(57)【要約】組換えタンパク質、ポリペプチド、又はそのフラグメントの発現のためのレンチベクターコンストラクト及びそれらを作製する方法を説明する。レンチベクターは、通常、第１及び第２のタンパク質又はポリペプチドコード配列の間に自己プロセシング開裂配列を有し、単一のプロモーターの操作制御下で機能タンパク質又はポリペプチドの発現を可能にし、更には、発現したタンパク質又はポリペプチドから自己プロセシング開裂配列を除去する手段を提供する更なるタンパク質開裂配列も含む場合がある。ベクターコンストラクトは、免疫グロブリン又はそのフラグメント等の生物活性を有するタンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおける産生の向上に関連する方法に有用性を見出す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え免疫グロブリンの発現のためのレンチベクターであって、
５’から３’方向に、免疫グロブリン分子又はそのフラグメントの第１の鎖のコード配列に操作可能に結合するプロモーター；更なるタンパク質分解性開裂部位；自己プロセシング開裂部位をコードする配列；及び免疫グロブリン分子又はそのフラグメントの第２の鎖のコード配列を含み、該自己プロセシング開裂部位をコードする該配列が、前記免疫グロブリン分子の該第１の鎖の該コード配列と該第２の鎖の該コード配列の間に挿入される、レンチベクター。
【請求項２】
該自己プロセシング開裂部位をコードする該配列が２Ａ配列を含む、請求項１に記載のレンチベクター。
【請求項３】
該２Ａ配列が口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）配列である、請求項１又は２に記載のレンチベクター。
【請求項４】
該２Ａ配列が、アミノ酸残基
【化１】
2009502134.tif 000015
を含むオリゴペプチドをコードする、請求項３に記載のレンチベクター。
【請求項５】
前記免疫グロブリン分子又はそのフラグメントの該第１の鎖の該コート配列が、免疫グロブリン重鎖又は軽鎖をコードする、請求項１〜４の何れか１項に記載のレンチベクター。
【請求項６】
該コード配列が全長コード配列である、請求項５に記載のレンチベクター。
【請求項７】
前記更なるタンパク質分解性開裂部位が、共通配列ＲＫＲＲ（配列番号１５）を有するフューリン開裂部位である、請求項１〜６の何れか１項に記載のレンチベクター。
【請求項８】
該プロモーターが、伸長因子１−αプロモーター（ＥＦ１ａ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１プロモーター（ＰＧＫ）、サイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ）、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、サイトメガロウイルスエンハンサー／トリβアクチンプロモーター（ＣＡＧ）、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＭＮＤプロモーター、サルウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）、及びＣＫ６プロモーターからなる群から選択される、請求項１〜７の何れか１項に記載のレンチベクター。
【請求項９】
前記プロモーターが、ＣＡＧハイブリッドプロモーター／エンハンサーである、請求項８に記載のレンチベクター。
【請求項１０】
前記プロモーターが、ＣＭＶプロモーター／エンハンサーである、請求項８に記載のレンチベクター。
【請求項１１】
更にシグナル配列を含む、請求項１〜１０の何れか１項に記載のレンチベクター。
【請求項１２】
前記重鎖及び軽鎖の免疫グロブリンコード配列が、実質的に等モル比で発現される、請求項１〜１１の何れか１項に記載のレンチベクター。
【請求項１３】
前記レンチベクターが、免疫グロブリン分子の第１の鎖の該コード配列に操作可能に結合するＣＡＧプロモーター；自己プロセシング開裂部位をコードする配列；及び免疫グロブリン分子の第２の鎖の該コード配列を含み、前記自己プロセシング開裂部位をコードする該配列が、前記免疫グロブリン分子の該第１の鎖の該コード配列と該第２の鎖の該コード配列の間に挿入される、請求項９に記載のレンチベクター。
【請求項１４】
請求項１〜１３の何れか１項に記載のベクターで形質導入されるプロデューサー細胞。
【請求項１５】
請求項１〜１３の何れか１項に記載のレンチベクターに感染させたプロデューサー細胞によって産生される組換え免疫グロブリン分子。
【請求項１６】
組換え免疫グロブリン分子を産生する方法であって、以下の工程：
宿主細胞に請求項１〜１３の何れか１項に記載のレンチベクターを形質導入する工程；
前記形質導入された宿主細胞で前記組換え免疫グロブリンを発現させる工程
を含み、
前記第１の免疫グロブリンコード配列及び前記第２の免疫グロブリンコード配列が同一の宿主細胞から発現される、方法。
【請求項１７】
前記発現された免疫グロブリンをカルボキシペプチダーゼで処置する工程を更に含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記宿主細胞が、ＣＨＯＤ−細胞、ＰＥＲＣ６細胞、及びＨｕＨ７細胞からなる群から選択される、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
組換え免疫グロブリン分子を産生する方法であって、以下の工程：
第１の及び少なくとも第２のレンチウイルスを提供する工程；
プロデューサー細胞を、免疫グロブリン分子又はそのフラグメントの第１の鎖のコード配列に操作可能に結合するプロモーターを含む第１のレンチウイルスに、及び免疫グロブリン分子又はそのフラグメントの第２の鎖のコード配列に操作可能に結合するプロモーターを含む少なくとも第２のレンチウイルスに複数回感染させる工程；及び
前記感染させた宿主プロデューサー細胞において組換え免疫グロブリンを発現させる工程
を含む、方法。
【請求項２０】
前記レンチベクターが、伸長因子１−αプロモーター（ＥＦ１ａ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１プロモーター（ＰＧＫ）、サイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ）、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、サイトメガロウイルスエンハンサー／トリβアクチンプロモーター（ＣＡＧ）、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）、サルウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）、及びＣＫ６プロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記プルモーターがＣＡＧプロモーターである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記プロモーターがＣＭＶプロモーターである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記宿主細胞が、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、２９３細胞、ＰＥＲＣ６、ＨｕＨ７、ＮＳＯ細胞、３Ｔ３線維芽細胞、Ｗ１３８細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＰＧ２細胞、ＤＵＸ細胞、及びＭＤＣＫ細胞からなる群から選択される、請求項１９〜２２の何れか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記全長組換え免疫グロブリンが、少なくとも３ヶ月間、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０、６０、７０、８０、９０、及び１００ｐｇ／細胞／日を超える群から選択されるレベルで発現される、請求項１９〜２３の何れか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記全長組換え免疫グロブリンが、少なくとも３ヶ月間、２０ｐｇ／細胞／日を超えるレベルで発現される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記全長組換え免疫グロブリンが、前記形質導入後１ヶ月以内に、２０ｐｇ／細胞／日を超えるレベルで発現されるプロデューサー細胞のクローンが選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記全長組換え免疫グロブリンが、前記形質導入後２ヶ月以内に、２０ｐｇ／細胞／日を超えるレベルで発現されるプロデューサー細胞のクローンが選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
組換え免疫グロブリンを産生する方法であって、プロデューサー細胞を、請求項１〜１３の何れか１項に記載の組換えレンチウイルスを用いて少なくとも４回感染させることを含み、前記組換え免疫グロブリンが２０ｐｇ／細胞／日を超えるレベルで発現される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００５年７月１９日に出願された米国仮特許出願第６０／７００，２９８号の優先権の利益を主張する。その優先権出願は、その全体が本明細書中に参考として明確に援用される。
（発明の分野）
本発明は、組換え全長タンパク質又はそのフラグメントを発現させるために設計された新規のレンチベクターコンストラクトに関する。レンチコンストラクトは、細胞若しくは器官による異種タンパク質コード配列のｅｘ  ｖｉｖｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏにおける発現に、又はレンチベクターにより形質導入される細胞による組換えタンパク質の産生のためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用される場合がある。
【背景技術】
【０００２】
（技術背景）
治療法としての組換えタンパク質は、近年益々多くの利用法が見出されてきている。組換えタンパク質に基づく治療法は、数多くが種々の臨床開発段階にある。組換えタンパク質技術の広範な臨床応用を制限している１つの要因は、機能的なヘテロ二量体分子を産生する適切な翻訳後プロセシングにより適切な比率でドメインが発現されるように、複数のコード配列又はドメインを含むタンパク質を産生するのが難しい点である。更なる制限要因には、臨床応用に適当なレベルのタンパク質を生成する能力には費用がかかる点である。
【０００３】
モノクローナル抗体は、癌及びその他の疾患のための有効な治療学として証明されてきた。現在の抗体治療は、反復投与及び長期治療計画に関与することが多く、それらは、一貫性のない血清レベル、頻繁に高いコストでの再投与が必要となるような投与毎の有効性の限られた期間等、幾つかの不利点に関連する。診断ツール及び治療法としての抗体の使用も、近年更なる使用法が見出されてきた。抗体技術の広範な臨床応用に対する１つの制限は、通常は、治療効果に大量の抗体が必要であり、及び生成に関連するコストが大きいことである。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＳＰ２０及びＮＳＯ２骨髄腫細胞は、抗体等のグリコシル化ヒトタンパク質の商業規模生産で最も一般的に使用される哺乳動物細胞系である。哺乳動物細胞系産生から得られる収率は、一般的に、バッチ発酵槽内の５〜７日培養に関しては５０〜２５０ｍｇ／Ｌ、又は流加培養法での７〜１２日培養に関しては３００〜１０００ｍｇ／Ｌの範囲である。
高レベル生成は、遺伝子増殖及び優良クローンの選択に依存することが多く、それは、多大な時間を必要とし、更に開発及び生成のコストを増大させる。更に、抗体産生細胞系に関する安定性の問題は、複数の継代の後で明らかになることが多い。
【０００４】
組換えＤＮＡ技術による複数のドメイン又は鎖（従って、複数のコード配列又はオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ））を有する全長組換えタンパク質を発現させるこれまでの試みは、ある程度の成果は収めたものの、一般的にはタンパク質又はポリペプチドの２つのドメイン又は鎖の発現レベルが一貫せず、更に重要なことに、第２のコード配列の発現レベルが低下する結果となった。複数のドメインを有する完全に機能的な及び生物活性を有するタンパク質又はポリペプチドの最適な発現を得るには、複数のドメインの実質的に等モルの発現が必要となる。遺伝子発現の二重プロモーター調節に依存する従来のベクターは、遺伝子の等モルの発現又は実質的に等モルの発現を損なう場合があるプロモーターの相互作用（即ち、プロモーターの干渉）の影響を常に受ける。
【０００５】
レンチウイルスベクターは、分裂細胞及び非分裂細胞の両方に感染させることができるレトロウイルスベクターの一種である。これらを、神経細胞、マクロファージ、造血幹細胞、網膜視細胞、筋細胞及び肝細胞、他のベクター系が効果的に使用されない細胞種類等の非分裂細胞又は最終分化細胞由来のタンパク質を発現させるために使用することが可能である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
組換えタンパク質及びポリペプチド、特に、生物活性組換えタンパク質又はポリペプチドの十分な発現が商業的に相応なコストで達成されるように、複数のドメイン又は鎖を有するタンパク質及びポリペプチドの産生のための改善された遺伝子発現系に対する必要性が残る。
【０００７】
本発明は、複数のドメインを有する機能的組換えタンパク質及びポリペプチドの発現のためのレンチベクターコンストラクトの可能性及び使用を示すことによってこの必要性に取り組む。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、単細胞由来の複数のタンパク質又はポリペプチドのオープンリーディングフレームを発現させるためのレンチベクターコンストラクト、及びそれらを使用する方法を提供する。
【０００９】
好ましい一手法において、ベクターは、単一のプロモーターを使用する複数の機能タンパク質又はポリペプチドの発現を可能にするタンパク質又はポリペプチドのコード配列の間に自己プロセシング開裂配列（ｓｅｌｆ−ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を有する。本発明は、複数のタンパク質若しくはポリペプチド、又は単細胞内で持続発現が起こるレンチウイルスベクターを使用して複数のドメイン（又は鎖）を有するタンパク質若しくはポリペプチドの産生において有用性を見出す。例示的なレンチベクターコンストラクトは、自己プロセシング開裂配列を含み、更には、その自己プロセシング開裂配列を発現タンパク質又はポリペプチドから除去のために更なるタンパク質分解性開裂部位（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅ）も含む場合がある。ベクターコンストラクトは、生物活性を有するタンパク質、ポリペプチド、又はそのフラグメントの、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの改善された産生に関する方法に有用性を見出す。
【００１０】
本発明は、多量体タンパク質からなる複数のドメイン又は鎖をコードする改変レンチウイルスベクターに関する。一態様において、多量体タンパク質は、免疫グロブリン（即ち、抗体）であり、並びに全長抗体の重鎖及び軽鎖コード配列は、ベクターが重鎖及び軽鎖のコード配列間に自己プロセシング開裂部位（ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅ）又は配列を含む単一のプロモーターによって駆動される単一のオープンリーディングフレームを含むレンチベクターを使用して発現される。別の態様において、タンパク質は、多量体タンパク質であり、及び全長コード配列は、ベクターが自己プロセシング開裂部位又は配列を含む、単一のプロモーターによって駆動される単一のオープンリーディングフレームを含むレンチベクターを使用して発現される。
【００１１】
更に別の態様において、本発明は、各レンチベクターが単一のプロモーターによって駆動される多量体タンパク質の単一のオープンリーディングフレームをコードする、複数の改変レンチウイルスベクターを使用して組換えタンパク質の高レベル発現のための方法に関する。例えば、全長抗体の発現のために、全長抗体重鎖及び軽鎖をそれぞれコードするそれぞれのレンチベクターを、生物活性を有する抗体の高レベル発現が生じるように、同一の細胞を感染させるために使用する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（発明の詳細な説明）
本発明の種々の組成物及び方法を以下に説明する。特定の組成物及び方法が本明細書に例示されているが、幾つかの代わりの組成物及び方法の任意のものが、本発明の実施における使用のために適用可能であり、及び適しているものと理解される。又、本発明のタンパク質又はポリペプチド発現のコンストラクト（ベクター）の評価及び方法は、当該技術分野で標準的な手順を使用して実施される場合があることも理解されるであろう。
【００１３】
本発明の実施は、特に記載がない限り、当業者に既知である細胞生物学、分子生物学（組換え技法を含む）、細菌学、生化学、及び免疫学の従来の技法を使用する。このような技法は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｒｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ＆  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）；「Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ」（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ＆  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）；「ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ」，（Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）；及び「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｊ．Ｅ．ｏｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）等の文献に完全に説明される。
【００１４】
定義
特に記載がない限り、本明細書に使用する全ての用語は、当業者にとって同一意味を有し、本発明の実施は、当業者の知識の範囲内に含まれる細菌学及び組換えＤＮＡ技術の従来の技法を使用する。
【００１５】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、非相同ＤＮＡ又は組換えＤＮＡの配列を１つ以上含む、及び異なる宿主細胞間の転移のために設計されるプラスミド、ウイルス、又はその他のビヒクル等のＤＮＡ又はＲＮＡ分子を指す。「発現ベクター」及び「遺伝子治療ベクター」という用語は、細胞に組み込まれ、及び非相同ＤＮＡフラグメントを発現するのに効果的である任意のベクターを指す。クローニングベクター又は発現ベクターは、更なる要素を含む場合がある。例えば、発現ベクターは、２つの複製系を有することも可能であり、従って２つの生物で、例えば発現のためのヒト細胞で、並びにクローニング及び増幅のための原核宿主で維持されることを可能にする。タンパク質又はポリペプチド発現が生じるような、例えばウイルスベクター又は非ウイルスプラスミドベクターのように、細胞への核酸導入に効果的である、任意の適切なベクターを使用することが可能である。発現に効果的な任意の細胞、例えば昆虫細胞及び酵母菌又は哺乳動物細胞等の真核細胞は、本発明の実施において有用である。
【００１６】
「非相同ＤＮＡ」及び「非相同ＲＮＡ」という用語は、それらが存在する細胞又はゲノムの一部に対して内在性（未変性）でないヌクレオチドを指す。以下に詳述する通り、一般的に、非相同のＤＮＡ又はＲＮＡは、形質導入、感染、形質移入、形質転換等によって細胞に付加される。このようなヌクレオチドは、一般的に少なくとも１つのコード配列を含むが、このコード配列を発現する必要はない。「非相同ＤＮＡ」という用語は、「非相同コード配列」又は「導入遺伝子」を指す場合がある。
【００１７】
本明細書で使用される「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、交換可能に使用されることができ、通常は、本発明の自己プロセシング開裂部位を含むベクターを使用して発現される目的の「タンパク質」及び「ポリペプチド」を指す。このような「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、更に後述するように研究、診断、又は治療の目的に有用な何れかのタンパク質又はポリペプチドである場合がある。
【００１８】
本発明のウイルス遺伝子治療ベクターに関連して本明細書で使用される「複製欠損」という用語は、該ウイルスベクターが単独で更にそのゲノムを複製し且つパッケージすることができないことを意味する。例えば、対象の細胞がｒＡＡＶビリオンに感染している場合、非相同遺伝子は感染細胞内で発現されるが、感染細胞がＡＡＶｒｅｐ及びキャップ遺伝子並びにアクセサリー機能遺伝子が欠けているために、ｒＡＡＶは、複製することができない。
【００１９】
本明細書で使用される「レトロウイルス転移ベクター」は、トランス遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含み、更にベクターのパッケージングに必要なヌクレオチド配列を含む発現ベクターを指す。好ましくは、レトロウイルス転移ベクターは、細胞内でトランス遺伝子を発現するために必要な配列も含む。
【００２０】
本明細書で使用される「パッケージング系」は、組換えウイルスのパッケージに関与するウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含むウイルスコンストラクトのセットを指す。通常は、パッケージング系のコンストラクトは、パッケージング細胞に最終的に組み込まれる。
【００２１】
本明細書で使用される「第二世代」のレンチウイルスベクター系とは、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ及びｎｅｆのアクセサリー遺伝子が欠失された、又は不活性化された等の機能アクセサリー遺伝子を欠くレンチウイルスパッケージングを指す。例えば、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：８７１−８７５を参照されたい。
【００２２】
本明細書で使用される「第三世代」のレンチウイルスベクター系とは、第二世代のベクター系の特徴を有し、及び更にｔａｔ遺伝子が欠失された又は不活性化された等の機能ｔａｔ遺伝子を欠く、レンチウイルスパッケージング系を指す。
通常は、ｒｅｖをコードする遺伝子は、別の発現コンストラクトで提供される。例えば、Ｄｕｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（１１）：８４６３−８４７１を参照されたい。
【００２３】
本明細書で使用される「偽型」とは、未変性のエンベロープタンパク質を異種又は機能修飾されたエンベロープタンパク質との置換を指す。
【００２４】
組換えＤＮＡコンストラクト又はベクターに関連して本明細書で使用される「操作的に結合する」という用語は、組換えＤＮＡコンストラクト又はベクターのヌクレオチド成分が、選択されるコード配列の操作制御のために互いに機能的に関連されることを意味する。一般的に、「操作的に結合する」ＤＮＡ配列は、隣接しており、及び分泌性リーダーの場合には、隣接し且つ読み枠内にある。しかし、エンハンサーは、隣接する必要がない。
【００２５】
本明細書で使用される「遺伝子」又は「コード配列」という用語は、適切な調節配列に操作的に結合する場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでポリペプチドに複写される（ＤＮＡ）及び翻訳される（ｍＲＮＡ）核酸配列を意味する。遺伝子は、コード領域の前後の領域、例えば５’非翻訳（５’ＵＴＲ）配列又は「リーダー」配列、及び３’ＵＴＲ又は「トレーラー」配列、並びに個々のコードセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）を含む場合もあれば、含まない場合もある。
【００２６】
「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼの結合を指示し、それによってＲＮＡ合成（即ち転写を指示するのに十分な最小配列）を促進するＤＮＡ配列である。プロモーター及び対応するタンパク質又はポリペプチド発現は、細胞型特異的、組織特異的、又は種特異的である場合がある。又、本発明の核酸コンストラクト又はベクターには、プロモーター配列に隣接する場合もあれば、隣接しない場合もあるエンハンサーも含まれる。エンハンサー配列は、プロモーター依存性遺伝子発現に影響し、及び未変性遺伝子の５’又は３’領域に位置する場合がある。
【００２７】
「エンハンサー」は、隣接遺伝子の転写を促進又は阻害するシス作用因子である。転写を阻害するエンハンサーは、「サイレンサー」とも呼ばれる。エンハンサーは、コード配列及び転写領域の下流の位置から数キロ塩基対（ｋｂ）までの距離で、何れの方向にも機能することが可能である（即ち、コード配列と関連することが可能である）。
【００２８】
「調節可能プロモーター」とは、シス又はトランス作用因子（例えば、外部シグナル又は薬剤等の誘導性プロモーター）によって活性がされる何れかのプロモーターである。
【００２９】
「構成的プロモーター」とは、殆どの場合に多数の又は全ての組織／細胞型におけるＲＮＡの産生を指示する何れかのプロモーターであり、例えば、哺乳動物細胞でクローン化ＤＮＡインサートの構成的発現を促進するヒトＣＭＶ前初期のエンハンサー／プロモーター領域がある。
【００３０】
「転写調節タンパク質」、「転写調節因子」、及び「転写因子」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、及びＤＮＡ応答エレメントを結合し、それによって関連する１つ以上の遺伝子の発現を転写調節する核タンパク質を指す。転写調節タンパク質は、一般的にＤＮＡ応答エレメントに直接結合するが、場合により、ＤＮＡへの結合は、別のタンパク質に結合し、それによってＤＮＡ応答エレメントに結合する、又は結合していることによって間接的に行われる場合がある。
【００３１】
本明細書で使用される「配列同一性」という用語は、配列アライメントプログラムを使用して整列させる場合、複数の整列する配列の間の核酸配列又はアミノ酸配列を意味する。「％の相同性」及び「％の同一性」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、且つ配列アライメントプログラムを使用して整列する場合、複数の整列する配列の間の核酸配列同一性又はアミノ酸配列同一性のレベルを指す。例えば、８０％の相同性とは、定義された条件下で定義されたアルゴリズムによって決定された８０％の配列同一性と同じものを意味する。
【００３２】
複数の核酸配列又はタンパク質配列との関連における「同一の」又はパーセント「相同性」という用語は、複数の配列又は部分配列を指す。それらは、本明細書に記載の配列比較アルゴリズムの１つ（例えば、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム）を使用して、又は目視検査によって測定される最大一致を比較し、整列させた場合に同一である、又はアミノ酸残基若しくは同一であるヌクレオチドの特定の割合を有する。
【００３３】
本明細書で使用される「内部リボソーム侵入部位」又は「ＩＲＥＳ」とは、ＡＴＧ等のシストロン（タンパク質コード領域）の開始コドンに直接の内部リボソーム侵入を促進し、それによって遺伝子のキャプ非依存的翻訳につながる要素を指す。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｒ  Ｊ，Ｈｏｗｅｌｌ  Ｍ  Ｔ，Ｋａｍｉｎｓｋｉ  Ａ（１９９０）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  １５（１２）：４７７−８３）；及びＪａｃｋｓｏｎ  Ｒ  Ｊ  ａｎｄ  Ｋａｍｉｎｓｋｉ  Ａ（１９９５）ＲＮＡ  １（１０）：９８５−１０００を参照されたい。本明細書に記載の実施例は、任意のＩＲＥＳ要素の使用に関し、それは、シストロンの開始コドンへの直接の内部リボソーム侵入を促進することができる。本明細書で使用する「ＩＲＥＳの翻訳制御下」は、翻訳がＩＲＥＳに関連し、且つキャップ非依存的様式で進むことを意味する。
【００３４】
「自己プロセシング開裂部位（ｓｅｌｆ−ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅ）」又は「自己プロセシング開裂配列（ｓｅｌｆ−ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、翻訳後の又は同時翻訳のプロセシング開裂部位又は配列として、本明細書で定義される。このような「自己プロセシング開裂」部位又は配列は、本明細書に２Ａ部位、配列若しくはドメイン、又は２Ａ様部位、配列若しくはドメインとして例示される、ＤＮＡ又はアミノ酸配列を指す。本明細書で使用される「自己プロセシングペプチド」は、自己プロセシング開裂部位、配列、又はドメインをコードするＤＮＡ配列のペプチド発現産物として本明細書で定義される。翻訳が行われると、これは、分離した成熟タンパク質又はポリペプチド産物を得るために、自己プロセシング開裂部位を含むタンパク質又はポリペプチドの急速な分子内（シス）開裂を媒介する。
【００３５】
本明細書で使用される「更なるタンパク質分解性開裂部位（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅ）」という用語は、２Ａ配列又は２Ａ様配列等の自己プロセシング開裂部位に隣接する本発明の発現コンストラクトに組み込まれ、及び自己プロセシング開裂配列による開裂後に残る更なるアミノ酸を取り除く手段を提供する配列を指す。例示的な「更なるタンパク質分解性開裂部位」は、本明細書に記載され、これには、共通配列ＲＸＫ（Ｒ）Ｒ（配列番号１０）を有するフューリン（ｆｕｒｉｎ）開裂部位が含まれるが、これに限定されない。このようなフューリン開裂部位は、タンパク質分泌経路内のフューリン及び他のセリンプロテアーゼ等の内在性サブチリシン様プロテアーゼによって開裂されることができる。
【００３６】
本明細書で使用される「免疫グロブリン」及び「抗体」という用語は、交換可能に使用される場合があり、無傷の免疫グロブリン又は抗体分子、並びに抗原決定基を結合することができるＦａ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ等のそのフラグメントを指す。このような「免疫グロブリン」及び「抗体」は、分子量約２３，０００ダルトンの２つの同一の軽ポリペプチド鎖、及び分子量５３，０００〜７０，０００の２つの同一の重鎖からなる。これらの４つの鎖は、「Ｙ」構成でジスフィド結合によって接合される。重鎖は、γ（ＩｇＧ）、μ（ＩｇＭ）、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、又はε（ＩｇＥ）と分類され、所定の抗体のエフェクター機能を決定する免疫グロブリンのクラス名の基礎となる。軽鎖は、κ又はλの何れかで分類される。本明細書で「免疫グロブリン又はそのフラグメント」を言及する場合、このような「そのフラグメント」は、免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントであることが理解されるであろう。
【００３７】
「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト抗体の抗原結合領域の１つ以上のアミノ酸が、ヒト抗体に更に密接に似せるために、置換されながら、最初の非ヒト抗体の結合活性を保持する抗体分子を指す。例えば、米国特許第６，６０２，５０３号を参照されたい。
【００３８】
本明細書で使用される「抗原決定基」という用語は、特定の抗体と接触する分子（即ち、エピトープ）のフラグメントを指す。タンパク質又はタンパク質フラグメントの多数の領域は、タンパク質の三次元構造の所定の領域に特異的に結合する抗体の産生を誘導する場合がある。これらの領域又は構造が抗原決定基と呼ばれる。抗原決定基は、抗体に結合するために、無傷の抗原（即ち、免疫応答を誘発するために使用される免疫原）と競う。
【００３９】
本発明の組換えタンパク質又はポリペプチドを参照すると、「フラグメント」という用語は、対応する全長タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列の一部と同一であるが、全てが同一ではなく、且つ対応する全長タンパク質又はポリペプチドの少なくとも１つの機能又は活性を保持するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。好ましくは、フラグメントは、全長タンパク質又はポリペプチドの少なくとも２０〜１００個の隣接するアミノ酸残基を含む。
【００４０】
本明細書で使用される「投与する」又は「導入する」という用語は、細胞又は対象の細胞及び／又は器官への組換えタンパク質発現のためのベクター送達を指す。このような投与又は導入は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、又はｅｘ  ｖｉｖｏで行われる場合がある。組換えタンパク質又はポリペプチド発現のためのベクターは、形質移入（通常、非相同ＤＮＡを物理的手段（例えば、リン酸カルシウム形質移入法、電気穿孔法、微量注入法、又はリポフェクション）によって細胞に挿入することを意味する）；感染（通常、ウイルス等の感染因子による導入を指す）；又は形質導入（通常、ウイルスによる、又はウイルス性因子（例えば、バクテリオファージ）による微生物間の遺伝物質の移動による、細胞の安定した感染を意味する）によって細胞に導入される場合がある。
【００４１】
「形質転換」は、癌遺伝子を発現し、従って腫瘍細胞等の継続増殖様式に転換される非相同ＤＮＡ又は細胞を含む細菌を指すものとして通常使用される。細胞を「転換する」するために使用するベクターは、プラスミド、ウイルス、又はその他のヒビクルである場合がある。
【００４２】
通常、細胞は、細胞への非相同ＤＮＡ（即ち、ベクター）の投与、導入、又は挿入のために使用される手段に依存して、「形質導入される」、「感染する」、「形質移入される」、又は「形質転換する」と呼ばれる。「形質導入される」、「形質移入される」、及び「形質転換する」という用語は、非相同ＤＮＡの導入方法にかかわらず、本明細書では交換可能に使用される場合がある。細胞は、ウイルスベクターの感染によって「形質導入される」場合がある。
【００４３】
本明細書で使用される「安定して形質転換する」、「安定して形質移入される」、及び「遺伝子組換え」という用語は、ゲノムに組み込まれた非相同核酸配列を有する細胞を指す。安定した形質移入は、そのゲノムに安定して組み込まれた形質移入されたＤＮＡを含む娘細胞の集団からなる細胞系又はクローンの確立によって示される。場合により、「形質移入」は安定していない、即ち、一過性である。一過性の形質移入の場合、外来性の又は非相同ＤＮＡが発現されるが、導入された配列は、ゲノムに組み込まれず、エピソームであると考えられる。
【００４４】
本明細書に使用されるように、「ｅｘ  ｖｉｖｏ投与」は、一次細胞を対象から採取し、形質導入された、感染した、又は形質移入された組換え細胞を産生するために一次細胞をベクターに投与し、その組換え細胞を同一の対象又は別の対象に再投与するプロセスを指す。
【００４５】
「マルチシストロン性転写物」は、複数のタンパク質コード領域、又はシストロンを含むｍＲＮＡ分子を指す。２つのコード領域を含むｍＲＮＡを「バイシストロン性転写物」と示す。「５’近位の」コード領域又はシストロンは、その翻訳開始コドン（通常ＡＵＧ）が、マルチシストロン性ｍＲＮＡ分子の５’末端に最も近いコード領域である。「５’遠位の」コード領域又はシストロンは、その翻訳開始コドン（通常ＡＵＧ）が、ｍＲＮＡ分子の５’末端に最も遠いコード領域である。「５’遠位の」及び「下流」という用語は、ｍＲＮＡ分子の５’末端に隣接してないコード領域を指すものとして同義的に使用される。
【００４６】
本明細書で使用される「共転写される」という用語は、２つ（又は複数）のコード領域又はポリヌクレオチドが、単一の転写調節又は調節要素の転写調節下にあることを意味する。
【００４７】
本明細書で使用される「宿主細胞」という用語は、ベクターを形質導入された、感染した、形質移入された、又は形質転換された細胞を指す。ベクターは、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ等である場合がある。温度、ｐＨ等の培養条件は、発現のために選択した宿主細胞で以前に使用したものであり、及び当業者に明らかであろう。「宿主細胞」という用語は、形質導入された、感染した、形質移入された、又は形質転換された最初の細胞及びその子孫を指すことが理解されるであろう。
【００４８】
本明細書で使用される「生物活性」及び「生物活性を有する」という用語は、培養中の細胞系で、又はＥＬＩＳＡプレートのリガンド−受容体検定等の無細胞系で特定のタンパク質に起因する活性を指す。「免疫グロブリン」、「抗体」、又はそのフラグメントの「生物活性」は、抗原決定基を結合し、及びそれによって免疫学的機能を促進する能力を指す。
【００４９】
本明細書で使用される「腫瘍」及び「癌」という用語は、増殖調節の損失を示し、且つ細胞の異常に大きなクローンを形成する細胞を指す。腫瘍又は癌細胞は、一般的に接触阻止を失い、浸襲性であり、及び／又は転移する能力を有する場合がある。
【００５０】
内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）
ＩＲＥＳ要素は、最初にピコルナルウイルスｍＲＮＡで発見された（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｒ  Ｊ，Ｈｏｗｅｌｌ  Ｍ  Ｔ，Ｋａｍｉｎｓｋｉ  Ａ（１９９０）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  １５（１２）：４７７−８３；及びＪａｃｋｓｏｎ  ＲＪ  ａｎｄ  Ｋａｍｉｎｓｋｉ，Ａ．（１９９５）ＲＮＡ  １（１０）：９８５−１０００）。当業者によって一般的に利用されるＩＲＥＳの例には、米国特許第６，６９２，７３６号に記載のものが含まれる。当該技術分野で周知の「ＩＲＥＳ」の例には、ピコルナウイルスから得られるＩＲＥＳ（Ｊａｃｋｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９９０）及びウイルス性供給源又は細胞性ｍＲＮＡ供給源から得られるＩＲＥＳが含まれるが、これらに限定されない。このような供給源は、例えば、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（Ｈｕｅｚ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８（１１）：６１７８−６１９０）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ−２）、並びにインスリン様増殖因子（ＩＧＦＩＩ）、翻訳開始因子（ｅＩＦ４Ｇ）及び酵母転写因子（ＴＦＩＩＤ及びＨＡＰ４）、Ｎｏｖａｇｅｎから市販されている脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）（Ｄｕｋｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ６６（３）：１６０２−９）及びＶＥＧＦ  ＩＲＥＳ（Ｈｕｅｚ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １８（１１）：６１７８−９０）である。ＩＲＥＳは、カルジオウイルス、ライノウイルス、アフトウイルス、ＨＣＶ、フレンドマウス白血病ウイルス（ＦｒＭＬＶ）、及びモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）等の異なるウイルスでも報告されている。本明細書で使用される「ＩＲＥＳ」は、突然変異がシストロンの開始コドンに直接の内部リボソーム侵入を促進できる限り、ＩＲＥＳ配列の機能性突然変異を含む。ＩＲＥＳは、哺乳動物、ウイルス、又は原生動物のものである場合がある。
【００５１】
ＩＲＥＳは、下流シストロンの開始コドンに直接の内部リボソーム侵入を促進し、キャップ非依存的翻訳を行う。従って、下流シストロンの産物は、ポリタンパク質の開裂又はモノシストロニックｍＲＮＡの産生の何れかを必要とせずに、バイシストロニック（又はマルチシストロニック）ｍＲＮＡから発現されることができる。内部リボソーム侵入部位は、長さが約４５０ヌクレオチドであり、一次配列の中程度の保存及び二次構造の強い保存によって特徴付けられる。ＩＲＥＳの最も著しい一次配列の特徴は、開始がＩＲＥＳの３’末端の約２５ヌクレオチド上流に位置するピリミジンの豊富な部位である。Ｊａｃｋｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）を参照されたい。
【００５２】
真核細胞において、翻訳は、通常、開始因子の制御下で、キャップｍＲＮＡ  ５’末端からリボソームスキャニングによって開始される。しかし、幾つかの細胞ｍＲＮＡは、キャップ非依存的翻訳を媒介するためのＩＲＥＳ構造を有することが分った（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｅｌｄｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３１：８７−１０６）。実施例１に示すように、ＩＲＥＳ配列を試験し、２Ａ配列と比較することも可能である。１つの例示的なプロトコルにおいて、試験ベクター又はプラスミドは、試験されるＩＲＥＳ、２Ａ、又は２Ａ様配列の翻訳制御下に置かれる、ＰＦ−４又はＶＥＧＦ−ＴＲＡＰ等の１つのトランス遺伝子で産生される。細胞は、ＩＲＥＳ−又は２Ａ−レポーター遺伝子配列を含むベクター又はプラスミドで形質移入され、及びそのトランス遺伝子の存在を検出するために検定を実施する。１つの例示的な実施例において、試験プラスミドは、ＣＭＶプロモーターによって転写的に駆動される共転写ＰＦ−４及びＶＥＧＦ−ＴＲＡＰのコード配列を含み、そこでＰＦ−４又はＶＥＧＦ−ＴＲＡＰのコード配列が、試験されるＩＲＥＳ、２Ａ、又は２Ａ様配列によって転写的に駆動される。宿主細胞は、当業者に既知の手段によって、試験ベクター又はプラスミドで一過的に形質移入され、トランス遺伝子の発現を検定される。
【００５３】
しばらくの間、単一のウイルスベクター又は非ウイルスベクター由来の複数のタンパク質を発現させるために、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列は、通常使用され、第２、第３、第４の遺伝子等の発現を駆動した。ＩＲＥＳの使用は、多くの人によって最先端であると考えられるが、２つの遺伝子をＩＲＥＳを介して結合させる場合、第２遺伝子の発現レベルは、著しく低下することが多い（Ｆｕｒｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：８６４−８７３（２００１））。実際に、同一のプロモーターに操作的に結合する複数の遺伝子の転写を調節するためのＩＲＥＳの使用は、プロモーターに隣接する遺伝子に関連する第２、第３等の遺伝子の発現レベルが低下する可能性がある。更に、ＩＲＥＳ配列は、ベクターのパッケージング制限にかかわる問題を呈するほど長い場合がある。例えばｅＣＭＶ  ＩＲＥＳは、５０７塩基対の長さを有する。
【００５４】
本発明は、自己プロセシングペプチド（本明細書で２Ａペプチドによって示される）を含む組換えタンパク質又はポリペプチドの発現のためのベクターが、単一のプロモーターを使用して複数のタンパク質又はポリペプチドのコード配列の発現を促進し、そこで複数のタンパク質又はポリペプチドが実質的に等モル比で発現されるという点において、ＩＲＥＳの使用に優る利点を提供する。
【００５５】
自己プロセシング開裂部位又は配列
単一のオープンリーディングフレームにおいてポリタンパク質の形態でタンパク質を結合する手法は、ピコルナウイルス科を含む多数のウイルスの複製で採用されている。翻訳が行われると、ウイルスコードプロテイナーゼは、急速にポリタンパク質の分子内（シス）開裂を媒介し、分離した成熟タンパク質産物を得る。口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）は、単一の、約２２５ｋＤの長いオープンリーディングフレームをコードするリタンパク質を発現する、ピコルナウイルス科内の群である。全長翻訳産物は、自己プロセシング開裂部位のＣ末端（例えば、キャプシドタンパク質前駆体（Ｐ１−２Ａ）並びにポリタンパク質２ＢＣ及びＰ３の複製ドメインの間に位置する２Ａ部位又は領域）で、２Ａ領域自体のプロテイナーゼ様活性によって媒介される開裂により急速な分子内（シス）開裂を起こす（Ｒｙａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２７２７−２７３２，１９９１；Ｖａｋｈａｒｉａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３１９９−３２０７，１９８７）。同様のドメインも、ピコルナウイルス科のアフトウイルス属及び心筋炎ウイルス属から特徴付けられた。
【００５６】
上に定義した通り、「自己プロセシング開裂」又は「自己プロセシング開裂配列」は、ＤＮＡ又はアミノ酸配列を指し、この配列では、翻訳されると、自己プロセシング開裂部位を含むポリペプチドの急速な分子内（シス）開裂が生じて、分離した成熟タンパク質又はポリペプチドの産物が発現する。このような「自己プロセシング開裂部位」は、本明細書に２Ａ部位、配列、又はドメインによって例示され、翻訳後の又は同時翻訳のプロセシング開裂部位として呼ばれることも可能である。２Ａ部位、配列又はドメインは、エステル結合の加水分解を促進させるためにリボソーム活性を修飾し、それによって分離した下流の翻訳産物の合成を続行できるように翻訳複合体からポリペプチドを放出させることによって、翻訳効果を示すことが報告されている（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，２００１）。或いは、２Ａ部位、配列又はドメインは、一次開裂産物を産生するためにシス内でそれ自体のＣ末端を開裂することによって「自己タンパク質分解」又は「開裂」を示す（Ｆｕｒｌｅｒ；  Ｐａｌｍｅｎｂｅｒｇ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：６０３−６２３（１９９０））。
【００５７】
もっとも、この機序は本発明の一部に含まれていない。しかし、このドメインは自己融解酵素により似た作用を行うと考えられてきたものの（Ｒｙａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．１７３：３５−４５（１９８９））、２Ａ様配列の活性は、ペプチド結合の形成を防止するコドン間のリボソームの読み飛ばしを伴う場合がある（ｄｅ  Ｆｅｌｉｐｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １１：１９２１−１９３１（２０００）；Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０１３−１０２５（２００１））。口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａコード領域が、発現ベクターにクローン化され、且つ標的細胞に形質移入された種々の研究は、コムギ胚芽ライセート及び遺伝子導入タバコ（Ｈａｌｐｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許出願第５，８４６，７６７号；１９９８、及びＨａｌｐｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １７：４５３−４５９，１９９９）；Ｈｓヒトグリオーマ細胞系（ｄｅ  Ｆｅｌｉｐｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６：１９８−２０８，１９９９）、以下「ｄｅ  Ｆｅｌｉｐｅ  ＩＩ」と呼ぶ）；ウサギ網状赤血球ライセート及びヒトＨＴＫ−１４３細胞（Ｒｙａｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：９２８−９３３（１９９４））；並びに昆虫細胞（Ｒｏｏｓｉｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１７０３−１７１１，１９９０）内で人工レポーターポリタンパク質のＦＭＤＶ  ２Ａ開裂を示した。非相同ポリタンパク質のＦＭＤＶ−２Ａ媒介開裂は、ＩＬ−１２に対して示された（ｐ４０／ｐ３５  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ；Ｃｈａｐｌｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．１９：２３５−２４１，１９９９）。形質移入されたＣＯＳ−７細胞において、ＦＭＤＶ  ２Ａは、ｐ４０−２Ａ−ｐ３５ポリタンパク質の生物学的な機能のサブユニットｐ４０及びｐ３５（ＩＬ−１２に関連する活性を有する）への開裂を媒介したことを、参考文献は示す。
【００５８】
ＦＭＤＶ  ２Ａ配列は、バイシストロニック、トリシストロニック、及びテトラシストロニックベクターを構築するために、単独又は別のＩＲＥＳ配列と組み合わせてレトロウイルスベクターに組み込まれてきた。動物における２Ａ媒介遺伝子発現の効率は、α−シヌクレイン及びＥＧＦＰ又はＣｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ−１）及びＦＭＤＶ  ２Ａ配列を介して結合したＥＧＦＰをコードする組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用して、Ｆｕｒｌｅｒ（２００１）により示された。ＥＧＦＰ及びα―シヌクレインは、対応するＩＲＥＳ系ベクターに関連する２Ａ配列を含むベクターから実質的に高レベルで発現されたが、ＳＯＤ−１は比較的又は若干高いレベルで発現された。Ｆｕｒｌｅｒは、２Ａ配列が、２Ａ含有ＡＡＶベクターをラット黒質に注入した後、ｉｎ  ｖｉｖｏでバイシストロニック遺伝子発現をもたらすことも示した。
【００５９】
本発明に対して、ＤＮＡ配列コード自己プロセシング開裂部位は、エンテロウイルス、ライノウイルス、カルジオウイルス、アフタウイルス、又は口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）を含むがこれらに限定されないピコルナウイルス由来のウイルス配列によって例示される。好ましい一実施形態において、自己プロセシング開裂部位コード配列は、ＦＭＤＶ由来である。自己プロセシング開裂部位には、２Ａ及び２Ａ様部位、配列、又はドメインが含まれるが、これらに限定されない（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７−１０４１（２００１））。ベクターコンストラクトで複数の非相同ＤＮＡ配列間の２Ａ配列の位置的なサブクローニングは、単一のプロモーターへの操作可能な結合によって複数のオープンリーディングフレームの送達及び発現を可能にする。好ましくは、ＦＭＤＶ  ２Ａ配列等の自己プロセシング開裂部位は、例えば、免疫グロブリン因子ＶＩＩＩ、サイトカイン、若しくは別のヘテロ二量体タンパク質、抗体、又はヘテロ二量体受容体のそれぞれの部分であってもよい単一のウイルスベクター、複数のタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドから発現及び送達するためのユニークな手段を提供する。
【００６０】
ＦＭＤＶ  ２Ａは、ＦＭＤＶゲノム内でそれ自体のＣ末端で単一の開裂を指示する働きをするポリタンパク質領域であり、従ってシスで機能する。ＦＭＤＶ  ２Ａドメインは、通常は約１９アミノ酸の長さ（（ＬＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１）；ＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２）；Ｒｙａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２７２７−２７３２（１９９１））であると報告されるが、わずか１４のアミノ酸残基からなるオリゴペプチド（（ＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３））も、未変性ＦＭＤＶポリタンパク質のプロセシングにおける役割に類似する方法で、２ＡのＣ末端で開裂を媒介することが示された。
【００６１】
２Ａ配列の変異体は、ポリタンパク質の効率的なプロセシングを媒介する能力について試験が行われてきた（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ＭＬＬ，ｅｔ  ａｌ．，２００１）。２Ａ相同物及び変異体配列は、本発明の適用範囲内に含まれ、これには、以下の表１に示される配列が含まれるが、これらに限定されない。
【００６２】
【化２】
2009502134.tif 000002
【００６３】
【化３】
2009502134.tif 000003
２Ａ配列又はその変異体等の自己プロセシング開裂配列の明確な利点は、自己プロセシングポリタンパク質を発現するベクターの産生におけるそれらの使用である。本発明は、自己プロセシング開裂部位の存在によるポリタンパク質の開裂後、それぞれのタンパク質又はポリペプチドが等モル量又は等モルに近い量で発現されるように、自己プロセシング開裂部位を介して結合された複数のタンパク質又はポリペプチドのコード配列を含むレンチベクターを含む。これらのタンパク質は、ベクター自体に対して、互いに対して、又は自己プロセシング開裂部位、例えばＦＭＤＶに対して非相同である場合がある。従って、本発明の実施における使用のための自己プロセシング開裂部位は、開裂を機能させる又は媒介する能力において、異種タンパク質又はポリペプチドと自己プロセシング開裂部位と同一の供給源由来のコード配列間で区別しない。
【００６４】
複数のコード配列を含む単一のオープンリーディングフレームを駆動するプロモーター由来の個々のタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドの発現レベルは、ＩＲＥＳ配列又は二重プロモーターを使用する達成可能な発現レベルと比較すると、等モルにより近い。二重プロモーターの除去は、各コード配列の発現レベルの低減及び／又は低下をもたらす場合があるプロモーター干渉を削減する。
【００６５】
好ましい一実施形態において、本発明によるレンチベクターに含まれるＦＭＤＶ２Ａ配列は、ＬＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１）を含むアミノ酸残基をコードする。或いは、本発明によるレンチベクターは、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７−１０４１（２００１）で考察される通り、及びピコルナウイルス、昆虫ウイルス、Ｃ型ロタウイルス、トリパノソーマ反復配列、又は細菌、サーモトガ・マリティア由来の２Ａ様ドメインを含むがこれらに限定されない、その他の２Ａ様領域のアミノ酸残基をコードする場合がある。
【００６６】
本発明は、２Ａ又は２Ａ様ポリペプチド、及び親（未変性）ヌクレオチドのそれと関連する１つ以上のアミノ酸の異なるコドンを有する核酸コード配列等の自己プロセシング開裂部位をコードする核酸配列変異体の使用を考慮する。このような変異体は、本発明で具体的に考慮され、包含される。自己プロセシング開裂ペプチド及びポリペプチドの配列変異体は、同様に本発明の適用範囲内に含まれる。
【００６７】
比較に最適な配列のアライメントは、以下の種々の方法により実行することができる：例えば、ローカルホモロジーアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１））；ホモロジーアライメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０））；類似性検索方法（Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４（１９８８））；ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡアルゴリズムのコンピュータ実行法（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）；全米バイオテクノロジー情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公的に入手可能なソフトウェアを使用するＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））；又は目視検査（一般的にＡｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，後掲を参照）がある。本発明において、比較に最適な配列のアライメントは、最も好ましくは、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎのローカルホモロジーアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１））により実行される。又、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９０；及びＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９７を参照されたい。
【００６８】
本発明に従って、未変性配列に８０、８５、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％、又はそれを超える配列同一性を有する、自己プロセシング開裂ポリペプチド及びポリペプチド自体をコードする配列変異体も包含される。
【００６９】
核酸配列は、２つの配列が、中から高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション及び洗浄の条件下で特異的に互いにハイブリダイズする場合、基準核酸配列に「選択的にハイブリダイズ可能」であると考えられる。ハイブリダイゼーション条件は、核酸結合複合体又はプローブの融解温度（Ｔｍ）に基づいている。例えば、「最大ストリンジェンシー」は通常約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃低い）時に；「高ストリンジェンシー」はプローブのＴｍより５〜１０°低い時に；「中ストリンジェンシー」はプローブのＴｍより１０〜２０°低い時に；及び「低ストリンジェンシー」はＴｍより２０〜２５°低い時に起こる。機能的に、最大ストリンジェンシー条件は、ハイブリダイゼーションプローブと厳密な同一性又はほぼ厳密な同一性を有する配列を同定するために使用されることが可能であるのに対して、高ストリンジェンシー条件は、プローブと約８０％以上の配列同一性を有する配列を同定するために使用される。
【００７０】
中及び高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ９  ａｎｄ  １１；及びＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９３を参照）。高ストリンジェンシー条件の例には、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハート溶液、０．５％ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍＬ変性キャリアＤＮＡでの約４２℃のハイブリダイゼーションに続く、２×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳでの室温の洗浄２回、及び０．１×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳでの４２℃の更なる洗浄２回が含まれる。本明細書に記載の２Ａポリペプチドと同一の生物活性を有するポリペプチドをコードし、及び中／高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする２Ａ配列変異体は、本発明の適用範囲内に含まれると考えられる。
【００７１】
遺伝子コードの縮重により、２Ａ又は２Ａ様ペプチド等の同一のタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドをコードする幾つかのコード配列を提供することができる。例えば、トリプレットＣＧＴは、アミノ酸アルギニンをコードする。アルギニンは、代わりにＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、及びＡＧＧによってコードされる。従って、このようなコード領域の置換は、本発明の対象とされる配列変異体の範囲に含まれることが理解されるであろう。
【００７２】
自己プロセシングペプチド配列の除去
２Ａ又は２Ａ様配列等の自己プロセシングペプチドの使用に関連する１つの懸念は、発現されるポリペプチドのＣ末端に自己プロセシングペプチド由来のアミノ酸、即ち２Ａ由来のアミノ酸残基が含まれることである。これらのアミノ酸残基は、宿主細胞にとっては「異質」であり、組換えタンパク質がｉｎ  ｖｉｖｏで発現される（即ち、遺伝子治療と関連してウイルスベクター又は非ウイルスベクターから発現され、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生の組換えタンパク質又はポリペプチドとして投与される）、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｅｘ  ｖｉｖｏ発現の後、ｉｎ  ｖｉｖｏで送達される場合、免疫応答を誘発する。更に、除去されない場合、アミノ酸残基由来の自己プロセシングペプチドは、プロデューサー細胞でタンパク質分泌を妨害する及び／又はタンパク質立体構造を変化させることもあり得、最適発現に満たないレベル及び／又は組換えタンパク質の生物活性を低下させるという結果になる。
【００７３】
本発明は、更なるタンパク質分解性開裂部位が、第１のタンパク質又はポリペプチドのコード配列（第１の又は５’ＯＲＦ）と自己プロセシング開裂部位の間に、発現タンパク質産物に存在するアミノ酸残基由来の自己プロセシング開裂部位の除去の手段として提供されるように改変されたレンチウイルスをベースした発現コンストラクトを含む。
【００７４】
更なるタンパク質分解性開裂部位の例には、共通配列ＲＸＫ（Ｒ）Ｒ（配列番号１０）を有するフューリン開裂部位があり、これらはフューリン及びその他のセリンプロテアーゼ等の内在性サブチリシン様プロテアーゼによって開裂することができる。本発明者等は、第１の発現タンパク質のＣ末端の自己プロセシングアミノ酸残基が、フューリン開裂部位ＲＡＫＲを第１ポリペプチドと自己プロセシング２Ａ配列の間に導入することによって効率的に除去することが可能であることを実証した。更に、２Ａ配列及びこの２Ａ配列に隣接するフューリン開裂部位を含むプラスミドの使用は、２Ａ配列のみを含むプラスミドよりはよりタンパク質発現レベルが生じることが示された。この改善は、２Ａアミノ酸残基がタンパク質のＣ末端から除去されと、より長い２Ａ又は２Ａ様配列、又は他の自己プロセシング配列が使用できるようになる点において更なる利点を提供する。例えば、参考として本明細書に明示的に援用される米国特許出願公開第２００４０２６５９５５号及び第２００５０００３４８２号を参照されたい。
【００７５】
完全にヒト特質を有する治療用タンパク質、ポリペプチド、そのフラグメント又は類似体を産生することは、しばしば有利である。これらの試薬は、異なる種から生じるタンパク質、ポリペプチド、そのフラグメント、又は類似体によって誘発される望ましくない免疫応答を回避する。自己プロセシングペプチド由来のアミノ酸残基に対する起こり得る宿主免疫応答に対処するために、発現タンパク質又はポリペプチドから自己プロセシングペプチド配列を除去するように、第１のタンパク質のコード配列と自己プロセシングペプチドのコード配列の間にタンパク質分解性開裂部位のコード配列が（当該技術分野で既知の標準方法を使用して）挿入される場合がある。これは、ｉｎ  ｖｉｖｏ使用のための治療用並びに診断用のタンパク質及びポリペプチドにおいて特に有用である。
【００７６】
組換えＤＮＡ技術を使用して発現することができる当該技術分野で既知の何れかの更なるタンパク質分解性開裂部位は、本発明を実施する際に使用される場合がある。ポリペプチド又はタンパク質コード配列と自己プロセシング開裂配列の間に挿入することができる例示的な更なるタンパク質分解性開裂部位には、以下が含まれるが、これらに限定されない：
ａ）フューリン共通配列又は部位：ＲＸＫ（Ｒ）Ｒ（配列番号１０）；
ｂ）因子Ｘａ開裂配列又は部位：ＩＥ（Ｄ）ＧＲ（配列番号１１）；
ｃ）シグナルペプチダーゼＩ開裂配列又は部位：例えばＬＡＧＦＡＴＶＡＱＡ（配列番号１２）；及び
ｄ）トロンビン開裂配列又は部位：ＬＶＰＲＧＳ（配列番号１３）。
【００７７】
本明細書に詳述する通り、２Ａペプチド配列は、翻訳のプロセスで免疫グロブリン又は他のタンパク質の両鎖の産生を促進する「開裂」部位を提供する。一例示的実施形態において、第１タンパク質のＣ末端、例えば免疫グロブリン重鎖は、２Ａ配列自体に由来する約１３個のアミノ酸残基を含む。残留するアミノ酸の数は、使用する２Ａ配列に依存している。上述の通り、フューリン開裂部位配列、例えばＲＡＫＲを第１タンパク質と２Ａ配列の間に挿入すると、２Ａ残基は第１タンパク質のＣ末端から除去される。しかし、質量スペクトルデーターは、ＲＡＫＲ−２Ａコンストラクトから発現した第１タンパク質のＣ末端は、フューリン開裂部位ＲＡＫＲ由来の２つの添加されたアミノ酸残基（ＲＡ）を含むことを示す。
【００７８】
一実施形態において、本発明は、これらの残留するアミノ酸を除去する方法、及びこれらを発現するための組成物を提供する。タンパク質のＣ末端からこれらの添加されたアミノ酸の除去を行う幾つかの新規のコンストラクトが設計されている。フューリン開裂は、共通配列ＲＸＲ（Ｋ）Ｒ（Ｘは任意のアミノ酸）を有する、開裂部位のＣ末端で起こる。一態様において、本発明は、カルボキシベプチダーゼＤ、Ｅ及びＨ（ＣＰＤ、ＣＰＥ、ＣＰＨ）を含むがこれらに限定されない、カルボキシペプチダーゼ（ＣＰ）と呼ばれる酵素の群から選択される酵素の使用によって、タンパク質のＣ末端から新たに露出した塩基性アミノ酸残基Ｒ又はＫを除去する手段を提供する。ＣＰは、タンパク質のＣ末端の塩基性アミノ酸残基を除去することができるので、ＲＫＫＲ、ＲＫＲＲ、ＲＲＲＲ等の塩基性アミノ酸残基Ｒ又はＫを独占的に含むフューリン開裂部位由来の全てのアミノ酸残基は、ＣＰによって除去することができる。２Ａ配列及びフューリン開裂部位を含み、Ｃ末端に塩基性アミノ酸残基を有するＩ値連の免疫グロブリン発現コンストラクトは、開裂及び残基の除去の効率を評価するために構築されてきた。例示的な構築設計は以下の通りである：重鎖−フューリン（例えば、ＲＫＫＲ、ＲＫＲＲ、ＲＲＫＲ、又はＲＲＲＲ）−２−軽鎖、又は軽鎖−フューリン（例えば、ＲＫＫＲ、ＲＫＲＲ、ＲＲＫＲ、又はＲＲＲＲ）−２Ａ−重鎖。例示的なコンストラクトの模式図は、参考として本明細書で明示的に援用される米国特許出願第６０／６５９，８７１号の図１４及び図１５にそれぞれ示す。
【００７９】
当業者に明らかな通り、免疫グロブリン重（Ｈ）鎖のＣ末端に塩基性アミノ酸残基（Ｋ）が１つある（カルボキシペプチダーゼを使用する開裂を受けやすくする）、一方免疫グロブリン軽（Ｌ）鎖は、非塩基性アミノ酸Ｃで終結する。本発明の好ましい一実施形態において、フューリン部位及び２Ａ配列を含む抗体発現コンストラクトが提供され、翻訳後、添加されたフューリンアミノ酸残基がカルボキシペプチダーゼで開裂されるように、免疫グロブリン軽鎖は、免疫グロブリン重鎖に対して５’末端である。
【００８０】
免疫グロブリン及びそのフラグメント
抗体は、重鎖及び軽鎖のヘテロ二量体である免疫グロブリンタンパク質であって、哺乳動物の培養発現系において単一のベクターから全長形態で発現することが困難であると判明した。現在、脊椎動物抗体の産生のために３つの方法が使用されている；「ポリクローナル」抗体を産生するための動物のｉｎ  ｖｉｖｏ免疫化、モノクローナル抗体を産生するためのＢ細胞ハイブリドーマのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養（Ｋｏｈｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：５１１，１９７６；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）、及び組換えＤＮＡ技術（米国特許第６，３３１，４１５号（Ｃａｂｉｌｌｙ，ｅｔ  ａｌ．）に例が記載される）。
【００８１】
免疫グロブリンポリペプチドの基本的分子構造は、約２３，０００ダルトンの分子量を有する２本の同一の軽鎖、及び５３，０００〜７０，０００分子量を有する２本の同一の重鎖を含み、これら４本の鎖は「Ｙ」構成でジスルフィド結合によって連結されていることが知られている。アミノ酸配列は、Ｙ構成の最上部のＮ末端から各鎖の底部のＣ末端まで達する。Ｎ末端の終わりには、抗原結合の特異性を与える可変性領域（長さが約１００のアミノ酸）がある。
【００８２】
本発明は、以下を含むがこれらに限定されないあらゆる種類の免疫グロブリンを産生する改良された方法を提供する：未変性配列（即ち、抗原による刺激に反応して産生されるその配列）、安定して折り畳まれたポリペプチド単鎖における重鎖及び軽鎖の両方の抗原結合可変領域を結合する単鎖抗体を有する全長抗体及び抗体フラグメント；一価抗体（第２の重鎖のＦｃ領域に結合する重鎖／軽鎖二量体を含む）；免疫グロブリン分子の全「Ｙ」領域を含む「Ｆａｂフラグメント」、即ち「Ｙ」の両枝、軽鎖又は重鎖何れかのみ、又はその部分（即ち、一般的にＦａｂ’として知られる１本の重鎖及び１本の軽鎖の集合体）；複数の異なる抗原に対する特異性を有する「ハイブリッド免疫グロブリン」（例えば、米国特許第６，６２３，９４０号に例が記載されているクアドローマ又は二重特異性抗体）；重鎖及び軽鎖が異なる種又は特異性からのそれらに模倣する「複合免疫グロブリン」；及び重鎖及び軽鎖の各アミノ酸配列の部分が複数の種由来である「キメラ抗体」（即ち、可変領域は、マウス抗体等の１つの供給源由来であるが、定常領域はヒト抗体等の別の供給源由来である。
【００８３】
本発明の組成物及び方法は、免疫グロブリン又はそのフラグメントの産生に有用性を見出し、そこで重鎖又は軽鎖は「哺乳動物の」、「キメラ」、又はその有効性を向上させる方法で修飾されたものである。修飾された抗体は、アミノ酸及び核酸配列変異体の両方を含み、それらは、非修飾形態と同一の生物活性を保持し、及びその活性が変えられる（即ち補体結合、膜相互作用、及び他のエフェクター機能を改善する定常領域における変化、又は抗原結合特性を改善する可変領域における変化）ように修飾されたものである。本発明の組成物及び方法は、更に触媒免疫グロブリン又はそのフラグメントを含む。
【００８４】
「変異体」免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチド配列は、基準ポリペプチド配列からの１つ以上のアミノ酸によって変化される「変異体」免疫グロブリンアミノ酸配列をコードする場合がある。変異体ポリヌクレオチド配列は、「同類」置換を含む変異体アミノ酸配列をコードすることが可能であり、そこで置換されるアミノ酸は、それが置換するアミノ酸と同様の構造特性又は化学的特性を有する。更に、又は代わりに、変異体ポリヌクレオチド配列は、「非同類」置換を含む変異体アミノ酸配列をコードすることが可能であり、そこで置換されるアミノ酸は、それが置換するアミノ酸と異なる構造特性又は化学的特性を有する。変異体免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチドは、またアミノ酸挿入若しくは欠失又は両方を含む、変異体アミノ酸配列をコードする場合がある。
【００８５】
本発明は、生物活性を有する免疫グロブリン又はそのフラグメントをコードする免疫グロブリン配列を熟考し、それをコードする免疫グロブリンポリペプチド配列又はヌクレオチド配列変異体は、未変性配列に対して８０、８５、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％又はそれを超える配列同一性を有する。
【００８６】
更に、変異性「免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチド」は、基準ポリヌクレオチド配列と同一のポリペプチドをコードする場合があるが、遺伝子コードの縮重によって、基準ポリヌクレオチド配列由来の１つ以上の塩基によって変化したポリヌクレオチド配列を有する。本明細書に記載の免疫グロブリンポリペプチドと同一の生物活性でポリペプチドをコードし、且つ中／高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする免疫グロブリン配列変異体は、本発明の適用範囲内に含まれると考えられる。
【００８７】
本発明の組換え免疫グロブリンを参照する場合、「フラグメント」という用語は、対応する全長免疫グロブリンタンパク質のアミノ酸配列の全部ではないが一部が同じであるアミノ酸配列を有し、対応する全長タンパク質と本質的に同一の生物機能又は活性を保持する、又は対応する全長タンパク質の機能又は活性のうち少なくとも１つを保持するかの何れかであるポリペプチドを意味する。好ましくは、フラグメントは、全長免疫グロブリンの少なくとも２０〜１００、２０〜１５０、又は２０〜２００の隣接するアミノ酸残基を含む。
【００８８】
治療法としての抗体の可能性は、商業的に実用的なレベルの免疫グロブリンを産生するクローンを選択するために必要とされる長い期間、生産能力、及び現在の技術の多大なコストによって現在制限されている。免疫グロブリン産生のための改善したベクター発現系は、複数のコード配列（即ち単一のベクターからの二重又は多重特異性を有する免疫グロブリン）の発現及び送達を可能にする。本発明は、これらの制限に取り組み、本明細書に詳述する通り、単鎖抗体、全長抗体、又は抗体フラグメント等の改変抗体を含む任意の免疫グロブリン（即ち抗体）又はそのフラグメントに適用可能である。
【００８９】
抗体の産生
本発明の一実施例において、タンパク質又はポリペプチドの第１の又は第２の鎖のコード配列は、任意の免疫グロブリン（例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、又はＩｇＡ）の重鎖又はそのフラグメントのコード配列である。或いは、タンパク質又はポリペプチドの第１又は第２の鎖のコード配列は、軽鎖又はそのフラグメントのＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、又はＩｇＡのコード配列である。抗体分子全体の遺伝子、並びに例えばＦａｂ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、及びＦ（ａｂ’）２といったフラグメント等の修飾型又は由来型の遺伝子は、本発明の適用範囲内に含まれる。抗体及びフラグメントは、動物由来、ヒト−マウスキメラ型、ヒト化型、ＤｅＩｍｍｕｎｉｚｅｄＴＭ、又は完全にヒト型であってもよい。抗体は、二重特異性であってもよく、これには、二重特異性抗体、クアドローマ、ミニ抗体、ＳｃＢｓ抗体、及びｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【００９０】
本発明の実施に際して、組換えＤＮＡ技術を使用する抗体又は変異体（類似体）若しくはそのフラグメントの産生は、コード配列の発現をもたらすその宿主細胞の増殖に適切な培養条件下で、修飾された組換え宿主細胞を培養することによって達成することができる。発現の成功を監視するために、抗原に関する抗体レベルを、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウェスタンブロット法等の標準的な技法を使用して監視することが可能である。抗体を、当該技術分野で既知の標準的な技法を使用して培養上清から回収することができる。これらの抗体の精製された形態は、当然ながら、例えばタンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、又はタンパク質Ｌカラムを介するアフィニティークロマトグラフィー等の標準的な精製技法によって、又は特定の抗原、又は特異性が望まれる抗原の特定のエピトープへの結合に基づいて容易に調製することができる。抗体を、硫酸アンモニア沈澱及びサイズを限定した膜濾過等の他の技術と組み合わせて、イオン交換又はサイズ排除カラム等の従来のクロマトグラフィーで精製することもできる。好ましい発現系を、結果として得られる抗体が培養培地又は上清に分泌されるようシグナルペプチドを含むように設計し、精製を簡略化することも可能である。しかし、細胞内産生も可能である。
【００９１】
ヒトＩｇ遺伝子座を操作されたマウス由来の抗原特異的な完全ヒトモノクローナル抗体の産生及び選択については、既に記載されている（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｖｏｌ．３１，ｐｐ：３３−４２（１９９８）；Ｍｅｎｄｅｚ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｖｏｌ．１５，ｐｐ：１４６−１５６（１９９７）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．５，ｐｐ：５６１−５６６（１９９５）；Ｇｒｅｅｎ  Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．１，ｐｐ：１３−２１（１９９４））。
【００９２】
抗体自体の産生及び回復は、当該技術分野で既知の種々の方法（Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ  ａｌ．，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ，１９８８））で達成することができる。
【００９３】
タンパク質コード配列
本明細書で使用される「第１のタンパク質コード配列」とは、抗体又は免疫グロブリン分子の鎖又はそのフラグメント、サイトカイン又はそのフラグメント、増殖因子又はそのフラグメント、因子ＶＩＩＩ分子の鎖、可溶性又は膜関連受容体又はそのフラグメント、ウイルスタンパク質又はそのフラグメント、免疫原性タンパク質又はそのフラグメント、転写調節因子又はそのフラグメント、アポトーシス促進分子又はそのフラグメント、腫瘍抑制因子又はそのフラグメント、血管新生抑制因子又はそのフラグメント等を含むがこれらに限定されないポリペプチド又はタンパク質分子若しくはドメイン若しくはその鎖をコードする非相同核酸配列を指す。
【００９４】
本明細書で使用される「第２のタンパク質コード配列」とは、抗体又は免疫グロブリンの鎖又はそのフラグメント、サイトカイン又はそのフラグメント、増殖因子又はそのフラグメント、因子ＶＩＩＩ分子の鎖、可溶性又は膜関連受容体又はそのフラグメント、ウイルスタンパク質又はそのフラグメント、免疫原性タンパク質又はそのフラグメント、転写調節因子又はそのフラグメント、アポトーシス促進分子又はそのフラグメント、腫瘍抑制因子又はそのフラグメント、血管新生抑制因子又はそのフラグメント等を含むがこれらに限定されないポリペプチド又はタンパク質分子若しくはドメイン若しくはその鎖をコードする非相同核酸配列を指す。
【００９５】
本発明のレンチベクターコンストラクトは、例えば第１のタンパク質コード配列、第２のタンパク質コード配列、第３のタンパク質コード配列等の複数のトランス遺伝子又は非相同コード配列を含む場合がある。複数のトランス遺伝子は、１つ以上のレンチベクターを使用して細胞に送達される場合がある。単一のレンチベクターを使用する場合、複数のトランス遺伝子は、単一のプロモーターへの操作可能な結合、又は２Ａ等の自己プロセシング開裂配列によって同時発現される。トランス遺伝子は、数多くが本発明の実施の際に使用される場合があり、これには、以下に示す１つ以上のタンパク質又はそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列が含まれるが、これらに限定されない。
【００９６】
１．ＨＩＦ−１α及びＨＩＦβ、ｐ３５及びｐ４０（ＩＬ−１２）、インスリンＡ鎖及びＢ鎖、αＶβ３若しくはαＶβ５、抗体重鎖及び軽鎖、並びに因子ＶＩＩＩの重鎖及び軽鎖等のインテグリンをコードする配列。
【００９７】
２．ＴＮＦ  ｐ５５及びｐ７５受容体、ＩＬ−２受容体、ＦＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、ＴＩＥ２、ＩＬ−６受容体及びＩＬ−１受容体を含むがこれらに限定されない可溶性受容体をコードする配列。
【００９８】
３．例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１８、ＩＬ−２４、ＩＮＦ−α、ＩＮＦ−β、ＩＮＦ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、及びエリスロポエチン等あらゆる周知の又はのちに発見されるサイトカインを含むがこれらに限定されないサイトカインをコードする配列。
【００９９】
４．ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、アンジオポエチン−１及び２、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ、ＮＧＦ、ＩＤＦ、ＨＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−βを含むがこれらに限定されない増幅因子をコードする配列。
【０１００】
５．Ｂａｄ、Ｂａｋ、Ｂａｘ、Ｂｃｌ２、Ｂｃｌ−Ｘｓ、Ｂｉｋ、カスパーゼ、ＦａｓＬ、及び腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘発リガンド（ＴＲＡＩＬ）を含むがこれらに限定されないアポトーシス促進因子をコードする配列。
【０１０１】
６．ｐ５３、ｐ１６、ｐ１９、−２１、ｐ２７、ＰＴＥＮ、ＲＢ１を含むがこれらに限定されない腫瘍抑制因子タンパク質又は細胞周期制御因子をコードする配列。
【０１０２】
７．アンジオスタチン、エンドスタチン、ＴＩＭＰｓ、アンチトロンビン、血小板因子４（ＰＦ４）、ＩｇＧ１のＦｃセグメントに融合させた可溶型ＶＥＧＦＲ１（ドメイン１〜７）及び可溶型ＶＥＧＦＲ２（ドメイン１〜７）、ＶＥＧＦ−ＴＲＡＰ、ＰＥＤＦ、ＰＥＸ、トロポニンＩ、トロンボスポンジン、タムスタチン、１６Ｋｄプロラクチンを含むがこれらに限定されない血管新生抑制因子をコードする配列。
【０１０３】
上で参照した生物活性を有する分子の何れかをコードするクローン配列及び全長ヌクレオチドは、当該技術分野で周知の方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９）によって取得可能である。一般的に、核酸コード配列は知られており、公開データベース及び／又は化学出版物から取得することも可能である。
【０１０４】
異種タンパク質及びポリペプチドコード配列の相同体及び変異体は、既知の核酸配列に対する「配列同一性」又は「％の相同性」に基づいて、本発明の適用範囲内に含まれ、それら既知の核酸配列は、公開データベース及び／又はストリンジェント条件下でそのように既知の核酸配列（自己プロセシング開裂配列について上述の通り）への選択的ハイブリダイゼーションで入手可能である。異種タンパク質及びポリペプチドアミノ酸配列の相同体及び変異体並びにそれらをコードする核酸配列は、更に本発明の適用範囲内に含まれる。このような配列は、公的に入手可能なデータベース及び自己プロセシング開裂配列について上述の通り配列アライメントプログラムを使用して、既知の配列に対する「配列同一性」に基づいて同定される場合がある。
【０１０５】
本発明は、生物活性を有するタンパク質、ポリペプチド、又はそのフラグメントをコードする異種タンパク質及びポリペプチド変異体を熟考し、タンパク質若しくはポリペプチド配列又はそれをコードするヌクレオチド配列は、未変性配列に対して８０、８５、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％又はそれを超える配列同一性を有する。
【０１０６】
更に、変異体「異種タンパク質又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、基準ポリヌクレオチド配列と同一のポリペプチドをコードする場合があるが、遺伝子コードの縮重によって基準ポリヌクレオチド配列から１つ以上の塩基により変化したポリヌクレオチド配列を有する。本明細書に記載の異種タンパク質又はポリペプチドと同一の生物活性でポリペプチドをコードし、且つ中〜高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする異種タンパク質及びポリペプチド配列の変異体は、本発明の適用範囲内に含まれると考えられる。
【０１０７】
更に、「免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチド」の変異体は、基準ポリヌクレオチド配列と同一のポリペプチドをコードするが、遺伝子コードの縮重によって基準ポリヌクレオチド配列から１つ以上の塩基により変化したポリヌクレオチド配列を有する。本明細書に記載の免疫グロブリンポリペプチドと同一の生物活性でポリペプチドをコードし、且つ中〜高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする免疫グロブリン配列の変異体は、本発明の適用範囲内に含まれると考えられる。
【０１０８】
タンパク質発現
本発明のレンチベクターは、レンチウイルスをベースとする何れかのタンパク質発現系における組換えタンパク質及びポリペプチドの発現に有用性を見出し、これらの幾つかは当該技術分野で既知であり、これらの例が本明細書に記載されているが理解されるであろう。
【０１０９】
発現の後、組換えタンパク質は、当該技術分野で既知の標準的な技法を使用して培養から回収される。組換えタンパク質それ自体の産生及び回収は、種々の方法によって達成することが可能であり、これらの例については数多くが当該技術分野で既知である。例えば、組換えタンパク質、ポリペプチド、類似体、又はそのフラグメントの産生は、その宿主細胞がコード配列の発現をもたらす適切な培養条件下で修飾組換え宿主細胞を培養することによって行うことができる。発現の成功を監視するために、組換えタンパク質又はポリペプチドのレベルは、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウェスタンブロット法等の標準的な技法を使用して監視される。
【０１１０】
当然ながら、組換えタンパク質の精製形態は、アフィニティークロマトグラフィー等の当該技術分野で既知の標準的な精製技法によって容易に調製することができる。組換えタンパク質は、サイズを限定した膜濾過等の他の技術と組み合わせて、イオン交換又はサイズ排除カラム等の従来のクロマトグラフィーで精製することもできる。発現系は、結果として得られる組換えタンパク質が培養培地に分泌されるようシグナルペプチドを含むように好ましく設計されるが、細胞内産生も可能である。
【０１１１】
本発明の操作性は、本発明のレンチベクター（例えば、実施例２を参照）を含有する自己プロセシング開裂配列を使用する免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の発現によって実証された。自己プロセシング開裂配列の使用に伴う利点は、第１のタンパク質又はポリペプチドのコード配列と本発明のベクター内の自己プロセシング開裂配列との間に更なるタンパク質分解性開裂部位を含めることによって向上し、自己プロセシング開裂配列に関連するアミノ酸残基を除去することができる。本発明のベクター内のフューリン開裂部位の取り込みによる２Ａ残基の効率的な除去は、米国特許出願公開第２００４０２６５９５５及び第２００５０００３４８２号によって実証される。
【０１１２】
発明の実施における使用のためのベクター
レトロウイルスベクターは、遺伝子送達の一般的な手段（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：４５５−４６０，１９９２）でもある。レトロウイルスベクター及びより詳細にはレンチウイルスベクターは、本発明の実施において使用される場合がある。従って、本明細書で使用される「レトロウイルス」又は「レトロウイルスベクター」という用語は、それぞれ「レンチウイルス」及び「レンチウイルスベクター」を含むものとして意図されている。レトロウイルスベクターの試験を行い、目的の遺伝子を標的細胞の広い範囲のゲノムへ安定して導入するのに好適な送達ビヒクルであることが判明した。非再配列された単一コピートランス遺伝子を細胞に送達するレトロウイルスベクターの能力は、細胞に遺伝子を転移するためにレトロウイルスベクターを適切にする。更に、宿主細胞上の特定の細胞表面受容体へのレトロウイルスエンベロープ糖タンパク質の結合によって、レトロウイルスは宿主細胞に進入する。従って、コードされた未変性エンベロープタンパク質は、未変性エンベロープタンパク質とは異なる細胞特異性を有する（例えば、未変性エンベロープタンパク質と比較すると、異なる細胞表面受容体に結合する）非相同エンベロープタンパク質によって置き換えられる偽型レトロウイルスベクターも、本発明の実施に際して有用性を見出す場合もある。１つ以上の標的タンパク質コード配列をコードするレトロウイルスベクターの送達を特定の標的細胞に向かわせる能力は、本発明の実施において望ましい。
【０１１３】
本発明は、レトロウイルスベクター、プロデューサー細胞、及びプロデューサー細胞系に関する。特に、本発明は、非相同配列をコードする１つ以上の自己不活性化（「ＳＩＮ」）レトロウイルスベクターを使用して、単一の哺乳動物細胞で多量体、非相同コード配列の発現のための新規の手法に関する。より詳細には、レトロウイルスベクターは、ＳＩＮレンチウイルスベクターである。更に、本発明は、多量体組換えタンパク質を作製するためにＳＩＮレンチウイルスベクターを使用する方法に関する。
【０１１４】
本発明は、例えば、１つ以上のトランス遺伝子配列、及び１つ以上のパッケージング要素を含むレトロウイルスパッケージングベクターを含むレトロウイルス転移ベクターを含むレトロウイルスベクターを提供する。特に、本発明は、偽型レトロウイルを産生するために、非相同又は機能的に修飾されたエンベロープタンパク質をコードする偽型レトロウイルスベクターを提供する。好ましくは、非相同ｅｎｖ遺伝子は、ＶＳＶ−Ｇ又はバキュロウイルスｇｐ６４  ｅｎｖ遺伝子を含むが、当業者であれば、その他のｅｎｖ遺伝子が使用される場合があることを理解するであろう。
【０１１５】
ベクター産生の好ましい一方法は、ウイルスパッケージング遺伝子及びトランス遺伝子を含むプラスミドの細胞系への一過性形質移入である。或いは、ベクターは、プロデューサー細胞を作製するために、パッケージング細胞系への形質移入、形質導入、又は感染を介して産生される。形質移入、形質導入、又は感染の方法は、当業者に周知である。一過的に形質移入した細胞及びプロデューサー細胞の両方は、トランス遺伝子を含むウイルス粒子を生成するために効果的である。安定した又は一過的な産生方法の何れかの場合、組換えウイルスは、当業者が使用する標準的な方法によって濃縮及び／又は精製した、並びに滴定した培養培地から、回収される。
【０１１６】
本発明のレトロウイルスベクターのコア配列は、例えば、レトロウイルスＢ型、Ｃ型、及びＤ型、並びにスプマウイルス及びレンチウイルス（ＲＮＡ  Ｔｕｍｏｒ  Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８５）を含む広範なレトロウイルスから容易に誘導される場合がある。本発明の組成物及び方法での使用に好適なレトロウイルスの例には、レンチウイルスが含まれるが、これに限定されない。本発明の組成物及び方法における使用に好適なその他のレトロウイルスには、トリ白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、マウス白血病ウイルス、ミンク細胞フォーカス形成ウイルス、マウス肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルス、ラウス肉腫ウイルスが含まれるが、これらに限定されない。好ましいマウス白血病ウイルスは、４０７０Ａ及び１５０４Ａ（Ｈａｒｔｌｅｙ  ａｎｄ  Ｒｏｗｅ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９：１９−２５，１９７６）、アベルソン（ＡＣＴＴ番号ＶＲ−９９９）、フレンド（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−２４５）、グラフィ、グロス（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−５９０）、カーステン、ハーベイ肉腫ウイルス及びラウシャー（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−９９８）、並びにモロニーマウス白血病ウイルス（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−１９０）を含む。このようなレトロウイルスは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」：米国メリーランド州ロックビル）等の保管所又はコレクションから容易に得られる場合もあれば、通常使用可能な技法を使用して既知の供給源から単離される場合もある。
【０１１７】
好ましくは、本発明のレトロウイルスベクター配列は、レンチイウルスに由来する。好ましいレンチウイルスは、例えば１型若しくは２型のヒト免疫不全ウイルス（即ち、ＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２。ＨＩＶ−１は、以前にリンパ節症関連ウイルス３（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ）及び後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）関連ウイルス（ＡＲＶ）と呼ばれていた）、又はＡＩＤＳ若しくはＡＩＤＳ様疾患と同定され、関連したＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２に関連する別のウイルスである。その他のレンチウイルスには、ヒツジビスナ・マエディウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシレンチウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、及びヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）が含まれる。
【０１１８】
組成物及び方法における使用に好適なレトロウイルスの種々の属及び菌株は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９６）を参照）、例えば、Ｃｈａｐｔｅｒ  ５８，Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ：  Ｔｈｅ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｐｐ．１７６８−１７７１（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ｔａｂｌｅ  １）を参照。
【０１１９】
レトロウイルスベクターを生成するために使用されるパッケージング系は、ｇａｇ、ｐｏｌ、又はｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子を含む第１のヌクレオチド配列を含む第１のパッケージングベクターと、非相同又は機能的に修飾されたエンベロープ遺伝子を含む第２のヌクレオチド配列を含む第２のパッケージングベクターとの少なくとも２つのパッケージングベクターから構成される。好ましい実施形態において、レトロウイルスエレメントは、ＨＩＶ等のレンチウイルス由来である。好ましくは、ベクターは、機能ｔａｔ遺伝子及び／又は機能アクセサリー遺伝子（ｖｉｆ  ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、ｎｅｆ）を欠く。更に好ましい実施形態において、パッケージング系は、更に、ｒｅｖ遺伝子を含むヌクレオチド配列を含む第３のパッケージングベクターを含む。パッケージング系は、第１、第２、及び場合により第３のヌクレオチド配列を含むパッケージング細胞の形態で提供してもよい。
【０１２０】
本発明は、種々の系に適用可能であり、当業者は、レトロウイルスの異なる複数の群全体で共有される共通のエレメントを理解するであろう。本明細書の説明は、代表的な例としてレンチウイルス系を使用する。しかし、全てのレトロウイルスは、表面突起を有し、１つの線状分子、プラスセンス１本鎖ＲＮＡ、二量体からなるゲノム、並びに共通のタンパク質ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖを含む、エンベロープウイルス粒子の特徴を共有する。
【０１２１】
レンチウイルスは、ｅｎｖ遺伝子によってコードされるエンベロープ糖タンパク質ＳＵ（ｇｐ１２０）及びＴＭ（ｇｐ４１）；ｇａｇ遺伝子によってコードされるＣＡ（ｐ２４）、ＭＡ（ｐ１７）及びＮＣ（ｐ７〜１１）；並びにｐｏｌ遺伝子によってコードされるＲＴ、ＰＲ及びＩＮを含む、幾つかのウイルス粒子構造タンパク質を共通して共有する。ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２は、合成及びプロセシングウイルスＲＮＡ並びに他の複製機能の調節に関与するアクセサリー及び他のタンパク質を含む。ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ／ｖｐｘ、及びｎｅｆ遺伝子によってコードされるアクセサリータンパク質は、組換え系から取り除く（又は不活性化する）ことができる。更に、ｔａｔ及びｒｅｖは、例えば突然変異又は欠失によって取り除く、又は不活性化することもできる。
【０１２２】
第１世代のレンチウイルスベクターパッケージング系は、ｇａｇ／ｐｏｌ及びｅｎｖに対して別々のパッケージングコンストラクトを提供し、及び通常は、安全上の理由から非相同、又は機能的に修飾されたエンベロープタンパク質を使用する。例えば、Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂｕｔｔｉｍｏｒｅ，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６（８）：２８９５−２９０２（１９８６）を参照されたい。これらの修飾は、組換えを形成するベクターの能力を低減するよう、パッケージングゲノムとウイルスベクターの間の相同性を最小限にする（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｓｍａｎ，ＢｉｏＴｅｃｌｎｉｑｕｅｓ  ７（９）：９８０−９９０（１９８９）を参照）。
【０１２３】
第２世代のレンチウイルスベクター系において、アクセサリー遺伝子であるｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ及びｎｅｆは、除去又は不活性化され、及びパッケージング機能は２つのゲノムに分割される。即ち、１つはｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子産物を発現するゲノムであり、もう１つはｅｎｖ遺伝子産物を発現するゲノムである（例えば、Ｂｏｓｓｅｌｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７（５）：１７９７−１８０６（１９８７）；Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２（４）：１１２０−１１２４（１９８８）；Ｄａｎｏｓ  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５：６４６０−６４６４（１９８８）を参照）。この手法は、同時パッケージング及びその後のｐｓｉゲノム（ウイルスパッケージングのエレメントｐｓｉを含む）の転移に関する能力を削除し、並びにＲＣＲを産生するために組換えを起こすことが必要となるパッケージング細胞内の３つのレトロウイルスゲノムの存在によって組換え頻度を有意に低下させる。組換えが起こると、望ましくない遺伝子産物内の突然変異又は欠失は、組換えを非機能的にする（例えば、Ｄａｎｏｓ  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｉｇａｎ，前掲；Ｄａｎｏｓ  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｉｇａｎ，前掲；Ｂｏｓｅｌｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，前掲；及びＭａｒｋｏｗｉｔｚ，ｅｔ  ａｌ．，前掲を参照）更に、両パッケージング機能コンストラクトの３’ＬＴＲの欠失は、機能的組換えを形成する能力を更に低下させる。
【０１２４】
第３世代のレンチウイルスベクター系は、本発明の実施における使用のために好ましく、ｔａｔ遺伝子が除去された、さもなければ不活性化（例えば突然変異を介して）されたものを含む。通常、ｔａｔによって提供される転写の調節に対する補償は、ヒトサイトメガロウイルス細初期（ＨＣＭＶ−ＩＥ）エンハンサー／プロモーター等の強力な構成的プロモーターの使用によって提供することができる。その他のプロモーター／エンハンサーは、構成的プロモーター活性の強度、標的組織に対する特異性（例えば、肝臓特異的プロモーター）、又は当該技術分野で理解されるように、発現に対する所望の制御に関連する他の因子に基づいて選択することができる。例えば、幾つかの実施形態において、制御発現を達成するために、ｔｅｔ等の誘導性プロモーターを使用することが望ましい。遺伝子をコードするｒｅｖは、好ましくは、一般的な第３世代のレンチウイルスベクター系が４つのプラスミド（ｇａｇｐｏｌ、ｒｅｖ、エンベロープ及び転移ベクターに各１つずつ）を含むように、別々の発現コンストラクト上に提供される。使用されるパッケージング系の世代にかかわらず、ｇａｇ及びｐｏｌは、単一のコンストラクト又は別々のコンストラクト上に提供することができる。
【０１２５】
通常、パッケージングベクターは、パッケージング細胞に含まれ、且つ形質移入、形質導入、又は感染を介して細胞に導入される。形質移入、形質導入、又は感染の方法は、当業者に周知である。本発明のレトロウイルス／レンチウイルス転移ベクターは、プロデューサー細胞又は細胞系を生成するために形質移入、形質導入、又は感染を介してパッケージング細胞系に導入することができる。本発明のパッケージングベクターは、例えば、リン酸カルシウム形質移入、リポフェクション、又は電気穿孔法を含む標準的な方法によってヒト細胞又は細胞系に導入することができる。幾つかの実施形態において、パッケージングベクターは、ネオ、ＤＨＦＲ、Ｇｌｎシンテターゼ、又はＡＤＡ等（後に適切な薬剤の存在化での選択及びクローンの単離を伴う）の優性選択マーカーと共に細胞に導入される。選択マーカー遺伝子は、パッケージングベクターによって、コードする遺伝子に物理的に結合することができる。
【０１２６】
パッケージング機能が、適切なパッケージング細胞によって発現されるよう構成される安定した細胞系が知られている。例えば、パッケージング細胞について記載する、米国特許第５，６８６，２７９号；及びＯｒｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９６）９３：１１４００−１１４０６を参照されたい。更に安定した細胞系産生の説明は、Ｄｕｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７２（１１）：８４６３−８４７１；及びＺｕｆｆｅｒｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７２（１２）：９８７３−９８８０に記載されている。
【０１２７】
Ｚｕｆｆｅｒｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：８７１−８７５は、ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子を含むｐｏｌの３’の配列が欠失される、レンチウイルスパッケージングプラスミドを教示する。コンストラクトは、ｔａｔ及びｒｅｖ配列を含み、並びに３’ＬＴＲはポリＡ配列と置換される。５’ＬＴＲ及びｐｓｉ配列は、誘導可能である別のプロモーターによって置換される。例えば、ＣＭＶプロモーター又はその誘導体を使用できる。
【０１２８】
好ましいパッケージングベクターは、レンチウイルスタンパク質発現を向上させ、且つ安全性を向上させるために、パッケージング機能への付加的な変更を含む場合がある。例えば、ｇａｇ上流のＨＩＶ配列は全て除去することができる。又、エンベロープ下流の配列も除去することができる。更に、ＲＮＡスプライシング及び翻訳を向上させるためにベクターを修飾する工程を行うこともできる。
【０１２９】
場合により、Ｄｕｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７２（１１）：８４６３−８４７１，１９９８に記載のもののような、条件付きパッケージング系が使用される。例えば、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７２（１２）：９８７３−９８８０に記載の通り、ＨＩＶ−１末端反復配列（ＬＴＲ）の欠失によってベクターのバイオセーフティーを改善する自己不活性化ベクター（ＳＩＮ）の使用も好ましい。ｔｅｔ誘導ＬＴＲを介する等の誘導ベクターも使用することができる。
【０１３０】
本発明の実施における使用のための任意のベクターは、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ＲＳＶ  ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ  ＬＴＲ、及びＰＧＫプロモーター；ｍＴＴＲ、ＴＫ、ＨＢＶ、ｈＡＡＴ、調節可能又は誘導性プロモーター、エンハンサー等を含む組織又は細胞型特異的プロモーターの構成的プロモーター等の非相同制御配列を含む。好ましいプロモーターは、ＬＳＰプロモーター（Ｉｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ８Ｓ２：２３−３．１９９７）、ＥＦ１−αプロモーター（Ｋｉｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ９１（２）：２１７−２３，１９９０；及びＧｕｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３（９）：８０２−１０，１９９６）を含む。最も好ましいプロモーターは、伸長因子１−αプロモーター（ＥＦ１ａ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１プロモーター（ＰＧＫ）、サイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ）、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、サイトメガロウイルスエンハンサー／トリβアクチンプロモーター（ＣＡＧ）、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ），トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＭＮＤプロモーター、サルウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）、及びＣＫ６プロモーターを含む。他のプロモーター／エンハンサーは、構成的プロモーター活性の強度、標的組織に対する特異性、又は当該技術分野で理解されるように、発現に対する所望の制御に関連する他の因子に基づいて選択することができる。これらの配列及び多数の付加的なプロモーターは、当該技術分野で既知である。関連する配列は、公開データベースから容易に得て、本発明の実施における使用のためのベクターに組み込まれる場合がある。
【０１３１】
本発明は、レンチウイルスベクター、特に、ヒト及び他の哺乳動物細胞を選択的に感染させることが可能な高力価組換えレンチウイルスを産生できるパッケージング系及びプロデューサー細胞を使用する。一実施形態において、本発明の組換えレンチウイルスは、５×１０５感染単位／ｍＬを超える力価を有する。好ましくは、組換えレトロウイルスは、１×１０６感染単位／ｍＬを超える力価を有する。通常は、力価は、２９３Ｔ、ＨｅＬａ、又はＨＵＨ７ヘパトーマ細胞で従来の感染性試験によって決定される。
【０１３２】
本発明は、又、複数の目的のポリペプチド又はタンパク質のコード配列の制御発現のための遺伝子調節系の封入を熟考する。遺伝子調節系は、特定の１つ以上の遺伝子の調節発現に有用である。１つの例示的な手法において、遺伝子調節系又はスイッチには、リガンド結合ドメイン、転写活性化ドメイン、及びＤＮＡ結合ドメインを有するキメラ転写因子を含む。これらのドメインは、殆ど全ての供給源から得られる場合があり、新規のタンパク質を得る種々の方法の何れかにおいて組み合わせる場合がある。調節可能な遺伝子系も、キメラ転写因子と相互作用するＤＮＡ応答エレメントを含む。このエレメントは、調節される遺伝子に隣接して位置する。
【０１３３】
本発明の実施において使用される場合がある例示的な遺伝子調節系は、以下を含む：ショウジョウバエエクジソン系（Ｙａｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９３：３３４６（１９９６））、カイコエクジソン系（Ｓｕｈｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９５：７９９９（１９９８））、誘導物質としてＲＵ−４８６を使用する（Ｏｓｔｅｒｗａｌｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９８（２２）：１２５９６−６０１（２００１））Ｖａｌｅｎｔｉｓ  ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ（登録商標）合成プロゲステロン受容体系；標的遺伝子の転写を調節する（転写開始／停止）ためにテトラサイクリン（Ｔｃ）又は例えば、ドキシサイクリンの類似体等の小分子を使用（Ｋｎｏｔｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３２（４）：７９６，７９８，８００（２００２））する、ＴｅｔＴＭ  ＆  ＲｅｖＴｅｔＴＭシステム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；２つの細胞内分子を結合する（各分子は転写活性化因子又はＤＮＡ結合タンパク質の何れかに結合する）ために小分子の使用に基づくＡＲＩＡＤ調節技術。これらの成分が一体となると、目的の遺伝子の転写が活性化される。ＡＲＩＡＤには２つの主要な系がある。即ち、ホモ二量体化をベースした系及びヘテロ二量体化をベースにした系である（Ｒｉｖｅｒａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ，２（９）：１０２８−１０３２（１９９６）；Ｙｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：８８−９１（２０００））。何れも本発明のベクターに組み入れ可能である。
【０１３４】
本発明の実施における使用に好ましい遺伝子調節系は、ＡＲＩＡＤ調節技術及びＴｅｔＴＭ  ＆  ＲｅｖＴｅｔＴＭシステムである。
タンパク質又はポリペプチドコード配列を含む核酸コンストラクトの細胞への送達
異種タンパク質若しくはポリペプチドをコードする核酸配列、及び単独の自己プロセシング開裂部位又は更なるタンパク質分解性開裂部位をコードする配列との組み合わせを含む、本発明のベクターコンストラクトは、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ体細胞の細胞による非相同コード配列の発現のために、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏベクター形質導入細胞による組換えポリペプチドの産生のために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、若しくはｉｎ  ｖｉｖｏで細胞に導入されることが可能である。
【０１３５】
本発明のベクターコンストラクトは、当該技術分野で既知の標準的な手法を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで細胞に導入されることが可能である。このような方法は、リン酸カルシウムを使用する形質移入、培養細胞への微量注入法（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ  ２２：４７９−４８８（１９８０））、電気穿孔法（Ｓｈｉｇｅｋａｗａ，ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎ．６：７４２−７５１（１９８８））、リポソーム媒介遺伝子導入（Ｍａｎｎｉｎｏ，ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎ．６：６８２−６９０（１９８８））、脂質媒介形質導入（Ｆｅｌｇｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７（１９８７））、高速マイクロプロジェクタイルを使用する核酸送達（Ｋｌｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：７０−７３（１９８７））を含む。
【０１３６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏ発現では、機能タンパク質を発現できる何れかの細胞が使用される場合がある。タンパク質発現に使用される細胞及び細胞系の例は、数多くが当該技術分野で既知である。例えば、原核細胞及び昆虫細胞は、発現のために使用される場合がある。更に、酵母菌等の真核微生物も使用される場合がある。原核細胞系、昆虫細胞系、及び酵母系における組換えタンパク質の発現は、一般的に当該技術分野で既知であり、本発明の組成物及び方法を使用してタンパク質又はポリペプチドの発現に適応させる場合がある。
【０１３７】
発現に有用な例示的な宿主細胞には、線維芽細胞等の哺乳動物細胞；ヒツジ、ブタ、マウス、及びウシ細胞等の非ヒト哺乳動物由来細胞；並びに虫細胞等が更に含まれる。哺乳動物細胞の具体例には、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、２９３細胞、ＮＳＯ細胞、３Ｔ３線維芽細胞、Ｗ１３８細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＰＧ２細胞、ＤＵＸ細胞、及びＭＤＣＫ細胞が含まれる。
【０１３８】
宿主細胞は、従来の養分培地で培養され、プロモーターを誘導する、形質転換体を選択する、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅させるのに適切に修飾される。哺乳動物宿主細胞は、種々の培地で培養される場合がある。ハムＦ１０培地（Ｓｉｇｍａ）、最少必須培地（ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）等の市販の培地は、通常、宿主細胞を培養するのに好適である。所与の培地は、通常、ホルモン及び／又は他の成長因子（インスリン、トランスファー因子、又は上皮細胞増殖因子等）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩等）、緩衝剤（ＨＥＰＥＳ等）、ヌクレオシド（アデノシン及びチミジン等）、抗生物質、微量元素、及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて追加される。その他何れかの必要な追加も、当業者に既知であろう適切な濃度で含まれる場合もある。温度、ｐＨ等、特定の細胞系に対する適切な培養条件は、例えば、ウェブサイト「ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ＳｅａｒｃｈＣａｔａｌｏｇｓ／ＡｌｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ．ｃｆｍ」より入手可能なＡＴＣＣカタログに多数の細胞系培養のための培養条件が示唆されると共に、一般的に当該技術分野で既知である。
【０１３９】
本発明のレンチベクターは、又、動物モデル又はヒト被験者において複数のタンパク質又はポリペプチドを発現させるために同義遺伝子を送達するための種々の経路を介して（例えば、皮内に、静脈内に、腫瘍内に、脳内に、門脈内に、腹腔内に、筋肉内に、膀胱内に等）ｉｎ  ｖｉｖｏで投与される場合もある。投与経路に依存して、治療用タンパク質は、その効果を局所的に（例えば、脳又は膀胱内）又は全身的に（他の投与経路）誘導する。本発明のベクターにおけるタンパク質又はポリペプチドのオープンリーディングフレームへの組織特異的プロモーター５’の使用は、ベクターによってコードされる複数のタンパク質又はポリペプチドの組織特異的発現をもたらすために使用される場合がある。
【０１４０】
組換えレンチベクターを標的細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、又はｉｎ  ｖｉｖｏで導入する種々の方法は、既に記載されており、当該技術分野で既知である。例えば、本発明の組換えベクターのｉｎ  ｖｉｖｏ送達は、脳、肝臓、血管、筋肉、肺、及び皮膚を含むがこれらに限定されない広範な器官を標的とする場合がある。ｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子導入の場合、標的細胞は宿主細胞から除去され、及び本発明の組換えベクター並びに当該技術分野で周知の方法を使用して、研究室で遺伝子修飾される。
【０１４１】
本発明の組換えベクターは、上述の様式を含むがこれらに限定されない従来の投与様式を使用して投与することができる。本発明の組換えベクターは、溶液及び懸濁液、微小胞、リポソーム、並びに注射用液又は注入液等、種々の製剤の何れかで提供される場合がある。好ましい形態は、投与様式及び治療への応用に依存する。送達経路に適切な形態は、当業者であれば通常知り得る知識を使用して容易に決定される場合がある。
【０１４２】
組換え免疫グロブリン産生の現在の方法は、ＣＨＯ細胞、その誘導体；ＮＳＯ細胞；ＰｅｒＣ．６細胞；及びＨＥＫ細胞の使用に依存する。組換え免疫グロブリン産生のために現在最も使用される方法は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）等の増幅可能な遺伝子を含むベクターコンストラクトの使用に基づく。結果として、組換えタンパク質産生のプロセスは、以下の工程を必要とする：（１）形質移入；（２）ネオマイシン等の薬物を含有する培地での培養による選択；（３）コンストラクト内のＤＨＦＲの存在及びほぼ致死濃度のメトトレキサートを含有する培地での培養に基づく免疫グロブリンコード配列の増幅；（４）生存細胞のスクリーニング；及び（５）濃度を増加させたメトトレキサート含有培養培地での更に段階的な増幅；及び（６）生存細胞を同定するために、各増幅手順での更なるスクリーニング。
【０１４３】
ＤＨＦＲ系を使用する、免疫グロブリンをコードする核酸のゲノムのコピー数は、メトトレキサート（ＤＨＦＲの活性を遮断する薬物）に曝された細胞の選択圧によって増加し、より高い抗体発現という結果をもたらす。ほぼ致死濃度のメトトレキサートへの曝露から２〜３週間後、大多数の細胞は死亡するが、ＤＨＦＲを過剰産生する細胞は、生き残る。通常は、メトトレキサート含有培地で複数回数の段階的な増幅が必要であり、少なくとも２０ｐｇ／ｃ／日（１日当たりの各細胞のｐｇ）を産生するクローンを選択するには、６〜１２ヶ月要する。少なくとも２０ｐｇ／ｃ／日を産生するクローンを選択するためには、しばしば、２０００〜４０００もの数の初期クローンをスクリーニングする。
【０１４４】
段階的なメトトレキサート増幅から採取する異なる細胞クローンのタンパク質発現レベルは、大きく異なる可能性がある。そのため、高プロデューサー細胞系の同定は、退屈で、大きな労働力を要するプロセスである。幾つかのクローン単離方法が存在し、最も人気のあるのは、限定希釈クローニングである。
【０１４５】
対照的に、本発明の方法は、メトトレキサート含有培地の増幅を必要とせず、従って、複数回数の連続的培養及びスクリーニングを回避する。細胞を複数回再感染させるレンチウイルスベクターの感染効率及び能力は、抗体２Ａ融合タンパク質をコードする核酸の多数回のゲノムコピーを含有する細胞系の迅速な産生を可能する。結果として、少なくとも２０ｐｇ／ｃ／日を産生するクローンを選択するためのスクリーニングで必要なクローンは１０倍〜５０倍より少なく、クローン選択プロセスは約１０ヶ月も短縮される。
【０１４６】
モノクローナル抗体のような産物のために、細胞系は、商業生産の適切対象となる少なくとも２０ｐｇ／細胞／日を産生する必要がある。高速の増殖と高い生産性の組み合わせることにより、細胞系は商業生産の対象となる。更に重要な考慮は、長期間にわたる、及び拡大時の細胞系の安定性である。
【０１４７】
ＧＳ−ＮＳ０等の一部のクローン細胞系は、長期間培養の後に不安定になることが分った。更に、長期間の培養中にメトトレキサートが存在することは、細胞内に望ましくない遺伝的異質性を生じることが示された。
【０１４８】
本発明は以下の点において利点を提供する：１）プロセスは、発現コンストラクトにジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）等の増幅可能な遺伝子の封入、又は増幅のたにメトトレキサート等の薬剤の使用に依存しない；２）結果として得られる細胞系は、メトトレキサート抵抗性である必要がなく、それによって培養培地に外来性メトトレキサートを添加する必要性を排除し、及び大量培養ができる付加的な細胞系が本発明の方法で使用されることを可能するために、プロセスは費用が安くなる；３）現在の市販プロセスよりも少ない工程を必要とするためにプロセスでのスクリーニング時間が有意に短縮される。プロセスが必要とするのは、ネオマイシン等の薬物を含有する培地での形質移入及び選択だけである。増幅又はその後のスクリーニング回数が不要である；４）細胞系は、ベクターのゲノムコピー回数を迅速に上げるために、好ましくは、形質移入される、又は短期間で複数回感染される。形質移入又は感染の回数は、発現する抗体のコード配列、選択するプロモーター強度、及び発現のために使用される親細胞系に部分的に応じて異なる可能性がある。幾つかの実施形態において、少なくとも３回の形質移入又は感染（「Ｐｉｎｇ」）が、レンチウイルスベクターによる非相同コード配列の最適発現を得るために、使用される；５）高プロデューサークローンの選択のための時間は、一般的な６〜１２ヶ月から１〜２ヶ月に大幅に低減される；並びに６）長期間にわたる、及び拡大時のプロデューサー細胞系の不安定性は、培養培地内のメトトレキサートの非存在によって問題になる可能性は低い。
【０１４９】
好ましい一実施形態において、免疫グロブリンの産生では、本発明のクローン細胞系が、少なくとも２０ｐｇ／細胞／日、好ましくは少なくとも２５、３０、３５、４０、４５又は５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０又は２００ｐｇ／細胞／日を産生する。別の好ましい実施形態において、少なくとも２０ｐｇ／細胞／日を産生するクローンの選択の時期は４ヶ月未満であり、好ましくは３ヶ月未満、より好ましくは２ヶ月未満である。更に別の好ましい実施形態において、培養温度は少なくとも３１℃である。
【０１５０】
好ましい一実施形態において、免疫グロブリン産生のために、本発明のクローン細胞系は、免疫グロブリン２Ａコンストラクトをコードする核酸を含むレンチウイルスベクターのゲノムコピー数を少なくとも２０、好ましくは少なくとも２５、３０、３５、４０、４５又は５０、６０、７０、８０、９０、１００含む。
【０１５１】
更に別の好ましい実施形態において、本発明のクローン細胞系は、少なくとも２０ｐｇ／細胞／日、好ましくは少なくとも２５、３０、３５、４０、４５又は５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０又は２００ｐｇ／細胞／日を産生し、且つ免疫グロブリン２Ａコンストラクトをコードする核酸を含むレンチウイルスベクターのゲノムコピー数を少なくとも２０含む。
【０１５２】
組換えタンパク質及びポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ産生において実現される本発明の数多くの利点には、患者における複数の組換えタンパク質又はポリペプチドＯＲＦの長期間及び持続発現のための単一ベクターの投与；生物活性を有する複数の組換えタンパク質又はポリペプチドＯＲＦのｉｎ  ｖｉｖｏ発現；及びヒト細胞内で産生される組換えタンパク質又はポリペプチドの天然の翻訳後修飾が含まれる。
【０１５３】
好ましい一態様は、組換えタンパク質又はポリペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生のための本発明の組換えベクターコンストラクトの使用である。組換えタンパク質産生の方法は、当該技術分野で周知であり、及び本発明のベクターコンストラクトを含む自己プロセシング開裂部位は、このような標準的な方法を使用する組換えタンパク質及びポリペプチドの発現のために利用される場合がある。
【０１５４】
本発明の一例示的態様において、細胞へのレンチベクター導入又は投与は、以下によって実行される。
（１）１回以上の形質移入/形質導入又は感染により細胞にレンチベクターを導入又は投与する；
（２）組換えタンパク質又はポリペプチドを発現する細胞を選択する条件下（例えば、ネオマイシン等の選択薬剤を含有する培地で）で、感染した細胞を培養する；
（３）組換えタンパク質又はポリペプチドの発現を評価する；及び
（４）組換えタンパク質又はポリペプチドを収集する。
【０１５５】
好ましい一実施形態において、細胞は、少なくとも３回、より好ましくは，少なくとも４若しくは５回、形質移入又は感染される。
【０１５６】
本発明の方法及び組成物
本発明は、多量体タンパク質の複数のドメイン又は鎖の発現のための改変レンチウイルスベクターに関する。多量体タンパク質の一態様は免疫グロブリンであり、並びに全長抗体重鎖及び軽鎖のコード配列は、単一のプロモーターによって駆動される単一のオープンリーディングフレームを含むレンチベクターを使用して発現され、ベクターは重鎖及び軽鎖コード配列の間に自己プロセシング開裂部位又は配列を含む。別の態様において、タンパク質は、多量体の異種タンパク質であり、並びに全長コード配列は、単一のプロモーターによって駆動される単一のオープンリーディングフレームを含むレンチベクターを使用して発現され、ベクターは１つ以上の自己プロセシング開裂部位又は配列を含む。
【０１５７】
更に別の態様において、本発明は、複数の改変レンチベクターを使用する組換えタンパク質の高レベル発現の方法であって、各レンチベクターが、単一のプロモーターによって駆動される多量体タンパク質の単一のオープンリーディングフレームをコードする、方法を提供する。例えば、生物活性を有する抗体の高レベル発現をもたらすように、同一の細胞を感染させるために使用される。
【０１５８】
好ましい一実施形態において、宿主細胞の個々の集団は、レンチウイルス転移ベクターを形質導入され、ベクターによってコードされた異種タンパク質コード配列は、同一ではなく、及び各レンチベクターは、発現制御配列に操作可能に結合する異種タンパク質の単一のドメイン又は鎖のコード配列を含む。例えば、細胞集団は、発現制御配列に操作可能に結合する免疫グロブリン軽鎖コード配列等の異種タンパク質コード配列を含む転移ベクターを導入され、及びこの集団又はそれに由来するクローンは、発現制御配列に操作可能に結合する免疫グロブリン重鎖等の第２の異種タンパク質コード配列を含む第２の転移ベクターを形質導入される。結果として得られる集団は、多量体タンパク質の産生に適切な条件下で培養される。
【０１５９】
別の好ましい実施形態において、転移ベクターは、更に、後に抗体重鎖配列（Ｈ）、フューリン開裂部位（Ｆ）、口蹄疫ウイルス（２Ａ）由来の２Ａ自己プロセシング配列、及び抗体軽鎖配列（Ｌ）を伴う第１の強力なプロモーター（例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、又はＣＡＧ）を含む。結果として得られるコンストラクトを、Ｈ−Ｆ−２Ａ−Ｌと命名する。２Ａペプチド配列は、図１に示すように翻訳プロセスの間、抗体分子の２本のポリペプチド鎖の産生を促進する「開裂」部位を提供する。フューリン開裂部位は、第１の遺伝子（即ち、このコンストラクトの重鎖）のＣ末端に結合する２Ａ残基を除去するために抗体分泌経路の間、第２の開裂を提供する。更に別の好ましい実施形態において、転移ベクターは、更に、後に抗体軽鎖配列（Ｌ）、フューリン開裂部位（Ｆ）、口蹄疫ウイルス（２Ａ）由来の２Ａ自己プロセシング配列、及び抗体重鎖配列（Ｈ）を伴う第１の強力なプロモーターを含む。結果として得られるコンストラクトを、Ｌ−Ｆ−２Ａ−Ｈと命名する。
【０１６０】
組換えレンチウイルス粒子を、ヒト又はハムスター細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質導入するために産生して、使用した。これらの上清からの抗体発現のためのＥＬＩＳＡ検定は、ＣＡＧ  Ｈ−Ｆ−２Ａ−Ｌレンチウイルス粒子を形質導入された２９３及びＣＨＯの両細胞で抗体が高レベルで産生されたことを明らかにした。Ｈ−Ｆ−２Ａ−Ｌコンストラクトから発現した重鎖及び軽鎖の比率は、約１：１であった。最終抗体は、抗体結合検定及び中和検定に基づいた完全な生物活性を保持した。
【０１６１】
本発明は、レンチウイルスベクターを形質導入された哺乳動物細胞由来の全長モノクローナル抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ）又は抗体フラグメントの発現、並びに任意のヘテロ二量体たんぱく質の発現に有用性を見出す。高い形質導入有効性及び遺伝子発現レベルを考慮すると、レンチウイルスベクターは、抗体等の高レベルの組換えタンパク質を発現する安定した細胞系を迅速に産生できる。好ましい一実施形態において、レンチウイルスベクターは、自己プロセシング部位又は配列を含む。
【０１６２】
本発明の目的は、一連の実験によって達成された。その一部を以下の非限定的な実施例を通じて説明する。
【実施例】
【０１６３】
（実施例１）
２Ａ抗体発現コンストラクトの形質移入プラスミドの構成及び産生：
ラット抗マウスＶＥＧＦＲ２及びヒト抗ＫＤＲ抗体をコードするレンチベクターコンストラクトを産生するために、抗体重鎖、フューリン開裂部位、２Ａ配列、及び抗体軽鎖をコードするＤＮＡフラグメントをＰＣＲ伸長によって連結した。フューリン開裂部位ＲＡＫＲ（配列番号１０）、及びＦＭＤＶ２Ａ配列ＡＰＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号６）を含むＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲによってクローン化プラスミドから増幅した。フラグメントの重鎖及び軽鎖を、全長抗体の重鎖又は軽鎖をそれぞれコードするクローン化プラスミドから増幅した。ＰＣＲの間、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレオチダーゼ部位を重鎖の５’末端及び軽鎖の３’末端に付加した。融合重鎖−フューリン開裂部位−２Ａ−軽鎖ＤＮＡフラグメントをＥｃｏＲＩで消化して、アガロースゲルを介して精製した。精製したＤＮＡフラグメントを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用してＥｃｏＲＩ部位でｐＤＨＦＲプラスミドに挿入した。ｐＤＨＦＲは、抗体コード配列に操作的に結合するＣＡＧプロモーター及びＤＨＦＲ遺伝子に操作的に結合するＳＶ４０プロモーターを含む。未変性シグナルペプチド（リーダー）を、合成時にポリペプチドの分泌を促進させるために、重鎖又は軽鎖にそれぞれ入れた。更に、コンストラクトは、高レベルの遺伝子発現を確実にするために、ポリＡ配列を含む（図２）。抗体軽鎖を駆動するＣＡＧプロモーター及び抗体重鎖を駆動する第２のＣＡＧプロモーターを有するｐＤＨＦＲ二重ＣＡＧ抗体発現プラスミドも構築した（図２）。このプラスミドは、ｐＤＨＦＲと同一のプラスミドバックボーンを含むが、２つのＣＡＧプロモーターをコードする。多重クローニング部位及びポリＡシグナル配列は、各ＣＡＧプロモーター配列に続く。二重プロモーター抗体プラスミドを産生するために、抗体重鎖又は軽鎖コード配列を、抗体重鎖又は軽鎖配列をそれぞれ含むクローン化プラスミドから増幅した。抗体軽鎖配列を、多重クローニング部位を使用して第１のＣＡＧプロモーターの後に、重鎖を第２のＣＡＧプロモーターの後に挿入した。
レンチウイルスプラスミド：
ＫＤＲ及びＤＣ１０１ＨＦ２ＡＬ抗体をコードするヌクレオチドコード配列を、当業者によって日常的に使用される標準的な分子生物技法を使用して第３世代のレンチウイルス転移ベクターにクローン化した。第３世代のレンチウイスベクター系については、既に記載されている（Ｄｕｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３−８４７１，１９９８）。簡単に言うと、転移ベクターは、５’キメラＲＳＶ／ＬＴＲプロモーター、ｃＰＰＴ（Ｚｅｎｎｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １０１：１７３−１８５，２０００）、ＣＡＧプロモーター（Ｍｉｙａｚａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ７９：２６９−２７７，１９８９）、及びＳＩＮ  ＬＴＲ（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３−９８８０，１９９８）を含む。これらの研究のために、抗体の発現を駆動するプロモーターは、ＣＭＶエンハンサー、トリβアクチンプロモーター及びスプライス供与部位、並びにウサギβグロビンスプライス受容部位（ＣＡＧ）で構成される。レンチウイルス転移ベクターの模式図を、図２に表示する。
【０１６４】
レンチウイルス産生：
ベクター産生、濃度、ｐ２４解析、及び力価検定を、既述の通り実施した（Ｄｕｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３−８４７１，１９９８）。簡単に言うと、ベクターを、６．５μｇのｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ、２．５μｕｇのｐＲＳＶ−Ｒｅｖ、３．５μｇのｐＭＤ２．ＶＳＶＧ−Ｅｎｖ、及び１０μｇの転移ベクターを使用して１０ｃｍシャーレ内で一過性形質移入によって調製した。ベクター粒子を、２４時間後に採取して、貯蔵し、０．２ｕｍ酢酸セルロースフィルターで濾過し、ＳＷ２８スウィング型ローターで、１９，５００ｒｐｍ（５０，０００ｇ）速度で２時間２０分間、超遠心分離によって濃縮した。ペレットを、４０ｍｇ／ｍＬラクトースを含有するＰＢＳで再懸濁させ、−８０℃でアリコートに保管した。ｇａｇ  ｐ２４タンパク質の検出を、アライアンスＨＩＶ−１  ｐ２４ＥＬＩＳＡキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して評価した。
【０１６５】
ＡＡＶ産生：
組換えＡＡＶウイルスを、Ｓｎｙｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６（Ｉｎ：  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｓｅｉｄｍａｎ  ＪＳ，（ｅｄｉｔｏｒ），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；１−２４）に記載の標準的な手順に従って調製した。簡単に言うと、２９３のサブコンフルエントな細胞を、リン酸カルシウム法を使用して、ベクターコンストラクトｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ＫＤＲ（２．１３）−ＨＦ２ＡＬ、ＡＡＶヘルパープラスミドｐＵＣ−ＡＣＧ、及びアデノヘルパープラスミドｐＸＸ６を同時導入した。形質移入から８時間後、培地を新鮮な培養培地と置換して、細胞を７２時間培養した。その時点で細胞を採取して、３回の凍結融解サイクルで溶解した。可溶化液を、核酸を消化させるために３７℃で１５分間Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（ＥＭ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ［米国ニューヨーク州ホーソン］）で処理し、細胞残屑を除去するために遠心した。除去した細胞可溶化液を硫酸アンモニウムで分画し、及びｒＡＡＶビリオンを２連続的ＣｓＣｌ勾配で単離した。ｒＡＡＶを含む勾配分画を、ＣａＣｌ２及びＭｇＣｌ２を含有する無菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で透析し、−８０℃で貯蔵した。ＡＡＶ力価を、デオキシリボヌクレアーゼＩ及びプロテイナーゼＫで処置した後、ドットブロット法及び定量ＰＣＲ法により（Ｈａｒｄｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，２００４  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ（１１）：２０４−２１３に記載される）ゲノム等価物として算出した。
【０１６６】
形質移入、選択、及びクローニング：
ＣＨＯＤ−細胞を、形質移入の２４時間前に１０ｃｍシャーレに３×１０６播種した。シャーレ当たり１２μｇのＤＨＦＲ含有プラスミドの形質移入を、無血清ＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で製造者のプロトコルに従いＦｕｇｅｎ６試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を使用して行った。形質移入から５〜６時間後、培地を通常の増殖培地（Ｌ−グルタミン２ｍＭ、グリシン１０μｇ／ｍＬ、ヒポキサンチン１５μｇ／ｍＬ、チミジン５μｇ／ｍＬ、及びウシ胎児血清（ＦＢＳ）１０％を補充した５０：５０Ｆ１２／ＤＭＥＭ培地）と置換し、３７℃で、５％ＣＯ２で培養した。形質移入から４８〜７２時間後、ＤＨＦＲ選択を、ＩＭＤＭ培地（ＪＲＨ）でＬ−グルタミン２ｍＭ及び透析ＦＢＳ１０％を使用して行った。選択から１０日後、クローンを９６ウェルプレートに採取し、２〜３日後にプレートを２つにした。２４時間上清を２つのプレートの１つから収集し、抗体産生のためにＥＬＩＳＡに従って、各ウェルの生存細胞の数をＣＣＫ−８増殖検定（Ｄｏｊｉｎｄｏ）によって決定した。ＥＬＩＳＡ及びＣＣＫ−８検定のデータを使用して、各クローンの抗体産生レベルをｐｇ／細胞／日で決定した。クローン＞１ｐｇ／細胞／日を、更なる性質決定のために第２プレートから拡大させた。メトトレキサート（ＭＴＸ）増幅のために選択したクローン又は集団を、１０ｃｍシャーレ内のＭＴＸ含有培地に１シャーレ当たり５×１０５細胞で開始した。ＭＴＸ濃度を２５ｎＭから５０ｎＭ、１００ｎＭ等へと上昇させた。各選択での細胞を２〜３継代させ、より高濃度の選択培地に移した。各選択後に細胞の集団を保存した（凍結）。
【０１６７】
レンチウイルス感染及びクローニング：
ＣＨＯＤ−細胞を、適切な量のレンチベクター及びポリブレンを８μｇ／ｍＬで含有する培養培地２ｍＬを使用して、６ウェルプレートに１ウェル当たり１×１０５細胞で播種した。感染から２４時間後、培地を変えた。細胞がコンフルエントに達した時点で、それらを１０ｃｍシャーレに拡大した。感染の連続的回数を２〜７日の間隔で実施した。細胞を限界希釈法でサブクローン化した。クローンは形質移入方法に記載の通り採取及び選別した。
クローンの作製方法：
異なるベクター系の相互効力を決定するために、ラット抗マウスＶＥＧＦＲ２抗体（ＤＣ１０１）及びヒトＩｇＧ１抗ＫＤＲ抗体（２．１３）を発現する細胞系を作製する種々の方法の比較を、以下を含めて評価した。
（１）重鎖及び軽鎖が単一のプロモーターの制御下で発現される、２Ａ配列を含むプラスミドを使用する形質移入、その後メトトレキサートでの増幅が続く；
（２）抗体重鎖及び軽鎖を発現させるために二重プロモーター含むプラスミドを使用する形質移入、その後メトトレキサートでの増幅が続く；
（３）重鎖及び軽鎖が単一のプロモーターの制御下で発現される、２Ａ配列を含むＡＡＶコンストラクトによる感染；及び
（４）重鎖及び軽鎖が単一のプロモーターの制御下で発現される、２Ａ配列を含むレンチウイルスコンストラクトによる感染。
（実施例２）
安定した抗体を産生する細胞系を作製するための異なる方法の比較
上述の通り、安定した抗体発現細胞系を、ＣＨＯＤ−細胞で二重プロモーター抗ＫＤＲプラスミド又は２Ａ抗ＫＤＲプラスミドによるＦｕｇｅｎｅ６形質移入によって作製した。或いは、ＣＨＯＤ−細胞をＡＡＶ−２Ａ−抗ＫＤＲベクター又はレンチ−２Ａ−抗ＫＤＲベクターの何れかに感染させた。この実施例では、ＣＨＯＤ−細胞を、ｐ２４を５００ｎｇ含有するレンチ−２Ａ−ＫＤＲベクター上清で、１週間隔で５回（５×）感染させた。ＡＡＶ−２Ａ−ＫＤＲ感染を、１０５粒子／細胞のＭＯＩで３回実施した。形質移入した集団、レンチ４回及び５回感染集団、並びにＡＡＶ形質導入された集団を全てサブクローン化した。クローンを採取、選別し、上述のように拡大した。表２は、これら４つの方法を比較する。
【０１６８】
【化４】
2009502134.tif 000004
単一のプロモーターに操作的に結合し、更に自己プロセシング２Ａ配列を含む抗体重鎖及び軽鎖のコード配列を含むプラスミドによるＣＨＯＤ−細胞の形質移入は、形質移入及びスクリーニング後に、抗体重鎖及び軽鎖のコード配列の二重プロモーター制御発現に対する利点を示さなかったことを表３の結果は示す。或いは、単一のプロモーターに操作的に結合し、更に自己プロセシング２Ａ配列を含む抗体重鎖及び軽鎖のコード配列を含むレンチベクターコンストラクトによるＣＨＯＤ−細胞の４〜５回数の形質移入／形質導入は、１００％のクローン形質導入という結果になり、他の方法に比べて有意に高いレベルの抗体産生を有するより多い数のクローンをもたらした。この手法は、またスクリーニングに必要なクローンの数を低減させ、及び高発現クローンの単離に必要な時間を大幅に低減させた（図３）。レンチベクターによる形質導入の複数回数も、高レベルタンパク質発現という結果になるプロデューサー細胞でのコピー数を増加させた。最も高い発現レベルを有する１２のレンチクローンを１×１０７細胞／１０ｃｍシャーレで蒔き、３１℃で抗体発現を評価した（表３）。これらのデータは、評価した個々のクローン全てが高レベルの抗体を発現することを示す。
【０１６９】
【化５】
2009502134.tif 000005
クローンを産生する方法を比較する同様の実験を、ラット抗マウスＤＣ１０１抗体を使用して実施した。ＣＨＯＤ−形質移入を上述のように実施し、二重プロモーターＤＣ１０１プラスミドに関連する２Ａ  ＤＣ１０１プラスミドの形質移入後に、タンパク質発現を比較した。或いは、ＣＨＯＤ−細胞の５連続感染を１週間隔で、レンチ−２Ａ−ＤＣ１０１ベクター（２００ｎｇ  ｐ２４／感染）を使用して実施した。３例全てにおいて、クローンを単離して抗体発現を解析した。表４は、二重プロモーター（Ｈ＋Ｌ）プラスミドを有する２Ａ−ＤＣ１０１プラスミドの発現レベルを比較する。形質移入実験において２Ａコンストラクトに対する明らかな利点はなかった。一般的に、抗ＤＣ１０１抗体の発現レベルは、抗ＫＤＲ抗体よりも高い。レンチ−２Ａ−ＤＣ１０１集団の抗体発現は、形質移入した集団よりも遥かに高かった。又、試験したその他の系と比較すると、高い抗体発現レベル及び陽性クローンのより大きな頻度のために、選別する必要のあるクローンは少量であった。例えば、６ウェルプレートに拡大した際に、レンチウイルスクローンの全ては１ｐｇ／細胞／日を超える抗体を産生した。６ウェルプレートからレンチ−２Ａを最も多く産生するクローンのうち１０を、更なる解析のために１０ｃｍシャーレに拡大した（表５）。１０クローンの内の８クローンだけが１０ｐｇ／細胞／日を超えたが、＃４５及び＃５１の２クローンが、群を抜いて高い産生を示し、レンチ２Ａベクターによる形質導入の連続回数が、高発現クローンを得るために、少量のクローンのスクリーニングを実施する必要性をもたらすことを示した。この方法も、例えばＤＨＦＲを使用する等の増幅工程を必要としない。
【０１７０】
【化６】
2009502134.tif 000006
ＤＣ１０１抗体をコードする免疫グロブリン２Ａコンストラクトを含むレンチウイルスベクターを形質移入した細胞における組み込みゲノムコピーの数も、サザンブロット解析によって調べた（図６）。ゲノムＤＮＡを、未処理のＣＨＯ細胞及び約２０〜４０ｐｇ／細胞／日を発現する５回形質導入された２クローン（４５及び５１クローン）から単離した。ゲノムＤＮＡを、標準的条件下で制限酵素ＥｃｏＲＩを使用して消化し、コピー数を推定するためにゲノム量を増加させた既知の制限ＤＮＡの存在下で１％アガロースゲル上で電気泳動によって分離させたＤＮＡフラグメントを、更なる解析のためにナイロンフィルターに移した。フィルターを、ＤＣ１０１抗体をコードする全長ヌクレオチド配列を含む、２．２Ｋｂの放射性標識ＤＮＡフラグメントにハイブリダイズさせた。結合プローブの位置を、オートラジオグラフィーを使用して可視化し、ホスフォイメージャー（Ｍｏｌｅｃｕｒａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ［米国カリフォルニア州サニーベール］）を使用して定量化した。
【０１７１】
図５に示すように、放射性標識プローブは、ＤＣ１０１抗体をコードするヌクレオチド配列を含む単一の２．２Ｋｂフラグメントにハイブリダイズする。クローン４５及び５１は、又、単一の２．２Ｋｂバンドだけを示し、且つ約３３ゲノムコピー数のレンチウイルスベクターコンストラクトを含む。この数は、上述のＴａｑＭａｎ結果と一致する。従って、５週期間以内に３３コピーの抗体コード配列を含む高プロデューサー細胞系を、薬物により増幅させることなく調製される場合がある。
【０１７２】
ＣＨＯＤ−細胞に、３日間隔でＤＣ１０１をコードする２００ｎｇのレンチウイルスベクターｐ２４を４回、７回、又は９回形質移入した。形質移入した細胞からの集団をサブクローン化し、約１００〜１６０クローンを９６ウェルプレートに拡大して、ＤＣ１０１発現レベルを決定するために上清をＥＬＩＳＡにより選別した。細胞数をＣＣＫ８検定により決定した。約５０の高発現クローンを選択して、６ウェルプレートに拡大し、産生される抗体量（ｐｇ／細胞／日）を各クローン対して決定した（図６）。形質移入の数が増加するにつれて、抗体を上昇するレベルで発現する細胞（例えば４回及び９回クローンの抗体産生のｐｇ／細胞／日を比較する）の数に随伴性の増加が見られた（図６）。更に、９回の集団において形質移入した細胞の約５０％が、３０ｐｇ／細胞／日より多く発現し、それによって組換え抗体の市販に関連する量を発現することができる細胞系を同定するための時間及び選別されるべきクローンの数を大幅に低下させた。
（実施例３）
レンチウイルスコンストラクトによる形質導入後の異なる細胞型由来の抗体発現レベルの実証
抗体発現レベルを、変数の数：異なる細胞型、異なるプロモーター、及び異なるレンチコンストラクト、を考察しながら、レンチヒト抗ＫＤＲ及びレンチラット抗ＶＥＧＦＲ２（ＤＣ１０１）に関して評価した。試験した異なる細胞型は、ＣＨＯＤ−細胞、ＰｅｒＣ６細胞、及びＨｕＨ７細胞であった。異なるプロモーターは、ＣＡＧ、ＣＭＶ，及びＭＮＤであった。
【０１７３】
検定のために、ＣＨＯＤ−細胞、ＰｅｒＣ６細胞、又はＨｕＨ７細胞を、適切な量のレンチベクター及びポリブレンを８μｇ／ｍＬで含有する培養培地２ｍＬを使用して、６ウェルプレートに１ウェル当たり１×１０５細胞で播種した。上述のように感染を進行させた。感染から２４時間後培地を変えた。細胞が８０％コンフルエンスに達するまで、それらを６ウェルプレートで維持した。次いで培地を２４時間で新にし、各ウェルから上清を収集した。各ウェルの細胞数を血球計数器で決定した。抗体の発現レベルをＥＬＩＳＡで決定した。
【０１７４】
図４は、レンチ−２Ａ−抗ＤＣ１０１に感染させた３つの細胞系（ＣＨＯＤ−、ＰｅｒＣ６、ＨｕＨ７）からの抗体産生を比較する。図７は、ＣＭＶプロモーターを使用するレンチ−２Ａ−抗ＫＤＲによる感染後、抗体が、同一の細胞系で発現されることを示す。
（実施例４）
レンチベクター量の変更及び感染間隔の変更により、抗体発現レベルの上昇、クローンの同定時間の短縮が可能
ＣＨＯＤ−細胞をレンチ−２Ａ−ＤＣ１０１ベクターに連続して感染させる。１週間隔で行った形質導入を２〜３日間隔で行った形質導入と比較した。感染を上述のように実施した。各感染の後、集団を保存して、拡大し、記載の通り抗体発現を検定した。更に、各細胞集団をＴａｑＭａｎ  ＰＣＲによってレンチコピー／細胞の数に関して解析した（表６）。
【０１７５】
【化７】
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まとめると、これらの結果からは、レンチベクターによる連続的形質導入により、高レベルの抗体を産生する抗体プロデューサークローンの数が増大することが示唆されている。組み込まれるレンチベクターコピー数は、各形質導入と共に増加し、且つ集団の抗体発現上昇と相関する。興味深いことに、感染の間の時間が減少すると、抗体発現レベルにプラス効果が生じた。更に、感染の間の間隔を１週間から２〜３日へと短くすると、抗体発現は、約２倍増加し、感染の全プロセスは、１週間短縮された。
（実施例８）
カルボキシペプチダーゼによるＣ末端のフューリン開裂部位由来の余分なアミノ酸の除去
フューリン開裂後タンパク質のＣ末端に新たに露出した塩基性アミノ酸は、カルボキシペプチダーゼによって除去できることが示されており、抗体重鎖のＣ末端でフューリン開裂部位に由来する全ての添加されたアミノ酸は、塩基性アミノ酸、即ちＲ又はＫだけからなるフューリン開裂部位を使用して除去できると、本出願者は仮定した。幾つかのフューリン開裂部位を全ての塩基性アミノ酸で試験した際に、抗体重鎖のＣ末端の最後のアミノ酸Ｋが欠失し、並びに抗体重鎖及び軽鎖がフューリン開裂部位ＲＫＲＲ及び２Ａ配列に結合された、１つのコンストラクトが発生した。プラスミドＤＮＡを１０ｃｍの組織培養シャーレ内でＣＨＯ細胞に形質移入し、及び抗体タンパク質を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって上清から精製した。
【０１７６】
精製したＩｇＧタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、及び重鎖バンドをゲルからスライスした。次いで重鎖タンパク質を臭化シアン（ＣＮＢｒ）で開裂し、結果として得られるペプチドを質量分析計で解析した。質量スペクトル解析は、抗体重鎖のＣ末端フラグメントに一致する強いピークを示した（図８）。スペクトルには、Ｃ末端フラグメントとフューリン開裂部位に由来する幾らかのアミノ酸を表すピークは観察されなかった。ＲＫＲＲ部位が、ＨＦ２ＡＬコンストラクトの抗体重鎖のＣ末端で余分のアミノ酸の効率的な除去を促進し、何ら余分なアミノ酸残基のない抗体重鎖の発現という結果になることをこのデータは強く示唆した。
（実施例９）
ヒト膵臓細胞及びマウスＣＴ２６細胞におけるレンチベクターの安定した長期発現
ＣＡＧプロモーター由来のヒトＧＭＣＳＦを発現するレンチウイルスベクターを、記載の通り一過性形質移入によって調製した。膵臓細胞を培養し、３×１０４細胞を１ｍＬのレンチウイルス及び８μｇ／ｍＬポリブレンに４時間、３４００ｒｐｍの遠心で感染（ｓｐｉｎｏｃｕｌａｔｅ）させ、次いで新しい培地の６ウェルプレートに蒔いた。
合計３回の感染を２週間隔で実施した。各感染からの集団を「１回、２回、及び３回」と標識した。３回の集団を希釈クローン化して、１２８０クローンを採取し、９６ウェルプレートに転移させた。これらのクローンの上清をＥＬＩＳＡによりＧＭ−ＣＳＦ発現を選別した。ほぼ全てのクローンはヒトＧＭ−ＣＳＦ発現に対して陽性であり、及び８８クローンを６ウェルプレートに拡大し、再検定した。５００〜２５００ｎｇ／１０６細胞／２４時間  ＧＭ−ＣＳＦを発現する１３クローンを１０ｃｍのシャーレに拡大し、再度、再検定して、安定性試験を開始した。安定性試験のために、細胞を１２週間の連続培養で維持させ、３週間隔でＧＭ−ＣＳＦ発現レベルをチェックした。図９は、１３クローンでのレンチベクターＧＭ−ＣＳＦ発現が、何らの選択を含まない培地での１２週間の連続培養期間中、安定していたことを示す。
【０１７７】
第２のレンチベクター発現安定性試験では、マウスＧＭ−ＣＳＦ産生クローンの長期発現を、マウスＧＭ−ＣＳＦを発現するレンチウイルスベクターを形質導入されたＣＴ２６細胞（マウス腺癌細胞）を使用して評価した。このＣＴ２６細胞を、記載の通り遠心で感染させ、クローン化した。ＧＭ−ＣＳＦを発現する５クローンを安定性試験に対して選択した。第１、３、５、７及び９週に、細胞をＥＬＩＳＡによってＧＭ−ＣＳＦ発現を検定した。図１０に示した結果は、５クローンが安定性試験の過程で安定したＧＭ−ＣＳＦ発現を示したことを表す。
【０１７８】
膵臓及びＣＴ２６  ＧＭ−ＣＳＦの両発現実験は、レンチベクター産生クローンが、長期培養で安定していることを示す。
（実施例１０）
ＣＨＯ−Ｓ細胞におけるレンチベクターの安定した長期発現
ＣＡＧプロモーター由来のヒトＤＣ１０１−ＩｇＧ１又はＫＤＲ−ＩｇＧ４を発現するレンチウイルスベクターを調製した。口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）由来の３３アミノ酸配列を含むレンチベクターコンストラクトを２Ａ１４（配列番号９）と命名し、及び最適化したフューリン配列ＲＫＲＲ（配列番号１５）を本明細では「レンチ−ＤＣ１０１ベクター」と呼ばれる。無血清ＣＨＯ−Ｓ細胞に適応した懸濁液、又はＮＳＯ細胞に適応した懸濁液をレンチベクターコンストラクトに形質移入した。Ｃ末端が、質量スペクトル解析のために開裂することができるメチオニンを含むように、ＤＣ１０１抗体コード配列を修飾した。
【０１７９】
ＣＨＯ−Ｓ細胞を、２００ｎｇのレンチ−ＤＣ１０１ベクターＰ２４に２〜３日の間隔で連続的に感染させた。集団をＥＬＩＳＡによってＤＣ１０１発現を検定し（図７）、各感染の後、倍加時間に対する影響もなく抗体産生における着実な増加がもたらされたことを、データが示す。
【０１８０】
【化８】
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それぞれ、４回及び７回感染させた細胞の集団をサブクローン化して、ＤＣ１０１産生を解析した。比較すると、７回感染した集団に由来するクローンは、概して４回感染した集団に由来するクローンよりも高いレベルのＤＣ１０１発現を有した（表８）。
【０１８１】
【化９】
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２回、３回及び４回感染した集団から単離したクローンのパネルを１０ｍＬの振盪フラスコで１２週間の連続培養にさらし、ＤＣ１０１産生の安定性に関して１週間隔で評価した。クローンが安定していることが判明した（表９）。
【０１８２】
【化１０】
2009502134.tif 000010
倍加時間は２０時間未満であり安定していた（表１０）。
【０１８３】
【化１１】
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クローン４×−３及び４×−４を遺伝的安定性に関してサザンブロットで解析した。第１週及び７週に両クローンからＤＮＡを抽出し、制限酵素ＥｃｏＲＩ又はＮｓｉＩで終夜消化させて、１％アガロース／ＴＢＥゲル上で移動させ、ＨＣ領域から５９２ｂｐフラグメントで探索させた。標準は、１０ｍｇのゲノムＣＨＯ−ＳＤＮＡのバックグラウンドでＥｃｏＲＩ消化ＤＣ１０１プラスミドの段階希釈である。ＥｃｏＲＩは、両クローンで２．２ｋｂフラグメントを放出し、及びクローン４×−４は、幾つかの部分的な成分を有するように思われる。両制限酵素で、２つのクローンは、第１週〜７週まで安定した組込みパターンを有し、遺伝的安定性を示す。
【０１８４】
これらのクローン由来の抗体がハイブリドーマから産生される抗体と生物学的に同等であることを確立するために、結合及び中和検定を実施した。結合検定では、９６ウェルプレートを組換えＦｌｋ−１でコーティングし、クローン７×−２４、Ｄｃ１０１ハイブリドーマ、又は対照クローンからの上清の段階希釈で培養し、抗ラットＩｇＧ１  ＨＲＰで定量化した。結果は、抗体が同等に結合することを示す（表１１）。
（表１１．ハイブリドーマにより産生されたＤＣ１０１に関連するレンチ−ＤＣ１０１−フューリン／２Ａ１４に感染させたＣＨＯーＳ細胞から発現したＤＣ１０１の結合）
【０１８５】
【化１２】
2009502134.tif 000012
中和検定を、クローン７×−２４、ＤＣ１０１ハイブリドーマ、及び陰性対照からの上清を使用して実施した。各上清を段階希釈して、Ｆｌｋ−１と混合し、次いでヒトＶＥＧＦでプレコーティングした９６ウェルプレート上で培養し、抗Ｆｌｋ−ｌ−ＨＲＰで読み取った。クローン７×―２４から産生される抗体は、ＤＣ１０１抗体を産生するハイブリドーマに同等なレベルでＦｌｋ−１結合を中和した（表１２）。
（表１２．クローン７×―２４によって産生されるＤＣ１０１抗体とハイブリドーマ産生ＤＣ１０１の中和検定）
【０１８６】
【化１３】
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クローンを、ＶＳＶ．Ｇ配列に関するＴａｑＭａｎ検定によって複製能力のあるレンチウイルスについて試験した。検定の感受性を確立するために、ＶＳＶ．Ｇエンベロープを１コピー含むことが知られている細胞系を１０〜１０，０００細胞範囲のＣＨＯ細胞のバックグラウンドにスパイクを打った。ＤＮＡ試料を調製し、ＶＳＶ．Ｇ配列の存在に関して検定した。この検定の感受性は、１０，０００細胞のバックグラウンドで１つのＶＳＶ．Ｇ配列の検出を可能にする。３つのクローン及びＣＨＯ−Ｓ対照細胞は、複製能力のあるレンチウイルス配列に対して全て陰性であった。
【０１８７】
【化１４】
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【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１】図１は、２Ａ等の自己プロセシング開裂部位及びフューリン開裂部位を含むコンストラクトを使用して全長免疫グロブリン（抗体）の発現のためのプロセスを表す模式図である。
【図２】図２は、ベクターが更なるタンパク質分解性開裂部位（フューリン；「Ｆ」）も更に含む場合がある、ＣＡＧプロモーターに操作的に結合する免疫グロブリン重鎖（Ｈ）及び軽鎖（Ｌ）の発現のための自己プロセシング開裂部位（２Ａ）を含む、プラスミド、レンチウイルス、及びＡＡＶ発現カセットを表す模式図である。
【図３】図３は、抗体発現クローンの開発に関連した計画と隣接するクローン開発の計画の説明を示す模式図であり、抗体発現レベルの点から、プラスミド（形質移入及び選択）の使用に対するレンチベクターの利点を示す。
【図４】図４は、レンチベクターでの形質導入後に、異なる細胞系（ＣＨＯＤ−、ＨｕＨ７、及びＰｅｒＣ６）で全長ラット抗ＶＥＧＦＲ２モノクローナル抗体（ＣＡＧ−ＤＣ１０１  ＩｇＧ１）の発現を示し、２Ａは、自己プロセシング配列を含む単一のベクターを介してのＤＣ１０１の発現を指す。
【図５】図５は、およそ２０〜４０ｐｇ／細胞／日のＤＣ１０１抗体を発現する２つの５Ｘ形質移入クローンのためのレンチウイルスベクターの組み込まれるゲノムコピーの数を決定するためにサザンブロット解析の結果を示す。レンチウイルスベクターの既知のゲノム数を含む検体を、組み込まれるゲノムコピーの数を決定するための基準として使用した。
【図６】図６は、ベクターをコードするレンチウイルス２Ａ  ＤＣ１０１を４Ｘ、７Ｘ、又は９Ｘ形質移入された細胞から単離された６０の個々のクローンに対する抗体発現のレベルを示す。産生される抗体の量（ｐｇ／細胞／日）を、各集団から組換えＤＣ１０１抗体のその量を発現するクローンの数に対してプロットする。
【図７】図７は、レンチベクターの形質導入後の異なる細胞系（ＣＨＯＤ−、ＨｕＨ７、及びＰｅｒＣ６）で抗ＫＤＲ  ＩｇＧ１モノクローナル抗体の発現レベルの比較を示す。２Ａは、自己プロセシング配列を含む単一のベクターを介するＫＤＲ重鎖及び軽鎖の発現を指す。
【図８】図８は、フューリン開裂及びカルボキシペプチダーゼで処置が続く、ＣＨＯ細胞にコードするＨＦ２ＡＬプラスミドの形質移入の後に産生された精製ＩｇＧタンパク質の質量スペクトル解析の結果を示す。
【図９】図９は、ヒトＧＭ−ＣＳＦをコードするレンチウイルスベクターを形質導入された１３の膵臓クローンの安定性試験の結果を示す。ＧＭ−ＣＳＦを発現（５００〜２５００ｎｇ／１０６細胞／２４時間）するクローンのＧＭ−ＣＳＦ発現レベルを、３週間間隔で試験したＧＭ−ＣＳＦ発現レベルで１２週間の連続培養を維持した。
【図１０】図１０は、マウスＧＭ−ＣＳＦをコードするレンチウイルスベクターを形質導入したＣＴ２６クローンの安定性試験の結果を示す。ＣＴ２６げっ歯類細胞系のＧＭ−ＣＳＦ発現レベルは、少なくとも９週間の連続培養で安定していることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2009502134.tif 000022
【図８】
2009502134.tif 000023
【図９】
2009502134.tif 000024
【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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