(57)【要約】  異種細胞集団から幹細胞を選別する方法を開示する。本発明の方法は、非幹細胞に対してアポトーシス性があり、かつ幹細胞に対して非アポトーシス性である条件下のアポトーシス含有因子で細胞集団を接触させるステップを具え、これにより、異種細胞集団から幹細胞を選択する。選別された幹細胞は、次いで、移植および分化を含む各種用途に用いることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
造血細胞集団から幹細胞を選別する方法において、この方法が、非幹細胞に対してアポトーシス性があり、かつ幹細胞に対して非アポトーシス性である条件下で、アポトーシス誘導因子を細胞集団に接触させるステップを具え、これによって、造血細胞集団から幹細胞を選別することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記幹細胞が、臍帯血幹細胞、可動性末梢血幹細胞、骨髄幹細胞及び神経幹細胞からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記幹細胞が骨髄幹細胞であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記骨髄幹細胞が造血幹細胞であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
修飾幹細胞を得るために、前記接触ステップの前に、前記幹細胞を修飾するステップを更に具えることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
精製幹細胞を得るために、前記接触ステップの前に、前記幹細胞を精製するステップを更に具えることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
増幅幹細胞を得るために、前記接触ステップの前に、前記幹細胞を増幅するステップを更に具えることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記骨髄幹細胞が間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記幹細胞が成体幹細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記幹細胞が胚性幹細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記アポトーシス誘導因子が、ＴＮＦ−α、ＦａｓＬ、Ｔｒａｉｌ及びＴｗｅａｋからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記アポトーシス誘導因子がＦａｓＬであることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＦａｓＬが表面に結合することを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＦａｓＬが非開裂性であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記接触ステップの前に、前記造血細胞集団のアポトーシスレセプタの発現を上方制御するステップを更に具えることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記アポトーシスレセプタが、Ｆａｓレセプタ、ＴＮＦ−αレセプタ、Ｔｗｅａｋレセプタ及びＴｒａｉｌレセプタからなるレセプタ群から選択されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記アポトーシスレセプタの発現を上方制御するステップが、前記造血細胞集団にインターフェロンγ又はＴＮＦ−αを接触させることによって影響を受けることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記造血細胞集団が、免疫活性化Ｔリンパ球を具えないことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記造血細胞集団が、系統陽性細胞を具えることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記系統陽性細胞が、顆粒球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、赤芽球、抗原提示細胞、骨髄細胞、リンパ球細胞及び巨大核細胞からなる群から選択されることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記造血細胞集団は、アポトーシス反応性悪性細胞を具えることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記接触ステップ後に、幹細胞を単離するステップを更に具えることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
選別された幹細胞を宿主に移植する方法において、この方法が、
（ａ）非幹細胞に対してアポトーシス性であり、幹細胞に対して非アポトーシス性である条件下で、アポトーシス誘導因子を異種細胞集団の幹細胞に接触させるステップであって、これにより、幹細胞を選別する、ステップと、
（ｂ）前記選別された細胞を宿主に移植するステップであって、これにより、前記選別された幹細胞を移植する、ステップと、
を具えることを特徴とする方法。
【請求項２４】
ステップ（ａ）の後であってステップ（ｂ）の前に、前記選択された幹細胞を単離するステップを更に具えることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記幹細胞は、臍帯血幹細胞、可動性末梢血幹細胞、骨髄幹細胞及び神経幹細胞からなる群から選択されることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記幹細胞は、骨髄幹細胞であることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記骨髄幹細胞は造血幹細胞であることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
修飾された幹細胞を得るために、前記接触ステップの前に、前記幹細胞を修飾するステップを更に具えることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
精製された幹細胞を得るために、前記接触ステップの前に、前記幹細胞を精製するステップを更に具えることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
増幅した幹細胞を得るために、前記接触ステップの前又は前記接触ステップ中に、前記幹細胞を増幅するステップを更に具えることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
前記骨髄幹細胞は間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記幹細胞が成体幹細胞であることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
前記幹細胞が胚性幹細胞であることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項３４】
前記アポトーシス誘導因子が、ＴＮＦ−α、ＦａｓＬ、Ｔｒａｉｌ及びＴｗｅａｋからなる群から選択されることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項３５】
前記アポトーシス誘導因子は、ＦａｓＬであることを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＦａｓＬが表面に結合することを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＦａｓＬが非開裂性であることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記接触ステップの前に、前記異種細胞集団でのアポトーシスレセプタの発現を上昇制御するステップを更に具えることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項３９】
前記アポトーシスレセプタが、Ｆａｓレセプタ、ＴＮＦ−αレセプタ、Ｔｗｅａｋレセプタ及びＴｒａｉｌレセプタからなる群から選択されることを特徴とする請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記アポトーシスレセプタの発現を上方制御するステップが、前記異種細胞集団にインターフェロンγ又はＴＮＦ−αを接触させることによって、影響を受けることを特徴とする請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記異種細胞集団が、免疫活性化Ｔリンパ球を具えないことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項４２】
前記異種細胞集団が、系統陽性細胞を具えることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項４３】
前記系統陽性細胞が、顆粒球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、赤芽球、抗原提示細胞、骨髄細胞、リンパ球、赤血球細胞及び巨大核細胞からなる群から選択されることを特徴とする請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記異種細胞集団が、アポトーシス反応性悪性細胞を具えることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項４５】
前記幹細胞は、宿主に対して自家移植であることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項４６】
前記幹細胞は宿主と同系であることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項４７】
前記幹細胞は宿主に対して同種異系であることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項４８】
前記幹細胞は宿主に対して異種であることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項４９】
幹細胞を分化する方法において、この方法が、
（ａ）非幹細胞に対してアポトーシス性があり、幹細胞に対して非アポトーシス性である条件下で、異種細胞集団の幹細胞にアポトーシス誘導因子を接触させるステップであって、これにより、幹細胞を選別する、ステップと、
（ｂ）前記選別された幹細胞の分化を誘導するステップであって、これにより、幹細胞を分化する、ステップと、
を具えることを特徴とする方法。
【請求項５０】
前記分化を誘導するステップが、前記幹細胞で遺伝子産物を発現させることによって影響を受けることを特徴とする請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記遺伝子産物が、ポリペプチドであることを特徴とする請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記遺伝子産物がポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項５０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞の選別方法およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、身体中の細胞集団を再構成できる独自の能力を有する。通常、幹細胞は、２つの主な群：成体幹細胞および胚性幹細胞に分けられる。成体および胚性由来の双方の幹細胞の増幅に関連した技術の重要性は、幅広い疾患の治療において、多くの臨床前および臨床中での上記細胞の使用によって示されている。
【０００３】
生理学的活性を緩和する外科治療または薬剤に依存した現在の全ての治療とは異なり、幹細胞は機能不全または変性した組織に代替物を提供する。幹細胞を用いれば、代替物治療は、多くの従来の治療不可能な疾患の予後を劇的に変化させ、損傷した組織の機能を回復し、生まれつきの代謝疾患および欠陥を治すことができるであろう。
【０００４】
骨髄由来の成体幹細胞が、非造血組織を生成するという近年の発見は、これらの細胞が、以前に仮定されていたよりも大きな分化能力を有し、これらの治療用途のフロンティアが開くことを示唆する［Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｂ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９９；２８４：１１６８−１１７０；Ｂｒａｚｅｌｔｏｎ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００；２９０：１７７５−１７７９；Ｋｒａｕｓｅ，Ｄ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ２００１；１０５，３６９−３７７］。
【０００５】
いくつかの研究が示すのは、臍帯血由来の幹細胞が脳障害および衝撃によって生じた神経ダメージを回復することができ（Ｌｕ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２００２；１１：２７５−８１）、機能的および形態学的に、動物の心臓組織に組み込むことも可能であるということである［Ｏｒｌｉｃ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００１；９８：１０３４４−９］。
【０００６】
幹細胞の最も初期の臨床使用の１つは、悪性血液疾患を有する患者の骨髄移植を行うことであり、ここで、ドナー骨髄由来の造血幹細胞をレシピエントに投与し、続いて、レシピエントに十分な投与量の照射および／または化学療法を行った。この治療は、悪性細胞だけでなく非悪性細胞も破壊する。内在性の造血細胞は骨髄破壊的照射中で生存するのは珍しく、ストローマはひどい損傷を受ける。破壊的損傷の結果、ドナー造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）は宿主骨髄への経路を見つけ、細胞は免疫−造血システムの再構築するために、シーディングし、生着（ｅｎｇｒａｆｔ）する。造血幹細胞および前駆体の一般的な供給源は、骨髄、臍帯血および末梢血へと移動する細胞を含む。
【０００７】
血液悪性腫瘍の治療に加えて、幹細胞、前駆細胞および免疫細胞は、固形腫瘍の治療で使用されてきた。従って、例えば、固形腫瘍の高投与量の化学／放射線治療と組み合わせた造血細胞の自己移植は、胸部［Ｐｅｐｐｅｒｃｏｒｎ，ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｃａｎｃｅｒ  １０４：１５８０−１５８９］；大腸［Ｌｅｆｆ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １９８６；４：１５８６−１５９１］、肺［Ｚｉｓｋｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００２；２２：３７２３−３７２６］、上咽頭癌「Ｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｐｎ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００３；３３：３３１−３３５」及び他の種類の癌［Ｇｒａｔｗｏｈｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００４；１５：６５３−６６０］に対して、広範囲にわたり調査されてきた。
【０００８】
Ｉ型膜貫通タンパク質／接着分子、すなわち、造血幹細胞のマーカーとしてのシアロムチンＣＤ３４の特定は、造血幹細胞活性を高める手段としてのＣＤ３４＋細胞セレクションの使用となった［Ｃｉｖｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９８４；１３３：１５７−１６５］。特に、骨髄単核細胞は、約１〜４％のＣＤ３４＋細胞を具えるが、ＣＤ３４＋を除いた骨髄ではない上記細胞を致死量の放射線を照射したヒヒに投与することで、造血が再構築された［Ｂｅｒｅｎｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９８８；８１：９５１−９５５］。同様に、ＣＤ１３３は、造血幹細胞及び前駆細胞のマーカーとして考えられている［Ｋｏｂａｒｉ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ２００１；１０：２７３−２８１］。注目すべき点は、骨髄中の幹細胞の有病率（ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ）は、０．２〜０．５％のオーダで相当低い。
【０００９】
ＣＤ３４＋又はＣＤ１３３＋細胞を単離する上述の方法は、全系統、及び、リンパ球造血幹細胞および前駆細胞ステージ、ならびに、ある程度後期の前駆細胞ステージを含む幹細胞および前駆細胞の混合された細胞集団となる。ＣＤ３４＋細胞集団中の最も初期の細胞のみを単離するのに有用であることが示されたので、これは、不利な点である［Ａｓｋｅｎａｓｙ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２００６；１：８５−９４］。このようなポジティブセレクション工程は、さらに、ＣＤ３４＋細胞の抗体及び／又は磁石ビーズなど物質の存在、及び、上記物質の除去による損傷を含むいくつかの不利益を被る。
【００１０】
さらに、最近の証拠では、細胞膜のＣＤ３４の発現が、幹細胞活性と常に相関していない。ヒトでは、ＣＤ３４の発現を欠く幹細胞の高度静態（ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ）集団があるが、完全な再構成能を有することが示されている［Ｄａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２０００；１４：７７３−７７６］。表現型マーカーが欠損している成体骨髄及び臍帯血由来の幹細胞と比較して、造血前駆体は、多分化能力が限定されることが繰り返し示されている［Ｊａｎｇ  ＹＹ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００４；６：５３２−５３９］。
【００１１】
従って、幹細胞および初期前駆細胞の割合が高くなった細胞集団を単離する従来の方法に代わる、又は、それを補助する他の方法を探すことへの関心が継続している。
【００１２】
幹細胞及び前駆体細胞は、損傷及び炎症の厳しい条件で分化応答を行うように、要求されることがしばしばある。このプロセスにおいて、発達中の造血細胞中のデスレセプタの発現及び活性化は、特に、分化した細胞の負の制御など、各種機能的役割に起因し、しかしながら、ＨＳＰＣ機能ステージのあたりでのデスレセプタの関与は、不透明である。生着効率を改善するために使用可能であるので、このような過酷な環境で造血性再構成細胞が活躍（ｆｌｏｕｒｉｓｈ）するメカニズムは、特別な関心の対象である。
【００１３】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパファミリに属していると現在認知されている個別の４０以上のリガンドレセプタシステムがある。大半のＴＮＦリガンド、最も顕著なＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）は、膜結合タンパク質で合成され、可溶型（ｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍ）は、タンパク質分解によって放出される。各種細胞は、各種生理学的刺激による活性に基づいて放出されるベシクル（ｖｅｓｉｃｌｅ）中にＦａｓＬを貯蔵する。発現から数分以内で、ＦａｓＬは、マトリックスメタロプロテナーゼによって細胞表面から開裂され、可溶性分子として蓄積される。可溶型および膜型は、アポトーシス及び免疫調節に関して機能するように分化する。ＦａｓＬ（ｓＦａｓＬ）可溶型アイソフォームの生物学は複雑であり、アポトーシス性活性、抗アポトーシス活性及び走化性活性を含む一方で、アポトーシスは主に膜結合ＦａｓＬによって生じる。抗アポトーシス性（ｓ）ＦａｓＬは、Ｆａｓ結合で膜型と競合し、好中球に対する走化性因子である。
【００１４】
造血幹細胞および前駆細胞中（ＨＳＰＣ）のＦａｓレセプタの発現は、系統分化に沿って可変であり、変化する。胎児肝臓、臍帯血（ＵＣＢ）および成体骨髄（ＢＭ）由来の免疫ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ヒト細胞のサブ集団は、このレセプタおよび他のアポトーシス仲介ＴＮＦレセプタが低い濃度で発現することを示す［Ｎｉｈｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ．１９９８；５：１６３−１６５］。
【００１５】
造血細胞の分化中、Ｆａｓレセプタは、増殖及び分化前駆細胞で発現し、全系統中の末端分化の負の制御因子として機能する［Ｇａｕｒ  Ｕ，Ａｇｇａｒｗａｌ  ＢＢ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００３；６６：１４０３−１４０８；Ｇｒｅｉｌ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；２３：３０１−３２２］。このようなＦａｓの増長された発現は、培養した造血前駆細胞で観察され、エクスビボでの細胞のサイトカインへの暴露、増幅及びマニピュレーション後、損傷した生存能力及び低下したクローン原性に関連していた。
【００１６】
現在に至るまでＴＮＦスーパファミリレセプタ及びリガンドは、各種実験条件下でアポトーシスシグナルに対するＨＳＰＣ反応性の増加に関連していると考えられてきた。移植後、損傷シグナルに晒されるＨＳＰＣ中のＦａｓの過剰発現は、ドナー細胞中のアポトーシスを促進し、ドナー細胞活性の抑制に関する。エクスビボで、ＴＮＦ−αを用いたヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣおよびマウスｃ−ｋｉｔ＋ｌｉｎ−ＳＣＡ−１＋（ＫＬＳ）ＨＳＰＣの培養は、Ｆａｓレセプタの発現上昇と関連し、不十分なホーミング及び生着となる［Ｂｒｙｄｅｒ  Ｄ，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２００１；１９４：９４１−９５２；Ｄｙｂｅｄａｌ  Ｉ，Ｂｌｏｏｄ．２００３；１０２：１１８−１２６］。これらの有害な影響は、抗Ｆａｓ抗体を活性させることによって効果的に誘導され、抗Ｆａｓ抗体及び可溶性Ｆａｓリガンドをブロッキングすることによって逆転した。ＨＳＰＣの生着におけるＦａｓレセプタに起因する負の役割を確証するために、グラフト（ｇｒａｆｔ）対宿主の疾患によって生じる骨髄形成不全は、ＦａｓＬ欠陥細胞の注入によって回復した［Ｉｗａｓａｋｉ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９；１９７：３０−３８］。
【００１７】
Ｃｉｖｉｎ等［米国特許出願公開公報第２００４０１３１５９９］は、ドナー造血幹細胞中にリコンビナントＦａｓＬを発現することによってドナー造血幹細胞グラフトに対するレシピエント哺乳類の免疫応答を抑制する方法を教示する。この文脈におけるＦａｓＬの正の役割は、非自己拒絶を改善するために宿主の反応性Ｔリンパ球を殺すのに関連し、又、グラフト対宿主の疾患を改善するためにドナーの反応性Ｔリンパ球を殺すのに関連している。
【００１８】
Ｓｈｉｒｗａｎ等［米国特許出願公開公報第２００４００１８１７０］は、活性化リンパ球のアポトーシスによって緩和される条件の治療方法を教示する。特に、Ｓｈｉｒｗａｎ等は、活性化リンパ球のデスレセプタの活性化効率を改善するために、例えば、ＦａｓＬの安定なテトラマーなどのタンパク質の利用を開示している。
【００１９】
両方の方法は、活性化誘導細胞死を介して反応免疫細胞を除去するように、デスレセプタに対するリガンドを使用する［Ｃｏｈｅｎ  ＪＪ，Ｄｕｋｅ  ＲＣ．Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２；１０：２６７−２９３］。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
しかしながら、Ｃｉｖｉｎ等及びＳｈｉｒｗａｎ等のいずれも、移植前に幹細胞の選別又は幹細胞集団の精製を提案または示唆していない。
【００２１】
Ｊｏｓｅｆｓｅｎ等［Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．１９９９；２７：１４５１−１４５９］は、可溶性ＦａｓＬの付加によるＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞バイアビリティの促進及びサイトカイン誘導クローン原性の向上を教示している。同様の結果は、ＣＤ３４＋＋ＣＤ３８−の幼児幹細胞から得られる［Ｂａｒｃｅｎａ  ｅｔ．，Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．１９９９，２７：１４２８−１４３９］。この場合、可溶性ＦａｓＬは、Ｆａｓレセプタの活性化（三重化）によってアポトーシスを阻害するために使用され［Ａｓｋｅｎａｓｙ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００５；１０５：１３９６−４０４］、Ｆａｓレセプタは、ヒト被験者に移植されたヒト細胞の重要なフラクション［Ｓａｈｅｋｉ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．２０００；１０９：４４７−４５２］及び異種移植のマウスモデル［Ｄｙｂｅｄａｌ  Ｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００３；１０２：１１８−１２６］で発現する。しかしながら、幹細胞を選別するための因子としてＦａｓＬを使用することは、示唆されていない。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明の一態様によれば、異種細胞集団から幹細胞を選別する方法が提供され、この方法は、非幹細胞に対してアポトーシス性があり、幹細胞に対しては非アポトーシス性である条件下で細胞集団をアポトーシス誘導薬剤と接触させるステップであって、これにより、異種細胞集団から幹細胞を選別する、ステップを具える。
【００２３】
本発明の他の態様によれば、宿主に選別された幹細胞を移植する方法であって、この方法が：
（ａ）非幹細胞に対してアポトーシス性であり、幹細胞に対して非アポトーシス性である条件下で、異種細胞集団の幹細胞をアポトーシス誘導薬剤に接触させるステップであって、これにより、幹細胞を選別する、ステップと、
（ｂ）選別された幹細胞を宿主に移植するステップであって、従って、選別された幹細胞を移植する、ステップと、を具える。
【００２４】
記載される好適な実施例の更なる特徴によれば、この方法は、ステップ（ａ）の後であってステップ（ｂ）の前に、選別された幹細胞を単離するステップを更に具える。
【００２５】
本発明の他の態様によれば、幹細胞の分化方法が提供され、この方法は、
（ａ）非幹細胞に対してアポトーシス性があり、幹細胞に対して非アポトーシス性である条件下で、異種細胞集団の幹細胞をアポトーシス誘導薬剤に接触させるステップであって、これにより、幹細胞を選別する、ステップと、
（ｂ）選別された幹細胞の分化を誘導するステップであって、これにより、幹細胞を分化する、ステップと、を具える。
【００２６】
下記に記載の本発明の好適な実施例において更なる特徴によれば、幹細胞は、臍帯血幹細胞、可動性末梢血幹細胞、骨髄幹細胞および神経系幹細胞からなる群から選択される。
【００２７】
記載された好適な実施例の更なる特徴によれば、幹細胞は骨髄幹細胞である。
【００２８】
記載された好適な実施例の更なる特徴によれば、骨髄幹細胞は、造血幹細胞である。
【００２９】
記載された好適な実施例の更なる特徴によれば、本発明の方法は、修飾された幹細胞を得るために、前記接触の前に幹細胞を修飾するステップを更に具える。
【００３０】
記載された好適な実施例の更なる特徴によれば、本発明の方法は、精製された幹細胞を得るために、前記接触の前に幹細胞を精製するステップを更に具える。
【００３１】
記載された好適な実施例の更なる特徴によれば、本発明の方法は、増幅した幹細胞を得るために、前記接触の前に幹細胞を増幅させるステップを更に具える。
【００３２】
記載された好適な実施例の更なる特徴によれば、骨髄幹細胞は、間充織幹細胞である。
【００３３】
記載された好適な実施例の更なる特徴によれば、幹細胞は成体幹細胞である。
【００３４】
記載された好適な実施例の更なる特徴によれば、幹細胞は胚性幹細胞である。
【００３５】
記載された好適な実施例の更なる特徴によれば、アポトーシス性誘導薬剤は、ＴＮＦα、ＦａｓＬ、Ｔｒａｉｌ及びＴｗｅａｋからなる群から選択される。
【００３６】
記載された好適な実施例の更なる特徴によれば、アポトーシス性誘導薬剤は、ＦａｓＬである。
【００３７】
記載された好適な実施例の更なる特徴によれば、ＦａｓＬは、面に結合する。
【００３８】
記載された好適な実施例の更なる特徴によれば、ＦａｓＬは、非開裂性である。
【００３９】
記載された好適な実施例の更なる特徴によれば、この方法は、前記接触の前に異種細胞集団のアポトーシスレセプタの発現を上方制御するステップを具える。
【００４０】
記載された好適な実施例の更なる特徴によれば、アポトーシスレセプタは、Ｆａｓレセプタ、ＴＮＦαレセプタ、ＴｗｅａｋレセプタおよびＴｒａｉｌレセプタからなる群から選択される。
【００４１】
記載された好適な実施例の更なる特徴によれば、アポトーシスレセプタの発現の上方制御は、インタフェロンγ又はＴＮＦαを異種細胞集団に接触させることによって影響される。
【００４２】
記載された好適な実施例の更なる特徴によれば、異種細胞集団は、免疫活性化Ｔリンパ球を具えない。
【００４３】
記載された好適な実施例の更なる特徴によれば、異種細胞集団は、系統陽性細胞を具える。
【００４４】
記載された好適な実施例の更なる特徴によれば、系統陽性細胞は、顆粒球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、赤芽細胞、抗原提示細胞、骨髄細胞、リンパ球細胞及び巨核球（巨大核細胞）からなる群から選択される。
【００４５】
記載された好適な実施例の更なる特徴によれば、異種細胞集団は、アポトーシス反応性悪性細胞を具える。
【００４６】
記載された好適な実施例の更なる特徴によれば、この方法は、前記接触の後、幹細胞を単離するステップを具える。
【００４７】
記載された好適な実施例の更なる特徴によれば、幹細胞は、宿主に対して自家移植（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）される。
【００４８】
記載された好適な実施例の更なる特徴によれば、幹細胞は、宿主に対して同系（ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ）である。
【００４９】
記載された好適な実施例の更なる特徴によれば、幹細胞は、宿主に対して同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）である。
【００５０】
記載された好適な実施例の更なる特徴によれば、幹細胞は、宿主に対して異種（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ）である。
【００５１】
記載された好適な実施例の更なる特徴によれば、分化を誘導することは、幹細胞中に遺伝子産物を発現することによって影響を受ける。
【００５２】
記載された好適な実施例の更なる特徴によれば、遺伝子産物は、ポリペプチドである。
【００５３】
記載された好適な実施例の更なる特徴によれば、遺伝子産物は、ポリヌクレオチドである。
【００５４】
本発明は、アポトーシスシグナルに対する非反応性に基づいて幹細胞を選別する新規な方法を提供することによって、周知な構成の問題点を十分に解決できる。
【００５５】
他に規定がなければ、本明細書に使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明の属する分野の当業者であれば一般的に理解される意味と同一である。本明細書に記載されるものと同様又は同等の方法及び材料を、本発明の実施または試験に用いることができるが、好適な方法及び材料を以下に示す。疑義が生じる場合、定義の場合を含み、特許明細書が制御する。加えて、材料、方法及び実施例は、例示のみを目的として限定を意図するものではない。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
本発明は、幹細胞を選別し、非幹細胞の異種細胞集団を取り除く方法に関する。
【００５７】
本発明の選別方法の原理及び処置は、実施例及び添付の記載と関連してよりいっそう理解されるであろう。
【００５８】
本発明の少なくとも１つの実施例を詳細に説明する前に、本発明は、以下の実施例の記載又は例示に記載された本出願の詳細に限定する意図ではないことを理解されたい。本発明は、他の実施例も実施可能であり、各種態様で実施又は実行することもできる。又、本明細書に使用される専門用語及び技術用語は、記述を目的とするものであって、限定を意図するものではないことを理解されたい。
【００５９】
幅広い疾患の治療における幹細胞の各種利用は、大量の幹細胞を単離し精製することが極めて重要であることを示唆している。
【００６０】
造血システム内で幹細胞は、通常、細胞表面表現型（フェノタイプ）（例えばＣＤ３４＋）のベースで同定される。しかしながら、十分な証拠は、細胞膜でのＣＤ３４の発現は、幹細胞活性と常に相関していない。造血幹細胞（ＨＳＣ）を検出し精製するために使用される他の戦略は、蛍光染料の染色パターンに基づいている。生命蛍光染料Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（ＤＮＡの副溝のアデニン−チミンリッチ領域に結合するビス−ベンゾイミダゾール）及びローダミン１２３（活性ミトコンドリア中に優先的に蓄積する）は、ＨＳＣの割合を高めるために、フローサイトメトリー実験で長い間使用されてきた。
【００６１】
上述した選択工程の使用は、造血フェノタイプに対してバイアスした幹細胞又は初期前駆細胞を選別する傾向がある。
【００６２】
造血細胞の生着能を調査するとき、移植後の早い段階で、ドナー細胞中のデスレセプタの発現の上方制御が検出される本発明は（図３Ａ−Ｂ）、放射線障害の結果として放出される因子（ケモカイン及びサイトカイン）によって、少なくとも部分的に誘導される。
【００６３】
本発明者らは、Ｆａｓ欠損（ｌｐｒ）及びＦａｓＬ欠損（ｇｌｄ）マウス中の造血幹細胞の生着能の減少に注目したので（図１Ａ−Ｂ）、彼らは、造血細胞生着の早期段階で、誘導されたデスレセプタに関するポジティブな役割があると考えた。さらに、発明者らは、異所性ＦａｓＬタンパク質の一過性の提示が、造血幹細胞の同系（図１Ｃ−Ｄ）及び同種異系（図２Ａ−Ｅ）細胞生着の双方を改善したことを示した。
【００６４】
さらに、本発明者らは、最も初期の前駆細胞のみが移植後すぐにデスレセプタを上方制御し、次の日を超えてこの発現を維持したことを示した。驚くべきことに、これらの細胞が高濃度のデスレセプタを示したにもかかわらず、細胞にはアポトーシス性シグナルに対する耐性があった。
【００６５】
本発明者らは、これらの結果から、造血性再構成能を有する前駆細胞において、これらの前駆細胞に発現したデスレセプタは、アポトーシス性シグナルを仲介しないと判断した。分化の後期段階（ｄｉｓｔａｌ  ｓｔａｇｅ）及び体細胞における死を仲介する全く同一のレセプタは、最も初期の造血幹細胞及び前駆細胞における栄養性シグナルを仲介する。
【００６６】
本発明を低減して実施する際に、本発明者らは、ＦａｓＬなどプロアポトーシス性リガンドを用いた未処理（ｎａｉｖｅ）（すなわち、例えばアポトーシス性メディエータを発現させるなど未修飾）の骨髄細胞の前培養は、Ｆａｓの発現を刺激する（図７Ｃ）ことを示し、さらに、これらの大量の細胞集団がアポトーシスに対して反応しなかったことを示した（図７Ｄ）。
【００６７】
本発明は、造血細胞集団で幹細胞を選別しその割合を高める自然発生現象を利用するように努める。本発明者らは、初期前駆細胞のみがプロアポトーシスシグナルに免疫性があることを示し、本発明は、ＣＤ３４などの細胞マーカーの発現に従って分離することによって生成した細胞集団より高い可塑性を有する細胞集団の生成へと導き、従ってＣＤ３４＋細胞とは異なり、造血系に対してバイアスされない。結果的に、本発明者らは機能的特性：細胞表面のデスレセプタを介してシグナルを送られるアポトーシス性シグナルに対して幹細胞／前駆細胞が反応しないことを用いて、幹細胞／前駆細胞の選別を提言する。
【００６８】
本発明は、造血性細胞の移植、及び、細胞性遺伝子治療として使用され得る遺伝的操作に適した幹細胞の生成、の用途で使用できる幹細胞のエキソビボ集団を提供するために使用可能である。さらなる用途は、限定するものではないが、養子免疫治療、例えばβ−異常血色色素症など複数の疾患の治療、インビボでの分化及び分化転換セッティングにおける幹細胞の移植、分化及び分化転換セッティングにおけるエクスビボ組織工学を含む。
【００６９】
次いで、本発明の一態様によれば、異種細胞集団から幹細胞を選別するエクスビボ方法が提供される。この方法は、非幹細胞に対してアポトーシス性であり、幹細胞に対して非アポトーシス性である条件下で、細胞集団をアポトーシス誘導因子と接触させるステップを具える。
【００７０】
本明細書に使用されるように、用語「選別」は、以下に規定される本発明の幹細胞と非幹細胞とを区別する方法を意味する。本発明は、非幹細胞に必ず死をもたらすので、以下でさらに記載されるように、選別工程は、非幹細胞を取り除くことによって、本発明の幹細胞の割合を高める。
【００７１】
本明細書に使用される用語「幹細胞」は、アポトーシス性メディエータを発現する（又は発現するように誘導される）が、アポトーシス性シグナルに対して耐性のある最終的に分化していない細胞を意味する。従って、幹細胞の定義に、幹細胞よりもいくらか分化した初期前駆細胞が含まれるが、本発明者らによって、アポトーシス性レセプタを発現するのにも関わらず、アポトーシス性シグナルに耐性があることが示された。本発明の方法によって選択される幹細胞は、機能特性によって特徴付けることもできる。従って、例えば、本発明者らが示したことは、本発明の方法によって選択される幹細胞は、他の従来の方法によって選択される幹細胞と比較して、改善された生着特性を具える。
【００７２】
本発明の幹細胞は、臍帯血由来、末梢血由来、骨髄（例えば、間葉幹細胞、造血幹細胞）又は、限定するものではないが、脳、肝臓及び筋肉を含むいずれかの成体組織由来であってもよい。さらに、幹細胞は、胚性幹細胞及びその誘導体でもよい。
【００７３】
胚性幹細胞及びこれらの回収（ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）方法は、当分野では周知であり、例えば、Ｔｒｏｕｎｓｏｎ  ＡＯ（Ｒｅｐｒｏｄ  Ｆｅｒｔｉｌ  Ｄｅｖ  ２００１；１３：５２３）、Ｒｏａｃｈ  ＭＬ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２００２；１８５：１）、及びＳｍｉｔｈ  ＡＧ（Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２００１；１７：４３５）に記載されている。成体幹細胞は、成人の組織から得られ、当分野で周知の幹細胞である。成体幹細胞を単離又はその割合を高める方法が、例えば、Ｍｉｒａｇｌｉａ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １９９７；９０：５０１３；Ｕｃｈｉｄａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２０００；９７：１４７２０；Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １９９１；７８：５５；Ｐｒｏｃｋｏｐ  ＤＪ  Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ２００１；３：３９３，Ｂｏｈｍｅｒ  ＲＭ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｅｔａｌ  Ｄｉａｇｎ  Ｔｈｅｒ  ２００２；１７：８３）及びＲｏｗｌｅｙ  ＳＤ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １９９８；２１：１２５３；Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｄａｎｉｅｌ  Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ（編集者）Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｌ．Ｇａｒｄｎｅｒ（編集者）、出版社：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）、及び、Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｄ．Ｈｏ（編集者）Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｃｈａｍｐｌｉｎ（編集者）、出版社：Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ（２０００）に記載されている。
【００７４】
本発明のこの態様によれば、幹細胞は、異種細胞集団から選別される。
【００７５】
本明細書に使用されるように、用語「異種細胞集団」は、少なくとも２種類の細胞の混合物を意味し、一方の種類は、上記に規定したような幹細胞であり、他方はアポトーシス反応性がある。この異種細胞集団は、１又は複数の組織、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはヒトから得られる。
【００７６】
一実施例によれば、異種細胞集団は、陽性細胞及び幹細胞の混合物を具える。この例において、本発明の方法は、系統細胞除去（ｌｉｎｅａｇｅ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）を行うために使用される。
【００７７】
本明細書に使用されるように、用語「系統陽性細胞」は、方向付けられた（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）前駆細胞及び他のさらに分化した細胞など、特定の細胞系統へと方向付けられた細胞を意味する。通常、系統陽性細胞は、例えば、限定するものではないが、ＣＤ３、ＣＤ６１、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ１４、ＣＤ１５及び／又はＣＤ４を含む系統分化マーカを表す。
【００７８】
本発明の選別方法によって削除され得る系統陽性細胞の例は、限定するものではないが、Ｂ及びＴリンパ球（成熟又は未成熟の両方）、顆粒球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、赤芽球、抗原提示細胞、骨髄細胞及び巨核球細胞を含む。好ましくは、Ｔリンパ球は、すなわち、Ｔ細胞レセプタ活性化Ｔリンパ球など、免疫活性化Ｔリンパ球ではない。
【００７９】
他の実施例によれば、異種細胞集団は、幹細胞及びアポトーシス反応性悪性細胞の混合物を具える。従って、本発明の方法は、異種悪性細胞集団を取り除くために使用できる。
【００８０】
異種細胞集団は、ＦＡＣＳ（幹細胞ＣＤ３４＋又は他のマーカーとして規定される）、ローダミン１２３及びＨｏｅｓｃｈｔの除去、向流遠心エラトリエーション、及び、系統細胞除去によって、当分野で周知の技術を用いて本発明の選別方法の実施前に、幹細胞の割合を高め、小さな芽細胞（ｓｍａｌｌ  ｂｌａｓｔ）集団を得る。
【００８１】
異種細胞集団は、プロアポトーシス因子にアクセス（到達）可能である限りにおいて、組織（例えば、骨髄）又はその一部、凝集体、単一細胞懸濁液あるいは初代培養又は細胞サンプルの一部に含まれてもよい。
【００８２】
異種細胞集団は、本発明の選別方法の実施前に、修飾（ｍｏｄｉｆｙ）されてもよいが、好ましくは、この修飾プロセスは、異種細胞集団が本発明の方法に従って選別されなくなるように、アポトーシス因子に対する幹細胞の耐性に影響を与えることはない。従って、例えば、異種細胞集団は、対象となる分子を発現するように一般的に修飾されてもよい。
【００８３】
代替又は付加的に、異種細胞集団は増幅する。好ましくは、異種細胞集団の増幅に用いられる培養条件によって、本発明の幹細胞は最終的に増加することとなり、幹細胞がアポトーシスに対して反応性があるようにはならない。
【００８４】
様々な組織起源の幹細胞のエクスビボ培養方法は、細胞培養の分野で周知である。この効果に関しては、例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓによるテキストブック「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ  −  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」Ｎ．Ｙ．（１９９４）第三版を参照し、この内容は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする。分化させずに細胞増幅が可能な条件下で幹細胞を培養する特定の方法は、当分野で周知であり、例えば、米国特許出願公開２００５０１８１５０４、２００５０２６５９８０、２００５０２７６７９３及び２００５０１２４００３を参照し、これら全ては参照することによって本明細書に組み込まれるものとする。又、幹細胞の増幅は、本発明の選別工程中、及び／又は、本発明の選別工程後、影響を受けてもよい。
【００８５】
上述のように、本発明の選別方法は、幹細胞が非幹細胞よりもプロアポトーシス因子に対して高い耐性を示すことに基づいている。従って、細胞集団は、非幹細胞が死ぬ条件下でプロアポトーシス因子と接触することによって、幹細胞の割合が高まる。
【００８６】
本明細書に使用されるように、用語「プロアポトーシス因子」はプログラムされた細胞死を促進可能な因子（化学物質又はポリペプチド）を意味する。
【００８７】
本発明に関して使用される例示のプロアポトーシス性因子は、限定するものではないが、ＴＮＦ−α、ＦａｓＬ、Ｔｒａｉｌ（Ａｐｏ２リガンド）及びＴｗｅａｋ（Ａｐｏ３リガンド）を含む。このようなプロアポトーシス性因子は、細胞抽出物から生化学的に合成又は生成された組み替えペプチドでもよい。組み替えＴＮＦ−α、ＦａｓＬ、Ｔｒａｉｌ及びＴｗｅａｋは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ（ミネアポリス、ミネソタ州）及びＡｂｎｏｖａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（台湾）から商業的に入手可能である。当分野の当業者であれば、アポトーシスを促進する多くの製薬的因子があることに気付くであろう。これらの因子には、ビス−インドイルマレイミド−８（ｂｉｓ−ｉｎｄｏｌｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ−８）及びクアベイン（ｑｕａｂａｉｎ）がある。必要であれば、これらの因子を本発明のプロアポトーシス性因子とともに使用してもよい。
【００８８】
本発明のこの態様の好適な実施例によると、幹細胞を選別するために使用されるプロアポトーシス性因子は、ＦａｓＬである。
【００８９】
本明細書に使用されるように、用語「ＦａｓＬ」はＦａｓレセプタに結合し、アポトーシスを誘導可能なＦａｓＬポリペプチドの少なくとも活性部位を意味する。好ましくは、ＦａｓＬは、例えばヒトなど哺乳類のＦａｓＬである。ヒトＦａｓの例示的なポリペプチド配列が、ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ５０１２４に記載されている。従って、本発明のこの様態によれば、ＦａｓＬは、Ｆａｓリガンドポリペプチドの生物学的に活性のあるペプチド誘導体、Ｆａｓリガンドポリペプチドから得られる生物学的に活性のあるペプトイド（ｐｅｐｔｏｉｄ）、又は、Ｆａｓリガンド活性の有機小分子アゴニストでもよい。Ｆａｓリガンドポリペプチドは、Ｆａｓリガンドポリペプチド変異体、Ｆａｓリガンドポリペプチド誘導体、修飾されたＦａｓリガンドポリペプチド又は切断されたＦａｓリガンドポリペプチドなどの生物学的に活性のあるＦａｓリガンドポリペプチドが可能である。
【００９０】
本発明のこの態様の一実施例によれば、ＦａｓＬは表面（例えば細胞膜）に結合し、Ｆａｓレセプタの３量体を形成し、これにより、その活性効率を上昇させる。ＦａｓＬは、例えばリポソームなどの他の表面に位置を与えられるか、ＦａｓＬ結合ストレプトアビジンを用いてビオチン化ビーズと結合させてもよい。
【００９１】
本発明の好適な実施例によれば、ＦａｓＬは、Ｆａｓレセプタの３量体化が維持されるように非開裂性であるが、しかしながら、ＦａｓＬは表面に対して開裂性又は非開裂性であってもよい。膜結合形体としてのみ発現される自然発生的非開裂性ヒトＦａｓリガンドの例は、Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ  Ｎｏ．ＡＡＧ６００１７．１に記載されている。米国特許第６，９５１，９１９号は、タンパク質分解に対して反応性が低くくなることによって、アポトーシス活性を促進するＦａｓリガンドを教示する。
【００９２】
本発明のこの態様の他実施例によれば、ＦａｓＬは、フリーポリペプチド（すなわち、表面に結合していない）であるが、４量体状態（すなわち、非可溶性）であり、Ｆａｓレセプタの３量体化を誘導可能であり、これによってアポトーシスが誘導される。このようなポリペプチドの例は、当分野で周知であり、米国特許出願公開第２００４００１８１７０号を参照し、参照することにより本明細書に組み込まれるものとする。さらに、ストレプトアビジン結合ＦａｓＬは、４量体を生成可能であり、従って、プロアポトーシス性リガンドとして作用する。
【００９３】
本発明のプロアポトーシス因子は、Ｈｏｅｃｈｓｔ又は類似体など、幹細胞から能動的に排出される染料と結合してもよい。このような染料は、幅広く商業的に入手可能であり、例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅである。このように、本発明の幹細胞は、プロアポトーシス性因子の負の効果から保護される。
【００９４】
本発明のプロアポトーシス性因子を、十分な時間、異種細胞集団に接触させ、非幹細胞のアポトーシスを誘導してもよい。通常、アポトーシスを開始するまでにかかる時間は、約１時間であるが、好ましくは、アポトーシスが開始して、選別工程が行われるまで約１２〜１８時間待たされる。非幹細胞のアポトーシスを誘導するのに最も有効なＦａｓＬの濃度は、インビトロアッセイを用いて決定されてもよく、ＦａｓＬの正確な剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）及び異種集団中の細胞の種類に関連していてもよい。
【００９５】
代替としては、本発明のプロアポトーシス性ポリペプチドは、本発明の異種集団中に発現してもよい。
【００９６】
従って、本発明は、本発明の異種細胞集団中にプロアポトーシス性ポリペプチドを発現するために使用可能な、プロアポトーシス性ポリペプチドをコード化する発現コンストラクトを更に提供する。例えば、全長または選択された部分をコードしている哺乳類ＦａｓＬタンパク質のクローンから得られたポリヌクレオチド配列は、ＦａｓＬポリペプチドの組み替え形体を生成するのに使用可能である。ワイルドタイプのヒトＦａｓＬをコードする核酸配列の例は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．Ｕ１１８２．１に記載されている。膜結合形体でのみ発現される自然発生的非開裂性ヒトＦａｓリガンドをコードする核酸配列の例は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＦ２８８５７３に記載される。
【００９７】
本発明の核酸コンストラクト（本明細書で「発現ベクタ」を指す）は、通常、原核生物、真核生物又は好ましくは両方で、このベクタが複製及び組み込みに適するようになる付加的な配列を含む（例えば、シャトルベクタ）。さらに、通常のクローニングベクタは、開始配列の転写及び翻訳、ターミネータ及びポリアデニル化シグナルの転写及び翻訳を含む。
【００９８】
真核生物プロモータは、通常、２種類の認識配列、ＴＡＴＡボックス及び上流プロモータエレメントを含む。転写開始サイトの２５〜３０塩基対上流に位置したＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡ合成を開始するためにＲＮＡポリメラーゼに指令することを含むとされている。他の上流プロモータエレメントは、転写が開始される速度を決定する。
【００９９】
エンハンサーエレメントは、結合ホモロガス又はヘテロプロモータから１０００倍まで転写を刺激することができる。転写開始因子の下流又は上流に配置されるとき、エンハンサーは、活性化される。ウィルスから得られた多くのエンハンサーエレメントは、幅広い宿主範囲を有し、各種組織で活性となる。本発明に適した他のエンハンサ／プロモータの組み合わせは、ポリマウィルスから得られるもの、ヒト又はマウスサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、マウス白血病ウィルスなど各種レトロウィルスから得られるロングタームリピート、マウス又はラウス肉腫ウィルス及びＨＩＶを含む。Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ  ａｎｄ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．１９８３を参照し、参照することで、本明細書に組み込まれるものとする。
【０１００】
発現ベクタのコンストラクトにおいて、プロモータは、自然の設定における転写開始サイトからの距離と同様に、ヘテロ転写開始サイトからの距離とほぼ同じ位置にある。なお、当分野で周知のように、この距離のある程度の変化は、プロモータ機能の低下なしに、許容することができる。
【０１０１】
ポリアデニル化配列は、プロアポトーシス性ポリペプチドｍＲＮＡ翻訳の効率を上昇させるために、発現ベクタに加えられる。２つの異なる配列は、正確かつ有効なポリアデニル化：ポリアデニル化サイトから下流に位置したＧＵ又はＵリッチな配列、及び、１１〜３０ヌクレオチド上流に配置された６ヌクレオチドの高保存配列ＡＡＵＡＡＡ、を必要とする。本発明に適したターミネーション及びポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０から得られたものを含む。
【０１０２】
既に記載されたエレメントに加えて、本発明の発現ベクターは、通常、クローニングされた核酸の発現レベルを上昇させ、組み替えＤＮＡを保持する細胞の特定を促進するように意図された他の特別なエレメントを含んでもよい。例えば、多数の動物ウィルスは、複製を許容する細胞主のウィルスゲノムの染色体外の複製を促進するＤＮＡ配列を含む。適宜な因子が、プラスミド上に保持されるか、宿主細胞のゲノムとともに、遺伝子によって提供される限りにおいて、これらのウィルス性レプリコンを保持するプラスミドは、エピソーム的に複製される。
【０１０３】
ベクタは、真核生物レプリコンを含んでも、含まなくてもよい。真核生物レプリコンがある場合、ベクタは、適宜の選択可能なマーカを用いて真核細胞で増幅可能である。ベクタが真核生物レプリコンを具えない場合、エピソーム的複製は不可能である。実際に、組み替えＤＮＡは、操作された細胞のゲノム内に組み込まれ、ここでプロモータが所望の核酸の発現を指令する。
【０１０４】
本発明の発現ベクタは、例えば、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）、及び、プロモータ−キメラポリペプチドをゲノムに組み込むための配列など、単一のｍＲＮＡからいくつかのタンパク質を翻訳可能な付加的なポリヌクレオチド配列を更に含むことができる。
【０１０５】
哺乳類発現ベクタの例は、限定するものではないが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１、Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能なｐＣＩ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅから入手可能なｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ−ＲＳＶ及びｐＢＫ−ＣＭＶ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能なｐＴＲＥＳ、及び、これらの誘導体を含む。
【０１０６】
レトロウィルスなど真核生物ウィルス由来の調節エレメントを具える発現ベクタを使用することができる。ＳＶ４０ベクタは、ｐＳＶＴ７及びｐＭＴ２を具える。ウシパピローマウィルスから得られるベクタはｐＢＶ−１ＭＴＨＡを含み、エプスタインバーウィルスから得られるベクタはｐＨＥＢＯ及びｐ２Ｏ５を含む。他の例示的なベクタは、ＳＶ−４０早期プロモータ、ＳＶ−４０後期プロモータ、メタロチオネインプロモータ、マウス乳ガンウィルスプロモータ、ラウス肉腫ウィルスプロモータ、ポリヘデリンプロモータ、又は、真核細胞中で効率的な発現を示すプロモータ、の指令の下で、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｐＤＳＶＥ及びタンパク質を発現可能な他のベクタを具える。
【０１０７】
ウィルスは、多くの場合、宿主の防御機構を避けるように進化した極めて特殊化した感染因子である。通常、ウィルスは特定の細胞種に感染して増殖する。ウィルスベクタの標的特異性は、自然な特異性を利用し、所定の細胞種を特異的に標的とし、これによって、組み替え遺伝子を感染細胞内に導入する。従って、本発明に使用されるベクタの種類は、形質転換される細胞種に関連している。形質転換される細胞種によって適宜なベクタを選択する能力は、当業者であれば十分にあるので、選択事項の一般的な説明はここでは行わない。例としては、Ｌｉａｎｇ  ＣＹ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ．２００４；１４９：５１−６０）に記載されるように、骨髄細胞は、ヒトＴ細胞の白血病ウィルスタイプＩ（ＨＴＬＶ−１）を用いてターゲット化可能であり、腎臓細胞は、バキュロウィルスオートグラフカリフォルカヌクレオポリヘドロウィルス（ＡｃＭＮＰＶ）にあるヘテロプロモータを用いてターゲティングされる。
【０１０８】
組み替えウィルスベクタは、水平感染や特異的ターゲティングなどの利点を提供するから、プロアポトーシス性ポリペプチドのインビボ発現に有用である。水平感染は、例えば、レトロウィルスのライフサイクル中に内在し、単一の感染した細胞が、成長して隣の細胞に感染する多数の子孫ビリオンを生成する。この結果、広い範囲で急速に感染が広がり、そのほとんどは、最初のウィルス粒子によって初期感染したものではない。これは、感染因子が娘細胞（ｐｒｏｇｅｎｙ）を介してのみ広がる垂直タイプの感染と対照的である。ウィルスベクタは、水平方向に広がることができないように作製可能である。この特性は、所望の目的が、一部の標的細胞にのみ特異的な遺伝子を導入することである場合、有用である。
【０１０９】
各種方法は、本発明の発現ベクタを幹細胞に導入するように使用可能である。このような方法は、一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク（１９８９，１９９２）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ボルチモア、メリーランド（１９８９）、Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，アナーバー、ミシガン（１９９５），Ｖｅｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，アナーバー、ミシガン（１９９５）、ベクター：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，ボストン、マサチューセッツ（１９８８）、及び、Ｇｉｌｂｏａ  ｅｔ  ａｌ．［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９８６；４：５０４−５１２］に記載されており、例えば、組み替えウィルスベクタを用いた、安定的又は一過性トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション及びインフェクションを含む。さらには、ポジティブ−ネガティブ選別方法に関して、米国特許第５，４６４，７６４号、第５，４８７，９９２号を参照されたい。
【０１１０】
高効率トランスフェクションは、ウィルスの感染する性質によって得られるので、ウィルス感染にによる核酸の導入は、リポインフェクション及びエレクトポレーションなどの他の方法より優れた点がいくつかある。
【０１１１】
さらに、本発明は、本発明の選別工程前に、異種細胞集団のアポトーシスレセプタ（例えば、Ｆａｓレセプタ、ＴＮＦαレセプタ、Ｔｗｅａｋレセプタ及びＴｒａｉｌレセプタ）を上方制御することを意図する。このように、アポトーシスシグナルに対する反応は、本発明の幹細胞において陽性方向、及び、本発明の非幹細胞において陰性方向に拡張される。
【０１１２】
アポトーシスレセプタの上方制御方法は、インターフェロンγ又はＴＮＦαを細胞に接触させることなど、当分野において周知である。このような因子は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ及びＰｒｏｍｏｋｉｎｅなど企業から商業的に入手可能である。好ましくは、細胞を３時間から５日の間の時間で上記因子と接触させる。従って、例示的な幹細胞選別方法は、Ｆａｓを上方制御するために、異種細胞集団をＴＮＦαで２日間培養し、続いて、非幹細胞を殺すためにＦａｓＬで１日間培養することを具える。本発明の本態様によれば、幹細胞選別のさらなる例は、異種細胞集団をインターフェロンγとともに３日間培養し、続いて、非幹細胞を殺すためにＴＮＦαで１日間培養することを具える。
【０１１３】
本発明の幹細胞のアポトーシスシグナルに対する耐性は、プロアポトーシス因子で接触させる前に、向上されると理解されたい。例えば、Ｆａｓ関連のデスドメイン（ＦＡＤＤ）のドミナントネガティブ変異体（例えば、切断されたＦＡＤＤ−−例えばＷｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００１；２０８：１３７−４７）など、Ｆａｓ経路のドミナントネガティブな成分、又は、Ｆａｓ関連デスドメイン様インターロイキン−１β変換酵素阻害タンパク質（ＦＬＩＰ）などＦａｓ経路を阻害可能な他の分子は、ＦａｓＬを提示した本発明の細胞に導入され、ＦａｓＬによる誘導死から前記提示細胞を保護することができる。プロアポトーシス因子に対する幹細胞の耐性をどのように上昇させるかについての更なる例は、Ｃｉｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．［米国特許出願公開２００４０１３１５９９］を参照されたい。
【０１１４】
本発明の方法によってエクスビボで選別された幹細胞は、複数の臨床的症状に適用できる。以下に、いくつかを挙げる。
【０１１５】
細胞移植：
造血細胞の移植は、各種遺伝的疾患又は悪性疾患に関して選択の治療となる。早期移植工程は、全ての骨髄（ＢＭ）集団を利用していたが、近年では、幹細胞（ＣＤ３４＋細胞）の割合が高いより明確な集団を使用している。骨髄に加えて、このような細胞は、末梢血（ＰＢ）及び新生児の臍帯血（ＣＢ）へと移動（ｍｏｂｉｌｅｚｅｄ）される骨髄幹細胞などの他の供給源から得ることができる。ＢＭと比較して、ＰＢ細胞を有する移植は、汎血球減少症の期間を短縮し、感染及び出血の危険性を低減する。
【０１１６】
ドナー及びレシピエントは、例えば、各々、単一の個人又は異なる個人の自家移植又は同種異系移植でもよい。同種異系移植を実施するとき、当分野で周知なように、移植の拒絶反応及び／又はグラフト対宿主疾患を低減するレジームで行われるべきである。このようなレジームは、ヒトの治療で現在実施されている。本発明の方法によって選別される細胞集団は、Ｔリンパ球が大幅に激減され、これは、グラフト対宿主疾患を低減するように設定される同種異系移植及び半合致（ハプロアイデンティカル）移植で有益である。
【０１１７】
多くの改善されたレジームは、例えば、Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００２；２２：６４及びＪ  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ２００２；１１：２６５、Ｇｕｒ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ２００２；９９：４１７４、及び、Ｍａｒｔｅｌｌｉ  ＭＦ  ｅｔ  ａｌ、Ｓｅｍｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２００２；３９：４８など、Ｓｌａｖｉｎ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．による出版物に開示されており、参照することによって本明細書に組み込むものとする。
【０１１８】
悪性腫瘍を有するレシピエントの自家移植の場合、自家感染において腫瘍細胞の汚染は、疾患が再発する原因となることがよくある。非悪性幹細胞の選別及び増幅は、最終的な移植における腫瘍細胞の添加を低減するであろう。
【０１１９】
わずかな細胞における遺伝的欠陥の出生前診断：
出生前診断は、妊婦から子宮内の胚性細胞を回収し、遺伝的欠陥を分析することを含む。好ましくは、胚性細胞を回収する非浸襲性の手段は、母系末梢循環内に浸透した胚性の核形成された赤血球前駆細胞の分離を含む。しかしながら、これらの細胞の量は極めて少ないので、本発明のさらなる適用によって、分析前に、本明細書に記載された方法によって上記細胞が選別される。従って、本発明は、出生前診断に適用するために胚性幹細胞を選別する手段を提供する。
【０１２０】
遺伝子治療：
長期遺伝子治療の成功に関して、導入遺伝子が幹細胞のゲノム内に安定的に組み込まれた一般的に修飾された幹細胞の高頻度は、必須の必要条件である。骨髄（ＢＭ）組織において、細胞の大半は、前駆体及び前駆細胞を循環し、幹細胞は、小さなフラクションの細胞集団のみを構成し、そのほとんどが、静状態、非サイクル状態である。ウィルスベース（例えば、レトロウィルス）ベクタは、トランスジーンを宿主ゲノム内に組み込むための活発な細胞分裂を必要とする。従って、遺伝子を新鮮な骨髄幹細胞内に導入することは、極めて非効率である。幹細胞集団を増幅して精製し、エクスビボでその細胞分裂を制御する能力は、遺伝子組み換えの可能性を増大させるであろう。
【０１２１】
従って、本発明の選択された細胞は、上述したように遺伝子産物を発現するように修飾される。
【０１２２】
本明細書に使用されるように、用語「遺伝子産物」は、タンパク質、ペプチド及び機能的ＲＮＡ分子（すなわち、ポリヌクレオチド）を意味する。一般的に、核酸でコードされた遺伝子産物は、対象に供給される所望の遺伝子産物である。このような遺伝子産物の例は、レシピエント対象の組織によって生成されるタンパク質、ペプチド、糖タンパク質及びリポタンパク質を具える。例えば、膵臓の欠陥器官に対して遺伝子置換によって供給される遺伝子産物は、インスリン、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、トリプシノゲン、キモトリプシノゲン、カルボキシペプチダーゼ、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、ホスホリパーゼＡ２、エラスターゼ及びアミラーゼを含み、；通常、肝臓によって生成される遺伝子産物は、血清アデノシンの処理及び低密度リポタンパク質のエンドサイトーシスに関し、血液凝固因子ＶＩＩＩ及び因子ＩＸ、ＵＤＰグルクロニルトランスフェラーゼ、オルニチントランスカルバノイラーゼ、シトクロムｐ４５０酵素、及び、アデノシンデアミナーゼなど血液凝固因子を含み：胸腺によって生成される遺伝子産物は、血清胸腺因子、胸腺体液因子、胸腺タンパク質、及びチモシンα１を含み：消化管細胞によって生成される遺伝子産物は、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、ソマトスタチン、セロトニンおよび物質Ｐを含む。
【０１２３】
代替としては、コード化された遺伝子産物は、細胞によって生成される所望の遺伝子産物の発現を誘導するものである（例えば、導入された遺伝子物質が対象に供給される遺伝子産物の転写を誘導する転写因子など）。
【０１２４】
他の実施例において、組み替え遺伝子は、ヘテロタンパク質を、例えば、人工的に（ｎｏｔ  ｎａｔｉｖｅ）その遺伝子が発現される細胞に提供することができる。例えば、各種ヒトＭＨＣ成分は、非ヒト細胞に提供可能であり、ヒトレシピエントにおける生着を支持することができる。代替としては、このトランスジーンは、微生物外移植体（エクスプラント）において通常発現されるドナーＭＨＣ遺伝子産物の発現又は作用を阻害するものである。
【０１２５】
非造血幹細胞及び前駆細胞のエクスビボ選別：
ここで提案されるさらなる技術用途は、例えば、神経幹細胞及びオリゴデンドロサイト前駆細胞などを含む非造血幹細胞及び前駆細胞のエクスビボ選別を含む。このような幹細胞は、遺伝子産物（ポリペプチド又はポリヌクレオチド産物）を発現するように、細胞にトランスフェクションすることによって、特定の経路に沿ってエクスビボで分化するように強制されてもよい。代替又は付加的に、選択された細胞は、適宜な培地で培養することによって分化するように誘導されてもよい。
【０１２６】
ミエリン疾患は、未だに治療不可能なヒト神経疾患の重要なグループを形成している。動物モデルの進歩、特に、オリゴデンドロサイト系統細胞の移植は、極めて限定的な再ミエリン化及び機能回復の生理学的証拠をもたらした。未来の治療は、移植及び内在性修復の双方を含み、この２つのアプローチは、エクスビボのドナー組織の処置と組み合わせることもできるであろう。
【０１２７】
米国特許第５，４８６，３５９号は、単離されたヒト間葉系幹細胞は、複数の組織（例えば、骨、軟骨、筋肉、骨髄ストローマなど）に分化可能であり、培養ヒト間葉系幹細胞の単離、精製および増幅方法を提供する。
【０１２８】
米国特許第５，７３６，３９６号は、単離され、培養増幅されたヒト間葉系幹細胞のインビトロ又はエクスビボでの系統を方向付けた誘導方法を提供しており、この方法は、間葉系幹細胞を、選択した系統に幹細胞の分化を誘導する効果的な生物学的因子と接触させるステップを具える。さらに開示されているのは、間葉組織の再生又は修復を目的として、培養増幅し、系統が誘導された間葉系幹細胞を、元の自己宿主内に誘導する方法である。
【０１２９】
米国特許第４，６４２，１２０号は、軟骨及び骨の欠陥を修復する組成物を提供する。これらは、ゲル状、あるいは、天然又は人工骨に固定される。ゲルは、所定の細胞種を具える。これらの細胞は、フィブリノゲン、抗プロテアーゼ及びトロンビンと組み合わせて、通常、軟骨形成誘導因子を包含することによって、機能的軟骨細胞となるように潜在的に変換される胚性軟骨細胞、又は、間葉系由来の細胞へと方向付けられてもよい。
【０１３０】
米国特許第５，６５４，１８６号は、動物モデルで実証されたように、血液由来の間葉系細胞が培養系及びインビボで増殖し、血液から損傷した部位に移動し皮膚を形成することを示している。
【０１３１】
米国特許第５，７１６，４１１号は、動物又はヒトの傷又は火傷の皮膚再生方法を開示している。この方法は、最初に、傷をコラーゲングリコサミノグリカン（ＧＣ）マトリックスで被覆するステップと、移植した（ｇｒａｆｔｅｄ）ＧＣマトリックス内の健康な下層組織からの間葉系細胞及び血管の浸透を促すステップと、を具える。続いて、動物又はヒトの傷のない部位からとられた上皮細胞から成長された上皮自家移植（ａｕｔｏｇｒａｆｔ）シートが、身体表面に適用される。最終的なグラフトは完全な包含率（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｒａｔｅ）を有し、通常の肌の様相、成長、成熟及び分化を有する。
【０１３２】
米国特許第５，７１６，６１６号は、骨、軟骨又は肺の欠陥によって特徴付けられる病気、疾患又は症状に苦しむレシピエントの治療方法を提供する。この方法は、正常な同系遺伝子型の個人から単離されたストローマ（間質）細胞の静脈投与、又は、単離された細胞の遺伝的欠陥を修正に続いてレシピエントから単離された間質細胞の静脈投与を具える。遺伝子をレシピエント個人に導入する方法が、さらに、開示される。この方法は、レシピエント個人又は適合した同系遺伝子型のドナーから骨髄サンプルを得るステップと、サンプルから接着細胞を単離するステップと、を具える。単離されてから、ドナー接着細胞は、遺伝子でトランスフェクションされ、レシピエント個人の静脈に投与される。制御配列に操作によって結合した外因性遺伝子を含む間質細胞を単離するステップを具える組成物も開示している。
【０１３３】
上記例の各々において、非造血幹細胞及び前駆細胞は、器官の損失した細胞又は損傷した細胞を補充するために、細胞の外部供給源として使用される。このような利用は、提案される治療の適用が成功するために、幹細胞及び前駆細胞の精製された組成物を必要とする。このことは大量の精製された幹細胞及び前駆細胞集団を必要するので、本発明の方法及び用途は、上記の米国特許に開示されたあらゆる方法の重要なニッチを解決する。
【０１３４】
エクスビボ及びインビボの両方の用途に対するさらなる実験例：
幹細胞及び前駆細胞増幅のさらなる実験例は、皮膚再生、肝臓再生、筋肉再生及び骨粗鬆症における骨増殖を具える。
【０１３５】
この特許の存続期間中に、多くの関連するプロアポトーシス因子が開発され、用語「アポトーシス誘導因子」の範囲は、このような新しい技術も全て含むことを意図する。
【０１３６】
ここで使用されるように、用語「約」は、±１０％を意味する。
【０１３７】
本発明のその他の目的、利点及び新規な特徴は、限定を意図するものではない以下の実施例の実験に基づいて当分野の当業者にとっては明らかになるであろう。さらに、各種実施例の各々、ならびに、上述した本発明の態様、及び、以下の特許請求の範囲で主張する本発明の態様は、以下の実験例における実験的サポートを見つける。
【０１３８】
実験例
上述の記載とともに以下の実験例になされる参照は、限定する意図でなく、本発明を例示する。
【０１３９】
一般的に、本明細書で使用される専門用語及び本発明で使用される実験工程は、分子、生化学、マイクロ生物学及び組み替えＤＮＡ技術を具える。このような技術は、論文で詳細に説明されている。例えば、「分子クローニング：実験室マニュアル」Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔ  ＤＮＡ」，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号、第４，６８３，２０２号、第４，８０１，５３１号；第５，１９２，６５９号及び第５，２７２，０５７号「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）：入手可能な免疫アッセイは、特許及び科学論文に幅広く記載されており、例えば、米国特許第３，７９１，９３２号、第３，８３９，１５３号、第３，８５０，７５２号、第３，８５０，５７８号、第３，８５３，９８７号、第３，８６７，５１７号、第３，８７９，２６２号、第３，９０１，６５４号、第３，９３５，０７４号、第３，９８４，５３３号、第３，９９６，３４５号、第４，０３４，０７４号、第４，０９８，８７６号、第４，８７９，２１９号、第５，０１１，７７１号及び第５，２８１，５２１号を参照されたい。「オリゴヌクレオチド合成」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．，ｅｄ．（１９８４）：「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，Ｅｄｓ．（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，Ｅｄｓ．（１９８４）���「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，ｅｄ．（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．ｅｄ．（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，（１９８４）  ａｎｄ  「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」Ｖｏｌ．１−３１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｃｉａｔｉｏｎｓ」，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｎｕａｌ」ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらの全ては、参照することにより、本明細書に全て記載されているように組み込まれるものとする。他の一般的な参考文献は、この明細書に組み込まれる。そこに記載される工程は、当分野で周知であると考えられ、読み手の理解を助ける。そこに含まれる全ての情報は、参照することにより本明細書に組み込まれるものとする。
【０１４０】
一般的な材料及び方法
動物の準備及び移植：
この研究で使用したマウスは、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ（Ｂ６，Ｈ２ｂ、ＣＤ４５．２）、Ｂ６．ＳＪＬ−ＰｔｐｒｃａＰｅｐｃｂ／ＢｏｙＪ（Ｈ２Ｋｂ、ＣＤ４５．１）、Ｂ６．ＭＲＬ−Ｆａｓｌｐｒ／Ｊ（ｌｐｒ、Ｈ２ｋｂ、ＣＤ４５．２）、Ｂ６Ｓｍｎ．Ｃ３−Ｔｎｆｓｆ６ｇｌｄ／Ｊ（ｇｌｄ、Ｈ２ｋｂ、ＣＤ４５．２）及びＣ５７ＢＬ／６−ＴｇＮ（ＡＣＴｂＥＧＦＰ）１０ｓｂ（ＧＦＰ，Ｈ２ｋｂ）だった。これらのマウスを、バリア施設で飼育した。レシピエントをＸ線照射器（ＲａｄＳｏｕｒｃｅ２０００）を用いて１０６ｒａｄ／分のレートで、致死量に近い量（８５０ｒａｄ）及び致死量（９５０ｒａｄ）全身照射によって調整した。マウスを移植前にルーチンで１８〜２４時間調整した。注意すべき点は、Ｘ線照射は、骨髄破壊的な量のγ放射線及び毒性とは異なる。移植に関しては、０．２ｍｌリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁された細胞を外側尾静脈内に注入した。
【０１４１】
細胞単離、性質決定、及び、染色：
全骨髄細胞（ｗＢＭＣ）を、無菌状態でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ）で大腿骨及び頸骨から回収した。系統ネガティブ（ｌｉｎ−）ＢＭＣの免疫磁性的分離のため、細胞を、４５分間４℃で、ＣＤ５、Ｂ２２０、ＴＥＲ−１１９、Ｍａｃ−１、Ｇｒ−１及びＮＫ１．１に特異的な抗マウスモノクロナール抗体（ｍＡｂ）を飽和させて培養した。Ｔｅｒ−１１９及びＮＫ１．１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）以外の全ての抗体をハイブリドーマ細胞培養系から得た。抗体で被覆された細胞を、１％ウシ胎児血清（ＦＣＳ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）で２回洗浄し、細胞当たり４ビーズの比率でＭ−４５０磁性ビーズに結合した羊抗ラットＩｇＧで培養した。非結合ｌｉｎ−ＢＭＣを、磁場に暴露させることによって回収し、分離効率を、系統マーカーに対するフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）でラベルされたｍＡＢのカクテルを用いて、フローサイトメトリーで再評価した（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ及びＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）。純度がさらに高くなるように（＞９５％）、いくつかの場合、免疫学的分離を繰り返した。
【０１４２】
長期（ＬＴＲ）及び短期（ＳＴＲ）造血再構成細胞を、Ｂｅｃｋｍａｎ遠心のＪ−６ロータを用いてカウンタフロー遠心エラトリエーションによって単離した。大腿骨及び頸骨から回収されたｗＢＭＣは、３０００ｒｐｍで、１５、２５（Ｆｒ２５）、２９及び３３ｍｌ／分の流量、ならびに、ロータをオフにして（ＳＴＲ）、でフラクション化した。Ｆｒ２５細胞を、ＡＡ−４、ＣＤ５、ＧＲ−１、Ｍａｃ−１、Ｂ２２０（ハイブリドーマ細胞株由来）に対するラット抗マウスｍＡｂを用いて、４℃で培養することによって、系統細胞除去し、ＴＥＲ１１９（ｅＢｉｏｓｃｉｅｃｎｃｅ）を精製し、ＬＴＲ集団を得た。ＬＴＲ細胞の系統除去の効率を、フルオロクロムでラベルしたｍＡｂ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のカクテルを用いてフローサイトメトリーによって再評価した。
【０１４３】
細胞内染料で染色するために、細胞を２．５μＭの５−（及び−６）−カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で２０分間培養し、洗浄し、再懸濁した。
【０１４４】
ＦａｓＬタンパク質を用いたアポトーシスチャレンジ：
ストレプトアビジン−ＦａｓＬキメラタンパク質は潜在的アポトーシスシグナルをＦａｓ＋細胞に誘導することが以前から示されている（Ｙｏｌｃｕ  ＥＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２００２；１７：７９５−８０８）。細胞を、ＳｔｅｍＰｒｏ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５０μＭ  ２β−ＭＥを添加したαＭＥＭ培養液で２４時間培養した（５×１０６細胞／ｍｌ）。いくつかの例では、培地に１０ｎｇ／ｍｌ幹細胞因子（ＳＣＦ）及び１００ｎｇ／ｍｌのトロンボポイエチン（ＴＰＯ）を添加した。全ての添加物は、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社から購入した。これらの細胞は、１８〜２４時間、７５〜２５０ｎｇ／ｍｌのストレプトアビジン−ＦａｓＬキメラタンパク質を加えることによってチャレンジされ、続いて、アポトーシス及び細胞死のフローサイトメトリ分析を行った。
【０１４５】
組織回収：
脾臓、肺及び肝臓を、１００ユニットのヘパリンを含む３０ｍｌのコールドＰＢＳを心臓内潅流（パーフュージョン）した後、回収される。これらの組織を、ピースに分けて処理した：肺を３８０ｕ／ｍｌのコラーゲナーゼタイプＶ（Ｓｉｇｍａ）で３７℃６０分間消化し、肝臓を１５００ｕ／ｍｌのコラーゲナーゼで３７℃で２０分間消化した。脾臓を含む全ての組織を、４０μｍメッシュ以上でろ過し、細胞懸濁液をＰＢＳで２回洗浄した。
【０１４６】
細胞表面のＦａｓＬタンパク質の吸着：
細胞を、室温で３０分間、新たに調製した５μＭのＰＢＳ中のＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）に再懸濁した。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞をＰＢＳ中でストレプトアビジン−ＦａｓＬキメラタンパク質（１００ｎｇタンパク質／１０６細胞）を用いて培養した。吸着効率を、第２次ブタ抗ヤギＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）を有する第１次ヤギ抗ストレプトアビジンｍＡＢ（Ｚｙｍｅｄ）及び抗ＦａｓＬ抗体（ｃｌｏｎｅ  ＭＦＬ−４、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いたフローサイトメトリーによって評価した。アイソタイプコントロール抗体で染色したコントロール細胞で標準化し、対数スケールでポジティブ染色を判定した。
【０１４７】
フローサイトメトリー：
測定を、Ｖａｎｔａｇｅ  ＳＥフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で行った。有核（ｎｕｃｌｅａｔｅｄ）の末梢血及び骨髄細胞を、製造者の指示（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）に従って、フィコール（ｆｉｃｏｌｌ）勾配に亘って遠心分離によって単離した。細胞をＰＢＳで洗浄し、ラベルした第１次ｍＡｂを用いて４℃で４５分間培養するか、又は、フルオロクロムでラベルした第２次ｍＡｂで対比染色した。同系移植におけるドナーキメリズムを、マイナー抗体ＣＤ４５．１（クローンＡ２０、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＣＤ４５．２（クローン１０４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に対するモノクロナール抗体を用いて、ドナー及び宿主末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の割合から判定した。
【０１４８】
細胞死及びアポトーシスを、５μｇ／ｍｌの７−アミノアクチオマイシン−Ｄ（７−ＡＡＤ、Ｓｉｇｍａ）及びＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ（ＩＱ製品、フローニンゲン、オランダ）を用いて培養した細胞中で判定した。
【０１４９】
レセプタ及びリガンドを第１のラベルしたｍＡＢで同定した：Ｆａｓ（ＣＤ９５）クローン１５Ａ７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＴＮＦ−Ｒ１（ＣＤ１２０ａ）クローンＨＭ１０４（Ｓｅｒｏｔｅｃ）、ＴＮＦ−Ｒ２（ＣＤ１２０ｂ）クローンＴＲ７５−８９（Ｓｅｒｏｔｅｃ）、Ｔｒａｉｌ−Ｒ２（ＤＲ５）クローンＭＤ５−１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＦａｓＬクローンＭＦＬ４（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）。
【０１５０】
想定される幹細胞の細胞表面マーカーを、Ｓｃａ−１（Ｌｙ−６Ａ）クローンＤ７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びｃ−ｋｉｔ（ＣＤ１１７）クローン２Ｂ８（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）として同定した。ビオチン化された抗体をＦＩＴＣ、フィコエリトリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、及び、ペリジニンクロロフィルαタンパク質（ＰｅｒＣＰ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に結合したストレプトアビジンで対比染色した。
【０１５１】
半定量的ＲＴ−ＰＣＲ：
全ＲＮＡをＥＺ−ＲＮＡＩＩ抽出物薬剤又はＲＮｅａｓｙミニカラム（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン、ドイツ）を用いて細胞から抽出した。ｐｄ（Ｔ）１２−１８プライマとともに逆転写反応中でＲＮＡを使用した。ＰＣＲステップを、プライマ対の以下のセット：マウスＦＡＳ−フォワード５’ＧＣＣＴＴＧＧＴＴＧＴＴＧＡＣＣＡ（配列番号１）、リバース５’ＧＴＡＣＣＡＧＣＡＣＡＧＧＡＧＣＡ（配列番号２）を用いて行い、３００ｂｐフラグメントを生成した；マウスＦＡＳリガンド−フォワード５’ＡＣＣＧＣＣＡＴＣＡＣＡＡＣＣＡ（配列番号３）、リバース５’ＴＣＡＡＣＣＴＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＡ（配列番号４）を用いて行い、５００ｂｐのフラグメントを生成した。βアクチン用のプライマを発現のインターナルコントロール及び標準として使用した。
【０１５２】
インビトロでのコロニー形成ユニット（ＣＦＵ）アッセイ
３×１０４細胞を、Ｉｓｃｏｖｅ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）中の２０％ＦＢＳ、１％ＢＳＡ、０．１ｍＭの２β−ＭＥ、１０ｕ／ｍｌの組み替えヒトエリスロポイエチン（ＥＰＯ）、２０ｎｇ／ｍｌの組み替えマウス（ｒｍ）ＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍｌのｒｍインターロイキン−３（ＩＬ−３）及び１０ｎｇ／ｍｌのｒｍＧＭ−ＣＳＦを含む、１．２％メチルセルロース中に播種（ｐｌａｔｅ）した。５０細胞を超えるコロニー（ＣＦＵ−Ｃ）を、７〜１０日後に測定した。ストレプトアビジン−ＦａｓＬキメラタンパク質を、２００〜１，５００ｎｇ／ｍｌの範囲のインクリメンタル濃度で付加し、ビオチン化を介して細胞表面に吸着した［Ｙｏｌｃｕ  ＥＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２００２；１７：７９５−８０８；Ａｓｋｅｎａｓｙ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００３；１０７：１５２５−１５３１；Ｐｅａｒｌ−Ｙａｆｅ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００７；印刷中］。組み替えヒト可溶性ＦａｓＬ（ＳｕｐｅｒＦａｓＬ、Ａｌｅｘｉｓ）を５ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した。カスパーゼ３及び８を、Ｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋ及びＺ−ＩＥＴＤ−ｆｍｋ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を各々加えることによって阻害した。
【０１５３】
統計分析
データは、各々の実験プロトコルに対して平均±標準偏差として示される。各々の実験群の結果は、繰り返し測定の線形解析によって、再現性を評価した。実験プロトコル間での差異は、事後ｔ検定（ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  Ｓｃｈｅｆｆｅ  ｔ−ｔｅｓｔ）で測定し、有意差は、ｐ＜０．０５とみなされた。
【０１５４】
実験１
造血細胞生着における生理学的Ｆａｓ活性
結果
造血細胞中のＦａｓ／ＦａｓＬ相互作用に起因した有害な結果は、造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）移植の文脈において、負の影響を示唆してきた。この相互作用の抑制活性は、Ｆａｓを介した制御に対する非反応性及び／又はドナー細胞活性の抑制によって、Ｆａｓ欠損ＨＳＰＣが生着に有利であることを示唆している可能性があった。このような可能性を試験するために、本発明者らは、同系移植において、Ｆａｓ欠損（ｌｐｒ）及びＦａｓＬ欠損（ｇｌｄ）マウスを用いて、グラフト拒絶及びグラフト対宿主疾患（ＧＶＨＤ）に関わる免疫機構を回避し、早期生着プロセスにおけるこの分子対の役割を特定した。ワイルドタイプ（ＣＤ４５．１）又はＦａｓ欠損（ｌｐｒ、ＣＤ４５．２）ドナーから、骨髄破壊された（９５０ｒａｄ）同系ＧＦＰレシピント（ＣＤ４５．２）へと１０６ｌｉｎ−ＢＭＣを移植して、移植して３週間（ｎ＝５）後、末梢血中において、完全ドナー型キメリズムとなった。競合生着実験を、５×１０５ｌｉｎ−ＢＭＣを、ワイルドタイプ（ｗｔ）及びｌｐｒドナーの両方から、骨髄破壊された同系ＧＦＰレシピエント（ｎ＝１６）へと移植することによって行った。これらの条件下で、キメラは、３週間で、５９±５％のＣＤ４５．１及び３５±４％のｌｐｒキメリズムを示し（図１）、差異は、移植して１４週間後で維持された。これらのデータは、造血細胞生着の早期段階においてＦａｓ／ＦａｓＬ相互作用の正の役割を示唆しており、ドナー細胞活性のＦａｓを介した抑制の証拠はなかった。逆に、不十分な生着は、ドナー細胞のＦａｓに対するサポート的役割を示唆した。
【０１５５】
更に、生着を、５×１０５ｌｉｎ−ＢＭＣの、致死量に近い量（８５０ｒａｄ）で照射されたレシピエントへの同系移植でアッセイし、混合されたキメリズムを得た（図１Ｂ）。第１の一般的な観察は、ワイルドタイプ（ｗｔ）レシピエントのｌｐｒ細胞の不十分な生着であり、ｌｐｒ宿主におけるワイルドタイプの細胞は、交換的（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌｌｙ）だった。興味深いことに、生着は、ドナー細胞がＦａｓ欠損（ｌｐｒ）である場合だけでなく、ワイルドタイプの細胞がｌｐｒレシピエントにインフュージョンされる場合も、不十分であり（図１Ｂ）、これによって、複数の機構がＦａｓ／ＦａｓＬの相互作用に関与することが示唆された。さらに、生着は、ｇｌｄ細胞をワイルドタイプのレシピエントにインフュージョンする場合、及び、ワイルドタイプの細胞をｇｌｄレシピエントにインフュージョンする場合、不十分だった。これらのデータの総合的な解釈は、２０〜２５％の、生着が不十分な細胞は、Ｆａｓレセプタ及びリガンドが不足していることを示す。
【０１５６】
実験２
異所的ＦａｓＬタンパク質の一過性の提示は、同系細胞生着を改善する
結果
生着不十分なｇｌｄ細胞が、ＦａｓＬによって回復するかどうか判定するために、ドナー細胞を、ビオチン化を介してＦａｓＬタンパク質でコーティングした。ドナーｇｌｄ細胞の表面のＦａｓＬタンパク質の発現は、同系ｗｔレシピエント中の生着欠損を回復した（ｐ＜０．００１）（図１Ｃ）。同様の結果は、ＦａｓＬ発現ｗｔ細胞がｇｌｄレシピエント内に移植された場合（ｐ＜０．００１）に観察され、これによって、生着している細胞でのドナーＦａｓＬ−宿主Ｆａｓの相互作用、及び、明確な自己分泌Ｆａｓ／ＦａｓＬ活性が示唆される。生着の調整は、ＦａｓＬの特異的な効果に起因し、細胞表面のタンパク質デコレーションの長期的効果に起因しなかった。ビオチン化を介したＦａｓＬタンパク質でのｗｔＢＭＣのデコレーションは、同系ｗｔレシピエントの早期生着を改善し（ｐ＜０．００５）（図１Ｄ）、これらのマウスは、移植して１６週間後、完全なドナー型キメリズムを展開した。これらの結果によって、生着ＢＭＣは、ＦａｓＬ誘導アポトーシスに対して反応せず、このタンパク質の発現は、長期再増殖細胞を傷つけずに、短期生着を改善したことが示唆された。
【０１５７】
実験３
ドナー細胞のＦａｓＬの第１のターゲットは、同系移植における骨髄ストローマである
結果
異所的ＦａｓＬタンパク質の生着促進効果が、宿主のＦａｓシグナル伝達を介して作動したかどうかを確実にするために、ワイルドタイプのマウスからの細胞をＦａｓ欠損ｌｐｒレシピエント（ｎ＝８）内に移植した。細胞の同種異系移植片（アログラフト）の表面でのＦａｓＬタンパク質の発現によってなされた生着の利点は、失われ、これによって、この機構が、宿主中のコンピテントなＦａｓシグナル伝達経路に関与することが示唆された（図１Ｅ）。これらの結果は、ＦａｓＬでデコレーションされた細胞の生着を向上させることが、ＦａｓＬの特異的効果であり、エクスビボ細胞操作の人為的結果でないことの更なる証拠となった。
【０１５８】
ＦａｓＬでデコレーションされたｌｉｎ−ＢＭＣのベト（ｖｅｔｏ）活性は、ベト活性が宿主免疫システムによってプレホーミング（ｐｒｅ−ｈｏｍｅｄ）されたＢＭＣの破壊を阻止する全身レベルで、又は、ベト活性が照射を生き延びて残った宿主細胞を除去できる骨髄において、操作可能である。同系移植において、免疫調節は、生着プロセスにおいて相対的に可変であることは予想されていなかった。ドナー細胞ＦａｓＬによってターゲティングされ得る残りの宿主細胞は、免疫細胞、ＨＳＰＣ及び骨髄ストローマを含む。ＦａｓＬの生着をサポートする効果に関連した非免疫学的機構の証拠は、本発明者らを、宿主（照射を生き延びたストローマ又は残りの宿主ＨＳＰＣ及び免疫細胞）中のＦａｓＬでデコレーションされた細胞の特異的細胞ターゲットを探し求めさせた。本発明者らは、１０７全ＢＭＣをＧＦＰドナーから骨髄破壊された（９５０ｒａｄＴＢＩ）ｌｐｒレシピエントへの移植によって、Ｆａｓ−ストローマ及びＦａｓ＋造血細胞を有するキメラマウスを生成した。移植して６週間後、これらのマウスは、末梢血及び骨髄において、完全にドナー型造血キメリズムを示した（図１Ｆ）。骨髄ストローマがｌｐｒ宿主表現型であることを確かめるために、骨髄吸引液を、長期培養用に播種（ｐｌａｔｅ）した。培養中に成長した細胞の主な優性な表現型は、ＣＤ１１ｃ＋及びＣＤ４５＋細胞をゲートアウトした後、ｌｐｒ宿主（ＧＦＰ−）由来のものであった（図１Ｇ）。致死量に近い量を照射された（８５０ｒａｄ）キメラは、同系４５．１細胞の第２の移植のレシピエントとして供給した。造血キメリズムのレベルは、ｌｐｒレシピエント中のＦａｓＬを介した生着の利点の損失（図１Ｅ）と同様に、未処理でＦａｓＬコーティングされたｌｉｎ−ＢＭＣの移植後（図１Ｈ）も同様だった。エリミネーションによって、これらのデータは、宿主骨髄中の残りの造血細胞のベト活性ではなく、ドナー細胞ＦａｓＬの第１のターゲットがマウスストローマであることを示唆している。
【０１５９】
実験４
ＦａｓＬの異所的発現は、同種異系の造血細胞の生着を促進する。
結果
システムレベルで、ＦａｓＬのドナー細胞発現の影響を判定するために、ＦａｓＬキメラタンパク質を、ビオチン化を介して脾細胞の表面及びｌｉｎ−ＢＭＣに発現させた。これらの細胞を、１０６未処理のｌｉｎ−ＢＭＣとともに、照射した同種異系宿主（Ｈ２Ｋｄ→Ｈ２Ｋｂ）内に移植した。生着レベルは、２倍の数の未処理のｌｉｎ−ＢＭＣと比較して（図２Ａ）、ｌｉｎ−ＢＭＣのＦａｓＬタンパク質の発現によって大幅に改善され（ｐ＜０．００１）、ドナー脾細胞でのＦａｓＬの発現によって更に改善される（ｐ＜０．００１）。これらのデータは、アロレスポンスの阻害は、ドナー造血細胞の生着に有益であることを示唆している。しかしながら、生着された細胞が、未処理又はＦａｓＬコーティングされたサブセットのｌｉｎ−ＢＭＣだったかどうかは、不透明のままだった。
【０１６０】
全てのグラフトされたｌｉｎ−ＢＭＣ細胞の上のＦａｓＬの発現が、生着に影響を与えるかどうか判定するために、タンパク質を、ほぼ完璧な効率でドナー細胞の表面に吸着させた（図２Ｂ）。１．５×１０６のＦａｓＬでデコレーションした同種異系のｌｉｎ−ＢＭＣを移植した結果、未修飾細胞と比較して、３週間でドナー造血キメリズムのレベルが上昇した。移植して１６週間後、全てのマウスを処理して全キメリズムを展開し、これにより、異所的なタンパク質の一過性の提示は、耐久性のある造血キメリズムの最終的な確立に影響を与えなかったことが示唆された（図２Ｄ）。改良された早期生着によって、幹細胞の死滅が生じなかったかどうかについて試験するために、連続的な移植を実施した。完全なキメラから第２の骨髄破壊された宿主へとｌｉｎ−ＢＭＣの移植は、生着における有意な差を示さなかった（図２Ｅ）。従って、ドナー細胞でのＦａｓＬタンパク質の発現は、十分に寛容され、短期生着を改善し、長期再構成能を損傷しなかった。
【０１６１】
実験５
ＦａｓＬタンパク質の発現は、Ｆａｓ従属状態でアロ反応性を阻害する。
同種異系細胞生着を支持する同様の機構は、宿主免疫細胞の活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）を介してＦａｓＬタンパク質を過剰発現することによって、アロレスポンスを阻害する。ＦａｓＬの免疫抑制（ｉｍｍｕｎｏｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ）機能に対する直接の証拠を提供するために、上記タンパク質でコーティングされた細胞を腹腔内で同種異系宿主内にインジェクションした。レシピエント脾細胞の応答を、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）で７日後アッセイした。ＦａｓＬでデコレーションされたｌｉｎ−ＢＭＣ及び脾細胞は、アロ反応性応答を特異的に阻害し、第三者の抗原に対する応答は、完全な状態で残った（図２Ｆ−Ｇ）。ＦａｓＬでデコレーションされた脾細胞は、アロ反応性Ｔ細胞応答の阻害に関して、ｌｉｎ−ＢＭＣよりも有効だった。これは、ＡＩＣＤ（３，３５，３６）を介してＦａｓＬを介した死滅（ｋｉｌｌｉｎｇ）反応するアロ反応性Ｔ細胞を効果的に活性化できる、専門的な抗原を提示している脾臓細胞の普及（ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ）による可能性がある。総合すると、これらのデータは、グラフトに対して同種免疫応答のシステム的阻害によって部分的に仲介される造血細胞の生着プロセスにおいて、ＦａｓＬの極めて早期の関与を示唆している。これは、本発明者らによって既に報告されている、同系対同種異系ドナー細胞の優れたホーミングと一致する（１）。
【０１６２】
実験６
デスレセプタは、ドナー細胞で上方制御される。
結果
Ｆａｓ、ＴＮＦ及びＴＲＡＩＬレセプタの濃度は、未処理で有核の全ＢＭＣ（ｗＢＭＣ）ならびに未処理のＣ５７Ｂｌ６及びＢＡＬＢ／ｃマウスから回収された系統除去（ｌｉｎ−）ＢＭＣで、評価した。顕著な違いは、ｗＢＭＣと比べて、ｌｉｎ−サブセットのＴＮＦ及びＴＲＡＩＬレセプタのより強調された発現だった。ｗＢＭＣ移植においては、成熟細胞と比べてより初期の前駆細胞の優先的なホーミングあるので、移植後のデスレセプタ発現の変化を観察するために、ｌｉｎ−ＢＭＣを用いた（１）。ｌｉｎ−ＢＭＣを、照射された（８５０ｒａｄ）同系レシピエント内に移植した（ＣＤ４５．１→ＣＤ４５．２）後、骨髄は、ドナー及び宿主細胞でゲーティングすることによって回収及び分析された。照射を生き延びた残された宿主細胞は（４８時間後）、未処理のＢＭＣ中の分布と比べて、レセプタの発現において小さな変化を示した。２日目の骨髄（ＢＭ）ホーミングドナー細胞は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２レセプタの比較的小さな増加とは逆に、Ｆａｓレセプタ及びＴＮＦレセプタの双方の顕著な上方制御を示した（図２Ｃ）。続いて、デスレセプタの発現は、６日後、６０〜７５％のドナー細胞まで上昇した。平行して、移植後６日目で、残りの宿主ＢＭＣは、Ｆａｓが１４．５±３％、ＴＮＦ−Ｒ２が２２．５±２．５％及びＴＲＡＩＬが１９．５±０．５％の穏やかな上昇を示した（ｐ＜０．００１ｖｓ基準値）。これらの移植条件下で、これらのマウスは、３週間（ｎ＝１５）で〜５０％のドナーキメリズムを展開し、１６週間後、完全なドナーキメリズムを展開した。総合すると、これらのデータは、移植後早い段階におけるドナー細胞のデスレセプタの急性的な発現を示した。
【０１６３】
実験７
サイクル（細胞周期）及び分化におけるデスレセプタ発現の関連性
いくつかのドナー細胞は骨髄にホーミングする早い段階でサイクルに関与するので、デスレセプタの発現は分裂及び早期分化によって誘導される（１）。従って、ＴＮＦファミリのレセプタの発現を、ＣＦＳＥ低下（ｄｉｌｕｔｉｏｎ）及び系統マーカーの発現に関して、初期シーディング（ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｓｅｅｄｉｎｇ）プロセスの間のドナー細胞でモニタリングした。ドナー細胞を移植前に細胞内染料ＣＦＳＥでプレラベルした。約１／３の細胞が、宿主骨髄へとホーミングした後の細胞分裂を示すＣＦＳＥ低下を示した（図３Ｅ）。レセプタは、移植して２４時間後のＣＦＳＥｂｒｉｇｈｔが残る細胞と比べて、ＣＦＳＥｄｉｍフラクション（ｐ＜０．００１）において主に発現した（図３Ｆ）。同様の不均衡な分布は、第１の移植をして４８時間後内で、系統マーカーを発現した細胞内で観察された。移植して２日以内において、５±１．７％から２０±２％までの骨髄にホーミングするｌｉｎ＋ＢＭＣの上昇は、デスレセプタの発現によってなされた（図３Ｈ）。これらのデータは、レセプタの発現が、宿主骨髄へのホーミング及びシーディングの際、早期細胞周期及び分化と主に関連していることを示す。
【０１６４】
実験８
Ｆａｓ／ＦａｓＬは、転写活性の際、ドナー細胞によって同時発現した。
結果
デスレセプタの急激な発現の観点から、本発明者らは、同族（ｃｏｇｎａｔｅ）リガンドも発現されるかどうか判定することを試みた。ＴＮＦスーパーファミリ中の唯一の膜結合リガンドは、ＦａｓＬである。同種異系ｌｉｎ−ＢＭＣを、照射した宿主に移植（Ｈ２Ｋｄ→Ｈ２Ｋｂ）して２日目、骨髄ホーミング細胞を回収し、Ｆａｓレセプタ及びリガンドの発現を分析した。宿主の残りのＢＭＣが上記分子の発現の穏やかな上昇を示した一方で、ドナー細胞は、骨髄へとホーミングした後、数時間内にＦａｓ及びＦａｓＬの顕著な上方制御を示した（図４Ａ）。Ｆａｓレセプタ及びリガンドの構造的結合発現は、照射された骨髄における歪んだサイトカイン環境の結果となり、骨髄細胞をサイクルすることによって上記分子を上方制御した。
【０１６５】
Ｆａｓ及びＦａｓＬの増加した発現が、ＲＮＡ転写のレベルで制御されたかどうかを判定するために、ＲＴ−ＰＣＲ分析をドナー細胞で実施した（転写前）。有核の全骨髄細胞は、Ｆａｓをコードする大量のｍＲＮＡ、及び、ＦａｓＬをコードする微量のｍＲＮＡを発現した（図４Ｃ）。両分子のｍＲＮＡの転写は、移植に使用されるｌｉｎ−ＢＭＣでは検出できなかった。従って、グラフトされた細胞のＦａｓ及びＦａｓＬタンパク質の出現は、転写レベルで誘導された。
【０１６６】
実験８
種々のストローマとの相互作用に関して、グラフト化された細胞のＦａｓ／ＦａｓＬの動的発現
造血細胞中のＦａｓレセプタ及びＦａｓリガンドの発現の変化は、複数の環境因子及び分化に対応して生じる（４−１４，２３）。骨髄ストローマは、ＨＳＰＣの最終的な生着サイトを提供する唯一の微少環境である。Ｆａｓ及びＦａｓリガンドの発現の上方制御が、骨髄ホーミング細胞のみで特徴付けられるかどうかを試験するために、同系宿主の各種器官にホーミングするドナー細胞を分析した。レセプタ及びリガンドの両方共、骨髄（図４Ｄ）及び肺（図４Ｅ）にホーミングするドナー細胞で上方制御された。変動において、脾臓（図４Ｆ）及び肝臓（図４Ｇ）にホーミングするグラフト細胞は、ＦａｓＬ発現を主に上方制御する。上記分子は、肺及び肝臓にホーミングするドナー細胞で一過的に発現する（移植して２４時間でピークに達する）のに対し、上記分子は骨髄及び脾臓にホーミングする細胞で連続的に発現した。同時に、放射線損傷は、これらの器官の柔組織細胞での上記分子の発現を誘導した（図４Ｄ−Ｇ）。各種器官の柔組織及びグラフト細胞での付随する上方制御は、Ｆａｓ及びＦａｓＬの発現が、放射線損傷の結果として放出されるファクタ（ケモカイン及びサイトカイン）によって一部誘導される。にもかかわらず、Ｆａｓ及びＦａｓＬ発現の刺激因子は、各種器官で変化する。
【０１６７】
実験９
デスレセプタは、条件設定及び骨髄ストローマとの相互作用によって誘導される。
結果
発現に影響を与える外来性細胞因子を判定するために、上記レセプタを、照射されていない同系（ＣＤ４５．１→ＣＤ４５．２）レシピエントにインフュージョンした後、観察した。これらの条件下で、デスレセプタ及びＦａｓＬの発現は、照射された宿主のレベルよりも約４０−６５％低く、これによって、ストローマ損傷後、ケモカイン及びサイトカインの放出がデスレセプタの発現に部分的に応答していることが示唆された。続く実験では、ｌｉｎ−ＢＭＣを６時間、エクスビボ大腿骨でインキュベートし、発現レベルをフローサイトメトリで測定した。この簡易培養工程は、３．５±１．２％から１１．８±３．２％まで（ｐ＜０／００１）Ｆａｓの発現を上昇させ、６±１．５％から１２．２±２．８％までＦａｓＬの発現を上昇させ、上記分子の重要な誘導要素として細胞−ストローマ相互作用を明確に特定した。
【０１６８】
実験１０
造血幹細胞及び前駆細胞におけるデスレセプタの発現
結果
デスレセプタを上方制御した細胞の性質を研究し、これらの細胞が造血再構成能を有する前駆細胞のサブセットの範囲に入るかどうか研究した。幹細胞は、全ＢＭＣの〜０．５％にのぼり、従って、ｌｉｎ−細胞における発生率が小さく、表現型に基づいた単離工程は、マークされた機能的不均一性を有するＢＭＣのサブセットを生む。２つの単離工程を、造血幹細胞及び前駆細胞の割合を高めるために使用した。
【０１６９】
Ａ．表現型が特徴的な幹細胞及び前駆細胞
マウスＨＳＰＣは、主として、ｌｉｎ−Ｓｃａ−１＋ｃ−ｋｉｔ＋として表現型が規定されるサブセットの範囲に入る。デスレセプタの分布は、ＣＦＳＥ＋ｌｉｎ−ドナー細胞を移植して２日後（ｎ＝７）及び６日後（ｎ＝５）、上記マーカーを発現するＢＭホーミングドナー細胞において測定した。４８時間後、デスレセプタは、Ｓｃａ−１＋細胞で最初に発現し（図５Ａ）、ｃ−ｋｉｔ−細胞で優性に発現した（図５Ｂ）。Ｓｃａ−１＋フラクション（１１．５±２％のＣＦＳＥ＋ｌｉｎ−ＢＭホーミングドナー細胞）及びデスレセプタの発現において有意な変化はなかった（図５Ａ）一方で、ｃ−ｋｉｔ＋サブセットは、２日目の３２±５％から６日目の２０±３％まで低下した（図５Ｂ）。このような数字の減少は、レセプタを発現するｃ−ｋｉｔ＋細胞のフラクションの相対的な増加によってなされた。ＴＮＦレセプタが細胞アポトーシスを仲介すると予想していたので、ＴＮＦレセプタに対してネガティブなｃ−ｋｉｔ＋細胞のフラクション及び総数の減少は、逆に予想外であった。
【０１７０】
最も主要な候補ＨＳＰＣからなる、細胞のＣＦＳＥ＋ｌｉｎ−Ｓｃａ−１＋ｃ−ｋｉｔ＋のさらなる分析は、移植して４８時間後、全てのデスレセプタの発現を明らかにした（図５Ｃ）。ＴＮＦ−Ｒ１の発現例は、図５Ｄに示す。同様に、再増殖するＨＳＰＣに最もよく対応する、実質的に全てのＣＦＳＥ＋ｌｉｎ−Ｓｃａ−１＋ｃ−ｋｉｔ＋細胞は、Ｆａｓ及びＦａｓＬに対してポジティブである（図５Ｅ−Ｆ）。ｌｉｎ−ｃ−ｋｉｔ＋細胞のサブセットにおいて、〜３０％がＦａｓを発現し、〜８５％がＦａｓＬを発現した（図５Ｅ）。総合すると、これらのデータは、最も初期のマウス前駆細胞が、移植後直ぐにデスレセプタを上方制御し、翌日を超えて発現を維持したことを示唆する。
【０１７１】
Ｂ．短期及び長期造血再構成細胞における発現
長期（ＬＴＲ）及び短期（ＳＴＲ）造血再構成能を有する２つの細胞集団を精製するために、密度に基づいた単離工程を使用した。大量のＳＴＲサブセットをロータオフ位置におけるＢＭＣ分画の端部で回収する一方で、２５ｍｌ／分のエラトリエーション流速で集めた少量の細胞を、系統除去（ｌｉｎｅａｇｅ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）によって処理し、ＬＴＲ細胞の割合の高いフラクション（Ｆｒ２５  ｌｉｎ−）を得た。細胞移植を受けなかった骨髄破壊されたマウスで通常観察される期間内で、Ｆｒ２５  ｌｉｎ−細胞を移植したマウスの大半は死んだ（８／１１）。変動において、ＳＴＲ細胞を移植したマウスは、数週間、生き延び、その多く（５／８）が、ドナー型キメリズムを構築するのに失敗した。変動において、（ＬＴＲとＳＴＲ）の両方の細胞集団を移植したマウスは、連続的移植において、耐久性のある生着及びコンピテントな血液生成能を示した（図示せず）。これらのデータは、上記細胞のサブセットの早期及び後期の造血再構成能に関する先のレポートと一致した（３５）。
【０１７２】
新たにエラトリエーションされた細胞の分析は、２７±４％のＦｒ２５  ｌｉｎ−細胞において、ＦａｓＬの発現を明らかにし（図５Ｈ）、コンタミネートしたリンパ球のフローサイトメトリ分析は、ｌｉｎ−ＢＭＣにおける発現が示された。これは、ＬＴＲ幹細胞の割合の高いフラクションでの構造的ＦａｓＬの発現を示唆する。両方のサブセットは、次に、照射された（８５０ｒａｄ）同系レシピエント（ＣＤ４５．２→ＣＤ４５．１）に移植され、分析するために２日後に回収した。骨髄にホーミングするＦｒ２５  ｌｉｎ−及びＳＴＲ細胞は、骨髄にホーミングするとき、Ｆａｓ及びＦａｓＬの双方の顕著な上方制御を示し、ＳＴＲ前駆細胞において発現（ｐ＜０．００１）がより高かった（図５Ｈ）。従って、長期及び短期造血再構成能の各々を有する、最も最初の幹細胞及び前駆細胞のサブセットは、骨髄にホーミングした後すぐにデスレセプタを発現した。
【０１７３】
実験１１
骨髄ホーミング細胞は、Ｆａｓを介したアポトーシスに耐性がある。
結果
Ｆａｓレセプタの発現における顕著な上方制御は、ドナー細胞がアポトーシスに反応することを示唆する。この可能性を試験するために、照射したマウス（８５０ｒａｄ）を、同系ｌｉｎ−ＢＭＣ（ＣＤ４５．１→ＣＤ４５．２）で移植し、ＢＭにホーミングした細胞を、２日後、大腿骨の骨髄から回収した。アポトーシスに対する細胞反応性を促進するためにケモカイン及び血清をサポートせずに、これらの細胞を２５０ｎｇ／ｍｌのＦａｓＬタンパク質を用いて１８時間、インビトロでアポトーシスチャレンジに晒した。ＦａｓＬチャレンジは、アポトーシスに対する骨髄にある細胞の顕著な耐性を明らかにした（図６Ａ）。照射を生き延びた残りの宿主ＢＭＣの中で、Ｆａｓ発現のレベルが低かったので、ＦａｓＬ誘導アポトーシスに対する耐性が期待された。変動において、約４５％のＢＭホーミングドナー細胞は、移植して４８時間後、Ｆａｓに対してポジティブだった。Ｆａｓ及び系統マーカー発現（図６Ｂ）に関するアポトーシスの測定によって、Ｆａｓ＋ＢＭホーミングドナー細胞の大半が、ＦａｓＬ誘導アポトーシスに反応しなかったことが示された。
【０１７４】
同様のアポトーシスチャレンジを、エラトリエートしたＬＴＲ及びＳＴＲサブセットの移植後（図６Ｃ）、ＢＭホーミング細胞に適用した。ＦａｓＬタンパク質及びアポトーシスに対する比較的非反応性を示した２日目のＢＭにホーミングした細胞は、未処理のエラトリエートした細胞サブセットと比べて、大幅に低かった（ｐ＜０．００１）。Ｆａｓ発現に関するアポトーシス細胞死の測定（図６Ｄ）によって、ＬＴＲ及びＳＴＲサブセットの双方におけるＦａｓ＋細胞が、ＦａｓＬ誘導アポトーシスに反応しなかったことが明らかにされた。Ｆａｓ＋ＬＴＲ細胞は、Ｆａｓ＋ＳＴＲ細胞と比べて、ＦａｓＬ誘導アポトーシスにより耐性があった。同様の実験を、２日目のＢＭホーミング細胞をＴＮＦα及びＴＲＡＩＬに供することによって行い、同族レセプタによって仲介されるアポトーシスに対するｌｉｎ−ＢＭＣのしっかりした耐性を得た。
【０１７５】
実験１２
レセプタの影響は、アポトーシスに対する細胞の反応性とクロストークする。
先の研究は、造血細胞の生存能力及び機能に極めて有害な結果の原因となった、造血細胞のＴＮＦによるＦａｓレセプタの誘導を示した（１５−２２、２８−３０）。ＴＮＦレセプタの早期上方制御は、〜３０％のドナー細胞及び８９〜９３％のｌｉｎ−Ｓｃａ−１＋ｃ−ｋｉｔ＋細胞は、２日後ＴＮＦ及びＦａｓＬ用レセプタを発現した（図５Ｃ）。従って、１〜２日後に回収してＦａｓＬでアポトーシスチャレンジを暴露するＢＭホーミング細胞の、ＴＮＦスーパーファミリの発現に関するアポトーシスを観察した。アポトーシスの一般的な感受性（反応性）を増大するために、細胞を、補助剤及びケモカインを加えず培地中で培養した。上記レセプタに関してポジティブなサブセット内の部分的な死における有意なバリエーションはなく、ＦａｓＬは、ＴＮＦ及びＦａｓレセプタに対して細胞染色ポジティブのアポトーシスを誘導しなかった（図６Ｅ）。これらのデータは、デスレセプタ間の誘導的なクロストークが、ＦａｓＬ誘導アポトーシスの特定のサブセットの感作に関連していたことを示唆している。このような感作は、レセプタの同時発現の欠如、又は、Ｆａｓを介したアポトーシスに対して細胞のサブセットの非反応性によって、生じた可能性がある。最も初期のＨＳＰＣによる全デスレセプタの同時発現の観点から、これらのデータは、アポトーシストリガーを受け取るレセプタの欠如ではなく、アポトーシスに対する細胞の非反応性を示す。
【０１７６】
実験１３
アポトーシス反応性細胞の除去は、前駆細胞及び幹細胞の造血再構成能を破壊しない。
本発明者らは、次に、骨髄破壊さらたマウスの耐久性（長期）及び短期造血再構成に対して応答可能な幹細胞及び前駆細胞が、ＢＭＣのアポトーシス反応性サブセットか、又は、アポトーシス耐性サブセットに属するかを調べた。ＦａｓＬタンパク質を用いてインビトロで予め培養した細胞を、致死量に近い条件下（８５０ｒａｄ）で同系（ＣＤ４５．１→ＣＤ４５．２）レシピエント内に移植した（下記の実験１４参照）。キメリズムのレベルは、３週間で均等になり（図６Ｆ）、全てのレシピエントは、移植して１４週間後に完全なドナー型キメリズムを展開した（図６Ｇ）。キメラ骨髄細胞をドナトーして第２の骨髄破壊された（９５０ｒａｄ）レシピエント（ＣＤ４５．２）に用いた。全ての第２レシピエント（ｎ＝７）は、１２〜１６週間後、完全なドナー型キメリズムを示した。総合すると、これらのデータは、短期及び長期造血再構成細胞の両方が、プロアポトーシスＦａｓＬタンパク質に短期間暴露することによって影響を受けなかったことを示す。前駆細胞がｌｉｎ−フラクションにあったと仮定すると、同様の実験は、移植前にｌｉｎ−ＢＭＣをおＦａｓＬに暴露することによって実行された。培地（６６±５．８％）及びＦａｓＬタンパク質（６５±４．１％）を用いて２４時間培養したｌｉｎ−ＢＭＣの移植後に得られたキメリズムの同様のレベルは、アポトーシスに対する前駆細胞の非反応性の直接の証拠となる。
【０１７７】
プロアポトーシス性リガンドを用いた前培養は、移植の結果を改善するかどうか試験するために、少量の細胞をインフュージョンした。特筆すべきことは、このような培養期間は、Ｆａｓ発現を誘導し、成熟ＢＭＣのフラクションにおけるアポトーシスを誘導したことがわかった（下記の実験例１４を参照）。骨髄破壊された同系宿主（９５０ｒａｄ）をレスキューするのに必要な限界数（ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｎｕｍｂｅｒ）のｌｉｎ−細胞は、約２×１０５細胞であり、従って、マウスは、１．５×１０５ＢＭＣでインフュージョンした（図６Ｈ）。同系移植（ＣＤ４５．２→ＣＤ４５．１）から４週間後、ＦａｓＬを用いて前培養したレシピエント細胞の生存率（１４／２０）は、（ＦａｓＬフリー）培地で前培養したＢＭＣを移植したマウスの生存率（９／２０）よりもよかった。生存率に関する同様の差異では、同種異系（Ｈ２Ｋｂ→Ｈ２Ｋｄ）移植において、ＦａｓＬで前処理して移植したマウスの生存率（１０／２０）、及び、コントロールのＢＭＣを移植したマウスの生存率（６／２０）が各々観察された。従って、ＦａｓＬタンパク質を用いた前培養は、グラフト細胞の放射能防護能を改善した。本発明者らは、次に、ＦａｓＬによって造血前駆細胞の活性によって、長期再構成能を有する幹細胞の死滅が生じたかどうかを評価した。キメラの骨髄細胞を、第１の移植をして１２週間後に回収し、第２の骨髄破壊された同系レシピエント（４５．１）内にインフュージョンした。大腿骨の細胞内容物の半分を、第２のレシピエントの各々に移植すると、１６週間後、完全なドナー型キメリズムとなり、このことによって、幹細胞の自己再生が、プロアポトーシスリガンドを用いて培養した後、保存されていたことが示唆された。
【０１７８】
実験１４
アポトーシスに対する未処理の骨髄細胞の反応性
結果
インビトロのアポトーシス刺激に応答する未処理の骨髄細胞の挙動は、一連の実験で試験された。ＦａｓＬタンパク質を用いて、ｗＢＭＣを２４時間培養すると、〜４０％の細胞がアポトーシス死となり（図７Ａ）、アポトーシスした細胞の主なフラクションは、ｌｉｎ＋サブセットに含まれた。さらなる分析によって、ＢＭＣの主な系統全てが、Ｆａｓを介したアポトーシスに反応することが示された（図７Ｂ）。デスレセプタの低い発生率から始まり（図３Ａ）、Ｆａｓの発現は、これらの培養条件下で未処理のｗＢＭＣで刺激された（図７Ｃ）。にもかかわらず、ｌｉｎ−Ｆａｓ＋細胞のかなりのフラクションは、ＦａｓＬを介したアポトーシスに反応しなかった。同一条件におけるｌｉｎ−ＢＭＣの培養は、Ｆａｓの上昇制御を確証し、約５０％のｌｉｎ−Ｆａｓ＋細胞がアポトーシスに対して反応しなかったことを更に示した（図７Ｄ）。予想に反して、ＦａｓＬは、１０ｎｇ／ｍｌの幹細胞ファクタ（ＳＣＦ）及び１００ｎｇ／ｍｌのトロンボポエチン（ＴＰＯ）の組み合わせよりも、Ｆａｓ誘導能が高かった。
【０１７９】
培養における造血細胞の生存を支援する成長因子として、ＳＣＦ＋ＴＰＯ、又は、ＳＣＦ＋ＴＰＯ＋ＩＬ−３を加えて、次の培養を、１日、３日及び５日間行った。一連のパイロット実験は、アポトーシストリガーとしてＴＮＦαを用いた細胞前培養の重要な効果がないことを示した。さらに、Ｆａｓ発現の誘導及びアポトーシスに対する反応性における仮定されるＴＮＦαの機能により、細胞を、この因子で３日間培養し、ＦａｓＬを培養中の最後の２４時間に加えた。全体の細胞数が減少したが、ｌｉｎ−ＢＭＣのフラクションはほとんど保護された（図７Ｅ）。Ｆａｓ及びＴＮＦレセプタの発現に関してアポトーシスを分析した（図７Ｆ）。培地の培養は、Ｆａｓ＋及びＴＮＦ−Ｒ１＋細胞（ｐ＜０．００１）と比べて、ＴＮＦ−Ｒ２＋細胞のより高いアポトーシス率を示した。培地中にＴＮＦ−αが存在することで、Ｆａｓ＋及びＴＮＦ−Ｒ２＋細胞における効果は小さく、ＴＮＦ−Ｒ１＋細胞におけるアポトーシスは減少し（ｐ＜０．００１）、これによって、このレセプタが、阻害ではなく、細胞刺激として関与したことが示された。３日間の培養中にＦａｓＬに暴露すると、ＴＮＦ−αを用いた前培養にかかわりなく、アポトーシスのレートが大幅に増大した。インビトロでのこれらのデータは、Ｆａｓを介したアポトーシスが、ＴＮＦスーパーファミリを発現する細胞において、アポトーシスの共通エフェクタ経路であり、これらの細胞の反応性におけるＴＮＦαに対して比較的穏やかな役割を果たすことを示した。
【０１８０】
ＳＦＣ＋ＴＰＯ存在下での培養は、細胞数（図７Ｇ）及びアポトーシス細胞のフラクション（図７Ｈ）に関して、効果は小さかった。しかしながら、ＳＣＦ＋ＴＰＯ＋ＩＬ−３の存在下で、生存細胞数は、特に、ｌｉｎ−サブセット（図７Ｉ）で実質的に上昇した。これは、アポトーシスに対するレセプタ−ポジティブ細胞の反応性を低下させることでなされた（図７Ｊ）。さらなる分析は、推定上の幹細胞マーカー、Ｓｃａ−１及びｃ−ｋｉｔを発現する細胞は、生存細胞のフラクション内で多かったことを示した。同様に、培地をサポートする制御的培養中、１０±２％のＬＴＲ細胞、及び、２２±４％のＳＴＲ細胞は、アネキシンＶに関してポジティブに染色された（図６Ｃ）。ＦａｓＬタンパク質の付加によって、４０％の新たにエラトリエーションされたＳＴＲサブセットがアポトーシスし、このＬＴＲサブセットはアポトーシスのわずかな増加を示した。特筆すべきことは、培養期間中、ＬＴＲ及びＳＴＲ細胞の両方が、Ｆａｓ発現をそれぞれ、１８±５％及び４２±６％にそれぞれ上方制御した。ＴＮＦを用いて５日間培養し、最終日にＦａｓＬを加えた後、ｌｉｎ−ＢＭＣの生存数に２．３倍の上昇があり、これにより、ｌｉｎ＋ＢＭＣのほとんどのフラクションはアポトーシス死したことが示唆された（図７Ｋ）。これらのデータは、最初の骨髄含有物から未分化の細胞のフラクションの割合を高める各種アプローチを示した。
【０１８１】
実験１５
Ｆａｓ及びＴＮＦレセプタがアポトーシスシグナル及び非アポトーシスシグナルを仲介する。
生理学的条件下で、造血再構成能を有する幹細胞及び前駆細胞は、（各種分化段階の）大量の前駆細胞に包埋された非常に少量のフラクションからなる。分化の後期（ｄｉｓｔａｌ）段階では、デスレセプタは、増幅するクローンのサイズを制御する重要な役割を果たす。これらのレセプタは、全ての造血系統において末端分化の負の制御として同定されている（７−１４）。アポトーシスに対するドナー細胞の反応性がないときの、移植後早い段階でデスレセプタの急激な上方制御は、これらのレセプタの役割に疑問を生じさせた。従って、本発明者らは、最小限の刺激条件下で、ＦａｓＬ及びＴＮＦ−αの上昇の分類によって、ｗＢＭＣ及びｌｉｎ−ＢＭＣのクローン原性活性の調節を評価した。ＦａｓＬの濃度が上昇するにつれ、ｗＢＭＣの活性は徐々に抑制され（図８Ａ）、ＴＮＦ−αの存在下では、ｗＢＭＣの活性は大きな影響を受けなかった（図８Ｂ）。これらのデータは、未処理のＢＭＣ中のＴＮＦ−αによってトリガーを引かれるアポトーシスシグナルが欠如していることと一致した（実験１３参照）。著しく対照的に、ｌｉｎ−ＢＭＣのクローン原性活性は、〜５００ｎｇ／ｍｌのＦａｓＬ及びＴＮＦ−α濃度で、各々、４５％及び７０％で、徐々に刺激された。この挙動を、可溶性ＦａｓＬオリゴマーを培地に加えた場合、及び、ビオチン化を介して前記タンパク質を細胞表面に吸着させた場合の双方で観察した（図８Ａ）。ＦａｓＬは、〜１μｇ／ｍｌの閾値濃度でｌｉｎ−ＢＭＣに対して毒性があった。マウス（１７）及びヒトＨＰＳＣ（５，１８）のコロニー形成におけるＦａｓ抗体（Ｊｏ２）を活性化する重要な効果の欠如に関する先の報告と一致し、５ｎｇ／ｍｌ濃度の可溶性スーパーＦａｓＬは、ｌｉｎ−ＢＭＣのクローン原性を低減しなかった。総合すると、これらのデータは、Ｆａｓレセプタ３量体化が成長（増殖）シグナルの伝達に必須であることを示唆する。
【０１８２】
ｗＢＭＣ及びｌｉｎ−ＢＭＣの相対的なクローン原性活性は、細胞のアポトーシス反応性及び非反応性においてＦａｓレセプタを介する、付随する栄養シグナル及びアポトーシスシグナルを示唆する。ｗＢＭＣの培養において、死んだ細胞は、前駆細胞のクローン原性活性を阻害した可能性があった。この可能性を試験するために、アポトーシスしたｗＢＭＣを、５００ｎｇ／ｍｌのＦａｓＬタンパク質とともに、ｌｉｎ−ＢＭＣ培養液に加えた。生存ｌｉｎ−ＢＭＣと、死んだＢＭＣと、が１：１の比率において、ＦａｓＬによって誘導される強化されたクローン原性は消え、このことから、バルク細胞（ｂｕｌｋ  ｃｅｌｌ）の生存能は、コロニー形成に影響を与えることが示唆された。
【０１８３】
さらなるアセスメントを、アポトーシスカスケードの初期ステージ及び後期ステージで行った。ＦａｓＬがＦａｓレセプタへの結合を介して細胞に影響を与えたことを確実にするために、クローン原性アッセイをＦａｓ欠損（ｌｐｒ）マウスから回収した細胞で行った。ｌｐｒ変異は、ｗＢＭＣ及びｌｉｎ−ＢＭＣを、ＦａｓＬタンパク質のアポトーシス効果及び栄養効果の各々に非反応性としたので（図８Ｃ）、このことから、前駆細胞活性の調節は、特に、Ｆａｓレセプタのライゲーションによってなされたことが示唆された。同様にクローン原性の低下は、ＴＮＦ−Ｒ１抗体をブロッキングして細胞培養するときに観察され、このことから、このレセプタは、好ましくは、ＴＮＦ−Ｒ２と比べて栄養に関するシグナル伝達に関与することが示唆された。
【０１８４】
アポトーシス性カスケードの後期段階で、カスパーゼ３及び８は、培養中のアポトーシス死を最小化することを阻害した。カスパーゼ３（ＤＥＶＤ）及び８（ＩＥＴＤ）の阻害は、アポトーシスを低下させ、全てのＦａｓＬ濃度（図８Ｄ）でｗＢＭＣのクローン原性活性を改善した。同一の結果が、ｌｉｎ−ＢＭＣ（図８Ｅ）のクローン原性アッセイの上記カスパーゼの阻害で観察された。ＦａｓＬの非存在下でカスパーゼ阻害剤の添加は、大きくクローン原性に影響を与えなかった。特筆すべきことは、カスパーゼ活性の阻害は、ｌｉｎ−ＢＭＣにおける５００ｎｇ／ｍｌのＦａｓＬの刺激効果を抑制せず、このことから、Ｆａｓを介した屈性（トロピズム）は、カスパーゼ８活性に近いファクタによって仲介されたことが示された。
【０１８５】
エラトリエートされた細胞集団の分析は、これらの細胞に関して予想されかつ既に報告（３４，３５）されているように、ＦａｓＬの存在下にかかわらず、ＬＴＲ細胞（５つのコロニーで１つはカルチャー、４つはヌルカルチャー（ｎｕｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ））のヌルのクローン原性活性を示した。顕著な変動において、ＳＴＲ細胞のクローン原性活性は、致死量を超えた５００ｎｇ／ｍｌ濃度のＦａｓＬタンパク質の存在下で（図８Ｆ）、２６±６％（ｐ＜０．００５）上昇した。ＦａｓＬの１．５μｇ／ｇの濃度は、これらの前駆細胞のクローン原性活性を完全に破壊した。Ｆａｓレセプタによって仲介される栄養シグナルとアポトーシスシグナルとの間の平衡関係を評価するために、共通のエフェクタ、カスパーゼ３（ＤＥＶＤ）の阻害によって、ＦａｓＬのプロクローン原性効果を７５±５％更に上昇した。総合すると、これらのデータは、早期造血再構成細胞（ＳＴＲ）のサブセットが、Ｆａｓレセプタを介してアポトーシスシグナル及び栄養シグナルの双方を受けることを示唆する。
【０１８６】
実験１６
造血性ストレスの間のアポトーシスに対する前駆細胞の耐性
結果
アポトーシスシグナルに対して未処理又は移植した骨髄由来のＨＳＰＣが反応しなかったことで、デスレセプタによって仲介されるメカニズムが、造血性ストレスの条件下で作動したかどうかという疑問を生じさせた。５−フルオロウラシル（５ＦＵ）は毒性があり、前駆細胞の周期を早め、これらの殺傷が、骨髄中の初期造血前駆細胞の同期的な刺激を誘導する。造血前駆細胞を活性化し同期させるために、マウスに、１５０μｇ／ｇの５フルオロウラシル（５ＦＵ）をインジェクションし、これらの骨髄細胞を、１日、３日及び５日後に回収した。５日後、Ｓｃａ−１発現の発生率は、２９±２％に増加し（ｐ＜０．００１、これに対して未処理のＢＭＣでは２±１％）、ｃ−ｋｉｔ発現の発生率は１２±２％に増加し（ｐ＜０．０５、これに対し未処理のＢＭＣでは８±１．５％）、及び、Ｓｃａ−１＋ｃ−ｋｉｔ＋のフラクションは、５±０．９％に上昇した（ｐ＜０．００１、これに対して未処理のＢＭＣでは０．４±０．１）（図９）。これらの変化は、Ｆａｓレセプタの上昇制御、及び、そのリガンド（ｐ＜０．００１）によってなされ（図９Ｂ）、安定状態の条件下で低レベルの上記分子を発現したｌｉｎ−ＢＭＣのフラクションを含む（図９Ｃ）。同様の変化は、より低い大きさで、ＴＮＦ及びＴＲＡＩＬレセプタに関して観察された。この時間で回収した細胞を、１８時間のエクスビボ培養の追加期間で、ＦａｓＬタンパク質を用いてチャレンジした。ｌｉｎ−及びｌｉｎ＋の双方のサブセットは、未処理のマウスから回収したＢＭＣと比べて、ＦａｓＬタンパク質で培養した後、顕著な生存率を示した（図９Ｄ）。Ｆａｓ発現とアポトーシスとの間の関連性を示すために、レセプタは、５ＦＵをインジェクションして１日、３日及び５日後に回収した細胞をエクスビボ培養した後、フローサイトメトリーによって定量化された。Ｆａｓ発現の関数としての部分的な細胞死（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ）の表示は、いくつかの特徴を示した（図９Ｅ−Ｆ）。第１に、Ｆａｓの発現は、５ＦＵ投与後の時間と共に増加した。第２に、エクスビボでＦａｓＬに細胞を暴露すること（図９Ｆ）は、培地で培養された細胞と比較して、レセプタの発現をさらに増大させた（図９Ｅ）。第３に、ほとんどのＦａｓ＋ＢＭＣは、５ＦＵ処理後、ＦａｓＬ誘導アポトーシスに対して反応しなかった。これらのデータは、特にＦａｓなどのデスレセプタが、ストレス条件下で、造血システムの生理学的機能において栄養に関する役割を果たしたことを示唆する。
【０１８７】
考察
ほとんどの体細胞とは異なり、幹細胞は、極端な損傷や炎症条件下で、分化することが必要とされる。特に、損傷した組織の機能特性に分化し、選択する（ａｄｏｐｔ）など、組織修復に加わるための成体幹細胞の多様性能力の必要性は、宿主環境内で生き延び、機能するための細胞能力に疑問を生じさせている。骨髄に厳しい損傷を与える積極的な化学療法及び放射線療法に続く、十分に確立された工程は、造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）の移植である。内在性造血細胞は、骨髄破壊的な放射能をほとんど生き延びることはなく、ストローマは、激しく損傷する。破壊的損傷後、ドナーＨＳＰＣは、宿主骨髄への道をみつけ、骨髄でドナーＨＳＰＣは、シードしグラフトして、免疫造血システムの再構成する。このプロセスで、デスレセプタの急激な上方制御が、ドナー細胞の多くのフラクションで見られた。先行技術は、デスレセプタが、免疫造血システムの分化後期段階のレセプタ阻害機能から採用されたコンセプトとしての造血細胞機能において、有害な役割を果たしていることを示している。これとは逆に、本発明者らは、幹細胞機能におけるデスレセプタのポジティブな役割を発見した。造血再構成細胞が過酷な環境で活躍するメカニズムは、生着効率を向上するのに使用できるので、特別な関心の対象である。
【０１８８】
要約すると、本発明らは、以下のことを明らかにした。
１．デスレセプタは、安定条件下で、骨髄細胞において、低レベルで発現する。これらのレセプタは、移植を含む、刺激された造血系の条件下で、急激に上方制御される。
２．最も初期の幹細胞及び前駆細胞のサブセットは、全てデスレセプタを発現した。
３．造血再構成能を有する前駆細胞において、デスレセプタは、アポトーシスシグナルを仲介しなかった。
４．分化の後期段階及び体細胞において、死を媒介する同様のレセプタは、最も初期の造血幹細胞及び前駆細胞において、栄養シグナルを仲介する。
５．デスシグナルを用いた非幹細胞の除去は、前駆細胞の短期造血再構成能及び幹細胞の長期再構成能に影響を与えなかった。
６．転写レベルでのデスレセプタの発現は、複数の内因性及び外因性因子によって誘導される。これらは、損傷、ストローマとの相互作用、サイクル及び分化に応答した因子の放出を含む。
７．Ｆａｓリガンドの構造的及び強制的発現は、同種免疫（ａｌｌｏｉｍｍｕｎｅ）応答及び非免疫機構を介して、造血細胞の生着を補助する。
８．エクスビボでのデスレセプタの誘導された発現及び活性は、アポトーシスシグナルを介して非幹細胞を除去するのに有効である。
【０１８９】
総合すると、これらのデータは、幹細胞及び前駆細胞におけるＴＮＦスーパーファミリのデスレセプタの明確な活性モードを示す。生理学的条件下で、ＨＳＰＣ活性を誘導するシグナルは、デスレセプタの発現を誘導する。これは、Ｆａｓレセプタを徐々に発現することによってなされた前駆細胞の５ＦＵ同期活性化によって例証された。しかしながら、活性化前駆細胞のプールは、ほとんどＦａｓを介したアポトーシスに反応せず：Ｆａｓ＋細胞のフラクションの３〜４倍の増加は、５日後の大多数の細胞のＦａｓＬ誘導アポトーシスに対する耐性と関連していた。これらのデータは、Ｆａｓが、おそらく骨髄細胞死によって生じた歪んだサイトカイン環境によって、５ＦＵ投与後の早い段階で上方制御され、造血前駆細胞の成長を促進するように作用することを示唆する。Ｆａｓレセプタは、分化の後期段階においてのみ、発達している前駆細胞のプールの負のレギュレータとしての機能が仮定される（７−１４）。
【０１９０】
移植設定において、以下のシナリオは、造血細胞生着の早い段階において、Ｆａｓ／ＦａｓＬシグナル経路の関与が提示される。ドナー細胞が骨髄細胞へのホーミングするとき、炎症環境及びストローマ相互作用は、レセプタ及びリガンドの発現を誘導する。Ｆａｓの発現は、活性を調節する環境因子に応答するようにドナー細胞を変換し、造血細胞の生着に有害ではなく、支援的である。アポトーシスを介したより分化した前駆細胞の除去は、より多くの初期幹細胞及び前駆細胞の生着機会を増加させる。このことは、コミットされた前駆細胞と比較して、ＨＳＰＣの優れたホーミングに役立つ早期エンリッチメントプロセスの継続において、シーディング及び早期生着のプロセス内でＨＳＰＣのエンリッチメント機構と考えられる（１）。Ｆａｓを介したアポトーシス死に対する耐性は、上手く生着したドナー細胞の機能的特徴として発展する。この特徴は、初期前駆細胞に、ＴＮＦスーパーファミリのリガンドを使用した免疫反応に反撃する能力を付与する（３２−３４）。
【０１９１】
ＴＮＦスーパーファミリのデスレセプタの発現は、宿主環境に遭遇するとき、又は、ストレス条件に暴露されるときの、免疫−造血細胞の生理学的応答である。これらの保護因子を付与された幹細胞及び前駆細胞は、この発展的なシステムにおいて重要な要素を維持することを保証する。アポトーシス耐性前駆細胞において、これらのレセプタは、初期前駆細胞が分化及び増殖するのを補助する栄養シグナルに関連する。このメカニズムは、この発生系における最も重要な要素である幹細胞を保護するだけでなく、損傷による過酷な条件化における幹細胞の活性化に関与する。先の研究は、造血前駆細胞が、ＦＬＩＰ、Ｂｃｌ−２、サバイビンを含む高レベルの抗アポトーシス因子、及び、カスパーゼ−８Ｌのユニークな発現によって、アポトーシスから保護されることを示している（５，６）。本データは、栄養シグナル伝達が、カスパーゼ８活性化に近いデスレセプタに関連したアポトーシスシグナルの主な経路からはずれることを示唆している。
【０１９２】
個別の実施例の内容として明確に記載されている本発明の特徴は、組み合わせた単一の実施例として提供できることを理解されたい。逆に、単一の実施例の内容として簡潔に記載された本発明の種々の特徴は、別々に、又は、適宜な副実施例の組み合わせとして提供できる。
【０１９３】
本発明は、特定の実施例の組み合わせて記載されているが、多くの代替、修正及び変形が当業者に明らかなことは明白である。従って、添付の特許請求の範囲の意図及び広い範囲内にある代替、修正及び変形などの全てを含むことが意図される。個々の文献、特許又は特許出願、あるいは、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号を、特別かつ個々に、参照することで、本明細書に組み込まれることが示唆されるように、本明細書に記載された文献、特許及び特許出願、ならびに、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号は、全体を参照することで本明細書に組み込まれる。加えて、本出願におけるいずれの参考文献の引用及び特定も、上記文献が本発明に対する先行技術として入手可能であるというアドミッションとして解釈されるべきではない。
【０１９４】
参考文献
【非特許文献１】Ｙａｎｉｖ  Ｉ，Ｓｔｅｉｎ  Ｊ，Ｆａｒｋａｓ  ＤＬ，Ａｓｋｅｎａｓｙ  Ｎ．Ｔｈｅ  ｔａｌｅ  ｏｆ  ｅａｒｌｙ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｅｅｄｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｎｉｃｈｅ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ＆  Ｄｅｖｅｏｐｍｅｎｔ．２００６；１５：４−１６。
【非特許文献２】Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  Ａ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  ｄｅｃｏｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｕｒ−ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ．Ｎａｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｖ．２００２；２；４２０−４３０。
【非特許文献３】Ａｓｋｅｎａｓｙ  Ｎ，Ｙｏｌｃｕ  ＥＳ，Ｙａｎｉｖ  Ｉ，Ｓｈｉｒｗａｎ  Ｈ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｕｓｉｎｇ  Ｆａｓ  ｌｉｇａｎｄ：ａ  ｄｏｕｂｌｅ−ｅｄｇｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ．Ｂｌｏｏｄ．２００５；１０５：１３９６−１４０４。
【非特許文献４】Ｎｉｈｏ  Ｙ，Ａｓａｎｏ  Ｙ．Ｆａｓ／Ｆａｓ  ｌｉｇａｎｄ  ａｎｄ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ．１９９８；５：１６３−１６５
【非特許文献５】Ｋｉｍ  Ｈ，Ｗｈａｒｔｅｎｂｙ  ＫＡ，Ｇｅｏｒｇａｎｔｓ  ＲＷ  ３ｒｄ，Ｗｉｎｇａｒｄ  Ｊ，Ｃｉｖｉｎ  ＣＩ．Ｈｕｍａｎ  ＣＤ３４＋  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ＦＬＩＰ  ａｎｄ  ａｒｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｔｏ  Ｆａｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２００２；２０：１７４−１８２
【非特許文献６】Ｍｏｈｒ  Ａ，Ｚｗａｃｋａ  ＲＭ，Ｊａｒｍｙ  Ｇ，Ｂｕｎｅｋｅｒ  Ｃ，Ｓｃｈｒｅｚｅｎｍｅｉｅｒ  Ｈ，Ｄｏｈｎｅｒ  Ｋ，Ｂｅｌｔｉｎｇｅｒ  Ｃ，Ｗｉｅｓｎｅｔｈ  Ｍ，Ｄｅｂａｔｉｎ  ＫＭ，Ｓｔａｈｎｋｅ  Ｋ．Ｃａｓｐａｓｅ−８Ｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ＣＤ３４＋  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｌｅｕｋｅｍｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ＣＤ９５−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００５；２４：２４２１−２４２９。
【非特許文献７】Ｂｈａｒｄｗａｊ  Ａ，Ａｇｇａｒｗａｌ  ＢＢ．Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｈｏｒｅｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  ｌｉｆｅ  ａｎｄ  ｄｅａｔｈ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；２３：３１７−３３２。
【非特許文献８】Ｄｅｍｐｓｅｙ  ＰＷ，Ｄｏｙｌｅ  ＳＥ，Ｈｅ  ＪＱ，Ｃｈｅｎｇ  Ｇ．Ｔｈｅ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ａｄａｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  ＴＮＦ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．２００３；１４：１９３−２０９。
【非特許文献９】Ｇｒｅｉｌ  Ｒ，Ａｎｅｔｈｅｒ  Ｇ，Ｊｏｈｒｅｒ  Ｋ，Ｔｉｎｈｏｆｅｒ  Ｉ．Ｔｕｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｈｅｏｓｔａｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｙｅｌｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ  ｖｉａ  Ｆａｓ  ａｎｄ  ＴＲＡＩＬ。Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；２３：３０１−３２２。
【非特許文献１０】Ｇａｕｒ  Ｕ，Ａｇｇａｗａｌ  ＢＢ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｂｙ  ｍｅｍｅｂｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＴＮＦ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００３；６６：１４０３−１４０８。
【非特許文献１１】Ｗａｒｅ  ＣＦ．  Ｔｈｅ  ＴＮＦ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．２００３；１４：１８１−１８４。
【非特許文献１２】Ｄｉ  Ｐｉｅｔｒｏ  Ｒ，Ｚａｕｌｉ  Ｇ．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｎｏｎ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ  （ＴＲＡＩＬ）／Ａｐｏ２Ｌ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００４；２０１：３３１−３４０。
【非特許文献１３】Ｔｅｓｔａ  Ｕ．  Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２００４；１８：１１７６−１１９９。
【非特許文献１４】Ｚａｕｌｉ  Ｇ，Ｓｅｃｃｈｉｅｒｏ  Ｐ．Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬ  ｒｅｃｅｐｔｏｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．２００６；１７：２４５−２５７。
【非特許文献１５】Ｔａｋｅｎａｋａ  Ｋ，Ｎａｇａｆｕｊｉ  Ｋ，Ｈａｒａｄａ  Ｍ，Ｍｉｚｕｎｏ  Ｓ，Ｍｉｙａｍｏｔｏ  Ｔ，Ｍａｋｉｎｏ  Ｓ，Ｇｏｎｄｏ  Ｈ，Ｏｋａｍｕｒａ  Ｔ，Ｎｉｈｏ  Ｙ．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｆａｓ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＣＤ９５）．Ｂｌｏｏｄ．１９９６：８８：２８７１−２８７７。
【非特許文献１６】Ｓｔａｈｎｋｅ  Ｋ，Ｈｅｃｋｅｒ  Ｓ，Ｋｏｈｎｅ  Ｅ，Ｄｅｂａｔｉｎ  ＫＭ．  ＣＤ９５（ＡＰＯ−１／ＦＡＳ）−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．  Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．１９９８；２６：８４４−８５０。
【非特許文献１７】Ｂｒｙｄｅｒ  Ｄ，Ｒａｍｓｆｊｅｌｌ  Ｖ，Ｄｙｂｅｄａｌ  Ｉ，Ｔｈｅｌｉｇａａｒｄ−Ｍｏｎｃｈ  Ｋ，  Ｈｏｇｅｒｋｏｒｐ  ＣＭ，Ａｄｏｌｆｓｓｏｎ  Ｊ，Ｂｏｒｇｅ  ＯＪ，  Ｊａｃｏｂｓｅｎ  ＳＥ．  Ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  Ｆａｓ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２００１；１９４：９４１−９５２。
【非特許文献１８】Ｄｙｂｅｄａｌ  Ｉ，Ｙａｎｇ  Ｌ，Ｂｒｙｄｅｒ  Ｄ，Ａａｓｔｒａｎｄ−Ｇｒｕｎｄｓｔｒｏｍ  Ｉ，Ｌｅａｎｄｅｒｓｓｏｎ  Ｋ，Ｊａｃｏｂｓｅｎ  ＳＥ．  Ｈｕｍａｎ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｎｇ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ。
【非特許文献１９】Ｍａｃｉｅｊｅｗｓｋｉ  ｊ，Ｓｅｌｌｅｒｉ  Ｃ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｓ，Ｙｏｕｎｇ  ＮＳ．Ｆａｓ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｎ  ＣＤ３４＋  ｈｕｍａｎ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇａｍｍａ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｂｌｏｏｄ．１９９５；８５：３１８３−３１９０。
【非特許文献２０】Ｓａｔｏ  Ｔ，Ｓｅｌｌｅｒｉ  Ｃ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｓ，Ｙｏｕｎｇ  ＮＳ，  Ｍａｃｉｅｊｅｗｓｋｉ  ＪＰ．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ，ｔｕｍｏｕｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ，ａｎｄ  Ｆａｓ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ＣＤ３４＋  ｃｅｌｌｓ．Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．  １９９７；９７：３５６−３６５。
【非特許文献２１】１９９８；２６：１２０２−１２０８
【非特許文献２２】Ｙａｎｇ  Ｌ，  Ｄｙｂｅｄａｌ  Ｉ，Ｂｒｙｄｅｒ  Ｄ，Ｎｉｌｓｓｏｎ  Ｌ，Ｓｉｔｎｉｃｋａ  Ｅ，Ｓａｓａｋｉ  Ｙ，Ｊａｃｏｂｓｅｎ  ＳＥ．  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ  ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ  ｏｆ  ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５；１７４：７５２−７５７。
【非特許文献２３】Ｍｏｏｒｅ  ＭＡＳ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｒｒｏｗ  ｈｏｍｉｎｇ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００２；３８：２９−３８。
【非特許文献２４】Ａｇｇａｒｗａｌ  ＢＢ．Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＴＮＦ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ：ａ  ｄｏｕｂｌｅ−ｅｄｇｅｄ  ｓｗｏｒｄ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；３：７４５−７５６。
【非特許文献２５】Ｃｕｒｔｉｎ  ＪＦ，Ｃｏｔｔｅｒ  ＴＧ．Ｌｉｖｅ  ａｎｄ  ｌｅｔ  ｄｉｅ：  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎ  Ｆａｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ．２００３；１５：９８３−９９２．
【非特許文献２６】Ｗａｊａｎｔ  Ｈ，Ｐｆｉｚｅｎｍａｉｅｒ  Ｋ，  Ｓｃｈｅｕｒｉｃｈ  Ｐ．  Ｎｏｎ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  Ｆａｓ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．２００３；１４：５３−６６。
【非特許文献２７】Ｐａｒｋ  ＳＭ，  Ｓｃｈｉｃｋｅｌ  Ｒ，Ｐｅｔｅｒ  ＭＥ．  Ｎｏｎａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＦＡＤＤ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｅａｔｈ  ｒｅｒｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００５；１７：６１０−６。
【非特許文献２８】Ｌｉｕ  Ｂ，Ｂｕｃｋｌｅｙ  ＳＭ，Ｌｅｗｉｓ  ＩＤ，Ｇｏｌｄｍａｎ  ＡＩ，Ｗａｇｎｅｒ  ＪＥ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｏｏ  ＪＣ．  Ｈｏｍｉｎｇ  ｄｅｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＮＯＤ／ＳＣＩＤ  ｍｏｕｓｅ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  Ｆａｓ／ＣＤ９５．Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２００３；３１：８２４−８３２。
【非特許文献２９】Ｂａｒｃｅｎａ  Ａ，Ｍｕｅｎｃｈ  Ｍ，Ｓｏｎｇ  ＫＳ，Ｏｈｋｕｂｏ  Ｔ，Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ＭＲ．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＣＤ９５／Ｆａｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｌｉｇａｎｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ３４＋＋ＣＤ３８−  ｆｅｔａｌ  ｌｉｖｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．１９９９，２７：１４２８−１４３３９．
【非特許文献３０】Ｊｏｓｅｆｓｅｎ  Ｄ，Ｍｙｋｌｅｂｕｓｔ  ＪＨ，Ｌｙｎｃｈ  ＤＨ，Ｓｔｏｋｋｅ  Ｔ，Ｂｌｏｍｈｏｆｆ  ＨＫ，Ｓｍｅｌａｎｄ  ＥＢ．  Ｆａｓ  ｌｉｇａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｉｍｍａｔｕｒｅ  ｈｕｍａｎ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ＣＤ３４＋ＣＤ３８−  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｉｍｍａｔｕｒｅ  ｈｕｍａｎ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ＣＤ３４＋ＣＤ３８−  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．１９９９；２７：１４５１−１４５９。
【非特許文献３１】Ｓａｈｅｋｉ  Ｋ，Ｆｕｊｉｍｏｒｉ  Ｙ，Ｔａｋｅｍｏｔｏ  Ｙ，Ｋａｋｉｓｈｉｔａ  Ｅ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｆａｓ（ＡＰＯ−１，ＣＤ９５）ｏｎ  ＣＤ３４＋  ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｆｔｅｒ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．２０００；１０９：４４７−４５２。
【非特許文献３２】Ｇｕｒ  Ｈ，Ｋｒａｕｔｈｇａｍｅｒ  Ｒ，Ｂａｃｈａｒ−Ｌｕｓｔｉｇ  Ｅ，Ｋａｔｃｈｍａｎ  Ｈ，Ａｒｂｅｌ−Ｇｏｒｅｎ  Ｒ，Ｂｅｒｒｅｂｉ  Ａ，Ｋｌｅｉｎ  Ｔ，Ｎａｇｌｅｒ  Ａ，Ｔａｂｉｌｉｏ  Ａ，Ｍａｒｔｅｌｌｉ  ＭＦ，Ｒｅｉｓｎｅｒ  Ｙ．Ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＣＤ３４＋  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ＴＮＦ−ａｌｐｈａ．Ｂｌｏｏｄ．２００５；１０５：２５８５−２５９３。
【非特許文献３３】Ｗｈａｒｔｅｎｂｙ  ＫＡ，Ｓｔｒａｌｅｙ  ＥＥ，Ｋｉｍ  Ｈ，Ｒａｃｋｅ  Ｆ，Ｔａｎａｖｄｅ  Ｖ，Ｇｏｒｓｋｉ  ＫＳ，Ｃｈｅｎｇ  Ｌ，Ｐａｒｄｏｌｌ  ＤＭ，Ｃｉｖｉｎ  ＣＩ．Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｏｎｏｒ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ−ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  Ｆａｓ  ｌｉｇａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ−ｔｅｒｍ  ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ．２００２；１００：３１４７−３１５４。
【非特許文献３４】Ｐｅａｒｌ−Ｙａｆｅ  Ｍ，Ｙｏｌｃｕ  ＥＳ，  Ｓｔｅｉｎ  Ｊ，Ｋａｐｌａｎ  Ｏ，Ｙａｎｉｖ  Ｉ，Ｓｈｉｒｗａｎ  Ｈ，Ａｓｋｅｎａｓｙ  Ｎ．Ｆａｓ−ｌｉｇａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｂｒｏｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｌｏｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２００７；ｉｎ  ｐｒｅｓｓ。
【非特許文献３５】Ｂｏｈａｎａ−Ｋａｓｈｔａｎ  Ｏ，Ｃｉｖｉｎ  ＣＩ．Ｆａｓ  ｌｉｇａｎｄ  ａｓ  ａ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２００４；２２：９０８−９２４。３６．Ｐｅａｒｌ−Ｙａｆｅ  Ｍ，Ｙｏｌｃｕ  ＥＳ，Ｙａｎｉｖ  Ｉ，Ｓｔｅｉｎ  Ｊ，Ｓｈｉｒｗａｎ  Ｈ，Ａｓｋｅｎａｓｙ  Ｎ．  Ｔｈｅ  ｄｕａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｆａｓ−ｌｉｇａｎｄ  ａｓ  ａｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｄｅｆｅｎｓｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｉｎ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ａｎｄ  ｉｓｌｅｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｂｉｏａｓｓａｙｓ．２００６；２８：２１１−２２２。
【図面の簡単な説明】
【０１９５】
発明は、例示のみを目的として、添付の図面に関して本明細書に記載される。ここで、図面の詳細に関し、示される細部は、例示のみを目的として、かつ本発明の好適な実施例の例示的な議論の目的であり、最も利用可能であり、法則の記載に容易に理解される。この点に関し、本発明の本発明の構造的詳細を示す。
【図１Ａ】図１Ａ−Ｈは、同系造血細胞生着中のＦａｓ／ＦａｓＬの相互作用の機能的関与を示す。図１Ａでは、骨髄芽球（９５０ｒａｄ）ＧＦＰマウス（ＣＤ４５．２＋ＧＦＰ＋）を、５×１０５の同系ワイルドタイプ（ＣＤ４５．１＋ＧＦＰ−）と、Ｆａｓ欠損（ｌｐｒ）ドナー（ＣＤ４５．２＋ＧＦＰ−）と、のｌｉｎ−ＢＭＣ１：１混合液を用いて移植した。造血キメラを移植して３週間後、末梢血で測定し、ワイルドタイプ（ＣＤ４５．１）及びｌｐｒ（ＣＤ４５．２）ドナー細胞（ＧＦＰ−）生着（ｎ＝１６）を比較した。
【図１Ｂ】照射された（８５０ｒａｄ）レシピエント内への５×１０５ｌｉｎ−ＢＭＣの同系移植（ＣＤ４５．１→ＣＤ４５．２）。ｌｐｒ細胞をワイルドタイプ（ｗｔ）のレシピエント（ｎ＝８）に移植し、ｗｔ細胞をｌｐｒレシピエント（ｎ＝１０）に移植したとき、３週間での生着は不十分だった。
【図１Ｃ】ｗｔレシピエント（ｎ＝８）のｇｌｄ細胞及びｇｌｄレシピエント（ｎ＝１１）のｗｔ細胞の不十分な生着は、ビオチン標識（ｎ＝９）を介してドナー表面の異所的なＦａｓＬタンパク質の発現によって、効率的にリバースした。
【図１Ｄ】ＦａｓＬタンパク質でコーティングされたｗｔ細胞の同系移植から３週間後の抹消血キメリズム中に実証される差異。
【図１Ｅ】同系ｌｐｒレシピエント内に移植された（ＣＤ４５．１→ＣＤ４５．２）５×１０５ｌｉｎ−ＢＭＣ中のＦａｓＬの発現は、３週間での生着（ｎ＝６）における有意な効果を有しなかった。
【図１Ｆ】ＧＦＰドナーから１０７ＢＭＣの全てを骨髄破壊ｌｐｒレシピエント内に移植した結果、移植後６週間で骨髄中はフルドナー（ＧＦＰ＋）キメリズムとなる。
【図１Ｇ】ＧＦＰ／ｌｐｒキメラのストローマ培養は、ＣＤ４５＋及びＣＤ１１ｃ＋細胞をゲートアウトした後、宿主ｌｐｒ（ＧＦＰ−）表現型が優性となった。このデータは、５匹の移植マウスからの培養系を示している。
【図１Ｈ】同系ＣＤ４５．１マウス（ｎ＝６）からの、未処理及びＦａｓＬコーティングｌｉｎ−ＢＭＣのレシピエントとして用いたフルＧＦＰ／ｌｐｒキメラ（Ｆａｓ＋ＧＦＰ＋ＢＭＣ及びＦａｓ−ＧＦＰ−ストローマ）。キメリズムは、ｌｐｒマウスの移植と同様に、ＦａｓＬ発現によって影響されず、これは、ストローマは、ドナー細胞ＦａｓＬによってターゲティングされたことを示唆する。
【図２Ａ】図２Ａ−Ｇは、ＦａｓＬタンパク質の異所的発現が同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）生着を改善することを示している。図２Ａでは、照射条件下の同種異系（Ｈ２Ｋｄ→Ｈ２Ｋｂ）レシピエント（８５０ｒａｄ）を、ＦａｓＬタンパク質でコーティングした１０６ｌｉｎ−ＢＭＣ又は脾細胞、及び、未処理の２×１０６ｌｉｎ−ＢＭＣで移植したコントロール群（ｎ＝５）と併せて、未処理の１０６ｌｉｎ−ＢＭＣをインジェクションした。ドナーキメリズムの濃度を、移植して３週間後に末梢血で測定した。
【図２Ｂ】ストレプタビジン−ＦａｓＬキメラタンパク質は、ビオチンを介してＢＭＣ表面で効果的に吸着された。このタンパク質は、フローサイトメトリ中で抗ＦａｓＬモノクロナール抗体で検出した。
【図２Ｃ】異所的ＦａｓＬタンパク質の発現は、ほとんど致死量に近い放射能（８５０ｒａｄ）を与えたレシピエント（Ｂ６＝Ｈ２Ｋｂ）に移植された同種異系細胞の生着を改善した。
【図２Ｄ】未処理及びＦａｓＬコーティングｌｉｎ−ＢＭＣで移植されたマウスを処理して、移植後１６週で、フルキメリズムに発達した（ｎ＝１６）。
【図２Ｅ】主な移植（Ｈ２Ｋｄ→Ｈ２Ｋｂ）後１４週で、第２の致死量近くを照射された（Ｈ２Ｋｂ）宿主（ｎ＝５）に対してｗＢＭＣのドナーとして用いたキメラマウス。
【図２Ｆ】８×１０６の未処理又はＦａｓＬコーティング同種異系ｌｉｎ−ＢＭＣ（Ｈ２Ｋｄ）をインジェクションしたＢ６マウス（Ｈ２Ｋｂ）の脾細胞を、移植して７日後に５−ｄａｙＭＬＲアッセイで評価した（ｎ＝６）。Ｂ１０．ＢＲマウス（Ｈ２Ｋｋ）の脾細胞を、第三の抗原群として用いた。
【図２Ｇ】８×１０６の未処理又はＦａｓＬコーティングの同種異系脾細胞（Ｈ２Ｋｄ→Ｈ２Ｋｂ）をインジェクションしたマウスの脾臓を、ＭＬＲ（ｎ＝５）で評価した。
【図３Ａ】図３Ａ−Ｈは、骨髄にホーミングするドナー細胞中のデスレセプタの発現を示す。図３Ａでは、全ＢＭＣは、低濃度のＴＮＦファミリーのデスレセプタを発現し、一方、３０％以下のｌｉｎ−ＢＭＣが、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２に対してポジティブである。
【図３Ｂ】残りの骨髄細胞は、細胞移植（ｎ＝５）に関係なく、全身照射（８５０ｒａｄ）後、低濃度のデスレセプタを発現する。
【図３Ｃ】Ｆａｓ、ＴＮＦ−Ｒ１及びＴＮＦ−Ｒ２は、照射した同系宿主の骨髄へと適切に返すドナー細胞中で顕著に上方制御された。データは、移植した４８時間後（ｎ＝５）での発現の平均値±ＳＤ（標準偏差）を示している。
【図３Ｄ】デスレセプタの発現は、移植（ｎ＝４）後、第１日の間でドナー細胞中で連続的に増加した。
【図３Ｅ】ＣＦＳＥでプレラベルされたＬｉｎ−ＢＭＣ（＞９０％純粋）を照射された同系レシピエント（８５０ｒａｄ  ＴＢＩ）内に移植し、骨髄ホーミング細胞を、ＣＦＳＥ希釈（ｎ＝７）に対して４８時間後に分析した。ＣＦＳＥ希釈（ＣＦＳＥｄｉｍ）によって決定されるとき、約２５％の細胞のサイクルが早くなる。
【図３Ｆ】サイクルの早い細胞（ＣＦＳＥｂｒｉｇｈｔ）のより小さなフラクション中で発現する場合、デスレセプタは、サイクルの早い細胞（ＣＦＳＥｄｉｍ）で主に上方制御された（ｎ＝５）。
【図３Ｇ】移植して４８時間以内に系統マーカを発現したドナーｌｉｎ−ＢＭＣの約５分の１は、早期分化を示した（ｎ＝１１）。
【図３Ｈ】早期分化細胞において（ｎ＝８）、主にデスレセプタを上方制御した。
【図４Ａ】図４Ａ−Ｇは、Ｆａｓレセプタ及びリガンドの動的発現を示している。図４Ａでは、８５０ｒａｄ全身照射（ＴＢＩ）の条件下のマウスに、１〜２×１０７の同種異系ｌｉｎ−ＢＭＣ（Ｈ２Ｋｄ→Ｈ２Ｋｂ）をインジェクションした。４８時間後、レシピエントマウスの骨髄を回収し、ドナー−宿主由来の発現、及び、系統マーカー発現に関して、Ｆａｓ及びＦａｓＬの発現を測定した（ｎ＝８）。
【図４Ｂ】Ｆａｓ及びＦａｓＬを同一ドナー細胞で同時に発現させた。実証的な読み取りは、複数の実験（ｎ＝２９）の特徴である。
【図４Ｃ】未処理のｌｉｎ−及び全ての（ｗ）ＢＭＣを、Ｆａｓ及びＦａｓＬをエンコードするｍＲＮＡの存在下で、ＲＴ−ＰＣＴでアッセイした。データは、同様の結果を示す３回の独立した実験を示す。
【図４Ｄ】図４Ｄでは、Ｆａｓ及びＦａｓＬの発現のパターンは、ｌｉｎ−ＢＭＣを照射マウス（８５０ｒａｄＴＢＩ）で（Ｄ）骨髄に同系移植した後、フローサイトメトリーで判定し、これとともに骨髄組織の柔組織細胞中の上記分子が発現していた（ｎ＝５）。
【図４Ｅ】図４Ｅでは、Ｆａｓ及びＦａｓＬの発現のパターンは、ｌｉｎ−ＢＭＣを照射マウス（８５０ｒａｄＴＢＩ）で（Ｅ）肺に同系移植した後、フローサイトメトリーで判定し、これとともに肺組織の柔組織細胞中の上記分子が発現していた（ｎ＝５）。
【図４Ｆ】図４Ｆでは、Ｆａｓ及びＦａｓＬの発現のパターンは、ｌｉｎ−ＢＭＣを照射マウス（８５０ｒａｄＴＢＩ）で（Ｆ）脾臓に同系移植した後、フローサイトメトリーで判定し、これとともに脾臓組織の柔組織細胞中の上記分子が発現していた（ｎ＝５）。
【図４Ｇ】図４Ｇでは、Ｆａｓ及びＦａｓＬの発現のパターンは、ｌｉｎ−ＢＭＣを照射マウス（８５０ｒａｄＴＢＩ）で（Ｇ）肝臓に同系移植した後、フローサイトメトリーで判定し、これとともに肝臓組織の柔組織細胞中の上記分子が発現していた（ｎ＝５）。
【図５Ａ】図５Ａ−Ｈは、造血幹細胞及び前駆細胞中のデスレセプタの発現を示している。図５Ａでは、骨髄ホーミング細胞を、ＣＦＳＥ＋ｌｉｎ−ＢＭＣ（ｎ＝８）を同系移植して２日及び６日後にＨＳＰＣマーカー（Ａ）Ｓｃａ−１に関するデスレセプタの発現を分析した。ＨＳＰＣマーカーの発現は、デスレセプタに対してポジティブなフラクションとして発現した。
【図５Ｂ】骨髄ホーミング細胞を、ＣＦＳＥ＋ｌｉｎ−ＢＭＣ（ｎ＝８）を同系移植して２日及び６日後にＨＳＰＣマーカー（Ｂ）ｃ−ｋｉｔに関するデスレセプタの発現を分析した。ＨＳＰＣマーカーの発現は、デスレセプタに対してポジティブなフラクションとして発現した。
【図５Ｃ】照射された同系宿主の骨髄にホーミングし、ｌｉｎ−Ｓｃａ−１＋ｃ−ｋｉｔ＋として規定される造血ＨＳＰＣ候補の全ては、デスレセプタを発現する（ｎ＝８）。
【図５Ｄ】ｌｉｎ−Ｓｃａ−１＋ｃ−ｋｉｔ＋ＨＳＰＣ中のＴＮＦ−Ｒ１発現の実証的な読み取り。
【図５Ｅ】Ｆａｓの発現が３０％以下のｃ−ｋｉｔ＋細胞で見られるとき、ＦａｓＬは、このサブセットのほとんど、ならびに、実質的にｌｉｎ−Ｓｃａ−１＋及びｌｉｎ−Ｓｃａ−１＋ｃ−ｋｉｔ＋で発現した（ｎ＝７）。
【図５Ｆ】骨髄にホーミングするＣＦＳＥ＋ｌｉｎ−細胞のＳｃａ−１＋及びｃ−ｋｉｔ＋サブセット中のＦａｓ発現の実証的な読み取り。
【図５Ｇ】小さな寸法の細胞を、２５ｍｌ／ｍｉｎの流量で、カウンターフローエラトリエーションによって単離し、系統マーカーの発現を分析し、系統除去を行い、Ｆｒ２５ｌｉｎ−細胞（ＬＴＲ）の＞９０％の系統陰性サブセットを得た。このデータは、７つの独立した実験を示す。
【図５Ｈ】ロータオフ位置で、ＳＴＲ細胞をエラトリエーションの後に回収した。ＬＴＲ及びＳＴＲ細胞を照射した同系宿主に移植し（ＣＤ４５．２→ＣＤ４５．１）、Ｆａｓ及びＦａｓＬ発現を分析するために２日後に回収した。このデータは、５つの独立した実験の手段を意味する。
【図６Ａ】図６Ａ−Ｈは、アポトーシスに対する造血再構成細胞の耐性を示す。骨髄ホーミング細胞を同系移植（ＣＤ４５．１→ＣＤ４５．２）して２日後に回収し、１８時間、ＦａｓＬタンパク質（２５０ｎｇ／ｍｌ）でアポトーシスチャレンジに暴露した（ｎ＝６）。ドナー及び宿主由来の細胞を、系統マーカーの発現と同時に、デス（７ＡＡＤ）及びアポトーシス（アネキシン−Ｖ）で判定した。細胞をコントロールとして使用される（ＦａｓＬフリー）培地で培養した。
【図６Ｂ】アポトーシス死（アネキシン−Ｖ）を、ドナー細胞（ｎ＝５）のゲーティングによって、系統陰性（ｌｉｎ−）及び系統陽性（ｌｉｎ＋）マーカーのＦａｓレセプタ発現に関して測定した。
【図６Ｃ】エラトリエートして、２日目の骨髄ホーミングしたＦｒ２５ｌｉｎ−（ＬＴＲ）及びＳＴＲ細胞を培養し、インビトロで１８時間、２５０ｎｇ／ｍｌのＦａｓＬタンパク質でチャレンジした（ｎ＝５）。
【図６Ｄ】３つの独立した実験において、アポトーシス死を２日目のＦａｓ発現に関して測定した。
【図６Ｅ】インビトロで２５０ｎｇ／ｍｌのＦａｓＬタンパク質のアポトーシスチャレンジに暴露した後、アポトーシス死をＦａｓ、ＴＮＦ及びＴＲＡＩＬレセプタにポジティブな２日目の骨髄ホーミング細胞で判定した。
【図６Ｆ】致死量に近い照射された（８５０ｒａｄ）レシピエントに、フレッシュで（ｆｒｅｓｈ）（ｎ＝１０）又はＦａｓＬタンパクで２４時間前培養した後、５×１０５同系細胞を移植した（ＣＤ４５．１→ＣＤ４５．２）。キメリズムを、３週間後、フローサイトメトリによって臍帯血リンパ球で判定した。
【図６Ｇ】ＦａｓＬタンパク質での前培養は、長期及び短期生着に影響を与えなかった（ｎ＝８）。
【図６Ｈ】骨髄破壊的な（９５０ｒａｄ）マウスの生存したものに、同系（ＣＤ４５．２→ＣＤ４５．１）及び同種異系（Ｈ２ｋｂ→Ｈ２ｋｄ）ドナー（ｎ＝２０）から、１．５×１０５の未処理のＢＭＣ及びＦａｓＬで前処理したＢＭＣを移植した。
【図７Ａ】Ｆａｓを介した造血幹細胞の反応性を示す。５×１０６細胞／ｍｌをＳｔｅｍＰｒｏ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５０μＭ  ２βメルカプトエタノールを加えたα−ＭＥＭ培地で、可変期間培養した。全ＢＭＣは、２５０ｎｇ／ｍｌのＦａｓＬタンパク質を用いて、又は用いないで、２４時間培養した。細胞死及びアポトーシスを、７ＡＡＤ及びアネキシンＶの各々の取り込みによって判定し、系統マーカーが抗体カクテルを用いて判定した。これらのデータは、５つの独立した実験から集計する。
【図７Ｂ】２５０ｎｇ／ｍｌのＦａｓＬタンパク質を用いた培養に応答したアポトーシスを受けＢＭＣ系統の分析は、系統陽性ＢＭＣ：顆粒球（ＧＲ−１）、マクロファージ（Ｍａｃ−１）、Ｂリンパ球（Ｂ２２０）及びＴリンパ球（ＣＤ５）、の主なサブセットのほとんどがアポトーシスに対して反応することを明らかにした。これらのデータは、６つの独立した実験の全体のｗＢＭＣ集団に対する数値を示す。
【図７Ｃ】２５０ｎｇ／ｍｌのＦａｓＬタンパク質を用いて、又は用いないで培養した後、未処理の全ＢＭＣ内の系統マーカー発現（ｌｉｎ−及びｌｉｎ＋）に関してＦａｓレセプタの発現の関数として、アポトーシス細胞（アネキシン＋）及び生存可能細胞（アネキシン−）を判定した。水平バーは、培養開始点のＦａｓ発現を表す。
【図７Ｄ】Ｌｉｎ−ＢＭＣを、１０ｎｇ／ｍｌの幹細胞ファクタ（ＳＣＦ）を添加して、又は添加しないで２４時間培養した。アポトーシス（アネキシン＋）及びバイアビリティ（生存能力）（アネキシン−）を、Ｆａｓレセプタ発現に関して測定した（ｎ＝３独立培養）。
【図７Ｅ】図７Ｅ〜Ｊでは、１０７全ＢＭＣを、５０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（ＴＮＦ）を添加した培地で３日間培養し、最終日に、２５０ｎｇ／ｍｌのＦａｓＬタンパク質（ＦａｓＬ）及びこれらの組み合わせ（ＴＮＦ＋ＦａｓＬ）を加えた。アポトーシスを、Ｆａｓ及びＴＮＦレセプタ（ｎ＝４独立培養）の発現に関してアネキシンを取り込みによって判定した。図７Ｅは、培地培養後のｌｉｎ−及びｌｉｎ＋生存細胞の割合。
【図７Ｆ】培地で培養されたレセプタ陽性細胞のアポトーシスの割合。
【図７Ｇ】ＳＣＦ及びＴＰＯを添加された培地で培養した後のｌｉｎ−及びｌｉｎ＋の生存細胞数。
【図７Ｈ】ＳＣＦ及びＴＰＯで培養したレセプタ−ポジティブ細胞のアポトーシス割合。
【図７Ｉ】ＳＣＦ、ＴＰＯ及びインターロイキン（ＩＬ）−３を添加した培地での培養後のｌｉｎ−及びｌｉｎ＋生存細胞数。
【図７Ｊ】ＳＣＦ、ＴＰＯ及びインターロイキン−３を添加したレセプタ−ポジティブ細胞のアポトーシス割合。
【図７Ｋ】培地中、及び、ＳＣＦ、ＴＰＯ及びＩＬ−３（ｎ＝３独立培養）を添加した培地中で５日間培養した後、ｌｉｎ−細胞の割合の増加。
【図８Ａ】図８Ａ〜Ｆは、デスレセプタの栄養性機能及びアポトーシス機能を例示する。３×１０４細胞を、Ｉｓｃｏｖｅ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）中で、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％胎児血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１ｍＭの２βメルカプトエタノール、１０μ／ｍｌの組み替えヒトエリスロポイエチン（ＥＰＯ）、２０ｎｇ／ｍｌの組み替えマウス（ｒｍ）幹細胞ファクタ（ＳＣＦ）、１０ｎｇ／ｍｌのｒｍインターロイキン３（ＩＬ−３）、及び、１０ｎｇ／ｍｌの顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ｒｍＧＭ−ＣＳＦ）を含む、１．２％メチルセルロースを播種した。図８Ａでは、半固体メチルセルロース培養で、ＦａｓＬオリゴマを用いた全ＢＭＣ（ｗＢＭＣ）及びｌｉｎ−ＢＭＣの培養は、ｌｉｎ−ＢＭＣのクローン原性活性の投与量関連増分（インクリメント）となった。高タンパク質濃度（＞１μｇ／ｍｌ）での、クローン原性活性における突然の崩壊は、全ＢＭＣで観察されたものと似ている。
【図８Ｂ】同一の培養条件下で、高濃度（＞２５０ｎｇ／ｍｌ）ＴＮＦαは、ｗＢＭＣ（ｎ＝５）の活性に影響を与えずにｌｉｎ−ＢＭＣの活性を刺激した。
【図８Ｃ】Ｆａｓ欠損（ｌｐｒ）マウスからのｗＢＭＣ及びｌｉｎ−ＢＭＣのクローン原性活性及び死は、ＦａｓＬタンパク質（ｎ＝５）の存在下で、反応しなかった。
【図８Ｄ】Ｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋを有するカスパーゼ３、及び、Ｚ−ＩＥＴＤ−ｆｍｋを有するカスパーゼ８の阻害は、全ＢＭＣのクローン原性活性を回復させた（ｎ＝５）。
【図８Ｅ】カスパーゼ−３阻害（ＤＥＶＤ）は、ｌｉｎ−ＢＭＣ中の５００ｎｇ／ｍｌのＦａｓＬタンパク質によって誘導された増大されたクローン原性に影響を与えず、毒性タンパク質濃度でアポトーシス死を低減した。
【図８Ｆ】カスパーゼ３阻害（ＤＥＶＤ）は、エラトリエーションによって単離された短期再増殖細胞（ＳＴＣ）のクローン原性を顕著に増大した（ｎ＝５）。
【図９Ａ】図９Ａ〜Ｆは、５ＦＵ誘導ストレス造血下で、デスレセプタの機能を示している。マウスを１０μｇ／ｇの５ＦＵをインジェクションし、骨髄細胞を、１日、３日及び５日後（ｎ＝６）に分析用に回収した。図９Ａは、候補マウスＨＳＰＣのＳｃａ−１及びｃ−ｋｉｔの細胞表面マーカーの発現を示す。
【図９Ｂ】Ｆａｓ及びＦａｓＬの発現
【図９Ｃ】未処理のＢＭＣ及び５ＦＵ投与後５日目の細胞における系統マーカー発現に関するＦａｓ及びＦａｓＬの発現
【図９Ｄ】未処理のＢＭＣ、及び、５ＦＵを投与して５日後に回収した細胞を、ＳｔｅｍＰｒｏ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０μＭの２βメルカプトエタノールを添加したαＭＥＭ培地で２４時間培養し、２５０ｎｇ／ｍｌのＦａｓＬタンパク質でチャレンジした。アポトーシスを、系統マーカー発現に関してアネキシンＶの取り込みによって判定した（ｎ＝５）。
【図９Ｅ】５ＦＵを投与して１日、３日及び５日後に回収したＢＭＣを、Ｆａｓ＋細胞のフラクション内で、生存（アネキシン−）及びアポトーシス（アネキシン＋）を判定するために培地で２４時間培養した。同一条件下で培養した細胞を、２５０ｎｇ／ｍｌのＦａｓＬタンパク質でアポトーシスチャレンジした。
【図９Ｆ】５匹のマウスからのデータを集計して、アポトーシス（アネキシン＋）をＦａｓレセプタ発現に対しプロットした。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図７Ｉ】
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【図７Ｊ】
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【図７Ｋ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【国際調査報告】
2009538615.tif 000071
2009538615.tif 000072
2009538615.tif 000073