(57)【要約】  本発明は幹細胞の分化を誘導または抑制するための組成物および方法に関する。また、本発明は、医療症状、例えば、骨粗しょう症、骨折、骨損傷、心筋梗塞症、心筋ミオパチー、退行性筋肉病、ミオパチー、および尿失禁の治療への応用に関する。【選択図】図１
2009538903.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞の分化を誘導または抑制するための、下記一般式（Ｉ）の化合物を含む組成物：
【化１】
2009538903.tif 000070
（Ｉ）
ここで：
Ｅは−（ＺＲ４）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり；
Ｇは不存在であるか、−（ＸＲ５）−、または−（Ｃ＝Ｏ）−であり；
Ｗは−Ｙ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＳＯ２）−または不存在であり；
Ｙは酸素または硫黄であり；
ＸまたはＺは独立に窒素またはＣＨであり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は同じであるか異なり、下記群から独立に選択される：
アミノ酸側鎖部分；
Ｃ１−１２アルキルまたは置換Ｃ１−１２アルキル、この時、前記置換Ｃ１−１２アルキルはアミノ、グアニジノ、Ｃ１−４アルキルグアニジノ、ジＣ１−４アルキルグアニジノ、アミジノ、Ｃ１−４アルキルアミジノ、ジＣ１−４アルキルアミジノ、Ｃ１−５アルキルアミノ、ジＣ１−５アルキルアミノ、スルフィド、カルボキシル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
Ｃ１−６アルコキシ；
Ｃ６−１２アリールまたは置換Ｃ６−１２アリール、この時、前記置換Ｃ６−１２アリールはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシル、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
窒素、酸素または硫黄から選択される１〜２個のヘテロ原子を有し得る５〜７環構成員を有する単環式アリール−アルキル、または
アミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する置換された単環式アリール−アルキル；
窒素、酸素または硫黄から選択される１〜２個のヘテロ原子を有し得る８〜１０環構成員を有する二環式アリール−アルキル、または
ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、シアノ、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する置換された二環式アリール−アルキル；
窒素、酸素または硫黄から選択される１〜２個のヘテロ原子を有し得る５〜１４環構成員を有する三環式アリール−アルキル、または
ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、シアノ、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する置換された二環式アリール−アルキル；
アリールＣ１−４アルキルまたは置換アリールＣ１−４アルキル、この時、前記置換アリールＣ１−４アルキルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、Ｃ３−６シクロアルキル、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシル、シアノ、スルフリル、ヒドロキシル、アミド、Ｃ１−６アルキルオキシＣ１−６アシル、およびモルホリニルＣ１−６アルキルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
シクロアルキルアルキルまたは置換シクロアルキルアルキル、この時、前記置換シクロアルキルアルキルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシル、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；および
シクロアルキルまたは置換シクロアルキル、この時、前記置換シクロアルキルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシル、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する。
【請求項２】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は同じであるか異なり、下記群から独立に選択される、請求項１に記載の組成物：
Ｃ１−１２アルキルまたは置換Ｃ１−１２アルキル、この時、前記置換Ｃ１−１２アルキルはアミノ、グアニジノ、Ｃ１−４アルキルグアニジノ、ジＣ１−４アルキルグアニジノ、アミジノ、Ｃ１−４アルキルアミジノ、ジＣ１−４アルキルアミジノ、Ｃ１−５アルキルアミノ、ジＣ１−５アルキルアミノ、スルフィド、カルボキシル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
Ｃ１−６アルコキシ；
シクロアルキルＣ１−３アルキル；
シクロアルキル；
フェニルまたは置換フェニル、この時、前記置換フェニルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシル、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
フェニルＣ２−４アルキルまたは置換フェニルＣ２−４アルキル、この時、前記置換フェニルＣ２−４アルキルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシル、シアノ、スルフリル、スルフィド、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
ナフチルまたは置換ナフチル、この時、前記置換ナフチルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシル、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
ナフチルＣ１−４アルキルまたは置換ナフチルＣ１−４アルキル、この時、前記置換ナフチルＣ１−４アルキルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシル、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
ベンジルまたは置換ベンジル、この時、前記置換ベンジルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、トリフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシル、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
ビスフェニルメチルまたは置換ビスフェニルメチル、この時、前記置換ビスフェニルメチルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシル、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
ベンジルフェニルアミドまたは置換ベンジルフェニルアミド、この時、前記置換ベンジルフェニルアミドはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシル、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
ピリジルまたは置換ピリジル、この時、前記置換ピリジルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシル、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
ピリジルＣ１−４アルキルまたは置換ピリジルＣ１−４アルキル、この時、前記置換ピリジルＣ１−４アルキルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシル、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
ピリミジルＣ１−４アルキルまたは置換ピリミジルＣ１−４アルキル、この時、前記置換ピリミジルＣ１−４アルキルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシル、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
トリアジン−２−イルＣ１−４アルキルまたは置換トリアジン−２−イルＣ１−４アルキル、この時、前記置換トリアジン−２−イルＣ１−４アルキルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
イミダゾリルＣ１−４アルキルまたは置換イミダゾリルＣ１−４アルキル、この時、前記置換イミダゾリルＣ１−４アルキルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
ベンゾチアゾリンＣ１−４アルキルまたは置換ベンゾチアゾリンＣ１−４アルキル、この時、前記置換ベンゾチアゾリンＣ１−４アルキルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
フェノキサジンＣ１−４アルキル；
ベンジルｐ−トリルエーテル；
フェノキシベンジル；
Ｎ−アミジノピペラジニル−Ｎ−Ｃ１−４アルキル；
キノリンＣ１−４アルキル；
Ｎ−アミジノピペラジニル；
Ｎ−アミジノピペリジニルＣ１−４アルキル；
４−アミノシクロヘキシルＣ１−２アルキル；および
４−アミノシクロヘキシル。
【請求項３】
Ｅは−（ＺＲ４）−であり、Ｇは−（ＸＲ５）−であり、ここで、ＺはＣＨであり、Ｘは窒素であり、前記化合物が一般式（ＩＩ）の構造を有する、請求項１に記載の組成物：
【化２】
2009538903.tif 000071
（ＩＩ）
【請求項４】
前記化合物が一般式（ＩＩＩ）の構造を有する、請求項３に記載の組成物：
【化３】
2009538903.tif 000072
（ＩＩＩ）
【請求項５】
Ｅは−（ＺＲ４）−であり、Ｇは不存在であり、ここで、Ｚは窒素であり、前記化合物が一般式（ＩＶ）の構造を有する、請求項１に記載の組成物：
【化４】
2009538903.tif 000073
（ＩＶ）
【請求項６】
Ｅは−（ＺＲ４）−であり、Ｇは−（ＸＲ５）−であり、ここで、ＺおよびＸは独立にＣＨであり、前記化合物が一般式（Ｖ）の構造を有する、請求項１に記載の組成物：
【化５】
2009538903.tif 000074
（Ｖ）
【請求項７】
前記化合物が一般式（ＶＩ）の構造を有する、請求項６に記載の組成物：
【化６】
2009538903.tif 000075
（ＶＩ）
【請求項８】
幹細胞の分化を誘導または抑制する方法であって、幹細胞を請求項１〜７のうちのいずれか１項に記載の組成物と前記幹細胞の分化を調節するのに有効な量で接触させるステップを含む、幹細胞の分化を誘導または抑制する方法。
【請求項９】
骨形成、心筋形成、および筋形成からなる群から選択されるものを誘導または抑制するための、請求項８に記載の幹細胞の分化を誘導または抑制する方法。
【請求項１０】
神経形成および造血（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ）からなる群から選択されるものを誘導または抑制するための、請求項８に記載の幹細胞の分化を誘導または抑制する方法。
【請求項１１】
癌幹細胞（ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）または癌開始細胞（ｃａｎｃｅｒ  ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）の増殖または自己再生（ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ）を抑制するための方法であって、前記幹細胞を請求項１〜７のうちのいずれか１項に記載の化合物と癌幹細胞または癌開始細胞の増殖または自己再生を抑制するのに有効な量で接触させるステップを含む、癌幹細胞または癌開始細胞の増殖または自己再生を抑制するための方法。
【請求項１２】
前記幹細胞は、前記化合物が１ｎＭ〜５０μＭ含まれている培地で培養される、請求項８に記載の幹細胞の分化を誘導または抑制する方法。
【請求項１３】
請求項１〜７のうちのいずれか１項に記載の化合物および薬学的に許容可能な担体を含む薬学組成物。
【請求項１４】
骨粗しょう症、骨折（ｂｏｎｅ  ｆｒａｃｔｕｒｅ）、骨損傷、心筋梗塞症、心筋ミオパチー、退行性筋肉病、および尿失禁からなる群から選択された医療病態を治療のための、請求項１３に記載の薬学組成物。
【請求項１５】
前記薬学組成物を対象に投与することにより、癌性腫瘍（ｃａｎｃｅｒｏｕｓ  ｔｕｍｏｒ）内に存在する癌幹細胞の成長を選択的死滅（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｋｉｌｌｉｎｇ）、抑制または調節するための、請求項１３に記載の薬学組成物。
【請求項１６】
筋形成を誘導するための、請求項６に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は幹細胞分化の誘導または抑制のための組成物および方法に関する。また、本発明は、医療病態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）、例えば、骨粗しょう症、骨折（ｂｏｎｅ  ｆｒａｃｔｕｒｅ）、骨損傷（ｂｏｎｅ  ｉｎｊｕｒｉｅｓ）、心筋梗塞症（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ）、心筋ミオパチー（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ）、退行性筋肉病、ミオパチー（ｍｙｏｐａｔｈｙ）、および尿失禁の治療への応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は期間制限無しで自身を複製できる能力を有しており、心臓細胞、神経細胞、骨細胞、筋細胞、血液細胞、および膵β細胞などのように特化した機能を有する成熟した細胞に発達できる潜在力のある細胞である。幹細胞には色々なタイプまたはソース（ｓｏｕｒｃｅ）がある。胚幹細胞（ＥＳ  ｃｅｌｌ）は胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）の内部細胞塊から由来した幹細胞であり、万能分化性 (ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）を有する；すなわち、これらは３つの１次胚葉、すなわち、外胚葉、内胚葉または幹細胞の中胚葉の全てから由来した細胞に分化し得る（非特許文献１）。成体幹細胞は持続的に複製され特定の専門化した細胞を提供する未分化した細胞である。成体幹細胞は骨髄、末梢血液、脳、脊髄、肝および膵臓の内部を含むボディーの全体で確認されており、これらは胚幹細胞に比べてより制約的な潜在性を有する。典型的に、成体幹細胞は、これらが由来した組織の機能に貢献する細胞に分化するように予定された多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）細胞である。しかし、成体幹細胞は、特定条件下で、相異なる胚の胚葉層から由来した細胞を含み、関連しない組織の専門化した細胞に分化し得るものとして明らかになっている（非特許文献２）。
【０００３】
遺伝子のＷｎｔファミリーは、標的細胞上のＦｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚｄ）受容体に結合することによって作用する、システインが豊富に分泌される糖タンパク質を２０種類以上エンコーディングする。ＷｎｔがＦｚｄに結合すればｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ（Ｄｖｌ）を活性化し、これは、細胞質のセリン−トレオニンキナーゼ（ｓｅｒｉｎｅ−ｔｈｒｅｏｎｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）であるグルコース合成酵素キナーゼ−３β（ＧＳＫ−３β）の非活性化をもたらす。前記ＧＳＫ−３β標的β−カテニンは安定化し、核に転位し、特定プロモーター上のＴＣＦ（Ｔ−細胞因子）−依存性転写を活性化する（非特許文献３）。Ｗｎｔ信号伝達は腎臓（非特許文献４）、中枢神経系（ＣＮＳ）（非特許文献５）、
造血（非特許文献６）、および骨格筋（非特許文献７）を含む様々な組織において細胞の運命決定を指示する。また、Ｗｎｔ信号伝達はゼブラフィッシュおよびヒドラにおける後天性の傷治癒および組織再生に関連する（非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０）。Ｗｎｔ信号伝達は骨密度および骨形成の調節に関与すると提案されてきた。ＬＲＰ５における機能突然変異の損失は、常染色体劣性疾患（ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）である骨粗しょう症−偽網膜膠腫症候群（ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ−ｐｓｅｕｄｏｇｌｉｏｍａ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）と関連したものとして明らかになっている（非特許文献１１；非特許文献１２）。また、ＬＲＰ５において、Ｇｌｙ１７１からＶａｌへの（Ｇｌｙ１７１−ｔｏ−Ｖａｌ）置換突然変異は高い骨密度表現型を現す（非特許文献１３）。ＬＲＰ５の機能損失または置換突然変異と関連したこれらの表現型は、Ｗｎｔ信号伝達が骨密度（ｂｏｎｅ  ｍａｓｓ）および骨形成（ｂｏｎｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の統制（ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）を調節するのに関連され得るということを示す（非特許文献１４）。骨形成（ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ）途中、万能分化性間葉幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）は前骨芽細胞（ｐｒｅｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ）に分化し、前骨芽細胞は最終的にミネラル化した骨基質（ｂｏｎｅ  ｍａｔｒｉｘ）の形成に必要な成分を沈着させる成熟骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）に分化する。骨芽細胞に分化する時に、前記細胞は高濃度の、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、副甲状腺ホルモン受容体、タイプＩコラーゲン、オステオカルシン、マトリックス・エクストラセルラー・フォスフォグリコプロテイン（ＭＥＰＥ）、および骨シアロタンパク質（ｂｏｎｅ  ｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）のような分化−関連表現型を発現する。培養された細胞において、Ｂａｉｎら（非特許文献１５）は、β−カテニンの構成的に活性である形態を利用して正準な（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）Ｗｎｔ信号伝達を刺激すれば、ＡＬＰの活性が誘導されるということを記述している。ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣｓ）は骨髄からの万能分化性細胞であり、試験管内で増殖させることができ、骨細胞（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ）、軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ）、および脂肪細胞（ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ）系に分化し得る（非特許文献１６）。間葉幹細胞（ＭＳＣｓ）は、初めには骨髄穿刺液（ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ａｓｐｉｒａｔｅｓ）の繊維母細胞付着性分画として発見され（非特許文献１７）、また、コロニー形成単位−繊維芽細胞（ＣＦＵ−Ｆ）、骨髄間質細胞（ｍａｒｒｏｗ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ）、骨髄間葉細胞、または間葉先祖細胞として呼ばれた。試験管内ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣｓ）の骨細胞系への分化は正常な生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）骨発生の発達段階の多くの部分を繰り返す。例えば、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）およびβ−グリセロールホスフェートの存在下で、ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣｓ）は、骨−特異的アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）のような骨形成マーカーを発現し、細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌ��ｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ）を沈着し、これは、適切な培養条件においてミネラル化する（非特許文献１８）。これらの即時利用可能性およびよく確立した試験管内の培養プロトコルのために、ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣｓ）は自家骨髄移植および軟骨組織工学における細胞のソースとなった（非特許文献１９）。
【０００４】
Ｗｎｔタンパク質は、Ｍｙｆ５およびＭｙｏＤの発現を活性化することにより、マウス沿軸中胚葉の体外移植における筋形成（ｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ）を開始させる（非特許文献２０）。前体節中胚葉（ｐｒｅｓｏｍｉｔｉｃ  ｍｅｓｏｄｅｒｍ）および初期体節における筋形成はＷｎｔ拮抗剤可溶性Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−関連タンパク質３（ｓＦＲＰ３／Ｆｒｚｂ１）によって抑制される（非特許文献２１）。したがって、Ｗｎｔ信号伝達は胚前駆細胞において筋形成プログラムを誘導し維持するのに必要であると見られ、いくつかの場合には充分であると見られる。
【０００５】
Ｗｎｔ／β−カテニン経路は、通常、増殖および分化を増進させるのに関与する多くの遺伝子の発現を調節する。ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１（非特許文献２２；非特許文献２３）、およびｃ−ｍｙｃ  （非特許文献２４）を含み、これら遺伝子の多くのものが細胞成長、増殖、および分化に重要な役割を果たす。本発明は、成体幹細胞および胚幹細胞の分化を調節する製剤（ａｇｅｎｔ）を提供し、下記に記述された関連長所をさらに提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋｅｌｌｅｒ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ，２００５，１９，１１２９−５５
【非特許文献２】Ｂｈａｔｉａ  Ｒ  ａｎｄ  Ｈａｒｅ  ＪＭ，Ｃｏｎｇｅｓｔ  Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌ．２００５，１１，８７−９１；Ｗｅｉｓｓｂｅｒｇ  ＰＬ  ａｎｄ  Ｑａｓｉｍ  Ａ，Ｈｅａｒｔ、２００５，９１，６９６−７０２
【非特許文献３】ｒｅｖｉｅｗｅｄ  ｂｙ  Ｄｉｅｒｉｃｋ  ａｎｄ  Ｂｅｊｓｏｖｅｃ，１９９９；Ｗｏｄａｒｚ  ａｎｄ  Ｎｕｓｓｅ，１９９８
【非特許文献４】Ｌａｂｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｒｅｇｅｎ，１９９８，６，５８−６４；Ｖａｉｎｉｏ  ａｎｄ  Ｕｕｓｉｔａｌｏ，Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｎｅｐｈｒｏｌ，２０００，１５，１５１−６
【非特許文献５】Ｐａｔａｐｏｕｔｉａｎ  ａｎｄ  Ｒｅｉｃｈａｒｄｔ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ，２０００，１０，３９２−９
【非特許文献６】Ｖａｎ  Ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１９９８，９２，３１８９−２０２
【非特許文献７】Ｃｏｓｓｕ  ａｎｄ  Ｂｏｒｅｌｌｏ，ＥＭＢＯ  Ｊ，１９９９，１８，６８６７−７２
【非特許文献８】Ｈｏｂｍａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０００，４０７，１８６−９
【非特許文献９】Ｌａｂｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｒｉ  Ｒｅｇｅｎ，１９９８，６，５８−６４
【非特許文献１０】Ｐｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｄｙｎ，２０００，２１９，２８２−６
【非特許文献１１】Ｇｏｎｇ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ，２００１，１０７，５１３−２３
【非特許文献１２】Ｋａｔｏ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，２００２，１５７，３０３−１４
【非特許文献１３】Ｂｏｙｄｅｎ  ＬＭ  ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，２００２，３４６，１５１３−２１
【非特許文献１４】Ｗｅｓｔｅｎｄｏｒｆ  ＪＪ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ，２００４，３４１，１９−３９
【非特許文献１５】Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，２０３，３０１，８４−９１
【非特許文献１６】Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ  ＭＦ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２８４，１４３−７
【非特許文献１７】Ｃａｓｔｒｏ−Ｍａｌａｓｐｉｎａ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，１９８０，５６，２８９−３０１
【非特許文献１８】Ｃａｐｌａｎ  ＡＩ  ａｎｄ  Ｂｒｕｄｅｒ  ＳＰ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ，２００１，７，２５９−６４
【非特許文献１９】Ｂｉａｎｃｏ  Ｐ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｙ  ＰＧ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００１，４１４，１１８−２１
【非特許文献２０】Ｔａｊｂａｋｈｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９８，１２１，４０７７−８３
【非特許文献２１】Ｂｏｒｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９９，１２６，４２４７−５５
【非特許文献２２】Ｓｈｔｕｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１  ｇｅｎｅ  ｉｓ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ／ＬＥＦ−１  ｐａｔｈｗａｙ、”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：５５２２−２７（１９９９）
【非特許文献２３】Ｔｅｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，“ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１  ｉｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ、”Ｎａｔｕｒｅ  ３９８：４２２−２６（１９９９）
【非特許文献２４】Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃ−ＭＹＣ  ａｓ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＰＣ  ｐａｔｈｗａｙ、”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１５０９−１２（１９９８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は幹細胞の分化を誘導または抑制する製剤を提供し、その使用方法を提供する。
【０００８】
一側面において、本発明は骨髄幹細胞の骨形成を誘導および増進する方法を提供し、関連した側面において、本発明は前記方法に有用な化合物を提供する。本発明は、骨リモデリングと関連した色々な問題、例えば、骨粗しょう症およびその他骨疾患を取り扱う方法および組成物に関する。また、本発明は、骨折またはその他の損傷または非正常な骨を治癒するのに役に立つ組成物の用途を提供する。本発明は哺乳類を対象に骨芽細胞ミネラル化を刺激したり増強したりする方法を提供し、前記方法は組成物の有効量を対象に投与することを含む。
【０００９】
また他の側面において、本発明は骨髄幹細胞の骨形成の分化を抑制する組成物および方法を提供する。
【００１０】
また他の側面において、本発明は幹細胞を心筋系の細胞に分化させることを誘導し指示する組成物および方法を提供する。本発明は心筋形成を誘導する方法を提供する。哺乳類細胞を化合物と接触させ、そこで、前記哺乳類細胞は心筋系の細胞に分化する。前記接触は生体内または生体外で行われ得る。これらが心筋形成を誘導できる能力に照らし、前記化合物は、例えば、心筋ミオパチーおよび不整脈（ａｒｒｈｙｔｈｍｉａ）のような心筋異常を治療するのに、および心臓麻痺からもたらされた心筋梗塞症のような心臓筋肉組織の損傷を治療するのに有用である。
【００１１】
また他の側面において、本発明は幹細胞が心筋系に分化することを抑制するための組成物および方法を提供する。
【００１２】
また他の側面において、本発明は幹細胞を骨格筋細胞または平滑筋細胞に分化することを誘導し指示するための組成物および方法を提供する。哺乳動物の細胞を化合物と接触させ、そこで、前記哺乳動物細胞は筋細胞系（ｍｙｏｃｙｔｉｃ  ｌｉｎｅａｇｅ）の細胞に分化する。前記接触段階は生体内または試験管内で行われ得る。これらが筋形成を誘導できる能力がある点に照らし、前記化合物は退行性筋肉疾患、例えば、筋ジストロフィー（ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）またはミオパチーまたは尿失禁の治療に有用である。
【００１３】
また他の一側面において、本発明は幹細胞の筋形成の分化を抑制するための組成物および方法を提供する。
【００１４】
本発明の方法は様々な医療病態（ｍｅｄｉｃａｌ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）を治療するのに用いられ得る。例えば、本発明の様々な側面において：組成物が細胞内にあり、製剤（ａｇｅｎｔ）が細胞の分化可能性を増加させる；組成物が細胞内にあり、製剤が細胞の増殖可能性を増加させる。
【００１５】
組成物は生体内または生体外にあってもよい。一側面において、組成物は生体外にあり、組成物は幹細胞をさらに含む。また他の一側面において、組成物は生体内にあり、組成物は哺乳動物、例えば、マウス内にある。
【００１６】
また他の一側面において、本発明は細胞増殖を調節する方法を提供し、これは、（ａ）細胞集団を、前記集団の一部は増殖し一部は分化する条件下で提供するステップ；および（ｂ）前記集団に化学製剤を添加し、この時、前記製剤が、分化する細胞の比率に比べて増殖する細胞の比率を増加させるステップを含む。前記方法の様々な選択的実現例は次のものを含む：前記集団にＷｎｔ経路を活性化する製剤を添加すること；前記細胞集団が幹細胞の集団であること；前記方法が生体外で行われること；前記方法が、前記細胞集団の分化を引き起こす製剤を添加することをさらに含み、この時、例えば、前記集団の細胞が分化して骨芽細胞、骨細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、血液細胞を形成するか、前記集団の細胞が分化して神経細胞を形成すること。
【００１７】
また他の一側面において、本発明は幹細胞を未分化状態に維持する方法を提供し、前記方法は幹細胞を、細胞分化を抑制するか細胞増殖を増進させる製剤と、前記幹細胞を未分化状態に維持するのに有効な量で接触させることを含む。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の組成物および方法において、化学製剤は一般式（Ｉ）の化合物から選択され得る：
【化１】
2009538903.tif 000003
ここで：
Ｅは−（ＺＲ４）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり；
Ｇは不存在であるか、−（ＸＲ５）−、または−（Ｃ＝Ｏ）−であり；
Ｗは−Ｙ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＳＯ２）−または不存在であり；
Ｙは酸素または硫黄であり；
ＸまたはＺは独立に窒素またはＣＨであり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は同じであるか異なり、独立に下記からなる群から選択される：
アミノ酸側鎖部分；
Ｃ１−１２アルキルまたは置換Ｃ１−１２アルキルであり、前記置換Ｃ１−１２アルキルはアミノ、グアニジノ、Ｃ１−４アルキルグアニジノ、ジＣ１−４アルキルグアニジノ、アミジノ、Ｃ１−４アルキルアミジノ、ジＣ１−４アルキルアミジノ、Ｃ１−５アルキルアミノ、ジＣ１−５アルキルアミノ、スルフィド、カルボキシル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
Ｃ１−６アルコキシ；
Ｃ６−１２アリールまたは置換Ｃ６−１２アリールであり、前記置換Ｃ６−１２アリールはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシル、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
窒素、酸素または硫黄から選択される１〜２個のヘテロ原子を有し得る５〜７環構成員の単環式アリール−アルキル、またはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する置換された単環式アリール−アルキル；
窒素、酸素または硫黄から選択される１〜２個のヘテロ原子を有し得る８〜１０環構成員を有する二環式アリール−アルキル、または
ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、シアノ、またはヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する置換された二環式アリール−アルキル；
窒素、酸素または硫黄から選択される１〜２個のヘテロ原子を有し得る５〜１４環構成員を有する三環式アリール−アルキル、または
ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、シアノ、またはヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する置換された二環式アリール−アルキル；
アリールＣ１−４アルキルまたは置換アリールＣ１−４アルキルであり、前記置換アリールＣ１−４アルキルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、Ｃ３−６シクロアルキル、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシル、シアノ、スルフリル、ヒドロキシル、アミド、Ｃ１−６アルキルオキシＣ１−６アシル、およびモルホリニルＣ１−６アルキルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
シクロアルキルアルキルまたは置換シクロアルキルアルキルであり、前記置換シクロアルキルアルキルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシル、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；および
シクロアルキルまたは置換シクロアルキルであり、前記置換シクロアルキルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシル、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する。
【００１９】
特定実現例において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は同じであるか異なり、下記群から独立に選択される：
Ｃ１−１２アルキルまたは置換Ｃ１−１２アルキルであり、前記置換Ｃ１−１２アルキルはアミノ、グアニジノ、Ｃ１−４アルキルグアニジノ、ジＣ１−４アルキルグアニジノ、アミジノ、Ｃ１−４アルキルアミジノ、ジＣ１−４アルキルアミジノ、Ｃ１−５アルキルアミノ、ジＣ１−５アルキルアミノ、スルフィド、カルボキシル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
Ｃ１−６アルコキシ；
シクロアルキルＣ１−３アルキル；
シクロアルキル；
フェニルまたは置換フェニルであり、前記置換フェニルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシル、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
フェニルＣ２−４アルキルまたは置換フェニルＣ２−４アルキルであり、前記置換フェニルＣ２−４アルキルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシル、シアノ、スルフリル、スルフィド、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
ナフチルまたは置換ナフチルであり、前記置換ナフチルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシル、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
ナフチルＣ１−４アルキルまたは置換ナフチルＣ１−４アルキルであり、前記置換ナフチルＣ１−４アルキルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシル、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
ベンジルまたは置換ベンジルであり、前記置換ベンジルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、トリフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシル、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
ビスフェニルメチルまたは置換ビスフェニルメチルであり、前記置換ビスフェニルメチルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシル、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
ベンジルフェニルアミドまたは置換ベンジルフェニルアミドであり、前記置換ベンジルフェニルアミドはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシル、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
ピリジルまたは置換ピリジルであり、前記置換ピリジルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシル、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
ピリジルＣ１−４アルキルまたは置換ピリジルＣ１−４アルキルであり、前記置換ピリジルＣ１−４アルキルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシル、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
ピリミジルＣ１−４アルキルまたは置換ピリミジルＣ１−４アルキルであり、前記置換ピリミジルＣ１−４アルキルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシル、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
トリアジン−２−イルＣ１−４アルキルまたは置換トリアジン−２−イルＣ１−４アルキルであり、前記置換トリアジン−２−イルＣ１−４アルキルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
イミダゾリルＣ１−４アルキルまたは置換イミダゾリルＣ１−４アルキルであり、前記置換イミダゾリルＣ１−４アルキルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
ベンゾチアゾリンＣ１−４アルキルまたは置換ベンゾチアゾリンＣ１−４アルキルであり、前記置換ベンゾチアゾリンＣ１−４アルキルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
フェノキサジンＣ１−４アルキル；
ベンジルｐ−トリルエーテル；
フェノキシベンジル；
Ｎ−アミジノピペラジニル−Ｎ−Ｃ１−４アルキル；
キノリンＣ１−４アルキル；
Ｎ−アミジノピペラジニル；
Ｎ−アミジノピペリジニルＣ１−４アルキル；
４−アミノシクロヘキシルＣ１−２アルキル；および
４−アミノシクロヘキシル。
【００２０】
特定実現例において、Ｅは−（ＺＲ４）−であり、Ｇは−（ＸＲ５）−であり、ここで、ＺはＣＨであり、Ｘは窒素であり、前記化合物は下記一般式（ＩＩ）を有する：
【化２】
2009538903.tif 000004
ここで、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ５は一般式（Ｉ）で定義した通りである。
【００２１】
特定実現例において、前記化合物は一般式（ＩＩＩ）を有する：
【化３】
2009538903.tif 000005
【００２２】
特定実現例において、Ｅは−（ＺＲ４）−であり、Ｇは不存在であり、この時、Ｚは窒素であり、前記化合物は下記一般式（ＩＶ）を有する：
【化４】
2009538903.tif 000006
ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＷは一般式（Ｉ）で定義した通りである。
【００２３】
特定実現例において、Ｅは−（ＺＲ４）−であり、Ｇは−（ＸＲ５）−であり、ここで、ＺおよびＸは独立にＣＨであり、前記化合物は一般式（Ｖ）の構造を有する：
【化５】
2009538903.tif 000007
ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＷは一般式（Ｉ）で定義した通りである。
【００２４】
特定実現例において、前記化合物は下記の一般式（ＶＩ）を有する：
【化６】
2009538903.tif 000008
【００２５】
本発明のこれらおよび関連側面は下記にてより詳細に記述する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明のリバースターンミメティック構造体を製造するための概略的な合成スキーム（ｓｃｈｅｍｅ）。
【図２】化合物Ａ（表２の１１１番）はβ−カテニン／ＴＣＦ転写を抑制する。化合物Ａは１．４５５μＭのＩＣ５０でβ−カテニン／ＴＣＦリポーター遺伝子構造体を選択的に抑制する。ＳＷ４８０細胞（１０５）がβ−カテニン／ＴＣＦルシフェラーゼ構造体をトランスフェクションさせた。細胞に化合物Ａ（１−５０μＭ）を処理した。処理２４時間後、細胞溶解物を作り、デュアルルシフェラーゼアッセイを行った。
【図３】化合物Ｂ（表２の１０番）はβ−カテニン／ＴＣＦ転写を抑制する。化合物Ｂは６．９７８μＭのＩＣ５０でβ−カテニン／ＴＣＦリポーター遺伝子構造体を選択的に抑制する。ＳＷ４８０細胞（１０５）にβ−カテニン／ＴＣＦルシフェラーゼ構造体をトランスフェクションさせた。細胞に化合物Ｂ（１−５０μＭ）を処理した。処理２４時間後、細胞溶解物を作り、デュアルルシフェラーゼアッセイを行った。
【図４】図４〜７：化合物による幹細胞の骨形成の調節。  化合物Ｂはヒト骨髄−由来の間葉幹細胞（ｈＢＭＭＳＣ）が骨細胞系（ｏｓｔｅｏｃｙｔｉｃ  ｌｉｎｅａｇｅ）に分化することを抑制する。化合物ＢをｈＢＭＭＳＣ細胞培養に添加し、細胞アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性を測定した。２０μＭの化合物Ｂはアルカリフォスファターゼ活性を強く抑制した。化合物Ｃ（表２の８２番）および化合物Ｄ（表２の６６番）はｈＢＭＭＳＣに２０μＭで処理した時にＡＬＰ数値（各々２００％、２０２％）を相当増強させた。
【図５】化合物ＣおよびＤは、骨形成誘導カクテル（ＯＩＣ）と共に処理した時も、また、ｈＢＭＭＳＣのミネラル化を強く誘導した。
【図６】色々な濃度の化合物ＣおよびＤを処理した時、２つの化合物は両方とも０．５μＭにおいても骨形成誘導活性（ミネラル化の刺激）を示した。
【図７】ＡＬＰ  ｍＲＮＡ発現はｈＢＭＭＳＣにおいて化合物ＣおよびＤの処理によって増加した。
【図８】図８〜１４：化合物による幹細胞の心筋形成の調節  ｐＥＧＦＰ−１のＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ部位の間にマウスα−ＭＨＣ遺伝子の１．８ｋｂプロモーター配列を含むベクトル構造体。
【図９】化合物Ｅ（表２の７１番）の処理（１０μＭ）は、蛍光顕微鏡下で観察した時に処理後の蛍光を増強させた。また、ＤＭＳＯ対照群と比較した時、５日目にその数値が相当増加した。
【図１０】ＤＭＳＯ処理した胚様体（ＥＢ）のＦＡＣＳ分析。蛍光（α−ＭＨＣポジティブ）を示す細胞集団は０．５４％であった。
【図１１】化合物Ｅ（１０μＭ）を処理した胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｉｅｓ）（ＥＢ）のＦＡＣＳ分析。蛍光（α−ＭＨＣポジティブ）を示す細胞集団は２．５０％であり、これは、ＤＭＳＯ処理したＥＢに比べて４．６倍増加したものである。
【図１２】図１２は、ＤＭＳＯ処理した対照群グループに比べ、化合物Ｅを処理したグループにおけるＥＧＦＰ（増強されたグリーン蛍光タンパク質）の発現数値の倍数増加を示す。化合物Ｅの心筋形成分化増進活性は濃度依存的であり、その効果は０．３μＭにおいても明らかなものであった。
【図１３】化合物Ｅを胚幹（ＥＳ）細胞に７日および１０日間処理した時、ＤＭＳＯ対照群に比べ、胚幹（ＥＳ）細胞においてＡＮＰおよびＮｋｘ２．５  ｍＲＮＡの発現数値を強く増加させた。
【図１４】化合物Ｂの処理は、マウス胚幹細胞を化合物Ｂ  １０μＭに５日間露出した時に蛍光発現を減少させた（０．２６：１＝化合物Ｂ：ＤＭＳＯ対照群）。
【図１５】化合物Ｆによる筋形成の調節（表２の１１２番）。  Ａ：Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞はこれらの細胞を、２％馬血清を含有する分化培地（ＤＭ）で３日間培養した時、分化して広範囲な筋管（ｍｙｏｔｕｂｅｓ）を形成した。  Ｂ：成長培地（ＧＭ）で培養し、化合物Ｆを処理したＣ２Ｃ１２細胞は広範囲な筋管形成を示した。  Ｃ：化合物Ｆのない成長培地（ＧＭ）で成長したＣ２Ｃ１２細胞は筋管形成を示さなかった。  Ｄ：化合物Ｆの処理はＭｙｏＤおよびＭｙｆ５タンパク質の発現も相当増加させた。
【図１６】ｗｎｔまたはＣＢＰまたはｐ３００と共にまたは関係なく（ｗｉｔｈ  ｏｒ  ｗｉｔｈｏｕｔ）化合物による筋形成の調節。  Ａ：Ｗｎｔ１条件化した（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）培地を化合物ＢおよびＦで処理するかまたは処理しなかった。Ｍｙｆ−５発現はＣ２Ｃ１２細胞においてＷｎｔ１処理によって増加し、その発現数値は化合物Ｆの共同処理でより増強された。化合物Ｂの処理はＣ２Ｃ１２細胞においてＭｙｆ−５の発現を減少させ、Ｗｎｔ１で共同投与された場合にはＷｎｔ１のＭｙｆ−５増強効果を相殺した。  Ｂ：ＣＢＰまたはｐ３００をテスト化合物と共にまたは共ではなく、Ｃ２Ｃ１２細胞に露出させ、Ｍｙｆ５タンパク質の細胞発現レベルを測定した。５μＭおよび１０μＭの化合物ＦはＤＭＳＯ対照群に比べて容量依存的にＭｙｆ５の発現を増加させた。５μＭおよび１０μＭの化合物ＢはＤＭＳＯ対照群に比べて容量依存的にＭｙｆ５の発現を減少させた。また、ｐ３００を化合物Ｂと共同投与すれば化合物ＢによるＭｙｆ５の発現減少が回復したが、ＣＢＰとの共同投与においては回復しなかった。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は幹細胞の分化を誘導または抑制する製剤およびそれに関連した方法を提供する。
【００２８】
これらの方法および製剤のより詳しい詳細を下記にて提供する。これらの詳細を提供する前に本技術の理解を助けるために下記にて定義を提供する。
【００２９】
定義
ここで用いられた「幹細胞」は任意の自己再生（ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ）の万能分化性細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）または多分化能細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）または複数の細胞類型に分化し得る先祖細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）または前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ）を意味する。本発明の方法に用いるのに好適な幹細胞は、骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）、骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｙｔｅ）のような骨細胞（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ）系、または心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ）または骨格筋細胞のような心筋系、平滑筋細胞、血液細胞、またはニューロンなどを含む。
【００３０】
ここで用いられた用語「分化」は、細胞が特定機能のために専門化される発達段階、例えば、細胞が初期細胞類型とは異なる１つ以上の形態的特性および／または機能を獲得する段階を意味する。用語「分化」はリニージコミットメント（ｌｉｎｅａｇｅ  ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）および末端分化段階を両方とも含む。分化は測定することができ、例えば、ＦＡＣＳ分析、免疫組織化学または当業界に知られた他の手続きを用いて系統マーカーの存在または不存在をモニターすることによって測定することができる。先祖細胞から由来した分化した子孫細胞（ｐｒｏｇｅｎｙ  ｃｅｌｌ）は、必ずそうではないが、幹細胞のソース組織と同一な組織の胚葉層と関連し得る。例えば、神経先祖細胞および筋肉先祖細胞は造血細胞系に分化し得る。
【００３１】
ここで用いられた「骨形成」は、骨細胞の増殖および骨組織の成長（すなわち、新しい骨基質（ｂｏｎｅ  ｍａｔｒｉｘ）の合成および沈着）を意味する。また、骨形成は先祖細胞または前駆細胞の骨細胞（すなわち、骨芽細胞）への分化またはトランス分化（ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を意味する。先祖細胞または前駆細胞は間葉幹細胞のような万能分化性幹細胞であり得る。先祖細胞または前駆細胞は骨芽細胞系（例えば、前骨芽細胞（ｐｒｅ−ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ  ｃｅｌｌｓ））または骨芽細胞系に予めに予定されていない細胞（例えば、前駆脂肪細胞（ｐｒｅ−ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ）または筋芽細胞）であり得る。
【００３２】
ここで用いられた用語「心筋形成」は、先祖細胞または前駆細胞が心筋細胞に分化することおよび心筋組織の成長を意味する。先祖細胞または前駆細胞は胚幹細胞のような万能分化性幹細胞であり得る。前駆細胞または前駆細胞は、例えば、前駆心筋細胞（ｐｒｅｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｃｅｌｌｓ））のように心筋系に予めに予定された細胞であり得るし、または予めに予定されていない細胞（例えば、多分化能成体幹細胞）であり得る。
【００３３】
用語「癌幹細胞（ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）」は相当期間の寛解後に新しい腫瘍を開始させることができる腫瘍内の細胞の下位集団を意味する。これらは癌幹細胞が正常な組織幹細胞と類似する、長寿（ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ）、休止（ｑｕｉｅｓｃｅｎｃｅ）、および自己再生（ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ）のような独特の属性を有することに起因すると推測される。自己再生は幹細胞が均衡的分裂によって類似する娘細胞を生産する方法である。
【００３４】
β−カテニンは当業界によく知られたタンパク質をいう。Ｍｏｒｉｎ，Ｐ．Ｊ．，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  ２１：１０２１−３０（１９９９）；Ｇｏｔｔａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１１：Ｒ７９２−４（２００１）；Ｈｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １０５：３９１−４０２（２００１）を参照。β−カテニンは血漿膜における細胞付着の媒介因子および転写活性化因子として知られている。
【００３５】
用語「ＣＢＰタンパク質」はＣＲＥＢ−結合タンパク質として知られたタンパク質を意味し、ＣＲＥＢは「ｃＡＭＰ−反応要素結合」の略語である。このタンパク質は当業界によく知られている。例えば、Ｔａｋｅｍａｒｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４９：２４９−５４（２０００）および米国特許番号第６，０６３，５８３号を参照。
【００３６】
用語「ｐ３００タンパク質」は当業界によく知られたタンパク質を意味する。Ｇｕｓｔｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００３  Ｆｅｂ  ２８；２７８（９）：６８３８−４７；Ａｎ  ａｎｄ  Ｒｏｅｄｅｒ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００３  Ｊａｎ  １７；２７８（３）：１５０４−１０；Ｒｅｂｅｌ，Ｖ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００２  Ｎｏｖ  １２；９９（２３）：１４７８９−９４；米国特許番号第５，６５８，７８４号、およびその中に引用された参考文献を参照。
【００３７】
「細胞が増殖するよりは分化する可能性」という語句は細胞が増殖するよりは分化する可能性をいう。そのような可能性は与えられた条件下で分化する細胞数に対し増殖する細胞数の比率によって表現および／または測定される。「細胞が増殖するよりは分化する可能性を増加させる」製剤は、反応混合物に化合物が不存在である時の比率と比較した時、反応混合物内に化合物が存在する時に分化する細胞数に対し増殖する細胞数の比率を増加させる化合物をいう。同じく、「細胞が分化するよりは増殖する可能性を増加させる」製剤は、反応混合物に化合物が不存在である時の比率と比較した時、反応混合物内に化合物が存在する時に増殖する細胞数に対し分化する細胞数の比率を増加させる化合物をいう。
【００３８】
「Ｗｎｔ経路」とは、Ｗｎｔタンパク質（分泌された糖タンパク質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ））がｆｒｉｚｚｌｅｄ  ｓｅｖｅｎ−ｔｒａｎｓ−ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｓｐａｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓに結合することによって開始され得る信号伝達カスケードを意味する。この経路は当業界に知られて特徴が明らかになっており、多くの論文およびレビューの対象となった（例えば、Ｈｕｅｌｓｋｅｎ  ａｎｄ  Ｂｅｈｒｅｎｓ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１５：３９７７−８，２００２；Ｗｏｄａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１４：５９−８８（１９９８）；Ｍｏｒｉｎ，Ｐ．Ｊ．，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  ２１：１０２１−３０（１９９９）；Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：１６４４−４６（２００２）；Ｏｖｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．３２：４４８−５７（２００２）；Ｓａｋａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐｒｏｇ．Ｈｏｒｍ．Ｒｅｓ．５５：２２５−３６、２０００参照）。
【００３９】
製剤（ａｇｅｎｔ）
本発明の一側面は前記記述された方法に用いることができる製剤を提供することにある。本発明の方法に有用な製剤は一般式（Ｉ）の化合物をスクリーニングすることによって識別され得る：
【化７】
2009538903.tif 000009
ここで：
Ｅは−（ＺＲ４）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり；
Ｇは不存在であるか、−（ＸＲ５）−、または−（Ｃ＝Ｏ）−であり；
Ｗは−Ｙ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＳＯ２）−または不存在であり；
Ｙは酸素または硫黄であり；
ＸまたはＺは独立に窒素またはＣＨであり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は同じであるか異なり、下記群から独立に選択される：
アミノ酸側鎖部分；
Ｃ１−１２アルキルまたは置換Ｃ１−１２アルキルであり、前記置換Ｃ１−１２アルキルはアミノ、グアニジノ、Ｃ１−４アルキルグアニジノ、ジＣ１−４アルキルグアニジノ、アミジノ、Ｃ１−４アルキルアミジノ、ジＣ１−４アルキルアミジノ、Ｃ１−５アルキルアミノ、ジＣ１−５アルキルアミノ、スルフィド、カルボキシル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
Ｃ１−６アルコキシ；
Ｃ６−１２アリールまたは置換Ｃ６−１２アリールであり、前記置換Ｃ６−１２アリールはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシル、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
窒素、酸素または硫黄から選択される１〜２個のヘテロ原子を有し得る単環式アリール−アルキル、または置換された単環式アリール−アルキルであり、前記単環式アリール−アルキルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
窒素、酸素または硫黄から選択される１〜２個のヘテロ原子を有し得る８〜１０環構成員を有する二環式アリール−アルキル、または置換された二環式アリール−アルキルであり、前記置換された二環式アリール−アルキルはハロゲン、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、シアノ、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
窒素、酸素または硫黄から選択される１〜２個のヘテロ原子を有し得る５〜１４環構成員を有する三環式アリール−アルキル、または置換された二環式アリール−アルキルであり、前記置換された二環式アリール−アルキルはハロゲン、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、シアノ、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
アリールＣ１−４アルキルまたは置換アリールＣ１−４アルキルであり、前記置換アリールＣ１−４アルキルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、Ｃ３−６シクロアルキル、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシル、シアノ、スルフリル、ヒドロキシル、アミド、Ｃ１−６アルキルオキシＣ１−６アシル、およびモルホリニル（ｍｏｒｐｈｏｒｌｉｎｙｌ）Ｃ１−６アルキルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
シクロアルキルアルキルまたは置換シクロアルキルアルキルであり、前記置換シクロアルキルアルキルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシル、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；および
シクロアルキルまたは置換シクロアルキルであり、前記置換シクロアルキルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシル、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する。
【００４０】
特定実現例において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は同じであるか異なり、下記群から独立に選択される：
Ｃ１−１２アルキルまたは置換Ｃ１−１２アルキルであり、前記置換Ｃ１−１２アルキルはアミノ、グアニジノ、Ｃ１−４アルキルグアニジノ、ジＣ１−４アルキルグアニジノ、アミジノ、Ｃ１−４アルキルアミジノ、ジＣ１−４アルキルアミジノ、Ｃ１−５アルキルアミノ、ジＣ１−５アルキルアミノ、スルフィド、カルボキシル、ヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
Ｃ１−６アルコキシ；
シクロアルキルＣ１−３アルキル；
シクロアルキル；
フェニルまたは置換フェニルであり、前記置換フェニルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシル、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
フェニルＣ２−４アルキルまたは置換フェニルＣ２−４アルキルであり、前記置換フェニルＣ２−４アルキルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシル、シアノ、スルフリル、スルフィド、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
ナフチルまたは置換ナフチルであり、前記置換ナフチルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシル、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
ナフチルＣ１−４アルキルまたは置換ナフチルＣ１−４アルキルであり、前記置換ナフチルＣ１−４アルキルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシル、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
ベンジルまたは置換ベンジルであり、前記置換ベンジルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、トリフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシル、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
ビスフェニルメチルまたは置換ビスフェニルメチルであり、前記置換ビスフェニルメチルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシル、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
ベンジルフェニルアミド、または置換ベンジルフェニルアミドであり、前記置換ベンジルフェニルアミドはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシル、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
ピリジルまたは置換ピリジルであり、前記置換ピリジルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシル、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
ピリジルＣ１−４アルキルまたは置換ピリジルＣ１−４アルキルであり、前記置換ピリジルＣ１−４アルキルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシル、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
ピリミジルＣ１−４アルキル、または置換ピリミジルＣ１−４アルキルであり、前記置換ピリミジルＣ１−４アルキルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシル、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
トリアジン−２−イルＣ１−４アルキル、または置換トリアジン−２−イルＣ１−４アルキルであり、前記置換トリアジン−２−イルＣ１−４アルキルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
イミダゾリルＣ１−４アルキルまたは置換イミダゾリルＣ１−４アルキルであり、前記置換イミダゾリルＣ１−４アルキルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
ベンゾチアゾリンＣ１−４アルキルまたは置換ベンゾチアゾリンＣ１−４アルキルであり、前記置換ベンゾチアゾリンＣ１−４アルキルはアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、ハロゲン、ペルフルオロＣ１−４アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリル、およびヒドロキシルから独立に選択される１つ以上の置換体を有する；
フェノキサジンＣ１−４アルキル；
ベンジルｐ−トリルエーテル；
フェノキシベンジル；
Ｎ−アミジノピペラジニル−Ｎ−Ｃ１−４アルキル；
キノリンＣ１−４アルキル；
Ｎ−アミジノピペラジニル；
Ｎ−アミジノピペリジニルＣ１−４アルキル；
４−アミノシクロヘキシルＣ１−２アルキル；および
４−アミノシクロヘキシル。
【００４１】
ここで用いられる用語「アミノ酸側鎖部分」は、表１で確認した天然アミノ酸側鎖部分を含み（これらに限定されず）、天然タンパク質に存在する任意のアミノ酸側鎖部分を示す。本発明の他の天然アミノ酸側鎖部分は、３，５−ジブロモチロシン、３，５−ジヨード（ｉｏｄｏ）チロシン、ヒドロキシリジン、γ−カルボキシグルタメート、ホスホチロシン、およびホスホセリンの側鎖部分を含むが、これらに限定されない。それに加えて、グリコシル化トレオニン、セリン、およびアスパラギンを含む（但し、これらに限定されない）グリコシル化アミノ酸の側鎖部分が本発明の実施に使用され得る。
【００４２】
【表１】
2009538903.tif 000010
【００４３】
特定実現例において、Ｅは−（ＺＲ４）−であり、Ｇは−（ＸＲ５）−であり、ここで、ＺはＣＨであり、Ｘは窒素であり、前記化合物は下記一般式（ＩＩ）を有する：
【化８】
2009538903.tif 000011
ここで、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ５は一般式（Ｉ）で定義した通りである。
【００４４】
特定実現例において、前記化合物は下記一般式（ＩＩＩ）を有する：
【化９】
2009538903.tif 000012
【００４５】
特定実現例において、Ｅは−（ＺＲ４）−であり、Ｇは不存在であり、ここで、Ｚは窒素であり、前記化合物は下記一般式（ＩＶ）を有する：
【化１０】
2009538903.tif 000013
ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＷは一般式（Ｉ）で定義した通りである。
【００４６】
特定実現例において、Ｅは−（ＺＲ４）−であり、Ｇは−（ＸＲ５）−であり、ここで、ＺおよびＸは独立にＣＨであり、前記化合物は下記一般式（Ｖ）の構造を有する：
【化１１】
2009538903.tif 000014
ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＷは一般式（Ｉ）で定義した通りである。
【００４７】
特定実現例において、前記化合物は下記一般式（ＶＩ）を有する：
【化１２】
2009538903.tif 000015
【００４８】
これらの化合物は、適当な出発成分分子（以下、「成分片」と呼ぶ）を利用することにより、製造され得る。簡単に言えば、一般式（Ｉ）を有するリバースターンミメティック構造体の合成では、第１および第２成分片をカップリングして結合された第１−第２中間体を形成し、もし必要なら、第３および／または第４成分片をカップリングして結合された第３−第４中間体を形成し（または、もし市販されているなら、単一の第３中間体を使用してもよい）、結合された第１−第２中間体および第３−第４中間体（または第３中間体）をカップリングして第１−第２−第３−第４中間体（または、第１−第２−第３中間体）を形成し、これを閉環して、本発明のリバースターンミメティック構造体が得られる。他の方法としては、一般式（Ｉ）のリバースターンミメティック構造体は、個々の成分片を溶液中にて段階的に順次カップリングするか、または固相ペプチド合成で一般的に実施されているような固相合成によって製造することができる。
【００４９】
本発明の化合物を製造するための具体的な成分片およびその組立体は、図１に例示されている。例えば、「第１成分片」は、以下の式Ｓ１を有する：
【化１３】
2009538903.tif 000016
【００５０】
前記式において、Ｒ2は、上で定義した通りであり、そしてＲは、ペプチド合成で使用するのに適当な保護基である。この保護基は、固相合成を可能にするために、高分子支持体に結合されていてもよい。適当なＲ基には、アルキル基を含み、好ましい実施形態では、Ｒは、メチル基である。図１において、Ｒ基の１つは、高分子（固体）支持体であり、図面において「Ｐｏｌ」と表す。このような第１成分片は、ＣＨ（ＯＲ）2−ＣＨＯとＨ2Ｎ−Ｒ2の還元アミノ化により、または、Ｈ2Ｎ−Ｒ2とＣＨ（ＯＲ）2−ＣＨ2−ＬＧ（ここで、ＬＧは、離脱基、例えば、ハロゲン（Ｈａｌ）基を意味する）との置換反応により、容易に合成され得る。
【００５１】
本発明の「第２成分片」は、以下の式Ｓ２を有する：
【化１４】
2009538903.tif 000017
【００５２】
前記式において、Ｐは、ペプチド合成で使用するのに適当なアミノ保護基であり、Ｌ1は、ヒドロキシルまたはカルボキシル活性化基であり、Ｒ3は、上で定義した通りである。好ましい保護基には、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、メチルオキシカルボニル（ＭＯＣ）、９Ｈ−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、およびアリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）を含む。Ｎ−保護アミノ酸は、市販されており；例えば、ＦＭＯＣアミノ酸は、種々の供給源から市販されている。第２成分片を第１成分片と反応させるために、Ｌ１は、カルボキシル活性化基であり、また、カルボキシル基のカルボキシル活性化基への変換は、カルボキシル基の活性化について、当該分野において公知の方法で容易に達成され得る。適当な活性化カルボン酸基は、酸ハロゲン化物（ここで、Ｌ1は塩素または臭素などのハロゲン化物）、酸無水物（ここで、Ｌ1はアセチルのようなアシル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルおよびペンタフルオロフェニルエステルのような反応性エステル）、およびジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）のようにカルボジイミドを使用してカップリング反応で形成された活性中間体のようなその他の活性化中間体を含む。従って、商業的に市販されているＮ−保護アミノ酸は、当業界の技術者に公知の手段によって、カルボキシル活性化形態に変換することができる。
【００５３】
第２成分片として作用するアミノ酸のアジド誘導体の場合、このような化合物は、Ｚａｌｏｏｍら（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４６：５１７３〜７６，１９８１）で開示された反応により、対応するアミノ酸から製造され得る。
【００５４】
また他の方法としては、本発明の第１成分片は、以下の式Ｓ１’を有し得る。
【化１５】
2009538903.tif 000018
【００５５】
前記式において、Ｒは、上で定義した通りであり、そしてＬ2は、ハロゲン原子またはトシル基のような脱離基であり、本発明の第２成分片は、以下の式Ｓ２’を有し得る。
【化１６】
2009538903.tif 000019
【００５６】
前記式において、Ｒ2、Ｒ3およびＰは、上で定義した通りである。
【００５７】
本発明の「第３成分片」は、以下の式Ｓ３を有し得る：
【化１７】
2009538903.tif 000020
【００５８】
前記式において、Ｇ、Ｅ、Ｌ1、およびＬ2は、上で定義した通りである。適当な第３成分片は、種々の供給源から市販されているか、または有機化学における任意の公知方法により製造できる。
【００５９】
従って、上で例示した通り、一般式（Ｉ）を有するリバースターンミメティック構造体は、第１成分片を第２成分片と反応させて結合された第１−第２中間体を形成し、続いて、結合された第１−第２中間体を第３−第４中間体と（または第３成分片と）反応させて結合された第１−第２−第３−第４中間体（または結合された第１−第２−第３中間体）を形成した後、この中間体を閉環して、リバースターンミメティック構造体を得ることにより、合成され得る。
【００６０】
使用方法
本発明は、β−カテニン／ＴＣＦによって誘導される転写のサブセットを抑制する一般式（Ｉ）の化合物を提供する。
【００６１】
１つの特徴は、本発明はＷＮＴ／β−カテニン経路によって標的になる遺伝子の発現を選択的に抑制する方法を提供し、前記方法は組成物に化合物を投与することを含み、前記組成物はＷＮＴ／β−カテニン経路によって標的になる遺伝子を含み、前記化合物はＷＮＴ／β−カテニン経路によって標的になる遺伝子らの発現に変化を引き起こす。
【００６２】
また他の一側面において、本発明は幹細胞の分化を誘導する方法を提供し、幹細胞と特定系統、例えば骨芽細胞、骨細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、血液細胞、ニューロン、および膵β細胞への細胞分化を誘導する製剤を接触させることを含む。
【００６３】
細胞増殖および細胞分化は当業界に知られた任意の適当な方法によって特徴づけられる。そのような方法は実施例に記述されたようなフロー細胞係数分析法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＴ、および細胞増殖分析法などを含む。
【００６４】
また他の特徴は、本発明は未分化状態の幹細胞を維持させる方法を提供し、これは、細胞分化を抑制するか細胞増殖を増進させる薬剤と幹細胞を未分化状態の幹細胞に維持するのに有効な量で接触させることを含む。
【００６５】
幹細胞治療法は特定細胞タイプの異常機能による未成熟死亡および身体がこれを代替したり回復したりすることに失敗することによって引き起こされる多くの退行性疾患を治療する機会を提供する。幹細胞の可能な治療的用途は臓器移植のための患者の免疫的条件化（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）、筋ジストロフィー、多発硬化症、およびリウマチ関節炎のような自己免疫疾患の治療、脳卒中、脊髄損傷、および火傷のような損傷組織の回復、ルー・ゲーリック病、パーキンソン病、ハンチントン病、およびアルツハイマー病などの神経系症状のような神経退行性疾患の治療、白血病、鎌状赤血球貧血、心臓疾患、および糖尿の治療を含む。大部分の幹細胞治療法のために、胚幹細胞または成体幹細胞が試験管内で培養、所望の細胞への分化誘導、および患者に移植され得る。幹細胞を成功的に培養するために、幹細胞は未分化条件に維持させなければならない。
【００６６】
幹細胞を未分化条件に維持させるために、細胞増殖を促進または細胞分化を抑制する化合物のような本発明による化合物は幹細胞培養の様々な段階で使用され得る。例えば、このような化合物は幹細胞がそれらのソース組織から分離される時に使用され得る。他の方法としては、それは培養の特定培養期間後に培養培地に添加され得る。また、それは幹細胞を未分化状態に維持させるために培養培地に継続的に存在することもできる。化合物の濃度は、幹細胞が未分化状態に維持される、または幹細胞の分化が化合物がない場合に培養された幹細胞の場合に比べて減少する、そして細胞培養物の他の特徴が逆に影響（例えば、細胞生存率および細胞増殖率）を受けないレベルに化合物の量を調整することによって最適化し得る。
【００６７】
本発明のこれらおよび他の方法は化合物Ａ〜Ｆおよびその同族体としてここで識別された化学薬剤と同じ化学薬剤で実行され得る。
【００６８】
薬学組成物および投与
本発明による化合物は投与に好適な薬学組成物に含まれ得る。そのような組成物は典型的に化合物および薬学的に許容可能な担体（ｃａｒｒｉｅｒ）を含む。「薬学的に許容可能な担体」は薬学投与に利用可能な溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張、および吸収遅延剤などをいう。薬学活性成分のためのそのような媒質または薬剤の利用は当業界によく知られている。また、補助活性化合物もその組成物に含まれ得る。
【００６９】
本発明の薬学組成物は治療的処置のために非経口的、局所的、経口的または局部的に投与され得る。例えば、水、緩衝水、０．４％食塩水、０．３％グリシンなどの様々な水性担体が使用され得、アルブミン、脂質蛋白、グロブリンなどのような安定性を強化する他のタンパク質を含むことができる。その結果、組成物は既存のよく知られた滅菌技法によって滅菌され得る。その溶液は使用のために包装され得、無菌条件で濾過され冷凍乾燥され得るし、前記冷凍乾燥された製造物は投与前に滅菌された溶液と混合される。
【００７０】
経口組成物は一般的に不活性希釈剤または食用担体を含む。それらはゼラチンカプセルに封じ込められるかまたは錠剤に圧縮されている。経口治療的投与の目的のために、前記活性化合物は賦形剤と共に含まれ、錠剤、トローチまたはカプセルの形態で使用され得る。薬学的に利用可能な結合剤、および／または補助（ａｄｊｕｖａｎｔ）物質が前記組成物の部分として含まれ得る。前記錠剤、丸、カプセル、トローチなどは下記成分のうちの１つまたは類似する属性の化合物を含むことができる：結合剤（例えば、微晶質のセルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたは乳糖）、崩壊剤（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（例えば、アルギン酸、プリモゲル、またはコーンスターチ）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはステローツ（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ））；グリダント（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘美剤（例えば、サッカロースまたはサッカリン）；または香味剤（例えば、ペパーミント、メチルサリチル酸、またはオレンジ香り）。
【００７１】
吸入による投与のために、前記化合物は好適な噴射剤（例えば、二酸化炭素のような気体）を含む圧縮容器または分配器または噴霧器（ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ）からエアロゾルスプレーの形態で伝達される。
【００７２】
また、全身投与は経粘膜（ｔｒａｎｓｍｕｃｏｓａｌ）または経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）手段による。経粘膜または経皮投与のために、染み込まれる障壁に適した浸透剤が調製に使用される。このような浸透剤は当業界に一般的に知られており、例えば、経粘膜投与のためにデタージェント（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ）、胆汁塩（ｂｉｌｅ  ｓａｌｔｓ）、およびフシジン酸（ｆｕｓｉｄｉｃ  ａｃｉｄ）誘導体を含む。経粘膜投与は鼻スプレーまたは坐剤の使用によって達成され得る。経皮投与のためには、活性化合物は当業界に一般的に知られた軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔｓ）、膏薬（ｓａｌｖｅｓ）、ゲル、またはクリームに製造され得る。
【００７３】
一実施例において、その活性化合物は移植および微細カプセル化した伝達システムを含む制御された放出剤形のような、その化合物を体内から急速に除去することから保護する担体と共に製造される。生分解可能な、生利用可能なポリマーが使用され得、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などがある。このような剤形を製造する方法は当業者に明らかなものである。また、その物質は、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．で市販されている。
【００７４】
投与の便宜性および服用量の単一性のために、服用量単位形態で経口または非経口の組成物を調製することが特に有利な点がある。ここで使われた服用量単位形態は処置される患者に対する単一服用量であって、適した物理的に区別された単位をいう。それぞれの単位は必要な薬学キャリアと連合して所望の治療効果を算出するように計算された活性成分の所定量を含む。本発明の服用量単位形態の詳細は活性成分の独特の特徴および達成しようとする特定の治療効果および個々人の治療のための活性化合物を調製する技術の固有な制約に直接に依存し、それによって指示される。
【００７５】
このような化合物の毒性および治療効果は、細胞培養における標準薬学手続きまたは実験動物、例えば、ＬＤ５０（母集団の５０％に致死量）およびＥＤ５０（母集団の５０％に治療的有効量）を決定するための実験動物によって決定され得る。毒性および治療効果間の量の比率は治療指標であり、これはＬＤ５０／ＥＤ５０と表すことができる。大きい治療指標を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物が使用され得るが、病的な状態ではない細胞に潜在的損傷を最小化し、それによる副作用を減らすために、このような化合物が影響を受ける組織の部位に到達するようにする伝達システムを設計するのに注意を払うべきである。
【００７６】
細胞培養測定法および動物研究から得たデータはヒトに使用するための服用量の範囲を公式化するのに用いられ得る。このような化合物の服用量は、好ましくは、毒性がほぼまたは全くないＥＤ５０を含む循環濃度（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）の範囲内でなければならない。服用量は使用された服用形態および利用される投与経路に応じてこの範囲内で変えることができる。本発明の方法で用いられる任意の化合物に対し、治療的有効量は、初めには細胞培養測定法によって算定され得る。その量は細胞培養物で決定されたＩＣ５０（症状の最大値の半抑制を達成するテスト化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために動物モデルで公式化され得る。そのような情報はヒトに有用な量をより正確に決定するのに用いられ得る。血漿内のレベルは、例えば、高性能液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
【００７７】
（表２）
本発明の化合物から選択された化合物の生活性テストおよびこれらの％変化数値であり、これらは実施例２および３に記述された骨形成分析法および心筋形成分析法によって測定された。
【表２】
2009538903.tif 000021
【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
2009538903.tif 000027
【表９】
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【表１０】
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【表１１】
2009538903.tif 000030
【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【実施例】
【００７８】
次の実施例は本発明を説明するために提供されるものであって、本発明を限定するものではない。
【００７９】
製造例
製造例１
Ｎ−ベンジルカルバモイル−Ｎ’−メチル−ヒドラジノ酢酸の製造
（１）Ｎ−Ｂｏｃ−Ｎ−メチルヒドラジンの製造
【化１８】
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【００８０】
アイスウォーターエクスターナルバス（ｉｃｅ−ｗａｔｅｒ  ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｂａｔｈ）中で、水（２．０Ｌ）中のメチルヒドラジンスルフェート（１００ｇ、０．６９３ｍｏｌ）攪拌懸濁液にＮａＨＣＯ３をｐＨ１１〜１２になるように徐々に添加した。前記反応混合物を激しく攪拌し、その溶液にＴＨＦ（２．０Ｌ）中のＤｉＢｏｃ（１．１当量）を注いだ。室温で一晩中攪拌した後、有機層を除去し、エチルアセテート（１．０Ｌ  Ｘ  ３）で抽出した。前記混合溶液（ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を硫酸ナトリウムで乾燥し、真空中で蒸発させ、前記表題化合物（８０ｇ、７９％、淡い黄色オイル化合物）を得、その化合物をさらに精製することなく次のステップに用いた。
【００８１】
（２）Ｎ−Ｂｏｃ−Ｎ−メチル−Ｎ’−ベンジルカルバモイル−ヒドラジンの製造
【化１９】
2009538903.tif 000044
【００８２】
５．０Ｌの２首丸底フラスコ（ｔｗｏ−ｎｅｃｋｅｄ、ｒｏｕｎｄ−ｂｏｔｔｏｍ−ｆｌａｓｋ）にガラス栓（ｇｌａｓｓ  ｓｔｏｐｐｅｒ）および塩化カルシウムチューブを装着した。アイスウォーターエクスターナルバス（ｉｃｅ−ｗａｔｅｒ  ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｂａｔｈ）中で、フラスコ内にあるＴＨＦ（５００ｍｌ）中のＮ’−Ｂｏｃ−Ｎ’−メチルヒドラジン（８０ｇ、０．５４７ｍｏｌ）の攪拌溶液にＴＨＦ（３０ｍｌ）中のベンジルイソシアネート（３９ｍＬ、３００ｍｍｏｌ）を滴下漏斗（ｆｕｎｎｅｌ）を介して徐々に添加した。２時間後、前記溶液を蒸発させた。残留物をヘキサンに懸濁させ（少量のエチルアセテートを使用）、白色固体を得た。前記分離された無色固体を濾過し、最小量のヘキサンで洗浄し、真空中で一晩中乾燥して、前記表題化合物（１２４ｇ、８１％、白色固体）を得た。
【００８３】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δ１．４１（９Ｈ、ｓ）、δ３．１０（３Ｈ、ｓ）、δ４．４５（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝６Ｈｚ）、δ５．７１（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝６Ｈｚ）、δ７．０４（１Ｈ、ｂｒ）、δ７．２８（５Ｈ、ｍ）
【００８４】
（３）Ｎ−メチル−Ｎ’−ベンジルカルバモイル−ヒドラジンの製造
【化２０】
2009538903.tif 000045
【００８５】
５．０Ｌの２首丸底フラスコにガラス栓および塩化カルシウムチューブに連結された還流冷却器（ｒｅｆｌｕｘ  ｃｏｎｄｅｎｓｅｒ）を装着した。４Ｍ  ＨＣｌ（ジオキサン（ｄｉｏｘａｎｅ）中、５００ｍｌ）中のＮ−ベンジルカルバモイル−Ｎ−Ｂｏｃ−Ｎ’−メチルヒドラジン（１２４ｇ、０．４４３ｍｏｌ）の溶液を前記フラスコに入れ、１，４−ジオキサン（３Ｌ）を攪拌しながら添加した。前記反応混合物を室温で一晩中攪拌し、真空中で蒸発させ、アイスウォーターエクスターナルバス（ｉｃｅ−ｗａｔｅｒ  ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｂａｔｈ）中でＮａＨＣＯ３水溶液を徐々に添加した（ｐＨ１１〜１２）。水性層をエチルアセテートで分離し（３回）、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。前記残留物を真空中で蒸発させ、ヘキサンおよびＥｔＯＡｃに懸濁させて、白色固体を得た。前記固体を濾過し、最小量のヘキサンで洗浄し、真空中で一晩中乾燥して、前記表題化合物（７２ｇ、９１％、白色固体）を得た。
【００８６】
（４）ｔ−ブチルＮ−ベンジルカルバモイル−Ｎ’−メチル−ヒドラジノ酢酸の製造
【化２１】
2009538903.tif 000046
【００８７】
３Ｌの２首丸底フラスコにガラス栓およびカルシウムチューブに連結された還流冷却器を装着した。トルエン：ＤＭＦ（８００ｍＬ：１００ｍＬ＝ｖ／ｖ：８／１）の共溶媒（ｃｏ−ｓｏｌｖｅｎｔ）９００ｍＬ中のＮ−ベンジルカルバモイル−Ｎ’−メチルヒドラジン（７２ｇ、０．４０２ｍｏｌ）懸濁液を前記フラスコに添加し、Ｋ２ＣＯ３（２８１ｇ）を添加した。７０〜８０℃で１時間加熱した後、トルエン（１００ｍｌ）中のｔ−ブチルブロモアセテート（１．１当量）溶液を徐々に添加し、７０〜８０℃で５時間攪拌した。前記混合物を濾過し、ＥｔＯＡｃ（１．０Ｌ  Ｘ  ３）で抽出した。前記有機溶液を塩水（ｂｒｉｎｅ、１．０Ｌ  Ｘ  ３）で洗浄し、蒸発させ、その残留物をヘキサンおよびＥｔＯＡｃに懸濁させて、白色固体を得た。前記固体を濾過し、最小量のヘキサンで洗浄し、真空中で一晩中乾燥して、前記表題化合物（１０５ｇ、９０％、白色固体）を得た。
【００８８】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δ１．４６（９Ｈ、ｓ）、δ２．７０（３Ｈ、ｓ）、δ３．４２（２Ｈ、ｂｒ）、δ４．４５（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝６Ｈｚ）、δ６．２２（１Ｈ、ｂｒ）δ６．４１（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝６Ｈｚ）、δ７．３１（５Ｈ、ｍ）
【００８９】
（５）Ｎ−ベンジルカルバモイル−Ｎ’−メチル−ヒドラジノ酢酸の製造
【化２２】
2009538903.tif 000047
【００９０】
３Ｌの２首丸底フラスコにガラス栓および塩化カルシウムチューブを装着した。アイスウォーターエクスターナルバス（ｉｃｅ−ｗａｔｅｒ  ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｂａｔｈ）中で、ＨＣｌ（２００ｍＬ、ジオキサン中の４Ｍ溶液）中のＮ−ベンジルカルバモイル−Ｎ’−メチル−ヒドラジノ酢酸ｔ−ブチルエステル（１０５ｇ、０．３５８ｍｏｌ）溶液を添加し、激しく攪拌し、室温に加熱した。１，４−ジオキサン（２．０Ｌ）を前記反応溶液に添加した。室温で一晩中攪拌した後、前記溶液を４０℃の吸引装置による真空（ａｓｐｉｒａｔｏｒ  ｖａｃｕｕｍ）状態で回転式蒸発器（ｒｏｔａｒｙ  ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）で完全に濃縮した。飽和水性ＮａＨＣＯ３溶液を添加し、前記水性層をＥｔＯＡｃ（１．０Ｌ  Ｘ  ２）で洗浄した。濃い塩酸を０℃で徐々に滴下した（ｐＨ２−３）。前記混合物をＥｔＯＡｃ（１．０Ｌ  Ｘ  ２）で抽出し、前記有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させた。前記残留物をｎ−ヘキサンおよびＥｔＯＡｃを用い、結晶化によって精製して前記表題化合物を得、真空中で蒸発させた（７５ｇ、白色固体８９％を得る）。
【００９１】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ２．７９（３Ｈ、ｓ）δ３．４６〜３．５８（２Ｈ、ｂｒ）、δ４．４３（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝６Ｈｚ）、δ６．５３（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝６Ｈｚ）、δ７．２９（５Ｈ、ｍ）、δ７．８０（１Ｈ、ｓ）、δ１２．３８（１Ｈ、ｂｒ）
【００９２】
製造例２
Ｎ−ベンジルカルバモイル−Ｎ’−４−フルオロベンジル−ヒドラジノ酢酸の製造
（１）Ｎ−ベンジルカルバモイル−Ｎ’−Ｂｏｃ−ヒドラジンの製造
【化２３】
2009538903.tif 000048
【００９３】
ＴＨＦ（２．０Ｌ）中のＢｏｃ−カルバザート（Ｂｏｃ−Ｃａｒｂａｚａｔｅ、２００ｇ、１．５１ｍｏｌ）溶液を入れ、ＴＨＦ中のベンジルイソシアネート（１．１当量）溶液を添加した。６時間後、前記溶液を真空中で蒸発させた。前記残留物をヘキサン／ＥＡに懸濁させ、白色固体を得た。前記分離された無色固体を濾過し、最小量のヘキサンで洗浄し、真空下で一晩中乾燥して、前記表題化合物（白色固体、３８０ｇ、９５％）を得た。
【００９４】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、３００ＭＨｚ）δ２．８９〜３．０８（２Ｈ、ｍ）、４．１９（４Ｈ、ｍ）、７．２７〜７．４０（８Ｈ、ｍ）、７．６４〜７．７３（２Ｈ、ｍ）、７．８７（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝６Ｈｚ）
【００９５】
（２）Ｎ−ベンジルカルバモイル−ヒドラジンの製造
【化２４】
2009538903.tif 000049
【００９６】
前記化合物（３８０ｇ、１．４３ｍｏｌ）を添加した。アイスウォーターバス中で、ＨＣｌ（１Ｌ、ジオキサン中の４Ｍ溶液）および１，４−ジオキサン（３Ｌ）の溶液を激しく攪拌しながら徐々に添加した。前記反応混合物を常温で６時間攪拌した。前記溶液を４０℃の吸引装置による真空（ａｓｐｉｒａｔｏｒ  ｖａｃｕｕｍ）状態で回転式蒸発器（ｒｏｔａｒｙ  ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）で完全に濃縮した。前記残留物をヘキサン／ＥＡに懸濁させ、白色固体を得た。前記分離された無色固体を濾過し、最小量のヘキサンで洗浄し、真空下で一晩中乾燥して、前記表題化合物（白色固体、２７０ｇ、９４％）を得た。
【００９７】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、３００ＭＨｚ）δ２．８９〜３．０８（２Ｈ、ｍ）、４．１９（４Ｈ、ｍ）、７．２７〜７．４０（８Ｈ、ｍ）、７．６４〜７．７３（２Ｈ、ｍ）、７．８７（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝６Ｈｚ）
【００９８】
（３）ｔ−ブチルＮ−ベンジルカルバモイル−ヒドラジノ酢酸の製造
【化２５】
2009538903.tif 000050
【００９９】
１０Ｌの２首丸底フラスコにガラス栓およびカルシウムチューブに連結された還流冷却器を装着した。４Ｌのトルエン：ＤＭＦ（３Ｌ：１Ｌ）共溶媒中のＮ−ベンジルカルバモイル−ヒドラジン（２７０ｇ、１．３４ｍｏｌ）溶液を添加した。ジイソプロピルエチルアミン（１．１当量）を０℃で３０分間徐々に添加した。前記反応混合物を常温に加熱し、Ｋ２ＣＯ３（３．０当量）を徐々に添加した。トルエン中のｔ−ブチルブロモアセテート（１．１当量）溶液を滴下漏斗を介して添加した。前記反応混合物を７０℃〜８０℃で６時間攪拌した。前記混合物を濾過し、ＥｔＯＡｃ（４．０Ｌ）で抽出した。前記有機層を塩水で洗浄し（２回）、真空中で蒸発させ、前記残留物をヘキサンおよびＥｔＯＡｃに懸濁させ、白色固体を得た。前記固体を濾過し、最小量のヘキサンで洗浄し、真空中で一晩中乾燥して、前記表題化合物（２６０ｇ、７０％、白色固体）を得た。
【０１００】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）δ１．４７（９Ｈ、ｓ）、３．４１（２Ｈ、ｄ）、４．１３（１Ｈ、ｂｒ、ｔ）、４．４１（２Ｈ、ｄ）、６．３１（１Ｈ、ｂｒ）、６．３９（１Ｈ、ｂｒ）、７．３１（５Ｈ、ｍ）
【０１０１】
（４）ｔ−ブチルＮ−ベンジルカルバモイル−Ｎ’−４−フルオロベンジル−ヒドラジノ酢酸の製造
【化２６】
2009538903.tif 000051
【０１０２】
２級（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ）ヒドラジン（７４ｇ、２６５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ／トルエン（ｖ／ｖ＝１／３）２Ｌに溶かした。５Ｌの２首丸底フラスコにガラス栓およびカルシウムチューブに連結された還流冷却器を装着し、Ｋ２ＣＯ３（３．０当量）を前記反応混合物に添加した。前記溶液を３０分間７０℃〜８０℃に加熱し、トルエン中の４−フルオロベンジルブロマイド（１．１当量）を滴下漏斗を介して添加した。前記反応混合物を７０℃〜８０℃で６時間攪拌した。前記混合物を濾過し、ＥｔＯＡｃ（２．０Ｌ）で抽出した。前記有機層を塩水で洗浄し（２回）、真空中で蒸発させ、前記残留物をヘキサンおよびＥｔＯＡｃに懸濁させ、白色固体を得た。前記固体を濾過し、最小量のヘキサンで洗浄し、真空中で一晩中乾燥して、前記表題化合物（白色固体、８１ｇ、７９％）を得た。
【０１０３】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）δ１．４７（９Ｈ、ｓ）、３．４４（２Ｈ、ｂｒ）、３．９７（２Ｈ、ｂｒ）、４．３０（２Ｈ、ｂｒ）、６．１６（１Ｈ、ｂｒ）、６．３２（１Ｈ、ｂｒ）、６．９６（２Ｈ、ｍ）、７．１１（２Ｈ、ｄ）、７．２７（５Ｈ、ｍ）
【０１０４】
（５）Ｎ−ベンジルカルバモイル−Ｎ’−４−フルオロベンジル−ヒドラジノ酢酸の製造
【化２７】
2009538903.tif 000052
【０１０５】
３Ｌの丸底フラスコにガラス栓およびカルシウムチューブを装着した。Ｎ−ベンジルカルバモイル−Ｎ’−４−フルオロベンジル−ヒドラジノ酢酸ｔ−ブチルエステル（８１ｇ、０．２０９ｍｏｌ）を添加した。ＨＣｌ（５００ｍＬ、ジオキサン中の４Ｍ溶液）および１，４−ジオキサン（１Ｌ）の溶液をアイスウォーターバス中で激しく攪拌しながら徐々に添加した。前記反応混合物を常温で６時間攪拌した。前記溶液を４０℃の吸引装置による真空（ａｓｐｉｒａｔｏｒ  ｖａｃｕｕｍ）状態で回転式蒸発器（ｒｏｔａｒｙ  ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）で完全に濃縮した。前記残留物をヘキサン／ＥＡに懸濁させ、白色固体を得た。前記分離された無色固体を濾過し、最小量のヘキサンで洗浄し、一晩中真空下で乾燥して、前記表題化合物（５６ｇ、８１％、白色固体）を得た。
【０１０６】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、３００ＭＨｚ）δ３．５３（２Ｈ、ｓ）、３．８７（２Ｈ、ｓ）、４．１１（２Ｈ、ｄ）、６．８１（１Ｈ、ｔ）、７．０１（４Ｈ、ｍ）、７．１９（４Ｈ、ｍ）、７．４０（２Ｈ、ｍ）
【０１０７】
製造例３
Ｎ−ベンジルカルバモイル−Ｎ’−４−ベンジル−ヒドラジノ酢酸の製造
（１）Ｎ−ベンジルカルバモイル−Ｎ’−Ｂｏｃ−ヒドラジンの製造
【化２８】
2009538903.tif 000053
【０１０８】
ＴＨＦ（２．０Ｌ）中のＢｏｃ−カルバザート（２００ｇ、１．５１ｍｏｌ）溶液を入れ、ＴＨＦ中のベンジルイソシアネート（１．１当量）溶液を添加した。６時間後、前記溶液を真空中で蒸発させた。前記残留物をヘキサン／ＥＡに懸濁させ、白色固体を得た。前記分離された無色固体を濾過し、最小量のヘキサンで洗浄し、一晩中真空下で乾燥して、前記表題化合物（白色固体、３８０ｇ、９５％）を得た。
【０１０９】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、３００ＭＨｚ）δ２．８９〜３．０８（２Ｈ、ｍ）、４．１９（４Ｈ、ｍ）、７．２７〜７．４０（８Ｈ、ｍ）、７．６４〜７．７３（２Ｈ、ｍ）、７．８７（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝６Ｈｚ）
【０１１０】
（２）Ｎ−ベンジルカルバモイル−ヒドラジンの製造
【化２９】
2009538903.tif 000054
【０１１１】
前記化合物（３８０ｇ、１．４３ｍｏｌ）を入れ、ＨＣｌ（１Ｌ、ジオキサン中の４Ｍ溶液）および１，４−ジオキサン（３Ｌ）の溶液をアイスウォーターバス中で激しく攪拌しながら徐々に添加した。前記反応混合物を常温で６時間攪拌した。前記溶液を４０℃の吸引装置による真空（ａｓｐｉｒａｔｏｒ  ｖａｃｕｕｍ）状態で回転式蒸発器（ｒｏｔａｒｙ  ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）で完全に濃縮した。前記残留物をヘキサン／ＥＡに懸濁させ、白色固体を得た。前記分離された無色固体を濾過し、最小量のヘキサンで洗浄し、一晩中真空下で乾燥して、前記表題化合物（白色固体、２７０ｇ、９４％）を得た。
【０１１２】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、３００ＭＨｚ）δ２．８９〜３．０８（２Ｈ、ｍ）、４．１９（４Ｈ、ｍ）、７．２７〜７．４０（８Ｈ、ｍ）、７．６４〜７．７３（２Ｈ、ｍ）、７．８７（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝６Ｈｚ）
【０１１３】
（３）ｔ−ブチルＮ−ベンジルカルバモイル−ヒドラジノ酢酸の製造
【化３０】
2009538903.tif 000055
【０１１４】
１０Ｌの２首丸底フラスコにガラス栓およびカルシウムチューブに連結された還流冷却器を装着した。４Ｌのトルエン：ＤＭＦ（３Ｌ：１Ｌ）共溶媒中のＮ−ベンジルカルバモイル−ヒドラジン（２７０ｇ、１．３４ｍｏｌ）溶液を添加した。ジイソプロピルエチルアミン（１．１当量）を０℃で３０分間徐々に添加した。前記反応混合物を常温に加熱し、Ｋ２ＣＯ３（３．０当量）を徐々に添加した。トルエン中のｔ−ブチルブロモアセテート（１．１当量）溶液を滴下漏斗を介して添加した。前記反応混合物を７０℃〜８０℃で６時間攪拌した。前記混合物を濾過し、ＥｔＯＡｃ（４．０Ｌ）で抽出した。前記有機層を塩水で洗浄し（２回）、真空中で蒸発させ、前記残留物をヘキサンおよびＥｔＯＡｃに懸濁させ、白色固体を得た。前記固体を濾過し、最小量のヘキサンで洗浄し、一晩中真空下で乾燥して、前記表題化合物（２６０ｇ、７０％、白色固体）を得た。
【０１１５】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）δ１．４７（９Ｈ、ｓ）、３．４１（２Ｈ、ｄ）、４．１３（１Ｈ、ｂｒ、ｔ）、４．４１（２Ｈ、ｄ）、６．３１（１Ｈ、ｂｒ）、６．３９（１Ｈ、ｂｒ）、７．３１（５Ｈ、ｍ）
【０１１６】
（４）ｔ−ブチルＮ−ベンジルカルバモイル−Ｎ’−４−ベンジル−ヒドラジノ酢酸の製造
【化３１】
2009538903.tif 000056
【０１１７】
ＤＭＦ：トルエン（１．５Ｌ：０．５Ｌ）の２Ｌに２級ヒドラジン（７４ｇ、２６５ｍｍｏｌ）を溶かした。５Ｌの２首丸底フラスコにガラス栓およびカルシウムチューブに連結された還流冷却器を装着し、Ｋ２ＣＯ３（３．０当量）を前記反応混合物に添加した。前記溶液を７０℃〜８０℃で３０分間加熱し、トルエン中のベンジルブロマイド（１．１当量）を滴下漏斗を介して添加した。前記反応混合物を７０℃〜８０℃で６時間攪拌した。前記混合物を濾過し、ＥｔＯＡｃ（２．０Ｌ）で抽出した。前記有機層を塩水で洗浄し（２回）、真空中で蒸発させ、前記残留物をヘキサンおよびＥｔＯＡｃに懸濁させ、白色固体を得た。前記固体を濾過し、最小量のヘキサンで洗浄し、一晩中真空下で乾燥して、前記表題化合物（白色固体、８１ｇ、７９％）を得た。
【０１１８】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）δ１．４７（９Ｈ、ｓ）、３．４４（２Ｈ、ｂｒ）、３．９７（２Ｈ、ｂｒ）、４．３０（２Ｈ、ｂｒ）、６．１６（１Ｈ、ｂｒ）、６．３２（１Ｈ、ｂｒ）、７．２７（１０Ｈ、ｍ）
【０１１９】
（５）Ｎ−ベンジルカルバモイル−Ｎ’−４−ベンジル−ヒドラジノ酢酸の製造
【化３２】
2009538903.tif 000057
【０１２０】
３Ｌの２首丸底フラスコにガラス栓およびカルシウムチューブを装着した。Ｎ−ベンジルカルバモイル−Ｎ’−４−ベンジル−ヒドラジノ酢酸ｔ−ブチルエステル（８１ｇ、０．２０９ｍｏｌ）を添加した。ＨＣｌ（５００ｍＬ、ジオキサン中の４Ｍ溶液）および１，４−ジオキサン（１Ｌ）の溶液をアイスウォーターバス中で激しく攪拌しながら徐々に添加した。前記反応混合物を常温で６時間攪拌した。前記溶液４０℃の吸引装置による真空（ａｓｐｉｒａｔｏｒ  ｖａｃｕｕｍ）状態で回転式蒸発器（ｒｏｔａｒｙ  ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）で完全に濃縮した。前記残留物をヘキサン／ＥＡに懸濁させ、白色固体を得た。前記分離された無色固体を濾過し、最小量のヘキサンで洗浄し、一晩中真空下で乾燥して、前記表題化合物（５６ｇ、８１％、白色固体）を得た。
【０１２１】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、３００ＭＨｚ）δ３．５３（２Ｈ、ｓ）、３．８７（２Ｈ、ｓ）、４．１１（２Ｈ、ｄ）、６．８１（１Ｈ、ｔ）、７．２７（１０Ｈ、ｍ）
【０１２２】
製造例４
【化３３】
2009538903.tif 000058
【０１２３】
（１）８−（３−クロロ−２−ジメチルアミノ−ベンジル）−６−（４−ヒドロキシ−ベンジル）−２−メチル−４，７−ジオクソー−ヘキサヒドロ−ピラジノ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアジン−１−カルボン酸ベンジルアミドの製造
ブロモアセタール樹脂（６０ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ／ｇ）およびＤＭＳＯ（２．５ｍｌ、２Ｍ）中の（２−ジメチルアミノ−６−クロロ−フェニル）−メチル−アミン溶液をスクリューキャップ（ｓｃｒｅｗ  ｃａｐ）を有したバイアル（ｖｉａｌ）に入れた。前記反応混合物を６０℃で回転オーブン（Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を利用して１２時間振盪した。前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦに続いて、ＤＣＭで洗浄して、第１成分片（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｐｉｅｃｅ）を準備した。
【０１２４】
ＮＭＰ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ）中のＦｍｏｃ−チロシン（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（４当量、商業的に利用可能、第２成分片）、ＨＡＴＵ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、４当量）、およびＤＩＥＡ（４当量）の溶液を前記樹脂に添加した。前記反応混合物を室温で４時間振盪した後、前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、続いてＤＭＦで洗浄した。
前記樹脂にＤＭＦ中の２０％ピペリジンを添加した。前記反応混合物を室温で８分間振盪した後、前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、続いてＤＭＦで洗浄した。
【０１２５】
ＤＭＦ中のＮ−ベンジルカルバモイル−Ｎ’−メチル−ヒドラジノ酢酸（４当量、第３成分片）、ＨＯＢＴ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ、４当量）、およびＤＩＣ（４当量）の溶液を前記で準備した樹脂に添加した。前記反応混合物を３時間室温で振盪した後、前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、続いてＭｅＯＨで洗浄した。前記樹脂を室温の真空中で乾燥した。
前記樹脂を室温で１８時間ギ酸（２．５ｍｌ）で処理した。前記樹脂を濾過によって除去し、前記濾過液を減圧下で濃縮して、オイルである前記表題化合物を得た。
【０１２６】
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ；２．４５（ｓ、３Ｈ）、２．６５（ｓ、６Ｈ）、３．１２（ｍ、２Ｈ）、３．５２（ｍ、４Ｈ）、４．１２（ｄｄ、１Ｈ）、４．２４（ｄｄ、１Ｈ）、４．４５（ｄ、１Ｈ）、４．７５（ｄ、１Ｈ）、５．２０（ｔ、１Ｈ）、５．５６（ｄｄ、１Ｈ）、６．４０（ｍ、３Ｈ）、６．６６（ｄ、２Ｈ）、７．１１（ｄ、２Ｈ）、７．３９（ｍ、５Ｈ）
【０１２７】
製造例５
【化３４】
2009538903.tif 000059
【０１２８】
（１）８−イソブチル−２−メチル−４，７−ジオクソー−６−フェニル−ヘキサヒドロ−ピラジノ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアジン−１−カルボン酸ベンジルアミドの製造
ブロモアセタール樹脂（６０ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ／ｇ）およびＤＭＳＯ（２．５ｍｌ、２Ｍ）中の（２−アミノメチル−６−クロロ−フェニル）−ジメチル−アミン溶液をスクリューキャップを有したバイアルに入れた。前記反応混合物を回転オーブン（Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を利用して６０℃で１２時間振盪した。前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦに続いて、ＤＣＭで洗浄して、第１成分片を準備した。
【０１２９】
ＮＭＰ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ）中のＦｍｏｃ−フェニルアラニン−ＯＨ（４当量、商業的に利用可能、第２成分片）、ＨＡＴＵ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、４当量）、およびＤＩＥＡ（４当量）の溶液を前記樹脂に添加した。前記反応混合物を室温で４時間振盪した後、前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、続いてＤＭＦで洗浄した。
前記樹脂にＤＭＦ中の２０％ピペリジンを添加した。前記反応混合物を室温で８分間振盪した後、前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、続いてＤＭＦで洗浄した。
【０１３０】
ＤＭＦ中のＮ−ベンジルカルバモイル−Ｎ’−メチル−ヒドラジノ酢酸（４当量、第３成分片）、ＨＯＢＴ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ、４当量）、およびＤＩＣ（４当量）の溶液を前記で準備した樹脂に添加した。前記反応混合物を３時間室温で振盪した後、前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、続いてＭｅＯＨで洗浄した。前記樹脂を室温の真空中で乾燥した。
前記樹脂を室温で１８時間ギ酸（２．５ｍｌ）で処理した。前記樹脂を濾過によって除去し、前記濾過液を減圧下で濃縮して、オイルである前記表題化合物を得た。
【０１３１】
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ；１．１２（ｓ、６Ｈ）、２．４５（ｓ、３Ｈ）、２．４７（ｍ、１Ｈ）、３．１５（ｍ、４Ｈ）、３．４７（ｍ、４Ｈ）、４．１０（ｄ、１Ｈ）、４．２３（ｄ、１Ｈ）、５．１５（ｔ、１Ｈ）、６．０３（ｄｄ、１Ｈ）、７．１５（ｍ、５Ｈ）、７．２３（ｍ、５Ｈ）
【０１３２】
製造例６
【化３５】
2009538903.tif 000060
【０１３３】
（１）６−イソブチル−８−（４−メトキシ−ベンジル）−２−メチル−４，７−ジオクソー−ヘキサヒドロ−ピラジノ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアジン−１−カルボン酸ベンジルアミドの製造
Ｆｍｏｃ−フェニルアラニン−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−ロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ）−ＯＨを用いたことを除いては、前記製造例５に記述したのと同じ手続きを行って、オイルである前記表題化合物を得た。
【０１３４】
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ；１．１０（ｓ、６Ｈ）、１．８０（ｍ、３Ｈ）、２．４５（ｓ、３Ｈ）、３．４０（ｍ、２Ｈ）、３．５８（ｍ、２Ｈ）、３．７０（ｓ、３Ｈ）、４．４５（ｄｄ、１Ｈ）、４．４８（ｄｄ、１Ｈ）、４．５０（ｓ、２Ｈ）、４．５７（ｔ、１Ｈ）、６．２８（ｄｄ、１Ｈ）、６．７０（ｄ、２Ｈ）、６．９８（ｄ、２Ｈ）、７．１８（ｍ、５Ｈ）
【０１３５】
製造例７
【化３６】
2009538903.tif 000061
【０１３６】
（１）（６Ｓ，９ａＳ）−Ｎ−ベンジル−６−イソブチル−８−（４−メトキシベンジル）−２−メチル−４，７−ジオクソー−ヘキサヒドロ−２Ｈ−ピラジノ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアジン−１（６Ｈ）−カルボキサミドの製造
ブロモアセタール樹脂（６０ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ／ｇ）およびＤＭＳＯ（２．５ｍｌ、２Ｍ）中の４−メトキシ−ベンジルアミン溶液をスクリューキャップを有したバイアルに入れた。前記反応混合物を回転オーブン（Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を利用して６０℃で１２時間振盪した。前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦに続いて、ＤＣＭで洗浄して、第１成分片を準備した。
【０１３７】
ＮＭＰ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ）中のＦｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ（４当量）、ＨＡＴＵ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、４当量）、およびＤＩＥＡ（４当量）の溶液を前記樹脂に添加した。前記反応混合物を室温で４時間振盪した後、前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、続いてＤＭＦで洗浄した。
前記樹脂にＤＭＦ中のピペリジン（２０％）を添加した。前記反応混合物を室温で８分間振盪した後、前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、続いてＤＭＦで洗浄した。
【０１３８】
ＤＭＦ中の２−（２−（ベンジルカルバモイル）−１−メチルヒドラジニル）酢酸（４当量）、ＨＯＢＴ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ、４当量）、およびＤＩＣ（４当量）の溶液を前記で準備した樹脂に添加した。前記反応混合物を３時間室温で振盪した後、前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、続いてＭｅＯＨで洗浄した。前記樹脂を室温の真空中で乾燥した。
前記樹脂を室温で１８時間ギ酸（２．５ｍｌ）で処理した。前記樹脂を濾過によって除去した後、前記濾過液を減圧下で濃縮して、オイルである前記表題化合物を得た。
【０１３９】
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ；１．５１（ｄ、６Ｈ）、１．９１（ｍ、１Ｈ）、２．４９（ｓ、３Ｈ）、３．４５（ｄ、２Ｈ）、３．６９（ｍ、２Ｈ）、３．７２（ｓ、３Ｈ）、３．８２（ｍ、２Ｈ）、４．４０（ｓ、２Ｈ）、４．４８（ｓ、２Ｈ）、４．５３（ｔ、１Ｈ）、５．５５（ｔ、１Ｈ）、６．６１（ｄ、２Ｈ）、６．９５（ｄ、２Ｈ）、７．２４−７．３８（ｍ、５Ｈ）
【０１４０】
製造例８
【化３７】
2009538903.tif 000062
【０１４１】
（１）（６Ｒ，９ａＲ）−Ｎ，６−ジベンジル−２−メチル−４，７−ジオクソー−８−フェネチル−ヘキサヒドロ−２Ｈ−ピラジノ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアジン−１（６Ｈ）−カルボキサミドの製造
ブロモアセタール樹脂（６０ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ／ｇ）およびＤＭＳＯ（２．５ｍｌ、２Ｍ）中の２−フェニルエタンアミン溶液をスクリューキャップを有したバイアルに入れた。前記反応混合物を回転オーブン（Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を利用して６０℃で１２時間振盪した。前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦに続いて、ＤＣＭで洗浄して、第１成分片を準備した。
【０１４２】
ＮＭＰ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ）中のＦｍｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＨ（４当量、商業的に利用可能、第２成分片）、ＨＡＴＵ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、４当量）、およびＤＩＥＡ（４当量）の溶液を前記樹脂に添加した。前記反応混合物を室温で４時間振盪した後、前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、続いてＤＭＦで洗浄した。
前記樹脂にＤＭＦ中のピペリジン（２０％）を添加した。前記反応混合物を室温で８分間振盪した後、前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、続いてＤＭＦで洗浄した。
【０１４３】
ＤＭＦ中の２−（２−（ベンジルカルバモイル）−１−メチルヒドラジニル）酢酸（４当量）、ＨＯＢＴ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ、４当量）、およびＤＩＣ（４当量）の溶液を前記で準備した樹脂に添加した。前記反応混合物を３時間室温で振盪した後、前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、続いてＭｅＯＨで洗浄した。前記樹脂を室温の真空中で乾燥した。
前記樹脂を室温で１８時間ギ酸（２．５ｍｌ）で処理した。前記樹脂を濾過によって除去し、前記濾過液を減圧下で濃縮して、オイルである前記表題化合物を得た。
【０１４４】
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ；２．４７（ｓ、３Ｈ）、２．８１（ｔ、２Ｈ）、２．９０（ｄｄ、１Ｈ）、３．１５（ｄｄ、１Ｈ）、３．４７−３．５８（ｍ、５Ｈ）、３．８１（ｍ、１Ｈ）、４．４７（ｓ、２Ｈ）、４．９７（ｔ、１Ｈ）、５．８０（ｔ、１Ｈ）、７．１５（ｍ、２Ｈ）、７．２１−７．３８（ｍ、１３Ｈ）
【０１４５】
製造例９
【化３８】
2009538903.tif 000063
【０１４６】
（１）（６Ｓ，９ａＳ）−Ｎ−ベンジル−２−メチル−６−（４−メチルベンジル）−４，７−ジオクソー−８−フェネチル−ヘキサヒドロ−２Ｈ−ピラジノ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアジン−１（６Ｈ）−カルボキサミドの製造
Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｐｈｅ（４−Ｍｅ）−ＯＨを用いたことを除いては、前記製造例７に記述したのと同じ手続きを行って、オイルである前記表題化合物を得た。
【０１４７】
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ；２．１９（ｓ、３Ｈ）、２．５１（ｓ、３Ｈ）、２．９２（ｔ、２Ｈ）、２．９３（ｄｄ、１Ｈ）、３．２０（ｄｄ、１Ｈ）、３．４２−３．６０（ｍ、５Ｈ）、３．８５（ｍ、１Ｈ）、４．４５（ｓ、２Ｈ）、４．９２（ｔ、１Ｈ）、５．８０（ｔ、１Ｈ）、７．００（ｄ、４Ｈ）、７．２５−７．３５（ｍ、１０Ｈ）
【０１４８】
製造例１０
２−（４−フルオロ−ベンジル）−４，７−ジオクソー−６−フェネチル−８−（３−トリフルオロ−メチルベンジル）−ヘキサヒドロ−ピラジノ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアジン−１−カルボン酸ベンジルアミドの製造
ブロモアセタール樹脂（６０ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ／ｇ）およびＤＭＳＯ（２．５ｍｌ、２Ｍ）中の３−トリフルオロ−メチルベンジルアミンナフチルアミン溶液をスクリューキャップを有したバイアルに入れた。前記反応混合物を回転オーブン（Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を利用して６０℃で１２時間振盪した。前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦで洗浄し、続いてＤＣＭで洗浄した。
【０１４９】
ＮＭＰ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ）中のＦｍｏｃ−ホモフェニルアラニン（４当量）、ＨＡＴＵ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、４当量）、およびＤＩＥＡ（４当量）の溶液を前記樹脂に添加した。前記反応混合物を室温で４時間振盪した後、前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、続いてＤＭＦで洗浄した。
前記樹脂にＤＭＦ中のピペリジン（２０％）を添加した。前記反応混合物を室温で８分間振盪した後、前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、続いてＤＭＦで洗浄した。
【０１５０】
ＤＭＦ中のＮβ−Ｆｍｏｃ−Ｎα−４−フルオロベンジル−ヒドラジノグリシン（４当量）、ＨＯＢＴ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ、４当量）、およびＤＩＣ（４当量）の溶液を前記で準備した樹脂に添加した。前記反応混合物を３時間室温で振盪した後、前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦで洗浄し、続いてＤＣＭで洗浄した。前記樹脂にＤＭＦ中のピペリジン（２０％）を添加した（前記樹脂１ｇに対し１０ｍｌ）。前記反応混合物を室温で８分間振盪した後、前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、続いてＤＭＦで洗浄した。
前記樹脂をＤＣＭ中のベンジルイソシアネート（４当量）とＤＩＥＡ（４当量）の混合物で室温で４時間処理した。その次、前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、続いてＭｅＯＨで洗浄した。前記樹脂を室温の真空中で乾燥した後、前記樹脂を室温で１８時間ギ酸（２．５ｍｌ）で処理した。前記樹脂を濾過によって除去し、前記濾過液を減圧下で濃縮して、オイルである前記表題化合物を得た。
【０１５１】
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ；３．１５−３．５３（ｍ、６Ｈ）、４．３１−４．４２（ｍ、４Ｈ）、４．４７−４．８５（ｍ、２Ｈ）、５．２２（ｔ、１Ｈ）、５．４７（ｍ、２Ｈ）、６．８１（ｄ、２Ｈ）、６．８５（ｄ、２Ｈ）、６．９１（ｍ、４Ｈ）、７．１５−８．２４（ｍ、１４Ｈ）
【化３９】
2009538903.tif 000064
【０１５２】
製造例１１
２−（４−フルオロ−ベンジル）−６−（４−メトキシ−ベンジル）−４，７−ジオクソー−８−（３−トリフルオロメチル−ベンジル）−ヘキサヒドロ−ピラジノ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアジン−１−カルボン酸ベンジルアミドの製造
ブロモアセタール樹脂（６０ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ／ｇ）およびＤＭＳＯ（２．５ｍｌ、２Ｍ）中の３−トリフルオロ−メチルベンジルアミンナフチルアミン溶液をスクリューキャップを有したバイアルに入れた。前記反応混合物を回転オーブン（Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を利用して６０℃で１２時間振盪した。前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦに続いてＤＣＭで洗浄した。
【０１５３】
ＮＭＰ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ）中のＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（Ｏ−Ｍｅ）（４当量）、ＨＡＴＵ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、４当量）、およびＤＩＥＡ（４当量）の溶液を前記樹脂に添加した。前記反応混合物を室温で４時間振盪した後、前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、続いてＤＭＦで洗浄した。
【０１５４】
前記樹脂にＤＭＦ中のピペリジン（２０％）を添加した。前記反応混合物を室温で８分間振盪した後、前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、続いてＤＭＦで洗浄した。
ＤＭＦ中のＮβ−Ｆｍｏｃ−Ｎα−４−フルオロベンジル−ヒドラジノグリシン（４当量）、ＨＯＢＴ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ、４当量）、およびＤＩＣ（４当量）の溶液を前記で準備した樹脂に添加した。前記反応混合物を３時間室温で振盪した後、前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦで洗浄し、続いてＤＣＭで洗浄した。前記樹脂にＤＭＦ中のピペリジン（２０％）を添加した（前記樹脂１ｇに対し１０ｍｌ）。前記反応混合物を室温で８分間振盪した後、前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、続いてＤＭＦで洗浄した。
【０１５５】
前記樹脂をＤＣＭ中のベンジルイソシアネート（４当量）およびＤＩＥＡ（４当量）の混合物で室温で４時間処理した。その次、前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、続いてＭｅＯＨで洗浄した。前記樹脂を室温の真空中で乾燥した後、前記樹脂を室温で１８時間ギ酸（２．５ｍｌ）で処理した。前記樹脂を濾過によって除去し、前記濾過液を減圧下で濃縮して、オイルである前記表題化合物を得た。
【０１５６】
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ；３．２４−３．５２（ｍ、４Ｈ）、３．９８（ｓ、３Ｈ）４．１９−４．２５（ｍ、４Ｈ）、４．４７−４．８５（ｍ、２Ｈ）、５．３３（ｔ、１Ｈ）、５．３５（ｍ、２Ｈ）、６．７８（ｄ、２Ｈ）、６．８８（ｄ、２Ｈ）、６．９１（ｍ、４Ｈ）、７．０５−８．１１（ｍ、９Ｈ）
【０１５７】
製造例１２
６−（４−ベンジルオキシ−ベンジル）−２−（４−フルオロ−ベンジル）−４，７−ジオクソー−８−（３−トリフルオロメチル−ベンジル）−ヘキサヒドロ−ピラジノ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアジン−１−カルボン酸ベンジルアミドの製造
Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（Ｏ−Ｍｅ）の代わりにＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（Ｏ−Ｂｎ）を用いたことを除いては、製造に１１に記述したのと同じ手続きを行って、オイルである前記表題化合物を得た。
【０１５８】
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ；３．１０−３．５５（ｍ、４Ｈ）、４．３１−４．４５（ｍ、６Ｈ）、４．４７−４．８５（ｍ、２Ｈ）、５．２０（ｔ、１Ｈ）、５．４４（ｍ、２Ｈ）、６．６６（ｄ、２Ｈ）、６．６７（ｄ、２Ｈ）、７．２５−８．０３（ｍ、１８Ｈ）；
【０１５９】
製造例１３
６−（３，４−ジフルオロ−ベンジル）−２−（４−フルオロ−ベンジル）−４，７−ジオクソー−８−（３−トリフルオロメチル−ベンジル）−ヘキサヒドロ−ピラジノ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアジン−１−カルボン酸ベンジルアミドの製造
Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（Ｏ−Ｍｅ）の代わりにＦｍｏｃ−３，４−ジフルオロＰｈｅを用いたことを除いては、製造例１１に記述したのと同じ手続きを行って、オイルである前記表題化合物を得た。
【０１６０】
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ；３．１５−３．５３（ｍ、４Ｈ）、４．３１−４．４２（ｍ、６Ｈ）、４．４７−４．８５（ｍ、２Ｈ）、５．２２（ｔ、１Ｈ）、５．４７（ｍ、２Ｈ）、６．６８（ｄ、２Ｈ）、６．９９（ｄ、２Ｈ）、７．２１−８．２１（ｍ、１２Ｈ）
【０１６１】
製造例１４
【化４０】
2009538903.tif 000065
【０１６２】
２−ベンジル−８−［２−（４−クロロ−フェニル）−エチル］−６−（４−メトキシ−ベンジル）−４，７−ジオクソー−ヘキサヒドロ−ピラジノ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアジン−１−カルボン酸ベンジルアミドの製造
ブロモアセタール樹脂（６０ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ／ｇ）および２−（４−クロロ−フェニル）−エチルアミン（２．５ｍｌ、２Ｍ）溶液をスクリューキャップを有したバイアルに入れた。前記反応混合物を回転オーブン（Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を利用して６０℃で１２時間振盪した。前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦに続いてＤＣＭで洗浄して、第１成分片を準備した。
【０１６３】
ＮＭＰ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ）中の２−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−３−（４−メトキシ−フェニル）−プロピオン酸（４当量、商業的に利用可能、第２成分片）、ＨＡＴＵ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、４当量）、およびＤＩＥＡ（４当量）の溶液を前記樹脂に添加した。前記反応混合物を室温で４時間振盪した後、前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、続いてＤＭＦで洗浄した。
前記樹脂にＤＭＦ中のピペリジン（２０％）を添加した。前記反応混合物を室温で８分間振盪した後、前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、続いてＤＭＦで洗浄した。
【０１６４】
ＤＭＦ中の２−（１−ベンジルカルバモイル）ヒドラジニル）酢酸（４当量）、ＨＯＢＴ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ、４当量）、およびＤＩＣ（４当量）の溶液を前記で準備した樹脂に添加した。前記反応混合物を３時間室温で振盪した後、前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、続いてＭｅＯＨで洗浄した。前記樹脂を室温の真空中で乾燥した。
前記樹脂を室温で１８時間ギ酸（２．５ｍｌ）で処理した。前記樹脂を濾過によって除去し、前記濾過液を減圧下で濃縮して、オイルである前記表題化合物を得た。
【０１６５】
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ；３．２２−３．５７（ｍ、１０Ｈ）、３．８２（ｓ、３Ｈ）、４．３６（ｄ、２Ｈ）、４．５０（ｄ、１Ｈ）、４．９０（ｄ、１Ｈ）、５．３６−５．４５（ｍ、２Ｈ）、６．６２−６．７３（ｍ、４Ｈ）、６．９８−７．０５（ｍ、４Ｈ）、７．１０−７．４８（ｍ、１０Ｈ）
【０１６６】
製造例１５
２−ベンジル−８−［２−（４−クロロ−フェニル）−エチル］−６−（３，４−ジフルオロ−ベンジル）−４，７−ジオクソー−ヘキサヒドロ−ピラジノ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアジン−１−カルボン酸ベンジルアミドの製造
２−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−３−（４−メトキシ−フェニル）−プロピオン酸の代わりに３−（３，４−ジフルオロ−フェニル）−２−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−プロピオン酸を用いたことを除いては、製造例１４に記述したのと同じ手続きを行って、オイルである前記表題化合物を得た。
【０１６７】
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ；３．２５−３．６８（ｍ、９Ｈ）、４．３６（ｄ、２Ｈ）、４．５２（ｄ、１Ｈ）、４．９６（ｄ、１Ｈ）、５．３６−５．４５（ｍ、２Ｈ）、６．５０−６．７６（ｍ、２Ｈ）、６．９２−７．０８（ｍ、５Ｈ）、７．１０−７．４８（ｍ、１０Ｈ）
【０１６８】
製造例１６
２−ベンジル−６−（４−クロロ−ベンジル）−８−［２−（４−クロロ−フェニル）−エチル］−４，７−ジオクソー−ヘキサヒドロ−ピラジノ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアジン−１−カルボン酸ベンジルアミドの製造
２−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−３−（４−メトキシ−フェニル）−プロピオン酸の代わりに３−（４−クロロ−フェニル）−２−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−プロピオン酸を用いたことを除いては、製造例１４と同じ手続きを行って、オイルである生成物を得た。
【０１６９】
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ；３．１８−３．５０（ｍ、９Ｈ）、４．４１（ｄ、２Ｈ）、４．５０（ｄ、１Ｈ）、４．９０（ｄ、１Ｈ）、５．３６−５．４５（ｍ、２Ｈ）、６．６０−６．７８（ｍ、４Ｈ）、６．９８−７．０５（ｍ、４Ｈ）、７．１５−７．５８（ｍ、１０Ｈ）
【０１７０】
製造例１７
２−メチル−５−（ｐ−ヒドロキシフェニルメチル）−７−ナフチルメチル−３，６−ジオクソー−ヘキサヒドロ−［１，２，４］ｔｒｉａｚｏｌｏ［４，５−ａ］ｐｙｒａｚｉｎｅ−１−カルボン酸ベンジルアミドの製造
ブロモアセタール樹脂（３０ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ／ｇ）およびＤＭＳＯ（１．５ｍｌ、２Ｍ）中のナフチルメチルアミン溶液をスクリューキャップを有したバイアルに入れた。前記反応混合物を回転オーブン（Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を利用して６０℃で１２時間振盪した。前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦに続いてＤＣＭで洗浄して、第１成分片を準備した。
【０１７１】
ＮＭＰ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ）中のＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（ＯＢｕｔ）−ＯＨ（３当量）、ＨＡＴＵ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、３当量）、およびＤＩＥＡ（３当量）の溶液を前記樹脂に添加した。前記反応混合物を室温で４時間振盪した後、前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、続いてＤＭＦで洗浄することによって第２成分片を第１成分片に添加した。
前記樹脂にＤＭＦ中のピペリジン（２０％）を添加した。前記反応混合物を室温で８分間振盪した後、前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、続いてＤＭＦで洗浄した。
【０１７２】
ＤＣＭ中のＮ’−Ｆｍｏｃ−Ｎ−メチル−ヒドラジノカルボニルクロライド（５当量）およびＤＩＥＡ（５当量）の溶液を前記で準備した樹脂に添加した。前記反応混合物を室温で４時間振盪した後、前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、続いてＤＭＦで洗浄した。
前記樹脂にＤＭＦ中のピペリジン（２０％）を添加した（前記樹脂１ｇに対して１０ｍｌ）。前記反応混合物を室温で８分間振盪した後、前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、続いてＤＭＦで洗浄した。
【０１７３】
前記樹脂をＤＣＭ中のベンジルイソシアネート（４当量）およびＤＩＥＡ（４当量）の混合物で室温で４時間処理した。その次、前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、続いてＭｅＯＨで洗浄した。前記樹脂を室温の真空中で乾燥した。
前記樹脂を室温で１４時間ギ酸で処理した。前記樹脂を濾過によって除去し、前記濾過液を減圧下で濃縮してオイル生成物を得た。
【０１７４】
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ；２．８０−２．９８（ｍ、５Ｈ）、３．２１−３．３７（ｍ、２Ｈ）、４．２２−４．５２（ｍ、２Ｈ）、４．５９（ｔ、１Ｈ）、４．７１（ｄ、１Ｈ）、５．０２（ｄｄ、１Ｈ）、５．３５（ｄ、１Ｈ）、５．５１（ｄ、１Ｈ）、６．６６（ｔ、２Ｈ）、６．９４（ｄｄ、２Ｈ）、７．２１−８．２１（ｍ、１２Ｈ）
【０１７５】
実施例
実施例１
ＳＷ４８０細胞におけるトップフラッシュリポーター（ＴｏｐＦｌａｓｈ  Ｒｅｐｏｒｔ）遺伝子アッセイ
本実施例においては次のテスト化合物（化合物ＡおよびＢ）が用いられた。
【化４１】
2009538903.tif 000066
【０１７６】
ａ．リポーター遺伝子アッセイ
ＳＷ４８０細胞をＳｕｐｅｒｆｅｃｔＴＭトランスフェクション試薬（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ、Ｑｉａｇｅｎ、３０１３０７）を用いたトランスフェクションさせた。細胞がトランスフェクション当日に５０−８０％  ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ状態にあるように、細胞をトランスフェクションの１日前に簡単にトリプシン化（ｔｒｙｐｓｉｎｉｚｅ）し、６ウェルプレート（５ｘ１０５細胞／ウェル）上にプレーティングした。
【０１７７】
トップフラッシュＤＮＡ  ４マイクログラムおよびｐＲＬ−ｎｕｌｌ  ＤＮＡ  １マイクログラムを１５０ｍｌの無血清培地で薄め、３０μｌのＳｕｐｅｒｆｅｃｔＴＭトランスフェクション試薬を添加した。前記ＤＮＡ−Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ混合物を室温で１５分間培養し、１ｍｌの１０％ＦＢＳ  ＤＭＥＭを追加３時間の培養のためにこの複合体に添加した。複合体が形成される間、細胞を抗生剤のないＰＢＳで２回洗浄した。
【０１７８】
前記ＤＮＡ−ＳｕｐｅｒｆｅｃｔＴＭトランスフェクション試薬複合体を、３７℃、５％  ＣＯ２状態で３時間培養する前に前記細胞に適用した。培養後、１０％  ＦＢＳを有する回復培地（ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｍｅｄｉｕｍ）を最終体積が１．１８ｍｌになるように添加した。培養３時間後、前記細胞を収穫し、９６ウェルプレート（３ｘ１０４細胞／ウェル）にリシード（ｒｅｓｅｅｄ）した。３７℃、５％  ＣＯ２状態で一晩中培養した後、前記細胞を化合物Ａまたは化合物Ｂで２４時間処理した。最終的に、活性をルシフェラーゼ分析（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ１９６０）によってチェックした。
【０１７９】
図２および３はＳＷ４８０細胞に対する化合物Ａ（図２）および化合物Ｂ（図３）のＩＣ５０測定結果を説明する。
【０１８０】
実施例２
ヒト間葉幹細胞における骨形成の調節活性
本実施例においては次の化合物（化合物Ｂ、化合物Ｃ、および化合物Ｄ）が用いられた。
【化４２】
2009538903.tif 000067
【０１８１】
方法
細胞培養：正常被験者ら（ｎｏｒｍａｌ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ）からヒト骨髄誘導−間葉幹細胞（ｈＢＭＭＳＣ）を分離した。
【０１８２】
テスト化合物単独による骨形成調節活性分析：ｈＢＭＭＳＣを培養培地で培養し、細胞を９６−ウェル培養プレートに接種し、テスト化合物をＤＭＳＯに溶解させ、培養培地（最終０．０１％ＤＭＳＯ）で薄め、前記培地（テスト化合物の最終濃度は２０μＭであった。）に添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養した。培養培地を２日ごとに新しいものに交換し、培地を交換する時ごとに化合物を再び処理した。培養後６〜７日、細胞溶解物（ｌｙｓａｔｅｓ）のアルカリフォスファターゼ活性を色度測定（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙ）によって測定した。ＤＭＳＯ対照群と比較し、各化合物によるＡＬＰ活性の倍数変化（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）を表２（骨発生）に要約した。前記細胞内のミネラル化（ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）を測定するために、培養後１０−１４日にＶｏｎ  Ｋｏｓｓａ  ｓｔａｉｎｉｎｇまたはＡｌｉｚａｒｉｎ  Ｒｅｄ  Ｓ分析を行った。
【０１８３】
誘導培地におけるテスト化合物の骨形成調節活性：ｈＢＭＭＳＣを骨形成誘導カクテル（ＯＩＣ、０．１μＭデキサメタゾン、５０μＭアスコルベート−２−ホスフェート、１０ｍＭ  ｂ−グリセロホスフェート）を含有する培養培地で培養した。培養後４〜５日に、細胞溶解物のアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性を色度測定によって測定した。前記細胞内のミネラル化を測定するために、培養後１０−１４日にＶｏｎ  Ｋｏｓｓａ  ｓｔａｉｎｉｎｇまたはＡｌｉｚａｒｉｎ  Ｒｅｄ  Ｓ分析を行った。
【０１８４】
細胞増殖分析：ｈＢＭＭＳＣに対する前記テスト化合物の細胞毒性を調査するために、ｈＢＭＭＳＣを前記（方法ｂおよびｃ）と同じ条件で６〜７日間テスト化合物に露出させた。細胞増殖をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｇ３５８１）を使って評価した。各ウェルの４９０ｎｍにおける吸光度はマイクロプレートリーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）で測定し、％成長抑制を対照群と比較して算定した。
【０１８５】
ＲＴ−ＰＣＲ：アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）に対するｍＲＮＡレベルを分析するために、４日間化合物処理をするかまたはしないｈＢＭＭＳＣからトリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ）を用いて全体ＲＮＡを分離した。２μｇのＲＮＡを、ランダム六量体（ｒａｎｄｏｍ  ｈｅｘａｍｅｒ、５０ｎｇ）を有する総体積２０μｌの内で、製造者のガイドラインに沿ってＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を使って逆転写した。ＰＣＲを５μｌ  ｃＤＮＡ、１００ｐｍｏｌプライマー、１００μＭ  ｄＮＴＰｓ、１Ｘ  Ｔａｑバッファ、および１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する５０μｌの体積内で行った。反応混合物を１０分間８０℃に加熱し、その後にＴａｑを添加した。ｃＤＮＡｓを２５（ＥｐｈＢ２受容体）または１５（ＧＡＰＤＨ）サイクルの間増幅させた。１ラウンドの増幅は９４℃で１分、６０℃で２分、および７２℃で２分なされ、最終伸長時間（ｆｉｎａｌ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｔｉｍｅ）は７２℃で１０分であった。前記ＰＣＲ生成物を溶解させ、２％ｇｅｌにおいて電気泳動（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）によって可視化（ｖｉｓｕａｌｉｚｅ）し、エチジウムブロマイド（Ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）で染色させた。用いられたＡＬＰ  ＰＣＲプライマーは５’−ＡＴＣＧＧＧＡＣＴＧＧＴＡＣＴＣＧＧＡＴＡＡ−３’および５’−ＡＴＣＡＧＴＴＣＴＧＴＴＣＴＴＣＧＧＧＴＡＣ−３’であった。ＧＡＰＤＨに対するプライマー対（Ｐｒｉｍｅｒ  ｐａｉｒｓ）は５’−ＧＧＴＧＣＴＧＡＧＴＡＴＧＴＣＧＴＧＧＡ−３’および５’−ＡＣＡＧＴＧＴＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴ−３’であった。ハウスキーピング遺伝子（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅ）、ＧＡＤＰＨは対照群として用いられた。
【０１８６】
結果
化合物Ｂ  ２０μＭは、ｈＢＭＭＳＣに単独処理された時、ＡＬＰレベル（７７％）を減少させ（図４）、また、細胞増殖を抑制させた（５１％）。２０μＭの化合物Ｂは、骨形成誘導カクテル（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｃｏｃｋｔａｉｌｓ）と共に処理された時、溶媒対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べてＡＬＰレベルを減少（８０％）させた。その反面、２０μＭの化合物ＣまたはＤはＡＬＰレベルを顕著に高め（各々２００％および２０２％）（図４）、それが単独で処理された時、前記細胞増殖（各々１２７％および８３％）に顕著な影響を及ぼすことはなかった。また、化合物ＣおよびＤは、骨形成誘導カクテル（ＯＩＣ）と共に処理された時、ｈＢＭＭＳＣのミネラル化を強く誘導した（図５）。様々な濃度の化合物ＣおよびＤが処理された時、両化合物は０．５μＭにおいても骨形成誘導活性（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）を示した（図６）。ｈＢＭＭＳＣにおけるＡＬＰ  ｍＲＮＡ発現は化合物ＣおよびＤの処理によって増加した（図７）。
【０１８７】
実施例３
マウス胚幹細胞における心筋形成（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ）調節活性
本実施例においては次の化合物（化合物ＢおよびＥ）が用いられた。
【化４３】
2009538903.tif 000068
【０１８８】
方法
ａ．細胞培養：１２９／Ｓ６ストレイン（ｓｔｒａｉｎ）から誘導されたＴＣ１マウス胚幹（ＥＳ）細胞を、１５％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、０．１ｍＭβ−メルカプトエタノール、１μＭピルビン酸ナトリウム、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および１Ｘ  非必須アミノ酸で補充された高濃度ブドウ糖（ｈｉｇｈ−ｇｌｕｃｏｓｅ）ＤＭＥＭ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｇｅｒｍａｎｙ）である培養培地および照射された栄養細胞層（ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ  ｆｅｅｄｅｒ  ｌａｙｅｒ）上で培養した。
【０１８９】
ｂ．α−ＭＨＣが安定に形質転換された胚幹細胞株（ＥＳ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）の確立：ｐＥＧＦＰ−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．，ＣＡ、ＵＳＡ）のＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ位置の間に前記マウスのα−ＭＨＣ遺伝子の１．８ｋｂプロモーターシーケンスを含有する構造体（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ、図８）をＸｈｏＩ位置において線形化（ｌｉｎｅａｒｉｚａｔｉｏｎ）し、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（ＢｉｏＲａｄ、ＭＡ）を用いてマウスＥＳ細胞、ＴＣ１に導入した。Ｇ４１８を含む選択培地を電気穿孔（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）後、２４時間から２週間適用した。前記選択されたＥＳ細胞クローンを収穫し、栄養細胞層上で増殖させた。本実験においては、心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ）に分化する時に緑色蛍光を発現するクローンを使用した。
【０１９０】
ｃ．心筋形成調節活性分析：２日間、約６００個のＥＳ細胞を使い、懸滴培養（ｈａｎｇｉｎｇ  ｄｒｏｐ  ｃｕｌｔｕｒｅ）によって胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ）を形成し、それを再び２日間ペトリ皿（Ｐｅｔｒｉ−ｄｉｓｈ）上の懸濁条件で培養することによってより増殖させた。その次、各ＥＢを９６ウェル培養プレートのウェル上にプレーティングした。テスト化合物をＤＭＳＯに溶解させ、培養培地（最終０．０５％ＤＭＳＯ）で薄め、ＥＢを５日間テスト化合物で処理した。プレーティング後、培養培地を３日ごとに交換した。ＥＧＦＰの発現レベルをＦＡＣＳ（Ｂｅｃｋｍａｎ）で測定した。各化合物による、ＤＭＳＯ対照群と比較したＥＧＦＰ発現レベルの倍数変化（Ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）を表２（心筋形成）に要約した。ＦＡＣＳ分析のために、分化する細胞をトリプシンで分離した。分化の程度を測定するために、ＥＢを観察し、逆相蛍光顕微鏡（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、Ｚｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使って撮影した。１日に１回、拍動するＥＢ（ｂｅａｔｉｎｇ  ＥＢｓ）の数を前記顕微鏡でカウントして記録した。
【０１９１】
ｄ．リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ：心筋形成マーカー遺伝子、Ａｔｒｉａｌ  Ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ（ＡＮＰ）およびＮｋｘ２．５のｍＲＮＡレベルを分析するために、全体ＲＮＡを７日および１０日間化合物Ｅで処理するかまたは処理しない幹細胞からトリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）を用いて分離した。各ｍＲＮＡの相対的な発現レベルを測定した。
【０１９２】
結果
ＤＭＳＯ処理対照群ＥＢは、時間が経つにつれ、蛍光発現の漸次的な増加を示したが、その発現レベルは培養後５日においても極小的であった。化合物Ｅの処理（１０μＭ）は、蛍光顕微鏡で観察した時、処理後の蛍光の発現を増進させた。また、そのレベルはＤＭＳＯ対照群に比べて５日に顕著に増進した（図９）。蛍光発現細胞の細胞集団（ｃｅｌｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）のＦＡＣＳ分析は、ＤＭＳＯ対照群（図１０）に比べ、１０μＭの化合物Ｅの処理（図１１）によって４．６倍増加した蛍光陽性（α−ＭＨＣ陽性）細胞のパーセントを示した。また、それの心筋形成分化増進活性は容量依存的であった（図１２）。化合物Ｅを７日および１０日間処理した時、化合物Ｅは、ＤＭＳＯ対照群に比べ、ＥＳ細胞においてＡＮＰおよびＮｋｘ２．５  ｍＲＮＡの発現レベルを強く増加させた（図１３）。化合物Ｂをマウス胚幹細胞に５日間１０μＭで露出させた時、化合物Ｂの処理は蛍光の発現を減少させた（０．２６：１＝化合物Ｂ：ＤＭＳＯ対照群、図１４）。
【０１９３】
実施例４
Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞（ＭＹＯＢＬＡＳＴ）細胞における筋形成の調節
本実施例においては次の化合物（化合物ＢおよびＦ）が用いられた。
【化４４】
2009538903.tif 000069
【０１９４】
物質および方法
ａ．細胞培養：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｙｐｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入したマウス（ｍｕｒｉｎｅ）Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞の細胞株（大腿筋（ｔｈｉｇｈ  ｍｕｓｃｌｅ）からの衛星細胞（ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｃｅｌｌｓ））を、マルチウェルまたは組織培養ペトリ皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ  Ｉｎｃ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）および３７℃にて５％ＣＯ２で供給された湿度調節大気環境で、抗生剤溶液（ペニシリンおよびストレプトマイシン）で補充された成長培地（ＧＭ；ｇｒｏｗｔｈ  ｍｅｄｉｕｍ）であるグルタマックス（Ｇｌｕｔａｍａｘ）が添加された１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭを用い、成長対数期（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｐｈａｓｅ）に維持した。
【０１９５】
ｂ．分化の誘導およびテスト化合物の処理：１００％コンフルアンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）に到達するまで、毎日、細胞をリン酸緩衝溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）で２回洗浄し、培地を交換した。その次、コンフルアント細胞（皿表面を十分に覆う同一の細胞密度の筋芽細胞）を後有糸分裂状態（ｐｏｓｔ  ｍｉｔｏｔｉｃ  ｓｔａｔｕｓ）に誘導し、成長培地（ＧＭ）を分化培地（ＤＭ、ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）として考案された２％（ｖ／ｖ）馬血清ＨＳ／ＤＭＥＭに代替することによって分化および融合（ｆｕｓｉｏｎ）を開始させた。前記で言及した条件において、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞は容易にそして十分に筋管（ｍｙｏｔｕｂｅｓ）に分化し、したがって、その後の５日間分化プロセスの調節を実験することができた。前記研究中、実験的な因子（ｆａｃｔｏｒ）を有しないかまたは有する新しく準備された培地を毎２４時間ごとに交換した。テスト化合物をＤＭＳＯに溶解させ、培養培地で薄めた。テスト化合物（特定されていない場合、１０μＭが使われ、最終ＤＭＳＯは０．１％  ｖ／ｖであった。）またはＤＭＳＯ（０．１％  ｖ／ｖ）を前記培地に添加した。
【０１９６】
ｃ．ＭｙｏＤおよびＭｙｆ５の発現：細胞を溶解させ、文献（Ｖｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００４，１４３，１０６−１３）に記述された通り、ウェスタン免疫ブロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ−ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）によってタンパク質の発現レベルを分析した。タンパク質サンプルの同一量をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離し、ニトロセルロース膜に移動させた。前記膜を５％ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ、ＢＳＡ）で遮断し、標識された１次抗体と共に１２〜１６時間培養した：１／４００で薄められた多クローン性Ｃ２０アンチＭｙｏＤ（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、前記タンパク質のＣＯＯＨ−末端部分を直接指示する多クローン性アンチ−Ｍｙｆ５．ＰＢＳで何回か洗浄した後、膜を化学発光試薬（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅａｇｅｎｔｓ）で培養した。
【０１９７】
結果
Ｃ２Ｃ１２は骨格筋分化の研究に用いられる特徴がよく知られた（ｗｅｌｌ−ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ）細胞培養モデルである。低い血清濃度のような分化のための増殖許容条件下で、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞は分化して筋管を形成する。この細胞を、２％馬血清を含有する分化培地（ＤＭ）で３日間培養する時、Ｃ２Ｃ１２細胞において広範囲な筋管の形成が観察された。これらの筋管を形成するＣ２Ｃ１２細胞は、成長培地（ＧＭ）において細胞の成長（図１５Ｃ）と比較し、紡錘状（ｓｐｉｎｄｌｅ  ｓｈａｐｅｄ）および膜融合して多核筋管の形成を示した（図１５Ａ）。化合物ＦをＧＭで成長された前記細胞に添加した時、それは広範囲な筋管の形成を引き起こした（図１５Ｂ）。また、図１５Ｄに示すように、化合物Ｆの処理によってＭｙｏＤおよびＭｙｆ５タンパク質の発現レベルは顕著に増加した。
【０１９８】
Ｗｎｔ／β−カテニン信号は筋原性運命（ｍｙｏｇｅｎｉｃ  ｆａｔｅ）決定および分化に重要な役割をする（Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ２００５，１０２，１７３７８−８３）。筋形成においてＷｎｔ経路調節化合物およびＷｎｔリガンド間の関連性を調査するために、Ｗｎｔ１調節培地をテスト化合物ＢおよびＦで処理するかまたは処理しなかった。Ｍｙｆ−５発現はＷｎｔ１の処理によって増加し、その発現レベルは化合物Ｆの共同処理によってより増進された。化合物Ｂの処理はＣ２Ｃ１２細胞におけるＭｙｆ−５の発現を減少させ、また、それは、Ｗｎｔ１と共同処理した時、Ｗｎｔ１のＭｙｆ−５増進活性を相殺した（図１６Ａ）。
【０１９９】
ＣＲＥＢ−結合タンパク質（ＣＢＰ）および／またはその密接に関連した相同体、ｐ３００はＣＦ４／β−カテニン信号を含む複数の様々な転写因子の複数の活性に関与すると考えられる。Ｗｎｔ経路を調節するテスト化合物のＣＢＰまたはｐ３００間の可能な相互作用を評価するために、ＣＢＰまたはｐ３００をテスト化合物と共にまたはテスト化合物なしで前記Ｃ２Ｃ１２細胞に露出させ、Ｍｙｆ５タンパク質の細胞（ｃｅｌｌｕｌａｒ）発現レベルを測定した。化合物Ｆは、ＤＭＳＯ対照群に比べ、５および１０μＭにおいて容量依存的にＭｙｆ５発現を増加させた。化合物Ｂは、ＤＭＳＯ対照群に比べ、５および１０μＭにおいて容量依存的にＭｙｆ５発現を減少させた。また、Ｐ３００を化合物Ｂと共に共同処理した場合には化合物ＢによるＭｙｆ５発現の減少を回復させたが、ＣＢＰを共同処理した場合には変化がなかった（図１６Ｂ）。これは、同一の信号経路において、化合物Ｂはｐ３００を遮断するかそれと競争するが、密接に関連した相同体であるＣＢＰとはそうではないということを示唆する。
【図１】
2009538903.tif 000076
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年1月29日(2009.1.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０７】
製造例３
Ｎ−ベンジルカルバモイル−Ｎ’−ベンジル−ヒドラジノ酢酸の製造
（１）Ｎ−ベンジルカルバモイル−Ｎ’−Ｂｏｃ−ヒドラジンの製造
【化２８】
2009538903.tif 000092
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１６】
（４）ｔ−ブチルＮ−ベンジルカルバモイル−Ｎ’−ベンジル−ヒドラジノ酢酸の製造
【化３１】
2009538903.tif 000093
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１９】
（５）Ｎ−ベンジルカルバモイル−Ｎ’−ベンジル−ヒドラジノ酢酸の製造
【化３２】
2009538903.tif 000094
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２０】
３Ｌの２首丸底フラスコにガラス栓およびカルシウムチューブを装着した。Ｎ−ベンジルカルバモイル−Ｎ’−ベンジル−ヒドラジノ酢酸ｔ−ブチルエステル（８１ｇ、０．２０９ｍｏｌ）を添加した。ＨＣｌ（５００ｍＬ、ジオキサン中の４Ｍ溶液）および１，４−ジオキサン（１Ｌ）の溶液をアイスウォーターバス中で激しく攪拌しながら徐々に添加した。前記反応混合物を常温で６時間攪拌した。前記溶液４０℃の吸引装置による真空（ａｓｐｉｒａｔｏｒ  ｖａｃｕｕｍ）状態で回転式蒸発器（ｒｏｔａｒｙ  ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）で完全に濃縮した。前記残留物をヘキサン／ＥＡに懸濁させ、白色固体を得た。前記分離された無色固体を濾過し、最小量のヘキサンで洗浄し、一晩中真空下で乾燥して、前記表題化合物（５６ｇ、８１％、白色固体）を得た。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２２】
製造例４
【化３３】
2009538903.tif 000095
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２３】
（１）８−（３−クロロ−２−ジメチルアミノ−ベンジル）−６−（４−ヒドロキシ−ベンジル）−２−メチル−４，７−ジオクソー−ヘキサヒドロ−ピラジノ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアジン−１−カルボン酸ベンジルアミドの製造
ブロモアセタール樹脂（６０ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ／ｇ）およびＤＭＳＯ（２．５ｍｌ、２Ｍ）中の（２−ジメチルアミノ−３−クロロ−フェニル）−メチル−アミン溶液をスクリューキャップ（ｓｃｒｅｗ  ｃａｐ）を有したバイアル（ｖｉａｌ）に入れた。前記反応混合物を６０℃で回転オーブン（Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を利用して１２時間振盪した。前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦに続いて、ＤＣＭで洗浄して、第１成分片（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｐｉｅｃｅ）を準備した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２８】
（１）８−イソブチル−２−メチル−４，７−ジオクソー−６−ベンジル−ヘキサヒドロ−ピラジノ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアジン−１−カルボン酸ベンジルアミドの製造
ブロモアセタール樹脂（６０ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ／ｇ）およびＤＭＳＯ（２．５ｍｌ、２Ｍ）中のイソブチルアミン溶液をスクリューキャップを有したバイアルに入れた。前記反応混合物を回転オーブン（Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を利用して６０℃で１２時間振盪した。前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦに続いて、ＤＣＭで洗浄して、第１成分片を準備した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２９】
ＮＭＰ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ）中のＦｍｏｃ−フェニルアラニン（４当量、商業的に利用可能、第２成分片）、ＨＡＴＵ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、４当量）、およびＤＩＥＡ（４当量）の溶液を前記樹脂に添加した。前記反応混合物を室温で４時間振盪した後、前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、続いてＤＭＦで洗浄した。
前記樹脂にＤＭＦ中の２０％ピペリジンを添加した。前記反応混合物を室温で８分間振盪した後、前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、続いてＤＭＦで洗浄した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４８】
製造例１０
２−（４−フルオロ−ベンジル）−４，７−ジオクソー−６−フェネチル−８−（３−トリフルオロ−メチルベンジル）−ヘキサヒドロ−ピラジノ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアジン−１−カルボン酸ベンジルアミドの製造
ブロモアセタール樹脂（６０ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ／ｇ）およびＤＭＳＯ（２．５ｍｌ、２Ｍ）中の３−トリフルオロ−メチルベンジルアミン溶液をスクリューキャップを有したバイアルに入れた。前記反応混合物を回転オーブン（Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を利用して６０℃で１２時間振盪した。前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦで洗浄し、続いてＤＣＭで洗浄した。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５１】
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ；３．１５−３．５３（ｍ、６Ｈ）、４．３１−４．４２（ｍ、４Ｈ）、４．４７−４．８５（ｍ、２Ｈ）、５．２２（ｔ、１Ｈ）、５．４７（ｍ、２Ｈ）、６．８１（ｄ、２Ｈ）、６．８５（ｄ、２Ｈ）、６．９１（ｍ、４Ｈ）、７．１５−８．２４（ｍ、１４Ｈ）
【化３９】
2009538903.tif 000096
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５２】
製造例１１
２−（４−フルオロ−ベンジル）−６−（４−メトキシ−ベンジル）−４，７−ジオクソー−８−（３−トリフルオロメチル−ベンジル）−ヘキサヒドロ−ピラジノ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアジン−１−カルボン酸ベンジルアミドの製造
ブロモアセタール樹脂（６０ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ／ｇ）およびＤＭＳＯ（２．５ｍｌ、２Ｍ）中の３−トリフルオロ−メチルベンジルアミン溶液をスクリューキャップを有したバイアルに入れた。前記反応混合物を回転オーブン（Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を利用して６０℃で１２時間振盪した。前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦに続いてＤＣＭで洗浄した。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６４】
ＤＭＦ中の２−（１−ベンジルカルバモイル）−１−ベンジルヒドラジノ）酢酸（４当量）、ＨＯＢＴ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ、４当量）、およびＤＩＣ（４当量）の溶液を前記で準備した樹脂に添加した。前記反応混合物を３時間室温で振盪した後、前記樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、続いてＭｅＯＨで洗浄した。前記樹脂を室温の真空中で乾燥した。
前記樹脂を室温で１８時間ギ酸（２．５ｍｌ）で処理した。前記樹脂を濾過によって除去し、前記濾過液を減圧下で濃縮して、オイルである前記表題化合物を得た。
【国際調査報告】
2009538903.tif 000097
2009538903.tif 000098
2009538903.tif 000099