(57)【要約】  本発明は、細胞壊死に関連した外傷、虚血、卒中、変性性疾患、及び他の状態を治療するための化合物、医薬組成物、及び方法を特徴とする。これらの状態を治療するのに有用な化合物を識別するためのスクリーニングアッセイも記載される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
表１に示す疾患または状態を有する対象を処置する方法であって、有効量のＮｅｃ−１ｅ化合物、Ｎｅｃ−２ｂ化合物またはＮｅｃ−３ｂ化合物を前記対象に投与することを含む、前記処置方法。
【請求項２】
前記Ｎｅｃ−１ｅ化合物が実質的に純粋なＡ異性体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
表１に示す疾患または状態を有する対象を処置する方法であって、前記処置方法は有効量のＮｅｃ−３化合物を前記対象に投与することを含み、前記Ｎｅｃ−３化合物が実質的に純粋な（３Ｒ，３ａＲ）−ｒｅｌ異性体である前記方法。
【請求項４】
前記Ｎｅｃ−３化合物が化合物（１）〜（２１７）から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｎｅｃ−３化合物が表７の化合物（１４１）、（１６１）、（１６６）、（１６７）、（１６９）、（１７１）、（１７８）および（１８２）、表８の化合物（１８５）、（１８８）、（１９０）、（１９２）および（１９４）、および表９の化合物（１４７）、（１４８）、（１５０）、（１５１）、（１５４）、（１５８）および（１５９）から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
表２に示す疾患または状態を有する対象を処置する方法であって、有効量のＮｅｃ化合物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項７】
前記Ｎｅｃ化合物が化学式（Ｉ）に示されるＮｅｃ−１化合物である請求項６に記載の方法
【化１】
2009521454.tif 000203
（式中、
Ｒ１はメチル、メトキシル、Ｃｌ、ＢｒまたはＦを表し、Ｒ２は１から４の炭素原子を有するアルキルを表す。）。
【請求項８】
Ｒ１がＣｌであり、Ｒ２がメチルである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
Ｒ１がＣｌであり、Ｒ２がエチルである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｎｅｃ−１化合物が実質的に純粋なＡ異性体である、請求項７ないし９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
表３に示す疾患または状態を有する対象を処置する方法であって、有効量のＮｅｃ−１ｃ化合物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項１２】
表４に示す疾患または状態を有する対象を処置する方法であって、有効量のＮｅｃ−１ｄ化合物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項１３】
表１に示す疾患または状態を有する対象を処置する方法であって、有効量のゲルダナマイシンを前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項１４】
Ｎｅｃ−１ｅ化合物。
【請求項１５】
化学式（ＸＶＩ）に示されるＮｅｃ−１化合物
【化２】
2009521454.tif 000204
（式中、
Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に＝Ｓ、＝Ｏ、＝Ｎ、Ｈ、Ｒ１１、ＳＲ１１、ＮＲ１１またはＯＲ１１を表し；
ＹはＳ、ＮＨまたはＮＲ８を表し；
ＧはＣＨ２、Ｏ、ＳＲ７またはＮＲ７を表し；
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立にＨ、ＯＨ、ＯＲ８、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ（Ｒ８）２、ＣＯＯＨ、ＣＯ２Ｒ８、ＮＯ２、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ８、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ６−１２アリール、アシル、アセチル、アシルアミノまたはＣ２−９ヘテロアリールを表し；
Ｒ４はＨ、ＯＨ、ＯＲ８、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ（Ｒ８）２、ＣＯＯＨ、ＣＯ２Ｒ８、ＮＯ２、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ８、アシル、アセチル、アシルアミノ、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ６−１２アリール、Ｃ２−９ヘテロアリール、アミンまたはピペリジンを表し；
Ｒ５、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ独立にＨ、ＯＨ、ＯＲ８、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ（Ｒ８）２、アシル、アセチル、アシルアミノ、ＮＯ２、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニルまたはＣ２−７アルケニルを表し；
Ｒ８はＨ、ＯＨ、ＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｃ１−７アルキル、Ｃ６−１２アリール、アリールアルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ２−９ヘテロアリール、アセチル、メトキシル、アミノ、アシルアミノ、アシルまたはハロゲンを表し；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ９’およびＲ１０’はそれぞれ独立にＨ、ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニルか、またはＣｎおよび／またはＣｎ’を含んでなる３から６員環のシクロアルキルを表し、あるいはＲ９および／またはＲ１０はなくてもよく；
Ｒ１１はＨ、ＯＨ、ＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、アセチル、メトキシル、アミノ、アシルアミノ、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、またはアシルを表し；
ｎおよびｎ’はそれぞれ０から５の整数であり；
ｎ’’は０または１であり；
結合（ａ）、（ｂ）および（ｃ）はそれぞれ独立に単結合または二重結合であり、ただし、結合（ａ）および結合（ｂ）の両者が二重結合となることはなく、
ここで、Ｘ１が＝Ｏ、ＯＨまたはＨの場合、Ｘ２は＝ＳまたはＳＲ１２ではなく、Ｒ１２はＨまたはアルキルであり、
Ｘ１およびＸ２の両者が＝Ｏとなることはない。）。
【請求項１６】
ＧおよびＹがそれぞれＮＨを表し：
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ９およびＲ１０がそれぞれＨを表し；
ｎが１であり；
ｎ’およびｎ’’がそれぞれ０であり；
（ａ）が二重結合であり；
（ｂ）および（ｃ）がそれぞれ二重結合である、
請求項１５に記載のＮｅｃ−１化合物。
【請求項１７】
Ｒ４がメチル、メトキシル、Ｃｌ、ＢｒまたはＦを表し；
Ｒ６が１から４の炭素原子を有するアルキルを表す、
請求項１６に記載のＮｅｃ−１化合物。
【請求項１８】
Ｘ１が＝Ｏである、請求項１７に記載のＮｅｃ−１化合物。
【請求項１９】
Ｘ２が＝Ｏである、請求項１７に記載のＮｅｃ−１化合物。
【請求項２０】
前記Ｎｅｃ−１化合物が実質的に純粋なＡ異性体である、請求項１４ないし１９のいずれかに記載のＮｅｃ−１化合物。
【請求項２１】
Ｎｅｃ−２ｂ化合物。
【請求項２２】
化学式（ＩＶ）に示されるＮｅｃ−２化合物
【化３】
2009521454.tif 000205
｛式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０はそれぞれ独立に水素、アシル、アセチル、直鎖および分岐アルキル、ハロゲン、アミノ、メトキシル、ニトロ、またはＣ（Ｏ）Ｒ１２、Ｃ（Ｓ）Ｒ１２、Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１２Ｒ１３、Ｃ（Ｓ）ＮＲ１２Ｒ１３またはＳ（Ｏ２）Ｒ１２を表し（ここで、Ｒ１２およびＲ１３はそれぞれ独立に水素、置換されていてもよいＣ１−１２アルキル、置換されていてもよいＣ６またはＣ１０アリール、置換されていてもよいＣ２−９ヘテロアリール、置換されていてもよいＣ７−１６アラルキルまたは置換されていてもよいＣ２−１５ヘテロアラルキルを表し）；
（ａ）により示される結合は単結合または二重結合であることができ；
（ｂ）により示される結合は単結合または二重結合であることができ；
Ｘは水素、アシル、アセチル、アルキル、ハロゲン、アミノ、アシルアミノ、ニトロ、＝Ｓ、ＳＲ１１、＝Ｎ、ＮＲ１１、＝Ｏ、またはＯＲ１１であり（ここで、Ｒ１１は水素、アシル、アセチル、アルキルまたはアシルアミノであり）；
但し、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ９およびＲ１０がそれぞれ水素であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ７およびＲ８がそれぞれメトキシルである場合、Ｘは＝Ｏ、水素またはヒドロキシルではない。｝。
【請求項２３】
Ｎｅｃ−３ｂ化合物。
【請求項２４】
化合物（１）〜（２１７）から選択される、請求項２３に記載のＮｅｃ−３ｂ化合物。
【請求項２５】
表７の化合物（１４１）、（１６１）、（１６６）、（１６７）、（１６９）、（１７１）、（１７８）および（１８２）、表８の化合物（１８５）、（１８８）、（１９０）、（１９２）および（１９４）、および表９の化合物（１４７）、（１４８）、（１５０）、（１５１）、（１５４）、（１５８）および（１５９）から選択される、請求項２４に記載のＮｅｃ−３ｂ化合物。
【請求項２６】
化学式（Ｖ）に示されるＮｅｃ−３化合物
【化４】
2009521454.tif 000206
｛式中、
Ｚは結合、ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ２）またはＮＲ８であり（ここで、Ｒ８は置換されていてもよいＣ１−６アルキル、置換されていてもよいＣ７−１６アラルキルまたは置換されていてもよいＣ２−１５ヘテロアラルキルであり）；
（ａ）により示される結合は単結合または二重結合であることができ；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立に水素、１から６の炭素原子を有するアルカノイル、１から６の炭素原子を有するアルキル、１から６の炭素原子を有するアルコキシ、アルキルおよびアルキレン基が独立に１から６の炭素原子を有するアルコキシアルキル、１から６の炭素原子を有するアルキルスルフィニル、アルキルおよびアルキレン基が独立に１から６の炭素原子を有するアルキルスルフィニルアルキル、１から６の炭素原子を有するアルキルスルホニル、アルキルおよびアルキレン基が独立に１から６の炭素原子を有するアルキルスルホニルアルキル、Ｃ７−１６アラルキル、アミノ、１から６の炭素原子を有するアミノアルキル、Ｃ６またはＣ１０アリール、Ｃ７またはＣ１１アリーロイル、アジド、１から６の炭素原子を有するアジドアルキル、カルボキシアルデヒド、アルキレン基が１から６の炭素原子を有する（カルボキシアルデヒド）アルキル、３から８の炭素原子を有するシクロアルキル、シクロアルキル基が３から８の炭素原子を有しアルキレン基が１から１０の炭素原子を有するシクロアルキルアルキル、ハロ、１から６の炭素原子を有するハロアルキル、Ｃ２−９ヘテロシクリル、Ｃ２−９（ヘテロシクリル）オキシ、Ｃ３−１０（ヘテロシクリル）オイル、ヒドロキシル、１から６の炭素原子を有するヒドロキシアルキル、ニトロ、１から６の炭素原子を有するニトロアルキル、Ｎ−保護アミノ、アルキレン基が１から６の炭素原子を有するＮ−保護アミノアルキル、１から６の炭素原子を有するチオアルコキシ、アルキルおよびアルキレン基が独立に１から６の炭素原子を有するチオアルコキシアルキル、−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ（ここで、ｑは０から４であり、ＲＡは（ａ）Ｃ１−６アルキル、（ｂ）Ｃ６またはＣ１０アリール、および（ｃ）アルキレン基が１から６の炭素原子を有するアリールアルキルからなる群から選ばれる）、−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢＲＣ（ここで、ＲＢおよびＲＣは独立に（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１−６アルキル、（ｃ）Ｃ６またはＣ１０アリール、および（ｄ）アルキレン基が１から６の炭素原子を有するアリールアルキルからなる群から選ばれる）、−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ（ここで、ＲＤは（ａ）Ｃ１−６アルキル、（ｂ）Ｃ６またはＣ１０アリール、および（ｃ）アルキレン基が１から６の炭素原子を有するアリールアルキルからなる群から選ばれる）、−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥＲＦ（ここで、ＲＥおよびＲＦは独立に（ａ）水素、（ｂ）アルキル、（ｃ）Ｃ６またはＣ１０アリール、および（ｄ）アルキレン基が１から６の炭素原子を有するアリールアルキルからなる群から選ばれる）、−（ＣＨ２）ｑＮＲＧＲＨ（ここで、ＲＧおよびＲＨは独立に（ａ）水素、（ｂ）Ｎ−保護基、（ｃ）１から６の炭素原子を有するアルキル、（ｄ）２から６の炭素原子を有するアルケニル、（ｅ）２から６の炭素原子を有するアルキニル、（ｆ）Ｃ６またはＣ１０のアリール、（ｇ）アルキレン基が１から６の炭素原子を有するアリールアルキル、（ｈ）３から８の炭素原子を有するシクロアルキル、および（ｉ）シクロアルキル基が３から８の炭素原子を有しアルキレン基が１から１０の炭素原子を有するシクロアルキルアルキルからなる群から選ばれ、ただし、２つの基がカルボニル基またはスルホニル基を介して該窒素原子に結合することはない）、Ｃ１−６パーフルオロアルキル、Ｃ１−６パーフルオロアルコキシ、Ｃ６またはＣ１０アリールオキシ、Ｃ３−８シクロアルコキシ、Ｃ９−１４シクロアルキルアルコキシ、またはＣ７−１６アリールアルコキシを表し；
Ｒ５は置換されていてもよいＣ６またはＣ１０アリールまたは置換されていてもよいＣ２−９ヘテロアリールであり；
Ｒ６はＣ（Ｏ）Ｒ９、Ｃ（Ｓ）Ｒ９、Ｃ（Ｏ）ＯＲ９、Ｃ（Ｏ）ＮＲ９Ｒ１０、Ｃ（Ｓ）ＮＲ９Ｒ１０、Ｃ（ＮＨ）Ｒ９またはＳ（Ｏ２）Ｒ９であり（ここで、Ｒ９およびＲ１０はそれぞれ独立にＨ、置換されていてもよいＣ１−１２アルキル、置換されていてもよいＣ１−７ヘテロアルキル、置換されていてもよいＣ６またはＣ１０アリール、置換されていてもよいＣ２−９ヘテロアリール、置換されていてもよいＣ７−１６アラルキル、または置換されていてもよいＣ２−１５ヘテロアラルキルであり）；
Ｒ７は水素、Ｃ１−６アルキル、置換されていてもよいＣ６またはＣ１０アリール、置換されていてもよいＣ７−１６アラルキル、置換されていてもよいＣ２−９ヘテロアリール、または置換されていてもよいＣ２−１５ヘテロアラルキルであり；
Ｒ１１はＨ、置換されていてもよいＣ１−１２アルキル、または置換されていてもよいＣ１−７ヘテロアルキルであり、
但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ７がそれぞれ水素、アミノ、ハライドおよびヒドロキシルからなる群から選ばれ、ＺがＣＨ２である場合、Ｒ３はヒドロキシルまたはメトキシルではない。｝。
【請求項２７】
化学式（ＶＩ）に示されるＮｅｃ−３化合物
【化５】
2009521454.tif 000207
｛式中、
Ｚは結合、ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ２）またはＮＲ１２であり（ここで、Ｒ１２は置換されていてもよいＣ１−６アルキル、置換されていてもよいＣ７−１６アラルキルまたは置換されていてもよいＣ２−１５ヘテロアラルキルであり）；
（ａ）により示される結合は単結合または二重結合であることができ；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１はそれぞれ独立に水素、１から６の炭素原子を有するアルカノイル、１から６の炭素原子を有するアルキル、１から６の炭素原子を有するアルコキシ、アルキルおよびアルキレン基が独立に１から６の炭素原子を有するアルコキシアルキル、１から６の炭素原子を有するアルキルスルフィニル、アルキルおよびアルキレン基が独立に１から６の炭素原子を有するアルキルスルフィニルアルキル、１から６の炭素原子を有するアルキルスルホニル、アルキルおよびアルキレン基が独立に１から６の炭素原子を有するアルキルスルホニルアルキル、Ｃ７−１６アラルキル、アミノ、１から６の炭素原子を有するアミノアルキル；Ｃ６またはＣ１０アリール、Ｃ７またはＣ１１アリーロイル、アジド、１から６の炭素原子を有するアジドアルキル、カルボキシアルデヒド、アルキレン基が１から６の炭素原子を有する（カルボキシアルデヒド）アルキル、３から８の炭素原子を有するシクロアルキル、シクロアルキル基が３から８の炭素原子を有しアルキレン基が１から１０の炭素原子を有するシクロアルキルアルキル、ハロ、１から６の炭素原子を有するハロアルキル、Ｃ２−９ヘテロシクリル、Ｃ２−９（ヘテロシクリル）オキシ、Ｃ３−１０（ヘテロシクリル）オイル、ヒドロキシル、１から６の炭素原子を有するヒドロキシアルキル、ニトロ、１から６の炭素原子を有するニトロアルキル、Ｎ−保護アミノ、アルキレン基が１から６の炭素原子を有するＮ−保護アミノアルキル、１から６の炭素原子を有するチオアルコキシ、アルキルおよびアルキレン基が独立に１から６の炭素原子を有するチオアルコキシアルキル、−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ（ここで、ｑは０から４であり、ＲＡは（ａ）Ｃ１−６アルキル、（ｂ）Ｃ６またはＣ１０アリール、および（ｃ）アルキレン基が１から６の炭素原子を有するアリールアルキルからなる群から選ばれる）、−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢＲＣ（ここで、ＲＢおよびＲＣは独立に（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１−６アルキル、（ｃ）Ｃ６またはＣ１０アリール、および（ｄ）アルキレン基が１から６の炭素原子を有するアリールアルキルからなる群から選ばれる）、−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ（ここで、ＲＤは（ａ）Ｃ１−６アルキル、（ｂ）Ｃ６またはＣ１０アリール、および（ｃ）アルキレン基が１から６の炭素原子を有するアリールアルキルからなる群から選ばれる）、−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥＲＦ（ここで、ＲＥおよびＲＦは独立に（ａ）水素、（ｂ）アルキル、（ｃ）Ｃ６またはＣ１０アリール、および（ｄ）アルキレン基が１から６の炭素原子を有するアリールアルキルからなる群から選ばれる）、−（ＣＨ２）ｑＮＲＧＲＨ（ここで、ＲＧおよびＲＨは独立に（ａ）水素、（ｂ）Ｎ−保護基、（ｃ）１から６の炭素原子を有するアルキル、（ｄ）２から６の炭素原子を有するアルケニル、（ｅ）２から６の炭素原子を有するアルキニル、（ｆ）Ｃ６またはＣ１０のアリール、（ｇ）アルキレン基が１から６の炭素原子を有するアリールアルキル、（ｈ）３から８の炭素原子を有するシクロアルキル、および（ｉ）シクロアルキル基が３から８の炭素原子を有しアルキレン基が１から１０の炭素原子を有するシクロアルキルアルキルからなる群から選ばれ、ただし、２つの基がカルボニル基またはスルホニル基を介して該窒素原子に結合することはない）、Ｃ１−６パーフルオロアルキル、Ｃ１−６パーフルオロアルコキシ、Ｃ６またはＣ１０アリールオキシ、Ｃ３−８シクロアルコキシ、Ｃ９−１４シクロアルキルアルコキシ、またはＣ７−１６アリールアルコキシを表し；
Ｒ５はＣ（Ｏ）Ｒ１３、Ｃ（Ｓ）Ｒ１３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ１３、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１３Ｒ１４、Ｃ（Ｓ）ＮＲ１３Ｒ１４、Ｃ（ＮＨ）Ｒ１３またはＳ（Ｏ２）Ｒ１３であり（ここで、Ｒ１３およびＲ１４はそれぞれ独立に水素、置換されていてもよいＣ１−１２アルキル、置換されていてもよいＣ１−７ヘテロアルキル、置換されていてもよいＣ６またはＣ１０アリール、置換されていてもよいＣ２−９ヘテロアリール、置換されていてもよいＣ７−１６アラルキル、または置換されていてもよいＣ２−１５ヘテロアラルキルを表す）；
Ｒ６は水素、Ｃ１−６アルキル、置換されていてもよいＣ６またはＣ１０アリール、置換されていてもよいＣ７−１６アラルキル、置換されていてもよいＣ２−９ヘテロアリール、または置換されていてもよいＣ２−１５ヘテロアラルキルであり、ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ６ないしＲ１１が水素、アミノ、ハライドおよびヒドロキシルからなる群から選ばれ、ＺがＣＨ２である場合、Ｒ３はヒドロキシルまたはメトキシルではない。｝。
【請求項２８】
（ａ）で示される結合が二重結合であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１０およびＲ１１がそれぞれ独立に水素を表す、請求項２７に記載のＮｅｃ−３化合物。
【請求項２９】
Ｒ３およびＲ９がそれぞれ独立に１から６の炭素原子を有するアルキル、１から６の炭素原子を有するアルコキシ、ハロ、またはアミノを表す、請求項２８に記載のＮｅｃ−３化合物。
【請求項３０】
実質的に純粋な（３Ｒ，３ａＲ）−ｒｅｌ異性体である、請求項２３ないし２９のいずれかに記載のＮｅｃ−３化合物。
【請求項３１】
実質的に純粋な（３Ｒ，３ａＲ）−鏡像異性体である、請求項２３ないし３０のいずれかに記載のＮｅｃ−３化合物。
【請求項３２】
実質的に純粋な（３Ｓ，３ａＳ）−鏡像異性体である、請求項２３ないし３０のいずれかに記載のＮｅｃ−３化合物。
【請求項３３】
（ｉ）請求項１４ないし２０のいずれかに記載のＮｅｃ−１化合物、および
（ｉｉ）医薬的に許容できる賦形剤
を含む、医薬組成物。
【請求項３４】
（ｉ）請求項２１または２２に記載のＮｅｃ−２化合物、および
（ｉｉ）医薬的に許容できる賦形剤
を含む、医薬組成物。
【請求項３５】
（ｉ）請求項２３ないし３２のいずれかに記載のＮｅｃ−３化合物、および
（ｉｉ）医薬的に許容できる賦形剤
を含む、医薬組成物。
【請求項３６】
（ｉ）請求項１４ないし２０のいずれかに記載のＮｅｃ−１化合物、および
（ｉｉ）表１に示される疾患または状態を有する対象に前記化合物を投与するための指示書
を含む、キット。
【請求項３７】
（ｉ）請求項２１または２２に記載のＮｅｃ−２化合物、および
（ｉｉ）表１に示される疾患または状態を有する対象に前記化合物を投与するための指示書
を含む、キット。
【請求項３８】
（ｉ）請求項２３ないし３２のいずれかに記載のＮｅｃ−３化合物、および
（ｉｉ）表１に示される疾患または状態を有する対象に前記化合物を投与するための指示書
を含む、キット。
【請求項３９】
ＲＩＰ１を選択的に阻害する化合物としての候補化合物を識別するための方法であって、
ａ）ＲＩＰ１ポリペプチドと前記化合物とを含む混合物を、前記化合物不存在では前記ＲＩＰ１ポリペプチドが基準レベルのリン酸化を受けることができる条件下でインキュベートし、
ｂ）ＲＩＰ１リン酸化のレベルを検出し、
ｃ）ＲＩＰ１の前記リン酸化レベルの前記基準レベルに対する比を決定し、
ｄ）ＲＩＰ２またはＲＩＰ３ポリペプチドと前記化合物とを含む第２の混合物を、前記化合物不存在では前記ＲＩＰ２ポリペプチドが第２の基準レベルのリン酸化を受けることができる条件下でインキュベートし、
ｅ）ＲＩＰ２またはＲＩＰ３のリン酸化のレベルを検出し、
ｆ）ＲＩＰ２またはＲＩＰ３の前記リン酸化レベルの前記第２の基準レベルに対する比を決定する、
工程を含み、
工程ｃ）で決定された前記比が工程ｆ）で決定された前記比よりも小さい場合、前記化合物はＲＩＰ１を選択的に阻害する方法。
【請求項４０】
ＲＩＰ１を選択的に阻害する化合物としての候補化合物を識別するための方法であって、
ａ）ＲＩＰ１ポリペプチドと前記化合物を接触させ、
ｂ）前記化合物の前記ＲＩＰ１ポリペプチドへの結合を検出し、
ｃ）ＲＩＰ２またはＲＩＰ３ポリペプチドと前記化合物を接触させ、
ｄ）前記化合物の前記ＲＩＰ２またはＲＩＰ３ポリペプチドへの結合を検出する、
工程を含み、
前記ＲＩＰ１ポリペプチドに結合し前記ＲＩＰ２またはＲＩＰ３ポリペプチドには結合しない化合物はＲＩＰ１を選択的に阻害する化合物として識別される方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
政府援助研究に関する記述
本研究は、国立衛生研究所により供与された助成金（助成金番号ＧＭ６４７０３、ＡＧ０１２８５９、およびＮＳ３７１４１−０８）の援助の下で行われた。米国政府は、この発明において特定の権利を有する。
【発明の背景】
【０００２】
多くの疾患において、細胞死はアポトーシスおよび／または壊死経路により媒介される。アポトーシスを制御する作用機序についてはよく知られているが、壊死の制御については余りよく知られていない。細胞の壊死およびアポトーシス両者を調節する機構を理解することは、神経変性疾患、脳卒中、冠性心疾患、腎疾患、および肝疾患などの状態を処置することをできるようにするために必須である。壊死およびアポトーシス細胞死経路を詳細に理解することは、エイズおよび網膜壊死などのエイズ関連状態を処置する上で極めて重要である。
【０００３】
カスパーゼ類がアポトーシス誘導の中心的役割を担っていることが報告されている。ｚＶＡＤ−ｆｍｋなどのペプチドベースのカスパーゼ阻害剤は、ＴＮＦαなどの化合物によりアポトーシスを受けるように刺激された細胞においてアポトーシス細胞死経路の活性化の防止に有用である。しかしながら、ｚＶＡＤ−ｆｍｋで処理した細胞およびこれらの細胞死刺激もなおカスパーゼ非依存性の形態の壊死により死に至る。
【０００４】
カスパーゼ非依存性細胞死（例えば、壊死またはネクロトーシス）を防止する化合物の発見は、壊死が起きる状態の処置および壊死やネクロトーシスの発症の防止に有用な治療薬を提供する。そのような化合物および方法は、特に、神経変性疾患、虚血性脳および心傷害、および頭部外傷の処置に有用である。
【発明の要旨】
【０００５】
本発明は、所定の範囲の状態、例えば、細胞または組織の壊死が原因または結果である状態、増殖能の喪失が原因または結果である状態、ＴＮＦαファミリーであるサイトカインが原因または結果である状態、およびＲＩＰ１タンパク質が寄与因子である状態を処置するための化合物、医薬組成物、キット、および方法を特徴とする。本発明の化合物は、例えば、目的細胞の壊死の低減、細胞増殖の増強、あるいは免疫応答を刺激する治療法として使用することができる。本発明の化合物は、例えば、表１に示した状態のいずれかの処置に使用することもできる。状態の例としては、中枢または末梢神経系の神経変性疾患；網膜神経細胞死によるもの；心筋の細胞死によるもの；免疫系細胞の細胞死によるもの；脳卒中；肝疾患；膵疾患；腎不全に伴う細胞死によるもの；心臓、腸間膜、網膜、肝臓、または脳の虚血性傷害；臓器保存中の虚血性傷害；頭部外傷；敗血症性ショック；冠性心疾患；心筋症；無血管性骨壊死（bone avascular necrosis）；鎌状赤血球病；筋肉るいそう；消化器疾患；結核；糖尿病；血管の変性；筋ジストロフィー；移植片対宿主病；ウィルス感染；クローン病；潰瘍性大腸炎；喘息；細胞または組織の壊死が原因または結果である状態；細胞増殖、分化、または細胞内シグナル伝達における変性が原因である状態、およびＲＩＰ１タンパク質が寄与因子である状態がある。さらに、本発明は、本発明に記載の化合物の分子標的であるＲＩＰ１のインヒビターを識別できるスクリーニングアッセイを特徴とする。また、そのように識別される更なるインヒビターは疾患の処置法に使用することができる。
【０００６】
従って、第一の側面において、本発明は、表１に示される疾患又は状態を有する対象を、その対象に有効量のＮｅｃ−１ｅ化合物、Ｎｅｃ−２ｂ化合物、またはＮｅｃ−３ｂ化合物を投与することによって処置する方法を特徴とする。Ｎｅｃ−１ｅ化合物は実質的に純粋なＡ異性体またはＢ異性体である場合もある。
【０００７】
本発明はまた、表１に示される疾患又は状態を有する対象を、その対象に有効量のＮｅｃ−３化合物を投与することによって処置する方法を特徴とし、Ｎｅｃ−３化合物は実質的に純粋な（３Ｒ，３ａＲ）−ｒｅｌ異性体または実質的に純粋な（３Ｒ，３ａＳ）−ｒｅｌ異性体である。また、Ｎｅｃ−３化合物は実質的に純粋な（３Ｒ，３ａＲ）−鏡像異性体、実質的に純粋な（３Ｒ，３ａＳ）−鏡像異性体、実質的に純粋な（３Ｓ，３ａＲ）−鏡像異性体、または実質的に純粋な（３Ｓ，３ａＳ）−鏡像異性体である場合もある。さらに、Ｎｅｃ−３化合物は化合物（１）から（２１７）から選択されるものである場合もある。例えば、Ｎｅｃ−３化合物は表７の化合物（１４１）、（１６１）、（１６６）、（１６７）、（１６９）、（１７１）、（１７８）および（１８２）、表８の化合物（１８５）、（１８８）、（１９０）、（１９２）および（１９４）、および表９の化合物（１４７）、（１４８）、（１５０）、（１５１）、（１５４）、（１５８）および（１５９）から選択される化合物であってよい。
【０００８】
さらに、本発明は、表２に示される疾患又は状態を有する対象を、その対象に有効量のＮｅｃ化合物を投与することによって処置する方法を特徴とする。該Ｎｅｃ化合物は化学式（Ｉ）に示されるＮｅｃ−１化合物である場合がある。
【０００９】
【化１】
2009521454.tif 000002
【００１０】
式中、Ｒ１はメチル、メトキシル、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＦを表し、Ｒ２は炭素原子数１から４のアルキルを表す。Ｒ１がＣｌを表わし、Ｒ２がメチルまたはエチルを表す場合もある。Ｎｅｃ−１化合物は実質的に純粋なＡ異性体またはＢ異性体であってもよい。
【００１１】
さらに、本発明は、表３に示される疾患又は状態を有する対象を、その対象に有効量のＮｅｃ−１ｃ化合物を投与することによって処置する方法を特徴とする。
さらに、本発明は、表４に示される疾患又は状態を有する対象を、その対象に有効量のＮｅｃ−１ｄ化合物を投与することによって処置する方法を特徴とする。
【００１２】
一般に、本発明は、表１に示される疾患又は状態を有する対象を、その対象に有効量のＮｅｃ化合物を投与することによって処置する方法を特徴とする。
本発明は、表１に示される疾患又は状態を有する対象を、その対象に有効量のゲルダナマイシンを投与することによって処置する方法を特徴とする。あるいは、有効量のＲＩＰ１阻害剤またはＨＳＰ９０阻害剤を対象に投与して処置することもできる。
【００１３】
さらに、本発明は、Ｎｅｃ化合物、医薬的に許容される賦形剤と共にＮｅｃ化合物を含有する医薬組成物、およびそれら化合物あるいは組成物をそれらの使用のための指示書と共に有するキットを特徴とする。また、ある場合には、本発明は、Ｎｅｃ−１ｅ化合物；Ｎｅｃ−１ｅ化合物の実質に純粋なＡ異性体およびＢ異性体；Ｎｅｃ−２ｂ化合物；Ｎｅｃ−３ｂ化合物；並びにＮｅｃ−３化合物の実質的に純粋な（３Ｒ，３ａＲ）−ｒｅｌ異性体および（３Ｒ，３ａＳ）−ｒｅｌ異性体、例えば、化合物（１）から（２１７）（例えば、表７の化合物（１４１）、（１６１）、（１６６）、（１６７）、（１６９）、（１７１）、（１７８）および（１８２）、表８の化合物（１８５）、（１８８）、（１９０）、（１９２）および（１９４）、および表９の化合物（１４７）、（１４８）、（１５０）、（１５１）、（１５４）、（１５８）および（１５９））から選択される化合物を特徴とする。ここで、本明細書中で特徴とされるＮｅｃ−３化合物は、Ｎｅｃ−３化合物の実質的に純粋な（３Ｒ，３ａＲ）−鏡像異性体、（３Ｒ，３ａＳ）−鏡像異性体、（３Ｓ，３ａＲ）−鏡像異性体、または（３Ｓ，３ａＳ）−鏡像異性体であってもよい。
【００１４】
さらに、本発明は化学式（Ｉ）を有するＮｅｃ−１化合物を特徴とし、
【００１５】
【化２】
2009521454.tif 000003
【００１６】
式中、Ｒ１はメチル、メトキシル、Ｃｌ、ＢｒまたはＦを表し、Ｒ２は１から４の炭素原子を有するアルキルを表す。
他の例では、本発明は化学式（ＩＩ）を有するＮｅｃ−１化合物を特徴とし、
【００１７】
【化３】
2009521454.tif 000004
【００１８】
式中、Ｒ１はメトキシル、Ｃｌ、ＢｒまたはＦを表し、Ｒ２は１から４の炭素原子を有するアルキルを表す。
さらに他の例では、本発明は化学式（ＩＩＩ）を有するＮｅｃ−１化合物を特徴とし、
【００１９】
【化４】
2009521454.tif 000005
【００２０】
式中、Ｒ１はメチルを表し、Ｒ２は水素または１から４の炭素原子を有するアルキルを表す。
さらに、本発明は化学式（ＸＶＩ）に示されるＮｅｃ−１化合物を特徴とし、
【００２１】
【化５】
2009521454.tif 000006
【００２２】
式中、
Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に＝Ｓ、＝Ｏ、＝Ｎ、Ｈ、Ｒ１１、ＳＲ１１、ＮＲ１１またはＯＲ１１を表し；ＹはＳ、ＮＨまたはＮＲ８を表し；ＧはＣＨ２、Ｏ、ＳＲ７またはＮＲ７を表し；Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立にＨ、ＯＨ、ＯＲ８、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ（Ｒ８）２、ＣＯＯＨ、ＣＯ２Ｒ８、ＮＯ２、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ８、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ６−１２アリール、アシル、アセチル、アシルアミノまたはＣ２−９ヘテロアリールを表し；Ｒ４はＨ、ＯＨ、ＯＲ８、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ（Ｒ８）２、ＣＯＯＨ、ＣＯ２Ｒ８、ＮＯ２、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ８、アシル、アセチル、アシルアミノ、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ６−１２アリール、Ｃ２−９ヘテロアリール、アミンまたはピペリジンを表し；Ｒ５、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ独立にＨ、ＯＨ、ＯＲ８、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ（Ｒ８）２、アシル、アセチル、アシルアミノ、ＮＯ２、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニルまたはＣ２−７アルケニルを表し；Ｒ８はＨ、ＯＨ、ＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｃ１−７アルキル、Ｃ６−１２アリール、アリールアルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ２−９ヘテロアリール、アセチル、メトキシル、アミノ、アシルアミノ、アシルまたはハロゲンを表し；Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ９’およびＲ１０’はそれぞれ独立にＨ、ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニルか、またはＣｎおよび／またはＣｎ’を含んでなる３から６員環のシクロアルキルを表し、あるいはＲ９および／またはＲ１０はなくてもよく；Ｒ１１はＨ、ＯＨ、ＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、アセチル、メトキシル、アミノ、アシルアミノ、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、またはアシルを表し；ｎおよびｎ’はそれぞれ０から５の整数であり；ｎ’’は０または１であり；結合（ａ）、（ｂ）および（ｃ）はそれぞれ独立に単結合または二重結合であり、ただし、結合（ａ）および結合（ｂ）の両者が二重結合となることはなく、ここで、Ｘ１が＝Ｏ、ＯＨまたはＨの場合、Ｘ２は＝ＳまたはＳＲ１２ではなく（Ｒ１２はＨまたはアルキルである）、そしてＸ１およびＸ２の両者が＝Ｏとなることはない。また、ＧおよびＹがそれぞれＮＨを表し：Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ９およびＲ１０がそれぞれＨを表し；ｎが１であり；ｎ’およびｎ’’がそれぞれ０であり；（ａ）が二重結合であり；（ｂ）および（ｃ）がそれぞれ二重結合であってもよい。また、Ｒ４がメチル、メトキシル、Ｃｌ、ＢｒまたはＦを表し；Ｒ６が１から４の炭素原子を有するアルキルを表すものであってもよい。さらに、Ｘ１が＝ＯまたはＸ２が＝Ｏであってもよい。該Ｎｅｃ−１化合物のいずれも、実質的に純粋なＡ異性体またはＢ異性体であってもよい。
【００２３】
さらに、本発明は化学式（ＩＶ）に示されるＮｅｃ−２化合物を特徴とし、
【００２４】
【化６】
2009521454.tif 000007
【００２５】
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０はそれぞれ独立に水素、アシル、アセチル、直鎖および分岐アルキル、ハロゲン、アミノ、メトキシル、ニトロ、またはＣ（Ｏ）Ｒ１２、Ｃ（Ｓ）Ｒ１２、Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１２Ｒ１３、Ｃ（Ｓ）ＮＲ１２Ｒ１３またはＳ（Ｏ２）Ｒ１２を表し（ここで、Ｒ１２およびＲ１３はそれぞれ独立に水素、置換されていてもよいＣ１−１２アルキル、置換されていてもよいＣ６またはＣ１０アリール、置換されていてもよいＣ２−９ヘテロアリール、置換されていてもよいＣ７−１６アラルキルまたは置換されていてもよいＣ２−１５ヘテロアラルキルを表し）；（ａ）により示される結合は単結合または二重結合であることができ；（ｂ）により示される結合は単結合または二重結合であることができ；Ｘは水素、アシル、アセチル、アルキル、ハロゲン、アミノ、アシルアミノ、ニトロ、＝Ｓ、ＳＲ１１、＝Ｎ、ＮＲ１１、＝Ｏ、またはＯＲ１１であって（ここで、Ｒ１１は水素、アシル、アセチル、アルキルまたはアシルアミノであり）；但し、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ９およびＲ１０がそれぞれ水素であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ７およびＲ８がそれぞれメトキシルである場合、Ｘは＝Ｏ、水素またはヒドロキシルではない。
【００２６】
さらに、本発明は化学式（Ｖ）で示されるＮｅｃ−３化合物を特徴とし、
【００２７】
【化７】
2009521454.tif 000008
【００２８】
式中、
Ｚは結合、ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ２）またはＮＲ８であり（ここで、Ｒ８は置換されていてもよいＣ１−６アルキル、置換されていてもよいＣ７−１６アラルキルまたは置換されていてもよいＣ２−１５ヘテロアラルキルであり）；
（ａ）により示される結合は単結合または二重結合であることができ；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立に水素、１から６の炭素原子を有するアルカノイル、１から６の炭素原子を有するアルキル、１から６の炭素原子を有するアルコキシ、アルキルおよびアルキレン基が独立に１から６の炭素原子を有するアルコキシアルキル、１から６の炭素原子を有するアルキルスルフィニル、アルキルおよびアルキレン基が独立に１から６の炭素原子を有するアルキルスルフィニルアルキル、１から６の炭素原子を有するアルキルスルホニル、アルキルおよびアルキレン基が独立に１から６の炭素原子を有するアルキルスルホニルアルキル、Ｃ７−１６アラルキル、アミノ、１から６の炭素原子を有するアミノアルキル、Ｃ６またはＣ１０アリール、Ｃ７またはＣ１１アリーロイル、アジド、１から６の炭素原子を有するアジドアルキル、カルボキシアルデヒド、アルキレン基が１から６の炭素原子を有する（カルボキシアルデヒド）アルキル、３から８の炭素原子を有するシクロアルキル、シクロアルキル基が３から８の炭素原子を有しアルキレン基が１から１０の炭素原子を有するシクロアルキルアルキル、ハロ、１から６の炭素原子を有するハロアルキル、Ｃ２−９ヘテロシクリル、Ｃ２−９（ヘテロシクリル）オキシ、Ｃ３−１０（ヘテロシクリル）オイル、ヒドロキシル、１から６の炭素原子を有するヒドロキシアルキル、ニトロ、１から６の炭素原子を有するニトロアルキル、Ｎ−保護アミノ、アルキレン基が１から６の炭素原子を有するＮ−保護アミノアルキル、１から６の炭素原子を有するチオアルコキシ、アルキルおよびアルキレン基が独立に１から６の炭素原子を有するチオアルコキシアルキル、−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ（ここで、ｑは０から４であり、ＲＡは（ａ）Ｃ１−６アルキル、（ｂ）Ｃ６またはＣ１０アリール、および（ｃ）アルキレン基が１から６の炭素原子を有するアリールアルキルからなる群から選ばれる）、−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢＲＣ（ここで、ＲＢおよびＲＣは独立に（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１−６アルキル、（ｃ）Ｃ６またはＣ１０アリール、および（ｄ）アルキレン基が１から６の炭素原子を有するアリールアルキルからなる群から選ばれる）、−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ（ここで、ＲＤは（ａ）Ｃ１−６アルキル、（ｂ）Ｃ６またはＣ１０アリール、および（ｃ）アルキレン基が１から６の炭素原子を有するアリールアルキルからなる群から選ばれる）、−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥＲＦ（ここで、ＲＥおよびＲＦは独立に（ａ）水素、（ｂ）アルキル、（ｃ）Ｃ６またはＣ１０アリール、および（ｄ）アルキレン基が１から６の炭素原子を有するアリールアルキルからなる群から選ばれる）、−（ＣＨ２）ｑＮＲＧＲＨ（ここで、ＲＧおよびＲＨは独立に（ａ）水素、（ｂ）Ｎ−保護基、（ｃ）１から６の炭素原子を有するアルキル、（ｄ）２から６の炭素原子を有するアルケニル、（ｅ）２から６の炭素原子を有するアルキニル、（ｆ）Ｃ６またはＣ１０のアリール、（ｇ）アルキレン基が１から６の炭素原子を有するアリールアルキル、（ｈ）３から８の炭素原子を有するシクロアルキル、および（ｉ）シクロアルキル基が３から８の炭素原子を有しアルキレン基が１から１０の炭素原子を有するシクロアルキルアルキルからなる群から選ばれ、ただし、２つの基がカルボニル基またはスルホニル基を介して該窒素原子に結合することはない）、Ｃ１−６パーフルオロアルキル、Ｃ１−６パーフルオロアルコキシ、Ｃ６またはＣ１０アリールオキシ、Ｃ３−８シクロアルコキシ、Ｃ９−１４シクロアルキルアルコキシ、またはＣ７−１６アリールアルコキシを表し；
Ｒ５は置換されていてもよいＣ６またはＣ１０アリールまたは置換されていてもよいＣ２−９ヘテロアリールであり；
Ｒ６はＣ（Ｏ）Ｒ９、Ｃ（Ｓ）Ｒ９、Ｃ（Ｏ）ＯＲ９、Ｃ（Ｏ）ＮＲ９Ｒ１０、Ｃ（Ｓ）ＮＲ９Ｒ１０、Ｃ（ＮＨ）Ｒ９またはＳ（Ｏ２）Ｒ９であり（ここで、Ｒ９およびＲ１０はそれぞれ独立にＨ、置換されていてもよいＣ１−１２アルキル、置換されていてもよいＣ１−７ヘテロアルキル、置換されていてもよいＣ６またはＣ１０アリール、置換されていてもよいＣ２−９ヘテロアリール、置換されていてもよいＣ７−１６アラルキル、または置換されていてもよいＣ２−１５ヘテロアラルキルであり）；
Ｒ７は水素、Ｃ１−６アルキル、置換されていてもよいＣ６またはＣ１０アリール、置換されていてもよいＣ７−１６アラルキル、置換されていてもよいＣ２−９ヘテロアリール、または置換されていてもよいＣ２−１５ヘテロアラルキルであり；
Ｒ１１はＨ、置換されていてもよいＣ１−１２アルキル、または置換されていてもよいＣ１−７ヘテロアルキルであって、
但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ７がそれぞれ水素、アミノ、ハライドおよびヒドロキシルからなる群から選ばれ、ＺがＣＨ２である場合、Ｒ３はヒドロキシルまたはメトキシルではない。
【００２９】
また、本発明は、化学式（ＶＩ）により示されるＮｅｃ−３化合物に関し、
【００３０】
【化８】
2009521454.tif 000009
【００３１】
式中、
Ｚは結合、ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ２）またはＮＲ１２であり（ここで、Ｒ１２は置換されていてもよいＣ１−６アルキル、置換されていてもよいＣ７−１６アラルキルまたは置換されていてもよいＣ２−１５ヘテロアラルキルであり）；
（ａ）により示される結合は単結合または二重結合であることができ；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１はそれぞれ独立に水素、１から６の炭素原子を有するアルカノイル、１から６の炭素原子を有するアルキル、１から６の炭素原子を有するアルコキシ、アルキルおよびアルキレン基が独立に１から６の炭素原子を有するアルコキシアルキル、１から６の炭素原子を有するアルキルスルフィニル、アルキルおよびアルキレン基が独立に１から６の炭素原子を有するアルキルスルフィニルアルキル、１から６の炭素原子を有するアルキルスルホニル、アルキルおよびアルキレン基が独立に１から６の炭素原子を有するアルキルスルホニルアルキル、Ｃ７−１６アラルキル、アミノ、１から６の炭素原子を有するアミノアルキル；Ｃ６またはＣ１０アリール、Ｃ７またはＣ１１アリーロイル、アジド、１から６の炭素原子を有するアジドアルキル、カルボキシアルデヒド、アルキレン基が１から６の炭素原子を有する（カルボキシアルデヒド）アルキル、３から８の炭素原子を有するシクロアルキル、シクロアルキル基が３から８の炭素原子を有しアルキレン基が１から１０の炭素原子を有するシクロアルキルアルキル、ハロ、１から６の炭素原子を有するハロアルキル、Ｃ２−９ヘテロシクリル、Ｃ２−９（ヘテロシクリル）オキシ、Ｃ３−１０（ヘテロシクリル）オイル、ヒドロキシル、１から６の炭素原子を有するヒドロキシアルキル、ニトロ、１から６の炭素原子を有するニトロアルキル、Ｎ−保護アミノ、アルキレン基が１から６の炭素原子を有するＮ−保護アミノアルキル、１から６の炭素原子を有するチオアルコキシ、アルキルおよびアルキレン基が独立に１から６の炭素原子を有するチオアルコキシアルキル、−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ（ここで、ｑは０から４であり、ＲＡは（ａ）Ｃ１−６アルキル、（ｂ）Ｃ６またはＣ１０アリール、および（ｃ）アルキレン基が１から６の炭素原子を有するアリールアルキルからなる群から選ばれる）、−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢＲＣ（ここで、ＲＢおよびＲＣは独立に（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１−６アルキル、（ｃ）Ｃ６またはＣ１０アリール、および（ｄ）アルキレン基が１から６の炭素原子を有するアリールアルキルからなる群から選ばれる）、−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ（ここで、ＲＤは（ａ）Ｃ１−６アルキル、（ｂ）Ｃ６またはＣ１０アリール、および（ｃ）アルキレン基が１から６の炭素原子を有するアリールアルキルからなる群から選ばれる）、−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥＲＦ（ここで、ＲＥおよびＲＦは独立に（ａ）水素、（ｂ）アルキル、（ｃ）Ｃ６またはＣ１０アリール、および（ｄ）アルキレン基が１から６の炭素原子を有するアリールアルキルからなる群から選ばれる）、−（ＣＨ２）ｑＮＲＧＲＨ（ここで、ＲＧおよびＲＨは独立に（ａ）水素、（ｂ）Ｎ−保護基、（ｃ）１から６の炭素原子を有するアルキル、（ｄ）２から６の炭素原子を有するアルケニル、（ｅ）２から６の炭素原子を有するアルキニル、（ｆ）Ｃ６またはＣ１０のアリール、（ｇ）アルキレン基が１から６の炭素原子を有するアリールアルキル、（ｈ）３から８の炭素原子を有するシクロアルキル、および（ｉ）シクロアルキル基が３から８の炭素原子を有しアルキレン基が１から１０の炭素原子を有するシクロアルキルアルキルからなる群から選ばれ、ただし、２つの基がカルボニル基またはスルホニル基を介して該窒素原子に結合することはない）、Ｃ１−６パーフルオロアルキル、Ｃ１−６パーフルオロアルコキシ、Ｃ６またはＣ１０アリールオキシ、Ｃ３−８シクロアルコキシ、Ｃ９−１４シクロアルキルアルコキシ、またはＣ７−１６アリールアルコキシを表し；
Ｒ５はＣ（Ｏ）Ｒ１３、Ｃ（Ｓ）Ｒ１３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ１３、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１３Ｒ１４、Ｃ（Ｓ）ＮＲ１３Ｒ１４、Ｃ（ＮＨ）Ｒ１３またはＳ（Ｏ２）Ｒ１３であり（ここで、Ｒ１３およびＲ１４はそれぞれ独立に水素、置換されていてもよいＣ１−１２アルキル、置換されていてもよいＣ１−７ヘテロアルキル、置換されていてもよいＣ６またはＣ１０アリール、置換されていてもよいＣ２−９ヘテロアリール、置換されていてもよいＣ７−１６アラルキル、または置換されていてもよいＣ２−１５ヘテロアラルキルを表す）；
Ｒ６は水素、Ｃ１−６アルキル、置換されていてもよいＣ６またはＣ１０アリール、置換されていてもよいＣ７−１６アラルキル、置換されていてもよいＣ２−９ヘテロアリール、または置換されていてもよいＣ２−１５ヘテロアラルキルであり、
但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ６ないしＲ１１が、各々水素、アミノ、ハライドおよびヒドロキシルからなる群から選ばれ、ＺがＣＨ２である場合、Ｒ３はヒドロキシルまたはメトキシルではない。また、（ａ）で示される結合が二重結合であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１０およびＲ１１がそれぞれ独立に水素を表してもよい。また、Ｒ３およびＲ９がそれぞれ独立に１から６の炭素原子を有するアルキル、１から６の炭素原子を有するアルコキシ、ハロ、またはアミノを表してもよい。
【００３２】
本発明はさらに、（ｉ）上述のＮｅｃ化合物のいずれか、例えば、Ｎｅｃ−１ｅ、Ｎｅｃ−２ｂ、またはＮｅｃ−３ｂ化合物、および（ｉｉ）医薬的に許容できる賦形剤を含む、医薬組成物を特徴とする。
【００３３】
本発明はさらに、（ｉ）上述のＮｅｃ化合物のいずれか、例えば、Ｎｅｃ−１ｅ、Ｎｅｃ−２ｂ、またはＮｅｃ−３ｂ化合物、および（ｉｉ）表１に示される疾患又は状態を有する対象に前記化合物を投与するための指示書を含む、キットを特徴とする。
【００３４】
また、本発明は、ＲＩＰ１を選択的に阻害する化合物としての候補化合物を識別するための方法を特徴とし、該方法は、ａ）ＲＩＰ１ポリペプチドと該候補化合物とを含む混合物を、該化合物不存在下では該ＲＩＰ１ポリペプチドが基準レベルのリン酸化を受けることができる条件下でインキュベートし、ｂ）ＲＩＰ１のリン酸化のレベルを検出し、ｃ）ＲＩＰ１の前記リン酸化レベルの前記基準レベルに対する比を決定し、ｄ）ＲＩＰ２またはＲＩＰ３ポリペプチドと該化合物とを含む第２の混合物を、該化合物不存在下では該ＲＩＰ２ポリペプチドが第２の基準レベルのリン酸化を受けることができるような条件下でインキュベートし、ｅ）ＲＩＰ２またはＲＩＰ３のリン酸化のレベルを検出し、ｆ）ＲＩＰ２またはＲＩＰ３の前記リン酸化レベルの前記第２の基準レベルに対する比を決定する、工程を含む。この方法において、工程ｃ）で求められた比が工程ｆ）で求められた比よりも小さい場合、該化合物はＲＩＰ１を選択的に阻害すると判定される。
【００３５】
さらに、本発明は、ＲＩＰ１を選択的に阻害する化合物としての候補化合物を識別するための方法を特徴とし、該方法は、ａ）ＲＩＰ１ポリペプチドと該候補化合物を接触させ、ｂ）該化合物の該ＲＩＰ１ポリペプチドへの結合を検出し、ｃ）ＲＩＰ２またはＲＩＰ３ポリペプチドと該化合物を接触させ、ｄ）該化合物の該ＲＩＰ２またはＲＩＰ３ポリペプチドへの結合を検出する、工程を含む。この方法において、該ＲＩＰ１ポリペプチドに結合し該ＲＩＰ２またはＲＩＰ３ポリペプチドには結合しない化合物が、ＲＩＰ１を選択的に阻害することが見出される。
【００３６】
定義
本明細書および特許請求の範囲において、以下の用語は次のような意味に使用される。
「Ｎｅｃ−１ａ化合物」は、化学式（ＶＩＩ）により示される化合物を意味し、
【００３７】
【化９】
2009521454.tif 000010
【００３８】
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ独立に水素、カルボキシ、メチル、ヒドロキシル、メトキシル、アミノおよびニトロからなる群から選択され；Ｒ５は水素、Ｃ１−６アルキルおよびアシルからなる群から選択され；Ｒ６はＣ１−６アルキル、アシル、ハロゲン、水素、またはヒドロキシルからなる群から選択され；Ｒ７はメチル、ヒドロキシル、カルボキシルおよびＣ１−６アルキル基からなる群から選択され；Ｘは＝Ｏ、−ＯＨおよび−Ｈからなる群から選択され；Ｙは＝Ｓおよび−ＳＲ８からなる群から選択され（ここで、Ｒ８は水素またはＣ１−６アルキル基である）；結合（ａ）、（ｂ）および（ｃ）はそれぞれ独立に二重結合または単結合であり、ただし、結合（ａ）および結合（ｂ）が同時に二重結合であることはない。
【００３９】
「Ｎｅｃ−１ｂ化合物」は、化学式（ＶＩＩＩ）から（ＸＶ）の内の一つの化合物を意味する。
化学式（ＶＩＩＩ）により示される化合物は次の構造を有し、
【００４０】
【化１０】
2009521454.tif 000011
【００４１】
式中、ＸはＯを表し；ＹはＳを表し；ＧはＯまたはＮＲ７を表し；Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立にＨ、ＯＨ、ＯＲ８、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ（Ｒ８）２、ＣＯＯＨ、ＣＯ２Ｒ８、ＮＯ２、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ８、低級アルキル、置換低級アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリールを表し；Ｒ４はＨ、ＯＨ、ＯＲ８、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ（Ｒ８）２、ＣＯＯＨ、ＣＯ２Ｒ８、ＮＯ２、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ８、メチル、メトキシル、低級アルキル、置換低級アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、又は置換ヘテロアリール、アミン、またはピペリジンを表し；Ｒ５、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ独立にＨまたは低級アルキルを表し；Ｒ８は低級アルキル、置換低級アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリールを表し；Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ９’、Ｒ１０’はそれぞれ独立にＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、低級アルキル、置換低級アルキルか、またはＣｎおよび／またはＣｎ’を含んでなる３から６員環のシクロアルキルまたは置換シクロアルキルを表し；ｎおよびｎ’は０から５の整数である。
【００４２】
化学式（ＩＸ）により示される化合物は次の構造を有し、
【００４３】
【化１１】
2009521454.tif 000012
【００４４】
式中、ＸはＯを表し；ＹはＮＲ８を表し；ＧはＯまたはＮＲ７を表し；Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立にＨ、ＯＨ、ＯＲ８、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ（Ｒ８）２、ＣＯＯＨ、ＣＯ２Ｒ８、ＮＯ２、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ８、低級アルキル、置換低級アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリールを表し；Ｒ４はＨ、ＯＨ、ＯＲ８、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ（Ｒ８）２、ＣＯＯＨ、ＣＯ２Ｒ８、ＮＯ２、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ８、メチル、メトキシル、低級アルキル、置換低級アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、又は置換ヘテロアリール、アミン、またはピペリジンを表し；Ｒ５、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ独立にＨまたは低級アルキルを表し；Ｒ８は低級アルキル、置換低級アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリールを表し；Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ９’、Ｒ１０’はそれぞれ独立にＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、低級アルキル、置換低級アルキルか、またはＣｎおよび／またはＣｎ’を含んでなる３から６員環のシクロアルキルまたは置換シクロアルキルを表し；ｎおよびｎ’は０から５の整数である。
【００４５】
化学式（Ｘ）により示される化合物は次の構造を有し、
【００４６】
【化１２】
2009521454.tif 000013
【００４７】
式中、ＸはＯを表し；ＹはＮＨを表し；Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立にＨ、ＯＲ８、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ（Ｒ８）２、ＣＯ２Ｒ８、ＮＯ２、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ８、低級アルキル、置換低級アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリールを表し；Ｒ４はＨ、ＯＲ８、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ（Ｒ８）２、ＣＯ２Ｒ８、ＮＯ２、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ８、メチル、メトキシル、低級アルキル、置換低級アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、又は置換ヘテロアリール、アミン、またはピペリジンを表し；Ｒ５、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ独立にＨまたは低級アルキルを表し（ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ７がＨの場合、Ｒ６はメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、またはｔ−ブチルではない）；Ｒ８はＨ、低級アルキル、置換低級アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリールを表し；Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ９’およびＲ１０’はそれぞれ独立にＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、低級アルキル、置換低級アルキルか、またはＣｎおよび／またはＣｎ’を含んでなる３から６員環のシクロアルキルまたは置換シクロアルキルを表し；ｎおよびｎ’は０から５の整数である。
【００４８】
化学式（ＸＩ）により示される化合物は次の構造を有し、
【００４９】
【化１３】
2009521454.tif 000014
【００５０】
式中、ＸはＯを表し；ＹはＮＨを表し；Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立にＨ、ＯＨ、ＯＲ８、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ（Ｒ８）２、ＣＯＯＨ、ＣＯ２Ｒ８、ＮＯ２、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ８、低級アルキル、置換低級アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリールを表し；Ｒ４はＨ、ＯＨ、ＯＲ８、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ（Ｒ８）２、ＣＯＯＨ、ＣＯ２Ｒ８、ＮＯ２、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ８、メチル、メトキシル、低級アルキル、置換低級アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、又は置換ヘテロアリール、アミン、またはピペリジンを表し；Ｒ５、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ独立にＨまたは低級アルキルを表し；Ｒ８は低級アルキル、置換低級アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリールを表し；Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ９’およびＲ１０’はそれぞれ独立にＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、低級アルキル、置換低級アルキル、またはＣｎおよび／またはＣｎ’を含んでなる３から６員環のシクロアルキルまたは置換シクロアルキルを表し；ｎおよびｎ’は０から５の整数である。
【００５１】
化学式（ＸＩＩ）により示される化合物は次の構造を有し、
【００５２】
【化１４】
2009521454.tif 000015
【００５３】
式中、ＸはＳを表し；ＹはＳを表し；ＧはＯまたはＮＲ７を表し；Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立にＨ、ＯＨ、ＯＲ８、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ（Ｒ８）２、ＣＯＯＨ、ＣＯ２Ｒ８、ＮＯ２、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ８、低級アルキル、置換低級アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリールを表し；Ｒ４はＨ、ＯＨ、ＯＲ８、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ（Ｒ８）２、ＣＯＯＨ、ＣＯ２Ｒ８、ＮＯ２、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ８、メチル、メトキシル、低級アルキル、置換低級アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、又は置換ヘテロアリール、アミン、またはピペリジンを表し；Ｒ５、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ独立にＨまたは低級アルキルを表し；Ｒ８は低級アルキル、置換低級アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリールを表し；Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ９’およびＲ１０’はそれぞれ独立にＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、低級アルキル、置換低級アルキル、またはＣｎおよび／またはＣｎ’を含んでなる３から６員環のシクロアルキルまたは置換シクロアルキルを表し；ｎおよびｎ’は０から５の整数である。
【００５４】
化学式（ＸＩＩＩ）により示される化合物は次の構造を有し、
【００５５】
【化１５】
2009521454.tif 000016
【００５６】
式中、ＸはＳを表し；ＹはＮＲ８を表し；ＧはＯまたはＮＲ７を表し；Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立にＨ、ＯＨ、ＯＲ８、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ（Ｒ８）２、ＣＯＯＨ、ＣＯ２Ｒ８、ＮＯ２、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ８、低級アルキル、置換低級アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリールを表し；Ｒ４はＨ、ＯＨ、ＯＲ８、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ（Ｒ８）２、ＣＯＯＨ、ＣＯ２Ｒ８、ＮＯ２、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ８、メチル、メトキシル、低級アルキル、置換低級アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、又は置換ヘテロアリール、アミン、またはピペリジンを表し；Ｒ５、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ独立にＨまたは低級アルキルを表し；Ｒ８は低級アルキル、置換低級アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリールを表し；Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ９’およびＲ１０’はそれぞれ独立にＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、低級アルキル、置換低級アルキル、またはＣｎおよび／またはＣｎ’を含んでなる３から６員環のシクロアルキルまたは置換シクロアルキルを表し；ｎおよびｎ’は０から５の整数である。
【００５７】
化学式（ＸＩＶ）により示される化合物は次の構造を有し、
【００５８】
【化１６】
2009521454.tif 000017
【００５９】
式中、ＸはＳを表し；ＹはＮＨを表し；ＧはＯまたはＮＲ７を表し；Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立にＨ、ＯＲ８、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ（Ｒ８）２、ＣＯ２Ｒ８、ＮＯ２、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ８、低級アルキル、置換低級アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリールを表し；Ｒ４はＨ、ＯＲ８、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ（Ｒ８）２、ＣＯ２Ｒ８、ＮＯ２、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ８、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アミン、ピペリジン、または低級アルキルおよび置換低級アルキル（ただし、メチルおよびメトキシルを除く）を表し；Ｒ５、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ独立にＨまたは低級アルキルを表し（ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ７がＨの場合、Ｒ６はメチルではない）；Ｒ８はＨ、低級アルキル、置換低級アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリールを表し；Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ９’およびＲ１０’はそれぞれ独立にＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、低級アルキル、置換低級アルキル、またはＣｎおよび／またはＣｎ’を含んでなる３から６員環のシクロアルキルまたは置換シクロアルキルを表し；ｎおよびｎ’は０から５の整数である。
【００６０】
化学式（ＸＶ）により示される化合物は次の構造を有し、
【００６１】
【化１７】
2009521454.tif 000018
【００６２】
式中、ＸはＳまたはＯを表し；ＹはＳ、ＮＨまたはＮＲ８を表し；ＧはＯまたはＮＲ７を表し；Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立にＨ、ＯＲ８、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ（Ｒ８）２、ＣＯ２Ｒ８、ＮＯ２、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ８、低級アルキル、置換低級アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリールを表し；Ｒ４はＨ、ＯＲ８、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ（Ｒ８）２、ＣＯ２Ｒ８、ＮＯ２、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ８、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、又は置換ヘテロアリール、アミン、ピペリジン、低級アルキル、または置換低級アルキルを表し；Ｒ５、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ独立にＨまたは低級アルキルを表し；Ｒ８はＨ、低級アルキル、置換低級アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリールを表し；Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ９’およびＲ１０’はそれぞれ独立にＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、低級アルキル、置換低級アルキル、またはＣｎおよび／またはＣｎ’を含んでなる３から６員環のシクロアルキルまたは置換シクロアルキルを表し；ｎおよびｎ’は０から５の整数である。
【００６３】
「Ｎｅｃ−１ｃ化合物」はＮｅｃ−１ａ化合物ではないＮｅｃ−１ｂ化合物を意味する。
「Ｎｅｃ−１ｄ化合物」はＮｅｃ−１ｂ化合物ではないＮｅｃ−１ａ化合物を意味する。
【００６４】
「Ｎｅｃ−１化合物」はＮｅｃ−１ａ化合物、Ｎｅｃ−１ｂ化合物または化学式（ＸＶＩ）により示される化合物を意味する。
化学式（ＸＶＩ）により示される化合物は次の構造を有し、
【００６５】
【化１８】
2009521454.tif 000019
【００６６】
式中、Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に＝Ｓ、＝Ｏ、＝Ｎ、Ｈ、Ｒ１１、ＳＲ１１、ＮＲ１１、またはＯＲ１１を表し；ＹはＳ、ＮＨまたはＮＲ８を表し；ＧはＣＨ２、Ｏ、ＳＲ７またはＮＲ７を表し；Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立にＨ、ＯＨ、ＯＲ８、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ（Ｒ８）２、ＣＯＯＨ、ＣＯ２Ｒ８、ＮＯ２、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ８、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ６−１２アリール、アシル、アセチル、アシルアミノ、またはＣ２−９ヘテロアリールを表し；Ｒ４はＨ、ＯＨ、ＯＲ８、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ（Ｒ８）２、ＣＯＯＨ、ＣＯ２Ｒ８、ＮＯ２、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ８、アシル、アセチル、アシルアミノ、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ６−１２アリール、Ｃ２−９ヘテロアリール、アミン、またはピペリジンを表し；Ｒ５、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ独立にＨ、ＯＨ、ＯＲ８、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ（Ｒ８）２、アシル、アセチル、アシルアミノ、ＮＯ２、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、またはＣ２−７アルケニルを表し；Ｒ８はＨ、ＯＨ、ＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｃ１−７アルキル、Ｃ６−１２アリール、アリールアルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ２−９ヘテロアリール、アセチル、メトキシル、アミノ、アシルアミノ、アシル、またはハロゲンを表し；Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ９’およびＲ１０’はそれぞれ独立にＨ、ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、またはＣｎおよび／またはＣｎ’を含んでなる３から６員環のシクロアルキルを表し、あるいはＲ９および／またはＲ１０はなくてもよく；Ｒ１１はＨ、ＯＨ、ＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、アセチル、メトキシル、アミノ、アシルアミノ、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、またはアシルを表し；ｎおよびｎ’はそれぞれ０から５の整数であり；ｎ’’は０または１であり；結合（ａ）、（ｂ）および（ｃ）はそれぞれ独立に単結合または二重結合である（ただし、結合（ａ）と結合（ｂ）が同時に二重結合であることはない）。代表的なアシル基は、以下のものである。
【００６７】
【化１９】
2009521454.tif 000020
【００６８】
一実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ９およびＲ１０がそれぞれ水素であり；Ｒ６がメチル基であり；ｎが１であり；ｎ’およびｎ’’がそれぞれ０であり；Ｘ１が＝Ｏであり；Ｘ２が＝Ｓであり；ＹおよびＧがそれぞれ−ＮＨ−であり；結合（ａ）が二重結合であり；結合（ｂ）および（ｃ）がそれぞれ単結合である。
【００６９】
他の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ９およびＲ１０がそれぞれ水素であり；Ｒ４がメチルまたはハロゲンであり；Ｒ６がメチル基であり；ｎが１であり；ｎ’およびｎ’’がそれぞれ０であり；Ｘ１が＝Ｏであり；Ｘ２が＝Ｓであり；ＹおよびＧがそれぞれ−ＮＨ−であり；結合（ａ）が二重結合であり；結合（ｂ）および（ｃ）がそれぞれ単結合である。
【００７０】
他の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ９およびＲ１０がそれぞれ水素であり；Ｒ４が水素、メチルまたはハロゲンであり；Ｒ６がメチル基または水素であり；ｎが１であり；ｎ’およびｎ’’がそれぞれ０であり；Ｘ１が＝Ｏであり；Ｘ２が＝Ｏであり；ＹおよびＧがそれぞれ−ＮＨ−であり；結合（ａ）が二重結合であり；結合（ｂ）および（ｃ）がそれぞれ単結合である。
【００７１】
「Ｎｅｃ−１ｅ化合物」はＮｅｃ−１ａ化合物でもＮｅｃ−１ｂ化合物でもないＮｅｃ−１化合物を意味する。
「Ｎｅｃ−２ａ化合物」は化学式（ＸＶＩＩ）または（ＸＶＩＩＩ）により示される化合物を意味する。
【００７２】
化学式（ＸＶＩＩ）により示される化合物は次の構造を有し、
【００７３】
【化２０】
2009521454.tif 000021
【００７４】
式中、Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に＝Ｏ、−ＯＨおよび−Ｈからなる群から選ばれ；Ｒ１は水素およびヒドロキシルからなる群から選ばれ；Ｒ２は水素、スルフェート、ニトロおよびハライドからなる群から選ばれ；結合（ａ）は単結合または二重結合である。
【００７５】
化学式（ＸＶＩＩＩ）により示される化合物は次の構造を有し、
【００７６】
【化２１】
2009521454.tif 000022
【００７７】
式中、Ｒはそれぞれ独立にＨおよびＣＨ３からなる群から選ばれ；結合（ａ）は単結合または二重結合であり；結合（ｂ）は単結合または二重結合であり；Ｘは＝Ｏ、−ＯＨおよび−Ｈからなる群から選ばれる。
【００７８】
「Ｎｅｃ−２化合物」はＮｅｃ−２ａ化合物または化学式（ＸＩＸ）により示される化合物を意味する。
化学式（ＸＩＸ）により示される化合物は次の構造を有し、
【００７９】
【化２２】
2009521454.tif 000023
【００８０】
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立にＨ、ＯＨ、ＳＯ２、ＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、アシル、アセチル、アルキル、メトキシル、アミノ、アシルアミノ、
【００８１】
【化２３】
2009521454.tif 000024
【００８２】
（ここで、ＲａはＣ６−１２アリール置換基である）を表し；結合（ａ）は単結合または二重結合であり；Ｘは＝Ｏ、ＯＨまたはＨを表し；Ｒ６は
【００８３】
【化２４】
2009521454.tif 000025
【００８４】
を表わす（ここで、結合（ｂ）は単結合または二重結合であり（ただし、ｎが０の場合、結合（ｂ）は単結合である）；ＹはＯまたはＳであり；Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０はそれぞれ独立にＨ、ＯＨ、ＳＯ２、ＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、アシル、アセチル、アルキル、メトキシル、アミノ、アシルアミノ、
【００８５】
【化２５】
2009521454.tif 000026
【００８６】
（ここで、ＲａはＣ６−１２アリール置換基である）を表し；Ｒ１１は＝Ｏ、ＯＨまたはＨを表す）。
一実施形態では、Ｒ６が
【００８７】
【化２６】
2009521454.tif 000027
【００８８】
式中、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ１０およびＲ１１はそれぞれ水素であり；Ｒ２、Ｒ３、Ｒ８およびＲ９はそれぞれ−ＣＨ３であり；Ｘは＝Ｏであり；結合（ａ）および（ｂ）はそれぞれ二重結合である。
【００８９】
他の実施形態では、Ｒ６が
【００９０】
【化２７】
2009521454.tif 000028
【００９１】
であり、Ｒ１１およびＸはそれぞれ＝Ｏであり；Ｒ７およびＲ３はそれぞれヒドロキシル基であり；Ｒ２はニトロ基であり；Ｒ９はメチル基であり；Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ８はそれぞれ水素であり；結合（ａ）は二重結合である。
【００９２】
他の実施形態では、Ｎｅｃ−２化合物が次の化学式を有する場合：
【００９３】
【化２８】
2009521454.tif 000029
【００９４】
Ｒ１１が＝Ｏであるならば、Ｘは＝Ｏではないか、又はＲ７はヒドロキシル基ではないか、又はＲ２はニトロ基ではないか、あるいは結合（ａ）は二重結合ではない。Ｘが＝Ｏであるならば、Ｒ１１は＝Ｏではないか、又はＲ７はヒドロキシル基ではないか、又はＲ２はニトロ基ではないか、あるいは結合（ａ）は二重結合ではない。Ｒ７がヒドロキシル基であるならば、Ｒ１１およびＸが両者とも＝Ｏである場合はないか、又はＲ２はニトロ基ではないか、あるいは結合（ａ）は二重結合ではない。Ｒ２がニトロ基であるならば、Ｒ１１およびＸが両者とも＝Ｏである場合はないか、又はＲ７はヒドロキシル基ではないか、あるいは結合（ａ）は二重結合ではない。結合（ａ）が二重結合であるならば、Ｒ１１およびＸが両者とも＝Ｏとなる場合はないか、又はＲ７はヒドロキシル基ではないか、あるいはＲ２はニトロ基ではないか、あるいは結合（ａ）は二重結合ではない。
【００９５】
「Ｎｅｃ−２ｂ化合物」はＮｅｃ−２ａ化合物ではないＮｅｃ−２化合物を意味する。
「Ｎｅｃ−３ａ化合物」は化学式（ＸＸ）により示される化合物を意味し、
【００９６】
【化２９】
2009521454.tif 000030
【００９７】
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９はそれぞれ独立に水素、アミノ、ハライド、およびヒドロキシルからなる群から選択され；Ｒ３は水素およびメチルからなる群から選択され；結合（ａ）は単結合または二重結合である。
【００９８】
「Ｎｅｃ−３化合物」はＮｅｃ−３ａ化合物、化学式（ＸＸＩ）により示される化合物、または化合物（１）から（２１７）のいずれかを意味する。
化学式（ＸＸＩ）により示される化合物は次の構造を有し、
【００９９】
【化３０】
2009521454.tif 000031
【０１００】
式中、Ｚは結合、ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ２）またはＮＲ８であり（ここで、Ｒ８はアルキル、アラルキルまたはヘテロアラルキルであり）；
（ａ）により示される結合は単結合または二重結合であることができ；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立にＨ、１から６の炭素原子を有するアルカノイル、１から６の炭素原子を有するアルキル、１から６の炭素原子を有するアルコキシ、アルキルおよびアルキレン基が独立に１から６の炭素原子を有するアルコキシアルキル、１から６の炭素原子を有するアルキルスルフィニル、アルキルおよびアルキレン基が独立に１から６の炭素原子を有するアルキルスルフィニルアルキル、１から６の炭素原子を有するアルキルスルホニル、アルキルおよびアルキレン基が独立に１から６の炭素原子を有するアルキルスルホニルアルキル、アミノ、１から６の炭素原子を有するアミノアルキル、Ｃ６−１２アリール、アルキレン基が１から６の炭素原子を有するＣ７−１６アリールアルキル、Ｃ７またはＣ１１アリーロイル、アジド、１から６の炭素原子を有するアジドアルキル、カルボキシアルデヒド、アルキレン基が１から６の炭素原子を有する（カルボキシアルデヒド）アルキル、３から８の炭素原子を有するシクロアルキル、シクロアルキル基が３から８の炭素原子を有しアルキレン基が１から１０の炭素原子を有するシクロアルキルアルキル、ハロ、１から６の炭素原子を有するハロアルキル、Ｃ２−９ヘテロシクリル、Ｃ２−９（ヘテロシクリル）オキシ、Ｃ３−１０（ヘテロシクリル）オイル、ヒドロキシル、１から６の炭素原子を有するヒドロキシアルキル、ニトロ、１から６の炭素原子を有するニトロアルキル、Ｎ−保護アミノ、アルキレン基が１から６の炭素原子を有するＮ−保護アミノアルキル、１から６の炭素原子を有するチオアルコキシ、アルキルおよびアルキレン基が独立に１から６の炭素原子を有するチオアルコキシアルキル、−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ（ここで、ｑは０から４であり、ＲＡは（ａ）Ｃ１−６アルキル、（ｂ）Ｃ６−１２アリール、および（ｃ）アルキレン基が１から６の炭素原子を有するアリールアルキルからなる群から選ばれる）、−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢＲＣ（ここで、ＲＢおよびＲＣは独立に（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１−６アルキル、（ｃ）Ｃ６−１２アリール、および（ｄ）アルキレン基が１から６の炭素原子を有するアリールアルキルからなる群から選ばれる）、−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ（ここで、ＲＤは（ａ）Ｃ１−６アルキル、（ｂ）Ｃ６−１２アリール、および（ｃ）アルキレン基が１から６の炭素原子を有するアリールアルキルからなる群から選ばれる）、−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥＲＦ（ここで、ＲＥおよびＲＦは独立に（ａ）水素、（ｂ）アルキル、（ｃ）Ｃ６−１２アリール、および（ｄ）アルキレン基が１から６の炭素原子を有するアリールアルキルからなる群から選ばれる）、−（ＣＨ２）ｑＮＲＧＲＨ（ここで、ＲＧおよびＲＨは独立に（ａ）水素、（ｂ）Ｎ−保護基、（ｃ）１から６の炭素原子を有するアルキル、（ｄ）２から６の炭素原子を有するアルケニル、（ｅ）２から６の炭素原子を有するアルキニル、（ｆ）Ｃ６−１２アリール、（ｇ）アルキレン基が１から６の炭素原子を有するアリールアルキル、（ｈ）３から８の炭素原子を有するシクロアルキル、および（ｉ）シクロアルキル基が３から８の炭素原子を有しアルキレン基が１から１０の炭素原子を有するシクロアルキルアルキルからなる群から選ばれ、ただし、２つの基がカルボニル基またはスルホニル基を介して該窒素原子に結合することはない）、Ｃ１−６パーフルオロアルキル、Ｃ１−６パーフルオロアルコキシ、Ｃ６またはＣ１０アリールオキシ、Ｃ３−８シクロアルコキシ、Ｃ９−１４シクロアルキルアルコキシ、またはＣ７−１６アリールアルコキシを表し；
Ｒ５は置換されていてもよいＣ６またはＣ１０アリールまたは置換されていてもよいＣ２−９ヘテロアリールであり；
Ｒ６はＣ（Ｏ）Ｒ９、Ｃ（Ｓ）Ｒ９、Ｃ（Ｏ）ＯＲ９、Ｃ（Ｏ）ＮＲ９Ｒ１０、Ｃ（Ｓ）ＮＲ９Ｒ１０、Ｃ（ＮＨ）Ｒ９またはＳ（Ｏ２）Ｒ９であり（ここで、Ｒ９およびＲ１０はそれぞれ独立にＨ、置換されていてもよいＣ１−１２アルキル、置換されていてもよいＣ１−７ヘテロアルキル、置換されていてもよいＣ６またはＣ１０アリール、置換されていてもよいＣ２−９ヘテロアリール、置換されていてもよいＣ７−１６アラルキル、または置換されていてもよいＣ２−１５ヘテロアラルキルである）；
Ｒ７はＨ、Ｃ１−６アルキル、置換されていてもよいＣ６またはＣ１０アリール、置換されていてもよいＣ７−１６アラルキル、置換されていてもよいＣ２−９ヘテロアリール、または置換されていてもよいＣ２−１５ヘテロアラルキルであり；
Ｒ１５はＨ、置換されていてもよいＣ１−１２アルキル、または置換されていてもよいＣ１−７ヘテロアルキルである。
【０１０１】
一実施形態では、（ａ）により示される結合が単結合である。望ましい実施形態においては、（ａ）により示される結合が二重結合である。
他の実施形態では、Ｚが結合、ＣＨ２ＣＨ２、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ２）またはＮＲ８である（ここで、Ｒ８の定義は上記と同様である）。
【０１０２】
他の実施形態では、Ｒ５が置換されていてもよいＣ１０アリールまたは置換されていてもよいＣ２−９ヘテロアリール基である。
他の実施形態では、Ｒ６がＣ（Ｏ）Ｒ９であり、ここで、Ｒ９は置換されていてもよいＣ２−１２アルキル基である。望ましいＲ６の例では、Ｒ９は、例えば、モルフォリノ基、モルフォリノアミド、またはモルフォリノアルキルエステル部分（例えば、Ｒ９は−（ＣＨ２）ｎ−モルフォリノ、−（ＣＨ２）ｎＣＯ−モルフォリノ、または−（ＣＨ２）ｎＣＯ２（ＣＨ２）２−モルフォリノである）；ピペラジニル基、ピペラジニルアミド、またはピペラジニルアルキルエステル部分（例えば、Ｒ９が、−（ＣＨ２）ｎ−ピペリジニル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ４−アルキルピペリジニル、−（ＣＨ２）ｎＣＯ−ピペリジニル、−（ＣＨ２）ｎＣＯ−Ｎ４−アルキルピペリジニル、−（ＣＨ２）ｎＣＯ２（ＣＨ２）２−ピペリジニル、または−（ＣＨ２）ｎＣＯ２（ＣＨ２）２−Ｎ４−アルキルピペリジニルである）、ここで、ｎは１から６の整数である；ヒドロキシル基（例えば、１から４のヒドロキシル置換基）、Ｃ２−７アシルオキシ基、Ｃ２−７カルボン酸エステル、第一級アミン、第二級アミン、または第三級アミンのような水溶性を高める部分で置換されたＣ２-１２アルキル基である。。さらに、ビオチン部分などの認識部分を含むアルキル置換基、例えば、−（ＣＨ２）ｎＮＨ−ビオチニルなども望ましい。
【０１０３】
他の実施形態では、Ｒ６がＣ（Ｏ）Ｒ９、Ｃ（Ｓ）Ｒ９、Ｃ（Ｏ）ＯＲ９、Ｃ（Ｏ）ＮＲ９Ｒ１０、Ｃ（Ｓ）ＮＲ９Ｒ１０、またはＳ（Ｏ２）Ｒ９であり、ここで、Ｒ９は置換されていてもよいＣ６またはＣ１０アリール、置換されていてもよいＣ２−９ヘテロアリール、置換されていてもよいＣ７−１６アラルキル、または置換されていてもよいＣ２−１５ヘテロアラルキルであり；Ｒ１０はＨ、置換されていてもよいＣ１−１２アルキル、置換されていてもよいＣ６またはＣ１０アリール、置換されていてもよいＣ２−９ヘテロアリール、置換されていてもよいＣ７−１６アラルキル、または置換されていてもよいＣ２−１５ヘテロアラルキルである。
【０１０４】
他の実施形態では、Ｒ６がＣ（Ｓ）Ｒ９、Ｃ（Ｏ）ＯＲ９、Ｃ（Ｏ）ＮＲ９Ｒ１０、Ｃ（Ｓ）ＮＲ９Ｒ１０、またはＳ（Ｏ２）Ｒ９であり、ここで、Ｒ９およびＲ１０の定義は上記と同様である。
【０１０５】
他の実施形態では、ＺがＣＨ２であり；Ｒ１およびＲ４がそれぞれＨであり；Ｒ２がＨ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６チオアルコキシ、ハロであるか、またはＲ３と共にジオキソメチレンまたはジオキソエチレン基を形成し；Ｒ３がＨ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６チオアルコキシ、ハロであるか、またはＲ２と共にジオキソメチレンまたはジオキソエチレン基を形成し；Ｒ５が
【０１０６】
【化３１】
2009521454.tif 000032
【０１０７】
であり、式中、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３はそれぞれ独立にＨ、Ｃ１−６アルコキシまたはＣ１−６チオアルコキシを表し、Ｒ１１とＲ１２またはＲ１２とＲ１３とが一緒にジオキソメチレンまたはジオキソエチレン基を形成してもよく；Ｒ１４はＨである。
【０１０８】
望ましくは、例えば、ＺがＣＨ２であり；（ａ）により示される結合が二重結合であり；Ｒ１、Ｒ２およびＲ４がそれぞれ水素であり；Ｒ３がメトキシであり；Ｒ５が４−メトキシフェニル環であり；Ｒ６がメチル基であり；Ｒ７がＨである。
【０１０９】
さらに他の実施形態では、ＺがＣＨ２であり；（ａ）により示される結合が二重結合であり；Ｒ１、Ｒ２およびＲ４はそれぞれ独立に水素、アミノ、ハライド、およびヒドロキシルからなる群から選択され；Ｒ３が水素またはメトキシであり；Ｒ５が、２−、３−、４−、５−および６−位の置換基が独立に水素、アミノ、ハライド、およびヒドロキシルからなる群から選択されるフェニル環であり；Ｒ７がＨであり、Ｒ９がメチルである。
【０１１０】
望ましい例において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ４がそれぞれ水素であり；Ｒ３がメトキシであり；Ｒ５が４−フルオロフェニル環であり；Ｒ６がメチル基であり；Ｒ７がＨであり；ＺがＣＨ２であり；（ａ）により示される結合が二重結合である。
【０１１１】
「Ｎｅｃ−３ｂ化合物」はＮｅｃ−３ａ化合物ではないＮｅｃ−３化合物を意味する。
ここで、「Ｎｅｃ化合物」、「ネクロスタチン化合物」および「ネクロスタチン」は本明細書中で相互に交換可能に使用され、Ｎｅｃ−１化合物、Ｎｅｃ−２化合物あるいはＮｅｃ−３化合物を指す。
【０１１２】
「壊死を低減する」とは、例えば、低分子候補阻害剤なしで、ＴＮＦαあるいはＤＭＳＯを接触させることなどの細胞死刺激を受るコントロール細胞に比較して、壊死を受ける細胞の数を減少させることを意味する。好ましくは、壊死がコントロールに比較して１０％低下する。より好ましくは、壊死がコントロールに比較して５０％低下する。さらに好ましくは、壊死がコントロールに比較して９０％低下する。壊死の低減は、候補化合物、例えば、化学ライブラリーの化合物などを受けた細胞におけるＡＴＰレベルを測定し、そのレベルをコントロール細胞におけるＡＴＰレベルと比較することにより試験することが好ましい。壊死は、ＡＴＰレベルがコントロール細胞におけるほど大きく低下しない、候補化合物により処理された細胞において、低減している。
【０１１３】
「候補化合物」とは、本明細書で説明されるアッセイ方法の一つにより壊死のレベルをモジュレートさせる能力を有するかどうか評価される、天然または人工の化合物を指す。候補化合物には、例えば、ペプチド、ポリペプチド、合成有機分子、天然有機分子、核酸分子、およびそれらの構成成分などがある。
【０１１４】
「細胞死」はアポトーシスまたは壊死による細胞の死を意味する。
「壊死」は、本明細書で用いる場合、細胞ＡＴＰ減少を特徴とするカスパーゼ非依存性細胞死を意味する。ビヒクルのみ（例えば、ＤＭＳＯ）を導入されたコントロール細胞と比較して細胞のＡＴＰが１０％減少することが好ましい。より好ましくは細胞のＡＴＰはコントロール細胞に比較して５０％減少する。さらに好ましくは細胞のＡＴＰはコントロール細胞に比較して９０％減少する。壊死は、化合物、例えば、ｚＶＡＤ-ｆｍｋ、ＤＭＳＯあるいはＴＮＦα、を添加された細胞におけるＡＴＰレベルを測定し、そのレベルをビヒクルのみを添加された細胞におけるＡＴＰレベルと比較することによって試験することが好ましい。壊死は、ＡＴＰレベルがコントロール細胞に比較して低下した、候補化合物により処理された細胞において生じる。
【０１１５】
壊死は、液化壊死であっても、脂肪または肝組織に影響を及ぼすものであっても、乾酪またはフィブリノイド壊死であってもよい。細胞は虚血性細胞傷害またはウィルス感染に応じて壊死してもよい。
【０１１６】
「カスパーゼ非依存細胞死」はアポトーシスが阻害された際に生じる細胞の死を意味する。アポトーシスは、アポトーシスを誘起するようにアポトーシス促進薬または電離放射線などにより細胞を処理した際に、細胞が生存するのに十分な濃度のｚＶＡＤ−ｒｍｋなどのカスパーゼ阻害剤を細胞に接触させることにより、防止され得る。
【０１１７】
「アポトーシス」は、次の特性、すなわち、核凝縮、ＤＮＡ断片化、膜ブレブ形成、または細胞収縮のいずれかを特徴とする細胞死を意味する。
「ＴＮＦαにより媒介される細胞内シグナル伝達経路のモジュレーション」は、細胞がＴＮＦαに接触するのに応じた細胞成分間伝達の変化を意味する。その変化は、細胞内タンパク質が相互作用する仕方や持続時間、リン酸化や脱リン酸化などのタンパク質の変化の仕方や持続時間、あるいはタンパク質がＤＮＡと相互作用する仕方や持続時間における変化であってよい。
【０１１８】
「ＤＭＳＯにより媒介される細胞内シグナル伝達経路のモジュレーション」は、細胞がＤＭＳＯに接触するのに応じた細胞成分間伝達の変化を意味する。その変化は、細胞内タンパク質が相互作用する仕方や持続時間、リン酸化や脱リン酸化などのタンパク質の変化の仕方や持続時間、あるいはタンパク質がＤＮＡと相互作用する仕方や持続時間における変化であってよい。
【０１１９】
「処置」は、予防および／または治療目的で医薬組成物を投与することを意味する。「疾病を防止する」とは、現在はまだ病気ではないが、ある特定の疾患のにかかり易いあるいはそのリスクが高い対象に対する予防的処置を指す。「疾病を処置」または「治療的処置」のための使用とは、すでに疾患にかかっている対象の状態を改善または安定させるために処置することを指す。従って、特許請求の範囲および実施形態において、処置とは、治療または予防を目的とした対象への投与である。
【０１２０】
「状態」とは、そうなっている状態または感覚を意味する。表１に疾患の例を示すが、これらに限定されるものではない。
「有効な量」および「有効量」とは、本明細書で用いる場合、例えば、表１に示す疾患を処置するために必要な本発明の化合物の量を指す。疾患例としては、中枢または末梢神経系の神経変性疾患、網膜神経細胞死によるもの、心筋の細胞死によるもの、免疫系細胞の細胞死によるもの、脳卒中、肝疾患、膵疾患、腎不全に伴う細胞死によるもの、心臓、腸間膜、網膜、肝臓、または脳の虚血傷害、臓器保存中の虚血傷害、頭部外傷、敗血症性ショック、冠性心臓病、心筋症、無血管性骨壊死、鎌状赤血球病、筋肉るいそう、消化器疾患、結核、糖尿病、血管の変性、筋ジストロフィー、移植片対宿主病、ウィルス感染、クローン病、潰瘍性大腸炎、喘息、細胞または組織壊死が原因または結果である状態、細胞増殖、分化、または細胞内シグナル伝達における変性が原因である状態、およびＲＩＰ１タンパク質が寄与因子である状態がある。上記のような状態の治療または予防的処置において本発明を実施するために使用される有効量は、投与方法、対象の年齢、体重、全体的な状態により異なる。最終的には、担当の医師または獣医が適切な量および用法を決めることになる。そのような量を「有効」量と呼ぶ。
【０１２１】
「神経変性疾患」とは、神経細胞死を特徴とする疾病を意味する。神経変性疾患としては、例えば、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、脳虚血、クロイツフェルト・ヤコブ病、ファール病、ハンチントン舞踏病および関連ポリグルタミン伸長病、レビー小体病、メンケス病、多発性硬化症、脳卒中およびウィルソン病があるが、これらに限定されるものではない。
【０１２２】
「ニューロン」とは、動物の神経系の部分から派生する外胚葉胚起源の細胞を意味する。ニューロンは、ニューロフィラメント・タンパク質、ＭＡＰ２、クラスIIIβ−チューブリンなどの十分に特徴付けがなされているニューロン特異的マーカーを発現する。例えば、ニューロンとして、海馬、皮質、中脳ドーパミン作動、運動、知覚、交感神経、中隔コリン作動および小脳ニューロンが挙げられる。
【０１２３】
「壊死を低減するに十分な用量」とは、対象に投与すると壊死を低減する化合物あるいは小分子の量を意味する。対象の壊死を非投与対象に比較して１０％低減することが好ましい。対象の壊死を非投与対象に比較して５０％低減することがさらに好ましい。対象の壊死を非投与対象に比較して９０％低減することが最も好ましい。
【０１２４】
「壊死を測定する」とは、化合物の存在下に細胞が壊死を介して染色されるかどうかを、化合物不存在下における細胞（コントロール細胞）と比較して、測定することを意味する。壊死は、細胞内ＡＴＰレベルを測定することによって測定することができ、壊死を受けている細胞は、コントロール細胞に比較して細胞内ＡＴＰが低減している。壊死はまた、トリパンブルーなどの生体染色色素で染色することによって測定してもよく、壊死しつつある細胞は生体染色色素によって染色されるが、壊死の無い細胞は染色されない。
【０１２５】
「医薬組成物」は、医薬的に許容される賦形剤と共に製剤され、哺乳類の疾病を処置するための治療的処方の一部として政府管理機関の認可を得て製造または販売される、本発明の化合物を含有する組成物を意味する。エタノールまたはＤＭＳＯからなる賦形剤は特に排除される。医薬組成物は、例えば、単位用量型の経口投与用剤型（例えば、錠剤、カプセル、カプレット、ジェルキャップ、またはシロップ）、局所性投与用剤型（例えば、クリーム、ジェル、ローション、または軟膏）、静脈内投与用剤型（例えば、微粒子塞栓を引き起こさない滅菌溶液あるいは静脈内使用に適切な溶媒系）、またはここで説明される他の剤型として製剤することができる。
【０１２６】
「医薬的に許容される塩」とは、本明細書で用いる場合、健全な医学的判断の範囲内で重篤な毒性、炎症、アレルギー性反応などを伴わずに、ヒトまたは動物の組織と接触させる使用に適切であり、妥当な利益／危険比を有する塩を表す。医薬的に許容される塩は当技術分野で周知である。例えば、S. M Bergeらは医薬的に許容される塩についてJ. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66:1-19の中で詳細に述べている。そのような塩は、本発明の化合物の最終的な分離・精製の段階で調製、あるいは遊離塩基群と適切な有機酸との反応により分離することができる。代表的な酸付加塩には、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、硼酸塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモン酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などがある。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどがあり、また、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどの無毒のアンモニウム、四級アンモニウムおよびアミンカチオンが挙げられる。
【０１２７】
「医薬的に許容されるエステル」とは、本明細書で用いる場合、体内で加水分解されるエステルを表し、ヒト体内で親化合物あるいはその塩に容易に分解されるエステルが含まれる。適切なエステル基としては、例えば、医薬的に許容される脂肪族カルボン酸、特に、好ましくはそのアルキルまたはアルケニル基がそれぞれ６以下の炭素原子を有するアルカン酸、アルケン酸、シクロアルカン酸およびアルカン二酸から生じるエステルを挙げることができる。具体的なエステルの例としては、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、アクリル酸、およびエチルコハク酸のエステルがある。
【０１２８】
「医薬的に許容されるプロドラッグ」とは、本明細書で用いる場合、健全な医学的判断の範囲内で重篤な毒性、炎症、アレルギー性反応などを伴わずに、ヒトまたは動物の組織と接触させる使用に適切であり、妥当な利益／危険比を有し、本発明の化合物の所望の使用に有効である、本発明の化合物のプロドラッグ、並びに可能な場合には、本発明の化合物の両性イオン型を表す。
【０１２９】
「プロドラッグ」とは、本明細書で用いる場合、生体内で、例えば、血中で加水分解され、上記の化学式に示される親化合物に迅速に変換される化合物を表す。詳細な考察は、T. Higuchi and V. Stella, Pro-drugs as Novel Delivery Systems, the A.C.S. Symposium Series, Vol. 14, Edward B. Roche編；Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987；およびJudkinsら. Synthetic Communications, 26(23), 4351-4367 (1996)になされており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３０】
本発明の化合物は不斉あるいはキラル中心を有していてもよい。本発明は種々の立体異性体およびその混合物を意図する。本発明の化合物の個々の立体異性体は、不斉あるいはキラル中心を有する市販の出発物質から合成により調製、あるいは鏡像異性の化合物の混合物を調製した後、当業者により周知の分解法により調製できる。これらの調製方法は、例えば、（１）（＋／−）により示される鏡像異性体のラセミ混合物をキラル補助基に付着させ、得られたジアステレオマーを再結晶またはクロマトグラフィーにより分離し、補助基から光学的に純粋な生成物を単体分離する、あるいは（２）キラルクロマトグラフカラムを用いて光学鏡像異性体の混合物を直接分離することにより行う。本明細書では、鏡像異性体は、キラル炭素原子の周りの置換基の配置に基づいて記号「Ｒ」または「Ｓ」により示される。
【０１３１】
本発明の化合物は幾何異性体を有していてもよい。本発明は、炭素‐炭素二重結合の周りの置換基の配置に起因する種々の幾何異性体およびその混合物を意図し、ＺまたはＥ配置のような異性体を示す。「Ｚ」は炭素‐炭素二重結合と同じ側の置換基を示し、「Ｅ」は炭素‐炭素二重結合の反対側の置換基を示す。
【０１３２】
本発明において有用な化合物には、医薬的に許容される形態における本明細書で述べた化合物が含まれ、例えば、ジアステレオマーや鏡像異性体などの異性体、酸または塩基付加塩などの塩、エステル、アミド、チオエステル、溶媒和物、およびそれらの多形体、並びにそれら化合物のラセミ混合物や純粋な異性体が含まれる。
【０１３３】
「Ａ異性体」とは、本明細書で用いる場合、＊で示される位置の立体化学が化学式ＸＸＸＩＸに示されるような、Ｎｅｃ−化合物（例えば、Ｎｅｃ−１ａ化合物、Ｎｅｃ−１ｂ化合物、Ｎｅｃ−１ｃ化合物、Ｎｅｃ−１ｄ化合物、またはＮｅｃ−１ｅ化合物）を指す。
【０１３４】
【化３２】
2009521454.tif 000033
【０１３５】
例えば、以下に示されるＲ−７−Ｃｌ−Ｏ−Ｎｅｃ−１はＡ異性体である（ヒダントイン部分は以下の表示において裏返っていることに留意すべきである）。
【０１３６】
【化３３】
2009521454.tif 000034
【０１３７】
「実質的に純粋なＡ異性体」は、Ａ異性体のＢ異性体に対する比率が少なくとも１０、２０、３０、１００、２００さらには４００である組成物を指す。
「Ｂ異性体」とは、本明細書で用いる場合、＊で示される位置の立体化学が化学式ＸＸＸＸに示されるような、Ｎｅｃ−化合物（例えば、Ｎｅｃ−１ａ化合物、Ｎｅｃ−１ｂ化合物、Ｎｅｃ−１ｃ化合物、Ｎｅｃ−１ｄ化合物、またはＮｅｃ−１ｅ化合物）を指す。
【０１３８】
【化３４】
2009521454.tif 000035
【０１３９】
「実質的に純粋なＢ異性体」は、Ｂ異性体のＡ異性体に対する比率が少なくとも１０、２０、３０、１００、２００さらには４００である組成物を指す。
「（３Ｒ，３ａＲ）−ｒｅｌ異性体」（Ｃ３／Ｃ３ａシス異性体としても知られる）は、化学式ＸＸＩＩに示されるように、Ｃ３およびＣ３ａの位置での最低優先順位の置換基（例えば、水素）が互いにｓｙｎの関係にある、Ｎｅｃ−３化合物（例えば、Ｎｅｃ−３ａ化合物またはＮｅｃ−３ｂ化合物）を意味する。「実質的に純粋な（３Ｒ，３ａＲ）−ｒｅｌ異性体」は、（３Ｒ，３ａＲ）−ｒｅｌ異性体の（３Ｒ，３ａＳ）−ｒｅｌ異性体に対する比率が少なくとも１０、２０、３０、１００、２００さらには４００である組成物を指す。
【０１４０】
「（３Ｒ，３ａＳ）−ｒｅｌ異性体」（Ｃ３／Ｃ３ａトランス異性体としても知られる）は、化学式ＸＸＩＩに示されるように、Ｃ３およびＣ３ａの位置での最低優先順位の置換基（例えば、水素）が互いにａｎｔｉの関係にある、Ｎｅｃ−３化合物（例えば、Ｎｅｃ−３ａ化合物またはＮｅｃ−３ｂ化合物）を意味する。「実質的に純粋な（３Ｒ，３ａＳ）−ｒｅｌ異性体」は、（３Ｒ，３ａＳ）−ｒｅｌ異性体の（３Ｒ，３ａＲ）−ｒｅｌ異性体に対する比率が少なくとも１０、２０、３０、１００、２００さらには４００である組成物を指す。
【０１４１】
「（３Ｒ，３ａＲ）−鏡像異性体」は、カーン−インゴールド−プレログ優先順位則により決定した場合に、化学式ＸＸＩＩに示されるように、Ｃ３の位置の絶対立体化学がＲであり、化学式ＸＸＩＩに示されるように、Ｃ３ａの位置での絶対立体化学がＲである、Ｎｅｃ−３化合物（例えば、Ｎｅｃ−３ａ化合物またはＮｅｃ−３ｂ化合物）を指す。「実質的に純粋な（３Ｒ，３ａＲ）−鏡像異性体」は、（３Ｒ，３ａＲ）−鏡像異性体の（３Ｓ，３ａＳ）−鏡像異性体に対する比率が少なくとも１０、２０、３０、１００、２００さらには４００である組成物を指す。
【０１４２】
「（３Ｒ，３ａＳ）−鏡像異性体」は、カーン−インゴールド−プレログ優先順位則により決定した場合に、化学式ＸＸＩＩに示されるように、Ｃ３の位置での絶対立体化学がＲであり、化学式ＸＸＩＩに示されるように、Ｃ３ａの位置での絶対立体化学がＳである、Ｎｅｃ−３化合物（例えば、Ｎｅｃ−３ａ化合物またはＮｅｃ−３ｂ化合物）を指す。「実質的に純粋な（３Ｒ，３ａＳ）−鏡像異性体」は、（３Ｒ，３ａＳ）−鏡像異性体の（３Ｓ，３ａＲ）−鏡像異性体に対する比率が少なくとも１０、２０、３０、１００、２００さらには４００である組成物を指す。
【０１４３】
「（３Ｓ，３ａＲ）−鏡像異性体」は、カーン−インゴールド−プレログ優先順位則により決定した場合に、化学式ＸＸＩＩに示されるように、Ｃ３の位置での絶対立体化学がＳであり、化学式ＸＸＩＩに示されるように、Ｃ３ａの位置での絶対立体化学がＲである、Ｎｅｃ−３化合物（例えば、Ｎｅｃ−３ａ化合物またはＮｅｃ−３ｂ化合物）を指す。「実質的に純粋な（３Ｓ，３ａＲ）−鏡像異性体」は、（３Ｓ，３ａＲ）−鏡像異性体の（３Ｒ，３ａＳ）−鏡像異性体に対する比率が少なくとも１０、２０、３０、１００、２００さらには４００である組成物を指す。
【０１４４】
「（３Ｓ，３ａＳ）−鏡像異性体」は、カーン−インゴールド−プレログ優先順位則により決定した場合に、化学式ＸＸＩＩに示されるように、Ｃ３の位置での絶対立体化学がＳであり、化学式ＸＸＩＩに示されるように、Ｃ３ａの位置での絶対立体化学がＳである、Ｎｅｃ−３化合物（例えば、Ｎｅｃ−３ａ化合物またはＮｅｃ−３ｂ化合物）を指す。「実質的に純粋な（３Ｓ，３ａＳ）−鏡像異性体」は、（３Ｓ，３ａＳ）−鏡像異性体の（３Ｒ，３ａＲ）−鏡像異性体に対する比率が少なくとも１０、２０、３０、１００、２００さらには４００である組成物を指す。
【０１４５】
「虚血」とは、通常、組織の低酸素症の原因となる、動脈血供給の障害または不十分な血流による低酸素状態を特徴とする循環器疾患を意味する。
「心筋梗塞」は、血液供給の障害を原因とする限局性壊死を特徴とする循環器疾患を意味する。
【０１４６】
「脳卒中」は、通常、血栓が血管を塞ぎ脳内の血流が妨げられて起こる、脳内の血栓や出血を原因とする循環器疾患を意味する。本発明の特定の実施形態においては、「脳卒中」は虚血性脳卒中または出血性脳卒中を指す。
【０１４７】
「外傷」は、暴力、事故、骨折などを原因とする身体的損傷を意味する。
【０１４８】
Ｎｅｃ−１ｂ化合物に特有の定義
以下の定義は、Ｎｅｃ−１ｂ化合物に特有である。
「アルキル」は、直鎖状アルキル基、分岐鎖状アルキル基、シクロアルキル（脂環式）基、アルキル置換シクロアルキル基およびシクロアルキル置換アルキル基などの飽和脂肪族基を指す。好ましい実施形態では、直鎖状または分岐鎖状アルキルが１２以下の炭素原子をその骨格に有し（例えば、Ｃ１−Ｃ１２の直鎖、Ｃ３−Ｃ１２の分岐鎖）、さらに好ましくは６以下、さらに好ましくは４以下の炭素原子を有する。同様に、好ましいシクロアルキルは３から１０の炭素原子をその環構造に有し、さらに好ましくは５、６または７の炭素をその環構造に有する。Ｃ１−７のヘテロアルキルは、例えば、１から６の炭素原子と１つまたは複数のヘテロ原子を有する。これ以外原子の数や種類も同様に示すことができる。
【０１４９】
炭素の数は特に断りがない限り、「低級アルキル」とは、本明細書で用いる場合、上記に定義されたアルキル基を意味し、骨格構造に１から１０の炭素、より好ましくは１から６の炭素原子を有し、さらに好ましくは骨格構造に１から４の炭素原子を有する。同様に、「低級アルケニル」と「低級アルキニル」は類似の鎖長を有する。アルキル基は好ましくは低級アルキルである。好ましい実施形態において、アルキルとして示される置換基は、本明細書では低級アルキルである。
【０１５０】
「ハロゲン」と「ハロ」は本明細書において同義に用いられ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉを示し；「スルフヒドリル」は−ＳＨを意味し；「ヒドロキシル」は−ＯＨを意味する。
【０１５１】
「メチル」は一価のラジカル、−ＣＨ３を指し；「メトキシ」は一価のラジカル、−ＣＨ２ＯＨを指す。
「アラルキル」または「アリールアルキル」は、本明細書で用いる場合、アリール基（例えば、芳香族またはヘテロ芳香族基）で置換されたアルキル基を指す。
【０１５２】
「アルケニル」および「アルキニル」は、上述のアルキルに長さおよび可能な置換基において類似する不飽和脂肪族基を指すが、それぞれ少なくとも一つの二重および三重結合を有する。
【０１５３】
「アリール」は、本明細書で用いる場合、例えば、０から４のヘテロ原子を含んでよい５−、６−、および７−員単環芳香族基であり、その例としては、ベンゼン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジンおよびピリミジンなどが挙げられる。環構造にヘテロ原子を有するこれらのアリール基は、「アリール複素環」または「ヘテロ芳香族」とも称される。該芳香族環は一箇所以上の位置に上述の置換基を有することができる。そのような置換基としては、例えば、ハロゲン、アジド、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルフォニル、スルホンアミド、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族またはヘテロ芳香族部分、−ＣＦ３、−ＣＮなどが挙げられる。「アリール」はまた、２つ以上の環を有する多環系であって、２つ以上の炭素が２つの隣接する環に共有され（それらの環は縮合環である）、それらの環の少なくとも１つは芳香族であって、他の環は、例えば、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、および／またはヘテロシクリルであってもよい多環系であってもよい。
【０１５４】
オルト、メタ、およびパラは、それぞれ１，２−、１，３−、および１，４−に置換ベンゼン類を指す。例えば、１，２−ジメチルベンゼンとオルト−ジメチルベンゼンは同義である。
【０１５５】
「ヘテロシクリル」または「複素環基」または「ヘテロアリール」は、環構造が１から４のへテロ原子を有する、３−から１０−員環構造、より好ましくは３−から７−員環を指す。複素環は、多環であってもよい。ヘテロシクリル基としては、例えば、チオフェン、チアントレン、フラン、ピラン、イソベンゾフラン、クロメン、キサンテン、フェノキサチイン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、イソチアゾール、イソオキサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、ピリミジン、フェナントロリン、フェナジン、フェナルサジン、フェノチアジン、フラザン、フェノキサジン、ピロリジン、オキソラン、チオラン、オキサゾール、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、ラクトン類、アゼチジノン類およびピロリジノン類などのラクタム類、スルタム類、スルトン類が挙げられる。複素環は一箇所以上の位置に上述の置換基を有することができる。そのような置換基としては、例えば、ハロゲン、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルフォニル、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族またはヘテロ芳香族部分、−ＣＦ３、−ＣＮなどが挙げられる。
【０１５６】
本明細書では、例えば、アルキル、ｍ、ｎなどの各表現が任意の構造の中で２回以上使われている場合、各表現の定義は、同じ構造内の別の場所のそれの定義とは独立のものである。
【０１５７】
「置換」または「置換されている」とは、その置換が置換された原子および置換基の許容価数に従ってなされ、置換によって安定な化合物が得られ、例えば、転位、環化、脱離などの変化が自発的に生じない、ということを暗黙の条件として含んでいる。
【０１５８】
本明細書では、「置換された」とは、有機化合物の全ての許容される置換基を含むことを意図している。広義において、許容される置換基には、有機化合物の非環式および環式、分岐状および非分岐状、炭素環式および複素環式、芳香族および非芳香族置換基が含まれる。具体的な置換基としては、例えば、上述の置換基を挙げることができる。許容される置換基は、適当な有機化合物に対して１つ以上で、同一または異なってよく、例えば、ハロゲン、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルフォニル、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族またはヘテロ芳香族部分、−ＣＦ３、−ＣＮなどが挙げられる。本発明の目的として、窒素などのヘテロ原子は水素置換基および／または該ヘテロ原子の価数を満足する上述の有機化合物の許容される置換基を有してもよい。本発明が有機化合物の許容される置換基によって限定されることは、何ら意図されるものではない。
【０１５９】
本発明の化合物の特定のものは、特有の幾何または立体異性体として存在してもよい。本発明はそのような化合物も想定しており、例えば、シス−およびトランス−異性体、Ｒ−およびＳ−鏡像異性体、ジアステレオマー、（Ｄ）−異性体、（Ｌ）−異性体、それらのラセミ混合物および他の混合物は、本発明の範囲に含まれる。付加的な不斉炭素原子がアルキル基などの置換基に存在してもよい。全てのそのような異性体およびそれらの混合物は、本発明に含まれるものとする。特定の実施形態においては、本発明は、本明細書に概説されている構造を有する、単一立体異性体である化合物に関する。
【０１６０】
例えば、本発明の化合物の特定の鏡像異性体が必要な場合、不斉合成により調製してもよく、あるいはキラル補助基での誘導、すなわち、得られたジアステレオマー混合物を分離し、補助基を開裂して純粋な目的の鏡像異性体を調製してもよい。あるいは、アミノなどの塩基性官能基またはカルボキシルなどの酸性官能基を有する分子では、ジアステレオマー塩を適当な光学活性酸または塩基により作成し、得られたジアステレオマーを当技術分野において周知である分別結晶法またはクロマトグラフ法により分離した後、純粋な鏡像異性体を回収する。
【０１６１】
上述の化合物の同等物としては、例えば、置換基が化合物の有効性に悪影響を及ぼさないような１つ以上の単純な変化を有しているが、その化合物の全体的な特性（例えば、細胞壊死に対する阻害作用）は該化合物と同等である、該化合物に対応する化合物を挙げることができる。一般に、本発明の化合物は、例えば、後に述べる一般的な反応手順として説明される方法またはそれらの変法により、容易に入手可能な出発物質、試薬、および従来の合成手段を用いて、調製してもよい。これらの反応では、ここに例示されない、それ自身公知である変異体を用いることも可能である。
【０１６２】
本発明の目的では、化学元素はHandbook of Chemistry and Physics, 67th Ed., 1986-87の内表紙の元素周期表（ＣＡＳ版）にしたがって特定される。
【０１６３】
非Ｎｅｃ−１ｂ化合物に特有の定義
以下の定義は、本明細書に記載される、Ｎｅｃ−１ｂ化合物以外の全ての化合物に適用され、Ｎｅｃ−１ｂ化合物については上述の代表的な定義が適用される。
【０１６４】
本発明の非Ｎｅｃ−１ｂ化合物の包括的な説明では、置換基における特定の種類の原子の数は一般に範囲として、例えば、１から７の炭素原子を有するアルキル基またはＣ１−７アルキルのように表現される。そのような範囲の言及は、特定された範囲内における各整数に対応する数の原子を有する基を具体的に参照することを含むことを意図している。例えば、１から７の炭素原子を有するアルキル基とは、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６およびＣ７のそれぞれを含んでいる。また、例えば、Ｃ１−７へテロアルキルは１から６の炭素原子と１以上のヘテロ原子を有する。これ以外の原子の数や種類も同様に示すことができる。
【０１６５】
「アルキル」および接頭辞「アルキ−」には、本明細書で用いる場合、直鎖および分岐鎖基の両者と環状基、すなわち、シクロアルキルが含まれる。断りがない限り、アルキルはＣ１−７アルキルを意味する。環状基は、単環または多環であることができ、好ましくは３から６の環炭素原子を有する。環状基として、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロへキシル基が挙げられる。Ｃ１−７アルキル基は置換されてもよく、非置換でもよい。Ｃ１−７アルキル基としては、これらに制限されないが、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、シクロプロピルメチル、シクロプロピルエチル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロブチル、シクロブチルメチル、シクロブチルエチル、ｎ−ペンチル、シクロペンチル、シクロペンチルメチル、シクロペンチルエチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、２，２−ジメチルプロピル、１−エチルプロピル、１，１−ジメチルプロピル、１，２−ジメチルプロピル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル、１，１，２−トリメチルプロピル、１，２，２−トリメチルプロピル、１−エチル−１−メチルプロピル、１−エチル−２−メチルプロピルおよびシクロヘキシルなどが挙げられる。
【０１６６】
「Ｃ２−７アルケニル」は、１つまたは複数の二重結合と２から７の炭素原子を有する分岐または非分岐の炭化水素基を意味する。Ｃ２−７アルケニルは単環または多環を有してもよく、その場合の各環は３−ないし６−員であることが望ましい。Ｃ２−７アルケニル基は置換されていてもよく、非置換でもよい。Ｃ２−７アルケニルとしては、これらに制限されないが、例えば、ビニル、アリル、２−シクロプロピル−１−エテニル、１−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、２−メチル−１−プロペニル、２−メチル−２−プロペニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、４−ペンテニル、３−メチル−１−ブテニル、３−メチル−２−ブテニル、３−メチル−３−ブテニル、２−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、２−メチル−３−ブテニル、２−エチル−２−プロペニル、１−メチル−１−ブテニル、１−メチル−２−ブテニル、１−メチル−３−ブテニル、２−メチル−２−ペンテニル、３−メチル−２−ペンテニル、４−メチル−２−ペンテニル、２−メチル−３−ペンテニル、３−メチル−３−ペンテニル、４−メチル−３−ペンテニル、２−メチル−４−ペンテニル、３−メチル−４−ペンテニル、１，２−ジメチル−１−プロペニル、１，２−ジメチル−１−ブテニル、１，３−ジメチル−１−ブテニル、１，２−ジメチル−２−ブテニル、１，１−ジメチル−２−ブテニル、２，３−ジメチル−２−ブテニル、２，３−ジメチル−３−ブテニル、１，３−ジメチル−３−ブテニル、１，１−ジメチル−３−ブテニルおよび２，２−ジメチル−３−ブテニルなどが挙げられる。
【０１６７】
「Ｃ２−７アルキニル」は、１つまたは複数の三重結合と２から７の炭素原子を有する分岐または非分岐の炭化水素基を意味する。Ｃ２−７アルキニルは単環、二環、または三環を有してもよく、その場合の各環は５−または６−員であることが望ましい。Ｃ２−７アルキニル基は置換されていてもよく、非置換でもよい。Ｃ２−７アルキニルとしては、これらに制限されないが、例えば、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−ペンチニル、４−ペンチニル、５−ヘキセン−１−イニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、４−ヘキシニル、５−ヘキシニル、１−メチル−２−プロピニル、１−メチル−２−ブチニル、１−メチル−３−ブチニル、２−メチル−３−ブチニル、１，２−ジメチル−３−ブチニル、２，２−ジメチル−３−ブチニル、１−メチル−２−ペンチニル、２−メチル−３−ペンチニル、１−メチル−４−ペンチニル、２−メチル−４−ペンチニルおよび３−メチル−４−ペンチニルなどが挙げられる。
【０１６８】
「Ｃ２−９ヘテロシクリル」または「Ｃ２−９ヘテロアリール」は、飽和、部分不飽和または不飽和（芳香族）の安定な５−ないし７−員の単環または７−ないし１４−員の二環式複素環を意味し、２から９の炭素原子とＮ、ＯおよびＳからなる群から独立に選ばれる１、２、３または４のヘテロ原子からなり、それには上記に定義した複素環がベンゼン環に縮合した二環基が含まれる。ヘテロシクリル基は置換されていてもよく、非置換でもよい。窒素および硫黄へテロ原子は酸化されていてもよい。複素環はヘテロ原子または炭素原子を介して共有結合して安定な構造を形成してもよい。例えば、イミダゾリニル環が環炭素の位置または窒素原子に結合してもよい。複素環の窒素原子は、四級化されてもよい。好ましくは、複素環中のＳおよびＯ原子の合計数が１を超える場合、これらのヘテロ原子は互いに隣り合わない。複素環としては、これらに制限されないが、例えば、１Ｈ−インダゾール、２−ピロリドニル、２Ｈ，６Ｈ−１，５，２−ジチアジニル、２Ｈ−ピロリル、３Ｈ−インドリル、４−ピペリドニル、４ａＨ−カルバゾール、４Ｈ−キノリジニル、６Ｈ−１，２，５−チアジアジニル、アクリジニル、アゾシニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフラニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾオキサゾリル、ベンズチアゾリル、ベンズトリアゾリル、ベンズテトラゾリル、ベンズイソオキサゾリル、ベンズイソチアゾリル、ベンズイミダザロニル、カルバゾリル、４ａＨ−カルバゾリル、ｂ−カルボリニル、クロマニル、クロメニル、シンノリニル、デカヒドロキノリニル、２Ｈ，６Ｈ−１，５，２−ジチアジニル、ジヒドロフロ［２，３−ｂ］テトラヒドロフラン、フラニル、フラザニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリル、１Ｈ−インダゾリル、インドレニル、インドリニル、インドリジニル、インドリル、イソベンゾフラニル、イソクロマニル、イソインダゾリル、イソインドリニル、イソインドリル、イソキノリニル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、モルホリニル、ナフチリジニル、オクタヒドロイソキノリニル、オキサジアゾリル、１，２，３−オキサジアゾリル、１，２，４−オキサジアゾリル、１，２，５−オキサジアゾリル、１，３，４−オキサジアゾリル、オキサゾリジニル、オキサゾリル、オキサゾリジニルペリミジニル、フェナントリジニル、フェナントロリニル、フェナルサジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサチイニル、フェノキサジニル、フタラジニル、ピペラジニル、ピペリジニル、プテリジニル、ピペリドニル、４−ピペリドニル、プテリジニル、プリニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリドオキサゾール、ピリドイミダゾール、ピリドチアゾール、ピリジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリジニル、ピロリニル、ピロリル、キナゾリニル、キノリニル、４Ｈ−キノリジニル、キノキサリニル、キヌクリジニル、カルボリニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロイソキノリニル、テトラヒドロキノリニル、６Ｈ−１，２，５−チアジアジニル、１，２，３−チアジアゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、１，２，５−チアジアゾリル、１，３，４−チアジアゾリル、チアントレニル、チアゾリル、チエニル、チエノチアゾリル、チエノオキサゾリル、チエノイミダゾリル、チオフェニル、トリアジニル、１，２，３−トリアゾリル、１，２，４−トリアゾリル、１，２，５−トリアゾリル、１，３，４−トリアゾリル、キサンテニルなどが挙げられる。好ましい５−ないし１０−員複素環としては、これらに制限されないが、例えば、ピリジニル、ピリミジニル、トリアジニル、フラニル、チエニル、チアゾリル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、テトラゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフラニル、インドリル、ベンズイミダゾリル、１Ｈ−インダゾリル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンズイソオキサゾリル、オキシンドリル、ベンズオキサゾリニル、キノリニル、イソキノリニルなどが挙げられる。好ましい５−または６−員複素環としては、これらに制限されないが、例えば、ピリジニル、ピリミジニル、トリアジニル、フラニル、チエニル、チアゾリル、ピロリル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピラゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、テトラゾリルなどが挙げられる。
【０１６９】
「Ｃ６−１２アリール」は、共役π電子を有している炭素原子を含む環系（例えば、フェニル）を有する芳香族基を意味する。該アリール基は６から１２の炭素原子を有する。アリール基は、単環、二環または三環を有してもよく、それらの各環は５−または６−員であることが望ましい。アリール基は置換されていてもよく、非置換でもよい。
【０１７０】
「Ｃ７−１４アルカリール」は、７から１４の炭素原子を有するアリール基により置換されているアルキル（例えば、ベンジル、フェネチル、あるいは３，４−ジクロロフェネチルなど）を意味する。
【０１７１】
「Ｃ３−１０アルキヘテロシクリル」は、１つまたは複数のヘテロ原子と７から１４の炭素原子を有する複素環により置換されているアルキルを指す（例えば、３−フラニルメチル、２−フラニルメチル、３−テトラヒドロフラニルメチル、２−テトラヒドロフラニルメチルなど）。
【０１７２】
「Ｃ１−７へテロアルキル」は、１から７の炭素原子とＮ、Ｏ、ＳおよびＰからなる群から独立に選ばれる１、２、３または４のヘテロ原子を有する分岐または非分岐のアルキル、アルケニル、アルキニル基を意味する。ヘテロアルキルとしては、これらに制限されないが、例えば、第三級アミン類、第二級アミン類、エーテル類、チオエーテル類、アミド類、チオアミド類、カルバメート類、チオカルバメート類、ヒドラゾン類、イミン類、ホスホジエステル類、ホスホロアミデート類、スルホンアミド類、ジスルフィド類などが挙げられる。ヘテロアルキルは、単環、二環または三環を有してもよく、それらの各環は３−ないし６−員であることが望ましい。ヘテロアルキル基は置換されていてもよく、非置換でもよい。
【０１７３】
「アシル」は、化学式Ｒ−Ｃ（Ｏ）−で示される化学部分を意味し、ここで、ＲはＣ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ２−６ヘテロシクリル、Ｃ６−１２アリール、Ｃ７−１４アルカリール、Ｃ３−１０アルキヘテロシクリルおよびＣ１−７ヘテロアルキルから選択される。
【０１７４】
上記定義において、置換基としては、例えば、アルコキシ、アリールオキシ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、ハライド、ヒドロキシル、フルオロアルキル、パーフルオロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アジド、ニトロ、オキソ、ヒドロキシアルキルのアシル誘導体、−ＣＯ２ＲＡ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＢＲＣ、−ＳＯ２ＲＤ、−ＳＯ２ＮＲＥＲＦおよび‐ＮＲＧＲＨが挙げられ、ここでＲＡ，ＲＢ、ＲＣ、ＲＤ、ＲＥ、ＲＦ、ＲＧおよびＲＨはそれぞれ独立にＨ、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ２−６ヘテロシクリル、Ｃ６−１２アリール、Ｃ７−１４アルカリール、Ｃ３−１０アルキヘテロシクリル、Ｃ１−７ヘテロアルキルおよびアシルから選択される。
【０１７５】
「ハライド」は、臭素、塩素、ヨウ素またはフッ素を意味する。
「フルオロアルキル」は、フッ素により置換されているアルキル基を意味する。
「パーフルオロアルキル」は、炭素およびフッ素原子のみからなるアルキル基を意味する。
【０１７６】
「ヒドロキシアルキル」は、化学式−（Ｒ）−ＯＨで示される化学部分を意味し、ここで、ＲはＣ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ２−６ヘテロシクリル、Ｃ６−１２アリール、Ｃ７−１４アルカリール、Ｃ３−１０アルキヘテロシクリルおよびＣ１−７ヘテロアルキルから選択される。
【０１７７】
「アルコキシ」は、化学式−ＯＲで示される化学置換基を意味し、ここで、ＲはＣ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ２−６ヘテロシクリル、Ｃ６−１２アリール、Ｃ７−１４アルカリール、Ｃ３−１０アルキヘテロシクリルおよびＣ１−７ヘテロアルキルから選択される。
【０１７８】
「アリールオキシ」は、化学式−ＯＲで示される化学置換基を意味し、ここで、ＲはＣ６−１２アリール基である。
「アルキルチオ」は、化学式−ＳＲで示される化学置換基を意味し、ここで、ＲはＣ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ２−６ヘテロシクリル、Ｃ６−１２アリール、Ｃ７−１４アルカリール、Ｃ３−１０アルキヘテロシクリルおよびＣ１−７ヘテロアルキルから選択される。
【０１７９】
「アリールチオ」は、化学式−ＳＲで示される化学置換基を意味し、ここで、ＲはＣ６−１２アリール基である。
「糖」は、単糖や二糖あるいは多糖の一部としてのアルドースまたはケトースを意味する。糖類には、グリコース（glycose）、グリコサミン（glycosamine）、アルドヘキソース類、ケトヘキソース類、アルドペントース、ケトペントース、二糖類、３から２０の糖単位の多糖類、およびそれらのデオキシ、ハライド（例えば、フッ素化）、アミン、アルカノエート、スルホネートおよび／またはホスフェート誘導体が含まれる。適当な単糖類としては、これらに制限されないが、７つの炭素（ヘプトース単糖）の他に、代表的には５または６（ペントース単糖またはヘキソース単糖）並びに７の炭素を有する（ヘプトース単糖）いくつかの単純な開鎖または閉鎖糖類（ＬまたはＤ配置）が挙げられる。また、環酸素原子が炭素、窒素または硫黄に置き換えられた糖誘導体、単純な糖のヒドロキシル置換基がアミノ基に置き換えられたアミノ糖類、２つの隣接する炭素原子間に二重結合を有する糖類も含まれる。本発明の化合物または方法に使用可能な糖類としては、これらに制限されないが、例えば、ラムノース、グルコース、ジギトキソース、ジギタロース、ジギノース、サーメントース、バラロース、フルクトース、グルコサミン、５−チオ−Ｄ−グルコース、ノジリマイシン（nojirimycin）、デオキシノジリマイシン、１，５−アンヒドロ−Ｄ−ソルビトール、２，５−アンヒドロ−Ｄ−マンニトール、２−デオキシ−Ｄ−ガラクトース、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、３−デオキシ−Ｄ−グルコース、アロース、アラビノース、アラビニトール、フシトール、フコース、ガラクチトール、グルシトール、イジトール、リキソース、マンニトール、レボ−ラムニトール、２−デオキシ−Ｄ−リボース、リボース、リビトール、リブロース、ラムノース、キシロース、キシルロース、アロース、アルトロース、ガラクトース、グロース、イドース、レブロース、マンノース、プシコース（psicose）、ソルボース、タガトース、タロース、ガラクタール、グルカール、フカール、ラムナール、アラビナール、キシラール、バリエナミン、バリダミン、バリオールアミン、バリオール、バリオロン、バリエノール、バリエノン、グルクロン酸、ガラクツロン酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸、グルコン酸−Ｄ−ラクトン、ガラクトン酸−γ−ラクトン、ガラクトン酸−δ−ラクトン、マンノン酸−γ−ラクトン、Ｄ−アルトロ−ヘプチュロース、Ｄ−マンノ−ヘプチュロース、Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース、Ｄ−グリセロ−Ｄ−グルコ−ヘプトース、Ｄ−アロ−ヘプチュロース、Ｄ−アルトロ−３−ヘプチュロース、Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプチトール、Ｄ−グリセロ−Ｄ−アルトロ−ヘプチトールなどを挙げられる。望ましくは、本発明の化合物に使用される糖は、次の化学式により表される：
【０１８０】
【化３５】
2009521454.tif 000036
【０１８１】
式中、Ｒ４０はＦ、Ｃｌ、ＣＦ３、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＲ４０Ａ、ＮＲ４０ＢＲ４０Ｃ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ４０Ｄ、ＮＨＣ（Ｓ）Ｒ４０Ｅ、ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲ４０Ｆ、ＮＨＣ（Ｓ）ＯＲ４０Ｇ、ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ４０Ｈ、ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨＲ４０Ｉ、ＮＨＣ（Ｏ）ＳＲ４０Ｊ、ＮＨＣ（Ｓ）ＳＲ４０Ｋ、またはＮＨＳ（Ｏ）２Ｒ４０Ｌであり、ここで、Ｒ４０Ａ、Ｒ４０Ｂ、Ｒ４０Ｃ、Ｒ４０Ｄ、Ｒ４０Ｅ、Ｒ４０Ｆ、Ｒ４０Ｇ、Ｒ４０Ｈ、Ｒ４０Ｉ、Ｒ４０Ｊ、Ｒ４０Ｋ、およびＲ４０Ｌはそれぞれ独立にＣ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ２−６ヘテロシクリル、Ｃ６−１２アリール、Ｃ７−１４アルカリール、Ｃ３−１０アルキヘテロシクリルまたはＣ１−７ヘテロアルキルを表す。
【０１８２】
本発明のその他の特徴および利点は下記の詳細な説明と特許請求の範囲から明らかである。
【発明の詳しい説明】
【０１８３】
本明細書には、化合物、医薬組成物、キット、スクリーニングアッセイ、および一定の範囲の状態を治療する方法が記載されている。本願は、細胞または組織の壊死が原因因子または結果である状態に焦点が絞られているが、本発明の方法を使用して、表１に記載する任意の状態を処置することができる。次に、本発明を作製し、使用する技法を詳述する。
【０１８４】
化合物
上記に定義するＮｅｃ−１化合物、Ｎｅｃ−２化合物、およびＮｅｃ−３化合物は、本発明の組成物、キット、および方法に有用である。本発明の化合物は、当技術分野で知られている方法に従って合成することができる。例示的なＮｅｃ−１、Ｎｅｃ−２、およびＮｅｃ−３化合物の合成方法は、例えば米国特許出願公開第２００５／０１１９２６０号；米国特許第６，７５６，３９４号；Ｔｅｎｇら、Bioorg. Med. Chem. Lett. 15:5039-5044, 2005；およびＤｅｇｔｅｒｅｖら、Nat. Chem. Bio. 1:112-119, 2005（これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）；ならびに下記の実施例に記載されている。
【０１８５】
上記の定義の１つに適合するＮｅｃ化合物はそれぞれ、本明細書に明確かつ個別に記載されていると考えられる。
本発明の化合物または医薬組成物のいずれかを１組の指示書と共に使用して、すなわちキットを形成することができる。
【０１８６】
壊死を低減する化学物質の構造誘導体
壊死を低減することが特定された低分子を構造的に改変し、続いて使用して、壊死を低減し、または壊死が起こる状態の対象者を処置することができる。例えば、低分子を次のプロセスのいずれかによって改変することができる。脂肪族二重結合の還元；脂肪族ケトンの還元；ニトロ基のプロトン、ハライド、またはサルフェートによる置換；フラボン環のＣ＝Ｏ二重結合の還元；フラボン環に結合している酸素の脱離；メトキシ基のヒドロキシル基による置換；ヒドロキシルおよびアミノ基のベンジル環への結合；Ｃ＝Ｎ二重結合の還元；フルオライド、またはヒドロキシルもしくは他のハライド基によるその置換体の脱離；水素のアルキル基による置換；ヒドロキシル、メトキシル、アミノ、およびニトロ基のベンジル環への導入；インドールの２位における二重結合の還元；インドールとヒダントイン部分間のリンカーへの二重結合の導入；チオ尿素部分の還元またはアルキル化；インドールアミノ基の還元、アルキル化、またはアシル化；様々な長さの直鎖および分岐アルキル基、およびヒドロキシル、メチル、またはカルボキシル官能基によるヒダントインの３−メチル基の置換；ならびにヒダントインのケトン部分の還元。
【０１８７】
壊死を低減する化学物質を、上記のプロセスの１つまたは上記のプロセスの様々な組合せによって改変することができる。壊死を低減する低分子の構造誘導体を生成するために使用される方法は、有機および医薬品化学の分野の技術者によく知られている。
【０１８８】
治療
本発明に従う治療は単独で、または別の治療と一緒に行うことができ、自宅、医院、クリニック、病院の外来部門、または病院で提供することができる。単独で、または組み合わせて存在する表１に記載する状態はいずれも、本発明の化合物および方法を使用して処置することができる。治療は、一般に病院で始まり、したがって医師は治療の効果を綿密に観察し、必要とされる調整を行うことができる。治療期間は、患者の年齢および状態、ならびに患者の治療への反応性に依存する。さらに、表１に記載する状態を発症するリスクがより高い者は、予防的処置を受けて、疾患の症状を抑制または遅延させることができる。
【０１８９】
【表１Ａ】
2009521454.tif 000037
【０１９０】
【表１Ｂ】
2009521454.tif 000038
【０１９１】
【表１Ｃ】
2009521454.tif 000039
【０１９２】
表１に記載する状態の例示的サブセットを、表２、３、および４に示す。
【０１９３】
【表２】
2009521454.tif 000040
【０１９４】
【表３】
2009521454.tif 000041
【０１９５】
【表４Ａ】
2009521454.tif 000042
【０１９６】
【表４Ｂ】
2009521454.tif 000043
【０１９７】
【表４Ｃ】
2009521454.tif 000044
【０１９８】
本明細書に記載するＮｅｃ化合物のいずれかを使用して、上記の表に記載する状態のいずれかを処置することができるが、表１の状態をＮｅｃ−１ｅ化合物、Ｎｅｃ−２ｂ化合物、またはＮｅｃ−３ｂ化合物で処置し、表２の状態をＮｅｃ化合物のいずれかで処置し、表３の状態をＮｅｃ−１ｃ化合物で処置し、表４の状態をＮｅｃ−１ｄ化合物で処置することが望ましい。
【０１９９】
いくつかの態様では、本発明の化合物および方法を使用して、次のいずれかを処置することができる：中枢または末梢神経系の神経変性疾患、網膜神経細胞死の結果、心筋の細胞死の結果、免疫系細胞の細胞死の結果；脳卒中、肝疾患、膵疾患、腎不全に関連する細胞死の結果；心臓、腸間膜、網膜、肝、もしくは脳虚血傷害、器官貯蔵時の虚血傷害、頭部外傷、敗血症性ショック、冠動脈心疾患、心筋症、無血管性骨壊死、鎌状赤血球症、筋肉るいそう、胃腸疾患、結核、糖尿病、血管変性、筋ジストロフィー、移植片対宿主病、ウイルス感染症、クローン病、潰瘍性大腸炎、喘息、および細胞増殖、分化、または細胞内シグナルにおける変化が原因因子である任意の状態。
【０２００】
神経変性状態は、例えばアルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ＨＩＶ関連認知症、脳虚血、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、レビー小体病、メンケス病、ウィルソン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、およびファール病である。
【０２０１】
筋ジストロフィーまたは関連疾患は、例えばベッカー型筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、ランドゥジー−デジェリン筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（スタイナート病）、先天性筋緊張症、トムゼン病、およびポンペ病である。
【０２０２】
筋肉るいそうは、癌、エイズ、うっ血性心不全、および慢性閉塞性肺疾患と関連し、かつ集中治療の壊死性ミオパチーを含む可能性がある。
細胞増殖、分化、または細胞内シグナルの変化が原因因子である状態として、癌、および例えばウイルス（例えば、急性、潜在性、および持続性）、細菌、真菌、または他の微生物による感染が挙げられる。
【０２０３】
ウイルスは、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、麻疹ウイルス、パポーバウイルス（ＪＣおよびＢＫ）、肝炎ウイルス、アデノウィルス、パルボウイルス、およびヒトパピローマウイルスである。
【０２０４】
さらに、治療対象の患者が免疫低下状態を有するか否かにかかわらず、本発明の化合物および方法を使用して、免疫系を増強することができる。例えば、Ｎｅｃ化合物は、免疫化時に、例えばアジュバントとして機能する、またはアジュバントと組み合わせることによって免疫系を強化する方法で使用することができる。
【０２０５】
医薬組成物および製剤の投与
本発明のＮｅｃ−１化合物、Ｎｅｃ−２化合物、またはＮｅｃ−３化合物を利用して、医薬組成物および製剤を調製することができる。当業者に周知の方式、例えば通常の溶解、凍結乾燥、混合、顆粒化、または糖剤化プロセスによって、本発明の医薬組成物を調製する。当技術分野で周知の製剤を作製する方法は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed., ed. A. R. Gennaro, 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia、およびEncyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New Yorkに出ている。
【０２０６】
本明細書に記載する方法のいずれかを使用して、表１の状態のいずれかを治療することができると特定された化合物を、薬剤として許容できる希釈剤、担体、または賦形剤と共に単位投与剤形として、患者または動物に投与することができる。このような治療で使用するための化学物質を、医薬品化学分野の技術者に周知の任意の標準的技法で生成し、単離することができる。本発明の方法の治療に適した化合物は、例えばＮｅｃ−１化合物、Ｎｅｃ−２化合物、およびＮｅｃ−３化合物である。通常の製薬慣行を用いて、壊死が起こる疾患患者に特定された化合物を投与するために適切な製剤または組成物を提供することができる。投与は、患者が症状を示す前に開始することができる。
【０２０７】
任意の適切な投与経路を使用することができる。例えば、治療剤を、予測された細胞死事象の部位に直接に（例えば、注射によって）、または全身に（例えば、任意の通常投与技法によって）投与することができる。化合物の投与は、非経口、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、経眼、脳室内、関節内、脊髄内、嚢内、腹腔内、鼻腔内、エアゾール、坐薬、または経口投与とすることもできる。治療製剤は、溶液剤または懸濁剤の形とすることができ、経口投与の場合、製剤を錠剤またはカプセル剤の形とすることができ、鼻腔内製剤の場合、散剤、点鼻薬、またはエアゾールの形とすることができる。薬剤として許容できる製剤中の治療化合物の投与量は、個々の患者の体格および健康を含めて、いくつかの要因に依存する。送達する投与量は、当業者によって確定することができる。
【０２０８】
非経口投与製剤は、例えば賦形剤、滅菌水、もしくは生理食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物由来油、または水素添加ナフタレンを含有することができる。生体適合性生分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーを使用して、化合物の放出を調節することができる。壊死を低減する化合物のための潜在的に有用な他の非経口送達システムとしては、エチレン−ビニルアセテートコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、植込み型注入システム、およびリポソームが挙げられる。吸入製剤は、賦形剤、例えばラクトースを含有することができ、あるいは例えばポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココレート、およびデオキシコレートを含有する水溶液とすることができ、あるいは点鼻薬の形またはゲルとしての投与向けの油性溶液剤とすることができる。
【０２０９】
本明細書に記載するように、本発明の化合物、組成物、および方法を使用して、いくつかの疾患を治療することができる。例えば、本明細書に記載する方法によって、壊死経路を介して生じる細胞死の低減が可能になる。本発明は、壊死が起こる疾患を治療する化合物および方法も提供する。これらの化合物および方法を使用して、神経変性疾患、脳卒中、肝疾患、膵疾患、虚血心もしくは脳傷害または他の虚血傷害、頭部外傷、敗血症性ショック、冠動脈心疾患、胃腸疾患、結核、血管の変化、ＨＩＶなどのウイルス感染症、あるいはエイズなどのウイルス感染症を伴う状態などの状態を治療することができる。
【０２１０】
本発明の任意の医薬組成物の使用としては例えば、動物の中枢もしくは末梢神経系、網膜神経、心筋、または免疫系細胞において細胞死を治療または軽減すること；動物において多発性嚢胞腎、腎アミロイドーシス、急性腎不全、シクロスポリンＡ誘導性マウス尿細管上皮細胞死、ＨＩＶ誘導性腎症、または貧血／赤血球造血を治療または予防すること；哺乳類の器官または組織を正常な血液供給の低下による細胞死から保護すること；宿主免疫細胞の効果による、宿主に移植された後のドナー器官または組織における細胞死を低減または予防すること；体外受精手順で使用される哺乳類の精子または卵子の死を低減または予防すること；哺乳類の細胞系の寿命を延長すること；哺乳類において脱毛または毛髪の早期白髪化を治療または軽減すること；高レベルの放射線、熱、または化学薬品への曝露による哺乳類の皮膚損傷を治療または軽減すること；動物において敗血症を治療または軽減すること；動物において肝炎を治療または軽減すること；動物において遺伝性チロシン血症１型を治療または軽減すること；動物において慢性アルコール摂取誘導性頬粘膜細胞死を治療または軽減すること；動物において放射線または紫外線照射誘導性細胞死を治療または軽減すること；熱傷後の器官細胞死を治療または軽減すること；腸管虚血−再灌流後の小腸組織傷害を治療または軽減すること；および動物において癌の化学療法または放射線療法によって生ずる口腔粘膜炎、胃腸粘膜炎、膀胱粘膜炎、直腸炎、骨髄細胞死、皮膚細胞死、または脱毛を治療、軽減、または予防することを含む。
【０２１１】
望むなら、上記の方法に従って特定された化合物を用いた治療を、アルツハイマー病の治療のための塩酸タクリン、または多発性硬化症の治療のためのインターフェロンα−１ａなど、細胞死を特徴とする疾患のより伝統的な治療剤と組み合わせることができる。
【０２１２】
投与量
選択された投与経路にかかわらず、適切な水和物の形で使用することができる本発明の化合物、および／または本発明の医薬組成物を、当業者に周知の通常の方法で薬剤として許容できる剤形に製剤する。
【０２１３】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の用量レベルは、患者への毒性がなく、特定の患者、組成物、および投与モードに所望の治療効果を実現するのに有効な一定量の活性成分が得られるように変更することができる。
【０２１４】
用量レベルの選択は、使用する本発明の特定の化合物、またはそのエステル、塩、もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用する特定の化合物の排泄または代謝速度、治療期間、使用する特定の化合物と組み合わせて使用する他の薬物、化合物、および／または材料、治療対象の患者の年齢、性別、体重、状態、全身的健康状態、および前病歴、ならびに医療技術分野で周知の同様な要因を含めて、様々な要因に依存する。１日、１週間、または１か月の投与量（または他の時間間隔）を使用することができる。
【０２１５】
当技術分野の医師または獣医は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に確定し、処方することができる。例えば、医師または獣医は、医薬組成物中で使用される本発明の化合物の用量を、所望の治療効果を実現するために必要とされるレベルより低いレベルで開始し、次いで所望の効果が実現されるまで投与量を徐々に増加させることができる。
【０２１６】
一般に、本発明の化合物の適切な１日用量は、治療効果をもたらすのに有効な最低用量である量の化合物である。このような有効用量は、一般に上記の要因に依存する。一般に、患者に対する本発明の化合物の用量は、記載された効果のために使用する場合、約０．０００１ｍｇ〜約１００ｍｇ／体重（ｋｇ）／日である。１日の投与量は、好ましくは化合物０．００１ｍｇ〜５０ｍｇ／体重（ｋｇ）、さらにより好ましくは化合物０．０１ｍｇ〜１０ｍｇ／体重（ｋｇ）である。
【０２１７】
併用療法
望むなら、Ｎｅｃ化合物を用いた治療は、表１の状態のいずれか、例えば壊死または虚血が関与する状態の治療のための治療剤と組み合わせることができる。このような治療としては、外科手術、放射線療法、化学療法、または１つもしくは複数の追加の化合物の投与が挙げられる。Ｎｅｃ化合物との併用療法に適した化合物の例を下記に示す。
【０２１８】
本発明の化合物を、アポトーシス阻害剤である化合物、すなわち、限定されるものではないが、可逆的および非可逆的カスパーゼ阻害剤のようなアポトーシスを阻害する化合物と組み合わせて投与することができる。アポトーシス阻害剤としては、例えばｚＶＡＤ（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−（ＯＭｅ）フルオロメチルケトン）、ＩＥＴＤ（Ｎ−アセチル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−ａｌ）、ＹＶＡＤ（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−ＯＭｅ）フルオロメチルケトン）、ＤＥＶＤ（Ｎ−［２−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）ベンゾイル］−Ｌ−α−アスパルチル−Ｌ−α−グルタミル−Ｎ−［（１Ｓ）−１−（カルボキシメチル）−３−フルオロ−２−オキソプロピル］−Ｌ−バリンアミド）、およびＬＥＨＤ（Ｎ−アセチル−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−ａｌ）が挙げられる。
【０２１９】
場合によっては、本発明の化合物を、ＰＡＲＰポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ阻害剤と組み合わせて投与する。ＰＡＲＰ阻害剤は限定されるものではないが、例えば６（５Ｈ）−フェナントリジノン、４−アミノ−１，８−ナフタルイミド、１，５−イソキノリンジオール、および３−アミノベンズアミドが挙げられる。
【０２２０】
本発明の化合物をＳｒｃ阻害剤と組み合わせて投与することもできる。Ｓｒｃタンパク質は、シグナル伝達において広範な役割を果たす哺乳類の細胞質チロシンキナーゼである。Ｓｒｃ阻害剤としては、ＰＰ１（１−（１，１−ジメチルエチル）−１−（４−メチルフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン）、ＰＰ２（３−（４−クロロフェニル）−１−（１，１−ジメチルエチル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン）、ダムナカンタール（３−ヒドロキシ−１−メトキシ−２−アントラ−キノンカルボアルデヒド）、およびＳＵ−５５６５が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２１】
本発明の方法は、いくつかの側面では、細胞壊死の阻害剤である化合物（例えば、ヘテロ環式チオヒダントイン、ヒダントイン、オキサゾリジノン、チオキソ−オキサゾリジノン、ピリミジン、もしくはオキサジナノン化合物、またはその組合せ）と心血管障害の治療剤との組合せを含む。このような治療剤としては、抗炎症剤、抗血栓剤、抗血小板剤、線維素溶解剤、脂質還元剤、直接トロンビン阻害剤、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体阻害剤、細胞接着分子に結合し、白血球のこのような分子と結合する能力を阻害する作用剤（例えば抗細胞接着分子抗体）、カルシウムチャネル阻害薬、β−アドレナリン受容体遮断剤、シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤、アンジオテンシン系阻害剤、およびその任意の組合せが挙げられる。１つの好ましい治療剤はアスピリンである。
【０２２２】
抗炎症剤としては、アルクロフェナク；ジプロピオン酸アルクロメタゾン；アルゲストンアセトニド；αアミラーゼ；アムシナファル；アムシナフィド；アンフェナクナトリウム；アミプリロース塩酸塩；アナキンラ；アニロラク；アニトラザフェン；アパゾン；バルサラジド二ナトリウム；ベンダザック；ベノキサプロフェン；ベンジルアミン塩酸塩；ブロメライン；ブロペラモール；ブデソニド；カルプロフェン；シクロプロフェン；シンタゾン；クリプロフェン；プロピオン酸クロベタゾール；酪酸クロベタゾン；クロピラック；プロピオン酸クロチカゾン；酢酸コルメタゾン；コルトドキソン；デフラザコート；デソニド；デスオキシメタゾン；ジプロピオン酸デキサメタゾン；ジクロフェナクカリウム；ジクロフェナクナトリウム；二酢酸ジフロラゾン；ジフルミドンナトリウム；ジフルニサル；ジフルプレドナート；ジフタロン；ジメチルスルホキシド；ドロシノニド；エンドリソン；エンリモマブ；エノリカムナトリウム；エピリゾール；エトドラク；エトフェナメート；フェルビナク；フェナモール；フェンブフェン；フェンクロフェナク；フェンクロラク；フェンドサール；フェンピパロン；フェンチアザク；フラザロン；フルアザコート；フルフェナム酸；フルミゾール；酢酸フルニソリド；フルニキシン；フルニキシンメグルミン；フルオコルチンブチル；酢酸フルオロメトロン；フルクアゾン；フルルビプロフェン；フルレトフェン；プロピオン酸フルチカゾン；フラプロフェン；フロブフェン；ハルシノニド；プロピオン酸ハロベタゾール；酢酸ハロプレドン；イブフェナク；イブプロフェン；イブプロフェンアルミニウム；イブプロフェンピコノール；イロニダップ；インドメタシン；インドメタシンナトリウム；インドプロフェン；インドキソール；イントラゾール；酢酸イソフルプレドン；イソキセパク；イソキシカム；ケトプロフェン；ロフェミゾール塩酸塩；ロモキシカム；エタボン酸ロテプレドノール；メクロフェナム酸ナトリウム；メクロフェナム酸；二酪酸メクロリソン；メフェナム酸；メサラミン；メセクラゾン；スレプタン酸メチルプレドニソロン；モルニフルメート；ナブメトン；ナプロキセン；ナプロキセンナトリウム；ナプロキソール；ニマゾン；オルサラジンナトリウム；オルゴテイン；オルパノキシン；オキサプロジン；オキシフェンブタゾン；パラニリン塩酸塩；多硫酸ペントサンナトリウム；フェンブタゾンナトリウムグリセラート；ピルフェニドン；ピロキシカム；ケイ皮酸ピロキシカム；ピロキシカムオラミン；ピルプロフェン；プレドナザート；プリフェロン；プロドール酸；プロカゾン；プロキサゾール；クエン酸プロキサゾール；リメキソロン；ロマザリット；サルコレクス；サルナセジン；サルサラート；サリシレート；サンギナリンクロライド；セクラゾン；セルメタシン；スドキシカム；スリンダク；スプロフェン；タルメタシン；タルニフルマート；タロサラート；テブフェロン；テニダップ；テニダップナトリウム；テノキシカム；テシカム；テシミド；テトリダミン；チオピナック；ピバル酸チキソコルトール；トルメチン；トルメチンナトリウム；トリクロニド；トリフルミダート；ジドメタシン；グルココルチコイド；およびゾメピラック���トリウムが挙げられる。
【０２２３】
抗血栓および線維素溶解剤としては、プラスミノーゲン（プレカリクレイン、キニノーゲン、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩａ因子、プラスミノーゲンプロアクチベーター、および組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）の相互作用を介してプラスミンとなる）ストレプトキナーゼ；ウロキナーゼ：アニソイル化プラスミノーゲン−ストレプトキナーゼアクチベーター複合体；プロウロキナーゼ（ｐｒｏ−ＵＫ）；ｒＴＰＡ（アルテプラーゼまたはアクチベース）；ｒＰｒｏ−ＵＫ；アボキナーゼ；エミナーゼ；スレプターゼアナグレリド塩酸塩；ビバリルジン；ダルテパリンナトリウム；ダナパロイドナトリウム；ダゾキシベン塩酸塩；硫酸エフェガトラン；エノキサパリンナトリウム；イフェトロバン；イフェトロバンナトリウム；チンザパリンナトリウム；レタプラーゼ；トリフェナグレル；ワルファリン；およびデキストランが挙げられる。
【０２２４】
抗血小板剤としては、クロピドグレル；スルフィンピラゾン；アスピリン；ジピリダモール；クロフィブラート；ピリジノールカルバメート；ＰＧＥ；グルカゴン；抗セロトニン薬；カフェイン；テオフィリン；ペントキシフィリン；チクロピジン；およびアナグレリドが挙げられる。
【０２２５】
脂質還元剤としては、ゲンフィブロジル、コレスチラミン、コレスチポール、ニコチン酸、プロブコール、ロバスタチン、フルバスタチン、シンバスタチン、アトルバスタチン、プラバスタチン、およびセリバスタチンが挙げられる。
【０２２６】
直接トロンビン阻害剤としては、ヒルジン、ヒルゲン、ヒルログ、アルガトロバン、ＰＰＡＣＫ、およびトロンビンアプタマーが挙げられる。
糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体阻害剤は抗体と非抗体とを含み、これらとしては、ＲｅｏＰｒｏ（アブシキシマブ）、ラミフィバン、およびチロフィバンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２７】
カルシウムチャネル阻害薬は、高血圧、狭心症、および心不整脈など、複数の心血管障害を含む様々な疾患の調節において重要な治療価値を有する化学的に多様なクラスの化合物である（Fleckenstein, Cir. Res. 52:13-16 (1983); Fleckenstein, Experimental Facts and Therapeutic Prospects, John Wiley, New York (1983); McCaIl5 D., Curr. Pract. Cardiol. 10:1-11 (1985)）。カルシウムチャネル阻害薬は、細胞のカルシウムチャネルを制御することによって、カルシウムの細胞への進入を阻止または遅延させる異質な一群の薬物である。（Remington, The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Edition, Mack Publishing Company, Eaton, Pa., p. 963 (1995)）。現在利用可能で、本発明に従って有用なカルシウムチャネル阻害薬の大部分は、主要な化学的な３群の薬物、つまりニフェジピンなどのジヒドロピリジン、ベラパミルなどのフェニルアルキルアミン、およびジルチアゼムなどのベンゾチアゼピンのうちのいずれか１群に属する。本発明によれば有用な他のカルシウムチャネル阻害薬としては、アムリノン、アムロジピン、ベンシクラン、フェロジピン、フェンジリン、フルナリジン、イスラジピン、ニカルジピン、ニモジピン、ペルへキシレン、ガロパミル、チアパミルおよびチアパミル類似体（１９９３ＲＯ−１１−２９３３など）、フェニル、バルビツレート、ならびにペプチドであるダイノルフィン、ωコノトキシン、およびωアガトキシン、ならびにそれらの薬剤として許容できる塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２８】
βアドレナリン受容体遮断剤は、狭心症、高血圧、および心不整脈においてカテコールアミンの心血管への効果に拮抗するクラスの薬物である。βアドレナリン受容体遮断剤としては、アテノロール、アセブトロール、アルプレノロール、ベフノロール、ベタキソロール、ブニトロロール、カルテオロール、セリプロロール、ヘドロキサロール、インデノロール、ラベタロール、レボブノロール、メピンドロール、メチプラノール、メチンドール、メトプロロール、メトリゾラノロール、オクスプレノロール、ピンドロール、プロプラノロール、プラクトロール、プラクトロール、ソタロールナドロール、チプレノール、トマロロール、チモロール、ブプラノロール、ペンブトロール、トリメプラノール、２−（３−（１，１−ジメチルエチル）−アミノ−２−ヒドロキシプロポキシ）−３−ピリデンカルボニトリルＨＣｌ、１−ブチルアミノ−３−（２，５−ジクロロフェノキシ−）−２−プロパノール、１−イソプロピルアミノ−３−（４−（２−シクロプロピルメトキシエチル）フェノキシ）−２−プロパノール、３−イソプロピルアミノ−１−（７−メチルインダン−４−イルオキシ）−２−ブタノール、２−（３−ｔ−ブチルアミノ−２−ヒドロキシ−プロピルチオ）−４−（５−カルバモイル−２−チエニル）チアゾール、７−（２−ヒドロキシ−３−ｔ−ブチルアミノプロポキシ）フタリドが挙げられるが、これらに限定されない。これらの化合物は、異性体混合物として、または左旋形もしくは右旋形で使用することができる。
【０２２９】
シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）は、アラキドン酸から様々なプロスタグランジンおよびトロンボキサンを生成する、大部分の組織中に存在する酵素複合体である。いくつかの選択的ＣＯＸ−２阻害剤が当技術分野で周知である。これらとしては、米国特許第５，４７４，９９５号、第５，５２１，２１３号、第５，５３６，７５２号、第５，５５０，１４２号、第５，５５２，４２２号、第５，６０４，２５３号、第５，６０４，２６０号、第５，６３９，７８０号、第５，６７７，３１８号、第５，６９１，３７４号、第５，６９８，５８４号、第５，７１０，１４０号、第５，７３３，９０９号、第５，７８９，４１３号、第５，８１７，７００号、第５，８４９，９４３号、第５，８６１，４１９号、第５，９２２，７４２号、第５，９２５，６３１号、および第５，６４３，９３３号に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。上記の特定ＣＯＸ−２阻害剤のいくつかは、選択的ＣＯＸ−２阻害剤のプロドラッグであり、それらの作用を活性で選択的なＣＯＸ−２阻害剤へのインビボ変換によって及ぼす。上記の特定ＣＯＸ−２阻害剤プロドラッグから生成される活性で選択的なＣＯＸ−２阻害剤は、国際公開第９５／００５０１号、第９５／１８７９９号、および米国特許第５，４７４，９９５号に詳細に記載されている。米国特許第５，５４３，２９７号の教示を考慮して、当業者なら、作用剤が選択的ＣＯＸ−２阻害剤であるかそれともＣＯＸ−２阻害剤の前駆体であるかを確定することができる。
【０２３０】
アンジオテンシン系阻害剤は、アンジオテンシンＩＩの機能、合成、または異化に干渉することができる。これらの作用剤としては、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンジオテンシンＩＩアンタゴニスト、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、アンジオテンシンＩＩの異化を活性化する作用剤、および最終的にアンジオテンシンＩＩが誘導されるアンジオテンシンＩの合成を防止する作用剤が挙げられるが、これらに限定されない。レニン−アンジオテンシン系は、血行動態、ならびに水および電解質バランスの制御に関与する。血液量、腎灌流圧、または血漿中Ｎａ＋濃度を低下させる要因は、系を活性化させる傾向があり、これらのパラメータを上昇させる要因はその機能を抑制する傾向がある。
【０２３１】
アンジオテンシンＩおよびアンジオテンシンＩＩは、酵素レニン−アンジオテンシン経路によって合成される。合成プロセスは、酵素であるレニンが血漿中においてアンジオテンシノーゲン、プソイドグロブリンに作用して、デカペプチドであるアンジオテンシンＩが生成されると開始する。アンジオテンシンＩは、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）によって、アンジオテンシンＩＩ（アンジオテンシン−［１−８］オクタペプチド）に変換される。後者は、様々な哺乳類の種、例えばヒトにおいていくつかの形の高血圧の病原因子として関係付けられている活性な昇圧剤物質である。
【０２３２】
アンジオテンシン（レニン−アンジオテンシン）系阻害剤は、アンジオテンシンＩＩのアンジオテンシノーゲンもしくはアンジオテンシンＩからの生成し、またはアンジオテンシンＩＩの活性に干渉するように機能する化合物である。このような阻害剤は当業者に周知であり、これらとしては、レニンおよびＡＣＥを含めて、最終的にアンジオテンシンＩＩを生成することに関与する酵素を抑制するように機能する化合物が挙げられる。これらには、一旦生成されたアンジオテンシンＩＩの活性に干渉する化合物も含まれる。このような化合物クラスとしては例えば、抗体（例えば、レニンに対する抗体）、アミノ酸およびその類似体（より大きい分子に抱合されているものを含む）、ペプチド（アンジオテンシンおよびアンジオテンシンＩのペプチド類似体を含む）、ｐｒｏ−レニン関連類似体などが挙げられる。最も強力で有用なレニン−アンジオテンシン系阻害剤の中には、レニン阻害剤、ＡＣＥ阻害剤、およびアンジオテンシンＩＩアンタゴニストがある。本発明の好ましい一態様では、レニン−アンジオテンシン系阻害剤はレニン阻害剤、ＡＣＥ阻害剤、およびアンジオテンシンＩＩアンタゴニストである。
【０２３３】
アンジオテンシンＩＩアンタゴニストは、アンジオテンシンＩＩ受容体に結合し、その活性に干渉することによって、アンジオテンシンＩＩの活性に干渉する化合物である。アンジオテンシンＩＩアンタゴニストは周知であり、これらとしては、ペプチド化合物および非ペプチド化合物が挙げられる。大部分のアンジオテンシンＩＩアンタゴニストは、わずかに改変された同族体である。これらの同族体では、８位のフェニルアラニンが他のアミノ酸で置換されていることによって、アゴニスト活性が減弱され、インビボ変性を遅延する他の置換によって、安定性を向上させることができる。アンジオテンシンＩＩアンタゴニストとしては例えば、ペプチド化合物（例えば、サララシン、［（Ｓａｎ１）（Ｖａｌ５）（Ａｌａ８）］アンジオテンシン−（１−８）オクタペプチドおよび関連類似体）；Ｎ−置換イミダゾール−２−オン（米国特許第５，０８７，６３４号）；２−Ｎ−ブチル−４−クロロ−１−（２−クロロベンジル）イミダゾール−５−酢酸を含めて、イミダゾールアセテート誘導体（Longら、J. Pharmacol. Exp. Ther. 247(1), 1-7 (1988)を参照のこと）；４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−６−カルボン酸および類似誘導体（米国特許第４，８１６，４６３号）；Ｎ２−テトラゾールβ−グルクロニド類似体（米国特許第５，０８５，９９２号）；置換ピロール、ピラゾール、およびトリアゾール（米国特許第５，０８１，１２７号）；フェニル、および１，３−イミダゾールなどのヘテロ環式誘導体（米国特許第５，０７３，５６６号）；７員環のイミダゾ縮合ヘテロ環（米国特許第５，０６４，８２５号）；ペプチド（例えば、米国特許第４，７７２，６８４号）；アンジオテンシンＩＩに対する抗体（例えば、米国特許第４，３０２，３８６号）；およびビフェニル−メチル置換イミダゾールなどのアラルキルイミダゾール化合物（例えば、欧州特許第２５３，３１０号、Jan. 20, 1988)；ＥＳ８８９１  （Ｎ−モルホリノアセチル−（１−ナフチル）−Ｌ−アラニル−（４，  チアゾリル）−Ｌ−アラニル（３５，４５）−４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−シクロ−ヘキサペンタノイル−Ｎ−ヘキシル、Sankyo Company, Ltd., Tokyo, Japan）；ＳＫＦ  １０８５６６（Ｅ−α−２−［２−ブチル−１−（カルボキシフェニル）メチル］１Ｈ−イミダゾール−５−イル［メチラン］−２−チオフェンプロパン酸、Smith Kline Beecham Pharmaceuticals, PA）；ロサルタン（ＤＵＰ７５３／ＭＫ９５４、DuPont Merck Pharmaceutical Company）；レミキリン（ＲＯ４２−５８９２、F. Hoffman LaRoche AG）；Ａ２アゴニスト（Marion Merrill Dow）、およびいくつかの非ペプチドヘテロ環（G. D. Searle and Company）が挙げられる。
【０２３４】
アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）は、アンジオテンシンＩのアンジオテンシンＩＩへの変換を触媒する酵素である。ＡＣＥ阻害剤としては、アミノ酸およびその誘導体、ジおよびトリペプチドを含めて、ペプチド、およびＡＣＥの活性を抑制し、それによって昇圧剤物質であるアンジオテンシンＩＩの生成を低減またはなくすことによってレニン−アンジオテンシン系に介入する、ＡＣＥに対する抗体が挙げられる。ＡＣＥ阻害剤は、医療において高血圧、うっ血性心不全、心筋梗塞、および腎疾患を治療するために使用されている。ＡＣＥ阻害剤として有用であることが知られている化合物クラスとしては、カプトプリル（米国特許第４，１０５，７７６号）およびゾフェノプリル（米国特許第４４，３１６，９０６号）などのアシルメルカプトおよびメルカプトアルカノイルプロリン；エナラプリル（米国特許第４，３７４，８２９号）、リシノプリル（米国特許第４，３７４，８２９号）、キナプリル（米国特許第４，３４４，９４９号）、ラミプリル（米国特許第４，５８７，２５８号）、およびペリンドプリル（米国特許第４，５０８，７２９号）などのカルボキシアルキルジペプチド；シラザプリル（米国特許第４，５１２，９２４号）およびベナザプリル（米国特許第４，４１０，５２０号）などのカルボキシアルキルジペプチド模倣体、ホシノプリル（米国特許第４，３３７，２０１号）、およびトランドロプリルなどのホスフィニルアルカノイルプロリンが挙げられる。
【０２３５】
レニン阻害剤は、レニンの活性に干渉する化合物である。レニン阻害剤としては、アミノ酸およびその誘導体、ペプチドおよびその誘導体、およびレニンに対する抗体が挙げられる。米国特許第の対象であるレニン阻害剤の例は、以下の通りである。ペプチドの尿素誘導体（米国特許第５，１１６，８３５号）；非ペプチド結合で結合されているアミノ酸（米国特許第５，１１４，９３７号）；ジおよびトリペプチド誘導体（米国特許第５，１０６，８３５号）；アミノ酸およびその誘導体（米国特許第５，１０４，８６９号および第５，０９５，１１９号）；ジオールスルホンアミドおよびスルフィニル（米国特許第５，０９８，９２４号）；修飾ペプチド（米国特許第５，０９５，００６号）；ペプチジルβ−アミノアシルアミノジオールカルバメート（米国特許第５，０８９，４７１号）；ピロルイミダゾロン（米国特許第５，０７５，４５１号）；フッ素および塩素スタチンまたはスタトンを含有するペプチド（米国特許第５，０６６，６４３号）；ペプチジルアミノジオール（米国特許第５，０６３，２０８号および第４，８４５，０７９号）；Ｎ−モルホリノ誘導体（米国特許第５，０５５，４６６号）；ペプスタチン誘導体（米国特許第４，９８０，２８３号）；Ｎ−ヘテロ環式アルコール（米国特許第４，８８５，２９２号）；レニンに対するモノクローナル抗体（米国特許第４，７８０，４０１号）；および様々な他のペプチドおよびその類似体（米国特許第５，０７１，８３７号、第５，０６４，９６５号、第５，０６３，２０７号、第５，０３６，０５４号、第５，０３６，０５３号、第５，０３４，５１２号、および４，８９４，４３７号）。
【０２３６】
細胞接着分子に結合し、このような分子と結合する白血球の能力を抑制する作用剤としては、ポリペプチド物質が挙げられる。このようなポリペプチドとしては、通常の方法に従って調製されるポリクローナルおよびモノクローナルの抗体が挙げられる。このような抗体はすでに当技術分野で周知であり、これらとしては、抗ＩＣＡＭ  １抗体および他のこのような抗体が挙げられる。当技術分野でよく知られているように、抗体分子のわずかな部分であるパラトープしか、抗体とそのエピトープの結合に関与しないことは重要である（一般に、Clark, W. R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxfordを参照のこと）。例えば、ｐＦｃ’およびＦｃ領域は補体活性化経路のエフェクターであるが、抗原結合には関与しない。ｐＦｃ’領域が酵素によって切断され、またはｐＦｃ’領域なしに生成されたＦ（ａｂ’）２断片と呼ばれる抗体は、インタクトな抗体の抗原結合部位の両方を保持する。同様に、Ｆｃ領域が酵素によって切断され、またはＦｃ領域なしに生成されたＦａｂ断片と呼ばれる抗体は、インタクトな抗体分子の抗原結合部位の一方を保持する。さらに進行すると、Ｆａｂ断片は、共有結合した抗体軽鎖、およびＦｄで示される抗体重鎖の一部分からなる。Ｆｄ断片は、抗体特異性の主な決定要因であり（単一のＦｄ断片は、抗体特異性を変更することなく、最高１０個の異なる軽鎖と結合することができる）、Ｆｄ断片は、エピトープ結合能力を分離して保持する。
【０２３７】
当技術分野でよく知られているように、抗体の抗原結合部位内には、抗原のエピトープと直接相互作用する相補性決定領域（ＣＤＲ）、およびパラトープの三次構造を維持するフレームワーク領域（Ｆｒ）が存在する（一般に、Clar, 1986; Roitt. 1991を参照のこと）。ＩｇＧ免疫グロブリンの重鎖Ｆｄ断片と軽鎖の両方には、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１からＣＤＲ３）でそれぞれ分離された４つのフレームワーク領域（ＦＲ１からＦＲ４）が存在する。ＣＤＲ、特にＣＤＲ３領域、より具体的には重鎖ＣＤＲ３は、抗体特異性を主に担う。
【０２３８】
現在、当技術分野では、哺乳類の抗体の非ＣＤＲ領域を、元の抗体のエピトープ特異性を保持しながら、同種または異種の抗体の同様な領域で置換できることは十分確立している。これは、非ヒトＣＤＲがヒトＦＲおよび／またはＦｃ／ｐＦｃ’領域に共有結合して、機能的抗体を生成する「ヒト化」抗体の開発および使用に最もはっきりと顕在化している。そういうわけで、例えば国際公開第９２／０４３８１号は、マウスＦＲ領域の少なくとも一部分がヒト由来のＦＲ領域で置換されているヒト化マウスＲＳＶ抗体の生成および使用を教示している。抗原結合能力を有する、インタクトな抗体の断片を含むこのような抗体は、「キメラ」抗体と呼ばれることが多い。
【０２３９】
したがって、当業者に明らかなように、本発明は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、およびＦｄ断片；Ｆｃおよび／またはＦｒおよび／またはＣＤＲｌおよび／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が相同なヒトまたは非ヒト配列によって置換されているキメラ抗体；ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が相同なヒトまたは非ヒト配列によって置換されているキメラＦ（ａｂ’）２断片抗体；ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が相同なヒトまたは非ヒト配列によって置換されているキメラＦａｂ断片抗体；ならびにＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２領域が相同なヒトまたは非ヒト配列によって置換されているキメラＦｄ断片抗体も提供する。本発明は、いわゆる単鎖抗体も含む。
【０２４０】
したがって、本発明は、細胞接着分子に特異的に結合する多数のサイズおよび種類のポリペプチドを含む。これらのポリペプチドは、抗体技術以外の供給源に由来することもある。例えば、このようなポリペプチド結合剤は、溶液、固定化した形で容易に調製することができる縮重ペプチドライブラリー、またはファージディスプレイライブラリーとして提供することができる。１つまたは複数のアミノ酸を含有するペプチドのコンビナトリアルライブラリーも合成することができる。さらに、ペプチドおよび非ペプチド合成部分のライブラリーも合成することができる。
【０２４１】
ファージディスプレイは、本発明によれば有用な結合ペプチドを同定する際に特に有効であり得る。簡潔に言えば、ファージディスプレイを（例えば、ｍ１３、ｆｄ、またはラムダファージを使用して）調製し、通常の手順を用いて４個〜約８０個のアミノ酸残基のインサートを示す。インサートは、例えば完全に縮重したまたは偏向した配列を表すことがある。次いで、細胞接着分子に結合するファージを有するインサートを選択することができる。このプロセスは、細胞接着分子に結合するファージの再選択を複数サイクル行うことによって繰り返すことができる。このプロセスを繰り返すことによって、ファージを有する特定の配列が濃縮される。ＤＮＡ配列分析を実施して、発現されたポリペプチドの配列を同定することができる。細胞接着分子に結合する配列の最小直線部分を確定することができる。この手順は、最小直線部分の全部に、その上流または下流に存在する１つまたは複数の追加の縮重残渣を加えた部分を含むインサートを含む偏向ライブラリーを使用して繰り返すことができる。酵母ツーハイブリッドスクリーニング法を用いて、細胞接着分子に結合するポリペプチドを同定することもできる。したがって、細胞接着分子またはその断片を使用して、ファージディスプレイライブラリーを含むペプチドライブラリーをスクリーニングし、細胞接着分子のペプチド結合パートナーを同定および選択することができる。
【０２４２】
予防的治療
表１の状態、例えば心疾患（例えば、冠動脈心疾患または虚血心傷害）または変性疾患（例えば、アルツハイマー病やハンチントン病などの神経変性疾患）のいずれかであると診断される患者において、上記の治療剤のいずれかを疾病表現型が出現する前に投与することができる。特に、壊死を低減することがわかっている化合物を、（上述するような）標準的投与量および投与経路で投与することができる。
【０２４３】
任意の対象、例えばヒト、例えばイヌやネコなどの家庭用ペット、または家畜において、本発明の方法を使用して、細胞の壊死を低減し、または本明細書に記載する障害を治療することができる。
【０２４４】
ゲルダナマイシン
ゲルダナマイシンは、シグナル伝達、細胞周期調節、および転写制御に関与する重要なタンパク質を含めて、広範囲のタンパク質の折り畳み、活性化、およびアセンブリに関与する熱ショックタンパク質−９０（Ｈｓｐ９０）の阻害剤である。ゲルダナマイシンがＨｓｐ９０に結合すると、Ｈｓｐ９０−タンパク質相互作用が混乱し、タンパク質が正確に折り畳まれることができなくなり、プロテアソームによって媒介される破壊を受けやすくなる。これらのタンパク質の中には、癌および他の疾患に関与する多くの変異または過剰発現タンパク質、例えばｐ５３、Ｂｃｒ−Ａｂ１キナーゼ、Ｒａｆ−１キナーゼ、Ａｋｔキナーゼ、Ｎｐｍ−Ａｌｋキナーゼｐ  １８５ＥｒｂＢ２膜貫通キナーゼ、Ｃｄｋ４、Ｃｄｋ６、Ｗｅｅ１、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ（ＥｒｂＢ２）、および低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）がある（例えば、米国特許第６，８８７，９９３号を参照のこと）。ゲルダナマイシンは、周知の天然物であり、例えば産生生物であるストレプトマイセス・ヒグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus var. geldanus NRL 3602）を培養することによって得られる。ゲルダナマイシン誘導体を、ゲルダナマイシンの化学修飾によって半合成することができる。
【０２４５】
表１に記載する状態、例えば細胞壊死または虚血が関与する状態のいずれかを、ゲルダナマイシンもしくはその誘導体を単独で、または１つまたは複数のＮｅｃ化合物と組み合わせて使用して治療することができる。ゲルダナマイシンおよびその誘導体は、例えば米国特許第６，８８７，９９３号、第６，８７５，８６３号、第６，８７２，７１５号、第６，８７０，０４９号、第６，８５５，７０５号、第６，８５２，４９６号、第４，２６１，９８９号、および第３，９８７，０３５号に記載されている。
【０２４６】
候補化合物を同定するためのスクリーニング
細胞壊死を減少させる化学化合物の同定
細胞が最初の攻撃を受けた後は、細胞死のアポトーシスまたは壊死の機序の一方または両方が活性化され得る。本発明においては、壊死経路に焦点が当てられる。腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）及びβ−アミロイドタンパク質への曝露等の幾つかの化学物質攻撃を用いて細胞死を誘導した。また、ヒト神経芽腫細胞（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）やヒトジャーカット（Jurkat）Ｔ細胞等の各種細胞も使用された。アポトーシスの機序を遮断するために、一般的なカスパーゼ阻害剤、即ちＣｂｚ−バリン−アラニン−アスパルチル・フルオロメチルケトン（ｚＶＡＤ−ｆｍｋ、PolverinoおよびPatterson、J. Biol. Chem. 272:7013-7021, 1997）を得た。この化合物は全てのカスパーゼを阻害し、その結果アポトーシス経路を崩壊させる。その結果生じるいずれの細胞死も、壊死の機序に起因すると考えられる。ｚＶＡＤ−ｆｍｋおよびＴＮＦαを細胞に投与した後、細胞を救出しようとして細胞に試験化合物を加えた。その結果、このプロトコルを用いて細胞生存度を回復させることが判明した化合物は、壊死経路の阻害剤である。
【０２４７】
例えば、ある方法においては、ｚＶＡＤ−ｆｍｋ／ＴＮＦαに反応して壊死が起こる可能性がある高密度（例えば、５×１０５または７．５×ｌ０５細胞／ｍＬ）の細胞の培地にｚＶＡＤ−ｆｍｋが添加される。候補物質分子、例えば化学ライブラリーからの化学化合物、例えばChemBridge Research Laboratories（サンディエゴ、カリフォルニア州）からの化合物のライブラリー等が細胞に対する様々な濃度で添加され、次いで細胞がＴＮＦαに曝露される。
【０２４８】
次いで、例えばｚＶＡＤ−ｆｍｋ／ＴＮＦαに曝露された細胞の細胞ＡＴＰレベルを測定することによって、処理された細胞の壊死の発現を測定する（Crouchら、J. Immunol. Methods 160:81-8, 1993；Storerら、Mutat. Res. 368:59-101, 1996；およびCreeら、Toxicol. In Vitro 11:553-556, 1997）。候補分子の存在下における壊死のレベルは、他の全ての因子（例えば細胞型や培養条件）を等しくして、候補分子の非存在下における壊死のレベルと比較される。本発明におけるｚＶＡＤ−ｆｍｋの重要性は、壊死による細胞死を完全に明らかにすることができるように、アポトーシスによって発現し得る細胞死を遮断することである。
【０２４９】
第２の方法においては、細胞を、ｚＶＡＤ−ｆｍｋまたはＴＮＦαのいずれかに曝露すると同時に、壊死を減少させる候補分子に曝露することができる。第３の方法においては、細胞を、最初にｚＶＡＤ−ｆｍｋおよびＴＮＦαに、次いで候補化合物に曝露することができる。これらの各方法の後に発現する壊死のレベルを上記の通りに測定する。
【０２５０】
また、細胞死刺激、例えばＴＮＦαまたはＤＭＳＯによって誘導される壊死に対する候補分子の作用は、他の方法、例えばトリパンブルーまたはアクリジンオレンジ／臭化エチジウム等の染料を使用する生体染色色素の染色によって測定することができる。
【０２５１】
壊死を減少させる化合物は、精製または実質的に精製され得、あるいは化学化合物のプール等の化合物の混合物の１つの成分であり得る。化合物の混合物のアッセイにおいて、壊死の発現は、単一の化合物または最小数の有効な化合物が壊死を減少させるまで、化合物プール（例えば、ＨＰＬＣまたはＦＰＬＣ等の標準的精製法によって作製されるもの）の徐々に小さくなるサブセットに対してテストされる。ｚＶＡＤ−ｆｍｋ／ＴＮＦαによって誘導される壊死の減少を促進する分子は、特に本発明で有用であると判断され；そのような分子は、例えば、神経変性疾患等の壊死が発現する症状の患者において壊死を減少させる療法として使用され得る。
【０２５２】
上記の方法によって例えばインビトロの系においてｚＶＡＤ−ｆｍｋ／ＴＮＦαによって誘導される壊死を効果的に減少させることが判明する化学化合物は、動物モデルにおいて更にテストされ得る。特に有用な動物モデルとしては、虚血脳または心臓傷害または他の虚血傷害、頭部外傷、神経変性疾患、冠性心疾患および敗血症性ショックの細胞死のマウスおよびラットのモデルが挙げられる。このようなモデルの例としては、ＳＯＤまたはハンチントン病遺伝子トランスジェニックマウスおよび他の知られたモデル（Liら、Hum. Mol. Genet. 8:1227-12236, 1999；Levineら、Neurosci. Res. 58:515-532, 1999；Vukosavicら、J. Neurochem. 73:2460-2468, 1999；Gruney, J. Neurol. Sci. 152 suppl. 1: S67-73, 1997；Deshmukhら、Am. J. Physiol. 273 (4 Pt 1): C1130-1135, 1997；およびIsibashiら、J. Immunol. 163:5666-5677, 1999、に記載されたもの等）が挙げられる。インビボモデルにおいて壊死を減少させる能力を示す化合物は、必要に応じて壊死を予防する療法として使用され得る。
【０２５３】
ｚＶＡＤ−ｆｍｋ／ＤＭＳＯ誘導細胞の壊死を減少させる化学化合物の同定
例えば細胞密度が低い（例えば１×１０５細胞／ｍＬ）ｚＶＡＤ−ｆｍｋ／ＤＭＳＯによって誘導される細胞壊死を減少させる化学化合物の同定方法は、壊死の誘導物質がｚＶＡＤ−ｆｍｋ／ＴＮＦαではなくｚＶＡＤ−ｆｍｋ／ＤＭＳＯであることを除いて殆ど上記の通りにして達成される。
【０２５４】
ＲＩＰ１
我々は、Ｎｅｃ化合物がＲＩＰ１（受容体相互作用タンパク質１）を阻害することができるということを発見した（例えば実施例１０参照）。従って、本発明は、ＲＩＰ１が標的分子である候補化合物を同定するスクリーニングアッセイを提供するものである。
【０２５５】
ＲＩＰ１は、ＦａｓおよびＴＮＦＲ１と相互作用することが示された固有の死ドメイン含有キナーゼである。ＲＩＰ１は、Ｓｅｒ／Ｔｈｒおよびチロシンキナーゼとの相同性を有するＮ末端キナーゼドメイン、Ｃ末端死ドメインならびに中間体ドメイン（ＩＭ）を含む。そのキナーゼ活性は、ＲＩＰの中間体ドメイン（ＩＭ）によって調節されるＤＲ誘導アポトーシスにもＮＦＫＢ活性化にも必要とされない。ＲＩＰは、ＴＮＦαやＩＬ−１β等のサイトカインや、トール様受容体３および４が媒介するＮＦκＢの誘導が包含される広範囲にわたる細胞調節の範例に寄与する。
【０２５６】
ＲＩＰ１のキナーゼ活性は、我々がその後ネクロトーシス（necroptosis）と呼称したＦａｓＬ、ＴＮＦαおよびＴＲＡＩＬによって媒介される代替的な壊死細胞死経路に必須である。我々は、一方でＲＩＰの欠如のためにこの経路に対して非感受性のジャーカット細胞のＲＩＰ欠乏クローンにおける死の受容体に誘導されたネクロトーシスに必要なＲＩＰのドメインを解析した。図２２に示すように、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）／シクロヘキサミドおよびｚＶＡＤ．ｆｍｋによって引き起こされるネクロトーシスを媒介するのにＲＩＰのキナーゼドメインが必要とされるだけでなく、分子の死ドメインも必要とされる。更に、我々は、二量化によるＲＩＰ１キナーゼの活性化がＮｅｃ−１によって阻害され得るネクロトーシスの誘導に十分であることを見出した。従って、ＲＩＰ１のキナーゼ活性は、ネクロトーシスにおける必須の上流のシグナル伝達ステップを表す。
【０２５７】
我々の発見に基づいて、ＲＩＰ１を標的として利用して、候補化合物を、ＲＩＰ１と結合する能力、さもなければＲＩＰ１を阻害する能力についてアッセイするスクリーニングアッセイを実施することができる。例えば、ＲＩＰ１の自己リン酸化の阻害を測定するアッセイを用いることができる。或いは、ＲＩＰ１に対する候補化合物の結合を測定するアッセイが、本発明の方法において有用である。結合アッセイの多くの他の変種が本技術分野で知られており、用いられ得る。ＲＩＰ１結合アッセイは、例えば米国特許第６，２１１，３３７号に記載されており、それは参照により本明細書に組み込まれる。
【０２５８】
ＲＩＰ１に特異的な化合物を同定するために、多数の標的を使用してスクリーニングアッセイを実施することができる。例えば、所定の候補化合物において、ＲＩＰ１とＲＩＰ２との両方、あるいはＲＩＰ１とＲＩＰ３との両方について、標的活性の結合、自己リン酸化または他の基準をアッセイすることが可能であり、次いでその結果を比較することができる（例えば実施例１０参照）。ＲＩＰ２、ＲＩＰ３あるいは本目的のために選択される別のホモログまたは分子よりもＲＩＰ１に大きな効果を及ぼす候補化合物は、ＲＩＰ１に対して特異的であると考えられ、本発明の方法に特に望ましくあり得る。
【０２５９】
代替のスクリーニングアッセイ
タンパク質相互作用および標的分子（例えばＲＩＰ１）の活性の阻害を測定する任意の方法を利用することができる。このような方法としては、蛍光偏光測定法、質量分析法（NelsonおよびKrone, J. Mol. Recognit., 12:77-93, 1999）、表面プラズモン共鳴（Spigaら、FEBS Lett., 511:33-35, 2002；RichおよびMizka, J. Mol. Recognit., 14:223-228, 2001；Abrantesら、Anal. Chem., 73:2828-2835, 2001）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）（Baderら、J. Biomol. Screen, 6:255-264, 2001；Songら、Anal. Biochem. 291:133-41, 2001；Brockhoffら、Cytometry, 44:338-248, 2001）、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）（Angersら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:3684-3689, 2000；Xuら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 151-156, 1999）、蛍光消光（Engelborghs, Spectrochim. Acta A. Mol. Biomol. Spectrosc, 57:2255-2270, 1999；Geogheganら、Bioconjug. Chem. 11:71-77, 2000）、蛍光活性化細胞分類／選別（Barthら、J. Mol. Biol., 301:751-757, 2000）、ＥＬＩＳＡおよびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２６０】
候補化合物
一般に、本発明のスクリーニングアッセイにおいて使用される候補化合物は、本技術分野で知られている方法によって、天然物、合成（または半合成）抽出物の両方の大きなライブラリーまたは化学物質ライブラリーから同定される。
【０２６１】
更なる方法
抗体および試薬
ＦａｓＬ（１０ｎｇ ｍＬ−１で使用）およびｚＶＡＤ．ｆｍｋ（１００μＭで使用）は、Alexis Biochemicals社から入手した。ヒトまたはマウス（ＭＥＦ細胞に使用）ＴＮＦ（１０ｎｇ ｍＬ−１で使用）は、Cell Sciences社から入手した。Sytox Green、TO-PRO-3およびDioC6は、Molecular Probes社から入手した。ヨウ化プロピジウムは、Roche社から入手した。二量化剤ＡＰ１５１０およびＡＰ２０１８７（両方とも１００ｎＭで使用）は、Ariad Pharmaceuticals社から入手した。ＣＨＸ（１μｇｍＬ−１で使用）、抗酸化剤（Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）（２．５ｍＭで使用）；スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）（８００ＵｍＬ−１；カタラーゼ（ｃａｔ．）１，４００ＵｍＬ−１；ビタミンＥ（ｖｉｔ．Ｅ）（５ｍＭ）、ファロイジン−ＴＲＩＴＣおよび全ての一般的化学物質は、Sigma社から入手した。以下の抗体が、用いられた：マウス抗βチューブリン（Stressgen社）、ウサギ抗ＬＣ３、ウサギ抗ベクリン（beclin）−１（Santa Cruz社）、ウサギ抗ギアンチン（giantin）（Covance社）、マウス抗ＫＤＥＬ（Stressgen社）およびマウス抗チトクロームｃ（Pharmingen社）。二次ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合抗体は、Southern Biotech社から入手した。二次Ａｌｅｘａ４８８複合抗体は、Molecular Probes社から入手し；Ｃｙ３複合抗体は、Jackson ImmunoResearch社から入手した。
【０２６２】
化学スクリーニング
マルチドロップ（Multidrop）ディスペンサー（Thermo Electron社）を使用して、１００μＭのｚＶＡＤ．ｆｍｋおよび４０ｎｇのｍＬ−１のヒトＴＮＦαを含有する、４０μＬのフェノールレッド不含ＲＰＭＩ１６４０培地中で、１ウェル当たり５０００〜１０，０００個の細胞で３８４ウェルプレートにおいてＵ９３７細胞を我々は平板培養した。我々は、セイコー社によるカスタムメイドのピン搬送ロボット（Institute of Chemistry and Cell Biology, Harvard Medical School）を用いて１００ｎＬのDiverSetE（ＤＭＳＯ中に５ｍｇ ｍＬ−１（Chembridge社））を添加した。７２時間後、我々は、発光に基づくＡＴＰアッセイ（ATPLite-M, PerkinElmer社）を使用して細胞生存度を評価した。我々は、陽性対照として、各プレートにＴＮＦαが投与されない細胞を分注した。我々は、Ｎｅｃ−１および他の予備的陽性対照を個々の再テストのためのChembridge社から購入した。
【０２６３】
細胞生存度アッセイ
我々は、１００μＬの適切なフェノールレッド不含培地中で、付着細胞については１ウェル当たり５，０００〜１０，０００個の細胞密度で、懸濁細胞については１ウェル当たり２０，０００〜５０，０００個の細胞密度で９６ウェルプレート（白色プレートは発光アッセイ用；黒色プレートは蛍光アッセイ用；透明プレートはＭＴＴアッセイ用）において細胞を播種した。インキュベーション後、我々は、以下の方法の内の１つを用いて細胞生存度を求めた。我々は、ＡＴＰアッセイについては、発光に基づく市販のキット（CellTiter-Glo（Promega社）またはATPLite-M（PerkinElmer社））を使用し、Wallac Victor IIプレートリーダー（PerkinElmer社）を使用して発光を解析した。我々は、Sytoxアッセイについては、３７℃で３０分間、１μＭのSytox Green試薬と共に細胞をインキュベーションし、次いで蛍光読取りを実施した。その後、我々は、各ウェルに５μＬの２０％トリトンＸ−１００溶液を添加して最大溶解を生じ、３７℃で１時間細胞をインキュベーションし、次いで第２の読取りを実施した。我々は、トリトン投与の前後で値の比（各ウェルの死細胞の率）を算出し、次いで図の説明文に示すように、細胞毒の刺激に供されない関連対照に対してそれを正規化した。ＭＴＴアッセイについては、我々はCellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assayキット（Promega社）を使用した。ＰＩ除外アッセイについては、我々は、培地中に２μｇｍＬ−１のＰＩを添加し、直ちにFACSCalibur（BD Biosciences社）を使用して試料を解析した。ＰＩ−アネキシン（Annexin）Ｖアッセイについては、我々はApoAlert Annexin V-EGFP Apoptosis Kit（Clontech社）を使用した。ＤｉｏＣ６染色については、我々は、３７℃で３０分間、４０ｎＭのＤｉｏＣ６と共に細胞をインキュベーションし、１回洗浄し、次いでFACSCaliburで解析した。ＲＯＳ解析については、我々は、３７℃で３０分間、５μＭジヒドロエチジウム（Molecular Probes社）と共に細胞をインキュベーションし、１回洗浄し、次いでFACSCaliburで解析した。我々は、Axiovert 200顕微鏡（Zeiss社）を使用して細胞の明視野像を得た。
【０２６４】
マウスにおける一過性局所脳虚血
動物は、「Guide for the Care and Use of Laboratory Animals」（National Research Council、１９９６年）に従って維持した。自発呼吸下の成体雄ＳＶ−１２９マウス（１９〜２３ｇ、Taconic Farms）を２％イソフルランによって麻酔した後、Fluotec３吸入器（Colonial Medical社製）を用いて、これらをＮ２Ｏ７０％とＯ２３０％中イソフルラン０．８〜１％の状態に保った。シリコン樹脂（Xantopren、Bayer Dental社製）と硬化剤（エラストマー活性化剤、Bayer Dental社製）の混合物でコーティングされた腔内８−０ナイロンモノフィラメント（Ethicon社製）を用いて、左のＭＣＡを閉塞した。この処置を１５分間続けた後、麻酔を停止した。２時間後、動物にイソフルランで一時的に再度麻酔をかけ、フィラメントを抜き取った。再灌流の１８時間後、マウス脳マトリックス（RBM-2000C;Activational System）を用いて、前脳を５つの冠状（２ｍｍ）断面に分けた後、これらの断面を２％の塩化２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム（Sigma社製）で染色した。画像解析システム（Bioquant IV, R&M Biometrics社製）を用いて梗塞領域を定量し、梗塞容積をそれぞれの断面に加えることによって、梗塞容積を直接算出した。
【０２６５】
薬剤投与については、７−Ｃｌ−Ｎｅｃ−１または他の誘導体を、４％のメチル−β−シクロデキストリン（Sigma社製）ＰＢＳ溶液に溶解し、それを指定の時間に脳室内投与法によって投与した。一般的には、４ｍＭ原液の２μｌ注射を２回行った（特に明記しない限り）。閉塞前送達については、２−ｈ  ＭＣＡＯ閉塞を始める５分前と、再灌流時の閉塞停止直後に注射を行った。閉塞後送達については、ＭＣＡＯの２時間後の再灌流時と再灌流開始の２時間後に注射を行った。注入に関しては、２０μｌの化合物を３０分かけて注入した。閉塞６時間後の注射に関しては、４μｌ用量を１回注射した。ｚＶＡＤ．ｆｍｋ投与に関しては、Ｎｅｃ−１製剤にそれを加えて、合計用量１６０ｎｇを投与した。
【０２６６】
細胞培養
Nakagawaら, Nature 403:98-103,2000に従って、マウス胎児性繊維芽細胞を調製し、ＳＶ−４０コード化レトロウイルスによる感染によって不死化した。Ａｔｇ５−／−ＭＥＦ細胞については、以前から記載がある（例えば、Kuma et al., Nature 432:1032-1036,2004を参照のこと）。
【０２６７】
ＤＮＡチップ解析
Poly（Ａ）Puristキット（Ambion社製）を用いて、細胞からｍＲＮＡを２度精製した。Agilent DNAチップ解析は、Harvard Center for Genomics Researchによって行われた。
【０２６８】
免疫蛍光
Ｂａｌｂｃ３Ｔ３細胞をＰＢＳ中で洗浄し、この細胞を４％ホルムアルデヒド中において２５℃で１５分間固定した。これらの細胞をＰＢＳ中で２回すすいだ後、０．４％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０％正常ヤギまたはロバ血清（Jackson Immunoresearch）のＰＢＳ溶液中において、２５℃で３０分、透過処理／ブロック処理を施した。これらのサンプルを、適当な一次抗体でインキュベートし、製造者の指示に従って、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ、１％血清のＰＢＳ溶液で、４℃で６時間希釈した。その後、ＰＢＳで３回洗浄した後、一次抗体と同様の緩衝液で１：２００に希釈された蛍光団結合二次抗体を用いて、２５℃で３０分、インキュベートを行った。ＰＢＳで２回洗浄した後、ＴＯ−ＰＲＯ−３またはファロイジン−ＴＲＩＴＣで細胞を染色し、製造者の指示に従って、２５℃で１０分、ＰＢＳで希釈した。ＰＢＳで１回洗浄した後、これらのサンプルをProLong Antifadeキット（Molecular Probes社製）を用いて取り付けた。Nikon回転ディスク共焦点顕微鏡を使用して画像を取得し、それらの画像を、Metamorphソフトウェア（Universal Imaging社製）を用いて解析した。
【０２６９】
ヨウ化プロピジウムＤＮＡ含有量分析
適当な処理の後、ジャーカット細胞を１回洗浄し、それらをＰＢＳ中に再懸濁した後、４容量の氷冷１００％エタノールを加えて、細胞を固定した。固定液を廃棄した後、細胞を氷上で１時間維持し、次いでこれらの細胞をＰＢＳで１回洗浄した。５０μｇ／ｍｌのＰＩと５μｇ／ｍｌのRNAse A（Sigma社製）を補充したＰＢＳ中に、それらを再懸濁した後、サンプルを、暗所において３７℃で１５分間インキュベートし、その後、FACSCaliburで分析した。これらのデータは、ModFitソフトウェア（Verity Software House社製）を用いて解析した。
【０２７０】
免疫ブロット
Complete Mini Protease Inhibitor錠（Roche社製）を補充した２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０ｍＭピロリン酸四ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＦ、１７．５ｍＭ  β−グリセロリン酸緩衝液に細胞を溶解した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ蛋白質アッセイ試薬を用いて蛋白質濃度を測定し、図説明文に記載された抗体を用いて、等量の蛋白質をウェスタンブロットにかけた。虚血脳サンプルの場合、皮質の損傷部位を切除し、それらを、ＲＩＰＡ緩衝液（Complete MiniProtease Inhibitorを補充した５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、１％ＮＰ−４０）に溶解し、等量の蛋白質をウェスタンブロットにかけた。ウェスタンブロットの結果を、Scion Imageソフトウェア（Scion Corporation社製）を用いて定量した。
【０２７１】
ジャーカット細胞の電気穿孔
ＤＤドメイン、ＲＩＰのキナーゼドメインおよびキナーゼ失活変異体ＲＩＰを欠いたＲＩＰ蛋白質をコード化する、pcDNA3-RIP-(1-580)-Fpk3-Myc、pcDNA3-RIP-(1-287)-Fpk3-Myc(pFR-KD)とpcDNA3-RIP-(1-580)-K45M-Fpk3-Myc（それぞれ、３つのFKBP12蛋白質コピー、および対照ベクターであるpcDNA3-Fpk3-Myc (pFpk)に融合している）は、Ｇ．Ｎｕｎｅｚ氏（ミシガン大学）から親切にも贈られたものであった。対応するｃＤＮＡを用いて全長ＲＩＰを増幅し、それを、切断ＲＩＰを置き換えるpcDNA3-RIP-(1-580)-Fpk3-Mycにクローン化して、全長ＲＩＰコード二量化構成物（ｐＦＲ）を生成した。この構成物を用いて、QuikChange変異誘発キット（Stratagene社製）により、キナーゼ失活変異体（pFR-K45M）を生成した。
【０２７２】
ミリストイル化シグナルとそれに続く２つの３６ｖ変異体ＦＫＢＰ１２（Ｆｖ２Ｅ）コピー、およびＦＡＤＤのコード化領域からなるＦＡＤＤ二量化カセットをコード化するｐＦＦ構成物を生成するために、ｐＣ４Ｍ−Ｆｖ２Ｅプラスミド（Ariad Pharmaceuticals社製）およびＦＡＤＤｃＤＮＡを用いて、Ｆｖ２ＥとＦＡＤＤのそれぞれをＰＣＲ増幅し、これらの断片をｐｃＤＮＡ６ベクター（インビトロゲン）にクローン化した。
【０２７３】
電気穿孔については、２０×１０６個のＦＡＤＤ欠損ジャーカット細胞を、１．２５％ＤＭＳＯを補充した１ｍｌの低浸透圧血（hypoosmolar）緩衝液（Eppendorf社製）に再懸濁し、細胞を１８μｇのＲＩＰベクターおよび２μｇの空ｐＥＧＦＰベクターと混合した後、Gene Pulser II（Bio-Rad社製）を用いて電気穿孔を行った。細胞を５〜１０分間静置した後、それらを、１．２５％ＤＭＳＯ、１％グルタミン、１％抗生物質−抗真菌薬混合物（インビトロゲン）および１０％熱不活性化ウシ胎仔血清を補充した、４ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地に移した。３時間後、Ficoll-Paque（Pharmacia社製）を用いて生細胞を分離し、それらを１回洗浄した後、二量化試薬ＡＰ１５１０（Ariad Pharmaceuticals社製）および記載した他の化学物質を含む培地に再懸濁した。所定の時間処理した後、それぞれのサンプルに２μｇ／ｍｌのＰＩを加え、生存可能なＰＩ陰性のＧＦＰ発現細胞の割合を測定した。また、ブラストサイジン（インビトロゲン）中に二量化可能なＦＡＤＤ（JK-FF）を発現するジャーカット細胞の安定クローンを選択した。
【０２７４】
ウイルス性ＲＮＡｉベクターの生成
ＲＮＡｉ配列を含むオリゴヌクレオチドを、ｐＭＳＣＶ−ｐｕｒｏ（インビトロゲン）ウイルス性ベクターに基づき、かつＨ１プロモーターを有する、ｐＳＲＰベクターに直接連結した。公表済みのマウスベクリン−１の配列を使用した（例えば、Yu et al., Science 304:1500-2502, 2004を参照のこと）。レトロウイルスＧａｇ／ＰｏｌおよびＶＳＶ−Ｇ蛋白質をヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞にコード化するプラスミドを用いて、ｐＳＲＰベースのベクターを同時トランスフェクションすることによってウイルスを生成した。Ｂａｌｂｃ３Ｔ３細胞を、それぞれのウイルスで３回感染させた後、ピュロマイシンで選択した。安定した細胞集団を用いて、標的蛋白質の発現および細胞生存度を解析した。
【０２７５】
実施例
以下の実施例は、本発明を説明するために提供されるものであって、限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例１】
【０２７６】
ＣＩＣＤ／ネクロトーシスの小分子阻害剤の特徴づけ
ヒトＵ９３７細胞における既知のデスレセプター（death receptor）媒介性カスパーゼ-非依存性細胞死の例を用いて、カスパーゼ-非依存性細胞死（ＣＩＣＤ）(caspase-independent cell death)の小分子阻害剤について、３８４穴フォーマットを用いた高速大量スクリーニング法(high-throughput screen)を確立した。本システムでは、ＴＮＦαおよびｚＶＡＤ.ｆｍｋの存在下でＣＩＣＤを受けるようにＵ９３７細胞を誘導し、細胞死率を、細胞内ＡＴＰレベルを測定する市販の発光ベースのアッセイ(Ｐａｃｋａｒｄ)であるＡＴＰ-Ｌｉｔｅ-Ｍアッセイにより測定した。Ｕ９３７細胞は、これら細胞がＣＨＸのようなさらなるストレス-誘導感作刺激剤（stress-inducing sensitizing stimuli）の非存在下でも、ＴＮＦα／ｚＶＡＤ処理時に非常に効率良くＣＩＣＤを受けるように誘導でき、ＣＩＣＤ阻害剤の同定を信頼できるものにするために該システムを完全に適合させるため、選択した。さらに、Ｕ９３７細胞の高速懸濁増殖速度は、大量の細胞を入手可能にし、該細胞は高速大量スクリーニングに理想的な強いシグナルになる。ＡＴＰ-Ｌｉｔｅ-Ｍアッセイは、試験したすべての異なるアッセイシステムの内、該アッセイは、もっとも一貫性のある強いシグナルを呈し、該シグナルは高速大量スクリーニングにも重要であるため、選択された。Ｕ９３７をＴＮＦα単独にさらすと、部分的に細胞死が起こるが、ＴＮＦαおよびカスパーゼ阻害剤ｚＶＡＤ.ｆｍｋで共処理すると、細胞死の量が有意に増加し、ＡＴＰの損失は、公表された知見と一致する。さらに、ｚＶＡＤ.ｆｍｋの存在下では、細胞消失の形態は、アポトーシスの細胞収縮（cell shrinkage）、核断片化（nuclear  fragmentation）、膜ブレブ形成（membrane blebbing）を伴うアポトーシスから、細胞膨張、サイトソル密度増加および原形質膜完全性の早期消失を特徴とするネクローシスに変化する。ＭＴＴアッセイ(ミトコンドリア代謝)およびＳｙｔｏｘアッセイ(原形質膜の浸透圧)のような、その他の細胞死アッセイを、スクリーニングを確認する別の手段として用いると、ＡＴＰ-Ｌｉｔｅ-Ｍアッセイを用いて得られた結果と類似した結果が一貫して得られ、このことから、ＡＴＰ-Ｌｉｔｅ-Ｍアッセイを用いるとＣＩＣＤの程度を正確に測定できることが確認された。ＡＴＰ-Ｌｉｔｅ-Ｍアッセイと比較した卓越した感受性により、その他の市販のＡＴＰアッセイ、Ｃｅｌｌ-Ｔｉｔｅｒ-Ｇｌｏ(Ｐｒｏｍｅｇａ)もまた、その後の分析に用いられ、匹敵する結果が得られる。
【０２７７】
市販品ならびにコンビナトリアルケミストリー合成の両方から得られたおおよそ１５,０００の小分子の種々のケミカルコレクションを、Ｕ９３７細胞死アッセイを用いてスクリーニングし、最も高い活性を有する３つの化合物(ネクロスタチン)をさらなる分析用に選択した(図１)。これらの化合物、Ｎｅｃ-１、Ｎｅｃ-２およびＮｅｃ-３は、それぞれ(上に示したように)、Ｎｅc-１化合物、Ｎｅｃ-２化合物およびＮｅｃ-３化合物クラスの模範的化合物である。
【０２７８】
ＣＩＣＤを阻害するこれらのＮｅｃ化合物のＥＣ50値は変化するが、一般的に、下位(sub-)／低いμＭの範囲である（表５）。該表では、ＥＣ50値は、ＴＮＦαで３６時間処理したＦＡＤＤ欠損ジャーカット細胞で細胞死の５０％を救うために必要な濃度を示しており、該細胞は、ＡＴＰアッセイによって測定されるようなＣＩＣＤを誘導するが、該アッセイでは、Ｎｅｃ-２についての値は、二量体化因子(dimerizer)／ｚＶＡＤで３６時間処理した二量体化できるＦＡＤＤを発現するジャーカット細胞を用いて得られ、ＡＴＰレベルについてアッセイした。ＬＤ50値は、ＴＮＦαまたは二量体化因子非存在下、化合物での相当するジャーカット細胞の処理に基づき、計算された。これら化合物は、いずれも、対照の健康細胞のＡＴＰレベルを増加させなかった。
【０２７９】
【表５】
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【０２８０】
最初に単離されたネクロスタチンＮｅｃ-１は、最も高いネクロスタチン活性を示すが、多数の細胞アッセイで、さらに特徴を調べた。Ｎｅｃ-１の選択性を試験するために、Ｎｅｃ-１がアポトーシスを遮断する能力を持たないことを確かめた。ジャーカット細胞のＦａｓリガンド-誘導アポトーシスは、パンカスパーゼ(pan caspase)阻害剤ｚＶＡＤ．ｆｍｋによって保護されたが、Ｎｅｃ-１によっては保護されなかった（図２Ａ）。ＦａｓＬおよびＣＨＸでのジャーカット細胞の同時処理もまた、アポトーシスを誘導するが、Ｎｅｃ-１によって阻害することはできなかった（図２Ｂ）。ＣＨＸでの同時処理は、ｚＶＡＤ.ｆｍｋ存在下でのＦａｓＬによるＣＩＣＤ誘導に対して、細胞をより感受性にしたが、この誘導は、Ｎｅｃ-１によって効率よく阻害された（図２Ｂ）。アポトーシスではないが、ＤＲ-誘導ＣＩＣＤからの同様の防御は、Ｕ９３７、Ｂａｌｂｃ３Ｔ３、およびマウス胎芽繊維芽細胞（ＭＥＦ）（mouse embryonic fibroblast）のような、他の細胞型でも認められた。さらに、他のネクロスタチンもまた、特異的なＣＩＣＤ阻害剤であることが分かった。これらの結果から、選択された化合物はＣＩＣＤの特異的阻害剤であり、ネクロトーシスシグナル化経路を選択的に標的化するために利用できることが、分かる。ネクロスタチンがアポトーシスを阻害できないことは、さらに、ＣＩＣＤが、あるカスパーゼ-依存特性を持たないアポトーシスというよりむしろ、別の細胞プロセスを示しているという考えを支持する。
【０２８１】
ネクロトーシスによるものであって、アポトーシスによるものでない死の選択的阻害に加えて、Ｎｅｃ-１効果の厳密な選択性はまた、細胞生理の多様な特徴に対する化合物の効果がないことを示すことによって、確認された。我々は、Ｎｅｃ-１が、健康細胞内で、ＡＴＰレベル、ミトコンドリア膜電位差、原形質膜完全性、細胞の形または大きさ、細胞周期分布、増殖、全体的なｍＲＮＡ発現、反応性酸素種の細胞内レベル、細胞粘着性、アクチンおよび微小管細胞骨格または様々な細胞構成部、例えば、核、ゴルジ体、ＥＲおよびミトコンドリア、の形態に対して一般的効果を有さないことを見いだした。
【０２８２】
Ｎｅｃ-１は、ＴＮＦα／ｚＶＡＤ.ｆｍｋで誘導したヒト単球Ｕ９３７およびマウス繊維芽細胞Ｂａｌｂｃ  ３Ｔ３のＣＩＣＤ、ｚＶＡＤ.ｆｍｋ存在下、ジャーカット細胞中で二量体化された外因性ＦＡＤＤおよび／またはＲＩＰによって誘導されたＣＩＣＤ、ＦａｓＬ／ＣＨＸ／ｚＶＡＤ.ｆｍｋによって誘導されたＣＩＣＤ、ＦＡＤＤ欠損変異クローンのジャーカット細胞でのＴＮＦα-誘導ＣＩＣＤ、およびマウス繊維肉腫Ｌ９２９細胞でＴＮＦαにより誘導されたＣＩＣＤ、を含む様々な細胞システムで、ＣＩＣＤに対して一貫した活性を示した。これらシステムでカスパーゼを阻害すると、Ｌ９２９およびＦＡＤＤ欠損細胞を除き、アポトーシスが壊死に変わることが、以前に報告されており、該除外細胞では、壊死の誘導は、カスパーゼ阻害剤不在下での主な細胞死応答であることが、以前から示されており、我々は、一貫して、ｚＶＡＤ.ｆｍｋ不在下で、Ｎｅｃ-１により死が阻害されることを見いだした。該システムのすべてでＣＩＣＤを阻害するＮｅｃ-１の能力は、該効果が、ＴＮＦα／ｚ-ＶＡＤ.ｆｍｋで処理されたＵ９３７細胞、オリジナルのスクリーニングに用いたアッセイに限定されないこと、類似のネクロトーシス経路は、様々なＤＲ-関連死-誘導刺激に応答して多様な細胞型で起こることを示している。さらに、これらのデータは、ＣＩＣＤがアポトーシスに失敗した場合の単なる副産物ではなく、少なくともある場合、ＣＩＣＤがアポトーシスが起こらない場合に活性化される死の主な機構であることを、示している。
【０２８３】
酸化防止剤ＰＤＴＣおよびＢＨＡ、ならびにｈｓｐ９０阻害剤ゲルダナマイシン（geldanamycin）を含む多数の化合物は、抗-ＣＩＣＤ活性を有することが報告されてきた。さらに、我々は、カテプシンＢ阻害剤Ｃａ-０７４-Ｍｅおよびｐ３８阻害剤が、ある選択された細胞株で抗-ＣＩＣＤ活性を有することを見いだした。我々は、Ｎｅｃ-１とこれら化合物の活性を比較した。興味深いことに、我々は、Ｎｅｃ-１が全細胞ベースアッセイで抗-ＣＩＣＤ活性を有する唯一の化合物であることを見いだした。例えば、ｐ３８阻害剤ＰＤ１６９３１６は、３Ｔ３細胞でＣＩＣＤを阻害し、カテプシンＢ阻害剤Ｃａ-０７４-Ｍｅは、ジャーカットおよび３Ｔ３細胞でＣＩＣＤを阻害するが、これら化合物もゲルダナマイシンも、Ｎｅｃ-１と違って、Ｌ９２９細胞では働かない（図３）。これらのデータは、ＣＩＣＤの普遍的阻害剤を製造するための高速大容量スクリーニング研究方法のユニークな能力を強調している。
【０２８４】
この概念と一致するが、我々は、ジャーカットおよびＢａｌｂｃ３Ｔ３細胞のネクロトーシス細胞死は、ミトコンドリア膜透過性遷移細孔（mitochondrial permeability transition pore）（ＭＰＴＰ）、カルパイン、カルシウムホメオスタシス恒常性摂動、ＨｔｒＡ２／Ｏｍｉ、ホスホリパーゼＡ２および酸化窒素シンターゼのような因子の小分子阻害、またはアポトーシス誘導因子（Apoptosis inducing factor）（ＡＩＦ）のＲＮＡｉ-媒介ダウンレギュレーション、によって遮断できないと決定した。また、我々は、既知の生物活性を有する４８９の化合物のＢｉｏｍｏｌ／ＩＣＣＢ化学ライブラリーをスクリーニングし、全細胞型でＮｅｃ-１の様にＣＩＣＤを遮断できる化合物はないことを見出した。これらの結果は、ネクロトーシス細胞死の遮断におけるネクロスタチンの活性のユニークさを強調している。
【０２８５】
ＣＩＣＤは、以前、抗酸化剤によって阻害可能であると示唆されたことがあるため、ＴＮＦα／ｚ-ＶＡＤ.ｆｍｋによって誘導されたＵ９３７細胞のＣＩＣＤを抗酸化剤によって阻害できるか否か、さらに、Ｎｅｃ-１が酸化ストレスによって誘導された細胞死を阻害できるか否かについて、試験した。Ｕ９３７細胞を、ＴＮＦα／ｚＶＡＤ.ｆｍｋで７２時間、または酸化ストレス誘導剤メナジオン（menadione）で２４時間処理した。Ｎｅｃ-１は、ＴＮＦα／ｚＶＡＤ.ｆｍｋに対して予想された防御を提供したが、メナジオンが誘導する細胞死に対しては防御を提供せず、これに対して、抗酸化剤Ｎ-アセチル-システイン、スーパーオキシドジスムターゼ（superoxide dismutase）、カタラーゼ、ビタミンＥは、メナジオンに対する防御を提供するが、ＴＮＦα／ｚＶＡＤ誘導細胞死を防御することはなかった（図４）。活性酸素種（reactive oxygen species）（ＲＯＳ）は、ある型のＣＩＣＤに関与する可能性があるが、ＲＯＳは、ネクロトーシス細胞死経路のキーメディエーターではないと、われわれは結論を下している。さらに、Ｎｅｃ-１が抗-酸化剤メカニズムを通してＴＮＦα／ｚＶＡＤ.ｆｍｋ誘導細胞死を防御することは、考えにくい。
【０２８６】
ＰＡＲＰ-１は、ニコチンアミドの遊離を伴う、呼吸補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+）のタンパク質結合ＡＤＰ-リボースポリマーへの転化を触媒することによりＤＮＡ損傷に応答する核タンパク質である（Ｄ’Ａｍｏｕｒｓら、１９９９）。ＤＮＡ損傷に関与することに加えて、ＰＡＲＰ-１は、グルタメート興奮性毒性（excitotoxicity）、虚血性障害およびＭＰＴＰによって誘導される神経性細胞死のカスパーゼ-非依存性成分に寄与することが示された。従って、ＮＥＣ-１がＰＡＲＰ阻害剤として作用し得る可能性について、試験した。しかしながら、ＰＡＲＰ阻害剤、６(５Ｈ)-フェナントリジオンまたはＤＰＱ(３,４-ジヒドロ-５[４(１-ピペリンジニル)ブトキシ]-１(２Ｈ)-イソキノリン)は、ジャーカット細胞のＣＩＣＤ（図５Ａ）、ならびに、Ｕ９３７およびＢａｌｂｃ３Ｔ３を含む、上記のＣＩＣＤシステムを阻害できず、またＰＡＲ-ポリマー生成もネクロトーシス細胞内で検出できなかったので、ＰＡＲＰは、ＣＩＣＤのキーレギュレーターであるとは考えにくいと結論付けた。さらに、Ｎｅｃ-１は、ＰＡＲＰ活性化を通して媒介される、ＤＮＡアルキル化剤１-メチル-３-ニトロ-１-ニトロニトロソグアニジン(ＭＮＮＧ)-誘導死（図５Ｂ）から細胞を防御できなかった。
【０２８７】
さらに、Ｎｅｃ-１およびその他のネクロスタチンは、形および大きさの変化（前方／側方散乱分析）、ＡＴＰ損失(ＡＴＰアッセイ)、ミトコンドリア機能不全（ＭＴＴアッセイおよびＤｉＯＣ６染色）および原形質膜透過性上昇（Ｓｙｔｏｘ／ＰＩアッセイ）を含む、ネクロトーシス死の全ての徴候を阻害する。さらに、Ｎｅｃ-１は、ＴＮＦα-処理ＦＡＤＤ-欠損細胞の増殖を、未処理細胞と区別できない速度で、可能にした。これらの結果と一致するが、電子顕微鏡（ＥＭ）(electron microscopy)、蛍光および光学(bright field)顕微鏡を用いた形態分析から、Ｎｅｃ-１はネクロトーシス細胞死の全ての徴候を阻害することが示された。
【実施例２】
【０２８８】
ネクロスタチンの薬化学研究
最初の高速大量スクリーニングで見つかったＮｅｃ-１（メチルチオヒダントイン-トリプトファン、ＭＴＨ-Ｔｒｐ）（ＥＣ50＝４９４ｎＭ）の系統的修飾を、その効力を向上させるために、その毒性を減少させるために、さらに、その代謝安定性を増加させるために、行った（図６）。最初に、分子のチオヒダントイン部分を変化させることはなかった。代わりに、インドール環の様々な修飾について調べた。インドール環を、ベンゾチオフェン、ベンゼン環、およびピリジンで置換した。しかしながら、これらの変化はすべて、分子の活性に有害であった。次に、インドール環上の様々な置換基について調べた。我々は、インドール環の7-位への小さな電子-中性（即ちメチル）、電子-供与性（即ちメトキシ）、または電子-求引性（即ちクロリド）基の導入が抗ＣＩＣＤ活性を増加させることを見いだした。例えば、７-クロロ誘導体、７-Ｃｌ-Ｎｅｃ-１、はＴＮＦαで処理したジャーカット  ＦＡＤＤ欠損細胞でＥＣ50＝１８２ｎＭであり、これらの誘導体のうちで最も高い活性を有した。この分子を、我々のインビボでの虚血性脳障害モデルで、さらに研究を行うために選択した。(２-および４-位を含む)インドール環のいくつかの位置はいかなる置換も許容しないことが分かったが、一方、５-および６-位の置換は完全には禁止されず、有効性が減少するのみである。同様に、ヒダントイン環とインドールの間のメチレン橋もまた、いかなる置換をも許容しなかった。最終的に、インドール環の窒素が置換されていない化合物が最良であることが分かった。最適化された分子のインドール部分用い、次に、チオヒダントイン部分について、詳細に検討した。特に、ヒダントイン環へのチオヒダントインの転化について試験した。ヒダントイン環は毒性がより少なく、代謝安定性がより大きいと予想される。得られた誘導体、７-Ｃｌ-Ｏ-Ｎｅｃ-１は、等しい強さの抗-ＣＩＣＤ活性を有するが、非特異的毒性が著しく減少した（ＬＤ50＞１ｍＭ）。ヒダントイン環の２つの窒素上の置換基についてもまた、試験した。尿素窒素は、分枝鎖でない小さいアルキル基（即ちＭｅおよびＥｔ）を許容するのみであることが分かった。用量依存応答曲線を図７に示す。
【０２８９】
ヒダントインのアミド窒素のみならず、アミドへのα-炭素もまた、いかなる置換をも許容しなかった。次に、７-Ｃｌ-Ｏ-Ｎｅｃ-１の鏡像異性体を製造した。(Ｒ)-鏡像異性体(「Ａ異性体」とも言う)（ＥＣ50＝４７ｎＭ）は、ＣＩＣＤ阻害で、(Ｓ)-鏡像異性体（「Ｂ異性体」とも言う）より約４倍強いことが分かった。ＣＩＣＤの阻害に関しての一連のＮｅｃ-１の構造-活性-相関（ＳＡＲ）(structure-activity-relationship)についての完全な概説を図８に示した。Ｎｅｃ-１  ＳＡＲの理解は、インビトロおよびインビボでの強い抗-ＣＩＣＤ活性を有し、最少の非特異的毒性を有し、そして代謝安定性がより大きい可能性のある誘導体の合成をもたらした。
【実施例３】
【０２９０】
虚血性脳障害のマウスモデルでのＮｅｃ-１誘導体のインビボでの効果
脳虚血のマウス２時間中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）／再潅流モデルでのＮｅｃ-１誘導体の効果について、研究を行った。（虚血性障害と関連する）梗塞容量および行動変化での有意な用量依存性減少を、ｉｃｖ注射後に検出した（図９）。
【０２９１】
脳虚血性障害の発症後、６時間までの7-Ｃｌ-Ｎｅｃ-１注射は、防御を提供し（図１０Ａ）、これは、興奮毒性の阻害剤（例えばＭＫ-８０１、グルタメートレセプターアンタゴニストは、閉塞１時間後に投与した場合、作用を停止する）およびアポトーシスの阻害剤（ｚＶＡＤ.ｆｍｋは、閉塞後３時間まで有効である）を含む、現在追跡されている薬剤候補群の大部分について報告された、ＭＣＡ閉塞後２時間の虚血-再潅流モデルを用いた治療時間枠（therapeutic window）にまさる。虚血性脳障害中にアポトーシスおよびネクローシスの両方を誘導することから、ネクロスタチンがカスパーゼ阻害剤と共に追加の防御効果を示すはずであると、予想される。ｚＶＡＤ.ｆｍｋを単独、またはＮｅｃ-１と組み合わせた場合の効果を比較することによって、この可能性について試験した。カスパーゼ阻害剤が未だ高い効果を有する時間枠である、虚血性障害の発症後２時間に、Ｎｅｃ-１をｚＶＡＤ.ｆｍｋと一緒に投与した場合に、Ｎｅｃ-１は、カスパーゼ阻害剤と一緒になって、さらなる防御効果を示した（図１０Ｂ）。興味深いことに、カスパーゼ阻害剤がもはや有効でない時間点である、虚血性障害発症後６時間に投与した場合にも、Ｎｅｃ-１は、未だ、統計学的に有意な防御を示した（図１０Ｂ）。さらに、７-Ｃｌ-Ｎｅｃ-１の神経保護効果は、カスパーゼ-３活性化の減少と関連しなかった（図１０Ｃ）。
【０２９２】
これらの結果は、ネクロスタチンが：１）非依存性非-アポトーシス細胞死の経路を標的とすると言う考え、２）アポトーシス阻害剤にさらなる防御を提供できると言う考え、および、３）ＣＩＣＤの誘導を遅らせることにより、治療の時間枠を延長すると言う考え：を支持し、このクラスの化合物を虚血性脳障害の処置の候補として非常に見込みがあるものにする。実際、我々のインビボでの研究で検出されたＣＩＣＤの遅れは、ＣＩＣＤを、より速い発症を伴う別の型の虚血性細胞死よりも、抗-卒中治療についてのより「薬にできる(druggable)」標的にする可能性を秘めている。
【実施例４】
【０２９３】
ＣＩＣＤおよび虚血性脳障害でのＬＣ３IIの蓄積
Ｌ９２９細胞のｚＶＡＤ.ｆｍｋ-誘導ＣＩＣＤにおける自食作用（autophagy）の役割を含意する以前の報告によって示唆されたように、ネクロトーシス細胞死の間に自食作用、蛋白質分解／異化メカニズム、が活性化されるか否かについて、調べた。微小管関連タンパク質１軽鎖３II（ＬＣ３II）のホスファチジルエタノールアミン結合フラグメントの蓄積は、自己融解液胞の形成における早期の重要な工程であることが示されているため、該フラグメントの蓄積をマーカーとして用いた。実際、ＬＣ３IIの蓄積は、ＴＮＦα／ｚＶＡＤまたはＦａｓＬ／ｚＶＡＤ（図１１Ａ）で処理したネクロトーシスＢａｌｂｃ  ３Ｔ３、ならびにその他の細胞株、例えばＪＫおよびＵ９３７細胞、で検出された。さらに、ＬＣ３IIの出現は、Ｎｅｃ-１によって効率良く阻害され、ＣＩＣＤ阻害におけるＮｅｃ-１の役割と一致する（図１１Ａ）。また、ＬＣ３IIの蓄積は、虚血性脳でも検出された（図１２Ｂ）。興味深いことに、ＬＣ３１１の量の増加は、アポトーシスのマーカーとは反対に、ゆっくりした反応速度で起こった。例えば、カスパーゼ-３の活性化は、早く起こり、閉塞後１時間で検出可能であったが、これに対してＬＣ３IIレベルは、ＭＣＡ閉塞後５時間で増加し始め、おおよそ８時間後でピークに達した。さらに、Ｎｅｃ-１の遅い投与はＬＣ３IIの生成を阻害し、このことは、脳虚血中のＣＩＣＤの活性化が遅いことと一致する。この結果は、ＣＩＣＤが虚血性障害後の遅い神経細胞死の１つの型であるという考えを支持し、何故Ｎｅｃ-１が損傷後６時間で送達された場合に梗塞容量を減少させることができるかについての理論的解釈を提供する。さらに、これらの結果から、虚血性脳障害中に起こる分子イベント、および細胞培養モデルでのＤＲ-誘導ＣＩＣＤにおける類似性のネクロスタチン-非依存性の確認が提供される。
【実施例５】
【０２９４】
インビボでのＮｅｃ-１活性の構造-機能分析
インビボでのＮｅｃ-１の活性の特異性を確認するために、インビボでの虚血性脳障害に対する防御に関して、ＳＡＲ分析を行った。最初に、ＭＡＣＯモデルで、ヒダントイン部分のメチル基を欠くＮｅｃ-１の不活性誘導体であるＮｅｃ-１ｉについて試験した（図１２Ａ）。再潅流の前およびすぐ後に２用量で、Ｎｅｃ-１がもっとも大きい防御を提供する条件で、送達した場合（図１０）、Ｎｅｃ-liは、梗塞容量に統計的に有意の効果を及ぼさなかった（図１２Ｂ）。また、ＭＣＡＯモデルで、７-Ｃｌ-Ｏ-Ｎｅｃ-１についても試験した。上に示したように、７-Ｃｌ-Ｎｅｃ-１のヒダントイン部分で硫黄を酸素で置換しても、インビトロで抗-ＣＩＣＤ活性に変化を生じなかった（図１２Ｃ）。同様に、Ｎｅｃ-１ｉ試験で用いた条件よりさらに厳格な条件下(４時間および６時間での遅い注入)で２化合物を比較した場合でさえ、7-Ｃｌ-Ｏ-Ｎｅｃ-１は、インビボで、７-Ｃｌ-Ｎｅｃ-１の活性と区別できない活性を示した（図１２Ｃ）。全体的に、データは、インビトロでのＣＩＣＤの阻害と、インビボでの７-Ｃｌ-Ｎｅｃ-１の抗虚血活性の間の厳密な相関を示しており、Ｎｅｃ-１による神経保護がＣＩＣＤの阻害を通して成し遂げられると言う仮説の強い支持を提供する。
【実施例６】
【０２９５】
免疫細胞制御におけるＮｅｃ-１活性
多くの例で、カスパーゼ、および特別にはカスパーゼ-８は、一次免疫細胞での生存促進機能を演じるか、あるいは適当な抗原刺激に応答したそれらの活性化および分化に積極的に寄与することが報告されている。ある例では、Ｔ細胞の活性化-誘導細胞死（ＡＩＣＤ）（activation-induced cell death）および単球／マクロファージ細胞のリポ多糖／ｚＶＡＤ.ｆｍｋ-誘導死の様な、非アポトーシス細胞死メカニズムの活性化が直接示唆された。これらの例では、細胞は、Ｎｅｃ-１-依存性ＣＩＣＤを受けていることを我々は証明した。
【０２９６】
ＬＰＳによるマウス-マクロファージまたはマクロファージ細胞株（ＲＡＷ２６４.７）の活性化は、該細胞がカスパーゼ阻害-誘導（ｚＶＡＤ.ｆｍｋ）死に敏感にすることを示した。Ｎｅｃ-１での処理は、ＲＡＷ２６４.７細胞のｚＶＡＤ.ｆｍｋの用量-依存毒性へのＬＰＳ-媒介増感を有効に阻害した（図１３）。
【実施例７】
【０２９７】
ＮＥＣ-１は、インビトロでの酸素-グルコース欠乏誘導細胞死から、一次ニューロンを保護する
培養した皮質一次ニューロンの酸素-グルコース欠乏（ＯＧＤ）（oxygen-glucose deprivation）は、卒中中のインビボでの虚血性脳障害の状態とある側面でよく似ているが、ネクローシスを誘導することが示されており、ｚＶＡＤ.ｆｍｋによって防御されなかった。Ｎｅｃ-１は、皮質ニューロンのＯＧＤ誘導死を減じた（図１４Ａ）。Ｎ-メチル基のみを欠いたＮｅｃ-１の不活性類似体（図８のＲ１、図１４Ａの活性を参照のこと）である、Ｎｅｃ１ｉは、ニューロン細胞死を助けることはできなかった（図１４Ａ）。以前に公表されたデータと同様に、このモデルではｚＶＡＤ.ｆｍｋによるいかなる防御も検出されなかっただけでなく、ｚＶＡＤ.ｆｍｋの存在下でのいかなるＮｅｃ-１防御の強化も認めなかった（図１４Ｂ）。それ故、アポトーシスではなく、ＣＩＣＤは、ＴＮＦαで処理したＦＡＤＤ欠損−ＪＫ細胞の細胞死と同様に、ＯＧＤ条件下で皮質ニューロンでの一次細胞死経路の一つを表し得る。
【実施例８】
【０２９８】
神経変性の他のモデルでのネクロスタチンの神経保護活性
上記のように、非アポトーシス細胞死は、虚血性障害に加えて様々な型のニューロン細胞死と深く関係していた。例えば、発展的な研究では、カスパーゼ-欠損マウスの運動ニューロンにおける内因性の壊死様プログラムの活性化が示唆され、我々の実験でのカスパーゼ阻害時のＣＩＣＤの活性化が思い出される。パーキンソン病の場合、アポトーシスは、動物モデルでのパーキンソン様症状の原因となる薬剤、ＭＰＴＰまたはその代謝物ＭＰＰ＋、によって活性化される一次メカニズムであると提案されたが、カスパーゼを阻害すると、ＣＩＣＤを示すネクローシス様死を起こすことが示されていた。この目的を達成するため、我々は、インビトロでの２つの異なるドーパミン作動性ニューロン細胞株（ヒトＳＨ-ＳＹ５ＹおよびマウスＳＮ-４７４１細胞）で、ネクロスタチンによるＭＰＰ+／ｚＶＡＤ-誘導死が阻害されることを見出した（図１５）。この効果は、Ｎｅｃ-２の場合に特に顕著であり、該分子が、ＭＰＰ＋毒性に特に重要な工程を標的にしているであろうことが示唆された。特に、ニトロ基を欠くＮｅｃ-２の不活性類似体は、ＳＮ-４７４１細胞でのＭＰＰ＋細胞毒性を減少させることができなかった。
【０２９９】
さらに、我々は、Ｎｅｃ-１によって、ラットの海馬一次ニューロンでの凝集したアミロイド-βペプチド（Ａβ）毒性が減衰することを見出した（図１６）。Ａβの凝集は、アミロイド前駆体タンパク質の異常なプロセシングの結果として生成されるが、アルツハイマー病の主な原因である。
【０３００】
興味深いことに、ＯＧＤ-誘導死と同様に、神経変性のその他の範例での神経毒性は、カスパーゼ阻害剤不在下でさえＮｅｃ-１によって減衰し、また、ニューロン集団内での内因性条件ではアポトーシスの実行を許さないであろうことを潜在的に示しており、ＣＩＣＤを病的ニューロン死の主なメカニズムとする。
【実施例９】
【０３０１】
免疫細胞制御でのＮｅｃ-１活性
Ｔ細胞の活性化-誘導細胞死（ＡＩＣＤ）（Activation-Induced Cell Death）は、自己免疫応答の発達を妨げるためのＴ細胞の再活性化を制限するプロセスであるが、正常な生理学的条件下でのカスパーゼ-非依存性細胞死の例でもある。マウスＣＤ４＋細胞の再活性化は、細胞死を効率よく誘導した（図１７）。Ｎｅｃ-１は、ｚＶＡＤ.ｆｍｋ不在下で再活性化されたＴ細胞の生存率にほとんど効果を示さず、ｚＶＡＤ.ｆｍｋ単独の添加は、部分的にのみ保護を示した。しかしながら、Ｎｅｃ-１およびｚＶＡＤ.ｆｍｋを一緒に添加すると、細胞死を効率よく排除した（図１７）。非常によく似た結果は、ＣＤ８＋細胞のＡＩＣＤでも得られたが、ｚＶＡＤ.ｆｍｋによる保護は余り顕著でなく、Ｔ細胞のこのサブタイプでは、ＣＩＣＤがより有効に誘導／実行されることが示唆される（図１７）。これらの結果は、アポトーシスがＡＩＣＤの一次様式であり、一方でカスパーゼ阻害はＣＩＣＤの有効な誘導を引き起こすことを、示している。
【０３０２】
プライマリーマウスおよびヒトのＴおよびＢリンパ球、単球ならびにナチュラルキラー細胞での一次活性化およびエフェクター機能の発達は、ｚＶＡＤ.ｆｍｋの存在によって、またはカスパーゼ-８の不活性化によって阻害されることが、多数の報告によって示唆された。ヒトＴ細胞の様々なサブクラスは、この制御に感受性を示すが、マウスＣＤ８＋細胞毒性リンパ球（ＣＴＬ）（cytotoxic lymphocyte）では、一次活性化のためのカスパーゼ活性に依存すると思われる。一方、ヘルパーＣＤ４＋細胞はそうではない。この例でのカスパーゼ活性への依存が、Ｎｅｃ-１-制御シグナル化工程とのかかわりを反映したものであるか否かについて確かめた。
【０３０３】
αＣＤ3抗体の刺激によるプライマリーＣＴＬの活性化は、細胞数の増加によって評価されるが、ｚＶＡＤによって抑制された。カスパーゼ阻害剤によるこの効果は、Ｎｅｃ-１によって完全に抑制され、このことは、該Ｎｅｃ-１は、ｚＶＡＤ.ｆｍｋの存在下でＣＴＬの蓄積を可能とした（図１８Ａ）。この効果の特異性は、ｚＶＡＤで処理されていない細胞内では、Ｎｅｃ-１の効果がないことによって強調される。同様の結果は、特定の抗原；トランスジェニックＴＣＲ  ＯＴ-１  マウス系から単離したオアブルブミン（oavlbumin）ペプチド２５７−２６４；に特異的なＣＴＬ  Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）（T cell receptor）の刺激でも得られた（図１８Ｂ）。
【０３０４】
ｚＶＡＤ.ｆｍｋによるＣＴＬ活性化の抑制は、細胞数の減少がｚＶＡＤ.ｆｍｋ-処理サンプルでの細胞死の増加と関連しないことから、ＴＣＲシグナルおよびカスパーゼ阻害剤の組み合わせによるネクロトーシス細胞死の誘導によるものではなかった（図１８Ｂ）。ｚＶＡＤ.ｆｍｋのこの効果は、[３Ｈ]-チミジンの細胞内ＤＮＡへの取り込みによって評価される細胞増殖の阻害によるものであり、細胞増殖の該抑制は、Ｎｅｃ-１の存在下で妨げられた（図１９Ａ）。この知見と一致して、ｚＶＡＤ.ｆｍｋは、ＣＴＬのＧ１期からＳ-期への移行、次にＴＣＲシグナルを妨げ、この効果は、Ｎｅｃ-１によって薄められた（図１９Ｂ）。
【０３０５】
Ｎｅｃ-１の不活性誘導体であるＮｅｃ-１ｉはＴ細胞増殖を回復できないので、Ｎｅｃ-１の効果は、特異的であり、そのＣＩＣＤ-抑制活性と類似の標的に関連する（図２０）。
【０３０６】
最終的に、ヒトカスパーゼ-８変異により生じるＢ細胞活性化の欠損と一致して、Ｎｅｃ-１は、ｚＶＡＤ.ｆｍｋによるＢ細胞活性化の抑制をも減少させた（図２１）。
【実施例１０】
【０３０７】
Ｎｅｃ-１活性の分子的根拠
内因性ＲＩＰタンパク質を効率よく免疫沈降できるＲＩＰの市販の抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）および免疫沈降したＲＩＰ１の自己リン酸化についてのキナーゼアッセイを用いて、免疫沈降したＲＩＰ１ならびにトランスフェクトしたＲＩＰ１、ＦＬＡＧ抗体を用いるＩＰｅｄ、がインビトロで自己リン酸化を受けることを示した（図２３）。Ｎｅｃ-１の存在は、インビトロでのＲＩＰ１自己リン酸化を阻害した；これに対してＮｅｃ-１不活性化誘導体であるＮｅｃ-１ｉは、ＲＩＰ１の自己リン酸化を阻害する活性の有意な減少を示した（図２３Ａ）。このインビトロでのキナーゼアッセイの特異性は、ＲＩＰ１欠損ジャーカット細胞が、免疫沈降およびインビトロでのキナーゼアッセイの後にそのような自己リン酸化を受けないことによって、示される(図２３Ａ)。さらに、野生型ＲＩＰのみが２９３Ｔ細胞内で過剰発現した時に自己リン酸化活性を示し、そのキナーゼ触媒的に不活性なＫ４５Ｍ変異体は該活性を示さないので、リン酸化イベントは、ＲＩＰキナーゼの自触触媒活性を表している（図２３Ｃ）。これらの結果は、Ｎｅｃ-１がＲＩＰ-１のキナーゼ活性を標的としていることを示している。ＲＩＰ１のキナーゼ活性は、この別の細胞死経路に重要であり特異的であるので、この結果は、Ｎｅｃ-１がネクロトーシスを特異的に標的とする能力と完全に一致する。Ｎｅｃ-１の標的としてのＲＩＰ１キナーゼ活性の同定は、ネクロトーシスの特異的阻害剤を同定する我々の細胞ベーススクリーニングにさらなる確認をも提供する。
【０３０８】
Ｎｅｃ-１特異性の対照として、過剰発現したＲＩＰと、その最も近い相同体ＲＩＰ２／ＲＩＣＫ（キナーゼドメインの＞３０％の同一性を持つ）の阻害を、図２３Ｂおよび図２３Ｃに記載されたものと同じアッセイを用いて、Ｎｅｃ-１によって比較した。図２４に示すように、Ｎｅｃ-１は、両タンパク質が匹敵するレベルで発現される（底のパネルを参照のこと）にもかかわらず、ＲＩＰ２自己リン酸化には効果を与えなかった。この結果は、ＲＩＰの場合のＮｅｃ-１ｉ効果の欠如と共に、ＲＩＰキナーゼ活性のＮｅｃ-１阻害の特異性を確認する。
【０３０９】
興味深いことに、ＢおよびＴ細胞増殖のカスパーゼ-阻害依存抑制についての最近の分析は、それがＮＦｋＢ活性化の喪失により生じることを、示唆した。それ故、カスパーゼ阻害条件下でのＮｅｃ-１によるＢおよびＴ細胞活性化の回復を示唆する我々のデータは、Ｎｅｃ-１がＮＦｋＢ活性化を含む細胞制御の典型例に直接関わっていることを示している。免疫制御に加えて、これらには、筋ジストロフィーおよび本明細著に記載のその他の病気、ならびにＲＩＰにより媒介される生来の免疫応答およびＲＮＦαやＩＬ-１βを含む病気のような病理に関与する。
【実施例１１】
【０３１０】
ネクロスタチン-１のさらなる特徴づけ
壊死性細胞死は、卒中を含む広範囲の病理状態において共通である。しかしながら、壊死を特異的に標的とする治療法の開発は、アポトーシスとは違って、壊死性細胞死が圧倒的なストレスに対する制御できない応答であるとの慣用的な概念故に、ほとんど試みられてこなかった。いかなる細胞損傷もない古典的ＤＲシグナルにより活性化された一般的な壊死性細胞死経路を示すことは、この概念に直接挑戦すし、インビボでの壊死性細胞死の一部分は、事実上、細胞内組織によって制御されうることを示唆する。このことは、次に、病的壊死性細胞死を選択的に標的とする先例のない機会を提供するであろう。
【０３１１】
この実施例および次の数個の実施例では、カスパーゼシグナル化を伴わない死-ドメインレセプターによって媒介される非アポトーシス経路を規定するために、小分子を用いた。我々は、多数の細胞型において、カスパーゼ阻害存在下でのＤＲ刺激を原因とする細胞死の特異的かつ強力な小分子阻害剤であるネクロスタチン-１（Ｎｅｃ-１）を同定した。これらの結果は、ＤＲシグナル化が一般的な代替的非アポトーシス細胞死経路（我々はこれをネクロトーシスと名付けた）を引き起こすと言う、最初の直接的証拠を提供している。Ｎｅｃ-１を用いて、我々は、ネクロトーシスが虚血性神経障害の遅延した要素であり、それ故、卒中治療の有望な治療標的であると言って良いことを、示した。
【０３１２】
カスパーゼの化学阻害剤は、哺乳動物システムでのアポトーシスの特徴を調べる手段であるため、我々は、特異的ネクロトーシス阻害剤が、他の細胞死プロセスからネクロトーシスを識別するための特異的手段を提供するために、また、治療上の利益のために病理的細胞死の非アポトーシス成分を標的とする可能性のあるリード分子として、多様な細胞株で共通の代替的細胞死経路の存在を示すために等しく有用である、と期待した。我々がネクロトーシスの操作上の定義として用いた、ＴＮＦαおよびｚＶＡＤ.ｆｍｋによって誘導されたヒト単球Ｕ９３７細胞の壊死の化学阻害剤のために、〜１５,０００化合物の化学ライブラリーをスクリーニングした。このスクリーニングの結果、Ｎｅｃ-１が選択され、該化合物は、濃度-依存様式でＵ９３７細胞のネクロトーシスによる死を効率よく遮断した（図２５Ａおよび図２５Ｂ）。
【０３１３】
次に、異なる細胞型で観測されたＤＲ-誘導非アポトーシス細胞死が共通のメカニズムによって媒介されるか否かを試験するための道具として、Ｎｅｃ-１を用いた。Ｎｅｃ-１は、（ｉ）ＦａｓＬ、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）（cycloheximide）およびｚＶＡＤ.ｆｍｋによって誘導されたジャーカット細胞の壊死（Ｆａｓｌ-ＣＨＸ-ｚＶＡＤ.ｆｍｋ、図２５Ｃ）、（ii）化学二量体化剤（chemical dimerizer）ＡＰ２０１８７およびｚＶＡＤ.ｆｍｋの存在下でＦＫＢＰ-１２ベース二量体化ドメイン（ＪＫ-ＦＦ）と融合したＦＡＤＤを安定に発現するジャーカット細胞の壊死（図２５Ｄ）、（iii）ＴＮＦαとｚＶＡＤ.ｆｍｋ（ＴＮＦα-ｚＶＡＤ.ｆｍｋ）またはＦａｓＬとｚＶＡＤ.ｆｍｋ（Ｆａｓｌ-ｚＶＡＤ.ｆｍｋ）で処理されたＢＡＬＢ／ｃ ３Ｔ３細胞の壊死（図２５Ｅ）、ならびに（ｉｖ）ＴＮＦα-ｚＶＡＤ.ｆｍｋで処理されたＭＥＦ（図２５Ｆ）、ＨＴ２９、およびＩＥＣ-１８およびＨＬ-６０細胞の壊死を含む、カスパーゼ阻害剤存在下でＤＲ活性化により誘導される壊死性細胞死の公表された例のすべてを阻害した。
【０３１４】
Ｎｅｃ-１は、ｓＶＡＤ.ｆｍｋでのスクリーニングで選択されたにもかかわらず、その作用は、カスパーゼの薬学的阻害に依存しない。ネクロトーシスの直接的活性化と一致して、Ｎｅｃ-１は、ｚＶＡＤ.ｆｍｋ不在下でさえＤＲシグナル化に応答してカスパーゼを活性化できないＴＮＦα-処理ＦＡＤＤ-欠損ジャーカット細胞の死を防いだ（図２５Ｇ）。同様に、Ｎｅｃ-１は、Ｌ９２９細胞のＴＮＦα-誘導壊死を効率的に阻害し、該細胞は内因性カスパーゼ阻害剤を必要としない（図２５Ｈ）。全体では、これらシステムのすべてで細胞死を阻害するＮｅｃ-１の能力は、ＤＲシグナル化によって媒介される共通のネクロトーシス経路の存在を初めて直接証明する。ＦＡＤＤ-欠損ジャーカット細胞でのネクロトーシスの誘導は、その他の化学物質（ＣＨＸ、ｚＶＡＤ.ｆｍｋ）の存在に依存しないので、本システムを用いてＮｅｃ-１についての半値応答（half-maximum response）（ＥＣ50）の有効濃度を４９４±１２５ｎＭと決定した（図２５Ｇ）。Ｎｅｃ-１によるネクロトーシスからの有効な防御は、細胞の大きさの前方-および側方-散乱分析（図３１）、ＡＴＰレベル（図２５）、ミトコンドリア機能不全（図２６Ａおよび図２６Ｂ）、原形質膜の透過性上昇（図２６Ａ−図２６Ｃ）、および細胞増殖（図３１）を含む、いくつかの異なるアッセイによって確認された。これらの結果と一致して、電子、蛍光および明視野顕微鏡に基づく形態分析から、Ｎｅｃ-１がネクロトーシス細胞死のすべての徴候を阻害することが、証明された（図２６Ｄ−図２６Ｆ、図３１および図３２）。これらの結果は、ネクロトーシスの有力かつ有効な阻害剤としてＮｅｃ-１を確立する。
【実施例１２】
【０３１５】
Ｎｅｃ-１の特異性
Ｎｅｃ-１の特異性を確立させるために、ネクロトーシスの比較として、ＤＲ-誘導アポトーシスに対するその効果を比較した。両者は、形態的基準および選択的染料染色によって容易に識別できる。Ｎｅｃ-１は、アポトーシスを示す結果である、ＦａｓＬ-ＣＨＸ誘導のアネキシンＶ-陽性およびヨウ化プロピジウム(ＰＩ)-陰性細胞の蓄積に効果を有さなかった（図２７Ａ）。逆に、Ｎｅｃ-１は、ＴＮＦαで処理したＦＡＤＤ欠損ジャーカット細胞（図２６Ａ）およびＦａｓＬ-ＣＨＸ-ｚＶＡＤ.ｆｍｋで処理した野生型ジャーカット細胞（図２６Ｂ）のミトコンドリア膜電位および原形質膜完全性の同時損失を有効に阻害した。アポトーシスの発症は、類似の刺激（ＦａｓＬ-ＣＨＸおよびＦａｓＬ-ＣＨＸ-ｚＶＡＤ.ｆｍｋ、それぞれ図２６Ｂおよび図２７Ａを参照のこと）に応答するネクロトーシスの発症より明らかに速く、アポトーシスは、そのより早い反応速度故に、この細胞型でのネクロトーシスを、通常覆い隠すかまたは先行して封じると、示唆され得る。
【０３１６】
この知見と一致して、Ｎｅｃ-１は、ＦａｓＬ-ＣＨＸ-処理アポトーシスジャーカット細胞でのアポトーシス的形態（細胞質凝縮、クロマチンマーギナリゼーション(marginalization)、核フラグメント化および原形質膜液胞化）に効果を有さなかった（図２６Ｆ）が、ＴＮＦα-処理ＦＡＤＤ-欠損ジャーカット細胞での壊死的形態（核凝縮、オルガネラ腫脹、原形質膜完全性の早期消失および半透明サイトゾルの出現、図２６Ｄおよび図２６Ｆを参照のこと）の出現を完全に阻害した。ＤＲシグナル化により誘導されるネクロトーシスからの選択的防御は、その他の細胞死アッセイ（図２５Ｄ、図２７Ｂおよび図２７Ｃ）でも認められた。これらの結果から、ネクロトーシスを阻害するＮｅｃ-１の選択性が立証され、これらの２つの型の細胞死が異なる制御によるものであることが示される。このモデルと一致して、ジャーカット細胞でのＢｃｌ-ｘLの過剰発現は、アポトーシスを有力に抑制したが、ネクロトーシスを阻害しなかった。
【０３１７】
Ｎｅｃ-１の特異性をさらに確立するために、別の細胞の生理学的パラメーターへの可能な効果について分析した。Ｎｅｃ-１は、健康細胞で、ＡＴＰレベル、ミトコンドリア膜電位、原形質膜完全性、細胞の形または大きさ、細胞周期分布、増殖、アジレント(agilent)  ｍＲＮＡ  チップ分析に反映されるようなグローバルｍＲＮＡ発現、活性酸素種（ＲＯＳ）(reactive oxygen species)の細胞内レベル、細胞粘着性、アクチンおよび微小管細胞骨格、または様々な細胞構成成分、例えば、核、ゴルジ体、小胞体およびミトコンドリア、の形態に一般的効果を有さないことが分かった（図３１および図３２）。これらの知見から、Ｎｅｃ-１は、ネクロトーシスに特異的であることが示唆される。Ｎｅｃ-１の特異性をさらに特徴づけるために、広範な構造-活性相関分析を行い、試験した９３の化学修飾したＮｅｃ-１の大部分が、活性を実質上または完全に損失させたことが分かった。例えば、ヒダントイン部分のメチル基の除去（Ｎｅｃ-１ｉ、図２７Ｄ）は、抗ネクロトーシス活性を完全に消失させた（図２５Ｃおよび図２５Ｇ）。試験したすべての修飾Ｎｅｃ-１の内、２つの型の変化のみが、その抗ネクロトーシス活性を保持していた。第一に、Ｎｅｃ-１のフェニル環への塩素の付加（７-Ｃｌ-Ｎｅｃ-１、図２７Ｄ）は、活性をおおよそ２.７倍に増加させた（ＥＣ５０＝１８２±２４ｎＭ）。第二に、潜在する代謝傾向である、ヒダントイン部分の硫黄を酸素に変化させると、Ｎｅｃ-１の抗ネクロトーシス活性に効果を有さなかった（７-Ｃｌ-Ｏ-Ｎｅｃ-１；図２７Ｄ；ＥＣ５０＝２０６±３３ｎＭ）。その様な厳密な構造的要求は、ネクロスタチンの細胞保護の非常に特異的な様式を示している。
【０３１８】
最後に、Ｎｅｃ-１の活性を、細胞シグナル化のその他の小分子レギュレーターの活性と比較した。分析により、ジャーカットおよびＢＡＬＢ／ｃ  ３Ｔ３細胞でのネクロトーシス細胞死は、ミトコンドリア透過転移細孔、カルパイン、カルシウム恒常性摂動（calcium homeostasis perturbation）、ポリ(ＡＤＰ-リボース)ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）、ＨｔｒＡ２／Ｏｍｉ、ホスホリパーゼＡ２および一酸化窒素シンターゼ、の様な因子の小分子阻害、またはアポトーシス誘導因子のＲＮＡｉ-媒介ダウンレギュレーションにより遮断されないことが明らかになった。さらに、既知の生物活性を有する４８９化合物からなる化学ライブラリー（ＢＩＯＭＯＬ  ＩＣＣＢ  Ｋｎｏｗｎ  Ｂｉｏａｃｔｉｖｅｓ  ｌｉｂｒａｒｙ；http://iccb.med.harvard.edu）をスクリーニングしたが、Ｎｅｃ-１の様に、全細胞型でネクロトーシスを遮断できる化合物はなかった。これらの結果から、ネクロトーシス制御およびＮｅｃ-１の活性のユニークな性質が強調される。
【０３１９】
酸化ストレスは、Ｕ９３７およびＬ９２９を含む、いくつかの細胞型でＤＲ-誘導カスパーゼ-非依存性細胞死に役割を果たしていることを示唆した。しかしながら、ＴＮＦα-処理ネクロトーシスＦＡＤＤ-欠損ジャーカット細胞の小画分のみがＲＯＳで贈加を示した（染色細胞の〜３０％、図３１を参照のこと）が、ＦＡＤＤ二量体化によって起こったネクロトーシスは、以前に報告されたように酸化ストレスに伴うものではないことが分かった。この知見と一致して、ジャーカット細胞のネクロトーシスは、抗酸化剤ＢＨＡによって阻害されないだけでなく、Ｕ９３７細胞型ではＢＨＡによる保護が報告されているにも関わらず、一般の抗酸化剤の一団からのいかなる化学物質もネクロトーシスからＵ９３７細胞を保護しなかった（図２８Ａ）。逆に、Ｎｅｃ-１は、メナジオンを原因とする「古典的な」酸化ストレス誘導壊死を遮断しなかった（図２８Ａ）。これらの結果から、酸化ストレスは、あるシステムでは重要ではあるが、ネクロトーシスシグナル化に普遍的役割を演ずるわけではなく、また、ＮＥＣ-１は抗酸化剤としてネクロトーシスの阻害に作用しないと、結論付けた。
【実施例１３】
【０３２０】
ネクロトーシスシグナル化による自食作用の活性化
自食作用、大規模タンパク質分解および異化メカニズムは、カスパーゼ-非依存性細胞死に関わるとされているが、その機能的役割は、論争の主題として残されたままである。ネクロトーシスジャーカット細胞のＥＭ分析では、自食作用を暗示する、高電子密度の物質で満たされた二重膜で包まれたベシクルの存在が示された（図２８Ｂ）。それ故、ネクロトーシスでの自食作用の役割について、さらに研究した。自食作用のマーカーとして、オートファゴソーム（autophagosome）形成において初期に重要な役割を演じることが分かった、微小管-関連タンパク質１軽鎖３（ＬＣ３-II）のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）-結合形の出現を用いた。実際、自食作用は、ＬＣ３-IIのレベルの増加によって示されるが、ＴＮＦαで処理したＦＡＤＤ-欠損ジャーカット細胞およびＬ９２９細胞（図２８Ｃ）、ＴＮＦα-ｚＶＡＤ.ｆｍｋまたはＦａｓＬ-ｚＶＡＤ.ｆｍｋで処理したＢＡＬＢ／ｃ  ３Ｔ３細胞（図２８Ｄ）、ならびにＴＮＦｚＶＡＤ.ｆｍｋで処理したＵ９３７細胞を含む、多数のネクロトーシス系で誘導された。ＬＣ３-IIの生成が、ＬＣ３のＬＣ３-Ｉ型への切断とそれに続くそのＰＥへの結合を含む、多段階プロセスによるものであるにもかかわらず、試験したすべての細胞型で中間体ＬＣ３-Ｉ種が検出されず；このことは、前後関係から、ＬＣ３-IIに素早く処理されうることを示唆している。しかしながら、ネクロトーシスは、自己融解-欠損Ａｔｇ５−／−  ＭＥＦ細胞（図２８Ｆ）内、および重要な自食作用因子ベクリン-１がＲＮＡiによってノックアウトされた細胞（図２８Ｇおよび図２８Ｈ）内において、自食作用阻害剤である３-メチルアデニン（３-ＭＡ）の存在下で正常に進んだ。これらの結果は、ネクロトーシス細胞死への寄与因子と言うよりむしろ、ネクロトーシスの共通の下流の結果としての自食作用を立証する。他方、自食作用の阻害は、ジャーカット細胞の最終死に効果を有さなかったが、高電子密度細胞質物質の特記すべき蓄積を生じ（図２８Ｂ）、細胞デブリが除去できなかったことを示している。特記すべきは、Ｎｅｃ-１での処理は、ネクロトーシスＬＣ３-II誘導、ならびに自食作用ベシクルの形成を有効に遮断した（図２６Ｆ、図２８Ｃおよび図２８Ｄ）のに対して、自食作用の古典的誘導物質である、ラパマイシンを原因とするＬＣ３-IIの誘導に影響を与えず（図２８Ｄ）、結果として、Ｎｅｃ-１は、自食作用の上流のネクロトーシスシグナル化工程を阻害するが、自食作用それ自身を阻害しないことが示される。
【実施例１４】
【０３２１】
ネクロスタチンによるＲＩＰ-誘導ネクロトーシスの阻害
以前の分析から、ＤＲ-媒介タンパク質ＲＩＰのキナーゼ活性は、他のＤＲ-依存経路からネクロトーシスを分ける分岐点として役立つことが示唆された。実際、二量体化した全長のＲＩＰまたは単独のそのキナーゼドメインは、キナーゼ-依存性ネクロトーシス細胞死を誘導するに十分であり、これはＮｅｃ-１によって阻害された（図２９）；この結果から、Ｎｅｃ-１はＤＲシグナル化のネクロトーシス支流に特異的に影響することが確認された。これらを合わせると、我々の結果は、ＤＲの下流であるが、ミトコンドリア機能不全、原形質膜完全性の消失および細胞デブリの自食作用的クリアランスを含む、多数の実行イベントの上流の、重要な共通のネクロトーシス工程を、Ｎｅｃ-１が標的としていることを立証している。
【実施例１５】
【０３２２】
ネクロトーシスは虚血性神経障害に貢献する
ネクロトーシスの阻害におけるＮｅｃ-１の厳格な特異性に刺激され、Ｎｅｃ-１を用いて、インビボでのネクロトーシスの以前から未知の役割を調査した。虚血性障害を原因とする神経細胞死は、実質的な非アポトーシス成分を含むことが知られており、虚血性脳障害でのＤＲの関与が示唆された。それ故、虚血性脳障害は、アポトーシスに最適でないが、ネクロトーシスに適した条件を作り出すであろうと仮説を立てた。
【０３２３】
虚血性脳障害におけるネクロトーシスの関与を試験するために、マウスの中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）（middle cerebral artery occlusion）から生ずる虚血性障害へのＮｅｃ-１の効果を調べた。Ｎｅｃ-１の脳室内投与は、ＭＣＡＯ後の梗塞容量を有意に減少させ（Ｐ＜０.０５）、ネクロトーシスはこの型の病的死に関与し得ることを示唆した（図３０Ａ）。さらなる詳細な分析を行うため、インビトロでより大きい活性を示した７-Ｃｌ-Ｎｅｃ-１にスイッチした。７-Ｃｌ-Ｎｅｃ-１もまた、梗塞容量の有意な（Ｐ＜０.０５）用量依存減少、およびＭＣＡＯ後の神経学的スコアで比例した改善を提供した（図３０Ｂ）。
【０３２４】
次に、インビボでの７-Ｃｌ-Ｎｅｃ-１活性の特異性について試験した。インビトロでネクロトーシスを遮断するがアポトーシスを遮断しないＮｅｃ-１の特異性と一致して、７-Ｃｌ-Ｎｅｃ-１での処理は、虚血性脳障害中のカスパーゼ-３活性化を遮断しなかったが、ｚＶＡＤ.ｆｍｋは遮断した（図３０Ｃ）。さらに、ｚＶＡＤ.ｆｍｋと７-Ｃｌ-Ｎｅｃ-１の同時投与は、有意（Ｐ＜０.０５）な相加効果を生じた（図３３）が、処理の組み合わせによる神経保護の全範囲について評価するためには、広範囲での最適化が必要であろう。さらに、７-Ｃｌ-Ｎｅｃ-１は、血液の酸素およびＣＯ２レベル、体温または大脳血流に効果を有さず、一般的生理機能への非特異的効果を通しての虚血性細胞死を防御するものではないことを示した。
【０３２５】
インビボでのＮｅｃ-１の作用様式を確認するために、虚血性脳障害に対するその保護の構造-活性相関分析を行った。第一に、１つのメチル基を欠いたＮｅｃ-１の不活性誘導体であるＮｅｃ-１ｉ（図２７Ｄ）は、梗塞容量に有意な効果を有さなかった（図３０Ａ）。第二に、インビトロで７-Ｃｌ-Ｎｅｃ-１（図２７Ｄ）と類似した抗ネクロトーシス活性を有する、７-Ｃｌ-Ｏ-Ｎｅｃ-１（図２７Ｄ）は、インビボでは７-Ｃｌ-Ｎｅｃ-１と区別できない活性を示した（図３０Ｄ）。これらのデータから、インビトロでのネクロトーシスの阻害とインビボでの７-Ｃｌ-Ｎｅｃ-１の抗虚血活性との間に厳格な相関が示され、Ｎｅｃ-１による神経保護がネクロトーシスの阻害を通して成し遂げられると言う我々の仮説に強い支持をもたらす。
【０３２６】
特記すべきことに、７-Ｃｌ-Ｎｅｃ-１の保護効果は、ｚＶＡＤ.ｆｍｋの投与がもはや梗塞容量を減少しない時点（図３０Ｆ）である、障害発症後６時間に化合物を投与した場合でさえ容易に検出できた（図３０Ｅ）。インビボでの７-Ｃｌ-Ｎｅｃ-１による神経保護のこの延長された時間枠は、虚血性脳障害中のネクロトーシス誘導の遅れを反映し得ると理由付けた。この仮説を確認するために、インビトロでの分析で、この出来事がネクロトーシスと関連することが示唆されたので、ＭＣＡＯ中のＬＣ３-IIの誘導について分析した。ＬＣ３-IIは虚血性脳障害後に誘導されることがあきらかであるが、閉塞後８時間まで、最大レベルに到達しないことが分かった（図３０Ｇ）。さらに、閉塞後４および６時間での７-Ｃｌ-Ｎｅｃ-１の遅い注射は、８時間の時点でのＬＣ３-IIの増加を、なお有効に遮断し（図３０Ｈ）、このことは、インビボでのＬＣ３-IIの遅い誘導は、ネクロトーシスの遅い活性化を反映していることを確認するものである。
【実施例１６】
【０３２７】
Ｎｅｃ-１およびその誘導体の製造
Ｎｅｃ-１は、Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈから商品として入手できる。
我々は、本技術分野で既知の方法に従って、Ｎｅｃ-ｌｉを製造した(例えば、Ｓｕｚｕｋｉら、Ｃａｎ.Ｊ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.,５５：５２１-５２７、１９７７を参照の事)。我々は、スキーム１に従って、７-Ｃｌ-Ｎｅｃ-１を製造した。
【０３２８】
スキーム１
【０３２９】
【化３６】
2009521454.tif 000046
【０３３０】
ジメチルアミン(２.０５ｍｌ、１６.３ｍｍｏｌ、４０％溶液)を、酢酸(１３.６ｍｌ)およびホルムアルデヒド(０.３４０ｍｌ、４.５ｍｍｏｌ、３７％溶液)の混合物に、アルゴン下で加えた。反応混合物を１０分間攪拌し、次に７-クロロインドール(Ｉ-１)(６０４ｍｌ、４.０ｍｍｏｌ)で処理した。得られた混合物を室温で〜１６時間攪拌した。最初に、反応混合物をＫ２ＣＯ３で中和し、次にＮａＯＨ(２Ｎ)で塩基性にし、さらに酢酸エチルで抽出し、水で洗浄し、乾燥させ、濃縮した。得られた固体を酢酸エチルおよびヘキサンから再結晶し、(Ｉ-２)を得た：収率８６％、ｍｐ１３６℃−１３８℃
【０３３１】
【化３７】
2009521454.tif 000047
【０３３２】
(Ｉ-２)（２.８ｍｍｏｌ）、２-ホルミルアミノ-マロン酸ジエチルエステル(３.１ｍｍｏｌ)、およびＮａＯＨ(３０ｍｇ)の懸濁液を、トルエン(２０ｍｌ)中、アルゴン下で３日間還流した。反応混合物を濃縮し、シリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィーで、４０％酢酸エチル-ヘキサンを用いて精製し、(Ｉ-３)を得た：収率６５％、ｍｐ１７０℃−１７４℃
【０３３３】
【化３８】
2009521454.tif 000048
【０３３４】
ＴＨＦ中の(Ｉ-３)溶液を、ＮａＯＨ(３００ｍｇ、１０ｍｌ水中)と共に、室温で２４時間処理した。酢酸(５ｍｌ)で混合物をゆっくりと酸性にし、次に、２４時間還流した。反応混合物を真空下で濃縮し、希ＨＣｌ(１０ｍｌ、３Ｍ)で処理し、次に再度、〜１６時間、還流した。反応物を室温に冷却し、２Ｍ  ＫＯＨでｐＨを６.０に調整した。形成された白色固体をろ過し、水で洗浄し、真空下で乾燥させ、(Ｉ-４)を得た：収率８３％、ｍｐ２３６℃−２３９℃
【０３３５】
【化３９】
2009521454.tif 000049
【０３３６】
塩化チオニル(０.０９ｍｌ、１.２ｍｍｏｌ)を、無水メタノール３ｍｌ中に０℃で溶解し、次に、この溶液を粗(Ｉ-４)（２００ｍｇ、０.５ｍｍｏｌ）を含むフラスコに加えた。−５℃で４時間攪拌した後、反応混合物を室温に暖め、一晩攪拌し、濃縮した。白色固体を集め、酢酸エチルで洗浄し、真空下で乾燥した。生成物(ｉ-５)はさらに精製することなく、直接用いた。
【０３３７】
ジクロロメタン(１０ｍｌ)中の(Ｉ-５)溶液(１.０ｍｍｏｌ)に、トリエチルアミン(０.１ｍｌ)、次にメチルイソチオシアネート(７.４ｍｇ、０.１ｍｍｏｌ)を加えた。反応混合物を室温で１時間攪拌し、その後濃縮した。得られた残留分をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、ヘキサン中の３０％酢酸エチルを用いて精製し、(７-Ｃｌ-Ｎｅｃ-１)を得た：ｍｐ２４９℃−２５３℃
【０３３８】
【化４０】
2009521454.tif 000050
【０３３９】
(７-Ｃｌ-Ｎｅｃ-１)の 酸素含有誘導体（７-Ｃｌ-Ｏ-Ｎｅｃ-１）を、スキーム２に従って製造した。
【０３４０】
スキーム２
【０３４１】
【化４１】
2009521454.tif 000051
【０３４２】
塩化ホスホリル(０.６６ｍｌ、７ｍｍｏｌ)を、０℃、アルゴン下で、無水ＤＭＦ(５ｍｌ)に滴下で加えた。次に、無水ＤＭＦ(１５ｍｌ)中の(Ｉ-１)(１ｇ、６.６ｍｍｏｌ)溶液を、室温で滴下し、得られた混合物を２時間攪拌した。反応混合物を氷および飽和ＮａＨＣＯ３中に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。合わせた有機溶液を飽和ＮａＣｌ(１０ｍｌ×３)で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、濃縮すると、９９０ｍｇの生成物(Ｉ-６)が黄橙色の固体として得られた（８３％）。
【０３４３】
【化４２】
2009521454.tif 000052
【０３４４】
ピペリジン(２ｍｌ)中の(Ｉ-６)(１ｍｍｏｌ)および１-メチルイミダゾール-２,５(１,３Ｈ)-ジオン(Ｊａｎｉｎら、Ｅｕｒ.Ｊ.Ｏｒｇ.Ｃｈｅｍ.,２００２：１７６３-１７６９、２００２で用いられた方法に従って合成した)（２５０ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）の混合物を、１１０℃で４時間、アルゴン大気下で加熱した。次に、反応混合物を、冷蔵庫（〜５℃）中、エーテル(２ｍｌ)を加えて、冷却した。沈殿物をろ過し、エーテルで洗浄すると、(Ｉ-７)が得られた。
【０３４５】
【化４３】
2009521454.tif 000053
【０３４６】
ＣｏＣｌ２(１.０ｍｍｏｌ)およびＮａＢＨ４(１０ｍｍｏｌ)を、無水ＭｅＯＨ／ＴＨＦ(１：１、４０ｍｌ)の混合溶媒中の(Ｉ-７)(０.５ｍｍｏｌ)溶液に、分割して加えた。混合物を、室温で一晩攪拌し、次に、酢酸エチル(１００ｍｌ)で希釈した。混合物を、飽和ＮａＨＣＯ３(３０ｍｌ)、１Ｎ  ＨＣｌ(３０ｍｌ)、飽和ＮａＣｌ(３０ｍｌ)で順次洗浄し、次に無水ＭｇＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、(７-Ｃｌ-Ｏ-Ｎｅｃ-１)を得た：
【０３４７】
【化４４】
2009521454.tif 000054
【実施例１７】
【０３４８】
ｚＶＡＤ-ｆｍｋおよびＴＮＦαに応答した細胞の壊死
ｚＶＡＤ-ｆｍｋ(カスパーゼ阻害剤)およびＴＮＦα(細胞死刺激剤)の組み合わせ処理に応答した壊死の発生について、細胞株Ｕ-９３７およびＢＡＬＢ／ｃ  ３Ｔ３をアッセイした。細胞(５×１０５細胞／ｍｌ)を、ｚＶＡＤ-ｆｍｋ(１００μＭ)およびヒトＴＮＦα(４０ｎｇ／ｍｌ)に、７２時間さらした。ＴＮＦαに応答した細胞内ＡＴＰレベルを測定することにより、壊死の誘導をアッセイした(Ｃｒｏｕｃｈら、上記、Ｓｔｏｒｅｒら、上記、およびＣｒｅｅら、上記)。壊死した細胞は、未処理、ｚＶＡＤ-ｆｍｋ(１００μＭ)単独、またはヒトＴＮＦα(４０ｎｇ／ｍｌ)単独で処理された対照細胞と比較して、細胞内ＡＴＰの減少を示した。細胞は、ｚＶＡＤ-ｆｍｋおよびＴＮＦαで処理することに応答して壊死することが分かった。また、例えば、膜ブレブ形成(ｍｅｍｂｒａｎｅ ｂｌｅｂｂｉｎｇ)および核濃縮について細胞を分析することにより、アポトーシスまたは壊死の発生について、細胞を形態学的に観察した。
【実施例１８】
【０３４９】
壊死を減少させる小分子の同定
Ｕ-９３７細胞株を用いて、ｚＶＡＤ-ｆｍｋおよびＴＮＦαに細胞をさらすことにより誘導される壊死を減少させる化合物の能力について、１６,０００の小分子化合物のライブラリーを、スクリーニングした。このスクリーニングに用いられた化合物のライブラリーは、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ(ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ)から得られた。
【０３５０】
一次スクリーニングでは、最初に、Ｕ-９３７細胞(５×１０５または７.５×１０５細胞／ｍｌ)をｚＶＡＤ-ｆｍｋ(１００μＭ)にさらした。３０分後、同細胞を当該ライブラリーからの化合物(５ｍｇ／ｍｌ、０.１-０.５μｌのＤＭＳＯに溶解し、最終ＤＭＳＯ濃度０.３％-１.５％を与えた)にさらした。さらに３０分後、ＴＮＦα(４０ｎｇ／ｍｌ)を細胞培地に加えた。次に、細胞を３７℃で７２時間インキュベートし、その後、細胞内ＡＴＰレベルをアッセイした。細胞内ＡＴＰレベルの減少を防がなかった化合物は、ｚＶＡＤ-ｆｍｋおよびＴＮＦαで細胞を処理することに応答した壊死を防がなかった化合物であった。細胞内ＡＴＰレベルを維持した化合物は、ｚＶＡＤ-ｆｍｋおよびＴＮＦαにより引き起こされた壊死を遮断する化合物であった。
【０３５１】
一次スクリーニングの結果により、ｚＶＡＤ-ｆｍｋおよびＴＮＦαで誘導される壊死を減少させる５０化合物を、当該ライブラリーから同定した。これらの化合物を、ｚＶＡＤ-ｆｍｋおよびＴＮＦαで誘導される壊死を減少させる化合物についての二次スクリーニング用に選択した。
【０３５２】
二次スクリーニングでは、ｚＶＡＤ-ｆｍｋおよびＴＮＦαで誘導される壊死を減少させる、上記一次スクリーニングから同定された化合物を、その能力についてアッセイした。おのおのの化合物について一連の希釈を行い、化合物を、一次スクリーニングのように、Ｕ-９３７細胞に投与した。個々の化合物の濃度は、７０μＭ、２３μＭ、８μＭおよび２.５μＭであった。ｚＶＡＤ-ｆｍｋおよびＴＮＦαならびに様々な濃度の化合物に応答して起こる壊死のレベルを、一次スクリーニングについて上記したようにアッセイした。
【０３５３】
二次スクリーニングの結果では、ｚＶＡＤ-ｆｍｋおよびＴＮＦαに細胞をさらすこと応答した壊死を減少させる、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅライブラリーからの４化合物、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ化合物番号１１５８０７、１１５６８１、２１０２２７および２１５６８６、を同定した。これらの化合物の構造は、以下の通りである：
【０３５４】
【化４５】
2009521454.tif 000055
【実施例１９】
【０３５５】
ｚＶＡＤ-ｆｍｋおよびＤＭＳＯにさらすことによる壊死からの細胞の保護
ｚＶＡＤ-ｆｍｋ(１００μＭ)およびＤＭＳＯ(０.５％)に低濃度Ｕ-９３７細胞(１×１０５細胞／ｍｌ) を７２時間さらすと、結果として壊死による細胞死が起こる。ｚＶＡＤ-ｆｍｋおよびＴＮＦαによって引き起こされる細胞壊死を減少させることが同定された化合物、ケンブリッジ化学ライブラリー(ChemBridge chemical library)からの化合物１１５８０７、１１５６８１、２１０２２７および２１５６８６はまた、ｚＶＡＤ-ｆｍｋおよびＤＭＳＯによって誘導される細胞壊死を減少させる能力について評価された。細胞(１×１０５細胞／ｍｌ)を、最初にｚＶＡＤ-ｆｍｋにさらし、３０分後、壊死を減少させた上記で同定した小分子にさらした。さらに３０分後、細胞をＤＭＳＯにさらした。化合物にさらした７２時間後、上記の方法に従って、細胞内ＡＴＰレベルを測定した。ｚＶＡＤ-ｆｍｋ／ＴＮＦαによって誘導される壊死を減少させた４つの化合物はすべて、ｚＶＡＤ-ｆｍｋ／ＤＭＳＯによって誘導される壊死をもまた、減少させた。
【実施例２０】
【０３５６】
式(ＸＸII)化合物の製造
壊死阻害剤として同定された一つの化合物は、ケンブリッジ化合物番号２１０２２７(Ｎｅｃ-３)であった。この化合物の類似体についてはすでに記述があり(Ｅｌ-ＲａｙｙｅｓおよびＡｌ-Ｊａｗｈｅｒｙ、Ｊ.Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｈｅｍ.,２３：１３５-１４０、１９８６；ＳｉｎｈａおよびＲｓｔｏｇｉ、Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ.Ｃｈｅｍ.,３０８：６８４-６９２、１９９１；Ｓｚｏｌｌｏｓｙら、Ｊ.Ｃｈｅｍ.Ｓｏｃ.,Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ.,２、１９９１：４８９-４９３)、本構造クラスについて報告された生物学的活性には、弱い抗アメーバ活性が含まれる。
【０３５７】
本発明では、ケンブリッジ化合物番号２１０２２７の新規類似体を製造し、式(ＸＸII)で表す。一例では、式(ＸＸII)の化合物の合成の開始点を式(ＸＸIII)のテトラロンを用いて開始し、該テトラロンは、市販品を用いるか、または当業者らに既知の方法(例えば、Ｚｕｂａｉｄｈａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４７：５７５９、１９９１；Ｋｕｍａｒ、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、２９：４７７-７９，１９９７；および、Ｃｕｉら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ.,４４：４００７-４０１０,２００３を参照されたい)によって製造できる。
【０３５８】
【化４６】
2009521454.tif 000056
【０３５９】
式(ＸＸIII)化合物は、 触媒量の(例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはピペリジンのような) 塩基、または(例えばＨ２ＳＯ４、Ｈ３ＰＯ４あるいはＨＣｌのような)酸の存在下、アルコール溶媒中で、芳香族またはヘテロ芳香族アルデヒドＲ５-ＣＨＯとの縮合によって、それぞれ２-アリーリデン-または２-ヘテロアリーリジン-１-テトラロン(ＸＸIＶ)に転化され、式(ＸＸIＶ)化合物：
【０３６０】
【化４７】
2009521454.tif 000057
【０３６１】
式中、ＺはＣＨ２であり、Ｒ７はＨである：
を製造できる。
次に、式(ＸＸIＶ)化合物を、ヒドラジンおよび、例えばＲ９ＣＯ２Ｈ（式中、Ｒ９は所望により置換されたＣ１−１２アルキル、所望により置換されたＣ６またはＣ１０アリール、所望により置換されたＣ２−９ヘテロアリール、所望により置換されたＣ７−１６アラルキル、または、所望により置換されたＣ２−１５ヘテロアラルキルである）の様なカルボン酸と反応させて、式(ＸＸII)化合物を製造できる：
【０３６２】
【化４８】
2009521454.tif 000058
【０３６３】
（式中、ＺはＣＨ２であり、Ｒ７はＨであり、Ｒ６は−Ｃ(Ｏ)Ｒ９であり、式中、Ｒ９は前に定義したとおりであり、(ａ)で表される結合は二重結合であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、前に定義の通りである。）。
【０３６４】
この反応では、通常シスおよびトランス異性体の混合物が形成されるが、その後本技術分野で既知のクロマトグラフィー技術によって分離することができる。
【０３６５】
代わりの方法として、式(ＸＸIＶ)の化合物をヒドラジンのみと、またはヒドラジンおよび(例えば、トリメチル酢酸のような)立体障害カルボン酸と反応させて、式(ＸＸII)化合物（式中、Ｒ６はＨである）を製造することもできる。ヒドラジンとの反応を、カルボン酸不在下で行う場合、トランス異性体が優勢に形成される（即ち、Ｃ３とＣ３aの水素がトランスである）。カルボン酸存在下では、通常シスとトランスの混合物が形成されるが、後にクロマトグラフィー技術によって分離できる。次に、Ｒ６を持つ窒素原子を、例えば塩化アシルのような活性化カルボン酸またはチオカルボン酸でアシル化して、式(ＸＸII)化合物（Ｒ６は−Ｃ(Ｏ)Ｒ９または−Ｃ(Ｓ)Ｒ９である）を形成でき；クロロホルメートと反応して、式(ＸＸII)化合物（Ｒ６は−Ｃ(Ｏ)ＯＲ９である）を生成でき；ホスゲンまたはチオホスゲンと反応し、次にアミンと反応して式(ＸＸII)化合物（Ｒ６はそれぞれ−Ｃ(Ｏ)ＮＲ９Ｒ１０または−Ｃ(Ｓ)ＮＲ９Ｒ１０である）を生成できる；または、塩化スルホニルと反応して式(ＸＸII)化合物（Ｒ６は−Ｓ(Ｏ２)Ｒ９であり、Ｒ９およびＲ１０は、前に定義の通りである）を生成できる。
【０３６６】
式(ＸＸII)化合物（Ｚは一重結合であり、エチレン部分、酸素原子、硫黄原子、または窒素原子を含む）を製造するために、式(ＸＸIII)の化合物を式(ＸＸIＶ)化合物に転化するための前述した方法と類似の方法で、芳香族またはヘテロ芳香族アルデヒドＲ５-ＣＨＯを、アルコール溶媒中、触媒量の塩基または酸を用いて、式(ＸＸＶ)の１-インダノン、式(ＸＸＶI)の１-ベンゾスベロン、式(ＸＸＶII)の４-クロマノン、式(ＸＸＶIII)の１-チオ-４-クロマノン、または式(ＸＸIＸ)のキノリノンとそれぞれ反応させることができる。次に、得られた式(ＸＸIＶ)のα,β-非置換ケトンを、ヒドラジンと反応させ、次に、前述のように、Ｒ６置換基を形成する試薬と反応させることができる。
【０３６７】
【化４９】
2009521454.tif 000059
【０３６８】
ＺがＳ(Ｏ)またはＳ(Ｏ２)である式(ＸＸII)化合物を製造するために、式(ＸＸＶIII)化合物を、(例えばジメチルジオキシランのような)酸化剤で処理し、得られたスルホキシドまたはスルホンは、前述のように、Ｒ５-ＣＨＯで、次にヒドラジンおよびＲ６-ＣＯ２Ｈで処理することによって前進した。
【０３６９】
(ａ)によって示される結合が一重結合である式(ＸＸII)化合物は、(ａ)によって示される結合が二重結合である対応する式(ＸＸII)の化合物を、触媒的水素化法で、還元することによって得ることができる。
【０３７０】
式(ＸＸII)化合物の製造に用いられる任意の合成工程において、非所望の反応から反応官能性を保護する必要がある場合には、置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5又はＲ6の内のいずれかを、Ｇｒｅｅｎｅ“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  Ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第三版”(Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９９)(本明細書中に参照として取り入れる)に記載の方法に従って、保護できる。
【０３７１】
式(ＸＸII)化合物の例を表６に示す：
【０３７２】
【化５０】
2009521454.tif 000060
【０３７３】
（式中、(ａ)によって示される結合は二重結合であり、Ｒ4およびＲ7はそれぞれＨであり、Ｒ5は
【０３７４】
【化５１】
2009521454.tif 000061
【０３７５】
であり、Ｒ6は−Ｃ(Ｏ)Ｒ9であり、Ｚ、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5a、Ｒ5b、Ｒ5c、Ｒ5dおよびＲ9は、それぞれ表に示すとおりである。）。
【０３７６】
【表６−１】
2009521454.tif 000062
【０３７７】
【表６−２】
2009521454.tif 000063
【０３７８】
【表６−３】
2009521454.tif 000064
【０３７９】
【表６−４】
2009521454.tif 000065
【０３８０】
【表６−５】
2009521454.tif 000066
【０３８１】
式(ＸＸII)化合物のその他の例を、以下のものからなる化合物の群から選択できる：
【０３８２】
【化５２−１】
2009521454.tif 000067
【０３８３】
【化５２−２】
2009521454.tif 000068
【０３８４】
【化５２−３】
2009521454.tif 000069
【０３８５】
【化５２−４】
2009521454.tif 000070
【０３８６】
（式中、Ｃ3およびＣ3aの水素の相対立体化学は、示したとおりであり、これらのキラル中心での絶対配置は両鏡像異性体を許容する。）。
【実施例２１】
【０３８７】
式(ＸＸII)化合物による壊死の阻害
式(ＸＸII)化合物を、実施例１８の二次スクリーニングに記載の方法に従って、抗壊死活性について、アッセイしたが、アッセイには試験化合物をより低い濃度で用い、Ｕ-９３７細胞の代わりにヒトジャーカット  Ｔ細胞を用いた。最初に、化合物ライブラリーを、ヒトＢ細胞株Ｕ-９３７中、ｚＶＡＤ存在下でＴＮＦαによって誘導される細胞死の阻害について、スクリーニングした。壊死阻害剤として同定された一つの化合物は、(１４０)であった。最初の試験サンプルは、ジアステレオマーの混合物であった。(１４０)の誘導体のいくつかは、文献中に報告されている(Ｅｌ-Ｒａｙｙｅｓ,Ｎ.Ｒ.；Ａｌ-Ｊａｗｈｅｒｙ,Ａ.Ｊ.、Ｊ.Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｈｅｍ.１９８６、２３，１３５-１４０；Ｓｉｎｈａ,Ａ.Ｋ.；Ｒａｓｔｏｇｉ,Ｓ.Ｎ.Ｉｎｄｉａｎ Ｊ.Ｃｈｅｍ.,１９９１、３０Ｂ、６８４-６９２；Ｓｏｚｏｌｌｏｓｙ,Ａ；Ｔｏｔｈ,Ｇ.；Ｌｏｒａｎｄ,Ｔ.;Ｋｏｎｙａ,Ｔ.；Ａｒａｄｉ,Ｆ.；Ｌｅｖａｉ，Ａ.、Ｊ.Ｃｈｅｍ.Ｓｏｃ.Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ.,２、１９９１、４８９-４９３)。
【０３８８】
この構造クラスについてそれら科学文献中に報告された生物活性には、弱い抗アメーバ活性が含まれる。
【０３８９】
【化５３】
2009521454.tif 000071
【０３９０】
トランス異性体(５)およびシス異性体(４)の製造方法を、以下のスキーム３に概説した。最初に、６-メトキシテトラロン(Ｉ-８)を、塩基(水酸化ナトリウム)存在下でｐ-フルオロベンズアルデヒド(Ｉ-９)と反応させると、カルコン(Ｉ-１０)が得られた。次に、この物質を、過剰酢酸存在下でヒドラジン水和物で処理すると、ジアステレオマー(５)および(４)が製造された。これらの化合物は、容易に分離された。また、スキーム４に概説したような、代わりの合成方法も用いた。テトラロン(Ｉ-８)を４-メトキシベンズアルデヒド(Ｉ-１１)で処理すると、カルコン(Ｉ-１２)が製造された。次に、カルコンを、過剰なトリメチル酢酸存在下でヒドラジン水和物と反応させると、ジアステレオマー(Ｉ-１３)と(Ｉ-１４)が製造され、これらが分離された。トリメチル酢酸のような有機酸の非存在下では、トランス異性体(Ｉ-１３)のみが形成された。次に、それぞれのジアステレオマーを酢酸無水物および触媒量のＤＭＡＰ(４-ジメチルアミノピリジン)と反応させると、それぞれ(２０)および(１９)が得られた。
【０３９１】
スキーム３
【０３９２】
【化５４】
2009521454.tif 000072
【０３９３】
スキーム４
【０３９４】
【化５５】
2009521454.tif 000073
【０３９５】
また、ヒトジャーカットＴ細胞、細胞死を誘導するＦａｓリガンド、およびアポトーシス経路を阻害するｚＶＡＤを用いた、別の壊死アッセイでも化合物を試験した。３６時間後、細胞生存度を、市販のＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ＡＴＰ細胞生存度アッセイ(Ｐｒｏｍｅｇａ)によって測定した。(４)／(５)および(１９)／(２０)の場合、シス異性体(４)(図３４Ａ)および(１９)だけが(図３４Ｂ)、効率的に壊死を阻害し、高い細胞生存度をもたらすことが分かった。
【０３９６】
上記のように、構造-活性-相関（structure-activity-relationship）（ＳＡＲ）の研究を、抗壊死活性を高めるために、行った。製造されアッセイされた化合物には、化合物(１)−(２１７)（例えば、表６に列挙された化合物および以下に示す化合物）が含まれる。これら化合物は、(４)、(５)、(１９)および(２０)の製造に用いられた方法と類似した方法を用いて、製造された。化合物(１３５)、(１３６)および(１３７)を、スキーム５に示す方法に従って、製造した。
【０３９７】
スキーム５
【０３９８】
【化５６】
2009521454.tif 000074
【０３９９】
（１９）が壊死から神経細胞を保護できることをさらに確かめるため、ｚＶＡＤ存在下、２つの異なる神経毒を用いて、ヒト神経芽腫細胞株ＳＨ-ＳＹ５Ｙで試験した。細胞死は、アルツハイマー病の細胞モデルであるβ-アミロイド、およびパーキンソン病の細胞モデルであるメチルピリジニウムイオン(ＭＰＰ＋)によって誘導された。両例では、化合物は、細胞内ＡＴＰレベルによって測定されるように、毒性の減少に有効であった（図３５Ａおよび３５Ｂ）。
【０４００】
本明細書に記載された化合物は、細胞が毒素(例えば、Ｆａｓリガンド、ＭＰＰ＋、または-β-アミロイド)でチャレンジされ、アポトーシス経路がｚＶＡＤの付加により妨げられる場合に、細胞生存度の維持に有効である細胞壊死阻害剤である。この保護は、ヒト神経細胞およびヒトＴ細胞のような、異なる細胞型でも認められた。本明細書に記載された化合物は、急性または慢性の神経病にかかったヒトの治療のための治療薬として(単独または他の化合物との組み合わせで)有効でありうる。さらに、本発明の化合物は壊死による細胞死の誘導に必須な新規の分子標的のアッセイ開発に有効でありうる。
【０４０１】
化合物の製造および特徴づけ
２-アリーリデン-１-テトラロン類および２-(アリーリデン)-コマン-４-オン類の一般的合成法を、２-(４-フルオロベンジリデン)-７-メトキシ-１-テトラロンを例として説明する：エタノール(２０ｍｌ)中の７-メトキシ-１-テトラロン(１.７６０ｇ、０.０１ｍｏｌ)および４-フルオロベンズアルデヒド(１.２４０ｇ、０.０１ｍｏｌ)溶液に、ＮａＯＨ(０．０１２ｍｏｌ、８Ｎ)を、 室温でゆっくり加えた。混合物を２時間攪拌した。沈殿した固体をろ過により集め、次に、エタノール、水、再度エタノールで順次洗浄した。固体を真空中で乾燥させると、２-(４-フルオロベンジリデン)-７-メトキシ-１-テトラロン(２.４８５ｇ、８８％)が得られた：ｍｐ１２９℃―１３０℃
【０４０２】
【化５７】
2009521454.tif 000075
【０４０３】
３,３ａ-トランスおよび３,３ａ-シス  Ｎ-アセチル-１-［３-(アリール)-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-ベンゾ[ｇ]インダゾール］類およびＮ-アセチル-１-(３-アリール-３ａ,４-ジヒドロ-３Ｈ-クロメノ[４,３-ｃ]ピラゾール)類の一般的製造法を、(４)および(５)を例として説明する：２-(４-フルオロベンジリデン)-７-メトキシ-１-テトラロン(０.３００ｇ、０．００１ｍｏｌ)、ヒドラジン水和物(０.３ｍｌ)の酢酸(３ｍｌ)中溶液を、１２０℃で１５時間還流した。反応混合物を濃縮し、次に酢酸エチル中に溶解した。有機層を、水、飽和ＮａＨＣＯ3水溶液、水および食塩水で順次洗浄し、無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、ろ過し、さらに濃縮した。得られた残留物をシリカゲルカラム、酢酸エチル：ヘキサン(３：７)を用いて精製すると、(５)(０.０５１ｇ、２１％)および(４)(０.１０９ｇ、４５％)が得られた。収率は、出発物質(９５ｍｇ）の回収を基にした。
【０４０４】
【化５８−１】
2009521454.tif 000076
【０４０５】
【化５８−２】
2009521454.tif 000077
【０４０６】
【化５８−３】
2009521454.tif 000078
【０４０７】
【化５８−４】
2009521454.tif 000079
【０４０８】
【化５８−５】
2009521454.tif 000080
【０４０９】
【化５８−６】
2009521454.tif 000081
【０４１０】
【化５８−７】
2009521454.tif 000082
【０４１１】
(１１)の製造：エタノール(１０ｍｌ)およびメタノール(５ｍｌ)中の(２３)(０.２６０ｍｇ、０.７１ｍｍｏｌ)、５％ Ｐｄ-Ｃ(２５ｍｇ)の混合物を水素大気下で２日間攪拌した。混合物をろ過し、酢酸エチル、酢酸で順次洗浄した。ろ過物を集め、濃縮した。得られた固体を酢酸エチルから再結晶化すると、(１１)（０.２０５ｇ、８６％）が得られた：
【０４１２】
【化５９】
2009521454.tif 000083
【０４１３】
(１０)の製造：酢酸エチル(２０ｍｌ)中の(２８)(０.３７０ｍｇ、０.８６ｍｍｏｌ)、５％Ｐｄ-Ｃ(１０ｍｇ)混合物を水素大気下で２０時間攪拌し、次にセライトのパッドを通してろ過した。次に、セライトを酢酸エチル、酢酸で順次洗浄した。ろ過液を合わせて濃縮した。得られた固体を酢酸エチルから再結晶化すると、(１０)(０.１８５ｇ、６３％)が得られた：
【０４１４】
【化６０】
2009521454.tif 000084
【０４１５】
(１２)の製造：アルゴン大気下、ジクロロメタン(５ｍｌ)中の(１０)(０.１００ｇ、０.２８ｍｍｏｌ)溶液に、−７８℃でＢＢｒ3(１.０ｍｌ、ジクロロメタン中の１.０Ｍ溶液)を加えた。反応混合物を室温で１時間攪拌し、その後ＨＣｌの氷冷溶液(１.０Ｎ)に注いだ。混合物を酢酸エチルで抽出した。有機層を水で洗い、無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、ろ過し、濃縮した。得られた固体を酢酸エチルから再結晶化すると、(１２)(０.０６２ｇ、６７％)が得られた：ｍｐ．１６４−６７℃
【０４１６】
【化６１】
2009521454.tif 000085
【０４１７】
(２６)および(２５)の製造：ギ酸(２０ｍｌ)中の２-(４-メトキシベンジリデン)-７-メトキシ-１-テトラロン(２.０ｇ、０.００６８ｍｏｌ)、ヒドラジン水和物(２.０ｍｌ)の溶液を、１２０℃で２日間加熱した。反応混合物を濃縮し、次に酢酸エチルで抽出した。有機層を、水、飽和ＮａＨＣＯ3、水、食塩水で順次洗浄し、無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、ろ過し、その後濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで溶離剤として酢酸エチル-ヘキサン(３：７)を用いて精製すると、化合物(２６)(０.７４０ｇ、３２％)および(２５)(０．９０５ｇ、４０％)が得られた。
【０４１８】
【化６２】
2009521454.tif 000086
【０４１９】
(７９)および(３９)の製造：プロピオン酸(５ｍｌ)中の２-(４-メトキシベンジリデン)-７-メトキシ-１-テトラロン(０.５００ｇ、１.７ｍｍｏｌ)およびヒドラジン水和物(０.５ｍｌ)水溶液を１４０℃で２日間還流した。反応混合物を濃縮し、残留物を酢酸エチル(２５ｍｌ)中に溶解した。混合物を、水、飽和ＮａＨＣＯ3水溶液、および水で順次洗浄し、無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、ろ過し、さらに濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、溶離剤として酢酸エチル：ヘキサン(３：７)を用いて精製すると、(７９)(０.２１７ｇ、３５％)および（３９）（０.２５２ｇ、４１％）が得られた。
【０４２０】
【化６３】
2009521454.tif 000087
【０４２１】
３,３ａ-トランス及び３,３ａ-シスＮ-置換-１[３-(アリール)-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-ベンゾ[ｇ]インダゾール]類の一般的製造法を、(１３８)および(８５)を例として説明する：  エタノール(５ｍｌ)中の２-(４-メトキシベンジリデン)-１-テトラロン(１.０ｇ、０.００３４ｍｏｌ)、トリメチル酢酸(５.０ｇ)、ヒドラジン水和物(１０ｍｌ)の溶液を６時間還流し、次に濃縮した。得られた残留物を酢酸エチル(２０ｍｌ)に溶解し、次に水で洗浄した。有機層を、飽和ＮａＨＣＯ3溶液(２５０ｍｌ)にゆっくり注いだ。得られた溶液を、メチル-５-クロロ-５-オキソバレレート(０.４１０ｍｌ、０.０１ｍｏｌ)でゆっくり処理した。混合物を、室温で３０分間攪拌した。酢酸エチル層を分離し、水、食塩水で順次洗浄し、無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。残留物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで、溶離剤として酢酸エチル-ヘキサン(３：７)を用いて精製すると、化合物(１３８)(３７％)および(８５)(２３％)が得られた。
【０４２２】
【化６４−１】
2009521454.tif 000088
【０４２３】
【化６４−２】
2009521454.tif 000089
【０４２４】
３,３ａ-トランスおよび３,３ａ-シス  2-アセトキシ-１-[８-メトキシ-３-(４-メトキシ-フェニル)-３.３ａ,４,５-テトラヒドロ-ベンゾ[ｇ]-インダゾール-２-イル]-プロパン-１-オン((１３９)、(１００)および(１０１))の製造：エタノール（５ｍｌ）中の２-(４-メトキシ-ベンジリデン)-１-テトラロン(１.１ｇ、０.００３７ｍｏｌ)、トリメチル酢酸(６.０ｇ)、ヒドラジン水和物(１.１ｍｌ)の溶液を６時間還流し、真空下で濃縮した。得られた残留物を、酢酸エチル(２００ｍｌ)中に溶解し、ゆっくりと、飽和ＮａＨＣＯ3溶液(２００ｍｌ)上に注ぎ、得られた溶液を、ゆっくり、(Ｓ)-アセトキシ-プロピオニルクロリド(２.３５０ｍｌ、０.０１８ｍｏｌ)で処理し、室温で３０分間攪拌した。酢酸エチル層を分離し、水、食塩水で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥、濃縮した。残留物をシリカゲルカラム上、酢酸エチル-ヘキサン(３５％)を用いて精製した。初期のフラクションは、(１３９)(０．４４０ｇ、２８％)を含み、後方のフラクションは、（１００）（０．５０８g、３２％）および（１０１）（０.１３０ｍｇ、８％）を含んでいた。
【０４２５】
【化６５】
2009521454.tif 000090
【０４２６】
(１０２)の製造：  メタノール(５ｍｌ)中の（１０３）（０.５０ｇ、０.１１ｍｍｏｌ）溶液にＮａＯＨ(５０％、１ｍｌ)を室温で加えた。反応混合物を室温で２３時間攪拌した。次に、酢酸エチルで希釈した。有機層を水で洗浄し、無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。得られた残留物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで、溶離剤として酢酸エチル-ヘキサン(３：７)を用いて精製すると、(１０２)(０.０２７ｇ、６０％)が得られた：
【０４２７】
【化６６】
2009521454.tif 000091
【０４２８】
(１０３)の製造：  メタノール(５ｍｌ)中の(１０１)(０.５０ｇ、０.１１ｍｍｏｌ)の溶液に、ＮａＯＨ(５０％、１ｍｌ)を室温で加えた。反応混合物を室温で２３時間攪拌した。次に、酢酸エチルで希釈した。有機層を水で洗浄し、無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。得られた残留物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで、溶離剤として酢酸エチル-ヘキサン(３：７)を用いて精製すると、(１０３)(０.０３１ｇ、６９％)が得られた：
【０４２９】
【化６７】
2009521454.tif 000092
【０４３０】
(９８)の製造：  ジクロロメタン(５ｍｌ)中の(１０２)(８０ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ)、Ｎ-メチルモルホリン-オキシド塩酸(７５ｍｇ、０.６３ｍｍｏｌ)溶液に、テトラプロピルアンモニウムパールテネート(５ｍｇ)を加え、室温で５分間攪拌した。次に、これをろ過し、濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで、溶離剤２５％酢酸エチル-ヘキサンを用いて精製すると、(９８)（６２ｇ、７８％）が得られた：
【０４３１】
【化６８】
2009521454.tif 000093
【０４３２】
(４８)の製造：  メタノール(１０ｍｌ)中の(４７)（０.１５０ｇ、０.３６ｍｍｏｌ）溶液に、ＮａＯＨ(５０％、２ｍｌ)を室温で加えた。反応混合物を室温で２４時間攪拌し、酢酸エチルで希釈した。有機層を水で洗浄し、無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。得られた残留物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで、溶離剤として酢酸エチル：ヘキサン(４：６)を用いて、精製すると、(４８)（０.１０５ｇ、７８％）が得られた：
【０４３３】
【化６９】
2009521454.tif 000094
【０４３４】
３,３ａ-シス-１-[３-(アリール)-３,３ａ，４,５-テトラヒドロ-ベンゾ[ｇ]インダゾール]類のＮ-アリールカルボン酸の一般的製造法を、(８６)を例として説明する：メタノール(１０ｍｌ)およびＴＨＦ(５ｍｌ)中の(８５)(０.１８５ｇ、００.４２ｍｍｏｌ)の溶液に、ＮａＯＨ(１０Ｎ、１ｍｌ)を室温で加えた。反応混合物を室温で３時間攪拌し、酢酸エチルで希釈した。有機層を水で洗浄し、無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。得られた固体を酢酸エチル−ヘキサンから再結晶すると、(８６)(０.１５４ｇ、８６％)が得られた：
【０４３５】
【化７０】
2009521454.tif 000095
【０４３６】
３,３ａ-シス-１-[３-(アリール)-３,３ａ，４,５-テトラヒドロ-ベンゾ[ｇ]インダゾール]類のＮ-アリルカルボキサミドの一般的製造法を、(８７)を例として説明する：アルゴン大気下、ＣＨ2Ｃｌ2(１０ｍｌ)中の(８６)(0.１２０ｇ、０.２８ｍｍｏｌ)、ＨＵＢＴ(０.１０８ｇ，０.２８ｍｍｏｌ)、１-[３-ジメチルアミノ]プロピル-３-エチル-カルボジイミド(０.０８５ｇ、０.２８ｍｍｏｌ)およびＮ,Ｎ-ジイソプロピルエチルアミン(０.１ｍｌ、０.５６ｍｍｏｌ)の懸濁液に、モルホリン(０.０５０ｍｌ、０.５８ｍｍｏｌ)を室温で加えた。反応混合物を室温で１６時間攪拌した。反応混合物をジクロロメタン(２０ｍｌ)で希釈し、有機層をＨＣｌ(１Ｎ)、水、食塩水で順次洗浄し、無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。残留物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで、溶離剤として酢酸エチル：ヘキサン(８：２)を用いて精製すると、(８７)(０.１０６ｇ、７５％)が得られた：
【０４３７】
【化７１】
2009521454.tif 000096
【０４３８】
３,３ａ-トランスおよび３,３ａ-シス-１-[３-(アリール)-３,３ａ，４,５-テトラヒドロ-ベンゾ[ｇ]インダゾール]類のＮ-チオウレアまたはＮ−ウレアの一般的製造法を、(１１７)を例として説明する：エタノール(３０ｍｌ)および濃ＨＣｌ(２ｍｌ)中の２-(４-メトキシベンジリデン)-７-メトキシ-１-テトラロン(０.８５０ｇ、０.００２８ｍｏｌ)およびチオセミカルバジド(０.７９０ｇ、０.００８４ｍｏｌ)の懸濁液を、６時間還流した。得られた溶液を室温に冷やした。固体沈殿物をろ過し、エタノールで洗浄し、エタノールで再結晶すると、(１１７)（０.９８５ｇ、９６％)が得られた
【０４３９】
【化７２】
2009521454.tif 000097
【０４４０】
(１１９)の製造：  エタノール(１０ｍｌ)中の(１１７)(０.５ｇ、１.３ｍｍｏｌ)およびヨウ化メチル(１.０ｍｌ)溶液を２時間還流した。反応混合物を１／４容量に濃縮すると、固体沈殿物が得られた。混合物をろ過し、固体を冷エタノールで洗浄すると、シス-８-メトキシ-３-(４-メトキシフェニル)-３,３ａ,４,５-テトラヒドロベンゾ[ｇ]インダゾール-２-カルボキシミドチオ酸メチルエステルヨウ化水素(５６５ｍｇ、８５％)が得られ、さらに精製することなく用いた。エタノール中のシス-８-メトキシ-３-(４-メトキシフェニル)-３,３ａ,４,５-テトラヒドロベンゾ[ｇ]インダゾール-２-カルボキシミドチオ酸メチルエステルヨウ化水素(１７５ｍｇ、０.３４ｍｍｏｌ)およびアンモニア(エタノール中の２.０Ｎ溶液、１５ｍｌ)の溶液を６０℃で１６時間攪拌した。反応混合物を濃縮した。固体をメタノール：ジエチルエーテルから再結晶すると、(１１９)(１０５ｍｇ、８８％)が得られた：
【０４４１】
【化７３】
2009521454.tif 000098
【０４４２】
(１３５)の製造：アセトニトリル中の(１９)(８００ｍｇ、２.２ｍｇ)溶液に、アルゴン大気下で、トリメチルシリルアジド(１.５１７ｍｌ、５.０当量)を加え、次に[ビス(トリフルオロアセトキシ)ヨード]-ベンゼン(２.９４８ｇ、３.０当量)をゆっくり加えた。反応混合物を室温で２４時間攪拌した。反応混合物を濃縮すると、こげ茶色の残留物が得られ、該残留物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで、溶離剤として酢酸エチル-ヘキサン(１：３)を用いて精製すると、(１３５)(２５２ｍｇ、２９％)が得られ、出発物質(１９)(４５ｍｇ)が回収された。
【０４４３】
【化７４】
2009521454.tif 000099
【０４４４】
(１３６)の製造：  酢酸エチル(１０ｍｌ)中の(１３５)(０.２４０ｇ、０.６１ｍｍｏｌ)および１０％  Ｐｄ-Ｃ(５０ｍｇ)の溶液を、水素(８０ｐｓｉ)下で２４時間攪拌した。反応混合物をセライトのショートカラムを通してろ過した。ろ過物を酢酸水溶液(５０％、１０ｍｌ)でトリチル化した。固体を酢酸エチル-水から再結晶すると、(１３６)(０.１５３ｇ、５９％)が得られた：ｍｐ１１６−１９℃。
【０４４５】
【化７５】
2009521454.tif 000100
【０４４６】
(１３７)の製造：  ＴＨＦ(１０ｍｌ)中の(１３６)(２１０ｍｇ、０.５７ｍｍｏｌ)の溶液に、ギ酸(０.１５０ｍｌ)を０℃で加え、次にホルムアルデヒド水溶液(３７％)をゆっくり加えた。反応混合物を２４時間還流した。溶液を冷やし、ＮａＯＨ水溶液(２５％)で塩基性にし、酢酸エチルで抽出した。有機層を水で洗浄し、無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、ろ過し、濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、溶離剤として酢酸エチルを用いて精製すると、(１３７)(１０５ｍｇ、４７％)が得られた：
【０４４７】
【化７６】
2009521454.tif 000101
【０４４８】
(１２２)の製造：  ＴＨＦ(５ｍｌ)中の(１９)(１８０ｍｇ、０.５１ｍｍｏｌ)溶液に、ＬｉＡｌＨ4(２.０５６ｍｌ、２.０５６ｍｍｏｌ；１Ｍ／ＴＨＦ)を、室温で加えた。反応混合物を室温で１時間攪拌し、次にメタノール、後に氷でクエンチした。反応混合物を酢酸エチルで抽出した。有機層を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、溶離剤として２５％酢酸エチル-ヘキサンを用いて精製すると、(１２２)(３０ｍｇ、１７％)が得られた：濃厚油、
【０４４９】
【化７７】
2009521454.tif 000102
【０４５０】
他の化合物、例えば(６)、(７)、(８)、(９)、(１７)、(１８)、(２１)、(２７)、(２９)、(３０)、(３２)、(３３)、(３５)、(３７)、(３８)、(４０)、(４１)、(４２)、(４３)、(４４)、(４５)、(４６)、(８１)、(８３)、(８８)、(９６)、(９９)、(１０６)、(１０７)、(１０８)、(１０９)、(１１０)、(１１１)、(１１２)、(１１４)および(１１６)を、本明細書中に記載の方法に類似した方法を用いて製造した。
【実施例２２】
【０４５１】
ｚＶＡＤ-ｆｍｋ／ＴＮＦα-またはｚＶＡＤ-ｆｍｋ／ＤＭＳＯ−誘導壊死での、Ｆａｓ-関連死ドメインタンパク質の役割
支配的なネガティブ型のタンパク質Ｆａｓ-関連死滅ドメイン(Fas-associated death domain)(ＦＡＤＤ)を発現する細胞もまた、ｚＶＡＤ-ｆｍｋ／ＴＮＦα-またはｚＶＡＤ-ｆｍｋ／ＤＭＳＯでの処理に応答した壊死から細胞を護ることができる。ジャーカット細胞を、ＦＡＤＤ-ＦＫＢＰ融合構築物(Ｋａｗａｈａｒａら、Ｊ.Ｃｅｌｌ.Ｂｉｏｌ.,１４３：１３５３-６０、１９９８)で安定にトランスフェクトした。通常、その様な細胞は、ＦＡＤＤがマルチマー化(multimerize)されると、アポトーシスを受ける。しかしながら、これらの細胞は、カスパーゼ阻害剤ｚＶＡＤ-ｆｍｋ存在下で、アポトーシスから保護されるが、代わりに壊死を受け、このことから、このシステムでのカスパーゼ活性へのアポトーシスの依存性、およびカスパーゼ非存在下での壊死の誘導が確認された。
【０４５２】
安定にトランスフェクトされたジャーカット細胞(５００,０００細胞／ｍｌ)を、１００μＭのｚＶＡＤ-ｆｍｋ(１時間、前処理した) 、および壊死の減少が同定されたライブラリーからの化合物(ＤＭＳＯ中に溶解し、ＤＭＳＯの最終濃度を０.５％とした；ｚＶＡＤ-ｆｍｋの３０分後に加えた)の存在下、１００ｎＭのＦＫＢＰ二量体化剤(Ａｒｉａｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ；ＦＡＤＤ多量体化を刺激するために使用)で、４８時間処理した。その後、細胞生存度を、細胞内ＡＴＰレベルを測定することによって評価した。小分子は、ｚＶＡＤ-ｆｍｋ存在下で誘導される壊死からの保護を提供したが、ｚＶＡＤ-ｆｍｋ不在下でＦＡＤＤ二量体化により誘導されるアポトーシスからの保護は提供しなかった。これらの結果から、ＦＡＤＤは、ｚＶＡＤ-ｆｍｋ／ＴＮＦα-またはｚＶＡＤ-ｆｍｋ／ＤＭＳＯに応答した壊死の媒介に関与する可能性があることが分かる。壊死を減少させる小分子は、ＦＡＤＤと相互作用して、ｚＶＡＤ-ｆｍｋ／ＴＮＦα-またはｚＶＡＤ-ｆｍｋ／ＤＭＳＯでの細胞の処理時に壊死を促進するＦＡＤＤの正常機能を崩壊させることによって、機能しうる可能性がある。
【実施例２３】
【０４５３】
壊死を減少させる小分子の細胞内標的の同定
壊死を減少させる小分子化合物と相互作用する細胞内分子を、多数の異なるストラテジーを用いて同定できる。それぞれのストラテジーは、細胞からの様々なタンパク質と、上記の方法に従って同定された壊死を減少させる小分子の間の相互作用を検出することを含む。壊死を減少させる小分子と相互作用するタンパク質を同定するために、小分子を、当業者らに既知の方法を用いて、ビーズと結合させて良い。それぞれのストラテジーは、ｚＶＡＤ-ｆｍｋ／ＴＮＦα-またはｚＶＡＤ-ｆｍｋ／ＤＭＳＯにさらされた細胞からのタンパク質を用いて、実行されるべきである。
【０４５４】
一つのストラテジーでは、他のタンパク質中で、ＦＡＤＤを含むシグナル化複合体を、当業者らに既知の標準技術を用いて、免疫沈降して良い。次に、この複合体を、壊死を減少させる望ましい小分子化合物を含むビーズに加えて良い。壊死を減少させる小分子と相互作用するタンパク質を、複合体に含まれるタンパク質のウェスタンブロット検出によって、または分子生物学領域の当業者らに既知のその他の技術によって、同定されうる。検出された任意の結合相互作用は、壊死を減少させる小分子の標的が免疫沈降したＦＡＤＤ複合体内に存在することを示している。
【０４５５】
壊死を減少させる小分子の標的を同定するための第二のストラテジーでは、細胞を分画し、標準的な分子生物学技術を用いて、様々な分画プールを化合物との相互作用について、アッセイされうる。壊死を減少させる小分子と相互作用するタンパク質のプールは、該プールが壊死を減少させる小分子の標的であるタンパク質を含むことを示している。壊死を減少させる小分子の標的は、当業者らに既知の技術を用いて同定され得る。
【０４５６】
第三のストラテジーは、小プール発現スクリーニングシステムを含む。壊死を減少させる小分子の標的を、小分子がｚＶＡＤ-ｆｍｋ／ＴＮＦαまたはｚＶＡＤ-ｆｍｋ／ＤＭＳＯによって誘発される壊死から保護する任意の細胞から同定できる。壊死を減少させる小分子の標的を同定するためのこの方法を、例えば、Ｌｕｓｔｉｇら(Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ,２８３：８３-９９、１９９７)の方法に従って、行うことができる。この方法では、ｃＤＮＡライブラリーを望ましい細胞株またはその他の望ましい源から作成する。次に、ｃＤＮＡを、１００クローンのプールに分け、ｃＤＮＡを転写翻訳して、タンパク質と壊死を減少させる小分子との間の相互作用を検出するための、タンパク質プールを形成させた。壊死を減少させる小分子とライブラリータンパク質のプールとの間の相互作用は、分子生物学で標準的な技術、例えばＳＤＳ-ＰＡＧＥ、を用いて検出できる。
【実施例２４】
【０４５７】
壊死を減少させる小分子の構造的誘導体
壊死を減少させる小分子に以下の修飾を行うことができ、例えばｚＶＡＤ-ｆｍｋ／ＴＮＦα-またはｚＶＡＤ-ｆｍｋ／ＤＭＳＯによって誘導される、壊死を減少させるそれらの効果について評価した。
【０４５８】
化合物１１５８０７を、例えば、ベンジル環内（例えば式(ＶII)のＲ1-Ｒ4位のいずれか又はすべての位置）へヒドロキシル、メチル、カルボキシ、メトキシル、アミノまたはニトロ基を導入することによって、修飾して良い。二重結合を、インドールとヒダントイン部分の間のリンカー内に導入しても良い(例えば、式(ＶII)内では、結合(ａ)および(ｂ)の両方が二重結合でない限りにおいて、結合(ａ)、(ｂ)または(ｃ)が二重結合であって良い)。チオウレア部分を、還元またはアルキル化しても良い(例えば、該部分は−ＳＨまたはＳＲ8であってよく、式中、Ｒ8はアルキル基である)。インドールアミノ基を還元、アルキル化、またはアシル化しても良い（例えば、式(ＶII)中で、Ｒ5はＣＨ3、ＣＨ3(ＣＨ2)ｎ(nは１−４である) 、およびＨＯＯＣ-(ＣＨ2)n（ｎは１−４である）であってよい）。
【０４５９】
【化７８】
2009521454.tif 000103
【０４６０】
さらに、ヒダントイン３-メチル基を、様々な長さの直鎖または分枝鎖のアルキル基で、及び、ヒドロキシル、メチルまたはアシル官能基で置換して良い：例えば、以下の基が式(ＶII)のＲ7位に存在して良い；ＣＨ3、ＣＨ3(ＣＨ2)n（式中ｎは１−４である）、ＯＨ、またはＨＯＯＣ−(ＣＨ2)n−（式中ｎは１−４である)。さらに、インドールとヒダントイン部分の間のリンカーＣＨ2基を、アルキル化、アシル化、ハロゲン化またはヒドロキシル化することができる：例えば、式(ＶII)中、Ｒ7は、ＣＨ3、ＣＨ3(ＣＨ2)n（式中ｎは１−４である）、およびＨＯＯＣ−(ＣＨ2)n（式中ｎは１−４である）であって良い。
【０４６１】
【化７９】
2009521454.tif 000104
【０４６２】
最後に、ヒダントインケトン部分をヒドロキシル基または水素に還元しても良い。
化合物２１０２２７を、例えば、ベンジル環（例えば、式(ＸＸ)のＲ1−Ｒ2またはＲ4-Ｒ9位の任意の位置）のいずれかまたは両方に、ハライド、またはヒドロキシルあるいはアミノ基を結合することによって、修飾して良い。Ｃ＝Ｎ二重結合を還元して良く、またフッ化物を取り除く、あるいはヒドロキシル基あるいはその他のハライドで置換しても良い。
【０４６３】
化合物２１５６８６を、例えば、２つの中心脂肪族二重結合を、共に、またはどちらかを独立的に還元することによって、修飾して良い。また、ケトンを還元しても良く、またはメトキシル基を、各々を独立的に、または一緒に、ヒドロキシル基で置換しても良い。
【０４６４】
化合物１１５６８１を、例えば、以下の方法で修飾して良い。脂肪族二重結合または脂肪族ケトンを還元して良い。ニトロ基を、プロトン、ハライドまたはスルフェートで置換して良い。フラボン環内のＣ＝Ｏ二重結合を還元して良い。また、フラボンに結合した１または２のいずれかの酸素も、取り除いても良い。
【実施例２５】
【０４６５】
Ｎｅｃ-２化合物の合成スキーム
Ｎｅｃ-２化合物を、本技術分野で既知の方法(例えば、Ｒｅｖｕｅ  Ｒｏｕｍａｉｎ  ｄｅ  Ｃｈｉｍｉｅ,３０：２４５-８,１９８５；Ｉｎｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ,Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｂ：Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ,４２Ｂ：１４５-１４９,２００３；および、Ｒｕｓｓｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ(Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｚｈｕｒｎａｌ  Ｏｒｇａｎｉｃｈｅｓｋｏｉ  Ｋｈｉｍｉｉ),３５：１５１６-１５２４,１９９９)に従って、作成できる。例えば、スキーム６を用いることができる。
【０４６６】
スキーム６
【０４６７】
【化８０】
2009521454.tif 000105
【０４６８】
４-ヒドロキシ-３-ニトロベンズアルデヒド（Ｍａｔｒｉｘ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃまたはＷａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手できる）を出発物質として用いると、Ｎｅｃ-２を上記スキームで製造できる。
【０４６９】
【化８１】
2009521454.tif 000106
【０４７０】
本発明のＮｅｃ-２化合物、特に式(ＸＶIII)化合物の製造に有用な３つのさらなる合成スキームを、以下のスキーム７，８および９に示す。
【０４７１】
スキーム７
【０４７２】
【化８２】
2009521454.tif 000107
【０４７３】
スキーム８
【０４７４】
【化８３】
2009521454.tif 000108
【０４７５】
スキーム９
【０４７６】
【化８４】
2009521454.tif 000109
【実施例２６】
【０４７７】
Ｎｅｃ-３化合物での構造-活性相関
構造-活性相関（ＳＡＲ）研究を、腫瘍壊死因子-α（ＴＮＦ-α）誘導ネクロトーシスを阻害する一連の式(ＸＸＸ)のＮｅｃ-３三環式化合物について行った。
【０４７８】
【化８５】
2009521454.tif 000110
【０４７９】
化学
３-フェニル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール(Ｘ＝ＣＨ2)、３-フェニル-２,３,３ａ,４-テトラヒドロ[１]ベンゾピラノ[４,３-ｃ]ピラゾール(Ｘ＝Ｏ)および３-フェニル-２,３,３ａ,４-テトラヒドロ-[１]ベンゾチオピラノ[４,３-ｃ]ピラゾール(Ｘ＝Ｓ)のような式(ＸＸＸ)の化合物を、スキーム１０に概説した方法に従って、それぞれ、１−テトラロン、４-クロマノンおよび４-チオクロマノンから製造した。例えば、式(ＸＸＸI)(Ｘ＝ＣＨ2、ＯまたはＳ)の化合物を、水酸化ナトリウム存在下、芳香族アルデヒドと縮合すると、式(ＸＸＸII)のカルコン化合物が得られた。７-ニトロ-１-テトラロンおよび７-メトキシ-４-クロマノンの場合、４-アニスアルデヒドとの縮合は、酸性条件下で成し遂げられた。酢酸内でのヒドラジン水和物と式(ＸＸＸII)の化合物を処理すると、容易に分離可能な式(ＸＸＸIII)［即ち、(３Ｒ,３ａＳ)-ｒｅｌ-異性体］、および式(ＸＸＸIＶ) ［即ち、(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-異性体］のジアステレオマーの混合物が得られた。５,５-ジオキソ-３-フェニル-２,３,３ａ,４-テトラヒドロ-[１]ベンゾチオピラノ[４,３-ｃ]ピラゾール（Ｘ＝ＳＯ2）化合物は、相当する式(ＸＸＸIII)および式(ＸＸＸIＶ)の３-フェニル-２,３,３ａ,４-テトラヒドロ-[１]ベンゾチオピラノ[４,３-c]ピラゾールをｍ-クロロパーオキシ安息香酸（ＭＣＰＢＡ）で酸化することによって、製造された。
【０４８０】
スキーム１０
【０４８１】
【化８６】
2009521454.tif 000111
【０４８２】
立体化学わりあてを、1Ｈ-ＮＭＲ、１-Ｄ ｎＯｅおよびＨＨ-ＣＯＳＹ実験を用いて、確認した。例えば、化合物(１４１)を、３ａ-位(δ３.４７-３.５５)と３-位(δ５.６６)のプロトン間の強いｎＯｅおよび大きい結合定数（Ｊ＝１１.２Ｈｚ）から、(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-異性体と、分析した。(３Ｒ,３ａＳ)-ｒｅｌ-異性体(１４２)は、３ａ-位（δ３.１６-３.２３）と３-位(δ４.９１)のプロトン間に弱いｎＯｅ、より小さい結合定数(Ｊ＝９.２Ｈｚ)を有し、３ａ-位(δ３.２０)のプロトンは、(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-異性体の相当するプロトンと比較して、４’-メトキシフェニル環によって遮蔽されていた。
【０４８３】
【化８７】
2009521454.tif 000112
【０４８４】
(１４１)の３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール環の５-位を、スキーム１１に示すように、修飾した。[ビス(トリフルオロアセトキシ)ヨード]-ベンゼンの存在下でのＭｅ3ＳｉＮ3を用いてのこのベンジル位へのアジドの導入を、Ｋｉｔａらの方法(Ｓｙｎｌｅｔｔ,４２７-４２８,１９９４)に従って行われ、２９％の収率で(１４３)が得られた。また、この反応に、除去反応が伴うと、３１％収率で(１４４)が得られた。次に、アジド(１４３)を、水素化することによってアミン(１４５)に還元し、その後、還元的アミノ化によって三級アミン(１４６)に転化した。(１４６)の５-位での相対的立体化学を、1Ｈ-ＮＭＲおよびＨＨ-ＣＯＳＹ実験によって立証した。(１４６)のジメチルアミンプロトン(δ２.２１)は、３ａ-位のプロトン(δ４.０３-４.０９)との強い結合定数を有し、ｓｙｎ-関係を示している。
【０４８５】
スキーム１１
【０４８６】
【化８８】
2009521454.tif 000113
【０４８７】
三環式環の２-位に様々な置換基を有する誘導体もまた、製造した。化合物(１４７)および(１４８)を、スキーム１０に従って合成したが、溶媒として酢酸の代わりに、それぞれ、ギ酸およびプロピオン酸を用いた。カルコン(１−１５)を、スキーム１２に示したように、トリメチル酢酸存在下でヒドラジン水和物と反応させると、アミン(１４９)が、ジアステレオマーの混合物として分離された（この物質は、その後、精製することなく用いた）。酢酸との場合と異なり、トリメチル酢酸のような立体的に過酷な酸（sterically  demanding acid）を用いると、直接アミド形成が阻害され、アミンが単離される。様々な酸塩化物で処理すると、式(ＸＸＸＶ)および式(ＸＸＸＶI)の化合物が得られる。次に、アミド(１５１)が、メタノール中のＮａＯＨで処理して、(１５０)から作られる。様々なセミカルバジドおよびチオセミカルバジドで(１−１５)を環化すると、スキーム１２に示すように、式(ＸＸＸＶII)および式(ＸＸＸＶIII)の化合物が得られた。例えば、(１５２)、(１５３)および(１５４)は、全てこの環化法によって生成する化合物である。ここに報告された全環化反応中、(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-および(３Ｒ,３ａＳ)-ｒｅｌ-異性体は、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる分離に従って単離した。その後、化合物(１５２)は、ＭｅＩでアルキル化して中間体(１５６)を得、次にエタノール中のアンモニウムで処理することを含む一連の反応によって、(１５７)に転化された（スキーム１３）。最終的に、水素化アルミニウムリチウムで還元することによって、(１４１)から化合物(２１３)を製造した。
【０４８８】
スキーム１２
【０４８９】
【化８９】
2009521454.tif 000114
【０４９０】
スキーム１３
【０４９１】
【化９０】
2009521454.tif 000115
【０４９２】
ネクロトーシス阻害活性の評価を、本明細書中に記載のように、ＴＮＦ-αで処理したヒトジャーカット  Ｔ細胞のＦＡＤＤ-欠損変異体を用いて行った。これらの条件を用いると、細胞は効率的にネクロトーシスを受けたが、正の対照としてのＮｅｃ-１(ＥＣ50＝０.０５０μＭ)によって、完全に且つ選択的に阻害された。ＥＣ50値を決定するために、細胞を、２４時間、試験化合物の濃度を増加させながら、１０ｎｇ／ｍｌのヒトＴＮＦ-αで処理し、その後、ＡＴＰ-ベース生存度評価を行った。精密度および再現性を確認するために、いくつかの鍵となる誘導体について、ＥＣ50値を、３つの別々の実験から独立的に得た。ＥＣ50値±標準偏差を示す。
【０４９３】
表７．ＴＮＦ-αで処理したＦＡＤＤ-欠損ジャーカットＴ細胞でのネクロトーシスの阻害についてのＥＣ50の決定
【０４９４】
【表７】
2009521454.tif 000116
【０４９５】
３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール環系で試験した５つのケースでは、ネクロトーシスの阻害で、それら(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-異性体は、相応する(３Ｒ,３ａＳ)-ｒｅｌ-異性体より、より活性であった（表７）。例えば、(１４１)は、(１４２)より２８倍より強かった。さらに、三環式環の８-位へのメトキシ基の導入は、活性を増加させた。例えば、（１６５）対（１６１）および（１６７）対（１４１）。
【０４９６】
三環式環の６−、７−、または９−位へのメトキシ基の転位、例えば、（１７３）、(１６３)および（１８０）、は、結果として活性を失った。サイズの増加（１８１）または三環式環の８-位のエーテル（１８３）上へのアミンの導入もまた、活性を減少させる結果となった。電子求引性フッ素（１７１）は、三環式環の８-位に許容された。しかしながら、ニトロ基でのフッ素の置換（１６９）は、阻害活性を減少させた。ペンダントフェニル環の４’-位の電子供与性メトキシ基は、フッ素またはニトロ置換基と比較して、活性を増加させた、たとえば（１４１）対（１６２）および（１７２）。しかしながら、エーテルの大きさの増加（１７４）、２’-位への転位（１７９）、それのヒドロキシル（１７５）またはチオエーテル（１８２）での置換は、程度は異なるものの、活性に有害であった。三環式環の５-位への一級アミン（１４５）または３級アミン（１４６）の導入もまた、有意な活性の浸食（＞１０倍）を生じた。
【０４９７】
表８．  ＴＮＦ-αで処理したＦＡＤＤ-欠損ジャーカット Ｔ細胞でのネクロトーシスの阻害についてのＥＣ50の決定
【０４９８】
【表８】
2009521454.tif 000117
【０４９９】
２,３,３ａ,４-テトラヒドロ-[１]ベンゾチオピラノ[４,３-ｃ]ピラゾール環での３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール環の置換は（表８）、活性にわずかな減少が生ずるのみであった、例えば、（１４１）対（１８８）および（１７１）対（１９０）。しかしながら、ある例では、(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ―と(３Ｒ,３ａＳ)-ｒｅｌ-異性体の活性の差は、２,３,３ａ,４-テトラヒドロ-[１]ベンゾピラノ-[４,３-ｃ]ピラゾール環系でより劇的であると考えられる。例えば（１８９）対（１９０）。ペンダントフェニル基のＳＡＲは、２つの環系の間で比較できるらしい。３-フェニル-２,３,３ａ,４-テトラヒドロ-[１]ベンゾチオピラノ[４,３-ｃ]ピラゾールまたは５,５-ジオキソ-３-フェニル-２,３,３ａ,４-テトラヒドロ-[１]ベンゾチオピラノ［４,３-ｃ］ピラゾール環での３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール環の置換は、より有意な活性の減少を生じた。例えば（１４１）対（１９２）および（１９４）。
【０５００】
次に、３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール環の２-位上の様々な窒素置換基のＳＡＲについて試験した（表９）。一般的に、アミドが最善であり、エチル、ヒドロキシメチルおよびトリフルオロメチルアミド、即ち（１４８）、（１９１）および（１５９）は、（１４１）にもっとも匹敵した。三環式環の２-位への尿素またはチオ尿素の導入は、活性に有害であった。同様に、アルキル基でのアミドの置換（２１３）も、ネクロトーシス阻害活性を完全に消失させた。
【０５０１】
表９．ＴＮＦ-αで処理したＦＡＤＤ-欠損ジャーカット Ｔ細胞でのネクロトーシスの阻害に関するＥＣ50の決定
【０５０２】
【表９】
2009521454.tif 000118
【０５０３】
三環式化合物、３-フェニル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾールおよび３-フェニル-２,３,３ａ,４-テトラヒドロ-[１]ベンゾチオピラノ[４,３-ｃ]ピラゾールは、強力なネクロスタチンであることが分かった。いずれの環系についても、ＳＡＲ研究では、(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-ジアステレオマーが、相応する(３Ｒ,３ａＳ)-ｒｅｌ-ジアステレオマーよりより活性であることが示された。三環式環の８-位へのフッ素またはメトキシの導入は、活性を増加させたが、６,７および９-位の置換は、有害であった。また、ペンダントフェニル環の４-位へのメトキシ基の導入は、活性を増加させたが、フェニル環の２位にメトキシを配置すると、活性がなくなった。三環式環系の２-位でのアミドが最善であった。さらに、３-フェニル-２,３,３ａ,４-テトラヒドロ-[１]ベンゾチオピラノ[４,３-ｃ]ピラゾールまたは５,５-ジオキソ-３-フェニル-２,３,３ａ,４-テトラヒドロ-[１]ベンゾチオピラノ[４,３-ｃ]ピラゾール環での３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール環の置換は、結果として活性を有意に減少させた。ネクロトーシスが重要な役割を演じると考えられる病気（即ち虚血性卒中）の動物モデルで、これらの化合物をさらに評価するために、目下、研究を行っている。さらに、これらの化合物は、さらにネクロトーシス性の細胞死のメカニズムを調べるための分子ツール（即ち無限試薬）として役立ち得る。
【実施例２７】
【０５０４】
方法
化学物質および方法
ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  ４００ＭＨｚ、Ｖａｒｉａｎ  ４００ＭＨｚ、または５００ＭＨｚスペクトロメーターを用いて得られた。全ての1Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、μ尺度ｐｐｍで表記され、ＣＤＣｌ3で処理された場合には、テトラメチルシラン（ＴＭＳ），］ＣＤ3ＯＤ中のサンプルでは３.３０ｐｐｍの五重線の中心線、ｄ6-ＤＭＳＯ中のサンプルでは２.４９ｐｐｍの五重線の中心線を参照した。すべての13Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、δ尺度（単位ｐｐｍ）で表記され、ＣＤＣｌ3で処理された場合には７７.２３ｐｐｍの三重線の中心線、ＣＤ3ＯＤ中のサンプルでは４９.０ｐｐｍの七重線の中心線、ｄ6-ＤＭＳＯ中のサンプルでは３９.５ｐｐｍの七重線の中心線を参照した。結合定数（Ｊ値）は、Ｈｚで示した。カラムクロマトグラフィーはシリカゲル（Ｍｅｒｃｋ、グレード60、２３０−４００メッシュ）上で、またはＲｅｄｉＳｅｐ ディスポーザルシリカゲルカラム（ｉｓｃｏ）を含む  ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ Ｓｇ １００ｃ分離システム（ＩＳＣＯ）を用いた。高分解能マススペクトルは、ＳＸ-１２０Ａマススペクトロメーター（ＪＥＯＬ ＵＳＡ.Ｉｎｃ.,Ｐｅａｂｏｄｙ  ＭＡ）またはＬＣＴマススペクトロメーター（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｉｎｃ.,Ｂｅｖｅｌｙ,ＭＡ）を用いて得られた。すべての融点は、Ｍｅｌ-Ｔｅｍｐ(登録商標)装置上のガラスキャピラリーチューブで測定され、未修正である。化合物の元素組成は、計算値の±０.４％以内である。
【０５０５】
化合物の製造および特徴づけ
塩基性条件下での２-アリーリデン-１-テトラロン類、２-(アリーリデン)クロマン-４-オン類および２-(アリーリデン)チオクロマン-４-オン類の合成に関する一般的方法を、２-(４-フルオロベンジリデン)７-メトキシ-１-テトラロンを例として示す：エタノール(２０ｍｌ)中の７-メトキシ-１-テトラロン(１.７６０ｇ、０.０１ｍｏｌ)および４-フルオロベンズアルデヒド(１.２４０ｇ、０.０１ｍｏｌ)の溶液に、ＮａＯＨ(０.０１２ｍｏｌ、８Ｎ)水溶液を、室温でゆっくり加えた。混合物を２時間攪拌した。固体沈殿物をろ過して集め、次にエタノール、水、再度エタノールで順次洗浄した。固体を真空下で乾燥させると、２-(４-フルオロベンジリデン)-７-メトキシ-１-テトラロン(２.４８５ｇ、８８％)が得られた：
【０５０６】
【化９１】
2009521454.tif 000119
【０５０７】
酸性条件下での２-アリーリデン-１-テトラロン類および２-(アリーリデン)クロマン-４-オン類の一般的合成法を、２-(４-メトキシベンジリデン)-７-ニトロ-１-テトラロンを例として示す：メタノール(５.４ｍｌ)中の７-ニトロ-１-テトラロン(０.３８２ｇ２.０ｍｍｏｌ)、４-メトキシベンズアルデヒド(０.２４３ｍｌ、２.０ｍｍｏｌ)および濃ＨＣｌ(１０ｍｌ)の混合物を、４時間加熱還流した。混合物を室温まで冷却し、その後ろ過した。残留物を少量のメタノールで洗浄し、真空下で乾燥させると、２-(４-メトキシベンジリデン)-７-ニトロ-１-テトラロン(０.２８５ｇ、８８％)が淡黄色の固体として得られた：
【０５０８】
【化９２】
2009521454.tif 000120
【０５０９】
他の２-アリーリデン-１-テトラロン類、２-(アリーリデン)クロマン-４-オン類および２-(アリーリデン)チオクロマン-４-オン類の特徴づけは、実施例２８を参照のこと。
(３Ｒ,３ａＳ)-ｒｅｌ-および(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-２-アセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(アリール)-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール類、２-アセチル-２,３,３ａ,４-テトラヒドロ-[１]ベンゾピラノ[４,３-ｃ]ピラゾール類ならびに２-アセチル-２,３,３ａ,４-テトラヒドロ-[１]ベンゾチオピラン[４,３-ｃ]ピラゾール類の一般製法。(３Ｒ,３ａＳ)-ｒｅｌ-２-アセチル-３,３a,４,５-テトラヒドロ-３-(４-フルオロフェニル)-８-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール(１６０)および(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-２-アセチル-３,３a,４,５-テトラヒドロ-３-(４-フルオロフェニル)-８-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール(１６１)を例として示す：  酢酸(３ｍｌ)中の２-(４-フルオロベンジリデン)-７-メトキシ-１-テトラロン(０.３００ｇ、１.０ｍｍｏｌ)、ヒドラジン水和物(０.３ｍｌ)の溶液を１２０℃で１５時間還流した。反応混合物を濃縮し、次に酢酸エチルに溶解した。有機層を、水、飽和ＮａＨＣＯ3水溶液、水および食塩水で順次洗浄し、無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、ろ過し、濃縮した。得られた残留物をシリカゲルカラム、酢酸エチル-ヘキサン(３：７)を用いて精製すると、(１６０)(０.０５１ｇ、２１％)および（１６１)(０.１０９ｇ、４５％)が得られた。収率は、出発物質(９５ｍｇ)の回収を基礎にした。
【０５１０】
【化９３】
2009521454.tif 000121
【０５１１】
(３Ｒ,３ａＳ)-ｒｅｌ-２-アセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-フルオロフェニル)-７-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール(１６２)：収率１８％、ｍｐ２２８−３０℃
【０５１２】
【化９４】
2009521454.tif 000122
【０５１３】
(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-２-アセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-フルオロフェニル)-７-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール(１６３)：収率２０％、 
【０５１４】
【化９５】
2009521454.tif 000123
【０５１５】
(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-２-アセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-フルオロフェニル)-７,８-ジメトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール(１６４)：収率３３％、ｍｐ１８９−９３℃
【０５１６】
【化９６】
2009521454.tif 000124
【０５１７】
(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-２-アセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-フルオロフェニル)-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール(１６５)：収率２３％、ｍｐ１６６−６８℃
【０５１８】
【化９７】
2009521454.tif 000125
【０５１９】
(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-２-アセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(３-フルオロフェニル)-８-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール(１６６)：収率３９％、ｍｐ１７６−７７℃
【０５２０】
【化９８】
2009521454.tif 000126
【０５２１】
(３Ｒ,３ａＳ)-ｒｅｌ-２-アセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-８-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール(１４２)：収率２５％、ｍｐ１４６−４８℃
【０５２２】
【化９９】
2009521454.tif 000127
【０５２３】
(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-２-アセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-８-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール(１４１)：収率３０％、ｍｐ１５１−５３℃
【０５２４】
【化１００】
2009521454.tif 000128
【０５２５】
(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-２-アセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール(１６７)：収率３０％、ｍｐ２５７−６０℃
【０５２６】
【化１０１】
2009521454.tif 000129
【０５２７】
(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-２-アセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-８-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール(１６８)：収率２５％、
【０５２８】
【化１０２】
2009521454.tif 000130
【０５２９】
(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-２-アセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-８-ニトロ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール(１６９)：収率４５％、
【０５３０】
【化１０３】
2009521454.tif 000131
【０５３１】
(３Ｒ,３ａＳ)-ｒｅｌ-２-アセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-８-フルオロ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール(１７０)：ＣＨ2Ｃｌ2中の２％  ＭｅＯＨを用いた第二シリカゲルカラムクロマトグラフィーを必要とする：  収率２６％、
【０５３２】
【化１０４】
2009521454.tif 000132
【０５３３】
(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-２-アセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-８-フルオロ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール(１７１)：収率２９％、
【０５３４】
【化１０５】
2009521454.tif 000133
【０５３５】
(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-２-アセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-ニトロキシフェニル)-８-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール(１７２)：収率２９％、ｍｐ２１９−２１℃
【０５３６】
【化１０６】
2009521454.tif 000134
【０５３７】
(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-２-アセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-６-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール(１７３)：収率４３％、ｍｐ２０３−２０７℃
【０５３８】
【化１０７】
2009521454.tif 000135
【０５３９】
(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-２-アセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-ベンジルオキシフェニル)-８-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール(１７４)：収率４１％、ｍｐ１５６−６１℃
【０５４０】
【化１０８】
2009521454.tif 000136
【０５４１】
(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-２-アセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(３,４-メチレンジオキシフェニル)-８-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール(１７７)：収率４１％、ｍｐ２０６−２０９℃
【０５４２】
【化１０９】
2009521454.tif 000137
【０５４３】
(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-２-アセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(３,４-エチレンジオキシフェニル)-８-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール(１７８)：収率１７％、ｍｐ１８９−９３℃
【０５４４】
【化１１０】
2009521454.tif 000138
【０５４５】
(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-２-アセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-９-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール(１８０)：収率２７％、ｍｐ１５７−６０℃
【０５４６】
【化１１１】
2009521454.tif 000139
【０５４７】
(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-２-アセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-８-ベンジルオキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール(１８１)：収率３６％、ｍｐ１５５−５７℃
【０５４８】
【化１１２】
2009521454.tif 000140
【０５４９】
(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-２-アセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-チオメトキシフェニル)-８-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール(１８２)：収率２２％、ｍｐ１４４−４７℃
【０５５０】
【化１１３】
2009521454.tif 000141
【０５５１】
(３Ｒ,３ａＳ)-ｒｅｌ-２-アセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-フルオロフェニル)-８-メチル-[１]ベンゾピラノ[４,３-ｃ]ピラゾール(１８４)：収率１５％、ｍｐ２１８−２０℃
【０５５２】
【化１１４】
2009521454.tif 000142
【０５５３】
(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-２-アセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-８-(４-モルホリノ)エトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール(１８３)：収率３３％、ｍｐ１２２−２６℃
【０５５４】
【化１１５】
2009521454.tif 000143
【０５５５】
(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-２-アセチル-２,３,３ａ,４-テトラヒドロ-３-(４-フルオロフェニル)-８-メチル-[１]ベンゾピラノ[４,３-ｃ]ピラゾール(１８５)：ヘキサン／ＥｔＯＡｃ／ＭｅＣＮ(６２：２５：１０)を用いた第二のシリカゲルカラムクロマトグラフィー精製を必要とする；収率４２％、ｍｐ２４３−４６℃。
【０５５６】
【化１１６】
2009521454.tif 000144
【０５５７】
(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-２-アセチル-２,３,３ａ,４-テトラヒドロ-３-(４-フルオロフェニル)-８-メトキシ-[１]ベンゾピラノ[４,３-ｃ]ピラゾール(１８６)：収率３２％、ｍｐ２４５℃
【０５５８】
【化１１７】
2009521454.tif 000145
【０５５９】
(３Ｒ,３ａＳ)-ｒｅｌ-２-アセチル-２,３,３ａ,４-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-８-メトキシ-[１]ベンゾピラノ[４,３-ｃ]ピラゾール(１８７)：収率３９％、
【０５６０】
【化１１８】
2009521454.tif 000146
【０５６１】
(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-２-アセチル-２,３,３ａ,４-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-８-メトキシ-[１]ベンゾピラノ[４,３-ｃ]ピラゾール(１８８)：収率５０％、
【０５６２】
【化１１９】
2009521454.tif 000147
【０５６３】
(３Ｒ,３ａＳ)-ｒｅｌ-２-アセチル-２,３,３ａ,４-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-８-フルオロ-[１]ベンゾピラノ[４,３-ｃ]ピラゾール(１８９)：収率３３％、
【０５６４】
【化１２０】
2009521454.tif 000148
【０５６５】
(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-２-アセチル-２,３,３ａ,４-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-８-フルオロ-[１]ベンゾピラノ[４,３-ｃ]ピラゾール(１９０)：収率５３％、
【０５６６】
【化１２１】
2009521454.tif 000149
【０５６７】
(３Ｒ,３ａＳ)-ｒｅｌ-２-アセチル-２,３,３ａ,４-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-８-メトキシ-[１]ベンゾピラノ[４,３-ｃ]ピラゾール(１９１)：収率３６％、
【０５６８】
【化１２２】
2009521454.tif 000150
【０５６９】
(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-２-アセチル-２,３,３ａ,４-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-８-メトキシ-[１]ベンゾチオピラノ[４,３-ｃ]ピラゾール(１９２)：収率５２％、
【０５７０】
【化１２３】
2009521454.tif 000151
【０５７１】
(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-２-アセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-ヒドロキシフェニル)-８-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール(１７５)の製造：酢酸エチル（２０ｍｌ）中の（１７４）(０.３７０ｍｇ、０.８６ｍｍｏｌ）および５％  Ｐｄ-Ｃ(１０ｍｇ)の混合物を水素大気下で２０時間攪拌し、次にセライトのパッドを通してろ過した。次に、セライトを、酢酸エチルおよび酢酸で順次洗浄した。合わせたろ液を濃縮した。得られた固体を、酢酸エチルから再結晶すると、（１７５）(０.１８５ｇ、６３％)が得られた：
ｍｐ２４０−４１℃
【０５７２】
【化１２４】
2009521454.tif 000152
【０５７３】
(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-２-アセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-ヒドロキシフェニル)-８-ヒドロキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール(１７６)の製造：アルゴン大気下、ジクロロメタン(５ｍｌ)中の（１７５）(０.１００ｇ、０.２８ｍｍｏｌ)の溶液に、ＢＢｒ3(１.０ｍｌ、ジクロロメタン中１.０Ｍ溶液)を、−７８℃で加えた。反応混合物を室温で１時間攪拌し、次にＨＣｌ(１.０Ｎ)の氷冷溶液中に注いだ。混合物を酢酸エチルで抽出した。有機層を、水で洗浄し、無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、ろ過し、濃縮した。得られた固体を酢酸エチルから再結晶すると、（１７６）(６２ｍｇ、６７％)が得られた：ｍｐ１６４−６７℃
【０５７４】
【化１２５】
2009521454.tif 000153
【０５７５】
(３Ｒ,３ａＳ)-ｒｅｌ-２-アセチル-２,３,３ａ,４-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-５,５-ジオキソ-８-メトキシ-[１]ベンゾチオピラノ[４,３-ｃ]ピラゾール(１９３)および(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-２-アセチル-２,３,３ａ,４-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-５,５-ジオキソ-８-メトキシ-[１]ベンゾチオピラノ[４,３-ｃ]ピラゾール(１９４)の製造：ジクロロメタン(５ｍｌ)中の（１９１）(２１ｍｇ、０.０５７ｍｍｏｌ)溶液を、０℃、ＭＣＰＢＡ(６０ｍｇ)で処理した。反応混合物を室温で１６時間攪拌し、次に、酢酸エチル(５０ｍｌ)で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ3および食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、濃縮した。残留物を、酢酸エチル-ヘキサン(２：３)を溶離剤として用いて、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製すると、（１９３）(９６％)が白色の固体として得られる：（１９４）(９２％)は、類似の方法で（１９２）から製造した。
【０５７６】
【化１２６】
2009521454.tif 000154
【０５７７】
(３Ｒ,３ａＳ)-ｒｅｌ-２-ホルミル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-８-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール（１９５）および(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-２-ホルミル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-８-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール（１４７）の製造：ギ酸(２０ｍｌ)中の２-(４-メトキシベンジリデン)-７-メトキシ-１-テトラロン(２.０ｇ、０.００６８ｍｏｌ)、ヒドラジン水和物(２.０ｍｌ)の溶液を、１２０℃で２時間加熱した。反応混合物を濃縮し、その後酢酸エチルで抽出した。有機層を、水、飽和ＮａＨＣＯ3水溶液、水および食塩水で順次洗浄し、無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、ろ過し、その後濃縮した。残留物を、溶離剤として酢酸エチル-ヘキサン(３：７)を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製すると、化合物（１９５）(０.７４０ｇ、３２％)および（１４７）(０.９０５ｇ、４０％)が得られた。
【０５７８】
【化１２７】
2009521454.tif 000155
【０５７９】
(３Ｒ,３ａＳ)-ｒｅｌ-２-プロピオニル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-８-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール（１９６）および(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-２-プロピオニル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-８-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール（１４８）の製造：プロピオン酸(５ｍｌ)中の２-(４-メトキシベンジリデン)-７-メトキシ-１-テトラロン(０.５００ｇ、１.７ｍｍｏｌ)およびヒドラジン水和物(０.５ｍｌ)の溶液を、１４０℃で２日間還流した。反応混合物を濃縮し、残留物を酢酸エチル(２５ｍｌ)に溶解した。混合物を、順次、水、飽和ＮａＨＣＯ3水溶液および水で洗浄し、無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。残留物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、溶離剤として酢酸エチル-ヘキサン(３：７)を用いて精製すると、（１９６）(０.２１７ｇ、３５％)および（１４８）(０.２５２ｇ、４１％)が得られた。
【０５８０】
【化１２８】
2009521454.tif 000156
【０５８１】
２-置換の(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-および(３Ｒ,３ａＳ)-ｒｅｌ-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-８-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール類の一般的製法。(３Ｒ,３ａＳ)-ｒｅｌ-２-アセトキシアセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-８-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール（１９７）および(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-２-アセトキシアセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-８-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール（１５０）を例として示す：エタノール(５ｍｌ)中の２-(４-メトキシベンジリデン)-１-テトラロン(１.０ｇ、３.４ｍｍｏｌ)、トリメチル酢酸（５.０ｇ）、ヒドラジン水和物(１.０ｍｌ)溶液を６時間還流し、その後濃縮した。得られた残留物を酢酸エチル（１０ｍｌ）中に溶解し、次に水で洗浄した。有機層を飽和ＮａＨＣＯ3水溶液(１０ｍｌ)中にゆっくり注いだ。得られた溶液をアセトキシアセチルクロリド(１.８３ｍｌ、１７ｍｍｏｌ)でゆっくり処理した。混合物を室温で３０分間攪拌した。酢酸エチル層を分離し、水および食塩水で順次洗浄し、無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。残留物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、溶離剤として酢酸エチル−ヘキサン(２：３)を用いて精製すると、化合物（１９７）(１１％)および（１５０)(６８％)が得られた。
【０５８２】
【化１２９】
2009521454.tif 000157
【０５８３】
(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-２-メトキシアセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-８-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール（１５８）：収率１６％、ｍｐ１５７−５９℃
【０５８４】
【化１３０】
2009521454.tif 000158
【０５８５】
(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-２-トリフルオロアセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-８-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール（１５９）：収率２２％、ｍｐ２２０−２２℃
【０５８６】
【化１３１】
2009521454.tif 000159
【０５８７】
(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-２-ヒドロキシアセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-８-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール（１５１）の製造：メタノール(１０ｍｌ)中の（１５０）(０.１５０ｇ、０.３６ｍｍｏｌ)溶液に、ＮａＯＨ(５０％、２ｍｌ)を室温で加えた。反応混合物を室温で２４時間攪拌し、酢酸エチルで希釈した。有機層を水で洗浄し、無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。得られた残留物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、溶離剤として酢酸エチル−ヘキサン(２：３)を用いて精製すると、（１５１）(０.１０５ｇ、７８％)が得られた：ｍｐ１６３−１６４℃
【０５８８】
【化１３２】
2009521454.tif 000160
【０５８９】
(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-８-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール類の２-カルボチオアミドおよび２-カルボキサミドの一般製法。  (３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-２-カルボチオアミド-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-８-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール（１５２）を例として説明する：  エタノール(３０ｍｌ)および濃ＨＣｌ(２ｍｌ)中の２-(４-メトキシベンジリデン)-７-メトキシ-１-テトラロン(０.８５０ｇ、０.００２８ｍｏｌ)およびチオセミカルバジド(０.７９０ｇ、０.００８ｍｏｌ)の懸濁液を６時間還流させた。得られた溶液を室温に冷却した。固体沈殿物をろ過によって単離し、エタノールで洗浄し、その後エタノールから再結晶させると、（１５２）(０.９８５ｇ、９６％)が得られた：ｍｐ２３６−３９℃
【０５９０】
【化１３３】
2009521454.tif 000161
【０５９１】
(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-２-カルボキサミド-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-８-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール（１５３）：収率７５％、ｍｐ２１７−２０℃
【０５９２】
【化１３４】
2009521454.tif 000162
【０５９３】
(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-２-カルボチオアミド-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-８-メトキシ-Ｎ-メチル-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール（１５４）：収率２８％、
【０５９４】
【化１３５】
2009521454.tif 000163
【０５９５】
(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-２-カルボキサミジン-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-８-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール（１５６）の製造方法：エタノール(１０ｍｌ)中の（１５２）(０.５ｇ、１.３ｍｍｏｌ)およびヨウ化メチル(１.０ｍｌ)の溶液を２時間還流した。反応混合物を容量１／４に濃縮すると、固体沈殿物が形成された。混合物をろ過し、固体を冷エタノールで洗浄すると、（１５６）(５６５ｍｇ、８５％)が得られ、これをさらに精製することなく用いた。エタノール（１５ｍｌ）中の（１５６）(１７５ｍｇ、０.３４ｍｍｏｌ)およびアンモニア(エタノール中の２.０Ｎ溶液、１５ｍｌ)の溶液を、６０℃で１６時間攪拌した。反応混合物を濃縮した。固体をメタノール−ジエチルエーテルから再結晶すると、（１５７）(１０５ｍｇ、８８％)が得られた：
【０５９６】
【化１３６】
2009521454.tif 000164
【０５９７】
(３Ｒ,３ａＲ,５Ｓ)-ｒｅｌ-２-アセチル-５-アジド-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-８-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール（１４３）および２-アセチル-３-(４-メトキシフェニル)-８-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール（１４４）の製造：アルゴン大気下、アセトニトリル(１０ｍｌ)中の（１４１）(８００ｍｇ、２.２ｍｍｏｌ)溶液に、トリメチルシリルアジド(１.５１７ｍｌ、５.０当量)を加え、その後、[ビス(トリフルオロアセトキシ)ヨード]ベンゼン(２.９４８ｇ、３.０当量)をゆっくり加えた。反応混合物を室温で２４時間攪拌した。反応混合物を濃縮すると焦げ茶色の残留物が得られ、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー、溶離剤として酢酸エチル−ヘキサン(１：３)を用いて精製すると、（１４３）(２５２ｍｇ、２９％)、（１４４）(２３９ｍｇ、３１％)および回収された出発物質（１４１）(４５ｍｇ)が得られた。
【０５９８】
【化１３７】
2009521454.tif 000165
【０５９９】
(３Ｒ,３ａＲ,５Ｓ)-ｒｅｌ-２-アセチル-５-アミノ-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-８-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール（１４５）の製造：酢酸エチル(１０ｍｌ)中の（１４３）(０.２４０ｇ、０.６１ｍｍｏｌ)および１０％  Ｐｄ-Ｃ(５０ｍｇ)の溶液を、水素(８０ｐｓｉ)下で２４時間、攪拌した。反応混合物を、セライトのショートカラムを通してろ過した。ろ液を酢酸水溶液(５０％、１０ｍｌ)でトリチル化した。次に、固体を酢酸エチル−水から再結晶化すると、（１４５）(０.１５３ｇ、５９％)が得られた：
【０６００】
【化１３８】
2009521454.tif 000166
【０６０１】
(３Ｒ,３ａＲ,５Ｓ)-ｒｅｌ-２-アセチル-５-(Ｎ,Ｎ-ジメチルアミノ)-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-８-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール（１４６）の製造：ＴＨＦ(１０ｍｌ)中の（１４５）(２１０ｍｇ、０.５７ｍｍｏｌ)溶液に、０℃でギ酸(０.１５０ｍｌ)を加え、その後ホルムアルデヒド水溶液(３７重量％)をゆっくり加えた。反応混合物を２４時間還流させた。溶液を冷却し、ＮａＯＨ水溶液(２５重量％)で塩基性にし、酢酸エチルで抽出した。有機層を水で洗浄し、無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、ろ過し、濃縮した。残留物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで、溶離剤として酢酸エチルを用いて精製すると、（１４６）(１０５ｍｇ、４７％)が得られた：
【０６０２】
【化１３９】
2009521454.tif 000167
【０６０３】
(３Ｒ,３ａＲ)-ｒｅｌ-２-エチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-８-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール（１５７）の製造：ＴＨＦ(５ｍｌ)中の（１４１）(１８０ｍｇ、０.５１ｍｍｏｌ)溶液に、ＬｉＡｌＨ4（２.０５６ｍｌ、２.０５６ｍｍｏｌ；ＴＨＦ中１Ｍ)を、室温で加えた。反応混合物を室温で１時間攪拌し、その後メタノール、次に氷でクエンチした。反応混合物を酢酸エチルで抽出した。有機層を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮した。残留物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで、溶離剤として２５％酢酸エチル−ヘキサンを用いて精製すると、（１５７）(３０ｍｇ、１７％)が得られた：濃厚油
【０６０４】
【化１４０】
2009521454.tif 000168
【０６０５】
化合物１９８−２１２の特徴付け
(３Ｒ,３ａＳ)-ｒｅｌ-２-アセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-フルオロフェニル)-７,８-ジメトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール（１９８）：収率２８％、ｍｐ２３１−３３℃
【０６０６】
【化１４１】
2009521454.tif 000169
【０６０７】
(３Ｒ,３ａＳ)-ｒｅｌ-２-アセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-フルオロフェニル)-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール（１９９）：収率１５％、ｍｐ１６８−７１℃
【０６０８】
【化１４２】
2009521454.tif 000170
【０６０９】
(３Ｒ,３ａＳ)-ｒｅｌ-２-アセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(３-フルオロフェニル)-８-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール（２００）：収率２０％、ｍｐ１９６−９９℃
【０６１０】
【化１４３】
2009521454.tif 000171
【０６１１】
(３Ｒ,３ａＳ)-ｒｅｌ-２-アセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール（２０１）：収率２０％、ｍｐ２６０−６２℃
【０６１２】
【化１４４】
2009521454.tif 000172
【０６１３】
(３Ｒ,３ａＳ)-ｒｅｌ-２-アセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-ニトロキシフェニル)-８-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール（２０２）：収率２０％、ｍｐ１７０−７５℃
【０６１４】
【化１４５】
2009521454.tif 000173
【０６１５】
(３Ｒ,３ａＳ)-ｒｅｌ-２-アセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-６-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール（２０３）：収率２７％、ｍｐ１７５−７８℃
【０６１６】
【化１４６】
2009521454.tif 000174
【０６１７】
(３Ｒ,３ａＳ)-ｒｅｌ-２-アセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-ベンジルオキシフェニル)-８-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール（２０４）：収率１１％、ｍｐ１４９−５１℃
【０６１８】
【化１４７】
2009521454.tif 000175
【０６１９】
(３Ｒ,３ａＳ)-ｒｅｌ-２-アセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(３,４-メチレンジオキシフェニル)-８-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール（２０５）：収率２１％、ｍｐ１６５−６９℃
【０６２０】
【化１４８】
2009521454.tif 000176
【０６２１】
(３Ｒ,３ａＳ)-ｒｅｌ-２-アセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(３,４-エチレンジオキシフェニル)-８-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール（２０６）：収率２８％、ｍｐ１９４−９７℃
【０６２２】
【化１４９】
2009521454.tif 000177
【０６２３】
(３Ｒ,３ａＳ)-ｒｅｌ-２-アセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-９-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール（２０７）：収率１４％、ｍｐ１５８−６２℃
【０６２４】
【化１５０】
2009521454.tif 000178
【０６２５】
(３Ｒ,３ａＳ)-ｒｅｌ-２-アセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-８-ベンジルオキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール（２０８）：収率１９％、ｍｐ１４４−４６℃
【０６２６】
【化１５１】
2009521454.tif 000179
【０６２７】
(３Ｒ,３ａＳ)-ｒｅｌ-２-アセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-チオメトキシフェニル)-８-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール（２０９）：収率１９％、ｍｐ１４４−４５℃
【０６２８】
【化１５２】
2009521454.tif 000180
【０６２９】
(３Ｒ,３ａＳ)-ｒｅｌ-２-アセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-８-(４-モルホリノ)エトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール（２１０）：収率３０％、ｍｐ９７−９９℃
【０６３０】
【化１５３】
2009521454.tif 000181
【０６３１】
(３Ｒ,３ａＳ)-ｒｅｌ-２-アセチル-２,３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-フルオロフェニル)-８-メトキシ-[１]ベンゾピラノ[４,３-ｃ]ピラゾール（２１１）：収率３４％、ｍｐ１７４−７６℃
【０６３２】
【化１５４】
2009521454.tif 000182
【０６３３】
(３Ｒ,３ａＳ)-ｒｅｌ-２-メトキシアセチル-３,３ａ,４,５-テトラヒドロ-３-(４-メトキシフェニル)-８-メトキシ-２Ｈ-ベンズ[ｇ]インダゾール（２１２）：収率４９％、ｍｐ１２４−２７℃
【０６３４】
【化１５５】
2009521454.tif 000183
【０６３５】
ネクロトーシス阻害活性の評価
ネクロトーシス活性を、本明細書中に記載の通り、ＴＮＦ-αで処理したヒトジャーカット  Ｔ細胞のＦＡＤＤ-欠損変異体を用いて、測定した。ＥＣ50値を決定するために、増加する濃度の化合物の存在下で、細胞（５００,０００細胞／ｍｌ、１００μｌ／穴、９６穴プレート中）を、１０ｎｇ／ｍｌのヒトＴＮＦ-αで２４時間処理し、次にＡＴＰ-ベースの生存度を評価した。化合物試験濃度は、０.０３−１００μＭであった。細胞生存度評価を、市販の発光ＡＴＰ-ベースアッセイキット(ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ-Ｇｌｏ、Ｐｒｏｍｅｇａ,Ｍａｄｉｓｏｎ,ＷＩ)を用いて、行った。細胞生存度の値を調整して、非特異的毒性を除いたが、それは、ほとんどの場合＜１０％であった。ＥＣ50値を、ｌｏｇ[Ｉ]対生存度のプロットからのシグモイド用量反応(可変勾配)曲線の非直線回帰分析を用いて計算した。
【実施例２８】
【０６３６】
テトラロンの合成
【０６３７】
【化１５６】
2009521454.tif 000184
【０６３８】
７-ベンジルオキシ-１-テトラロンの合成：ＤＭＦ(２０ｍｌ)中の７-ヒドロキシ-１-テトラロン(１.０ｇ、０．００６１ｍｏｌ)およびＫ2ＣＯ3(５.５ｇ)の懸濁液に、アルゴン大気下で、ベンジルブロミド(０.７２５ｍｌ、０．００６１ｍｏｌ)を、室温で加えた。次に、反応混合物を、室温で１８時間攪拌し、その後、氷上に注いだ。水溶液を酢酸エチルで抽出し、水で洗浄し、無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、溶離剤として酢酸エチル−ヘキサン(１５％)を用いて精製すると、７-ベンジルオキシ-１-テトラロン(１.３９５ｇ、９０％)が得られた：濃厚油
【０６３９】
【化１５７】
2009521454.tif 000185
【０６４０】
【化１５８】
2009521454.tif 000186
【０６４１】
７-(２-モルホリノ-４-イル-エトキシ)-１-テトラロンの製造：ＤＭＦ(２０ｍｌ)中の７-ヒドロキシ-１-テトラロン(０.９００ｇ、５.５ｍｍｏｌ)およびＫ2ＣＯ3(５ｇ)の懸濁液に、４-(２-クロロエチル)モルホリン塩酸塩(１.０３５ｇ５.５ｍｍｏｌ)を、室温、アルゴン大気下で加えた。反応混合物を室温で〜１６時間攪拌し、氷上に注いだ。水溶液を酢酸エチルで抽出し、水で洗浄し、無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。残留物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで、溶離剤として酢酸エチルーヘキサン(２：８)を用いて精製すると、７-(２-モルホリノ-４-イル-エトキシ)-１-テトラロン(１.２６０ｇ、８３％)が得られた：濃厚油
【０６４２】
【化１５９】
2009521454.tif 000187
【０６４３】
【化１６０】
2009521454.tif 000188
【０６４４】
７-(３-エトキシカルボニルプロポキシ)-１-テトラロンの製造：ＤＭＦ(２０ｍｌ)中の７-ヒドロキシ-テトラロン(０.８７０ｇ、５.３ｍｍｏｌ)およびＫ2ＣＯ3(５ｇ、過剰)の懸濁液に、エチル-４-ブロモブチレート(０.７７０ｍｌ、５.３ｍｍｏｌ)を、室温、アルゴン大気下で加えた。反応混合物を室温で〜１６時間攪拌し、その後氷上に注いだ。水溶液を酢酸エチルで抽出し、水で洗浄し、無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、溶離剤として酢酸エチル−ヘキサン(２：８)を用いて精製すると、７-(３-エトキシカルボニルプロポキシ)-１-テトラロン(１.１８０ｇ、８０％)が得られた。ｍ．ｐ．６２〜６３℃
【０６４５】
【化１６１】
2009521454.tif 000189
【０６４６】
【化１６２】
2009521454.tif 000190
【０６４７】
４-(８-オキソ-５,６,７-テトラヒドロ-ナフタレン-２-イルオキシ)酪酸の製造：７-(３-エトキシカルボニルプロポキシ)-１-テトラロン(１.１００ｇ、３.９ｍｍｏｌ)をメタノール中(２０ｍｌ)中に溶解し、ＮａＯＨ(２ｍｌ、１０Ｎ)で処理し、室温で３０分間攪拌し、希ＨＣｌ(１.０Ｎ)で酸性にした。次に、反応混合物を酢酸エチルで抽出し、水で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥した。酢酸エチルの濃縮後得られた残留物を酢酸エチル−ヘキサンから再結晶化すると、酸４-(８-オキソ-５,６,７-テトラヒドロ-ナフタレン-２-イルオキシ)酪酸(０.９７０ｇ、９９％)が得られた。
【０６４８】
【化１６３】
2009521454.tif 000191
【０６４９】
【化１６４】
2009521454.tif 000192
【０６５０】
７-(４-モルホリン-４-イル-４-オキソ-ブトキシ)-１-テトラロンの製造：ＣＨ2Ｃｌ2(２０ｍｌ)中の７-(３-エトキシカルボニルプロポキシ)-１-テトラロン(０.９２５g，７３.７ｍｍｏｌ)。ＨＵＢＴ(１.４１５ｇ、３.７ｍｍｏｌ)、Ｎ,Ｎ-ジイソプロピルエチルアミン(１.３ｍｌ)の懸濁液にモルホリン(０.３３０ｍｌ、３.７ｍｍｏｌ)を、室温、アルゴン大気下で加えた。次に、反応混合物を、室温で２４時間攪拌し、その後、濃縮した。残留物を酢酸エチル(５０ｍｌ)中に溶解し、有機層を希ＨＣｌ、水、食塩水で洗浄し、無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、ろ過し、濃縮した。残留物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで、溶離剤として酢酸エチルーヘキサン(８：２)を用いて精製すると、７-(４-モルホリン-４-イル-４-オキソ-ブトキシ)-１-テトラロン(１.０１０ｇ、８６％)が得られた：
【０６５１】
【化１６５】
2009521454.tif 000193
【０６５２】
注記しない限り、全２-アリーリデン-１-テトラロン類、２-(アリーリデン)クロマン-４-オン類および２-(アリーリデン)チオクロマン-４-オン類は、塩基性条件下で製造した。
【０６５３】
【化１６６−１】
2009521454.tif 000194
【０６５４】
【化１６６−２】
2009521454.tif 000195
【０６５５】
【化１６６−３】
2009521454.tif 000196
【０６５６】
【化１６６−４】
2009521454.tif 000197
【０６５７】
【化１６７】
2009521454.tif 000198
【０６５８】
燃焼解析
表１０
【０６５９】
【表１０】
2009521454.tif 000199
【０６６０】
ＨＰＬＣ法および純度評価
ＨＰＬＣ一般情報：装置；Ａｇｉｌｅｎｔ １１００、カラム：Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ(登録商標)Ｃ１８、２５ｃｍ×４.６ｍｍ、５μｍ、注入用量：５−１０μｌ、試料濃度：１００％アセトニトリル中１−２ｍｇ／ｍｌ、λ：２５４ｎｍ。
【０６６１】
ＨＰＬＣ法Ａ：溶出溶媒：６６％メタノール；３４％水、溶出速度：０.７５ｍｌ／分。
ＨＰＬＣ法Ｂ：溶出溶媒：５０％アセトニトリル；５０％水、溶出速度：１.００ｍｌ／分。
【０６６２】
表１１
【０６６３】
【表１１】
2009521454.tif 000200
【実施例２９】
【０６６４】
Ｎｅｃ-３と関連する化合物
次のＮｅｘ-３-様化合物を合成した：
【０６６５】
【表１２】
2009521454.tif 000201
【０６６６】
以下の合成スキームを用いて、化合物（２１６）および（２１７）を生成した：
スキーム１４
【０６６７】
【化１６８】
2009521454.tif 000202
【０６６８】
一般に、いずれのＮｅｃ-３化合物も、Ｃ３ａ位にメチル基、またはその他のアルキルあるいはヘテロアルキル基を付加することによって、修飾することができる。
【０６６９】
その他の実施態様
上の明細書中に記載したすべての文献、特許および特許明細書を、参照として、本明細書中に取り入れる。記載された本発明の方法およびシステムの様々な修飾および変更は、本発明の範囲および精神から離れることなく、当業者らに明らかであろう。本発明は、具体的実施態様と関連させて記載されているが、特許請求されている本発明は、その様な具体的実施態様に過度に限定されるべきではないことが、理解されるべきである。実際、本発明を実施するために記載された様式の当業者らに自明な本発明様々な修飾は、本発明の範囲内であることが意図される。その他の実施態様は、特許請求の範囲中にある。
【図面の簡単な説明】
【０６７０】
【図１】図１は、３つの例示的ネクロスタチンＮｅｃ−１、Ｎｅｃ−２、およびＮｅｃ−３の１組の構造を示す。
【図２】図２は、Ｎｅｃ−１によるＣＩＣＤの選択的抑制を示す１対のグラフである。ジャーカット細胞を、シクロヘキサミド（ＣＨＸ）を含まない（図２Ａ）または含む（図２Ｂ）５ｎｇ／ｍｌのＦａｓＬで処理して、アポトーシスを誘導し、あるいは５ｎｇ／ｍｌのＦａｓＬ、１μｇ／ｍｌのＣＨＸ、および１００μＭのｚＶＡＤ．ｆｍｋで処理して、ＣＩＣＤを誘導した（図２Ｂ）。Ｎｅｃ−１（３０μＭ）は、ＦａｓＬ／ＣＨＸ／ｚＶＡＤによって誘導されたＣＩＣＤから保護した（図２Ｂ）が、ＦａｓＬまたはＦａｓＬ／ＣＨＸによって誘導されたアポトーシスからは保護しなかった（図２Ａおよび図２Ｂ）。記載された試剤を用いて２４時間インキュベートした後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  ＡＴＰアッセイを使用して、細胞生存率を測定した。数値は、ＦａｓＬで処理していないジャーカット細胞を対照として生存率１００％と設定し、それと比較した生存率を表す。
【図３】図３は、Ｎｅｃ−１がＬ９２９細胞をＣＩＣＤから保護することを示すグラフである。Ｌ９２９細胞を、４０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαと、記載された試剤：５０μＭのＮｅｃ−１、２μｇ／ｍｌのＨｓｐ−９０阻害剤ゲルダナマイシン、５μＭのカテプシンＢ阻害剤Ｃａ−０７４−Ｍｅ、および５μＭのｐ３８阻害剤ＰＤ１６９３１６の内の一つとで７２時間処理した。これらの化合物を、ジャーカット細胞またはＢａｌｂｃ  ３Ｔ３細胞においてＣＩＣＤから保護するために選択した。ＡＴＰ−Ｌｉｔｅ−Ｍ  ＡＴＰアッセイ（Ｐａｃｋａｒｄ）を使用して、細胞生存率を測定した。数値は、ＴＮＦαを含まない対照を生存率１００％と設定し、それと比較した生存率を表す。
【図４】図４は、Ｎｅｃ−１が酸化防止剤でないことを示すグラフである。Ｕ９３７細胞を９６ウェルプレートに播種し、４０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα、１００μＭのｚＶＡＤ．ｆｍｋ（ＴＮＦ＋ｚＶＡＤ）で７２時間、または２５０μＭの酸化ストレス誘導剤メナジオン（Menadione）で２４時間、および２．５ｍＭのＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、８００Ｕ／ｍｌのスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、１４００Ｕ／ｍｌのカタラーゼ、５ｍＭのビタミンＥ（ｖｉｔ．  Ｅ）、１００μＭのＮｅｃ−１で処理した。ＴＮＦα／ｚＶＡＤ／ＤＭＳＯまたはメナジオン／ＤＭＳＯのブランク処理細胞の生存率も示す（−−−）。ＡＴＰ−Ｌｉｔｅ−Ｍアッセイ（Ｐａｃｋａｒｄ）を使用して、細胞生存率を測定した。数値は、生細胞の百分率を表す。数値は、ｚＶＡＤまたはＤＭＳＯで処理した対照を生存率１００％と設定し、それに対して標準化した。
【図５】図５は、Ｎｅｃ−１の効果がＰＡＲＰ阻害剤の効果と識別できることを示す１対のグラフである。図５Ａでは、ＪＫ細胞を、５ｎｇ／ｍｌのＦａｓＬ、１μｇ／ｍｌのＣＨＸ、および１００μＭのｚＶＡＤ．ｆｍｋ、ならびに記載された濃度（単位：μＭ）のＰＡＲＰ阻害剤で処理した。ＡＴＰアッセイを使用して、細胞生存率を測定した。数値は、ＦａｓＬを含まない、化合物で処理した細胞に対して標準化した生細胞の百分率を表す。図５Ｂでは、ＦＡＤＤ欠損ＪＫ細胞を、記載された量のＭＮＮＧ（単位：ｍＭ）、および３０μＭのＮｅｃ−１または１００μＭのＤＰＱで５時間処理した。ＴＰアッセイを使用して、生存率を測定した。数値は、ＦａｓＬを含まない、化合物で処理した細胞に対して標準化した生細胞の百分率を表す。
【図６】図６は、一連のＮｅｃ−１化合物への重要な改善を示す１組の構造を示す。
【図７】図７は、７−Ｃ１−Ｏ−Ｎｅｃ−１の用量依存的な反応曲線を示す。ＦＡＤＤ欠損ジャーカット細胞を、ＣＩＣＤを誘導する１０ｎｇ／ｍｌのヒトＴＮＦαで３６時間処理した。化合物単独でまたはＴＮＦαと組み合わせて処理した細胞の生存率を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  ＡＴＰアッセイを使用して測定した。前者の数値を用いて、毒性を算出した。ＴＮＦαを含む場合と含まない場合の同じ薬物濃度でのウェル中のＡＴＰ含有量の比を用いて、化合物による特異的保護を測定した。
【図８】図８は、Ｎｅｃ−１の構造活性相関（ＳＡＲ）の概要を示す。
【図９】図９は、７−Ｃｌ−Ｎｅｃ−１がin vivoで脳虚血を抑制することを示す１対のグラフである。図９Ａは、ＭＣＡＯモデルにおいて７−Ｃｌ−Ｎｅｃ−１を閉塞前または閉塞後に送達した時の梗塞体積の用量依存的減少を示す。閉塞前の送達は、４μＬの４ｍＭ  ７−Ｃ１−Ｎｅｃ−１を、２時間のＭＣＡＯ閉塞の開始５分前、および再灌流時の閉塞の休止直後に脳室内（ｉｃｖ）注射することによって行った（２μＬ／１回の注射）。閉塞後の送達は、２時間のＭＣＡＯを行った後の再灌流時、および再灌流の開始２時間後に行った（２μＬ／１回の注射）。あるいは、２時間の閉塞を行った後の再灌流時に、蠕動ポンプを使用して、２０μＬの化合物溶液を連続的にｉｃｖ注入した（注入：infusion）。閉塞の後、動物を２４時間回復させ、屠殺し、脳を採取し、固定し、切片を作製した。切片の２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリドによる生死判別染色に基づいて、梗塞体積を測定した。動物行動も点数化した（挿入図を参照のこと）。各処理群において、少なくとも６匹の動物を分析した。ビヒクル（vehicle）に対して＊＊−Ｐ＜０．０５。エラーバーは、平均値の誤差を反映する。図９Ｂでは、動物行動は、動物を屠殺する前に、処理群を知らされていない医師によって評価され、３（最悪）〜０（欠陥なし）で点数化された。各処理群において、４匹〜５匹の動物を分析した。閉塞後に、注射を行った。
【図１０】図１０は、in vivoでのＭＣＡＯの治療域の拡大、およびｚＶＡＤ．ｆｍｋの相加効果を示す１組のグラフおよびゲルを示す。図１０Ａでは、化合物を閉塞前５分、閉塞後２時間、および閉塞後６時間に注射することによって、ＬＤＮ−５３０６４（７−Ｃｌ−Ｎｅｃ−１）の治療域を測定した。図１０Ｂは、ｚＶＡＤ．ｆｍｋを含むＬＤＮ５３０６４の、局所虚血後の梗塞サイズに及ぼす相加効果を示す。イソフルラン麻酔下のＳＶ−１２９マウスに対して、腔内線維技法で２時間の中大脳動脈（ＭＣＡ）一過性閉塞を行った。ＬＤＮ５３０６４（４ｍＭ）とｚＶＡＤ．ｆｍｋ（１６０ｎｇ）（ｎ＝１６）の混合物溶液、またはｚＶＡＤ．ｆｍｋ単独（ｎ＝１６）、または等量（４μｌ）のビヒクル（ｎ＝８）を、虚血後２時間または６時間に脳室内注射した。ＭＣＡ閉塞後２４時間に、脳切片をＴＴＣ染色して、梗塞サイズを測定した。図１０Ｃは、２時間のＭＣＡＯを行う前に、７−Ｃｌ−Ｎｅｃ−１有りまたはなしで、閉塞前２時間および５分に脳室内に送達されたｚＶＡＤ．ｆｍｋを示す。脳を再灌流後３時間に収集し、溶解し、同じ動物の梗塞半球（＋）または対照（−）半球からのタンパク質に対して、抗活性カスパーゼ−３抗体または抗チューブリン抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。
【図１１】図１１は、培養細胞のＣＩＣＤおよび虚血性脳障害において、切断されたＬＣ３の検出を示す１組のゲルを示す。図１１Ａでは、Ｌ９２９細胞、またはＦＡＤＤ欠損ジャーカット細胞を、３０μＭのＮｅｃ−１存在下または非存在下に１００μＭのｚＶＡＤ．ｆｍｋまたは１０ｎｇ／ｍｌのヒトＴＮＦαで処理した。等量の細胞タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、抗ＬＣ３およびチューブリン抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。矢印は、ＬＣ３ＩＩを示す。図１１Ｂは、一過性局所虚血後、ＬＣ３ＩＩのレベル上昇の遅延を示す。イソフルラン麻酔下のＳＶ−１２９マウスに対して、腔内線維技法で２時間の中大脳動脈（ＭＣＡ）一過性閉塞を行った。脳の虚血領域および対側領域を、ＭＣＡ後の記載された時間に収集し、ＲＩＰＡ緩衝液に溶解し、等量の全タンパク質に対して、抗ＬＣ３およびチューブリン抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。図１１Ｃは、マウスに、２μＬの４ｍＭ  ７−Ｃｌ−Ｎｅｃ−１を閉塞後４時間および６時間にｉｃｖ注射し、閉塞後８時間に脳を収集した点を除いて、図１１Ｂと同様である。
【図１２】図１２は、in vivoでのＮｅｃ−１のＳＡＲを示す１組のグラフである。図１２Ａは、ヒダントイン部分のメチル基を欠く、Ｎｅｃ−１の不活性誘導体であるＮｅｃ−１ｉがin vitroでＣＩＣＤを抑制しないことを示す。ＦＡＤＤ欠損ジャーカット細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのヒトＴＮＦα、および記載された濃度のＮｅｃ−１またはＮｅｃ−１ｉで３０時間で処理した。ＡＴＰアッセイを使用して、細胞生存率を測定した。数値は、ＴＮＦαの非存在下に、対応する化合物／ＤＭＳＯ処理細胞の生存率に対して標準化した生存率を表す。図１２Ｂは、Ｎｅｃ−１ｉが、in vivo神経保護活性を欠いていることを示す。マウスに、４μＬの４ｍＭ  ７−Ｃｌ−Ｎｅｃ−１および７−Ｃｌ−Ｎｅｃ−１ｉを、ＭＣＡＯ前５分およびＭＣＡＯ直後に注射した（２μＬ／１回の注射）。閉塞の後、動物を２４時間回復させ、屠殺し、脳を採取し、固定し、切片を作製した。切片の２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリドによる生死判別染色に基づいて、梗塞体積を測定した。各処理群において、少なくとも５匹の動物を分析した。ビヒクルに対して＊＊−Ｐ＜０．０５。図１２Ｃは、７−Ｃｌ−Ｏ−Ｎｅｃ−１が、in vivoで７−Ｃｌ−Ｎｅｃ−１の活性に匹敵する活性を発現することを示す。マウスに、４μＬの４ｍＭ  ７−Ｃｌ−Ｎｅｃ−１または７−Ｃ１−Ｏ−Ｎｅｃ−１を、閉塞後４時間および６時間に脳室内注射した（２μＬ／１回注射）。梗塞体積を、図１２Ａと同様にして測定した。各処理群において、少なくとも１０匹の動物を分析した。ビヒクルに対して＊＊−Ｐ＜０．０５。
【図１３】図１３は、Ｎｅｃ−１がマクロファージ細胞においてＬＰＳ誘導性ＣＩＣＤから保護することを示すグラフである。マウスＲＡＷ２６４．７細胞を、記載される１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ、５０μＭまたは１００μＭのｚＶＡＤ．ｆｍｋ、および３０μＭのＮｅｃ−１またはＮｅｃ−１で処理する。２４時間後に、ＡＴＰアッセイを使用して、細胞生存率を測定した。数値は、ＤＭＳＯで処理した対照細胞に対して標準化した生細胞の百分率を表す。
【図１４】図１４は、Ｎｅｃ−１が一次皮質ニューロンを低酸素−低グルコース誘導性の細胞死から保護することを示す１対のグラフである。図１４Ａでは、成熟一次皮質−グリア混合培養物に対して、記載されるグルタミン酸拮抗薬：１０μＭのＣＮＱＸ／１μＭのＭＫ８０１、３０μＭのＮｅｃ−１またはＴＨ−Ｔｒｐ（Ｎｅｃ１ｉ）の存在下で、ＯＧＤを９０分間行った。細胞を、（ＣＮＱＸ／ＭＫ８０１を除く）化合物の存在下で２４時間回復させ、ＭＡＰ２サイトブロットを使用して、特定の神経細胞生存率を測定した。数値は、グルコース含有非脱酸素媒体中で維持された、化合物で処理した細胞に対して標準化した生細胞の百分率を表す。＊＊−Ｐ＜０．０２。図１４Ｂでは、成熟一次皮質−グリア混合培養物に対して、３０μＭのＮｅｃ−１および１００μＭのｚＶＡＤ．ｆｍｋの存在下で、ＯＧＤを９０分間行った。細胞を、化合物の存在下で２４時間回復させ、ＭＡＰ２サイトブロットを使用して、特定の神経細胞生存率を測定した。数値は、グルコース含有非脱酸素媒体中で維持された、化合物で処理した細胞に対して標準化した生細胞の百分率を表す。＊＊−Ｐ＜０．０４。
【図１５】図１５は、ネクロスタチンがヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞においてＭＰＰ＋細胞毒性を減弱することを示すグラフである。細胞を、１００μＭのｚＶＡＤ．ｆｍｋおよび３０μＭのネクロスタチンの存在下または非存在下に、５ｍＭのＭＰＰ＋で７２時間処理し、続いてＡＴＰアッセイを行った。数値は、対応する化合物で処理したがＭＰＰ＋で処理していない対象に対して標準化した細胞生存率を表す。
【図１６】図１６は、Ｎｅｃ−１によるアミロイドβ毒性からの保護を示すグラフである。ラット海馬神経細胞（Ｅ１７）を、ｚＶＡＤ−ｆｍｋおよびＮｅｃ−１の存在下に、記載された濃度のＡβ２５−３５で４８時間または７２時間処理した。ＡＴＰアッセイを使用して、生存率を測定した。Ａβ１−４２を使用しても、同様な結果が得られた。
【図１７】図１７は、Ｎｅｃ−１によるＡＩＣＤの抑制を示す１対のグラフである。まず、１μｇ／ｍｌのαＣＤ３、および１μｇ／ｍｌのαＣＤ２８抗体（ＣＤ４＋）、または１００Ｕ／ｍｌのマウスＩＬ−２抗体（ＣＤ８＋）で細胞を７２時間刺激し、続いて１００Ｕ／ｍｌのｍＩＬ−２中で数時間静止させ、記載される３０μＭのＮｅｃ−１を含むまたは含まない１００μＭのｚＶＡＤ．ｆｍｋの存在下で、ｍＩＬ−２を含む（ＣＤ８＋）または含まない（ＣＤ４＋）αＣＤ３で４８時間再活性化することによって、一次マウスＣＤ４＋およびＣＤ８＋のＴ細胞に対して、ＡＩＣＤが行われるように誘導した。図１７ＡにおいてはＳｙｔｏｘ  Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）（ＣＤ８）またはヨウ化プロピジウム排除（ＣＤ４）アッセイ、または図１７ＢにおいてはＡＴＰアッセイを使用して、細胞生存率を評価した。数値は、αＣＤ３を含まない、対応する化合物で処理した細胞に対して標準化した生細胞の百分率を表す。
【図１８】図１８は、Ｎｅｃ−１がカスパーゼ阻害によって阻害されたＣＴＬの正常な活性化を回復させることを示す１対のグラフである。図１８Ａでは、ＣＤ８＋細胞を、３０μＭのＮｅｃ−１を含むまたは含まない１００μＭのｚＶＡＤ．ｆｍｋの存在下で、１μｇ／ｍｌのαＣＤ３および１００Ｕ／ｍｌのマウスＩＬ−２で９６時間刺激した。ＦＡＣＳ分析法を使用して、細胞数を測定した。細胞数は、非刺激対照の細胞数を１００％と設定し、それに対して標準化する。図１８Ｂでは、ＯＴ−Ｉマウスから単離された脾細胞を、３０μＭのＮｅｃ−１を含むまたは含まない１００μＭのｚＶＡＤ．ｆｍｋの存在下で、１０μＭのＯＶＡ２５７−２６４ペプチド（Ｂａｃｈｅｍ）で７２時間刺激した。細胞をαＣＤ８＋−ＦＩＴＣ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色し、ＣＤ８＋細胞数をＦＡＣＳで測定した。細胞数は、非刺激対照の細胞数を１００％と設定し、それに対して標準化する。細胞をヨウ化プロピジウムで共染色することによって、死細胞（系）の百分率を測定した。
【図１９】図１９は、Ｎｅｃ−１によるＣＴＬ増殖の回復を示す１対のグラフである。図１９Ａでは、精製したＣＤ８＋細胞を、３０μＭのＮｅｃ−１を含むまたは含まない１００μＭのｚＶＡＤ．ｆｍｋの存在下で、１μｇ／ｍｌのαＣＤ３および１００Ｕ／ｍｌのマウスＩＬ−２で４８時間刺激し、その後、［３Ｈ］−チミジンを媒体にさらに２４時間添加し、続いてシンチレーションカウンタで分析した。数値は、無刺激対象に対する倍増を表す。図１９Ｂでは、精製したＣＤ８＋細胞を、３０μＭのＮｅｃ−１を含むまたは含まない１００μＭのｚＶＡＤ．ｆｍｋの存在下で、１μｇ／ｍｌのαＣＤ３および１００Ｕ／ｍｌのマウスＩＬ−２で７２時間刺激し、その後、細胞を固定し、ヨウ化プロピジウムで染色し、細胞ＤＮＡ量をＦＡＣＳで測定し、ＭｏｄＦｉｔソフトウェアパッケージ（Ｖｅｒｉｔｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｈｏｕｓｅ）を使用して、細胞周期の（記載された）異なる期の細胞の量を測定した。
【図２０】図２０は、Ｎｅｃ−１ｉがＴ細胞増殖に影響しないことを示すグラフである。ＯＴ−Ｉマウスから単離された脾細胞を、３０μＭのＮｅｃ−１もしくはＮｅｃ−１ｉを含むまたは含まない１００μＭのｚＶＡＤ．ｆｍｋの存在下で、１０μＭのＯＶＡ２５７−２６４ペプチド（Ｂａｃｈｅｍ）で７２時間刺激した。細胞をαＣＤ８＋−ＦＩＴＣ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色し、ＣＤ８＋細胞数をＦＡＣＳで測定した。細胞数は、非刺激対照の細胞数を１００％と設定し、それに対して標準化する。細胞をヨウ化プロピジウムで共染色することによって、死細胞（系）の百分率を測定した。
【図２１】図２１は、Ｎｅｃ−１がＢ細胞活性化を促進することを示すグラフである。脾細胞を、３０μＭのＮｅｃ−１もしくはＮｅｃ−１ｉを含むまたは含まない１００μＭのｚＶＡＤ．ｆｍｋの存在下で、１０μｇ／ｍのＬＰＳおよび２５ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ−４で７２時間刺激した。細胞をαＢ２２０−ＦＩＴＣ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色し、Ｂ細胞数をＦＡＣＳで測定した。細胞数は、非刺激対照の細胞数を１００％と設定し、それに対して標準化する。
【図２２】図２２は、ＲＩＰ欠損ジャーカット細胞におけるネクロトーシスの回復のためのインタクトなキナーゼドメインおよびデスドメインの要件を示すグラフである。ＲＩＰ欠損ジャーカット細胞に、次のコンストラクトを一時的に電気穿孔した：ＦＫＢＰ１２系二量体化カセットに融合しているＲＩＰの異なるドメインをコードするＲＩＰ−ＦＫＢＰ  １２３−Ｍｙｃ（ｐＦＲ）、ＲＩＰ（１−５８０）−ＦＫＢＰ１２３−Ｍｙｃ（デルタＤＤ）、ＲＩＰ（１−２８７）−ＦＫＢＰ１２３−Ｍｙｃ（ｐＫＤ、キナーゼドメインのみ）、およびＦＫＢＰ１２３−Ｍｙｃ（ｐＦｐｋ３）。あるいは、野生型ジャーカット細胞に、ｐＦｐｋ３を電気穿孔した。すべての条件において、ｐＥＧＦＰベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を添加して、電気穿孔した細胞を追跡した。細胞を、ＦａｓＬ（５ｎｇ／ｍｌ）、シクロヘキシミド（１μｇ／ｍｌ）、ｚＶＡＤ．ｆｍｋ（１００μＭ）、およびＮｅｃ−１（３０μＭ）で４８時間処理した。死細胞を選択的に染色するヨウ化プロピジウムで、細胞を染色し、各試料においてＧＦＰ発現を喪失し、ＰＩ陽性であった細胞の百分率（死、％）を測定した。
【図２３】図２３は、Ｎｅｃ−１がin vitroでＲＩＰの自己リン酸化を抑制することを示す１組のゲルを示す。図２３ＡはＮｅｃ−１がＲＩＰ１の自己リン酸化を抑制することを示す。ＲＩＰキナーゼアッセイを、基本的には記載するように行った。簡潔に言えば、アガロース結合抗ＲＩＰ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、ＷＴ  ジャーカット細胞およびＲＩＰ欠損ジャーカット細胞の溶解産物からＲＩＰを免疫沈降（ＩＰ）させ、記載された量（単位：μＭ）のＮｅｃ−１またはＮｅｃ−１ｉの存在下に、３０℃で放射性μ−Ｐ３２−ＡＴＰとともに３０分間インキュベートした。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、〜７０ｋＤａのＲＩＰ帯をオートラジオグラフ法で可視化した。図２３ＢはＮｅｃ−１が、トランスフェクトしたＲＩＰ１の自己リン酸化をin vitroで抑制することを示す。２９３Ｔ細胞に、ｐＲＩＰ１−ＦＬＡＧまたは空の対照ベクターをトランスフェクトし、抗Ｍ２  ＦＬＡＧビーズ（Ｓｉｇｍａ）を使用して、免疫沈降を実施した。図２３Ａのように、in vitroキナーゼアッセイを実施した。図２３Ｃは、ＲＩＰ１の自己リン酸化にはそのキナーゼ活性が必要であることを示す。ｆｌａｇタグ付きＷＴまたはＲＩＰ１のキナーゼ−死点変異体（Ｋ４５Ｒ）（ＲＩＰ  ＫＤ）の発現コンストラクトを、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、図２３Ｂのように、免疫沈降を実施し、図２３Ａのように、キナーゼアッセイを実施した。
【図２４】図２４は、ＲＩＰ２自己リン酸化に及ぼすＮｅｃ−１効果の欠如を示す１対のゲルである。２９３Ｔ細胞にＲＩＰ−ＦＬＡＧまたはＲＩＰ２−Ｍｙｃベクターをトランスフェクトした。それぞれＦＬＡＧまたはＭｙｃ抗体を使用して、タンパク質を免疫沈降させ、キナーゼ反応を、図２３に示すように記載された量のＮｅｃ−１（単位：μＭ）の存在下で行った。下図では、キナーゼ反応で使用したタンパク質量に相当するタンパク質量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、タンパク質量をＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ染色法で可視化した。リン酸化ＲＩＰ、ＲＩＰ２、アスタリスク、およびＩｇＧに対応する主要なバンドを示す。
【図２５】図２５は、ネクロトーシス阻害剤としてのＮｅｃ−１の同定を示す。図２５ＡはＮｅｃ−１の構造を示す。図２５ＢはＴＮＦαおよびｚＶＡＤ．ｆｍｋで７２時間処理されたＵ９３７細胞の細胞死のＮｅｃ−１による抑制を示す。この図と次の図の細胞生存率は、ＡＴＰ系生存率アッセイで測定した。数値は、無処理の対照ウェル中の生細胞に対して標準化した生細胞の百分率を表す。全体を通して、エラーバーは標準偏差を表す。図２５Ｃは、ＦａｓＬ−ＣＨＸ−ｚＶＡＤ．ｆｍｋで３０時間処理されたジャーカット細胞におけるＮｅｃ−１および不活性誘導体であるＮｅｃ−１ｉの細胞保護の用量反応曲線（単位：μＭ）を示す。数値は、ＦａｓＬの非存在下に、対応する化合物で処理した細胞の生存率に対して標準化した生存率を表す。図２５Ｄは、二量体化因子ＡＰ２０１８７およびｚＶＡＤ．ｆｍｋで４８時間処理した後、二量体化可能なＦＡＤＤ（ジャーカット−ＦＦ）を安定に発現するジャーカット細胞における細胞死のＮｅｃ−１による抑制を示す。数値は、二量体化因子の非存在下に、対応する化合物で処理した細胞の生存率に対して標準化した生存率を表す。さらに、対照のジャーカット細胞も、Ｎｅｃ−１を含まないｚＶＡＤ．ｆｍｋの存在下または非存在下に、ＡＰ２０１８７で処理した。図２５Ｅ、図２５Ｆ、および図２５Ｈは、ＢＡＬＢ／ｃ  ３Ｔ３（Ｅ）、ＳＶ４０形質転換ＭＥＦ（Ｆ）、およびＬ９２９（Ｈ）細胞における細胞死のＮｅｃ−１による抑制を示す。ＴＮＦα（Ｅ、Ｆ、Ｈ）、ｚＶＡＤ．ｆｍｋ（Ｅ、Ｆ）、またはＣＨＸ（Ｆ）で、細胞を１６時間（Ｆ）または２４時間（Ｅ、Ｈ）処理した。数値は、ＴＮＦαの非存在下に、対応する化合物で処理した細胞の生存率に対して標準化した生存率を表す。図２５Ｇは、ＴＮＦαで３０時間処理したＦＡＤＤ欠損ジャーカット細胞のＮｅｃ−１およびＮｅｃ−１ｉの細胞保護の用量反応を示す（条件についてはＣを参照のこと）。
【図２６】図２６は、Ｎｅｃ−１によるネクロトーシスのすべての症状発現の効率的な抑制を示す。図２６Ａおよび図２６Ｂは、Ｎｅｃ−１による細胞膜完全性の喪失およびミトコンドリア機能不全の抑制を示す。野生型（Ａ）およびＦＡＤＤ欠損（Ｂ）ジャーカット細胞を、記載された時間、ＦａｓＬ−ＣＨＸ−ｚＶＡＤ．ｆｍｋ（Ａ）またはＴＮＦα（Ｂ）で処理した。記載されている場合、細胞をＮｅｃ−１でも２４時間処理した。細胞をＤｉｏＣ６、またはアネキシンＶおよびＰＩで染色し、低ＰＩおよび高アネキシンＶ、高ＰＩおよび高アネキシンＶ、高ＰＩおよび低アネキシンＶ、ならびに低ＤｉｏＣ６（低いミトコンドリア膜電位）の細胞の百分率を示す。全体を通して、エラーバーは標準偏差を表す。図２６Ｃは、ネクロトーシスのＮｅｃ−１抑制のＳｙｔｏｘアッセイによる実証例を示す。ジャーカット−ＦＦ細胞を、ＡＰ２０１８７−ｚＶＡＤ．ｆｍｋおよびＮｅｃ−１で４８時間処理した。数値は、二量体化因子を含まない、化合物で処理した細胞に対して標準化した生細胞の百分率を表す。あるいは、ＢＡＬＢ／ｃ  ３Ｔ３細胞を、ＴＮＦα−ｚＶＡＤ．ｆｍｋおよび４０μＭのＮｅｃ−１で２４時間で処理し、あるいはジャーカット細胞を、ＦａｓＬ−ＣＨＸ−ｚＶＡＤ．ｆｍｋおよびＮｅｃ−１で４８時間処理した。図２６Ｄおよび図２６Ｅは、３６時間、（Ｄ）ＦａｓＬ−ＣＨＸ−ｚＶＡＤ．ｆｍｋで処理したジャーカット細胞、または（Ｅ）ＴＮＦαで処理したＬ９２９細胞におけるＮｅｃ−１の細胞保護効果の明視野の顕微鏡像を示す。４０倍拡大の明視野像が得られた。図２６Ｆは、それぞれＦａｓＬおよびＣＦｆＸで１６時間、またはＴＮＦαで６時間処理したアポトーシスまたはネクロトーシスジャーカット細胞におけるＮｅｃ−１の効果の電子顕微鏡像を示す。代表的ＥＭ像を示す。矢印は死細胞を示す。Ｃｏｎはビヒクル対照を示す。
【図２７】図２７は、Ｎｅｃ−１の特異性を示す。図２７Ａは、ＦａｓＬ−ＣＨＸで２４時間処理したアポトーシスジャーカット細胞におけるＮｅｃ−１による細胞保護の欠如を示す。Ｎｅｃ−１で処理していない試料における細胞変化の時間経過も示す。細胞を、図２６Ａおよび図２６Ｂで示すようにＤｉＯＣ６、またはアネキシンＶおよびＥＧＦＰ−ＰＩで染色した。図２７Ｂおよび図２７Ｃは、ｚＶＡＤ．ｆｍｋを含まない（アポトーシス）または含む（ネクロトーシス）ＴＮＦαおよびＣＨＸ（Ｂのみ）で４８時間（Ｂ）または２４時間（Ｃ）処理したＵ９３７（Ｂ）およびＢＡＬＢ／ｃ  ３Ｔ３（Ｃ）細胞における、アポトーシスではなくネクロトーシスのＮｅｃ−１による選択的抑制を示す。ＡＴＰアッセイで、細胞生存率を測定した。数値は、ＴＮＦαの非存在下に、対応する化合物で処理した細胞の生存率に対して標準化した生存率を表す。エラーバーは標準偏差を示す。図２７Ｄは選択されたＮｅｃ−１誘導体の構造を示す。
【図２８】図２８はネクロトーシスにおける酸化ストレスおよび自食作用の役割を示す。図２８Ａはネクロトーシスが酸化ストレス誘導性細胞死と識別できることを示す。Ｕ９３７細胞を、様々な酸化防止剤および１００μＭのＮｅｃ−１の存在下で、４０ｎｇ／ｍｌのヒトＴＮＦαおよびｚＶＡＤ．ｆｍｋで７２時間、または２５０μＭのメナジオンで２４時間処理した。この図と次の図では、細胞生存率をＡＴＰアッセイで測定した。数値は、ＴＮＦαおよびメナジオンの非存在下に、ＤＭＳＯで処理した細胞の生存率に対して標準化した生存率を表す。全体を通して、エラーバーは標準偏差を表す。図２８Ｂは、１０ｍＭの３ＭＡを含むまたは含まないＴＮＦαで１２時間処理したＦＡＤＤ欠損ジャーカット細胞におけるオートファゴソームの電顕的検出を示す。代表的像を示す。図２８Ｃは、ＴＮＦαおよびＮｅｃ−１でそれぞれ８時間および２４時間処理したＬ９２９細胞およびＦＡＤＤ欠損ジャーカット細胞におけるネクロトーシス時のＬＣ３−ＩＩの誘導を示す。タンパク質溶解産物に対して、ＬＣ３およびチューブリンに対する抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。ＬＣ３−ＩＩ信号対チューブリン信号の比を算出し（「比」）、対照試料の値に対して標準化した。図２８Ｄは、ＴＮＦα−ｚＶＡＤ．ｆｍｋまたはＦａｓＬ−ｚＶＡＤ．ｆｍｋおよびＮｅｃ−１で２４時間処理したＢＡＬＢ／ｃ  ３Ｔ３細胞におけるネクロトーシス時のＬＣ３−ＩＩの誘導を示す。あるいは、細胞を２μＭのラパマイシンで処理した。図２８Ｅ、図２８Ｆ、および図２８Ｇは、ＢＡＬＢ／ｃ  ３Ｔ３（Ｅ）、ＦＡＤＤ欠損ジャーカット（Ｅ）、Ａｔｇ５−／−  ＭＥＦｓ（Ｆ）、およびベクリン（beclin）−１  ＲＮＡｉ発現ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３（Ｇ）細胞において、自食作用の抑制によるネクロトーシスの抑制がないことを示す。細胞を、ＴＮＦα−ｚＶＡＤ．ｆｍｋおよび３ＭＡまたはＮｅｃ−１で２４時間または３０時間（ジャーカット細胞）処理した。数値は、ＴＮＦαの非存在下に、対応する化合物で処理した細胞の生存率に対して標準化した生存率を表す。図２８Ｈでは、図２８Ｇの安定な細胞集団におけるベクリン（「Ｂｅｃ」）およびチューブリン（「Ｔｕｂ」）の発現を、ウェスタンブロッティングで分析した。アスタリスクは、ベクリンに対する抗体で検出される非特異的バンドを示す。
【図２９】図２９は、Ｎｅｃ−１がＲＩＰキナーゼ誘導性ネクロトーシスを抑制することを示すグラフである。ＦＡＤＤ欠損ジャーカット細胞に、ｐＥＧＦＰ、ならびにＦＫＢＰ１２系二量体化ドメイン単独（ｐＦｐｋ）またはＲＩＰに融合しているＦＫＢＰ１２系二量体化ドメイン（ｐＦＲ）、ＲＩＰのキナーゼ不活性Ｋ４５Ｍ変異体（ｐＦＲ  Ｋ４５Ｍ）、およびＲＩＰのキナーゼドメイン（ｐＦＲ−ＫＤ）をコードするベクターを一時的に電気穿孔し、６時間後にｚＶＡＤ．ｆｍｋおよびＮｅｃ−１を含まないまたは含む二量体化因子ＡＰ１５１０で４８時間処理した。ＰＩ陰性ＧＦＰ陽性細胞の百分率（「生存率、％」）を、ＦＡＣＳで測定した。数値は、二量体化因子の非存在下に、化合物で処理した細胞の生存率に対して標準化した生存率を表す。エラーバーは標準偏差を表す。
【図３０】図３０は、in vivo虚血傷害のＮｅｃ−１による抑制を示す。図３０ＡはＮｅｃ−１ｉの投与ではなくＮｅｃ−１の投与による梗塞体積の低下を示す。実験を本明細書に記載する通り行った。各処理群についてｎ≧５。全体を通して、エラーバーは平均の標準誤差を表す。すべての図において、ビヒクルに比べて＊＊Ｐ＜０．０５。図３０Ｂは、７−Ｃｌ−Ｎｅｃ−１を閉塞前（pre-）または閉塞後（post-）（方法）に送達した時の梗塞体積の用量依存的減少および神経学的点数の改善を示す。注射用化合物の原液濃度を示す。各処理群についてｎ≧６。この挿入図では、動物行動は、動物を屠殺する前に、投与群を知らない医師によって評価され、３（最悪）〜０（欠陥なし）で点数化された。各処理群において、ｎ＝４〜５。図３０Ｃは、７−Ｃ１−Ｎｅｃ−１が脳虚血時にカスパーゼ−３活性化を阻害しないことを示す。ｚＶＡＤ．ｆｍｋまたは７−Ｃｌ−Ｎｅｃ−１を、閉塞前送達条件下で送達した。脳を再灌流後３時間に収集し、同じ動物の梗塞半球（＋）または対照（−）半球からのタンパク質に対して、活性カスパーゼ−３またはチューブリン（tub）に対する抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。カスパーゼ−３信号対チューブリン信号の比を算出し、対応する対照半球の値に対して標準化した。図３０Ｄは、７−Ｃｌ−Ｏ−Ｎｅｃ−１が７−Ｃｌ−Ｎｅｃ−１のin vivo活性に相当する活性を有することを示す。マウスに、閉塞後４時間および６時間に７−Ｃｌ−Ｎｅｃ−１または７−Ｃｌ−Ｏ−Ｎｅｃ−１を注射した。各処理群において、ｎ≧１０。図３０Ｅでは、ＭＣＡＯモデルにおいて、閉塞後２時間、４時間、または６時間における２時間のＭＣＡＯの５分前または直後に化合物を注射することによって、７−Ｃｌ−Ｎｅｃ−１の治療時間域を確立する。各処理群において、ｎ≧１０。図３０Ｆは、閉塞後６時間における投与時にｚＶＡＤ．ｆｍｋによる神経保護の欠如を示す。閉塞の開始後２時間、４時間、または６時間に、化合物の送達を行った。各処理群において、ｎ≧８。Ｐ値を示す。図３０Ｇはin vivo脳虚血時のＬＣ３−ＩＩの誘導の遅延を示す。脳を、閉塞後記載された時点で収集し、ＬＣ３およびチューブリン（tub）に対する抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。ＬＣ３−ＩＩ／チューブリン比を示す。図３０Ｈは、閉塞後４時間および６時間における７−Ｃｌ−Ｎｅｃ−１の遅延投与によるＬＣ３−ＩＩの後期誘導の抑制を示す。脳を、閉塞後８時間に回収し、図３０Ｇのように分析した。
【図３１】図３１は、Ｎｅｃ−１がネクロトーシスを特異的かつ効率的に抑制することを示す。図３１Ａは、Ｎｅｃ−１が、ＴＮＦαで２４時間処理したＦＡＤＤ欠損ジャーカット細胞においてネクロトーシスに関連する細胞サイズおよび形状の変化を特異的に予防することを示す。前方および側方散乱光ＦＡＣＳ分析の結果を示す。さらに、各試料におけるＰＩ陰性生細胞の百分率（±標準偏差値）を測定した。図３１Ｂは、Ｎｅｃ−１が、図３１Ａのように記載された時間処理されたネクロトーシスＦＡＤＤ欠損ジャーカット細胞において増殖能の喪失を予防することを示す。各試料におけるＰＩ陰性生細胞数（±標準偏差値）を示す。図３１Ｃは、ネクロトーシスおよびＮｅｃ−１細胞保護が細胞周期の顕著な変化と関連がないことを示す。ＦＡＤＤ欠損ジャーカット細胞を、図３１Ａに記載されているように処理し、細胞周期プロファイルをＰＩ  ＤＮＡ量ＦＡＣＳ分析法で分析した。ＭｏｄＦｉｔソフトウェアを使用して、細胞周期の異なる期の細胞の百分率（±標準偏差値）を測定し、表に集計する。図３１Ｄは、Ｎｅｃ−１（１）が、ＦＡＤＤ欠損ジャーカット細胞において非特異的細胞毒性を誘導しないことを示す。ＦＡＤＤ欠損ジャーカット細胞を、記載された濃度のＮｅｃ−１およびＮｅｃ−１ｉ（対数スケール、単位：μＭ）で２４時間処理した。ＡＴＰアッセイを使用して、細胞生存率を測定した。数値は、対応するＤＭＳＯで処理した細胞の生存率に対して標準化した生存率を表す。エラーバーは標準偏差値を示す。図３１Ｅは、Ｎｅｃ−１が化合物で６時間処理したＦＡＤＤ欠損ジャーカット細胞の形態に有意には影響しないことを示す。細胞を固定し、包埋し、電子顕微鏡法を用いて分析した。代表的像を示す。図３１Ｆは、Ｎｅｃ−１が、図３１Ａのように処理したネクロトーシスＦＡＤＤ欠損ジャーカット細胞において反応性酸素種（ＲＯＳ）の部分増加を予防することを示す。細胞をジヒドロエチジウム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色し、ＦＡＣＳで分析した。ＲＯＳレベルの上昇を伴う細胞の百分率（±標準偏差値）を示す。図３１Ｇは、Ｎｅｃ−１が、ジャーカット細胞における遺伝子発現に有意には影響しないことを示す。細胞をＮｅｃ−１で１６時間処理し、対照（Ｃｙ５）およびＮｅｃ−１（Ｃｙ３）試料からのｍＲＮＡをＡｇｉｌｅｎｔ  ＤＮＡチップ分析にかけた。赤色点は、内部基準の対照である。
【図３２】図３２は、Ｎｅｃ−１が複数のネクロトーシス関連性形態変化を抑制することを示す。Ｂａｌｂｃ  ３Ｔ３細胞を、ＴＮＦα、ｚＶＡＤ．ｆｍｋ、およびＮｅｃ−１で２４時間処理した。細胞を固定し、抗ギアンチン（giantin）（ゴルジ、緑色）／抗ＫＤＥＬ（小胞体、赤色）抗体（図３２Ａ）、抗β−チューブリン（チューブリン、緑色）／ＴＯ−ＰＲＯ−３色素（細胞核、青色）／ファロイジン−ＴＲＩＴＣ（アクチン、赤色）（図３２Ｂ）、および抗シトクロムｃ（ミトコンドリア、赤色）／ＴＯ−ＰＲＯ−３（細胞核、青色）（図３２Ｃ）で染色した。
【図３３】図３３は、in vivo虚血誘導性神経細胞死の抑制に及ぼす７−Ｃｌ−Ｎｅｃ−１とｚＶＡＤ．ｆｍｋの相加効果を示す。２時間の閉塞の開始後２時間および４時間に、ｚＶＡＤ．ｆｍｋのｉｃｖ送達を単独で、または７−Ｃｌ−Ｎｅｃ−１と組み合わせて行った。個体動物の梗塞体積を示す。各処理群において、少なくとも８匹の動物を分析した。Ｐ値を示す。
【図３４Ａ】図３４Ａは、ジャーカットＴ細胞を、記載された量の抗壊死性化合物（４）および（５）の存在下にＦａｓリガンド（５ｎｇ／ｍｌ）、シクロヘキサミド（１μｇ／ｍｌ）、およびｚＶＡＤ（１００μＭ）で処理した結果を示すグラフである。３６時間後に、ＡＴＰアッセイを使用して、生存率を測定した。生存率の値は、Ｆａｓリガンドを含まない試料を生存率１００％の対照として使用して、比べたものである。
【図３４Ｂ】図３４Ｂは、抗壊死性化合物が（１９）および（２０）である場合に、図３４Ａと同様にして得られたグラフである。
【図３５Ａ】図３５Ａは、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、ｚＶＡＤ（１００μＭ）および化合物（１９）（３０μＭ）の存在下に１ｍＭのＭＰＰ＋で７２時間処理した結果を示すグラフである。ＡＴＰアッセイを使用して、細胞生存率を測定した。
【図３５Ｂ】図３５Ｂは、ＭＰＰ＋ではなく１００μＭのアミロイド−β  ２５−３５タンパク質の存在下で細胞を処理した場合に、図３５Ａと同様にして得られたグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年8月21日(2008.8.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学式（ＶＩ）に示されるＮｅｃ−３化合物
【化１】
2009521454.tif 000245
｛式中、
Ｚは結合、ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ２）またはＮＲ１２であり（ここで、Ｒ１２は置換されていてもよいＣ１−６アルキル、置換されていてもよいＣ７−１６アラルキルまたは置換されていてもよいＣ２−１５ヘテロアラルキルであり）；
（ａ）により示される結合は単結合または二重結合であることができ；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１はそれぞれ独立に水素、１から６の炭素原子を有するアルカノイル、１から６の炭素原子を有するアルキル、１から６の炭素原子を有するアルコキシ、アルキルおよびアルキレン基が独立に１から６の炭素原子を有するアルコキシアルキル、１から６の炭素原子を有するアルキルスルフィニル、アルキルおよびアルキレン基が独立に１から６の炭素原子を有するアルキルスルフィニルアルキル、１から６の炭素原子を有するアルキルスルホニル、アルキルおよびアルキレン基が独立に１から６の炭素原子を有するアルキルスルホニルアルキル、Ｃ７−１６アラルキル、アミノ、１から６の炭素原子を有するアミノアルキル、Ｃ６またはＣ１０アリール、Ｃ７またはＣ１１アリーロイル、アジド、１から６の炭素原子を有するアジドアルキル、カルボキシアルデヒド、アルキレン基が１から６の炭素原子を有する（カルボキシアルデヒド）アルキル、３から８の炭素原子を有するシクロアルキル、シクロアルキル基が３から８の炭素原子を有しアルキレン基が１から１０の炭素原子を有するシクロアルキルアルキル、ハロ、１から６の炭素原子を有するハロアルキル、Ｃ２−９ヘテロシクリル、Ｃ２−９（ヘテロシクリル）オキシ、Ｃ３−１０（ヘテロシクリル）オイル、ヒドロキシル、１から６の炭素原子を有するヒドロキシアルキル、ニトロ、１から６の炭素原子を有するニトロアルキル、Ｎ−保護アミノ、アルキレン基が１から６の炭素原子を有するＮ−保護アミノアルキル、１から６の炭素原子を有するチオアルコキシ、アルキルおよびアルキレン基が独立に１から６の炭素原子を有するチオアルコキシアルキル、−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ（ここで、ｑは０から４であり、ＲＡは（ａ）Ｃ１−６アルキル、（ｂ）Ｃ６またはＣ１０アリール、および（ｃ）アルキレン基が１から６の炭素原子を有するアリールアルキルからなる群から選ばれる）、−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢＲＣ（ここで、ＲＢおよびＲＣは独立に（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１−６アルキル、（ｃ）Ｃ６またはＣ１０アリール、および（ｄ）アルキレン基が１から６の炭素原子を有するアリールアルキルからなる群から選ばれる）、−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ（ここで、ＲＤは（ａ）Ｃ１−６アルキル、（ｂ）Ｃ６またはＣ１０アリール、および（ｃ）アルキレン基が１から６の炭素原子を有するアリールアルキルからなる群から選ばれる）、−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥＲＦ（ここで、ＲＥおよびＲＦは独立に（ａ）水素、（ｂ）アルキル、（ｃ）Ｃ６またはＣ１０アリール、および（ｄ）アルキレン基が１から６の炭素原子を有するアリールアルキルからなる群から選ばれる）、−（ＣＨ２）ｑＮＲＧＲＨ（ここで、ＲＧおよびＲＨは独立に（ａ）水素、（ｂ）Ｎ−保護基、（ｃ）１から６の炭素原子を有するアルキル、（ｄ）２から６の炭素原子を有するアルケニル、（ｅ）２から６の炭素原子を有するアルキニル、（ｆ）Ｃ６またはＣ１０アリール、（ｇ）アルキレン基が１から６の炭素原子を有するアリールアルキル、（ｈ）３から８の炭素原子を有するシクロアルキル、および（ｉ）シクロアルキル基が３から８の炭素原子を有しアルキレン基が１から１０の炭素原子を有するシクロアルキルアルキルからなる群から選ばれ、ただし、２つの基がカルボニル基またはスルホニル基を介して該窒素原子に結合することはない）、Ｃ１−６パーフルオロアルキル、Ｃ１−６パーフルオロアルコキシ、Ｃ６またはＣ１０アリールオキシ、Ｃ３−８シクロアルコキシ、Ｃ９−１４シクロアルキルアルコキシ、またはＣ７−１６アリールアルコキシを表し；
Ｒ５はＣ（Ｏ）Ｒ１３、Ｃ（Ｓ）Ｒ１３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ１３、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１３Ｒ１４、Ｃ（Ｓ）ＮＲ１３Ｒ１４、Ｃ（ＮＨ）Ｒ１３またはＳ（Ｏ２）Ｒ１３であり（ここで、Ｒ１３およびＲ１４はそれぞれ独立に水素、置換されていてもよいＣ１−１２アルキル、置換されていてもよいＣ１−７ヘテロアルキル、置換されていてもよいＣ６またはＣ１０アリール、置換されていてもよいＣ２−９ヘテロアリール、置換されていてもよいＣ７−１６アラルキル、または置換されていてもよいＣ２−１５ヘテロアラルキルを表す）；
Ｒ６は水素、Ｃ１−６アルキル、置換されていてもよいＣ６またはＣ１０アリール、置換されていてもよいＣ７−１６アラルキル、置換されていてもよいＣ２−９ヘテロアリール、または置換されていてもよいＣ２−１５ヘテロアラルキルであり、ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ６ないしＲ１１が水素、アミノ、ハライドおよびヒドロキシルからなる群から選ばれ、ＺがＣＨ２である場合、Ｒ３はヒドロキシルまたはメトキシルではない。｝。
【請求項２】
（ａ）で示される結合が二重結合であり；ＺはＣＨ２であり；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１０およびＲ１１はそれぞれ独立に水素を表す、請求項１に記載のＮｅｃ−３化合物。
【請求項３】
Ｒ３およびＲ９がそれぞれ独立に１から６の炭素原子を有するアルキル、１から６の炭素原子を有するアルコキシ、ハロ、またはアミノを表す、請求項２に記載のＮｅｃ−３化合物。
【請求項４】
Ｒ３がメトキシルを表し；Ｒ５がＣ（Ｏ）ＣＨ２ＯＨを表し；Ｒ９が１から６の炭素原子を有するアルコキシを表す、請求項３に記載のＮｅｃ−３化合物。
【請求項５】
化合物（１）〜（２１７）から選択される、Ｎｅｃ−３化合物。
【請求項６】
表７の化合物（１４１）、（１６１）、（１６６）、（１６７）、（１６９）、（１７１）、（１７８）および（１８２）、表８の化合物（１８５）、（１８８）、（１９０）、（１９２）および（１９４）、および表９の化合物（１４７）、（１４８）、（１５０）、（１５１）、（１５４）、（１５８）および（１５９）から選択される、請求項５に記載のＮｅｃ−３化合物。
【請求項７】
化学式（Ｖ）に示されるＮｅｃ−３化合物
【化２】
2009521454.tif 000246
｛式中、
Ｚは結合、ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ２）またはＮＲ８であり（ここで、Ｒ８は置換されていてもよいＣ１−６アルキル、置換されていてもよいＣ７−１６アラルキルまたは置換されていてもよいＣ２−１５ヘテロアラルキルであり）；
（ａ）により示される結合は単結合または二重結合であることができ；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立に水素、１から６の炭素原子を有するアルカノイル、１から６の炭素原子を有するアルキル、１から６の炭素原子を有するアルコキシ、アルキルおよびアルキレン基が独立に１から６の炭素原子を有するアルコキシアルキル、１から６の炭素原子を有するアルキルスルフィニル、アルキルおよびアルキレン基が独立に１から６の炭素原子を有するアルキルスルフィニルアルキル、１から６の炭素原子を有するアルキルスルホニル、アルキルおよびアルキレン基が独立に１から６の炭素原子を有するアルキルスルホニルアルキル、Ｃ７−１６アラルキル、アミノ、１から６の炭素原子を有するアミノアルキル、Ｃ６またはＣ１０アリール、Ｃ７またはＣ１１アリーロイル、アジド、１から６の炭素原子を有するアジドアルキル、カルボキシアルデヒド、アルキレン基が１から６の炭素原子を有する（カルボキシアルデヒド）アルキル、３から８の炭素原子を有するシクロアルキル、シクロアルキル基が３から８の炭素原子を有しアルキレン基が１から１０の炭素原子を有するシクロアルキルアルキル、ハロ、１から６の炭素原子を有するハロアルキル、Ｃ２−９ヘテロシクリル、Ｃ２−９（ヘテロシクリル）オキシ、Ｃ３−１０（ヘテロシクリル）オイル、ヒドロキシル、１から６の炭素原子を有するヒドロキシアルキル、ニトロ、１から６の炭素原子を有するニトロアルキル、Ｎ−保護アミノ、アルキレン基が１から６の炭素原子を有するＮ−保護アミノアルキル、１から６の炭素原子を有するチオアルコキシ、アルキルおよびアルキレン基が独立に１から６の炭素原子を有するチオアルコキシアルキル、−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ（ここで、ｑは０から４であり、ＲＡは（ａ）Ｃ１−６アルキル、（ｂ）Ｃ６またはＣ１０アリール、および（ｃ）アルキレン基が１から６の炭素原子を有するアリールアルキルからなる群から選ばれる）、−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢＲＣ（ここで、ＲＢおよびＲＣは独立に（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１−６アルキル、（ｃ）Ｃ６またはＣ１０アリール、および（ｄ）アルキレン基が１から６の炭素原子を有するアリールアルキルからなる群から選ばれる）、−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ（ここで、ＲＤは（ａ）Ｃ１−６アルキル、（ｂ）Ｃ６またはＣ１０アリール、および（ｃ）アルキレン基が１から６の炭素原子を有するアリールアルキルからなる群から選ばれる）、−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥＲＦ（ここで、ＲＥおよびＲＦは独立に（ａ）水素、（ｂ）アルキル、（ｃ）Ｃ６またはＣ１０アリール、および（ｄ）アルキレン基が１から６の炭素原子を有するアリールアルキルからなる群から選ばれる）、−（ＣＨ２）ｑＮＲＧＲＨ（ここで、ＲＧおよびＲＨは独立に（ａ）水素、（ｂ）Ｎ−保護基、（ｃ）１から６の炭素原子を有するアルキル、（ｄ）２から６の炭素原子を有するアルケニル、（ｅ）２から６の炭素原子を有するアルキニル、（ｆ）Ｃ６またはＣ１０のアリール、（ｇ）アルキレン基が１から６の炭素原子を有するアリールアルキル、（ｈ）３から８の炭素原子を有するシクロアルキル、および（ｉ）シクロアルキル基が３から８の炭素原子を有しアルキレン基が１から１０の炭素原子を有するシクロアルキルアルキルからなる群から選ばれ、ただし、２つの基がカルボニル基またはスルホニル基を介して該窒素原子に結合することはない）、Ｃ１−６パーフルオロアルキル、Ｃ１−６パーフルオロアルコキシ、Ｃ６またはＣ１０アリールオキシ、Ｃ３−８シクロアルコキシ、Ｃ９−１４シクロアルキルアルコキシ、またはＣ７−１６アリールアルコキシを表し；
Ｒ５は置換されていてもよいＣ６またはＣ１０アリールまたは置換されていてもよいＣ２−９ヘテロアリールであり；
Ｒ６はＣ（Ｏ）Ｒ９、Ｃ（Ｓ）Ｒ９、Ｃ（Ｏ）ＯＲ９、Ｃ（Ｏ）ＮＲ９Ｒ１０、Ｃ（Ｓ）ＮＲ９Ｒ１０、Ｃ（ＮＨ）Ｒ９またはＳ（Ｏ２）Ｒ９であり（ここで、Ｒ９およびＲ１０はそれぞれ独立にＨ、置換されていてもよいＣ１−１２アルキル、置換されていてもよいＣ１−７ヘテロアルキル、置換されていてもよいＣ６またはＣ１０アリール、置換されていてもよいＣ２−９ヘテロアリール、置換されていてもよいＣ７−１６アラルキル、または置換されていてもよいＣ２−１５ヘテロアラルキルであり）；
Ｒ７は水素、Ｃ１−６アルキル、置換されていてもよいＣ６またはＣ１０アリール、置換されていてもよいＣ７−１６アラルキル、置換されていてもよいＣ２−９ヘテロアリール、または置換されていてもよいＣ２−１５ヘテロアラルキルであり；
Ｒ１１はＨ、置換されていてもよいＣ１−１２アルキル、または置換されていてもよいＣ１−７ヘテロアルキルであり、
ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ７がそれぞれ水素、アミノ、ハライドおよびヒドロキシルからなる群から選ばれ、ＺがＣＨ２である場合、Ｒ３はヒドロキシルまたはメトキシルではない。｝。
【請求項８】
前記Ｎｅｃ−３化合物が実質的に純粋な（３Ｒ，３ａＲ）−ｒｅｌ異性体、実質的に純粋な（３Ｒ，３ａＲ）−鏡像異性体、または実質的に純粋な（３Ｓ，３ａＳ）−鏡像異性体である、請求項１ないし７のいずれかに記載のＮｅｃ−３化合物。
【請求項９】
化学式（ＸＶＩ）に示されるＮｅｃ−１化合物
【化３】
2009521454.tif 000247
｛式中、
Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に＝Ｓ、＝Ｏ、＝Ｎ、Ｈ、Ｒ１１、ＳＲ１１、ＮＲ１１またはＯＲ１１を表し；
ＹはＳ、ＮＨまたはＮＲ８を表し；
ＧはＣＨ２、Ｏ、ＳＲ７またはＮＲ７を表し；
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立にＨ、ＯＨ、ＯＲ８、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ（Ｒ８）２、ＣＯＯＨ、ＣＯ２Ｒ８、ＮＯ２、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ８、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ６−１２アリール、アシル、アセチル、アシルアミノまたはＣ２−９ヘテロアリールを表し；
Ｒ４はＨ、ＯＨ、ＯＲ８、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ（Ｒ８）２、ＣＯＯＨ、ＣＯ２Ｒ８、ＮＯ２、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ８、アシル、アセチル、アシルアミノ、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ６−１２アリール、Ｃ２−９ヘテロアリール、アミンまたはピペリジンを表し；
Ｒ５、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ独立にＨ、ＯＨ、ＯＲ８、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ（Ｒ８）２、アシル、アセチル、アシルアミノ、ＮＯ２、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニルまたはＣ２−７アルケニルを表し；
Ｒ８はＨ、ＯＨ、ＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｃ１−７アルキル、Ｃ６−１２アリール、アリールアルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ２−９ヘテロアリール、アセチル、メトキシル、アミノ、アシルアミノ、アシルまたはハロゲンを表し；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ９’およびＲ１０’はそれぞれ独立にＨ、ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニルを表すか、またはＣｎおよび／またはＣｎ’を含んでなる３から６員環のシクロアルキルを表し、あるいはＲ９および／またはＲ１０はなくてもよく；
Ｒ１１はＨ、ＯＨ、ＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、アセチル、メトキシル、アミノ、アシルアミノ、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、またはアシルを表し；
ｎおよびｎ’はそれぞれ０から５の整数であり；
ｎ’’は０または１であり；
結合（ａ）、（ｂ）および（ｃ）はそれぞれ独立に単結合または二重結合であり、ただし、結合（ａ）および結合（ｂ）の両者が共に二重結合となることはなく、
ここで、前記Ｎｅｃ−１化合物はＮｅｃ−１ｅ化合物である。｝。
【請求項１０】
化学式（ＩＶ）に示されるＮｅｃ−２化合物
【化４】
2009521454.tif 000248
｛式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０はそれぞれ独立に水素、アシル、アセチル、直鎖および分岐アルキル、ハロゲン、アミノ、メトキシル、ニトロ、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２、Ｃ（Ｓ）Ｒ１２、Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１２Ｒ１３、Ｃ（Ｓ）ＮＲ１２Ｒ１３、またはＳ（Ｏ２）Ｒ１２を表し（ここで、Ｒ１２およびＲ１３はそれぞれ独立に水素、置換されていてもよいＣ１−１２アルキル、置換されていてもよいＣ６またはＣ１０アリール、置換されていてもよいＣ２−９ヘテロアリール、置換されていてもよいＣ７−１６アラルキル、または置換されていてもよいＣ２−１５ヘテロアラルキルを表す）；
（ａ）により示される結合は単結合または二重結合であることができ；
（ｂ）により示される結合は単結合または二重結合であることができ；
Ｘは水素、アシル、アセチル、アルキル、ハロゲン、アミノ、アシルアミノ、ニトロ、＝Ｓ、ＳＲ１１、＝Ｎ、ＮＲ１１、＝Ｏ、またはＯＲ１１であり（ここで、Ｒ１１は水素、アシル、アセチル、アルキルまたはアシルアミノであり）；
ここで、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ９およびＲ１０がそれぞれ水素であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ７およびＲ８がそれぞれメトキシルである場合、Ｘは＝Ｏ、水素またはヒドロキシルではない。｝。
【請求項１１】
（ｉ）請求項１ないし１０のいずれかに記載の化合物、および
（ｉｉ）医薬的に許容できる賦形剤
を含む、医薬用組成物。
【請求項１２】
表１に示す疾患または状態を有する対象を処置するための薬剤の製造における、Ｎｅｃ−１ｅ化合物、Ｎｅｃ−２ｂ化合物、Ｎｅｃ−３化合物、またはゲルダナマイシンの使用であって、前記Ｎｅｃ−３化合物がＮｅｃ−３ｂ化合物または実質的に純粋な（３Ｒ，３ａＲ）−ｒｅｌ異性体である、その使用。
【請求項１３】
表２に示す疾患または状態を有する対象を処置するための薬剤の製造における、Ｎｅｃ化合物の使用。
【請求項１４】
前記疾患または状態が網膜神経細胞死を有する状態である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記Ｎｅｃ化合物が化学式（Ｉ）に示されるＮｅｃ−１化合物である請求項１３または１４に記載の使用：
【化５】
2009521454.tif 000249
（式中、
Ｒ１はメチル、メトキシル、Ｃｌ、ＢｒまたはＦを表し、Ｒ２は１から４の炭素原子を有するアルキルを表す。）。
【請求項１６】
前記Ｎｅｃ−１化合物が下記の化学式に示される化合物である、請求項１５に記載の使用。
【化６】
2009521454.tif 000250
【請求項１７】
表３に示す疾患または状態を有する対象を処置するための薬剤の製造における、Ｎｅｃ−１ｃ化合物の使用。
【請求項１８】
表４に示す疾患または状態を有する対象を処置するための薬剤の製造における、Ｎｅｃ−１ｄ化合物の使用。
【請求項１９】
ＲＩＰ１を選択的に阻害する化合物としての候補化合物を識別するための方法であって、
ａ）ＲＩＰ１ポリペプチドと前記化合物とを含む混合物を、前記化合物不存在では前記ＲＩＰ１ポリペプチドが基準レベルのリン酸化を受けることができる条件下でインキュベートし、
ｂ）ＲＩＰ１のリン酸化レベルを検出し、
ｃ）ＲＩＰ１の前記リン酸化レベルの前記基準レベルに対する比を決定し、
ｄ）ＲＩＰ２またはＲＩＰ３ポリペプチドと前記化合物とを含む第２の混合物を、前記化合物不存在では前記ＲＩＰ２ポリペプチドが第２の基準レベルのリン酸化を受けることができる条件下でインキュベートし、
ｅ）ＲＩＰ２またはＲＩＰ３のリン酸化レベルを検出し、
ｆ）ＲＩＰ２またはＲＩＰ３の前記リン酸化レベルの前記第２の基準レベルに対する比を決定する、
工程を含み、
工程ｃ）で決定された前記比が工程ｆ）で決定された前記比よりも小さい場合、前記化合物はＲＩＰ１を選択的に阻害する、方法。
【請求項２０】
ＲＩＰ１を選択的に阻害する化合物としての候補化合物を識別するための方法であって、
ａ）ＲＩＰ１ポリペプチドと前記化合物を接触させ、
ｂ）前記化合物の前記ＲＩＰ１ポリペプチドへの結合を検出し、
ｃ）ＲＩＰ２またはＲＩＰ３ポリペプチドと前記化合物を接触させ、
ｄ）前記化合物の前記ＲＩＰ２またはＲＩＰ３ポリペプチドへの結合を検出する、
工程を含み、
前記ＲＩＰ１ポリペプチドに結合し、かつ前記ＲＩＰ２またはＲＩＰ３ポリペプチドには結合しない化合物はＲＩＰ１を選択的に阻害する化合物として識別される方法。