(57)【要約】  本発明には、口腔内においてある種が有害であるかどうかを決定して、口腔細菌種を識別する方法が含まれる。前記方法には、口腔細菌種の少なくとも一つの細菌、または細菌の一部を、歯肉細胞と接触させる工程、及び、指標化合物の存在を検出する工程が含まれる。指標物質の実質的な非存在は、その細菌種が有害種ではないことを示す。薬剤の抗炎症効果を決定する方法もまた、本発明の範囲内に含まれる。前記方法には、有害細菌またはその細菌の一部の存在下で、細胞と薬剤とを接触させる工程、及び、指標化合物の存在を検出する工程が含まれる。指標物質の実質的な非存在は、その薬剤が抗炎症薬剤であることを示す。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）  口腔細菌種の少なくとも一つの細菌、または細菌の一部を、歯肉細胞と接触、させる工程；及び、
（b）  指標化合物の存在を検出する工程
を含む、口腔細菌種を識別する方法であって、この場合、指標物質の実質的な非存在は、その細菌種が有害種ではないことを示す、前記方法。
【請求項２】
歯肉細胞がin vitroのものである、請求項1の方法。
【請求項３】
歯肉細胞が、哺乳類の口腔内のin situのものである、請求項1の方法。
【請求項４】
指標物質が、Toll様受容体の調節によって産生される分子からなる群より選択される、請求項1の方法。
【請求項５】
指標物質が、TLR2、TLR3、及びTLR4の調節によって産生される分子からなる群より選択される、請求項1の方法。
【請求項６】
指標物質が、TLR5、TLR7、及びTLR9の調節によって産生される分子からなる群より選択される、請求項1の方法。
【請求項７】
指標物質が、NF-κB経路の分子からなる群より選択される、請求項1の方法。
【請求項８】
指標物質が、サイトカイン及びインターロイキンからなる群より選択される、請求項1の方法。
【請求項９】
指標物質が、IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、及びTNF-αからなる群より選択される、請求項1の方法。
【請求項１０】
指標分子が直接的に検出される、請求項1の方法。
【請求項１１】
指標物質が間接的に検出される、請求項1の方法。
【請求項１２】
少なくとも一つの細菌が、臨床試料より入手される、請求項1の方法。
【請求項１３】
有害細菌またはその細菌の一部の存在下で、細胞と薬剤とを接触させる工程、及び、指標化合物の存在を検出する工程を含む、薬剤の抗炎症効果を決定する方法であって、この場合、指標物質の実質的な非存在は、その薬剤が抗炎症性薬剤であることを示す、前記方法。
【請求項１４】
細胞が原核細胞である、請求項13の方法。
【請求項１５】
細胞が真核細胞である、請求項13の方法。
【請求項１６】
指標物質が、Toll様受容体の調節によって産生される分子からなる群より選択される、請求項13の方法。
【請求項１７】
指標物質が、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7及びTLR9の調節によって産生される分子からなる群より選択される、請求項13の方法。
【請求項１８】
指標物質が、NF-κB経路の分子からなる群より選択される、請求項13の方法。
【請求項１９】
指標物質が、サイトカイン及びインターロイキンからなる群より選択される、請求項13の方法。
【請求項２０】
指標物質が、IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、及びTNF-αからなる群より選択される、請求項13の方法。
【請求項２１】
指標分子が直接的に検出される、請求項13の方法。
【請求項２２】
薬剤が、約20％より少ないMICを示す薬剤より選択される、請求項13の方法。
【請求項２３】
Toll様受容体とトリクロサンとを接触させることを含む、哺乳類口腔細胞においてToll様受容体の調節を防ぐ方法。
【請求項２４】
細胞が歯肉細胞である、請求項23の方法。
【請求項２５】
Toll様受容体が、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7及びTLR9より選択される、請求項23の方法。
【請求項２６】
口腔組織の炎症を軽減または予防する方法であって、その方法が、MIC以下のレベルで組織にトリクロサンを適用することになる濃度のトリクロサンを含む組成物を、口腔組織へ適用することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連する出願の参照
［0001］  本明細書は、2006年1月10日に出願されたアメリカ合衆国仮特許出願シリアル番号60/757,751の利益を請求し、その内容は本明細書中で参照として援用される。
【０００２】
発明の背景
［0002］  哺乳類口腔の軟組織は、炎症の最初期の兆候を示すことが知られている。この一般的な低いレベルの炎症は、歯肉炎、及び／または、歯周炎に至る可能性がある。前記炎症は、少なくとも一部分は、口腔内に存在する細菌による結果であると一般的に考えられている。さらに、口腔組織の炎症は、手術、局所損傷、外傷、壊死、不適切な口腔衛生、または様々な全身性の原因により、引き起こされ得る。
【０００３】
［0003］  これらの疾患及び状態に関与する細胞性構成要素には、上皮組織、歯肉線維芽細胞、及び循環白血球が含まれ、これらすべては細菌により産生される病原因子に対する宿主応答に寄与すると、一般的に考えられている。これらの口腔内感染に関与する細菌性病原体のいくつかは知られているが、多くは未知か、または同定されていないままである可能性がある。これら多数の口腔の疾患において、特定の型の細菌による感染は、しばしば、病因学的事象であるが、その病状または症状の発症機序は、宿主応答を介する。抗菌剤の使用は、使用された口腔内の細菌数を減少させ、さらに、炎症の軽減をもたらし得る。しかしながら、この方法は、前記殺菌が無差別に達せられること（有益な口腔細菌及び有害な口腔細菌の両方が死に得る）、また、それは用量及び時間に敏感であることより、不都合である。
【０００４】
［0004］  口腔組織の細菌感染は、宿主の免疫応答を刺激し、そして、重大な組織損傷をもたらす炎症性メディエーターをアップレギュレートすることにより、治癒過程を減少させる。これらの代謝産物は、歯肉炎、歯周炎、骨髄炎、及び他の炎症性疾患の主要なメディエーターであると指摘されている。
【０００５】
［0005］  炎症機構の一つは、哺乳類の特定の膜貫通受容体を介することが報告されている。例えば、Toll様受容体（TLR）は、糖鎖付加された膜貫通タンパク質であり、リガンド誘導性のオリゴマー化によって一度活性化されると、細胞内で免疫応答を開始し、最終的に、サイトカイン、インターロイキン、及び、炎症状態を仲介するその他の分子の発現をもたらす。
【０００６】
［0006］  専門分野において、このような炎症効果の診断、治療、及び予防に有用な，薬剤及び技術が必要とされている。
発明の概要
［0009］  本発明には、口腔内においてある種が有害であるかどうかを決定して、口腔細菌種を識別する方法が含まれる。前記方法には、口腔細菌種の少なくとも一つの細菌、または細菌の一部を、歯肉細胞と接触させる工程、及び、指標化合物の存在を検出する工程が含まれる。指標物質の実質的な非存在は、その細菌種が有害種ではないことを示す。
【０００７】
［0010］  薬剤の抗炎症効果を決定する方法もまた、本発明の範囲内に含まれる。前記方法には、有害細菌またはその細菌の一部の存在下で、細胞と薬剤とを接触させる工程、及び、指標化合物の存在を検出する工程が含まれる。指標物質の実質的な非存在は、その薬剤が抗炎症薬剤であることを示す。
【０００８】
発明の詳細な説明
［0011］  本発明は、(1)有害細菌種と有益な口腔細菌とを識別する方法、及び(2)特定の薬剤の抗炎症効果を決定する方法を提供する。トリクロサンを使用して、細胞におけるToll様受容体の調節を防ぐ方法もまた、提供する。
【０００９】
［0012］  本明細書中で使用される場合、“炎症”とは、組織の損傷または破壊によって誘導される、有害物質及び損傷組織の両方を、破壊、減弱、または隔離する、局所的な保護応答をいう。急性の形態では、痛み、熱、赤み、及び、腫れ、により特徴づけられる。組織学的には、炎症は、透過性の上昇及び血流の増加を伴う細動脈、毛細血管、及び小動脈の拡張；血漿タンパク質を含む液体の滲出、及び、炎症部位への白血球の移動を含む、複雑な一連の事象を伴う。炎症は、炎症促進性細胞メディエーター、または例えば、抗原と抗体との相互作用の結果としてまたは感作されたリンパ球への抗原の作用によって放出される物質のレベルの上昇に応答する。ひいては、抗炎症薬剤は、薬剤処理をされていない同様の細胞と比較して、細胞におけるこれら組織学的効果の質、及び／または量を減少させるあらゆるものである。
【００１０】
［0013］  本発明は、一つには、口腔において特定の細菌種または株が有害であるかどうかを決定するために、その細菌種または株を評価する方法を提供する。“有害である”とは、その存在が、作用された細胞による炎症メディエーターの産生をもたらす、病原細菌を意味する。いくつかの細菌株／種は、有害であることが報告されており、下記表1のものが含まれる：
【００１１】
【表１】
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【００１２】
表1：有害であることが報告されている口腔細菌
［0014］  本方法には、評価される口腔細菌の少なくとも一つの細菌種または株を、少なくとも一つの歯肉細胞と接触させることが含まれる。あるいは、歯肉細胞は、細菌の一部、細胞膜、細胞質内容物、細菌の代謝最終産物若しくは代謝副産物、及び／または毒性因子と、接触され得る。
【００１３】
［0015］  この工程は、例えば、細菌または細菌の一部の培養、及び歯肉細胞の培養を維持し、そして、それらの培養物を混ぜ合わせることによって、in vitroで行われ得る。あるいは、接触は、口腔への適切な運搬ビヒクル中の細菌培養物の適用によって、in vivoで行われ得る。
【００１４】
［0016］  前記接触の後、一つまたはそれ以上の指標物質が検出され得る。そのような指標物質には、中間化合物、酵素、タンパク質、RNA、DNA、及び、サイトカイン及び他の炎症促進性メディエーターの細胞内産生に関与する他の分子を含む、通常の宿主の免疫応答の経過において産生されることが既知であるか、または発見されるべきあらゆるものが含まれる。好ましくは、指標物質は、（例えば図2に示されるように）Toll様受容体のいずれかの調節によって産生されるものであり、それには例えばTLR2、3、4、5、7及び9、NFk-B経路の分子、サイトカイン、インターロイキン（例えば1、6、8、12）、腫瘍壊死因子（TNF）、ペプチダーゼ、及び、インターロイキンをコードする、またはTNFサブユニット及び／またはインターロイキンをコードするmRNA、ケモカイン（例えばCCL5、CCL4、CCL3、及びCC10）、及び、マトリックスメタロプロテアーゼが含まれる。
【００１５】
［0017］  選択された指標物質の検出は、専門分野において既知または開発中の、いかなる様式においても行うことができ、また、相対測定、または、絶対測定であり得る。検出は、選択された指標物質の量の直接測定により達せられ得る。あるいは、放射性及び／または蛍光マーカー、抗体、特異的な遺伝子の遺伝子発現レベルの変化、mRNA分析、マイクロアレイ分析、及び／または、抗酸化状態の変化といった、さらなる検出系を用いる、間接的な測定により達せられ得る。例えば、指標物質が酵素である場合、試料を適切な基質にさらし、そして酵素触媒反応の最終産物を測定して、酵素指標物質の存在または非存在を決定し得る。発明のこの観点での実施において、選択された指標物質の実質的な非存在は、細菌種／株が有害ではない、すなわち、炎症促進性メディエーターの産生を開始させるといった様式で、細胞に影響を及ぼさないことを示す。
【００１６】
［0018］  本発明にはまた、特定の薬剤の抗炎症能または効果、すなわち、病原性細菌に暴露された組織において炎症を軽減または除去する薬剤の効能を、評価する方法が含まれる。本方法には、評価される薬剤の選択が含まれる。前記薬剤は、タンパク質、ペプチド、有機分子、無機分子、または同様のものいずれかの結合物であり得る。
【００１７】
［0019］  いくつかの状況下で、評価のため選択される薬剤は口腔において顕著な殺菌効果を示さないことが望ましいであろう。例えば、薬剤は、最小阻止濃度（MIC）が0、約5％より少ない、約10％より少ない、約20％より少ない、及び、約30％より少ない値を示すものより選択され得る。
【００１８】
［0020］  MIC検査には、一般に、適切な溶媒中での活性薬剤溶液の調製、及び、それに続く可溶化された活性物の連続的希釈が含まれる。選択された細菌（これらは、各細菌が、独自の特殊化した増殖及び操作プロトコールを必要とする、一連の細菌であり得る）の標準懸濁液を、各濃度の希釈された活性物に加える。細菌＋活性物は37℃で、適切な条件下で培養され、そして細菌の増殖は、通常、48時間の培養の後に測定される。
【００１９】
［0021］  MIC検査の対照には、添加した溶媒または賦形剤の非存在下での細菌増殖を測定する、増殖対照が含まれる。さらなる対照は、試験に使用される培地の無菌性を測定する。活性薬剤を可溶化するのに使用される溶媒の細菌への効果は、これらの検査において含まれる最終の一連の対照である。
【００２０】
［0022］  培養に続いて、プレートを、マイクロプレート分光光度計で610 nmで測定する。結果から、細菌増殖を阻害する活性薬剤の最低濃度として読みとる。高い活性濃度では、細菌は増殖せず（測定値は低い吸光度を示す）、また、低い活性濃度では、細菌は増殖する（測定値は高い吸光度を示す）。細菌増殖を停止させる最も低い活性濃度は、MICとして定義される。対照は以下の結果となる：
［0023］  培地の無菌性-細菌の増殖なし
［0024］  細菌増殖の測定-培養は十分な増殖の証明を示す。
【００２１】
［0025］  活性薬剤の可溶化に使用される溶媒は細菌を阻害するべきではない（それらは基本的に無害でなければならない）。
［0026］  特定の薬剤の抗炎症能または効果を評価する方法には、細胞を病原性または有害な細菌と接触させる工程が含まれる。接触させる細胞は、in vitroまたはin vivo、原核細胞または真核細胞であってよく、また、培養細胞株または臨床試料より入手されてもよい。
【００２２】
［0027］  本方法における使用に適した病原性または有害な細菌には、選択される細胞に免疫応答を誘導するように作用する、専門分野で既知または発見されるべきあらゆるものが含まれる。前記細菌には、例えば上記表1に記載されるものが含まれ得る。
【００２３】
［0028］特定の薬剤の抗炎症能または効果を評価する方法には、一つまたはそれ以上の指標化合物の存在または非存在を検出する工程が含まれる。指標化合物及び検出方法と検出系は、上述されるもののいずれかであり得る。
【００２４】
［0029］また、本発明には、口腔組織細胞とトリクロサンとの接触によりその細胞上のToll様受容体の調節を防ぐ方法とともに、上述のアッセイにより、抗炎症効果を示すことが見い出された薬剤を含有する、経口製剤が含まれる。
【００２５】
［0030］  発明はまた、トリクロサンといった化合物を、組織へのMIC以下の濃度で適用することにより、口腔組織の炎症を軽減または予防する方法も提供する。MIC以下の濃度によって。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】［0007］  図1は、微生物と接触する細胞の表面を示す概略図である。
【図２】［0008］  図2は、Toll様受容体（TLR）1、2、3、4、5、6、7及び9のシグナル経路を、各TLRの調節により産生される様々な分子とともに示す。
【図１】
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【図２】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年11月20日(2008.11.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
口腔細菌種の少なくとも一つの細菌、または細菌の一部を接触させたin vitroまたは非ヒト哺乳類のin situの歯肉細胞中で、指標化合物の存在を検出する工程を含む、口腔細菌種を識別する方法であって、この場合、指標物質の実質的な非存在は、その細菌種が有害種ではないことを示す、前記方法。
【請求項２】
有害細菌またはその細菌の一部の存在下で細胞と薬剤とを接触させたin vitroまたは非ヒト哺乳類のin situの歯肉細胞中で、指標化合物の存在を検出する工程を含む、薬剤の抗炎症効果を決定する方法であって、この場合、指標物質の実質的な非存在は、その薬剤が抗炎症性薬剤であることを示す、前記方法。
【請求項３】
哺乳類口腔細胞においてToll様受容体の調節を防ぐための、トリクロサンを含む医薬組成物。
【請求項４】
細胞が歯肉細胞である、請求項３の医薬組成物。
【請求項５】
Toll様受容体が、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7及びTLR9より選択される、請求項３の医薬組成物。
【請求項６】
トリクロサンが、約20％より少ないMICを示す、請求項３の医薬組成物。
【請求項７】
口腔組織の炎症を軽減または予防するための、MIC以下のレベルで組織にトリクロサンを適用することになる濃度のトリクロサンを含む医薬組成物。
【請求項８】
哺乳類口腔細胞においてToll様受容体の調節を防ぐための、請求項７の医薬組成物。
【請求項９】
Toll様受容体が、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7及びTLR9より選択される、請求８の医薬組成物。
【国際調査報告】
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