(57)【要約】  本発明は、最適化された濃度の、固体の支持体上に固定化されているＦｃ受容体−抗体の複合体を用いて試料内の分析物を検出する装置及び方法に関する。
2009539102.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの支持体、
該少なくとも１つの支持体の少なくとも一部の上及び／又は該少なくとも１つの支持体の少なくとも一部の内部に配置される少なくとも１つの分析物センサー受容体分子、並びに、
該少なくとも１つの分析物センサー受容体分子と結合する少なくとも１つの分析物センサー分子を含み、
該少なくとも１つの分析物センサー分子と前記少なくとも１つの分析物センサー受容体分子とのモル比が、約２：１から約１：１０，０００である、検出装置。
【請求項２】
前記少なくとも１つの分析物センサー分子と前記少なくとも１つの分析物センサー受容体分子とのモル比が、約１．９：１から約１：１０００、約１．８：１から約１：７５０、約１．７：１から約１：５００、約１．６：１から約１：２５０、約１．５：１から約１：１５０、約１．４：１から約１：１２５、約１．３：１から約１：１００、約１．３：１から約１：９０、約１．２：１から約１：８０、約１．１：１から約１：７０、約１：１から約１：６０、約１：１．１から約１：５０、約１：１．２から約１：４０、約１：１．３から約１：３０、約１．４：１から約１：２０、約１：１．５から約１：１５、又は、約１：１．５から約１：１０である、請求項１に記載の検出装置。
【請求項３】
前記少なくとも１つの支持体のμｍ２表面積あたりの前記分析物センサー分子の数が、約５０から２５０，０００、約１００から約１００，０００、約１５０から約７５，０００、約２００から約５０，０００、約２５０から約２５，０００、約３００から約２１，０００、約３５０から約１８，０００、約４００から約１５，０００、約４５０から約１２，０００、約５００から約１１，０００、約５５０から約９０００、又は、約６００から約８０００である、請求項２に記載の検出装置。
【請求項４】
前記少なくとも１つの支持体のμｍ２表面積あたりの前記分析物センサー受容体分子の数が、約５００から２５０，０００、約１０００から約１００，０００、約１５００から約５０，０００、約５０００から約２５，０００、約６０００から約２０，０００、約６５００から約１６，０００、約７０００から約１５，０００、約７５００から約１３，０００、又は、約８０００から約１２，０００である、請求項２又は３のいずれか1項に記載の検出装置。
【請求項５】
前記少なくとも１つの支持体が、高分子材料、ガラス、セラミックス、ゲル、繊維材料、不織布、金属、フィルター、膜、及び、その複合物を含む多孔性又は非多孔性の材料を含んだ群から選択されることが好ましい固体の基板である、請求項１に記載の検出装置。
【請求項６】
膜が、ナイロン、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ、又はポリエーテルスルホンから作製されることが好ましい、請求項５に記載の検出装置。
【請求項７】
前記少なくとも１つの分析物センサー受容体分子が、抗体のＦｃ部分に結合することができる、請求項１に記載の検出装置。
【請求項８】
前記分析物センサー受容体分子が、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）のプロテインＡ、Ｃ若しくはＧ群の菌株の連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）のプロテインＧ、又は、組み換えプロテインＡ／Ｇを含んだ群から選択される、請求項７に記載の検出装置。
【請求項９】
前記少なくとも１つの分析物センサー分子が、１つの結合部位によって前記少なくとも１つの分析物センサー受容体分子と、及び、第２の結合部位によって関心のある分析物と特異的に相互作用することができ、前記分析物に対する結合が、前記分析物センサー受容体分子に対する同時結合により実質的に影響されない、請求項１に記載の検出装置。
【請求項１０】
前記分析物センサー分子が、蛋白質、蛋白質受容体、酵素、抗体、抗原、アプタマー、リガンド、及び、ハプテンを含んだ群から選択されることが好ましい、請求項９に記載の検出装置。
【請求項１１】
前記少なくとも1つの分析物センサー受容体分子が、共有結合性の化学結合により前記少なくとも１つの支持体上に配置され、前記基板が、該基板に対する前記分析物センサー受容体分子の結合のために少なくとも１つの化学官能基を提供することが好ましく、該少なくとも１つの化学官能基が、カルボキシル基、無水物、エポキシド、アルデヒド、ヒドラジド、アシルアジド、アリルアジド、ジアゾ化合物、ベンゾフェノン、カルボジイミド、イミドエステル、イソチオシアナート、ＮＨＳエステル、ＣＮＢｒ、マレイミド、トシラート、トレシルクロライド、無水マレイン酸、及び、カルボニルジイミダゾールを含んだ群から選択される、請求項１に記載の検出装置。
【請求項１２】
当該検出装置が、前記少なくとも１つの支持体に対する、前記少なくとも１つの分析物センサー受容体分子に対する、並びに／又は、前記少なくとも１つの分析物センサー分子に対する非特異的結合を減少及び／若しくは阻止する能力がある溶液で処理される、請求項１に記載の検出装置。
【請求項１３】
前記溶液が、ＢＳＡ、ＨＳＡ、ＦＳＡ、カゼイン、Ｆｃテール、又は、ＴｒｉｔｏｎＸ１００、ＴｒｉｔｏｎＸ８０、Ｔｗｅｅｎ−８０、Ｔｗｅｅｎ−２０、及びＮＰ−４０を含む界面活性剤を含んだ群から選択された化合物を含む、請求項１２に記載の検出装置。
【請求項１４】
少なくとも１つの試料内の少なくとも１つの分析物を検出する方法であって：
請求項１に記載の検出装置を少なくとも１つ提供するステップ、
少なくとも１つの分析物を含んだ少なくとも１つの試料に前記少なくとも１つの検出装置を接触させるステップ、
任意選択で、非結合の又は非特異的に結合した試料を除去することができる溶液で前記少なくとも１つの検出装置を洗浄するステップ、
前記少なくとも１つの分析物センサー分子と前記少なくとも１つの試料の少なくとも１つの分析物との特異的相互作用を検出するステップ
を含む、方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの試料の前記少なくとも１つの分析物が、少なくとも１つの検出可能なマーカーで修飾される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの検出可能なマーカーが、蛍光物質、酵素、染料、化学発光化合物、放射性同位体、金属錯体、磁性粒子、ビオチン、ハプテン、無線周波送信器、及び、放射蛍光化合物を含んだ群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
臨床分析、新規薬物の同定、血液分析、薬物発見、構造−機能の研究、法医学、環境試料の試験、化学曝露、小分子ライブラリーの試験、又は、細胞ベースのアッセイにおいて使用することができる、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、支持体に結合している、分析物センサー受容体分子（ａｎａｌｙｔｅ  ｓｅｎｓｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）と分析物センサー分子（ａｎａｌｙｔｅ  ｓｅｎｓｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）との複合体に依拠する、試料内の分析物を検出するための検出装置に関する。
【０００２】
本発明は、さらに、前記の検出装置を用いて試料内の分析物を検出する方法に関する。
【０００３】
その上、本発明は、本発明による検出装置を含んだ機器に関する。
【背景技術】
【０００４】
小型の検出装置が、種々の化学及び生化学的診断用途並びに合成用途において使用されてきた。そのような検出装置は、例えば、側方流動試験及び薬物乱用に対する試験のため、特に、ポイントオブケア診断に焦点を合わせて使用される。
【０００５】
米国特許出願第２００３／０１９８９６７  Ａ１号は、プロテインＡがアシルフルオリド（ａｃｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）官能基を介して固体の基板に結合しているアレイベースの検出装置を記載している。第二の段階で、抗体がプロテインＡを載せた支持体に結合する。次に、この配置が、プロテインＡが結合した抗体に特異的に結合する試料内の分析物を検出するのに使用される。この装置の仕組みにおいて、抗体が分析物センサー分子に相当する一方で、プロテインＡは分析物センサー受容体分子として使用される。
【０００６】
しかし、支持体上の機能的な立体構造における分析物センサー分子の固定化、分析物検出中の信号対雑音比の改善、並びに、一般的に高価な分析物センサー受容体分子及び分析物センサー分子の量の削減が、さらに小型化された効果的な検出装置の開発に対して、依然として重大な要因のままである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
試験されることになる試料内の分析物の存在を決定するための検出装置及び方法を提供することが、本発明の目的である。
【０００８】
使用されることになる分析物センサー受容体分子及び／又は分析物センサー分子の量を改善すると同時に、試料内の分析物における能率的な検出を可能にする検出装置を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の目的を達成するために、独立した請求項１に記載の検出装置、及び、独立した請求項１４に記載の検出方法が提供される。
【００１０】
本発明の例証的な実施形態によると、少なくとも１つの支持体、該少なくとも１つの支持体の少なくとも一部の上及び／又は該少なくとも１つの支持体の少なくとも一部の内部に配置された少なくとも１つの分析物センサー受容体分子、並びに、該少なくとも１つの分析物センサー受容体分子と結合する少なくとも１つの分析物センサー分子を含む検出装置が提供されており、前記少なくとも１つの分析物センサー分子と前記少なくとも１つの分析物センサー受容体分子とのモル比が、１．９：１から１：１０００である。
【００１１】
本発明の別の例証的な実施形態によると、前記少なくとも１つの分析物センサー分子と前記少なくとも１つの分析物センサー受容体分子とのモル比は、約１．８：１から約１：７５０、約１．７：１から約１：５００、約１．６：１から約１：２５０、約１．５：１から約１：１５０、約１．４：１から約１：１２５、約１．３：１から約１：１００、約１．３：１から約１：９０、約１．２：１から約１：８０、約１．１：１から約１：７０、約１：１から約１：６０、約１：１．１から約１：５０、約１：１．２から約１：４０、約１：１．３から約１：３０、好ましくは、約１．４：１から約１：２０、約１：１．５から約１：１５、又は、約１：１．５から約１：１０である。
【００１２】
本発明におけるさらに別の例証的な実施形態は前述の特徴の検出装置に関し、前記少なくとも１つの支持体のμｍ２表面積あたりの前記分析物センサー分子の数は、約５０から２５０，０００、約１００から約１００，０００、約１５０から約７５，０００、約２００から約５０，０００、約２５０から約２５，０００、約３００から約２１，０００、約３５０から約１８，０００、約４００から約１５，０００、約４５０から約１２，０００、約５００から約１１，０００、約５５０から約９０００、又は、約６００から約８０００である。
【００１３】
本発明のさらに別の実施形態において、当該検出装置は、前記少なくとも１つの支持体のμｍ２表面積あたり、約５００から２５０，０００、約１０００から約１００，０００、約１５００から約５０，０００、約５０００から約２５，０００、約６０００から約２０，０００、約６５００から約１６，０００、約７０００から約１５，０００、約７５００から約１３，０００、又は、約８０００から約１２，０００の分析物センサー受容体分子を含む。
【００１４】
別の実施形態において、支持体のμｍ２表面積あたりの分析物センサー受容体分子及び分析物センサー分子の数は、前記の指定されたモル比を満たすよう選択される。
【００１５】
本発明の一実施形態において、当該検出装置の前記支持体は、高分子材料、ガラス、セラミックス、ゲル、イオン物質、不織布、金属、フィルター、膜、及び、その複合物を含む多孔性又は非多孔性の材料を含んだ群から選択される固体の基板であり得る。
【００１６】
特に好ましい実施形態において、ナイロン、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ、ポリエーテルスルホン等から作製されることが好ましい膜が使用される。
【００１７】
一実施形態で、本発明は、機能的な立体構造の配置において、分析物センサー受容体分子が分析物センサー分子に結合することができる検出装置に関する。本発明によると、そのような検出装置は、１つの結合部位によって分析物センサー受容体分子と、及び、第２の結合部位によって関心のある分析物と特異的に相互作用することができる、少なくとも１つの分析物センサー分子を含み、前記第２の結合部位による分析物に対する結合は、前記第１の結合部位を介した分析物センサー受容体分子の同時結合により実質的に影響されない。
【００１８】
本発明の一態様において、前記分析物センサー受容体分子は、抗体のＦｃ部分に結合することができる。
【００１９】
従って、一実施形態において前記分析物センサー受容体分子は、別の抗体のＦｃ部分を特異的に認識する抗体から、又は、好ましくは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）のプロテインＡ、Ｃ若しくはＧ群の菌株の連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）のプロテインＧ、又は、組み換えプロテインＡ／Ｇから選択することができる。特に好ましい実施形態は、分析物センサー受容体分子として組み換えプロテインＡ／Ｇを使用している。
【００２０】
一実施形態において、当該検出装置は、アプタマー、蛋白質受容体、酵素、抗原、リガンド、及び、ハプテン、さらに、特に好ましくは抗体から選択される分析物センサー分子を使用している。
【００２１】
本発明の一実施形態は、共有結合的又は非共有結合的な相互作用により、分析物センサー受容体分子が、ニトロセルロース膜等の膜であり得る支持体上に配置される検出装置に関する。共有結合的な相互作用の場合、分析物センサー受容体分子は、少なくとも１つの化学結合により、膜であり得る支持体に連結することができる。この目的のために、支持体は、支持体と分析物センサー受容体分子との間に化学結合を確立することができる化学官能基を少なくとも１つ提供することができる。好ましい実施形態において、この官能基はＣＯＯＨ基を含む。
【００２２】
本発明のさらに別の実施形態は、分析物センサー分子が、共有結合的又は非共有結合的な相互作用により、分析物センサー受容体分子に結合する検出装置に関する。非共有結合的な相互作用の場合、分析物センサー受容体分子に対する分析物センサー分子の結合は、分析物センサー受容体分子及び分析物センサー分子の三次元構造の相補性から生じる、２つの分子間の親和性により媒介され得る。
【００２３】
さらに別の実施形態において、検出装置は、支持体、分析物センサー受容体分子、及び／又は分析物センサー分子に対する、試験されることになる試料の構成成分の非特異的結合を減少、阻止、及び／又は除去する能力がある溶液で処理することができる。従って、本発明の一実施形態において、検出装置は、試験されることになる試料に接触する前に、ＢＳＡ、ＨＳＡ、ＦＳＡ、カゼイン、Ｆｃテール、及び／又は界面活性剤を含んだ群から選択された化合物を含むことができる遮断液で処理されている。
【００２４】
本発明は、少なくとも１つの試料内の少なくとも１つの分析物を検出する方法も対象とし：
上記の検出装置を少なくとも１つ提供するステップ、
少なくとも１つの分析物を含んだ少なくとも１つの試料に前記少なくとも１つの検出装置を接触させるステップ、
任意選択で、非結合の又は非特異的に結合した試料の構成成分を除去することができる溶液で前記少なくとも１つの検出装置を洗浄するステップ、
前記少なくとも１つの分析物センサー分子と前記少なくとも１つの試料の少なくとも１つの分析物との特異的相互作用を検出するステップ
を含んでいる。
【００２５】
試料の分析物と分析物センサー分子との相互作用を検出するために、前記分析物を検出可能なマーカーで修飾することができる。
【００２６】
そのような本発明の目的による方法を、特に、臨床分析、新規薬物の同定、血液分析、薬物発見、構造−機能の研究、法医学、環境試料の試験、化学曝露、小分子ライブラリーの試験、細胞ベースのアッセイ等において使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明は、一実施形態において：
少なくとも１つの支持体、
該少なくとも１つの支持体の少なくとも一部の上及び／又は該少なくとも１つの支持体の少なくとも一部の内部に配置された少なくとも１つの分析物センサー受容体分子、並びに、
該少なくとも１つの分析物センサー受容体分子と結合する少なくとも１つの分析物センサー分子
を含んだ検出装置を対象としており、
前記少なくとも１つの分析物センサー分子と前記少なくとも１つの分析物センサー受容体分子とのモル比は、１．９：１から１：１０００である。
【００２８】
従来、例えば抗体等の分析物センサー分子は、例えばマイクロアレイ、ビーズ等の固体の基板に結合されてきた。しかし、試料内の分析物を検出するために使用することができる抗体等の分析物センサー分子を固体の支持体に直接結合した場合、その分析物センサー分子は非機能的な立体構造で支持体に結合する可能性がある。これは、例えば、試料内の分析物を検出するために必要とされる結合部位が、固体の支持体に対する結合がこの結合部位を介して生じるために利用可能でない場合に起こる。
【００２９】
これらの問題を解決するために、第一に分析物センサー受容体分子を支持体上に配置し、次に、機能的な立体構造で分析物センサー分子に結合させることが考慮されてきた。これは、分析物センサー受容体分子が分析物センサー分子内の１つの結合部位と相互作用し、同時に、検出されることになる分析物に対する結合に必要とされる分析物センサー分子の第２の結合部位が、実質的には、分析物センサー受容体分子と分析物センサー分子との相互作用により影響されないことを意味している。そのような分析物センサー受容体分子と分析物センサー分子との立体構造的に機能的な相互作用の例は、分析物センサー分子がビオチンに結合すると同時に、例えばストレプトアビジンで基板を被覆することである。次に、分析物センサー分子は、ビオチンを介して基板上に配置された分析物センサー受容体分子、この場合ストレプトアビジンと相互作用する。これにより、分析物センサー分子を支持体上で機能的な立体構造で方向づけ、それによって、惜しげなく利用可能な試料内の分析物の検出に必要とされる分析物センサー分子の結合部位を維持することが可能になる。
【００３０】
本発明者等は、検出装置が：
少なくとも１つの支持体、
該少なくとも１つの支持体の少なくとも一部の上及び／又は該少なくとも１つの支持体の少なくとも一部の内部に配置された少なくとも１つの分析物センサー受容体分子、並びに、
該少なくとも１つの分析物センサー受容体分子と結合する少なくとも１つの分析物センサー分子を含み、
該少なくとも１つの分析物センサー分子と前記少なくとも１つの分析物センサー受容体分子とのモル比が、１．９：１から１：１０００であり、
試料内の分析物における能率的及び感度のよい検出を可能にすると同時に、分析物センサー分子及び分析物センサー受容体分子の量を比較的少なく維持することが可能であると意外にも発見した。
【００３１】
このように、本発明は、一態様において、少なくとも１つの分析物センサー受容体分子が配置された支持体を含む検出装置を対象としている。この分析物センサー受容体分子は少なくとも１つの分析物センサー分子と相互に作用し、試料内の分析物と反応することができると同時に、分析物センサー受容体分子に結合するよう機能的な立体構造で分析物センサー分子を維持している。本発明によると、分析物センサー分子及び分析物センサー受容体分子は、異なる比及び／又は数で支持体上に存在し、配置されることになる分子の数と能率的な分析物の検出との最適なバランスが達成される。
【００３２】
本発明に有用な支持体は、一実施形態において固体の基板である。基板は、該基板のうち少なくとも一部の表面上に分析物センサー分子を堆積させることができる多孔性又は非多孔性の材料から作製することができる。基板が、例えば多孔質の特徴を持つものである場合、分析物センサー受容体分子は、多孔性の支持体の表面のうち少なくとも一部の上に配置することができるだけでなく、多孔性で固体の支持体のうち少なくとも一部の内部にも配置することができる。本発明の目的に有用な基板は、技術の現状から当然既知であり、これらの基板は、特に高分子材料、ガラス、セラミックス、ゲル、天然繊維、繊維、シリコーン、金属、不織布、フィルター物質、膜、及び、その複合物から製造されると当業者は理解するであろう。
【００３３】
好ましい実施形態は、固体の支持体として膜を使用する。これらの膜は、ナイロン、ニトロセルロース、又はＰＶＤＦから作製されるのが好ましい。
【００３４】
そのような膜は、商用名Ｐｒｏｔｒａｎ、Ｕｌｔｒａｂｉｎｄ、Ｉｍｍｕｎｏｄｙｎｅ、Ｈｙｂｏｎｄ、及びＢｉｏｄｙｎｅのもとで商業的に得ることができる。Ｐａｌｌ社から入手可能な（カルボキシル基の存在のため）陰電気を帯びたナイロン膜であるＢｉｏｄｙｎｅ膜が、特に好ましい。
【００３５】
当然ながら、固体の支持体は、特定の用途に応じて全ての形状及びサイズで製造することができる。例として、プレート、薄板、フィルム、糸、スポット等が挙げられる。必須ではないが好ましい形状は、自動診断システムにより扱うことが好ましくあり得る膜、フィルター、又はマイクロプレート等の平らなプレーナー表面を有するものである。
【００３６】
寸法はさまざまであり得るが、１から１５ｍｍ、２から１２ｍｍ、３から１１ｍｍ、４から１０ｍｍ、４から１０ｍｍ若しくは８ｍｍ近くの厚さ、並びに／又は、０．１から１μｍ、０．２から０．８μｍ、０．３から０．７μｍ、及び、０．４から０．６μｍの孔径を有する膜が、一実施形態において好ましい。これは、膜が例えば前述の陰電気を帯びたナイロン膜のうちの１つである場合にも有効である。
【００３７】
本発明に有用な分析物センサー受容体分子は、分析物センサー分子に対して結合部位を提供し、分析物センサー分子を機能的な立体構造で維持すると同時に、上記のような支持体上に配置される能力を持っている。
【００３８】
分析物センサー受容体分子は、従って、種々の生物物質若しくは化学物質を支持体に結合若しくは共役させることができる化合物、複合体、リガンド、又は試薬であり得る。分析物センサー受容体分子は、蛋白質、酵素、炭水化物、核酸、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アプタマー、ハプテン、薬物、色素、小有機分子、細胞、細胞の断片、受容体、又は、細胞表面結合剤等であり得る。分析物センサー受容体分子の例として、例えば、ストレプトアビジン又はビオチン、ＦＬＡＧ−Ｅｐｉｔｏｐｅ、ｍｙｃ−Ｅｐｉｔｏｐｅ、Ａｌ−ｔａｇ、ＧＳＴ−ｔａｇ、Ｈｉｓ−Ｔａｇ、Ｍａｌｔｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔａｇ等が挙げられる。
【００３９】
実施形態のうち１つは、イムノアッセイにおいて使用することができる検出装置に関し、従って、分析物センサー分子として抗体を使用することに依拠し、分析物センサー受容体分子は、この実施形態において、いわゆるＦｃ受容体であることが好ましい。
【００４０】
Ｆｃ受容体は、抗体のＦｃ部分に結合することができる分子である。分析物センサー分子としての抗体という明確な状況において、抗体のＦｃ部分に対するＦｃ受容体の結合は、（捕獲抗体と呼ぶこともできる）抗体が、Ｆｃ部分を介して分析物センサー受容体分子に結合し、抗体のうち、検出されることになる分析物に対して特異的結合をもたらす可変領域が、この後者の相互作用に対して惜しげなく利用可能なままであることを確実にしている。
【００４１】
Ｆｃ受容体の場合の例証的な分析物受容体分子は、好ましい実施形態において、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）のプロテインＡ、Ｃ若しくはＧ群の菌株の連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）のプロテインＧ、又は、組み換えプロテインＡ／Ｇ等の蛋白質を含む。他の例証的なＦｃ受容体は、別の抗体のＦｃ部分に対して産生された抗体である限り、抗体自体を含むことができる。当然ながら、Ｆｃ受容体は、抗体のＦｃ部分を特異的に認識するために産生された分子である限り、例えばアプタマー又は他の蛋白質を含むこともできる。
【００４２】
プロテインＡ及びＧのＳＣ結合領域における遺伝子融合の産物であるプロテインＡ／Ｇが、特に好ましい。プロテインＡ／Ｇは、抗体に対して、プロテインＡ又はプロテインＧよりも広範な結合特異性を有している。従って、プロテインＡ／Ｇは、全てのヒトＩｇＧのサブクラス、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、及びＩｇＤに結合する。プロテインＡ及びＧの結合の好みは、例えば、the  textbook  Harlow  and  Lane,  Antibodies:  A  laboratory  manual,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  1988  (e.g.  page  617)から選ぶことができる。
【００４３】
本発明に有用な分析物センサー分子は、前述の分析物センサー受容体分子により機能的な立体構造で結合することができる分子であり、つまり、分析物センサー分子が、分析物センサー受容体分子に結合しながら、一般的に分析物と呼ばれる標的構造体と特異的に相互作用するための可能性を保持していることを意味する。
【００４４】
種々の分析物を含んだ試料が、分析物センサー分子と共にインキュベートされた場合、分析物センサー分子は、特異的である分析物と優先的に相互作用し、従って、後に検出することができる特異的な相互作用を生じるであろう。このように、本発明の目的に有用な分析物センサー分子は、上記のように分析物センサー受容体分子に結合すると同時に、別の分子と依然として特異的に相互作用することができる分子であり得る。従って、分析物センサー分子は、蛋白質、酵素、受容体、リガンド、アプタマー、ＤＮＡ断片、抗原、ハプテン、細胞、細胞の断片、小分子、ヌクレオチド配列、及び、抗体であり得る。
【００４５】
上記のように、Ｆｃ受容体が分析物センサー受容体分子として使用される場合、分析物センサー分子は、Ｆｃテールを提供するべきである。これは、当然ながら、分析物センサー分子が、この場合捕獲抗体とも呼ばれる抗体であり得ることを意味すると同時に、分析物センサー分子は、決してこの捕獲抗体の種類の蛋白質に限定されない。従って、別の分子に結合することができる、又は、別の分子と特異的に相互作用することができ、Ｆｃ領域に融合される、いかなる種類の分析物センサー分子も、Ｆｃ受容体が分析物センサー受容体分子として使用されることになる場合に、分析物センサー分子として使用することができる。例えば、小分子、アプタマー、ヌクレオチド配列、リガンド等を、例えば、化学架橋を介してＦｃ領域に融合し、従って、前述のＦｃ受容体の１つに接触させることができる。
【００４６】
本発明の一実施形態において、抗体が、前述のＦｃ受容体の１つと相互に作用することができるＦｃ部分、及び、別の分子に特異的で、抗体のＦｃ部分とははっきりと引き離されている別の結合部位を提供するため、抗体のＦｃ受容体との相互作用が、抗体とその抗体が特異的な分子構造体との相互作用に対して実質的に影響しないとすれば、抗体は分析物センサー分子として好ましい。抗体が分析物センサー分子として使用される場合、それらは捕獲抗体と呼ぶこともできる。
【００４７】
分析物センサー分子として使用されることになる抗体は、マウス、ヒト、ネズミ、ニワトリ、ヒツジ、ヤギ等を含めたいかなる起源のものでもあり、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体等、当技術分野において一般的に既知である全種類の抗体を含むことができる。
【００４８】
使用することができる異なる種類の抗体における概要は、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（前記参照）において見つけられる。さらに、前述のＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ等、全種類の抗体のサブクラスを使用することができる。Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（前記参照）が、再度この状況において参照される。当然ながら、特定の抗体を選択することは、特定のＦｃ受容体の分析物センサー受容体分子としての使用を必要とし得ることに当業者は気付くであろう。
【００４９】
本発明の特に好ましい実施形態では、本発明による検出装置のために、プロテインＡ、プロテインＧ、又は、特にプロテインＡ／Ｇ等のＦｃ受容体が分析物センサー受容体分子として使用され、抗体が分析物センサー分子として使用され、さらに、厚さ及び孔径に関しては前述の寸法を好都合にも有するナイロン膜であり得る膜が使用されている。
【００５０】
分析物センサー受容体分子を、支持体に対する共有結合又は非共有結合を介して、前述の支持体のうち、どの支持体の少なくとも一部の上及び／又はどの支持体の少なくとも一部の内部にも配置することができる。
【００５１】
支持体と分析物センサー受容体分子との共有結合は、化学結合が形成されたことを意味している。共有結合という目的のため、この支持体に官能性を持たせて、支持体と分析物センサー受容体分子との化学結合の形成を可能にする化学官能基を提供することができる。
【００５２】
従って、例えばＦｃ受容体が分析物センサー受容体分子として使用され、共有結合的に膜に結合されるべきである場合、カルボキシル基、アミド基、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基等の官能基を与える膜を使用することができる。
【００５３】
次に、これらの基を、直接Ｆｃ受容体に、又は、ホモ若しくはヘテロ二官能性であり得るリンカーを用いて架橋することができる。
【００５４】
このように、例えば、不活性な固体の基板を例えばアシルフルオリド官能基を有するポリマーで被覆することによって、分析物受容体分子に化学結合を提供するために支持体を活性化することができる。他の共有結合の化学的性質も、それだけに限らないが、無水物、エポキシド、アルデヒド、ヒドラジド、アシルアジド、アリルアジド、ジアゾ化合物、ベンゾフェノン、カルボジイミド、イミドエステル、イソチオシアナート、ＮＨＳエステル、ＣＮＢｒ、マレイミド、トシラート、トレシルクロライド、無水マレイン酸、及び、カルボニルジイミダゾールに適用できる。
【００５５】
好ましい実施形態において、支持体とＦｃ受容体等の分析物センサー受容体分子との間に連結を確立するために、カルボジイミドの官能基を使用することができる。
【００５６】
この目的のために、ＣＯＯＨ基を含んだ、Ｂｉｏｄｙｎｅ  Ｃ膜等の陰電気を帯びたナイロン膜を、ＥＤＡＣ（Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩）等のリンカーで前処理することができる。この活性な中間体は、次に、Ｆｃ受容体等の分析物センサー受容体分子のアミノ基と反応する。
【００５７】
上記のように、プロテインＡ／Ｇ等のＦｃ受容体及び抗体だけでなく、膜も使用される本発明の特定の実施形態において、プロテインＡ等のＦｃ受容体の結合は、低濃度のＥＤＡＣを用いることによって生じ得る。
【００５８】
一般的に、これらのＥＤＡＣの濃度は、０から２５重量％のＥＤＡＣの間で変動し、０．５から１０重量％、０．５から８重量％、０．５から４重量％、０．５から２重量％、特に、１重量％が好ましい。
【００５９】
非共有結合的な相互作用を使用して、分析物センサー受容体分子を支持体上に配置する場合、吸収、疎水的相互作用等の機構を使用することができる。
【００６０】
分析物センサー受容体分子と分析物センサー分子との相互作用も、共有結合的又は非共有結合的な相互作用を用いて確立することができる。
【００６１】
非共有結合的な相互作用は、一般的に、その相補的な三次元構造体の結果として生じる、分析物センサー受容体分子と分析物センサー分子との結合親和性に依拠している。これらの相互作用の典型的な例は、例えば、ストレプトアビジン（分析物センサー受容体分子）とビオチン（分析物センサー分子の一部）、Ｆｃ受容体（分析物センサー受容体分子）と分析物センサー分子のＦｃ部分との間にある相互作用である。
【００６２】
当然ながら、分析物センサー受容体分子と分析物センサー分子との相互作用は、共有結合を用いて確立することができる。これらの目的のために、ホモ及び／又はヘテロの二官能性及び／又は多官能性架橋剤を使用することができる。典型的な架橋剤には、それだけに限らないが、ビス（スルホスクシンイミド）ビス（ジアゾ−ベンジジン）、アジプイミド酸ジメチル、ピメルイミド酸ジメチル、スベルイミノ酸ジメチル、スベリン酸ジスクシンイミジル（Ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｎｎｃｌｙｌ  Ｓｕｂｅｒａｔｅ）、グルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、スルホスクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸等を含めた、それだけに限らないがＨａｒｌｏｗ  ｅｔ  Ｌａｎｅ（前記参照）にすでに記載されたものが含まれる。
【００６３】
分析物センサー受容体分子及び分析物センサー分子の堆積は、同時に、又は、引き続いて起き得ると当業者は明瞭に気付いている。従って、第一に分析物センサー受容体分子を基板上に配置し、次に、分析物センサー分子を分析物センサー受容体分子で被覆された支持体に加えることができる。或いは、第一に分析物センサー受容体分子と分析物センサー分子との相互作用を確立し、次に、この複合体を支持体上に配置することができる。さらに別の方法において、事前に分析物センサー受容体分子と分析物センサー分子の複合体を確立することなく、分析物センサー受容体分子及び分析物センサー分子を基板と接触させる、いわゆる一段階反応を使用することができる。
【００６４】
プロテインＡ／Ｇ等のＦｃ受容体が分析物センサー受容体分子として使用され、抗体が分析物センサー分子として使用され、さらに、膜が支持体として使用される、本発明の好ましい実施形態において、支持体の皮膜とも呼ぶことができる堆積物を一段階反応で得ることができ、すなわち、Ｆｃ受容体及び抗体は、膜である支持体上に直接被覆される。
【００６５】
当業者は、Ｆｃ受容体等の分析物センサー受容体分子を支持体に接触させる場合に、及び、Ｆｃ受容体等の分析物センサー受容体分子を抗体等の分析物センサー分子と接触させる場合に注意を払わなければならない反応条件に精通している。典型的な反応条件は、特定の緩衝剤、温度、ｐＨの条件等に依拠している。しかし、これらの条件は、分析物センサー受容体分子と対応する分析物センサー分子の種類だけでなく、共有結合の状況において使用される化学官能性にも依拠し、通常、文献から既知であるか、又は、例えば化学架橋剤の製造業者により提供されるであろう。
【００６６】
本発明の一実施形態で、検出装置は、支持体のうち少なくとも一部の上及び／又は支持体のうち少なくとも一部の内部に均一に分散された1種類の分析物センサー受容体分子、及び、対応する１種類の分析物センサー分子を含んでいる。
【００６７】
しかし、同様に好ましい本発明の別の実施形態において、分析物センサー受容体分子及び対応する分析物センサー分子は、通常「アレイ」と呼ばれる支持体のパターンを確立する立体規則及び分けられた方法で、支持体のうち少なくとも一部の上及び／又は支持体のうち少なくとも一部の内部に分散することができる。
【００６８】
アレイの形状で分析物センサー受容体分子及び分析物センサー分子を支持体上に配置することから生じる利点の１つは、異なる種類の分析物センサー受容体分子と対応する異なる分析物センサー分子を、既知の配向及び配置状態でアレイ上に配置することができるということである。そのような配向により、試料内の多数の分析物における並行検出が可能になる。
【００６９】
一般的にそのようなアレイは、分析物センサー受容体分子と分析物センサー分子との特異的な組合せを表すスポットから作製される。スポット内の分析物センサー受容体分子と分析物センサー分子との対の正体は既知であるため、複雑なアレイを確立することができる。業界基準に従いアレイの形式は特定の密度を有し、それは、スポットの数が１０から１００，０００、５０から５０，０００、１００から１０，０００に及ぶか、又は、１０００、２０００、３０００、４０００、又は５０００であることを意味している。
【００７０】
さらに別の実施形態において、本発明に従い、各ウェルが１つの検出装置を表している、一般的にマイクロタイタープレートとして既知のものの中で多数の検出装置を組み立てることができる。そのような組み立てられた検出装置は、商業的に入手可能なマイクロタイタープレートのウェルの数に対応する９６，３８４又は１，５３６という複数の検出アッセイを行うことを可能にし得る。
【００７１】
本発明のうちこれら後者の態様の利点は、反応容積においてより小さな試料サイズを可能にする小型の支持体基盤を開発することができ、規模の経済及び時間の節約を生じ得るということである。さらに、これらの分析装置は、従来のマイクロアッセイの形式と同等の、又は、それ以上の感度を得ることができる。
【００７２】
分析物センサー受容体分子並びに分析物センサー分子を、特別に設計されたアレイの順序で配置するために、マイクロアレイ印刷技術等のマイクロアレイ技術から既知の技術に依拠することができる。
【００７３】
本発明によると、今までに記述された実施形態のどれにおいても、分析物センサー受容体分子並びに分析物センサー分子は、支持体のμｍ２表面積あたりの特定の異なるモル比及び／又は数で存在することになると注目されたい。
【００７４】
本発明によると、分析物センサー分子と分析物センサー受容体分子とのモル比は、１．９：１から１：１０００である。
【００７５】
好ましい場合がある本発明の他の実施形態において、前記分析物センサー分子と分析物センサー受容体分子とのモル比は、約１．８：１から約１：７５０、約１．７：１から約１：５００、約１．６：１から約１：２５０、約１．５：１から約１：１５０、約１．４：１から約１：１２５であることが好ましく、より好ましくは、約１．３：１から約１：１００、約１．３：１から約１：９０、約１．２：１から約１：８０、約１．１：１から約１：７０、約１：１から約１：６０であり、さらにより好ましくは、約１：１．１から約１：５０、約１：１．２から約１：４０、約１：１．３から約１：３０、約１．４：１から約１：２０、さらに、最も好ましくは、約１：１．５から約１：１５、又は、約１：１．５から約１：１０である。
【００７６】
特に好ましいのは、１：１．５から約１：１０という比である。
【００７７】
同様に特に好ましいのは、１：１．５、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、又は１：１５という分析物センサー分子対分析物センサー受容体分子の比である。
【００７８】
本発明の例証的な実施形態において、支持体のμｍ２表面積あたりの分析物センサー分子の数は、５０から２５０，０００、約１００から約１００，０００、約１５０から約７５，０００、約２００から約５０，０００、約２５０から約２５，０００、約３００から約２１，０００、約３５０から約１８，０００でありえ、約４００から約１５，０００、約４５０から約１２，０００、約５００から約１１，０００であることが好ましく、さらに、より好ましくは、約５５０から約９０００、又は、約６００から約８０００である。
【００７９】
特に好ましい実施形態において、支持体のμｍ２表面積あたりの分析物センサー分子の数は、６００、７００、９００、１３００、１６００、１９００、２２００、２５００、２８００、３１００、３４００、３７００、４０００、４３００、４６００、４９００、５２００、５５００、５８００、７１００、７４００、７７００、又は８０００であり得る。
【００８０】
本発明のさらに別の例証的な実施形態において、支持体のμｍ２表面積あたりの分析物センサー受容体分子の数は、約５００から２５０，０００、約１０００から約１００，０００、約１５００から約５０，０００でありえ、約５０００から約２５，０００、約６０００から約２０，０００、約６５００から約１６，０００、約７０００から約１５，０００、であることが好ましく、さらに、より好ましくは、約７５００から約１３，０００、又は、約８０００から約１２，５００である。
【００８１】
特に好ましい実施形態において、支持体のμｍ２表面積あたりの分析物センサー受容体分子の数は、８０００、８５００、９０００、９５００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００、１２，０００、又は１２，５００であり得る。
【００８２】
当然ながら、前述の支持体のμｍ２表面積あたりの分析物センサー受容体分子及び分析物センサー分子の数は、上記の指定されたモル比内である限り組み合わせることができる。
【００８３】
前述の支持体のμｍ２表面積あたりのモル比並びにモル数は、特に、プロテインＡ、プロテインＧ、及び、特にプロテインＡ／Ｇ等のＦｃ受容体が分析物センサー受容体分子として使用され、抗体が分析物センサー分子として使用され、さらに、膜が支持体として使用される本発明の好ましい実施形態に適用する。この状況において、特に好ましいものとして上記で明示されてきた表面積のμｍ２あたりの分析物センサー受容体分子並びに分析物センサー分子のモル比及び数は、特に注視されることになる。
【００８４】
１つの好ましい実施形態において、抗体対Ｆｃ受容体のモル比が約１：１．５から約１：１０で、プロテインＡ／Ｇ等のＦｃ受容体が分析物センサー受容体分子として、及び、抗体が分析物センサー分子として使用される。この実施形態で、抗体分子の数は、支持体のμｍ２表面積あたり約６００から約８０００で、Ｆｃ受容体分子の数は、支持体のμｍ２表面積あたり約８０００から約１２５，０００であり得る。
【００８５】
例えばプロテインＡ／Ｇ等のＦｃ受容体及び抗体が使用される場合、Ｆｃ受容体の被覆液は、一般的に２５〜５００ｎＭ、５０〜２５０ｎＭ、７５〜２００ｎＭ、又は１５０ｎＭの濃度を含むのに対して、抗体印刷液は、一般的に１μＭ、７５０ｎＭ、５００ｎＭ、３００ｎＭ、２５０ｎＭ、２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１２５ｎＭ、１００ｎＭ、７５ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１０ｎＭ、１．５ｎＭ、１ｎＭ、７５０ｆＭという濃度である。Ｆｃ受容体に対する１００ｎＭ、１５０ｎＭ、又は２００ｎＭという濃度及び捕獲抗体に対する１５０ｎＭ未満又は１０ｎＭ未満の濃度が、一実施形態において好ましくあり得る。これらの濃度は、全体の膜に対して約１２．５ｃｍ×５ｃｍ（１つのアレイあたり１ｃｍ×１ｃｍ）という寸法の、約５０μｍから５００μｍ、１００μｍから４００μｍ、２００μｍ又は３００μｍという多孔度を有する膜支持体が被覆された場合に、特に有用である。
【００８６】
試料内の蛋白質等の分析物検出中に、試験されることになる試料の構成成分の非特異的結合が検出装置で起こり得るということは周知である。この非特異的結合は、支持体、分析物センサー受容体分子、及び／又は分析物センサー分子に対して生じ得る。一般的に、そのような非特異的結合は、非特異的に結合した構成成分を取り除くためのいわゆる洗浄液を用いて、検出装置を試料と接触させた後に非特異的に結合した構成成分を取り除くことによって考慮しようと試みられるけれども、本発明者等は、本発明の一実施形態において、支持体、分析物センサー受容体分子、及び／若しくは分析物センサー分子に対する非特異的結合を減少、除去、並びに／又は、阻止することができる水溶液又は液体で検出装置を処理することが望ましいと発見した。そのような水溶液又は液体は、一般的に遮断液と呼ばれる。
【００８７】
検出装置での前述の構成要素に対する試料成分の非特異的結合を減少及び／又は阻止することができる遮断要素は、一般的に、支持体、分析物センサー受容体分子、及び分析物センサー分子の性質及び量に依拠する。
【００８８】
そのような遮断要素は、例えば、ＳＤＳ、ＴｒｉｔｏｎＸ１００、ＴｒｉｔｏｎＸ８０、ＮＰ−４０、Ｔｗｅｅｎ−８０、Ｔｗｅｅｎ−２０等の界面活性剤を含むことができる。別の実施形態において、遮断液の遮断要素は、分析物センサー分子に結合しないＦｃテール、ＢＳＡ、ＦＳＡ、ＨＳＡ、又はカゼインであり得る。当然ながら、前述の遮断薬の組合せも使用することができる。
【００８９】
後者の遮断要素、すなわちＢＳＡ、ＨＡＳ、ＦＳＡ、並びに、特にカゼイン及びＦｃテールは、プロテインＡ、プロテインＧ、及び、特にプロテインＡ／Ｇ等のＦｃ受容体が分析物センサー受容体分子として、抗体が分析物センサー分子として、さらに、膜が支持体として使用される、本発明の実施形態のうちの１つにおいて好ましい。
【００９０】
遮断液は、一般的に、ブロッキングバッファー等の水溶液又は液体の形状で適用される。そのような例えばブロッキングバッファーのさらなる構成要素は、特定の用途に応じて、塩、酸等である。典型的なブロッキングバッファーは、ＢＳＡ、ＦＳＡ、ＨＡＳ、又はカゼインの１重量％、２重量％、３重量％、４重量％；５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、及び、１５重量％又は２０重量％までの濃度で前述の構成要素のうちのどれかを含むＰＢＳ（ＰＨ７．４）である。
【００９１】
当然ながら、抗体も、使用される分析物受容体分子のＦｃ受容体に対してそのＦｃテールが特異的に認識されない限り、遮断薬として使用することができる。
【００９２】
カゼイン、ＢＳＡ、ＨＳＡ等の構成要素が、遮断液内の遮断要素として使用される場合、その濃度は、一般的に、１から１５％、２から１０％、及び、好ましくは５から１０％である。これらの濃度は、重量パーセントである。
【００９３】
例えば、分析物センサー受容体分子により認識されないＦｃ断片又は抗体が遮断要素として使用される場合、これら後者の化合物の濃度は、一般的に、０．５から１０μＭ、１から５μＭ、及び、好ましくは、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、又は５μＭである。
【００９４】
好ましい実施形態において、遮断液は、添加剤として１μＭのＦｃテールを有する５重量％から１０重量％のカゼインを含む。
【００９５】
遮断の時点は異なる場合がある。従って、膜等の支持体は、Ｆｃ受容体等の分析物センサー受容体分子が支持体に結合する前に、予め遮断することができる。同時に、分析物センサー分子、この場合抗体が検出装置に加えられる前に、例えば、プロテインＡ／Ｇ等の分析物センサー受容体分子がすでに膜に結合している場合、遮断は発生し得る。遮断は、Ｆｃ受容体等の分析物センサー受容体分子と抗体等の分析物センサー分子との複合物が膜等の支持体上で形成された後にも発生し得る。
【００９６】
上記の検出装置は、主として、分析物センサー受容体分子としてのＦｃ受容体、及び、分析物センサー分子としての抗体に関して記述されてきたけれども、これは、決して、検出装置がこれらの構成要素に限定されると意味するべきではない。本発明による検出装置は、例えば特定の蛋白質又は酵素、本願の場合は分析物センサー分子に特異的な分子の存在を求めて小分子のライブラリーをスクリーニングする等、多数の目的のために使用することができる。別の実施形態では、ウイルスを、その蛋白質又は核酸の構成要素の、本発明による検出装置上に予め固定された特異的な抗体に結合するという能力によって、血液試料において検出することができる。同様に、環境試料内の微生物、又は、有毒で環境的に危険性のある化学物質を、これらの構成要素と特異的に相互作用することができる抗体、受容体、又は他の分子を用いて検出することができる。
【００９７】
本発明の別の目的は、従って、少なくとも１つの試料内の少なくとも１つの分析物を検出する方法に関し、当該方法は、
上記の検出装置を少なくとも１つ提供するステップ、
少なくとも１つの分析物を含んだ少なくとも１つの試料に前記少なくとも１つの検出装置を接触させるステップ、
任意選択で、非結合の又は非特異的に結合した試料を除去することができる溶液で前記少なくとも１つの検出装置を洗浄するステップ、
前記少なくとも１つの分析物センサー分子と前記少なくとも１つの試料の少なくとも１つの分析物との特異的相互作用を検出するステップ
を含む。
【００９８】
本発明による方法の目的のために、記述された検出装置を使用することができる。好ましい実施形態において、μｍ２表面積あたりの分析物センサー受容体分子並びに分析物センサー分子のモル比及び数の優良値、並びに、遮断要素及び濃度は前述の通りで、支持体として膜を、分析物センサー受容体分子としてプロテインＡ、プロテインＧ、及び、特にプロテインＡ／Ｇ等のＦｃ受容体を、さらに、分析物センサー分子として、特定の分析物に特異的な抗体を使用する検出装置が使用される。
【００９９】
次に、本発明によるこれらの好ましい検出装置だけでなく、他の検出装置も、分析物センサー分子と試料内の分析物との相互作用を可能にする条件下で、少なくとも１つの試料と接触させることができる。
【０１００】
試料と検出装置を接触させ、前記試料内の少なくとも１つの分析物と検出装置上の１又は複数の分析物センサー分子との特異的相互作用を可能にした後、任意選択で、基板、分析物センサー受容体分子、及び／又は分析物センサー分子と非特異的に相互作用する、非特異的に結合した分析物試料の構成成分を除去及び／又は減少するように意図された、いわゆる洗浄ステップを含むことができる。この任意の洗浄ステップの後、分析物センサー分子と試料の少なくとも１つの分析物との特異的相互作用の検出が生じる。
【０１０１】
試料内の分析物と分析物センサー分子との特異的相互作用を検出する種々の手段が存在する。これは、分析物センサー分子としての抗体と、試料の構成成分であり得るその抗体により特異的に認識される蛋白質又は典型的な化学化合物等の試料の構成成分との相互作用に関して例証される。しかしこれらの説明は、決して、本発明のこれらの例証的な実施形態に限定されると意味されない。
【０１０２】
抗体等の分析物センサー分子と分析物との相互作用の検出は、その分析物を検出可能なマーカーで修飾することにより生じ得る。検出可能なマーカーを用いた分析物の修飾は、検出装置を試料と接触させる前、検出装置を試料と接触させている間、又は、分析物センサー分子と分析物との特異的相互作用が生じた後に発生し得る。
【０１０３】
例えば、Ｃｙ５、Ｃｙ３、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ＦＩＴＣ、Ａｔｔｏｄｙｅ、Ｃｙｄｙｅ、Ａｌｅｘａ６４７等の蛍光要素、放射性の群等を用いた修飾によって、分析物を検出可能なマーカーで修飾することができる。抗体等の分析物センサー分子と例えばＣｙ５でラベルされた分析物との相互作用が生じる場合、いかなる他のラベルされた試料の構成成分も洗浄ステップにより取り除くことができ、さらに、試料内の特異的な分析物の存在を、分析物センサー分子と、その分析物センサー分子との相互作用により検出装置上に保持された分析物との相互作用から生じる例えば蛍光信号により検出することができる。
【０１０４】
誘発された銀染色等、他の方法を検出のために使用することができる。他の検出可能なマーカーは、染色が生じる酵素反応に依拠しており、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼは、試料内の分析物に結合することができ、後に、対応する基質を与えることにより反応を開始して、ホースラディッシュペルオキシダーゼで修飾された分析物が分析物センサー分子と相互に作用した量の所で染色を生じることができる。
【０１０５】
そのような酵素リンカー（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｌｉｎｋｅｒ）は、アルカリホスファターゼ又は化学発光システムをさらに含むことができる。レポーター分子とも呼ばれる検出可能なマーカーのさらなる例として、それだけに限らないが、染料、化学発光化合物、金属錯体、磁性粒子、ビオチン、ハプテン、無線周波送信器、及び、放射蛍光化合物が挙げられる。
【０１０６】
分析物と分析物センサー分子との相互作用を検出する他の方法を使用することもできる。例えば、分析物センサー分子が抗体である場合、分析物は試料からこの抗体に特異的に結合することができる。洗浄ステップを使用して、いかなる非結合の又は非特異的に結合した構成要素も試料から取り除く場合、同様に分析物の別の部分に特異的なさらなる抗体を検出装置に加えることができる。この抗体は、例えば、検出可能なマーカーに結合することができる。この原理は、図１に示されている。そのような検出可能なマーカーは、図１に描かれているように、Ｃｙ５等の蛍光マーカーであり得る。しかし、そのようなマーカーは、例えば既知の配列のオリゴヌクレオチドでもあり得る。検出装置上に保持されている分析物とのいわゆる第２の抗体の相互作用後に、重合の連鎖反応に使用される場合、試料内の分析物の存在を検出することができる。このいわゆるイムノＰＣＲは、非常に感度が良く、溶液内に存在する微量のナノライトを確実に検出するために使用することができる。当業者は、さらなる変更に気づいているであろう。
【０１０７】
上記のように、分析物センサー受容体分子及び分析物センサー分子が、アレイの形式で支持体上に配置される場合、本発明による方法を使用して、試料の並行処理、及び、１又は複数の試料内に存在する多数の分析物の並行検出を可能にすることができる。各検出スポットは、特定の分析物に特異的な、異なる分析物センサー受容体と分析物センサー分子との対に対応することができるので、そのような検出装置が試料でインキュベートされ、上記の方法で処理された後にそのような検出スポットから生じる信号は、試料内の分析物の存在を示す。
【０１０８】
このように、本発明の一態様は、比較的少量のいくぶん高価な分析物センサー受容体分子及び分析物センサー分子を使用すると同時に、試料内の分析物を確実且つ特異的に検出するための検出装置の使用に関する。本発明によると、これは、分析物センサー分子対分析物センサー受容体分子の異なるモル比、並びに／又は、基板のμｍ２表面積あたりの分析物センサー分子及び／若しくは分析物センサー受容体分子における前述された特定の分子数に帰し得る。支持体の形式に応じて、本発明による検出装置を、多数の試料内に存在する多数の分析物の同時並行検出のために使用することができる。
【０１０９】
以下において、本発明は、特定の実験例を考慮して例証されている。しかし、これらの例は、決して本発明の範囲を限定することを意味していない。むしろ、その例証的な実施形態の一部により本発明を説明するよう役立っている。
【実施例】
【０１１０】
実施例１：膜を被覆するためのプロテインＡにおける最適濃度の決定
ＣＯＯＨ基を含むＢｉｏｄｙｎｅ  Ｃ膜を使用した。膜は、以下の寸法、約１ｃｍ×１１ｃｍを有していた。その膜を、室温にて１０分間、１６％ＥＤＡＣ水溶液で前処理した。次に、膜を水で簡単に洗浄した。
【０１１１】
後に、室温にて1時間、０．００１μＭから１０μＭに及ぶ濃度のＦＩＴＣでラベルされたプロテインＡで前記膜を被覆した。対照膜として、未被覆のＢｉｏｄｙｎｅ−Ｃ膜を使用した。
【０１１２】
ラベルされたプロテインＡで膜を被覆した後、室温にて３０分間、５％ＢＳＡを含んだＰＢＳ（ｐＨ７．４）でその膜を遮断した。膜から非結合のプロテインＡを取り除くために、０．０５容量％のＴｗｅｅｎ−２０を含む１×ＰＢＳを用いて、前記膜を３回、室温にて５分間洗浄した。４８０／４０ｎｍの励起フィルター、及び、５２７／３０ｎｍのエミッションフィルターと共に蛍光顕微鏡を用いて、結合したラベルされたプロテインＡを測定した。
【０１１３】
図２に示されているデータにより、約１ｃｍ×１ｃｍ又は１２．５×５ｃｍという寸法を有する膜を被覆するためのプロテインＡの最適濃度は、１μＭで最大値を有するということが判ったと示されている。
【０１１４】
実施例２−プロテインＡで被覆された膜における抗体の結合能力対未被覆の膜における抗体の結合能力の決定
２つのＢｉｏｄｙｎｅ−Ｃ膜を使用し、そのうちの１つをプロテインＡ／Ｇで被覆し、もう一方は被覆しなかった。
【０１１５】
プロテインＡ／Ｇでの被覆を、上記のように、１０分間１６重量％のＥＤＡＣを用いて膜を活性化する、及び、後に水中で洗浄することにより行った。
【０１１６】
その後、室温にて１時間、１μＭのプロテインＡ／Ｇを含んだ１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で上記の寸法の膜を被覆した。もう一方の膜を、蛋白質を含有していない緩衝剤でｍｏｃｋ処理した。
【０１１７】
後に、室温にて３０分間、被覆した膜を５％ＢＳＡを含んだ１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で遮断した。このＣｙ５でラベルされた家兎抗マウスＩｇＧを、次に、１０ｎＭから５００ｎＭに及ぶ濃度で膜上に印刷した。プロテインＡ／Ｇで被覆していない第２の対照膜に対して、抗体を同じ濃度で使用した。
【０１１８】
いかなる非結合の抗体も膜から取り除くために、０．０５容量％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて、前記膜を３回、室温にて５分間洗浄した。
【０１１９】
抗体とプロテインＡ／Ｇとの相互作用を、蛍光測定を用いて可視化し、さらに定量化した。
【０１２０】
図３のデータから理解することができるように、プロテインＡ／Ｇで被覆した膜は、未被覆の膜よりも高い抗体への結合能力を有している。
【０１２１】
実施例３−プロテインＡ／Ｇを膜に結合させるためのＥＤＡＣにおける最適濃度の決定
架橋剤ＥＤＡＣは、高反応性分子であり、且つ、蛋白質と反応することができ、その蛋白質の立体構造的な機能性に対して潜在的に有害である。従って、目的は、ＥＤＡＣ濃度を可能な限り限定することであった。
【０１２２】
その目的のために、室温にて１時間、ＦＩＴＣでラベルされたプロテインＡをＢｉｏｄｙｎｅ−Ｃ膜上でインキュベートし、さらに、０重量％から１６重量％に及ぶ異なる濃度のＥＤＡＣで活性化させた。上記と同じ条件の下、ＥＤＡＣを水に適用した。インキュベーションの後、５重量％のカゼインを含んだ１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を含むブロッキングバッファーで前記膜を遮断し、さらに、前記膜を３回、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）及び０．０５容量％のＴｗｅｅｎ−２０を用いて、５分間洗浄した。
【０１２３】
図４から、最低１％というＥＤＡＣ量でも、膜に対するプロテインＡ／Ｇの能率的な結合をもはや可能にするということを導くことができる。
【０１２４】
実施例４−プロテインＡ／Ｇで被覆した膜の遮断
再度、Ｂｉｏｄｙｎｅ−Ｃ膜を使用して、実施例１及び２に記述されているように１段階のアッセイで、家兎抗ヒツジ抗体と共にプロテインＡ／Ｇで被覆した。対照として、家兎抗ヒツジ抗体だけで、プロテインＡ／Ｇ無しで同種の膜を被覆した。
【０１２５】
その後、５％ＢＳＡ及び１μＭのＢｉｏｔｙｎでラベルされた家兎抗マウス抗体を含んだＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて、両方の膜を１時間遮断した。後に、前記膜を３回、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）及び０．０５容量％のＴｗｅｅｎ−２０を用いて、５分間洗浄した。
【０１２６】
次に、Ｃｙ５でラベルされたストレプトアビジンを用いて、プロテインＡ／Ｇで被覆した膜及び未被覆の膜をインキュベートした。ビオチンでラベルされた家兎抗マウス抗体が、プロテインＡ／Ｇで被覆した膜を遮断することにおいて確かに能率的である場合、プロテインＡ／Ｇで被覆した膜は、未被覆の膜よりも強い信号を与えるはずである。このことは、図５において確証される。
【０１２７】
このように、抗体等の分析物センサー分子を載せたプロテインＡ／Ｇで被覆した膜を遮断するよう適した濃度で抗体を使用することができる。
【０１２８】
実施例５−他の遮断要素におけるさらなる試験
後に、他の要素もプロテインＡ／Ｇで被覆した膜を遮断するのに適している可能性があるかどうか試験した。
【０１２９】
この目的のために、図６において見ることができるように、異なる条件の異なるブロッキングバッファーを用いて、種々の膜をインキュベートした。図６では、表示された種々の膜を、Ｃｙ５でラベルされたヒツジ抗マウス抗体でインキュベートした。その後、これらの捕獲抗体で被覆した膜を、４℃にて一晩中、室温にて１時間、又は３７℃にて１時間、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）及び表示された量のＢＳＡ若しくはカゼインからなる遮断液を用いて処理した。
【０１３０】
図６の結果により、最適な遮断化合物及び最適な遮断濃度は特定の膜に依拠していることが明瞭に示されている。しかし、一般に、どちらの化合物も適した結果を与え、本願の場合、カゼインがいくぶんより効果的であると判っている。
【０１３１】
実施例６−プロテインＡ／Ｇ捕獲抗体における最適比の同定
膜全体を被覆することの１つの問題は、相当量のプロテインＡ／Ｇ、及び、対応する遮断薬を使用しなければならないことである。プロテインＡ／Ｇの多価な結合様式を考慮して、さらに結合部位は遮断される必要がある。
【０１３２】
例えば捕獲抗体を含んだ溶液等の印刷液を用いた被覆処理を実行する前に、プロテインＡ／Ｇをインキュベートした。次に、膜に印刷するためにこの溶液を使用した。
【０１３３】
このように、１０ｎＭから８００ｎＭという濃度の家兎抗ヒツジ抗体である捕獲抗体を、１５０ｎＭのプロテインＡ／Ｇと共に、５％グリセリンを含む１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）の印刷液中のＢｉｏｄｙｎｅ−Ｃ膜上に印刷した。
【０１３４】
次に、５％のカゼイン、１μＭのヤギＦｃテールを含んだＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて、室温にて１時間、前記膜を遮断した。その後、Ｃｙ５でラベルされた分析物のヒツジ抗マウス抗体を用いて、捕獲抗体／プロテインＡ／Ｇで被覆した膜をインキュベートした。この抗体は、家兎抗ヒツジ抗体である分析物センサー分子により前記膜上で保持される。室温での1時間のインキュベーションの後、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）及び０．０５容量％のＴｗｅｅｎ−２０を用いて、前記膜を３回、室温にて５分間洗浄した。
【０１３５】
次に、被覆又は未被覆の膜上に保持されたＣｙ５でラベルされたヒツジ抗マウス抗体に対して、結果を規格化した。この規格化は、以下のように行った。第一に、測定した強度は、バックグラウンドの強度及び励起の強度を用いて修正される。次に、すでに膜上に存在するＣｙ５でラベルされた抗体から生じる修正された強度に対して、結果が規格化される。これは、膜／プロテインＡ／Ｇの結合能力を修正する方法である。
【０１３６】
家兎抗ヒツジ抗体である分析物センサー分子に対する、Ｃｙ５でラベルされたヒツジ抗マウス抗体である分析物の結合能率の結果は、図７に描かれている。３００ｎＭ未満の濃度の家兎抗ヒツジ抗体で、未被覆の膜に対して被覆された膜において増加した信号が観察されたと明瞭に理解することができる。
【０１３７】
この特定の効果は、高い検出感度を維持すると同時に異なる比及び少量の蛋白質で、Ｆｃ受容体で被覆された膜を、そのような膜の上に捕獲抗体を立体構造で保持するために使用する可能性を広げている。
【０１３８】
従って、捕獲抗体の数及び量だけでなく、Ｆｃ受容体に対する被覆液の濃度も減らす場合、増加した数の機能抗体が観察され、捕獲抗体と分析物の抗体との間に、比較的強い信号を生じる。
【０１３９】
このことは、当然ながら、検出装置を小型化するだけでなく、前述のアッセイ原理に基づいた検出方法も小規模にすることを可能にしている。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】プロテインＡ／Ｇが固体膜に結合した実施形態を示す、本発明による検出装置の概略図である。プロテインＡ／Ｇで被覆した膜の組立体は、ＢＳＡ及びＦｃ断片で遮断されている。さらに、この図は、プロテインＡ／Ｇに対する抗体（分析物センサー分子）の結合、及び、検出可能なＣｙ５マーカーに結合している結合された分析物を描いている。
【図２】実施例１に記述されたニトロセルロース膜に適用されたプロテインＡ／Ｇの皮膜における最適濃度の決定を示している。
【図３】プロテインＡ／Ｇで被覆した膜に結合したＣｙ５でラベルされた家兎抗マウスＩｇＧ抗体の結合能力対未被覆の膜に結合したＣｙ５でラベルされた家兎抗マウスＩｇＧ抗体の結合能力を示している。
【図４】ＥＤＡＣの関数としてのプロテインＡ／Ｇの結合能力を示している。
【図５】ビオチンでラベルされた家兎抗マウス抗体を含んだ遮断液を用いて、プロテインＡ／Ｇで被覆した膜を遮断することができると示している。
【図６】ＢＳＡ又はカゼインを含んだ遮断液の種々の膜に対する遮断能率を示している。
【図７】捕獲された抗体（分析物センサー分子）対プロテインＡ／Ｇ（分析物センサー受容体分子）の異なるモル比における分析物検出の増加した感度を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年12月4日(2008.12.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの支持体、
該少なくとも１つの支持体の少なくとも一部の上及び／又は該少なくとも１つの支持体の少なくとも一部の内部に配置される少なくとも１つの分析物センサー受容体分子、並びに、
該少なくとも１つの分析物センサー受容体分子と結合する少なくとも１つの分析物センサー分子を含み、
該少なくとも１つの分析物センサー分子と前記少なくとも１つの分析物センサー受容体分子とのモル比が、１．９：１から１：１０００である、検出装置。
【請求項２】
前記少なくとも１つの分析物センサー分子と前記少なくとも１つの分析物センサー受容体分子とのモル比が、約１．８：１から約１：７５０、約１．７：１から約１：５００、約１．６：１から約１：２５０、約１．５：１から約１：１５０、約１．４：１から約１：１２５、約１．３：１から約１：１００、約１．３：１から約１：９０、約１．２：１から約１：８０、約１．１：１から約１：７０、約１：１から約１：６０、約１：１．１から約１：５０、約１：１．２から約１：４０、約１：１．３から約１：３０、約１．４：１から約１：２０、約１：１．５から約１：１５、又は、約１：１．５から約１：１０である、請求項１に記載の検出装置。
【請求項３】
前記少なくとも１つの支持体のμｍ２表面積あたりの前記分析物センサー分子の数が、約５０から２５０，０００、約１００から約１００，０００、約１５０から約７５，０００、約２００から約５０，０００、約２５０から約２５，０００、約３００から約２１，０００、約３５０から約１８，０００、約４００から約１５，０００、約４５０から約１２，０００、約５００から約１１，０００、約５５０から約９０００、又は、約６００から約８０００である、請求項２に記載の検出装置。
【請求項４】
前記少なくとも１つの支持体のμｍ２表面積あたりの前記分析物センサー受容体分子の数が、約５００から２５０，０００、約１０００から約１００，０００、約１５００から約５０，０００、約５０００から約２５，０００、約６０００から約２０，０００、約６５００から約１６，０００、約７０００から約１５，０００、約７５００から約１３，０００、又は、約８０００から約１２，０００である、請求項２又は３のいずれか1項に記載の検出装置。
【請求項５】
前記少なくとも１つの支持体が、高分子材料、ガラス、セラミックス、ゲル、繊維材料、不織布、金属、フィルター、膜、及び、その複合物を含む多孔性又は非多孔性の材料を含んだ群から選択されることが好ましい固体の基板である、請求項１に記載の検出装置。
【請求項６】
膜が、ナイロン、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ、又はポリエーテルスルホンから作製されることが好ましい、請求項５に記載の検出装置。
【請求項７】
前記少なくとも１つの分析物センサー受容体分子が、抗体のＦｃ部分に結合することができる、請求項１に記載の検出装置。
【請求項８】
前記分析物センサー受容体分子が、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）のプロテインＡ、Ｃ若しくはＧ群の菌株の連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）のプロテインＧ、又は、組み換えプロテインＡ／Ｇを含んだ群から選択される、請求項７に記載の検出装置。
【請求項９】
前記少なくとも１つの分析物センサー分子が、１つの結合部位によって前記少なくとも１つの分析物センサー受容体分子と、及び、第２の結合部位によって関心のある分析物と特異的に相互作用することができ、前記分析物に対する結合が、前記分析物センサー受容体分子に対する同時結合により実質的に影響されない、請求項１に記載の検出装置。
【請求項１０】
前記分析物センサー分子が、蛋白質、蛋白質受容体、酵素、抗体、抗原、アプタマー、リガンド、及び、ハプテンを含んだ群から選択されることが好ましい、請求項９に記載の検出装置。
【請求項１１】
前記少なくとも1つの分析物センサー受容体分子が、共有結合性の化学結合により前記少なくとも１つの支持体上に配置され、前記基板が、該基板に対する前記分析物センサー受容体分子の結合のために少なくとも１つの化学官能基を提供することが好ましく、該少なくとも１つの化学官能基が、カルボキシル基、無水物、エポキシド、アルデヒド、ヒドラジド、アシルアジド、アリルアジド、ジアゾ化合物、ベンゾフェノン、カルボジイミド、イミドエステル、イソチオシアナート、ＮＨＳエステル、ＣＮＢｒ、マレイミド、トシラート、トレシルクロライド、無水マレイン酸、及び、カルボニルジイミダゾールを含んだ群から選択される、請求項１に記載の検出装置。
【請求項１２】
当該検出装置が、前記少なくとも１つの支持体に対する、前記少なくとも１つの分析物センサー受容体分子に対する、並びに／又は、前記少なくとも１つの分析物センサー分子に対する非特異的結合を減少及び／若しくは阻止する能力がある溶液で処理される、請求項１に記載の検出装置。
【請求項１３】
前記溶液が、ＢＳＡ、ＨＳＡ、ＦＳＡ、カゼイン、Ｆｃテール、又は、ＴｒｉｔｏｎＸ１００、ＴｒｉｔｏｎＸ８０、Ｔｗｅｅｎ−８０、Ｔｗｅｅｎ−２０、及びＮＰ−４０を含む界面活性剤を含んだ群から選択された化合物を含む、請求項１２に記載の検出装置。
【請求項１４】
少なくとも１つの試料内の少なくとも１つの分析物を検出する方法であって：
請求項１に記載の検出装置を少なくとも１つ提供するステップ、
少なくとも１つの分析物を含んだ少なくとも１つの試料に前記少なくとも１つの検出装置を接触させるステップ、
任意選択で、非結合の又は非特異的に結合した試料を除去することができる溶液で前記少なくとも１つの検出装置を洗浄するステップ、
前記少なくとも１つの分析物センサー分子と前記少なくとも１つの試料の少なくとも１つの分析物との特異的相互作用を検出するステップ
を含む、方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの試料の前記少なくとも１つの分析物が、少なくとも１つの検出可能なマーカーで修飾される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの検出可能なマーカーが、蛍光物質、酵素、染料、化学発光化合物、放射性同位体、金属錯体、磁性粒子、ビオチン、ハプテン、無線周波送信器、及び、放射蛍光化合物を含んだ群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
臨床分析、新規薬物の同定、血液分析、薬物発見、構造−機能の研究、法医学、環境試料の試験、化学曝露、小分子ライブラリーの試験、又は、細胞ベースのアッセイにおいて使用することができる、請求項１４に記載の方法。
【国際調査報告】
2009539102.tif 000010
2009539102.tif 000011