(57)【要約】  抗体のようなＴｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）調節物質、ＴＬＲ３抗体をコードするポリヌクレオチド若しくはそれらのフラグメント、ならびに前述の作成および使用方法が開示される。
2009523010.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ１−α、ＲＡＮＴＥＳおよびＴＮＦ−αよりなる群から選択されるサイトカインの細胞性産生を誘導する、ヒトＴｏｌｌ様受容体３（ｈＴＬＲ３）若しくはそのホモログと反応性の単離された抗体。
【請求項２】
他のＴｏｌｌ様受容体リガンドに対する免疫応答を改変する、ｈＴＬＲ３若しくはそのホモログと反応性の単離された抗体。
【請求項３】
配列番号９、１１および１３に示されるところのＨ鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列、ならびに配列番号１９、２１および２３に示されるところのＬ鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を含んでなる、モノクローナル抗体の抗原結合能力を有する、ｈＴＬＲ３と反応性の単離された抗体。
【請求項４】
配列番号９、１１および１３に示されるところのＨ鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列、ならびに配列番号１９、２１および２３に示されるところのＬ鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を含んでなる、ｈＴＬＲ３と反応性の単離された抗体。
【請求項５】
配列番号６に示されるアミノ酸配列を含んでなるＨ鎖および配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含んでなるＬ鎖を含んでなる、ｈＴＬＲ３と反応性の単離された抗体。
【請求項６】
配列番号９、１１および１３に示されるＣＤＲアミノ酸配列を含んでなる抗体Ｈ鎖をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号１９、２１および２３に示されるＣＤＲアミノ酸配列を含んでなる抗体Ｌ鎖をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号６に示されるアミノ酸配列を含んでなる抗体Ｈ鎖をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号５に示される配列を含んでなる、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含んでなる抗体Ｌ鎖をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１】
配列番号１５に示される配列を含んでなる、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項６、７、８、９、１０若しくは１１に記載の最低１種のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１３に記載の宿主細胞を培養すること、および該宿主細胞により産生された抗体を回収することを含んでなる、ｈＴＬＲ３と反応性の抗体の作成方法。
【請求項１５】
請求項５に記載の抗体を産生するハイブリドーマ細胞株。
【請求項１６】
免疫刺激剤と組合せの治療上有効な量の請求項１に記載の抗体を患者に投与することを含んでなる、ウイルス感染症の処置方法。
【請求項１７】
免疫刺激剤がインターフェロン若しくはＴｏｌｌ様受容体−９（ＴＬＲ９）アゴニストである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ウイルス感染症が、肝炎ウイルス、単純疱疹ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトパピローマウイルス若しくは他の皮膚および粘膜関連の感染症である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
免疫刺激剤と組合せの予防上有効な量の請求項１に記載の抗体を患者に投与することを含んでなる、ウイルス感染症の予防方法。
【請求項２０】
免疫刺激剤が、インターフェロン若しくはＴｏｌｌ様受容体−９（ＴＬＲ９）アゴニストである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ウイルス感染症が、肝炎ウイルス、単純疱疹ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトパピローマウイルスまたは他の皮膚若しくは粘膜関連の感染症である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
免疫刺激剤と組合せの治療上有効な量の請求項１に記載の抗体を患者に投与することを含んでなる、癌の処置方法。
【請求項２３】
免疫刺激剤が、インターフェロン若しくはＴｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ）アゴニストである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
癌が、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、毛様細胞白血病、悪性黒色腫若しくは肉腫である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
免疫刺激剤と組合せの治療上有効な量の請求項１に記載の抗体を患者に投与することを含んでなる、炎症性腸疾患の処置方法。
【請求項２６】
免疫刺激剤がインターフェロン若しくはＴＬＲ９アゴニストである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
炎症性腸疾患がクローン病若しくは潰瘍性大腸炎である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
Ｔｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ７）アゴニストと組合せの治療上有効な量の請求項１に記載の抗体を患者に投与することを含んでなる、ウイルス感染関連症状の処置方法。
【請求項２９】
ＴＬＲ７アゴニストがイミキモド若しくはレシキモドである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ウイルス感染関連症状が陰部疣贅である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
Ｔｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ７）アゴニストと組合せの予防上有効な量の請求項１に記載の抗体を患者に投与することを含んでなる、ウイルス感染関連症状の予防方法。
【請求項３２】
ＴＬＲ７アゴニストがイミキモド若しくはレシキモドである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ウイルス感染関連症状が陰部疣贅である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
ＴＬＲ９若しくはＴＬＲ７アゴニストと組合せの治療上有効な量の請求項１に記載の抗体を患者に投与することを含んでなる、肺疾患および病原体媒介性の増悪の処置方法。
【請求項３５】
ＴＬＲ７アゴニストがイミキモド若しくはレシキモドである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
肺疾患が細菌性、真菌性若しくはウイルス性肺炎であり、および病原体媒介性の増悪が喘息、気管支炎若しくは慢性閉塞性肺疾患である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
ＴＬＲ９若しくはＴＬＲ７アゴニストと組合せの予防上有効な量の請求項１に記載の抗体を患者に投与することを含んでなる、肺疾患および病原体媒介性の増悪の予防方法。
【請求項３８】
ＴＬＲ７アゴニストがイミキモド若しくはレシキモドである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
肺疾患が細菌性、真菌性若しくはウイルス性肺炎であり、および病原体媒介性の増悪が喘息、気管支炎若しくは慢性閉塞性肺疾患である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
ＴＬＲ９若しくはＴＬＲ７アゴニストと組合せの治療上有効な量の請求項１に記載の抗体を患者に投与することを含んでなる、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の処置方法。
【請求項４１】
ＴＬＲ７アゴニストがイミキモド若しくはレシキモドである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ＴＬＲ９若しくはＴＬＲ７アゴニストと組合せの予防上有効な量の請求項１に記載の抗体を患者に投与することを含んでなる、ＧＶＨＤの予防方法。
【請求項４３】
ＴＬＲ７アゴニストがイミキモド若しくはレシキモドである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
免疫処置と組合せの治療上有効な量の請求項１に記載の抗体を患者に投与することを含んでなる、自己免疫疾患の処置方法。
【請求項４５】
免疫処置がインターフェロンである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
自己免疫疾患が多発性硬化症若しくは狼瘡である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
免疫処置と組合せの予防上有効な量の請求項１に記載の抗体を患者に投与することを含んでなる、自己免疫疾患の予防方法。
【請求項４８】
免疫処置がインターフェロンである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
自己免疫疾患が多発性硬化症若しくは狼瘡である、請求項４７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗体のようなＴｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）モジュレーターに関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物細胞による外来抗原の認識はＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）と呼ばれる一組の自然免疫受容体により媒介され得る。ＴＬＲはＰＡＭＰ（ｐａｔｈｏｇｅｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｔｅｒｎ）として同定される微生物病原体由来の保存されたパターンを認識する（非特許文献１）。ＴＬＲのＰＡＭＰとの相互作用は、ＮＦ−κＢ活性化およびサイトカイン遺伝子発現の転写を伴うシグナル伝達カスケードをもたらす。１０種のヒトｔｏｌｌ様受容体および５種のＴＬＲアダプタータンパク質が同定されている。
【０００３】
ＴＬＲは、ホモ若しくはヘテロ二量体を形成すること、ならびに多様なアダプタータンパク質を結合することにより、それらのリガンドレパートリーを拡大することが可能である。例えばＴＬＲ３はｄｓＲＮＡ（ウイルス複製における中間体）を結合する。ＴＬＲ３はポリＩ：Ｃ（合成ｄｓＲＮＡアナログ）、および壊死細胞からのｍＲＮＡともまた相互作用する。ＴＬＲ３の活性化は、ウイルス感染の制御で重要であるＩ型インターフェロンの分泌につながる。完全長のヒトＴＬＲ３のアミノ酸配列およびコードするポリヌクレオチドの配列をそれぞれ配列番号１および２に示す。ＴＬＲ類、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９は核酸リガンドもまた有し；これらＴＬＲの活性化もまたインターフェロン分泌につながり得る。
【０００４】
Ｉ型インターフェロンはシグナル伝達カスケードを誘発して一組の前初期応答遺伝子（ＩＦＮ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅすなわちＩＳＧ）を活性化し、そして診察室で有用と判明している。生じる抗ウイルス活性は、ｍＲＮＡ翻訳阻害、ＲＮＲエディティングおよびＲＮＡ分解を包含する（非特許文献２）。現在、ペグ化インターフェロンおよび広域スペクトルの抗ウイルス化合物リバビリンの併用療法がＣ型肝炎感染を処置するのに使用されている（非特許文献３）。
【０００５】
Ｉ型ＩＦＮの決定的に重要な抗ウイルス性の役割は、感染宿主細胞によるＩ型ＩＦＮの産生を阻害するウイルス耐性機構の進化によりさらに示される。例えば、インフルエンザのＮＳ１タンパク質はＩＲＦ−３活性化およびＩＦＮβ産生に拮抗し（非特許文献４）、また、Ａ５２Ｒポックスウイルスタンパク質はＩＲＡＫ２およびＴＲＡＦ６と会合してＴＬＲ３の下流のシグナル伝達を阻害する（非特許文献５）。従って、ＴＬＲ活性化を誘発すること若しくはＴＬＲ媒介性のシグナル伝達経路を高めることに基づく治療は、内因性ＩＦＮα／β産生を増大しかつ急性ウイルス感染の制御において宿主を補助する。
【０００６】
免疫応答の結果を調節するためのＴＬＲアゴニストの使用が治療的使用に現在検討されている（非特許文献６；非特許文献７）。例えば、ＴＬＲ９リガンド、ＣｐＧオリゴジヌクレオチド（ＯＤＮ）は、Ｉ型ＩＦＮおよびＴＨ１応答の産生を刺激することが可能であり（非特許文献８）、これはワクチンアジュバントとしてのみならずしかしまた強力なＴＨ１応答を必要とする疾患の処置および若しくは予防のためのＣｐＧ  ＯＤＮの可能な使用を示唆する知見である。別の例は、陰部疣贅の処置のための承認された剤、合成ＴＬＲ７アゴニスト、イミキモド（ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）であり；その保護効果はＩＦＮα、ＴＮＦαおよびＩＬ−１βのような炎症性サイトカインの刺激により媒介されると考えられる（非特許文献９）。全体として、これらの知見は、ＴＬＲアゴニストが、大きな治療上の利益を有する可能性をもつ免疫調節剤の新規一分類であることを示す。
【０００７】
従って、ＴＬＲアゴニストの効果を増強する新規免疫調節剤の同定に対する必要性が存在する。こうした新規のＴＬＲに基づく治療は、より少なく頻繁な投薬レジメンで持続性免疫応答を提供するという利点を有することが期待される。
【０００８】
【非特許文献１】Ｂａｒｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００：１５２４−１５２５、２００３
【非特許文献２】Ｓａｍｕｅｌら、Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  １４：７７８−８０９、２００１
【非特許文献３】Ｍａｎｎｓら、Ｌａｎｃｅｔ  ３５８：９５８−９６５、２００１
【非特許文献４】Ｄｏｎｅｌａｎら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７８：１１５７４−１１５８２、２００４
【非特許文献５】Ｈａｒｔｅら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ、１９７：３４３−３５１、２００３
【非特許文献６】Ｏ’Ｎｅｉｌｌ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍ  ３：３９６−４０３、２００３
【非特許文献７】Ｓｃｈｅｔｔｅｒら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｄｅｖｅｌ  ７：２０４−２１０、２００４
【非特許文献８】Ｋｒｉｅｇ、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０：７０９−６０、２００２
【非特許文献９】Ｓａｕｎｄｅｒ、Ｊ  Ａｍｅｒ  Ａｃａｄ  Ｄｅｒｍ  ４３：Ｓ６−Ｓ１１、２０００
【発明の開示】
【０００９】
［発明の要約］
本発明の一局面は、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ１−α、ＲＡＮＴＥＳおよびＴＮＦ−αよりなる群から選択されるサイトカインの細胞性産生を誘導する、ヒトＴｏｌｌ様受容体３（ｈＴＬＲ３）若しくはそのホモログと反応性の単離された抗体である。
【００１０】
本発明の別の局面は、他のＴｏｌｌ様受容体リガンドに対する免疫応答を改変する、ｈＴＬＲ３若しくはそのホモログと反応性の単離された抗体である。
【００１１】
本発明の別の局面は、配列番号９、１１および１３に示されるところのＨ鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列、ならびに配列番号１９、２１および２３に示されるところのＬ鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を含んでなる、モノクローナル抗体の抗原結合能力を有する、ｈＴＬＲ３と反応性の単離された抗体である。
【００１２】
本発明の別の局面は、配列番号９、１１および１３に示されるところのＨ鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列、ならびに配列番号１９、２１および２３に示されるところのＬ鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を含んでなる、ｈＴＬＲ３と反応性の単離された抗体である。
【００１３】
本発明の別の局面は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含んでなるＨ鎖および配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含んでなるＬ鎖を含んでなる、ｈＴＬＲ３と反応性の単離された抗体である。
【００１４】
本発明の別の局面は、配列番号９、１１および１３に示されるＣＤＲアミノ酸配列を含んでなる抗体Ｈ鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドである。
【００１５】
本発明の別の局面は、配列番号１９、２１および２３に示されるＣＤＲアミノ酸配列を含んでなる抗体Ｌ鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドである。
【００１６】
本発明の別の局面は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含んでなる抗体Ｈ鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドである。
【００１７】
本発明の別の局面は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含んでなる抗体Ｌ鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドである。
【００１８】
本発明の他の局面は、免疫刺激剤と組合せの治療上有効な量の本発明の抗体を患者に投与することを含んでなる、ウイルス感染症の処置若しくは予防方法を包含する。
【００１９】
本発明の別の局面は、免疫刺激剤と組合せの治療上有効な量の本発明の抗体を患者に投与することを含んでなる、癌の処置方法である。
【００２０】
本発明の別の局面は、免疫刺激剤と組合せの治療上有効な量の本発明の抗体を患者に投与することを含んでなる、炎症性腸疾患の処置方法である。
【００２１】
本発明の他の局面は、Ｔｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ７）アゴニストと組合せの治療上有効な量の本発明の抗体を患者に投与することを含んでなる、ウイルス感染関連症状の処置若しくは予防方法を包含する。
【００２２】
本発明の他の局面は、ＴＬＲ９若しくはＴＬＲ７アゴニストと組合せの治療上有効な量の本発明の抗体を患者に投与することを含んでなる、肺疾患および病原体媒介性の増悪の処置若しくは予防方法を包含する。
【００２３】
本発明の他の局面は、ＴＬＲ９若しくはＴＬＲ７アゴニストと組合せの治療上有効な量の本発明の抗体を患者に投与することを含んでなる、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の処置若しくは予防方法を包含する。
【００２４】
本発明の他の局面は、免疫処置と組合せの治療上有効な量の本発明の抗体を患者に投与することを含んでなる、自己免疫疾患の処置若しくは予防方法を包含する。
［発明の詳細な記述］
本明細で引用される、限定されるものでないが特許および特許出願を挙げることができる全刊行物は、完全に示されるかのように引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００２５】
本明細書で使用されるところの「抗体」という用語は広範な意味で意味しており、そしてポリクローナル抗体、マウス、ヒト、ヒト化およびキメラモノクローナル抗体を包含するモノクローナル抗体を包含する免疫グロブリンすなわち抗体分子、ならびに抗体フラグメントを包含する。
【００２６】
一般に、抗体は特異的抗原に対する結合特異性を表すタンパク質すなわちポリペプチドである。無傷の抗体は２本の同一のＬ鎖および２本の同一のＨ鎖から構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。典型的には、各Ｌ鎖は１個の共有ジスルフィド結合によりＨ鎖に連結される一方、ジスルフィド結合の数は多様な免疫グロブリンアイソタイプのＨ鎖間で変動する。各ＨおよびＬ鎖は規則的に空間を空けられた鎖内ジスルフィド架橋もまた有する。各Ｈ鎖は、一端に１個の可変ドメイン（ＶＨ）、次いで多数の定常ドメインを有する。各Ｌ鎖は、一端に１個の可変ドメイン（ＶＬ）およびその他端に１個の定常ドメインを有し；Ｌ鎖の定常ドメインはＨ鎖の第一の定常ドメインと整列され、また、Ｌ鎖可変ドメインはＨ鎖の可変ドメインと整列される。いずれの脊椎動物種の抗体Ｌ鎖も、それらの
定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、２種の明らかに異なるタイプすなわちκおよびλの一方に帰属し得る。免疫グロブリンは、Ｈ鎖定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、５種の主要なクラスすなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭに帰属し得る。ＩｇＡおよびＩｇＧはアイソタイプＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４としてさらに下位分類される。
【００２７】
「抗体フラグメント」という用語は、無傷の抗体の一部分、一般には無傷の抗体の抗原結合すなわち可変領域を意味している。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント、二特異性抗体、一本鎖抗体分子、および最低２種の無傷の抗体から形成される多特異性抗体を包含する。
【００２８】
本明細書で使用されるところの「抗原」という用語は、直接若しくは間接的いずれかで抗体を生成する能力を有するいかなる分子も意味している。タンパク質をコードする核酸が「抗原」の定義内に包含される。
【００２９】
「ＣＤＲ」は、免疫グロブリンＨおよびＬ鎖の超可変領域である抗体の相補性決定領域のアミノ酸配列と定義する。例えば、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第４版、米国保健福祉省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、国立保健研究所（１９８７）を参照されたい。免疫グロブリンの可変部分に３個のＨ鎖および３個のＬ鎖ＣＤＲ若しくはＣＤＲ領域が存在する。従って、本明細書で使用されるところの「ＣＤＲ」は、全３個のＨ鎖ＣＤＲ、若しくは全３個のＬ鎖ＣＤＲ、または適切な場合には全Ｈおよび全Ｌ鎖双方のＣＤＲを指す。
【００３０】
ＣＤＲは抗原若しくはエピトープへの抗体の結合のための接触残基の大多数を提供する。本発明の目的のＣＤＲはドナー抗体の可変ＨおよびＬ鎖配列に由来し、そして天然に存在するＣＤＲのアナログを包含し、このアナログは、それらが由来したドナー抗体と同一の抗原結合特異性および／若しくは中和能力もまた共有若しくは保持する。
【００３１】
「ホモログ」という用語は、参照配列に対する４０％と１００％の間の配列同一性を有するタンパク質配列を意味している。ｈＴＬＲ３のホモログは、既知のｈＴＬＲ３配列に対する４０％と１００％の間の配列同一性を有する他の種からのポリペプチドを包含する。２種のペプチド鎖間の同一性パーセントは、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  ｖ．９．０．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、カリフォルニア州カールズバッド）のＡｌｉｇｎＸモジュールのデフォルトの設定を使用した対にしたアライメントにより決定し得る。
【００３２】
本明細書で使用されるところの「と組合せの」という用語は、記述される剤が、混合物で、単一の剤として同時に、若しくは単一の剤としていずれかの順序で連続して一緒に動物に投与され得ることを意味している。
【００３３】
本明細書で使用されるところの「ミメティボディ（ｍｉｍｅｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、一般式（Ｉ）：
（Ｖ１−Ｐｅｐ−Ｌｋ−Ｖ２−Ｈｇ−ＣＨ２−ＣＨ３）（ｔ）
（Ｉ）
［式中、Ｖ１は免疫グロブリン可変領域のＮ末端の一部分であり、Ｐｅｐは細胞表面ＴＬＲ３に結合するポリペプチドであり、Ｌｋはポリペプチド若しくは化学結合であり、Ｖ２は免疫グロブリン可変領域のＣ末端の一部分であり、Ｈｇは免疫グロブリンヒンジ領域の一部分であり、ＣＨ２は免疫グロブリンＨ鎖ＣＨ２定常領域であり、およびＣＨ３は免疫グロブリンＨ鎖ＣＨ３定常領域であり、ならびにｔは独立に１ないし１０の整数である］を有するタンパク質を意味している。ミメティボディは、該構築物中に存在するＨ鎖定常
ドメインのアミノ酸配列に依存して、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥのような多様なタイプの免疫グロブリン分子の特性および機能を模倣し得る。いくつかのミメティボディの態様において、Ｖ１は非存在であってもよい。本発明のミメティボディは、ＴＬＲ発現細胞への結合によりＴＬＲの生物学的活性を調節する。
【００３４】
本明細書で使用されるところの「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体（若しくは抗体フラグメント）を意味している。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、典型的には単一の抗原決定子に向けられる。「モノクローナル」という修飾語は該抗体の実質的に均質な特徴を示し、そしていずれかの特定の方法による抗体の製造を必要としない。例えば、マウスｍＡｂはＫｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５）のハイブリドーマ法により作成し得る。アクセプター抗体（典型的にはヒトのような別の哺乳動物種）由来のＬおよびＨ鎖定常領域とともにのドナー抗体（典型的にはマウス）由来のＬ鎖およびＨ鎖可変領域を含有するキメラｍＡｂは、米国特許第４，８１６，５６７号明細書に開示される方法により製造し得る。ヒト以外のドナー免疫グロブリン（典型的にはマウス）由来のＣＤＲ、および、場合によっては結合アフィニティーを保存するように変えられた枠組み支持残基を有する１種若しくはそれ以上のヒト免疫グロブリン由来である分子の残存する免疫グロブリン由来部分を有するヒト化ｍＡｂは、Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、８６：１００２９−１００３２（１９８９）およびＨｏｄｇｓｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：４２１（１９９１）に開示される技術により得ることができる。
【００３５】
ヒト化に有用な例示的ヒト枠組み配列は、例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ；
ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｐｈａｇｅ／ｈｄｂ．ｈｔｍｌ；
ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ＡＬＩＧＮＭＥＮＴＳ．ｐｈｐ；
ｗｗｗ／ｋａｂａｔｄａｔａｂａｓｅ．ｃｏｍ／ｔｏｐ．ｈｔｍｌ；
ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ／ｋａｂａｔ；ｗｗｗ．ｓｃｉｑｕｅｓｔ．ｃｏｍ；
ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ／；ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／ｏｎｌｉｎｅｃｏｍｐ．ｈｔｍｌ；
ｗｗｗ．ｐｕｂｌｉｃ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／〜ｐｅｄｒｏ／ｒｅｓｅａｒｃｈ＿ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ；
ｗｗｗ．ｗｈｆｒｅｅｍａｎ．ｃｏｍ／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ＣＨ０５／ｋｕｂｙ０５．ｈｔｍ；
ｗｗｗ．ｈｈｍｉ．ｏｒｇ／ｇｒａｎｔｓ／ｌｅｃｔｕｒｅｓ／１９９６／ｖｌａｂ；
ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／〜ｍｒｃ７／ｍｉｋｅｉｍａｇｅｓ．ｈｔｍｌ；
ｍｃｂ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ＢｉｏＬｉｎｋｓ／Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．ｈｔｍｌ；
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【００３６】
いかなるヒト以外の配列も欠く完全にヒトのｍＡｂは、例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１（１９９６）およびＭｅｎｄｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６（１９９７）で参照される技術により、ヒト免疫グロブリントランスジェニックマウスから製造し得る。ヒトｍＡｂは、例えばＫｎａｐｐｉｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６（２０００）およびＫｒｅｂｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２５４：６７−８４（２００１）で参照される技術により、ファージディスプレイライブラリーから調製かつ至適化もまたし得る。
【００３７】
本発明は、ＴＬＲ３受容体媒介性のシグナリングを調節することが可能なＴＬＲ３受容体結合剤に関する。こうした結合剤は、ＴＬＲ３受容体を結合しかつＴＬＲ３受容体媒介性のシグナリングを調節するという特性を有する抗ＴＬＲ３抗体を包含する。
【００３８】
本発明の一局面は、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ１−α、ＲＡＮＴＥＳおよびＴＮＦ−αよりなる群から選択されるサイトカインの細胞性産生を誘導する、ヒトＴｏｌｌ様受容体３（ｈＴＬＲ３）若しくはｈＴＬＲ３ホモログと反応性の抗体である。これらの抗体は、研究試薬、診断試薬および治療薬として有用である。とりわけ、本発明の抗体は、外来抗原に対する免疫応答を刺激し得る治療薬として有用である。
【００３９】
本発明の別の局面は、他のＴＬＲリガンドにより誘導されるサイトカイン応答を調節する、ｈＴＬＲ３若しくはｈＴＬＲ３ホモログと反応性の抗体である。サイトカイン応答の調節は、Ｃｐｇ  ＯＤＮおよびＲ８４８を包含する他のＴＬＲリガンドに対する免疫応答の増強若しくは改変をもたらす。例えば、本発明の化合物は、ＣｐＧオリゴジヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）のようなＴＬＲ９リガンドと組合せで使用される場合、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）のような１型インターフェロンの産生を高め得る。
【００４０】
本発明の別の局面は、ＴＬＲ７アゴニストにより生じられるＩＬ−１０の産生を低下させる、ｈＴＬＲ３若しくはｈＴＬＲ３ホモログと反応性の抗体である。例えば、本発明の抗体は、レシキモド（ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）としてもまた知られるＴＬＲ７アゴニストＲ８４８により生じられる抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の産生を有意に低下させる。いずれかの特定の理論に束縛されることを願わない一方、本発明の抗体はＴＬＲ７アゴニストに対する炎症応答を増強すると考えられる。
【００４１】
一態様において、本発明の抗体は、配列番号９（ＣＤＲ  Ｈ１）、１１（ＣＤＲ  Ｈ２）および１３（ＣＤＲ  Ｈ３）に示されるところのＨ鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列、ならびに配列番号１９（ＣＤＲ  Ｌ１）、２１（ＣＤＲ  Ｌ２）および２３（ＣＤＲ  Ｌ３）に示されるところのＬ鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体の抗原結合能力を有する、ｈＴＬＲ３と反応性の単離された抗体である。例示的一抗体は、配列番号９、１１および１３に示されるところのＨ鎖ＣＤＲアミノ酸配列、ならびに配列番号１９、２１および２３に示されるところのＬ鎖ＣＤＲアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体である。
【００４２】
本発明の別の態様は、配列番号９、１１および１３に示されるＣＤＲアミノ酸配列を有する抗体Ｈ鎖をコードする単離されたポリヌクレオチド、若しくは相補核酸である。所定の発現系での遺伝暗号若しくはコドンの好みの縮重を考えれば配列番号９、１１および１３に示されるＨ鎖可変領域ＣＤＲをコードする他のポリヌクレオチドもまた、本発明の範囲内にある。
【００４３】
本発明の別の態様は、配列番号１９、２１および２３に示されるＣＤＲアミノ酸配列を有する抗体Ｌ鎖をコードする単離されたポリヌクレオチド、若しくは相補核酸である。所定の発現系での遺伝暗号若しくはコドンの好みの縮重を考えれば配列番号１９、２１および２３に示されるＬ鎖可変領域ＣＤＲをコードする他のポリヌクレオチドもまた、本発明の範囲内にある。
【００４４】
本発明の別の態様は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖および配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖を含んでなるｈＴＬＲ３と反応性の単離された抗体である。
【００４５】
本発明の別の態様は、配列番号６に示されるアミノ酸配列をコードする単離されたポリヌクレオチド若しくはその相補物である。配列番号６に示されるアミノ酸配列をコードする例示的一ポリヌクレオチドは、配列番号５に示される配列を有する。
【００４６】
本発明の別の態様は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列をコードする単離されたポリヌクレオチド若しくはその相補物である。配列番号１６に示されるアミノ酸配列をコードする例示的一ポリヌクレオチドは、配列番号１５に示される配列を有する。
【００４７】
例示的抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＧＡ若しくはＩｇＭアイソタイプの抗体でありうる。加えて、こうした抗体は、グリコシル化、異性化、アグリコシル化、若しくはポリエチレングリコール部分の付加（ペグ化）および脂質化のような天然に存在しない共有修飾のような過程により翻訳後に修飾され得る。こうした修飾はｉｎ  ｖｉｖｏでもｉｎ  ｖｉｔｒｏでも起こりうる。完全にヒトの、ヒト化、およびアフィニティーで成熟させた抗体分子若しくは抗体フラグメントは、ミメティボディ、融合タンパク質およびキメラタンパク質がそうであるように、本発明の範囲内にある。
【００４８】
本発明の抗体は、約１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１若しくは１０−１２Ｍ未満若しくはそれに等しいＫｄでｈＴＬＲ３を結合しうる。ｈＴＬＲ３受容体に対する所定の分子のアフィニティーは、いずれの適する方法を使用しても実験で決定し得る。こうした方法は、当業者に既知のＢｉａｃｏｒｅ若しくはＫｉｎＥｘａ装置、ＥＬＩＳＡまたは競合結合アッセイを利用しうる。
【００４９】
所望のアフィニティーをもつ所定のＴＬＲ３ホモログを結合する抗体分子は、抗体アフィニティー成熟を包含する技術、および抗体以外の分子に適する他の技術に認識された技
術により、バリアント若しくはフラグメントのライブラリーから選択し得る。
【００５０】
本発明の別の態様は、本発明の最低１種のポリヌクレオチドを含んでなるベクターである。こうしたベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、トランスポゾンに基づくベクター、または所定の生物体若しくは遺伝的背景への本発明のポリヌクレオチドのいずれかの手段による導入に適するいかなる他のベクターでもありうる。
【００５１】
本発明の別の態様は、配列番号９、配列番号１１および配列番号１３を含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに配列番号１９、配列番号２１および配列番号２３を含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのような本発明のポリヌクレオチドのいずれかを含んでなる宿主細胞である。こうした宿主細胞は真核生物細胞、細菌細胞、植物細胞若しくは古細菌細胞でありうる。例示的真核生物細胞は、哺乳動物、昆虫、トリ若しくは他の動物起源のものでありうる。哺乳動物真核生物細胞は、ＳＰ２／０（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、バージニア州マナサス、ＣＲＬ−１５８１）、ＮＳ０（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）、英国ウィルトシャー州ソールズベリー、ＥＣＡＣＣ番号８５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６４６）およびＡｇ６５３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８０）マウス細胞株のようなハイブリドーマ若しくは骨髄腫細胞株のような不死化細胞株を包含する。例示的一ヒト骨髄腫細胞株はＵ２６６（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−ＴＩＢ−１９６）である。他の有用な細胞株はＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−６１）若しくはＤＧ４４のようなチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞由来のものを包含する。
【００５２】
本発明の別の態様は、本発明の宿主細胞を培養すること、および該宿主細胞により産生される抗体を回収することを含んでなる、本発明の抗体の作成方法である。こうした抗体は、配列番号６および１６にそれぞれ示されるところのＨおよびＬアミノ酸配列を有するｍＡｂ  Ｃ１１３０として下で例示されるｈＴＬＲ３抗体でありうる。
【００５３】
ＣｐＧ媒介性のＩＦＮ−α産生を増強する本発明の抗体の能力は多様な組合せ型治療を提供する。例えば、ＴＬＲアゴニスト分子若しくはワクチン抗原のような外来抗原と組合せの本発明の抗体の使用は、免疫応答を調節しかつ感染症の処置において有用であることができる。従って、本発明の別の局面は、肝炎ウイルス、単純疱疹ウイルス、ヒト免疫不全ウイルスおよびヒトパピローマウイルスを包含するウイルス感染症、ならびに他の皮膚および粘膜関連の感染症を予防若しくは処置するためにＩ型ＩＦＮ（例えばＩＦＮα）の高められた産生により測定されるところの免疫応答を刺激かつ持続するための、インターフェロン、若しくは限定されるものでないがＣｐＧ  ＯＤＮを挙げることができるＴＬＲ９アゴニストのような他の免疫刺激剤と組合せの本発明の抗体の使用である。また、本発明は、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、毛様細胞白血病、悪性黒色腫および肉腫（カポシ肉腫を包含する）を包含する癌を処置するための、インターフェロン、若しくは限定されるものでないがＣｐＧ  ＯＤＮを挙げることができるＴＬＲ９アゴニストのような他の免疫刺激剤と組合せの本発明の抗体の使用を提供する。さらに、本発明は、炎症性腸疾患（例えばクローン病および潰瘍性大腸炎）を処置するための、インターフェロン、若しくは限定されるものでないがＣｐＧ  ＯＤＮを挙げることができるＴＬＲ９アゴニストのような他の免疫刺激剤と組合せの本発明の抗体の使用もまた提供する。
【００５４】
本発明の別の局面は、陰部疣贅のようなウイルス感染関連症状を予防若しくは処置するための併用療法を提供するための、Ｒ８４８（レシキモド）若しくはイミキモドのようなＴＬＲ７アゴニストと組合せの本発明の抗体の使用である。合成ＴＬＲ７アゴニスト、イミキモドは陰部疣贅の処置のため規制当局により承認された。本発明の別の局面は、細菌、真菌およびウイルス性肺炎を包含する肺疾患、ならびに喘息、気管支炎および慢性閉塞
性肺疾患のような肺疾患の病原体媒介性の増悪を予防若しくは処置するための、ＴＬＲ９若しくはＴＬＲ７アゴニストと組合せの本発明の抗体の使用である。本発明のなお別の局面は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を予防若しくは処置するためのＴＬＲ９若しくはＴＬＲ７アゴニストと組合せの本発明の抗体の使用である。本発明のなお別の局面は、多発性硬化症および狼瘡を包含する自己免疫疾患を予防若しくは処置するためのインターフェロンのような免疫処置と組合せの本発明の抗体の使用である。
【００５５】
本発明の方法は、いずれの属に属する動物も処置するのに使用しうる。こうした動物の例はヒト、マウス、鳥類、は虫類および魚類を包含する。
【００５６】
所定の状態を処置するのに十分な所定のＴＬＲ３抗体の量は容易に決定し得る。本発明の方法において、ＴＬＲ３抗体は、単独で、または最低１種の他のＴＬＲアゴニスト分子若しくはワクチン抗原と組合せで投与しうる。
【００５７】
本発明の抗体の治療的使用のための投与様式は、宿主に該剤を送達するいずれの適する経路でもよい。該タンパク質、抗体、抗体フラグメントおよびミメティボディ、ならびにこれらの剤の製薬学的組成物は、非経口投与に、すなわち皮下、筋肉内、皮内、静脈内若しくは鼻内でとりわけ有用である。
【００５８】
本発明の抗体は、製薬学的に許容できる担体中に有効成分として有効量の抗体を含有する製薬学的組成物として製造しうる。注入の準備ができている形態の、好ましくは生理学的ｐＨで緩衝された、抗体を含有する水性懸濁液若しくは溶液が好ましい。非経口投与のための組成物は、一般に、製薬学的に許容できる担体、好ましくは水性担体に溶解された本発明の抗体若しくはそれらのカクテルの溶液を含むことができる。多様な水性担体、例えば０．４％生理的食塩水、０．３％グリシンなどを使用しうる。これらの溶液は無菌かつ一般に微粒子物質を含まない。これらの溶液は慣習的な公知の滅菌技術（例えば濾過）により滅菌しうる。該組成物は、ｐＨ調節剤および緩衝剤などのような、生理学的条件に近づけるために必要とされるところの製薬学的に許容できる補助物質を含有しうる。こうした製薬学的製剤中の本発明の抗体の濃度は広範に、すなわち約０．５％未満、通常は約１％若しくは最低約１％から約１５若しくは２０重量％まで変動し得、そして、選択される特定の投与様式に従って、液体の容量、粘度などに主として基づいて選択されることができる。
【００５９】
従って、筋肉内注入のための本発明の製薬学的組成物は、１ｍＬの無菌緩衝水、および約１ｎｇないし約１００ｍｇ、例えば約５０ｎｇないし約３０ｍｇ、若しくはより好ましくは約５ｍｇないし約２５ｍｇの間の本発明の抗体を含有するよう製造し得る。同様に、静脈内注入のための本発明の製薬学的組成物は、約２５０ｍｌの無菌リンゲル液、ならびに約１ｍｇないし約３０ｍｇ、および好ましくは５ｍｇないし約２５ｍｇの本発明の抗体を含有するよう構成し得る。非経口投与可能な組成物の実際の製造方法は公知であり、そして例えば“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ”、第１５版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ペンシルバニア州イーストンにより詳細に記述されている。
【００６０】
本発明の抗体は、製薬学的製剤中の場合に単位用量形態物で存在しうる。適切な治療上有効な用量は当業者により容易に決定され得る。決定された用量は、必要な場合は、処置期間の間に医師により適切として選択される適切な時間間隔で反復されうる。
【００６１】
本発明の抗体は、貯蔵のため凍結乾燥されかつ使用前に適する担体で再構成され得る。この技術は慣習的免疫グロブリンおよびタンパク質製剤で有効であることが示されており、そして、技術既知の凍結乾燥および再構成技術を使用し得る。
【００６２】
本発明は今や、以下の特定の制限しない実施例を参照して記述されよう。
【００６３】
実施例
【実施例１】
【００６４】
抗ＴＬＲ３  ｍＡｂの生成
抗ＴＬＲ３  ｍＡｂは正常Ｂａｌｂ／ｃマウスで標準的ハイブリドーマ技術を使用して生成した（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６：５１１−５１９、１９７６）、全動物手順は、施設の動物の管理および使用委員会により確立されたガイドラインに従って実施した。マウスに、ヒトＴＬＲ３のアミノ酸１−７０３をコードするプラスミドＤＮＡ（配列番号３）を２回皮内注入した。アミノ酸１−７０３は、ｈＴＬＲ３の予測される細胞外ドメイン（配列番号４）に対応する。該マウスは１０μｇ／マウスのプラスミドＤＮＡ注入を２週間隔で受領した。マウスを精製組換えヒトＴＬＲ３タンパク質の細胞外ドメインの皮内注入により追加免疫した。１５μｇのタンパク質を用いる第一および第二のタンパク質免疫化が第二のプラスミドＤＮＡ注入の２および４週後に発生した。第三の追加免疫（１０μｇタンパク質）は５か月後に発生した。脾の収集の３日前にマウスにＴＬＲ３タンパク質（１５μｇ／マウス）を静脈内注入した。Ｂ細胞融合を、標準的方法（Ｋｏｈｌｅｒら、上記）を使用して実施した。ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジンを含有する培地を使用してハイブリドーマを選択した。ウェルをＥＬＩＳＡによりスクリーニングして抗ＴＬＲ３抗体を検出した。陽性のウェルを増殖させ、そして限界希釈を使用してクローン化した。抗体の大型バッチを調製し、そしてプロテインＧカラムを使用して精製した。エンドトキシン濃度は＜１ＥＵ／ｍｇであることが確認された。ｍＡｂ  Ｃ１１３０をこの様式で生成した。該抗体の配列を図１および２に示す。
【実施例２】
【００６５】
ヒト末梢血単核細胞の単離
ＰＢＭＣをヒト血液から単離した。全血をヒトドナーからヘパリン被覆したシリンジに収集した。およそ５０ｍＬの無菌ハンクス液（ＨＢＳＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１００ｍＬの血液ごとに添加した。３８ｍＬの血液：ＨＢＳＳを５０ｍＬコニカルチューブに添加し、そして１１ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ溶液（Ａｍｅｒｓｈａｍ）をゆっくりと下に層にした。チューブを４００×ｇで室温で４０分間遠心分離した。勾配を保存するため遠心機のブレーキのスイッチを切った。ＰＢＭＣはＦｉｃｏｌｌのすぐ上で白層を形成した。１個のコニカルからのＰＢＭＣをピペットで新たな５０ｍＬコニカルに吸引した。チューブをＨＢＳＳで満たしてＦｉｃｏｌｌの残部を洗い流した。細胞を６００×ｇで１０分間回転した。上清を捨て、そしてペレットを単一チューブ中１０ｍＬの赤血球溶解溶液（Ｓｉｇｍａ）に再懸濁した。該チューブを室温で１０分間インキュベートした。該チューブをＨＢＳＳで５０ｍＬにし、そして細胞を６００×ｇでの遠心分離によりペレットにした。細胞をＨＢＳＳであと２回洗浄した。最終洗浄後にペレットを完全培地、すなわちＲＰＭＩ  １６４０培地／１０％ＦＢＳ／１×非必須アミノ酸／１×ピルビン酸ナトリウム／１０μｇ／ｍＬゲンタマイシンに再懸濁した。ゲンタマイシンはＳｉｇｍａから購入し；他の培地成分はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。細胞のアリコートを取り出し、そして生存細胞数を得るため５０μＬのトリパンブルーと混合した。細胞を３×１０６細胞／ウェル（０．５ｍＬ／ウェル）の濃度で４８ウェルプレートにプレーティングした。
【実施例３】
【００６６】
サイトカイン／ケモカイン産生に対する抗ｈＴＬＲ３抗体の影響の測定
精製した抗体を２０μｇ／ｍＬの最終濃度までＰＢＭＣに添加した。細胞および抗体は、１μｇ／ｍＬのＣｐＧ２２１６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより合成された）若しくは１
μｇ／ｍＬのＲ８４８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の添加１時間前まで３７℃で３０分間インキュベートした。ＣｐＧ２２１６は配列５’−ｇｇＧ  ＧＧＡ  ＣＧＡ  ＴＣＧ  ＴＣｇ  ｇｇｇ  ｇｇ−３’を有する。大文字の塩基はホスホジエステル結合により連結され、また、小文字のものはホスホロチオエート結合により連結されている。レシキモドとしてもまた知られるＲ８４８はイミダゾキノリンアミドであり、そしてイミキモドと同一の化合物分類にある。上清を２４時間後に収集しかつ−２０℃で凍結した。
【００６７】
上清中のサイトカインおよびケモカイン濃度を、Ｌｕｍｉｎｅｘ技術を使用して測定した。ＢｉｏｓｏｕｒｃｅからのＬｕｍｉｎｅｘキットは、以下のサイトカイン／ケモカイン、すなわちＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＴＮＦα、ＩＦＮα、ＩＦＮγ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１αおよびＩＰ−１０を測定するのに使用した。いくつかの場合には、ＩＦＮα濃度はＥＬＩＳＡキット（ＰＢＬ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｓ）を使用して測定した。統計学的解析は、追跡対比較を伴う二因子分散分析を使用して実施した。
【００６８】
該結果を図３に示し、そして、Ｃ１１３０とのＰＢＭＣのインキュベーションがヒト細胞によるＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳおよびＴＮＦαの産生をもたらしたことを示す（ｎ＝３実験）。これらの影響は、Ｃ１１３０に類似の様式で生成した別の抗ＴＬＲ３マウスＩｇＧ１抗体Ｃ１０６８とインキュベートしたＰＢＭＣで見られなかった。精製した抗体のロットをエンドトキシンについて試験し、そして該濃度は１ＥＵ／ｍｇより低かった。
【実施例４】
【００６９】
ＩＦＮα産生に対する抗ｈＴＬＲ３抗体の影響の測定
数種のＴＬＲは二量体化しかつ／若しくは異なるアダプタータンパク質を使用してリガンド結合特異性を変えることが既知であるため、抗ｈＴＬＲ３抗体Ｃ１１３０で前処理したＰＢＭＣを、実施例３に記述されるとおり他のＴＬＲのリガンド、具体的にはＣｐＧ２２１６で刺激して、他のＴＬＲリガンドに対する応答に対するＴＬＲ３調節の影響を検査した。ＴＬＲ３およびＴＬＲ９のリガンドは核酸であり、そして双方がインターフェロン分泌を活性化するため、それらがシグナル伝達経路を共有し得るという仮説を立てた。３実験からの結果を図４に示し、そして、Ｃ１１３０およびＣｐＧ２２１６とインキュベートしたＰＢＭＣがＣｐＧ単独で刺激した細胞より多いＩＦＮαを分泌したことを示す。平均の増大は７倍であった。
【実施例５】
【００７０】
ＩＬ１０産生に対する抗ｈＴＬＲ３抗体の影響の測定
ＴＬＲ７およびＴＬＲ８のリガンドもまた核酸である。Ｒ８４８（レシキモド）はヒトでのＴＬＲ７およびＴＬＲ８の合成リガンドであり、グアノシンおよびウリジン豊富な一本鎖ＲＮＡを認識することが示され（Ｈｅｉｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５６６３：１５２６、２００４）、そしてヒトＰＢＭＣを刺激するのに使用した。ＴＬＲ７の活性化は、ＴＬＲ３同様、Ｉ型インターフェロンの分泌を誘発する。図５の結果は、Ｃ１１３０がＲ８４８に応答してＰＢＭＣにより分泌されるＩＦＮαのレベルに影響を及ぼさなかったことを示す。ＰＢＭＣは通常、Ｒ８４８に応答して非常に高レベルのＩＦＮαを分泌するが、３実験のうち２回で、Ｒ８４８での刺激は約５００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮα（アゴニスト若しくはアンタゴニストｍＡｂによるいかなる影響もおそらく見るのに十分に低いレベル）の産生を誘導した。Ｃ１１３０はＲ８４８誘導性のＩＬ−１０レベルに影響を及ぼさなかった。３実験で、Ｃ１１３０はＲ８４８誘導性のＩＬ−１０を平均５倍低下させた。
【実施例６】
【００７１】
抗体Ｃ１１３０による上皮細胞表面ＴＬＲ３の認識
フローサイトメトリー分析を蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）装置で実施した。Ｃ１１３０抗体を、製造元のプロトコルに従ってＺｅｎｏｎマウスＩｇＧ１標識キットを使用してＡＰＣに複合した。１μｇのｍＡｂあたり５マイクロリットルの標識試薬を室温でかつ光から保護して５分間インキュベートした。製造元のプロトコルに従い、１μｇのｍＡｂに対し５μｌの比でブロッキング試薬を添加した。Ｚｅｎｏｎ標識した抗体は複合３０分以内に使用した。ヒトＴＬＲ３で安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎臓上皮細胞）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。
【００７２】
２９３−ＴＬＲ３を、染色前若しくは後いずれかにＣｙｔｏｆｉｘ中で１５分のインキュベーションにより固定した。５０μｌ中およそ１×１０６細胞を、９６ウェル丸底プレート中でＡＰＣ標識抗体と氷上で３０〜６０分間インキュベートした。細胞を１６００ｒｐｍで２分間の遠心分離によりＰＢＳ＋１％ＦＢＳで３回洗浄した。データ取得はＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置で実施し、そして、データ解析はＷｉｎＬｉｓｔ（Ｖｅｒｉｔｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｈｏｕｓｅ、メーン州トプシャム）を使用して実施した。
【００７３】
図６の結果は、抗体Ｃ１１３０が染色前若しくは後いずれかに固定した２９３−ｈＴＬＲ３細胞上の表面ＴＬＲ３に結合することを示す。商業的に入手可能なＰＥ標識抗ｈＴＬＲ３（クローン３．７）を陽性対照として、また、Ｚｅｎｏｎ  ＡＰＣ標識マウスＩｇＧ１を陰性対照として使用した。これらのデータは、抗ｈＴＬＲ３抗体Ｃ１１３０が上皮細胞を認識することを示す。
【実施例７】
【００７４】
抗体Ｃ１１３０による肺上皮細胞表面ＴＬＲ３の認識
ヒト肺上皮細胞株Ａ５４９細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得た（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−１８５）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を使用し、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下にヒトＴＬＲ３遺伝子の完全長コピーと一緒にネオマイシン選択可能なマーカーをコードする哺乳動物発現ベクターで細胞をトランスフェクトした。Ａ５４９細胞は、対照としてベクタープラスミドＤＮＡのみ（ネオマイシン耐性をコードする）でもまた同時にトランスフェクトした。トランスフェクション２４時間後に、細胞をその後トリプシン処理し、そして０．５ｍｇ／ｍｌのネオマイシン（Ｇ４１８）を含有する培地中２０倍希釈で播種した。Ｇ４１８を含有する選択培地中で２週間増殖後に細胞クローンが出現した。各トランスフェクションからの細胞コロニーを個別にプールした。完全長ヒトＴＬＲ３発現ベクター（Ａ５４９−ｈＴＬＲ３）若しくはベクター対照（Ａ５４９−ｎｅｏ）でのトランスフェクションおよび選択由来のＡ５４９細胞株を、０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含有する成長培地中で維持した。
【００７５】
Ｃ１１３０抗体は実施例７に記述されるとおりＡＰＣに複合させた。Ａ５４９−ＴＬＲ３．２細胞を、染色前若しくは後いずれかにＣｙｔｏｆｉｘ中で１５分のインキュベーションにより固定した。５０μｌ中およそ１×１０６細胞を、９６ウェル丸底プレート中でＡＰＣ標識抗体と氷上で３０〜６０分間インキュベートした。細胞を１６００ｒｐｍで２分間の遠心分離によりＰＢＳ＋１％ＦＢＳで３回洗浄した。データ取得および解析は実施例７に記述されるとおり実施した。図７の結果は、Ｃ１１３０が、染色前若しくは後いずれかに固定したＡ５４９−ＴＬＲ３．２細胞上の表面ＴＬＲ３に結合することを示す。商業的に入手可能なＰＥ標識抗ＴＬＲ３（クローン３．７）を陽性対照として、およびＺｅｎｏｎ  ＡＰＣ標識マウスＩｇＧ１を陰性対照として使用した。肺上皮細胞を認識するＣ１１３０の能力は、それが肺感染症で潜在的治療用途を有することを示す。
【実施例８】
【００７６】
抗体Ｃ１１３０によるカニクイザル白血球の認識
カニクイザルからの全血をＦＡＣＳＬｙｓｅ緩衝液で１０倍希釈し、そして室温で１５分間インキュベートして赤血球を溶解した。細胞をその後、１４００ｒｐｍで８分間の遠心分離によりＰＢＳ＋１％ＦＢＳで４回洗浄した。生じる細胞ペレットをＰＢＳ＋１％ＦＢＳに再懸濁し、そして血球計算板を使用して手動で計数した。サンプル細胞集団を０．２％トリパンブルーで染色することにより細胞生存率を測定した。試験した全サンプルは最低９５％生存可能であった。
【００７７】
全細胞ペレットを、１０％ＦＢＳを補充したＰＢＳ  １〜２ｍｌに再懸濁し、そして受容体内部移行の差違について評価するため４℃若しくは３７℃いずれかに保った。５０マイクロリットル（およそ２×１０６細胞）を９６ウェル丸底プレートの各ウェルに分配した。ＦＩＴＣ、ＰＥおよびＡＰＣ標識したｍＡｂをウェルあたり１μｇで添加し、４℃若しくは３７℃いずれかでかつ光から保護して最低３０分間インキュベートした。細胞をその後、１６００ｒｐｍで２分間の遠心分離によりＰＢＳ＋１％ＦＢＳで３回洗浄した。最終洗浄後に細胞をＣｙｔｏｆｉｘ緩衝液に再懸濁し、そして４℃若しくは３７℃いずれかで１５分間インキュベートした。Ｃｙｔｏｆｉｘ緩衝液中でパラホルムアルデヒド固定後に、細胞を１６００ｒｐｍで２分間の遠心分離により１回洗浄し、そして２００μｌのＰＢＳ＋１％ＦＢＳに再懸濁した。サンプルは、直ちに読み取ったか、若しくは取得前に４℃で一夜保存したかのいずれかであった。データ取得および解析は実施例７に記述されるとおり実施した。
【００７８】
図８に示される結果は、Ｃ１１３０が、カニクイザル（ｃｙｎｏ）ＣＤ１１ｂ陽性細胞、ＣＤ８３陽性細胞、ＣＤ８６陽性細胞およびＣＤ３陽性細胞に結合することを示す。ＣＤ８３はＢ細胞および樹状細胞上で見出され、また、ＣＤ３はＴ細胞上のみで見出され、Ｃ１１３０がＰＢＭＣ中の多様な細胞集団を認識することを示す。
【００７９】
本発明は今や完全に記述されたので、付随する請求の範囲の技術思想若しくは範囲から離れることなく多くの変更および改変がそれに対しなされ得ることが当業者に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】Ｃ１１３０抗ｈＴＬＲ３  ｍＡｂのＨ鎖可変領域配列を示す。
【図２】Ｃ１１３０抗ｈＴＬＲ３  ｍＡｂのＬ鎖可変領域配列を示す。
【図３】Ｃ１１３０が２４時間でヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）によるＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳおよびＴＮＦα分泌を誘導したことを示す。
【図４】Ｃ１１３０が２４時間でＣｐＧ誘発性のＩＦＮα産生を高めたことを示す。
【図５】Ｃ１１３０が２４時間でＲ８４８誘発性のＩＬ−１０産生を低下したことを示す。
【図６】安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞上の細胞表面ＴＬＲ３のＣ１１３０認識を示す。
【図７】安定にトランスフェクトしたＡ５４９−ＴＬＲ３．２細胞上の細胞表面ＴＬＲ３のＣ１１３０認識を示す。
【図８】カニクイザルＰＢＭＣのＣ１１３０認識を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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