(57)【要約】  本発明は、酸性多糖類及びキトサンのオリゴ糖誘導体などの塩基性多糖類の誘導体の混合物の水溶液から取得可能なハイドロゲル（又は３Ｄマトリックス）の調製について述べる。この溶液は、生物医学及び医薬分野に使用するための、溶液又は懸濁液の形態の、単離され又は多細胞会合の状態の細胞、又は医薬的に活性な分子をカプセル化する目的として、化学的又は生理的ゲル化剤を用いて、適当にゲル化される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイドロゲルからなる組成物であって、
前記ハイドロゲルは、少なくともひとつの離液性又はサーモトロピックなアニオン性多糖類と、少なくともひとつのキトサンのオリゴ糖誘導体との混合物の水溶液から、前記混合物中に含まれる離液性又はサーモトロピックなポリアニオン多糖類をゲル化し得る化学剤又は物理剤で処理することにより、取得可能であり、
前記のキトサンの誘導体は、少なくとも４０％の誘導体化率を有し、
前記の多糖類の混合物の水溶液は、前記の多糖類の混合物の水溶液を、少なくとも５０ｍＭを超え１７５ｍＭを超えないイオン強度と、少なくとも７のｐＨとを有することを特徴とするハイドロゲルからなる組成物。
【請求項２】
前記のキトサンのオリゴ糖誘導体は、５０％〜８０％の誘導体化率を有することを特徴とする請求項１に記載のハイドロゲルからなる組成物。
【請求項３】
前記のキトサンのオリゴ糖誘導体は、７０％の誘導体化率を有することを特徴とする請求項２に記載のハイドロゲルからなる組成物。
【請求項４】
前記のキトサンのオリゴ糖誘導体は、キトサンの、１〜４のグリコシド単位を有するオリゴ糖を用いた誘導体化により、取得可能であることを特徴とする請求項１に記載のハイドロゲルからなる組成物。
【請求項５】
前記のキトサンのオリゴ糖誘導体は、キトサンの、２〜４のグリコシド単位を有するオリゴ糖を用いた誘導体化により、取得可能であることを特徴とする請求項１に記載のハイドロゲルからなる組成物。
【請求項６】
前記オリゴ糖は、ラクトース、セロビオース、セロトリオース、マルトース、マルトリオース、マルトテトラオース、チトビオース、チトトリオース、メリビオースからなる群から選択されることを特徴とする請求項５に記載のハイドロゲルからなる組成物。
【請求項７】
前記オリゴ糖は、ラクトースであることを特徴とする請求項６に記載のハイドロゲルからなる組成物。
【請求項８】
前記キトサンは、１，５００ｋＤａ以下の平均分子量を有することを特徴とする請求項４乃至７のいずれか一項に記載のハイドロゲルからなる組成物。
【請求項９】
前記キトサンは、４００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａの平均分子量を有することを特徴とする請求項８に記載のハイドロゲルからなる組成物。
【請求項１０】
前記離液性のアニオン性多糖類は、カラギーナン、ペクチン酸塩及びペクチネート、アルギン酸塩、ゲラン、ラムサン、ウェラン、キサンタンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載のハイドロゲルからなる組成物。
【請求項１１】
前記離液性のアニオン性多糖類は、アルギン酸塩であることを特徴とする請求項１０に記載のハイドロゲルからなる組成物。
【請求項１２】
前記サーモトロピックなアニオン性多糖類は、部分的に硫酸化されたアガロース、カラギーナン、硫酸セルロース、ゲラン、ラムサン、ウェラン、キサンタンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載のハイドロゲルからなる組成物。
【請求項１３】
前記のアニオン性多糖類は、２，０００ｋＤａ以下の平均分子量を有することを特徴とする請求項１０乃至１２のいずれか一項に記載のハイドロゲルからなる組成物。
【請求項１４】
前記のアニオン性多糖類は、１００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａの平均分子量を有することを特徴とする請求項１３に記載のハイドロゲルからなる組成物。
【請求項１５】
前記のアニオン性多糖類は、２００ｋＤａの平均分子量を有することを特徴とする請求項１４に記載のハイドロゲルからなる組成物。
【請求項１６】
前記の少なくともひとつの離液性又はサーモトロピックなアニオン性多糖類と、少なくともひとつのキトサンのオリゴ糖誘導体との混合物は、キトサンのオリゴ糖誘導体に対するアニオン性多糖類の重量比が３：１〜１：１の範囲で、アニオン性多糖類及びキトサンのオリゴ糖誘導体を有することを特徴とする請求項１に記載のハイドロゲルからなる組成物。
【請求項１７】
前記の少なくともひとつの離液性又はサーモトロピックなアニオン性多糖類と、少なくともひとつのキトサンのオリゴ糖誘導体との混合物の水溶液は、３％ｗ／ｖ以下のポリマー濃度を有することを特徴とする請求項１に記載のハイドロゲルからなる組成物。
【請求項１８】
前記の少なくともひとつの離液性又はサーモトロピックなアニオン性多糖類と、少なくともひとつのキトサンのオリゴ糖誘導体との混合物の水溶液は、１．５％〜３％ｗ／ｖの範囲のポリマー濃度を有することを特徴とする請求項１７に記載のハイドロゲルからなる組成物。
【請求項１９】
前記の少なくともひとつの離液性又はサーモトロピックなアニオン性多糖類と、少なくともひとつのキトサンのオリゴ糖誘導体との混合物の水溶液は、２％ｗ／ｖのポリマー濃度を有することを特徴とする請求項１８に記載のハイドロゲルからなる組成物。
【請求項２０】
前記の少なくともひとつの離液性又はサーモトロピックなアニオン性多糖類と、少なくともひとつのキトサンのオリゴ糖誘導体との混合物の水溶液は、７〜８の範囲のｐＨを有することを特徴とする請求項１に記載のハイドロゲルからなる組成物。
【請求項２１】
前記の少なくともひとつの離液性又はサーモトロピックなアニオン性多糖類と、少なくともひとつのキトサンのオリゴ糖誘導体との混合物の水溶液は、１５０ｍＭのイオン強度を有することを特徴とする請求項１に記載のハイドロゲルからなる組成物。
【請求項２２】
前記の多糖類の水溶液のイオン強度は、０．０５Ｍ〜０．１７５Ｍの範囲の前記水溶液中の濃度を得るように、ＮａＣｌを添加することにより、取得可能であることを特徴とする請求項１に記載のハイドロゲルからなる組成物。
【請求項２３】
前記の多糖類の水溶液のイオン強度は、０．１５Ｍの前記水溶液中の濃度を得るように、ＮａＣｌを添加することにより、取得可能であることを特徴とする請求項２１に記載のハイドロゲルからなる組成物。
【請求項２４】
前記の少なくともひとつの離液性又はサーモトロピックなアニオン性多糖類と、少なくともひとつのキトサンのオリゴ糖誘導体との混合物の水溶液は、非イオン性溶質のさらなる添加により、２５０ｍＭ〜３５０ｍＭの範囲のオスモル濃度を有することを特徴とする請求項１に記載のハイドロゲルからなる組成物。
【請求項２５】
前記離液性のアニオン性多糖類をゲル化し得る化学剤は、１０ｍＭを超える濃度の一価、二価又は三価のイオンの水溶液であることを特徴とする請求項１に記載のハイドロゲルからなる組成物。
【請求項２６】
前記のゲル化剤が一価のイオンの水溶液である場合、カリウム、ルビジウム、セシウム、タリウム、銀及びこれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項２５に記載のハイドロゲルからなる組成物。
【請求項２７】
前記のゲル化剤が二価のイオンの水溶液である場合、カルシウム、バリウム、ストロンチウム、銅、鉛、マグネシウム、マンガン、亜鉛及びこれらの混合物から選択され、ただし、前記アニオン性多糖類がアルギン酸塩又はペクチン酸塩である場合、この二価カチオンは、マグネシウムではないことを特徴とする請求項２５に記載のハイドロゲルからなる組成物。
【請求項２８】
前記のゲル化剤が三価のイオンの水溶液である場合、アルミニウム、鉄、ガドリニウム、テルビウム、ユーロピウム及びこれらの混合物から選択されることを特徴とする請求項２５に記載のハイドロゲルからなる組成物。
【請求項２９】
前記の一価、二価又は三価のイオンの水溶液は、１０ｍＭ〜１００ｍＭの範囲の濃度を有することを特徴とする請求項２５に記載のハイドロゲルからなる組成物。
【請求項３０】
前記の一価、二価又は三価のイオンの水溶液は、５０ｍＭ又は１００ｍＭの範囲の濃度を有することを特徴とする請求項２９に記載のハイドロゲルからなる組成物。
【請求項３１】
前記の一価、二価又は三価のイオンの水溶液は、イオン性オスモライト又は非イオン性オスモライトのさらなる添加により取得可能な０．３Ｍ以下のオスモル濃度を有することを特徴とする請求項２５乃至３０のいずれか一項に記載のハイドロゲルからなる組成物。
【請求項３２】
前記サーモトロピックなアニオン性多糖類をゲル化し得る物理剤は、４０℃を上回らず、１０℃を下回らない温度であることを特徴とする請求項１に記載のハイドロゲルからなる組成物。
【請求項３３】
前記サーモトロピックなアニオン性多糖類をゲル化し得る物理剤は、２０℃の温度であることを特徴とする請求項３２に記載のハイドロゲルからなる組成物。
【請求項３４】
細胞及び／又は活性化合物をさらに導入したことを特徴とする請求項１乃至３３のいずれか一項に記載のハイドロゲルからなる組成物。
【請求項３５】
ａ）少なくともひとつの離液性又はサーモトロピックなアニオン性多糖類と、少なくともひとつのキトサンのオリゴ糖誘導体との混合物の水溶液を調製するステップであって、前記キトサン誘導体は、少なくとも４０％の誘導体化率を有し、且つ前記水溶液は、少なくとも５０ｍＭであり１７５ｍＭを超えないイオン強度を有し、少なくともｐＨ７を有する、ステップであり、その後、任意で、調製された多糖類溶液に、細胞及び／又は活性化合物を添加するステップと；
ｂ）ステップａ）で調製した溶液を、必要なハイドロゲルの形態を得るための適当な手段により、離液性のアニオン性多糖類用の架橋イオンを含有するゲル化溶液に添加するか、サーモトロピックなポリアニオン用の適当な温度とするかするステップと；
ｃ）適当な方法により、形成したハイドロゲルを除去し、任意で、細胞及び／又は活性化合物を導入するステップと；
を少なくとも有する調製方法により取得可能であることを特徴とするハイドロゲルからなる組成物。
【請求項３６】
前記ハイドロゲルは、請求項３５の調製方法により取得可能であることを特徴とする請求項２乃至３４のいずれか一項に記載のハイドロゲルからなる組成物。
【請求項３７】
ａ）少なくともひとつの離液性又はサーモトロピックなアニオン性多糖類と、少なくともひとつのキトサンのオリゴ糖誘導体との混合物の水溶液を調製するステップであって、前記キトサン誘導体は、少なくとも４０％の誘導体化率を有し、且つ前記水溶液は、少なくとも５０ｍＭであり１７５ｍＭを超えないイオン強度を有し、少なくともｐＨ７を有する、ステップであり、その後、任意で、調製された多糖類溶液に、細胞及び／又は活性化合物を添加するステップと；
ｂ）ステップａ）で調製した溶液を、必要なハイドロゲルの形態を得るための適当な手段により、離液性のアニオン性多糖類用の架橋イオンを含有するゲル化溶液に添加するか、サーモトロピックなポリアニオン用の適当な温度とするかするステップと；
ｃ）適当な方法により、形成したハイドロゲルを除去し、任意で、細胞及び／又は活性化合物を導入するステップと；
を少なくとも有することを特徴とするハイドロゲルを調製する方法。
【請求項３８】
請求項２乃至３４のいずれか一項に記載のハイドロゲルを調製するための、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ハイドロゲルは、マイクロカプセル、円筒形又は円盤状の形態を有することを特徴とする請求項３８に記載のハイドロゲルを調製する方法。
【請求項４０】
ヒト又は非ヒトの生物医学の分野に適用するための、請求項１乃至３６のいずれか一項に記載のハイドロゲルの使用。
【請求項４１】
組織工学に使用するための、細胞を導入する請求項４０に記載のハイドロゲルの使用。
【請求項４２】
化合物の遅延型又は制御型放出に使用するための、活性化合物を導入する請求項４０に記載のハイドロゲルの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲル化剤で適当にゲル化された、酸多糖類及びキトサンのオリゴ糖などの塩基性多糖類の誘導体の混合物の水溶液から得たハイドロゲル（３Ｄマトリックス）、及びその生物医学領域への使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に生体適合性を有するポリマーである多糖類は、広範に研究されており、生物学的に活性な化合物及び細胞などの組織工学用の生物学的物質の両方のキャリアとして生物医学分野で種々の適用例にしばしば使用されてきている。この工程は、当業者に公知であるように、カプセル化又はマイクロカプセル化、つまり、材料自体の三次元ポリマーマトリックスを封入することにより、得られる。多糖類をマイクロカプセル化に適するようにする特徴は、水溶液及び特定の条件下で、全ての点で三次元ポリマーマトリックスであるハイドロゲルを形成する公知の能力である。特に、組織工学は、細胞をカプセル化する目的で多糖類を使用することが未だ広範な研究対象である領域であって、生命工学の研究において最も革新的な態様のもののひとつである。この技術は、交換型の移植手術から、生物材料を用いた再生型の外科手術へと移行する必要性から生じたものであって、元の組織の構造的及び生理的な再生を行うとともに、代謝活性の完全な回復、並びに移植細胞から生成したこの新規の組織周囲の組織との生理的且つ機能的一体化を行うように、同様の組織細胞の再生を惹起する。
【０００３】
組織工学の適用の分野は多数あり、特定の治療領域について、この手法は、実験の連結（例えば、人工皮膚）に依存し得る。生命工学の分野における技術的な進歩は、それほど探索されていない領域を含む、組織工学における広範な発展を可能としている。これらとしては、弱体化する関節軟骨病態の治療用の組織工学の使用が挙げられる。
【０００４】
この治療分野において、最も周知の発達の問題に加えて、関節の再生外科の領域内の有意な問題である、細胞の成長及び増殖用の最適な空間的且つ代謝的な状況を再形成することを可能とする生体適合性を有するシステムは、それ自体を実際に移植する前にその管理及び拡張を可能とするｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける軟骨細胞を提供することである。さらに、軟骨細胞の培養は、分化の工程、並びに生理的条件又は病態条件に関連したものにおける代謝的及び機能的改変を伴う分子工程を研究する最も可能性の高い手段である。軟骨細胞の培養を使用することの主要な制限は、マトリックスから単離された後のこれらの細胞が、線維芽細胞に脱分化する顕著な傾向を示すことである。分化工程に関与し又は惹起する因子としては、本質的に：接着する培養システム、低い細胞密度、サイトカインなどの炎症性因子の存在、細胞の不死化が挙げられる。これらの条件下、細胞は、数日の後に、軟骨細胞の発現型として典型的な円形の形状を急速に消失し、線維芽細胞の典型的な細長い形状となる。この発現型の改変は、コラーゲンＩＩやコラーゲンＸなどの特定の軟骨細胞のマーカー、アグリカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）などの高分子量のプロテオグリカンの下方制御された発現とともに、コラーゲンＩ及びビグリカンやデコリンなどのプロテオグリカンの同時期の発現増加を伴う。軟骨細胞の分化プロセスを回避又は制限するため、効果的な培養方法を構築するため、２０年来多くの努力がなされてきた。これらは、３Ｄアルギン酸塩、アガロース又はコラーゲンマトリックス内（単にこれらの上に接着するものではない）での培養システムを有する。これらの手法が軟骨細胞の発現型の維持性を向上可能であるものの、これらのなかで、細胞は、利用可能な細胞マトリックスの量に対比して、非常に低い成長性と複製率を示すに過ぎない。
【０００５】
後述するが、マイクロカプセル中に細胞を捕捉するために最も利用されている材料のひとつは、アルギン酸塩である。用語アルギン酸塩は、藻類及びバクテリアから産生された多糖類のファミリーをいう（非特許文献１）。これは、β−Ｄ−マンヌロン酸と、α−Ｌ−グルロン酸とからなり、多糖類鎖に沿って、ブロック構造中に配置された１→４結合で結合されている。カルボキシル基が存在するため、カルボキシル基を有するその他の多糖類と同様、アルギン酸塩は、生理的ｐＨにおいてポリアニオンである。さらに、この多糖類は、全体的に生体適合性を有し（非特許文献２）、一方、工業及び生物医学分野における適用に最も重要な生理的特徴は、典型的にはカルシウムである二価イオンを含有する溶液と接触するハイドロゲルを形成する能力に関連する。この点、このイオンを有する濃縮されたアルギン酸塩溶液の単純な処理により、瞬間的にハイドロゲルを形成する。公知の細胞のマイクロカプセル化の手法は、アルギン酸塩及び細胞懸濁液を、カルシウムを含有する浴に投入することと、種々の物理的方法によりマイクロカプセルの径を制御することとからなる。ゲルの瞬間的な形成により、その内部に細胞を捕捉することが可能となる。関節軟骨の修復のための軟骨細胞のマイクロカプセル化の場合、アルギン酸塩の使用に対する制約は、内部における細胞の複製活性の欠如に主として起因する。より最近では、この場合、塩基性であるその他の多糖類は、生物学的材料のマイクロカプセル化の分野において、可能性のある使用における特定の量の興味の対象を刺激し、これは、アルギン酸塩のような多量の量で生体適合性と利用性を有する。これは、キトサンである。キトサンは、５０〜１，５００ｋＤａの分子量の塩基性多糖類であって、Ｎ−アセチル−グルコサミン単位で散在されたＤ−グルコサミン（ＧｌｃＮＨ２）残基の鎖からなり、全て、β１→４結合で結合されているものである。これは、通常、中性又は塩基性の水溶液に不溶性である；ｐＨ≦５の酸性溶液では、フリーのアミノ基は、ポリマーを溶解性を有するようにプロトン化されている。このポリマーは、既に、医療分野に広く使用されており、低い免疫反応性、病態反応性及び感染反応性を示す（非特許文献３及び４）。キトサンは、物理−化学的特性故、生体材料として使用するのに理想的な全ての特徴を有しており、溶液中での高い密度での正電荷、細胞に移植され得る多孔性構造を得ることができるという高い加工性が挙げられる。最近の研究は、キトサンの生物学的効果を促進する方法を提供することに焦点が向けられている。特に、（生物）化学的改変により、ポリマーの正電荷性の増加、又はその生物学的利用能の改変を目的として、最も多くの努力が払われている。生体材料として使用するのに必要な特性を有するキトサンは、まさに、誘導体の形態である。最近の研究で実際に示されているように、ラクトースを用いたキトサンの特定の誘導体は、生体適合性を有し、且つ初代培養における軟骨細胞の凝集を誘導可能であるとともに、その内部で、ＩＩ型コラーゲンやアグリカンなどの軟骨組織の特徴マーカーの形成を刺激する（非特許文献５）。
【０００６】
例えば反応性アミノ化反応を介してラクトース単位を挿入することにより、多糖類側鎖基を用いたキトサンの改変は、公知であって、Ｈａｌｌ，Ｌ．Ｄ．及びＹａｌｐａｎｉ，Ｍ．の特許文献１に報告されるように、多糖類誘導体の水における溶解性を増大させる。特許文献１は、キトサンのラクトース誘導体が、３〜５％を超える濃度の水溶液中で堅いゲルを与えるが、塩又は酸（特に、Ｃａ、Ｃｒ、Ｚｎ塩化物、Ｋクロム酸塩、ボロン酸）、及びこれらを組み合わせた混合物では、ゲルでも沈殿物でもない旨、言及している。再び、特許文献１は、セロビオースなどの他のオリゴ糖を用いて誘導体化されたキトサンが、水溶液中ではそれ自体でゲルを形成しないが、アルギン酸塩と混合した場合に堅いゲルを形成する旨、言及している。このゲルの形成は、上記のポリカチオンの正電荷と、マイクロカプセル化を制限する工程である液滴形成のシステムをもたらすポリアニオンの負電荷との強力な相互作用に起因する。
【０００７】
生物学的材料又は生物学的に活性な化合物を導入するのに適した三次元ポリマーマトリックスを得る目的で、これらのマトリックスは、水溶液において良好な溶解性を好ましく有すべきであり、斯かるマトリックスは、いずれにしても、不溶性の沈殿物を生じることなく水溶液中で一定程度の分散性を有する必要があり、マイクロカプセル化に適した三次元構造を確保する。
【０００８】
上記を克服するため、これらのマトリックスの物理−化学的特徴を向上するように、多糖類の混合物、改変され及び／又は架橋された多糖類の使用を有する種々の系について、述べられている。
【０００９】
特に、Ｇｒｉｆｆｉｔｈ−Ｃｉｍａ，Ｌ．ら著の特許文献２は、注入可能な多糖類−細胞組成物について述べており、ここでは、本質的にはヒアルロン酸である他の多糖類と組み合わせたアルギン酸塩を使用して、組織工学用の細胞のカプセル化に適したハイドロゲルを得ることを提供している。単離した細胞を移植するためのハイドロゲルを形成する目的に適したポリマーは、最も多様であり、イオン（好ましくは二価又は三価）からなる架橋剤で架橋され、ｐＨ及び温度が変化する。架橋のためのイオンの濃度は、０．００５Ｍを下回らない。また、このハイドロゲルは、ポリエチレンアミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン及びポリリジン（ｐｏｌｙｓｉｎｅ）などの合成ポリアミンから選択されたポリカチオンで複合体化され、及び安定化されてもよい。
【００１０】
同様に、Ｈｕｂｂｅｌｌ，Ｊの特許文献３は、架橋剤を用いて架橋されたポリマーから形成されたハイドロゲルについて述べており、イオン、ｐＨ及び温度の変化、ラジカル開始剤及び酵素について、述べている。ポリマーは、多糖類を含むと参照されており、後者は、改変されたアルギン酸塩、改変されたヒアルロン酸、ゲラン及びカラギーナンから選択され得る。
【００１１】
Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．Ｓ．らの特許文献４は、薬物送達及び組織工学用の相互貫入ポリマーネットワーク（ＩＰＮｓ）又は半相互貫入ポリマーネットワークについて述べる。このＩＰＮｓは、好ましくは、親水性、イオン性又は共有結合性の架橋ポリマーハイドロゲルの形態の溶液からなり、イオン架橋性ポリマーとしては：ヒアルロン酸、デキストラン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、アルギン酸塩、ゲラン及びカラギーナンが挙げられ、一方、共有結合性架橋ポリマーとしては、イソシアネートで架橋されたキトサンが挙げられる。ＩＰＮｓは、相互ではなく架橋された２つのポリマー成分から形成され、一方、半ＩＰＮｓは、２つの成分を有し、そのうちのひとつのみが架橋され、決して相互に架橋されているものではない。好ましくは、また、排他的でなく、ポリマーの架橋は、ラジカル光開始剤の光活性化により、達成される。この点、ポリマー組成物は、光開始剤による共有結合的に架橋されたポリマーから、又は放射線に曝露された際に半ＩＰＮｓを形成する共有結合及びイオン性で架橋可能なポリマー又は親水性ポリマーの混合物から形成されてもよい。
【００１２】
Ｓｅｖｅｒｉａｎ，Ｄらの特許文献５は、酸多糖類と塩基性多糖類との間のイオン性複合体について報告しており、特に、キトサンとキサンタンとの液滴形成、側鎖に負電荷を有する多糖類、不溶性のハイドロゲルを得るようにこれらを使用したものの特徴について、報告している。
【００１３】
Ｗｈｉｔｅ、Ｂ．Ｊ．らの特許文献６は、塩基性多糖類の架橋された水溶性誘導体と、非架橋のアニオン性多糖類とを有する組成物からなる相互貫入ポリマーネットワーク又は半相互貫入ポリマーネットワークの調製について述べている。特に、このＩＰＮｓは、ヒアルロン酸を、架橋Ｎ−カルボキシメチル、Ｏ−カルボキシメチル、Ｏ−ヒドロキシエチルキトサン誘導体と、又は部分的にアセチル化されたキトサンと混合することにより、得られる。これらのキトサン誘導体は、本願発明者によるように、鎖上に種々の正電荷を有さず、且つイオン性複合体の形成を回避するようなｐＨ条件下で溶解されるので、ヒアルロン酸と溶液中で混合されてもよい。この様式において、ポリアニオンを用いた液滴形成は、ポリマーのうちのひとつの電荷の完全な除去又は電荷の補完により、回避される。従って、これらは、ポリアニオン／中性多糖類、又はポリアニオン／両性高分子電解質の溶液である。
【００１４】
上記の事項にもかかわらず、細胞を導入し細胞の発現型を保持し得る生体適合性を有すると同時に成長及び複製を可能とするシステムを提供するという問題は、上述の通り、未だ解決されていない。
【特許文献１】米国特許第４，４２４，３４６号明細書
【特許文献２】国際公開第９４／２５０８０号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９６／４０３０４号パンフレット
【特許文献４】米国特許第６，２２４，８９３号パンフレット
【特許文献５】米国特許第５，６２０，７０６号明細書
【特許文献６】国際公開第２００５／０６１６１１号パンフレット
【非特許文献１】Ｓａｂｒａ  Ｗ．ら著、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００１年、５６巻、ｐ．３１５−２５
【非特許文献２】Ｕｌｕｄａｇ  Ｈ．ら著、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．、２０００年、４２巻、ｐ．２９−６４
【非特許文献３】Ｓｕｈ  Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｊ．Ｋ．、及びＭａｔｔｈｅｗ  Ｈ．Ｗ．Ｔ．著、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２０００年、２１巻、ｐ．２５８９−２５９８
【非特許文献４】Ｍｉｙａｚａｋｉ  Ｓ．ら著、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、１９８１年、２９巻、ｐ．３０６７−３０６９
【非特許文献５】Ｄｏｎａｔｉ，Ｉ．ら著、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００５年、２６巻、ｐ．９８７−９９８
【非特許文献６】Ｓｔｒａｎｄら著、Ｊ．ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ、２００２年、１９巻、ｐ．６１５−６３０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
従って、本発明の第一の目的は、細胞の生存だけでなく、それらの表現型の特徴、成長性及び複製性の保持を確保し得る、組織工学用の生体適合性システムを構築することである。
【００１６】
さらなる目的は、化学的手法に付することなく、且つこのシステムを調製するのに複合的な手法を必要とすることなく、容易に入手し得る市販の多糖類を使用することにより、上記のシステムを提供することである。
【００１７】
さらなる目的は、使用上の種々の要件に沿って容易に使用可能であり、且つ健常な技術者によるさらなる手法を必要とすることなく、細胞キャリアとして、ハイドロゲル又は３Ｄマトリックスの形態の生体適合性システムを提供することである。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、使用上の種々の要件に沿って容易に使用可能な、薬物キャリアとしての、ハイドロゲル又は３Ｄマトリックスの形態の生体適合性システムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
上記の目的を実行するため、本願発明者らは、不溶性の液滴形成を生じることなく、アニオン性多糖類と物理的に混合した場合、適当な条件下で上記の多糖類の水溶液を提供する塩基性多糖類の適当な誘導体を同定した。
【００２０】
この混合物の水溶液は、適当なゲル化剤でその後ゲル化可能であって、運搬されるべき細胞又は薬物が導入され得る三次元のハイドロゲル又はマトリックスを得る。本発明の３Ｄマトリックスを調製するための多糖類の混合物は、アニオン性多糖類と、キトサンのオリゴ糖誘導体とを有する。
【００２１】
驚くべきことに、ポリアニオン性の多糖類とポリカチオン性の多糖類誘導体との上記の物理的な混合物が水性環境で溶解された組成物を生じることに加えて、この組成物は、適当なゲル化剤で処理した際、細胞をマイクロカプセル化し得るハイドロゲルを生じ、この内部で、細胞は、その発現型を保持し、且つ増殖し得る。
【００２２】
アルギン酸塩がこの使用に関して多くの利点を有するにもかかわらず、マイクロカプセル化の技術は、イオンの溶液（離液性（ｌｙｏｔｒｏｐｉｃ））又は冷却溶液（サーモトロピック（ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｐｉｃ））と瞬間的に接触するハイドロゲルを形成する全てのイオン性多糖類で効果的に実行され得る。最初に述べた多糖類のクラスには、例えば、アルギン酸塩とともに、ペクチン酸塩及びカラギーナンが含まれる。多糖類の第二のクラスには、例えば、カラギーナンとともに、アガロース（部分的に硫酸化されているもの）及びゲランが含まれる。
【００２３】
従って、本発明の第一の態様は、少なくともひとつの離液性又はサーモトロピックなアニオン性多糖類と、少なくともひとつのキトサンのオリゴ糖誘導体との混合物の水溶液から得られることを特徴とするハイドロゲルからなる組成物であって、このキトサン誘導体は、上記の多糖類の混合物の水溶液を、混合物自体に有する上記の離液性又はサーモトロピックなポリアニオン性多糖類をゲル化し得る試薬で処理することにより、少なくとも４０％の誘導体化率を有し、且つ上記の水溶液が、少なくとも５０ｍＭであり１７５ｍＭを超えないイオン強度を有し、少なくともｐＨ７を有する。
【００２４】
本発明の他の態様は、上記の組成物を調製する方法である。
【００２５】
本発明のさらなる態様は、組織工学に用いるための細胞のマイクロカプセル化用、又は生体臨床医学に用いるための活性化合物のマイクロカプセル化用の上記組成物の使用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
（定義）
用語「ハイドロゲル」又は「複数のハイドロゲル」は、変形にさらされない場合に形態及び寸法を維持し得る、高度に水和された半固形の構造を示す。ハイドロゲルは、適当に架橋された多糖類の濃縮溶液から取得可能である。
【００２７】
用語「３Ｄマトリックス」又は「三次元マトリックス」は、変形にさらされない場合に形態及び寸法を維持し得る固形又は半固形の構造を示す。３Ｄマトリックスは、適当に架橋された多糖類の濃縮溶液から取得可能である。
【００２８】
従って、用語「複数のハイドロゲル」又は「３Ｄマトリックス」は、以下に示す本発明の詳細な説明の目的に関して、同様のものと考慮されるべきである。
【００２９】
用語「マイクロカプセル化」は、生物学的又はその他の材料を、排他的ではなく、通常、第一の場合（つまり、離液性の多糖類）に適当なイオンを用いて、且つ第二の場合（つまり、サーモトロピックな多糖類）に冷却した溶液を用いて処理した後に、離液性又はサーモトロピックな多糖類から形成されたミリメートルサイズ又はマイクロメートルサイズの球形の形態のハイドロゲルの内部に封入する工程を示す。
【００３０】
（記述）
本発明のゲル化された多糖類の少なくとも二成分の溶液から取得可能な三次元マトリックスの目的及び利点は、下記の詳細な記載を通じて、良好に理解されるであろうところ、ここでは、非限定的に示す目的をもって、ハイドロゲル及びその物理−化学的特徴の数例を、この内部にカプセル化された単離された細胞の有する生物学的適合性／生物学的特性とともに、述べる。
【００３１】
続行した目的に関し、生理的マーカーの観点で、細胞、特に軟骨細胞を培養するより効果的な方法を開発するための細胞外マトリックスと最も近似した、特徴を保持する細胞マイクロカプセル化用の生体材料を同定し計画することに関する数次の思想を述べる。特に、組織工学で既に広く用いられているバイオポリマー、即ち、上述のオリゴ糖で改変された、アルギン酸塩やキトサンなどの酸性多糖類を用いた。しかしながら、アニオン性の多糖類と塩基性多糖類との組合せは、上述の通り、生物学的材料の封入に適した三次元構造を喪失することを伴う、システムの液滴形成をもたらす可能性がある。従って、液滴形成は、生物学的材料又は生物学的に活性な分子のマイクロカプセル化には全ての面で欠点を構成する。事実、マイクロカプセル化に関し、出発物質である多糖類の溶解性処方を使用することは、非常に重要で、当業者に公知なように、ポリマー溶液を、適当な架橋イオンを含有する溶液に滴下で添加することにより、ハイドロゲル中で特徴が変化する細胞や化合物などの生物学的材料を捕捉することが可能であるためである。液滴形成が起こり、又はポリマー溶液が形成されると、架橋イオンの溶液と接触することにより、生物学的材料自体を包含し得ない繊維状の沈殿物の形成が起こる。従って、イオン含有溶液又は冷却溶液であるゲル化剤と適当に処理される二成分の多糖類の混合物に関する溶解性の範囲を同定することは重要であって、ハイドロゲルの形成を生じる。
【００３２】
従って、本発明の目的を実行し、且つ特許文献１に報告の事項とは反対に、本発明の３Ｄマトリックスを得るのに必要な多糖類の組成物は、適当な条件下で、水溶液中に溶解性を有し、且つ不溶性の液滴形成を生じないことを特徴とする、アニオン性の多糖類とキトサンのオリゴ糖誘導体との少なくとも二成分の混合物を有する。この点、本願発明者らは、少なくともひとつのアニオン性多糖類と、少なくともひとつのキトサンのオリゴ糖誘導体とを水溶液に有する混合物であって、少なくとも４０％の誘導体化率を有するキトサン誘導体であり、溶液のｐＨが生理的範囲、特に７〜８であり、且つ特に少なくとも５０ｍＭ以上であり１７５ｍＭを超えない適当なイオン強度を有するものが、この２つの多糖類の液滴形成をもたらさず、従って、溶液の状態を保持することを、驚くべきことに見出した。これらの条件において、アニオン性及びカチオン性多糖類は、ポリマーの全濃度が３％まで、水性環境下で、液滴形成も、沈殿物も生じない。
【００３３】
本発明の目的は、全ての好適な態様及びその派生物において、本願において援用するイタリア国特許出願番号ＰＤ２００６Ａ０００２０２に述べる上記の観察に起因するものである。
【００３４】
三次元ハイドロゲル又はマトリックスの形成は、ポリアニオン性多糖類をゲル化し得る適当なゲル化剤で処理することにより、上記の二成分の溶液から取得可能である。
【００３５】
この点、本発明は、少なくともひとつの離液性又はサーモトロピックなアニオン性多糖類と、少なくともひとつのキトサンのオリゴ糖誘導体との混合物の水溶液から取得可能なハイドロゲルからなる組成物を提供し、ここで、上記のキトサン誘導体は、少なくとも４０％の誘導体化率を有し、上記の水溶液は、上記の混合物自体の離液性又はサーモトロピックなアニオン性の多糖類のゲル化剤でゲル化することにより、少なくとも５０ｍＭで１７５ｍＭを超えないイオン強度を有し、少なくとも７のｐＨを有する。このポリアニオン性多糖類のゲル化工程により、上記のキトサン誘導体は、ハイドロゲル中に捕捉される。従って、少なくともひとつの離液性又はサーモトロピックなアニオン性多糖類と、少なくともひとつのキトサンのオリゴ糖誘導体との混合物の水溶液のゲル化から得られるハイドロゲルであって、少なくとも４０％の誘導体化率を有し、且つ上記の水溶液が、少なくとも５０ｍＭであり１７５ｍＭを超えないイオン強度を有し、少なくともｐＨ７を有するものは、キトサン誘導体を捕捉した網状の離液性又はサーモトロピックなアニオン性多糖類により、形成される。
【００３６】
本発明のハイドロゲルを調製するため、キトサンは、１〜４のグリコシド単位を有するオリゴ糖で誘導体化されてもよく、好適な態様において、このオリゴ糖は、２〜４のグリコシド単位を有し、より好ましくは、ラクトース、セロビオース、セロトリオース、マルトース、マルトテトラオース、チトビオース（ｃｈｉｔｏｂｉｏｓｅ）、チトトリオース、メリビオースからなる群から選択される。上記のオリゴ糖誘導体を得るのに使用し得るキトサンの平均分子量（以下、公知のＭＷとして表記）は、１，５００ｋＤａに達してもよく、好ましくは、４００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａの範囲であってもよい。また、本発明の目的のため、キトサンのアミン基の上記オリゴ糖による置換の度合いは、４０〜４５％（〜４５％）以上である必要がある。好ましくは、キトサンのアミン基のオリゴ糖による置換の度合いは、５０〜８０％の範囲であり、より好ましくは７０％である。
【００３７】
キトサンの上記オリゴ糖誘導体の調製工程は、公知の方法であって、酢酸（ｐＨ４．５）及びメタノール中にキトサンを有する溶液を、シアノ水素化ホウ素の存在下、ラクトースなどの還元糖で処理することからなる。キトサンのアミン基とラクトースのアルデヒド基との相互作用により、シッフ塩基として知られる不安定な中間体が形成する。これは、水素化ホウ素の存在により、安定な第二級アミンを形成する。
【００３８】
ポリアニオン性多糖類について、本発明のハイドロゲルは、離液性のアニオン性多糖類を有する多糖類混合物で取得され得る。この場合、好適な態様において、カラギーナン、ペクチン酸塩、ペクチネート（ｐｅｃｔｉｎａｔｅ）、アルギン酸塩、ゲラン、ラムサン（ｒｈａｍｓａｎ）、ウェラン、キサンタンからなる群から選択され、又はサーモトロピックなアニオン性多糖類を有し、これは、部分的に硫酸化されたアガロース、カラギーナン、セルロース、硫酸セルロース、ゲラン、ラムサン、ウェラン、キサンタンからなる群から好ましく選択される。多糖類であるゲラン、ラムサン、ウェラン、キサンタンは、知られているように、離液性及びサーモトロピックの両方の化学−物理的挙動を有し、使用可能なゲル化剤は、イオンなどの化学剤及び温度などの物理剤であってもよい。
【００３９】
ポリアニオンの平均分子量（ＭＷ）は、２，０００ｋＤａ以下であってもよく、好ましくは１００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａであってもよく、さらに好ましくは２００ｋＤａの平均分子量のものを用いてもよい。
【００４０】
他の好適な態様において、多糖類混合物のポリマー間の重量比は、１：１〜３：１である（ポリアニオン：キトサン誘導体）。
【００４１】
本発明の目的のため、キトサン誘導体とポリアニオンとの二成分混合物は、ポリマーの全濃度が３％ｗ／ｖ（ｇ／ｍＬ）以下であってもよい。好ましくは、このポリマーの全濃度は、１．５％ｗ／ｖ（ｇ／ｍＬ）〜３％ｗ／ｖ（ｇ／ｍＬ）の範囲であり、より好ましくは、２％ｗ／ｖ（ｇ／ｍＬ）である。
【００４２】
本発明のハイドロゲルを調製するために必要な、上記の多糖類の少なくともふたつの成分の溶液は、生理的範囲のｐＨを有し、特に、７〜８のｐＨであり、より好ましくは、ｐＨ７．４であり、また、２５０〜３００ｍＭの範囲のオスモル濃度を有し、５０ｍＭ〜１７５ｍＭのイオン強度を有し、好ましくは、０．０５Ｍ〜０．１５Ｍの、より好ましくは０．１５Ｍの濃度のＮａＣｌを添加することにより、取得可能である。このオスモル濃度は、マンニトールなどの非イオン性溶質で得られる。
【００４３】
ゲル化剤は、離液性のアニオン性多糖類の種類に応じて、最適な一価、二価又は三価のイオンから選択され、サーモトロピックな多糖類については、４０℃を超えず且つ１０℃を下回らない温度から選択される。
【００４４】
キトサン誘導体と離液性ポリアニオンとを含有する二成分の多糖類溶液の場合、ハイドロゲルは、上記のものを、アニオン性多糖類に従った適当な濃度の、適当なアルカリイオン若しくはアルカリ土類イオン又は遷移金属若しくは希土類金属で処理して得られる。
【００４５】
好ましくは、ゲル化剤が一価のイオンから選択される場合、カリウム、ルビジウム、タリウム、銀及びこれらの混合物からなる群から選択され、二価のイオンである場合、Ｃａ２＋、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｃｕ２＋、Ｐｂ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋及びこれらの混合物から選択され、三価のイオンから選択される場合、Ａｌ３＋、Ｆｅ３＋、Ｇｄ３＋、Ｔｂ３＋、Ｅｕ３＋及びこれらの混合物から選択される。
【００４６】
アルギン酸塩やペクチン酸塩について、上記のイオンは、マグネシウムや遷移金属を除いたアルカリ土類金属であり、この場合、好ましくは、カルシウム、バリウム、ストロンチウム、鉛、銅、マンガン及びこれらの混合物から選択されるか、希土類金属であり、この場合、好ましくは、ガドリニウム、テルビニウム、ユーロピウム及びこれらの混合物から選択される。
【００４７】
二成分の多糖類溶液をゲル化するのに適当なイオンの水溶液の濃度は、１０ｍＭを超え、好ましくは１０ｍＭ〜１００ｍＭであり、さらに好ましくは５０ｍＭである。また、ゲル化溶液は、０．３Ｍ以下のオスモル濃度を有するゲル化溶液を得るように、イオン性のオスモライト（ｏｓｍｏｌｉｔｅ）（例えばＮａＣｌ）又は非イオン性のオスモライト（例えばマンニトール）を含有してもよい。好ましくは、ゲル化溶液は、５０ｍＭの濃度のＣａＣｌ２及び０．０７５Ｍの濃度のＮａＣｌを含有し、又は０．１５Ｍの濃度の非イオン性のオスモライト（例えばマンニトール）を含有する。
【００４８】
カラギーナンの場合、アルカリイオンが用いられ、好ましくは、カリウム、ルビジウム及びセシウムから選択され、濃度は、５０ｍＭを下回らず、好ましくは５０ｍＭ〜１００ｍＭであり、より好ましくは０．１Ｍである。
【００４９】
部分的に硫酸化されたアガロースなどのサーモトロピックなハイドロゲルを与える、キトサン誘導体及びポリアニオンを含有する多糖類溶液の場合、ハイドロゲルの調製は、ゲル形成よりも低い温度に冷却することにより、行われる。特に、サーモトロピックな多糖類ついて、ゲル化剤が温度である場合、この後者は、４０℃〜１０℃の範囲であることが好ましい。
【００５０】
多糖類溶液は、サーモトロピックな多糖類により、ハイドロゲルの形成よりも高い温度で調製される。この温度において、サーモトロピックな多糖類は、ハイドロゲルを形成しない。多糖類溶液が調製される温度は、５０℃〜３０℃の範囲であり、より好ましくは３７℃である。ハイドロゲルの形成は、多糖類混合物をゲル化浴に投入し、これをゲル形成よりも低い温度に冷却することにより、起こる。好ましくは、この温度は、１０℃〜４０℃の範囲であり、より好ましくは２０℃である。
【００５１】
好適な態様において、本発明のハイドロゲルは、ポリアニオン−ポリカチオンの二成分の多糖類混合物から出発して、調製され、ここで、ポリアニオンは、好ましくは、アルギン酸塩であり、ポリカチオンは、キトサンのオリゴ糖誘導体であり、好ましくは、キトサンのラクトース誘導体（キトラック（ｃｈｉｔｌａｃ））である。
【００５２】
本発明の目的のため、運搬されるべき生物学的材料又は活性化合物は、適当なゲル化剤を用いた処理によるハイドロゲルの調製の前に水溶性ポリマー溶液に添加される。
【００５３】
本発明の３Ｄマトリックス又はハイドロゲルは、公知の方法により取得可能であるが、特に下記のステップを有する。
【００５４】
ａ）少なくともひとつの離液性又はサーモトロピックなアニオン性多糖類と、少なくともひとつのキトサンのオリゴ糖誘導体との混合物の水溶液を調製するステップであって、このキトサン誘導体は、少なくとも４０％の誘導体化率を有し、且つ上記の水溶液が、少なくとも５０ｍＭであり１７５ｍＭを超えないイオン強度を有し、少なくともｐＨ７を有する、ステップであり、その後、任意で、調製された多糖類溶液に、細胞及び／又は活性化合物を添加するステップと；
ｂ）ステップａ）で調製した溶液を、例えば、ニードルで滴下するなどの必要なハイドロゲルの形態を得るための適当な手段により、離液性のアニオン性多糖類用の架橋イオンを含有するゲル化溶液に添加するか、サーモトロピックなポリアニオン用の適当な温度とするかするステップと；
ｃ）例えば遠心分離や透析などの適当な方法により、形成したハイドロゲルを除去し、任意で、細胞及び／又は活性化合物を導入するステップ。
【００５５】
滴下する場合、種々の物理的方法（例えば、ニードルの外径の選択、電場の存在、又はニードルに同軸の気流）により制御可能な滴径は、マイクロカプセルの形態の最終的なハイドロゲルの寸法を決定する。このカプセルは、例えば、約１０分間、ゲル化溶液中に残存させ、その後除去される。
【００５６】
上記の方法により、ハイドロゲルは、適当かつ更なる処理により、種々の形態、好ましくは、マイクロカプセルであってもよく円筒形又はディスク型と推測される、ハイドロゲルを取得可能である。
【００５７】
特に、二成分のポリマー溶液から出発した円筒形のハイドロゲルの形成をもたらす各ステップは、以下の通りである。
【００５８】
ａ）カプセル化される細胞及び／又は活性化合物を添加される二成分のポリマー溶液を、円筒形又は円盤状の容器に導入し、透析膜で端部を閉口し；
ｂ）これらの容器を、その後、架橋イオンを含有する溶液、又は適当な温度のもの（ゲル化溶液）に浸漬する。
【００５９】
円筒形又は円盤状の容器を、約３０分間、ゲル化溶液に載置しその後、除去し；ｃ）透析膜を除去した後、得た円筒形又は円盤状のハイドロゲルを、容器から取り出す。
【００６０】
代替的に、アルギン酸塩の場合、円筒形のものは、ＣａＣＯ３やＣａ−ＥＤＴＡなどの架橋イオンの不活性な形態のものを、多糖類溶液に添加して、調製されてもよい。ＧＤＬ（Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン）などのＣａ塩を緩徐に加水分解する物質をその後添加する。この懸濁液を、円筒形又は円盤状の容器に導入し、そこで２４時間、保持する。その後、円筒形又は円盤状のハイドロゲルを、容器から取り出す。この方法は、ｉｎ  ｓｉｔｕカルシウム放出による円筒形成（ｃｙｌｉｎｄｅｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）として、述べられている。
【実施例】
【００６１】
非限定的な例示を目的として、以下に、少なくともひとつの離液性又はサーモトロピックなアニオン性多糖類と、少なくともひとつのキトサンのオリゴ糖誘導体との二成分溶液から得られる本発明によるマイクロカプセル又は円筒形の形態のハイドロゲル又は３Ｄマトリックスの一般的な調製法、及び導入される単離細胞を有するこのマイクロカプセルの調製法の例について、述べる。
【００６２】
Ａ．アニオン性多糖類とキトサンのオリゴ糖誘導体との溶液からの３Ｄマトリックスの調製
マイクロカプセルの調製
離液性又はサーモトロピックなアニオン性多糖類の二成分混合物の水溶液は、例えば、下記の通り調製する。
【００６３】
ａ−ＮａＣｌ０．１５Ｍ、Ｈｅｐｅｓ１０ｍＭ（ｐＨ７．４）を添加することにより、例えばアルギン酸塩（Ｍｗ〜１３０，０００）のアニオン性多糖類の溶液であって、１５０ｍＭのイオン強度を有するものを調製する；
ｂ−ＮａＣｌ０．１５Ｍ、Ｈｅｐｅｓ１０ｍＭ（ｐＨ７．４）を添加することにより、例えばキトラック（Ｍｗ〜１．５×１０６）のキトサン誘導体の溶液であって、１５０ｍＭの同様のイオン強度を有するものを調製する；
ｃ−これらの２つの溶液を、マグネティックスターラーで混合し、アルギン酸塩及びキトラックを有する溶液（例えば、重量比１：１、ポリマーの全濃度２％）を得る。
【００６４】
このようにして調製した水溶液は、完全に澄明であり、沈殿物及び／又は液滴形成はない。
【００６５】
同様の手法は、沈殿物及び／又は液滴の形成がなく、上記の異なるｗ／ｗ比のアニオン性多糖類：キトサン誘導体及び上記のポリマーの異なる全濃度とともに、その他の離液性又はサーモトロピックな多糖類及びキトサン誘導体にも適用され得る。
【００６６】
従って、下記の特定の例のマイクロカプセルは、公知の方法に従って調製され、特に：
ａ）簡単なシリンジを用いて、アニオン性多糖類及びキトサンのオリゴ糖誘導体の二成分の水溶液を、適当なゲル化浴に投入し；
ｂ）非特許文献６に述べるようにトロンドハイムＮＴＮＵ大学（ノルウェー）の生命工学研究所のＧｕｄｍｕｎｄ  Ｓｋｊａｋ−Ｂｒａｅｋ教授により開発された電気ビーズ発生器（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｂｅａｄ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ）を用いる。
このシステムは、適当なスイッチで調節可能な電圧（１０ｋＶ以下）を有する静電発生器からなり、プレキシガラス製の安全ケージに含まれるオートクレーブ可能なニードル用の支持体に接続されている。ポンプにより制御され内径１ｍｍのラテックスチューブに接続されたシリンジからなる、ケージの外部のシステムにより、アルギン酸塩溶液は、電極が挿入されているゲル化溶液を含有する晶析装置（ケージの内部）に投入される。この機器は、ニードルの位置とゲル化溶液の自由表面との間に一定の電位差を発生させ、これは、制御可能であり、０〜１０ｋＶの範囲で可変である。この電位差は、上記のニードルの位置からポリマーの液滴（負に帯電）を突如離脱させ、従って、非常に小さな径（＜２００μｍ）のカプセルを取得可能である。カプセルの寸法は、ニードルの内径、ニードルのゲル化溶液の表面との距離、ポリマーの流率などの他のファクターを変化させることによっても制御され得る。
【００６７】
円筒形のものの調製
下記の特定の例の円筒形又は円盤状のゲルは、二成分の水溶性多糖類溶液を、円筒形又は円盤状の容器に投入することにより、調製された。円筒形又は円盤状のハイドロゲルの寸法は、容器の寸法に依存する。典型的には、円筒形の容器の寸法は、高さ１８ｍｍ、内径１６ｍｍであるが、異なる寸法（高さ及び内径）も可能である。
【００６８】
オリゴ糖で改変されたキトサンと、離液性又はサーモトロピックなポリアニオンの多糖類との二成分多糖類混合物から出発したハイドロゲルの調製の例を以下に述べる。
【００６９】
下記の例に従って３Ｄマトリックスを調製するには、市販のアニオン性多糖類と下記の例１で述べるように還元的アミド化により調製したキトサンのラクトース誘導体との水溶液を使用する。
【００７０】
例１
ラクトースを含有するキトサン誘導体（キトラック）の合成
キトサン（１．５ｇ、アセチル化度１１％）を、メタノール（５５ｍＬ）とｐＨ４．５の１％酢酸緩衝液（５５ｍＬ）との溶液１１０ｍＬに溶解する。これに、ラクトース（２．２ｇ）及びシアノ水素化ホウ素ナトリウム（９００ｍｇ）を含有する、メタノール（３０ｍＬ）とｐＨ４．５の１％酢酸緩衝液（３０ｍＬ）との溶液６０ｍＬを添加する。この混合物を２４時間攪拌下に保持し、透析チューブ（カットオフ１２，０００Ｄａ）に投入し、伝導度が４℃において４μＳとなるまで、０．１ＭのＮａＣｌ（２倍量（ｃｈａｎｇｅ））及び水に対して透析する。最終的にその溶液を、０．４５μｍのミリポアフィルターで濾過し、凍結乾燥する。
【００７１】
例２
３：１の重量比のアルギン酸塩：キトラック２％ｗ／ｖ（ｇ／ｍＬ）の二成分の多糖類溶液からのシリンジを用いたマイクロカプセルの調製
キトラック（例１、ＭＷ〜１，５００ｋＤａ）及びアルギン酸塩（ＭＷ〜１３０ｋＤａ）を含有する二成分の多糖類溶液（ポリマーの全濃度２％、キトラックに対するアルギン酸塩の比率＝３：１）であって、ＮａＣｌ０．１５Ｍ、Ｈｅｐｅｓ１０ｍＭ（ｐＨ７．４）を含有するものを調製した。この溶液２０ｍＬを、２３Ｇニードルを装着したシリンジを用いて、マグネティックスターラーによる攪拌下、５０ｍＭのＣａＣｌ２及び０．１５Ｍのマンニトールを含有する溶液（ゲル化浴）に滴下で添加した。除去する前に、カプセルを、１０分間、ゲル化浴に攪拌下で保持し、脱イオン水で洗浄した。
【００７２】
例３
３：１の重量比のアルギン酸塩：キトラック２％ｗ／ｖ（ｇ／ｍＬ）の二成分の多糖類溶液からのシリンジを用いたマイクロカプセルの調製
キトラック（例１、ＭＷ〜１，５００ｋＤａ）及びアルギン酸塩（ＭＷ〜１３０ｋＤａ）を含有する二成分の多糖類溶液（ポリマーの全濃度２％、キトラックに対するアルギン酸塩の比率＝３：１）であって、ＮａＣｌ０．１５Ｍ、Ｈｅｐｅｓ１０ｍＭ（ｐＨ７．４）を含有するものを調製した。この溶液２０ｍＬを、２３Ｇニードルを装着したシリンジを用いて、マグネティックスターラーによる攪拌下、５０ｍＭのＣａＣｌ２及び０．０７５ＭのＮａＣｌを含有する溶液（ゲル化浴）に滴下で添加した。除去する前に、カプセルを、１０分間、ゲル化浴に攪拌下で保持し、脱イオン水で洗浄した。
【００７３】
例４
３：１の重量比のカラギーナン：キトラック２％ｗ／ｖ（ｇ／ｍＬ）の二成分の多糖類溶液からのシリンジを用いたマイクロカプセルの調製
キトラック（例１、ＭＷ〜１，５００ｋＤａ）及びカラギーナン（ＭＷ〜３００ｋＤａ）を含有する二成分の多糖類溶液（ポリマーの全濃度２％、キトラックに対するカラギーナンの比率＝３：１）であって、ＮａＣｌ０．１５Ｍ、Ｈｅｐｅｓ１０ｍＭ（ｐＨ７．４）を含有するものを調製した。この溶液２０ｍＬを、２３Ｇニードルを装着したシリンジを用いて、マグネティックスターラーによる攪拌下、１００ｍＭのＫＣｌを含有する溶液（ゲル化浴）に滴下で添加した。除去する前に、カプセルを、１０分間、ゲル化浴に攪拌下で保持し、脱イオン水で洗浄した。
【００７４】
例５
３：１の重量比の部分的に硫酸化されたアガロース：キトラック２％ｗ／ｖ（ｇ／ｍＬ）の二成分の多糖類溶液からのシリンジを用いたマイクロカプセルの調製
キトラック（例１、ＭＷ〜１，５００ｋＤａ）及び部分的に硫酸化されたアガロース（低ゲル化点（ｌｏｗ  ｇｅｌｌｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ））を含有する二成分の多糖類溶液（ポリマーの全濃度２％、キトラックに対する（部分的に硫酸化された）アガロースの比率＝３：１）であって、ＮａＣｌ０．１５Ｍ、Ｈｅｐｅｓ１０ｍＭ（ｐＨ７．４）を含有するものを約６０℃で調製した。約３０℃に冷却したこの溶液２０ｍＬを、２３Ｇニードルを装着したシリンジを用いて、約４℃の脱イオン水に滴下で添加した。除去する前に、カプセルを、１０分間、上記の冷却溶液に攪拌下で保持し、脱イオン水で洗浄した。
【００７５】
例６
３：１の重量比のアルギン酸塩：キトラック２％ｗ／ｖ（ｇ／ｍＬ）の二成分の多糖類溶液からの静電ビーズ発生器を用いたマイクロカプセルの調製
キトラック及びアルギン酸塩を含有する二成分の多糖類溶液（ポリマーの全濃度２％、キトラックに対するアルギン酸塩の比率＝３：１）であって、ＮａＣｌ０．１５Ｍ、Ｈｅｐｅｓ１０ｍＭ（ｐＨ７．４）を含有するものを調製した。この溶液２０ｍＬを、５０ｍＭのＣａＣｌ２及び０．１５Ｍのマンニトールを含有する溶液（ゲル化浴）に滴下で添加した。液滴の径は、静電ビーズ発生器を用いて、制御した。典型的には、用いた条件は、下記の通りである：電圧５ｋＶ、ニードルの内径０．７ｍｍ、ゲル化浴とニードルとの距離４ｃｍ、二成分ポリマー溶液の流率１０ｍＬ／分。除去する前に、カプセルを、１０分間、ゲル化浴に攪拌下で保持し、脱イオン水で洗浄した。
【００７６】
例７
３：１の重量比のアルギン酸塩：キトラック２％ｗ／ｖ（ｇ／ｍＬ）の二成分の多糖類溶液からの静電ビーズ発生器を用いたマイクロカプセルの調製
キトラック及びアルギン酸塩を含有する二成分の多糖類溶液（ポリマーの全濃度２％、キトラックに対するアルギン酸塩の比率＝３：１）であって、ＮａＣｌ０．１５Ｍ、Ｈｅｐｅｓ１０ｍＭ（ｐＨ７．４）を含有するものを調製した。この溶液２０ｍＬを、５０ｍＭのＣａＣｌ２及び０．０７５ＭのＮａＣｌを含有する溶液（ゲル化浴）に滴下で添加した。カプセルの寸法は、上記の例の通り、静電ビーズ発生器を用いて、制御した。除去する前に、カプセルを、１０分間、ゲル化浴に攪拌下で保持し、脱イオン水で洗浄した。
【００７７】
例８
３：１の重量比のアルギン酸塩：キトラック２％ｗ／ｖ（ｇ／ｍＬ）の二成分の多糖類溶液からの透析を用いたマイクロカプセルの調製
キトラック及びアルギン酸塩を含有する二成分の多糖類溶液（ポリマーの全濃度２％、キトラックに対するアルギン酸塩の比率＝３：１）であって、ＮａＣｌ０．１５Ｍ、Ｈｅｐｅｓ１０ｍＭ（ｐＨ７．４）を含有するものを調製した。この溶液２０ｍＬを、下部と上部の端部を閉口し、透析膜（カットオフ：〜１２，０００）を有する、１６ｍｍ（φ）×１８ｍｍ（ｈ）の寸法のプラスティック製シリンダーに投入した。この二成分の多糖類溶液を含有するシリンダーを、ゲル化溶液から除去する前に、５０ｍＭのＣａＣｌ２及び０．１５ＭのＮａＣｌを含有する溶液１Ｌに３０分間浸漬した。
【００７８】
例９
３：１の重量比のアルギン酸塩：キトラック２％ｗ／ｖ（ｇ／ｍＬ）の二成分の多糖類溶液から出発した、ｉｎ  ｓｉｔｕカルシウム放出法による、円筒形のハイドロゲルの調製
キトラック及びアルギン酸塩を含有する二成分の多糖類溶液（ポリマーの全濃度２％、キトラックに対するアルギン酸塩の比率＝３：１）であって、ＮａＣｌ０．１５Ｍ、Ｈｅｐｅｓ１０ｍＭ（ｐＨ７．４）を含有するものを調製した。この溶液２０ｍＬに、ＣａＣＯ３（最終濃度１５ｍＭ）及びＧＤＬ（Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン）（最終濃度３０ｍＭ）を添加した。この混合物を、１６ｍｍ（φ）×１８ｍｍ（ｈ）の寸法のプラスティック製シリンダーに投入した。この混合物を周囲温度で２４時間載置し、その後、ゲルを除去した。
【００７９】
例１０
３：１の重量比のアルギン酸塩：キトラック２％ｗ／ｖ（ｇ／ｍＬ）の二成分の多糖類溶液から出発して得たマイクロカプセルへの軟骨細胞のカプセル化
ブタの関節軟骨から抽出した軟骨細胞を、５×１０５細胞／ｍＬの密度で、０．１５ＭのＮａＣｌ及び１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）の緩衝液中に調製した１．５％アルギン酸塩及び０．５％キトラックを有する混合物に懸濁した。この細胞懸濁液を、緩徐に攪拌し、静電ビーズ発生器から、５０ｍＭのＣａＣｌ２、０．１５Ｍのマンニトール及び１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）からなるゲル化溶液へと滴下した。このカプセルを、軽く攪拌しながら、１０分間、完全にゲル化させ、その後、収集し、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）培地中で培養し、種々の生化学的測定法を行うための連続的な時間間隔で採取した。
【００８０】
例１１
３：１の重量比のアルギン酸塩：キトラック２％ｗ／ｖ（ｇ／ｍＬ）の二成分の多糖類溶液から出発して得たマイクロカプセルへの軟骨細胞のカプセル化
ブタの関節軟骨から抽出した軟骨細胞を、５×１０５細胞／ｍＬの密度で、０．１５ＭのＮａＣｌ及び１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）の緩衝液中に調製した１．５％アルギン酸塩及び０．５％キトラックを有する混合物に懸濁した。この細胞懸濁液を、緩徐に攪拌し、静電ビーズ発生器から、５０ｍＭのＣａＣｌ２、０．１５Ｍのマンニトール及び１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）からなるゲル化溶液へと滴下した。このカプセルを、軽く攪拌しながら、１０分間、完全にゲル化させ、その後、収集し、ＤＭＥＭ培地中で培養した。
【００８１】
例１２
３：１の重量比のアルギン酸塩：キトラック２％ｗ／ｖ（ｇ／ｍＬ）の二成分の多糖類溶液から出発して得たマイクロカプセルへの、シリンジによる軟骨細胞のカプセル化
ブタの関節軟骨から抽出した軟骨細胞を、５×１０５細胞／ｍＬの密度で、０．１５ＭのＮａＣｌ及び１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）の緩衝液中に調製した１．５％アルギン酸塩及び０．５％キトラックを有する混合物に懸濁した。この細胞懸濁液を、緩徐に攪拌し、２３Ｇシリンジから、５０ｍＭのＣａＣｌ２、０．１５Ｍのマンニトール及び１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）からなるゲル化溶液へと滴下した。このカプセルを、軽く攪拌しながら、１０分間、完全にゲル化させ、その後、収集し、ＤＭＥＭ培地中で培養した。
【００８２】
例１３
３：１の重量比のアルギン酸塩−ローダミン：キトラック−フルオレセイン２％ｗ／ｖ（ｇ／ｍＬ）の二成分の多糖類溶液のマイクロカプセルの調製
フルオレセインで標識したキトラック及びローダミンで標識したアルギン酸塩を含有する二成分の多糖類溶液（ポリマーの全濃度２％、キトラックに対するアルギン酸塩の比率＝３：１）であって、ＮａＣｌ０．１５Ｍ、Ｈｅｐｅｓ１０ｍＭ（ｐＨ７．４）を含有するものを調製した。この溶液２０ｍＬを、５０ｍＭのＣａＣｌ２及び０．１５Ｍのマンニトールを含有する溶液（ゲル化浴）に滴下で添加した。カプセルの径は、静電ビーズ発生器を用いて、制御した。典型的には、用いた条件は、下記の通りである：電圧５ｋＶ、ニードルの内径０．７ｍｍ、ゲル化浴とニードルとの距離４ｃｍ、二成分ポリマー溶液の流率１０ｍＬ／分。除去する前に、カプセルを、１０分間、ゲル化浴に攪拌下で保持し、脱イオン水で洗浄した。
【００８３】
Ｂ．アニオン性多糖類とキトサンのオリゴ糖誘導体との溶液からのハイドロゲルの特徴付け
カプセル／シリンダーの寸法は、これに用いた調製方法に明確に依存する。図１は、例として、静電ビーズ発生器を用いて調製したマイクロカプセルの光学顕微鏡写真であり、一方、図２は、簡単なシリンジを用い、且つ溶液を適当なゲル化浴に滴下で添加することにより、ポリアニオン／ポリカチオンの二成分多糖類混合物の水溶液から出発して得たより大きな寸法のカプセルを示す。このシリンダーは、上記の例に従って調製され、１６ｍｍ（φ）×１８ｍｍ（ｈ）の寸法である。
【００８４】
３Ｄマトリックスの形成方法により、この二成分ポリマー溶液は、離液性ポリアニオン用の適当なイオン含量条件のゲル化溶液と、又はサーモトロピックなもの用の冷却溶液と接触する。例えば、ハイドロゲルの形成は、特にアルギン酸塩及びキトラックの多糖類を含有する二成分ポリマー溶液が適当な濃度のカルシウムイオンを含有するゲル化溶液と接触すると、瞬間的に起こる。続いて、改変されたキトサン、つまりキトラックは、ハイドロゲル構造の一部を形成しないが、その内部に捕捉された状態となる。このことは、例１３で調製したように、ローダミンで標識したアルギン酸塩及びフルオレセインで標識したキトラックを含有する二成分の多糖類混合物から得たカプセルの共焦点顕微鏡を用いた分析により確認された。カプセルの内部の両方の蛍光色素分子の存在は、最終産物において両方の多糖類が存在することを示す。さらに、例６の通り調製したマイクロカプセルの形成の前後における二成分多糖類溶液で行ったプロトンＮＭＲ分析により明確に示されたように、キトラックは、両方の場合に存在する（図３）。
【００８５】
特にキトラック及びアルギン酸塩などの多糖類を含有する二成分の多糖類溶液から得たハイドロゲルの機械的特性の分析は、ｉｎ  ｓｉｔｕ技術より得た円筒形の形態のマトリックスについて行われた（例９）。ゲルの形成動態及びその弾性特性について、レオロジー的な検討を行った。特に、図４は、キトラック及びアルギン酸塩の二成分水溶液から出発して得たハイドロゲル、及び単独の水溶液から出発した得たものに関して、経時的な弾性係数（Ｇ’）及び粘性係数（Ｇ’’）の進行を示す。なお、改変されたキトサン、すなわちキトラックの存在は、ハイドロゲルの形成動態に変化を与えず、Ｇ’の増加率は、両ケースの場合、かなりのものである。しかしながら、興味深いのは、Ｇ’の最大値は、キトラック及びアルギン酸塩の二成分溶液から出発して得たハイドロゲルの場合に、より大きかった。このことが結論付けるのは、ポリマー混合物から取得可能なハイドロゲルは、ゲル化ポリマー（例えば、アルギン酸塩）のみを含有する溶液から取得可能なものよりも、より良好な機械的特性を示すということである。
【００８６】
このことは、これらの結果を、再びｉｎ  ｓｉｔｕ形成法（例９）より、キトラック及びアルギン酸塩の二成分溶液より、並びにアルギン酸塩単独の溶液より、それぞれ得た円筒形のハイドロゲルについて測定した圧縮係数と比較することにより、確認した。Ｇ’で生じたものと同様の様式において、キトラック及びアルギン酸塩の二成分の混合物の水溶液から得たハイドロゲルの圧縮係数は、単にアルギン酸塩を含有する溶液から得たゲルよりも、大きい（図５）。
【００８７】
Ｃ．軟骨細胞を有するアルギン酸塩（１．５％）／キトラック（０．５％）のカプセルについての生物学的試験
例１２で得てＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）で培養したマイクロカプセルを、細胞毒性キット（ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｋｉｔ）を用いて、２つの蛍光色素（ＳＹＴＯ（登録商標）１０及びＤＥＡＤ  Ｒｅｄ（登録商標））に対する生細胞及び死細胞の透過性の違いに基づいて、それらのバイアビリティーを測定するため、連続的な時間間隔で採取した。アルギン酸塩：キトラックカプセルにおいて、細胞の９０％以上が培養後１０日後において生存していたことが明らかに観察された。
【００８８】
混合されたカプセル、及びコントロールとしてアルギン酸塩単独で製造されたものにおいて合成されたＥＣＭ（細胞外マトリックス）の巨大分子成分の特徴を、ＲＴ−ＰＣＲ及び生化学的測定法により、評価した。軟骨細胞は、マトリックスを活動的に合成することが明らかになるとともに、培養後種々の時間におけるコラーゲン成分は、ＩＩ型のコラーゲンからなることが分かる一方、プロテオグリカンの成分は、アグリカンであることが分かった。なお、いずれの成分も、軟骨細胞の特異的なマーカーである（図６及び７）。
【００８９】
キトラックの糖重合体の存在下でのこれらの細胞の増殖能をさらに示すため、これらの細胞における［３Ｈ］−チミジンの取り込みを測定した。軟骨細胞をアルギン酸塩カプセル及び例１２のアルギン酸塩：キトラックカプセル中で成長させた；１μＣｉの［３Ｈ］−チミジン、関連する間隔（１日、５日、１０日及び１５日）で培地に導入した。このように導入した放射活性を、２４時間後に測定した。結果が示すように、培養一日目において、アルギン酸塩カプセルにおいて、軟骨細胞の複製は阻害されたが、混合されたカプセル（アルギン酸塩：キトラック）において、軟骨細胞は、培養の最初の２週間まで、急速な細胞複製を示した（図８）。
【００９０】
これらの結果は、例１２でカプセル化し、トルイジンブルー及びその他の銀含浸による２つの染色プロトコールにより染色した細胞についての光学顕微鏡分析により再確認された。トルイジンブルーは、細胞骨格を示すとともに、ＧＡＧｓと相互作用する塩基性色素であって、負に帯電しているためであり、細胞外マトリックスにおいて強調されるものである。アルギン酸塩カプセルを参照する画像は、負に帯電したポリマーのベースラインのシグナルのため、より強度の高い色度を有する。代わって、銀含浸は、細胞マトリックスにおけるコラーゲンの同定を可能とする。光学顕微鏡写真は、コラーゲンに対応する細胞周囲の暗い後光（ｈａｌｏ）を示し、またＧＡＧｓに対応する紫色の後光を示し、このことは、細胞が、マトリックスを合成し続けていることを確認するものである。
【００９１】
組織光学的観点から、ここで得た実験結果は、アニオン性多糖類及びキトサンのオリゴ糖誘導体などの改変されたカチオン性多糖類の二成分水溶液から出発した生体適合性を有する三次元マトリックスの計画及び調製に関連するデータを提供する。好適実施例において、これらは、それぞれ、アルギン酸塩及びキトサンのラクトース誘導体である。第一のものは、生物学的反応を生じる能力はほとんど又は全くないが、適当な条件下でゲルを形成する能力を有する生体適合性ポリマーであり、第二のものは、それ自体では三次元ゲルを形成し得ないがＥＣＭ合成能を保持しつつ細胞増殖を刺激し得る生物活性ポリマーである。同時に、これらの混合した成分の三次元の骨格系は、急速な拡大を同時に可能としつつ発現型を保持し得る軟骨細胞の培養方法である。
【００９２】
従って、得た実験結果が示すように、本発明の３Ｄマトリックスは、上記の目的を満足し、生物医学分野及び特に細胞のマイクロカプセル化の分野に有用に使用され得るものであって、すなわち細胞を含有する３Ｄマトリックスが組織工学に使用され得る。事実、これらの結果は、単離されているか多細胞会合であるかにかかわらず、組織工学に使用される全ての細胞型のマイクロカプセル化用の３Ｄマトリックスに拡張可能であって、例示すると、軟骨細胞、肝細胞、膵臓β細胞及びランゲルハンス島、間充織幹細胞、上皮細胞、骨芽細胞、ケラチノサイトが挙げられる。
【００９３】
これらの結果は、化合物の遅延放出型又は制御放出型システムを提供するための、薬物又は医薬的な活性分子のカプセル化にも拡張され得る。これらの場合、その調製方法は、細胞懸濁液を、ポリマー溶液に溶解又は懸濁された医薬的な活性分子に単に置き換えることにより、上記の細胞又は多細胞会合のカプセル化と同様である。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】アルギン酸塩及びキトサンのラクトース誘導体（以下、キトラックとして表記する、公知のもの）の、ＮａＣｌ０．１５Ｍ、Ｈｅｐｅｓ１０ｍＭ（ｐＨ７．４）中で調製した二成分のポリマー溶液から例６に従って得たマイクロカプセルの光学顕微鏡写真。ポリマーの全濃度は、２％であり、ポリカチオンに対するポリアニオンの重量比は、３：１である。上記の二成分溶液を、５０ｍＭのＣａＣｌ２、０．１５Ｍのマンニトール及び１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）を含有する溶液に投入してマイクロカプセルを得た。静電ビーズ発生器に関する条件：電圧５ｋＶ、ニードルの内径０．７ｍｍ、ゲル化浴とニードルとの距離４ｃｍ、二成分ポリマー溶液の流率１０ｍＬ／分、カプセルの平均径８７０±２０μｍ。
【図２】Ａ）アルギン酸塩及びキトラックの二成分の多糖類溶液を、５０ｍＭのＣａＣｌ２を含有するゲル化浴に（例２）；Ｂ）κ−カラギーナン及びキトラックの二成分の多糖類溶液をＫＣｌ１００ｍＭを含有するゲル化浴に（例４）；Ｃ）アガロース（部分的に硫酸化されたもの）及びキトラックの二成分の多糖類溶液を、約３０℃に冷却した水からなるゲル化浴に（例５）、それぞれ投入することで開始した、２３Ｇのニードルを有するシリンジにより得たマイクロカプセル。全ての場合、多糖類の全濃度は、３％であり、キトラックに対するポリアニオンの重量比は、１：１である。
【図３】例６に従って、（Ａ）マイクロカプセルの形成前、（Ｂ）マイクロカプセルの形成後に行った、アルギン酸塩（１．５％）及びキトラック（０．５％）の二成分の混合物のプロトン性１Ｈ−ＮＭＲ分析であって、いずれの場合も、キトラックが存在することがわかる。
【図４】アルギン酸塩の溶液（ポリマー濃度１．５％、ＮａＣｌ０．１５Ｍ、Ｈｅｐｅｓ１０ｍＭ（ｐＨ７．４））並びにアルギン酸塩及びキトラックの二成分溶液（Ｇ’＝●；Ｇ’’＝○）（ポリマーの全濃度２％、キトラックに対するアルギン酸塩の重量比３：１、ＮａＣｌ０．１５Ｍ、Ｈｅｐｅｓ１０ｍＭ（ｐＨ７．４））に関する、弾性係数（Ｇ’＝■）及び粘性係数（Ｇ’’＝□）の時間変化。１５ｍＭのＣａＣＯ３及び３０ｍＭのＧＤＬを用いたｉｎ−ｓｉｔｕ法により、ゲル化を行った（例９）。
【図５】アルギン酸塩溶液（濃度１．５％）から、並びに、アルギン酸塩及びキトラックの二成分溶液（ポリマーの全濃度２％、キトラックに対するアルギン酸塩の重量比３：１）からそれぞれ出発して、ｉｎ−ｓｉｔｕ法により得た円筒形のハイドロゲルに関して測定した圧縮係数（Ｅ）（例９）。いずれの場合も、ＮａＣｌ０．１５Ｍ、Ｈｅｐｅｓ１０ｍＭ（ｐＨ７．４）の溶液を使用した。
【図６ａ】アルギン酸塩及びアルギン酸塩キトラックのカプセル（例１２の通り調製したもの）中で保持した軟骨細胞培養の比色分析（ジメチルメチレンブルー）により測定したプロテオグリカン含量。
【図６ｂ】アルギン酸塩及びアルギン酸塩キトラックのカプセル（例１２の通り調製したもの）中で保持した軟骨細胞培養において導入された［３Ｈ−プロリン］の測定法による、コラーゲン合成のレベルの評価。
【図７】例１２の通り調製した、アルギン酸塩カプセル及びアルギン酸塩：キトラックカプセル中で成長させた軟骨細胞における、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩ及びアグリカンの発現の評価に関するＲＴ−ＰＣＲ分析。左のａにおいては、カプセル化後２日目に、右のｂにおいては、カプセル化後１７日目に軟骨細胞からのＲＮＡの抽出を行った。
【図８】［３Ｈ−チミジン］を用いた増殖測定。上の曲線は、例１２で調製したアルギン酸塩／キトラックカプセル中での細胞で得た結果を示すものであって、培養１５日目まで増殖活性が増加した。下の曲線は、アルギン酸塩カプセル中での細胞で得た結果を示したものであって、複製能があまりなかった。実験データが明確且つ明白に示すように、培養数日後、アルギン酸塩カプセルの軟骨細胞は、複製が遮断されたのに対して、混合したカプセルでは、急速な細胞の複製が観察され、これは、培養の最初の２週間まで続いた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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