(57)【要約】  ナノ構造、液体および少なくとも１つの凍結保護剤を含む凍結保護組成物が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノ構造、液体および少なくとも１つの凍結保護剤を含む凍結保護組成物。
【請求項２】
（ａ）細胞材料を、ナノ構造および液体を含む組成物と接触させること、および、
（ｂ）細胞材料を冷凍保存温度に供し、それにより、細胞材料を冷凍保存すること
を含む、細胞材料を冷凍保存する方法。
【請求項３】
（ａ）請求項２に記載の方法によって細胞材料を冷凍保存すること、
（ｂ）冷凍保護された細胞材料を解凍すること、および、
（ｃ）前記組成物を除去し、それにより、冷凍保存された細胞材料を回復すること
を含む、冷凍保存された細胞材料を回復する方法。
【請求項４】
請求項１に記載の凍結保護組成物を含む冷凍保存容器。
【請求項５】
ナノ構造および液体を含む冷凍保存容器。
【請求項６】
凍結保護組成物は、少なくとも１つの凍結保護剤をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記ナノ構造は、前記液体の整列した流体分子によって包まれるナノメートルサイズのコア材料を含み、前記コア材料、および、前記整列した流体分子のエンベロープが定常的な物理的状態にある、請求項１、２または５のいずれかに記載の凍結保護組成物、方法または冷凍保存容器。
【請求項８】
前記流体分子は、少なくとも２つの均一な流体組成物を含む不均一な流体組成物を含み、一方、前記液体は前記少なくとも２つの均一な流体組成物の少なくとも１つと同一である、請求項７に記載の凍結保護組成物、方法または冷凍保存容器。
【請求項９】
前記流体分子の少なくとも一部分は気体状態にある、請求項７に記載の凍結保護組成物、方法または冷凍保存容器。
【請求項１０】
前記ナノ構造の濃度が１０２０個／リットル未満である、請求項７に記載の凍結保護組成物、方法または冷凍保存容器。
【請求項１１】
前記ナノ構造の濃度が１０１５個／リットル未満である、請求項７に記載の凍結保護組成物、方法または冷凍保存容器。
【請求項１２】
前記ナノ構造は、クラスターを形成することができる、請求項７に記載の凍結保護組成物、方法または冷凍保存容器。
【請求項１３】
前記ナノ構造は、ナノ構造間の遠距離相互作用を維持することができる、請求項７に記載の凍結保護組成物、方法または冷凍保存容器。
【請求項１４】
前記組成物は、水に対する高まった超音波速度によって特徴づけられる、請求項１または２に記載の凍結保護組成物または方法。
【請求項１５】
前記コア材料は、強誘電性物質、強磁性物質および圧電性物質からなる群から選択される、請求項７に記載の凍結保護組成物、方法または冷凍保存容器。
【請求項１６】
前記コア材料は結晶性のコア材料である、請求項７に記載の凍結保護組成物、方法または冷凍保存容器。
【請求項１７】
前記液体は水である、請求項７に記載の凍結保護組成物、方法または冷凍保存容器。
【請求項１８】
前記ナノ構造のそれぞれが、前記液体の比重よりも小さい比重、または、前記液体の比重と等しい比重によって特徴づけられる、請求項７に記載の凍結保護組成物、方法または冷凍保存容器。
【請求項１９】
前記ナノ構造および液体は、水の緩衝能力よりも大きい緩衝能力を含む、請求項７に記載の凍結保護組成物、方法または冷凍保存容器。
【請求項２０】
前記ナノ構造はヒドロキシアパタイトから配合される、請求項７に記載の凍結保護組成物、方法または冷凍保存容器。
【請求項２１】
１０体積％未満のグリセロールを含む、請求項１に記載の凍結保護組成物。
【請求項２２】
グリセロールを含まない、請求項１に記載の凍結保護組成物。
【請求項２３】
前記少なくとも１つの凍結保護剤は、アセトアミド、アガロース、アルギン酸塩、ｌ−アナリン、アルブミン、酢酸アンモニウム、ブタンジオール、コンドロイチン硫酸塩、クロロホルム、コリン、デキストラン、ジエチレングリコール、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エリトリトール、エタノール、エチレングリコール、ホルムアミド、グルコース、グリセロール、α−グリセロリン酸塩、グリセロールモノアセタート、グリシン、ヒドロキシエチルデンプン、イノシトール、ラクトース、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、マルトース、マンニトール、マンノース、メタノール、メチルアセトアミド、メチルホルムアミド、メチルウレア類、フェノール、プルロニックポリオール類、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、プロリン、プロピレングリコール、ピリジンＮ−オキシド、リボース、セリン、臭化ナトリウム、塩化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、ソルビトール、スクロース、トレハロース、トリエチレングリコール、トリメチルアミンアセタート、ウレア、バリンおよびキシロースからなる群から選択される、請求項１または６に記載の凍結保護組成物または方法。
【請求項２４】
安定剤をさらに含む、請求項１に記載の凍結保護組成物。
【請求項２５】
前記安定剤は、二価陽イオン、ラジカル捕捉剤、抗酸化剤、エチレン阻害剤または熱ショックタンパク質である、請求項２４に記載の凍結保護組成物。
【請求項２６】
前記エチレン阻害剤は、エチレン生合成阻害剤またはエチレン作用阻害剤である、請求項２５に記載の凍結保護組成物。
【請求項２７】
緩衝剤または培地をさらに含む、請求項１に記載の凍結保護組成物。
【請求項２８】
前記緩衝剤は、Ｔｒｉｓ緩衝剤またはリン酸塩緩衝剤である、請求項２７に記載の凍結保護組成物。
【請求項２９】
前記細胞材料は、体液、細胞培養物、細胞懸濁物、細胞マトリックス、組織、器官および生物体を含む群から選択される、請求項２または３に記載の方法。
【請求項３０】
前記体液は精液である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記精液は、乏精子症、奇形精子症または精子無力症の男性に由来する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞材料は植物細胞材料である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項３３】
前記植物細胞材料は、新生の針葉、葉、根、樹皮、幹、根茎、カルス細胞、プロトプラスト、細胞懸濁物、器官、分裂組織、種子および胚からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞材料は微生物細胞材料である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞材料は哺乳動物細胞材料である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項３６】
前記哺乳動物細胞材料は、幹細胞、精子、卵子および胚からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞材料は遺伝子改変されている、請求項２または３に記載の方法。
【請求項３８】
細胞材料を工程（ａ）の前に状態調節することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項３９】
前記状態調節は、安定剤処理、低温順応、熱ショック処理、および／または、凍結乾燥によって行われる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
工程（ａ）および工程（ｂ）は同時に行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項４１】
前記冷凍保存温度は約−８０℃未満である、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規な凍結保護組成物およびその使用方法に関連する。
【背景技術】
【０００２】
自然の命ずるところによれば、生物学的材料は崩壊し、死滅する。冷凍技術は、腐りやすい食品の劣化速度を遅くする手段を提供するが、はるかにより低い温度の使用は、生命体を仮死状態で長期間にわたって保管する手段を証明している。低温生物学の科学的分野は公式には、生きた精子が、グリセロールを効果的な保護剤として使用して氷点下の温度で長期間にわたって保存された５０年以上前の最初の発見の後で始まった［Ｐｏｌｇｅ  Ｃ，Ｓｍｉｔｈ  ＡＵおよびＰａｒｋｅｓ  ＡＳ（１９４９），Ｎａｔｕｒｅ，１６４，６６６］。適切に制御されないならば、冷凍保存は細胞の損傷および細胞生存能力における低下を引き起こし得るので、この発見は、改善された技術を発見するための道を開いた。
【０００３】
低温生物学は広範囲の様々な適用を包含し、また、多くのタイプの生物学的材料を長期間にわたって保管するための解決法を提供する潜在的可能性を有する。
【０００４】
細胞移植および組織移植が急速に、糖尿病［Ｊａｎｊｉｃら，Ｐａｎｃｒｅａｓ  １３：１６６〜１７２，１９９６］、心臓弁置換［Ｆｅｎｇら，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ  ６：２５１〜２５５，１９９２］、白内障［Ｔａｙｌｏｒ  Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２３：３２３〜３５３，１９８６］、皮膚置換［Ｄｅ  Ｌｕｃａら，Ｂｕｒｎｓ  １５：３０３〜３０９，１９８９］、ならびに、形成外科および再建手術［Ｈｉｂｉｎｏら，Ｊ  Ｃｒａｎｉｏｍａｘｉｌｌｏｆａｃ  Ｓｕｒｇ，２４：３４６〜３５１，１９９６］を含めるが、これらに限定されないいくつかの疾患および状態のための重要な処置になりつつある。
【０００５】
細胞および組織の移植がより広範囲に受け入れられ、使用されるにつれ、それらの長期間の保管のための改善された方法に対する要求もまた増大している。
【０００６】
細胞の冷凍保存は、健康な個体および健康でない個体の両方について、体外受精の分野に特に関連する。例えば、健康な男性は、精子を提供したいと思うことがあり（特に、職業上の危険（例えば、放射線）にさらされる男性）、その場合、精子は保存されなければならない。化学療法、放射線または精巣生検を受ける男性もまた、受精能を保持するために、処置前の自分の精子を保存したいと思うことがある。
【０００７】
世界の人口の２０％が、正常より劣った生殖能力に苦しんでいることが推定され、そのうちの６０％が男性である。この５０年間において、平均精子数および精子性状の両方が絶えず低下し続けている（世界保健機構、２００５）。若年齢において非常に低い精子産生（重篤な乏奇形精子無力症、Ｏ．Ｔ．Ａ．）を有する、正常より劣った生殖能力の男性からの精子が保存された場合には、このような男性が子供をもうける可能性が増大すると考えられる。
【０００８】
家畜動物（例えば、ウシおよびブタなど）からの精子の保存は、乳汁および食肉の市場に寄与するそれらの遺伝的改良を助けている。
【０００９】
雌性生殖細胞の保存およびドナー「卵子バンク」の形成は、自身の卵母細胞を産生することができない女性のための卵母細胞提供を容易にし、また、その費用を少なくすると考えられる。生存能力をもったままでの卵子の保管方法を提供することは、その生殖機会を遅らせたいと望む女性には利益となると考えられる。加えて、卵巣組織の保存は、その生殖健康状態を脅かし得る治療を受けようとしている女性には利益となると考えられる。
【００１０】
胚の冷凍保存のための方法が十分に確立されており、体外受精（ＩＶＦ）を受ける女性の胚を保存するために日常的に使用される。このことは、女性がもしも子供をもう１人もうけたいと思うたびに卵巣を刺激するための連続したホルモン処置の潜在的な損傷副作用を防止する。加えて、ＩＶＦ処置はストレスが多く、費用がかかる。冷凍保存は、女性が受けなければならない卵子回収の回数を減らし、その一方で、妊娠する多数の機会を提供することによって、ＩＶＦの不便さ、不快さおよび費用を軽減することを助ける。しかしながら、使用される技術には依然として、高度の技術的複雑さが伴い、また、凍結された胚が大きい割合で解凍手順後に生存していない（５０％〜６０％）。
【００１１】
精子、卵子および胚の保存はまた、絶滅危惧動物種を絶えさせないためにも、また、遺伝子組換え動物創始体を維持するためにも適切である。
【００１２】
臓器全体の長期間の保存は、低温生物学の科学に対する特別の課題である。ほとんどの臓器移植がドナーの死後直ちに行われる。臓器が生体外に取り出されたままにされる時間は、無酸素性および虚血性の損傷を軽減するように最小限に抑えられる。移植された臓器は、その後、臓器の回復または修復のための時間を全く有することなく、被移植者が生命維持システムから外された後直ちに機能しなければならない。組織の型決定および交差試験を行う（ドナーからの取得と、移植との間での）時間もまた、そのような対策がプロセスにもたらす著しい改善にもかかわらず、全くない。
【００１３】
取り出し後の臓器を十分な時間にわたって保存することは、これらの問題の多くを克服することを助けると考えられる。臓器のバンク化もまた、必要とされる移植片の総数に対して臓器入手性における不足である移植医療における最大の問題を解決することを助けると考えられる。
【００１４】
しかしながら、細胞を凍結するというプロセスは、細胞に対する熱的ショック、浸透圧ショックおよび／または機械的ショック、ならびに、細胞の構造体（特に、原形質膜）に損傷を与え得る結晶の形成の結果として過酷であり得る。加えて、凍結し、解凍するというプロセスは、細胞の損傷に対する潜在的可能性を伴う細胞の脱水を引き起こす。凍結保護物質の使用は、これらの問題のいくつかを緩和することに役立つ。一般に使用される凍結保護物質には、グリセロール、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、エチレングリコールおよびＤＭＳＯが含まれる。それにもかかわらず、凍結保護プロセスは低い細胞生存能力の成績により妨げられたままであり、多くの組織タイプおよび臓器が損傷を受け、良好に機能していない。
【００１５】
例えば、精液のための最も許容可能な凍結保護剤は、ＴＲＩＳ緩衝剤、卵黄およびグリセロールからなるＡｃｋｅｒｍａｎ培地（ＴＥＳ緩衝液）である。しかしながら、グリセロールは、精子の生存および機能に対する毒性作用を有することが知られている。従って、日常的に実施されるが、精子の冷凍保存技術は、凍結解凍手順後、わずかに２５％〜３０％の細胞生存能力が伴うだけである。冷凍保存後、卵子と受精することができる精子はほとんどなく、元気な胚をもたらす精子は一層少なくなっている［Ｔｈｏｍａｓ  ＣＡら，１９９８，Ｂｉｏ．Ｒｅｐｒｏｄ．，５８：７８６〜７９３］。
【００１６】
哺乳動物の卵母細胞を容易に生殖可能な様式で冷凍保存できることは未だ達成されておらず、成功はこれまで散発的である。絶え間ない懸念が生じており、成熟した卵母細胞の凍結および解凍が減数分裂紡錘体を破壊し、従って、そのような卵から生じる胚における異数性に対する潜在的可能性を増大させ得るかどうかが問題となっている。提供された卵母細胞の冷凍保存に関して、ある程度の成功をこの方法により示している報告がいくつかなされている（Ｐｏｌａｋ  ｄｅ  Ｆｒｉｅｄら，１９９８；Ｔｕｃｋｅｒら，１９９８ａ；Ｙａｎｇら，１９９８）。６名の妊婦が、これらの報告では、冷凍保存されたドナー卵母細胞から１０人の赤ちゃんを授かっている。加えて、凍結されたドナー卵母細胞を卵細胞質移入のために使用することが、解凍された卵細胞質提供の後で双子の出産に成功したこととともに報告されている（Ｌａｎｚｅｎｄｏｒｆら，１９９９）。マウスの卵母細胞を冷凍保存する研究では、非常に異なる生存率および受精率が報告される［Ｃａｒｒｏｌｌら，１９９３；Ｃａｒｒｏｌｌら，１９９０；Ｃｏｈｅｎら，１９８８；Ｇｅｏｒｇｅら，１９９４；Ｇｌｅｎｉｓｔｅｒら，１９９０；Ｇｏｏｋら，１９９３；Ｗｈｉｔｔｉｎｇｈａｍら，１９７７］。
【００１７】
一部の植物組織、微細藻類および原生動物が保存目的のために首尾良く冷凍保存されているが、多くの種は、成功した冷凍保存を受けることができない［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，１４，Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｒｅｅｚｅ−Ｄｒｙｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５］。
【００１８】
細胞の冷凍保存に伴う問題は、組織の冷凍保存の場合には悪化するばかりであり、臓器全体の冷凍保存に関しては一層大きく悪化するばかりである。多くの異なる細胞タイプが存在し、それぞれが、最適な冷凍保存のためのそれ自体の要求を有することにより、１つだけの熱プロトコルが細胞のすべてに強いられるとき、それぞれの回復が制限される。細胞外の氷は、氷が形成する可能性がある組織または器官（特に、血管の構成成分）の構造的一体性に対して機械的損傷を引き起こし得る。機械的な割れ目が、熱ストレスが低温で生じるとき、氷結晶の間に存在するガラス状固体において生じる。これらの割れ目は器官の構成部分を互いに分離させる。細胞間を形成する連結部、および、細胞と、その基底膜との間を形成する連結部の破壊が認められる。機械的ストレスが隙間水の浸透圧移動によって引き起こされる。これらのそれぞれが損傷のさらなる手に負えない恐るべき根源である。
【００１９】
従って、上記の制限を有しない冷凍保護技術を改良するための方法および組成物が必要であることが広く認識されており、また、そのような方法および組成物を有することは非常に好都合である。
【発明の開示】
【００２０】
本発明の１つの態様によれば、ナノ構造、液体および少なくとも１つの凍結保護剤を含む凍結保護組成物が提供される。
【００２１】
本発明の別の態様によれば、細胞材料を冷凍保存する方法であって、細胞材料を、ナノ構造および液体を含む組成物と接触させること、および、細胞材料を冷凍保存温度に供し、それにより、細胞材料を冷凍保存することを含む方法が提供される。
【００２２】
本発明のさらに別の態様によれば、冷凍保存された細胞材料を回復する方法であって、細胞材料を、ナノ構造および液体を含む組成物と接触させ、細胞材料を冷凍保存温度に供することによって細胞材料を冷凍保存すること、冷凍保護された細胞材料を解凍すること、および、組成物を除去し、それにより、冷凍保存された細胞材料を回復することを含む方法が提供される。
【００２３】
本発明のなおさらに別の態様によれば、ナノ構造、液体および少なくとも１つの凍結保護剤を含む凍結保護組成物を含む冷凍保存容器が提供される。
【００２４】
本発明のさらなる態様によれば、ナノ構造および液体を含む冷凍保存容器が提供される。
【００２５】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、凍結保護組成物はさらに、少なくとも１つの凍結保護剤を含む。
【００２６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ナノ構造は、液体の整列した流体分子によって包まれる（囲まれる）ナノメートルサイズのコア材料を含み、コア材料、および、整列した流体分子のエンベロープが定常的な物理的状態にある。
【００２７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ナノ構造はヒドロキシアパタイトから配合される。
【００２８】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、流体分子は、少なくとも２つの均一な流体組成物を含む不均一な流体組成物を含み、一方、液体は少なくとも２つの均一な流体組成物の少なくとも１つと同一である。
【００２９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、流体分子の少なくとも一部分は気体状態（ガス状状態）にある。
【００３０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ナノ構造の濃度が１０２０個／リットル未満である。
【００３１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ナノ構造の濃度が１０１５個／リットル未満である。
【００３２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ナノ構造はクラスターを形成することができる。
【００３３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ナノ構造はナノ構造間の遠距離相互作用を維持することができる。
【００３４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、組成物は、水に対する高まった超音波速度によって特徴づけられる。
【００３５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、コア材料は、強誘電性物質、強磁性物質および圧電性物質からなる群から選択される。
【００３６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、コア材料は結晶性のコア材料である。
【００３７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、液体は水である。
【００３８】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ナノ構造のそれぞれが、液体の比重よりも小さい比重、または、液体の比重と等しい比重によって特徴づけられる。
【００３９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ナノ構造および液体は、水の緩衝能力よりも大きい緩衝能力を含む。
【００４０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、凍結保護組成物は１０体積％未満のグリセロールを含む。
【００４１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、凍結保護組成物はグリセロールを含まない。
【００４２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、少なくとも１つの凍結保護剤は、アセトアミド、アガロース、アルギン酸塩、ｌ−アナリン、アルブミン、酢酸アンモニウム、ブタンジオール、コンドロイチン硫酸塩、クロロホルム、コリン、デキストラン、ジエチレングリコール、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エリトリトール、エタノール、エチレングリコール、ホルムアミド、グルコース、グリセロール、α−グリセロリン酸塩、グリセロールモノアセタート、グリシン、ヒドロキシエチルデンプン、イノシトール、ラクトース、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、マルトース、マンニトール、マンノース、メタノール、メチルアセトアミド、メチルホルムアミド、メチルウレア類、フェノール、プルロニックポリオール類、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、プロリン、プロピレングリコール、ピリジンＮ−オキシド、リボース、セリン、臭化ナトリウム、塩化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、ソルビトール、スクロース、トレハロース、トリエチレングリコール、トリメチルアミンアセタート、ウレア、バリンおよびキシロースからなる群から選択される。
【００４３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、凍結保護組成物はさらに安定剤を含む。
【００４４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、安定剤は、二価陽イオン、ラジカル捕捉剤、抗酸化剤、エチレン阻害剤または熱ショックタンパク質である。
【００４５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、エチレン阻害剤はエチレン生合成阻害剤またはエチレン作用阻害剤である。
【００４６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、凍結保護組成物はさらに緩衝剤または培地を含む。
【００４７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、緩衝剤はＴｒｉｓ緩衝剤またはリン酸塩緩衝剤である。
【００４８】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、細胞材料は、体液、細胞培養物、細胞懸濁物、細胞マトリックス、組織、器官および生物体を含む群から選択される。
【００４９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、体液は精液である。
【００５０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、精液は、乏精子症、奇形精子症または精子無力症の男性に由来する。
【００５１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、細胞材料は植物細胞材料である。
【００５２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、植物細胞材料は、新生の針葉（ｇｒｏｗｔｈ  ｎｅｅｄｌｅ）、葉、根、樹皮、幹、根茎、カルス細胞、プロトプラスト、細胞懸濁物、器官、分裂組織、種子および胚からなる群から選択される。
【００５３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、細胞材料は微生物細胞材料である。
【００５４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、細胞材料は哺乳動物細胞材料である。
【００５５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、哺乳動物細胞材料は、幹細胞、精子、卵子および胚からなる群から選択される。
【００５６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、細胞材料は遺伝子改変されている。
【００５７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、細胞材料を冷凍保存する方法はさらに、細胞材料を工程（ａ）の前に状態調節することを含む。
【００５８】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、状態調節とは、安定剤処理、低温順応、熱ショック処理、および／または、凍結乾燥によって行われる。
【００５９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、工程（ａ）および工程（ｂ）は同時に行われる。
【００６０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、冷凍保存温度は約−８０℃未満である。
【００６１】
本発明は、新規な凍結保護組成物および冷凍保存方法を提供することによって、現在知られている形態の欠点に対処することに成功している。
【００６２】
別途定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が下記に記載される。本明細書中に言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照として援用される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。さらに、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【００６３】
図面の簡単な記述
本明細書では本発明を単に例示し図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の好ましい実施態様を例示考察することだけを目的としており、本発明の原理や概念の側面の最も有用でかつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示していることを強調するものである。この点について、本発明を基本的に理解するのに必要である以上に詳細に本発明の構造の詳細は示さないが、図面について行う説明によって本発明のいくつもの形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【００６４】
図１Ａ〜Ｄは、標準的な凍結保護緩衝剤ＴＥＳに加えられたときの、ナノ構造を含む液体の凍結保護作用を例示する棒グラフである。図１Ａは、精子の活力に対する、ナノ構造を含む液体の存在下での冷凍保存の影響を例示する。図１Ｂは、精子の運動性に対する、ナノ構造を含む液体の存在下での冷凍保存の影響を例示する。図１Ｃは、精子の受精能力に対する、ナノ構造を含む液体の存在下での冷凍保存の影響を例示する。図１Ｄは、精子のＤＮＡ断片化に対する、ナノ構造を含む液体の存在下での冷凍保存の影響を例示する。
【００６５】
図２は、観測時間の関数としての本発明の液体組成物における絶対的な超音波速度の等温測定の結果を示す。
【００６６】
図３は５５７ｎｍでの吸光度によって測定されたときの様々な水組成物の水酸化ナトリウム滴定を例示するグラフである。
【００６７】
図４Ａ〜ＣはｐＨによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の水酸化ナトリウム滴定、および、ＲＯ水の水酸化ナトリウム滴定を例示する、三連で行われた実験のグラフである。
【００６８】
図５Ａ〜ＣはｐＨによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の水酸化ナトリウム滴定、および、ＲＯ水の水酸化ナトリウム滴定を例示するグラフである。それぞれのグラフは３つの三連での実験をまとめる。
【００６９】
図６Ａ〜ＣはｐＨによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の塩酸滴定、および、ＲＯ水の塩酸滴定を例示する、三連で行われた実験のグラフである。
【００７０】
図７はｐＨによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の塩酸滴定、および、ＲＯ水の塩酸滴定を例示するグラフである。それぞれのグラフは３つの三連での実験をまとめる。
【００７１】
図８Ａ〜Ｃは５５７ｎｍでの吸光度によって測定されたときの、ナノ構造を含む水、および、ＲＯ水の塩酸滴定（図８Ａ）および水酸化ナトリウム滴定（図８Ｂ〜図８Ｃ）を例示するグラフである。
【００７２】
図９Ａ〜ＢはＲＯの塩酸滴定の後でのキュベットの写真（図９Ａ）、および、ナノ構造を含む水の塩酸滴定の後でのキュベットの写真（図９Ｂ）である。それぞれのキュベットは１μｌの塩酸の添加を例示する。
【００７３】
図１０Ａ〜ＣはＲＦ水の塩酸滴定を例示するグラフ（図１０Ａ）、ＲＦ２水の塩酸滴定を例示するグラフ（図１０Ｂ）、および、ＲＯ水の塩酸滴定を例示するグラフ（図１０Ｃ）である。矢印は２回目の照射を示す。
【００７４】
図１１はＲＯ水と比較したときの、ＦＲ２水の塩酸滴定を例示するグラフである。実験を３回繰り返した。３回の実験のすべてについての平均値がＲＯ水についてプロットされた。
【００７５】
図１２Ａ〜Ｂは２つの異なるＴａｑポリメラーゼを使用する実施例７に記載されるプロトコルに従って加熱した後、ナノ構造を含む液体組成物の存在下および不在下で得られたＰＣＲ生成物を例示する、臭化エチジウムにより染色されたＤＮＡゲルの写真である。
【００７６】
図１３は２つの異なるＴａｑポリメラーゼを使用する実施例８に記載されるプロトコルに従って加熱した後、ナノ構造を含む液体組成物の存在下および不在下で得られたＰＣＲ生成物を例示する、臭化エチジウムにより染色されたＤＮＡゲルの写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７７】
本発明は、新規な凍結保護組成物およびその使用方法に関連する。
【００７８】
具体的には、本発明は、細胞材料を冷凍保存するために使用されることができ、それによって細胞材料の保存、輸送および取扱いを容易にする。
【００７９】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の記載において示されるか、または、図面において例示される構築の細部および構成成分の配置に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または、様々な方法で実施することができ、または、様々な方法で実施される。また、本明細書中で用いられる表現法および用語法は記述のためであって、限定するものとして見なすべきでないことを理解しなければならない。
【００８０】
低温生物学は広範囲の適用を包含し、また、多くのタイプの生物学的材料を長期間にわたって保管するための解決法を提供する潜在的可能性を有する。しかしながら、適切に制御されないならば、冷凍保存は、熱的ショック、浸透圧ショックおよび／または機械的ショック、ならびに、細胞の構造体（特に、原形質膜）に損傷を与え得る結晶の形成に起因する細胞の損傷および細胞生存能力における低下を引き起こし得る。加えて、凍結し、解凍するというプロセスは、細胞の損傷に対する潜在的可能性を伴う細胞の脱水を引き起こす。凍結保護物質（すなわち、凍結保護剤）の使用は、これらの問題のいくつかを緩和することに役立つ。一般に使用される凍結保護剤には、グリセロール、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、エチレングリコールおよびＤＭＳＯが含まれる。これらの凍結保護剤は、凍結中および解凍中における細胞の傷害を軽減するために不可欠ではあるが、細胞にとって毒性でもある。例えば、精子細胞に対するグリセロールの毒性作用が２％未満の濃度でさえ報告されている（ＴｕｌａｎｄｉおよびＭｃＩｎｎｅｓ，１９８４）。加えて、精子の運動性が、グリセロールの濃度が増大するにつれ、低下することが示されている（ＷｅｉｄｅｌおよびＰｒｉｎｓ，１９８７，Ｊ  Ａｎｄｒｏｌ．，Ｊａｎ−Ｆｅｂ，８（１）：４１〜７；Ｃｒｉｔｓｅｒら，１９８８，Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ．Ａｕｇ；５０（２）：３１４〜２０）。さらに、凍結保護剤の存在は、浸透圧ストレスに起因する精子細胞の傷害を誘発することが示された（Ｃｒｉｔｓｅｒら，１９８８，Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ．Ａｕｇ；５０（２）：３１４〜２０）。
【００８１】
従って、上記の制限を有しない新規な凍結保護組成物を有することは非常に好都合である。
【００８２】
本発明を実施に移しつつ、本発明者は、ナノ構造を含む組成物（例えば、米国特許出願第６０／５４５９５５号および同第１０／８６５９５５号ならびに国際特許出願公開番号ＷＯ２００５／０７９１５３に記載される組成物など）が、細胞材料を効率的に冷凍保存するために使用できることを発見している。
【００８３】
以下および続く実施例の欄において例示されるように、本発明者は、凍結保護剤（グリセロール）を含む緩衝剤の存在下でのナノ構造および液体は、凍結保護後の精子細胞を保護すること、および、解凍後の精子の性状を高めることの両方において、緩衝剤単独よりも効果的であることを明らかにしている。従って、本発明の組成物は、凍結保護のために必要である毒性凍結保護剤（例えば、グリセロールなど）の量を減らし、それにより、凍結保護剤の有害な作用を制限するために使用することができる。
【００８４】
従って、本発明の１つの態様によれば、ナノ構造と、液体と、場合により、少なくとも１つの凍結保護剤とを含む凍結保護組成物が提供される。
【００８５】
本明細書中で使用される場合、語句「凍結保護組成物」は、凍結中および解凍中における細胞の傷害（例えば、細胞内および細胞外での氷結晶の形成によって引き起こされる機械的傷害；および、細胞外での氷形成により引き起こされる変化する溶質条件によりもたらされる浸透圧の力によって引き起こされる傷害）を軽減する液体組成物を示す。
【００８６】
本明細書中で使用される場合、語句「凍結保護剤」は、凍結時および解凍時における細胞の傷害を軽減することによって冷凍保護プロセスを容易にする化学物質または化学溶液を示す。好ましくは、凍結保護剤は、凍結保護剤が使用される条件のもとで、（すなわち、特定の濃度において、特定の暴露時間について、また、特定の浸透圧モル濃度の培地において）細胞材料に対して非毒性である。本発明のこの態様によれば、凍結保護剤は細胞浸透性または非浸透性であり得る。凍結保護剤の例には、脱水剤、浸透圧剤およびガラス化溶質（すなわち、低温にさらされたとき、結晶性固体ではなく、ガラスへの溶液の転移を助ける溶質）が含まれるが、これらに限定されない。
【００８７】
理論にとらわれることはないが、非浸透性の凍結保護剤は細胞内の水の流出を阻害し、それにより、その最小臨界体積を超えた細胞収縮を防止することが考えられる。細胞の収縮を低下させることによって、凍結保護剤は細胞内流体の過剰濃縮を弱め、それにより、タンパク質の沈殿化を阻害する。浸透性の凍結保護剤は、細胞内で形成される氷の量を低下させ、従って、細胞膜およびオルガネラに対する物理的傷害の量を低下させる。
【００８８】
好ましくは、凍結保護剤およびその濃度は、経験に基づいて選択される。これは、それぞれの細胞が、そのタイプおよび環境に従って特定の様式で個々の凍結保護剤に応答するからである。典型的には、組織は、細胞懸濁物よりも多くの浸透性凍結保護剤を必要とする。逆に、小さい細胞の冷凍保存では、細胞膜を透過する薬剤が必要とされない場合がある。加えて、凍結保護剤およびその濃度は、以下でさらに記載されるように、冷凍保護の方法および段階に従って選択される。
【００８９】
本発明のこの態様に従って使用することができる凍結保護剤の例には、アセトアミド、アガロース、アルギン酸塩、ｌ−アナリン、アルブミン、酢酸アンモニウム、ブタンジオール、コンドロイチン硫酸塩、クロロホルム、コリン、デキストラン、ジエチレングリコール、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エリトリトール、エタノール、エチレングリコール、ホルムアミド、グルコース、グリセロール、α−グリセロリン酸塩、グリセロールモノアセタート、グリシン、ヒドロキシエチルデンプン、イノシトール、ラクトース、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、マルトース、マンニトール、マンノース、メタノール、メチルアセトアミド、メチルホルムアミド、メチルウレア類、フェノール、プルロニックポリオール類、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、プロリン、プロピレングリコール、ピリジンＮ−オキシド、リボース、セリン、臭化ナトリウム、塩化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、ソルビトール、スクロース、トレハロース、トリエチレングリコール、トリメチルアミンアセタート、ウレア、バリンおよびキシロースが含まれるが、これらに限定されない。
【００９０】
好ましくは、本発明の凍結保護組成物は（上記の理由のために）２０％未満のグリセロールを含み、一層より好ましくは、グリセロールを含まない。
【００９１】
述べられたように、本発明のこの態様の凍結保護剤はさらに、ナノ構造および液体を含む。
【００９２】
本明細書中で使用される用語「ナノ構造（ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」は、一つ以上の粒子を含むサブマイクロメートルスケールの構造を指し、それらの粒子の各々はナノメートル又はサブナノメートルスケールであり、一般に「ナノ粒子」と略される。構造の異なる要素（例えばナノ粒子、分子）の間の距離は、数十ピコメートル又はそれ未満のオーダであることができ（その場合においてナノ構造は「連続ナノ構造」と称される）、又は数百ピコメートルから数百ナノメートルのオーダであることができる（その場合においてナノ構造は「不連続ナノ構造」と称される）。従って、本実施態様のナノ構造は、ナノ粒子、ナノ粒子の配置、又は一つ以上のナノ粒子及び一つ以上の分子のいかなる配置も含むことができる。
【００９３】
上記組成物の液体は水性液体、例えば水であることが好ましい。
【００９４】
本発明のこの態様による一つの好ましい実施態様によれば、本発明の凍結保護組成物のナノ構造は、整列した流体分子によって包囲されたナノメートルサイズのコア材料を含み、それらは互いに定常的な物理的状態にある。
【００９５】
コア材料の例は、限定されないが、強誘電性物質、強磁性物質及び圧電性物質を含む。
【００９６】
強誘電性物質は、電場を加えることによって逆転又は再配向させることができる永続的な電気的分極をある温度範囲にわたって維持する物質である。強磁性物質は、磁場を加えることによって逆転できる永続的な磁化を維持する物質である。好ましくは、ナノ構造は、コア材料の強誘電性又は強磁性を保持し、それによってマクロスケールの物理的特性がナノスケール環境にもたらされる特別な特徴を有する。
【００９７】
コア材料はまた、結晶構造を持ってもよい。
【００９８】
本明細書中で使用される用語「整列した流体分子」は、相互関係を有する、例えば流体分子間の相関を有する流体分子の組織化された配置を示す。例えば、一つの流体分子の即座の変位は、コア材料を包囲する一つ以上の他の流体分子の即座の変位と相互に関係されることができる。
【００９９】
本明細書中で使用される用語「定常的な物理状態」は、物体または分子が、少なくとも局所的な最小値を有する何らかのポテンシャルによって結びついている状況を示す。そのようなポテンシャルについての代表的な例には、限定されないが、ファンデルワールスポテンシャル、湯川ポテンシャル、およびレナード・ジョーンズポテンシャルなどが含まれる。他の形態のポテンシャルもまた、考えられる。
【０１００】
好ましくは、エンベロープの流体分子は担体組成物の液体分子と同一である。エンベロープの流体分子は、担体組成物の液体分子と同一でない追加の流体を含んでもよく、従ってエンベロープは不均一流体組成物を含んでもよい。
【０１０１】
整列した流体分子のエンベロープの形成のため、本実施態様のナノ構造は、液体の比重より低いか又はそれに等しい比重を有することが好ましい。
【０１０２】
流体分子は液体状態又はガス状状態又はそれらの二つの混合状態のいずれかであってもよい。
【０１０３】
ナノ構造の好ましい濃度は１リットルあたり１０２０個未満のナノ構造、より好ましくは１リットルあたり１０１５個未満のナノ構造である。ナノ構造の濃度は好ましくは、本明細書において以下に記載されるような凍結保護の特定の段階または方法に従って選択される。
【０１０４】
好ましくは、液体中のナノ構造は、それらの間で引きつける静電力によってクラスター形成することができる。好ましくは、ナノ構造間の距離がクラスター形成（約０．５〜１０μｍ）を防止するとき、ナノ構造は長距離の相互作用を維持することができる。
【０１０５】
ナノ構造の長距離の相互作用は本発明者によって証明されている（後述する実施例の欄中の実施例２参照）。本実施態様の組成物は温度変化を受け、超音波速度に対する温度変化の影響が調査された。当業者によって認識されているように、超音波速度は組成物中のナノ構造間の相互作用に関係される。後述する実施例の欄において示されているように、本発明の担体組成物は、水に対して増強された超音波速度によって特徴づけられる。
【０１０６】
理論に拘束されないが、ナノ構造間の長距離の相互作用は凍結保護組成物の独自の特性を与えると考えられる。一つのこのような特徴は、後述する実施例の欄に示すように、ナノ構造および液体が、グリセロールのような他の凍結保護剤の凍結保護特性を増強できることである。これは、低濃度のグリセロールの添加（またはグリセロールの欠如）を可能にし、従って、潜在的な有毒な副作用が低減されるので有利である。別の特徴は、ナノ構造および液体が、安定する環境を与えることによって凍結保護特性を増強しうることである。例えば、担体組成物が熱からタンパク質を保護することができることが示される（図１２Ａ〜Ｂ、および図１３）。
【０１０７】
本発明者らは、本発明の組成物が増強された緩衝能力（即ち、水の緩衝能力より大きい）を含み、それがまた本発明の凍結保護特性に影響しうることを示した。
【０１０８】
本明細書中で使用される「緩衝能力」は、酸又は塩基が加えられると安定可能なｐＨを安定に維持する組成物の能力を示す。
【０１０９】
本発明のこの態様に従ったナノ構造の製造は、「トップダウン」プロセスを使用して行うことができる。このプロセスは、固体粉末（例えば、鉱物、セラミック粉末、ガラス粉末、金属粉末または合成ポリマー）が、十分に高い温度に、好ましくは約７００℃を越えて加熱される下記の方法工程を含む。意図される固体粉末の例には、ＢａＴｉＯ３、ＷＯ３およびＢａ２Ｆ９Ｏ１２が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１０】
驚いたことに、本発明者はまた、ハイドロキシアパタイト（ＨＡ）が本発明の液体組成物を生成するために加熱されてもよいことを示した。
【０１１１】
ハイドロキシアパタイトは、それが非毒性によって特徴づけられ、一般に人の治療のためにＦＤＡ承認されているので、特に好ましい。
【０１１２】
多くのハイドロキシアパタイト粉末がＳｉｇｍａ，Ａｌｄｒｉｃｈ及びＣｌａｒｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（例えばカタログＮｏ．１３０６−０６−５）のような多数の製造業者から入手可能であることが認識されるだろう。
【０１１３】
表２に示されるように、ＨＡに基づく液体組成物は全て、水と比較すると高い緩衝能力を持つ。
【０１１４】
加熱された粉末は次いで、冷たい液体に、その密度異常温度以下で、例えば３℃又は２℃で浸漬される。同時に、冷たい液体及び粉末は、電磁ＲＦ放射線、好ましくは５００ＭＨｚ以上のものによって照射され、それは連続波ＲＦ放射線又は変調ＲＦ放射線のいずれであってもよい。
【０１１５】
本発明の凍結保護組成物は１つ以上の安定化剤をさらに含むことができる。本明細書中で使用される場合、語句「安定化剤」は、細胞の生存能力を増大させる薬剤を示す。本発明の凍結保護組成物の安定化剤、および、その濃度は、細胞タイプおよび細胞環境に従って選択される。安定剤の濃度は一般に、約１μＭ〜約１ｍＭの間で使用されるか、または、好ましくは、約１０μＭ〜約１００μＭの間で使用される。
【０１１６】
１つの実施形態において、安定化剤は、有害な物質を培養培地から除くことによって細胞の生存能力を増大させる。安定化剤は、天然に存在する物質（すなわち、成長期間中の細胞または細胞死によって分泌される物質）および人為的に導入された物質の両方を培養培地から除くことができる。例えば、安定剤は、活性酸素種および他のフリーラジカルの存在に起因すると考えられる有害な作用を中和するラジカル捕捉剤化学物質または抗酸化剤であり得る。そのような物質は、細胞材料の冷凍保存および回復がひどく損なわれるように（内部または外部の両方で）細胞膜を損傷させ得る。これらの物質が除かれないならば、または、他の方法で無力化されないならば、生存能力に対するそれらの影響が時間とともに累積し、これにより、実用的な保管寿命がひどく制限される。そのうえ、細胞が死ぬとき、または、細胞がストレスを受けるとき、さらなる有害物質が放出され、これにより、隣接細胞の損傷および死を増大させる。
【０１１７】
本発明のこの態様に従って使用することができる酸素ラジカル捕捉剤および抗酸化剤の例には、還元型グルタチオン、１，１，３，３−テトラメチルウレア、１，１，３，３−テトラメチル−２−チオウレア、チオ硫酸ナトリウム、チオ硫酸銀、ベタイン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−（２−メルカプトプロピオニル）グリシン、β−メルカプトエチルアミン、セレノメチオニン、チオウレア、没食子酸プロピル、ジメルカプトプロパノール、アスコルビン酸、システイン、ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム、スペルミン、スペルミジン、フェルラ酸、セサモール、レゾルシノール、没食子酸プロピル、ＭＤＬ−７１８９７、カダベリン、プトレシン、１，３−ジアミノプロパン、１，２−ジアミノプロパン、デオキシグルコース、尿酸、サリチル酸、３−アミノ−１，２，４−トリアゾール、４−アミノ−１，２，４−トリアゾール、安息香酸、ヒドロキシルアミン、ならびに、そのような薬剤の組合せおよび誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１８】
植物細胞の冷凍保護において有用であり得る安定化剤には、エチレン生合成および／またはエチレン作用を妨げるか、または、実質的に阻止する薬剤が含まれ得る。植物細胞は、ストレスを受けたとき、毒性のエチレンを放出することが広く知られている。従って、エチレンの生成またはエチレンの作用のいずれかを阻止することにより、細胞生存能力および冷凍保護プロセスからの細胞回復がさらに高まる。
【０１１９】
本発明において使用することができるエチレン生合成阻害剤の例には、リゾビトキシン、メトキシルアミン塩酸、ヒドロキシルアミンアナログ、α−カナリン、ＤＮＰ（２，４−ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）ジニトロフェノール）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、スペルミン、スペルミジン、ＡＣＣアナログ、α−アミノイソ酪酸、没食子酸ｎ−プロピル、安息香酸、安息香酸誘導体、フェルラ酸、サリチル酸、サリチル酸誘導体、セサモール、カダバリン、ヒドロキノン、Ａｌａｒ  ＡＭＯ−１６１８、ＢＨＡ（ブチル化ヒドロキシアニソール）、フェニルエチルアミン、ブラシノステロイド、Ｐ−クロロメルクリベンゾエート、Ｎ−エチルマレイミド、ヨードアセタート、塩化コバルトおよび他の塩、ビピリジル、アミノ（オキシ酢酸）、塩化第二水銀および他の酸塩、サリチルアルコール、サリシン、塩化ニッケルおよび他の塩、カテコール、フロログルシノール、１，２−ジアミノプロパン、デスフェリオキサミン、インドメタシン、１，３−ジアミノプロパンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２０】
エチレン作用の阻害剤の例には、銀塩、ベンジルイソチオシアネート、硫酸８−ヒドロキシキノリン、クエン酸８−ヒドロキシキノリン、２，５−ノルボルナジエン、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン、Ｔｒａｎｓ−シクロオテン、７−ブロモ−５−クロロ−８−ヒドロキシキノリン、Ｃｉｓ−プロペニルホスホン酸、ジアゾシクロペンタジエン、メチルシクロプロパン、２−メチルシクロプロパン、カルボン酸、メチルシクロプロパンカルボキシレート、シクロオクタジエン、シクロオクトジン（クロロメチル）およびシクロプロパンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２１】
銀イオンはまた、様々な植物における強力な抗エチレン剤であり、植物組織および細胞培養物の寿命を改善することが知られている。本発明のこの態様に従って使用することができる銀イオンの例には、チオ亜硫酸銀、硝酸銀、塩化銀、酢酸銀、リン酸銀、クエン酸の三銀塩、安息香酸銀、硫酸銀、酸化銀、亜硝酸銀、シアン酸銀、乳酸の銀塩、ならびに、ペンタフルオロプロピオン酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩およびトルエンスルホン酸の銀塩が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２２】
別の実施形態において、安定化剤は、例えば、脂質二重層内にインターカレーションすること（例えば、ステロール、リン脂質、糖脂質、糖タンパク質）、または、膜タンパク質を安定化すること（例えば、二価陽イオン）により細胞膜を安定化することによって細胞生存能力を増大させる。本発明の凍結保護組成物において使用することができる二価陽イオンの例には、ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２およびＭｇＣｌ２が含まれるが、これらに限定されない。ナトリウムは、微量を超えた任意の濃度では、その毒性のためにそれほど好ましくない。好ましい濃度は約１ｍＭ〜約３０ｍＭの範囲であり、より好ましくは約５ｍＭ〜約２０ｍＭの範囲であり、さらにより好ましくは約１０ｍＭまたは１５ｍＭである。二価陽イオンもまた、凍結温度を下げ、また、細胞が凍結点をより迅速に通過することを可能にする。
【０１２３】
さらに別の実施形態において、安定化剤は、熱ショックを防止するか、または、最小限に抑えることによって細胞の生存能力を高める。従って、安定化剤は熱ショックタンパク質であり得るか、または、熱ショックタンパク質安定剤（例えば、上記されるように、二価陽イオン）であり得る。
【０１２４】
本発明の凍結保護組成物はさらに、安定剤、例えば、増殖因子、卵黄、血清（例えば、ウシ胎児血清）および抗生物質（例えば、チロシン、ゲンタマイシン、リンコスペクチンおよび／またはスペクチノマイシン）などを含むことができる。
【０１２５】
加えて、本発明の凍結保護組成物は増殖培地または緩衝剤を含むことができる。選択される培地または緩衝剤のタイプは、冷凍保護される細胞タイプに依存しており、複数の例がこの分野では広く知られている。許容され得る細胞緩衝剤の好適な例には、リン酸塩系緩衝剤（例えば、ＰＢＳなど）およびＴｒｉｓ系緩衝剤（例えば、Ｔｒｉｓ  ＥＤＴＡなど）が含まれる。本発明の凍結保護組成物に加えることができる増殖培地の一例がＤＭＥＭである。
【０１２６】
上述したように、本発明の組成物は凍結保護特性によって特徴づけられ、そのようなものとして、細胞材料を冷凍保存するために使用することができる。
【０１２７】
従って、本発明の別の態様によれば、（ａ）細胞材料を、ナノ構造および液体を含む組成物と接触させること、および、（ｂ）細胞材料を冷凍保存温度に供することを含む、細胞材料を冷凍保存する方法が提供される。
【０１２８】
本明細書中で使用される場合、用語「冷凍保存する」とは、非常に低い温度で保管することによって細胞材料の生存能力を維持または保存することを示す。典型的には、冷凍保存することは、凍結保護剤の存在下で行われる。好ましくは、細胞材料は、本発明の教示に従って少なくとも５年間にわたって冷凍保存することができる。
【０１２９】
本明細書中で使用される場合、語句「細胞材料（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｔｅｒ）」とは、細胞を含む生物学的材料を示す。
【０１３０】
本発明のこの態様に従って冷凍保存することができる細胞材料の例には、原核生物および真核生物細胞材料（例えば、哺乳動物、植物、酵母）、細胞性体液（例えば、脊髄液、血液、羊水、唾液、滑液、膣分泌物および精液）、単離された細胞、細胞培養物（例えば、細胞株、初代細胞培養物、酵母または細菌の培養物）、細胞懸濁物、固定化細胞（例えば、足場結合細胞）、組織、器官または生物体が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３１】
植物細胞材料の例には、新生の針葉、葉、根、樹皮、幹、根茎、カルス細胞、プロトプラスト、細胞懸濁物、器官、分裂組織、種子および胚、ならびに、それらの一部分が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３２】
具体的な実施形態において、細胞材料は、幹細胞、精子細胞または卵子（すなわち、卵母細胞）を含むことができる。
【０１３３】
別の具体的な実施形態において、細胞材料はナイーブであり得るか、または、遺伝子改変され得る。
【０１３４】
細胞材料は、生物または死体から得ることができる。例えば、細胞材料を手術（例えば、生検）によって、または、射精液で得ることができる。あるいは、細胞材料を研究室の細胞培養物から得ることができる。
【０１３５】
下記には、例示的な細胞材料についての典型的な冷凍保存手順が要約される。
【０１３６】
精液
精液を、好ましくは提供によって、正常な男性、乏精子症の男性、奇形精子症の男性または精子無力症の男性から得ることができるが、外科的方法によってもまた得ることができる。精液は、典型的には、受精の現実的機会が回復後に予定されているならば、冷凍保存されることが要求されるサンプルの量を決定するために、機能的検査に供される。精液サンプルは典型的には、本発明の凍結保護組成物と１：１の比率で混合され、静的な気相冷却を使用してストローにおいて０．５ｍｌのアリコートで凍結される。
【０１３７】
胚
胚は典型的には、体外受精後、着床前の段階（例えば、胚盤胞段階）で冷凍保存される。胚は、成功した冷凍保存を最適化するために、基準の範囲に従って選択される（例えば、１．胚盤胞の成長速度−５日目での成長速度は６日目での成長速度よりも大きくなければならず、このことは、結果として、７日目での成長速度よりも大きくなければならない；２．全体的な細胞数−数は（発達の日数に依存して）６０個以上の細胞でなければならない；３．栄養外胚葉：内部細胞塊に対する相対的な細胞配置；４．割球の規則性；５．単核化；および６．ＤＮＡ断片化）。
【０１３８】
標準的な胚冷凍保存技術では、胚を、単純なナトリウム系塩溶液中に希釈された本発明の凍結保護組成物に５分間〜１５分間暴露して取り込みを可能としてもよい。その後、胚は、胚を播種することができる約７℃に急速冷却され（−２℃／分）、そして、約−３０℃以下にゆっくり冷却され（−０．３℃／分〜−０．５℃／分）、その後、液体窒素の中に直接投入することができる。プログラム可能な冷凍庫が典型的には、制御された速度での冷却のために必要となる。胚は、急速方法を使用して解凍することができる。胚はまた、胚が数分間超暴露されるとき、細胞に対して毒性である非常に高い凍結保護可能な濃度（２Ｍ〜６Ｍ）を使用する場合だけ、急速に凍結またはガラス化することができる。
【０１３９】
卵母細胞
好ましくは、冷凍保存のために使用される卵母細胞は成熟している。成熟した卵母細胞を、外科的手順を使用して取り出すことができる。取り出す前に卵母細胞を刺激することもまた必要となり得る。典型的には、卵母細胞は、下記の基準に基づいて冷凍保存のために選択される：半透明、形状、および、第１極体の排出。卵母細胞を冷凍保存するための典型的なプロトコルが米国特許第６５００６０８号および米国特許第５９８５５３８号に記載される。
【０１４０】
幹細胞
多能性幹細胞の保存では、細胞は依然として成長可能でなければならないだけでなく、その分化能もまた保持しなければならない（すなわち、未分化の状態で維持されなければならない）ので、さらなる課題が低温生物学には提起される。従って、ある特定のシグナル伝達経路は依然として適切に機能しなければならず、また、凍結および乾燥に伴うストレスにより、早すぎる分化または誤った分化が誘導されてはならない。細胞の非分化表現型を維持する安定剤を解凍後直ちに含めることができる。
【０１４１】
典型的には、幹細胞の冷凍保存プロトコルには、（１）接着性幹細胞コロニーに適用される従来の緩速冷却プロトコル、および（２）接着性幹細胞コロニーおよび自由懸濁された幹細胞塊の両方のためのガラス化プロトコルが含まれる。
【０１４２】
皮膚
皮膚は典型的には、死体または健康な個体から取り出される。動物の皮膚組織もまた、移植での使用のために冷凍保存することができる。皮膚は典型的には、組織型決定が冷凍保存前または解凍後に行われる。皮膚細胞は冷凍保存の前にインビトロで培養および拡大することができる。冷凍保存では、典型的には、高速解凍プロトコルが要求される。このプロトコルの成功または失敗が、創傷床への移植片生着によるか、または、細胞生存能アッセイによるかのいずれかによって測定される。
【０１４３】
卵巣組織
卵巣組織（卵巣全体またはその一部）を健康な女性または健康でない女性から取り出すことができる。卵巣組織を冷凍保存するために好都合であり得る疾患の例には、ガン、悪性疾患（例えば、サラセミアなど）、および、ある特定の自己免疫状態が含まれる。早期閉経の履歴を有する健康な女性もまた、卵巣組織の冷凍保存を望み得る。取り出しまたは解凍の後で、組織は悪性細胞についてスクリーニングされ、また、その後の自己移植のために安全性について評価され得る。
【０１４４】
細胞材料は、冷凍保存手順を容易にするために状態調節することができ、または、本発明の組成物と直接に接触させることができる。本明細書中で使用される場合、用語「状態調節する」とは、細胞材料を、ナノ構造および／または凍結保護剤の毒性作用、ならびに／あるいは、低下させた温度の毒性作用から保護することを示す。例えば、細胞材料は安定剤により状態調節し、続いて、本発明の組成物の存在下でインキュベーションすることができる。あるいは、本発明の組成物を最初に細胞に適用し、その後、安定剤または他の凍結保護剤を加えることができる。
【０１４５】
安定剤の例が上記される。
【０１４６】
加えて、または、代替として、細胞材料は冷凍保護の前に低温順応させることができる。これは、安定剤による状態調節と同時に、または、安定剤による状態調節の後であっても、本発明の組成物とインキュベーションする前またはインキュベーションするのと同時のいずれかで行うことができる。これにより、細胞は、細胞の代謝が著しく遅くなり、また、より重大な意味をもつ温度変化のいくつかを通り抜ける急速な温度移行のショックが軽減されることによって冷凍保存プロセスのために準備される。重大な意味をもつ温度範囲は、細胞損傷の危険性が最も高いそのような範囲であり、例えば、氷の結晶が形成する臨界温度の付近である。当業者には知られているように、これらの温度は、溶液の組成に依存して幾分か変化する（水、すなわち、ほとんどの細胞培養培地の主成分については、氷結晶の形成および再形成が約０℃〜約−５０℃で生じる）。
【０１４７】
順応は、細胞の脱水の程度を任意の所与の浸透圧ポテンシャルでも低下させ、また、極端な脱水の期間中におけるタンパク質および膜の安定化に寄与する内因性溶質の蓄積をもたらす。
【０１４８】
順応を段階的様式で行うことができ、または、徐々に行うことができる。工程を、損傷を引き起こすことなく、細胞がより低い温度に順応することを可能にするために十分な期間に約０．５℃〜約１０℃の低下率で行うことができる。温度勾配は、徐々にであっても、または、段階的であっても、細胞に凍結点をできる限り迅速に通過させるように設定される。好ましくは、順応温度は約１℃〜約１５℃の間であり、より好ましくは約２℃〜約１０℃の間であり、一層より好ましくは約４℃である。細胞は、そのような低下させた温度に、段階的もしくは連続的な様式であっても徐々に、または、急速に順応させることができる。順応のための技術が当業者には広く知られており、これらには、市販の順応化装置が含まれる。緩やかな順応は、インキュベーション温度を、目標温度に到達するまで約１℃毎時で下げることを含む。緩やかな順応は、感受性が最も大きく、冷凍保護することが困難であると考えられるそのような細胞には最も有用である。段階的な順応は、細胞を、所定の期間低下させた温度に置き、続いて、さらに所定の期間さらなる低下させた温度に置くことを含む。これらの工程を、必要に応じて繰り返すことができる。
【０１４９】
細胞材料の凍結乾燥もまた、冷凍保護の前に行うことができる。凍結乾燥は、細胞の水分含有量を真空蒸発によって低下させることに関する。真空蒸発では、細胞を、低下させた空気圧の環境に置くことを含む。所望される水分除去速度に依存して、約−３０℃〜−５０℃の間での温度で作用する低下した周囲圧力は、１００ｔｏｒｒ、１ｔｏｒｒ、０．０１ｔｏｒｒ以下であり得る。減圧条件下では、水の蒸発速度が、細胞内の水の６５％までが一晩で除かれ得るように増大する。最適な条件により、水の除去を数時間以内で達成することができる。蒸発期間中の熱喪失により、細胞が冷却状態で維持される。真空レベルを注意深く調節することによって、細胞を、真空蒸発プロセスの期間中、低い順応温度で維持することができる。強い真空は、迅速な水除去を可能にする一方で、細胞を凍結の危険性にさらす。
【０１５０】
凍結を、熱を細胞に直接加えることによって、または、真空レベルの調節によって抑制することができる。細胞が最初に蒸発チャンバーに置かれるとき、細胞内の残留熱が凍結を防止するので、高真空を加えることができる。脱水が進み、細胞の温度が低下するにつれ、真空度を下げるか、または、加熱することで凍結を防止することができる。半乾燥の細胞は、蒸発チャンバーに飛散する傾向を有し得る。この傾向は、処理が終了したとき、気流がチャンバー内に戻されるときに特に高い。空気の流れが半乾燥の細胞に近づくならば、気流は細胞を空中に浮遊させ、サンプルの相互汚染を引き起こし得る。そのような乱れを防止するために、蒸発冷却を、細胞が、乾燥しながら、遠心力によってチューブに閉じ込められる真空遠心分離器において行うことができる。このプロセスで除かれる水の量を、細胞の乾燥重量の測定を行うことによって定期的にモニタリングすることができる。
【０１５１】
熱ショック処理もまた、冷凍保護前の順応に対する代替として行うことができる。熱ショック処理は、ストレスに対する適合化に関与することが推測されるある種のタンパク質（熱ショックタンパク質）のデノボ合成を誘導することが知られている。加えて、熱ショック処理は、膜およびタンパク質を安定化させるように作用する。熱ショック処理は冷凍保存後の細胞の生存を約２０％〜約４０％改善する傾向がある。この手法では、細胞材料（状態調節された細胞材料または状態調節されていない細胞材料のいずれでも）を、約３１℃〜約４５℃の間で、好ましくは約３３℃〜約４０℃の間で、より好ましくは約３７℃で水浴振とう機においてインキュベーションすることを含む。培養が数分間〜数時間行われ、好ましくは約１時間〜約６時間、より好ましくは約２時間〜約４時間行われる。
【０１５２】
上述したように、本発明のこの態様の方法は、細胞材料を本発明の組成物と接触させること（インキュベーションすること）によって行われる。好ましくは、接触させることは、ナノ構造の細胞内濃度および／または細胞外濃度を平衡化させるように作用する。本発明のこの態様の組成物を細胞材料に直接に加えることができ、または、細胞材料がインキュベーションされている培地に希釈することができる。平衡化のために要求される時間を最小限にするために、接触させることはおよそ室温で行うことができるが、最適な温度および負荷のための他の条件は、好ましくは、生存能力のある細胞を維持する条件（例えば、培地、光強度および酸素レベルなど）と一致する。
【０１５３】
本発明の組成物は細胞材料に直接に適用することができ、または、培養培地などの培地をインキュベーションする細胞材料に希釈することができる。加えて、段階的なインキュベーション（接触）を行うことができる。従って、例えば、段階的に接触させることを、細胞材料がナノ構造の増大する濃度の存在下でインキュベーションされるように行うことができる。従って、例えば、細胞材料を、最初は、１リットルあたり１０１０個のナノ構造を含む組成物と接触させることができ、最後は、１リットルあたり１０１５個のナノ構造を含む組成物と接触させることができる。
【０１５４】
段階的に接触させることは単一用量負荷よりも幾分か穏和であるので、段階的に接触させることが時には、細胞へのナノ構造の送達を容易にするために所望される。段階的に負荷するための添加の間における時間増分または時間間隔は、数分から数時間以上に及んでもよいが、約１分〜約１０分が好ましく、より好ましくは約１分〜約５分であり、さらにより好ましくは約１分または約２分の間隔である。段階的に接触させる手法における添加の回数は、典型的には、実用的であればどれも可能であり、ほんの数回から非常に多数にまで及び得る。好ましくは約２０回未満の添加であり、より好ましくは約１０回未満のであり、一層より好ましくは約５回である。間隔期間および間隔の数は特定のタイプの細胞および負荷剤について当業者によって容易に決定される。インキュベーション時間は、実用的であるように数分から数時間に及ぶ。
【０１５５】
本発明の組成物における凍結保護剤またはナノ構造は、接触させることにより、細胞材料のガラス化が誘発されるように、高い十分な濃度であり得る。
【０１５６】
ガラス化手法では、液体窒素でクエンチする前に、高濃度の溶液に直接にさらすことによる細胞材料の緩やかな浸透圧脱水または段階的な浸透圧脱水を含む。
【０１５７】
ガラス化する前に、細胞材料は、その濃度が、ガラス化をもたらすために十分に高くない本発明の組成物でインキュベーションすることができる。このことは主に、細胞膜およびおそらくはタンパク質の、脱水により誘導される脱安定化を防止するために役立つ。このような組成物は場合により、ガラス化の前に除去することができる。組成物が残留するならば、ナノ構造の濃度を、緩やかに、または、段階的な様式のいずれかで増大させ、ガラス化を容易にすることができる。細胞材料を最初に接触させるために使用される凍結保護剤以外に他の凍結保護剤を加えることができ、あるいは、同一の凍結保護剤もまた、より高い濃度ではあるが、上記で議論されたように段階的な様式または緩やかな様式で加えることができる。凍結保護剤の濃度は約４Ｍ〜約１０Ｍの範囲または約２５重量％〜約６０重量％の間であり得る。これにより、サンプル細胞の極度の脱水がもたらされる。７Ｍを越える溶液では典型的には、浸透圧活性な水の９０％超が細胞から除去される。しかしながら、それぞれの薬剤についての正確な濃度は経験的に決定することができる。ガラス化のために使用することができる凍結保護剤には、ＤＭＳＯ、プロピレングリコール、マンニトール、グリセロール、ポリエチレングリコール、エチレングリコール、ブタンジオール、ホルムアミド、プロパンジオール、および、これらの物質の混合物が含まれる。
【０１５８】
高濃度の凍結保護剤またはナノ構造にさらされることの傷害的結果を最小限に抑えるために、脱水を、できる限り短い暴露時間で約０℃〜約４℃で行うことができる。これらの条件のもとでは、細胞材料内へのさらなる凍結保護剤の流入が、水および溶質についての透過係数における違いのために認めることができない。結果として、細胞材料は収縮したままであり、ガラス化のために要求される細胞質ゾル濃度における増大が脱水によって達成される。
【０１５９】
本発明の組成物と接触させられている細胞材料は、冷凍保存温度に凍結することによって冷凍保存される。凍結速度は、急速凍結中に機械的な力によって細胞に引き起こされる損傷と、緩速凍結中に浸透圧の力によって細胞に引き起こされる損傷との間でのバランスを取らなければならない。異なる最適な冷却速度が細胞毎に記載されている。そのような異なる最適な冷却速度は、細胞の氷核形成定数および細胞膜の相転移温度が細胞毎に違うことに起因することが示唆されている（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／１４０５８；Ｋａｒｌｓｓｏｎら，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊ  ６５：２５２４〜２５３６，１９９３）。−１℃毎分〜−１０℃毎分の間での凍結速度が当該分野では好ましい（Ｋａｒｌｓｓｏｎら，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊ  ６５：２５２４〜２５３６，１９９３）。凍結は、十分に迅速で氷結晶の形成を阻害しなければならない。凍結時間は、およそ５分または４分、３分、２分または１分以下でなければならない。臨界凍結時間を１個の細胞の基準系から測定しなければならない。例えば、１０分を要して細胞の大きなサンプルを液体窒素の中に注いでもよいが、個々の細胞はこの方法によって急速に凍結される。
【０１６０】
上述したように、細胞材料をガラス化することができる。そのような条件のもとで、細胞材料は、細胞間または細胞内での氷形成を受けることなく、極めて速い速度で冷却することができる（過冷却することができる）。氷形成に影響を及ぼす要因のすべてを取り除くことと同様に、急速冷却によりまた、一部の細胞材料の低温感受性の問題が回避される。
【０１６１】
細胞材料を直接に凍結することができる。直接的な凍結方法では、細胞を極低温度の流体（例えば、液体窒素または液体ヘリウムなど）中に直接浸け、噴霧し、注入し、または注ぐことが含まれる。細胞材料はまた、冷却された固体（例えば、液体窒素により凍結されたスチール製ブロックなど）に直接に接触させることができる。極低温度の流体もまた、細胞材料に直接に注ぐことができる。直接的な方法はまた、細胞を、空気を含めて、ガスと極低温度で接触させることを包含する。窒素またはヘリウムの極低温のガス流を細胞懸濁物に直接に吹き付けることができ、または、細胞懸濁物の中に吹き込むことができる。間接的な方法では、細胞を容器に入れ、容器を極低温度での固体、液体またはガスと接触させることを含む。容器の例には、極低温度に耐えるように設計されたプラスチックバイアル、ガラスバイアル、アンプルが含まれる。間接的な凍結方法のための容器は、空気または液体に対して不透過性であってはならない。例えば、プラスチックバッグまたはアルミニウムホイルが適切である。そのうえ、容器は必ずしも極低温度に耐えることができなくてもよい。極低温度のもとで亀裂が生じるが実質的に無傷なままであるプラスチックバイアルもまた使用することができる。細胞はまた、細胞のサンプルを金属ホイルの一方の面に置き、一方、ホイルの反対側を極低温度の固体、液体またはガスと接触させることによって凍結することができる。
【０１６２】
本発明の組成物は冷凍保存に好適な容器に含むことができる。制限するように設計された容器は、好ましくは、化学物質（例えば、ナノ構造および下記で議論されるさらなる凍結保護剤）に対して不浸透性である。容器は、好ましくは、極低温に耐えることができる材料から作製される。好ましくは、容器は、凍結／解凍サイクル中での様々な成分の体積変化を吸収することができるように柔軟である。一層より好ましくは、本発明のこの態様の容器は、口の開いたチューブを含む。
【０１６３】
冷凍保存された細胞材料は、低温保管のために適切である温度で維持することができる。最終的な保管温度は細胞タイプに依存しており、しかし、一般には、およそ−８０℃〜−１９６℃（ドライアイスおよび液体窒素の冷凍庫によってそれぞれ維持される温度）であることが当該分野では知られている。好ましくは、細胞は、液体窒素（約−１９６℃）、液体アルゴン、液体ヘリウムまたは液体水素において維持される。これらの温度は細胞の長期間の保管のために最も適切であり、さらには、温度変動を最小限に抑えることができる。長期間の保管は、回復した際の細胞の生存能力を著しく失うことなく数ヶ月間、好ましくは数年間であり得る。短期間の保管（２〜３ヶ月未満の保管）もまた、所望され得、この場合、−１５０℃、−１００℃、または、−５０℃の保管温度でさえ使用することができる。ドライアイス（二酸化炭素）および市販の冷凍庫を、そのような温度を維持するために使用することができる。
【０１６４】
好適な解凍および回復は、細胞が元々の凍結された状態と実質的に同じ状態における細胞の生存および細胞の回復には不可欠である。冷凍保護された細胞材料の温度が解凍中に上がるにつれ、小さい氷の結晶はまとまり、サイズを増大させる。細胞内の大きい氷結晶は一般に、細胞の生存にとって有害である。このことが起こらないようにするために、冷凍保護された細胞材料はできる限り急速に解凍しなければならない。加熱速度は少なくとも３０℃毎分〜６０℃毎分であり得る。９０℃毎分、１４０℃毎分〜２００℃毎分またはそれ以上のより急速な加熱速度もまた使用することができる。急速加熱が所望される一方で、ほとんどの細胞は、室温を著しく超えるインキュベーション温度で生存するための能力が低い。加熱しすぎることを防止するために、細胞の温度が好ましくはモニタリングされる。任意の加熱方法を用いることができ、これには、伝導、対流、放射、電磁放射線またはそれらの組合せが含まれる。伝導による方法では、水浴に浸漬すること、ヒートブロックに入れること、または、裸火の中に直接入れることを含む。対流による方法では、ヒートガンまたはオーブンの使用を含む。放射による方法では、例えば、加熱ランプまたはオーブン（例えば、対流式オーブンまたは放射式オーブンなど）を含む。電磁放射線では、電子レンジおよび類似したデバイスの使用を含む。いくつかのデバイスはこれらの組合せによって加熱することができる。例えば、オーブンは対流および放射によって加熱する。加熱は、好ましくは、細胞および周囲の溶液が液状になると直ちに終了されるが、これは０℃を越えなければならない。冷凍保護されている細胞材料は、凍結点を低下させるナノ構造およびおそらくは他の薬剤の存在下で凍結されるので、凍結された細胞は、０℃よりも低い温度（例えば、約−１０℃、−２０℃、−３０℃または−４０℃など）で液化し得る。冷凍保護された細胞の解凍は、これらの温度のいずれでも、または、０℃を越える温度で終了することができる。
【０１６５】
ナノ構造および液体を含む組成物の希釈、ならびに、その後のその除去は、典型的には、冷凍保護された細胞材料を解凍した後できる限り迅速に、かつ、できる限り直ちに行われる。高濃度のナノ構造または凍結保護剤が組成物に存在するならば、浸透圧による膨張を最小限に抑えながら、懸濁媒体の希釈を行うことが好ましい。従って、懸濁媒体の希釈、および、細胞材料内からのナノ構造または他の凍結保護剤の流出を、高張性媒体での希釈によって、または、段階的な希釈によって達成することができる。
【０１６６】
解凍された細胞は、細胞が正常に機能することを可能にする条件に、または、細胞材料が解凍条件の後で成長させられることになるならば、成長を促す条件に徐々に順応させることができる。凍結保護剤は、細胞毒性、細胞増殖抑制性または変異誘発性であり得、好ましくは、解凍された細胞材料から、細胞を傷つけない速度で除去される。数多くの除去方法を使用することができる（例えば、再懸濁および遠心分離、透析、連続洗浄、バイオレメディエーション、ならびに、化学物質による中和、または、電磁放射線など）。ナノ構造および他の凍結保護剤の迅速な除去は細胞のストレスおよび死を増大させ得、従って、除去工程は徐々にでなければならない。除去速度は、より少ないナノ構造または凍結保護剤を含有する溶液による連続洗浄によって制御することができる。
【０１６７】
解凍および解凍後の処理を、（上記されるような）安定剤の存在下で行い、生存を保証し、かつ、遺伝子および細胞の損傷を最小限に抑えることができる。安定剤（例えば、二価陽イオンまたはエチレン阻害剤など）は、冷凍保存から生じる損傷性作用因を減らし、排除し、または中和する。そのような損傷性作用因には、フリーラジカル、酸化剤およびエチレンが含まれる。
【０１６８】
好ましくは、細胞材料は、解凍後も生存する細胞の割合を増大させるように、完全に機能する細胞を含む。以下の実施例の欄に記載されるように、妊娠の可能性が低かった異常な精子細胞は、本発明の凍結保護組成物の存在下では、正常な精子細胞よりも低下した凍結ストレス後の生存率を有した。従って、機能する精子細胞材料および機能しない精子細胞材料の混合物を本発明の組成物において冷凍保護することにより、機能する細胞：機能しない細胞の比率を増大させることができ、それにより、解凍後の受精の機会を改善することができる。
【０１６９】
好ましくは、細胞材料における細胞の少なくとも１０％、より好ましくは２０％、より好ましくは３０％、より好ましくは４０％、より好ましくは５０％、より好ましくは６０％、より好ましくは７０％、より好ましくは８０％、一層より好ましくは９０％が完全に機能し、生存能力を有する（例えば、精子細胞は運動性で、卵母細胞と受精することができなければならず、かつ、断片化したＤＮＡを含んではならない）。
【０１７０】
解凍後、細胞材料は、場合により、生存能力についてアッセイすることができ、または、移植のために直ちに使用することができる。生存能力は組織学的方法および機能的方法によって求めることができる。細胞は、例えば、形態学的指数、生体染料の排除および細胞内ｐＨを含めて、当該分野で知られている組織学的方法によってアッセイされる。
【０１７１】
好ましくは、１つ以上のインビトロアッセイを使用して、細胞材料の機能性を明らかにする。当該分野では広く知られているアッセイまたは診断検査をこれらの目的のために使用することができる。例えば、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｂｅｌｓｏｎ編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３を参照のこと。例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、クロマトグラフィーアッセイまたは酵素アッセイ、あるいは、分泌された産物について特異的なバイオアッセイを使用することができる。
【０１７２】
具体的には、細胞材料が精子を含有するならば、その状態を、波動分析、運動性アッセイおよび生存能力カウント数によって分析することができる。例えば、精液の全体的な顕微鏡分析を、波動を低倍率（例えば、１０倍）のもとで分析し、動きについてのスコアを０〜５（０は波動が全くなく、５は渦を伴う迅速な波動である）で割り当てることによって行うことができる。次に、より高倍率（例えば、４０倍）のもとで、運動性精子の数を計数し、総精子の百分率としてスコア化することができる。この百分率に後で濃度／カウント数を乗じ、視覚的に生存可能な精子の数を求める。精子の濃度は様々な手法によって求めることができる；０．９％の生理的食塩水により１：１０で希釈された精液を含有するマイクロキュベットがＳｐｅｒｍａｃｕｅ光度計でアッセイされる；または、精子の一連の希釈物（１：１０００）が作製され、血球計を用いて計数される。
【０１７３】
生存可能な精子比率の割合を、精子の展開サンプルの１５μｌの液滴をＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色（Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  Ｓｔａｉｎ，Ｌａｎｅ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｎｖｅｒ  Ｃｏｌｏ．）の１５μｌ液滴とともに顕微鏡スライドガラスに置くことによって求めることができる。薄い塗沫標本が、これら２滴を混合した後で調製される。サンプルは空気乾燥され、その後、２００個の精子が、１００倍の油浸レンズによる顕微鏡で、生体色素による染色によって計数される。
【０１７４】
最後に、精子の完全性を、精子の先体および尾部の形態学を、Ｓｐｅｒｍａｃ染色を使用して観察することによってアッセイすることができる。別の顕微鏡スライドが、精子の１５μｌの液滴を用いて調製され、空気乾燥され、その後、製造者の仕様書に従ってＳｐｅｒｍａｃにより染色される。サンプルの全体的な性状および形態学が、先体を無傷または非無傷として採点することによって、また、２００個の精子あたりの正常な尾部の数を計数することによって求められる。
【０１７５】
本明細書中で使用される場合、語句「約」は、±２０％を意味する。
【０１７６】
本発明のさらなる目的、利点および新規な特徴が、限定であることが意図されない下記の実施例を検討したとき、当業者には明らかになる。加えて、本明細書中上記に描かれるような、また、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【実施例】
【０１７７】
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
【０１７８】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技法は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ他著「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，米国メリーランド州バルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ著「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，米国ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ他、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎ他編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク（１９９８）；米国特許の４６６６８２８号、４６８３２０２号、４８０１５３１号、５１９２６５９号および５２７２０５７号に記載される方法；Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻（１９９４）；Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ他編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニューヨーク（１９８０）；また利用可能な免疫検定法は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている：米国特許の３７９１９３２号、３８３９１５３号、３８５０７５２号、３８５０５７８号、３８５３９８７号、３８６７５１７号、３８７９２６２号、３９０１６５４号、３９３５０７４号、３９８４５３３号、３９９６３４５号、４０３４０７４号、４０９８８７６号、４８７９２１９号、５０１１７７１号および５２８１５２１号；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（１９８４）；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」（１９８５）；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」（１９８４）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．著（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋ他、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；なお、これらの文献類は、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。それらの文献に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１７９】
実施例１
凍結および解凍の後における精子の性状に対する、ナノ構造を標準的な凍結保護溶液とともに含む希釈された液体の影響
ナノ構造を含む液体を標準的な凍結保護緩衝液に加えることにより、その凍結保護能が改善されるかどうかを確認するために、精子サンプルを、ナノ構造を含む液体の存在下または非存在下のいずれかで凍結し、精子の特徴を解凍後に分析した。
【０１８０】
材料および方法
精子運動性の測定：精子の運動性を、Ｈｅｌｂｅｒ小型カメラを使用して、運動性の精子細胞の数を計数することによって光学顕微鏡で測定した。
【０１８１】
精子生存能力の測定：精子の生存能力をエオシン・ニグロシン染色によって測定した。
【０１８２】
精子ＤＮＡ断片化の測定：精子のＤＮＡ断片化をＳＣＳＡ（精子クロマチン構造アッセイ）によって測定した。
【０１８３】
卵子と受精する精子能力の測定：卵子と受精する精子の能力をＭＳＯＭ（運動性精子オルガネラ形態学試験）によって測定した。この試験では、特定の正常な形態学および進行性の運動性（それぞれが、受精能を有する細胞についてのマーカーとして作用することが文献において示される）を有する精子細胞の数が調べられる。
【０１８４】
材料：ＴＲＩＳ緩衝剤、卵黄およびグリセロールを含む標準的な凍結保護緩衝液（ＴＥＳ緩衝液）をＩｒｖｉｎｅ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｓａｎｔａ  Ａｎｎａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から得た。
【０１８５】
実験手順：精子サンプルが、受精能力が正常よりも低い男性（男性不妊症クリニックにかかっている男性）によって提供され、このサンプルを、穏やかな温度低下プログラムを使用するＰＬＡＮＥＲ  ＫＲＹＯ−１０装置で凍結した。試料を、ＴＥＳの存在下（５０％の精液、５０％のＴＥＳ）または新規な凍結保護緩衝液の存在下（５０％の精液、２５％のＴＥＳおよび２５％のＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（Ｄｏ  Ｃｏｏｐ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、イスラエル）のいずれかで凍結した。凍結された精液を分析のために２日後に解凍した。精液の性状に対する凍結後のこれら２つの緩衝液の保護効果を、同じ精液の非凍結の非処理サンプルと比較した。実験を３回繰り返した。
【０１８６】
結果および結論
結果が以下の表１にまとめられる。
2009521949.tif 000002
【０１８７】
上記の表１から理解され得るように、また、図１Ａ〜図１Ｄに示されるように、凍結用カクテルが、ナノ構造を含む液体を含有するとき、精子の運動性、生存能力およびＤＮＡ断片化における改善が認められ、生存している正常な細胞の割合がより大きくなっている。
【０１８８】
従って、低い妊娠可能性を有する異常な精子細胞は、ナノ構造を含む液体の存在下では、凍結ストレスにより生き残れないと結論することができる。
【０１８９】
実施例２
超音波試験
本発明の組成物を超音波共振器における一連の超音波試験に供す。
【０１９０】
方法
本発明の組成物（本実施例ではＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）として示される）および２回蒸留水における超音波速度の測定を、ＲｅｓｏＳｃａｎ（登録商標）研究システム（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）を使用して行った。
【０１９１】
校正：ＲｅｓｏＳｃａｎ（登録商標）研究システムの両方のセルを、０．００５％のＴｗｅｅｎ２０が補充された標準水（脱塩水、Ｒｏｔｈ．Ａｒｔ．３１７５．２、Ｃｈａｒｇｅ：０３５６９０３６）で満たし、２０℃での等温測定の期間中に測定した。両方のセルの間における超音波速度の差を、本明細書中下記でさらに詳述されるような等温測定および温度走査におけるゼロ値として使用した。
【０１９２】
等温測定：ＲｅｓｏＳｃａｎ（登録商標）研究システムのセル１を参照として使用し、蒸留水（Ｒｏｔｈ  Ａｒｔ．３４７８１、ロット＃４８３６２０７７）で満たした。セル２を本発明の担体組成物で満たした。絶対値の超音波速度を２０℃で測定した。実験値の比較を可能にするために、超音波速度を２０．０００℃に補正した。
【０１９３】
結果
図２は、２０．０５１℃で測定されたときの、観測時間の関数としての絶対値の超音波速度Ｕを本発明の担体組成物（Ｕ２）および蒸留水（Ｕ１）について示す。両方のサンプルが観測の時間枠（３５分）において安定な等温速度を示した。
【０１９４】
下記の表２には、測定された超音波速度（Ｕ１、Ｕ２）および２０℃へのそれらの補正をまとめる。補正を、蒸留水については１℃あたり３ｍ／ｓの温度−速度補正を使用して計算した。
2009521949.tif 000003
【０１９５】
図２および表２に示されるように、蒸留水と、本発明の担体組成物との間における差が等温測定によって認められた。差ΔＵ＝Ｕ２−Ｕ１が、２０．０５１℃の温度では１５．６８ｃｍ／ｓであり、２０℃の温度では１３．６１ｃｍ／ｓであった。ΔＵの値は、ＲｅｓｏＳｃａｎ（登録商標）システムのどのノイズシグナルよりも著しく大きい。結果が第２のＲｅｓｏＳｃａｎ（登録商標）研究システムで１回繰り返された。
【０１９６】
実施例３
ナノ構造を含む組成物の緩衝能力
緩衝能力に対する、ナノ構造を含む組成物の影響を調べた。
【０１９７】
材料および方法
フェノールレッド溶液（２０ｍｇ／２５ｍｌ）を調製した。２９０μｌを、１３ｍｌのＲＯ水、または、ナノ構造を含む水（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）、Ｄｏ−Ｃｏｏｐ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、イスラエル）の様々なバッチに加えた。それぞれの水が、フェノールレッド溶液が加えられた後でのそれらの黄色または明るいオレンジ色により、それらのすべてが酸性であったが、異なる開始ｐＨを有したことが認められた。２．５ｍｌのそれぞれの水＋フェノールレッド溶液をキュベットに加えた。水酸化ナトリウムの増大する体積をそれぞれのキュベットに加え、吸収スペクトルを分光光度計で読み取った。酸性溶液はピークを４３０ｎｍにおいて与え、アルカリ性溶液はピークを５５７ｎｍにおいて与える。波長の範囲は２００ｎｍ〜８００ｎｍであり、しかし、０．０２Ｍ水酸化ナトリウムの添加に関連しては、グラフは５５７ｎｍの波長だけを示す。
【０１９８】
結果
表３には、水酸化ナトリウム滴定の後でのそれぞれの水の溶液の５５７ｎｍにおける吸光度がまとめられる。
2009521949.tif 000004
【０１９９】
図３および表３に例示されるように、ＲＯ水は、水酸化ナトリウムを加えたとき、ｐＨにおけるより大きい変化を示す。ＲＯ水はわずかな緩衝作用を有するが、吸光度が０．０９Ａに達したとき、緩衝作用が「破れ」、ｐＨ変化が、より多くの水酸化ナトリウムを加えた後ではより大きくなる。ＨＡ−９９水はＲＯと類似している。ＮＭ（＃１５０９０５−１０６）（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標））、ＡＢ水Ａｌｅｘａｎｄｅｒ（ＡＢ１−２２−１  ＨＡ  Ａｌｅｘａｎｄｅｒ）は若干の緩衝作用を有する。ＨＡＰおよびＨＡ−１８はＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）よりも一層大きい緩衝作用を示す。
【０２００】
まとめると、この実験から、ＨＡ−９９−Ｘを除いて、試験されたナノ構造を含むすべての新しい水タイプ（ＨＡＰ、ＡＢ１−２−３、ＨＡ−１８、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ）が、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）と類似した特性を示す。
【０２０１】
実施例４
ナノ構造を含む液体組成物の緩衝能力
緩衝能力に対する、ナノ構造を含む液体組成物の影響を調べた。
【０２０２】
材料および方法
水酸化ナトリウムおよび塩酸を、５０ｍｌのＲＯ水、または、ナノ構造を含む水（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）、Ｄｏ−Ｃｏｏｐ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、イスラエル）に加え、ｐＨを測定した。実験を三連で行った。すべてにおいて、３回の実験を行った。
水酸化ナトリウム滴定：１μｌ〜１５μｌの１Ｍ水酸化ナトリウムを加えた。
塩酸滴定：１μｌ〜１５μｌの１Ｍ塩酸を加えた。
【０２０３】
結果
水酸化ナトリウム滴定についての結果を図４Ａ〜Ｃおよび図５Ａ〜Ｃに示す。塩酸滴定についての結果を図６Ａ〜Ｃおよび図７に示す。
【０２０４】
ナノ構造を含む水は、ＲＯ水について必要とされる同じｐＨレベルに到達するためにより多量の水酸化ナトリウムを要求するので、ナノ構造を含む水は緩衝能力を有する。この特徴は７．６〜１０．５のｐＨ範囲においてより著しい。加えて、ナノ構造を含む水は、ＲＯ水について必要とされる同じｐＨレベルに到達するためにより多量の塩酸を必要とする。この作用は、アルカリ範囲よりも、酸性ｐＨ範囲での方が大きい。例えば、１０μｌの水酸化ナトリウム（１Ｍ）を（総和で）加えたとき、ＲＯのｐＨが７．５６から１０．３に増大した。ナノ構造を含む水のｐＨは７．６２から９．３３に増大した。１０μｌの塩酸（０．５Ｍ）を（総和で）加えたとき、ＲＯのｐＨが７．５２から４．３１に低下した。ナノ構造を含む水のｐＨは７．７１から６．６５に低下した。この特徴は７．７〜３のｐＨ範囲においてより著しい。
【０２０５】
実施例５
ナノ構造を含む液体組成物の緩衝能力
緩衝能力に対する、ナノ構造を含む液体組成物の影響を調べた。
【０２０６】
材料および方法
フェノールレッド溶液（２０ｍｇ／２５ｍｌ）を調製した。１ｍｌを、４５ｍｌのＲＯ水、または、ナノ構造を含む水（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）、Ｄｏ−Ｃｏｏｐ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、イスラエル）に加えた。ｐＨを測定し、必要ならば、滴定した。３ｍｌのそれぞれの水＋フェノールレッド溶液をキュベットに加えた。水酸化ナトリウムまたは塩酸の増大する体積をそれぞれのキュベットに加え、吸収スペクトルを分光光度計で読み取った。酸性溶液はピークを４３０ｎｍにおいて与え、アルカリ性溶液はピークを５５７ｎｍにおいて与える。波長の範囲は２００ｎｍ〜８００ｎｍであり、しかし、０．０２Ｍ水酸化ナトリウムの添加に関連しては、グラフは５５７ｎｍの波長だけを示す。
【０２０７】
塩酸滴定：
ＲＯ：４５ｍｌ  ｐＨ５．８
１ｍｌのフェノールレッドおよび５μｌの水酸化ナトリウム（１Ｍ）を加えた。新しいｐＨ＝７．８５
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（＃１５０９０５−１０６）：４５ｍｌ  ｐＨ６．３
１ｍｌのフェノールレッドおよび４μｌの水酸化ナトリウム（１Ｍ）を加えた。新しいｐＨ＝７．１９
【０２０８】
水酸化ナトリウム滴定：
Ｉ．ＲＯ：４５ｍｌ  ｐＨ５．７８
１ｍｌのフェノールレッド、６μｌの塩酸（０．２５Ｍ）および４μｌの水酸化ナトリウム（０．５Ｍ）を加えた。新しいｐＨ＝４．４３
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（＃１５０６０４−１０９）：４５ｍｌ  ｐＨ８．８
１ｍｌのフェノールレッドおよび４５μｌの塩酸（０．２５Ｍ）を加えた。新しいｐＨ＝４．４３
ＩＩ．ＲＯ：４５ｍｌ  ｐＨ５．７８
１ｍｌのフェノールレッドおよび５μｌの水酸化ナトリウム（０．５Ｍ）を加えた。新しいｐＨ＝６．４６
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（＃１２０１０４−１０７）：４５ｍｌ  ｐＨ８．６８
１ｍｌのフェノールレッドおよび５μｌの塩酸（０．５Ｍ）を加えた。新しいｐＨ＝６．９１
【０２０９】
結果
図８Ａ〜Ｃおよび図９Ａ〜Ｂに例示されるように、ナノ構造を含む水の緩衝能力はＲＯ水の緩衝能力よりも大きかった。
【０２１０】
実施例６
ＲＦ水の緩衝能力
緩衝能力に対するＲＦ水の影響を調べた。
【０２１１】
材料および方法
水酸化ナトリウム（１Ｍ）の数μｌの液滴を加えて、１５０ｍｌのＲＯ水のｐＨ（ｐＨ＝５．８）を上げた。この水の５０ｍｌを３つのボトルに等分した。３つの処理を行った：
ボトル１：非処理（ＲＯ水）
ボトル２：３０Ｗにより３０分間照射されたＲＯ水。このボトルは、滴定を開始する前に実験台に１０分間放置された（ＲＦ水）。
ボトル３：ｐＨが５に達したとき、２回目の照射に供されたＲＦ水。照射後、このボトルは、滴定を開始する前に実験台に１０分間放置された。
【０２１２】
１μｌの０．５Ｍ塩酸を５０ｍｌの水に加えることによって滴定を行った。ｐＨ値が４．２未満に達したときに滴定を終えた。
【０２１３】
実験を三連で行った。
【０２１４】
結果
図１０Ａ〜Ｃおよび図１１から理解され得るように、ＲＦ水およびＲＦ２水は、ナノ構造を含む担体組成物の緩衝特性と類似する緩衝特性を含む。
【０２１５】
実施例７
ナノ構造を含む液体組成物の安定化作用
ナノ構造を含む液体組成物がタンパク質の安定性をもたらしたかを確認するために、下記の実験を行った。
【０２１６】
材料および方法
２つの市販のＴａｑポリメラーゼ酵素（Ｐｅｑ−ｌａｂおよびＢｉｏ−ｌａｂ）を、ｄｄＨ２Ｏ（ＲＯ）におけるそれらの活性、および、ナノ構造を含む担体（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）、Ｄｏ−Ｃｏｏｐ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、イスラエル）におけるそれらの活性を求めるために、ＰＣＲ反応において調べた。酵素を１時間〜２．５時間までの種々の期間にわたって９５℃に加熱した。２つのタイプの反応液を作製した：
水のみ−酵素および水のみを煮沸した。
中味すべて−反応成分のすべてを煮沸した（酵素、水、緩衝液、ｄＮＴＰ類、ゲノムＤＮＡおよびプライマー）。
【０２１７】
煮沸後、必要とされる任意のさらなる反応成分をＰＣＲチューブに加え、通常のＰＣＲプログラムを３０サイクルに設定した。
【０２１８】
結果
図１２Ａ〜Ｂに示されるように、ナノ構造を含む担体組成物は、成分のすべてが熱ストレスに供された条件、および、酵素のみが熱ストレスに供された条件の両方の下で、酵素を加熱から保護した。対照的に、ＲＯ水は、成分のすべてが熱ストレスに供された条件下で、酵素を加熱から保護しただけであった。
【０２１９】
実施例８
ナノ構造を含む担体の安定化作用のさらなる例示
ナノ構造を含む担体組成物が２つの市販のＴａｑポリメラーゼ酵素（Ｐｅｑ−ｌａｂおよびＢｉｏ−ｌａｂ）の安定性をもたらしたかを確認するために、下記の実験を行った。
【０２２０】
材料および方法
ＰＣＲ反応を下記のように設定した：
Ｐｅｑ−ｌａｂサンプル：ナノ構造を含む担体組成物（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）、Ｄｏ−Ｃｏｏｐ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、イスラエル）、または、蒸留水（逆浸透＝ＲＯ）のいずれか２０．４μｌ。
０．１μｌのＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｑ−ｌａｂ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、５Ｕ／μｌ）
【０２２１】
３つのサンプルを設定し、９５℃の一定温度でのＰＣＲ装置に入れた。インキュベーション時間は、６０分、７５分および９０分であった。
【０２２２】
Ｔａｑ酵素の煮沸の後、下記の成分を加えた：
２．５μｌの１０Ｘ反応緩衝液Ｙ（Ｐｅｑ−ｌａｂ）
０．５μｌのｄＮＴＰ類（１０ｍＭ）（Ｂｉｏ−ｌａｂ）
１μｌのプライマー  ＧＡＰＤＨミックス  １０ｐｍｏｌ／μｌ
０．５μｌのゲノムＤＮＡ  ３５μｇ／μｌ
【０２２３】
Ｂｉｏｌａｂサンプル
ナノ構造を含む担体（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）、Ｄｏ−Ｃｏｏｐ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、イスラエル）、または、蒸留水（逆浸透＝ＲＯ）のいずれか１８．９μｌ。
０．１μｌのＴａｑポリメラーゼ（Ｂｉｏ−ｌａｂ、Ｔａｑポリメラーゼ、５Ｕ／μｌ）
【０２２４】
５つのサンプルを設定し、９５℃の一定温度でのＰＣＲ装置に入れた。インキュベーション時間は、６０分、７５分、９０分、１２０分および１５０分であった。
【０２２５】
Ｔａｑ酵素の煮沸の後、下記の成分を加えた：
２．５μｌのＴＡＱ  １０Ｘ緩衝液（Ｍｇ非含有）（Ｂｉｏ−ｌａｂ）
１．５μｌのＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）（Ｂｉｏ−ｌａｂ）
０．５μｌのｄＮＴＰ類（１０ｍＭ）（Ｂｉｏ−ｌａｂ）
１μｌのプライマー  ＧＡＰＤＨミックス（１０ｐｍｏｌ／μｌ）
０．５μｌのゲノムＤＮＡ（３５μｇ／μｌ）
【０２２６】
それぞれの処理（ＮｅｏｗａｔｅｒまたはＲＯ）のために、陽性コントロールおよび陰性コントロールを作製した。陽性コントロールは、酵素を煮沸することを伴わないものであった。陰性コントロールは、酵素を煮沸することを伴わず、かつ、ＤＮＡを反応において伴わないものであった。ＰＣＲミックスを、煮沸ｔａｑアッセイ、ならびに、コントロール反応のために作製した。
【０２２７】
サンプルをＰＣＲ装置に入れ、下記のように操作した：
【０２２８】
ＰＣＲプログラム：
１．９４℃で２分間の変性
２．９４℃で３０秒間の変性
３．６０℃で３０秒間のアニーリング
４．７２℃で３０秒間の伸長
工程２〜４を３０回繰り返す
５．７２℃で１０分間の伸長
【０２２９】
結果
図１３に示されるように、ナノ構造を含む液体組成物は、１．５時間までの期間、両方の酵素を熱ストレスから保護した。
【０２３０】
明確にするため別個の実施態様で説明されている本発明の特定の特徴は単一の実施態様に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施態様で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
【０２３１】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更及び変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更及び変形すべてを包含するものである。本願で挙げた刊行物、特許及び特許願はすべて、個々の刊行物、特許及び特許願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用又は確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０２３２】
【図１】標準的な凍結保護緩衝剤ＴＥＳに加えられたときの、ナノ構造を含む液体の凍結保護作用を例示する棒グラフである。
【図２】観測時間の関数としての本発明の液体組成物における絶対的な超音波速度の等温測定の結果を示す。
【図３】５５７ｎｍでの吸光度によって測定されたときの様々な水組成物の水酸化ナトリウム滴定を例示するグラフである。
【図４】ｐＨによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の水酸化ナトリウム滴定、および、ＲＯ水の水酸化ナトリウム滴定を例示する、三連で行われた実験のグラフである（図４ａ〜図４ｃ）。
【図５】ｐＨによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の水酸化ナトリウム滴定、および、ＲＯ水の水酸化ナトリウム滴定を例示するグラフである。それぞれのグラフは３つの三連での実験をまとめる（図５ａ〜図５ｃ）。
【図６】ｐＨによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の塩酸滴定、および、ＲＯ水の塩酸滴定を例示する、三連で行われた実験のグラフである（図６ａ〜図６ｃ）。
【図７】ｐＨによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の塩酸滴定、および、ＲＯ水の塩酸滴定を例示するグラフである。それぞれのグラフは３つの三連での実験をまとめる。
【図８】５５７ｎｍでの吸光度によって測定されたときの、ナノ構造を含む水、および、ＲＯ水の塩酸滴定（図８ａ）および水酸化ナトリウム滴定（図８ｂ〜図８ｃ）を例示するグラフである。
【図９】ＲＯの塩酸滴定の後でのキュベットの写真（図９ａ）、および、ナノ構造を含む水の塩酸滴定の後でのキュベットの写真（図９ｂ）である。それぞれのキュベットは１μｌの塩酸の添加を例示する。
【図１０】ＲＦ水の塩酸滴定を例示するグラフ（図１０ａ）、ＲＦ２水の塩酸滴定を例示するグラフ（図１０ｂ）、および、ＲＯ水の塩酸滴定を例示するグラフ（図１０ｃ）である。矢印は２回目の照射を示す。
【図１１】ＲＯ水と比較したときの、ＦＲ２水の塩酸滴定を例示するグラフである。実験を３回繰り返した。３回の実験のすべてについての平均値がＲＯ水についてプロットされた。
【図１２】２つの異なるＴａｑポリメラーゼを使用する実施例７に記載されるプロトコルに従って加熱した後、ナノ構造を含む液体組成物の存在下および不在下で得られたＰＣＲ生成物を例示する、臭化エチジウムにより染色されたＤＮＡゲルの写真である（図１２ａ〜図１２ｂ）。
【図１３】２つの異なるＴａｑポリメラーゼを使用する実施例８に記載されるプロトコルに従って加熱した後、ナノ構造を含む液体組成物の存在下および不在下で得られたＰＣＲ生成物を例示する、臭化エチジウムにより染色されたＤＮＡゲルの写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図９】
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