(57)【要約】  抱合部位のアミノ酸残基の側鎖を通じた、所定の抱合化学による付加機能部位の抱合に適しているＦｃドメイン配列の少なくとも１つの内部抱合部位が選択される、薬理学的に活性な化合物を調製する方法が開示されている。抱合のための適切なアミノ酸残基は、抱合部位における未変性Ｆｃドメイン中に存在することが可能であり、又は挿入（すなわち、未変性のＦｃドメイン中のアミノ酸の間に）又は置換（すなわち、アミノ酸残基を除去し、別のアミノ酸残基で置換すること）によって付加され得る。後者の場合には、付加されるアミノ酸の数は、以前に存在したＦｃドメイン配列から除去されるアミノ酸の数と対応する必要はない。本技術は、有用な組成物及びこれを含有する医薬組成物を作製するためにされ得る。本発明の組成物をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する発現ベクター及び該発現ベクターを含有する宿主細胞も開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抱合部位のアミノ酸残基の側鎖を通じて、Ｆｃドメイン中の１つ又はそれ以上の特異的に選択された抱合部位に共有結合されている少なくとも１つの付加機能部分を有する単量体又は多量体Ｆｃドメインを含む組成物。
【請求項２】
付加機能部分が薬理学的に活性な部分である、請求項１の組成物。
【請求項３】
薬理学的に活性な部分がポリペプチド、ペプチド又はペプチド模倣部分である、請求項２の組成物。
【請求項４】
ペプチドがトキシンペプチドである、請求項３の組成物。
【請求項５】
ペプチドが環状ペプチドを含む、請求項３の組成物。
【請求項６】
薬理学的に活性な部分が非ペプチド有機部分である、請求項２の組成物。
【請求項７】
抱合部位がループ領域の一部である、請求項１の組成物。
【請求項８】
ループ領域がＣＨ２又はＣＨ３ループ領域を含む、請求項７の組成物。
【請求項９】
付加機能部分が放射性同位体、酵素、ビオチン部分、蛍光色素分子又は発色団を含む標識された部分である、請求項１の組成物。
【請求項１０】
付加機能部分が固定化された基質である、請求項１の組成物。
【請求項１１】
付加機能部分が半減期延長部分である、請求項１の組成物。
【請求項１２】
半減期延長部分が、ポリエチレングリコール、エチレングリコールの共重合体、ポリプロピレングリコール、プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／マレイン酸無水物共重合体、ポリアミノ酸、デキストランｎ−ビニルピロリドン、ポリｎ−ビニルピロリドン、プロピレングリコールホモ重合体、プロピレンオキシドポリマー、エチレンオキシドポリマー、ポリオキシエチル化されたポリオール、ポリビニルアルコール、直鎖若しくは分岐のグリコシル化された鎖、ポリアセタール、長鎖脂肪酸、長鎖疎水性脂肪族基、免疫グロブリンＦｃドメイン、アルブミン、トランスサイレチン、チロキシン結合グロブリン、若しくはペプチドリガンド及び小分子リガンドからなる群から選択される、長い半減期の血清タンパク質に対して親和性を有するリガンド、
又はこれらの要素の何れかの組み合わせである、請求項１１の組成物。
【請求項１３】
１つ又はそれ以上の特異的に選択された抱合部位が、図１中の下線が付されたアミノ酸残基の位置、図２中の太字のアミノ酸残基の位置、図３中の強調されたアミノ酸残基の位置又はこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択される、請求項１の組成物。
【請求項１４】
１つ又はそれ以上の特異的に選択された抱合部位が、図３中の下線が付されたアミノ酸残基の位置からなる群から選択される、請求項１の組成物。
【請求項１５】
１つ又はそれ以上の特異的に選択された抱合部位が、配列番号６００の位置１、配列番号６００の位置２、配列番号６００の位置３、配列番号６００の位置４、配列番号６００の位置５、配列番号６００の位置６、配列番号６００の位置９、配列番号６００の位置１１、配列番号６００の位置１３、配列番号６００の位置１６、配列番号６００の位置１７、配列番号６００の位置２２６及び配列番号６００の位置２２７又はこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択される部位に対応する、請求項１の組成物。
【請求項１６】
特異的に選択された抱合部位のアミノ酸残基が、基準配列である配列番号５９９に対するＬｅｕ１３９、Ｇｌｎ１４３、Ｓｅｒ１４５及びＳｅｒ１９６からなる群から選択されるＦｃ部位における又はこれらの何れかの組み合わせにおける置換によって、Ｆｃドメインに付加されたシステイン残基である、請求項１の組成物。
【請求項１７】
１つ又はそれ以上の特異的に選択された抱合部位が、表３中に特定されたループ領域から選択される部位である、請求項１の組成物。
【請求項１８】
特異的に選択された抱合部位のアミノ酸残基がシステイン残基である、請求項１の組成物。
【請求項１９】
システイン残基が、未変性Ｆｃドメイン配列において、システイン残基によって占有されていないＦｃドメインのアミノ酸配列の位置中に存在する、請求項１８の組成物。
【請求項２０】
付加機能部分がポリマーである、請求項１の組成物。
【請求項２１】
付加機能部分がポリエチレングリコールである、請求項１の組成物。
【請求項２２】
式
【化１】
2009504164.tif 000094
の請求項１の組成物
（式中、Ｆ１は、単量体又は多量体Ｆｃドメインの単量体であり；
Ｘ１は、Ｆ１のα−アミノ部位を通じて、Ｆ１のＮ末端に共有結合されており；
Ｘ２は、Ｆ１のα−カルボキシ部位を通じて、Ｆ１のＣ末端に共有結合されており；
Ｘ３は、図１中の下線が付された残基位置、図２中の太字の残基位置、図３中の下線が付された残基位置並びに基準配列である配列番号５９９に対するＬｅｕ１３９、Ｇｌｎ１４３、Ｓｅｒ１４５及びＳｅｒ１９６、又はｇ＞１であれば、これらの要素のあらゆる組み合わせからなる群から選択されるＦｃ部位における置換によって、Ｆｃドメインに付加されたシステイン残基からなる群から選択される、Ｆ１中の１つ又はそれ以上の特異的に選択された抱合部位に共有結合されており；
Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は、各々独立に、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ０、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３及び−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４から選択され；
Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４は、各々独立に、
ｉ）医薬として許容されるポリマー又はデキストラン；
ｉｉ）薬理学的に活性なポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣体又は非ペプチド有機部分；
ｉｉｉ）放射性同位体、酵素、ビオチン部分、蛍光色素分子又は発色団；及び
ｉｖ）固定化された基質（但し、２個以上の付加機能的部分を含む鎖中において、前記固定化された基質は、Ｆ１から最も離れた部分であり、及び前記鎖中には、最大１個の固定化された基質が存在し得る。）
からなる群から選択され；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、各々独立に、リンカーであり；
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、各々独立に、０又は１であり；並びに
ｇは、１、２、３又は４である。）。
【請求項２３】
ＦｃドメインがＩｇＧＦｃドメインを含む、請求項２２の組成物。
【請求項２４】
ＦｃドメインがＩｇＧ１Ｆｃドメインを含む、請求項１の組成物。
【請求項２５】
ＩｇＧ１Ｆｃドメインが配列番号６００又は配列番号６０３を含む、請求項２４の組成物。
【請求項２６】
ａ＝０及びｂ＝１である、請求項２２の組成物。
【請求項２７】
ａ＝１及びｂ＝０である、請求項２２の組成物。
【請求項２８】
ａ＝１及びｂ＝１である、請求項２２の組成物。
【請求項２９】
ａ＝０及びｂ＝０である、請求項２２の組成物。
【請求項３０】
Ｘ３がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、請求項２２の組成物。
【請求項３１】
Ｘ３が構造−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１を有する、請求項２２の組成物。
【請求項３２】
Ｘ３が構造−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２を有する、請求項２２の組成物。
【請求項３３】
ｇ＝１又は２である、請求項２２の組成物。
【請求項３４】
Ｆｃドメインが、アミノ酸配列配列番号６０３を含むＩｇＧ１Ｆｃドメインであり、並びに１つ又はそれ以上の特異的に選択された抱合部位が、配列番号６０１、６０２、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０及び６１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むループ領域中に含有されるアミノ酸残基位置から選択される、請求項１の組成物。
【請求項３５】
アンギオテンシン−２（ａｎｇ−２）結合ペプチド又はポリペプチドを含む、請求項１の組成物。
【請求項３６】
Ｘ１、Ｘ２又はＸ３の何れかかが、アンギオテンシン−２（ａｎｇ−２）結合ペプチド又はポリペプチドを含む、請求項２２の組成物。
【請求項３７】
ａｎｇ−２結合ペプチド又はポリペプチドが、配列番号１００から１８９及び６１２から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３６の組成物。
【請求項３８】
ａｎｇ−２結合ペプチドが配列番号１４７を含む、請求項３６の組成物。
【請求項３９】
Ｆ１がＩｇＧ１Ｆｃドメインを含む、請求項３６の組成物。
【請求項４０】
ミオスタチン結合ペプチド又はポリペプチドを含む、請求項１の組成物。
【請求項４１】
Ｘ１、Ｘ２又はＸ３の何れかが、ミオスタチン結合ペプチド又はポリペプチドを含む、請求項２２の組成物。
【請求項４２】
ミオスタチン結合ペプチド又はポリペプチドが、配列番号２１９から５０９、６１３及び６１６から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４１の組成物。
【請求項４３】
ミオスタチン結合ペプチドが配列番号３６５を含む、請求項４１の組成物。
【請求項４４】
Ｆ１がＩｇＧ１Ｆｃドメインを含む、請求項４１の組成物。
【請求項４５】
エリスロポエチン模倣（ＥＰＯ模倣）ペプチド又はポリペプチドを含む、請求項１の組成物。
【請求項４６】
Ｘ１、Ｘ２又はＸ３の何れかが、エリスロポエチン模倣（ＥＰＯ模倣）ペプチド又はポリペプチドを含む、請求項２２の組成物。
【請求項４７】
ＥＰＯ模倣ペプチド又はポリペプチドが、配列番号１から２７及び６１４から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４６の組成物。
【請求項４８】
ＥＰＯ模倣ペプチドが配列番号２を含む、請求項４６の組成物。
【請求項４９】
Ｆ１がＩｇＧ１Ｆｃドメインを含む、請求項４６の組成物。
【請求項５０】
トロンボポエチン模倣（ＴＰＯ模倣）ペプチド又はポリペプチドを含む、請求項１の組成物。
【請求項５１】
Ｘ１、Ｘ２又はＸ３の何れかが、トロンボポエチン模倣（ＴＰＯ模倣）ペプチド又はポリペプチドを含む、請求項２２の組成物。
【請求項５２】
ＴＰＯ模倣ペプチド又はポリペプチドが、配列番号２８から９９及び６１５から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５１の組成物。
【請求項５３】
ＴＰＯ模倣ペプチドが配列番号２８を含む、請求項５１の組成物。
【請求項５４】
Ｆ１がＩｇＧ１Ｆｃドメインを含む、請求項５１の組成物。
【請求項５５】
神経成長因子（ＮＧＦ）結合ペプチド又はポリペプチドを含む、請求項１の組成物。
【請求項５６】
Ｘ１、Ｘ２又はＸ３の何れかが、神経成長因子（ＴＧＦ）結合ペプチド又はポリペプチドを含む、請求項２２の組成物。
【請求項５７】
ＮＧＦ結合ペプチド又はポリペプチドが、配列番号１９０から２１８から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５６の組成物。
【請求項５８】
Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）結合ペプチド又はポリペプチドを含む、請求項１の組成物。
【請求項５９】
Ｘ１、Ｘ２又はＸ３の何れかが、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）結合ペプチド又はポリペプチドを含む、請求項２２の組成物。
【請求項６０】
ＢＡＦＦ結合ペプチド又はポリペプチドが、配列番号５１０から５９４から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５９の組成物。
【請求項６１】
請求項１の組成物及び医薬として許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項６２】
請求項１の組成物をコードするＤＮＡ。
【請求項６３】
請求項６２のＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項６４】
請求項６３の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項６５】
細胞が細菌又は哺乳動物細胞である、請求項６４の宿主細胞。
【請求項６６】
薬理学的に活性な化合物を調製する方法であり、
ａ）Ｆｃドメイン配列の少なくとも１つの内部抱合部位を選択すること（前記抱合部位は、前記抱合部位のアミノ酸残基の側鎖を通じた、所定の抱合化学による付加機能的部位の抱合に適している。）、及び
ｂ）前記所定の抱合化学を使用することによって、前記選択された抱合部位に、所定の機能的部分を抱合することを、
を含む、前記方法。
【請求項６７】
Ｆｃドメインの内部抱合部位がループ領域中に存在する、請求項６６の方法。
【請求項６８】
少なくとも１つの内部抱合部位を選択することが、選択された内部抱合部位中のアミノ酸残基を、システイン残基と置換すること、又は選択された内部抱合部位中にシステイン残基を挿入することをさらに含み、付加機能的部分が、前記システイン残基の側鎖を通じて抱合される、請求項６６の方法。
【請求項６９】
少なくとも１つの内部抱合部位を選択することが、選択された内部抱合部位中のアミノ酸残基を、非標準アミノ酸残基と置換すること、又は選択された内部抱合部位中に非標準アミノ酸残基を挿入することをさらに含み、付加機能部分が、前記非標準アミノ酸残基の側鎖を通じて抱合される、請求項６６の方法。
【請求項７０】
非標準アミノ酸残基が、アジド含有アミノ酸残基、ケト含有アミノ酸残基；アルキン含有アミノ酸残基、アルケン含有アミノ酸残基、ハロゲン化アリール含有アミノ酸残基；及び１，２−アミノチオール含有アミノ酸残基からなる群から選択される、請求項６９の方法。
【請求項７１】
Ｆｃドメイン配列をコードする遺伝子構築物が、細菌又は哺乳動物細胞中で発現される、請求項６６の方法。
【請求項７２】
請求項１の組成物であり、
（ａ）前記組成物が、図１中の下線が付された残基位置、図２中の太字の残基位置、図３中の強調された残基位置、図３中の下線が付された残基位置並びに基準配列である配列番号５９９に対するＬｅｕ１３９、Ｇｌｎ１４３、Ｓｅｒ１４５及びＳｅｒ１９６からなる群、又はＸ３が２個以上存在すれば、これらの要素のあらゆる組み合わせからなる群から選択されるＦｃ部位における置換によってＦｃドメインに付加されたシステイン残基からなる群から選択されるＦｃドメイン中の１つ又はそれ以上の特異的に選択された抱合部位を通じて、抗体のＦｃドメインに共有結合された少なくとも１つのＸ３付加機能部位を含むように修飾された抗体であり；
（ｂ）Ｘ３が、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ０、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３及び−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４から選択され；
Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４が、各々独立に、
ｉ）医薬として許容されるポリマー又はデキストラン；
ｉｉ）薬理学的に活性なポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣体又は非ペプチド有機部分；
ｉｉｉ）放射性同位体、酵素、ビオチン部分、蛍光色素分子又は発色団；及び
ｉｖ）固定化された基質（但し、２個以上の付加機能部分を含む鎖中において、前記固定化された基質は、Ｆｃドメインから最も離れた部分であり、及び前記鎖中には、最大１個の固定化された基質が存在し得る。）；
からなる群から選択され；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４が、各々独立に、リンカーであり；
ｃ、ｄ、ｅ及びｆが、各々独立に、０又は１である；
前記組成物。
【請求項７３】
Ｘ１、Ｘ２又はＸ３の何れかが、配列番号６１７を含むポリペプチドを含む、請求項２２の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物化学の分野に関し、具体的には、免疫グロブリンＦｃドメインを有する抱合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリンＦｃドメインには、様々な治療及び診断分子用の担体タンパク質として、幅広い用途が見出されている。抗体は、「Ｆａｂ」として知られる可変ドメイン（抗原を結合する。）及び「Ｆｃ」として知られる定常ドメイン（補体活性化及び貪食細胞による攻撃として、このようなエフェクター機能に関連する。）という機能的に独立した２つの部分を含む。Ｆｃは長い血清半減期を有するのに対して、Ｆａｂは短寿命である。（Ｃａｐｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：５２５−３１）。治療用タンパク質又はペプチドと一緒に構築されると、Ｆｃドメインは、より長い半減期を与えることができ、又は、Ｆｃ受容体結合、プロテインＡ結合、補体固定などの機能、及びおそらくは胎盤伝達のような機能さえ取り込むことが可能である。同著。
【０００３】
タンパク質及びペプチドの多数の融合物は、アミノ又はカルボキシ末端の何れかに加工を施されてきた。また、様々な酵素及び合成レポーター分子は、非末端アミノ酸の側鎖及びＦｃドメインの誘導化された炭水化物部分に化学的に抱合されてきた。さらに、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの幾つかのポリマーは、インビボでの半減期を改善し、免疫原性を低下させることを目的として、Ｆｃドメインに抱合されてきた。
【０００４】
薬物Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）（エタネルセプト）の成功は、抗体の定常ドメインで修飾された治療剤の有望性に結実した。表１は、本分野で公知のＦｃ融合タンパク質の使用の幾つかの例を要約している。
【０００５】
【表１】
2009504164.tif 000002
【０００６】
より最近の発展は、無作為に作製されたペプチドのＦｃドメインとの融合である。２００３年１２月９日に、Ｆｅｉｇｅらに対して付与された米国  特許番号６，６６０，８４３（参照により、その全体が組み込まれる。）を参照されたい。このような分子は、「ペプチボディ」として知られるようになった。これらは、Ｎ末端、Ｃ末端、アミノ酸側鎖に、又はこれらの部位の２以上に連結された１つ又はそれ以上のペプチドを含む。ペプチボディ技術によって、１つ又はそれ以上のリガンド又は受容体、腫瘍ホーミングペプチド、膜輸送ペプチドなどを標的とするペプチドを取り込んだ治療剤の設計が可能となる。直鎖ペプチド及びジスルフィドによって拘束されたペプチド、「タンデムペプチド多量体」（すなわち、Ｆｃドメインの一本鎖上の、２個以上のペプチド）など、多数のこのような分子の設計において、ペプチボディ技術が有用であることが判明している。例えば、米国  特許番号６，６６０，８４３；２００３年１０月１６日に公開された米国  特許出願番号２００３／０１９５１５６  Ａ１（２００２年１１月２１日に公開されたＷＯ０２／０９２６２０に対応する。）；２００３年９月１８日に公開された米国  特許出願番号２００３／０１７６３５２（２００３年４月１７日に公開されたＷＯ  ０３／０３１５８９に対応する。）；１９９９年１０月２２日に出願された米国逐次番号０９／４２２，８３８（２０００年５月４日に公開されたＷＯ００／２４７７０に対応する。）；２００３年１２月１１日に公開された米国  特許出願番号２００３／０２２９０２３；２００３年７月１７日に公開されたＷＯ  ０３／０５７１３４；２００３年１２月２５日に公開された米国  特許出願番号２００３／０２３６１９３（２００４年４月８日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ０４／０１０９８９に対応する。）；２００３年９月１８日に出願された米国逐次番号１０／６６６，４８０（２００４年４月１日に公開されたＷＯ  ０４／０２６３２９に対応する。）；２００６年６月２９日に公開された米国  特許出願番号２００６／０１４０９３４（２００６年４月４日に公開されたＷＯ  ２００６／０３６８３４に対応する。）（それぞれ、参照により、それらの全体が本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。ポリペプチド治療剤のこのような合理的設計を可能とするさらなる技術は、本分野にとって有益である。
【０００７】
免疫グロブリンＦｃドメインへの化学的抱合のための慣用のアプローチには、リジン及びアミノ末端などの天然に存在する一級アミン又はグルタミン酸、アスパラギン酸及びカルボキシ末端などのカルボン酸へのランダムな結合が含まれる。あるいは、半選択的な部位特異的結合は、適切な条件下でのＮ末端抱合又は真核生物源から単離されたＦｃタンパク質上に見出される誘導化された炭水化物を通じて、又は未変性のシステイン残基の部分的還元及びカップリングによって達成され得る。（例えば、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｆｃ  ｒｅｇｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｃａｒｒｉｅｒ，ＷＯ  ２００５／０４７３３７）。これらのアプローチの各々は上手く利用されているが、それらは、通例、抱合体の不均一性の様々な程度、相対的に低い収率という問題を抱えており、特には、機能的活性の著しい喪失も観察される。機能的活性の著しい低下を伴わない、免疫グロブリンＦｃドメインへの選択的な部位特異的抱合の方法は、本分野において有益である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、組成物及び組成物を製造する方法に関する。薬理学的に活性な本発明の組成物は、抱合部位のアミノ酸残基の側鎖を通じて、Ｆｃドメイン中の１つ又はそれ以上の特異的に選択された抱合部位に、直接又はリンカーを通じて共有結合されている（又は抱合されている）少なくとも１つの付加機能部分を有する単量体又は多量体Ｆｃドメインを含む。このような内部抱合部位は、未変性のＦｃドメイン配列中に既に存在することが可能であり、又は、抱合部位を作製若しくは「加工」するために、未変性のＦｃドメイン配列中での挿入（すなわち、未変性のＦｃドメイン中のアミノ酸の間に）又は置換（すなわち、アミノ酸残基を除去し、別の標準及び／又は非標準アミノ酸残基で置換すること）によって付加することが可能である。後者の場合には、付加されるアミノ酸残基の数は、以前に存在したＦｃドメイン配列から除去されるアミノ酸残基の数と対応する必要はない。
【０００９】
Ｆｃドメイン配列を含む薬理学的に活性な化合物を調製する本発明の方法は、
ａ．Ｆｃドメイン配列の少なくとも１つの内部抱合部位を選択すること（前記抱合部位は、前記抱合部位のアミノ酸残基の側鎖を通じた、所定のカップリング化学による付加的部分の抱合に適している。）、及び
ｂ．前記所定の抱合化学を使用することによって、前記選択された抱合部位に、所定の機能的部分を抱合することを、
を含む。
【００１０】
幾つかの実施形態において、機能的部分は、半減期延長部分及び／又は薬理学的に活性な部分であり、これらは、例えば、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣部分又は非ペプチド有機部分であり得る。別の実施形態において、付加機能部分は、放射性同位体、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ又はキナーゼ）、ビオチン部分、蛍光色素分子又は発色団で検出可能に標識された部分である。あるいは、追加機能部分は、プレート表面、ビーズ、粒子、微粒子、ナノ粒子、チップ、リポソーム、マトリックスなど（但し、これらに限定されない。）の固定化された基材であるが、但し、付加機能部分の鎖中において、前記固定化された基材は、Ｆｃドメインから最も離れた付加的部分であり、鎖中には、１以下の固定化された基材が存在し得る。
【００１１】
本発明の方法は、Ｎ末端若しくはＣ末端又は側鎖を通じて、ポリペプチド（例えば、エタネルセプトにおけるように、ＴＮＦ−Ｒ２の可溶性断片）又はペプチド（例えば、米国特許出願番号２００３／０１９５１５６  Ａ１、２００３／０１７６３５２、２００３／０２２９０２３及び２００３／０２３６１９３；ＷＯ  ００／２４７７０；ＷＯ  ０４／０２６３２９に記載されているとおり）に既に連結されているＦｃドメインを修飾するために使用することが可能である。全体を通じて記載されている方法は、抗体（例えば、アダリムマブ、エプラツズマブ、インフリキシマブ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）など）の一部であるＦｃドメインを修飾するためにも使用することも可能である。このようにして、異なるエピトープへの結合ドメイン、前駆体分子の既存のエピトープへの追加結合ドメイン又は追加の半減期延長部分など、追加機能を有する様々な分子を作製することが可能である。
【００１２】
本発明の化合物は、標準的な合成法、組換えＤＮＡ技術又は本明細書の開示を参照してペプチド及び融合タンパク質を調製する他の方法によって調製することが可能である。
【００１３】
本発明の化合物は、他のタンパク質性分子に関して公知の方法によって、本発明の化合物を調合すること、及び本発明の化合物を必要としているヒト（又はその他の哺乳動物）などの患者に有効量を投与することによって、治療又は予防目的のために使用することが可能である。他の関連する態様も、本発明に含められる。
【００１４】
本発明の多数のさらなる態様及び利点が、本発明の図面及び詳細な説明の検討において明らかとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
用語の定義
本明細書を通じて使用される用語は、具体的な事例において別段の限定がなければ、以下のとおり定義される。また、本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されている単数形（「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」）には、文脈から別段の意味であることが明らかである場合を除き、複数表記も含まれる。別段の記載がなければ、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左手末端は５’末端である。二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は、５’方向と称される。新生ＲＮＡ転写物の５’から３’付加の方向は、転写方向と称される。ＲＮＡと同一の配列を有し、ＲＮＡ転写物の５’から５’末端へのＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上流配列」と称される。ＲＮＡと同一の配列を有し、ＲＮＡ転写物の３’から３’末端へのＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下流配列」と称される。
【００１６】
アミノ酸配列と関連して使用される場合、「含む」という用語は、化合物が、所定の配列のＮ末端又はＣ末端の一方又は両方の上に追加のアミノ酸残基を含み得ることを意味する。
【００１７】
「抱合に適した」抱合部位とは、選択された抱合部位のアミノ酸残基の側鎖が、所定の化学条件下で、目的の追加機能部分と（又は追加機能部分に共有結合されたリンカーと）反応し、主要な反応産物として、追加機能部分が（直接に、又はリンカーを介して）側鎖に共有結合することを意味する。
【００１８】
「抗体」又は「抗体ペプチド」とは、原型状態の抗体を表し、又は特異的結合について原型状態の抗体と競合する原型状態の抗体の断片を表し、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体及び二重特異抗体が含まれる。ある種の実施形態において、結合断片は、組み換えＤＮＡ技術によって産生される。さらなる実施形態において、結合断片は、原型状態の抗体の酵素的又は化学的切断によって産生される。結合断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ及び一本鎖抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【００１９】
本発明の組成物は、Ｆｃドメインに共有結合された少なくとも１つの追加機能部分を有するＦｃドメインを含む。「Ｆｃドメイン」という用語は、本明細書において以下に定義されている未変性Ｆｃ及びＦｃバリアント分子及び配列を包含する。Ｆｃバリアント及び未変性のＦｃにおけるごとく、「Ｆｃドメイン」には、完全な抗体から消化されたものであれ、又はその他の手段によって作製されたものであれ、単量体又は多量体形態の分子が含まれる。一実施形態において、Ｆｃドメインはヒト未変性Ｆｃドメインである。別の実施形態において、「Ｆｃドメイン」は、ヒトＦｃの、又は別の哺乳動物ＦｃポリペプチドのＦｃバリアント、類縁体、変異体、末端切断又は誘導体とすることができる。
【００２０】
「未変性のＦｃ」という用語は、単量体形態であれ、又は多量体形態であれ、直接的に又はリンカーを通じて間接的に、Ｆｃドメインのループ領域に共有結合されることによってペプチドを付加又は抱合し得る、完全な抗体の消化から得られる非抗原結合断片のアミノ酸配列を含む分子又は配列を表す。未変性Ｆｃの元の免疫グロブリン源は、（非ヒト哺乳動物の未変性Ｆｃは「未変性Ｆｃ」中に含まれ、幾つかの実施形態において有用であり得るが）好ましくは、ヒト由来であり、免疫グロブリンの何れでもあり得るが、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２が好ましい。未変性Ｆｃは、場合によって、アミノ末端のメチオニン残基を含み得る。例として、配列番号６００は、未変性ヒトＩｇＧ１配列（幾つかの事例において、本明細書における基準配列として使用される。）及びＦｃバリアント配列番号５９９（同じく、幾つかの事例において、本明細書における基準配列として使用される。）は、アミノ末端メチオニン残基を有する同じ配列である。未変性Ｆｃは、共有（すなわち、ジスルフィド結合）及び非共有会合によって、二量体又は多量体形態へと連結され得る単量体ポリペプチドから構成される。未変性Ｆｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）又はサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＧＡ２）に応じて、１から４の範囲である。未変性Ｆｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化から得られるジスルフィド結合された二量体である（Ｅｌｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １０：４０７１−９参照）。本明細書において使用される「未変性Ｆｃ」という用語は、単量体、二量体及び多量体形態に対する総称である。
【００２１】
ある特定の「基準配列」（すなわち、配列番号６００又は配列番号５９９）に対する本明細書に引用されているアミノ酸残基の位置に関する記述又は請求は、他の基準配列中の対応する位置、又は異なる未変性Ｆｃ配列、Ｆｃバリアント配列若しくは他の修飾されたＦｃドメイン配列中、２つのアラインメント（すなわち、記載されている基準配列と目的とする第二のＦｃドメイン配列を比較する。）中の対応する位置に等しく適用される（例えば、配列番号５９９中の２位は、配列番号６００中の１位に対応するなど。）。
【００２２】
「Ｆｃバリアント」という用語は、未変性Ｆｃから修飾されているが、サルベージ受容体であるＦｃＲｎに対する結合部位をなお含む分子又は配列を表す。国際出願ＷＯ９７／３４６３１（１９９７年９月２５日公開）及びＷＯ９６／３２４７８は、典型的なＦｃバリアント及びサルベージ受容体との相互作用を記載しており、参照により、本明細書に組み込まれる。従って、「Ｆｃバリアント」という用語には、非ヒト未変性Ｆｃからヒト化された分子又は配列が含まれる。さらに、除去可能な部位は、本発明の分子に対して必要とされない構造的特徴又は生物学的活性を与えるので、未変性Ｆｃは、除去され得る部位を含む。従って、「Ｆｃバリアント」という用語は、（１）ジスルフィド結合形成、（２）選択された宿主細胞との非適合性、（３）選択された宿主細胞中で発現された際のＮ末端不均一性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合又は（７）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に影響を与えるか、又はこれらに関与する１つ又はそれ以上の未変性Ｆｃ部位又は残基を欠如する分子又は配列を含む。Ｆｃバリアントは、以下でさらに詳しく記載されている。
【００２３】
「内部」抱合部位という用語は、少なくとも１つの追加部分又は複数の部分の抱合が末端でないこと、すなわち、Ｆｃドメインのαアミノ部位又はαカルボキシ部位を通じていないことを意味するが、ＦｃドメインのＮ末端及び／又はＣ末端に、末端抱合された追加部分が場合によって存在することも可能である。
【００２４】
「ループ」領域又は「Ｆｃループ」領域という用語は、ループ領域からの一次構造のすぐＮ末端及びＣ末端方向に、二次構造（αヘリックス又はβシートなど）を含む２つの領域を接続するアミノ酸残基の一次配列を表す。例には、ＣＨ２又はＣＨ３ループ領域が含まれるが、これに限定されない。当業者は、ループ領域自身は二次構造を含まないが、二次又はそれより高次のタンパク質構造に影響し又は寄与し得ることを理解する。
【００２５】
Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む分子に対して用いられる「多量体」は、共有的に、非共有的に、又は共有的相互作用及び非共有的相互作用の両者によって会合された２つ又はそれ以上のＦｃドメインポリペプチド鎖を有する分子を表す。ＩｇＧ分子は、典型的には、二量体を形成し、ＩｇＭは五量体；ＩｇＤは二量体及びＩｇＡは単量体、二量体、三量体又は四量体を形成する。多量体は、Ｆｃの未変性Ｉｇ源の配列若しくは生じた活性を調べることによって、又はこのような未変性Ｆｃを誘導体化（以下に定義されている。）することによって形成され得る。
【００２６】
Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む分子に対して用いられる「二量体」という用語は、共有的に又は非共有的に会合された２つのポリペプチド鎖を有する分子を表す。本発明の範囲に属する典型的な二量体は、米国  特許番号６，６６０，８４３、図２に示されている（参照により、本明細書に組み込まれる。）。「二量体」には、ホモ二量体及びヘテロ二量体が含まれる。
【００２７】
「誘導体化する」及び「誘導体」又は「誘導体化された」という用語は、方法及び得られた化合物を含み、それぞれそれぞれ、（１）化合物が、環状部分、例えば、化合物内のシステイン残基間の架橋を有する；（２）化合物が架橋され、又は架橋部位を有する、例えば、化合物がシステイン残基を有し、従って、培養若しくはインビボにおいて架橋された二量体を形成している；（３）非ペプチド結合によって、１つ又はそれ以上のペプチド結合が置換されている；（４）Ｎ末端が、−ＮＲＲ１、ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ１、−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ１、−ＮＲＳ（Ｏ）２Ｒ１、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ、スクシンイミド基又は置換された若しくは置換されていないベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−（Ｒ及びＲ１及び環置換基は、以下で定義されているとおりである。）；（５）Ｃ末端が−Ｃ（Ｏ）Ｒ２又は−ＮＲ３Ｒ４によって置換されている（Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、以下に定義されているとおりである。）；並びに（６）選択された側鎖又は末端残基と反応することができる因子での処理を通じて、各アミノ酸部分が修飾されている化合物。誘導体は、さらに、以下に記載されている。
【００２８】
「半減期延長部分」という用語は、薬理学的に活性な部分の非抱合形態と比べて、インビボタンパク分解による医薬として活性な部分の分解若しくは医薬として活性な部分の活性を減少させる他の化学的修飾を抑制若しくは軽減し、吸収の速度を増加させ、毒性を軽減し、溶解度を改善し、目的の標的に関して、医薬として活性な部分の生物学的活性及び／又は標的選択性を増加させるなど（但し、これらに限定されない。）半減期若しくはその他の薬物動態学的特性を増加させ、製造可能性を増加させ、及び／又は医薬として活性な部分（例えば、ペプチド又は非ペプチド部分）の免疫原性を軽減させる、Ｆｃドメイン及び／又は医薬として活性な部分に共有結合若しくは抱合された、医薬として許容される部分、ドメイン若しくは「ビヒクル」を表す。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、有用な半減期延長部分の例である。本発明において、半減期延長部分の他の例には、エチレングリコールの共重合体、プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／マレイン酸無水物共重合体、ポリアミノ酸（例えば、ポリリジン）、デキストランｎ−ビニルピロリドン、ポリｎ−ビニルピロリドン、プロピレングリコールホモ重合体、プロピレンオキシドポリマー、エチレンオキシドポリマー、ポリオキシエチレン化されたポリオール、ポリビニルアルコール、直鎖若しくは分岐グリコシル化された鎖、ポリアセタール、長鎖脂肪酸、長鎖疎水性脂肪族基、免疫グロブリンＦｃドメイン（例えば、Ｆｅｉｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ，米国特許第６，６６０，８４３号参照）、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）；例えば、Ｒｏｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｌｂｕｍｉｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，米国特許第６，９２６，８９８号及びＵＳ２００５／００５４０５１；Ｂｒｉｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｂｌｏｏｄ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ，米国特許第６，８８７，４７０号参照）、トランスサイレチン（ＴＴＲ；例えば、Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ／ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｕｓｉｏｎｓ  ｔｏ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｔｈｅ  ｓｅｒｕｍ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ／ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＵＳ  ２００３／０１９５１５４  Ａ１；２００３／０１９１０５６  Ａ１参照）又はチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）が含まれる。
【００２９】
本発明において、有用な半減期延長部分の他の実施形態には、温度、ｐＨ及びイオン強度の生理的条件下で長い半減期の血清タンパク質に対して結合親和性を有するペプチドリガンド又は小（非ペプチド有機）分子リガンドが含まれる。例には、アルブミン結合ペプチド若しくは小分子リガンド、トランスサイレチン結合ペプチド若しくは小分子リガンド、チロキシン結合グロブリン結合ペプチド若しくは小分子リガンド、抗体結合ペプチド若しくは小分子リガンド又は長い半減期の血清タンパク質に対して親和性を有する別のペプチド若しくは小分子が含まれる。（例えば、Ｂｌａｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｅｒｕｍ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔｓ  ｂｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ−  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｌｉｇａｎｄｓ，米国特許第５，７１４，１４２号；Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｉｅｓ，ＵＳ  ２００３／００６９３９５  Ａ１  ；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，米国特許第６，３４２，２２５号を参照）。「長い半減期の血清タンパク質」は、いわゆる「担体タンパク質」（アルブミン、トランスフェリン及びハプトグロビンなど）、フィブリノーゲン及びその他の血液凝固因子、補体成分、免疫グロブリン、酵素阻害剤、アンギオテンシン及びブラジキン及びタンパク質の他の多くの種類などの物質の前駆体など、哺乳動物の血漿中に溶解された様々な何百ものタンパク質の１つである。本発明は、本明細書に記載されているものなど（但し、これらに限定されない。）、医薬として許容される半減期伸長部分のあらゆる単一種の使用又は２つ若しくはそれ以上の異なる半減期延長部分の組み合わせの使用を包含する。
【００３０】
「ポリペプチド」という用語は、天然に存在しているか否かを問わず、４０を超えるアミノ酸の分子を表す（但し、このような分子は、非膜結合型である。）。典型的なポリペプチドには、インターロイキン（ＩＬ）−１ｒａ、レプチン、可溶性腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体１型及び２型（ｓＴＮＦ−Ｒ１、ｓＴＮＦ−Ｒ２）、ケラチン生成細胞増殖因子（ＫＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ダルベポエチン、膠細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、Ｆａｂ断片などが含まれる。「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書において、互換的に使用される。
【００３１】
「ペプチド」という用語は、２から４０アミノ酸残基の長さの分子を表し、３から４０アミノ酸残基又は６から４０アミノ酸残基の長さの分子が好ましい。典型的なペプチドは、上に引用されている何れの方法によっても無作為に作製され、ペプチドライブラリー（例えば、ファージディスプレイライブラリー）中に担持され、又はタンパク質の消化によって得ることができる。「ペプチド」には、環状ペプチドが含まれる。
【００３２】
本明細書においてペプチド又はポリペプチドをさらに記載する際には、天然に存在するペプチド及びタンパク質中に一般的に取り込まれる２０の「標準」アミノ酸残基の種類を表すために、一文字略号システムがしばしば適用される（表１Ａ）。このような一文字略号は、意味において、三文字略号又は省略されていないアミノ酸名と完全に互換的である。本明細書に使用されている一文字略号システムにおいて、本明細書に別段の記載がなければ、大文字はＬアミノ酸を示し、小文字はＤアミノ酸を示す。例えば、略号「Ｒ」はＬ−アルギニンを表し、略号「ｒ」はＤ−アルギニンを表す。
【００３３】
【表２】
2009504164.tif 000003
【００３４】
本明細書において、アミノ酸配列中のアミノ酸置換は、特定の位置におけるアミノ酸残基に対する一文字略号に続き、目的の未変性ペプチド又はポリペプチド配列に対する数字のアミノ酸位置、次いで、これに続く、置換されたアミノ酸残基に対する一文字記号によって典型的に表される。例えば、「Ｔ３０Ｄ」は、仮想の未変性ペプチド又はポリペプチド配列に対して、アミノ酸位置３０におけるアスパラギン酸残基によるトレオニン残基の置換を表す。さらなる例として、「Ｒ１８ｈＲ」又は「Ｒ１８Ｃｉｔ」は、仮想の未変性ペプチド又はポリペプチド配列に対して、それぞれ、アミノ酸位置１８におけるホモアルギニン又はシトルリン残基によるアルギニン残基の置換を表す。本明細書に記載されているあらゆる特定のポリペプチド又はペプチド（又はペプチド類縁体）のアミノ酸配列内のアミノ酸位置は、ペプチドアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端を、適宜、未変性ポリペプチド又はペプチド配列のＮ末端又はＣ末端と併置して決定される場合のように、未変性配列に対するその位置とは異なり得る。
【００３５】
「非標準アミノ酸残基」という用語は、天然に存在するタンパク質中に一般的に取り込まれる２０個の標準アミノ酸に属さないＤ又はＬ型のアミノ酸残基を表す。非標準アミノ酸には、天然には稀な（ペプチド又はタンパク質中の）アミノ酸残基又は非天然アミノ酸残基が含まれる。非標準アミノ酸の例には、β−アミノ酸、ホモアミノ酸、環状アミノ酸、α，α−二置換されたアミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸及び誘導化された側鎖を有するアミノ酸が含まれるが、これらに限定されない。他の例には、（Ｌ型又はＤ型の）：シトルリン（Ｃｉｔ）、ホモシトルリン（ｈＣｉｔ）、Ｎ−メチルシトルリン（ＮＭｅＣｉｔ）、Ｎ−メチルホモシトルリン（ＮＭｅＨｏＣｉｔ）、オルニチン（Ｏｒｎ又はＯ）、Ｎ−メチルオルニチン（ＮＭｅＯｒｎ）、サルコシン（Ｓａｒ）、ホモリジン（ｈＫ又はＨｌｙｓ）、ホモアルギニン（ｈＲ又はｈＡｒｇ）、ホモグルタミン（ｈＱ）、Ｎ−メチルアルギニン（ＮＭｅＲ）、Ｎ−メチルロイシン（ＮＭｅＬ）、Ｎ−メチルホモリジン（ＮＭｅＨｏＫ）、Ｎ−メチルグルタミン（ＮＭｅＱ）、ノルロイシン（ＮＩｅ）、ノルバリンＯ（Ｎｖａ）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン（Ｔｉｃ）、ニトロフェニルアラニン（ｎｉｔｒｏｐｈｅ）、アミノフェニルアラニン（ａｍｉｎｏｐｈｅ）、ベンジルフェニルアラニン（ｂｅｎｚｙｌｐｈｅ）、γ−カルボキシグルタミン酸（γ−ｃａｒｂｏｘｙｇｌｕ）、ヒドロキシプロリン（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏ）、ｐ−カルボキシル−フェニルアラニン（Ｃｐａ）、α−アミノアジピン酸（Ａａｄ）、アセチルアルギニン（ａｃｅｔｙｌａｒｇ）、α，β−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、α，γ−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、β−（１−ナフチル）−アラニン（１Ｎａｌ）、β−（２−ナフチル）−アラニン（２Ｎａ１）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、４−メチル−フェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、β，β−ジフェニル−アラニン（ＢｉＰｈＡ）、アミノ酪酸（Ａｂｕ）、４−フェニル−フェニルアラニン（４Ｂｉｐ）、α−アミノ−イソ酪酸（Ａｉｂ）、β−アラニン、β−アミノプロピオン酸、ピペリジン酸、アミノカプロン酸（ａｍｉｎｏｃａｐｒｉｏｉｃ  ａｃｉｄ）、アミノヘプタン酸、アミノピメリン酸、デスモシン、ジアミノピメリン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン（ｈｙｒｏｘｙｌｙｓｉｎｅ）、アロ−ヒドロキシリジン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルバリン、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、ω−メチルアルギニン及び他の類似のアミノ酸本明細書に記載されているこれらの何れかの誘導体化された形態が含まれる。
【００３６】
ＵＰＡＣ−ＩＵＢ生物化学の命名法に関する合同委員会（ＪＣＢＮ）によるアミノ酸及びペプチドに対する命名法及び記号表記は、以下の文書：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９８４，２１９，３４５−３７３；Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｏ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８４，１３８，９−３７；１９８５，１５２，１；１９９３，２１３，２；Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｊ．  Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．，１９８４，２４，ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｐ８４；Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８５，２６０，１４−４２；Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８４，５６，５９５−６２４；Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，１９８５，１６，３８７−４１０；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ  Ｐｒｅｓｓ，１９９２，ｐａｇｅｓ  ３９−６９］に公表されている。「プロテアーゼ」という用語は、「ペプチダーゼ」と同義である。プロテアーゼは、タンパク質内の点でペプチド結合を切断するエンドペプチダーゼ、及び、それぞれ、Ｎ末端又はＣ末端の何れかから１つ又はそれ以上のアミノ酸を除去するエキソペプチダーゼという酵素の２つの群を含む。「プロテイナーゼ」という用語は、「エンドペプチダーゼ」に対する同義語としても使用される。プロテイナーゼの４つの機構的クラスは、セリンプロテイナーゼ、システインプロテイナーゼ、アスパラギン酸プロテイナーゼ及びメタロプロテイナーゼである。これらの４つの機構的クラスの他に、同定されていない触媒機構のプロテアーゼに対して割り当てられる酵素命名法の部門が存在する。これは、触媒機構が特定されていないことを示している。
【００３７】
切断サブサイト命名法は、ＳｃｈｅｃｈｔｅｒとＢｅｒｇｅｒによって作製されたスキームから一般に採用されている（Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ  Ｉ．  ＆  Ｂｅｒｇｅｒ  Ａ．，Ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｉｚｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．  Ｉ．  Ｐａｐａｉｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，２７：１５７  （１９６７）；Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ  Ｉ．  ＆  Ｂｅｒｇｅｒ  Ａ．，Ｏｎ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．３．Ｍａｐｐｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｐａｐａｉｎ；ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｆ  ｐａｐａｉｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，３２：８９８  （１９６８））。このモデルに従って、切断を経験する基質中のアミノ酸残基は、切断された結合からＮ末端の方向に、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４などと表記される。同様に、Ｃ末端方向での残基は、Ｐ１’、Ｐ２’、Ｐ３’、Ｐ４’などと表記される。
【００３８】
当業者は、目的のプロテアーゼ結合部位又はプロテアーゼ切断部位を特定するための様々なツールに想到する。例えば、Ｓｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＳＩＢ；ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｅｐｔｉｄｅｃｕｔｔｅｒ）のＥｘＰＡＳｙ（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）プロテオミクスサーバを通じて、ＰｅｐｔｉｄｅＣｕｔｔｅｒソフトウェアツールを入手することが可能である。ＰｅｐｔｉｄｅＣｕｔｔｅｒは、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ及び／又はＴｒＥＭＢＬデータベース又はユーザが入力したタンパク質配列から、プロテアーゼ切断部位についてタンパク質を検索する。単一のプロテアーゼ及び化学物質、プロテアーゼ及び化学物質の選択又は完全なリストを使用することが可能である。酵素名に従ってアルファベットでグループ化されるか、又は順次、アミノ酸番号に従ってグループ化された切断部位の表という、結果の出力の様々な形態が入手可能である。出力のための第三の選択肢は、切断部位のマップである。マップ上にマッピングされた配列及び切断部位は、ブロックにグループ化され、そのサイズは、ユーザによって選択されることができる。プロテアーゼ切断部位を決定するための他のツールも公知である。（例えば、Ｔｕｒｋ，Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅ  ｍｏｔｉｆｓ  ｕｓｉｎｇ  ｍｉｘｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  ｏｒｉｅｎｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９：６６１−６６７（２００１）；Ｂａｒｒｅｔｔ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９８））。
【００３９】
セリンプロテイナーゼには、キモトリプシン、トリプシン又はエラスターゼ又はカリクレインなどの哺乳動物のプロテアーゼ酵素を含むキモトリプシンファミリーが含まれる。セリンプロテイナーゼは、基質残基と相互作用する様々な酵素サブサイト中のアミノ酸置換に関連する異なる基質特異性を示す。幾つかの酵素は、基質との幅広い相互作用部位を有するが、他の酵素はＰ１基質残基に限定した特異性を有する。
【００４０】
トリプシンは、位置Ｐ１のＲ又はＫで優先的に切断する。Ｋｅｉｌ（１９９２）によって実施された統計学的研究は、トリプシン切断時における、Ａｒｇ結合及びＬｙｓ結合を取り囲む残基（すなわち、それぞれ、位置Ｐ２及びＰ１’）の負の影響を記載した。（Ｋｅｉｌ，Ｂ．，Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｂｅｒｌｉｎ−Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ−ＮｅｗＹｏｒｋ，３３５  （１９９２））。位置Ｐ１’中のプロリン残基は、通常、トリプシン切断に対して強力な負の影響を発揮する。同様に、Ｐ１’中のＲ及びＫ並びに位置Ｐ２及びＰ１’における負に帯電した残基は阻害をもたらす。
【００４１】
キモトリプシンは、位置Ｐ１のＷ、Ｙ又はＦで優先的に切断し（高特異性）、これより低い程度で、位置Ｐ１のＬ、Ｍ又はＨ残基で切断する。（Ｋｅｉｌ，１９９２）。これらの規則に対する例外は、以下のとおりである。Ｗが位置Ｐ１に見出され、Ｍ又はＰが、同時に位置Ｐ１’に見出される場合には、切断は遮断される。さらに、位置Ｐ１’におけるプロリン残基は、位置Ｐ１に見出されるアミノ酸とは無関係に、切断をほぼ完全に遮断する。Ｍ残基が位置Ｐ１に見出される場合には、切断は、位置Ｐ１’におけるＹ残基の存在によって遮断される。最後に、Ｈが位置Ｐ１に位置する場合には、Ｄ、Ｍ又はＷ残基の存在も、切断を遮断する。
【００４２】
膜メタロエンドペプチダーゼ（ＮＥＰ；中性エンドペプチダーゼ、腎臓刷子縁中性プロテイナーゼ、エンケファリナーゼ、ＥＣ３．４．２４．１１）は、疎水性アミノ酸残基のアミノ側でペプチドを切断する。（Ｃｏｎｎｅｌｌｙ，ＪＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｔｒａｌ  Ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ２４．１１  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ：Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ，ＰＮＡＳ，８２（２４）：８７３７−８７４１  （１９８５））。
【００４３】
トロンビンは、位置Ｐ１のＲ残基で優先的に切断する。（Ｋｅｉｌ，１９９２）。トロンビンの天然基質は、フィブリノーゲンである。最適な切断部位は、Ｒ残基が位置Ｐ１に存在し、Ｇｌｙが位置Ｐ２及び位置Ｐ１’に存在する場合である。同様に、疎水性アミノ酸残基が位置Ｐ４及び位置Ｐ３に見出される場合には、位置Ｐ２におけるプロリン残基、位置Ｐ１におけるＲ残基並びに位置Ｐ１’及び位置Ｐ２’における非酸性アミノ酸残基。その天然基質であるフィブリノーゲンに対する極めて重要な残基は、Ｐ１０中のＤ残基である。
【００４４】
カスパーゼは、保存されたアミノ酸配列を有する活性部位を有し、及びＤ残基後にペプチドを特異的に切断するシステインプロテアーゼのファミリーである。（Ｅａｒｎｓｈａｗ  ＷＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃａｓｐａｓｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ，ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６８：３８３−４２４  （１９９９））。
【００４５】
Ａｒｇ−Ｃプロテイナーゼは、位置Ｐ１のＲ残基で優先的に切断する。切断の挙動は、位置Ｐ１’の残基によって、穏やかに影響を受けるに過ぎないように見受けられる（Ｋｅｉｌ，１９９２）。Ａｓｐ−Ｎエンドペプチダーゼは、位置Ｐ１’のＤ残基との結合を特異的に切断する。（Ｋｅｉｌ，１９９２）。
【００４６】
前述の記載は単なる例示に過ぎず、当業者が本発明を実施する際に除去することに関心を抱き得るプロテアーゼ結合及び／又は切断部位に関して、当業者に利用可能な知識を網羅的に羅列したものではない。
【００４７】
ペプチド配列を表すために使用される「無作為化された」という用語は、（例えば、ファーディスプレイ法によって選択された）無作為な配列及び天然に存在する分子の１つ又はそれ以上の残基が、天然に存在する分子中の位置に出現しないアミノ酸残基によって置換された配列を表す。ペプチド配列を同定するための典型的な方法には、ファージディスプレイ、Ｅ．コリディスプレイ、リボソームディスプレイ、酵母を基礎としたスクリーニング、ＲＮＡ−ペプチドスクリーニング、化学的スクリーニング、合理的設計、タンパク質構造分析などが含まれる。
【００４８】
ペプチド模倣体は、１つ又はそれ以上のアミド結合同配体を含有し、並びに天然及び非天然アミノ酸の両者を含有することができる小さなペプチド様鎖を含むことができる。このようなペプチド様ペプチド模倣体は、典型的には、分子の特性を変化させるために、既存のポリペプチド又はペプチドを修飾することから得られる。例えば、ペプチド様ペプチド模倣体は、分子の安定性又は生物学的活性を変化させるための修飾から得られ得る。これらの修飾は、天然には存在しない変化をペプチドに施すことを含む（非天然アミノ酸の取り込みなど）。あるいは、ペプチド模倣体には、ペプチド様生化学的若しくは薬理学的活性及び／又は化学的構造（立体構造など、但し、これに限定されない。）を有する非ペプチド小分子が含まれる。このようなペプチド模倣化合物の例は、ＢＩＢＮ４０９６ＢＳである。
【００４９】
「薬理学的に活性な」という用語は、このようにして記載された物質が、医学的パラメータ（例えば、血圧、血液細胞数、コレステロールレベル）又は病状（例えば、癌、自己免疫疾患、神経疾患、慢性的な疼痛）に影響を与える活性を有することが決定される。従って、薬理学的に活性なペプチド又はポリペプチドは、以下に定義されている、アゴニストペプチド又は模倣的ペプチド及びアンタゴニストペプチドを含む。
【００５０】
「模倣ペプチド」及び「アゴニストペプチド」という用語は、それぞれ、対象のタンパク質（例えば、ＥＰＯ、ＴＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ）と同等の生物学的活性を有するペプチド若しくはポリペプチド又は特定の対象タンパク質と、アゴニストとして相互作用するペプチド又はポリペプチドを表す。さらに、これらの用語には、対象タンパク質の天然リガンドの効果を強化することによるなど、対象タンパク質の活性を間接的に模倣するペプチド又はポリペプチドが含まれる。例えば、本明細書の表５及び米国特許番号６，６６０，８４３（参照により、本明細書に組み込まれる。）に列記されているＥＰＯ模倣ペプチドを参照されたい。従って、「ＥＰＯ模倣ペプチド」という用語は、Ｗｒｉｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３：４５８−６３，Ｎａｒａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ  （１９９９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：７５６９−７４又はＥＰＯ模倣主題を有するとして特定された表５中の他の全ての参考文献に記載されているように、同定又は誘導され得る全てのペプチド又はポリペプチドを含む。これらの参考文献の各々は、様々なペプチドライブラリーを用いて開示された手順を踏むことによって、これらの参考文献の各々に実際に開示されているペプチドとは異なるペプチド又はポリペプチドを選択可能とすることを、当業者は理解する。
【００５１】
「アンタゴニストペプチド」又は「阻害剤ペプチド」という用語は、対象の会合されたタンパク質の生物活性を遮断し、若しくは何らかの方法で妨害するペプチド、又は対象の会合されたタンパク質の公知のアンタゴニスト若しくは阻害剤と同等の生物活性を有するペプチドを表す。従って、「ＢＡＦＦ−アンタゴニストペプチド」という用語は、米国特許Ａｐｐｌｎ．番号２００３／０１９５１５６  Ａ１（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されているように、同定又は誘導され得るペプチドを含み、これらのペプチドは、表１０に記載されている。先述の参考文献は、様々なペプチドライブラリーを用いて開示された手順を踏むことによって、先述の参考文献に実際に開示されているペプチドとは異なるペプチドを選択可能とすることを、当業者は理解する。
【００５２】
本発明の組成物において、単量体又は多量体Ｆｃドメインは、Ｆｃドメイン中の１つ又はそれ以上の「特異的に選択された」抱合部位に共有結合（又は抱合）されている少なくとも１つの付加機能部分を有する。抱合部位に関する「特異的に選択された」という用語は、使用されている抱合化学（又は化学反応）の主要産物又は誘導体が、Ｆｃドメイン中の特異的に選択された抱合部位に存在するアミノ酸残基の側鎖を通じていることを意味する。微少な反応産物が抱合反応から生じることもあり得るが、所望であれば、又は適切であれば、これらは精製によって除去することが可能である。「トキシンペプチド」には、毒から単離することが可能な薬理学的に天然に存在する活性ペプチド又はポリペプチドの同じアミノ酸配列を有するペプチド及びポリペプチドが含まれ、天然に存在するこのような分子の修飾されたペプチド類縁体も含まれる。（例えば、Ｋａｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＳｈＫ−Ｄａｐ２２，ａ  ｐｏｔｅｎｔ  Ｋｖ１．３−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３（４９）：３２６９７−７０７  （１９９８）；Ｋｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許番号６，０７７，６８０；Ｍｏｕｈａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＯｓＫ１  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，ＷＯ２００６／００２８５０  Ａ２）Ｃｈａｎｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｏｇｓ  ｏｆ  ＳＨＫ  ｔｏｘｉｎ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ  ｉｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｋｖ１．３  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌｓ，ＷＯ  ２００６／０４２１５１を参照）。ヘビ、サソリ、クモ、ハチ、カタツムリ及びイソギンチャクは、イオンチャンネル及び受容体を強力且つ選択的に標的とする小さな生物活性トキシンペプチド又は「トキシン」の豊富な源としての役割を果たすことができる毒を産生する生物の数例である。
【００５３】
トキシンペプチドは、通常、約２０と約８０アミノ酸長の間であり、２から５個のジスルフィド結合を含有し、極めてコンパクトな構造を形成する。トキシンペプチド（例えば、サソリ、イソギンチャク及びイモ貝の毒から得られる。）が単離され、イオンチャンネルに対するそれらの影響が特徴付けられている。このようなペプチドは、効力及び安定性の重大な問題に対処するために特にきわめて適している構造的骨格の相対的に少数から進化してきたように見受けられる。サソリ及びイモガイのトキシンペプチドの多くは、例えば、１０から４０個のアミノ酸及び最大５個のジスルフィド結合を含有し、しばしばタンパク分解に対して抵抗性の極めてコンパクトで、固定された構造（ミクロタンパク質）を形成する。コノトキシン及びサソリトキシンペプチドは、それらのジスルフィド結合及びペプチドの折り畳みに基づいて、多数のスーパーファミリーに分類することが可能である。これらの多くの溶液構造がＮＭＲ分光法によって決定されており、それらのコンパクトな構造を示し、それらのファミリー折り畳みの保存を確認している。（例えば、Ｔｕｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ  ｂｅｈａｖｉｏｕｒ  ａｎｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ−ｃｈａｎｎｅｌ  ｂｌｏｃｋｅｒ  ＳｈＫ  ｔｏｘｉｎ，Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２５１（１−２）：１３３−４１（１９９８）；Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＳｈＫ  ｔｏｘｉｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３８（４４）：１４５４９−５８  （１９９９）；Ｊａｒａｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｏｘｉｎ  ＯＳＫｌ  ｆｒｏｍ  Ｏｒｔｈｏｃｈｉｒｕｓ  ｓｃｒｏｂｉｃｕｌｏｓｕｓ  ｓｃｏｒｐｉｏｎ  ｖｅｎｏｍ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３６（６）：１２２３−３２  （１９９７）；ｄｅｌ  Ｒｉｏ−Ｐｏｒｔｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．；ＮＭＲ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｃｎ１２，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｍｅｘｉｃａｎ  ｓｃｏｒｐｉｏｎ  Ｃｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓ  ｎｏｘｉｕｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔｙｐｉｃａｌ  ｂｅｔａ−ｔｏｘｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂｕｔ  ｗｉｔｈ  ａｌｐｈａ−ｌｉｋｅ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２７１（１２）：２５０４−１６（２００４）；Ｐｒｏｃｈｎｉｃｋａ−Ｃｈａｌｕｆｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｄｉｓｃｒｅｐｉｎ，ａ  ｎｅｗ  Ｋ＋−ｃｈａｎｎｅｌ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａ−ＫＴｘｌ５  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．４５（６）：１７９５−１８０４（２００６））。本発明の実施が有用であり得る薬理学的に活性なトキシンペプチドの例には、ＳｈＫ、ＯＳＫ１、カリブドトキシン（ＣｈＴｘ）、カリオトキシン１（ＫＴＸ１）若しくはマウロトキシン又は１つ若しくはそれ以上のアミノ酸残基において、未変性の配列から修飾された、これらの何れかのトキシンペプチド類縁体が含まれるが、これらに限定されない。他の例が本分野において公知であり、又は２００６年４月１７日に出願された米国特許出願番号１１／４０６，４５４（発明の名称：Ｔｏｘｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ）（参照により、その全体が組み込まれる。）に見出すことが可能である。
【００５４】
「ＴＰＯ模倣ペプチド」という用語は、Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：１６９６−９、米国  特許番号５，８６９，４５１及び５，９３２，９４６（これらは、参照により、本明細書に組み込まれる。）；２００３年９月１８日に公開された米国特許出願番号２００３／０１７６３５２（参照により、組み込まれる。）；２００３年４月１７日に公開されたＷＯ０３／０３１５８９；２０００年５月４日に公開されたＷＯ  ００／２４７７０に記載されているように、同定又は誘導され得るペプチド及び表６中に示されている全てのペプチドを含む。これらの参考文献の各々は、様々なペプチドライブラリーを用いて開示された手順を踏むことによって、これらの参考文献の各々に実際に開示されているペプチドとは異なるペプチドを選択可能とすることを、当業者は理解する。
【００５５】
「ａｎｇ−２−結合ペプチド」という用語は、２００３年１２月１１日に公開された米国特許出願番号２００３／０２２９０２３；７／１７／０３に公開されたＷＯ０３／０５７１３４；２００３年１２月２５日に公開された２００３／０２３６１９３（これらの各々は、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されているように、同定又は誘導され得るペプチド及び表７中に示されている全てのペプチドを含む。これらの文献の各々は、様々なペプチドライブラリーを用いて開示された手順を踏むことによって、これらの参考文献の各々に実際に開示されているペプチドとは異なるペプチドを選択可能とすることを、当業者は理解する。
【００５６】
「ＮＧＦ結合ペプチド」という用語は、２００４年４月１日に公開されたＷＯ０４／０２６３２９に記載されているように同定又は誘導され得るペプチド及び表８中に示されているペプチドを含む。この参考文献は、様々なペプチドライブラリーを用いて開示された手順を踏むことによって、この参考文献に実際に開示されているペプチドとは異なるペプチドを選択可能とすることを、当業者は理解する。
【００５７】
「ミオスタチン結合ペプチド」という用語は、２００３年１２月１９日に出願された米国逐次番号１０／７４２，３７９（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されているように、同定又は誘導され得るペプチド及び表９中に示されているペプチドを含む。これらの参考文献の各々は、様々なペプチドライブラリーを用いて開示された手順を踏むことによって、これらの参考文献の各々に実際に開示されているペプチドとは異なるペプチドを選択可能とすることを、当業者は理解する。
【００５８】
「ＰＥＧ化されたペプチド」とは、ペプチド自体のアミノ酸残基に共有結合されるか、又はペプチドの残基に共有結合されたペプチド若しくは非ペプチドリンカー（芳香族リンカーを含むが、これに限定されない。）に共有結合されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を有するペプチド又はタンパク質を意味する。
【００５９】
「ポリエチレングリコール」又は「ＰＥＧ」とは、カップリング剤あり若しくはなしの、又はカップリング若しくは活性化部分での（例えば、アルデヒド、ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジド、チオール、トリフラート、トレシラート、アジリジン、オキシラン、オルトピリジルジスルフィド）、ビニルスルホン、ヨードアセトアミド又はマレイミド部分での誘導体化あり若しくはなしの、ポリアルキレングリコール化合物又はその誘導体を意味する。本発明に従えば、有用なＰＥＧには、実質的に直線の、直鎖ＰＥＧ、分岐ＰＥＧ又は樹状ＰＥＧが含まれる。（例えば、Ｍｅｒｒｉｌｌ，米国特許第５，１７１，２６４号；Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｌｔｉａｒｍｅｄ，ｍｏｎｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ，ｐｏｌｙｍｅｒ  ｆｏｒ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｔｏ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  ｓｕｒｆａｃｅｓ，米国特許第５，９３２，４６２号；Ｓｈｅｎ，Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｙｌ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，米国特許第６，６０２，４９８号を参照）。
【００６０】
さらに、本発明の化合物の生理的に許容される塩も、本発明に包含される。「生理的に許容される」塩とは、医薬として許容されることが公知であるか、又は後に発見されるすべての塩を意味する。幾つかの例は、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、塩化水素酸塩及び臭化水素酸塩などのハロゲン化水素、硫酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、グルコン酸塩、コハク酸塩、メシル酸塩、ベシル酸塩及びシュウ酸塩である。
【００６１】
一般的な方法
本発明は、Ｆｃドメイン配列の少なくとも１つの内部抱合部位を選択することを含む、薬理学的に活性な化合物を調製する方法に関する。抱合部位は、抱合部位に位置するアミノ酸残基の側鎖を通じて、所定の抱合化学による付加機能部分の抱合に適していなければならない。本発明に従って、Ｆｃへの高度に選択的な部位特異的抱合を達成するには、多岐にわたる設計基準を検討する必要がある。まず、抱合対、すなわち、目的の追加機能部分（又は複数の部分）及び好ましい抱合又はカップリング化学を確定し、又は予め決定しなければならない。タンパク質、ペプチド、ポリマー又は他の非ペプチド有機部分（例えば、「小分子」）など（但し、これらに限定されない）の機能部分は、本分野で公知の異なる様々な抱合化学を通じて、選択された抱合部位へ抱合又は結合され得る。例えば、Ｆｃドメイン上の接近可能なシステインチオールを標的とする、マレイミドで活性化された抱合対は一実施形態であるが、本発明に従って、Ｆｃドメイン配列中の標準又は非標準、例えば、非天然アミノ酸の側鎖を標的とする多数の抱合又はカップリング化学を使用することが可能である。
【００６２】
新規及び特異的に反応性を有する側鎖官能基を提示するタンパク質を加工するために、特異的に誘導化されたペプチド、ポリマー、小分子又は他の因子に、本発明に従って、化学選択的な抱合を施すための化学には、銅（Ｉ）によって触媒されるアジド−アルキン［３＋２］双極性環付加、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ連結、他のアシル転移法（Ｓ→Ｎ；Ｘ→Ｎ）、オキシム化、ヒドラゾン結合形成及び水溶性パラジウム触媒を用いたクロスカップリングなどの他の適切な有機化学反応が含まれる。（例えば、Ｂｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｐｄ（０）−ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｉｎ  ｗａｔｅｒ，Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３（１６）：２５０９−ｌ１（２００１）；Ｄｉｂｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｂｙ  ｐａｌｌａｄｉｕｍ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ  Ｃ−Ｃ  ｃｒｏｓｓ−ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｉｎ  ｗａｔｅｒ，Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  ３７（４）：４７６−７８  （１９９８）；ＤｅＶａｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｑｕｅｏｕｓ−ｐｈａｓｅ，ｐａｌｌａｄｉｕｍ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｃｒｏｓｓ−ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｏｆ  ａｒｙｌ  ｂｒｏｍｉｄｅｓ  ｕｎｄｅｒ  ｍｉｌｄ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｕｓｉｎｇ  ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ，ｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ  ｄｅｍａｎｄｉｎｇ  ａｌｋｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅｓ，Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  ６９：７９１９−２７（２００４）；Ｓｈａｕｇｎｅｓｓｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ，２００３，６８，６１６１−６１１  Ａ；Ｐｒｅｓｃｈｅｒ，ＪＡ  ａｎｄ  Ｂｅｒｔｏｚｚｉ  ＣＲ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １（１）；１３−２１  （２００５））。幾つかの有用な抱合化学が、下表１Ｂに示されている。
【００６３】
【表３】
2009504164.tif 000004
【００６４】
上述のように、Ｆｃドメインへの抱合（又は共有結合）は、抱合部位のアミノ酸残基、例えばシステイン残基（但し、これに限定されない。）の側鎖を通じて行われる。選択された内部抱合部位のアミノ酸残基（例えば、システイン残基）は、未変性のＦｃドメイン配列中の同じアミノ酸残基位置を占有するものであり得、又はアミノ酸残基は、置換若しくは挿入によって、Ｆｃドメイン配列中に加工することが可能である。このようなアミノ酸残基は、Ｌ又はＤ立体化学（ＬでもＤでもないＧｌｙを除く。）の何れかを有することが可能であり、本発明のポリペプチド、ペプチド及び組成物は、立体化学の組み合わせを含むことが可能である。しかしながら、Ｌ立体化学が好ましい。本発明は、アミノ酸のアミノ末端配列からカルボキシ末端配列が逆転している逆転分子も提供する。例えば、正常な配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３を有する分子の逆転は、Ｘ３−Ｘ２−Ｘ１である。本発明は、上述のように、アミノ酸のアミノ末端からカルボキシ末端配列が逆転し、及び、通常、「Ｌ」鏡像異性体である残基が「Ｄ」立体異性体形態へと変化されているレトロ逆転分子も提供する。
【００６５】
本明細書に記載されている、２０の標準アミノ酸及び他の非標準アミノ酸（非天然アミノ酸など）の立体異性体（例えば、Ｄアミノ酸）も、本発明の組成物のある種の実施形態のポリペプチド又はペプチド部分に対する適切な成分であり得る。
【００６６】
本発明の方法及び組成物の幾つかの実施形態において、抱合部位として特に有用であり得る非天然アミノ酸残基の他の例には、アジド含有アミノ酸残基、例えば、アジドホモアラニン、ｐ−アジド−フェニルアラニン；ケト含有アミノ酸残基、例えば、ｐ−アセチル−フェニルアラニン；アルキン含有アミノ酸残基、例えば、ｐ−エチニルフェニルアラニン、ホモプロパルギルグリシン、ｐ−（プロプ−２−イニル）−チロシン；アルキン含有アミノ酸残基、例えば、ホモアリルグリシン；ハロゲン化アリール含有アミノ酸残基、例えば、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン；及び１，２−アミノチオール含有アミノ酸残基が含まれる。
【００６７】
非標準アミノ酸残基は、アミノ酸置換又は挿入によって取り込むことが可能である。非標準アミノ酸残基は、組換え的に発現する細胞などの生物学的系での合成によるより、むしろ、化学的ペプチド合成によってペプチド中に取り込むことが可能であり、あるいは、当業者は、組換え的に発現している細胞を使用するタンパク質工学の公知の技術を使用することが可能である。（例えば、Ｌｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４（６）：６０３−６０９  （２００３）；Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ，米国  特許番号７，０４５，３３７を参照）。
【００６８】
総Ｆｃ配列中での抱合部位の配置の選択は、本発明に従って内部抱合部位を選択する別の重要な側面である。Ｆｃ表面上の曝露されたアミノ酸残基の何れも、又はＦｃＣＨ２若しくはＣＨ３ループ領域若しくはサブドメインの何れかは、有用な抱合部位である可能性を秘めており（図１）、Ｆｃドメイン配列の選択された抱合部位に既に存在していなければ、部位選択的カップリングのために、システイン又は幾つかの他の反応性アミノ酸へ変異させることが可能である。しかしながら、このアプローチは、融合対の活性を擾乱し、又は加工された変異の反応性を限定し得る潜在的な立体的拘束を考慮に入れていない。例えば、完全に溶媒に曝露されるように加工されたシステインは、精製の間に酸化された状態となり得、抱合のためのチオールが殆ど又は全く残存しなくなる。さらに、抱合のために導入された変異は、それがシステインであれ、又は他の何れのアミノ酸であれ、Ｆｃ構造を不安定化させるべきでなく、又はＦｃ類縁体の発現若しくは回収率を妨害すべきでない。最後に、原型状態のＦｃドメインの場合、選択された抱合部位は、存在する場合、Ｆｃ二量体界面に対してアロステリックであるべきである。また、幾つかの治療的適用は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）界面に対して遠位の抱合部位を維持することによってさらに有益となり得る。
【００６９】
本発明において、免疫グロブリンＦｃ表面構造の詳細な局所的調査が記載されており、これは、タンパク質、ペプチド、ポリマー又は他の小分子を化学的にカップリングするのに適切な可能性がある抱合部位に相当する溶媒曝露されたアミノ酸を特定する（図１）。この分析において、溶媒に曝露された親水性残基の全てが、抱合に適していると考えられるわけではなかった。実際、可能性のある１１５のうち僅か３６残基が、ＦｃＲｎ結合及び二量体界面とのそれらの併置並びにその他の局在化された立体的制約に基づいて選択された。Ｆｃ構造的ループ候補領域（図２、太字）の全てをマッピングするために、利用可能なＦｃドメイン結晶構造、それらの受容体及び多数のＦｃ配列アラインメントを用いて、潜在的抱合部位のリストをさらに精緻化した。これらのループ領域内の置換に最も適した具体的な残基は、相同性モデリング及び溶媒の接近可能性によって特定された（図２、下線部が付されている。）。最後に、これらの潜在的部位の各々は、ＦｃＲｎ及び二量体界面に対するそれらの併置、種間及びイソタイプ相同性並びにＦｃ二次構造の中心的要素における当該部位の近接性及び関与に基づいて順位を付けた（表２）。Ｆｃループ領域を特定し、挿入耐性変異部位を予想するための構造をベースとした相同性モデリングを用いた本アプローチは、２００４年９月２４日に出願されたＡｍｇｅｎの特許出願米国出願番号６０／６１２，６８０に記載されているように、治療的ペプチド挿入を用いて、以前に有効性が確認されている。（ＷＯ２００６／０３６８３４参照）本研究に基づいて、最も好ましい変異部位は、Ｔｈｒ１４０、Ａｓｎ７８及びＧｌｕ５０（図２、引用されているアミノ酸残基位置は、基準配列である配列番号５９９に関する。）である。
【００７０】
図１において強調表示されている溶媒曝露された表面残基から選択される好ましい抱合部位を、太字表記のループ領域候補及びこれらのループ内の下線が付された好ましい抱合部位（図２）と比較するために、図３に示されているように、２つの配列を、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインに併置し、マッピングした。ここに、潜在的抱合部位を選択するための表面曝露モデルとループモデルの間に、極めて一貫した一致が現れる。明らかに、これらの例は、免疫グロブリンＦｃドメインの詳細な構造分析及び比較を通じて、配列の単純な疎水的マップからは容易に明らかでない潜在的抱合部位の実験的に管理可能な数を特定することが可能である。
【００７１】
カップリングのための好ましい変異の別のサブセットは、効率的な抱合のために遊離チオール官能基が保持されなければならないシステイン類縁体の使用について具体的に述べる。この戦略は、システイン変異が、ループ領域ではなく、二次構造の比較的堅固な要素中に加工されるべきこと、及びシステインチオールを酸化から保護するのを助けるために、タンパク質表面上のポケット内に隣接され、最小限の溶媒曝露を与えるべきことを仮定する。この戦略は、米国特許番号６，４２０，３３９において、効果的に実証されている。このアプローチ下で、システイン変異に対する最も好ましい残基には、ヒトＦｃ配列のＳｅｒ１９６、Ｇｌｎ１４３、Ｌｅｕ１３９及びＳｅｒ１４５（図４）が含まれるが、これらに限定されるものではなく、記載されている位置は、配列番号５５９の基準配列に対するものである。
【００７２】
本発明者らは、これらの潜在的抱合部位の何れもが、タンパク質、ペプチド、ポリマー又はその他の小分子をカップリングするための適切な基質を提供するために、完全長免疫グロブリンＦｃドメインを必要としないことを、本発明の一部としてさらに想定している。実際、本発明によって認識された潜在的抱合部位をなお含むＦｃのあらゆる末端切断を、抱合のために使用することが可能である。例えば、約９Ｋｄより大きなＦｃのＣＨ２サブドメイン又はＣＨ３サブドメインは、本発明において、有用な「Ｆｃドメイン」であり得る。従って、本発明は、ＣＨ２又はＣＨ３ループ領域又はサブドメインなどの単離されたＦｃ末端切断を含む。さらに、「免疫グロブリン折り畳み」の高度に保存された三次元構造に鑑みれば、配列のアラインメントによって、他のＩｇＦｃイソタイプ、末端切断及びサブドメイン中に、均等な抱合部位を容易に推定することが可能であり、従って、均等な抱合部位は、本発明に含まれる。
【００７３】
表２は、ヒトＦｃ表面残基を示している（データ源として、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅファイル１ＦＣ１を使用）（ＰＤＢファイルからのＳ２３９は、配列番号６００の基準配列Ｓ１９及び配列番号５９９の基準配列のＳ２０に対応する。Ｋ２４６は、配列番号６００のＫ２６及び配列番号５９９のＫ２７に対応するなど）。
【００７４】
【表４】
2009504164.tif 000005
【００７５】
下表３は、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインの予想されるループ領域中の変異又は修飾ための優先的部位を示す。ここでは、アミノ酸残基位置は、基準配列である配列番号５９９に関して付番されている。
【００７６】
【表５】
2009504164.tif 000006
【００７７】
要約すると、本明細書は、免疫グロブリンＦｃの表面上に有用な抱合部位を同定するための体系的アプローチを詳述し、本明細書に記載されている全ての変異部位を含む。具体的な抱合部位の同定は、これらの発明者らによって開発された構造／機能基準の詳細な組に対する構造及び配列データの応用から得られる。
【００７８】
本発明の化合物の構造
Ｆｃドメイン。本発明の組成物は、少なくとも１つのＦｃドメイン単量体の存在を必要とするが、多量体Ｆｃ実施形態（例えば、Ｆｃドメイン二量体、三量体、四量体、五量体など）も好ましい。抗体中に含まれるＦｃドメインのように、未変性のＦｃ及びＦｃバリアントの両方が、本発明の範囲内での使用のための適切なＦｃドメインである。未変性のＦｃは、サルベージ受容体への結合が維持される限り、本発明に従う、Ｆｃバリアントを形成するように広く修飾することができる。例えば、ＷＯ９７／３４６３１及びＷＯ９６／３４２７８を参照されたい。幾つかの有用な実施形態において、融合分子など、本発明の分子によって必要とされない構造的特徴又は機能的活性を提供する未変性Ｆｃの１つ又はそれ以上の部位を除去することが可能である。例えば、アミノ酸残基を置換若しくは欠失させ、部位中に残基を挿入し、又は部位を含有する部分を末端切断させることによって、これらの部位を除去し得る。挿入された又は置換された残基は、ペプチド模倣体又はＤアミノ酸などの変化されたアミノ酸でもあり得る。Ｆｃバリアントは、多数の理由のために望ましいことがあり、これらの幾つかが以下に記載されている。
【００７９】
典型的なＦｃバリアントには、以下の分子及び配列が含まれる。
【００８０】
１．ジスルフィド結合の形成に関与する部位が除去されている。このような除去は、本発明の分子を作製するために使用される宿主細胞中に存在する他のシステイン含有タンパク質との反応を回避し得る。この目的のために、Ｎ末端のシステイン含有セグメントは末端切断させることができ、又はシステイン残基は欠失されるか、若しくは他のアミノ酸（例えば、アラニル、セリル）で置換することができる。例えば、Ｎ末端セグメントを末端切断し（配列番号５９９又は配列番号６００の基準配列の概ね最初の２０アミノ酸残基までの末端切断）又は配列番号５９９の７位及び１０位（配列番号６００の６位及び９位）のシステイン残基を欠失若しくは置換し得る。システイン残基が除去されている場合でさえ、一本鎖Ｆｃドメインは、非共有的に互いに結合された二量体Ｆｃドメインをなお形成することができる。
【００８１】
２．未変性のＦｃは、選択された宿主細胞とより適合性があるように修飾される。例えば、プロリンイミノペプチダーゼなどの、Ｅ．コリ中の消化酵素によって認識され得る典型的な未変性のＦｃのＮ末端に近いＰＡ配列を除去し得る。分子が、Ｅ．コリなどの細菌細胞中で組み換え的に発現されている場合には特に、Ｎ末端メチオニン残基も付加し得る。基準配列である配列番号５９９（図２）のＦｃドメインは、配列番号６００のＮ末端にメチオニンが付加されているこのようなＦｃバリアントである。
【００８２】
３．未変性のＦｃのＮ末端の一部は、選択された宿主細胞中で発現されたときにＮ末端の不均一性を防ぐために除去される。この目的のために、Ｎ末端の最初の２０アミノ酸残基、特に基準配列である配列番号６００の位置１、２、３、４及び５に対応するものの何れか又は全部を欠失させ得る。
【００８３】
４．１つ又はそれ以上のグリコシル化部位が除去される。典型的にグリコシル化される残基（例えば、アスパラギン）は、細胞溶解応答を付与し得る。このような残基は、欠失させるか、又はグリコシル化されない残基（例えば、アラニン）で置換し得る。
【００８４】
５．Ｃ１ｑ結合部位などの補体との相互作用に関与する部位が除去される。例えば、ヒトＩｇＧ１のＥＫＫ配列を欠失又は置換し得る。補体の動員は、本発明の分子にとって有利でない場合があり得、このようなＦｃバリアントを用いて回避し得る。
【００８５】
６．サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合に影響を与える部位が除去される。未変性のＦｃは、本発明の融合分子に対して必要とされないある種の白血球を妨害するための部位を有することがあり、従って、除去され得る。
【００８６】
７．ＡＤＣＣ部位が除去される。ＡＤＣＣ部位は、本分野において公知である。例えば、ＩｇＧ１中のＡＤＣＣ部位に関して「Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（５）：６３３−９（１９９２）」を参照。これらの部位も、本発明の融合分子にとって不要であり、従って、除去することが可能である。
【００８７】
８．未変性のＦｃが非ヒト抗体に由来する場合には、未変性のＦｃはヒト化され得る。典型的には、未変性のＦｃをヒト化するために、ヒトの未変性Ｆｃ中に通常見出される残基で、非ヒト未変性Ｆｃ中の選択された残基を置換する。抗体のヒト化のための技術は、本分野において周知である。
【００８８】
好ましいＦｃバリアントには、以下のものが含まれる。基準配列である配列番号５９９（図２）では、１５位のロイシンはグルタミン酸で、９９位のグルタミン酸はアラニンで、並びに１０１位及び１０３位のリジンはアラニンで置換され得る。さらに、１つ又はそれ以上のチロシン残基は、フェニルアラニン残基によって置換することが可能である。幾つかの好ましい実施形態において、Ｆｃドメインは、配列番号６０３のアミノ酸配列を含むＩｇＧ１Ｆｃドメインであり、
【００８９】
【化２】
2009504164.tif 000007
、１つ又はそれ以上の特異的に選択された抱合部位が、
【００９０】
【化３】
2009504164.tif 000008
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むループ領域中に含有されるアミノ酸残基の位置から選択される。
【００９１】
本発明に従って調製された組成物において、少なくとも１つの追加機能部位は、本明細書に記載されているように選択されたアミノ酸残基側鎖を含む特異的に選択された抱合部位を通じて、単量体又は多量体Ｆｃドメインへ共有結合されている。場合によって、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣部分又は非ペプチド有機部分などのその他の部分は、ＦｃドメインのＮ末端を通じて（すなわち、αアミノ部位を介して）又はＣ末端を通じて（すなわち、αカルボキシ部位を介して）、Ｆｃドメインに付着させることが可能である。
【００９２】
本発明の分子のある実施形態は、以下の式Ｉによって記載され得る。
【００９３】
【化４】
2009504164.tif 000009
【００９４】
（Ｆ１は、単量体又は多量体Ｆｃドメインの単量体であり；
Ｘ１は、Ｆ１のα−アミノ部位を通じて、Ｆ１のＮ末端に共有結合されており；
Ｘ２は、Ｆ１のα−カルボキシ部位を通じて、Ｆ１のＣ末端に共有結合されており；
Ｘ３は、図１中の下線が付された残基の位置、図２中の太字の残基の位置、図３中の強調された残基の位置、図３中の下線が付された残基の位置並びにＬｅｕ１３９、Ｇｌｎ１４３、Ｓｅｒ１４５及びＳｅｒ１９６からなる群から選択されるＦｃ部位における置換によって、Ｆｃドメインに付加されたシステイン残基、又はｇ＞１であれば、これらの要素のあらゆる組み合わせからなる群から選択される、Ｆ１中の１つ又はそれ以上の特異的に選択された抱合部位に共有結合されており；
Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は、各々独立に、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ０、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３及び−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４から選択され；
Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４が、各々独立に、
ｉ）医薬として許容されるポリマー又はデキストラン；
ｉｉ）薬理学的に活性なポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣体又は非ペプチド有機部分；
ｉｉｉ）放射性同位体、酵素、ビオチン部分、蛍光色素分子又は発色団；及び
ｉｖ）固定化された基質（但し、２個以上の付加機能的部分を含む鎖中において、前記固定化された基質は、Ｆ１から最も離れた部分であり、及び前記鎖中には、最大１個の固定化された基質が存在し得る。）
からなる群から選択され；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、各々独立に、リンカーであり；
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、各々独立に、０又は１であり；並びに
ｇは、１、２、３又は４である。）
当業者は、２以上の追加機能部分（Ｘ３）をＦｃドメインに付着させることが可能であること、及び複数のＸ３置換基が同一又は別異であり得ること；例えば、同一又は別異のＰ１機能部分（すなわち、ある式中のＰ１は、他の何れのＰ１、Ｐ２、Ｐ３又はＰ４とも同一であり、又は異なり得る。）、同じペプチド配列に付着された異なるリンカーを含むなど。同様に、Ｘ１及びＸ２は、同一、別異又は不存在であり得（すなわち、ａ及び／又はｂ＝０）、整数ｃからｆは、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３に対して異なり得る。
【００９５】
従って、式Ｉの化合物は、以下の式（ＩＩ）から（ＸＸＶＩＩＩ）の本発明の化合物の典型的な実施形態を包含するが、これらに限定されるものではない。
【００９６】
【化５】
2009504164.tif 000010
及びこの多量体（ａ＝１、ｂ＝０、Ｆ１は、Ｘ１中に含まれるポリペプチド又はペプチドのＣ末端に付着され、及びＸ３は、Ｆ１中の特異的に選択された内部抱合部位を通じて付着されている。）；
【００９７】
【化６】
2009504164.tif 000011
及びこの多量体（ａ＝０、ｂ＝１、Ｆ１は、Ｘ２中に含まれるポリペプチド又はペプチドのＮ末端に付着され、及びＸ３は、Ｆ１中の特異的に選択された内部抱合部位を通じて付着されている。）；
【００９８】
【化７】
2009504164.tif 000012
及びこの多量体（ａ＝０、ｂ＝１、Ｆ１は、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１中に含まれるポリペプチド又はペプチドＰ１のＮ末端を通じて付着され、及び−（Ｌ１）ｃ−ＰＥＧは、Ｆ１中の特異的に選択された内部抱合部位を通じて付着されている。）；
【００９９】
【化８】
2009504164.tif 000013
及びこの多量体（ａ＝０、ｂ＝１、Ｆ１は、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２中に含まれるポリペプチド又はペプチドＰ１のＮ末端を通じて付着され、及び−（Ｌ１）ｃ−ＰＥＧは、Ｆ１中の特異的に選択された内部抱合部位を通じて付着されている。）；
【０１００】
【化９】
2009504164.tif 000014
及びこの多量体（ａ＝０、ｂ＝１、Ｆ１は、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ０中に含まれるポリペプチド又はペプチドＰ０のＮ末端を通じて付着され、及び−（Ｌ１）ｃ−ＰＥＧは、Ｆ１中の特異的に選択された内部抱合部位を通じて付着されている。）；
【０１０１】
【化１０】
2009504164.tif 000015
及びこの多量体（ａ＝０、ｂ＝１、Ｆ１は、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ０中に含まれるポリペプチド又はペプチドＰ０のＮ末端を通じて付着され、及び−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１は、Ｆ１中の特異的に選択された内部抱合部位を通じて付着されている。）；
【０１０２】
【化１１】
2009504164.tif 000016
及びこの多量体（ａ＝０、ｂ＝１、Ｆ１は、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ０中に含まれるポリペプチド又はペプチドＰ０のＮ末端を通じて付着され、及び−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２は、Ｆ１中の特異的に選択された内部抱合部位を通じて付着されている。）；
【０１０３】
【化１２】
2009504164.tif 000017
及びこの多量体（ａ＝０、ｂ＝１、ｇ＝２、Ｆ１は、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ０中に含まれるポリペプチド又はペプチドＰ０のＮ末端を通じて付着され、及び−（Ｌ１）ｃ−ＰＥＧ及び−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１は、各々独立に、Ｆ１中の特異的に選択された内部抱合部位を通じて付着されている。）；
【０１０４】
【化１３】
2009504164.tif 000018
及びこの多量体（ａ＝０、ｂ＝１、ｇ＝２、Ｆ１は、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ０中に含まれるポリペプチド又はペプチドＰ０のＮ末端を通じて付着され、並びに−（Ｌ１）ｃ−ＰＥＧ及び−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２は、各々独立に、Ｆ１中の特異的に選択された内部抱合部位を通じて付着されている。）；
【０１０５】
【化１４】
2009504164.tif 000019
及びこの多量体（ａ＝０、ｂ＝１、Ｆ１は、ポリペプチド又はペプチド−Ｐ０のＮ末端に付着され、並びに−（Ｌ１）ｃ−ＰＥＧ及び−（Ｌ１）ｃ−Ｐ２−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２は、各々独立に、Ｆ１中の特異的に選択された内部抱合部位を通じて付着されている。）；
【０１０６】
【化１５】
2009504164.tif 000020
及びこの多量体（ａ＝１、ｂ＝０、Ｆ１は、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１中に含まれるポリペプチド又はペプチドＰ１のＣ末端を通じて付着され、及び−（Ｌ１）ｃ−ＰＥＧは、Ｆ１中の特異的に選択された内部抱合部位を通じて付着されている。）；
【０１０７】
【化１６】
2009504164.tif 000021
及びこの多量体（ａ＝１、ｂ＝０、Ｆ１は、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２中に含まれるポリペプチド又はペプチドＰ１のＣ末端を通じて付着され、及び−（Ｌ１）ｃ−ＰＥＧは、Ｆ１中の特異的に選択された内部抱合部位を通じて付着されている。）；
【０１０８】
【化１７】
2009504164.tif 000022
及びこの多量体（ａ＝１、ｂ＝０、Ｆ１は、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ０中に含まれるポリペプチド又はペプチドＰ０のＣ末端を通じて付着され、及び−（Ｌ１）ｃ−ＰＥＧは、Ｆ１中の特異的に選択された内部抱合部位を通じて付着されている。）；
【０１０９】
【化１８】
2009504164.tif 000023
及びこの多量体（ａ＝１、ｂ＝０、Ｆ１は、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ０中に含まれるポリペプチド又はペプチドＰ０のＣ末端を通じて付着され、及び−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１は、Ｆ１中の特異的に選択された内部抱合部位を通じて付着されている。）；
【０１１０】
【化１９】
2009504164.tif 000024
及びこの多量体（ａ＝１、ｂ＝０、Ｆ１は、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ０中に含まれるポリペプチド又はペプチドＰ０のＣ末端を通じて付着され、及び−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２は、Ｆ１中の特異的に選択された内部抱合部位を通じて付着されている。）；
【０１１１】
【化２０】
2009504164.tif 000025
及びこの多量体（ａ＝０、ｂ＝１、ｇ＝２、Ｆ１は、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ０中に含まれるポリペプチド又はペプチドＰ０のＣ末端を通じて付着され、及び−（Ｌ１）ｃ−ＰＥＧ及び（Ｌ１）ｃ−Ｐ１は、各々独立に、Ｆ１中の特異的に選択された内部抱合部位を通じて付着されている。）；
【０１１２】
【化２１】
2009504164.tif 000026
及びこの多量体（ａ＝１、ｂ＝０、ｇ＝２、Ｆ１は、ポリペプチド又はペプチドＰ０のＣ末端に付着され、並びに−（Ｌ１）ｃ−ＰＥＧ及び−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２ｄ）−Ｐ２は、各々独立に、Ｆ１中の特異的に選択された内部抱合部位を通じて付着されている。）；
【０１１３】
【化２２】
2009504164.tif 000027
及びこの多量体（ａ＝１、ｂ＝０、ｇ＝２、Ｆ１は、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１中に含まれるポリペプチド又はペプチドＰ１のＣ末端を通じて付着され、並びに−（Ｌ１）ｃ−ＰＥＧ及び−（Ｌ１）ｃ−Ｐ２−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２は、各々独立に、Ｆ１中の特異的に選択された内部抱合部位を通じて付着されている。）；
【０１１４】
【化２３】
2009504164.tif 000028
及びこの多量体（ａ＝１、ｂ＝１、Ｐ０−（Ｌ１）ｃ−Ｆ１−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１は、ポリペプチド又はペプチドＰ０のＮ末端からポリペプチド又はペプチドＰ１のＣ末端へと書かれているように付着され、及び−（Ｌ１）ｃ−ＰＥＧは、Ｆ１中の特異的に選択された内部抱合部位を通じて付着されている。）；
【０１１５】
【化２４】
2009504164.tif 000029
及びこの多量体（ａ＝１、ｂ＝１、ｃ＝１、Ｐ０−（Ｌ１）ｃ−Ｆ１−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２は、ポリペプチド又はペプチドＰ０のＮ末端からポリペプチド又はペプチドＰ１（Ｐ２でなくＰ１がポリペプチド又はペプチドである場合）又はＰ２（Ｐ１及びＰ２がともに、ポリペプチド又はペプチドである場合）のＣ末端へと書かれているように付着され、及び−（Ｌ１）ｃ−ＰＥＧは、Ｆ１中の特異的に選択された内部抱合部位を通じて付着されている。）；
【０１１６】
【化２５】
2009504164.tif 000030
及びこの多量体（ａ＝１、ｂ＝１、Ｐ０−Ｆ１−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２は、ポリペプチド又はペプチドＰ０のＮ末端からポリペプチド又はペプチドＰ１（Ｐ２でなくＰ１がポリペプチド又はペプチドである場合）又はＰ２（Ｐ１及びＰ２がともに、ポリペプチド又はペプチドである場合）のＣ末端へと書かれているように付着され、及び−（Ｌ１）ｃ−ＰＥＧは、Ｆ１中の特異的に選択された内部抱合部位を通じて付着されている。）；
【０１１７】
【化２６】
2009504164.tif 000031
及びこの多量体（ａ＝１、ｂ＝１、ｃ＝１、Ｐ１−（Ｌ１）ｃ−Ｆ１−（Ｌ１）ｃ−Ｐ０は、ポリペプチド又はペプチドＰ１のＮ末端からポリペプチド又はペプチドＰ０のＣ末端へと書かれているように付着され、及び−（Ｌ１）ｃ−ＰＥＧは、Ｆ１中の特異的に選択された内部抱合部位を通じて付着されている。）；
【０１１８】
【化２７】
2009504164.tif 000032
及びこの多量体（ａ＝１、ｂ＝１、ｃ＝１、Ｐ１−（Ｌ１）ｃ−Ｆ１−（Ｌ１）ｃ−Ｐ０は、ポリペプチド又はペプチドＰ１のＮ末端からポリペプチド又はペプチドＰ０のＣ末端へと書かれているように付着され、及び−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１は、Ｆ１中の特異的に選択された内部抱合部位を通じて付着されている。）；
【０１１９】
【化２８】
2009504164.tif 000033
及びこの多量体（ａ＝１、ｂ＝１、ｃ＝１、Ｐ１−（Ｌ１）ｃ−Ｆ１−（Ｌ１）ｃ−Ｐ０は、ポリペプチド又はペプチドＰ１のＮ末端からポリペプチド又はペプチドＰ０のＣ末端へと書かれているように付着され、及び−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２ｄ）−Ｐ２は、Ｆ１中の特異的に選択された内部抱合部位を通じて付着されている。）；
【０１２０】
【化２９】
2009504164.tif 000034
及びこの多量体（ａ＝１、ｂ＝１、ｃ＝１、Ｐ１−（Ｌ１）ｃ−Ｆ１−（Ｌ１）ｃ−Ｐ０は、ポリペプチド又はペプチドＰ１のＮ末端からポリペプチド又はペプチドＰ０のＣ末端へと書かれているように付着され、並びに−（Ｌ１）ｃ−ＰＥＧ及び−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１は、各々独立に、Ｆ１中の特異的に選択された内部抱合部位を通じて付着されている。）；
【０１２１】
【化３０】
2009504164.tif 000035
及びこの多量体（ａ＝１、ｂ＝１、ｃ＝１、Ｐ１−（Ｌ１）ｃ−Ｆ１−（Ｌ１）ｃ−Ｐ０は、ポリペプチド又はペプチドＰ１のＮ末端からポリペプチド又はペプチドＰ０のＣ末端へと書かれているように付着され、並びに−（Ｌ１）ｃ−ＰＥＧ及び−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２ｄ）−Ｐ２は、各々独立に、Ｆ１中の特異的に選択された内部抱合部位を通じて付着されている。）；
【０１２２】
【化３１】
2009504164.tif 000036
及びこの多量体（ａ＝１、ｂ＝１、ｃ＝１、Ｐ１−（Ｌ１）ｃ−Ｆ１−（Ｌ１）ｃ−Ｐ０は、ポリペプチド又はペプチドＰ１のＮ末端からポリペプチド又はペプチドＰ０のＣ末端へと書かれているように付着され、並びに第二の−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１及び−（Ｌ１）ｃ−Ｐ２−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２は、各々独立に、Ｆ１中の特異的に選択された内部抱合部位を通じて付着されている。）。
【０１２３】
本発明の別の実施形態において、組成物は、Ｆｃドメイン中の１つ又はそれ以上の特異的に選択された抱合部位を通じて、抗体のＦｃドメインに共有結合されている少なくとも１つの付加機能部分（Ｘ３）を含む修飾された抗体である。抱合部位は、図１中の下線が付された残基の位置、図２中の太字のアミノ酸残基の位置、図３中の強調表示された残基の位置、図３中の下線が付された残基の位置、又はＬｅｕ１３９、Ｇｌｎ１４３、Ｓｅｒ１４５及びＳｅｒ１９６からなる群から選択されるＦｃ部位における置換によって、Ｆｃドメインに付加されたシステイン残基、又は２以上のＸ３が存在すれば、これらの要素のあらゆる組み合わせから選択される。Ｘ３は、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ０、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３及び−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４から選択され；
Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４は、各々独立に、
ｉ）医薬として許容されるポリマー又はデキストラン；
ｉｉ）薬理学的に活性なポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣体又は非ペプチド有機部分；
ｉｉｉ）放射性同位体、酵素、ビオチン部分、蛍光色素分子又は発色団；及び
ｉｖ）固定化された基質（但し、２個以上の付加機能的部分を含む鎖中において、前記固定化された基質は、Ｆｃドメインから最も離れた部分であり、及び前記鎖中には、最大１個の固定化された基質が存在し得る。）
からなる群から選択され；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、各々独立に、リンカーであり；
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、各々独立に、０又は１である。
【０１２４】
追加機能部分（Ｘ３）
ここで、本発明に従ってＦｃドメインへ抱合することが可能な追加機能部分の幾つかの実施形態（すなわち、Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４）を、さらに詳細に例示する。
【０１２５】
ポリペプチド又はペプチド。１つ又はそれ以上の追加機能部分が、本発明のＦｃドメイン分子に抱合される。このような追加機能部分は、サルベージ受容体に結合することが可能な、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗体断片、（又は非ペプチド有機分子「小分子」、例えば、ペプチド模倣化合物）が含まれ得る。例えば、１９９８年４月１４日にＰｒｅｓｔａらに付与された米国特許第５，７３９，２７７号に記載されているようなポリペプチドを、機能的部分として使用することが可能である。目的のペプチドは、ＦｃＲｎサルベージ受容体への結合について、ファージディスプレイによって選択することも可能である。このようなサルベージ受容体結合化合物も、本発明における「機能的部分」の意味の中に含まれる。このような機能的部分は、例えば、（例えば、プロテアーゼによって認識される配列を避けることによって）増加した半減期のために選択されるべきであり、及び（例えば、抗体のヒト化で発見されるように、非免疫原性配列を優先することによって）減少した免疫原性について選択されるべきである。
【０１２６】
他の実施形態において、様々な他のペプチド又はポリペプチドを、本発明に関連する追加機能部分として使用することが可能である。使用可能な典型的なポリペプチドには、本明細書の上記表１において、融合対として挙げられているポリペプチドが含まれる。好ましいポリペプチドは、治療的な有用性を有しており、ヒトタンパク質アナキンラ、ｓＴＮＦ−Ｒ２、ｓＴＮＦ−Ｒ１、ＣＴＬＡ４、ＯＰＧ、ＧＤＮＦ、ＯＰＧ、ＧＤＮＦ、ＰＴＨ断片、グルカゴン断片、ＧＬＰ−１などが含まれる。従って、好ましいポリペプチド配列は、以下のｓＴＮＦ−Ｒ２配列である。
【０１２７】
【化３２】
2009504164.tif 000037
【０１２８】
本発明に従って、Ｆｃドメイン中の選択された部位を通じて、ＰＥＧなどの追加機能部分を付加することによって、このようなポリペプチドを含むＦｃ融合タンパク質を修飾し得る。このようにして、例えば、エタネルセプトのＦｃドメイン中の選択された部位を通じてＰＥＧ分子が付着されたエタネルセプトのＰＥＧ化された誘導体は、本発明の範囲に属する。このような分子は、Ｐ０−（Ｌ１）ｃ−Ｆ１がエタネルセプトをコードする上式ＸＩＶによって記載することが可能である。（Ｐ０は、
【０１２９】
【化３３】
2009504164.tif 000038
2009504164.tif 000039
2009504164.tif 000040
であり、又は、（Ｌ１）ｃ−ＰＥＧ置換基への連結を可能とするために１若しくはそれ以上の修飾された残基を有する、エタネルセプト配列に基づく分子である。
【０１３０】
また、本発明に従い、ペプチド又は追加ポリペプチド機能部分は、Ｆｃドメイン中の選択された部位を通じて連結することが可能である。あるいは、ポリペプチド−ｆｃ融合タンパク質は、ペプチド又は直列二量体、三量体若しくは四量体（すなわち、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３及び−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４）に連結することが可能である。ペプチドは、選択された内部Ｆｃ部位を通じて、又は融合タンパク質の利用可能なＮ末端若しくはＣ末端に連結することが可能である。このようにして、本発明は、例えば、ＢＡＦＦ結合ペプチド二量体（本明細書の下表１０参照）、ＰＥＧ部分又は両者を含むエタネルセプト誘導体を包含する。このような分子では、例えば、構造は、Ｐ０が配列番号６１７であり、Ｐ１及びＰ２がＬＰＧＣＫＷＤＬＬＩＫＱＷＶＣＤＰＬ（配列番号５１４）などのＢＡＦＦ結合ペプチドである上式ＸＸＩに従い得る。
【０１３１】
ペプチド又はポリペプチドのあらゆる数を、本発明に関連して使用することが可能である。幾つかの実施形態において、ペプチド又はポリペプチドは、アンギオポエチン−２（ａｎｇ−２）、ミオスタチン、神経成長因子（ＮＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ、ＴＡＬＬ−１とも称される）に結合し、又はＥＰＯ、ＴＰＯ若しくはＧ−ＣＳＦの活性を模倣する。腫瘍ホーミングペプチド、膜輸送ペプチドなどの標的化ペプチドも興味深い。ペプチド又はポリペプチドのこれらのクラスは全て、本明細書及びその他の参考文献に引用されている参考文献中に記載されている方法によって発見することが可能である。
【０１３２】
上述のように、本発明において使用するためのペプチドを作製する上で、ファージディスプレイが有用である。任意の遺伝子産物の任意の部位に対してペプチドリガンドを同定するために、ランダムペプチドのライブラリーからの親和性選択を使用できることが記載されている。Ｄｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２３０２５−３０。ファージディスプレイは、細胞表面受容体又は直鎖エピトープを有する何れかのタンパク質としてのこのような対象タンパク質に結合するペプチドを同定するために特に極めて適している。Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：３１３−２９；Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．Ｔｏｄａｙ  ３：３７０−８。このようなタンパク質は、「Ｈｅｒｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７），Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＆  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｒｅｓ．１７（５）：６７１−７７６」（参照により、本明細書に組み込まれる。）に詳しく概説されている。このような目的のタンパク質は、本発明において使用するのに好ましい。
【０１３３】
ペプチドの特に好ましい群は、サイトカイン受容体に結合するものである。サイトカインは、最近、それらの受容体コードに従って分類された。Ｉｎｇｌｏｔ（１９９７），Ａｒｃｈｉｖｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａｅ  ｅｔ  Ｔｈｅｒａｐｉａｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ  ４５：３５３−７（参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照。これらの受容体のうち、最も好ましいのは、ＣＫＲ（表４中のファミリーＩ）である。受容体の分類は、表４に示されている。
【０１３４】
【表６】
2009504164.tif 000041
2009504164.tif 000042
【０１３５】
本発明におけるペプチド生成に対する標的として興味深い具体的なタンパク質には、以下のものが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３６】
αｖβ３
αＶβ１
Ａｎｇ−２
ＢＡＦＦ／ＴＡＬＬ−１
Ｂ７
Ｂ７ＲＰ１
ＣＲＰ１
カルシトニン
ＣＤ２８
ＣＥＴＰ
ｃＭｅｔ
補体因子Ｂ
Ｃ４ｂ
ＣＴＬＡ４
グルカゴン
グルカゴン受容体
ＬＩＰＧ
ＭＰＬ
ミオスタチン
腫瘍細胞上に優先的に発現される分子のスプライスバリアント；例えば、ＣＤ４４、ＣＤ３０
ムチン及びルイスＹ表面糖タンパク質のグリコシル化されていないバリアント
ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ４５
前立腺特異的膜抗原及び前立腺特異的細胞抗原
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）（分泌及び膜結合型（例えば、ＭＭＰ−９）の両方）
カテプシン
アンギオポエチン−２
ＴＩＥ−２受容体
ヘパラナーゼ
ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ＵＰＡ）、ＵＰＡ受容体
副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）、ＰＴＨ−ＲＩ、ＰＴＨ−ＲＩＩ
Ｈｅｒ２
Ｈｅｒ３
インシュリン
本発明における典型的なペプチドは、米国特許番号６，６６０，８４３（参照により、本明細書に組み込まれる。）の表４から２０に示されている。さらなる好ましいペプチドが、２００３年１２月１１日に公開された米国２００３／０２２９０２３；２００３年６月１７日に公開されたＷＯ０３／０５７１３４；２００３年１２月２５日に公開された米国２００３／０２３６１９３；２０００年５月４日に公開されたＷＯ００／２４７７０；２００３年９月１８日に公開された米国２００３／０１７６３５２；２００３年４月１７日に公開されたＷＯ０３／０３１５８９；２００３年９月１８日に出願された米国逐次番号１０／６６６，４８０；２００４年４月１日公開されたＷＯ０４／０２６３２９；２００３年１２月１９日に出願された米国逐次番号１０／７４２，３７９；２００３年１２月１９日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ０３／４０７８１（これらの各々は、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。このようなペプチドは、本分野において開示されている方法によって調製することが可能である。
【０１３７】
幾つかの好ましいペプチド及びポリペプチドのアミノ酸配列が、下表５から１０に記載されている。一文字アミノ酸略号が使用されている。これらのペプチドの何れも、リンカーを用いて又は用いずに、直列に（すなわち、連続的に）連結することが可能である。システイン残基を含有するペプチドは何れも、別のＣｙｓ含有ペプチド又はタンパク質を用いて架橋され得る。２以上のＣｙｓ残基を有するペプチドは全て、ペプチド内ジスルフィド結合も形成し得る。これらのペプチドの何れもが、本明細書に記載されているように誘導化することが可能である。別段の記載がなければ、全てのペプチドは、ペプチド結合を通じて連結される。
【０１３８】
【表７】
2009504164.tif 000043
【０１３９】
【表８】
2009504164.tif 000044
2009504164.tif 000045
【０１４０】
【表９】
2009504164.tif 000046
2009504164.tif 000047
2009504164.tif 000048
【０１４１】
【表１０】
2009504164.tif 000049
【０１４２】
【表１１】
2009504164.tif 000050
2009504164.tif 000051
2009504164.tif 000052
2009504164.tif 000053
2009504164.tif 000054
2009504164.tif 000055
2009504164.tif 000056
2009504164.tif 000057
【０１４３】
【表１２】
2009504164.tif 000058
2009504164.tif 000059
2009504164.tif 000060
【０１４４】
表５から１０に記されているアミノ酸配列を有するペプチド及びポリペプチドに加えて、本発明において有用であり得るポリペプチドには、以下のアミノ酸配列を有するＡｎｇ−２結合ポリペプチド：
【０１４５】
【化３４】
2009504164.tif 000061
及び以下のアミノ酸配列を有するミオスタチン結合ポリペプチド：
【０１４６】
【化３５】
2009504164.tif 000062
及び以下のアミノ酸配列を有するＥＰＯ模倣ポリペプチド：
【０１４７】
【化３６】
2009504164.tif 000063
及び以下のアミノ酸配列を有するＴＰＯ模倣ポリペプチド：
【０１４８】
【化３７】
2009504164.tif 000064
が含まれる。
【０１４９】
医薬として許容されるポリマー。本発明は、さらに、１つ又はそれ以上の水溶性ポリマーの付着を含むように共有的に修飾された分子を含む。本発明において有用な医薬として許容されるポリマーには、米国特許番号４，６４０，８３５；４，４９６，６８９；４，３０１，１４４；４，６７０，４１７；４，７９１，１９２；及び４，１７９，３３７に記載されているように、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール又はポリプロピレングリコールが含まれる。本分野で公知のさらに他の有用なポリマーには、モノモメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース又は他の炭水化物をベースとしたポリマー（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース）、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化されたポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン及びポリプロリン、ヒアルロン酸、ポリ−１，３−ジオキソラン及びポリ−１，３，６−トリオキソラン、ペクチン、デンプン、ゼラチン並びにこれらのポリマーの何れかの混合物が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５０】
好ましいポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧ基は、あらゆる便利な分子量とすることが可能であり、直鎖又は分岐であり得る。ＰＥＧの平均分子量は、好ましくは、約２キロダルトン（「ｋＤ」）から約１００ｋＤ、より好ましくは、約５ｋＤａから約５０ｋＤａ、最も好ましくは、約５ｋＤから約２０ｋＤの範囲である。ＰＥＧ基は、一般に、ＰＥＧ部分上の反応性基（例えば、アルデヒド、マレイミド、アミノ、チオール又はエステル基）を通じた、本発明の化合物上の反応性基（例えば、アルデヒド、アミノ、チオール又はエステル基）へのアシル化又は還元的アルキル基を介して、本発明の化合物へ付着される。
【０１５１】
ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）との、タンパク質及びペプチドの共有的抱合は、治療的タンパク質のインビボ循環半減期を著しく延長させるためのアプローチとして広く認識されている。ＰＥＧ部分は、タンパク質にかなりの流体力学的半径を加えるので、ＰＥＧ化は、主として腎クリアランスを遅延させることによって、この効果を達成する。（Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｕｓｅ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）ｓ  ｆｏｒ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ．，ｉｎ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．，Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ，Ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．，３４７−３７０  （１９９２））。タンパク質及びペプチドのＰＥＧ化によってしばしば付与されるさらなる利点には、増加した溶解度、タンパク分解による分解に対する耐性及び治療用ポリペプチドの減少した免疫原性が含まれる。タンパク質ＰＥＧ化の長所は、ＰＥＧ−アデノシンデアミナーゼ（ＡｄａｇｅｎＴＭ／Ｅｎｚｏｎ  Ｃｏｒｐ，）、ＰＥＧ−Ｌアスパラギナーゼ（ＯｎｃａｓｐａｒＴＭ／Ｅｎｚｏｎ  Ｃｏｒｐ．）、ＰＥＧ−インターフェロンα−２ｂ（ＰＥＧ−ｌｎｔｒｏｎＴＭ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ／Ｅｎｚｏｎ）、ＰＥＧ−インターフェロンα−２ａ（ＰＥＧＡＳＹＳＴＭ／Ｒｏｃｈｅ）及びＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ（ＮｅｕｌａｓｔａＴＭ／Ａｍｇｅｎ）並びに臨床試験中の多数のその他など、幾つかのＰＥＧ化されたタンパク質の商品化によって証明されている。
【０１５２】
要約すると、ＰＥＧ基は、一般に、ＰＥＧ部分上の反応性基（例えば、アルデヒド、アミノ、チオール又はエステル基）を通じた、本発明の化合物上の反応性基（例えば、アルデヒド、アミノ又はエステル基）へのアシル化又は還元的アルキル基を介して、本発明の組成物のペプチド部分へ付着される。
【０１５３】
合成ペプチドのＰＥＧ化のための有用な戦略は、溶液中での抱合体結合を形成することを通じて、ポリペプチド又はペプチド及びＰＥＧ部分（各々が他のＰＥＧ部分に対して相互に反応性である特別な官能性を有する。）を結合させることからなる。ポリペプチド又はペプチドは、慣用の固相合成を用いて容易に調製することが可能である。ポリペプチド又はペプチドは、特異的な部位における適切な官能基で「予め活性化」される。前駆体は、ＰＥＧ部分との反応前に精製され、完全に性質決定される。ポリペプチド又はペプチドのＰＥＧとの連結は、通常、水相で起こり、逆相分析ＨＰＬＣによって容易にモニターすることが可能である。ＰＥＧ化されたポリペプチド又はペプチドは、調製用ＨＰＬＣによって容易に精製し、分析用ＨＰＬＣ、アミノ酸分析及びレーザー脱離質量分析法によって性質決定することが可能である。
【０１５４】
ＰＥＧは、市販されている周知の水溶性ポリマーであるか、又は、当技術分野で周知の方法に従い、エチレングリコールの開環ポリマー化により調製することができる（Ｓａｎｄｌｅｒ及びＫａｒｏ、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．３、１３８−１６１頁）。本願において、「ＰＥＧ」という用語は、サイズ又はＰＥＧの末端への修飾に関わらず、１、２又は多官能型のあらゆるポリエチレングリコール分子を包含するために広く使用され、式：
Ｘ−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−１ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ，（ＸＸＩＸ）
（ｎは２０から２３００であり、及びＸは、Ｈ又は末端修飾、例えばＣ１−４アルキルである。）
によって表される。
【０１５５】
幾つかの有用な実施形態において、本発明で使用されるＰＥＧは、一方の末端がヒドロキシ又はメトキシで終わっている（即ち、Ｘは、Ｈ又はＣＨ３（「メトキシＰＥＧ」）である。）。ＰＥＧの他の末端（式（ＩＩ）では、ＯＨで終結するように示されている。）は、エーテル酸素結合、アミン結合又はアミド結合を介して活性化部分に共有結合することが注目される。化学的構造において使用される場合、「ＰＥＧ」という用語は、示されている水酸基の水素なしの上記式（ＩＩ）を含み、エーテル結合を形成するためにリンカーの遊離炭素原子との反応に利用可能な酸素が残存する。より具体的には、ＰＥＧをペプチドに抱合するために、ペプチドは、「活性化された」形態のＰＥＧと反応させなければならない。活性化されたＰＥＧは、式：
（ＰＥＧ）−（Ａ）  （ＸＸＸ）
によって表すことができる。
【０１５６】
ＰＥＧ（上で定義されている。）は、活性化部分（Ａ）の炭素分子に共有結合して、エーテル結合、アミン結合又はアミド結合を形成し、及び（Ａ）は、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド部分に共有結合されたリンカー部分のアミノ酸残基上のアミノ、イミノ又はチオール基と反応することが可能な反応性基を含有する。
【０１５７】
活性化されたＰＥＧを調製するための技術及び生物学的に活性なペプチドへのその抱合は、本分野において周知である。（例えば、米国特許番号５，６４３，５７５，５，９１９，４５５，５，９３２，４６２及び５，９９０，２３７；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＥＰ  ０５７５５４５  Ｂｌ；Ｐｅｔｉｔ，Ｓｉｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，米国特許番号６，４５１，９８６及び６，５４８，６４４；Ｓ．Ｈｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）  ｗｉｔｈ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｅｎｄｇｒｏｕｐｓ：Ｉ．Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｊ．Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，１０：１４５−１８７  （１９９５）；Ｙ．Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｇｙｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ＩＩＩ：Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ＰＥＧｙｌａｔｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｏｆ  ｖａｒｙｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｙ  ＰＥＧｙｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：２２１−２２９（１９９４）；Ａ．Ｍ．Ｆｅｌｉｘ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＥＧｙｌａｔｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ＩＶ：Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ＰＥＧｙｌａｔｅｄ  ＧＲＰ  ａｎａｌｏｇｓ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．，４６：２５３−２６４（１９９５）；Ａ．Ｍ．Ｆｅｌｉｘ，Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）ｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ６８０（ｐｏｌｙ  （ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ））：２１８−２３８（１９９７）；Ｙ．Ｉｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，ｔｈｅｉｒ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｔｈｅｍ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＥＰ  ０４７３０８４  Ｂｌ；Ｇ．Ｅ．Ｍｅａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎｓ，ｉｎ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｈｏｌｄｅｎ  Ｄａｙ，Ｉｎｃ．，２１９  （１９７１）を参照）。
【０１５８】
ＰＥＧ−アルデヒド又はＰＥＧ−アルデヒド水和物などの活性化されたＰＥＧは、公知の手段によって化学的に合成し、又は商業的な入手源（例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌ）又はＥｎｚｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．））から取得することができる。
【０１５９】
本発明における有用な活性化ＰＥＧの例は、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  （Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌ）から市販されているＰＥＧ−プロピオンアルデヒドなどのＰＥＧ−アルデヒド化合物（例えば、メトキシＰＥＧ−アルデヒド）である。ＰＥＧ−プロピオンアルデヒドは、式ＰＥＧ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨＯによって表される。（例えば、米国特許第５，２５２，７１４号参照）。有用な活性化されたＰＥＧの他の例は、ＰＥＧアセトアルデヒド水和物及びＰＥＧビスアルデヒド水和物であり、後者は、二機能性に活性化された構造を与える。（例えば、Ｂｅｎｔｌｅｙｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｈｙｄｒａｔｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ａｍｉｎｅｓ，米国特許第５，９９０，２３７号参照）。
【０１６０】
本発明のＰＥＧ抱合されたポリペプチド又はペプチドを作製するための別の有用な活性化ＰＥＧは、メトキシＰＥＧ−マレイミド（マレイミドモノメトキシＰＥＧなど）などの（但し、これに限定されない。）ＰＥＧ−マレイミド化合物であり、本発明のＰＥＧ抱合されたペプチドを作製するために特に有用である。（例えば、Ｓｈｅｎ，Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｙｌ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，米国特許番号６，６０２，４９８；Ｃ．Ｄｅｌｇａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ＰＥＧ−ｌｉｎｋｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，９：２４９−３０４（１９９２）；Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕｓｅ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）ｓ  ｆｏｒ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｉｎ：Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，３４７−３７０  （１９９２）；Ｓ．Ｈｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）  ｗｉｔｈ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｅｎｄｇｒｏｕｐｓ：Ｉ．Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｊ．Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，１０：１４５−１８７  （１９９５）；ＰＪ．Ｓｈａｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，５  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｔｏ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ−１，米国特許番号４，８４７，３２５；Ｇ．Ｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ａｄｄｅｄ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ＩＬ−３  ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ，米国特許番号５，１６６，３２２及びＥＰ  ０４６９０７４  Ｂｌ；Ｇ．Ｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ａｄｄｅｄ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｆ  ＥＰＯ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ，ＥＰ  ０６６８３５３Ａ１；Ｇ．Ｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ａｄｄｅｄ  ｖａｒｉａｎｔｓ  Ｇ−ＣＳＦ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ，ＥＰ  ０  ０６６８３５４Ａ１；Ｎ．Ｖ．Ｋａｔｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ｍｕｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒｅｏｆ，米国特許番号５，２０６，３４４；ＲＪ．Ｇｏｏｄｓｏｎ  ａｎｄ  Ｎ．Ｖ．Ｋａｔｒｅ，Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ａｔ  ｉｔｓ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：３４３−３４６（１９９０））。
【０１６１】
ポリ（エチレングリコール）ビニルスルホンは、チオール化されたアミノ酸残基での、例えば、Ｃ残基での抱合によって、本発明のＰＥＧ抱合されたペプチドを作製するための別の有用な活性化ＰＥＧである。（例えば、Ｍ．Ｍｏｒｐｕｒｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）  ｖｉｎｙｌ  ｓｕｌｆｏｎｅ，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，７：３６３−３６８  （１９９６）；Ｈａｒｒｉｓ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｆｏｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｕｌｆｏｎｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ  ＰＥＧ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ，米国特許番号５，４４６，０９０；５，７３９，２０８；５，９００，４６１；６，６１０，２８１及び６，８９４，０２５；並びにＨａｒｒｉｓ，Ｗａｔｅｒ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｕｌｆｏｎｅｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ），ＷＯ９５／１３３１２  Ａ１も参照）。
【０１６２】
本発明において有用であるＰＥＧの別の活性化された形態は、ＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化合物、例えば、メトキシＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルである。
【０１６３】
ＰＥＧのヘテロ二機能的に活性化された形態も有用である。（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｆｏｒｍｅｄ  ｔｈｅｒｅｗｉｔｈ，米国特許第６，５５２，１７０号を参照されたい。）
【０１６４】
典型的には、目的のポリペプチド又はペプチドは、チオール活性化されたＰＥＧ化合物、ジオール活性化されたＰＥＧ化合物、ＰＥＧヒドラジド化合物、ＰＥＧ−オキシアミン化合物又はＰＥＧ−ブロモアセチル化合物など（但し、これらに限定されない。）の活性化されたＰＥＧ化合物との公知の化学的技術によって反応される。（例えば、Ｓ．Ｈｅｒｍａｎ，Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）  ｗｉｔｈ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｅｎｄｇｒｏｕｐｓ：Ｉ．Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｊ．Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，１０：１４５−１８７  （１９９５）；Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１６：１５７−１８２（１９９５）；Ｒ．Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｄｒｕｇｓ：ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｒｅｖｉｅｗ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１７：１０１−１６１  （２０００）参照）。
【０１６５】
多糖ポリマーは、タンパク質修飾のために使用することができる水溶性ポリマーの別の種類である。デキストランは、主にα１−６結合によって連結されたグルコースの各サブユニットから構成される多糖ポリマーである。デキストラン自体は、多くの分子量範囲で入手可能であり、約１ｋＤから約７０ｋＤまでの分子量で容易に入手可能である。デキストランは、単独で、又は異なる付加機能部分（例えば、Ｆｃ）と組み合わせて、本発明において使用するための適切な水溶性ポリマーである。例えば、ＷＯ９６／１１９５３及びＷＯ９６／０５３０９を参照されたい。治療用免疫グロブリン又は診断用免疫グロブリンに抱合されたデキストランの使用が報告されており、例えば、欧州特許公開０３１５４５６号（参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。本発明において、デキストランが使用される場合、約１ｋＤから約２０ｋＤのデキストランが好ましい。
【０１６６】
リンカー。全ての「リンカー」基は、場合によって使用される。リンカーが存在する場合、リンカーは、主にスペーサー（本発明の組成物の幾つかの実施形態の薬理学的活性を最適化する上で有用であり得る。）として働くので、その化学構造がどのようなものであるかは重要でない。リンカーは、好ましくは、ペプチド結合により連結されたアミノ酸から構成される。本明細書に上述されているように、リンカー部分は、存在するとすれば、本発明の組成物中に存在し得る、他の何れのリンカーとも、独立に同一又は別異であることが可能である。例えば、「（Ｌ）ｃ」は、本発明における他の何れの「（Ｌ）ｃ」又は何れの「（Ｌ）ｄ」、「（Ｌ）ｅ」若しくは「（Ｌ）ｆ」とも同一のリンカー部分又は異なるリンカー部分を表すことが可能である。リンカーは、好ましくは、ペプチド結合により一緒に連結されたアミノ酸から構成される。したがって、幾つかの実施形態において、リンカーは、ペプチド結合により連結された１から約３０個のアミノ酸から構成され、アミノ酸は、天然に存在する２０個のアミノ酸から選択される。これらのアミノ酸の幾つかは、当業者によって十分に理解されているように、グリコシル化することが可能である。例えば、シアル化部位を構成する有用なリンカー配列は、Ｘ１Ｘ２ＮＸ４Ｘ５Ｇ（配列番号６１９）であり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４及びＸ５は、各々独立に、任意のアミノ酸残基である。）
【０１６７】
より好ましい実施形態において、１から３０個のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン及びリジンから選択される。より好ましくは、リンカーは、グリシン及びアラニンなどの、立体的に妨害されないアミノ酸の過半数から構成される。従って、好ましいリンカーには、ポリグリシン（特に、（Ｇｌｙ）４、（Ｇｌｙ５））、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）及びポリアラニンが含まれる。他の好ましいリンカーは、本明細書において「Ｌ５」（ＧＧＧＧＳ；配列番号６２０）、「Ｌ１０」（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号６２１）、「Ｌ２５」ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号６２２）として特定されるリンカー、並びに、以下の実施例に使用されている全てのリンカーである。しかしながら、本明細書に記載されているリンカーは、典型的なものであり、本発明の範囲に属するリンカーは、さらに長くすることが可能であり、他の残基を含むことが可能である。従って、好ましいリンカーには、ポリグリシン（特に、（Ｇｌｙ）４、（Ｇｌｙ５））、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）及びポリアラニンが含まれる。リンカーの他の具体例は、
【０１６８】
【化３８】
2009504164.tif 000065
である。
【０１６９】
上記命名法を説明するために、例えば、（Ｇｌｙ）３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）４は、ＧＩｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを意味する。Ｇｌｙ及びＡｌａの組み合わせも好ましい。本明細書に示されているリンカーは、典型的なものであり、本発明の範囲に属するリンカーは、さらに長くしてもよく、他の残基を含み得る。
【０１７０】
ペプチドリンカーブ部分（Ｌ）を含む、本発明の組成物の幾つかの実施形態において、酸性残基、例えば、グルタミン酸又はアスパラギン酸残基が、リンカー部分（Ｌ）のアミノ酸配列中に配置される。例には、以下のペプチドリンカー配列が含まれる。
【０１７１】
【化３９】
2009504164.tif 000066
【０１７２】
他の実施形態においては、リンカーは、リン酸化部位、例えば、Ｘ１Ｘ２ＹＸ３Ｘ４Ｇ（配列番号６３８）（Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、各々独立に、任意のアミノ酸残基である。））；Ｘ１Ｘ２ＳＸ３Ｘ４Ｇ（配列番号６３９）（Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、各々独立に、任意のアミノ酸残基である。））；又はＸ１Ｘ２ＴＸ３Ｘ４Ｇ（配列番号６４０）（Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、各々独立に、任意のアミノ酸残基である。））を構成する。
【０１７３】
非ペプチドリンカーも可能である。例えば、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−Ｃ（Ｏ）−（式中、ｓ＝２から２０）などのアルキルリンカーを使用することが可能である。これらのアルキルリンカーは、さらに、低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ６）低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニルなどの、立体的に妨害を生じない全ての基によって置換することが可能である。典型的な非ペプチドリンカーは、ＰＥＧリンカー、
【０１７４】
【化４０】
2009504164.tif 000067
【０１７５】
（ｎは、リンカーが１００から５０００ｋＤ、好ましくは１００から５００ｋＤの分子量を有する。）
である。ペプチドリンカーは、上記と同一の様式で誘導体を形成するために改変され得る。
【０１７６】
誘導体。本発明の組成物は、アミノ酸残基の挿入、欠失若しくは置換以外の修飾を有し、又はアミノ酸残基の挿入、欠失若しくは置換に加えて修飾を有するポリペプチド又はペプチド部分を含む「誘導体」も包含する。好ましくは、修飾は、性質上、共有結合であり、例えば、ポリマー、脂質、他の有機及び無機部分との化学結合が含まれる。本発明の誘導体は、分子の循環半減期を増加させるために、所望の細胞、組織若しくは臓器への分子の標的誘導能力を向上させるために、分子の溶解度若しくは吸収を改善させるために、又は分子の望ましくない何らかの副作用を除去若しくは減弱させるために調製され得る。
【０１７７】
典型的な誘導体には、以下の化合物が含まれる。
【０１７８】
１．化合物又はそのある部分が環状である。例えば、ペプチド部分は、（例えばリンカー中に）２つ又はそれ以上のＣｙｓ残基を含有するように修飾することができ、ジスルフィド結合形成によって環状化することができる。
【０１７９】
２．化合物は、架橋されているか、又は分子間を架橋できるようにされる。例えば、ペプチド部分は、１つのＣｙｓ残基を含有し、これによりリンカー分子と分子間ジスルフィド結合を形成することができるように修飾され得る。化合物は、以下に示されている分子におけるように、そのＣ末端を通じて架橋し得る。
【０１８０】
【化４１】
2009504164.tif 000068
【０１８１】
３．非ペプチジル連結によって、１つ又はそれ以上のペプチジル［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−］連結（結合）が置換されている。典型的な非ペプチジル連結は、−ＣＨ２−カルバマート［−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−］、ホスホナート、−ＣＨ２−スルホンアミド［−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ−］結合、尿素［−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−］、−ＣＨ２−二級アミン及びアルキル化されたペプチド［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６―（Ｒ６は、低級アルキルである。］である。
【０１８２】
４．Ｎ末端が、誘導体化されている。典型的には、Ｎ末端は、アシル化され、又は置換されたアミンへと修飾され得る。典型的なＮ末端誘導体基には、−ＮＲＲ１（−ＮＨ２以外）、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ１、−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ１、−ＮＲＳ（Ｏ）２Ｒ１、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ１、スクシンイミド又はベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−（ＣＢＺ−ＮＨ−）（Ｒ及びＲ１は、各々独立に、水素又は低級アルキルであり、フェニル環は、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、クロロ及びブロモからなる群から選択される１から３個の置換基で置換され得る。）が含まれる。
【０１８３】
５．遊離のＣ末端が、誘導体化されている。典型的には、Ｃ末端は、エステル化され又はアミド化される。例えば、本発明の化合物に、（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２）２を付加するために、本分野で記載されている方法を使用し得る。同様に、本発明の化合物に、ＮＨ２を付加するために、本分野で記載されている方法を使用し得る。典型的なＣ末端誘導体基には、例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２（Ｒ２は、低級アルコキシ又は−ＮＲ３Ｒ４である（Ｒ３及びＲ４は、独立に、水素又はＣ１−Ｃ８アルキル（好ましくは、Ｃ１−Ｃ４アルキル）である。）。）が含まれる。
【０１８４】
６．ジスルフィド結合は、別の、好ましくはより安定な、架橋部分（例えば、アルキレン）と置換される。例えば、Ｂｈａｔｎａｇａｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：３８１４−９；Ａｌｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｔｈｉｒｔｅｅｎｔｈ  Ａｍ．Ｐｅｐ．Ｓｙｍｐ．３５７−９を参照されたい。
【０１８５】
７．１つ以上の各アミノ酸残基が修飾される。以下に詳しく記載されているように、様々な誘導体化剤が、選択された側鎖又は末端残基と特異的に反応することが知られている。
【０１８６】
リジン残基およびアミノ末端残基を、コハク酸または他のカルボキシル酸無水物と反応させることができ、これは、リジン残基の電荷を逆転させる。α−アミノ含有残基を誘導体化するための他の適切な試薬には、イミドエステル（メチルピコリンイミダートなど）、ピリドキサルリン酸、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４ペンタンジオン、およびグリオキシラートとのトランスアミナーゼ触媒反応が含まれる。
【０１８７】
アルギニン残基は、１個又は数個の慣用の試薬のあらゆる組み合わせ（フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオンおよびニンヒドリンなど）との反応により修飾され得る。グアニジン官能基の高ｐＫａのため、アルギニン残基の誘導体化においては、該反応をアルカリ条件中で行う必要がある。さらに、これらの試薬は、リジンの基およびアルギニンのεアミノ基と反応させ得る。
【０１８８】
チロシン残基自体の具体的な修飾は広範に研究されており、特に、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によるチロシン残基内へのスペクトル標識の導入に関心がもたれている。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンを使用して、それぞれＯ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体を形成させることができる。
【０１８９】
カルボキシル側鎖基（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）（１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドなど）との反応により選択的に修飾され得る。さらに、アスパラギンおよびグルタミン残基は、アンモニウムイオンとの反応によりアスパラギンおよびグルタミン残基に変換され得る。
【０１９０】
グルタミンおよびアスパラギン残基は、対応するグルタミン酸およびアスパラギン酸残基へと脱アミド化される。あるいは、これらの残基は、穏やかな酸条件下で脱アミド化され得る。これらの残基のいずれの形態も本発明の範囲内に含まれる。
【０１９１】
システイン残基は、ジスルフィド結合を除去するために、又は、逆に架橋を安定化させるために、アミノ酸残基又は他の部分によって置換することが可能である。例えば、「Ｂｈａｔｎａｇａｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６），Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：３８１４−９」を参照されたい。
【０１９２】
二官能性物質での誘導体化は、ペプチド若しくはそれらの機能的誘導体を水溶性支持マトリックスに、または他の高分子ビヒクルに架橋するのに有用である。一般に用いられる架橋剤には、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４−アジドサリチル酸とのエステル、ホモ二官能性イミドエステル、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオナートなどのジスクシンイミジルエステルなど）、および二官能性マレイミド（ビス−Ｎ−マレイミド−１．８−オクタンなど）が含まれる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミダートなどの誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成し得る光活性化中間体を与える。あるいは、臭化シアンで活性化される炭水化物、および米国特許第３，９６９，２８７号、第３，６９１，０１６号、第４，１９５，１２８号、第４，２４７，６４２号、第４，２２９，５３７号および第４，３３０，４４０号に記載されている反応性基質などの反応性の水不溶性マトリックスが、タンパク質の固定化に使用される。
【０１９３】
炭水化物（オリゴ糖）基は、タンパク質中のグリコシル化部位であることが知られている部位に都合よく付着させ得る。一般には、それらが配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（式中、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸でありうる。）の一部である場合には、Ｏ−結合型オリゴ糖はセリン（Ｓｅｒ）またはトレオニン（Ｔｈｒ）残基に付着され、Ｎ結合型オリゴ糖はアスパラギン（Ａｓｎ）残基に付着される。Ｘは、好ましくは、プロリンを除く１９個の天然に存在するアミノ酸の１つである。Ｎ結合およびＯ−結合型オリゴ糖ならびに各タイプ中に見出される糖残基の構造は様々である。それらの両方に一般に存在する１つのタイプの糖は、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸と称される。）である。シアル酸は、通常、Ｎ−結合およびＯ−結合型オリゴ糖の両方の末端残基であり、その負電荷のため、グリコシル化された化合物に酸性特性を付与し得る。このような部位を本発明の化合物のリンカー内に取り込ませることができ、該部位は、好ましくは、ポリペプチド化合物の組換え産生中に細胞により（例えば、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＯＳなどの哺乳類細胞において）グリコシル化される。しかしながら、このような部位は、当技術分野で公知の合成または半合成操作によって、更にグリコシル化され得る。
【０１９４】
他の可能な修飾には、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリンまたはトレオニン残基のヒドロキシル基のリン酸化が、Ｃｙｓ中の硫黄原子の酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化が含まれる。Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ），ｐｐ．７９−８６（１９８３）。
【０１９５】
このような誘導化された部分は、好ましくは、化合物の抗血管新生活性、溶解度、吸収、生物学的半減期などを含む１つ又はそれ以上の特性を改善する。あるいは、誘導化された部分は、誘導化されていない化合物と同一又は実質的に同一の特徴及び／又は特性を有する化合物をもたらし得る。あるいは、前記部分は、化合物の望ましくない何らかの副作用などを削除又は軽減し得る。
【０１９６】
本発明の化合物は、ＤＮＡレベルでも変化させ得る。化合物の何れの部分をコードするＤＮＡ配列も、選択された宿主細胞とより適合的なコドンへと変化させ得る。好ましい宿主細胞であるＥ．コリの場合、最適化されたコドンが本分野において公知である。制限部位を除去するために、又はサイレントな制限部位を含めるためにコドンを置換することができ、これは、選択された宿主細胞中でのＤＮＡのプロセッシングを補助し得る。ビヒクル、リンカー及びペプチドＤＮＡ配列は、先述の配列の変化の何れをも含むように修飾され得る。
【０１９７】
同位体及びトキシンが抱合された誘導体。有用な誘導体の別の組は、トキシン、トレーサー又は放射性同位体に抱合された上記分子である。このような抱合は、腫瘍細胞又は病原体に結合するペプチド配列を含む分子に対して特に有用である。このような分子は、治療剤として、手術の補助として（例えば、放射線免疫でガイドされた手術（ＲＩＧＳ；ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｇｕｉｄｅｄ  ｓｕｒｇｅｒｙ））又は診断剤として（例えば、放射線免疫診断薬又はＲＩＤ）として使用し得る。
【０１９８】
治療剤として、これらの抱合された誘導体は、多数の利点を有している。これらは、ペプチド配列によって与えられる特異的結合なしに投与された場合に有毒であるトキシン及び放射性同位体の使用を容易にする。これらは、抱合対のより低い有効用量を促進することによって、放射線及び化学療法の使用に付随する副作用を低減することも可能である。
【０１９９】
有用な抱合対には、以下のものが含まれる。
【０２００】
・９０イットリウム、１３１ヨウ素、２２５アクチニウム及び２１３ビスマスなどの放射性同位体：
・リシンＡトキシン、シュードモナス内毒素（例えばＰＥ３８、ＰＥ４０）などの微生物由来のトキシンなど；
・捕捉系中の対分子（以下参照）；
・ビオチン、ストレプトアビジン（捕捉系中の対分子として、又は特に、診断用の追跡物質として有用）；及び
・細胞毒性剤（例えば、ドキソルビシン）。
【０２０１】
これらの抱合された誘導体の１つの有用な応用は、捕捉系での使用である。このような系において、本発明の分子は、良性捕捉分子を含む。この捕捉分子は、例えば、トキシン又は放射性同位体を含む別個のエフェクター分子へ特異的に結合することが可能である。ビヒクル抱合された分子及びエフェクター分子の両方が患者に投与される。このような系において、エフェクター分子は、ビヒクル抱合された捕捉分子に結合された場合を除き、短い半減期を有するので、あらゆる有毒な副作用を最小限に抑える。ビヒクル抱合された分子は、相対的に長い半減期を有するが、良性及び無毒である。両分子の特異的結合部分は、公知の特異的結合対（例えば、ビオチン、ストレプトアビジン）の一部であり得、又は本明細書に記載されている方法などのペプチド作製方法から得ることが可能である。
【０２０２】
このような抱合された誘導体は、本分野で公知の方法によって調製され得る。
タンパク質エフェクター分子（例えば、シュードモナス内毒素）の場合には、このような分子は、相関的ＤＮＡ構築物から融合タンパク質として発現され得る。放射性同位体抱合された誘導体は、例えば、ＢＥＸＡ抗体（Ｃｏｕｌｔｅｒ）について記載されているように調製され得る。細胞毒製剤又は微生物のトキシンを含む誘導体は、例えば、ＢＲ９６抗体（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）について記載されているように調製され得る。捕捉系において使用された分子は、例えば、ＮｅｏＲｘからの特許、特許出願及び公報によって記載されているように調製され得る。ＲＩＧＳ及びＲＩＤに対して使用された分子は、例えば、ＮｅｏＰｒｏｂｅからの特許、特許出願及び公報によって記載されているように調製され得る。
【０２０３】
本発明に従ってＦｃドメインへの抱合のためのペプチド誘導体を調製することは有用であり得る。腫瘍細胞は、例えば、腫瘍細胞の正常な対応物には見出されないエピトープを示す。このようなエピトープには、例えば、それらの迅速な増殖から生じる様々な翻訳後修飾が含まれる。従って、本発明の一態様は、
ａ）標的エピトープに特異的に結合する少なくとも１つの無作為化されたペプチドを選択すること、並びに
ｂ）（ｉ）少なくとも１つのＦｃドメイン単量体、（ｉｉ）選択されたペプチドの少なくとも１つのアミノ酸配列及び（ｉｉｉ）エフェクター分子を含む薬剤を調製すること、
を含む方法である。
【０２０４】
標的エピトープは、好ましくは、腫瘍特異的エピトープ又は病原性生物に対して特異的なエピトープである。エフェクター分子は、上記抱合対の何れでもあり得、好ましくは放射性同位体である。
【０２０５】
バリアント。本発明の組成物のポリペプチド又はペプチド部分のバリアント（例えば、付加機能部分、リンカー又はＦｃドメイン部分）も、本発明の範囲内に含まれる。バリアントに含まれるのは、挿入、欠失及び置換バリアントである。本発明の特定の分子は、バリアントポリペプチド又はペプチドの１種、２種又は全ての３種を含有し得ることが理解される。挿入及び置換バリアントは、標準アミノ酸、（本明細書に記載されているような）非標準アミノ酸又は両方を含有し得る。本発明に従って、ポリペプチド若しくはペプチドバリアントは、Ｆｃドメインへの化学的抱合の前に作製することが可能であり、又は本発明の組成物の様々な実施形態において所望されるように、Ｆｃドメインとの融合タンパク質の一部として発現されるように設計できることも理解される。
【０２０６】
１つの例において、１つ又はそれ以上のアミノ酸残基（天然に存在するアミノ酸又は非慣用アミノ酸の何れか）がペプチド又はポリペプチドアミノ酸配列を補充する挿入バリアントが提供される。挿入は一方若しくは両方の末端に位置し得、又はアミノ酸配列の内部領域内に位置し得る。一方又は両方の末端に追加の残基を有する挿入バリアントには、例えば、融合タンパク質及びアミノ酸タグ又は標識を含むタンパク質が含まれ得る。挿入バリアントには、１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が、ペプチド若しくはポリペプチドアミノ酸配列又はこれらの断片に付加されているペプチド及びペプチボディが含まれる。
【０２０７】
本発明のバリアントには、リーダー又はシグナル配列が除去されており、得られたタンパク質が追加のアミノ末端残基（アミノ酸は、天然又は非天然であり得る。）を有する成熟ペプチド及びポリペプチドも含まれる。本発明に従って、追加部分としてＦｃドメインに抱合された位置−２及び−１における追加のメチオニン及びリジン残基（Ｍｅｔ−２−Ｌｙｓ−１−）を有する特異的結合因子のように、アミノ酸位置−１に追加のメチオニン残基を有する（ペプチバディなどの）本発明の分子（Ｍｅｔ−１−ペプチバディ）が想定される。追加のＭｅｔ、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ残基（一般に、又は１つ若しくはそれ以上の塩基性残基）を有するバリアントは、細菌性宿主細胞中での増強された組み換えタンパク質産生のために特に有用である。
【０２０８】
本発明は、特異的発現系の使用から生じる、追加アミノ酸残基を有するバリアントも包含する。例えば、グルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ）融合産物の一部として所望のポリペプチドを発現する市販のベクターの使用によって、所望のポリペプチドからのＧＳＴ成分の切断後に、アミノ酸位置−１に追加のグリシン残基を有する所望ポリペプチドが得られる。一般的に、アミノ酸配列のカルボキシ及び／又はアミノ末端にポリヒスチジンタグが取り込まれているバリアントなど、他のベクター系での発現から得られるバリアントも想定される。
【０２０９】
挿入バリアントには、ペプチド又はペプチボディのアミノ及び／又はカルボキシ末端が別のポリペプチド、その断片又は一般に、何れの特異的タンパク質配列の一部であるとも認識されないアミノ酸に融合されている融合タンパク質も含まれる。このような融合タンパク質の例は、免疫原性ポリペプチド、長い循環半減期を有するタンパク質（免疫グロブリン定常領域など）、マーカータンパク質、所望のペプチド又はペプチボディの精製を容易にするタンパク質又はポリペプチド及び多量体タンパク質の形成を促進するポリペプチド配列（二量体形成／安定性において有用であるロイシンジッパーモチーフなど）である。
【０２１０】
挿入バリアントのこのタイプは、一般的に、第二のポリペプチドの全部又は一部へ、Ｎ末端又はＣ末端において連結された未変性分子の全部又はかなりの部分を有する。例えば、異種宿主中でのタンパク質の組み換え発現を可能とするために、融合タンパク質は、典型的には、他の種からのリーダー配列を使用する。別の有用な融合タンパク質は、融合タンパク質の精製を容易にするために、抗体エピトープなどの免疫学的に活性なドメインの付加を含む。融合結合部に又は融合結合部付近に切断部位を含めることによって、精製後に、外来ポリペプチドを除去することが容易になる。他の有用な融合には、酵素由来の活性部位、グリコシル化ドメイン、細胞標的化シグナル又は膜貫通領域などの機能的ドメインの連結が含まれる。
【０２１１】
本発明において使用され得る様々な市販の融合タンパク質発現系が存在する。特に有用な系には、グルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ）系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、マルトース結合タンパク質系（ＮＥＢ、Ｂｅｖｅｒｌｅｙ，ＭＡ）、ＦＬＡＧ系（ＩＢＩ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）及び６×Ｈｉｓ系（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）が含まれるが、これらに限定されない。これらの系は、ペプチド又はペプチボディの活性に著しい影響を与える可能性が低い追加アミノ酸の少数のみを有する組み換えペプチド及び／又はペプチボディを産生することができる。例えば、ＦＬＡＧ系及び６×Ｈｉｓ系は何れも、短い配列を付加するに過ぎず、何れも抗原性が乏しいことが知られており、その未変性の立体構造へのポリペプチドの折り畳みに悪影響を及ぼさない。有用であると想定される別のＮ末端融合は、タンパク質又はペプチドのＮ末端領域へのＭｅｔ−Ｌｙｓジペプチドの融合である。このような融合は、タンパク質の発現又は活性の有益な増加をもたらし得る。
【０２１２】
他の融合系は、所望のペプチド又はペプチボディから融合対を切り出すことが望ましいポリペプチドハイブリッドを産生する。一実施形態において、融合対は、プロテアーゼに対する特異的な認識配列を含有するペプチド配列によって、組み換えペプチボディに連結される。
【０２１３】
適切な配列の例は、タバコエッチウイルスプロテアーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）又はＸａ因子（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｅｙ，ＭＡ）によって認識される配列である。
【０２１４】
本発明の組成物の幾つかの実施形態において、融合ポリペプチドは、末端切断された組織因子（ｔＴＦ）と組み合わせて、分子の全部又は一部を含む。ｔＴＦは、米国特許番号：５，８７７，２８９；６，００４，５５５；６，１３２，７２９；６，１３２，７３０；６，１５６，３２１；及び欧州特許番号ＥＰ０９８８０５６に記載されているように、腫瘍血管凝固因子として作用するヒト凝固誘導タンパク質の末端切断された形態からなる血管標的誘導因子である。抗Ａｎｇ−２ペプチボディ若しくはペプチド又はこれらの断片へのｔＴＦの融合は、標的細胞への抗Ａｎｇ−２の送達を容易にする。
【０２１５】
本発明の幾つかの実施形態において、組成物のペプチド又はポリペプチド部分中の１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が除去されている欠失バリアントが有用であり得る。欠失は、ポリペプチド若しくはペプチド部分の一方又は両方の末端において実施することが可能であり、又はアミノ酸配列内の１つ若しくはそれ以上の非末端残基の除去から実施することが可能である。欠失バリアントには、必然的に、本発明の組成物のペプチド又はポリペプチドの部分の全ての断片が含まれる。
【０２１６】
本発明の別の実施形態において、置換バリアントが有用であり得る。置換バリアントには、１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が除去され、及び１つ又はそれ以上の別のアミノ酸（このアミノ酸は、天然に存在するものであり得、又は天然に存在しないものであり得る。）で置換されたペプチド及びポリペプチドが含まれる。置換バリアントは、両者が同一アミノ酸の一定パーセントを有する配列を有する点で、元のペプチド又はポリペプチドと「同様」であるペプチド又はポリペプチドを与える。置換バリアントには、ペプチド又はペプチボディ内の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０アミノ酸の置換を含み、置換の数は、ペプチド又はペプチボディのアミノ酸の最大１０％又はそれ以上とし得る。置換は、性質上、保存的であり得るが、本発明は、非保存的な置換も含み、非標準的アミノ酸も含む。
【０２１７】
関連するペプチド及びペプチボディの同一性及び類似性は、公知の方法によって容易に計算することが可能である。このような方法には、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  １．Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）；ａｎｄ  Ｃａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に記載されているものが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２１８】
２つのペプチド若しくはポリペプチド又は１つのポリペプチドと１つのペプチドの関連性又はパーセント同一性を決定するための好ましい方法は、検査されている配列間で最大の一致を与えるように設計されている。同一性を決定するための方法は、公に入手可能なコンピュータプログラムに記載されている。２つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータプログラム法には、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１２：３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ａｎｄ  ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａＬ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ，２１５：４０３−４１０（１９９０））などのＧＣＧプログラムパッケージが含まれるが、これに限定されるものでない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）及びその他の入手源（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ（１９９０））から公的に入手可能である。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも、同一性を決定するために使用し得る。
【０２１９】
２つのアミノ酸配列を併置するためのある種のアラインメントスキームは、２つの配列の短い領域のみのマッチングをもたらし得、併置されたこの小さな領域は、２つの完全長配列の間に有意な関連性が存在しないとしても、極めて高い配列同一性を有し得る。従って、ある種の実施形態において、選択されたアラインメント法（ＧＡＰプログラム）は、比較されている標的ポリペプチドの完全長の少なくとも１０％に及ぶアラインメント（すなわち、少なくとも４００アミノ酸の配列が比較されている場合には、少なくとも４０個の連続するアミノ酸、少なくとも３００から約４００個のアミノ酸の配列が比較されている場合には、３０個の連続するアミノ酸、２００から約３００個のアミノ酸の配列が比較されている場合には、少なくとも２０個の連続するアミノ酸、約１００から約２００個のアミノ酸の配列が比較されている場合には、及び少なくとも１０個の連続するアミノ酸）をもたらす。
【０２２０】
例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、２つのポリペプチドの各アミノ酸の最適なマッチングを得るために（本アルゴリズムによって決定される「合致したスパン」）、パーセント配列同一性を決定すべき２つのポリペプチドが併置される。ある種の実施形態において、ギャップオープニングペナルティ（典型的には、３×平均対角として計算される。「平均対角」は、使用されている比較行列の対角の平均である。「対角」は、この比較行列による各完全なアミノ酸の合致に対して割り当てられるスコア又は数である。）及びギャップ伸長ペナルティー（通常、ギャップオープニングペナルティーの１／１０である。）並びにＰＡＭ２５０又はＢＬＯＳＵＭ６２などの比較行列が、アルゴリズムとともに使用される。ある種の実施形態において、アグロリズム中に標準的な比較行列も使用し得る。ＰＡＭ２５０比較行列については、「Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５（３）（１９７８）」及びＢＬＯＳＵＭ  ６２比較行列については、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ．８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）。
【０２２１】
ある種の実施形態において、ポリペプチド配列比較のためのパラメータには、以下のものが含まれる。
【０２２２】
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３（１９７０）；
比較行列：Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ，上記（１９９２）から得られるＢＬＯＳＵＭ６２；
ギャップペナルティ：１２
ギャップ長ペナルティー：４
類似性の閾値：０
【０２２３】
ＧＡＰプログラムは、上記パラメータとともに使用し得る。ある種の実施形態において、前記パラメータは、ＧＡＰアルゴリズムを用いるポリペプチド比較のための初期設定パラメータ（エンドギャップに対するペナルティーが存在しない。）である。
【０２２４】
ある種の実施形態において、（アミノ酸配列ではなく）ポリヌクレオチド分子配列の比較のためのパラメータには、以下のものが含まれる。
【０２２５】
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，上記（１９７０）；
比較行列：合致＝＋１０、非合致＝０
ギャップペナルティー：５０
ギャップ長ペナルティー：３
【０２２６】
ＧＡＰプログラムも、上記パラメータとともに使用し得る。上記パラメータは、ポリヌクレオチド分子比較のための初期設定パラメータである。
【０２２７】
「Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，１９９７」に記載されているものを含む他の典型的なアルゴリズム、ギャップオープニングペナルティー、ギャップ伸長ペナルティー、比較行列、類似性の閾値などを使用し得る。行うべき具体的な選択は当業者に自明であり、ＤＮＡ対ＤＮＡ、タンパク質対タンパク質、タンパク質対ＤＮＡなど、行うべき具体的な比較に依存し、さらに、比較が、配列の所定の対の間で（この場合には、一般に、ＧＡＰ又はＢｅｓｔＦｉｔが好ましい。）又は１つの配列と配列の巨大なデータベースとの間で（この場合には、ＦＡＳＴＡ又はＢＬＡＳＴＡが好ましい。）為されるかどうかに依存する。
【０２２８】
アミノ酸残基は、それらの共通する側鎖特性に基づいて、クラスに分割することが可能であることは、理解されるであろう。
【０２２９】
１．中性疎水性：アラニン（Ａｌａ；Ａ）、バリン（ＶａＩ；Ｖ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）及びメチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）。
２．中性極性：グリシン（ＧＩｙ；Ｇ）；セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン（ＧＩｕ；Ｑ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）及びノルロイシン。
３．酸性：アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）；
４．塩基性：リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）。
「Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｖ．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９４），ｐ．１１」を参照。
【０２３０】
保存的アミノ酸置換は、非慣用アミノ酸残基を包含し得、これは、通例、生物系での合成によってではなく、化学的なペプチド合成によって取り込まれる。これには、ペプチド模倣物及びアミノ酸部分の他の反転又は逆転した形態が含まれるが、これらに限定されない。非保存的置換は、これらのクラスの１つの要素を別のクラスから得られる要素に交換することを含み得る。
【０２３１】
このような変化を作製する上で、ある種の実施形態に従えば、アミノ酸のヒドロパチー指数を検討し得る。各アミノ酸には、その疎水性及び電荷特性に基づいて、ヒドロパチー指数が割り当てられている。それらは、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）及びアルギニン（−４．５）である。
【０２３２】
タンパク質に対する相互作用性生物機能を付与する上でのヒドロパチーアミノ酸指数の重要性は、本分野において理解されている。Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−１３１  （１９８２）。ある種のアミノ酸は、類似のヒドロパチー指数又はスコアを有する別のアミノ酸と置換され得、類似の生物活性をなお保持し得ることが知られている。ヒドロパチー指数に基づいて変化を行う際には、ある種の実施形態において、そのヒドロパチー指数が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれる。ある種の実施形態において、±１以内のものが含まれ、ある種の実施形態においては、±０．５以内のものが含まれる。
【０２３３】
特に、置換によって作製される生物学的に機能的なペプチボディ又はペプチドが、本事例の場合と同様に、免疫学的実施形態において使用されることが意図される場合には、類似アミノ酸の置換は、親水性に基づいて効果的に行い得ることも本分野において理解される。ある種の実施形態において、その隣接するアミノ酸の親水性によって支配される、タンパク質の最大局所平均親水性は、その免疫原性及び抗原性と、すなわち、タンパク質の生物学的特性と相関する。
【０２３４】
以下の親水性値が、これらのアミノ酸残基に割り振られている。アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）及びトリプトファン（−３．４）である。類似の親水性値に基づいて変化を行う場合、ある種の実施形態において、その親水性値が±２以内のアミノ酸の置換が含まれ、ある種の実施形態において、±１以内のものが含まれ、ある種の実施形態において、±０．５以内のものが含まれる。一次アミノ酸配列由来のエピトープは、親水性に基づいても同定し得る。これらの領域は、「エピトープコア領域」とも称される。典型的なアミノ酸置換は、下表１１に示されている。
【０２３５】
【表１３】
2009504164.tif 000069
【０２３６】
当業者は、周知の技術を用いて、本明細書に記載されている有用なポリペプチド又はペプチドの適切なバリアントを決定することが可能である。ある種の実施形態において、当業者は、活性にとって重要でないと思われる領域を標的とすることによって、活性を破壊することなく変化させることができる分子の適切な領域を同定し得る。ある種の実施形態において、類似のペプチド又はポリペプチドの間で保存されている分子の残基及び部分を同定することが可能である。ある種の実施形態において、生物活性を破壊せずに、又はポリペプチド構造に悪影響を及ぼさずに、生物活性又は構造にとって重要な領域を保存的アミノ酸置換に供してもよい。
【０２３７】
さらに、当業者は、活性又は構造にとって重要である、類似のポリペプチド中の残基を同定する構造−機能研究を参照することが可能である。このような比較に照らして、類似のタンパク質中の活性又は構造にとって重要であるアミノ酸残基に対応する、タンパク質中のアミノ酸残基の重要性を予測することが可能である。当業者は、このような予測された重要なアミノ酸残基に対する化学的に類似のアミノ酸置換を選択し得る。
【０２３８】
当業者は、類似のポリペプチド中のその構造に関連して、三次元構造及びアミノ酸配列も分析することが可能である。このような情報に照らして、当業者は、その三次元構造に関して、抗体のアミノ酸残基のアラインメントを予測し得る。ある種の実施形態において、タンパク質の表面上に存在すると予測されるアミノ酸は、他の分子との重要な相互作用に関与し得るので、当業者は、このような残基に極端な変化を施さないように選択し得る。さらに、当業者は、所望される各アミノ酸残基に単一のアミノ酸置換を含有する試験バリアントを作製し得る。次いで、このバリアントは、当業者に公知の活性アッセイを用いてスクリーニングすることが可能である。このようなバリアントは、適切なバリアントについての情報を集めるために使用し得る。例えば、あるアミノ酸残基に対する変化が破壊された活性、望ましくない減少した活性又は不適切な活性をもたらせことを発見すれば、このような変化を有するバリアントは回避し得る。換言すれば、このような定型的実験から集められた情報に基づいて、当業者は、単独で、又は他の変異と組み合わせて、さらなる置換が回避されるべきアミノ酸を容易に決定することが可能である。
【０２３９】
多数の科学的刊行物が、二次構造の予測に注力している。Ｍｏｕｌｔ  Ｊ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．７（４）：４２２−４２７（１９９６），Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１３（２）：２２２−２４５（１９７４）；Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１１３（２）：２１１−２２２（１９７４）；Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４７：４５−１４８（１９７８）；Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２５１−２７６及びＣｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２６：３６７−３８４（１９７９）を参照されたい。さらに、二次構造の予測を補助するために、現在、コンピュータプログラムを使用することが可能である。二次構造を予測する１つの方法は、相同性モデリングを基礎とする。例えば、３０％を超える配列同一性又は４０％を超える類似性を有する２つのポリペプチド又はタンパク質は、しばしば、類似の構造的トポロジーを有する。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の近年の拡充によって、ポリペプチド又はタンパク質の構造内に存在し得る折り畳みの数など、強化された二次構造の予測可能性が得られている。Ｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２７（１）：２４４−２４７（１９９９）を参照。あるポリペプチド又はタンパク質中に限定された折り畳みの数が存在すること、及び、構造の臨界数が決定されれば、構造的予測は、劇的により正確になることが示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７（３）：３６９−３７６（１９９７））。
【０２４０】
二次構造を予測するさらなる方法には、「スレディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」が含まれる（Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７（３）：３７７−８７（１９９７）；Ｓｉｐｐｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，４（１）：１５−１９（１９９６）），“ｐｒｏｆｉｌｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ”（Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２５３：１６４−１７０（１９９１）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１８３：１４６−１５９（１９９０）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４（１３）：４３５５−４３５８（１９８７））及び“ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｌｉｎｋａｇｅ”（Ｈｏｌｍ，上記（１９９９）及びＢｒｅｎｎｅｒ，上記（１９９７）を参照）。
【０２４１】
ある種の実施形態において、ペプチボディバリアントには、１つ又はそれ以上のグリコシル化部位（Ｎ結合型グリコシル化部位など）がペプチボディに付加されているグリコシル化バリアントが含まれる。Ｎ結合型グリコシル化部位は、配列：Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（Ｘとして表記されているアミノ酸残基は、プロリンを除く全てのアミノ酸残基であり得る。）によって特徴付けられる。この配列を作製するためのアミノ酸残基の置換又は付加は、Ｎ結合型炭水化物鎖の付加に対する新規部位を与える可能性を秘めている。あるいは、この配列を除去する置換は、既存のＮ結合型炭水化物鎖を除去する。１つ又はそれ以上のＮ結合型グリコシル化部位（典型的には、天然に存在するもの）が除去され、及び１つ又はそれ以上の新たなＮ結合型部位が作製されるＮ結合型炭水化物鎖の再配置も提供される。
【０２４２】
本発明の化合物は、ＤＮＡレベルでも変化させ得る。化合物の何れの部分のＤＮＡ配列も、選択された宿主細胞とより適合的なコドンへと変化させ得る。好ましい宿主細胞であるＥ．コリの場合、最適化されたコドンが本分野において公知である。制限部位を除去するために、又はサイレントな制限部位を含めるためにコドンを置換することができ、これは、選択された宿主細胞中でのＤＮＡのプロセッシングを補助し得る。Ｆｃドメイン、リンカー、ポリペプチド及び／又はペプチドをコードするＤＮＡ配列は、先述の配列の変化の何れをも含むように修飾され得る。従って、本明細書に論述されている全ての修飾、置換、誘導体化などが、本発明の組成物の全てのポリペプチド又はペプチド部分に対して、等しく適用される。
【０２４３】
本発明の一実施形態は、ペプチバディ実施形態など、「親和性成熟化された」ペプチド及びポリペプチド部分を含む。この手順は、ファージディスプレイ又はその他の選択技術を用いて、ペプチド及びポリペプチドの親和性又は生物活性を増加させることを想定する。（関連ペプチドの集団に対して生成された）コンセンサス配列に基づいて、「コア」アミノ酸（コンセンサス配列から決定される。）が一定に保たれているか、又は「コア」アミノ酸の出現頻度に偏りがある誘導された二次ファージディスプレイライブラリーを作製することが可能である。あるいは、偏りのある誘導されたファージディスプレイライブラリーを作製するために、各ペプチド配列を使用することが可能である。このようなライブラリーのパンニングは、標的への増強された結合を有するペプチド又は増強された生物活性を有するペプチド（ペプチドは、ペプチボディへ変換することが可能である。）を与え得る。
【０２４４】
非ペプチド類縁体／タンパク質模倣物。さらに、安定化された構造又は低下した生物分解を与えるペプチドの非ペプチド類縁体も有用である。ペプチド模倣類縁体は、非ペプチド部分による１つ又はそれ以上の残基の置換によって、選択された阻害的ペプチドに基づいて調製することが可能である。好ましくは、非ペプチド部分は、ペプチドがその天然の立体構造を保持することを可能とし、又は、Ａｎｇ−２を認識及び結合する能力を保持する好ましい（例えば、生物活性を示す）立体構造を安定化させることを可能とする。一態様において、生じた類縁体／模倣物は、Ａｎｇ−２に対する増加した結合親和性を示す。ペプチドから非ペプチド模倣類縁体を調製するための方法の一例は、「Ｎａｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．．Ｒｅｇｕｌ．Ｐｅｐｔ．５７：３５９−３７０（１９９５）」に記載されている。所望であれば、本発明のペプチドは、例えば、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化若しくはリン酸化によって、又は、本発明のペプチドの酸付加塩、アミド、エステル、特に、Ｃ末端エステル及びＮ−アシル誘導体の作製によって修飾することが可能である。ペプチドボディは、他の部分との共有又は非共有複合体を形成することによってペプチド誘導体を作製するために修飾することも可能である。共有的に結合された複合体は、ペプチボディを含むアミノ酸の側鎖上の官能基に、又はＮ末端若しくはＣ末端に化学的部分を連結することによって調製することが可能である。
【０２４５】
ペプチドは、放射性標識、蛍光標識、（例えば、比色又は蛍光定量的反応を触媒する）酵素、基質、固体マトリックス又は担体（例えば、ビオチン又はアビジン）などの（但し、これらに限定されない。）レポーター基に抱合させることが可能である。従って、本発明は、ペプチボディ分子（本分子は、好ましくは、放射性標識、蛍光標識、酵素、基質、固体マトリックス及び担体からなる群から選択されるレポーター基を含む。）をさらに含む分子を提供する。このような標識は、当業者に周知であり、例えば、ビオチン標識が特に想定される。このような標識の使用は当業者に周知であり、例えば、米国特許番号３，８１７，８３７；３，８５０，７５２；３，９９６，３４５；及び４，２７７，４３７に記載されている。有用である他の標識には、放射性標識、蛍光標識及び化学発光標識が含まれるが、これらに限定されない。このような標識の使用に関する米国特許には、例えば、米国特許番号３，８１７，８３７；３，８５０，７５２；３，９３９，３５０；及び３，９９６，３４５が含まれる。本発明のペプチボディの何れもが、これらの標識の何れもの１つ、２つ又はそれ以上を含み得る。
【０２４６】
組み換え方法。一般に、本発明の化合物のペプチド又はポリペプチド部分（追加部分、リンカー及び／又はＦｃドメインとしてのペプチド又はポリペプチドなど）は、概ね、組み換えＤＮＡ技術を用いて、形質転換された宿主細胞中に作製することが可能である。このようにするために、ペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子が調製される。このようなＤＮＡ分子を調製する方法は、本分野において周知である。例えば、ペプチドをコードする配列は、適切な制限酵素を用いてＤＮＡから切り出すことが可能である。あるいは、ＤＮＡ分子は、ホスホルアミダート法などの化学的合成技術を用いて合成することが可能である。また、これらの技術の組み合わせを使用することも可能である。
【０２４７】
従って、本発明は、本発明のポリペプチド組成物を作製する上で有用な核酸、発現ベクター及び宿主細胞にも関する。宿主細胞は、真核細胞とすることが可能であり、哺乳動物の細胞、例えば、ＣＨＯ細胞及びＨＥＫ２９３細胞が好ましい。宿主細胞は、原核細胞とすることも可能であり，Ｅ．コリ細胞が最も好ましい。
【０２４８】
本発明の化合物は、概ね、組換えＤＮＡ技術を用いて、形質転換された宿主細胞中で作製することが可能である。このようにするために、ペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子が調製される。このようなＤＮＡ分子を調製する方法は、本分野において周知である。例えば、ペプチドをコードする配列は、適切な制限酵素を用いてＤＮＡから切り出すことが可能である。あるいは、ＤＮＡ分子は、ホスホルアミダート法などの化学的合成技術を用いて合成することが可能である。また、これらの技術の組み合わせを使用することも可能である。
【０２４９】
本発明は、適切な宿主中でペプチドを発現することが可能なベクターも含む。ベクターは、適切な発現調節配列に作用可能に連結されたペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む。ＤＮＡ分子の前又は後の何れかに、ベクター中にこの作用可能な結合を挿入する方法は、周知である。発現調節配列には、プロモーター、アクチベーター、エンハンサー、オペレーター、リボソーム結合部位、開始シグナル、停止シグナル、キャップシグナル、ポリアデニル化シグナル及び転写又は翻訳の調節に関わる他のシグナルが含まれる。
【０２５０】
その上にＤＮＡ分子を有する生じたベクターは、適切な宿主を形質転換するために使用される。この形質転換は、本分野において周知な方法を用いて実施することが可能である。
【０２５１】
多数の利用可能な、周知の宿主細胞の何れをも、本発明の実施において使用することが可能である。特定の宿主の選択は、本分野によって認知される多数の因子に依存する。これらには、例えば、選択された発現ベクターとの適合性、ＤＮＡ分子によってコードされるペプチドの毒性、形質転換の速度、ペプチドの回収の容易さ、発現の特徴、生物学的安全性及び費用が含まれる。全ての宿主細胞が特定のＤＮＡ配列の発現に対して等しく効果的であり得るわけではないことを理解して、これらの因子のバランスを決定しなければならない。これらの一般的な指針の中で、有用な微生物宿主細胞には、細菌（Ｅ．コリ種など）、酵母（サッカロミセス種など）及び他の真菌、昆虫、植物、培養中の哺乳動物（ヒトを含む。）細胞又は本分野において公知の他の宿主が含まれる。
【０２５２】
次に、形質転換された宿主細胞は、培養及び精製される。宿主細胞は、所望の化合物が発現されるように慣用の発酵条件下で培養することが可能である。このような発酵条件は、本分野において周知である。最後に、ペプチドは、本分野において周知の方法によって、培養物から精製される。
【０２５３】
化合物は、合成的方法によって作製することも可能である。固相合成は、小ペプチドを作製する最も費用対効果が優れた方法であるので、各ペプチドを作製する好ましい技術である。例えば、周知の固相合成技術には、保護基、リンカー及び固相支持体の使用、並びに特異的な保護及び脱保護反応条件、リンカー切断条件、スカベンジャーの使用及び固相ペプチド合成の他の態様が含まれる。適切な技術は、本分野において周知である。（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９７３），Ｃｈｅｍ．Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｐｐ．３３５−６１（Ｋａｔｓｏｙａｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｐａｎａｙｏｔｉｓ  ｅｄｓ．）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９；Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．１０：３９４−４１４；Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ（１９６９），Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：米国特許番号３，９４１，７６３；Ｆｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６），Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（３ｒｄ  ｅｄ．）２：１０５−２５３；ａｎｄ  Ｅｒｉｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６），Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（３ｒｄ  ｅｄ．）２：２５７−５２７；“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９；ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ  Ｃａｔａｌｏｇ，２０００；“Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ  Ｕｓｅｒ‘ｓ  Ｇｕｉｄｅ，”  Ｇ．Ａ．Ｇｒａｎｔ，Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９２；“Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｔｅｃｈ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ＆  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”  Ｗ．Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔ，Ｊ．Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｌ．Ｋ．Ｈａｍａｋｅｒ，Ｍ．Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．Ｒｈｏｄｅｓ，ａｎｄ  Ｈ．Ｈ．Ｓａｎｅｉｉ，Ｅｄｓ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｔｅｃｈ，１９９８；“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，”Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−  Ｖｅｒｌａｇ，１９９３；“Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，”  Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ  ａｎｄ  Ａ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−  Ｖｅｒｌａｇ，１９９４；“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ，”  Ｐ．Ｊ，Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ，Ｅｄ．，Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１９９４；“Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，”Ｗ．Ｃ．Ｃｈａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ，Ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｒｅｓｓ，２０００，Ｇ．Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ，１９９０，７７−１８３）。
【０２５４】
本発明の組成物が合成技術又は組換え技術によって調製されるか否かによらず、適宜、適切なタンパク質精製技術を含めることも可能である。本発明の組成物の幾つかの実施形態において、トキシンペプチド部分及び／又は半減期延長部分又は他の何れかの部分は、定量又は検出を容易にするために、適切な同位体標識（例えば、１２５Ｉ、１４Ｃ、１３Ｃ、３５Ｓ、３Ｈ、２Ｈ、１３Ｎ、１５Ｎ、１８０、１７Ｏなど）を含むように調製することが可能である。
【０２５５】
誘導体化されたペプチド又はポリペプチドを含有し、又は非ペプチド基を含有する化合物は、周知の有機化学技術によって合成することが可能である。
【０２５６】
本発明の化合物の使用
総論。本発明の化合物は、このような目的のタンパク質の未変性リガンドのアゴニスト、模倣物又はアンタゴニストとして、目的のタンパク質に結合するそれらの能力に起因する薬理学的活性を有する。例として、様々な具体的化合物の用途が、表５から１０に示されている。これらの化合物の活性は、本分野で公知のアッセイによって測定することが可能である。
【０２５７】
治療的用途に加えて、本発明の化合物は、それらの関連する対象タンパク質の機能不全を特徴とする疾病を診断する上で有用である。これらの診断的実施形態の幾つかのために、並びに他の検出（半定量的及び定量的など）目的のために、プレート表面、チップ、ビーズ、マトリックス又は粒子など（但し、これらに限定されない。）の付加機能部分として、固定化された基材にＦｃドメインを抱合することは有用であり得る。また、放射性同位体、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ又はキナーゼ）、ビオチン部分、蛍光色素分子又は発色団で検出可能に標識された部分は、このような目的のために有用であり得る。
【０２５８】
一実施形態において、生物学的試料中に、活性化されることができる目的のタンパク質（例えば、受容体）を検出する方法であり、（ａ）前記試料を、本発明の化合物と接触させる工程、及び（ｂ）前記化合物による、前記目的のタンパク質の活性化を検出する工程を含む。生物学的試料には、組織試料、原型状態の細胞又はこれらの抽出物が含まれる。本発明の化合物は、生物学的試料中における、それらの関連する対象タンパク質の存在を検出するための診断キットの一部として使用され得る。このようなキットは、検出を可能とするために付着された標識を有する本発明の化合物を使用する。前記化合物は、正常な又は異常な対象タンパク質を同定するのに有用である。ＥＰＯ模倣化合物の場合、例えば、生物学的試料中に、目的の異常なタンパク質が存在することは、ダイアモンド・ブラックファン貧血（ＥＰＯ受容体が機能不全であると考えられている。）などの疾患の指標であり得る。
【０２５９】
ＥＰＯ模倣分子の治療的使用
本発明のＥＰＯ模倣化合物は、低い赤血球レベルによって特徴付けられる疾患を治療するのに有用である。本発明に含まれるのは、哺乳動物中のＥＰＯ受容体の内在的活性を調節する方法、好ましくは、ＥＰＯ受容体の活性を増加させる方法である。一般的に、エリスロポエチンによって治療可能なあらゆる症状（喘息など）も、本発明のＥＰＯ模倣化合物によって治療され得る。これらの化合物は、治療されている症状の性質及び重篤度に対して適切である量及び送達経路によって投与され、当業者によって確認され得る。好ましくは、投与は、皮下、筋肉内又は静脈内の注射による。
【０２６０】
ＴＰＯ模倣化合物の治療的使用
ＴＰＯ模倣化合物に対して、「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ」という名称のＷＯ９５／２６７４６に記載されているような標準的アッセイを使用することが可能である。治療されるべき症状は、一般に、既存の巨核芽球／血小板欠乏又は（計画された手術又は血小板提供による）予測された巨核芽球／血小板欠乏を伴う症状である。このような症状は、一般に、インビボでの活性なＭｐｌリガンドの欠乏（一時的又は恒常的）の結果である。血小板欠乏に対する包括的用語は血小板減少症であり、従って、本発明の方法及び組成物は、一般に、血小板減少症の治療を必要としている患者における血小板減少症を治療するために利用可能である。
【０２６１】
血小板減少症（血小板欠乏）は、化学療法及び様々な薬物を用いた他の療法、放射線療法、手術、偶発的な失血及びその他の特異的な疾病症状を含む様々な理由のために存在し得る。血小板減少症を伴い、本発明に従って治療され得る典型的な具体的疾病症状は、再生不良貧血、突発性血小板減少症、血小板減少症をもたらす転移性腫瘍、全身性紅斑性狼瘡、脾腫大、ファンコニ症候群、ビタミンＢ１２欠乏症、葉酸欠乏症、メイ・ヘグリン異常、ウィスコット−アルドリッチ症候群及び発作性夜間血色素尿症である。ＡＩＤＳのためのある種の治療も、血小板減少症をもたらす（例えば、ＡＺＴ）。ある種の創傷治癒疾患においても、血小板数の増加が有益であり得る。
【０２６２】
例えば、将来の手術による予想される血小板欠乏に関して、本発明の化合物は、血小板が必要となる数日から数時間前に投与され得る。急性状態（例えば、偶発的且つ大量の失血）に関して、本発明の化合物は、血液又は精製された血小板とともに投与することが可能である。
【０２６３】
本発明のＴＰＯ模倣化合物は、巨核芽球以外のある種の細胞種がＭｐｌ受容体を発現することが見出されるのであれば、このような細胞を刺激する上でも有用であり得る。Ｍｐｌリガンドによる刺激に対して応答性であるＭｐｌ受容体を発現するこのような細胞に伴う症状も、本発明の範囲に属する。
【０２６４】
本発明のＴＯ模倣化合物は、血小板又は血小板前駆体細胞の産生が望まれる全ての状態又はｃＭｐｌ受容体の刺激が望まれる全ての状態において使用され得る。従って、例えば、本発明の化合物は、血小板、巨核芽球などの必要が存在する哺乳動物中の全ての症状を治療するために使用され得る。このような症状は、以下の典型的な出典：ＷＯ９５／２６７４６；ＷＯ９５／２１９１９；ＷＯ９５／１８８５８；ＷＯ９５／２１９２０に詳しく記載されており、これらは本明細書に組み込まれる。
【０２６５】
本発明のＴＰＯ模倣化合物は、血小板及び／又は巨核芽球及び関連細胞の生存性又は保存寿命を維持する上でも有用であり得る。従って、このような細胞を含有する組成物中に１つ又はそれ以上のこのような化合物の有効量を含めることが有用であり得る。
【０２６６】
Ａｎｇ−２結合分子の治療的使用
Ａｎｇ−２結合活性又はその他の細胞活性を調節する因子は、それらの治療効果を増強し、若しくは生じ得る副作用を減少させるための他の治療剤と組み合わせて使用され得る。
【０２６７】
一態様において、本発明は、細胞中のＡｎｇ−２活性の望ましくないレベル又は異常なレベルによって特徴付けられる疾病及び症状を治療するために有用な試薬及び方法を提供する。これらの疾病には、癌及び過形成などの他の過剰増殖性症状、乾癬、接触性皮膚炎、免疫疾患及び不妊症が含まれる。
【０２６８】
本発明は、Ａｎｇ−２活性を阻害又は減少させるペプチボディなどの特異的結合剤の有効量を動物（ヒトを含む。）に投与することを含む、動物中の癌を治療する方法も提供する。さらに、本発明は、生物系内での細胞増殖、浸潤及び転移の方法など、癌細胞の増殖を阻害する方法に関する。方法には、癌細胞増殖の阻害剤としての本発明の化合物の使用が含まれる。好ましくは、本方法は、癌細胞の増殖、浸潤、転移又は生きた動物（哺乳動物など）での腫瘍の発生を阻害又は低減するために使用される。本発明の方法は、アッセイ系での使用（例えば、癌細胞の増殖及びその特性をアッセイすること、並びに癌細胞増殖に影響を与える化合物を同定すること）に容易に適合させることも可能である。
【０２６９】
本発明の方法によって治療可能な癌は、好ましくは、哺乳動物中に発生する。哺乳動物には、例えば、ヒト及びその他の霊長類、イヌ及びネコなどのペット又は愛玩動物、ラット、マウス及びウサギなどの実験動物、並びにウマ、ブタ、ヒツジ及びウシなどの畜産動物が含まれる。
【０２７０】
腫瘍又は新生物には、組織細胞の増殖が制御されず、及び進行性である組織細胞の増殖が含まれる。幾つかのこのような増殖は良性であるが、その他は、悪性と称され、生物の死を引き起こし得る。悪性新生物又は癌は、侵襲性の細胞増殖を示すことに加え、周囲組織を侵襲し、転移し得る点で、良性増殖とは区別される。さらに、悪性新生物は、分化のより大きな喪失（より大きな脱分化）並びに互いに及びそれらの周囲組織に対してそれらの組織化のより大きな喪失を示すことを特徴とする。この特性は、「退形成」とも称される。
【０２７１】
本発明によって治療可能な新生物には、固形腫瘍、すなわち癌腫及び肉腫も含まれる。癌腫には、周囲組織に浸潤（侵入）し、転移を生じる上皮細胞由来の悪性新生物が含まれる。腺癌は、腺組織に由来し、又は認識可能な腺構造を形成する癌腫である。別の広いカテゴリー又は癌には肉腫が含まれ、これらは、胚性結合組織のような繊維性又は均質な物質中にその細胞が包埋された腫瘍である。本発明は、白血病、リンパ腫及び、典型的には、腫瘍塊として存在せず、血管又はリンパ細網系内に分布している他の癌など、骨髄又はリンパ系の癌の治療も可能とする。
【０２７２】
従って、本発明のａｎｇ−２結合分子は、固形腫瘍及び白血病を含む多様な癌の治療に有用である。本発明の治療に適している癌又は腫瘍細胞の種類には、例えば、ＡＣＴＨ産生腫瘍；急性リンパ球性白血病；急性非リンパ球性白血病；腺腫；副腎皮質の癌；乳房、前立腺及び大腸の腺癌；エナメル上皮腫；ＡＰＵＤ系腫瘍；膀胱癌；脳癌；鰓腫；乳癌；肺の気管支原性癌腫の全形態；カルチノイド心疾患；癌腫（例えば、ウォーカー、基底細胞、基底扁平細胞、ブラウン・ピアース、管、エールリッヒ腫瘍、クレブス２、メルケル細胞、粘液性、非小細胞肺、燕麦細胞、乳糖状、硬、細気管支、気管支原性、扁平上皮細胞及び移行細胞）；悪性カルチノイド症候群；免疫増殖性小肺細胞癌腫；セメント質腫；子宮頸癌；軟骨芽細胞腫；軟骨腫；軟骨肉腫；分離腫；慢性リンパ球性白血病；慢性骨髄性白血病；直腸結腸癌；脊索腫；頭蓋咽頭腫；皮膚Ｔ細胞リンパ腫；未分化胚細胞腫；子宮内膜癌；食道癌；ユーイング肉腫；繊維腫；繊維肉腫；胆嚢癌；巨細胞腫瘍；神経膠腫；有毛細胞白血病；過誤腫；頭部及び頸部癌；肝細胞腫；組織球性疾患；組織球増殖症；ホジキンリンパ腫；カポジ肉腫；腎臓癌；脂肪腫；脂肪肉腫；肝臓癌；肝臓癌（小細胞及び非小細胞）；悪性腹水；悪性胸水；黒色腫；間葉細胞腫；中腎腫；中皮腫瘍；多発性骨髄腫；筋肉腫；粘液腫；粘液肉腫；神経芽細胞腫；非ホジキンリンパ腫；歯牙腫；骨腫；骨肉腫；卵巣癌；卵巣（生殖細胞）癌；膵臓癌；乳頭腫；陰茎癌；形質細胞腫；前立腺癌；細網内皮症；網膜芽細胞腫；皮膚癌；軟部組織肉腫；扁平上皮細胞癌；胃癌；奇形腫；精巣癌；胸腺腫；甲状腺癌；絨毛性新生物；子宮癌；膣癌；外陰部の癌；ウィルムス腫瘍が含まれる。
【０２７３】
さらに、癌の以下の種類も治療され得る。胆管癌（ｃｈｏｌａｎｇｉｏｍａ）；真珠腫；円柱腫（ｃｙｃｌｉｎｄｒｏｍａ）；嚢胞腺癌；嚢胞腺腫；顆粒膜細胞腫；ギナンドロブラストーマ；汗腺腫；膵島腫瘍；ライディッヒ細胞腫；乳頭腫；セルトーリ細胞腫；卵胞膜細胞腫；平滑筋腫；平滑筋肉腫；筋芽細胞腫；筋腫；筋肉腫；横紋筋腫；横紋筋肉腫；上衣腫；神経節腫；神経膠腫；髄芽細胞腫；髄膜腫；神経鞘腫；神経芽細胞腫；神経上皮腫；神経線維腫；神経腫；傍神経節腫；非クロム親和性傍神経節腫；被角血管腫；好酸球性血管リンパ球増殖症；硬化性血管腫；血管腫症；グロムス血管腫；血管内皮腫；血管腫；血管周囲細胞腫；血管肉腫；リンパ管腫；リンパ管筋腫；リンパ管肉腫；松果体腫；癌肉腫；軟骨肉腫；葉状嚢肉腫；繊維肉腫；血管肉腫；平滑筋腫；白血肉腫症；脂肪肉腫；リンパ管肉腫；筋肉腫；粘液肉腫；卵巣癌；横紋筋肉腫；肉腫；新生物；神経線維腫症；及び子宮頸部異形成。
【０２７４】
ＮＧＦ結合分子の治療的使用
ＮＧＦ結合分子は、ＮＧＦ関連疾病及び疾患の予防又は治療において使用され得る。このような適応症には、疼痛（炎症性疼痛並びに付随する痛覚過敏及び異痛症、神経障害性の疼痛並びに付随する痛覚過敏及び異痛症、糖尿病性神経障害痛、灼熱痛、交感神経性に維持される疼痛、求心路遮断症候群、急性疼痛、緊張型頭痛、偏頭痛、歯痛、外傷からの疼痛、手術痛、切断又は膿瘍から生じる疼痛、灼熱痛、脱髄性疾患及び三叉神経痛が含まれるが、これらに限定されない。）が含まれるが、これらに限定されない。本発明のペプチド及び修飾されたペプチドは、喘息、切迫性尿失禁（すなわち、過活動膀胱）、乾癬、癌（特に、膵臓癌及び黒色腫）、慢性アルコール依存症、発作、視床痛症候群、糖尿病、後天性免疫不全症候群（「ＡＩＤＳ」）、トキシン及び化学療法、一般的な頭痛、偏頭痛、群発性頭痛、血管及び非血管混合症候群（ｍｉｘｅｄ−ｖａｓｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ）、一般的な炎症、関節炎、リウマチ性疾患、狼瘡、骨関節炎、炎症性腸疾患、炎症性眼疾患、炎症性又は不安定膀胱疾患、乾癬、炎症性要素を伴う皮膚疾患、日焼け、心臓炎、皮膚炎、筋肉炎、神経炎、膠原病性脈管疾患、慢性炎症性症状、喘息、上皮組織の損傷若しくは機能不全、単純ヘルペス、呼吸器、泌尿生殖、胃腸又は血管領域における内臓の運動性の障害、創傷、火傷、アレルギー性皮膚反応、掻痒症、白斑、一般的な胃腸疾患、大腸炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、血管運動性若しくはアレルギー性鼻炎又は気管支疾患など（これらに限定されない。）、原因因子としてＮＧＦに関連するその他の疾病の予防又は治療に対して治療的価値を有する。
【０２７５】
ミオスタチン結合分子の治療的使用
本発明のミオスタチン結合剤は、ミオスタチンに結合し、標的とされる細胞内のミオスタチンシグナル伝達を遮断又は阻害する。本発明は、１つ又はそれ以上のミオスタチン結合剤の有効用量を動物に投与することによって、動物中のミオスタチンの量又は活性を減少させるための方法及び試薬を提供する。一態様において、本発明は、１つ又はそれ以上の結合剤の有効投薬量を動物に投与することを含む、動物中のミオスタチン関連疾患を治療するための方法及び試薬を提供する。これらのミオスタチン関連疾患には、筋萎縮の様々な形態、並びに糖尿病及び関連疾患などの代謝的疾患並びに骨粗鬆症などの骨変性疾患が含まれるが、これらに限定されない。
【０２７６】
米国逐次番号１０／７４２，３７９の実施例８に示されているように、本発明の典型的なペプチボディは、ＣＤ１ｎｕ／ｎｕマウスモデル中の除脂肪筋肉質量を劇的に増加させる。このインビボ活性は、同じペプチボディに対して以下に記載されているインビトロ結合及び阻害活性に対して相関がある。
【０２７７】
筋萎縮疾患には、ドゥシェンヌ型筋ジストロフィー、進行性筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、デジェリーヌ・ランドゥジニー筋ジストロフィー、エルブ筋ジストロフィー及び乳児型神経軸索筋ジストロフィーなどのジストロフィーが含まれる。例えば、インビボでの抗体の使用を通じてミオスタチンを遮断することによって、ドゥシェンヌ型筋ジストロフィーのｍｄｘマウスモデルのジストロフィー表現型が改善された（Ｂｏｇｄａｎｏｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔｕｒｅ  ４２０：２８）。典型的なペプチボディの使用は、以下の実施例９に記載されているように、除脂肪筋肉質量を増加させ、ｍｄｘマウスモデルにおいて、脂肪に対する除脂肪筋肉の比率を増加させる。
【０２７８】
さらなる筋萎縮疾患は、筋萎縮性側索硬化症、うっ血性閉塞性肺疾患、癌、ＡＩＤＳ、腎不全及び関節リウマチなどの慢性疾患から生じる。例えば、悪液質及び筋萎縮及び体重減少が、全身的に投与されたミオスタチンによって、胸腺欠損ヌードマウス中で誘導された（Ｚｉｍｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，上記）。別の例において、ミオスタチン免疫反応性タンパク質の血清及び筋肉内濃度は、ＡＩＤＳに関連する筋肉萎縮を示すヒトにおいて増加していることが見出され、無脂肪質量と逆相関していた（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃａｄａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９５：１４９３８−１４９４３）。筋肉の萎縮をもたらすさらなる症状が、車椅子への拘束、発作による長期間の病臥、病気、骨折又は外傷及び微少重力環境における筋萎縮（宇宙飛行）などの身体障害による不活動から生じ得る。例えば、血漿ミオスタチン免疫反応性タンパク質は、長期間の病臥後に増加することが明らかとなった（Ｚａｃｈｗｉｅｊａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｇｒａｖｉｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．６（２）：１１（１９９９）。スペースシャトル飛行中の微少重力環境に曝されたラットの筋肉は、微少重力環境に曝されていないラットの筋肉と比べてミオスタチンの増加した量を発現することも明らかとなった（Ｌａｌａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００），Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．１６７（３）：４１７−２８）。
【０２７９】
さらに、年齢に関連した筋肉に対する脂肪の比率の増加及び年齢に関係した筋萎縮は、ミオスタチンと関連しているように見受けられる。例えば、平均血清ミオスタチン免疫反応性タンパク質は、若い（１９から３５歳）、中年（３６から７５歳）及び高齢（７６から９２歳）の男性及び女性の群において、年齢とともに増加するのに対して、平均筋肉質量及び無脂肪質量は、これらの群において、年齢とともに減少したＹａｒａｓｈｅｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｎｕｔｒ  Ａｇｉｎｇ  ６（５）：３４３−８  （２００２））。マウスにおけるミオスタチン遺伝子ノックアウトは筋形成を増加させ、及び脂肪形成を減少させて（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｎｉｕｎ  ２９１（３）：７０１−６）、増加した筋肉質量並びに減少した脂肪の蓄積及びレプチン分泌を有する成体をもたらすことも示されている。典型的な分子は、以下に示されているように、高齢のｍｄｘマウスにおける、脂肪に対する除脂肪筋肉質量の比を改善する。
【０２８０】
さらに、現在では、ミオスタチンが心臓の筋肉中において、低レベルで発現されていること、及び梗塞後の心筋細胞後に発現が上方制御されることも明らかとなっている（Ｓｈａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９），Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１８０（１）：１−９）。従って、心筋中のミオスタチンレベルを減少させることによって、梗塞後の心筋の回復を改善させ得る。
【０２８１】
ミオスタチンは、２型糖尿病、非インシュリン依存性糖尿病、高血糖及び肥満などの代謝性疾患にも影響を与えるようである。例えば、ミオスタチンの欠如は、２つのマウスモデルの肥満及び糖尿病表現型を改善することが示されている（Ｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．上記）。さらに、ミオスタチンレベルを減少させることによって筋肉の質量を増加させることは、骨強度を改善させ、骨粗鬆症及び他の変性性骨疾患を抑制し得る。例えば、ミオスタチン欠損マウスは、マウス上腕骨の増加した無機質含量及び密度並びに筋肉が付着している領域における海綿骨及び皮質骨の両方の増加した無機質含量並びに増加した筋肉質量を示すことが見出されている（Ｈａｍｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｃａｌｃｉｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ  ７１（１）：６３−８）。本発明において、典型的なペプチボディは、以下に示されているように、ｍｄｘマウスにおいて、脂肪に対する除脂肪筋肉質量の比を増加させる。
【０２８２】
本発明は、ミオスタチン結合剤の有効用量を動物に投与することによって、食用動物中の筋肉質量を増加させるための方法及び試薬も提供する。成熟したＣ末端ミオスタチンポリペプチドは、検査された全ての種において同一であるので、ミオスタチン結合剤は、ウシ、ニワトリ、シチメンチョウ及びブタなどの農業で重要な全ての種において、筋肉質量を増加させ、脂肪を減少させるのに有効であると予測される。
【０２８３】
本発明のミオスタチン結合分子は、単独で使用され得、又は、それらの治療効果を増強させ、もしくは生じ得る副作用を減少させるために、他の治療剤と組み合わせて使用され得る。本発明の分子は、薬剤の治療的価値を改善する特性の、１つ又はそれ以上の望ましいが予測されない組み合わせを有する。これらの特性には、増加された活性、増加された溶解度、減少された分解、増加された半減期、減少された毒性及び減少された免疫原性が含まれる。従って、本発明の分子は、延長された治療計画に対して有用である。さらに、本発明の化合物の親水性及び疎水性の特性は優れてバランスが取れており、これにより、インビトロ及び特にインビボでの両使用に対する有用性を増強する。具体的には、本発明の化合物は、体内での吸収を可能とする水性溶媒中での溶解度の適切な程度及び生物学的利用性を有すると同時に、化合物が推定作用部位（特定の筋肉の量など）まで細胞膜を横切ることを可能とする脂質中での溶解度の程度も有する。
【０２８４】
本発明のミオスタチン結合分子は、適切な組成物中の有効用量で投与された場合に、「対象」又はあらゆる動物（ヒトを含む。）を治療するのに有用である。
【０２８５】
さらに、本発明のミオスタチン結合分子は、多数のアッセイにおいて、ミオスタチンを検出及び定量するのに有用である。これらのアッセイは、米国逐次番号１０／７４２，３７９に詳しく記載されている。
【０２８６】
一般に、本発明のミオスタチン結合分子は、例えば、「Ａｓａｉ，ｅｄ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３７，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９３）」に記載されているアッセイと類似の様々なアッセイにおいて、ミオスタチンを結合及び固定化するための捕捉剤として有用である。ミオスタチン結合分子は、何らかの様式で標識することができ、又はミオスタチンの検出及び定量を可能とするように標識された抗結合分子抗体などの第三の分子と反応し得る。例えば、ミオスタチン結合分子又は第三の分子はビオチンなどの検出可能部分で修飾することが可能であり、検出可能部分は、次いで、酵素標識されたストレプトアビジン又はその他のタンパク質などの第四の分子によって結合されることができる。（Ａｋｅｒｓｔｒｏｍ（１９８５），Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３５：２５８９；Ｃｈａｕｂｅｒｔ  （１９９７），Ｍｏｄ  Ｐａｔｈｏｌ  １０：５８５）。
【０２８７】
あらゆる特定のアッセイを通じて、試薬の各組み合わせ後に、温置及び／又は洗浄工程が必要となり得る。温置工程は、約５秒から数時間まで、好ましくは約５分から約２４時間までを変動し得る。しかしながら、温置時間は、アッセイフォーマット、溶液の容積、濃度などに依存する。通常、アッセイは、周囲温度で実施されるが、温度の広範囲にわたって実施することが可能である。
【０２８８】
ＢＡＦＦ結合分子の治療的使用。本発明のＢＡＦＦ結合分子は、Ｂ細胞によって媒介される自己免疫疾患の治療において特に有用であり得る。特に、本発明のＢＡＦＦ分子は、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）並びに狼瘡関連疾患及び症状などの狼瘡を治療し、予防し、軽減し、診断し、又は予測する上で有用であり得る。他の好ましい適応症には、Ｂ細胞リンパ腫などＢ細胞によって媒介される癌が含まれる。
【０２８９】
本発明の化合物は、関節の炎症性症状を治療するために使用することも可能である。関節の炎症性症状は、様々な程度で、世界中で何百万人もの人々を苦しめ、身体を障害もたらす慢性の関節疾患である。関節リウマチは、滑膜に由来する、パンヌスと称される増殖性浸潤性結合組織によって、軟骨及び骨がゆっくり侵食される関節結合部の疾病である。本疾病は、滑液体包、腱鞘及び腱などの関節周囲構造並びに皮下組織、心血管系、肺、脾臓、リンパ節、骨格筋、神経系（中枢及び末梢）及び眼などの関節外組織を含み得る（Ｓｉｌｂｅｒｂｅｒｇ  （１９８５），Ａｎｄｅｒｓｏｎ’ｓ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｋｉｓｓａｎｅ  （ｅｄ．），１１：１８２８）。骨関節炎は、関節軟骨の変性性変化並びに関節周囲の骨及び軟骨の反応性増殖によって特徴付けられる一般的な関節疾患である。骨関節炎は、異化及び同化刺激に対する軟骨細胞の不適切な応答から生じ得る細胞媒介性の活発なプロセスである。報告によれば、初期の骨関節炎において、関節軟骨の幾つかのマトリックス分子の変化が起こる（Ｔｈｏｎａｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３），Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｃｌｉｎｉｃｓ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｍｏｓｋｏｗｉｔｚ  （ｅｄ．），１９：６３５−６５７  ａｎｄ  Ｓｈｉｎｍｅｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２），Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．，３５：１３０４−１３０８）。ＴＡＬＬ−１、ＴＡＬＬ−１Ｒ及びこれらの調節物質は、これら及び関連症状の治療において有用であると考えられている。
【０２９０】
ＢＡＦＦ結合分子は、急性膵炎；ＡＬＳ；アルツハイマー病；喘息；アテローム性動脈硬化症；自己免疫性溶血性貧血、癌、特に、Ｂ細胞に関連する癌；悪液質／食欲不振；慢性疲労症候群；肝硬変（例えば、原発性胆汁性肝硬変；糖尿病（例えば、インシュリン糖尿病）；発熱；ＩｇＡ糸球体腎炎及び原発性糸球体腎炎などの糸球体腎炎；グッドパスチャー症候群；ギランバレー症候群；移植片対宿主病；橋本甲状腺炎；出血性ショック；痛覚過敏；炎症性腸疾患；骨関節炎、乾癬性関節炎及び関節リウマチなどの関節の炎症性症状；筋挫傷、捻挫、軟骨損傷、外傷、整形外科手術、感染又はその他の疾病過程から生じる炎症症状；インシュリン依存性糖尿病；脳虚血（例えば、外傷の結果としての脳傷害、てんかん、出血又は発作（これらの各々は、神経変性を導き得る。））虚血性傷害などの虚血性傷害；学習障害；肺疾患（例えば、ＡＲＤＳ）；狼瘡、特に、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）；多発性骨髄腫；多発性硬化症；重症筋無力症；骨髄性（例えば、ＡＭＬ及びＣＭＬ）及びその他の白血病；筋症（例えば、特に、敗血症における筋肉タンパク質代謝）；（例えば、ＨＩＶによって誘導される）神経毒性；骨粗鬆症；疼痛；パーキンソン病；天疱瘡；多発性筋炎／皮膚筋炎；自己免疫性肺炎症などの肺炎症；早期陣痛；乾癬；ライター病；再灌流傷害；敗血性ショック；放射線療法由来の副作用；シェーグレン症候群；睡眠障害；側頭下顎骨関節疾患；突発性血小板減少症及び自己免疫性新生児血小板減少症などの血小板減少症；腫瘍転移；ブドウ膜炎；及び血管炎など、多数のさらなる疾病及び疾患の治療においても有用であり得る。
【０２９１】
併用療法。発明の治療法、組成物及び化合物は、血小板欠乏及び他の症候によって特徴付けられる疾病の治療において、単独で、又は他のサイトカイン、可溶性Ｍｐｌ受容体、造血因子、インターロイキン、成長因子又は抗体と組み合わせても使用され得る。本発明の化合物は、ＩＬ−３又はＧＭ−ＣＳＦなどの造血の一般的刺激物質と組み合わせて、血小板減少症の幾つかの形態を治療する上で有用であると予測される。他の巨核芽球刺激因子、すなわち、ｍｅｇ−ＣＳＦ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）又は巨核芽球刺激活性を有する他の分子も、Ｍｐｌリガンドとともに使用し得る。このような同時投与のためのさらなる典型的なサイトカイン又は造血因子には、ＩＬ−１α、Ｉｌ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＥＰＯ、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、コンセンサスインターフェロン、ＩＦＮ−β又はＩＦＮ−γが含まれる。さらに、同時又は順次に、一旦巨核芽球が成熟形態に達したときに、巨核芽球の血小板への分断を引き起こす効果を有すると見受けられる可溶性哺乳動物Ｍｐｌ受容体の有効量を投与することが有用であり得る。従って、（成熟した巨核芽球の数を増大させるために）本発明の化合物を投与した後に、（リガンドを不活化し、成熟した巨核芽球に血小板を産生させるために）可溶性Ｍｐ１受容体を投与することは、血小板産生を刺激する特に有効な手段であると予測される。上記投薬量は、治療組成物中のこのような追加成分を補償するように調整される。治療を受けた患者の進行は、慣用法によってモニターすることが可能である。
【０２９２】
血小板及び／又は巨核芽球及び関連細胞の組成物に本発明の化合物を添加する場合には、含められるべき量は、一般に、本分野において公知の技術及びアッセイによって、実験的に確立される。典型的な量の範囲は、０．１μｇから１ｍｇの本発明の化合物／１０６細胞である。
【０２９３】
トキシンペプチドを取り込む治療薬。本発明の組成物の幾つかの実施形態は、追加機能部分として、トキシンペプチドを取り込み、該トキシンペプチドは、このような目的のイオンチャンネルの未変性リガンドのアゴニスト、模倣物又はアンタゴニストとして、目的のイオンチャンネルに結合する能力に起因する薬理学的活性を有することが可能である。従って、本発明の組成物のこのような実施形態は、イオンチャンネルに伴う病変の治療において有用性を有することができる。イオンチャンネルへの公知の関連を有する遺伝病（「チャンネル病（ｃｈａｎｎｅｌｏｐａｔｈｙ）」）は、医薬の様々な分野を包含し、その幾つかには、神経学、腎臓学、筋肉学及び心臓学が含まれる。イオンチャンネル（カッコ内は、チャンネルの型）を原因とする遺伝疾患のリストには、以下のものが含まれる。
【０２９４】
・嚢胞性繊維症（Ｃｌ−チャンネル；ＣＦＴＲ）、
・デント病（タンパク質尿及び高カルシウム尿症；Ｃｌ−チャンネル；ＣＬＣＮ５）、
・大理石骨病（Ｃｌ−チャンネル；ＣＬＣＮ７）、
・家族性高インシュリン血症（ＳＵＲ１；ＫＣＮＪ１１；Ｋチャンネル）、
・糖尿病（ＫＡＴＰ／ＳＵＲチャンネル）、
・アンデルセン症候群（ＫＣＮＪ２、Ｋｉｒ２．１Ｋチャンネル）、
・バーター症候群（ＫＣＮＪ１；Ｋｉｒ１．１／ＲＯＭＫ；Ｋチャンネル）、
・遺伝性難聴（ＫＣＮＱ４；Ｋチャンネル）、
・遺伝性高血圧（リドル症候群）；ＳＣＮＮ１；上皮ＮＡチャンネル）、
・拡張型心筋症（ＳＵＲ２；Ｋチャンネル）、
・ＱＴ延長症候群又は心不整脈（心臓のカリウム及びナトリウムチャンネル）、
・ティモシー症候群（ＣＡＣＮＡ１Ｃ、Ｃａｖ１．２）、
・筋無力症候群（ＣＨＲＮＡ、ＣＨＲＮＢ、ＣＮＲＮＥ；ｎＡＣｈＲ）及び様々な他のミオパシー、
・高カリウム性周期性四肢麻痺（Ｎａ及びＫチャンネル）、
・てんかん（Ｎａ＋及びＫ＋チャンネル）、
・片麻痺性偏頭痛（ＣＡＣＮＡ１Ａ、Ｃａｖ２．１Ｃａ２＋チャンネル及びＡＴＰ１Ａ２）、
・セントラルコア病（ＲＹＲ１、ＲｙＲ１；Ｃａ２＋チャンネル）、及び
・パラミオトニア及びミオトニア（Ｎａ＋、Ｃｌ−チャンネル）。
【０２９５】
Ｐｔａｃｅｋ  ａｎｄ  Ｙ−Ｈ  Ｆｕ（２００４），Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．６１：１６６−８；Ｂ．Ａ．Ｎｉｅｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），ＥＭＢＯ  ｒｅｐｏｒｔｓ  ２１：５６８−７３；Ｆ．Ｌｅｈｍａｎｎ−Ｈｏｒｎ  ａｎｄ  Ｋ．Ｊｕｒｋａｔ−Ｒｏｔｔ（１９９９），Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．７９：１３１７−７２を参照。先述のリストは遺伝性の疾患に関するが、これらの疾患中に引用されているチャンネルを標的とする分子は、他の起源又は起源が不明な関連疾患を治療する上でも有用であり得る。
【０２９６】
先述の疾患に加えて、イオンチャンネルを以下の治療のための標的として裏付ける証拠も提供されている。
【０２９７】
・鎌型赤血球貧血症（ＩＫＣａ１）−鎌型赤血球貧血症では、赤血球からの水分の喪失が、ヘモグロビンの多量体化をもたらし、その後、溶血及び血管の閉塞をもたらす。いわゆるガルドスチャンネル（すなわち、ＩＫＣａ１）を通じたカリウム流出後に、水分の喪失が起こる。従って、ＩＫＣａ１の遮断は、鎌形赤血球貧血症に対する治療的処置となり得る。
【０２９８】
・緑内障（ＢＫＣａ）−緑内障では、眼内圧が高すぎ、視神経の損傷、異常な眼機能及びを引き起こし、失明に至る場合もある。ＢＫＣａカリウムチャンネルの遮断は、眼内液の分泌を低下させ、平滑筋収縮を増加させることが可能であり、より低い眼内圧と眼内の神経保護をもたらす可能性がある。
【０２９９】
・多発性硬化症（Ｋｖ、ＫＣａ）、
・乾癬（Ｋｖ、ＫＣａ）、
・関節炎（Ｋｖ、ＫＣａ）、
・喘息（ＫＣａ、Ｋｖ）、
・アレルギー（ＫＣａ、Ｋｖ）、
・ＣＯＰＤ（ＫＣａ、Ｋｖ、Ｃａ）、
・アレルギー性鼻炎（ＫＣａ、Ｋｖ）、
・肺繊維症、
・狼瘡（ＩＫＣａ１、Ｋｖ）、
・移植、ＧｖＨＤ（ＫＣａ、Ｋｖ）、
・炎症性骨吸収（ＫＣａ、Ｋｖ）、
・歯周病（ＫＣａ、Ｋｖ）、
・糖尿病、１型（Ｋｖ）−１型糖尿病は、異常なグルコース、タンパク質及び脂質代謝を特徴とする自己免疫疾患であり、インシュリン欠乏又は耐性を伴う。本疾患では、Ｋｖ１．３発現Ｔリンパ球が、膵島を攻撃及び破壊し、β細胞の喪失をもたらす。Ｋｖ１．３の遮断は、炎症性サイトカインを減少させる。さらに、Ｋｖ１．３の遮断は、形質膜へのＧＬＵＴ４の転位を促進し、これにより、インシュリン感受性を増加させる。
【０３００】
・肥満（Ｋｖ）、−Ｋｖ１．３は、エネルギー恒常性の調節及び食事によって誘発される肥満からの保護において重大な役割を果たしているようである。従って、Ｋｖ１．３遮断剤は、代謝速度を増加させることが可能であり、より大きなエネルギー使用及び減少した体重をもたらす。
【０３０１】
・再狭窄（ＫＣａ、Ｃａ２＋）、−血管平滑筋細胞の増殖及び遊走は、新生内膜肥厚及び血管の再狭窄をもたらすことが可能である。過剰な新生内膜血管平滑筋細胞増殖には、ＩＫＣａ１の上昇した発現を伴う。従って、ＩＫＣａ１の遮断は、血管形成術後の再狭窄を防ぐための治療的戦略となり得る。
【０３０２】
・虚血（ＫＣａ、Ｃａ２＋）−神経又は心虚血、細胞膜の脱分極は、電圧開口型ナトリウム及びカルシウムチャンネルの開口をもたらす。続いて、これは、細胞に対して有害であるカルシウムの過剰負荷をもたらし得る。電圧開口型ナトリウム及び／又はカルシウムチャンネルの遮断は、カルシウムの過剰負荷を低減し、細胞保護効果を与えることが可能である。さらに、細胞膜電位の調節及び安定化におけるそれらの重大な役割のために、電圧及びカルシウム活性化されるカリウムチャンネルの調節物質も、カルシウムの過剰負荷を低減し、細胞を保護するように作用することが可能である。
【０３０３】
・腎性失禁（ＫＣａ）、腎性失禁は、機能亢進した膀胱平滑筋細胞に関連する。カルシウムによって活性化されるカリウムチャンネルは、膀胱平滑筋細胞中で発現され、これらは膜電位を調節し、細胞収縮の力及び頻度を間接的に調節する。従って、カルシウムによって活性化されるカリウムチャンネルの開口剤は、膀胱内の電気的及び収縮活性を弱め、排尿の刺激の低下をもたらす機構を提供する。
【０３０４】
・骨粗鬆症（Ｋｖ）、
・偏頭痛を含む疼痛（Ｎａｖ、ＴＲＰ［一過性受容体電位チャンネル］、Ｐ２Ｘ、Ｃａ２＋、Ｎ型電圧開口型カルシウムチャンネルは、脊髄中の侵害受容神経伝達の中心的制御物質である。ジコノチド（Ｎ型カルシウムチャンネルのペプチド遮断剤）は、侵害受容神経伝達を低下させ、ヒトにおける重度の慢性痛の症状の緩和について、世界で承認されている。侵害受容特異的Ｎ型カルシウムチャンネルの新規遮断剤は、減少した副作用特性を有する鎮痛剤で改善される。
【０３０５】
・高血圧（Ｃａ２＋）、−Ｌ型及びＴ型電圧開口型カルシウムチャンネルは、血管平滑筋細胞中で発現され、ここで、興奮−収縮のカップリング及び細胞の増殖を調節する。特に、Ｔ型カルシウムチャンネルの活性は、高血圧時の新生内膜形成に関連している。Ｌ型及びＴ型カルシウムチャンネルの遮断剤は、カルシウム流入を低下させ、平滑筋細胞の収縮を阻害するので、高血圧の臨床的治療に対して有用である。
【０３０６】
・創傷治癒、細胞遊走は、創傷治癒において中心的な役割を果たしている。細胞内カルシウム勾配は、ケラチン細胞及び繊維芽細胞中の細胞遊走機構の重要な制御物質として推定されている。さらに、細胞膜を横切るイオン流動は、細胞容積の変化を伴う。細胞容積を調節することによって、イオンチャンネルは、細胞遊走機構の稼働に必要とされる細胞内環境に寄与する。特に、ＩＫＣａ１は、細胞遊走のために、全般的に必要とされるようである。さらに、Ｋｖ１．３、Ｋｖ３．１、ＮＭＤＡ受容体及びＮ型カルシウムチャンネルは、リンパ球及び神経細胞の遊走と関連する。
【０３０７】
・発作、
・アルツハイマー病、
パーキンソン病（ｎＡＣＨＲ、Ｎａｖ）、
躁うつ病（Ｎａｖ、Ｃａｖ）
・癌、多くのカリウムチャンネル遺伝子が増幅され、タンパク質サブユニットが多くの癌性症状において上方制御されている。カリウムチャンネル上方制御のための病態生理学的役割と合致して、カリウムチャンネル遮断剤は、おそらくは、カルシウム流入の阻害及びカルシウム依存性遺伝子発現に対する効果を通じて、子宮癌細胞及び肝細胞癌細胞の増殖を抑制することが示されている。
・様々な神経学的、心血管、代謝的及び自己免疫疾患
【０３０８】
イオンチャンネルのアゴニスト及びアンタゴニストは何れも、治療的な利益を達成することが可能である。治療的な利益は、例えば、Ｋｖ１．３、ＩＫＣａ１、ＳＫＣａ、ＢＫＣａ、Ｎ型又はＴ型Ｃａ２＋チャンネルなどから得ることが可能である。これらのチャンネルの小分子及びペプチドアンタゴニストは、インビトロ及びインビボでの有用性を有することが示されている。
【０３０９】
本明細書に記載されている疾病及び薬理学的に活性な付加部分は典型的なものに過ぎず、本発明の方法を用いて調製することが可能な本発明の薬理学的に活性な化合物及び組成物又は本発明の利点により治療することが可能な疾病及び疾患の範囲を限定するものではない。
【０３１０】
医薬組成物
総論。本発明は、本発明の組成物と、及び医薬として許容される担体とを含む医薬組成物も提供する。このような医薬組成物は、多様な送達経路、例えば、注射若しくは注入によるなどの血管内送達経路、皮下、筋肉内、腹腔内、硬膜外又は髄腔内送達経路、又は経口、腸内、経肺（例えば、吸入）、鼻内、経粘膜（例えば、舌下投与）、経皮又はその他の送達経路及び／又は本分野において公知の投与の形態によって、患者に投与するように設定することが可能である。本発明の医薬組成物は、液体形態で調製することができ、又は凍結乾燥された形態などの乾燥された粉末形態であり得る。経口又は経腸用途の場合、医薬組成物は、例えば、錠剤、トローチ剤、舐剤、水性若しくは油性懸濁液剤、分散性散剤又は顆粒剤、エマルジョン、硬若しくは軟カプセル剤、シロップ、エリキシル又は経腸処方として、設定することが可能である。
【０３１１】
本発明の実施において、「医薬として許容される担体」は、単一に又は組み合わせた、医薬として許容される全ての希釈剤、賦形剤、分散剤、結合剤、充填剤、流動促進剤、抗摩擦剤、圧縮補助、錠剤崩壊剤（崩壊剤）、懸濁剤、潤滑剤、着香剤、着臭剤、甘味剤、浸透若しくは貫通強化物質、防腐剤、界面活性剤、可溶化剤、乳化剤、濃縮剤、アジュバント、色素、コーティング、封入材料及び／又は他の添加物など、医薬組成物を調合する上で有用である、当業者に公知の生理的に耐容される全ての物質である。このような医薬組成物は、様々な緩衝液内容物（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、アセタート、ホスファート）、ｐＨ及びイオン強度の希釈剤；界面活性剤及び可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、防腐剤（例えば、Ｔｉｍｅｒｓｏｌ（登録商標）、ベンジルアルコール）及び充填剤（例えば、ラクトース、マニトール）などの添加物；ポリ乳酸、ポリグリコール酸などのポリマー性化合物の粒状調製物中への、又はリポソーム中への材料の取り込みを含むことが可能である。ヒアルロン酸も使用することが可能であり、これは、循環中の持続時間を促進する効果を有し得る。このような組成物は、本発明のタンパク質及び誘導体の物理的状態、安定性、インビボ放出の速度及びインビボクリアランス速度に影響を与えることが可能である。例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．（１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ  １８０４２）  ｐａｇｅｓ  １４３５−１７１２」（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。前記組成物は、液体形態で調製することが可能であり、又は凍結乾燥された形態などの乾燥された粉末とすることが可能である。経皮又は経粘膜製剤のように、埋め込み可能な徐放製剤も有用である。これに加えて（又はこれに代えて）、本発明は、当業者に公知の様々な遅延放出若しくは徐放製剤又は微粒子製剤の何れかにおいて、例えば、経肺、鼻内又は皮下送達経路を介して投与されることが可能な徐放微粒子製剤において使用するための組成物を提供する。
【０３１２】
不活性材料を用いて、本発明の組成物を希釈し、又は本発明の医薬組成物の容量を増加させることが可能である。このような希釈剤は、炭水化物、特に、マニトール、α−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、修飾されたデキストラン及びデンプンを含むことが可能である。ある種の無機塩は、カルシウム三リン酸、炭酸マグネシウム及び塩化ナトリウムなど、充填剤としても使用し得る。幾つかの市販の希釈剤は、Ｆａｓｔ−Ｆｌｏ、Ｅｍｄｅｘ、ＳＴＡ−Ｒｘ  １５００、Ｅｍｃｏｍｐｒｅｓｓ及びＡｖｉｃｅｌｌである。
【０３１３】
様々な慣用の濃縮剤が、アルギナート、キサンタンガム又は石油など（これらに限定されない。）、医薬組成物のクリーム、軟膏、坐薬及びゲル構造において有用である。本発明の医薬組成物のこのような構成においても使用し得る。ポリエチレングリコールモノラウラート、ジメチルスルホキシド、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピロリドン又は３−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−２−ピロリドンなどの浸透又は貫通増強物質も使用することが可能である。ヒドロゲルマトリックスを製造するための有用な技術は公知である。（例えば、Ｆｅｉｊｅｎ，Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔｓ，米国特許第４，９２５，６７７号；Ｓｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｐＨ／ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｆｏｒ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔｓ，ＷＯ００／３８６５１  Ａ１）。このような生物分解性ゲルマトリックスは、例えば、タンパク質成分と多糖又はムコポリ多糖成分を架橋し、次いで、送達されるべき本発明の組成物を充填することによって形成することが可能である。
【０３１４】
無菌溶液又は懸濁液である本発明の液体医薬組成物は、例えば、筋肉内、髄腔内、硬膜外、血管内（例えば、静脈内又は動脈内）、腹腔内又は皮下注射によって、患者に投与することが可能である。（例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，米国特許第６，２４５，７４０号及びＷＯ００／３８６５２Ａ１を参照されたい。）。無菌溶液は、静脈内注入によって投与することも可能である。本発明の組成物は、無菌水、生理的食塩水、緩衝化された生理的食塩水又は他の適切な無菌注射可能溶媒を用いて患者に投与する前に、都合の良い時点で溶解又は懸濁することが可能な無菌固体医薬組成物（凍結乾燥された粉末など）中に含めることが可能である。
【０３１５】
植え込み可能な徐放製剤も、本発明の医薬組成物の有用な実施形態である。例えば、医薬として許容される担体（ヒト又はヒト以外の脊椎動物の体内又は皮膚の下に植え込まれた生物分解性マトリックスである。）は、上記のものと類似のヒドロゲルであり得る。あるいは、医薬として許容される担体は、ポリ−αアミノ酸成分から形成され得る。（Ｓｉｄｍａｎ，Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ，ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｄｅｖｉｃｅ，ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｕｓｉｎｇ  ｓａｍｅ，米国特許第４，３５１，３３７号）。薬物の送達用インプラントを作製するための他の技術も公知であり、本発明において有用である。
【０３１６】
粉末形態において、医薬として許容される担体は、細かく分割された固体であり、これは、本発明の組成物を含む細かく分割された活性成分と混合される。例えば、幾つかの実施形態において、医薬組成物が吸入剤として構成されている場合には、粉末形態が有用である。（例えば、Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  ｄｒｙ  ｐｏｗｄｅｒ  ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ，ＷＯ２００４／０１７９１８；Ｔｒｕｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓａｌｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＧＲＰ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ＢＩＢＮ４０９６  ａｎｄ  ｉｎｈａｌａｂｌｅ  ｐｏｗｄｅｒｅｄ  ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｈｅｍ，米国特許第６，９００，３１７号を参照されたい。）。
【０３１７】
不活性材料を用いて、本発明の化合物を希釈し、又は本発明の化合物の容量を増加させることが可能である。これらの希釈剤は、炭水化物、特に、マニトール、α−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、修飾されたデキストラン及びデンプンを含むことが可能である。ある種の無機塩は、カルシウム三リン酸、炭酸マグネシウム及び塩化ナトリウムなど、充填剤としても使用することが可能である。幾つかの市販の希釈剤は、Ｆａｓｔ−ＦｌｏＴＭ、ＥｍｄｅｘＴＭ、ＳＴＡ−Ｒｘ  １５００ＴＭ、ＥｍｃｏｍｐｒｅｓｓＴＭ及びＡｖｉｃｅｌｌＴＭである。
【０３１８】
固体剤形の医薬組成物の製剤中には、崩壊剤を含めることが可能である。崩壊剤として使用される材料には、デンプンを基礎とした市販の崩壊剤ＥｘｐｌｏｔａｂＴＭなどのデンプンが含まれるが、これに限定されない。グリコール酸デンプンナトリウム、ＡｍｂｅｒｌｉｔｅＴＭ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラミロペクチン（ｕｌｔｒａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ）、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジの皮、酸性カルボキシメチルセルロース、天然の海綿及びベントナイトは全て使用することが可能である。不溶性の陽イオン交換樹脂は、崩壊剤の別の形態である。粉末化されたゴムは、崩壊剤として、及び結合剤として使用することが可能であり、これらには、寒天、インドゴム又はトラガカントなどの粉末化されたゴムが含まれ得る。アルギン酸及びそのナトリウム塩も、崩壊剤として有用である。
【０３１９】
結合剤は、治療剤を一体化させて硬い錠剤を形成するために使用することが可能であり、アラビアゴム、トラガカント、デンプン及びゼラチンなどの天然産物から得られる材料を含む。その他には、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）及びカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）が含まれる。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）及びヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）は何れも、治療剤を顆粒化するためにアルコール溶液中で使用することが可能である。
【０３２０】
減摩剤は、調合プロセス時の固着を防ぐために、治療剤の製剤中に含めることが可能である。潤滑剤は、治療剤とダイ壁との間の層として使用することが可能であり、これらには、ステアリン酸のマグネシウム及びカルシウム塩などのステアリン酸、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、液体パラフィン、植物油及び蝋が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、様々な分子量のポリエチレングリコール、Ｃａｒｂｏｗａｘ４０００及び６０００などの可溶性潤滑剤も使用することが可能である。
【０３２１】
調合時の薬物の流動特性を改善することができ、及び圧縮時の転位を補助するための滑り剤を添加し得る。滑り剤には、デンプン、タルク、焼成シリカ及び水和されたケイアルミン酸が含まれ得る。
【０３２２】
本発明の化合物の水性環境中への溶解を補助するために、界面活性剤を、湿潤剤として添加し得る。界面活性剤には、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム及びスルホン酸ジオクチルナトリウムなどの陰イオン性界面活性剤が含まれ得る。陽イオン性界面活性剤を使用し得、塩化ベンズアルコニウム又は塩化ベンゾエトニウムを含み得る。界面活性剤として製剤中に含め得る非イオン性界面活性剤の候補のリストは、ラウロマクロゴール４００、ポリオキシル４０ステアラート、ポリオキシエチレン硬化ひまし油１０、５０及び６０、モノステアリン酸グリセロール、ポリソルベート４０、６０、６５及び８０、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース並びにカルボキシメチルセルロースである。これらの界面活性剤は、単独で、又は異なる比率での混合物として、タンパク質又は誘導体の製剤中に存在することができる。
【０３２３】
経口剤形。本発明の組成物の経口剤形も有用である。必要であれば、組成物は、経口送達が有効であるように化学的に修飾することが可能である。一般的に、想定される化学的修飾は、分子自体への少なくとも１つの部分の付着であり、前記部分は、（ａ）タンパク質分解の阻害及び（ｂ）胃又は腸からの血流中への取り込みを可能とする。化合物の全体的な安定性の増加及び体内での循環時間の増加も望まれる。本発明において、共有結合された半減期延長部分として有用な部分も、この目的のために使用することが可能である。このような部分の例には、ＰＥＧ，エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン及びポリプロリンが含まれる。例えば、「Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ  （１９８１），Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｄｄｕｃｔｓ，Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇｓ（Ｈｏｃｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ，ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ｐｐ  ３６７−８３；Ｎｅｗｍａｒｋ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８２），Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，４：１８５−９」を参照されたい。使用され得る他のポリマーは、ポリ−１，３−ジオキソラン及びポリ−１，３，６−チオキソカンである。前記のとおり、医薬的な使用に好ましいのは、ＰＥＧ部分である。
【０３２４】
経口送達剤形の場合、本発明の治療用化合物の吸収を増加させるための担体として、ナトリウムＮ−（８−［２−ヒドロキシベンゾイル］アミノ）カプリラート（ＳＮＡＣ）などの修飾された脂肪族アミノ酸の塩を使用することも可能である。ＳＮＡＣを使用するヘパリン製剤の臨床的効力は、Ｅｍｉｓｐｈｅｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより行われた第ＩＩ相試験において証明されている。米国特許第５，７９２，４５１号，「Ｏｒａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ」を参照されたい。
【０３２５】
一実施形態において、医薬として許容される担体は液体とすることが可能であり、医薬組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エリキシル又は加圧された組成物の形態で調製される。活性成分（例えば、本発明の組成物）は、水、有機溶媒、両者の混合物又は医薬として許容される油若しくは脂肪などの医薬として許容される液体担体中に溶解し、希釈し又は懸濁することが可能である。液体担体は、界面活性剤及び／又は可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０）、乳化剤、適切なｐＨの緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、アセタート、ホスファート）、アジュバント、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えば、Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ、ベンジルアルコール）、甘味剤、着香剤、懸濁剤、濃縮剤、増量物質（例えば、ラクトース、マンニトール）；着色料、粘度調節物質、安定化物質、電解質、浸透溶質又は浸透圧制御物質などの他の適切な医薬添加物を含有することが可能である。本発明の組成物の取り込みを増強させるために、製剤中に添加物を含めることも可能である。この特性を有する可能性がある添加物は、例えば、脂肪酸オレイン酸、リノール酸及びリノレン酸である。
【０３２６】
有用であるのは、上記Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （１９９０）の第８９章（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。）に一般的に記載されている経口固体剤形である。固体剤形には、錠剤、カプセル、丸薬、トローチ又はドロップ、カシェ剤又はペレットが含まれる。また、本組成物を調合するために、（例えば、米国特許第４，９２５，６７３号に報告されているプロテイノイド小球体のような）リポソーム封入又はプロテイノイド封入を使用することが可能である。リポソーム封入を使用することが可能であり、様々なポリマーでリポソームを誘導体化することが可能である（例えば、米国特許第５，０１３，５５６号）。治療剤に対して可能な固体剤形の記述は、「Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｋ．，Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ（１９７９），ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｇ．Ｓ．Ｂａｎｋｅｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｔ．Ｒｈｏｄｅｓ，ｉｎ  Ｃｈａｐｔｅｒ  １０」（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。）に記載されている。一般に、製剤は、本発明の化合物、及び胃環境に対する保護及び腸内での生物学的に活性な材料の放出を可能とする不活性成分を含む。
【０３２７】
本発明の組成物は、粒径約１ｍｍの顆粒又はペレットの形態の細かい多微粒子状物質として、製剤中に含めることが可能である。カプセル投与用の材料の製剤も、粉末、軽く圧縮されたプラグ又は錠剤でもあり得る。治療剤は、圧縮によって調製することが可能である。
【０３２８】
着色剤及び着香剤は、全て含めることが可能である。例えば、（リポソーム又は小球体封入などによって）タンパク質（又は誘導体）を調合し、次いで、着色剤及び着香剤を含有する冷蔵された飲料などの飲食物内にさらに含有させることが可能である。
【０３２９】
錠剤形態で、活性成分は、適切な割合で、必要な圧縮特性を有する医薬として許容される担体と混合され、所望の形状及びサイズに圧縮される。粉末及び錠剤は、好ましくは、活性成分の最大９９％を含有する。適切な固体担体には、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリドン、低融点蝋及びイオン交換樹脂が含まれる。
【０３３０】
徐放製剤が望ましい場合があり得る。本発明の組成物は、拡散又は浸出機構の何れか、例えばガムによって放出を可能とする不活性マトリックス中に取り込ませることが可能である。ゆっくり変性するマトリックス、例えば、アルギナート、多糖を、製剤中に取り込ませることも可能である。本発明の組成物の徐放の別の形態は、ＯｒｏｓＴＭ治療システム（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐ．）に基づく方法による。すなわち、薬物は、水の浸入を可能とし、浸透圧効果によって、単一の小さな開口部を通じて薬物を押し出すことが可能な半透膜中に封入される。幾つかの腸溶コーティングも、遅延した放出効果も有する。
【０３３１】
調合のために、他のコーティングを使用することが可能である。これらには、コーティングパン中に適用可能な様々な糖が含まれる。また、治療剤は、フィルムコーティングされた錠剤に入れて与えることも可能であり、この場合に使用される物質は、２つのグループに分類される。第１のグループは、非腸溶性物質であり、これらには、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、プロビドンおよびポリエチレングリコールが含まれる。第２のグループは、一般にはフタル酸のエステルである腸溶性物質よりなる。
【０３３２】
最適なフィルムコーティングを得るために、物質の混合物を使用し得る。フィルムコーティングは、パンコーター内若しくは流動床内で、又は圧縮コーティングにより行なうことができる。
【０３３３】
経肺送達形態。本発明の組成物の経肺送達も有用である。該タンパク質（または誘導体）は、吸入されながら哺乳動物の肺に運搬され、肺上皮内層（ｌｕｎｇ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｌｉｎｉｎｇ）を越えて血流に入る。（これに関する他の報告には、Ａｄｊｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａ．Ｒｅｓ．（１９９０）７：５６５−９；Ａｄｊｅｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０），Ｉｎｔｅｒｎａｌ．Ｊ−Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ６３：１３５−４４（酢酸リュープロリド）；Ｂｒａｑｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３（ｓｕｐｐｌ．５）：ｓ．１４３−１４６（エンドセリン−１）；Ｈｕｂｂａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），Ａｎｎａｌｓ  Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．３：２０６−１２（αｌ−アンチトリプシン）；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８４；１１４５−６（α１−プロテイナーゼ）；Ｏｓｗｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍａｒｃｈ  １９９０），“Ａｅｒｏｓｏｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｐｒｏｃ．Ｓｙｍｐ．Ｒｅｓｐ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ＩＩＫｅｙｓｔｏｎｅ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ（組み換えヒト成長ホルモン）；Ｄｅｂｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：３４８２−８（インターフェロン−γ及び腫瘍壊死因子α）及びＰｌａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許番号５，２８４，６５６（顆粒球コロニー刺激因子）が含まれる。本発明の実施において有用であるのは、治療用産物の経肺送達用に設計された多種多様な機械装置（噴霧器、定量吸入器及び粉末吸入器などの、いずれも当業者によく知られたものが含まれるが、これらに限定されるものではない。）である。本発明の実施に適した商業的に入手可能な装置のいくつかの具体例としては、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）製のＵｌｔｒａｖｅｎｔ噴霧器、Ｍａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ）製のＡｃｏｒｎＩＩ噴霧器、Ｇｌａｘｏ  Ｉｎｃ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ）製のＶｅｎｔｏｌｉｎ定量吸入器およびＦｉｓｏｎｓ  Ｃｏｒｐ．（Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）製のＳｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器が挙げられる。（例えば、Ｈｅｌｇｅｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ  ｄｅｖｉｃｅ，米国特許第６，８９２，７２８号；ＭｃＤｅｒｍｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｙ  ｐｏｗｄｅｒ  ｉｎｈａｌｅｒ，ＷＯ０２／１１８０１Ａ１；Ｏｈｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｈａｌａｎｔ  ｍｅｄｉｃａｔｏｒ，米国特許第６，２７３，０８６号）。
【０３３４】
このような何れの装置においても、本発明の化合物の投薬に適した製剤を使用することが必要である。典型的には、各製剤は、用いる装置のタイプに特有のものであり、治療において有用な希釈剤、佐剤および／または担体に加えて適切な噴射物質の使用を伴い得る。
【０３３５】
遠位の肺への最も効果的な送達のためには、本発明の化合物は、１０μｍ（またはミクロン）未満、最も好ましくは０．５から５μｍの平均粒径を有する粒子形態で遊離に製造されるのが最も有利なはずである。
【０３３６】
医薬として許容される担体には、トレハロース、マンニトール、キシリトール、スクロース、ラクトース及びソルビトールなどの炭水化物が含まれる。製剤中で使用するための他の成分には、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣおよびＤＯＰＣが含まれうる。天然または合成界面活性剤を使用することができる。ＰＥＧを使用することができる（これは、該タンパク質または類縁体の誘導体化におけるその使用と独立して使用することさえ可能である）。シクロデキストランなどのデキストランを使用することができる。胆汁酸塩および他の関連した増強剤を使用することができる。セルロースおよびセルロース誘導体を使用することができる。緩衝液製剤中での使用など、アミノ酸を使用することができる。
【０３３７】
また、リポソーム、マイクロカプセルまたは小球体、包接複合体、又は他のタイプの担体の使用も想定される。
【０３３８】
噴霧器（ジェット式または超音波式のいずれか）と併用するのに適した製剤は、典型的には、溶液１ｍＬ当たり生物学的活性タンパク質約０．１から２５ｍｇの濃度で水に溶解された本発明の化合物を含む。また、該製剤は、緩衝液及び単純な糖（例えば、タンパク質の安定化および浸透圧の調節用のもの）を含み得る。また、エアロゾルの形成において該溶液の噴霧により生じる該タンパク質の界面誘導凝集を抑制または予防するために、噴霧製剤は界面活性剤を含有することも可能である。
【０３３９】
定量吸入装置と併用する製剤は、一般に、界面活性剤の補助により噴射剤中に懸濁された本発明の化合物を含有する微細化された粉末を含む。該噴射剤は、この目的に用いるあらゆる慣用的物質（クロロフルオロカーボン、ハイドロクロロフルオロカーボン、ハイドロフルオロカーボン、または炭化水素（トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール及び１，１，１，２−テトラフルオロエタンまたはこれらの組合せなど）であってもよい。適切な界面活性剤には、ソルビタントリオレアートおよび大豆レシチンが含まれる。オレイン酸も界面活性剤として有用であり得る。（例えば、Ｂａｃｋｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｅｒｏｓｏｌ  ｄｒｕｇ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｏａｌｋａｎｅｓ  ａｎｄ  ａｌｋｙｌ  ｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，米国特許第６，９３２，９６２号を参照されたい。）。
【０３４０】
粉末吸入装置からの投薬のための製剤は、本発明の化合物を含有する微細化された乾燥粉末を含み、装置からの粉末の分散を促進する量（例えば、該製剤の５０から９０重量％）の増量剤（ラクトース、ソルビトール、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはキシリトールなど）を含むことも可能である。
【０３４１】
経鼻送達形態。本発明において、本発明の組成物及び／又は医薬組成物の鼻内送達も有用であり、鼻内運搬においては、鼻の内部への投与後、該産物の肺内への堆積を要することなく、本発明の組成物及び／又は医薬組成物を直接血流へ通過させることが可能である。鼻内投与に適した製剤には、デキストラン又はシクロデキストランを有する製剤が含まれ、鼻内送達装置は公知である。（例えば、Ｆｒｅｅｚｅｒ、Ｉｎｈａｌｅｒ、米国特許第４，０８３，３６８号を参照）。
【０３４２】
経皮及び経粘膜（例えば、口腔）送達形態。幾つかの実施形態において、本発明の組成物は、医薬として許容される経皮又は経粘膜パッチ又はトローチの一部として構成される。経皮パッチ薬物送達系、例えば、マトリックスタイプの経皮パッチは公知であり、本発明の医薬組成物の幾つかの実施形態を実施するのに有用である。（例えば、Ｃｈｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ／ｐｒｏｇｅｓｔｉｎ  ｄｏｓａｇｅ  ｕｎｉｔ，ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓ，米国特許第４，９０６，１６９号及び同第５，０２３，０８４号；Ｃｌｅａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｍａｔｒｉｘ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ｄｒｕｇ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｄｅｖｉｃｅｓ  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｓａｍｅ，米国特許第４，９１１  ，９１６号；Ｔｅｉｌｌａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＶＡ−ｂａｓｅｄ  ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ｍａｔｒｉｘ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ａｎｄ／ｏｒ  ａ  ｐｒｏｇｅｓｔｏｇｅｎ，米国特許第５，６０５，７０２号；Ｖｅｎｋａｔｅｓｈｗａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｍａｔｒｉｘ  ｆｏｒ  ｃｏａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ  ｅｓｔｒａｄｉｏｌ  ａｎｄ  ａｎｏｔｈｅｒ  ｓｔｅｒｏｉｄ，米国特許第５，７８３，２０８号；Ｅｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ  ａｎｄ  ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｔｏ  ｗｏｍｅｎ，米国特許第５，４６０，８２０号）。治療剤の経粘膜送達用の医薬として許容される様々なシステムも本分野において公知であり、本発明の実施と適合性がある。（例えば、Ｈｅｉｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｍｕｃｏｓａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｒｕｇｓ，米国特許第５，３４６，７０１号及び同第５，５１６，５２３号；Ｌｏｎｇｅｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，米国特許第４，９９４，４３９号）。
【０３４３】
本発明の組成物の口腔送達も有用である。口腔送達製剤は、ペプチドとともに使用するために、本分野において公知である。例えば、経口粘膜（例えば、舌下粘膜）を通じた薬物送達用に設計された公知の錠剤又はパッチ系には、薬物を含有する内側層と、胆汁酸塩又はフシジン酸塩（ｆｕｓｉｄａｔｅ）などの浸透増強物質と、及びヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、デキストラン、ペクチン、ポリビニルピロリドン、デンプン、ゼラチン又はこの目的に対して有用であることが知られた他のポリマーのあらゆる数などの親水性ポリマーとを含む幾つかの実施形態が含まれる。内側層は、口腔の湿った粘膜組織と接触して、これに粘着するように適合された１つの表面を有することが可能であり、上に存在する非粘着性の不活性層に付着する反対側表面を有することが可能である。場合によって、このような経皮送達系は、内側層がさらなる結合剤、着香剤又は充填剤も含有する二層錠剤の形態であり得る。幾つかの有用な系は、浸透増強物質とともに、非イオン性界面活性剤を使用する。経粘膜送達装置は、クリーム、ゲル若しくは軟膏など遊離形態であり得、又は錠剤、パッチ若しくはトローチなどの明確な形態を含み得る。例えば、本発明の組成物の送達は、例えば、接着層、裏打ち層、本発明の組成物を含有する容器を画する浸透膜、該膜の下に位置する剥離シールディスク、１つ又はそれ以上の熱シール及び除去可能な剥離ライナーの積層複合材を含む経皮送達系を介することが可能である。（例えば、Ｅｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｗｉｔｈ  ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｏｖｅｒｌａｙ  ａｎｄ  ｐｅｅｌ  ｓｅａｌ  ｄｉｓｃ，米国特許第５，６６２，９２５号；Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｉｃｅ  ｆｏｒ  ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ  ａｎ  ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｋｉｎ  ｏｒ  ｍｕｃｏｓａ，米国特許第４，８４９，２２４号及び同第４，９８３，３９５号）。これらの例は、利用可能な経粘膜薬物送達技術の単なる例示であり、本発明を限定するものではない。
【０３４４】
投薬量。上記症状の治療方法に関わる投与計画は、薬物の作用を改変する種々の要因（例えば、患者の年齢、状態、体重、性別および食事、いずれかの感染の重症度、投与時間ならびに他の臨床的要因）を考慮して担当医師により決定される。一般には、１日用量は、本発明の化合物０．１から１０００μｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１から１５０μｇ／ｋｇの範囲である。
【０３４５】
以下の実施例は、例示であり、いかなる意味においても、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきでない。
【０３４６】
実施例
【実施例１】
【０３４７】
細菌性発現のために構築されたｈｕＦｃ（ＩｇＧ１）バリアント
例として、ヒトＦｃドメイン（ｈｕＦｃ（ＩｇＧ１）の４つのバリアントを構築した。
【０３４８】
１）Ｑ１４３Ｃ変異を有するｈｕＦｃ（Ｉｇ１Ｇ１）（配列番号５９９の１４３位に；「株１３３００」と表記）を以下のようにして作製した。Ｑ１４３Ｃ変異を導入する２つのＰＣＲ断片を、ｈｕＦｃ（ＩｇＧ１）をコードするプラスミドから増幅した。第一のＰＣＲ断片は、以下の２つのプライマーによって増幅した。
【０３４９】
【化４２】
2009504164.tif 000070
【０３５０】
ｈｕＦｃ（ＩｇＧ１）の最初の８アミノ酸＋ＮｄｅＩ部位を含む１５ヌクレオチドの５’伸長をコードする；及び
【０３５１】
【化４３】
2009504164.tif 000071
【０３５２】
１３９番目のアミノ酸から１４７番目のアミノ酸までのｈｕＦｃ（ＩｇＧ１）の９アミノ酸をコードし、１４３番目のアミノ酸が３’方向にグルタミンからシステインへ変異されている。
【０３５３】
第二のＰＣＲ断片は、以下の２つのプライマーによって増幅した。
【０３５４】
【化４４】
2009504164.tif 000072
【０３５５】
１３９番目のアミノ酸から１４７番目のアミノ酸までのｈｕＦｃ（ＩｇＧ１）の９アミノ酸をコードし、１４３番目のアミノ酸が５’方向にグルタミンからシステインへ変異されている。
【０３５６】
【化４５】
2009504164.tif 000073
【０３５７】
ｈｕＦｃ（ＩｇＧ１）の最後の８アミノ酸、停止コドン及びＸｈｏＩ部位を含む１５ヌクレオチドの３’伸長をコードする。
【０３５８】
再度、プライマー３４３０−３７及び３４２１−８７を用いて、２つのＰＣＲ断片を増幅した。ｐＡＭＧ２１ベクター中にＰＣＲ産物をクローニングし、ＤＮＡ配列決定によって配列を確認した。このプラスミドを有するＥ．コリ株は、株１３３００と名付けられる。
【０３５９】
株１３３００の関連するコード配列は、以下のとおりである。
【０３６０】
【化４６】
2009504164.tif 000074
【０３６１】
このヌクレオチド配列の翻訳は、以下のとおりである。
【０３６２】
株１３３００（ｈｕＦｃ（ＩｇＧ１）Ｑ１４３Ｃ）：
【０３６３】
【化４７】
2009504164.tif 000075
【０３６４】
２）以下のプライマー及び手順を使用し、上記（１）に記載されている手順と類似の手順に従って、Ｌ１３９Ｃ変異を有するｈｕＦｃ（Ｉｇ１Ｇ１）（配列番号５９９の１３９位に；「株１３３２２」と表記）を作製した。
【０３６５】
第一のＰＣＲ断片は、以下の２つのプライマーによって増幅した。
【０３６６】
【化４８】
2009504164.tif 000076
【０３６７】
ｈｕＦｃ（ＩｇＧ１）の最初の８アミノ酸＋ＮｄｅＩ部位を含む１５ヌクレオチドの５’伸長をコードする；及び
【０３６８】
【化４９】
2009504164.tif 000077
【０３６９】
１３５番目のアミノ酸から１４３番目のアミノ酸までのｈｕＦｃ（ＩｇＧ１）の９アミノ酸をコードし、１３８番目のアミノ酸が３’方向にロイシンからシステインへ変異されている。
【０３７０】
第二のＰＣＲ断片は、以下の２つのプライマーによって増幅した。
【０３７１】
【化５０】
2009504164.tif 000078
【０３７２】
１３５番目のアミノ酸から１４３番目のアミノ酸までのｈｕＦｃ（ＩｇＧ１）の９アミノ酸をコードし、１３８番目のアミノ酸が５’方向にロイシンからシステインへ変異されている。
【０３７３】
【化５１】
2009504164.tif 000079
【０３７４】
ｈｕＦｃ（ＩｇＧ１）の最後の８アミノ酸、停止コドン及びＸｈｏＩ部位を含む１５ヌクレオチドの３’伸長をコードする。再度、プライマー３４３０−３７及び３４２１−８７を用いて、２つのＰＣＲ断片を増幅した。ｐＡＭＧ２１ベクター中にＰＣＲ産物をクローニングし、ＤＮＡ配列決定によって配列を確認した。このプラスミドを有するＥ．コリ株は、株１３３２２と名付けられる。
【０３７５】
株１３３２２の関連するコード配列は、以下のとおりである。
【０３７６】
【化５２】
2009504164.tif 000080
【０３７７】
このヌクレオチド配列の翻訳は、以下のとおりである。
【０３７８】
株１３３２２（ｈｕＦｃ（ＩｇＧ１）Ｌ１３９Ｃ）：
【０３７９】
【化５３】
2009504164.tif 000081
【０３８０】
３）以下のプライマー及び手順を使用し、上記（１）に記載されている手順と類似の手順に従って、Ｓ１４５Ｃ変異を有するｈｕＦｃ（Ｉｇ１Ｇ１）（配列番号５９９の１４５位に；「株１３３２３」と表記）を作製した。第一のＰＣＲ断片は、以下の２つのプライマーによって増幅した。
【０３８１】
【化５４】
2009504164.tif 000082
【０３８２】
ｈｕＦｃ（ＩｇＧ１）の最初の８アミノ酸＋ＮｄｅＩ部位を含む１５ヌクレオチドの５’伸長をコードする；及び
【０３８３】
【化５５】
2009504164.tif 000083
【０３８４】
１４１番目のアミノ酸から１４９番目のアミノ酸までのｈｕＦｃ（ＩｇＧ１）の９アミノ酸をコードし、１４５番目のアミノ酸が３’方向にセリンからシステインへ変異されている。
【０３８５】
第二のＰＣＲ断片は、以下の２つのプライマーによって増幅した。
【０３８６】
【化５６】
2009504164.tif 000084
【０３８７】
１４１番目のアミノ酸から１４９番目のアミノ酸までのｈｕＦｃ（ＩｇＧ１）の９アミノ酸をコードし、１４５番目のアミノ酸が５’方向にセリンからシステインへ変異されている。
【０３８８】
【化５７】
2009504164.tif 000085
【０３８９】
ｈｕＦｃ（ＩｇＧ１）の最後の８アミノ酸、停止コドン及びＸｈｏＩ部位を含む１５ヌクレオチドの３’伸長をコードする。再度、プライマー３４３０−３７及び３４２１−８７を用いて、２つのＰＣＲ断片を増幅した。ｐＡＭＧ２１ベクター中にＰＣＲ産物をクローニングし、ＤＮＡ配列決定によって配列を確認した。このプラスミドを有するＥ．コリ株は、株１３３２３と名付けられる。
【０３９０】
株１３３２３の関連するコード配列は、以下のとおりである。
【０３９１】
【化５８】
2009504164.tif 000086
【０３９２】
このヌクレオチド配列の翻訳は、以下のとおりである。
【０３９３】
株１３３２３（ｈｕＦｃ（ＩｇＧ１）Ｓ１４５Ｃ）：
【０３９４】
【化５９】
2009504164.tif 000087
【０３９５】
４）以下のプライマー及び手順を使用し、上記（１）に記載されている手順と類似の手順に従って、Ｓ１９６Ｃ変異を有するｈｕＦｃ（Ｉｇ１Ｇ１）（配列番号５９９の１９６位に；「株１３３２４」と表記）を以下のようにして作製した。第一のＰＣＲ断片は、以下の２つのプライマーによって増幅した。
【０３９６】
【化６０】
2009504164.tif 000088
【０３９７】
ｈｕＦｃ（ＩｇＧ１）の最初の８アミノ酸＋ＮｄｅＩ部位を含む１５ヌクレオチドの５’伸長をコードする；及び
【０３９８】
【化６１】
2009504164.tif 000089
【０３９９】
１９２番目のアミノ酸から２００番目のアミノ酸までのｈｕＦｃ（ＩｇＧ１）の９アミノ酸をコードし、１９６番目のアミノ酸が３’方向にセリンからシステインへ変異されている。
【０４００】
第二のＰＣＲ断片を、以下の２つのプライマーによって増幅した。
【０４０１】
【化６２】
2009504164.tif 000090
【０４０２】
１９２番目のアミノ酸から２００番目のアミノ酸までのｈｕＦｃ（ＩｇＧ１）の９アミノ酸をコードし、１９６番目のアミノ酸が５’方向にセリンからシステインへ変異されている。
【０４０３】
【化６３】
2009504164.tif 000091
【０４０４】
ｈｕＦｃ（ＩｇＧ１）の最後の８アミノ酸、停止コドン及びＸｈｏＩ部位を含む１５ヌクレオチドの３’伸長をコードする。再度、プライマー３４３０−３７及び３４２１−８７を用いて、２つのＰＣＲ断片を増幅した。ｐＡＭＧ２１ベクター中にＰＣＲ産物をクローニングし、ＤＮＡ配列決定によって配列を確認した。このプラスミドを有するＥ．コリ株は、株１３３２４と名付けられる。
【０４０５】
株１３３２４の関連するコード配列は、以下のとおりである。
【０４０６】
【化６４】
2009504164.tif 000092
【０４０７】
このヌクレオチド配列の翻訳は、以下のとおりである。
【０４０８】
株１３３２４（ｈｕＦＣ（ＩｇＧ１）Ｓ１９６Ｃ）：
【０４０９】
【化６５】
2009504164.tif 000093
【実施例２】
【０４１０】
Ｆｃシステイン類縁体の精製
上記実施例１に記載されているとおりに構築されたｃＤＮＡクローン：株１３３００（ｈｕＦｃ（ＩｇＧ１）Ｑ１４３Ｃ）、株１３３２２（ｈｕＦｃ（ＩｇＧ１）Ｌ１３９Ｃ）、株１３３２３（ｈｕＦｃ（ＩｇＧ１）Ｓ１４５Ｃ）及び株１３３２４（ｈｕＦｃ（ＩｇＧ１）Ｓ１９６Ｃ）を、Ｅ．コリ中に形質転換し、封入体中に発現させた。各株から得た細胞ペーストを、１０ｍＬ水／ｇペースト中に再懸濁し、顕微溶液化装置を３回通過させることによって溶解し、遠心によって、可溶性封入体（ＩＢ）画分を集めた。続いて、１％デオキシコラートでＩＢを洗浄し、遠心し、水で再度洗浄した。デオキシコラートで洗浄された封入体（ＤＷＩＢ）の最終ペレットを秤量し、−８０℃で凍結した。
【０４１１】
次いで、各クローンから得た凍結されたＤＷＩＢを融解し、１ｍＬ水／ｇＤＷＩＢ中に再懸濁した後、可溶化し、８Ｍの緩衝化されたＧｄｎ−ＨＣｌ、１１ｍＭＤＴＴの９ｍＬを添加することによって還元した。可溶化は、撹拌しながら、１時間、室温で進行した。
【０４１２】
次いで、２Ｍ尿素、１５０ｍＭアルギニン、５０ｍＭＴｒｉｓ、１ｍＭシステイン、３ｍＭシスタミン、ｐＨ８．５からなる再折り畳み緩衝液中に、可溶化されたＤＷＩＢを迅速に希釈（２０倍）することにより、各ｈｕＦｃ−システイン類縁体の再折り畳みを行った。４℃で穏やかに撹拌しながら、４８から７２時間、再折り畳み反応を進行させた。
【０４１３】
ｈｕＦｃ−システイン類縁体の精製は、ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィーを開始した。要約すると、遠心後の０．４５ミクロンろ過によって、再折り畳み反応を清澄化した。次いで、ろ過された再折り畳みを、ＰＢＳ中で予め平衡化されたＭＡｂＳｅｌｅｃｔカラムにかけた。カラムにかけた後、３カラム容量のＰＢＳでカラムをさらに洗浄した後、０．１Ｎ酢酸で溶出した。ＭＡｂＳｅｌｅｃｔカラムから溶出された酸であるタンパク質画分を、１０ｍＭＮａＯＡｃ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０中に直ちに透析した。
【０４１４】
ＳＰＳｅｐｈａｒｏｓｅＨｐ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いた陽イオン交換クロマトグラフィーによって、さらなる精製を行った。要約すると、透析後、ＭＡｂＳｅｌｅｃｔによって溶出されたプールを、１０ｍＭＮａＯＡｃ、５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ５．０中で予め平衡化されたイオン交換カラムにかけ、平衡化緩衝液の３カラム容積で洗浄し、次いで、５０から５００ｍＭＮａＣｌへの線形グラジエントで溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、溶出されたピークを評価し、約５１ｋのタンパク質を含有するピークをプールし、濃縮した。次いで、濃縮されたプールをＰＢＳ中に透析し、計算された吸光係数を用いて、分光学的に濃度を測定した。
【０４１５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣ及びＬＣ−ＭＳによって、最後のプールを分析した。図５は、精製された４つのｈｕＦｃ−システイン類縁体のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによる純度を示している。図６は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによるクローン１３３２４ｈｕＦＣＳ１９６Ｃの純度を示している。図７は、クローン１３３２４ｈｕＦｃ（Ｓ１９６Ｃ）のＬＣ−ＭＳによる純度及び質量測定を示している。観察された増加した質量は、再折り畳み反応から持ち越されたシスタミン付加物と合致している。観察された質量の相違は、ＬＣ−ＭＳ分析の前に試料を還元すると消失し、混合されたジスルフィド付加物が存在することをさらに示唆している。
【実施例３】
【０４１６】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のＦｃ−システイン類縁体への抱合
Ｆｃ−システイン類縁体に対する部位選択的方法を開発する目的で、本明細書の上記実施例２に記載されているように作製されたｈｕＦｃ−システイン類縁体の代表として、ｈｕＦｃ（Ｓ１９６Ｃ）類縁体、クローン＃１３３２４を選択した。精製されたｈｕＦｃ−システイン類縁体のＬＣ−ＭＳ分析は、低分子量付加物との混合されたジスルフィドの存在を示唆したので、抱合の前に、限定的な還元工程を行った。加工を施されたシステインでの抱合の程度及び部位選択性を評価するために、この後に、チオール特異的ＰＥＧ化を行った。
【０４１７】
要約すれば、加工を施されたシステインの濃度に対して、０から５モル過剰の化学量論で、トリス（２−カルボキシエチルホスフィン）塩酸塩（ＴＣＥＰ）を滴定することによって、実施例２に記載されているｈｕＦｃ（Ｓ１９６Ｃ）類縁体を部分的に還元した。１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で、５０ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ６．０中において、室温で２時間、還元反応を温置した。５０ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ６．０中で平衡化された使い捨てＺｅｂｒａ脱塩スピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いたゲルろ過によって、ＴＣＥＰ及び還元された付加物を除去した。次いで、ゲルろ過からろ過された、還元されたタンパク質を、加工を施されたシステインの濃度に対して２倍モル過剰の２０ｋＤＰＥＧ−マレイミド（Ｎｅｋｔａｒ  Ｉｎｃ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）と反応させた。室温で一晩、ＰＥＧ化反応を進行させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図８Ａ及び図８Ｂ）及びＳＥＣ−ＨＰＬＣ（図９）によって、修飾の程度を測定した。
【０４１８】
次に、加工を施されたシステイン：ＴＣＥＰの１：１．２５モル比を使用して、ＰＥＧ化反応をスケールアップし、陽イオン交換クロマトグラフィーによってＰＥＧ−ｈｕＦｃ（Ｓ１９６Ｃ）類縁体を精製した。２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０中に平衡化されたＳＰＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて精製を達成し、０から０．５Ｍの塩化ナトリウム線形グラジエントを用いて溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥＣ−ＬＳによって、溶出されたピークを評価し、プールし、サイズに基づいて濃縮した。図９は、単離されたＰＥＧ−ｈｕＦｃ（Ｓ１９６Ｃ）抱合体を同定し、１つのＦｃ二量体に抱合された２つの２０ｋＰＥＧ分子と合致する質量（約５３ｋＤ）を示すＳＥＣ−ＬＳの結果を示している。その後のペプチドマッピングにより、このプール中のＰＥＧ化の部位としてＣｙｓ１９６が確認された。
【０４１９】
略号
本明細書を通じて使用される略号は、具体的な事例において別段の定義がなければ、以下のとおり定義される。
【０４２０】
Ａｃ  アセチル（アセチル化された残基を表すために使用される。）
ＡｃＢｐａ  アセチル化されたｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン
ＡＤＣＣ  抗体依存性細胞傷害
Ａｉｂ  アミノイソ酪酸
ｂＡ  β−アラニン
Ｂｐａ  ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン
ＢｒＡｃ  ブロモアセチル（ＢｒＣＨ２Ｃ（Ｏ））
ＢＳＡ  ウシ血清アルブミン
Ｂｚｌ  ベンジル
Ｃａｐ  カプロン酸
ＣＴＬ  細胞傷害性Ｔリンパ球
ＣＴＬＡ４  細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４
ＤＡＲＣ  ダフィー血液群抗原受容体
ＤＣＣ  ジシクロヘキシルカルボジイミド
Ｄｄｅ  １−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソ−シクロヘキシリデン）エチル
ＥＤＴＡ  エチレンジアミン四酢酸
ＥＭＰ  エリスロポエチン模倣ペプチド
ＥＳＩ−ＭＳ  電子スプレーイオン化質量分析
ＥＰＯ  エリスロポエチン
Ｆｍｏｃ  フルオレニルメトキシカルボニル
Ｇ−ＣＳＦ  顆粒球コロニー刺激因子
ＧＨ  成長ホルモン
ＨＣＴ  ヘマトクリット
ＨＧＢ  ヘモグロビン
ｈＧＨ  ヒト成長ホルモン
ＨＯＢｔ  １−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＰＬＣ  高性能液体クロマトグラフィー
ＩＬ  インターロイキン
ＩＬ−Ｒ  インターロイキン受容体
ＩＬ−１Ｒ  インターロイキン−１受容体
ＩＬ−１ｒａ  インターロイキン−１受容体アンタゴニスト
Ｌａｕ  ラウリン酸
ＬＰＳ  リポ多糖
ＬＹＭＰＨ  リンパ球
ＭＡＬＤＩ−ＭＳ  マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析
Ｍｅ  メチル
ＭｅＯ  メトキシ
ＭＨＣ  主要組織適合性複合体
ＭＭＰ  マトリックスメタロプロテイナーゼ
ＭＭＰＩ  マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤
１−Ｎａｐ  １−ナフチルアラニン
ＮＥＵＴ  好中球
ＮＧＦ  神経成長因子
Ｎｌｅ  ノルロイシン
ＮＭＰ  Ｎ−メチル−２−ピロリジノン
ＰＡＧＥ  ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＰＢＳ  リン酸緩衝化生理的食塩水
Ｐｂｆ  ２，２，４，６，７−ペンダメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル
ＰＣＲ  ポリメラーゼ連鎖反応
Ｐｅｃ  ピペコリン酸
ＰＥＧ  ポリ（エチレングリコール）
ｐＧｌｕ  ピログルタミン酸
Ｐｉｃ  ピコリン酸
ＰＬＴ  血小板
ｐＹ  ホスホチロシン
ＰＴＦＥ  ポリテトラフルオロエチレン
ＲＢＣ  赤血球
ＲＢＳ  リボソーム結合部位
ＲＰ−ＨＰＬＣ  逆相ＨＰＬＣ
ＲＴ  室温（２５℃）
Ｓａｒ  サルコシン
ＳＤＳ  ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＴＫ  セリン−トレオニンキナーゼ
ｔ−ＢＯＣ  ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
ｔＢｕ  ｔｅｒｔ−ブチル
ＴＧＦ  組織成長因子
ＴＨＦ  胸腺液性因子
ＴＫ  チロシンキナーゼ
ＴＭＰ  トロンボポエチン模倣ペプチド
ＴＮＦ  組織壊死因子
ＴＰＯ  トロンボポエチン
ＴＲＡＩＬ  ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド
Ｔｒｔ  トリチル
ＵＫ  ウロキナーゼ
ＵＫＲ  ウロキナーゼ受容体
ＶＥＧＦ  血管内皮細胞成長因子
ＶＩＰ  血管活性腸管ペプチド
ＷＢＣ  白血球
【図面の簡単な説明】
【０４２１】
【図１】図１は、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン配列（配列番号６００）中の、溶媒に曝露された表面残基（表２参照）のスーパーセットから得られる抱合部位として修飾するためのアミノ酸残基位置の好ましいサブセット（強調表示されている。）を示している。下線部の残基は結晶構造１ＦＣ１中に存在せず、これらの残基の多くは、本発明に従って抱合部位を作製するための修飾（例えば、アミノ酸残基の挿入又は置換）に対する優れた候補であり、特に、アミノ末端断片から得られる以下のアミノ酸残基（最初の１８個のアミノ酸残基）：ＤＫＴＨＴＣ．．．Ｃ．Ａ．．Ｅ．．．ＧＧ、すなわち、配列番号６００の１位から６位、配列番号６００の９位、配列番号６００の１１位、配列番号６００の１３位、配列番号６００の１６位、配列番号６００の１７位のサブ配列中の側鎖を通じて、及び以下のカルボキシ末端断片：．ＧＫから得られる以下のアミノ酸、すなわち、配列番号６００の２２６位又は配列番号６００の２２７位の非末端部位は優れた候補である。
【図２】図２は、太字で記載された予想ループ領域配列を有するヒトＩｇＧ１Ｆｃ単量体の配列（配列番号５９９）を示している。Ｅ．コリからの発現のためにＮ末端メチオニンが付加されており、本来、未変性ＩｇＧ１配列（基準配列である配列番号６００）中には存在しない。本発明に従って抱合部位を作製するためのアミノ酸残基の挿入又は置換のために好ましい部位として有用なアミノ酸残基には、下線が付されている。
【図３】図３は、太字で示された予想ループ領域配列を有するヒトＩｇＧ１Ｆｃ単量体の配列（配列番号５９９）を示している。本発明において抱合部位として有用なアミノ酸残基の位置には、下線が付されている。図１から選択される表面曝露された好ましい抱合部位は、ここでは、強調表示されている。
【図４】図４は、Ｆｃ構造にマッピングされる、提案されたシステイン変異部位を示している。矢印によって特定されたアミノ酸残基は、以下のように、基準配列である配列番号５９９に対する指定された位置である。Ａ：Ｓｅｒ１９６、最も溶媒に曝露されており、堅固なヘリックス中に存在する。Ｂ：Ｇｌｎ１４３、深い極性ポケットであり、Ｃｙｓ１４８と同一の鎖に由来する。Ｃ：Ｌｅｕ１３９、Ｆｃループ領域であり、極性ポケット中のＣ末端に近い。Ｄ：Ｓｅｒ１４５、ｃｙｓ１４８と同じ鎖から得られ、サブユニット間の間隙中のβ−シート表面上の極性ポケット中に存在する。
【図５】図５は、実施例２に記載されている精製されたｈｕＦｃシステイン類縁体のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析（４から２０％Ｔｒｉｓ：グリシンポリアクリルアミドゲル、１２５Ｖ、３５ｍＡで１．５時間、０．１％ＳＤＳ）を示している。レーン：１，８は分子量マーカーを含有し、レーン２、９はクローン１３３００Ｆｃ（Ｑ１４３Ｃ）を含有し、レーン３、１０はクローン１３３２２Ｆｃ（Ｌ１３９Ｃ）を含有し、レーン４、１１はクローン１３３２３Ｆｃ（Ｓ１４５Ｃ）を含有し、レーン５、１２はクローン１３３２４（Ｓ１９６Ｃ）を含有した。レーン２から６は還元され、レーン９から１２は還元されなかった。
【図６】図６は、実施例２に記載されているクローン１３３２４ｈｕＦｃ（Ｓ１９６Ｃ）のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析による純度を示している。０．５ｍＬ／分で、ＴＳＫＧ３０００ＳＷ×１カラム、７．８ｍｍＩＤ×３０ｃｍ、５μｍベッドサイズ）上で、試料（２０μｇ）を１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ６．９中に溶出した。
【図７】図７は、実施例２に記載されているクローン１３３２４ｈｕＦｃ（Ｓ１９６Ｃ）のＬＣ−ＭＳによる純度及び質量測定を示している。Ｚｏｒｂａｘ３００ＳＢ−Ｃ１８カラム、２．１ｍｍ×１５０ｃｍから、０から９０％への線形アセトニトリルグラジエントを用いて、試料（２０μｇ）を０．１％ＴＦＡ中に溶出した。
【図８Ａ】図８Ａは、実施例３に記載されているように、ＴＣＥＰ還元の様々な程度の後にＰＥＧ化されたｈｕＦｃ（Ｓ１９６Ｃ）類縁体の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。加工されたシステイン：ＴＣＥＰのモル化学量論は、レーン１では１：０、レーン３では１：０．５、レーン４では１：０．７５、レーン５では１：１、レーン６では１：１．２５、レーン７では１：１．５、レーン８では１：２及びレーン９では１：５であった。分子量マーカーは、レーン２中であった。非還元タンパク質２μｇを各レーンに加え、１２５Ｖ、３５ｍＡ及び５Ｗで、１．５時間、０．１％ＳＤＳを加えた４から２０％のＴｒｉｓ−グリシンポリアクリルアミドゲル中に走行させた。
【図８Ｂ】図８Ｂは、実施例３に記載されているように、ＴＣＥＰ還元の様々な程度の後にＰＥＧ化されたｈｕＦｃ（Ｓ１９６Ｃ）類縁体の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。加工されたシステイン：ＴＣＥＰのモル化学量論は、レーン２では１：０、レーン３では１：０．５、レーン４では１：０．７５、レーン５では１：１、レーン６では１：１．２５、レーン７では１：１．５、レーン８では１：２及びレーン９では１：５であった。分子量マーカーは、レーン１中であった。還元されたタンパク質２μｇを各レーンに加え、１２５Ｖ、３５ｍＡ及び５Ｗで、１．５時間、０．１％ＳＤＳを加えた４から２０％のＴｒｉｓ−グリシンポリアクリルアミドゲル中に走行させた。
【図９】図９は、実施例３に記載されているように、ＴＣＥＰ還元の様々な程度の後にＰＥＧ化されたｈｕＦｃ（Ｓ１９６Ｃ）類縁体のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析を示している。２０μｇタンパク質をＴＳＫ３０００ＳＷＸ１カラム（７．８ｍｍ×３０ｃｍ、５ミクロン）にかけ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ６．９中に溶出した。
【図１】
2009504164.tif 000095
【図２】
2009504164.tif 000096
【図３】
2009504164.tif 000097
【図４】
2009504164.tif 000098
【図５】
2009504164.tif 000099
【図６】
2009504164.tif 000100
【図７】
2009504164.tif 000101
【図８Ａ】
2009504164.tif 000102
【図８Ｂ】
2009504164.tif 000103
【図９】
2009504164.tif 000104
【配列表】
2009504164000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成20年4月11日(2008.4.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４１７】
要約すれば、加工を施されたシステインの濃度に対して、０から５モル過剰の化学量論で、トリス（２−カルボキシエチルホスフィン）塩酸塩（ＴＣＥＰ）を滴定することによって、実施例２に記載されているｈｕＦｃ（Ｓ１９６Ｃ）類縁体を部分的に還元した。１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で、５０ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ６．０中において、室温で２時間、還元反応を温置した。５０ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ６．０中で平衡化された使い捨てＺｅｂｒａ脱塩スピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いたゲルろ過によって、ＴＣＥＰ及び還元された付加物を除去した。次いで、ゲルろ過からろ過された、還元されたタンパク質を、加工を施されたシステインの濃度に対して２倍モル過剰の２０ｋＤＰＥＧ−マレイミド（Ｎｅｋｔａｒ  Ｉｎｃ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）と反応させた。室温で一晩、ＰＥＧ化反応を進行させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図８Ａ及び図８Ｂ）及びＳＥＣ−ＨＰＬＣ（図９Ａ、Ｂ）によって、修飾の程度を測定した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４１８】
次に、加工を施されたシステイン：ＴＣＥＰの１：１．２５モル比を使用して、ＰＥＧ化反応をスケールアップし、陽イオン交換クロマトグラフィーによってＰＥＧ−ｈｕＦｃ（Ｓ１９６Ｃ）類縁体を精製した。２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０中に平衡化されたＳＰＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて精製を達成し、０から０．５Ｍの塩化ナトリウム線形グラジエントを用いて溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥＣ−ＬＳによって、溶出されたピークを評価し、プールし、サイズに基づいて濃縮した。図９Ａ、Ｂは、単離されたＰＥＧ−ｈｕＦｃ（Ｓ１９６Ｃ）抱合体を同定し、１つのＦｃ二量体に抱合された２つの２０ｋＰＥＧ分子と合致する質量（約５３ｋＤ）を示すＳＥＣ−ＬＳの結果を示している。その後のペプチドマッピングにより、このプール中のＰＥＧ化の部位としてＣｙｓ１９６が確認された。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４２１】
【図１】図１は、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン配列（配列番号６００）中の、溶媒に曝露された表面残基（表２参照）のスーパーセットから得られる抱合部位として修飾するためのアミノ酸残基位置の好ましいサブセット（強調表示されている。）を示している。下線部の残基は結晶構造１ＦＣ１中に存在せず、これらの残基の多くは、本発明に従って抱合部位を作製するための修飾（例えば、アミノ酸残基の挿入又は置換）に対する優れた候補であり、特に、アミノ末端断片から得られる以下のアミノ酸残基（最初の１８個のアミノ酸残基）：ＤＫＴＨＴＣ．．．Ｃ．Ａ．．Ｅ．．．ＧＧ、すなわち、配列番号６００の１位から６位、配列番号６００の９位、配列番号６００の１１位、配列番号６００の１３位、配列番号６００の１６位、配列番号６００の１７位のサブ配列中の側鎖を通じて、及び以下のカルボキシ末端断片：．ＧＫから得られる以下のアミノ酸、すなわち、配列番号６００の２２６位又は配列番号６００の２２７位の非末端部位は優れた候補である。
【図２】図２は、太字で記載された予想ループ領域配列を有するヒトＩｇＧ１Ｆｃ単量体の配列（配列番号５９９）を示している。Ｅ．コリからの発現のためにＮ末端メチオニンが付加されており、本来、未変性ＩｇＧ１配列（基準配列である配列番号６００）中には存在しない。本発明に従って抱合部位を作製するためのアミノ酸残基の挿入又は置換のために好ましい部位として有用なアミノ酸残基には、下線が付されている。
【図３】図３は、太字で示された予想ループ領域配列を有するヒトＩｇＧ１Ｆｃ単量体の配列（配列番号５９９）を示している。本発明において抱合部位として有用なアミノ酸残基の位置には、下線が付されている。図１から選択される表面曝露された好ましい抱合部位は、ここでは、強調表示されている。
【図４】図４は、Ｆｃ構造にマッピングされる、提案されたシステイン変異部位を示している。矢印によって特定されたアミノ酸残基は、以下のように、基準配列である配列番号５９９に対する指定された位置である。Ａ：Ｓｅｒ１９６、最も溶媒に曝露されており、堅固なヘリックス中に存在する。Ｂ：Ｇｌｎ１４３、深い極性ポケットであり、Ｃｙｓ１４８と同一の鎖に由来する。Ｃ：Ｌｅｕ１３９、Ｆｃループ領域であり、極性ポケット中のＣ末端に近い。Ｄ：Ｓｅｒ１４５、ｃｙｓ１４８と同じ鎖から得られ、サブユニット間の間隙中のβ−シート表面上の極性ポケット中に存在する。
【図５】図５は、実施例２に記載されている精製されたｈｕＦｃシステイン類縁体のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析（４から２０％Ｔｒｉｓ：グリシンポリアクリルアミドゲル、１２５Ｖ、３５ｍＡで１．５時間、０．１％ＳＤＳ）を示している。レーン：１，８は分子量マーカーを含有し、レーン２、９はクローン１３３００Ｆｃ（Ｑ１４３Ｃ）を含有し、レーン３、１０はクローン１３３２２Ｆｃ（Ｌ１３９Ｃ）を含有し、レーン４、１１はクローン１３３２３Ｆｃ（Ｓ１４５Ｃ）を含有し、レーン５、１２はクローン１３３２４（Ｓ１９６Ｃ）を含有した。レーン２から６は還元され、レーン９から１２は還元されなかった。
【図６】図６は、実施例２に記載されているクローン１３３２４ｈｕＦｃ（Ｓ１９６Ｃ）のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析による純度を示している。０．５ｍＬ／分で、ＴＳＫＧ３０００ＳＷ×１カラム、７．８ｍｍＩＤ×３０ｃｍ、５μｍベッドサイズ）上で、試料（２０μｇ）を１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ６．９中に溶出した。
【図７】図７は、実施例２に記載されているクローン１３３２４ｈｕＦｃ（Ｓ１９６Ｃ）のＬＣ−ＭＳによる純度及び質量測定を示している。Ｚｏｒｂａｘ３００ＳＢ−Ｃ１８カラム、２．１ｍｍ×１５０ｃｍから、０から９０％への線形アセトニトリルグラジエントを用いて、試料（２０μｇ）を０．１％ＴＦＡ中に溶出した。
【図８Ａ】図８Ａは、実施例３に記載されているように、ＴＣＥＰ還元の様々な程度の後にＰＥＧ化されたｈｕＦｃ（Ｓ１９６Ｃ）類縁体の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。加工されたシステイン：ＴＣＥＰのモル化学量論は、レーン１では１：０、レーン３では１：０．５、レーン４では１：０．７５、レーン５では１：１、レーン６では１：１．２５、レーン７では１：１．５、レーン８では１：２及びレーン９では１：５であった。分子量マーカーは、レーン２中であった。非還元タンパク質２μｇを各レーンに加え、１２５Ｖ、３５ｍＡ及び５Ｗで、１．５時間、０．１％ＳＤＳを加えた４から２０％のＴｒｉｓ−グリシンポリアクリルアミドゲル中に走行させた。
【図８Ｂ】図８Ｂは、実施例３に記載されているように、ＴＣＥＰ還元の様々な程度の後にＰＥＧ化されたｈｕＦｃ（Ｓ１９６Ｃ）類縁体の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。加工されたシステイン：ＴＣＥＰのモル化学量論は、レーン２では１：０、レーン３では１：０．５、レーン４では１：０．７５、レーン５では１：１、レーン６では１：１．２５、レーン７では１：１．５、レーン８では１：２及びレーン９では１：５であった。分子量マーカーは、レーン１中であった。還元されたタンパク質２μｇを各レーンに加え、１２５Ｖ、３５ｍＡ及び５Ｗで、１．５時間、０．１％ＳＤＳを加えた４から２０％のＴｒｉｓ−グリシンポリアクリルアミドゲル中に走行させた。
【図９】図９Ａ、Ｂは、実施例３に記載されているように、ＴＣＥＰ還元の様々な程度の後にＰＥＧ化されたｈｕＦｃ（Ｓ１９６Ｃ）類縁体のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析を示している。２０μｇタンパク質をＴＳＫ３０００ＳＷＸ１カラム（７．８ｍｍ×３０ｃｍ、５ミクロン）にかけ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ６．９中に溶出した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2009504164.tif 000298
【図２】
2009504164.tif 000299
【図３】
2009504164.tif 000300
【図４】
2009504164.tif 000301
【図５】
2009504164.tif 000302
【図６】
2009504164.tif 000303
【図７】
2009504164.tif 000304
【図８Ａ】
2009504164.tif 000305
【図８Ｂ】
2009504164.tif 000306
【図９】
2009504164.tif 000307
【手続補正書】
【提出日】平成20年6月20日(2008.6.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2009504164000001.app
【国際調査報告】
2009504164.tif 000308
2009504164.tif 000309
2009504164.tif 000310
2009504164.tif 000311