少ない核酸がヌクレオリンタンパク質に結合する場合に、試験分子がヌクレオリン置換を引き起こす分子として同定される方法を提供する。いくつかの態様において、ヌクレオリンタンパク質は検出可能な標識と結合しており、ヌクレオリンタンパク質は場合によって固相に結合している。核酸は場合により検出可能な標識と結合しており、特定の態様において核酸は固相に結合していてもよい。核酸はDNA、RNA、またはそれらの類似体であってもよく、特定の態様においては上記のヌクレオチド配列を含んでもよい。いくつかの態様において、試験分子はキノロン類似体である。本明細書に提供するリボソームヌクレオチド配列またはそれと実質的に同一である配列を有する核酸、およびヌクレオチド配列に結合するタンパク質(例えば、ヌクレオリン、フィブリラリン、RecQ、QPN1、および前記物の機能的断片)を含む組成物もまた提供する。
【００２０】
核酸合成の調節因子を同定する方法であって、プライマーオリゴヌクレオチドが鋳型核酸にハイブリダイズするのを可能にする条件下で、ヒトリボソームヌクレオチド配列を含む鋳型核酸、鋳型核酸ヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を有するプライマーオリゴヌクレオチド、伸長ヌクレオチド、ポリメラーゼ、および試験分子を接触させる段階、ならびにプライマー核酸の伸長によって合成された伸長プライマー産物の有無または量を検出する段階を含み、それによって、試験分子の非存在下よりも試験分子の存在下においてより少ない伸長プライマー産物が合成される場合に、試験分子が核酸合成の調節因子として同定される方法もまた本明細書に提供する。特定の態様において、本方法は、RNA合成の調節因子を同定すること、および特定の態様においては核小体RNA合成の調節因子を同定することに向けられる。鋳型核酸はDNAである場合もあればRNAである場合もあり、鋳型は本明細書に記載のリボソームヌクレオチド配列の任意の1つまたは複数を含み得る。ポリメラーゼは、DNAポリメラーゼである場合もあれば、RNAポリメラーゼである場合もある。
【００２１】
本明細書に記載の核酸を含む組成物もまた提供する。いくつかの態様において、組成物は、本明細書に記載のヒトrDNAまたはrRNAヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸を含む。いくつかの態様において、組成物は薬学的に許容される担体を含んでもよく、組成物は場合により核酸、および核酸中のヒトリボソームヌクレオチド配列に結合する(例えば、ヌクレオチド配列に特異的に結合する)化合物を含む。特定の態様において、化合物は、本明細書に記載する化合物のようなキノロン類似体である。
【００２２】
本明細書に記載の単離された核酸を含む細胞または動物もまた提供する。任意の適切な種類の細胞を用いることができ、場合により細胞は、組織培養で維持されるかまたは増殖させる細胞株である。単離された核酸は、研究動物(例えば、げっ歯類(例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ)、ネコ、イヌ、サル、または類人猿)などの動物の1つまたは複数の細胞に取り込まれ得る。
【００２３】
本明細書に記載のヒトリボソームヌクレオチド配列に結合する化合物を含む細胞もまた提供する。特定の態様においては、そのような細胞を含む動物を提供する。いくつかの態様において、化合物は核小体に局在する。特定の態様においては、H2AX、p53、chk1、p38 MAPK、およびchk2タンパク質の1つまたは複数がリン酸化され、場合によってはH2AX、p53、chk1、およびp38 MAPKタンパク質は実質的にリン酸化され、chk2タンパク質はリン酸化されない。いくつかの態様においては、JUNプロテインキナーゼ(JNK)がリン酸化される。特定の態様において、ヌクレオリンは核小体から核質に再分布する。
【００２４】
細胞におけるrRNA合成を阻害する方法であって、細胞におけるrRNA合成を減少させるのに十分な量の、rRNAまたはrDNAと相互作用する化合物と細胞を接触させる段階を含む方法もまた本明細書に提供する。そのような方法は、インビトロ、インビボ、および/またはエクスビボで行うことができる。したがって、いくつかのインビボ態様およびエクスビボ態様は、対象の細胞におけるrRNA合成を阻害する方法であって、rRNAまたはrDNAと相互作用する化合物を、それを必要とする対象に、対象の細胞におけるrRNA合成を減少させるのに十分な量投与する段階を含む方法に向けられる。いくつかの態様においては、細胞を1つまたは複数の化合物と接触させることができ、そのうちの1つまたは複数がrRNAまたはrDNAと相互作用する(例えば、一薬物または薬物および共薬物方法)。特定の態様において、化合物は、本明細書に記載のキノロン誘導体(例えば、化合物A-1またはB-1)のようなキノロン誘導体である。関連態様においては、細胞を、rRNAまたはrDNAと相互作用する化合物、および細胞に他の効果をもたらす1つまたは複数の共分子(例えば、共薬物)と接触させる。例えば、細胞増殖を減少させる、または組織炎症を軽減する共薬物が選択され得る。共薬物の非限定的な例を本明細書において後に提供する。
【００２５】
本明細書に記載のヒトリボソームヌクレオチド配列および/または構造に結合する化合物と細胞を接触させることによって細胞応答をもたらす方法もまた提供する。細胞応答は場合により、(a) H2AX、p53、chk1、JUNK、およびp38 MAPKタンパク質の実質的リン酸化；(b) ヌクレオリンの核小体から核質への再分布；(c) リソソームからのカテプシンDの放出；(d) アポトーシスの誘導；(e) 染色体ラダー化の誘導；(f) 細胞周期進行を停止させることのないアポトーシスの誘導；ならびに(g) アポトーシスの誘導および細胞周期停止の誘導(例えば、S期および/またはG1停止)である。
【００２６】
細胞周期進行を停止させることなくアポトーシスを誘導する方法であって、アポトーシスを誘導するのに有効な量の、本明細書に記載のヒトリボソームヌクレオチド配列および/または構造に結合する(例えば、特異的に結合する)化合物を細胞と接触させる段階を含む方法もまた本明細書に提供する。細胞周期進行を停止させることなくアポトーシスを誘導する方法であって、本明細書に記載のヒトリボソームヌクレオチド配列および/または構造に結合する(例えば、特異的に結合する)化合物を、それを必要とする対象に、アポトーシスを誘導するのに有効な量投与する段階を含む方法もまた提供する。対象は、げっ歯類(例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ)、ネコ、イヌ、有蹄動物、サル、類人猿、またはヒトであってもよく、化合物は、アポトーシスを誘導するために適切かつ簡便な任意の形態(例えば、経口、非経口、静脈内、経皮)で対象に投与することができる。そのような化合物の例は、式2Cまたは3Aのキノロン類似体である。特定の態様において、キノロン類似体は構造A-1を有する。細胞周期進行は多くの場合、周期の任意の1つの期で有意に停止しない。
【００２７】
アポトーシスを誘導し、かつ細胞周期進行を停止させる(例えば、S期細胞周期停止および/またはG1細胞周期停止)方法であって、アポトーシスを誘導するのに有効な量の、本明細書に記載のヒトリボソームヌクレオチド配列および/または構造に結合する(例えば、特異的に結合する)化合物を細胞と接触させる段階を含む方法もまた提供する。アポトーシスを誘導し、かつ細胞周期進行を停止させる(例えば、S期細胞周期停止および/またはG1細胞周期停止)方法であって、本明細書に記載のヒトリボソームヌクレオチド配列および/または構造に結合する(例えば、特異的に結合する)化合物を、それを必要とする対象に、アポトーシスを誘導するのに有効な量投与する段階を含む方法もまた提供する。対象は、げっ歯類(例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ)、ネコ、イヌ、有蹄動物、サル、類人猿、またはヒトであってもよく、化合物は、アポトーシスを誘導するために適切かつ簡便な任意の形態(例えば、経口、非経口、静脈内、経皮)で対象に投与することができる。そのような化合物の例は、式2Dのキノロン類似体である。特定の態様において、キノロン類似体は構造B-1を有する。細胞周期進行は多くの場合、1つの期で、および場合によっては2つの期で有意に停止する。
【００２８】
前記方法においては、場合により、化合物によって染色体DNAラダー化が誘導される。特定の態様において、細胞は膵臓細胞、結腸直腸細胞、腎細胞、およびバーキットリンパ腫細胞であり、前記物は対象において標的化される。
【００２９】
化合物が細胞または対象に対して毒性があるかどうかを決定する方法であって、細胞を化合物と接触させる段階、ならびにJNKタンパク質のリン酸化状態および任意でp38MAPKタンパク質のリン酸化状態を決定する段階を含み、それによって、JNKタンパク質のリン酸化レベルおよび任意でp38MAPKタンパク質のリン酸化レベルが、化合物と接触させていない細胞と比較して化合物と接触させた細胞において高い場合に、化合物が細胞または対象に対して毒性があると決定される方法もまた提供する。いくつかの態様において、毒性は炎症である。本方法は場合により、JNKタンパク質のリン酸化レベルおよび任意でp38MAPKタンパク質のリン酸化レベルを、化合物と接触させていない細胞に対して化合物と接触させた細胞において比較する段階を含み、場合によっては化合物で処理していない細胞においてあらかじめ決定されたJNKタンパク質のリン酸化レベルおよびまたはp38MAPKタンパク質のリン酸化レベルを、化合物で処理した細胞におけるリン酸化レベルと比較する。特定の態様において、JNKタンパク質はJNKタンパク質の特定のアイソフォームであり、p38MAPKタンパク質は特定のp38MAPKタンパク質アイソフォームである。JNKタンパク質またはp38MAPKタンパク質のリン酸化は、任意の簡便な様式で決定することができ、その例は本明細書に後述する。本方法を用いて、細胞または対象の細胞に対するキノロン化合物の毒性を決定することができ、キノロン化合物は本明細書に記載する式のキノロン化合物であり得る。
【００３０】
本発明を実施するための最良の形態
本明細書に記載のリボソーム核酸および関連した方法は、種々の応用において有用である。例えば、本明細書に記載のヌクレオチド配列は、相互作用分子をスクリーニングする(例えば、スクリーニングアッセイにおいて)ための標的となり得る。相互作用分子は、新規治療薬として、または新規治療薬の開発のために用いることができる。リボソーム核酸相互作用分子は、他の標的ヌクレオチド配列(例えば、標的スクリーニングアッセイ)または他の相互作用分子(例えば、競合スクリーニングアッセイ)を同定するための手段となり得る。ヌクレオチド配列またはその相補配列はアプタマーとして用いることもでき、またはアプタマーを作製するための基礎として役立ち得る。アプタマーは、治療薬として、または新規相互作用分子を同定するためのアッセイにおいて用いることができる。
【００３１】
核酸
本明細書に記載のrDNAもしくはrRNAヌクレオチド配列、または実質的に同一なその変種を有する単離されたリボソーム核酸を本明細書に提供する。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列は、28S、18S、もしくは5.8S rRNAヒトヌクレオチド配列、または実質的に同一なその変種を含むか、またはその一部である。ヌクレオチド配列は場合により、SEQ ID NO:1もしくは実質的に同一なその変種を含むか、またはその一部である。「リボソーム核酸」または「リボソームヌクレオチド配列」には、ヒトrRNAヌクレオチド配列、ヒトrDNAヌクレオチド配列、またはヒトrRNA前駆体ヌクレオチドが含まれてもよく、場合によっては前記物の実質的に同一な変種である。
【００３２】
核酸は、一本鎖、二本鎖、三重鎖、直線状、または環状であってもよい。核酸はRNAである場合もあればDNAである場合もあり、前記物の1つまたは複数のヌクレオチド誘導体または類似体(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上の類似体または誘導体ヌクレオチド)を含んでもよい。いくつかの態様において、核酸は全体的に1つまたは複数の類似体または誘導体ヌクレオチドから構成され、場合によって核酸は、約50%もしくはそれ未満、約25%もしくはそれ未満、約10%もしくはそれ未満、または約5%もしくはそれ未満の、類似体または誘導体ヌクレオチド塩基から構成される。類似体または誘導体核酸中の1つまたは複数のヌクレオチドは、RNAまたはDNAヌクレオチドと比較して、リボースまたはリン酸修飾(例えば、リボースペプチド核酸(PNA)またはホスホチオエート結合)などの核酸塩基修飾または骨格修飾を含んでもよい。ヌクレオチド類似体および誘導体は当業者に公知であり、そのような修飾の非限定的な例は、米国特許第6,455,308号(Freier et al.)；米国特許第4,469,863号；第5,536,821号；第5,541,306号；第5,637,683号；第5,637,684号；第5,700,922号；第5,717,083号；第5,719,262号；第5,739,308号；第5,773,601号；第5,886,165号；第5,929,226号；第5,977,296号；第6,140,482；ならびにWIPO公報 WO 00/56746およびWO 01/14398に記載されている。そのような類似体または誘導体を含む核酸を合成する方法は、例えば上記の特許公報、ならびに米国特許第6,455,308号；第5,614,622号；第5,739,314号；第5,955,599号；第5,962,674号；第6,117,992号；およびWO 00/75372に開示されている。
【００３３】
核酸またはその中のリボソームヌクレオチド配列は、場合により約8〜約80ヌクレオチド長、場合により約8〜約50ヌクレオチド長、および場合により約10〜約30ヌクレオチド長である。いくつかの態様において、核酸またはその中のリボソームヌクレオチド配列は、場合により約500ヌクレオチド長もしくはそれ未満、約400ヌクレオチド長もしくはそれ未満、約300ヌクレオチド長もしくはそれ未満、約200ヌクレオチド長もしくはそれ未満、約150ヌクレオチド長もしくはそれ未満、約100ヌクレオチド長もしくはそれ未満、約90ヌクレオチド長もしくはそれ未満、約80ヌクレオチド長もしくはそれ未満、約70ヌクレオチド長もしくはそれ未満、約60ヌクレオチド長もしくはそれ未満、または約50ヌクレオチド長もしくはそれ未満であり、場合により約40ヌクレオチド長もしくはそれ未満、約35ヌクレオチド長もしくはそれ未満、約30ヌクレオチド長もしくはそれ未満、約25ヌクレオチド長もしくはそれ未満、約20ヌクレオチド長もしくはそれ未満、または約15ヌクレオチド長もしくはそれ未満である。核酸は場合により、プラスミド形態である態様などにおいて前記の長さよりも大きく、特定の態様においては、約600、約700、約800、約900、約1000、約1100、約1200、約1300、または約1400塩基対長もしくはそれ以上である。
【００３４】
本明細書に記載の核酸は多くの場合に単離されている。本明細書で用いる「単離された」という用語は、当初の環境(例えば、天然物である場合は天然環境、または外因的に発現される場合は宿主細胞)から取り出された物質を指し、当初の環境中の他の物質から精製されている場合が多く、したがってその当初の環境から「人為的に」改変されている。分子に関して本明細書で用いる「精製された」という用語は、絶対純度を指すものではない。むしろ、「精製された」とは、由来元の試料と比較して、関心対象の物質以外の同じ種類(例えば、核酸またはタンパク質種)の物質種をより少なく含む組成物中の物質を指す。「精製された」という用語は、由来元の試料と比較して、関心対象の核酸以外の核酸種をより少なく含む組成物中の物質を指す。場合により核酸は「実質的に純粋」であり、これは、核酸が組成物の質量に基づいて核酸の少なくとも50%を表すことを意味する。多くの場合、実質的に純粋な核酸は組成物の質量に基づいて少なくとも75%純粋であり、場合によっては組成物の質量に基づいて少なくとも95%純粋である。核酸は生物学的供給源から精製してもよく、および/または製造してもよい。核酸の製造工程(例えば、化学合成および組換えDNA工程)および精製工程は、当業者に公知である。例えば、Applied Biosystems(カリフォルニア州、フォスターシティー)から入手可能なABI(商標) 3900 High Throughput DNA Synthesizerを使用するなど、標準的な方法および機器を用いて、合成オリゴヌクレオチドを合成することができる。
【００３５】
上記の通り、核酸は、本明細書に記載のヌクレオチド配列の実質的に同一な配列変種を含んでもよい。本明細書で用いる「実質的に同一な変種」という用語は、記載のリボソームヌクレオチド配列と配列同一性を共有するヌクレオチド配列を指す。本明細書に記載のリボソームヌクレオチド配列と、55%もしくはそれ以上、60%もしくはそれ以上、65%もしくはそれ以上、70%もしくはそれ以上、75%もしくはそれ以上、80%もしくはそれ以上、85%もしくはそれ以上、90%もしくはそれ以上、91%もしくはそれ以上、92%もしくはそれ以上、93%もしくはそれ以上、94%もしくはそれ以上、95%もしくはそれ以上、96%もしくはそれ以上、97%もしくはそれ以上、98%もしくはそれ以上、または99%もしくはそれ以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列が含まれる。特定の態様において、実質的に同一な変種は、本明細書に記載のリボソームヌクレオチド配列と91%またはそれ以上同一である。2つのヌクレオチド配列が実質的に同一であるかどうかを決定するための1つの試験は、共有される同一ヌクレオチド配列の割合を決定することである。
【００３６】
配列同一性の計算は以下のように行うことができる。最適に比較できるように配列を整列させる(例えば、最適なアライメントのために、第1アミノ酸および第2アミノ酸または核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、また比較のために非相同配列を無視することができる)。比較目的で整列させる参照配列の長さは、場合により参照配列の長さの30%もしくはそれ以上、40%もしくはそれ以上、50%もしくはそれ以上、多くの場合には60%もしくはそれ以上、より多くの場合には70%もしくはそれ以上、80%もしくはそれ以上、90%もしくはそれ以上、または100%である。次いで、対応するヌクレオチド位置またはポリペプチド位置のヌクレオチドまたはアミノ酸をそれぞれ、2つの配列間で比較する。第1配列中の位置が、第2配列中の対応する位置と同じヌクレオチドまたはアミノ酸によって占有されている場合、ヌクレオチドまたはアミノ酸はその位置において同一であると見なされる。2つの配列間のパーセント同一性は、2つの配列の最適なアライメントのために導入されるギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、配列によって共有される同一位置の数の関数である。配列の比較および2つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成し得る。2つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれているMeyers & Miller, CABIOS 4: 11-17 (1989)のアルゴリズムを使用して、PAM120荷重残基表(weight residue table)、ギャップ長ペナルティ(gap length penalty)12、およびギャップペナルティ4を用いて決定され得る。また、2つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、GCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムに組み込まれているNeedleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)のアルゴリズムを使用して(httpアドレスwww.gcg.comで利用可能)、Blossum 62行列またはPAM250行列、ならびにギャップ荷重(gap weight)16、14、12、10、8、6、または4、および長さ荷重(length weight)1、2、3、4、5、または6を用いて決定され得る。2つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、GCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムを用いて(httpアドレスwww.gcg.comで利用可能)、NWSgapdna.CMP行列、ならびにギャップ荷重40、50、60、70、または80および長さ荷重1、2、3、4、5、または6を用いて決定され得る。多くの場合に用いられるパラメータセットは、ギャップオープンペナルティ12、ギャップ伸長ペナルティ(gap extend penalty)4、およびフレームシフトギャップペナルティ5によるBlossum 62スコアリング行列である。
【００３７】
2つの核酸が実質的に同一であるかどうかを決定するための別の様式は、ストリンジェントな条件下で、一方の核酸に相同的なポリヌクレオチドがもう一方の核酸にハイブリダイズするかどうかを評価することである。本明細書で用いる「ストリンジェントな条件」という用語は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を指す。ストリンジェントな条件は当業者に公知であり、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 6.3.1-6.3.6 (1989)に見出すことができる。この参考文献には水性および非水性方法が記載されているが、どちらも使用できる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、約45℃での6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中でのハイブリダイゼーション、およびその後の50℃での0.2× SSC、0.1% SDS中での1回または複数回の洗浄である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の別の例は、約45℃での6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中でのハイブリダイゼーション、およびその後の55℃での0.2× SSC、0.1% SDS中での1回または複数回の洗浄である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のさらなる例は、約45℃での6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中でのハイブリダイゼーション、およびその後の60℃での0.2× SSC、0.1% SDS中での1回または複数回の洗浄である。多くの場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約45℃での6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中でのハイブリダイゼーション、およびその後の65℃での0.2× SSC、0.1% SDS中での1回または複数回の洗浄である。より多くの場合、ストリンジェンシー条件は、65℃での0.5 Mリン酸ナトリウム、7% SDS、およびその後の65℃での0.2× SSC、0.1% SDSでの1回または複数回の洗浄である。
【００３８】
本明細書に記載の特定のリボソームヌクレオチド配列は、例えば他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定する目的で公的データベースに対して検索を行うための「問い合わせ配列」として用いることができる。問い合わせ配列を用いて、ヒト以外の生物(例えば、類人猿、げっ歯類(例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット)、有蹄動物(例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ)、爬虫類、両生類、および鳥類)における実質的に同一な配列を検索することができる。そのような検索は、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10 (1990)のNBLASTおよびXBLASTプログラム(バージョン2.0)を用いて行うことができる。本明細書に記載のリボソームヌクレオチド配列と相同的なヌクレオチド配列を得るためには、NBLASTプログラム、スコア＝100、ワード長＝12を用いてBLASTヌクレオチド検索を行うことができる。SEQ ID NO:1、2、3、6、7、8、13、15、17、19、21、22、23、26、または28によってコードされるアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を得るためには、XBLASTプログラム、スコア＝50、ワード長＝3を用いてBLASTポリペプチド検索を行うことができる。比較目的でギャップの入ったアラインメントを得るためには、Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402 (1997)に記載されているように、Gapped BLASTを用いることができる。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを用いる場合、それぞれのプログラム(例えば、XBLASTおよびNBLAST)の初期設定パラメータを用いることができる(httpアドレスwww.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい）。
【００３９】
特定の態様において、リボソームヌクレオチド配列は以下の配列の1つまたは複数を含まない：
2009504192.tif 000020
。
特定の態様において、リボソームヌクレオチド配列は以下の配列の1つまたは複数を含まない：
2009504192.tif 000021
。
【００４０】
いくつかの態様において、単離された核酸は、本明細書に記載のヌクレオチド配列をコードするヌクレオチド配列を含み得る。他の態様において、核酸は、本明細書に記載のヌクレオチド配列の相補体をコードするヌクレオチド配列を含む。例えば、本明細書に記載のリボソーム配列、または本明細書に記載のリボソームヌクレオチド配列に相補的な配列は、核酸のより長いヌクレオチド配列内に含まれ得る。コードされるヌクレオチド配列は場合により、本明細書において「アプタマー」と称され、スクリーニング法において、または治療薬として用いることができる。特定の態様において、アプタマーは本明細書におけるヌクレオチド配列に相補的であり、標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズし得る。ハイブリダイズしたアプタマーは、例えば、標的相補的ヌクレオチド配列と二重鎖または三重鎖を形成し得る。アプタマーは、インビトロ系またはインビボ系においてコード配列によって合成され得る。インビトロで合成する場合、アプタマーは場合により類似体または誘導体ヌクレオチドを含む。インビボで合成する場合、コード配列はその系のゲノムDNA中に組み込まれてもよいし、またはゲノムから自律的に複製してもよい(例えば、プラスミド核酸内で)。アプタマーは場合により、特定のタンパク質または核酸標的に対する結合またはハイブリダイゼーション親和性の尺度によって選択される。特定の態様において、アプタマーは細胞内または血漿内の1つまたは複数のタンパク質分子に結合し、治療応答を誘導するか、またはタンパク質の存在を検出するための方法として用いることができる。
【００４１】
特定の態様において、単離された核酸中のヒトリボソームヌクレオチド配列は、ヒトリボソームヌクレオチド配列またはその相補体の以下の領域の1つに由来する：(a) rDNA(例えば、SEQ ID NO:1)の5'ETS領域、ITS1領域、ITS2領域、28S rRNAコード領域、3'ETS領域、18S rRNAコード領域、もしくは5.8S rRNAコード領域；(b) (a)の相補体；(c) (a)のコード化RNA；または(d) (b)のコード化RNA。SEQ ID NO:1において、5'ETS領域は約1位〜約3656位にわたり；ITS1領域は約5528位〜約6622位にわたり；ITS2領域は約6780位〜約7934位にわたり、28S rRNAコード領域は約7935位〜約12969位にわたり、3'ETS領域は約12970位〜約13350位にわたり、18S rRNAコード領域は約3657位〜約5527位にわたり；および5.8 S rRNAコード領域は約6623位〜約6779位にわたる。特定の態様において、単離された核酸中のリボソームヌクレオチド配列は、(a) rDNA(例えば、SEQ ID NO:1)の5'ETS領域、ITS1領域、ITS2領域、28S rRNAコード領域、もしくは3'ETS領域；(b) (a)の相補体；(c) (a)のコード化RNA；または(d) (b)のコード化RNA、に由来する。
【００４２】
単離された核酸は、四重鎖構造の形成を可能にし、かつ場合によりその構造を安定化する条件下で、他の分子と共に提供され得るか、または他の分子と接触させることができる。本明細書で用いる「四重鎖構造」という用語は、1つまたは複数のグアニンテトラッド(guanine-tetrad)(Gテトラッド(G-tetrad))構造またはシトシンテトラッド(cytosine-tetrad)構造(Cテトラッド(C-tetrad)または「iモチーフ」)を含む核酸内の構造を指す。Gテトラッドは、フーグスティーン(Hoogsteen)水素結合を介して四重鎖構造内に形成され得る。四重鎖構造は、分子間(すなわち、2つ、3つ、4つ、またはそれ以上の別個の核酸間で形成される)であってもよいし、または分子内(すなわち、単一の核酸内で形成される)であってもよい。いくつかの態様において、四重鎖形成核酸は、4本の平行な鎖を有する平行型四重鎖構造(例えば、プロペラ型構造)、2本の平行な鎖に対して逆平行である2本の鎖を有する逆平行型四重鎖構造(例えば、イス型四重鎖構造またはかご型四重鎖構造)、または3本の平行な鎖に対して逆平行である1本の鎖を有する「混合平行型(mixed parallel)」とも称される部分的平行型四重鎖構造(例えば、イス-プロペラ型(chair-eller)またはかご-プロペラ型(basket-eller)四重鎖構造)を形成し得る。そのような構造は、例えば、米国特許出願公開第2004/0005601号およびPCT出願 PCT/US2004/037789に記載されている。1つまたは複数の四重鎖構造が核酸内で形成されてもよく、また核酸中の1つのまたは複数の領域で形成されてもよい。核酸の長さに応じて、核酸全体が四重鎖構造を形成することも可能であるが、核酸の一部が部分的四重鎖構造を形成する場合が多い。核酸配列またはサブ配列がとる特定の四重鎖高次構造(例えば、平行型、逆平行型、混合平行型)を決定するための種々の方法が公知であり、本明細書に記載される(例えば、円二色性)。
【００４３】
四重鎖の形成および安定化を可能にする条件は当業者に公知であり、最適な四重鎖形成条件を試験することができる。イオン型、イオン濃度、対陰イオン型、およびインキュベーション時間を変更することができ、当業者は、本明細書に記載する方法を用いることによって、所与の条件セットに関して四重鎖高次構造が形成されるかどうか、および安定化されるかどうかを日常的に決定することができる。例えば、陽イオン(例えば、カリウムなどの一価陽イオン)は四重鎖構造を安定化し得る。例えば約5分、約10分、約20分、約30分、約40分、約50分、または約60分もしくはそれ以上といった特定の時間にわたり、イオンを含む溶液中で核酸を接触させることができる。四重鎖構造が溶液中で機能的な四重鎖を形成し得る場合、または四重鎖構造が溶液中で検出され得る場合に、四重鎖構造は安定化される。
【００４４】
1つの核酸配列は異なる四重鎖配向性をもたらすことができ、異なる高次構造は、核酸のヌクレオチド配列、ならびに系中に存在するカリウムイオンの濃度および四重鎖を形成させる時間など、それらが形成される際の条件に一部依存する。複数の高次構造が相互に平衡状態になる場合があり、系中に相補鎖が存在する場合には二重鎖核酸と平衡状態になり得る。平衡は、支持される高次構造がもう一方の高次構造または残りの高次構造よりも高濃度または高比率で存在するように、一方の高次構造が別の高次構造よりも支持されるよう移行し得る。本明細書で用いる「支持する」または「安定化する」という用語は、1つの高次構造が残りの高次構造と比較してより高濃度または高比率で存在することを指す。本明細書で用いる「妨げる」または「不安定化する」という用語は、1つの高次構造がより低い濃度で存在することを指す。一方の高次構造がもう一方の高次構造(例えば、別の四重鎖高次構造、別の並行高次構造、または二重鎖高次構造)に関して50%もしくはそれ以上、75%もしくはそれ以上、または80%もしくはそれ以上、または90%もしくはそれ以上の割合で系中に存在する場合に、一方の高次構造はもう一方の高次構造よりも支持され得る。逆に、一方の高次構造がもう一方の高次構造に関して50%もしくはそれ未満、25%もしくはそれ未満、または20%もしくはそれ未満、および10%もしくはそれ未満の割合で系中に存在する場合、一方の高次構造は妨げられ得る。
【００４５】
本明細書に記載の方法により、一方の四重鎖形態がもう一方の形態よりも支持されるよう平衡を移行させることができる。核酸中の四重鎖形成領域は、種々の様式で改変することができる。改変は、1つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換によって起こり得る。置換は、Gテトラッドに関与するグアニンなどの核酸の単一ヌクレオチド置換を含むことができ、ここで四重鎖核酸中のそのようなグアニンの1つ、2つ、3つ、もしくは4つまたはそれ以上を置換してもよい。同様に、Gテトラッドに関与するグアニン近傍の1つもしくは複数のヌクレオチドを欠失させるかもしくは置換することも可能であり、または1つもしくは複数のヌクレオチドを挿入することも可能である(例えば、Gテトラッドに関与するグアニンの1つ、2つ、3つ、または4つのヌクレオチド内に)。ヌクレオチドは、例えばヌクレオチド類似体と、または別のDNAもしくはRNAヌクレオチドと(例えば、グアニンのアデニン、シトシン、またはチミンとの置換)置換することができる。イオン濃度および四重鎖DNAを特定のイオンと接触させる時間は、もう一方の高次構造よりも一方の高次構造を支持し得る。特定の四重鎖高次構造に関して選択するために、イオン型、対イオン型、イオン濃度、およびインキュベーション時間を変更することができる。加えて、四重鎖DNAと相互作用する化合物も一方をもう一方よりも支持し得り、よって特定の形態を安定化し得る。
【００４６】
核酸内で四重鎖構造が形成されるかどうかを決定するための標準的な手順は、当業者に公知である。同様に、当業者に公知の標準的手順を用いて、異なる四重鎖高次構造を相互に別々に同定することができる。例えばポリメラーゼ停止および円二色性により四重鎖形成を特徴づけるようなそのような方法の例は、実施例の項において後述する。
【００４７】
リボソームヌクレオチド配列相互作用分子の同定
本明細書に記載のリボソーム核酸と相互作用する物質を同定する方法を提供する。1つのまたは複数のリボソーム核酸、および1つまたは複数の試験分子などのアッセイ成分を接触させ、相互作用の有無を観察する。アッセイ成分は、当業者により任意の簡便な形式および系で接触させることができる。本明細書で用いる「系」という用語は、これらに限定されないが、マイクロタイタープレート(例えば、96ウェルまたは384ウェルプレート)、チップ上に固定化され、かつ任意にアレイ中に配置された分子を有するシリコンチップ(例えば、米国特許第6,261,776号、およびFodor, Nature 364: 555-556 (1993)を参照されたい)、マイクロ流体装置(例えば、米国特許第6,440,722号；第6,429,025号；第6,379,974号；および第6,316,781号を参照されたい)、および細胞培養容器を含む、アッセイ成分を受容する環境を指す。系は、シグナル検出器、ロボットプラットホーム、ピペットディスペンサー、および顕微鏡などの付帯装置を含み得る。系は無細胞である場合もあれば、1つまたは複数の細胞を含む場合もあり、場合によっては動物由来の細胞試料を含むかまたはそのような細胞試料であり(例えば、生検試料、臓器、付属器)、場合によっては非ヒト動物である。細胞は、例えばマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、モルモット、有蹄動物(例えば、ウマ、ウシ、ブタ)、サル、類人猿、またはヒト対象などの任意の適切な対象から抽出され得る。
【００４８】
当業者は、使用する系、ならびにモニターする相互作用および/または生物活性パラメータに基づいて、試験分子および試験条件を選択することができる。本明細書に記載する任意の試薬を含む任意の種類の試験分子を用いることができ、試験分子は、例えば化合物、抗体および抗体断片、結合パートナーおよび断片、ならびに核酸分子から選択され得る。そのような分子の各種類の特定の態様は、本明細書に後述する。リボソーム核酸相互作用分子を同定するためのアッセイにおいて、1つまたは複数の試験分子を系に添加することができる。試験分子および他の成分は、任意の適切な順で系に添加することができる。相互作用または生物活性の任意の変化を観察および/または定量化できるように、多くの場合、特定の条件または試験分子に曝露した試料を、その条件または試験分子に曝露していない試料と比較する。
【００４９】
アッセイ系は場合により、ヘテロジニアスまたはホモジニアスである。ヘテロジニアスアッセイでは、1つまたは複数の試薬および/またはアッセイ成分を固相上に固定化し、反応の終了時に固相上で複合体を検出する。ホモジニアスアッセイでは、反応全体を液相中で行う。いずれのアプローチにおいても、反応物質を添加する順序は、試験する分子に関して異なる情報が得られるように変更することができる。例えば、標的分子/結合パートナー相互作用を作動させる試験化合物は、競合形式で試験分子の存在下で反応を行うことによって同定することができる。または、予め形成された複合体を作動させる試験分子、例えば複合体から成分の1つを置換する、より高い結合定数を有する分子は、複合体が形成された後に試験化合物を反応混合物に添加することによって試験することができる。
【００５０】
ヘテロジニアスアッセイ態様では、1つまたは複数のアッセイ成分を固体表面(例えば、マイクロタイタープレート)に係留し、多くの場合、非係留成分を直接または間接的に標識する。ヘテロジニアスアッセイ態様では、1つまたは複数のアッセイ成分を固体支持体に固定化することができる。成分と固体支持体との付着は、共有結合であっても非共有的であってもよい(非共有結合的付着に関しては、例えば米国特許第6,022,688号を参照されたい)。本明細書で用いる「固体支持体」または「固相」という用語は、固体、半固体、ゲル、フィルム、膜、メッシュ、フェルト、複合物、粒子などを含む多種多様な物質を指す。適切な固相には、固相結合アッセイにおける固相として開発されたおよび/または用いられるものが含まれる(例えば、米国特許第6,261,776号；第5,900,481号；第6,133,436号；および第6,022,688号；WIPO公報 WO 01/18234；Immunoassay, E. P. Diamandis and T. K. Christopoulos eds., Academic Press: New York, 1996の第9章；Leon et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 8: 2997 (1998)；Kessler et al., Agnew. Chem. Int. Ed. 40: 165 (2001)；Smith et al., J. Comb. Med. 1: 326 (1999)；Orain et al., Tetrahedron Lett. 42: 515 (2001)；Papanikos et al., J. Am. Chem. Soc. 123: 2176 (2001)；Gottschling et al., Bioorg. And Medicinal Chem. Lett. 11: 2997 (2001))。適切な固相の例には、分子を捕捉するために当業者によって用いられ得る膜フィルター、セルロースベースの紙、ビーズ(ポリマー、ラテックス、および常磁性粒子を含む)、ガラス(例えば、スライドガラス)、フッ化ビニリデン樹脂(PVDF)、ナイロン、シリコンウエハー、マイクロチップ、微粒子、ナノ粒子、クロマトグラフィー支持体、TentaGel、AgroGel、PEGAゲル、SPOCCゲル、マルチウェルプレート(例えば、マイクロタイタープレート)、ナノチューブなどが含まれる。固相は、非多孔性であってもよいし多孔性であってもよい。アッセイ成分は、アレイ中の固相上に配置されてもよい。したがって、規則正しいアレイ中の固相上の個々の位置に固定化された、1つまたはそれ以上、2つまたはそれ以上、3つまたはそれ以上といった本明細書に記載のアッセイ成分(例えば、リボソーム核酸)を含むアレイを提供する。そのようなアレイは場合により、各スポットが平方センチメートル当たり少なくとも100分子を含むアレイのような高密度アレイである。
【００５１】
特定のヘテロジニアスアッセイ態様では、場合により、固定化種のパートナーを、試験分子と共にまたは試験分子の非存在下で被覆表面に曝露する。反応が完了した後、形成された任意の複合体のかなりの部分が固体表面上に固定化されたまま残るように、未反応の成分を除去する(例えば、洗浄によって)。非固定化種が前標識されている場合には、表面上に固定化された標識が検出されることが複合体の形成を示す。非固定化種が前標識されていない場合には、間接的標識を用いて、表面に係留された複合体を検出することができる(例えば、最初の非固定化種に特異的な標識抗体を用いて)。反応成分を添加する順序に応じて、複合体形成を阻害する、または予め形成された複合体を破壊する、試験化合物を検出することができる。
【００５２】
特定の態様においては、タンパク質もしくはペプチド試験分子またはアッセイ成分を、ファージコートタンパク質を介してファージに連結する。ファージに連結されたタンパク質またはペプチドと相互作用し得る分子を固相に固定化し、固定化成分と相互作用するタンパク質またはペプチドを提示するファージを固体支持体に付着させる。次いで、付着したファージの核酸を単離し、配列決定して、固相上に固定化された成分と相互作用するタンパク質またはペプチドの配列を決定する。多種多様なペプチドまたはタンパク質をバクテリオファージコートタンパク質との融合物として提示させる方法は、周知である(Scott and Smith, Science 249: 386-390 (1990)；Devlin, Science 249: 404-406 (1990)；Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 6378-6382 (1990)；Felici, J. Mol. Biol. 222: 301-310 (1991))。試験ポリペプチドをファージコートタンパク質のN末端またはC末端に連結する方法もまた利用できる。最初のファージディスプレイシステムは、例えば米国特許第5,096,815号および第5,198,346号に開示されている。この系は直線状ファージM13を使用し、これはクローニングされたタンパク質が大腸菌(E. coli)において産生されることを必要とし、かつクローニングされたタンパク質が大腸菌内膜を越えて移行することを必要とした。λ、T4、およびT7などの溶菌性バクテリオファージベクターは、大腸菌の分泌に依存しないため、より実用的である。T7は市販されており、米国特許第5,223,409号；第5,403,484号；第5,571,698号；および第5,766,905号に記載されている。
【００５３】
ヘテロジニアスアッセイ態様では、反応は試験分子の存在下または非存在下において液相中で行うことができ、反応産物を未反応成分から分離し、複合体を検出する(例えば、溶液中で形成された任意の複合体を係留するための結合成分の1つに特異的な固定化抗体、および係留された複合体を検出するためのもう一方のパートナーに特異的な標識抗体を用いる)。この場合も同様に、反応物質を液相に添加する順序に応じて、複合体を阻害する、または予め形成された複合体を破壊する試験化合物を同定することができる。
【００５４】
いくつかのホモジニアスアッセイ態様においては、試薬および/または他の成分を含む予め形成された複合体を調製する。複合体中の1つまたは複数の成分(例えば、リボソーム核酸、ヌクレオリンタンパク質、または核酸結合化合物)を標識する。いくつかの態様においては、標識によって生じるシグナルが複合体形成により消される(例えば、このアプローチを免疫測定法に利用する米国特許第4,109,496号)。予め形成された複合体の種の1つと競合する、およびこれを置換する試験分子を添加すると、バックグラウンドを超えるシグナルの発生またはシグナルの減少が起こり得る。このようにして、リボソーム核酸/試験分子複合体を破壊する試験物質を同定することができる。
【００５５】
リボソーム核酸を含む複合体の形成を阻止するまたは作動させる試験分子を同定する態様においては、複合体の成分を含む反応混合物を、複合体形成を可能にするのに十分な条件および時間で調製する。反応混合物は多くの場合、試験分子の存在下または非存在下で提供される。試験分子は、反応混合物中に最初から含めることができ、または標的分子およびその結合パートナーを添加した後に添加することができる。対照反応混合物は、試験分子なしでまたは偽薬と共にインキュベートする。任意の複合体の形成を検出する。対照反応混合物と比較して、試験分子を含む反応混合物中の複合体形成が減少することにより、分子が複合体形成を阻止することが示される。または、対照反応混合物と比較して、試験分子を含む反応混合物中の複合体形成が増加することにより、分子が標的分子/結合パートナー形成を作動させることが示される。特定の態様においては、リボソーム核酸/相互作用分子の複合体形成を、修飾リボソーム核酸/相互作用分子(例えば、リボソーム核酸中のヌクレオチド置換)の複合体形成と比較することができる。そのような比較は、修飾核酸の相互作用は調節するが、被修飾核酸の相互作用は調節しない試験分子を同定することを所望する場合に有用であり得る。
【００５６】
いくつかの態様において、当業者は、アッセイ成分間(例えば、リボソーム核酸と試験分子)の相互作用の有無を検出する。本明細書で用いる「相互作用」という用語は、典型的に、特定の系の成分が相互に可逆的に結合することを指し、そのような相互作用は定量化することができる。分子は、系において他の分子と比較してある程度の特性で標的に結合する場合に、標的に「特異的に結合」し得る(例えば、分子の約75%〜約95%またはそれ以上が系において標的に結合する)。多くの場合、結合親和性は、試薬、反応物質、または系の他の成分の濃度または量の範囲の関数としてシグナル強度をプロットすることによって定量化される。定量化された相互作用は、最大シグナルの50%であるシグナルの放出に必要な試薬の濃度または量(IC50)に換算して表すことができる。同様に、定量化された相互作用は、当技術分野において公知の速度論的方法を用いて解離定数(KdまたはKi)として表すことができる。系における相互作用特性を表す速度論的パラメータを評価することができ、これには例えば、Km、kcat、kon、および/またはkoffパラメータの評価が含まれる。
【００５７】
種々のシグナルを検出して、相互作用の有無または量を検出することができる。検出される1つまたは複数のシグナルは、場合により、1つまたは複数のアッセイ成分に連結された1つまたは複数の検出可能な標識から放出される。いくつかの態様においては、1つまたは複数のアッセイ成分を検出可能な標識に連結させる。検出可能な標識は、アッセイ成分に共有結合させることができるか、または非共有結合で成分と結合させてもよい。非共有結合は結合対によって生じ得るが、この場合、一方の結合対メンバーがアッセイ成分と結合しており、もう一方の結合対メンバーが検出可能な標識と結合している。これらに限定されないが、抗体/抗原、抗体/抗体、抗体/抗体断片、抗体/抗体受容体、抗体/プロテインAまたはプロテインG、ハプテン/抗ハプテン、ビオチン/アビジン、ビオチン/ストレプトアビジン、葉酸/葉酸結合タンパク質、ビタミンB12/内因子、核酸/相補的核酸(例えば、DNA、RNA、PNA)を含む、任意の適切な結合対を用いて、非共有結合をもたらすことができる。共有結合も同様に、化学反応基/相補的化学反応基(例えば、スルフヒドリル/マレイミド、スルフヒドリル/ハロアセチル誘導体、アミン/イソトリオシアネート、アミン/スクシンイミジルエステル、およびアミン/ハロゲン化スルホニル)などの結合対によって生じ得る。そのような結合対を試薬に付着させ、結合をもたらす方法は、当業者に公知である。
【００５８】
当業者は、相互作用の検出に適した任意の検出可能な標識を適切に選択し、用いることができる。検出可能な標識の例には、フルオレセイン、ローダミン、およびその他(例えば、Anantha, et al., Biochemistry (1998) 37:2709 2714；およびQu & Chaires, Methods  Enzymol. (2000) 321:353 369)などの蛍光標識；放射性同位体(例えば、125I、131I、35S、31P、32P、14C、3H、7Be、28Mg、57Co、65Zn、67Cu、68Ge、82Sr、83Rb、95Tc、96Tc、103Pd、109Cd、および127Xe)；光散乱標識(例えば、米国特許第6,214,560号、およびGenicon Sciences Corporation、カリフォルニア州から市販されている)；化学発光標識および酵素基質(例えば、ジオキセタンおよびアクリジニウムエステル)、酵素またはタンパク質標識(例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)またはそれらの色変種、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ)；他の発色標識または色素(例えば、シアニン)、ならびに以前に記載されている標識がある。
【００５９】
蛍光シグナルは一般に、特定の励起波長でフルオロフォアを励起させ、次いで異なる発光波長でフルオロフォアによって発せられる蛍光を検出することによって、アッセイにおいてモニターする。多くの核酸相互作用フルオロフォアおよびそれらに付随する励起および発光波長が公知である(例えば、上記のもの)。蛍光検出機を用いるなどして、蛍光シグナルを検出する標準的な方法もまた公知である。シグナル対ノイズ比を増強し得る光子減少剤(例えば、米国特許第6,221,612号を参照されたい)を添加することによって、系においてバックグラウンド蛍光を減少させることも可能である。
【００６０】
検出可能な別のシグナルは、固体光学表面での屈折率の変化であり、変化は、光学表面の近傍または光学表面における屈折率増大分子の結合または放出によって起こる。光学表面の屈折率変化を測定するこれらの方法は、表面プラズモン共鳴(SPR)に基づく。SPRは、光学的に透明な物質(例えば、ガラス)と金属薄膜(例えば、銀または金)との界面からの特定の角度で反射される光強度の低下として観察される。SPRは、金属表面近くの媒体(例えば、試料溶液)の屈折率に依存する。表面近くでの物質の吸着または結合などによる金属表面での屈折率の変化により、SPRが起こる角度に対応する変化が生じる。SPRシグナルおよびその使用は、米国特許第5,641,640号；第5,955,729号；第6,127,183号；第6,143,574号；および第6,207,381号、ならびにWIPO公報 WO 90/05295でさらに例証されており、SPRシグナルを測定するための装置は市販されている(Biacore, Inc.、ニュージャージー州、ピスカタウェイ)。特定の態様においては、アッセイ成分を、光学的に透明な物質および金属薄膜を有するチップにリンカーを介して結合することができ、試薬間の、および/または試薬との相互作用を屈折率の変化によって検出することができる。特定の態様においてSPR解析のためにチップに連結されるアッセイ成分は、例えば、(1) 場合により四重鎖形成配列を含むrDNAもしくはrRNAサブ配列、(2) ｒDNAもしくはrRNA結合タンパク質(例えば、ヌクレオリン)、または(3) rDNAもしくはrRNA結合分子(例えば、化合物A-1)であり得る。
【００６１】
NMRスペクトル移動(例えば、Arthanari & Bolton, Anti-Cancer Drug Design 14: 317-326 (1999))、質量スペクトルシグナルおよび蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)シグナル(例えば、Lakowicz et al.、米国特許第5,631,169号；Stavrianopoulos et al. 米国特許第4,868,103号)などの、構造を表す他のシグナルもまた検出が可能である。FRETアプローチでは、第1「ドナー」分子上のフルオロフォア標識の発した蛍光エネルギーが、第2「アクセプター」分子上の蛍光標識によって吸収され、次いで吸収されたエネルギーに起因して蛍光が発せられ得るように、フルオロフォア標識を選択する。または、「ドナー」ポリペプチド分子が、単にトリプトファン残基の天然の蛍光エネルギーを利用してもよい。「アクセプター」分子標識が「ドナー」分子標識と識別され得るように、異なる波長の光を発する標識を選択する。標識間のエネルギー移動の効率は分子を隔てる距離に関連しているため、分子間の空間関係を評価することができる。分子間で結合が起こる状況において、アッセイにおける「アクセプター」分子標識の蛍光発光は最大となるはずである。FRET結合事象は、周知の標準的な蛍光検出手段を用いて(例えば、蛍光光度計を用いて)簡便に測定することができる。FRETに有用な分子は公知である(例えば、フルオレセインおよびテルビウム)。FRETを用いて、インビトロまたはインビボで相互作用を検出することができる。
【００６２】
相互作用アッセイは場合により、固相に連結された標的と結合しているかまたは結合していない検出可能な標識をモニターすることによって相互作用が検出される、ヘテロジニアス形式で行われる。そのような形式の一例は免疫沈降アッセイである。例えばゲル電気泳動、クロマトグラフィー、沈降(例えば、勾配沈降)、およびフローサイトメトリー工程などの複数の分離工程が利用できる。フローサイトメトリー工程には、例えば、流動微量蛍光定量法(flow microfluorimetry)(FMF)および蛍光活性化細胞選別(fluorescence activated cell sorting)(FACS)；米国特許第6,090,919号(Cormack, et al.)；第6,461,813号(Lorens)；および第6,455,263号(Payan))が含まれる。いくつかの態様においては、細胞から非結合の検出可能標識を洗浄除去してもよく、細胞成分に結合している検出可能標識を可視化することができる(例えば、顕微鏡観察により)。
【００６３】
特定のアッセイ態様において、ヒトリボソームヌクレオチド配列を含む核酸に結合する分子を同定する方法であって、(a) 本明細書に記載のヒトリボソームヌクレオチド配列を含む核酸、核酸に結合する化合物、および試験分子を接触させる段階、ならびに(b) 核酸に結合したかまたは結合しなかった化合物の量を検出する段階を含み、それによって試験分子の非存在下よりも試験分子の存在下においてより少ない化合物が核酸に結合する場合に、試験分子がヒトリボソームヌクレオチド配列を含む核酸に結合する分子として同定される方法を提供する。化合物は場合により検出可能な標識と結合しており、場合によっては放射標識されている。特定の態様において、化合物はキノロン類似体(例えば、本明細書に記載のキノロン類似体)である。特定の態様において、化合物は式Aの放射標識化合物であり、特定の態様において、化合物は放射標識化合物A-1である。化合物を放射標識する方法は公知である(例えば、METHODS FOR PREPARING RADIOACTIVE QUINOLONE ANALOGSという表題の、2005年9月16日に出願された米国特許出願第60/718,021号)。いくつかの態様において、化合物はポルフィリンである(例えば、TMPyP4または米国特許出願公開第20040110820号に記載されている拡張ポルフィリン(例えば、Se2SAP))。後者の態様において、ポルフィリンの蛍光は場合により、シグナルとして検出される。特定の態様において、核酸および/または別のアッセイ成分は場合により、固相と結合している。核酸はDNA、RNA、またはそれらの類似体であってもよく、特定の態様においては上記のヌクレオチド配列を含んでもよい。核酸は、分子内四重鎖などの四重鎖を形成し得る。
【００６４】
他の特定のアッセイ態様において、ヌクレオリン置換を引き起こす分子を同定する方法であって、(a) ヌクレオリンタンパク質に結合し得るヒトリボソームヌクレオチド配列を含む核酸およびヌクレオリンタンパク質を試験分子と接触させる段階、ならびに(b) ヌクレオリンタンパク質に結合したかまたは結合しなかった核酸の量を検出する段階を含み、それによって、試験分子の非存在下よりも試験分子の存在下においてより少ない核酸がヌクレオリンタンパク質に結合する場合に、試験分子がヌクレオリン置換を引き起こす分子として同定される方法を提供する。いくつかの態様において、ヌクレオリンタンパク質は検出可能な標識と結合しており、またヌクレオリンタンパク質は固相に結合していてもよい。核酸は場合により検出可能な標識と結合しており、特定の態様において核酸は固相に結合していてもよい。前記物の任意の簡便な組み合わせを用いることができる。核酸はDNA、RNA、またはそれらの類似体であってもよく、特定の態様においては上記のヌクレオチド配列を含んでもよい。核酸はG-四重鎖配列および/またはヘアピン構造を含んでもよく、場合によっては5塩基対ステムおよび7〜10ヌクレオチドループ(例えば、U/GCCCGAモチーフ)から構成され得る。アクセッション番号NM_005381の配列を有するヌクレオリン、または核酸と結合し得る前記物の断片もしくは実質的に同一な配列変種などの、任意のヌクレオリンタンパク質を用いることができる。ヌクレオリンドメインの例は、RRMドメイン(例えば、アミノ酸278〜640)およびRGGドメイン(例えば、アミノ酸640〜709)である。いくつかの態様において、試験分子はキノロン類似体である。細胞における免疫蛍光顕微鏡観察によって、ヌクレオリン分布を検出することができる。
【００６５】
特定のアッセイ態様において、リボソームRNA(rRNA)合成を調節する分子を同定する方法であって、細胞を試験分子と接触させる段階、rRNAをrRNAの一部を増幅する1つまたは複数のプライマーおよび増幅産物にハイブリダイズする標識プローブと接触させる段階、標識プローブのハイブリダイゼーションによって増幅産物の量を検出する段階を含み、それによって増幅産物の量を減少または増加させる試験分子がrRNA合成を調節する分子として同定される方法を提供する。いくつかの態様において、本方法は、細胞を試験分子と接触させる段階、混合物をrRNAの一部を増幅する1つまたは複数のプライマーおよび増幅産物にハイブリダイズする標識プローブと接触させる段階、標識プローブのハイブリダイゼーションによって増幅産物の量を検出する段階を含み、それによって、増幅産物の量を減少または増加させる試験分子がrRNA合成を調節する分子として同定される。いくつかの態様における標識プローブは、プライマーを添加し、かつrRNAを増幅した後に添加し、特定の態様においては、標識プローブおよびプライマーを同時に添加する。増幅するrRNAの部分は、場合によりrRNAの5'末端である。特定の態様において、試験分子は、式3もしくは3A、または式2もしくは2A〜2Dのキノロン類似体のようなキノロン類似体である。特定の多重態様において、上記の方法は単一の反応において複数のプローブを用いて行われ(例えば、2つまたはそれ以上のプローブ)、プローブはそれぞれ異なる増幅産物にハイブリダイズし(例えば、rDNA産物および比較産物(例えば、c-Myc産物))、独特の検出タグを含む。そのような多重態様において、複数の異なるプローブ、および任意に標的配列領域を増幅するための複数の異なるプライマー対を提供し得る。
【００６６】
いくつかの態様は53に向けられる。ヒトリボソームDNAもしくはRNA中の((G3+)N1-7)3G3+もしくは((C3+)N1-7)3C3+、またはその相補体、式中、Gはグアニンであり、Cはシトシンであり、3+は3またはそれ以上のヌクレオチドであり、Nは任意のヌクレオチドである、を含むヌクレオチド配列中の標的配列に特異的にハイブリダイズするプローブオリゴヌクレオチドを含む組成物、およびプローブオリゴヌクレオチドは、検出可能な標識を含む。いくつかの態様において、標的領域はrDNAまたはrRNAの5'末端のヌクレオチド配列を含み、場合によっては、(a) rDNA(例えば、SEQ ID NO:1)の5'ETS領域、ITS1領域、ITS2領域、28S rRNA領域、3'ETS領域、18S rRNA領域、もしくは5.8S rRNA領域；(b) (a)の相補体；(a)のコード化RNA；または(b)のコード化RNAである。鋳型は場合によりDNAであり、鋳型配列は場合によりSEQ ID NO:1由来のヒトリボソームヌクレオチド配列を含む。特定の態様において鋳型はRNAであり、場合により鋳型配列はSEQ ID NO:1中のヌクレオチド配列によってコードされる。組成物は場合により、5'から3'へのヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼをさらに含む。プローブオリゴヌクレオチドは5'末端で標識され得り、プローブは、非核酸の尾部、または標的核酸配列と非相補的であるヌクレオチドの配列を含み得る。特定の態様において、プローブオリゴヌクレオチドは第1標識および第2標識を含む。第1標識および第2標識は、検出可能なシグナルの発生を消すようにプローブオリゴヌクレオチド上に効果的に位置する相互作用的シグナル発生標識であり得る。第1標識は場合によりフルオロフォアであり、かつ第2標識は場合により消光剤であり、第1標識は5'末端に位置してよく、第2標識は3'末端に位置してよい。いくつかの態様においてプローブオリゴヌクレオチドの3'末端はブロックされており、プローブオリゴヌクレオチドは場合により蛍光によって検出可能である。プローブオリゴヌクレオチドは場合により、特異的結合パートナーを有するリガンドを含み、リガンドは場合によりビオチン、アビジン、またはストレプトアビジンである。特定の態様における組成物は、標的配列またはその相補体に隣接したヒトリボソーム鋳型DNAまたはRNAに特異的にハイブリダイズする1つまたは複数のプライマーオリゴヌクレオチドをさらに含み、組成物は場合により1つまたは複数の伸長ヌクレオチドをさらに含む。
【００６７】
特定の態様は、試料中の標的核酸配列を増幅および検出する過程において用いるための反応混合物を対象とし、反応混合物は増幅前に、1対のオリゴヌクレオチドプライマーおよび標識オリゴヌクレオチドを含み、オリゴヌクレオチドプライマー対は、標的核酸に相補的な第1伸長産物の合成を開始する(prime)標的核酸に相補的な第1プライマー、および第2伸長産物の合成を開始する第1伸長産物に相補的な第2プライマーを含み、標識オリゴヌクレオチドは標的核酸または標的核酸の相補体の領域にハイブリダイズし、領域はプライマー対の一方のメンバーとプライマー対のもう一方のメンバーの相補体との間であり、領域はrDNAまたはrRNAの領域である。特定の態様において、領域はrDNAまたはrRNAの5'末端に位置し、場合によっては、(a) rDNA(例えば、SEQ ID NO:1)の5'ETS領域、ITS1領域、ITS2領域、28S rRNA領域、3'ETS領域、18S rRNA領域、もしくは5.8S rRNA領域；(b) (a)の相補体；(a)のコード化RNA；または(b)のコード化RNAに由来する。場合により、反応混合物は、5'から3'へのヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼをさらに含む。特定の態様において、標識オリゴヌクレオチドは5'末端で標識され、場合により標識オリゴヌクレオチドは、非核酸の尾部、または標的核酸配列と非相補的であるヌクレオチドの配列をさらに含む。標識オリゴヌクレオチドは第1標識および第2標識を含んでもよく、場合により第1標識および第2標識は、検出可能なシグナルの発生を消すように標識オリゴヌクレオチド上に効果的に位置する相互作用的シグナル発生標識である。標識オリゴヌクレオチドの3'末端はブロックされてよく、場合により標識オリゴヌクレオチドは蛍光によって検出可能である。特定の態様において、第1標識はフルオロフォアであり、かつ第2標識は消光剤である。場合により、第1標識は5'末端に位置し、第2標識は3'末端に位置する。特定の態様において、標識オリゴヌクレオチドは、特異的結合パートナーを有するリガンドを含み、場合によりリガンドはビオチンである。PCRの方法、成分、および反応混合物は、例えば、米国特許第4,683,202号；第4,683,195号；第4,965,188号；第6,214,979号；第5,804,375号；第5,210,015号；第5,487,972号；および第5,538,848、に記載されており、本明細書に記載のrDNAまたはrRNAにハイブリダイズするプライマーおよびプローブは、これらの特許に記載されている態様に適用することができる。
【００６８】
(a) 標的核酸の領域に相補的な配列を含む少なくとも1つの標識オリゴヌクレオチドであって、(b)部のオリゴヌクレオチドプライマーが結合した標的核酸配列内にアニールし、rDNAまたはrRNA配列に相補的であり、かつプライマー伸長産物に標識オリゴヌクレオチドが取り込まれるのを防ぐために3'末端においてブロックされており、該ブロックが、最終ヌクレオチドの3'ヒドロキシルにその後の検出のための標識としても機能しない化学部分を付加することによって、または3'ヒドロキシルを除去することによって達成される標識オリゴヌクレオチド；および(b) 第1プライマーが標的核酸配列の一方の鎖中の領域に相補的な配列を含み、かつ第1伸長産物の合成を開始し、第2プライマーが第1伸長産物中の領域に相補的な配列を含み、かつ第1伸長産物に相補的な核酸鎖の合成を開始し、各オリゴヌクレオチドプライマーが、同じ核酸鎖にアニールした任意の標識オリゴヌクレオチドの上流のその相補的鋳型にアニールするように選択される1対のオリゴヌクレオチドプライマーを含む、試料中の標的核酸配列を検出するためのキットもまた提供する。いくつかの態様において、ブロックは、標識オリゴヌクレオチドの最終ヌクレオチドの3'ヒドロキシルに化学部分を付加することによって達成され、化学部分はリン酸基である。特定の態様において、ブロックは、標識オリゴヌクレオチドから3'ヒドロキシルを除去することによって達成される。特定のキットは、耐熱性酵素(例えば、サーマス属(Thermus)種由来)などの、5'から3'へのヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼをさらに含む。標識オリゴヌクレオチドは蛍光によって検出可能であってもよく、5'末端で標識され得る。標識オリゴヌクレオチドは場合により第1標識および第2標識を含み、第1標識はヌクレアーゼ感受性切断部位によって第2標識から分離されている。特定の態様において、第1標識は5'末端に位置し、第2標識は3'末端に位置する。標識オリゴヌクレオチドは場合により、検出可能なシグナルの発生を消すように標識オリゴヌクレオチド上に位置する1対の相互作用的シグナル発生標識を含み、場合により第1標識はフルオロフォアであり、かつ第2標識はそれと相互作用する消光剤である。
【００６９】
検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブもまた提供するが、プローブは、ポリメラーゼによって触媒されるプローブの伸長を防ぐために3'末端でブロックされており、そのブロックは、最終ヌクレオチドの3'ヒドロキシルにその後の検出のための標識としても機能しない化学部分を付加することによって、または3'ヒドロキシルを除去することによって達成され、標識オリゴヌクレオチドプローブは、第1標識および第2標識からなる1対の非放射性相互作用的標識を含み、第1標識および第2標識はオリゴヌクレオチドに直接または間接的に付着され、第1標識はヌクレアーゼ感受性切断部位によって第2標識から分離され、プローブはrDNAまたはrRNAヌクレオチド配列にハイブリダイズする。特定の態様において、プローブはrDNAまたはrRNAの5'末端に特異的にハイブリダイズし、場合によっては、(a) rDNA(例えば、SEQ ID NO:1)の5'ETS領域、ITS1領域、ITS2領域、28S rRNA領域、3'ETS領域、18S rRNA領域、もしくは5.8S rRNA領域；(b) (a)の相補体；(a)のコード化RNA；または(b)のコード化RNAに由来する。いくつかの態様において、第1標識はプローブの5'末端に位置し、第2標識は3'末端に位置し、場合により第1標識および第2標識は、検出可能なシグナルの発生を消すように標識オリゴヌクレオチド上に位置する1対の相互作用的シグナル発生標識を含む。特定の態様において、第1標識はフルオロフォアであり、かつ第2標識はそれと相互作用する消光剤である。
【００７０】
本明細書に記載のアッセイにおいて効果を有すると同定された試験分子を解析し、相互に比較する(例えば、順位づける)ことができる。本明細書に記載の方法において相互作用または効果を有すると同定された分子は、「候補分子」と称される。本明細書に記載のスクリーニング法によって同定された候補分子、そのような候補分子を表す情報、および候補分子を用いる方法(例えば、状態の治療的処置)を本明細書に提供する。
【００７１】
したがって、本明細書に記載の方法によって同定された候補分子を表す構造情報が提供される。特定の態様において、分子構造を表す情報(例えば、化学式または配列情報)は場合により、画像としてまたは三次元座標として、保存および/または表現される。情報はコンピュータ可読形式で保存および/または表現される場合が多く、場合によってはデータベース中に保存され組織化される。特定の態様において、情報は、物理的媒体(例えば、紙)またはコンピュータ可読媒体(例えば、光および/もしくは磁気記憶または伝送媒体、フロッピーディスク、ハードディスク、ランダムアクセスメモリ、コンピュータ演算処理装置、ファクシミリ信号、衛星信号、インターネットを介した伝送、またはワールドワイドウェブを介した伝送)を用いて、1つの位置から別の位置に移され得る。
【００７２】
リボソームヌクレオチド配列相互作用分子
当業者は、複数種類のリボソームヌクレオチド配列相互作用分子を構築し、同定し、かつ使用することができる。そのような相互作用分子の例は、化合物、核酸、および抗体である。これらの種類の分子はいずれも、本明細書に記載のアッセイにおいて試験分子として用いることが可能である。
【００７３】
化合物は、以下を含む、当技術分野において公知のコンビナトリアルライブラリー方法における多くのアプローチのいずれかを用いて得ることができる：生物学的ライブラリー；ペプトイドライブラリー(ペプチドの機能性を有するものの、酵素分解に対して耐性であるがそれでもなお生物活性を保持する新規の非ペプチド骨格を有する分子のライブラリー(例えば、Zuckermann et al., J. Med. Chem.37: 2678-85 (1994)を参照されたい))；空間的にアドレス可能な平行の固相または液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法；「1ビーズ1化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法。生物学的ライブラリーおよびペプトイドライブラリーアプローチは典型的にペプチドライブラリーに限定されるが、他のアプローチは、化合物のペプチドライブラリー、非ペプチドオリゴマーライブラリー、または小分子ライブラリーに適用可能である(Lam, Anticancer Drug Des. 12: 145 (1997))。分子ライブラリーを合成する方法の例は、例えば、DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909 (1993)；Erb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422 (1994)；Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37: 2678 (1994)；Cho et al., Science 261: 1303 (1993)；Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059 (1994)；Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061 (1994)；およびGallop et al., J. Med. Chem. 37: 1233 (1994)に記載されている。化合物のライブラリーは、溶液中(例えば、Houghten, Biotechniques 13: 412-421 (1992))、またはビーズ(Lam, Nature 354: 82-84 (1991))、チップ(Fodor, Nature 364: 555-556 (1993))、細菌もしくは胞子(Ladner、米国特許第5,223,409号)、プラスミド(Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869 (1992))、もしくはファージ(Scott and Smith, Science 249: 386-390 (1990)；Delvin, Science 249: 404-406 (1990)；Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 6378-6382 (1990)；Felici, J. Mol. Biol. 222: 301-310 (1991)；Ladner 前記)上に提示してもよい。
【００７４】
化合物は場合により小分子である。小分子には、これらに限定されないが、ペプチド、ペプチド模倣体(例えば、ペプトイド)、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、約10,000グラム/モル未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物(すなわち、ヘテロ有機化合物および有機金属化合物を含む)、約5,000グラム/モル未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物、約1,000グラム/モル未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物、約500グラム/モル未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物、ならびにそのような化合物の塩、エステル、および他の薬学的に許容される形態が含まれる。
【００７５】
リボソームヌクレオチド配列相互作用化合物は場合により、キノロン類似体または誘導体である。特定の態様において、化合物は、式1：
2009504192.tif 000022
のもの、ならびに薬学的に許容されるその塩、エステル、およびプロドラッグであり；
式中、B、X、A、もしくはVは、Z1、Z2、Z3、もしくはZ4がそれぞれNである場合には存在せず、Z1、Z2、Z3、もしくはZ4がそれぞれCである場合には、独立してH、ハロ、アジド、R2、CH2R2、SR2、OR2、もしくはNR1R2であり；または
AおよびV、AおよびX、もしくはXおよびBは、それぞれ環と置換および/もしくは縮合されてもよい炭素環、複素環、アリール、もしくはヘテロアリールを形成してもよく；
ZはO、S、NR1、CH2、またはC=Oであり；
Z1、Z2、Z3、およびZ4は、いずれか2つのNが隣接しないという条件でCまたはNであり；
WはNおよびZと共に、置換されてもよい飽和環または不飽和環に縮合された置換されてもよい5員環または6員環を形成し；そのような飽和環または不飽和環はヘテロ原子を含んでもよく、単環であるかまたは単一もしくは複数の炭素環もしくは複素環と縮合されており；
UはR2、OR2、NR1R2、NR1-(CR12)n-NR3R4、またはN=CR1R2であり、N=CR1R2において、R1およびR2はCと共に環を形成してもよく；
各NR1R2において、R1およびR2はNと共に置換されてもよい環を形成してもよく；
NR3R4において、R3およびR4はNと共に置換されてもよい環を形成してもよく；
R1およびR3は独立してHまたはC1-6アルキルであり；
R2はそれぞれ、H、またはハロゲン、1つもしくは複数の非隣接ヘテロ原子、炭素環、複素環、アリール、もしくはヘテロアリールでそれぞれ置換されてもよいC1-10アルキルもしくはC2-10アルケニルであり、環はそれぞれ置換されてもよく；またはR2は、置換されてもよい炭素環、複素環、アリール、もしくはヘテロアリールであり；
R4はH；N、O、およびSより選択される1つもしくは複数の非隣接ヘテロ原子を任意に含み、炭素環もしくは複素環で置換されてもよいC1-10アルキルもしくはC2-10アルケニルであり；またはR3およびR4はNと共に置換されてもよい環を形成してもよく；
R5はそれぞれ環W上の任意の位置における置換基であり；H、OR2、アミノ、アルコキシ、アミド、ハロゲン、シアノ、もしくは無機置換基であり；またはR5は、それぞれハロ、カルボニル、または1つもしくは複数の非隣接ヘテロ原子により置換されてもよいC1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、-CONHR1であり；または2つの隣接したR5は、置換されてもよい付加的な炭素環もしくは複素環に縮合され得る5〜6員環の置換されてもよい炭素環もしくは複素環が得られるように結合しており；かつ
nは1〜6である。
【００７６】
上記の式(1)において、Bは、Z1がNである場合には存在しなくてもよく、またはZ1がCである場合にはHもしくはハロゲンである。特定の態様において、Uは場合によりHではない。いくつかの態様において、UがOH、OR2、またはNH2である場合、Z1〜Z4の少なくとも1つはNである。
【００７７】
いくつかの態様において、化合物は一般式(2A)または(2B)：
2009504192.tif 000023
を有し、
式中、A、B、V、X、U、Z、Z1、Z2、Z3、Z4、R5、およびnは、式(1)において定義される通りであり；
Z5はO、NR1、CR6、またはC=Oであり；
R6はH、C1-6アルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、ハロ、アミノ、またはアミドであり；かつ
ZおよびZ5は任意に二重結合を形成し得る。
【００７８】
いくつかの態様においては、以下の式(2C)の化合物、または薬学的に許容されるその塩、エステル、もしくはプロドラッグが用いられる：
2009504192.tif 000024
式中、置換基は上記のものである。
【００７９】
いくつかの態様においては、以下の式(2D)の化合物、または薬学的に許容されるその塩、エステル、もしくはプロドラッグが用いられる：
2009504192.tif 000025
式中、置換基は上記のものである。特定の態様において、式(2D)の化合物は、例えばG1期停止および/またはS期停止のように、細胞周期を実質的に停止させる。
【００８０】
特定の局面において、化合物は一般的(3)：
2009504192.tif 000026
を有し、
式中、A、U、V、X、R5、Z、およびnは式(1)において上記した通りであり；
W1は、単環であるかまたは単一もしくは複数の環と縮合されてもよく、かつ任意にヘテロ原子を含む、置換されてもよいアリールまたはヘテロアリールであり；かつ
Z6、Z7、およびZ8は、いずれか2つのNが隣接しないという条件で、独立してCまたはNである。
【００８１】
上記の式(3)において、Z6、Z7、およびZ8はそれぞれCであってもよい。いくつかの態様において、Z6、Z7、およびZ8の1つまたは2つは、いずれか2つのNが隣接しないという条件でNである。
【００８２】
上記の式において、式(1)中のWとNおよびZ、または式(2A)、(2B)、もしくは(3)中のW1は、以下からなる群より選択される、置換されてもよいアリールまたはヘテロアリールに縮合された置換されてもよい5員環または6員環を形成する：
2009504192.tif 000027
2009504192.tif 000028
式中、Q、Q1、Q2、およびQ3はそれぞれ独立してCHまたはNであり；
Yは独立してO、CH、C=O、またはNR1であり；
nおよびR5は上記で定義される通りである。
【００８３】
特定の態様において、式(1)中のWとNおよびZは、以下からなる群より選択される式を有する基を形成する：
2009504192.tif 000029
式中、ZはO、S、CR1、NR1、またはC=Oであり；
Z5はそれぞれ、隣接する場合のZおよびZ5の両方がNR1となることはないという条件で、CR6、NR1、またはC=Oであり；
R1はそれぞれH、C1-6アルキル、COR2、またはS(O)pR2であり、ここでpは1〜2であり；
R6は、H、またはこれらに限定されないがヒドロキシル、アルキル、アルコキシ、ハロ、アミノ、もしくはアミドを含む当技術分野で公知の置換基であり；かつ
環Sおよび環Tは、飽和または不飽和であってもよい。
【００８４】
いくつかの態様において、式(1)中のWとNおよびZは、フェニルに縮合された5員環または6員環を形成する。他の態様においては、UがNH2ではないという条件で、UがNR1R2である場合に、WはNおよびZと共に、別の環に任意に縮合された5員環または6員環を形成する。特定の態様においては、UがNR1R2(例えば、NH2)である場合に、WはNおよびZと共に、別の環に縮合されていない5員環または6員環を形成する。
【００８５】
上記の式(1)、(2A)、(2B)、または(3)において、UはNR1R2であってもよく、式中、R1はHであり、R2は、ヘテロ原子、C3-6シクロアルキル、アリール、または1つもしくは複数のN、O、もしくはSを含む5〜14員環複素環で置換されてもよいC1-10アルキルである。例えば、R2は、置換されてもよいモルホリン、チオモルホリン、イミダゾール、アミノジチアダゾール(aminodithiadazole)、ピロリジン、ピペラジン、ピリジン、またはピペリジンで置換されたC1-10アルキルであってもよい。他の例において、R1およびR2はNと共に、置換されてもよいピペリジン、ピロリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリン、イミダゾール、またはアミノジチアゾール(aminodithiazole)を形成する。
【００８６】
いくつかの態様において、UはNR1-(CR12)n-NR3R4であり；nは1〜4であり；かつNR3R4中のR3およびR4は共に、置換されてもよいピペリジン、ピロリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリン、イミダゾール、またはアミノジチアゾールを形成する。いくつかの例において、UはNH-(CH2)n-NR3R4であり、R3およびR4はNと共に、ピロリジン環中の任意の位置で(CH2)nに結合され得る、置換されてもよいピロリジンを形成する。1つの態様において、R3およびR4はNと共にN-メチル置換ピロリジンを形成する。いくつかの態様において、Uは2-(1-メチルピロリジン-2-イル)エチルアミノまたは(2-ピロリジン-1-イル)エタンアミノである。
【００８７】
上記の式(1)、(2A)もしくは(2B)、または(3)において、ZはSまたはNR1であってもよい。
【００８８】
いくつかの態様において、式(1)、(2A)、または(2B)中のB、X、またはAの少なくとも1つはハロであり、Z1、Z2、およびZ3はCである。他の態様において、Z2およびZ3がCである場合、XおよびAはそれぞれHではない。上記の式(1)、(2A)、および(2B)において、VはHであってもよい。特定の態様において、UはOHではない。
【００８９】
1つの態様において、式(1)、(2A)、または(2B)中のZ1、Z2、Z3、およびZ4はそれぞれCである。別の態様において、Z1、Z2、Z3、およびZ4のうちの3つはCであり、残りはNである。例えば、Z1、Z2、およびZ3はCであり、Z4はNである。または、Z1、Z2、およびZ4はCであり、Z3はNである。他の例では、Z1、Z3、およびZ4はCであり、Z2はNである。さらなる他の例では、Z2、Z3、およびZ4はCであり、Z1はNである。
【００９０】
特定の態様において、式(1)、(2A)、または(2B)中のZ1、Z2、Z3、およびZ4のうちの2つはCであり、残りの2つは隣接しない窒素である。例えば、Z1およびZ3はCであってもよく、Z2およびZ4はNである。または、Z1およびZ3はNであってもよく、Z2およびZ4はCであってもよい。他の例では、Z1およびZ4はNであり、Z2およびZ3はCである。特定の例において、WはNおよびZと共に、フェニルに縮合された5員環または6員環を形成する。
【００９１】
いくつかの態様において、式(1)、(2A)、または(2B)中のB、X、A、およびVはそれぞれHであり、Z1〜Z4はCである。多くの態様において、B、X、A、およびVの少なくとも1つはHであり、対応する隣接Z1〜Z4原子はCである。例えば、B、X、A、およびVのいずれか2つはHであってもよい。一例では、VおよびBはいずれもHであってもよい。他の例では、B、X、A、およびVのいずれか3つはHであり、対応する隣接Z1〜Z4原子はCである。
【００９２】
特定の態様において、B、X、A、およびVの1つはハロゲン(例えば、フッ素)であり、対応する隣接Z1〜Z4原子はCである。他の態様において、X、A、およびVのうちの2つはハロゲンまたはSR2であり、式中、R2は、ヘテロ原子、炭素環、複素環、アリール、またはヘテロアリールで置換されてもよいC0-10アルキルまたはC2-10アルケニルであり；対応する隣接Z2〜Z4はCである。例えば、XおよびAはそれぞれハロゲンであってもよい。他の例では、XおよびAは存在する場合にそれぞれSR2であってもよく、式中、R2はフェニルまたはピラジンで置換されたC0-10アルキルである。さらなる他の例において、V、A、およびXは、アルキニル、例えばCF3、CH2CF3、全フッ素置換アルキルなどのフッ化アルキル；シアノ、ニトロ、アミド、スルホニルアミド、またはCOR2などのカルボニル化合物であってもよい。
【００９３】
上記の式のそれぞれにおいて、U、ならびに存在する場合のX、V、およびAは独立してNR1R2であってもよく、式中、R1はHであり、R2は、ヘテロ原子、C3-6シクロアルキル、アリール、または1つもしくは複数のN、O、もしくはSを含む5〜14員環複素環で置換されてもよいC1-10アルキルである。上記の式のいずれか1つの化合物においてAおよびUがいずれもNR1R2である場合のように、本発明内の化合物中に複数のNR1R2部分が存在する場合には、各R1および各R2は独立して選択される。一例において、R2は、置換されてもよい5〜14員環複素環で置換されたC1-10アルキルである。例えば、R2は、モルホリン、チオモルホリン、イミダゾール、アミノジチアダゾール、ピロリジン、ピペラジン、ピリジン、またはピペリジンで置換されたC1-10アルキルであってもよい。または、R1およびR2はNと共に、1つまたは複数のN、O、またはSを含む置換されてもよい複素環を形成し得る。例えば、R1およびR2はNと共に、ピペリジン、ピロリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリン、イミダゾール、またはアミノジチアゾールを形成する。
【００９４】
置換されてもよい複素環の具体例には、これらに限定されないが、テトラヒドロフラン、1,3-ジオキソラン、2,3-ジヒドロフラン、テトラヒドロピラン、ベンゾフラン、イソベンゾフラン、1,3-ジヒドロ-イソベンゾフラン、イソオキサゾール、4,5-ジヒドロイソオキサゾール、ピペリジン、ピロリジン、ピロリジン-2-オン、ピロール、ピリジン、ピリミジン、オクタヒドロ-ピロロ[3,4-b]ピリジン、ピペラジン、ピラジン、モルホリン、チオモルホリン、イミダゾール、アミノジチアダゾール、イミダゾリジン-2,4-ジオン、ベンズイミダゾール、1,3-ジヒドロベンズイミダゾール-2-オン、インドール、チアゾール、ベンゾチアゾール、チアジアゾール、チオフェン、テトラヒドロ-チオフェン 1,1-二酸化物、ジアゼピン、トリアゾール、ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタン、2,5-ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタン、および2,3,4,4a,9,9a-ヘキサヒドロ-1H-β-カルボリンが含まれる。
【００９５】
いくつかの態様において、化合物は一般式(1)、(2A)、(2B)、または(3)を有し、式中：
A、V、およびBは存在する場合、それぞれ独立してHまたはハロゲン(例えば、クロロまたはフルオロ)であり；
Xは-(R5)R1R2であり、式中、R5はCまたはNであり、各-(R5)R1R2において、R1およびR2は共に、置換されてもよいアリールまたはヘテロアリール環を形成してもよく；
ZはNHまたはN-アルキル(例えば、N-CH3)であり；
式(1)中のWとNおよびZ、または式(2A)、(2B)、もしくは(3)中のW1は、置換されてもよいアリールまたはヘテロアリール環に縮合された置換されてもよい5員環または6員環を形成し；かつ
Uは-R5R6-(CH2)n-CHR2-NR3R4であり、式中、R6はHまたはC1-10アルキルであり、-CHR2-NR3R4部分において、R3もしくはR4はそれぞれCと共に、置換されてもよい複素環もしくはヘテロアリール環を形成してもよく、または-CHR2-NR3R4部分において、R3もしくはR4はそれぞれNと共に、置換されてもよい炭素環、複素環、アリール、またはヘテロアリール環を形成し得る。
【００９６】
特定の態様において、化合物は式(1)、(2A)、(2B)、または(3)を有し、式中：
Aは存在する場合、Hまたはハロゲン(例えば、クロロまたはフルオロ)であり；
Xは存在する場合、-(R5)R1R2であり、式中、R5はCまたはNであり、各-(R5)R1R2において、R1およびR2は共に、置換されてもよいアリールまたはヘテロアリール環を形成してもよく；
ZはNHまたはN-アルキル(例えば、N-CH3)であり；
式(1)中のWとNおよびZ、または式(2A)、(2B)、もしくは(3)中のW1は、置換されてもよいアリールまたはヘテロアリール環に縮合された置換されてもよい5員環または6員環を形成し；かつ
Uは-R5R6-(CH2)n-CHR2-NR3R4であり、式中、R6はHまたはアルキルであり、-CHR2-NR3R4部分において、R3もしくはR4はそれぞれCと共に、置換されてもよい複素環もしくはヘテロアリール環を形成してもよく、または-CHR2-NR3R4部分において、R3もしくはR4はそれぞれNと共に、置換されてもよい炭素環、複素環、アリール、またはヘテロアリール環を形成し得る。
【００９７】
上記の式それぞれにおいて、置換されてもよい部分はそれぞれ、ハロ、C=O、アリール、または1つもしくは複数のヘテロ原子によりそれぞれ置換されてもよい1つまたは複数のハロ、OR2、NR1R2、カルバミン酸、C1-10アルキル、C2-10アルケニル；無機置換基、アリール、炭素環、または複素環で置換され得る。他の置換基には、これらに限定されないが、アルキニル、シクロアルキル、例えばCF3、CH2CF3、全フッ素置換アルキルなどのフッ化アルキル；例えばOCF3またはCH2CF3などの酸素化フッ化アルキル；シアノ、ニトロ、COR2、NR2COR2、スルホニルアミド；NR2SOOR2；SR2、SOR2、COOR2、CONR22、OCOR2、OCOOR2、OCONR22、NRCOOR2、NRCONR22、NRC(NR)(NR22)、NR(CO)NR22、およびSOONR22が含まれ、R2はそれぞれ式1において定義される通りである。
【００９８】
本明細書で使用する「アルキル」という用語は、炭素含有化合物を指し、1つまたは複数のヘテロ原子含む化合物を包含する。「アルキル」という用語は、これらに限定されないが、OR1、アミノ、アミド、ハロ、=O、アリール、複素環基、または無機置換基を含む1つまたは複数の置換基で置換されたアルキルもまた包含する。
【００９９】
本明細書で使用する「炭素環」という用語は、環中に炭素原子のみを含む環状化合物を指し、これに対し「複素環」は、ヘテロ原子を含む環状化合物を指す。炭素環および複素環構造は、単環系、二環系、または複数環系を有する化合物を包含する。
【０１００】
本明細書で使用する「アリール」という用語は、多価不飽和の、典型的に芳香族の炭化水素置換基を指し、これに対し「ヘテロアリール」または「ヘテロ芳香族」は、ヘテロ原子を含む芳香環を指す。アリールおよびヘテロアリール構造は、単環系、二環系、または複数環系を有する化合物を包含する。
【０１０１】
本明細書で使用する「ヘテロ原子」という用語は、窒素、酸素、または硫黄などの、炭素でも水素でもない任意の元素を指す。
【０１０２】
複素環の具体例には、これらに限定されないが、テトラヒドロフラン、1,3-ジオキソラン、2,3-ジヒドロフラン、ピラン、テトラヒドロピラン、ベンゾフラン、イソベンゾフラン、1,3-ジヒドロ-イソベンゾフラン、イソオキサゾール、4,5-ジヒドロイソオキサゾール、ピペリジン、ピロリジン、ピロリジン-2-オン、ピロール、ピリジン、ピリミジン、オクタヒドロ-ピロロ[3,4-b]ピリジン、ピペラジン、ピラジン、モルホリン、チオモルホリン、イミダゾール、イミダゾリジン-2,4-ジオン、1,3-ジヒドロベンズイミダゾール-2-オン、インドール、チアゾール、ベンゾチアゾール、チアジアゾール、チオフェン、テトラヒドロ-チオフェン 1,1-二酸化物、ジアゼピン、トリアゾール、グアニジン、ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタン、2,5-ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタン、2,3,4,4a,9,9a-ヘキサヒドロ-1H-β-カルボリン、オキシラン、オキセタン、テトラヒドロピラン、ジオキサン、ラクトン、アジリジン、アゼチジン、ピペリジン、ラクタムが含まれ、ヘテロアリールもまた包含し得る。ヘテロアリールの他の具体例には、これらに限定されないが、フラン、ピロール、ピリジン、ピリミジン、イミダゾール、ベンズイミダゾール、およびトリアゾールが含まれる。
【０１０３】
本明細書で使用する「無機置換基」という用語は、炭素を含まない、または水素以外の元素に結合した炭素を含む置換基(例えば、元素炭素、一酸化炭素、二酸化炭素、および炭酸塩)を指す。無機置換基の例には、これらに限定されないが、ニトロ、ハロゲン、スルホニル、スルフィニル、リン酸などが含まれる。
【０１０４】
本発明の化合物を調製するための合成手順は、PCT/US05/011108およびPCT/US2005/26977に記載されており、これらはそれぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる。当業者に公知である合成手順における他の変化形を用いて、本発明の化合物を調製することも可能である。
【０１０５】
本発明の化合物はキラルであってもよい。本明細書で使用するキラル化合物とは、その鏡像と異なり、鏡像異性体を有する化合物である。さらに、化合物はラセミであるか、または単離された鏡像異性体もしくは立体異性体であってもよい。キラル化合物を合成し、鏡像異性体のラセミ混合物を分割する方法は、当業者に周知である。例えば、参照により本明細書に組み入れられる、March, 「Advanced Organic Chemistry,」 John Wiley and Sons, Inc., New York, (1985)を参照されたい。
【０１０６】
上記の式を有する化合物の具体例を、表1(A〜C)および実施例に示す。本発明はまた、表1(A〜C)に例証される置換基から独立して選択される置換基U、A、X、V、およびBを含む、いずれか1つの式(1)、(2A)、(2B)、および(3)を有する他の化合物もまた包含する。例えば、表1Aに示される最後の2つの化合物中のイソプロピル置換基は、アセチル置換基で置換されてよく、または縮合環中のN-CH3はNH基で置換されてよい。さらに、フルオロ基はHで置換され得る。したがって、本発明は、以下の種々の態様において記載される置換基の特定の組み合わせに限定されない。
【０１０７】
いくつかの態様において、以下の式(3A)の化合物、またはその薬学的に許容される塩、エステル、もしくはプロドラッグが用いられる：
2009504192.tif 000030
式中、置換基は上記のものである。
【０１０８】
いくつかの態様において、以下の式A-1：
2009504192.tif 000031
を有する化合物、または薬学的に許容されるその塩、エステル、もしくはプロドラッグが、本明細書に記載の方法または組成物において用いられ得る。
【０１０９】
いくつかの態様において、以下の式B-1：
2009504192.tif 000032
を有する化合物、または薬学的に許容されるその塩、プロドラッグ、もしくはエステルが、本明細書に記載の方法または組成物において用いられ得る。
【０１１０】
特定の局面において、化合物は、式4のもの、または薬学的に許容されるその塩、プロドラッグ、もしくはエステルである：
2009504192.tif 000033
式中、X'はヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシル、ハロゲン、CF3、アミノ、アミド、硫化物、3〜7員環炭素環もしくは複素環、5員環もしくは6員環アリールもしくはヘテロアリール、縮合炭素環もしくは複素環、二環性化合物、NR1R2、NCOR3、N(CH2)nNR1R2、またはN(CH2)nR3であり、N(CH2)nNR1R2およびN(CH2)nR3中のNは任意にC1-10アルキルに結合しており、X'はそれぞれ任意に1つまたは複数の置換基に結合しており；
X''はヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アミド、硫化物、3〜7員環炭素環もしくは複素環、5員環もしくは6員環アリールもしくはヘテロアリール、縮合炭素環もしくは複素環、二環性化合物、NR1R2、NCOR3、N(CH2)nNR1R2、またはN(CH2)nR3であり、N(CH2)nNR1R2およびN(CH2)nR3中のNは任意にC1-10アルキルに結合しており、X''は任意に1つまたは複数の置換基に結合しており；
YはH、ハロゲン、またはCF3であり；
R1、R2、およびR3は独立してH、C1〜C6アルキル、C1〜C6置換アルキル、C3〜C6シクロアルキル、C1〜C6アルコキシル、カルボキシル、イミン、グアニジン、3〜7員環炭素環もしくは複素環、5員環もしくは6員環アリールもしくはヘテロアリール、縮合炭素環もしくは複素環、または二環性化合物であり、R1、R2、およびR3はそれぞれ任意に1つまたは複数の置換基に結合しており；
Zはハロゲンであり；
かつLは式Ar1-L1-Ar2を有するリンカーであり、式中、Ar1およびAr2はアリールまたはヘテロアリールである。
【０１１１】
上記の式(4)において、L1は、mは1〜6である(CH2)m(mは1〜6)、またはジスルフィドのような別のヘテロ原子に任意に結合しているヘテロ原子であってもよい。Ar1およびAr2はそれぞれ独立して、1つまたは複数の置換基で置換されてもよいアリールまたはヘテロアリールであってもよい。一例では、Lは、2つのキノリノンを結合する[フェニル-S-S-フェニル]リンカーである。特定の態様において、Lは、2つの同一キノリン種を結合する[フェニル-S-S-フェニル]リンカーである。
【０１１２】
上記の式(4)において、X''はヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アミド、スルフィド、3〜7員環炭素環もしくは複素環、5員環もしくは6員環アリールもしくはヘテロアリール、縮合炭素環もしくは複素環、二環性化合物、NR1R2、NCOR3、N(CH2)nNR1R2、またはN(CH2)nR3であってもよく、N(CH2)nNR1R2およびN(CH2)nR3中のNは任意にC1-10アルキルに結合しており、X''は任意に1つまたは複数の置換基に結合している。
【０１１３】
前記式の化合物の具体例は、参照により本明細書に組み入れられる、2006年2月22日に出願された米国仮特許出願第60/775,924号中の表1A〜1C、表2、表3、および表4に記載されている。
【０１１４】
キノロン類似体には、米国特許第5,817,669号に記載され、かつ参照により本明細書に組み入れられる化合物、およびUS 2006/0025437 A1に記載される以下の化合物：
2009504192.tif 000034
もまた含まれ得る。
【０１１５】
当業者は、リボソームヌクレオチド配列相互作用核酸分子を選択および調製することができる。特定の態様において、相互作用核酸分子は、本明細書に記載のリボソームヌクレオチド配列に相補的な配列を含み、「アンチセンス」核酸と称される。アンチセンス核酸は、ポリアミド核酸(PNA)、ロックド(locked)核酸(LNA)およびその他の2'修飾核酸、ならびに米国特許第4,469,863号；第5,536,821号；第5,541,306号；第5,637,683号；第5,637,684号；第5,700,922号；第5,717,083号；第5,719,262号；第5,739,308号；第5,773,601号；第5,886,165号；第5,929,226号；第5,977,296号；第6,140,482；第5,614,622号；第5,739,314号；第5,955,599号；第5,962,674号；第6,117,992号；WIPO公報 WO 00/56746、WO 00/75372、およびWO 01/14398、ならびに関連の出版物に例証されているその他のものなどの類似体または誘導体核酸を含んでもよく、またはそれらからなってもよい。アンチセンス核酸は場合により、リボソーム核酸を阻害するために、当業者によって設計、調製、および/または使用される。アンチセンス核酸は、コード鎖全体に対して、またはその一部もしくはそれと実質的に同一である配列に対して相補的であり得る。別の態様において、アンチセンス核酸分子は、ヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領」に対してアンチセンスである。アンチセンス核酸は、リボソームヌクレオチド配列のコード領域全体に対して相補的であり得、かつアンチセンス核酸は、リボソームヌクレオチド配列のコード領域または非コード領域の一部に対してのみアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである場合が多い。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、mRNAの翻訳開始部位を取り囲む領域、例えば、関心対象の標的遺伝子ヌクレオチド配列の-10〜+10の領域に対して相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80ヌクレオチド長、またはそれ以上のであり得る。
【０１１６】
アンチセンス核酸は、標準的な化学合成反応および酵素による連結反応を用いて構築することができる。例えば、アンチセンス核酸(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド)は、天然ヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増加させるかもしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間に形成される二重鎖の物理学的安定性を増加させるように設計された多様に改変されたヌクレオチドを用いて(例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを用いることができる)、化学合成することができる。アンチセンス核酸はまた、核酸がアンチセンス方向でサブクローニングされた発現ベクターを用いて、生物学的に生成することができる(すなわち、挿入された核酸から転写されるRNAは、関心対象の標的核酸に対してアンチセンス方向となり、これについては以下の説でさらに説明する)。
【０１１７】
動物において使用する場合には、アンチセンス核酸がポリペプチドをコードする細胞mRNAおよび/またはゲノムDNAとハイブリダイズするかまたはこれに結合し、それにより例えば転写および/または翻訳を阻害することによってポリペプチドの発現を阻害するように、アンチセンス核酸を典型的には対象に投与するか(例えば、組織部位における直接注射または静脈内投与により)、またはインサイチューで産生させる。または、選択された細胞を標的化するようにアンチセンス核酸分子を改変することができ、次いでこれを全身投与する。全身投与するには、例えば、細胞表面受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体にアンチセンス核酸分子を連結することによって、選択された細胞表面上に発現される受容体または抗原にアンチセンス分子が特異的に結合するように、アンチセンス分子を改変することができる。アンチセンス核酸分子はまた、本明細書に記載のベクターを用いて細胞に送達することができる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度は、ベクター構築物中に、CMVプロモーター、pol IIプロモーター、またはpol IIIプロモーターなどの強力なプロモーターを組み入れることによって達成される。
【０１１８】
アンチセンス核酸分子は場合により、α-アノマー核酸分子である。α-アノマー核酸分子は相補的RNAと共に特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、このハイブリッドにおいて、これらの鎖は通常のβ単位とは対照的に互いに平行に延びる(Gaultier et al., Nucleic Acids. Res. 15: 6625-6641 (1987))。アンチセンス核酸分子はまた、2'-o-メチルリボヌクレオチド(Inoue et al., Nucleic Acids Res. 15: 6131-6148 (1987))またはキメラRNA-DNA類似体(Inoue et al., FEBS Lett. 215: 327-330 (1987))を含み得る。アンチセンス核酸は場合により、DNAもしくはPNA、または以前に記載されている任意の他の核酸誘導体から構成される。
【０１１９】
いくつかの態様において、アンチセンス核酸はリボザイムである。リボソームヌクレオチド配列に対して特異性を有するリボザイムは、そのようなヌクレオチド配列に相補的な1つまたは複数の配列、およびmRNAの切断を担う公知の触媒配列を有する配列を含み得る(例えば、米国特許第5,093,246号、またはHaselhoff and Gerlach, Nature 334: 585-591 (1988))。例えば、活性部位のヌクレオチド配列がmRNA中の切断されるべきヌクレオチド配列に対して相補的であるテトラヒメナL-19 IVS RNAの誘導体が場合により用いられる(例えば、Cech et al. 米国特許第4,987,071号；およびCech et al. 米国特許第5,116,742号)。リボソームヌクレオチド配列を使用して、RNA分子のプールから特定のリボヌクレアーゼ活性を有する触媒RNAを選択することも可能である(例えば、Bartel & Szostak, Science 261: 1411-1418 (1993))。
【０１２０】
特異的結合試薬は場合により、リボソームヌクレオチド配列と三重らせんを形成し得る核酸である。三重らせんの形成は、「スイッチバック」核酸分子を作製することによって増強することができる。スイッチバック分子は5'-3'、3'-5'の交互の様式で合成され、その結果、これらは二重鎖の一方の鎖と最初に対合し、次いで他方の鎖と対合して、プリンまたはピリミジンのかなり大きなひと続きが二重鎖の一方の鎖上に存在することの必要性が排除される。
【０１２１】
当業者は、使用するための干渉RNA(RNAi)またはsiRNAリボソームヌクレオチド配列相互作用物質を選択することができる。選択される核酸は場合により、RNAiもしくはsiRNAまたはそのような産物をコードする核酸である。本明細書で使用する「RNAi」という用語は、特定のmRNAの分解を媒介し、また遺伝子発現を低下させるまたは排除するために用いることができる二本鎖RNA(dsRNA)を指す。本明細書で使用する「短鎖干渉核酸」、「siNA」、「短鎖干渉RNA」、「siRNA」、「短鎖干渉核酸分子」、「短鎖干渉オリゴヌクレオチド分子」、または「化学修飾短鎖干渉核酸分子」という用語は、遺伝子に向けられた任意の核酸分子を指す。例えば、siRNAは、例えば配列特異的様式でRNA干渉「RNAi」または遺伝子サイレンシングを媒介することにより、遺伝子発現またはウイルス複製を阻害または下方制御し得る；例えば、Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33；Bass, 2001, Nature, 411, 428-429；Elbashir et al., 2001, Nature, 411, 494-498；ならびにKreutzer et al., 国際PCT公報番号 WO 00/44895；Zernicka-Goetz et al.,国際PCT公報番号 WO 01/36646；Fire,国際PCT公報番号 WO 99/32619；Plaetinck et al.,国際PCT公報番号 WO 00/01846；Mello and Fire,国際PCT公報番号 WO 01/29058；Deschamps-Depaillette,国際PCT公報番号 WO 99/07409；およびLi et al.,国際PCT公報番号 WO 00/44914；Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819；Volpe et al., 2002, Science, 297, 1833-1837；Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218；およびHall et al., 2002, Science, 297, 2232-2237；Hutvagner and Zamore, 2002, Science, 297, 2056-60；McManus et al., 2002, RNA, 8, 842-850；Reinhart et al., 2002, Gene & Dev., 16, 1616-1626；およびReinhart & Bartel, 2002, Science, 297, 1831を参照されたい。siRNAは、毒性を示さない限り、その長さに特に制限はない。修飾RNAiおよびsiRNAの例には、STEALTH(商標)型(Invitrogen Corp.、カリフォルニア州、カールズバッド)、米国特許出願公開第2004/0014956号(出願第10/357,529号)および米国特許出願第11/049,636号(2005年2月2日に出願)に記載されている形態、shRNA、MIR、ならびに本明細書に後述する他の形態が含まれる。
【０１２２】
siNAは、自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子であり得、アンチセンス領域は、標的核酸分子中のヌクレオチド配列またはその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有する。siNAは、2つの別個のオリゴヌクレオチドから構築することができ、この場合、一方の鎖がセンス鎖であり、他方がアンチセンス鎖であり、アンチセンス鎖およびセンス鎖は自己相補的である(すなわち、各鎖が、他方の鎖のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む；アンチセンス鎖およびセンス鎖が二重鎖または二本鎖構造を形成し、例えば二本鎖領域が約19塩基対である場合など)、すなわちアンチセンス鎖は、標的核酸分子中のヌクレオチド配列またはその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス鎖は、標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を含む。または、siNAは単一のオリゴヌクレオチドから構築され、この場合、siNAの自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域は、核酸に基づくかまたは非核酸に基づくリンカーによって連結されている。siNAは、自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域を有する、二重鎖、非対称二重鎖、ヘアピン、または非対称ヘアピン二次構造をもつポリヌクレオチドであり得り、アンチセンス領域は、別個の標的核酸分子中のヌクレオチド配列またはその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有する。siNAは、2つまたはそれ以上のループ構造、ならびに自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域を含むステムを有する環状一本鎖ポリヌクレオチドであり得、アンチセンス領域は、標的核酸分子中のヌクレオチド配列またはその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有し、環状ポリヌクレオチドは、RNAiを媒介し得る活性siNA分子を生じるようにインビボまたはインビトロでプロセシングされ得る。siNAはまた、標的核酸分子中のヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含んでもよく(例えばこの場合、そのようなsiNA分子は、siNA分子中に標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列の存在を必要としない)、一本鎖ポリヌクレオチドは5'-リン酸(例えば、Martinez et al., 2002, Cell, 110, 563-574、およびSchwarz et al., 2002, Molecular Cell, 10, 537-568)を参照されたい)または5',3'-二リン酸などの末端リン酸基をさらに含み得る。特定の態様において、本発明のsiNA分子は別個のセンスおよびアンチセンスの配列または領域を含み、センス領域とアンチセンス領域は、当技術分野において公知のようにヌクレオチドもしくは非ヌクレオチドリンカー分子によって共有結合しているか、または代わりにイオン相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、および/もしくはスタッキング相互作用によって非共有結合している。特定の態様において、本発明のsiNA分子は、標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。別の態様において、本発明のsiNA分子は、標的遺伝子の発現の阻害を引き起こす様���で、標的遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用する。
【０１２３】
2本のRNA鎖が対合するsiRNAの二本鎖RNA部分は、完全に対合した形態に限定されず、ミスマッチ(対応するヌクレオチドが相補的でない)、バルジ(一方の鎖に対応する相補的ヌクレオチドが欠如している)などに起因する非対合部分を含んでもよい。非対合部分は、siRNAの形成を妨げない程度まで含まれ得る。本明細書で使用する「バルジ」は好ましくは非対合ヌクレオチドを1〜2つ含み、2本のRNA鎖が対合するsiRNAの二本鎖RNA領域は、好ましくはバルジを1〜7つ、より好ましくは1〜5つ含む。加えて、本明細書で使用する「ミスマッチ」は、2本のRNA鎖が対合するsiRNAの二本鎖RNA領域中に、好ましくは1〜7つ、より好ましくは1〜5つ含まれる。好ましいミスマッチにおいて、ヌクレオチドの一方はグアニンであり、他方はウラシルである。そのようなミスマッチは、センスRNAをコードするDNAにおけるCからT、GからAへの変異、またはそれらの混合したものに起因するが、特にこれらに限定されるわけではない。さらに、本発明において、2本のRNA鎖が対合するsiRNAの二本鎖RNA領域は、バルジおよびミスマッチの両方を、合計して好ましくは1〜7つ、より好ましくは1〜5つ含んでもよい。siRNAの末端構造は、siRNAがそのRNAi効果により標的遺伝子発現をサイレンシングできる限り、平滑または付着(オーバーハング)のいずれかであってよい。
【０１２４】
本明細書で使用するsiRNA分子は、RNAのみを含む分子に限定される必要はなく、化学修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに包含する。加えて、本明細書で使用するRNAiという用語は、転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、またはエピジェネティクスなどの、配列特異的RNA干渉を記述するために用いられる他の用語に等しいことが意図される。例えば、本発明のsiRNA分子は、転写後レベルまたは転写前レベルの両方において遺伝子を後成的にサイレンシングするために用いることができる。非限定的な例において、本発明のsiRNA分子による遺伝子発現の後成的制御は、siRNAが媒介する、遺伝子発現を変更するクロマチン構造の改変によって起こり得る(例えば、Verdel et al., 2004, Science, 303, 672-676；Pal-Bhadra et al., 2004, Science, 303, 669-672；Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819；Volpe et al., 2002, Science, 297, 1833-1837；Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218；およびHall et al., 2002, Science, 297, 2232-2237を参照されたい)。
【０１２５】
RNAiは、当業者に公知の方法によって設計することができる。一例では、機能性に基づいてRNAi配列、例えば1000個の配列、を分類し、85%を超えるノックダウン活性を有するとして機能性群を分類し、85%未満のノックダウン活性を有するとして非機能性群を分類することにより、siRNAを設計することができる。機能性群および非機能性群の両方に関して、全RNAi標的配列全体に対して塩基組成の分布が算出された。次いで、機能性群および非機能性群の塩基分布の比を用いて、RNAi配列の各位置に関するスコア行列を構築することができる。所与の標的配列について、各位置の塩基をスコア化し、次いですべての位置を掛け合わせたものの対数比を最終スコアとする。このスコアシステムを使用して、機能的ノックダウン活性と対数比スコアに非常に強力な相関関係が見出される可能性がある。標的配列が選択された時点で、Unigeneデータベースに対するfast NCBI blastおよびslow Smith Watermanアルゴリズム検索によりこれにフィルターをかけて、遺伝子特異的RNAiまたはsiRNAを同定することができる。最後の12塩基中に少なくとも1つのミスマッチを有する配列も選択され得る。
【０１２６】
核酸試薬には、例えばdsRNAを生じるように操作されたものも含まれる。そのような核酸分子の例には、転写された際にそれ自体に折り重なって、二本鎖部分を含むヘアピン分子を生じる配列を有するものが含まれる。二本鎖部分の一方の鎖は、サイレンシングしようとする遺伝子から転写されるmRNAのセンス鎖のすべてまたは一部に対応してもよく、二本鎖部分の他方の鎖は、アンチセンス鎖のすべてまたは一部に対応してもよい。dsRNAを生じるその他の方法を用いることも可能であり、例えば、転写された際に、サイレンシングしようとする遺伝子から転写されるmRNAのセンス鎖のすべてまたは一部に対応する第1配列、および、転写された際に、サイレンシングしようとする遺伝子から転写されるmRNAのアンチセンス鎖(すなわち逆相補体)のすべてまたは一部に対応する第2配列を有するように、核酸分子を操作してもよい。
【０１２７】
RNAiを媒介する核酸分子はまた、例えばオリゴヌクレオチド合成によってエクスビボで生成されもよいてもよい。オリゴヌクレオチド合成を用いて、例えばdsRNA分子、および1つまたは複数の化学修飾(例えば、2'-O-メチル、2'-O-エチル、2'-メトキシエトキシ、2'-O-プロピル、2'-フルオロなどの基を含めるなど、核酸分子に通常認められない化学修飾)を有するその他の核酸分子(例えば、RNAiを媒介するその他の核酸分子)を設計することができる。
【０１２８】
いくつかの態様において、遺伝子をサイレンシングするために使用するdsRNAは、サイレンシングしようとする遺伝子に対する配列相同性または配列同一性の領域を1つまたは複数(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つなど)含み得る。相同性および同一性の領域は、約20 bp(塩基対)〜約5 kbp(キロ塩基対)長、20 bp〜約4 kbp長、20 bp〜約3 kbp長、20 bp〜約2.5 kbp長、約20 bp〜約2 kbp長、20 bp〜約1.5 kbp長、約20 bp〜約1 kbp長、20 bp〜約750 bp長、約20 bp〜約500 bp長、20 bp〜約400 bp長、20 bp〜約300 bp長、20 bp〜約250 bp長、約20 bp〜約200 bp長、約20 bp〜約150 bp長、約20 bp〜約100 bp長、約20 bp〜約90 bp長、約20 bp〜約80 bp長、約20 bp〜約70 bp長、約20 bp〜約60 bp長、約20 bp〜約50 bp長、約20 bp〜約40 bp長、約20 bp〜約30 bp長、約20 bp〜約25 bp長、約15 bp〜約25 bp長、約17 bp〜約25 bp長、約19 bp〜約25 bp長、約19 bp〜約23 bp長、または約19 bp〜約21 bp長であってもよい。
【０１２９】
二本鎖領域を有するヘアピン含有分子は、RNAiとして用いることができる。二本鎖領域の長さは、約20 bp(塩基対)〜約2.5 kbp(キロ塩基対)長、約20 bp〜約2 kbp長、20 bp〜約1.5 kbp長、約20 bp〜約1 kbp長、20 bp〜約750 bp長、約20 bp〜約500 bp長、20 bp〜約400 bp長、20 bp〜約300 bp長、20 bp〜約250 bp長、約20 bp〜約200 bp長、約20 bp〜約150 bp長、約20 bp〜約100 bp長、20 bp〜約90 bp長、20 bp〜約80 bp長、20 bp〜約70 bp長、20 bp〜約60 bp長、20 bp〜約50 bp長、20 bp〜約40 bp長、20 bp〜約30 bp長、または約20 bp〜約25 bp長であってもよい。ヘアピンの非塩基対形成部分(すなわちループ)は、ヘアピンの二本鎖部分を構成する2つの相同性領域が相互に折り重なることを可能にする任意の長さのものであり得る。
【０１３０】
上記のプロモーターなどの任意の適切なプロモーターを用いて、核酸試薬からのRNAの産生を制御してもよい。プロモーターは、任意のポリメラーゼ酵素に認識されるものであってもよい。例えば、プロモーターは、RNAポリメラーゼIIまたはRNAポリメラーゼIIIのためのプロモーター(例えば、U6プロモーター、H1プロモーターなど)であってもよい。他の適切なプロモーターには、これらに限定されないが、T7プロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、マウス乳癌ウイルス(MMTV)プロモーター、メタロチオネイン、RSV(ラウス肉腫ウイルス)末端反復配列、SV40プロモーター、ヒト成長ホルモン(hGH)プロモーターが含まれる。他の適切なプロモーターは当業者に公知であり、本発明の範囲内に属する。
【０１３１】
本発明を実施する際に用いられる二本鎖RNAは、大きさが大きく異なり得る。さらに、使用するdsRNAの大きさは、dsRNAと接触させる細胞種に依存する場合が多い。一例として、線虫(C. elegans)およびキイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)の細胞などの動物細胞は、約30ヌクレオチド長よりも大きいdsRNA(すなわち、30ヌクレオチドの二本鎖領域)と接触させた場合に、一般にアポトーシスを起こさないが、哺乳動物細胞は、そのようなdsRNAに曝露された場合、典型的にアポトーシスを起こす。したがって、特定の実験の設計では、使用するdsRNAの大きさを決定する場合が多い。
【０１３２】
多くの例において、本発明の実施において用いられる核酸分子内に含まれる、またはそれによってコードされるdsRNAの二本鎖領域は、以下の範囲の範囲内である：約20〜約30ヌクレオチド、約20〜約40ヌクレオチド、約20〜約50ヌクレオチド、約20〜約100ヌクレオチド、約22〜約30ヌクレオチド、約22〜約40ヌクレオチド、約20〜約28ヌクレオチド、約22〜約28ヌクレオチド、約25〜約30ヌクレオチド、約25〜約28ヌクレオチド、約30〜約100ヌクレオチド、約30〜約200ヌクレオチド、約30〜約1,000ヌクレオチド、約30〜約2,000ヌクレオチド、約50〜約100ヌクレオチド、約50〜約1,000ヌクレオチド、または約50〜約2,000ヌクレオチド。上記の範囲は、二本鎖領域中に存在するヌクレオチドの数を指す。したがって、これらの範囲はdsRNA自体の全長を反映しない。一例として、6ヌクレオチドループを有する全長50ヌクレオチドの単一転写産物から形成される平滑末端dsRNAは、23ヌクレオチドの二本鎖領域を有する。
【０１３３】
上記で示唆した通り、本発明の実施において用いられるdsRNAは平滑末端であってもよく、平滑末端を1つ有してもよく、または両末端にオーバーハングを有してもよい。さらに、1つまたは複数のオーバーハングが存在する場合、オーバーハングは、一端または両端において3'鎖および/または5'鎖上にあってもよい。さらに、これらのオーバーハングは、独立して任意の長さ(例えば、1、2、3、4、5ヌクレオチドなど)であってもよい。一例として、STEALTH(商標) RNAiは両端において平滑末端である。
【０１３４】
RNAiおよびRNAiを産生するもののセットもまた含まれる。そのようなセットには、同じ標的遺伝子に対する複数のdsRNAを(1) 産生するように設計された、または(2) 含むもの、が含まれる。一例として、本発明は、複数のSTEALTH(商標) RNAiが同じ標的遺伝子の異なる領域に対して配列相同性または配列同一性を共有するSTEALTH(商標) RNAiのセットを含む。
【０１３５】
リボソームヌクレオチド配列相互作用物質として、当業者は抗体または抗体断片を作製し、これを使用することができる。抗体は、場合によりIgG、IgM、IgA、IgE、またはこれらのアイソタイプ(例えば、IgG1、IgG2a、IgG2b、またはIgG3)であり、場合よりポリクローナルまたはモノクローナルであり、場合によりそのような抗体のキメラ、ヒト化、または二重特異性型である。特異的抗原と結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体は市販されており、そのような抗体を作製する方法は公知である。一般に、ポリクローナル抗体は、単離された抗原(例えば、本明細書に記載のrDNAまたはrRNA配列)を適切な動物(例えば、ヤギまたはウサギ)に注射し；血液および/または抗原に特異的な抗体を含む動物由来の他の組織を回収し、抗体を精製することによって作製される。モノクローナル抗体を作製する方法は、一般に、単離された抗原を動物(例えば、多くの場合、マウスまたはラット)に注射する段階；動物から脾細胞を単離する段階；脾細胞を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを形成する段階；ハイブリドーマを単離する段階；、および抗原と特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する段階を含む(例えば、Kohler & Milstein, Nature 256:495 497 (1975)、およびStGroth & Scheidegger, J Immunol Methods 5:1 21 (1980))。
【０１３６】
キメラ抗体およびヒト化抗体を作製する方法もまた公知であり(例えば、米国特許第5,530,101号(Queen, et al.)、米国特許第5,707,622号(Fung, et al.)、ならびに米国特許第5,994,524号および第6,245,894号(Matsushima, et al.)を参照されたい)、一般に、1つの種(例えば、マウス)由来の抗体可変領域を別の種(例えば、ヒト)の抗体定常ドメインに移植する段階を含む。抗体の抗原結合領域(例えば、Fab領域)は軽鎖および重鎖を含み、可変領域は軽鎖および重鎖由来の領域から構成される。抗体の可変領域が、重鎖および軽鎖可変領域中の6つの相補性決定領域(CDR)から形成されることを考えれば、1つの抗体に由来する1つまたは複数のCDRを別の抗体のCDRで置換(すなわち、移植)して、キメラ抗体を作製することができる。同様に、ヒト化抗体は、得られた抗体のヒトに投与した際の免疫原性が低くなるように、アミノ酸置換を導入することによって作製される。
【０１３７】
特異的結合試薬は場合により、Fab、Fab'、F(ab)'2、Dab、Fv、または一本鎖Fv(ScFv)断片などの抗体断片であり、抗体断片を作製する方法は公知である(例えば、米国特許第6,099,842号および第5,990,296号ならびにPCT/GB00/04317を参照されたい)。いくつかの態様において、1つまたは複数のハイブリッド中の結合パートナーは一本鎖抗体断片であり、これは場合によっては、組換え分子生物学的過程により、重鎖可変領域と軽鎖可変領域をポリペプチドリンカー(例えば、リンカーは各鎖のC末端またはN末端に付着される)によって連結することにより構築される。そのような断片は、当初のモノクローナル抗体に類似した、抗原に対する特異性および親和性を示す場合が多い。二機能性抗体は場合により、2つの異なる結合特異性を単一の抗体鎖になるよう操作することによって構築され、場合によっては2つのFab'領域を共に連結することによって構築され、この場合、各Fab'領域は異なる抗体に由来する(例えば、米国特許第6,342,221号)。抗体断片は、CDR移植断片またはヒト化断片のような操作された領域を含む場合が多い。特定の態様において、結合パートナーは無傷の免疫グロブリンであり、他の態様において、結合パートナーはFab単量体またはFab二量体である。
【０１３８】
核酸および/または相互作用分子を含む組成物、細胞、および動物
本明細書に記載の核酸を含む組成物を本明細書に提供する。特定の態様において、組成物は、本明細書に記載のヒトリボソームDNAまたはRNAヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸を含む。いくつかの態様において、組成物は薬学的に許容される担体を含んでもよく、組成物は場合により核酸、および核酸中のヒトリボソームヌクレオチド配列に結合する(例えば、ヌクレオチド配列に特異的に結合する)化合物を含む。特定の態様において、化合物は、本明細書に記載する化合物のようなキノロン類似体である。
【０１３９】
提供する他の組成物は、細胞内でリボソームRNAを合成する複合体の成分または成分の断片と結合している化合物を含み、化合物はキノロン類似体である。キノロン類似体は場合によっては式3または3Aのものであり、場合によっては式2または2A〜2Dのものである。成分は場合により、UBF、TBP、TAF 48、TAF 63、TAF 110、およびRNAポリメラーゼIサブユニットからなる群より選択される。そのような成分の配列は公知であり、アクセッション番号(HUGO Gene Nomenclature Committee)によって示される配列の例を以下の表に示す。
2009504192.tif 000035
【０１４０】
プロテインキナーゼまたはその断片と結合している化合物を含む組成物もまた提供し、化合物はキノロン類似体である。プロテインキナーゼは場合により、MAPキナーゼ、mTOR、またはPI3キナーゼ経路のメンバーである。特定の経路のメンバーには、(a) 指定のプロテインキナーゼによって直接もしくは間接的にリン酸化される、(b) 指定のプロテインキナーゼを直接もしくは間接的にリン酸化する、または(c) 指定のプロテインキナーゼもしくはそのアイソフォームであるプロテインキナーゼ、が含まれる。間接的リン酸化事象は以下によって例証され得る：特定のプロテインキナーゼによって間接的にリン酸化されるタンパク質は、第2プロテインキナーゼによって最初にリン酸化される第1プロテインキナーゼによってリン酸化され得、経路中にはかなり多くの介在プロテインキナーゼが存在し得る。特定の態様において、プロテインキナーゼは細胞周期制御プロテインキナーゼ(例えば、cdk2またはcdk4などのサイクリン依存性プロテインキナーゼ)もしくはRSKプロテインキナーゼ(例えば、RSK 1α、RSK 1β、またはRSK 2)であり、またはカゼインプロテインキナーゼであり、またはAKTプロテインキナーゼ(例えば、AKT 1、2、または3)である。プロテインキナーゼは場合により、ABL、S6K、Tie、TrkA、ZIPK、Pim-1、SAPK、Flt3、およびDRK3プロテインキナーゼからなる群より選択される。複数のプロテインキナーゼの配列が公知であり、アクセッション番号(HUGO Gene Nomenclature Committee)によって示される配列の例を以下の表に示す。
2009504192.tif 000036
【０１４１】
核酸およびそれに結合しているキノロン化合物を含む組成物もまた提供し、核酸はヒトリボソーム核酸ヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、ヒトリボソーム核酸ヌクレオチド配列は、核酸構造を形成するポリヌクレオチド配列を含み、場合によって化合物は核酸構造に結合する。任意の核酸構造を用いることができ、核酸構造は、四重鎖、ヘアピン、らせん、同軸らせん、テトラループ受容体、Aマイナーモチーフ、キッシング(kissing)ヘアピンループ、tRNA Dループ:Tループ、シュードノット、デオキシリボーズジッパー、およびリボースジッパーからなる群より選択され得る。特定の態様において、核酸構造は、G-四重鎖などの分子内四重鎖である。そのような組成物中の化合物は場合によっては式3また3Aのものであり、場合によっては2または2A〜2Dのものである。特定の態様において、リボソーム核酸はrRNAであり、場合によってはrDNAである。
【０１４２】
本明細書に記載の単離された核酸を含む細胞または動物もまた提供する。任意の種類の細胞を用いることができ、場合により細胞は、組織培養で維持されるかまたは増殖させる細胞株である。単離された核酸は、研究動物(例えば、げっ歯類(例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ)、有蹄動物(例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ)、ネコ、イヌ、サル、または類人猿)などの動物の1つまたは複数の細胞に取り込まれ得る。化合物および他の分子を細胞に挿入する方法は、本明細書で後述する方法においてなど、当業者に公知である。
【０１４３】
細胞は、本明細書に記載のリボソームヌクレオチド配列を過剰発現または低発現し得る。種々の様式で細胞を処理することができる。例えば、当業者は、細胞試薬から溶解物を調製すること、および任意に細胞の成分を単離または精製することができ、細胞に核酸試薬をトランスフェクションすることができ、解析(例えば、顕微鏡による解析)のために細胞試薬をスライドに固定することができ、また細胞を固相に固定化することができる。リボソームヌクレオチド配列を「過剰発現」する細胞は、遺伝子改変されていない、および/または細胞増殖性疾患の明白な症状を示さない生物由来の天然細胞と比較して、少なくとも2、3、4、もしくは5倍またはそれ以上の産物を産生する。過剰発現細胞は、リボソームヌクレオチド配列をコードする核酸を安定してトランスフェクションされ得るか、または一過性にトランスフェクションされ得る。リボソームヌクレオチド配列を「低発現」する細胞は、遺伝子改変されていないおよび/または細胞増殖性疾患の明白な症状を示さない生物由来の天然細胞と比較して、少なくとも5倍少ない産物を産生する。いくつかの態様において、リボソームヌクレオチド配列を低発現する細胞は、そのような産物をコードし得る核酸を含まず(例えば、細胞はノックアウトマウスに由来する)、検出可能な量の産物が産生されない。ノックアウト動物を作製する方法、およびそこから抽出された細胞を使用する方法は公知である(例えば、Miller et al., J. Cell. Biol. 165: 407-419 (2004))。リボソームヌクレオチド配列を低発現する細胞は、例えば場合により、阻害剤の非存在下で細胞によって産生される産物の量を阻止するまたは減少させる核酸阻害剤と接触させられる。過剰発現または低発現細胞は、生物内(インビボ)にあってもまたは生物由来(エクスビボまたはインビトロ)であってもよい。
【０１４４】
当業者は、本発明の細胞組成物(例えば、リボソームヌクレオチド配列を過剰発現または低発現する細胞)を作製するために任意の細胞を選択することができる。細胞には、これらに限定されないが、細菌細胞(例えば、DH10B、Stbl2、DH5-α、DB3、例えばDB3.1、DB4、DB5、JDP682、およびccdA-over(例えば、米国特許出願第09/518,188号)などのエシェリキア属(Escherichia)種細胞(例えば、Expressway(商標) HTP Cell-Free E. coli Expression Kit、カリフォルニア州、Invitrogen)、バチルス属(Bacillus)種細胞(例えば、枯草菌(B. subtilis)および巨大菌(B. megaterium)細胞)、ストレプトマイセス属(Streptomyces)種細胞、エルウィニア属(Erwinia)種細胞、クレブシエラ属(Klebsiella)種細胞、セラチア属(Serratia)種細胞(特に、霊菌(S. marcessans)細胞)、シュードモナス属(Pseudomonas)種細胞(特に、緑膿菌(P. aeruginosa)細胞)、およびサルモネラ属(Salmonella)種細胞(特に、ネズミチフス菌(S. typhimurium)およびチフス菌(S. typhi)細胞))；光合成細菌(例えば、緑色非硫黄細菌(例えば、クロフレクサス属(Choroflexus)種(例えば、C. オーランティアカス(C. aurantiacus))、クロロネマ属(Chloronema)種(例えば、C. ギガテウム(C. gigateum)))、緑色硫黄細菌(例えば、クロロビウム属(Chlorobium)種(例えば、C. リミコラ(C. limicola))、ペロディクチオン属(Pelodictyon)種(例えば、P. ルテオラム(P. luteolum)))、紅色硫黄細菌(例えば、クロマチウム属(Chromatium)種(例えば、C. オケニイ(C. okenii)))、および紅色非硫黄細菌(例えば、ロドスピリラム属(Rhodospirillum)種(例えば、R. ルブラン(R. rubrum))、ロドバクター属(Rhodobacter)種(例えば、R. スファエロイデス(R. sphaeroides)、R. カプスラタス(R. capsulatus))、ロドミクロビウム属(Rhodomicrobium)種(例えば、R. バネリイ(R. vanellii)))；酵母細胞(例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)細胞およびピキア・パストリス(Pichia pastoris)細胞)；昆虫細胞(例えば、ショウジョウバエ属(Drosophila)種(例えば、キイロショウジョウバエ)、スポドプテラ属(Spodoptera)(例えば、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda) Sf9およびSf21細胞)、およびトリコプルサ属(Trichoplusa)(例えば、High-Five細胞))；線形動物細胞(例えば、線虫細胞)；鳥類細胞；両生類細胞(例えば、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)細胞)；爬虫類細胞；および哺乳動物細胞(例えば、NIH3T3、293、CHO、COS、VERO、C127、BHK、Per-C6、Bowes黒色腫、およびHeLa細胞)が含まれる。特定の態様において、細胞は膵臓細胞、結腸直腸細胞、腎細胞、またはバーキットリンパ腫細胞である。いくつかの態様においては、PC3、HCT116、HT29、MIA Paca-2、HPAC、Hs700T、Panc10.05、Panc 02.13、PL45、SW 190、Hs 766T、CFPAC-1、およびPANC-1などの膵臓細胞株が用いられる。これらおよびその他の適切な細胞は、例えば、Invitrogen Corporation(カリフォルニア州、カールズバッド)、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)(バージニア州、マナッサス)、およびアグリカルチュラル・リサーチ・カルチャー・コレクション(Agricultural Research Culture Collection)(NRRL；イリノイ州、ピオリア)から市販されている。
【０１４５】
リボソームヌクレオチド配列および相互作用分子の使用
リボソームヌクレオチド配列相互作用分子は、場合によっては細胞応答をもたらすために用いられ、いくつかの態様においては治療応答をもたらすために用いられる。したがって、細胞におけるrRNA合成を阻害する方法であって、細胞を、細胞におけるrRNA合成を減少させるのに十分な量の、rRNAまたはrDNAと相互作用する化合物と接触させる段階を含む方法を本明細書に提供する。そのような方法は、インビトロ、インビボ、および/またはエクスビボで行うことができる。したがって、いくつかのインビボおよびエクスビボ態様は、対象の細胞におけるrRNA合成を阻害する方法であって、rRNAまたはrDNAと相互作用する化合物を、それを必要とする対象に、対象の細胞におけるrRNA合成を減少させるのに十分な量投与する段階を含む方法に向けられる。いくつかの態様においては、細胞を1つまたは複数の化合物と接触させることができ、そのうちの1つまたは複数がrRNAまたはrDNAと相互作用する(例えば、一薬物または薬物および共薬物方法)。特定の態様において、化合物は、本明細書に記載のキノロン誘導体(例えば、式A-1またはB-1の化合物)のようなキノロン誘導体である。細胞は多くの場合、例えば、通常よりも高い増殖を起こしている細胞および腫瘍細胞などの癌細胞である。
【０１４６】
いくつかの態様においては、細胞に他の効果をもたらす1つまたは複数の他の治療(例えば、腫瘍摘出手術および/または放射線療法)および/または他の分子(例えば、共薬物)と組み合わせて、細胞をrRNAまたはrDNAと相互作用する化合物と接触させる。例えば、細胞増殖を減少させる、または組織炎症を軽減する共薬物が選択され得る。当業者は、併用アプローチにおいて、多種多様な共薬物を選択し投与することができる。共薬物の非限定的な例には、アバスチン、ダカルバジン(例えば、多発性骨髄腫)、5-フルオロウラシル(例えば、膵癌)、ゲムシタビン(例えば膵癌)、およびグリーバック(例えば、CML)が含まれる。
【０１４７】
本明細書で使用する「rRNA合成を阻害すること」という用語は、細胞を化合物と接触させた後、または化合物を対象に投与した後に、細胞によって産生されるrRNAの量を減少させることを指す。特定の態様においては、細胞を化合物と接触させた後、または化合物を対象に投与した後の特定の細胞において、rRNAレベルは、約1時間、約2時間、約3時間、約4時間、約5時間、約6時間、約7時間、約8時間、約9時間、約10時間、約12時間、約16時間、約20時間、または約24時間といった特定の時間枠内で、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約70%、約75%、約80%、約90%、もしくは約95%またはそれ以上減少する。rRNAレベルを減少させる特定の細胞は、場合により、癌細胞または系中の他の細胞よりも速い速度で増殖を起こしている細胞である。細胞中のrRNAのレベルは、インビトロおよびインビボで決定することができる(例えば、実施例の項を参照されたい)。特定の態様において、DNA複製もタンパク質翻訳も実質的に阻害することなく、rRNA合成は阻害される。後者の態様において、DNA複製および/またはタンパク質翻訳は、特定の細胞において最大で10%減少した場合、実質的な減少とはなり得ない。
【０１４８】
本明細書で使用する「rRNAと相互作用すること」という用語は、化合物とrRNAの直接的相互作用または間接的相互作用を指す。いくつかの態様において、化合物は、本明細書に記載のヌクレオチド配列領域などのrRNAに直接結合してよい。特定の態様において、化合物は、特定のrRNAをコードするrDNAヌクレオチド配列(例えば、本明細書に記載のrDNA配列)に直接結合してよい。特定の態様において、化合物は、rRNAまたはrDNA中の四重鎖構造に結合し得り、かつ/またはそれを安定化し得る。いくつかの態様において、化合物は、例えばrRNA合成に関与するタンパク質、rRNA伸長に関与するタンパク質(例えば、Pol IもしくはPol IIIなどのポリメラーゼ、またはヌクレオリンタンパク質)、rRNA前駆体プロセシングに関与するタンパク質(例えば、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、RNAヘリカーゼ)、またはリボソーム生合成に関与するタンパク質(例えば、リボソームサブユニットタンパク質、またはリボソームサブユニットへのrRNAの負荷を促進するタンパク質)のような、rRNAまたはrDNAヌクレオチド配列に結合する、またはそれと相互作用するタンパク質に直接結合してよい。
【０１４９】
特定の態様において、細胞を本明細書に記載のヒトリボソームヌクレオチド配列および/または構造に結合する化合物と接触させることによって細胞応答をもたらす方法もまた提供する。細胞応答は場合により、(a) H2AX、p53、chk1、およびp38 MAPKタンパク質の実質的リン酸化；(b) ヌクレオリンの核小体から核質への再分布；(c) リソソームからのカテプシンDの放出；(d) アポトーシスの誘導；(e) 染色体ラダー化の誘導；(f) 細胞周期進行を実質的に停止させることのないアポトーシスの誘導；ならびに/または(g) アポトーシスの誘導および細胞周期停止の誘導(例えば、S期および/またはG1停止)である。
【０１５０】
本明細書で用いる「実質的リン酸化」という用語は、リン酸部分に連結された特定の種類のタンパク質または断片の1つまたは複数の部位を指す。特定の態様において、リン酸化は検出可能な場合に実質的であり、いくつかの態様においては、特定の種類のタンパク質または断片の約55%〜99%がリン酸化されているか、または特定の部位でリン酸化されている場合に、リン酸化は実質的である。特定のタンパク質は場合により、H2AX、DNA-PK、p53、chk1、JNK、およびp38 MAPKタンパク質、または1つもしくは複数のリン酸化部位を含むそれらのタンパク質である。そのようなタンパク質のリン酸化を検出する方法を本明細書に記載する。
【０１５１】
本明細書で使用する「アポトーシス」という用語は、内因性の細胞自己破壊または自殺プログラムを指す。細胞は誘因刺激に応答して、細胞収縮、細胞膜の気泡形成、ならびに染色体の凝縮および断片化を含む事象のカスケードを起こす。これらの事象の結果、細胞は膜結合性粒子(アポトーシス小体)のクラスターへと変換され、その後これはマクロファージによって貪食される。染色体DNAは多くの場合、アポトーシスを起こしている細胞において切断され、その結果、細胞DNAをゲル電気泳動によって解析した場合にラダーが可視化される。アポトーシスは、場合により、カスパーゼS活性などのカスパーゼ活性を検出することによって、およびホスファチジルセリンの移行をモニターすることによって、モニターされる。本明細書に記載する方法は、非癌細胞よりも、腫瘍における癌細胞などの癌細胞のアポトーシスを優先的に誘導するように設計される。
【０１５２】
本明細書で使用する「細胞周期進行」という用語は、細胞が分裂し増殖する過程を指す。有糸分裂および間期など、細胞周期進行の特定の期が認識されている。間期内にはG1期、S期、およびG2期などのサブ期が存在し、有糸分裂内には前期、中期、後期、終期、および細胞質分裂などのサブ期が存在する。細胞周期進行は場合により、細胞周期の特定の期で実質的に停止する(例えば、集団中の約90%の細胞が、G1期またはS期などの特定の期で停止する)。いくつかの態様において、細胞周期進行は場合により、周期の任意の1つの期で有意に停止しない。例えば、細胞の亜集団は、細胞周期のS期で実質的に停止し得、細胞の別の亜集団は、細胞周期のG1期で実質的に停止し得る。特定の態様において、細胞周期は、細胞周期の任意の特定の期で実質的に停止しない。停止の決定は多くの場合、約4時間、約8時間、約12時間、約16時間、約20時間、約24時間、約36時間、または約48時間といった1つまたは複数の特定の時点で行われ、アポトーシスはこれらの時点中に、またはこれらの時点までに起こってしまっていてもよく、または起こっている最中であってもよい。
【０１５３】
「ヌクレオリンの再分布」という用語は、タンパク質ヌクレオリンまたはその断片の核小体から核質などの細胞の別の部分への移行を指す。異なる種類のヌクレオリンが存在し、これについて本明細書に記載する。別の細胞区画(例えば、核小体)中に検出可能なレベルのヌクレオリンが存在する場合に、ヌクレオリンは場合によって核小体から分布される。ヌクレオリンを検出する方法は公知であり、これについて本明細書に記載する。いくつかの態様において、ヌクレオリンが再分布される細胞の核小体は、未処理の細胞におけるヌクレオリンの約55%〜約95%を含み得る。ヌクレオリンが実質的に再分布される細胞の核小体は、未処理の細胞におけるヌクレオリンの約5%〜約50%を含み得る。
【０１５４】
特定の態様において、細胞成分と相互作用するリボソーム核酸中の特定のヌクレオチド配列は、染色体免疫沈降法(ChIP)などの当技術分野で公知の方法により決定される。ChIPアッセイはまた、どの細胞成分が染色体DNA中の特定のヌクレオチド配列と複合体形成しているかを決定するのにも有用であり得る。一般的にChIPアッセイにおいては、染色体DNAをそれと複合化している分子に架橋し、架橋された産物を断片化する。これらの段階中または段階後に、クロマチンを1つまたは複数の抗原結合剤と接触させ、この段階の前または後に断片を分離する。このような技法を用いて、抗原結合剤と相互作用する特定の分子と複合体形成しているヌクレオチド配列を決定することができる。ChIPアッセイ手順は公知である(例えば、www.protocol-online.org/prot/Molecular_Biology/Protein/Immunoprecipitation/Chromatin_Immunoprecipitation_ChIP_Assay_/におけるhttpアドレス)。
【０１５５】
可逆的または非可逆的な結合をもたらす適切な化学的リンカーを用いて、分子を架橋する(例えば、Orlando, et al., Methods 11:205-214 (1997)を参照されたい)。1つの態様では、ホルムアルデヒドが可逆的架橋剤として用いられる(例えば、Johnson & Bresnick, Methods 26:27-36 (2002)を参照されたい)。架橋剤は多くの場合、生物または細胞(例えば、破壊されていない細胞)と接触させ、場合によっては細胞溶解物と接触させる。1つの態様においては、細胞を架橋剤と接触させ、次いで細胞を溶解する。細胞は多くの場合、架橋剤に曝露する前に、以前に記載されている特定の分子または条件(例えば、有機小分子もしくは無機小分子または電離放射線)に曝露される。架橋剤は、多くの場合に細胞または試料中の隣接した分子を相互に連結し、その結果、試料中の分子抗原は場合によって相互に直接架橋され、場合によっては相互に間接的に架橋され、その場合、1つまたは複数の非抗原分子が介在する。
【０１５６】
架橋試料を調製した後、多くの場合には、架橋されたクロマチンDNAを、例えば超音波処理または針およびシリンジを通した剪断などの適切な過程により断片化する。超音波処理を用いると、多くの場合に約500〜約1000塩基対長のクロマチン断片が得られる。いくつかの態様においては、架橋されたクロマチンを他の試料成分から分離した後に断片化を行い、場合によっては、断片化されたクロマチンを他のアッセイ成分から分離した後に、クロマチン断片を抗原結合剤と接触させる。架橋されたクロマチンまたはクロマチン断片は、例えば密度遠心分離、ゲル電気泳動、またはクロマトグラフィーなどの適切な過程により、他の試料成分から分離される。
【０１５７】
クロマチン(例えば、架橋されたクロマチン、断片化されたクロマチン、または架橋され断片化されたクロマチン)を、1つまたは複数の抗原結合剤と接触させる。抗原結合剤は、染色体DNAに架橋された細胞成分中の抗原(例えば、タンパク質(例えば、転写因子、ポリメラーゼ、ヒストン))、または染色体DNA自体の成分(例えば、染色体DNA中に取り込まれたBrdU)に特異的に結合する。抗原結合剤は多くの場合に、クロマチンと結合している分子抗原を検出するのに有用であり、かつ/または系中の他の非架橋成分から架橋されたクロマチンを分離するのに(例えば、種々の大きさの架橋された染色体を相互に分離するのに)有用である。この段階は断片化の前または後に行ってもよく、また断片を分離する前または後に行ってもよい。抗原結合剤は場合により抗体または抗体断片であり、例えば、細胞内でリボソームRNAを合成する複合体の成分に特異的に結合する抗体などである。そのような抗体は、例えばUBF、TBP、TAF 48、TAF 63、TAF 110、もしくはRNAポリメラーゼIサブユニットに特異的に結合してもよく、またはヌクレオリン、フィブララリン、もしくはRecQ、または前記タンパク質の一部に特異的に結合してもよい。抗原結合剤は、例えば標識二次抗体を用いて検出する、または抗原結合剤自体に連結された標識を検出するなど、任意の簡便な公知の方法を用いて検出することができる。酵素標識(例えば、ペルオキシダーゼ)、蛍光標識、および光散乱標識などの適切な標識の例は公知であり、当業者は入手が可能である。
【０１５８】
特定の細胞成分が特定の染色体ヌクレオチド配列と複合化しているかどうかの決定は、ChIPによって評価することができる。そのような態様においては、染色体DNAを、(1) 関心対象のヌクレオチド配列を特異的に検出するヌクレオチド配列結合剤(例えば、検出可能な標識に連結されたハイブリダイゼーションプローブ)、および(2) 関心対象の細胞成分に特異的に結合する検出可能な抗原結合剤、と接触させることができる。後者の態様では、共局在する配列結合剤および抗原結合剤を検出することによって、特定のヌクレオチド配列が関心対象の細胞成分と複合化していることが決定される(例えば、単一の、分離および架橋された染色体DNA断片上におけるこれらの物質の同時検出)。架橋された染色体DNAにおいて、2つの分子抗原が相互に近接しているかどうかを決定することができる。この解析は、複合化している抗原に相互に近接して結合した場合に検出可能なシグナルを生じる2つの抗原結合剤と染色体DNAを接触させることによって行うことができる。そのような抗原結合剤の例は、例えば、第1オリゴヌクレオチドに連結された第1抗体、および第1オリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る第2オリゴヌクレオチドに連結された第2抗体のような、それぞれ結合対の1つのメンバーに連結された異なる抗体の対である。後者の例では、第1オリゴヌクレオチドおよび第2オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション産物を、PCRによって検出することができる(例えば、WO 2005/074417)。抗原結合剤は、抗原結合剤ならびにそれと複合体形成しているDNAおよび他の分子の分離を可能にするビーズまたは他の固相への結合のように、分離を容易にする分子に連結させてもよい。抗原結合剤は、分離を容易にする物質に直接連結させても(例えば、共有結合または非共有結合性の直接結合)、または間接的に連結させてもよい(例えば、ビーズに直接連結された二次抗体を介して、またはビオチン-ストレプトアビジン結合を介して)。
【０１５９】
抗原結合剤/クロマチンDNA複合体を分離する態様に関しては、その後の段階を行う場合が多い。例えば、場合により、固定化伸長産物を、伸長産物と結合しているタンパク質を消化する物質(例えば、抗原タンパク質および抗体などの結合パートナータンパク質を消化するプロナーゼなどのプロテアーゼ)で処理する。いくつかの態様では、標準的な技法(例えば、試料の加熱)により架橋を逆転させ、以前に記載されている通りに伸長産物成分を相互に分離する。特定の態様においては、抗原結合剤と結合している1つまたは複数のクロマチンDNA断片を、標準的な技法を用いて(例えば、TOPO(登録商標)クローニングプラスミドを用いて)配列決定する。
【０１６０】
したがって、特定の態様において、1つまたは複数の細胞成分に架橋された染色体DNA、ならびにヌクレオリン、フィブリラリン、および/またはRecQに特異的に結合する抗原結合剤を含む組成物を提供する。特定の態様において、1つまたは複数の細胞成分に架橋された染色体DNA、およびUBF、TBP、TAF 48、TAF 63、TAF 110、またはRNAポリメラーゼIサブユニットに特異的に結合する抗原結合剤を含む組成物もまた提供する。そのような組成物は場合により、式3もしくは3A、または式2もしくは2A〜2Dの類似体のようなキノロン類似体を含む。特定の態様において、染色体DNAは染色体断片である。染色体DNAまたはDNA断片は場合により、本明細書に記載のリボソームヌクレオチド配列のようなリボソーム核酸ヌクレオチド配列を含む。リボソームヌクレオチド配列は、四重鎖構造(例えば、分子内平行型または混合平行型構造)を形成する可能性があるか、または形成することができる。
【０１６１】
いくつかの態様において、リボソーム核酸ヌクレオチド配列と複合体形成している特定の細胞成分と複合体形成しているリボソーム核酸ヌクレオチド配列を決定する方法であって、1つまたは複数の細胞成分に架橋された染色体DNAまたはその断片を、特定の細胞成分に特異的に結合する抗原結合剤と接触させる段階；および特定の細胞成分に架橋された染色体DNAまたはその断片の配列決定を行う段階を含み、それによってリボソーム核酸ヌクレオチド配列が決定される方法を提供する。特定の細胞成分は場合により、ヌクレオリン、フィブリラリン、またはRecQであり、いくつかの態様においてはUBF、TBP、TAF 48、TAF 63、TAF 110、またはRNAポリメラーゼIサブユニットであってもよい。そのような方法は場合により、式3もしくは式3Aまたは式2もしくは2A〜2Dの類似体のようなキノロン類似体と染色体DNAを接触させる段階を含む。いくつかの態様において、染色体DNAは染色体断片である。特定の態様においては、特異的結合剤と結合している断片を他の断片から分離し、場合によっては特異的結合剤と結合している断片を、結合剤に連結されている検出可能な標識によって検出する。場合によっては、抗原結合剤をビーズなどの固相に連結し、場合によっては検出可能な標識に連結する。
【０１６２】
細胞アポトーシスを誘導する方法であって、細胞アポトーシスを誘導するのに有効な量の化合物と細胞を接触させる段階を含み、化合物がプロテインキナーゼと相互作用し、細胞内でリボソームRNAを合成する複合体の成分と相互作用する方法もまた本明細書に提供する。特定の態様において、化合物はプロテインキナーゼおよび成分に結合する。プロテインキナーゼは場合により、マイトジェン活性化プロテイン(MAP)キナーゼ、mTOR、またはPI3キナーゼ経路のメンバーである。特定の態様において、プロテインキナーゼは細胞周期制御プロテインキナーゼであり、RSKプロテインキナーゼであり、カゼインキナーゼであり、AKTプロテインキナーゼであり、またはABL、S6K、Tie、TrkA、ZIPK、Pim-1、SAPK、Flt3、およびDRAKプロテインキナーゼからなる群より選択される。成分は場合により、UBF、TBP、TAF 48、TAF 63、TAF 110、およびRNAポリメラーゼIサブユニットからなる群より選択される。いくつかの態様において、化合物は、静止細胞よりも優先的に増殖細胞のアポトーシスを誘導する。化合物は場合により、式3または3A(例えば、式A-1)の化合物のようなキノロン類似体である。
【０１６３】
細胞アポトーシスを誘導する方法であって、細胞アポトーシスを誘導するのに有効な量の化合物と細胞を接触させる段階を含み、化合物がリボソームDNAの核酸構造と相互作用する方法もまた提供する。核酸構造は、いくつかの態様において、ヌクレオリン、フィブララリン、またはRecQと相互作用し得る分子内四重鎖構造である。化合物は場合により、式3もしくは3A、または式2もしくは2A〜2Dの化合物のようなキノロン類似体である。
【０１６４】
細胞アポトーシスを誘導する方法であって、細胞アポトーシスを誘導するのに有効な量の化合物と細胞を接触させる段階を含み、化合物がヌクレオリン、フィブリラリン、および/またはRecQと相互作用するリボソーム核酸の領域と相互作用する方法もまた提供する。ヌクレオリン、フィブリラリン、および/またはRecQと相互作用するリボソーム核酸の領域は、四重鎖構造を含み得る。化合物は場合により、式3もしくは3A、または式2もしくは2A〜2Dの化合物のようなキノロン類似体である。リボソーム核酸は場合によりrRNAであり、またはrDNAであってもよい。
【０１６５】
図6Aおよび6Bに記載の細胞シグナル経路により、rRNA生合成を阻害する併用療法を選択し、ひいては細胞増殖を阻害することが可能になった。1つの態様において、併用治療薬は、プロテインキナーゼ阻害剤、サイクリン活性化因子、腫瘍抑制因子活性化因子、およびリボソーム生合成阻害剤からなる群より選択される2つまたはそれ以上のクラスに由来する2つまたはそれ以上の分子を含む組成物である。各クラスに由来する単一分子治療薬よりも有効性および毒性の低い、2つまたはそれ以上のクラスに由来する分子を選択することができ、それらを併用することで各単一分子治療薬と同程度かまたはそれよりも優れた有効性が得られ、かつ毒性はより低いことから、そのような併用治療薬は単一分子治療薬よりも有利であり得る。そのような併用治療薬態様における「阻害剤」という用語は、標的の触媒活性(ホスホリル転移またはヌクレオチドの重合)を減少させるか、または標的が細胞結合パートナーと相互作用する可能性を減少させる分子を指す。特定の態様において、リボソーム生合成阻害剤は、ポリメラーゼI複合体の2つまたはそれ以上の成分間の相互作用を阻害する。いくつかの態様において、ポリメラーゼI複合体の成分の1つまたは複数は、UBF、SL1、RRN3、TIF1A、TBP、TAF 48、TAF 63、TAF 110、およびRNAポリメラーゼIサブユニットからなる群より選択される。1つの態様において、リボソーム生合成阻害剤は、ポリメラーゼI複合体の成分とrDNAとの間の相互作用を阻害する。特定の態様において、リボソーム生合成阻害剤は、rRNA転写産物の成熟rRNAへのプロセシングを阻害する。いくつかの態様において、プロテインキナーゼ阻害剤は、プロテインキナーゼの触媒活性を阻害し、かつ/またはプロテインキナーゼとリボソーム生合成をもたらす経路においてそれと相互作用するタンパク質との間の相互作用を阻害し得る。特定の態様において、プロテインキナーゼ阻害剤は、ポリメラーゼI活性を制御する経路中のプロテインキナーゼを阻害し、場合によってプロテインキナーゼは、mTOR、S6K、ERK-MAPK、PI3K、AKT、CDK2/4、CK2、CDK7、8、9、およびUCK2からなる群より選択される。特定の態様において、サイクリン活性化因子は、ポリメラーゼI複合体を制御する経路中のサイクリンを活性化し、場合によりサイクリン活性化因子はCdk1/サイクリンB相互作用活性化因子である。いくつかの態様において、腫瘍抑制因子活性化因子は、ポリメラーゼI制御に関与する腫瘍抑制因子を活性化し、場合によっては、p53、PTEN、およびRbからなる群より選択される。特定の態様において、組成物はリボソーム生合成阻害剤を含む。場合により、組成物はリボソーム生合成阻害剤およびプロテインキナーゼ阻害剤を含むか、または本質的にそれらからなる。上記の阻害剤および活性化因子の例は公知である。例えば、リボソーム生合成の阻害剤(例えば、化合物A-1)；サイクリン依存性プロテインキナーゼ(例えば、Flavopiridol、BSM-387032、Roscovitine、およびUCN-01)；MEK(例えば、PD-0325901、CI-1040、およびAZD6244)；CK2(例えば、CIGB-300)；mTOR(例えば、AP23573；CCI-779；ラパマイシン/シロリムス；およびSL0101)；およびPI3K(例えば、SF1126)が公知である。
【０１６６】
候補分子または核酸は製剤または薬物として調製することができ、治療薬として使用することができる。いくつかの態様において、疾患を治療する方法であって、本明細書に記載の方法によって同定された分子を対象に、疾患を治療するのに有効な量投与する段階を含み、分子の投与によって疾患が治療される方法を提供する。本明細書内で使用する「治療すること」、「治療」、および「治療効果」という用語は、疾患または状態の症状を改善する、緩和する、軽減する、および除去することを指す。候補分子または核酸は、製剤または薬物中に治療有効量で存在してもよく、その量は、例えば、特定の細胞もしくは組織(例えば、癌細胞および腫瘍)におけるリボソーム生合成の減少、特定の細胞(例えば、癌細胞)のアポトーシス、特定の細胞の増殖の減少などの生物学的効果をもたらし得るか、または疾患もしくは状態の症状の改善、緩和、軽減、もしくは除去をもたらし得る量である。遺伝子療法、アンチセンス療法、およびsiRNAまたはRNAi療法などにおける核酸候補分子を含むいくつかの態様において、核酸は宿主ゲノムに組み込まれてもよいし、組み込まれなくてもよい。候補分子の任意の適切な製剤を、投与用に調製することができる。経口、非経口、静脈内、筋肉内、経皮、局所、および皮下経路を含むがこれらに限定されない、任意の適切な投与経路を用いることができる。対象は、げっ歯類(例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ)、有蹄動物(例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ)、魚類、鳥類、爬虫類、ネコ、イヌ、有蹄動物、サル、類人猿、またはヒトであってもよい。
【０１６７】
候補分子が安定した非毒性の酸性塩または塩基性塩を形成するのに十分に塩基性または酸性である場合には、塩として候補分子を投与することが適切であると考えられる。薬学的に許容される塩の例は、生理学的に許容される陰イオンを形成する酸と共に形成される有機酸付加塩であり、例えばトシラート、メタンスルホン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、α-ケトグルタル酸塩、およびα-グリセロリン酸塩である。塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、重炭酸塩、および炭酸塩を含む適切な無機塩もまた形成され得る。薬学的に許容される塩は、例えば、アミンなどの十分に塩基性の候補分子を生理学的に許容される陰イオンを生成する適切な酸と反応させるなど、当技術分野で周知の標準的な手順を用いて得ることができる。カルボン酸のアルカリ金属(例えば、ナトリウム、カリウム、またはリチウム)塩、またはアルカリ土類金属(例えば、カルシウム)塩もまた作製される。
【０１６８】
いくつかの態様において、候補分子は、不活性希釈剤または吸収性の可食担体などの薬学的に許容される媒体と組み合わせて全身(例えば、経口)投与される。候補分子は、硬ゼラチンもしくは軟ゼラチンカプセルに封入するか、錠剤に圧縮するか、または患者食の食材に直接組み込むことができる。経口治療投与では、活性候補分子を1つまたは複数の賦形剤と混合し、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ、オブラートなどの形態で使用することができる。このような組成物および調製物は、少なくとも0.1%の活性候補分子を含むべきである。組成物および調製物の割合は様々であってもよく、都合のよいことには所与の単位剤形の約2〜約60重量%であってもよい。このような治療上有用な組成物中の活性候補分子の量は、有効な投与量レベルが得られるような量である。
【０１６９】
錠剤、トローチ、丸剤、カプセルなどは、以下のものもまた含み得る。トラガカントゴム、アカシア、コーンスターチ、またはゼラチンなどの結合剤；第二リン酸カルシウムなどの賦形剤；コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；およびスクロース、フルクトース、ラクトース、もしくはアスパルテームなどの甘味剤；またはペパーミント、ウィンターグリーン油、もしくはチェリー香味料などの香味剤を添加してもよい。単位剤形がカプセルである場合には、上記の種類の物質に加えて、植物油またはポリエチレングリコールなどの液体担体を含めてもよい。コーティングとしての、またはさもなければ固体単位剤形の物理的形態を改良するための他の様々な物質が存在してもよい。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセルは、ゼラチン、蝋、シェラック、または糖などでコーティングすることができる。シロップまたはエリキシル剤は、活性候補分子、甘味剤としてのスクロースまたはフルクトース、保存剤としてのメチルおよびプロピルパラベン、チェリーまたはオレンジフレーバーなどの色素および香味料を含み得る。いかなる単位剤形を調製する際に用いられるいかなる物質も、薬学的に許容されるものであり、使用する量において実質的に非毒性である。加えて、活性候補分子を徐放性の調製物および装置に組み入れることも可能である。
【０１７０】
活性候補分子は、注入または注射により静脈内または腹腔内投与することもできる。活性候補分子またはその塩の溶液は、緩衝液、多くの場合はリン酸緩衝生理食塩水中で調製してもよく、任意に非毒性の界面活性剤と混合してもよい。分散液もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン、およびそれらの混合物中、ならびに油中で調製することができる。保存および使用の通常の条件下で、これらの調製物は微生物の増殖を防ぐための保存剤を含む。候補分子は場合により、そのような投与用にポリマトリックス(polymatrix)含有製剤(例えば、リポソームまたはミクロソーム)として調製される。リポソームは、例えば米国特許第5,703,055号(Felgner, et al.)およびGregoriadis, Liposome Technology vols. I to III (2nd ed. 1993)に記載されている。
【０１７１】
注射または注入に適した薬学的剤形には、滅菌水溶液もしくは分散液、または任意にリポソーム中に封入された、滅菌注射用もしくは注入用溶液もしくは分散液の即時調製に適した有効成分を含む滅菌粉末が含まれ得る。いずれの場合にも、最終的な剤形は、製造および保存条件下で無菌性、流動性、かつ安定であるべきである。液体担体または媒体は、例えば水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど)、植物油、非毒性のグリセリルエステル、およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または液体分散媒であり得る。適切な流動性は、例えばリポソームの形成により、分散液の場合には必要な粒径を維持することにより、または界面活性剤を使用することにより、維持することができる。微生物作用の予防は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、例えば糖、緩衝液、または塩化ナトリウムなどの等張剤を含めることが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅延させる薬剤を組成物中に使用することによってもたらされ得る。
【０１７２】
滅菌注射液は、必要な量の活性候補分子を、必要に応じて上記に列挙した種々の他の成分と共に適切な溶媒中に取り込み、次いで濾過滅菌することによって調製される。滅菌注射液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製法は真空乾燥法および凍結乾燥法であり、これらの方法によって、あらかじめ濾過滅菌した溶液中に存在した有効成分および任意の付加的な所望の成分の粉末が得られる。
【０１７３】
局所的投与の場合、本候補分子は液体形態で適用することができる。候補分子は、皮膚科学的に許容される担体と組み合せた組成物または製剤として投与される場合が多いが、これは固体であっても液体であってもよい。候補分子を皮膚に送達するために用いられる有用な皮膚科学的組成物の例は公知である(例えば、Jacquet, et al.(米国特許第4,608,392号）、Geria(米国特許第4,992,478号)、Smith, et al.(米国特許第4,559,157号)、およびWortzman(米国特許第4,820,508号)を参照されたい)。
【０１７４】
候補分子は固体担体と共に製剤化することもでき、固体担体には、タルク、粘土、微結晶セルロース、シリカ、アルミナなどの微粉化固体が含まれる。有用な液体担体には、水、アルコールもしくはグリコール、または水-アルコール/グリコール混合物が含まれ、そこに本候補分子を、任意に非毒性の界面活性剤を用いて有効レベルで溶解させるか、または分散させることができる。芳香剤および付加的な抗菌剤などの補助剤を添加して、所与の使用のための特性を最適化することもできる。得られた液体組成物は、吸水パッドから適用するか、包帯および他の包帯剤に含浸させるために使用するか、またはポンプ型もしくはエアロゾル噴霧器を用いて患部に噴霧することができる。合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸の塩およびエステル、脂肪アルコール、変性セルロース、または変性無機物質などの増粘剤を液体担体と共に使用して、使用者の皮膚に直接適用するための塗付可能なペースト剤、ゲル、軟膏、石鹸などを形成することもできる。
【０１７５】
リボソームヌクレオチド配列またはその相補体を有する核酸を、使用および投与のために単離し、組成物中に調製することができる。核酸組成物は、1つまたは複数の核酸の薬学的に許容される塩、エステル、またはそのようなエステルの塩を含み得る。裸の核酸を系に投与してもよいし、または核酸を1つもしくは複数の他の分子と共に製剤化してもよい。
【０１７６】
核酸を含む組成物は、溶液、乳濁液、またはポリマトリックス含有製剤(例えば、リポソームおよびミクロスフェア)として調製することができる。そのような組成物の例は、米国特許第6,455,308号(Freier)、第6,455,307号(McKay et al.)、第6,451,602号(Popoff et al.)、および第6,451,538号(Cowsert)に記載されており、リポソームの例も同様に、米国特許第5,703,055号(Felgner et al.)およびGregoriadis, Liposome Technology vols. I to III (2nd ed. 1993)に記載されている。組成物は、局所、経口、経肺、非経口、髄腔内、およびイントラニュートリカル(intranutrical)投与を含む任意の投与様式のために調製することができる。特定の投与様式のための製剤の例は、米国特許第6,455,308号(Freier)、第6,455,307号(McKay et al.)、第6,451,602号(Popoff et al.)、および第6,451,538号(Cowsert)に記載されている。核酸組成物は、1つまたは複数の薬学的に許容される担体、賦形剤、浸透促進剤、および/または補助剤を含んでもよい。組成物中の薬学的に許容される塩、担体、賦形剤、浸透促進剤、および/または補助剤の組み合わせの選択は、一部には投与形式に依存する。核酸オリゴヌクレオチド組成物に関して成分の組み合わせを選択するための指針は公知であり、その例は、米国特許第6,455,308号(Freier)、第6,455,307号(McKay et al.)、第6,451,602号(Popoff et al.)、および第6,451,538号(Cowsert)に記載されている。
【０１７７】
核酸を、核酸の毒性を軽減する、核酸の活性、細胞分布、または細胞取り込みを増強する化学結合、部分、または複合体によって修飾してもよい。そのような修飾の例は、米国特許第6,455,308号(Freier)、第6,455,307号(McKay et al.)、第6,451,602号(Popoff et al.)、および第6,451,538号(Cowsert)に記載されている。
【０１７８】
別の態様において、組成物は、本明細書に記載の核酸をコードするプラスミドを含み得る。担体、賦形剤、浸透促進剤、および補助剤成分などの、オリゴヌクレオチド組成物に関して上記した組成物成分の多くを、発現プラスミドを含む組成物中で使用することができる。同様に、プラスミドによって発現される核酸は、プラスミドによる発現後に、核酸と共にまたは核酸中に取り込まれ得る上記の修飾のいくつかを含んでもよい。組換えプラスミドは、場合により、微生物細胞(例えば、細菌(例えば、大腸菌)、酵母(例えば、S. セレビシエ)、または真菌)における核酸発現のために設計され、より多くの場合には、プラスミドは真核細胞(例えば、ヒト細胞)における核酸発現のために設計される。適切な宿主細胞は、Goeddel, Gene Expressison Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)にさらに考察されている。プラスミドを系に送達してもよいし、またはヌクレオチド配列をコードする核酸を含むプラスミドの一部を送達してもよい。
【０１７９】
哺乳動物細胞において核酸をプラスミドから発現させる場合、発現プラスミド制御エレメントは場合により、ウイルスの制御エレメントに由来する。例えば、一般に用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス2型、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、およびサルウイルス40に由来する。プラスミドは、核酸コードヌクレオチド配列に機能的に連結された誘導性プロモーターを含んでもよい。加えて、プラスミドは場合によって、核酸コード配列に機能的に連結された組織特異的プロモーターの使用により、特定の細胞種における核酸発現を導くことができ、その例には、アルブミンプロモーター(肝臓特異的；Pinkert et al., Genes Dev. 1: 268-277 (1987))、リンパ球特異的プロモーター(Calame & Eaton, Adv. Immunol. 43: 235-275 (1988))、T細胞受容体プロモーター(Winoto & Baltimore, EMBO J. 8: 729-733 (1989))、免疫グロブリンプロモーター(Banerji et al., Cell 33: 729-740 (1983)、およびQueen & Baltimore, Cell 33: 741-748 (1983))、ニューロン特異的プロモーター(例えば、神経フィラメントプロモーター；Byrne & Ruddle, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477 (1989))、膵臓特異的プロモーター(Edlund et al., Science 230: 912-916 (1985))、および乳腺特異的プロモーター(例えば、乳清プロモーター；米国特許第4,873,316号および欧州特許出願公開第264,166号)がある。発生的に制御されるプロモーターを使用してもよく、これには例えば、マウスhoxプロモーター(Kessel & Gruss, Science 249: 374-379 (1990))、およびα-フェトポリペプチドプロモーター(Campes & Tilghman, Genes Dev. 3: 537-546 (1989))が含まれる。
【０１８０】
核酸組成物は都合のよいことに単位剤形中に存在してもよく、それは製薬産業において公知の従来技法に従って調製される。一般論として、そのような技法は、液体形態もしくは微粉化固体形態またはその両方で、核酸を薬学的担体および/または賦形剤と合わせる段階、ならびに必要に応じて生成物を成形する段階、を含む。核酸組成物は、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、ソフトゲル、坐剤、および浣腸などの任意の剤形に製剤化することができる。組成物はまた、水性媒体、非水性媒体、または混合媒体中の懸濁剤として製剤化することも可能である。水性懸濁剤は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および/またはデキストランを含む、粘性を増加させる物質をさらに含み得る。懸濁剤はまた、1つまたは複数の安定剤を含んでもよい。
【０１８１】
核酸は、従来の形質転換法またはトランスフェクション法を介して細胞内に移行させることができる。本明細書で使用する「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、核酸を宿主細胞内に導入するための種々の標準的な技法を指し、これにはリン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈法、形質導入/感染、DEAE-デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、およびイオン導入法が含まれる。また、本明細書に記載のリポソーム組成物を、核酸投与を容易にするために用いることもできる。核酸組成物は、局所投与(眼および粘膜(例えば、膣および直腸)送達を含む)、経肺投与(例えば、噴霧器によることを含む、粉末およびエアロゾルの吸入または吹送；気管内、鼻腔内、上皮、および経皮)、経口投与、および非経口投与(例えば、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内注射または注入、筋肉内注射または注入；および頭蓋内(例えば、髄腔内または脳室内))を含むいくつかの様式で生物に投与することができる。
【０１８２】
一般に、液体組成物中の候補分子または核酸の濃度は、多くの場合に約0.1 wt%〜約25 wt%であり、場合によっては約0.5 wt%〜約10 wt%である。ゲルまたは粉末などの半固体または固体組成物中の濃度は、多くの場合に約0.1 wt%〜約5 wt%であり、場合によっては約0.5 wt%〜約2.5 wt%である。候補分子または核酸組成物は単位剤形として調製することができ、それは製薬産業において公知の従来技法に従って調製される。一般論として、そのような技法は、液体形態もしくは微粉化固体形態またはその両方で、候補分子または核酸を薬学的担体および/または賦形剤と合わせる段階、ならびに必要に応じて生成物を成形する段階、を含む。候補分子または核酸組成物は、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、ソフトゲル、坐剤、および浣腸などの任意の剤形に製剤化することができる。組成物はまた、水性媒体、非水性媒体、または混合媒体中の懸濁剤として製剤化することも可能である。水性懸濁剤は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および/またはデキストランを含む、粘性を増加させる物質をさらに含み得る。懸濁剤はまた、1つまたは複数の安定剤を含んでもよい。
【０１８３】
治療における使用に必要な候補分子もしくは核酸、またはそれらの活性塩もしくは誘導体の量は、選択した特定の塩のみならず、投与経路、治療する状態の性質、ならびに患者の年齢および状態によっても変化し、最終的には担当医または臨床医の判断となる。候補分子または核酸は一般的に、標的細胞の数を減少させる；標的細胞を検出可能に根絶する；疾患または状態の症状を治療する、改善する、緩和する、軽減する、および除去する；ならびに疾患もしくは状態の可能性または疾患もしくは状態の再発を予防または軽減する、という本来の目的を達成するのに有効な量で用いられる。治療有効量は、一部には対象、インビトロで維持された細胞、および実験動物由来の試料を解析することによって決定される場合もある。例えば、用量を定式化し、アッセイおよび実験動物において試験し、細胞を死滅させるためのIC50値を決定することができる。そのような情報を用いて、有用な用量をより正確に決定することができる。
【０１８４】
有用な候補分子または核酸の投与量は、多くの場合、細胞もしくは組織系におけるそのインビトロ活性および/または動物系でのインビボ活性を評価することにより決定される。例えば、マウスおよびその他の動物における有効な投与量からヒトの投与量を推定する方法は、当業者に公知である(例えば、米国特許第4,938,949号を参照されたい)。このような系は、候補分子または核酸のLD50(集団の50%にとって致死的な用量)およびED50(集団の50%において治療上有効な用量)を決定するために用いることができる。毒性効果と治療効果の用量比は治療指数であり、これは比ED50/LD50として表すことができる。候補分子または核酸の投与量は多くの場合、ED50が毒性をほとんど伴わない循環濃度の範囲内に収まる。投与量は、使用する剤形および使用する投与経路に応じて、この範囲内で変化し得る。本明細書に記載の方法で用いられる任意の候補分子または核酸に関しては、治療有効用量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。そのような情報を用いてヒトにおける有用な用量がより正確に決定される場合も多く、用量は場合により、インビトロアッセイで決定されたIC50(すなわち、症状の最大半量の阻害を達成する試験候補分子の濃度)を包含する循環血漿濃度範囲を達成するように製剤化される。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
【０１８５】
対象に対して有効な用量を決定する別の例は、試験対象の血清中の「遊離」および「結合」候補分子または核酸のレベルを直接アッセイする能力である。このようなアッセイでは、抗体模倣体および/または分子インプリント法によって作製された「バイオセンサー」を使用し得る。候補分子または核酸を、鋳型または「インプリントする分子」として使用して、重合可能な単量体を空間的に組織化し、その後に触媒試薬によりそれらを重合させる。インプリントさせた分子をその後除去すると、候補分子の反復した「ネガ像」を含み、生物学的アッセイ条件下で分子を選択的に再結合できるポリマーマトリックスが残る(例えば、Ansell, et al., Current Opinion in Biotechnology 7: 89-94 (1996)、およびShea, Trends in Polymer Science 2: 166-173 (1994)を参照されたい)。このような「インプリント」親和性マトリックスはリガンド-結合アッセイに適しており、そのため固定化モノクローナル抗体成分は、適切にインプリントされたマトリックスにより置き換えられる(例えば、Vlatakis, et al., Nature 361: 645-647 (1993)を参照されたい)。同位体標識化を用いることで、候補分子の「遊離」濃度を容易にモニターし、IC50の算出に使用することができる。このような「インプリント」親和性マトリックスはまた、候補分子または核酸の局所的結合および選択的結合に際して、その光子放出特性が測定可能に変化する蛍光基を含むように設計することもできる。これらの変化は、適切な光ファイバー装置を用いてリアルタイムで容易にアッセイすることができ、試験対象における用量をその個々のIC50に基づいて迅速に最適化することが可能になる。このような「バイオセンサー」の一例は、Kriz, et al., Analytical Chemistry 67: 2142-2144 (1995)において考察されている。
【０１８６】
例示的な用量には、対象または試料重量1キログラム当たりの、ミリグラムまたはマイクログラム量の候補分子または核酸、例えば、約1マイクログラム/キログラム〜約500ミリグラム/キログラム、約100マイクログラム/キログラム〜約5ミリグラム/キログラム、または約1マイクログラム/キログラム〜約50マイクログラム/キログラムが含まれる。小分子の適切な用量は、調節しようとする発現または活性に関連した小分子の効力に依存することが理解される。本明細書に記載のポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節するために、これら小分子の1つまたは複数を動物(例えば、ヒト)に投与する場合には、医師、獣医、または研究者は、例えば最初に比較的低い用量を処方し、その後適切な応答が得られるまで用量を増加させてもよい。加えて、任意の特定の動物対象に対する特定用量レベルは、使用する特定の候補分子の活性、対象の年齢、体重、全身の健康状態、性別、および食事、投与時間、投与経路、排泄率、任意の薬物併用、ならびに調節しようとする発現または活性の程度を含む様々な要因に依存することが理解される。
【０１８７】
いくつかの態様において、候補分子または核酸は、細胞増殖性状態を治療するために用いられる。そのような治療において、「治療すること」、「治療」、および「治療効果」という用語は、細胞増殖速度を減少または停止させること(例えば、腫瘍成長を遅延または中止させること)、増殖している癌細胞の数を減少させること(例えば、腫瘍の一部またはすべてを除去すること)、および細胞増殖性状態を完全にまたは部分的に緩和することを指す。細胞増殖性状態には、これらに限定されないが、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、肝癌、膵癌、リンパ節癌、結腸癌、前立腺癌、脳腫瘍、頭頚部癌、皮膚癌、肝癌、腎癌、および心臓癌が含まれる。癌の例には、造血器起源の過形成/新生物細胞を含む疾患である造血器腫瘍性疾患が含まれる(例えば、骨髄、リンパ、もしくは赤血球系列、またはそれらの前駆細胞から生じる)。この疾患は、低分化型急性白血病、例えば赤芽球性白血病および急性巨核芽球性白血病から生じ得る。さらなる骨髄性疾患には、これらに限定されないが、急性前骨髄性白血病(APML)、急性骨髄性白血病(AML)、および慢性骨髄性白血病(CML)が含まれ(Vaickus, Crit. Rev. in Oncol./Hemotol. 11:267-297 (1991)に概説されている)；リンパ性悪性腫瘍には、これらに限定されないが、B細胞系列ALLおよびT細胞系列ALLが含まれる急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性リンパ性白血病(CLL)、前リンパ球性白血病(PLL)、ヘアリー細胞白血病(HLL)、およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症(WM)が含まれる。悪性リンパ腫のさらなる形態には、これらに限定されないが、非ホジキンリンパ腫およびその変種、末梢性T細胞リンパ腫、成人T細胞白血病/リンパ腫(ATL)、皮膚T細胞性リンパ腫(CTCL)、大顆粒リンパ球性白血病(LGF)、ホジキン病、およびリード・スターンバーグ病が含まれる。特定の態様において、細胞増殖性疾患は、非内分泌腫瘍および内分泌腫瘍を含む膵癌である。非内分泌腫瘍の具体例には、これらに限定されないが、腺癌、腺房細胞癌、腺扁平上皮癌、巨細胞腫、膵管内乳頭粘液腫瘍、粘液性嚢胞性癌、膵芽腫、漿液性嚢胞腺腫、固形腫瘍、および偽乳頭状腫瘍が含まれる。内分泌腫瘍は膵島腫瘍であってよい。
【０１８８】
細胞増殖性状態には、例えば湿疹、円板状エリテマトーデス、扁平苔癬、硬化性苔癬、菌状息肉腫、光線皮膚症、バラ色粃糠疹、乾癬を含む皮膚の炎症性状態といった炎症性状態もまた含まれる。例えば脂肪細胞の増殖といった、肥満症に関連した細胞増殖性状態もまた含まれる。
【０１８９】
細胞増殖性状態には、例えば後天性免疫不全症候群、アデノウイルス感染症、アルファウイルス感染症、アルボウイルス感染症、ボルナ病、ブニヤウイルス感染症、カリシウイルス感染症、水痘、コロナウイルス感染症、コクサッキーウイルス感染症、サイトメガロウイルス感染症、デング熱、DNAウイルス感染症、膿瘡、伝染性、脳炎、アルボウイルス、エプスタイン・バーウイルス感染症、伝染性紅斑、ハンタウイルス感染症、出血熱、ウイルス性、肝炎、ウイルス性、ヒト、単純疱疹、帯状疱疹、耳帯状疱疹、ヘルペスウイルス感染症、伝染性単核球症、鳥のインフルエンザ、インフルエンザ、ヒト、ラッサ熱、麻疹、伝染性軟属腫、流行性耳下腺炎、パラミクソウイルス感染症、サシチョウバエ熱、ポリオーマウイルス感染症、狂犬病、呼吸器合胞体ウイルス感染症、リフトバレー熱、RNAウイルス感染症、風疹、遅発性ウイルス感染症、天然痘、亜急性硬化性全脳炎、腫瘍ウイルス感染症、疣贅、ウェストナイル熱、ウイルス性疾患、および黄熱を含むウイルス性疾患もまた含まれる。例えば、SV40形質転換ウイルスのラージT抗原はUBFに作用してそれを活性化し、他のウイルスタンパク質をPol I複合体に動員し、それによって細胞増殖を促進してウイルス増殖を確実にする。細胞増殖性状態には、血管新生に関連した状態(例えば、癌)、ならびに脂肪細胞(adipocyte)および他の脂肪細胞(fat cell)の増殖によって起こる肥満症もまた含まれる。
【０１９０】
細胞増殖性状態には、高血圧、バルーン血管形成、弁膜症、および心筋梗塞などの心臓負荷によって起こる心臓の状態もまた含まれる。例えば、心筋細胞は心室壁の大部分を構成する心臓における分化した筋細胞であり、血管平滑筋細胞は血管を裏打ちしている。いずれも筋細胞種であるが、心筋細胞および血管平滑筋細胞は、収縮、増殖、および分化の機構が異なる。心筋細胞は心臓形成の直後に最終分化型となり、そのため分裂する能力を失うのに対し、血管平滑筋細胞は、収縮から増殖に至る表現形の調節を連続して行っている。例えば高血圧、バルーン血管形成、弁膜症、および心筋梗塞などの様々な病態生理学的負荷において、心臓および血管は増殖に関連した形態的変化を起こし、それによって心臓機能が低下し、最終的に心不全として現れる。したがって、本明細書に記載の化合物または核酸を心臓病態を治療するのに有効な量投与することによって、心臓の細胞増殖性状態を治療する方法を本明細書に提供する。化合物または核酸は、心臓負荷が起こるかまたは検出される前または後に投与することができ、化合物または核酸は、例えば高血圧、バルーン血管形成、弁膜症、または心筋梗塞の発症または検出後に投与することができる。そのような化合物または核酸の投与により、血管筋細胞および/または平滑筋細胞の増殖が減少する可能性がある。
【０１９１】
特定の態様はまた、本明細書に記載の候補分子または核酸を投与することにより、加齢の症状を治療することおよび/または細胞老化に関する状態を治療することに向けられる。例えば、ウェルナー症候群という早老病は、WRN DBAヘリカーゼをコードするウェルナー遺伝子の変化によって起こる。理論によって制限されることはないが、このタンパク質が核小体に局在し、G-四重鎖に特異的に結合することが知られており、かつWRN DNAヘリカーゼにおける変異が老化を引き起こす。
【０１９２】
毒性評価手順
細胞または対象に対する分子の毒性を予測するアッセイを本明細書に提供する。特定の態様においては、JNKのリン酸化および任意でMAPKのリン酸化を評価し、これらのタンパク質のリン酸化状態に基づいて毒性のリスクを評価する。全長JNKおよびMAPKタンパク質を用いることができ、特定の態様においては、リン酸化され得るJNKおよび/またはMAPKタンパク質の断片を用いてもよい。1つまたは複数のリン酸化部位が除去された変異体タンパク質のような変異JNKまたは変異MAPKアミノ酸配列を用いることも可能である(例えば、リン酸化部位が減少することでバックグラウンドレベルが減少し得る)。毒性の予測は、毒性の割合もしくは可能性、および/または等級(例えば、高度、中程度、低度の毒性リスク)のような、簡便でかつ情報を与える任意の形式で表すことができる。毒性は場合により炎症または刺激である。
【０１９３】
JNKもしくはMAPKタンパク質または断片上のリン酸部分の有無は、当業者によって選択される種々の系で検出することができる。いくつかの態様においては、プロテインキナーゼによってタンパク質基質に転移されるアデノシン三リン酸(ATP)のγホスホリル部分またはその誘導体を検出可能に標識する。そのような態様では、基質に転移された検出可能に標識されたγホスホリル部分を検出する。いくつかの態様では、32Pまたは33P γホスホリル部分を有するATPをアッセイにおいて使用する。特定の態様において、ATPのγリン酸は、当業者に公知の方法によって検出可能に標識することができる。特定の態様において、γ部分は硫黄同位体(例えば、35S原子)を含む。
【０１９４】
特定の態様においては、JNKおよび/またはMAPKタンパク質を固相に固定化し(例えば、基質アレイ)、リン酸化活性をモニターする。そのような系では、リン酸化反応に寄与する成分を含む反応緩衝液を使用し得る。これらの条件には、例えば、pH、塩濃度、Mg2+の濃度、および界面活性剤濃度が含まれる。反応緩衝液中でインキュベートした後、マイクロアレイを洗浄して標識ATPを除去し、キナーゼ反応中にATPから基質へ転移された検出可能に標識されたリン酸により、生成物を定量化する。シグナル強度は基質上の標識リン酸の量に比例し、リン酸化活性と対応する。いくつかの態様においては、基質を検出可能なホスホリル部分で標識し、基質の脱リン酸化を検出する。
【０１９５】
理論によって縛られることはないが、いくつかのキナーゼおよびホスファターゼは、特定の分子状況においてのみ基質に作用する。そのような分子状況は、例えば特定の足場タンパク質からなってもよい。特定の態様においては、そのような足場タンパク質をアッセイ条件に提供する(例えば、反応緩衝液と共に)。いくつかの態様においては、足場タンパク質もまた固体支持体の表面上に固定化する。
【０１９６】
特定の態様において、JNKリン酸化および/またはMAPKリン酸化は、リン酸化タンパク質またはリン酸化ペプチドに特異的に結合する抗体を用いて可視化し、かつ任意に定量化する。そのような抗体には、これらに限定されないが、ホスホ-セリンに結合する抗体、ホスホ-スレオニンに結合する抗体、またはホスホ-チロシンに結合する抗体が含まれる。抗体は場合により、ホスホリルアミノ酸の周囲のアミノ酸配列にかかわらずホスホリルアミノ酸に特異的であり、いくつかの態様において、抗体はホスホリルアミノ酸および1つまたは複数の周囲のアミノ酸を含むエピトープに特異的に結合する。リン酸化タンパク質またはリン酸化ペプチドに結合する抗体は検出可能な標識を含んでもよいか、またはアッセイ中に検出可能な標識と結合させることができる。いくつかの態様においては、二次抗体を用いてリン酸化タンパク質またはリン酸化ペプチドに結合した抗体を検出する。リン酸化基質の量を検出することができ、そのようなアッセイは、リン酸化および/または脱リン酸化活性を検出するのに有用である。いくつかのアッセイ態様においては、フルオロフォアに連結されたペプチド基質およびリン酸化ペプチドに特異的に結合する抗体と試料を接触させた後に、蛍光偏光によってリン酸化を検出する(例えば、PolarScreen(商標)キナーゼアッセイ；httpアドレス www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=10568)。
【０１９７】
特定のアッセイ態様では、FRETによってリン酸化を検出する。1つの態様においては、FRETし得る2つのフルオロフォア(例えば、N末端における1つのフルオロフォアおよびC末端における1つのフルオロフォア)に連結されたペプチド基質、およびそのリン酸化状態に基づいて差次的にペプチド基質を特異的に切断するプロテアーゼと、試料を接触させる(例えば、Z'-LYTE(商標)プロテインキナーゼおよびホスファターゼアッセイ(httpアドレス www.invitrogen.com/content. cfm?pageid=9866))。いくつかの態様においては、試料を(1) 第1フルオロフォアを含むペプチド基質および(2) ペプチドに連結された第1フルオロフォアとFRETし得る第2フルオロフォアに連結された検出分子、と接触させる(例えば、LanthaScreen(商標) TR-FRET Assay(httpアドレス www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=10513))。後者の態様において、検出分子は場合により、リン酸化ペプチドに特異的に結合し、非リン酸化ペプチドに特異的に結合しない抗体である(例えば、テルビウム標識ホスホ-チロシン特異的抗体)。検出分子は場合により結合対の一部である分子(例えば、ビオチン)であり、ペプチドを他方の結合対メンバー(例えば、ストレプトアビジンまたはアビジン)に連結し、アッセイ系を、リン酸化および非リン酸化ペプチドを差次的に切断するプロテアーゼと接触させる。これらのアッセイは、ホモジニアスまたはヘテロジニアス形式で行うことができる。
【０１９８】
特定の態様において、リン酸化は、リン酸に結合しかつ検出可能な標識に連結された分子を用いて検出することができる。金属キレート部分を含む色素のような色素を、検出可能な標識として使用することができる。特定の態様において、リン酸化タンパク質またはペプチドは、金属キレート色素を用いて検出される。金属キレート色素には、非限定的にBAPTA、IDA、DTPA、フェナントロリン、およびそれらの誘導体が含まれる(例えば、米国特許第4,603,209号；第4,849,362号；第5,049,673号；第5,453,517号；第5,459,276号；第5,516,911号；第5,501,980号；および第5,773,227号)。特定の態様では、Pro-Q Diamond染色(Molecular Probes、オレゴン州)における色素が用いられる(例えば、ゲルまたはマイクロアレイ染色)。
【０１９９】
使用が可能な他のリン酸化検出系には、PhosphoELISA(Biosource International)などの市販のキットおよび蛍光に基づくアッセイが含まれる。蛍光に基づく適切なアッセイ系では、Mg2+への結合に際してキレート化増強蛍光(CHEF)を示す新規な金属結合アミノ酸残基を有する試薬を使用する(例えば、US 2005/0080242A2およびUS 2005/0080243A1)。
【０２００】
キット
キットは1つまたは複数の容器を含み、容器は本明細書に記載の組成物および/または成分の1つまたは複数を含む。キットは、任意の数の別個の容器、小包、チューブ、バイアル、マイクロタイタープレートなどの中に組成物の1つまたは複数を含んでもよく、いくつかの態様において、成分はそのような容器中で種々の組み合わせで混合されてよい。いくつかの態様におけるキットは、本明細書に記載の試薬を1つ含み、キット中に含まれていない本明細書に記載の別の試薬に使用者を導く説明書を提供する。
【０２０１】
キットは、任意の組み合わせで本明細書に記載の試薬を含み得る。キットは、本明細書に記載の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上の試薬を含み得る。例えば、キットは、(1) 本明細書に記載のリボソームヌクレオチド配列を含む単離された核酸；(2) ヌクレオリンタンパク質もしくはその断片およびそれに結合する核酸；または(3) 本明細書に記載のリボソームヌクレオチド配列を含む単離された核酸、および検出可能な標識に連結されたそれに結合する化合物、を含み得る。
【０２０２】
キットは、場合によっては本明細書に記載の方法と併せて用いられ、場合によっては、本明細書に記載の1つもしくは複数の方法を行うための説明書、および/または本明細書に記載の1つもしくは複数の組成物もしくは試薬の解説書を含む。説明書および/または解説書は印刷形式であってもよく、キット挿入物として含まれ得る。キットはまた、そのような説明書または解説書を提供するインターネット所在地の書面による記載を含み得る。
【０２０３】
代表的なヒトrDNA配列
代表的なヒトrDNA配列(SEQ ID NO:1)を以下に提供する。
2009504192.tif 000037
2009504192.tif 000038
2009504192.tif 000039
2009504192.tif 000040
2009504192.tif 000041
2009504192.tif 000042
2009504192.tif 000043
2009504192.tif 000044
2009504192.tif 000045
2009504192.tif 000046
2009504192.tif 000047
2009504192.tif 000048
(a) 相補的なDNA配列、(b) 前記物のサブ配列、(c) SEQ ID NO:1に相補的なrRNAヌクレオチド配列およびサブ配列、ならびに(c) (c)に相補的なRNA配列およびサブ配列もまた本明細書に含まれる。
【０２０４】
実施例
以下に記載する実施例は本発明を説明するものであって、本発明を制限するものではない。
【０２０５】
実施例1
四重鎖モチーフリボソームヌクレオチド配列の同定
SEQ ID NO:1の配列を有するヒトリボソームDNA、およびその転写された相補的RNA配列を、四重鎖配列モチーフと一致するヌクレオチド配列に関して検索した。SEQ ID NO:1のrDNA配列は、他のゲノムDNA配列を含むデータベース中に記録されていなかった。例えば、SEQ ID NO:1のrDNA配列は、NCBIヒトゲノムDNA配列のbuild 34およびbulid 35の一部ではない。
【０２０６】
四重鎖モチーフを見出すため、PERLプログラムでSEQ ID NO:1をスキャンし((>EMBLRELEASE|U13369|HSU13369 HUMAN RIBOSOMAL DNA COMPLETE REPEATING UNIT)、正規表現GGG(.{1,7})GGG(.{1,7})GGG(.{1,7})GGGの範囲内に現れる任意のヌクレオチド塩基を同定した。rDNA配列中の42999塩基を処理した。全部で544塩基を含む、18の別個の潜在的四重鎖配列(PQS)領域が同定された。同じ配列において、正規表現CCC(.{1,7})CCC(.{1,7})CCC(.{1,7})CCCを用いて2回目の検索を行った。この場合も同様に42999塩基を処理したが、995塩基を含む30の別個のPQS領域が認められた。検索パラメータの第1セットを用いて、rDNAのコード鎖においてG-四重鎖形成配列に関して検索し、第2検索パラメータを用いて、相補的rRNAおよびrDNAの非コード鎖においてG-四重鎖形成配列に関して検索した。
【０２０７】
以下のrDNA四重鎖モチーフ配列が同定された。DNA配列はrDNAのコード鎖状のものであり、ヌクレオチド範囲は43 kbヒトリボソームDNA反復単位(アクセッション番号U13369)上の位置を指す。コード鎖(非鋳型鎖、プラス(+)鎖、またはアンチセンス鎖)またはその逆相補体において、NCBI build 35内に以下のヌクレオチド配列に関する完全な配列一致は同定されなかった。
2009504192.tif 000049
。
【０２０８】
以下は、ヒトゲノムDNA中の非rDNA配列と同一であるrDNAヌクレオチド配列の例である。DNA配列はすべてrDNAコード鎖中のものであり、ヌクレオチド範囲は43 kbヒトリボソームDNA反復単位(アクセッション番号U13369)上の位置を指す。
2009504192.tif 000050
。
【０２０９】
以下のrRNA四重鎖モチーフ配列が同定された。RNA配列はrDNA配列から推測され、注釈づけはアクセッション番号U13369内に見出される。rRNAおよびrRNA前駆体を生成するために転写されるDNA配列に関して、ヒトゲノムのコード鎖(CDS)に沿って、遺伝子内に(Curwen et al. The Ensemble Automatic Gene Annotation System, Genome Res. 2004 May; 14(5):942-950によって同定される)一致は同定されなかった。
rDNA中の5'外部転写スペーサー領域由来のRNA配列
2009504192.tif 000051
；
rDNA中の内部転写スペーサー1領域由来のRNA配列
2009504192.tif 000052
；
rDNA中の内部転写スペーサー2領域由来のRNA配列
2009504192.tif 000053
；
28S rRNA内のRNA配列
2009504192.tif 000054
；
rDNA中の3'外部転写スペーサー領域由来のRNA配列
2009504192.tif 000055
。
【０２１０】
以下はrDNAの転写領域中のCリッチrRNAおよびrRNA前駆体配列であり、特定の態様において四重鎖を形成し得る。
rDNA中の5'外部転写スペーサー領域由来のRNA配列
2009504192.tif 000056
rDNA中の内部転写スペーサー2領域由来のRNA配列
2009504192.tif 000057
28S rRNA内のRNA配列
2009504192.tif 000058
rDNA中の3'外部転写スペーサー領域由来のRNA配列
2009504192.tif 000059
。
【０２１１】
以下は、非rDNAから転写されるRNA、およびそれらが転写されるまたは位置するrDNA領域の記載と完全に一致するrRNA配列である。
rDNA中の内部転写スペーサー1領域由来のRNA配列
2009504192.tif 000060
；
rDNA中の3'外部転写スペーサー領域由来のRNA配列
2009504192.tif 000061
。
【０２１２】
実施例2
ヒトrRNA相互作用スクリーニングアッセイ
HCT116細胞からRNAを単離し(RNeasyキット、QIAGEN)、化合物ライブラリー由来の各化合物とインビトロで接触させた。代表的なアッセイでは、10 uL量中、HCT116細胞由来の全RNA 1 ugを0.5 ug/mLヨウ化プロピジウム(PI)、10 uM化合物A-1、またはライブラリー中の別の化合物と共に室温で15分間インキュベートし、その後アガロースゲル電気泳動した。各ゲル上で、化合物の蛍光を可視化した。PIは18S rRNAおよび28S rRNAに対する結合において識別をしないが、A-1は28S rRNAに優先的に結合することが判明した。化合物A-1、化合物C-1、および化合物C-2は、電気泳動移動度シフトアッセイにおいて、18Sに勝る28Sへの選択的結合を示した。化合物C-3およびC-4は、化合物A-1、化合物C-1、および化合物C-2と比較して、18Sに勝る28Sへのより低い選択性を示した。化合物C-5は、電気泳動移動度シフトアッセイにおいて、18Sに勝る28Sへの特異的結合を示した。化合物C-1、C-2、C-3、C-4、およびC-5は、以下の一般式を有する：
2009504192.tif 000062
2009504192.tif 000063
。
【０２１３】
確認試験において、28S rRNAに結合した化合物を、アクチノマイシンD、Se2SAP(2004年6月10日に公開されたUS20040110820の図3A)、および二本鎖DNA(dsDNA)とのrRNA結合に対する競合に供した。そのようなアッセイでは、10 uL量中、HCT116細胞由来の全RNA 1 ugを10 uM化合物A-1と共に、(a) 漸増量のアクチノマイシンD(10、100、および200 uM)の非存在/存在下において室温で15分間、(b) 漸増量のSe2SAP(図を参照のこと)の非存在/存在下において室温で30分間、または(c) 漸増量のpUC18(0.25、0.5、1、2、および4 ug)の非存在/存在下において室温で30分間インキュベートし、その後アガロースゲル電気泳動した。28S rRNAおよび18S rRNAに対応するバンドの蛍光強度によると、(a) アクチノマイシンDはrRNAに対して化合物A-1と競合できず、(b) Se2SAPは28S rRNAに対して化合物A-1と競合し、18S rRNAに対してはより低度に競合し、(c) dsDNAは化合物A-1に対して28S rRNAと競合した。
【０２１４】
実施例3
細胞におけるリボソーム核酸相互作用分子の局在性
細胞局在アッセイを用いて、rRNAと相互作用する化合物の細胞局在性を決定した。これらの試験では、A549細胞をホウケイ酸チャンバースライドにプレーティングした。翌日、細胞を2 uM化合物A-1で1時間または2時間処理し、PBSで洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで10分間固定し、蛍光顕微鏡(Olympus)下で倍率600×にてEx360 nm/Em 548 nmチャネルで観察した。蛍光強度から判断して、化合物A-1は核小体および細胞質/核周囲空間に蓄積した。したがって、アッセイで試験した化合物は、細胞核小体に局在した。
【０２１５】
実施例4
リボソーム核酸相互作用分子の細胞標的
rRNA相互作用化合物の細胞標的を決定するため、化合物が細胞DNAを選択し得るかまたは細胞RNAを選択し得るかを確認するための実験を行った。これらの試験では、A549細胞をホウケイ酸チャンバースライドにプレーティングした。翌日、細胞を2 uM化合物A-1で1時間または2時間処理し、PBSで洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで10分間固定し、1:1エタノール:アセトン混合液で5分間透過処理し、2.5 ug/mL RNアーゼAまたは340 Kunitz単位/mL DNアーゼIで処理し、蛍光顕微鏡(Olympus)下で倍率600×にてEx360 nm/Em 548 nmチャネルで観察した。DNアーゼIによる処理は化合物A-1の局在性に最小の効果を及ぼしたが、RNアーゼIは薬物による核小体染色を有意に減少させた。したがって、アッセイで試験した化合物は、細胞においてDNAよりもRNAと優先的に相互作用した。
【０２１６】
実施例5
細胞ヌクレオリン局在性に及ぼすリボソーム核酸相互作用分子の効果
細胞のヌクレオリンの位置にリボソーム核酸相互作用化合物が及ぼす効果を決定するため、アッセイを行った。これらの試験では、A549細胞をホウケイ酸チャンバースライドにプレーティングした。翌日、細胞を10 uM化合物A-1で2時間処理し、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで10分間固定し、1:1エタノール:アセトン混合液で5分間透過処理し、5%ロバ血清中の1:100希釈の抗ヌクレオリンモノクローナル抗体(カタログ番号RDI-NUCLEOLabm；Research Diagnostics, Inc.)と共にインキュベートし、その後1:100希釈したTRITC標識二次抗マウス抗体と共にインキュベートし、蛍光顕微鏡(例えば、Olympus)下で倍率600×にてTRITCチャネルで観察した。未処理の細胞では、ヌクレオリンは核小体に局在したが、化合物A-1で処理した細胞では、ヌクレオリンは核質に再分布していた。したがって、アッセイで試験した化合物で処理した細胞において、ヌクレオリンは核小体から核質に再分布した。
【０２１７】
細胞のフィブリラリンの位置に及ぼすリボソーム核酸相互作用化合物の効果を決定するため、別のアッセイを行った。これらの試験は、フィブリラリンに特異的に結合する抗体(カタログ番号ab5821；Novus Biologicals, Inc.)を使用した以外は、前の段落に記載した手順と同様の手順を用いて行った。ヌクレオリンの再分布と同様の時間枠内で、化合物A-1がフィブリラリンの再分布を引き起こしたことが判明した。
【０２１８】
実施例6
リボソーム核酸の四重鎖構造
円二色性(CD)を用いて、リボソーム核酸由来のサブ配列が四重鎖構造を形成するかどうかを決定した。配列はすべて、HPLC精製したDNAオリゴヌクレオチド(以下に表す5'〜3'配列)であった。図3Aおよび3B中の各試料の名称は、rDNA単位に沿ってのおよその位置および特定の鎖(NC＝非コード；C＝コード)を特定する。以下の手順を使用した：各オリゴヌクレオチドを5 uMの鎖濃度で、Tris pH 7.4(10 mM)を含む水性緩衝液200 ulに溶解した。試料を95℃で5分間加熱し、次いで周囲温度まで冷却した。1 mm光路長の石英セルを用いて、JASCO 810分光偏光計でCDスペクトル測定を行った。20 ul KCl (1 M)をオリゴヌクレオチド溶液に添加した後に、さらなるスペクトルをとった。化合物A-1は、競合アッセイにおいて混合平行型四重鎖構造と優先的に相互作用することが示されている(例えば、「Competition Assay for Identifying Modulators of Quadruplex Nucleic Acids」という表題の、2004年10月7日に出願されたPCT/US2004/033401)。
【０２１９】
ヒトリボソームDNAに由来する配列を有する核酸、鋳型(T)および非鋳型(NT)鎖の四重鎖構造を同様の方法で試験し、そのスペクトルを図3および以下の表に要約する。核酸識別子は、(i) ヌクレオチド配列がヒトrDNAの非鋳型(NT)鎖(例えば、SEQ ID NO:1)に由来するのかまたは鋳型(T)鎖(例えば、SEQ ID NO:1の逆相補体)に由来するのか、および(ii) NT鎖中の配列の位置、またはrDNAのT鎖に関しては逆相補体配列の由来元のSEQ ID NO:1における位置を意味する。NT鎖由来のヌクレオチド配列に関しては、識別子中の数字はオリゴヌクレオチドの5'ヌクレオチドを表し、SEQ ID NO:1における1ヌクレオチド少ない位置である(例えば、オリゴヌクレオチド13079NTのヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1の13080位から始まるSEQ ID NO:1中の16ヌクレオチドにまたがる)。T鎖由来のヌクレオチド配列に関しては、識別子中の数字は、SEQ ID NO:1における1ヌクレオチド少ない位置に由来する逆相補体オリゴヌクレオチドの3'ヌクレオチドを規定する(例えば、10110Tのヌクレオチド配列はSEQ ID NO:1にまたがる17ヌクレオチドの逆相補体であり、オリゴヌクレオチドの3'末端はSEQ ID NO:1の10111位に規定される)。平行型、混合平行型、逆平行型(混合平行型の特徴を伴う)、および複合型細胞内四重鎖構造のスペクトル特性が認められた。四重鎖高次構造の決定を以下の表に要約する。
2009504192.tif 000064
【０２２０】
実施例7
ヌクレオリン/核酸相互作用に及ぼすリボソーム核酸相互作用分子の効果
以下のアッセイでは、ヌクレオリンと、四重鎖(QP)およびヘアピン(HP)二次構造を形成し得る核酸リガンドとの相互作用に及ぼす化合物の効果を評価した。試験した核酸リガンドは、ヌクレオチド配列
2009504192.tif 000065
を有するcMyc QP DNA、および配列
2009504192.tif 000066
を有する、ヌクレオリンが結合するHPrRNA前駆体領域であった。アッセイでは、マルトース結合タンパク質に融合され、N末端酸性ストレッチドメインを欠くアクセッション番号NM_005381における配列を有する組換えヌクレオリン(〜250 nM)を、2種類の32P標識核酸リガンド(10または250 nM)のそれぞれと共にインキュベートした。ヌクレオリンおよび核酸リガンドは、インキュベーション緩衝液(12.5 mM Tris、pH 7.6、60 mM KCl、1 mM MgCl2、0.1 mM EDTA、1 mM DTT、5%グリセロール、0.1 mg/ml BSA)中、式A-1、B-1、C-6、またはC-7の試験化合物の存在下または非存在下で室温で30分間インキュベートした。A-1およびB-1の構造は上記に示してあり、C-6およびC-7の構造を以下に示す：
2009504192.tif 000067
。
得られた複合体を、泳動緩衝液として20 mM KClを含む0.5× TBEを用いて、6% DNA遅延ゲルで分離した(すなわち、電気泳動易動度シフトアッセイ(EMSA))。図1は、式A-1、C-6、およびC-7の化合物がヌクレオリン/QPリガンド相互作用を妨げたが、ヌクレオリン/HPリガンド相互作用は妨げなかったことを示す。図2は、化合物A-1およびB-1が、濃度依存的様式でヌクレオリン/QPリガンド相互作用を妨げたが、ヌクレオリン/HP相互作用は有意に妨げなかったことを示す。
【０２２１】
アッセイはまた、ヒトリボソームDNAに由来する核酸リガンドを用いて行った。これらの核酸の配列は、前実施例に示してある。これらのアッセイから、化合物A-1がヌクレオリン/核酸リガンド相互作用を妨げたが、アクチノマイシンDはこれを妨げなかったことが判明した。すぐ下の表は、ヌクレオリンに対する相対的親和性、およびヌクレオリン/核酸リガンド相互作用の妨害における化合物A-1の相対活性を各核酸リガンドについて示す。「+」は最も弱いヌクレオリン親和性および化合物A-1による最も低い妨害を表し、「++++」は最も強いヌクレオリン親和性および化合物A-1による最も高い妨害を表す。表はまた、上記の通り円二色性により決定された、核酸リガンドによって形成される分子内四重鎖構造の高次構造を示す。RND27は、四重鎖構造を形成しないランダム配列を有する一本鎖核酸である。
2009504192.tif 000068
【０２２２】
アッセイはまた、フィルター結合形式で行った。そのようなアッセイ形態では、0.2 nM 32P標識四重鎖を結合緩衝液(12.5 mM Tris-HCl、pH 7.6、60 mM KCl、1 mM MgCl2、0.1 mM EDTA、5%グリセロール、0.1 mg/mL BSA) 50 uL中で85℃で10分間インキュベートし、次いで氷上に10分間置き、漸増量の組換えタンパク質ヌクレオリンを含む結合緩衝液さらに50 uLと混合した。タンパク質-四重鎖混合物を周囲温度で30分間インキュベートし、穏やかに吸引しながら混合セルロースエステル膜フィルター(Millipore)を通して濾過した。フィルターを結合緩衝液300 mLで2回洗浄し、乾燥させ、OptiPhase「SuperMix」シンチレーションカクテル(Perkin Elmer)をウェルに添加した。MicroBetaシンチレーションカウンター(Perkin Elmer)で放射能をアッセイした。結合曲線を作成し、GraphPad Prizmソフトウェアプログラム(GraphPad Software)を用いて複合体の見かけのKdおよびBmaxを算出した。以下の表において、第1列に、本明細書に記載の命名法を用いて核酸リガンドを指定し；第2列は、核酸リガンドのヌクレオチド配列を提供し；第3列は、円二色性により決定されたリガンドの高次構造であり(Mは混合型、Pは平行型、Aは逆平行型、Cは複合型、SSは一本鎖、およびNDは未決定である)；第4列は、フィルター結合アッセイによって決定されたヌクレオリンタンパク質と核酸リガンドの解離定数であり；第5列は、フィルター結合アッセイによって決定されたBmax定数であって、各アッセイにおける活性核酸リガンドの割合であり；第6列は、上記のEMSAアッセイによって決定された、複合化核酸リガンドおよびヌクレオリンタンパク質の半分を解離するのに必要な化合物A-1の濃度を表す。
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【０２２３】
実施例8
細胞周期進行および細胞アポトーシスに及ぼす化合物の影響
本明細書に記載の化合物が細胞周期進行に影響を及ぼすかどうか、および細胞アポトーシスを誘導し得るかどうかを決定するために、アッセイを行った。細胞周期進行への影響を決定するためのアッセイでは、細胞を回収し、単一細胞懸濁液を緩衝液(例えば、PBS＋2% FBS；PBS＋0.1% BSA)で調製した。細胞を2回洗浄し、1〜2 × 106個細胞/mlで再懸濁した。細胞1 mlを15 mlプロピレンV底チューブに分注し、冷無水エタノール3 mlを添加した。細胞を4℃で少なくとも1時間固定した。固定した細胞をPBSで2回洗浄し、ヨウ化プロピジウム染色溶液(PBS中の3.8 mMクエン酸ナトリウム、50 ug/mlヨウ化プロピジウム) 1 mlを各細胞ペレットに添加し、十分に混合した。RNアーゼA保存溶液(5分間煮沸し、分注し、-20℃で保存した10 ug/ml RNアーゼA) 50 μlを添加し、得られた混合物を4℃で3時間インキュベートした。試料は、フローサイトメトリーで解析するまで4℃で保存した。
【０２２４】
アポトーシスは、フローサイトメトリー蛍光活性化細胞選別(FACS)アッセイにおいてアネキシンV結合により評価した。そのようなアッセイでは、細胞を回収し、PBS(4℃)で2回洗浄し、結合緩衝液(10×溶液は0.1 M HEPES/NaOH、pH 7.4；140 mM NaCl；25 mM CaCl2を含む；PharMingen 66121A)で1×106個細胞/mlの濃度で再懸濁した。細胞を、アネキシンVおよび/または生存率色素を含むFACSチューブ中に分注した(100 ul)。チューブの内容物を穏やかに混合し、暗下にて室温で15分間インキュベートした。結合緩衝液(400 ul)を各チューブに添加し、フローサイトメトリーにより直ちに解析した。
【０２２５】
アネキシンVは、ビオチン、FITC(アネキシン-V-FITC；Pharmingen、65874X)、およびPE(アネキシン-PE；Pharmingen、65875X)形式で入手可能である。アネキシン-V-FITCを使用する場合には、ヨウ化プロピジウム(PI；Sigma、P 4170)を生存率マーカーとして使用した(50 ug/ml保存溶液の5 ul)。アネキシン-V-PEを使用する場合には、7-アミノアクチノマイシンD(7-ADD；Sigma、A9400)が好ましい生存率マーカーであったが(1 ug/ml最終濃度)、それはPEとPIよりもPEと7-ADDの方がスペクトルの重複が少ないためである。7-AADはPIほど明るくなく、FITC、PE、およびPIを効果的に組み合わせることもできる。チューブは、いくつかのアッセイにおいて(i) 細胞のみ、(ii) 細胞＋アネキシン、(iii) 細胞＋PI(または7-ADD)、または(iv) 細胞＋アネキシン＋PI(または7-ADD)を含んだ。
【０２２６】
これらのアッセイにおいて、化合物A-1は細胞周期にほとんど影響を及ぼすことなくアポトーシスを誘導した。化合物A-1は様々な時間、様々な濃度で添加したが、細胞周期特性に影響しなかった。DNAラダー化および細胞外ホスファチジルセリン(アネキシン染色により検出される)が誘導されたことから、化合物A-1によって誘導された細胞死は古典的なアポトーシス特性と一致した。
【０２２７】
アッセイにおける化合物B-1は、細胞周期進行の効率的な停止後にアポトーシスを誘導した。HCT-116結腸癌細胞(p53+)は、細胞周期のG1期およびG2期で停止した。MiaPaCa膵臓細胞およびDAOY髄芽腫細胞(p53-)は主にS期で停止し、一部はG2停止した。
【０２２８】
実施例9
四重鎖形成および高次構造を決定する方法
公知のアッセイを用いて、核酸が四重鎖構造をとるかどうかを決定することができる。これらのアッセイには、移動度シフトアッセイ、DMSメチル化保護アッセイ、ポリメラーゼ停止アッセイ、転写レポーターアッセイ、円二色性アッセイ、および蛍光アッセイが含まれる。
【０２２９】
ゲル電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)
EMSAは、核酸が四重鎖を形成するかどうか、およびヌクレオチド配列が四重鎖に変化をきたすかどうかを決定するために有用である。EMSAは、わずかに変更を加えて以前に記載されている通りに行う(Jin & Pike, Mol. Endocrinol. 10: 196-205 (1996))。合成一本鎖オリゴヌクレオチドの5'末端を、[α-32P] ATP(1,000 mCi/mmol、Amersham Life Science)の存在下でT4-キナーゼによって標識し、セファデックスカラムを通して精製する。次いで、10 mM Tris pH7.5、100 mM KCl、5 mMジチオスレイトール、0.1 mM EDTA、5 mM MgCl2、10%グリセロール、0.05% Nonedit P-40、および0.1 mg/mlのポリ(dI-dC)(Pharmacia)を含む緩衝液20μl中、32P標識オリゴヌクレオチド(〜30,000 cpm)を様々な濃度の試験化合物と共にまたは化合物なしでインキュベートする。室温で20分間インキュベートした後、0.25 × Trisホウ酸-EDTA緩衝液(0.25 × TBE、1 × TBEは89 mM Tris-ホウ酸、pH 8.0、1 mM EDTAである)中の5%ポリアクリルアミドゲルに結合反応物を添加する。ゲルを乾燥させ、ホスホイメージャーを用いて各バンドを定量化する。
【０２３０】
DMSメチル化保護アッセイ
化学的フットプリントアッセイは四重鎖構造の評価に有用である。四重鎖構造は、核酸中のどのヌクレオチドが、それぞれ変性試薬に到達不能または到達可能であることの結果として、化学修飾から保護されるかまたは保護されいないかを決定することによって評価される。DMSメチル化アッセイは、化学的フットプリントアッセイの一例である。そのようなアッセイでは、EMSA由来のバンドを単離し、DMS誘導性の鎖切断に供する。関心対象のバンドをそれぞれ電気泳動移動度シフトゲルから切り出し、100 mM KCl溶液(300μl)中に4℃で6時間浸漬する。溶液を濾過し(微量遠心機)、30,000 cpm(反応当たり)のDNA溶液を0.1× TE中の100 mM KClでさらに希釈して、全量を70μl(反応当たり)にする。サケ精子DNA(0.1μg/μl) 1μlを添加した後、反応混合物をDMS溶液(DMS:エタノール；4:1；v:v) 1μlと共に一定時間インキュベートする。停止緩衝液(b-メルカプトエタノール:水:NaOAc (3M)；1:6:7；v:v:v) 18μlにより、各反応を停止させる。エタノール沈殿(2回)およびピペリジン切断の後、反応物を分取ゲル(16%)で分離し、ホスホイメージャーで可視化する。
【０２３１】
ポリメラーゼ停止アッセイ
Taqポリメラーゼ停止アッセイの一例はHan et al., Nucl. Acids Res. 27: 537-542 (1999)に記載されているが、これはWeitzmann et al., J. Biol. Chem. 271, 20958-20964 (1996)によって用いられたアッセイの変法である。簡潔に説明すると、鋳型DNA(50 nM)、Tris HCl(50 mM)、MgCl2(10 mM)、DTT(0.5 mM)、EDTA(0.1 mM)、BSA(60 ng)、および5'末端標識四重鎖核酸(〜18 nM)の反応混合物を90℃で5分間加熱し、30分かけて周囲温度まで冷却する。Taqポリメラーゼ(1μl)を反応混合物に添加し、反応物を一定温度で30分間維持する。停止緩衝液(ホルムアミド(20 ml)、1 M NaOH(200μl)、0.5 M EDTA(400μl)、および10 mgブロモフェノールブルー) 10μlを添加した後、反応物を分取ゲル(12%)で分離し、ホスホイメージャーで可視化する。アデニン配列決定(ゲルの上部に「A」で表示)は、Life Technologiesによるの二本鎖DNA Cycle Sequencing Systemを用いて実施する。鋳型鎖の一般的配列は、
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である。遅い移動度を示すゲル上のバンドは四重鎖形成を示す。
【０２３２】
転写レポーターアッセイ
He, et al., Science 281: 1509-1512 (1998)に記載されているルシフェラーゼプロモーターアッセイは、四重鎖形成の研究に用いられる場合が多い。具体的には、このアッセイで用いられるベクターは、Heらの文献の参考文献11に記載されている。このアッセイでは、製造業者の手順に従ってリポフェクタミン2000に基づく系(Invitrogen)を使用し、pRL-TK(ウミシイタケルシフェラーゼレポータープラスミド) 0.1μgおよび四重鎖形成プラスミド0.9μgを用いてHeLa細胞にトランスフェクションする。製造業者の手順に従って、96ウェルプレート形式でDual Luciferase Reporter Assay System(Promega)を用いて、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ活性をアッセイする。
【０２３３】
円二色性アッセイ
別の分子が四重鎖核酸と相互作用するかどうかを決定するために、円二色性(CD)を使用する。CDは、PNAまたはPNA-ペプチド複合体がインビトロで四重鎖核酸とハイブリダイズするかどうかを決定するのに特に有用である。10 mMリン酸カリウム(pH7.2)および10または250 mM KClを含む37℃の緩衝液中の四重鎖DNA(それぞれ5μM)にPNAプローブを添加し、同一温度で5分間置いた後、スペクトルを記録する。CDスペクトルは、熱電制御単一セルホルダーを備えたJasco J-715分光偏光計で記録する。CD強度は通常220 nm〜320 nmで検出し、相互作用の有無を決定するために、四重鎖DNAのみ、PNAのみ、および四重鎖DNAとPNAの比較スペクトルを作成する(例えば、Datta, et al., JACS 123:9612-9619 (2001)を参照されたい)。スペクトルは、100 nm/分で記録された8回のスキャンの平均を表すようにまとめる。
【０２３４】
蛍光結合アッセイ
四重鎖核酸または四重鎖を形成し得ない核酸50μlを96ウェルプレートに添加する。試験分子または四重鎖標的核酸もまた、様々な濃度で添加する。典型的なアッセイは、100μlの20 mM HEPES緩衝液、pH7.0、140 mM NaCl、および100 mM KCl中で行う。次いで、シグナル分子N-メチルメソポルフィリンIX(NMM) 50μlを最終濃度3μMで添加する。NMMは、Frontier Scientific Inc、ユタ州、ローガンから入手できる。FluroStar 2000蛍光光度計(BMG Labtechnologies、ノースカロライナ州、ダラム)を使用して、蛍光を励起波長420 nmおよび発光波長660 nmで測定する。蛍光は多くの場合、試験分子または四重鎖標的核酸の濃度の関数としてプロットし、NMMの最大蛍光シグナルは、これらの分子の非存在下で評価される。
【０２３５】
実施例10
rRNA合成の阻害
DNA合成、RNA合成、およびタンパク質合成に及ぼす化合物A-1および化合物B-1の影響を、HCT116細胞で決定した。HCT116細胞を100,000個細胞/mLでプレーティングし、一晩置いた。翌日、細胞を漸増量の化合物A-1または化合物B-1で処理し、その後BrdU標識(BrdU細胞増殖アッセイキット、Calbiochemによる)と共に1時間インキュベートして、DNA合成をモニターした；5 mCiの3H-ウリジンと共に1時間インキュベートして、全RNA合成をモニターした；5 mCiの3H-メチオニンと共に1時間インキュベートして、タンパク質合成をモニターした、または単純培地と共に1時間インキュベートして、RNAポリメラーゼII依存的RNA合成をモニターした。DNA合成は、BrdU-ELISA(BrdU細胞増殖アッセイキット、Calbiochem)を用いて評価した。全RNA合成を測定するため、処理細胞由来の全RNAをRNeasyキット(QIAGEN)を用いて単離し、全RNAのレベルをRibogreen試薬(Invitrogen)で評価し、新たに合成されたトリチウム化RNAをシンチレーションカウンター(Perkin Elmer)で測定した。タンパク質合成に及ぼす影響を測定するため、細胞をRIPA緩衝液中で溶解し、全タンパク質を10% TCAを用いてガラスフィルター上に沈殿させた。新たに合成されたトリチウム化タンパク質を、シンチレーションカウンター(Perkin Elmer)で測定した。Pol II依存的RNA合成に及ぼす薬物の影響は、Taqman qRT-pCR(ABI)により、約30分という比較的短い半減期を有するc-myc mRNAのレベルをモニターすることにより評価した。
【０２３６】
化合物A-1は、試験した濃度において、タンパク質合成およびc-myc mRNAレベルに測定可能な影響を及ぼさなかった。この化合物は、1 mM濃度において核小体RNA合成を有意に減少させた。細胞の多くが死滅した濃度である10 mM濃度において、化合物A-1はDNA合成を有意に減少させた。化合物B-1は、試験した濃度において、タンパク質合成およびc-myc mRNAレベルに測定可能な影響を及ぼさなかった。化合物B-1は、10 mMにおいて核小体RNA合成を、および30 mMにおいてDNA合成を有意に減少させた。
【０２３７】
経時的試験において、3 mM化合物A-1による15分間、および10 mM化合物B-1による30分間の細胞の処理により、3H-ウリジンの取り込みが実質的に阻害された。したがって、試験した化合物は核小体RNA合成を阻害した。
【０２３８】
実施例11
プロテインキナーゼの阻害
特定の化合物を、プロテインキナーゼ阻害アッセイにおいて活性に関して試験した。ヒストンH1(20 mM MOPS pH 7.0中での10×作業保存液)、PDKtide(50 mM Tris pH 7.0中での10×作業保存液)、ATF2(典型的に、50 mM Tris pH 7.5、150 mM NaCl、0.1 mM EDTA、0.03% Brij-35、50%グリセロール、1 mMベンズアミジン、0.2 mM PMSF、および0.1% R-メルカプトエタノール中の20×作業保存液で保存)、KKLNRTLSFAEPGおよびRRRLSFAEPG(50 mM HEPES pH 7.4)、ならびにGGEEEEYFELVKKKK(20 mM MOPS pH 7.0)は別として、基質はすべて脱イオン水に溶解し、作業保存液となるよう希釈した。キナーゼはすべて10×作業濃度となるように前希釈してから、アッセイに添加した。各キナーゼの希釈緩衝液の組成を以下に記載する。
1. Blk、c-RAF、CSK、IGF-1R、IR、Lyn、MAPK1、MAPK2、MKK4、MKK6、MKK70、SAPK2a、SAPK2b、SAPK3、SAPK4、Syk、ZAP-70：50 mM Tris pH 7.5、0.1 mM EGTA、0.1 mM Na3VO4、0.1% β-メルカプトエタノール、l mg/ml BSA。
2. JNK1a1、JNK2a2、JNK3、PRK2、ROCK-II：50 mM Tris pH 7.5、0.1 mM EGTA、0.1% β-メルカプトエタノール、1 mg/ml BSA。
3. PDK1：50 mM Tris pH 7.5、0.05% β-メルカプトエタノール、1 mg/ml BSA。
4. MEK-1：25 mM Tris pH 7.5、0.1 mM EGTA、0.1% β-メルカプトエタノール、1 mg/ml BSA。
5. Abl、Abl(T315I)、ALK、ALK4、Arg、Ask1、Aurora-A、Ax1、Bmx、BRK、BTK、CDKl/サイクリンB、CDK2/サイクリンA、CDK2/サイクリンE、CDK3/サイクリンE、CDK5/p25、CDK5/p35、CDK6/サイクリンD3、CDK7/サイクリンH/MAT1、CHK1、CHK2、CKl、CKIS、cKit、cKit (D816V)、cSRC、DDR2、EGFR、EGFR (L858R)、EGFR (L861Q)、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphB2、EphB3、EphB4、ErbB4、Fer、Fes、FGFRl、FGFR2、FGFR3、FGFR4、Fgr、Flt1、Flt3、Flt3 (D835Y)、Fms、Fyn、GSK3a、GSK30、Hck、HIPK2、IKKa、IKKO、IRAK4、IRR、JAK2、JAK3、KDR、Lck、MAPKAP-K2、MAPKAP-K3、Met、MINK、MLCK、MRCKP、MSKl、MSK2、MSTl、MST2、MuSK、NEK2、NEK6、Nek7、p70S6K、PAK2、PAK4、PAK6、PAR-1Ba、PDGFRa、PDGFRO、Pim-1、PKA、PKBa、PKBP、PKBy、PKC6、PKCQ、PKGlO、Plk3、Pyk2、Ret、RIPK2、Rse、ROCK-I、Ron、Ros、Rskl、Rsk2、Rsk3、SGK、SGK2、SGK3、Snk、TAKl、TBKl、Tie2、TrkA、TrkB、TSSK2、Yes、ZIPK：20 mM MOPS pH 7.0、1 mM EDTA、0.1% β-メルカプトエタノール、0.01% Brij-35、5%グリセロール、1 mg/ml BSA。
6. CK2：20 mM HEPES pH 7.6、0.15 M NaCl、0.1 mM EGTA、5 mM DTT、0.1% Triton X-100、50%グリセロール。
7. CaMKII、CaMKTV：40 mM HEPES pH 7.4、1 mg/ml BSA。
8. PKCa、PKCRI、PKCRII、PKCy、PKCS、PKC6、PKCYI、PKCL、PKCμ、PKD2：20 mM HEPES pH 7.4、0.03% Triton X-100。
9. PRAK：β-メルカプトエタノール、0.1 mM EGTA、1 mg/ml BSA。
10 AMPK：50 mM Na R-グリセロリン酸 pH 7.0、0.1%。
【０２３９】
プロテインキナーゼアッセイは以下の通りに行った。
【０２４０】
Abl (h)
最終反応量25μlで、Abl (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、50μM EAIYAAPFAKKK、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２４１】
Abl (T315I) (h)
最終反応量25μlで、Abl (T315I) (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、50μM EAIYAAPFAKKK、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２４２】
Abl (m)
最終反応量25μlで、Abl (m)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、50μM EAIYAAPFAKKK、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２４３】
ALK (h)
最終反応量25μlで、ALK (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、250μM KKKSPGEYVNIEFG、10 mM酢酸Mg、および[y-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２４４】
ALK4 (h)
最終反応量25μlで、ALK4 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、2 mg/mlカゼイン、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２４５】
AMPK (r)
最終反応量25μlで、AMPK (r)(5〜10 mU)を32 mM HEPES pH 7.4、0.65 mM DTT、0.012% Brij-35、200μM AMP、200μM AMARAASAAALARRR、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２４６】
Arg (h)
最終反応量25μlで、Arg (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、50μM EAIYAAPFAKKK、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２４７】
Arg (m)
最終反応量25μlで、Arg (m)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、50μM EAIYAAPFAKKK、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２４８】
ASK1 (h)
最終反応量25μlで、ASK1 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.33 mgミエリン塩基性タンパク質、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２４９】
Aurora-A (h)
最終反応量25μlで、Aurora-A (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、200μM LRRASLG(Kemptide)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、50 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２５０】
Axl (h)
最終反応量25μlで、Axl (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、250μM KKSRGDYMTMQIG、10 mM酢酸Mg、および[y-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２５１】
Blk (m)
最終反応量25μlで、Blk (m)(5〜10 mU)を50 mM Tris pH 7.5、0.1 mM EGTA、0.1 mM Na3VO4、0.1% R-メルカプトエタノール、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２５２】
Bmx (h)
最終反応量25μlで、Bmx (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２５３】
BRK (h)
最終反応量25μlで、BRK (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、5 mM MnCl2、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットAにスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２５４】
BTK (h)
最終反応量25μlで、BTK (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、250μM KVEKIGEGTYGVVYK(Cdc2ペプチド)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２５５】
CaMKII (r)
最終反応量25μlで、CAMKII (r)(5〜10 mU)を40 mM HEPES pH 7.4、5 mM CaCl2、30μg/mlカルモジュリン、30μM KKLNRTLSVA、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２５６】
CaMKIV (h)
最終反応量25μlで、CaMKIV (h)(5〜10 mU)を40 mM HEPES pH 7.4、5 mM CaCl2、30μg/mlカルモジュリン、30μM KKLNRTLSVA、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２５７】
CDK1/サイクリンB (h)
最終反応量25μlで、CDK1/サイクリンB (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.1 mg/mlヒストンH1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２５８】
CDK2/サイクリンA (h)
最終反応量25μlで、CDK2/サイクリンA (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.1 mg/mlヒストンH1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２５９】
CDK2/サイクリンE (h)
最終反応量25μlで、CDK2/サイクリンE (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.1 mg/mlヒストンH1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２６０】
CDK3/サイクリンE (h)
最終反応量25μlで、CDK3/サイクリンE (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.1 mg/mlヒストンH1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２６１】
CDK5/p25 (h)
最終反応量25μlで、CDK5/p25 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.1 mg/mlヒストンH1、10 mM酢酸Mg、および[y-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２６２】
CDK5/p35 (h)
最終反応量25μlで、CDK5/p35 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.1 mg/mlヒストンH1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２６３】
CDK6/サイクリンD3 (h)
最終反応量25μlで、CDK6/サイクリンD3 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.1 mg/mlヒストンH1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２６４】
CDK7/サイクリンH/MAT1 (h)
最終反応量25μlで、CDK7/サイクリンH/MAT1 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、500μMペプチド、10 mM酢酸Mg、および[y-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２６５】
CHK1 (h)
最終反応量25μlで、CHK1 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、200μM KKKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２６６】
CHK2 (h)
最終反応量25μlで、CHK2 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、200μM KKKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２６７】
CK1 (y)
最終反応量25μlで、CK1 (y)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、200μM KRRRALS(p)VASLPGL、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２６８】
CK1S (h)
最終反応量25μlで、CK1S (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、200μM KRRRALS(p)VASLPGL、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２６９】
CK2 (h)
最終反応量25μlで、CK2 (h)(5〜10 mU)20 mM HEPES pH 7.6、0.15 M NaCl、0.1 mM EDTA、5 mM DTT、0.1% Triton X-100、165μM RRRDDDSDDD、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２７０】
cKit (h)
最終反応量25μlで、cKit (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、10 mM MnCl2、0.1 mg/mlポリ(Glu，Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２７１】
cKit (D816V) (h)
最終反応量25μlで、cKit (D816) (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、10 mM MnCl2、0.1 mg/mlポリ(Glu，Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２７２】
c-RAF (h)
最終反応量25μlで、c-RAF (h)(5〜10 mU)を25 mM Tris pH 7.5、0.02 mM EGTA、0.66 mg/mlミエリン塩基性タンパク質、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２７３】
CSK (h)
最終反応量25μlで、CSK (h)(5〜10 mU)を50 mM Tris pH 7.5、0.1 mM EGTA、0.1 mM Na3VO4、0.1% R-メルカプトエタノール、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM MnCl2、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２７４】
cSRC (h)
最終反応量25μlで、cSRC (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、250μM KVEKIGEGTYGVVYK(Cdc2ペプチド)、10 mM酢酸Mg、および[y-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２７５】
DDR2 (h)
最終反応量25μlで、DDR2 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、250μM KKSRGDYMTMQIG、10 mM MnCl2、10 mM酢酸Mg、および[y-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２７６】
EGFR (h)
最終反応量25μlで、EGFR (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、10 mM MnCl2、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２７７】
EGFR (L858R) (h)
最終反応量25μlで、EGFR (L858R) (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２７８】
EGFR (L861Q) (h)
最終反応量25μlで、EGFR (L861Q) (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２７９】
EphA2 (h)
最終反応量25μlで、EphA2 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２８０】
EphA3 (h)
最終反応量25μlで、EphA3 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２８１】
EphA4 (h)
最終反応量25μlで、EphA4 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、10 mM MnCl2、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[y-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２８２】
EphA5 (h)
最終反応量25μlで、EphA5 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、2.5 mM MnCl2、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２８３】
EphB2 (h)
最終反応量25μlで、EphB2 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、10 mM MnCl2、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２８４】
EphB3 (h)
最終反応量25μlで、EphB3 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、10 mM MnCl2、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２８５】
EphB4 (h)
最終反応量25μlで、EphB4 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、10 mM MnCl2、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２８６】
ErbB4 (h)
最終反応量25μlで、ErbB4 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、2.5 mM MnCl2、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２８７】
Fer (h)
最終反応量25μlで、Fer (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、1 mM MnCl2、250μM KKKSPGEYVNIEFG、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２８８】
Fes (h)
最終反応量25μlで、Fes (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[y-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２８９】
FGFR1 (h)
最終反応量25μlで、FGFR (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、250μM KKKSPGEYVNIEFG、10 mM酢酸Mg、および[y-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２９０】
FGFR2 (h)
最終反応量25μlで、FGFR2 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、2.5 mM MnCl2、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２９１】
FGFR3 (h)
最終反応量25μlで、FGFR3 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM MnCl2、10 mM酢酸Mg、および[y-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２９２】
FGFR4 (h)
最終反応量25μlで、FGFR4 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、10 mM MnCl2、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２９３】
Fgr (h)
最終反応量25μlで、Fgr (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２９４】
Flt1 (h)
最終反応量25μlで、Flt1 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、250μM KKKSPGEYVNIEFG、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２９５】
Flt3 (h)
最終反応量25μlで、Flt3 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、50μM EAIYAAPFAKKK、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２９６】
Flt3 (D835Y) (h)
最終反応量25μlで、Flt3 (D835Y) (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、50μM EAIYAAPFAKKK、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２９７】
Fms (h)
最終反応量25μlで、Fms (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、250μM KKKSPGEYVNIEFG、10 mM酢酸Mg、および[y-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２９８】
Fyn (h)
最終反応量25μlで、Fyn (h)(5〜10 mU)を50 mM Tris pH 7.5、0.1 mM EGTA、0.1 mM Na3VO4，250μM KVEKIGEGTYGVVYK(Cdc2ペプチド)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２９９】
GSK3a (h)
最終反応量25μlで、GSK3a (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、20μM
2009504192.tif 000071
(ホスホGS2ペプチド)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、50 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３００】
GSK3P (h)
最終反応量25μlで、GSK30 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、20μM
2009504192.tif 000072
(ホスホGS2ペプチド)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、50 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３０１】
Hck (h)
最終反応量25μlで、Hck (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、250μM KVEKIGEGTYGVVYK(Cdc2ペプチド)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３０２】
HIPK2 (h)
最終反応量25μlで、HIPK2 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.33 mg/mlミエリン塩基性タンパク質、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３０３】
IGF-1R (h)
最終反応量25μlでIGF-1R (h)(5〜10 mU)を50 mM Tris pH 7.5、0.1 mM EGTA、0.1 mM Na3VO4、0.1% R-メルカプトエタノール、250μM KKKSPGEYVNIEFG、10 mM MnCl2、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３０４】
IKKa (h)
最終反応量25μlで、IKKa (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、200μMペプチド、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３０５】
IKKP (h)
最終反応量25μlで、IKKP (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、100μMペプチド、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３０６】
IR (h)
最終反応量25μlで、IR (h)(5〜10 mU)を50 mM Tris pH 7.5、0.1 mM EGTA、0.1 mM Na3VO4、0.1% R-メルカプトエタノール、250μM KKSRGDYMTMQIG、10 mM MnCl2、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３０７】
IRAK4 (h)
最終反応量25μlで、IRAK4 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.33 mg/mlミエリン塩基性タンパク質、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３０８】
IRR (h)
最終反応量25μlで、IRR (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.33 mg/mlミエリン塩基性タンパク質、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３０９】
JAK2 (h)
最終反応量25μlで、JAK2 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、100μM
2009504192.tif 000073
、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３１０】
JAK3 (h)
最終反応量25μlで、JAK3 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、500μM GGEEEEYFELVKKKK、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３１１】
JNK1a1 (h)
最終反応量25μlで、JUNK1a1 (h)(5〜10 mU)を50 mM Tris  pH 7.5、0.1 mM EGTA、0.1% R-メルカプトエタノール、3μM ATF2、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３１２】
JNK2a2 (h)
最終反応量25μlで、JUNK2a2 (h)(5〜10 mU)を50 mM Tris  pH 7.5、0.1 mM EGTA、0.1% R-メルカプトエタノール、3μM ATF2、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３１３】
JNK3 (h)
最終反応量25μlで、JUNK3 (h)(5〜10 mU)を50 mM Tris  pH 7.5、0.1 mM EGTA、0.1% R-メルカプトエタノール、250μMペプチド、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３１４】
KDR (h)
最終反応量25μlで、KDR (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS  pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.33 mg/mlミエリン塩基性タンパク質、10 mM酢酸Mg、および[y-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３１５】
Lck (h)
最終反応量25μlで、Lck (h)(5〜10 mU)を50 mM Tris pH 7.5、0.1 mM EGTA、0.1 mM Na3VO4，250μM KVEKIGEGTYGVVYK(Cdc2ペプチド)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３１６】
Lyn (h)
最終反応量25μlで、Lyn (h)(5〜10 mU)を50 mM Tris pH 7.5、0.1 mM EGTA、0.1 mM Na3VO4，0.1% R-メルカプトエタノール、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4.1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３１７】
Lyn (m)
最終反応量25μlで、Lyn (m)(5〜10 mU)を50 mM Tris pH 7.5、0.1 mM EGTA、0.1 mM Na3VO4，0.1% R-メルカプトエタノール、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4.1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３１８】
MAPK1 (h)
最終反応量25μlで、MAPK1 (h)(5〜10 mU)を25 mM Tris pH 7.5、0.02 mM EGTA、250μMペプチド、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３１９】
MAPK2 (h)
最終反応量25μlで、MAPK2 (h)(5〜10 mU)を25 mM Tris pH 7.5、0.02 mM EGTA、0.33 mg/mlミエリン塩基性タンパク質、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３２０】
P,-MAPK2 (m)
最終反応量25μlで、MAPK2 (m)(5〜10 mU)を25 mM Tris pH 7.5、0.02 mM EGTA、0.33 mg/mlミエリン塩基性タンパク質、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３２１】
MAPKAP-K2 (h)
最終反応量25μlで、MAPKAP-K2 (h)(5〜10 mU)を50 mM Na R-グリセロリン酸 pH 7.5、0.1 mM EGTA、30μM KKLNRTLSVA、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３２２】
MAPKAP-K3 (h)
最終反応量25μlで、MAPKAP-K3 (h)(5〜10 mU)を50 mM Na R-グリセロリン酸 pH 7.5、0.1 mM EGTA、30μM KKLNRTLSVA、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３２３】
MEK1 (h)
最終反応量25μlで、MEK1 (h)(1〜5 mU)を50 mM Tris pH 7.5、0.2 mM EGTA、0.1% R-メルカプトエタノール、0.01% Brij-35、1μM不活性MAPK2 (m)、10 mM酢酸Mg、および非放射性ATP(必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、このインキュベーション混合物5μlを用いて、この本の12ページに記載されているMAPK2 (m)アッセイを開始する。
【０３２４】
Met (h)
最終反応量25μlで、Met (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、250μM KKKSPGEYVNIEFG、10 mM酢酸Mg、および[y-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３２５】
MINK (h)
最終反応量25μlで、MINK (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.33 mg/mlミエリン塩基性タンパク質、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３２６】
MKK4 (m)
最終反応量25μlで、MKK4 (m)(1〜5 mU)を50 mM Tris pH 7.5、0.1 mM EGTA、0.1% R-メルカプトエタノール、0.1 mM Na3VO4、2μM不活性JNK1a1 (h)、10 mM酢酸Mg、および非放射性ATP(必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、このインキュベーション混合物5μlを用いて、ATF2を250μMペプチドと置換すること以外はこの本の11ページに記載されている通りにJNK1a1 (h)アッセイを開始する。
【０３２７】
MKK6 (h)
最終反応量25μlで、MKK6 (h)(1〜5 mU)を50 mM Tris pH 7.5、0.1 mM EGTA、0.1% R-メルカプトエタノール、0.1 mM Na3VO4、1 mg/ml BSA、1μM不活性SAPK2a (h)、10 mM酢酸Mg、および非放射性ATP(必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、このインキュベーション混合物5μlを用いて、この本の18ページに記載されているSAPK2a (h)アッセイを開始する。
【０３２８】
MKK7P (h)
最終反応量25μlで、MKK70 (h)(1〜5 mU)を50 mM Tris pH 7.5、0.1 mM EGTA、0.1% R-メルカプトエタノール、0.1 mM Na3VO4、2μM不活性JNK1a1 (h)、10 mM酢酸Mg、および非放射性ATP(必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、このインキュベーション混合物5μlを用いて、ATF2を250μMペプチドと置換すること以外はこの本の11ページに記載されている通りにJNK1a1 (h)アッセイを開始する。
【０３２９】
MLCK (h)
最終反応量25μlで、MLCK (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.5 mM CaCl2、16μg/mlカルモジュリン、250μM KKLNRTLSFAEPG、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３３０】
MRCKP (h)
最終反応量25μlで、MRCKP (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、100μM KKRNRTLTV、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３３１】
MSK1 (h)
最終反応量25μlで、MSK1 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、30μM GRPRTSSFAEGKK、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３３２】
MSK2 (h)
最終反応量25μlで、MSK2 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、30μM GRPRTSSFAEGKK、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３３３】
MST1 (h)
最終反応量25μlで、MST1 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、250μM KKSRGDYMTMQIG、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３３４】
MST2 (h)
最終反応量25μlで、MST2 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.33 mg/mlミエリン塩基性タンパク質、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３３５】
Musk (h)
最終反応量25μlで、MuSK (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、5 mM MnCl2、0.33 mg/mlミエリン塩基性タンパク質、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３３６】
NEK2 (h)
最終反応量25μlで、NEK2 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.33 mg/mlミエリン塩基性タンパク質、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３３７】
NEK6 (h)
最終反応量25μlで、MEK6 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、300μM FLAKSFGSPNRAYKK、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３３８】
NEK7 (h)
最終反応量25μlで、MEK7 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、300μM FLAKSFGSPNRAYKK、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３３９】
PAK2 (h)
最終反応量25μlで、PAK2 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、30μM
2009504192.tif 000074
、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３４０】
PAK4 (h)
最終反応量25μlで、PAK4 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.8 mg/mlミエリン塩基性タンパク質、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３４１】
PAK6 (h)
最終反応量25μlで、PAK6 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、200μM RRRLSFAEPG、10 mM酢酸Mg、および[y-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３４２】
PAR-1Ba (h)
最終反応量25μlで、PAR-1Ba (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、100μM KKKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３４３】
PDGFRa (h)
最終反応量25μlで、PDGFRa (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4.1、10 mM MnCl2、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３４４】
PDGFRP (h)
最終反応量25μlで、PDGFRP (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4.1、10 mM MnCl2、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３４５】
PDK1 (h)
最終反応量25μlで、PDK1 (h)(5〜10 mU)を50mM Tris pH 7.5、100μM
2009504192.tif 000075
(PDKtide)、0.1% R-メルカプトエタノール、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３４６】
PI3Ky (h)[非放射性アッセイ]
最終反応量20μlで、PI3Ky (h)を、10μMホスファチジルイノシトール-4,5-二リン酸およびMgATP(必要に応じた濃度)を含むアッセイ緩衝液中でインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で30分間インキュベートした後、EDTAおよびビオチン化ホスファチジルイノシトール-3,4,5-三リン酸を含む停止溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。最後に、ユーロピウム標識抗GSTモノクローナル抗体、GSTタグ化GRP1 PHドメイン、およびストレプトアビジン-アロフィコシアニンを含む検出緩衝液5μlを添加する。次いで、プレートを時間分解蛍光モードで読み取り、式HTRF(登録商標)＝10000 × (Em665 nm/Em620 nm)に従って、ホモジニアス時間分解蛍光(HTRF(登録商標))*シグナルを決定する。
【０３４７】
Pim-1 (h)
最終反応量25μlで、Pim-1 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、100μM KKRNRTLTV、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３４８】
PKA (h)
最終反応量25μlで、PKA (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、30μM LRRASLG(Kemptide)、10 mM酢酸Mg、および[y-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、50 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３４９】
PKA (b)
最終反応量25μlで、PKA (b)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、30μM LRRASLG(Kemptide)、10 mM酢酸Mg、および[y-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、50 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３５０】
PKBa (h)
最終反応量25μlで、PKBa (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、30μM GRPRTSSFAEGKK、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３５１】
PKBP (h)
最終反応量25μlで、PKBP (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、30μM GRPRTSSFAEGKK、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３５２】
PKBy (h)
最終反応量25μlで、PKBy (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、30μM GRPRTSSFAEGKK、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３５３】
PKCa (h)
最終反応量25μlで、PKCa (h)(5〜10 mU)を20 mM HEPES pH 7.4、0.03% Triton X-100、0.1 mM、0.1 mg/mlホスファチジルセリン、10μg/mlジアシルグリセロール、0.1 mg/mlヒストンH1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３５４】
PKCPI (h)
最終反応量25μlで、PKCRI (h)(5〜10 mU)を20 mM HEPES pH 7.4、0.03% Triton X-100、0.1 mM CaCl2、0.1 mg/mlホスファチジルセリン、10μg/mlジアシルグリセロール、0.1 mg/mlヒストンH1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３５５】
PKCPII (h)
最終反応量25μlで、PKCRII (h)(5〜10 mU)を20 mM HEPES pH 7.4、0.03% Triton X-100、0.1 mM、0.1 mg/mlホスファチジルセリン、10μg/mlジアシルグリセロール、0.1 mg/mlヒストンH1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３５６】
PKCy (h)
最終反応量25μlで、PKCy (h)(5〜10 mU)を20 mM HEPES pH 7.4、0.03% Triton X-100、0.1 mM、0.1 mg/mlホスファチジルセリン、10μg/mlジアシルグリセロール、0.1 mg/mlヒストンH1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３５７】
PKCS (h)
最終反応量25μlで、PKCS (h)(5〜10 mU)を20 mM HEPES pH 7.4、0.03% Triton X-100、0.1 mg/mlホスファチジルセリン、10μg/mlジアシルグリセロール、50μM ERMRPRKRQGSVRRRV、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３５８】
PKCS (h)
最終反応量25μlで、PKC6 (h)(5〜10 mU)を20 mM HEPES pH 7.4、0.03% Triton X-100、0.1 mg/mlホスファチジルセリン、10μg/mlジアシルグリセロール、50μM ERMRPRKRQGSVRRRV、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３５９】
PKCYI (h)
最終反応量25μlで、PKCYj (h)(5〜10 mU)を20 mM HEPES pH 7.4、0.03% Triton X-100、0.1 mM CaCl2、0.1 mg/mlホスファチジルセリン、10μg/mlジアシルグリセロール、50μM ERMRPRKRQGSVRRRV、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３６０】
PKCL (h)
最終反応量25μlで、PKCL (h)(5〜10 mU)を20 mM HEPES pH 7.4、0.03% Triton X-100、50μM ERMRPRKRQGSVRRRV、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３６１】
PKCμ (h)
最終反応量25μlで、PKCV (h)(5〜10 mU)を20 mM HEPES pH 7.4、0.03% Triton X-100、30μM KKLNRTLSVA、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３６２】
PKCe (h)
最終反応量25μlで、PKC6 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.1 mg/mlヒストンH1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３６３】
PKCM (h)
最終反応量25μlで、PKCQ (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、50μM ERMRPRKRQGSVRRRV、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３６４】
PKD2 (h)
最終反応量25μlで、PKD2 (h)(5〜10 mU)を20 mM HEPES pH 7.4、0.03% Triton X-100、30μM KKLNRTLSVA、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３６５】
PKG1P (h)
最終反応量25μlで、PKG10 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、10μM cGMP、200μM RRRLSFAEPG、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３６６】
Plk3 (h)
最終反応量25μlで、Plk3 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、2 mg/mlカゼイン、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３６７】
PRAK (h)
最終反応量25μlで、PRAK (h)(5〜10 mU)を50 mM Na R-グリセロリン酸グリセロリン酸 pH 7.5、0.1 mM EGTA、30μM KKLRRTLSVA、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、50 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３６８】
PRK2 (h)
最終反応量25μlで、PRK2 (h)(5〜10 mU)を50 mM Tris pH 7.5、0.1 mM EGTA、0.1% R-メルカプトエタノール、30μM AKRRRLSSLRA、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３６９】
Pyk2 (h)
最終反応量25μlで、Pyk2 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３７０】
P70S6K (h)
最終反応量25μlで、p70S6K (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、100μM KKRNRTLTV、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３７１】
Ret (h)
最終反応量25μlで、Ret (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、250μM KKKSPGEYVNIEFG、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３７２】
RIPK2(h)
最終反応量25μlで、RIPK2 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.33 mg/mlミエリン塩基性タンパク質、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３７３】
ROCK-I (h)
最終反応量25μlで、ROCK-I (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、30μM
2009504192.tif 000076
、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３７４】
ROCK-II (h)
最終反応量25μlで、ROCK-II (h)(5〜10 mU)を50 mM Tris pH 7.5、0.1 mM EGTA、30μM
2009504192.tif 000077
、10 mM酢酸Mg、および[y-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３７５】
ROCK-II (r)
最終反応量25μlで、ROCK-II (r)(5〜10 mU)を50 mM Tris pH 7.5、0.1 mM EGTA、30μM
2009504192.tif 000078
、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３７６】
Ron (h)
最終反応量25μlで、Ron (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、250μM KKSRGDYMTMQIG、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３７７】
Ros (h)
最終反応量25μlで、Ros (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、10 mM MnCl2、250μM KKKSPGEYVNIEFG、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３７８】
Rse (h)
最終反応量25μlで、Rse (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、250μM KVEKIGEGTYGVVYK、1 mM MnCl2、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３７９】
Rsk1 (h)
最終反応量25μlで、Rsk1 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、30μM KKKNRTLSVA、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３８０】
Rsk1 (r)
最終反応量25μlで、Rsk1 (r)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、30μM KKKNRTLSVA、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３８１】
Rsk2 (h)
最終反応量25μlで、Rsk2 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、30μM KKKNRTLSVA、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３８２】
Rsk3 (h)
最終反応量25μlで、Rsk3 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、30μM KKKNRTLSVA、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３８３】
SAPK2a (h)
最終反応量25μlで、SAPK2a (h)(5〜10 mU)を25 mM Tris pH 7.5、0.02 mM EGTA、0.33 mg/mlミエリン塩基性タンパク質、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３８４】
SAPK2b (h)
最終反応量25μlで、SAPK2b (h)(5〜10 mU)を25 mM Tris pH 7.5、0.02 mM EGTA、0.33 mg/mlミエリン塩基性タンパク質、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３８５】
SAPK3 (h)
最終反応量25μlで、SAPK3 (h)(5〜10 mU)を25 mM Tris pH 7.5、0.02 mM EGTA、0.33 mg/mlミエリン塩基性タンパク質、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３８６】
SAPK4 (h)
最終反応量25μlで、SAPK4 (h)(5〜10 mU)を25 mM Tris pH 7.5、0.02 mM EGTA、0.33 mg/mlミエリン塩基性タンパク質、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３８７】
SGK (h)
最終反応量25μlで、SGK (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、30μM GRPRTSSFAEGKK、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３８８】
SGK2 (h)
最終反応量25μlで、SGK2 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、30μM GRPRTSSFAEGKK、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３８９】
SGK3 (h)
最終反応量25μlで、SGK3 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、250μM GRPRTSSFAEGKK、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３９０】
Snk (h)
最終反応量25μlで、Snk (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、2mg/mlカゼイン、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３９１】
Syk (h)
最終反応量25μlで、Syk (h)(5〜10 mU)を50 mM Tris pH 7.5、0.1 mM EGTA、0.1 mM Na3VO4、0.1% R-メルカプトエタノール、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３９２】
TAK1 (h)
最終反応量25μlで、TAK1 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、2 mg/mlカゼイン、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３９３】
TBK1 (h)
最終反応量25μlで、TBK1 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、200μM KRRRALS(p)VASLPGL、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３９４】
Tie2 (h)
最終反応量25μlで、Tie2 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.5 mM MnCl2、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３９５】
TrkA (h)
最終反応量25μlで、TrkA (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、250μM KKKSPGEYVNIEFG、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３９６】
TrkB (h)
最終反応量25μlで、TrkB (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３９７】
TSSK2 (h)
最終反応量25μlで、TSSK2 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、100μM KKKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR、10 mM酢酸Mg、および[y-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３９８】
Yes (h)
最終反応量25μlで、Yes (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３９９】
ZAP-70 (h)
最終反応量25μlで、ZAP-70 (h)(5〜10 mU)を50 mM Tris pH 7.5、0.1 mM EGTA、0.1 mM Na3VO4、0.1% R-メルカプトエタノール、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM MnCl2、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０４００】
ZIPK (h)
最終反応量25μlで、ZIPK (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、250 mM KKLNRTLSFAEPG、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０４０１】
以下の表は、化合物A-1またはB-1と共にインキュベートした場合の各プロテインキナーゼの残存活性の割合を示す。
2009504192.tif 000079
2009504192.tif 000080
2009504192.tif 000081
2009504192.tif 000082
2009504192.tif 000083
【０４０２】
以下の表に反映されるように、Abl(h)の阻害を、45マイクロモルATPの存在下でさらに特徴づけた。
2009504192.tif 000084
*注記。n＝2の場合、ここに報告した値は実際には範囲/√2である。
【０４０３】
上記のデータから、化合物B-1がMKK7Bを阻害することが示される。化合物A-1は、Abl、DRAK1、p70S6K、PASK、およびTie2を80%を超えて阻害し、他のキナーゼを60〜80%阻害する。
【０４０４】
実施例12
リボソームRNA合成に及ぼす化合物の効果
45S rDNAからのrRNA合成に及ぼす化合物の効果を決定するために、アッセイを行った。詳細には、種々の濃度の化合物A-1を細胞と共にインキュベートし、化合物と共に2時間または4時間インキュベートした後に、rRNA合成に及ぼす効果について試験した。合成されたrRNAは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)アッセイにより定量化した。Primer Expressソフトウェアを用いてプライマー/プローブセットを設計し、合成はApplied Biosystemsによる。使用した5' ETSプローブは以下の配列を有した(その3'末端において)：6FAM-TTG ATC CTG CCA GTA GC-MGBNFQ。プライマー配列は以下の通りであった：
フォワードプライマー：CCG CGC TCT ACC TTA CCT ACC T
リバースプライマー：GCA TGG CTT AAT CTT TGA GAC AAG。
C-myc転写に及ぼす化合物の影響を検出する対照アッセイもまた、ABIから購入したプライマー/プローブセット(アッセイID:Hs99999003_mlを有するTaqMan Gene Expression Assay)を用いて行った。以下のアッセイ手順を使用した：
段階1. RNAからDNAへの逆転写
以下のものを混合する
1 ug RNA
2.5 ul 10× Taq Man緩衝液
5.5 ul 25 mM MgCl2
5 ul dNTP混合物(各500 uM)
1.2 ul ランダムヘキサマープライマー(2.5 uM保存液)
0.5 ul RNアーゼ阻害剤(.4単位/ul)
0.6 ul 逆転写酵素(1.2単位/ul)
水で全量を25 ulにする
48℃で30分間インキュベートする
95℃で5分間インキュベートして、逆転写酵素を失活させる
段階2. PCR
以下のものを混合する
5 ul 逆転写酵素反応産物
12.5 ul 2× PCR混合物
1 uM フォワードプライマー
1 uM リバースプライマー
0.5 uM Taq Manプローブ
500 nM Rox
水で最終量を25 ulに調整する
以下のサイクルでPCRを行う
95℃、1分
40サイクルの
95℃、15秒
60℃、1分。
消化された標識の蛍光を検出し、定量化した。図4Aおよび4Bに示すように、化合物A-1は、2時間および4時間の時点でrRNA合成を阻害した。比較として、c-Myc転写に及ぼす化合物A-1の影響を図4Cに示す。rRNA合成に及ぼす他の化合物の効果もまたアッセイで評価し、rRNA合成およびcMYC RNA合成に関する選択された化合物のIC50値を以下の表に提供する。
2009504192.tif 000085
2009504192.tif 000086
このアッセイによって決定された複数の化合物のIC50値を、細胞生存率アッセイにおける同じ化合物のIC50値に対してプロットした。具体的には、PCRによって測定されたrDNA抑制に関するIC50の対数を、アラマーブルーにより測定された細胞生存率(4日間；HCT-116細胞)に関するlog IC50に対してプロットした。プロットから、細胞生存率とrDNA転写の抑制との間の明白な正の相関が明らかとなり、このことはPCRアッセイの生物学的関連性を強調する。
【０４０５】
本明細書において参照した各特許、特許出願、出版物、および文献の全文が、参照により本明細書に組み入れられる。上記の特許、特許出願、出版物、および文献の引用は、前記物のいずれかが関連先行技術であることを認めるものではなく、またこれら出版物また文献の内容または日付に関していかなる承認を構成するものでもない。
【０４０６】
本発明の基本的局面から逸脱することなく、前記物に修正がなされ得る。1つまたは複数の特定の態様に関して本発明を実質的に詳細に説明してきたが、本出願に具体的に開示した態様に変更がなされ得ること、なおかつこれらの修正および改良も本発明の範囲および精神の範囲内であることを当業者は認識すると考えられる。本明細書に例示的に記載した本発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素の非存在下で適切に実施され得る。したがって、例えば、本明細書中のそれぞれの場合において、「〜を含む」、「本質的に〜からなる」、および「〜からなる」という用語はいずれも、他の2つの用語のいずれかと置換され得る。したがって、使用している用語および表現は説明の用語として用いられるのであって、限定の用語として用いられるのではなく、示されたおよび記載された特徴の等価物またはその一部は排除されず、種々の修正が本発明の範囲内で可能であることが理解される。本発明の態様は、特許請求の範囲の局面に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【０４０７】
【図１】四重鎖核酸/結合タンパク質相互作用を妨げ得るキノロン類似体を示す。
【図２】四重鎖核酸/結合タンパク質相互作用を妨げ得るキノロン類似体を示す。
【図３】混合型高次構造(「M」；例えば、核酸6914T)、平行型高次構造(「P」；例えば、核酸10110T)、逆平行型高次構造(「A」；例えば、核酸9749NT)、および複合型高次構造(「C」；例えば、核酸8762NT)四重鎖構造を含む、特定のリボソーム核酸ヌクレオチド配列の円二色性スキャンを示す。
【図４】図4A、4B、および4Cは、rRNAおよびc-MYC RNAの合成に及ぼす化合物A-1の影響を示す。
【図１】
2009504192.tif 000093
【図２】
2009504192.tif 000094
【図３】
2009504192.tif 000095
【図４】
2009504192.tif 000096
【手続補正書】
【提出日】平成19年6月19日(2007.6.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、ヒトリボソームRNA中に同定される選択されたヌクレオチド配列を有する核酸、前記物をコードするDNA配列、ならびに非限定的にアッセイおよび治療を含む関連した使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
細胞内のタンパク質は「翻訳」と称される過程で合成される。タンパク質は、デオキシリボ核酸(DNA)ヌクレオチド配列から転写されたメッセンジャーリボ核酸(mRNA)から翻訳される。各タンパク質はアミノ酸の一本の鎖として合成され、翻訳過程においては、リボソームがmRNAに結合してそれに沿って進み、各アミノ酸を鎖に順次付加していく。mRNAに結合したリボソームは、mRNAに沿って連続して配置されたヌクレオチドトリプレット(すなわちコドン)に従って、tRNAに取り付けられたアミノ酸を選択する。
【０００３】
ヒトリボソームは、60S大サブユニットおよび40S小サブユニットを含む80S粒子である。「80S」、「60S」、および「40S」における「S」という表示は、粒子サイズの沈降尺度である「スベドベリ単位」を指す。各リボソームサブユニットはタンパク質と機能的RNAが集合したものであり、tRNAに取り付けられたアミノ酸のドッキング領域として働く。機能的RNAは「リボソームRNA(rRNA)」と称され、「リボソームDNA(rDNA)」と称されるゲノムDNAの領域を鋳型として用いるポリメラーゼIおよびIII酵素によって合成される。rDNA配列は、ヒトゲノム中で約400回反復されている。リボソームRNAの生合成は47S前駆体rRNAの合成から始まり、これは、様々なエンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、RNAヘリカーゼ、および他のタンパク質因子の協調した作用によって繰り返し切断されて、より小さな成熟18S、5.8S、および28S rRNAとなる。18S rRNAは40Sリボソームサブユニットに組み立てられ、28Sおよび5.8S rRNAは60Sリボソームサブユニットに組み立てられる。ヒトリボソームの生合成は主に、細胞核内の特殊化した区画である核小体で行われる。
【発明の開示】
【０００４】
発明の開示
ヒトゲノムrDNAおよびコードされるrRNA中に、四重鎖ヌクレオチド配列モチーフを有するグアニンリッチヌクレオチド配列が存在することが発見された。これらのヌクレオチド配列は、ヒトrDNAをグアニンリッチヌクレオチド配列((G3+)N1-7)3G3+、式中、Gはグアニンであり、Nは任意のヌクレオチドであり、「G3+」は3つまたはそれ以上のグアニンである、に関して検索することによって発見された。ヌクレオチド配列はまた、ヒトrDNAをシトシンリッチヌクレオチド配列((C3+)N1-7)3C3+、式中、Cはシトシンであり、Nは任意のヌクレオチドであり、「C3+」は3つまたはそれ以上のシトシンである、に関して検索することによって発見された。ヒトゲノムrDNAの代表的なヌクレオチド配列をSEQ ID NO:1に記載する。
【０００５】
したがって、ヒトrRNAまたはrDNAヌクレオチド配列由来のヌクレオチド配列((G3+)N1-7)3G3+（SEQ ID NO:230）もしくは((C3+)N1-7)3C3+（SEQ ID NO:231）、またはその相補体、式中、Gはグアニンであり、Nは任意のヌクレオチドである、を含む単離された核酸を本明細書に提供する。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列は100ヌクレオチド長またはそれよりも短く、場合によってはヌクレオチド配列は50ヌクレオチド長またはそれよりも短い。いくつかの態様において、単離された核酸はプラスミドであってもよく、他の態様においては、場合により直線状核酸である。いくつかの態様において、核酸は100ヌクレオチド長またはそれよりも短くてもよい。核酸はDNAである場合もあればRNAである場合もあり、ヌクレオチド配列は場合により、SEQ ID NO:1の連続した配列である。特定の態様において、核酸はDNAであり、rRNA配列またはその相補体(すなわち、ウラシルがチミンで置換される)を含む。特定の態様において、ヌクレオチド配列はヒト28S rRNA配列をコードしてもよく、いくつかの態様においてはヒト28S rRNA配列であってもよい。
【０００６】
以下は、非rDNAゲノムDNA配列と配列同一性を共有しないrDNAヌクレオチド配列の例である。DNA配列はrDNAのコード鎖(非鋳型鎖、プラス(+)鎖、またはアンチセンス鎖)上のものであり、ヌクレオチド範囲は43 kbヒトリボソームDNA反復単位(アクセッション番号U13369)上の位置を指し、コード鎖またはその逆相補体において、ヒトゲノムのNCBI build 35内に完全な配列一致は同定されなかった。
2009504192.tif 000097
2009504192.tif 000098
。
【０００７】
以下は、ヒトゲノムDNA中の非rDNA配列と配列同一性を共有するrDNAヌクレオチド配列の例である。DNA配列はrDNAコード鎖中のものであり、ヌクレオチド範囲は43 kbヒトrDNA反復単位(アクセッション番号U13369)上の位置を指す。
2009504192.tif 000099
。
【０００８】
特定のヒトrDNA配列と他の哺乳動物種の配列比較を行った。以下の配列は、他の哺乳動物種と配列同一性をほとんど共有しなかった：
2009504192.tif 000100
。
【０００９】
以下の配列は、別の哺乳動物種(例えば、マウス、ラット、チンパンジー)において顕著な配列類似性を共有した：
2009504192.tif 000101
。
【００１０】
以下の配列はrDNAの非コード鎖におけるGリッチ配列およびCリッチ配列であり、特定の態様において四重鎖構造を形成する可能性がある。
2009504192.tif 000102
2009504192.tif 000103
。
【００１１】
いくつかの態様において、単離された核酸はRNAであり、場合によってはSEQ ID NO:1の配列によってコードされるヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列はヒト28S rRNA配列である。
【００１２】
以下は、rDNA中の特定の領域によってコードされるrRNAおよびrRNA前駆体(pre-rRNA)ヌクレオチド配列の例である。RNA配列はrDNA配列から推測され、注釈づけはアクセッション番号U13369内に見出される。rRNAおよびrRNA前駆体を生成するために転写されるDNA配列に関して、ヒトゲノムのコード鎖(CDS)に沿って、遺伝子内に(Curwen et al., The Ensembl Automatic Gene Annotation System, Genome Res. 2004 May; 14(5):942-950によって同定される)一致は同定されなかった。
rDNA中の5'外部転写スペーサー領域由来のRNA配列
2009504192.tif 000104
；
rDNA中の内部転写スペーサー1領域由来のRNA配列
2009504192.tif 000105
；
rDNA中の内部転写スペーサー2領域由来のRNA配列
2009504192.tif 000106
；
28S rRNA内のRNA配列
2009504192.tif 000107
；
rDNA中の3'外部転写スペーサー領域由来のRNA配列
2009504192.tif 000108
。
【００１３】
以下は、非rDNAから転写されるRNA、およびそれらが転写されるrDNA領域と完全に一致するrRNAおよびrRNA前駆体配列である。
rDNA中の内部転写スペーサー1領域由来のRNA配列
2009504192.tif 000109
；
rDNA中の3'外部転写スペーサー領域由来のRNA配列
2009504192.tif 000110
。
【００１４】
以下はrDNAの転写領域中のCリッチrRNAおよびrRNA前駆体配列であり、特定の態様において四重鎖を形成する可能性がある。
rDNA中の5'外部転写スペーサー領域由来のRNA配列
2009504192.tif 000111
rDNA中の内部転写スペーサー2領域由来のRNA配列
2009504192.tif 000112
28S rRNA内のRNA配列
2009504192.tif 000113
rDNA中の3'外部転写スペーサー領域由来のRNA配列
2009504192.tif 000114
【００１５】
いくつかの態様において、本明細書に記載の単離された核酸は、本明細書に記載の別の核酸および/または本明細書に後述する別の成分(例えば、タンパク質、抗体)と組み合わされる。本明細書に提供する単離された核酸は、場合により、前記ヌクレオチド配列またはそのサブ配列を含み、本質的に前記ヌクレオチド配列もしくはそのサブ配列からなるか、または前記ヌクレオチド配列もしくはそのサブ配列の1つからなる。特定の態様において、核酸は、ペプチド核酸(PNA)類似体または本明細書に記載の他の類似体のような核酸類似体である。いくつかの態様において、核酸中のヌクレオチド配列は、配列モチーフ((G3+)N1-7)3G3+（SEQ ID NO:230）または((C3+)N1-7)3C3+（SEQ ID NO:231）と一致するヌクレオチド配列をもたらす1つまたは複数のヌクレオチド置換を含んでもよく、場合によってヌクレオチドはヌクレオチド類似体と置換される。特定の態様において、核酸またはその一部は、分子内四重鎖構造などの四重鎖構造を形成する。いくつかの態様において、単離された核酸を含む組成物はまた、例えばカリウムイオン(例えば、0.5 mM〜100 mMカリウムイオン)などの四重鎖構造を安定化する1つまたは複数の成分を含む。
【００１６】
特定の態様において、ヒトリボソームヌクレオチド配列またはそれと実質的に同一であるヌクレオチド配列を含む核酸は、四重鎖構造を形成する。核酸は多くの場合に、四重鎖形成を可能にし、かつ場合により四重鎖構造を安定化する他の成分を含む組成物中に存在する。ヒトリボソームヌクレオチド配列または実質的に同一なその変種は場合によりGリッチであり、場合によってはCリッチであり、特定の態様においてはヌクレオチド配列((G3+)N1-7)3G3+（SEQ ID NO:230）または((C3+)N1-7)3C3+（SEQ ID NO:231）と一致する。核酸は場合によりRNAであり、いくつかの態様においてはDNAである。実質的に同一なヌクレオチド配列変種は、場合により、SEQ ID NO:1のヌクレオチド配列またはその相補体と80%もしくはそれ以上、81%もしくはそれ以上、82%もしくはそれ以上、83%もしくはそれ以上、84%もしくはそれ以上、85%もしくはそれ以上、86%もしくはそれ以上、87%もしくはそれ以上、88%もしくはそれ以上、89%もしくはそれ以上、90%もしくはそれ以上、91%もしくはそれ以上、92%もしくはそれ以上、93%もしくはそれ以上、94%もしくはそれ以上、95%もしくはそれ以上、96%もしくはそれ以上、97%もしくはそれ以上、98%もしくはそれ以上、または99%もしくはそれ以上同一である。特定の態様において、ヒトリボソームヌクレオチド配列は、ヒトリボソームヌクレオチド配列またはその相補体の以下の領域の1つに由来する：(a) rDNA(例えば、SEQ ID NO:1)の5'ETS領域、ITS1領域、ITS2領域、28S rRNA領域、3'ETS領域、18S rRNA領域、もしくは5.8S rRNA領域；(b) (a)の相補体；(a)のコード化RNA；または(b)のコード化RNA。
【００１７】
ヒトrRNAコードゲノムDNA中の四重鎖形成配列候補を同定する方法であって、ヒトrRNAコードゲノムDNA中の配列((G3+)N1-7)3G3+（SEQ ID NO:230）または((C3+)N1-7)3C3+（SEQ ID NO:231）、式中、Gはグアニンであり、Cはシトシンであり、「3+」は3またはそれ以上のヌクレオチドであり、Nは任意のヌクレオチドである、を同定する段階を含む方法もまた本明細書に提供する。いくつかの態様において、ヒトrRNAコードゲノムDNAはSEQ ID NO:1である。
【００１８】
本明細書に記載のリボソームヌクレオチド配列の1つまたは複数を用いる方法もまた提供する。例えば、ヒトリボソームヌクレオチド配列を含む核酸に結合する分子を同定する方法であって、(a) 本明細書に記載のヒトリボソームヌクレオチド配列を含む核酸、その核酸に結合する化合物、および試験分子を接触させる段階、ならびに(b) 核酸に結合したかまたは結合しなかった化合物の量を検出する段階を含み、それによって、試験分子の非存在下よりも試験分子の存在下においてより少ない化合物が核酸に結合する場合に、試験分子が核酸に結合する分子として同定される方法を提供する。化合物は場合により検出可能な標識と結合しており、場合によっては放射標識されている。特定の態様において、化合物はキノロン類似体(例えば、本明細書に記載のキノロン類似体)またはポルフィリンである。特定の態様において、核酸は固相に結合していてよい。核酸はDNA、RNA、またはそれらの類似体であってもよく、特定の態様においては上記のヌクレオチド配列を含んでもよい。特定の態様において、核酸は、分子内四重鎖などの四重鎖を形成する可能性がある。
【００１９】
リボソーム核酸と、核酸と相互作用するタンパク質との間の相互作用を調節する分子を同定する方法であって、(a) タンパク質に結合し得るヒトリボソームヌクレオチド配列を含む核酸およびタンパク質を試験分子と接触させる段階、ならびに(b) タンパク質に結合したかまたは結合しなかった核酸の量を検出する段階を含み、それによって、試験分子が相互作用を調節する分子として同定される(例えば、試験分子の非存在下よりも試験分子の存在下において、異なる量の核酸がタンパク質に結合する)方法もまた本明細書に提供する。いくつかの態様において、タンパク質は、ヌクレオリン、フィブリラリン、RecQ、QPN1、および前記物の機能的断片からなる群より選択される。いくつかの態様においては、ヌクレオリン置換を引き起こす分子を同定する方法であって、(a) ヌクレオリンタンパク質に結合し得るヒトリボソームヌクレオチド配列を含む核酸およびヌクレオリンタンパク質を試験分子と接触させる段階、ならびに(b) ヌクレオリンタンパク質に結合したかまたは結合しなかった核酸の量を検出する段階を含み、それによって、試験分子の非存在下よりも試験分子の存在下においてより少ない核酸がヌクレオリンタンパク質に結合する場合に、試験分子がヌクレオリン置換を引き起こす分子として同定される方法を提供する。いくつかの態様において、ヌクレオリンタンパク質は検出可能な標識と結合しており、ヌクレオリンタンパク質は場合によって固相に結合している。核酸は場合により検出可能な標識と結合しており、特定の態様において核酸は固相に結合していてもよい。核酸はDNA、RNA、またはそれらの類似体であってもよく、特定の態様においては上記のヌクレオチド配列を含んでもよい。いくつかの態様において、試験分子はキノロン類似体である。本明細書に提供するリボソームヌクレオチド配列またはそれと実質的に同一である配列を有する核酸、およびヌクレオチド配列に結合するタンパク質(例えば、ヌクレオリン、フィブリラリン、RecQ、QPN1、および前記物の機能的断片)を含む組成物もまた提供する。
【００２０】
核酸合成の調節因子を同定する方法であって、プライマーオリゴヌクレオチドが鋳型核酸にハイブリダイズするのを可能にする条件下で、ヒトリボソームヌクレオチド配列を含む鋳型核酸、鋳型核酸ヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を有するプライマーオリゴヌクレオチド、伸長ヌクレオチド、ポリメラーゼ、および試験分子を接触させる段階、ならびにプライマー核酸の伸長によって合成された伸長プライマー産物の有無または量を検出する段階を含み、それによって、試験分子の非存在下よりも試験分子の存在下においてより少ない伸長プライマー産物が合成される場合に、試験分子が核酸合成の調節因子として同定される方法もまた本明細書に提供する。特定の態様において、本方法は、RNA合成の調節因子を同定すること、および特定の態様においては核小体RNA合成の調節因子を同定することに向けられる。鋳型核酸はDNAである場合もあればRNAである場合もあり、鋳型は本明細書に記載のリボソームヌクレオチド配列の任意の1つまたは複数を含み得る。ポリメラーゼは、DNAポリメラーゼである場合もあれば、RNAポリメラーゼである場合もある。
【００２１】
本明細書に記載の核酸を含む組成物もまた提供する。いくつかの態様において、組成物は、本明細書に記載のヒトrDNAまたはrRNAヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸を含む。いくつかの態様において、組成物は薬学的に許容される担体を含んでもよく、組成物は場合により核酸、および核酸中のヒトリボソームヌクレオチド配列に結合する(例えば、ヌクレオチド配列に特異的に結合する)化合物を含む。特定の態様において、化合物は、本明細書に記載する化合物のようなキノロン類似体である。
【００２２】
本明細書に記載の単離された核酸を含む細胞または動物もまた提供する。任意の適切な種類の細胞を用いることができ、場合により細胞は、組織培養で維持されるかまたは増殖させる細胞株である。単離された核酸は、研究動物(例えば、げっ歯類(例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ)、ネコ、イヌ、サル、または類人猿)などの動物の1つまたは複数の細胞に取り込まれ得る。
【００２３】
本明細書に記載のヒトリボソームヌクレオチド配列に結合する化合物を含む細胞もまた提供する。特定の態様においては、そのような細胞を含む動物を提供する。いくつかの態様において、化合物は核小体に局在する。特定の態様においては、H2AX、p53、chk1、p38 MAPK、およびchk2タンパク質の1つまたは複数がリン酸化され、場合によってはH2AX、p53、chk1、およびp38 MAPKタンパク質は実質的にリン酸化され、chk2タンパク質はリン酸化されない。いくつかの態様においては、JUNプロテインキナーゼ(JNK)がリン酸化される。特定の態様において、ヌクレオリンは核小体から核質に再分布する。
【００２４】
細胞におけるrRNA合成を阻害する方法であって、細胞におけるrRNA合成を減少させるのに十分な量の、rRNAまたはrDNAと相互作用する化合物と細胞を接触させる段階を含む方法もまた本明細書に提供する。そのような方法は、インビトロ、インビボ、および/またはエクスビボで行うことができる。したがって、いくつかのインビボ態様およびエクスビボ態様は、対象の細胞におけるrRNA合成を阻害する方法であって、rRNAまたはrDNAと相互作用する化合物を、それを必要とする対象に、対象の細胞におけるrRNA合成を減少させるのに十分な量投与する段階を含む方法に向けられる。いくつかの態様においては、細胞を1つまたは複数の化合物と接触させることができ、そのうちの1つまたは複数がrRNAまたはrDNAと相互作用する(例えば、一薬物または薬物および共薬物方法)。特定の態様において、化合物は、本明細書に記載のキノロン誘導体(例えば、化合物A-1またはB-1)のようなキノロン誘導体である。関連態様においては、細胞を、rRNAまたはrDNAと相互作用する化合物、および細胞に他の効果をもたらす1つまたは複数の共分子(例えば、共薬物)と接触させる。例えば、細胞増殖を減少させる、または組織炎症を軽減する共薬物が選択され得る。共薬物の非限定的な例を本明細書において後に提供する。
【００２５】
本明細書に記載のヒトリボソームヌクレオチド配列および/または構造に結合する化合物と細胞を接触させることによって細胞応答をもたらす方法もまた提供する。細胞応答は場合により、(a) H2AX、p53、chk1、JUNK、およびp38 MAPKタンパク質の実質的リン酸化；(b) ヌクレオリンの核小体から核質への再分布；(c) リソソームからのカテプシンDの放出；(d) アポトーシスの誘導；(e) 染色体ラダー化の誘導；(f) 細胞周期進行を停止させることのないアポトーシスの誘導；ならびに(g) アポトーシスの誘導および細胞周期停止の誘導(例えば、S期および/またはG1停止)である。
【００２６】
細胞周期進行を停止させることなくアポトーシスを誘導する方法であって、アポトーシスを誘導するのに有効な量の、本明細書に記載のヒトリボソームヌクレオチド配列および/または構造に結合する(例えば、特異的に結合する)化合物を細胞と接触させる段階を含む方法もまた本明細書に提供する。細胞周期進行を停止させることなくアポトーシスを誘導する方法であって、本明細書に記載のヒトリボソームヌクレオチド配列および/または構造に結合する(例えば、特異的に結合する)化合物を、それを必要とする対象に、アポトーシスを誘導するのに有効な量投与する段階を含む方法もまた提供する。対象は、げっ歯類(例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ)、ネコ、イヌ、有蹄動物、サル、類人猿、またはヒトであってもよく、化合物は、アポトーシスを誘導するために適切かつ簡便な任意の形態(例えば、経口、非経口、静脈内、経皮)で対象に投与することができる。そのような化合物の例は、式2Cまたは3Aのキノロン類似体である。特定の態様において、キノロン類似体は構造A-1を有する。細胞周期進行は多くの場合、周期の任意の1つの期で有意に停止しない。
【００２７】
アポトーシスを誘導し、かつ細胞周期進行を停止させる(例えば、S期細胞周期停止および/またはG1細胞周期停止)方法であって、アポトーシスを誘導するのに有効な量の、本明細書に記載のヒトリボソームヌクレオチド配列および/または構造に結合する(例えば、特異的に結合する)化合物を細胞と接触させる段階を含む方法もまた提供する。アポトーシスを誘導し、かつ細胞周期進行を停止させる(例えば、S期細胞周期停止および/またはG1細胞周期停止)方法であって、本明細書に記載のヒトリボソームヌクレオチド配列および/または構造に結合する(例えば、特異的に結合する)化合物を、それを必要とする対象に、アポトーシスを誘導するのに有効な量投与する段階を含む方法もまた提供する。対象は、げっ歯類(例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ)、ネコ、イヌ、有蹄動物、サル、類人猿、またはヒトであってもよく、化合物は、アポトーシスを誘導するために適切かつ簡便な任意の形態(例えば、経口、非経口、静脈内、経皮)で対象に投与することができる。そのような化合物の例は、式2Dのキノロン類似体である。特定の態様において、キノロン類似体は構造B-1を有する。細胞周期進行は多くの場合、1つの期で、および場合によっては2つの期で有意に停止する。
【００２８】
前記方法においては、場合により、化合物によって染色体DNAラダー化が誘導される。特定の態様において、細胞は膵臓細胞、結腸直腸細胞、腎細胞、およびバーキットリンパ腫細胞であり、前記物は対象において標的化される。
【００２９】
化合物が細胞または対象に対して毒性があるかどうかを決定する方法であって、細胞を化合物と接触させる段階、ならびにJNKタンパク質のリン酸化状態および任意でp38MAPKタンパク質のリン酸化状態を決定する段階を含み、それによって、JNKタンパク質のリン酸化レベルおよび任意でp38MAPKタンパク質のリン酸化レベルが、化合物と接触させていない細胞と比較して化合物と接触させた細胞において高い場合に、化合物が細胞または対象に対して毒性があると決定される方法もまた提供する。いくつかの態様において、毒性は炎症である。本方法は場合により、JNKタンパク質のリン酸化レベルおよび任意でp38MAPKタンパク質のリン酸化レベルを、化合物と接触させていない細胞に対して化合物と接触させた細胞において比較する段階を含み、場合によっては化合物で処理していない細胞においてあらかじめ決定されたJNKタンパク質のリン酸化レベルおよびまたはp38MAPKタンパク質のリン酸化レベルを、化合物で処理した細胞におけるリン酸化レベルと比較する。特定の態様において、JNKタンパク質はJNKタンパク質の特定のアイソフォームであり、p38MAPKタンパク質は特定のp38MAPKタンパク質アイソフォームである。JNKタンパク質またはp38MAPKタンパク質のリン酸化は、任意の簡便な様式で決定することができ、その例は本明細書に後述する。本方法を用いて、細胞または対象の細胞に対するキノロン化合物の毒性を決定することができ、キノロン化合物は本明細書に記載する式のキノロン化合物であり得る。
【００３０】
本発明を実施するための最良の形態
本明細書に記載のリボソーム核酸および関連した方法は、種々の応用において有用である。例えば、本明細書に記載のヌクレオチド配列は、相互作用分子をスクリーニングする(例えば、スクリーニングアッセイにおいて)ための標的となり得る。相互作用分子は、新規治療薬として、または新規治療薬の開発のために用いることができる。リボソーム核酸相互作用分子は、他の標的ヌクレオチド配列(例えば、標的スクリーニングアッセイ)または他の相互作用分子(例えば、競合スクリーニングアッセイ)を同定するための手段となり得る。ヌクレオチド配列またはその相補配列はアプタマーとして用いることもでき、またはアプタマーを作製するための基礎として役立ち得る。アプタマーは、治療薬として、または新規相互作用分子を同定するためのアッセイにおいて用いることができる。
【００３１】
核酸
本明細書に記載のrDNAもしくはrRNAヌクレオチド配列、または実質的に同一なその変種を有する単離されたリボソーム核酸を本明細書に提供する。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列は、28S、18S、もしくは5.8S rRNAヒトヌクレオチド配列、または実質的に同一なその変種を含むか、またはその一部である。ヌクレオチド配列は場合により、SEQ ID NO:1もしくは実質的に同一なその変種を含むか、またはその一部である。「リボソーム核酸」または「リボソームヌクレオチド配列」には、ヒトrRNAヌクレオチド配列、ヒトrDNAヌクレオチド配列、またはヒトrRNA前駆体ヌクレオチドが含まれてもよく、場合によっては前記物の実質的に同一な変種である。
【００３２】
核酸は、一本鎖、二本鎖、三重鎖、直線状、または環状であってもよい。核酸はRNAである場合もあればDNAである場合もあり、前記物の1つまたは複数のヌクレオチド誘導体または類似体(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上の類似体または誘導体ヌクレオチド)を含んでもよい。いくつかの態様において、核酸は全体的に1つまたは複数の類似体または誘導体ヌクレオチドから構成され、場合によって核酸は、約50%もしくはそれ未満、約25%もしくはそれ未満、約10%もしくはそれ未満、または約5%もしくはそれ未満の、類似体または誘導体ヌクレオチド塩基から構成される。類似体または誘導体核酸中の1つまたは複数のヌクレオチドは、RNAまたはDNAヌクレオチドと比較して、リボースまたはリン酸修飾(例えば、リボースペプチド核酸(PNA)またはホスホチオエート結合)などの核酸塩基修飾または骨格修飾を含んでもよい。ヌクレオチド類似体および誘導体は当業者に公知であり、そのような修飾の非限定的な例は、米国特許第6,455,308号(Freier et al.)；米国特許第4,469,863号；第5,536,821号；第5,541,306号；第5,637,683号；第5,637,684号；第5,700,922号；第5,717,083号；第5,719,262号；第5,739,308号；第5,773,601号；第5,886,165号；第5,929,226号；第5,977,296号；第6,140,482；ならびにWIPO公報 WO 00/56746およびWO 01/14398に記載されている。そのような類似体または誘導体を含む核酸を合成する方法は、例えば上記の特許公報、ならびに米国特許第6,455,308号；第5,614,622号；第5,739,314号；第5,955,599号；第5,962,674号；第6,117,992号；およびWO 00/75372に開示されている。
【００３３】
核酸またはその中のリボソームヌクレオチド配列は、場合により約8〜約80ヌクレオチド長、場合により約8〜約50ヌクレオチド長、および場合により約10〜約30ヌクレオチド長である。いくつかの態様において、核酸またはその中のリボソームヌクレオチド配列は、場合により約500ヌクレオチド長もしくはそれ未満、約400ヌクレオチド長もしくはそれ未満、約300ヌクレオチド長もしくはそれ未満、約200ヌクレオチド長もしくはそれ未満、約150ヌクレオチド長もしくはそれ未満、約100ヌクレオチド長もしくはそれ未満、約90ヌクレオチド長もしくはそれ未満、約80ヌクレオチド長もしくはそれ未満、約70ヌクレオチド長もしくはそれ未満、約60ヌクレオチド長もしくはそれ未満、または約50ヌクレオチド長もしくはそれ未満であり、場合により約40ヌクレオチド長もしくはそれ未満、約35ヌクレオチド長もしくはそれ未満、約30ヌクレオチド長もしくはそれ未満、約25ヌクレオチド長もしくはそれ未満、約20ヌクレオチド長もしくはそれ未満、または約15ヌクレオチド長もしくはそれ未満である。核酸は場合により、プラスミド形態である態様などにおいて前記の長さよりも大きく、特定の態様においては、約600、約700、約800、約900、約1000、約1100、約1200、約1300、または約1400塩基対長もしくはそれ以上である。
【００３４】
本明細書に記載の核酸は多くの場合に単離されている。本明細書で用いる「単離された」という用語は、当初の環境(例えば、天然物である場合は天然環境、または外因的に発現される場合は宿主細胞)から取り出された物質を指し、当初の環境中の他の物質から精製されている場合が多く、したがってその当初の環境から「人為的に」改変されている。分子に関して本明細書で用いる「精製された」という用語は、絶対純度を指すものではない。むしろ、「精製された」とは、由来元の試料と比較して、関心対象の物質以外の同じ種類(例えば、核酸またはタンパク質種)の物質種をより少なく含む組成物中の物質を指す。「精製された」という用語は、由来元の試料と比較して、関心対象の核酸以外の核酸種をより少なく含む組成物中の物質を指す。場合により核酸は「実質的に純粋」であり、これは、核酸が組成物の質量に基づいて核酸の少なくとも50%を表すことを意味する。多くの場合、実質的に純粋な核酸は組成物の質量に基づいて少なくとも75%純粋であり、場合によっては組成物の質量に基づいて少なくとも95%純粋である。核酸は生物学的供給源から精製してもよく、および/または製造してもよい。核酸の製造工程(例えば、化学合成および組換えDNA工程)および精製工程は、当業者に公知である。例えば、Applied Biosystems(カリフォルニア州、フォスターシティー)から入手可能なABI(商標) 3900 High Throughput DNA Synthesizerを使用するなど、標準的な方法および機器を用いて、合成オリゴヌクレオチドを合成することができる。
【００３５】
上記の通り、核酸は、本明細書に記載のヌクレオチド配列の実質的に同一な配列変種を含んでもよい。本明細書で用いる「実質的に同一な変種」という用語は、記載のリボソームヌクレオチド配列と配列同一性を共有するヌクレオチド配列を指す。本明細書に記載のリボソームヌクレオチド配列と、55%もしくはそれ以上、60%もしくはそれ以上、65%もしくはそれ以上、70%もしくはそれ以上、75%もしくはそれ以上、80%もしくはそれ以上、85%もしくはそれ以上、90%もしくはそれ以上、91%もしくはそれ以上、92%もしくはそれ以上、93%もしくはそれ以上、94%もしくはそれ以上、95%もしくはそれ以上、96%もしくはそれ以上、97%もしくはそれ以上、98%もしくはそれ以上、または99%もしくはそれ以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列が含まれる。特定の態様において、実質的に同一な変種は、本明細書に記載のリボソームヌクレオチド配列と91%またはそれ以上同一である。2つのヌクレオチド配列が実質的に同一であるかどうかを決定するための1つの試験は、共有される同一ヌクレオチド配列の割合を決定することである。
【００３６】
配列同一性の計算は以下のように行うことができる。最適に比較できるように配列を整列させる(例えば、最適なアライメントのために、第1アミノ酸および第2アミノ酸または核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、また比較のために非相同配列を無視することができる)。比較目的で整列させる参照配列の長さは、場合により参照配列の長さの30%もしくはそれ以上、40%もしくはそれ以上、50%もしくはそれ以上、多くの場合には60%もしくはそれ以上、より多くの場合には70%もしくはそれ以上、80%もしくはそれ以上、90%もしくはそれ以上、または100%である。次いで、対応するヌクレオチド位置またはポリペプチド位置のヌクレオチドまたはアミノ酸をそれぞれ、2つの配列間で比較する。第1配列中の位置が、第2配列中の対応する位置と同じヌクレオチドまたはアミノ酸によって占有されている場合、ヌクレオチドまたはアミノ酸はその位置において同一であると見なされる。2つの配列間のパーセント同一性は、2つの配列の最適なアライメントのために導入されるギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、配列によって共有される同一位置の数の関数である。配列の比較および2つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成し得る。2つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれているMeyers & Miller, CABIOS 4: 11-17 (1989)のアルゴリズムを使用して、PAM120荷重残基表(weight residue table)、ギャップ長ペナルティ(gap length penalty)12、およびギャップペナルティ4を用いて決定され得る。また、2つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、GCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムに組み込まれているNeedleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)のアルゴリズムを使用して(ワールドワイドウェブアドレス：www.gcg.comで利用可能)、Blossum 62行列またはPAM250行列、ならびにギャップ荷重(gap weight)16、14、12、10、8、6、または4、および長さ荷重(length weight)1、2、3、4、5、または6を用いて決定され得る。2つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、GCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムを用いて(ワールドワイドウェブアドレス：www.gcg.comで利用可能)、NWSgapdna.CMP行列、ならびにギャップ荷重40、50、60、70、または80および長さ荷重1、2、3、4、5、または6を用いて決定され得る。多くの場合に用いられるパラメータセットは、ギャップオープンペナルティ12、ギャップ伸長ペナルティ(gap extend penalty)4、およびフレームシフトギャップペナルティ5によるBlossum 62スコアリング行列である。
【００３７】
2つの核酸が実質的に同一であるかどうかを決定するための別の様式は、ストリンジェントな条件下で、一方の核酸に相同的なポリヌクレオチドがもう一方の核酸にハイブリダイズするかどうかを評価することである。本明細書で用いる「ストリンジェントな条件」という用語は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を指す。ストリンジェントな条件は当業者に公知であり、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 6.3.1-6.3.6 (1989)に見出すことができる。この参考文献には水性および非水性方法が記載されているが、どちらも使用できる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、約45℃での6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中でのハイブリダイゼーション、およびその後の50℃での0.2× SSC、0.1% SDS中での1回または複数回の洗浄である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の別の例は、約45℃での6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中でのハイブリダイゼーション、およびその後の55℃での0.2× SSC、0.1% SDS中での1回または複数回の洗浄である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のさらなる例は、約45℃での6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中でのハイブリダイゼーション、およびその後の60℃での0.2× SSC、0.1% SDS中での1回または複数回の洗浄である。多くの場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約45℃での6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中でのハイブリダイゼーション、およびその後の65℃での0.2× SSC、0.1% SDS中での1回または複数回の洗浄である。より多くの場合、ストリンジェンシー条件は、65℃での0.5 Mリン酸ナトリウム、7% SDS、およびその後の65℃での0.2× SSC、0.1% SDSでの1回または複数回の洗浄である。
【００３８】
本明細書に記載の特定のリボソームヌクレオチド配列は、例えば他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定する目的で公的データベースに対して検索を行うための「問い合わせ配列」として用いることができる。問い合わせ配列を用いて、ヒト以外の生物(例えば、類人猿、げっ歯類(例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット)、有蹄動物(例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ)、爬虫類、両生類、および鳥類)における実質的に同一な配列を検索することができる。そのような検索は、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10 (1990)のNBLASTおよびXBLASTプログラム(バージョン2.0)を用いて行うことができる。本明細書に記載のリボソームヌクレオチド配列と相同的なヌクレオチド配列を得るためには、NBLASTプログラム、スコア＝100、ワード長＝12を用いてBLASTヌクレオチド検索を行うことができる。本明細書に記載のアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を得るためには、XBLASTプログラム、スコア＝50、ワード長＝3を用いてBLASTポリペプチド検索を行うことができる。比較目的でギャップの入ったアラインメントを得るためには、Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402 (1997)に記載されているように、Gapped BLASTを用いることができる。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを用いる場合、それぞれのプログラム(例えば、XBLASTおよびNBLAST)の初期設定パラメータを用いることができる(ワールドワイドウェブアドレス：www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい）。
【００３９】
特定の態様において、リボソームヌクレオチド配列は以下の配列の1つまたは複数を含まない：
2009504192.tif 000115
。
特定の態様において、リボソームヌクレオチド配列は以下の配列の1つまたは複数を含まない：
2009504192.tif 000116
。
【００４０】
いくつかの態様において、単離された核酸は、本明細書に記載のヌクレオチド配列をコードするヌクレオチド配列を含み得る。他の態様において、核酸は、本明細書に記載のヌクレオチド配列の相補体をコードするヌクレオチド配列を含む。例えば、本明細書に記載のリボソーム配列、または本明細書に記載のリボソームヌクレオチド配列に相補的な配列は、核酸のより長いヌクレオチド配列内に含まれ得る。コードされるヌクレオチド配列は場合により、本明細書において「アプタマー」と称され、スクリーニング法において、または治療薬として用いることができる。特定の態様において、アプタマーは本明細書におけるヌクレオチド配列に相補的であり、標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズし得る。ハイブリダイズしたアプタマーは、例えば、標的相補的ヌクレオチド配列と二重鎖または三重鎖を形成し得る。アプタマーは、インビトロ系またはインビボ系においてコード配列によって合成され得る。インビトロで合成する場合、アプタマーは場合により類似体または誘導体ヌクレオチドを含む。インビボで合成する場合、コード配列はその系のゲノムDNA中に組み込まれてもよいし、またはゲノムから自律的に複製してもよい(例えば、プラスミド核酸内で)。アプタマーは場合により、特定のタンパク質または核酸標的に対する結合またはハイブリダイゼーション親和性の尺度によって選択される。特定の態様において、アプタマーは細胞内または血漿内の1つまたは複数のタンパク質分子に結合し、治療応答を誘導するか、またはタンパク質の存在を検出するための方法として用いることができる。
【００４１】
特定の態様において、単離された核酸中のヒトリボソームヌクレオチド配列は、ヒトリボソームヌクレオチド配列またはその相補体の以下の領域の1つに由来する：(a) rDNA(例えば、SEQ ID NO:1)の5'ETS領域、ITS1領域、ITS2領域、28S rRNAコード領域、3'ETS領域、18S rRNAコード領域、もしくは5.8S rRNAコード領域；(b) (a)の相補体；(c) (a)のコード化RNA；または(d) (b)のコード化RNA。SEQ ID NO:1において、5'ETS領域は約1位〜約3656位にわたり；ITS1領域は約5528位〜約6622位にわたり；ITS2領域は約6780位〜約7934位にわたり、28S rRNAコード領域は約7935位〜約12969位にわたり、3'ETS領域は約12970位〜約13350位にわたり、18S rRNAコード領域は約3657位〜約5527位にわたり；および5.8 S rRNAコード領域は約6623位〜約6779位にわたる。特定の態様において、単離された核酸中のリボソームヌクレオチド配列は、(a) rDNA(例えば、SEQ ID NO:1)の5'ETS領域、ITS1領域、ITS2領域、28S rRNAコード領域、もしくは3'ETS領域；(b) (a)の相補体；(c) (a)のコード化RNA；または(d) (b)のコード化RNA、に由来する。
【００４２】
単離された核酸は、四重鎖構造の形成を可能にし、かつ場合によりその構造を安定化する条件下で、他の分子と共に提供され得るか、または他の分子と接触させることができる。本明細書で用いる「四重鎖構造」という用語は、1つまたは複数のグアニンテトラッド(guanine-tetrad)(Gテトラッド(G-tetrad))構造またはシトシンテトラッド(cytosine-tetrad)構造(Cテトラッド(C-tetrad)または「iモチーフ」)を含む核酸内の構造を指す。Gテトラッドは、フーグスティーン(Hoogsteen)水素結合を介して四重鎖構造内に形成され得る。四重鎖構造は、分子間(すなわち、2つ、3つ、4つ、またはそれ以上の別個の核酸間で形成される)であってもよいし、または分子内(すなわち、単一の核酸内で形成される)であってもよい。いくつかの態様において、四重鎖形成核酸は、4本の平行な鎖を有する平行型四重鎖構造(例えば、プロペラ型構造)、2本の平行な鎖に対して逆平行である2本の鎖を有する逆平行型四重鎖構造(例えば、イス型四重鎖構造またはかご型四重鎖構造)、または3本の平行な鎖に対して逆平行である1本の鎖を有する「混合平行型(mixed parallel)」とも称される部分的平行型四重鎖構造(例えば、イス-プロペラ型(chair-eller)またはかご-プロペラ型(basket-eller)四重鎖構造)を形成し得る。そのような構造は、例えば、米国特許出願公開第2004/0005601号およびPCT出願 PCT/US2004/037789に記載されている。1つまたは複数の四重鎖構造が核酸内で形成されてもよく、また核酸中の1つのまたは複数の領域で形成されてもよい。核酸の長さに応じて、核酸全体が四重鎖構造を形成することも可能であるが、核酸の一部が部分的四重鎖構造を形成する場合が多い。核酸配列またはサブ配列がとる特定の四重鎖高次構造(例えば、平行型、逆平行型、混合平行型)を決定するための種々の方法が公知であり、本明細書に記載される(例えば、円二色性)。
【００４３】
四重鎖の形成および安定化を可能にする条件は当業者に公知であり、最適な四重鎖形成条件を試験することができる。イオン型、イオン濃度、対陰イオン型、およびインキュベーション時間を変更することができ、当業者は、本明細書に記載する方法を用いることによって、所与の条件セットに関して四重鎖高次構造が形成されるかどうか、および安定化されるかどうかを日常的に決定することができる。例えば、陽イオン(例えば、カリウムなどの一価陽イオン)は四重鎖構造を安定化し得る。例えば約5分、約10分、約20分、約30分、約40分、約50分、または約60分もしくはそれ以上といった特定の時間にわたり、イオンを含む溶液中で核酸を接触させることができる。四重鎖構造が溶液中で機能的な四重鎖を形成し得る場合、または四重鎖構造が溶液中で検出され得る場合に、四重鎖構造は安定化される。
【００４４】
1つの核酸配列は異なる四重鎖配向性をもたらすことができ、異なる高次構造は、核酸のヌクレオチド配列、ならびに系中に存在するカリウムイオンの濃度および四重鎖を形成させる時間など、それらが形成される際の条件に一部依存する。複数の高次構造が相互に平衡状態になる場合があり、系中に相補鎖が存在する場合には二重鎖核酸と平衡状態になり得る。平衡は、支持される高次構造がもう一方の高次構造または残りの高次構造よりも高濃度または高比率で存在するように、一方の高次構造が別の高次構造よりも支持されるよう移行し得る。本明細書で用いる「支持する」または「安定化する」という用語は、1つの高次構造が残りの高次構造と比較してより高濃度または高比率で存在することを指す。本明細書で用いる「妨げる」または「不安定化する」という用語は、1つの高次構造がより低い濃度で存在することを指す。一方の高次構造がもう一方の高次構造(例えば、別の四重鎖高次構造、別の並行高次構造、または二重鎖高次構造)に関して50%もしくはそれ以上、75%もしくはそれ以上、または80%もしくはそれ以上、または90%もしくはそれ以上の割合で系中に存在する場合に、一方の高次構造はもう一方の高次構造よりも支持され得る。逆に、一方の高次構造がもう一方の高次構造に関して50%もしくはそれ未満、25%もしくはそれ未満、または20%もしくはそれ未満、および10%もしくはそれ未満の割合で系中に存在する場合、一方の高次構造は妨げられ得る。
【００４５】
本明細書に記載の方法により、一方の四重鎖形態がもう一方の形態よりも支持されるよう平衡を移行させることができる。核酸中の四重鎖形成領域は、種々の様式で改変することができる。改変は、1つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換によって起こり得る。置換は、Gテトラッドに関与するグアニンなどの核酸の単一ヌクレオチド置換を含むことができ、ここで四重鎖核酸中のそのようなグアニンの1つ、2つ、3つ、もしくは4つまたはそれ以上を置換してもよい。同様に、Gテトラッドに関与するグアニン近傍の1つもしくは複数のヌクレオチドを欠失させるかもしくは置換することも可能であり、または1つもしくは複数のヌクレオチドを挿入することも可能である(例えば、Gテトラッドに関与するグアニンの1つ、2つ、3つ、または4つのヌクレオチド内に)。ヌクレオチドは、例えばヌクレオチド類似体と、または別のDNAもしくはRNAヌクレオチドと(例えば、グアニンのアデニン、シトシン、またはチミンとの置換)置換することができる。イオン濃度および四重鎖DNAを特定のイオンと接触させる時間は、もう一方の高次構造よりも一方の高次構造を支持し得る。特定の四重鎖高次構造に関して選択するために、イオン型、対イオン型、イオン濃度、およびインキュベーション時間を変更することができる。加えて、四重鎖DNAと相互作用する化合物も一方をもう一方よりも支持し得り、よって特定の形態を安定化し得る。
【００４６】
核酸内で四重鎖構造が形成されるかどうかを決定するための標準的な手順は、当業者に公知である。同様に、当業者に公知の標準的手順を用いて、異なる四重鎖高次構造を相互に別々に同定することができる。例えばポリメラーゼ停止および円二色性により四重鎖形成を特徴づけるようなそのような方法の例は、実施例の項において後述する。
【００４７】
リボソームヌクレオチド配列相互作用分子の同定
本明細書に記載のリボソーム核酸と相互作用する物質を同定する方法を提供する。1つのまたは複数のリボソーム核酸、および1つまたは複数の試験分子などのアッセイ成分を接触させ、相互作用の有無を観察する。アッセイ成分は、当業者により任意の簡便な形式および系で接触させることができる。本明細書で用いる「系」という用語は、これらに限定されないが、マイクロタイタープレート(例えば、96ウェルまたは384ウェルプレート)、チップ上に固定化され、かつ任意にアレイ中に配置された分子を有するシリコンチップ(例えば、米国特許第6,261,776号、およびFodor, Nature 364: 555-556 (1993)を参照されたい)、マイクロ流体装置(例えば、米国特許第6,440,722号；第6,429,025号；第6,379,974号；および第6,316,781号を参照されたい)、および細胞培養容器を含む、アッセイ成分を受容する環境を指す。系は、シグナル検出器、ロボットプラットホーム、ピペットディスペンサー、および顕微鏡などの付帯装置を含み得る。系は無細胞である場合もあれば、1つまたは複数の細胞を含む場合もあり、場合によっては動物由来の細胞試料を含むかまたはそのような細胞試料であり(例えば、生検試料、臓器、付属器)、場合によっては非ヒト動物である。細胞は、例えばマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、モルモット、有蹄動物(例えば、ウマ、ウシ、ブタ)、サル、類人猿、またはヒト対象などの任意の適切な対象から抽出され得る。
【００４８】
当業者は、使用する系、ならびにモニターする相互作用および/または生物活性パラメータに基づいて、試験分子および試験条件を選択することができる。本明細書に記載する任意の試薬を含む任意の種類の試験分子を用いることができ、試験分子は、例えば化合物、抗体および抗体断片、結合パートナーおよび断片、ならびに核酸分子から選択され得る。そのような分子の各種類の特定の態様は、本明細書に後述する。リボソーム核酸相互作用分子を同定するためのアッセイにおいて、1つまたは複数の試験分子を系に添加することができる。試験分子および他の成分は、任意の適切な順で系に添加することができる。相互作用または生物活性の任意の変化を観察および/または定量化できるように、多くの場合、特定の条件または試験分子に曝露した試料を、その条件または試験分子に曝露していない試料と比較する。
【００４９】
アッセイ系は場合により、ヘテロジニアスまたはホモジニアスである。ヘテロジニアスアッセイでは、1つまたは複数の試薬および/またはアッセイ成分を固相上に固定化し、反応の終了時に固相上で複合体を検出する。ホモジニアスアッセイでは、反応全体を液相中で行う。いずれのアプローチにおいても、反応物質を添加する順序は、試験する分子に関して異なる情報が得られるように変更することができる。例えば、標的分子/結合パートナー相互作用を作動させる試験化合物は、競合形式で試験分子の存在下で反応を行うことによって同定することができる。または、予め形成された複合体を作動させる試験分子、例えば複合体から成分の1つを置換する、より高い結合定数を有する分子は、複合体が形成された後に試験化合物を反応混合物に添加することによって試験することができる。
【００５０】
ヘテロジニアスアッセイ態様では、1つまたは複数のアッセイ成分を固体表面(例えば、マイクロタイタープレート)に係留し、多くの場合、非係留成分を直接または間接的に標識する。ヘテロジニアスアッセイ態様では、1つまたは複数のアッセイ成分を固体支持体に固定化することができる。成分と固体支持体との付着は、共有結合であっても非共有的であってもよい(非共有結合的付着に関しては、例えば米国特許第6,022,688号を参照されたい)。本明細書で用いる「固体支持体」または「固相」という用語は、固体、半固体、ゲル、フィルム、膜、メッシュ、フェルト、複合物、粒子などを含む多種多様な物質を指す。適切な固相には、固相結合アッセイにおける固相として開発されたおよび/または用いられるものが含まれる(例えば、米国特許第6,261,776号；第5,900,481号；第6,133,436号；および第6,022,688号；WIPO公報 WO 01/18234；Immunoassay, E. P. Diamandis and T. K. Christopoulos eds., Academic Press: New York, 1996の第9章；Leon et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 8: 2997 (1998)；Kessler et al., Agnew. Chem. Int. Ed. 40: 165 (2001)；Smith et al., J. Comb. Med. 1: 326 (1999)；Orain et al., Tetrahedron Lett. 42: 515 (2001)；Papanikos et al., J. Am. Chem. Soc. 123: 2176 (2001)；Gottschling et al., Bioorg. And Medicinal Chem. Lett. 11: 2997 (2001))。適切な固相の例には、分子を捕捉するために当業者によって用いられ得る膜フィルター、セルロースベースの紙、ビーズ(ポリマー、ラテックス、および常磁性粒子を含む)、ガラス(例えば、スライドガラス)、フッ化ビニリデン樹脂(PVDF)、ナイロン、シリコンウエハー、マイクロチップ、微粒子、ナノ粒子、クロマトグラフィー支持体、TentaGel、AgroGel、PEGAゲル、SPOCCゲル、マルチウェルプレート(例えば、マイクロタイタープレート)、ナノチューブなどが含まれる。固相は、非多孔性であってもよいし多孔性であってもよい。アッセイ成分は、アレイ中の固相上に配置されてもよい。したがって、規則正しいアレイ中の固相上の個々の位置に固定化された、1つまたはそれ以上、2つまたはそれ以上、3つまたはそれ以上といった本明細書に記載のアッセイ成分(例えば、リボソーム核酸)を含むアレイを提供する。そのようなアレイは場合により、各スポットが平方センチメートル当たり少なくとも100分子を含むアレイのような高密度アレイである。
【００５１】
特定のヘテロジニアスアッセイ態様では、場合により、固定化種のパートナーを、試験分子と共にまたは試験分子の非存在下で被覆表面に曝露する。反応が完了した後、形成された任意の複合体のかなりの部分が固体表面上に固定化されたまま残るように、未反応の成分を除去する(例えば、洗浄によって)。非固定化種が前標識されている場合には、表面上に固定化された標識が検出されることが複合体の形成を示す。非固定化種が前標識されていない場合には、間接的標識を用いて、表面に係留された複合体を検出することができる(例えば、最初の非固定化種に特異的な標識抗体を用いて)。反応成分を添加する順序に応じて、複合体形成を阻害する、または予め形成された複合体を破壊する、試験化合物を検出することができる。
【００５２】
特定の態様においては、タンパク質もしくはペプチド試験分子またはアッセイ成分を、ファージコートタンパク質を介してファージに連結する。ファージに連結されたタンパク質またはペプチドと相互作用し得る分子を固相に固定化し、固定化成分と相互作用するタンパク質またはペプチドを提示するファージを固体支持体に付着させる。次いで、付着したファージの核酸を単離し、配列決定して、固相上に固定化された成分と相互作用するタンパク質またはペプチドの配列を決定する。多種多様なペプチドまたはタンパク質をバクテリオファージコートタンパク質との融合物として提示させる方法は、周知である(Scott and Smith, Science 249: 386-390 (1990)；Devlin, Science 249: 404-406 (1990)；Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 6378-6382 (1990)；Felici, J. Mol. Biol. 222: 301-310 (1991))。試験ポリペプチドをファージコートタンパク質のN末端またはC末端に連結する方法もまた利用できる。最初のファージディスプレイシステムは、例えば米国特許第5,096,815号および第5,198,346号に開示されている。この系は直線状ファージM13を使用し、これはクローニングされたタンパク質が大腸菌(E. coli)において産生されることを必要とし、かつクローニングされたタンパク質が大腸菌内膜を越えて移行することを必要とした。λ、T4、およびT7などの溶菌性バクテリオファージベクターは、大腸菌の分泌に依存しないため、より実用的である。T7は市販されており、米国特許第5,223,409号；第5,403,484号；第5,571,698号；および第5,766,905号に記載されている。
【００５３】
ヘテロジニアスアッセイ態様では、反応は試験分子の存在下または非存在下において液相中で行うことができ、反応産物を未反応成分から分離し、複合体を検出する(例えば、溶液中で形成された任意の複合体を係留するための結合成分の1つに特異的な固定化抗体、および係留された複合体を検出するためのもう一方のパートナーに特異的な標識抗体を用いる)。この場合も同様に、反応物質を液相に添加する順序に応じて、複合体を阻害する、または予め形成された複合体を破壊する試験化合物を同定することができる。
【００５４】
いくつかのホモジニアスアッセイ態様においては、試薬および/または他の成分を含む予め形成された複合体を調製する。複合体中の1つまたは複数の成分(例えば、リボソーム核酸、ヌクレオリンタンパク質、または核酸結合化合物)を標識する。いくつかの態様においては、標識によって生じるシグナルが複合体形成により消される(例えば、このアプローチを免疫測定法に利用する米国特許第4,109,496号)。予め形成された複合体の種の1つと競合する、およびこれを置換する試験分子を添加すると、バックグラウンドを超えるシグナルの発生またはシグナルの減少が起こり得る。このようにして、リボソーム核酸/試験分子複合体を破壊する試験物質を同定することができる。
【００５５】
リボソーム核酸を含む複合体の形成を阻止するまたは作動させる試験分子を同定する態様においては、複合体の成分を含む反応混合物を、複合体形成を可能にするのに十分な条件および時間で調製する。反応混合物は多くの場合、試験分子の存在下または非存在下で提供される。試験分子は、反応混合物中に最初から含めることができ、または標的分子およびその結合パートナーを添加した後に添加することができる。対照反応混合物は、試験分子なしでまたは偽薬と共にインキュベートする。任意の複合体の形成を検出する。対照反応混合物と比較して、試験分子を含む反応混合物中の複合体形成が減少することにより、分子が複合体形成を阻止することが示される。または、対照反応混合物と比較して、試験分子を含む反応混合物中の複合体形成が増加することにより、分子が標的分子/結合パートナー形成を作動させることが示される。特定の態様においては、リボソーム核酸/相互作用分子の複合体形成を、修飾リボソーム核酸/相互作用分子(例えば、リボソーム核酸中のヌクレオチド置換)の複合体形成と比較することができる。そのような比較は、修飾核酸の相互作用は調節するが、被修飾核酸の相互作用は調節しない試験分子を同定することを所望する場合に有用であり得る。
【００５６】
いくつかの態様において、当業者は、アッセイ成分間(例えば、リボソーム核酸と試験分子)の相互作用の有無を検出する。本明細書で用いる「相互作用」という用語は、典型的に、特定の系の成分が相互に可逆的に結合することを指し、そのような相互作用は定量化することができる。分子は、系において他の分子と比較してある程度の特性で標的に結合する場合に、標的に「特異的に結合」し得る(例えば、分子の約75%〜約95%またはそれ以上が系において標的に結合する)。多くの場合、結合親和性は、試薬、反応物質、または系の他の成分の濃度または量の範囲の関数としてシグナル強度をプロットすることによって定量化される。定量化された相互作用は、最大シグナルの50%であるシグナルの放出に必要な試薬の濃度または量(IC50)に換算して表すことができる。同様に、定量化された相互作用は、当技術分野において公知の速度論的方法を用いて解離定数(KdまたはKi)として表すことができる。系における相互作用特性を表す速度論的パラメータを評価することができ、これには例えば、Km、kcat、kon、および/またはkoffパラメータの評価が含まれる。
【００５７】
種々のシグナルを検出して、相互作用の有無または量を検出することができる。検出される1つまたは複数のシグナルは、場合により、1つまたは複数のアッセイ成分に連結された1つまたは複数の検出可能な標識から放出される。いくつかの態様においては、1つまたは複数のアッセイ成分を検出可能な標識に連結させる。検出可能な標識は、アッセイ成分に共有結合させることができるか、または非共有結合で成分と結合させてもよい。非共有結合は結合対によって生じ得るが、この場合、一方の結合対メンバーがアッセイ成分と結合しており、もう一方の結合対メンバーが検出可能な標識と結合している。これらに限定されないが、抗体/抗原、抗体/抗体、抗体/抗体断片、抗体/抗体受容体、抗体/プロテインAまたはプロテインG、ハプテン/抗ハプテン、ビオチン/アビジン、ビオチン/ストレプトアビジン、葉酸/葉酸結合タンパク質、ビタミンB12/内因子、核酸/相補的核酸(例えば、DNA、RNA、PNA)を含む、任意の適切な結合対を用いて、非共有結合をもたらすことができる。共有結合も同様に、化学反応基/相補的化学反応基(例えば、スルフヒドリル/マレイミド、スルフヒドリル/ハロアセチル誘導体、アミン/イソトリオシアネート、アミン/スクシンイミジルエステル、およびアミン/ハロゲン化スルホニル)などの結合対によって生じ得る。そのような結合対を試薬に付着させ、結合をもたらす方法は、当業者に公知である。
【００５８】
当業者は、相互作用の検出に適した任意の検出可能な標識を適切に選択し、用いることができる。検出可能な標識の例には、フルオレセイン、ローダミン、およびその他(例えば、Anantha, et al., Biochemistry (1998) 37:2709 2714；およびQu & Chaires, Methods  Enzymol. (2000) 321:353 369)などの蛍光標識；放射性同位体(例えば、125I、131I、35S、31P、32P、14C、3H、7Be、28Mg、57Co、65Zn、67Cu、68Ge、82Sr、83Rb、95Tc、96Tc、103Pd、109Cd、および127Xe)；光散乱標識(例えば、米国特許第6,214,560号、およびGenicon Sciences Corporation、カリフォルニア州から市販されている)；化学発光標識および酵素基質(例えば、ジオキセタンおよびアクリジニウムエステル)、酵素またはタンパク質標識(例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)またはそれらの色変種、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ)；他の発色標識または色素(例えば、シアニン)、ならびに以前に記載されている標識がある。
【００５９】
蛍光シグナルは一般に、特定の励起波長でフルオロフォアを励起させ、次いで異なる発光波長でフルオロフォアによって発せられる蛍光を検出することによって、アッセイにおいてモニターする。多くの核酸相互作用フルオロフォアおよびそれらに付随する励起および発光波長が公知である(例えば、上記のもの)。蛍光検出機を用いるなどして、蛍光シグナルを検出する標準的な方法もまた公知である。シグナル対ノイズ比を増強し得る光子減少剤(例えば、米国特許第6,221,612号を参照されたい)を添加することによって、系においてバックグラウンド蛍光を減少させることも可能である。
【００６０】
検出可能な別のシグナルは、固体光学表面での屈折率の変化であり、変化は、光学表面の近傍または光学表面における屈折率増大分子の結合または放出によって起こる。光学表面の屈折率変化を測定するこれらの方法は、表面プラズモン共鳴(SPR)に基づく。SPRは、光学的に透明な物質(例えば、ガラス)と金属薄膜(例えば、銀または金)との界面からの特定の角度で反射される光強度の低下として観察される。SPRは、金属表面近くの媒体(例えば、試料溶液)の屈折率に依存する。表面近くでの物質の吸着または結合などによる金属表面での屈折率の変化により、SPRが起こる角度に対応する変化が生じる。SPRシグナルおよびその使用は、米国特許第5,641,640号；第5,955,729号；第6,127,183号；第6,143,574号；および第6,207,381号、ならびにWIPO公報 WO 90/05295でさらに例証されており、SPRシグナルを測定するための装置は市販されている(Biacore, Inc.、ニュージャージー州、ピスカタウェイ)。特定の態様においては、アッセイ成分を、光学的に透明な物質および金属薄膜を有するチップにリンカーを介して結合することができ、試薬間の、および/または試薬との相互作用を屈折率の変化によって検出することができる。特定の態様においてSPR解析のためにチップに連結されるアッセイ成分は、例えば、(1) 場合により四重鎖形成配列を含むrDNAもしくはrRNAサブ配列、(2) ｒDNAもしくはrRNA結合タンパク質(例えば、ヌクレオリン)、または(3) rDNAもしくはrRNA結合分子(例えば、化合物A-1)であり得る。
【００６１】
NMRスペクトル移動(例えば、Arthanari & Bolton, Anti-Cancer Drug Design 14: 317-326 (1999))、質量スペクトルシグナルおよび蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)シグナル(例えば、Lakowicz et al.、米国特許第5,631,169号；Stavrianopoulos et al. 米国特許第4,868,103号)などの、構造を表す他のシグナルもまた検出が可能である。FRETアプローチでは、第1「ドナー」分子上のフルオロフォア標識の発した蛍光エネルギーが、第2「アクセプター」分子上の蛍光標識によって吸収され、次いで吸収されたエネルギーに起因して蛍光が発せられ得るように、フルオロフォア標識を選択する。または、「ドナー」ポリペプチド分子が、単にトリプトファン残基の天然の蛍光エネルギーを利用してもよい。「アクセプター」分子標識が「ドナー」分子標識と識別され得るように、異なる波長の光を発する標識を選択する。標識間のエネルギー移動の効率は分子を隔てる距離に関連しているため、分子間の空間関係を評価することができる。分子間で結合が起こる状況において、アッセイにおける「アクセプター」分子標識の蛍光発光は最大となるはずである。FRET結合事象は、周知の標準的な蛍光検出手段を用いて(例えば、蛍光光度計を用いて)簡便に測定することができる。FRETに有用な分子は公知である(例えば、フルオレセインおよびテルビウム)。FRETを用いて、インビトロまたはインビボで相互作用を検出することができる。
【００６２】
相互作用アッセイは場合により、固相に連結された標的と結合しているかまたは結合していない検出可能な標識をモニターすることによって相互作用が検出される、ヘテロジニアス形式で行われる。そのような形式の一例は免疫沈降アッセイである。例えばゲル電気泳動、クロマトグラフィー、沈降(例えば、勾配沈降)、およびフローサイトメトリー工程などの複数の分離工程が利用できる。フローサイトメトリー工程には、例えば、流動微量蛍光定量法(flow microfluorimetry)(FMF)および蛍光活性化細胞選別(fluorescence activated cell sorting)(FACS)；米国特許第6,090,919号(Cormack, et al.)；第6,461,813号(Lorens)；および第6,455,263号(Payan))が含まれる。いくつかの態様においては、細胞から非結合の検出可能標識を洗浄除去してもよく、細胞成分に結合している検出可能標識を可視化することができる(例えば、顕微鏡観察により)。
【００６３】
特定のアッセイ態様において、ヒトリボソームヌクレオチド配列を含む核酸に結合する分子を同定する方法であって、(a) 本明細書に記載のヒトリボソームヌクレオチド配列を含む核酸、核酸に結合する化合物、および試験分子を接触させる段階、ならびに(b) 核酸に結合したかまたは結合しなかった化合物の量を検出する段階を含み、それによって試験分子の非存在下よりも試験分子の存在下においてより少ない化合物が核酸に結合する場合に、試験分子がヒトリボソームヌクレオチド配列を含む核酸に結合する分子として同定される方法を提供する。化合物は場合により検出可能な標識と結合しており、場合によっては放射標識されている。特定の態様において、化合物はキノロン類似体(例えば、本明細書に記載のキノロン類似体)である。特定の態様において、化合物は式Aの放射標識化合物であり、特定の態様において、化合物は放射標識化合物A-1である。化合物を放射標識する方法は公知である(例えば、METHODS FOR PREPARING RADIOACTIVE QUINOLONE ANALOGSという表題の、2005年9月16日に出願された米国特許出願第60/718,021号)。いくつかの態様において、化合物はポルフィリンである(例えば、TMPyP4または米国特許出願公開第20040110820号に記載されている拡張ポルフィリン(例えば、Se2SAP))。後者の態様において、ポルフィリンの蛍光は場合により、シグナルとして検出される。特定の態様において、核酸および/または別のアッセイ成分は場合により、固相と結合している。核酸はDNA、RNA、またはそれらの類似体であってもよく、特定の態様においては上記のヌクレオチド配列を含んでもよい。核酸は、分子内四重鎖などの四重鎖を形成し得る。
【００６４】
他の特定のアッセイ態様において、ヌクレオリン置換を引き起こす分子を同定する方法であって、(a) ヌクレオリンタンパク質に結合し得るヒトリボソームヌクレオチド配列を含む核酸およびヌクレオリンタンパク質を試験分子と接触させる段階、ならびに(b) ヌクレオリンタンパク質に結合したかまたは結合しなかった核酸の量を検出する段階を含み、それによって、試験分子の非存在下よりも試験分子の存在下においてより少ない核酸がヌクレオリンタンパク質に結合する場合に、試験分子がヌクレオリン置換を引き起こす分子として同定される方法を提供する。いくつかの態様において、ヌクレオリンタンパク質は検出可能な標識と結合しており、またヌクレオリンタンパク質は固相に結合していてもよい。核酸は場合により検出可能な標識と結合しており、特定の態様において核酸は固相に結合していてもよい。前記物の任意の簡便な組み合わせを用いることができる。核酸はDNA、RNA、またはそれらの類似体であってもよく、特定の態様においては上記のヌクレオチド配列を含んでもよい。核酸はG-四重鎖配列および/またはヘアピン構造を含んでもよく、場合によっては5塩基対ステムおよび7〜10ヌクレオチドループ(例えば、U/GCCCGAモチーフ)から構成され得る。アクセッション番号NM_005381の配列を有するヌクレオリン、または核酸と結合し得る前記物の断片もしくは実質的に同一な配列変種などの、任意のヌクレオリンタンパク質を用いることができる。ヌクレオリンドメインの例は、RRMドメイン(例えば、アミノ酸278〜640)およびRGGドメイン(例えば、アミノ酸640〜709)である。いくつかの態様において、試験分子はキノロン類似体である。細胞における免疫蛍光顕微鏡観察によって、ヌクレオリン分布を検出することができる。
【００６５】
特定のアッセイ態様において、リボソームRNA(rRNA)合成を調節する分子を同定する方法であって、細胞を試験分子と接触させる段階、rRNAをrRNAの一部を増幅する1つまたは複数のプライマーおよび増幅産物にハイブリダイズする標識プローブと接触させる段階、標識プローブのハイブリダイゼーションによって増幅産物の量を検出する段階を含み、それによって増幅産物の量を減少または増加させる試験分子がrRNA合成を調節する分子として同定される方法を提供する。いくつかの態様において、本方法は、細胞を試験分子と接触させる段階、混合物をrRNAの一部を増幅する1つまたは複数のプライマーおよび増幅産物にハイブリダイズする標識プローブと接触させる段階、標識プローブのハイブリダイゼーションによって増幅産物の量を検出する段階を含み、それによって、増幅産物の量を減少または増加させる試験分子がrRNA合成を調節する分子として同定される。いくつかの態様における標識プローブは、プライマーを添加し、かつrRNAを増幅した後に添加し、特定の態様においては、標識プローブおよびプライマーを同時に添加する。増幅するrRNAの部分は、場合によりrRNAの5'末端である。特定の態様において、試験分子は、式3もしくは3A、または式2もしくは2A〜2Dのキノロン類似体のようなキノロン類似体である。特定の多重態様において、上記の方法は単一の反応において複数のプローブを用いて行われ(例えば、2つまたはそれ以上のプローブ)、プローブはそれぞれ異なる増幅産物にハイブリダイズし(例えば、rDNA産物および比較産物(例えば、c-Myc産物))、独特の検出タグを含む。そのような多重態様において、複数の異なるプローブ、および任意に標的配列領域を増幅するための複数の異なるプライマー対を提供し得る。
【００６６】
いくつかの態様は53に向けられる。ヒトリボソームDNAもしくはRNA中の((G3+)N1-7)3G3+（SEQ ID NO:230）もしくは((C3+)N1-7)3C3+（SEQ ID NO:231）、またはその相補体、式中、Gはグアニンであり、Cはシトシンであり、3+は3またはそれ以上のヌクレオチドであり、Nは任意のヌクレオチドである、を含むヌクレオチド配列中の標的配列に特異的にハイブリダイズするプローブオリゴヌクレオチドを含む組成物、およびプローブオリゴヌクレオチドは、検出可能な標識を含む。いくつかの態様において、標的領域はrDNAまたはrRNAの5'末端のヌクレオチド配列を含み、場合によっては、(a) rDNA(例えば、SEQ ID NO:1)の5'ETS領域、ITS1領域、ITS2領域、28S rRNA領域、3'ETS領域、18S rRNA領域、もしくは5.8S rRNA領域；(b) (a)の相補体；(a)のコード化RNA；または(b)のコード化RNAである。鋳型は場合によりDNAであり、鋳型配列は場合によりSEQ ID NO:1由来のヒトリボソームヌクレオチド配列を含む。特定の態様において鋳型はRNAであり、場合により鋳型配列はSEQ ID NO:1中のヌクレオチド配列によってコードされる。組成物は場合により、5'から3'へのヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼをさらに含む。プローブオリゴヌクレオチドは5'末端で標識され得り、プローブは、非核酸の尾部、または標的核酸配列と非相補的であるヌクレオチドの配列を含み得る。特定の態様において、プローブオリゴヌクレオチドは第1標識および第2標識を含む。第1標識および第2標識は、検出可能なシグナルの発生を消すようにプローブオリゴヌクレオチド上に効果的に位置する相互作用的シグナル発生標識であり得る。第1標識は場合によりフルオロフォアであり、かつ第2標識は場合により消光剤であり、第1標識は5'末端に位置してよく、第2標識は3'末端に位置してよい。いくつかの態様においてプローブオリゴヌクレオチドの3'末端はブロックされており、プローブオリゴヌクレオチドは場合により蛍光によって検出可能である。プローブオリゴヌクレオチドは場合により、特異的結合パートナーを有するリガンドを含み、リガンドは場合によりビオチン、アビジン、またはストレプトアビジンである。特定の態様における組成物は、標的配列またはその相補体に隣接したヒトリボソーム鋳型DNAまたはRNAに特異的にハイブリダイズする1つまたは複数のプライマーオリゴヌクレオチドをさらに含み、組成物は場合により1つまたは複数の伸長ヌクレオチドをさらに含む。
【００６７】
特定の態様は、試料中の標的核酸配列を増幅および検出する過程において用いるための反応混合物を対象とし、反応混合物は増幅前に、1対のオリゴヌクレオチドプライマーおよび標識オリゴヌクレオチドを含み、オリゴヌクレオチドプライマー対は、標的核酸に相補的な第1伸長産物の合成を開始する(prime)標的核酸に相補的な第1プライマー、および第2伸長産物の合成を開始する第1伸長産物に相補的な第2プライマーを含み、標識オリゴヌクレオチドは標的核酸または標的核酸の相補体の領域にハイブリダイズし、領域はプライマー対の一方のメンバーとプライマー対のもう一方のメンバーの相補体との間であり、領域はrDNAまたはrRNAの領域である。特定の態様において、領域はrDNAまたはrRNAの5'末端に位置し、場合によっては、(a) rDNA(例えば、SEQ ID NO:1)の5'ETS領域、ITS1領域、ITS2領域、28S rRNA領域、3'ETS領域、18S rRNA領域、もしくは5.8S rRNA領域；(b) (a)の相補体；(a)のコード化RNA；または(b)のコード化RNAに由来する。場合により、反応混合物は、5'から3'へのヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼをさらに含む。特定の態様において、標識オリゴヌクレオチドは5'末端で標識され、場合により標識オリゴヌクレオチドは、非核酸の尾部、または標的核酸配列と非相補的であるヌクレオチドの配列をさらに含む。標識オリゴヌクレオチドは第1標識および第2標識を含んでもよく、場合により第1標識および第2標識は、検出可能なシグナルの発生を消すように標識オリゴヌクレオチド上に効果的に位置する相互作用的シグナル発生標識である。標識オリゴヌクレオチドの3'末端はブロックされてよく、場合により標識オリゴヌクレオチドは蛍光によって検出可能である。特定の態様において、第1標識はフルオロフォアであり、かつ第2標識は消光剤である。場合により、第1標識は5'末端に位置し、第2標識は3'末端に位置する。特定の態様において、標識オリゴヌクレオチドは、特異的結合パートナーを有するリガンドを含み、場合によりリガンドはビオチンである。PCRの方法、成分、および反応混合物は、例えば、米国特許第4,683,202号；第4,683,195号；第4,965,188号；第6,214,979号；第5,804,375号；第5,210,015号；第5,487,972号；および第5,538,848、に記載されており、本明細書に記載のrDNAまたはrRNAにハイブリダイズするプライマーおよびプローブは、これらの特許に記載されている態様に適用することができる。
【００６８】
(a) 標的核酸の領域に相補的な配列を含む少なくとも1つの標識オリゴヌクレオチドであって、(b)部のオリゴヌクレオチドプライマーが結合した標的核酸配列内にアニールし、rDNAまたはrRNA配列に相補的であり、かつプライマー伸長産物に標識オリゴヌクレオチドが取り込まれるのを防ぐために3'末端においてブロックされており、該ブロックが、最終ヌクレオチドの3'ヒドロキシルにその後の検出のための標識としても機能しない化学部分を付加することによって、または3'ヒドロキシルを除去することによって達成される標識オリゴヌクレオチド；および(b) 第1プライマーが標的核酸配列の一方の鎖中の領域に相補的な配列を含み、かつ第1伸長産物の合成を開始し、第2プライマーが第1伸長産物中の領域に相補的な配列を含み、かつ第1伸長産物に相補的な核酸鎖の合成を開始し、各オリゴヌクレオチドプライマーが、同じ核酸鎖にアニールした任意の標識オリゴヌクレオチドの上流のその相補的鋳型にアニールするように選択される1対のオリゴヌクレオチドプライマーを含む、試料中の標的核酸配列を検出するためのキットもまた提供する。いくつかの態様において、ブロックは、標識オリゴヌクレオチドの最終ヌクレオチドの3'ヒドロキシルに化学部分を付加することによって達成され、化学部分はリン酸基である。特定の態様において、ブロックは、標識オリゴヌクレオチドから3'ヒドロキシルを除去することによって達成される。特定のキットは、耐熱性酵素(例えば、サーマス属(Thermus)種由来)などの、5'から3'へのヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼをさらに含む。標識オリゴヌクレオチドは蛍光によって検出可能であってもよく、5'末端で標識され得る。標識オリゴヌクレオチドは場合により第1標識および第2標識を含み、第1標識はヌクレアーゼ感受性切断部位によって第2標識から分離されている。特定の態様において、第1標識は5'末端に位置し、第2標識は3'末端に位置する。標識オリゴヌクレオチドは場合により、検出可能なシグナルの発生を消すように標識オリゴヌクレオチド上に位置する1対の相互作用的シグナル発生標識を含み、場合により第1標識はフルオロフォアであり、かつ第2標識はそれと相互作用する消光剤である。
【００６９】
検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブもまた提供するが、プローブは、ポリメラーゼによって触媒されるプローブの伸長を防ぐために3'末端でブロックされており、そのブロックは、最終ヌクレオチドの3'ヒドロキシルにその後の検出のための標識としても機能しない化学部分を付加することによって、または3'ヒドロキシルを除去することによって達成され、標識オリゴヌクレオチドプローブは、第1標識および第2標識からなる1対の非放射性相互作用的標識を含み、第1標識および第2標識はオリゴヌクレオチドに直接または間接的に付着され、第1標識はヌクレアーゼ感受性切断部位によって第2標識から分離され、プローブはrDNAまたはrRNAヌクレオチド配列にハイブリダイズする。特定の態様において、プローブはrDNAまたはrRNAの5'末端に特異的にハイブリダイズし、場合によっては、(a) rDNA(例えば、SEQ ID NO:1)の5'ETS領域、ITS1領域、ITS2領域、28S rRNA領域、3'ETS領域、18S rRNA領域、もしくは5.8S rRNA領域；(b) (a)の相補体；(a)のコード化RNA；または(b)のコード化RNAに由来する。いくつかの態様において、第1標識はプローブの5'末端に位置し、第2標識は3'末端に位置し、場合により第1標識および第2標識は、検出可能なシグナルの発生を消すように標識オリゴヌクレオチド上に位置する1対の相互作用的シグナル発生標識を含む。特定の態様において、第1標識はフルオロフォアであり、かつ第2標識はそれと相互作用する消光剤である。
【００７０】
本明細書に記載のアッセイにおいて効果を有すると同定された試験分子を解析し、相互に比較する(例えば、順位づける)ことができる。本明細書に記載の方法において相互作用または効果を有すると同定された分子は、「候補分子」と称される。本明細書に記載のスクリーニング法によって同定された候補分子、そのような候補分子を表す情報、および候補分子を用いる方法(例えば、状態の治療的処置)を本明細書に提供する。
【００７１】
したがって、本明細書に記載の方法によって同定された候補分子を表す構造情報が提供される。特定の態様において、分子構造を表す情報(例えば、化学式または配列情報)は場合により、画像としてまたは三次元座標として、保存および/または表現される。情報はコンピュータ可読形式で保存および/または表現される場合が多く、場合によってはデータベース中に保存され組織化される。特定の態様において、情報は、物理的媒体(例えば、紙)またはコンピュータ可読媒体(例えば、光および/もしくは磁気記憶または伝送媒体、フロッピーディスク、ハードディスク、ランダムアクセスメモリ、コンピュータ演算処理装置、ファクシミリ信号、衛星信号、インターネットを介した伝送、またはワールドワイドウェブを介した伝送)を用いて、1つの位置から別の位置に移され得る。
【００７２】
リボソームヌクレオチド配列相互作用分子
当業者は、複数種類のリボソームヌクレオチド配列相互作用分子を構築し、同定し、かつ使用することができる。そのような相互作用分子の例は、化合物、核酸、および抗体である。これらの種類の分子はいずれも、本明細書に記載のアッセイにおいて試験分子として用いることが可能である。
【００７３】
化合物は、以下を含む、当技術分野において公知のコンビナトリアルライブラリー方法における多くのアプローチのいずれかを用いて得ることができる：生物学的ライブラリー；ペプトイドライブラリー(ペプチドの機能性を有するものの、酵素分解に対して耐性であるがそれでもなお生物活性を保持する新規の非ペプチド骨格を有する分子のライブラリー(例えば、Zuckermann et al., J. Med. Chem.37: 2678-85 (1994)を参照されたい))；空間的にアドレス可能な平行の固相または液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法；「1ビーズ1化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法。生物学的ライブラリーおよびペプトイドライブラリーアプローチは典型的にペプチドライブラリーに限定されるが、他のアプローチは、化合物のペプチドライブラリー、非ペプチドオリゴマーライブラリー、または小分子ライブラリーに適用可能である(Lam, Anticancer Drug Des. 12: 145 (1997))。分子ライブラリーを合成する方法の例は、例えば、DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909 (1993)；Erb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422 (1994)；Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37: 2678 (1994)；Cho et al., Science 261: 1303 (1993)；Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059 (1994)；Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061 (1994)；およびGallop et al., J. Med. Chem. 37: 1233 (1994)に記載されている。化合物のライブラリーは、溶液中(例えば、Houghten, Biotechniques 13: 412-421 (1992))、またはビーズ(Lam, Nature 354: 82-84 (1991))、チップ(Fodor, Nature 364: 555-556 (1993))、細菌もしくは胞子(Ladner、米国特許第5,223,409号)、プラスミド(Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869 (1992))、もしくはファージ(Scott and Smith, Science 249: 386-390 (1990)；Delvin, Science 249: 404-406 (1990)；Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 6378-6382 (1990)；Felici, J. Mol. Biol. 222: 301-310 (1991)；Ladner 前記)上に提示してもよい。
【００７４】
化合物は場合により小分子である。小分子には、これらに限定されないが、ペプチド、ペプチド模倣体(例えば、ペプトイド)、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、約10,000グラム/モル未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物(すなわち、ヘテロ有機化合物および有機金属化合物を含む)、約5,000グラム/モル未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物、約1,000グラム/モル未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物、約500グラム/モル未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物、ならびにそのような化合物の塩、エステル、および他の薬学的に許容される形態が含まれる。
【００７５】
リボソームヌクレオチド配列相互作用化合物は場合により、キノロン類似体または誘導体である。特定の態様において、化合物は、式1：
2009504192.tif 000117
のもの、ならびに薬学的に許容されるその塩、エステル、およびプロドラッグであり；
式中、B、X、A、もしくはVは、Z1、Z2、Z3、もしくはZ4がそれぞれNである場合には存在せず、Z1、Z2、Z3、もしくはZ4がそれぞれCである場合には、独立してH、ハロ、アジド、R2、CH2R2、SR2、OR2、もしくはNR1R2であり；または
AおよびV、AおよびX、もしくはXおよびBは、それぞれ環と置換および/もしくは縮合されてもよい炭素環、複素環、アリール、もしくはヘテロアリールを形成してもよく；
ZはO、S、NR1、CH2、またはC=Oであり；
Z1、Z2、Z3、およびZ4は、いずれか2つのNが隣接しないという条件でCまたはNであり；
WはNおよびZと共に、置換されてもよい飽和環または不飽和環に縮合された置換されてもよい5員環または6員環を形成し；そのような飽和環または不飽和環はヘテロ原子を含んでもよく、単環であるかまたは単一もしくは複数の炭素環もしくは複素環と縮合されており；
UはR2、OR2、NR1R2、NR1-(CR12)n-NR3R4、またはN=CR1R2であり、N=CR1R2において、R1およびR2はCと共に環を形成してもよく；
各NR1R2において、R1およびR2はNと共に置換されてもよい環を形成してもよく；
NR3R4において、R3およびR4はNと共に置換されてもよい環を形成してもよく；
R1およびR3は独立してHまたはC1-6アルキルであり；
R2はそれぞれ、H、またはハロゲン、1つもしくは複数の非隣接ヘテロ原子、炭素環、複素環、アリール、もしくはヘテロアリールでそれぞれ置換されてもよいC1-10アルキルもしくはC2-10アルケニルであり、環はそれぞれ置換されてもよく；またはR2は、置換されてもよい炭素環、複素環、アリール、もしくはヘテロアリールであり；
R4はH；N、O、およびSより選択される1つもしくは複数の非隣接ヘテロ原子を任意に含み、炭素環もしくは複素環で置換されてもよいC1-10アルキルもしくはC2-10アルケニルであり；またはR3およびR4はNと共に置換されてもよい環を形成してもよく；
R5はそれぞれ環W上の任意の位置における置換基であり；H、OR2、アミノ、アルコキシ、アミド、ハロゲン、シアノ、もしくは無機置換基であり；またはR5は、それぞれハロ、カルボニル、または1つもしくは複数の非隣接ヘテロ原子により置換されてもよいC1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、-CONHR1であり；または2つの隣接したR5は、置換されてもよい付加的な炭素環もしくは複素環に縮合され得る5〜6員環の置換されてもよい炭素環もしくは複素環が得られるように結合しており；かつ
nは1〜6である。
【００７６】
上記の式(1)において、Bは、Z1がNである場合には存在しなくてもよく、またはZ1がCである場合にはHもしくはハロゲンである。特定の態様において、Uは場合によりHではない。いくつかの態様において、UがOH、OR2、またはNH2である場合、Z1〜Z4の少なくとも1つはNである。
【００７７】
いくつかの態様において、化合物は一般式(2A)または(2B)：
2009504192.tif 000118
を有し、
式中、A、B、V、X、U、Z、Z1、Z2、Z3、Z4、R5、およびnは、式(1)において定義される通りであり；
Z5はO、NR1、CR6、またはC=Oであり；
R6はH、C1-6アルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、ハロ、アミノ、またはアミドであり；かつ
ZおよびZ5は任意に二重結合を形成し得る。
【００７８】
いくつかの態様においては、以下の式(2C)の化合物、または薬学的に許容されるその塩、エステル、もしくはプロドラッグが用いられる：
2009504192.tif 000119
式中、置換基は上記のものである。
【００７９】
いくつかの態様においては、以下の式(2D)の化合物、または薬学的に許容されるその塩、エステル、もしくはプロドラッグが用いられる：
2009504192.tif 000120
式中、置換基は上記のものである。特定の態様において、式(2D)の化合物は、例えばG1期停止および/またはS期停止のように、細胞周期を実質的に停止させる。
【００８０】
特定の局面において、化合物は一般的(3)：
2009504192.tif 000121
を有し、
式中、A、U、V、X、R5、Z、およびnは式(1)において上記した通りであり；
W1は、単環であるかまたは単一もしくは複数の環と縮合されてもよく、かつ任意にヘテロ原子を含む、置換されてもよいアリールまたはヘテロアリールであり；かつ
Z6、Z7、およびZ8は、いずれか2つのNが隣接しないという条件で、独立してCまたはNである。
【００８１】
上記の式(3)において、Z6、Z7、およびZ8はそれぞれCであってもよい。いくつかの態様において、Z6、Z7、およびZ8の1つまたは2つは、いずれか2つのNが隣接しないという条件でNである。
【００８２】
上記の式において、式(1)中のWとNおよびZ、または式(2A)、(2B)、もしくは(3)中のW1は、以下からなる群より選択される、置換されてもよいアリールまたはヘテロアリールに縮合された置換されてもよい5員環または6員環を形成する：
2009504192.tif 000122
2009504192.tif 000123
式中、Q、Q1、Q2、およびQ3はそれぞれ独立してCHまたはNであり；
Yは独立してO、CH、C=O、またはNR1であり；
nおよびR5は上記で定義される通りである。
【００８３】
特定の態様において、式(1)中のWとNおよびZは、以下からなる群より選択される式を有する基を形成する：
2009504192.tif 000124
式中、ZはO、S、CR1、NR1、またはC=Oであり；
Z5はそれぞれ、隣接する場合のZおよびZ5の両方がNR1となることはないという条件で、CR6、NR1、またはC=Oであり；
R1はそれぞれH、C1-6アルキル、COR2、またはS(O)pR2であり、ここでpは1〜2であり；
R6は、H、またはこれらに限定されないがヒドロキシル、アルキル、アルコキシ、ハロ、アミノ、もしくはアミドを含む当技術分野で公知の置換基であり；かつ
環Sおよび環Tは、飽和または不飽和であってもよい。
【００８４】
いくつかの態様において、式(1)中のWとNおよびZは、フェニルに縮合された5員環または6員環を形成する。他の態様においては、UがNH2ではないという条件で、UがNR1R2である場合に、WはNおよびZと共に、別の環に任意に縮合された5員環または6員環を形成する。特定の態様においては、UがNR1R2(例えば、NH2)である場合に、WはNおよびZと共に、別の環に縮合されていない5員環または6員環を形成する。
【００８５】
上記の式(1)、(2A)、(2B)、または(3)において、UはNR1R2であってもよく、式中、R1はHであり、R2は、ヘテロ原子、C3-6シクロアルキル、アリール、または1つもしくは複数のN、O、もしくはSを含む5〜14員環複素環で置換されてもよいC1-10アルキルである。例えば、R2は、置換されてもよいモルホリン、チオモルホリン、イミダゾール、アミノジチアダゾール(aminodithiadazole)、ピロリジン、ピペラジン、ピリジン、またはピペリジンで置換されたC1-10アルキルであってもよい。他の例において、R1およびR2はNと共に、置換されてもよいピペリジン、ピロリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリン、イミダゾール、またはアミノジチアゾール(aminodithiazole)を形成する。
【００８６】
いくつかの態様において、UはNR1-(CR12)n-NR3R4であり；nは1〜4であり；かつNR3R4中のR3およびR4は共に、置換されてもよいピペリジン、ピロリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリン、イミダゾール、またはアミノジチアゾールを形成する。いくつかの例において、UはNH-(CH2)n-NR3R4であり、R3およびR4はNと共に、ピロリジン環中の任意の位置で(CH2)nに結合され得る、置換されてもよいピロリジンを形成する。1つの態様において、R3およびR4はNと共にN-メチル置換ピロリジンを形成する。いくつかの態様において、Uは2-(1-メチルピロリジン-2-イル)エチルアミノまたは(2-ピロリジン-1-イル)エタンアミノである。
【００８７】
上記の式(1)、(2A)もしくは(2B)、または(3)において、ZはSまたはNR1であってもよい。
【００８８】
いくつかの態様において、式(1)、(2A)、または(2B)中のB、X、またはAの少なくとも1つはハロであり、Z1、Z2、およびZ3はCである。他の態様において、Z2およびZ3がCである場合、XおよびAはそれぞれHではない。上記の式(1)、(2A)、および(2B)において、VはHであってもよい。特定の態様において、UはOHではない。
【００８９】
1つの態様において、式(1)、(2A)、または(2B)中のZ1、Z2、Z3、およびZ4はそれぞれCである。別の態様において、Z1、Z2、Z3、およびZ4のうちの3つはCであり、残りはNである。例えば、Z1、Z2、およびZ3はCであり、Z4はNである。または、Z1、Z2、およびZ4はCであり、Z3はNである。他の例では、Z1、Z3、およびZ4はCであり、Z2はNである。さらなる他の例では、Z2、Z3、およびZ4はCであり、Z1はNである。
【００９０】
特定の態様において、式(1)、(2A)、または(2B)中のZ1、Z2、Z3、およびZ4のうちの2つはCであり、残りの2つは隣接しない窒素である。例えば、Z1およびZ3はCであってもよく、Z2およびZ4はNである。または、Z1およびZ3はNであってもよく、Z2およびZ4はCであってもよい。他の例では、Z1およびZ4はNであり、Z2およびZ3はCである。特定の例において、WはNおよびZと共に、フェニルに縮合された5員環または6員環を形成する。
【００９１】
いくつかの態様において、式(1)、(2A)、または(2B)中のB、X、A、およびVはそれぞれHであり、Z1〜Z4はCである。多くの態様において、B、X、A、およびVの少なくとも1つはHであり、対応する隣接Z1〜Z4原子はCである。例えば、B、X、A、およびVのいずれか2つはHであってもよい。一例では、VおよびBはいずれもHであってもよい。他の例では、B、X、A、およびVのいずれか3つはHであり、対応する隣接Z1〜Z4原子はCである。
【００９２】
特定の態様において、B、X、A、およびVの1つはハロゲン(例えば、フッ素)であり、対応する隣接Z1〜Z4原子はCである。他の態様において、X、A、およびVのうちの2つはハロゲンまたはSR2であり、式中、R2は、ヘテロ原子、炭素環、複素環、アリール、またはヘテロアリールで置換されてもよいC0-10アルキルまたはC2-10アルケニルであり；対応する隣接Z2〜Z4はCである。例えば、XおよびAはそれぞれハロゲンであってもよい。他の例では、XおよびAは存在する場合にそれぞれSR2であってもよく、式中、R2はフェニルまたはピラジンで置換されたC0-10アルキルである。さらなる他の例において、V、A、およびXは、アルキニル、例えばCF3、CH2CF3、全フッ素置換アルキルなどのフッ化アルキル；シアノ、ニトロ、アミド、スルホニルアミド、またはCOR2などのカルボニル化合物であってもよい。
【００９３】
上記の式のそれぞれにおいて、U、ならびに存在する場合のX、V、およびAは独立してNR1R2であってもよく、式中、R1はHであり、R2は、ヘテロ原子、C3-6シクロアルキル、アリール、または1つもしくは複数のN、O、もしくはSを含む5〜14員環複素環で置換されてもよいC1-10アルキルである。上記の式のいずれか1つの化合物においてAおよびUがいずれもNR1R2である場合のように、本発明内の化合物中に複数のNR1R2部分が存在する場合には、各R1および各R2は独立して選択される。一例において、R2は、置換されてもよい5〜14員環複素環で置換されたC1-10アルキルである。例えば、R2は、モルホリン、チオモルホリン、イミダゾール、アミノジチアダゾール、ピロリジン、ピペラジン、ピリジン、またはピペリジンで置換されたC1-10アルキルであってもよい。または、R1およびR2はNと共に、1つまたは複数のN、O、またはSを含む置換されてもよい複素環を形成し得る。例えば、R1およびR2はNと共に、ピペリジン、ピロリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリン、イミダゾール、またはアミノジチアゾールを形成する。
【００９４】
置換されてもよい複素環の具体例には、これらに限定されないが、テトラヒドロフラン、1,3-ジオキソラン、2,3-ジヒドロフラン、テトラヒドロピラン、ベンゾフラン、イソベンゾフラン、1,3-ジヒドロ-イソベンゾフラン、イソオキサゾール、4,5-ジヒドロイソオキサゾール、ピペリジン、ピロリジン、ピロリジン-2-オン、ピロール、ピリジン、ピリミジン、オクタヒドロ-ピロロ[3,4-b]ピリジン、ピペラジン、ピラジン、モルホリン、チオモルホリン、イミダゾール、アミノジチアダゾール、イミダゾリジン-2,4-ジオン、ベンズイミダゾール、1,3-ジヒドロベンズイミダゾール-2-オン、インドール、チアゾール、ベンゾチアゾール、チアジアゾール、チオフェン、テトラヒドロ-チオフェン 1,1-二酸化物、ジアゼピン、トリアゾール、ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタン、2,5-ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタン、および2,3,4,4a,9,9a-ヘキサヒドロ-1H-β-カルボリンが含まれる。
【００９５】
いくつかの態様において、化合物は一般式(1)、(2A)、(2B)、または(3)を有し、式中：
A、V、およびBは存在する場合、それぞれ独立してHまたはハロゲン(例えば、クロロまたはフルオロ)であり；
Xは-(R5)R1R2であり、式中、R5はCまたはNであり、各-(R5)R1R2において、R1およびR2は共に、置換されてもよいアリールまたはヘテロアリール環を形成してもよく；
ZはNHまたはN-アルキル(例えば、N-CH3)であり；
式(1)中のWとNおよびZ、または式(2A)、(2B)、もしくは(3)中のW1は、置換されてもよいアリールまたはヘテロアリール環に縮合された置換されてもよい5員環または6員環を形成し；かつ
Uは-R5R6-(CH2)n-CHR2-NR3R4であり、式中、R6はHまたはC1-10アルキルであり、-CHR2-NR3R4部分において、R3もしくはR4はそれぞれCと共に、置換されてもよい複素環もしくはヘテロアリール環を形成してもよく、または-CHR2-NR3R4部分において、R3もしくはR4はそれぞれNと共に、置換されてもよい炭素環、複素環、アリール、またはヘテロアリール環を形成し得る。
【００９６】
特定の態様において、化合物は式(1)、(2A)、(2B)、または(3)を有し、式中：
Aは存在する場合、Hまたはハロゲン(例えば、クロロまたはフルオロ)であり；
Xは存在する場合、-(R5)R1R2であり、式中、R5はCまたはNであり、各-(R5)R1R2において、R1およびR2は共に、置換されてもよいアリールまたはヘテロアリール環を形成してもよく；
ZはNHまたはN-アルキル(例えば、N-CH3)であり；
式(1)中のWとNおよびZ、または式(2A)、(2B)、もしくは(3)中のW1は、置換されてもよいアリールまたはヘテロアリール環に縮合された置換されてもよい5員環または6員環を形成し；かつ
Uは-R5R6-(CH2)n-CHR2-NR3R4であり、式中、R6はHまたはアルキルであり、-CHR2-NR3R4部分において、R3もしくはR4はそれぞれCと共に、置換されてもよい複素環もしくはヘテロアリール環を形成してもよく、または-CHR2-NR3R4部分において、R3もしくはR4はそれぞれNと共に、置換されてもよい炭素環、複素環、アリール、またはヘテロアリール環を形成し得る。
【００９７】
上記の式それぞれにおいて、置換されてもよい部分はそれぞれ、ハロ、C=O、アリール、または1つもしくは複数のヘテロ原子によりそれぞれ置換されてもよい1つまたは複数のハロ、OR2、NR1R2、カルバミン酸、C1-10アルキル、C2-10アルケニル；無機置換基、アリール、炭素環、または複素環で置換され得る。他の置換基には、これらに限定されないが、アルキニル、シクロアルキル、例えばCF3、CH2CF3、全フッ素置換アルキルなどのフッ化アルキル；例えばOCF3またはCH2CF3などの酸素化フッ化アルキル；シアノ、ニトロ、COR2、NR2COR2、スルホニルアミド；NR2SOOR2；SR2、SOR2、COOR2、CONR22、OCOR2、OCOOR2、OCONR22、NRCOOR2、NRCONR22、NRC(NR)(NR22)、NR(CO)NR22、およびSOONR22が含まれ、R2はそれぞれ式1において定義される通りである。
【００９８】
本明細書で使用する「アルキル」という用語は、炭素含有化合物を指し、1つまたは複数のヘテロ原子含む化合物を包含する。「アルキル」という用語は、これらに限定されないが、OR1、アミノ、アミド、ハロ、=O、アリール、複素環基、または無機置換基を含む1つまたは複数の置換基で置換されたアルキルもまた包含する。
【００９９】
本明細書で使用する「炭素環」という用語は、環中に炭素原子のみを含む環状化合物を指し、これに対し「複素環」は、ヘテロ原子を含む環状化合物を指す。炭素環および複素環構造は、単環系、二環系、または複数環系を有する化合物を包含する。
【０１００】
本明細書で使用する「アリール」という用語は、多価不飽和の、典型的に芳香族の炭化水素置換基を指し、これに対し「ヘテロアリール」または「ヘテロ芳香族」は、ヘテロ原子を含む芳香環を指す。アリールおよびヘテロアリール構造は、単環系、二環系、または複数環系を有する化合物を包含する。
【０１０１】
本明細書で使用する「ヘテロ原子」という用語は、窒素、酸素、または硫黄などの、炭素でも水素でもない任意の元素を指す。
【０１０２】
複素環の具体例には、これらに限定されないが、テトラヒドロフラン、1,3-ジオキソラン、2,3-ジヒドロフラン、ピラン、テトラヒドロピラン、ベンゾフラン、イソベンゾフラン、1,3-ジヒドロ-イソベンゾフラン、イソオキサゾール、4,5-ジヒドロイソオキサゾール、ピペリジン、ピロリジン、ピロリジン-2-オン、ピロール、ピリジン、ピリミジン、オクタヒドロ-ピロロ[3,4-b]ピリジン、ピペラジン、ピラジン、モルホリン、チオモルホリン、イミダゾール、イミダゾリジン-2,4-ジオン、1,3-ジヒドロベンズイミダゾール-2-オン、インドール、チアゾール、ベンゾチアゾール、チアジアゾール、チオフェン、テトラヒドロ-チオフェン 1,1-二酸化物、ジアゼピン、トリアゾール、グアニジン、ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタン、2,5-ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタン、2,3,4,4a,9,9a-ヘキサヒドロ-1H-β-カルボリン、オキシラン、オキセタン、テトラヒドロピラン、ジオキサン、ラクトン、アジリジン、アゼチジン、ピペリジン、ラクタムが含まれ、ヘテロアリールもまた包含し得る。ヘテロアリールの他の具体例には、これらに限定されないが、フラン、ピロール、ピリジン、ピリミジン、イミダゾール、ベンズイミダゾール、およびトリアゾールが含まれる。
【０１０３】
本明細書で使用する「無機置換基」という用語は、炭素を含まない、または水素以外の元素に結合した炭素を含む置換基(例えば、元素炭素、一酸化炭素、二酸化炭素、および炭酸塩)を指す。無機置換基の例には、これらに限定されないが、ニトロ、ハロゲン、スルホニル、スルフィニル、リン酸などが含まれる。
【０１０４】
本発明の化合物を調製するための合成手順は、PCT/US05/011108およびPCT/US2005/26977に記載されており、これらはそれぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる。当業者に公知である合成手順における他の変化形を用いて、本発明の化合物を調製することも可能である。
【０１０５】
本発明の化合物はキラルであってもよい。本明細書で使用するキラル化合物とは、その鏡像と異なり、鏡像異性体を有する化合物である。さらに、化合物はラセミであるか、または単離された鏡像異性体もしくは立体異性体であってもよい。キラル化合物を合成し、鏡像異性体のラセミ混合物を分割する方法は、当業者に周知である。例えば、参照により本明細書に組み入れられる、March, 「Advanced Organic Chemistry,」 John Wiley and Sons, Inc., New York, (1985)を参照されたい。
【０１０６】
上記の式を有する化合物の具体例を、表1(A〜C)および実施例に示す。本発明はまた、表1(A〜C)に例証される置換基から独立して選択される置換基U、A、X、V、およびBを含む、いずれか1つの式(1)、(2A)、(2B)、および(3)を有する他の化合物もまた包含する。例えば、表1Aに示される最後の2つの化合物中のイソプロピル置換基は、アセチル置換基で置換されてよく、または縮合環中のN-CH3はNH基で置換されてよい。さらに、フルオロ基はHで置換され得る。したがって、本発明は、以下の種々の態様において記載される置換基の特定の組み合わせに限定されない。
【０１０７】
いくつかの態様において、以下の式(3A)の化合物、またはその薬学的に許容される塩、エステル、もしくはプロドラッグが用いられる：
2009504192.tif 000125
式中、置換基は上記のものである。
【０１０８】
いくつかの態様において、以下の式A-1：
2009504192.tif 000126
を有する化合物、または薬学的に許容されるその塩、エステル、もしくはプロドラッグが、本明細書に記載の方法または組成物において用いられ得る。
【０１０９】
いくつかの態様において、以下の式B-1：
2009504192.tif 000127
を有する化合物、または薬学的に許容されるその塩、プロドラッグ、もしくはエステルが、本明細書に記載の方法または組成物において用いられ得る。
【０１１０】
特定の局面において、化合物は、式4のもの、または薬学的に許容されるその塩、プロドラッグ、もしくはエステルである：
2009504192.tif 000128
式中、X'はヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシル、ハロゲン、CF3、アミノ、アミド、硫化物、3〜7員環炭素環もしくは複素環、5員環もしくは6員環アリールもしくはヘテロアリール、縮合炭素環もしくは複素環、二環性化合物、NR1R2、NCOR3、N(CH2)nNR1R2、またはN(CH2)nR3であり、N(CH2)nNR1R2およびN(CH2)nR3中のNは任意にC1-10アルキルに結合しており、X'はそれぞれ任意に1つまたは複数の置換基に結合しており；
X''はヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アミド、硫化物、3〜7員環炭素環もしくは複素環、5員環もしくは6員環アリールもしくはヘテロアリール、縮合炭素環もしくは複素環、二環性化合物、NR1R2、NCOR3、N(CH2)nNR1R2、またはN(CH2)nR3であり、N(CH2)nNR1R2およびN(CH2)nR3中のNは任意にC1-10アルキルに結合しており、X''は任意に1つまたは複数の置換基に結合しており；
YはH、ハロゲン、またはCF3であり；
R1、R2、およびR3は独立してH、C1〜C6アルキル、C1〜C6置換アルキル、C3〜C6シクロアルキル、C1〜C6アルコキシル、カルボキシル、イミン、グアニジン、3〜7員環炭素環もしくは複素環、5員環もしくは6員環アリールもしくはヘテロアリール、縮合炭素環もしくは複素環、または二環性化合物であり、R1、R2、およびR3はそれぞれ任意に1つまたは複数の置換基に結合しており；
Zはハロゲンであり；
かつLは式Ar1-L1-Ar2を有するリンカーであり、式中、Ar1およびAr2はアリールまたはヘテロアリールである。
【０１１１】
上記の式(4)において、L1は、mは1〜6である(CH2)m(mは1〜6)、またはジスルフィドのような別のヘテロ原子に任意に結合しているヘテロ原子であってもよい。Ar1およびAr2はそれぞれ独立して、1つまたは複数の置換基で置換されてもよいアリールまたはヘテロアリールであってもよい。一例では、Lは、2つのキノリノンを結合する[フェニル-S-S-フェニル]リンカーである。特定の態様において、Lは、2つの同一キノリン種を結合する[フェニル-S-S-フェニル]リンカーである。
【０１１２】
上記の式(4)において、X''はヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アミド、スルフィド、3〜7員環炭素環もしくは複素環、5員環もしくは6員環アリールもしくはヘテロアリール、縮合炭素環もしくは複素環、二環性化合物、NR1R2、NCOR3、N(CH2)nNR1R2、またはN(CH2)nR3であってもよく、N(CH2)nNR1R2およびN(CH2)nR3中のNは任意にC1-10アルキルに結合しており、X''は任意に1つまたは複数の置換基に結合している。
【０１１３】
前記式の化合物の具体例は、参照により本明細書に組み入れられる、2006年2月22日に出願された米国仮特許出願第60/775,924号中の表1A〜1C、表2、表3、および表4に記載されている。
【０１１４】
キノロン類似体には、米国特許第5,817,669号に記載され、かつ参照により本明細書に組み入れられる化合物、およびUS 2006/0025437 A1に記載される以下の化合物：
2009504192.tif 000129
もまた含まれ得る。
【０１１５】
当業者は、リボソームヌクレオチド配列相互作用核酸分子を選択および調製することができる。特定の態様において、相互作用核酸分子は、本明細書に記載のリボソームヌクレオチド配列に相補的な配列を含み、「アンチセンス」核酸と称される。アンチセンス核酸は、ポリアミド核酸(PNA)、ロックド(locked)核酸(LNA)およびその他の2'修飾核酸、ならびに米国特許第4,469,863号；第5,536,821号；第5,541,306号；第5,637,683号；第5,637,684号；第5,700,922号；第5,717,083号；第5,719,262号；第5,739,308号；第5,773,601号；第5,886,165号；第5,929,226号；第5,977,296号；第6,140,482；第5,614,622号；第5,739,314号；第5,955,599号；第5,962,674号；第6,117,992号；WIPO公報 WO 00/56746、WO 00/75372、およびWO 01/14398、ならびに関連の出版物に例証されているその他のものなどの類似体または誘導体核酸を含んでもよく、またはそれらからなってもよい。アンチセンス核酸は場合により、リボソーム核酸を阻害するために、当業者によって設計、調製、および/または使用される。アンチセンス核酸は、コード鎖全体に対して、またはその一部もしくはそれと実質的に同一である配列に対して相補的であり得る。別の態様において、アンチセンス核酸分子は、ヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領」に対してアンチセンスである。アンチセンス核酸は、リボソームヌクレオチド配列のコード領域全体に対して相補的であり得、かつアンチセンス核酸は、リボソームヌクレオチド配列のコード領域または非コード領域の一部に対してのみアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである場合が多い。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、mRNAの翻訳開始部位を取り囲む領域、例えば、関心対象の標的遺伝子ヌクレオチド配列の-10〜+10の領域に対して相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80ヌクレオチド長、またはそれ以上のであり得る。
【０１１６】
アンチセンス核酸は、標準的な化学合成反応および酵素による連結反応を用いて構築することができる。例えば、アンチセンス核酸(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド)は、天然ヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増加させるかもしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間に形成される二重鎖の物理学的安定性を増加させるように設計された多様に改変されたヌクレオチドを用いて(例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを用いることができる)、化学合成することができる。アンチセンス核酸はまた、核酸がアンチセンス方向でサブクローニングされた発現ベクターを用いて、生物学的に生成することができる(すなわち、挿入された核酸から転写されるRNAは、関心対象の標的核酸に対してアンチセンス方向となり、これについては以下の説でさらに説明する)。
【０１１７】
動物において使用する場合には、アンチセンス核酸がポリペプチドをコードする細胞mRNAおよび/またはゲノムDNAとハイブリダイズするかまたはこれに結合し、それにより例えば転写および/または翻訳を阻害することによってポリペプチドの発現を阻害するように、アンチセンス核酸を典型的には対象に投与するか(例えば、組織部位における直接注射または静脈内投与により)、またはインサイチューで産生させる。または、選択された細胞を標的化するようにアンチセンス核酸分子を改変することができ、次いでこれを全身投与する。全身投与するには、例えば、細胞表面受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体にアンチセンス核酸分子を連結することによって、選択された細胞表面上に発現される受容体または抗原にアンチセンス分子が特異的に結合するように、アンチセンス分子を改変することができる。アンチセンス核酸分子はまた、本明細書に記載のベクターを用いて細胞に送達することができる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度は、ベクター構築物中に、CMVプロモーター、pol IIプロモーター、またはpol IIIプロモーターなどの強力なプロモーターを組み入れることによって達成される。
【０１１８】
アンチセンス核酸分子は場合により、α-アノマー核酸分子である。α-アノマー核酸分子は相補的RNAと共に特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、このハイブリッドにおいて、これらの鎖は通常のβ単位とは対照的に互いに平行に延びる(Gaultier et al., Nucleic Acids. Res. 15: 6625-6641 (1987))。アンチセンス核酸分子はまた、2'-o-メチルリボヌクレオチド(Inoue et al., Nucleic Acids Res. 15: 6131-6148 (1987))またはキメラRNA-DNA類似体(Inoue et al., FEBS Lett. 215: 327-330 (1987))を含み得る。アンチセンス核酸は場合により、DNAもしくはPNA、または以前に記載されている任意の他の核酸誘導体から構成される。
【０１１９】
いくつかの態様において、アンチセンス核酸はリボザイムである。リボソームヌクレオチド配列に対して特異性を有するリボザイムは、そのようなヌクレオチド配列に相補的な1つまたは複数の配列、およびmRNAの切断を担う公知の触媒配列を有する配列を含み得る(例えば、米国特許第5,093,246号、またはHaselhoff and Gerlach, Nature 334: 585-591 (1988))。例えば、活性部位のヌクレオチド配列がmRNA中の切断されるべきヌクレオチド配列に対して相補的であるテトラヒメナL-19 IVS RNAの誘導体が場合により用いられる(例えば、Cech et al. 米国特許第4,987,071号；およびCech et al. 米国特許第5,116,742号)。リボソームヌクレオチド配列を使用して、RNA分子のプールから特定のリボヌクレアーゼ活性を有する触媒RNAを選択することも可能である(例えば、Bartel & Szostak, Science 261: 1411-1418 (1993))。
【０１２０】
特異的結合試薬は場合により、リボソームヌクレオチド配列と三重らせんを形成し得る核酸である。三重らせんの形成は、「スイッチバック」核酸分子を作製することによって増強することができる。スイッチバック分子は5'-3'、3'-5'の交互の様式で合成され、その結果、これらは二重鎖の一方の鎖と最初に対合し、次いで他方の鎖と対合して、プリンまたはピリミジンのかなり大きなひと続きが二重鎖の一方の鎖上に存在することの必要性が排除される。
【０１２１】
当業者は、使用するための干渉RNA(RNAi)またはsiRNAリボソームヌクレオチド配列相互作用物質を選択することができる。選択される核酸は場合により、RNAiもしくはsiRNAまたはそのような産物をコードする核酸である。本明細書で使用する「RNAi」という用語は、特定のmRNAの分解を媒介し、また遺伝子発現を低下させるまたは排除するために用いることができる二本鎖RNA(dsRNA)を指す。本明細書で使用する「短鎖干渉核酸」、「siNA」、「短鎖干渉RNA」、「siRNA」、「短鎖干渉核酸分子」、「短鎖干渉オリゴヌクレオチド分子」、または「化学修飾短鎖干渉核酸分子」という用語は、遺伝子に向けられた任意の核酸分子を指す。例えば、siRNAは、例えば配列特異的様式でRNA干渉「RNAi」または遺伝子サイレンシングを媒介することにより、遺伝子発現またはウイルス複製を阻害または下方制御し得る；例えば、Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33；Bass, 2001, Nature, 411, 428-429；Elbashir et al., 2001, Nature, 411, 494-498；ならびにKreutzer et al., 国際PCT公報番号 WO 00/44895；Zernicka-Goetz et al.,国際PCT公報番号 WO 01/36646；Fire,国際PCT公報番号 WO 99/32619；Plaetinck et al.,国際PCT公報番号 WO 00/01846；Mello and Fire,国際PCT公報番号 WO 01/29058；Deschamps-Depaillette,国際PCT公報番号 WO 99/07409；およびLi et al.,国際PCT公報番号 WO 00/44914；Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819；Volpe et al., 2002, Science, 297, 1833-1837；Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218；およびHall et al., 2002, Science, 297, 2232-2237；Hutvagner and Zamore, 2002, Science, 297, 2056-60；McManus et al., 2002, RNA, 8, 842-850；Reinhart et al., 2002, Gene & Dev., 16, 1616-1626；およびReinhart & Bartel, 2002, Science, 297, 1831を参照されたい。siRNAは、毒性を示さない限り、その長さに特に制限はない。修飾RNAiおよびsiRNAの例には、STEALTH(商標)型(Invitrogen Corp.、カリフォルニア州、カールズバッド)、米国特許出願公開第2004/0014956号(出願第10/357,529号)および米国特許出願第11/049,636号(2005年2月2日に出願)に記載されている形態、shRNA、MIR、ならびに本明細書に後述する他の形態が含まれる。
【０１２２】
siNAは、自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子であり得、アンチセンス領域は、標的核酸分子中のヌクレオチド配列またはその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有する。siNAは、2つの別個のオリゴヌクレオチドから構築することができ、この場合、一方の鎖がセンス鎖であり、他方がアンチセンス鎖であり、アンチセンス鎖およびセンス鎖は自己相補的である(すなわち、各鎖が、他方の鎖のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む；アンチセンス鎖およびセンス鎖が二重鎖または二本鎖構造を形成し、例えば二本鎖領域が約19塩基対である場合など)、すなわちアンチセンス鎖は、標的核酸分子中のヌクレオチド配列またはその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス鎖は、標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を含む。または、siNAは単一のオリゴヌクレオチドから構築され、この場合、siNAの自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域は、核酸に基づくかまたは非核酸に基づくリンカーによって連結されている。siNAは、自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域を有する、二重鎖、非対称二重鎖、ヘアピン、または非対称ヘアピン二次構造をもつポリヌクレオチドであり得り、アンチセンス領域は、別個の標的核酸分子中のヌクレオチド配列またはその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有する。siNAは、2つまたはそれ以上のループ構造、ならびに自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域を含むステムを有する環状一本鎖ポリヌクレオチドであり得、アンチセンス領域は、標的核酸分子中のヌクレオチド配列またはその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有し、環状ポリヌクレオチドは、RNAiを媒介し得る活性siNA分子を生じるようにインビボまたはインビトロでプロセシングされ得る。siNAはまた、標的核酸分子中のヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含んでもよく(例えばこの場合、そのようなsiNA分子は、siNA分子中に標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列の存在を必要としない)、一本鎖ポリヌクレオチドは5'-リン酸(例えば、Martinez et al., 2002, Cell, 110, 563-574、およびSchwarz et al., 2002, Molecular Cell, 10, 537-568)を参照されたい)または5',3'-二リン酸などの末端リン酸基をさらに含み得る。特定の態様において、本発明のsiNA分子は別個のセンスおよびアンチセンスの配列または領域を含み、センス領域とアンチセンス領域は、当技術分野において公知のようにヌクレオチドもしくは非ヌクレオチドリンカー分子によって共有結合しているか、または代わりにイオン相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、および/もしくはスタッキング相互作用によって非共有結合している。特定の態様において、本発明のsiNA分子は、標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。別の態様において、本発明のsiNA分子は、標的遺伝子の発現の阻害を引き起こす様���で、標的遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用する。
【０１２３】
2本のRNA鎖が対合するsiRNAの二本鎖RNA部分は、完全に対合した形態に限定されず、ミスマッチ(対応するヌクレオチドが相補的でない)、バルジ(一方の鎖に対応する相補的ヌクレオチドが欠如している)などに起因する非対合部分を含んでもよい。非対合部分は、siRNAの形成を妨げない程度まで含まれ得る。本明細書で使用する「バルジ」は好ましくは非対合ヌクレオチドを1〜2つ含み、2本のRNA鎖が対合するsiRNAの二本鎖RNA領域は、好ましくはバルジを1〜7つ、より好ましくは1〜5つ含む。加えて、本明細書で使用する「ミスマッチ」は、2本のRNA鎖が対合するsiRNAの二本鎖RNA領域中に、好ましくは1〜7つ、より好ましくは1〜5つ含まれる。好ましいミスマッチにおいて、ヌクレオチドの一方はグアニンであり、他方はウラシルである。そのようなミスマッチは、センスRNAをコードするDNAにおけるCからT、GからAへの変異、またはそれらの混合したものに起因するが、特にこれらに限定されるわけではない。さらに、本発明において、2本のRNA鎖が対合するsiRNAの二本鎖RNA領域は、バルジおよびミスマッチの両方を、合計して好ましくは1〜7つ、より好ましくは1〜5つ含んでもよい。siRNAの末端構造は、siRNAがそのRNAi効果により標的遺伝子発現をサイレンシングできる限り、平滑または付着(オーバーハング)のいずれかであってよい。
【０１２４】
本明細書で使用するsiRNA分子は、RNAのみを含む分子に限定される必要はなく、化学修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに包含する。加えて、本明細書で使用するRNAiという用語は、転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、またはエピジェネティクスなどの、配列特異的RNA干渉を記述するために用いられる他の用語に等しいことが意図される。例えば、本発明のsiRNA分子は、転写後レベルまたは転写前レベルの両方において遺伝子を後成的にサイレンシングするために用いることができる。非限定的な例において、本発明のsiRNA分子による遺伝子発現の後成的制御は、siRNAが媒介する、遺伝子発現を変更するクロマチン構造の改変によって起こり得る(例えば、Verdel et al., 2004, Science, 303, 672-676；Pal-Bhadra et al., 2004, Science, 303, 669-672；Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819；Volpe et al., 2002, Science, 297, 1833-1837；Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218；およびHall et al., 2002, Science, 297, 2232-2237を参照されたい)。
【０１２５】
RNAiは、当業者に公知の方法によって設計することができる。一例では、機能性に基づいてRNAi配列、例えば1000個の配列、を分類し、85%を超えるノックダウン活性を有するとして機能性群を分類し、85%未満のノックダウン活性を有するとして非機能性群を分類することにより、siRNAを設計することができる。機能性群および非機能性群の両方に関して、全RNAi標的配列全体に対して塩基組成の分布が算出された。次いで、機能性群および非機能性群の塩基分布の比を用いて、RNAi配列の各位置に関するスコア行列を構築することができる。所与の標的配列について、各位置の塩基をスコア化し、次いですべての位置を掛け合わせたものの対数比を最終スコアとする。このスコアシステムを使用して、機能的ノックダウン活性と対数比スコアに非常に強力な相関関係が見出される可能性がある。標的配列が選択された時点で、Unigeneデータベースに対するfast NCBI blastおよびslow Smith Watermanアルゴリズム検索によりこれにフィルターをかけて、遺伝子特異的RNAiまたはsiRNAを同定することができる。最後の12塩基中に少なくとも1つのミスマッチを有する配列も選択され得る。
【０１２６】
核酸試薬には、例えばdsRNAを生じるように操作されたものも含まれる。そのような核酸分子の例には、転写された際にそれ自体に折り重なって、二本鎖部分を含むヘアピン分子を生じる配列を有するものが含まれる。二本鎖部分の一方の鎖は、サイレンシングしようとする遺伝子から転写されるmRNAのセンス鎖のすべてまたは一部に対応してもよく、二本鎖部分の他方の鎖は、アンチセンス鎖のすべてまたは一部に対応してもよい。dsRNAを生じるその他の方法を用いることも可能であり、例えば、転写された際に、サイレンシングしようとする遺伝子から転写されるmRNAのセンス鎖のすべてまたは一部に対応する第1配列、および、転写された際に、サイレンシングしようとする遺伝子から転写されるmRNAのアンチセンス鎖(すなわち逆相補体)のすべてまたは一部に対応する第2配列を有するように、核酸分子を操作してもよい。
【０１２７】
RNAiを媒介する核酸分子はまた、例えばオリゴヌクレオチド合成によってエクスビボで生成されもよいてもよい。オリゴヌクレオチド合成を用いて、例えばdsRNA分子、および1つまたは複数の化学修飾(例えば、2'-O-メチル、2'-O-エチル、2'-メトキシエトキシ、2'-O-プロピル、2'-フルオロなどの基を含めるなど、核酸分子に通常認められない化学修飾)を有するその他の核酸分子(例えば、RNAiを媒介するその他の核酸分子)を設計することができる。
【０１２８】
いくつかの態様において、遺伝子をサイレンシングするために使用するdsRNAは、サイレンシングしようとする遺伝子に対する配列相同性または配列同一性の領域を1つまたは複数(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つなど)含み得る。相同性および同一性の領域は、約20 bp(塩基対)〜約5 kbp(キロ塩基対)長、20 bp〜約4 kbp長、20 bp〜約3 kbp長、20 bp〜約2.5 kbp長、約20 bp〜約2 kbp長、20 bp〜約1.5 kbp長、約20 bp〜約1 kbp長、20 bp〜約750 bp長、約20 bp〜約500 bp長、20 bp〜約400 bp長、20 bp〜約300 bp長、20 bp〜約250 bp長、約20 bp〜約200 bp長、約20 bp〜約150 bp長、約20 bp〜約100 bp長、約20 bp〜約90 bp長、約20 bp〜約80 bp長、約20 bp〜約70 bp長、約20 bp〜約60 bp長、約20 bp〜約50 bp長、約20 bp〜約40 bp長、約20 bp〜約30 bp長、約20 bp〜約25 bp長、約15 bp〜約25 bp長、約17 bp〜約25 bp長、約19 bp〜約25 bp長、約19 bp〜約23 bp長、または約19 bp〜約21 bp長であってもよい。
【０１２９】
二本鎖領域を有するヘアピン含有分子は、RNAiとして用いることができる。二本鎖領域の長さは、約20 bp(塩基対)〜約2.5 kbp(キロ塩基対)長、約20 bp〜約2 kbp長、20 bp〜約1.5 kbp長、約20 bp〜約1 kbp長、20 bp〜約750 bp長、約20 bp〜約500 bp長、20 bp〜約400 bp長、20 bp〜約300 bp長、20 bp〜約250 bp長、約20 bp〜約200 bp長、約20 bp〜約150 bp長、約20 bp〜約100 bp長、20 bp〜約90 bp長、20 bp〜約80 bp長、20 bp〜約70 bp長、20 bp〜約60 bp長、20 bp〜約50 bp長、20 bp〜約40 bp長、20 bp〜約30 bp長、または約20 bp〜約25 bp長であってもよい。ヘアピンの非塩基対形成部分(すなわちループ)は、ヘアピンの二本鎖部分を構成する2つの相同性領域が相互に折り重なることを可能にする任意の長さのものであり得る。
【０１３０】
上記のプロモーターなどの任意の適切なプロモーターを用いて、核酸試薬からのRNAの産生を制御してもよい。プロモーターは、任意のポリメラーゼ酵素に認識されるものであってもよい。例えば、プロモーターは、RNAポリメラーゼIIまたはRNAポリメラーゼIIIのためのプロモーター(例えば、U6プロモーター、H1プロモーターなど)であってもよい。他の適切なプロモーターには、これらに限定されないが、T7プロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、マウス乳癌ウイルス(MMTV)プロモーター、メタロチオネイン、RSV(ラウス肉腫ウイルス)末端反復配列、SV40プロモーター、ヒト成長ホルモン(hGH)プロモーターが含まれる。他の適切なプロモーターは当業者に公知であり、本発明の範囲内に属する。
【０１３１】
本発明を実施する際に用いられる二本鎖RNAは、大きさが大きく異なり得る。さらに、使用するdsRNAの大きさは、dsRNAと接触させる細胞種に依存する場合が多い。一例として、線虫(C. elegans)およびキイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)の細胞などの動物細胞は、約30ヌクレオチド長よりも大きいdsRNA(すなわち、30ヌクレオチドの二本鎖領域)と接触させた場合に、一般にアポトーシスを起こさないが、哺乳動物細胞は、そのようなdsRNAに曝露された場合、典型的にアポトーシスを起こす。したがって、特定の実験の設計では、使用するdsRNAの大きさを決定する場合が多い。
【０１３２】
多くの例において、本発明の実施において用いられる核酸分子内に含まれる、またはそれによってコードされるdsRNAの二本鎖領域は、以下の範囲の範囲内である：約20〜約30ヌクレオチド、約20〜約40ヌクレオチド、約20〜約50ヌクレオチド、約20〜約100ヌクレオチド、約22〜約30ヌクレオチド、約22〜約40ヌクレオチド、約20〜約28ヌクレオチド、約22〜約28ヌクレオチド、約25〜約30ヌクレオチド、約25〜約28ヌクレオチド、約30〜約100ヌクレオチド、約30〜約200ヌクレオチド、約30〜約1,000ヌクレオチド、約30〜約2,000ヌクレオチド、約50〜約100ヌクレオチド、約50〜約1,000ヌクレオチド、または約50〜約2,000ヌクレオチド。上記の範囲は、二本鎖領域中に存在するヌクレオチドの数を指す。したがって、これらの範囲はdsRNA自体の全長を反映しない。一例として、6ヌクレオチドループを有する全長50ヌクレオチドの単一転写産物から形成される平滑末端dsRNAは、23ヌクレオチドの二本鎖領域を有する。
【０１３３】
上記で示唆した通り、本発明の実施において用いられるdsRNAは平滑末端であってもよく、平滑末端を1つ有してもよく、または両末端にオーバーハングを有してもよい。さらに、1つまたは複数のオーバーハングが存在する場合、オーバーハングは、一端または両端において3'鎖および/または5'鎖上にあってもよい。さらに、これらのオーバーハングは、独立して任意の長さ(例えば、1、2、3、4、5ヌクレオチドなど)であってもよい。一例として、STEALTH(商標) RNAiは両端において平滑末端である。
【０１３４】
RNAiおよびRNAiを産生するもののセットもまた含まれる。そのようなセットには、同じ標的遺伝子に対する複数のdsRNAを(1) 産生するように設計された、または(2) 含むもの、が含まれる。一例として、本発明は、複数のSTEALTH(商標) RNAiが同じ標的遺伝子の異なる領域に対して配列相同性または配列同一性を共有するSTEALTH(商標) RNAiのセットを含む。
【０１３５】
リボソームヌクレオチド配列相互作用物質として、当業者は抗体または抗体断片を作製し、これを使用することができる。抗体は、場合によりIgG、IgM、IgA、IgE、またはこれらのアイソタイプ(例えば、IgG1、IgG2a、IgG2b、またはIgG3)であり、場合よりポリクローナルまたはモノクローナルであり、場合によりそのような抗体のキメラ、ヒト化、または二重特異性型である。特異的抗原と結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体は市販されており、そのような抗体を作製する方法は公知である。一般に、ポリクローナル抗体は、単離された抗原(例えば、本明細書に記載のrDNAまたはrRNA配列)を適切な動物(例えば、ヤギまたはウサギ)に注射し；血液および/または抗原に特異的な抗体を含む動物由来の他の組織を回収し、抗体を精製することによって作製される。モノクローナル抗体を作製する方法は、一般に、単離された抗原を動物(例えば、多くの場合、マウスまたはラット)に注射する段階；動物から脾細胞を単離する段階；脾細胞を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを形成する段階；ハイブリドーマを単離する段階；、および抗原と特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する段階を含む(例えば、Kohler & Milstein, Nature 256:495 497 (1975)、およびStGroth & Scheidegger, J Immunol Methods 5:1 21 (1980))。
【０１３６】
キメラ抗体およびヒト化抗体を作製する方法もまた公知であり(例えば、米国特許第5,530,101号(Queen, et al.)、米国特許第5,707,622号(Fung, et al.)、ならびに米国特許第5,994,524号および第6,245,894号(Matsushima, et al.)を参照されたい)、一般に、1つの種(例えば、マウス)由来の抗体可変領域を別の種(例えば、ヒト)の抗体定常ドメインに移植する段階を含む。抗体の抗原結合領域(例えば、Fab領域)は軽鎖および重鎖を含み、可変領域は軽鎖および重鎖由来の領域から構成される。抗体の可変領域が、重鎖および軽鎖可変領域中の6つの相補性決定領域(CDR)から形成されることを考えれば、1つの抗体に由来する1つまたは複数のCDRを別の抗体のCDRで置換(すなわち、移植)して、キメラ抗体を作製することができる。同様に、ヒト化抗体は、得られた抗体のヒトに投与した際の免疫原性が低くなるように、アミノ酸置換を導入することによって作製される。
【０１３７】
特異的結合試薬は場合により、Fab、Fab'、F(ab)'2、Dab、Fv、または一本鎖Fv(ScFv)断片などの抗体断片であり、抗体断片を作製する方法は公知である(例えば、米国特許第6,099,842号および第5,990,296号ならびにPCT/GB00/04317を参照されたい)。いくつかの態様において、1つまたは複数のハイブリッド中の結合パートナーは一本鎖抗体断片であり、これは場合によっては、組換え分子生物学的過程により、重鎖可変領域と軽鎖可変領域をポリペプチドリンカー(例えば、リンカーは各鎖のC末端またはN末端に付着される)によって連結することにより構築される。そのような断片は、当初のモノクローナル抗体に類似した、抗原に対する特異性および親和性を示す場合が多い。二機能性抗体は場合により、2つの異なる結合特異性を単一の抗体鎖になるよう操作することによって構築され、場合によっては2つのFab'領域を共に連結することによって構築され、この場合、各Fab'領域は異なる抗体に由来する(例えば、米国特許第6,342,221号)。抗体断片は、CDR移植断片またはヒト化断片のような操作された領域を含む場合が多い。特定の態様において、結合パートナーは無傷の免疫グロブリンであり、他の態様において、結合パートナーはFab単量体またはFab二量体である。
【０１３８】
核酸および/または相互作用分子を含む組成物、細胞、および動物
本明細書に記載の核酸を含む組成物を本明細書に提供する。特定の態様において、組成物は、本明細書に記載のヒトリボソームDNAまたはRNAヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸を含む。いくつかの態様において、組成物は薬学的に許容される担体を含んでもよく、組成物は場合により核酸、および核酸中のヒトリボソームヌクレオチド配列に結合する(例えば、ヌクレオチド配列に特異的に結合する)化合物を含む。特定の態様において、化合物は、本明細書に記載する化合物のようなキノロン類似体である。
【０１３９】
提供する他の組成物は、細胞内でリボソームRNAを合成する複合体の成分または成分の断片と結合している化合物を含み、化合物はキノロン類似体である。キノロン類似体は場合によっては式3または3Aのものであり、場合によっては式2または2A〜2Dのものである。成分は場合により、UBF、TBP、TAF 48、TAF 63、TAF 110、およびRNAポリメラーゼIサブユニットからなる群より選択される。そのような成分の配列は公知であり、アクセッション番号(HUGO Gene Nomenclature Committee)によって示される配列の例を以下の表に示す。
2009504192.tif 000130
【０１４０】
プロテインキナーゼまたはその断片と結合している化合物を含む組成物もまた提供し、化合物はキノロン類似体である。プロテインキナーゼは場合により、MAPキナーゼ、mTOR、またはPI3キナーゼ経路のメンバーである。特定の経路のメンバーには、(a) 指定のプロテインキナーゼによって直接もしくは間接的にリン酸化される、(b) 指定のプロテインキナーゼを直接もしくは間接的にリン酸化する、または(c) 指定のプロテインキナーゼもしくはそのアイソフォームであるプロテインキナーゼ、が含まれる。間接的リン酸化事象は以下によって例証され得る：特定のプロテインキナーゼによって間接的にリン酸化されるタンパク質は、第2プロテインキナーゼによって最初にリン酸化される第1プロテインキナーゼによってリン酸化され得、経路中にはかなり多くの介在プロテインキナーゼが存在し得る。特定の態様において、プロテインキナーゼは細胞周期制御プロテインキナーゼ(例えば、cdk2またはcdk4などのサイクリン依存性プロテインキナーゼ)もしくはRSKプロテインキナーゼ(例えば、RSK 1α、RSK 1β、またはRSK 2)であり、またはカゼインプロテインキナーゼであり、またはAKTプロテインキナーゼ(例えば、AKT 1、2、または3)である。プロテインキナーゼは場合により、ABL、S6K、Tie、TrkA、ZIPK、Pim-1、SAPK、Flt3、およびDRK3プロテインキナーゼからなる群より選択される。複数のプロテインキナーゼの配列が公知であり、アクセッション番号(HUGO Gene Nomenclature Committee)によって示される配列の例を以下の表に示す。
2009504192.tif 000131
【０１４１】
核酸およびそれに結合しているキノロン化合物を含む組成物もまた提供し、核酸はヒトリボソーム核酸ヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、ヒトリボソーム核酸ヌクレオチド配列は、核酸構造を形成するポリヌクレオチド配列を含み、場合によって化合物は核酸構造に結合する。任意の核酸構造を用いることができ、核酸構造は、四重鎖、ヘアピン、らせん、同軸らせん、テトラループ受容体、Aマイナーモチーフ、キッシング(kissing)ヘアピンループ、tRNA Dループ:Tループ、シュードノット、デオキシリボーズジッパー、およびリボースジッパーからなる群より選択され得る。特定の態様において、核酸構造は、G-四重鎖などの分子内四重鎖である。そのような組成物中の化合物は場合によっては式3また3Aのものであり、場合によっては2または2A〜2Dのものである。特定の態様において、リボソーム核酸はrRNAであり、場合によってはrDNAである。
【０１４２】
本明細書に記載の単離された核酸を含む細胞または動物もまた提供する。任意の種類の細胞を用いることができ、場合により細胞は、組織培養で維持されるかまたは増殖させる細胞株である。単離された核酸は、研究動物(例えば、げっ歯類(例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ)、有蹄動物(例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ)、ネコ、イヌ、サル、または類人猿)などの動物の1つまたは複数の細胞に取り込まれ得る。化合物および他の分子を細胞に挿入する方法は、本明細書で後述する方法においてなど、当業者に公知である。
【０１４３】
細胞は、本明細書に記載のリボソームヌクレオチド配列を過剰発現または低発現し得る。種々の様式で細胞を処理することができる。例えば、当業者は、細胞試薬から溶解物を調製すること、および任意に細胞の成分を単離または精製することができ、細胞に核酸試薬をトランスフェクションすることができ、解析(例えば、顕微鏡による解析)のために細胞試薬をスライドに固定することができ、また細胞を固相に固定化することができる。リボソームヌクレオチド配列を「過剰発現」する細胞は、遺伝子改変されていない、および/または細胞増殖性疾患の明白な症状を示さない生物由来の天然細胞と比較して、少なくとも2、3、4、もしくは5倍またはそれ以上の産物を産生する。過剰発現細胞は、リボソームヌクレオチド配列をコードする核酸を安定してトランスフェクションされ得るか、または一過性にトランスフェクションされ得る。リボソームヌクレオチド配列を「低発現」する細胞は、遺伝子改変されていないおよび/または細胞増殖性疾患の明白な症状を示さない生物由来の天然細胞と比較して、少なくとも5倍少ない産物を産生する。いくつかの態様において、リボソームヌクレオチド配列を低発現する細胞は、そのような産物をコードし得る核酸を含まず(例えば、細胞はノックアウトマウスに由来する)、検出可能な量の産物が産生されない。ノックアウト動物を作製する方法、およびそこから抽出された細胞を使用する方法は公知である(例えば、Miller et al., J. Cell. Biol. 165: 407-419 (2004))。リボソームヌクレオチド配列を低発現する細胞は、例えば場合により、阻害剤の非存在下で細胞によって産生される産物の量を阻止するまたは減少させる核酸阻害剤と接触させられる。過剰発現または低発現細胞は、生物内(インビボ)にあってもまたは生物由来(エクスビボまたはインビトロ)であってもよい。
【０１４４】
当業者は、本発明の細胞組成物(例えば、リボソームヌクレオチド配列を過剰発現または低発現する細胞)を作製するために任意の細胞を選択することができる。細胞には、これらに限定されないが、細菌細胞(例えば、DH10B、Stbl2、DH5-α、DB3、例えばDB3.1、DB4、DB5、JDP682、およびccdA-over(例えば、米国特許出願第09/518,188号)などのエシェリキア属(Escherichia)種細胞(例えば、Expressway(商標) HTP Cell-Free E. coli Expression Kit、カリフォルニア州、Invitrogen)、バチルス属(Bacillus)種細胞(例えば、枯草菌(B. subtilis)および巨大菌(B. megaterium)細胞)、ストレプトマイセス属(Streptomyces)種細胞、エルウィニア属(Erwinia)種細胞、クレブシエラ属(Klebsiella)種細胞、セラチア属(Serratia)種細胞(特に、霊菌(S. marcessans)細胞)、シュードモナス属(Pseudomonas)種細胞(特に、緑膿菌(P. aeruginosa)細胞)、およびサルモネラ属(Salmonella)種細胞(特に、ネズミチフス菌(S. typhimurium)およびチフス菌(S. typhi)細胞))；光合成細菌(例えば、緑色非硫黄細菌(例えば、クロフレクサス属(Choroflexus)種(例えば、C. オーランティアカス(C. aurantiacus))、クロロネマ属(Chloronema)種(例えば、C. ギガテウム(C. gigateum)))、緑色硫黄細菌(例えば、クロロビウム属(Chlorobium)種(例えば、C. リミコラ(C. limicola))、ペロディクチオン属(Pelodictyon)種(例えば、P. ルテオラム(P. luteolum)))、紅色硫黄細菌(例えば、クロマチウム属(Chromatium)種(例えば、C. オケニイ(C. okenii)))、および紅色非硫黄細菌(例えば、ロドスピリラム属(Rhodospirillum)種(例えば、R. ルブラン(R. rubrum))、ロドバクター属(Rhodobacter)種(例えば、R. スファエロイデス(R. sphaeroides)、R. カプスラタス(R. capsulatus))、ロドミクロビウム属(Rhodomicrobium)種(例えば、R. バネリイ(R. vanellii)))；酵母細胞(例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)細胞およびピキア・パストリス(Pichia pastoris)細胞)；昆虫細胞(例えば、ショウジョウバエ属(Drosophila)種(例えば、キイロショウジョウバエ)、スポドプテラ属(Spodoptera)(例えば、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda) Sf9およびSf21細胞)、およびトリコプルサ属(Trichoplusa)(例えば、High-Five細胞))；線形動物細胞(例えば、線虫細胞)；鳥類細胞；両生類細胞(例えば、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)細胞)；爬虫類細胞；および哺乳動物細胞(例えば、NIH3T3、293、CHO、COS、VERO、C127、BHK、Per-C6、Bowes黒色腫、およびHeLa細胞)が含まれる。特定の態様において、細胞は膵臓細胞、結腸直腸細胞、腎細胞、またはバーキットリンパ腫細胞である。いくつかの態様においては、PC3、HCT116、HT29、MIA Paca-2、HPAC、Hs700T、Panc10.05、Panc 02.13、PL45、SW 190、Hs 766T、CFPAC-1、およびPANC-1などの膵臓細胞株が用いられる。これらおよびその他の適切な細胞は、例えば、Invitrogen Corporation(カリフォルニア州、カールズバッド)、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)(バージニア州、マナッサス)、およびアグリカルチュラル・リサーチ・カルチャー・コレクション(Agricultural Research Culture Collection)(NRRL；イリノイ州、ピオリア)から市販されている。
【０１４５】
リボソームヌクレオチド配列および相互作用分子の使用
リボソームヌクレオチド配列相互作用分子は、場合によっては細胞応答をもたらすために用いられ、いくつかの態様においては治療応答をもたらすために用いられる。したがって、細胞におけるrRNA合成を阻害する方法であって、細胞を、細胞におけるrRNA合成を減少させるのに十分な量の、rRNAまたはrDNAと相互作用する化合物と接触させる段階を含む方法を本明細書に提供する。そのような方法は、インビトロ、インビボ、および/またはエクスビボで行うことができる。したがって、いくつかのインビボおよびエクスビボ態様は、対象の細胞におけるrRNA合成を阻害する方法であって、rRNAまたはrDNAと相互作用する化合物を、それを必要とする対象に、対象の細胞におけるrRNA合成を減少させるのに十分な量投与する段階を含む方法に向けられる。いくつかの態様においては、細胞を1つまたは複数の化合物と接触させることができ、そのうちの1つまたは複数がrRNAまたはrDNAと相互作用する(例えば、一薬物または薬物および共薬物方法)。特定の態様において、化合物は、本明細書に記載のキノロン誘導体(例えば、式A-1またはB-1の化合物)のようなキノロン誘導体である。細胞は多くの場合、例えば、通常よりも高い増殖を起こしている細胞および腫瘍細胞などの癌細胞である。
【０１４６】
いくつかの態様においては、細胞に他の効果をもたらす1つまたは複数の他の治療(例えば、腫瘍摘出手術および/または放射線療法)および/または他の分子(例えば、共薬物)と組み合わせて、細胞をrRNAまたはrDNAと相互作用する化合物と接触させる。例えば、細胞増殖を減少させる、または組織炎症を軽減する共薬物が選択され得る。当業者は、併用アプローチにおいて、多種多様な共薬物を選択し投与することができる。共薬物の非限定的な例には、アバスチン、ダカルバジン(例えば、多発性骨髄腫)、5-フルオロウラシル(例えば、膵癌)、ゲムシタビン(例えば膵癌)、およびグリーバック(例えば、CML)が含まれる。
【０１４７】
本明細書で使用する「rRNA合成を阻害すること」という用語は、細胞を化合物と接触させた後、または化合物を対象に投与した後に、細胞によって産生されるrRNAの量を減少させることを指す。特定の態様においては、細胞を化合物と接触させた後、または化合物を対象に投与した後の特定の細胞において、rRNAレベルは、約1時間、約2時間、約3時間、約4時間、約5時間、約6時間、約7時間、約8時間、約9時間、約10時間、約12時間、約16時間、約20時間、または約24時間といった特定の時間枠内で、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約70%、約75%、約80%、約90%、もしくは約95%またはそれ以上減少する。rRNAレベルを減少させる特定の細胞は、場合により、癌細胞または系中の他の細胞よりも速い速度で増殖を起こしている細胞である。細胞中のrRNAのレベルは、インビトロおよびインビボで決定することができる(例えば、実施例の項を参照されたい)。特定の態様において、DNA複製もタンパク質翻訳も実質的に阻害することなく、rRNA合成は阻害される。後者の態様において、DNA複製および/またはタンパク質翻訳は、特定の細胞において最大で10%減少した場合、実質的な減少とはなり得ない。
【０１４８】
本明細書で使用する「rRNAと相互作用すること」という用語は、化合物とrRNAの直接的相互作用または間接的相互作用を指す。いくつかの態様において、化合物は、本明細書に記載のヌクレオチド配列領域などのrRNAに直接結合してよい。特定の態様において、化合物は、特定のrRNAをコードするrDNAヌクレオチド配列(例えば、本明細書に記載のrDNA配列)に直接結合してよい。特定の態様において、化合物は、rRNAまたはrDNA中の四重鎖構造に結合し得り、かつ/またはそれを安定化し得る。いくつかの態様において、化合物は、例えばrRNA合成に関与するタンパク質、rRNA伸長に関与するタンパク質(例えば、Pol IもしくはPol IIIなどのポリメラーゼ、またはヌクレオリンタンパク質)、rRNA前駆体プロセシングに関与するタンパク質(例えば、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、RNAヘリカーゼ)、またはリボソーム生合成に関与するタンパク質(例えば、リボソームサブユニットタンパク質、またはリボソームサブユニットへのrRNAの負荷を促進するタンパク質)のような、rRNAまたはrDNAヌクレオチド配列に結合する、またはそれと相互作用するタンパク質に直接結合してよい。
【０１４９】
特定の態様において、細胞を本明細書に記載のヒトリボソームヌクレオチド配列および/または構造に結合する化合物と接触させることによって細胞応答をもたらす方法もまた提供する。細胞応答は場合により、(a) H2AX、p53、chk1、およびp38 MAPKタンパク質の実質的リン酸化；(b) ヌクレオリンの核小体から核質への再分布；(c) リソソームからのカテプシンDの放出；(d) アポトーシスの誘導；(e) 染色体ラダー化の誘導；(f) 細胞周期進行を実質的に停止させることのないアポトーシスの誘導；ならびに/または(g) アポトーシスの誘導および細胞周期停止の誘導(例えば、S期および/またはG1停止)である。
【０１５０】
本明細書で用いる「実質的リン酸化」という用語は、リン酸部分に連結された特定の種類のタンパク質または断片の1つまたは複数の部位を指す。特定の態様において、リン酸化は検出可能な場合に実質的であり、いくつかの態様においては、特定の種類のタンパク質または断片の約55%〜99%がリン酸化されているか、または特定の部位でリン酸化されている場合に、リン酸化は実質的である。特定のタンパク質は場合により、H2AX、DNA-PK、p53、chk1、JNK、およびp38 MAPKタンパク質、または1つもしくは複数のリン酸化部位を含むそれらのタンパク質である。そのようなタンパク質のリン酸化を検出する方法を本明細書に記載する。
【０１５１】
本明細書で使用する「アポトーシス」という用語は、内因性の細胞自己破壊または自殺プログラムを指す。細胞は誘因刺激に応答して、細胞収縮、細胞膜の気泡形成、ならびに染色体の凝縮および断片化を含む事象のカスケードを起こす。これらの事象の結果、細胞は膜結合性粒子(アポトーシス小体)のクラスターへと変換され、その後これはマクロファージによって貪食される。染色体DNAは多くの場合、アポトーシスを起こしている細胞において切断され、その結果、細胞DNAをゲル電気泳動によって解析した場合にラダーが可視化される。アポトーシスは、場合により、カスパーゼS活性などのカスパーゼ活性を検出することによって、およびホスファチジルセリンの移行をモニターすることによって、モニターされる。本明細書に記載する方法は、非癌細胞よりも、腫瘍における癌細胞などの癌細胞のアポトーシスを優先的に誘導するように設計される。
【０１５２】
本明細書で使用する「細胞周期進行」という用語は、細胞が分裂し増殖する過程を指す。有糸分裂および間期など、細胞周期進行の特定の期が認識されている。間期内にはG1期、S期、およびG2期などのサブ期が存在し、有糸分裂内には前期、中期、後期、終期、および細胞質分裂などのサブ期が存在する。細胞周期進行は場合により、細胞周期の特定の期で実質的に停止する(例えば、集団中の約90%の細胞が、G1期またはS期などの特定の期で停止する)。いくつかの態様において、細胞周期進行は場合により、周期の任意の1つの期で有意に停止しない。例えば、細胞の亜集団は、細胞周期のS期で実質的に停止し得、細胞の別の亜集団は、細胞周期のG1期で実質的に停止し得る。特定の態様において、細胞周期は、細胞周期の任意の特定の期で実質的に停止しない。停止の決定は多くの場合、約4時間、約8時間、約12時間、約16時間、約20時間、約24時間、約36時間、または約48時間といった1つまたは複数の特定の時点で行われ、アポトーシスはこれらの時点中に、またはこれらの時点までに起こってしまっていてもよく、または起こっている最中であってもよい。
【０１５３】
「ヌクレオリンの再分布」という用語は、タンパク質ヌクレオリンまたはその断片の核小体から核質などの細胞の別の部分への移行を指す。異なる種類のヌクレオリンが存在し、これについて本明細書に記載する。別の細胞区画(例えば、核小体)中に検出可能なレベルのヌクレオリンが存在する場合に、ヌクレオリンは場合によって核小体から分布される。ヌクレオリンを検出する方法は公知であり、これについて本明細書に記載する。いくつかの態様において、ヌクレオリンが再分布される細胞の核小体は、未処理の細胞におけるヌクレオリンの約55%〜約95%を含み得る。ヌクレオリンが実質的に再分布される細胞の核小体は、未処理の細胞におけるヌクレオリンの約5%〜約50%を含み得る。
【０１５４】
特定の態様において、細胞成分と相互作用するリボソーム核酸中の特定のヌクレオチド配列は、染色体免疫沈降法(ChIP)などの当技術分野で公知の方法により決定される。ChIPアッセイはまた、どの細胞成分が染色体DNA中の特定のヌクレオチド配列と複合体形成しているかを決定するのにも有用であり得る。一般的にChIPアッセイにおいては、染色体DNAをそれと複合化している分子に架橋し、架橋された産物を断片化する。これらの段階中または段階後に、クロマチンを1つまたは複数の抗原結合剤と接触させ、この段階の前または後に断片を分離する。このような技法を用いて、抗原結合剤と相互作用する特定の分子と複合体形成しているヌクレオチド配列を決定することができる。ChIPアッセイ手順は公知である(例えば、www.protocol-online.org/prot/Molecular_Biology/Protein/Immunoprecipitation/Chromatin_Immunoprecipitation_ChIP_Assay_/におけるhttpアドレス)。
【０１５５】
可逆的または非可逆的な結合をもたらす適切な化学的リンカーを用いて、分子を架橋する(例えば、Orlando, et al., Methods 11:205-214 (1997)を参照されたい)。1つの態様では、ホルムアルデヒドが可逆的架橋剤として用いられる(例えば、Johnson & Bresnick, Methods 26:27-36 (2002)を参照されたい)。架橋剤は多くの場合、生物または細胞(例えば、破壊されていない細胞)と接触させ、場合によっては細胞溶解物と接触させる。1つの態様においては、細胞を架橋剤と接触させ、次いで細胞を溶解する。細胞は多くの場合、架橋剤に曝露する前に、以前に記載されている特定の分子または条件(例えば、有機小分子もしくは無機小分子または電離放射線)に曝露される。架橋剤は、多くの場合に細胞または試料中の隣接した分子を相互に連結し、その結果、試料中の分子抗原は場合によって相互に直接架橋され、場合によっては相互に間接的に架橋され、その場合、1つまたは複数の非抗原分子が介在する。
【０１５６】
架橋試料を調製した後、多くの場合には、架橋されたクロマチンDNAを、例えば超音波処理または針およびシリンジを通した剪断などの適切な過程により断片化する。超音波処理を用いると、多くの場合に約500〜約1000塩基対長のクロマチン断片が得られる。いくつかの態様においては、架橋されたクロマチンを他の試料成分から分離した後に断片化を行い、場合によっては、断片化されたクロマチンを他のアッセイ成分から分離した後に、クロマチン断片を抗原結合剤と接触させる。架橋されたクロマチンまたはクロマチン断片は、例えば密度遠心分離、ゲル電気泳動、またはクロマトグラフィーなどの適切な過程により、他の試料成分から分離される。
【０１５７】
クロマチン(例えば、架橋されたクロマチン、断片化されたクロマチン、または架橋され断片化されたクロマチン)を、1つまたは複数の抗原結合剤と接触させる。抗原結合剤は、染色体DNAに架橋された細胞成分中の抗原(例えば、タンパク質(例えば、転写因子、ポリメラーゼ、ヒストン))、または染色体DNA自体の成分(例えば、染色体DNA中に取り込まれたBrdU)に特異的に結合する。抗原結合剤は多くの場合に、クロマチンと結合している分子抗原を検出するのに有用であり、かつ/または系中の他の非架橋成分から架橋されたクロマチンを分離するのに(例えば、種々の大きさの架橋された染色体を相互に分離するのに)有用である。この段階は断片化の前または後に行ってもよく、また断片を分離する前または後に行ってもよい。抗原結合剤は場合により抗体または抗体断片であり、例えば、細胞内でリボソームRNAを合成する複合体の成分に特異的に結合する抗体などである。そのような抗体は、例えばUBF、TBP、TAF 48、TAF 63、TAF 110、もしくはRNAポリメラーゼIサブユニットに特異的に結合してもよく、またはヌクレオリン、フィブララリン、もしくはRecQ、または前記タンパク質の一部に特異的に結合してもよい。抗原結合剤は、例えば標識二次抗体を用いて検出する、または抗原結合剤自体に連結された標識を検出するなど、任意の簡便な公知の方法を用いて検出することができる。酵素標識(例えば、ペルオキシダーゼ)、蛍光標識、および光散乱標識などの適切な標識の例は公知であり、当業者は入手が可能である。
【０１５８】
特定の細胞成分が特定の染色体ヌクレオチド配列と複合化しているかどうかの決定は、ChIPによって評価することができる。そのような態様においては、染色体DNAを、(1) 関心対象のヌクレオチド配列を特異的に検出するヌクレオチド配列結合剤(例えば、検出可能な標識に連結されたハイブリダイゼーションプローブ)、および(2) 関心対象の細胞成分に特異的に結合する検出可能な抗原結合剤、と接触させることができる。後者の態様では、共局在する配列結合剤および抗原結合剤を検出することによって、特定のヌクレオチド配列が関心対象の細胞成分と複合化していることが決定される(例えば、単一の、分離および架橋された染色体DNA断片上におけるこれらの物質の同時検出)。架橋された染色体DNAにおいて、2つの分子抗原が相互に近接しているかどうかを決定することができる。この解析は、複合化している抗原に相互に近接して結合した場合に検出可能なシグナルを生じる2つの抗原結合剤と染色体DNAを接触させることによって行うことができる。そのような抗原結合剤の例は、例えば、第1オリゴヌクレオチドに連結された第1抗体、および第1オリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る第2オリゴヌクレオチドに連結された第2抗体のような、それぞれ結合対の1つのメンバーに連結された異なる抗体の対である。後者の例では、第1オリゴヌクレオチドおよび第2オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション産物を、PCRによって検出することができる(例えば、WO 2005/074417)。抗原結合剤は、抗原結合剤ならびにそれと複合体形成しているDNAおよび他の分子の分離を可能にするビーズまたは他の固相への結合のように、分離を容易にする分子に連結させてもよい。抗原結合剤は、分離を容易にする物質に直接連結させても(例えば、共有結合または非共有結合性の直接結合)、または間接的に連結させてもよい(例えば、ビーズに直接連結された二次抗体を介して、またはビオチン-ストレプトアビジン結合を介して)。
【０１５９】
抗原結合剤/クロマチンDNA複合体を分離する態様に関しては、その後の段階を行う場合が多い。例えば、場合により、固定化伸長産物を、伸長産物と結合しているタンパク質を消化する物質(例えば、抗原タンパク質および抗体などの結合パートナータンパク質を消化するプロナーゼなどのプロテアーゼ)で処理する。いくつかの態様では、標準的な技法(例えば、試料の加熱)により架橋を逆転させ、以前に記載されている通りに伸長産物成分を相互に分離する。特定の態様においては、抗原結合剤と結合している1つまたは複数のクロマチンDNA断片を、標準的な技法を用いて(例えば、TOPO(登録商標)クローニングプラスミドを用いて)配列決定する。
【０１６０】
したがって、特定の態様において、1つまたは複数の細胞成分に架橋された染色体DNA、ならびにヌクレオリン、フィブリラリン、および/またはRecQに特異的に結合する抗原結合剤を含む組成物を提供する。特定の態様において、1つまたは複数の細胞成分に架橋された染色体DNA、およびUBF、TBP、TAF 48、TAF 63、TAF 110、またはRNAポリメラーゼIサブユニットに特異的に結合する抗原結合剤を含む組成物もまた提供する。そのような組成物は場合により、式3もしくは3A、または式2もしくは2A〜2Dの類似体のようなキノロン類似体を含む。特定の態様において、染色体DNAは染色体断片である。染色体DNAまたはDNA断片は場合により、本明細書に記載のリボソームヌクレオチド配列のようなリボソーム核酸ヌクレオチド配列を含む。リボソームヌクレオチド配列は、四重鎖構造(例えば、分子内平行型または混合平行型構造)を形成する可能性があるか、または形成することができる。
【０１６１】
いくつかの態様において、リボソーム核酸ヌクレオチド配列と複合体形成している特定の細胞成分と複合体形成しているリボソーム核酸ヌクレオチド配列を決定する方法であって、1つまたは複数の細胞成分に架橋された染色体DNAまたはその断片を、特定の細胞成分に特異的に結合する抗原結合剤と接触させる段階；および特定の細胞成分に架橋された染色体DNAまたはその断片の配列決定を行う段階を含み、それによってリボソーム核酸ヌクレオチド配列が決定される方法を提供する。特定の細胞成分は場合により、ヌクレオリン、フィブリラリン、またはRecQであり、いくつかの態様においてはUBF、TBP、TAF 48、TAF 63、TAF 110、またはRNAポリメラーゼIサブユニットであってもよい。そのような方法は場合により、式3もしくは式3Aまたは式2もしくは2A〜2Dの類似体のようなキノロン類似体と染色体DNAを接触させる段階を含む。いくつかの態様において、染色体DNAは染色体断片である。特定の態様においては、特異的結合剤と結合している断片を他の断片から分離し、場合によっては特異的結合剤と結合している断片を、結合剤に連結されている検出可能な標識によって検出する。場合によっては、抗原結合剤をビーズなどの固相に連結し、場合によっては検出可能な標識に連結する。
【０１６２】
細胞アポトーシスを誘導する方法であって、細胞アポトーシスを誘導するのに有効な量の化合物と細胞を接触させる段階を含み、化合物がプロテインキナーゼと相互作用し、細胞内でリボソームRNAを合成する複合体の成分と相互作用する方法もまた本明細書に提供する。特定の態様において、化合物はプロテインキナーゼおよび成分に結合する。プロテインキナーゼは場合により、マイトジェン活性化プロテイン(MAP)キナーゼ、mTOR、またはPI3キナーゼ経路のメンバーである。特定の態様において、プロテインキナーゼは細胞周期制御プロテインキナーゼであり、RSKプロテインキナーゼであり、カゼインキナーゼであり、AKTプロテインキナーゼであり、またはABL、S6K、Tie、TrkA、ZIPK、Pim-1、SAPK、Flt3、およびDRAKプロテインキナーゼからなる群より選択される。成分は場合により、UBF、TBP、TAF 48、TAF 63、TAF 110、およびRNAポリメラーゼIサブユニットからなる群より選択される。いくつかの態様において、化合物は、静止細胞よりも優先的に増殖細胞のアポトーシスを誘導する。化合物は場合により、式3または3A(例えば、式A-1)の化合物のようなキノロン類似体である。
【０１６３】
細胞アポトーシスを誘導する方法であって、細胞アポトーシスを誘導するのに有効な量の化合物と細胞を接触させる段階を含み、化合物がリボソームDNAの核酸構造と相互作用する方法もまた提供する。核酸構造は、いくつかの態様において、ヌクレオリン、フィブララリン、またはRecQと相互作用し得る分子内四重鎖構造である。化合物は場合により、式3もしくは3A、または式2もしくは2A〜2Dの化合物のようなキノロン類似体である。
【０１６４】
細胞アポトーシスを誘導する方法であって、細胞アポトーシスを誘導するのに有効な量の化合物と細胞を接触させる段階を含み、化合物がヌクレオリン、フィブリラリン、および/またはRecQと相互作用するリボソーム核酸の領域と相互作用する方法もまた提供する。ヌクレオリン、フィブリラリン、および/またはRecQと相互作用するリボソーム核酸の領域は、四重鎖構造を含み得る。化合物は場合により、式3もしくは3A、または式2もしくは2A〜2Dの化合物のようなキノロン類似体である。リボソーム核酸は場合によりrRNAであり、またはrDNAであってもよい。
【０１６５】
図6Aおよび6Bに記載の細胞シグナル経路により、rRNA生合成を阻害する併用療法を選択し、ひいては細胞増殖を阻害することが可能になった。1つの態様において、併用治療薬は、プロテインキナーゼ阻害剤、サイクリン活性化因子、腫瘍抑制因子活性化因子、およびリボソーム生合成阻害剤からなる群より選択される2つまたはそれ以上のクラスに由来する2つまたはそれ以上の分子を含む組成物である。各クラスに由来する単一分子治療薬よりも有効性および毒性の低い、2つまたはそれ以上のクラスに由来する分子を選択することができ、それらを併用することで各単一分子治療薬と同程度かまたはそれよりも優れた有効性が得られ、かつ毒性はより低いことから、そのような併用治療薬は単一分子治療薬よりも有利であり得る。そのような併用治療薬態様における「阻害剤」という用語は、標的の触媒活性(ホスホリル転移またはヌクレオチドの重合)を減少させるか、または標的が細胞結合パートナーと相互作用する可能性を減少させる分子を指す。特定の態様において、リボソーム生合成阻害剤は、ポリメラーゼI複合体の2つまたはそれ以上の成分間の相互作用を阻害する。いくつかの態様において、ポリメラーゼI複合体の成分の1つまたは複数は、UBF、SL1、RRN3、TIF1A、TBP、TAF 48、TAF 63、TAF 110、およびRNAポリメラーゼIサブユニットからなる群より選択される。1つの態様において、リボソーム生合成阻害剤は、ポリメラーゼI複合体の成分とrDNAとの間の相互作用を阻害する。特定の態様において、リボソーム生合成阻害剤は、rRNA転写産物の成熟rRNAへのプロセシングを阻害する。いくつかの態様において、プロテインキナーゼ阻害剤は、プロテインキナーゼの触媒活性を阻害し、かつ/またはプロテインキナーゼとリボソーム生合成をもたらす経路においてそれと相互作用するタンパク質との間の相互作用を阻害し得る。特定の態様において、プロテインキナーゼ阻害剤は、ポリメラーゼI活性を制御する経路中のプロテインキナーゼを阻害し、場合によってプロテインキナーゼは、mTOR、S6K、ERK-MAPK、PI3K、AKT、CDK2/4、CK2、CDK7、8、9、およびUCK2からなる群より選択される。特定の態様において、サイクリン活性化因子は、ポリメラーゼI複合体を制御する経路中のサイクリンを活性化し、場合によりサイクリン活性化因子はCdk1/サイクリンB相互作用活性化因子である。いくつかの態様において、腫瘍抑制因子活性化因子は、ポリメラーゼI制御に関与する腫瘍抑制因子を活性化し、場合によっては、p53、PTEN、およびRbからなる群より選択される。特定の態様において、組成物はリボソーム生合成阻害剤を含む。場合により、組成物はリボソーム生合成阻害剤およびプロテインキナーゼ阻害剤を含むか、または本質的にそれらからなる。上記の阻害剤および活性化因子の例は公知である。例えば、リボソーム生合成の阻害剤(例えば、化合物A-1)；サイクリン依存性プロテインキナーゼ(例えば、Flavopiridol、BSM-387032、Roscovitine、およびUCN-01)；MEK(例えば、PD-0325901、CI-1040、およびAZD6244)；CK2(例えば、CIGB-300)；mTOR(例えば、AP23573；CCI-779；ラパマイシン/シロリムス；およびSL0101)；およびPI3K(例えば、SF1126)が公知である。
【０１６６】
候補分子または核酸は製剤または薬物として調製することができ、治療薬として使用することができる。いくつかの態様において、疾患を治療する方法であって、本明細書に記載の方法によって同定された分子を対象に、疾患を治療するのに有効な量投与する段階を含み、分子の投与によって疾患が治療される方法を提供する。本明細書内で使用する「治療すること」、「治療」、および「治療効果」という用語は、疾患または状態の症状を改善する、緩和する、軽減する、および除去することを指す。候補分子または核酸は、製剤または薬物中に治療有効量で存在してもよく、その量は、例えば、特定の細胞もしくは組織(例えば、癌細胞および腫瘍)におけるリボソーム生合成の減少、特定の細胞(例えば、癌細胞)のアポトーシス、特定の細胞の増殖の減少などの生物学的効果をもたらし得るか、または疾患もしくは状態の症状の改善、緩和、軽減、もしくは除去をもたらし得る量である。遺伝子療法、アンチセンス療法、およびsiRNAまたはRNAi療法などにおける核酸候補分子を含むいくつかの態様において、核酸は宿主ゲノムに組み込まれてもよいし、組み込まれなくてもよい。候補分子の任意の適切な製剤を、投与用に調製することができる。経口、非経口、静脈内、筋肉内、経皮、局所、および皮下経路を含むがこれらに限定されない、任意の適切な投与経路を用いることができる。対象は、げっ歯類(例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ)、有蹄動物(例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ)、魚類、鳥類、爬虫類、ネコ、イヌ、有蹄動物、サル、類人猿、またはヒトであってもよい。
【０１６７】
候補分子が安定した非毒性の酸性塩または塩基性塩を形成するのに十分に塩基性または酸性である場合には、塩として候補分子を投与することが適切であると考えられる。薬学的に許容される塩の例は、生理学的に許容される陰イオンを形成する酸と共に形成される有機酸付加塩であり、例えばトシラート、メタンスルホン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、α-ケトグルタル酸塩、およびα-グリセロリン酸塩である。塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、重炭酸塩、および炭酸塩を含む適切な無機塩もまた形成され得る。薬学的に許容される塩は、例えば、アミンなどの十分に塩基性の候補分子を生理学的に許容される陰イオンを生成する適切な酸と反応させるなど、当技術分野で周知の標準的な手順を用いて得ることができる。カルボン酸のアルカリ金属(例えば、ナトリウム、カリウム、またはリチウム)塩、またはアルカリ土類金属(例えば、カルシウム)塩もまた作製される。
【０１６８】
いくつかの態様において、候補分子は、不活性希釈剤または吸収性の可食担体などの薬学的に許容される媒体と組み合わせて全身(例えば、経口)投与される。候補分子は、硬ゼラチンもしくは軟ゼラチンカプセルに封入するか、錠剤に圧縮するか、または患者食の食材に直接組み込むことができる。経口治療投与では、活性候補分子を1つまたは複数の賦形剤と混合し、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ、オブラートなどの形態で使用することができる。このような組成物および調製物は、少なくとも0.1%の活性候補分子を含むべきである。組成物および調製物の割合は様々であってもよく、都合のよいことには所与の単位剤形の約2〜約60重量%であってもよい。このような治療上有用な組成物中の活性候補分子の量は、有効な投与量レベルが得られるような量である。
【０１６９】
錠剤、トローチ、丸剤、カプセルなどは、以下のものもまた含み得る。トラガカントゴム、アカシア、コーンスターチ、またはゼラチンなどの結合剤；第二リン酸カルシウムなどの賦形剤；コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；およびスクロース、フルクトース、ラクトース、もしくはアスパルテームなどの甘味剤；またはペパーミント、ウィンターグリーン油、もしくはチェリー香味料などの香味剤を添加してもよい。単位剤形がカプセルである場合には、上記の種類の物質に加えて、植物油またはポリエチレングリコールなどの液体担体を含めてもよい。コーティングとしての、またはさもなければ固体単位剤形の物理的形態を改良するための他の様々な物質が存在してもよい。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセルは、ゼラチン、蝋、シェラック、または糖などでコーティングすることができる。シロップまたはエリキシル剤は、活性候補分子、甘味剤としてのスクロースまたはフルクトース、保存剤としてのメチルおよびプロピルパラベン、チェリーまたはオレンジフレーバーなどの色素および香味料を含み得る。いかなる単位剤形を調製する際に用いられるいかなる物質も、薬学的に許容されるものであり、使用する量において実質的に非毒性である。加えて、活性候補分子を徐放性の調製物および装置に組み入れることも可能である。
【０１７０】
活性候補分子は、注入または注射により静脈内または腹腔内投与することもできる。活性候補分子またはその塩の溶液は、緩衝液、多くの場合はリン酸緩衝生理食塩水中で調製してもよく、任意に非毒性の界面活性剤と混合してもよい。分散液もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン、およびそれらの混合物中、ならびに油中で調製することができる。保存および使用の通常の条件下で、これらの調製物は微生物の増殖を防ぐための保存剤を含む。候補分子は場合により、そのような投与用にポリマトリックス(polymatrix)含有製剤(例えば、リポソームまたはミクロソーム)として調製される。リポソームは、例えば米国特許第5,703,055号(Felgner, et al.)およびGregoriadis, Liposome Technology vols. I to III (2nd ed. 1993)に記載されている。
【０１７１】
注射または注入に適した薬学的剤形には、滅菌水溶液もしくは分散液、または任意にリポソーム中に封入された、滅菌注射用もしくは注入用溶液もしくは分散液の即時調製に適した有効成分を含む滅菌粉末が含まれ得る。いずれの場合にも、最終的な剤形は、製造および保存条件下で無菌性、流動性、かつ安定であるべきである。液体担体または媒体は、例えば水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど)、植物油、非毒性のグリセリルエステル、およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または液体分散媒であり得る。適切な流動性は、例えばリポソームの形成により、分散液の場合には必要な粒径を維持することにより、または界面活性剤を使用することにより、維持することができる。微生物作用の予防は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、例えば糖、緩衝液、または塩化ナトリウムなどの等張剤を含めることが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅延させる薬剤を組成物中に使用することによってもたらされ得る。
【０１７２】
滅菌注射液は、必要な量の活性候補分子を、必要に応じて上記に列挙した種々の他の成分と共に適切な溶媒中に取り込み、次いで濾過滅菌することによって調製される。滅菌注射液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製法は真空乾燥法および凍結乾燥法であり、これらの方法によって、あらかじめ濾過滅菌した溶液中に存在した有効成分および任意の付加的な所望の成分の粉末が得られる。
【０１７３】
局所的投与の場合、本候補分子は液体形態で適用することができる。候補分子は、皮膚科学的に許容される担体と組み合せた組成物または製剤として投与される場合が多いが、これは固体であっても液体であってもよい。候補分子を皮膚に送達するために用いられる有用な皮膚科学的組成物の例は公知である(例えば、Jacquet, et al.(米国特許第4,608,392号）、Geria(米国特許第4,992,478号)、Smith, et al.(米国特許第4,559,157号)、およびWortzman(米国特許第4,820,508号)を参照されたい)。
【０１７４】
候補分子は固体担体と共に製剤化することもでき、固体担体には、タルク、粘土、微結晶セルロース、シリカ、アルミナなどの微粉化固体が含まれる。有用な液体担体には、水、アルコールもしくはグリコール、または水-アルコール/グリコール混合物が含まれ、そこに本候補分子を、任意に非毒性の界面活性剤を用いて有効レベルで溶解させるか、または分散させることができる。芳香剤および付加的な抗菌剤などの補助剤を添加して、所与の使用のための特性を最適化することもできる。得られた液体組成物は、吸水パッドから適用するか、包帯および他の包帯剤に含浸させるために使用するか、またはポンプ型もしくはエアロゾル噴霧器を用いて患部に噴霧することができる。合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸の塩およびエステル、脂肪アルコール、変性セルロース、または変性無機物質などの増粘剤を液体担体と共に使用して、使用者の皮膚に直接適用するための塗付可能なペースト剤、ゲル、軟膏、石鹸などを形成することもできる。
【０１７５】
リボソームヌクレオチド配列またはその相補体を有する核酸を、使用および投与のために単離し、組成物中に調製することができる。核酸組成物は、1つまたは複数の核酸の薬学的に許容される塩、エステル、またはそのようなエステルの塩を含み得る。裸の核酸を系に投与してもよいし、または核酸を1つもしくは複数の他の分子と共に製剤化してもよい。
【０１７６】
核酸を含む組成物は、溶液、乳濁液、またはポリマトリックス含有製剤(例えば、リポソームおよびミクロスフェア)として調製することができる。そのような組成物の例は、米国特許第6,455,308号(Freier)、第6,455,307号(McKay et al.)、第6,451,602号(Popoff et al.)、および第6,451,538号(Cowsert)に記載されており、リポソームの例も同様に、米国特許第5,703,055号(Felgner et al.)およびGregoriadis, Liposome Technology vols. I to III (2nd ed. 1993)に記載されている。組成物は、局所、経口、経肺、非経口、髄腔内、およびイントラニュートリカル(intranutrical)投与を含む任意の投与様式のために調製することができる。特定の投与様式のための製剤の例は、米国特許第6,455,308号(Freier)、第6,455,307号(McKay et al.)、第6,451,602号(Popoff et al.)、および第6,451,538号(Cowsert)に記載されている。核酸組成物は、1つまたは複数の薬学的に許容される担体、賦形剤、浸透促進剤、および/または補助剤を含んでもよい。組成物中の薬学的に許容される塩、担体、賦形剤、浸透促進剤、および/または補助剤の組み合わせの選択は、一部には投与形式に依存する。核酸オリゴヌクレオチド組成物に関して成分の組み合わせを選択するための指針は公知であり、その例は、米国特許第6,455,308号(Freier)、第6,455,307号(McKay et al.)、第6,451,602号(Popoff et al.)、および第6,451,538号(Cowsert)に記載されている。
【０１７７】
核酸を、核酸の毒性を軽減する、核酸の活性、細胞分布、または細胞取り込みを増強する化学結合、部分、または複合体によって修飾してもよい。そのような修飾の例は、米国特許第6,455,308号(Freier)、第6,455,307号(McKay et al.)、第6,451,602号(Popoff et al.)、および第6,451,538号(Cowsert)に記載されている。
【０１７８】
別の態様において、組成物は、本明細書に記載の核酸をコードするプラスミドを含み得る。担体、賦形剤、浸透促進剤、および補助剤成分などの、オリゴヌクレオチド組成物に関して上記した組成物成分の多くを、発現プラスミドを含む組成物中で使用することができる。同様に、プラスミドによって発現される核酸は、プラスミドによる発現後に、核酸と共にまたは核酸中に取り込まれ得る上記の修飾のいくつかを含んでもよい。組換えプラスミドは、場合により、微生物細胞(例えば、細菌(例えば、大腸菌)、酵母(例えば、S. セレビシエ)、または真菌)における核酸発現のために設計され、より多くの場合には、プラスミドは真核細胞(例えば、ヒト細胞)における核酸発現のために設計される。適切な宿主細胞は、Goeddel, Gene Expressison Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)にさらに考察されている。プラスミドを系に送達してもよいし、またはヌクレオチド配列をコードする核酸を含むプラスミドの一部を送達してもよい。
【０１７９】
哺乳動物細胞において核酸をプラスミドから発現させる場合、発現プラスミド制御エレメントは場合により、ウイルスの制御エレメントに由来する。例えば、一般に用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス2型、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、およびサルウイルス40に由来する。プラスミドは、核酸コードヌクレオチド配列に機能的に連結された誘導性プロモーターを含んでもよい。加えて、プラスミドは場合によって、核酸コード配列に機能的に連結された組織特異的プロモーターの使用により、特定の細胞種における核酸発現を導くことができ、その例には、アルブミンプロモーター(肝臓特異的；Pinkert et al., Genes Dev. 1: 268-277 (1987))、リンパ球特異的プロモーター(Calame & Eaton, Adv. Immunol. 43: 235-275 (1988))、T細胞受容体プロモーター(Winoto & Baltimore, EMBO J. 8: 729-733 (1989))、免疫グロブリンプロモーター(Banerji et al., Cell 33: 729-740 (1983)、およびQueen & Baltimore, Cell 33: 741-748 (1983))、ニューロン特異的プロモーター(例えば、神経フィラメントプロモーター；Byrne & Ruddle, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477 (1989))、膵臓特異的プロモーター(Edlund et al., Science 230: 912-916 (1985))、および乳腺特異的プロモーター(例えば、乳清プロモーター；米国特許第4,873,316号および欧州特許出願公開第264,166号)がある。発生的に制御されるプロモーターを使用してもよく、これには例えば、マウスhoxプロモーター(Kessel & Gruss, Science 249: 374-379 (1990))、およびα-フェトポリペプチドプロモーター(Campes & Tilghman, Genes Dev. 3: 537-546 (1989))が含まれる。
【０１８０】
核酸組成物は都合のよいことに単位剤形中に存在してもよく、それは製薬産業において公知の従来技法に従って調製される。一般論として、そのような技法は、液体形態もしくは微粉化固体形態またはその両方で、核酸を薬学的担体および/または賦形剤と合わせる段階、ならびに必要に応じて生成物を成形する段階、を含む。核酸組成物は、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、ソフトゲル、坐剤、および浣腸などの任意の剤形に製剤化することができる。組成物はまた、水性媒体、非水性媒体、または混合媒体中の懸濁剤として製剤化することも可能である。水性懸濁剤は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および/またはデキストランを含む、粘性を増加させる物質をさらに含み得る。懸濁剤はまた、1つまたは複数の安定剤を含んでもよい。
【０１８１】
核酸は、従来の形質転換法またはトランスフェクション法を介して細胞内に移行させることができる。本明細書で使用する「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、核酸を宿主細胞内に導入するための種々の標準的な技法を指し、これにはリン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈法、形質導入/感染、DEAE-デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、およびイオン導入法が含まれる。また、本明細書に記載のリポソーム組成物を、核酸投与を容易にするために用いることもできる。核酸組成物は、局所投与(眼および粘膜(例えば、膣および直腸)送達を含む)、経肺投与(例えば、噴霧器によることを含む、粉末およびエアロゾルの吸入または吹送；気管内、鼻腔内、上皮、および経皮)、経口投与、および非経口投与(例えば、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内注射または注入、筋肉内注射または注入；および頭蓋内(例えば、髄腔内または脳室内))を含むいくつかの様式で生物に投与することができる。
【０１８２】
一般に、液体組成物中の候補分子または核酸の濃度は、多くの場合に約0.1 wt%〜約25 wt%であり、場合によっては約0.5 wt%〜約10 wt%である。ゲルまたは粉末などの半固体または固体組成物中の濃度は、多くの場合に約0.1 wt%〜約5 wt%であり、場合によっては約0.5 wt%〜約2.5 wt%である。候補分子または核酸組成物は単位剤形として調製することができ、それは製薬産業において公知の従来技法に従って調製される。一般論として、そのような技法は、液体形態もしくは微粉化固体形態またはその両方で、候補分子または核酸を薬学的担体および/または賦形剤と合わせる段階、ならびに必要に応じて生成物を成形する段階、を含む。候補分子または核酸組成物は、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、ソフトゲル、坐剤、および浣腸などの任意の剤形に製剤化することができる。組成物はまた、水性媒体、非水性媒体、または混合媒体中の懸濁剤として製剤化することも可能である。水性懸濁剤は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および/またはデキストランを含む、粘性を増加させる物質をさらに含み得る。懸濁剤はまた、1つまたは複数の安定剤を含んでもよい。
【０１８３】
治療における使用に必要な候補分子もしくは核酸、またはそれらの活性塩もしくは誘導体の量は、選択した特定の塩のみならず、投与経路、治療する状態の性質、ならびに患者の年齢および状態によっても変化し、最終的には担当医または臨床医の判断となる。候補分子または核酸は一般的に、標的細胞の数を減少させる；標的細胞を検出可能に根絶する；疾患または状態の症状を治療する、改善する、緩和する、軽減する、および除去する；ならびに疾患もしくは状態の可能性または疾患もしくは状態の再発を予防または軽減する、という本来の目的を達成するのに有効な量で用いられる。治療有効量は、一部には対象、インビトロで維持された細胞、および実験動物由来の試料を解析することによって決定される場合もある。例えば、用量を定式化し、アッセイおよび実験動物において試験し、細胞を死滅させるためのIC50値を決定することができる。そのような情報を用いて、有用な用量をより正確に決定することができる。
【０１８４】
有用な候補分子または核酸の投与量は、多くの場合、細胞もしくは組織系におけるそのインビトロ活性および/または動物系でのインビボ活性を評価することにより決定される。例えば、マウスおよびその他の動物における有効な投与量からヒトの投与量を推定する方法は、当業者に公知である(例えば、米国特許第4,938,949号を参照されたい)。このような系は、候補分子または核酸のLD50(集団の50%にとって致死的な用量)およびED50(集団の50%において治療上有効な用量)を決定するために用いることができる。毒性効果と治療効果の用量比は治療指数であり、これは比ED50/LD50として表すことができる。候補分子または核酸の投与量は多くの場合、ED50が毒性をほとんど伴わない循環濃度の範囲内に収まる。投与量は、使用する剤形および使用する投与経路に応じて、この範囲内で変化し得る。本明細書に記載の方法で用いられる任意の候補分子または核酸に関しては、治療有効用量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。そのような情報を用いてヒトにおける有用な用量がより正確に決定される場合も多く、用量は場合により、インビトロアッセイで決定されたIC50(すなわち、症状の最大半量の阻害を達成する試験候補分子の濃度)を包含する循環血漿濃度範囲を達成するように製剤化される。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
【０１８５】
対象に対して有効な用量を決定する別の例は、試験対象の血清中の「遊離」および「結合」候補分子または核酸のレベルを直接アッセイする能力である。このようなアッセイでは、抗体模倣体および/または分子インプリント法によって作製された「バイオセンサー」を使用し得る。候補分子または核酸を、鋳型または「インプリントする分子」として使用して、重合可能な単量体を空間的に組織化し、その後に触媒試薬によりそれらを重合させる。インプリントさせた分子をその後除去すると、候補分子の反復した「ネガ像」を含み、生物学的アッセイ条件下で分子を選択的に再結合できるポリマーマトリックスが残る(例えば、Ansell, et al., Current Opinion in Biotechnology 7: 89-94 (1996)、およびShea, Trends in Polymer Science 2: 166-173 (1994)を参照されたい)。このような「インプリント」親和性マトリックスはリガンド-結合アッセイに適しており、そのため固定化モノクローナル抗体成分は、適切にインプリントされたマトリックスにより置き換えられる(例えば、Vlatakis, et al., Nature 361: 645-647 (1993)を参照されたい)。同位体標識化を用いることで、候補分子の「遊離」濃度を容易にモニターし、IC50の算出に使用することができる。このような「インプリント」親和性マトリックスはまた、候補分子または核酸の局所的結合および選択的結合に際して、その光子放出特性が測定可能に変化する蛍光基を含むように設計することもできる。これらの変化は、適切な光ファイバー装置を用いてリアルタイムで容易にアッセイすることができ、試験対象における用量をその個々のIC50に基づいて迅速に最適化することが可能になる。このような「バイオセンサー」の一例は、Kriz, et al., Analytical Chemistry 67: 2142-2144 (1995)において考察されている。
【０１８６】
例示的な用量には、対象または試料重量1キログラム当たりの、ミリグラムまたはマイクログラム量の候補分子または核酸、例えば、約1マイクログラム/キログラム〜約500ミリグラム/キログラム、約100マイクログラム/キログラム〜約5ミリグラム/キログラム、または約1マイクログラム/キログラム〜約50マイクログラム/キログラムが含まれる。小分子の適切な用量は、調節しようとする発現または活性に関連した小分子の効力に依存することが理解される。本明細書に記載のポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節するために、これら小分子の1つまたは複数を動物(例えば、ヒト)に投与する場合には、医師、獣医、または研究者は、例えば最初に比較的低い用量を処方し、その後適切な応答が得られるまで用量を増加させてもよい。加えて、任意の特定の動物対象に対する特定用量レベルは、使用する特定の候補分子の活性、対象の年齢、体重、全身の健康状態、性別、および食事、投与時間、投与経路、排泄率、任意の薬物併用、ならびに調節しようとする発現または活性の程度を含む様々な要因に依存することが理解される。
【０１８７】
いくつかの態様において、候補分子または核酸は、細胞増殖性状態を治療するために用いられる。そのような治療において、「治療すること」、「治療」、および「治療効果」という用語は、細胞増殖速度を減少または停止させること(例えば、腫瘍成長を遅延または中止させること)、増殖している癌細胞の数を減少させること(例えば、腫瘍の一部またはすべてを除去すること)、および細胞増殖性状態を完全にまたは部分的に緩和することを指す。細胞増殖性状態には、これらに限定されないが、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、肝癌、膵癌、リンパ節癌、結腸癌、前立腺癌、脳腫瘍、頭頚部癌、皮膚癌、肝癌、腎癌、および心臓癌が含まれる。癌の例には、造血器起源の過形成/新生物細胞を含む疾患である造血器腫瘍性疾患が含まれる(例えば、骨髄、リンパ、もしくは赤血球系列、またはそれらの前駆細胞から生じる)。この疾患は、低分化型急性白血病、例えば赤芽球性白血病および急性巨核芽球性白血病から生じ得る。さらなる骨髄性疾患には、これらに限定されないが、急性前骨髄性白血病(APML)、急性骨髄性白血病(AML)、および慢性骨髄性白血病(CML)が含まれ(Vaickus, Crit. Rev. in Oncol./Hemotol. 11:267-297 (1991)に概説されている)；リンパ性悪性腫瘍には、これらに限定されないが、B細胞系列ALLおよびT細胞系列ALLが含まれる急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性リンパ性白血病(CLL)、前リンパ球性白血病(PLL)、ヘアリー細胞白血病(HLL)、およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症(WM)が含まれる。悪性リンパ腫のさらなる形態には、これらに限定されないが、非ホジキンリンパ腫およびその変種、末梢性T細胞リンパ腫、成人T細胞白血病/リンパ腫(ATL)、皮膚T細胞性リンパ腫(CTCL)、大顆粒リンパ球性白血病(LGF)、ホジキン病、およびリード・スターンバーグ病が含まれる。特定の態様において、細胞増殖性疾患は、非内分泌腫瘍および内分泌腫瘍を含む膵癌である。非内分泌腫瘍の具体例には、これらに限定されないが、腺癌、腺房細胞癌、腺扁平上皮癌、巨細胞腫、膵管内乳頭粘液腫瘍、粘液性嚢胞性癌、膵芽腫、漿液性嚢胞腺腫、固形腫瘍、および偽乳頭状腫瘍が含まれる。内分泌腫瘍は膵島腫瘍であってよい。
【０１８８】
細胞増殖性状態には、例えば湿疹、円板状エリテマトーデス、扁平苔癬、硬化性苔癬、菌状息肉腫、光線皮膚症、バラ色粃糠疹、乾癬を含む皮膚の炎症性状態といった炎症性状態もまた含まれる。例えば脂肪細胞の増殖といった、肥満症に関連した細胞増殖性状態もまた含まれる。
【０１８９】
細胞増殖性状態には、例えば後天性免疫不全症候群、アデノウイルス感染症、アルファウイルス感染症、アルボウイルス感染症、ボルナ病、ブニヤウイルス感染症、カリシウイルス感染症、水痘、コロナウイルス感染症、コクサッキーウイルス感染症、サイトメガロウイルス感染症、デング熱、DNAウイルス感染症、膿瘡、伝染性、脳炎、アルボウイルス、エプスタイン・バーウイルス感染症、伝染性紅斑、ハンタウイルス感染症、出血熱、ウイルス性、肝炎、ウイルス性、ヒト、単純疱疹、帯状疱疹、耳帯状疱疹、ヘルペスウイルス感染症、伝染性単核球症、鳥のインフルエンザ、インフルエンザ、ヒト、ラッサ熱、麻疹、伝染性軟属腫、流行性耳下腺炎、パラミクソウイルス感染症、サシチョウバエ熱、ポリオーマウイルス感染症、狂犬病、呼吸器合胞体ウイルス感染症、リフトバレー熱、RNAウイルス感染症、風疹、遅発性ウイルス感染症、天然痘、亜急性硬化性全脳炎、腫瘍ウイルス感染症、疣贅、ウェストナイル熱、ウイルス性疾患、および黄熱を含むウイルス性疾患もまた含まれる。例えば、SV40形質転換ウイルスのラージT抗原はUBFに作用してそれを活性化し、他のウイルスタンパク質をPol I複合体に動員し、それによって細胞増殖を促進してウイルス増殖を確実にする。細胞増殖性状態には、血管新生に関連した状態(例えば、癌)、ならびに脂肪細胞(adipocyte)および他の脂肪細胞(fat cell)の増殖によって起こる肥満症もまた含まれる。
【０１９０】
細胞増殖性状態には、高血圧、バルーン血管形成、弁膜症、および心筋梗塞などの心臓負荷によって起こる心臓の状態もまた含まれる。例えば、心筋細胞は心室壁の大部分を構成する心臓における分化した筋細胞であり、血管平滑筋細胞は血管を裏打ちしている。いずれも筋細胞種であるが、心筋細胞および血管平滑筋細胞は、収縮、増殖、および分化の機構が異なる。心筋細胞は心臓形成の直後に最終分化型となり、そのため分裂する能力を失うのに対し、血管平滑筋細胞は、収縮から増殖に至る表現形の調節を連続して行っている。例えば高血圧、バルーン血管形成、弁膜症、および心筋梗塞などの様々な病態生理学的負荷において、心臓および血管は増殖に関連した形態的変化を起こし、それによって心臓機能が低下し、最終的に心不全として現れる。したがって、本明細書に記載の化合物または核酸を心臓病態を治療するのに有効な量投与することによって、心臓の細胞増殖性状態を治療する方法を本明細書に提供する。化合物または核酸は、心臓負荷が起こるかまたは検出される前または後に投与することができ、化合物または核酸は、例えば高血圧、バルーン血管形成、弁膜症、または心筋梗塞の発症または検出後に投与することができる。そのような化合物または核酸の投与により、血管筋細胞および/または平滑筋細胞の増殖が減少する可能性がある。
【０１９１】
特定の態様はまた、本明細書に記載の候補分子または核酸を投与することにより、加齢の症状を治療することおよび/または細胞老化に関する状態を治療することに向けられる。例えば、ウェルナー症候群という早老病は、WRN DBAヘリカーゼをコードするウェルナー遺伝子の変化によって起こる。理論によって制限されることはないが、このタンパク質が核小体に局在し、G-四重鎖に特異的に結合することが知られており、かつWRN DNAヘリカーゼにおける変異が老化を引き起こす。
【０１９２】
毒性評価手順
細胞または対象に対する分子の毒性を予測するアッセイを本明細書に提供する。特定の態様においては、JNKのリン酸化および任意でMAPKのリン酸化を評価し、これらのタンパク質のリン酸化状態に基づいて毒性のリスクを評価する。全長JNKおよびMAPKタンパク質を用いることができ、特定の態様においては、リン酸化され得るJNKおよび/またはMAPKタンパク質の断片を用いてもよい。1つまたは複数のリン酸化部位が除去された変異体タンパク質のような変異JNKまたは変異MAPKアミノ酸配列を用いることも可能である(例えば、リン酸化部位が減少することでバックグラウンドレベルが減少し得る)。毒性の予測は、毒性の割合もしくは可能性、および/または等級(例えば、高度、中程度、低度の毒性リスク)のような、簡便でかつ情報を与える任意の形式で表すことができる。毒性は場合により炎症または刺激である。
【０１９３】
JNKもしくはMAPKタンパク質または断片上のリン酸部分の有無は、当業者によって選択される種々の系で検出することができる。いくつかの態様においては、プロテインキナーゼによってタンパク質基質に転移されるアデノシン三リン酸(ATP)のγホスホリル部分またはその誘導体を検出可能に標識する。そのような態様では、基質に転移された検出可能に標識されたγホスホリル部分を検出する。いくつかの態様では、32Pまたは33P γホスホリル部分を有するATPをアッセイにおいて使用する。特定の態様において、ATPのγリン酸は、当業者に公知の方法によって検出可能に標識することができる。特定の態様において、γ部分は硫黄同位体(例えば、35S原子)を含む。
【０１９４】
特定の態様においては、JNKおよび/またはMAPKタンパク質を固相に固定化し(例えば、基質アレイ)、リン酸化活性をモニターする。そのような系では、リン酸化反応に寄与する成分を含む反応緩衝液を使用し得る。これらの条件には、例えば、pH、塩濃度、Mg2+の濃度、および界面活性剤濃度が含まれる。反応緩衝液中でインキュベートした後、マイクロアレイを洗浄して標識ATPを除去し、キナーゼ反応中にATPから基質へ転移された検出可能に標識されたリン酸により、生成物を定量化する。シグナル強度は基質上の標識リン酸の量に比例し、リン酸化活性と対応する。いくつかの態様においては、基質を検出可能なホスホリル部分で標識し、基質の脱リン酸化を検出する。
【０１９５】
理論によって縛られることはないが、いくつかのキナーゼおよびホスファターゼは、特定の分子状況においてのみ基質に作用する。そのような分子状況は、例えば特定の足場タンパク質からなってもよい。特定の態様においては、そのような足場タンパク質をアッセイ条件に提供する(例えば、反応緩衝液と共に)。いくつかの態様においては、足場タンパク質もまた固体支持体の表面上に固定化する。
【０１９６】
特定の態様において、JNKリン酸化および/またはMAPKリン酸化は、リン酸化タンパク質またはリン酸化ペプチドに特異的に結合する抗体を用いて可視化し、かつ任意に定量化する。そのような抗体には、これらに限定されないが、ホスホ-セリンに結合する抗体、ホスホ-スレオニンに結合する抗体、またはホスホ-チロシンに結合する抗体が含まれる。抗体は場合により、ホスホリルアミノ酸の周囲のアミノ酸配列にかかわらずホスホリルアミノ酸に特異的であり、いくつかの態様において、抗体はホスホリルアミノ酸および1つまたは複数の周囲のアミノ酸を含むエピトープに特異的に結合する。リン酸化タンパク質またはリン酸化ペプチドに結合する抗体は検出可能な標識を含んでもよいか、またはアッセイ中に検出可能な標識と結合させることができる。いくつかの態様においては、二次抗体を用いてリン酸化タンパク質またはリン酸化ペプチドに結合した抗体を検出する。リン酸化基質の量を検出することができ、そのようなアッセイは、リン酸化および/または脱リン酸化活性を検出するのに有用である。いくつかのアッセイ態様においては、フルオロフォアに連結されたペプチド基質およびリン酸化ペプチドに特異的に結合する抗体と試料を接触させた後に、蛍光偏光によってリン酸化を検出する(例えば、PolarScreen(商標)キナーゼアッセイ；httpアドレス www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=10568)。
【０１９７】
特定のアッセイ態様では、FRETによってリン酸化を検出する。1つの態様においては、FRETし得る2つのフルオロフォア(例えば、N末端における1つのフルオロフォアおよびC末端における1つのフルオロフォア)に連結されたペプチド基質、およびそのリン酸化状態に基づいて差次的にペプチド基質を特異的に切断するプロテアーゼと、試料を接触させる(例えば、Z'-LYTE(商標)プロテインキナーゼおよびホスファターゼアッセイ(httpアドレス www.invitrogen.com/content. cfm?pageid=9866))。いくつかの態様においては、試料を(1) 第1フルオロフォアを含むペプチド基質および(2) ペプチドに連結された第1フルオロフォアとFRETし得る第2フルオロフォアに連結された検出分子、と接触させる(例えば、LanthaScreen(商標) TR-FRET Assay(httpアドレス www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=10513))。後者の態様において、検出分子は場合により、リン酸化ペプチドに特異的に結合し、非リン酸化ペプチドに特異的に結合しない抗体である(例えば、テルビウム標識ホスホ-チロシン特異的抗体)。検出分子は場合により結合対の一部である分子(例えば、ビオチン)であり、ペプチドを他方の結合対メンバー(例えば、ストレプトアビジンまたはアビジン)に連結し、アッセイ系を、リン酸化および非リン酸化ペプチドを差次的に切断するプロテアーゼと接触させる。これらのアッセイは、ホモジニアスまたはヘテロジニアス形式で行うことができる。
【０１９８】
特定の態様において、リン酸化は、リン酸に結合しかつ検出可能な標識に連結された分子を用いて検出することができる。金属キレート部分を含む色素のような色素を、検出可能な標識として使用することができる。特定の態様において、リン酸化タンパク質またはペプチドは、金属キレート色素を用いて検出される。金属キレート色素には、非限定的にBAPTA、IDA、DTPA、フェナントロリン、およびそれらの誘導体が含まれる(例えば、米国特許第4,603,209号；第4,849,362号；第5,049,673号；第5,453,517号；第5,459,276号；第5,516,911号；第5,501,980号；および第5,773,227号)。特定の態様では、Pro-Q Diamond染色(Molecular Probes、オレゴン州)における色素が用いられる(例えば、ゲルまたはマイクロアレイ染色)。
【０１９９】
使用が可能な他のリン酸化検出系には、PhosphoELISA(Biosource International)などの市販のキットおよび蛍光に基づくアッセイが含まれる。蛍光に基づく適切なアッセイ系では、Mg2+への結合に際してキレート化増強蛍光(CHEF)を示す新規な金属結合アミノ酸残基を有する試薬を使用する(例えば、US 2005/0080242A2およびUS 2005/0080243A1)。
【０２００】
キット
キットは1つまたは複数の容器を含み、容器は本明細書に記載の組成物および/または成分の1つまたは複数を含む。キットは、任意の数の別個の容器、小包、チューブ、バイアル、マイクロタイタープレートなどの中に組成物の1つまたは複数を含んでもよく、いくつかの態様において、成分はそのような容器中で種々の組み合わせで混合されてよい。いくつかの態様におけるキットは、本明細書に記載の試薬を1つ含み、キット中に含まれていない本明細書に記載の別の試薬に使用者を導く説明書を提供する。
【０２０１】
キットは、任意の組み合わせで本明細書に記載の試薬を含み得る。キットは、本明細書に記載の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上の試薬を含み得る。例えば、キットは、(1) 本明細書に記載のリボソームヌクレオチド配列を含む単離された核酸；(2) ヌクレオリンタンパク質もしくはその断片およびそれに結合する核酸；または(3) 本明細書に記載のリボソームヌクレオチド配列を含む単離された核酸、および検出可能な標識に連結されたそれに結合する化合物、を含み得る。
【０２０２】
キットは、場合によっては本明細書に記載の方法と併せて用いられ、場合によっては、本明細書に記載の1つもしくは複数の方法を行うための説明書、および/または本明細書に記載の1つもしくは複数の組成物もしくは試薬の解説書を含む。説明書および/または解説書は印刷形式であってもよく、キット挿入物として含まれ得る。キットはまた、そのような説明書または解説書を提供するインターネット所在地の書面による記載を含み得る。
【０２０３】
代表的なヒトrDNA配列
代表的なヒトrDNA配列(SEQ ID NO:1)を以下に提供する。
2009504192.tif 000132
2009504192.tif 000133
2009504192.tif 000134
2009504192.tif 000135
2009504192.tif 000136
2009504192.tif 000137
2009504192.tif 000138
2009504192.tif 000139
2009504192.tif 000140
2009504192.tif 000141
2009504192.tif 000142
2009504192.tif 000143
(a) 相補的なDNA配列、(b) 前記物のサブ配列、(c) SEQ ID NO:1に相補的なrRNAヌクレオチド配列およびサブ配列、ならびに(c) (c)に相補的なRNA配列およびサブ配列もまた本明細書に含まれる。
【０２０４】
実施例
以下に記載する実施例は本発明を説明するものであって、本発明を制限するものではない。
【０２０５】
実施例1
四重鎖モチーフリボソームヌクレオチド配列の同定
SEQ ID NO:1の配列を有するヒトリボソームDNA、およびその転写された相補的RNA配列を、四重鎖配列モチーフと一致するヌクレオチド配列に関して検索した。SEQ ID NO:1のrDNA配列は、他のゲノムDNA配列を含むデータベース中に記録されていなかった。例えば、SEQ ID NO:1のrDNA配列は、NCBIヒトゲノムDNA配列のbuild 34およびbulid 35の一部ではない。
【０２０６】
四重鎖モチーフを見出すため、PERLプログラムでSEQ ID NO:1をスキャンし((>EMBLRELEASE|U13369|HSU13369 HUMAN RIBOSOMAL DNA COMPLETE REPEATING UNIT)、正規表現GGG(.{1,7})GGG(.{1,7})GGG(.{1,7})GGGの範囲内に現れる任意のヌクレオチド塩基を同定した。rDNA配列中の42999塩基を処理した。全部で544塩基を含む、18の別個の潜在的四重鎖配列(PQS)領域が同定された。同じ配列において、正規表現CCC(.{1,7})CCC(.{1,7})CCC(.{1,7})CCCを用いて2回目の検索を行った。この場合も同様に42999塩基を処理したが、995塩基を含む30の別個のPQS領域が認められた。検索パラメータの第1セットを用いて、rDNAのコード鎖においてG-四重鎖形成配列に関して検索し、第2検索パラメータを用いて、相補的rRNAおよびrDNAの非コード鎖においてG-四重鎖形成配列に関して検索した。
【０２０７】
以下のrDNA四重鎖モチーフ配列が同定された。DNA配列はrDNAのコード鎖状のものであり、ヌクレオチド範囲は43 kbヒトリボソームDNA反復単位(アクセッション番号U13369)上の位置を指す。コード鎖(非鋳型鎖、プラス(+)鎖、またはアンチセンス鎖)またはその逆相補体において、NCBI build 35内に以下のヌクレオチド配列に関する完全な配列一致は同定されなかった。
2009504192.tif 000144
。
【０２０８】
以下は、ヒトゲノムDNA中の非rDNA配列と同一であるrDNAヌクレオチド配列の例である。DNA配列はすべてrDNAコード鎖中のものであり、ヌクレオチド範囲は43 kbヒトリボソームDNA反復単位(アクセッション番号U13369)上の位置を指す。
2009504192.tif 000145
。
【０２０９】
以下のrRNA四重鎖モチーフ配列が同定された。RNA配列はrDNA配列から推測され、注釈づけはアクセッション番号U13369内に見出される。rRNAおよびrRNA前駆体を生成するために転写されるDNA配列に関して、ヒトゲノムのコード鎖(CDS)に沿って、遺伝子内に(Curwen et al. The Ensemble Automatic Gene Annotation System, Genome Res. 2004 May; 14(5):942-950によって同定される)一致は同定されなかった。
rDNA中の5'外部転写スペーサー領域由来のRNA配列
2009504192.tif 000146
；
rDNA中の内部転写スペーサー1領域由来のRNA配列
2009504192.tif 000147
；
rDNA中の内部転写スペーサー2領域由来のRNA配列
2009504192.tif 000148
；
28S rRNA内のRNA配列
2009504192.tif 000149
；
rDNA中の3'外部転写スペーサー領域由来のRNA配列
2009504192.tif 000150
。
【０２１０】
以下はrDNAの転写領域中のCリッチrRNAおよびrRNA前駆体配列であり、特定の態様において四重鎖を形成し得る。
rDNA中の5'外部転写スペーサー領域由来のRNA配列
2009504192.tif 000151
rDNA中の内部転写スペーサー2領域由来のRNA配列
2009504192.tif 000152
28S rRNA内のRNA配列
2009504192.tif 000153
rDNA中の3'外部転写スペーサー領域由来のRNA配列
2009504192.tif 000154
。
【０２１１】
以下は、非rDNAから転写されるRNA、およびそれらが転写されるまたは位置するrDNA領域の記載と完全に一致するrRNA配列である。
rDNA中の内部転写スペーサー1領域由来のRNA配列
2009504192.tif 000155
；
rDNA中の3'外部転写スペーサー領域由来のRNA配列
2009504192.tif 000156
。
【０２１２】
実施例2
ヒトrRNA相互作用スクリーニングアッセイ
HCT116細胞からRNAを単離し(RNeasyキット、QIAGEN)、化合物ライブラリー由来の各化合物とインビトロで接触させた。代表的なアッセイでは、10 uL量中、HCT116細胞由来の全RNA 1 ugを0.5 ug/mLヨウ化プロピジウム(PI)、10 uM化合物A-1、またはライブラリー中の別の化合物と共に室温で15分間インキュベートし、その後アガロースゲル電気泳動した。各ゲル上で、化合物の蛍光を可視化した。PIは18S rRNAおよび28S rRNAに対する結合において識別をしないが、A-1は28S rRNAに優先的に結合することが判明した。化合物A-1、化合物C-1、および化合物C-2は、電気泳動移動度シフトアッセイにおいて、18Sに勝る28Sへの選択的結合を示した。化合物C-3およびC-4は、化合物A-1、化合物C-1、および化合物C-2と比較して、18Sに勝る28Sへのより低い選択性を示した。化合物C-5は、電気泳動移動度シフトアッセイにおいて、18Sに勝る28Sへの特異的結合を示した。化合物C-1、C-2、C-3、C-4、およびC-5は、以下の一般式を有する：
2009504192.tif 000157
2009504192.tif 000158
。
【０２１３】
確認試験において、28S rRNAに結合した化合物を、アクチノマイシンD、Se2SAP(2004年6月10日に公開されたUS20040110820の図3A)、および二本鎖DNA(dsDNA)とのrRNA結合に対する競合に供した。そのようなアッセイでは、10 uL量中、HCT116細胞由来の全RNA 1 ugを10 uM化合物A-1と共に、(a) 漸増量のアクチノマイシンD(10、100、および200 uM)の非存在/存在下において室温で15分間、(b) 漸増量のSe2SAP(図を参照のこと)の非存在/存在下において室温で30分間、または(c) 漸増量のpUC18(0.25、0.5、1、2、および4 ug)の非存在/存在下において室温で30分間インキュベートし、その後アガロースゲル電気泳動した。28S rRNAおよび18S rRNAに対応するバンドの蛍光強度によると、(a) アクチノマイシンDはrRNAに対して化合物A-1と競合できず、(b) Se2SAPは28S rRNAに対して化合物A-1と競合し、18S rRNAに対してはより低度に競合し、(c) dsDNAは化合物A-1に対して28S rRNAと競合した。
【０２１４】
実施例3
細胞におけるリボソーム核酸相互作用分子の局在性
細胞局在アッセイを用いて、rRNAと相互作用する化合物の細胞局在性を決定した。これらの試験では、A549細胞をホウケイ酸チャンバースライドにプレーティングした。翌日、細胞を2 uM化合物A-1で1時間または2時間処理し、PBSで洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで10分間固定し、蛍光顕微鏡(Olympus)下で倍率600×にてEx360 nm/Em 548 nmチャネルで観察した。蛍光強度から判断して、化合物A-1は核小体および細胞質/核周囲空間に蓄積した。したがって、アッセイで試験した化合物は、細胞核小体に局在した。
【０２１５】
実施例4
リボソーム核酸相互作用分子の細胞標的
rRNA相互作用化合物の細胞標的を決定するため、化合物が細胞DNAを選択し得るかまたは細胞RNAを選択し得るかを確認するための実験を行った。これらの試験では、A549細胞をホウケイ酸チャンバースライドにプレーティングした。翌日、細胞を2 uM化合物A-1で1時間または2時間処理し、PBSで洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで10分間固定し、1:1エタノール:アセトン混合液で5分間透過処理し、2.5 ug/mL RNアーゼAまたは340 Kunitz単位/mL DNアーゼIで処理し、蛍光顕微鏡(Olympus)下で倍率600×にてEx360 nm/Em 548 nmチャネルで観察した。DNアーゼIによる処理は化合物A-1の局在性に最小の効果を及ぼしたが、RNアーゼIは薬物による核小体染色を有意に減少させた。したがって、アッセイで試験した化合物は、細胞においてDNAよりもRNAと優先的に相互作用した。
【０２１６】
実施例5
細胞ヌクレオリン局在性に及ぼすリボソーム核酸相互作用分子の効果
細胞のヌクレオリンの位置にリボソーム核酸相互作用化合物が及ぼす効果を決定するため、アッセイを行った。これらの試験では、A549細胞をホウケイ酸チャンバースライドにプレーティングした。翌日、細胞を10 uM化合物A-1で2時間処理し、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで10分間固定し、1:1エタノール:アセトン混合液で5分間透過処理し、5%ロバ血清中の1:100希釈の抗ヌクレオリンモノクローナル抗体(カタログ番号RDI-NUCLEOLabm；Research Diagnostics, Inc.)と共にインキュベートし、その後1:100希釈したTRITC標識二次抗マウス抗体と共にインキュベートし、蛍光顕微鏡(例えば、Olympus)下で倍率600×にてTRITCチャネルで観察した。未処理の細胞では、ヌクレオリンは核小体に局在したが、化合物A-1で処理した細胞では、ヌクレオリンは核質に再分布していた。したがって、アッセイで試験した化合物で処理した細胞において、ヌクレオリンは核小体から核質に再分布した。
【０２１７】
細胞のフィブリラリンの位置に及ぼすリボソーム核酸相互作用化合物の効果を決定するため、別のアッセイを行った。これらの試験は、フィブリラリンに特異的に結合する抗体(カタログ番号ab5821；Novus Biologicals, Inc.)を使用した以外は、前の段落に記載した手順と同様の手順を用いて行った。ヌクレオリンの再分布と同様の時間枠内で、化合物A-1がフィブリラリンの再分布を引き起こしたことが判明した。
【０２１８】
実施例6
リボソーム核酸の四重鎖構造
円二色性(CD)を用いて、リボソーム核酸由来のサブ配列が四重鎖構造を形成するかどうかを決定した。配列はすべて、HPLC精製したDNAオリゴヌクレオチド(以下に表す5'〜3'配列)であった。図3Aおよび3B中の各試料の名称は、rDNA単位に沿ってのおよその位置および特定の鎖(NC＝非コード；C＝コード)を特定する。以下の手順を使用した：各オリゴヌクレオチドを5 uMの鎖濃度で、Tris pH 7.4(10 mM)を含む水性緩衝液200 ulに溶解した。試料を95℃で5分間加熱し、次いで周囲温度まで冷却した。1 mm光路長の石英セルを用いて、JASCO 810分光偏光計でCDスペクトル測定を行った。20 ul KCl (1 M)をオリゴヌクレオチド溶液に添加した後に、さらなるスペクトルをとった。化合物A-1は、競合アッセイにおいて混合平行型四重鎖構造と優先的に相互作用することが示されている(例えば、「Competition Assay for Identifying Modulators of Quadruplex Nucleic Acids」という表題の、2004年10月7日に出願されたPCT/US2004/033401)。
【０２１９】
ヒトリボソームDNAに由来する配列を有する核酸、鋳型(T)および非鋳型(NT)鎖の四重鎖構造を同様の方法で試験し、そのスペクトルを図3および以下の表に要約する。核酸識別子は、(i) ヌクレオチド配列がヒトrDNAの非鋳型(NT)鎖(例えば、SEQ ID NO:1)に由来するのかまたは鋳型(T)鎖(例えば、SEQ ID NO:1の逆相補体)に由来するのか、および(ii) NT鎖中の配列の位置、またはrDNAのT鎖に関しては逆相補体配列の由来元のSEQ ID NO:1における位置を意味する。NT鎖由来のヌクレオチド配列に関しては、識別子中の数字はオリゴヌクレオチドの5'ヌクレオチドを表し、SEQ ID NO:1における1ヌクレオチド少ない位置である(例えば、オリゴヌクレオチド13079NTのヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1の13080位から始まるSEQ ID NO:1中の16ヌクレオチドにまたがる)。T鎖由来のヌクレオチド配列に関しては、識別子中の数字は、SEQ ID NO:1における1ヌクレオチド少ない位置に由来する逆相補体オリゴヌクレオチドの3'ヌクレオチドを規定する(例えば、10110Tのヌクレオチド配列はSEQ ID NO:1にまたがる17ヌクレオチドの逆相補体であり、オリゴヌクレオチドの3'末端はSEQ ID NO:1の10111位に規定される)。平行型、混合平行型、逆平行型(混合平行型の特徴を伴う)、および複合型細胞内四重鎖構造のスペクトル特性が認められた。四重鎖高次構造の決定を以下の表に要約する。
2009504192.tif 000159
【０２２０】
実施例7
ヌクレオリン/核酸相互作用に及ぼすリボソーム核酸相互作用分子の効果
以下のアッセイでは、ヌクレオリンと、四重鎖(QP)およびヘアピン(HP)二次構造を形成し得る核酸リガンドとの相互作用に及ぼす化合物の効果を評価した。試験した核酸リガンドは、ヌクレオチド配列
2009504192.tif 000160
を有するcMyc QP DNA、および配列
2009504192.tif 000161
を有する、ヌクレオリンが結合するHPrRNA前駆体領域であった。アッセイでは、マルトース結合タンパク質に融合され、N末端酸性ストレッチドメインを欠くアクセッション番号NM_005381における配列を有する組換えヌクレオリン(〜250 nM)を、2種類の32P標識核酸リガンド(10または250 nM)のそれぞれと共にインキュベートした。ヌクレオリンおよび核酸リガンドは、インキュベーション緩衝液(12.5 mM Tris、pH 7.6、60 mM KCl、1 mM MgCl2、0.1 mM EDTA、1 mM DTT、5%グリセロール、0.1 mg/ml BSA)中、式A-1、B-1、C-6、またはC-7の試験化合物の存在下または非存在下で室温で30分間インキュベートした。A-1およびB-1の構造は上記に示してあり、C-6およびC-7の構造を以下に示す：
2009504192.tif 000162
。
得られた複合体を、泳動緩衝液として20 mM KClを含む0.5× TBEを用いて、6% DNA遅延ゲルで分離した(すなわち、電気泳動易動度シフトアッセイ(EMSA))。図1は、式A-1、C-6、およびC-7の化合物がヌクレオリン/QPリガンド相互作用を妨げたが、ヌクレオリン/HPリガンド相互作用は妨げなかったことを示す。図2は、化合物A-1およびB-1が、濃度依存的様式でヌクレオリン/QPリガンド相互作用を妨げたが、ヌクレオリン/HP相互作用は有意に妨げなかったことを示す。
【０２２１】
アッセイはまた、ヒトリボソームDNAに由来する核酸リガンドを用いて行った。これらの核酸の配列は、前実施例に示してある。これらのアッセイから、化合物A-1がヌクレオリン/核酸リガンド相互作用を妨げたが、アクチノマイシンDはこれを妨げなかったことが判明した。すぐ下の表は、ヌクレオリンに対する相対的親和性、およびヌクレオリン/核酸リガンド相互作用の妨害における化合物A-1の相対活性を各核酸リガンドについて示す。「+」は最も弱いヌクレオリン親和性および化合物A-1による最も低い妨害を表し、「++++」は最も強いヌクレオリン親和性および化合物A-1による最も高い妨害を表す。表はまた、上記の通り円二色性により決定された、核酸リガンドによって形成される分子内四重鎖構造の高次構造を示す。RND27は、四重鎖構造を形成しないランダム配列を有する一本鎖核酸である。
2009504192.tif 000163
【０２２２】
アッセイはまた、フィルター結合形式で行った。そのようなアッセイ形態では、0.2 nM 32P標識四重鎖を結合緩衝液(12.5 mM Tris-HCl、pH 7.6、60 mM KCl、1 mM MgCl2、0.1 mM EDTA、5%グリセロール、0.1 mg/mL BSA) 50 uL中で85℃で10分間インキュベートし、次いで氷上に10分間置き、漸増量の組換えタンパク質ヌクレオリンを含む結合緩衝液さらに50 uLと混合した。タンパク質-四重鎖混合物を周囲温度で30分間インキュベートし、穏やかに吸引しながら混合セルロースエステル膜フィルター(Millipore)を通して濾過した。フィルターを結合緩衝液300 mLで2回洗浄し、乾燥させ、OptiPhase「SuperMix」シンチレーションカクテル(Perkin Elmer)をウェルに添加した。MicroBetaシンチレーションカウンター(Perkin Elmer)で放射能をアッセイした。結合曲線を作成し、GraphPad Prizmソフトウェアプログラム(GraphPad Software)を用いて複合体の見かけのKdおよびBmaxを算出した。以下の表において、第1列に、本明細書に記載の命名法を用いて核酸リガンドを指定し；第2列は、核酸リガンドのヌクレオチド配列を提供し；第3列は、円二色性により決定されたリガンドの高次構造であり(Mは混合型、Pは平行型、Aは逆平行型、Cは複合型、SSは一本鎖、およびNDは未決定である)；第4列は、フィルター結合アッセイによって決定されたヌクレオリンタンパク質と核酸リガンドの解離定数であり；第5列は、フィルター結合アッセイによって決定されたBmax定数であって、各アッセイにおける活性核酸リガンドの割合であり；第6列は、上記のEMSAアッセイによって決定された、複合化核酸リガンドおよびヌクレオリンタンパク質の半分を解離するのに必要な化合物A-1の濃度を表す。
2009504192.tif 000164
【０２２３】
実施例8
細胞周期進行および細胞アポトーシスに及ぼす化合物の影響
本明細書に記載の化合物が細胞周期進行に影響を及ぼすかどうか、および細胞アポトーシスを誘導し得るかどうかを決定するために、アッセイを行った。細胞周期進行への影響を決定するためのアッセイでは、細胞を回収し、単一細胞懸濁液を緩衝液(例えば、PBS＋2% FBS；PBS＋0.1% BSA)で調製した。細胞を2回洗浄し、1〜2 × 106個細胞/mlで再懸濁した。細胞1 mlを15 mlプロピレンV底チューブに分注し、冷無水エタノール3 mlを添加した。細胞を4℃で少なくとも1時間固定した。固定した細胞をPBSで2回洗浄し、ヨウ化プロピジウム染色溶液(PBS中の3.8 mMクエン酸ナトリウム、50 ug/mlヨウ化プロピジウム) 1 mlを各細胞ペレットに添加し、十分に混合した。RNアーゼA保存溶液(5分間煮沸し、分注し、-20℃で保存した10 ug/ml RNアーゼA) 50 μlを添加し、得られた混合物を4℃で3時間インキュベートした。試料は、フローサイトメトリーで解析するまで4℃で保存した。
【０２２４】
アポトーシスは、フローサイトメトリー蛍光活性化細胞選別(FACS)アッセイにおいてアネキシンV結合により評価した。そのようなアッセイでは、細胞を回収し、PBS(4℃)で2回洗浄し、結合緩衝液(10×溶液は0.1 M HEPES/NaOH、pH 7.4；140 mM NaCl；25 mM CaCl2を含む；PharMingen 66121A)で1×106個細胞/mlの濃度で再懸濁した。細胞を、アネキシンVおよび/または生存率色素を含むFACSチューブ中に分注した(100 ul)。チューブの内容物を穏やかに混合し、暗下にて室温で15分間インキュベートした。結合緩衝液(400 ul)を各チューブに添加し、フローサイトメトリーにより直ちに解析した。
【０２２５】
アネキシンVは、ビオチン、FITC(アネキシン-V-FITC；Pharmingen、65874X)、およびPE(アネキシン-PE；Pharmingen、65875X)形式で入手可能である。アネキシン-V-FITCを使用する場合には、ヨウ化プロピジウム(PI；Sigma、P 4170)を生存率マーカーとして使用した(50 ug/ml保存溶液の5 ul)。アネキシン-V-PEを使用する場合には、7-アミノアクチノマイシンD(7-ADD；Sigma、A9400)が好ましい生存率マーカーであったが(1 ug/ml最終濃度)、それはPEとPIよりもPEと7-ADDの方がスペクトルの重複が少ないためである。7-AADはPIほど明るくなく、FITC、PE、およびPIを効果的に組み合わせることもできる。チューブは、いくつかのアッセイにおいて(i) 細胞のみ、(ii) 細胞＋アネキシン、(iii) 細胞＋PI(または7-ADD)、または(iv) 細胞＋アネキシン＋PI(または7-ADD)を含んだ。
【０２２６】
これらのアッセイにおいて、化合物A-1は細胞周期にほとんど影響を及ぼすことなくアポトーシスを誘導した。化合物A-1は様々な時間、様々な濃度で添加したが、細胞周期特性に影響しなかった。DNAラダー化および細胞外ホスファチジルセリン(アネキシン染色により検出される)が誘導されたことから、化合物A-1によって誘導された細胞死は古典的なアポトーシス特性と一致した。
【０２２７】
アッセイにおける化合物B-1は、細胞周期進行の効率的な停止後にアポトーシスを誘導した。HCT-116結腸癌細胞(p53+)は、細胞周期のG1期およびG2期で停止した。MiaPaCa膵臓細胞およびDAOY髄芽腫細胞(p53-)は主にS期で停止し、一部はG2停止した。
【０２２８】
実施例9
四重鎖形成および高次構造を決定する方法
公知のアッセイを用いて、核酸が四重鎖構造をとるかどうかを決定することができる。これらのアッセイには、移動度シフトアッセイ、DMSメチル化保護アッセイ、ポリメラーゼ停止アッセイ、転写レポーターアッセイ、円二色性アッセイ、および蛍光アッセイが含まれる。
【０２２９】
ゲル電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)
EMSAは、核酸が四重鎖を形成するかどうか、およびヌクレオチド配列が四重鎖に変化をきたすかどうかを決定するために有用である。EMSAは、わずかに変更を加えて以前に記載されている通りに行う(Jin & Pike, Mol. Endocrinol. 10: 196-205 (1996))。合成一本鎖オリゴヌクレオチドの5'末端を、[α-32P] ATP(1,000 mCi/mmol、Amersham Life Science)の存在下でT4-キナーゼによって標識し、セファデックスカラムを通して精製する。次いで、10 mM Tris pH7.5、100 mM KCl、5 mMジチオスレイトール、0.1 mM EDTA、5 mM MgCl2、10%グリセロール、0.05% Nonedit P-40、および0.1 mg/mlのポリ(dI-dC)(Pharmacia)を含む緩衝液20μl中、32P標識オリゴヌクレオチド(〜30,000 cpm)を様々な濃度の試験化合物と共にまたは化合物なしでインキュベートする。室温で20分間インキュベートした後、0.25 × Trisホウ酸-EDTA緩衝液(0.25 × TBE、1 × TBEは89 mM Tris-ホウ酸、pH 8.0、1 mM EDTAである)中の5%ポリアクリルアミドゲルに結合反応物を添加する。ゲルを乾燥させ、ホスホイメージャーを用いて各バンドを定量化する。
【０２３０】
DMSメチル化保護アッセイ
化学的フットプリントアッセイは四重鎖構造の評価に有用である。四重鎖構造は、核酸中のどのヌクレオチドが、それぞれ変性試薬に到達不能または到達可能であることの結果として、化学修飾から保護されるかまたは保護されいないかを決定することによって評価される。DMSメチル化アッセイは、化学的フットプリントアッセイの一例である。そのようなアッセイでは、EMSA由来のバンドを単離し、DMS誘導性の鎖切断に供する。関心対象のバンドをそれぞれ電気泳動移動度シフトゲルから切り出し、100 mM KCl溶液(300μl)中に4℃で6時間浸漬する。溶液を濾過し(微量遠心機)、30,000 cpm(反応当たり)のDNA溶液を0.1× TE中の100 mM KClでさらに希釈して、全量を70μl(反応当たり)にする。サケ精子DNA(0.1μg/μl) 1μlを添加した後、反応混合物をDMS溶液(DMS:エタノール；4:1；v:v) 1μlと共に一定時間インキュベートする。停止緩衝液(b-メルカプトエタノール:水:NaOAc (3M)；1:6:7；v:v:v) 18μlにより、各反応を停止させる。エタノール沈殿(2回)およびピペリジン切断の後、反応物を分取ゲル(16%)で分離し、ホスホイメージャーで可視化する。
【０２３１】
ポリメラーゼ停止アッセイ
Taqポリメラーゼ停止アッセイの一例はHan et al., Nucl. Acids Res. 27: 537-542 (1999)に記載されているが、これはWeitzmann et al., J. Biol. Chem. 271, 20958-20964 (1996)によって用いられたアッセイの変法である。簡潔に説明すると、鋳型DNA(50 nM)、Tris HCl(50 mM)、MgCl2(10 mM)、DTT(0.5 mM)、EDTA(0.1 mM)、BSA(60 ng)、および5'末端標識四重鎖核酸(〜18 nM)の反応混合物を90℃で5分間加熱し、30分かけて周囲温度まで冷却する。Taqポリメラーゼ(1μl)を反応混合物に添加し、反応物を一定温度で30分間維持する。停止緩衝液(ホルムアミド(20 ml)、1 M NaOH(200μl)、0.5 M EDTA(400μl)、および10 mgブロモフェノールブルー) 10μlを添加した後、反応物を分取ゲル(12%)で分離し、ホスホイメージャーで可視化する。アデニン配列決定(ゲルの上部に「A」で表示)は、Life Technologiesによるの二本鎖DNA Cycle Sequencing Systemを用いて実施する。鋳型鎖の一般的配列は、
2009504192.tif 000165
である。遅い移動度を示すゲル上のバンドは四重鎖形成を示す。
【０２３２】
転写レポーターアッセイ
He, et al., Science 281: 1509-1512 (1998)に記載されているルシフェラーゼプロモーターアッセイは、四重鎖形成の研究に用いられる場合が多い。具体的には、このアッセイで用いられるベクターは、Heらの文献の参考文献11に記載されている。このアッセイでは、製造業者の手順に従ってリポフェクタミン2000に基づく系(Invitrogen)を使用し、pRL-TK(ウミシイタケルシフェラーゼレポータープラスミド) 0.1μgおよび四重鎖形成プラスミド0.9μgを用いてHeLa細胞にトランスフェクションする。製造業者の手順に従って、96ウェルプレート形式でDual Luciferase Reporter Assay System(Promega)を用いて、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ活性をアッセイする。
【０２３３】
円二色性アッセイ
別の分子が四重鎖核酸と相互作用するかどうかを決定するために、円二色性(CD)を使用する。CDは、PNAまたはPNA-ペプチド複合体がインビトロで四重鎖核酸とハイブリダイズするかどうかを決定するのに特に有用である。10 mMリン酸カリウム(pH7.2)および10または250 mM KClを含む37℃の緩衝液中の四重鎖DNA(それぞれ5μM)にPNAプローブを添加し、同一温度で5分間置いた後、スペクトルを記録する。CDスペクトルは、熱電制御単一セルホルダーを備えたJasco J-715分光偏光計で記録する。CD強度は通常220 nm〜320 nmで検出し、相互作用の有無を決定するために、四重鎖DNAのみ、PNAのみ、および四重鎖DNAとPNAの比較スペクトルを作成する(例えば、Datta, et al., JACS 123:9612-9619 (2001)を参照されたい)。スペクトルは、100 nm/分で記録された8回のスキャンの平均を表すようにまとめる。
【０２３４】
蛍光結合アッセイ
四重鎖核酸または四重鎖を形成し得ない核酸50μlを96ウェルプレートに添加する。試験分子または四重鎖標的核酸もまた、様々な濃度で添加する。典型的なアッセイは、100μlの20 mM HEPES緩衝液、pH7.0、140 mM NaCl、および100 mM KCl中で行う。次いで、シグナル分子N-メチルメソポルフィリンIX(NMM) 50μlを最終濃度3μMで添加する。NMMは、Frontier Scientific Inc、ユタ州、ローガンから入手できる。FluroStar 2000蛍光光度計(BMG Labtechnologies、ノースカロライナ州、ダラム)を使用して、蛍光を励起波長420 nmおよび発光波長660 nmで測定する。蛍光は多くの場合、試験分子または四重鎖標的核酸の濃度の関数としてプロットし、NMMの最大蛍光シグナルは、これらの分子の非存在下で評価される。
【０２３５】
実施例10
rRNA合成の阻害
DNA合成、RNA合成、およびタンパク質合成に及ぼす化合物A-1および化合物B-1の影響を、HCT116細胞で決定した。HCT116細胞を100,000個細胞/mLでプレーティングし、一晩置いた。翌日、細胞を漸増量の化合物A-1または化合物B-1で処理し、その後BrdU標識(BrdU細胞増殖アッセイキット、Calbiochemによる)と共に1時間インキュベートして、DNA合成をモニターした；5 mCiの3H-ウリジンと共に1時間インキュベートして、全RNA合成をモニターした；5 mCiの3H-メチオニンと共に1時間インキュベートして、タンパク質合成をモニターした、または単純培地と共に1時間インキュベートして、RNAポリメラーゼII依存的RNA合成をモニターした。DNA合成は、BrdU-ELISA(BrdU細胞増殖アッセイキット、Calbiochem)を用いて評価した。全RNA合成を測定するため、処理細胞由来の全RNAをRNeasyキット(QIAGEN)を用いて単離し、全RNAのレベルをRibogreen試薬(Invitrogen)で評価し、新たに合成されたトリチウム化RNAをシンチレーションカウンター(Perkin Elmer)で測定した。タンパク質合成に及ぼす影響を測定するため、細胞をRIPA緩衝液中で溶解し、全タンパク質を10% TCAを用いてガラスフィルター上に沈殿させた。新たに合成されたトリチウム化タンパク質を、シンチレーションカウンター(Perkin Elmer)で測定した。Pol II依存的RNA合成に及ぼす薬物の影響は、Taqman qRT-pCR(ABI)により、約30分という比較的短い半減期を有するc-myc mRNAのレベルをモニターすることにより評価した。
【０２３６】
化合物A-1は、試験した濃度において、タンパク質合成およびc-myc mRNAレベルに測定可能な影響を及ぼさなかった。この化合物は、1 mM濃度において核小体RNA合成を有意に減少させた。細胞の多くが死滅した濃度である10 mM濃度において、化合物A-1はDNA合成を有意に減少させた。化合物B-1は、試験した濃度において、タンパク質合成およびc-myc mRNAレベルに測定可能な影響を及ぼさなかった。化合物B-1は、10 mMにおいて核小体RNA合成を、および30 mMにおいてDNA合成を有意に減少させた。
【０２３７】
経時的試験において、3 mM化合物A-1による15分間、および10 mM化合物B-1による30分間の細胞の処理により、3H-ウリジンの取り込みが実質的に阻害された。したがって、試験した化合物は核小体RNA合成を阻害した。
【０２３８】
実施例11
プロテインキナーゼの阻害
特定の化合物を、プロテインキナーゼ阻害アッセイにおいて活性に関して試験した。ヒストンH1(20 mM MOPS pH 7.0中での10×作業保存液)、PDKtide(50 mM Tris pH 7.0中での10×作業保存液)、ATF2(典型的に、50 mM Tris pH 7.5、150 mM NaCl、0.1 mM EDTA、0.03% Brij-35、50%グリセロール、1 mMベンズアミジン、0.2 mM PMSF、および0.1% R-メルカプトエタノール中の20×作業保存液で保存)、KKLNRTLSFAEPG(SEQ ID NO：203)およびRRRLSFAEPG(SEQ ID NO：204)(50 mM HEPES pH 7.4)、ならびにGGEEEEYFELVKKKK(SEQ ID NO：205)(20 mM MOPS pH 7.0)は別として、基質はすべて脱イオン水に溶解し、作業保存液となるよう希釈した。キナーゼはすべて10×作業濃度となるように前希釈してから、アッセイに添加した。各キナーゼの希釈緩衝液の組成を以下に記載する。
1. Blk、c-RAF、CSK、IGF-1R、IR、Lyn、MAPK1、MAPK2、MKK4、MKK6、MKK70、SAPK2a、SAPK2b、SAPK3、SAPK4、Syk、ZAP-70：50 mM Tris pH 7.5、0.1 mM EGTA、0.1 mM Na3VO4、0.1% β-メルカプトエタノール、l mg/ml BSA。
2. JNK1a1、JNK2a2、JNK3、PRK2、ROCK-II：50 mM Tris pH 7.5、0.1 mM EGTA、0.1% β-メルカプトエタノール、1 mg/ml BSA。
3. PDK1：50 mM Tris pH 7.5、0.05% β-メルカプトエタノール、1 mg/ml BSA。
4. MEK-1：25 mM Tris pH 7.5、0.1 mM EGTA、0.1% β-メルカプトエタノール、1 mg/ml BSA。
5. Abl、Abl(T315I)、ALK、ALK4、Arg、Ask1、Aurora-A、Ax1、Bmx、BRK、BTK、CDKl/サイクリンB、CDK2/サイクリンA、CDK2/サイクリンE、CDK3/サイクリンE、CDK5/p25、CDK5/p35、CDK6/サイクリンD3、CDK7/サイクリンH/MAT1、CHK1、CHK2、CKl、CKIS、cKit、cKit (D816V)、cSRC、DDR2、EGFR、EGFR (L858R)、EGFR (L861Q)、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphB2、EphB3、EphB4、ErbB4、Fer、Fes、FGFRl、FGFR2、FGFR3、FGFR4、Fgr、Flt1、Flt3、Flt3 (D835Y)、Fms、Fyn、GSK3a、GSK30、Hck、HIPK2、IKKa、IKKO、IRAK4、IRR、JAK2、JAK3、KDR、Lck、MAPKAP-K2、MAPKAP-K3、Met、MINK、MLCK、MRCKP、MSKl、MSK2、MSTl、MST2、MuSK、NEK2、NEK6、Nek7、p70S6K、PAK2、PAK4、PAK6、PAR-1Ba、PDGFRa、PDGFRO、Pim-1、PKA、PKBa、PKBP、PKBy、PKC6、PKCQ、PKGlO、Plk3、Pyk2、Ret、RIPK2、Rse、ROCK-I、Ron、Ros、Rskl、Rsk2、Rsk3、SGK、SGK2、SGK3、Snk、TAKl、TBKl、Tie2、TrkA、TrkB、TSSK2、Yes、ZIPK：20 mM MOPS pH 7.0、1 mM EDTA、0.1% β-メルカプトエタノール、0.01% Brij-35、5%グリセロール、1 mg/ml BSA。
6. CK2：20 mM HEPES pH 7.6、0.15 M NaCl、0.1 mM EGTA、5 mM DTT、0.1% Triton X-100、50%グリセロール。
7. CaMKII、CaMKTV：40 mM HEPES pH 7.4、1 mg/ml BSA。
8. PKCa、PKCRI、PKCRII、PKCy、PKCS、PKC6、PKCYI、PKCL、PKCμ、PKD2：20 mM HEPES pH 7.4、0.03% Triton X-100。
9. PRAK：β-メルカプトエタノール、0.1 mM EGTA、1 mg/ml BSA。
10 AMPK：50 mM Na R-グリセロリン酸 pH 7.0、0.1%。
【０２３９】
プロテインキナーゼアッセイは以下の通りに行った。
【０２４０】
Abl (h)
最終反応量25μlで、Abl (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、50μM EAIYAAPFAKKK(SEQ ID NO：206)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２４１】
Abl (T315I) (h)
最終反応量25μlで、Abl (T315I) (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、50μM EAIYAAPFAKKK(SEQ ID NO：206)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２４２】
Abl (m)
最終反応量25μlで、Abl (m)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、50μM EAIYAAPFAKKK(SEQ ID NO：206)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２４３】
ALK (h)
最終反応量25μlで、ALK (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、250μM KKKSPGEYVNIEFG(SEQ ID NO：207)、10 mM酢酸Mg、および[y-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２４４】
ALK4 (h)
最終反応量25μlで、ALK4 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、2 mg/mlカゼイン、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２４５】
AMPK (r)
最終反応量25μlで、AMPK (r)(5〜10 mU)を32 mM HEPES pH 7.4、0.65 mM DTT、0.012% Brij-35、200μM AMP、200μM AMARAASAAALARRR(SEQ ID NO：208)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２４６】
Arg (h)
最終反応量25μlで、Arg (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、50μM EAIYAAPFAKKK(SEQ ID NO：206)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２４７】
Arg (m)
最終反応量25μlで、Arg (m)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、50μM EAIYAAPFAKKK(SEQ ID NO：206)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２４８】
ASK1 (h)
最終反応量25μlで、ASK1 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.33 mgミエリン塩基性タンパク質、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２４９】
Aurora-A (h)
最終反応量25μlで、Aurora-A (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、200μM LRRASLG(SEQ ID NO：209)(Kemptide)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、50 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２５０】
Axl (h)
最終反応量25μlで、Axl (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、250μM KKSRGDYMTMQIG(SEQ ID NO：210)、10 mM酢酸Mg、および[y-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２５１】
Blk (m)
最終反応量25μlで、Blk (m)(5〜10 mU)を50 mM Tris pH 7.5、0.1 mM EGTA、0.1 mM Na3VO4、0.1% R-メルカプトエタノール、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２５２】
Bmx (h)
最終反応量25μlで、Bmx (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２５３】
BRK (h)
最終反応量25μlで、BRK (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、5 mM MnCl2、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットAにスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２５４】
BTK (h)
最終反応量25μlで、BTK (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、250μM KVEKIGEGTYGVVYK(SEQ ID NO：211)(Cdc2ペプチド)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２５５】
CaMKII (r)
最終反応量25μlで、CAMKII (r)(5〜10 mU)を40 mM HEPES pH 7.4、5 mM CaCl2、30μg/mlカルモジュリン、30μM KKLNRTLSVA(SEQ ID NO：212)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２５６】
CaMKIV (h)
最終反応量25μlで、CaMKIV (h)(5〜10 mU)を40 mM HEPES pH 7.4、5 mM CaCl2、30μg/mlカルモジュリン、30μM KKLNRTLSVA(SEQ ID NO：212)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２５７】
CDK1/サイクリンB (h)
最終反応量25μlで、CDK1/サイクリンB (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.1 mg/mlヒストンH1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２５８】
CDK2/サイクリンA (h)
最終反応量25μlで、CDK2/サイクリンA (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.1 mg/mlヒストンH1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２５９】
CDK2/サイクリンE (h)
最終反応量25μlで、CDK2/サイクリンE (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.1 mg/mlヒストンH1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２６０】
CDK3/サイクリンE (h)
最終反応量25μlで、CDK3/サイクリンE (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.1 mg/mlヒストンH1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２６１】
CDK5/p25 (h)
最終反応量25μlで、CDK5/p25 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.1 mg/mlヒストンH1、10 mM酢酸Mg、および[y-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２６２】
CDK5/p35 (h)
最終反応量25μlで、CDK5/p35 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.1 mg/mlヒストンH1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２６３】
CDK6/サイクリンD3 (h)
最終反応量25μlで、CDK6/サイクリンD3 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.1 mg/mlヒストンH1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２６４】
CDK7/サイクリンH/MAT1 (h)
最終反応量25μlで、CDK7/サイクリンH/MAT1 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、500μMペプチド、10 mM酢酸Mg、および[y-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２６５】
CHK1 (h)
最終反応量25μlで、CHK1 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、200μM KKKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR(SEQ ID NO：213)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２６６】
CHK2 (h)
最終反応量25μlで、CHK2 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、200μM KKKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR(SEQ ID NO：213)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２６７】
CK1 (y)
最終反応量25μlで、CK1 (y)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、200μM KRRRALS(p)VASLPGL(SEQ ID NO：214)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２６８】
CK1S (h)
最終反応量25μlで、CK1S (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、200μM KRRRALS(p)VASLPGL(SEQ ID NO：214)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２６９】
CK2 (h)
最終反応量25μlで、CK2 (h)(5〜10 mU)20 mM HEPES pH 7.6、0.15 M NaCl、0.1 mM EDTA、5 mM DTT、0.1% Triton X-100、165μM RRRDDDSDDD(SEQ ID NO：215)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２７０】
cKit (h)
最終反応量25μlで、cKit (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、10 mM MnCl2、0.1 mg/mlポリ(Glu，Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２７１】
cKit (D816V) (h)
最終反応量25μlで、cKit (D816) (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、10 mM MnCl2、0.1 mg/mlポリ(Glu，Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２７２】
c-RAF (h)
最終反応量25μlで、c-RAF (h)(5〜10 mU)を25 mM Tris pH 7.5、0.02 mM EGTA、0.66 mg/mlミエリン塩基性タンパク質、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２７３】
CSK (h)
最終反応量25μlで、CSK (h)(5〜10 mU)を50 mM Tris pH 7.5、0.1 mM EGTA、0.1 mM Na3VO4、0.1% R-メルカプトエタノール、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM MnCl2、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２７４】
cSRC (h)
最終反応量25μlで、cSRC (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、250μM KVEKIGEGTYGVVYK(SEQ ID NO：211)(Cdc2ペプチド)、10 mM酢酸Mg、および[y-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２７５】
DDR2 (h)
最終反応量25μlで、DDR2 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、250μM KKSRGDYMTMQIG(SEQ ID NO：210)、10 mM MnCl2、10 mM酢酸Mg、および[y-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２７６】
EGFR (h)
最終反応量25μlで、EGFR (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、10 mM MnCl2、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２７７】
EGFR (L858R) (h)
最終反応量25μlで、EGFR (L858R) (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２７８】
EGFR (L861Q) (h)
最終反応量25μlで、EGFR (L861Q) (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２７９】
EphA2 (h)
最終反応量25μlで、EphA2 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２８０】
EphA3 (h)
最終反応量25μlで、EphA3 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２８１】
EphA4 (h)
最終反応量25μlで、EphA4 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、10 mM MnCl2、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[y-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２８２】
EphA5 (h)
最終反応量25μlで、EphA5 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、2.5 mM MnCl2、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２８３】
EphB2 (h)
最終反応量25μlで、EphB2 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、10 mM MnCl2、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２８４】
EphB3 (h)
最終反応量25μlで、EphB3 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、10 mM MnCl2、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２８５】
EphB4 (h)
最終反応量25μlで、EphB4 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、10 mM MnCl2、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２８６】
ErbB4 (h)
最終反応量25μlで、ErbB4 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、2.5 mM MnCl2、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２８７】
Fer (h)
最終反応量25μlで、Fer (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、1 mM MnCl2、250μM KKKSPGEYVNIEFG(SEQ ID NO：207)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２８８】
Fes (h)
最終反応量25μlで、Fes (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[y-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２８９】
FGFR1 (h)
最終反応量25μlで、FGFR (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、250μM KKKSPGEYVNIEFG(SEQ ID NO：207)、10 mM酢酸Mg、および[y-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２９０】
FGFR2 (h)
最終反応量25μlで、FGFR2 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、2.5 mM MnCl2、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２９１】
FGFR3 (h)
最終反応量25μlで、FGFR3 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM MnCl2、10 mM酢酸Mg、および[y-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２９２】
FGFR4 (h)
最終反応量25μlで、FGFR4 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、10 mM MnCl2、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２９３】
Fgr (h)
最終反応量25μlで、Fgr (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２９４】
Flt1 (h)
最終反応量25μlで、Flt1 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、250μM KKKSPGEYVNIEFG(SEQ ID NO：207)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２９５】
Flt3 (h)
最終反応量25μlで、Flt3 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、50μM EAIYAAPFAKKK(SEQ ID NO：206)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２９６】
Flt3 (D835Y) (h)
最終反応量25μlで、Flt3 (D835Y) (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、50μM EAIYAAPFAKKK(SEQ ID NO：206)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２９７】
Fms (h)
最終反応量25μlで、Fms (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、250μM KKKSPGEYVNIEFG(SEQ ID NO：207)、10 mM酢酸Mg、および[y-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２９８】
Fyn (h)
最終反応量25μlで、Fyn (h)(5〜10 mU)を50 mM Tris pH 7.5、0.1 mM EGTA、0.1 mM Na3VO4，250μM KVEKIGEGTYGVVYK(SEQ ID NO：220)(Cdc2ペプチド)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０２９９】
GSK3a (h)
最終反応量25μlで、GSK3a (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、20μM
2009504192.tif 000166
(ホスホGS2ペプチド)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、50 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３００】
GSK3P (h)
最終反応量25μlで、GSK30 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、20μM
2009504192.tif 000167
(ホスホGS2ペプチド)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、50 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３０１】
Hck (h)
最終反応量25μlで、Hck (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、250μM KVEKIGEGTYGVVYK(SEQ ID NO：211)(Cdc2ペプチド)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３０２】
HIPK2 (h)
最終反応量25μlで、HIPK2 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.33 mg/mlミエリン塩基性タンパク質、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３０３】
IGF-1R (h)
最終反応量25μlでIGF-1R (h)(5〜10 mU)を50 mM Tris pH 7.5、0.1 mM EGTA、0.1 mM Na3VO4、0.1% R-メルカプトエタノール、250μM KKKSPGEYVNIEFG(SEQ ID NO：207)、10 mM MnCl2、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３０４】
IKKa (h)
最終反応量25μlで、IKKa (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、200μMペプチド、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３０５】
IKKP (h)
最終反応量25μlで、IKKP (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、100μMペプチド、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３０６】
IR (h)
最終反応量25μlで、IR (h)(5〜10 mU)を50 mM Tris pH 7.5、0.1 mM EGTA、0.1 mM Na3VO4、0.1% R-メルカプトエタノール、250μM KKSRGDYMTMQIG(SEQ ID NO：210)、10 mM MnCl2、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３０７】
IRAK4 (h)
最終反応量25μlで、IRAK4 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.33 mg/mlミエリン塩基性タンパク質、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３０８】
IRR (h)
最終反応量25μlで、IRR (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.33 mg/mlミエリン塩基性タンパク質、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３０９】
JAK2 (h)
最終反応量25μlで、JAK2 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、100μM
2009504192.tif 000168
、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３１０】
JAK3 (h)
最終反応量25μlで、JAK3 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、500μM GGEEEEYFELVKKKK(SEQ ID NO：218)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３１１】
JNK1a1 (h)
最終反応量25μlで、JUNK1a1 (h)(5〜10 mU)を50 mM Tris  pH 7.5、0.1 mM EGTA、0.1% R-メルカプトエタノール、3μM ATF2、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３１２】
JNK2a2 (h)
最終反応量25μlで、JUNK2a2 (h)(5〜10 mU)を50 mM Tris  pH 7.5、0.1 mM EGTA、0.1% R-メルカプトエタノール、3μM ATF2、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３１３】
JNK3 (h)
最終反応量25μlで、JUNK3 (h)(5〜10 mU)を50 mM Tris  pH 7.5、0.1 mM EGTA、0.1% R-メルカプトエタノール、250μMペプチド、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３１４】
KDR (h)
最終反応量25μlで、KDR (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS  pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.33 mg/mlミエリン塩基性タンパク質、10 mM酢酸Mg、および[y-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３１５】
Lck (h)
最終反応量25μlで、Lck (h)(5〜10 mU)を50 mM Tris pH 7.5、0.1 mM EGTA、0.1 mM Na3VO4，250μM KVEKIGEGTYGVVYK(SEQ ID NO：211)(Cdc2ペプチド)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３１６】
Lyn (h)
最終反応量25μlで、Lyn (h)(5〜10 mU)を50 mM Tris pH 7.5、0.1 mM EGTA、0.1 mM Na3VO4，0.1% R-メルカプトエタノール、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4.1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３１７】
Lyn (m)
最終反応量25μlで、Lyn (m)(5〜10 mU)を50 mM Tris pH 7.5、0.1 mM EGTA、0.1 mM Na3VO4，0.1% R-メルカプトエタノール、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4.1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３１８】
MAPK1 (h)
最終反応量25μlで、MAPK1 (h)(5〜10 mU)を25 mM Tris pH 7.5、0.02 mM EGTA、250μMペプチド、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３１９】
MAPK2 (h)
最終反応量25μlで、MAPK2 (h)(5〜10 mU)を25 mM Tris pH 7.5、0.02 mM EGTA、0.33 mg/mlミエリン塩基性タンパク質、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３２０】
P,-MAPK2 (m)
最終反応量25μlで、MAPK2 (m)(5〜10 mU)を25 mM Tris pH 7.5、0.02 mM EGTA、0.33 mg/mlミエリン塩基性タンパク質、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３２１】
MAPKAP-K2 (h)
最終反応量25μlで、MAPKAP-K2 (h)(5〜10 mU)を50 mM Na R-グリセロリン酸 pH 7.5、0.1 mM EGTA、30μM KKLNRTLSVA(SEQ ID NO：212)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３２２】
MAPKAP-K3 (h)
最終反応量25μlで、MAPKAP-K3 (h)(5〜10 mU)を50 mM Na R-グリセロリン酸 pH 7.5、0.1 mM EGTA、30μM KKLNRTLSVA(SEQ ID NO：212)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３２３】
MEK1 (h)
最終反応量25μlで、MEK1 (h)(1〜5 mU)を50 mM Tris pH 7.5、0.2 mM EGTA、0.1% R-メルカプトエタノール、0.01% Brij-35、1μM不活性MAPK2 (m)、10 mM酢酸Mg、および非放射性ATP(必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、このインキュベーション混合物5μlを用いて、この本の12ページに記載されているMAPK2 (m)アッセイを開始する。
【０３２４】
Met (h)
最終反応量25μlで、Met (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、250μM KKKSPGEYVNIEFG(SEQ ID NO：207)、10 mM酢酸Mg、および[y-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３２５】
MINK (h)
最終反応量25μlで、MINK (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.33 mg/mlミエリン塩基性タンパク質、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３２６】
MKK4 (m)
最終反応量25μlで、MKK4 (m)(1〜5 mU)を50 mM Tris pH 7.5、0.1 mM EGTA、0.1% R-メルカプトエタノール、0.1 mM Na3VO4、2μM不活性JNK1a1 (h)、10 mM酢酸Mg、および非放射性ATP(必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、このインキュベーション混合物5μlを用いて、ATF2を250μMペプチドと置換すること以外はこの本の11ページに記載されている通りにJNK1a1 (h)アッセイを開始する。
【０３２７】
MKK6 (h)
最終反応量25μlで、MKK6 (h)(1〜5 mU)を50 mM Tris pH 7.5、0.1 mM EGTA、0.1% R-メルカプトエタノール、0.1 mM Na3VO4、1 mg/ml BSA、1μM不活性SAPK2a (h)、10 mM酢酸Mg、および非放射性ATP(必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、このインキュベーション混合物5μlを用いて、この本の18ページに記載されているSAPK2a (h)アッセイを開始する。
【０３２８】
MKK7β (h)
最終反応量25μlで、MKK7β(h)(1〜5 mU)を50 mM Tris pH 7.5、0.1 mM EGTA、0.1% R-メルカプトエタノール、0.1 mM Na3VO4、2μM不活性JNK1a1 (h)、10 mM酢酸Mg、および非放射性ATP(必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、このインキュベーション混合物5μlを用いて、ATF2を250μMペプチドと置換すること以外はこの本の11ページに記載されている通りにJNK1a1 (h)アッセイを開始する。
【０３２９】
MLCK (h)
最終反応量25μlで、MLCK (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.5 mM CaCl2、16μg/mlカルモジュリン、250μM KKLNRTLSFAEPG(SEQ ID NO：203)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３３０】
MRCKβ (h)
最終反応量25μlで、MRCKβ (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、100μM KKRNRTLTV(SEQ ID NO：219)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３３１】
MSK1 (h)
最終反応量25μlで、MSK1 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、30μM GRPRTSSFAEGKK(SEQ ID NO：220)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３３２】
MSK2 (h)
最終反応量25μlで、MSK2 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、30μM GRPRTSSFAEGKK(SEQ ID NO：220)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３３３】
MST1 (h)
最終反応量25μlで、MST1 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、250μM KKSRGDYMTMQIG(SEQ ID NO：210)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３３４】
MST2 (h)
最終反応量25μlで、MST2 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.33 mg/mlミエリン塩基性タンパク質、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３３５】
Musk (h)
最終反応量25μlで、MuSK (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、5 mM MnCl2、0.33 mg/mlミエリン塩基性タンパク質、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３３６】
NEK2 (h)
最終反応量25μlで、NEK2 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.33 mg/mlミエリン塩基性タンパク質、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３３７】
NEK6 (h)
最終反応量25μlで、MEK6 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、300μM FLAKSFGSPNRAYKK(SEQ ID NO：221)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３３８】
NEK7 (h)
最終反応量25μlで、MEK7 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、300μM FLAKSFGSPNRAYKK(SEQ ID NO：221)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３３９】
PAK2 (h)
最終反応量25μlで、PAK2 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、30μM
2009504192.tif 000169
、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３４０】
PAK4 (h)
最終反応量25μlで、PAK4 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.8 mg/mlミエリン塩基性タンパク質、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３４１】
PAK6 (h)
最終反応量25μlで、PAK6 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、200μM RRRLSFAEPG(SEQ ID NO：223)、10 mM酢酸Mg、および[y-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３４２】
PAR-1Bα (h)
最終反応量25μlで、PAR-1Bα (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、100μM KKKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR(SEQ ID NO：213)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３４３】
PDGFRα (h)
最終反応量25μlで、PDGFRα (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4.1、10 mM MnCl2、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３４４】
PDGFRβ (h)
最終反応量25μlで、PDGFRβ (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4.1、10 mM MnCl2、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３４５】
PDK1 (h)
最終反応量25μlで、PDK1 (h)(5〜10 mU)を50mM Tris pH 7.5、100μM
2009504192.tif 000170
(PDKtide)、0.1% R-メルカプトエタノール、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３４６】
PI3Ky (h)[非放射性アッセイ]
最終反応量20μlで、PI3Ky (h)を、10μMホスファチジルイノシトール-4,5-二リン酸およびMgATP(必要に応じた濃度)を含むアッセイ緩衝液中でインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で30分間インキュベートした後、EDTAおよびビオチン化ホスファチジルイノシトール-3,4,5-三リン酸を含む停止溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。最後に、ユーロピウム標識抗GSTモノクローナル抗体、GSTタグ化GRP1 PHドメイン、およびストレプトアビジン-アロフィコシアニンを含む検出緩衝液5μlを添加する。次いで、プレートを時間分解蛍光モードで読み取り、式HTRF(登録商標)＝10000 × (Em665 nm/Em620 nm)に従って、ホモジニアス時間分解蛍光(HTRF(登録商標))*シグナルを決定する。
【０３４７】
Pim-1 (h)
最終反応量25μlで、Pim-1 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、100μM KKRNRTLTV(SEQ ID NO：219)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３４８】
PKA (h)
最終反応量25μlで、PKA (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、30μM LRRASLG(SEQ ID NO：209)(Kemptide)、10 mM酢酸Mg、および[y-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、50 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３４９】
PKA (b)
最終反応量25μlで、PKA (b)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、30μM LRRASLG(SEQ ID NO：209)(Kemptide)、10 mM酢酸Mg、および[y-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、50 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３５０】
PKBa (h)
最終反応量25μlで、PKBa (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、30μM GRPRTSSFAEGKK(SEQ ID NO：220)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３５１】
PKBβ (h)
最終反応量25μlで、PKBβ (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、30μM GRPRTSSFAEGKK(SEQ ID NO：220)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３５２】
PKBy (h)
最終反応量25μlで、PKBy (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、30μM GRPRTSSFAEGKK(SEQ ID NO：220)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３５３】
PKCα (h)
最終反応量25μlで、PKCα (h)(5〜10 mU)を20 mM HEPES pH 7.4、0.03% Triton X-100、0.1 mM、0.1 mg/mlホスファチジルセリン、10μg/mlジアシルグリセロール、0.1 mg/mlヒストンH1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３５４】
PKCβI (h)
最終反応量25μlで、PKCβI (h)(5〜10 mU)を20 mM HEPES pH 7.4、0.03% Triton X-100、0.1 mM CaCl2、0.1 mg/mlホスファチジルセリン、10μg/mlジアシルグリセロール、0.1 mg/mlヒストンH1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３５５】
PKCβII (h)
最終反応量25μlで、PKCβII (h)(5〜10 mU)を20 mM HEPES pH 7.4、0.03% Triton X-100、0.1 mM、0.1 mg/mlホスファチジルセリン、10μg/mlジアシルグリセロール、0.1 mg/mlヒストンH1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３５６】
PKCy (h)
最終反応量25μlで、PKCy (h)(5〜10 mU)を20 mM HEPES pH 7.4、0.03% Triton X-100、0.1 mM、0.1 mg/mlホスファチジルセリン、10μg/mlジアシルグリセロール、0.1 mg/mlヒストンH1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３５７】
PKCδ (h)
最終反応量25μlで、PKCδ (h)(5〜10 mU)を20 mM HEPES pH 7.4、0.03% Triton X-100、0.1 mg/mlホスファチジルセリン、10μg/mlジアシルグリセロール、50μM ERMRPRKRQGSVRRRV(SEQ ID NO：224)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３５８】
PKCε (h)
最終反応量25μlで、PKCε6 (h)(5〜10 mU)を20 mM HEPES pH 7.4、0.03% Triton X-100、0.1 mg/mlホスファチジルセリン、10μg/mlジアシルグリセロール、50μM ERMRPRKRQGSVRRRV(SEQ ID NO：224)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３５９】
PKCYη (h)
最終反応量25μlで、PKCYη (h)(5〜10 mU)を20 mM HEPES pH 7.4、0.03% Triton X-100、0.1 mM CaCl2、0.1 mg/mlホスファチジルセリン、10μg/mlジアシルグリセロール、50μM ERMRPRKRQGSVRRRV(SEQ ID NO：224)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３６０】
2009504192.tif 000171
最終反応量25μlで、
2009504192.tif 000172
(5〜10 mU)を20 mM HEPES pH 7.4、0.03% Triton X-100、50μM ERMRPRKRQGSVRRRV(SEQ ID NO：224)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３６１】
PKCμ (h)
最終反応量25μlで、PKCμ (h)(5〜10 mU)を20 mM HEPES pH 7.4、0.03% Triton X-100、30μM KKLNRTLSVA(SEQ ID NO：212)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３６２】
PKCθ (h)
最終反応量25μlで、PKCθ (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.1 mg/mlヒストンH1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３６３】
PKCξ (h)
最終反応量25μlで、PKCξ (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、50μM ERMRPRKRQGSVRRRV(SEQ ID NO：224)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３６４】
PKD2 (h)
最終反応量25μlで、PKD2 (h)(5〜10 mU)を20 mM HEPES pH 7.4、0.03% Triton X-100、30μM KKLNRTLSVA(SEQ ID NO：212)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３６５】
PKG1β (h)
最終反応量25μlで、PKG1β (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、10μM cGMP、200μM RRRLSFAEPG(SEQ ID NO：223)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３６６】
Plk3 (h)
最終反応量25μlで、Plk3 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、2 mg/mlカゼイン、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３６７】
PRAK (h)
最終反応量25μlで、PRAK (h)(5〜10 mU)を50 mM Na R-グリセロリン酸グリセロリン酸 pH 7.5、0.1 mM EGTA、30μM KKLRRTLSVA(SEQ ID NO：212)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、50 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３６８】
PRK2 (h)
最終反応量25μlで、PRK2 (h)(5〜10 mU)を50 mM Tris pH 7.5、0.1 mM EGTA、0.1% R-メルカプトエタノール、30μM AKRRRLSSLRA(SEQ ID NO：226)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３６９】
Pyk2 (h)
最終反応量25μlで、Pyk2 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３７０】
p70S6K (h)
最終反応量25μlで、p70S6K (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、100μM KKRNRTLTV(SEQ ID NO：212)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３７１】
Ret (h)
最終反応量25μlで、Ret (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、250μM KKKSPGEYVNIEFG(SEQ ID NO：207)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３７２】
RIPK2(h)
最終反応量25μlで、RIPK2 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.33 mg/mlミエリン塩基性タンパク質、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３７３】
ROCK-I (h)
最終反応量25μlで、ROCK-I (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、30μM
2009504192.tif 000173
、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３７４】
ROCK-II (h)
最終反応量25μlで、ROCK-II (h)(5〜10 mU)を50 mM Tris pH 7.5、0.1 mM EGTA、30μM
2009504192.tif 000174
、10 mM酢酸Mg、および[y-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３７５】
ROCK-II (r)
最終反応量25μlで、ROCK-II (r)(5〜10 mU)を50 mM Tris pH 7.5、0.1 mM EGTA、30μM
2009504192.tif 000175
、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３７６】
Ron (h)
最終反応量25μlで、Ron (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、250μM KKSRGDYMTMQIG(SEQ ID NO：210)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３７７】
Ros (h)
最終反応量25μlで、Ros (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、10 mM MnCl2、250μM KKKSPGEYVNIEFG(SEQ ID NO：207)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３７８】
Rse (h)
最終反応量25μlで、Rse (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、250μM KVEKIGEGTYGVVYK(SEQ ID NO：211)、1 mM MnCl2、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３７９】
Rsk1 (h)
最終反応量25μlで、Rsk1 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、30μM KKKNRTLSVA(SEQ ID NO：212)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３８０】
Rsk1 (r)
最終反応量25μlで、Rsk1 (r)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、30μM KKKNRTLSVA(SEQ ID NO：212)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３８１】
Rsk2 (h)
最終反応量25μlで、Rsk2 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、30μM KKKNRTLSVA(SEQ ID NO：212)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３８２】
Rsk3 (h)
最終反応量25μlで、Rsk3 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、30μM KKKNRTLSVA(SEQ ID NO：212)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３８３】
SAPK2a (h)
最終反応量25μlで、SAPK2a (h)(5〜10 mU)を25 mM Tris pH 7.5、0.02 mM EGTA、0.33 mg/mlミエリン塩基性タンパク質、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３８４】
SAPK2b (h)
最終反応量25μlで、SAPK2b (h)(5〜10 mU)を25 mM Tris pH 7.5、0.02 mM EGTA、0.33 mg/mlミエリン塩基性タンパク質、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３８５】
SAPK3 (h)
最終反応量25μlで、SAPK3 (h)(5〜10 mU)を25 mM Tris pH 7.5、0.02 mM EGTA、0.33 mg/mlミエリン塩基性タンパク質、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３８６】
SAPK4 (h)
最終反応量25μlで、SAPK4 (h)(5〜10 mU)を25 mM Tris pH 7.5、0.02 mM EGTA、0.33 mg/mlミエリン塩基性タンパク質、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３８７】
SGK (h)
最終反応量25μlで、SGK (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、30μM GRPRTSSFAEGKK(SEQ ID NO：220)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３８８】
SGK2 (h)
最終反応量25μlで、SGK2 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、30μM GRPRTSSFAEGKK(SEQ ID NO：220)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３８９】
SGK3 (h)
最終反応量25μlで、SGK3 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、250μM GRPRTSSFAEGKK(SEQ ID NO：220)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３９０】
Snk (h)
最終反応量25μlで、Snk (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、2mg/mlカゼイン、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３９１】
Syk (h)
最終反応量25μlで、Syk (h)(5〜10 mU)を50 mM Tris pH 7.5、0.1 mM EGTA、0.1 mM Na3VO4、0.1% R-メルカプトエタノール、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３９２】
TAK1 (h)
最終反応量25μlで、TAK1 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、2 mg/mlカゼイン、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３９３】
TBK1 (h)
最終反応量25μlで、TBK1 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、200μM KRRRALS(p)VASLPGL(SEQ ID NO：214)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３９４】
Tie2 (h)
最終反応量25μlで、Tie2 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.5 mM MnCl2、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３９５】
TrkA (h)
最終反応量25μlで、TrkA (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、250μM KKKSPGEYVNIEFG(SEQ ID NO：207)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３９６】
TrkB (h)
最終反応量25μlで、TrkB (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３９７】
TSSK2 (h)
最終反応量25μlで、TSSK2 (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、100μM KKKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR(SEQ ID NO：213)、10 mM酢酸Mg、および[y-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３９８】
Yes (h)
最終反応量25μlで、Yes (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０３９９】
ZAP-70 (h)
最終反応量25μlで、ZAP-70 (h)(5〜10 mU)を50 mM Tris pH 7.5、0.1 mM EGTA、0.1 mM Na3VO4、0.1% R-メルカプトエタノール、0.1 mg/mlポリ(Glu、Tyr) 4:1、10 mM MnCl2、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをフィルターマットA上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０４００】
ZIPK (h)
最終反応量25μlで、ZIPK (h)(5〜10 mU)を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、250 mM KKLNRTLSFAEPG(SEQ ID NO：203)、10 mM酢酸Mg、および[γ-33P-ATP](比活性約500 cpm/pmol、必要に応じた濃度)と共にインキュベートする。MgATP混合物を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液5μlを添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物10μlをP30フィルターマット上にスポットし、75 mMリン酸で5分間、3回およびメタノールで1回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数する。
【０４０１】
以下の表は、化合物A-1またはB-1と共にインキュベートした場合の各プロテインキナーゼの残存活性の割合を示す。
2009504192.tif 000176
2009504192.tif 000177
2009504192.tif 000178
2009504192.tif 000179
2009504192.tif 000180
【０４０２】
以下の表に反映されるように、Abl(h)の阻害を、45マイクロモルATPの存在下でさらに特徴づけた。
2009504192.tif 000181
*注記。n＝2の場合、ここに報告した値は実際には範囲/√2である。
【０４０３】
上記のデータから、化合物B-1がMKK7Bを阻害することが示される。化合物A-1は、Abl、DRAK1、p70S6K、PASK、およびTie2を80%を超えて阻害し、他のキナーゼを60〜80%阻害する。
【０４０４】
実施例12
リボソームRNA合成に及ぼす化合物の効果
45S rDNAからのrRNA合成に及ぼす化合物の効果を決定するために、アッセイを行った。詳細には、種々の濃度の化合物A-1を細胞と共にインキュベートし、化合物と共に2時間または4時間インキュベートした後に、rRNA合成に及ぼす効果について試験した。合成されたrRNAは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)アッセイにより定量化した。Primer Expressソフトウェアを用いてプライマー/プローブセットを設計し、合成はApplied Biosystemsによる。使用した5' ETSプローブは以下の配列を有した(その3'末端において)：6FAM-TTG ATC CTG CCA GTA GC-MGBNFQ(SEQ ID NO：227)。プライマー配列は以下の通りであった：
フォワードプライマー：CCG CGC TCT ACC TTA CCT ACC T(SEQ ID NO：228)
リバースプライマー：GCA TGG CTT AAT CTT TGA GAC AAG(SEQ ID NO：229)。
C-myc転写に及ぼす化合物の影響を検出する対照アッセイもまた、ABIから購入したプライマー/プローブセット(アッセイID:Hs99999003_mlを有するTaqMan Gene Expression Assay)を用いて行った。以下のアッセイ手順を使用した：
段階1. RNAからDNAへの逆転写
以下のものを混合する
1 ug RNA
2.5 ul 10× Taq Man緩衝液
5.5 ul 25 mM MgCl2
5 ul dNTP混合物(各500 uM)
1.2 ul ランダムヘキサマープライマー(2.5 uM保存液)
0.5 ul RNアーゼ阻害剤(.4単位/ul)
0.6 ul 逆転写酵素(1.2単位/ul)
水で全量を25 ulにする
48℃で30分間インキュベートする
95℃で5分間インキュベートして、逆転写酵素を失活させる
段階2. PCR
以下のものを混合する
5 ul 逆転写酵素反応産物
12.5 ul 2× PCR混合物
1 uM フォワードプライマー
1 uM リバースプライマー
0.5 uM Taq Manプローブ
500 nM Rox
水で最終量を25 ulに調整する
以下のサイクルでPCRを行う
95℃、1分
40サイクルの
95℃、15秒
60℃、1分。
消化された標識の蛍光を検出し、定量化した。図4Aおよび4Bに示すように、化合物A-1は、2時間および4時間の時点でrRNA合成を阻害した。比較として、c-Myc転写に及ぼす化合物A-1の影響を図4Cに示す。rRNA合成に及ぼす他の化合物の効果もまたアッセイで評価し、rRNA合成およびcMYC RNA合成に関する選択された化合物のIC50値を以下の表に提供する。
2009504192.tif 000182
2009504192.tif 000183
このアッセイによって決定された複数の化合物のIC50値を、細胞生存率アッセイにおける同じ化合物のIC50値に対してプロットした。具体的には、PCRによって測定されたrDNA抑制に関するIC50の対数を、アラマーブルーにより測定された細胞生存率(4日間；HCT-116細胞)に関するlog IC50に対してプロットした。プロットから、細胞生存率とrDNA転写の抑制との間の明白な正の相関が明らかとなり、このことはPCRアッセイの生物学的関連性を強調する。
【０４０５】
本明細書において参照した各特許、特許出願、出版物、および文献の全文が、参照により本明細書に組み入れられる。上記の特許、特許出願、出版物、および文献の引用は、前記物のいずれかが関連先行技術であることを認めるものではなく、またこれら出版物また文献の内容または日付に関していかなる承認を構成するものでもない。
【０４０６】
本発明の基本的局面から逸脱することなく、前記物に修正がなされ得る。1つまたは複数の特定の態様に関して本発明を実質的に詳細に説明してきたが、本出願に具体的に開示した態様に変更がなされ得ること、なおかつこれらの修正および改良も本発明の範囲および精神の範囲内であることを当業者は認識すると考えられる。本明細書に例示的に記載した本発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素の非存在下で適切に実施され得る。したがって、例えば、本明細書中のそれぞれの場合において、「〜を含む」、「本質的に〜からなる」、および「〜からなる」という用語はいずれも、他の2つの用語のいずれかと置換され得る。したがって、使用している用語および表現は説明の用語として用いられるのであって、限定の用語として用いられるのではなく、示されたおよび記載された特徴の等価物またはその一部は排除されず、種々の修正が本発明の範囲内で可能であることが理解される。本発明の態様は、特許請求の範囲の局面に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【０４０７】
【図１】四重鎖核酸/結合タンパク質相互作用を妨げ得るキノロン類似体を示す。
【図２】四重鎖核酸/結合タンパク質相互作用を妨げ得るキノロン類似体を示す。
【図３】混合型高次構造(「M」；例えば、核酸6914T)、平行型高次構造(「P」；例えば、核酸10110T)、逆平行型高次構造(「A」；例えば、核酸9749NT)、および複合型高次構造(「C」；例えば、核酸8762NT)四重鎖構造を含む、特定のリボソーム核酸ヌクレオチド配列の円二色性スキャンを示す。
【図４】図4A、4B、および4Cは、rRNAおよびc-MYC RNAの合成に及ぼす化合物A-1の影響を示す。
【手続補正書】
【提出日】平成20年9月16日(2008.9.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009504192000001.app
【国際調査報告】
2009504192.tif 000184
2009504192.tif 000185