(57)【要約】  Ｆｃ含有タンパク質例えば抗体の特性は、Ｆｃ領域中のオリゴ糖のシアリル化を変えることにより制御される。改変されたＦｃ含有タンパク質は、ＦｃｇＲＩ、ＦｃｇＲＩＩＡおよびＦｃｇＲＩＩＩＡ受容体の１種若しくはそれ以上に対するアフィニティー、ＡＤＣＣ活性、マクロファージ若しくは単球活性化、血清半減期ならびにアビディティーを制御することが望ましい疾患若しくは状態で治療的利用性を有する。
2009504569.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｃ領域中のオリゴ糖のシアリル化を変えることを含んでなる、Ｆｃ含有分子の特性の制御方法。
【請求項２】
シアリル化がＦｃ領域中で増大される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
制御される特性が、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ受容体の１種若しくはそれ以上に対するアフィニティー、ＡＤＣＣ活性、マクロファージ若しくは単球活性化、血清半減期ならびにアビディティーよりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
シアリル化が、酵素処理、分子の酵素的改変、分子の遺伝子操作、レクチンクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、タンパク質の発現に使用される細胞株を変えること、Ｆｃ含有タンパク質を産生するのに使用される宿主細胞を血清中で培養すること、およびタンパク質を多様なｐＨ環境に曝露することよりなる群から選択される最低一の方法により野生型Ｆｃ領域から変えられている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
酵素処理がシアリダーゼ若しくはシアリルトランスフェラーゼで処理することを含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Ｆｃ含有分子が標的に特異的な結合ドメインを有し、前記標的が固定された標的である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
Ｆｃ含有分子が標的に特異的な結合ドメインを有し、前記標的が細胞の表面上に発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
Ｆｃ含有分子が抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
Ｇ２Ｓ２糖形態のものでないＦｃ含有治療的タンパク質を、実質的にＧ２Ｓ２シアリル化糖形態のものであるオリゴ糖に転化することを含んでなる、Ｆｃ含有治療的タンパク質のＣＨ２免疫グロブリンドメイン中のアスパラギン残基に共有結合された二分岐オリゴ糖を有することを特徴とするＦｃ含有治療的タンパク質の特性の制御方法。
【請求項１０】
前記Ｆｃ含有タンパク質が、Ｇ２Ｓ２糖形態のものでない同一のＦｃ含有治療的タンパク質に比較して、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡに対する低下されたアフィニティー、ＮＫ細胞媒介性のＡＤＣＣアッセイにおける低下された活性、ＦｃγＲＩに対する高められたアフィニティー、マクロファージを活性化する高められた能力、ならびにより短い血清半減期よりなる群から選択される特性の１種若しくはそれ以上を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
転化段階が、組換え発現されたモノクローナル抗体を酵素的に工作すること、クロマトグラフィーを使用して特定の糖形態を濃縮すること、シアリルトランスフェラーゼを使用してシアル酸残基を付加すること、および該タンパク質の発現に使用される細胞株を変更することの最低１つを含んでなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
クロマトグラフィーが、レクチンアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー若しくはサイズ排除クロマトグラフィーを含んでなる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
遺伝子工作がグリコシルトランスフェラーゼを組み込む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｇ２Ｓ２糖形態のＦｃ含有治療的タンパク質を実質的にＧ２、Ｇ１若しくはＧ）のシアリル化されていない糖形態のものであるオリゴ糖に転化することを含んでなる、Ｆｃ含有治療的タンパク質のＣＨ２免疫グロブリンドメイン中のアスパラギン残基に共有結合された二分岐オリゴ糖を有することを特徴とするＦｃ含有治療的タンパク質の特性の制御方法。
【請求項１５】
前記Ｆｃ含有タンパク質が、実質的にシアリル化されたＧ２Ｓ２糖形態の同一のＦｃ含有治療的タンパク質に比較して、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡに対する高められたアフィニティー、ＮＫ細胞媒介性のＡＤＣＣアッセイにおける高められた活性、ＦｃγＲＩに対する低下されたアフィニティー、マクロファージを活性化する低下された能力、ならびにより長い血清半減期よりなる群から選択される特性の１種若しくはそれ以上を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかに記載の方法により製造若しくは変更されたＦｃ含有タンパク質。
【請求項１７】
実質的にＧ２Ｓ２シアリル化糖形態のものであるＦｃ含有治療的タンパク質のＣＨ２免疫グロブリンドメイン中のアスパラギン残基に共有結合された二分岐オリゴ糖を有することを特徴とする、Ｆｃ含有治療的タンパク質であって、前記Ｆｃ含有タンパク質が、実質的にシアリル化されていないＧ０、Ｇ１若しくはＧ２糖形態の同一のＦｃ含有治療的タンパク質の調製物に比較して、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡに対する低下されたアフィニティー、ＮＫ細胞媒介性のＡＤＣＣアッセイにおける低下された活性、ＦｃγＲＩに対する高められたアフィニティー、マクロファージを活性化する高められた能力、およびより短い血清半減期を有する、上記タンパク質。
【請求項１８】
該タンパク質の標的結合ドメインにより結合される標的が固定された標的である、請求項１７に記載のタンパク質。
【請求項１９】
該タンパク質の結合ドメインにより結合される標的が細胞の表面上で発現される、請求項１７に記載のタンパク質。
【請求項２０】
タンパク質が、腫瘍学関連障害、慢性疾患若しくは感染性疾患の処置に指示される、請求項１７〜１９のいずれか１つに記載のタンパク質。
【請求項２１】
感染性疾患が、ウイルスおよび細菌の一方若しくは双方を含んでなる抗体にオプソニン化された細胞若しくは粒子のＦｃＲ媒介性の消失、ならびに長期処置を必要とする慢性疾患を伴う、請求項２０に記載のタンパク質。
【請求項２２】
タンパク質が、組換え発現されたモノクローナル抗体を含んでなり、該抗体がシアリルトランスフェラーゼを使用して酵素的に改変されるか、レクチンアフィニティークロマトグラフィーを使用して特定の糖形態が濃縮されているか、若しくはシアリダーゼを使用してシアル酸残基が除去されている、請求項１７に記載のタンパク質。
【請求項２３】
タンパク質が、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーの１種若しくはそれ以上を使用して精製された、組換え発現されたモノクローナル抗体である、請求項１７に記載のタンパク質。
【請求項２４】
アフィニティークロマトグラフィーがレクチンアフィニティークロマトグラフィーである、請求項２３に記載のタンパク質。
【請求項２５】
タンパク質が、シアリル化若しくはアシアリル化モノクローナル抗体の高められたレベルを有する、遺伝子的に工作された宿主細胞中で発現されたモノクローナル抗体である、請求項１７に記載のタンパク質。
【請求項２６】
実質的にシアリル化されていないＧ０、Ｇ１若しくはＧ２糖形態にあるＦｃ含有治療的タンパク質のＣＨ２免疫グロブリンドメイン中のアスパラギン残基に共有結合された二分岐オリゴ糖を有することを特徴とする、Ｆｃ含有治療的タンパク質であって、前記Ｆｃ含有タンパク質が、実質的にＧ２Ｓ２糖形態にある同一のＦｃ含有治療的タンパク質に比較して、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡに対する高められたアフィニティー、ＮＫ細胞媒介性のＡＤＣＣアッセイにおける高められた活性、ＦｃγＲＩに対する低下されたアフィニティー、マクロファージを活性化する低下された能力、および延長された血清半減期を有する、上記タンパク質。
【請求項２７】
腫瘍学関連の適応症および状態の処置に指示される、請求項２６に記載のタンパク質。
【請求項２８】
腫瘍学関連の適応症が非ホジキンリンパ腫である、請求項２６に記載のタンパク質。
【請求項２９】
タンパク質が、シアリルトランスフェラーゼ若しくはシアリダーゼを使用して酵素的に改変された組換え発現されたモノクローナル抗体である、請求項２６に記載のタンパク質。
【請求項３０】
タンパク質が、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーの１種若しくはそれ以上を使用して精製される、組換え発現されたモノクローナル抗体である、請求項２６に記載のタンパク質。
【請求項３１】
アフィニティークロマトグラフィーがレクチンアフィニティークロマトグラフィーである、請求項３０に記載のタンパク質。
【請求項３２】
タンパク質が、シアリル化若しくはアシアリル化オリゴ糖の高められたレベルを有するように遺伝子的に工作された宿主細胞中で発現されるモノクローナル抗体である、請求項３０に記載のタンパク質。
【請求項３３】
タンパク質が、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３若しくはＡｂ５よりなる群から選択される、請求項１７若しくは３０に記載のタンパク質。
【請求項３４】
最低１個のヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの１個の免疫グロブリンＩｇＧアイソタイプドメインを含んでなることを特徴とする治療的組換えＦｃ含有タンパク質のバッチの製造方法であって、該方法が、前記タンパク質に結合された多糖鎖から糖残基を付加若しくは除去するために酵素でバッチを処理することを含んでなる、上記方法。
【請求項３５】
製薬学的に許容できる担体と組合せの、請求項３４に記載の方法により製造されるタンパク質を含んでなる製薬学的組成物。
【請求項３６】
疾患若しくは状態の処置若しくは診断のための、請求項３５に記載の方法により製造されるタンパク質の使用方法。
【請求項３７】
前記タンパク質が、癌腫、リンパ腫、肉腫および骨髄腫よりなる群から選択される腫瘍性疾患を処置するのに使用される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記タンパク質が、乾癬、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、クローン病および全身性エリテマトーデスよりなる群から選択される炎症性障害を処置するのに使用される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
タンパク質が、角膜若しくは網膜血管新生を伴う障害を処置するのに使用される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
Ｆｃ領域のオリゴ糖のシアリル化を変えることを含んでなる、標的に特異的な結合ドメインを有するＦｃ含有分子の標的に対する結合アフィニティーの制御方法。
【請求項４１】
シアリル化がＦｃ領域中で増大されかつアビディティーが減少される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
シアリル化がＦｃ領域中で減少されかつアビディティーが増大される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
シアリル化が、酵素処理、分子の酵素的改変、分子の遺伝子操作、レクチンクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、タンパク質の発現に使用される細胞株を変えること、Ｆｃ含有タンパク質を産生するにの使用される宿主細胞を血清中で培養すること、およびタンパク質を多様なｐＨ環境に曝露することよりなる群から選択される最低一方法により野生型Ｆｃ領域から変えられている、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
酵素処理がシアリダーゼ若しくはシアリルトランスフェラーゼで処理することを含んでなる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
標的が固定された標的である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
標的が細胞の表面上で発現される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
Ｆｃ含有分子が抗体である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４８】
本明細書に記述されるいずれかの発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｆｃ受容体と相互作用する治療的タンパク質の改変方法、ならびに、オリゴ糖鎖の組成が、未改変の抗体に比較してその標的に対する抗体のアビディティーを高めることができかつ受容体結合アフィニティーおよび従って前記抗体のエフェクター機能活性を変えうるような、改変された治療的タンパク質例えば抗体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は自然免疫で重大な役割を演じている可溶性血清糖タンパク質である。Ｈ鎖定常領域中の保存された位置の全部の天然に産生される抗体の炭水化物構造はアイソタイプで異なる。各アイソタイプは異なる多数のＮ結合したオリゴ糖構造を有し、それらはタンパク質の集成、分泌若しくは機能的活性に多様に影響を及ぼす（非特許文献１）。図１および２を参照すれば、結合されたＮ結合したオリゴ糖の構造はプロセシングの程度に依存してかなり変動し、そして高マンノース、ならびに分岐ＧｌｃＮＡｃおよび核フコース残基を伴う若しくは伴わない複雑な二分岐オリゴ糖を包含し得る（非特許文献１）。典型的に、モノクローナル抗体でさえ複数の糖形態（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ）として存在するような特定のグリコシル化部位に結合された核オリゴ糖構造の不均質なプロセシングが存在する。同様に、抗体のグリコシル化の大きな差違が抗体産生細胞株間で存在し、そしてなお小さな差違が異なる培養条件下で増殖された所定の一細胞株について見られることが示された。
【０００３】
グリカン上のシアル酸（静的基）は抗体以外の糖タンパク質の血清半減期の延長において重要であることが既知である（非特許文献２）。これまで、モノクローナル抗体（Ｍａｂ）に対するシアル酸の役割は十分に理解されていない。Ｍａｂの血清半減期はとりわけ長命であり、そしてＦｃ融合タンパク質の構築は、治療的タンパク質、例えばタンパク質エンテラセプト（ｅｎｔｅｒａｃｅｐｔ）の開発における有用な戦略と判明している。
【０００４】
抗体およびＴ細胞受容体分子は、特異的細胞表面受容体結合（その結合が細胞応答を調節する）を司る領域を有する。免疫系ではこれらの機能は体液性および細胞性と分類される。抗体はしばしば体液性および細胞性免疫機構を結びつけるアダプター分子と称される。すなわち、体液性応答は主として標的抗原への高アフィニティー結合が可能な成熟分泌型循環抗体に帰される。細胞性応答は、ａｂ−ａｇ複合体の結合、およびエフェクター細胞へのａｂ−ａｇ複合体結合の結果としての細胞メディエーターの放出により引き起こされる下流の続発症による細胞の活性化の結果に帰される。これらの細胞応答は、標的の中和、オプソニン化および感作（抗原が細胞の表面上に表示される場合）、肥満細胞の感作、ならびに補体の活性化を包含する。細胞標的、すなわち細胞表面抗原については、これらのエフェクター機能は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）として一般に知られるものに至る。
【０００５】
抗体アイソタイプ（例えばＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧ）の間で、ＩｇＧが最も豊富であり、ＩｇＧ１サブクラスが最も大きな程度および範囲のエフェクター機能を表す。ＩｇＧ１タイプの抗体は、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性がしばしば重要と思われる癌免疫療法で最も一般に使用される抗体である。構造的に、ＩｇＧのヒンジ領域およびＣＨ２ドメインが抗体エフェクター機能で主要な役割を演じている。（ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの二量体化により形成される）Ｆｃ領域に存在するＮ結合したオリゴ糖がエフェクター機能に影響を及ぼす。共有結合したオリゴ糖は複雑な二分岐型構造であり、そして高度に不均質である（図１および２を参照されたい）。Ａｓｎ２９７の保存されたＮ結合したグリコシル化部位は各ＣＨ２ドメイン中に存する。成熟抗体中で、Ａｓｎ２９７に結合された２個の複雑な二分岐オリゴ糖はＣＨ２ドメイン間に埋没されて、ポリペプチドバックボーンと後半な接触点を形成する。ＡＤＣＣのようなエフェクター機能を抗体が媒介するのにそれらの存在が不可欠であることが見出された（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献１）。
【０００６】
これらの不均質なオリゴ糖は、末端糖として主にシアル酸、フコース、ガラクトースおよびＧｌｃＮＡｃ残基を含有する（非特許文献５）。露出されたガラクトース、核フコースおよび分岐したＧｌｃＮＡｃ残基のようなこれらの末端糖のいくつかが、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性に影響を及ぼし、そしてまたＣ１ｑ補体タンパク質を包含する多様なリガンドへの抗体結合にも影響を及ぼすことが示された（非特許文献６）。Ｆｃ中に存在するＮ結合したオリゴ糖の大多数は、性質が複雑な二分岐であるとは言え、それらは有意の程度までシアリル化されてはいない（非特許文献７）。
【０００７】
ヒトＩｇＧおよび他の組換え産生されたＩｇＧ中で見出される主要構造は、露出したＧａｌ残基を伴う若しくは伴わない複雑な二分岐構造である（図１）。抗体機能に対する末端Ｇａｌ含有構造の生物学的意義が詳細に研究されている。抗体のガラクトシル化の程度は、齢、性および疾患により影響を及ぼされる（非特許文献５）。一般に、オリゴ糖構造はいくぶん種特異的であり、そして広範に変動する。さらに、分岐ＧｌｃＮａｃおよび核フコース残基を伴うおよび伴わないオリゴ糖構造の生物学的意義もまた研究されている。ヒトＩｇＧ、および組換え産生されたＩｇＧの多くは少量のシアリル化されたオリゴ糖を含有するが、しかしながら、ＩｇＧの大多数はシアリル化されていないオリゴ糖構造を含有する。
【０００８】
Ｆｃ機能に対するＡｂのＦｃグリカン中のシアル酸の影響に関する情報は、部分的に、シアル酸含量が有意に異なる同一の基礎Ｍａｂの対の利用不可能性により、制限されていた。抗癌ＩｇＧ１、Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈからのシアル酸の除去がＡＤＣＣ活性に対し影響を有しないことが報告されたが、しかし、参照として使用された元のＭａｂ調製物上のＦｃグリカンは１０％未満シアリル化されているようであり、いずれかの影響を検出することを困難にした（非特許文献８）。同様に、非特許文献９は、シアリル化が欠損していた変異体ＣＨＯ細胞株で発現されたＩｇＧ１  Ａｂと、野生型ＣＨＯ細胞株で発現された同一Ａｂの間のＦｃγＲＩ結合の認識可能な差違を報告しなかった。しかしながら、野生型細胞からのＡｂに存在するシアル酸の量は極めて低いことがありそうであり（非特許文献１０）、そして従ってシアリル化およびアシアリル化Ａｂの間の結合のいかなる差違もまた検出することが困難であるとみられる。非特許文献１１は、天然の（不均質な）ＩｇＧ１−ＦｃおよびＩｇＧ１  ＡｂのＦｃ活性を、シアリダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ双方での処理後の同一物質と比較したが、しかし、シアル酸の影響の分析を可能にしたとみられるシアリダーゼのみで処理しなかった。変異させたおよび（α２，３結合を介して）高度にシアリル化されたヒトＩｇＧ３  Ａｂ（非特許文献１２）は、補体溶解アッセイ、ならびにＦｃγＲＩ依存性およびＦｃγＲＩＩ依存性機能アッセイで、その野生型の低シアリル化対照物より２ないし３倍より少なく活性であったが、しかし、２種のシアル酸結合（α２，３およびα２，６）の混合物を含有した同一Ａｂの高度シアリル化バリアントは野生型に匹敵する活性を示した（非特許文献１３）。シアル酸結合の型が変異体ＩｇＧ３  ＡｂのＦｃ機能に対し少なくとも何らかの影響を有し得ることを示すとは言え、研究は、高シアル酸含量を伴うＩｇＧのＦｃ機能を、低シアル酸含量を伴うＩｇＧと比較していない。
【０００９】
従って、免疫グロブリン定常領域に結合されたオリゴ糖構造中のシアル酸組成の役割の系統的分析が正当化される。治療的抗体の発現前遺伝子工作若しくは発現後修飾の利用可能な技術を考えれば、この分類の生物医薬品により導き出される細胞応答を高めかつ手元の一次標的および疾患の適応症にさらに一致させるのにこの情報を使用し得る。
【非特許文献１】Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．とＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：２６−３２（１９９７）
【非特許文献２】Ｓｔｏｃｋｅｒｔ，Ｒ．Ｊ．（１９９５）Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．７５、５９１−６０９
【非特許文献３】Ｌｉｆｅｌｙ，Ｍ．Ｒ．ら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５：８１３−８２２（１９９５）
【非特許文献４】Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，Ｒ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．１６３：５９−７６（１９９８）
【非特許文献５】Ｒａｊｕ，Ｔ．Ｓ．ら  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０００．１０（５）：４７７−８６
【非特許文献６】Ｐｒｅｓｔａ  Ｌ．２００３．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．１３（４）：５１９−２５
【非特許文献７】Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ＥＥら  ２０００．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：１６４（８）：４１７８−８４
【非特許文献８】Ｂｏｙｄら、１９９５
【非特許文献９】ＷｒｉｇｈｔとＭｏｒｒｉｓｏｎ（１９９８）
【非特許文献１０】Ｗｒｉｇｈｔら、２０００
【非特許文献１１】Ｍｉｍｕｒａら（２０００）
【非特許文献１２】Ｌｕｎｄら、１９９６  上記
【非特許文献１３】Ｊａｓｓａｌら、２００１  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ  ２８６：２４３−２４９
【発明の開示】
【００１０】
［発明の要約］
本発明は、Ｆｃ含有分子、とりわけ抗体治療薬の体液性および細胞性免疫機能の至適化方法を含んでなる。
【００１１】
本発明は、多様に局在化された標的タンパク質に対する分子のアビディティー；Ｆｃγ受容体、例えばＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ受容体の１種若しくはそれ以上に対するアフィニティー；ＡＤＣＣ活性；マクロファージ若しくは単球活性化；ならびに血清半減期を制御するためにＦｃ領域中のオリゴ糖のシアリル化を変える（野生型から増大若しくは低下する）ことを含んでなる、Ｆｃ含有分子の特性の制御方法を含んでなる。
【００１２】
グリカンのシアリル化は、酵素処理、分子の酵素的改変、分子の遺伝子操作、レクチンクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、タンパク質の発現に使用される細胞株の特異的選択若しくは遺伝子工作、Ｆｃ含有タンパク質を産生するのに使用される宿主細胞を血清中でまたはオリゴ糖改変の可能な酵素若しくはこうした酵素の阻害剤を含有する環境中で培養すること、および多様なｐＨ環境にタンパク質を曝露することにより変えうる。
【００１３】
本発明は、Ｆｃドメイン中に最大にシアリル化されたＮ結合したオリゴ糖を含有する抗体の高度に均質なバッチの製造法にもまた関する。それは、Ｆｃオリゴ糖中にシアル酸を含有する抗体ならびにＦｃオリゴ糖中にシアル酸を含有しない抗体について濃縮された抗体のバッチの精製にさらに関する。
【００１４】
より具体的には、本発明は、得られる組換え的に発現されたモノクローナル抗体若しくは他のＦｃ含有融合タンパク質のシアリル化のレベルに影響を及ぼすための、宿主細胞若しくは細胞培地若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏでのグリコシルトランスフェラーゼ（シアリルトランスフェラーゼ）若しくはシアリダーゼ酵素の活性の操作方法に関し、そして、この方法は、得られる組換え発現されたタンパク質に、シアル酸含量について至適化されていない組換え的に発現されたＦｃ含有ポリペプチドに比較して適切に至適化された（ｉ）Ｆｃ媒介性のエフェクター機能、（ｉｉ）Ｆｃγ受容体結合、（ｉｉｉ）変えられたＡＤＣＣ（ｉｖ）血清半減期、または（ｖ）天然の若しくは合成のアレイに表示される標的分子に対するアビディティーを有することを引き起こす。
【００１５】
［発明の詳細な記述］
略語
α１，３ＧＴ、α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ；α２，３ＳＴ、α−２，３−シアリルトランスフェラーゼ；β１，４ＧＴ、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ；ＡＤＣＣ、抗体依存性細胞傷害；ＡＴＣＣ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；ＢＡＴＤＡ、ビス（アセトキシメチル）２，２’：６，２”−テルピリジン−ｙ，ｙ”−ジカルボキシレート；ＢＳＡ、ウシ血清アルブミン；ＣＤ培地、既知組成培地；ＣＤＣ、補体依存性細胞傷害；ＣＭＰ−Ｓｉａ、シチジン一リン酸Ｎ−アセチルノイラミン酸；ＤＭＥＭ、ダルベッコ変法イーグル培地；Ｅ：Ｔ、エフェクター細胞対標的細胞比：ＦＢＳ、ウシ胎児血清；ＥＳＩ−ＭＳ、エレクトロスプレーイオン化質量分析。ＮＫ細胞、ナチュラルキラー細胞；ＩｇＧ、免疫グロブリンＧ；ＩＭＤＭ、イスコフ変法ダルベッコ培地；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、マトリックス支援レーザー／脱離イオン化飛行時間質量分析；ＭＨＸ、ミコフェノール酸、ヒポキサンチン、キサンチン；ＮＡＮＡ、シアル酸のＮ−アセチルノイラミン酸異性体；ＮＧＮＡ、シアル酸のＮ−グリコリルノイラミン酸異性体；ＰＢＭＣ、末梢血単核細胞；ＰＢＭＣ、末梢血単核細胞；ＰＢＳ、リン酸緩衝生理的食塩水；ＰＮＧアーゼＦ、ペプチドＮグリコシダーゼＦ；ＲＰ−ＨＰＬＣ、逆相高速液体クロマトグラフィー；ＲＴ、室温；Ｓｉａ、シアル酸；ＵＤＰ−Ｇａｌ、ウリジン二リン酸ガラクトース；ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ウリジン二リン酸Ｎ−アセチルグルコサミン。
【００１６】
定義
本明細書で使用されるところの「アフィニティー」という用語は、その同族の結合パートナーに対する単純な一価リガンドの結合定数（例えば抗原若しくはエピトープに対するＦａｂの結合）の尺度であることを意図している。アフィニティーは、限定されるものでないが、例えばプラズモン共鳴（ＢｉａＣｏｒｅ）によりオンおよびオフ速度（それぞれｋｏｎおよびｋｏｆｆ）を測定することを包含するいくつかの方法で測定し得、そして全体会合（Ｋａｓｓ）若しくは解離定数（ＫＤ）（ここでＫａｓｓはｋｏｎ／ｋｏｆｆでありかつＫＤはｋｏｆｆ／ｋｏｎである）として表し得る。ＫＤは、例えば結合パートナーへのリガンドの結合が半飽和である濃度を測定することにより経験的にもまた測定しうる。ＫＤの別の測定方法は、１種の結合体若しくはリガンドを標識（ｌａｂｅｌｅｄ）若しくは標識（ｔａｇｇｅｄ）しかつ一定濃度で保持する一方、試験結合体若しくはリガンドを変動する濃度で添加して、競合してその同族の結合パートナーから標識物質を離す競合アッセイ、および標識が半分だけ減少される濃度を決定することによる。
【００１７】
本明細書で使用されるところの「アビディティー」という用語は、リガンドおよび結合パートナー双方が多価であることができかつ複数の会合および解離事象に対する傾向が特定の一リガンドに対して同時に存在し得る限りは結合パートナーに結合されたまま留まるリガンドの傾向の尺度であることを意図している。従って、アビディティーは既知のアフィニティーをもつ結合パートナーの多価コンホメーションの見かけのアフィニティーの増大により測定し得る。
【００１８】
本明細書で使用されるところの「Ｆｃ含有タンパク質」若しくは「Ｆｃ含有分子」という用語は、１個のリガンド結合ドメインならびに最低１個の免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメインを有する単量体、二量対若しくはヘテロ二量体タンパク質を指す。ＣＨ２およびＣＨ３ドメインは該タンパク質／分子（例えば抗体）の二量体領域の少なくとも一部分を形成し得る。
【００１９】
「抗体」という用語は、抗体またはその指定されるフラグメント若しくは部分の構造および／若しくは機能を模倣しかつ限定されるものでないがＦｃ受容体（例えばＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）およびＦｃＲｎ）への結合、補体（例えばＣ１ｑ）を結合すること、ＡＤＣＣならびにＣＤＣを挙げることができるＦｃ媒介性の機能を保持する、抗体模倣物を制限なしに包含するか若しくは抗体の部分を含んでなる、抗体、それらの消化フラグメント、指定される部分およびバリアントを包含することを意図している。
【００２０】
本明細書で使用されるところの「モノクローナル抗体」という用語は、リガンド結合ドメインが、動物抗体の最低１種のＨ若しくはＬ鎖抗体可変ドメインの最低１種に対する実質的相同性を保持する、特定の形態のＦｃ含有融合タンパク質である。
【００２１】
「シアル酸」という用語は９炭素のカルボキシル化糖の１ファミリーのいずれかのメンバーを指す。シアル酸ファミリーの最も一般的なメンバーはＮ−アセチルノイラミン酸（２−ケト−５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロピラノス−１−オニックＩ酸（しばしばＮｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃ若しくはＮＡＮＡと略記される）である。該ファミリーの第二のメンバーは、ＮｅｕＡｃのＮ−アセチル基がヒドロキシル化されているＮ−グリコリル−ノイラミン酸（ＮＧＮＡ、Ｎｅｕ５Ｇｃ若しくはＮｅｕＧｃ）である。この形態はげっ歯類および微生物供給源からの糖タンパク質中で優勢である。第三のシアル酸ファミリーメンバーは２−ケト−３−デオキシノヌロソン酸（ＫＤＮ）（Ｎａｄａｎｏら（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１１５５０−１１５５７；Ｋａｎａｍｏｒｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２１８１１−２１８１９（１９９０））である。９−Ｏ−ラクチル−Ｎｅｕ５Ａｃ若しくは９−Ｏ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃのような９−Ｏ−Ｃ−Ｃ６アシルＮｅｕ５Ａｃ、９−デオキシ−９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃおよび９アジド−９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃのような９−置換シアル酸もまた包含される。シアル（ｓｔａｔｉｃ）酸ファミリーの総説については、例えばＶａｒｋｉ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２：２５−４０（１９９２）；Ｓｉａｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｒ．Ｓｃｈａｕｅｒ編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク（１９９２））を参照されたい。
【００２２】
記述
Ｆｃオリゴ糖のシアリル化のレベルがＦｃγ受容体に対する組換え産生された治療的抗体のアフィニティーを変えて前記抗体の生物学的作用の多様な局面の調節をもたらすことが、予期せぬことに見出された。より具体的には、高度にシアリル化されたＡｂが、低アフィニティー受容体ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）およびＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）に対する有意に低下されたアフィニティーを有し、また、ＦｃγＲＩＩＩＡが関連受容体であると考えられているｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣアッセイで有意に低下された活性を有することが発見された。高度にシアリル化されたＡｂが、高アフィニティーＦｃγ受容体ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）に対する増大されたアフィニティーを有すること、および、完全にシアリル化されたＦｃ含有タンパク質が、アシアリル化若しくは部分的シアリル化Ｆｃ含有タンパク質に比較して短縮された血清半減期を有することがさらに発見された。
【００２３】
Ｆｃオリゴ糖からのシアル酸の除去（または非存在若しくは低下されたレベル）が、それらの標的分子に対する組換え産生された治療的抗体のアビディティーを高めることがさらに発見された。いずれか１つの論理に束縛されることを願わない一方、オリゴ糖からの荷電した静的基の除去は、抗体構造全体でのより大きな柔軟性を可能にすることと解釈し得、この柔軟性は、他方に対する一方の関係で２個の結合ドメインの潜在的相互作用の拡大されたスフェアーを与える。２種の抗原エピトープに二価で結合するＡｂの能力は、エピトープの到達可能性、方向、密度および移動性にもまた依存することができる。シアリル化の抗原結合の影響は、ウイルス若しくは細菌の表面抗原、およびホモポリマーである可溶性抗原さえ認識するＡｂにもまた関係しうることが注目されるべきである。Ａｂの柔軟性が、Ａｂのいくつかが１種以上の抗原を結合しうるのみならず抗原のいくつかもまた１種以上のＡｂにより結合されうる可溶性免疫複合体内で、個々のＡｂ分子がどの程度まで二価で結合するかを決定し得るからである。
【００２４】
本発明は、Ｆｃのオリゴ糖および変えられたＦｃ含有分子のシアリル化を変えることによるＦｃ含有分子の特性の制御方法を含んでなる。シアル酸は生理学的ｐＨで正味の負の電荷を有し、そして従ってＦｃに結合した炭水化物中のシアル酸の存在は、三次元構造、そしてこれゆえにＣＨ２ドメインのコンホメーションを変え、そしてそれにより多様なリガンド若しくは受容体に対するＦｃ結合に影響を及ぼすと期待されうる。変えられたＦｃ含有分子は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ受容体の１種若しくはそれ以上に対するアフィニティー、ＡＤＣＣ活性、マクロファージ若しくは単球活性化、ならびに血清半減期に影響を及ぼす。
【００２５】
シアリル化された形態のＦｃ含有タンパク質の濃縮
シアル酸含量が異なる特定のＦｃ含有タンパク質の下位ロットを製造するための１アプローチは、シアリル化およびアシアリル化双方の分子を包含する不均質なＦｃオリゴ糖とＦｃ含有タンパク質調製物を一緒にし、そして、シアリル化およびアシアリル化オリゴ糖に対する差別的アフィニティーを有する固定されたレクチンを含有するカラムにそれを通すことである。結合しない通過物（Ｔ、ｔｈｒｏｕｇｈ）すなわちカラム未結合画分を結合画分（Ｂ、ｂｏｕｎｄ）から分離し得、後者は溶出緩衝液がカラムを通過する間に収集される。弱結合画分すなわちカラム停滞画分（Ｒ、ｒｅｔａｒｄｅｄ）を、例えば、元のサンプル緩衝液でのカラムの継続的洗浄の間に溶出するＦｃ含有タンパク質を収集することにより別個に収集することもまた可能でありうる。使用されるレクチンに依存して、非結合画分は、結合する画分より高い若しくはより低いシアル酸含量を有しうる。
【００２６】
シアリル化若しくはアシアリル化Ｆｃ含有タンパク質について濃縮しうるレクチンの例は、末端シアル酸をもつオリゴ糖を特異的に結合するイヌエンジュ（Ｍａａｃｋｉａ  ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）からのレクチン（ＭＡＡ）、および末端シアル酸若しくは末端Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）いずれかをもつオリゴ糖を特異的に結合するレクチン、コムギ胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）である。別の例は、末端ガラクトースをもつオリゴ糖を結合するレクチン、リシンＩ（ＲＣＡ）である。後者の例では、非結合通過画分がシアリル化Ｆｃ含有分子について濃縮されうる。
【００２７】
Ｆｃ含有タンパク質の酵素的改変
シアル酸含量が異なるＦｃ含有タンパク質の下位ロットを製造するための代替の一アプローチは、Ｆｃ含有タンパク質調製物の一部分をシアリダーゼ酵素で処理してそれによりシアル酸を除去することである。生じるアシアリル化物質を、生物学的活性の差違について、元の部分的シアリル化物質と比較し得る。元のＦｃ含有タンパク質ロット中のシアル酸含量が高いほど、生物学的活性のいずれかの差違を検出する機会が多くなる。例えば、元のタンパク質調製物中のＦｃオリゴ糖の１０％のみがシアル酸を含有した場合、オリゴ糖の０〜１％がシアル酸を含有する場合にシアリダーゼ処理後の生物学的活性の差違を検出することが困難でありうる。シアリダーゼ処理の前および後のＦｃ含有タンパク質の生物学的活性を比較することは、シアリダーゼ処理がフコシル化およびアフコシル化オリゴ糖の異なる分布をもたらす場合に、より困難になることができる。フコースレベルは、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡに対するアフィニティーおよびＡＤＣＣ活性のようなある種の生物学的活性に対する顕著な影響を有するからである。例えば、オリゴ糖の３０％から０％までのシアル酸含量の低下が、５％から１５％まで増大するアフコシル化オリゴ糖の比率をもたらす場合には、ＡＤＣＣ活性の差違をシアル酸含量の低下のみに帰することが可能でないことができる。フコシル化およびアフコシル化オリゴ糖の相対比率に対するシアリダーゼ処理のこうした影響は、シアル酸残基を除去するためのシアリダーゼでの処理の前のフコシル化およびアフコシル化オリゴ糖のシアリル化の差違により可能である（そして観察されている）。
【００２８】
Ｆｃ領域中に存在するオリゴ糖のシアリル化はｉｎ  ｖｉｔｒｏグリコシル化法を使用してもまた達成し得る。こうした方法を使用して、最大にシアリル化された糖形態の抗体サンプルを達成することが可能である。発明者の発見に基づき、最大にシアリル化された糖形態の抗体若しくは他のＦｃ含有構築物は、アシアリル化若しくは過小シアリル化抗体に比較して短縮された血清半減期を有することができる。従って、本発明の方法は、抗体若しくは免疫グロブリンＦｃ領域を含有する他の組換えタンパク質構築物を含んでなる糖形態の均質性、および前記抗体若しくは構築物のｉｎ  ｖｉｖｏでの機能の局面の双方を制御するための任意の手段を提供する。
【００２９】
グリコシルトランスフェラーゼはもちろんオリゴ糖を合成するように機能する。それらは優れた立体化学および位置化学の配置をもつ特定の生成物を生じる。グリコシル残基の転移はオリゴ糖若しくは多糖の伸長若しくは合成をもたらす。シアリルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼなどを包含する多数のグリコシルトランスフェラーゼ型が記述されている。
【００３０】
本発明で有用であるグリコシルトランスフェラーゼは、例えば、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）若しくは他の細菌供給源からのもの、ならびに、ラット、マウス、ウサギ、ウシ、ブタ、ヒトおよび昆虫ならびにウイルス供給源からのもののような、α−シアリルトランスフェラーゼ、α−グルコシルトランスフェラーゼ、α−ガラクトシルトランスフェラーゼ、α−フコシル−トランスフェラーゼ、α−マンノシルトランスフェラーゼ、α−キシロシルトランスフェラーゼ、α−Ｎ−アセチルへキソサミニルトランスフェラーゼ、β−シアリルトランスフェラーゼ、β−グルコシルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシルトランスフェラーゼ、β−フコシルトランスフェラーゼ、β−マンノシルトランスフェラーゼ、β−キシロシルトランスフェラーゼおよびβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニルトランスフェラーゼを包含する。好ましくは、グリコシルトランスフェラーゼは、膜結合ドメインが欠失されている短縮バリアントのグリコシルトランスフェラーゼ酵素である。
【００３１】
例示的ガラクトシルトランスフェラーゼは、α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．番号２．４．１．１５１、例えばＤａｂｋｏｗｓｋｉら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．２５：２９２１（１９９３）およびＹａｍａｍｏｔｏら  Ｎａｔｕｒｅ  ３４５：２２９−２３３（１９９０）を参照されたい）、ならびにα（１，４）ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．番号２．４．１．３８）を包含する。シアリルトランスフェラーゼのような他のグリコシルトランスフェラーゼを使用し得る。
【００３２】
しばしばシアリルトランスフェラーゼと称されるα（２，３）シアリルトランスフェラーゼを、シアリルラクトース若しくはより高次の構造の製造で使用し得る。この酵素は、２種の糖の間のα結合の形成を伴いＣＭＰ−シアル酸からシアル酸（ＮｅｕＡｃ）をＧａｌ残基に転移する。糖間の結合（連結）は、ＮｅｕＡｃの２位とＧａｌの３位の間である。α（２，３）シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．９９．６）と称される例示的一α（２，３）シアリルトランスフェラーゼは、シアル酸をＧａｌβ１→３Ｇｌｃ二糖若しくは配糖体の非還元末端Ｇａｌに転移する。Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｉｊｎｄｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５６：３１５９（１９８１）、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５７：１３８４５（１９８２）およびＷｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７：２１０１１（１９９２）を参照されたい。別の例示的α−２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．９９．４）は、シアル酸を二糖若しくは配糖体の非還元末端Ｇａｌに転移する。Ｒｅａｒｉｃｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５４：４４４４（１９７９）およびＧｉｌｌｅｓｐｉｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７：２１００４（１９９２）を参照されたい。さらなる例示的酵素はＧａｌ−β−１，４−ＧｌｃＮＡｃ  α−２，６シアリルトランスフェラーゼ（Ｋｕｒｏｓａｗａら  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１９：３７５−３８１（１９９４）を参照されたい）を包含する。
【００３３】
本発明のオリゴ糖の製造でとりわけ有用な他のグルコシルトランスフェラーゼは、α（１，２）マンノシルトランスフェラーゼ、α（１，３）マンノシルトランスフェラーゼ、β（１，４）マンノシルトランスフェラーゼ、Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ合成酵素、ＯＣｈ１およびＰｍｔ１を包含するマンノシルトランスフェラーゼである。
【００３４】
なお他のグルコシルトランスフェラーゼは、α（１，３）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、β（１，４）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｎａｇａｔａら  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１２０８２−１２０８９（１９９２）およびＳｍｉｔｈら  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１５１６２（１９９４））ならびにポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｈｏｍａら  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２６０９（１９９３））を包含するＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼを包含する。適するＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼは、ＧｎＴＩ（２．４．１．１０１、Ｈｕｌｌら、ＢＢＲＣ  １７６：６０８（１９９１））、ＧｎＴＩＩおよびＧｎＴＩＩＩ（Ｉｈａｒａら  Ｊ．Ｂｉｏｌｃｈｅｍ．１１３：６９２（１９９３））、ＧｎＴＶ（Ｓｈｏｒｅｉｂａｎら  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１５３８１（１９９３））を包含する。
【００３５】
該方法が商業的スケールで実施されるべきである態様について、グリコシルトランスフェラーゼを支持体に固定することが有利であり得る。この固定は、生成物のバッチからの酵素の除去および該酵素のその後の再使用を容易にする。グリコシルトランスフェラーゼの固定は、例えば、トランスフェラーゼをその膜結合ドメインから取り出すこと、およびその場所にセルロース結合ドメインを結合することにより達成し得る。当業者は、他の固定方法もまた使用し得かつ入手可能な文献に記述されていることを理解するであろう。
【００３６】
アクセプター基質は、本質的に、特定のグリコシルトランスフェラーゼがそれに対する特異性を表す末端糖残基を有するいかなる単糖若しくはオリゴ糖でもあり得るため、基質はその非還元端の位置で置換されうる。従って、配糖体アクセプターは単糖、オリゴ糖、蛍光標識した糖、若しくはアミノグリコシド抗生物質、ガングリオシドのような糖誘導体、または抗体および他のＦｃ含有タンパク質を包含する糖タンパク質でありうる。好ましい態様の一群において、配糖体アクセプターは、オリゴ糖、好ましくはＧａｌβ（１−３）ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ（１−３）ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ（１−４）ＧａｌＮＡｃ、Ｍａｎα（１，３）Ｍａｎ、Ｍａｎα（１，６）Ｍａｎ若しくはＧａｌＮＡｃβ（１−４）−マンノースである。とりわけ好ましい一態様において、オリゴ糖アクセプターはＦｃ含有タンパク質のＣＨ２ドメインに結合されている。
【００３７】
活性化された糖基質、すなわち糖−ヌクレオシドリン酸の使用は、グリコトランスフェラーゼ反応と同時に再生反応（再利用系としてもまた知られる）を使用することのいずれかにより回避し得る。例えば、例えば米国特許第６，０３０，８１５号明細書に教示されるとおり、ＣＭＰ−シアル酸再利用系は、それがα（２，３）シアリルトランスフェラーゼの存在下でシアリルトランスフェラーゼアクセプターと反応してシアリル糖を形成する際にＣＭＰ−シアル酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を補給するためにＣＭＰ−シアル酸合成酵素を利用する。本発明で有用なＣＭＰ−シアル酸再生系は、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、ヌクレオシド三リン酸（例えばアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、リン酸ドナー（例えばホスホエノールピルビン酸若しくはアセチルリン酸）、リン酸をリン酸ドナーからヌクレオチド二リン酸に転移することが可能なキナーゼ（例えばピルビン酸キナーゼ若しくは酢酸キナーゼ）、および末端リン酸をヌクレオシド三リン酸からＣＭＰに転移することが可能なヌクレオシド一リン酸キナーゼ（例えばミオキナーゼ）を含んでなる。α（２，３）シアリルトランスフェラーゼおよびＣＭＰ−シアル酸合成酵素は、活性化されたシアル酸の除去が合成の前進速度を維持するようにはたらくため、ＣＭＰ−シアル酸再生系の一部としてもまた見ることができる。改変されたＣＭＰ−シアル酸合成酵素の酵素の遺伝子を含んでなるファージミドを使用するシアリル化手順でのシアル酸化合物の合成および使用は、１９９２年１０月１日公開の国際特許出願第ＷＯ  ９２／１６６４０号明細書に開示されている。
【００３８】
オリゴ糖の代替の一製造方法は、米国特許第５，９５２，２０３号明細書に教示されるとおり、グリコシルトランスフェラーゼ、および、ドナー糖としての糖ヌクレオチドの必要性を未然に防ぐ、ドナー糖としての活性化されたグリコシル誘導体の使用による。活性化グリコシル誘導体は、高価な糖ヌクレオチド、通常は、ヌクレオチドリン酸が糖の１位にα結合されているヌクレオチド二リン酸糖若しくはヌクレオチド一リン酸糖である天然に存在する基質に対する代替として作用する。
【００３９】
有用である活性化された配糖体誘導体は、例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ、トシル酸エステル、メシル酸エステル、トリフレートエステルなどのような活性化された脱離基を包含する。活性化された配糖体誘導体の好ましい態様は、フッ化グリコシルおよびグリコシルメシレートを包含し、フッ化グリコシルがとりわけ好ましい。フッ化グリコシルのなかで、フッ化α−ガラクトシル、フッ化α−マンノシル、フッ化α−グルコシル、フッ化α−フコシル、フッ化α−キシロシル、フッ化α−シアリル、フッ化α−Ｎ−アセチルグルコサミニル、フッ化α−Ｎ−アセチルガラクトサミニル、フッ化β−ガラクトシル、フッ化β−マンノシル、フッ化β−グルコシル、フッ化β−フコシル、フッ化β−キシロシル、フッ化β−シアリル、フッ化β−Ｎ−アセチルグルコサミニルおよびフッ化β−Ｎ−アセチルガラクトサミニルが最も好ましい。
【００４０】
フッ化グリコシルは、最初に糖をアセチル化すること、および次にそれをＨＦ／ピリジンで処理することにより、遊離糖から製造し得る。アセチル化したフッ化グリコシルは、メタノール中弱（触媒的）塩基（例えばＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨ）との反応により脱保護しうる。加えて、多くのフッ化グリコシルは商業的に入手可能である。他の活性化されたグリコシル誘導体は、当業者に既知の慣習的方法を使用して製造し得る。例えば、グリコシルメシレートは、完全にベンジル化したヘミアセタールの形態の糖の塩化メシルでの処理、次いでベンジル基を除去するための触媒的水素化により製造し得る。
【００４１】
該反応のさらなる一成分は触媒量のヌクレオシドリン酸若しくはそのアナログである。本発明での使用に適するヌクレオシド一リン酸は、例えば、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、イノシン一リン酸（ＩＭＰ）およびチミジン一リン酸（ＴＭＰ）を包含する。本発明による使用に適するヌクレオシド三リン酸は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、イノシン三リン酸（ＩＴＰ）およびチミジン三リン酸（ＴＴＰ）を包含する。好ましいヌクレオシド三リン酸はＵＴＰである。好ましくは、ヌクレオシドリン酸はヌクレオシド二リン酸、例えばアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、イノシン二リン酸（ＩＤＰ）およびチミジン二リン酸（ＴＤＰ）である。好ましいヌクレオシド二リン酸はＵＤＰである。上に示されたとおり、本発明はヌクレオシドリン酸のアナログでもまた実施し得る。適するアナログは、例えばヌクレオシド硫酸およびスルホン酸を包含する。なお他のアナログは単純なリン酸例えばピロリン酸を包含する。
【００４２】
ヒドロキシル化された形態のシアル酸が優位を占める（ＮＧＮＡ）例えばマウス細胞中で産生される組換えタンパク質の一改変手順は、タンパク質をシアリダーゼで処理してＮＧＮＡ型シアル酸を除去すること、次いで試薬ＵＤＰ−Ｇａｌおよびβ１，４Ｇａｌトランスフェラーゼを使用して高度に均質なＧ２糖形態を生じる酵素的ガラクトシル化である。調製物をその後、場合によっては、高度に均質なＧ２Ｓ２糖形態を生じるために試薬ＣＭＰ−ＮＡＮＡおよびα−２，３シアリルトランスフェラーゼで処理し得る。
【００４３】
シアル酸バリアントの構造の特徴付け
シアル酸バリアントを含有するオリゴ糖の構造の特徴付けのため、抗体調製物を包含する糖タンパク質調製物をペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦで処理してＮ結合したオリゴ糖を遊離させた。酵素ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧアーゼＦ）はアスパラギンに結合したオリゴ糖を切断する。遊離されたオリゴ糖を、記述されるとおり（Ａｎｕｍｕｌａ，Ｋ．Ｒ．とＤｈｕｍｅ  ＳＴ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．１９９８  Ｊｕｌ；８（７）：６８５−９４を参照されたい）アントラニル酸（２−アミノ安息香酸）で蛍光標識し、精製しかつＨＰＬＣにより分析した。図３に示されるとおり、クロマトグラム中でＧ０、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ２Ｓ１およびＧ２Ｓ２として分離されるオリゴ糖を検出かつ定量し得る。グリカンを天然に欠く、またはグリカンが化学的若しくは酵素的に奪われたアグリコシル化種をＧｎｏと称する。
【００４４】
シアル酸バリアントの生物学的特徴付け
Ｆｃ含有タンパク質を、数種の公知のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにより機能性について比較し得る。とりわけ、Ｆｃγ受容体のＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩファミリーのメンバーに対するアフィニティーは興味深い。これらの測定は、組換えの可溶性の形態の受容体若しくは細胞と会合した形態の受容体を使用して行い得る。加えて、ＦｃＲｎ（ＩｇＧの延長された循環半減期の原因である受容体）に対するアフィニティーは、例えば組換えの可溶性ＦｃＲｎを使用するＢＩＡｃｏｒｅにより測定し得る。ＡＤＣＣアッセイおよびＣＤＣアッセイのような細胞に基づく機能アッセイは、特定のバリアントの構造のありそうな機能の結果への洞察を提供する。一態様において、ＡＤＣＣアッセイは、一次エフェクター細胞として作用するＮＫ細胞を有するよう構成され、それによりＦｃγＲＩＩＩＡ受容体に対する機能の影響を反映する。食作用アッセイもまた、スーパーオキシド若しくは炎症メディエーター遊離のような細胞応答を測定するアッセイがし得るように、多様なバリアントの免疫エフェクター機能を比較するのに使用しうる。
【００４５】
アフィニティーおよびアビディティーアッセイ
天然に多価である抗体を、標的タンパク質への結合の多様なパラメータを決定するために試験し得る。見かけのＫｄを決定するための慣習的一形式はＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）若しくはＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）である。「ＥＬＩＳＡ」は、間接検出法を使用して固体支持体上で実施される結合アッセイを意味するために一般に使用されるようになった。一般に、ＥＬＩＳＡでは、可溶性被検体を、固相反応体に特異的に結合した後に溶液から除去する。該方法で、固相反応体は、抗原若しくは抗体をプラスチック製マイクロタイタープレートに吸着させることにより調製し；他の方法では、固相反応体は細胞に会合した分子である。全部のプロトコルで、固相試薬を、酵素に共有結合させた二次若しくは三次反応体とインキュベートする。未結合の複合物を洗浄することにより除去し、そして色素生産若しくは蛍光発生基質を添加する。結合された酵素複合物により基質が加水分解される際に、着色した若しくは蛍光の生成物が生成される。最後に生成物を視覚的に若しくはマイクロタイタープレートリーダーで検出する。生成されるシグナルの強度は試験混合物中の当初の被検体の量に比例する。
【００４６】
固相アッセイの一変形において、抗原は、例えば、抗原上の無関係なドメインを認識する固定した捕捉抗体を使用して、または標的タンパク質に工作された「標識」例えばポリヒスチジン配列を結合する抗体若しくは他のリガンドを使用することにより、間接的に固定若しくは捕捉しうる。
【００４７】
表面抗原に対する抗体の結合の代替の一測定方法は、細胞表面上で抗原を（天然に若しくは遺伝子工作により）発現する全細胞を使用することによる。細胞を、一次抗体を含有する試験溶液とインキュベートする。未結合の抗体を洗い流し、そして細胞をその後、該一次抗体に特異的な抗体に複合させた酵素とインキュベートする。未結合の酵素複合物を洗い流し、そして基質溶液を添加する。結合した一次抗体のレベルは基質加水分解の量に比例する。これは、単位容量あたりの細胞の数が一定に保持される場合に定量的であることができる。あるいは、検出は、放射標識リガンドを使用して、上述されたところの直接結合若しくは競合により行う。ＥＬＩＳＡアッセイのプロトコルは例えばＡｕｓｅｂｅｌ，ＦＭら  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．２００３  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃに見出される。
【００４８】
結合速度、会合速度および解離速度は、プラズモン表面共鳴により検出される固相結合体若しくはリガンドならびに移動溶液相結合体若しくはリガンドを使用するＢＩＡｃｏｒｅ技術を使用してもまた測定し得る。
【００４９】
エフェクター機能の評価方法
治療的Ｆｃ含有タンパク質の消失および従って薬物動態における抗体グリコシル化の役割は最低限と思われ；循環からのＩｇＧ除去の原因であると考えられる新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合は、抗体のＦｃ部分のＮ結合したオリゴ糖の欠如により破壊されないようである。
【００５０】
細胞のエフェクター機能とＩｇＧ抗体媒介性免疫応答を結びつけるＩｇＧ  Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）は、Ｆｃγ受容体、すなわちＦｃＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃＲＩＩ（ＣＤ３２）（ＦｃＲＩＩＡおよびＦＣＲＩＩＢ双方）ならびにＦｃＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を包含する。全３種は単球上に表示されて見出される。しかしながら、多様な標的細胞上のこれらの受容体の生成は差別的にかつ他の因子に応答して起こるようである。従って、Ｆｃγ受容体に対するグリコシル化修飾されたＦｃ含有生物学的治療薬のアフィニティーの測定は、高められたエフェクター機能を予測するための１つの適切な測定である。
【００５１】
それらのＦｃグリカン中の低レベルのフコースを伴うヒトＩｇＧ１  Ａｂは、ヒトＣＤ１６  ＦｃＲに対するより大きいアフィニティー、そして、ヒトＰＢＭＣエフェクター細胞を使用するＡＤＣＣアッセイで劇的に高められたｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を有することが報告された（Ｓｈｉｎｋａｗａら  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８（５）：３４６６−３４７３、２００３；Ｓｈｉｅｌｄｓら  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７（３０）：２６７３３−２６７４０、２００２；Ｕｍａｎａら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １７：１７６−１８０、１９９９）。
【００５２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣアッセイを使用するエフェクター機能の評価方法は定量的様式で実施し得る。従って、標的およびエフェクター細胞株の正しい選択、ならびに駆動することを継続することの細胞の不能若しくは内的含有物の放出、例えば５１Ｃｒ放出のいずれかにより細胞の「死滅」を評価することにより、その同族のリガンドを表示する細胞の破壊を引き起こす結合した抗体の能力を測定するように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを設計し得る。標的細胞は、本発明の抗体、抗体フラグメント若しくは融合タンパク質の標的リガンドを通常発現する細胞株でありうるか、または標的タンパク質をその表面上で発現しかつ保持するよう工作しうる。こうした工作された細胞株の一例がＫ２細胞、すなわち成熟サイトカインのアミノ酸１−１２の欠失の導入により膜貫通形態として留まる組換えヒトＴＮＦをその表面上で安定に発現するＳｐ２／０マウス骨髄腫細胞株である（Ｐｅｒｅｚら、Ｃｅｌｌ  ６３：２５１−２５８、１９９０）。この細胞株は、抗ＴＮＦ抗体、抗体フラグメント、またはＦｃドメイン若しくはＦｃドメイン活性を有する工作された抗ＴＮＦαを標的とする融合タンパク質のＡＤＣＣ活性の変化を評価するのに有用である。
【００５３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣ活性アッセイのためのエフェクター細胞は、ヒト若しくは他の哺乳動物供給源のＰＢＭＣ（末梢血単球細胞）でありうる。ＰＢＭＣエフェクター細胞は、承認された方法によりドナーから血液を収集した後から新鮮な状態で単離し得る。使用しうる他の単球若しくはマクロファージ細胞は、腹腔滲出液のような滲出液由来のものである。
【００５４】
細胞の免疫機能を測定するためのｉｎ  ｖｉｖｏモデルもまた利用可能である。例えば、抗ＣＤ３抗体を使用してマウスでのＴ細胞活性化を測定し得る。抗体Ｆｃドメインが特定のＦｃγ受容体を結合する様式にＴ細胞活性化が依存するためである。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＣＣケモカイン受容体４に対するキメラヒトＩｇＧ１  Ａｂの高フコースおよび低フコースバージョンの抗腫瘍活性を比較し、それらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣ活性の差違は観察されなかった（マウスエフェクター細胞を使用して）が、しかしながら、低フコースＡｂはｉｎ  ｖｉｖｏでより強力な有効性を示した。ヒトエフェクター細胞は提供されず、また、マウスは内因性ＮＫ細胞を保持する（Ｎｉｗａら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４：２１２７−２１３３、２００４）。ヒトＮＫ細胞上のＣＤ１６受容体はＩｇＧ１  Ａｂのフコースレベルに対する高められた感受性を示したため、これらのデータは、ヒトエフェクター細胞で研究されたものと異なる機構がマウスで作動していることを示唆する。１つの可能性はより最近発見されたマウスＣＤ１６−２受容体である（Ｍｅｃｈｅｔｉｎａら  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ  ５４：４６３−４６８、２００２）。マウスＣＤ１６−２の細胞外ドメインは、より良好に知られているマウスＣＤ１６受容体が有するよりもヒトＣＤ１６Ａに対する有意により高い配列同一性（６５％）を有し、それが結合するＩｇＧのフコースレベルに対しそれがマウスＣＤ１６よりも感受性でありうることを示唆する。マウスマクロファージ様Ｊ７７４細胞中でのその報告された発現は、ＣＤ１６−２を発現するマウスマクロファージがＮｉｗａら（２００４）により記述された低フコースＡｂによるより大きな抗腫瘍活性の原因でありうるという可能性と矛盾しない。従って、マウスエフェクター細胞へのヒトＩｇＧ１型Ｆｃ含有タンパク質によるＦｃ受容体結合の研究は予測的でない。
【００５５】
タンパク質製造方法
Ｆｃ含有タンパク質の製造に関与する多様な方法が、シアル酸を包含するＦｃオリゴ糖構造に影響し得る。一態様において、上昇された熱処理（例えば５６℃３０分間）に以前にかけられなかった血清、例えばウシ胎児血清（ＦＢＳ）の存在下で、Ｆｃ含有タンパク質を分泌する宿主細胞を培養する。これは、それらの細胞から分泌されるＦｃ含有タンパク質からシアル酸を除去し得る活性のシアリダーゼ酵素の血清中での天然の存在により、シアル酸を含有しないか若しくは非常に少量のシアル酸を含有するＦｃ含有タンパク質をもたらし得る。別の態様において、それが望ましいかもしれない場合に応用（例えば治療的適応症）のためより高レベルのシアル酸をＦｃ含有タンパク質が有するような、上昇された熱処理にかけられてそれによりシアリダーゼ酵素を不活性化させた血清の存在下、または血清若しくはシアリダーゼ酵素を含有しうる他の培地成分の非存在下のいずれかで、Ｆｃ含有タンパク質を分泌する細胞を培養する。
【００５６】
別の態様において、至適のシアル酸含量に好都合であることができる、Ｆｃ含有タンパク質を精製かつさらに加工するのに使用する条件が確立されている。例えば、シアル酸は酸不安定性であるため、低ｐＨ環境への長時間の曝露（例えばプロテインＡクロマトグラフィーカラムからの溶出後、若しくはウイルス不活性化過程の間）は、同時にシアル酸含量の低下につながり得る。
【００５７】
宿主細胞の細胞工作
本明細書に記述されるとおり、組換えＦｃ含有タンパク質若しくはモノクローナル抗体の発現に選ばれる宿主細胞は、免疫グロブリンＣＨ２ドメイン中のタンパク質を装飾するオリゴ糖部分の組成の変動を制限なしに包含する最終組成への重要な寄与因子である。従って、本発明の一局面は、所望の治療的タンパク質を発現する産生細胞の使用および／若しくは開発のための適切な宿主細胞の選択を伴う。
【００５８】
一態様において、宿主細胞は、シアリルトランスフェラーゼが天然に欠損しているすなわちそれを欠く細胞である。別の態様において、宿主細胞はシアリルトランスフェラーゼを欠くように遺伝子的に改変若しくは処理されている。さらなる一態様において、宿主細胞は、低下された若しくは検出不可能なレベルのシアリルトランスフェラーゼを発現するよう選択された誘導体宿主細胞である。なお別の態様において、宿主細胞は、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素（シアル酸を抗体に転移するためにシアリルトランスフェラーゼにより使用されるシアル酸の供給源であるＣＭＰ−シアル酸の形成を触媒する酵素）を天然に欠くか、またはそれを欠くように遺伝子的に改変若しくは処理されている。関連する一態様において、宿主細胞は、ピルビン酸合成酵素（ピルビン酸からシアル酸を形成する酵素）を天然に欠くことができるか、またはそれを欠くように遺伝子的に改変若しくは処理されている。
【００５９】
付加的な一態様において、宿主細胞は、前記細胞で発現される抗体がガラクトースを欠くような、ガラクトシルトランスフェラーゼを天然に欠くことができるか、またはそれを欠くように遺伝子的に改変若しくは処理されている。ガラクトースなしでは、シアル酸は結合されることができない。別個の一態様において、宿主細胞は、産生の間に抗体からシアル酸を除去するシアリダーゼ酵素を天然に過剰発現しうるか、若しくは過剰発現するように遺伝子的に改変されうる。こうしたシアリダーゼ酵素は、抗体が分泌される前に細胞内で抗体に作用しうるか、若しくは培地に分泌されかつ培地に既に分泌された抗体に作用しうる。変えられたグリコシラーゼをもちかつ変えられた炭水化物組成をもつ糖タンパク質を発現する細胞株の選択方法は記述されている（ＲｉｐｋａとＳｔａｎｌｅｙ、１９８６．Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  １２：５１−６２；第ＵＳ２００４／０１３２１４０号明細書）。高められたＡＤＣＣをもたらす変えられたグリコシル化パターンをもつ抗体を産生させるための宿主細胞の工作方法は、米国特許第６，６０２，８６４号明細書に教示されており、ここで、宿主細胞は最低１種の糖タンパク質を修飾するグリコシルトランスフェラーゼ、とりわけβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサムニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）をコードする核酸を持つ。
【００６０】
宿主細胞のグリコシルトランスフェラーゼの操作により宿主細胞のグリコシル化特性を遺伝子的に工作することへの他のアプローチは、第ＥＰ１，１７６，１９５号明細書に教示されるところの活性（具体的にはα１，６フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８遺伝子産物））を除外若しくは抑制することを伴う。上で引用された特定の例以外で宿主細胞の工作方法を実施することが当業者に明らかであるとみられる。さらに、工作される宿主細胞は哺乳動物起源のものでありうるか、あるいは、骨髄腫、リンパ腫、酵母、昆虫若しくは植物細胞、またはそれらのいずれかの誘導体、不死化若しくは形質転換細胞から選択しうる。
【００６１】
別の態様において、シアル酸結合に必要とされる酵素の活性の抑制若しくは除外方法は、ｓｉＲＮＡ、遺伝子ノックアウトによるような遺伝子サイレンシング、または結合しかつその酵素活性を阻害する酵素に特異的な細胞内Ａｂ若しくはペプチドの共発現によるような酵素阻害剤の付加、および他の既知の遺伝子工学技術よりなる群から選択しうる。別の態様において、シアル酸結合を阻害する酵素、若しくは既に結合されているシアル酸を除去するシアリダーゼ酵素の発現若しくは活性を高める方法は、組換え酵素遺伝子でのトランスフェクション、酵素ＲＮＡの合成を高める転写因子のトランスフェクション、若しくは酵素ＲＮＡの安定性を高める遺伝子修飾（全部、精製される生成物中でより低レベルのシアル酸をもたらすシアリダーゼのような酵素の高められた活性につながる）よりなる群から選択しうる。別の態様において、特定の酵素阻害剤を細胞培地に添加しうる。
【００６２】
抗体
本出願に記述される抗体は、限定されるものでないがヒト、マウス、ウサギ、ラット、げっ歯類、霊長類を挙げることができるいずれかの哺乳動物若しくはそれらのいずれかの組み合わせを包含し得るか若しくはそれらに由来し得、そして、単離されたヒト、霊長類、げっ歯類、哺乳動物、キメラ、ヒト化および／若しくはＣＤＲ移植抗インテグリン抗体、免疫グロブリン、切断生成物、ならびにそれらの他の指定される部分およびバリアントを包含する。本発明は、当該技術分野で既知であるものと組合せられるところと一緒に本明細書に記述されるところの、抗体をコードする若しくは相補的核酸、ベクター、宿主細胞、組成物、製剤、装置、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、ならびにそれらの作成および使用方法にもまた関する。
【００６３】
本発明はさらに、抗原、サイトカイン、インテグリン、抗体、増殖因子、細胞系譜および分化のマーカーである表面抗原、ホルモン、受容体若しくはその融合タンパク質、血液タンパク質、凝固に関与するタンパク質、それらのいずれかのフラグメント、ならびに前述のいずれかのいずれかの構造若しくは機能アナログを結合するＣＨ２ドメイン中のグリコシル化が可能な免疫グロブリン若しくはそのフラグメントを発現する細胞、細胞株および細胞培養物を提供する。好ましい一態様において、免疫グロブリン、そのフラグメント若しくは誘導体は標的細胞の表面上の抗原を結合する。とりわけ好ましい一態様において、標的細胞は腫瘍細胞、腫瘍脈管構造の細胞若しくは免疫細胞である。特定の一態様において、免疫グロブリン、そのフラグメント若しくは誘導体はＴＮＦ、インテグリン、Ｂ細胞抗原若しくは組織因子に結合する。
【００６４】
なお別の態様において、本発明の細胞、細胞株および細胞培養物は、増殖因子若しくはホルモンを含んでなる融合タンパク質を検出可能に発現しうる。本発明により企図される増殖因子の例は、限定されるものでないが、ヒト成長因子、血小板由来増殖因子、上皮細胞成長因子、線維芽細胞増殖因子、神経成長因子、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、骨形成タンパク質、トランスフォーミング増殖因子、インスリン様増殖因子、若しくはグルカゴン様ペプチド、およびそれらのいずれかの構造若しくは機能アナログを挙げることができる。
【００６５】
本発明の単離された抗体は、ＡＤＣＣ活性をもつ抗体アイソタイプ、とりわけヒトＩｇＧ１（例えばＩｇＧ１  κおよびＩｇＧ１  λ）を有するものを包含し、そして、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３がより少なく好ましいか、若しくはＦｃドメイン中の特定の残基に変えられた残基を含有するハイブリッドアイソタイプが他の種からのそれらの対照物である。抗体は完全長抗体（例えばＩｇＧ１）であり得るか、または、抗原結合部分、ならびにＡＤＣＣ、補体活性化およびＣ１ｑ結合を包含するエフェクター機能を導き出すことが可能なＦｃの部分若しくはドメインのみを包含し得る。
【００６６】
さらに、本発明の細胞、細胞株および細胞培養物により産生される免疫グロブリンフラグメントは、限定されるものでないが、Ｆｃ若しくは他のＣＨ２ドメイン含有構造およびそれらのいずれかの構造若しくは機能アナログを挙げることができる。一態様において、免疫グロブリンフラグメントは二量体の受容体ドメイン融合ポリペプチドである。特定の一態様において、二量体受容体ドメイン融合ポリペプチドはエタネルセプトである。エタネルセプトは、皮下に投与されかつ患者の血清中のＴＮＦαに結合してそれを生物学的に不活性にする、組換えの可溶性ＴＮＦα受容体分子である。エタネルセプトは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に連結されたヒト７５キロダルトン（ｐ７５）腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）の細胞外リガンド結合部分よりなる二量体融合タンパク質である。エタネルセプトのＦｃ成分はＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびヒンジ領域を含有するが、しかしＩｇＧ１のＣＨ１ドメインを含有しない。
【００６７】
本発明の細胞株を使用する製造に従いやすい他の生成物は、他の型の動物細胞株により現在製造されかつグリコシル化されることが可能なＣＨ２を有する治療的若しくは予防的タンパク質を包含する。細胞表面上の標的抗原に結合する治療的なグリコシル化されたＣＨ２ドメイン含有タンパク質がとりわけ好ましく、その細胞型は能力を奪うか若しくは身体から排除することが望ましい。多数のこうした治療的抗体が、ヒトＩｇＧ１、とりわけヒトＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含んでなるＩｇＧ１、Ｈ鎖を含有するよう工作されている。こうした治療的タンパク質は、限定されるものでないが下で本明細書に記述されるものを挙げることができる。
【００６８】
現在ＲＥＭＩＣＡＤＥ（Ｒ）として販売されるインフリキシマブ。インフリキシマブは、１４９，０００ダルトンのおよその分子量をもつキメラＩｇＧ１κモノクローナル抗体である。それはヒト定常およびマウス可変領域から構成される。インフリキシマブは１０１０Ｍ−１の会合定数でヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ（α））に特異的に結合する。インフリキシマブは、可溶性および膜貫通の形態のＴＮＦ（α）に高アフィニティーで結合することによりＴＮＦ（α）の生物学的活性を中和し、そしてＴＮＦ（α）のその受容体との結合を阻害する。インフリキシマブにより結合された膜貫通ＴＮＦ（α）を発現する細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏで溶解され得る。インフリキシマブは、関節リウマチ、クローン病および強直性脊椎炎の処置に指示される。インフリキシマブは、静脈内注入として与えられる３ないし５ｍｇ／ｋｇの用量、次いで処置されるべき疾患に依存してその後同様な２、６および／若しくは８週の用量、ならびに８週ごとの間隔で付加的に与えられる。
【００６９】
ダクリズマブ（ＺＥＮＡＰＡＸ（Ｒ）として販売される）は、活性化されたリンパ球の表面上で発現されるヒト高アフィニティーインターロイキン−２（ＩＬ−２）受容体のαサブユニット（ｐ５５  α、ＣＤ２５若しくはＴａｃサブユニット）に特異的に結合する、組換えＤＮＡ技術により製造された免疫抑制性ヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。ダクリズマブは、相補性決定領域（ＣＤＲ）移植されたマウス−ヒトキメラ抗体である。ヒト配列は、ヒトＩｇＧ１の定常ドメインおよびＥｕ骨髄腫抗体の可変枠組み領域由来であった。マウス配列はマウス抗Ｔａｃ抗体のＣＤＲ由来であった。ダクリズマブは、腎移植を受領する患者での急性臓器拒絶の予防に指示され、また、一般に、シクロスポリンおよびコルチコステロイドを包含する免疫抑制レジメンの一部として使用される。
【００７０】
バシリキシマブ（ＳＩＭＵＬＥＣＴ（Ｒ）として販売される）は、活性化されたＴリンパ球の表面上のインターロイキン−２受容体（α）−鎖（ＩＬ−２Ｒ（α）、ＣＤ２５抗原としてもまた知られる）に特異的に結合しかつ阻害する免疫抑制剤として機能する、組換えＤＮＡ技術により製造されるキメラ（マウス／ヒト）モノクローナル抗体である。アミノ酸配列に基づき、該タンパク質の計算される分子量は１４４キロダルトンである。それは、ヒトＨおよびＬ鎖定常領域遺伝子（ＩｇＧ１）、ならびにＩＬ−２Ｒ（α）に選択的に結合するＲＦＴ５抗体をコードするマウスＨおよびＬ鎖可変領域遺伝子を含有するプラスミドを発現するよう遺伝子的に工作された、樹立マウス骨髄腫細胞株の醗酵から得られる糖タンパク質である。バシリキシマブは、シクロスポリンおよびコルチコステロイドを包含する免疫抑制レジメンの一部として使用される場合に、腎移植を受領する患者での急性臓器拒絶の予防に指示される。
【００７１】
アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（Ｒ）として販売される）は、ヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に特異的な組換えヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体である。アダリムマブは、ヒト由来ＨおよびＬ鎖可変領域ならびにヒトＩｇＧ１  κ定常領域をもつ抗体をもたらすファージディスプレイ技術を使用して創製された。ＨＵＭＩＲＡ（Ｒ）は、１種若しくはそれ以上のＤＭＡＲＤに対する不十分な応答を有した、中程度ないし重度に活動性の関節リウマチを伴う成人患者での構造の損傷の徴候および症状を低下させかつその進行を阻害するために指示される。ＨＵＭＩＲＡ（Ｒ）は単独でまたはＭＴＸ若しくは他のＤＭＡＲＤと組合せで使用し得る。
【００７２】
リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（Ｒ）として販売される）は、正常および悪性Ｂリンパ球の表面上で見出されるＣＤ２０抗原に向けられた、遺伝子的に工作されたキメラマウス／ヒトモノクローナル抗体である。該抗体は、マウスＬおよびＨ鎖可変領域配列ならびにヒト定常領域配列を含有するＩｇＧ１  κ免疫グロブリンである。リツキシマブは、およそ８．０ｎＭのＣＤ２０抗原に対する結合アフィニティーを有する。リツキシマブは再発性若しくは難治性の低グレード若しくは濾胞性ＣＤ２０陽性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫を伴う患者の処置に指示される。ＲＩＴＵＸＡＮ（Ｒ）は４若しくは８用量にわたり週１回３７５ｍｇ／ｍ２  ＩＶ注入で与えられる。
【００７３】
トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（Ｒ）として販売される）は、ヒト上皮細胞成長因子受容体２タンパク質ＨＥＲ２の細胞外ドメインに、細胞に基づくアッセイで高アフィニティー（Ｋｄ＝５ｎＭ）で選択的に結合する、組換えＤＮＡ由来ヒト化モノクローナル抗体である。該抗体は、ＨＥＲ２に結合するマウス抗体（４Ｄ５）の相補性決定領域とともにヒト枠組み領域を含有するＩｇＧ１  κである。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮは、その腫瘍がＨＥＲ２タンパク質を過剰発現しかつ彼らの転移性疾患に対し１種若しくはそれ以上の化学療法レジメンを受領した転移性乳癌を伴う患者の処置のための単剤療法として指示される。パクリタキセルと組合せのＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（Ｒ）は、その腫瘍がＨＥＲ２タンパク質を過剰発現しかつ彼らの転移性疾患に対し化学療法を受領したことがない転移性乳癌を伴う患者の処置に指示される。推奨される投薬量は、９０分注入として投与される４ｍｇ／ｋｇトラスツズマブの初期負荷用量、および初期負荷用量が十分に耐えられた場合に３０分注入として投与し得る２ｍｇ／ｋｇトラスツズマブの週１回維持用量である。
【００７４】
アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ（Ｒ）として販売される）は、２１〜２８ｋＤの細胞表面糖タンパク質ＣＤ５２に向けられる組換えＤＮＡ由来ヒト化モノクローナル抗体（Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ）である。アレムツズマブは、本質的に、全部のＢおよびＴリンパ球、単球、マクロファージおよびＮＫ細胞の大多数、顆粒球の一亜集団、ならびに男性生殖器官の組織の表面上に存在する非調節抗原ＣＤ５２に結合する。Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ抗体は、ヒト可変枠組みおよび定常領域、ならびにマウス（ラット）モノクローナル抗体（Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｇ）からの相補性決定領域をもつＩｇＧ１  κである。Ｃａｍｐａｔｈは、アルキル化剤で処置されかつフルダラビン療法に失敗した患者でのＢ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）の処置に指示される。Ｃａｍｐａｔｈの有効性の決定は全体奏功率に基づく。Ｃａｍｐａｔｈは、当初１日に２時間のＩＶ注入として投与される３ｍｇで与えられ；一旦耐えられれば、１日用量を１０ｍｇに増加させかつ耐えられるまで継続すべきである。この用量レベルが一旦耐えられれば、Ｃａｍｐａｔｈ  ３０ｍｇの維持用量を開始することができ、そして１２週まで週あたり３回投与しうる。大部分の患者で、３０ｍｇへの増加は３〜７日で達成し得る。
【００７５】
オマリズマブ（ＸＯＬＡＩＲ（Ｒ）として販売される）は、ヒト免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に選択的に結合する組換えヒト化ＩｇＧ１（κ）モノクローナル抗体である。オマリズマブは、肥満細胞および好塩基球の表面上の高アフィニティーＩｇＥ受容体（Ｆｃ（ε）ＲＩ）へのＩｇＥの結合を阻害する。Ｆｃ（ε）ＲＩを持つ細胞上の表面結合型ＩｇＥの減少は、アレルギー応答のメディエーターの放出の程度を制限する。オマリズマブでの処置はまた、アトピー患者での好塩基球上のＦｃ（ε）ＲＩ受容体の数も減少させる。オマリズマブは、通年性空気アレルゲンに対する陽性の皮膚試験若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏ反応性を有しかつその症状が吸入コルチコステロイドで不十分に制御される、中等度ないし重度の持続性喘息を伴う成人および青年（１２歳およびより上）に指示される。オマリズマブは１５０ないし３７５ｍｇの用量で２若しくは４週ごとにＳＣ投与する。
【００７６】
エファリズマブ（ＲＡＰＴＩＶＡ（Ｒ））は、ヒトＣＤ１１ａに結合する免疫抑制性組換えヒト化ＩｇＧ１  κアイソタイプモノクローナル抗体である。エファリズマブは、全白血球上で発現される白血球機能抗原−１（ＬＦＡ−１）の（α）サブユニットＣＤ１１ａに結合し、そしてＣＤ１１ａの細胞表面発現を減少させる。エファリズマブは、細胞内接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）へのＬＦＡ−１の結合を阻害して、それにより他の細胞型への白血球の接着を阻害する。ＬＦＡ−１とＩＣＡＭ−１の間の相互作用は、Ｔリンパ球の活性化、内皮細胞へのＴリンパ球の接着、および乾癬性皮膚を包含する炎症の部位へのＴリンパ球の移動を包含する複数の過程の開始および維持に寄与する。リンパ球の活性化および皮膚への輸送は慢性の尋常性乾癬の病態生理学である役割を演じている。乾癬性皮膚では、ＩＣＡＭ−１の細胞表面発現が内皮およびケラチノサイト上で上方制御されている。ＣＤ１１ａは、Ｂリンパ球、単球、好中球、ナチュラルキラー細胞および他の白血球の表面上でもまた発現されている。従って、エファリズマブがＴリンパ球以外の細胞の活性化、接着、移動および数に影響を及ぼす可能性が存在する。ＲＡＰＴＩＶＡ（Ｒ）の推奨用量は、単回の０．７ｍｇ／ｋｇ  ＳＣ馴化用量、次いで１ｍｇ／ｋｇの週１回のＳＣ用量（合計２００ｍｇを超えない最大単回用量）である。
【００７７】
別の態様において、本発明の細胞株は、免疫グロブリンに由来しないがしかしＦｃ含有タンパク質の定義内にあるポリペプチドを発現するように安定にトランスフェクト若しくは別の方法で工作されている。
【００７８】
本発明の抗体およびタンパク質をコードする核酸は、当該技術分野で公知のいくつかの方法で派生させ得る。一局面において、抗体は、マウスを本発明のペプチドで免疫することにより製造されるハイブリドーマから便宜的に得られる。抗体は従って、当該技術分野で公知のハイブリドーマ技術（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク州ニューヨーク（１９８７−２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）；ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）；Ｃｏｌｌｉｇａｎら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク（１９９４−２００１）；Ｃｏｌｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ニューヨーク州ニューヨーク（１９９７−２００１）（それぞれそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい）のいずれを使用しても得ることができる。
【００７９】
抗体の標的結合部分、典型的には抗体の可変Ｈおよび／若しくは可変Ｌドメインの別の便宜的派生方法において、例えばファージライブラリーで創製されるこうした結合ドメインのライブラリーからこれらの部分を選択する。ファージライブラリーは、無作為オリゴヌクレオチドのライブラリー、または免疫した動物若しくはヒトのＢ細胞からのような目的の配列を含有するポリヌクレオチドのライブラリー（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１３１５−１３１７）を挿入することにより創製し得る。抗体ファージライブラリーは、１ファージ中にＨおよびＬ鎖可変領域対を含有し、一本鎖Ｆｖフラグメント若しくはＦａｂフラグメントの発現を可能にする（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら  ２０００、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２１（８）３７１−８）。ファージミドライブラリーの多様性を操作して、付加的な所望のヒトモノクローナル抗体を製造しかつその後同定するようにライブラリーのモノクローナル抗体の免疫特異性を増大するかつ／若しくは変えることができる。例えば、Ｈ鎖およびＬ鎖免疫グロブリン分子をコードする遺伝子を、集成された免疫グロブリン分子中で新たなＨＬ対を創製するように無作為に混合（シャッフル）し得る。加えて、ＨおよびＬ鎖をコードする遺伝子のいずれか若しくは双方を、免疫グロブリンポリペプチドの可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）中で突然変異誘発し得、そしてその後、所望のアフィニティーおよび中和能力についてスクリーニングし得る。抗体ライブラリーは、１種若しくはそれ以上のヒト枠組み配列を選択すること、およびヒト抗体レパートリー由来のＣＤＲカセットの集合物を導入することにより、または設計された変動によってもまた合成で創製し得る（Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒとｖｏｎ  Ｒｕｄｅｎ  ２０００、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３：５９８−６０２）。多様性の位置はＣＤＲに制限されないが、しかし、可変領域の枠組みセグメントもまた包含し得るか、若しくはペプチドのような抗体可変領域以外を包含しうる。
【００８０】
抗体可変領域以外を包含しうる標的結合成分の他のライブラリーは、リボソームディスプレイ、酵母ディスプレイおよび細菌ディスプレイである。リボソームディスプレイは、タンパク質をＲＮＡに結合されたまま保ちつつｍＲＮＡのそれらの同族のタンパク質への翻訳方法である。核酸のコーディング配列はＲＴ−ＰＣＲにより回収される（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ，Ｌ．Ｃ．ら  １９９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１、９０２２）。酵母ディスプレイは、膜結合α−アグルチニン酵母接着受容体ａｇａ１およびａｇａ２（接合型系の一部）の融合タンパク質の構築に基づく（Ｂｒｏｄｅｒら  １９９７．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５：５５３−７）。細菌ディスプレイは、細胞膜若しくは細胞壁と会合する輸送された細菌タンパク質への標的の融合に基づく（ＣｈｅｎとＧｅｏｒｇｉｏｕ  ２００２．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ、７９：４９６−５０３）。
【００８１】
ハイブリドーマ技術に比較して、ファージおよび他の抗体ディスプレイ法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、かつ、抗原に対する宿主の影響の可能性の制限なしに、若しくはその逆で、抗原標的に対する選択を操作する機会を提供する。
【００８２】
宿主細胞
本明細書に記述される宿主細胞は、前記抗体のオリゴ糖含有物中の規定されたシアル酸含量をもつ特定の抗体を産生することが可能な宿主細胞を含んでなる。
【００８３】
連続的ゲノムＤＮＡ配列から転写される大部分の遺伝子と異なり、抗体遺伝子は、生殖系列に広範に分離されうる遺伝子セグメントから集成される。とりわけ、Ｈ鎖遺伝子は、抗体の可変（Ｖ）、多様性（Ｄ）および結合部（Ｊ）／定常（Ｃ）領域をコードする３個のゲノムセグメントの組換えにより形成される。機能的Ｌ鎖遺伝子は２個の遺伝子セグメント（一方はＶ領域をコードしかつ他方はＪ／Ｃ領域をコードする）を結合することにより形成される。Ｈ鎖およびκ  Ｌ鎖双方の遺伝子座は、１０００ｋｂに十分にわたると推定される多くのＶ遺伝子セグメント（推定値は数百と数千の間で変動する）を含有する。λ遺伝子座は対照的にはるかにより小さく、そしてマウスで第１６染色体上のおよそ３００ｋｂにわたることが示されている。それは２個の可変遺伝子セグメントおよび４個の結合部／定常（Ｊ／Ｃ）領域遺伝子セグメントよりなる。機能的遺伝子の形成はＶとＪ／Ｃ要素の間の組換えを必要とする。
【００８４】
抗体が天然に産生されるＢ細胞中で、再配列されたＨおよびκ  Ｌ鎖双方の遺伝子の転写の制御は、Ｖ領域の上流の組織特異的プロモーターおよびＪ−Ｃイントロン中に位置する組織特異的エンハンサー双方の活性に依存する。これらの要素は相乗的に作用する。また、第二のＢ細胞特異的エンハンサーがκ  Ｌ鎖遺伝子座中で同定されている。このさらなるエンハンサーはＣｋａｐｐａの９ｋｂ下流に位置する。従って、抗体発現遺伝子のハイブリドーマの不死化方法は、親Ｂ細胞系譜の内因性プロモーターおよびエンハンサー配列に頼る。あるいは、本発明の核酸は、本発明の抗体をコードする内因性ＤＮＡを含有する宿主細胞中で（操作により）スイッチを入れることにより宿主細胞中で発現させ得る。こうした方法は、例えば米国特許第５，５８０，７３４号、同第５，６４１，６７０号、同第５，７３３，７４６号および同第５，７３３，７６１号明細書（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されるとおり、当該技術分野で公知である。
【００８５】
抗体のゲノムＤＮＡの人工的ベクターへのクローニングは、抗体を発現することが可能な宿主細胞の別の創製方法である。しかしながら、強力なプロモーターの後のモノクローナル抗体の発現は、高産生細胞株を同定しかつモノクローナル抗体のより高収量を得る機会を増大させる。本発明の抗体は、例えば、当該技術分野で公知であるところの（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２）組換えＤＮＡ技術および遺伝子トランスフェクション法の組合せを使用して、宿主細胞トランスフェクトーマ（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａ）中で産生させ得る。
【００８６】
多様な異なる宿主細胞中でのポリペプチドのクローニングおよび発現のための系が公知である。適する宿主細胞は、細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、酵母およびバキュロウイルス系、ならびにトランスジェニック植物および動物を包含する。異種ポリペプチドの無傷のグリコシル化タンパク質の発現のため当該技術分野で利用可能な哺乳動物細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、ＮＳＯマウス黒色腫細胞ならびに派生細胞株、例えばＳＰ２／０、ＹＢ２／０（ＡＴＣ  ＣＲＬ−１６６２）ラット骨髄腫細胞、ヒト胎児腎臓由来細胞（ＨＥＫ）、ヒト胚性網膜細胞ＰｅｒＣ．６細胞、ｈｅｐ  Ｇ２細胞、ＢＳＣ−１（例えばＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２６）、および、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、バージニア州マナサス（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）から入手可能な多くの他者を包含する。一般的な好ましい一細菌宿主は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
【００８７】
ＣＨＯ細胞、骨髄腫細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞（ＢＨＫ２１、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０）、マウスＬｔｋ−細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞のような哺乳動物細胞は、異種遺伝子の安定発現に頻繁に使用されている。Ｃｏｓ（ＣＯＳ−１  ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０；ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５１）およびＨＥＫ２９３のような細胞株は組換えタンパク質の一過性発現に慣例に使用されている。
【００８８】
本発明の組換え抗体を発現するための好ましい哺乳動物宿主細胞は、それらの高発現率により、Ｓｐ２／０、ＹＢ２／０（ＡＴＣ  ＣＲＬ−１６６２）、ＮＳＯ、およびＰ３Ｘ６３．Ａｇ８．６５３（例えばＳＰ２／０−Ａｇ１４）のような骨髄腫細胞を包含する。とりわけ、ＮＳＯ骨髄腫細胞との使用のため、別の好ましい発現系は、第ＷＯ  ８７／０４４６２号、同第ＷＯ  ８９／０１０３６号および欧州特許第ＥＰ  ３３８，８４１号明細書に開示されるＧＳ遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入する場合、抗体は、宿主細胞中での該抗体の発現、若しくはより好ましくは宿主細胞が増殖される培地中への該抗体の分泌を見込むのに十分な時間、宿主細胞を培養することにより製造する。抗体は、標準的タンパク質精製法を使用して培地から回収し得る。
【００８９】
ＣＨＯ−Ｋ１およびＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞ＤＧ４４およびＤＵＫ−Ｂ１１（Ｇ．Ｕｒｌａｕｂ，Ｌ．Ａ．Ｃｈａｓｉｎ、１９８０．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７７、４２１６−４２２０）は、例えば薬物メトトレキサート（ＭＴＸ）を使用して、選択可能な増幅可能なマーカーＤＨＦＲの取り込みにより目的の遺伝子の増幅が可能にされる（Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ、１９９０．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：５３７−５６６）ため、高レベルタンパク質製造に使用される。ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞を、組換えｍＡｂを高レベルで産生させるのに成功裏に使用し得る。ＤＨＦＲ−ＣＨＯは、抗ＭＣＰ−１抗体を８０〜１１０ｍｇ  １０６細胞−１日−１若しくは２００ｍｇ  １０６細胞−１日−１以上の速度で産生しうる。多様なプロモーター、例えばｂ−アクチンプロモーター、ヒトＣＭＶ  ＭＩＥプロモーター、Ａｄウイルス主後期プロモーター（ＭＬＰ）、ＲＳＶプロモーター、およびマウス白血病ウイルスＬＴＲが、これらのＣＨＯ細胞中でＨおよびＬ鎖の発現を得るのに使用されている。２種のＩｇ鎖が独立した選択可能／増幅可能マーカーとともに２種の異なるプラスミドにより運搬されている、ｍＡｂ発現のための多数のベクターが文献に記述されている。ＤＨＦＲマーカーに連結された１本の抗体鎖、例えばＨ鎖、およびＮｅｏｒマーカーを伴うＬ鎖発現カセット、若しくはその逆を含有するベクターを、スピナーフラスコ中で１８０ｍｇまでのヒト化ｍＡｂ  Ｌ−１  ７日−１を得るのに使用し得る。最初の選択およびその後の増幅に使用される方法は変動し得、そして当業者に公知である。一般に、高レベルのｍＡｂ発現は、以下の段階、すなわち候補クローンの初期選択およびその後の増幅、（例えばＨ鎖およびＬ鎖双方の発現ベクターがＤＨＦＲ発現ユニットを運搬する場合の）共選択および増幅、多様な増幅可能なマーカーを使用する共増幅、ならびに大量培養での初期選択および増幅、次いで個々の高発現クローンを同定するための希釈クローニングを使用して得ることができる。組込み部位はＨ鎖およびＬ鎖発現の効率ならびにｍＡｂ発現全体に影響しうるため、２個のＩｇ鎖発現ユニットが縦列に配置されている単一のベクターが創製された。これらのベクターは、Ｎｅｏｒのようなドミナントの選択可能なマーカーおよびＤＨＦＲ発現カセットもまた運搬する。総説については、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．によるＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ，ａｎｄ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ．１９９９中、Ｇａｎｇｕｌｙ，Ｓ．とＡ．Ｓｈａｔｚｍａｎ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓを参照されたい。
【００９０】
Ｃｏｃｋｅｔｔら（１９９０．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８、６６２−６６７）は、ＣＨＯ細胞中での異種遺伝子の高レベル発現のためのＧＳ系を開発した。ｃＤＮＡ（ｈＣＭＶプロモーターの転写制御下）およびＧＳミニ遺伝子（ＳＶ４０後期プロモーターの制御下）を含有する発現ベクターのＣＨＯ−Ｋ１細胞へのトランスフェクション（次いで２０ｍＭないし５００ｍＭ  ＭＳＸでの選択）を、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ系の収量に匹敵する収量で本発明の抗体を発現するクローンを生じるのに使用し得る。ＧＳ系は、欧州特許第０  ２１６  ８４６号、同第０  ２５６  ０５５号および同第０  ３２３  ９９７号明細書、ならびに欧州特許出願第８９３０３９６４．４号明細書に関して全体として若しくは部分的に論考されている。
【００９１】
本発明を概説した一方、本発明の態様は以下の実施例にさらに開示されるであろう。
【実施例１】
【００９２】
多様なレベルのシアル酸をもつ抗体種のレクチンに基づく分離
ＭＡＡ（イヌエンジュ（Ｍａａｃｋｉａ  ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）アグルチニン）若しくはＷＧＡ（コムギ胚芽アグルチニン）に複合させたアガロースビーズはＶｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ若しくはＥＹ  Ｌａｂｓいずれかから購入した。試験抗体Ａｂ１はヒトＴＮＦを結合する完全にヒトのモノクローナル抗体である。２０ｍＭ  ＣａＣｌ２および２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）中のＡｂ１（約１〜１０ｍｇ）を、ＭＡＡ−アガロース若しくはＷＧＡ−アガロースカラムで分画した。ＭＡＡ−アガロースカラムに結合したＡｂ１を０．５％酢酸で溶離し、１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で中和し、そしてその後ＰＢＳに緩衝液交換した。この物質をＡｂ１  ＭＡＡＢと称した。
【００９３】
Ａｂ１抗体サンプルをＷＧＡ−アガロースカラムに負荷した後、結合しない（Ｔ、ｔｈｒｏｕｇｈ）画分を収集し、そしてＰＢＳに緩衝液交換した。この物質をＡｂ１  ＷＧＡＴと称した。結合したＡｂ１を含有するカラムを上述されたと同一の緩衝液で洗浄し、そしていかなる溶離する抗体（弱結合（Ｒ、ｒｅｔａｒｄｅｄ）物質を表す）も、２８０ｎｍでＯＤを測定することによりモニターしつつ１ｍｌ画分で収集した。溶離された物質をＰＢＳに緩衝液交換し、そしてＡｂ１  ＷＧＡ−Ｒと称した。最後に、洗浄後にカラムになお結合されている物質を２００ｍＭ  ＧｌｃＮＡｃ溶液で溶離し、そしてサンプルをＰＢＳに緩衝液交換した。この物質をＡｂ１  ＷＧＡＢと称した。ＨＰＬＣおよび質量分析は、Ａｂ１の下位ロットが、それらのシアル酸含量が実際に変動した（表１を参照されたい）（Ａｂ１  ＭＡＡＢについて４３％の高からＡｂ１  ＷＧＡＴについて２９％の低までの範囲にわたる）ことを示した。未改変Ａｂ１−２９の別のバッチを、固定したコムギ胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）レクチンに直接渡した。通過画分および弱結合画分は、それぞれ２９％および４１％のシアリル化グリカンを含有することが決定され、そしてＡｂ１−ＷＧＡ−２９およびＡｂ１−ＷＧＡ−４１と称した。
【００９４】
約５％のＦｃシアリル化を含有した別の抗ＴＮＦ  Ａｂ、Ａｂ２を、最初にガラクトシルトランスフェラーゼで処理して、ＷＧＡカラム分画前に完全にガラクトシル化された物質を調製して、大量のＡｂ２−ＧＴ−ＷＧＡ−５および少量のＡｂ２−ＧＴ−ＷＧＡ−６７をもたらした。Ａｂ２により認識される抗原はＡｂ１についてのものと同一であり、また、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体に認識されるＡｂ２を抗Ｉｄ２と称する。
【実施例２】
【００９５】
抗体のガラクトシル化およびシアリル化の酵素的改変
精製した抗体サンプルを、酵素的方法を介してガラクトシル化するため、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（ミズーリ州セントルイス）から得たウシβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（β１，４ＧＴ）およびＵＤＰ−Ｇａｌを酵素サンプルに添加する。組換えラット肝α−２，３−シアリルトランスフェラーゼ（α２，３ＳＴ）、組換えα−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（α１，３ＧＴ）およびＣＭＰ−ＳｉａはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（カリフォルニア州サンディエゴ）から得た。ＰＮＧアーゼＦはＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（マサチューセッツ州ビバリー）若しくはＰｒｏｚｙｍｅ（カリフォルニア州サンレアンドロ）若しくはＳｅｌｅｃｔｉｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ（カリフォルニア州プレザントヒル）から得た。肺炎双球菌（Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からのβ−ガラクトシダーゼおよびβ−グルコサミニダーゼはＰｒｏＺｙｍｅ若しくはＳｅｌｅｃｔｉｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓいずれかから得た。ウシ腎からのβ−ガラクトシダーゼおよび全部の他の酵素はＰｒｏＺｙｍｅ若しくはＳｅｌｅｃｔｉｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓいずれかからであった。ＮＡＰ−５およびＨｉＴｒａｐプロテインＡカラムはＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（ニュージャージー州ピスカタウェイ）からであった。全部の他の試薬は分析等級のものであった。
【００９６】
酵素で脱グリコシル化した形態（Ｇｎｏと称される）のＡｂ１を、Ｆｃ免疫エフェクター機能を欠く対照抗体としてはたらくように製造した。このバリアントは、Ａｂ１（１．０ｍＬの緩衝液中約１０ｍｇ）を１００ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中に取ること、およびそれを１０００ＵのＰＮＧアーゼＦで３７℃で２４時間処理することにより調製した。酵素の別のアリコートを添加し、そしてインキュベーションを追加の２４時間継続した。脱グリコシル化Ａｂ１をＨｉＴｒａｐプロテインＡカラムを使用して精製しかつＰＢＳ、ｐＨ７．０中で処方した。Ｇｎｏ糖形態は、脱グリコシル化を確認するためにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより特徴付けした。
【００９７】
実験室で操作したＡｂ調製物に加えて、ここで「天然のバリアント」と称される、シアル酸含量が天然に異なるＡｂの下位ロットもまた比較した。未改変抗体は、元のロットからの物質をＰＢＳに緩衝液交換した後にＡｂ１  ＰＢＳと称した。１対のメンバーが明らかに異なる製造工程によりＦｃシアリル化の程度が異なった、ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体Ａｂ、Ａｂ１およびＡｂ３を、それらを製造するのに使用した（しかし同一宿主細胞型により製造した）。Ａｂ１バリアント、Ａｂ１−２０およびＡｂ１−２９はそれぞれ２０％および２９％のシアリル化グリカンを含有し、また、Ａｂ５バリアント、Ａｂ５−２０およびＡｂ５−２６はそれぞれ０％および２６％のシアリル化グリカンを含有した。それ以外は、各対のメンバーは、同一アミノ酸配列、同一レベルのＦｃフコシル化および分岐ＧｌｃＮＡｃ含量（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析）、ならびに同一の低レベルのＡｂ凝集物（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析により＜１％）を有した。
【００９８】
多様なバイオアッセイで使用したＡｂおよびＦｃ含有タンパク質調製物、ならびにそれらが派生された様式の要約を表１に要約する。
【００９９】
【表１】
2009504569.tif 000003
【０１００】
【表２】
2009504569.tif 000004
【０１０１】
試験サンプルは全部ヒトＩｇＧ１ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含有する。Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３およびＡｂ５はヒトＩｇＧ１およびκ定常領域を伴うモノクローナルＩｇＧ  Ａｂである。Ａｂ１はヒトＴＮＦに特異的な完全にヒトのＡｂであり、また、Ａｂ２はヒトＴＮＦに特異的なマウス／ヒトキメラＡｂである。Ａｂ３はヘテロ二量体の炎症前サイトカインのサブユニットの１つに特異的な完全にヒトのＡｂである。全４種のＡｂはトランスフェクトしたＳｐ２／０マウス骨髄腫細胞中で発現された。Ａｂ５はヘテロ二量体の細胞表面受容体の１サブユニットに向けられた完全にヒトの抗体である。ＦｃＰ１はヒトＩｇＧ１ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含んでなる二量体融合タンパク質である。
【０１０２】
Ｇ２糖形態は、１００ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中のＩｇＧサンプル（１．０ｍＬ緩衝液中約１０ｍｇ）を５０ミリ単位のβ１，４ＧＴ、５μｍｏｌのＵＤＰ−Ｇａｌおよび５μｍｏｌのＭｎＣｌ２に３７℃で２４時間さらすことにより調製した。酵素の別のアリコートおよびＵＤＰ−Ｇａｌを添加し、そして混合物を３７℃で追加の２４時間インキュベートした。再ガラクトシル化ＩｇＧサンプルを、ＨｉＴｒａｐプロテインＡカラムを使用して精製した。オリゴ糖をＰＮＧアーゼＦにより遊離させ、そして下述されるとおりＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳおよびＨＰＬＣにより特徴付けした。
【０１０３】
Ｇ２Ｓ２糖形態は、製造元の示唆されるプロトコルに従ってＮＡＰ−５カラムを使用して１００ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中（１．０ｍＬ緩衝液中約１０ｍｇ）にＩｇＧサンプルをもたらすことにより作成した。この溶液に、それぞれ５０ミリ単位のβ１，４ＧＴおよびα２，３ＳＴ、ならびにそれぞれ５μｍｏｌのＵＤＰ−Ｇａｌ、ＣＭＰ−Ｓｉａ（ＮＡＮＡ異性体）およびＭｎＣｌ２を添加した。混合物を３７℃でインキュベートした。２４時間後に、酵素の別のアリコートをヌクレオチド糖と一緒に添加し、そして混合物を３７℃で追加の２４時間インキュベートした。Ｇ２Ｓ２糖形態のＩｇＧサンプルを上述されたとおり精製した。１種の特定のＡｂ１  Ｇ２Ｓ２ロット、Ａｂ１  Ｇ２Ｓ２（ｌｏ）について、元は結合されていたシアル酸が、おそらく汚染するシアリダーゼにより貯蔵の間にその後喪失された。分析は、Ａｂ１  Ｇ２Ｓ２（ｌｏ）中のＦｃオリゴ糖の３０％のみがシアル酸を含有した一方、Ａｂ１  Ｇ２Ｓ２（ｈｉ）中のオリゴ糖の約９５％がシアル酸を含有したことを示した。
【０１０４】
Ａｂ調製物のグリカン構造を多様な方法により分析した。無傷のＩｇＧ  ＡｂのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを実施するため、ＩｇＧサンプルを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．０中にもたらし、そして約１ｍｇ／ｍＬ緩衝液まで濃度を調節した。約２μｌのＩｇＧ溶液を２μｌのマトリックス溶液（マトリックス溶液は、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水中５０％アセトニトリル１．０ｍｌに１０ｍｇのシナピン酸を溶解することにより調製した）と混合し、そしてこの溶液２ｍｌを標的に負荷しかつ風乾させた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳはＡｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フォスターシティ）からのＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ装置を使用して取得した。
【０１０５】
遊離されたＦｃグリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を実施するため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏグリコシル化反応前および後のＩｇＧサンプル（約５０μｇ）を、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（５０μｌ）ｐＨ７．０中でＰＮＧアーゼＦで３７℃で４時間消化した。反応混合物を５０％酢酸（約５μｌ）で酸性化することにより消化を停止し、そしてその後、以前に記述された（Ｐａｐａｃら、１９９６；Ｐａｐａｃら、１９９８；Ｒａｊｕら、２０００）とおり陽イオン交換樹脂カラムを通過させた。酸性および中性のオリゴ糖の混合物を含有するこれらのサンプルを、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フォスターシティ）からのＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ装置を使用して、別の場所（Ｐａｐａｃら、１９９６；Ｐａｐａｃら、１９９８；Ｒａｊｕら、２０００）に記述されたとおり、陽および陰イオンモードのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより分析した。
【０１０６】
ＦｃグリカンのＨＰＬＣ分析は、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（約５０μｌ）ｐＨ７．０中でＩｇＧサンプル（約５０μｇ）をＰＮＧアーゼＦで３７℃で４〜８時間消化することにより行った。遊離されたオリゴ糖のアントラニル酸（２−アミノ安息香酸）での誘導体化は記述された（Ａｎｕｍｕｌａ  ＫＲ、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０００  Ｊｕｌ  １５；２８３（１）：１７−２６を参照されたい）とおり実施した。簡潔には、メタノール中４％酢酸ナトリウム・３Ｈ２Ｏ（ｗ／ｖ）および２％ホウ酸（ｗ／ｖ）の溶液を最初に調製した。誘導体化試薬をその後、約３０ｍｇのアントラニル酸（Ａｌｄｒｉｃｈ）および約２０ｍｇのシアノホウ水素化ナトリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ）を１．０ｍｌのメタノール−酢酸ナトリウム−ホウ酸溶液に溶解することにより、新たに調製した。ＩｇＧ由来オリゴ糖（２０〜５０μｌの水中３ｎｍｏｌ未満）を、「Ｏ」リング付き１．６ｍｌポリプロピレン製ねじ蓋凍結バイアル中で０．１ｍｌのアントラニル酸（ＡＡ）試薬溶液と混合し、かつ、きつく蓋をした。バイアルをオーブン若しくは加熱ブロック（Ｒｅａｃｔｉ−Ｔｈｅｒｍ、Ｐｉｅｒｃｅ）中８０℃で１〜２時間加熱した。バイアルを室温に冷却した後に、容量を約０．５ｍｌにもたらすためサンプルを水で希釈した。誘導体化オリゴ糖は、ＮＡＰ−５カラムを使用することにより精製した。
【実施例３】
【０１０７】
低アフィニティー細胞Ｆｃ受容体への結合
エフェクター細胞上のＦｃ受容体のいくつかの型のうち、Ｆｃｇａｍｍａ型ＩＩおよびＩＩＩは低若しくは中程度のアフィニティーの受容体とみなされる。一般に、単量体結合は検出されるには低すぎるアフィニティーのものでありうるか、若しくは非常に低レベルで検出されうる。例えば、Ｆｃｇａｍｍａ型ＩＩＡへの単量体ＩｇＧの結合は測定することがより困難である。これらの受容体は免疫複合体を結合するように機能し、それら複合体は、それらの多価の性質により、おそらく該複合体の遅いオフ速度によりより貪欲に結合する。
【０１０８】
唯一のＦｃγ受容体としてＦｃγＲＩＩＡを発現するヒトＫ５６２細胞を、Ｆｃグリカン中のシアル酸含量の変動がこの低アフィニティーヒトＦｃγ受容体への結合に影響を及ぼすかどうかを試験するための２つの型の結合アッセイで使用した。単量体ＩｇＧに対する低アフィニティーを有するＦｃγＲＩＩＡへの結合の十分なアビディティーを得るため、抗ＴＮＦ試験Ａｂを２：１のモル比（痕跡量のみの遊離Ａｂ若しくは遊離ＴＮＦをもたらすことが示された比）でホモ三量体ＴＮＦと混合することにより、免疫複合体を調製した。免疫複合体への依存性は、Ｋ５６２細胞への放射標識Ａｂ２単独の結合が１μｇ／ｍｌまでの濃度で検出可能でなかったが、しかし、Ａｂ２：ＴＮＦ複合体が０．０２μｇ／ｍｌで有意の結合を示した場合に具体的に説明された（データは示されない）。
【０１０９】
競合結合形式。２組のＩｇＧ免疫複合体、すなわち抗Ｖ領域特異的なヒト以外ＡｂおよびＡｂ５に複合体形成させた無関係な特異性をもつヒトＩｇＧ１抗体を含有する標識複合体を調製した。標識複合体を創製するため、ヒトＩｇＧ１およびＬ鎖κ定常領域をもつハムスターＶ領域を伴うキメラモノクローナルＡｂを、以前に記述された（Ｋｎｉｇｈｔら、１９９３）ところのＩＯＤＯ−ＧＥＮ試薬を使用してヨウ化した。ハムスター−ヒトキメラのＶ領域イディオタイプに特異的なラットＩｇＧ２ａモノクローナルＡｂをその後、ＰＢＳ中で１：１のモル比で３０分間混合して、放射標識免疫複合体の形成を可能にした。ラット抗Ｉｄは、脱グリコシル化したハムスター−ヒトキメラを用いて複合体を作成した場合にほとんど結合が起こらなかったため、ＦｃγＲＩＩＡ結合に直接寄与しないことが示された。一方、未改変キメラＡｂを伴う複合体は高レベルの結合を示した（データは示されない）。加えて、１免疫複合体が他の免疫複合体に結合しうることを示しうる別個の免疫複合体を作成するのに使用した剤の間に、検出可能な交差反応性が存在しなかった（データは示されない）。
【０１１０】
試験複合体について、Ａｂ１のシアル酸バリアントを、ＰＢＳ中２：１のモル比（非常にわずかの未結合Ａｂおよび未結合ＴＮＦをもたらすことが光散乱分析により示された）でヒトＴＮＦホモ三量体と室温で３０分間混合した。一組の実験で、２０および２９パーセントのシアル酸を含むＡｂ１の天然のバリアントの複合体を相互と比較した。第二の組の実験で、Ａｂ１−２９：ＴＮＦ複合体を、レクチンカラムで増強した調製物Ａｂ１−４３：ＴＮＦ複合体と比較した。双方の場合で、対照複合体は、抗体がグリカンを酵素的に奪われていたＡｂ１−Ｇｎｏ：ＴＮＦであった。
【０１１１】
ヒトＫ５６２細胞を９６ウェルプレート中、ＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ中で３×１０５細胞／ウェルで播種した。固定した量の放射標識抗体複合体を変動する量の試験抗体複合体に添加し、そして、合わせた混合物を、各ウェルが０．１μｇ／ｍｌのヨウ化抗体複合体の最終濃度を含有したようなＫ５６２細胞に添加した。プレートを４℃で１６〜１８時間インキュベートし、その後ＩＭＤＭ、５％ＦＢＳで３回洗浄することにより未結合Ａｂを除去し、そして、細胞に結合したカウント数を、ガンマカウンターを使用して測定した。
【０１１２】
結果。増大する量の未標識競合体免疫複合体は、放射標識免疫複合体による結合をますます阻害した。シアル酸バリアント、未改変Ａｂ１（２９％シアリル化）およびＡｂ１  ＭＡＡＢ（４３％シアリル化）は、より高度にシアリル化されたＡｂとの複合体が、ＦｃγＲＩＩへの同一程度の結合を生じるために、より少なくシアリル化されたＡｂ１を伴う複合体より５ないし１０倍より高濃度で必要とされたことを示した（図４Ａ）。９％シアル酸含量だけ異なる（２０対２９）Ａｂ１の天然のバリアントについて、該差違はより少なくシアリル化された調製物（示されない）に対する約４倍より高いアビディティーであった。従って、このヒトＩｇＧ１上でのマウス骨髄腫宿主細胞中での組換え発現の結果としてのＮＧＮＡ異性体の形態のシアル酸の存在は、ヒトＦｃγＲＩＩに対する免疫複合体のアビディティーを低下させた。
【０１１３】
Ｋ５６２細胞への免疫複合体の結合。Ａｂ１試験サンプルを、固定した２：１のモル比で１２５Ｉ標識ヒトＴＮＦと混合し、そしてその後、変動する量の生じる免疫複合体を、９６ウェル培養プレート中の３×１０５  Ｋ５６２細胞に添加した。Ａｂ１  Ｇ２Ｓ２（ｈｉ）：ＴＮＦ複合体（完全にシアリル化されたＡｂ）に対するＡｂ１  Ｇ２：ＴＮＦ複合体（非シアリル化複合体）の比較は、完全にシアリル化されたＡｂがはるかにより小さいアビディティーで結合し、高度にシアリル化されたバリアントは、同一程度の結合を達成するためにアシアリル化バリアントより１０倍より高濃度で必要とされた（図４Ｂ）ことを示した。これらの結果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素的改変により導入したシアル酸のＮＡＮＡ異性体の存在が、安定性の低下したＡｂ：ＴＮＦ複合体によるか、Ｆｃ受容体に対する定常領域のアフィニティーを低下させることによるか、若しくは双方により、標的（ＴＮＦ）への結合アフィニティーの低下に帰することができる、ヒトＦｃγＲＩＩに対する抗体のアビディティーを低下させたことを示す。
【０１１４】
細胞ＦｃγＲＩＩＩａへのＡｂ結合。ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）上のＦｃγＲＩＩＩａへのＡｂ結合を分析するため、ヒトＰＢＭＣを上述されたとおり単離し、そして、ＮＫ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用する磁性細胞分取によりＮＫ細胞をＰＢＭＣから単離した。ＮＫ細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中ウェルあたり１×１０５細胞で９６ウェルプレート中で５％ＣＯ２を伴い３７℃で一夜培養した。抗ＦｃγＲＩＩＩａ  ｍＡｂ  ３Ｇ８２２（ＢＤ  Ｂｉｏｅｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を、Ｉｏｄｏｇｅｎチューブ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して１１μＣｉ／μｇの比活性まで１２５Ｉで標識した。ヨウ化ｍＡｂ  ３Ｇ８を、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ中で変動する量の未標識競合体Ａｂと前混合し、そしてＡｂ混合物を０．３μｇ／ｍｌのヨウ化３Ｇ８の最終濃度のためＮＫ細胞に添加した。細胞を４℃で１６時間インキュベートし、そしてその後ＰＢＳで４回洗浄することにより未結合のＩｇＧを除去した。細胞に結合したＣＰＭ数を、ガンマカウンターを使用して測定した。
【０１１５】
２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｕ−９３７培地）中で培養したＵ−９３７細胞（ＦｃγＲ発現を高めるよう前処理されていない）を、５０μｌのＵ−９３７培地中ウェルあたり３×１０５細胞を有するように９６ウェルプレートに播種した。Ａｂ２（ヒトＩｇＧ１）を１７μＣｉ／μｇの比活性まで１２５Ｉで標識した。ヨウ化Ａｂ２  Ａｂを、Ｕ−９３７培地中で変動する量の未標識競合体Ａｂ２サンプルと前混合した。５０μｌのＡｂ混合物をその後、全ウェル中で０．２μｇ／ｍｌのヨウ化Ａｂ３の最終濃度を有するように５０μｌのＵ−９３７細胞に添加した。細胞を４℃で１６時間インキュベートし、そしてＵ−９３７培地で３回洗浄することにより未結合のＡｂを除去した。細胞に結合したＣＰＭ数を、ガンマカウンターを使用して測定した。
【０１１６】
ＡｂバリアントがＦｃγＲＩＩＩａに対する差別的アフィニティーを示すかどうかを試験するため、新たに単離したＮＫ細胞を健康ヒトドナーから単離し、そして放射標識ｍＡｂ  ３Ｇ８（Ｆｃとの結合について競合する抗ＦｃγＲＩＩＩａ  Ａｂ）および競合体としての未標識Ａｂを伴う競合結合実験で使用した。遊離の複合体形成されないＡｂを、Ｆｃシアル酸含量により影響され得る可溶性免疫複合体それら自身の安定性の差違により結果が混乱されないとみられるように（われわれの未発表データ）、免疫複合体（一般に、ＦｃγＲＩＩＩａへのはるかにより大きな結合を示す）の代わりに使用した。該結果は、Ａｂ１のより多くシアリル化された天然のバリアントＡｂ１−２９が、ＮＫ細胞上のＦｃγＲＩＩＩａに対する低下されたアフィニティーを有し、同一程度の結合を達成するのにＡｂ１−２０より４倍より高濃度で必要とされたことを示した（図５Ａ）。Ａｂ５の天然のバリアントで類似の差違が存在し、Ａｂ５−２６はｍＡｂ  ３Ｇ８に対し同一程度まで競合するのにＡｂ５−０より５倍より高濃度で必要とされた（図５Ｂ）。類似の結果が、少なくとも２名の他の血液ドナーからのＮＫ細胞を使用する場合に各実験で得られた（データは示されない；ＦｃγＲＩＩＩａのアロタイプは決定されない）。これらの結果は、より高レベルのシアリル化がＦｃγＲＩＩＩａに対するＩｇＧのアフィニティーを低下させ得、そして従ってＡＤＣＣ活性の観察された低下にほぼ確実に寄与したことを示した。
【０１１７】
同一実験をレクチン分画により派生したバリアントの対で行った場合は、しかしながら、より多くシアリル化されたバリアントが、より少なくシアリル化されたバリアントとちょうど同様に、およびおそらくわずかにより良好に、ＦｃγＲＩＩＩａを結合することが見られた（図５Ｃおよび５Ｄ）。該２対の天然のバリアントおよび２対のレクチン由来のバリアントでの異なる結果の理由は知られていないが、しかし、良好な可能性は、存在するシアル酸残基の位置の差違が存在することである。
【実施例４】
【０１１８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣアッセイ
抗ＴＮＦ  Ａｂの標的細胞は、成熟ＴＮＦのアミノ酸１−１２の欠失の導入により膜貫通形態に留まる、その表面上で組換えヒトＴＮＦを安定に発現するＳｐ２／０マウス骨髄腫細胞株を含んだ（Ｐｅｒｅｚら、１９９０）。Ｋ２細胞を、熱不活性化ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸およびＭＨＸを含有するイスコフ培地中で培養した。培地および補充物はＧｉｂｃｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から購入した。細胞は２〜３日ごとに１：５で継代した。アッセイ日にＫ２細胞を遠心分離しかつＰＢＳで１回洗浄した。細胞を培地で約１×１０６細胞／ｍｌに調節し、そして１５マイクロリットルのＢＡＴＤＡ蛍光標識試薬（Ｄｅｌｆｉａ  ＥｕＴＤＡ細胞傷害性試薬キット、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ中）を５ｍｌの細胞に添加した（Ｂｌｏｍｂｅｒｇら、１９９６）。細胞を３７℃で３０分間インキュベートし、その後ＰＢＳで１０００ｒｐｍ、５分で２回洗浄した。ＰＢＭＣエフェクター細胞と混合する直前に、標的細胞を遠心分離し、そして１％ＢＳＡを含有するイスコフ培地に２×１０５細胞／ｍｌで再懸濁した。
【０１１９】
ＰＢＭＣエフェクター細胞は、ヘパリン化ヴァキュテーナーに血液を収集しかつＰＢＳで２倍に希釈した後に健康ドナーから単離した。３０ｍｌの希釈血液を、５０ｍｌコニカルチューブ中１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、スウェーデン・ウプサラ）の上部に重ね、そして室温（ＲＴ）で１５００ｒｐｍ、３０分で遠心分離した。ＰＢＭＣを含有する界面（バフィ層）を収集しかつＰＢＳで２回洗浄し、そして１２００ｒｐｍ、１０分、ＲＴで遠心分離した。細胞を、５％熱不活性化ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび０．１ｍＭ非必須アミノ酸を含有するイスコフ培地に再懸濁した。４℃でＯＫＴ３（ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌ、Ｏｒｔｈｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）で一夜被覆しかつＰＢＳですすいだ１００ｍｍ組織培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上でインキュベートすることにより、ＰＢＭＣを３７℃、５％ＣＯ２でおよそ４時間活性化した。ＰＢＭＣを収集し、１％ＢＳＡを含有するイスコフ培地で１回洗浄し；計数しかつおよそ１×１０７細胞／ｍｌまで再懸濁した。
【０１２０】
陰性対照バリアントＡｂ１  Ｇｎｏを包含するＡｂ１の試験サンプルをイスコフ−１％ＢＳＡ培地で連続希釈した。５０マイクロリットルの標的細胞（約１０，０００）および１００マイクロリットルの抗体を丸底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に添加した。５０マイクロリットルのエフェクター細胞（約５００，０００細胞）を混合物に添加し、そしてプレートを１０００ｒｐｍで５分間ＲＴで遠心分離した。Ｅ：Ｔの比は通常５０：１であったが、しかしながら３５：１をときに使用した。バックグラウンド蛍光のため、ウェルをエフェクター細胞、標的細胞および培地とインキュベートした。最大の蛍光のため、１０マイクロリットルの溶解溶液（Ｄｅｌｆｉａ  ＥｕＴＤＡ細胞傷害性キットから）をバックグラウンドウェルに添加した。ＡＤＣＣアッセイのため、細胞を３７℃、５％ＣＯ２でおよそ２時間インキュベートした。２０マイクロリットルの上清を９６ウェル平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移した。２００マイクロリットルのユーロピウム溶液（Ｄｅｌｆｉａ  ＥｕＴＤＡ細胞傷害性キット）を添加し、そしてプレートをプレート振とう器上にＲＴで１０分間置いた。時間分解蛍光計ＥｎＶｉｓｉｏｎ装置（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で蛍光を測定した。各サンプル中の特異的溶解のパーセントを、以下の式、すなわち％特異的放出＝（［実験放出−自発放出］÷［最大放出−自発放出］）×１００に従って計算した。
【０１２１】
シアル酸の影響の初期評価は、２対の天然のバリアントのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣ活性に焦点を当てた。Ａｂ１−２９およびＡｂ１−２０を、ユーロピウム標識したＡｇ１発現標的細胞と変動する濃度でインキュベートした。図６Ａに示されるとおり、細胞傷害活性の明瞭な差違が存在し、より高レベルのＦｃシアリル化を伴うＡｂ１−２９は、同一程度まで細胞溶解を誘発するためにＡｂ１−２０よりおよそ７倍より高濃度で必要とされた。該結果は、シアリル化糖形態について濃縮されたＡｂ１下位ロットＡｂ１  ＭＡＡＢが未改変Ａｂ１  ＰＢＳより少なく強力であったことを示した。Ａｂ１  ＰＢＳ−２９％サンプルと同一量の溶解を達成するのに約３倍のＡｂ１  ＭＡＡＢ−４３％物質が必要とされた。Ａｇ５発現標的細胞を用いる実験は、Ａｂ２の天然のバリアントの対について同一パターンを示した。検出可能なシアル酸を含まないＡｂ２−０バリアントと同一程度の細胞溶解を達成するために、およそ６倍より高濃度のＡｂ２−２６が必要とされた（図６Ｂに示されるとおり）。従って、ＡＤＣＣのこの尺度に対する天然のグリコシル化変動の影響はＡｂ若しくは標的特異的でない。
【０１２２】
レクチンに基づく分画後のそれらのシアル酸含量が異なるＡｂ１の下位ロットのＡＤＣＣ活性を比較するための代表的実験で、Ａｂ１  ＭＡＡＢ（４３％シアリル化）をそれが由来した未改変Ａｂ１ロット（Ａｂ１  ＰＢＳ）と比較した。シアル酸含量が異なったＡｂ１下位ロットを比較するための第二の実験で、Ａｂ１  ＷＧＡＴ（２９％シアリル化）、Ａｂ１  ＷＧＡＲ（４０％シアリル化）およびＡｂ１  ＷＧＡＢ（３２％シアリル化）を相互と比較した。
【０１２３】
アッセイの結果は、Ａｂを調製した様式に関係なく、シアル酸含量とＡＤＣＣアッセイでの効力の間の逆相関もまた示す（図６Ｃ）。すなわち、未改変Ａｂ１とほぼ同一量のシアル酸を含有するＡｂ１  ＷＧＡＴは未改変Ａｂ１と同一の活性を示した。しかしながら、ＷＧＡで調製した画分は増大するシアル酸含量とともに効力を喪失した（図６Ｃ）。
【０１２４】
一実験で、シアル酸含量のより顕著な差違を伴う２サンプル、すなわち酵素で改変したＡｂ１  Ｇ２（０％シアリル化）およびＡｂ１  Ｇ２Ｓ２（ｈｉ）（約９５％シアリル化）を比較した。新鮮ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ中での密度遠心分離により単離した。１００ｍｌの容量中の５×１０５  ＰＢＭＣを、変動する量の未処理Ａｂ１、Ａｂ１  Ｇ２Ｓ２（ｈｉ）（完全にガラクトシル化かつシアリル化）、若しくはＡｂ７（アイソタイプを一致させた陰性対照Ａｂ）とおよそ１０分間前インキュベートした。表面結合した組換えヒトＴＮＦを発現するＫ２細胞を、２００ｍＣｉの５１Ｃｒで標識することにより標的として使用した。標識した細胞をＰＢＭＣ／Ａｂ混合物に添加し、１０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、そして３７℃で４時間インキュベートした。このインキュベーション時間（４時間）は、一般にＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）およびＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）を発現するマクロファージによるよりむしろＦｃγＲＩＩＩＡを発現するＮＫ細胞（ＰＢＭＣ細胞の集団内）により誘導される主として細胞溶解を示すことが知られている。細胞上清中の放射活性数をその後、Ｔｏｐｃｏｕｎｔを使用して測定した。示される結果（図６Ｄ）は、異なるドナーからのＰＢＭＣを使用して行った２回の独立した実験を代表し、そして完全にシアリル化されているＡｂとほぼ脱シアリル化されているものの間の細胞溶解の効力の１０倍以上の変化を示す。
【０１２５】
Ａｂ調製物の他の対もまたＡＤＣＣアッセイで比較した。ガラクトシル化Ａｂ２から調製したＷＧＡレクチン画分を、Ａｇ２発現標的細胞を使用するＡＤＣＣアッセイで評価した。再度、より多くシアリル化された物質がより少なく活性であったとは言え、シアル酸含量のそれらの劇的な差違（５％対６７％）にもかかわらずそれらのＥＣ５０値の４倍のみの差違が存在した。対照的に、Ａｂ１から作成したＷＧＡレクチン画分は４１％シアリル化バリアントを示し、同一程度の細胞溶解を達成するために２９％シアリル化バリアントよりおよそ６倍より高濃度であることを必要とした。
【０１２６】
試験した全３三種のＡｂのこれらの結果は、より高レベルのＦｃシアル酸が低下されたＡＤＣＣ活性と関連したことを一貫して示した。定量的でないとは言え、ＡＤＣＣ活性とＡｂ調製物のシアル酸含量の大きさの変化の間の相違、４種のＡｂ１バリアントの一団内に一貫した関係が存在し、ＥＣ５０値は、Ａｂ１−２０、Ａｂ１−２９、Ａｂ１−ＷＧＡ−２９およびＡｂ１−ＷＧＡ−４１についてそれぞれ典型的に０．３ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌおよび１０ｎｇ／ｍｌであった。レクチン画分での結果もまた、シアリル化Ａｂ調製物が変動するレベルのＡＤＣＣ活性をもつ分子種を含有することを確認した。Ａｂ３−０およびＡｂ３−２６を除き、ここで分析したバリアントは、達成された最大レベルの溶解の差違を示す傾向がなかったことに注目すべきである。
【０１２７】
ＡＤＣＣ活性の本測定方法はＦｃγＲＩＩＩＡ陽性ＮＫ細胞により主に媒介されるため、該データは、Ｆｃオリゴ糖中のシアル酸の存在がＦｃγＲＩへの結合を高める一方で、その存在がＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を有意に減少させることを意味する。
【実施例５】
【０１２８】
高アフィニティーの細胞Ｆｃ受容体への結合
高アフィニティーヒトＦｃ受容体ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）へのシアル酸含量の異なった試験Ａｂの結合を、ヒト単球細胞株Ｕ−９３７細胞で競合結合形式を使用して測定した。Ｕ−９３７細胞を、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ  １６４０培地中、Ｔフラスコ中で培養し、そして３７℃で５％ＣＯ２を含むインキュベータ中で維持した。マウス／ヒトＩｇＧ１キメラＡｂ、Ａｂ２を、ＩＯＤＯ−Ｇｅｎ前被覆ヨウ化チューブを使用して１７．２ｍＣｉ／ｍｇの比活性までヨウ化した。Ｕ−９３７細胞を６×１０６細胞／ｍｌで新鮮培地に再懸濁し、そしてその後、ウェルあたり３×１０５細胞の密度でフィルター付きＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ９６ウェル組織培養プレートに播種した。細胞はより高いＦｃγＲ発現を誘導するために前処理しなかった。ヨウ化Ａｂ２を、５０μｌの容量中で、希釈剤として培地を使用して、変動する量の未標識Ｍａｂ競合体（試験サンプル）と前混合した。混合物をその後、０．２ｎｇ／ｍｌの最終のヨウ化Ａｂ２濃度を生じるように、Ｕ−９３７細胞の５０μｌ培養物に添加した。細胞をその後４℃で１６時間インキュベートした。培地で洗浄することおよびプレート真空装置を使用して３回吸引することにより未結合ＩｇＧを除去した。細胞に結合したカウント数を、ガンマカウンターを使用して測定した。
【０１２９】
図７Ａは、Ａｂ１  Ｇ２（シアル酸なし）に比較して、Ａｂ１  Ｇ２Ｓ２（ｈｉ）（約９５％シアリル化）が５ないし１０倍より高アフィニティーでＵ−９３７細胞上の高アフィニティーＦｃＲ（ＣＤ６４）に結合した、すなわち、Ａｂ１  Ｇ２Ｓ２（ｈｉ）はヨウ化Ａｂ２結合の同一程度の阻害を生じるためにわずか１／５ないし１／１０の濃度で必要とされたことを示す。Ａｂ１  Ｇ２は未処理Ａｂ１と検出可能な差違を示さず（データは示されない）、後者は多様な糖形態の不均質な混合物であり、その大部分はＡｂ１  Ｇ２サンプルより少ないガラクトース（すなわちＧ０およびＧ１糖形態）を含有する。
【０１３０】
図７Ｂは、荷電したオリゴ糖種（シアル酸含有種）の量が異なる（）オリゴ糖全体の２％若しくは４２％のいずれかであるＡｂ３の異なる２ロットが、より高いシアル酸含量を有すると特徴付けられるロットがＦｃγＲＩに対するより高いアフィニティーを有することを同様に示すことを示す。
【０１３１】
Ａｂ１およびＡｂ５の２対の天然のグリコシル化バリアントについて、より高いシアル酸含量をもつ抗体調製物によるＮＫ細胞ＦｃγＲＩＩＩａへの低下された結合（実施例３、図５ＡおよびＢ）を観察した後に、該効果が負に荷電したシアル酸と負に荷電した細胞表面の間の単純な静電反発によったという可能性を考慮した。しかしながら、ヒトＵ−９３７細胞上のＦｃγＲＩ受容体に対する結合アフィニティーに対するシアル酸含量の逆の影響は、Ａｂ５若しくは他のＡｂについての同一パターンに従わなかった（データは示されない）。
【０１３２】
２種のＡｂ１サンプルはＮＡＮＡの形態のシアル酸の非存在／存在が異なる一方で、２種のＡｂ３サンプルはＮＧＮＡの形態のシアル酸（マウス宿主細胞中で産生される）の量が異なると考えられることが注目されるべきである。
【実施例６】
【０１３３】
血清半減期の測定
本実施例において、マウス骨髄腫細胞中で発現される抗体可変領域配列ならびにヒトＩｇＧ１ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに融合されたＮ末端ペプチドを含んでなるＦｃ含有融合タンパク質を、完全にシアリル化された（Ｇ２Ｓ２）形態を形成するよう処理した。正常雌性ＣＤ１ラット（処置群あたり４匹）に、５％シアリル化されたＦｃオリゴ糖を含有した未改変の形態のＦｃＰ１の静脈内注入を与えたか、若しくは完全シアリル化バージョン（約９８％シアリル化）を雌性ＣＤ１ラットの群に別個に静脈内注入したかのいずれかであった。１時間、５時間、２４時間、７２時間、７日、１４日および２１日に後眼窩採血により血液を収集し、そしてその後、ＣＯ２麻酔した動物から心穿刺により第２８日に終末部血液収集物を採取した。血液サンプルから血清を調製し、そして血清中のヒトＦｃの濃度を比色ＥＬＩＳＡを使用して測定した。簡潔には、９６ウェルＥＩＡプレートをポリクローナルヤギ抗ヒトＦｃ抗体で最初に被覆した。血清サンプルの変動する希釈をウェル中室温で１時間インキュベートした。洗浄することにより未結合タンパク質を除去し、そして、結合したヒトＦｃを、酵素複合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体、次いで適切な色基質を使用して検出した。
【０１３４】
試験の結果を図８に示す。計算された曲線下面積（ＡＵＣ）は、未改変抗体について９５±１．６日・ｎｇ／ｍｌ×１０−３および４８±１．９日・ｎｇ／ｍｌ×１０−３であった。これは、Ｆｃオリゴ糖中のより高程度のシアリル化が、正常ラットでの消失のより速い速度と関連したことを示した。
【０１３５】
第二の実験で、正常マウスに、完全アシアリル化（Ｇ２）若しくは完全シアリル化（Ｇ２Ｓ２）のいずれかとなるように酵素的に改変したＡｂ２の単回の３ｍｇ／ｋｇ用量を注入した。血清中のヒトＦｃを上述されたところの比色ＥＬＩＳＡを使用してモニターかつ測定した。この実験の結果を図９に示す。およそ１週間後に、Ａｂ２  Ｇ２Ｓ２はマウスの血清からより迅速に消失されることを開始し、そして、２０日までに、血清中に残存するＡｂ２  Ｇ２Ｓ２はＡｂ２−Ｇ２の濃度のおよそ１０００倍より少なかった。
【０１３６】
マウスでの全身循環からのＡｂ１シアル酸バリアントの消失。Ａｂ１に結合したグリカン種の不均質混合物を含有するサンプルの注入後の血清からの個々のグリコシル化種の消失速度を定量化することにより、シアル酸含量の影響の別の直接測定を行った。
【０１３７】
Ａｂ１の同一の不均質にグリコシル化された調製物を、１８匹の正常な８〜１０週齢Ｂａｌｂ／ｃマウスに２０ｍｇ／ｋｇの用量でｉ．ｐ．注入した。血液を第３日に６マウスから、第１４日に別の６マウスから、および第２８日に最後の６マウスから収集した。血清を各血液サンプルから調製し、そしてＡｂ１  Ｖ領域に特異的な抗Ｉｄアフィニティーカラムを使用してＡｂ１を血清から再精製した。再精製したＡｂ１サンプルのＦｃグリカンの構造をその後ＨＰＬＣ分析により分析し、そして多様な糖形態の相対比率を本明細書に前述されたとおり決定した。
【０１３８】
シアル酸を欠くガラクトシル化糖形態（Ｇ２Ｓ０）はマウスで４週間にわたりその相対的豊富さを維持する一方、１シアル酸を伴うグリカン（Ｇ２Ｓ１）を含有するＡｂ糖形態および２シアル酸を伴う糖形態（Ｇ２Ｓ２）はより速い速度で消失したことが見出された。
【０１３９】
従って、完全にシアリル化されたＦｃ含有タンパク質は、アシアリル化若しくは部分的シアリル化組成物より短い血清半減期を有する。
【実施例７】
【０１４０】
シアル酸含量および抗体アビディティー
本明細書に記述される結果は、Ｆｃドメイン（二量体化したヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）のＦｃグリカンのシアル酸含量の変化がタンパク質全体に影響することができるという理論を裏付ける。抗体およびグリコシル化Ｆｃを含んでなる融合タンパク質の二価性に関して、該影響は特異的標的に対するタンパク質のアビディティーに明示されうる。本実施例の実験は、この理論を試験し、そしてさらに標的結合アフィニティーに対するシアル酸含量の特定の影響を示すために実施した。
【０１４１】
細胞表面抗原への結合。上述されたＡＤＣＣアッセイで使用した同一のＡｇ発現細胞株を、それらの抗原結合アビディティーのシアル酸バリアント間での差違について試験するための結合アッセイで使用した。アッセイは、固定した濃度に保った放射標識Ａｂ（Ａｂ１、Ａｂ２若しくはＡｂ５のいずれか）の１種を、変動する量の未標識試験Ａｂの存在下でＡｇ発現細胞とインキュベートした競合形式で実施した。Ｉｏｄｏｇｅｎ法により調製したヨウ化Ａｂは一般に１０μＣｉ／μｇの比活性であった。
【０１４２】
表面ＴＮＦを発現する細胞をウェルあたり５０，０００細胞、およびＡｇ２発現細胞をウェルあたり１８０，０００細胞で、５％ＦＢＳを含むＩＭＤＭ培地中、９６ウェル組織培養プレートに播種した。適切な１２５Ｉ標識Ａｂを滴定量の試験Ａｂと前混合し、そして該混合物を適切なＡｇ発現細胞に添加した。プレートをＲＴで２時間インキュベートして細胞へのＡｂ結合を可能にした。細胞をその後ＩＭＤＭ、５％ＦＢＳで３回洗浄して未結合Ａｂを除去し、そして、細胞に結合したカウント数を、ガンマカウンターを使用して測定した。
【０１４３】
Ａｂ５バリアントについて、Ａｇ５発現細胞を、５０μｌのＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ中ウェルあたり１８６，０００細胞で９６ウェル組織培養プレートに播種した。１２５Ｉ標識Ａｂ２を滴定量の試験Ａｂと前混合し、そして５０μｌの混合物をＡｇ発現細胞に添加した。プレートを４℃で１６時間インキュベートして細胞上の抗原へのＡｂ結合を可能にした。細胞をその後ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳで３回洗浄して未結合Ａｂを除去し、そして、細胞に結合したカウント数を、ガンマカウンターを使用して測定した。サンプルは２検体若しくは４検体で試験し、そして結果は３若しくは４回の独立した実験を代表する。これらの試験サンプル間の結合の差違は、追加二乗和（ｅｘｔｒａ  ｓｕｍ  ｏｆ  ｓｑｕａｒｅ）Ｆ検定により決定されるとおり有意（グラフａ、ｃおよびｄについてＰ＜０．０００１）であった。
【０１４４】
結果を、図１０Ａ〜Ｄ、すなわち競合体としての未標識のＡｂ１天然バリアントの存在下でのＡｇ１発現細胞への放射標識Ａｂ１による結合（図１０Ａ）；競合体としての未標識のＡｂ５天然バリアントの存在下でのＡｇ５発現細胞への放射標識Ａｂ５による結合（図１０Ｂ）；競合体としての未標識のＡｂ１のレクチン由来バリアントの存在下でのＡｇ１発現細胞への放射標識Ａｂ１による結合（図１０Ｃ）：競合体としての未標識のＡｂ３のレクチン由来バリアントの存在下でのＡｇ３発現細胞への放射標識Ａｂ３による結合（図１０Ｄ）に示す。
【０１４５】
固相リガンドへのＡｂ結合。組換え可溶性ＴＮＦ若しくは抗Ｉｄ２を、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌのＡｇ若しくは抗Ｉｄ  Ａｂ  ５０μｌを各ウェルに添加すること、およびプレートを４℃で一夜インキュベートすることにより、ＥＩＡプレートに被覆した。ウェルを洗浄し、そしてその後、非特異的結合を最低限にするため、ＰＢＳ中１％ＢＳＡ、０．１２５％ゼラチン５０μｌでＲＴで１時間前処理した。１２５Ｉ標識Ａｂ１若しくは１２５Ｉ標識Ａｂ３をＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ中の滴定量のそれぞれの試験Ａｂと前混合し、そして５０μｌの混合物を標的で被覆したウェルに添加した。放射標識Ａｂの最終濃度は全ウェル中で１００ｎｇ／ｍｌであった。プレートをＲＴで２時間インキュベートして、被覆した標的へのＡｂ結合を可能にした。ウェルを洗浄して未結合Ａｂを除去し、そして、結合したカウント数を、ガンマカウンターを使用して測定した。
【０１４６】
可溶性抗原へのプレート被覆したＡｂの結合。９６ウェルプレートをＡｂ１若しくはＡｂ３のシアル酸バリアントで被覆し、そしてその後、後に続くところの変動する量の放射標識可溶性抗原とインキュベートした。すなわち（ａ）プレート被覆したＡｂ１の天然のバリアントへの放射標識可溶性Ａｇ１の結合、（ｂ）プレート被覆したＡｂ１のレクチン分画バリアントへの放射標識可溶性Ａｇ１の結合、および（ｃ）プレート被覆したＡｂ３のレクチン分画バリアントへの放射標識可溶性Ａｇ３の結合。非特異的結合を測定するため、放射標識Ａｇおよび１００倍過剰の未標識Ａｇとの同時インキュベーションを行った。サンプルは３検体で試験した。Ａｂ２バリアントは可溶性Ａｇ２の入手不可能性のため分析しなかった。
【０１４７】
統計学的解析。ゼロ濃度の一般的プラトーを考えた傾きおよび範囲についての予備検定（すなわち、増加曲線の一般的な「底」および減少曲線の一般的な頂点を検定せずに常に想定する）後に一般的な最小値、最大値および傾きをもつ同時の４パラメータロジスティック回帰を使用する曲線の比較により、抗体バリアント間の効力の差違を解析した。有意性検定はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ４の追加二乗和Ｆ検定を用いて行った。＜０．０５のＰ値を有意であるとみなした。ＣＰＭの分析は、ＣＰＭの標準誤差がその平均に比例して増大する（すなわちＣＰＭの変動係数ＣＶが平均に無関係である）ため、ＣＰＭ２により逆加重した。
【０１４８】
結果
ＡＤＣＣアッセイで使用した同一のＡｇ発現標的細胞を用い競合形式で実施した抗原結合実験は、予期しないことに、Ａｂ１−２９がＡｂ１−２０より約３倍より小さいアフィニティーで細胞表面抗原を一貫して結合することを示した（図１０Ａ）。Ａｂ５−２６は、対照的にＡｂ５−０と識別不可能であったアフィニティーを示した（図１０Ｂ）。２対のレクチン由来バリアントを用いて実施した同一の分析は、Ａｂ１の天然バリアントに類似の結果を示した。すなわち、より多くシアリル化されたＡｂ１−ＷＧＡ−４１は、同一程度の競合結合を達成するために、より少なくシアリル化されたＡｂ１−ＷＧＡ−２９より４ないし６倍より高濃度で必要とされ（図１０Ｃ）、また、より多くシアリル化されたＡｂ２−ＧＴ−ＷＧＡ−６７は、より少なくシアリル化されたＡｂ２−ＧＴ−ＷＧＡ−５より４ないし６倍より高濃度で必要とされた（図１０Ｄ）。
【０１４９】
興味深いことに、より多量のシアリル化を伴うＡｂ１およびＡｂ２による減少された結合の同一のパターンは、９６ウェルＥＩＡプレートに固定された標的（可溶性組換え抗原若しくは抗Ｉｄ  Ａｂ）への結合を分析する実験でもまた観察された（図１１ＡおよびＢ）。これらの結果は、Ｆｃシアリル化の程度の差違が抗原ならびにＦｃγＲＩＩＩＡへの結合に影響しうること、しかしシアリル化の程度は全Ａｂの抗原結合に影響しないことを示した。
【０１５０】
固定した標的の結合に関するデータから、増大されたＦｃシアリル化がＡｂのヒンジ領域の柔軟性を低下させるようはたらきうることが考えられる。細胞表面抗原へのＡｂ１およびＡｂ２結合の場合、低下されたヒンジ柔軟性は、固体支持体若しくは細胞表面上の抗原エピトープの空間に依存して、抗原へのより多い一価結合およびより少ない二価（高アビディティー）結合につながり得る。Ａｂ５のヒンジ領域もまた低下された柔軟性を有しうるが、しかし、柔軟性はこのＡｂがＡｇ５への最大の結合を達成するのに必要とされないとみられる。
【０１５１】
Ａｂの柔軟性の影響がＦｃシアリル化により影響を及ぼされたか、若しくは固有の結合アフィニティー変化が影響を及ぼされたかどちらかを識別するために、可溶性リガンドへのＡｂの結合を純粋に一価結合アフィニティーの尺度として試験した。該結果は、実際に、細胞表面抗原への結合の差違を示した３対のシアル酸バリアントについて、可溶性標的へのそれらの結合にバリアントの対間で観察された検出可能な差違が存在しなかったことを示した（図１２Ａ〜Ｃ）。一緒にすれば、これらの結果は、固定された標的（細胞表面若しくはプレート被覆）への結合の差違が各Ｆａｂアームと標的の間の固有のアフィニティーの差違によらなかったことを示した。従って、固定した標的へのそれらの結合のＡｂ１およびＡｂ２シアル酸バリアント間の差違は、細胞への二価結合の程度の差違による。
【０１５２】
本発明は、前述の記述および実施例に具体的に記述されたもの以外の方法で実施し得ることが明らかであろう。本発明の多数の改変および変形が上の教示に照らして可能であり、そして従って付随する請求の範囲の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】ヒトＩｇＧ中で見出される最大のオリゴ糖構造の図解である。
【図２】チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で産生される組換えＩｇＧ中で見出される主要なオリゴ糖構造を描く。
【図３】Ｆｃオリゴ糖のＨＰＬＣ分析の結果を示す。Ｎ結合したオリゴ糖を、ＰＮＧアーゼＦ酵素で処理することにより抗体から最初に遊離した。遊離されたオリゴ糖をアントラニル酸で標識し、そして、標識されたオリゴ糖をゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した。精製された標識オリゴ糖をＨＰＬＣにより分析して、示されるクロマトグラムをもたらした。
【図４Ａ−Ｂ】２種の異なる形式によるＫ５６２細胞上のヒトＦｃγＲＩＩへの多様なＡｂ１：ＴＮＦ免疫複合体の結合を示すグラフである。（Ａ）Ａｂ６（Ａｂ５に特異的なマウスモノクローナルＡｂ）と複合体形成した固定された量の１２５Ｉ標識ヒトＩｇＧ１  Ａｂ５の存在下で、Ａｂ１およびＴＮＦの変動する量の未標識複合体を細胞に添加することにより測定される競合結合。（Ｂ）１２５Ｉ標識ＴＮＦと複合体形成した変動する量のＡｂ１をＫ５６２細胞に添加することにより測定される直接結合。
【図５Ａ−Ｄ】ＮＫ細胞のＦｃγＲＩＩＩａ：Ａｂ１の天然のグリコシル化バリアント（Ａ）；Ａｂ５の天然のグリコシル化バリアント（Ｂ）；Ａｂ１のレクチンカラム画分（Ｃ）；およびＡｂ２のレクチンカラム画分（Ｄ）を結合することについて、固定された濃度の放射標識抗ＦｃγＲＩＩＩａ  ｍＡｂ、３Ｇ８と競合するのに使用される多様な試験Ａｂ調製物を用いるＦｃγＲＩＩＩａ結合研究のグラフである。
【図６Ａ−Ｄ】シアル酸含量が異なるＡｂ１、それらの細胞表面上でＴＮＦを過剰発現するＫ２標的細胞、およびＦｃγＲを発現するヒトＰＢＭＣエフェクター細胞を使用して実施したｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣアッセイの結果を示すグラフである。（Ａ）Ａｂ１の天然のグリコシル化バリアント、（Ｂ）Ａｂ５の天然のグリコシル化バリアント、（Ｃ）ＷＧＡレクチンアフィニティーに基づく分画後のシアル酸含量が異なるＡｂ１の３種の下位ロットおよび酵素的脱グリコシル化した（Ｇｎｏ）Ａｂ１の比較、（Ｄ）未処理のＡｂ１サンプルおよび完全にシアリル化されたＡｂ１  Ｇ２Ｓ２サンプル、若しくはＡｂ７アイソタイプを一致させた陰性対照Ａｂの比較。サンプルは三重で分析し（誤差の棒はｓ．ｄ．を表す）、そして、示される結果はバリアントの各対の３回の独立の実験を代表する。これらの試験サンプル間の活性の差違は、追加二乗和Ｆ検定により決定されるとおり、有意であった（グラフＡ、ＣおよびＤについてＰ＜０．０００１；グラフＢについてＰ＝０．００１６）。
【図７Ａ−Ｂ】Ｕ−９３７細胞上のヒトＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）受容体への多様なＩｇＧ抗体サンプルの競合結合を示すグラフである（Ａ）Ａｂ１  Ｇ２（完全にガラクトシル化されかつシアリル化されていない）およびＡｂ１  Ｇ２Ｓ２（ｈｉ）（完全にガラクトシル化されかつ完全にシアリル化された）はシアル酸の非存在および存在によってのみ異なる、（ｂ）Ａｂ３の２種の異なるロットは荷電したオリゴ糖種（シアル酸含有種）の量が異なり、全オリゴ糖の２％若しくは４２％のいずれかである。
【図８】完全にシアリル化されていた（Ｇ２Ｓ２）若しくは未改変であった融合タンパク質（ＦｃＰ１）の投与後の時間とＦｃ部分の血清濃度の間の関係を示すグラフである。
【図９】記述されるところの酵素的方法により完全にシアリル化されたＡｂ２  Ｇ２Ｓ２若しくは完全にアシアリル化されたＡｂ２  Ｇ２の投与後の時間とＦｃ部分の血清濃度の間の関係を示すグラフである。
【図１０Ａ−Ｄ】放射標識Ａｂすなわち（Ａ）Ａｂ１の天然のバリアント、（ｂ）Ａｂ５の天然のバリアント、（Ｃ）Ａｂ１のレクチンカラム画分バリアントおよび（Ｄ）Ａｂ２のレクチンカラム画分バリアントとの競合結合による、細胞表面上の標的リガンドに対するアフィニティーに対するＡｂ調製物中のシアル酸の影響を示すグラフである。サンプルは２検体若しくは４検体で試験し、そして示される結果は３若しくは４回の独立の実験を代表する。これらの試験サンプル間の結合の差違は、追加二乗和Ｆ検定により決定されるとおり有意であった（グラフＡ、ＣおよびＤについてＰ＜０．０００１）。
【図１１Ａ−Ｂ】ＥＩＡプレートに被覆した標的リガンドに対するアフィニティーに対するＡｂ調製物中のシアル酸の影響を示すグラフである。すなわち（Ａ）ＴＮＦへのＡｂ１の天然のバリアントの結合、（Ｂ）抗Ｉｄ抗体へのＡｂ２結合。
【図１２Ａ−Ｃ】表面結合されたＡｂすなわち（Ａ）Ａｂ１の天然のバリアント、（Ｂ）Ａｂ１  １のレクチンカラム画分のバリアントおよび（Ｃ）Ａｂ２のレクチンカラム画分のバリアントに対する、放射標識可溶性抗原として提示される標的リガンドに対するアフィニティーに対するＡｂ調製物中のシアル酸の影響を示すグラフである。放射標識Ａｇおよび１００倍過剰の未標識Ａｇとの同時インキュベーションを、非特異的結合を測定するために行った。サンプルは３検体で試験した。
【図１】
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【図２】
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【図９】
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【図３】
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【図４Ａ−Ｂ】
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【図５Ａ−Ｄ】
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【図６Ａ−Ｄ】
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【図７Ａ−Ｂ】
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【図８】
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【図１０Ａ−Ｄ】
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【図１１Ａ−Ｂ】
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【図１２Ａ−Ｃ】
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