(57)【要約】  骨再構成、及び皮膚と軟組織の病変の修復を含む、組織再生及び修復におけるインプラントのための血管新生活性を有するバイオメンブレンが記載される。それは特に、間葉幹細胞／前駆細胞をも含む細胞の完全なin vivo機能性のための増殖及び／または分化及び／または血管新生因子を提供可能なゲルによって構成される。前記バイオメンブレンを含む、骨組織、皮膚及び軟組織病変の再構成手術のためのインプラント器具、及びその製造方法も記載される。組織再生のためのゲル単独の使用、及びそれを含む接着プラスターの使用も記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉幹細胞及び／または間葉前駆細胞によって、並びに支持体、及び細胞の完全なin vivo機能性のための増殖因子及び／または分化因子及び／または血管新生因子を提供することができるゲルによって必須に構成されるバイオメンブレンであって、前記間葉細胞は前記ゲル内またはゲル上で増殖する、バイオメンブレン。
【請求項２】
前記間葉幹細胞及び／または間葉前駆細胞は皮膚形成細胞である、請求項１に記載のバイオメンブレン。
【請求項３】
前記間葉幹細胞及び／または間葉前駆細胞は軟骨形成細胞である、請求項１に記載のバイオメンブレン。
【請求項４】
前記間葉幹細胞及び／または間葉前駆細胞は骨形成細胞である、請求項１に記載のバイオメンブレン。
【請求項５】
前記細胞は骨髄から得られる、請求項１から４のいずれか一項に記載のバイオメンブレン。
【請求項６】
前記細胞は骨膜から得られる、請求項４に記載のバイオメンブレン。
【請求項７】
骨形成因子を有する培養培地中で事前処理される、請求項４に記載のバイオメンブレン。
【請求項８】
前記細胞は自己由来である、請求項１から７のいずれか一項に記載のバイオメンブレン。
【請求項９】
前記細胞は異種由来である、請求項１から７のいずれか一項に記載のバイオメンブレン。
【請求項１０】
前記ゲルは血小板ゲルである、請求項１から９のいずれか一項に記載のバイオメンブレン。
【請求項１１】
前記ゲルは、細胞の完全な機能性のための増殖及び／または分化及び／または血管新生因子を補った、再吸収可能な合成、天然、または組換えポリマーによって必須に構成される、請求項１から９のいずれか一項に記載のバイオメンブレン。
【請求項１２】
増殖因子及び／または分化因子及び／または血管新生因子を放出可能なミクロ及び／またはナノ粒子を更に含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載のバイオメンブレン。
【請求項１３】
部分的に脱水されている、請求項１から１２のいずれか一項に記載のバイオメンブレン。
【請求項１４】
多孔性の足場と請求項４または６に記載のバイオメンブレンとによって必須に構成され、前記バイオメンブレンが前記支持体を覆っている、骨組織の再構成手術のためのインプラント器具。
【請求項１５】
前記バイオメンブレンが骨形成因子を有する培養培地中で事前処理される、請求項１４に記載の骨組織の再構成手術のためのインプラント器具。
【請求項１６】
増殖及び／または分化及び／または血管新生因子を有する更なるゲル膜を更に含み、前記更なるゲル膜で移植の直前で覆われる、請求項１４または１５に記載の骨組織の再構成手術のためのインプラント器具。
【請求項１７】
前記更なるゲル膜は血小板ゲルである。請求項１６に記載の骨組織の再構成手術のためのインプラント器具。
【請求項１８】
皮膚及び軟組織の病変の修復のための医薬の調製のための血小板ゲルの使用。
【請求項１９】
前記皮膚及び軟組織の病変の修復が、慢性潰瘍、重篤な創傷、床擦れ、裂傷、腱の裂傷、軟組織物質の損失を含む、請求項１８に記載の血小板ゲルの使用。
【請求項２０】
治療上の活性物質として請求項１８または１９に記載の血小板ゲルを含む、皮膚及び軟組織の病変の修復のための接着プラスター。
【請求項２１】
治療上の活性物質として、増殖及び／または分化及び／または血管新生因子を補った再吸収可能な合成、天然、または組換えポリマーによって必須に構成されるゲルを含む、皮膚及び軟組織の病変の修復のための接着プラスター。
【請求項２２】
治療上の活性物質として、増殖及び／または分化及び／または血管新生因子を放出可能なミクロ及び／またはナノ粒子を含む、皮膚及び軟組織の病変の修復のための接着プラスター。
【請求項２３】
ａ）適切な条件で末梢血から得られる血小板濃縮物及び寒冷沈降物を混合することから血小板ゲルを得る工程；
ｂ）間葉幹細胞及び／または間葉前駆細胞を得て、前記ゲル上または前記ゲル内で増殖させる工程
を必須に含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載のバイオメンブレンの製造方法。
【請求項２４】
前記間葉幹細胞及び／または間葉前駆細胞は、移植される被験者に関して自己由来または異種由来である、請求項２３に記載のバイオメンブレンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、加工された組織バイオメンブレン、骨の再構成としての組織再生及び修復、皮膚と軟組織の病変、例えば慢性潰瘍、重篤な創傷、床擦れ、裂傷、腱の裂傷、軟組織物質の損失の修復のためのインプラント器具、並びにその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床の実践及び手術では、物質の損失と関連する大組織病変を修復するための有効なシステムを同定することが更に必要とされている。
【０００３】
整形外科及び顎顔面の手術では、過去数年において、多数の物質の損失を修復するために病変に関してほぼデザインされた、セラミックの足場と関連した患者自身の細胞の使用を示唆する生体技術的アプローチが提案されている（非特許文献１）。特に有効である文献に提示された結果は、それにもかかわらず更なる改善が可能である。臨床前の試験及びパイロット臨床試験では、インプラント自体のレベルでの血管新生の欠如が、細胞死（アポトーシス）を導き、「骨髄ストロマ細胞（ＢＭＳＣ）」の真の効果を無効にし得ることが注目されている。
【０００４】
ヒツジにおける最近の試験では（非特許文献２）、再吸収可能なセラミックの足場が使用され、骨膜残余物から開始して、骨の形成工程を誘導でき、病変の完全な修復が可能であることが観察された。骨組織の段階的な形成とセラミックの孔の充填が、セラミックの再吸収と、インプラントの同時的な血管新生によって達成される。不幸にも、患者の骨膜の使用は、再構成手術において稀に応用可能であるのみである。
【０００５】
他の組織の修復／再生に関しては、火傷、重篤なまたは術後の創傷、慢性潰瘍による皮膚病変を修復するための、創面切除術のような方法または血管新生組織の移植の使用が、数個の可能な応用の一つのみである（非特許文献５）。血小板及びマクロファージによって果たされる組織修復における規則的な役割を考慮して、最近では、血小板ゲルの局所応用の使用が、各種の皮膚病変を修復するために提案されている（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Quarto等, N. Engl. J. Med., 2001, 344(5); 385-86
【非特許文献２】Mastrogiacomo等, Tissue Eng. 2006, 12(5): 1261-73
【非特許文献３】Rhee等, Thromb Haemost. 2004, 92(2): 394-402
【非特許文献４】Scala M等, Proc. Am Acad Maxillofacial Prosth. International Congress Maxillofacial Prosthetics in the 21st Century, Kauai - Hawaii, November 11-14, 2000: 132
【非特許文献５】Warnke PH等, Lancet 2004, 364: 766-70
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
今回発明者らは、従来技術の問題を解消し、動物及びヒトにおいてin vivoで、新生組織の生産を誘導することが可能なバイオメンブレンを開発した。前記バイオメンブレンが、大きなサイズの骨不足の修復のための再吸収可能な多孔性のセラミックの足場のような足場の外皮として移植された際、前記新生組織は骨であることができる。前記新生組織は、直接的な接触による皮膚病変の修復においては、軟組織であることもできる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
それ故、本発明の目的は、間葉幹細胞及び／または間葉前駆細胞によって、並びに支持体、及び細胞の完全なin vivo機能性のための増殖因子及び／または分化因子及び／または血管新生因子を提供することができるゲルによって必須に構成されるバイオメンブレンであり、前記間葉細胞は、前記ゲル内またはゲル上で増殖する。
【０００９】
好ましくは、前記間葉幹細胞及び／または間葉前駆細胞は皮膚形成細胞である。
【００１０】
別法として、前記間葉幹細胞及び／または間葉前駆細胞は軟骨形成細胞である。
【００１１】
別法として、前記間葉幹細胞及び／または間葉前駆細胞は骨形成細胞である。
【００１２】
好ましい実施態様では、前記細胞は、ヒト及び動物の骨髄から得られる。
【００１３】
好ましい実施態様では、前記バイオメンブレンは、骨形成因子で培養中で事前処理される。
【００１４】
好ましくは、前記細胞は自己由来である。別法として、前記細胞は異種由来である。
【００１５】
好ましい形態では、前記ゲルは血小板ゲルである。別法として、前記ゲルは、再生中の骨組織及び皮膚病変に働きかける細胞の完全な機能性のための増殖及び／または分化及び／または血管新生因子（組換え体または血液由来）を補った、再吸収可能な合成、天然、または組換えポリマーによって必須に構成される。
【００１６】
一実施態様では、前記バイオメンブレンは更に、増殖及び／または分化及び／または血管新生因子を放出可能なミクロ及び／またはナノ粒子を含む。前記因子は、血小板溶解物から由来しても良く、またはＶＥＧＦ及びＰＤＧＦのような合成の、若しくは天然の、若しくは特定の組換え産物であっても良い。
【００１７】
本発明のバイオメンブレンは有利には、その応用前に部分的に脱水されるならば使用可能である。
【００１８】
本発明の別の目的は、多孔性支持体（足場）と本発明に係るバイオメンブレンとによって必須に構成される、骨組織の再構成手術のためのインプラント器具であり、前記バイオメンブレンは前記支持体を覆い、好ましくは１−２週間のような各種の期間、骨形成因子で培養中に事前処理される。一つの実施態様では、増殖因子の段階的な放出を有するミクロ及び／またはナノ粒子が、前記多孔性支持体と会合できる。
【００１９】
一つの好ましい実施態様では、本発明に係る骨組織の再構成手術のためのインプラント器具は、増殖及び／または分化及び／または血管新生因子を有する更なるゲル膜を含み、前記更なるゲル膜は、移植の直前で覆われる。好ましくは、前記更なる膜は血小板ゲルである。
【００２０】
本発明の別の目的は、好ましくは慢性潰瘍、重篤な創傷、床擦れ、裂傷、腱の裂傷、軟組織物質の損失を含む、皮膚及び軟組織の病変の修復のための医薬の調製のための血小板ゲルの使用である。
【００２１】
皮膚の病変の修復のために、本発明は、血小板ゲルのみを含む接着プラスターを提案する。前記接着プラスターは、三種の必須のエレメント；パッド、支持体、及び接着剤によって構成される。前記パッドは、高吸収能を有するアクリルと混合したコットン、または同様な特徴を有する材料によって構成することができ、ポリエステルの薄膜、または同様な特徴を有する材料で被覆でき、創傷と接触した際に治癒を促進する活性生物学的因子が豊富な血小板ゲルに配置できる。
【００２２】
本発明の更なる目的は、治療上の活性物質として血小板ゲルを含む皮膚及び軟組織の病変の修復のための接着プラスターである。
【００２３】
別法として、皮膚及び軟組織の病変の修復のための前記接着プラスターは、治療上の活性物質として、増殖及び／または分化及び／または血管新生因子を補った再吸収可能な合成、天然、または組換えポリマーによって必須に構成されるゲルを含む。
【００２４】
別法として、皮膚及び軟組織の病変の修復のための前記接着プラスターは、治療上の活性物質として、増殖及び／または分化及び／または血管新生因子を放出可能なミクロ及び／またはナノ粒子を含む。
【００２５】
本発明の更なる目的は、
ａ）適切な条件で末梢血から得られる血小板濃縮物及び寒冷沈降物を混合することから血小板ゲルを得る工程；
ｂ）骨髄（ＢＭＳＣまたはストロマ細胞）または他の組織から得られた間葉幹細胞及び／または間葉前駆細胞を得て、前記ゲル上または前記ゲル内で培養する工程
を必須に含む、本発明に係るバイオメンブレンを得る方法である。
【００２６】
好ましくは、前記間葉幹細胞及び／または間葉前駆細胞は、移植される被験者に関して自己由来または異種由来である。
【００２７】
本発明は、以下の図面を参照して、その非制限的な実施例において記載されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、血小板溶解物（ＰＬ）（５％、１０％、２０％）、ＦＢＳ１０％またはＦＧＦ−２  １ｎｇ／ｍｌの存在下でのヒトＢＭＳＣの細胞増殖の棒グラフを示す。低細胞密度（ＬＳＤ、低速密度）及び高細胞密度（ＨＳＤ、高速密度）で蒔かれたウェルの細胞カウントによって増殖が評価された。
【図２】図２は、骨組織形成を示す写真である。ヒツジＢＭＳＣと会合した血小板ゲルのフィルムを、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ、１００％純度のＨＡ：６０〜７０ｍｍ３）のキューブの周囲に巻きつけ、４及び８週齢の免疫不全マウスの皮下に移植した：細胞は、ゲルのマトリックスの内部（ＩＮ）に収まり（パネルａ及びｃ）、またはゲルの表面（ＯＮ）に積層した（パネルｂ及びｄ）。骨組織の形成は、矢印によって示されるヘマトキシリン−エオシン染色によって強調されている。
【図３】図３は、骨組織形成を示す写真である。単独（ａ）またはヒツジＢＭＳＣ  ＩＮ（ｂ）若しくはＯＮ（ｃ）と会合した血小板ゲルのフィルムを、skelite（登録商標）（ＴＣＰ−ＨＡ：２０００〜２５００ｍｍ３）の足場に巻きつけ、８週齢の免疫不全マウスに移植した。骨組織形成は、矢印によって示されるヘマトキシリン−エオシン染色によって強調されている。
【図４】図４は、骨組織形成を示す写真である。キューブ状の足場（１００％純度：６４ｍｍ３）上のヒツジＢＭＳＣを有する血小板ゲルのフィルムを示す。ＢＭＳＣは、血小板ゲルの表面に積層され、２週間骨形成培地で刺激した。ヘマトキシリン−エオシン染色は、矢印に示されるように、セラミックの孔中の骨組織形成を強調している。
【図５】図５は、バイオメンブレンの脱水を示す写真である。移植部位への挿入を容易にすることが可能な稠性と弾性を推定する滅菌吸収紙（ａ）によって、バイオメンブレンを脱水する（ｂ−ｃ）。細胞生存試験により、脱水後（ｅ）のバイオメンブレンに含まれる細胞の生存能は、脱水していないコントロールのものに等しいことが示される。
【図６】図６は、ウマにおける皮膚病変の修復を示す写真である。自己由来のウマの血小板ゲルとヒアルロン酸パッチによって構成されたバイオメンブレンを、病変に積層した。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
細胞培養物
骨髄ストロマ細胞（ＢＭＳＣ）をヒトまたはヒツジの骨髄から単離した。患者による承認、または動物での試験の場合は倫理委員会による承認の後、サンプルを腸骨稜から引き出した（１０ｍｌ）。
【００３０】
いくつかの実験では、標準的なプロトコールに従った０．２５％のコラゲナーゼでの連続的切断により、ヒトまたはヒツジの骨膜生検から直接細胞は由来した。
【００３１】
骨髄をＰＢＳで洗浄し、サンプルのｍｌ当たりの核酸塩細胞カウントを実施した。サンプルの一部を非常に低密度（１００ｍｌ／プレート）でプレートに蒔き、２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンと１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２、及び１０％の胎児ウシ血清を補ったＦ１２培地でＣＦＵの数を評価した。骨髄吸引物の残りの部分を、標準的な培養培地における培養中の細胞の増殖に向けた。細胞が最初の飽和に達した際、それらをトリプシン処理し、ペトリ皿に蒔くか表面で血小板ゲルに蒔き（ＩＮと称される方法）、またはその重合の間で血小板ゲルに会合した（ＯＮと称される方法）。ＩＮまたはＯＮのゲルにおける蒔かれた細胞の濃度は、表面領域のｃｍ２当たり１×１０６から６×１０６細胞まで変化する。
【００３２】
ヒト血小板ゲルの調製
ヒト血小板ゲルを、ジェノバのTransfusion Center of the San Martino Hospitalによって調製された血液成分から得た。ヒトまたはヒツジのドナーの抹消血の引き出しから、以下のものを得た：
ａ）凝固因子と免疫グロブリンとを含む寒冷沈降物；
ｂ）血小板を含む血小板濃縮物（ＣＰ）；
ｃ）フィブリンの重合工程で介在する自己トロンビン。
【００３３】
個々の成分の調製は以下のように進行する：
【００３４】
血液を１７００ｇ／分で２０℃で７分間遠心分離し、ＰＲＰと称される血小板が富化した血漿の分離を実施する。
【００３５】
ＰＲＰを２０℃で５分間４４００ｇ／分で遠心分離し、ＰＰＰと称される血小板が乏しい血漿と血小板濃縮物（ＣＰ）の分離を実施する。ＣＰを凍結し、使用時に環境温度で融解する。
【００３６】
ＰＰＰを−４０℃で凍結し、サテライトサックで夜中４℃で融解する。完全に融解したら、寒冷沈降物をサイフォン処理によって得る。
【００３７】
ＣＰと寒冷沈降物を１：１の比でプレート上で混合した。１ｍｌの自己トロンビンと１ｍｌの１０％グルコン酸カルシウムを１０ｍｌの全容量で添加し、ゲル重合工程を開始した。
【００３８】
ヒトＢＭＳＣに対する血小板ゲルの効果を評価するために、サプリメントと、以下に記載されるＣＰから得られた各種の濃度の血小板溶解物（ＬＰ）（５％、１０％及び２０％）とを含む完全培養培地の存在下で、細胞を増殖させた。ＬＰの存在下または不存在下で、高密度（１００００細胞／ウェル）及び低密度（２０００細胞／ウェル）で細胞をプレートに蒔いた。培養が半飽和に到達した際（１０日目）、細胞カウントによって各種の条件下の細胞増殖を評価した。
【００３９】
血小板溶解物の調製のために、Doucet C等(2005)によって記載されたプロトコールに従った。３回の凍結／融解サイクルにＣＰを供した後ＬＰを得て、完全な血小板溶解を促進し、低ＥＤＴＡ濃度の存在下で、そこに存在する全ての増殖因子（ＰＤＧＦ−ｂｂ、ＰＤＧＦ−ａａ、ＥＧＦ、ＩＧＦ等）を完全に放出する。ＬＰを各種の濃度で培養物に添加した。
【００４０】
動物（ウマ）由来の血小板ゲルの調製
介入の前日に、抗凝固剤(Fresenius HemoCare CODE T2375)としてＡＣＤ（クエン酸＋クエン酸ナトリウム＋デキストロース）を含むヒト血液の引き出しのための標準的なトリプルバッグによって、２単位の４５０ｍｌの血液をウマから引き出した。５００×ｇで８分間ALC PM980R遠心分離機(BICase, イタリア)でバッグを遠心分離した；次いで、血液を赤血球と血小板の富化した血漿（ＰＲＰ）に分離し、部分的にBuffy-Coat(登録商標)に入れる。
【００４１】
ＰＲＰを５０００×ｇで７分間再遠心分離し、約８０ｍｌの自己血漿に再懸濁しなければならない血小板濃縮物（ＣＰ）を得て、０．５から３×１０６マイクロリットルの間の血小板カウントを調製しなければならない。
【００４２】
ＣＰを含むバッグを、使用時まで＋２２℃で攪拌恒温器に配置する。
【００４３】
介入の当日に、ＣＰをバッグから滅菌フード下で、ウマの同定データをラベルしたシリンジで引き出す。
【００４４】
ＣＰは修復される病変部位に注射するのに適している
製品を半固体ゲルの形態で使用するのであれば、使用時に、約１０ｃｍの直径のいくつかの滅菌プラスチックペトリ皿を、１０ｍＬの血小板濃縮物、１ｍＬのグルコン酸カルシウム(ind. Farmaceutical Senese, イタリア, Lot. No. )を添加して調製する。
【００４５】
数分後、大きな表面上で局所的に適用できる血小板濃縮物の「ゲル化」でフィブリノーゲンからフィブリンへのトランスフォーメーションが生じる。
【００４６】
腱の病変の場合、音波検査器によるガイドの下で、病変部位でゲル化せずに製品が注射されるであろう。
【００４７】
in vivoの骨組織形成
in vivoでの骨組織形成を評価するために、小さな動物モデル、即ち免疫不全マウス(Ｎｕ／Ｎｕ株またはＳＣＩＤ株)を使用した。各種のサイズ及び破壊度のセラミックの足場(Engiopore(登録商標)、１００％ＨＡ、Finceramioa, Faenza, イタリア、及びSkelite(登録商標), TCP70/HA30, Millenium Biologix)を、血小板ゲルとヒト若しくはヒツジＢＭＳＣのバイオメンブレンで被覆した後、免疫不全マウスの背中に皮下で移植した。
【００４８】
ＢＭＳＣをゲル上に積層し（ＯＮ）、または重合フェーズの間で直接ゲル中に含ませた（ＩＮ）。血小板ゲルのバイオメンブレン（ＯＮ法またはＩＮ法で得られた）を、１−３日目はＦＧＦ−２なしで完全培地で維持し、その後１００％のＨＡの立方体の足場（６０−７０ｍｍ３；EngiPore(登録商標)）の周りに被覆した。いくつかの実験では、移植の前数分で、細胞を含まない新鮮なゲルの更なる膜でサンプルを被覆し、増殖因子のより大きな供給を補助した。各動物で、コントロールインプラントを含む４種の足場を移植し、セラミックに対する細胞の接着の調節剤として、フィブリン接着剤(Tissucol(登録商標), Baxter)を使用して足場に直接ＢＭＳＣを積層した。
【００４９】
第二シリーズの実験では、より大きなサイズ（２０００−２５００ｍｍ３の中空シリンダー）の再吸収可能なskelite(登録商標)（ＴＣＰ７０％、ＨＡ３０％, Millenium Biologix, Ontaria, カナダ）から形成されたセラミックの足場を使用した。この場合、単一のサンプルを動物当たり移植した。
【００５０】
いくつかの実験では、ＢＭＳＣに接合した血小板ゲルを、吸収剤である滅菌フィルターペーパーを重ねることによって部分的に脱水し、それによってより稠性でより容易に扱えるバイオメンブレンを形成した。部分的に脱水したゲルでは、細胞は正常に増殖し、動物における移植後に骨形成能力を維持した。
【００５１】
いくつかの実験では、ヒトまたはヒツジＢＭＳＣに接合した血小板ゲルを、骨形成培地でin vitroで事前処理した。調製後２４時間で、骨形成分化を誘導する因子：１０−８Ｍのデキサメタゾン、１０ｍＭのｂ−グリセロール−ホスフェート（ＢＧＰ）、及び５０ｍｇ／ｍｌの被覆された丸いＨＡキューブで補った培養培地に血小板ゲルメンブレンを移し、ＢＭＳＣなしの新鮮な血小板ゲルによって再被覆し、ＩＤマウスに皮下で移植した。
【００５２】
in vivoの移植片を４週後及び／または８週後に回収し、組織科学的分析に供した：サンプルを脱カルシウム化し、パラフィンに埋没した。標準的なプロトコールにしたがって、切片をヘマトキシリン−エオシン染色した。
【００５３】
皮膚病変の修復（ウマ）
上述のように調製された血小板ゲルによって構成されたバイオメンブレンを病変に積層し、ヒアルロン酸のパッチ(ComvaTec Hyalofill, FAB Srl, Abano Terme, イタリア)またはOpSite Flexigrid (Smith and Nephew)のような被覆特性を有する他の材料によってカバーした。次いで生物学的インプラントに対して、適当な圧迫の従来の医療を適用し、ガーゼとバンデージを１４日後に取り替えた。患者の臨床上のモニタリングによってフォローを実施し、治療の開始後に規則的な間隔で残余の病変の表面領域を測定した。
【００５４】
結果
増殖
実験の第一のフェーズでは、ヒトＢＭＳＣに対する血小板ゲルの効果を測定し、血清のみ、ＦＧＦ−２のみ、または各種の濃度のＬＰを補った培養培地の存在下で細胞を増殖させた。低密度または高密度でウェルに細胞を蒔いた。図１に示されるチャートは、５％ＬＰの存在下で高密度または低密度で増殖する細胞は、血清のみで増殖する細胞よりも有意にたくさん増殖することを示す。ＦＧＦ−２の存在下で増殖する細胞は、ＬＰで処理されたものより多くの増殖を示さない。高いＢＭＳＣの増殖は、１０または２０％のＬＰを補った培地で観察される。ＬＰの添加は、血清のみまたはＦＧＦ−２を有する条件に対して増殖の優位な増大を決定する。活性のピークが１０％で得られる一方、以下のin vitro実験では、同様に有効であるという理由で、使用されたＬＰ濃度は５％であった。
【００５５】
in vitroの分化
ヒトまたはヒツジＢＭＳＣを、ゲルの表面に積層し（ＯＮ法）、またはゲルのメッシュの内部に直接積層し（ＩＮ法）、バイオメンブレンと称される真の圧縮フィルムを形成し、それを使用して小さいまたは大きいセラミックの足場を被覆した。
【００５６】
図２では、ＩＮ法及びＯＮ法の両者のＢＭＳＣで調製された血小板ゲルバイオメンブレンを、１００％ＨＡの丸いキューブに被覆して移植し、４及び８の脱カルシウムサンプル、パラフィン埋没サンプルについて、ゲルの内部に埋め込まれたもの（ＩＮ、ａ及びｃ）並びにゲルの表面に維持されたもの（ＯＮ、ｂ及びｄ）の両者の細胞が骨芽細胞に分化し、移植の最初の４週間の間で既に、セラミックの孔内に骨形成マトリックスを堆積することができることが観察可能であった。新たに並んだ骨の端部の骨芽細胞の有意な列は、強度の骨マトリックスの整列活性を示す。移植の８週後では、より多い量の骨がセラミックの孔を充填する。表面に積層した細胞を有するバイオメンブレンによって被覆されたサンプル（ＩＮ法）と、フィブリンメッシュに埋め込まれた細胞を有するバイオメンブレンを有するサンプル（ＯＮ法）との両者で、骨組織の形成において有意な減少は存在しなかった。
【００５７】
ＩＤマウスのモデルは、細胞のバイオ材料の骨形成を試験するための最も受け入れられているin vivoモデルの一つであるが、臨床上の実施で見出される「真の」条件により近いアプローチである試験条件下で実験を繰り返すことが適切であると考えられる。
【００５８】
この目的のため、より多い存在のリン酸三カルシウムと、より少ない存在のヒドロキシアパタイト（ＴＣＰ７０％、ＨＡ３０％）を有する、多孔性で再吸収可能なセラミックの足場を使用した(Mastrogiacomo等, 2006)。約２０００ｍｍ３の中空シリンダーを、血小板ゲルバイオメンブレン単独で、またはＩＮ法若しくはＯＮ法での細胞と会合させて被覆し、８週間ＩＤマウスに移植した。図３のパネルａ）は、細胞のない血小板ゲルによって被覆されたサンプルでは骨組織形成が存在しないことを示す。脂肪組織と共に繊維状組織が、セラミックの孔に生成するのみである。しかしながら、いくつかの血管新生を得ることができ、病変部位の血管新生における血小板ゲルによって果たされる重要な役割を確認できる（非特許文献３）。ＩＮ法またはＯＮ法で得られた細胞と会合した血小板ゲルのフィルムによって足場を巻いた場合（図３、ｂ−ｃ）、セラミックの孔において骨組織が観察される。たくさんの骨芽細胞が、積層した骨の表面で分布している。十分に着色した切片の顕微鏡観察により、足場の周縁部から中央部に広がる新たに形成された骨組織の分布が観察できる。
【００５９】
ＩＮ法及びＯＮ法の両者で得られた血小板ゲルとＢＭＳＣ（ヒトまたはヒツジ）のバイオメンブレンから開始する最高の骨形成及び血管新生能力を有するバイオメンブレンを生成する試みでは、骨誘導性培養培地（方法は参照）で２週間の期間、in vitroでバイオメンブレンを事前処理し、足場への移動の前にマトリックスの初期積層を促進した。in vivo移植の８週間後、サンプルの周縁部から中央部へ分布する良好な骨組織形成をサンプルは示した（図４）。
【００６０】
in vitroでの血小板ゲルにおけるＢＭＳＣの持続した維持は、その骨形成能力を減少する。しかしながら、２週間の期間にわたる骨誘導性培地でバイオメンブレンを事前処理することができ、十分な骨形成能力の維持が推定される。
【００６１】
図５では、メンブレンの可溶性部分と水を完全に除去する滅菌吸収性ペーパーのディスクを連続的に重ねることによる、バイオメンブレンの脱水を示す。この方法は、そこに含まれる細胞の生存能を改変することなく、外科手術の間でより可塑性でより扱いやすいメンブレンを生成する。
【００６２】
皮膚病変の修復に関しては、ウマにおける皮膚病変の処理の例が報告される（図６）。全ての処理された動物では、血小板ゲルを適用すると、直ぐに再生工程を誘導することが十分に可能であった（図６ａ−ｂ）。この図は、ウマがその運動−競争活動を再開した際に、治療から１５日目での病変の減少と（図６ｃ）１３日目での完全な回復（図６ｄ）を明確に示す。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１】
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【国際調査報告】
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