(57)【要約】解析法の組み合わせを使用して、癌におけるマーカーの後成的サイレンシングが決定された。癌は一般に、食道、頭部および頚部、胃、膵臓、肝臓、ならびに結腸を含み、これらに限定されない胃腸管の癌である。遺伝子は、癌の早期検出のために使用することもできるか、または癌腫に進行する可能性が高い腺腫を特定するために使用することができる。後成的なサイレンシングされた遺伝子に基づく治療法を選択および／またはモニタリングすることができる。検出およびモニタリングには、これらの遺伝子の後成的サイレンシングを評価するためのキットを使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
直腸結腸細胞または直腸結腸細胞からの核酸を含有する試験試料において、表1に列挙された少なくとも一つの遺伝子の後成的サイレンシングを検出する段階；
該試験試料を、新生物性であるかもしくは新生物形成の素因を有すると特定するか、または新生物性であるかもしくは新生物形成の素因を有する細胞からの試験試料を特定する段階
を含む、結腸直腸癌または結腸直腸癌の素因を特定するための方法。
【請求項２】
試験試料が腺腫細胞を含有する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
試験試料が癌腫細胞を含有する、請求項1記載の方法。
【請求項４】
少なくとも一つの遺伝子が、NM_145059.1、NM_183244.1、NM_145341.2、NM_080672.3、NM_002630、NM_003383、NM_005504、NM_016269、NM_006988、NM_021637、NM_001888およびNM_014899からなる群より選択され、
試験試料が、新生物細胞または新生物細胞からの核酸を含有すると特定される、
請求項3記載の方法。
【請求項５】
試験試料が腺腫細胞を含有し、
少なくとも一つの遺伝子が、
2009539404.tif 000020
からなる群より選択され、
該試験試料が、癌腫に進行する可能性が高い細胞を含有するかまたは該細胞からの核酸を含有すると特定される、
請求項2記載の方法。
【請求項６】
試験試料が生検検体からの試験試料である、請求項1記載の方法。
【請求項７】
試験試料が外科的検体からの試験試料である、請求項1記載の方法。
【請求項８】
試験試料が細胞学的検体からの試験試料である、請求項1記載の方法。
【請求項９】
試験試料が、糞便、血液または尿から単離された試験試料である、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
新生物組織の外科的除去が患者に推奨される、請求項5記載の方法。
【請求項１１】
アジュバント化学療法が患者に推奨される、請求項5記載の方法。
【請求項１２】
アジュバント放射線療法が患者に推奨される、請求項5記載の方法。
【請求項１３】
結腸鏡検査が患者に推奨される、請求項5記載の方法。
【請求項１４】
結腸鏡検査の頻度の増大が患者に推奨される、請求項5記載の方法。
【請求項１５】
結腸の画像診断検査が患者に推奨される、請求項5記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも二つの遺伝子の後成的サイレンシングが検出される、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも三つの遺伝子の後成的サイレンシングが検出される、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
遺伝子のCpGジヌクレオチドモチーフのメチル化を検出することによって後成的サイレンシングが検出される、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
遺伝子のプロモータ中のCpGジヌクレオチドモチーフのメチル化を検出することによって後成的サイレンシングが検出される、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
遺伝子のmRNAの発現の低減を検出することによって後成的サイレンシングが検出される、請求項1記載の方法。
【請求項２１】
遺伝子によってコードされるタンパク質の発現の低減を検出することによって後成的サイレンシングが検出される、請求項1記載の方法。
【請求項２２】
遺伝子の少なくとも一部分をメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼと接触させることによってメチル化が検出され、該エンドヌクレアーゼが、非メチル化認識部位よりもメチル化認識部位を優先的に開裂させ、それにより、該遺伝子の該部分の開裂が該遺伝子の該部分のメチル化を示す、請求項18記載の方法。
【請求項２３】
メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼが、Acc III、Ban I、BstN I、Msp IおよびXma Iからなる群より選択される、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
遺伝子の少なくとも一部分をメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼと接触させることによってメチル化が検出され、該エンドヌクレアーゼが、メチル化認識部位よりも非メチル化認識部位を優先的に開裂させ、それにより、該遺伝子が該メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼのための認識部位を含む場合には、該遺伝子の該部分の開裂が該遺伝子の該部分の非メチル化を示す、請求項18記載の方法。
【請求項２５】
メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼが、Acc II、Ava I、BssH II、BstU I、Hpa IIおよびNot Iからなる群より選択される、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
メチル化が以下の段階によって検出される、請求項18記載の方法：
メチル化シトシン残基よりも非メチル化シトシン残基を選択的に修飾するか、または非メチル化シトシン残基よりもメチル化シトシン残基を選択的に修飾する化学試薬と、試験細胞の遺伝子の少なくとも一部分を接触させる段階；および
該接触によって生成される産物を検出する段階。
【請求項２７】
検出段階が、修飾された非メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にはハイブリダイズするが、非修飾メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にはハイブリダイズしない少なくとも一つのプライマを用いる増幅を含み、それによって増幅産物を形成する、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
検出段階が、非修飾メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にはハイブリダイズするが、修飾された非メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にはハイブリダイズしない少なくとも一つのプライマを用いる増幅を含み、それによって増幅産物を形成する、請求項26記載の方法。
【請求項２９】
増幅産物が以下を使用して検出される、請求項27記載の方法：
(a)修飾された非メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にはハイブリダイズするが、非修飾メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にはハイブリダイズしない、第一のオリゴヌクレオチドプローブ；
(b)非修飾メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にはハイブリダイズするが、修飾された非メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にはハイブリダイズしない、第二のオリゴヌクレオチドプローブ；または
(c)該第一および第二のオリゴヌクレオチドプローブの両方。
【請求項３０】
増幅産物が以下を使用して検出される、請求項28記載の方法：
(a)修飾された非メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にはハイブリダイズするが、非修飾メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にはハイブリダイズしない、第一のオリゴヌクレオチドプローブ；
(b)非修飾メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にはハイブリダイズするが、修飾された非メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にはハイブリダイズしない、第二のオリゴヌクレオチドプローブ；または
(c)該第一および第二のオリゴヌクレオチドプローブの両方。
【請求項３１】
産物が、電気泳動法、クロマトグラフィー法および質量分析法からなる群より選択される方法によって検出される、請求項26記載の方法。
【請求項３２】
化学試薬がヒドラジンである、請求項26記載の方法。
【請求項３３】
ヒドラジンと接触させた遺伝子の少なくとも一部分をピペリジンで開裂させる段階をさらに含む、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
化学試薬が亜硫酸水素イオンを含む、請求項26記載の方法。
【請求項３５】
亜硫酸水素イオンと接触させた遺伝子の少なくとも一部分をアルカリで処理する段階をさらに含む、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
メチル化が以下の段階よって検出される、請求項18記載の方法：
遺伝子のうちの、CpGジヌクレオチドモチーフを含む少なくとも一部分を増幅して増幅産物を形成する段階；
該増幅産物を、メチル化シトシン残基よりも非メチル化シトシン残基を選択的に修飾するか、または非メチル化シトシン残基よりもメチル化シトシン残基を選択的に修飾する化学試薬と接触させる段階；および
該接触によって生成される産物を、
(a)修飾された非メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にはハイブリダイズするが、非修飾メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にはハイブリダイズしない、第一のオリゴヌクレオチドプローブ、
(b)非修飾メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にはハイブリダイズするが、修飾された非メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にはハイブリダイズしない、第二のオリゴヌクレオチドプローブ、または
(c)該第一および第二のオリゴヌクレオチドプローブの両方
を使用して、検出する段階。
【請求項３７】
癌に関連する少なくとも一つの遺伝子の後成的なサイレンシングされた転写を示す細胞の新生物成長を低減または阻害する方法であって、
細胞が、
2009539404.tif 000021
からなる群より選択される後成的なサイレンシングされた遺伝子を有するということを決定する段階；
該細胞をCpGジヌクレオチド脱メチル化剤と接触させることによって該細胞中の後成的なサイレンシングされた遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現を回復させ、それにより、該細胞の無秩序な成長を低減または阻害する段階
を含む、方法。
【請求項３８】
接触がインビトロで実施される、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
細胞を含む哺乳動物対象に薬剤を投与することによって接触がインビボで実施される、請求項37記載の方法。
【請求項４０】
脱メチル化剤が、5-アザ-2'-デオキシシチジン、5-アザ-シチジン、ゼブラリン、プロカインおよびL-エチオニンからなる群より選択される、請求項37記載の方法。
【請求項４１】
癌に関連する少なくとも一つの遺伝子の後成的なサイレンシングされた転写を示す細胞の新生物成長を低減または阻害する方法であって、
細胞が、
2009539404.tif 000022
からなる群より選択される後成的なサイレンシングされた遺伝子を有するということを決定する段階；
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを該細胞に導入する段階であって、該ポリペプチドが該遺伝子によってコードされ、該ポリペプチドが該細胞中で発現し、それにより、該細胞中の該ポリペプチドの発現を回復させる段階
を含む、方法。
【請求項４２】
患者中の癌細胞が、
2009539404.tif 000023
からなる群より選択される後成的なサイレンシングされた遺伝子を有するということを決定する段階；
脱メチル化剤を、該患者の癌細胞中の後成的なサイレンシングされた遺伝子の発現を回復させるのに十分な量で該患者に投与する段階
を含む、癌患者を処置する方法。
【請求項４３】
脱メチル化剤が、5-アザ-2'-デオキシシチジン、5-アザ-シチジン、ゼブラリン、プロカインおよびL-エチオニンからなる群より選択される、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
患者中の癌細胞が、
2009539404.tif 000024
からなる群より選択される後成的なサイレンシングされた遺伝子を有するということを決定する段階；
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを該患者に投与する段階であって、該ポリペプチドが該後成的なサイレンシングされた遺伝子によってコードされ、該ポリペプチドが該患者の腫瘍中で発現し、それにより、癌中の該ポリペプチドの発現を回復させる段階
を含む、癌患者を処置する方法。
【請求項４５】
患者の癌細胞中でのその発現が脱メチル化剤によって再活性化される遺伝子を特定する段階であって、該遺伝子が、
2009539404.tif 000025
からなる群より選択される段階；および
該癌患者を処置するための遺伝子の発現を増大させる治療剤を選択する段階を含む、癌患者を処置するための治療戦略を選択する方法。
【請求項４６】
癌患者のための治療剤を処方する段階をさらに含む、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
治療剤を癌患者に投与する段階をさらに含む、請求項45記載の方法。
【請求項４８】
治療剤が遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項45記載の方法。
【請求項４９】
脱メチル化剤が5-アザ-2'-デオキシシチジンである、請求項45記載の方法。
【請求項５０】
治療剤が5-アザ-2'-デオキシシチジンである、請求項45記載の方法。
【請求項５１】
癌細胞が外科的検体から得られる、請求項45記載の方法。
【請求項５２】
癌細胞が生検検体から得られる、請求項45記載の方法。
【請求項５３】
癌細胞が細胞学的試料から得られる、請求項45記載の方法。
【請求項５４】
癌細胞が糞便、血液または尿から得られる、請求項45記載の方法。
【請求項５５】
パッケージ中に
(a)メチル化シトシン残基を修飾するが、非メチル化シトシン残基を修飾しない試薬、または(b)非メチル化シトシン残基を修飾するが、メチル化シトシン残基を修飾しない試薬、および
増幅条件下、
2009539404.tif 000026
からなる群より選択される遺伝子の領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマの対であって、該領域が該遺伝子の転写開始点から約1kb以内であるオリゴヌクレオチドプライマの対
を含む、試験試料におけるメチル化を評価するためのキット。
【請求項５６】
オリゴヌクレオチドプライマの対の少なくとも一つが、修飾された非メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にはハイブリダイズするが、非修飾メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にはハイブリダイズしない、または、
該オリゴヌクレオチドプライマの対の少なくとも一つが、非修飾メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にはハイブリダイズするが、修飾された非メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にはハイブリダイズしない、
請求項55記載のキット。
【請求項５７】
以下をさらに含む、請求項55記載のキット：
(a)修飾された非メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にはハイブリダイズするが、非修飾メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にはハイブリダイズしない、第一のオリゴヌクレオチドプローブ；
(b)非修飾メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にはハイブリダイズするが、修飾された非メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にはハイブリダイズしない、第二のオリゴヌクレオチドプローブ；または
(c)該第一および第二のオリゴヌクレオチドプローブの両方。
【請求項５８】
以下をさらに含む、請求項56記載のキット：
(a)修飾された非メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にはハイブリダイズするが、非修飾メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にはハイブリダイズしない、第一のオリゴヌクレオチドプローブ；
(b)非修飾メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にはハイブリダイズするが、修飾された非メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にはハイブリダイズしない、第二のオリゴヌクレオチドプローブ；または
(c)該第一および第二のオリゴヌクレオチドプローブの両方。
【請求項５９】
オリゴヌクレオチドプローブをさらに含む、請求項55記載のキット。
【請求項６０】
DNAを増幅するためのDNAポリメラーゼをさらに含む、請求項55記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全ての内容が参照により本明細書に組み入れられる、2006年6月12日出願の米国特許仮出願第60/812,635号の恩典を主張する。
【０００２】
添付のコンパクトディスク(3部提出)が参照により本明細書に組み入れられる。ディスクに含まれるファイルは、(1) 2006年6月8日作成のsplices.txt, 3kb、(2) 2006年6月8日作成のprot.fasta, 151kb、(3) 2006年6月8日作成のprom5000-1000.fasta, 1596kb、(4) 2006年6月8日作成のmrna.fasta, 854kb、(5) 2006年6月8日作成の34_combinations_final.txt, 96.024kb、および(6) 2007年6月12日作成の00014onco.seq.txt、4148kbである。
【０００３】
発明の技術分野
本発明は癌診断および治療学の分野に関する。特に、大腸癌および前癌における特定の遺伝子の異常なメチル化パターンに関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
DNAメチル化および発癌におけるその役割
すべての生物の細胞を作るための情報はそのDNAに含まれている。DNAは、4種の塩基、アデニン(A)、グアニン(G)、チミン(T)およびシトシン(C)の固有の配列で構成されている。これらの塩基は、DNA二重らせんを形成する2本の鎖上のAとTおよびGとCの対合である。これらの対の鎖が、遺伝子と呼ばれる領域にグループ分けされた特定の分子を作るための情報を記憶する。各細胞内には、どの遺伝子がオンになる、すなわち発現するのかを制御して、その細胞固有の機能を規定するプロセスがある。これらの制御機構の一つは、シトシン(C)にメチル基を付加することによって提供される。メチル基で標識されたCはmCと表記することができる。
【０００５】
DNAメチル化は、一部の遺伝子が発現しているかどうかを決定する際に重要な役割を演じる。必要とされない遺伝子をオフにすることにより、DNAメチル化は、生物の正常な発達および機能にとって不可欠な制御機構である。または、異常なDNAメチル化は、加齢および多くの癌の発生とともに認められる変化の基礎を成す機構の一つでもある。
【０００６】
癌は、旧来、DNA内の染色体突然変異によって生じる遺伝子変化に関連づけられていた。突然変異は、遺伝性であるのか後天性であるのかにかかわらず、健常な状態を維持するためにきわめて重要な遺伝子の発現の損失を招くおそれがある。今や、比較的多数の癌が、多くの場合、DNA突然変異に近い不適切なDNAメチル化によって引き起こされるということを裏付ける証拠がある。多くの場合、DNAの過剰メチル化が決定的な遺伝子、たとえば腫瘍サプレッサ遺伝子またはDNA修復遺伝子を過ってオフにして、癌の発生および進行を許してしまう。遺伝子発現を制御するためのこの非突然変異的プロセスは後成学と述べられる。
【０００７】
DNAメチル化は、メチルトランスフェラーゼと呼ばれる酵素によって実行される、メチル基(m)がDNAの特定のシトシン(C)に付加されるDNAの化学的修飾である。この非突然変異的(後成的)プロセス(mC)は遺伝子発現調節における決定的要因である。J.G. Herman, Seminars in Cancer Biology, 9: 359-67, 1999（非特許文献1）を参照すること。
【０００８】
遺伝子メチル化の現象は長らく癌研究者たちの注目を集めてきたが、ヒト癌の進行におけるその真の役割は認識されはじめたばかりである。正常な細胞では、メチル化が、CG塩基反復を少ししか有しないDNA領域で主に起こるが、CG塩基の長い反復を有するDNA領域であるCpGアイランドはメチル化されないまま残る。タンパク質発現を制御する遺伝子プロモータ領域は、多くの場合、CpGアイランドを多く含む。プロモータ領域における、通常非メチル化状態にあるこれらのCpGアイランドの異常なメチル化が、ヒト癌における特定の腫瘍サプレッサ発現の転写不活性化またはサイレンシングを生じさせる。
【０００９】
腫瘍細胞中で過剰メチル化される遺伝子は腫瘍の起源の組織に対して特異性が強い。癌の検出、癌の危険性の評価および治療に対する反応を改善するためには、すべてのタイプの癌の分子サインを使用することができる。プロモータ過剰メチル化事象は、そのような目的にとってもっとも有望なマーカーのいくつかを提供する。
【００１０】
プロモータ遺伝子過剰メチル化：有望な腫瘍マーカー
特定のプロモータ遺伝子の過剰メチル化に関する情報は、種々の癌の診断、予後および処置に有益であることができる。特定の遺伝子プロモータ領域のメチル化は、発癌において早期かつ頻繁に起こることができ、これらのマーカーを癌診断にとって理想的な標的にする。
【００１１】
メチル化パターンは腫瘍特異的である。陽性シグナルが常に遺伝子の同じ場所で見つかる。リアルタイムPCRベースの方法は高感度であり、定量的であり、臨床使用に適している。DNAは安定であり、入手しやすい流体(たとえば血清、痰、糞便、血液および尿)およびパラフィン包埋組織の中で無傷の状態で見つかる。適切な遺伝子マーカーのパネルが大部分のヒト癌をカバーすることができる。
【００１２】
診断
癌患者における臨床結果を改善するカギは、癌がまだ限局性であり、容易に処置可能である最早期段階での診断である。上記特性は、より高リスクな患者を分子ベースで特定することにより、より正確なスクリーニングおよびサーベイランスプログラムのための手段を提供する。また、分子的な特徴を有するが、悪性疾患に伴うすべての病理的または臨床的特徴をまだ有しない患者のより決定的な経過観察の正当化を提供することもできる。
【００１３】
現在、結腸直腸癌の早期検出は、(1) 感度および特異性が非常に低い「便潜血試験」(FOBT)、(2) 侵襲的であり、高額である(かつ供給が限られる) S字結腸鏡検査法および／または結腸鏡検査法、(3) 比較的大きなポリープの検出のみが可能である、二重造影バリウム注腸後のX線検出法、または、まだ実験段階であるCT結腸画像法(バーチャル結腸鏡検査法とも呼ばれる)および(4) コストが大きく、感度が限られる、PreGen-Plus (Exact Sciences; LabCorp)と呼ばれる遺伝子突然変異解析試験法によって実施されている。
【００１４】
処置反応の予測
癌が分子事象を介していかに発生するか関する情報は、そのような癌がいかに特定の化学療法剤に反応する可能性が高いかを臨床医がより正確に予測することを可能にするかもしれない。この方法で、腫瘍の化学感受性の知識に基づく療法を合理的に設計することができる。グリオーム患者におけるMGMTプロモータの過剰メチル化が、療法に対する良好な反応、より高い全体生存率および進行までのより長い期間を示すということを研究が証明している。
【００１５】
当技術分野においては、患者ケアの管理を改善するために、癌のための新たな診断および予後マーカーならびに治療標的の必要性が絶えずある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】J.G. Herman, Seminars in Cancer Biology, 9: 359-67, 1999
【発明の概要】
【００１７】
本発明の一つの態様にしたがって、結腸直腸癌または結腸直腸癌の素因を特定する方法が提供される。試験試料において、表1に列挙された少なくとも一つの遺伝子の後成的サイレンシングを検出する。試験試料は、直腸結腸細胞または直腸結腸細胞からの核酸を含有する。試験試料を、新生物性であるかまたは新生物形成の素因を有すると特定する。
【００１８】
本発明のもう一つの態様は、癌に関連する少なくとも一つの遺伝子の後成的なサイレンシングされた転写を示す細胞の新生物成長を低減または阻害する方法である。細胞において、後成的にサイレンシングされた遺伝子を決定する。後成的にサイレンシングされた遺伝子は、
2009539404.tif 000002
からなる群より選択される。細胞をCpGジヌクレオチド脱メチル化剤と接触させ、それにより細胞の無秩序な成長を低減または阻害することにより、細胞中で、後成的なサイレンシングされた遺伝子によってコードされたポリペプチドの発現を回復させる。
【００１９】
本発明のもう一つの態様は、癌に関連する少なくとも一つの遺伝子の後成的なサイレンシングされた転写を示す細胞の新生物成長を低減または阻害する方法である。細胞において、後成的にサイレンシングされた遺伝子を決定する。遺伝子は、
2009539404.tif 000003
からなる群より選択される。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入する。ポリペプチドは該遺伝子によってコードされる。ポリペプチドは細胞中で発現し、それにより、細胞中のポリペプチドの発現を回復させる。
【００２０】
本発明のさらに別の局面にしたがって、癌患者を処置する方法が提供される。患者中の癌細胞が、
2009539404.tif 000004
からなる群より選択される後成的なサイレンシングされた遺伝子を有するということを決定される。脱メチル化剤を、患者の癌細胞中で後成的なサイレンシングされた遺伝子の発現を回復させるのに十分な量で患者に投与する。
【００２１】
本発明のさらに別の態様は、癌患者を処置するもう一つの方法である。患者中の癌細胞が、
2009539404.tif 000005
からなる群より選択される後成的なサイレンシングされた遺伝子を有するということを決定される。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを患者に投与する。ポリペプチドは後成的なサイレンシングされた遺伝子によってコードされる。ポリペプチドは患者の腫瘍中で発現し、それにより、癌におけるポリペプチドの発現を回復させる。
【００２２】
本発明はまた、癌患者を処置するための治療戦略を選択する方法を提供する。患者の癌細胞中でのその発現が脱メチル化剤によって再活性化される遺伝子を特定する。遺伝子は、
2009539404.tif 000006
からなる群より選択される。該癌患者を処置するために遺伝子の発現を増大させる治療剤を選択する。
【００２３】
本発明はまた、細胞試料におけるメチル化を評価するためのキットを提供する。キットは、パッケージ中に、下記を提供する：(1) (a)メチル化シトシン残基を修飾するが、非メチル化シトシン残基を修飾しない試薬、または(b)非メチル化シトシン残基を修飾するが、メチル化シトシン残基を修飾しない試薬、および(2) 増幅条件下、
2009539404.tif 000007
からなる群より選択される遺伝子の領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマの対。遺伝子の領域は該遺伝子の転写開始点から約1kb以内である。
【００２４】
本明細書を読むことによって当業者に明らかになるこれらの態様および他の態様は、新生物細胞および癌に関連する検出、診断、予後、治療および薬物選択のためのツールおよび方法を当技術分野に提供する。
【００２５】
表の簡単な説明
表1は、大腸癌または前癌の早期検出および予後のためのメチル化マーカーを示す。
表2は、本明細書に組み入れられるコンパクトディスクに含まれる。表2は、メチル化マーカーのヌクレオチド配列を示す。
表3は、本明細書に組み入れられるコンパクトディスクに含まれる。表3は、メチル化マーカーのアミノ酸配列を示す。
表4は、本明細書に組み入れられるコンパクトディスクに含まれる。表4は、メチル化マーカーのプロモータ領域を示す。
表5は、本明細書に組み入れられるコンパクトディスクに含まれる。表5は、使用可能なマーカーの組み合わせを示す。
表6は、本明細書に組み入れられるコンパクトディスクに含まれる。表6は、マーカーのスプライスバリアントを示す。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】以下のプライマによるDNAの完全性の品質管理のための遺伝子の増幅。AF4エキソン3 (プライマ配列番号：794, 795)、AF4エキソン11 (プライマ配列番号：796, 797)、PLZFエキソン1 (プライマ配列番号：798, 799)、RAGlエキソン2 (プライマ配列番号800, 801)およびTBXAS1エキソン9 (プライマ配列番号：802, 803)。実施例2を参照。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
本発明者らは、癌および前癌においてその転写が後成的にサイレンシングされる遺伝子のセットを見いだした。特定されたすべての遺伝子を表1に示す。
【００２８】
遺伝子の後成的サイレンシングは、当技術分野で公知の任意の方法によって決定することができる。一つの方法は、正常な細胞中で発現する遺伝子が腫瘍細胞中では発現しにくい、または発現しないということを決定することである。しかし、たとえば体細胞突然変異によってサイレンシングの機構が遺伝子的であることもあるので、この方法は、それだけで、サイレンシングが後成的であることを示すものではない。サイレンシングが後成的であるということを決定するための一つの方法は、DAC (5'-デアザシチジン)のような試薬または細胞DNAのヒストンアセチル化状態を変化させる試薬または細胞中に存在する後成機構に影響する他の処置によって処置し、サイレンシングが逆転していること、すなわち遺伝子の発現が再活性化または回復していることを確認することである。後成的サイレンシングを決定するためのもう一つの手段は、サイレンシングされた遺伝子中のメチル化CpGジヌクレオチドモチーフの存在を決定することである。典型的には、これらは、転写開始点の近く、たとえば約1kbp以内、約750bp以内または約500bp以内に存在する。腫瘍細胞中の後成的サイレンシングの標的として遺伝子を特定したのち、その遺伝子の発現の低下を後成的サイレンシングの指標として使用することができる。
【００２９】
遺伝子の発現は、当技術分野で公知の手段を使用して評価することができる。mRNAまたはタンパク質のいずれかを計測することができる。特異的mRNAを計測する場合には、核酸プローブへのハイブリダイゼーションを用いる方法を使用することができる。このような方法は、核酸プローブアレイ(マイクロアレイ技術)、インサイチューハイブリダイゼーションおよびノーザンブロットの使用を含む。また、RT-PCRのような増幅技術を使用してメッセンジャRNAを評価することもできる。今や、ゲノム技術における進歩が何千もの遺伝子の同時解析を可能にするが、多くは、同じ特異的プローブ−標的ハイブリダイゼーションの概念に基づく。配列決定ベースの方法が代替方法である。これらの方法は、表現配列標識(EST)の使用とともに始まったが、今や、短い標識に基づく方法、たとえばSAGE (serial analysis of gene expression/遺伝子発現の連続分析)およびMPSS (massively parallel signature sequencing/大量並行サイン配列決定)を含む。ディファレンシャルディスプレイ技術が、遺伝子発現を解析するさらに別の手段を提供する。この種の技術は、制限消化によって生成されるcDNAフラグメントのランダム増幅に基づき、二つの組織の間で異なるバンドが対象のcDNAを特定する。イムノアッセイ法および免疫細胞化学を含みこれらに限定されない任意の好都合な方法を使用して特異的タンパク質を評価することができる。大部分のそのような方法は、特定のタンパク質またはタンパク質フラグメントに対して特異的である抗体を用いる。本発明のマーカーのmRNA (cDNA)およびタンパク質の配列を配列リストに提供する。
【００３０】
メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを検出するためには、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼを使用することができる。このようなエンドヌクレアーゼは、非メチル化認識部位よりもメチル化認識部位を優先的に開裂させることができるか、またはメチル化認識部位よりも非メチル化認識部位を優先的に開裂させることができる。前者の例は、Acc III、Ban I、BstN I、Msp IおよびXma Iである。後者の例は、Acc II、Ava I、BssH II、BstU I、Hpa IIおよびNot Iである。または、CpGジヌクレオチドモチーフのメチル化形態または非メチル化形態のいずれかを選択的に修飾する化学試薬を使用することもできる。
【００３１】
修飾された産物は、直接的に検出することができるか、または容易に区別可能である産物を創製するさらなる反応の後で検出することができる。修飾された産物を検出するためには、電気泳動法、クロマトグラフィー法および質量分析法を含みこれらに限定されないが、サイズおよび／または電荷の変化を検出する手段を使用することができる。選択的修飾のためのそのような化学試薬の例はヒドラジンおよび亜硫酸水素イオンを含む。ヒドラジン修飾DNAは、ピペリジンで処理してそれを開裂させることができる。亜硫酸水素イオンで処理したDNAは、アルカリで処理することができる。
【００３２】
区別可能な産物を創製するための反応では多様な増幅技術を使用することができる。それらの技術のいくつかはPCRを用いる。他の適当な増幅法としては、リガーゼ連鎖反応法(LCR)(Barringer et al, 1990)、転写増幅法(Kwoh et al. 1989、WO88/10315)、標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅法(米国特許第6,410,276号)、コンセンサス塩基配列プライミングポリメラーゼ連鎖反応法(米国特許第4,437,975号)、随意プライミングポリメラーゼ連鎖反応法(WO90/06995)、核酸ベースの配列増幅法(NASBA)(米国特許第5,409,818号、第5,554,517号、第6,063,603号)、切れ目移動増幅法(WO2004/067726)がある。
【００３３】
元のゲノムDNA中のCpGジヌクレオチドにおけるメチル化状態を反映する配列変化がPCRプライマ設計への二つの手法を提供する。第一の手法では、プライマは、それ自体、任意の潜在的なDNAメチル化部位を「カバー」しない、またはそれにハイブリダイズしない。示差的なメチル化の部位における配列変異が二つのプライマの間に位置している。このようなプライマは、亜硫酸水素塩ゲノム配列決定、COBRA、Ms-SNuPEで使用される。第二の手法では、プライマは、変換配列のメチル化または非メチル化バージョンのいずれかとで特異的にアニールするように設計されている。標的に対して十分な相補性領域、たとえば12、15、18または20個のヌクレオチドがある場合には、プライマはまた、ハイブリダイゼーションを妨げず、かつ他の操作にとって有用であることができるさらなるヌクレオチド残基を含有することができる。このような他の残基の例は、制限エンドヌクレアーゼ開裂、リガンド結合または因子結合またはリンカもしくはリピートのための部位であることができる。オリゴヌクレオチドプライマは、修飾されたメチル化残基に対して特異的であるようなものであってもよいし、そうでなくてもよい。
【００３４】
修飾されたDNAと非修飾DNAとを区別する一つの方法は、DNAの一方または他方の形態に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプライマをハイブリダイズすることである。ハイブリダイゼーションののち、増幅反応を実施し、増幅産物をアッセイすることができる。増幅産物の存在は、試料がプライマにハイブリダイズしたことを示す。プライマの特異性は、DNAが修飾されたものであるのかどうかを示し、それが他方で、DNAがメチル化されたものであるのかどうかを示す。たとえば、亜硫酸水素イオンが非メチル化シトシン塩基を修飾して、それらをウラシル塩基へと変化させる。ウラシル塩基は、ハイブリダイゼーション条件下、アデニン塩基にハイブリダイズする。したがって、グアニン塩基の代わりにアデニン塩基を含むオリゴヌクレオチドプライマは、亜硫酸水素イオン修飾DNAにハイブリダイズするであろうが、一方、グアニン塩基を含有するオリゴヌクレオチドプライマはDNA中の非修飾(メチル化)シトシン残基にハイブリダイズするであろう。DNAポリメラーゼを使用する増幅および第二のプライマが、容易に観察することができる増幅産物を生じさせる。このような方法はMSP (Methylation Specific PCR/メチル化特異的PCR、特許第5,786,146号、第6,017,704号、第6,200,756号)と呼ばれる。増幅産物は、場合によっては、特定の産物に対して特異的であることもできる特定のオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせることができる。または、修飾されたDNAおよび非修飾DNAの両方からの増幅産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを使用することもできる。
【００３５】
修飾されたDNAと非修飾DNAとを区別するもう一つの方法は、特定の産物に対して特異的であることもできるオリゴヌクレオチドプローブを使用することである。そのようなプローブは、修飾されたDNAに、または修飾されたDNAの増幅産物に直接ハイブリダイズさせることができる。オリゴヌクレオチドプローブは、当技術分野で公知の任意の検出システムを使用して標識することができる。そのような検出システムとしては、蛍光成分、放射性同位元素標識成分、生体発光成分、発光成分、化学発光成分、酵素、基質、レセプタまたはリガンドがあるが、これらに限定されない。
【００３６】
メチル化CpGジヌクレオチドの同定のためのさらに別の方法は、McCP2タンパク質のMBDドメインがメチル化DNA配列に選択的に結合する能力を利用する(Cross et al, 1994、Shiraishi et al, 1999)。制限エンドヌクレアーゼ消化ゲノムDNAが、固体マトリックスに固定された発現His標識メチル-CpG結合ドメインに添加され、高メチル化DNA配列を単離するための分取カラムクロマトグラフィーに使用される。
【００３７】
リアルタイム化学が反応の早期段階におけるPCR増幅の検出を可能にし、DNAおよびRNAの定量をより容易かつより正確にする。リアルタイムPCRのいくつかの変形が公知である。そのような変形としては、蛍光体および蛍光クエンチャで標識された別個のプローブを有するTaqManシステムおよびモレキュラービーコンシステムがある。Scorpionシステムでは、ヘアピン構造の形態の標識プローブがプライマにリンクされる。
【００３８】
DNAメチル化解析は、MALDI-TOFF、MassARRAY、MethyLight、エチル化アレルの定量解析(QAMA)、酵素的領域メチル化アッセイ法(ERMA)、HeavyMethyl、QBSUPT、MS-SNuPE、MethylQuant、定量的PCR配列決定およびオリゴヌクレオチドベースのマイクロアレイシステムをはじめとする多数の技術で成功裏に実施されてきた。
【００３９】
サイレンシングが試験および／または検出される遺伝子の数は異なることができ、一、二、三、四、五またはそれ以上の遺伝子を試験および／または検出することができる。場合によっては、少なくとも二つの遺伝子が選択される。他の態様では、少なくとも三つの遺伝子が選択される。試験および決定に有用な例示的な組み合わせを表5に示す。
【００４０】
試験は、診断的にまたは治療法と併せて、実施することができる。試験は、治療法の効能を、化学療法剤であるのか、またはポリヌクレオチドのような生物学的薬剤であるのかを問わず、モニタリングするために使用することができる。試験はまた、どの治療法または予防法を患者に対して使用するのかを決定するために使用することもできる。そのうえ、試験は、薬剤を試験し、様々な患者グループに対するそれらの効能を決定するために、患者をグループに層別化するために使用することもできる。本発明の試験は、他の要因と併用されて診断を提供することができる。当技術分野における熟練した実践者は、診断を下す際には数多くの要因が考慮され、比較考量されるということを知っている。そのような要因としては、他の遺伝子マーカーおよび身体的所見、放射線学的所見、病理組織学的検査所見等を挙げることができる。したがって、本発明のマーカーは、診断の計画を支援するために使用することができる。そのうえ、臨床検査を実施し、評価し、マーカーに関する決定を有形の媒体、たとえば紙または電子記録に記録することができる。患者または他の医師への診断の提供は、医師により、書面、口頭または電子的に実施することができる。
【００４１】
診断、予後または個別薬物使用のための試験試料は、外科的試料、たとえば生検材料または細針吸引物、パラフィン包埋結腸、直腸、小腸、胃、食道、骨髄、乳房、卵巣、前立腺、腎臓、肺、脳または他の器官組織、体液、たとえば血液、血清、リンパ液、脳髄液、唾液、痰、気管支液、管液、糞便、尿、リンパ節または精液から得ることができる。このような供給源は、くまなく挙げたわけではなく、例示的である。そのような検体または流体から得ることができる試験試料は、剥離した腫瘍細胞または死滅もしくは損傷した腫瘍細胞から放出される遊離核酸を含む。核酸としては、RNA、ゲノムDNA、ミトコンドリアDNA、一本または二本鎖およびタンパク質会合核酸がある。そのような検体細胞から得られる精製または非精製形態の任意の核酸検体を出発核酸として使用することができる。
【００４２】
細胞への正常な遺伝子発現を回復させるためには、脱メチル化剤をインビトロまたはインビボで細胞と接触させることができる。適当な脱メチル化剤としては、5-アザ-2'-デオキシシチジン、5-アザ-シチジン、ゼブラリン、プロカインおよびL-エチオニンがあるが、これらに限定されない。この反応を、診断、予後の決定および適当な治療法の決定に使用することができる。結腸、頭部および頚部、食道、胃、膵臓または肝臓の癌を処置するために脱メチル化剤が使用される場合には、表1に示す群より選択される遺伝子の発現またはメチル化を試験することができる。
【００４３】
後成的にサイレンシングされた遺伝子発現を回復させる代替方法は、非メチル化ポリヌクレオチドを細胞に導入して、その細胞の中で発現するようにすることである。様々な遺伝子治療ベクターおよびヒビクルが当技術分野で公知であり、特定の状況に適するように任意のものを使用することができる。特定のベクターは短期的発現に適し、特定のベクターは長期的発現に適している。特定のベクターは特定の器官にとって栄養性であり、特定の状況で適切であるようにこれらを使用することができる。ベクターはウイルス性または非ウイルス性であることができる。ポリヌクレオチドは、ベクター、たとえばウイルス性ベクターに含めることができるが、含める必要はなく、たとえば、リポソーム、マイクロバブルのようなマトリックスに製剤化することができる。ポリヌクレオチドは、対象に投与することによって細胞に導入することができ、それが細胞と接触し、細胞によって吸収され、コードされたポリペプチドが発現するようにする。適当なポリヌクレオチドが配列リスト中に配列番号273〜532として提供されている。また、配列番号533〜793に示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドを使用することもできる。好ましくは、特異的なポリヌクレオチドは、患者がそれに関して試験されており、サイレンシングされたバージョンを有することが見いだされているポリヌクレオチドである。結腸、頭部および頚部、食道、胃、膵臓、肝臓の癌を処置するためのポリヌクレオチドは、典型的には、表1に示すものから選択される遺伝子をコードする。
【００４４】
メチル化サイレンシングされた遺伝子発現を示す細胞は一般に、脱メチル化剤を対象に投与することによってインビボで脱メチル化剤と接触させる。好都合な場合には、脱メチル化剤は、たとえばカテーテル処置法を使用して、対象中で無秩序な成長を示す細胞の部位もしくはその近くまたは血液が細胞部位に流れるところの血管中に投与することができる。同様に、処置される器官またはその部分を短絡化処置によって単離することができる場合、その短絡部を介して脱メチル化剤を投与して、細胞を含有する部位に脱メチル化剤を実質的に提供することができる。脱メチル化剤はまた、全身にまたは当技術分野で公知の他の経路で、投与することができる。
【００４５】
ポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードする配列に加えて、機能的に連結される転写調節要素、翻訳調節要素等を含むことができ、ベクターに含まれることができるか、または、特定の細胞へのポリヌクレオチドの導入を容易にするマトリックス、たとえばリポソームもしくはマイクロバブルに製剤化されることができる裸のDNA分子の形態にあることができる。「機能的に連結される」とは、二つ以上の分子が、単一ユニットとして働き、一方もしくは両分子またはそれらの組み合わせに帰することができる機能を発揮するように互いに対して配置されていることをいう。所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は調節要素に機能的に連結されていることができ、その場合、その調節要素は、通常それが細胞中で会合しているポリヌクレオチド配列に影響するのと同様に、その調節効果をポリヌクレオチドに付与する。
【００４６】
哺乳動物またはヒトに投与するか、または細胞と接触させる所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの恒常的もしくは望むならば誘導性または組織特異的もしくは発生段階特異的発現を提供することができるプロモータ配列、ポリA認識配列およびリボソーム認識部位もしくは内部リボソーム導入部位または組織特異的であることができる他の調節要素、たとえばエンハンサを含むことができる。ベクターはまた、所望により、原核生物または真核生物宿主システムまたは両方における複製に必要な要素を含有することができる。プラスミドベクターおよびウイルス性ベクター、たとえばバクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、セムリキ森林ウイルスおよびアデノ関連ウイルスを含むこのようなベクターは周知であり、販売元(Promega, Madison WI., Stratagene, La Jolla CA., GIBCO/BRL, Gaithersburg MD.)から購入することができるか、または当業者によって構築されることができる(たとえば、いずれも参照により本明細書に組み入れられるMeth. Enzymol., Vol. 185, Goeddel, ed. (Academic Press, Inc., 1990)、Jolly, Canc. Gene Ther. 1:51-64, 1994、Flotte, J. Bioenerg. Biomemb. 25:37-42, 1993、Kirshenbaum et al., J. Clin. Invest. 92:381-387, 1993を参照すること)。
【００４７】
所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を駆動するためには、テトラサイクリン(tet)誘導性プロモータを使用することができる。tet誘導性プロモータに機能的に連結されるポリヌクレオチドを含有する対象にテトラサイクリンまたはテトラサイクリン類似物を投与すると、コードされたポリペプチドの発現が誘導される。または、ポリヌクレオチドは、組織特異的調節要素、たとえばα胎児タンパク質プロモータ(Kanai et al., Cancer Res. 57:461-465, 1997; He et al., J. Exp. Clin. Cancer Res. 19:183-187, 2000)またはアルブミンプロモータ(Power et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 203:1447-1456, 1994; Kuriyama et al., Int. J. Cancer 71:470-475, 1997)のような肝細胞特異的調節要素、ミオグロビンプロモータ(Devlin et al., J. Biol. Chem. 264:13896-13901, 1989; Yan et al., J. Biol. Chem. 276:17361-17366, 2001)のような筋細胞特異的調節要素、PSAプロモータ(Schuur et al., J. Biol. Chem. 271:7043-7051, 1996; Latham et al., Cancer Res. 60:334-341, 2000)のような前立腺細胞特異的調節要素、エラスターゼプロモータ(Ornitz et al., Nature 313:600-602, 1985; Swift et al., Genes Devel. 3:687-696, 1989)のような膵細胞特異的調節要素、白血症(CD43)プロモータ(Shelley et al., Biochem. J. 270:569-576, 1990; Kudo and Fukuda, J. Biol. Chem. 270:13298-13302, 1995)のような白血球特異的調節要素などに、機能的に連結されて、ポリペプチドの発現が個体中の特定の細胞または培養物、たとえば器官培養物中の混合細胞集団中の特定の細胞に限定されるようになっていることもできる。その多くが市販されている組織特異的調節要素をはじめとする調節要素は当技術分野で周知である(たとえば、InvivoGen; San Diego Calif.を参照すること)。
【００４８】
ポリヌクレオチドを細胞、特に対象中の細胞に導入するためには、ウイルス性発現ベクターを使用することができる。ウイルス性ベクターは、比較的高い効率で宿主細胞に感染し、特定の細胞型に感染することができるという利点を提供する。たとえば、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをバキュロウイルスベクター中にクローニングしたのち、それを使用して昆虫宿主細胞に感染させて、それにより、コードされたポリペプチドを大量に産生するための手段を提供することができる。特定の宿主システム、特に哺乳動物システムで使用するためのウイルス性ベクターが開発されており、たとえば、レトロウイルスベクター、他のレンチウイルスベクター、たとえばヒト免疫不全ウイルス(HIV)に基づくもの、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、肝炎ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター等がある(いずれも参照により本明細書に組み入れられるMiller and Rosman, BioTechniques 7:980-990, 1992; Anderson et al., Nature 392:25-30 Suppl., 1998; Verma and Somia, Nature 389:239-242, 1997; Wilson, New Engl. J. Med. 334:1185-1187 (1996)を参照すること)。
【００４９】
場合によってはベクターに含めることができるポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の多様な任意の方法によって細胞に導入することができる(いずれも参照により本明細書に組み入れられるSambrook et al., 前記、1989； Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1987, and supplements through 1995))。このような方法としては、たとえば、トランスフェクション法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法および、ウイルス性ベクターの場合、感染法があり、細胞へのポリヌクレオチドの導入を容易にすることができ、細胞への導入の前にポリヌクレオチドを分解から保護することができるリポソーム、マイクロエマルション等の使用を含むことができる。特に有用な方法は、ポリヌクレオチドをマイクロバブルに組み込むことを含み、このマイクロバブルを循環に注入することができる。超音波が腫瘍に伝達されるように超音波源を配置することができ、ポリヌクレオチドを含有する循環するマイクロバブルが腫瘍の部位で超音波によって破裂し、それにより、癌の部位でポリヌクレオチドを提供する。特定の方法の選択は、たとえば、ポリヌクレオチドが導入される細胞およびその細胞が培養状態にあるのか、または体内でインサイチュー状態にあるのかに依存する。
【００５０】
ウイルス性ベクターの感染による細胞へのポリヌクレオチドの導入は、効率的に核酸分子を細胞に導入することができる。そのうえ、ウイルスは、非常に特殊化されており、一つまたはいくつかの特定の細胞型に感染し、その中で増殖する能力に基づいてベクターとして選択することができる。したがって、それら固有の特異性を使用して、ベクターに含まれる核酸分子を特定の細胞型に標的化することができる。HIVに基づくベクターを使用してT細胞に感染させ、アデノウイルスに基づくベクターを使用して、たとえば気道上皮細胞に感染させ、ヘルペスウイルスに基づくベクターを使用して神経細胞に感染させることができるなどである。他のベクター、たとえばアデノ関連ウイルスは、より大きな宿主細胞範囲を有することができ、したがって、種々の細胞型に感染させるために使用することができるが、ウイルス性または非ウイルス性ベクターを特定のレセプタまたはリガンドで修飾して、レセプタ媒介事象を介して標的特異性を変化させることもできる。本発明のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含有するベクターは、細胞、たとえばポリヌクレオチドを含有するベクターの増殖を可能にする宿主細胞またはポリヌクレオチドを含有するウイルス性ベクターのパッケージングを可能にするヘルパー細胞に含めることができる。ポリヌクレオチドは、細胞中に一時的に含めることができるか、またはたとえば細胞ゲノムへの組み込みによって安定な状態に維持することができる。
【００５１】
配列番号533〜793のいずれかのポリペプチドは、対象中で無秩序な成長を示す細胞の部位に直接投与することができる。ポリペプチドは、本明細書に開示する方法を使用して産生し、単離し、望みどおり製剤化することができ、かつポリペプチドが標的細胞の細胞膜を透過することができるように、細胞と接触させることができる。ポリペプチドは、細胞膜を透過する輸送を促進するペプチドまたはポリペプチド成分を含む融合タンパク質の一部として提供することもできる。たとえば、ヒト免疫不全ウイルス(HIV) TATタンパク質トランスダクションドメインまたは核局在化ドメインを対象のマーカーに融合させることができる。投与されるポリペプチドは、細胞へのポリペプチドの導入を容易にするマトリックスに製剤化することができる。
【００５２】
公知の遺伝子およびタンパク質の代表として特定のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列がここで挙げられているが、当業者は、データベース中の配列が特定の個体中に存在する配列を表すということを理解するであろう。他の個体からの任意の対立遺伝子配列をも同様に使用することができる。これらは典型的には、1〜10残基、1〜5残基または1〜3残基で開示された配列とは異なる。そのうえ、対立遺伝子配列は典型的には、BLASTホモロジーツールのようなアルゴリズムを使用して計測されると、データベース配列と少なくとも95、96、97、98または99％同一である。
【００５３】
脱メチル化剤、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのような薬剤は典型的には、対象への投与に適した組成物に製剤化される。したがって、本発明は、一つまたは複数の遺伝子のメチル化サイレンシングされた転写のせいで無秩序な成長を示す細胞に対し、調節された成長を回復させるのに有用である薬剤を含有する組成物を提供する。薬剤は、そのような無秩序な成長に関連する病的状態を患う対象を処置するための医薬として有用である。このような医薬は一般にキャリヤを含む。許容可能なキャリアは当技術分野で周知であり、たとえば、水溶液、たとえば水もしくは生理食塩水もしくは他の溶媒または賦形剤、たとえばグルコール、グリセロール、油、たとえばオリーブ油または注射可能な有機エステルを含む。許容可能なキャリヤは、たとえば複合体の吸収を安定化または増大させるように働く生理的に許容可能な化合物を含有することができる。このような生理学的に許容可能な化合物としては、たとえば、炭水化物、たとえばグルコース、スクロースもしくはデキストラン、抗酸化物質、たとえばアスコルビン酸もしくはグルタチオン、キレート化剤、低分子量タンパク質または他の安定剤もしくは賦形剤がある。当業者は、生理学的に許容可能な化合物をはじめとする許容可能なキャリヤを察知する、または容易に決定することができるであろう。キャリヤの性質は、治療剤の物理化学的特性および組成物の投与経路に依存する。治療剤または医薬の投与は、経口投与であることができるか、または非経口投与、たとえば静脈内、筋内、皮下、経皮、鼻腔内、気管支内、膣、直腸、腫瘍内投与または当技術分野で公知の他のそのような方法による投与であることができる。医薬組成物はまた、一つまたは複数のさらなる治療剤を含有することができる。
【００５４】
治療剤は、被包材料、たとえば水中油型エマルション、マイクロエマルション、ミセル、混合ミセル、リポソーム、微小球、マイクロバブルまたは他のポリマーマトリックスの中に組み込むことができる(たとえば、いずれも参照により本明細書に組み入れられるGregoriadis, Liposome Technology, Vol. 1 (CRC Press, Boca Raton, Fla. 1984); Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6:77 (1981)を参照すること)。たとえばリン脂質または他の脂質からなるリポソームは、比較的簡単に製造し、投与することができる非毒性で、生理学的に許容可能かつ代謝可能なキャリヤである。「ステルス」リポソーム(たとえば、いずれも参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,882,679号、第5,395,619号および第5,225,212号を参照すること)が、本発明の方法で有用な組成物を調製する場合に特に有用なそのような被包剤の一例であるが、治療剤が循環中にとどまる時間を延ばすような他の「隠蔽された」リポソームを同様に使用することができる。また、たとえばカチオン性リポソームを特定のレセプタまたはリガンドで修飾することもできる(参照により本明細書に組み入れられるMorishita et al., J. Clin. Invest., 91:2580-2585 (1993))。加えて、たとえばアデノウイルス−ポリリシンDNA複合体を使用してポリヌクレオチド剤を細胞に導入することができる(たとえば、参照により本明細書に組み入れられるMichael et al., J. Biol. Chem. 268:6866-6869 (1993)を参照すること)。
【００５５】
治療剤を含有する組成物の投与経路は、一部には、分子の化学構造に依存する。たとえばポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、消化管中で分解されることがあるため、経口的には効率的に送達されない。しかし、たとえば内在性プロテアーゼによる分解を受けにくくするか、または消化管中で吸収されやすくするためにポリペプチドを化学的に修飾する方法を使用することができる(たとえば、Blondelle et al., 前記、1995, Ecker and Crook, 前記、1995を参照すること)。
【００５６】
本発明の方法を実施する際に投与される薬剤の合計量は、単一用量としてボーラス投与または比較的短期間の輸液によって対象に投与することができるか、あるいは多数の用量が長期間にわたって投与される分割処置プロトコルを使用して投与することができる。当業者は、対象における病的状態を処置するための組成物の量が、対象の年齢および健康状態ならびに投与経路および施される処置の回数をはじめとする多くの要因に依存するということを察知するであろう。これらの要因を考慮して、当業者は、具体的な用量を必要に応じて調節するであろう。一般に、組成物の製剤形態ならびに投与の経路および頻度は、はじめに、フェーズIおよびフェーズII治験を使用して決定される。
【００５７】
組成物は、経口製剤形態、たとえば錠剤または液剤もしくは懸濁剤の形態として製剤化することができるか、あるいは経腸または非経口的適用に適した有機または無機キャリヤまたは賦形剤との混合物を含むことができ、たとえば、錠剤、ペレット剤、カプセル剤、坐剤、液剤、乳剤、懸濁剤または使用に適した他の剤形のための薬学的に許容可能な通常の非毒性キャリヤとで複合化することができる。キャリヤとしては、上記で開示したものに加えて、グルコース、ラクトース、マンノース、アカシアガム、ゼラチン、マンニトール、デンプンペースト、三ケイ酸マグネシウム、タルク、トウモロコシデンプン、ケラチン、コロイドシリカ、ジャガイモデンプン、尿素、中鎖トリグリセリド、デキストランおよび製剤を固形、半固形または液体形に製造する際の使用に適した他のキャリヤを挙げることができる。加えて、補助剤、安定剤、増粘剤または着色剤および香料、たとえばトリウロースのような安定化乾燥剤を使用することができる(たとえば米国特許第5,314,695号を参照すること)。
【００５８】
診断および予後の精度および感度は、マーカー、たとえば5もしくは6種または9もしくは10種または14もしくは15種のマーカーの組み合わせを使用することによって達成することができるが、実用を考慮すると、少なめの組み合わせを使用せざるを得ないかもしれない。特定のガンに関して、2、3、4または5種のマーカーを含むマーカーの任意の組み合わせを使用することができる。本明細書で提供される個々のマーカーの具体的な開示を与えられると、2、3、4または5種のマーカーの組み合わせは容易に想定することができる。試験および決定に有用な例示的な組み合わせを表5に示す。
【００５９】
示差的にメチル化されたGpGアイランドのメチル化のレベルが疾病または癌に関する多様な情報を提供することができる。それを使用して個体における疾病または癌を診断することができる。または、それを使用して、個体における疾病または癌の経過を予測すること、または疾病もしくは癌に対する罹病性を予測すること、または個体における疾病もしくは癌の進行を病期決定することができる。それは、全体的生存率を予測するか、または疾病もしくは癌の再発率を予測すること、および個体が受けた処置過程の有効性を決定することに役立つことができる。基準レベルと比較した場合のメチル化レベルの増減および検出時の増減の変化が有用な予後および診断値を提供する。
【００６０】
予後法を使用して、癌腫に進行する可能性の高い腺腫を有する患者を特定することができる。そのような予測は、正常組織に対し、腺腫中で、表1に特定された遺伝子の一つの後成的サイレンシングに基づいて行うことができる。そのような患者には、内視鏡的ポリープ切除術または摘除術および示唆される場合には外科的処置、化学療法、放射線、生物学的反応変更因子または他の療法をはじめとするさらなる適切な療法または予防法オプションを提供することができる。そのような患者はまた、より頻繁な結腸鏡検査、バーチャル結腸鏡検査、ビデオカプセル内視鏡検査、PET-CT、分子画像診断または他の画像診断技術を含み、これらに限定されないさらなる診断またはモニタリング手法の推奨を受けることができる。
【００６１】
癌患者を処置するための治療戦略は、後成的にサイレンシングされた遺伝子の再活性化に基づいて選択することができる。まず、表1に列挙されたものから選択される、患者の癌細胞中でのその発現が脱メチル化剤によって再活性化されるか、または後成的にサイレンシングされる遺伝子を特定する。次いで、その遺伝子の発現を高める処置を選択する。そのような処置は、再活性化剤またはポリヌクレオチドの投与を含むことができる。または、ポリペプチドを投与することもできる。
【００６２】
本発明によるキットは、メチル化を試験するための試薬をアセンブルしたものである。キットは典型的に、すべての要素を含み、場合によっては取扱説明書をも含むパッケージの状態にある。パッケージは、望むときまで成分が混合しないように分割されてもよい。各成分は異なる物理的状態にあることができる。たとえば、一部の成分は凍結乾燥状態にあり、一部の成分は水溶液の状態にあってもよい。一部の成分は凍結していてもよい。個々の成分がキット内で別々のパッケージングされることができる。キットは、メチル化および非メチル化シトシン残基を示差的に修飾するための、上記のような試薬を含有することができる。望むならば、キットは、添付の表1で特定された遺伝子／マーカーの転写開始点から1kb以内の領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマを含有する。典型的には、キットは、単一の遺伝子またはマーカーに関してフォワードプライマおよびリバースプライマの両方を含有する。十分な相補性領域、たとえば12、15、18または20のヌクレオチドがある場合には、プライマはまた、ハイブリダイゼーションを妨げず、かつ他の操作にとって有用であることができるさらなるヌクレオチド残基を含有することもできる。例示的な他のそのような残基は、制限エンドヌクレアーゼ開裂、リガンド結合または因子結合またはリンカもしくはリピートのための部位であってもよい。オリゴヌクレオチドプライマは、修飾されたメチル化残基に特異的であるようなものであってもよいし、そうでなくてもよい。キットは、場合によっては、オリゴヌクレオチドプローブを含有することができる。プローブは、修飾されたメチル化残基を含有する配列または非メチル化残基を含有する配列に特異的であることができる。キットは、場合によっては、メチル化シトシン残基を修飾するための試薬を含有することができる。キットはまた、増幅を実行するための成分、たとえばDNAポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオチドを含有することもできる。また、プライマまたはプローブ上の検出可能な標識を含む検出手段がキットに設けられてもよい。キットはまた、本発明のマーカー(表1)の一つに関して遺伝子発現を検出するための試薬を含有することもできる。このような試薬は、たとえばプローブ、プライマまたは抗体を含むことができる。酵素またはリガンドの場合、マーカーの存在を評価するために基質または結合相手を求めることができる。
【００６３】
本発明の一つの局面では、遺伝子を、シトシン残基を修飾するが、メチル化シトシン残基を修飾しないヒドラジンと接触させ、その後、ヒドラジン処理した遺伝子配列を、ヒドラジン修飾シトシン残基における核酸分子を開裂させる試薬、たとえばピペリジンと接触させて、それにより、フラグメントを含む産物を産生する。たとえば電気泳動法、クロマトグラフィー法または質量分析法を使用してフラグメントを分子量にしたがって分離し、分離パターンを同様に処理された対応する非メチル化遺伝子配列の分離パターンと比較することにより、メチル化シトシン残基を含有する試験遺伝子中の位置でギャップが明らかになる。そのようなものとして、ギャップの存在は、試験細胞の標的遺伝子中のCpGジヌクレオチド中のシトシン残基のメチル化を示す。
【００６４】
亜硫酸水素イオン、たとえば亜硫酸水素ナトリウムが非メチル化シトシン残基を亜硫酸水素修飾シトシン残基に転換する。亜硫酸水素イオン処理した遺伝子配列をアルカリ条件に曝露すると、亜硫酸水素修飾シトシン残基をウラシル残基に転換することができる。亜硫酸水素ナトリウムはシトシンの5,6-二重結合と容易に反応して(ただし、メチル化シトシンとは反応し難い)、脱アミノ化を受けてスルホン化ウラシルを生じさせやすいスルホン化シトシン反応中間体を形成する。スルホネート基をアルカリ条件への曝露によって脱離させて、ウラシルを形成することができる。DNAをたとえばPCRによって増幅させ、配列決定して、試料のDNA中でCpG部位がメチル化されているかどうかを決定することができる。ウラシルは、Taqポリメラーゼによってチミンとして認識され、PCRにより、得られた産物は、出発鋳型DNA中で5-メチルシトシンが存在していた位置でのみシトシンを含有する。試験細胞の亜硫酸水素イオン処理遺伝子配列中のウラシル残基の量または分布を、同様に処理された対応する非メチル化遺伝子配列とで比較することができる。試験細胞からの遺伝子中のウラシル残基の量または分布の減少が、試験細胞の遺伝子中のCpGジヌクレオチド中のシトシン残基のメチル化を示す。ウラシル残基の量または分布はまた、亜硫酸水素イオン処理標的遺伝子配列を、アルカリ条件への曝露ののち、ウラシル残基を含有する標的遺伝子かまたはウラシル残基を欠く標的遺伝子のいずれかであるが両方ではない、ヌクレオチド配列に選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと接触させることによって、かつオリゴヌクレオチドの選択的ハイブリダイゼーション(またはその欠如)を検出することによって検出することができる。
【００６５】
試験化合物は、癌を処置するその潜在能力に関して試験することができる。試験のための癌細胞は、前立腺癌、肺癌、乳癌および大腸癌からなる群より選択することができる。表1に列挙されたものから選択される遺伝子の発現を決定し、細胞中の化合物によってそれが増大している場合には、または細胞中の化合物によって遺伝子のメチル化が低減している場合には、それを、癌を処置する潜在能力を有すると特定することができる。
【００６６】
または、そのような試験は、化学療法剤に対する食道、頭部および頚部、胃、小腸、膵臓、肝臓の癌の患者の反応を決定するために使用することもできる。患者を化学療法剤で処置することができる。表1に列挙されたものから選択される遺伝子の発現が癌細胞中の化合物によって増大する場合には、または遺伝子のメチル化が癌細胞中の化合物によって低減する場合には、それを、患者を処置するのに有用なものとして選択することができる。
【００６７】
上記開示は本発明を概説する。本明細書に開示されたすべての参考文献は参照により明示的に組み入れられる。例示の目的のためだけに提供され、本発明を範囲を限定することを意図しない以下の具体例を参照することにより、より完全な理解を得ることができる。
【００６８】
実施例
実施例1―材料および方法
試料採取および核酸抽出
ポリープ切除または外科手術の直後、68個の大腸腫瘍試料、37個の腺腫および31個の癌腫をそれぞれ採取し、病理学者が評価し、これらの検体の組織試料を液体窒素中で凍結させた。
【００６９】
Trizol溶液(Invitrogen life technologies)を用いて、供給元の取り扱い説明書にしたがってRNAおよびDNAの単離を実施した。RNAおよびDNA単離のための組織試料を得る前および得たのちに厚さ4μmの二つの凍結切片をそれぞれ切除し、ヘマトキシリン−エオシンで染色して、組織試料中に存在する腫瘍細胞の割合を推定した。腫瘍細胞を少なくとも70％有する試料だけをRNAおよびDNA単離のために選択した。
【００７０】
マイクロアレイスライド標本
Compugen (San Jose, CA, USA)によって設計され、Sigma-Genosys (Zwijndrecht, The Netherlands)から得られた、18,664個の固有のヒト遺伝子を表す18,861個の60量体オリゴヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドアレイを、マイクロアレイ発現解析に使用した。アレイは、VUmc Microarray施設で調製したものであった(ワールドワイドウェブ上ではマイクロアレイのページのドメイン.vumc.nl)。簡潔にいうと、オリゴヌクレオチドを、150mMリン酸ナトリウム(pH8.5)中10μMの濃度で、CodeLinkスライド(Amersham BioSciences, Roosendaal, The Netherlands)上に、SpotArray Enterprise(Perkin Elmer Life Sciences, Zaventem, Belgium)を使用してスポッティングし、製造者のプロトコルにしたがって処理した。
【００７１】
cDNA合成、プローブ調製およびハイブリダイゼーション
全試料RNA15μgおよびUniversal Human Reference RNA (Stratagene, La Jolla, CA, USA) 15μgから、オリゴ-dT20-VNプライマ(Invitrogen, Breda, The Netherlands)、Superscript II逆転写酵素(Invitrogen)ならびに20mM dATP、20mM dCTP、20mM dGTP、4mM dTTP (すべてInvitrogen)および16mMアミノアリル-dUTP (Ambion, Cambridgeshire, UK)を含有するアミノアリルdNTP原液を使用して、cDNAを調製した。ミクロコンYM-30フィルタカラム(Millipore B.V., Amsterdam, The Netherlands)を使用してcDNAを精製し、真空遠心分離器で完全に乾燥させ、50mM NaHCO3/Na2CO3 (pH9.0) 9μl中に溶解させた。次に、cDNAを、室温で1時間、Cy3 (試料)またはCy5 (参照)染料(Fluorolink Cy3/Cy5一官能性染料パック(Amersham Biosciences))に結合させたのち、4Mヒドロキシルアミンを加えることによって非結合染料をブロックした。Cy3(試料)およびCy5 (参照)標識cDNAを混合し、Qiaquick PCR精製キット(Qiagen Benelux B. V., Venlo, The Netherlands)を使用してプローブを精製した。ポリA (Pharmacia, Capelle a/d IJssel, The Netherlands) 12μg、酵母tRNA (Sigma) 60μgおよびCot-1 DNA (Invitrogen)24μgを加え、その後、プローブを析出させ、ハイブリダイゼーションミックス(2x SSC中0.2％SDS、8％グリセロール、50％ホルムアミドおよび0.1％硫酸デキストラン)127μl中に溶解し、70℃で10分間変性させ、37℃で1時間インキュベートした。スライドを、37℃で45分間、ハイブリダイゼーションミックス127μlに溶解したサケ精子DNA (Gibco, Breda, The Netherlands)30μg、ポリA(Pharmacia) 12μg、酵母tRNA (Sigma) 60μgおよびCot-1 DNA (Invitrogen) 24μgを含有するプレハイブリダイゼーション溶液でプレハイブリダイズさせた。プレハイブリダイゼーションののち、プローブハイブリダイゼーションを37℃で14時間実施した。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションはいずれもHybStation 12 (Perkin Elmer Life Sciences)中で実施した。
【００７２】
データ解析
画像取得および定量化
ScanArray Express (Perkin Elmer Life Sciences)を使用してアレイをスキャンし、ImaGene 5.6.1ソフトウェア(BioDiscovery Ltd, Marina del Rey, CA, USA)で、低画質スポットのフラギングのためのデフォルト設定を使用して定量化した。フラギングされたスポットをさらなる解析から除外した。
【００７３】
アレイ解析
それぞれ遺伝子30000個を含む68個のチップを解析した。腺腫からのRNAおよび31の使用された癌腫DNAを使用して37個のスライドを解析した。VUMCマイクロアレイグループによって供給されたGALファイル(galfile＝"H30K 25042004 b34.gal")を使用して、スポット位置と遺伝子名とを相関させた。RベースのBioconductorパッケージ(marray)を使用して発現データを正規化／解析した。
【００７４】
メジアンベースの手法を使用してアレイ間で正規化を実施した(「marray」パッケージの「maNorm」ルーチン)。ユニバーサル標準を常にRED［R］で標識した。比Mを21og(R/G)(A＝21og(R*G)/2)と定義した。
【００７５】
Wilcoxon試験をM比に対して使用して腺腫と癌腫との間の統計的差違を計算した。Wilcoxonに加えて、亜(集団)における示差的行動を検出することができる「Thas」試験を適用した。
【００７６】
進行マーカー解像力：
(メジアン癌腫比M)―(メジアン腺腫比M)＞0 および Wilcoxon p値＜0.00001。この0.00001の値を多数の仮説検証に関して修正する。
【００７７】
早期マーカー解像力：
(メジアン癌腫比M＋培地腺腫比M)、降順でソート(スコアが高ければ高いほど発現が低い)、任意カットオフ4
【００７８】
進行または早期検出マーカー解像力を通過する遺伝子のプロモータは、56個のマーカーの確立されたリストから5祖先ノード少ないゲノムワイドなアライメントに位置しなければならないか(BROADプロモータ解析を参照すること)、または、4個と等しいかまたはそれ以上の異なるモチーフを含有しなければならない(DEEPプロモータ解析を参照すること)。
【００７９】
BROAD解析：ゲノムワイドなプロモータアライメント
転写開始点のデータベース(DBTSS、バージョン3.0、ヒトアセンブリビルド31に基づく)から8793種の配列を抽出した。その後、Newcpgreportを使用して、遺伝子ごとに500bp領域中のCpGアイランドを検出した。CpGアイランドとは、最小200bp、GC含有率50％超、実測／予測(O/E)比0.60超の領域と定義される。500bpがTSSに対して-300〜＋200までに位置している。このセットを56個の報告済み／既知の癌特異的にメチル化された遺伝子で補足した。その結果、4738個の遺伝子の配列セットが得られ、その後それらをclustalwによって整列させる。既知のマーカーの位置を示すことに加えて、Treeillustratorと呼ばれるソフトウェアツールを使用して大きな系統樹を視覚化した。
【００８０】
DEEP解析：特異的結合パターン
計算的プロモータ解析のDEEP部分は、プロモータを含有するCpGアイランドの二つの異なる機能クラス(AおよびB)の間の差別的配列特徴を特定することに焦点を置く。クラスAは、癌でのみメチル化され、正常組織ではメチル化されない遺伝子を列挙し、一方、クラスBは、正常組織で少なくとも部分的にメチル化される遺伝子を列挙する。これらの遺伝子それぞれに関して、予測される転写開始点(TSS)の周辺1kbの対称領域を抽出した。ここでもまた、newcpgreportを使用し、CpGアイランドを、最小200bp、GC含有率50％超、O/E比0.60超の領域と定義する。7種のモチーフがクラスBよりもクラスAで過剰発現することがわかり、これらを使用して情報提供的癌特異的メチル化を予測した。
【００８１】
実施例2
材料および方法
試料はPEFFまたは新鮮な凍結材料として到着し、それらの試料を3クラスに細分する。C＝癌(病理学者によって指示された領域)、N＝正常(患者からの非癌材料、組織学的に正常な切除端)、NN＝ノーマルノーマル(「健常な」患者からの生検材料)。
【００８２】
従来的なフェノール／クロロホルム抽出法によってgDNAを抽出し、Nanodrop分光光度計(Isogen)で計測する。gDNA 1〜1.5μgをEZ-96 DNAメチル化キット(商標)(ZymoResearch)でBT処理し、50μlに溶離させる。BT処理試料に対してプライマを用いて完全性試験を実施してDNAフラグメントの長さをチェックする。完全性試験プライマを図1および配列番号794〜803に示す。300bpまでのバックアンプリコンを見つける場合には、品質管理が許容可能である。
【００８３】
すべての試料をbACT STD曲線およびbACTビーコンMB6
2009539404.tif 000008
とともにLightCycler (LightCyclerプロトコルを参照すること)で処理し、bACTコピー番号を決定する。コピー番号＜200の試料を捨て、試料を同じコピー番号に正規化する。
【００８４】
以下のセンス(S)、アンチセンス(A)およびビーコン(B)プローブをFUK、PDCD4およびPHACTR3に使用した。
【００８５】
2009539404.tif 000009
【００８６】
BioTrove (高スループット)またはLC480 (Roche)のいずれかで、384フォーマットでメチル化特異的リアルタイムPCRを実施する。
【００８７】
試料位置を試料タイプ(C、N、NN)にしたがってランダム化するOMSpark(商標)ソフトウェアに試料UIDをロードする。常に同じ数(n)の癌試料および正常試料をロードするように努める。
【００８８】
BioTrove OpenArray（商標）転写物解析システム(BioTrove, Inc.12 Gill Street Suite 4000 Woburn, MA 01801-1728)
各BioTroveアレイは、それぞれが64個のスルーホールを含む48個のサブアレイからなるものである。サブアレイ1個あたり8個のスルーホールを負の対照として使用し、56個を濃度250nMのプライマでスポッティングする。各サブアレイには、LC Faststart DNA SYBR Green I Master Mix(Roche)、SYBR Green I (Sigma)最終希釈度1：1,6、グリセロール最終濃度0,5％、Pluronic F-68 (Gibco)最終濃度0,2％、BSA最終濃度1mg/ml、Roche MgCl2最終濃度1mM、ホルムアミド最終濃度8％およびBT処理gDNA 50ng (BT処理前の開始濃度で計算)のミックスを添加した。PCR仕様：90℃-10"、(43℃-18"、49℃-60"、77℃-22"、72℃-70"、95℃-28"、40サイクル)、70℃-200"、45℃-5"、融解曲線45℃＞94℃(固定BioTroveプレートファイルに準じる)。
【００８９】
解析
1. PCR-O-Matic
結果を、csvファイルとしてエクスポートし、以下のアルゴリズムを使用して、形成された価値ある増幅産物があるかどうかを決定するPCR-O-Matic解析ソフトウェアにインポートする。
【００９０】
Light Cutoff (1000)(ID＝29)からのパラメータを用いて選択されたホールを解析する。
【００９１】
平坦域までの最小サイクル＝40、最小強度差＝1000
強度温度の最小dy/dx：200
融解温度の最小dy/dx：200
1＝増幅＝メチル化
0＝増幅なし＝非メチル化
【００９２】
すべてのスルーホールが常に満たされているわけではないため、ROX(マスタミックスに含まれる)シグナルを使用してスルーホールのローディングをチェックする。ROXシグナルが所与の値未満である場合には、ソフトウェアによって結果を-1とマークし、解析において偽陰性を避けるために捨てる。アッセイごとに特異性および感受性を次のように計算する。
感受性＝メチル化癌試料の合計／癌試料の合計カウント
特異性＝1-(メチル化正常試料の合計／正常試料の合計カウント)
【００９３】
特異性および感受性でアッセイ法をランク付けし、最高ランクのアッセイ法を「n」個の癌患者試料および「n」個の正常患者試料の選択においてLC480でチェックする。
【００９４】
2. 融解ピークに基づく解析―Ct値
融解ピークに基づいてプライマ二量体と実際の増幅産物とを区別することを可能にし、さらにCt値に基づいてメチル化増幅産物と非メチル化材料からのバックグラウンド増幅とを区別することを可能にする第二のより洗練された解析を実施する。
最小デルタCt＝5ct (アッセイ依存性)
【００９５】
ここでもまた、特異性および感受性を計算し、特異性および感受性にしたがってアッセイ法をランク付けする。最高ランクのアッセイ法を使用してビルディングブロックを導出する。
LightCycler LC480 (Roche)
【００９６】
384フォーマットで、LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix、Roche MgCl2最終濃度1mM、BSA最終濃度1mg/ml、プライマF最終濃度125nM、プライマR最終濃度125nMおよびgDNA試料10ng/10μlからなるPCR反応ミックスをウェルあたり10μl使用する。
【００９７】
2009539404.tif 000010
【００９８】
LightCyclerで、融解ピークおよびCt値に基づく第二の解析法を使用する。
【００９９】
結果
進行マーカーの検査のために、FUK_11670、PHACTR3_11706およびPDCD4_11827アッセイ法をとりわけ含むBioTrove結腸アレイを使用した。
【０１００】
37個の癌試料(腺腫／癌腫)、11個の正常試料および27個のノーマルノーマル試料をBioTroveで処理し、40個の癌(癌腫)試料および40個の正常試料をLightCyclerで処理した。得られた結果を以下にまとめる。3種のマーカー(FUK_11670、PHACTR3_11706およびPDCD4_11827)すべてが正常試料に比べて示差的にメチル化されていた。
【０１０１】
2009539404.tif 000011
【０１０２】
3種のマーカーのメチル化を16個の腺腫試料および16個の癌腫試料でさらに調査した。結果を以下に掲載する。3種のマーカーすべてのメチル化が腺腫および癌種の両方で実証された。3種のマーカーは、癌腫に比べて腺腫の場合に同じCt平均値を示した。これらの結果は、3種のマーカーすべてが癌の早期検出に適していることを示す。これらの結果は、3種のマーカーのうちPHACTR3が腺腫試料中で最初に出現するマーカーであることを示した。
【０１０３】
2009539404.tif 000012
【０１０４】
【表１】
2009539404.tif 000013
2009539404.tif 000014
2009539404.tif 000015
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2009539404.tif 000018
2009539404.tif 000019
【０１０５】
各遺伝子の配列は、本出願の出願日に公共データベース中に存在する状態で、参照により本明細書に組み入れられる。
【図１】
2009539404.tif 000027
【配列表】
2009539404000001.app
【国際調査報告】
2009539404.tif 000028
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2009539404.tif 000030
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