(57)【要約】この発明は、アデノウイルス−３６（Ａｄ−３６）のような脂肪生成アデノウイルスによる感染と、肥満になる病因および肥満が関係する癌およびそれ以外の疾患との関係に関する。さらに、本発明はＡｄ−３６の発現状態について被験体を評価し、Ａｄ−３６の発現状態を癌の存在を表すマーカーとして使用して、将来乳癌または前立腺癌のような癌が発生する危険性を予測したりこうした癌の攻撃性および予後を予測したりすることに関する。
2009521707.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体が脂肪生成アデノウイルス関連疾患を発生しやすい傾向にあるかどうかを予測する方法であって、
該被験体から試料を採取する工程、および
該被験体が該脂肪生成アデノウイルスに感染しているかどうかを測定する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記被験体が前記脂肪生成アデノウイルスに感染しているかどうかを測定する前記工程は、
前記試料中の該脂肪生成アデノウイルスに特異的な抗体の有無をスクリーニングする工程、および
該試料中の該脂肪生成アデノウイルスに特異的な抗体の存在を測定する工程
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記脂肪生成アデノウイルスは、アデノウイルス５型、アデノウイルス３５型およびアデノウイルス３７型からなる群より選択される１つ以上の脂肪生成ウイルスである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記脂肪生成関連疾患は、癌、前立腺癌、乳癌、膵機能障害、膵疾患、糖尿病、肺疾患、脳および神経系機能不全および副腎機能障害からなる群より選択される疾患である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記被験体はヒトである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記被験体は動物である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記測定する工程における前記抗体は、配列番号５、配列番号６および配列番号７からなる群より選択される核酸配列によりコードされる１つ以上のペプチドに特異的である請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記スクリーニング工程は血清中和法およびＥＬＩＳＡからなる群より選択される方法を用いることにより実施される請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記試料は生体試料、体液、組織試料、臓器試料、糞便、血液、唾液およびこれらのあらゆる組み合わせからなる群より選択される請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
抗脂肪生成アデノウイルスワクチンを被験体に投与することを含む、該被験体の脂肪生成アデノウイルス関連疾患を予防する方法。
【請求項１１】
前記抗脂肪生成アデノウイルスワクチンは、有効投与量の有効成分として、死菌アデノウイルス３６型、不活化アデノウイルス３６型、アデノウイルス３６外被タンパク質またはその断片をコードするタンパク質またはペプチド配列、アデノウイルス３６型外被タンパク質またはその断片をコードする核酸配列、アデノウイルス３６型Ｅ１Ａタンパク質、遺伝子組換え非病原性ウイルスおよび非病原性ウイルスからなる群より選択される１つ以上の化合物を含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗脂肪生成アデノウイルスワクチンを鼻内、経口、静脈内、筋肉内皮下および／または腹腔内に投与する請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記被験体はヒトである請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記被験体は動物である請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記脂肪生成アデノウイルス関連疾患は癌、前立腺癌、乳癌、膵機能障害、膵疾患、糖尿病、肺疾患、脳および神経系機能不全および副腎機能障害からなる群より選択される１つ以上の疾患である請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
被験体の癌の攻撃性を予測する方法であって、
該被験体から試料を採取する工程、
該被験体が、脂肪生成アデノウイルスの存在が浸潤癌と相関を成すような脂肪生成アデノウイルスに感染しているかどうかを測定する工程
を含む、方法。
【請求項１７】
前記被験体が前記脂肪生成アデノウイルスに感染しているかどうかを測定する前記工程は、
前記試料中の前記脂肪生成アデノウイルスに特異的な抗体の有無をスクリーニングする工程、および
該試料中の該脂肪生成アデノウイルスに特異的な抗体の存在を測定する工程
を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記脂肪生成アデノウイルスはアデノウイルス５型、アデノウイルス３５型およびアデノウイルス３７型からなる群より選択される１つ以上の脂肪生成ウイルスである請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記癌は乳癌、前立腺癌、子宮癌、卵巣癌、大腸癌、腎臓癌、膵臓癌および肺癌からなる群より選択される請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記被験体はヒトである請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記被験体は動物である請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記測定する工程の前記抗体は、配列番号５、配列番号６および配列番号７からなる群より選択される核酸配列によりコードされる１つ以上のペプチドに特異的である請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記スクリーニング工程は血清中和法およびＥＬＩＳＡからなる群より選択される方法を用いて実施される請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記試料は生体試料、体液、組織試料、臓器試料、糞便、血液、唾液およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００５年１２月２７日に出願された米国仮特許出願第６０／７５３，４０２号に関連し、米国仮特許出願第６０／７５３，４０２号に対する米国特許法第１１９（ｅ）条の下での利益を主張する。米国仮特許出願第６０／７５３，４０２号の開示は、本明細書中にその全体が援用される。
【０００２】
（発明の分野）
この発明は、アデノウイルス−３６（Ａｄ−３６）のような脂肪生成アデノウイルスによる感染と、肥満になる病因および肥満が関係する癌およびそれ以外の疾患との関係に関する。さらに具体的には、本発明は被験体が乳癌または前立腺を発生する傾向にあるかどうかを予測する手法に関する。また、本発明はＡｄ−３６の発現状態について被験体を評価し、Ａｄ−３６の発現状態を癌の存在を表すマーカーとして使用して、将来乳癌または前立腺癌のような癌が発生する危険性を予測したり、こうした癌の攻撃性および予後を予測したりすることに関する。
【背景技術】
【０００３】
（関連技術）
肥満の割合と特定の癌の割合とが同時に劇的に増大している。１９８０年頃から肥満の世界的流行が劇的に加速した。米国では、成人肥満の割合は、１９８０年から２０００年の２０年間で２倍を超えた（１５％から３１％）が、その２０年前の１９６０年から１９８０年では、わずかに増大するにとどまった（１３．５％から１５％）。小児肥満の割合は１９７０年頃から２０００年までに３倍になった。同様に、近年では乳癌、前立腺癌、大腸癌および肝臓癌も罹患率が急速に増大してきた。
【０００４】
（特に）乳癌および前立腺癌の関係およびこのような癌の攻撃性には、肥満による生殖ホルモンの変化が一役を担っていることが示唆されている。しかし、生殖ホルモンの変化では、ホルモン支配下にはない大腸癌、腎臓癌または膵臓癌のような癌を説明することができない。
【０００５】
肥満と癌との関係のもう１つの可能性には、肥満の個体に見られる免疫機能の低下がある。肥満のヒトは、Ｂ型肝炎ワクチンに対する抗体反応がワクチンを受けた肥満ではないヒトよりも低い。免疫系は新生物の増殖を阻害するのに重要であるため、これが、肥満では多くの種類の癌が増大する機序であっても驚くことではなかろう。しかし、ヒト宿主を含む宿主内で、アデノウイルスがその複製を促進させる一つの方法として免疫機能を低下させることは周知である。しかも、ＳＭＡＭ−１ニワトリアデノウイルスは、肥満の原因になることが報告されており、ニワトリの免疫機能を低下させて大きな影響を与えた。このため、肥満の原因になるアデノウイルスと、免疫機能も低下させるアデノウイルスとは直結するものであった。発明者らは、ＳＭＡＭ−１がヒトの肥満の原因であることを報告しており、アデノウイルスがヒトの肥満に関係していることを加えている。
【０００６】
ヒトアデノウイルスの血清型には発癌性のものがあることが知られており、それがラットやハムスターの腫瘍を誘発する。アデノウイルスの血清型は群により区別される。Ａ群アデノウイルス（たとえば、Ａｄ−１２、Ａｄ−１８）は発癌性が高く、４ヵ月以内にほとんどの動物に腫瘍を産生する。Ｂ群アデノウイルス（たとえば、Ａｄ−３、Ａｄ−７）は発癌性が弱く、４〜１８ヵ月以内にほとんどの動物に腫瘍を誘発する。Ｄ群ウイルスは発癌性がほとんどないと思われるが、血清型９型は効率よく３〜５ヵ月以内に乳腺腫瘍を誘発する。アデノウイルスが誘発する癌に関する研究が幅広く行われているが、これまでに、アデノウイルスがヒトの癌に起因するという証拠は得られていない。
【０００７】
アデノウイルスがヒトの癌を発生させるのであれば、アデノウイルスは、細胞が無秩序に増殖するのを可能にする宿主で、遺伝子の発現を変化させて癌を発生させると思われる。そのような腫瘍マーカーは数多く確認されてきた。なかには遺伝的変異によるものもある。ＢＲＣＡｌ、ＢＲＣＡ２、ＣＨＥＫ２、ＴＰ５３またはＰＴＥＮのような浸透度が高い傾向にある遺伝子の一方の対立遺伝子では、遺伝性乳癌は生殖細胞突然変異と関係がある。このような遺伝的に影響を受けやすい個体では、アデノウイルス感染が癌を助長することは可能である。しかし、アデノウイルスは種々のオンコジーンの発現を誘発したり、宿主の腫瘍抑制遺伝子の発現を抑制したりすることにより任意の発癌に寄与することがある。癌に寄与していると考えられるアデノウイルスの変化のなかには、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ、脂肪酸結合タンパク質、ｍＴＯＲ、ｐｌ６、ｐ５３、ＰＤＺタンパク質、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ、ＰＭＬ、チミジンキナーゼおよびＺｉｐキナーゼの変化がある。アデノウイルスＥ４領域により変化するこうした腫瘍関連因子は特に興味深く、なかでもＥ４ｏｒｆｌ遺伝子は興味深い。Ｅ４オンコジーンにはＤＮＡ−依存性プロテインキナーゼ、ｐ５３、ＰＤＺタンパク、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ、ＰＭＬ、チミジンキナーゼおよびＺｉｐキナーゼがある。以下に記載したように、Ａｄ−３６Ｅ４ｏｒｆｌ遺伝子は脂肪細胞代謝に直接作用して肥満を引き起こすことに関与していることが示されている。ヒトアデノウイルス−５のＥ４ｏｒｆｌ領域はオンコジーンになることが示されており、最近の論文では、Ａｄ−５がマウスを肥満にさせることが報告された。こうした結果は、肥満と癌の両者がヒトアデノウイルスにより直接関係していることを示し、ウイルス遺伝子を介すると思われる機序を明らかにしている。
【０００８】
癌研究の分野の多くの研究者の間では、アデノウイルスがヒトの癌に起因することはないという見解の一致があった。このため、Ａｄ−３６のような脂肪生成アデノウイルスが乳癌および前立腺癌のような肥満による癌の原因であることを明らかにしたのは技術的に大きな進歩であろう。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明の一態様は、被験体が脂肪生成アデノウイルス関連疾患を発生しやすい傾向にあるかどうかを予測する方法に関する。この手法は、被験体から試料を採取し、試料中の脂肪生成アデノウイルスに特異的な抗体の有無をスクリーニングすることにより被験体が脂肪生成アデノウイルスに感染しているかどうかを測定し、試料中の脂肪生成アデノウイルスに特異的な抗体の存在を測定することを含む。抗体は核酸配列配列番号５、配列番号６および配列番号７によりコードされる１つ以上のペプチドに特異的でもよい。そのうえさらに、スクリーニング工程は血清中和法およびＥＬＩＳＡからなる群より選択される方法を用いて実施することができる。
【００１０】
別の態様では、脂肪生成アデノウイルスは、アデノウイルス５型、アデノウイルス３６型およびアデノウイルス３７型を含めることができる。また、脂肪生成アデノウイルスに関する疾患には、癌、前立腺癌、乳癌、膵機能障害、膵疾患、糖尿病、肺疾患、脳および神経系機能障害および副腎機能障害を含めることができる。
【００１１】
さらに別の態様では、被験体はヒトでも動物でもよい。さらに、試料は体液、組織試料、臓器試料、糞便、血液、唾液のような生体試料にすることができ、こうした試料を任意に組み合わせてもよい。
【００１２】
本発明の別の態様は、被験体に抗脂肪生成アデノウイルスワクチンを投与することにより、被験体の脂肪生成アデノウイルスに関係のある疾患を予防する方法に関する。抗脂肪生成アデノウイルスワクチンは有効投与量の死菌アデノウイルス３６型、不活化アデノウイルス３６型、アデノウイルス３６外被タンパク質またはその断片をコードするタンパク質またはペプチド配列、アデノウイルス３６型外被タンパク質またはその断片をコードする核酸配列、アデノウイルス３６型Ｅ１Ａタンパク質、遺伝子組換え非病原性ウイルスおよび非病原性ウイルスのような有効成分を含めることができる。
【００１３】
別の態様では、ワクチンを被験体に鼻内、経口、静脈内、筋肉内、皮下および／または腹腔内投与してもよい。被験体はヒトでも動物でもよい。脂肪生成疾患には、癌、前立腺癌、乳癌、膵機能障害、膵疾患、糖尿病、肺疾患、脳および神経系機能不全および副腎機能障害を含めることができる。
【００１４】
本発明の別の態様は、被験体の癌の攻撃性を測定する方法に関する。この手法は、被験体から試料を採取し、試料中の脂肪生成アデノウイルスに特異的な抗体の有無をスクリーニングして試料中の脂肪生成アデノウイルスに特異的な抗体の存在を測定することにより、被験体が、脂肪生成アデノウイルスの存在が浸潤癌と相関を成すような脂肪生成アデノウイルスに感染しているかどうかを測定することを含む。抗体は核酸配列配列番号５、配列番号６および配列番号７によりコードされる１つ以上のペプチドに特異的でもよい。そのうえさらに、スクリーニング工程は血清中和法およびＥＬＩＳＡからなる群より選択される方法を用いて実施することができる。
【００１５】
別の態様では、脂肪生成アデノウイルスには、アデノウイルス５型、アデノウイルス３５型およびアデノウイルス３７型を含めることができる。また、癌には乳癌、前立腺癌、子宮癌、卵巣癌、大腸癌、腎臓癌、膵臓癌および肺癌を含めることができる。
【００１６】
さらに別の態様では、被験体はヒトでも動物でもよい。さらに、試料は体液、組織試料、臓器試料、糞便、血液、唾液のような生体試料でもよく、そのような試料を組み合わせてもよい。
【００１７】
本発明の付加的な特徴、利点および実施形態は、以下の詳細な説明、図面、および請求の範囲の考察に係るものであるか、あるいはそこから明らかなものにすることができる。さらに、これまでの本発明の開示およびこれ以降の詳細な説明はいずれも例示的であり、主張した本発明の範囲を制限することなくさらに説明を提供することを意図するものであることを理解されたい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
（発明の詳細な説明）
本発明は本明細書中に記載された手法、プロトコール、装置、器具、材料および試薬などに限定されず、変更可能であると理解されるものである。また、本明細書で使用される用語は特定の実施形態のみを記載する目的で使用されており、本発明の範囲を限定することを目的としないと理解されるものである。本明細書および添付の請求項で使用されるように、文脈上明確に別の意味が示されない限り、単数表現は複数表現を含むと了解しなければならない。このため、たとえば、「ウイルス粒子」という言及は１つ以上のウイルス粒子および当業者にとって既知な等価物などを指す。
【００１９】
特に定義されないかぎり、本明細書で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術の当業者が共通して理解する意味を有する。好ましい方法、装置および材料を記載してはいるが、本明細書中に記載されるものと同様であるかあるいは等価である方法および材料はいずれも、本発明を実施したり検査したりするのに使用することができる。本明細書中で引用される参考文献はいずれも、その全体を参照により本明細書中に援用している。
【００２０】
本明細書に挙げられている数字範囲はいずれも１単位の増分であり、低い方の値から高い方の値までの値をすべて包含する。ただし、任意の低い方の値と任意の高い方の値との間に少なくとも２単位の分離がある。一例として、成分濃度またはたとえば用量、希釈のような処理変数の値が、たとえば１〜９０、具体的には２０〜８０、さらに具体的には３０〜７０であるとすれば、１５〜８５、２２〜６８、４３〜５１、３０〜３２のような値は、本明細書中に明白に列挙されていることを意味する。１未満の値については、１単位が必要に応じて、０．０００１、０．００１、０．０１、または０．１であると考えられる。こうした数値は、特別に意図されているものの例にすぎず、本出願では、列挙されている最低値と最高値との間の数値のあらゆる可能な組み合わせが同じ要領で明白に記載されていると考えられるものとする。
【００２１】
さらに、「定義」の項を真下に設けており、本発明に関する特定の用語を明確にするために具体的に定義しているが、定義はすべて当業者がこのような用語をどのように解釈するのかと一致するものである。特定の方法、装置および材料を記載したが、本発明の実施または試験には、本明細書中に記載されたものと同様であるかまたは等価である任意の方法および材料を使用することができる。
【００２２】
（定義）
Ａｄ−２はアデノウイルス２型である。
【００２３】
Ａｄ−５はアデノウイルス５型である。
【００２４】
Ａｄ−３１はアデノウイルス３１型である。
【００２５】
Ａｄ−３６はアデノウイルス３６型である。
【００２６】
Ａｄ−３７はアデノウイルス３７型である。
【００２７】
ＢＭＩは体格指数である。
【００２８】
ＦＡＳは脂肪生成酵素である。
【００２９】
ＰＰＡＲはペルオキシソーム増殖因子活性化受容体である。
【００３０】
ＣＥＢＰはＣＣＡＡＴ−エンハンサー結合タンパク質である。
【００３１】
本明細書中で用いられる用語「脂肪生成アデノウイルス」は通常、感染した宿主の細胞の仕組みを変えることにより宿主が脂肪生成酵素を産生するようにし、そこで感染した細胞が過剰な脂肪酸を産生し、脂肪貯蔵を促進させる細胞、組織および／または臓器で脂質産生の増大を刺激することができるアデノウイルスを指す。脂肪生成アデノウイルスはＡｄ−５、Ａｄ−３６およびＡｄ−３７を制限することなく含む。
【００３２】
本明細書中で用いられる用語「ＢＭＩ」は通常、身長に基づいて測定した人の重量の統計的基準を指す。ＢＭＩは個体の体重を身長の２乗で除したものと定義することができ、ｋｇ／ｍ２単位で表わすことができる。ＢＭＩは重量に問題がある成人および小児を洗い出すためのスクリーニング手段として使用されることがある。しかし、超過体重が健康リスクであるかどうかを明らかにするには、医療従事者がさらに皮下脂肪率、死因、運動、家族歴、腰と胴の比率、脂肪生成アデノウイルス感染などの評価をはじめ適切な健康スクリーニング評価を実施する必要がある。２０歳以上の成人については、全年齢で、男性でも女性でも同一の標準重量状態区分を用いてＢＭＩを解釈することができる。一方、小児および１０代については、ＢＭＩの解釈は年齢特異的かつ性別特異的なものである。たとえば、（ｉ）ＢＭＩが１８．５パーセント未満の成人は低体重であると考えられ、（ｉｉ）ＢＭＩが約１８．５〜約２４．９の範囲であれば標準体重であると考えられ、（ｉｉｉ）ＢＭＩが約２５〜約２９．９の範囲であれば過体重であると考えられ、（ｉｖ）ＢＭＩが約３０．０超であれば肥満であると考えられる。
【００３３】
用語「腰と胴の比率」は肥満の決め手に用いられる測定値を指す。脂肪の分布は胴周りを腰周りで除して評価される。たとえば、胴周りが約３０インチあり、腰周りが約４０インチある個体は比率が約０．７５であり、胴周りが約４１インチあり、腰周りが約３９インチある個体は比率が約１．０５である。比率が高くなるほど、心疾患をはじめとする肥満関連障害のリスクが高くなる。
【００３４】
「生体試料」は、血漿、血清、髄液、リンパ液、皮膚、呼吸器、腸および泌尿生殖器の外部切片、涙、唾液、血液細胞、腫瘍、臓器、組織およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養構成物の試料を含むがこれに限定されるわけではないヒトまたは動物の組織または体液の試料を指す。
【００３５】
「単離された」または「実質的に純粋な、」たとえば核酸（たとえば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは混合ポリマー）は、生来のヒトまたは動物の配列またはタンパク質、たとえば、リボソーム、ポリメラーゼ、その他多くのヒトまたは動物のゲノム配列およびタンパク質が自然に備わっている別の細胞成分から実質的に分離された核酸である。この用語は自然発生する環境から取り出された核酸配列またはタンパク質を包含し、組換えＤＮＡ単離体またはクローン化したＤＮＡ単離体および化学的に合成された類似体または異種系により生物学的に合成された類似体を含む。
【００３６】
用語「免疫原性」は一般に、免疫動物に刺激を与えることができる抗肥満ワクチン、肥満原因に対する抗体を中和させる免疫応答、ワクチン投与後に人に感染する可能性がある生ウイルスを指す。
【００３７】
用語「抗体」は、抗体模倣物を包含するかあるいは抗体またはその特定の断片もしくはその部分の構造および／または機能を模倣する抗体の部分を含み、一本鎖抗体およびその断片を含む抗体、消化断片、それらの特定の部分およびバリアントを指す。本発明は、アデノウイルスの繊維外被タンパク質および具体的にはＡｄ−３６またはその部分のような生体分子（抗原またはレセプター）に結合することができる抗体および抗体断片を包含する。
【００３８】
用語「核酸配列、」はオリゴヌクレオチド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドおよびそれらの断片、一本鎖または二本鎖のセンス鎖またはアンチセンス鎖を表すゲノム起源または合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）または天然起源または合成起源の任意のＤＮＡ様材料またはＲＮＡ様材料を含む。
【００３９】
断片。異種ペプチドまたは核酸配列の任意の部分を含む。異種ペプチド断片は少なくとも１つの被験体の異種ポリペプチドの構造的特性または機能的特性を保持している。核酸配列断片は長さが約６０ヌクレオチドを超え、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約１０００ヌクレオチド、少なくとも約１０，０００ヌクレオチドの長さの断片を含むことが最も好ましい。
【００４０】
相補的または相補性。本明細書中で用いられるように、任意の塩濃度および温度条件下で、塩基対形成によるポリヌクレオチドの自然結合を含む。たとえば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」はその相補的配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に結合する。
【００４１】
２本の一本鎖分子間の相補性は、一部の核酸のみが結合する「部分的」なものでもよいし、２本の一本鎖分子間に完全な相補性が存在するときには完全なものであってもよい。核酸鎖の相補性の度合いは、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率と強度に著しく影響する。これは、核酸鎖の結合に依存する増幅反応および分子のデザインおよび使用の際には特に重要である。
【００４２】
機能的等価物。異種タンパク質、ポリペプチド、酵素または核酸分子と実質的に類似する機能的特徴または構造的特徴を有するタンパク質または核酸分子。タンパク質の機能的等価物は、特定の機能を果たすために必要とされるような変更に応じて変更を含むことができる。用語「機能的等価物」は、分子の断片、変異体、ハイブリッド、変種、類似体または化学的誘導体を含むことを意味する。
【００４３】
タンパク質精製。広義に定義すると、電荷、分子サイズまたは結合親和性に基づいてタンパク質が別の成分または化合物から分離されることによる任意の過程。
【００４４】
実質的に精製される。本明細書中で用いられるように、自然環境から取り出され、単離されるかあるいは分離され、自然に結合している他の成分を少なくとも６０％含まず、好ましくは少なくとも７５％含まず、最も好ましくは少なくとも９０％含まない核酸またはアミノ酸配列を含む。
【００４５】
阻害。本明細書中で用いられるように、アデノウイルス３６型が増殖しているかあるいは生存できるかを測定するパラメータの減少を指す。そのような減少量を標準（対照）と比較して測定する。本明細書中では、「減少」は対照と比較して少なくとも２５％前後、好ましくは少なくとも５０％前後、最も好ましくは少なくとも７５％前後の減少と定義される。
【００４６】
免疫原性構成成分が生命体、不活化ウイルス、死菌ウイルス、外被タンパク質そのもの、エピトープ構成外被タンパク質セグメントまたはワクシニアウイルスまたは鶏痘ウイルスのような非病原性、遺伝子組換えキャリヤーウイルスの使用に供される外被タンパク質（またはそのエピトープ構成セグメント）である本発明の抗脂肪生成アデノウイルスワクチンは、当技術分野で周知の方法を用いて調製される。そのため、ワクチンは当技術分野で十分に理解されている担体、賦形剤、アジュバント剤、抗菌剤、保存剤などを含む。このように、有効成分に加えて、ワクチンは通常リン酸緩衝生理食塩水のような水性緩衝液などの適切な組成物を有し、その中に、場合によりヒトワクチン製剤、抗菌組成物および別の製剤に使用される任意のさまざまな免疫系刺激アジュバントとともに有効成分を浮遊させてその製剤を安定化させる。ワクチン製剤に含まれる組成物はすべてヒトへの投与に適しているものである。ワクチン製剤は凍結乾燥した形で保存し、投与直前に溶液と混合することができる。経口投与用に、ワクチン製剤は液剤、錠剤または場合により当技術分野で既知の腸溶コーティングしたピルの剤型であってもよい。通常投与される溶液中の有効（免疫原性または免疫原をもたらす）成分の濃度は約１ｎｇ〜約１ｍｇ／ｍｌの間とする。
【００４７】
本発明の抗脂肪生成アデノウイルスワクチンは鼻内、経口または静脈内、筋肉内、皮下または腹腔内注射により投与されるものとする。本発明のワクチンは医師の指示のもとで投与される。
【００４８】
抗脂肪生成アデノウイルスワクチンを適切に投与することは医療担当者の技術範囲内に十分入っており、治療しようとする人の年齢、人が防御免疫を発現する緊急性、個人の免疫系の状態および当技術分野で既知の他の因子を含む多数の因子にかかっている。ワクチンを接種しようとする人には通常、肥満の原因となるウイルスに対する防御免疫を生じさせ維持するために、ワクチンを数段階で投与する。このように、初回ワクチン接種後、通常約１週間〜１０年の期間に分けて１〜約１０回の間でワクチンを追加接種する。
【００４９】
本発明の抗肥満ワクチンの単回投与量は（液剤では）約０．１ｍｌ〜１０ｍｌであり、任意の剤型では、死菌または不活化の脂肪生成ウイルスが約１ｎｇ〜１０ｍｇのあいだ、遺伝子組換え、非病原性ウイルスが約１ｎｇ〜１０ｍｇのあいだあるいは外被タンパク質（たとえば、繊維タンパク質）または６−３０アミノ酸ペプチド（免疫原性に修飾した形では）が約１ｎｇ〜１０ｍｇのあいだである。
【００５０】
また、本発明の抗脂肪生成アデノウイルスワクチンは、その有効成分が核酸であり、このタイプの標準的なワクチン製剤になると考えられる。このタイプのワクチンにより、核酸は免疫原性ではないが、ワクチン投与後にｉｎ  ｖｉｖｏで免疫原性であるペプチドまたはタンパク質として発現する。このタイプのワクチンは当技術分野で既知のワクチン接種法（たとえば、筋肉内注射）により投与される。また、ワクチン接種した個体のウイルス性肥満に対する防御免疫を発現させ維持させるため、投与は既知の方法に準拠するものとする。
【００５１】
本発明による抗脂肪生成アデノウイルスワクチンは、複数の脂肪生成ウイルス（または外被タンパク質（たとえば、繊維タンパク質）または外被タンパク質のエピトープセグメントそのもの）に基づいて有効成分を含むことができることに留意されたい。
【００５２】
さらに別の態様では、本発明は、ヒトが感染しやすいウイルスに起因する脂肪生成アデノウイルス関連疾患を予防する方法であり、脂肪生成アデノウイルスに対する防御免疫応答を高め、維持するのに有効な量の本発明の抗脂肪生成アデノウイルスワクチンをヒトに投与することを含む。
【００５３】
この発明は一般に、Ａｄ−５、Ａｄ−３６およびＡｄ−３７のようなヒト脂肪生成アデノウイルスによる感染、肥満になる病因と、癌のような細胞、組織および／または臓器の機能障害、膵機能障害、骨格筋および心臓血管筋の機能障害、肺機能障害、脳および神経系の機能障害および副腎疾患および副腎機能障害との関係に関する。さらに、本発明は、脂肪生成アデノウイルスの発現状態を、疾患の状態、予後、治療成績および感染および疾患の予防の指標として使用することに関する。
【００５４】
脂肪生成アデノウイルス関連疾患の主な機序は細胞内の脂質産生である。脂肪生成アデノウイルスは、感染した被験体の細胞の仕組みを変えて宿主が脂肪生成酵素を産生するのを可能にする。その結果、脂肪生成酵素により脂肪酸が過剰になり、複数の臓器の細胞内で脂肪の貯蔵が促進される。
【００５５】
体の複数種の細胞には、細胞内で脂肪酸を作ることができる能力があることが知られている。脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）は最も重要な脂肪生成酵素の１つであり、多数の成人細胞および胎児細胞で発現しており、このような組織は脂肪酸を産生することができることを示唆している。たとえば、ＦＡＳは、十二指腸および胃の上皮細胞、造血細胞、虫垂、消化管の神経節細胞、肝細胞、肥満細胞、精嚢、膀胱のアンブレラ細胞、副腎束状帯細胞、脂肪細胞、下垂体前葉細胞、小脳のバスケット細胞、大脳皮質ニューロン、脱落膜、子宮内膜の脱落間質細胞、アポクリン腺の上皮細胞、乳房の乳管および腺房、前立腺および皮脂腺、黄体細胞および肺のＩＩ型肺胞上細胞のような成人細胞で発現される。
【００５６】
さらに、ＦＡＳは下垂体前葉細胞、気管気管支壁の軟骨細胞、血管および心臓の内皮、気管支の上皮細胞、食道消化管、肺、膵臓、前立腺、甲状腺、舌、気管、腎臓の近位尿細管、線維芽細胞、結節性リンパ球、副腎髄質の神経芽細胞、胸腺細胞、舌の横紋筋細胞、唾液腺および気管気管支腺の上皮細胞、造血細胞、肝細胞、絨毛膜のラングハンス細胞、骨芽細胞、脊椎周囲線維芽細胞、交感神経節のシュワン細胞およびアウエルバッハ神経叢、副腎の被膜下細胞、脂肪細胞、精巣のライディッヒ細胞、肥満細胞、尿管の尿路上皮および上層の副腎皮質細胞のような胎児細胞でも発現される。
【００５７】
脂肪酸は多くの生化学的過程の点で細胞内環境にはきわめて重要なものであるが、細胞内の脂肪酸が過剰になると細胞生化学を大きく変えてしまう。細胞内の脂肪酸が過剰になると多数の細胞内作用の機能に異常を来たすことがある。たとえば、膵組織の脂肪酸が過剰になるとインスリン分泌量が減少し、癌細胞の脂肪酸が癌の増殖に多くのエネルギー源を提供する。さらに、肺細胞内の脂肪酸はマクロファージがその領域に誘導されるのを刺激し、喘息および気腫をもたらす。このため、細胞が脂肪酸に過剰に曝露されると逆効果が生じる。
【００５８】
一実施形態によると、脂肪生成アデノウイルスは、脂肪酸およびトリグリセリドが細胞および組織で過剰に産生される機序になることがある。諸試験の結果から、脂肪生成アデノウイルスが脂肪組織および肝臓の脂肪生成酵素を変化させることができることが示されている。たとえば、別の諸試験結果から、脂肪生成アデノウイルス、Ａｄ−３６に感染にすると、３Ｔ３−Ｌ１細胞のグリセロール−３−ホスフォデヒドロゲナーゼ、ＰＰＡＲ−γ、ＣＥＢＰ−αおよびβ、リポ蛋白リパーゼを含む分化因子が刺激を受けて急速に出現することが示されている。複数種の組織が脂肪生成アデノウイルス性ＤＮＡを蓄積するため、脂肪生成酵素が過剰になると、こうした酵素を産生することができる感染組織全体に存在することがある。
【００５９】
本発明のもう１つの実施形態によると、肥満に関連する癌の存在を測定するのに脂肪生成アデノウイルス感染を用いることができる。さらに実施形態では、被験体が肥満に関連する癌を発生しやすい傾向にあるかどうかを測定するのに脂肪生成アデノウイルス感染を用いることができる。
【００６０】
複数種の癌の割合は肥満のヒトに高い。このような癌には乳癌、前立腺癌、子宮癌、卵巣癌、大腸癌、腎臓癌、膵臓癌および肺癌が含まれるがこれに限られるわけではない。肝細胞性癌も肥満および代謝症候群に関係していることがある。さらに、肥満は特定の癌の攻撃性および予後不良に関係していることがある。たとえば、肥満により前立腺癌の異型性が高くなり根治的前立腺摘除術後の再発率が高くなることがある。また、非ヒスパニック系白人女性では、乳房腫瘍の大きさが肥満と相関している。具体的には、このことはオッズ比が２．７６である胴囲の４分位数が最高であることから最も顕著である。
【００６１】
諸試験では、脂肪酸は癌細胞のエネルギー消費の基質であり、ＦＡＳを阻止すると癌の増殖を阻止することができることが示されている。さらに、ＦＡＳは多くの肥満に関連する癌で増大し、ＦＡＳが腫瘍増殖に有利に働いていることが示されている。癌細胞が脂肪生成アデノウイルスに感染すると、細胞内の脂肪酸を刺激し、それにより癌細胞にエネルギー源を供給して癌の増殖を促進することができる。
【００６２】
ＦＡＳ発現はさまざまな腫瘍で検出されており、組織学的サブタイプ、病理組織学的悪性度および腫瘍の攻撃性と結びついている。諸試験では、ＦＡＳは乳癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸直腸癌および子宮内膜癌のようなヒト新生物に発現することが多いことが明らかにされている。ＦＡＳ（ＯＡ−５１９）は前立腺癌の指標であることが明らかにされている。試験した原発性前立腺癌９９例中５６（５７％）例にＯＡ−５１９免疫活性がみられたことが観察された。ＯＡ−５１９癌は非ＯＡ−５１９癌よりも進行しているように思われた。
【００６３】
実際、ヒト前立腺癌組織の６１％にＡｄ−３６の存在が確認され、正常集団の１３．８％に比して乳癌患者および前立腺癌患者それぞれ５０％および５１％に抗Ａｄ−３６抗体が認められたことが観察された。
【００６４】
このため、Ａｄ−３６に感染していることが確認された患者とほぼ同数の癌患者の前立腺癌組織にＦＡＳが存在していることは、脂肪生成アデノウイルスが細胞のＦＡＳを増大させ、ＦＡＳを阻害すると癌を抑制することができるという結果と合わせて、脂肪生成アデノウイルスに感染すると被験体が肥満にも肥満による癌にもなることを示唆している。
【００６５】
本発明の実施形態によると、Ａｄ−３６感染の有病率は乳癌および前立腺癌の患者の方が癌ではない個体よりも統計学的に高いと思われる。さらに実施形態では、Ａｄ−３６の発現状態は乳癌および前立腺癌のマーカーに使用することができる。さらに別の実施形態は、Ａｄ−３６ＤＮＡが組織中にある乳癌患者または前立腺癌患者の方が、Ａｄ−３６ＤＮＡが組織中にない患者よりも浸潤癌であったり予後不良であったりすることに関する。
【００６６】
本発明のもう１つの実施形態によると、脂肪生成アデノウイルス感染は、予後、治療成績の指標または攻撃性の指標として使用することができる。乳癌、前立腺癌および卵巣癌では、ＦＡＳの濃度が高いと予後不良になることが多い。ＦＡＳ発現と腫瘍の大きさまたは腫瘍細胞の増殖活性のマーカーの関係が、ＦＡＳがこのような悪性腫瘍の成長および増殖に関係していることを示唆していることがある。
【００６７】
たとえば、諸試験では、ＦＡＳが過剰発現するとラットの肝細胞癌発症が増大することが示されている。他の諸試験では、早期乳癌患者の約３０％がＦＡＳを発現したことが示されている。ＦＡＳを発現している乳癌患者は腫瘍の悪性度が有意に高く、腫瘍体積が大きく、病期が進行しており、最も有力な指標の１つであるグリーソンスコアを有してした。卵巣の新生物でＦＡＳ発現を検討したところ、それが腫瘍の組織学的悪性度および生存率の短縮に関わっていることがわかった。さらに、諸試験では、個体が過体重および肥満になると、ヒトの複数種の癌による死亡率が有意に増大することが示された。
【００６８】
ＦＡＳは大腸癌およびその重症度の原因になる。諸試験では、低度異形成の腺腫４３例中わずか２例（５％）にＦＡＳの反応性が認められたことが示されている。しかし、中等度異形成の腺腫４０例中７例（１７％）、高度異形成の腺腫１７例中９例（５３％）および腺癌の８１％（ｐ＜０．０００１）に陽性ＦＡＳ免疫染色がみられた。
【００６９】
このため、本発明の一実施形態は、被験体の脂肪生成アデノウイルス感染の有無を診断スクリーニングする試験を目的としている。被験体を検査して脂肪生成アデノウイルス陽性であれば、癌細胞ではＦＡＳ発現が増大し、浸潤癌や予後不良が増えると考えられる。Ａｄ−３６および癌に関係のある情報にはこのほか、ポリメラーゼ連鎖反応試験（ＰＣＲ）により、前立腺癌のような肥満による癌の組織にあるＡｄ−３６ＤＮＡに特有の配列の発見がある。Ａｄ−３６繊維タンパク質に特有のＤＮＡ配列は、譲受人のかつての米国特許第６，６６４，０５０号および第６，１２７，１１３号に記載されており、前立腺癌組織１８試料中１１件で検出された。例示的なスクリーニング技術を下に記載した。
【００７０】
脂肪生成アデノウイルス試験は２つの点で有用であろう。乳房にしこりがあるか前立腺が肥大した被験体が脂肪生成アデノウイルス試験陽性（たとえば、血清試験陽性またはＰＣＲ組織試験陽性のいずれかの試験による）であれば、被験体が癌であるリスクが高く、「経過観察」ではなく諸試験を実施して癌を評価する必要がある（たとえば、生検）。反対に、ある人が脂肪生成アデノウイルス試験陽性であれば、その被験体はＡｄ−３６試験陰性の人よりも多めに一定の間隔で癌をスクリーニングする必要がある。
【００７１】
ウサギでは、死菌ウイルスを用いて抗Ａｄ−３６ワクチンが開発された。ウサギの血清は、組織培養で１７倍希釈系列（原液濃度１に対して１３１，０７２希釈）までＡｄ−３６の成長を阻害する抗体を含有する。アデノウイルスの成長に唯一有効な抗体はさまざまなアデノウイルスの繊維タンパク質のセグメントに対する抗体（中和抗体）であることが知られている。Ａｄ−３６抗体はそれ以外の任意のアデノウイルスとは交差反応しないため、Ａｄ−３６繊維タンパク質に特有のＤＮＡ配列がこの特異性を担っている。Ａｄ−３６に特有のＡｄ−３６繊維タンパク質の３種類の配列が確認されている。当技術分野で標準的な技術を用いて、このような配列によるペプチドを使用してアレルギー反応を最小限に抑えた高純度ワクチンを作成する。ペプチドは、有効性を高めるために通常ワクチンに使用されるアジュバンドに結合される。こうした技術は当技術分野では既知である。
【００７２】
特定の実施形態では、癌を予防するために、Ａｄ−３６のような脂肪生成アデノウイルスに対するワクチンを作成することができる。脂肪生成アデノウイルスが起因して癌になるため、癌を予防するために抗脂肪生成アデノウイルスワクチンを使用してもよい。たとえば、ペプチドを作成するために、繊維タンパク質ＤＮＡに含まれる特有のＤＮＡ配列を用いて抗Ａｄ−３６ワクチンを開発してもよい。この技術は当技術分野では既知のものである。
【００７３】
さらに実施形態では、全脂肪生成アデノウイルスからその構造を決定するために、新規な概念の繊維タンパク質ＤＮＡを配列させることができる。配列させた後、多くの繊維タンパク質または全繊維タンパク質に存在しているＤＮＡ配列を当技術分野でよく使用されているＤＮＡ比較データベースを用いて確認する。これをたとえば、ＧｅｎＢａｎｋを用いて実施し、Ａｄ−３６繊維タンパク質ＤＮＡに特有の配列を確認してもよい。次に、約１０〜２５アミノ酸のペプチドをコードする約３０〜７５塩基対のＤＮＡ配列を選択する。繊維タンパク質のコブ部分にあるペプチドが効果的であることがわかっているため、こうした配列を検討する。確認した後に、ペプチドをアジュバントと結合させてあらゆるヒトアデノウイルスによる感染を予防するワクチンを作成することができる。よくみられる脂肪生成アデノウイルスのワクチンの有用性は、脂肪生成アデノウイルスによる肥満、癌をはじめとするヒト疾患を予防することにある。たとえば、きわめて高い割合の新兵が、基礎訓練期間中にアデノウイルス感染に罹患している。また、発熱、咳、下痢または生後２年の間の結膜炎を伴う軽度の疾病はアデノウイルスによるものである。
【００７４】
本発明の一実施形態によると、脂肪生成アデノウイルス感染は、肥満および肥満の合併症がもたらす疾患が発生する指標および体重に影響を及ぼす治療成績の指標として用いることができる。肥満の合併症には特に、糖尿病、高血圧、高リポ蛋白質血症、アテローム硬化型疾患および鬱血性心疾患のような心臓疾患、睡眠時無呼吸および喘息のような肺疾患、脳血管障害、乳癌、子宮癌、大腸癌および前立腺癌のような癌、胆石および感染症のような胆嚢疾患、妊娠中毒症、手術中のリスク、通風、生殖機能低下、変形性関節炎および早期死亡率を含めることができる。
【００７５】
ヒトＡｄ−３６は、マウス脂肪前駆細胞（３Ｔ３−Ｌ１細胞）（図１）およびヒト脂肪前駆細胞で脂肪の蓄積および新規の脂肪細胞の形成を刺激することが譲受人により明らかにされている。さらに、譲受人は、本明細書中に全文を参照により援用した米国特許第６，１２７，１１３号および第６，６６４，０５０号で、Ａｄ−３６感染が肥満の原因であることを明らかにしている。たとえば、ニワトリでは４種類、マウスでは１種類、サルでは２種類の実験を実施したところ、いずれもＡｄ−３６に感染すると体脂肪が増大し、血清コレステロールおよびトリグリセリドが低下したことを示した。ニワトリ、マウスおよびラットの食餌摂取量を測定したところ、感染した動物と対照動物の間に差はみられなかったが、エネルギー消費量には差が認められたことが最も注目に値した。Ａｄ−３６の機序は脂肪細胞に直接作用して、脂肪生成酵素および分化因子を増大させる。Ａｄ−３６に感染した細胞は５日間で蓄積されているトリグリセリド量の約２倍程度のトリグリセリド量を示した。
【００７６】
また、きわめて多くの諸試験を脂肪生成アデノウイルス、Ａｄ−３６で実施した。Ａｄ−３６に自然感染したアカゲザルは感染から１８ヵ月後に（図２）有意な体重増加を示した。また、マーモセットをＡｄ−３６に感染させたところ、感染したマーモセットの体重が感染していないマーモセットの４倍になったことが観察された（図３）。さらに、感染後、体脂肪は約７０％増加し、血清コレステロールは約３５ｍｇ／ｄｌ低下した（図４）。初回感染から７ヵ月後に、脳、肝臓、肺、筋肉および脂肪細胞組織のようなサルの複数種の組織でＡｄ−３６ＤＮＡが観察され、２ヵ月後には、もはや感染したサルの血液または糞便からのウイルスが増殖することができなかったことは注目に値する（図５−７）。図８にみられるように、Ａｄ−３６ＤＮＡはヒト脂肪細胞組織でも観察されている。
【００７７】
別の諸試験では、Ａｄ−３７はニワトリの肥満の原因であるが、Ａｄ−２およびＡｄ−３１は肥満の原因ではなかったことが明らかにされている（図９−１１）。累積食物摂取量は試験群間に差がみられなかった。さらに、諸試験ではＡｄ−５がマウスの肥満の原因であることが明らかにされている（図１２）。このような諸試験は、脂肪生成酵素の刺激および肥満は全アデノウイルス感染の非特異的な作用ではないが、複数種のアデノウイルスがそのような作用を及ぼすことを示している。
【００７８】
本発明のもう１つの実施形態は、糖尿病をはじめとする膵機能障害を予測すべく脂肪生成アデノウイルスを使用することを含む。さらに、もう１つの実施形態は、数種類の糖尿病を含む膵疾患を予防することができる抗アデノウイルスワクチンに関する。
【００７９】
膵β細胞は脂質をつくり、β細胞での脂質代謝はインスリン分泌の調節にきわめて重要である。脂質の合成または酸化に関わる酵素はインスリンの産生および分泌を低下させる。諸試験では、β細胞にＳＲＥＢＰ−Ｉを過剰発現させると、インスリンの合成が減少することが明らかにされている。ＳＲＥＢＰ−ＩはＦＡＳの直接の前駆体であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでアデノウイルスが肝細胞に感染することにより増加することがわかっている。別の諸試験では、脂肪酸合成酵素およびＬ−型ピルビン酸キナーゼ遺伝子に結合する糖質応答配列結合タンパク質（ＣｈＲＥＢＰ）が、膵β細胞のグルコースにより刺激されることが明らかにされている。β細胞のカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩ（ＣＰＴＩ）タンパク質濃度が高くなると、グルコースに反応してインスリンの分泌が低下する。脂肪生成アデノウイルスは、肥満を増大させ、インスリン抵抗性をもたらすため、糖尿病の原因になることがあるが、膵臓のウイルス感染による脂肪生成酵素の変化にも一役を担っている。
【００８０】
本発明のもう１つの実施形態は、脂肪生成アデノウイルスの発現状態を用いて肝疾患、肝硬変をはじめとする肝機能障害を予測することに関する。また、抗アデノウイルスワクチンを脂肪生成アデノウイルスによる肝疾患の予防に使用することができる。
【００８１】
肥満は肝疾患の原因になる。肥満を伴う肝疾患の流れは、肝臓の脂肪浸潤から始まり脂肪性肝炎（非アルコール性脂肪性肝炎＝ＮＡＳＨ）に進行し、相当な割合のＮＡＳＨ患者が特発性肝硬変の発症に続く。肝臓に脂肪が浸潤する頻度と重症度は体重増加とともに高くなり、病的肥満患者の大多数に肝臓の脂肪浸潤がある。非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）患者の約３０％〜約１００％が肥満であることが報告されている。別の諸試験では、重篤な肥満被験体の約９５％超に、肝臓のさまざまな程度の脂肪浸潤が認められ、約６５％がＮＡＳＨであったことが明らかにされている。
【００８２】
脂肪生成アデノウイルスは脂肪生成酵素の濃度を増大させ、肝臓に脂肪を蓄積させる。上で言及したように、肝臓に脂肪が浸潤すると、肝硬変になることがある。肝臓に脂肪が浸潤する原因は数多く、肝臓がさらに傷つくと肝硬変を発症する可能性が高くなる。肝疾患のリスク因子がある個体または肝機能試験で異常が認められた個体は、脂肪肝から肝硬変への進行を予防するのに特に注意を払う必要があるため、脂肪生成アデノウイルスを検査する必要がある。抗脂肪生成アデノウイルスワクチンにより、多くの患者の脂肪肝および肝硬変を減少させたり予防したりすることができる。
【００８３】
本発明のさらに別の実施形態は、筋不全を予測するために脂肪生成アデノウイルスを用いることを含む。また、筋不全を予防するために抗アデノウイルスワクチンを使用することができる。
【００８４】
筋肉には脂肪生成酵素が存在し、細胞内脂質が貯蔵されていることが知られている。脂質代謝異常および筋肉内脂質の蓄積は肥満によるものである。諸試験では、脂質生成遺伝子であるステアロイル−ＣｏＡ不飽和化酵素１（ＳＣＤ１）が、極度の肥満のヒトの骨格筋でアップレギュレートされることが示されている。筋肉内脂肪が多くなると、肥満のヒトの筋機能の低下につながり、インスリン抵抗性および糖尿病につながる。別の諸試験では、骨格筋および肝臓のような脂肪の貯蔵にふさわしくない組織に脂質が蓄積し、インスリン抵抗性および２型糖尿病に至ることが示されている。ＦＦＡ類は、既にインスリン作用を阻害することが示されている２種類のスフィンゴリン脂質であるセラミドおよびスフィンゴシンのｄｅ  ｎｏｖｏ合成を刺激した。主な燃料源として、脂肪からグルコースへ変換することができないと、インスリン抵抗性、代謝調節障害および心血管リスクをもたらすことになる。Ａｄ−３６に感染した脂肪細胞では、レプチン量の減少がみられるため、これによりインスリン抵抗性が生じるのではないか思われる。
【００８５】
肥満のヒトは運動をすると疼痛を訴える。この理由は明らかではないが、肥満の個体は筋肉内脂質が多めであり、運動能が低めである。筋肉内脂質は骨格筋の基質利用を変化させる。脂肪生成アデノウイルスにより筋肉内脂質が増加すると運動能が制限され、疼痛が増大し、基質利用が変化することがある。これは、競走馬やレース犬のような能力や持久力が利用される動物には特に重要であると思われる。動物（または人間）が脂肪生成アデノウイルスに感染すると、感染していない動物（または人間）よりも能力が劣ることがあるため、脂肪生成アデノウイルス検査を能力の質の指標として使用することができる。
【００８６】
最後に、心筋の筋肉内脂質が増大すると心機能に変化がみられ、心筋症および鬱血性心不全を来たすことがある。諸試験では、脂肪酸およびトリグリセリドが心筋内に過剰に蓄積されると心臓インスリン抵抗性および心機能障害を来たすことが示されている。
【００８７】
さらに本発明の実施形態は脂肪生成アデノウイルスの発現状態を用いて肺機能障害を予測することに関する。また、抗アデノウイルスワクチンは肺機能障害を予防する。
【００８８】
肥満が喘息および肺気腫のような肺疾患の原因になることは古くから知られている。この因果関係の機序は明らかではない。肺がＦＡＳを作り、脂質を合成することは既知である。このため、脂肪生成アデノウイルスが肺疾患の原因になり得るという結果から、肺では、ＦＡＳがアデノウイルスにより産生されると考えられる。諸試験では、Ａｄ−５に感染するとモルモットの肺のマクロファージ数が２倍になることが示された。喫煙とＡｄ−５の組み合わせでは、マクロファージ数が４倍になった。喘息患者および肺気腫患者には潜在性ウイルス感染が認められ、肺のＡｄ−５Ｅ１Ａタンパクは喘息患者および肺気腫患者の炎症と相関した。
【００８９】
本発明の一実施形態は、脂肪生成アデノウイルスの発現状態を用いて脳および神経系機能不全を予測することに関する。また、抗アデノウイルスワクチンは脳および神経系機能不全の予防に使用することができる。
【００９０】
脂肪生成ウイルスは脳組織に感染する。神経および脳がＦＡＳを作成することは周知である。肥満は認知機能低下およびアルツハイマー病を含む認知神経の有害転帰と関係がある。諸試験では、ＢＭＩは認知能力の全検査結果に反比例しており、ＢＭＩと年齢の相互作用を裏づけるデータが得られなかったことが明らかにされている。肥満では、アルツハイマー病の割合が増大している。アミロイドの１種であるベータ４２はアルツハイマー患者に沈着しているものであり、ＢＭＩと相関する。肥満のヒトは認知症になる可能性が約７４％も高い。別の諸試験では、遺伝子療法に使用されているＡｄ−５ベクターが脳の炎症の原因になることが明らかにされている。野生型Ａｄ−５が肥満の原因になることが報告されており、発明者らは、遺伝子導入に使用されるＡｄ−５ベクターはＳＲＥＢＰ−１を刺激し、肝細胞でＦＡＳを合成する能力を保持していることを述べている。したがって、このデータは、脂肪生成アデノウイルスが脳および神経で脂肪生成酵素を増加させ、過剰の脂肪酸およびトリグリセリドを産生して機能障害をもたらすことがあることを裏づけるものである。
【００９１】
本発明の一態様は、副腎機能障害を予測するために脂肪生成アデノウイルスの試験を使用することができるということである。また、抗アデノウイルスワクチンは副腎機能障害の予防に使用することができる。
【００９２】
肥満は副腎機能に大きな影響を及ぼすことが知られている。アルドステロンの分泌量が増加してもレニンの分泌量が増加しないのは、高血圧が原因であると考えられる。諸試験では、肥満女性の副腎機能は正常ではないが、腹部の脂肪のつき方によりばらつきがあることが明らかにされている。副腎ホルモンは基質の産生にコレステロールを使用するが、細胞内脂肪酸でもコレルテロール代謝でも脂肪生成アデノウイルスが基質の産生を変化させており、脂肪生成アデノウイルスを検出するために試験を用いることは、副腎機能障害の指標になることがある。
【００９３】
例示的な免疫分析用スクリーニング技術には、当技術分野で周知の標準的なウイルス中和法または酵素免疫測定法が含まれるが、これに限られるわけではない。こうしたウイルスまたはその断片（たとえば、繊維タンパク質またはその断片）に対する抗体を高めて精製する技術、すなわち、このような免疫測定法に使用するために、こうしたウイルスから得たタンパク質（またはその断片）を従来技術により調製することは当技術分野では周知である。本発明の具体的な実施形態では、抗体は溶液からアデノウイルスまたはアデノウイルスタンパク質を免疫沈降させ、ウエスタンブロットまたはイムノブロットまたはポリアクリルアミドゲル上でこのタンパク質と反応する。もう１つの具体的な実施形態では、免疫細胞化学法を用いて、抗体は凍結組織切片中のアデノウイルスまたはアデノウイルスタンパク質の存在を検出する。アデノウイルスまたはアデノウイルスタンパク質を検出する方法に関する具体的な実施形態には、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、免疫放射定量測定法（ＩＲＭＡ）およびモノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体を用いるサンドウィッチ測定法を含む酵素免疫測定法（ＩＥＭＡ）が含まれる。
【００９４】
同様に、本発明のこうした方法に用いられる核酸プローブハイブリダイゼーション測定技術は、肥満の原因になることが確認されたウイルスにより利用可能になり、本発明により利用可能になった核酸プローブ（および増幅を利用していればプライマー、）を用いる標準的な技術（場合により、血液のほかに体液、糞便、組織または臓器試料から抽出したＤＮＡまたはＲＮＡを増幅した後）になる。こうしたウイルスの核酸配列特性は、ウイルスをいったん慣例的に単離する標準的な技術により測定することが可能であり、ウイルスに特異的であり、しかも核酸をもとにしたウイルス測定法で使用することができる核酸プローブおよびプライマーの根拠となるプローブおよびプライマーが、従来技術を用いて配列に基づいて調製される。
【００９５】
たとえば、個体を易肥満性にするアデノウイルスの存在を検出するために、血液のような生体試料を調製してＡｄ−３６繊維外被タンパク質配列のようなアデノウイルスタンパク質の有無を解析する。この検査結果および解析情報を医療従事者に返却して被検個体に連絡する。このような診断は、診断検査施設が実施することもできれば、自己診断用に診断キットを製造して医療従事者または個人が販売することもできる。
【００９６】
初めに、スクリーニングにはアデノウイルスに関係のある配列の増幅を含む。本発明の具体的な実施形態では、スクリーニング法はＰＣＲによらない方式を含む。そのようなスクリーニング法には当技術分野で周知の２段階標識増幅法が含まれる。ＰＣＲによるスクリーニング方式もＰＣＲによらないスクリーニング方式も高い感度で標的配列を検出することができる。
【００９７】
本発明の一実施形態は標的増幅に関する。ここで、標的核酸配列はポリメラーゼで増幅される。ポリメラーゼによる増幅を用いる具体的な一方法がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。ポリメラーゼ連鎖反応をはじめとするポリメラーゼによる増幅法は、ポリメラーゼによる増幅サイクルを用いることによりコピー数を１００万倍以上にすることができる。いったん増幅したら、得られた核酸を配列させるかＤＮＡプローブの基質として使用することができる。
【００９８】
標的配列の存在を検出するためにプローブを使用する際に、核酸抽出を所望するのであれば、解析しようとする血液または血清のような生体試料を処理することができる。核酸試料をたとえば、変性、制限酵素消化、電気泳動またはドットブロット法という種々の方法で調製して標的配列の検出を促進させてもよい。分析対象核酸の標的領域は通常、プローブの標的としている配列とともにハイブリッドを形成するために少なくとも部分的に一本鎖にしなければならない。配列が自然に一本鎖になれば、変性は不要である。しかし、配列が二本鎖であれば、おそらくその配列を変性する必要があろう。変性は当技術分野で周知の種々の技術により実施することができる。
【００９９】
分析対象物中の標的配列のハイブリッド形成が安定して促進される条件下で、分析対象核酸およびプローブをインキュベートする。分析対象物を結合するのに使用されるプローブの領域は、対象となるアデノウイルスの標的領域のなかでも特に外被タンパク質繊維に完全に相補的なものにすることができる。このため、偽陽性を阻害するには緊縮性が高い条件が望ましい。しかし、緊縮性が高い条件は、プローブがアデノウイルスの領域に相補的である場合に限り使用される。ハイブリダイゼーションの緊縮性は温度、イオン強度、塩基組成、プローブ長、ホルムアミドの濃度を含むハイブリダイゼーション中および洗浄手順中の多数の因子により決められる。
【０１００】
もしあれば、得られたハイブリッドは通常、標識したプローブを用いて検出される。あるいは、プローブを標識せず、標識されているリガンドとの特異的結合によって直接的または間接的に検出することができるようにしてもよい。適切な標識およびプローブおよびリガンドを標識する方法は当技術分野では周知であり、たとえば、既知の方法（たとえば、ニックトランスレーション法、ランダムプライマー法またはキナーゼ処理）によって取り込まれる放射性標識、ビオチン、蛍光基、化学発光基（たとえば、ジオキセタン）酵素、抗体、金ナノ粒子などがある。この基本的なスキームの変更は当技術分野では既知のことであり、検出しようとするハイブリッドを外来材料から分離しやすくしたり、標識部分からのシグナルを増幅したりする変更が含まれる。
【０１０１】
上述のように、この発明は、ＰＣＲによらないスクリーニングアッセイも意図している。この手順は、核酸プローブ（または通常のホスホジエステルを置換するメチルリン酸骨格のような類似体）を、低量のＤＮＡ標的にハイブリダイズさせるものである。このプローブは、プローブに共有結合した酵素を有してもよく、共有結合がハイブリダイゼーションの特異性に干渉しないようになっている。そのとき、酵素−プローブ−コンジュゲート−標的核酸複合体は遊離プローブコンジュゲートから単離させることができ、酵素を検出させるには基質を添加する。酵素活性は発色の変化または放出される発光量の変化として観察され、感度が約１０３〜約１０６に増大する。
【０１０２】
２段階標識増幅法は当技術分野で既知である。このようなアッセイは、小さなリガンド（ジゴキシゲニン、ビオチンなどのような）を、対象となるアデノウイルス配列領域に特異的に結合することができる核酸プローブに付着させるという原理に基づくものである。一例では、核酸プローブに付着した小さなリガンドは、抗体−酵素コンジュゲートにより特異的に認識される。この実施例の一実施形態では、ジゴキシゲニンは核酸プローブに付着している。ハイブリダイゼーションは、化学発光基質を換える抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲートにより検出される。第２の例では、小さなリガンドは、第１のリガンドに特異的に複合体を形成することができる第２のリガンド−酵素コンジュゲートにより認識される。この例の周知形態は、ビオチン−アビジンタイプの相互作用である。
【０１０３】
本発明の核酸プローブアッセイは、さまざまな種類のアデノウイルスを検出することが可能な核酸プローブのカクテルを用いるということもこの発明の範囲に属するものである。したがって、ａｄ−３６、ａｄ−３７および／またはａｄ−５の存在を検出する一実施例では、たとえば生体試料では、さまざまな型のアデノウイルスに、対象とする標的領域に相補的な複数のプローブを用いてもよい。
【０１０４】
当業者が理解するように、本発明によるウイルスを検査する免疫学的アッセイ法または核酸によるアッセイ法では、複数系統の肥満の原因となるウイルスを同時に検査することができ、特定のウイルスまたは複数のウイルスについてその方法を容易に実施するために、複数のキットを組み合わせることができる。
【０１０５】
上に記載した代表的な形態を参照して、本発明を広範に開示し例証した。当業者は、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく種々の修飾を行うことができることを認識するであろう。さらに詳述せずとも、当業者であれば、前述の記載を用いて本発明を最大限利用することができると思われる。以下の実施例は例示にすぎず、いかなる方法にかかわらず開示の残部を制限するものではない。
【実施例】
【０１０６】
具体例１：
ウィスコンシン州マディソン、フロリダ州ナポリ、ニューヨーク州ニューヨーク市３都市の独立した集団を対象に、５０２人から採取した血液試料をＡｄ−３６感染について測定した。肥満の定義は、ＢＭＩが約３０ｋｇ／ｍ２を超えることとし、集団を肥満の被験体と肥満ではない被験体に分類した。肥満の被験体の血清中Ａｄ−３６抗体の保有率は約３０％であり、肥満ではない被験体では約１１％であった（すなわち、３：１の割合）（図１３）。
【０１０７】
被験体を抗体陽性と抗体陰性とに分けると、抗体陽性の方が約９ＢＭＩ単位重い（すなわち、約５０ポンド超）ことが観察された（ｐ＜．００１）（図１４）。
【０１０８】
さらに、血清中コレステロールおよび血清中トリグリセリドは抗体陽性のヒトの方が低く（約−３５ｍｇ／ｄｌ未満、ｐ＜．００１）、あらかじめ感染させておいたサルにもまったく同じ低下が観察された。Ａｄ−２またはＡｄ−３１の抗体と、ヒトの身体組成か血清コレステロールおよびトリグリセリドのいずれかとの相関は認められず、Ａｄ−３６の作用は特異的なものであり、ヒトアデノウイルス全体によくみられるものではないことを暗示している。
【０１０９】
もう１つの試験はＡｄ−３６抗体が揃わない２８組の双生児を対象に実施した。通常、双生児は体重およびＢＭＩがよく重なるものであるが、Ａｄ−３６抗体が陽性である双生児の方はＡｄ−３６抗体が陰性であるもう一方の双生児よりも太っていた（ｐ＜．０４）（図１５）。
【０１１０】
以上のことから、こうした結果は、Ａｄ−３６が動物およびヒトの肥満の原因になることを示している。
【０１１１】
具体例２：
Ａｄ−３６が癌の原因になるきわめて強力な証拠は、ウィスコンシン大学の諸試験から得られた。保管されている乳癌の被験体１２８例および前立腺癌の被験体３７例の血清を入手し、血清中和法を用いてＡｄ−３６抗体についてアッセイした。前立腺癌患者の５１％および乳癌患者の５０％がＡｄ−３６抗体陽性であったことが観察された。しかし、試料は匿名であったため、肥満、癌の種類や病期または転移の有無に関するデータはなかった。肥満の個体および肥満ではない個体のＡｄ−３６抗体に関するデータから、一般集団の約１４％にＡｄ−３６抗体が認められると判断した。したがって、乳癌患者および前立腺癌患者のＡｄ−３６抗体保有率は概ね４倍になる。
【０１１２】
具体例３：
患者１８例から前立腺癌組織を採取し、Ａｄ−３６繊維タンパク質ゲノムに特有のＤＮＡ配列に作成されたプライマーを用いるｎｅｓｔｅｄポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりＡｄ−３６ＤＮＡについてアッセイした。１８例中１１例の６１％に、癌組織内にＡｄ−３６ＤＮＡが認められた。図１６は、前立腺癌組織にＡｄ−３６ＤＮＡが存在していることを表わしているＰＣＲゲルを示したものである。上に記載したように、実験動物の複数種の組織でＡｄ−３６ＤＮＡが確認され、Ａｄ−３６繊維タンパク質ゲノムに特有のＤＮＡ配列から作成されたプライマーによるｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを用いると、特に脂肪組織で確認された。図１７は、Ａｄ−３６に感染したサルの脂肪組織から抽出したＤＮＡのＰＣＲゲルを示したものである。対照を除き、感染したサル３例全例にウイルスのＤＮＡが存在した。
【０１１３】
具体例４：
この実施例は、Ａｄ−３６の臨床検査をマーカーとして用いて癌が発生するおそれがある個体を洗い出すことを示すものである。癌である人の方が癌ではない患者よりもＡｄ−３６臨床検査結果が陽性になることがきわめて多い。著者らは乳癌の女性１２８例および３７前立腺癌の男性３７例を検査し、その結果を癌ではない患者５０２例と比較した。癌患者１６５例のうち８３例（５０％）がＡｄ−３６検査陽性であった（乳癌患者の５０％および前立腺癌患者の５１％）。米国集団の肥満の割合に基づくと、癌ではない被験体５０２例のデータは、癌ではない被験体の１７％がＡｄ−３６検査で陽性であったことを示した。ウィスコンシン州の癌ではない被験体を考慮しさえすれば（癌患者全例がウィスコンシン州出身であったため、これは優れた比較である）、癌ではない被験体の１４％がＡｄ−３６検査陽性であった。したがって、癌ではない患者のほぼ４倍の癌患者が陽性であった。
【０１１４】
具体例５：
ウィスコンシン大学病院で、剖検時にヒト９例から脂肪組織を採取し、Ａｄ−３６ＤＮＡを測定した。９例中７例の脂肪組織にＡｄ−３６ＤＮＡが認められた。このデータは、Ａｄ−３６ＤＮＡがヒトおよび動物の脂肪組織から単離されることがあるということ、それよりも重要なのは、組織中のＡｄ−３６ＤＮＡの存在がＡｄ−３６感染後のマーカーになるということを明らかにしている。Ａｄ−３６ＤＮＡは感染した動物の複数種の組織に現れるため、初回のウイルス血症により、体のほとんどの組織が感染するのは明白であると思われる。このため、以下の具体例６に記載した方法の項に記載したように、癌患者から癌組織または脂肪組織を採取してＡｄ−３６ＤＮＡの存在を検査することができる。
【０１１５】
具体例６：
癌患者および癌ではない患者の乳癌および前立腺の組織試料中のＡｄ−３６ＤＮＡについて試料を評価し、癌患者の方がＡｄ−３６の感染率が高いかどうかを明らかにする。Ａｄ−３６の発現状態は癌の存在と相関し、癌の病期、転移の存在および癌犠牲者の予後と相関すると考えられる。抗Ａｄ−３６ワクチンは、Ａｄ−３６が誘発する癌を予防することができる。
【０１１６】
実験計画：
ＮＣＩ  ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｂａｎｋｓ、ｔｈｅ  ＮＣＩ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＣＨＴＮ）およびｔｈｅ  ＮＣＩ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＣＢＣＴＲ）から、匿名の組織試料および完全な医療情報を入手する。以下に記載したｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲアッセイにより、試料をＡｄ−３６ＤＮＡについて評価する。また、ＤＮＡ試料が入手できなければ、それを注文することができる。ＤＮＡが試料から抽出されない場合、下に記載したようなことがある。
【０１１７】
乳癌を評価するために、癌の女性１００例から採取した乳房付近の乳癌組織または脂肪組織の試料と、乳房手術を施行した癌ではない女性５０例から採取した乳房組織または脂肪組織とを比較する。上に記載したように、乳癌組織が入手できなければ、乳房付近の脂肪組織でも問題ない。Ａｄ−３６ＤＮＡは感染すると組織全体に現れるため、実際の乳房組織は必ずしも必要ではないことから、脂肪組織が適している。
【０１１８】
前立腺癌を評価するため、前立腺癌の男性１００例から採取した試料を、良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）の手術を施行した男性から採取した前立腺組織と比較する。
【０１１９】
いずれのＮＣＩ組織バンクにも年齢、女性患者の更年期状態、身長、体重、乳癌または前立腺癌の家族歴、癌の種類及び病期、転移の存在および場合により生存期間に関する情報がある。肥満を起因とする乳癌は閉経後の女性によくみられるため、癌ではない被験体を可能なかぎり年齢と照合させる。前立腺癌およびＢＰＨを発症する集団が高齢者群であるため、著者らが試料を採取する前立腺癌患者は、高齢者群（５０歳超）に入ると予想することができる。小児患者では乳癌および前立腺癌はきわめて稀であるため、著者らが小児患者から採取された任意の組織を有することはまずありえない。
【０１２０】
臨床検査技術。このプロトコールで必要とされる手順は医学文献に発表され、当技術分野に関係ある者により理解される。個々の簡単な概要を下に示す。
【０１２１】
Ａｄ−３６の培養。前述したＡ５４９ヒト気管支癌細胞を用いてウイルス調製物を組織培養で培養する。Ａ５４９細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、メリーランド州、ロックビル）から入手する。イーグルの最小必須培地（ＭＥＭ）（カタログ番号Ｍ−０６４３、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）に非必須アミノ酸、アール塩およびＬ−グルタミンを加えて、Ａ５４９細胞の増殖に使用する。Ａ５４９細胞では、ｐＨ７．４で、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および２．９％ＮａＨＣＯ３（ｖ／ｖ）入りＭＥＭを用いて、作業用ストックを培養する。
【０１２２】
プラーク形成単位アッセイ。Ａ５４９細胞を用いて、このアッセイによりＡｄ−３６ウイルスの力価を測定する。ウイルス懸濁液１００μｌおよび培地９００μｌから始めて連続１０倍希釈を実施する。Ａ５４９細胞を６ウェルプレートで集密になるまで培養し、３ウェルをそれぞれの希釈に使用する。３ウェルをブランク対照として使用し、ウイルス懸濁液には感染させない。それぞれの細胞から培地を除去し、連続希釈したウイルス懸濁液１００μｌをウェルにピペット注入する。そのプレートを３７℃でインキュベートし、１５分ごとに穏やかに振盪させる。インキュベーションから１時間後、ウェルからウイルス懸濁液を除去して廃棄する。ウェルに１ウェルあたり１％寒天約３ｍｌ、１×抗真菌性抗生物質溶液を重層する。プレートを逆さにして、プラークが現れるまで３７℃で８日間インキュベートする。８日後、１ウェルあたり約１ｍｌのクリスタルバイオレットでウェルを一晩染色する。翌日、寒天を除去した後、形成されたプラーク数を数える。形成されたプラーク数×使用した懸濁液の希釈倍数が使用した接種量ＰＦＵ／１００μＬである。これを１０倍してＰＦＵ／ｍＬとする。
【０１２３】
組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）（６６−７２）。Ａ５４９細胞を含むウェルの５０％に細胞変性効果（ＣＰＥ）を生じさせる作業用ストックの力価を算出し、１ｍｌあたりの組織培養感染量（ＴＣＩＤ−５０）単位として表わす。連続１０倍希釈した作業用ウイルスストックを用いて、作業用ストックのＴＣＩＤ−５０を測定する。ウイルススットク溶液を連続希釈することによりＴＣＩＤ５０を算出し、細胞に希釈液を接種し、接種した細胞の５０％に細胞変性効果（ＣＰＥ）を生じさせるウイルスの最大希釈倍数の逆数を見つけ出す。ウイルス希釈に接種した細胞を３７℃で８日間インキュベートした後、力価を算出する。
【０１２４】
Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲアッセイ。Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲは生体試料中のＡｄ−３６ＤＮＡを検出する。前述したように、ウイルスのＤＮＡを検出するｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲアッセイで使用するために、４つのプライマーをＡｄ−３６繊維タンパク質遺伝子に特有の領域に指定した。プライマーの配列。
【０１２５】
外側順方向プライマー（５’−ＧＴＣＴＧＧＡＡＡＡＣＴＧＡＧＴＧＴＧＧＡＴＡ）（配列番号１）、
外側逆方向プライマー（５＝−ＡＴＣＣＡＡＡＡＴＣＡＡＡＴＧＴＡＡＴＡＧＡＧＴ）（配列番号２）、
内側順方向プライマー（５＝−ＴＴＡＡＣＴＧＧＡＡＡＡＧＧＡＡＴＡＧＧＴＡ）（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３）、
内側逆方向プライマー（５＝−ＧＧＴＧＴＴＧＴＴＧＧＴＴＧＧＣＴＴＡＧＧＡＴＡ）（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）。
【０１２６】
ＱＩＡａｍｐ組織キット（Ｑｉａｇｅｎ、米国、カリフォルニア州、バレンシア、Ｃａｔ＃２９３０４）を用いて、ヒト乳房組織および前立腺組織からＤＮＡを単離する。陰性ＰＣＲ対照は水とＡ５４９細胞のＤＮＡである。陽性ＰＣＲ対照はＡｄ−３６に感染したＡ５４９細胞のＤＮＡである。ＤＮＡを９５℃で２分間変性させ、ＰＣＲを３５サイクル（９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間）実施してから７２℃で５分間インキュベートする。サイズマーカーが付いた１％アガロースゲル上で、ＰＣＲ産物を可視化させる。
【０１２７】
このアッセイはウィスコンシン大学で開発されたものであり、当時、温度、マグネシウム濃度および動物およびヒトの組織を含む試料のサイクル数および３Ｔ３−Ｌ１細胞数に関する条件が最適化された。試料のＰＣＲ産物をゲルから抽出し、配列させるためにウィスコンシン大学バイオテックセンターに送付して、増幅したＤＮＡ塩基配列が標的領域からのものであることを保証する。バイオテックセンターはその正確性を確認した。こうした精度管理手順を繰り返して、ＣＬＩＡ規格および医薬品の非臨床試験の実施に関する基準を確認している。乳癌と前立腺癌の個々の陽性試料２件およびＡ５４９陽性対照ＤＮＡ試料のＤＮＡ配列を実施し、増幅が正確であることを確認する。
【０１２８】
統計学的解析および検出力演算。ヴァージニア・コモンウェルス大学の統計科学およびオペーレーションズリサーチ学部の統計学的支援が利用可能である。
【０１２９】
検出力分析。一般集団対ウィスコンシン州マディソンの癌患者のＡｄ−３６抗体保有率に関する予備データを用いて検出力分析を実施した。ウィスコンシン大学病院の乳癌患者および前立腺癌患者のそれぞれ５０％および５１％にＡｄ−３６抗体が認められたことが示された。一般集団およびウィスコンシン大学の肥満治療プログラムの志願者から採取した試料では、被験体２４７例を評価したところ、１８３例が肥満であり、６４例は肥満ではなかった。Ａｄ−３６抗体の有病率はそれぞれ２０％および１１％であった。ＣＤＣ図は、およそ成人米国人の３１％が肥満であり、６９％が肥満ではないことを示している。この数値を用いて、ウィスコンシン州、マディソンの一般集団のＡｄ−３６抗体保有率が１３．８％であったことを評価した。したがって、癌患者のＡｄ−３６保有率はほぼ４倍である。この図を用いて、検出力演算から、有意水準０．０５で検出力を８０％にして、癌患者対癌ではない患者のＡｄ−３６保有率の差を測定するには、１群あたりの被験体が３２例必要であることを明らかにした。予備データに基づくと、乳癌患者および前立腺癌患者両者の約５０％がＡｄ−３６抗体陽性であると予想することができる。しかし、ＮＣＩ組織バンク（またはＡｓｔｅｒａｎｄ組織バンク）の保管試料のなかではＡｄ−３６保有率は低めである可能性があり、このことが検出力に有意に影響を及ぼしていると思われる。このため、癌被験体１００例および癌ではない被験体５０例には確かに十分な検出力があるものと思われる。
【０１３０】
統計学的分析。癌被験体のＡｄ−３６ＤＮＡ保有率が癌ではない被験体よりも高いかどうかを測定するには、カイ２乗分析を使用する。重回帰分析するには被験体数が比較的少ないため、著者らは、効果が強力でないかぎり有意な相関が認められるとは思っていない。
【０１３１】
具体例７：
実施例８
既知の全ｃＤＮＡ配列に対してＡｄ−３６ゲノムのｃＤＮＡ配列をスクリーニングしたところ、２５−塩基配列２件および２８−塩基配列１件が確認され、いずれもＡｄ−３６に特有の繊維をコードする配列中にあった。この３種類の配列は以下のとおりである。
【０１３２】
配列番号５  ５’−ＡＧＴＴＧＡＡＡＣＡＧＣＡＡＧＡＧＡＣＴＣＡＡＡＧ
配列番号６  ５’−ＧＧＴＡＣＴＧＧＡＴＣＡＡＧＴＧＣＡＣＡＴＧＧＡＧ
配列番号７  ５’−ＴＴＧＡＡＡＣＡＧＣＡＡＧＡＧＡＣＴＣＡＡＡＧＣＴＡＡＣ
従来のニワトリ４羽から単離したＤＮＡの核酸プローブハイブリダイゼーションアッセイでは、上の３件の配列をＡｄ−３６のプローブに利用したところ、２羽はウイルスに感染して肥満になり、２羽は感染せず、肥満にならなかった。プローブにハイブリダイズしているＤＮＡは、感染した２羽のニワトリのＤＮＡにのみ観察された。アッセイは直接検出を要件とし、検出用レーザー励起蛍光法を用いたキャピラリー電気泳動によるものであった。さらに具体的には、緩衝装置では、電気泳動による分離には置換可能なポリアクリルアミドマトリックスを利用し、検出には５’標識するオリゴおよびチアゾールオレンジ挿入剤を備えた二重装置を利用した。
【０１３３】
当業者であれば、増幅にも使用する長さが約１５〜３０塩基の間のプローブおよびプライマーを有益に利用すると、適切な特異性および感度が提供されることを理解するであろう。当技術分野で既知のＰＣＲを用いる増幅法およびその変法を利用してもよい。
【０１３４】
上に挙げた実施例は例示にすぎず、本発明のあらゆる実施形態、応用または変更を網羅しようとするものではない。したがって、本発明の範囲および趣旨から逸脱することのない本発明に記載された方法および装置の種々の変更および変形は、当業者には明らかなことである。本発明を具体的な実施形態と結び付けて記載したが、主張した本発明はそのような特定の実施形態にむやみに限定する必要がないことを理解する必要がある。実際、本発明を実施するために記載した分子生物学または関連分野の当業者には自明であるモードの種々の変更は、添付の請求の範囲内に入るものである。
【０１３５】
上で引用した参照文献および刊行物すべての開示は、それぞれが個々に参照により援用されるのと同程度に、その全体を参照により明示的に援用する。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
添付図面は、本発明を更に理解するために含められ、本明細書中で援用され本明細書の一部を構成するものであり、本発明の好ましい実施形態を示し、詳細な説明とともに本発明の原理を説明するものである。本発明および本発明を具現化する種々の方法を基礎から理解するために、本発明の構造的な詳細を必要以上にさらに詳しく示すことはしていない。
【図１】図１はＭＤＩ処理後に３Ｔ３−Ｌ１細胞を５日間ＢＯＤＩＰＹ染色したものである。この図は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＡｄ−３６に感染した３Ｔ３−Ｌ１細胞と感染していない細胞の中のトリグリセリドを示している。対照細胞は中等度ＢＯＤＩＰＹ脂肪染色を示しているのに対して、Ａｄ−３６に感染した細胞には対照の約２倍量のトリグリセリドがあり、脂肪細胞の生化学が変化したことを示している。
【図２】図２は任意に食餌を与えていたアカゲザルのＡｄ−３６自然感染による影響を示したグラフである。サルが感染する前の期間と比較して、一度感染が観察される（↑で示した）と体重が絶え間なく増大し、約１８ヵ月の時点でも依然として増大していた。
【図３】図３はＡｄ−３６に感染したサルの体重増加を示しているグラフである。約７ヵ月で、感染したサルは感染していないサルの約４倍の体重になった。
【図４】図４はＡｄ−３６に感染したマーモセットサルの血清コレステロールの減少を示しているグラフである。血清コレステロールは感染後直ちに下がり始め約１０週まで下がり続けた。これは感染したサルのベースラインよりも有意に異なるものである。感染していないサルには何ら変化がみられない。
【図５】図５は、ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法を用いて、感染したマーモセットの脂肪組織中にＡｄ−３６ＤＮＡが存在していることを示しているゲルである。レーン１はＡｄ−３６ＤＮＡであり、レーン２−４は感染していないサルの脂肪中にはＡｄ−３６ＤＮＡが存在しないことを示しており、レーン５−７は感染したサル全例にＡｄ−３６ＤＮＡが存在していることを示している。
【図６】図６はｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法を用いて感染したマーモセットの肝臓（上部レーン）および筋組織（下部レーン）のＡｄ−３６ＤＮＡを示しているゲルである。レーン７−９の肝組織および筋組織では、感染したサルからＡｄ−３６ＤＮＡが確認され、感染していないサルのレーン４−６にはＡｄ−３６ＤＮＡは存在しなかった。レーン２は培養によるＡｄ−３６であり、レーン３はマーカーである。
【図７】図７はｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法により感染した動物の脳および筋組織中のＡｄ−３６ＤＮＡを示しているゲルである。上部レーンはマーモセットからの脳組織であり、下部レーンは筋組織である。感染したマーモセットからのＡｄ−３６ＤＮＡはレーン８−９では明瞭に見え、レーン７の方はぼんやりと見える。感染していないマーモセットのレーン４−６には、Ａｄ−３６ＤＮＡが存在しない。レーン２はＡｄ−３６培養による陽性対照である。
【図８】図８はｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法を用いてヒトの脂肪組織中のＡｄ−３６ＤＮＡを示しているゲルである（底部レーン）。上部レーンでは、このゲルはマーモセットの脂肪組織中のＡｄ−３６ＤＮＡを示している（図５のデータの繰り返し。レーン４−６  対照マーモセットによる陰性、レーン７−９  感染したマーモセットのＡｄ−３６ＤＮＡ）。底部レーンでは、剖検時に死体から採取したヒト内臓脂肪組織試料６件中２件にＡｄ−３６ＤＮＡが見える（レーン２は陽性対照、レーン６−７はＡｄ−３６陽性、レーン４、５、８、９は陰性である）。
【図９】図９は複数種のヒトアデノウイルスがニワトリの総体脂肪に及ぼす影響を示している図表である。Ａｄ−２およびＡｄ−３１では体脂肪が増加しなかったが、Ａｄ−３７では著明な影響が認められた。
【図１０】図１０は複数種のヒトアデノウイルスがニワトリの内臓脂肪に及ぼす影響を示している図表である。Ａｄ−２およびＡｄ−３１では内臓脂肪が増加しなかったが、Ａｄ−３７では著明な影響が認められた。
【図１１】図１１は複数種のヒトアデノウイルスに曝露した動物の食物摂取量を示している図表である。累積食物摂取量には群間差が認められなかったが、Ａｄ−２またはＡｄ−３１に感染した個体が肥満にならなかったのに対してＡｄ−３７に感染した個体は肥満になった。
【図１２】図１２はマウスに肥満を引き起こすヒトＡｄ−５を示している表である。また、体脂肪がほぼ３倍になった。
【図１３】図１３は米国３都市のヒトを対象にヒトＡｄ−３６に対する抗体が血清中に存在していることを示している表である。肥満のヒトの平均約３０％がＡｄ−３６に感染していたのに対して、肥満ではないヒトの約１１％がＡｄ−３６に感染していなかった。
【図１４】図１４はＡｄ−３６に感染している状態の米国３都市の５０２人を対象とした体容積指数を示している図表である。総じて、ＢＭＩは感染者の方が非感染者よりも約９単位高値であった（ｐ＜．０００１）。肥満群および非肥満群両者の感染者は各群の非感染者よりも有意に体重が重かった。
【図１５】図１５はＡｄ−３６に片方が感染していない双生児ペアを比較したものを示している表である。双生児ペア８９組のうち２６組の片方が感染していなかった。双生児ペアのＡｄ−３６に感染した方は感染していない方よりも体重が重く、体脂肪が多かった。
【図１６】図１６は前立腺癌組織にＡｄ−３６ＤＮＡが存在していることを示しているゲルである。
【図１７】図１７はサルにＡｄ−３６ＤＮＡが存在していることを示しているゲルである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年10月23日(2008.10.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体が脂肪生成アデノウイルス関連疾患を発生しやすい傾向にあるかどうかの予測を支援する方法であって、
該被験体が該脂肪生成アデノウイルスに感染しているかどうかの決定を支援するために、該被験体から採取した試料をアッセイする工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記試料をアッセイする前記工程は、
前記試料中の前記脂肪生成アデノウイルスに特異的な抗体の有無をスクリーニングする工程、および
該試料中の該脂肪生成アデノウイルスに特異的な抗体の存在を決定する工程
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記脂肪生成アデノウイルスは、アデノウイルス５型、アデノウイルス３５型およびアデノウイルス３７型からなる群より選択される１つ以上の脂肪生成ウイルスである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記脂肪生成アデノウイルス関連疾患は、癌、前立腺癌、乳癌、膵機能障害、膵疾患、糖尿病、肺疾患、脳および神経系機能不全および副腎機能障害からなる群より選択される疾患である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記被験体はヒトである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記被験体は動物である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記アッセイする工程における前記抗体は、配列番号５、配列番号６および配列番号７からなる群より選択される核酸配列によりコードされる１つ以上のペプチドに特異的である請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記スクリーニング工程は血清中和法およびＥＬＩＳＡからなる群より選択される方法を用いることにより実施される請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記試料は生体試料、体液、組織試料、臓器試料、糞便、血液、唾液およびこれらのあらゆる組み合わせからなる群より選択される請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
抗脂肪生成アデノウイルスワクチンを含む、被験体の脂肪生成アデノウイルス関連疾患を予防するための組成物。
【請求項１１】
前記抗脂肪生成アデノウイルスワクチンは、有効投与量の有効成分として、死菌アデノウイルス３６型、不活化アデノウイルス３６型、アデノウイルス３６型外被タンパク質またはその断片をコードするタンパク質またはペプチド配列、アデノウイルス３６型外被タンパク質またはその断片をコードする核酸配列、アデノウイルス３６型Ｅ１Ａタンパク質、遺伝子組換え非病原性ウイルスおよび非病原性ウイルスからなる群より選択される１つ以上の化合物を含む請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
鼻内、経口、静脈内、筋肉内、皮下および／または腹腔内への投与に適した、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記被験体はヒトである請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
前記被験体は動物である請求項１０に記載の組成物。
【請求項１５】
前記脂肪生成アデノウイルス関連疾患は癌、前立腺癌、乳癌、膵機能障害、膵疾患、糖尿病、肺疾患、脳および神経系機能不全および副腎機能障害からなる群より選択される１つ以上の疾患である請求項１０に記載の組成物。
【請求項１６】
腫瘍と適合性の異常を有する被験体の癌の攻撃性の予測を支援する方法であって、
該被験体が脂肪生成アデノウイルスに感染しているかどうかの決定を支援するために、該被験体から採取した試料をアッセイする工程
を含む、方法。
【請求項１７】
前記試料をアッセイする前記工程は、
前記試料中の前記脂肪生成アデノウイルスに特異的な抗体の有無をスクリーニングする工程、および
該試料中の該脂肪生成アデノウイルスに特異的な抗体の存在を決定する工程
を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記脂肪生成アデノウイルスはアデノウイルス５型、アデノウイルス３６型およびアデノウイルス３７型からなる群より選択される１つ以上の脂肪生成ウイルスである請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記癌は乳癌、前立腺癌、子宮癌、卵巣癌、大腸癌、腎臓癌、膵臓癌および肺癌からなる群より選択される請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記被験体はヒトである請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記被験体は動物である請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記測定する工程の前記抗体は、配列番号５、配列番号６および配列番号７からなる群より選択される核酸配列によりコードされる１つ以上のペプチドに特異的である請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記スクリーニング工程は血清中和法およびＥＬＩＳＡからなる群より選択される方法を用いて実施される請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記試料は生体試料、体液、組織試料、臓器試料、糞便、血液、唾液およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記脂肪生成アデノウイルスに感染していない被験体に比して、該脂肪生成アデノウイルスに感染した被験体における癌のより攻撃的な形態が、より高度の腫瘍進行度、より大きな腫瘍体積、進行した病期、増加したグリーソンスコア、およびより高度の異形成からなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【国際調査報告】
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