(57)【要約】  本発明は、顕微鏡スライド上の蛍光目標点を伴った標本をディジタル化するための方法および自動化された蛍光イメージング・システムに関係する。この方法は、前記蛍光目標点の検出およびスキャンのために蛍光顕微鏡システムを使用する。この方法は、前記スライド上の前記標本のポジションを、前記標本および前記蛍光目標点を含む標本エリアを画定するべく、可視マーキング手段によってマークするステップ、スライドの少なくとも一部であって標本エリアを含む１以上の部分の明視野画像を第１の光学倍率において取り込み、その可視マーキング手段から前記標本エリア内に入る目標野のポジションを決定するステップと、標本エリアの目標野を、前記第１の光学倍率より高い第２の光学倍率においてスキャンするステップであって、前記目標野の少なくとも部分へ焦点合わせするステップを含む、ステップと、を包含する。
2009538431.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
顕微鏡スライド上の標本をディジタル化する、前記標本が蛍光目標点を有する方法であって、前記蛍光目標点の検出およびスキャンのために蛍光顕微鏡システムを使用し、かつ
（ａ）前記スライド上の前記標本のポジションを、前記標本および前記蛍光目標点を含む標本エリアを画定するべく、可視マーキング手段によってマークするステップと、
（ｂ）前記スライドの少なくとも一部であって前記標本エリアを含む１以上の部分の明視野画像を第１の光学倍率において取り込み、かつ前記可視マーキング手段から前記標本エリア内に入る目標野のポジションを決定するステップと、
（ｃ）前記標本エリアの前記目標野を、前記第１の光学倍率より高い第２の光学倍率においてスキャンするステップであって、前記目標野の少なくとも部分へ焦点合わせするステップを含む、ステップと、
を包含する方法。
【請求項２】
前記ステップ（ｃ）が、
前記標本エリア内において複数の目標野を選択するステップと、
前記複数の選択された目標野のそれぞれに、前記第２の光学倍率において焦点合わせを行い、それぞれの選択された目標野についての最適焦点距離を、当該目標野内において蛍光目標点が検出される場合に決定するステップと、
前記複数の選択された目標野について獲得された複数の前記最適焦点距離を使用して焦点面を決定するステップと、
前記焦点面から、前記第２の光学倍率において前記目標野のすべてをスキャンするときの焦点距離を獲得するステップと、
を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標本エリアの上にグリッドを投影することと、前記グリッドのグリッド・ポイント上に落ちる目標野を選択することと、を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記グリッドは、１つの方向において野の長さの３〜８個分、好ましくは野の長さの５個分のグリッド距離を有し、垂直の方向において野の幅の３〜８個分、好ましくは野の幅の５個のグリッド距離を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記焦点合わせするステップは、蛍光目標点を含む第１の目標野について最大焦点範囲内で前記焦点距離を変更することと、すべてのその後に続く野について、前記最大焦点範囲内に含まれる細密焦点範囲内で前記焦点距離を変更することと、を含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記細密焦点範囲は、所定の目標野または変動する目標野について決定された最適焦点距離に中心を置く区間であり、前記区間は、前記最大焦点範囲の区間より小さい、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細密焦点範囲の区間は、前記最大焦点範囲の区間の好ましくは２〜１０倍、より好ましくは３〜５倍、もっとも好ましくは４倍の細かさである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記目標野についての全体的な焦点合わせ時間を短縮するために、前記目標野の最適品質の画像タイルを保証するために必要となるものより短い露出時間を焦点合わせに使用することを含む、先行する請求項のうちのいずれかに記載の方法。
【請求項９】
初期露出時間を設定することと、特定の焦点距離において取り込まれた画像タイルが充分に明るくないときには前記露出時間を増加することと、前記増加された露出時間を使用して同一の焦点距離において新しい画像タイルを取り込むことと、を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記目標野から開始野を選択することと、前記開始野についての最適焦点距離を決定する目的のために前記開始野への焦点合わせを行うことと、を含む、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
以前に選択された野において蛍光目標点が見つからなかった場合には、更なる目標野を、焦点合わせのために選択することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
可視マーキング手段により、前記標本が載置された前記スライド上の前記領域の輪郭を描くことによって前記標本の前記ポジションをマーキングすることを含む、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記より高い倍率のスキャンによって獲得された、より高い倍率の画像タイルを互いにつなぎ合わせて、前記標本のより高い倍率のモンタージュ画像を形成することを含む、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
可視マーキング手段（２２）を有する蛍光顕微鏡スライド（６）の自動化されたディジタル化のための蛍光イメージング・システム（１）であって、
第１の光学倍率を有し、かつ明視野イメージングに適応された第１のイメージング・デバイスと、
前記第１の光学倍率より高い第２の光学倍率を有し、かつ蛍光イメージングに適応された第２のイメージング・デバイスと、
前記顕微鏡スライドを支持し、かつ前記顕微鏡スライドを、前記第１および第２のイメージング・デバイスに対して変位させるスライド変位デバイスと、
前記デバイスに接続された、ディジタル化の処理をコントロールするためのコントロール・ユニットと、
を包含するシステム。
【請求項１５】
前記第１のイメージング・デバイスは、視野（Ｅ）を有するプレビュー・カメラ（２）である、請求項１４に記載の蛍光イメージング・システム。
【請求項１６】
前記視野（Ｅ）は第１の視野（Ｅ）であり、さらに、前記第２のイメージング・デバイスが、蛍光顕微鏡（２５）の顕微鏡対物レンズ（３）およびディジタル・カメラ（５）を包含し、前記第２のイメージング・デバイスが、前記第１の視野（Ｅ）より小さい第２の視野（Ｍ）を有する、請求項１５に記載の蛍光イメージング・システム。
【請求項１７】
前記コントロール・ユニットは、コンピュータ（４）、マイクロプロセッサ、またはマイクロ‐コントローラまたは類似物である、請求項１４〜１６のうちのいずれかに記載の蛍光イメージング・システム。
【請求項１８】
請求項１４〜１７のうちのいずれかに記載の蛍光イメージング・システム（１）によってスキャンされることになる、蛍光目標点を伴う標本（１６）を担持する顕微鏡スライド（６）のセットであって、それにおいて前記スライド（６）のそれぞれの上の前記標本（１６）のポジションが、前記標本（１６）および前記蛍光目標点を含む標本エリア（２２ａ）を画定する可視マーキング手段（２２）によってマークされる、顕微鏡スライドのセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光目標点を伴う標本をディジタル化するための方法およびシステムに関する。本発明は、さらに、自動化された蛍光イメージング・システムによってスキャンされる顕微鏡スライドのセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
組織切片の分析は、医療診断の重要な分野である。組織分析を行うために、患者から組織標本が採取され、非常に薄い断面（たとえば厚さ２〜１０μｍ）にスライスされ、その後それがガラス板に載置され、多様な染料を用いて染色される。最後に、結果の標本を担持するスライドが、顕微鏡を用いて分析される。
【０００３】
分析の効率は、最初に、顕微鏡を包含する自動化されたイメージング・デバイスを使用して標本をディジタル化し、その後その画像ファイルを処理するための適切なソフトウエアによりディジタル画像を分析することによって実質的に向上させることが可能である。その種のイメージング・デバイスは、通常、顕微鏡の光学系に結合されたカメラを包含する。概して言えば、カメラの視野は、スライド全体の比較的小さい部分に対応し、このことは、スライド全体をスキャンするために、光学系の視野に対応する野（field）にそれが分割されること、および画像が各野に関して取り込まれることを意味する。個別の画像（画像タイルと呼ばれる）は、その後、ソフトウエア・アプリケーション内において、単一の連続するスライドの画像を形成するべく互いに『つなぎ合わされる（stitched）』。しかしながら、単一の視野ごとに焦点合わせすることは、相当に時間を消費する操作であり、焦点合わせの最適化の問題が、多くの従来技術文献によって取り組まれてきた。
【０００４】
蛍光測定の場合においては、適切な分子（蛍光色素）を用いて標本がラベル付けされ、その分布は、蛍光励起光を用いた標本の照明の後に明らかになる。蛍光励起光を用いて標本が照明されるときにそれに応答して異なる波長の蛍光が放射され、かつ１つまたは複数の色ビーム・スプリッタによってイメージング装置（たとえば、顕微鏡の対物鏡およびカメラ）に向けて透過（または反射）されるように、フィルタおよび色ビーム・スプリッタの配列が採用される。標本上の蛍光色素によって放射される蛍光が照明強度の線形関数でないことから、光強度の増加は可能でない。このことは、露出時間が、可視染料を用いて組織標本が染色され、したがって透過光において分析が可能な明視野顕微鏡検査法測定と比較してきわめて長くなり得ることを意味する。透過光の強度は増加可能であり、それによって必要な露出時間を０．５ｍｓ台まで短縮できるが、蛍光測定の場合には、露出時間が１０００ｍｓ台まで達することがあり得る。
【０００５】
明視野顕微鏡検査法と蛍光顕微鏡検査法の間における別の有意の相違は、明視野顕微鏡検査法においては露出時間の事前見積もりが可能であり、同一の露出時間を複数の類似の標本に使用することが可能であるが、蛍光顕微鏡検査法においては、それぞれの与えられた標本内の蛍光色素の数および分布に依存して５ｍｓ〜１０００ｍｓの間にわたってそれが変動し得る。このことは、蛍光標本への焦点合わせ時に、焦点距離および露出時間の両方が決定されなければならないことを意味する。
【０００６】
蛍光顕微鏡検査法に関連する別の問題は、スライド上の標本を見つけること、より詳細には標本内の蛍光目標点を見つけることである。それらの蛍光目標点は、標本の自己蛍光点および／または標本の染色に使用される蛍光色素を包含し得る。
【０００７】
標本は、一般にきわめて薄い組織層であり、通常光においてはほとんど見えない。明視野測定においては、組織が着色染料を用いて染色され、それによって目標点が可視となり、高倍率の顕微鏡スキャニングに先行して低倍率のカメラによってスライドのプレビュー画像を取り込むことが可能である。高倍率のスキャニングの実行前に、目標点がプレビュー画像内において、たとえば相対的なコントラストに基づいて識別され、それらの目標点を含む野だけがより高倍率で再スキャンされる。この方法においては、かなりのスライド・エリアが自動的に高倍率スキャニングの外に置かれ、空の（すなわち目標点を含まない）野への焦点合わせが必要ないことによって有意の時間が節約される。その種のプレビュー・カメラを包含する自動化された顕微鏡が国際特許出願第ＰＣＴ／ＨＵ２００７／００００１８号の中に開示されており、その全体は参照によってこれに援用される。
【０００８】
しかしながらその種のプレビュー・カメラは照明のために可視光を使用し、標本は、前述したとおり、きわめて薄い組織層からなる。したがって、標本自体および標本を染色する蛍光色素のいずれも、スライド上で検出可能ではない。注意しなければならないが、標本エリア全体が関連する測定野を含まないこともあり、このことは、標本エリアが識別される必要があったとしても、明視野測定におけるように標本野の全体への焦点合わせが可能とならないことを意味する。
【０００９】
明視野顕微鏡検査法においてプレビュー・カメラを使用することは、高倍率スキャニングの間の焦点合わせを一次元問題に圧縮し、標本野の場所および露出時間が既知であるため、焦点距離の変更だけが必要となる。しかしながら蛍光顕微鏡検査法においては、焦点合わせが３次元問題であり、言い替えると目標野の場所、露出時間、および焦点距離がすべて未知である。また、これも前述したとおり、焦点合わせは、高露出時間が必要とされることからきわめて時間を消費する手順である。
【００１０】
したがって、蛍光イメージングの場合において、獲得される画像の品質を維持しつつスキャニングを高速化するため、およびスキャニング時間を短縮するために焦点合わせのプロセスを最適化することは、より一層重大なものとなる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の目的は、焦点合わせする野の数を低減することによって上で述べた蛍光顕微鏡検査法の問題を克服することである。追加の目的は、所定の野への焦点合わせに必要とされる全体的な時間を短縮することである。
【００１２】
本発明の１つの態様においては、顕微鏡スライド上の標本をディジタル化するための方法が提供され、前記標本は蛍光目標点を有する。この方法は、前記蛍光目標点の検出およびスキャンのために蛍光顕微鏡システムを使用し、かつ以下のステップを包含する。
（ａ）前記スライド上の前記標本のポジションを、前記標本および前記蛍光目標点を含む標本エリアを画定するべく、可視マーキング手段によってマークするステップ、
（ｂ）スライドの少なくとも一部であって標本エリアを含む１以上の部分の明視野画像を第１の光学倍率において取り込み、その可視マーキング手段から前記標本エリア内に入る目標野のポジションを決定するステップ、および
（ｃ）標本エリアの目標野を、前記第１の光学倍率より高い第２の光学倍率においてスキャンするステップであって、前記目標野の少なくとも部分への焦点合わせするステップを含む、ステップ。
【００１３】
本発明に従った方法の可能な追加の好ましい変形が、請求項２〜１２によって指定される。
【００１４】
本発明の別の態様においては、可視マーキング手段を有する蛍光顕微鏡スライドの自動化されたディジタル化のための蛍光イメージング・システムが提供される。このシステムは以下を包含する。
第１の光学倍率を有し、かつ明視野イメージングに適応された第１のイメージング・デバイス、
前記第１の光学倍率より高い第２の光学倍率を有し、かつ蛍光イメージングに適応された第２のイメージング・デバイス、
顕微鏡スライドを支持し、かつ前記顕微鏡スライドを、前記第１および第２のイメージング・デバイスに対して変位させるスライド変位デバイス、および
前記デバイスに接続された、ディジタル化の処理をコントロールするためのコントロール・ユニット。
【００１５】
本発明に従った蛍光イメージング・システムの追加の好ましい実施態様は、請求項１３〜１７によって保護される。
【００１６】
本発明のさらに別の態様においては、蛍光目標点を有する標本を担持し、本発明に従った自動化された蛍光イメージング・システムによってスキャンされることになる顕微鏡スライドのセットが提供され、それにおいては、前記スライドのそれぞれの上の標本のポジションが、前記標本および前記蛍光目標点を含む標本エリアを画定する可視マーキング手段によってマークされる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の追加の詳細は、添付図面および例示的な実施態様から明らかになるであろう。
【００１８】
図１は、本発明に従った自動化された蛍光顕微鏡システム１の好ましい実施態様の概略的な平面図を示す。システム１は、２つのディジタル・イメージング・デバイスを包含する。この実施態様において、第１のイメージング・デバイスは第１の視野Ｅを伴う低倍率プレビュー・カメラ２であり、第２のイメージング・デバイスは、コントロール・ユニットに、すなわちこの特定のケースにおいてはコンピュータ４に結合された高倍率、高解像度の顕微鏡対物レンズ３およびＣＣＤカメラ５であり、対物レンズ３によって形成される画像がディジタル化されるような形で構成される。ディジタル化の間に情報がまったく失われないようにするために、好ましくはＣＣＤカメラ５の解像度を少なくとも対物レンズ３の解像度と同じ高さにする。第１のイメージング・デバイスは、それぞれのスライド・ポジションごとに第１の視野Ｅのディジタル化を実行するが、第２のイメージング・デバイスは、それぞれのスライド・ポジションごとに第２の視野Ｍのディジタル化を実行する。
【００１９】
ディジタル化されることになる顕微鏡スライド６（通常、生物学的標本／組織標本）は、顕微鏡スライド変位デバイスによってプレビュー・カメラ２と対物レンズ３との間を移動させることが可能である。スライド６は、スライド保持枠７上に配置される。その種のスライド変位デバイスは、たとえば国際公開第２００６／０２４９６７号パンフレットから公知であり、その全体が参照によってこれに援用され、したがってここでの説明においては簡単にだけ論じる。スライド保持枠７が、Ｘ軸方向に横たわるレール１０の搬送表面１７に、周知の懸架手段を介して取り付けられる。第１のステッピング・モータ８が、当該ステッピング・モータ８によって駆動されるねじ付きバー９により、レール１０に沿って搬送表面１７を変位させることができる。搬送表面１７が変位されると、スライド６およびスライド保持枠７も周知の懸架手段を介して変位される。同様にレール１０が、Ｚ軸方向に横たわるレール１８上に配置されており、第２のステッピング・モータ１１によって駆動されるねじ付きバー１３により変位さることが可能である。この方法においては、スライド保持枠７、したがってスライド６を、ＸおよびＺ軸両方に沿って移動することができる。ステッピング・モータ８および１１もまた、好ましくはコンピュータ４によってコントロールされる。
【００２０】
ＸおよびＺ軸によって決定される平面を水平とすることは可能である。その場合においては、スライド保持枠７が、下からスライド６を支持するだけで足りる。しかしながら、説明中の実施態様は、Ｚ軸が垂直の向きを有するような構成を示しており、したがってスライド６がスライド保持枠７内に、その長さ方向のエッジを水平に横たえて垂直ポジションに維持される。注意される必要があるが、ＸおよびＺ軸によって決定される平面は、水平に対して任意の角度とすることが可能である。
【００２１】
スライド６と顕微鏡対物レンズ３の相対的な距離を変更するため、かつそれによって焦点を変更するために任意の周知の手段を使用することができる。都合よくは、国際公開第２００６／０２４９６７号パンフレットの中に述べられているとおり、Ｙ軸の方向に沿ったスライド６の変位に焦点合わせアームを使用することが可能である。対物レンズ３を、たとえば圧電結晶によって移動することも可能であるが、簡明のため対物レンズ３に対してスライド６が変位される実施態様を参照することにする。
【００２２】
都合よくは、スライド保持枠７へのスライド６の自動的な配置および取り出しに適したスライド供給装置１４がＸ方向のレール１０の１つの端に接続される。その種のスライド供給装置１４は、たとえば国際公開第２００４／１１３９８９号パンフレットから公知である。
【００２３】
プレビュー画像の取り込みのために必要な照明は、プレビュー・カメラ２の近傍に配置され、スライド６に指向された任意の一般的な光源１５によって保証される。
【００２４】
図２は、周知の懸架手段を介してＸ軸と平行にレール１０の搬送表面１７に取り付けられたスライド保持枠７に固定されたスライド６を示す。その種の懸架手段は、たとえば国際公開第２００６／０２４９６７号パンフレットの中に開示されているところの弾性平行リンケージとすることができる。この例においては、スライド６の物理的なサイズが１インチ×３インチ（約２５．４ｍｍ×７６．２ｍｍ）である。プレビュー・カメラ２は、任意の一般的に使用される市場で入手可能な６４０×４８０ピクセルのウェブカメラとすることが可能である。プレビュー・カメラ２は、スライド６の全体がプレビュー・カメラ２の視野Ｅ内に入るような方法で、またはスライド６の一部だけ（たとえば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＨＵ２００７／００００１８号の中に述べられているとおり、１インチ×３／４インチ（約２５．４ｍｍ×１９．０５ｍｍ）よりわずかに大きい部分）だけが視野Ｅ内に入るような方法で配置できる。後者の場合は、スライド６全体のモンタージュ画像を、スライド６の４つの部分１８、１９、２０、２１（図２内に破線を用いて示されている）に対応する４つの画像タイルから構成可能であり、それらのうちの最初の部分１８は、識別データおよびスライド６に関連するそのほかの情報を、たとえば書き込み２３および／またはバーコード２４の形式で担持する特別な情報部分とすることができる。
【００２５】
前述したとおり、スライド６上に載置された標本１６は、光源１５によって作られる可視光照明下において見ることはできない。したがって、自動化された蛍光顕微鏡システム１内にスライド６を挿入する前に標本１６（破線を用いて示されている）のポジションが、可視マーキング手段２２によってマークされる。たとえば病理学者が、スライド６上に標本１６を載置した直後にペンを用いてそれの輪郭を描くことによって標本１６のポジションをマークすることができる。図２におけるマーキング手段２２は、標本１６を含む標本エリア２２ａの周囲に描かれた、プレビュー・カメラ２のプレビュー画像内において可視となるペンのラインである。しかしながら、そのほかの任意タイプのマーキング手段２２を使用することは、それが標本１６を含む標本エリア２２ａをマークするのに適する限り可能であり、スライド６全体より標本エリア２２ａが小さく、それによってスライド６上のスキャンされるべきエリアが実質的に縮小される。たとえばスキャンされることになる複数のスライド６上の複数の標本１６がおおむね規則的なサイズおよび形状を有している場合には、標本１６のコーナの１つ（たとえば、上左コーナ）をマークすれば充分であり、それらから標本エリア２２ａおよびスライド６上におけるそれのポジションを計算することが可能である。
【００２６】
第２のイメージング・デバイスは、図３に概略的に示されるとおり、従来的なディジタル蛍光顕微鏡２５とすることができる。その種のディジタル蛍光顕微鏡２５の主要構成要素は、対物レンズ３、フィルタ・キューブとも呼ばれる光学ブロック２６、蛍光光源２７、およびディジタル・カメラ、たとえばＣＣＤカメラ５である。対物レンズ３は、ＣＣＤカメラ５とともに第２のイメージング・デバイス、すなわち蛍光顕微鏡２５の視野Ｍを定義する。たとえば、対物レンズ３は、１０２４×７６８ピクセルの解像度のＣＣＤカメラ５とともに使用可能な２０倍の光学一次倍率を有することができる。ＣＣＤカメラ５の各単一ピクセルは、スライド６の０．２３μｍ×０．２３μｍ平方（２０倍にの拡大する前）に対応可能であり、したがって蛍光顕微鏡２５の視野Ｍは、約２３５μｍ×１７６μｍとなる。明瞭にするため、スライド６の対応する矩形エリアをスライド野（または単に野）と呼び、その種の野の取り込まれた画像を画像タイル（またはタイル）と呼ぶことにする。標本１６は、たとえば約２ｃｍ２〜２．５ｃｍ２の標準的な組織切片とすることができる。
【００２７】
概して蛍光光源２７として水銀（Ｈｇ）またはキセノン（Ｘｅ）アーク灯が、これら２つの種類のランプについては適切な光学ブロック２６が容易に利用可能であることから使用される。任意タイプの蛍光光源２７用に適切な光学ブロック２６が設計可能であることから、このほかの蛍光光源２７も同様に使用可能である。
【００２８】
光学ブロック２６は、波長選択性励起フィルタ２８、ビーム・スプリッタ２９（またはダイクロイック・ミラー）、およびバリア（または放射）フィルタ３０を含む。ダイクロイック・ビーム・スプリッタ２９は、概して、光路内に４５°の角度（図中に示されるとおり）で配置されたときに特定波長の光を反射または通過させるべく設計された専用の干渉フィルタである。
【００２９】
本発明のディジタル化方法を、次に、上に示した本発明に従った自動化された蛍光顕微鏡システム１の例示的な実施態様を参照して述べる。
【００３０】
ディジタル化されることになるスライド６が、スライド供給装置１４内に配置され、それが、たとえばロボット・アームを介して最初のスライド６をスライド保持枠７内に導入する。顕微鏡システム１にスライド供給装置１４が備えられていない場合には、適切に設計された、最終的にスライド６がスライド保持枠７内となる開口またはそのほかの任意の手段を通じてユーザがスライド６を顕微鏡システム１内に導入することが可能である。
【００３１】
続くステップは、コンピュータ４のコマンドの下に好都合に実行される。スライド保持枠７が、部分１８、１９、２０、２１のうちの１つがプレビュー・カメラ２の視野Ｅ内となるように、ステッピング・モータ８を介してＸ軸レール１０に沿ってプレビュー・カメラ２の正面に移動される。プレビュー画像が取り込まれ、ディジタル情報がコンピュータ４に転送される。スライド６が移動され、各標本部分１９、２０、２１のそれぞれ、およびオプションとして情報部分１８があればそれのプレビュー画像が取り込まれる。情報部分１８は、任意の周知のスキャニングまたはイメージング手段（たとえばバーコード・スキャナ）によってスキャンが可能であり、かつ任意の周知の方法で処理することが可能である。標本部分１９、２０、２１は、コンピュータによって処理および分析され、それには、取り込まれた１以上のプレビュー画像上のマーキング手段２２を識別すること、およびそれから標本エリア２２ａのポジションを決定することが含まれる。オプションとしてスライドの部分１８、１９、２０、２１の個別のプレビュー画像は、プレビュー・モンタージュ画像を作るべく互いに嵌め込まれ、それをユーザに示すことができる。簡明のため、図４に、標本１６を含む標本エリア２２ａの全体を包含し、マーキング手段２２によって画定されているプレビュー画像を示す。標本エリア２２ａ内に入る目標スライド野３５（サイズにおいて蛍光顕微鏡２５の視野Ｍに対応する）が決定されるが、これは、顕微鏡対物レンズ３の下に目標野３５を位置決めするために目標野３５のそれぞれについてスライドのポジションが計算されることを意味する。注意する必要があるが、現実においては標本エリア２２ａのすべてを覆うために数万のスライド野３５が必要とされることになるため、図４は非常に概略的な図である。またディジタル蛍光顕微鏡２５によって取り込まれた個別の画像タイルから高倍率モンタージュ画像（仮想スライドとも呼ばれる）を作成することを容易にするために、目標スライド野３５が、好適にオーバーラップするスライド６の領域になる。
【００３２】
プレビュー画像が取り込まれると、それがコンピュータ４によって処理され、その一方でスライド６が、プレビュー・カメラ２から高倍率顕微鏡対物レンズ３を包含する第２のイメージング・デバイスに移動され、そこで目標スライド野３５のうちの少なくともいくつかの高倍率画像タイルが取り込まれる。
【００３３】
高倍率蛍光イメージングは、次の態様で実行される。
【００３４】
光源２７が多スペクトル光３１を放射し、それが励起フィルタ２８を通過し、続いてそれが特定波長（または定義済み帯域の波長）の励起光３２を作り出す。励起フィルタ２８によって通過された励起光３２は、ビーム・スプリッタ２９の表面で反射され、顕微鏡対物レンズ３を通してスライド６上に指向される。対物レンズ３の下の目標野内に標本片に取り付けられた蛍光色素が存在する場合には、観察された標本片が蛍光発光し、励起に続いて独自の放射光３３ａを作り出す。この放射光３３ａが対物レンズ３によって収集され、ビーム・スプリッタ２９を通って返され、その後に続いて不必要な励起波長を遮断するバリア・フィルタ３０によってフィルタリングされる。この場合において顕微鏡対物レンズ３は、第１に良好に矯正された集光器として、第２に画像形成光収集器として働く。最後にＣＣＤカメラ５がフィルタリング後の放射光３３ｂを取り込み、ディジタル情報がコンピュータ４に転送される。
【００３５】
本発明に従った高倍率蛍光イメージングの好ましい方法を、次に図４および図５を参照して説明する。
【００３６】
説明の導入部分において蛍光顕微鏡の場合で説明したとおり、ある部分だけにしか観察可能な蛍光色素（または目標点）を含まない大量の野３５がディジタル化されなければならない。さらにまた焦点合わせは、焦点距離および露出時間がともに未知の変量であることから、きわめて時間を要する。したがって、結果として得られる仮想スライドの高い品質を維持しつつ、不必要な焦点合わせを低減するといったイメージング方法を提供することは非常に重要である。
【００３７】
したがって、本発明に従った方法の基本コンセプトは、スキャンされるべき各スライド野３５についての焦点距離を決定するために必要とされる時間を短縮することである。これは、好ましくは組み合わせて使用される次の２つの方法で達成されることが可能である。
（ｉ）焦点合わせされるべきスライド野３５の数を低減すること、および
（ｉｉ）所定のスライド野３５について最適焦点距離を見つけるために必要とされる時間を短縮すること。
【００３８】
項目（ｉ）は、複数の目標野３５ａを選択すること、および選択された目標野３５ａだけに焦点合わせすることによって達成される。焦点距離が、それぞれの選択された目標野３５ａについて決定され、それにより、当該決定された最適焦点距離に対応する３次元データ・セットが、それぞれの選択された目標野のポジション（たとえば、所定の選択された目標野３５ａが顕微鏡２５の視野Ｍ内に入るとき、スライド保持枠７のｘ、ｚ座標によって定義される）において獲得される。次に、獲得された３次元データ・セット上に、目標野３５のすべてのための補間された焦点距離を提供する焦点面（focal surface）が当て嵌められる。当該焦点面は、その後、全体の標本エリア２２ａをスキャンするために使用される。焦点面の作成および使用は、伝統的な明視野顕微鏡検査法スキャニングから周知であり、したがってさらに詳細に論じることはしない。
【００３９】
焦点合わせされるべき複数の目標野３５ａを選択する目的のため、標本エリア２２ａ内の目標スライド野３５の上に適切な（仮想）グリッド３６を投影することが可能であり、選択された目標野３５ａを、図４の円Ａの拡大図である図５に示すとおり、グリッド・ポイント３６ａ上に落ちるものとすることが可能である。適切なグリッド３６は、たとえばＸおよびＺ両方の方向において、３つから５つの目標野３５のグリッド距離を有することができる（目標スライド野３５が矩形であれば、グリッド３５もまた矩形になることを意味する）。しかしながら蛍光標本１６に応じて、ほかの適切なグリッド３６が当業者によって容易に定義されることは可能である。
【００４０】
項目（ｉｉ）に示されているとおり、所定の目標スライド野３５の焦点距離を見つけるために必要とされる時間を短縮するために以下が提案され、これらは単独で、または組み合わせて適用可能である。
‐  最大焦点範囲より小さい細密焦点範囲を決定し、この焦点範囲内においてのみ焦点合わせを行うこと、
‐  より短い露出時間を使用して目標スライド野３５に焦点合わせすること。
【００４１】
最大焦点範囲は、上および下の焦点距離によって定義され、その間において焦点距離の変更が可能、または変更されるべきとする。
【００４２】
蛍光顕微鏡２５の焦平面（focal plane）は概して既知であり、スライド保持枠７を焦平面と同じレベルで移動することは可能であるが、標本１６の厚さが変動するため、標本１６のための厳密な焦点距離は未知である。推定された標本１６の表面から１０ミクロン異なるだけでも、ＣＣＤカメラ５の画像取り込み表面上に画像がまったく見られないという状況を導き得る。したがって、光軸（Ｙ軸）に沿った実用的な最大焦点範囲（すなわち距離区間）は、その中で被検査標本のスライド６について焦点距離が求められるべく見積もられなければならない。その種の見積もりは、スキャンされることになる標本１６のタイプ、標本１６の上に載置される保護カバー・ガラスの厚さ、スライド６のタイプ等に基づいて行うことが可能である。最大焦点範囲は、通常、０．１ｍｍ〜０．２ｍｍの区間とすることができる。
【００４３】
細密焦点範囲は、最大焦点範囲より小さい範囲であり、すでに測定済みの焦点距離上に中心が置かれる。細密焦点範囲の使用を支えるアイディアは、各目標野３５の焦点距離が、最大焦点範囲に比較すると非常に限られた範囲内でのみ変化し、したがって、目標野３５の１つについて一度焦点距離が見つけられた後は、当該測定された焦点距離に中心が置かれる細密焦点範囲を定義することが可能であり、残りの目標野３５の場合については、この細密焦点範囲内において焦点合わせを行えば充分であるということになる。
【００４４】
たとえば、最大焦点範囲を０．２ｍｍの焦点距離区間とすることが可能であり、目標野３５の１つについての焦点距離が、好ましくはその最大焦点範囲区間の少なくとも半分、さらに好ましくは１／４とする第２のより狭い区間、たとえば第１の区間の定義済みの値から±０．０２５ｍｍという形で細密焦点距離を定義できる区間の特定の値であることが見出されている。
【００４５】
細密焦点範囲を定義する目的のために、最初に、蛍光目標点、すなわち自己蛍光発光標本点および／または蛍光色素着色を含む目標野３５が見つけられなければならない。蛍光目標点を伴わない目標野３５は光を放出せず、したがってディジタル蛍光顕微鏡２５による位置合わせができない。したがって、その種の目標野３５に焦点を合わせることは不可能である。
【００４６】
取り込まれた画像が良好に焦点合わせされているか否か、すなわちそれが充分に鮮明であるか否かを決定するために多くの画像処理アルゴリズムが利用可能である。その種のアルゴリズムは、通常、隣接ピクセル間の強度における差を分析する。最適焦点距離は、もっとも有意の強度差を伴う画像に帰するものとなる。
【００４７】
蛍光イメージングの場合においては、何らかの塵埃またはそのほかの不必要な着色が自己蛍光性を有し得ることから、常にノイズ・レートがより高いものとなり、そのことが、自己蛍光発光標本点および／または蛍光色素の検出を困難とする。発明者らは、この高いノイズ・レートに起因して、図６に示される任意の周知のヒストグラム方法の使用が有利であることを見出した。特定のピクセル強度差を有する隣接ピクセルの数が記録され、獲得された数値からヒストグラム『ａ』が作成される。注意される必要があるが、アルゴリズムは、直接隣り合うピクセルの使用に代えて、互いから特定の距離にあるピクセル間における強度差を用いて動作できる。
【００４８】
現在の例においてはピクセル強度が８ビットで登録されるが、これは最大ピクセル強度が、また任意の２つの隣接ピクセルの間の最大ピクセル強度差が２５５であることを意味する。図６の例示的なヒストグラム『ａ』からわかるとおり、隣接ピクセルのほとんどは数単位の強度差しか有していなく、有意の強度差は、いくつかの隣接ピクセルについて記録されただけである。次にカット‐オフ値が定義され、ノイズ・フィルタリングを確保するために、当該カット‐オフ値より低い強度差を有する隣接ピクセルについての結果が無視される。たとえば、カット‐オフ値を８とすることが可能であり、これは８単位未満の強度差が標本１６の自己蛍光によるとして説明でき、したがって、それが現実の目標点を反映してなく、最良合焦画像を見つけ出すことを求める際に考慮されるべきではないことを意味する。カット‐オフ値は、特定タイプの組織標本または蛍光色素用に定義される、実験に基づく値とすることが可能である。しかしながら、いくつかの目標野３５は数個の蛍光目標点しか含まないか、それらのほとんどが微弱となり得ることから、これでも画像の鮮明さの決定のために充分でないことがあり、これは、より高い強度差を有するもっとも意味のある隣接ピクセルが、ヒストグラム『ａ』内において非常に不充分に表現されていることを意味する。この問題を克服するため、いくつかのアルゴリズムは、ヒストグラム『ａ』に適切な重み付け関数、たとえば放物線または指数関数『ｂ』を乗じる。このほかの任意の、より高い強度差を有する隣接ピクセルの数の重みを増加する補助となる重み付けも使用することが可能である。カット‐オフ値を適用し、ヒストグラム『ａ』に重み付け関数『ｂ』を乗ずることによってノイズのフィルタリングが行われた後は、結果の値が積算される。積算後の結果が高いほど、その画像への焦点合わせがより良好である。後述するが、異なる焦点距離において取り込まれる所定の目標野３５の画像のすべてについて、露出時間が必ずしも同一である必要はない。したがって、各焦点距離において獲得されたヒストグラムを比較するとき、値が、たとえば露出時間によりその値を除することによって好適に正規化される。
【００４９】
例示的な実施態様においては、細密焦点範囲を定義するための第１の焦点距離を見つけ出す試みのとき、焦点距離を０．２ｍｍの区間内において複数のステップ（たとえば３０〜４０ステップ）で変更することが可能であり、取り込まれた画像を、最良合焦画像を決定するための任意の周知の（たとえば、上での述べたタイプの）アルゴリズムを用いて分析することが可能である。
【００５０】
最大焦点範囲内の各焦点距離において焦点合わせが実行された後は、観察された野３５が目標点を含むか否かの決定に特殊な物体検出アルゴリズムを使用できる。または代替的に、同一のヒストグラムが、いずれかの画像が充分に合焦されているか否かを決定するべく機能することが可能であり、良好に合焦された画像が見つからない場合には、その観察された野３５内に蛍光目標点が存在しないことを意味する。
【００５１】
前述したとおり、必ずしもすべての目標野３５が蛍光目標点を含んでいるわけではない。したがって、最良合焦画像が獲得できる目標野３５、すなわちこれは蛍光目標点を有する目標野３５を意味するが、それを見つけるための特殊なアルゴリズムを有すると有利である。可能な方法は、最良合焦画像が獲得できるまで、目標野３５（または選択された目標野３５ａだけ）に１つずつ焦点合わせすることである。マーキング手段２２の近傍から開始することは、多くの場合（たとえば、ペンを用いて標本１６の輪郭を描くとき）に標本１６がマーキング手段２２から遠く離れ、標本エリア２２ａ内であるが、実際の標本１６の外の目標野３５への焦点合わせを試みて貴重な時間が失われることから、あまり有利でないことが明らかになった。好都合には焦点合わせを、標本エリア２２ａの内側の野３５、たとえば標本エリア２２ａの幾何学中心にもっとも近い開始野３５ｂ（図４）において開始することができる。開始野３５ｂをそのほかの方法で定義することも可能であり、都合よく選択される野３５ａ（存在する場合）に一致することも可能である。開始野３５ｂに焦点合わせができなかった場合に螺旋経路３７に沿って移動することも好都合である。螺旋経路３７は、隣接する野３５（または隣接する選択された野３５ａ）によって形成可能であり、焦点合わせが実行可能な蛍光野３５ｃ、すなわち蛍光目標点を含む蛍光野３５ｃが見つかるまで、螺旋経路３７上にある各野３５（または選択された野３５ａ）において焦点合わせを試みることができる。選択された野３５ａが開始野３５ｂとして使用された場合には、螺旋経路３７が、開始野３５ｂとほかの選択された野３５ａを螺旋パターン（図４に示されるとおりの）でリンクすることが可能であり、焦点合わせされるべき次の選択された野３５ａを、螺旋経路３７に沿った次の１つとすることが可能である。より良好な理解のため、個別の蛍光目標点を含む蛍光エリア３８が図４内に図解されている。このことは、蛍光野３５ｃが蛍光エリア３８の一部を含むことを意味する。
【００５２】
焦点合わせが可能な蛍光野３５ｃが見つかった後は、獲得された焦点距離を使用して細密焦点範囲を定義できる。細密焦点範囲の区間は、好ましくは最大焦点範囲の少なくとも２倍細かい。より好ましくは最大焦点範囲の３〜５倍、たとえば４倍細かい。特に、細密焦点範囲を、０．２ｍｍとする最大焦点範囲区間を用いて最初に獲得された焦点距離から±２５μｍとすることが可能である。細密焦点範囲の区間は、実験に基づく値とすること、またはほかの考慮事項（標本１６のタイプ、蛍光色素の垂直分布等）に頼ることが可能である。別の有利な実施態様においては、細密焦点範囲が標本エリア２２ａ全体を通じて一定ではなく、それに代えてあらかじめ与えられた細密焦点範囲区間（たとえば、５０μｍの区間、すなわち不定の中心から±２５μｍ）が、すでに焦点合わせが実行済みであり、かつ最適焦点距離が決定できたもっとも近い目標野３５の焦点距離とともに使用される。
【００５３】
しかしながら焦点距離だけを変更することは、露出時間もまた未知の因数であるため、一般に、評価可能な画像の取り込みにまったく充分でない。露出時間は、焦点距離に伴って有意に変動し得ることから、焦点距離の変更は充分なピクセル強度の画像を取り込むために充分ではなく、露出時間も変更されなければならない。
【００５４】
概して言えば、蛍光顕微鏡検査法に必要とされる露出時間は、５ｍｓと１０００ｍｓの間において変動し得る。蛍光目標点が、露出のない画像内においては可視ではなく、過剰露出された画像もまた、飽和に起因して評価可能ではない。したがって、適切な時間を選択することは非常に重要である。
【００５５】
取り込まれた画像のもっとも明るいピクセルのピクセル強度が、所定の強度レベルに達しない場合には、その画像を評価することが可能でなく、同一の焦点距離において、ただしより長い露出時間を使用して新しい画像が取り込まれる必要がある。同様に、もっとも明るいピクセルが、強度範囲の最大（たとえば、８ビット解像度使用時に２５５に近い）であるときは、飽和を押さえるべくより短い露出時間を用いてイメージングを反復する必要がある。このことは、第１の蛍光野３５ｃを見つけ出す試みのとき、および細密焦点範囲がすでに得られているときの両方に当て嵌まる。
【００５６】
項目（ｉｉ）の下における第２の提案は、所定の目標野３５についての全体の焦点合わせ時間を短縮するために、焦点合わせの間の最適品質の仮想スライドを保証する上で必要となるものより低い露出時間の使用に関係する。以下の方法は、最大焦点範囲内における焦点合わせを行うとき、および細密焦点範囲内における焦点合わせを行うときの両方に適用することが可能である。
【００５７】
時間を節約するために、最初に、観察される目標野３５について短い露出時間を使用して焦点合わせを試みることができる。
【００５８】
例示の実施態様においては、スライドと対物レンズとの距離が、最大焦点範囲または、すでに決定ずみであれば細密焦点範囲のうちのいずれかに入る第１の値に調整される。当該選択された距離において画像が取り込まれ、もっとも明るいピクセルの強度が決定される。焦点合わせの目的のためには、最大ピクセル強度値が、最大可能強度の１／８と１／４との間に入れば充分であることが明らかになっており、言い替えると８ビット・スケールを使用する場合には最大可能強度が２５５に対応するので、もっとも高いピクセル強度値は３２と６４との間とすることが可能である。当然のことながら、このほかの好ましい強度範囲を容易に決定することが可能である。
【００５９】
もっとも高いピクセル強度があらかじめ決定済みの範囲に入らない限り、または露出時間があらかじめ決定済みの最大値（たとえば１０００ｍｓ）より小さい限り、所定の第１の距離における焦点合わせが、順次より長い露出時間を使用して反復される。好ましい実施態様においては、初期露出時間を５ｍｓ〜１０ｍｓとすることが可能であり、取り込み済み画像内のもっとも明るいピクセルが好ましい範囲内に入らないことから所定の距離における焦点合わせを反復しなければならなくなる都度、倍加することができる。輝度が適切になった後は、その所定距離における画像の鮮明度が（たとえば、ヒストグラム・アルゴリズムを使用して）決定され、距離が（たとえば、スライド６を方向Ｙに変位させることによって）変更され、この手順が反復されることになり、言い替えると適切な露出時間が再び決定され、画像が取り込まれ、画像の鮮明度が計算される。
【００６０】
適切な焦点範囲内におけるすべての望ましい焦点距離ごとに画像が獲得されると、画像の鮮明度が比較される。もっとも鮮明な画像が調べられ、観察された野３５が蛍光目標点を含むか否か（すなわち、それが蛍光エリア３８に属するか否か）が決定される。観察された野３５が蛍光目標点を含むことが明らかになった場合には、もっとも鮮明な画像に属する焦点距離および露出時間が、その観察された野３５について記録される。
【００６１】
すべての焦点距離において合焦画像を獲得できなかった場合には（観察された野３５に属する蛍光目標点がないことを意味する）、新しい野３５が選択される。初期細密焦点範囲を求めている場合には、新しい野３５を、螺旋経路３７に沿った次の１つとすることができる。それ以外は、新しい野を別の選択された野３５ａとすることができる。好適には、その種の、焦点合わせされた画像が得られなかった野３５が非蛍光性としてマークされ、標本エリア２２ａの再スキャンを行うときに除外され、好都合にはその種の野３５の近傍さえも省略できる。
【００６２】
焦点合わせが可能である場合には（観察された野３５が蛍光目標点を有していることを意味する）、高品質の画像タイルの獲得のために必要となる値より短い露出時間において最適焦点距離が決定されており、言い替えるともっとも明るいピクセルの強度は、たとえば最高可能強度の４分の１より小さい。高品質のモンタージュ画像を作成する目的のためには、個別の画像タイルが共通の露出時間を使用して好ましく取り込まれるが、そうでなければ異なって適用された露出時間に起因してタイルのうちのいくつかがより明るく、またはより暗くなり得る。しかしながら、すべての目標野３５について最適露出時間、すなわちすべての関連する蛍光野３５ｃが可視となるように充分に長く、しかも取り込まれる画像タイルのいずれにおいても飽和が防止される長すぎない時間を前もって知ることは困難である。例として述べるが、最も短い露出時間（前述したとおり、焦点距離および露出時間は、焦点合わせされた各蛍光野３５ｃのもっとも鮮明な画像について登録される）を伴う蛍光野３５ｃを選択することによって最適グローバル露出時間を選択できる。もっとも高い強度値があらかじめ選択済みの範囲内に入ることから、この強度範囲に到達するためにもっとも短い露出時間を必要としている野３５ｃが、もっとも強い蛍光目標点を有すること、すなわちそれがもっとも明るい野３５ｃであると推測できる。この野３５ｃをグローバル露出時間の決定のために選択することによって、ほかの野３５ｃの画像タイルも飽和されないことが保証できる。したがって、もっとも短い露出時間を伴う野３５ｃが顕微鏡対物レンズ３の下に戻され、使用可能な露出時間の上限、すなわち飽和が生じないもっとも高い露出時間を見つけ出すために、以前の決定済みの最適焦点距離において、増加された露出時間を用いて新しい画像のセットが取り込まれる。好ましくは、グローバル露出時間が、画像タイルのいずれも飽和しないことを特定の許容度を伴って保証するべく選択される。たとえばグローバル露出時間は、焦点合わせステップにおいて、もっとも短い露出時間を伴う野３５ｃのうちのもっとも高い強度値が２００から２２０まで（８ビット表現の場合）に入るようにする。
【００６３】
すべての目標野３５に対して、またはすべての選択された目標野３５ａに対して焦点合わせが実行され、グローバル露出時間が決定された後は、所定の野３５について決定された焦点距離において、または焦平面によって与えられる補間された焦点距離において（項目（ｉ）との組み合わせで項目（ｉｉ）が使用される場合）グローバル露出時間を用いてすべての目標野３５を再スキャンすることが可能である。蛍光目標点の欠如が明らかにされた目標野３５は、標本エリア２２ａの再スキャン時に好適に除外される。
【００６４】
以上述べた実施態様は、例を示すことだけが意図されており、本発明の限定と見なされるべきではない。付随する特許請求の範囲によって決定される保護の範囲から逸脱することなく、当業者には多様な変形が明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】本発明に従った自動化された蛍光顕微鏡システムの概略的な平面図である。
【図２】プレビュー・カメラから見たときのレール上に配置されたスライド保持枠内に保持されたスライドのＹ軸の方向に沿った概略図である。
【図３】本発明に従った自動化された蛍光顕微鏡システム内に使用される蛍光顕微鏡の例示的な実施態様の概略的な断面図である。
【図４】プレビュー・カメラによって撮られたプレビュー画像の概略的に示す図である。
【図５】図４内の円Ａにおいて得られる拡大図である。
【図６】本発明に従った方法の例示的な実施態様の中で使用されるヒストグラム方法を図解した線図である。
【図１】
2009538431.tif 000003
【図２】
2009538431.tif 000004
【図３】
2009538431.tif 000005
【図４】
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【図５】
2009538431.tif 000007
【図６】
2009538431.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成20年8月19日(2008.8.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
顕微鏡スライド上の標本をディジタル化する、前記標本が蛍光目標点を有する方法であって、前記蛍光目標点の検出およびスキャンのために蛍光顕微鏡システムを使用し、かつ
（ａ）前記スライド上の前記標本のポジションを、前記標本および前記蛍光目標点を含む標本エリアを画定するべく、可視マーキング手段によってマークするステップと、
（ｂ）前記スライドの少なくとも一部であって前記標本エリアを含む１以上の部分の明視野画像を第１の光学倍率において取り込み、かつ前記可視マーキング手段から前記標本エリア内に入る目標野のポジションを決定するステップと、
（ｃ）前記蛍光顕微鏡システムによって前記目標野の画像タイルを獲得するべく、前記標本エリアの前記目標野を、前記第１の光学倍率より高い第２の光学倍率においてスキャンするステップであって、前記スキャンはグローバル露出時間を使用することによって実行され、前記グローバル露出時間は、それぞれが所定の目標野について前記目標野の少なくとも一部への焦点合わせが生じるときに獲得された露出時間から選択され、所定の目標野への前記焦点合わせの間に、前記それぞれの露出時間もまた、前記目標野の画像タイルがあらかじめ決定済みの品質を伴って取り込まれるまで変更されるステップと、
を包含する方法。
【請求項２】
前記ステップ（ｃ）が、
前記標本エリア内において複数の目標野を選択するステップと、
前記複数の選択された目標野のそれぞれに、前記第２の光学倍率において焦点合わせを行い、それぞれの選択された目標野についての最適焦点距離を、当該目標野内において蛍光目標点が検出される場合に決定するステップと、
前記複数の選択された目標野について獲得された複数の前記最適焦点距離を使用して焦点面を決定するステップと、
前記焦点面から、前記第２の光学倍率において前記目標野のすべてをスキャンするときの焦点距離を獲得するステップと、
を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標本エリアの上にグリッドを投影することと、前記グリッドのグリッド・ポイント上に落ちる目標野を選択することと、を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記グリッドは、１つの方向において野の長さの３〜８個分、好ましくは野の長さの５個分のグリッド距離を有し、垂直の方向において野の幅の３〜８個分、好ましくは野の幅の５個のグリッド距離を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記焦点合わせするステップは、蛍光目標点を含む第１の目標野について最大焦点範囲内で前記焦点距離を変更することと、すべてのその後に続く野について、前記最大焦点範囲内に含まれる細密焦点範囲内で前記焦点距離を変更することと、を含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記細密焦点範囲は、所定の目標野または変動する目標野について決定された最適焦点距離に中心を置く区間であり、前記区間は、前記最大焦点範囲の区間より小さい、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細密焦点範囲の区間は、前記最大焦点範囲の区間の好ましくは２〜１０倍、より好ましくは３〜５倍、もっとも好ましくは４倍の細かさである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記目標野についての全体的な焦点合わせ時間を短縮するために、前記目標野の最適品質の画像タイルを保証するために必要となるものより短い露出時間を焦点合わせに使用することを含む、先行する請求項のうちのいずれかに記載の方法。
【請求項９】
初期露出時間を設定することと、特定の焦点距離において取り込まれた画像タイルが充分に明るくないときには前記露出時間を増加することと、前記増加された露出時間を使用して同一の焦点距離において新しい画像タイルを取り込むことと、を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記目標野から開始野を選択することと、前記開始野についての最適焦点距離を決定する目的のために前記開始野への焦点合わせを行うことと、を含む、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
以前に選択された野において蛍光目標点が見つからなかった場合には、更なる目標野を、焦点合わせのために選択することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
可視マーキング手段により、前記標本が載置された前記スライド上の前記領域の輪郭を描くことによって前記標本の前記ポジションをマーキングすることを含む、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記より高い倍率のスキャンによって獲得された、より高い倍率の画像タイルを互いにつなぎ合わせて、前記標本のより高い倍率のモンタージュ画像を形成することを含む、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
可視マーキング手段（２２）を有する顕微鏡スライド（６）上の標本（１６）の自動化されたディジタル化のための、前記標本（１６）が蛍光目標点を有する、蛍光イメージング・システム（１）であって、
第１の光学倍率を有し、かつ前記顕微鏡スライド（６）の少なくとも一部の明視野イメージングに適応された第１のイメージング・デバイスと、
前記第１の光学倍率より高い第２の光学倍率を有し、かつ蛍光イメージングに適応された第２のイメージング・デバイスと、
前記顕微鏡スライド（６）を支持し、かつ前記顕微鏡スライド（６）を、前記第１および第２のイメージング・デバイスに対して変位させるスライド変位デバイスと、
前記イメージング・デバイスに接続された、ディジタル化の処理をコントロールするためのコントロール・ユニットと、を包含し、
前記コントロール・ユニットは、
前記第１のイメージング・デバイスによって、および前記可視マーキング手段（２２）によって獲得された画像に基づいて前記標本（１６）を含む標本エリア（２２ａ）を画定し、
前記標本エリア（２２ａ）内の目標野（３５）を選択し、
前記第２のイメージング・デバイスに、前記目標野（３５）の画像タイルを獲得するための前記目標野（３５）をイメージングさせる指示であって、前記イメージングがグローバル露出時間の使用によって実行され、前記グローバル露出時間が、それぞれが所定の目標野について前記目標野（３５）の少なくとも一部への焦点合わせが生じるときに獲得された露出時間から選択され、所定の目標野への前記焦点合わせの間に、前記それぞれの露出時間もまた、前記目標野の画像タイルがあらかじめ決定済みの品質を伴って取り込まれるまで変更されるような指示を行うべくプログラムされる、
蛍光イメージング・システム。
【請求項１５】
前記第１のイメージング・デバイスは、視野（Ｅ）を有するプレビュー・カメラ（２）である、請求項１４に記載の蛍光イメージング・システム。
【請求項１６】
前記視野（Ｅ）は第１の視野（Ｅ）であり、さらに、前記第２のイメージング・デバイスが、蛍光顕微鏡（２５）の顕微鏡対物レンズ（３）およびディジタル・カメラ（５）を包含し、前記第２のイメージング・デバイスが、前記第１の視野（Ｅ）より小さい第２の視野（Ｍ）を有する、請求項１５に記載の蛍光イメージング・システム。
【請求項１７】
前記コントロール・ユニットは、コンピュータ（４）、マイクロプロセッサ、またはマイクロ‐コントローラまたは類似物である、請求項１４〜１６のうちのいずれかに記載の蛍光イメージング・システム。
【国際調査報告】
2009538431.tif 000009
2009538431.tif 000010
2009538431.tif 000011