(57)【要約】  本発明は、ヒトのインスリン様成長因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）に特異的に結合することができる新規な抗体に関する。本発明は同様に、ＩＧＦ１及び／もしくはＩＧＦ２のいずれかで刺激されるＩＧＦ−ＩＲを過剰発現する癌又は当該受容体の過剰発現に関連する任意の病状の予防的処置及び／又は治療的処置のための薬剤としてのこれらの抗体の使用、並びにＩＧＦ−ＩＲ及び／又はＩＧＦ−Ｉ／インスリンハイブリット受容体の過剰発現に関連した疾病の診断のための方法又はキットの使用を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトのインスリン様成長因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）に対する結合親和性を有する、単離された抗体又はその機能的な免疫原性断片であって、前記ＩＧＦ−ＩＲへの結合の際、０．３ｎＭ未満、好ましくは０．０３ｎＭ未満のＩＣ５０で天然の結合相手であるＩＧＦ１の前記ＩＧＦ−ＩＲへの結合を阻害すること、及び、０．３ｎＭ未満、好ましくは０．１ｎＭ未満のＩＣ５０で天然の結合相手であるＩＧＦ２の前記ＩＧＦ−ＩＲへの結合も阻害することを特徴とする、単離された抗体又はその機能的な免疫原性断片。
【請求項２】
ヒトのインスリン様成長因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）のチロシンキナーゼを阻害する活性を有する、単離された抗体又はその機能的な免疫原性断片であって、前記ＩＧＦ−ＩＲへの結合の際、０．３ｎＭ未満、好ましくは０．０３ｎＭ未満のＩＣ５０で天然の結合相手であるＩＧＦ１の前記ＩＧＦ−ＩＲへの結合を阻害すること、及び、０．３ｎＭ未満、好ましくは０．１ｎＭ未満のＩＣ５０で天然の結合相手であるＩＧＦ２の前記ＩＧＦ−ＩＲへの結合も阻害することを特徴とする、単離された抗体又はその機能的な免疫原性断片。
【請求項３】
ＩＧＦ−ＩＲのβ鎖のＩＧＦ１及び／又はＩＧＦ２誘導性リン酸化を１００％阻害することもできることを特徴とする、請求項１又は２に記載の抗体又はその機能的な断片の一つ。
【請求項４】
固有のアゴニスト活性を全く示さないことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又はその機能的な断片の一つ。
【請求項５】
同じＦＡＣＳ分析方法を使用して、
ｉ）ＨＴ２９細胞におけるＩＧＦ−ＩＲの内在化の少なくとも３０％、及び／又は
ｉｉ）ＭＣＦ−７細胞におけるＩＧＦ−ＩＲの内在化の少なくとも８５％
を誘導することができることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体又はその機能的な断片の一つ。
【請求項６】
同じＦＡＣＳ分析方法を使用して、
ｉ）ＨＴ２９細胞におけるＩＧＦ−ＩＲの分解の少なくとも５０％、及び／又は
ｉｉ）ＭＣＦ−７細胞におけるＩＧＦ−ＩＲの分解の少なくとも６５％
を誘導することができることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体又はその機能的な断片の一つ。
【請求項７】
ＩＧＦ１及びＩＧＦ２誘導性のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＭＣＦ−７細胞の増殖の両方を、少なくとも１ｎＭの、好ましくはＩＧＦ１及びＩＧＦ２に対してそれぞれ少なくとも０．７ｎＭ及び０．５ｎＭに等しいＩＣ５０で阻害することができることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体又はその機能的な断片の一つ。
【請求項８】
配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５の配列の相補性決定領域（ＣＤＲ）から選択される少なくとも一つのＣＤＲ、又は、最適なアラインメントの後に配列が配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも一つのＣＤＲを含む軽鎖を含むこと、あるいは、配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６の配列のＣＤＲから選択される少なくとも一つのＣＤＲ、又は、最適なアラインメントの後に配列が配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも一つのＣＤＲを含む重鎖を含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体又はその機能的な断片の一つ。
【請求項９】
配列番号２、配列番号４、及び配列番号６の配列の三つのＣＤＲのうちの少なくとも二つのＣＤＲもしくは三つのＣＤＲ、又は最適なアラインメントの後に配列番号２、配列番号４、及び配列番号６の配列と少なくとも８０％の同一性をそれぞれ有する配列の三つのＣＤＲのうちの少なくとも二つのＣＤＲもしくは三つのＣＤＲを含む重鎖を含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体又はその機能的な断片の一つ。
【請求項１０】
配列番号１、配列番号３、及び配列番号５の配列の三つのＣＤＲのうちの少なくとも二つのＣＤＲもしくは三つのＣＤＲ、又は最適なアラインメントの後に配列番号１、配列番号３、及び配列番号５の配列と少なくとも８０％の同一性をそれぞれ有する配列の三つのＣＤＲのうちの少なくとも二つのＣＤＲもしくは三つのＣＤＲを含む軽鎖を含むことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体又はその機能的な断片の一つ。
【請求項１１】
配列番号２、配列番号４、及び配列番号６の配列の三つのＣＤＲ、又は最適なアラインメントの後に配列番号２、配列番号４、及び配列番号６の配列と少なくとも８０％の同一性をそれぞれ有する配列の三つのＣＤＲを含む重鎖を含むこと、そしてさらに、配列番号１、配列番号３、及び配列番号５の配列の三つのＣＤＲ、又は最適なアラインメントの後に配列番号１、配列番号３、及び配列番号５の配列と少なくとも８０％の同一性をそれぞれ有する配列の三つのＣＤＲを含む軽鎖を含むことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体又はその機能的な断片の一つ。
【請求項１２】
ヒトのインスリン受容体（ＩＲ）に有意な付着をしないことを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体又はその機能的な断片の一つ。
【請求項１３】
前記機能的な断片が、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ断片及びダイアボディ、又は、ペグ化断片などの半減期が延長した任意の断片から選択されることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体を分泌することができるマウスハイブリドーマ。
【請求項１５】
２００５年６月２３日にパリのパスツール研究所のＣＮＣＭに番号Ｉ−３４６６として寄託された、請求項１４に記載のマウスハイブリドーマ。
【請求項１６】
請求項１５に記載のハイブリドーマによって分泌されることを特徴とする抗体又はその機能的な断片の一つ。
【請求項１７】
配列番号７のアミノ酸配列を含む配列、もしくは最適なアラインメントの後に配列番号７の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列の軽鎖を含むこと、又は／及び、配列番号８のアミノ酸配列を含む配列、もしくは最適なアラインメントの後に配列番号８の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列の重鎖を含むことを特徴とする、請求項１〜１３又は１６のいずれか一項に記載の抗体又はその機能的な断片の一つ。
【請求項１８】
前記抗体がキメラ抗体であり、さらにマウスとは異なる種の抗体由来の軽鎖及び重鎖の定常領域を含むことを特徴とする、請求項１７に記載の抗体又はその機能的な断片の一つ。
【請求項１９】
前記異なる種がヒトであることを特徴とする、請求項１８に記載のキメラ抗体又はその機能的な断片の一つ。
【請求項２０】
ヒト抗体由来の軽鎖及び重鎖の定常領域がそれぞれ、κ領域及びγ−１領域、γ−２領域又はγ−４領域であることを特徴とする、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載のキメラ抗体又はその機能的な断片の一つ。
【請求項２１】
配列番号１７のアミノ酸配列、もしくは最適なアラインメントの後に配列番号１７の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む軽鎖を含むこと、又は／及び、配列番号１８のアミノ酸配列、もしくは最適なアラインメントの後に配列番号１８の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む重鎖を含むことを特徴とする、請求項１９又は２０に記載のヒト化抗体又はその機能的な断片の一つ。
【請求項２２】
配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含むこと、及び配列番号１８のアミノ酸配列を含む配列の重鎖を含むことを特徴とする、請求項２１に記載のヒト化抗体又はその機能的な断片の一つ。
【請求項２３】
ａ）請求項１〜１３及び１６〜２２のいずれか一項に記載の抗体又はその機能的な断片の一つをコードする核酸、ＤＮＡ又はＲＮＡ、
ｂ）ａ）で定義される核酸に相補的な核酸、
ｃ）配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、もしくは配列番号１４の配列のＣＤＲの少なくとも一つと、又は最適なアラインメントの後に配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、もしくは配列番号１４の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列と、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる、少なくとも１８個のヌクレオチドからなる核酸、
ｄ）少なくとも配列番号１５の核酸配列の軽鎖及び／もしくは配列番号１６の核酸配列の重鎖と、又は最適なアラインメントの後に配列番号１５及び／もしくは配列番号１６の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％及び９８％の同一性を有する配列と、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる、少なくとも１８個のヌクレオチドからなる核酸、
ｅ）少なくとも配列番号１９の核酸配列の軽鎖及び／もしくは配列番号２０の核酸配列の重鎖と、又は最適なアラインメントの後に配列番号１９及び／もしくは配列番号２０の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％及び９８％の同一性を有する配列と、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる、少なくとも１８個のヌクレオチドからなる核酸、
から選択されることを特徴とする、単離された核酸。
【請求項２４】
請求項２３に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２５】
請求項２４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２６】
請求項２５に記載のベクターで形質転換される少なくとも一つの細胞を含む、ヒトを除くトランスジェニック動物。
【請求項２７】
ａ）請求項２５に記載の細胞を培地で適切な培養条件下で培養する段階、
ｂ）このようにして産生した前記抗体又はその機能的な断片の一つを培養培地又は前記培養された細胞から回収する段階、
を含むことを特徴とする、請求項１〜１３及び１６〜２２のいずれか一項に記載の抗体又はその機能的な断片の一つを生成する方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法によって得ることができる抗体又はその機能的な断片の一つ。
【請求項２９】
さらに、ヒトのチロシンキナーゼファミリー受容体と特異的に結合することができること及び／又は該受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害することができることを特徴とする、請求項１〜１３及び１６〜２２及び２８のいずれか一項に記載の抗体又はその機能的な断片の一つ。
【請求項３０】
ＥＧＦのヒトの上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）への結合を特異的に阻害すること及び／又は該ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害することができる第二のモチーフを含む二重特異性抗体であることを特徴とする、請求項２９に記載の抗体又はその機能的な断片の一つ。
【請求項３１】
前記第二の抗ＥＧＦＲモチーフが、マウスモノクローナル抗体２２５、そのキメラ誘導体Ｃ２２５、又は該抗体２２５由来の任意のヒト化抗体から得られることを特徴とする、請求項３０に記載の抗体又はその機能的な断片の一つ。
【請求項３２】
ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体によって調節される活性を特異的に阻害すること及び／又は該ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害することができる第二のモチーフを含む二重特異性抗体から成ることを特徴とする、請求項２９に記載の抗体又はその機能的な断片の一つ。
【請求項３３】
前記第二の抗ＨＥＲ２／ｎｅｕモチーフが、マウスモノクローナル抗体４Ｄ５もしくは２Ｃ４、又はヒト化抗体トラスツズマブもしくはペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）に由来することを特徴とする、請求項３２に記載の抗体又はその機能的な断片の一つ。
【請求項３４】
肝細胞成長因子（ＨＧＦ）のｃＭＥＴ受容体上への結合を特異的に阻害すること及び／又は該ｃＭＥＴ受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害することができる第二のモチーフを含む二重特異性抗体であることを特徴とする、請求項２９に記載の抗体又はその機能的な断片の一つ。
【請求項３５】
マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）のＲＯＮ受容体上への結合を特異的に阻害すること及び／又は該ＲＯＮ受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害することができる第二のモチーフを含む二重特異性抗体であることを特徴とする、請求項２９に記載の抗体又はその機能的な断片の一つ。
【請求項３６】
例えばＶＥＧＦＲ、ＦＧＦ（線維芽細胞成長因子）又はＣＸＣＲ４もしくはＣＸＣＲ２（４型ケモカイン受容体又は２型ケモカイン受容体）等の、腫瘍の進行に関与する任意の種類の受容体と相互作用することができることを特徴とする、請求項１〜１３、１６〜２２及び２８〜３５のいずれか一項に記載の抗体又はその機能的な断片の一つ。
【請求項３７】
前記第二のモチーフが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’ＰＥＧ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ断片及びダイアボディ、又は半減期が延長した任意の形態から選択されることを特徴とする、請求項２８〜３６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３８】
薬剤としての、請求項１〜１３、１６〜２２及び２８〜３７のいずれか一項に記載の抗体又はその機能的な断片の一つ。
【請求項３９】
請求項１〜１３、１６〜２２及び２８〜３８のいずれか一項に記載の抗体又はその機能的な断片の一つから成る化合物を有効成分として含む組成物。
【請求項４０】
ＩＧＦ−ＩＲ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃＭＥＴ及び／又はＲＯＮのチロシンキナーゼ活性を特異的に阻害することができる化合物から選択される少なくとも第二の化合物を含むことを特徴とする、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
前記第二の化合物が、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ−ＩＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃＭＥＴ、及び／又はＲＯＮが介在する、増殖性及び／又は抗アポトーシス性及び／又は血管形成性及び／又は転移性の播種の誘導因子の活性を阻害することができる、単離された抗ＥＧＦＲ、抗ＩＧＦ−ＩＲ、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ、抗ｃＭＥＴ及び／もしくは抗ＲＯＮ抗体、又はそれらの機能的な断片から選択されることを特徴とする、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
同時使用、個別使用又は連続使用のための組合せ製品として、少なくともＩＲ、ＩＧＦ−ＩＲ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃＭＥＴ及び／又はＲＯＮのチロシンキナーゼ活性の阻害剤を含むことを特徴とする、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４３】
チロシンキナーゼ活性の前記阻害剤が、誘導性天然作用因子、ジアニリノフタルイミド、ピラゾロピリドピリミジンもしくはピロロピリドピリミジン、又は他のキナジリン（ｑｕｉｎａｚｉｌｉｎｅｓ）から成る群から選択されることを特徴とする、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
同時使用、個別使用又は連続使用のための組合せ製品として細胞傷害性作用因子／細胞増殖抑制剤をさらに含むことを特徴とする、請求項３９〜４３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４５】
前記細胞傷害性作用因子／細胞増殖抑制剤が、ＤＮＡと相互作用する作用因子、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼＩ阻害剤もしくはトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、又は紡錘体の阻害剤もしくは安定剤、あるいは化学療法に使用することができる他の任意の作用因子から選択されることを特徴とする、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
前記細胞傷害性作用因子／細胞増殖抑制剤が、同時使用のために前記組成物の要素の少なくとも一つと化学的に結合していることを特徴とする、請求項４４又は４５に記載の組成物。
【請求項４７】
前記細胞傷害性作用因子／細胞増殖抑制剤が、紡錘体の阻害剤又は安定剤、好ましくはビノレルビン、ビンフルニン（ｖｉｎｆｌｕｎｉｎｅ）又はビンクリスチンから選択されることを特徴とする、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４８】
前記抗体の少なくとも一つ又はその機能的な断片の一つが細胞毒素及び／又は放射性元素と結合していることを特徴とする、請求項３９〜４７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４９】
薬剤としての、請求項３９〜４８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５０】
ＩＧＦ−ＩＲの過剰発現及び／もしくは異常な活性化、並びに／又はＩＧＦ１もしくはＩＧＦ２のＩＧＦ−ＩＲとの相互作用が介在するシグナル伝達経路の過剰活性化に関連した疾病の予防又は治療を目的とした薬剤を製造するための、請求項１〜１３、１６〜２２及び２８〜３８のいずれか一項に記載の抗体もしくはその機能的な断片の一つ、及び／又は請求項３９〜４９のいずれか一項に記載の組成物の使用方法。
【請求項５１】
前記薬剤の投与が、インスリン受容体（ＩＲ）の阻害に関与する副作用を引き起こさないか、又はほんのわずかしか引き起こさないことを特徴とする、請求項５０に記載の使用方法。
【請求項５２】
正常細胞の、腫瘍形質を有する細胞、好ましくはＩＧＦ依存性細胞、少なくともＩＧＦ２依存性の細胞への形質転換、並びに／又は、腫瘍細胞、好ましくはＩＧＦ依存性細胞、少なくともＩＧＦ２依存性の細胞の成長及び／もしくは増殖を阻害することを目的とする薬剤を調製するための、請求項５０又は５１に記載の使用方法。
【請求項５３】
癌の予防又は治療を目的とする薬剤を調製するための、請求項５０〜５２のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項５４】
前記癌が、前立腺癌、骨肉種、肺癌、乳癌、子宮内膜癌、多発性骨髄腫、卵巣癌又は結腸癌から選択される癌であることを特徴とする、請求項５３に記載の使用方法。
【請求項５５】
前記癌が結腸癌であることを特徴とする、請求項５４に記載の使用方法。
【請求項５６】
乾癬又はアテローム性動脈硬化症の予防又は治療を目的とする薬剤を調製するための、請求項５０〜５２のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項５７】
正常な状態と比較してＩＧＦ−ＩＲが異常に発現していることを特徴とする病態をｉｎ  ｖｉｔｒｏで診断する方法であって、ＩＧＦ−ＩＲ／抗体複合体の形成に好都合な条件下で、ＩＧＦ−ＩＲを含んでいる疑いのある生体サンプルと、請求項１〜１３、１６〜２２及び２８〜３８のいずれか一項に記載の抗体とを接触させること、並びに、該サンプルにおける前記ＩＧＦ−ＩＲの存在の指標として前記複合体を検出することを含む方法。
【請求項５８】
前記抗体が検出可能に標識される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
ＩＧＦ−ＩＲの異常な発現がＩＧＦ−ＩＲの過剰発現である、請求項５７又は５８に記載の方法。
【請求項６０】
ＩＧＦ−ＩＲの異常な発現がＩＧＦ−ＩＲの過少発現である、請求項５７又は５８に記載の方法。
【請求項６１】
前立腺細胞サンプルの発癌性を予測するための診断方法であって、
（ａ）ヒトの肺組織又は乳房組織のサンプルの準備、並びに
（ｂ）ＩＧＦ−ＩＲ／抗体複合体の形成に好都合な条件下で、該サンプルを請求項１〜１３、１６〜２２又は２８〜３８のいずれか一項に記載の抗体と接触させることを含む、前記サンプルにおけるＩＧＦ−ＩＲの存在の確認（ここで、前記複合体の存在が前記組織における前記細胞の発癌性を示す）
を含む方法。
【請求項６２】
前記複合体の存在が、患者が前記ＩＧＦ−ＩＲの過剰発現を特徴とする病理学的障害の進行又は発症の危険性があることを示す、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
ＩＧＦ−ＩＲ発現の異常な発現を特徴とする病理学的障害を緩和するように設計された治療計画の進行を追跡するための方法であって、
（ａ）被験体のサンプルを検査して、第一の時点のＩＧＦ−ＩＲのレベルを測定すること、
（ｂ）第二の時点で、前記サンプルを検査すること、及び
（ｃ）前記第二の時点のレベルを（ａ）で測定したレベルと比較して、前記治療計画の効果を決定すること（ここで、前記サンプルにおけるＩＧＦ−ＩＲのレベルの低減は、前記患者における前記病理的障害の退行の決定因子であり、また、ＩＧＦ−ＩＲのレベルの増大は該患者における該病理的障害の進行の決定因子である）
を含む方法。
【請求項６４】
ＩＧＦ−ＩＲの過剰発現又は過少発現によって誘導される疾病を診断する方法を行うため、又は、生体サンプルにおけるＩＧＦ−ＩＲの過剰発現もしくは過少発現、好ましくは当該受容体の過剰発現を検出及び／又は定量する方法を行うためのキット又はセットであって、
ａ）請求項１〜１３、１６〜２２及び２８〜３８のいずれか一項に記載の抗体又はその機能的な断片の一つ、
ｂ）適宜、免疫反応に好ましい培地を形成するための試薬、
ｃ）適宜、免疫反応によって産生されたＩＧＦ−ＩＲ／抗体複合体の実証を可能にする試薬
の要素を含むことを特徴とするキット又はセット。
【請求項６５】
生物学的に活性な化合物を、ＩＧＦ−ＩＲを発現又は過剰発現する細胞に対して特異的にターゲティングさせることを目的とする薬剤を製造するための、請求項１〜１３、１６〜２２及び２８〜３８のいずれか一項に記載の抗体又はその機能的な断片の一つの使用。
【請求項６６】
ＩＧＦ−ＩＲ応答性の哺乳類細胞においてＩＧＦ−ＩＲ活性を調節する方法であって、ＩＧＦ−ＩＲ非応答性の細胞と比べて前記ＩＧＦ−ＩＲの活性を調節するのに十分な条件下で、細胞を請求項１〜１３、１６〜２２及び２８〜３８のいずれか一項に記載の抗体と接触させることを含む方法。
【請求項６７】
ＩＧＦ−ＩＲ応答性の哺乳類細胞において、正常細胞と比べてＩＧＦ−ＩＲ活性を低減させる方法であって、細胞を請求項１〜１３、１６〜２２及び２８〜３８のいずれか一項に記載の抗体と接触させることを含む方法。
【請求項６８】
ＩＧＦ−ＩＲの調節因子を同定する方法であって、
ａ）ＩＧＦ−ＩＲを請求項１〜１３、１６〜２２及び２８〜３８のいずれか一項に記載の抗体と接触させること、
ｂ）（ａ）の複合体を化合物ライブラリーと接触させること、
ｃ）（ａ）の複合体を崩壊させる化合物を同定すること、及び
ｄ）化合物がＩＧＦ−ＩＲにおけるアゴニスト活性又はアンタゴニスト活性を示すか否かを確定すること（ここで、該活性がＩＧＦ−ＩＲの調節因子の同定を示す）
を含む方法。
【請求項６９】
サンプルにおいて、請求項１〜１３、１６〜２２又は２８〜３８のいずれか一項に記載の抗体の結合相手を検出する方法であって、
ａ）請求項１〜１３、１６〜２２又は２８〜３８のいずれか一項に記載の抗体を、該抗体をその結合相手に特異的に結合させるのに十分な条件下で、異常なレベルのヒトＩＧＦ−ＩＲの発現及び／又は活性化を特徴とする細胞増殖性障害を有する患者から得られた生体サンプルとインキュベートすること、及び
ｂ）特異的な結合を検出すること（ここで、該特異的な結合はサンプルにおける結合相手の存在を示す）
を含む方法。
【請求項７０】
ＩＧＦ−ＩＲをサンプルから精製する方法であって、
ａ）抗体と受容体の特異的な結合を可能にする条件下で、請求項１〜１３、１６〜２２又は２８〜３８のいずれか一項に記載の抗体をサンプルとインキュベートすること、及び
ｂ）抗体をサンプルから分離し、精製された受容体を得ること
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトインスリン様成長因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）と特異的に結合すること及び／又はそのＩＧＦ−ＩＲのチロシンキナーゼ活性を特異的に阻害することができる新規の抗体、特にマウスモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、及びヒト化モノクローナル抗体、並びにこれらの抗体をコードするアミノ酸配列及び核酸配列に関する。特定の様態において、本発明は、リガンドＩＧＦ１のＩＧＦ−ＩＲへの結合を効果的に阻害するだけでなく、他のリガンド、すなわちＩＧＦ２の前記受容体への結合も効果的に阻害することができる新規の抗体に関する。本発明は同様に、ＩＧＦ１及び／もしくはＩＧＦ２のいずれかで刺激されるＩＧＦ−ＩＲを過剰発現する癌又は当該受容体の過剰発現に関連した任意の病状の予防的処置及び／もしくは治療的処置のための薬剤としての、これらの抗体の使用、並びにＩＧＦ−ＩＲ及び／又はＩＧＦ−Ｉ／インスリンハイブリッド受容体の過剰発現に関連した疾病の診断のための方法又はキットにおけるこれらの抗体の使用を含む。本発明は、最後に、例えば抗ＥＧＦＲの抗体及び／又は化合物及び／又は抗癌剤もしくは毒素と複合化した作用因子と組み合わせて上記抗体を含む製品及び／又は組成物、並びに特定の癌の予防及び／又は治療のためのその使用を含む。
【背景技術】
【０００２】
ＩＧＦ−ＩＲと呼ばれるインスリン様成長因子Ｉ受容体は、インスリン受容体ＩＲと７０％の相同性を有する、チロシンキナーゼ活性を有する受容体である。ＩＧＦ−ＩＲは分子量が約３５０，０００の糖タンパク質である。それはヘテロ四量体の受容体であり、その半分は互いにジスルフィド結合で連結されており、それぞれ細胞外α−サブユニット及び膜貫通型β−サブユニットで構成されている。ＩＧＦ−ＩＲは極めて高い親和性（Ｋｄ≒１ｎＭ）でＩＧＦ１及びＩＧＦ２と結合するが、同様に１００分の１〜１０００分の１の親和性でインスリンとも結合することができる。逆に、ＩＲは極めて高い親和性でインスリンと結合するが、ＩＧＦは１００分の１の親和性でしかインスリン受容体と結合しない。α−サブユニットとβ−サブユニットのＣ末端部分とに位置するシステインに富む領域において、相同性の低い区域がそれぞれ懸念されるが、ＩＧＦ−ＩＲのチロシンキナーゼドメインとＩＲのチロシンキナーゼドメインとは極めて高い配列相同性を有している。α−サブユニットに見られる配列の違いはリガンドの結合区域に存在するため、ＩＧＦ及びインスリンの各々に対するＩＧＦ−ＩＲとＩＲとの相対的親和性の原因になる。β−サブユニットのＣ末端部分における違いは、二つの受容体のシグナル伝達経路の相違をもたらし、ＩＧＦ−ＩＲは細胞分裂促進作用、分化作用及び抗アポトーシス作用を仲介するが、ＩＲの活性化は主として代謝経路のレベルにおける作用に関与している（Ｂａｓｅｒｇａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １３３２：  Ｆ１０５−１２６，  １９９７、  Ｂａｓｅｒｇａ  Ｒ．，  Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ．  Ｒｅｓ．，  ２５３：  １−６，  １９９９）。
【０００３】
細胞質チロシンキナーゼタンパク質は、リガンドの、受容体の細胞外ドメインへの結合によって活性化される。キナーゼの活性化に伴って、ＩＲＳ−１、ＩＲＳ−２、Ｓｈｃ及びＧｒｂ１０を含む様々な細胞内基質が刺激される（Ｐｅｒｕｚｚｉ  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．，  １２５：  １６６−１７３，  １９９９）。ＩＧＦ−ＩＲの二つの主要な基質はＩＲＳ及びＳｈｃであり、これらは下流の数多くのエフェクターの活性化によって、ＩＧＦのこの受容体への付着に関連した成長作用及び分化作用の大部分を仲介する。結果として、基質の利用可能性が、ＩＧＦ−ＩＲの活性化に関連した最終的な生物学的作用を決定することができることとなる。ＩＲＳ−１が優位を占める場合には、細胞は増殖し、形質転換する傾向にある。Ｓｈｃが優位を占める場合には、細胞は分化する傾向にある（Ｖａｌｅｎｔｉｎｉｓ  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４：  １２４２３−１２４３０，  １９９９）。アポトーシスに対する防御作用に主として関わる経路は、ホスファチジル−イノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼ）経路であると考えられている（Ｐｒｉｓｃｏ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｏｒｍ．  Ｍｅｔａｂ．  Ｒｅｓ．，  ３１：  ８０−８９，  １９９９、  Ｐｅｒｕｚｚｉ  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．，  １２５：  １６６−１７３，  １９９９）。
【０００４】
発癌におけるＩＧＦ系の役割は、ここ１０年の集中的な調査の対象となっている。この関心が生じたのは、ＩＧＦ−ＩＲが、その細胞分裂促進性及び抗アポトーシス性に加えて、形質転換された表現型の確立及び維持にも必要であると考えられることが明らかになったことによる。実際に、ＩＧＦ−ＩＲの過剰発現又は構成的活性化が、非常に多種多様な細胞において、ウシ胎児血清を含まない培地における補助とは無関係に細胞の成長をもたらすこと、そしてヌードマウスにおいて腫瘍の形成をもたらすことが十分に立証されている。多数の成長因子受容体を含む、過剰発現した遺伝子の非常に多種多様な産物が細胞を形質転換し得るため、このこと自体は独特な性質ではない。しかしながら、ＩＧＦ−ＩＲが形質転換において果たす主要な役割を明確に示した重大な発見は、ＩＧＦ−ＩＲをコードする遺伝子が不活性化されているＲ細胞が、ウシパピローマウイルスのＥ５タンパク質等の、細胞を通常形質転換することができる様々な作用因子、ＥＧＦＲもしくはＰＤＧＦＲの過剰発現、ＳＶ４０のＴ抗原、活性化したｒａｓ、又はこれら最後の二つの因子の組合せによる形質転換に全く不応であることを実証するものである（Ｓｅｌｌ  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ，  ９０：  １１２１７−１１２２１，  １９９３、  Ｓｅｌｌ  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １４：  ３６０４−３６１２，  １９９４、  Ｍｏｒｒｉｏｎｅ  Ａ．  Ｊ．，  Ｖｉｒｏｌ．，  ６９：  ５３００−５３０３，  １９９５、  Ｃｏｐｐｏｌａ  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １４：  ４５８８−４５９５，  １９９４、  ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  １６４：  ２１４−２２１，  １９９５）。
【０００５】
ＩＧＦ−ＩＲは非常に多種多様な腫瘍及び腫瘍株において発現され、ＩＧＦは、ＩＧＦ−ＩＲに付着することで腫瘍の成長を増幅する。ＩＧＦ−ＩＲの発癌における役割を支持する他の議論は、受容体に対するマウスモノクローナル抗体を使用する研究、又はＩＧＦ−ＩＲのドミナントネガティブを使用する研究によるものである。実際には、ＩＧＦ−ＩＲに対するマウスモノクローナル抗体は、培養における数多くの細胞株の増殖及びｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍細胞の成長を阻害する（Ａｒｔｅａｇａ  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ４９：  ６２３７−６２４１，  １９８９、  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍ．，  １９６：  ９２−９８，  １９９３、  Ｚｉａ  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２４：  ２６９−２７５，  １９９６、  Ｓｃｏｔｌａｎｄｉ  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ５８：  ４１２７−４１３１，  １９９８）。同様に、Ｊｉａｎｇら（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  １８：  ６０７１−６０７７，  １９９９）の研究において、ＩＧＦ−ＩＲのドミナントネガティブが腫瘍増殖を阻害することができることが示されている。
【０００６】
ＩＧＦ−ＩＲに特異的に結合することができるこのような抗体が記載されてきており、幾つかの特許出願が出願されている。例として、本出願人によって出願された、ＩＧＦ−ＩＲと結合することができる７Ｃ１０と呼ばれるモノクローナル抗体が記載されている国際公開第０３／０５９９５１号の特許出願を挙げることができる。他の特許出願は、国際公開第０２／０５３５９６号（ＰＦＩＺＥＲ  ＩＮＣ．及びＡＢＧＥＮＩＸ  ＩＮＣ．）、国際公開第０３／１００００８号（ＳＣＨＥＲＩＮＧ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）又は国際公開第０３／１０６６２１号（ＩＭＭＵＮＯＧＥＮ  ＩＮＣ．）を挙げることができる。これらの出願全てが、ＩＧＦ−ＩＲに特異的に結合すること及び／又はその活性を阻害することができる抗体を特許請求の範囲に記載している。
【０００７】
両天然リガンドのＩＧＦ−ＩＲへの結合、より詳細にはＩＧＦ２のＩＧＦ−ＩＲへの結合を効果的に阻害できることがこれらの各抗体の明らかな特性であると考えられるが、これら出願の明細書のいずれも、これらの抗体がそのような阻害をすることが可能であることを明確に実証してはいない。ＩＧＦ１及びＩＧＦ２誘導性の増殖の阻害等のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのデータが上記の出願で示され、当該データは、記載された抗体がＩＧＦ１及びＩＧＦ２誘導性の増殖の両方を効果的に阻害することができることを実証している。しかし、記載された抗体の大部分がＩＧＦ−ＩＲの部分的な下方調節を誘導する能力を示したので、抗増殖性がＩＧＦ−ＩＲへのＩＧＦ１とＩＧＦ２の両方の結合の阻害に直接関係していることは明らかではない。
【０００８】
実際、例えば、国際公開第０３／１０６６２１号パンフレットに示されているデータはＩＧＦ１のみに関するものであり、いかなる場合であってもＩＧＦ２のＩＧＦ−ＩＲへの結合の最終的な阻害は記載されていない（３３〜３５頁の実施例Ｃ及び図３、並びに３５〜３７頁の実施例Ｄ及び図４〜図６を参照のこと）。
【０００９】
同じ所見が、国際公開第０２／０５３５９６号パンフレットに対してなされ得る（７８〜７９頁の実施例ＩＶ及び図３、並びに８２頁の実施例ＶＩＩ及び図４を参照のこと)。
【００１０】
ヒトＩＧＦ−ＩＲ（ｈＩＧＦ−ＩＲ）に対するモノクローナル抗体又は組換え抗体の発見を記載しているものとして現在確認されている全ての特許出願のうち、二つのみ（国際公開第２００４／０８７７５６号パンフレット及び国際公開第２００５／００５６３５号パンフレット）が、［１２５Ｉ］ＩＧＦ２のｈＩＧＦ−ＩＲへの結合を阻害する抗体（それぞれＡＫ１ａ及びＡＫ１８）の効果を実際に示している。
【００１１】
実験手順は両者の場合で同一であり、ヒトの結腸直腸腺癌（ＨＴ２９）無傷細胞における競合結合に基づいている。記載されている手順は妥当なものであるが、天然ｈＩＧＦ−ＩＲリガンド（ＩＧＦ１及びＩＧＦ２）による競合等のポジティブコントロールがないので、競合結合に関するデータは信頼性がない。一方、抗体濃度が高くても不完全な競合のみが示されたため（ＡＫ１ａ及びＡＫ１８の両抗体について、［１２５Ｉ］ＩＧＦ２の結合を最大８０％阻害）、より有効な抗体の開発がヒトにおける治療効果を高めるために必要である。ＡＫ１ａ及びＡＫ１８によるＩＧＦ２介在性応答の推定される阻害に関する最後の問題点は、ｈＩＧＦ−ＩＲが介在する機能的なＩＧＦ２刺激性シグナル伝達の阻害を示している例が存在しないことである。実際、たとえＩＧＦ２結合の競合が生じたとしても、それは付随する下流のｈＩＧＦ−ＩＲのシグナル伝達の阻害を伴うはずであり、そしてこのような証拠が抗体の機能的有効性に対する機構的な証拠を与えるものとして例示されるはずである。
【特許文献１】国際公開第０３／０５９９５１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００４／０８７７５６号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、高い親和性で特異的にＩＧＦ−ＩＲを認識し、ＩＧＦ１のＩＧＦ−ＩＲへの結合だけでなくＩＧＦ２のＩＧＦ−ＩＲへの結合も阻害することができる、マウスモノクローナル抗体、好ましくはキメラ抗体又はヒト化抗体を利用可能にすることである。この抗体はＩＲとほとんど相互作用しないか、又は全く相互作用しない。それが付着することにより、ＩＧＦ１／ＩＧＦ−ＩＲ及びＩＧＦ２／ＩＧＦ−ＩＲの相互作用の間に活性化されたシグナル伝達経路と主に相互作用することによってＩＧＦ−ＩＲを過剰発現する細胞株の、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの成長が阻害される。この抗体は、エストロゲン依存性の乳房腫瘍及び前立腺腫瘍を含む、ＩＧＦ−ＩＲを発現する全ての腫瘍型に対してｉｎ  ｖｉｖｏで活性であることができ、このことは、現在利用可能な抗ＩＧＦ−ＩＲモノクローナル抗体（ＭＡｂ又はＭＡＢと記す）には当てはまらない。実際、ＩＧＦ−ＩＲのドメインに対するαＩＲ３は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで乳房のエストロゲン依存性腫瘍（ＭＣＦ−７）の成長を完全に阻害するが、ｉｎ  ｖｉｖｏでは対応モデルに対する効果は有さない（Ａｒｔｅａｇａ  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ８４：  １４１８−１４２３，  １９８９）。同様に、マウスモノクローナル抗体１Ｈ７由来のｓｃＦｖ−Ｆｃ断片は、乳房の腫瘍（ＭＣＦ−７）に対してほんのわずかな活性のみがあり、前立腺のアンドロゲン依存性の腫瘍に対しては完全に不活性である（Ｌｉ  Ｓ．  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，  ４９：  ２４３−２５２，  ２０００）。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
驚くべきことに、本発明者は、ＩＧＦ−ＩＲを認識し、上述した基準の全て、すなわちインスリンに対する受容体に認識されないこと、誘導されたＩＧＦ１性及び特にＩＧＦ２性の増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏで遮断すること、しかしまた、骨肉腫及び前立腺腫瘍を含む、ＩＧＦ−ＩＲを発現する様々な腫瘍の成長をｉｎ  ｖｉｖｏで阻害することに対応する、Ｉ−３４６６と記されるマウスモノクローナル抗体を生成した。さらに、これらの抗体が、ＭＣＦ−７細胞及びＨＴ２９細胞の両方において、ＩＧＦ−ＩＲのβ鎖のチロシンのＩＧＦ１及び／又はＩＧＦ２誘導性のリン酸化を阻害することが示されている。さらに、同様に、これらの抗体が、細胞表面上での受容体の迅速な再利用が可能である天然リガンドで通常観察されるものとは異なり、前記受容体の内在化及びその分解を引き起こすことを実証している。これらの抗体を、これらのペプチド配列及び核酸配列、特にＩＧＦ−ＩＲに対するこれらの相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列により特徴付けることが可能である。
【００１４】
このように、第一の実施の形態によれば、本発明の対象は、ヒトのインスリン様成長因子Ｉ受容体に特異的に結合すること、及び／又は当該ＩＧＦ−ＩＲ受容体のチロシンキナーゼ活性を特異的に阻害することができる、単離された抗体又はその機能的な断片の一つであり、０．３ｎＭ未満、好ましくは０．０３ｎＭ未満のＩＣ５０で、その第一のリガンドであるＩＧＦ１の天然の付着を阻害することができ、０．３ｎＭ未満、好ましくは０．１ｎＭ未満のＩＣ５０で、その第二のリガンドであるＩＧＦ２の天然の付着も阻害できることを特徴とする。
【００１５】
より詳細には、本発明は、ヒトのインスリン様成長因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）に対する結合親和性を有する、単離された抗体又はその機能的な免疫原性断片であって、前記ＩＧＦ−ＩＲへの結合の際、０．３ｎＭ未満、好ましくは０．０３ｎＭ未満のＩＣ５０で天然の結合相手であるＩＧＦ１の前記ＩＧＦ−ＩＲへの結合を阻害し、また０．３ｎＭ未満、好ましくは０．１ｎＭ未満のＩＣ５０で天然の結合相手であるＩＧＦ２の前記ＩＧＦ−ＩＲへの結合を阻害することを特徴とする、単離された抗体又はその機能的な免疫原性断片に関する。
【００１６】
さらに、本発明は、ヒトのインスリン様成長因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）のチロシンキナーゼ活性を阻害する活性を有する、単離された抗体又はその機能的な免疫原性断片であって、前記ＩＧＦ−ＩＲへの結合の際、０．３ｎＭ未満、好ましくは０．０３ｎＭ未満のＩＣ５０で天然の結合相手であるＩＧＦ１の前記ＩＧＦ−ＩＲへの結合を阻害し、また０．３ｎＭ未満、好ましくは０．１ｎＭ未満のＩＣ５０で天然の結合相手であるＩＧＦ２の前記ＩＧＦ−ＩＲへの結合を阻害することを特徴とする、単離された抗体又はその機能的な免疫原性断片に関する。
【００１７】
本出願において、ＩＣ５０は実施例２で説明されているようにグラフを使って求められている。
【００１８】
当該技術の現状では、１８と示されるＲｏｃｈｅの抗体（国際公開第２００４／０８７７５６号パンフレット及び国際公開第２００５／００５６３５号パンフレット）はＩＧＦ１及びＩＧＦ２の両方に対して約０．３ｎＭの平均ＩＣ５０を有しており（国際公開第２００５／００５６３５号パンフレットの実施例６を参照のこと)、これはすなわち、抗体Ｉ−３４６６で得られるＩＣ５０（実施例２を参照のこと）より大きい。
【００１９】
本明細書において、「結合」と「付着」という用語は同様の意味を有し、互いに交換可能である。
【００２０】
本発明の別の実施の形態によれば、抗体はＩＧＦ−Ｉ／インスリンハイブリッド受容体と結合することもできる。
【００２１】
実際、ＩＧＦ−ＩＲは、二つのアイソフォームＡ及びＢで存在するインスリン受容体（ＩＲ）と高い相同性を示す。
【００２２】
アイソフォームＡ及びＢのＩＲの配列は、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋにおいてそれぞれアクセッション番号Ｘ０２１６０及びＭ１００５１で登録されている。ＩＲに関する他のデータが、これに限定されるものではないが、参照により本明細書に援用される（Ｖｉｎｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８８：  ２４９−２５２、  Ｂｅｌｆｉｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２７７：  ３９６８４−３９６９５、  Ｄｕｍｅｓｉｃ  ｅｔ  al．，  ２００４，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，  ８９（７）：  ３５６１−３５６６）。
【００２３】
ＩＧＦ−ＩＲ及びＩＲは、ジスルフィド結合で連結された二つの細胞外α−サブユニットと二つの膜貫通型β−サブユニットから構成される四量体の糖タンパク質である。リガンド結合部位を含む各α−サブユニットは約１３０ｋＤａ〜１３５ｋＤａである一方で、チロシンキナーゼドメインを含む各β−サブユニットは約９０ｋＤａ〜９５ｋＤａである。これらの受容体は５０％を超える全アミノ酸の配列相同性を有し、チロシンキナーゼドメインにおいては８４％の相同性を有する。リガンドの結合後、リン酸化した受容体は、インスリン受容体基質−１タンパク質ファミリー（ＩＲＳ１）、Ｇａｂ１及びＳｈｃを含むドッキングタンパク質を動員し、それをリン酸化し（Ａｖｒｕｃｈ，  １９９８，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １８２，  ３１−４８、  Ｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．  Ｑｕａｎｔ．  Ｂｉｏｌ．，  ５３，  ５３７−５４３、  Ｗｈｉｔｅ，  １９９８，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １８２，  ３−１１、  Ｌａｖｉｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，  ９９，  ８３０−８３７、  Ｃｈｅａｔｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｅｎｄｏｃｒ．  Ｒｅｖ．，  １６，  １１７−１４２）、これにより様々な細胞内メディエーターを活性化させる。ＩＲ及びＩＧＦ−ＩＲは共に、主なシグナル伝達経路を同様に活性化するが、或る特定のドッキングタンパク質の動員及び細胞内メディエーターにおいて両受容体間に違いがある（Ｓａｓａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３７，  ４４２７−４４３４、  Ｎａｋａｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｅｎｄｏｃｒ．  Ｒｅｖ．，  ２２，  ８１８−８３５、  Ｄｕｐｏｎｔ  ａｎｄ  Ｌｅ  Ｒｏｉｔｈ，  ２００１，  Ｈｏｒｍ．  Ｒｅｓ．  ５５，  Ｓｕｐｐｌ．  ２，  ２２−２６、  Ｋｏｖａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．，  ３３０，  ９２３−９３２）。これらの違いは、ＩＲ活性化によって代謝作用が優位に誘発されること、並びにＩＧＦ−ＩＲ活性化によって細胞分裂促進作用、形質転換作用及び抗アポトーシス作用が優位に誘発されることの根拠である（Ｄｅ  Ｍｅｙｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ７６６，  ３８８−４０１、  Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００、  Ｐｒｉｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｈｏｒｍ．  Ｍｅｔａｂ．  Ｒｅｓ．，  ３１，  ８０−８９、  Ｋｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．，  ８６，  ９７２−９７９）。インスリンがＩＲと高い親和性で結合する一方で（ＩＧＦ−ＩＲよりも１００倍高い）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ１及びＩＧＦ２）はＩＲよりも１００倍高い親和性でＩＧＦ−ＩＲと結合する。
【００２４】
ヒトのＩＲは、ＩＲのα−サブユニットのカルボキシ末端にある小さいエクソン（エクソン１１）にコードされる１２個のアミノ酸残基を除くか又は含ませるＩＲ遺伝子の選択的スプライシングによって生じる二つのアイソフォーム、ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂで存在する。ＩＲのアイソフォームの相対存在量は、組織特異的な未知の因子によって調節される（Ｍｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｍｏｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，  ３，  １２６３−１２６９、  Ｍｏｓｔｈａｆ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ９，  ２４０９−２４１３）。ＩＲ−Ｂは、インスリンの代謝作用の主な標的組織である正常な成体組織（脂肪組織、肝臓及び筋肉)における主なＩＲアイソフォームである（Ｍｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９、  Ｍｏｓｔｈａｆ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０）。ＩＲ−Ａは、胎児の組織における主なアイソフォームであり、ＩＧＦ２に応じて胎児の成長に介在し（Ｆｒａｓｃａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９，  ３２７８−３２８８）、このことは、トランスジェニックマウスで行われた遺伝学的研究によっても示唆されている（ＤｅＣｈｉａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４５，  ７８−８０、  Ｌｏｕｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  １８９，  ３３−４８）。さらに、細胞が形質転換され悪性になる場合、脱分化がＩＲ−Ａの相対存在量の増大と関係することが多い（Ｐａｎｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｖｏｌ．  ２７７，  Ｎｏ．４２，  ｐｐ３９６８４−３９６９５）。
【００２５】
相同性が高いことから、インスリン及びＩＧＦ−Ｉの半受容体（一つのα−サブユニットと一つのβ−サブユニットから構成される）はヘテロ二量体化することができ、これによりインスリン／ＩＧＦ−Ｉハイブリッド受容体（ハイブリッド−Ｒ）が形成される（Ｓｏｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，  ２７０，  ３８３−３９０、  Ｋａｓｕｙａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２，  １３５３１−１３５３６、  Ｓｅｅｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３６，  １６３５−１６４１、  Ｂａｉｌｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，  ３２７，  ２０９−２１５）。
【００２６】
両ＩＲアイソフォームは同程度にＩＧＦ−ＩＲとハイブリッドを形成することができる。しかし、ハイブリッド−Ｒは様々な機能的特徴を有している。ハイブリッド−ＲＢはＩＧＦ１及び特にＩＧＦ２に対する親和性が低減されている。これに対して、ハイブリッド−ＲＡはＩＧＦ１に対する親和性が高く、生理学的濃度範囲でＩＧＦ２及びインスリンとも結合する。ハイブリッド−ＲＡの発現は、二つの異なる機構、ｉ）ＩＧＦ１及びＩＧＦ２の両方による結合（高い親和性で）及び活性化（ハイブリッド−ＲＢでは起こらない）、ｉｉ）インスリンの結合によるＩＧＦ−ＩＲ経路の活性化、によりＩＧＦ系を上方調節する。インスリンのハイブリッド−ＲＡへの結合がＩＧＦ−ＩＲのβ−サブユニットをリン酸化しＩＧＦ−ＩＲの特異的基質（ＣｒｋＩＩ）を活性化することで、ハイブリッド−ＲＡがインスリンをＩＧＦ−ＩＲのシグナル伝達に移行させる（Ｐａｎｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）。
【００２７】
肝臓、脾臓、又は胎盤等の幾つかの組織において、ハイブリッド−ＲはＩＧＦ−ＩＲよりも多く存在する（Ｂａｉｌｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）。腫瘍組織がＩＧＦ−ＩＲ及びＩＲ−Ａの両方を過剰発現するか、又はそれらの異常な活性化を示すので（Ｆｒａｓｃａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９、  Ｓｃｉａｃｃａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８，  ２４７１−２４７９、  Ｖｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｍｏｌ．  Ｐａｔｈｏｌ．，  ５４，  １２１−１２４）、ハイブリッド−ＲＡも甲状腺癌及び乳癌を含む多様なヒトの悪性腫瘍で過剰発現される可能性があり、これにより、ＩＧＦ１及び／又はＩＧＦ２だけでなく生理学的濃度のインスリンによる刺激にも従うＩＧＦ−ＩＲ型のシグナル伝達によって応答することができる悪性細胞に選択的成長の利点が与えられる（Ｂａｉｌｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７、  Ｐａｎｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５，  １９３５−１９４４、  Ｂｅｌｆｉｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  （Ｐａｒｉｓ）  ８１，  ４０３−４０７、  Ｆｒａｓｃａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９、  Ｓｃｉａｃｃａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９、  Ｖｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）。
【００２８】
本発明によれば、抗体は、ハイブリッド−Ｒと結合することができること、必要ならば、好ましくはさらにハイブリッド−Ｒのリガンドであるインスリン、ＩＧＦ１及び／もしくはＩＧＦ２の天然の付着を阻害することができること、並びに／又は当該ハイブリッド−Ｒのチロシンキナーゼ活性を特異的に阻害することができることも特徴とする。
【００２９】
本発明の目的は、ＩＧＦ−ＩＲのβ鎖（好ましくはＨＴ２９細胞における）のＩＧＦ１及び／又はＩＧＦ２誘導性のリン酸化を１００％阻害することもできることを特徴とする抗体又はその機能的な断片の一つである。
【００３０】
別の態様において、本発明による抗体又はその機能的な断片の一つは、固有のアゴニスト活性を全く示さないことを特徴とする。
【００３１】
本発明による抗体又はその機能的な断片の一つはさらに、同じＦＡＣＳ分析方法を使用して、
ｉ）ＨＴ２９細胞におけるＩＧＦ−ＩＲの内在化の少なくとも３０％、及び／又は
ｉｉ）ＭＣＦ−７細胞におけるＩＧＦ−ＩＲの内在化の少なくとも８５％
を誘導することができることを特徴とする。
【００３２】
本発明による抗体又はその機能的な断片の一つの特徴は、同じＦＡＣＳ分析方法を使用して、
ｉ）ＨＴ２９細胞におけるＩＧＦ−ＩＲの分解の少なくとも５０％、及び／又は
ｉｉ）ＭＣＦ−７細胞におけるＩＧＦ−ＩＲの分解の少なくとも６５％
を誘導する能力である。
【００３３】
別の実施の形態において、本発明による抗体又はその機能的な断片の一つは、ＩＧＦ１及びＩＧＦ２誘導性のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＭＣＦ−７細胞の増殖の両方を、少なくとも１ｎＭの、好ましくはＩＧＦ１及びＩＧＦ２の実験に対してそれぞれ少なくとも０．７ｎＭ及び０．５ｎＭのＩＣ５０で阻害することができることを特徴とする。
【００３４】
本発明による抗体又はその機能的な断片の一つは、腫瘍細胞株のｉｎ  ｖｉｖｏでの成長を阻害することができることも特徴とする。
【００３５】
本発明による抗体は、特異的なモノクローナル抗体、特にマウスモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、又はヒト化モノクローナル抗体であることが好ましく、これらは当業者に既知の標準的な方法によって得ることができる。
【００３６】
通常、特にマウス由来のモノクローナル抗体又はその機能的な断片の調製については、特にマニュアル「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＮＹ，  ｐｐ．  ７２６，  １９８８）に記載の技術、又はＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６：  ４９５−４９７，  １９７５）によって記載されたハイブリドーマからの調製技術を参照することができる。
【００３７】
本発明によるモノクローナル抗体は、例えば、本発明による前記モノクローナル抗体によって特異的に認識されるエピトープを含むＩＧＦ−ＩＲ又はその断片の一つに対して免疫付与された動物細胞から得ることができる。当該ＩＧＦ−ＩＲ又はその断片の一つは、特に、ＩＧＦ−ＩＲをコードするｃＤＮＡ配列に含まれる核酸配列から開始される遺伝子組換えによる、又はＩＧＦ−ＩＲのペプチド配列に含まれるアミノ酸配列から開始されるペプチド合成による、通常の作業方法に従って作成することができる。
【００３８】
本発明によるモノクローナル抗体は、例えば、本発明による前記モノクローナル抗体によって特異的に認識されるエピトープを含むＩＧＦ−ＩＲ又はその断片の一つが予め固定されているアフィニティーカラムで精製することができる。より詳細には、当該モノクローナル抗体は、プロテインＡ及び／又はプロテインＧ上でのクロマトグラフィーで精製することができ、当該クロマトグラフィーの後に、残留タンパク質混入物並びにＤＮＡ及びＬＰＳを排除することを目的としたイオン交換クロマトグラフィーを行っても行わなくてもよく、当該イオン交換クロマトグラフィーの後に、二量体又は他の多量体の存在に起因する潜在的な会合体を排除するためのセファロースゲルでの排除クロマトグラフィーを行っても行わなくてもよい。さらにより好ましい方法では、これらの技術全てを同時に又は連続的に用いることができる。
【００３９】
キメラ抗体又はヒト化抗体も同様に、本発明による抗体に含まれる。
【００４０】
キメラ抗体とは、所定の種の抗体に由来する天然の可変（軽鎖及び重鎖）領域を、当該所定の種とは異なる種の抗体の軽鎖及び重鎖の定常領域と組み合わせて含む抗体を示すものである。
【００４１】
本発明によるキメラ型の抗体又はその断片は遺伝子組換え技術を用いて調製することができる。例えば、キメラ抗体は、プロモーターと、本発明によるヒト以外の、特にマウスのモノクローナル抗体の可変領域をコードする配列と、ヒト抗体の定常領域をコードする配列とを含む組換えＤＮＡをクローニングすることによって作成することができる。このような組換え遺伝子によってコードされる本発明のキメラ抗体は、例えば、マウス−ヒトキメラであり、この抗体の特異性はマウスＤＮＡ由来の可変領域によって決定され、そのアイソタイプはヒトＤＮＡ由来の定常領域によって決定される。キメラ抗体の調製方法については、例えばＶｅｒｈｏｅｙｎらの文献（ＢｉｏＥｓｓａｙｓ，  ８：  ７４，  １９８８）を参照することができる。
【００４２】
ヒト化抗体とは、ヒト以外から得た抗体に由来するＣＤＲ領域を含む抗体を示すものであり、抗体分子の他の部分は一つの（又は幾つかの）ヒト抗体に由来する。さらに、骨格セグメント（ＦＲと呼ばれる）の残基の幾つかは、結合親和性を維持するために変更されていてもよい（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３２１：  ５２２−５２５，  １９８６、  Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３９：  １５３４−１５３６，  １９８８、  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３２：  ３２３−３２７，  １９８８）。
【００４３】
本発明によるヒト化抗体又はその断片は、当業者に既知の技術（例えば、文献、Ｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎ．  １５０：  ２８４４−２８５７，  １９９２、  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｅｎｇ．  Ｒｅｖ．，  １０：  １−１４２，  １９９２、又は、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １０：  １６９−１７５，  １９９２に記載されている技術等）によって調製することができる。本発明によるこのようなヒト化抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの診断方法又はｉｎ  ｖｉｖｏでの予防的処置及び／もしくは治療的処置での使用に好適である。他のヒト化方法は、例えば、欧州特許出願公開第０４５１２６１号明細書、欧州特許出願公開第０６８２０４０号明細書、欧州特許出願公開第０９１２７号明細書、欧州特許出願公開第０５６６６４７号明細書又は米国特許出願公開第５５３０１０１号明細書、米国特許出願公開第６１８０３７０号明細書、米国特許出願公開第５５８５０８９号明細書及び米国特許出願公開第５６９３７６１号明細書においてＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂ（ＰＤＬ）によって記載された「ＣＤＲグラフティング」法として当業者に知られている。米国特許出願公開第５６３９６４１号明細書、米国特許出願公開第６０５４２９７号明細書、米国特許出願公開第５８８６１５２号明細書及び米国特許出願公開第５８７７２９３号明細書も挙げることができる。本発明による抗体の機能的な断片とは、特に、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（ｓｃは単鎖を指す）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ−Ｆｃ断片又はダイアボディ等の抗体断片、あるいはポリ（アルキレン）グリコール、例えばポリ（エチレン）グリコールの付加（「ペグ化」）（Ｆｖ−ＰＥＧ、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ、Ｆａｂ−ＰＥＧ、Ｆ（ａｂ’）２−ＰＥＧ又はＦａｂ’−ＰＥＧと呼ばれるペグ化断片）（「ＰＥＧ」はポリ（エチレン）グリコールを指す）等の化学修飾によって、又はリポソームへの組み込みによって半減期が延長した任意の断片を示すものであり、当該断片は、本発明による配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号６の配列の特徴的なＣＤＲの少なくとも一つを有し、特に、それが由来する抗体の部分的活性、例えば、特に、ＩＧＦ−ＩＲを認識し結合し、必要であればＩＧＦ−ＩＲの活性を阻害するという能力でさえも、通常の様式で発揮することができる。
【００４４】
好ましくは、前記機能的な断片は、それらが由来する抗体の重鎖又は軽鎖の可変領域の部分配列から構成されるか、又はそれを含んでおり、当該部分配列は、それが由来する抗体と同様の結合特異性、及び十分な親和性、好ましくは、ＩＧＦ−ＩＲに対して、それが由来する抗体の親和性の少なくとも１／１００、より好ましくは少なくとも１／１０を保持するのに十分なものである。
【００４５】
このような機能的な断片は、それが由来する抗体の配列の最低でも５個のアミノ酸、好ましくは、１０個、１５個、２５個、５０個及び１００個の連続したアミノ酸を含む。
【００４６】
好ましくは、これらの機能的な断片は、それらが由来する抗体と同様の結合特異性を通常有する、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）、ｓｃＦｖ−Ｆｃ型の断片又はダイアボディである。本発明によれば、本発明の抗体断片は、上記のような抗体から、ペプシンもしくはパパイン等の酵素による消化等の方法によって、及び／又は化学的還元によるジスルフィド結合の切断によって得ることができる。別の方法では、本発明に包含される抗体断片を、当業者に同様に既知の遺伝子組換え技術によって、又は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社等から提供されるもののような自動ペプチド合成装置を用いたペプチド合成によって得ることができる。
【００４７】
より好ましい態様において、本発明は、遺伝子組換え又は化学合成によって得られる本発明による抗体又はその機能的な断片、特にキメラ抗体又はヒト化抗体を含む。
【００４８】
より詳細には、本発明の好ましい実施の形態によれば、抗体は、配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５の配列の相補性決定領域（ＣＤＲ）から選択される少なくとも一つのＣＤＲ、又は、最適なアラインメントの後に配列が配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも一つのＣＤＲを含む軽鎖を含むこと、あるいは、配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６の配列のＣＤＲから選択される少なくとも一つのＣＤＲ、又は、最適なアラインメントの後に配列が配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも一つのＣＤＲを含む重鎖を含むことを特徴とする。
【００４９】
本明細書において、抗体化合物又はこれらの配列に付着する、ポリペプチド、ポリペプチド配列、ペプチド、及びタンパク質という用語は、相互に交換可能である。
【００５０】
ここで、本発明は天然形態の抗体には関連していないこと、すなわち、抗体はそれらの天然の環境にはないが、天然源からの精製により単離又は取得されること、あるいは遺伝子組換え又は化学合成により取得されること、そして、従って抗体は以下に記載されるような非天然アミノ酸を含むことができるということを理解されたい。
【００５１】
ＣＤＲ領域又はＣＤＲとは、Ｋａｂａｔら（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ＮＩＨ，  １９９１、及び後版）によって定義された、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の超可変領域を示す。３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲが存在する。ＣＤＲという用語は、場合によって、抗体が認識する抗原又はエピトープに対する、抗体の親和性による結合を担うアミノ酸残基の大部分を含む、これらの領域の一つ、又は幾つか、又は全てをも示すために本明細書中で使用される。
【００５２】
本発明の意味において、二つの核酸配列間又はアミノ酸配列間の「同一率」とは、最良のアラインメント（最適なアラインメント）の後に得られる、比較される二つの配列間のヌクレオチド又は同一アミノ酸残基の割合を示すものであり、この割合は単に統計的なものであり、二つの配列間の違いはランダムに、その全長にわたって分布している。二つの核酸配列又はアミノ酸配列の間の配列比較は、最適にこれらの配列をアラインした後にそれらを比較することにより従来実施され、当該比較は、セグメント又は「比較ウインドウ」ごとに行うことができる。比較のための配列の最適なアラインメントは、手動のものに加えて、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）［Ａｄ．  Ａｐｐ．  Ｍａｔｈ．  ２：４８２］の局所的相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（１９７０）［Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：  ４４３］ の局所的相同性アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ（１９８８）［Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：  ２４４４］の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムを使用するコンピューターソフトウェア（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ、あるいはＢＬＡＳＴ  ＮもしくはＢＬＡＳＴ  Ｐ比較ソフトウェア）によって行うことができる。
【００５３】
二つの核酸配列又はアミノ酸配列の間の同一率は、最適にアラインしたこれらの二つの配列を比較することによって求められ、比較される核酸又はアミノ酸の配列は、これらの二つの配列間の最適なアラインメントのための参照配列に対して付加又は欠失を含み得る。ヌクレオチド残基又はアミノ酸残基が二つの配列間で同一である同一位置の数を求め、この同一位置の数を比較ウインドウにおける全位置数で割り、得られた結果に１００を掛けてこれらの二つの配列間の同一率を得ることで、同一率が算出される。
【００５４】
例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｂｌ２．ｈｔｍｌのサイトで利用可能なＢＬＡＳＴプログラム「ＢＬＡＳＴ  ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」（Ｔａｔｕｓｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｂｌａｓｔ  ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  −  ａ  ｎｅｗ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”，  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．  １７４：  ２４７−２５０）を使用することが可能であり、使用されるパラメータは、デフォルトで与えられており（特に、「開始ギャップペナルティ」：５、及び「ギャップ伸長ペナルティ」：２のパラメータに関して、選択されるマトリクスは、例えばこのプログラムで与えられるマトリクス「ＢＬＯＳＵＭ  ６２」である）、比較される二つの配列間の同一率はプログラムにより直接算出される。
【００５５】
参照アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％及び９８％の同一性を有するアミノ酸配列としては、参照配列に対して、特定の変更、特に少なくとも一つのアミノ酸の欠失、付加もしくは置換、切断又は伸長を有するものが好ましい。一つ又は複数の連続する又は連続しないアミノ酸の置換の場合、置換されるアミノ酸が「同等の」アミノ酸に置き換わる置換が好ましい。「同等のアミノ酸」という表現は、本明細書中では、対応する抗体の生物学的活性を本質的に変えることなく基本構造のアミノ酸の一つで置換されることができる、後に特に実施例で定義されるような任意のアミノ酸を示す。
【００５６】
本発明の別の実施の形態は、それに包含される他のアミノ酸配列の変更を有する抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体を提供する。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体のアミノ酸配列変異体が、適切なヌクレオチドの変化を抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体の核酸に導入することによって、又はペプチド合成によって調製される。このような変更としては、例えば、抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失及び／又はこの残基への挿入及び／又はこの残基の置換が挙げられる。最終構築物が所望の特徴を有するという条件で、最終構築物を得るために欠失、挿入及び置換が任意に組み合わせられる。アミノ酸の変化は、グリコシル化部位の数又は位置を変える等、抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体の翻訳後プロセスも改変することができる。
【００５７】
突然変異誘発に好ましい位置である抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体の特定の残基又は領域を同定するために有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４４：  １０８１−１０８５（１９８９））により記載されているように「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここでは、一つの残基または標的残基のグループを同定し（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕ等の荷電残基）、中性の又は陰性に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）で置換し、これらアミノ酸のＩＧＦ−ＩＲ抗原との相互作用に影響を与える。次に、置換部位でさらなる変異を導入すること又は置換部位に他の変異を導入することによって、置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置が絞り込まれる。それゆえ、アミノ酸配列の変異を導入する部位は予め決定されているが、変異の性質自体は予め決定しておく必要はない。例えば、所定の部位での突然変異の作用を分析するために、ａｌａスキャニング又はランダムな突然変異誘発を標的のコドン又は領域で行い、発現した抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体の変異体を所望の活性についてスクリーニングする。
【００５８】
アミノ酸配列の挿入としては、１残基から、１００残基以上を含むポリペプチドまでの範囲の長さの、アミノ末端及び／又はカルボキシル末端の融合、並びに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。末端挿入の例としては、Ｎ末端のメチオニン残基を有する抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体、又は細胞傷害性ポリペプチドに融合された抗体が挙げられる。抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体分子の他の挿入変異体は、抗体の血清半減期を延長させる酵素（例えばＡＤＥＰＴのための）又はポリペプチドの、抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体のＮ末端又はＣ末端への融合を含む。
【００５９】
別のタイプの変異体は、アミノ酸置換の変異体である。これらの変異体は、異なる残基で置き換えられた、抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体分子における少なくとも一つのアミノ酸残基を有している。置換による突然変異誘発が最も考えられる部位には超可変領域が含まれるが、ＦＲの改変も考えられる。保存的置換が「好ましい置換」という見出しで表１に示されている。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表１に「典型的な置換」で示されているか、又はアミノ酸クラスに関して以下にさらに記載されているような、より大きな変化が導入されている可能性があり、産物がスクリーニングされる。
【００６０】
【表１】
2009502129.tif 000002
【００６１】
抗体の生物学的特性における大きな変更が、（ａ）置換区域における、例えばシート構造又はらせん構造といったポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の荷電又は疎水性、あるいは（ｃ）側鎖のバルク、の維持に対する影響が有意に異なる置換を選択することによって達成され得る。天然に生じる残基は、共通の側鎖特性に基づき次の各群に分類される。
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ、
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ、
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ、
（５）鎖配向に影響を与える残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ、及び
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【００６２】
非保存的置換は、これらのクラスの一つのメンバーの別のクラスへの交換を引き起こす。
【００６３】
抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体の適切な立体構造の維持に関与しない全てのシステイン残基もまた、通常はセリンによって置換されてもよく、これにより分子の酸化安定性を向上させ、異常な架橋を防ぐことができる。これに対して、システイン結合を抗体に加えて、その安定性を向上させることができる（特に、抗体がＦｖ断片等の抗体断片である場合）。
【００６４】
特に好ましいタイプの置換変異体は、元の抗体（例えばヒト化抗体又はヒト抗体）の一つ又は複数の超可変領域残基を置換することを伴う。通常、さらなる開発のために選択された得られた変異体は、それらが生じた元の抗体に比べて生物学的特性が改善されている。このような置換変異体を生じさせるために便利な方法は、ファージディスプレイを使用した親和性成熟を伴うものである。要するに、超可変領域の幾つかの部位（例えば６〜７個の部位）を突然変異させ、それぞれの部位で全ての可能なアミノ置換を生じさせる。このように生じた抗体の変異体が、繊維状ファージ粒子から一価の形態で、各粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合体として提示される。次に、ファージに提示された変異体は、本明細書で開示されるように、これらの生物学的活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングされる。変更の候補となる超可変領域の部位を同定するためにアラニンスキャニング突然変異誘発を行い、抗原結合に大きく関与している超可変領域の残基を同定することができる。代わりに、又は加えて、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析し、抗体とヒトＩＧＦ−ＩＲとの間の接触点を同定することが有益であり得る。このような接触残基及び隣接する残基は、本明細書に詳述される技術による置換の候補である。このような変異体が生じたら、変異体パネルを本明細書に記載のようなスクリーニングに付し、一つ又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を有する抗体がさらなる開発のために選択され得る。
【００６５】
抗体における別のタイプのアミノ酸変異体は、抗体の当初のグリコシル化パターンを改変する。改変するとは、抗体で見られる一つもしくは複数の炭水化物部分が欠失すること、及び／又は抗体に存在しない一つもしくは複数のグリコシル化部位を付加することを意味する。
【００６６】
抗体のグリコシル化は、通常、Ｎ連結型又はＯ連結型である。Ｎ連結型とは、炭水化物部分のアスパラギン残基の側鎖への付着を表す。トリペプチド配列である、Ｘがプロリンを除く任意のアミノ酸であるアスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−スレオニンが、炭水化物部分のアスパラギンの側鎖への酵素的付着のための認識配列である。このように、ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在により、潜在的なグリコシル化部位が作られる。Ｏ連結型のグリコシル化は、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの糖の一つの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンへの付着を表すが、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリジンも用いられ得る。
【００６７】
抗体へのグリコシル化部位の付加は、一つ又は複数の上記のトリペプチド配列を含むようにアミノ酸配列を改変することによって従来は達成されている（Ｎ連結型のグリコシル化部位に関して）。改変はまた、元の抗体の配列に一つ又は複数のセリン残基又はスレオニン残基を付加すること、あるいはこれらによって置換することによってなされ得る（Ｏ連結型のグリコシル化部位に関して）。
【００６８】
対象となる抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当該技術分野で既知の様々な方法で調製される。これらの方法としては、天然源からの単離（天然に生じたアミノ酸配列変異体の場合）、又は抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体の事前に調製した変異体型もしくは非変異体型の、オリゴヌクレオチド介在性（又は部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発による調製が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
時として、例えば抗体の抗原依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を高めるように、エフェクター機能に関して本発明の抗体を変更することが望ましい場合があり得る。これは、一つ又は複数のアミノ酸置換を抗体のＦｃ領域に導入することにより達成され得る。代わりに、又は加えて、システイン残基をＦｃ領域に導入することができ、これによりこの領域における鎖間のジスルフィド結合の形成が可能になる。このようにして生じたホモ二量体抗体は、内在性が向上しており、さらに／又は補体介在性の細胞破壊及び抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）が増大している（Ｃａｒｏｎ  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．，  １７６：  １１９１−１１９５  （１９９２）及びＳｈｏｐｅｓ  Ｂ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４８：  ２９１８−２９２２  （１９９２）を参照のこと）。抗腫瘍活性が増大したホモ二量体抗体は、Ｗｏｌｆｆら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ５３：  ２５６０−２５６５ （１９９３））に記載のようなヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製することもできる。あるいは、二重のＦｃ領域を有する抗体を設計して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣの能力を高めることができる（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ｅｔ．  ａｌ．，  Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３：  ２１９−２３０  （１９８９）を参照のこと）。
【００７０】
同様に、抗体の血清半減期を延長するために、例えば米国特許第５７３９２７７号明細書に記載のように、サルベージ受容体結合エピトープを抗体（特に抗体断片）に組み込んでもよい。本明細書で使用される場合、「サルベージ受容体結合エピトープ」という用語は、ＩｇＧ分子のｉｎ  ｖｉｖｏでの血清半減期の延長に関与するＩｇＧ分子（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを表す。
【００７１】
さらに好ましくは、本発明は、本発明による抗体又はその機能的な断片の一つであって、配列番号２、配列番号４、及び配列番号６の配列の三つのＣＤＲのうちの少なくとも二つのＣＤＲもしくは三つのＣＤＲ、又は最適なアラインメントの後に配列番号２、配列番号４、及び配列番号６の配列と少なくとも８０％の同一性をそれぞれ有する配列の三つのＣＤＲのうちの少なくとも二つのＣＤＲもしくは三つのＣＤＲを含む重鎖を含むことを特徴とするものに関する。
【００７２】
さらに好ましくは、本発明の対象は、本発明による抗体又はその機能的な断片の一つであって、配列番号１、配列番号３、及び配列番号５の配列の三つのＣＤＲのうちの少なくとも二つのＣＤＲもしくは三つのＣＤＲ、又は最適なアラインメントの後に配列番号１、配列番号３、及び配列番号５の配列と少なくとも８０％の同一性をそれぞれ有する配列の三つのＣＤＲのうちの少なくとも二つのＣＤＲもしくは三つのＣＤＲを含む軽鎖を含むことを特徴とするものである。
【００７３】
より好ましくは、本発明による抗体又はその機能的な断片の一つは、配列番号２、配列番号４、及び配列番号６の配列の三つのＣＤＲ、又は最適なアラインメントの後に配列番号２、配列番号４、及び配列番号６の配列と少なくとも８０％の同一性をそれぞれ有する配列の三つのＣＤＲを含む重鎖を含むこと、そしてさらに、配列番号１、配列番号３、及び配列番号５の配列の三つのＣＤＲ、又は最適なアラインメントの後に配列番号１、配列番号３、及び配列番号５の配列と少なくとも８０％の同一性をそれぞれ有する配列の三つのＣＤＲを含む軽鎖を含むことを特徴とする。
【００７４】
当該技術分野の現状では、６個のＣＤＲ間で最大の変異性（長さ及び組成）が、重鎖の三つのＣＤＲ、より詳細にはＣＤＲ−Ｈ３で見られることが知られている。従って、本発明の抗体の好ましい特徴的なＣＤＲは、重鎖の三つのＣＤＲ、つまり配列番号２、配列番号４及び配列番号６の配列でコードされるＣＤＲであり、より好ましくは配列番号６でコードされるＣＤＲ−Ｈ３に対応するＣＤＲであることを理解されたい。
【００７５】
別の態様によれば、本発明の対象は、本発明による抗体又はその機能的な断片の一つであって、ヒトのインスリン受容体（ＩＲ）に付着しないか、又は有意な付着をしないことを特徴とするものである。
【００７６】
好ましい様式においては、本発明による上記の機能的な断片は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ−Ｆｃ断片もしくはダイアボディ、又は、化学修飾、特にペグ化もしくはリポソームへの組み込みによって半減期が延長した任意の機能的な断片から選択される。
【００７７】
別の態様によれば、本発明は、本発明によるモノクローナル抗体を分泌することができるマウスハイブリドーマ、特に、Ｃｅｎｔｒｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅ（ＣＮＣＭ、国立微生物培養センター）（パスツール研究所、パリ、フランス）に２００５年６月２３日に番号Ｉ−３４６６として寄託されたもののような、マウス由来のハイブリドーマに関するものであり、当該ハイブリドーマは、免疫付与されたマウスのＢａｌｂ／ｃ脾細胞とＳｐ２Ｏ  Ａｇ  １４骨髄腫細胞株との融合の結果得られる。
【００７８】
ＣＮＣＭに番号Ｉ−３４６６として２００５年６月２３日に寄託されたハイブリドーマによって分泌されることを特徴とする、本明細書においてＩ−３４６６と呼ばれるモノクローナル抗体又はその機能的な断片の一つは、当然ながら本発明の一部を成す。
【００７９】
特定の実施の形態において、本発明は、本発明によるマウス抗体又はその機能的な断片の一つであって、当該抗体が配列番号７のアミノ酸配列を含む配列、もしくは最適なアラインメントの後に配列番号７の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列の軽鎖を含むこと、又は／及び当該抗体が配列番号８のアミノ酸配列を含む配列、もしくは最適なアラインメントの後に配列番号８の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列の重鎖を含むことを特徴とするものに関する。
【００８０】
同様に特定の態様によれば、本発明は、本発明によるキメラ抗体又はその機能的な断片の一つであって、当該抗体がさらに、マウスとは異なる種、特にヒトの抗体に由来する軽鎖及び重鎖の定常領域を含むこと、そして好ましくは、ヒト抗体由来の軽鎖及び重鎖の定常領域がそれぞれκ領域及びγ−１領域、γ−２領域又はγ−４領域であることを特徴とするものに関する。
【００８１】
アイソタイプＩｇＧ１に対応する特定の実施の形態において、抗体の補足的な特徴は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞性細胞傷害）及び／又はＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）というエフェクター機能を潜在的に示すことである。
【００８２】
同様に特定の態様によれば、本発明は、本発明によるヒト化抗体又はその機能的な断片の一つであって、当該抗体が含む軽鎖及び／又は重鎖の骨格セグメントＦＲ１〜ＦＲ４がそれぞれ、ヒト抗体の軽鎖及び／又は重鎖の骨格セグメントＦＲ１〜ＦＲ４に由来することを特徴とするものに関する。
【００８３】
好ましい実施の形態によれば、本発明によるヒト化抗体又はその機能的な断片の一つは、当該ヒト化抗体が配列番号１７のアミノ酸配列、もしくは最適なアラインメントの後に配列番号１７の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む軽鎖を含むこと、又は／及び当該抗体が配列番号１８のアミノ酸配列、もしくは最適なアラインメントの後に配列番号１８の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む重鎖を含むことを特徴とする。
【００８４】
好ましくは、本発明によるヒト化抗体又はその機能的な断片の一つは、当該ヒト化抗体が配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含むこと、及び当該ヒト化抗体が配列番号１８のアミノ酸配列を含む配列の重鎖を含むことを特徴とする。
【００８５】
新たな態様によれば、本発明は、
ａ）本発明による抗体又はその機能的な断片の一つをコードする核酸、ＤＮＡ又はＲＮＡ、
ｂ）ａ）で定義される核酸に相補的な核酸、
ｃ）配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、もしくは配列番号１４の核酸配列のＣＤＲの少なくとも一つと、又は最適なアラインメントの後に配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、もしくは配列番号１４の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％及び９８％の同一性を有する配列と、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる、少なくとも１８個のヌクレオチドからなる核酸、
ｄ）少なくとも配列番号１５の核酸配列の軽鎖及び／もしくは配列番号１６の核酸配列の重鎖と、又は最適なアラインメントの後に配列番号１５及び／もしくは配列番号１６の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％及び９８％の同一性を有する配列と、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる、少なくとも１８個のヌクレオチドからなる核酸、
ｅ）少なくとも配列番号１９の核酸配列の軽鎖及び／もしくは配列番号２０の核酸配列の重鎖と、又は最適なアラインメントの後に配列番号１９及び／もしくは配列番号２０の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％及び９８％の同一性を有する配列と、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる、少なくとも１８個のヌクレオチドからなる核酸、
から選択されることを特徴とする、単離された核酸に関する。
【００８６】
核酸、核配列又は核酸配列、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド配列、ヌクレオチド配列という用語は、本明細書においては区別せずに使用され、変更された又は変更されていないヌクレオチドの正確な連鎖を示すものであり、核酸の断片又は領域を規定することを可能にし、非天然のヌクレオチドを含んでいても含んでいなくてもよく、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡはもちろんのこと、当該ＤＮＡの転写産物にも対応し得る。
【００８７】
本明細書において、本発明は、自身の天然の染色体環境にある、すなわち天然の状態にあるヌクレオチド配列に関するものではないことも理解されるべきである。本発明は、単離及び／又は精製されている配列に関するものであり、すなわちそれらの配列は直接的又は間接的に、例えばコピーによって選択されたものであり、それらの環境は少なくとも部分的に変更されている。よって、それは同様に、本明細書において、例えば宿主細胞を用いた遺伝子組換えによって得られるか、又は化学合成によって得られる単離された核酸を示すものとする。
【００８８】
最適なアラインメントの後に好ましい配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％及び９８％の同一率を有する核酸配列とは、参照の核配列に対して、特定の変更、例えば特に欠失、切断、伸長、キメラ融合及び／又は置換、特に点置換を有する核酸配列を示す。好ましくは、それは、配列が参照配列と同じアミノ酸配列をコードする配列に関するものであり、これは、遺伝暗号の縮重、又は、好ましくは特に以下で定義されるような高ストリンジェントな条件下で参照配列と特異的にハイブリダイズすることができる相補的配列と関係がある。
【００８９】
高ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、相補的ＤＮＡの二つの断片間でのハイブリダイゼーションの維持を可能にするように温度条件及びイオン強度条件が選択されることを意味する。例として、上記のポリヌクレオチド断片を規定することを目的としたハイブリダイゼーション工程の高ストリンジェントな条件は、有利には以下のものである。
【００９０】
ＤＮＡ−ＤＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡのハイブリダイゼーションは、次の二つの工程で実施される。（１）５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５ＭのＮａＣｌ＋０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム溶液に相当する）、５０％ホルムアミド、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、５％硫酸デキストラン、及び１％サケ精子ＤＮＡを含むリン酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）中、４２℃で３時間のプレハイブリダイゼーション。（２）プローブのサイズに応じた温度（すなわち、プローブサイズが１００ヌクレオチドを超える場合には４２℃）で２０時間の実際のハイブリダイゼーション、その後、２×ＳＳＣ＋２％ＳＤＳにおいて２０℃で２０分の洗浄を２回、０．１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳにおいて２０℃で２０分の洗浄を１回。最後の洗浄は、プローブサイズが１００ヌクレオチドを超える場合、０．１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳにおいて６０℃で３０分実施する。当業者ならば、規定されたサイズのポリヌクレオチドについての上記の高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの教示（１９８９，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．  ２ｎｄ  Ｅｄ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）に従って、より大きなサイズ又はより小さなサイズのオリゴヌクレオチドの場合に適合させることができる。
【００９１】
本発明は同様に、本発明による核酸を含むベクターに関する。
【００９２】
本発明は特に、本発明によるヌクレオチド配列を含むクローニングベクター及び／又は発現ベクターに関する。
【００９３】
本発明によるベクターは、好ましくは、所定の宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現及び／又は分泌を可能にするエレメントを含む。そのため、本発明によるベクターは、プロモーター、翻訳開始シグナル及び翻訳終結シグナル、並びに転写調節の適切な領域を含む必要がある。ベクターは宿主細胞中に安定して維持されることが可能である必要があり、適宜、翻訳されたタンパク質の分泌を指示する特定のシグナルを有することができる。これらの様々なエレメントは、用いる宿主細胞に応じて当業者により選択され、最適化される。このために、本発明によるヌクレオチド配列は、選択された宿主の自己複製ベクターに挿入してもよいし、又は選択された宿主の組み込みベクターとしてもよい。
【００９４】
このようなベクターは当業者によって現在使用されている方法によって調製され、得られたクローンは、リポフェクション、エレクトロポレーション、熱ショック、又は化学的方法等の標準的な方法によって適切な宿主に導入することができる。
【００９５】
本発明によるベクターは、例えば、プラスミド又はウイルスに由来するベクターである。それらは、宿主細胞を形質転換して本発明によるヌクレオチド配列をクローニングするか、又は発現させるために有用である。
【００９６】
本発明は同様に、本発明によるベクターによって形質転換された、又は本発明によるベクターを含む宿主細胞を含む。
【００９７】
宿主細胞は、原核細胞系又は真核細胞系、例えば細菌細胞だけでなく同様に酵母細胞又は動物細胞、特に哺乳類細胞から選択することもできる。同様に、昆虫細胞又は植物細胞を使用することもできる。
【００９８】
本発明は同様に、本発明に従った形質転換された少なくとも一つの細胞を含む、ヒト以外の動物に関する。
【００９９】
別の態様によれば、本発明の対象は、本発明による抗体又はその機能的な断片の一つを産生する方法であり、
ａ）本発明による宿主細胞を培地で適切な培養条件下で培養する段階、
ｂ）このようにして産生した上記抗体又はその機能的な断片の一つを培養培地又は上記培養された細胞から回収する段階、
を含むことを特徴とする。
【０１００】
本発明によって形質転換した細胞は、本発明による組換えポリペプチドを調製する方法で使用することができる。本発明によるベクター及び／又はベクターによって形質転換された細胞を使用することを特徴とする、本発明によるポリペプチドを組換え型で調製する方法は、それ自体が本発明に包含される。好ましくは、本発明によるベクターによって形質転換された細胞を、前記ポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養し、前記組換えペプチドを回収する。
【０１０１】
上述のように、宿主細胞は、原核細胞系又は真核細胞系から選択することができる。特に、このような原核細胞系又は真核細胞系での分泌を促進する本発明によるヌクレオチド配列を同定することができる。このため、このような配列を有する本発明によるベクターを、分泌させようとする組換えタンパク質の産成に有利に用いることができる。実際には、目的のこれらの組換えタンパク質の精製は、それらが宿主細胞の内部よりもむしろ細胞培養物の上清に存在することによって容易になる。
【０１０２】
同様に、化学合成によっても本発明によるポリペプチドを調製することができる。このような調製方法も同様に本発明の対象である。当業者は、化学合成の方法、例えば、断片の縮合又は溶液中での古典的な合成による、固相を使用する技術（特に、Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４，  Ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  １１１，  ２ｎｄ  ｅｄ．  （１９８４）を参照）又は部分的固相を用いる技術を理解している。化学合成によって得られ、対応する非天然のアミノ酸を含み得るポリペプチドもまた、本発明に包含される。
【０１０３】
本発明による方法によって得ることができる抗体又はその機能的な断片の一つも同様に、本発明に包含される。
【０１０４】
第二の実施の形態によれば、本発明は、上述したような本発明による抗体であって、さらに、ヒトのチロシンキナーゼファミリー受容体と特異的に結合することができること、及び／又は該受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害することができることを特徴とする抗体に関する。
【０１０５】
第一の実施の形態において、このような抗体は、ＥＧＦのヒトの上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦＲ）への結合を特異的に阻害すること及び／又は当該ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害することができる第二のモチーフを含む二重特異性抗体である。本発明のより好ましい実施の形態では、前記第二の抗ＥＧＦＲモチーフは、マウスモノクローナル抗体２２５、そのキメラ誘導体Ｃ２２５、又はこの抗体２２５由来の任意のヒト化抗体から得られる。
【０１０６】
第二の実施の形態において、このような抗体は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体によって調節される活性を特異的に阻害すること及び／又は当該ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害することができる第二のモチーフを含む二重特異性抗体である。本発明のより好ましい実施の形態では、前記第二の抗ＨＥＲ２／ｎｅｕモチーフは、マウスモノクローナル抗体４Ｄ５もしくは２Ｃ４、又はヒト化抗体トラスツズマブもしくはペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）に由来する。
【０１０７】
第三の実施の形態において、このような抗体は、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）のｃＭＥＴ受容体上への結合を特異的に阻害すること及び／又は当該ｃＭＥＴ受容体のチロシンキナーゼ活性を特異的に阻害することができる第二のモチーフを含む二重特異性抗体である。
【０１０８】
そして、最後の実施の形態において、このような抗体は、マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）のＲＯＮ受容体上への結合を特異的に阻害すること及び／又は当該ＲＯＮ受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害することができる第二のモチーフを含む二重特異性抗体である。
【０１０９】
本発明の別の実施の形態によれば、本発明による抗体が、例えばＶＥＧＦＲ、ＦＧＦ（線維芽細胞成長因子）、ＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）又はＣＸＣＲ４もしくはＣＸＣＲ２（４型ケモカイン受容体又は２型ケモカイン受容体）等の、しかしこれらに限定されない、腫瘍の進行に関与する任意の種類の受容体と相互作用することができることも考慮される。
【０１１０】
二重特異性抗体又は二官能性抗体は、二つの異なる可変領域が同一の分子内で組み合わされている第二世代のモノクローナル抗体を形成する（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂｏｈｌｅｎ，  １９９９，  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，  ｒｅｖ．  １８：  ４１１−４１９）。これらが、新たなエフェクター機能を生じさせるか、又は腫瘍細胞の表面上の幾つかの分子を標的化する能力を有することから、これらの使用が診断分野及び治療分野の両方で実証されている。これらの抗体は、化学的方法（Ｇｌｅｎｎｉｅ  ＭＪ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３９，  ２３６７−２３７５、  Ｒｅｐｐ  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｊ．  Ｈｅｍａｔ．，  ３７７−３８２）又は体細胞による方法（Ｓｔａｅｒｚ  Ｕ．  Ｄ．  ａｎｄ  Ｂｅｖａｎ  Ｍ．  Ｊ．，  １９８６，  ＰＮＡＳ  ８３，  １４５３−１４５７、  Ｓｕｒｅｓｈ  Ｍ．  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６，  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １２１：  ２１０−２２８）によって、また同様に、そして好ましくは、ヘテロ二量体化を強制的に行うことを可能にし、それにより所望の抗体の精製プロセスを容易にする遺伝子工学技術（Ｍｅｒｃｈａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  １６：  ６７７−６８１）によって得ることができる。
【０１１１】
これらの二重特異性抗体は、ＩｇＧ全体として、二重特異性Ｆａｂ’２として、Ｆａｂ’ＰＥＧとして、又はダイアボディとして、あるいは二重特異性ｓｃＦｖとして、しかし同様に、各標的抗原に対して二つの付着部位が存在している四価二重特異性抗体（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ３７  （１８）：  １１２３−３０）、又は上述したその断片として構築することができる。
【０１１２】
二重特異性抗体の産生及び投与が二つの特異的抗体の産生ほど面倒ではないということによる経済的利点に加えて、このような二重特異性抗体の使用は処置の毒性を低減させる利点を有している。これは、二重特異性抗体の使用により、循環する抗体の総量を低減させ、ひいては毒性の可能性を低減させることができるためである。
【０１１３】
本発明の好ましい実施の形態において、二重特異性抗体は二価抗体又は三価抗体である。
【０１１４】
本発明は同様に、好ましくは賦形剤及び／又は薬学的に許容可能な担体と混合された本発明による抗体又はその機能的な断片の一つから成る化合物を有効成分として含む薬学的組成物に関する。
【０１１５】
さらに別の実施の形態によれば、本発明は同様に、ＩＧＦ−ＩＲ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＶＥＧＦＲ、ｃＭＥＴ及び／又はＲＯＮのチロシンキナーゼ活性を特異的に阻害することができる化合物から選択される少なくとも第二の化合物を含む、上述した薬学的組成物に関する。
【０１１６】
本発明の第二の好ましい態様において、前記第二の化合物は、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ−ＩＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＶＥＧＦＲ、ｃＭＥＴ、及び／又はＲＯＮが介在する、増殖性及び／又は抗アポトーシス性及び／又は血管形成性及び／又は転移性の播種の誘導因子の活性を阻害することができる、単離された抗ＥＧＦＲ、抗ＩＧＦ−ＩＲ、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ、抗ＶＥＧＦＲ、抗ｃＭＥＴ及び／もしくは抗ＲＯＮ抗体、又はそれらの機能的な断片から選択される。
【０１１７】
本発明の別の実施の形態によれば、この組成物は、同時使用、個別使用又は連続使用のための組合せ製品として、少なくとも、ＩＧＦ−ＩＲ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＶＥＧＦＲ、ｃＭＥＴ及び／又はＲＯＮのチロシンキナーゼ活性の阻害剤を含む。
【０１１８】
別の好ましい実施の形態において、受容体のチロシンキナーゼ活性の前記阻害剤は、誘導性天然作用因子、ジアニリノフタルイミド、ピラゾロピリドピリミジンもしくはピロロピリドピリミジン、又は他のキナジリン（ｑｕｉｎａｚｉｌｉｎｅｓ）から成る群から選択される。このような阻害剤は当業者に既知であり、文献に記載されている（Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏ  Ｆ．，  Ｄｒｕｇｓ  ２０００，  Ｓｕｐｐｌ．  １，  ２５−３２）。
【０１１９】
本発明の別の補足的な実施の形態は、同時使用、個別使用又は連続使用のための組合せ製品として細胞傷害性作用因子／細胞増殖抑制剤をさらに含む、上記のような組成物である。
【０１２０】
「同時使用」とは、本発明による組成物の二つの化合物を単一及び同一の薬学的形態で投与することを意味するものである。
【０１２１】
「個別使用」とは、本発明による組成物の二つの化合物を異なる薬学的形態で同時に投与することを意味するものである。
【０１２２】
「連続使用」とは、本発明による組成物の二つの化合物を、各々が異なる薬学的形態で、連続的に投与すること意味するものである。
【０１２３】
通常、本発明による組成物は癌の治療効果をかなり高める。言い換えれば、本発明による抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体の治療効果は、細胞傷害性作用因子の投与によって予想外に増強される。それに続く、本発明による組成物によってもたらされる別の重要な利点は、副作用、特に細胞傷害性作用因子の作用が現れる危険性を回避するか、又は低減させることを可能にする、より低い有効用量での有効成分の使用が可能であることに関する。
【０１２４】
さらに、本発明によるこの組成物によって、期待される治療効果がより迅速に達成されるであろう。
【０１２５】
「抗癌治療剤」又は「細胞傷害性作用因子」とは、被験体に投与されると被験体の身体において癌の進行を治療又は予防する物質を意味する。このような作用因子の非限定的な例として、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質、有糸分裂阻害剤、クロマチン機能阻害剤、抗血管形成剤、抗エストロゲン、抗アンドロゲン、又は免疫調節剤を挙げることができる。
【０１２６】
このような作用因子は、例えば、ＶＩＤＡＬの２００１年版の、癌腫学及び血液学のコラム「Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｓ」に付随した化合物について記載した頁に引用されており、この文献を参照して引用されたこれらの細胞傷害性化合物は、好ましい細胞傷害性作用因子として本明細書に引用される。
【０１２７】
より詳細には、以下の作用因子が本発明では好ましい。
【０１２８】
「アルキル化剤」は、細胞内の任意の分子、好ましくは核酸（例えばＤＮＡ）を架橋するか、又はアルキル化することができる任意の物質を指す。アルキル化剤の例としては、メクロレタミン、クロラムブコール（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｏｌ）、メルファラン、クロリドレート（ｃｈｌｏｒｙｄｒａｔｅ）、ピポブロメン（ｐｉｐｏｂｒｏｍｅｎ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎ）、リン酸二ナトリウム、もしくはエストラムスチン等のナイトロジェンマスタード、シクロホスファミド、アルトレタミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、トロホスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、スルホホスファミド（ｓｕｌｆｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、もしくはイホスファミド等のオキサゾホリン（ｏｘａｚｏｐｈｏｒｉｎｓ）、チオテパ、トリエチレンアミン、もしくはアルテトラミン（ａｌｔｅｔｒａｍｉｎｅ）等のアジリジンもしくはイミンエチレン、カルムスチン、ストレプトゾシン、フォテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎ）、もしくはロムスチン等のニトロソウレア、ブスルファン、トレオスルファン（ｔｒｅｏｓｕｌｆａｎ）、もしくはインプロスルファン等のアルキルスルホネート、ダカルバジン等のトリアゼン、又は、シスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチン等の白金錯体が挙げられる。
【０１２９】
「代謝拮抗剤」は、特定の活性、通常はＤＮＡ合成を妨げることによって、細胞の成長及び／又は代謝を遮断する物質を指す。代謝拮抗剤の例としては、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、５−フルオロデオキシウリジン、カペシタビン、シタラビン、フルダラビン、シトシンアラビノシド、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、６−チオグアニン（６−ＴＧ）、クロロデオキシアデノシン、５−アザシチジン、ゲムシタビン、クラドリビン、デオキシコホルマイシン（ｄｅｏｘｙｃｏｆｏｒｍｙｃｉｎ）、及びペントスタチンが挙げられる。
【０１３０】
「抗腫瘍性抗生物質」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質の合成を予防又は阻害し得る化合物を指す。抗腫瘍性抗生物質の例としては、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、バルルビシン（ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎ）、ミトキサントロン、ダクチノマイシン、ミトラマイシン（ｍｉｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、及びプロカルバジンが挙げられる。
【０１３１】
「有糸分裂阻害剤」は、細胞周期の正常な進行及び有糸分裂を妨げる。一般に、微小管阻害剤又はパクリタキセル及びドセタキセル等のタキソイドは、有糸分裂を阻害することができる。ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン及びビノレルビン等のビンカアルカロイドもまた、有糸分裂を阻害することができる。
【０１３２】
「クロマチン機能阻害剤」又は「トポイソメラーゼ阻害剤」は、トポイソメラーゼＩ又はトポイソメラーゼＩＩ等のクロマチンモデリングタンパク質の正常な機能を阻害する物質を指す。クロマチン機能阻害剤の例としては、トポイソメラーゼＩに関しては、カンプトテシン、及びトポテカン又はイリノテカン等のその誘導体、またトポイソメラーゼＩＩに関しては、エトポシド、リン酸エトポシド及びテニポシドが挙げられる。
【０１３３】
「抗血管形成剤」は、血管の成長を阻害する任意の薬、化合物、物質、又は作用因子を指す。例示的な抗血管形成剤としては、ラゾキシン（ｒａｚｏｘｉｎ）、マリマスタット、バチマスタット（ｂａｔｉｍａｓｔａｔ）、プリノマスタット（ｐｒｉｎｏｍａｓｔａｔ）、タノマスタット（ｔａｎｏｍａｓｔａｔ）、イロマスタット（ｉｌｏｍａｓｔａｔ）、ＣＧＳ−２７０２３Ａ、ハロフギノン（ｈａｌｏｆｕｇｉｎｏｎ）、ＣＯＬ−３、ネオバスタット（ｎｅｏｖａｓｔａｔ）、ＢＭＳ−２７５２９１、サリドマイド、ＣＤＣ５０１、ＤＭＸＡＡ、Ｌ−６５１５８２、スクアラミン、エンドスタチン、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、インターフェロン−α、ＥＭＤ１２１９７４、インターロイキン−１２、ＩＭ８６２、アンジオスタチン、及びビタキシン（ｖｉｔａｘｉｎ）が挙げられるが、決してこれらに限定されない。
【０１３４】
「抗エストロゲン」又は「抗エストロゲン剤」は、エストロゲンの作用を低減させるか、又は拮抗するか、又は阻害する任意の物質を指す。抗エストロゲン剤の例は、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン（ｄｒｏｌｏｘｉｆｅｎｅ）、ヨードキシフェン（ｉｏｄｏｘｙｆｅｎｅ）、アナストロゾール、レトロゾール、及びエキセメスタンである。
【０１３５】
「抗アンドロゲン」又は「抗アンドロゲン剤」は、アンドロゲンの作用を低減させるか、又は拮抗するか、又は阻害する任意の物質を指す。抗アンドロゲンの例は、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、スピロノラクトン、酢酸シプロテロン、フィナステリド、及びシミチジン（ｃｉｍｉｔｉｄｉｎｅ）である。
【０１３６】
「免疫調節剤」は、免疫系を刺激する物質である。
【０１３７】
免疫調節剤の例としては、インターフェロン、アルデスロイキン（ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎｅ）、ＯＣＴ−４３、デニロイキンジフチトクス（ｄｅｎｉｌｅｕｋｉｎ  ｄｉｆｌｉｔｏｘ）及びインターロイキン−２等のインターロイキン、タソネルミン（ｔａｓｏｎｅｒｍｉｎｅ）等の腫瘍壊死因子、又は、レンチナン、シゾフィラン、ロキニメックス（ｒｏｑｕｉｎｉｍｅｘ）、ピドチモド（ｐｉｄｏｔｉｍｏｄ）、ペガデマーゼ（ｐｅｇａｄｅｍａｓｅ）、チモペンチン（ｔｈｙｍｏｐｅｎｔｉｎｅ）、ポリＩ：Ｃ、もしくは５−フルオロウラシルと併用したレバミソール等の他の免疫調節剤が挙げられる。
【０１３８】
より詳細には、当業者は、「Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｆｒａｎｃａｉｓｅ  ｄｅｓ  Ｅｎｓｅｉｇｎａｎｔｓ  ｄｅ  Ｃｈｉｍｉｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｑｕｅ」によって編集された、「ｔｒａｉｔｅ  ｄｅ  ｃｈｉｍｉｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｑｕｅ，  ｖｏｌ．６，  Ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔｓ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒａｕｘ  ｅｔ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｄａｎｓ  ｌｅ  ｔｒａｉｔｅｍｅｎｔ  ｄｅｓ  ｃａｎｃｅｒｓ，  ｅｄｉｔｉｏｎ  ＴＥＣ  ＆  ＤＯＣ，  ２００３」と題されたマニュアルを参照することができる。
【０１３９】
特に好ましい実施の形態において、本発明による組合せ製品としての上記組成物は、上記細胞傷害性作用因子が同時使用のために上記抗体と化学的に結合されていることを特徴とする。
【０１４０】
特に好ましい実施の形態では、本発明による上記組成物は、上記細胞傷害性作用因子／細胞増殖抑制剤が、紡錘体の阻害剤又は安定剤、好ましくはビノレルビン及び／又はビンフルニン（ｖｉｎｆｌｕｎｉｎｅ）及び／又はビンクリスチンから選択されることを特徴とする。
【０１４１】
上記細胞傷害性作用因子と本発明による上記抗体との結合を容易にするためには、特に、結合する二つの化合物間にポリエチレングリコールのようなポリ（アルキレン）グリコールあるいはアミノ酸等のスペーサー分子を導入することができ、又は、別の実施の形態では、本発明による上記抗体と反応することができる官能基を導入した上記細胞傷害性作用因子の活性な誘導体を用いることができる。これらの結合技術は当業者に既知であり、本明細書ではこれ以上説明しない。
【０１４２】
ＥＧＦＲの他の阻害剤は、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体Ｃ２２５及び２２Ｍａｂ（ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）、ＡＢＸ−ＥＧＦ（Ａｂｇｅｎｉｘ／Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｓｙｓ）、ＥＭＤ−７２００（Ｍｅｒｃｋ  ＫｇａＡ）、又は化合物ＺＤ−１８３４、ＺＤ−１８３８及びＺＤ−１８３９（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＰＫＩ−１６６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＰＫＩ−１６６／ＣＧＰ−７５１６６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＰＴＫ７８７（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＣＰ７０１（Ｃｅｐｈａｌｏｎ）、レフルノミド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ／Ｓｕｇｅｎ）、ＣＩ−１０３３（Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ  Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ）、ＣＩ−１０３３／ＰＤ−１８３、８０５（Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ  Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ）、ＣＬ−３８７、７８５（Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ）、ＢＢＲ−１６１１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＧｍｂＨ／Ｒｏｃｈｅ）、Ｎａａｍｉｄｉｎｅ  Ａ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、ＲＣ−３９４０−ＩＩ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ＢＩＢＸ−１３８２（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、ＯＬＸ−１０３（Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ）、ＶＲＣＴＣ−３１０（Ｖｅｎｔｅｃｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、ＥＧＦ融合毒素（Ｓｅｒａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）、ＤＡＢ−３８９（Ｓｅｒａｇｅｎ／Ｌｉｌｇａｎｄ）、ＺＭ−２５２８０８（Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｕｎｄ）、ＲＧ−５０８６４（ＩＮＳＥＲＭ）、ＬＦＭ−Ａ１２（Ｐａｒｋｅｒ  Ｈｕｇｈｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）、ＷＨＩ−Ｐ９７（Ｐａｒｋｅｒ  Ｈｕｇｈｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）、ＧＷ−２８２９７４（Ｇｌａｘｏ）、ＫＴ−８３９１（協和発酵）、又は「ＥＧＦＲワクチン」（Ｙｏｒｋ  Ｍｅｄｉｃａｌ／Ｃｅｎｔｒｏ  ｄｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）から成り得るが、これらに何ら限定されない。
【０１４３】
本発明のさらに別の実施の形態によれば、上記のような組成物はまた、癌、特に、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体並びに受容体ＩＧＦ−ＩＲ及び／又はＥＧＦＲを過剰発現する癌、例えば特に乳癌の予防及び治療を目的とした同時使用、個別使用又は連続使用のための組合せ製品として、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体の細胞外ドメインに対する別の抗体化合物を含んでもよい。
【０１４４】
特に、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体を本発明による抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体と組み合わせることが予想外に有益であることを正当化する、Ａｌｂａｎｅｌｌら（Ｊ．  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  ９３  （２４）：  １８３０−１８３１，  ２００１）及びＬｕら（Ｊ．  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  ９３  （２４）：  １８５２−１８５７，  ２００１） の文献を参照することができる。
【０１４５】
特に、本発明による組成物の上記抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体は、トラスツズマブと呼ばれる（ハーセプチンとも呼ばれる）抗体である。
【０１４６】
本発明は、別の態様において、上記抗体の少なくとも一つ又はその機能的な断片の一つが細胞毒素及び／又は放射性元素と複合化していることを特徴とする組成物に関する。
【０１４７】
好ましくは、上記毒素又は上記放射性元素は、ＩＧＦ−ＩＲを発現する細胞の少なくとも一つの細胞活性を阻害することができ、より好ましくは、前記細胞の成長又は増殖を抑制すること、特に、前記細胞を完全に不活性化することができる。
【０１４８】
また、好ましくは、上記毒素は腸内細菌毒素であり、特にシュードモナス外毒素Ａである。
【０１４９】
治療に使用する抗体に好ましくは複合化する放射性元素（又は放射性同位元素）は、ガンマ線を放つ放射性同位元素であり、好ましくは、ヨウ素１３１、イットリウム９０、金１９９、パラジウム１００、銅６７、ビスマス２１７及びアンチモン２１１である。ベータ線及びアルファ線を放つ放射性同位元素もまた治療に用いることができる。
【０１５０】
本発明による少なくとも一つの抗体又はその機能的な断片の一つに複合化している毒素又は放射性元素とは、当該毒素又は当該放射性元素が前記少なくとも一つの抗体と結合すること、特に、連結分子を導入した又は導入していない二つの化合物の間の共有結合によって結合することを可能にする任意の手段を示すものである。
【０１５１】
コンジュゲートの構成要素の全て又は一部の化学結合（共有結合）、静電結合又は非共有結合を可能にする作用因子の中で、特に、ベンゾキノン、カルボジイミドを挙げることができ、より詳細には、ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］−カルボジイミド塩酸塩）、ジマレイミド、ジチオビス−ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオ酢酸塩（ＳＡＴＡ）、紫外線（Ｕ．Ｖ．）と反応する一つ又は複数のフェニルアジド基を有する結合剤、そして好ましくは、Ｎ−［−４−（アジドサリチルアミノ）ブチル］−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド（ＡＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミド−イル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、６−ヒドラジノ−ニコチンアミド（ＨＹＮＩＣ）を挙げることができる。
【０１５２】
特に放射性元素との別の結合形態は、二官能性イオンキレート剤の使用であり得る。
【０１５３】
これらのキレートの中で、金属、特に放射性金属、及び免疫グロブリンの結合のために開発された、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）由来のキレート又はＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）由来のキレートを挙げることができる。従って、リガンド−金属錯体の安定性及び強度を高めるために、ＤＴＰＡ及びその誘導体を炭素鎖上で異なる基と置換することができる（Ｋｒｅｊｃａｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９７７）、  Ｂｒｅｃｈｂｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）、  Ｇａｎｓｏｗ，  １９９１、  米国特許第４８３１１７５号明細書）。
【０１５４】
例えば、医学及び生物学において長い間、遊離形又は金属イオンとの錯体の形態のいずれかで広く用いられてきたジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）及びその誘導体は、金属イオンと安定したキレートを形成し、且つ治療目的又は診断目的のタンパク質、例えば、癌治療における放射性免疫コンジュゲートの開発のための抗体と結合するという注目すべき特徴を備えている（Ｍｅａｓｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８４）、  Ｇａｎｓｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０））。
【０１５５】
同様に好ましくは、本発明による上記コンジュゲートを形成する上記少なくとも一つの抗体は、その機能的な断片、特に、そのＦｃ構成要素の切断された断片、例えばｓｃＦｖ断片から選択される。
【０１５６】
本発明はさらに、薬剤の調製のための本発明による組成物の使用を含む。
【０１５７】
より詳細には、別の実施の形態によれば、本発明は、ＩＧＦ−ＩＲの過剰発現及び／もしくは異常な活性化によって引き起こされる疾病、並びに／又はＩＧＦ１もしくはＩＧＦ２のＩＧＦ−ＩＲとの相互作用が介在するシグナル伝達経路の過剰活性化に関連した疾病の予防又は治療を目的とした薬剤を調製するための、抗体もしくはその機能的な断片の一つ及び／又は組成物の使用に関する。
【０１５８】
さらに別の好ましい実施の形態によれば、本発明は、ＩＧＦ−ＩＲの過剰発現及び／もしくは異常な活性化によって引き起こされる疾病、並びに／又はＩＧＦ２のＩＧＦ−ＩＲとの相互作用が介在するシグナル伝達経路の過剰活性化に関連した疾病の予防又は治療を目的とした薬剤を調製するための、抗体もしくはその機能的な断片の一つ及び／又は組成物の使用に関する。
【０１５９】
好ましくは、本発明による上記使用は、上記薬剤の投与が、インスリン受容体ＩＲの阻害、すなわち、当該薬剤が存在することによる、特に当該薬剤のＩＲへの付着に関連した競合的阻害による、ＩＲとその天然リガンドとの相互作用の阻害に関連した副作用を引き起こさないか、又はほんのわずかしか引き起こさないことを特徴とする。
【０１６０】
本発明はさらに、正常細胞の、腫瘍特性を有する細胞、好ましくはＩＧＦ依存性細胞、特に、少なくともＩＧＦ２依存性細胞への形質転換を阻害することを目的とする薬剤を調製するための、本発明による、好ましくはヒト化された抗体もしくはその機能的な断片の一つ及び／又は組成物の使用を含む。
【０１６１】
本発明は同様に、腫瘍細胞、好ましくはＩＧＦ依存性細胞、特に少なくともＩＧＦ２依存性細胞の成長及び／又は増殖を阻害することを目的とする薬剤を調製するための、本発明による、好ましくはヒト化された抗体もしくはその機能的な断片の一つ及び／又は組成物の使用に関する。
【０１６２】
通常、本発明の対象は、好ましくはＩＧＦ−ＩＲを発現する癌、並びに／又は、ＩＧＦ１及び／もしくはＩＧＦ２とＩＧＦ−ＩＲとの相互作用が介在するシグナル伝達経路の過剰活性化、例えばＩＲＳ１の過剰発現を好ましくは有する癌の予防又は治療を目的とする薬剤を調製するための、本発明による、好ましくはヒト化された抗体もしくはその機能的な断片の一つ、及び／又は組成物の使用である。
【０１６３】
本発明の対象は同様に、乾癬、すなわち上皮細胞の過剰増殖がＩＧＦ−ＩＲの発現もしくは過剰発現、並びに／又はＩＧＦ−ＩＲとその天然リガンドとの相互作用（Ｗｒａｉｇｈｔ  Ｃ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２０００，  １８  （５）：  ５２１−５２６，  Ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｓｏｒｉａｓｉｓ  ｂｙ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ｉ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）及び／もしくはＥＧＦＲとその天然リガンドとの相互作用が介在するシグナル伝達経路の過剰活性化と関連づけられる乾癬の予防又は治療を目的とする薬剤を調製するための、本発明による、好ましくはヒト化された抗体もしくはその機能的な断片の一つ及び／又は組成物の使用である。
【０１６４】
本発明は、アテローム性動脈硬化症を治療又は予防する薬剤を調製するための、好ましくはヒト化された抗体もしくはその任意の機能的な断片の使用、及び／又は前記抗体を含む任意の組成物の使用にも関する。
【０１６５】
予防及び／又は治療することができる癌の中でも、前立腺癌、骨肉腫、肺癌、乳癌、子宮内膜癌、結腸癌、多発性骨髄腫もしくは卵巣癌、又はＩＧＦ−ＩＲを過剰発現する他の任意の癌が好ましい。
【０１６６】
ＩＧＦ２が結腸癌に特に関与することが知られているので、より好ましい実施の形態において、ＩＧＦ２の結合を阻害する特定の能力により、本発明は、この癌の予防、診断、又は治療のための、本発明による抗体又はその断片の使用に関する。
【０１６７】
さらに別の態様によれば、本発明の対象は、ＩＧＦ−ＩＲの異常な存在が疑われる生体サンプルから、ＩＧＦ−ＩＲの過剰発現又は過少発現、好ましくは過剰発現に関連した疾病を、好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで診断する方法であって、前記生体サンプルを本発明による抗体又はその機能的な断片の一つと接触させることを特徴とする方法であり、前記抗体は必要に応じて標識することが可能である。
【０１６８】
好ましくは、上記診断方法において、ＩＧＦ−ＩＲの過剰発現に関連した上記疾病は癌である。
【０１６９】
上記抗体又はその機能的な断片の一つは、検出可能なシグナル及び／又は定量可能なシグナルを得るように、免疫コンジュゲート又は標識抗体の形態で存在してもよい。
【０１７０】
本発明の目的は、正常な状態と比較してＩＧＦ−ＩＲが異常に発現していることを特徴とする病態をｉｎ  ｖｉｔｒｏで診断する方法であって、この方法は、ＩＧＦ−ＩＲ／抗体複合体の形成に好都合な条件下で、ＩＧＦ−ＩＲを含んでいる疑いのある生体サンプルと本発明による抗体とを接触させること、及び、当該複合体を、前記サンプルにおける前記ＩＧＦ−ＩＲの存在の指標として検出することを含む。好ましい実施の形態では、前記抗体は検出可能に標識される。
【０１７１】
第一の態様において、ＩＧＦ−ＩＲの異常な発現はＩＧＦ−ＩＲの過剰発現である。第二の態様では、ＩＧＦ−ＩＲの異常な発現はＩＧＦ−ＩＲの過少発現である。
【０１７２】
本発明による標識された抗体又はそれらの機能的な断片としては、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースアミラーゼ、炭酸脱水酵素、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼもしくはグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ等の酵素と複合化することができるか、又は、ビオチン、ジゴキシゲニンもしくは５−ブロモデオキシウリジン等の分子により複合化することができる、免疫コンジュゲートと呼ばれる抗体等が挙げられる。また、蛍光標識を本発明による抗体又はそれらの機能的な断片と複合化してもよく、それらとしては特に、フルオレセイン及びその誘導体、フルオロクロム、ローダミン及びその誘導体、ＧＦＰ（ＧＦＰは「緑色蛍光タンパク質」を指す）、ダンシル、ウンベリフェロン等が挙げられる。このようなコンジュゲートでは、本発明の抗体又はそれらの機能的な断片は、当業者に既知の方法によって調製することができる。それらは直接、又は、スペーサー基、もしくはグルタルアルデヒドのようなポリアルデヒド、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＰＴＡ）等の結合基を介して、又は治療用コンジュゲートに関して上述したような結合剤の存在下で、酵素又は蛍光標識と結合させることができる。フルオレセインタイプの標識を含むコンジュゲートは、イソチオシアネートとの反応によって調製することができる。
【０１７３】
また、他のコンジュゲートは、ルミノール及びジオキセタン等の化学発光標識、ルシフェラーゼ及びルシフェリン等の生物発光標識、又は、ヨウ素１２３、ヨウ素１２５、ヨウ素１２６、ヨウ素１３３、臭素７７、テクネチウム９９ｍ、インジウム１１１、インジウム１１３ｍ、ガリウム６７、ガリウム６８、ルテニウム９５、ルテニウム９７、ルテニウム１０３、ルテニウム１０５、水銀１０７、水銀２０３、レニウム９９ｍ、レニウム１０１、レニウム１０５、スカンジウム４７、テルル１２１ｍ、テルル１２２ｍ、テルル１２５ｍ、ツリウム１６５、ツリウム１６７、ツリウム１６８、フッ素１８、イットリウム１９９、ヨウ素１３１等の放射性標識を含んでいてもよい。治療用放射性同位元素を直接、又は上記のＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ等のキレート剤を介して抗体に結合させるための当業者に既知の方法を、診断に用いることができる放射性元素に用いてもよい。また、クロラミンＴ法によるＮａ［Ｉ１２５］での標識［Ｈｕｎｔｅｒ  Ｗ．  Ｍ．  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ  Ｆ．  Ｃ．  （１９６２），  Ｎａｔｕｒｅ  １９４：  ４９５］、あるいは、Ｃｒｏｃｋｆｏｒｄら（米国特許第４４２４２００号明細書）の技術による、もしくはＨｎａｔｏｗｉｃｈ（米国特許第４４７９９３０号明細書）によって記載されるＤＴＰＡを介して付着される、テクネチウム９９ｍでの標識も挙げることができる。
【０１７４】
このように、本発明による抗体又はそれらの機能的な断片は、生体サンプルのＩＧＦ−ＩＲの過剰発現又は過少発現、好ましくは過剰発現を検出及び／又は定量するプロセスに使用することができ、当該方法は、
ａ）生体サンプルを、本発明による抗体又はその機能的な断片の一つと接触させる工程、および
ｂ）形成された可能性のあるＩＧＦ−ＩＲ／抗体複合体を実証する工程、
を含むことを特徴とする。
【０１７５】
特定の実施の形態において、本発明による抗体又はそれらの機能的な断片は、ＩＧＦ依存性の癌、あるいは乾癬又はアテローム性動脈硬化症の予防的処置及び／又は治療的処置の効果をモニタリングするための、生体サンプルにおけるＩＧＦ−ＩＲを検出及び／又は定量するプロセスに使用することができる。
【０１７６】
より一般には、本発明による抗体又はそれらの機能的な断片は、ＩＧＦ−ＩＲの発現を定性的及び／又は定量的に観察する必要のある任意の状況で有利に使用することができる。
【０１７７】
好ましくは、生体サンプルは、ヒト由来の、血清等の体液、全血、細胞、組織サンプル、又は生検標本から成る。
【０１７８】
本発明の別の態様は、前立腺細胞サンプルの発癌性を予測するための診断方法であって、
（ａ）ヒトの前立腺組織のサンプルの準備、及び
（ｂ）ＩＧＦ−ＩＲ／抗体複合体の形成に好都合な条件下で、前記サンプルを本発明による抗体と接触させることを含む、サンプルにおけるＩＧＦ−ＩＲの存在の確認（ここで、前記複合体の存在が前記組織における前記細胞の発癌性を示す）
を含む方法である。
【０１７９】
別の実施の形態において、上記複合体の存在は、患者が上記ＩＧＦ−ＩＲの過剰発現を特徴とする病理学的障害の進行又は発症の危険性があることを示す。
【０１８０】
また、本発明の目的は、ＩＧＦ−ＩＲ発現の異常な発現を特徴とする病理学的障害を緩和するように設計された治療計画の進行を追跡するための方法であって、
（ａ）被験体のサンプルを検査して、第一の時点のＩＧＦ−ＩＲのレベルを測定すること、
（ｂ）第二の時点で、上記サンプルを検査すること、及び
（ｃ）前記第二の時点のレベルを（ａ）で測定したレベルと比較して、上記治療計画の効果を決定すること（ここで、前記サンプルにおけるＩＧＦ−ＩＲレベルの低減は、上記患者における上記病理的障害の退行の決定因子であり、また、ＩＧＦ−ＩＲレベルの増大は当該患者における当該病理的障害の進行の決定因子である）
を含む方法である。
【０１８１】
このような検出及び／又は用量測定を実施するために、任意の手順又は従来の試験を用いることができる。当該試験は、競合試験もしくはサンドウィッチ試験、又は抗体−抗原タイプの免疫複合体の形成に依存した当業者に既知の任意の試験であってよい。本発明による適用の後に、抗体又はその機能的な断片の一つを固定化してもよいし、又は標識してもよい。この固定化は、当業者に既知の数多くの支持体上で行うことができる。これらの支持体としては、特に、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、又は自然細胞もしくは変更された細胞が挙げられる。これらの支持体は可溶性でも不溶性でもよい。
【０１８２】
例として、好ましい方法では、免疫蛍光法による、ＥＬＩＳＡ技術に従った免疫酵素過程、又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）技術、又はそれと同等のものを利用する。
【０１８３】
従って、本発明は同様に、ＩＧＦ−ＩＲの過剰発現又は過少発現によって誘導される疾病を診断する方法を行うため、又は、生体サンプルにおけるＩＧＦ−ＩＲの過剰発現もしくは過少発現、好ましくは当該受容体の過剰発現を検出及び／又は定量する方法を行うために必要なキット又はセットであって、
ａ）本発明による抗体又はその機能的な断片の一つ、
ｂ）適宜、免疫反応に好ましい培地を形成するための試薬、
ｃ）適宜、免疫反応によって産生されたＩＧＦ−ＩＲ／抗体複合体の実証を可能にする試薬
の要素を含むキット又はセットを含む。
【０１８４】
本発明はさらに、癌、特に、前記細胞傷害性作用因子又は前記抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体を一般に処方することができる癌、そして特に、腫瘍細胞がＩＧＦ−ＩＲを発現又は過剰発現している癌の予防又は治療を目的とする薬剤を調製するための、本発明による組合せ製品としての組成物の使用に関する。
【０１８５】
本発明の対象はまた、生物学的に活性な化合物を、ＩＧＦ−ＩＲを発現又は過剰発現する細胞に対して特異的にターゲティングさせることを目的とする薬剤を調製するための、本発明による抗体の使用である。
【０１８６】
本明細書において、生物学的に活性な化合物とは、細胞活性、特にそれらの成長、それらの増殖、転写又は遺伝子翻訳を調節すること、特に阻害することができる化合物を示す。
【０１８７】
本発明の対象はまた、好ましくは標識された、特に放射性標識された、本発明による抗体又はその機能的な断片の一つを含む、ｉｎ  ｖｉｖｏでの診断試薬、及び、特に細胞によるＩＧＦ−ＩＲの発現又は過剰発現に関連した癌の検出のための、医療用画像におけるその使用である。
【０１８８】
本発明は同様に、薬剤としての、本発明による、組合せ製品としての組成物、又は抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体／毒素コンジュゲートもしくは抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体／放射性元素コンジュゲートに関する。
【０１８９】
好ましくは、本発明による組合せ製品としての上記組成物又は上記コンジュゲートは、賦形剤及び／又は薬学的に許容可能な担体と混合される。
【０１９０】
本明細書において、薬学的に許容可能な担体とは、副作用を誘発しない、そして活性化合物の投与を容易にすること、身体内でのその持続時間及び／又はその効果を増大すること、溶液中のその溶解度を高めること、あるいはその保存性を向上させることなどを可能にする、薬学的組成物の一部になる化合物又は化合物の組合せを示すものである。これらの薬学的に許容可能な担体は既知であり、選択された活性化合物の性質及び投与形態に応じて当業者によって適合される。
【０１９１】
好ましくは、これらの化合物は、全身経路によって、特に静脈内経路によって、筋肉内、皮内、腹腔内もしくは皮下経路によって、又は経口経路によって投与される。より好ましくは、本発明の抗体を含む組成物は連続的に数回投与される。
【０１９２】
化合物の投与形態、用量及び最適な薬学的形態は、患者に適合させた処置の確立において一般に考慮される基準、例えば、患者の年齢又は体重、患者の全身状態の重篤度、処置に対する耐性及び留意すべき副作用等に従って決定することができる。
【０１９３】
本発明の他の特徴及び利点は、実施例と説明を以下に示した図面とを有する以下の記載で見ることができる。
【０１９４】
図面の説明
図１：モノクローナル抗体Ｉ−３４６６による、［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−１のＩＧＦ−ＩＲへの結合の競合。
特異的な［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−１の結合（％）を、半対数グラフ上でリガンド濃度の関数としてプロットした。特異的結合の値は、三回行った実験の平均である。
図２：モノクローナル抗体Ｉ−３４６６による、［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−２のＩＧＦ−ＩＲへの結合の競合。
特異的な［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−２の結合（％）を、半対数グラフ上でリガンド濃度の関数としてプロットした。特異的結合の値は、三回行った実験の平均である。
図３Ａ及び図３Ｂ：ＩＧＦ１又はＩＧＦ２誘導性のＭＣＦ−７の成長に対するＩ−３４６６抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの効果。
図４Ａ及び図４Ｂ：ＭＣＦ−７細胞におけるＩＧＦ−ＩＲのβ鎖のＩＧＦ１（図４Ａ）又はＩＧＦ２（図４Ｂ）誘導性のリン酸化に対するＩ−３４６６  Ｍａｂの効果。
図５Ａ及び図５Ｂ：ＨＴ２９細胞におけるＩＧＦ−ＩＲのβ鎖のＩＧＦ１（図５Ａ）又はＩＧＦ２（図５Ｂ）誘導性のリン酸化に対するＩ−３４６６  Ｍａｂの効果。
図６Ａ〜図６Ｅ：ＤＵ１４５（図６Ａ）、ＳＫ−ＥＳ−１（図６Ｂ）、ＨＴ２９（図６Ｃ）、Ａ５４９（図６Ｄ）及びＭＣＦ−７（図６Ｅ）異種移植腫瘍モデルにおけるＩ−３４６６のｉｎ  ｖｉｖｏでの活性。
図７：マウスＩ−３４６６（配列番号７）及びＣＤＲグラフト化によってヒト化したＩ−３４６６（配列番号２０）の、軽鎖（ＶＬ）の可変領域のアミノ酸配列の比較。
記号＊（アスタリスク）は、ＣＤＲループ構造の維持に重要な残基を示し、記号＃（シャープ）はＶＬ／ＶＨ境界で見られた保護された残基を示す。
図８：マウスＩ−３４６６（配列番号８）及びＣＤＲグラフト化によってヒト化したＩ−３４６６（配列番号２１）の、重鎖（ＶＨ）の可変領域のアミノ酸配列の比較。
記号＊（アスタリスク）は、ＣＤＲループ構造の維持に重要な残基を示し、記号＃（シャープ）はＶＬ／ＶＨ境界で見られた保護された残基を示す。
図９：精製したＩ−３４６６抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。説明は以下である。
Ｍ：マーカー、
レーン１：Ｉ−３４６６ヒト化可変領域、
レーン２：Ｉ−３４６６マウス可変領域、
パネルＡ：還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、
パネルＢ：非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
マウス３４６６及びヒト化３４６６共に定常領域はヒトである。
図１０：バイオセンサー捕捉アッセイの概略図。
定常Ｆｃ部に対するヒトＩｇＧ１  ＭａｂをＣＭ５センサーの表面に共有結合で付着させた。試験対象の限られた量のＭａｂを固定化し、分析物ｈＩＧＦ−ＩＲ−ＥＣＤを捕捉するために使用した。分析物へのＭａｂの結合は、会合速度定数ｋａ及び解離速度定数ｋｄのそれぞれに特徴付けられる。平衡解離定数（ＫＤ）は、解離速度定数と会合速度定数との間の比によって算出される。
図１１：５つの異なる濃度のｈＩＧＦ−ＩＲ−ＥＣＤについての、ＩｇＧ１ヒト化Ｉ−３４６６／ｈＩＧＦ−ＩＲ−ＥＣＤ複合体の会合相及び解離相のセンサーグラム。
【実施例１】
【０１９５】
マウスモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の生成及び選択
【０１９６】
ＩＧＦ−ＩＲに対して特異的でＩＲを認識しないＭＡｂを生成するために、６つのスクリーニング段階を含む手順を行った。
この手順は、
−ハイブリドーマを生成するために、ヒトの組換えＩＧＦ−ＩＲでマウスに免疫付与すること、
−免疫付与が可能であった組換えタンパク質について、ＥＬＩＳＡで培養上清をスクリーニングすること、
−ＥＬＩＳＡでハイブリドーマが陽性であった上清全てを、ＭＣＦ−７腫瘍細胞の表面上で過剰発現した天然受容体について試験すること、
−ＩＧＦ−ＩＲを特異的に認識する抗体を選択するために結合実験を行うこと、
−上記段階で選択された抗体が、ＭＣＦ−７細胞の誘導されたＩＧＦ１性の増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害することができたことを確認すること、
−ＭＣＦ−７腫瘍の成長に対する効果に関して維持されている候補の、ヌードマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでの活性を確実にすること
である。
【０１９７】
これらの様々な段階及び得られた結果の全てを実施例１において以下に簡潔に記載する。
【０１９８】
免疫付与段階において、マウスに８μｇの組換えＩＧＦ−ＩＲを皮下経路によって二回注射した。脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞Ｓｐ２ＯＡｇ１４との融合の三日前に、マウスに３μｇの組換え受容体を静脈内注射した。融合の１４日後、ハイブリドーマの上清を、組換えＩＧＦ−ＩＲで感作したプレート上でＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。上清が陽性であったハイブリドーマを保存し、増幅した後に、産生された抗体が同様に天然ＩＧＦ−ＩＲを認識することができたことを確認するためにＦＡＣＳｃａｎ分析で試験した。
【実施例２】
【０１９９】
［１２５Ｉ］−ＩＧＦ１及び［１２５Ｉ］−ＩＧＦ２のヒトＩＧＦ−１受容体への結合の阻害
【０２００】
細胞膜溶解物の調製
ヒトのＩＧＦ−ＩＲのｃＤＮＡで安定的にトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞を、１０％ウシ胎児血清を補ったＤＭＥＭで成長させた。擦り取ることで採取した後、血清飢餓細胞を遠心分離によってさらに回収した。細胞ペレットをリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、溶解緩衝液（プロテアーゼ阻害剤を含む、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５））に再懸濁した。約１ｍｌの緩衝液を２５・１０６個の細胞に加えた。細胞を、３回の凍結融解サイクルとその後の１，９００ｒｐｍでのポッター型ホモジナイザーでの３０ストロークでさらに溶解させた。超音波処理の後、＋４℃、１，０００×ｇで１５分間遠心分離して、核及び大きい細胞画分を除去した。＋４℃、１０５，０００×ｇで１時間遠心分離して全細胞膜を得た。細胞膜ペレットを溶解緩衝液で洗浄し、＋４℃、１０５，０００×ｇで１時間遠心分離した。最終的なペレットを、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％ＩＧＥＰＡＬ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．２５％デオキシコール酸ナトリウム、及びプロテアーゼ阻害剤を含む、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に再懸濁し、＋４℃で一晩撹拌した。＋４℃、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離して、ｈＩＧＦ−ＩＲを含む可溶性の抽出物から不溶性物質を分離した。細胞膜溶解物を、ビシンコニン酸アッセイによりタンパク質濃度について、及びウェスタンブロットによりＩＧＦ−ＩＲについて分析した。
【０２０１】
［１２５Ｉ］−ＩＧＦ１及び［１２５Ｉ］−ＩＧＦ２の結合アッセイ
ＩＧＦ−ＩＲのα−サブユニットを認識するものとして記載されている市販のモノクローナル抗体１７−６９（Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ、フレモント、カリフォルニア州、アメリカ）をまず、プロテインＡ  ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（登録商標）の９６ウェルマイクロプレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ボストン、マサチューセッツ州、アメリカ）上に被覆し、ＩＧＦ−ＩＲを固定化した。ＰＢＳ中の２０μｇ／ｍｌの抗体溶液２００μｌを各ウェルに添加し、＋４℃で一晩インキュベートした。プロテインＡに付着していない残りの１７−６９を含む緩衝液を吸引により除去した。１００μｇ／ｍｌの細胞膜溶解物２００μｌをさらに添加し、室温で２時間インキュベートして、ＩＧＦ−ＩＲを固定化した。捕捉されなかったタンパク質を吸引により除去した。競合アッセイにおいて、１００ｐＭの［１２５Ｉ］−ＩＧＦ１（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ボストン、マサチューセッツ州、アメリカ）又は［１２５Ｉ］−ＩＧＦ２（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サクレー、フランス）の、固定化されたＩＧＦ−ＩＲへの結合を、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１％ウシ血清アルブミン及び１ｍＭのＰＭＳＦを含む結合緩衝液中の、１ｐＭから１μＭに及ぶ様々な濃度のモノクローナル抗体Ｉ−３４６６又はリガンドＩＧＦ１、ＩＧＦ２、及びインスリン（Ｓｉｇｍａ、サン−カンタン・ファラヴィエ、フランス）の存在下で測定した。プレートを室温で２時間インキュベートした後、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔマイクロプレートシンチレーションカウンターで計測した。非特異的な結合を、１μＭのＩＧＦ１の存在下で確定した。ｈＩＧＦ−ＩＲに対するものではないが大腸菌のタンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体９Ｇ４を、マウスのＩｇＧ１アイソタイプの対照として使用した。
【０２０２】
結果
特異的な［１２５Ｉ］−ＩＧＦ１及び［１２５Ｉ］−ＩＧＦ２の結合率を、リガンド濃度の関数として半対数グラフにプロットした。放射性リガンドの結合を５０％阻害するために必要な様々な阻害剤の濃度（ＩＣ５０）は、得られたＳ字型の競合曲線からグラフを使って求められた（図１及び図２）。
【０２０３】
ＩＧＦ１及びＩＧＦ２リガンドの両方が、固定化されたｈＩＧＦ−ＩＲへの［１２５Ｉ］−ＩＧＦ１の結合を効率的に阻害した一方で、インスリン及びアイソタイプ対照抗体９Ｇ４は、５００ｎＭ未満の濃度では［１２５Ｉ］−ＩＧＦ１の結合を阻害することができなかった（図１）。モノクローナル抗体Ｉ−３４６６は、０．０２１ｎＭのＩＣ５０で［１２５Ｉ］−ＩＧＦ１の結合を阻害することができ（図１）、これは放射性標識していないＩＧＦ１で求められたＩＣ５０の３０分の１である。
【０２０４】
さらに、抗体Ｉ−３４６６は、固定化されたｈＩＧＦ−ＩＲに対する［１２５Ｉ］−ＩＧＦ２の結合の強い阻害活性も示していた（図２）。この場合、競合曲線から推測されたＩＣ５０値は約０．１ｎＭであった。Ｉ−３４６６のこのＩＧＦ２遮断活性は、ＩＧＦ２によって誘導される阻害活性と同程度であった（ＩＣ５０＝０．０６ｎＭ）。これはＩＧＦ１の阻害活性（ＩＣ５０＝０．０２ｎＭ）よりわずかに低く、インスリンの阻害活性（ＩＣ５０＝約２００ｎＭ）よりもかなり大きかった。予想通り、対照抗体９Ｇ４はＩＧＦ２遮断活性を全く示さなかった。
【実施例３】
【０２０５】
ＩＧＦ１又はＩＧＦ２誘導性のＭＣＦ−７の成長に対するＩ−３４６６抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの効果
【０２０６】
上記のように、ＩＧＦ−ＩＲは多くの腫瘍で過剰発現されるが、さらに、かなりの数の乳癌及び結腸癌において、増殖シグナルがＩＧＦ２（ＩＧＦ−２、ＩＧＦ−ＩＩ又はＩＧＦＩＩと記載されることもある）を介してこの受容体に与えられることが記載されている。従って、ＭＡｂ  Ｉ−３４６６が同様に、ＭＣＦ−７細胞でのＩＧＦ１及びＩＧＦ２誘導性の成長の両方をｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害することができることを確実にすることが必須である。このために、細胞を、２００μｌの無血清培地（１％Ｌ−グルタミンを添加した、フェノールレッドを含有しないＲＰＭＩ培地）で、５×１０４細胞数／ウェルの濃度で９６ウェルプレート内で平板培養した。平板培養から２４時間後、最終濃度が５０μｇ／ｍｌ（６．６ｎＭ）のＩＧＦ１又はＩＧＦ−２（最終濃度が１００ｎｇ／ｍｌ（１３．２ｎＭ））を、Ｉ−３４６６又はアイソタイプ対照として使用したマウス抗ＩＧＦ−ＩＲ非中和抗体（７Ｇ３）の存在下又は非存在下で、さらに５２時間近くＭＣＦ−７細胞に添加した。
【０２０７】
１０μｇ／ｍｌ（６６ｎＭ）から０．００９７μｇ／ｍｌ（０．０６５ｎＭ）に及ぶ範囲の最終濃度で抗体を試験した。次に細胞を０．２５μＣｉの［３Ｈ］チミジンで１６時間パルスし、ＤＮＡに組み込まれた［３Ｈ］チミジンの程度を液体シンチレーションカウンター計測によって定量した。ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２の両方が有意にＭＣＦ−７細胞の成長を刺激している（表２）。
【０２０８】
細胞を漸増用量のアイソタイプ対照抗体で処理した場合、有意な阻害は観察されなかった。
【０２０９】
これに対して、細胞を漸増用量のＩ−３４６６抗体とインキュベートした場合、ＩＧＦ１（９０％）及びＩＧＦ２（８４％）誘導性の増殖の両方の有意な用量依存性の阻害が、それぞれ０．７ｎＭ及び０．５ｎＭのＩＣ５０で観察された（表２、及び図３Ａ、図３Ｂ）。
【０２１０】
【表２】
2009502129.tif 000003
【実施例４】
【０２１１】
Ｉ−３４６６がＩＧＦ−ＩＲのβ鎖のＩＧＦ１及びＩＧＦ２誘導性のリン酸化の両方を阻害する
【０２１２】
ＭＣＦ７細胞又はＨＴ２９細胞を、フェノールレッドを含まず、５ｍＭのグルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン（それぞれ１００Ｕ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌ）並びに１０％ウシ胎児血清と混合した、２０ｍｌのＲＰＭＩにおいて、５・１０４細胞数／ｃｍ２（７５ｃｍ２のプレート、ＣＯＳＴＡＲ）で２４時間培養した。ＰＢＳで三回洗浄した後、細胞を、ウシ胎児血清を含まず、５ｍＭのグルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、０．５μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ  Ａ−８０２２）及び５μｇ／ｍｌのトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ  Ｔ８１５８）と混合した、フェノールレッドを含まない培地（ＲＰＭＩ）で１２時間インキュベートした。
【０２１３】
活性化のために、細胞をまず、試験対象の遮断抗体（１０μｇ／ｍｌ）と３７℃で１５分間インキュベートし、次に、ＩＧＦ１又はＩＧＦ２をさらに二分間添加した。反応をインキュベーション培地の吸引により停止させ、プレートを氷上に置いた。細胞を、プロテアーゼ阻害剤（５０ｍｌ当たり１錠、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、参照：１６９７４９８)及びホスファターゼ阻害剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、参照：５２４６２５（１／１００））と混合した、０．５ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭのｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム）の添加により可溶化した。細胞を削り取り、懸濁液を回収し、４℃で１．５時間、振盪器に入れた。溶液を１２，０００ｒｐｍで１０分間（４℃）遠心分離し、上清のタンパク質濃度をＢＣＡで定量した。
【０２１４】
免疫沈降のために、細胞溶解物のタンパク質５００μｇを抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体（Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ、参照：ｓｃ−７１３）と混合し、振盪しながら４℃で１．５時間インキュベートした。プロテインＡ−アガロース（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、参照：１１３４５１５）を加えて免疫沈降物を回収し、振盪しながら４℃で一晩インキュベートした。アガロースビーズを１ｍｌの溶解緩衝液で二回、洗浄緩衝液１（プロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤と混合した、５０ｍＭのｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０、０．０５％デオキシコール酸ナトリウム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、参照：１３３２５９７））で二回、並びに洗浄緩衝液２（プロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤１／１００と混合した、５０ｍＭのｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１％のＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０、０．０５％デオキシコール酸ナトリウム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、参照：１３３２５９７））で一回洗浄した。免疫沈降物をＬａｅｍｍｌｉ緩衝液に再懸濁し、５分間１００℃まで加熱した。上清をポリアクリルアミドＳＤＳゲル（８％  Ｎｏｖｅｘ  ＥＣ６０１５）上での電気泳動によって分析した。タンパク質をニトロセルロース膜に移し、その後、ＨＲＰと複合化した抗ホスホチロシン抗体（ＢＤ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｓ  ＰＹ２０）又は抗ＩＧＦ−ＩＲβ鎖抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、参照：ｓｃ７１３）による免疫ブロットを行い、その後、ＨＲＰと複合化した抗ウサギ抗体による免疫ブロットを行った。バンドを、化学発光（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＲＰＮ２２０９）及びその後のＫｏｄａｋ  Ｘ−ｍａｔ  ＡＲフィルムにおけるオートラジオグラフィーによって明らかにした。
【０２１５】
図４Ａ及び図４Ｂは、刺激していないＭＣＦ−７細胞（パネルＡ及びパネルＢのレーン１）又は５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ１のみ（パネルＡのレーン２）もしくは１００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ２（パネルＢのレーン２）で刺激したＭＣＦ−７細胞を示す。予想通り、ＭＣＦ−７細胞においてＩＧＦ−ＩＲの基底の刺激が観察されなかった一方で、ＭＣＦ−７細胞をＩＧＦ１又はＩＧＦ２のいずれかとインキュベートした場合、ＩＧＦ−ＩＲのβ鎖の有意なリン酸化が観察された。細胞をＩｇＧ１のアイソタイプ対照（パネルＡ及びパネルＢのレーン３）又はＩ−３４６６抗体のみ（パネルＡ及びパネルＢのレーン４）で処理した場合、刺激は観察されず、これにより、Ｉ−３４６６はＩＧＦ−ＩＲに対するアゴニスト作用を示さないことが明らかになった。Ｉ−３４６６をＩＧＦ１又はＩＧＦ２のいずれかと共に添加した場合、リガンド誘導性のリン酸化の完全な阻害が観察された（パネルＡ及びパネルＢのレーン５）。アイソタイプ対照として使用した９Ｇ４抗体は、ＩＧＦ１又はＩＧＦ２誘導性のリン酸化に対する作用を何ら示さなかった（パネルＡ及びパネルＢのレーン６）。
【０２１６】
ＩＧＦ１又はＩＧＦ２で刺激したＨＴ２９細胞において、Ｉ−３４６６の同程度の阻害活性が観察された（図５Ａ及び図５Ｂ）。これらの結果は、Ｉ−３４６６がＩＧＦ−ＩＲへのＩＧＦ１及びＩＧＦ２の両方の結合を阻害することができることを示している実施例２に記載の結果と一致している。
【実施例５】
【０２１７】
ＩＧＦ−ＩＲの内在化試験及び分解試験
【０２１８】
内在化試験及び分解試験は、ＦＡＣＳ分析で分析した。内在化試験は、Ｉ−３４６６抗体に認識されるものとは異なるエピトープに結合する、以下で１２Ｂ１  Ｍａｂと記載されるマウスのビオチン化した抗ＩＧＦ−ＩＲモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を用いて行った。９Ｇ４  Ｍａｂはアイソタイプ対照として取り入れた。両方の抗体は本発明者の研究所で生成された。コンフルエントなＭＣＦ−７細胞をトリプシン処理し、各細胞懸濁液の１×１０６個の細胞をＦＡＣＳ緩衝液中で９６ウェルプレートに平板培養した。プレートを、ＩＧＦ１（５０ｎｇ／ｍｌ）又は３０μｇ／ｍｌのＩ−３４６６、９Ｇ４、ｍＩｇＧ１のいずれかと３７℃で４時間インキュベートした。
【０２１９】
ＦＡＣＳ緩衝液のみでインキュベートした細胞を、ＩＧＦ−ＩＲ発現の基底レベルを求めるために使用した。
【０２２０】
次に細胞を二回洗浄し、２０μｇ／ｍｌのビオチン化した１２Ｂ１  ＭＡｂをプレートに添加した。受容体の内在化を避けるために４℃で３０分間インキュベートした後、細胞を４℃で３回洗浄し、ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８コンジュゲート（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＢＶ、ライデン、オランダ）の添加により染色した。分解実験では、細胞透過のさらなる工程を、ビオチン化した１２Ｂ１及びストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８コンジュゲートで細胞を染色する前に加えた。
【０２２１】
表３は、Ｉ−３４６６が、４時間のインキュベート期間の後にＭＣＦ−７細胞及びＨＴ２９細胞においてＩＧＦ−ＩＲの下方調節を引き起こすことを示している。細胞をアイソタイプ対照として使用した９Ｇ４  Ｍａｂとインキュベートした場合、下方調節は観察されなかった。
【０２２２】
【表３】
2009502129.tif 000004
【実施例６】
【０２２３】
ＤＵ１４５、ＳＫ−ＥＳ−１、ＨＴ２９、Ａ５４９及びＭＣＦ−７異種移植腫瘍モデルに対するＩ−３４６６  Ｍａｂの抗腫瘍効果
【０２２４】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍の成長に対するＩ−３４６６抗体の活性を研究するために、アンドロゲン非依存性前立腺癌ＤＵ１４５、骨肉腫ＳＫ−ＥＳ−１、結腸癌ＨＴ２９、非小細胞肺癌Ａ５４９及び乳癌ＭＣＦ−７の、５つの異種移植腫瘍モデルを使用した。この目的のために、雌の胸腺が欠損している６〜８週齢のヌードマウスに、ＤＵ−１４５、ＳＫ−ＥＳ−１、ＨＴ２９、Ａ５４９及びＭＣＦ−７をそれぞれ２・１０６、５・１０７、５・１０６、１０・１０６及び５・１０６で皮下注射した。ＤＵ１４５及びＳＫ−ＥＳ−１については、細胞注射の２４時間後に２００μｇの非精製抗体でマウスを処理した。
【０２２５】
処理は一週間に二回繰り返した。ＨＴ２９については、腫瘍が４９〜５９ｍｍ３の容積に達したら処理を開始し、マウスに０．５ｍｇの精製抗体を一週間に三回腹腔内注射した。
【０２２６】
Ａ５４９については、最初の腫瘍容積は３８〜４３ｍｍ３であり、ＭＣＦ−７の実験については、処理の開始時の最初の容積は４２〜５９ｍｍ３であった。腫瘍容積は一週間に一回又は二回評価し、次の式で算出した：π／６×長さ×幅×高さ。
【０２２７】
図６Ａ〜図６Ｅは、精製していない抗体で一部行われた結果を示し、これによりＩ−３４６６が５つの試験した細胞株のｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍の成長を有意に阻害することができることが示される。
【実施例７】
【０２２８】
ヒト化Ｉ−３４６６  ＩｇＧ１抗体のクローニング、産生、及び特徴づけ
【０２２９】
ヒト化抗体Ｉ−３４６６の軽鎖及び重鎖の化学合成された可変領域をＰＣＲ増幅し、ヒトの軽鎖のκ領域及び重鎖のＩｇＧ１定常領域を有する、抗体発現ベクターにクローニングした。ＰＣＲプライマーは３６個のヌクレオチドを含み、そのうちの１５個のヌクレオチドはベクターのオーバーラップしているクローニング領域とのＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎアニーリングのためのものであり、２１個のヌクレオチドは可変領域とのアニーリングのためのものである。正確なヌクレオチド配列を以下に示す。
軽鎖の可変領域のクローニングのために、
ＩＦ−ヒト化Ｉ−３４６６−ＬＣＫ−Ｆ（配列番号２１）
［５’−ＡＣＡＧＡＴＧＣＣＡＧＡＴＧＣＧＡＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣ］、
ＩＦ−ヒト化Ｉ−３４６６−ＬＣＫ−Ｒ（配列番号２２）
［５’−ＴＧＣＡＧＣＣＡＣＣＧＴＡＣＧＣＴＴＧＡＴＣＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＧＣＣ］、
重鎖の可変領域のクローニングのために、
ＩＦ−ヒト化Ｉ−３４６６−ＨＣＧ１−Ｆ（配列番号２３）
［５’−ＡＣＡＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＧＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴ］、
ＩＦ−ヒト化Ｉ−３４６６−ＨＣＧ１−Ｒ（配列番号２４）
［５’−ＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＧＡＴＧＣＧＧＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＣＡＧＧＧＴ］。
【０２３０】
ベクターは、ＢｍｔＩ及びＦｓｐＩ消化で線状化した。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応は製造業者の推奨手順に従って行った。得られたクローンを配列決定して確認した。ヒト胎児腎臓２９３細胞を軽鎖及び重鎖のプラスミドＤＮＡを用いてトランスフェクトした。分泌された抗体を含む培地を回収し、濃縮した。抗体を、プロテインＡ／Ｇカラムを用いてアフィニティー精製し、濃縮し、ＰＢＳ中で透析した。タンパク質濃度をＯＤ２８０ｎｍで求め、純度を還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図９）。
【実施例８】
【０２３１】
ヒト化Ｉ−３４６６  ＩｇＧ１抗体のＢＩＡＣｏｒｅ分析
【０２３２】
装置及び材料
ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ１００機器、ＣＭ５バイオセンサーチップ、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液、酢酸緩衝液（ｐＨ５）、グリシン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ１．５）、アミンカップリングキットは、ＢＩＡｃｏｒｅ（ウプサラ、スウェーデン）から入手した。抗ヒトＩｇＧのＦｃは、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（ウェストグローブ、アメリカ）から入手し、可溶性のヒトインスリン様成長因子−Ｉ受容体（ｈＩＧＦ−ＩＲ）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネアポリス、アメリカ）から入手した。
【０２３３】
Ｂｉａｃｏｒｅアッセイ
全ての実験は、２５℃で流速４０μｌ／分で行った。ＢＩＡｃｏｒｅアッセイを準備するために（図１０を参照）、抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ抗体（酢酸緩衝液中５０μｇ／ｍｌ、ｐＨ５）を、製造業者が記載したアミンカップリング手順を用いて、カルボキシメチルデキストランセンサーチップ（ＣＭ５）上に固定化した。１１０４２及び１１１１１リゾナンスユニット（ＲＵ）の抗ＩｇＧ  Ｆｃ抗体をそれぞれフローセル（ＦＣ）１及びＦＣ３上に連結させた。試験対象の精製Ｍａｂを、０．５％のＰ２０、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中に５μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、５００〜１０００ＲＵとなるようＦＣ３に注射した。ＦＣ１を参照セルとして使用した。特異的なシグナルは、ＦＣ２対ＦＣ１で得られたシグナルの差に対応している。分析物（見かけの分子量が３６５ｋＤａである可溶性ｈＩＧＦ−ＩＲ）を、０．５％のＰ２０、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中の５つの異なる濃度（１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、及び６．２５ｎＭ）で９０秒間注射した。これらの濃度は、０．５％のＰ２０、ＨＢＳ−ＥＰ中の原液から調製した。分析物の解離相を１０分間にわたってモニタリングした。泳動用緩衝液もまた、二重の参照として、同様の条件下で注射した。それぞれのサイクル（抗体＋ｈＩＧＦ−ＩＲの注射）の後、両方のフローセルを２０〜４５μｌのグリシン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ１．５）を注射することにより再生した。この再生は、センサーチップに捕捉された全てのＭａｂ及びＭａｂ／ｈＩＧＦ−ＩＲ複合体を取り除くために十分なものである。
【０２３４】
結果
Ｍａｂヒト化Ｉ−３４６６の、分析物ｈＩＧＦ−ＩＲ−ＥＣＤへの結合は、会合速度定数ｋａ及び解離速度定数ｋｄをそれぞれ特徴とする。平衡解離定数（ＫＤ）は、解離速度定数と会合速度定数との間の比によって算出した。結果は以下の表４に示す。様々な分析物濃度に対応するセンサーグラムは図１１に表されている。
【０２３５】
【表４】
2009502129.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【０２３６】
【図１】モノクローナル抗体Ｉ−３４６６による、［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−１のＩＧＦ−ＩＲへの結合の競合を示す図である。
【図２】モノクローナル抗体Ｉ−３４６６による、［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−２のＩＧＦ−ＩＲへの結合の競合を示す図である。
【図３Ａ】ＩＧＦ１誘導性のＭＣＦ−７の成長に対するＩ−３４６６抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの効果を示す図である。
【図３Ｂ】ＩＧＦ２誘導性のＭＣＦ−７の成長に対するＩ−３４６６抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの効果を示す図である。
【図４Ａ】ＭＣＦ−７細胞におけるＩＧＦ−ＩＲのβ鎖のＩＧＦ１誘導性のリン酸化に対するＩ−３４６６  Ｍａｂの効果を示す図である。
【図４Ｂ】ＭＣＦ−７細胞におけるＩＧＦ−ＩＲのβ鎖のＩＧＦ２誘導性のリン酸化に対するＩ−３４６６  Ｍａｂの効果を示す図である。
【図５Ａ】ＨＴ２９細胞におけるＩＧＦ−ＩＲのβ鎖のＩＧＦ１誘導性のリン酸化に対するＩ−３４６６  Ｍａｂの効果を示す図である。
【図５Ｂ】ＨＴ２９細胞におけるＩＧＦ−ＩＲのβ鎖のＩＧＦ２誘導性のリン酸化に対するＩ−３４６６  Ｍａｂの効果を示す図である。
【図６Ａ】ＤＵ１４５異種移植腫瘍モデルにおけるＩ−３４６６のｉｎ  ｖｉｖｏでの活性を示す図である。
【図６Ｂ】ＳＫ−ＥＳ−１異種移植腫瘍モデルにおけるＩ−３４６６のｉｎ  ｖｉｖｏでの活性を示す図である。
【図６Ｃ】ＨＴ２９異種移植腫瘍モデルにおけるＩ−３４６６のｉｎ  ｖｉｖｏでの活性を示す図である。
【図６Ｄ】Ａ５４９異種移植腫瘍モデルにおけるＩ−３４６６のｉｎ  ｖｉｖｏでの活性を示す図である。
【図６Ｅ】ＭＣＦ−７異種移植腫瘍モデルにおけるＩ−３４６６のｉｎ  ｖｉｖｏでの活性を示す図である。
【図７】マウスＩ−３４６６（配列番号７）及びＣＤＲグラフト化によってヒト化したＩ−３４６６（配列番号２０）の、軽鎖（ＶＬ）の可変領域のアミノ酸配列の比較を示す図である。
【図８】マウスＩ−３４６６（配列番号８）及びＣＤＲグラフト化によってヒト化したＩ−３４６６（配列番号２１）の、重鎖（ＶＨ）の可変領域のアミノ酸配列の比較を示す図である。
【図９】精製したＩ−３４６６抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。
【図１０】バイオセンサー捕捉アッセイの概略図である。
【図１１】５つの異なる濃度のｈＩＧＦ−ＩＲ−ＥＣＤについての、ＩｇＧ１ヒト化Ｉ−３４６６／ｈＩＧＦ−ＩＲ−ＥＣＤ複合体の会合相及び解離相のセンサーグラムを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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