(57)【要約】  イノシトール−トリピロリン酸は、赤血球の細胞膜を越える能力に起因するヘモグロビンのアロステリックエフェクターであり、赤血球のヘモグロビンの酸素親和力を低下させることによって、酸素を固形腫瘍に送達する。本発明は、循環する赤血球内のヘモグロビンの酸素に対する親和力を低下させる、イノシトール−トリピロリン酸の使用に関する。本発明はさらに、低酸素腫瘍の血管新生を阻害して放射線感受性を増強する、イノシトール−トリピロリン酸の使用に関する。本発明はさらに、低酸素腫瘍内のＰＯ２を増強する、イノシトール−トリピロリン酸の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたは動物に有効量のイノシトール−トリピロリン酸を投与する工程を含む、前記ヒトまたは動物の癌を治療する方法。
【請求項２】
前記有効量のイノシトール−トリピロリン酸の投与が、前記ヒトまたは動物の血管新生効果を阻害する一日量、一日部分用量、またはこれらの任意の適切な比率である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記有効量のイノシトール−トリピロリン酸の投与が、経口、非経口、経皮、局所、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、皮内、点眼、硬膜外、気管内、舌下、頬側、直腸、経腟、経鼻または吸入である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記有効量のイノシトール−トリピロリン酸が、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、液状担体、溶質、懸濁剤、増粘剤、着香剤、ゼラチン、グリセリン、バインダー、潤滑剤、不活性希釈剤、保存料、表面活性剤、分散剤、生分解性ポリマー、またはこれらの任意の組み合わせから選択される添加剤を含む組成物で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記有効量のイノシトール−トリピロリン酸が、錠剤、カプセル、ロゼンジ、カシェ、溶液、懸濁液、エマルジョン、粉末、エアロゾル、坐薬、スプレー、トローチ、軟膏、クリーム、ペースト、フォーム、ゲル、タンポン、膣坐薬、顆粒、ボーラス投与、うがい薬、または経皮パッチの形態で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記血管新生が血管新生依存性癌と関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記癌が、乳癌、前立腺癌、腎細胞癌、脳癌、卵巣癌、結腸癌、膀胱癌、膵臓癌、胃癌、食道癌、皮膚黒色腫、肝臓癌、肺癌、精巣癌、腎臓癌、膀胱癌、頚部癌、リンパ腫、副甲状腺癌、陰茎癌、直腸癌、小腸癌、甲状腺癌、子宮癌、ホジキンリンパ腫、口唇および口腔癌、皮膚癌、白血病または多発性骨髄腫から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ヒトまたは動物に有効量のイノシトール−トリピロリン酸を投与する工程を含む、低酸素腫瘍への酸素送達を増強する方法。
【請求項９】
前記有効量のイノシトール−トリピロリン酸の投与が、前記ヒトまたは動物の一日量、一日部分用量、またはこれらの任意の適切な比率である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記有効量のイノシトール−トリピロリン酸の投与が、経口、非経口、経皮、局所、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、皮内、点眼、硬膜外、気管内、舌下、頬側、直腸、経腟、経鼻または吸入である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記有効量のイノシトール−トリピロリン酸が、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、液状担体、溶質、懸濁剤、増粘剤、着香剤、ゼラチン、グリセリン、バインダー、潤滑剤、不活性希釈剤、保存料、界面活性剤、分散剤、生分解性ポリマー、またはこれらの任意の組み合わせから選択される添加剤を含む組成物で投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記有効量のイノシトール−トリピロリン酸が、錠剤、カプセル、ロゼンジ、カシェ、溶液、懸濁液、エマルジョン、粉末、エアロゾル、坐薬、スプレー、トローチ、軟膏、クリーム、ペースト、フォーム、ゲル、タンポン、膣坐薬、顆粒、ボーラス投与、うがい薬、または経皮パッチの形態で投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
ヒトまたは動物に有効量のイノシトール−トリピロリン酸を投与する工程を含む、前記ヒトまたは動物における腫瘍の放射線感受性を増強する方法。
【請求項１４】
前記有効量のイノシトール−トリピロリン酸の投与が、前記ヒトまたは動物の前記血管新生の効果を阻害する一日量、一日部分用量、またはこれらの任意の適切な比率である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記有効量のイノシトール−トリピロリン酸の投与が、経口、非経口、経皮、局所、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、皮内、点眼、硬膜外、気管内、舌下、頬側、直腸、経腟、経鼻または吸入である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記有効量のイノシトール−トリピロリン酸が、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、液状担体、溶質、懸濁剤、増粘剤、着香剤、ゼラチン、グリセリン、バインダー、潤滑剤、不活性希釈剤、保存料、界面活性剤、分散剤、生分解性ポリマー、またはこれらの任意の組み合わせから選択される添加剤を含む組成物で投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記有効量のイノシトール−トリピロリン酸が、錠剤、カプセル、ロゼンジ、カシェ、溶液、懸濁液、エマルジョン、粉末、エアロゾル、坐薬、スプレー、トローチ、軟膏、クリーム、ペースト、フォーム、ゲル、タンポン、膣坐薬、顆粒、ボーラス投与、うがい薬、または経皮パッチの形態で投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
ヒトまたは動物に有効量のイノシトール−トリピロリン酸を投与する工程を含む、低酸素腫瘍内のＰＯ２を増強する方法。
【請求項１９】
前記有効量のイノシトール−トリピロリン酸の投与が、前記ヒトまたは動物の一日量、一日部分用量、またはこれらの任意の適切な比率である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記有効量のイノシトール−トリピロリン酸の投与が、経口、非経口、経皮、局所、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、皮内、点眼、硬膜外、気管内、舌下、頬側、直腸、経腟、経鼻または吸入である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記有効量のイノシトール−トリピロリン酸が、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、液状担体、溶質、懸濁剤、増粘剤、着香剤、ゼラチン、グリセリン、バインダー、潤滑剤、不活性希釈剤、保存料、界面活性剤、分散剤、生分解性ポリマー、またはこれらの任意の組み合わせから選択される添加剤を含む組成物で投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記有効量のイノシトール−トリピロリン酸が、錠剤、カプセル、ロゼンジ、カシェ、溶液、懸濁液、エマルジョン、粉末、エアロゾル、坐薬、スプレー、トローチ、軟膏、クリーム、ペースト、フォーム、ゲル、タンポン、膣坐薬、顆粒、ボーラス投与、うがい薬、または経皮パッチの形態で投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
ヒトまたは動物に有効量のイノシトール−トリピロリン酸を投与する工程を含む、前記ヒトまたは動物の赤血球内で酸素に対するヘモグロビンの親和力を低下させる方法。
【請求項２４】
前記有効量のイノシトール−トリピロリン酸の投与が、前記ヒトまたは動物の一日量、一日部分用量、またはこれらの任意の適切な比率である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記有効量のイノシトール−トリピロリン酸の投与が、経口、非経口、経皮、局所、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、皮内、点眼、硬膜外、気管内、舌下、頬側、直腸、経腟、経鼻または吸入である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記有効量のイノシトール−トリピロリン酸が、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、液状担体、溶質、懸濁剤、増粘剤、着香剤、ゼラチン、グリセリン、バインダー、潤滑剤、不活性希釈剤、保存料、界面活性剤、分散剤、生分解性ポリマー、またはこれらの任意の組み合わせから選択される添加剤を含む組成物で投与される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記有効量のイノシトール−トリピロリン酸が、錠剤、カプセル、ロゼンジ、カシェ、溶液、懸濁液、エマルジョン、粉末、エアロゾル、坐薬、スプレー、トローチ、軟膏、クリーム、ペースト、フォーム、ゲル、タンポン、膣坐薬、顆粒、ボーラス投与、うがい薬、または経皮パッチの形態で投与される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
イノシトール−トリピロリン酸および薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤を含む医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イノシトール−トリピロリン酸（ＩＴＰＰ）を使用して、赤血球による酸素送達を増強するための組成物および方法に関する。ＩＴＰＰは、赤血球の細胞膜を越えて赤血球のヘモグロビンの酸素親和力を低下させる能力を有する、ヘモグロビンのアロステリックエフェクターである。本発明はさらに、低酸素腫瘍の血管新生を阻害して、放射線感受性を増強するためのＩＴＰＰの使用に関する。本発明はさらに、低酸素腫瘍内のＰＯ２を増強するためのＩＴＰＰの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
成人ヒトの脈管系内で、血液は約５〜６リットルの体積を有する。この体積のおよそ半分は、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）、白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）、および血液血小板をはじめとする細胞によって占められる。赤血球は血液の細胞構成要素の大部分を構成する。血液の液体部分である血漿はおよそ９０％が水であり、１０％が様々な溶質である。これらの溶質としては、血漿タンパク質、有機代謝産物および老廃物、および無機化合物を含む。
【０００３】
赤血球の主要な機能は、酸素を肺から身体組織に輸送し、二酸化炭素を組織から肺に輸送し、除去することである。酸素は水溶液には難溶性であるため、血漿によっては非常にわずかな酸素しか輸送されない。血液によって輸送される酸素のほとんどは、赤血球のヘモグロビンによって輸送される。哺乳類中の赤血球は、核、ミトコンドリアまたはあらゆるその他の細胞内小器官を含まず、自身の代謝において酸素を使用しない。赤血球は、酸素の結合および輸送の役割を担うヘモグロビンを約３５重量％含む。
【０００４】
ヘモグロビンは、およそ６４，５００ダルトンの分子量を有するタンパク質である。ヘモグロビンは４本のポリペプチド鎖と４個のヘム補欠分子族を含み、その中で鉄原子は第一鉄状態で結合する。正常なグロビンであるヘモグロビン分子のタンパク質部分は、２本のα鎖および２本のβ鎖からなる。４本の各鎖はその中で鎖が折りたたまれる特徴的な三次構造を有する。４本のポリペプチド鎖はほぼ四面体配置で適合して、特徴的なヘモグロビンの四次構造を構成する。各ポリペプチド鎖に結合する１個のヘム基があり、ヘム基は１個の酸素分子と可逆的に結合できる。ヘモグロビンが酸素と組み合わさると、オキシヘモグロビンを形成する。酸素が放出されると、オキシヘモグロビンはデオキシヘモグロビンに還元される。
【０００５】
腫瘍を含めた組織への酸素の送達は、血流量、赤血球数、赤血球内のヘモグロビン濃度、ヘモグロビンの酸素親和力、および特定の種では高および低酸素親和力の赤血球内ヘモグロビンのモル比に依存するが、これに限定されるものではないいくつかの要因に左右される。ヘモグロビンの酸素親和力は、４つの要因、すなわち（１）酸素分圧、（２）ｐＨ、（３）ヘモグロビン中の２，３−ジホスホグリセリン酸（ＤＰＧ）濃度、および（４）二酸化炭素濃度にも依存する。肺では１００ｍｍＨｇの酸素分圧下において、およそ９８％の循環ヘモグロビンが酸素飽和している。これは血液の総酸素輸送能力に相当する。完全に酸素化すると、１００ｍｌの哺乳類全血は約２１ｍｌの気体酸素を運搬できる。
【０００６】
ヘモグロビンの酸素結合能力に対する酸素分圧およびｐＨの影響は、ヘモグロビンの酸素飽和曲線を調べることで最も良く示される。酸素飽和曲線は、ヘモグロビン分子溶液が気相中の異なる酸素分圧と平衡状態にある場合に、酸素分子によって占有されるヘモグロビン分子の全酸素結合部位の百分率をプロットする。
【０００７】
ヘモグロビンの酸素飽和曲線はＳ字形である。したがって最初の酸素分子との結合は、さらに酸素分子と結合するために、残りのヘモグロビンの親和力を増大させる。酸素分圧が増大すると平坦域に近づき、そこで各ヘモグロビン分子は飽和して、上限４個の酸素分子を含む。ヘモグロビンによる酸素の可逆的結合は、式、
【化１】
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【０００８】
に従った水素イオン放出を伴う。したがってｐＨの増大は平衡を右側に偏らせ、特定分圧においてヘモグロビンをより多くの酸素と結合させる。ｐＨの低下は酸素結合量を低下させる。
【０００９】
肺においては、空隙内の酸素分圧はおよそ９０〜１００ｍｍＨｇであり、ｐＨもまた通常の血液ｐＨと比較して高い（７．６まで）。したがってヘモグロビンは、肺においてほぼ最大限に酸素飽和する傾向がある。この圧力とｐＨでは、ヘモグロビンはおよそ９８％の酸素飽和度である。他方、末梢組織内部の毛細血管では、酸素分圧はわずか約２５〜４０ｍｍＨｇであり、ｐＨもまたほぼ中性（約７．２〜７．３）である。筋肉細胞は酸素を高速に使用することによって局在性酸素濃度が低下するので、組織への一部の結合酸素の放出に有利となる。血液が筋肉内の毛細血管を通過するにつれて、酸素は赤血球内のほぼ飽和したヘモグロビンから血漿内、ひいては筋肉細胞内に放出される。ヘモグロビンが筋肉を離れる際にわずか約７５％の飽和度となるように、ヘモグロビンが筋肉毛細血管を通過する場合、その結合酸素の約４分の１を放出する。一般に、組織を離れる静脈血中のヘモグロビンは、肺と末梢組織との間のその反復する回路において、約６５から９７％の酸素飽和度の間で循環する。したがって酸素分圧とｐＨは一緒に機能して、ヘモグロビンによる酸素の放出をもたらす。
【００１０】
ヘモグロビンの酸素付加度の調節において重要な三番目の要素は、アロステリックエフェクター、２，３−ジホスホグリセリン酸（ＤＰＧ）である。ＤＰＧは哺乳類の赤血球内ヘモグロビンの通常の生理学的エフェクターである。ＤＰＧは肺中酸素分圧との関連して、赤血球内ヘモグロビンの酸素結合親和力を調節する。細胞内のＤＰＧ濃度が高いほど、酸素に対するヘモグロビンの親和力は低くなる。
【００１１】
組織への酸素の送達が慢性的に減少すると、赤血球内のＤＰＧ濃度は正常な個人における状態よりも高くなる。例えば高地では酸素分圧は顕著に低くなる。それに伴い組織内の酸素分圧はより低くなる。正常な被験者がより高い標高に移動すると、数時間以内に赤血球内のＤＰＧレベルが増大し、より多くのＤＰＧを結合させてヘモグロビンの酸素親和力を低下させる。赤血球のＤＰＧレベルの増大はまた、低酸素症を患っている患者でも起きる。この調節はヘモグロビンにその結合酸素をより容易に組織に放出させて、肺におけるヘモグロビンの酸素付加の減少を保障する。逆の変化は、人々が高い標高に順応してから低い標高に降りた場合に起きる。
【００１２】
常態で血液から単離されたままのヘモグロビンは、かなりの量のＤＰＧを含む。ヘモグロビンがＤＰＧを「除去」されると、酸素に対してはるかに高い親和力を示す。ＤＰＧが増大すると、ヘモグロビンの酸素結合親和力は低下する。したがってＤＰＧなどの生理学的なアロステリックエフェクターは、ヘモグロビンから組織内への正常な酸素放出に必須である。
【００１３】
ＤＰＧが哺乳類赤血球のヘモグロビンの通常の生理学的エフェクターであるのに対し、リン酸化イノシトールは、いくつかの鳥類および爬虫類の赤血球内で同一の役割を果たすことが発見されている。イノシトール六リン酸（ＩＨＰ）は哺乳類の赤血球膜を通過できないが、哺乳類赤血球のヘモグロビンとＤＰＧ結合部位で結合して、ヘモグロビンのアロステリック立体配座を改変でき、酸素に対するヘモグロビンの親和力を低下させる効果がある。例えばＤＰＧは、ＤＰＧよりもはるかに強力にヘモグロビンの酸素親和力を低下させるＩＨＰに置換できる。ＩＨＰはＤＰＧよりも１０００倍高いヘモグロビンへの親和力を有し（Ｒ．Ｅ．ベネッシュ（Ｂｅｎｅｓｃｈ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第１６巻、２５９４〜２５９７頁（１９７７年））、ヘモグロビンのＰ５０をｐＨ７．４および３７℃において９６．４ｍｍＨｇの値まで増大させる（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２５０巻、７０９３〜７０９８頁、１９７５年））。
【００１４】
哺乳類赤血球の酸素放出能は、ヘモグロビンの特定のアロステリックエフェクターを赤血球内に導入することによってヘモグロビンの酸素親和力を低下させ、血液の酸素効率を改善することで増強できる。この現象は、肺または循環系の不十分な機能に起因する組織の酸素付加低下を経験している個人を治療するための様々な医療用途を示唆する。
【００１５】
これらの変性赤血球の使用から達成される可能な医療上の利点のために、先行技術において、ヘモグロビンのアロステリックエフェクターの赤血球内封入を可能にする様々な技術が開発されている。結果として、封入手順を助けまたは簡単にする多数の装置が設計されている。技術分野で知られている封入法としては、細胞の浸透圧パルス（膨潤）と再構成、制御された溶解と再封、リポソーム組み込み、および電気穿孔を含む。現行の電気穿孔法は、商業利用に適した規模では手順が商業的に非実用的となる。
【００１６】
以下の参考文献は、ＩＨＰが詰め込まれたリポソームの相互作用による赤血球へのポリリン酸塩組み込みについて述べている：ジェルソンド（Ｇｅｒｓｏｎｄｅ）ら、「無処置赤血球へのポリリン酸塩の組み込みによる細胞内ヘモグロビンの酸素親和力の変更および毛細血管系における増強されたＯ２放出（Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ｂｙ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ  ｉｎｔｏ  Ｉｎｔａｃｔ  Ｒｅｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｏ２  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）」、Ｂｉｂｌｔｈｃａ．Ｈａｅｍａｔ．、第４６号、８１〜９２頁（１９８０年）；ジェルソンド（Ｇｅｒｓｏｎｄｅ）ら、「エフェクター含有脂質小胞との融合によるイノシトール六リン酸組み込み後のヒト赤血球のＯ２放出能およびボーア効果の増強（Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｏ２  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｏｈｒ−Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｆｔｅｒ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｏｓｉｔｏｌ  Ｈｅｘａｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｙ  Ｆｕｓｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｌｉｐｉｄ  Ｖｅｓｉｃｌｅｓ）」、ヘモグロビンの協合的結合の起源（Ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）、（１９８２年）；およびウィーナー（Ｗｅｉｎｅｒ）、「リポソーム技術による生赤血球内のＨｂ−Ｏ２解離の右方シフト（Ｒｉｇｈｔ  Ｓｈｉｆｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｈｂ−Ｏ２  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｖｉａｂｌｅ  Ｒｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）」、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ、第４７巻（１９８３年）。
【００１７】
さらにニコラウ（Ｎｉｃｏｌａｕ）らの米国特許第４，１９２，８６９号明細書、米国特許第４，３２１，２５９号明細書、および米国特許第４，４７３，５６３号明細書中では、流体装填した脂質小胞を赤血球膜と縮合してその内容物を赤血球内に入れる方法について述べている。この方式で、ＩＨＰなどのアロステリックエフェクターを赤血球内に輸送することが可能であり、自身のより高い結合定数のために、ＩＨＰはＤＰＧをそのヘモグロビン中の結合部位で置換する。
【００１８】
リポソーム技術によって、溶液が飽和するまでリン酸緩衝液にＩＨＰを溶解し、脂質小胞混合物を溶液中に懸濁する。次に懸濁液に超音波処理または注入処理を施して、次に遠心分離する。次にＩＨＰを含む小型脂質小胞を含有する上部懸濁液を収集する。収集した懸濁液に赤血球を添加してインキュベートし、その間にＩＨＰを含む脂質小胞は、赤血球の細胞膜と融合することによってその内容物が赤血球内部に沈着する。次に変性赤血球を洗浄して血漿に添加し、生成物を完成する。
【００１９】
リポソーム技術に関連する欠点としては、赤血球に組み込まれたＩＨＰ濃度の再現性不良、および処理に続く赤血球の顕著な溶血を含む。さらに手順が煩雑で複雑なため、商業化は現実的でない。
【００２０】
リポソーム技術に関連する欠点を解消する試みとして、赤血球を溶解して再封する方法が開発された。この方法についてはニコラウ（Ｎｉｃｏｌａｕ）ら、「ヘモグロビンのアロステリックエフェクターの赤血球内への組み込み。生理的効果（Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ｉｎ  Ｒｅｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ  Ｅｆｆｅｃｔｓ）」、Ｂｉｂｌｔｈｃａ．Ｈａｅｍａｔ．、第５１号、９２〜１０７頁、（１９８５年）で述べられている。関連したロパース（Ｒｏｐａｒｓ）らの米国特許第４，７５２，５８６号明細書および米国特許第４，６５２，４４９号明細書もまた、赤血球とリポソームの相互作用を避けて、赤血球の制御された溶解および再封によって、ヒトまたは動物の赤血球内に生物学的活性を有する物質を封入する手順について述べている。
【００２１】
この技術は、浸透圧パルス技術と類似した方法で機能する連続流動式透析システムとして、最も良く特徴づけられる。具体的には、少なくとも１つの透析要素の第１の区画に赤血球の水性懸濁液が連続的に供給される一方、透析要素の第２の区画は赤血球懸濁液に対して低浸透圧性の水溶液を含む。この低浸透圧性溶液は赤血球を溶解させる。次に赤血球溶解産物を赤血球内に組み込まれる生物学的活性物質と接触させる。赤血球膜を再封するために赤血球溶解産物の浸透圧および／またはコロイド浸透圧を増大させ、再封された赤血球懸濁液を回収する。
【００２２】
グッドリッチ（Ｇｏｏｄｒｉｃｈ）らの関連した米国特許第４，８７４，６９０号明細書および米国特許第５，０４３，２６１号明細書には、赤血球の凍結乾燥および再構成を伴う関連技術が開示されている。赤血球を再構成する方法の一部として、ＩＨＰをはじめとする種々のポリアニオンの添加について述べられている。開示された方法に従った赤血球の処理は、活性が影響を受けない細胞をもたらす。おそらくＩＨＰは再構成過程において細胞内に組み込まれることによってヘモグロビンの活性を維持する。
【００２３】
フランコ（Ｆｒａｎｃｏ）らの米国特許第４，４７８，８２４号明細書および米国特許第４，９３１，２７６号明細書では、細胞を効果的に溶解し再封することによって、ＩＨＰをはじめとする事実上非イオン性の薬剤を哺乳類の赤血球内に導入する第２の関連した方法および装置について述べられている。この手順は、「浸透圧パルス技術」として記載されている。浸透圧パルス技術の実施においては、細胞内外に容易に拡散する化合物を含む溶液中に濃縮赤血球供給材料を懸濁してインキュベートするが、化合物濃度は、細胞内への拡散を引き起こすのに十分であるので、細胞内容物は高浸透圧になる。次に少なくとも１種の導入する所望の薬剤の存在下で、高浸透圧細胞を含む溶液を本質的に等張な水性媒質で希釈して膜貫通イオン勾配を作り出し、これによって細胞内への水の拡散を引き起し、その結果として細胞の膨張および細胞外膜の透過性増大（ａｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ）が起きる。この「浸透圧パルス」は、細胞内への水の拡散、および結果として生じる細胞の膨張を引き起こし、所望の薬剤に対する細胞外膜の透過性を上昇させる。膜透過性の増大は、少なくとも１種類の薬剤の細胞内への輸送および化合物の細胞外への拡散に十分な期間のみ維持される。
【００２４】
浸透圧パルス技術の実施に使用してもよいポリアニオンとしては、水溶性で赤血球の外側脂質二層膜を破壊しない、ピロリン酸塩、トリポリリン酸塩、リン酸化イノシトール、２，３−ジホスホグリセリン酸（ＤＰＧ）、アデノシン三リン酸、ヘパリン、およびポリカルボン酸を含む。
【００２５】
浸透圧パルス技術には、封入の低い収率、不完全な再封、細胞内容物の損失、および対応する細胞寿命短縮をはじめとするいくつかの欠点がある。この技術は煩雑かつ複雑であり自動化には適さない。これらの理由から浸透圧パルス技術は、商業的にはわずかな成功しか収めていない。
【００２６】
赤血球内に種々の生物学的活性物質を封入する別の方法は、電気穿孔である。電気穿孔は、ムーナイム（Ｍｏｕｎｅｉｍｎｅ）らの「電気穿孔を使用した赤血球内へのイノシトール六リン酸の封入によって誘発されるオキシヘモグロビン解離曲線の安定した右方シフト（Ｓｔａｂｌｅ  ｒｉｇｈｔｗａｒｄ  ｓｈｉｆｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｘｙｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｃｕｒｖｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｏｓｉｔｏｌ  ｈｅｘａｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｉｎ  ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）」、ＦＥＢＳ、第２７５巻、第１、２号、１１７〜１２０頁（１９９０年））で述べられているように、ＩＨＰ赤血球を始めとする、異なる細胞タイプへの異質分子の封入に使用されている。米国特許第５，６１２，２０７号明細書もまた参照されたい。
【００２７】
血管新生は組織または臓器内への新たな血管の発生であり、組織内酸素圧に関係している。正常な生理学的条件下では、ヒトおよび動物は、非常に特異的な限定的状況のみで血管新生を起こす。例えば血管新生は通常、創傷治癒、胎児および胚発生、ならびに黄体、子宮内膜、および胎盤の形成において観察される。
【００２８】
血管新生は、血管新生の刺激物質と阻害物質との高度に制御されたシステムを通じて制御される。血管新生の制御は特定の疾患状態で改変され、多くの場合、疾患と関連付けられている病的損傷は、制御されない血管新生に関係している。制御されたおよび制御されない血管新生のどちらも、同様の様式で進行すると考えられる。基底膜によって取り囲まれる内皮細胞および周細胞が毛細血管を形成する。血管新生は、内皮細胞と白血球によって放出される酵素による基底膜浸食に始まる。次に血管内腔を裏打ちしている内皮細胞が、基底膜を貫いて突出する。血管新生刺激物質は、内皮細胞が浸食された基底膜を通って移動するように促す。移動する細胞は親血管から「新芽」を形成し、そこで内皮細胞は有糸分裂を起こして増殖する。内皮の新芽は互いに同化して毛細血管ループを形成し、新しい血管を創生する。
【００２９】
持続性の制御されない血管新生は多くの疾患状態、腫瘍転移、内皮細胞による異常増殖において起きる。制御されない血管新生が存在する様々な病理学的疾患状態は、血管新生依存または血管新生関連疾患としてグループ化されている。
【００３０】
腫瘍成長が血管新生依存性であるという仮説は、１９７１年に初めて提案された。（フォークマン（Ｆｏｌｋｍａｎ）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、２８５：１１８２〜８６頁（１９７１年））。その最も単純な表現では、この仮説は、「ひとたび腫瘍「獲得」が起きると、腫瘍細胞集団の各増加には、腫瘍に収束する新しい毛細血管の増加が先行しなくてはならない」と記述される。腫瘍「獲得」は、目下、その中で数立方ｍｍの体積を占めるが数百個の細胞を超えない腫瘍細胞集団が、既存の宿主微小血管上で生存できる、腫瘍成長の前血管相を示すものと理解される。この相を超える腫瘍体積の増大は、新しい毛細血管の誘発を必要とする。例えばマウスにおける初期前血管相の肺微小転移巣は、組織学的切片の高倍率鏡検法による以外では検出不能であろう。
【００３１】
血管新生は、固形腫瘍および血液由来腫瘍をはじめとするいくつかの異なるタイプの癌と関連付けられている。血管新生と関連付けられている固形腫瘍としては、限定されるものではないが、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、ユーイング肉腫、神経芽細胞腫、および骨肉腫を含む。血管新生はまた、白血病などの血液由来腫瘍や、その中で白血球の無制限の増殖が起きて、通常、貧血、血液凝固障害、およびリンパ節、肝臓、および脾臓の肥大を伴う、骨髄の様々な急性または慢性新生物疾患のいずれかとも関連している。血管新生は、白血病腫瘍および多発性骨髄腫疾患を生じさせる骨髄異常の一因であると考えられる。
【００３２】
小児期の最も高頻度の血管新生疾患の１つは、血管腫である。血管腫は、新たに形成された血管から構成される腫瘍である。ほとんどの症例では、腫瘍は良性であり介入なしに退行する。より重篤な症例では、腫瘍は大きな空洞性かつ浸潤性の形態に進行して、臨床的合併症を生じる。血管腫の全身性形態である血管腫症は、高死亡率を有する。目下使用されている療法で治療できない治療抵抗性血管腫が存在する。
【００３３】
別の血管新生関連疾患は関節リウマチである。関節の滑膜裏内の血管が血管新生を起こす。新しい血管網目状組織を形成するのに加えて、内皮細胞は、パンヌス生育と軟骨破壊をもたらす因子および反応性酸素種を放出する。血管新生はまた、骨関節炎の一因であるかもしれない。血管新生関連因子による軟骨細胞の活性化は、関節の破壊に寄与する。後期には、血管新生因子は新しい骨の生育を促進する。軟骨破壊を防止する治療的な介入は、疾患の進行を停止させ、関節炎を患う人々に苦痛緩和を提供するであろう。
【００３４】
慢性炎症もまた、病的血管新生に関連すると思われる。潰瘍性結腸炎およびクローン病などの疾患は、炎症組織内への新血管の内部成長と共に、組織学的変化を示す。南米で見られる細菌感染症であるバルトネラ症（Ｂａｒｔｏｎｅｌｏｓｉｓ）は、血管内皮細胞の増殖によって特徴づけられる慢性段階になることができる。血管新生と関連付けられている別の病理学的役割は、アテローム性動脈硬化で見られる。血管内腔内に形成されるプラークは、血管新生刺激活性を有することが示されている。
【００３５】
上述のように数行の証拠は、血管新生が、固形腫瘍の成長、持久性、および転移のために必須であることを示唆する。ひとたび血管新生が刺激されると、腫瘍は、線維芽細胞成長因子（αＦＧＦおよびβＦＧＦ）および血管内皮成長因子／血管透過度因子（ＶＥＧＦ／ＶＰＦ）をはじめとする、多様な血管新生因子の産生を上方制御する［２，３］。
【００３６】
血管新生の制御におけるＶＥＧＦの役割は、熱心な研究の対象である［５〜１０］。ＶＥＧＦは、生理学的血管新生における重要な律速段階に相当する一方で、腫瘍成長と関連付けられているものなどの病的血管新生においても重要であるように見える［１１］。ＶＥＧＦはまた、血管漏出を誘発する能力に基づいて、血管透過度因子としても知られている［１３］。いくつかの固形腫瘍は、内皮細胞の増殖および移行を刺激する十分な量のＶＥＧＦを産生することによって新生血管形成を誘発する［１２，１３］。
【００３７】
ＶＥＧＦ発現は、異なる種類のヒト癌の予後に顕著に影響することが示されている。腫瘍内の酸素圧は、ＶＥＧＦ遺伝子の発現を制御する上で重要な役割を有する。ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡの発現は、多様な病態生理学的状況下における低酸素圧への曝露によって誘発される［１３］。成長中の腫瘍は低酸素によって特徴づけられ、ＶＥＧＦの発現を誘発し、また転移性疾患発生の予測因子であるかもしれない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３８】
したがって必要なのは、組織、特に腫瘍内で酸素圧を制御できる組成物および方法である。さらに必要なのは、赤血球のＰ５０値の顕著な右方シフトを引き起こすことができる、単純で、好ましくは経口的に容易に投与される組成物である。
【課題を解決するための手段】
【００３９】
本発明は、異常な血管新生によって特徴づけられる疾患を治療するのに効果的なイノシトール−トリピロリン酸（ＩＴＰＰ）を含む組成物を提供する。本発明はまた、腫瘍を含めた組織への制御された酸素の送達を増大させるために、ＩＴＰＰを使用する方法も提供する。例えばヒトまたは動物における血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の制御は、赤血球内に入れたＩＴＰＰを使用して達成でき、したがって循環赤血球の酸素に対する親和力が低下される。本発明によって、ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡの発現、タンパク質濃度、および腫瘍細胞増殖に対するＩＴＰＰの効果が可能になる。また生体外および生体内の双方で、ＶＥＧＦ発現を制御する方法がＩＴＰＰを使用して開発された。
【００４０】
本発明は、赤血球内のＩＴＰＰを使用して、固形腫瘍に酸素を送達し、血管新生を阻害して、低酸素腫瘍の放射線感受性を増強するための組成物および方法をさらに含む。本発明はさらに、低酸素腫瘍内のＰＯ２を増強するためのＩＴＰＰの使用に関する。ヘモグロビンのアロステリックエフェクターであるＩＴＰＰは、酸素に対するヘモグロビンの親和力を低下させ、ヘモグロビンによる酸素放出を増強することができる。ＩＴＰＰは細胞の要求に応じて、腫瘍細胞中のＶＥＧＦ発現、ひいては血管新生を阻害する。
【００４１】
ここでの定義で、望ましくない血管新生または望ましくない血管新生によって特徴づけられる疾患としては、限定されるものではないが、内皮細胞の過剰なまたは異常な刺激（例えばアテローム性動脈硬化）、血液由来腫瘍、固形腫瘍および腫瘍転移、例えば血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫などの良性腫瘍、血管機能障害、異常な創傷治癒、炎症および免疫障害、ベーチェット病、痛風または痛風性関節炎、糖尿病性網膜症、ならびに未熟児網膜症（水晶体後線維増殖症）、黄斑変性、角膜移植片拒絶、血管新生緑内障、およびオスラー−ウェーバー症候群（オスラー−ウェーバー−ランジュ症候群）などのその他の眼の血管新生疾患を含む。本発明によって治療できる癌としては、乳癌、前立腺（ｐｒｏｓｔｒａｔｅ）癌、腎細胞癌、脳癌、卵巣癌、結腸癌、膀胱癌、膵臓癌、胃癌、食道癌、皮膚黒色腫，肝臓癌、肺癌、精巣癌、腎臓癌、膀胱癌、頚部癌、リンパ腫、副甲状腺癌、陰茎癌、直腸癌、小腸癌、甲状腺癌、子宮癌、ホジキンリンパ腫、口唇および口腔癌、皮膚癌、白血病または多発性骨髄腫を含むが、これらに限定されない。
【００４２】
本発明の目的は、癌およびその他の血管新生疾患の状態および病状を治療するための組成物および方法を提供することである。
【００４３】
本発明の別の目的は、低酸素腫瘍への酸素送達を増強するための組成物および方法を提供することである。
【００４４】
本発明のさらに別の目的は、血管新生を阻害するための組成物および方法を提供することである。
【００４５】
本発明のさらに別の目的は、低酸素腫瘍の放射線感受性を増強するための組成物および方法を提供することである。
【００４６】
低酸素腫瘍および疾患を治療するための組成物および方法を提供することは、本発明のさらに別の目的である。
【００４７】
本発明の別の目的は、組織、特に腫瘍内の酸素圧を制御できる組成物および方法を提供することである。
【００４８】
本発明のさらなる目的は、赤血球のＰ５０値の顕著な右方シフトを引き起こすことができる、単純で、好ましくは経口的に容易に投与される組成物を提供することである。
【００４９】
本発明のこれらのおよびその他の目的、特徴、および利点は、開示される実施態様の以下の詳細な説明を参照すれば明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
本発明による有用な組成物としては、抗血管新生および抗腫瘍特性を示すイノシトール−トリピロリン酸（ＩＴＰＰ）（図１）およびＩＴＰＰのナトリウム（Ｎａ）、カルシウム（Ｃａ）、アンモニウム（ＮＨ４）塩などを含み、血管新生または増殖関連の現象、病状または物質を制御する上で有用である。ここでの用法では、血管新生または増殖関連の現象、病状、または物質の制御とは、あらゆるタイプの因子、条件、活性、指標、化学物質または化学物質の組み合わせ、ｍＲＮＡ、受容体、標識、メディエータ、タンパク質、転写活性などにおけるあらゆる定性的または定量的な変化を指し、これらは血管新生または増殖に関してもよく、または関すると考えられ、本発明の組成物を投与することに起因する。当業者は、本発明が、記載の特徴を有する以下の特許請求の範囲にあるその他の組成物または化合物におよぶことを理解するであろう。これらの特徴は、以下および文献の他の箇所で詳述する分析法を使用して、各試験化合物について判定できる。
【００５１】
このようなその他の分析法としては、組織培養プレート内での細胞計数、または代謝分析法を通じた細胞数評価、または標識された（例えば、３Ｈ−チミジンで放射化学的に、または蛍光的に標識された）、または免疫反応性（ＢｒｄＵ）ヌクレオチドのＤＮＡへの組み込みを含む。さらに抗血管新生活性は、内皮細胞移行、内皮細胞細管形成、またはラット大動脈輪などの生体外モデルにおける血管成長を通じて評価してもよい。
【００５２】
経口的に投与されると、ＩＴＰＰはわずかな毒性または無毒性で、抗腫瘍および抗増殖性活性を示す。Ｐ５０値（５０％飽和ヘモグロビンにおけるＰ５０）のシフトとして測定される、ヘモグロビンのＯ２親和力低下を誘発する能力についてＩＴＰＰを試験した。マウスのヘモグロビンおよび全血において、ヘモグロビでは２５０％まで、全血では４０％までのより高いＰＯ２へのＰ５０シフトが観察された。
【００５３】
ＩＴＰＰについてマウスおよびブタで得られた結果は、血流障害症例において、制御された様式で赤血球による酸素送達を増強する能力により、ＩＴＰＰの治療薬としての開発可能性を強力に示唆する。
【００５４】
ＩＴＰＰは、経口、静脈内、または腹腔内投与されると、形成中の腫瘍内のＰＯ２を増強することで、成育中の腫瘍における血管新生を阻害する。本発明は、有効量のＩＴＰＰをヒトまたは動物に投与することで、ヒトまたは動物において血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を制御する方法をさらに提供する。より具体的には、本発明はＬＬＣ細胞系において、ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡおよびタンパク質発現に対するＩＴＰＰの用量依存効果を提供する。腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＶＥＧＦ遺伝子発現を分析し、ＩＴＰＰが誘発するＶＥＧＦの下方制御の効果を判定し、細胞増殖の調節と相関させた。本発明は、ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ発現、タンパク質濃度、および腫瘍細胞増殖を制御する方法を開発した。これらの研究結果は、ＶＥＧＦの用量依存ＩＴＰＰ誘発性下方制御と細胞増殖との強い相関を示し、ＩＴＰＰがＶＥＧＦ媒介腫瘍血管新生、ならびに腫瘍細胞増殖速度を低下できることを示唆する。したがってＩＴＰＰによるＶＥＧＦの下方制御は、腫瘍細胞増殖を低下させる。
【００５５】
Ｐ５０値のより高いＯ２分圧へのシフトは、腫瘍内でＶＥＧＦをコードする低酸素遺伝子の発現を阻害する。ＶＥＧＦをコードする低酸素遺伝子の発現は、腫瘍内で血管新生を刺激するのに必要である。この発現が起きない場合、血管新生は重篤に阻害され、腫瘍内で新しい血管は形成されない。
【００５６】
腫瘍内酸素分圧の上昇が低酸素遺伝子の発現阻害の原因であるので、ＶＥＧＦ発現に関して得られた結果は、ＩＴＰＰを投与すると腫瘍内の酸素分圧が上昇することを示唆する。この観察結果は、非常に重要な疑問、すなわちこのＰＯ２改良が癌細胞の強力な放射線増感剤として作用するのではないかという疑問を提起する。酸素は非常に強力な放射線増感剤であり、ＩＴＰＰによって確かに腫瘍内のＰＯ２が増強されるのならば、これは癌の放射線治療法の有効性を増強する上で、重大な因果関係を有するかもしれない。
【００５７】
ＩＴＰＰは、固形腫瘍の治療において、一方で血管新生阻害物質として、他方で放射線増感剤として、潜在的に顕著なアジュバントである。
【００５８】
ＩＴＰＰまたはそのプロドラッグの化合物または薬剤を含むインプラントまたはその他の装置もまた、本発明によって考察され、薬剤またはプロドラッグは、徐放のための生分解性または非生分解性ポリマー中で調合される。非生分解性ポリマーは、ポリマーそれ自体は分解することなく、物理的または機械的工程を通じて制御された様式で薬剤を放出する。生分解性ポリマーは、身体中の自然作用によって徐々に加水分解または可溶化されて、混合薬剤またはプロドラッグが漸進的に放出されるように設計される。薬剤またはプロドラッグは、ポリマーに化学的に結合でき、または混和によってポリマー内に組み込むことができる。生分解性および非生分解性双方のポリマー、および徐放のためにポリマー内に薬剤を組み込む工程は当業者によく知られている。このようなポリマーの例は、ブレム（Ｂｒｅｍ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  ７４：４４１〜４４６頁（１９９１年）などの多くの参考文献に見られる。これらの移植片または装置は、例えば腫瘍部位などの、送達が所望される周辺に移植できる。
【００５９】
本発明の化合物に加えて、本発明の医薬品組成物はまた、上で述べた１類以上の疾患状態の治療において有益である、１種類以上の薬理作用のある物質も含んでもよく、または（同時にまたは逐次に）同時投与されてもよい。
【００６０】
当業者は、「レミントンの医薬品科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、第１７版などの標準教科書を、剤形の作成および投与方法の決定に際して参照することができる。
【００６１】
本発明のさらに別の態様では、血管新生または加速した細胞分裂または炎症と関連している病状の予防または治療のための薬物を調製するための、本発明によるＩＴＰＰまたはプロドラッグ化合物の使用が提供される。
【００６２】
本発明のさらに別の態様では、薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤と共に、本発明によるＩＴＰＰまたはプロドラッグ化合物を含む医薬組成物が提供される。
【００６３】
医薬組成物は、血管新生または加速した細胞分裂または炎症と関連している病状の予防または治療のために使用してもよい。
【００６４】
本発明のさらに別の態様では、血管新生、急速に成長または増加した細胞分裂肥厚増殖もしくは炎症と関連している病状を予防または治療する方法が提供され、前記方法は、このような予防または治療を必要とする患者に、ここで述べられるように、本発明によるＩＴＰＰまたはプロドラッグ化合物の有効量を投与する工程を含む。前記病状の予防または治療は、前記病状の寛解を含むものと理解されるべきである。
【００６５】
「有効量」とは治療的または予防的有効量を意味する。このような量は、適切な当業者によって、治療する病状、投与経路、およびその他の関連要因を考慮に入れて、容易に判定することができる。このような当業者は、適切な用量、投与様式、および頻度を容易に判定できるであろう。
【００６６】
上述の組成物は、既知の技術を使用して生理学的に許容可能な剤形として提供でき、これらの剤形は標準経路によって投与できる。一般に組み合わせ物は、局所、経口、直腸、腹腔内または非経口（例えば静脈内、皮下または筋肉内）経路によって投与してもよい。さらに組み合わせ物をポリマー中に組み込んで徐放を可能にし、ポリマーを、例えば腫瘍部位などの送達が所望される周辺に移植してもよい。組成物の投薬量は、治療する病状と、使用する特定の誘導体と、患者の体重および病状および化合物投与経路などのその他の臨床的要因とに左右される。しかし経口投与のためには、奨励される投薬量は０．１〜５．０ｇ／ｋｇ／日の範囲内である。経口投与のための好ましい投薬量は０．５〜２．０ｇ／ｋｇ／日の範囲内である。経口投与のための特に好ましい投薬量は０．８０〜１．０ｇ／ｋｇ／日の範囲内である。
【００６７】
本発明による剤形は、錠剤、カプセル、ロゼンジ、カシェ、溶液、懸濁液、エマルジョン、粉末、エアロゾル、坐薬、スプレー、トローチ、軟膏、クリーム、ペースト、フォーム、ゲル、タンポン、膣坐薬、顆粒、ボーラス投与、うがい薬、または経皮パッチの形態で投与できる。
【００６８】
剤形しては、経口、直腸、経鼻、吸入、局所（皮膚、経皮、頬側、および舌下をはじめとする）、経腟、非経口（皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内、皮内、眼内、気管内、および硬膜外をはじめとする）または吸入投与に適したものを含む。剤形は好都合に単位剤形で与えられてもよく、従来の製薬技術によって調製されてもよい。このような技術は、活性成分と薬学的担体または賦形剤とを結びつける工程を含む。一般に剤形は、活性成分と、液体担体または超微粒子固体担体またはその両者とを均一かつ密接に結びつけ、次に必要ならば生成物を付形することで調製される。
【００６９】
経口投与に適した本発明の剤形は、粉末または顆粒として、水性液体または非水性液体中の溶液または懸濁液として、または水中油液体エマルジョンまたは油中水エマルジョンなどとして、それぞれ所定量の活性成分を含むカプセル、カシェまたは錠剤などの個別の単位として与えられてもよい。
【００７０】
錠剤は、場合により１種類以上の副成分と共に圧縮または成形して作成してもよい。圧縮錠剤は、適切な機械内で、場合によりバインダー、潤滑剤、不活性希釈剤、保存料、界面活性剤または分散剤と混合された、粉末または顆粒などの易流動性形態の活性成分を圧縮して調製してもよい。成形錠剤は、適切な機械内で、不活性希釈液で湿らせた粉末化合物の混合物を成形して作成してもよい。錠剤は、場合により被覆または分割してもよく、その中で活性成分の緩慢なまたは制御された放出を提供するように調合してもよい。
【００７１】
口内での局所投与に適した剤形としては、通常スクロースおよびアカシアまたはトラガカントである風味つき基剤中の成分を含むロゼンジと、ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアなどの不活性基剤中の活性成分を含むトローチと、適切な液体担体中に投与される成分を含むうがい薬とを含む。
【００７２】
皮膚への局所投与に適した剤形は、薬学的に許容可能な担体中に投与される成分を含む軟膏、クリーム、ゲル、およびペーストとして与えられてもよい。好ましい局所送達系は投与される成分を含む経皮パッチである。
【００７３】
直腸投与のための剤形は、例えばカカオ脂またはサリチル酸塩を含む適切な基剤の坐薬として与えられてもよい。
【００７４】
担体が固体である経鼻投与に適した剤形としては、鼻で嗅ぐ様式で、すなわち鼻の近くに保持される粉末容器からの鼻腔を通じた迅速な吸入によって投与される、例えば２０〜５００μｍの範囲内である粒度を有する粗粉末を含む。例えば経鼻スプレーとしてまたは経鼻滴剤として投与するための担体が液体である適切な剤形としては、活性成分の水性または油性溶液を含む。
【００７５】
経腟投与に適した剤形は、活性成分に加えて、当該技術分野で適切なことが知られている担体などの成分を含有する、膣坐薬、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォームまたはスプレー剤形として与えられてもよい。
【００７６】
吸入に適した剤形は、活性成分に加えて、当該技術分野で適切なことが知られている担体などの成分を含む、ミスト、ダスト、粉末またはスプレー剤形として与えられてもよい。
【００７７】
非経口投与に適した剤形としては、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および剤形を意図される被投与者の血液と等張にする溶質とを含んでもよい水性および非水性の無菌注射溶液、ならびに懸濁剤と増粘剤を含んでもよい水性および非水性の無菌懸濁液を含む。剤形は、例えば密封アンプルおよびバイアルなどの単位用量または多回用量容器で与えられてもよく、使用直前に、例えば注射用水などの無菌液体担体の添加のみを必要とする、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）状態で保存されてもよい。即時使用可能な注射溶液および懸濁液は、前述した種類の無菌粉末、顆粒、および錠剤から調製されてもよい。
【００７８】
好ましい単位用量剤形は、上述したような投与される成分の一日量または単位、一日部分用量、またはこれらの任意の適切な比率を含むものである。
【００７９】
特に上述の成分に加えて、本発明の剤形は、当該剤形タイプを考慮して当該技術分野で慣習的なその他の薬剤を含んでもよいものと理解され、例えば経口投与に適したものは着香剤を含んでもよい。
【００８０】
生体外実験では、ＩＴＰＰを脱イオン水に溶解してｐＨをｐＨ７に調節し、全血とのインキュベーションでは、ＩＴＰＰ溶液のモル浸透圧濃度をグルコースで２７０〜２９７ｍＯｓＭに調節した。ヘモグロビンとＩＴＰＰの混合物をロンドンのＰＤマーケティング（ＰＤ  Ｍａｒｋｅｔｉｎｇ（Ｌｏｎｄｏｎ））からのＨＥＭＯＸ分析器で直ちに測定した。赤血球をＩＴＰＰと共に３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーションに続いて細胞をビス−トリス−緩衝液（ＰＨ＝７．０）で３回洗浄し、次にＰ５０測定のために使用した。
【００８１】
ＩＴＰＰが経口的に投与された生体内で行われた実験では、循環ＲＢＣのＰ５０値の顕著なシフトが観察された。ＩＴＰＰを２０ｇ／Ｌの濃度（＝２７ｍＭ、ｐＨ約７．０）で飲用水に溶解して自由に飲めるよう供した。
【００８２】
以下の実施例は本発明を例示するが、制限はしない。したがって実施例は、修正を加えてもよく、なおも本発明の精神の範囲内であるという理解の下に与えられる。
【実施例】
【００８３】
実施例ｌ
マウス（経口的投与）における誘発されたＯ２−ヘモグロビン解離曲線（ＯＤＣ）の右方シフト
１２匹のＣ５７ＢＬ／６マウスにＩＴＰＰ−溶液（２０ｇ／Ｌの濃度＝２７ｍＭ、ｐＨ約７．０）を４日間にわたり与えた（２４時間あたり２５ｍｌまで）。３匹の対照マウスは浄水、４匹の対照マウスにはミオイノシトール六リン酸（ＩＨＰ）溶液（ＩＴＰＰと同一濃度およびｐＨ）を飲ませた。Ｐ５０値を測定するために、血液を全マウスから０日目（処置開始前）、および１、２、４、６、７、８、１０、１１、および１２日目（処理開始後）に採取した。
【００８４】
結果
ＩＴＰＰはマウスに拒絶されず、また動物に対して有害でもなかった。
【００８５】
マウスにおいてＩＴＰＰの経口適用は、Ｐ５０の顕著な右方シフト（３１％まで）を引き起こした。
【００８６】
ＩＴＰＰを２７ｍＭの濃度で経口的に投与すると、マウスの循環赤血球内でＰ５０値の右方シフトを引き起こす（図２）。最大シフトが得られるまでに、およそ４８時間の時間差がある。最大のＰ５０シフトは、ＩＴＰＰの経口投与開始後２日目と４日目の間に達成される。４日目に摂取を停止すると、１２日目にＰ５０値は対照値に戻る。赤血球数に対してＩＴＰＰ摂取の顕著な効果がある。理論による拘束は望まないが、赤血球数に対するＩＴＰＰ摂取の効果（赤血球新生の下方制御）は、Ｐ５０の増大に起因すると考えられる。生体外で赤血球溶解が全く起きないので、溶血は排除できる。マウスにおけるＩＴＰＰの経口適用後、ナトリウムおよびカリウムおよびカルシウムなどのイオンのレベルは正常であった（図３）。図３はＩＴＰＰ（４匹）、ＩＨＰ（３匹）または水（３匹）を飲み始めた後０、７、および１１日目に得られたナトリウム、カリウム、およびカルシウムの血清濃度の平均値およびＳＤを含む。
【００８７】
０、７、および１１日目に全マウスからの血球数を測定した。ＩＴＰＰを摂取したマウス中の赤血球数は低下した。異なる群のマウスからの血液中の白血球数（例えば顆粒球、マクロファージなど）に有意差はなかった。図４は対照と比較してシフトしたＯＤＣがあるマウスのＲＢＣ計数を示す。図４は、ＩＴＰＰを摂取したマウスにおける赤血球数／ｍｍ３に対するＰ５０シフト［％］の関係をさらに示す。予備データに基づいて、赤血球数とそれらのＰ５０値シフトの間に逆相関が存在するように見える。ＩＴＰＰ摂取の１２日目にひとたびΔＰ５０が０％になると、赤血球数の基準値が復元する。
【００８８】
実施例２
マウス（腹腔内注射）における誘発されたＯＤＣの右方シフト
マウスにＩＴＰＰ（ｐＨ７、２００μｌ）を腹腔内注射すると、循環赤血球のＰ５０値は２３％までシフトした。図５は、ＩＴＰＰが１５０ｍＭの濃度までマウスによって許容されたことを実証する。ナトリウム、カリウム、およびカルシウムなどのイオンのレベルは、腹腔内注射後に正常であった。６匹のマウスに４５〜１５０ｍＭ（＝０．１７〜０．８８ｇ／ｋｇ体重）のＩＴＰＰをそれぞれ腹腔内注射した。％シフトの平均値および標準偏差を図５に示す。
【００８９】
ＩＴＰＰによって誘発されるＰ５０シフトの濃度依存性は、この化合物が赤血球の細胞膜を越えることの追加的な兆候である。
【００９０】
実施例３
子ブタ（静脈内注射）における誘発されたＯＣＤの右方シフト
ＩＴＰＰを子ブタにも静脈内注射（ＩＶ）した。１ｇ／ｋｇ体重の用量で化合物を注射すると、Ｐ５０の右方シフトが観察された。
【００９１】
ＩＴＰＰの可能な副作用をチェックするために、注射された子ブタの血清中カルシウムレベルを判定した。輸液直後の動物血中のＣａ２＋濃度の急激な低下は、ＩＴＰＰが３個の解離リン酸基でＣａ２＋に結合して、血中遊離イオンとしての利用可能性を低下させた可能性を示唆した。輸液の１日後に、子ブタの血中Ｃａ２＋濃度は正常値に復元した。結果を表１に示す。
【表１】
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【００９２】
この観察に基づいて、ＩＴＰＰの解離リン酸基が飽和するように、ＩＴＰＰ溶液と共に塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）（ＩＴＰＰと等モル）溶液を注射した。先に起きたいかなる副作用も観察されなかった。カルシウムのレベルは一定のままで、Ｐ５０シフトはここでも基準値のおよそ２０％であった。ナトリウムおよびカリウムのその他のイオンのレベルは、子ブタへのＩＴＰＰのＩＶ注射後に変化しなかった。
【００９３】
実施例４
腫瘍内ＰＯ２、血管新生、およびＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ発現に対する、ＩＴＰＰによるヘモグロビンのＯ２に対する親和力の生体内低下の効果
ＩＴＰＰは、経口、静脈内、または腹腔内投与されると、形成中の腫瘍のＰＯ２を増強することで、成長中の腫瘍における血管新生を阻害する。３０匹のＣ５７ＢＬ／６マウスに、Ｐ５０値が対照値を少なくとも２０％超えるシフトを示すまで、２０ｇ／ＬのＩＴＰＰを経口的に投与した。次に全ての動物に、１×１０６個のルイス肺癌（ＬＬＣ）細胞を背側腔に注射して投与した。異なる時点で、双方のマウス群において成長中の腫瘍内で、ＲＴ−ＰＣＲによってＶＥＧＦ  ｍＲＮＡを分析した。
【００９４】
腫瘍組織サンプルをタンパク質分解酵素阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ（Ｒｅｉｎａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））を添加した、ＲＩＰＡ溶解緩衝液（１％ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）ｐ−４０界面活性剤、５０ｍＭトリス  ｐＨ８．０、１３７ｍＭ  塩化ナトリウム、１０％グリセロール）中で粉砕した。遠心分離（４℃および１２，０００ｇで１０分間）後、ブラッドフォード法によって組織抽出物のタンパク質濃度を判定した。洗剤可溶性タンパク質サンプル（１０ｍｇ）を１０％アクリルアミドゲル中でＳＤＳ−ＰＡＧＥによってサイズ分離し、ニトロセルロース膜（ＰｒｏｔｒａｎＢＡ  ８５；Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ（Ｄａｓｓｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ））に移した。膜を、０．１％トウィーンを含むトリス緩衝食塩水中の１０％スキムミルク中において室温で３時間ブロックしてから、ヒト、マウス、およびラット血管内皮成長因子を認識する、ウサギポリクローナル抗体（ＶＥＧＦ  Ａ−２０、ｓｃ−１５２；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））と共に、１：２００の希釈度で４℃において一晩インキュベーションした。次に膜を抗ウサギ（１：１６，０００）ペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｌ’Ｉｓｌｅ  ｄ’Ａｂｅａｕ  Ｃｈｅｓｎｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ））で、一次抗体について室温で６０分間プローブした。得られた複合体を高感度化学ルミネッセンスオートラジオグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｏｒｓａｙ，Ｆｒａｎｃｅ））によって視覚化した。
【００９５】
双方の群で、ＶＥＧＦ遺伝子のｍＲＮＡレベルに差があった。図６は、対照およびＩＴＰＰ飲水動物からの腫瘍内のＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ濃度を示すアガロースゲルを示す（それぞれＬＬＣ細胞接種１５日後（トラック１：対照、トラック２：ＩＴＰＰ治療動物）、および接種３０日後（トラック３：対照動物、トラック４：ＩＴＰＰ治療動物）に、２匹のマウスから採取した腫瘍組織からのＶＥＧＦ  ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲアガロースゲル分析法）。図７は、対照およびＩＴＰＰ治療されたＬＬＣ腫瘍を有する動物の腫瘍内で発現したＶＥＧＦのウエスタンブロット分析を示す。
【００９６】
ゲル分析の定量化は、９日目に、ＩＴＰＰを摂取した動物の腫瘍内で検出されたＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ量の１０，０００倍の低下を示し、次に治療および非治療動物間に差は残ったが、差は減少傾向にあった。これは循環赤血球によって取り込まれたＩＴＰＰが、腫瘍ＰＯ２を顕著に増大させたことを示唆する。
【００９７】
特定の組成物、検出方法、および活性起源、および有効性の提案などに言及して、本発明について述べたが、このような例示的な実施態様または機序によって発明を制限することは意図されず、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の精神と範囲を逸脱することなく修正ができることは、当業者には明らかであろう。全てのこのような明らかな修正および変形例は、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲内に含まれることが意図される。特許請求の範囲は、特に断りのない限り、主張される構成要素、および意図される目的を満たすのに効果的なあらゆる順序の工程を網羅することを意図する。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】イノシトール−トリピロリン酸（ＩＴＰＰ）の化学構造を描写する。
【図２】ＩＴＰＰを４日間にわたり摂取したマウスにおける、誘発されたＯ２−ヘモグロビン解離曲線（ＯＤＣ）の右方シフトの経時変化、ならびに対照動物における顕著なＰ５０シフトの不在を示す。
【図３】マウスにおけるＩＴＰＰの経口適用後に、ナトリウムおよびカリウムおよびカルシウムなどのイオンレベルが正常であったことを示す。
【図４】ＩＴＰＰを摂取したマウスにおける赤血球数／ｍｍ３に対するＰ５０シフト［％］の関係を示す。
【図５】マウスによる濃度１５０ｍＭまでのＩＴＰＰ耐性を実証する。腹腔内（ｉｐ）注射後に、ナトリウム、カリウム、およびカルシウムなどのイオンレベルは正常であった。
【図６】対照およびＩＴＰＰ飲水動物からの腫瘍内のＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ濃度を示すアガロースゲルを示す。
【図７】対照およびＩＴＰＰで治療されたルイス肺癌（ＬＬＣ）腫瘍を持つ動物の腫瘍内で発現したＶＥＧＦのウエスタンブロット分析法を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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