(57)【要約】  Notchシグナル伝達経路が、短期及び長期のUVBにより引き起こされる皮膚損傷の予防、及び／又は軽減、例えば、UVBにより引き起こされるシワの予防、及び／又は軽減、のためのスクリーニング及び治療の方法の標的として挙げられた。よって、本発明は、UVBにより引き起こされた皮膚損傷の予防又は軽減のためのスクリーニング及び治療の方法、並びに関連組成物、例えば、化粧品組成物、を特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における皮膚損傷の軽減又は治療方法であって、Notch経路活性を増強する作用物質を上記対象に投与し、その結果、皮膚損傷を軽減又は治療するステップを含む方法。
【請求項２】
前記作用物質を局所投与する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記NotchがNotch1である、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記対象が、UVB照射に晒されたか又は晒される、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記皮膚損傷が、UVB照射によって引き起こされる、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記皮膚損傷がシワである、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記作用物質が、AG-370、AG-1296（6,7-ジメトキシ-3-フェニルキノキサリン）、ナイジェリシン・Na、シトカラシンD、ウアバイン、FCCP（カルボニルシアニド-4-（トリフルオロメトキシ）-フェニルヒドラゾン）、及びSP600125から選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
Notch経路活性を増強する作用物質を含む化粧品組成物。
【請求項９】
前記組成物が、化粧品成分を更に含む、請求項8に記載の化粧品組成物。
【請求項１０】
前記化粧品成分が香料である、請求項9に記載の化粧品組成物。
【請求項１１】
前記化粧品成分が日焼け止め剤である、請求項9に記載の化粧品組成物。
【請求項１２】
前記作用物質が、AG-370、AG-1296（6,7-ジメトキシ-3-フェニルキノキサリン）、ナイジェリシン・Na、シトカラシンD、ウアバイン、FCCP（カルボニルシアニド-4-（トリフルオロメトキシ）-フェニルヒドラゾン）、及びSP600125から選択される、請求項8に記載の化粧品組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、局所適用のために処方される、請求項8に記載の化粧品組成物。
【請求項１４】
以下のステップ：
試験作用物質を提供し；
上記試験作用物質がNotch経路活性を増強するかどうか判断し；そして、
Notch経路活性を増強する試験作用物質の能力を、皮膚損傷を軽減する試験作用物質の能力と関連付け、
それによって、皮膚損傷の治療のための作用物質をスクリーニングする、
を含む皮膚損傷の治療のための作用物質のスクリーニング方法。
【請求項１５】
対象の皮膚損傷に対する前記作用物質の効果を評価するステップを更に含む、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
Notch経路活性を増強する試験作用物質を選択するステップを更に含む、請求項14に記載の方法。
【請求項１７】
前記判断ステップが、前記試験作用物質がNotchを増強又は誘発するかどうか判断するステップを含む、請求項14に記載の方法。
【請求項１８】
前記試験作用物質が、以下の：動物抽出物、植物抽出物、真菌抽出物、小分子、タンパク質、脂質、及び核酸から成る群から選択される、請求項14に記載の方法。
【請求項１９】
前記判断ステップが、以下のステップ：
レポーター・ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動できるように連結されたNotchシグナル伝達経路の成分の調節領域を含む外来の核酸を含む細胞、組織、又はヒト以外の対象を提供し；そして、
上記細胞、組織、又はヒト以外の対象における上記レポーター・ポリペプチドの活性を増強する上記試験作用物質の能力を評価する、
を含み、
上記試験作用物質が基準対照と比べてレポーター・ポリペプチドの活性を増強した場合に、その試験作用物質がNotch経路活性を増強すると判断する、請求項14に記載の方法。
【請求項２０】
前記判断ステップが、以下のステップ：
レポーター・ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動できるように連結されたNotch調節領域を含む外来の核酸を含む細胞、組織、又はヒト以外の対象を提供し；そして、
上記細胞、組織、又はヒト以外の対象における上記レポーター・ポリペプチドの活性を増強する上記試験作用物質の能力を評価する、
を含み、
上記試験作用物質が基準対照と比べてレポーター・ポリペプチドの活性を増強した場合に、その試験作用物質がNotchを増強又は誘発すると判断する、請求項17に記載の方法。
【請求項２１】
前記評価ステップが、前記対象の皮膚に前記作用物質を局所投与するステップを含む、請求項15に記載の方法。
【請求項２２】
前記対象が実験動物である、請求項15に記載の方法。
【請求項２３】
前記対象がヒトである、請求項15に記載の方法。
【請求項２４】
前記UVBにより引き起こされたシワに対する作用物質の効果を評価する、請求項15に記載の方法。
【請求項２５】
対象のNotchベースの障害の治療方法であって、以下のステップ：
Notchベースの障害の治療を必要としている対象を特定し；そして、
上記対象に、AG-370、AG-1296（6,7-ジメトキシ-3-フェニルキノキサリン）、ナイジェリシン・Na、シトカラシンD、ウアバイン、FCCP（カルボニルシアニド-4-（トリフルオロメトキシ）-フェニルヒドラゾン）、及びSP600125から選択される作用物質を投与する、
を含む治療方法。
【請求項２６】
前記Notchベースの障害が癌である、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
前記癌が、皮膚癌、前立腺癌、又は子宮頚癌である、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
前記癌が、ヒト・パピローマウイルスによって引き起こされる、請求項26に記載の方法。
【請求項２９】
皮膚損傷の治療のための医薬品の製造におけるNotch経路活性を増強する作用物質の使用。
【請求項３０】
前記医薬品が、局所投与のために処方される、請求項29に記載の使用。
【請求項３１】
前記NotchがNotch1である、請求項29に記載の使用。
【請求項３２】
前記皮膚損傷が、UVB照射によって引き起こされる、請求項29に記載の使用。
【請求項３３】
前記皮膚損傷がシワである、請求項29に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
当該出願は、その全体を本明細書中に援用する2005年7月29日に出願された米国特許出願番号第60/703,982号に基づく優先権を主張する。
連邦政府による援助を受けた研究又は開発
米国政府は、国立関節炎、並びに筋骨格及び皮膚疾患研究所から与えられた助成金交付番号第AR39190号に準じて、本願発明における特定の権利を有することができる。
【背景技術】
【０００２】
背景
Notch受容体は、細胞によって受け取られた環境シグナルを説明する「守衛」として機能することによって細胞運命決定を媒介すると考えられているシステインに富む膜貫通ポリペプチドである。細胞型及び環境状況に依存して、Notchの活性化は、増殖、分化、又は死滅さえも促進するかもしれない。Notch細胞に結合したリガンド（Delta、及び／又はJaggedファミリーメンバー）の活性化は、Notchの細胞内ドメイン（NICD）のタンパク質分解的切断をもたらし、そして、Notch経路のDNA結合成分であるRBP-Jκとの相互作用を介して標的遺伝子に動員される場である細胞核への上記リガンドの移動をもたらす。
【発明の開示】
【０００３】
概要
本発明は、一つには、Notchシグナル伝達経路が皮膚の維持管理、及び／又は外観に重要であるという発見に基づいている。1つの態様において、本発明者は、Notchシグナル伝達経路が皮膚損傷、例えば、紫外線B（UVB）により引き起こされる皮膚損傷及びシワの軽減、治療、及び／又は予防に重要であることを見つけ出した。それ故に、本発明者は、急性、及び／又は慢性の光損傷、例えば、UVBにより引き起こされる皮膚損傷の予防、及び／又は軽減（例えば、シワの予防、及び／又は軽減）のためのスクリーニング及び治療の方法の標的としてNotchシグナル伝達経路を挙げた。よって、本発明は、UVBによって引き起こされる皮膚損傷、例えば、シワ、の軽減、治療、及び／又は予防のためのスクリーニング及び治療方法、並びに、例えば、化粧品組成物といった関連組成物を特徴とする。
【０００４】
従って、1つの側面において、本発明は、UVBによって引き起こされる皮膚損傷、例えば、シワ、予防、及び／又は軽減する作用物質のスクリーニング方法を特徴とする。前記方法には、Notchシグナル伝達経路の成分、例えば、Notchタンパク質（例えば、Notch1）、Deltaタンパク質、Jaggedタンパク質、又はRBP-Jκ、通常、Notch1の発現、活性、又はレベルを増強するか、又は誘導する作用物質の同定が含まれる。
【０００５】
前記方法には、また、シワを予防又は軽減する作用物質の能力と、増強されたNotchシグナル伝達経路の成分の発現、活性、又はレベルの関連付け、例えば、シワ予防又は軽減作用物質として同定された作用物質を確認すること（例えば、同定された作用物質又はその使用に関連した印刷物（print material）又はコンピュータにより読み込み可能な媒体、例えば、情報提供、マーケティング、若しくは指導用の印刷物若しくはコンピュータにより読み込み可能な媒体を提供すること）も含まれる。関連付けは、シワを予防、軽減、又は治療できる作用物質としてNotchシグナル伝達経路の成分の発現、活性、又はレベルを増強する（そして、好ましくは、Notchの発現、レベル、又は活性を増強する）試験作用物質の確認を意味する。関連付けステップには、例えば、記録、例えば、印刷物若しくはコンピュータにより読み取り可能な記録、例えば、シワを予防、軽減、又は治療できる作用物質としてNotchシグナル伝達経路の成分の発現、活性、又はレベルを増強する（そして、好ましくは、Notchの発現、レベル、又は活性を増強する）試験作用物質を確認した実験室の記録若しくはデータセット、又はeメールなどの記録、を生じさせるか、又は提供することが含まれてもよい。前記記録には、例えば具体的な試験作用物質の確認者、日付、前記方法の操作者、又は試験作用物質の供給源、構造、精製方法、若しくは生物活性に関する情報などの他の情報が含まれてもよい。記録又は記録に由来する情報が、例えば、医薬又は治療上の使用のための化合物又は候補物質（例えば、リード化合物）として試験作用物質を確認するのに使用されてもよい。同定された作用物質は、シワの治療又は軽減のための作用物質又は潜在的な作用物質として確認され得る。この方法によって確認された作用物質、例えば、化合物は、例えば、シワの治療（又は、治療、例えば、美容整形術（cosmetic treatments）の開発）に使用されてもよい。
【０００６】
1つの態様において、前記方法には、皮膚に対する作用物質の効果の評価、例えば、判断、例えば、シワに関連するパラメーター、例えば、シワの存在、程度、又はタイプの評価；そして、スクリーニングからの作用物質、例えば、皮膚への損傷を予防又は軽減する、例えば、皮膚のシワを予防又は軽減する作用物質の選択が含まれる。好ましくは、皮膚に対する作用物質の効果の評価には、作用物質を、例えば、局所的に、組織又は対象に投与すること、そして、上記組織又は対象におけるシワに関連するパラメーター、例えば、シワの存在、程度、又はタイプを、必要に応じて、参照値、例えば、対照又は基準値、例えば、異なった処理がされた、例えば、作用物質が投与されていない若しくプラシーボを投与された、組織又は対象における同じパラメーターの値と比較することが含まれる。皮膚に対する作用物質の効果は、皮膚損傷の原因、例えば、シワ形成を引き起こす作用物質若しくは処置、例えばUVB照射、の不存在又は存在下において評価にされてもよい。いくつかの態様において、評価には、評価に関する値、例えば、シワの存在、程度、又はタイプに関する値の、データベース又は他の記録への入力が含まれる。
【０００７】
1つの態様において、作用物質は、UVBによって引き起こされるシワを予防又は軽減する能力について評価される。
他の態様において、対象は、実験動物、例えば、野生型又はトランスジェニック実験動物、例えば、齧歯動物、例えば、ラット、マウス、若しくはモルモットである。対象は、また、ヒトであってもよい。更なる態様において、評価ステップ構成には、例えば、局所的に、対象の皮膚に作用物質を投与することが含まれる。
【０００８】
1つの態様において、Notchの発現、活性、又はレベルを増強するか、又は誘発する作用物質が同定される。
他の態様において、同定ステップには：（a）レポーター・ポリペプチド（例えば、光に基づく、例えば、比色又は蛍光の検出可能な標識、例えば、蛍光レポーター・ポリペプチド、例えば、GFP、EGFP、BFP、RFP）をコードするヌクレオチド配列に作動できるように連結されたNotchシグナル伝達経路の成分の調節領域（例えば、プロモーター又はエンハンサ）が含まれる外来の核酸を抱えている細胞、組織、又はヒト以外の動物を提供し；（b）上記細胞、組織、又はヒト以外の動物におけるレポーター・ポリペプチドの活性を増強する試験作用物質の能力を評価し；そして、（c）Notchシグナル伝達経路の成分を増強するか、又は誘発する作用物質として（例えば、参照対照に対して）レポーター・ポリペプチドの活性を増強する試験作用物質を選択する、が含まれる。1つの態様において、前記細胞又は組織は、皮膚細胞又は組織、例えば、ケラチン生成細胞又は組織、例えば、皮膚外植片又は人工的な皮膚組織である。他の態様において、前記のヒト以外の動物は、トランスジェニック動物、例えば、トランスジェニック齧歯動物、例えば、核酸を抱えているマウス、ラット、又はモルモットである。1つの態様において、Notchシグナル伝達経路の成分はNotchである。
【０００９】
1つの態様において、前記方法には、2種類の評価ステップが含まれ、例えば、前記方法には、第1のシステム、例えば、細胞又は組織システムにおいて試験作用物質を評価する第1ステップ、及び、第2のシステム、例えば、第2の細胞若しくは組織システム、又はヒト以外の動物において試験作用物質を評価する第2のステップ、が含まれる。他の態様において、前記方法には、例えば、作用物質が、ヒト以外の動物における第1の評価の後に、同じ若しくは異なるヒト以外の動物で再評価されるといった、同じタイプのシステムにおける2つの評価ステップが含まれる。2つの評価は、いくらかの期間、例えば、何日間、何週間、何ヶ月間、又は何年間の間を置いてもよい。
【００１０】
他の態様において、UVBによって引き起こされるシワに対する作用物質の効果が評価される。例えば、作用物質は、UVB照射の前、照射中、及び／又はその後に評価される。
【００１１】
Notchシグナル伝達経路の成分、例えば、Notch、の発現、活性、又はレベルを増強するか又は誘発する作用物質は、未精製の又は半精製された抽出物、例えば、有機物の、例えば、動物若しくは植物の抽出物であるか、又は単離された化合物、例えば、小分子、タンパク質、脂質、若しくは核酸、であるかもしれない。代表的な作用物質は、天然の物質又は抽出物、例えば、植物若しくは真菌の抽出物である。
【００１２】
例えば、作用物質は、以下の：（a）Notchシグナル伝達経路のポリペプチド成分、例えば、Notchポリペプチド、又はその機能的なフラグメント若しくは模倣体（例えば、Notch細胞内ドメイン（NICD））；（b）Notchシグナル伝達経路の活性を増強する、例えば、Notch／Notchリガンド複合体形成、又はNotch細胞内ドメイン（NICD）の核局在化を増強する、Notchシグナル伝達経路の成分に関するペプチド又はタンパク質作動薬；（c）例えば、その遺伝子のプロモーター領域に結合することによって、Notchシグナル伝達経路の成分、例えば、Notch、Delta、Jagged、及びRBP-Jκ、の発現を増強する小分子；（d）抗体、例えば、Notch経路成分に結合し、そして、結合パートナーへの結合、例えば、NotchのJagged／Deltaへの結合、を安定化するか、又は促進する抗体；（e）化学物質、例えば、有機化合物、例えば、Notchシグナル伝達経路の成分の発現を増強する天然又は合成有機化合物、例えば、Notch、Delta、Jagged、及びRBP-Jκ；あるいは、（f）Notch経路のポリペプチド、又はその機能的なフラグメント、アナログ、活性化対立遺伝子、若しくは活性化因子をコードするヌクレオチド配列、のいずれかであるかもしれない。
【００１３】
前記ヌクレオチド配列は、ゲノム配列又はcDNA配列であってもよい。前記ヌクレオチド配列には、以下の：Notch経路成分コード領域；プロモータ配列、例えば、Notch経路成分の遺伝子又は他の遺伝子からのプロモータ配列；エンハンサ配列；非翻訳調節配列（UTR）、例えば、5’ UTR、例えば、Notch遺伝子又は他の遺伝子からの5’ UTR、3’ UTR、例えば、Notch遺伝子又は他の遺伝子からの3’ UTR；ポリアデニル化部位；及び／又は、インスレーター配列、が含まれてもよい。他の態様において、Notchシグナル伝達経路の成分、例えば、Notch、Delta、Jagged、又はRBP-Jκのレベルは、例えば、Notch遺伝子の転写が増加することによってか、又はNotch mRNAの安定性をたかめることによって、Notchシグナル伝達経路の内在性成分、例えば、Notch、Delta、Jagged、又はRBP-Jκの遺伝子の発現レベルを増強される。1つの態様において、Notch遺伝子の転写は、以下の：例えば、体細胞において、例えば、正の調節エレメント（例えば、エンハンサ若しくは転写活性化因子のDNA結合部位など）の付加によって、Notch遺伝子の内在性因子の調節配列を変更；負の調節エレメント（例えば、転写抑制因子のDNA結合部位など）の欠失、及び／又は内在性調節配列若しくはその中のエレメントの、他の遺伝子のものとの置き換え、によって増強され、その結果、Notch遺伝子のコード領域が、より効率的に転写されるのを可能にする。他の態様において、作用物質は、未精製の又は部分的に精製された植物抽出物である。
【００１４】
1つの側面において、本発明は、及び／又はが皮膚損傷を予防、治療、軽減するのに有効な量で、Notch経路の活性、発現、又はレベルを増強する作用物質（例えば、Notch経路作動薬）を対象に投与することによって、皮膚損傷、例えば、UVBによって引き起こされる皮膚損傷、及び／又はシワを軽減、治療、又は予防する方法を特徴とする。いくつかの態様において、前記作用物質は、Notchシグナル伝達経路の成分、例えば、Notch1、を増強するか、又は誘発する。いくつかの態様において、前記方法は、皮膚損傷の軽減、治療、又は予防を必要として対象を特定することを更に含む。いくつかの態様において、前記作用物質は、局所に投与される。いくつかの態様において、前記対象は、UVB照射を受けたか、又は晒されるであろう。いくつかの態様において、前記作用物質は、PDGF受容体キナーゼ阻害剤（例えば、AG-370又はAG-1296（6,7-ジメトキシ-3-フェニルキノキサリン））、K+及びH+イオノフォア（例えば、ナイジェリシン・Na）、アクチン重合の阻害剤（例えば、サイトカラサンD）、ナトリウム・ポンプ（Na+／K+ ATPアーゼ）の阻害剤（例えば、ウアバイン）、ミトコンドリアによる酸化的リン酸化の阻害剤（例えば、FCCP（カルボニルシアニド-4-（トリフルオロメトキシ）-フェニルヒドラゾン）、及びc-Jun N末端キナーゼ（JNK）阻害剤（例えば、SP600125）から選択される。Notch経路の他の作動薬もまた、前記方法で使用されてもよい。
【００１５】
更に他の側面において、本発明は、シワ、例えば、UVB照射に晒されることで引き起こされるシワ、を軽減するのに十分な量で、Notch経路の活性、レベル、又は発現を増強する作用物質を対象に投与することよって、対象の皮膚損傷の兆候の1つ以上、例えば、シワが寄る（例えば、シワの数若しくは形態）、発赤、炎症、落屑、及び色素沈着の1つ以上を軽減する方法を特徴とする。いくつかの態様において、前記作用物質は、Notchシグナル伝達経路の成分、例えば、Notch1、を増強するか、又は誘発する。いくつかの態様において、前記作用物質は、PDGF受容体キナーゼ阻害剤（例えば、AG-370又はAG-1296（6,7-ジメトキシ-3-フェニルキノキサリン））、K+及びH+イオノフォア（例えば、ナイジェリシン・Na）、アクチン重合の阻害剤（例えば、サイトカラサンD）、ナトリウム・ポンプ（Na+／K+ ATPアーゼ）の阻害剤（例えば、ウアバイン）、ミトコンドリアによる酸化的リン酸化の阻害剤（例えば、FCCP（カルボニルシアニド-4-（トリフルオロメトキシ）-フェニルヒドラゾン）、及びc-Jun N末端キナーゼ（JNK）阻害剤（例えば、SP600125）から選択される。いくつかの態様において、前記作用物質は局所的に投与される。前記作用物質は、組成物、例えば、化粧品組成物であってもよい。前記組成物は、無菌のであってもよく、及び／又はそれには化粧用の作用物質が更に含まれる。
【００１６】
他の側面において、本発明は、皮膚損傷から保護するのに十分な量で、Notch経路の活性、発現、又はレベルを増強する作用物質が含まれる組成物を対象に提供することによって、対象の皮膚損傷、例えば、UVBによって引き起こされる皮膚損傷、から保護する方法を特徴とする。いくつかの態様において、前記組成物は、Notchシグナル伝達経路の成分を増強するか又は誘発する。いくつかの態様において、前記方法には、皮膚損傷、例えば、UVBによって引き起こされる皮膚損傷、及び／又はシワ、から保護するための組成物の使用に関する対象用取扱説明書の提供を更に含まれる。いくつかの態様において、前記取扱説明書は、日光暴露の前、その最中、又はその後に前記組成物を皮膚に適用する指示が含まれる。前記組成物には、Notch経路作動薬、例えば、PDGF受容体キナーゼ阻害剤（例えば、AG-370又はAG-1296（6,7-ジメトキシ-3-フェニルキノキサリン））、K+及びH+イオノフォア（例えば、ナイジェリシン・Na）、アクチン重合の阻害剤（例えば、サイトカラサンD）、ナトリウム・ポンプ（Na+／K+ ATPアーゼ）の阻害剤（例えば、ウアバイン）、ミトコンドリアによる酸化的リン酸化の阻害剤（例えば、FCCP（カルボニルシアニド-4-（トリフルオロメトキシ）-フェニルヒドラゾン））、及びc-Jun N末端キナーゼ（JNK）阻害剤（例えば、SP600125）から選択される作用物質が含まれてもよい。前記組成物には、化粧用の作用物質が含まれてもよい。
【００１７】
用語「Notch経路」は、Notchシグナル伝達を媒介する生物学的成分を指す。前記経路には、例えば、Notchポリペプチド自体、Notch受容体、STAT3及びSTAT5を含めた受容体の活性化によって調節される細胞質成分、キナーゼ、及び／又は転写因子が含まれる。用語「Notch経路作動薬」は、Notch経路の活性を増強する作用物質、例えば、Notch受容体ポリペプチドの1つ以上の生物活性、例えば、本明細書中に記載の生物活性、を強化、誘発、又は他の方法で促進する作用物質を指す。例えば、作動薬は、Notch受容体ポリペプチドと相互作用する、例えば、結合する。
【００１８】
1つの態様において、Notch経路作動薬は、Notchリガンド（Notchリガンド若しくはそのフラグメント）であるか、又はNotchリガンド、例えば、Delta又はJaggedポリペプチドの配列に対して少なくとも85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一のアミノ酸配列である。
【００１９】
他の態様において、Notch経路作動薬は、Notch受容体と相互作用する作用物質である。Notch受容体と相互作用する作用物質は、受容体を活性化するか、又は別の方法で経路のシグナル伝達をアゴナイズ（agonize）してもよい。例えば、Notch経路作動薬は、Notch受容体と相互作用するタンパク質である。前記タンパク質は、Notch受容体と相互作用し、そして、活性化する作動性抗Notch受容体抗体（例えば、完全長の抗体又は抗原結合性フラグメント）を含んでもよい。前記タンパク質には、Notchリガンド（例えば、Delta又はJagged）を模倣する抗イディオタイプ抗体が含まれてもよい。
【００２０】
1つの態様において、Notch経路作動薬は、細胞質Notch経路成分を調節する作用物質である。細胞質Notch経路成分を調節する作用物質は、例えば、正に作用する細胞質経路成分を活性化するか、又は負に作用する細胞質成分を抑制してもよい。代表的な正に作用する細胞質成分には、Notch細胞内ドメイン（NICD）及びRBP-Jκが含まれる。前記作用物質は、また、正に作用する成分、例えば、Notch細胞内ドメインの構成的に活性化された形態、の模擬体であるかもしれない。
【００２１】
1つの態様において、Notch経路作動薬は、Notchポリペプチド、正に作用する細胞質経路成分（例えば、Notch細胞内ドメイン（NICD）又はRBP-Jκ）、Notch受容体と相互作用する（例えば、結合する、及び／又は活性化する）タンパク質、及び／又は細胞質Notch経路成分を調節するタンパク質をコードする核酸である。
前記対象は、哺乳動物であってもよく、通常、ヒト（例えば、女性又は男性、及び大人又は未成年者のヒト対象）である。
【００２２】
前記方法には、例えば、投与前、投与中、又は投与後に対象の皮膚損傷の1つ以上の兆候の評価が更に含まれてもよい。そのような兆候の例は、本明細書中に記載されている。前記方法は、対象のNotchの関連パラメーター、例えば、Notchポリペプチド、Notch受容体、又はNotch経路活性のレベルに関連するパラメーターの評価が更に含まれてもよい。用語「パラメーター」は、質的及び量的な記載、例えば、値、レベル、測定値、その他を含めた情報を指す。「Notchの関連パラメーター」は、Notch経路成分について説明するパラメーター、例えば、そのような成分、例えば、Notchポリペプチド、Notch受容体、若しくは他の細胞質成分の存在、不存在、レベル、発現、安定性、細胞内局在性、又は活性、を指す。前記パラメーターは、また、Notch経路成分をコードするmRNAについても説明するかもしれない。
【００２３】
他の側面において、本発明は、Notch経路の活性、発現、又はレベルを増強する作用物質（例えば、Notch経路の作動薬）が含まれる組成物、例えば、化粧品組成物を特徴とする。いくつかの態様において、作用物質は、Notchシグナル伝達経路の成分、例えば、Notch1を増強又は誘発する。前記化粧品組成物には、第2の成分、例えば化粧品成分（例えば、香料、保湿剤、又は日焼け止め剤）が更に含まれる。いくつかの態様において、Notchシグナル伝達経路の成分を増強又は誘発する作用物質は、PDGF受容体キナーゼ阻害剤（例えば、AG-370又はAG-1296（6,7-ジメトキシ-3-フェニルキノキサリン））、K+及びH+イオノフォア（例えば、ナイジェリシン・Na）、アクチン重合の阻害剤（例えば、サイトカラサンD）、ナトリウム・ポンプ（Na+／K+ ATPアーゼ）の阻害剤（例えば、ウアバイン）、ミトコンドリアによる酸化的リン酸化の阻害剤（例えば、FCCP（カルボニルシアニド-4-（トリフルオロメトキシ）-フェニルヒドラゾン）、及びc-Jun N末端キナーゼ（JNK）阻害剤（例えば、SP600125）から選択される。いくつかの態様において、前記作用物質は、Notchシグナル伝達経路の成分、例えば、Notchリガンドである。これらの組成物は、皮膚損傷、例えば、UVBによって引き起こされる皮膚損傷、及び／又はシワ、を治療、及び／又は予防するための方法において使用されてもよい。
【００２４】
他の側面において、本発明は、皮膚損傷、例えば、UVBによって引き起こされる皮膚損傷、及び／又はシワ、を軽減するのに十分な量で、Notch経路の活性、レベル、又は発現を増強する作用物質が含まれる組成物、例えば、局所適用のための組成物、を特徴とする。いくつかの態様において、前記作用物質は、Notchシグナル伝達経路の成分を増強するか、又は誘発する。前記作用物質は、例えば、PDGF受容体キナーゼ阻害剤（例えば、AG-370又はAG-1296（6,7-ジメトキシ-3-フェニルキノキサリン））、K+及びH+イオノフォア（例えば、ナイジェリシン・Na）、アクチン重合の阻害剤（例えば、サイトカラサンD）、ナトリウム・ポンプ（Na+／K+ ATPアーゼ）の阻害剤（例えば、ウアバイン）、ミトコンドリアによる酸化的リン酸化の阻害剤（例えば、FCCP（カルボニルシアニド-4-（トリフルオロメトキシ）-フェニルヒドラゾン）、及びc-Jun N末端キナーゼ（JNK）阻害剤（例えば、SP600125）、であってもよい。前記組成物には、化粧品成分、例えば、香料又は日焼け止め剤、が更に含まれてもよい。
【００２５】
他の側面において、本発明は、皮膚損傷、例えば、UVBによって引き起こされる皮膚損傷、及び／又はシワを予防、軽減、及び／又は治療するための医薬品又は化粧品の調製における、Notch経路の活性、レベル、又は発現を増強する作用物質の有効量の使用を特徴とする。いくつかの態様において、前記作用物質は、Notchシグナル伝達経路の成分を増強するか、又は誘発する。前記作用物質は、例えば、PDGF受容体キナーゼ阻害剤（例えば、AG-370又はAG-1296（6,7-ジメトキシ-3-フェニルキノキサリン））、K+及びH+イオノフォア（例えば、ナイジェリシン・Na）、アクチン重合の阻害剤（例えば、サイトカラサンD）、ナトリウム・ポンプ（Na+／K+ ATPアーゼ）の阻害剤（例えば、ウアバイン）、ミトコンドリアによる酸化的リン酸化の阻害剤（例えば、FCCP（カルボニルシアニド-4-（トリフルオロメトキシ）-フェニルヒドラゾン）、及びc-Jun N末端キナーゼ（JNK）阻害剤（例えば、SP600125）、であってもよい。前記の医薬品又は化粧品には、化粧品成分、例えば、香料又は日焼け止め剤が更に含まれてもよい。
【００２６】
更に他の側面において、本発明は、Notch経路の活性、レベル、又は発現を増強する作用物質、例えば、Notchシグナル伝達経路の成分を増強するか、又は誘発する作用物質、が含まれる組成物、並びに皮膚損傷を予防するための上記組成物の使用に関する取扱説明書が含まれた、対象の皮膚損傷、例えば、UVBによって引き起こされる皮膚損傷、及び／又はシワ、を軽減するか、治療するか、又は予防するためのキットを特徴とする。前記組成物には、化粧品成分、例えば、香料又は日焼け止め剤、が更に含まれてもよい。前記取扱説明書には、日光暴露の前、その最中、又はその後に上記組成物を皮膚に適用する指示が含まれてもよい。
【００２７】
他の側面において、本発明は、Notchベースの障害の治療を必要とする対象を特定し、そして、PDGF受容体キナーゼ阻害剤（例えば、AG-370又はAG-1296（6,7-ジメトキシ-3-フェニルキノキサリン））、K+及びH+イオノフォア（例えば、ナイジェリシン・Na）、アクチン重合の阻害剤（例えば、サイトカラサンD）、ナトリウム・ポンプ（Na+／K+ ATPアーゼ）の阻害剤（例えば、ウアバイン）、ミトコンドリアによる酸化的リン酸化の阻害剤（例えば、FCCP（カルボニルシアニド-4-（トリフルオロメトキシ）-フェニルヒドラゾン））、及びc-Jun N末端キナーゼ（JNK）阻害剤（例えば、SP600125）から選択される作用物質を上記対象に投与することによって対象のNotchに関連する障害を治療する方法を特徴とする。いくつかの態様において、前記Notchベースの障害は、癌、例えば、皮膚、肝臓、前立腺、又は子宮頚部の癌、である。いくつかの態様において、前記癌細胞は、ヒト・パピローマウイルスに感染している。
【００２８】
1つ以上の本発明の態様の詳細が、添付の図面、及び以下の説明に記載されている。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、説明及び請求項から明らかになる。本明細書中に引用した全ての参考文献が、援用される。
【００２９】
詳細な説明
本発明者は、皮膚損傷、例えば、UVBによって引き起こされる皮膚損傷、例えば、シワ、の治療、予防、及び／又は軽減のためのスクリーニング及び治療の方法、並びに組成物、例えば、化粧品組成物、の標的としてNotchシグナル伝達経路を挙げた。本願発明は、有効成分としてNotch誘導因子を有する組成物を特徴とする。
【００３０】
皮膚損傷
損傷した皮膚は、通常、炎症、表皮過形成、真皮の弾力線維症、及び基質タンパク質の分解、並びに中心静脈周囲のリンパ組織球真皮内浸潤（perivenular lymphohistiocytic dermal infiltrates）の存在の1つ以上を特徴とする。本明細書中に記載の結果は、Notchが皮膚損傷、例えばUVB照射により引き起こされる皮膚損傷、から保護することを明らかにする。
【００３１】
組成物の有効量は、対象への投与によって、対象における、皮膚損傷の兆候、例えば、炎症、表皮過形成、真皮の弾力線維症、基質タンパク質の分解、中心静脈周囲のリンパ組織球真皮内浸潤、及びシワ（例えば、小ジワ）の形成、の1つ以上を予防するか、又は軽減する組成物の量と規定される。対象に投与されるべき有効量は、通常、年齢、性別、表面積、体重、及び皮膚の状態を含めたさまざまな要因に基づいている。体表面積は、患者の身長と体重から近似的に決定されるかもしれない。例えば、Scientific Tables、Geigy Pharmaceuticals、Ardley, New York、1970年、537ページを参照のこと。当業者によって認識されているように、有効量は、投与経路、賦形剤の使用、及び他の治療、例えば、シワを軽減する他の化合物の使用などとの同時使用の可能性に依存して変化する。実験動物が、組成物の有効量の測定方法に使用されてもよい。
【００３２】
本明細書中に使用される場合、「皮膚損傷の予防又は治療」は、皮膚損傷の出現を減少、よりよく、緩和、変更、矯正、改善、又は影響を及ぼすことを目的として、皮膚損傷、例えば、シワ、があるか、又は皮膚損傷に向かう素因を持っているか、あるいは、皮膚損傷を引き起こす可能性が高い作用物質、例えば、UV照射、例えば、UVB照射、に晒された対象に対する治療薬の適用又は投与を意味する。前記治療薬は、対象自身によって、又は他のヒト、例えば、医療提供者若しくは化粧品の提供者によって、対象に投与されてもよい。本明細書中に記載の方法の好ましい態様において、皮膚損傷は、少なくとも5%、通常、少なくとも10%、例えば、少なくとも20%、25%以上の対象において軽減される。
【００３３】
前記方法及び組成物は、予防的に使用されても、あるいは、それらは、更なる皮膚損傷、例えば、シワ、を軽減、治療、及び／又は予防するか、又は対象の皮膚損傷の出現を減少させるのに使用されてもよい。前記組成物は、また、皮膚損傷、例えば、シワ、を予防、軽減、及び／又は治療するための医薬品又は化粧品の製造のためにも使用されてもよい。
【００３４】
シワ
シワは、一般に、皮膚の自然老化の過程、及び太陽の紫外線への暴露の結果である。シワは、組織学的レベルの特定の構造変化を伴わない、皮膚表面における配置の変化である。一般に、シワは、本明細書中に援用されるKligmanら（1985年）Br. J. Derm. 113：37-42ページに記載されているように分類される。Kligmanは、シワを3つのクラス：線状シワ（linear wrinkles）、図形シワ（glyphic wrinkles）、及び縮緬ジワ（crinkles）、に分類している。線状シワは、線状であり、通常、顔の皮膚に見られ、且つ、自然老化又は紫外線への暴露によって引き起こされる。図形シワは、見掛け上、三角形又は長方形のシワの形を成し、日光に晒された、顔、手、及び首に見られ、且つ、紫外線への暴露又は太陽皮膚症（dermatoheliosis）によって更に悪化する。縮緬ジワは、薄く、たるんだ皮膚の縮れたシワであり、皮膚のどこにでも見られるが、通常、手の甲とまぶたの周りに見られる。
【００３５】
線状シワは、（a）通常のシワと（b）小ジワに更に細分類される。通常のシワは、長く、深く、はっきりとしているので、カラスの足跡とも呼ばれる。小ジワは、薄くて、浅い。通常のシワは、少なくとも約155ミクロン（μm）（0〜32Hz）、主として、160〜250ミクロン（μm）の幅がある。小ジワは、例えば、（例えば、Takasuら（1996年）J. Soc. Cosmet. Chem. Japan 29：394-405ページ；及び1995年5月2日に公開された日本国特許出願公開番号第07-113623号で基本的に記載されている、Shiseido Wrinkle Analyzer 3D Pro systemを使用して）三次元形状データを二次元フーリエ変換によって周波数領域のデータに変換することで得られるパワースペクトルで計算されるとおり、少なくとも約154ミクロン（μm）、主として、約40〜154ミクロン（μm）（32〜126Hz）の幅がある。
【００３６】
スクリーニング方法
Notch、Delta、Jagged、及びRBP-Jκ/CBF-1を含めたNotchシグナル伝達経路は、十分に特徴付けされている（例えば、Artavanis-Tsakonasら（1999年）Science 284：770-776ページ及びOkuyamaら（2004年）J. Investig. Dermatol Symp. Proc. 9：248-252ページ）。経路の成分は、クローンニングされ、そして、それらのタンパク質及び遺伝子配列は、当業者にとって容易に入手可能である。例えば、ヒトNotch cDNA及び遺伝子のクローニングは、Ellisonら（1991年）Cell 66：649-61ページに記載された；GenBank受入番号NM_017617。Notch経路活性のレポーター構築物は、例えば、Jarriaultら（1995年）Nature 377：355-8ページ；Maier及びGessler（2000年）Biochem. Biophys. Res. Commun. 225：652-60ページ；Rangarajanら（2001年）EMBO J. 20：3427-36ページ；Itohら（2004年）EMBO J. 23：541-551ページ；及びOkuyamaら（2004年）Developmental Cell 6：551-62ページに記載されている。Notch制御性プロモーターには、通常、RBP-Jκ/CBF-1結合のための少なくとも1つの保存モチーフ、主として、GGCGCC（配列番号1）GTGGGAA（配列番号2）、及び／又はCAGC、あるいは、その変異形が含まれる。
【００３７】
Notch経路の活性を増強する化合物は、Notch制御性プロモーターの発現を増加させるあらゆる化合物、例えば、小分子、タンパク質、ペプチド、又は抗体である。Notch制御性プロモーターは、Notch細胞内ドメイン（NICD）によって誘導されるプロモーターである。代表的なNotch制御性プロモーターには、Hes-1、Hey-2（Herp2）、カスパーゼ3、及びp21のプロモーターが含まれる。Notch制御性プロモーター発現の増加は、例えば、Notchの上流若しくは下流の、Notch経路の正の調節因子の発現、レベル、又は活性の増強；及び、例えば、Notchの上流若しくは下流の、Notch経路の負の調節因子の発現、レベル、又は活性の軽減を含めた、あらゆる手段によって達成され得る。
【００３８】
作用物質が特定のmRNA又はタンパク質の発現、レベル、又は活性を変化させるかどうか評価するために、多数の方法が存在している。1つの態様において、Notch制御性プロモーターからの発現を（例えば、恒久的に又は一時的に）調節する（例えば、増減する）試験作用物質の能力は、例えば、レポーター（例えば、ルシフェラーゼ、LacZ、又はGFP）転写アッセイによって評価される。例えば、そのゲノムがNotch制御性プロモーターに作動できるように連結されたレポーター遺伝子を含む細胞又はトランスジェニック動物を、試験作用物質と接触させてもよく、そして、レポーター活性を増加又は減少させる試験作用物質の能力が、Notchを調節する作用物質の能力を示す。他の態様において、Notchの発現、レベル、又は活性を調節する試験作用物質の能力はトランスジェニック動物において評価される。
【００３９】
Notchの発現、レベル、又は活性に対する試験作用物質の効果は、細胞、細胞溶解物、対象、通常、ヒトではない実験用哺乳動物、例えば、齧歯動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ）、又はその体外移植物（例えば、皮膚）において評価されるかもしれない。Notch mRNA発現を評価する多数の方法が、当該技術分野で周知になっている、例えば、ノーザン解析、リボヌクレアーゼ・プロテクション・アッセイ、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR法）、又はRNA in situハイブリダイゼーションである（例えば、Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual（第3版2001年）を参照のこと）。Notchタンパク質のレベルは、例えば、ウエスタン解析、免疫学的アッセイ、又はin situハイブリダイゼーション、によって観察されるかもしれない。Notch活性（例えば、変化したプロモーター結合、及び／又は転写活性）は、例えば、電気泳動度シフト・アッセイ、DNAフットプリント、又はレポーター遺伝子アッセイ、によって測定されるかもしれない。通常、Notchの発現、レベル、又は活性に対する試験作用物質の効果は、トランスジェニック細胞、ヒト以外の動物、又はそれに由来する体外移植片若しくは細胞において評価される。小分子スクリーニングの一般的な方法が、例えば、Schrieber（2003年）Chem. & Eng. News 81：51-61ページ；並びにFlaumenhaft及びSim（2003年）Chem. Biol 10：481-6ページ、に説明されている。
【００４０】
作用物質
本明細書中に説明したスクリーニング法により試験される作用物質には、未精製の又は精製した有機物起源の抽出物、例えば、動物若しくは植物の抽出物、並びに部分的に又は完全に精製した合成作用物質、例えば、小分子、ポリペプチド、脂質、及び／又は核酸、及びこれらのライブラリが含まれる。Notchの誘導因子として同定される作用物質は、本明細書中に説明した皮膚損傷に関連した方法及び組成物において試験、及び／又は使用され得る。
【００４１】
PDGF受容体キナーゼ阻害剤（例えば、AG-370及びAG-1296（6,7-ジメトキシ-3-フェニルキノキサリン））、K+及びH+イオノフォア（例えば、ナイジェリシン・Na）、アクチン重合の阻害剤（例えば、サイトカラサンD）、ナトリウム・ポンプ（Na+／K+ ATPアーゼ）の阻害剤（例えば、ウアバイン）、ミトコンドリアによる酸化的リン酸化の阻害剤（例えば、FCCP（カルボニルシアニド-4-（トリフルオロメトキシ）-フェニルヒドラゾン））、並びにc-Jun N末端キナーゼ（JNK）阻害剤（例えば、SP600125）を含めた、Notchを誘導するいくつかの作用物質が本明細書中で特定されている。これら、及び構造的又は機能的に類似した作用物質が、Notchに関連する障害、例えば、皮膚損傷、シワ、及び癌、例えば、皮膚、肝臓、子宮頚部、及び前立腺の癌、並びにヒト・パピローマウイルスによって引き起こされる癌、の治療において試験、及び／又は使用され得る（例えば、Taloraら（2002年）Genes Dev. 16：2252-2263ページ；Nicolasら（2003年）Nature Genet. 33：416-421ページ；Qiら（2003年）Cancer Res, 63：8323-9ページを参照のこと）。他のNotch誘導因子が、Liuら（2003年）Mol. Cell. Biol. 23：14-25ページ及びUS 2006/0128619に記載されている。更に、いくつかのウイルスによりコードされるタンパク質がNotch経路の活性を調節する（例えば、Hayward（2004年）Semin. Cancer Biol. 14：387-396年及びHaywardら（2006年）Sci. STKE 2006：re4を参照のこと）。Notch経路のウイルス性活性化因子は、対象に直接投与されても、又はウイルス性活性化因子をコードする核酸として投与されてもよい。
【００４２】
1つの側面において、Notch経路作動薬は、皮膚損傷の軽減、治療、及び／又は予防、あるいは改善に使用される。代表的なNotch経路作動薬には、Notchポリペプチド、Notch細胞内ドメイン、Notchリガンド、例えば、Delta／Jagged、Notch受容体を活性化又はアゴナイズする作用物質、及びNotch経路のシグナル伝達が活性化するように他のNotch経路成分を調節する作用物質が含まれる。代表的な作動薬は、例えば、高い親和性、例えば、約107M-1未満、約108M-1、約109M-1〜1010M-1、又はそれよりより強い、親和定数でNotch受容体に結合する。
【００４３】
1つの態様において、Notch経路作動薬は、Notch受容体と相互作用するが、Notchリガンド以外のものである作用物質である。例えば、前記作用物質は、Notch受容体と相互作用し、そして、例えば、受容体をアゴナイズすることによって、Notch経路のシグナル伝達活性を活性化する免疫グロブリン、例えば、完全長抗体又は抗体フラグメント、であってもよい。前記抗体は、Notchリガンドの結合をまねるように設計された抗イディオタイプ抗体であってもよい。
1つの態様において、Notch経路作動薬は、例えば、Delta／JaggedとNotch受容体の一方又は両方に結合することによって、Notch／リガンド相互作用を安定させる作用物質（例えば、免疫グロブリン）である。
【００４４】
1つの態様において、Notch経路作動薬は、より多くのNotch細胞内ドメイン（NICD）又は核を標的としたより多くのNICDの産生をもたらす分子である（例えば、Kau及びSilver（2003年）Drug Discov. Today 8：78-85ページ；Kauら（2004年）Nature Reviews Cancer 4：1-12ページを参照のこと）。細胞内のNICDの分布は、自動化された顕微鏡によって観察され得る（Mitchison（2005年）Chembiochem 6：33-39ページ）。
【００４５】
抗体
本明細書中に使用される場合、用語「抗体」は、少なくとも1つの免疫グロブリン可変領域、例えば、免疫グロブリン可変ドメイン又は免疫グロブリン可変ドメイン配列を提供するアミノ酸配列、が含まれるタンパク質を指す。例えば、抗体には、重（H）鎖可変領域（本明細書中ではVHと略される）、及び軽（L）鎖可変領域（本明細書中ではVLと略される）が含まれる。他の例において、抗体には、2本の重（H）鎖可変領域、及び2本の軽（L）鎖可変領域が含まれる。用語「抗体」は、抗体の抗原結合性フラグメント（例えば、一本鎖抗体、Fabフラグメント、F（ab’）2フラグメント、Fdフラグメント、Fvフラグメント、及びdAbフラグメント）、並びに完全抗体、例えば、IgA、IgG（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）、IgE、IgD、IgMタイプ（並びにそのサブタイプ）の完全な、及び／又は完全長の免疫グロブリン、を網羅する。免疫グロブリンの軽鎖は、κ又はλ型のものであるかもしれない。1つの態様において、抗体はグリコシル化される。抗体は、抗体依存性細胞毒性、及び／又は補体介在性細胞毒性に関して機能的であり得るか、又はこれらの活性の一方又は両方に関して非機能的であるかもしれない。
【００４６】
VH及びVL領域は、「フレームワーク領域」（FR）と呼ばれる、より保存されている領域が組み入れられている「相補性決定領域」（「CDR」）呼ばれる超可変性の領域に更に細分され得る。FRs及びCDRsの範囲は、正確に規定されている（例えば、Kabat, E. A.ら（1991年）Sequences of Proteins of Immunological Interest、Fifth Edition、US Department of Health and Human Services、NIH Publication No. 91-3242；及びChothia, C.ら（1987年）J. Mol. Biol. 196：901-917ページを参照のこと）。Kabatの定義が、本明細書中に使用されている。各VH及びVLは、通常、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって以下の順位：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4、で並んだ3つのCDRsと4つのFRsから成る。
【００４７】
「免疫グロブリン・ドメイン」は、免疫グロブリン分子の可変又は定常ドメインからのドメインを指す。免疫グロブリン・ドメインは、通常、約7つのβ鎖、及び保存されたジスルフィド結合から形成される2つのβ-シートを含んでいる（例えば、A. F. Williams及びA. N. Barclay（1988年）Ann. Rev Immunol. 6：381-405ページを参照のこと）。「免疫グロブリン可変ドメイン配列」は、抗原結合に好適な立体構造の中にCDR配列を配置するのに十分な構造を形成し得るアミノ酸配列を指す。例えば、前記配列は、天然の可変ドメインのアミノ酸配列の全て又は一部を含むかもしれない。例えば、前記配列は、1つ、2つ、又はより多くのN又はC末端アミノ酸、内側のアミノ酸が除かれるか、1つ以上の挿入又は追加の末端アミノ酸を含むか、あるいは、他の変更を含むかもしれない。1つの態様において、免疫グロブリン可変ドメイン配列が含まれているポリペプチドは、標的結合構造（又は「抗原結合部位」）を形成するために他の免疫グロブリン可変ドメイン配列に結合されてもよい。
【００４８】
抗体のVH又はVL鎖には、重鎖又は軽鎖定常領域の全て又は一部が更に含まれてもよく、その結果、それぞれ、重又は軽免疫グロブリン鎖を形成する。1つの態様において、抗体は、2本の重免疫グロブリン鎖と2本の軽免疫グロブリン鎖の四量体である。重又は軽免疫グロブリン鎖は、ジスルフィド結合によって接続される。重鎖定常領域は、通常、3つの定常ドメイン、CH1、CH2、及びCH3を含んでいる。軽鎖定常領域は、通常、CLドメインを含んでいる。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含んでいる。抗体の定常領域は、通常、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクタ細胞）及び古典的補体系の第1成分（Clq）を含めた宿主の組織又は因子への抗体の結合を媒介する。
【００４９】
「事実上のヒト」免疫グロブリン可変領域は、その免疫グロブリン可変領域が正常なヒトにおいて免疫原性応答を誘発しないような、十分な数のヒト・フレームワーク・アミノ酸位置を含む免疫グロブリン可変領域である。「事実上のヒト」抗体は、その抗体が正常なヒトにおいて免疫原性応答を誘発しないような、十分な数のヒト・アミノ酸位置を含む抗体である。
【００５０】
「ヒト化」免疫グロブリン可変領域は、修飾形が非修飾形に比べてヒトのより少ない免疫応答しか誘発しないような、修飾された免疫グロブリン可変領域であって、例えば、その免疫グロブリン可変領域が正常なヒトにおいて免疫原性応答を誘発しないような、十分な数のヒト・フレームワーク・アミノ酸位置を含むように修飾される。「ヒト化」免疫グロブリンの説明は、例えば、米国特許番号第6,407,213号及び同第5,693,762号に含まれている。場合により、ヒト化免疫グロブリンには、1つ以上のフレームワーク・アミノ酸位置に非ヒト・アミノ酸が含まれていてもよい。
【００５１】
抗体は、例えば、動物を使用した、免疫化、又は、例えば、ファージディスプレイなどの試験管内における方法を含めたさまざまな手段によって製造され得る。抗原の全部又は一部は、免疫原として、又は選択のための標的として使用される。1つの態様において、免疫化動物は、天然の、ヒトの、又は、部分的にヒトの免疫グロブリン遺伝子座を有する免疫グロブリン産生細胞を含んでいる。1つの態様において、ヒト以外の動物は、少なくともヒト免疫グロブリン遺伝子の一部を含んでいる。例えば、ヒトIg遺伝子座の巨大フラグメントを用いてマウス抗体産生を欠くマウス系統を設計することが可能である。従って、ハイブリドーマ技術を使用することによって、少なくとも一部ヒトの、所望の特異性を有する抗原特異的なモノクローナル抗体が、産生され、そして、選択され得る。例えば、XENOMOUSE（商標）、Greenら（1994年）Nat. Gen. 7：13-21ページ；US 2003-0070185；米国特許番号第5,789,650号；及びWO 96/34096を参照のこと。
【００５２】
非ヒト抗体は、また、例えば、齧歯動物によっても製造される。非ヒト抗体は、例えば、EP 239 400；米国特許番号第6,602,503号；同第5,693,761号；及び同第6,407,213号に記載されているように、ヒト化されても、脱免疫化（deimmunized）されても、又はそれを事実上のヒトのものにするような他の方法で修飾されてもよい。
【００５３】
完全なヒト・モノクローナル抗体は、例えば、Boernerら（1991年）J. Immunol. 147：86-95ページによって説明されるように、試験管内において初回刺激を受けたヒト脾細胞を使用して、製造されてもよい。それらは、Perssonら（1991年）Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88：2432-2436ページによって、又はHuang及びStellar（1991年）J. Immunol. Methods 141：227-236ページによって；あるいは、また、米国特許番号第5,798,230号にも説明されているように、レパートリー・クローニングによって調製されるかもしれない。大きな非免疫化ヒト・ファージ・ディスプレイ・ライブラリは、また、標準的なファージ技術を使用したヒト治療薬として開発され得る高親和性抗体を単離するのにも使用されるかもしれない（例えば、Hoogenboomら（1998年）Immunotechnology 4：1-20ページ；Hoogenboomら（2000年）Imnunol Today 2：371-378ページ、及びUS 2003-0232333）。
【００５４】
本明細書中に説明した抗体及び他のタンパク質は、原核生物及び真核生物の細胞により製造されてもよい。1つの態様において、抗体（例えば、scFv’s）は、酵母細胞、例えば、ピキア（Pichia）（例えば、Powersら（2001年）J. Immunol. Methods 251：123-35ページ）、ハンセヌラ（Hanseula）、又はサッカロミセス（Saccharomyces）などにより発現される。
【００５５】
抗体、特に完全長抗体、例えば、IgGs、は、哺乳動物細胞により製造される。組み換え発現のための代表的な哺乳動物宿主細胞には、（例えば、Kaufman及びSharp（1982年）Mol. Biol. 159：601-621ページに記載されているような、DHFR選択マーカーと共に使用される、Urlaub及びChasin（1980年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77：4216-4220ページに記載されているジヒドロ葉酸レダクターゼ陰性CHO細胞を含めた）チャイニーズ・ハムスター卵巣（CHO細胞）、リンパ球細胞株、例えば、NS0骨髄腫細胞及びSP2細胞、COS細胞、K562、並びにトランスジェニック動物、例えば、トランスジェニック哺乳動物、からの細胞が含まれる。例えば、前記細胞は乳房上皮細胞である。
【００５６】
抗体及び他のタンパク質は、また、トランスジェニック動物によっても製造される。例えば、米国特許番号第5,849,992号は、トランスジェニック哺乳動物の乳腺において抗体を発現するための方法を説明している。ミルク特異的プロモータ、及び着目の抗体、例えば本明細書中に説明した抗体、をコードする核酸配列、並びに分泌のためのシグナル配列が含まれる導入遺伝子が構築される。そのようなトランスジェニック哺乳動物の雌によって産生されたミルクには、その中に分泌された、着目のタンパク質、例えば、抗体又はFc融合タンパク質、が含まれる。そのタンパク質は、ミルクから精製されるか、又はいくつかの適用については、そのまま使用され得る。
抗体との関連で説明される方法は、他のタンパク質、例えば、Fc融合及び可溶性受容体フラグメント、に適合させてもよい。
【００５７】
投与
シワ若しくは他の皮膚状態の予防又は軽減のための、あるいは、本明細書中に説明した他の障害の治療のための医薬組成物は、局所的、皮下、腹腔内、筋肉内、鼻腔内、及び静脈内を含めた非経口経路を通じて投与されるかもしれない。局所投与が、通常、使用される。組成物の反復投与、例えば、反復局所投与が、使用されてもよい。2つ以上の投与経路、例えば、経口投与に関連した局所投与、が、同時に使用されてもよい。非経口剤形の例には、等張生理的食塩水中の活性物質の水溶液、5%はグルコースの、又は他の周知の医薬として許容される賦形剤が含まれる。可溶化剤、例えば、シクロデキストリン又は他の可溶化剤などが、シワを軽減する組成物のデリバリーのための医薬賦形剤として利用されてもよい。
【００５８】
本明細書中に説明した組成物は、また、在来法を使用した他の投与経路のための投与形態でも処方され得る。医薬組成物は、例えば、カプセル剤、（それぞれ、持続放出及び徐放製剤を含む）錠剤、又はゲル・シール剤（gel seal）の状態で経口投与のための投与形態として、処方されてもよい。カプセルには、いずれかの標準的な医薬として許容される材料、例えば、ゼラチン又はセルロース誘導体などが含まれるかもしれない。錠剤は、作用物質と固体担体、及び滑沢剤の混合物を圧縮することによって従来どおりの手順に従って処方されるかもしれない。固体担体の例には、デンプンと糖ベントナイト（sugar bentonite）が含まれる。医薬組成物は、また、例えば、結合剤としてのラクトース又はマンニトール、従来の充填剤、及び錠剤化剤、を含むハードシェル錠剤又はカプセル剤の形態でも投与されるかもしれない。
【００５９】
本明細書中に説明した化合物、例えば、シワ軽減化合物、の局所投与は、先に説明した多くの異なった経路の中の好ましい投与経路を提供する。局所適用のために、組成物には皮膚に合った媒質が含まれる。そのような局所医薬組成物は、多くの形態で、例えば、皮膚への適用に適合させた溶液、クリーム、軟膏、ゲル、ローション、シャンプー、又はエアロゾル製剤の形態で、存在し得る。シワの予防若しくは軽減に、又は本明細書中に記載の障害の治療に有用な組成物中の有効成分の重量パーセントは、通常、医薬として許容される担体との混合物の状態で（上記組成物の全重量に基づいて）0.01%〜10%（例えば、0.02%、0.05%、0.1%、0.2%、0.5%、1.0%、2.0%、5.0%、又は10%）に及ぶ。さまざまな担体材料、例えば、アルコール、アロエベラ・ゲル、アラントイン、グリセリン、ビタミンA及びEオイル、鉱油、並びにポリエチレングリコールなどが、本明細書中に記載のシワ軽減組成物中に利用され得る。他の添加物、例えば、保存料、香料、日焼け止め剤、又は他の化粧品成分、が前記組成物中に存在してもよい。局所用化合物は、適用され、そして、すぐに取り外されるか、又はそれは適用され、そして、皮膚表面、例えば、顔、に長時間、例えば、一晩若しくは一日中、残しておく。
【００６０】
UVB照射
UVB照射の主な光源は自然光である。UVB光線の強さは、時間帯、時期、空の太陽の位置、高度、及び赤道からの距離によって異なる。これらの光線は常に存在し、冬季にさえ存在しているが、それらは夏の真昼の時間帯に最も強い。海抜及び赤道からの距離もまた、考慮の上で重要である。高度が高ければ高いほどUVB光線の強さもより強い。それ故に、登山家、スキーヤー、及び高地で生活する人は、長期UVB損傷の危険性が高い。また、赤道に近ければ近いほどUV放射もより強力であるので、長期UVB損傷の危険性が高い。
【００６１】
雪、水、及び砂は、日光を反射し、皮膚に達するUVB照射の量を増加させる。雲が太陽を覆っている時でさえ、長時間の暴露により、UVBレベルは、皮膚損傷、例えば、シワ、を引き起こすのに十分に高いままである。
【００６２】
（環境保護庁によって作成される）UV指数は、所定の日の太陽のUV光線の強さを示す。4つのカテゴリーが存在する−中程度（UV指数が3未満である）、高い（UV指数が3〜6である）、非常に高い（UV指数が6〜10である）、猛烈（UV指数が10より高い）。中程度のUV指数は、あなたの日焼けするまでに1時間よりも長くかかることを意味し；猛烈なレベルは、それに15分間未満しかかからないことを意味する。前記指数は、多くの場合、気象予報に含まれている。臨床的に、UVB暴露はMEDsにより計測される。1MEDは、感受性皮膚において日焼けを生み出すのに必要とされるUVBの量である。UVB暴露の影響は累積するので、長期の又は慢性的なUVBにより引き起こされたシワは、急性暴露によって、紅斑若しくは水腫、又は熱傷を引き起こし得るものを下回るUVBレベル（例えば、1MED未満）への長期暴露の結果として起こり得る。例えば、対象が太陽に慢性的に晒される場合、たとえその対象が低い又は中程度のUV指数の日々の間に太陽に晒されるとしても、その対象は長期UVBにより引き起こされるシワの危険性が高い。
【００６３】
シワの測定
シワの形成又は出現に対する化合物の効果は、例えば、目視検査によって、質的に、又は、例えば、シワの形態のコンピュータを利用した測定によって、量的に評価され得る。好ましくは、シワの形態は量的に分析される。シワの測定のための定量的方法の例には、これだけに制限されることなく、本明細書中に援用されるHoshino（1992年）Pixel 45：121ページによって提案されているレーザービームを利用した光学的切断技術；又は三次元の皮膚レプリカを分析する方法、例えば、Shiseido Wrinkle Analyzer 3D Pro system（Takasuら（1996年）J. Soc. Cosmet. Chem. Japan 29：394-405ページ；1995年5月2日に公開された日本国特許出願公開番号第07-113623号（米国特許出願第08/364,346号に相当））、が含まれる。SDLFLO（登録商標）（Mexico Development Ltd.、Potters Bar, UK）システム又は同様のシステムが、皮膚のレプリカを取るのに使用される。皮膚レプリカの表面の凸凹（すなわち、シワ）は、例えば、Shiseido Wrinkle Analyzer 3D Pro又は同様のシステムを用いて、分析されて、皮膚に対応する二次元平面上の地点の高さに基づく三次元形状データを提供する。三次元データに従って、それぞれのシワの長さ、幅、深さ、面積、及び容積が計算される。本明細書中に説明した通常のシワ及び小ジワに関するパラメーターに従って、通常のシワ及び小ジワのサブクラスを含めた異なるクラスのシワが、これにより個別に認識され、そして、スコア化される。
【００６４】
キット
Notch経路の活性を増強する作用物質、例えば、本明細書中に記載の方法により同定された作用物質、例えば、AG-370、AG-1296（6,7-ジメトキシ-3-フェニルキノキサリン）、ナイジェリシン・Na、シトカラシンD、ウアバイン、FCCP（カルボニルシアニド-4-（トリフルオロメトキシ）-フェニルヒドラゾン）、又はSP600125は、キットで提供されてもよい。前記キットには、（a）作用物質、例えば、作用物質が含まれた組成物、及び（b）情報提供用資料が含まれる。前記情報提供用資料は、説明用、指導用、販売用、又は方法に関連する他の材料が、本明細書中に記載の方法、及び／又は本明細書中に記載の作用物質の使用に関するその他の資料であってもよい。例えば、前記情報提供用資料は、シワ、又はそれらの予防若しくは軽減に関する。
【００６５】
1つの態様において、前記情報提供用資料は、本明細書中に記載の方法を実施するための好適な様式で、例えば、好適な用量、剤形、又は投与様式（例えば、本明細書中に記載の用量、剤形、又は投与様式）で、作用物質を投与するための取扱説明書が含まれてもよい。好ましい用量、剤形、又は投与様式は、例えば、皮膚への、局所的なものである。他の態様において、前記情報提供用資料には、好適な対象、例えば、ヒト、例えば、シワがあるか若しくはその危険性が高いヒト、に作用物質を投与するための取扱説明書が含まれてもよい。例えば、前記資料には、顔、首、又は手に作用物質を塗布するための取扱説明書が含まれてもよい。
【００６６】
キットの情報提供用資料は、その形態において制限されない。多くの場合、前記情報提供用資料、例えば、取扱説明書、は、例えば、印刷物、印刷されたテキスト、図面、及び／又は写真、例えば、ラベル若しくは印刷されたシートで提供される。しかしながら、前記情報提供用資料は、また、その他の形式、例えば、点字、コンピュータにより読み取り可能な物、録画されている物、又は録音されている物などでも提供される。他の態様において、キットの情報提供用資料は、そのキットの使用者が作用物質、及び／又は本明細書中に記載の方法におけるその使用についての確かな情報を得ることができる問い合わせ先、例えば、実際の住所、電子メール・アドレス、ウェブ・アドレス、又は電話番号、である。もちろん、前記情報提供用資料は、また、いずれの形式の組合せで提供されてもよい。
【００６７】
作用物質に加えて、キットの組成物には、他の成分、例えば、溶剤若しくは緩衝剤、安定化剤、保存料、香料又は他の化粧品成分など、及び／又は本明細書中に記載の状態又は障害を治療するための第2の作用物質、例えば、日焼け止め剤、が含まれる。あるいは、前記の他の成分は、キットに含まれるが、作用物質と異なった組成物又はコンテナに含まれ得る。そのような態様において、前記キットには、作用物質と他の成分を混合するための、又は他の成分と共に作用物質を使用するための取扱説明書が含まれてもよい。
【００６８】
作用物質は、あらゆる形態、例えば、液体、乾燥又は凍結乾燥形態、で提供されてもよい。作用物質は実質的に純粋であり、及び／又は無菌であることが好ましい。作用物質が液体溶液で提供される時、その液体溶液は、通常、水溶液、例えば、無菌の水溶液である。作用物質が乾燥形態として提供される時、再構成は、一般に、好適な溶剤の添加によってである。前記溶剤、例えば、滅菌水又は緩衝剤は、必要に応じてキット中に提供され得る。
【００６９】
キットには、作用物質を含む組成物のための1つ以上のコンテナが含まれる。いくつかの態様において、前記キットには、組成物及び情報提供用資料のための別々のコンテナ、仕切り、又は区画が含まれる。例えば、組成物は、ボトル、バイアル、又はシリンジ内に入れられてもよく、そして、情報提供用資料は、プラスチック・スリーブ又は小包内に含まれてもよい。他の態様において、キットの別個の要素は、1つの、分割されていないコンテナ内に含まれる。例えば、前記組成物は、ラベルの形で情報提供用資料をそこに取り付けた、ボトル、バイアル、又はシリンジ内に含まれる。いくつかの態様において、キットには、作用物質の1つ以上の単位剤形（例えば、本明細書中に記載の剤形）をそれぞれ含む、複数個（例えば、1パック）の個々のコンテナが含まれる。例えば、キットには、作用物質の1単位用量をそれぞれ含んでいる複数個のシリンジ、アンプル、ホイル小包、又はブリスターパックが含まれる。キットのコンテナは、気密、及び／又は防水であってもよい。
【００７０】
キットには、必要に応じて、組成物の投与に好適なデバイス、例えば、シリンジ、吸入器、ピペット、鉗子、計量スプーン、点滴器（例えば、点眼容器）、綿棒（例えば、綿の綿棒若しくは木製の綿棒）、又はいずれかのそのようなデリバリー・デバイス、が含まれる。
以下の具体例は、ただ単に説明に役立つものであるので、いかなる形であっても開示の残りの部分を制限することはないと理解されるべきである。
【実施例】
【００７１】
実施例1：Notch1は、UVB照射による炎症に対抗して保護する
Notch1遺伝子のケラチノサイト特異的欠失を有するマウス（Notch1-/-マウス）は、Rangarajanら（2001年）EMBO J. 20：3427-36ページに記載されている。雌Notch1-/-マウス（Notch1 ko）とNotch+/+同腹対象（野生型）（8週齢、1群あたりn＝2）を、UVB照射に続いて耳介腫脹応答に関して試験した。耳の厚さを、照射前、及び3日間毎日、UVB照射（80と160mJ/cm2）の後に厚さ計（Mitsutoyo Corp.）を使用して計測した。結果を、表1（80mJ/cm2のUVB）と表2（160mJ/cm2）に提示する。
【００７２】
【表１】
2009502962.tif 000002
【００７３】
【表２】
2009502962.tif 000003
【００７４】
野生型マウスと比較して、より大きな腫脹が、Notch1ノックアウト・マウスのUVB照射後に観察された。
同様の実験において、12週齢のNotch1 ko及び野生型対照同腹マウスには、右耳に500mJ/cm2のUVBを照射したのに対して、左耳は未処置のままにし、そして、内部標準として使用した。処置を0日目に与え、そして、耳の厚さをUVB照射後に5日間、計測した（図1）。UVBに応じて増加した膨張が、Notch1ノックアウト・マウスにおいて観察された。
【００７５】
これらの結果は、Notch1がUVBにより引き起こされた膨張及び炎症に対して保護的であることを示している。
【００７６】
実施例2：Notch1は、UVB照射による皮膚損傷に対抗して保護する
雌Notch1-/-マウスとNotch+/+同腹対照（8週齢、1群あたりn＝1）の体毛を刈り取り、次に、皮膚損傷を計測するためにUVB照射実験に使用した（80、160、及び240mJ/cm2）。2匹のマウスを、非照射対照として使用した。マウス（対照マウス、並びにUVB照射の24、48、及び72時間後のUVB照射マウス）からバック・スキン・サンプルを得、そして、ヘマトキシリン・エオジン（HE）染色を7μm切片上で実施した。代表的な切片をマウスから得、そして、OlympusBH-2顕微鏡（Olympus）を使用して評価した。皮膚損傷を5つのカテゴリー（−：損傷なし；±：軽い損傷；＋：明らかな損傷；＋＋：深い損傷；＋＋＋：重度の損傷）で評価した。結果を表3に示す。
【００７７】
【表３】
2009502962.tif 000004
【００７８】
野生型のUVB照射マウスと比較した場合に、より大きな皮膚損傷が、UVB照射後のNotch1 koマウスにおいて観察された。組織学的分析は、野生型マウスと比較して、Notch1ノックアウト・マウスにおいて真皮上層及び弾性結合組織、並びに真皮の繊維における炎症細胞の蓄積を示した。これらの結果は、Notch1がUVB照射により引き起こされる皮膚損傷に対抗して保護することを示している。
【００７９】
実施例3：Notch1ノックアウト・マウスは、シワ形成の増強を示す
雌Notch1-/-マウスとNotch+/+同腹対照（10週齢、1群あたりn＝2）の体毛を刈り取り、次に、10週間、UVB照射に晒した。長期UVB照射（累積UVB用量：6.8J/cm2）は、野生型マウスと比較して、Notch1欠損マウスにおける顕著なシワ形成を引き起こした。シワを5つのカテゴリー（0：シワなし；1：わずかなシワ；2：はっきりとしたシワ；3：深いシワ；4：重度のシワ）で評価した。
【００８０】
【表４】
2009502962.tif 000005
【００８１】
野生型マウスと比較して、より多くのシワが、Notch1ノックアウト・マウスにおいて観察された。組織学的分析は、野生型及びや非照射マウスと比較して、Notch1ノックアウト・マウスにおいて真皮上層及び真皮の弾性結合組織に炎症細胞の蓄積を示した。
【００８２】
実施例4：細胞ベースのアッセイにおける化学物質ライブラリの高速大量処理スクリーニングによるケラチノサイトにおけるNotchシグナル伝達の活性化因子の同定
Notch活性化因子についてのさまざまな化学物質の高速大量処理スクリーンの結果を提示する。TATAボックスの前部のEBV TP1プロモーターからの12のRBP Jκ結合反復（GTGGGAA；配列番号2）（Lauxら（1994年）J. Virol. 68：6947-6958ページ）を含むpHTS-RBPルシフェラーゼ・レポーター・プラスミドを、Notch活性化因子のスクリーニングのために使用した。前記レポーターを、一時的に293 E/T細胞内にトランスフェクトし、その後、384ウェル・プレート内にその細胞を蒔いた。次に、前記化学物質を、ロボット・ツールを使用してナノリットルの容量で前記プレートにピンで移した（pin-transferred）。スクリーンを、ICCB（Institute of Chemistry and Cell Biology）-Longwood Investigator Initiated Screening Programの一部として実施した。
【００８３】
これらの初期実験に使用されるライブラリは、BIOMOL ICCB Known Bioactivesライブラリであった。この収集物を、BIOMOL（Plymouth Meeting, PA；カタログ番号2840；www.biomol.com）から購入し、そして、蒔いた。収集物には、イオン・チャンネル遮断薬、Gタンパク質共役受容体リガンド、第2メッセンジャー・モジュレーター、核受容体リガンド、アクチン及びチューブリン・リガンド、キナーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、遺伝子調節物質、脂質生合成阻害剤、並びに細胞経路を混乱させる他の十分に特徴付けされた化合物を含めた多くの種類の化合物が含まれている。
【００８４】
2倍を越えるNotch応答レポーターを誘導する分子を、陽性ヒットとみなした。細胞内のNotch経路の潜在的な正の調節因子として同定されたこれらの分子を、表5に列挙する。
【００８５】
【表５】
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【００８６】
【表６】
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【００８７】
【表７】
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【００８８】
結論として、高速大量処理遺伝学的アプローチは、Notchシグナル伝達の正の調節因子を同定し、そして、研究するために開発された。Notch経路の標的とされた活性化に関する小分子候補の同定が報告されている。表5で列挙されたこれらの分子は、対象のNotch関連障害、例えば、癌若しくは皮膚損傷、治療、及び／又は予防するためのNotch誘導物質として、あるいは、Notch関連障害の治療、及び／又は予防に使用する作用物質を同定するための更なるスクリーニングのリード化合物として使用され得る。
【００８９】
実施例5：UVB暴露はNotchシグナル伝達を活性化し、そして、NotchはUVB誘発性アポトーシスに対して保護的である
UVBによる内在性Notch活性の誘発を、初代マウス・ケラチノサイトにおいて計測した。初代ケラチノサイトを、Notch応答性レポーター・プラスミド（RBP-luc）で一時的にトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性を、UVB処理（100mJ/cm2）の24時間後に計測した。RBP-lucレポーターの活性は、対象の未処理細胞と比べて、UVB処理細胞において3倍よりも高かった（図2A）。Notch活性の誘発は、また、初代ケラチノサイトにおける「正準の」Notch応答遺伝子であるHes-1の内在性発現をアッセイすることによっても調べた。初代ケラチノサイトを、50mJ/cm2のUVB処理に供し、そして、mRNAを24時間後に処理細胞及び対照細胞から採集した。mRNAを、標準化にGAPDHレベルを使用したリアルタイムRT-PCRによって分析した。Hes-1発現は、対照細胞に比べてUVB処理細胞において2〜3倍高かった（図2B）。UVB処理後のHes-1発現の誘導は、時間依存的であった。同様の結果を、Hey-2に関して観察した。
【００９０】
UVBによる内在性Notch活性の誘導もまた、生体内において計測した。マウスを、220mJ/cm2のUVBで4時間、処理した。熱で離れた表皮からのmRNAを、標準化にGAPDHレベルを使用したリアルタイムRT-PCRで分析した。正準なNotch反応遺伝子であるHes-1（図2C）、及びNotch誘導性ケラチノサイト分化マーカーであるKeratin1（図2D）が、対照皮膚に比べてUVB処理皮膚において3〜4倍も高く発現していた。
【００９１】
Notchは、また、試験管内及び生体内において、UVB処理に対応したアポトーシスに対して保護的であることもわかった。初代マウス・ケラチノサイトに、Notch1の構成的に活性な形態又はGFP対照を発現する組み換えアデノウイルスを感染させた。感染の16時間後に、前記細胞にUVB照射し（50mJ/cm2）、そして、アポトーシス応答をTUNELアッセイによって8時間後に評価した。UVBに対応したアポトーシスは、GFP対照と比べて、活性化されたNotch1を構成的に発現する細胞において約3倍減少した（図2E）。同様に、Notch1遺伝子の欠損は、生体内におけるUVB誘発性アポトーシスに対するケラチノサイトの感受性を高めた。表皮におけるNotch1の誘導された欠損を有するマウスと、野生型同腹対照を、UVB（160mJ/cm2）に晒し、そして、アポトーシスをTUNELアッセイによって48時間後に評価した。いずれの事例においても、2匹のマウスを分析し、そして、TUNEL陽性ケラチノサイトの割合を、3つの独立した領域にわたり最低300個の細胞をカウントすることによって測定した。UVB誘発性アポトーシスは、Notch1が欠損したケラチノサイトにおいて2〜3倍高かった（図2F）。
【００９２】
実施例6：Notchシグナル伝達は、DNA損傷誘発性アポトーシスに対して保護的である
Notchシグナル伝達がDNA損傷誘発性アポトーシスに対して保護的な機能を担うことを実証するために、我々はNotch/CBF-1依存性転写を抑制する特異的手段としてMAML1タンパク質の51アミノ酸のペプチド（MAM51）を発現するレトロウイルス・ベクターを感染させたDNA損傷を与えた初代ヒト・ケラチノサイトにおいてTUNELアッセイによってアポトーシスを計測した（Wengら（2003年）Mol. Cell Biol. 23：655-664ページ）。ケラチノサイトを、2μMの4-ニトロキノリン1-オキシド（4-NQO）又は300mJ/cm2のUVBで処理し、そして、アポトーシスを12時間後にアッセイした。かなり高いアポトーシス応答（2〜5倍）がMAM51発現ケラチノサイトにおいて観察され（図3A〜B）、Notch1がこれらのDNA損傷試薬によって誘発されたアポトーシスに対抗して保護することが示された。
【００９３】
他の態様
本発明の多くの態様を説明した。それにもかかわらず、様々な修飾が本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなしに成されるかもしれないことは理解されている。従って、他の態様は以下の請求項の範囲の中にある。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】UVB処理に続いて5日間、UVB照射したマウスの耳の厚さを示す線グラフである。
【図２】図２ＡはUVBに晒したマウス初代ケラチノサイトにおけるRBP-lucレポーターのルシフェラーゼ活性について示すチャートである。            図２ＢはUVBに晒したマウス初代ケラチノサイトにおける、GADPHと比較した場合の、Hes-1の相対的なmRNA発現について示すチャートである。            図２Ｃ及びＤはUVBに晒したマウス皮膚における、GADPHと比較した場合の、Hes-1及びKeratin1の相対的なmRNA発現について示すチャートである。            図２ＥはUVBに晒した、活性化したNotch又はGFP対照を発現するアデノウイルスを感染させたマウス初代ケラチノサイトにおける（アポトーシスを示す）TUNEL陽性核のパーセンテージについて示すチャートである。            図２ＦはUVB照射に続いて、Notch wt及びNotchノックアウト・マウス皮膚の20mm2あたりのTUNEL陽性ケラチノサイトの数について示すチャートである。
【図３】図３Ａは4-ニトロキノリン1-オキシド（4-NQO）での処理に続いて、Notchシグナル伝達阻害であるMAM51（MSCV-DNMAML1）又はGFP対照（MSCV-GFP）を発現するマウス幹細胞ウイルス（MSCV）を感染させたマウス初代ケラチノサイトにおける（アポトーシスを示す）TUNEL陽性核のパーセンテージについて示すチャートである。            図３ＢはUVB照射に続いて、Notchシグナル伝達阻害剤であるMAM51（MSCV-DNMAML1）又はGFP対照（MSCV-GFP）を発現するマウス幹細胞ウイルス（MSCV）を感染させたマウス初代ケラチノサイトにおける（アポトーシスを示す）TUNEL陽性核のパーセンテージについて示すチャートである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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