(57)【要約】  分化多能性細胞、例えば胚幹細胞に由来する無細胞化生体材料を含む組成物が提供される。無細胞化生体材料は、創傷治癒を促進し、組織再生を促進し、又は瘢痕化を抑制するために用いることができる。変性疾患を治療するために、無細胞化生体材料を用いる方法も提供される。【選択図】  図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
1つ以上の胚幹細胞に由来する無細胞化生体材料を、対照と比較して治癒を促進又は誘導するのに有効な量で含む組成物。
【請求項２】
前記生体材料が1つ以上の分化胚幹細胞に由来する、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
前記1つ以上の分化胚幹細胞が心臓分化、神経分化、筋原性分化、表皮分化又はそれらの組合せを受ける、請求項2記載の組成物。
【請求項４】
前記1つ以上の胚幹細胞が異種核酸を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項５】
前記生体材料が1つ以上の細胞外マトリックス成分を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項６】
前記生体材料が1つ以上の胚幹細胞パラクリン因子を含む、請求項2記載の組成物。
【請求項７】
1つ以上の胚幹細胞に由来する無細胞化生体材料を含む医薬組成物。
【請求項８】
賦形剤をさらに含む、請求項7記載の医薬組成物。
【請求項９】
分化を受けている胚幹細胞に由来する無細胞化生体材料を含み、前記生体材料がインビボで再生性組織修復を誘導又は助長する組成物。
【請求項１０】
1つ以上の胚幹細胞に由来する無細胞化生体材料を含む医療デバイス。
【請求項１１】
前記デバイスが、創傷被覆材、ステント、矯正器具、縫合糸、インプラント、カテーテル、ロッド、ピン、送達媒体及び固定器からなる群から選択される、請求項10記載の医療デバイス。
【請求項１２】
創傷を、1つ以上の胚幹細胞に由来する無細胞化生体材料と、対照と比較して治癒を促進又は誘導するのに有効な量で接触させること、を含む、創傷治癒を促進する方法。
【請求項１３】
a. 生体材料を生成するのに適した条件下、インビトロで1つ以上の胚幹細胞を培養すること;及び
b. 前記生体材料を無細胞化すること、
を含む、無細胞化生体材料を生成する方法。
【請求項１４】
創傷を、1つ以上の胚幹細胞に由来する無細胞化生体材料と、対照と比較して瘢痕化を減少させるのに有効な量で接触させること、を含む、瘢痕化を減少させる方法。
【請求項１５】
組織を、1つ以上の胚幹細胞に由来する無細胞化生体材料と、組織増殖を促進するのに有効な量で接触させること、を含む、組織増殖を促進する方法。
【請求項１６】
罹患又は損傷した心臓組織を、心臓筋原性分化を受けている胚幹細胞に由来する無細胞化生体材料と接触させること、を含む、心臓疾患の治療方法。
【請求項１７】
罹患又は損傷した神経組織を、神経分化を受けている胚幹細胞に由来する無細胞化生体材料と接触させること、を含む、神経疾患の治療方法。
【請求項１８】
罹患又は損傷した筋肉組織を、筋原性分化を受けている胚幹細胞に由来する無細胞化生体材料と接触させること、を含む、筋肉疾患の治療方法。
【請求項１９】
罹患又は損傷した皮膚を、上皮分化を受けている胚幹細胞に由来する無細胞化生体材料と接触させること、を含む、皮膚疾患の治療方法。
【請求項２０】
創傷の治療用医薬の製造のための、請求項1〜8のいずれか1項記載の組成物の使用。
【請求項２１】
変性疾患の治療のための、請求項1〜8のいずれか1項記載の組成物の使用。
【請求項２２】
分化胚幹細胞に由来する無細胞化生体材料;及び表面に前記無細胞化生体材料を塗布するためのアプリケーター、を含むキット。
【請求項２３】
1つ以上の多能性細胞をさらに含む、請求項22記載のキット。
【請求項２４】
前記無細胞化生体材料が組織特異的である、請求項22記載のキット。
【請求項２５】
胚分子形態形成の合図を成体組織に送達する方法であって、分化胚幹細胞に由来する無細胞化生体材料を成体組織に投与することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(発明の分野)
本発明の態様は、一般に無細胞化生体材料組成物に関し、特に胚幹細胞由来の無細胞化生体材料組成物に関する。
【０００２】
(関連出願)
本出願は、随意の参照により本明細書に完全に組み込まれる、2005年11月8日出願の米国特許仮出願第60/734,584号の優先権を主張する。
(政府援助)
本明細書で開示される研究の態様は、一部、国立科学財団(National Science Foundation)によって付与された助成金番号EEC-9731643によって援助された。したがって、米国政府は、請求される対象に特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
(発明の背景)
胚、骨髄及び心臓に由来するものを含め、多くの様々な幹細胞が、現在、傷害組織、例えば心筋を修復する可能性のある療法として試験されている。これらの手法は、一般的に、細胞性を再生させ、組織機能を回復することを重視する。これまでは、特定の細胞型とは無関係に、幹細胞療法は一貫して実験モデル及び治験で組織機能の強化を実証してきた。しかし、実質的な量の再生組織が存在しない場合でさえ改善を検出することができるので、広域の機能的改善を担う正確な機構はまだ完全に解明されていない。このことは、特定の細胞型に分化することができる幹細胞を損傷組織に送達したとしても、組織特異的分化を指示することができる内在性のシグナルが損傷組織の微小環境中に存在しないか又は不十分である可能性があることを示唆する。
【０００４】
現在まで、組織回復療法において利用される生体材料は、組織及び組織工学のための送達媒体として又は組織欠損のためのパッチとして、主に構造的な役割を果たしてきた。幹細胞の明白な治療的能力にもかかわらず、細胞のインビボでの潜在的な免疫原性及び腫瘍形成性を含むいくつかの欠点がまだ存在する。
【０００５】
主に接着タンパク質、サイトカイン及び多糖類から構成される細胞外マトリックス(extracellular matrix)(ECM)は、組織内での細胞の運命及び機能を調節する微小環境の生化学的及び物理的な性質を構成する。奇妙なことに、これらの分子は細胞の挙動を指示する重大な合図を提供すると考えられているが、初期の細胞及び組織の発達過程に存在するECMの複合アセンブリーについてはほとんど知られていない。多能性のES細胞は発達のインビトロモデルを提供するので、罹患又は損傷した組織を再生させる可能性のある細胞療法として、現在いくつかの実験モデルで試験されている。しかし、これまでは、ES細胞によって組織修復過程に寄与される細胞外マトリックスの役割を調べた研究はなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、多能性細胞、例えば胚幹細胞に由来する無細胞化生体材料を提供することである。
本発明の他の目的は、創傷治癒を促進するか、組織再生を促進するか、又は瘢痕化を減少させる方法及び組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
(発明の要旨)
本開示の態様は、多能性細胞、例えば分化幹細胞に由来する無細胞化生体材料を提供する。ある態様は、分化胚幹細胞(embryonic stem cell)(ESC)に由来する無細胞化生体材料を提供する。無細胞化組織は、様々な創傷治癒モデルでこれまで試験されてきたが、無細胞生体材料の組織源は、活発な分化、例えば形態形成を受ける胚に由来することはなかった。さらに、既存の幹細胞療法は、インビボで分化して損傷又は欠落した組織を再生させる幹細胞の投与に基づく。開示の態様は、幹細胞によって合成される生体分子が、細胞の機能分化と比較してそれ以上ではないにしろ、同じくらい重要であり得るという原理に基づく。従って、幹細胞の適用自体は、幹細胞によって生産される生体分子の適用ほど重要でない。これは、幹細胞再生療法の根本的パラダイムシフトを表す。開示される無細胞化生体材料は、成人の創傷治癒環境で強い再生能力を有する分子複合体を提供すると考えられる。無細胞化生体材料は、成体組織に直接的に胚分子形態形成合図を送達する系も提供する。
【０００８】
他の態様は、分化胚幹細胞に由来する無細胞化生体材料を治癒又は組織再生を促進するのに有効な量で投与することにより、変性疾患を治療する方法を提供する。無細胞化生体材料は、多能性細胞又は他の細胞型と組み合わせて又は交代で投与することができる。特定の態様は、分化胚幹細胞に由来する無細胞化生体材料を治癒又は組織再生を促進するのに有効な量で投与することにより、心臓障害を治療する方法を提供する。
【０００９】
別の態様は、分化多能性細胞に由来する無細胞化生体材料を創傷又は損傷組織に投与することにより、宿主で瘢痕形成を減少させるか又は抑制する方法を提供する。
さらに別の態様は、医療デバイス、例えば、分化多能性細胞由来の無細胞化生体材料で少なくとも部分的に被覆されたステントを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
(発明の詳細な説明)
(I.定義)
用語「無細胞化生体材料」とは、生物から生成される生細胞を含まない物質を指す。
用語「成体組織」とは、妊娠を完了した生物体由来の組織を指す。ある実施形態では、成体組織は胎児又は胚の組織を含まない。
用語「心臓分化」とは、分化全能性又は多能性の細胞が心臓の細胞及び/又は組織の1つ以上の特性の獲得を導く、進行的発達事象を指す。
【００１１】
用語「対照」とは、有効成分、例えば無細胞化活性成分なしで実施される実験を指す。対照は、当技術分野においては公知である。
用語「疾患」とは、遺伝的若しくは発達上の間違い、感染、毒、栄養の欠乏若しくはアンバランス、毒性又は好ましからぬ環境要因の影響から生じる障害又は機能不全を起こしている、生物体の臓器、組織、構造又は系を指す。
【００１２】
用語「胚幹細胞」とは、発達途上の胚盤胞、例えばマウス又はヒトの胚盤胞の内細胞塊に由来する細胞を指し、「多能性」であること、すなわち、それらが任意の体細胞性細胞型に分化することができることが知られている。
用語「表皮分化」とは、全能性又は多能性の細胞が表皮細胞型の1つ以上の特性を得るように、多能性又は全能性の細胞が表皮細胞型に分化することを指す。
【００１３】
用語「異種核酸」とは、他の生物体に由来する核酸を指す。
用語「筋原性分化」とは、全能性又は多能性の細胞が中胚葉細胞型の1つ以上の特性を得るように、多能性又は全能性の細胞が中胚葉細胞型に分化することを指す。
用語「神経分化」とは、全能性又は多能性の細胞が神経細胞型の1つ以上の特性を得るように、多能性又は全能性の細胞が神経細胞型に分化することを指す。
【００１４】
用語「パラクリン因子」とは、胚幹細胞によって分泌される、隣接細胞に作用する物質を指す。代表的なパラクリン因子には、それらに限定されないが、成長因子、マイトジェン、サイトカイン、発達因子若しくは合図、又はそれらの組合せが含まれる。
用語「再生性組織修復」とは、損傷した細胞又は組織を置換するために損傷組織の細胞を誘導することによる、損傷組織の修復を指す。
用語「創傷」とは、組織又は臓器の損傷を指し、外部でも又は内部でもよい。
【００１５】
(II.組成物)
一実施形態は、例えばインビトロで分化を受ける胚幹細胞などの多能性細胞に由来する無細胞化生体材料を提供する。分化には、形態形成が含まれる。形態形成は、様々な臓器及び生物体のパーツの形態及び構造の確立をもたらす、胚初期の細胞及び組織の分化を指す。無細胞化生体材料は、インビトロ又はインビボの再生性組織修復を含む創傷治癒を誘導又は助長することが機能的にできる可能性がある。無細胞化材料は、胚幹細胞によって生成されるパラクリン因子と任意選択で組み合わせた、細胞外物質を含有することもできる。一般的に、無細胞化材料は、それらの細胞がインビトロで例えば特定の組織型に分化するに従い、胚幹細胞などの多能性細胞によって生成されるパラクリン因子を含有する。胚幹細胞は、任意の細胞型、例えば表皮、中胚葉又は内胚葉の細胞型又は組織に分化することができる。従って、特定の組織の表皮、中胚葉又は内胚葉に由来する組織又は創傷に特異的な無細胞化材料を生産することができる。例示的な特定の組織には、それらに限定されないが、心臓、骨、皮膚、骨格筋、平滑筋、動脈組織、目の組織、神経組織、皮膚組織、肝臓組織、膵臓組織、インスリン産生組織又はそれらの組合せが含まれる。
【００１６】
パラクリン因子は、細胞外の物質と連結、コンジュゲート又は共有結合することができる。ある実施形態では、パラクリン因子は、無細胞化生体材料から創傷又は損傷組織に拡散することができる。パラクリン因子の拡散は、創傷又は損傷組織の断面にわたって、1つ以上のパラクリン因子の勾配を生成することができる。さらに、無細胞化生体材料は、幹細胞パラクリン因子の制御された、持続的送達のための、放出制御デバイスとして機能することができる。
【００１７】
他の実施形態では、無細胞化材料は創傷又は損傷組織と物理的に相互作用して治癒を促進する。治癒は、物理的相互作用単独で、又は、無細胞化生体材料から放出されるパラクリン因子との組み合わせによって生じ得る。
別の実施形態は、組織回復のための固有の再生特性を有する胚幹細胞に由来する無細胞化生体材料を提供し、創傷の修復は独立して、又は、細胞療法と併用して用いることができる。
【００１８】
開示される無細胞化生体材料は、創傷又は損傷組織の微小環境を、発達途上の組織、例えば胚組織の微小環境により似るように変化させることによって、それに限定されないが再生性組織修復を含む創傷治癒を有利に促進、助長又は誘導すると考えられている。無細胞化生体材料は、創傷又は組織の細胞と物理的に相互作用することによって、及び、任意選択で、創傷又は損傷組織の細胞を治癒過程に関与させるのに有効な量、濃度及び持続時間、創傷の内外の細胞に幹細胞パラクリン因子を送達することによって、創傷の微小環境を変化させる。従って、幹細胞を加え、幹細胞に再生させて組織を形成させようとする既存の幹細胞療法と異なり、開示される無細胞化材料は、創傷又は損傷組織の既存の細胞に治癒を促進する生物学的変化を起こさせると考えられる。
無細胞化生体材料の成分は、以下でより詳しく記載する。
【００１９】
(A.胚幹細胞生体材料)
(1.胚幹細胞)
開示される無細胞化生体材料は、多能性細胞又は幹細胞、好ましくは胚幹細胞によって産生される。胚幹細胞は哺乳動物のものであることができる。他の実施形態では、幹細胞は、ヒト以外の幹細胞又は、例えばヒト及びヒト以外の哺乳動物から産生されるキメラ幹細胞であることができる。開示される無細胞化生体材料を生産するために、1つ以上の細胞外マトリックス成分及びパラクリン因子を産生する任意の幹細胞を利用することができることが理解されよう。
【００２０】
胚幹(embryonic stem)(ES)細胞は、発達途上の胚盤胞、例えばマウス、ヒト又はヒト以外の胚盤胞の内細胞塊に由来し、「多能性」であること、すなわち、それらが任意の体細胞性細胞型に分化することができることが知られている。インビトロ及びインビボで心筋細胞、ニューロン及び肝細胞などの細胞型に分化するそれらの能力は、それらが、細胞置換の内因性の機構が十分に組織を再生することができないいくつかの変性性細胞障害に適用可能であろうことを示唆する。ES細胞は、「未分化型」状態で細胞増殖を刺激するための可溶性因子を補ったペトリ皿内の支持細胞層上で、又は、マトリックスコートの基質上で一般的に培養される。分化を開始するために、接着性ES細胞を表面からはがして懸濁培養に入れると、それらは胚様体(embryoid body)(EB)と呼ばれる細胞の凝集体を形成する。個々のEBは、そこから他の全ての前駆細胞及び以降の体細胞が形成される3つの胚系統(外胚葉、内胚葉及び中胚葉)への細胞の分化を含む、胚移植後組織の大部分の分子シグナル伝達及び細胞分化事象を反復する。EB内の分子環境は、続いて起こる細胞分化のコースを調節する。従って、別の実施態様は、それに限定されないがヒト以外の胚様体を含む、インビトロで分化する哺乳動物の胚様体に由来する無細胞化生体材料を提供する。
【００２１】
(2.細胞外マトリックス物質)
開示される無細胞化生体材料は、1つ以上の細胞外マトリックス(extracellular matrix)(ECM)成分、例えば構造成分、機能性成分又はそれらの組合せを含む。ECMは正常な組織ホメオスタシスの維持を担う構造的及び機能的成分を有することが広く知られ、ECMは、細胞若しくは組織の傷害又は変性疾患の開始などの摂動に応じて動的に変化する。発生生物学及び組織再生の間などの形態形成事象におけるECMの役割については、おそらく、特に再生に適した哺乳動物モデルがないために、あまり知られていない。
【００２２】
ECMの2つの主成分は、タンパク質及び多糖類(すなわちグリコサミノグリカン(glycosaminoglycan)(GAG))である。コラーゲンI及びIV、フィブロネクチン及びラミニンなどのECMタンパク質は、組織の維持で構造的及び機能的役割を演ずる。コラーゲンIは、一般的に成体組織のECMで最も豊富なタンパク質であるが、20を超える異なる型のコラーゲンが発見され、それぞれ独自の機能を有する。例えばコラーゲンIVは、血管構造の基底膜に存在して、内皮細胞のためのリガンドの役目を果たす。フィブロネクチンは、いくつかの異なる細胞型のためのリガンドであるので、構造的及び機能的タンパク質である。ラミニンは基底膜で一般的なさらに別のタンパク質であり、血管構造の維持で役割を果たすことがわかった。線維芽細胞成長因子(fibroblast growth factor)(FGF)、肝細胞増殖因子(heptatocyte growth factor)(HGF)、血小板由来成長因子(platelet-derived growth factor)(PDGF)、血管内皮細胞成長因子(vascular endothelial cell growth factor)(VEGF)及びインスリン様成長因子(insulin-like growth factor)(IGF)などの成長因子は、ECMタンパク質に直接的に、又はプロテオグリカン若しくはGAGを通して結合することができ、ECM内で結合した状態で安定して保持することができる。大部分のこれらの成長因子は、マトリックスとの関係の範囲内で関連する生化学エレメントによって異なる方法で細胞に影響を及ぼすことがある、いくつかの異なるアイソフォームの形態もとる。コンドロイチン硫酸、硫酸ヘパリン及びヒアルロン酸を含むいくつかのGAG、並びにパールカン、バーシカン及びデコリンなどのプロテオグリカンも、ECMにしばしば存在する。GAG及びプロテオグリカンは、成長因子と結合することを含む複数の機能をECMで有する。WNTのような強力な形態形成分子、及び骨形態形成タンパク質(bone morphogenic protein)(BMP)、並びにそれらのアンタゴニスト、例えばBMPのためのノギン及びコーディンも、ECMで見ることができる。上で述べた遺伝子及びタンパク質のための核酸及びアミノ酸配列は当技術分野で公知であり、例えばGENBANKにおいて見つけることができる。
【００２３】
組織維持におけるECMのホメオスタシス的役割に加えて、組織傷害又は疾患に応じてのECMの動的性質は、創傷治癒及び再生の経過及び予後にかなり影響することができる。具体的には、フィブロネクチンは正常な組織形態形成及び再生のための重要な分子であることがわかった。形態形成にとって重要であることが判明した他の成分は、基底膜タンパク質、ラミニンである。ヒアルロン酸(hyaluronic acid)(HA)は、潜在的な再生に関して関心のあるさらに別の分子であり、成長因子及びサイトカインを結合し、保水性を促進する役割を有する。新生児及び胎児の組織中でのその高濃度のために、並びに細胞移動及び創傷の修復過程へのその関与のために、過去においてヒアルロン酸は再生事象の誘導のために考慮された。
【００２４】
さらに、いくつかのWNTタンパク質が、下等生物の四肢再生で、及び哺乳動物の骨成長で重大な役割を演ずることが解明された。それらの名前が意味するように、BMPタンパク質は正常な骨形成の必須成分であり、BMP経路の阻止は再生事象に有意な影響を及ぼすことがわかった。ECMタンパク質及びパラクリン因子の組合せ及び濃度は、修復を必要とする組織の型に従い調節することができる。
【００２５】
(B.細胞療法)
開示される無細胞化生体材料は、任意選択で、細胞療法と組み合わせて又は交代で用いることができる。従って、該生体材料は、1つ以上の細胞又は1種類以上の細胞を播種して治癒を促進又は助長することができる。該播種は、無細胞化生体材料が創傷又は損傷組織に送達される前又はその後でよい。生体材料を播種するために用いる細胞の種類は、治療する創傷又は損傷組織の種類に基づいて選択することができる。一般に、多能性細胞を用いて、播種された細胞及び生体材料が相乗作用的に相互作用して治癒を促進するように生体材料を播種することができる。一実施形態では、その多能性細胞は、無細胞化生体材料及び無細胞化生体材料と関連するパラクリン因子にインビボで応答し、所定の細胞型又は組織に分化する。それらに限定されないが、幹細胞、体細胞又はそれらの組合せを含む他の細胞型を、無細胞化材料と組み合わせて用いることができることが理解されよう。
【００２６】
例えば、心臓物質に特異的な無細胞化生体材料は、心臓物質又は心臓様物質に分化するように胚幹細胞を誘導する条件及び持続時間の下で胚幹細胞を培養することによって、胚幹細胞から得ることができる。生体材料は無細胞化することができ、任意選択で、保存することができる。生体材料は、次いで、創傷又は損傷組織、例えば心臓組織に生体材料を送達する前に、又はその後に、細胞と組み合わせることができる。
【００２７】
(1.多能性細胞又は全能細胞)
胚幹細胞由来の無細胞化生体材料と組み合わせて用いることができる代表的な細胞には、これらに限定されないが、哺乳動物、ヒト又はヒト以外の胚又は成体の幹細胞;胎盤、臍帯血、脂肪組織、神経組織、筋組織、心臓組織、表皮組織又は骨髄から得た多能性又は全能の細胞;治療する組織に任意選択で対応する自己由来の細胞、異種細胞又は体細胞が含まれる。
【００２８】
(2.組換え細胞)
開示される無細胞化生体材料と組み合わせて用いる細胞は、1つ以上の異種核酸を発現する組換え細胞であることができる。異種核酸は、創傷治癒又は組織再生に関係するタンパク質、例えば細胞外マトリックスタンパク質、マトリックスメタロプロテアーゼ若しくはGAG合成酵素、又はそれらの融合タンパク質を発現することができる。或いは、細胞は、それらに限定されないが、線維芽細胞成長因子、肝細胞増殖因子、血小板由来成長因子、血管内皮細胞成長因子及びインスリン様成長因子などの成長因子、骨形態形成タンパク質並びにそれらの組合せを含む胚幹細胞パラクリン因子を分泌するように、一般に遺伝子操作することができる。組換え細胞を生成する方法及びプロトコルは、当技術分野で公知である。
【００２９】
(C.医薬組成物)
別の実施形態は、開示される無細胞化生体材料を含む、医薬組成物及び剤形を提供する。本開示の化合物の医薬用の単位用量剤形は、患者への粘膜(例えば、鼻、舌下、膣、口内若しくは直腸の粘膜)への投与、腸管外(例えば、筋肉内、皮下、静脈内、動脈内若しくはボーラス注射)投与、又は局所投与に適している。剤形の例には、これらに限定されないが、分散液;軟膏;パップ剤(湿布薬);ペースト;粉末;ドレッシング;クリーム;絆創膏;液剤;パッチ;ゲル;及び患者への非経口投与に適した無菌の固体が含まれる。
【００３０】
本開示の組成物の剤形の組成、形及び種類は、一般的にそれらの用途に従い異なる。本開示に包含される特定の剤形がお互いに異なるこれら及び他の様式は、当業者にとって容易に明らかとなる。例えば、レミントンの薬学(Remington's Pharmaceutical Sciences)、第18版、Mack Publishing、Easton、Pa、(1990)を参照されたい。
【００３１】
本開示の医薬組成物及び単位用量剤形は、1つ以上の医薬として許容し得る賦形剤又は希釈剤も一般的に含む。開示の特定の化合物によって提供される利点、例えば、それらに限定されないが、溶解性の増加及び/又は流量、純度若しくは安定性(例えば吸湿性)特性の向上は、医薬製剤に及び/又は患者への投与にそれらを先行技術よりも適するものにすることができる。適当な賦形剤は薬学又は薬剤学の技術者に公知であり、適当な賦形剤のそれには限定されない例が本明細書で提供される。特定の賦形剤が医薬組成物又は剤形への組込みに適当であるかどうかは、それに限定されないが、剤形が患者に投与される方法を含む当技術分野で公知の様々な要素によって決まる。
【００３２】
本開示は、無細胞化生体材料が分解する速度を低下させる1つ以上の化合物を含む、医薬組成物及び剤形をさらに包含する。本明細書で「安定剤」というそのような化合物には、これらに限定されないが、アスコルビン酸などの抗酸化剤、pH緩衝液又は塩緩衝液が含まれる。さらに、本開示の医薬組成物又は剤形は、1つ以上の溶解性モジュレーター、例えば塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム若しくはリン酸カリウム、又は有機酸を含むことができる。具体的な溶解性モジュレーターは、酒石酸である。
【００３３】
賦形剤の量及び種類と同様、剤形中の無細胞化生体材料の量は、これに限定されないが、例えばそれが患者に投与される経路などの要素によって異なる場合がある。しかし、開示化合物の一般的な投与形態は、約10mg〜約1000mgの量、好ましくは約25mg〜約750mgの量、より好ましくは50mg〜500mgの量、さらにより好ましくは約30mg〜約100mgの量である。
【００３４】
代表的な賦形剤には、それらに限定されないが、水、アセトン、エタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブタン-1,3-ジオール、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、鉱油、ゼラチン、カゼイン、レシチン、アラビアゴム、コレステロール、トラガカントゴム、ステアリン酸、塩化ベンザルコニウム、ステアリン酸カルシウム、モノステアリン酸グリセリン、セトステアリルアルコール、セトマクロゴール乳化蝋、ソルビタンエステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール、ステアリン酸ポリオキシエチレン、コロイド状二酸化ケイ素、リン酸エステル、ドデシル硫酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、非晶質セルロース、珪酸アルミニウムマグネシウム、トリエタノールアミン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、糖及びデンプン及びこれらの混合物が含まれる。  治療する特定の組織に従い、追加の成分を、本開示の無細胞化生体材料による処理に先立ち、それと一緒に、又はそれより後に、用いることができる。例えば、無細胞化材料の分解を予防するプロテアーゼ阻害剤及び他の化合物を用いることができる。
【００３５】
(D.併用療法)
胚幹細胞に由来する無細胞化生体材料は、治癒を助長し、また任意選択で、瘢痕化を減少させるか又は抑制するために、第2の治療剤と組み合わせて用いることができる。適当な治療剤には、これらに限定されないが、抗生物質、抗酸化剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、サイトカイン、並びに、線維芽細胞成長因子、肝細胞増殖因子、血小板由来成長因子、血管内皮細胞成長因子及びインスリン様成長因子などの成長因子が含まれる。第2の治療剤の量は、一般に、治療する組織によって決まる。具体的な投薬量は、当業者が容易に決定することができる。Ansel, Howard C.らの文献、『医薬剤形及び薬物送達系(Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems)』(第6版) Williams and Wilkins、Malvern、PA(ペンシルバニア)州(1995)を参照されたい。或いは、無細胞化生体材料は、細胞送達と、例えば幹細胞、多能性細胞、体細胞又はそれらの組合せの送達と併用することができる。
【００３６】
(III.無細胞化生体材料の製造方法)
開示された生体材料は、分化又は形態形成を受ける幹細胞などの、培養多能性細胞から得られる。好ましい方法は、胚幹細胞を用いる。しかし、細胞を、例えば特定の細胞若しくは組織に分化するように誘導することができるか、又は、特定の細胞型若しくは組織型の少なくとも1つ以上の特性を示すことができるならば、任意の多能性細胞を用いることができることが理解されよう。幹細胞は分化するように誘導され、一般的に、胚様体として知られる凝集体を形成する。幹細胞が分化するか又は特定の細胞型又は組織を生成するように誘導するための条件及び成長因子は、当技術分野で公知である。胚様体は、治療する細胞又は組織の型によって、異なる時間に収集することができる。胚幹細胞が分化した後、生体材料を収集して無細胞化する。
【００３７】
無細胞化は、そのECMの本来の構造及び組成を崩壊させることなく、組織から細胞を除去する工程である。無細胞化された組織の例としては、ブタの腸のコラーゲン層、皮膚、膀胱、ヒトの胎盤、肝臓及び血管があり、適用は、心臓弁から神経移植片まで多様である。組織は同じ組織を再生させるために用いることもあれば、異なる部位、例えば腱/靭帯修復又は心筋の治癒のためのSISで用いることもある。無細胞化はいくつかの異なる天然の生体材料を生成するために用いられてきたが、その理由は、ほとんど種全体で保存されるそれらのECMベースの組成物が、免疫応答を引き起こす可能性がより低いからである。無細胞化することができる多様なこれらの組織は、様々な無細胞化工程の必要性を示唆する。普通のプロトコルは、細胞構造を崩壊させてそれらの内容物を取り出す、物理的及び化学的手段を一般に含む。物理的方法には、凍結融解、圧力及び超音波処理技術を含めることができる。一般の機械的撹拌も用いられてきたが、最適な細胞除去では物理的崩壊を化学抽出処理と組み合わせる。
【００３８】
異なる組織試料を無細胞化するために用いられてきた様々な化学手法は、アルカリ又は酸による処理、非イオン性又はイオン性の界面活性剤及び酵素処理に分類することができる。酸/アルカリ処理には、酢酸、過酢酸(peracetic acid)(PAA)及び水酸化アンモニウムが含まれ、細胞の細胞質成分の可溶化及び核酸の崩壊に用いられる。薄い組織のECM成分を保存し、殺菌剤の役目を果たしつつ細胞物質を取り出すのに、特にPAAが有効であることがわかった。具体的には、ECMタンパク質、GAG及び成長因子は、処理後、安定して保持される。イオン性界面活性剤は、核及び細胞質の膜の可溶化のために用いられてきた。特に、ドデシル硫酸ナトリウム(sodium dodecyl sulfate)(SDS)は無細胞化プロトコルに広く組み込まれ、核内容物を取り出すことがわかったが、それは、ECM成分をかなり崩壊させる傾向があった。脂質-脂質間及び脂質-タンパク質間の相互作用を崩壊させる非イオン性界面活性剤は、細胞膜を溶解するためにしばしば用いられ、より穏やかな処理を提供する。最も普通に用いられる界面活性剤の1つはトリトンX-100であるが、一部の研究は、細胞物質を無事取り出すその能力が変動することを示した。同様に、トリトンX-100による処理の後、ECM成分の維持に関して相反する報告が存在し、試薬の使用が全てのGAG含量を取り出した場合もあれば、GAG及びコラーゲン成分の非有意な差が観察される場合もあった。最後に、ペプチド結合を切断するか又はヌクレオチドを消化するために、トリプシン及びDNアーゼなどの酵素処理が用いられてきた。異なる組織での類似した無細胞化処理の成功率の変動に関して相反する報告が存在することは、無細胞化生成物にかなりの影響を及ぼす処理の濃度及び持続時間を制御することにより、各組織について異なる試薬を最適化しなければならないという考えを支持する。
【００３９】
胚幹細胞によって産生される生体材料を無細胞化するための好ましい方法は、生体材料を実施例1で記載される界面活性剤及びDNAアーゼの組合せで処理することを含む。例示的な方法は、0.1〜1%(w/v)の界面活性剤、例えば非イオン性界面活性剤、及び1mg/mlのDNアーゼで約30分間胚様体を処理することを提供する。無細胞化する生体材料は、インビトロで任意の時間、例えば約1時間〜約12時間、又は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14日以上、分化させることができる。
【００４０】
(IV.使用方法)
(A.創傷治癒)
開示される無細胞化生体材料は、成体組織の創傷治癒、特に心臓又は神経の創傷治癒を促進又は誘導することに役立つ。無細胞化生体材料は、創傷又は損傷組織、例えば単独で再生する能力を失った組織に送達することができる。
成熟した心筋細胞は傷害に応じて増殖する能力が限定されているので、哺乳動物成体の心筋は固有の再生能を欠く。従って、虚血の発生後、梗塞性心筋組織は正しく再生することができず、正常な創傷治癒過程は、恒久的な線維性瘢痕の形成をもたらす。瘢痕形成は、組織再生の代わりに、最終的に心不全及び死亡につながる一連の有害な心室性リモデリング事象を開始する。傷ついた心臓で瘢痕組織形成を調節及び予防することは、1)有害心室性リモデリングを予防し、2)広域の心機能を改善する役目を果たすことができるだろう。心臓筋原性の分化を有利にするために梗塞性心筋組織の分子組成を調節することは、内因性及び任意選択で外来性の幹細胞療法による心筋組織の細胞再生のために、より導伝性な環境を提供する。従って、一実施形態は、胚幹細胞由来の無細胞化生体材料を、損傷した心臓組織を治癒又は再生させるのに有効な量で損傷又は創傷心臓組織に投与することによって、心臓の疾患又は障害を治療する方法を提供する。
【００４１】
創傷は外部でも、又は内部でもよい。一般的に、無細胞化生体材料が創傷又は損傷組織の細胞と物理的に相互作用するように、無細胞化生体材料は創傷と接触して置かれる。創傷が内部である場合、無細胞化材料は、外科的に投与することができるか、又は、化合物を内部に、例えば心臓又は他の臓器に送達するために適合させた医療デバイスを用いて投与することができる。
【００４２】
(B.瘢痕化の阻止)
開示される無細胞化生体材料は、瘢痕化を減少させるために用いることもできる。胚の環境は瘢痕形成を予防し、組織再生を起こさせ、成体の環境とは明確に異なると考えられている。瘢痕組織形成は、異常な組織構造をもたらす急性傷害又は慢性疾患の結果としてほとんどの成体哺乳動物種が示す、普通の有害反応である。一般的に、多能性胚幹細胞は、取替不能な内因性の細胞消失を引き起こす様々な変性疾患の治療のための、頑健な細胞ソースとして用いられる。開示される胚幹細胞由来の無細胞化生体材料を用いて、成体組織で胚微小環境を模倣し、瘢痕化を減少できることが発見された。
【００４３】
発達の初期段階の間、哺乳動物の胎児は瘢痕を伴わないで傷害を治癒させる能力を有するが、後に妊娠の間、恒久的な移行が起こり、組織傷害は結果的に組織再生ではなく瘢痕形成をもたらす。創傷を治癒させる胎児の不思議な能力は長年科学者を当惑させたが、瘢痕組織形成ではなく適切な創傷治癒を刺激するか又はそれに拮抗する様々な分子の役割を特定及び特徴づけするための、モデル系の提供もした。類似した再生能力は、他の系、特にイモリ及びマウスのMRL系統でも記載されている。瘢痕化に付随する過剰のECM再編成は、組織機能障害及び傷害域の機械的強度の低下を起こすので、瘢痕のない創傷治癒が望まれる。さらに、胎児の修復の特徴は、毛包及び皮脂腺再生を含む。皮膚創傷治癒モデルは、胎児及び成体で瘢痕のない再生を研究するために最も妥当な系として、長く認識されてきた。よって、切除、切開及び火傷の創傷などの皮膚の創傷の修復機構を試験をするために、いくつかの異なるモデルが作製された。これらの各モデルは、他と比較して異なる利点及び欠点を有するが、切除創傷モデルは、治癒の過程で視覚的に追跡することができる再現の容易な創傷を提供し、創傷閉鎖率、再上皮化率及び厚さ、並びにマクロファージ及び血管による細胞侵入の密度などの、組織修復のいくつかの定量的測定に適合する。
【００４４】
一実施形態は、創傷又は損傷組織で瘢痕形成を減少させることができる、分化胚幹細胞に由来する無細胞化生体材料を提供する。無細胞化生体材料は、成体組織で、少なくとも一部、胚の微小環境を模倣すると考えられている。無細胞化生体材料は、創傷又は損傷組織と接触させて置くことができる。次いで、無細胞化生体材料は創傷又は損傷組織と物理的に相互作用し、既存の細胞を刺激して、対照と比較してほとんど又は全く瘢痕を形成させずに治癒させることができる。或いは、無細胞化生体材料と関連するパラクリン因子は、創傷又は組織の細胞を刺激して、対照と比較してほとんど又は全く瘢痕を形成させずに治癒させることができる。
【００４５】
(C.足場)
他の実施形態は、開示される無細胞化生体材料を含有する基質又は足場を提供する。基質又は足場を用いて、所定細胞型又は組織型を含む特定の三次元構築物を生成することができる。例えば、動脈組織の生成を誘導するための特異な無細胞化生体材料を含有する基質又は足場を用いて、三次元の動脈構築物を生成することができる。構築物は、無細胞化生体材料と相互作用して動脈組織に分化する全能性又は多能性の細胞を基質又は足場に播種することによって、生成することができる。足場の基質は、構築物の形状又は形態を指示し、例えば、構築物は管状又は平面であることができる。
例示的な足場又は基質は、生物分解性であるか、又は生物分解性ポリマーで形成される。他の実施形態では、足場又は基質は、それらに限定されないがポリエステル、ポリウレタン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリイミド又はそれらの組合せを含む、合成ポリマーで作製される。
【００４６】
(D.処理方法)
例えば創傷面を、対照と比較して治癒を促進又は誘導するのに有効な量で1つ以上の胚幹細胞に由来する無細胞化生体材料と接触させることによって創傷治癒を促進するために、開示される無細胞化生体材料は単独で、又は、それらに限定されないが、成体幹細胞、胚幹細胞、多能性細胞若しくは体細胞を含む自己由来の又は異種の細胞と組み合わせて用いることができる。細胞は、無細胞化生体材料に、投与前又は投与後に加えることができる。当業者は、従来の技術を用いて「対照と比較して治癒を促進又は誘導するのに有効な量」を容易に確認することができる。
【００４７】
一実施形態は、創傷を、1つ以上の分化胚幹細胞に由来する無細胞化生体材料と、対照と比較して瘢痕化を減少させるのに有効な量で接触させることによって、瘢痕化を減少させる方法を提供する。無細胞化生体材料は、必要に応じて繰り返し投与することができる。ある実施形態では、無細胞化生体材料は、治療する組織に類似した細胞又は組織に分化するように誘導された多能性細胞から収集される。従って、創傷が心臓組織内にある場合は、無細胞化生体材料は心臓細胞又は心臓組織に分化する多能性細胞から収集される。
【００４８】
別の実施形態は、組織を、1つ以上の分化胚幹細胞に由来する無細胞化生体材料と、内因性の組織増殖を促進するのに有効な量で接触させることによって、組織増殖を促進する方法を提供する。この実施形態では、無細胞化生体材料は、例えば組織を再生させるか、成長因子若しくはサイトカインを産生させるか、分裂させるか、又はそれらの組合せによって治癒過程に関与するように、組織の細胞を誘導する。
【００４９】
さらなる別の実施形態は、罹患又は損傷した心臓組織を、心臓筋原性分化を受けている胚幹細胞に由来する無細胞化生体材料と接触させることによって、心臓疾患を治療する方法を提供する。無細胞化された生体材料は、対照と比較して治癒を促進又は誘導するのに有効な量で投与することができる。
さらに別の実施形態は、罹患又は損傷した神経組織を、神経分化を受けている胚幹細胞に由来する無細胞化生体材料と接触させることによって、神経疾患を治療する方法を提供する。
【００５０】
別の実施形態は、罹患又は損傷した筋肉組織を、筋原性分化を受けている胚幹細胞に由来する無細胞化生体材料と接触させることによって、筋肉疾患を治療する方法を提供する。
別の実施形態は、罹患又は損傷した皮膚を、上皮分化を受けている胚幹細胞に由来する無細胞化生体材料と接触させることによって、皮膚疾患を治療する方法を提供する。
別の実施形態は、軟骨生成細胞を生成するために、分化を受けている胚幹細胞に由来する無細胞化生体材料を投与することによって、軟骨形成を誘導する方法を提供する。
【００５１】
開示される無細胞化生体材料は、単独であろうが又は自己由来若しくは異種の細胞、例えば多能性細胞と併用しようが、様々な変性疾患を治療するために用いることができる。治療することができる代表的な疾患には、これらに限定されないが、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis)(ALS)、アテローム性動脈硬化症、癌、糖尿病、心疾患、炎症性腸疾患(inflammatory bowel disease)(IBD)、パーキンソン病、前立腺炎、骨関節炎及び骨粗鬆症が含まれる。
【００５２】
(V.デバイス)
一実施形態は、デバイス、例えば創傷被覆材を提供する。創傷被覆材は、その上に分化胚幹細胞に由来する無細胞化生体材料を有する、裏張りを含む。無細胞化生体材料が創傷と接触して、傷の細胞と物理的に相互作用するように、創傷被覆材は創傷に当てられる。裏張りは、布、フェルト、メッシュ又はポリマーであることができる。創傷被覆材は、無細胞化生体材料に続いて水分調節層、吸収層及び接着剤を任意選択で含む。吸収層は、裏張りと無細胞化生体材料との間に位置することができる。
【００５３】
別の実施形態は、多能性細胞、例えば分化胚幹細胞に由来する無細胞化生体材料を有するステントを提供する。無細胞化生体材料は、ステントの外表面又はステントの内表面にあることができる。一般的に、ステントの外面は、無細胞化生体材料で少なくとも部分的に、好ましくは完全に被覆され、例えば、動脈の瘢痕化を減少させるのに有効な量で被覆される。ステントは当技術分野で公知であり、開示される無細胞化生体材料は、任意の1つのステント又は1種類のステントでの使用に限定されない。
【００５４】
開示される無細胞化生体材料は、ヒト患者などの患者に移植される様々な医療デバイスと一緒に用いることができることは、理解されよう。医療デバイスは、一般的に、対照と比較して瘢痕化を減少させるために、組織統合を助長するために、又はその両方に有効な量で、無細胞化生体材料で被覆される。例示的な移植される医療デバイスには、これらに限定されないが、ペースメーカー、整形インプラント、薬物送達デバイス、カテーテル、バイオセンサー、人工歯根、補綴具、ネジ、固定器具及びピンが含まれる。
別の実施形態は、キットを提供する。キットは、分化多能性細胞、例えば胚幹細胞に由来する無細胞化生体材料を含む。無細胞化生体材料は個々に詰め込むことができ、緩衝液、試薬、指示書及びデバイスを投与するためのアプリケーターを含むことができる。
【実施例】
【００５５】
(方法及び材料)
(細胞培養)
マウス胚幹細胞(D3)を、15%ウシ胎仔血清、2mMのL-グルタミン、非必須アミノ酸、抗生物質/抗真菌剤及び0.1mMのβ-メルカプトエタノールを補ったダルベッコの修正イーグル培地を含有するゼラチンコートの培養皿の上で培養した。細胞をそれらの未分化状態で維持するために、103U/mlの白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor)(LIF)(ESGRO)を培養に加えた。細胞を2〜3日ごとに植え継ぎ、それらは約70%集密度に到達した。この研究のために、細胞は20〜30の継代培養時に用いた。胚様体培養を開始するために、ESCをトリプシン処理し、ゼラチンコートの培養皿から取り出した。4,000,000個の細胞を非組織培養処理ペトリ皿(0日)へ移動し、40rpmのオービタル回転振盪機に置いた。EBに、LIFを含有しない分化培地を1日おきに与えた。
【００５６】
(無細胞化)
胚様体は、分化から4、7及び/又は10日後に収集した。等量の出発物質(EB)を、微量遠心機チューブ全体に分配した。質量残留分析のために、試料添加の前に各チューブを計量した。対照EBは、リン酸緩衝食塩水(phosphate buffered saline)(PBS)で洗浄して以降の可溶化のために4℃で保存するか、又は、細胞生存率測定のために無血清培地で37℃で保存した。処理群は、試験する試薬の添加の前に、18,000rcfで2分間遠心分離した。試料は所望の時間LabQuake回転式焼き肉器内で回転させ、18,000rcfで2分間回転させ、PBSで2回洗浄し、適用可能な場合、所与の時間第2の試薬中で回転させた。処理の終わりに、試料を18,000rcfで2分間遠心分離し、PBSで2回洗浄した。試験した試薬は、トリトンX-100(VWR)及びDnase(〜2,000クーニッツ単位/mg、Worthington Biochemical社)の組合せであった。
【００５７】
(走査型電子顕微鏡)
未処理EB及び無細胞試料をグルテルアルデヒド(0.2Mのカコジラート緩衝液中に2.5%)で固定し、1%OsO4(Electron Microscopy Sciences)で後固定した。試料を0.2Mのカコジラート緩衝液で3回洗浄してアセトンに移し、直ちに臨界点ドライヤー(Quorum Technologies社)内で乾燥した。各試料は、スパッター塗工機で90秒間金スパッターを塗布し、Hitachi S800走査型電子顕微鏡を用いて観察した。
【００５８】
(細胞生存率)
収集及び処理の直後に、未処理のEB及び無細胞試料をalamarBlue溶液(無血清培地中に10%のalamarBlue)で3時間インキュベートした(Biosource社)。蛍光は、SpectraMax M2eプレートリーダーを用いて測定した(ex: 545nm、em: 590nm)。生存率の相対値を得るために、読取値を未処理のEBについて得られた値に標準化した。さらに、定量的なalamarBlueデータを確認するために、生/死染色を実施した。未処理の及び処理したEBを6穴培養皿のウェルに移し、インキュベートした。次いで、緑色及び赤色の蛍光を捕えるために、試料を、TE反転蛍光顕微鏡を用いて画像化した。
【００５９】
(タンパク質定量化)
未処理のEB及び無細胞試料は、6Mの塩酸グアニジン(guanidine hydrochloride)(GuHCl)を用いて可溶化した。総タンパク含有量は、ビシンコニン酸(bicinchoninic acid)(BCA)アッセイキット(Pierce)を用いて評価した。既知の濃度のウシ血清アルブミン(20〜2000μg/mL)から作製された試料及び標準を、BCA溶液中で37℃で30分間インキュベートし、吸光度読取値はSpectraMax M2eプレートリーダーで562nmで取得した。未知試料をアルブミン標準曲線にあてはめて、タンパク質濃度を決定した。
【００６０】
(DNA定量化)
処理及び未処理の試料のDNA含量は、Quant-iT(商標)PicoGreen(登録商標)dsDNAアッセイキット(Molecular Probes社)を用いて定量した。試料は6MのGuHClを用いて可溶化し、20×TE緩衝液(200mMトリス-HCl、20mM EDTA、pH = 7.5)及びPicoGreen色素溶液に加えた。未知試料及び仔ウシ胸腺DNA標準の蛍光測定値は、SpectraMax M2eプレートリーダー(ex: 485nm、em: 528nm)を用いて取得した。未知試料を標準曲線にあてはめて、DNA含量を決定した。
【００６１】
(質量残留)
未処理の及び無細胞化したEBをdH2Oで2回洗浄し、-80℃で一晩保存した。次いで、Labconco凍結乾燥器を用いて試料を24時間凍結乾燥し、計量した。質量残留は、平均の未処理のEBと無細胞材料との間の差として記録した。全ての試料は、同じ量の出発物質から作製した。
【００６２】
(組織学及び免疫組織化学(immunohistochemistry)(IHC))
EBは、細胞集塊をチューブの底に沈殿させることによって収集した。EB又は無細胞生成物は、メチルカルノイ(carnoy)又はホルマリン固定液で30分間インキュベートし、Histogel(登録商標)に包埋した。次いで、試料は、一連のキシレン及びアルコール洗浄処理及びパラフィン包埋を通して、組織学的切片化のために処理した。各群を、5μm切片に分割し、脱パラフィンした。一部の試料は、Leica Autostainer XLを用いてヘマトキシリン-エオジン(hematoxylin and eosin)(H&E)で染色した。IHCを受ける切片は、脱パラフィンの後、キシレン及び100%エタノール(ethanol)(EtOH)で洗浄した。内因性のペルオキシダーゼ活性を、100%メタノール中の0.75%過酸化水素を用いてクエンチし、その後、試料を段階的なエタノールシリーズ(100% EtOH〜35% EtOH)で水和させ、リン酸緩衝食塩水(phosphate buffered saline)(PBS、pH7.3)で洗浄した。試料を1%ウシ血清アルブミンで30分間インキュベートしてから、ヒアルロナン結合タンパク質(hyaluronan binding protein)(HABR-B)を加え、4℃で一晩インキュベートした。次いで、染色発色のためにVector Elite ABCキットを用い、その後、Gills #3ヘマトキシリンで対比染色した。抗退色剤(Biomeda Corp.)を含む水性の封入剤を用いてカバーガラスを各試料の上に載せ、Nikon 80iアップライト顕微鏡及びSPOT画像化ソフトウェアを用いて画像化した。
【００６３】
(免疫蛍光法(immunofluorescence)(IF))
染色のために10%ホルマリンで固定した試料を上述の通り調製した。脱パラフィンの後、組織学的切片を透過性化し、2%ヤギ血清(goat serum)(GS)及び0.05%トリトンX-100を用いて45分間ブロックした。試料を、コラーゲンIV、フィブロネクチン又はラミニン-1一次抗体(ポリクローナルウサギ)と一緒に4℃で一晩インキュベートし(1:80希釈溶液)、PBSで洗浄し、次いで、FITCコンジュゲートヤギ抗ウサギ二次抗体(1:100希釈溶液)とインキュベートした後、Hoechstを用いて対比染色を行った。最後に、抗退色剤(Biomeda Corp.)を含む水性の封入剤を用いてカバーガラスを上に載せ、Nikon 80i蛍光アップライト顕微鏡を用いて画像化した。
【００６４】
(実施例1):胚様体の無細胞化
トリトンX-100及びDNアーゼの濃度及び処理時間の変動について、無細胞化実験を実施した。濃度最適化のために、プロトコルの効率指標として細胞生存率を用いて、トリトン及びDNアーゼを評価した(図1A及びB)。生存能力は全ての場合で有意に抑制され、各群の間で有意差はなかった。
【００６５】
トリトン及びDNアーゼ濃度並びに処理時間を、総タンパク含有量を通しても評価した(図2A〜D)。タンパク含有量は各実験群で保持されたが、トリトン濃度、DNアーゼ濃度又はDNアーゼ処理時間内では有意差はなかった。分析したトリトン処理時間内では、30分の時間は、60分間及び90分間よりも有意に多くのタンパク質を保持した。
【００６６】
最後に、トリトン単独、DNアーゼ単独及びトリトンとDNアーゼ(図面3A〜C)との組合せを用いた場合の試薬の組合せを、細胞生存率、総タンパク含有量及び細胞密度を評価することによって分析した。Hoechst染色は、核は未処理のEBで異なるが、全ての処理群はび漫性の核染色を示すか又は核染色を示さないことを明らかにした。トリトン単独及びDNアーゼ単独の画像は、処理の試料ほど違いは明瞭ではないけれども、少量の核物質が存在を示したが、トリトン及びDNアーゼの組合せを用いた場合は、DNAシグナルはほとんど残っていなかった。細胞核の定量化は、効率的な細胞除去のためのトリトンとDNアーゼの併用をさらに支持した。さらに、細胞生存率データは、多少の生存能力がトリトン単独及びDNアーゼ単独試料に残っていたことを示したが、試薬の組合せでは、それはアッセイ検出限界以下に低下していた。タンパク含有量も、全ての試料で保持されていることがわかった。
【００６７】
トリトン及びDNアーゼを一緒に用いる最適化されたプロトコルは、DNアーゼ処理の時間及び濃度を変えてさらに調査したが、どちらも、生存能力、総タンパク含有量及びDNA含有量で有意差を示さなかった(図4A〜C)。DNアーゼと1%トリトンとを混合したが、この手法の変化は、トリトン及びDNアーゼを逐次的に用いる既存のプロトコルの改善において、有意差をもたらさなかった。追加又は代替の処理法として過酢酸を調査したが、トリトン/DNアーゼプロトコルの効率を有意に改善しないことがわかった。さらに、最終無細胞生成物の量及びタンパク含有量を増強する試みとして、アスコルビン酸を用いてEBを培養した(データは示さず)。
【００６８】
(実施例2):組織学
未処理の及び処理したEBのH&E染色切片は、無細胞化の後の個々のEBの凝集を示した。EBはより分化した形態をとるようであるが、無細胞材料は分化の過程でほとんど変化を示さなかった。個々の細胞は未処理のEBに明らかに存在したが、無細胞材料中には、明確な核は観察されなかった。
様々な倍率の走査電子顕微鏡写真は、未処理のEBの表面詳細、並びに無細胞EBの表面及び断面を示す。断面の画像は生成物内部の多孔性を示したが、無細胞表面と未処理表面との間の比較は、無細胞化処置が個々の細胞を除去又は破壊して、1つの比較的均一で平らな物質を形成することを示した。
【００６９】
(実施例3):無細胞化プロトコル分析:タンパク質、DNA及び質量定量化
トリトンとDNアーゼとの組合せがEBの無細胞化で最も効率的であることが明らかになったので、分化の過程における総タンパク含有量、DNA含有量及び質量残留の分析を最終プロトコルで実施した(図5A〜C)。タンパク含有量は、4、7及び10日後には維持されていた。さらに、DNA含有量は各時点で有意に減少し、4日後に残留DNAはほとんど残らず、7日後及び10日後にわずかに多く残っていた。最後に、質量は7日後及び10日後に保持されており、抽出工程の後に一部の物質が残されたことを示唆する。
【００７０】
(実施例4):細胞生存率及び成分残留
分化過程での細胞生存率は、定量的アッセイ及び視覚的アッセイを用いて分析した。生/死アッセイは、未処理のEBの分化過程での、全ての生細胞を示し、死細胞は示さなかった。無細胞材料は、4日後及び10日後に大部分死んだ細胞を示し、一部は7日後に生存していた。この視覚情報は、4日後及び10日後にアッセイの検出限界のレベル以下の生存能力を示し、7日後に〜25%の生存能力を示した定量的なalamarBlueデータで裏づけされた(図6)。
【００７１】
抽出工程の後にどの細胞外マトリックス成分が残ったか分析する最初の研究を、免疫染色を用いて実施した。コラーゲンIV、ラミニン-1及びヒアルロナン含有量を、未処理のEB及び無細胞材料で視覚化した。全ての3成分は、未処理のEBの周りに空間的に拡散していた。ヒアルロナンは、より低い細胞密度の領域に局在化するようであった。重要なことに、個々のタンパク質又はグリコサミノグリカンのかなりの量が無細胞化を通して維持され、最終生成物全体に存在することが発見された。
【００７２】
(実施例5): ES細胞の心臓筋原性分化
マウスES細胞は、一般的に、懸滴培養技術又は静的懸濁培養によって胚様体(embryoid body)(EB)形成を通して分化するように誘導されるが、両方法は固有の限界を有する。懸滴によって生成されるEBは、サイズ、形及び以降の分化挙動においてより均一であるが、個々の滴を物理的に分離しておく必要があることは、多数のEBの効率的な生産の妨げとなる。一方、静的懸濁培養は、細胞懸濁液から容易に開始することができるが、生じるEBはサイズ、形及び分化が大きく変動する。さらに、静的懸濁の間、EBはしばしば時期尚早にペトリ皿の表面に接着するので、低接着性表面塗膜を使用しない限り、分化細胞の全収率を減少させる。EB形成の間、懸濁EB培養物を回転プレート上の未処理細菌培養皿に単に置くことによって、EBのサイズ及び形の均一性が、EBの全収率及び分化の再現性と同様に有意に改善できることが、最近発見された。
【００７３】
マウスES細胞(D3系統)を、LIF(103 U/ml)の存在下で、無フィーダー増殖条件下で培養した。分化を開始するために、LIFを培地から除去し、EBをペトリ皿のふたの上の懸滴(600細胞/15μl液滴)又は懸濁培養(4×105細胞/ml; 10ml/100mmの培養皿)に入れた。回転懸濁液は、懸濁液培養皿を加湿されたCO2インキュベータ内の回転プレート(Barnstead Thermolyne社)上に置くことによって達成した。4日間の分化の後、異なる方法によって形成させたEBの位相差画像を得、個々のEBの断面積及び形状係数(長径で割った短径と定義される)をImageJソフトウェアで測定した。形態測定分析は、回転培養物が懸滴EBとサイズ及び形の点で類似しているが、静置培養は顕著に不規則であることを示した。同数の細胞を接種した静置培養でよりも、多くの数のEBが回転培養で生成された(図7)。
【００７４】
異なる方法によって形成したEBの心臓発生を、平板培養した後の拍動するEBの割合を数え、分化の過程での細胞の遺伝子発現プロフィールを評価することによって試験した。平板培養の1日後(分化の8日後)、少なくとも1つの拍動中心を含むEBの割合は、懸滴及び回転培養の両方で約60%であったが、10%未満の静的EBが収縮領域を示した(図8)。収縮性の懸滴EBの割合は経時的にわずかに上昇した(〜80%まで)のに対して、拍動回転EBの数は比較的一定のまま(〜50%)であったが、収縮領域は大きさにおいて増加し、より激しく収縮した。さらに、回転培養からのEB内の拍動中心の数は、試験時間の経過とともに増加するようであったが、このことは、個々のEBの増殖物内での境界の明瞭な中心と合併した中心とを区別することの困難のために、定量化は不可能であった。
【００７５】
半定量的リアルタイムPCR分析は、懸滴及び回転EBにおいて、静的懸濁液でよりも顕著なNanog発現(多能性幹細胞マーカー)の減少を示し(図9A)、分化のより効率的な誘導を示唆した。回転EBは、Brachyury-T発現に基づくと、懸滴及び静的懸濁液EBと比較して、4日後に中胚葉形成の有意な増加を示したが、4日後の懸滴のBrachyury Tのより低いレベルは、分化の間にその発現が急速に過ぎる性質に関係していた可能性がある(図9B)。MLC-2vの発現に基づくと、心筋細胞遺伝子発現も、分化7日後には静的懸濁液EBでよりも懸滴及び回転EBで有意に高かった(図9C)。従って、遺伝子発現の結果は、平板培養したEBの観察された分化及び収縮活動と相関しており、回転培養方法が、懸滴又は懸濁法のいずれよりも高い全体収率を示し、ES細胞からの心臓筋原性分化を促進する有効手段であることが示唆された。
【００７６】
(実施例6):心臓組織修復のための無細胞化生体材料
先に述べたようにマウスES細胞を培養し、EB形成を通して分化させた。4日間の分化の後、細胞物質を抽出し、残りの不溶性ECMを保持しようとして、生じたEBを収集して界面活性剤及び/又は酵素により処理した。EB試料を、トリトンX-100(0.1%若しくは1% w/v)又はDNアーゼ(1mg/ml)溶液で30分間処理した。生じた物質を、Hoechst染色によって組織学的に分析した。質量残留は、処理前及び処理後の値から計算し、細胞生存率は、Alamar Blueアッセイ(Biosource社)で測定した。トリトンX-100による無細胞化は、個々のEBが数分で凝集し、遠心分離によって容易に回収可能な連続した物質の粘性塊を形成するように誘導した。組織学は、トリトンX処理(0.1%)が単独で、正常で明確な、丸い細胞核の形態を崩壊させ、線維多孔性無細胞材料を与えることを示した。出発物質及び最終物質の質量計算は、ほとんどの質量が無細胞化後も保持され(〜70〜80%)、保持された質量の割合はトリトンX-100の濃度の上昇に伴い減少することを示した。細胞生存率はDNアーゼ処理単独で有意に低下し、トリトンX-100処理によって完全に消滅し、EBの無細胞化に成功したことが示された。類似した結果が無細胞化したEBから分化の7日後にも得られ、細胞抽出のタイミングを選択的に制御することができることが示された。
要約すると、前述の研究は、溶媒抽出法によるEBの無細胞化は、インビトロの分化の過程でES細胞由来の新規生体材料を生成することを証明した。
【００７７】
(実施例7):無細胞化材料の心臓移植。
無細胞化したEB材料を、左冠状動脈結紮の直後、雄CDFラットの梗塞性心臓の心外膜面に移植した。無細胞材料(〜2×2mm)を、フィブリン糊の1滴(＜100μl)で心臓に付着させた。心臓を1日後又は13日後に回収、固定し、ヘマトキシリン-エオジンで染色した。1日後に、材料を発達中の梗塞性組織に隣接して心臓表面に保持し、細胞核をほとんど含んでいなかった。13日後までには、無細胞材料はもはや容易に識別することができず、未処理対照と比較して、無細胞材料を有する梗塞性心臓では、治癒応答、壁厚及び室サイズにおいて有意差が明瞭であった。これらの結果は、ES細胞由来の無細胞ECMは、梗塞性ラット心臓に移植することができ、心筋梗塞後に正常な心室リモデリングの過程を変化させることができることを示す。
【００７８】
他に定義されていない場合は、本明細書で用いる全ての技術用語及び専門用語は、開示される発明が属する分野の技術者が通常理解するのと同じ意味を有する。本明細書で引用される刊行物及びそのためにそれらが引用される材料は、可能な場合、特に引用により組み込まれる。
当業者は、日常の実験を用いるだけで、本明細書に記載する発明の特定の実施形態の多くの同等物を認識するか、又は確認することができるようになる。そのような同等物は、上記の特許請求の範囲に包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】トリトンX-100濃度(A)又はDNアーゼ濃度(B)に対する胚様体の標準化された細胞生存率の棒グラフである。
【図２】トリトンX-100濃度(A);トリトンX持続時間(B);DNアーゼ濃度(c);及びDNアーゼ持続時間(D)に対する胚様体のタンパク質濃度の棒グラフである。
【図３】トリトンX100、DNアーゼ又は両方で処理した胚様体(A);トリトンX100、DNアーゼ又は両方で処理した胚様体のタンパク質濃度(B);及びトリトンX100、DNアーゼ又は両方で処理した胚様体の細胞密度(C)に対する標準化された細胞生存率の棒グラフである。
【図４】標準化生存率対トリトンX100と組み合わせたDNアーゼによる胚様体の処理持続時間(A);DNA含量対時間(B);及びタンパク質含量対時間(C)の棒グラフである。
【００８０】
【図５】タンパク質濃度対胚様体分化日(A);質量対胚様体分化日(B);及びDNA含量対胚様体分化日(C)の棒グラフである。
【図６】標準化細胞生存率対分化日の棒グラフである。
【図７】回転式又は静置式の培養手法を用いた胚様体形成の棒グラフである。
【図８】静置式又は回転式の培養手法を用いて生産された拍動胚様体の散布図である。
【図９】静置式又は回転式の培養手法を用いて生産された胚様体のNanog(A)、Brachyury T (B)又はMLC-2v (C)発現の増加倍率を示す棒グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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