(57)【要約】本発明は、胚品質を判定するためのシステムおよび方法に関し、これは、一定期間にわたって胚をモニタリングする工程であって、前記期間が少なくとも１つの細胞分裂期と分裂間期の少なくとも一部とを含むのに十分な長さを有する、工程と、ｉ）少なくとも１つの細胞分裂期の長さを判定する工程、および／またはｉｉ）細胞分裂期の間の細胞運動または細胞小器官運動の程度および／または空間的分布を判定する工程、および／またはｉｉｉ）分裂間期の継続期間、および／またはｉｖ）分裂間期の間の細胞運動または細胞小器官運動の程度および／または空間的分布を判定を判定する工程とを含み、それによって胚品質の指標を得る。したがって、観察した細胞分裂ならびに関連する細胞運動および細胞小器官運動の時期、継続時間、空間的分布および程度を基に、体外受精（ＩＶＦ）後の移植に最適な胚の選択が容易となる。
2009539387.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
胚品質を判定するための方法であって、一定期間にわたって該胚をモニタリングする工程であって、該一定期間が少なくとも１つの細胞分裂期と分裂間期の少なくとも一部とを含むのに十分な長さを有する、工程と、ｉ）該少なくとも１つの細胞分裂期の長さを判定する工程、および／またはｉｉ）該細胞分裂期の間の細胞運動または細胞小器官運動の程度および／または空間的分布を判定する工程、および／またはｉｉｉ）分裂間期の継続期間を判定する工程、および／またはｉｖ）該分裂間期の間の細胞運動または細胞小器官運動の程度および／または空間的分布を判定する工程とを含み、それによって胚品質の指標を得る、方法。
【請求項２】
前記胚が、少なくとも２つの細胞分裂期を含む一定期間にわたってモニタリングされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記胚が、少なくとも３つの細胞分裂期を含む一定期間にわたってモニタリングされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
各細胞分裂期の長さが判定される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
各分裂間期の長さが判定される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも２つの分裂間期における細胞運動の期間が判定される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも２つの分裂間期における細胞運動の程度が判定される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも２つの分裂間期が、連続した分裂間期である、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つの細胞分裂期の長さの判定と、前記分裂間期の間の細胞運動の判定とが実施される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの細胞分裂期の長さの判定と、前記分裂間期の間の細胞運動の期間の判定とが実施される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの細胞分裂期の長さの判定と、前記分裂間期の間の細胞運動の判定と、該分裂間期の間の細胞運動の期間の判定とが実施される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
移植に好適な胚を選択するための方法であって、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の胚をモニタリングする工程と、胚品質の指標を得る工程と、最高胚品質の指標を有する胚を選択する工程とを含む、方法。
【請求項１３】
一定期間にわたって胚をモニタリングするための手段を含む胚品質を判定するためのシステムであって、該一定期間が少なくとも１つの細胞分裂期と分裂間期の少なくとも一部とを含むのに十分な長さを有し、該システムは、さらに、該少なくとも１つの細胞分裂期の長さを判定する、および／または該分裂間期の間の細胞運動を判定する、および／または分裂間期の間の細胞運動の期間の長さを判定するための手段と、該細胞分裂期および該分裂間期における該判定を基に胚品質の指標を判定するための手段とを有する、システム。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の特徴の１つ以上を判定するための手段を含む、請求項１３に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、観察した細胞分裂ならびに関連する細胞運動および細胞小器官運動の時期、継続期間、空間的分布および程度に基づき体外受精用の胚を選択するための方法およびシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
不妊症は、世界中で８０００万人を超える人々に影響を及ぼしている。全夫婦の１０％が原発性または続発性不妊症を経験していると推測されている（Ｖａｙｅｎａ  ｅｔ  ａｔ．２００１）。体外受精（ＩＶＦ）は、処置しなければ妊娠できない夫婦に妊娠する機会を提供する場合がある選択的な治療法である。体外受精とは、女性の卵巣から取り出した卵子（卵母細胞）を、実験室で精子と受精させるプロセスである。その後、このプロセスで生成した胚を、着床の可能性を求めて子宮に戻す。多胎妊娠および多子出産を回避するため、移植する胚はごく少数である（通常４個未満、理想的には１個のみ（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａら、２００４））。移植に適切な胚を選択することは、いずれのＩＶＦ治療においても極めて重要な工程である。現行の選択工程は、発育時の異なる時点に行う胚の形態評価、具体的には標準的な実体顕微鏡を使用して移植時に行う評価にほとんどすべて基づいている。しかし、評価工程には、定量的な改善と同様に定性的な改善が必要であることが広く認識されている。
【０００３】
早期細胞分裂：有望な新しい手法には、２細胞期への「早期分裂」（すなわち、授精／注入後２５〜２７時間以前）を品質指標として使用する手法がある。この手法では、受精の２５〜２７時間後に胚を視覚的に検査し、最初の細胞分裂が完了したかどうかを判定する。いくつかの研究では、早期の卵割と個々の胚のその後の発育能力との間に強い相関性があることが実証されている(非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；Ｂｏｓ‐Ｍｉｋｉｃｈら、２００１；Ｌｕｎｄｉｎら、２００１；Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、２００１；Ｆｅｎｗｉｃｋら、２００２；Ｎｅｕｂｅｒら、２００３；Ｓａｌｕｍｅｔｓら、２００３；Ｗｉｎｄｔら、２００４)。また、より頻繁な観察の必要性が何人かの観察者により指摘されている。しかし、インキュベータから倒立顕微鏡までの移動を伴う頻繁な視覚的観察は、胚の発育を妨げ、さらには停止させる場合がある肉体的ストレスを誘発する。また、ＩＶＦ診療所の日常的な定常作業に組み入れるには、時間がかかり、困難を伴う。
【０００４】
何人かの研究者は胚発育時の微速度画像取得を実施している。これは主に、インキュベータ内に研究用顕微鏡を設置するか、または画像の取得が自動化された「インキュベータステージ」を顕微鏡ステージ上に構築することによって行われている。「インキュベータ」は、許容される温度（３７℃）、湿度（９０％超）およびガス組成（５％のＣＯ２および場合によっては低酸素濃度）を維持する。微速度画像の手動評価により、連続した細胞分裂が開始する時期や時間間隔に関する重要な情報が得られている（非特許文献４，非特許文献５，Ｍａｊｅｒｕｓら、２０００，Ｈｏｌｍら、２００２，Ｈｏｌｍら、２００３，Ｌｅｑｕａｒｒｅら、２００３，Ｍｏｔｏｓｕｇｉら、２００５）。
【０００５】
また、本願または本願で引用する特許文献および非特許文献はすべて、全体が参考として本明細書で援用される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｈｏｕｋｉｒら、Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ（１９９７）１２、１５３１〜１５３６
【非特許文献２】Ｓａｋｋａｓら、Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ（１９９８）１３、１８２〜１８７
【非特許文献３】Ｓａｋｋａｓら、Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ（２００１）１２、１１５０〜１１５６
【非特許文献４】Ｇｒｉｓａｒｔら、Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ  ｆｅｒｔｉｌｅ（１９９４）１０１（２）：２５７〜６４
【非特許文献５】Ｈｏｌｍら、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ（１９９８）５０、１２８５〜１２９９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
要旨
本発明は、観察した細胞分裂ならびに関連する細胞運動および細胞小器官運動の時期、継続期間、空間的分布および程度を基に、体外受精後の移植に最適な胚の選択を容易にする方法およびシステムに関する。
【０００８】
したがって、第１の態様において、本発明は、胚品質を判定する方法であって、一定期間にわたって胚をモニタリングする工程であって、前記一定期間が少なくとも１つの細胞分裂期と分裂間期の少なくとも一部とを含むのに十分な長さを有する、工程と、ｉ）少なくとも１つの細胞分裂期の継続期間、および／またはｉｉ）細胞分裂期の間の細胞運動または細胞小器官運動の程度および／または空間的分布、および／またはｉｉｉ）分裂間期の継続期間、および／またはｉｖ）分裂間期の間の細胞運動または細胞小器官運動の程度および／または空間的分布を判定し、それによって胚品質の指標を得る工程と、を含む方法に関する。
【０００９】
その後、妊娠および生産児をもたらすために、得られた胚品質の指標を使用して、女性の子宮への移植に好適な胚を特定および選択する場合がある。
【００１０】
したがって、さらなる態様において、本発明は、移植に好適な胚を選択する方法であって、上に定義した通りに胚をモニタリングして、胚品質の指標を得る工程と、胚品質の指標が最高の胚を選択する工程とを含む。
【００１１】
さらなる態様において、本発明は、上述の方法を実施する手段を有するシステムに関する。前記システムは、上述の方法を実行する手段を構成するコンピュータコード部分を含むコンピュータなどのいずれかの好適なシステムである場合がある。前記システムは、２００６年１０月１６日出願の“Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ａ  ｃｅｌｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ”と題する係属中のＰＣＴ出願に記載のシステムなど、異なる時間間隔で胚の画像を取得する手段もさらに含む場合がある。
【００１２】
尚さらなる態様において、本発明は、上述の方法を実行する手段を構成するコンピュータコード部分を含むデータ媒体に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図２】２つの代表的なウシ胚の卵割球活性を示す。「良好」は、孵化し始めた胚盤胞に発育した。「不良」は、胚盤胞に全く発育しなかった。
【図３】４１個のウシ胚の卵割球活性を示す。卵割球活性は擬似ゲル画像として示されており、運動性のピークを黒色の帯で、不活性のピークを白色の帯で示し、各レーンが１つの胚に対応している。黒色の帯パターンやスミアが胚内の細胞運動性の期間を表す。「良好」な胚は、上述の通り胚盤胞に発育しており、「不良」な胚は胚盤胞期に発育しなかった。良好な胚の方が、より多く（通常３つ）の鮮明な帯が最初見られる。
【図４】１３個の代表的なウシ胚の卵割球活性を示す。孵化し始めた胚盤胞に発育した「良好」な胚は緑色の曲線で表し、胚盤胞に全く発育しなかった「不良」な胚は赤色の曲線で表す。Ｘ軸はフレーム番号、Ｙ軸は卵割球活性である。画像取得は、受精後２４時間に開始し、毎時２フレームで行った。緑色の曲線は、卵割球活性値に３０を足してｙ軸の位置をずらした。
【図５】取得した全画像フレーム（明領域＝高卵割球活性、暗領域＝低卵割球活性）の平均卵割球活性を示す。
【図６】高品質の胚盤胞に発育しなかった２１個のウシ胚の卵割球活性を示す。卵割球活性パターンの分類に使用する３つの部分からなる曲線を示す。
【図７】高品質の胚盤胞に発育しなかった１８個のウシ胚の卵割球活性を示す。卵割球活性パターンの分類に使用する３つの部分からなる曲線を示す。
【図８】１３個の代表的な胚において手動で検出した細胞分裂と自動で検出した細胞分裂との相関性を示す。このアルゴリズムで約１０％の細胞分裂が検出されなかったものの、それを除けば相関性はきわめて高い。
【図９】手動で検出した良好な胚と不良な胚の細胞分裂を示す。
【図１０】得られるパラメータの推定図を示す。右上角のグラフは、フレーム番号を関数とした元の卵割球活性を示す。緑色と青色の線は、それぞれ第２および第３の時間間隔の開始を示す。右下角のグラフは、上述のような得られたパラメータを示す。赤色の縦線は、ピークまたはバレー（valley）内の最高または最低活性値の時間と値をそれぞれ示す。
【図１１】９４個の胚の卵割球活性分析から得られたパラメータ（上図を参照）を示す。高品質の増殖芽細胞に発育する胚を赤色（良好な例）で示し、発育しないものを青色（不良な例）で示す。
【図１２】最初の５つのＰＣＡを軸としたＰＣＡグラフを示す。赤色の点が高品質の胚で、青色の点が低品質の胚である。
【図１３】時間区分３（すなわち、受精後７６〜９６時間）における、９４種類の胚の卵割球活性のベースライン値を示す。等級は、７日間のインキュベーション後における所定のウシ胚の卵割球品質の指標である。１等級の胚が最高品質であり、品質が最低で閉鎖的なことが多い５等級よりもベースライン値がはるかに高い。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
定義
細胞分裂期：（細胞質分裂の開始を示す）細胞膜のへこみが最初に観察されてから、細胞質の細胞分裂が完了して、その後の娘細胞の細胞質が２つの別個の細胞に分離するまでの期間。
【００１５】
分裂間期：１つの細胞分裂期が終了してから次の細胞分裂期が開始するまでの期間。
【００１６】
分裂周期：連続した細胞分裂が開始する時間間隔、すなわち、１つの細胞分裂期が開始してからから次の細胞分裂が開始するまでの時間間隔。
【００１７】
細胞位置の再配置＝細胞運動（以下を参照）。
【００１８】
細胞運動：細胞中心および細胞外膜の運動。細胞内の細胞小器官の内部運動は細胞運動ではない。細胞外膜は動的な構造であるため、細胞の境界は絶えずわずかに位置を変化させる。しかし、これらのわずかな変動は細胞運動とは見なさない。細胞運動とは、細胞の重心や細胞の位置が他の細胞に対して変わる場合、ならびに細胞が分裂する場合である。細胞運動は、運動している細胞の２枚の連続したデジタル画像の差を計算することにより定量化することができる。このような定量化の一例については、２００６年１０月１６日出願の“Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ａ  ｃｅｌｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ”と題する係属中のＰＣＴ出願に詳述されている。一方で、例えば、胚の連続した光学的横断で各卵割球の境界の輪郭を半自動で描画するＦｅｒｔｉＭｏｒｐｈソフトウェア（ＩｍａｇｅＨｏｕｓｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ、デンマーク  コペンハーゲン）を使用することにより、細胞の重心および／または細胞質膜の位置の運動を判定する他の方法も構想される場合がある。
【００１９】
細胞小器官運動：顕微鏡検査法により確認される場合がある胚内の内部細胞小器官および細胞小器官膜の運動。細胞小器官運動は、本願における細胞運動ではない。
【００２０】
運動：対象物の空間的な再配置。運動は、運動の程度、運動に関与する面積および／または容積、回旋、並進ベクトル、運動の配向性、運動の速度、大きさの変化、膨張／収縮などを含むがこれらに限定されない多くの異なるパラメータを特徴とし、および／またはこれにより定量化され、および／またはこれにより説明される。したがって、細胞または細胞小器官運動の種々の測定が、種々の目的に使用される場合があり、これらの中には運動の程度または規模を反映するものもあれば、運動している対象物の空間的分布を反映するものもあり、運動が影響を及ぼしている軌道や容積を反映するものもある。
【００２１】
胚：場合により、「胚」という用語は、胚が胎児となる段階での受精後８週間までに子宮に着床した後の受精卵母細胞を説明するために使用される。この定義によると、受精卵母細胞は、着床するまで前胚と呼ばれることが多い。しかし、本特許出願全体では、前胚期を包含した胚という用語のより広義の定義を、本発明者等は使用する。したがって、本用語は、卵母細胞の受精から、桑実胚、胚盤胞期、孵化および着床までの全発育段階を包含する。
【００２２】
胚品質とは、着床に成功して、移植後に子宮で発育することができる前記胚の能力を示す指標である。高品質の胚は着床に成功して、移植後に子宮で発育するのに対して、低品質の胚は着床に成功せず、発育しない。
【００２３】
胚の発育能力とは、着床に成功して、移植後に子宮で発育することができる前記胚の能力を示す指標である。発育能力の高い胚は着床に成功して、移植後に子宮で発育するのに対して、発育能力の低い胚は着床に成功せず、発育しない。発育能力と品質は、本書において交換可能に使用される。
【００２４】
胚品質（または発育能力）の測定値とは、品質パラメータの値が高い胚は、品質（または発育能力）が高くなる可能性が高く、品質（または発育能力）が低くなる可能性が低いというように、胚の品質（または発育能力）を反映することが意図されたパラメータである。一方、品質（または発育能力）パラメータの関連する値のみが低い胚は、品質（または発育能力）が高くなる可能性が低く、品質（または発育能力）が低くなる可能性が高い。
【００２５】
胚
胚はほぼ球形をしており、透明帯として知られる無細胞マトリックスであるゼラチン状の外皮で覆われた１つ以上の細胞（卵割球）で構成される。透明帯は、胚が孵化するまで種々の機能を発揮し、胚評価に好適な指標である。透明帯は球形で半透明をしており、細胞残屑と明確に区別できなければならない。
【００２６】
精子細胞（精子）の融合または注入により卵母細胞が受精すると、胚が形成される。本用語は、孵化（すなわち、透明帯の破裂）後やその後の着床後にも従来より使用されている。ヒトの受精した卵母細胞は、従来より最初の８週間は胚と呼ばれている。それ以降（すなわち、８週間後や、主要な器官がすべて形成された時）は、胎児と呼ばれる。しかし、胚と胎児の区別は一般的に十分に定義されていない。
【００２７】
胚の発育時に、卵割球数は幾何学的に（例えば、１→２→４→８→１６→）増加する。同期の細胞分裂は、一般的に胚の１６細胞期まで維持される。その後、細胞分裂は非同期になり、最終的には個々の細胞が固有の細胞周期を有する。ウシ胚の場合は、胚を構成する卵割球が、少なくとも１６細胞期までは球形細胞として容易に特定できなければならない。約３２細胞期（桑実期）では、接着タンパク質の発現時に細胞間接着が生じることで、胚が緊密化を起こす。その結果、この段階以降に、胚の個々の細胞を評価し数え上げるのは難しい。ヒト胚の場合は、緊密化が幾分早く生じ、１６細胞期で個々の卵割球を容易には特定できない。不妊治療時に産生されたヒト胚は、桑実期以前に受容者に移植されるのが通常であるのに対し、他の哺乳類胚は、受容体への移植前や放出前に、さらなる発育段階（増殖胚盤胞）にまで実験により培養されることが多い。また、場合によっては、ヒト胚が移植前に胚盤胞期まで培養されるが、これは、良質な胚が多数利用可能な場合や、着床前の遺伝子診断（ＰＧＤ）の結果が出るまで長期間のインキュベーションが必要な場合に行われるのが好ましい。したがって、胚という用語は、受精卵母細胞、接合子、２細胞、４細胞、８細胞、１６細胞、桑実胚、胚盤胞、増殖卵割球および孵化胚盤胞の各段階、ならびにこれらの間の全段階（例えば、３細胞または５細胞）を指すものとして以下で使用される。
【００２８】
品質の判定
本発明は、ｉ）少なくとも１つの細胞分裂期の継続期間、および／またはｉｉ）細胞分裂期の間の細胞運動または細胞小器官運動の程度および／または空間的分布、および／またはｉｉｉ）分裂間期の継続期間、および／またはｉｖ）分裂間期の間の細胞運動または細胞小器官運動の程度および／または空間的分布を判定して、それにより胚品質の指標を得る工程など、１つ以上の胚の判定に基づく胚品質の測定値［上記の胚品質の測定値の定義を参照］を提供する。
【００２９】
本発明は、通常の場合、細胞の位置は細胞分裂間で比較的変わらない（すなわち、ほとんど細胞運動が行われない）が、但し、各細胞分裂前後の時間間隔は短く、１個の細胞が２つに分裂すると、分裂細胞だけでなく周囲の細胞までもが短期間に大幅に再配置される（すなわち、顕著な細胞運動が行われる）という所見に基づいている。
【００３０】
本発明の特定用途の一つに、発育胚の画像系列（微速度画像）を評価する用途がある。これらの微速度画像は、差分画像化法により分析される場合がある（２００６年１０月１６日出願の“Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ａ  ｃｅｌｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ”と題する係属中のＰＣＴ出願を参照）。得られた差分画像は、画像系列の連続したフレーム間に生じる変化の量を定量化するのに使用できる。
【００３１】
本発明は、差分画像データの分析に適用される場合がある。この分析では、細胞運動の結果として生じる細胞境界（すなわち、細胞膜）の位置の変化によって、差分画像から得られる範囲パラメータの一時的な上昇が引き起こされる（２００６年１０月１６日出願の“Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ａ  ｃｅｌｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ”と題する係属中のＰＣＴ出願を参照）。これらのパラメータには、平均絶対強度または分散の上昇が含まれる（が、これらに限定されない）。したがって、細胞分裂および細胞分裂の継続期間、ならびに関連する細胞の再配置は、差分画像中の全ピクセルの標準偏差における、あるいは２００６年１０月１６日出願の“Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ａ  ｃｅｌｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ”と題する係属中のＰＣＴ出願に列挙される「卵割球活性」のその他いずれかのパラメータにおける、一時的な変化、増加または減少により検出することができる。しかし、前記選択基準はまた、２００６年１０月１６日出願の“Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ａ  ｃｅｌｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ”と題とする係属中のＰＣＴ出願に定義される「卵割球活性」とは関連しない、胚発育に関する微速度画像およびその他の時間分解データ（例えば、代謝産物の排泄または摂取、物理的または化学的な外見、回折、散乱、吸収などの変化）の視覚的観察および分析にも適用される場合がある。
【００３２】
特に興味深い点は、得られたパラメータ値においてピークまたはバレーとして定量化される場合がある細胞分裂の開始、規模および継続期間である。これらの極値（ピークまたはバレー）は、高い頻度で細胞分裂の事象を指す。これらの事象の時期および継続期間、ならびにこれらの事象時および事象間に観察されるパラメータ値を使用して、胚の特徴を評価し、胚の発育能力を評価する。また、ピークの大きさで一般的に得られるのと同じように、各ピークの形状でも追加の情報が得られる。ピークは、卵割球の急激な崩壊とそれと同時に起こる細胞死を示す場合もある。しかし、事象前後のピーク形状とベースライン値の変化により、細胞分裂事象と細胞死事象とを区別できる場合がある。通常、ほとんどのパラメータの基線は細胞分裂による影響を受けないが、細胞溶解は、高い頻繁でベースライン値の著しい変化を伴う（ほとんどのパラメータが溶解後に低下する）。
【００３３】
これとは別に特に興味深い点は、細胞運動および細胞小器官運動の両方の空間的分布である。運動が見られない透明帯内の容積（または同様に、静止したままである胚の２次元投影画像内の面積）は、胚内の「死亡」区域を示す指標である。これらの静止した「死亡」区域が多く、大きいほど、胚の発育に成功する可能性は低くなる。いかなる種類の運動も見られない（すなわち、細胞運動と細胞小器官運動のいずれも見られない）大きな面積が胚の微速度画像系列に見られる場合は、発育能力が低いことを示す。一般的に、細胞小器官運動は、２つまたは少数の連続するフレームを単に比較しさえすれば、胚全体で検出できなければならない。細胞運動は特に胚発育の後期においてより局所化する場合があるが、多くの連続したフレームを評価する場合には、透明帯内の容積全体で細胞運動が検出できなければならず、これによって、胚内のすべての卵割球が分裂し、位置を変化させていることが示される。
【００３４】
したがって、胚品質の指標は、ｉ）少なくとも１つの細胞分裂期の継続期間、および／またはｉｉ）細胞分裂期の間の細胞運動または細胞小器官運動の程度および／または空間分布、および／またはｉｉｉ）分裂間期の継続期間、および／またはｉｖ）分裂間期の間の細胞運動または細胞小器官運動の程度および／または空間分布など、少なくとも１つの細胞分裂時および／または１つの分裂間期の少なくとも一部における細胞運動または細胞小器官運動に関する情報を含む。好ましい実施形態において、胚品質の指標は、本明細書に記載の２つ以上の判定（例えば、本明細書に記載の３つ以上の判定）に関する情報を含む。より好ましい実施形態において、胚品質の指標は、本明細書に記載のすべての判定に関する情報を含む。具体的に、胚品質の指標は、細胞分裂期の長さおよび分裂間期の長さに関する情報を含むか、あるいは胚品質の指標は、細胞分裂期における運動および分裂間期における運動に関する情報を含む。別の実施形態において、胚品質の指標は、期間の長さおよび同一期間における運動に関する情報を含む。
【００３５】
胚品質の指標は、以下の所見に基づく。
ａ）実際の細胞質分裂が急速に進行し、他の卵割球位置のその後の再配置が急速に起こる急激な細胞分裂（例えば、卵割球活性のピークの幅が狭い場合）は、高品質の胚であることを示し、細胞質分裂の継続期間が長期にわたり、他の卵割球のその後の空間的再配置（すなわち、細胞運動）が広範囲に及ぶ場合は、低品質の胚であることを示す（例えば、卵割球活性のピークの幅が広い場合）。（実施例１）
ｂ）細胞分裂間の卵割球位置の再配置がほとんど見られない場合は、高品質の胚であることを示すのに対し、可視できる細胞分裂間に運動が見られる場合は、低品質の胚であることを示すことが多い。（実施例１）
ｃ）細胞分裂間の細胞位置の再配置が長期にわたる場合（例えば、卵割球活性のピークの幅が広い場合）は、低い胚品質、非同期の細胞分裂、および広範な断片化を伴うことが多い。（実施例１）
ｄ）胚ゲノムが活性化され、タンパク質の合成が母性転写から胚性転写に切り換わる際には、細胞運動がほとんど見られない静止期間がほとんどの哺乳類で認められる。この期間において、ｉ）開始が早く、ｉｉ）活性がきわめて低く（＝細胞運動がほとんど見られない＝静止している）、およびｉｉｉ）終了が早い場合には、高品質の胚であることを強く示す。低品質の胚では、静止期間の開始が遅れることが多く、その期間が細胞運動により中断されることがある。低品質の胚はまた、検出可能な細胞分裂が見られない「静止」期間に細胞運動の基線レベルの上昇を示す場合もある。（実施例２）
ｅ）それ以降の発育が止まる低品質の胚では、常に静止した特定の領域が認められることが多く、この状態が続くと最終的には発育の停止につながる。このような静止領域には、広範な断片化や卵割球の死亡および溶解を伴う場合がある。これらの領域が所定の発育段階で所定の割合よりも大きいと、胚が生存する可能性がきわめて低くなる。高品質の胚では、各細胞質分裂事象の後にしばらく生じる細胞運動性が、最初に胚表面全体に広がり（すなわち、すべての卵割球がわずかに動く）、桑実期の緊密化後にのみ局所的な運動が見られる（実施例３）。
ｆ）発育可能な高品質の胚では、細胞小器官運動の均一な空間的分布が一般的に見られるのに対して、低品質の胚では、運動性が見られない「死亡」区域が見られることが多い。類似の観察が細胞運動についても行われているが、細胞運動の空間的な均一性を判定するには、より長い時間枠での観察が必要となる（実施例３）。
ｇ）種々の時間間隔における細胞運動量は、胚品質を示す良い指標である。品質に関連するパラメータは、種々の時間区分における平均運動の比率から、および／または種々の時間区分における標準偏差の比率から計算することができる。これらのパラメータの値に基づき、胚の選択工程を確立することができる（実施例４）。
ｈ）細胞運動性および細胞小器官運動性の基線レベルの緩徐なまたは急激な低下は、低い胚品質や、発育停止の高い可能性を伴うことが多い。基線レベルの変化は、不活性区域／領域の出現を伴う場合がある（上記の（ｅ）および（ｆ）を参照）。（実施例６）
ｉ）最初の細胞分裂の開始が早い場合は、胚品質が高いことを示す。最初（およびそれ以降）の細胞分裂の開始が遅い場合は、低品質の胚であることを示す。しかし、ほとんどの胚の場合、最初の細胞分裂の正確な開始だけでは、胚品質の明確な指標とはならない（実施例４）。
ｊ）細胞運動および細胞小器官運動を説明する得られたパラメータのほとんどでは、正常範囲から外れる値（例えば、異常に高い値や異常に低い値）がいずれも胚品質が低いことを示すように、正常範囲を定義することができる。（実施例６）
ｋ）連続する細胞分裂の間の間隔は、胚の発育能力を示す重要な（および種特異的な）指標である。例としては、１細胞から２細胞への分裂と２細胞から４細胞への分裂の間の間隔と、２細胞から４細胞への分裂と２細胞から８細胞への分裂の間の間隔とを比べた比率が考えられる。これらの間隔の比率は、発育可能な胚では所定の範囲内になければならない。
ｌ）後期の同期細胞分裂（例えば、２細胞→４細胞、４細胞→８細胞）は、主に高品質の胚に見られるのに対して、非同期細胞分裂（例えば、２細胞→３細胞→４細胞→５細胞→６細胞→７細胞→８細胞）は、低品質の胚に見られることが多い（実施例１）。
【００３６】
以下の判定が、胚品質の最も高い指標となる。
・細胞分裂期が短い（ここで「短い」とは、２時間未満として定義される）。
・分裂間期に細胞運動がほとんど見られない（ここで「ほとんど見られない」とは、常に差分画像に寄与する通常の周期的変動や細胞小器官運動以外に、細胞位置の変化がほとんど見られないこととして定義される）。細胞運動がほとんど見られないということは、細胞の重心が静止しており（運動量が３μｍ未満）、細胞質膜がほとんど動かない（運動量が３μｍ未満）ことを示す。
・最初の細胞分裂期の開始が早い（すなわち、ヒト胚の場合は受精後２５時間以前（ウシ胚の場合は受精後３０時間以前））。
・分裂間期の間の細胞運動の期間が短い（ここで「短い」とは、３時間未満として定義される）。
・一定期間にわたる透明帯内の細胞運動の均一な分布。すなわち、より長期間（すなわち、２４時間超）にわたり細胞運動が見られない、胚の不活性面積／区域／容積の不在。このような静止区域は、卵割球や断片が死亡しているか、死亡しつつあることが原因である可能性があり、これによってさらなる発育が妨げられる場合がある。
・細胞運動性のベースライン値が一定してまたはわずかに上昇している。
・得られたパラメータすべてが、特定の胚の正常範囲内にある。
【００３７】
胚品質の指標が最高品質の指標に近づくほど、胚の品質が高くなる。
【００３８】
ニューラルネットワークまたはその他の定量パターン認識アルゴリズムが、上述の複雑な細胞運動性パターンの評価に使用される場合がある。このようなネットワークは、ＩＶＦ治療における移植に最高の品質の胚を見出すのに使用される場合がある。実施例６では、胚発育時の「卵割球活性」（２００６年１０月１６日出願の“Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ａ  ｃｅｌｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ”と題する係属中のＰＣＴ出願を参照）から胚発育の重要なパラメータを導き出し、その後、種々の数学的モデル（線形、主成分分析、マルコフモデルなど）を使用して、得られたパラメータを評価する手法が説明されている。
【００３９】
その他の測定
最終分析工程には、得られた所見と、品質や発育能力の異なる胚の類似の所見とを比較する工程、ならびに所定の胚のパラメータ値と、同じ胚で得た他の定量的測定値とを比較する工程が含まれると考えられる。これには、卵割球運動性、呼吸数、アミノ酸摂取などのオンライン測定値との比較が含まれる場合がある。卵割球運動性分析、呼吸数および他の定量パラメータを組み合わせたデータセットにより、胚の選択が改善され、発生学者が移植に最適な胚を確実に選択できるようになる可能性がある。
【００４０】
したがって、一実施形態において、本発明に基づく方法は、対象となる胚を評価するために他の測定値と組み合わせる場合があり、受容者への移植に有望な胚の選択に使用される場合がある。
【００４１】
このような他の測定値は、呼吸数、アミノ酸摂取、運動性分析、卵割球運動性、形態、卵割球の大きさ、卵割球の顆粒化、断片化、卵割球色、極体配向性、核生成、紡錘体形成および完全性、ならびにその他数多くの定性的測定値からなる群から選択される場合がある。呼吸測定は、ＰＣＴ公開第２００４／０５６２６５号に記載の通りに実施される場合がある。
【００４２】
培地
好ましい実施形態において、観察は、細胞集団を培地に入れた時など、細胞集団の培養時に行われる。細胞集団を培養する手段は、当該技術分野で既知である。胚培養の例は、ＰＣＴ公開第２００４／０５６２６５号に記載されている。
【００４３】
データ媒体
本発明はさらに、デジタル処理装置のメモリに直接ロードすることができるコンピュータプログラムを含み、上述の通りに本発明の方法を実行する手段を構成するコンピュータコード部分を含むデータ媒体に関する。
【００４４】
前記データ媒体は、磁気または光ディスクである場合もあれば、ＥＥＰＲＯＭまたはフラッシュ形式の電子カードの形態で、既存のデジタル処理手段にロードするように設計される場合もある。
【００４５】
胚の選択または特定
本発明はさらに、移植用の胚を選択する方法も提供する。本方法は、細胞分裂が発生した時期や、場合によっては細胞死の発生の有無、ならびに細胞分裂の品質や胚の全体的な品質を判定する目的で、上述のように胚の変化を判定するために、胚がモニタリングされていることを示す。実質的に同期の細胞分裂によってはっきりとした差分画像のパラメータが得られる胚を選択するのが好ましく、細胞死を生じない胚を選択するのがより好ましい。
【００４６】
選択または特定方法は、胚の品質を評価するために、上述の他の測定値と組み合わせる場合がある。胚の形態学的評価における重要な基準としては、（１）卵割球の数や断片化の程度を含めた胚の形状、（２）透明帯の存在および品質、（３）大きさ、（４）色および質感、（５）発育段階と関連する胚の年齢に関する知識、および（６）卵割球膜の完全性がある。
【００４７】
その後、当業者に既知のいずれかの好適な方法により、移植が行われる場合がある。
【実施例】
【００４８】
（実施例１）
材料および方法：ウシ未熟卵丘卵母細胞複合体（ＣＯＣ）を、屠殺場から入手した卵巣から吸引して、選択し、４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、デンマーク  ロスキレ）で２４時間成熟させた。各ウェルは、１５％のウシ血清（ＣＳ；Ｄａｎｉｓｈ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、デンマーク  フレゼリクスベア）、１０ＩＵ／ｍＬのｅＣＧ、および５ＩＵ／ｍＬのｈＣＧ（Ｓｕｉｇｏｎａｎ  Ｖｅｔ；Ｉｎｔｅｒｖｅｔ  Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａ、デンマーク  スコルンデ）を補充した、４００μＬの炭酸水素緩衝ＴＣＭ‐１９９培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、英国ペイズリー）を含有した。胚は、５％ＣＯ２の加湿空気中で、３８．５℃にて、鉱油下で成熟させた。受精は、修正タイロード培地中で、凍結融解させてパーコール法で選択した精子を使用して実施した。２２時間後、卵丘細胞をボルテックス攪拌により除去した後、抗生物質（硫酸ゲンタマイシン、１０ｍｇ／ｍＬ）と５％のＣＳを補充したアミノ酸、クエン酸塩およびイノシトールを含む合成卵管液培地（ＳＯＦａａｃｉ）で構成される４００μＬの培地に、予定接合子を移し、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２雰囲気中で、３８．５℃にてインキュベートした。
【００４９】
このインキュベータ装置については、過去に詳述しており、体外胚培養に好適であることが証明されている（Ｈｏｌｍら、１９９８）。簡単に言うと、４ウェル培養プレートを、ニコンＴＭＤ倒立顕微鏡（Ｄｉａｐｈｏｔ、ＤＦＡ  Ａ／Ｓ、デンマーク  コペンハーゲン）の顕微鏡ステージ（ＭｕｌｔｉＣｏｎｔｒｏｌ  ２０００走査ステージ、ドイツ  メルツホイザー）に設置し、このステージの周辺に、空気温度調節器（Ａｉｒ‐Ｔｈｅｒｍ（登録商標）、Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、英国アストン）により制御された黒色プレキシガラスのインキュベータボックスを装着した。底が開いたプラスチックカバーを培養プレートの上に被せて、加湿した混合ガスを、インキュベータボックス内に設置したガス洗浄瓶に通した後、この半密閉培養チャンバーに送出した。
【００５０】
この培養ボックスは、体外胚培養に有用であることがすでに証明されており（Ｈｏｌｍら、１９９８，２００３）、安定した温湿度条件を提供する。実験中に本発明者等が毎週定期的に行った体外胚生産は、基本培養系の完全性に関する対照としての役割を果たした。
【００５１】
カメラ装置：微速度録画は、画像分析ソフトウェア（ＩｍａｇｅＰｒｏ（登録商標）、Ｕｎｉｔ  Ｏｎｅ、デンマーク  ビアカオル）が指示しており、このソフトウェアは、微速度連続場面の録画やコンピュータハードディスクへの保存だけでなく、走査ステージのｘ軸、ｙ軸およびｚ軸における移動や、接続する高光感度ビデオカメラ（ＷＡＴ‐９０２Ｈ、Ｗａｔｅｃ、ＤＦＡ  Ａ／Ｓ、デンマーク  コペンハーゲン）の操作を制御した。
【００５２】
各胚の微速度画像（総合倍率：２６５倍）は、７日間の培養期間を通して３０分間隔にて最小光量で連続録画した。各録画の間に、胚を光照射野の外に移動させた。
【００５３】
微速度画像系列の手動分析は、以下の卵割／胚期（２細胞、４細胞、８細胞、１６細胞）が最初に出現した時間と、一団の細胞塊が確認できる桑実胚や胚盤胞の場合は、最大限に緊密化した桑実胚、胚盤胞の最初の拡大、胚盤胞の崩壊、および胚盤胞の孵化が最初に出現した時間とを記録することにより構成されていた。
【００５４】
コンピュータに基づく自動分析は、連続した２つのフレーム間の差として計算される差分画像の標準偏差を計算することにより構成されていた。アラインメントアーチファクトやその他の問題を回避するため、以下の複雑な工程を使用した。
１）画像を取得する（上記の説明を参照）。
２）系列中の全画像から焦点のぼけたアーチファクトの基準画像を差し引くことにより、固定位置のアーチファクト（カメラの埃）を除去する。
３）不正確なステージ移動を補正するために転置する。画像のアラインメントを行うきわめて簡単な方法としては、元の差分画像と、元の差分画像の１つを所定の方向に１ピクセルずらしてから計算した差分画像とを比較する方法がある。転置後に計算した差分画像の分散が元の差分画像の分散よりも低い場合は、転置によってアラインメントが向上したことになる。すべての可能な転置方向とすべての関連する転置規模を系統立てて試みることによって、アラインメントを行った時間系列を得ることが可能となるが、本願の場合は、Ｔｈｅｖｅｎａｚ等が１９９８年に開発した画像アラインメント用の高度なＩｍａｇｅＪマクロを使用した。
４）対象領域（ＲＯＩ）および外部基準区域を特定する。胚内部の細胞運動と、胚外部の「運動」とを比較することは、ブラウン運動のアラインメントの問題などから有利である。これは、胚の輪郭を描画し、胚内部の差分画像と胚外部の類似区域の計算した差分とを比較することにより行われる。胚の輪郭の描画は手動で行った。本発明者等が選択した標準区域は、胚のない画像領域であった。
５）強度差を計算する。
６）各差分画像で得たパラメータを計算する。いくつかの差分パラメータを計算したが、最も有益であることが判明したパラメータは、差分画像の全ピクセルにおける強度の標準偏差であった。このパラメータを以下では「卵割球活性」と呼ぶ。
７）卵割球活性のピークの形状を特定および判定する。
８）診断に適切な時間間隔で卵割球活性の標準偏差および平均値を計算する。実施例４を参照されたい。
【００５５】
実験計画：７日間にわたり３０分毎に画像を取得しながら、Ｎｕｎｃ‐４ウェルプレートの１つのウェルにおいて約２０個のウシ胚を一緒にインキュベートした。この実験を合計５回繰り返し、９９個のウシ胚の微速度画像系列を得た。
【００５６】
結果：
発育する胚の微速度画像系列の定性的評価により（基本的には、これらの画像系列を動画として何度も再生して観察し、変化に着目することにより）、本発明者等は以下のことを観察した。まず、高品質の胚の指標は、急激な細胞分裂であり、この分裂では、実際の細胞質分裂が急速に進行して、他の卵割球の位置のその後の再配置が急速に生じ、その後、次の細胞質分裂が急激に始まるまでは細胞位置の再配置がほとんど見られない「静止」期間が続く。それに対し、低品質の胚は、細胞質分裂後や細胞質の細胞分裂間に卵割球位置の長期にわたる再配置を示すことが多い。これらの所見を定量化し、証拠を得るため、本発明者等は、上述のＰＣＴ出願に記載の通りに微速度画像系列から卵割球活性を計算した。代表的な卵割球活性を図２に示す。
【００５７】
観察した活性のいくつかは、高品質の胚で観察した同期細胞分裂（例えば、２細胞→４細胞、４細胞→８細胞）とは対照的に、非同期細胞分裂（例えば、２細胞→３細胞→４細胞→５細胞→６細胞→７細胞→８細胞）と断片化によるものである。
【００５８】
図１には、擬似ゲル画像として４１個の胚の卵割球活性を示しており、運動性のピークを黒色の帯で示し、不活性のピークを白色の帯で示している。
【００５９】
（実施例２）
材料および方法：実施例１と同じ。
【００６０】
結果：
哺乳類の胚の最初のタンパク質合成では、卵母細胞に由来する母系ｍＲＮＡを使用するが、数回の細胞分裂後は胚ゲノムが活性化、転写および翻訳される。母系ゲノムから胚ゲノムへの切り換えは、胚の発育の重要な段階である。ウシの場合は８細胞期にこの期間があり、継続期間が比較的長いが、ヒト胚の場合はこの切り換えがより早期の４〜８細胞期にあり、継続期間もより短い。
【００６１】
ほとんどの哺乳類では、胚ゲノムが活性化され、タンパク質合成によって母系から胚ゲノムへ切り替わる時に、細胞運動がほとんど見られない静止期間が認められる。この期間において、ｉ）開始が早く、ｉｉ）活性がきわめて低く（＝細胞運動がほとんど見られない＝静止している）、およびｉｉｉ）終了が早い場合には、高品質の胚であることを強く示す。低品質の胚では、静止期間の開始が遅れることが多く、その期間が細胞運動により中断されることがある。１３種類の胚の卵割球活性を示すこの一例を図４に示す。
【００６２】
（実施例３）
材料および方法：実施例１と同じ。
【００６３】
結果：それ以降の発育が止まる低品質の胚では、常に静止した特定の領域が認められることが多く、この状態が続くと最終的には発育の停止につながる。このような静止領域には、広範な断片化や卵割球の死亡および溶解を伴う場合がある。これらの領域が所定の発育段階で所定の割合よりも大きいと、胚が生存する可能性がきわめて低くなる。高品質の胚では、各細胞質分裂事象の後にしばらく生じる細胞運動性が、最初に胚表面全体に広がり（すなわち、すべての卵割球がわずかに動く）、桑実期の緊密化後にのみ局所的な運動が見られる。
【００６４】
図５の左側の図のように胚盤胞に発育する胚では、卵割球活性が均一に分布している。図５の右側の図のように卵割球活性が均一に分布していない胚は、胚盤胞に全く発育しない。
【００６５】
（実施例４）
材料および方法：実施例１と同じ。
【００６６】
結果：種々の時間間隔における細胞運動量は、胚品質を示す良い指標である。品質に関連するパラメータは、種々の時間区分における平均運動の比率から、および／または種々の時間区分における標準偏差の比率から計算することができる。これらのパラメータの値に基づき、胚の選択工程を確立することができる。種々の区分（＝部分）の例を図６および７に示す。この場合、部分１は受精後３２〜６０時間の時間区分であり、部分２は受精後６０〜７５時間の時間区分であり、部分３は受精後７５〜９６時間の時間区分である。
【００６７】
各部分における平均卵割球活性および／または卵割球活性の標準偏差を基に、胚を分類することが可能である。本願の場合は、以下に基づく選択基準を使用した。
・Ｒ１＝所定の胚の胚盤胞活性パターンの部分１および部分３における平均胚盤胞活性間の比率
・Ｒ２＝所定の胚の胚盤胞活性パターンの部分２および部分３における胚盤胞活性の標準偏差間の比率
計算値を以下の表１に示す。
【００６８】
【表１】
2009539387.tif 000003
（Ｒｌ＜１．１５およびＲ２＜０．５０）の場合は「良好」な胚となり、それ以外の場合は「不良」な胚となる。これらの基準を使用して、３９個中３６個の胚を、それ以降どのように発育したかに従って正しく分類した。
【００６９】
（実施例５）
材料および方法：実施例１と同じ。
【００７０】
結果：以下のの図８は、細胞分裂開始の自動判定と手動判定の優れた相関性を示す。最初の細胞分裂の開始が早い場合は、胚品質が高いことを示す。最初（およびそれ以降）の細胞分裂の開始が遅い場合は、低品質の胚であることを示す。しかし、ほとんどの胚の場合、最初の細胞分裂の正確な開始だけでは、以下の図８に示すように胚品質の明確な指標とはならない。不良な胚では細胞分裂の平均的な開始が遅くなるが、標準偏差が固有に大きいため、その絶対値は極端な場合を除いて不良な選択基準となる（例えば、３０時間以前に最初の細胞分裂が開始する場合は、良好な胚であることを示し、３５時間以降に最初の分裂が開始する場合は、不良な胚であることを示すが、調査したウシ胚の大部分では、解釈が容易ではない中間の分裂時間となった）。
【００７１】
（実施例６ａ）
材料および方法：実施例１と同じ。
【００７２】
結果：卵割球活性の典型的な時系列は、インキュベーション時の毎時数回の測定値（例えば、診断に適した時間枠である最初の２〜３日間に測定した、各胚につき約１５０のデータポイント）からなる。ほとんどの統計法では、このように高次元のデータの分析が困難である。したがって、得られたパラメータを抽出することによって次元を下げる堅牢な方法を見出すことが重要である。これを行うため、卵割球活性を、画像取得開始後０〜３２時間、３２〜５２時間および５２〜７２時間という３つの間隔に分割した（図９）。これらの間隔それぞれの中で、以下の方法に基づき３つのピークを見出した。すなわち、第１のピークは、最も高い卵割球活性とし、第２のピークは、第１のピークの少なくとも３．５時間前または３．５時間後の最も高い活性値とし、第３のピークは、第１および第２の両方のピークから少なくとも３．５時間の最も高い活性とした。各ピークから、時間、ピークの値、およびピークの０．５時間前からピークの１．５時間後までの活性値の平均値のパラメータを導き出した。さらに、２つのピークの間のバレーは、最低値、最低値の時間、および平均値で表した（得られたパラメータの例については、図１０を参照）。種々の胚で得られたパラメータ値を等しい分散と平均値に正規化すると、適切に発育しない胚（図１１の不良な胚＝青色の点）に異常値（すなわち、高すぎる値または低すぎる値）が認められることが明らかになる。適切に発育する胚（赤色の点）では、値の範囲がより狭い。上記の得られたパラメータを基に、胚品質の統計モデルを開発することができる。各胚を最終的な発育に基づき評価した場合には、得られたパラメータと最終的な発育との関係を分析する統計法がいくつか存在する。これらの方法には、線形および非線形モデル、ベイジアンネットワーク、ニューラルネットワーク、隠れマルコフモデル、最近隣法、主成分分析法などが含まれる。以下の図１２には、データの主成分分析法（ＰＣＡ）の例を示す。
【００７３】
新しいデータが生成されたら、統計モデルを評価および／または増殖することができる。これを容易にするには、堅牢なデータ構造と得られたパラメータ一式を見出すことが重要となる。
【００７４】
パラメータ３９（＝第３時間区分（受精後７６〜９６時間）における卵割球活性のベースライン値）などの個々のパラメータをごく簡単に分析するだけでも、異常な発育不能の胚をある程度分類することができる。このようにして、この単一のパラメータを基に、７２％の精度で高品質の胚を自動的に選択することが可能となる。
【００７５】
（実施例６Ｂ）
材料および方法：実施例１と同じ。
【００７６】
結果：卵割球活性の典型的な時系列は、インキュベーション時の毎時数回の測定（例えば、診断的に適切な時間枠である最初の２〜３日間に測定した、各胚につき約１５０のデータポイント）からなる。ほとんどの統計法では、このように高次元のデータの分析が困難である。したがって、得られたパラメータを抽出することによって次元を下げる堅牢な方法を見出すことが重要である。これを行うため、卵割球活性を、画像取得開始後０〜３２時間、３２〜５２時間および５２〜７２時間という３つの間隔に分割した（図９）。これらの３つの時間間隔は、ウシ胚の３つの発育段階を反映するために選択した。区分１：１細胞から８細胞への最初の細胞分裂。区分２：活性と運動が比較的少ない休止期。胚ゲノムはこの段階で活性化されると考えられている。胚によって休止期が８細胞の段階から始まるものもあれば、１６細胞期から始まるものもあるが、発育中の胚すべてにおいて、細胞分裂の起こらない期間が長い。区分３：細胞分裂の再開および桑実胚への発育。この段階では個々の卵割球を数えられないことが多いものの、細胞分裂が再開したことが微速度画像により明らかにされている。３つの発育段階を反映したこれら３つの時間間隔それぞれの中で、以下の方法に基づき卵割球活性の３つのピークを特定した。すなわち、第１のピークは、最も高い卵割球活性とし、第２のピークは、第１のピークの少なくとも３．５時間前または３．５時間後の最も高い活性値とし、第３のピークは、第１および第２の両方のピークから少なくとも３．５時間の最も高い活性とした。
【００７７】
各ピークから、発育時間、ピークの値、ピークの０．５時間前からピークの１．５時間後までの活性値の平均値のパラメータを導き出した。さらに、２つのピークの間のバレーは、最低値、最低値の時間、および平均値で表した（得られたパラメータの例については、図９を参照）。
【００７８】
このようにして、本発明者等は、３つの区分それぞれで以下のパラメータを得た：
１  ピーク１の値
２  ピーク１の時間
３  ピーク１の平均値
４  バレー１の値
５  バレー１の時間
６  バレー１の平均値
７  ピーク２の値
８  ピーク２の時間
９  ピーク２の平均値
１０  バレー２の値
１１  バレー２の時間
１２  バレー２の平均値
１３  ピーク３の値
１４  ピーク３の時間
１５  ピーク３の平均値。
【００７９】
さらに、本発明者等は、当該区分の卵割球活性の平均値と標準偏差を計算した。
１６  平均値
１７  標準偏差。
【００８０】
また、本発明者等は、上記のパラメータのいくつかを使用して、主な細胞分裂事象の継続期間または同期性を反映するピークの形状を表した。卵割球活性の鋭いピーク（すなわち、速い同期細胞分裂）は、ピーク値に対するピークの平均値の比率が低いことを特徴とするが、比率が高いほどピークの幅が広くなり、ピークの平均値とピーク値とがより類似する。ピーク値で除算したピークの平均値は常に１未満となり、１に近い値は幅の広いピークを示し、０に近い値は幅のきわめて狭いピークを示す。
１８  （ピーク１の平均値−平均値）／（ピーク１の値−平均値）＝（Ｐ１−Ｐ１６）／（Ｐ３−Ｐ１６）
１９  （ピーク２の平均値−平均値）／（ピーク２の値−平均値）＝（Ｐ７−Ｐ１６）／（Ｐ９−Ｐ１６）
２０  （ピーク３の平均値−平均値）／（ピーク３の値−平均値）＝（Ｐ１３−Ｐ１６）／（Ｐ１５−Ｐ１６）。
【００８１】
最後に、本発明者等は、第１のピークと第２のピークの間の時間の比率、ならびに第２のピークと第３のピークの間の時間の比率を計算した。
２１  （ピーク２の時間−ピーク１の時間）／（ピーク３の時間−ピーク２の時間）＝（Ｐ８−Ｐ２）／（Ｐ１４−Ｐ８）。
【００８２】
上に示した２１個のパラメータからなるパラメータセットは、第１の区分（すなわち、インキュベーション後３２時間）から得られる情報しか含んでいないため、高速分析に使用される。
【００８３】
この小規模のセットは、胚を発育可能なものと発育不能なものとに分類するのに使用できる重要な情報が含んでいるが、それ以降の２つの時間間隔のデータがある場合は、これら２つの以降の区分の分析を繰り返し行うことができる。本発明者等は、これらの以降の区分の比率（すなわち、形状の特徴とピークの間隔）は計算せず、ピークとバレーの比率（すなわち、１区分当たり１５個のパラメータ）のみを計算した。最後に、全体の平均値、全体の標準偏差、ならびに全体の最小値および最大値を、以下に示す５９個のパラメータの全パラメータセットに含めた。
全体の平均値
卵割球活性の全体の標準偏差
卵割球活性の全体の最小値
卵割球活性の全体の最大値
区分１の平均値
区分１の標準偏差
区分１のピーク１の値
区分１のピーク１の位置
区分１のピーク１の平均値
区分１のバレー１の値
区分１のバレー１の位置
区分１のバレー１の平均値
区分１のピーク２の値
区分１のピーク２の位置
区分１のピーク２の平均値
区分１のバレー２の値
区分１のバレー２の位置
区分１のバレー２の平均値
区分１のピーク３の値
区分１のピーク３の位置
区分１のピーク３の平均値
区分２の平均値
区分２の標準偏差
区分２のピーク１の値
区分２のピーク１の位置
区分２のピーク１の平均値
区分２のバレー１の値
区分２のバレー１の位置
区分２のバレー１の平均値
区分２のピーク２の値
区分２のピーク２の位置
区分２のピーク２の平均値
区分２のバレー２の値
区分２のバレー２の位置
区分２のバレー２の平均値
区分２のピーク３の値
区分２のピーク３の位置
区分２のピーク３の平均値
区分３の平均値
区分３の標準偏差
区分３のピーク１の値
区分３のピーク１の位置
区分３のピーク１の平均値
区分３のバレー１の値
区分３のバレー１の位置
区分３のバレー１の平均値
区分３のピーク２の値
区分３のピーク２の位置
区分３のピーク２の平均値
区分３のバレー２の値
区分３のバレー２の位置
区分３のバレー２の平均値
区分３のピーク３の値
区分３のピーク３の位置
区分３のピーク３の平均値
区分１のピーク１の比率
区分１のピーク２の比率
区分１のピーク３の比率
区分１の値１と値２の比率。
【００８４】
種々の胚で得られたパラメータ値を等しい分散と平均値に正規化すると、適切に発育しない胚（図１１の不良な胚＝青色の点）に異常値（すなわち、高すぎる値または低すぎる値）が認められることが明らかになる。図中のパラメータは上記と同じ順序であるが、最後にある４つの比率パラメータは割愛されている。適切に発育する胚（赤色の点）では、値の範囲がより狭い。
【００８５】
上記の得られたパラメータを基に、胚品質の統計モデルを開発することができる。各胚を最終的な発育に基づき評価した場合には、得られたパラメータと最終的な発育との関係を分析する統計法がいくつか存在する。これらの方法には、線形および非線形モデル、ベイジアンネットワーク、ニューラルネットワーク、隠れマルコフモデル、最近隣法、主成分分析法などが含まれる。以下の図１１には、データの主成分分析法（ＰＣＡ）の例を示す。
【００８６】
線形モデルの使用例は実施例７に示す。
【００８７】
新しいデータが生成されたら、統計モデルを評価および／または増殖することができる。これを容易にするには、堅牢なデータ構造と得られたパラメータ一式を見出すことが重要となる。
【００８８】
パラメータ３９（＝第３時間区分（受精後７６〜９６時間）における卵割球活性のベースライン値）などの個々のパラメータをごく簡単に分析するだけでも、異常な発育不能の胚をある程度分類することができる。このようにして、この単一のパラメータを基に、７２％の精度で高品質の胚を自動的に選択することが可能となる。
【００８９】
（実施例７）  自動検出または発育学者による検出に基づいた胚選択の比較
設計：９５個のウシ胚を、７日間一定の温度、湿度およびＣＯ２の下で微速度顕微鏡に設置した。受精後２４時間から９６時間まで毎時２回ずつ画像を取得した。その後（すなわち７日後）増殖した卵割球に発育した３８個の胚を正確に特定する画像分析工程の能力を評価し、各胚の同じ１４５枚の画像を基に訓練を受けた発育学者が行った品質評価と比較した。
【００９０】
材料および方法：ウシ未熟卵丘母細胞複合体を、屠殺場から入手した卵巣から吸引して、２２時間の受精前に２４時間成熟させた。その後、卵丘細胞を除去し、予定接合子を合成卵管液培地に移して培養した。微速度画像は、高感度ビデオカメラを装備したニコン倒立顕微鏡ステージ上に装着したインキュベータボックス内で取得した。
【００９１】
結果：全自動画像分析工程により、微速度系列の連続画像間で観察した運動を基に、卵割球活性の定量的な指標を生成した。卵割球活性と細胞分裂との相関性は、微速度画像系列の自動分析と手動分析とを比較することにより確認した。卵割球活性の顕著なピークは、細胞分裂に関連することが明らかになった。記録したピークの位置、形状および大きさを基に、細胞分裂の正確な開始と継続期間を定量化することができた。このようにして、所定の胚の卵割球活性パターンを、突出したピークの高さ、位置および幅に対応した１組の主要パラメータと、ピークの間の卵割球活性レベルを表す類似のパラメータとに減らすことができた。胚を「発育可能」または「発育不能」として分類するため、各胚につき合計５５個のパラメータを単純な線形モデルで使用した。このモデルを、観察した胚パターンのサブセットで訓練し、種々の独立したサブセットで評価した。同じ微速度系列の画像を熟練した発育学者が評価し、増殖した卵割球に胚が発育するかどうかの予測を試みた。
【００９２】
このモデルは精度に限界があるごく単純な線形モデルではあったものの、どの胚が増殖した卵割球に発育するかの予測においては、訓練を受けた発育学者（誤認率：２６％、９５個中１９個）よりも全自動解析（誤認率：２０％、９４個中２４個）の方が優れていることが認められた。さらにまた、自動解析（４５個中１３個＝２９％）の方が手動分析（６０個中２３個、３８％）よりも偽陽性が少なかった。偽陽性とは、高い発育能力を有すると考えられるにもかかわらず、発育が止まり、７日間の観察期間内に増殖胚盤胞期に全く到達しない胚である。このような胚を移植しても、妊娠に至る可能性は低い。
【００９３】
【表２】
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【００９４】
【化１】
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【００９５】
【化２】
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【００９６】
【化３】
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【００９７】
【化４】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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