(57)【要約】血液試料中の循環癌細胞からのステロイド受容体の発現は、前記血液試料から前記癌細胞を単離し、前記単離した癌細胞から抽出物を作成した後、前記抽出物に対して、癌細胞に関連するステロイド受容体を検出することができる高感度のイムノアッセイを行うことによって検出される。陽性結果は、前記癌細胞における前記ステロイド受容体の存在を示す。本方法は、内分泌療法剤による処置から利益が得られる可能性がある癌患者を同定するために使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液試料中の循環癌細胞からステロイド受容体の発現を検出する方法であって、該血液試料から該癌細胞を単離した後、該単離した癌細胞から抽出物を作製し、その後、該抽出物に対して、ステロイド受容体を検出することができるイムノアッセイを行う工程を含み、陽性のイムノアッセイ結果が、該癌細胞における該ステロイド受容体の存在を示し、
該癌細胞が乳癌細胞であり、該ステロイド受容体が、エストロゲン受容体−α、エストロゲン受容体−β、プロゲステロン受容体、およびアンドロゲン受容体からなる群から選択されるか、あるいは該癌細胞が前立腺癌細胞であり、該ステロイド受容体がアンドロゲン受容体であり、
該イムノアッセイが、癌を有さないヒト由来の血液試料１ミリリットル中に添加される９００個のＭＣＦ−７癌細胞から該ステロイド受容体を検出することができることによってか、あるいは４ｐｇの該ステロイド受容体を検出することができることにより定義される感度を有する、
方法。
【請求項２】
前記イムノアッセイが、癌を有さないヒト由来の血液試料１ミリリットル中に添加される５００個のＭＣＦ−７癌細胞から前記ステロイド受容体を検出することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記イムノアッセイが、乳癌を有さないヒト由来の血液試料１ミリリットル中に添加される１００個のＭＣＦ−７癌細胞から前記ステロイド受容体を検出することができる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記イムノアッセイが、乳癌を有さないヒト由来の血液試料１ミリリットル中に添加される３０個のＭＣＦ−７癌細胞から前記ステロイド受容体を検出することができる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記イムノアッセイが、電気化学発光を検出に使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記イムノアッセイが、化学発光、蛍光化学発光、蛍光偏光、および時間分解蛍光から選択される技法を検出に使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記イムノアッセイが、前記ステロイド受容体に対するポリクローナル抗体を使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記イムノアッセイが、前記ステロイド受容体のＮ末端領域に対する第１のポリクローナル抗体と、前記ステロイド受容体のＣ末端領域に対する第２のポリクローナル抗体とを使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記イムノアッセイが、前記ステロイド受容体に対するモノクローナル抗体を使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記癌細胞が、該癌細胞に選択的に結合できる免疫磁気ビーズと前記血液を接触させることによって単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ステロイド受容体がエストロゲン受容体−αである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ステロイド受容体がプロゲステロン受容体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
内分泌療法剤による処置から利益が得られる可能性がある癌患者を同定する方法であって、請求項１〜１２に記載のいずれか１項に記載の方法を含み、前記癌細胞含有血液試料が該患者から採取される、方法。
【請求項１４】
前記患者由来の腫瘍組織が、前記ステロイド受容体の発現に対して陰性であることが免疫組織化学的に予め測定されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
内分泌療法剤による処置から利益が得られる可能性がある癌患者を処置する方法であって、請求項１３に記載の方法に基づき同定された該患者に抗癌剤を投与し、それによって該患者を処置する工程を含む、方法。
【請求項１６】
前記内分泌療法剤が、タモキシフェン、アロマターゼ阻害剤、およびフルベストラントからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記アロマターゼ阻害剤が、アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、およびファドロゾールからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
内分泌療法またはホルモン療法は、乳癌および前立腺癌患者の処置において最も重要な手法の１つである。処置は、これらの癌患者の腫瘍におけるステロイド受容体の存在に大きく依存している。乳癌の女性を処置する意思決定プロセスにおいては、２５年以上にわたってステロイド受容体の状態が使用されてきた。内分泌療法またはホルモン療法は、エストロゲン受容体（ＥＲ）およびプロゲステロン受容体（ＰＲ）陽性腫瘍を有する患者の処置での使用に成功している（非特許文献１）。さらに、内分泌療法への反応に対する、腫瘍中のアンドロゲン受容体レベルの重要な役割も明らかにされている（非特許文献２）。内分泌療法は、高い割合で腫瘍反応を生じる（３０％と推定され、特定の患者では８０％までが報告されている；非特許文献３）。乳癌の内分泌療法は、高い効果と最小限の毒性および高い生活の質とを兼ね備えた利点を有する（非特許文献１）。
【０００２】
エストロゲン受容体には、エストロゲン受容体−αとエストロゲン受容体−βとの２種類がある（非特許文献４）。これら２つのタンパク質は、特にＤＮＡ結合ドメインにおいて、高度の相同性を示す（非特許文献５；非特許文献６）。腫瘍組織からのＥＲ−αレベルの的中率には議論の余地がない（非特許文献７）。エストロゲン受容体の他に、乳癌組織におけるプロゲステロン受容体の存在も、ホルモン療法による利益の独立した予測因子となることが明らかにされている（非特許文献７）。近年は、エストロゲン受容体−βおよびアンドロゲン受容体の腫瘍発現が、乳癌患者の処置において重要な役割を果たすことが明らかにされている（非特許文献８；非特許文献２）。
【０００３】
内分泌療法またはホルモン療法はまた、前立腺癌の処置にも重要な役割を果たす。この癌に対する内分泌療法剤は、循環するリガンドを減少させることによって間接的に、あるいはＡＲシグナル伝達を直接抑制することによって、アンドロゲン受容体（ＡＲ）を標的とする（非特許文献９）。最初は、事実上すべての前立腺癌においてＡＲが検出される（非特許文献９）。しかし、処置後は、ホルモン抵抗性前立腺癌の症例の３０％でＡＲタンパク質発現が下方調節されることが明らかにされている（非特許文献１０）。
【０００４】
ステロイド受容体を測定する現在の臨床的手法は、ホルマリン固定した生検材料由来の受容体の免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色を使用している（非特許文献１１；非特許文献２）。このような手法は時間がかかり、また組織がどのように処理されたかによって、誤解を招くような結果を示すことが多い。
【０００５】
具体的には、有意な率のＥＲ発現の偽陰性結果が、ＩＨＣを使用して報告されている。Ｄ．Ｃｒａｉｇ  Ａｌｌｒｅｄ，Ｍ．Ｄは、２０〜３０％の偽陰性率を報告している（ｗｗｗ．ｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｕｐｄａｔｅ．ｃｏｍ／ｂｃｕ２００４／７／ａｌｌｒｅｄ．ｈｔｍ）（総評については、非特許文献１２も参照）。地域環境においては、少なくとも２４％の偽陰性率が報告されている（非特許文献１１、Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎの第２パラグラフ）。
【０００６】
ホルモン療法はこのように高い効果と低い毒性を有することから、適切に処置されていない乳癌を有する女性にとっては、このことが大きな臨床的問題となっている。さらに、ＩＨＣは、生検組織が使用できない患者や、試料がＩＨＣに不適切である患者にとっては実用的ではない。
【０００７】
原発腫瘍のＩＨＣ試験により対処されていない別の問題には、原発腫瘍とは異なる受容体の状態を生じる（特に受容体陰性（原発）から受容体陽性（転移）に移行する）、転移の問題がある。ＩＨＣ試験を行うために転移の生検材料を採取することは、手術手順を伴うため、現実的な解決策にならないことが多い。好ましい方法は、患者に対するいかなる追加手術も伴わないものであると考えられる。以下の通り、１１〜３３％というＥＲ陰性から陽性への転化率が報告されている。
・ＥＲ陰性患者の１１％（原発での結果に基づく）が、その後転移においてＥＲ陽性結果を示した（非特許文献１３）。
・全被験患者の１１％（これは原発腫瘍のアッセイに基づくＥＲ陰性患者の３３％となる）が、その後転移においてＥＲ陽性結果を示した（非特許文献１４）。
・ＥＲ陰性患者（原発での結果に基づく）１４０例の３３％が、その後転移においてＥＲ陽性結果を示した（非特許文献１５）。
【０００８】
原発腫瘍のＩＨＣアッセイの結果は偽陰性結果であるため、あるいはホルモン状態は転移において変化したため、便利なアッセイが使用できれば、エストロゲン陰性またはプロゲステロン陰性の試験結果を得た多くの女性は、ホルモン療法から利益が得られるという十分な証拠があることは明らかである。したがって、どの患者がエストロゲン受容体（ＥＲ）およびプロゲステロン受容体（ＰＲ）を発現し、このような受容体を標的とする療法から利益が得られるかをより適切に同定する必要がある。血液試料中の循環腫瘍細胞由来のホルモン受容体のアッセイは、この患者にとって最も便利であると考えられる。残念なことに、これまで使用されてきたホルモン受容体のイムノアッセイは、少なくとも０．１グラムの組織、または約０．１ｍＬのサイトゾルを必要とするが（非特許文献１６；非特許文献１７）、これは約１Ｅ＋０８の腫瘍細胞に相当する［組織１グラムが約１Ｅ＋０９の腫瘍細胞に相当し（非特許文献１８；非特許文献１９）；１個の腫瘍細胞のサイトゾル体積が約１ピコリットルに相当する（非特許文献２０）］。報告されているイムノアッセイ方法は、きわめて少ない数の循環腫瘍細胞（１ｍＬ当たり１Ｅ＋０８オーダー未満）からホルモン受容体を検出するには明らかに感度が低すぎる。したがって、本発明は、循環腫瘍細胞からホルモン受容体を試験する手段を提供するため、ホルモン療法の対象となるさらなる患者を同定する医療ニーズに対応するのに便利な手段である。
【非特許文献１】Ｂｅｒｎａｒｄ−Ｍａｒｔｙら，２００４，Ｔｈｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  ９：６１７−３２
【非特許文献２】Ｂｕｃｈａｎａｎ  Ｇら，２００５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５：８４８７−８４９６
【非特許文献３】Ｇｒａｄｉｓｈａｒ，２００４，Ｔｈｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  ９：３７８−８４
【非特許文献４】Ｅｓｓｌｉｍａｎｉ−Ｓａｈｌａら，２００４，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：５７６９−５７７６
【非特許文献５】Ｈａｎｓｔｅｉｎ  Ｓら，２００４，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎ  １５０：２４３−２５５
【非特許文献６】Ｍａｔｔｈｅｗｓ＆Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ  ＪＡ，２００３，Ｍｏｌ．Ｉｎｔｅｒｖ．３：１８１−９２
【非特許文献７】Ｂａｒｄｏｕら，２００３，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １０：１９７３−７９
【非特許文献８】Ｈｏｐｐら，２００４；Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：７５９０−００
【非特許文献９】Ｓｃｈｅｒら，２００４，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｃａｎｃｅｒ  １１：４５９−７６
【非特許文献１０】Ｓｕｚｕｋｉら，２００３，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｃａｎｃｅｒｓ  １９：２０９−２１６
【非特許文献１１】Ｍａｎｎら，２００５，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２２：５１４８−５４
【非特許文献１２】ＭｃＣａｎｎ，２００４  Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ９３：５７９−８０
【非特許文献１３】Ｇｌａｓｓ  ＥＬ，２００３ら，Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ａｂｓｔｒａｃｔ  ＃２５７
【非特許文献１４】Ｆｒａｎｃｏ  Ｎ，２００４，Ｐｒｏｃ  ＡＳＣＯ，Ａｂｓｔｒａｃｔ  ５３９
【非特許文献１５】Ｓｐａｔａｒｏら，１９９２．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ３：７３３−７４０，１９９２
【非特許文献１６】Ｄｅｌａｇｅ  Ｖら，１９９６  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ４２：１９５５−１９６０
【非特許文献１７】Ｋｒａｍｂｏｖｉｔｉｓら，１９９５  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ４１：４８−５３
【非特許文献１８】Ｃｏｔｒａｎ，Ｋｕｍａｒ  ａｎｄ  Ｒｏｂｂｉｎｓ，１９８９
【非特許文献１９】Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＷＢ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐａｇｅ  ２５１，２ｎｄ  ｃｏｌｕｍｎ，１ｓｔ  ｐａｒａｇｒａｐｈ，２ｎｄ  ｓｅｎｔｅｎｃｅ
【非特許文献２０】Ｋｅｌｅｍｅｎら，２００２，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：８７４１−４８
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、血液試料中の循環癌細胞からステロイド受容体の発現を検出する方法であって、前記血液試料から前記癌細胞を単離した後、前記単離した癌細胞から抽出物（例えば、溶解産物）を作製し、その後前記抽出物に対してステロイド受容体を検出することができるイムノアッセイを行う工程を含み、陽性のイムノアッセイ結果が、癌細胞におけるステロイド受容体の存在を示す、方法を提供する。本発明によれば、癌細胞は乳癌細胞であり、ステロイド受容体は、エストロゲン受容体−α、エストロゲン受容体−β、プロゲステロン受容体、およびアンドロゲン受容体からなる群から選択されるか、あるいは癌細胞は前立腺癌細胞であり、ステロイド受容体はアンドロゲン受容体である。イムノアッセイは、癌を有さないヒト由来の血液試料１ミリリットル中に添加される９００個のＭＣＦ−７癌細胞からステロイド受容体を検出することができる。
【００１０】
本発明は、内分泌療法剤による処置から利益が得られる可能性がある癌患者を同定する方法であって、上述の検出方法を含む、方法を提供する。このような患者を同定するために使用する場合、癌細胞含有血液試料が患者から採取される。本発明は、このようにして同定された癌患者を処置する方法であって、前記患者に内分泌療法剤を投与する工程を含む、方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本明細書で使用される、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という移行語はオープンエンドな語である。本用語を使用する請求項は、当該請求項に列挙される要素に加えて、他の要素も含むことができる。したがって、例えば、本特許請求の範囲では、列挙される要素またはその等価物が存在する限り、特許請求の範囲で具体的に列挙されない他の手順も含む方法が記載されている。
【００１２】
本明細書では以下の略語が使用されている。
ＡＲ：アンドロゲン受容体
ＥＲ：エストロゲン受容体
ＰＲ：プロゲステロン受容体
ＩＨＣ：免疫組織化学
ＥＣＬ：電気化学発光
本発明は、血液試料中の循環乳癌または循環前立腺癌におけるステロイド受容体タンパク質（エストロゲン受容体−α、エストロゲン受容体−β、プロゲステロン受容体、および／またはアンドロゲン受容体）のレベルを定量化するのに十分な感度の方法を提供し、エストロゲン受容体および／またはプロゲステロン受容体などのステロイド受容体を対象とするホルモン療法剤または別の薬剤を使用した療法から利益が得られる可能性がある癌患者を同定する方法を提供する。したがって、本発明は、血液試料を試験して、ホルモン療法から利益が得られると思われるさらなる患者を同定するのに便利で、感度がきわめて高く、高速の手段を提供することによって、乳癌または前立腺癌の処置の分野を進歩させる。循環乳癌細胞におけるエストロゲン受容体−α、エストロゲン受容体−β、アンドロゲン受容体、および／またはプロゲステロン受容体タンパク質を検出するための、あるいは循環前立腺癌細胞におけるアンドロゲン受容体タンパク質を検出するための、例えば電気化学発光（ＥＣＬ）検出を使用した、高速かつきわめて感度が高い免疫学的アッセイは、ホルモン療法から利益が得られると思われるさらなる患者を同定するのに好ましい手段である。
【００１３】
本発明は、血液から循環癌細胞を単離するために使用される処置の高い特異性と、ＥＣＬなどの特定の免疫学的アッセイの高い感度とを組み合わせることに基づいている。まず、循環乳癌または循環前立腺癌細胞は、免疫磁気ビーズを使用して、血液から循環癌細胞を単離および精製することによって濃縮される。
【００１４】
本発明の検出方法の実施形態において、免疫学的アッセイの感度レベルは、血液１ミリリットル当たり３０〜９００個の癌細胞、好ましくは血液１ミリリットル当たり３０〜１００個の癌細胞、より好ましくは血液１ミリリットル当たり１０〜３０個の癌細胞、より好ましくは血液１ミリリットル当たり３〜１０個の癌細胞、最も好ましくは血液１ミリリットル当たり１〜３個の癌細胞の濃度で、血液中の癌細胞からステロイド受容体（すなわち、エストロゲン受容体−α、エストロゲン受容体−β、プロゲステロン受容体、またはアンドロゲン受容体）を検出することができる程度である。より具体的な実施形態において、癌細胞はＭＣＦ−７乳癌細胞である。ＭＣＦ−７細胞は、エストロゲン受容体−α（Ｄｅｔｒｅ  Ｓら，２００３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６３：６５１６−２２）、エストロゲン受容体−β（Ｈｏｐｐ  ＴＡら，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：７４９０−９）、プロゲステロン受容体（Ｄｅｔｒｅら，２００３）、およびアンドロゲン受容体（Ｂｕｃｈａｎａｎ  Ｇら，２００５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５：８４８７−９６）を発現することが知られている。
【００１５】
癌細胞を単離し、このような試料のホルモン受容体を試験するのに好ましい手段は、以下の通りである。
【００１６】
癌、特に乳癌を有する患者から、血液試料（通常約８〜２０ｍＬ）を採取する。手順には以下に詳述するような手順が含まれる。
１．赤血球の除去
２．正常な白血球をさらに枯渇させるための任意の陰性選択。好ましい実施形態はこの手順を含む。
３．循環癌細胞の陽性選択
４．エストロゲン受容体および／またはプロゲステロン受容体を含む核タンパク質の抽出
５．循環癌細胞からのエストロゲン受容体および／またはプロゲステロン受容体の検出および定量化
１．赤血球の除去
赤血球の除去には、密度に基づく分離（例えば、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＣＰＴチューブ内に直接血液を採取した後、遠心分離を行う）、ＰＵＲＥＳＣＲＩＰＴ  ＲＢＣ溶解緩衝液（Ｇｅｎｔｒａ、米国ミネソタ州ミネアポリス）、ＦＡＣＳ溶解溶液（ＢＤＩＳ）、ＩＭＭＵＮＯＬＹＳＥ（Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＯＰＴＩＬＹＳＥ  Ｂ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）、およびＡＣＫ溶解緩衝液（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、米国メリーランド州ロックビル）などの市販の溶解緩衝液を含むがこれらに限定されない、種々の方法を使用することができる。
【００１７】
好ましい方法では、抗凝固剤（ＥＤＴＡまたはクエン酸塩）を有するＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＣＰＴチューブが使用される。これらのチューブは、適切な遠心分離（１，１００ｘｇで１０分間、スウィングアウトバケットローター）時に赤血球や好中球の除去を可能にする原料を含む。遠心分離後に、チューブの底部には赤血球や好中球の細胞ペレットができる。この細胞ペレットの上にはゲルバリアであり、さらにこのゲルバリアの上には、血漿底部の帯状部として腫瘍細胞、リンパ球および単球がある。その後、これらの腫瘍細胞、リンパ球および単球は、ゲルバリアの上の最上部から容易に採取することができる。本方法は、赤血球だけでなく好中球も除去することから好ましい方法である。
２．正常な白血球をさらに枯渇させるための陰性選択
本発明の好ましい実施形態は、腫瘍細胞の単離に陰性選択手順を使用する。陰性選択は、白血球、特にリンパ球および単球のさらなる枯渇を可能にする。この手順は、白血球抗原（特に白血球共通抗原であるＣＤ４５）と赤血球抗原（グリコフォリンＡなど）との両に対して二重特異性を有する抗体の使用を含む。このような二重特異性抗体の市販のカクテルは、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手することができる（Ｒｏｓｅｔｔｅｓｅｐカタログ番号１５１２７および１５１６７）。このカクテルは、グリコフォリンＡ、およびヒト造血細胞上の各種細胞表面抗原（ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ６６ｂ）に対する二重特異性抗体を含む。これらの二重特異性抗体の１つ以上が、血液採取前に、ＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＣＰＴチューブに添加される。好ましい実施形態においては、１つ以上の白血球に関連するＣＤ分子に対する二重特異性抗体のカクテルが使用される。血液がＣＰＴ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒチューブ内に導入されると、二重特異性抗体は、それぞれ白血球と多くの赤血球とからなる免疫ロゼットを形成する。これらの免疫ロゼットは、赤血球の密度とほぼ同じ密度を有しており、遠心分離時に赤血球ペレット中に存在し、それによって細胞ペレットやゲルバリアの上にある腫瘍細胞画分から白血球をさらに除去する。血漿中に腫瘍細胞を有する画分は、さらなる処理のために採取される。
３．循環癌細胞の陽性選択
循環癌細胞を単離する好ましい方法では、免疫磁気ビーズが使用される。循環癌細胞を単離する他の方法には、濾過が含まれる（Ｖｏｎａ  Ｇら，２０００，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．２０００  １５６：５７−６３）。好ましい実施形態において、免疫磁気ビーズは、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、サイトケラチン−１９などのサイトケラチン、特にサイトケラチンやその他の表面マーカーに対する抗体のカクテルなど、癌細胞の表面に選択的に認められる抗原に対する抗体を有する。免疫磁気ビーズは種々のサイズ（５０ミクロン〜２００ｎｍ未満）となる場合があり、ＥｐＣＡＭに対する抗体を有するＤＹＮＡＬビーズ（１．５ミクロン超〜約５０ミクロン、市販）を含む。本発明の一実施形態において、ＥＡＳＹＳＥＰ（登録商標）ヒトＥｐＣＡＭ陽性選択カクテルおよびＥＡＳＹＳＥＰ（登録商標）磁性ナノ粒子（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、前の手順で得た血漿中の腫瘍細胞を有する画分に添加する。次いで磁石を使用して腫瘍細胞を残りの物質から分離し、これらの腫瘍細胞を水溶液で洗浄する。
４．ステロイド受容体を含む核タンパク質の抽出
次の手順において、濃縮または精製した腫瘍細胞は、核タンパク質の抽出ができる状態となっている。以下のような各種の市販のキットを使用することができる。
・Ｓｉｇｍａ  ＣｅｌＬｙｔｉｃ（登録商標）ＮｕＣｌＥＡＲ（登録商標）Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（製品コード：ＮＸＴＲＡＣＴ；Ｓｉｇｍａ、米国ミズーリ州セントルイス  ６３１０３）
・Ｐｉｅｒｃｅ  ＮＥ−ＰＥＲ  Ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｋｉｔ（製品番号７８８３３；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、米国イリノイ州ロックフォード  ６１１０５）
・核抽出キット（カタログ番号ＡＹ２００２、Ｐａｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州レッドウッドシティー  ９４０６３）
好ましい抽出方法では、ＲｌＰＡ緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号８９９００）を０．４Ｍ〜０．４５Ｍ  塩化カリウム（ＫＣｌ）とともに使用する。
５．循環癌細胞からのステロイド受容体の検出および定量化
次いで、アッセイ中の受容体に結合する抗体を使用した高感度のサンドイッチイムノアッセイを使用することにより、エストロゲン受容体−α、プロゲステロン受容体、またはアンドロゲン受容体の検出を行うことができる。イムノアッセイには種々の抗体、好ましくは少なくとも１つのポリクローナル抗体、最も好ましくは２つのポリクローナル抗体が使用できる。本発明の一実施形態において、イムノアッセイは、ステロイド受容体のＮ末端領域に対する第１のポリクローナル抗体と、ステロイド受容体のＣ末端領域に対する第２のポリクローナル抗体を使用する。
【００１８】
ステロイド受容体は、ステロイド受容体を対象とする２組の抗体によるサンドイッチイムノアッセイを使用することにより検出することができる。電気化学発光を使用する好ましい実施形態においては、一方の抗体がビオチンに結合し、他方の抗体がルテニウム検出分子に結合する。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態において、ステロイド受容体に対する抗体は、ビオチンと結合し、ステロイド受容体に対する第２の抗体は、検出分子で標識される。電気化学発光（ＥＣＬ）の場合、検出分子はルテニウムである。ルテニウムを抗体に結合させるのに十分に有用な方法を提供する公知の文献は豊富に存在する（例えば、Ｌｅｅら，Ａｍ  Ｊ  Ｔｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｈｙｇ  ２００１，６５：１−９）。核抽出物は、２つの抗体と混合し、短時間インキュベートした後、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズを含むトリプロピルアミンを含有する溶液を添加する。電位を印加し、標的抗原（ＥＲ）が存在する状況下で、ルテニウム標識が励起され、ＥＣＬ検知器（ＯＲＩＧＥＮ分析器、あるいはＢＩＯＶＥＲＩＳ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国メリーランド州ゲイサーズバーグ）のＭ−Ｓｅｒｉｅｓ（登録商標）３８４のような市販の機器など）を使用して光が発光され、検出される。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態において、本発明に基づいて使用されるイムノアッセイは、以下の組み合わせの１つを使用することができる。
１．ＥＲ−αに対する２組のポリクローナル抗体（最も好ましい実施形態）
２．ＥＲ−αに対するポリクローナル抗体とモノクローナル抗体
３．ＥＲ−αに対する２つのモノクローナル抗体
ＥＲ−αを検出するためには、ＥＲ−αに対する種々のモノクローナルおよびポリクローナル抗体が有用であり、これにはＥＲ−αに対する以下の抗体が含まれるが、これらに限定されない。
・ＥＲ−αに対するポリクローナル抗体（例えば、ウサギ抗ＥＲ−αポリクローナル抗体（ＢＥＴＨＹＬ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国テキサス州モントゴメリー、カタログ番号Ａ３００−４９５Ａ、Ａ３００−４９６Ａ、Ａ３００−４９７Ａ、およびＡ３００−４９８Ａ；ＡｎａＳｐｅｃ、米国カリフォルニア州サンホセ  ９５１３１、カタログ番号２９５９５；Ａｂｃａｍ，Ｉｎｃ．、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ  ０２１３９、Ａｂｃａｍカタログ番号ａｂ３５７５、ａｂ５７００−ｌ、ａｂ３０６５６、ａｂ２８７９８、ａｂ２８７９９、ａｂ３１３１２、ａｂ３１３１４−５、３１４７８；ＬａｂＶｉｓｉｏｎ、Ｌａｂｖｉｓｉｏｎ、カリフォルニア州フレモント  ９４５３９、米国カリフォルニア州フレモント  ９４５３９、ＬａｂＶｉｓｉｏｎカタログ番号ＲＢ−９０６１）
・ＥＲ−αに対するモノクローナル抗体（ＬａｂＶｉｓｉｏｎカタログ番号：ＭＳ−７５０、ＭＳ−３５４、ＭＳ−３９１、ＭＳ−１０７１、ＲＭ−９１０１、ＲＴ−１６３９、ＲＴ−１６４０、ＲＴ−１６４１、ＲＴ−１６４２；Ａｂｃａｍカタログ番号：ａｂ３１４７８、ａｂｌｌ０４、ａｂ８５８、ａｂ４８４、ａｂ２７４６、ａｂ９２６９、ａｂ８８５７、ａｂ７８２０−８、ａｂ１９３４８−９、ａｂ１５２８４）
本発明のイムノアッセイは、これまでに開発されたステロイド受容体に対するいずれのイムノアッセイよりも高速であり、有意に高い感度を有する。本発明のイムノアッセイは、癌を有さないヒト志願者の血液１ｍＬ当たりに添加された９００個のＭＣＦ−７乳癌細胞、好ましくは血液１ｍＬ当たり５００個のＭＣＦ−７細胞、より好ましくは血液１ｍＬ当たり１００個のＭＣＦ−７細胞、最も好ましくは血液１ｍＬ当たり３０個のＭＣＦ−７細胞からステロイド受容体発現を検出することができる。
【００２１】
電気化学発光の他に、この用途で必要とされる高い感度をもたらすことができる他のイムノアッセイには、以下が含まれるが、これらに限定されない。
ａ）Ｌｉｕ  Ｙら，２００３（Ｊ  Ｆｏｏｄ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ６６：５１２−７）に記載のような化学発光
ｂ）Ｙｕ  Ｈら，２０００（Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ  １４：８２９−４０）に記載のような蛍光化学発光（ＦＣＬ）
ｃ）蛍光偏光イムノアッセイ（Ｈｏｗａｎｉｔｚ  ＪＨ，１９８８  Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ  １１２：７７５−９を参照）
ｄ）時間分解蛍光イムノアッセイ（Ｂｕｔｃｈｅｒ  Ｈら，２００３，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２７２：２４７−５６；Ｓｏｕｋｋａら，２００１，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ４７：１２６９−７８；Ｈｏｗａｎｉｔｚ  ＪＨ，１９８８  Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ  １１２：７７５−９）
好ましい実施形態においては、アッセイで使用される乳癌細胞の相対量が推定される。これにより細胞１個当たりの総ＥＲ−αタンパク質の比率が得られ、細胞１個当たりのＥＲ−αタンパク質のレベルが高い、中程度の、および低い乳癌細胞の対照標準物質と比較することができる。これは、高レベルの発現を有する少数の乳癌細胞から得られるものによく似たシグナルを生じうる、低レベルのＥＲ−αタンパク質の発現を有する多くの循環乳癌細胞が存在する偽陽性の状況を排除することから、好ましい実施形態である。本実施形態においては、フローサイトメトリー分析、溶解細胞からの総ＤＮＡあるいはヒストンなどのＤＮＡ関連抗原の定量化（二倍体細胞当たりＤＮＡ６ｐｇが存在）、ベータアクチンのようなハウスキーピング遺伝子産物の定量化、および濁度または吸光測定を含めた、種々の手法を使用して相対細胞数を推定することができる。
【００２２】
ホルモン剤による処置から利益が得られる可能性がある乳癌患者を同定するための本発明による方法は、その感度から、ＥＲの組織アッセイによって腫瘍生検組織がＥＲ発現陰性であるとすでに測定されている（例えば、免疫組織化学によって）患者に効果的に適用することができる。
【００２３】
ＥＲベータのアッセイは、ＥＲベータに対して特異的な抗体を使用する点を除けば、ＥＲ−αと同じ方法を使用して行うことができる。ＥＲベータに対する有用な抗体の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない。
・ＥＲベータに対するウサギポリクローナル抗体（例えば、カタログ番号Ｅｒｂ１５−Ａ、Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、米国テキサス州サンアントニオ；カタログ番号ａｂ５７８６、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、米国コロラド州リトルトン）
・ＥＲベータに対するマウスモノクローナル抗体（例えば、カタログ番号ａｂ１６８１３、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）
ＰＲのアッセイは、ＰＲに対して特異的な抗体を使用する点を除けば、ＥＲ−αと同じ方法を使用して行うことができる。ＰＲに対する有用な抗体の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない。
・ＰＲに対するウサギポリクローナル抗体（例えば、Ａｂｃａｍカタログ番号ａｂｌ５５０９、ａｂ１５５１０、Ａｂｃａｍ，Ｉｎｃ．、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ  ０２１３９）
・ＰＲに対するマウスモノクローナル抗体（例えば、Ａｂｃａｍカタログ番号ａｂ９８９５、ａｂ９８９６、ａｂ２７６４、Ａｂｃａｍ，Ｉｎｃ．）
・ＰＲに対するウサギモノクローナル抗体（例えば、Ａｂｃａｍカタログ番号ａｂ２７６１６）
アンドロゲン受容体（ＡＲ）のアッセイは、ＡＲに対して特異的な抗体を使用する点を除けば、ＥＲ−αと同じ方法を使用して行うことができる。ＰＲに対する有用な抗体の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない。
・ＡＲに対するヤギポリクローナル抗体（例えば、Ａｂｃａｍカタログ番号ａｂ１９０６６、Ａｂｃａｍ，Ｉｎｃ．、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ  ０２１３９）
・ＡＲに対するウサギポリクローナル抗体（例えば、Ａｂｃａｍカタログ番号ａｂ３５０９）
本発明における乳癌の処置のためのホルモン療法剤（内分泌療法剤とも呼ばれる）には、以下を含む米国食品医薬品局の承認を受けたものが含まれるが、これらに限定されない（Ｂｕｚｄａｒ，２００３，Ｔｈｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  ８：３３５−４１）。
・タモキシフェン（Ｇｒａｄｉｓｈａｒ，２００４，Ｔｈｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  ９：３７８−８４も参照）
・アロマターゼ阻害剤（アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン；Ｃａｍｐｏｓ  ２００４（Ｔｈｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  ９：１２６−３６）も参照）
・エストロゲンおよびプロゲステロン受容体を下方調節し、既知のアゴニスト活性を有さないエストロゲン受容体拮抗薬である、フルベストラント（Ｂｒｏｓｓら，２００２，Ｔｈｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  ７：４７７−８０も参照）
アロマターゼ阻害剤のファドロゾールは、すでに日本で承認されている。
【００２４】
本発明は、以下の実施例を参照することにより、よりよく理解されるが、以下の実施例は本明細書に記載の本発明を例示するものであり、制限するものではない。
【実施例】
【００２５】
（実施例１）
乳癌患者が来院したら、凝固を予防するために血液試料をチューブに採取する。Ｓｉｇｍａ  ＣｅｌＬｙｔｉｃ（登録商標）ＮｕＣｌＥＡＲ（登録商標）Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔなどの市販のキットを使用して、癌細胞を単離し、核タンパク質を抽出する。ＥＲ−αに対するルテニウム標識ウサギポリクローナル抗体と、ビオチン化ポリクローナル抗体（ＥＲ−αに対する抗体も）とを添加した後、ストレプトアビジンが付着した磁気ビーズの懸濁液を添加し、次いでトリプロピルアミンを含有する溶液を添加する。電流を印加し、市販品（ＢｉｏＶｅｒｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）などのＥＣＬ検出装置を使用して電気化学発光（ＥＣＬ）を検出する。シグナルは、循環腫瘍細胞中に存在するＥＲ−α受容体の量に比例する。
【００２６】
（実施例２）
実施例１に記載のような、高レベルのＥＲ−αを循環悪性細胞に有する患者をホルモン療法で処置する。
【００２７】
（実施例３）
方法は実施例１と同様であるが、抗体はプロゲステロン受容体（ＰＲ）に対する抗体である。
【００２８】
（実施例４）
実施例１、２または３に記載のような、高レベルのＥＲ−αまたはＰＲを循環悪性細胞に有する患者をホルモン療法で処置する。
【００２９】
（実施例５）
本実施例では、電気化学発光によるサンドイッチイムノアッセイを使用して、乳癌細胞からＥＲ−αを検出する感度を検査する。
【００３０】
以下のＰＢＳアッセイ緩衝液を調製する。
・アッセイ緩衝液：０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０および０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）
まず、ビオチン化と非ビオチン化の両形態で、ウサギ抗ＥＲ−αポリクローナル抗体（好ましくは、このポリクローナル抗体は、完全長ＥＲ−αタンパク質に対する抗体である）を得る。非ビオチン化ポリクローナル抗体は、以下の通りにルテニウム標識（「ＴＡＧ標識」）する。
・１．５μｇ／μＬルテニウム標識（ＢＶ−ＴＡＧ−ＮＨＳ  Ｅｓｔｅｒ、カタログ番号１１００３４；ＢｉｏＶｅｒｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国メリーランド州ゲイサーズバーグ）をＤＭＳＯ中で調製する。
・５００μＬの抗体の場合は１８．８μＬのＢＶ−ＴＡＧ−ＮＨＳを添加し、２００μＬのポリクローナル抗体の場合は３．８μＬのＢＶ−ＴＡＧ−ＮＨＳを添加する。いずれの場合も、溶液を１時間インキュベートし、２０μＬの２Ｍ  グリシンを添加することにより反応を停止する。
・各反応混合物中の非結合ＢＶ−ＴＡＧ−ＮＨＳ  Ｅｓｔｅｒは、事前にＰＢＳ（０．０８％アジ化ナトリウムを含有）（溶出にも使用する）で平衡化したＰＤ−１０ゲル濾過カラムを使用して除去する。各標識抗体について、各画分中のタンパク質濃度をタンパク質アッセイにより測定し、タンパク質含有量の多い画分を次の実施例で使用する。
【００３１】
ルテニウム標識ポリクローナル抗体およびビオチン化ポリクローナル抗体は、本実施例において以後「ＴＡＧ−ｐＡｂ」および「ビオチン−ｐＡｂ」と呼ぶ。
【００３２】
ＭＣＦ−７乳癌細胞（ＡＴＣＣ、米国バージニア州マナッサス）を、ＡＴＣＣの推奨条件通りに６ウェル組織培養プレート内で増殖させ、ＰＢＳで２回洗浄し、血球計を使用してアリコートを計数する。ＭＣＦ−７細胞からの核タンパク質抽出は、Ｓｉｇｍａ  ＣｅｌＬｙｔｉｃ（登録商標）ＮｕＣｌＥＡＲ（登録商標）Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して、製造元の推奨通りに行う。
【００３３】
以下の通りに電気化学発光アッセイを行う。
・各ウェルに順次、ＭＣＦ−７細胞からの抽出物を添加し（１ウェル当たりの抽出物の量は、３０〜１００個のＭＣＦ−７細胞から抽出されたものと異なる。抽出物を含まない対照ウェルも使用する）、次に５０μＬ／ウェルのＴＡＧ−Ａｂとビオチン−Ａｂとの混合物（例えば、それぞれ０．５〜２μｇ／ｍＬの濃度；ＰＢＳアッセイ緩衝液で希釈）を９６ウェルＵ底ポリプロピレンプレートのウェルに添加し、絶えず振盪させながら室温にてインキュベートする（例えば、２時間）。
・ストレプトアビジン磁気ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、カタログ番号１１００２８、ＢｉｏＶｅｒｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国メリーランド州ゲイサーズバーグ）ｌ０μｇを含む２５μＬを各ウェルに添加し、絶えず振盪させながらインキュベートする（例えば、３０分間）。
・各ウェルにＰＢＳアッセイ緩衝液を添加して、１ウェル当たり２５０μＬの最終量とする。すべての条件を少なくとも２つのウェルで試験する。次に、Ｍ８  Ｍ−Ｓｅｒｉｅｓ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ（カタログ番号３１０８００、ＢｉｏＶｅｒｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国メリーランド州ゲイサーズバーグ）を使用して、９６ウェルプレートの電気化学発光を分析する。
【００３４】
このイムノアッセイを使用すると、ＥＲ−αは検出可能であり、少なくとも１ウェル当たり１００個のＭＣＦ−７細胞からの抽出物によるベースラインを上回る。
【００３５】
（実施例６）
本実施例では、組換えヒトエストロゲン受容体（ＥＲ）アルファを検出する感度を電気化学発光によるサンドイッチイムノアッセイを使用して検査した。
【００３６】
以下のＰＢＳアッセイ緩衝液を調製した。
・アッセイ緩衝液：０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０および０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２）
まず、以下の２組の抗ＥＲ−αウサギポリクローナル抗体をＡｂｃａｍ  Ｉｎｃ（ケンブリッジ、ＭＡ）から入手した。
・Ｃ末端を対象とするＡｂ−５７００
・ヒトエストロゲン受容体−αのアミノ酸セリン１６７の非リン酸化部位を対象とするＡｂ−３１３１５
Ｌｏｒｅｎｃｅ＆Ｌｕ（国際特許公開第ＷＯ  ２００６／０４１９５９  Ａ２号）の方法に基づき、両ポリクローナル抗体の一部をルテニウム標識（「ＴＡＧ標識」）し、Ａｂ−３１３１５の一部をビオチン標識した。ルテニウム標識ポリクローナル抗体Ａｂ５７００およびルテニウム標識ポリクローナル抗体Ａｂ３１３１５は、以後それぞれ「ＴＡＧ−５７００」および「ＴＡＧ−３１３１５」と呼ぶ。ビオチン化ポリクローナル抗体Ａｂ３１３１５は、本実施例において以後「ビオチン−３１３１５」と呼ぶ。
【００３７】
組換えエストロゲン受容体−αタンパク質は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（米国カリフォルニア州カールズバッド；カタログ番号Ｐ２１８７、２６００ｐｍｏｌ／ｍＬ）から入手した。
【００３８】
以下の通りに電気化学発光アッセイを行った。
・１ウェル当たり２５μＬの使用時に、１６００、１６０、１６、４、および１ｐｇ／ウェルとなるように、標準物質をアッセイ緩衝液で希釈した。９６ウェルＵ底ポリプロピレンプレートの各ウェル（１ウェル当たり標準物質２５μＬを有する）に、以下のいずれかの混合物５０μＬ／ウェルを添加した。
【００３９】
・ＴＡＧ−３１３１５とビオチン−３１３１５（例えば、添加前は５０μＬ中１．０μｇ／ｍＬの濃度）
・ＡＧ−５７００とビオチン−３１３１５（例えば、添加前は５０μＬ中１．０μｇ／ｍＬの濃度）
・得られた溶液を絶えず振盪させながら室温にてインキュベートした（２時間）。
・ｌ０μｇのストレプトアビジン磁気ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ  Ｍ−２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、カタログ番号１１００２８、ＢｉｏＶｅｒｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国メリーランド州ゲイサーズバーグ）を含む２５μＬを各ウェルに添加し、絶えず振盪させながらインキュベートした（３０分間）。
・ＰＢＳアッセイ緩衝液を各ウェルに添加し、１ウェル当たり２５０μＬの最終量を作製した。すべての条件を２つのウェルで試験した。次に、Ｍ−Ｓｅｒｉｅｓ（登録商標）  ３８４  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＢｉｏＶｅｒｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国メリーランド州ゲイサーズバーグ）を使用して、９６ウェルプレートの電気化学発光を分析した。
【００４０】
このイムノアッセイを使用すると、バックグラウンドを上回るシグナルによって、１ウェル当たり１６００ｐｇのＥＲ標準物質を検出することができた（図１）。
【００４１】
（実施例７）
これらの一連の実験では、最初に、実施例６と同じ抗体を使用して、組換えＥＲ−αを検出する感度の測定を繰り返し行った。しかし、これらの抗体を４℃で保管したところ、感度の低下が生じ、１ウェル当たり１，２５０ｐｇの場合のＥＣＬシグナルは、ベースラインを下回り、１ウェル当たり１２，５００ｐｇのＥＣＬシグナルは、ベースラインを１６０  ＥＣＬ単位上回った。こうした感度の低下により、さらなる抗体を試験した。ＥＲ−αに対するニワトリポリクローナルＩｇＹ抗体を、ＧｅｎＷａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（米国カリフォルニア州サンディエゴ；カタログ番号１５−２８８−２１１８２）から入手した。Ｌｏｒｅｎｃｅ＆Ｌｕ（国際特許公開第ＷＯ  ２００６／０４１９５９  Ａ２号）の方法に基づき、このポリクローナル抗体の一部をルテニウム標識し（「ＴＡＧ−ＩｇＹ」）、一部をビオチン標識した（「ビオチン−ＩｇＹ」）。
【００４２】
実施例６の方法に基づき、ＥＲ−α標準物質を使用したＥＣＬイムノアッセイをこれらの抗体で行った。これらのＩｇＹ抗体を使用すると、試験した最低量（１ウェル当たり１２．５ｐｇのＥＲ−α）が検出可能であり、ベースラインを上回るＥＣＬシグナルを生じた（表１）。
【００４３】
表１．ルテニウム標識ニワトリポリクローナル（ＴＡＧ−ＩｇＹ）およびビオチン化ニワトリポリクローナル抗体（ビオチン−ＩｇＹ）を使用したイムノアッセイによる、組換えＥＲ−αの電気化学発光（ＥＣＬ）検出
【００４４】
【表１】
2009538415.tif 000002
＊抗原のない対照ウェルの平均シグナルを上回る平均ＥＣＬシグナル
これらのＩｇＹ抗体を使用して、ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞（ＥＲ−α発現の陽性対照細胞）からの細胞抽出物を分析した。
【００４５】
ＭＣＦ−７細胞（ＡＴＣＣ、米国バージニア州マナッサス）を、ＡＴＣＣの推奨条件通りに組織培養基で増殖させ、ＰＢＳで２回洗浄し、血球計を使用してアリコートを計数した。ＳＫ−ＢＲ−３細胞の溶解と上清の採取は、Ｐｉｅｒｃｅプロテアーゼ阻害剤（カタログ番号７８４１０；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を有するＰｉｅｒｃｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍ−ＰＥＲ；カタログ番号７８５０１；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国イリノイ州ロックフォード）を使用して行った。１ウェル当たりの溶解産物の上清の量は、８〜１２５，０００個のＭＣＦ−７細胞から抽出したものと異なり、ＩｇＹ抗体によるイムノアッセイを使用してＥＲの分析を行った。このＭ−ＰＥＲによる抽出を使用してＥＣＬシグナルが見られたとしても少量であることから、これは抽出効率の低さが原因であった。
【００４６】
次に、種々の抽出法を使用し、以下の使用を試験した。
・ＲＩＰＡ抽出緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号８９９００）
・ＲＩＰＡ緩衝液と０．４Ｍの塩化カリウム（ＫＣｌ）
・ＲＩＰＡ緩衝液と９５℃にて２分間の加熱
・ＲＩＰＡ緩衝液とスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ）による剪断
・Ｍａｒｌｉｇｅｎの核抽出キット（カタログ番号１１９０６−１００）
ＭＣＦ−７細胞を試験したところ、ＫＣｌを含むＲＩＰＡ緩衝液がこれらの手法すべての中で最も優れていることが判明した（表２）。
【００４７】
表２．ルテニウム標識ニワトリポリクローナル（ＴＡＧ−ＩｇＹ）およびビオチン化ニワトリポリクローナル抗体（ビオチン−ＩｇＹ）を使用し、ＭＣＦ−７細胞のＲＩＰＡ−ＫＣＬ抽出を使用した、ＥＣＬイムノアッセイによるＥＲ−αの電気化学発光（ＥＣＬ）検出
【００４８】
【表２】
2009538415.tif 000003
＊抗原のない対照ウェルの平均シグナルを上回る平均ＥＣＬシグナル
ＭＣＦ−７細胞抽出物を使用したこのアッセイと並行して、別の標準曲線を作成し、感度の低下が認められた（表３と表１を比較）。このことから、次の実施例では、抗体の安定性を改善するために、ＩｇＹのさらなる保管条件を検査した。さらに、さらなる抗体も検査した。
【００４９】
表３．ルテニウム標識ニワトリポリクローナル（ＴＡＧ−ＩｇＹ）およびビオチン化ニワトリポリクローナル抗体（ビオチン−ＩｇＹ）を使用したイムノアッセイによる、組換えＥＲ−αの電気化学発光（ＥＣＬ）再検出
【００５０】
【表３】
2009538415.tif 000004
＊抗原のない対照ウェルの平均シグナルを上回る平均ＥＣＬシグナル。
＊＊これらの低いＥＣＬ値は、これらのウェルの分析時におけるＥＣＬ検出器の一時的な問題ときわめて一致する。
【００５１】
（実施例８）
本実施例では、電気化学発光によるサンドイッチイムノアッセイを使用して、以下を検査した。
・組換えＥＲ−αを検出する感度
・ＭＣＦ−７乳癌細胞からＥＲ−αを検出する感度
・ＭＣＦ−７（ＥＲ−α高発現の陽性対照細胞）とＫ５６２白血病細胞（陰性対照細胞）からＥＲ−αを検出する特異性
ニワトリ抗ＥＲ−αＩｇＹポリクローナル抗体を、ＧｅｎＷａｙから新たに入手した（カタログ番号１５−２８８−２１１８２）。Ｌｏｒｅｎｃｅ＆Ｌｕ（国際特許公開第２００６／０４１９５９  Ａ２）の方法に基づき、この抗体原料の一部を再びビオチン化し、一部を再びルテニウムで標識した。ルテニウム標識ニワトリポリクローナル抗体およびビオチン化ニワトリポリクローナル抗体は、本実施例において以後「ＴＡＧ−ＩｇＹ２」および「ビオチン−ＩｇＹ２」と呼ぶ。標識化後、これらの濃度はそれぞれ２０１μｇ／ｍＬおよび１２４μｇ／ｍＬとなった。また、標識化後、「ＴＡＧ−ＩｇＹ２」および「ビオチン−ＩｇＹ２」の一部はそれぞれ、ＢＳＡを添加せずに４℃で保管し、「ＴＡＧ−ＩｇＹ２」および「ビオチン−ＩｇＹ２」の一部はそれぞれ、１％のＢＳＡを添加して４℃で保管した。
【００５２】
以下の４種類のウサギ抗ＥＲ−αポリクローナル抗体を、ＢＥＴＨＹＬ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国テキサス州モントゴメリー）から入手した。
・カタログ番号Ａ３００−４９５Ａ：アミノ酸残基１〜５０のタンパク質領域に位置するＥＲ−αのエピトープに対し、したがってＮ末端を対象とする、ポリクローナル抗体。この抗体は、Ｌｏｒｅｎｃｅ＆Ｌｕ（国際特許公開第ＷＯ  ２００６／０４１９５９  Ａ２号）の方法に基づき、ルテニウムで標識した。これは、本実施例において以後「ＴＡＧ−４９５Ａ」と呼ぶ。標識化後、これは４８３μｇ／ｍＬの濃度を有し、ＢＳＡを添加せずに４℃で保管した。
・カタログ番号Ａ３００−４９６Ａ：アミノ酸残基１００〜１５０のタンパク質領域に位置するＥＲ−αのエピトープに対し、したがってＮ末端付近の領域を対象とする、ポリクローナル抗体。この抗体は、Ｌｏｒｅｎｃｅ＆Ｌｕ（国際特許公開第２００６／０４１９５９  Ａ２号）の方法に基づき、ビオチンで標識した。これは、本実施例において以後「ビオチン−４９６Ａ」と呼ぶ。標識化後、これは４８６μｇ／ｍＬの濃度を有し、ＢＳＡを添加せずに４℃で保管した。
・カタログ番号Ａ３００−４９７Ａ：アミノ酸残基５２５〜５７５のタンパク質領域に位置するＥＲ−αのエピトープに対し、したがって抗体Ａ３００−４９５ＡおよびＡ３００−４９６ＡよりもＣ末端に近い領域を対象とするポリクローナル抗体。この抗体は、Ｌｏｒｅｎｃｅ＆Ｌｕ（国際特許公開ＷＯ  ２００６／０４１９５９  Ａ２号）の方法に基づき、ルテニウムで標識した。これは、本実施例において以後「ＴＡＧ−４９７Ａ」と呼ぶ。標識化後、これは６２２μｇ／ｍＬの濃度を有し、ＢＳＡを添加せずに４℃で保チューブした。
・カタログ番号Ａ３００−４９８Ａ：アミノ酸残基５５０とＣ末端との間のタンパク質領域に位置するＥＲ−αのエピトープに対するポリクローナル抗体。この抗体は、Ｌｏｒｅｎｃｅ＆Ｌｕ（国際特許公開第２００６／０４１９５９  Ａ２号）の方法に基づき、ビオチンで標識した。これは、本実施例において以後「ビオチン−４９８Ａ」と呼ぶ。標識化後、これは３３５μｇ／ｍＬを有し、ＢＳＡを添加せずに４℃で保管した。
【００５３】
組換えヒトＥＲ−α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、実施例６で使用したものと同じものとした。
【００５４】
以下の通りに電気化学発光アッセイを行った。
・標準物質をアッセイ緩衝液中で再度希釈し、１ウェル当たり２５μＬを使用した場合、１６００、１６０、１６および４ｐｇ／ウェルを産生した。９６ウェルＵ底ポリプロピレンプレートの各ウェル（１ウェル当たり標準物質２５μＬを有する）に、５０μＬ／ウェルのＴＡＧ抗体とビオチン化抗体との混合物（添加前は５０μＬ中１．０μｇ／ｍＬの濃度）を添加し、得られた溶液を絶えず振盪させながら室温にてインキュベートした（２時間）。このアッセイでは以下の４組の抗体条件を試験した。
【００５５】
・条件１：標識化後、ＢＳＡを添加せずに４０℃で保存した「ＴＡＧ−ＩｇＹ２」および「ビオチン−ＩｇＹ２」
・条件２：標識化後、各標識抗体に１％ＢＳＡを添加して４℃で保存した「ＴＡＧ−ＩｇＹ２」および「ビオチン−ＩｇＹ２」
・条件３：「ＴＡＧ−４９５Ａ」および「ビオチン−４９８Ａ」（この抗体対は、タンパク質の２種類の領域に由来するエピトープに対する抗体であることから選択した）
・条件４：「ＴＡＧ−４９７Ａ」および「ビオチン−４９６Ａ」（この抗体の対は、タンパク質の２種類の領域に由来するエピトープに対する抗体であるため選択した）
・１０μｇのストレプトアビジン磁気ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、カタログ番号１１００２８、ＢｉｏＶｅｒｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国メリーランド州ゲイサーズバーグ）を含む２５μＬを各ウェルに添加し、絶えず振盪させながらインキュベートした（３０分間）。
・各ウェルにＰＢＳアッセイ緩衝液を添加して、１ウェル当たり２５０μＬの最終量を作製した。すべての条件を２つのウェルで試験した。次に、Ｍ−Ｓｅｒｉｅｓ（登録商標）３８４  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＢｉｏＶｅｒｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国メリーランド州ゲイサーズバーグ）を使用して、９６ウェルプレートの電気化学発光を分析した。
【００５６】
条件２、条件３、および条件４では、１ウェル当たりわずか４ｐｇのＥＲ−α標準物質が、バックグラウンドを上回る平均ＥＣＬシグナルを有した（表４）。条件１では、１ウェル当たりわずか１６ｐｇのＥＲ−α標準物質が、バックグラウンドを上回るシグナルで検出することができた（表４）。
【００５７】
標識ＩｇＹ抗体（４つのウサギ抗体のいずれよりも低濃度）が１％ＢＳＡ中で保管される条件２は、ＢＳＡを添加せずに標識ＩｇＹが保管される条件１に比べて、有利な結果をもたらした。
【００５８】
ウサギポリクローナル抗体を使用する条件３および条件４は、ニワトリポリクローナル抗体を使用する条件１および条件２に比べて、有利な結果をもたらした。さらに、ビオチン−４９８ＡとＴＡＧ−４９５Ａを使用する条件３は、ビオチン−４９６ＡとＴＡＧ−４９７Ａを使用する条件４に比べて、有利な結果をもたらした。
【００５９】
表４．４種類の抗体条件を使用したイムノアッセイによる、組換えＥＲ−αの電気化学発光（ＥＣＬ）検出（本実施例の本文を参照）
【００６０】
【表４】
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＊陰性：バックグラウンドレベルを下回る平均ＥＣＬシグナル
（実施例９）
本実施例では、電気化学発光によるサンドイッチイムノアッセイを使用して、以下を検査した。
・ＭＣＦ−７乳癌細胞からＥＲ−αを検出する感度
・ＭＣＦ−７（ＥＲ−α高発現の陽性対照細胞）とＫ５６２白血病細胞（ＥＲ−αの陰性対照細胞）からＥＲ−αを検出する特異性
方法は、条件３（ビオチン−４９８ＡとＴＡＧ−４９５Ａ）を使用する実施例８と同じであったが、細胞抽出物を得るための以下の追加の手順を行った。
・ＭＣＦ−７乳癌細胞およびＫ５６２白血病細胞（ＡＴＣＣ、米国バージニア州マナッサス）を、ＡＴＣＣの推奨条件通りに増殖させ、ＰＢＳで２回洗浄し、血球計を使用してアリコートを計数した。各細胞株（抽出緩衝液１ｍＬ当たり細胞５００万個）からのＥＲ−αの抽出は、０．４５Ｍの塩化カリウム（ＫＣｌ）と５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）とを添加して修正したＲＩＰＡ緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号８９９００）を使用して行った。抽出緩衝液の添加後、細胞物質を氷浴中ロッカー上で８０分間振盪させた。１８，０００ｒｐｍでの２０分間の遠心分離後、上清を得て、試験用の「抽出物」を産生した。
【００６１】
以下の通りに電気化学発光アッセイを行った。
・各ウェルに順次、ＭＣＦ−７またはＫ５６２細胞からの抽出物を添加し（１ウェル当たりの抽出物の量は、１００〜１０，０００細胞から抽出されたものと異なった。抽出物を含まない対照ウェルも使用した）、次に５０μＬ／ウェルのビオチン−４９８ＡとＴＡＧ−４９５Ａの混合物（１ウェル当たりに添加される５０μＬ中それぞれ１μｇ／ｍＬの濃度；ＰＢＳアッセイ緩衝液で希釈）を９６ウェルＵ底ポリプロピレンプレートのウェルに添加し、絶えず振盪させながら室温にて２時間インキュベートした。
・１０μｇのストレプトアビジン磁気ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、カタログ番号１１００２８、ＢｉｏＶｅｒｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国メリーランド州ゲイサーズバーグ）を含む２５μＬを各ウェルに添加し、絶えず振盪させながら３０分間インキュベートした。
・各ウェルにＰＢＳアッセイ緩衝液を添加して、１ウェル当たり２５０μＬの最終量を作製した。すべての条件を少なくとも２つのウェルで試験した。次に、Ｍ−Ｓｅｒｉｅｓ（登録商標）３８４  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＢｉｏＶｅｒｉｓ，Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国メリーランド州ゲイサーズバーグ）を使用して、９６ウェルプレートの電気化学発光を分析した。
【００６２】
このイムノアッセイを使用すると、ＥＲ−αは１ウェル当たり少数のＭＣＦ−７細胞から検出可能であり、Ｋ５６２抽出物からのＥＣＬシグナルは、ＭＣＦ−７細胞からのシグナルよりも少なく（表５および図２ならびに図３）、このイムノアッセイの高い感度と高い特異性を示した。
【００６３】
表５．ＭＣＦ−７細胞（高レベルのＥＲ−αの陽性対照）とＫ５６２細胞（陰性対照）それぞれのＥＲ−αをイムノアッセイにより検出するためのＥＣＬシグナルの比較。細胞のないウェルは８回実行し、その他の試料はすべて４回実行した。
【００６４】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】Ａｂｃａｍのウサギポリクローナル抗体Ａｂ−５７００およびＡｂ−３１３１５を使用して組換えＥＲ−αをイムノアッセイにより検出するためのＥＣＬシグナル（詳細は実施例６を参照）。ＴＡＧ−３１３１５とビオチン−３１３１５、あるいはＴＡＧ−５７００とビオチン−３１３１５のいずれかを使用し、かつ組換えＥＲ−αタンパク質１、４、１６、１６０および１６００ｐｇ／ウェルを使用して、２つの条件を試験した。
【図２】ＭＣＦ−７乳癌細胞（ＥＲ−α発現の陽性対照）からの溶解産物におけるＥＲ−αをイムノアッセイにより検出するためのＥＣＬシグナル。１ウェル当たり１００個、５００個および９００個の細胞の溶解産物を使用したデータを示す。
【図３】ＭＣＦ−７乳癌細胞（ＥＲ−α発現の陽性対照）とＫ５６２ヒト白血病細胞（陰性対照）それぞれの溶解産物におけるＥＲ−αをイムノアッセイにより検出するためのＥＣＬシグナルの比較。図２に示したものと同じ実験のデータを本図にも使用されているが、以下の追加のデータが使用されている：１０，０００個のＭＣＦ−７細胞の溶解産物材料から得られたデータ、およびＭＣＦ−７細胞から得られたデータ（１ウェル当たり１００個、５００個、９００個、および１０，０００個の細胞の溶解産物）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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