(57)【要約】コポリマー-１は、アラニン、グルタミン酸、リジン及びチロシンから構成される合成ポリペプチドの混合物である。本発明は、１つの反応で行われる、保護コポリマー-１の脱遮断により特徴付けられる、コポリマー-１の改善された製造方法に関する。本発明の方法は、高収率で製造が容易であるという利点を有する。コポリマー-１は多発性硬化症の治療において有用な医薬である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶媒中でアラニン、ε-Ｎ-R1-リジン、Ｏ-R2-チロシン及びγ-R3-グルタメートの各Ｎ-カルボキシ無水物と開始剤とを反応させて保護コポリマー-１を作製し、該保護コポリマー-１を脱保護してコポリマー-１を作製することを含んでなり、保護基R1、R2、 R3は、塩基切断、酸分解、チオール分解、水素添加又は酵素触媒性加水分解により一工程で除去され得る有機基である、コポリマー-１の製造方法。
【請求項２】
R1、R2、R3が３つより多い炭素原子のアルキル基及び/又は芳香族基である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
保護基R1が、ベンジルオキシカルボニル基、4-メトキシベンジルオキシカルボニル基、α,α-ジメチル3,5-ジメトキシベンジルオキシ基、2-(4-ビフェニリル)イソプロポキシカルボニル基、ｔ-ブチルオキシカルボニル基、2,2,2-トリクロロエトキシカルボニル基、ｔ-アミルオキシカルボニル基、アダマンチルオキシカルボニル基、アリルオキシカルボニル基、o-ニトロフェニルスルフェニル基、トリチル基、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基、フェニルアセチル基及びピログルタミル基からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
保護基R2が、ベンジル基、2,6-ジクロロベンジル基、2-ブロモベンジルオキシカルボニル基、ｔ-ブチル基及び2,4-ジニトロフェニル基からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
保護基R3が、シクロヘキシルエステル、ベンジルエステル、ｔ-ブチルエステル、アリルエステル、アダマンチル基、9-フルオレニルメチル基からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
コポリマー-１が、モル比L-Ala：L-Glu：L-Lys：L-Tyrがおよそ0.427：0.150：0.327：0.100のアラニン、グルタミン酸、リジン及びチロシンから構成されるポリペプチドの混合物であり、その偏差は約±10％まで変化してよい、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
開始剤がナトリウムメトキシド又はナトリウムｔ-ブトキシドである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
開始剤がアミン開始剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
アミン開始剤が、ジエチルアミン、ヘキシルアミン及びフェネチルアミンからなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
開始剤が遷移金属開始剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
遷移金属開始剤がbbyNi(COD)又は(Pme3)4Coである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
重合が、エーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド、Ｎ-メチルピロリドン、スルホラン、ニトロベンゼン、テトラメチル尿素及びジメチルスルホンからなる群より選択される有機溶剤中で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
保護コポリマー-１が、Ｏ-ベンジル-チロシン、アラニン、γ-ベンジル-グルタメート及びε-Ｎ-ベンジルオキシカルボニル-リジンの各Ｎ-カルボキシ無水物から製造される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
保護コポリマー-１が、Ｏ-ｔ-ブチル-チロシン、アラニン、γ-ｔ-ブチル-グルタメート及びε-Ｎ-ｔ-ブチルオキシカルボニル-リジンの各Ｎ-カルボキシ無水物から製造される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
保護コポリマー-１が、Ｏ-ベンジル-チロシン、アラニン、γ-ベンジル-グルタメート及びε-Ｎ-ベンジルオキシカルボニル-リジンの混合物から、トリホスゲン、ホスゲン又はジホスゲン及び開始剤を用いて製造される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
保護コポリマー-１が、Ｎ-ｔ-ブチルオキシカルボニル保護Ｏ-ｔ-ブチル-チロシン、アラニン、γ-ｔ-ブチル-グルタメート及びε-Ｎ-ｔ-ブチルオキシカルボニル-リジンの混合物から、トリエチルアミン/トリホスゲン、ホスゲン又はジホスゲン及び開始剤を用いて製造される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
保護コポリマー-１の脱保護が、氷酢酸中での臭化水素との反応により達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
保護コポリマー-１の脱保護が、酢酸、ジオキサン又は酢酸エチルの溶媒中でのトリフルオロ酢酸又は塩化水素との反応により達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
溶媒がエーテルであり、開始剤がジエチルアミンである、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
コポリマー-１が、セファデックスG25又はセファデックスG50により精製される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、2005年８月15日出願の米国仮特許出願第60/708,218号に基づく優先権を主張する。この仮特許出願の内容は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【０００２】
（発明の背景）
１．発明の分野
本発明は、コポリマー-１の改善された製造方法に関する。構造式は、ポリ[L-Alaw、L-Glux、L-Lysy、L-Tyrz]・n (CH3CO2H)  (式中、w、x、y、zは０〜１の間である)である。好ましくは、コポリマー-１は、およそ0.427：0.150：0.327：0.100のL-Ala：L-Glu：L-Lys：L-Tyrのモル比を有し、その偏差は約±10％まで変化してもよい。
【背景技術】
【０００３】
２．関連技術の説明
コポリマー-１は多発性硬化症のための免疫療法で使用される。これは、アラニン、グルタミン酸、リジン及びチロシンから構成される合成ポリペプチドの混合物である。チロシン、アラニン、γ-ベンジルグルタメート及びε-Ｎ-トリフルオロ-アセチルリジンの各Ｎ-カルボキシ無水物を、開始剤としてジエチルアミンを用いて無水ジオキサン中で重合する、コポリマー-１の製造方法が公知である(米国特許第3,849,550号)。グルタミン酸のγ-カルボキシル基の脱遮断(deblocking)が氷酢酸中の臭化水素により達成され、続いて１Ｍピペリジンによりリジン残基からトリフルオロアセチル基が除去される。
【０００４】
この公知方法によれば、ベンジルエステル保護基及びＮ-トリフルオロアセチル保護基の除去には、２つの別々の脱遮断が必要である。コポリマー-１は、ピペリジン及びそのトリフルオロアセチル誘導体を除去しコポリマー-１を酢酸塩に変換する冗長な透析方法によって単離された。更に、チロシンＮ-カルボキシ無水物側鎖の未保護フェノール基が、アミン開始剤と反応して求核性フェノラートアニオンを形成することにより、重合を複雑にする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、より経済的でより単純な商業的合成のために、現行の方法を改善する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
３．発明の要旨
本願の方法は、コポリマー-１の製造方法、具体的には所望のアミノ酸組成及び分子量分布を有するコポリマー-１の製造方法を記載する。この新規な方法のおかげで、先行技術における未保護コポリマー-１を取得するための２つの別々の工程が、１つの単純な工程に減った。この方法は、開始剤を用いる、不活性溶剤中でのアラニン、γ-ベンジルグルタメート、ε-Ｎ-ベンジルオキシカルボニルリジン及びＯ-ベンジルチロシンの各Ｎ-カルボキシ無水物(NCA)(それぞれ、Ala-NCA、Glu(OBzl)-NCA、Lys(Z)-NCA、Tyr(Bzl)-NCA)の共重合からなる。Tyr(Bzl)-NCAを選択したことにより、安定であること、結晶、高純度での取得容易という利点が提供される。４つのアミノ酸NCA及びジエチルアミンを含む共重合により、再現可能なアミノ酸組成及び分子量分布を有するコポリマー-１が提供される。重合の完了後、反応混合物に水を加えて完全保護コポリマー-１を沈降させた。対応する保護コポリマー-１の全ての保護基は、氷酢酸中の臭化水素により、僅か一工程で除去できる。脱保護の完了に際して、過剰の臭化水素酸及び酢酸を除去し、臭化水素酸塩として粗製コポリマー-１を得た。粗製コポリマー-１ HBr塩を１Ｎ酢酸中に溶解し、セファデックス(Sephadex)G25により精製して低分子量物質を除去した。精製コポリマー-１ HBr塩を炭酸ナトリウムで処理してpH８〜９にし、次いで酢酸によりpH３〜４まで酸性にし、HBr塩をコポリマー-１酢酸塩に変換させた。コポリマー-１酢酸塩を１Ｎ酢酸で溶出させるセファデックスG50により更に精製して、所望の分子量範囲を有するコポリマー-１酢酸塩を回収できる。コポリマー-１酢酸塩の良好な収率は、このようにして得られる。
【０００７】
保護基たる、グルタミン酸のγ-ベンジル基又はチロシンのＯ-ベンジル基の除去は、氷酢酸中の臭化水素によって除去されるためには、より長期間を必要とすることも判明した。一工程を用い、より高効率で穏やかな条件下にて保護前駆体からコポリマー-１を取得するための別の方法が開発された。この方法は、開始剤を用いる、不活性溶剤中でのアラニン、γ-ｔ-ブチルグルタメート、ε-Ｎ-ｔ-ブチルオキシカルボニルリジン及びＯ-ｔ-ブチルチロシンの各Ｎ-カルボキシ無水物(それぞれ、Ala-NCA、Glu(OBut)-NCA、Lys(Boc)-NCA、Tyr(But)-NCA)の共重合からなる。４つのアミノ酸NCA及びジエチルアミンを含む共重合により、再現可能なアミノ酸組成及び分子量分布を有するコポリマー-１が提供される。重合の完了後、反応混合物に水を加えて完全保護コポリマー-１を沈降させた。対応する保護コポリマー-１の全ての保護基は、氷酢酸中の塩化水素により、僅か一工程で、除去できる。脱保護の完了に際して、過剰の臭化水素酸及び酢酸を除去し、塩酸塩として粗製コポリマー-１を得た。粗製コポリマー-１ HCl塩を１Ｎ酢酸中に溶解し、セファデックスG25により精製して低分子量物質を除去した。精製コポリマー-１ HCl塩を炭酸ナトリウムで処理してpH８〜９にし、次いで酢酸によりpH３〜４まで酸性にし、HBr塩をコポリマー-１酢酸塩に変換させた。コポリマー-１酢酸塩を１Ｎ酢酸で溶出させるセファデックスG50により更に精製して、所望の分子量範囲を有するコポリマー-１酢酸塩を回収できる。コポリマー-１酢酸塩の良好な収率は、このようにして得られる。氷酢酸中の塩化水素は、ジオキサン又は酢酸エチル中のトリフルオロ酢酸、塩化水素で置換可能である。
【０００８】
全てのアミノ酸NCAは、溶媒中での対応するＮ-ブチルオキシカルボニル-アミノ酸とトリホスゲン及びトリエチルアミンとの反応により製造できる[J. Org. Chem. 1992, 57, 2755-2756]。Ala-NCA、Glu(OBzl)-NCA、Lys(Z)-NCA及びTyr(Bzl)-NCAはまた、対応するＮ-未保護アミノ酸とホスゲン、ジホスゲン又はトリホスゲンとの反応により製造できる[Tetrahedron Letters 1988, 29, 5859-5862]。
【０００９】
実際、アミノ酸NCA合成の反応条件は同様である。コポリマー-１の製造コストを削減するために、出発化合物として、アミノ酸NCAの代わりに、アラニン、γ-ベンジルグルタメート、ε-Ｎ-ベンジルオキシカルボニルリジン及びＯ-ベンジルチロシンの混合物を使用できる。１つの反応器で、アミノ酸混合物は、同一反応によって対応するアミノ酸NCA混合物に変換できる。アミノ酸NCAは、続く共重合で、コポリマー-１に変換できる。同様に、アラニン、γ-ｔ-ブチルグルタメート、ε-Ｎｔ-ブチルオキシカルボニルリジン及びＯ-ｔ-ブチルチロシンの混合物もまた、直接、出発化合物として使用できる。
【００１０】
NCAの重合は、溶剤(例えば、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド、Ｎ-メチルピロリドン、スルホラン、ニトロベンゼン、テトラメチル尿素、ジメチルスルホン、又はNCAを溶解でき、その結果均一系反応を生じる他の不活性溶剤)中で上記４つのNCAを単純に混合することにより行うことができる。
【００１１】
反応は、開始剤溶液の添加により開始した。有機アミンが好ましい開始剤である。使用する総NCAに対する開始剤のモル比は、0.7％〜５％の範囲である。反応は、任意の好都合の温度で行うことができるが、０〜50℃の温度が好ましい。他の開始剤としては、ナトリウムメトキシド、ナトリウムｔ-ブトキシド、ヘキシルアミン、フェネチルアミン又は遷移金属開始剤(例えばbbyNi(COD)、(Pme3)4Co)が挙げられる。
【００１２】
（図面の簡単な説明）
図１は、セファデックスG25カラムを通したコポリマー-１ HBrの溶出プロフィールを示す。
【００１３】
図２は、セファデックスG-50カラムを通したコポリマー-１アセテートの溶出プロフィールを示す。
【００１４】
以下の非限定的実施例により、本発明を説明する。
【００１５】
本発明の他の目的及び特徴は、添付の図面と併せて考慮すれば、以下の詳細な説明から明らかになる。しかし、図面は、説明のためのみに描かれ、本発明の範囲を規定するものとして描かれてはおらず、本発明の範囲の規定のためには、添付の特許請求の範囲を参照すべきであることを理解すべきである。図面は必ずしも一定の縮尺で描かれていないこと、及び特に示さない限り、それらは単に本明細書中に記載された構成及び手順を概念的に説明することを意図されていることをもまた理解すべきである。以下の非制限的な実施例により本発明を説明する。
【００１６】
実施例１
Ｎ-カルボキシ無水物の製造及び精製のための一般手順
アミノ酸及びトリホスゲンを、室温で乾燥酢酸エチル又はテトラヒドロフラン中に懸濁した。得られた混合物を、均質溶液が得られるまで、50〜60℃にて撹拌した。Ｎ-ヘキサンを反応混合物に加えて、所望のＮ-カルボキシ無水物を沈降させた。粗製Ｎ-カルボキシ無水物を酢酸エチルに溶解し、任意の未溶解物質を濾過により除去した。Ｎ-ヘキサンをNCA酢酸エチル溶液に加えて、NCAの結晶化をゆっくりと達成した。結晶化を繰り返して、一定の融点を有し、0.05重量％より低い加水分解性塩素の量を有する試料を得た。
【００１７】
実施例２
完全保護コポリマー-１の製造
0.870ｇのAla-NCA、0.596ｇのGlu(OBzl)-NCA、1.620ｇのLys(Z)-NCA及び0.450ｇのTyr(Bzl)-NCAを40mlのジオキサンに溶解し、これに17mlのジオキサン中ジエチルアミン(５×10-4ｇ/ml)を加えた。反応混合物を室温で48時間撹拌した。反応混合物を、よくかき混ぜながら800mlの水中に注いだ。白色沈降物を濾取し、続いて水及びアセトンで洗浄した。減圧下での乾燥後、2.56ｇ(91.3％収率)の完全保護コポリマー-１を得た。
【００１８】
実施例３
コポリマー-１ HBrの製造
1.5ｇの保護コポリマー-１を15mlの40％ HBr/HOAcに溶解し、30℃で16時間撹拌した。得られた反応混合物を減圧下で蒸留して、HBr及び酢酸を除去した。残渣をジクロロメタン(各回10ml)で５回抽出し、次いでエーテル(各回10ml)で３回洗浄し、減圧乾燥後、1.4ｇの粗製コポリマー-１ HBr塩を淡黄色粉末として得た。
【００１９】
200mgの粗製コポリマー-１ HBrを４mlの１Ｎ酢酸に溶解し、得られた溶液を、１Ｎ酢酸で平衡化したセファデックスG25(Φ4.2×48cm)カラムに充填した。243〜429mlの間の溶出物(図１を参照)を回収し、凍結乾燥して149mgのコポリマー-１ HBrを得た。
【００２０】
実施例４
コポリマー-１ HOAc溶液の製造
150mgのコポリマー-１ HBrを３mlの水に溶解し、氷浴で冷却した。この溶液に、0.15mlの10％ Na2CO3溶液を加え(pH８〜９)、次いで0.2mlの酢酸を添加することにより溶液のpHをpH３〜４に調整してコポリマー-１ HOAc溶液を得た。
【００２１】
実施例５
コポリマー-１アセテートの精製
３mlのコポリマー HOAc溶液(１Ｎ HOAc中50mg/ml)を、１Ｎ酢酸で平衡化したセファデックスG50 (Φ2.3×159cm)カラムに充填した。290〜490mlの間の溶出物(図２を参照)を回収し、凍結乾燥して、61.5mgの所望の分子量分布を有するコポリマー-１アセテートを41％の収率で得た(コポリマー-１ No.200503 A)。
【００２２】
実施例６
生成物の分析：コポリマー-１ No.200503 A
6.1  アミノ酸組成分析
0.1mgのコポリマー-１(No.200503 A)を２mlのフェノール含有６Ｎ HCl中で110℃で18時間加水分解した。得られた溶液をHITACHI 835アミノ酸分析装置により分析した。アミノ酸モル比を表１に示す。コパクソン(copaxone)と呼ばれる市販コポリマー-１をコントロールとして使用した。
【表１】
2009504885.tif 000002
【００２３】
6.2  スーパーデックス75 10/30 GPC分析
コポリマー-１(No.200503 A)の分子量分布をスーパーデックス(Superdex)75 HR 10/30により分析し、Mwマーカーとしてのタンパク質を使用して算出した。移動相は0.15Ｍ NaCl含有0.05Ｍ PBS(pH7.0)であり、230nmで検出した。データを表２に示す。コパクソンと呼ばれる市販のコポリマー-１をコントロールとして使用した。
【表２】
2009504885.tif 000003
【００２４】
以上のように、本発明の好適な実施形態に適用された本発明の基本的な新規特徴が示され、記載され、指摘されるが、示されたデバイスの形態及び細目並びにそれらの操作において種々の省略及び置換及び変更が、本発明の精神から逸脱することなく、当業者によりなされ得ることが理解されるであろう。例えば、実質的に同じ機能を実質的に同じ様式で実施して、同じ結果を達成する要素及び/又は方法工程の全ての組合せが本発明の範囲内にあると明白に意図される。更に、本発明の開示された任意の形態又は態様に関連して示され及び又は記載された構成及び/又は要素及び/又は方法工程は、一般的な設計上の選択事項として、任意の他の開示又は記載又は示唆される形態又は態様に組み込まれ得ると認識されるべきである。したがって、添付の特許請求の範囲によって示されるようにのみ限定されるべきことが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】セファデックスG25カラムを通したコポリマー-１ HBrの溶出プロフィールを示す。
【図２】セファデックスG-50カラムを通したコポリマー-１アセテートの溶出プロフィールを示す。
【図１】
2009504885.tif 000004
【図２】
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【国際調査報告】
2009504885.tif 000006
2009504885.tif 000007