(57)【要約】上昇したＴＮＦαおよび／またはＩＬ−６レベルを伴う状態の治療または予防用の薬物を製造するためのｈｓｐ９０タンパク質の阻害剤の使用。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
上昇したＴＮＦαおよび／またはＩＬ−６レベルを伴う状態の治療または予防用の薬品を製造するためのｈｓｐ９０タンパク質の阻害剤の使用。
【請求項２】
前記状態が、敗血症、ＳＩＲＳまたは自己免疫疾患、好ましくはクローン病、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎もしくは全身性エリテマトーデスを含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記敗血症が、感染に起因する敗血症である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記感染が、細菌感染または真菌感染である、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記敗血症が、真菌感染に起因しない、請求項２に記載の使用。
【請求項６】
前記敗血症が、細菌感染に起因しない、請求項２または５に記載の使用。
【請求項７】
前記敗血症が、感染に起因しない、請求項２に記載の使用。
【請求項８】
前記ｈｓｐ９０タンパク質が、アミノ酸配列ＸＸＸＬＸＶＩＲＫＸＩＶ（Ｘは、任意のアミノ酸である）（配列番号：６）を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記ｈｓｐ９０タンパク質が、アミノ酸配列ＸＸＩＬＸＶＩＸＸＸＸＸ（Ｘは、任意のアミノ酸である）（配列番号：７）を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
前記ｈｓｐ９０タンパク質が、アミノ酸配列ＬＫＶＩＲＫ（配列番号：４）を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
前記ｈｓｐ９０タンパク質が、配列番号２と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
前記阻害剤が、抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
前記抗体または抗原結合フラグメントが、アミノ酸配列ＬＫＶＩＲＫ（配列番号：４）を有するエピトープに結合することができるまたは特異的であり得る、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記抗体が、配列番号：１の配列を含む、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
ｈｓｐ９０タンパク質の阻害剤を患者に投与することを含む、患者におけるＴＮＦαおよび／またはＩＬ−６レベルを低下させる方法。
【請求項１６】
前記患者が、上昇したＴＮＦαおよび／またはＩＬ−６レベルに起因する状態に罹患している、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記阻害剤が、抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
患者におけるｈｓｐ９０タンパク質循環レベルを判定する段階を含む、上昇したＴＮＦαおよび／またはＩＬ−６レベルを伴う患者における状態の診断方法（上昇したｈｓｐ９０タンパク質レベルが、その状態の存在を示す）。
【請求項１９】
患者におけるｈｓｐ９０タンパク質循環レベルを判定する段階が、患者から採取したサンプル中のｈｓｐ９０タンパク質のレベルを判定することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
患者におけるｈｓｐ９０タンパク質循環レベルを判定する段階が、抗体またはその抗原結合フラグメントをｈｓｐ９０タンパク質に結合させることを含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記状態が、敗血症、ＳＩＲＳまたは自己免疫疾患、特に、クローン病、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎もしくは全身性エリテマトーデスを含む、請求項１６から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記敗血症が、感染に起因する敗血症である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記感染が、細菌感染または真菌感染である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記敗血症が、真菌感染に起因しない、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記敗血症が、細菌感染に起因しない、請求項２１または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記敗血症が、感染に起因しない、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記ｈｓｐ９０タンパク質が、アミノ酸配列ＸＸＸＬＸＶＩＲＫＸＩＶ（Ｘは、任意のアミノ酸である）（配列番号：６）を含む、請求項１５から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ｈｓｐ９０タンパク質が、アミノ酸配列ＸＸＩＬＸＶＩＸＸＸＸＸ（Ｘは、任意のアミノ酸である）（配列番号：７）を含む、請求項１５から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ｈｓｐ９０タンパク質が、アミノ酸配列ＬＫＶＩＲＫ（配列番号：４）を含む、請求項１５から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ｈｓｐ９０タンパク質が、配列番号２と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有する、請求項１５から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗体または抗原結合フラグメントが、アミノ酸配列ＬＫＶＩＲＫ（配列番号：４）を有するエピトープに結合することができるまたは特異的であり得る、請求項１７または２０に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗体が、配列番号：１の配列を含む、請求項３１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、上昇したＴＮＦαおよび／またはＩＬ−６レベルを伴う状態の治療的処置または予防のための薬物に関する。本発明は、患者におけるＴＮＦαおよび／またはＩＬ−６レベルを低下させる方法にも関し、また上昇したＴＮＦαおよび／またはＩＬ−６レベルを伴う状態を診断する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
敗血症は、全身性炎症反応に至ることもある重症感染によって一般に引き起こされる重篤な医学的状態である。症状としては、発熱、悪寒、倦怠感および低血圧を挙げることができる。たとえ治療を受けていても、敗血症に罹患している患者は、多数の器官の機能不全症候群または死にまでも進むことがある。
【０００３】
感染が起こったことがわからない状況で発生する敗血症の症状も観察され、そうした症例の状態は、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）として知られている。
【０００４】
インターロイキン６（ＩＬ−６）は、患者における上昇したレベルが、その患者におけるより重度の感染および転帰不良と相関付けられているような感染における急性期反応の要素である。近年、上昇したＩＬ−６レベルが敗血症およびＳＩＲＳに関連していると報告された。
【０００５】
新生児において、３１ｐｇ／ｍｌの最適カットオフで、上昇したＩＬ−６レベルは、第０日における遅発性感染症の診断のための８９％の感度および９１％の陰性予測値を有した（Ｎｇ等  １９９７）。ＩＬ−６のレベルは、グラム陽性敗血症と比較して真菌感染症の際に有意に高く（ｐ＝０．０３５）、真菌性敗血症によって死亡した新生児では非常に上昇したレベルであった（Ｎｇ等  ２００３）。外科的患者において、上昇したＩＬ−６は、ＳＩＲＳと関連付けられており（Ｍｉｙａｏｋａ等  ２００５）、ならびに３１０ｐｇ／ｍｌのカットオフで、手術後、最初の５日間に敗血症性合併症を有した患者において、手術後敗血症性合併症を有する患者と有さない患者とを区別する際、９０％の感度および５８％の特異性を有する試験を可能にした（Ｍｏｋａｒｔ等  ２００５）。上昇したＩＬ−６は、非感染性と推定されるＳＩＲＳ（平均８０．９ｐｇ／ｍｌ）と比較して、患者におけるＳＩＲＳおよび推定感染症（平均２２２．８ｐｇ／ｍｌ）に関連していた（Ｔｅｒｒｅｇｉｎｏ等  ２０００）。
【０００６】
インターロイキン６の生産は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）によって、一部、誘導される。治療目的でのＴＮＦ−αの中和、およびＴＮＦ−α活性の代用マーカーとしてのインターロイキン６レベルの使用が、当分野において報告されている。例えば、モノクローナル抗ＴＮＦ−α抗体Ｆ（ａｂ’）２（Ａｆｅｌｉｍｏｍａｂとして知られている）の有効性および安全性の研究において、その活性は、高いインターロイキン６レベルを有する患者では顕性であり、インターロイキン６陰性の患者では不在であった（Ｐａｎａｃｅｋ等  ２００４）。こうした提案された療法は、ＴＮＦ−αが宿主傷害性サイトカインである、およびＬＰＳ（リポ多糖類）がＴＮＦ−α放出を誘発し、これが敗血症性ショックの発現を招くという理論に基づく（ＨｅｈｌｇａｎｓおよびＰｆｅｆｆｅｒ  ２００５）。この理論は、高レベルのＴＮＦ−αが敗血症中に存在するという観察に基づき、この場合、患者の死は予測されるが、ＴＮＦ−αのレベルを患者の生存と相関させることはできない。
【０００７】
別の研究分野により、真菌ストレスタンパク質ｈｓｐ９０に対する抗体を含む薬物Ｍｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）が開発された。これは、侵襲性カンジダ症を有する患者が、その疾病から回復するとき、ｈｓｐ９０に血清変換するという観察に従って開発された。特許文献４は、真菌感染を治療するためのＭｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）抗体とポリエン（例えば、アンフォテリシンＢ）の併用剤またはエキノカンジン抗真菌剤の使用を報告している。この薬とアンフォテリシンＢの併用は、臨床試験においてアンフォテリシンＢとプラシーボ（食塩水）と比較したとき、抗真菌剤としてのその直接的活性、および循環ｈｓｐ９０を中和するその薬の能力のため、相乗効果を示したことも報告されている。Ｍａｔｔｈｅｗｓ等，２００５は、ｈｓｐ９０がヒト疾病においてどのような役割を果たすかに関して報告した。
【０００８】
【特許文献１】欧州特許出願公開第０４０６０２９号明細書
【特許文献２】国際公開第９２／０１７１７号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９４／０４６７６号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０１／７６６２７号パンフレット
【発明の開示】
【０００９】
本発明は、ｈｓｐ９０タンパク質の投与が、上昇したＴＮＦαおよびＩＬ−６レベルを生じさせる、およびこの効果を（ＭＲＳＡのＡＢＣトランスポーターに対する抗体を含むＡｕｒｏｇｒａｂ（登録商標）とではなく）Ｍｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）薬とｈｓｐ９０の事前の交差吸収によって中和できる、という発見に基づく。
【００１０】
いずれの理論による拘束も望まないが、本発明は、個体における循環ｈｓｐ９０タンパク質の存在が、その個体におけるＴＮＦαおよびＩＬ−６のレベルを上昇させるため、作用すると考えられる。個体におけるｈｓｐ９０タンパク質の存在が、その個体におけるＩＬ−６レベルを上昇させるように直接作用することもあり、または上昇したＴＮＦαレベルが、個体におけるＩＬ−６のレベルを上昇させるということもある。個体における、より高いレベルのこれら２つのサイトカイン（ＴＮＦαおよびＩＬ−６）の存在は、敗血症またはＳＩＲＳとして観察される炎症反応の原因となる。以下にこの理論の推論を説明する。
【００１１】
Ｍｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）薬が、真菌ｈｓｐ９０タンパク質を中和することによって真菌感染を治療する際に作用することは、従来技術において報告されている。Ｍｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）抗体が特異的であるエピトープは、ヒトｈｓｐ９０と共に保存されるので、Ｍｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）抗体は、必然的にヒトｈｓｐ９０タンパク質にも結合し、それを中和することとなる。この結合は、本明細書の実施例１（ヒトおよび真菌ｈｓｐ９０へのＭｙｃｏｇｒａｂの結合）において報告するデータによって確認された。
【００１２】
Ｈｓｐ９０は、細胞壊死の際にのみ放出され、細胞アポトーシスの際には放出されない細胞内タンパク質であると考えられる（Ｓａｉｔｏ等  ２００５）。従って、壊死性細胞がｈｓｐ９０を患者における循環に放出し、その結果、患者は、微生物の陽性培養物が不在の状態で敗血症に似た症状（すなわち、ＳＩＲＳ−全身性炎症反応症候群）を提示することとなることを提案する。真菌ｈｓｐ９０がヒトｈｓｐ９０のダイレクトミミックとしての機能を果たす真菌性敗血症では、この状況が悪化される。この状況は、細菌性敗血症においても悪化されることがあり、この場合、細菌相同体ｈｔｐＧが放出され、臨床像を生じさせるまたは悪化させることがある。
【００１３】
敗血症において、遊離ｈｓｐ９０／ｈｔｐＧは、敗血症像を生じさせることがあり、これは、今、報告するように、高レベルのインターロイキン６の誘導によって間接的に観察することができる（実施例３参照）。患者の血清中のインターロイキン６のレベルを、二重盲検、プラシーボ対照試験で測定した。ＩＬ−６レベルの低減は、Ｍｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）で治療した群では回復と相関したが、これは、プラシーボ群では起こらなかった。最も有意なことに、プラシーボ群におけるカンジダに起因して死亡した患者は、永続的、高レベルのＩＬ−６を有した。
【００１４】
本明細書において報告するデータは、ｈｓｐ９０がインターロイキン６放出を直接もたらすので、ｈｓｐ９０の中和によりＩＬ−６放出が効率的に遮断されるという概念を支持する。ｈｓｐ９０を中和する遮断が、ＴＮＦ−α放出を遮断することとなるので、ＴＮＦ−αが最も重要な分子である自己免疫疾患の治療においてｈｓｐ９０タンパク質の阻害は有効であるという概念も支持する。
【００１５】
本発明の１つの態様に従って、上昇したＴＮＦαおよび／またはＩＬ−６レベルを伴う状態の治療または予防用薬物を製造するためのｈｓｐ９０タンパク質の阻害剤の使用を提供する。
【００１６】
本発明のもう１つの態様において、患者におけるＴＮＦαおよび／またはＩＬ−６レベルを低下させる方法を提供し、この方法は、患者にｈｓｐ９０タンパク質の阻害剤を、好ましくは、その患者のＴＮＦαおよび／またはＩＬ−６レベルを低下させるために十分な量で、投与することを含む。
【００１７】
一部の実施形態において、前記患者は、上昇したＴＮＦαおよび／またはＩＬ−６レベルに起因する状態に罹患している。
【００１８】
本発明のさらなる態様に従って、上昇したＴＮＦαおよび／またはＩＬ−６レベルを伴う患者における状態を診断する方法を提供し、この方法は、その患者における循環ｈｓｐ９０タンパク質レベルを判定する段階を含み、上昇したｈｓｐ９０タンパク質レベルがその状態の存在を示す。
【００１９】
患者体内で循環しているｈｓｐ９０タンパク質のレベルの判定は、患者に対して直接行うことができるが、より適便には、患者から採取したサンプル（例えば、血液サンプル）中のｈｓｐ９０タンパク質のレベルを判定することによって行われる。このようにして、本診断法は、エクスビボで行われる。
【００２０】
前記患者は、一般には哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。
【００２１】
上昇したＴＮＦα（腫瘍壊死因子α）またはＩＬ−６（すなわち、インターロイキン−６）レベルを伴う状態とは、ＴＮＦαまたはＩＬ−６が、その状態に罹患している患者における正常レベルより上であるため、その状態のマーカーとしての機能をそれぞれ果たす状態である。上昇したＩＬ−６レベルを伴う状態およびマーカーとしてのＩＬ−６の使用に関するさらなる説明は、Ｍｉｙａｏｋａ等，２００５、Ｍｏｋａｒｔ等，２００５、Ｎｇ  １９９７、Ｎｇ等，２００３、Ｎｇ等，２００４およびＴｅｒｒｅｇｉｎｏ等，２０００に提供されている。そうした状態の例としては、敗血症およびＳＩＲＳ（全身性炎症反応症候群）が挙げられる。上昇したＴＮＦαレベルは、例えば、自己免疫疾患、例えばクローン病、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に関係する。
【００２２】
患者におけるＴＮＦαまたはＩＬ−６のレベルは、例えば、実施例２において報告するＴＮＦαアッセイおよびインターロイキン６アッセイを使用して評価することができる。一部の実施形態において、その異常レベルを示すＴＮＦαまたはＩＬ−６のレベルは、患者における正常濃度の５、１０または２０倍である。しかし、正常の数百倍の（例えば、１００倍）のレベルが一部の患者において観察されることに留意しなければならない。
【００２３】
敗血症は、感染に起因することもあり、または他の原因に起因することもあり（すなわち、ＳＩＲＳ）、本発明は、両方の場合を包含することを正しく認識しなければならない。一部の実施形態において、敗血症は、真菌または細菌感染の結果としてであるが、本発明は、真菌または細菌感染に起因しない敗血症にも関することを理解しなければならない。
【００２４】
ｈｓｐ９０タンパク質は、広範な生物において生産される、高度に保存されたストレスタンパク質の１ファミリーである。例えば、特許文献１は、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）のｈｓｐ９０タンパク質に関して報告している。特許文献２は、コリネバクテリウム・ジュイケイウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｅｕｋｅｉｕｍ）のｈｓｐ９０タンパク質に関して報告している。ホモサピエンスのｈｓｐ９０タンパク質も当分野において公知であり、配列番号：３として本明細書に含まれている。従って、本発明において用いる用語「ｈｓｐ９０タンパク質」は、これらのタンパク質のそれぞれを含み、ならびに例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の細菌相同体ｈｔｐＧも含む。さらに、特許文献３は、異なる生物のｈｓｐ９０タンパク質中に存在する多数の保存配列に関して報告している。従って、本発明は、このストレスタンパク質ファミリーに分類される任意のｈｓｐ９０タンパク質に関する。一定の実施形態において、ｈｓｐ９０タンパク質は、ここで説明するように、さらに具体的に定義される。
【００２５】
１つの実施形態において、ｈｓｐ９０タンパク質は、アミノ酸配列ＸＸＸＬＸＶＩＲＫＸＩＶ（Ｘは、任意のアミノ酸である）を含む。
【００２６】
代替実施形態において、ｈｓｐ９０タンパク質は、アミノ酸配列ＸＸＩＬＸＶＩＸＸＸＸＸ（Ｘは、任意のアミノ酸である）を含む。
【００２７】
上の２つのコンセンサス配列が、特許文献３に報告されていることを正しく認識しなければならず、ならびに本発明の他の実施形態では、ｈｓｐ９０タンパク質が、特許文献３（本明細書に参照により組み込まれている）に報告されている他のコンセンサス配列のいずれかによって定義されることを理解しなければならない。
【００２８】
一部の他の実施形態において、ｈｓｐ９０タンパク質は、アミノ酸配列ＬＫＶＩＲＫ、好ましくはＬＫＶＩＲＫＮＩＶを含む。
【００２９】
一部のさらなる実施形態において、ｈｓｐ９０タンパク質は、カンジダ・アルビカンスからのｈｓｐ９０の配列、すなわち、配列番号：２と、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有する。
【００３０】
これに関して、カンジダ・アルビカンスのｈｓｐ９０タンパク質の配列は、ヒトｈｓｐ９０αアイソフォーム２の配列と５８％の同一性を有し、その結果、カンジダ・アルビカンスのｈｓｐ９０タンパク質の配列との少なくとも５８％同一性のレベルも、本発明によるｈｓｐ９０タンパク質の１つの定義であることを正しく認識しなければならない。
【００３１】
本明細書において、二配列間の「同一性」百分率は、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムバージョン２．２．２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ  Ａ．Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ，Ｊｉｎｇｈｕｉ  Ｚｈａｎｇ，Ｚｈｅｎｇ  Ｚｈａｎｇ，Ｗｅｂｂ  Ｍｉｌｌｅｒ，ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９９７），「Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）を使用し、デフォルトパラメータを使用して決定される。詳細には、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＵＲＬ  ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔを使用してインターネット上で入手することができる。
【００３２】
ｈｓｐ９０タンパク質の阻害剤は、インビボでのｈｓｐ９０タンパク質の活性を低下させることができる、任意のタンパク質、ペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖または他の生体適合性産物であってもよい。さらに具体的には、前記阻害剤は、ＩＬ−６レベルの上昇に関するｈｓｐ９０タンパク質の作用を低下させる。従って、ｈｓｐ９０タンパク質の阻害剤としての生体適合性産物の有効性は、その産物を有するまたは有さない患者における循環ｈｓｐ９０タンパク質レベルを判定することにより、またはその産物を有するおよび有さない患者における循環ＩＬ−６レベルを判定することにより、評価することができる。
【００３３】
一部の実施形態において、前記阻害剤は、抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。しかし、これは、本発明にとって本質的ではなく、前記阻害剤は、別のタイプの活性成分、例えば、抗生物質ゲルダナマイシン、ラジシコールもしくはノボビオシンまたは薬物シスプラチンであってもよい。
【００３４】
抗体、それらの製造および使用は、周知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９に開示されている。
【００３５】
抗体は、当分野において公知の標準的な方法を使用して産生させることができる。抗体の例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、抗体のＦａｂフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリによって生産される抗体のフラグメント、および抗原結合フラグメントが挙げられる（しかし、これらに限定されない）。
【００３６】
「抗原結合フラグメント」は、ターゲット抗原に結合することができる抗体の任意のフラグメントを含み、従って、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントを含む。
【００３７】
抗体は、一定範囲の宿主、例えば、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒトおよびその他において生産され得る。カンジダ属からの熱ショックタンパク質、例えばＣ．アルビカンスからのｈｓｐ９０、または免疫原性を有するその任意のフラグメントもしくはオリゴペプチドを注射することによって、それらを免疫することができる。もう１つの例として、ホモサピエンスからの熱ショックタンパク質で宿主を免疫することができる。宿主種に依存して、免疫反応を増大させるために様々なアジュバントを使用することができる。そうしたアジュバントとしては、フロイント、ミネラルゲル、例えば水酸化アルミニウム、ならびに界面活性剤、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニンおよびジニトロフェノールが挙げられるが、これらに限定されない。ヒトにおいて使用されるアジュバントの中では、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）およびコリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）が特に有用である。
【００３８】
ｈｓｐ９０熱ショックタンパク質またはその任意のフラグメントまたはオリゴペプチドに対するモノクローナル抗体は、培養での連続細胞系統による抗体分子の生産に備える任意の技術を使用して、調製することができる。これらとしては、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｋｏｅｈｌｅｒ等．，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７；Ｋｏｓｂｏｒ等．，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ４：７２；Ｃｏｔｅ等．，１９８３，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８０：２０２６−２０３０；Ｃｏｌｅ等．，１９８５，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．７７−９６）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
加えて、「キメラ抗体」の生産のために開発された技術、適切な抗原特異性および生物活性を有する分子を得るためのヒト抗体遺伝子へのマウス抗体遺伝子のスプライシングを使用することができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等．，１９８４，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ等．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：６０４−６０８；Ｔａｋｅｄａ等．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ，３１４：４５２−４５４）。あるいは、当分野において公知の方法を使用して、一本鎖抗体の生産について記載された技術を、ｈｓｐ９０熱ショックタンパク質特異的一本鎖抗体の生産に適応させることができる。関連した特性を有するが、別のイディオタイプの組成の抗体を、ランダムコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリから鎖シャッフリングによって産生させることができる（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．，１９９１，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８８：１１１２０−１１１２３）。
【００４０】
抗体は、リンパ球集団におけるインビボ生産の誘導によって、または組換え免疫グロブリンライブラリもしくは高特異的結合試薬のパネルをスクリーニングすることによって生産することもできる（Ｏｒｌａｎｄｉ等．，１９８９，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８６：３８３３−３８３７；Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．等．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ，３４９：２９３−２９９）。
【００４１】
抗原結合フラグメントも産生させることができ、例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、抗体分子のペプシン消化によって生産することができ、およびＦａｂフラグメントは、それらのＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド結合を還元することによって産生させることができる。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリを構築して、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速で容易な同定を可能にすることができる（Ｈｕｓｅ等．，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：１２７５−１２８１）。
【００４２】
所望の特異性を有する抗体を同定するためのスクリーニングには、様々なイムノアッセイを用いることができる。確立された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを使用する、競合結合アッセイまたはイムノラジオメトリックアッセイについての非常に多数のプロトコルが、当分野において周知である。そうしたイムノアッセイは、一般に、ｈｓｐ９０熱ショックタンパク質またはその任意のフラグメントもしくはオリゴペプチドとその特異的抗体との複合体形成の測定を含む。２つの非干渉性ｈｓｐ９０熱ショックタンパク質エピトープに特異的なモノクローナル抗体を利用する、２サイトモノクローナルベースイムノアッセイを使用してもよいが、競合結合アッセイも利用してもよい（Ｍａｄｄｏｘ等．，１９８３，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１５８：１２１１−１２１６）。
【００４３】
有利には、前記抗体または抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＬＫＶＩＲＫ、好ましくはＬＫＶＩＲＫＮＩＶを有するエピトープに結合することができる、または特異的であり得る。
【００４４】
一部の実施形態において、前記抗体は、Ｍｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）の抗体成分の配列、すなわち、配列番号：１を含む。
【００４５】
本診断法においてｈｓｐ９０タンパク質のレベルを判定するために、一部の実施形態では、ｈｓｐ９０タンパク質（またはその抗原結合フラグメント）に結合することができる抗体が使用される。前記抗体または抗原結合フラグメントを、例えば、蛍光タグに結合させて、ｈｓｐ９０タンパク質への結合、および従って、存在するｈｓｐ９０タンパク質のレベル（濃度または絶対量）を視覚化することができる。ｈｓｐ９０タンパク質に関して上で説明した抗体も、こうして本診断法において使用することができる。
【００４６】
診断すべき状態が病原性感染である、本診断法の一部のさらなる実施形態では、その感染の原因である種も決定する。これを行うことができる１つの方法は、ｈｓｐ９０タンパク質のカルボキシ末端に存在する種特異的エピトープの配列を決定することによる。例えば、真菌種カンジダ・アルビカンスは、種特異的エピトープにペプチド配列ＤＥＰＡＧＥを有し（配列番号：２のアミノ酸残基６９５から７００を参照のこと）、従って、このエピトープに特異的な抗体の結合は、感染性病原体としてのカンジダ・アルビカンスの存在を示す。
【００４７】
しかし、本診断法は、病原体による感染に起因する状態の診断に限定されないことに留意しなければならない。実際、本診断法は、存在する病原体なしに発生するＳＩＲＳなどの状態において、特に有用である。
【００４８】
本発明の薬物を製造するために使用することができる方法は、周知である。例えば、薬物は、ｈｓｐ９０タンパク質の阻害剤に加えて、医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含むことがある（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ＵＳ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ，１９８４，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ）。当業者は、例えば、単純な用量応答実験の使用により、患者に投与すべき薬物の正確な用量（すなわち、医薬的に許容される用量）を容易に決定することができる。抗体または抗原結合フラグメントである薬物の場合、０．１から１０ｍｇ／体重１ｋｇまたは０．５から５ｍｇ／体重１ｋｇの範囲の投薬量が好ましく、１ｍｇ／ｋｇ付近の投薬量が、特に好ましい。本薬物は、経口投与することができる。
【００４９】
配列表の簡単な説明
配列番号：１は、Ｍｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）の抗体成分のアミノ酸配列である。
【００５０】
配列番号：２は、カンジダ・アルビカンスからのｈｓｐ９０ストレスタンパク質のアミノ酸配列である。
【００５１】
配列番号：３は、ヒトｈｓｐ９０αアイソフォーム２タンパク質のアミノ酸配列である。
【００５２】
配列番号：４は、配列番号：１の抗体が特異的な、ｈｓｐ９０におけるエピトープのアミノ酸配列である。
【００５３】
配列番号：５は、隣接アミノ酸残基を伴う配列番号：４のエピトープのアミノ酸配列である。
【００５４】
配列番号：６は、ｈｓｐ９０上のエピトープのコンセンサス配列である。
【００５５】
配列番号：７は、ｈｓｐ９０上のエピトープのコンセンサス配列である。
【００５６】
配列番号：８は、実施例において使用したＰＣＲプライマー配列である。
【００５７】
配列番号：９は、実施例において使用したＰＣＲプライマー配列である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５８】
実験
【実施例１】
【００５９】
ターゲットエピトープＬＫＶＩＲＫ、ヒトおよび真菌ｈｓｐ９０、へのＭｙｃｏｇｒａｂ結合の実証
Ｍｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）の、当初は対抗させたｈｓｐ９０の中からのＬＫＶＩＲＫ−ペプチド（配列番号４）への、ならびにカンジダ・アルビカンスおよびヒトｈｓｐ９０αからの相同体を代表する配列から誘導したｈｓｐ９０の組換えバージョンへの結合を、実時間Ｂｉａｃｏｒｅ分析を用いて実証した。加えて、ＬＫＶＩＲＫ−ペプチドへの結合に対する温度の影響を調査した。
【００６０】
材料および方法
Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＳＡへのビオチン化ＬＫＶＩＲＫペプチドの固定化は、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０および３．４ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４からなるＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を２０μｌ／分の流量で２つの隣接するフローセル上に継続的に流すことによって行った非共有結合性捕捉によるものであった。カンジダ・アルビカンスｈｓｐ９０は、１０ｍＭ  酢酸ナトリウム  ｐＨ４．０に対して透析し、それを、アミノカップリングを用いてＣＭ−５  Ｃｈｉｐの表面に共有結合させた。ヒトｈｓｐ９０α（１．１５ｍｇ／ｍｌ）は、１０ｍＭ  酢酸ナトリウム  ｐＨ４．０で１：５０希釈し、アミノカップリングを用いてＣＭ−５  Ｃｈｉｐの表面に共有結合させた。
【００６１】
Ｍｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）は、特許文献４（特に、１１および１２頁参照）（これは、本明細書に参照により組み込まれている）に記載されているとおり調合した。
【００６２】
結果
１濃度系列のＭｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）のそれらのペプチドへの結合を分析した結果を図１に示す。Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェアを使用してそれを分析した。リガンドと分析物との１：１結合のラングミュアモデルにより、結合曲線の良好なフィットが得られ、ｋａ（会合速度定数）は、２．２６ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１であると算定され、ｋｄ（解離速度定数）は、６．４７ｘ１０−４ｓ−１であった。ＫＤ（解離定数）は、２．８６ｘ１０−８Ｍであり、これは、結合が数日という長い半減期を有することを意味した。
【００６３】
観察された速度定数（Ｋｏｂｓ）をＭｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）の濃度に対してプロットして、Ｍｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）サンプル中の凝集または溶解性の問題の存在について検査した。この結果、凝集が論点にならないことを明示する直線を得た。
【００６４】
カンジダｈｓｐ９０への結合の場合、１：１のラングミュアモデルにより、結合曲線の良好なフィットが得られ、ｋａ（会合速度定数）は、３７３Ｍ−１ｓ−１であると算定され、ｋｄ（解離速度定数）は、２．６７ｘ１０−４ｓ−１であった。この結果を図２に示す。ＫＤ（親和定数、ｋａとｋｂの比）は、７．１７ｘ１０−７Ｍであった。このフィットのカイ値は、１．５８であった（２未満は、良好なフィットであった）。
【００６５】
この実験に用いた濃度範囲でのＭｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）サンプルに伴う凝集または溶解性の問題を除外するために、Ｋｏｂｓを濃度に対してプロットし、その結果、凝集の証拠がないサンプルを示す直線を得た。
【００６６】
ヒトｈｓｐ９０への結合の場合（その結果を図３に示す）、１：１のラングミュアモデルにより、結合曲線の良好なフィットが得られた。このモデルでは、ｋｄ３．２１ｘ１０−３ｓ−１で、ｋａが９８１Ｍ−１ｓ−１と算定された。ＫＤは、３．２７ｘ１０−６Ｍと算定され、このフィットのカイ値は、０．８２であった。
【００６７】
Ｍｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）サンプルにおける凝集または溶解性の問題を除外するために、ｋｏｂｓを濃度に対してプロットした。この結果、凝集の証拠がないことを明示する直線を得た。
【００６８】
この系では温度変化に伴ってペプチドへのＭｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）の結合プロフィールの明瞭な変化があった。この結果を図４に示す。図４は、オーバーレイした参照を引いたセンサーグラムにおいて、温度上昇に伴って最大ＲＵ値が増加したことを明示している。その結合を飽和点に外挿すると、温度が高いほど、チップの表面に結合したＭｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）が多かった。この温度系列の最低点、１０から２５℃で、５から２０ＲＵの範囲のＲｍａｘの小さな増加があった。３７℃で、応答の有意な増加があり、Ｒｍａｘは１１８ＲＵに増加した。解離曲線の検定は、解離速度定数が、温度に関係なく比較的一定のままであることを示した。
【００６９】
Ｍｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）は、ＬＫＶＩＲＫペプチドを代表するペプチドに緊密に結合した。その会合速度定数（ｋａ）は、２．２６ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１であり、それが結合したとき、６．４７ｘ１０−４ｓ−１の解離速度定数（ｋｄ）が示すように、そのターゲットと強く相互作用した。得られたＫＤは、２．８６ｘ１０−８Ｍであり、これは、その結合が数日という長い半減期を有することを意味した。
【００７０】
カンジダ・アルビカンスからのｈｓｐ９０およびヒトｈｓｐ９０へのＭｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）の結合についてのＫＤは、それぞれ、７．１７ｘ１０−７Ｍおよび３．２７ｘ１０−６Ｍであった。Ｍｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）は、単離されたペプチドと比較される、ｈｓｐ９０タンパク質についての明瞭な全体的に低い会合速度を、２．２６ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１（ペプチド）と比較されるｋａ  ３７３  Ｍ−１ｓ−１（カンジダｈｓｐ９０）および９８１  Ｍ−１ｓ−１（ヒトｈｓｐ９０）で明示した。しかし、２．６７ｘ１０−４ｓ−１（カンジダＨｓｐ９０）および３．２１ｘ１０−３ｓ−１（ヒトｈｓｐ９０）の天然相互作用系についてのｋｄは、両方とも、結合の際、ＬＫＶＩＲＫペプチドについてのもの（６．４７ｘ１０−４ｓ−１）と同様に強い相互作用（長い半減期）を惹起する。
【００７１】
天然ｈｓｐ９０は、約８０ｋＤａの相当大きな高分子であり、これは、Ｍｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）が指定された時間枠内で特定の結合部位に到達する確率を減少させ、従って、ｋａを減少させる。ｈｓｐ９０の高分子構造は、単独での単離されたペプチドと比較して、エピトープの静電環境を有意に修飾する。しかし、首尾よくドッキングされると、Ｍｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）は、エピトープの状況に関係なく十分に相互作用を維持することとなり、その結果、３つの異なる試験系について同様のｋｄ特性が生じる。
【００７２】
温度が高いほど、ペプチドへのＭｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）の結合が増加した。患者においてＭｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）が使用される温度である３７℃で、最高の結合が観察された。Ｍｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）は、ヒト免疫系によって最適化される構造に基づくので、その結合は、体温で最も有効であると予測された。
【実施例２】
【００７３】
マウスモデルにおけるインターロイキン６の誘導
この実験は、精製されたカンジダｈｓｐ９０の注射後のマウスにおけるＴＮＦ−αおよびインターロイキン６の生産を測定するために計画した。注射前の１５分間、３７℃でのＭｙｃｏｇｒａｂとの交差吸収によりこの現象を中和する能力も試験した。
【００７４】
材料および方法
カンジダＨｓｐ９０タンパク質のクローニングおよび発現
カンジダＨｓｐ９０タンパク質をクローニングし、発現させるために、ＤＮｅａｓｙ（商標）スピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）をその製造業者のインストラクションに従って使用して調製したカンジダゲノムＤＮＡから、直接、コーディング配列をＰＣＲ増幅した。使用したオリゴヌクレオチドは、Ｓｉｇｍａ  ｇｅｎｏｓｙｓによって合成した５’−ＡＴＧＧＣＴＧＡＣＧＣＡＡＡＡＧＴＴＧ−３’（配列番号：８）および５’−ＡＴＣＡＡＣＴＴＣＴＴＣＣＡＴＡＧＣＡＧ−３’（配列番号：９）であった。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して増幅を行い、それによって、発現ベクターｐＹＥＳ２．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、直接、ライゲーション依存的にクローニングすることができ、発現されたＨｓｐ９０タンパク質にＧＡＬ１プロモータの制御下でＣ末端融合Ｈｉｓ６−タグを付加させた。そのクローニングミックスを大腸菌発現株ＴＯＰ１０Ｆ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびモノクローナル抗Ｈｉｓ−タグペルオキシダーゼコンジュゲート抗体（Ｓｉｇｍａ）を使用する免疫ブロット法を用いて、組換え体を同定した。得られたプラスミドはｐＨｓｐ１と呼んだ。
【００７５】
カンジダＨｓｐ９０タンパク質の精製
６−Ｈｉｓ−タグＨｓｐ９０タンパク質の過発現のために、Ｓ．ｃ．ＥａｓｙＣｏｍｐ（商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をその製造業者の指示方法に従って使用して、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＩＮＶＳｃ１をｐＨｓｐ１で形質転換した。ＩＮＶＳｃ１（ｐＨｓｐ１）を、１０ｍｌのＳＣ−Ｕ増殖培地（０．６７％  イースト・ナイトロジェン・ベース（ＳＩＧＭＡ  ｃａｔ．Ｙ−０６２６）、０．１９％  酵母合成ドロップアウト培地サプリメント、ウラシル不含（ＳＩＧＭＡ  ｃａｔ．Ｙ−１５０１）、２％  ラフィノース）中で一晩、増殖させた。遠心分離（５０００ｇ、１０分  ４℃）によって細胞を回収し、そのペレットを１０ｍｌのＳｃ−Ｕ誘導培地（０．６７％  イースト・ナイトロジェン・ベース（ＳＩＧＭＡ  ｃａｔ．Ｙ−０６２６）、０．１９％  酵母合成ドロップアウト培地サプリメント、ウラシル不含（ＳＩＧＭＡ  ｃａｔ．Ｙ−１５０１）、２％  ガラクトース）中で洗浄した。洗浄した細胞を１０ｍｌのＳＣ−Ｕ誘導培地に再懸濁させ、１ＬのＳＣ−Ｕ誘導培地を添加し、さらに２４時間、３０℃での振盪で増殖させた。遠心分離（１００００ｇ、１０分  ４℃）によって細胞を回収し、２０ｍｌの破砕緩衝液（５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、５％  グリセロール、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）に再懸濁させ、Ｆｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓｉｎｇ（２トン、１回）によって破砕した。さらなる遠心分離段階（１００００ｇ、１０分、室温）によって、不溶性材料を除去した。その細胞溶解物は、５００ｍＭ  尿素の添加で緩衝調整し、そのｐＨをｐＨ８．０に調整した。
【００７６】
固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を使って、そのＨｓｐ９０タンパク質を精製した。１５ｍｌ  ニッケル充填済ＩＭＡＣカラムを５カラム容量（ＣＶ）の平衡緩衝液（５００ｍＭ  尿素、１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．０）で平衡させた。その後、その緩衝調整細胞溶解物をカラム適用した。そのカラムを５ＣＶの平衡緩衝液で洗浄し、続いて５ＣＶの洗浄緩衝液（５００ｍＭ  尿素、１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．０、５０ｍＭ  イミダゾール）で洗浄した。そのＨｓｐ９０タンパク質を３ＣＶの溶離緩衝液（５００ｍＭ  尿素、１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．０、５００ｍＭ  イミダゾール）でカラムから溶出させた。すべての画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。そのゲルを下に示す。
【００７７】
抗体源
Ｍｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）は、ｈｓｐ９０に対するヒト組換え抗体フラグメントである。それが結合するエピトープは、ヒトｈｓｐ９０と真菌ｈｓｐ９０の間で保存されている。Ａｕｒｏｇｒａｂ（登録商標）は、ＭＲＳＡからのＡＢＣトランスポータータンパク質に対するヒト組換え抗体である。Ａｕｒｏｇｒａｂ（登録商標）の製法は、ＷＯ−Ａ−０３／０４６００７（これは、本明細書に参照により組み込まれている）に開示されている。
【００７８】
注射のための実験的プロトコル
週齢６〜８週で、通常は２４ｇと３０ｇの間の体重の雌ＣＤ−１マウスを使用した。それぞれの実験の２４時間前にマウスを計量した。ｈｓｐ９０およびＭｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）およびＡｕｒｏｇｒａｂ（登録商標）の濃度は、マウスの体重を基に、０．１、０．５、１．０および１０ｍｇ／ｋｇと算定した。対照サンプルは、滅菌ＰＢＳ（ｈｓｐ９０用）および滅菌調合緩衝液（５００ｍＭ  尿素、２００ｍＭ  アルギニン  ｐＨ９．５）（Ｍｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）用）であった。併用する場合、注射前、１５分間、３７℃でｈｓｐ９０とＭｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）を交差吸収させた。
【００７９】
すべてのマウスを４１℃のサーモヒーティングボックス内に入れた。適切なサンプルをマウスに外側尾静脈経由で静脈内注射し、それらのマウスを、餌および水を自由に得られるケージに戻した。指定の時点で、マウスに終末麻酔をかけた（ハロタン使用）。心臓への滅菌針（心臓穿刺）を用いて血液を採取し、頸部脱臼によってマウスを殺した。
【００８０】
血液サンプルを３０００ｒｐｍで１０分間スピンし、滅菌ピペットを使用して血清を吸引した。血清サンプルは、試験のために必要になるまで、−２０℃で保管した。
【００８１】
ＴＮＦ−αアッセイ
これらは、マウス値のためのＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ（商標）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  Ｎｕｍｂｅｒ  ５５５２６８（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＵＳＡ）に従って行った。それぞれの場合、その製造業者のインストラクションに従って反応を行った。それぞれのアッセイ実行の際、標準曲線が必要であった。すべてのサンプルおよび標準物質を二重反復で実行した。
【００８２】
コーティング緩衝液中で希釈した（推奨希釈については、ロット固有の分析証明書を参照のこと）、１００μｌ／ウエルの捕捉抗体で、ＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。そのプレートを封止し、一晩、４℃でインキュベートした。それらのウエルを吸引し、洗浄緩衝液で３回、洗浄した。最後の洗浄の後、プレートを逆さにし、吸い取り紙で吸い取った。それらのプレートを２００μｌ／ウエルのアッセイ希釈物で、１時間、室温でブロックした。それらのプレートを前のとおりに３回、洗浄した。ＴＮＦ−α標準物質は、下記のとおり調製した。
【００８３】
室温に温めた後、それらの解凍標準物質を１ｍｌの脱イオン水で再構成し、１５分間、平衡させた後、ボルテックスして混合した。ストック標準物質から１０００ｐｇ／ｍｌの標準物質を調製した（希釈インストラクションは、ロット固有の分析証明書に基づく）。このストックから、アッセイ希釈剤を使用して１０００ｐｇ／ｍｌから１５．６ｐｇ／ｍｌの２倍希釈物を調製した。アッセイ希釈剤は、陰性対照として使用した。
【００８４】
１００μｌの各標準物質、サンプルおよび対照を適切なウエルに添加した。そのプレートを封止し、２時間、室温でインキュベートした。利用できる血清の容量が少ないため、マウス血清をアッセイ希釈剤で１／２希釈した。そのプレートを前のとおり洗浄したが、合計５回洗浄した。検出に必要な容量の抗体をアッセイ希釈剤に添加し、ボルテックスして混合した。使用直前、必要容量の酵素試薬をその溶液に添加し、ボルテックスして混合した。
【００８５】
１００μｌの作業用検出抗体を各ウエルに添加した。そのプレートを封止し、１時間、室温でインキュベートした。そのプレートを前のとおり洗浄したが、合計７回洗浄した。
【００８６】
基質は、１００μｌをそれぞれのウエルに添加する直前に、等容量の基質Ａおよび基質Ｂを添加することによって調製した。そのプレートを暗所で３０分間、インキュベートした。５０μｌの停止溶液をそれぞれのウエルに添加することによって反応を停止させた。そのプレートを４５０ｎｍで読み取った。それらのサンプルについてのＴＮＦ−α濃度を標準曲線から決定した。
【００８７】
インターロイキン６アッセイ
これらは、ヒト血清のためのＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ（商標）Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｓｅｔ  Ｂ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  Ｎｕｍｂｅｒ  ５５０５３４およびマウス値のためのＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ（商標）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  Ｎｕｍｂｅｒ  ５５５２４０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＵＳＡ）に従って行った。それぞれの場合、その製造業者のインストラクションに従って反応を行った。それぞれのアッセイ実行の際、標準曲線が必要であった。すべてのサンプルおよび標準物質を二重反復で実行した。
【００８８】
コーティング緩衝液中で希釈した（推奨希釈については、ロット固有の分析証明書を参照のこと）、１００μｌ／ウエルの捕捉抗体で、ＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。そのプレートを封止し、一晩、４℃でインキュベートした。それらのウエルを吸引し、洗浄緩衝液で３回、洗浄した。最後の洗浄の後、プレートを逆さにし、吸い取り紙で吸い取った。それらのプレートを２００μｌ／ウエルのアッセイ希釈物で、１時間、室温でブロックした。それらのプレートを前のとおりに３回、洗浄した。ＩＬ−６標準物質は、下記のとおり調製した：
室温に温めた後、それらの解凍標準物質を１ｍｌの脱イオン水で再構成し、１５分間、平衡させた後、ボルテックスして混合した。ストック標準物質から１０００ｐｇ／ｍｌの標準物質を調製した（希釈インストラクションは、ロット固有の分析証明書に基づく）。このストックから、アッセイ希釈剤を使用して１０００ｐｇ／ｍｌから１５．６ｐｇ／ｍｌの２倍希釈物を調製した。アッセイ希釈剤は、陰性対照として使用した。
【００８９】
１００μｌの各標準物質、サンプルおよび対照を適切なウエルに添加した。そのプレートを封止し、２時間、室温でインキュベートした。利用できる血清の容量が少ないため、マウス血清をアッセイ希釈剤で１／２希釈した。そのプレートを前のとおり洗浄したが、合計５回洗浄した。検出に必要な容量の抗体をアッセイ希釈剤に添加し、ボルテックスして混合した。使用直前、必要容量の酵素試薬をその溶液に添加し、ボルテックスして混合した。
【００９０】
１００μｌの作業用検出抗体を各ウエルに添加した。そのプレートを封止し、１時間、室温でインキュベートした。そのプレートを前のとおり洗浄したが、合計７回洗浄した。
【００９１】
基質は、１００μｌをそれぞれのウエルに添加する直前に、等容量の基質Ａおよび基質Ｂを添加することによって調製した。そのプレートを暗所で３０分間、インキュベートした。５０μｌの停止溶液をそれぞれのウエルに添加することによって反応を停止させた。そのプレートを４５０ｎｍで読み取った。それらのサンプルについてのＩＬ−６濃度を標準曲線から決定した。
【００９２】
実験１
精製したｈｓｐ９０を１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇでマウスに注射し、２匹のマウスを０、１５、３０、６０および１２０分で、および１０ｍｇ／ｋｇについては、加えて、１４４０分で犠牲にした。ＴＮＦ−αおよびインターロイキン６レベルを、上で説明したとおり測定した。
【００９３】
結果
ｐｇ／ｍｌでＴＮＦ−αレベルを示す結果を表１にまとめる。
【００９４】
【表１】
2009522344.tif 000003
ＴＮＦ−αのレベルは、低濃度でも、高濃度でも、ｈｓｐ９０の投与に応答して増加し、６０分でピークであった。高い用量のｈｓｐ９０を投与した後ほど、応答は大きかった。
【００９５】
ｐｇ／ｍｌでインターロイキン６レベルを示す結果を表２にまとめる。
【００９６】
【表２】
2009522344.tif 000004
これらの結果は、３０分後に検出可能な応答を明示しており、これは６０分でピークに達し、高いほうの用量では１４４０分で検出不能であった。高い用量のｈｓｐ９０を投与した後ほど、応答は大きかった。
【００９７】
実験２
マウスに次のいずれかを静脈内注射した。
１．１ｍｇ／ｋｇ  Ｍｙｃｏｇｒａｂ
２．１ｍｇ／ｋｇ  Ａｕｒｏｇｒａｂ
３．１ｍｇ／ｋｇ  ＨＳＰ９０
４．調合緩衝液
５．１ｍｇ／ｋｇ  Ｍｙｃｏｇｒａｂと交差吸収（３７℃で１５分）させた１ｍｇ／ｋｇ  ＨＳＰ９０
マウスを１時間および２時間の時点で殺した。それぞれの時点で二重重複で試験し、ＴＮＦ−αおよびインターロイキン６を測定した。
【００９８】
結果
ｐｇ／ｍｌでＴＮＦ−α濃度を示す結果を表３にまとめる。
【００９９】
【表３】
2009522344.tif 000005
ＴＮＦ−αのレベルは、調合緩衝液、ＭｙｃｏｇｒａｂおよびＡｕｒｏｇｒａｂの注射によってわずかに上昇した。ＨＳＰ９０への応答は顕著であり、１時間でピークに達した。Ｍｙｃｏｇｒａｂとの交差吸収は、１時間の時点ではわずかな効果しか有さず、２匹のマウスにおけるそのレベルは、２時間の時点でのほうが高かった。
【０１００】
ｐｇ／ｍｌでＩＬ−６濃度を示す結果を表４にまとめる。
【０１０１】
【表４】
2009522344.tif 000006
インターロイキン６のレベルは、調合緩衝液、ＭｙｃｏｇｒａｂおよびＡｕｒｏｇｒａｂの注射による影響を受けなかった。ＨＳＰ９０への応答は顕著であり、１時間でピークに達した。Ｍｙｃｏｇｒａｂとの交差吸収は、１時間の時点でのインターロイキン６のレベルを減少させた。
【０１０２】
実験３
注射前１５分間、３７℃で、Ｍｙｃｏｇｒａｂ（０〜１ｍｇ／ｋｇ）と交差吸収させた、またはさせていない、様々な濃度のｈｓｐ９０（０〜１ｍｇ／ｋｇ）を約２５ｇで１５匹のＣＤ−１マウスに注射した。すべてのマウスを１時間の時点で殺し、ＩＬ−６レベルをモニターした。
【０１０３】
実験４
注射前１５分間、３７℃で、Ｍｙｃｏｇｒａｂ（０〜１ｍｇ／ｋｇ）と交差吸収させた、またはさせていない、様々な濃度のｈｓｐ９０（０〜１ｍｇ／ｋｇ）を約２５ｇで１５匹のＣＤ−１マウスに注射した。すべてのマウスを１時間の時点で殺し、ＩＬ−６レベルをモニターした。
【０１０４】
実験５
注射前１５分間、３７℃で、Ｍｙｃｏｇｒａｂ（０〜１ｍｇ／ｋｇ）と交差吸収させた、またはさせていない、様々な濃度のｈｓｐ９０（０〜１ｍｇ／ｋｇ）を約２５ｇで３０匹のＣＤ−１マウスに注射した。すべてのマウスを１時間の時点で殺し、ＩＬ−６レベルをモニターした。
【０１０５】
結果
実験３、４および５からの結果を表５および図６から９にまとめる。図６は、ｈｓｐ９０へのＩＬ−６応答を示し、図７は、０．１ｍｇ／ｋｇの濃度のＭｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）と交差吸収させたときのｈｓｐ９０へのＩＬ−６応答を示し、図８は、０．５ｍｇ／ｋｇの濃度のＭｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）と交差吸収させたときのｈｓｐ９０へのＩＬ−６応答を示し、および図９は、１ｍｇ／ｋｇの濃度のＭｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）と交差吸収させたときのｈｓｐ９０へのＩＬ−６応答を示す。
【０１０６】
【表５】
2009522344.tif 000007
これらの結果は、注射したｈｓｐ９０の漸増用量０、０．１、０．５および１ｍｇ／ｋｇが、ＩＬ−６の漸増誘導をもたらしたことを明示した。これは、注射前に０．１、０．５または１ｍｇ／ｋｇのＭｙｃｏｇｒａｂとｈｓｐ９０を交差吸収させることによって、一部、阻害された。この効果は、より高いｈｓｐ９０注射用量（０．５および１ｍｇ／ｋｇ）で最も顕著であり、原シグナルの４３．８〜５９．９％に減少した。
【０１０７】
実施例１および２からの結論
上記は、ｈｓｐ９０のマウスへの注射が、ＴＮＦ−αおよびインターロイキン６のレベルの上昇を誘導することを実証するものであった。これは、侵襲性カンジダ症を有する患者における高いＩＬ−６レベルと一致し、ならびにＩＬ−６がその応答を生じさせる分子であることを明示している。ＩＬ−６のレベルの上昇は、部分的に用量依存的な様式でＭｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）との事前交差吸収によって逆行されたが、Ａｕｒｏｇｒａｂ（登録商標）によってはされなかった。
【実施例３】
【０１０８】
患者治験
２つの治験を行った。第一の治験は、２１人の患者の動員を含む予備的治験（パイロットスタディーと呼ぶ）であり、第二の調査は、欧州および米国から１３９人の患者が登録し、１１７人が、修正包括解析集団に存する検証的治験（検証スタディーと呼ぶ）であった。両方の治験は、二重盲検であり、無作為化されており、ならびに侵襲性カンジダ症が培養物で確認された患者において、Ｍｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）を加えた脂質会合アンフォテリシンＢが、プラシーボを加えたアンフォテリシンＢより優れているかどうかを判定するために行った。患者は、アンフォテリシンＢの脂質会合製剤、加えて、５日コースのＭｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）またはプラシーボを受けた。組み入れ基準としては、治験治療の開始の３日以内の臨床的に有意な部位からのカンジダの増殖に加えて、試験開始時の活性感染の臨床的証拠が挙げられた。有効性主要評価項目は、第１０日までの治療への全応答（臨床的および菌学的解消）であった。
【０１０９】
材料および方法
登録
登録されるには、患者は、１８歳以上でなければならず、前３日以内に臨床的に有意な部位からの１つ以上の陽性カンジダ培養物、加えて、治験開始時に以下の徴候の少なくとも１つを有さなければならなかった：高体温［＞３８℃］、低体温［＜３６℃］、頻脈［＞１１０／分］、低血圧［平均血圧＜７０ｍｍＨｇ］、高白血球数［＞１１０００／ｍｍ３］、左方移動、昇圧薬の必要、または進行中の感染性疾患経過に見合った他の異常。有意な部位としては、血液培養、および／または通常は無菌の深部からの培養が挙げられる。
【０１１０】
治験手順
登録後、患者を、１２時間ごとに５日間、静脈内Ｍｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）（体重ｋｇ当たり１ｍｇ）またはプラシーボ（食塩水）のいずれかを受けるようにランダムに割付けた。加えて、それぞれの患者を最低１０日間、製造業者の推奨用量のＡｂｅｌｃｅｔ（１日に５ｍｇ／ｋｇ）またはＡｍｂｉｓｏｍｅ（１日に３ｍｇ／ｋｇ）で治療した。患者および治験担当者は、その治験を通して、その条件を知らないままであった。全身性抗真菌療法薬を除けば、他の併用薬物はセンサリングしなかった。
【０１１１】
菌学的応答と臨床応答の両方を有効性の評価に用いた。治験薬（Ｍｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）またはプラシーボ）を５日間（第１〜５日）与え、第２、３、４、５、６、８および１０日、または感染の徴候および症状が解消され、培養物が繰り返し陰性になるまで、培養物を採取した。治療に対する臨床応答を第４、５、６、８、１０および３３日に評価し、１０日までは、毎日、前の２４時間の疾患経過を評価した。臨床応答の評価は、地元の治験担当者が行い、カンジダ感染症に起因すると考えられるすべての徴候および症状が解消された場合は完了と考えた。血液学、臨床化学、凝固プロフィールおよび尿検査を、スクリーニング時および第１、２、４、６および１０日に行った。
【０１１２】
有効性の評価
主要有効性エンドポイントは、第１０日での治療への全応答であり、これは、治験薬の最終投与およびＬ−アンフォテリシンでの最低治療期間の５日後であった。予後良好な全応答は、カンジダ症のすべての徴候および症状の解消ならびに培養物で確認された根絶を伴う、完全な臨床的および菌学的応答と定義した。カンジダ症の進行または悪化がない部分的改善は、予後不良と分類した。
【０１１３】
従って、患者を、感染症が解消された者（「治癒者」と呼ぶ）およびされなかったもの（「失敗」と呼ぶ）に細分した。３ヶ月の時点で生存していた患者を「生存者」と呼び、これは、第１０日までに十分な応答をしなかった数人の患者を含んでいた。
【０１１４】
さらなる亜集団は、死亡した患者（「全死」と呼ぶ）であり、これをカンジダによる死亡者（「カンジダ死」と呼ぶ）およびカンジダ感染症によらないもの（「非カンジダ死」と呼ぶ）に細分した。カンジダによる死亡は、治験担当者が、カンジダが死に有意に寄与したと述べた死亡と定義し、持続カンジダ症の臨床的証拠、剖検証拠、および／または血液培養陽性の４８時間以内の死があった（Ｐａｐｐａｓ等  ２００３）。
【０１１５】
インターロイキン６レベル
これらは、上で説明したとおりに測定した。血清は、治験開始時（第１日）および中間点（第３日）およびＭｙｃｏｇｒａｂまたは食塩水療法の最終日（第６日）に、様々な数の患者から得ることができた。これらを、パイロットスタディーからのものなのか、または検証スタディーからのものなのかによって解析し、その後、２つのデータセットを組み合わせてメタ解析表（検証／パイロット）を作成した。
【０１１６】
統計解析
平均値
異なる患者群からの平均値を、Ｐ＜０．０５のカットオフでマン・ホイットニー検定法によって比較した（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  ＩｎＳｔａｔ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０）。第１日からの平均結果を第３および６日と比較し、第３日からの結果を第６日と比較した。
【０１１７】
予測分析
死亡した患者の場合、高レベルのインターロイキン６の活性によりカンジダによるまたはカンジダでない死亡からの死を予測することができることを、受容体動作特性曲線（Ｂｅｗｉｃｋ等、２００４）によって検査した。これは、第１日の初期の高いインターロイキン６レベルが、後の死を予測するかどうか、およびこれが、カンジダ死亡により死ぬ患者と非カンジダ死亡により死ぬ患者とで異なるのかどうかの疑問に答えるために、死亡した患者におけるレベルと、生存者におけるレベルとを比較するものであった。プラシーボ群の場合、循環ｈｓｐ９０が存続するため、これは、高いインターロイキンレベル６のような予測因子となろう。Ｍｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）群の場合、このｈｓｐ９０は、Ｍｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）によって中和され、それ故、初期インターロイキン６レベルは、もはや予測因子にはならない。これを、プラシーボ群において、全死亡についても、患者をカンジダによる死亡とカンジダによらない死亡に分けた後も、検査した。Ｍｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）群の場合、このサブ分析には患者が少なすぎた。
【０１１８】
Ｍｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）を用いて死亡した検証／パイロット患者についての第１日の平均レベルは、２３５±３２７ｐｇ／ｍｌであり、これは、プラシーボ群２２５±３０７ｐｇ／ｍｌと類似していた（表８および１１）。
【０１１９】
結果
平均の比較
これらを表にまとめた。表６〜８は、Ｍｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）群の結果をまとめたものである。
【０１２０】
表６に示す結果は、第１日からの結果を第３および６日からの結果と比較したとき、すべての患者におけるおよび治癒群におけるパイロット群について、統計学的に有意な減少を明示した。
【０１２１】
表７に示す結果は、第１日からの結果を第６日からの結果と比較したとき、すべての患者におけるおよび生存者群における検証群について、統計学的に有意な減少を明示した。
【０１２２】
表８に示す結果は、第１日からの結果を第３および６日からの結果と比較したとき、すべての患者、第１０日に治癒していた患者におけるおよび生存者群における検証／パイロット群について、統計学的に有意な減少を明示した。
【０１２３】
表９から１１は、プラシーボ群におけるレベルに統計学的に有意な変化がないことを示した。
【０１２４】
【表６】
2009522344.tif 000008
【０１２５】
【表７】
2009522344.tif 000009
【０１２６】
【表８】
2009522344.tif 000010
【０１２７】
【表９】
2009522344.tif 000011
【０１２８】
【表１０】
2009522344.tif 000012
【０１２９】
【表１１】
2009522344.tif 000013
予測分析
Ｍｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）を用いて死亡した検証／パイロット患者についての第１日の平均レベルは、２３５±３２７ｐｇ／ｍｌであり、これはプラシーボ群２２５±３０７ｐｇ／ｍｌと類似していた（表８および１１）。Ｍｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）についての生存者２５３±３２７ｐｇ／ｍｌに関する平均値は、プラシーボ群についての１４７±２０２ｐｇ／ｍｌよりわずかに高かった。
【０１３０】
結果の比較は、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して感度のパイロット対１−特異性により生成したＡＵＲＯＣ（曲線下面積）（表１２参照）に基づくものであった。
【０１３１】
【表１２】
2009522344.tif 000014
結論
理想的な試験は、１のＡＵＲＯＣを有するが、任意の推量は、０．５のＡＵＲＯＣを有する。このデータは、Ｍｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）群についての低い予測値（０．５２０２）を明示した。これは、Ｍｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）によるｈｓｐ９０の中和（転帰改変における高いインターロイキン６の影響を打ち消すことを意味する）と一致する。プラシーボ群における非カンジダ死を生存者と比較したとき、同様の失敗（０．５５１０）が見られた。カンジダによる死の場合、この状況は変わり、ＡＵＲＯＣ値は０．７５５２であった。これは、循環ｈｓｐ９０を中和するＭｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）不在の状態での高いインターロイキン６が、カンジダに起因する死のはるかに高い機会を招くことを明示していた。
【実施例４】
【０１３２】
サイトカイン放出の研究
サイトカイン放出とｈｓｐ９０およびＭｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）への暴露との関連をさらに特性付けするために、白血球の応答を研究した。
【０１３３】
方法
それぞれの健常なボランティアからの２０ｍｌのヘパリン加新鮮血液サンプルを、等容量の組織培養培地と共に５０ｍｌ遠心管に入れた。４ｍｌのヒストパク（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ）をそれぞれの１５ｍｌ遠心管に添加し、８ｍｌの血液／培養培地ミックスをそのヒストパクに添加した。それらのサンプルを４００ｇで３０分間、遠心分離し、リンパ球を除去した。組織培養培地を補給してその管内の容量を４０ｍｌにし、細胞を洗浄し、計数し、５ｘ１０５細胞／ｍｌで組織培養培地に再懸濁させた。遠心分離後の１．５ｍｌの細胞懸濁液を０時間サンプルとして使用した。３ｍｌの細胞懸濁液を６ウエル組織培養プレートのそれぞれのウエルに入れ、試験試薬を添加した。インキュベーションは、３７℃、５％ＣＯ２で４時間および２４時間であった。各時点で１．５ｍｌの上清を一晩、４℃で保管した後、サイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ−６について試験し、２４時間の時点でＩＮＦ−γを試験した。Ｍｙｃｏｇｒａｂ（上で説明したとおり調合したもの）の濃度は、１ｍｇ／ｋｇのＭｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）を受ける患者の血清中、ＣＭＡＸに近い４μｇ／ｍｌであった。
【０１３４】
試験品
５人の健常なボランティア（ＨＶ６〜ＨＶ１０）から血液を採取し、単球を調合緩衝液（６μｌ／ｍｌ）ｈｓｐ９０（５０ｎｇ／ｍｌ）Ｍｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）（４μｇ／ｍｌ）およびｈｐｓ９０（５０ｎｇ／ｍｌ）に暴露した。
【０１３５】
結果
結果を表１３から１６にまとめた。これは、ＴＮＦ−αのレベルが、４時間後、ｈｓｐ９０に応答してわずかに、および２４時間後、Ｍｙｃｏｇｒａｂではなくｈｓｐ９０（登録商標）に応答して有意に上昇したことを明示した。２４時間の時点で、ｈｓｐ９０に対する応答は、Ｍｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）より、尚、大きかった。ＩＮＦ−γのアッセイは、２４時間の時点ですべて陰性であった。
【０１３６】
結論
この研究により、非常に低レベル（５０ｎｇ／ｍｌ）のｈｓｐ９０は、ＴＮＦ−αとＩＬ−６の両方を誘導できるが、ＩＮＦ−γを誘導できないことを確認した。４μｇ／ｍｌのＭｙｃｏｇｒａｂへの応答は、はるかに低かった。
【０１３７】
【表１３】
2009522344.tif 000015
【０１３８】
【表１４】
2009522344.tif 000016
【０１３９】
【表１５】
2009522344.tif 000017
【０１４０】
【表１６】
2009522344.tif 000018
参考文献
Ｂｅｗｉｃｋ，Ｖ．等．Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２００４  ＶｏＩ  ８  Ｎｏ  ６，５０８−５１２
Ｈｅｈｌｇａｎｓ，Ｔ．等．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１１５，１−２０
Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｒ．Ｃ．等．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００５，５，４０３−４１１
Ｍｉｙａｏｋａ，Ｋ．等．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２５，１４４−１５０（２００５）
Ｍｏｋａｒｔ，Ｄ．等．Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉａ  ９４（６）：７６７−７３（２００５）
Ｎｇ，Ｐ．Ｃ．等．Ａｒｃｈ．Ｄｉｓ．Ｃｈｉｌｄ．Ｆｅｔａｌ  Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｅｄ．１９９７；７７；２２１−２２７
Ｎｇ，Ｐ．Ｃ．等．Ａｒｃｈ．Ｄｉｓ．Ｃｈｉｌｄ．Ｆｅｔａｌ  Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｅｄ．２００３；８８；２０９−２１３
Ｎｇ，Ｐ．Ｃ．等．Ａｒｃｈ．Ｄｉｓ．Ｃｈｉｌｄ．Ｆｅｔａｌ  Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｅｄ．２００４；８９；２２９−２３５
Ｐａｎａｃｅｋ，Ｅ．Ａ．等．Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  ２００４  Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．１１；２１７３−２１８２
Ｓａｉｔｏ，Ｋ．等．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００５
Ｔｅｒｒｅｇｉｎｏ，Ｃ．Ａ．等．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３５：１，Ｊａｎ  ２０００；２６−３４
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】固定化ペプチドに対する異なる濃度のＭｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）の注射からの結合曲線のグラフを示す。
【図２】カンジダｈｓｐ９０に対する異なる濃度のＭｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）の注射からの結合曲線のグラフを示す。
【図３】固定化ヒトｈｓｐ９０αに対する１濃度系列のＭｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）からの結合曲線のグラフを示す。
【図４】異なる温度でのＬＫＶＩＲＫ−ペプチドへのＭｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）の結合を示すセンサーグラムのグラフを示す。
【図５】組換えｈｓｐ９０のＩＭＡＣ精製のゲル分析の画像を示す。ゲルのレーンは、次のとおりである：レーン１−フロースルー；レーン２−洗浄１ａ；レーン３−洗浄１ｂ；レーン４−洗浄１ｃ；レーン５−洗浄１ｄ；レーン６−洗浄１ｅ；レーン７−溶離１ａ；およびレーン８−溶離１ｂ。
【図６】Ｍｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）による交差吸収のないｈｓｐ９０に対するマウス応答のグラフを示す。
【図７】０．１ｍｇ／ｋｇの濃度のＭｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）による交差吸収を伴うｈｓｐ９０に対するマウス応答のグラフを示す。
【図８】０．５ｍｇ／ｋｇの濃度のＭｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）による交差吸収を伴うｈｓｐ９０に対するマウス応答のグラフを示す。
【図９】１ｍｇ／ｋｇの濃度のＭｙｃｏｇｒａｂ（登録商標）による交差吸収を伴うｈｓｐ９０に対するマウス応答のグラフを示す。
【図１】
2009522344.tif 000019
【図２】
2009522344.tif 000020
【図３】
2009522344.tif 000021
【図４】
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【図５】
2009522344.tif 000023
【図６】
2009522344.tif 000024
【図７】
2009522344.tif 000025
【図８】
2009522344.tif 000026
【図９】
2009522344.tif 000027
【国際調査報告】
2009522344.tif 000028
2009522344.tif 000029
2009522344.tif 000030
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