(57)【要約】  本発明は、新規な抗ウイルス性製品、Ｃ型肝炎の治療におけるその使用、及びその製造方法に関する。さらに具体的には、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対して抗ウイルス活性を示す特徴的な製品に関する。１実施態様では、Ｃ型肝炎の治療に抗ウイルス薬として用いるための単独ハーブ・アストラガルス抽出物又はその活性画分を提供する。2009539953.tif 000018
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎の治療に抗ウイルス薬として用いるための単独ハーブ・アストラガルス抽出物又はその活性画分。
【請求項２】
活性画分が、乾燥原料植物物質に関して少なくとも１０の倍率で精製されたアストラガルス抽出物であり、下記：
・アストラガロシドＩ；
・ホルモノネチン−７−ｏ−β−ｄ−グルコシド；及び
・３’−ヒドロキシル−ホルモノネチン−７−ｏ−β−ｄ−グルコシド
から成る群から選択される少なくとも１つのマーカーを含むことを特徴とする、請求項１記載の単独ハーブ・アストラガルス抽出物又はその活性画分。
【請求項３】
活性画分が、乾燥原料植物物質に関して５０の倍率で精製されたアストラガルス抽出物である、請求項２記載の単独ハーブ・アストラガルス抽出物又はその活性画分。
【請求項４】
活性画分が、乾燥原料植物物質に関して７５〜２００の倍率で精製されたアストラガルス抽出物である、請求項３記載の単独ハーブ・アストラガルス抽出物又はその活性画分。
【請求項５】
アルコール抽出物に由来する、請求項１〜４のいずれかに記載の単独ハーブ・アストラガルス抽出物又はその活性画分。
【請求項６】
該抽出物がエタノール−水沈降プロセスを受けたものである、請求項５記載の単独ハーブ・アストラガルス抽出物又はその活性画分。
【請求項７】
該抽出物が、異なる極性の複数の溶媒による系統的溶媒分画工程を受けたものである、請求項５又は６に記載の単独ハーブ・アストラガルス抽出物又はその活性画分。
【請求項８】
活性画分が、ジクロロメタン分画又は同様な極性の溶媒分画から得られるものである、請求項７記載の単独ハーブ・アストラガルス抽出物又はその活性画分。
【請求項９】
アストラガルスがアストラガルス・メンブラナセウス（フィッシュ）ビーゲ(Astragalus membranaceus(Fisch)Bge.)又はアストラガルス・メンブラナセウス・ビーゲ・バル・モンゴリカス・サイオ(Astragalus membranaceus Bge.var.Mongholicus Hsiao)である、請求項１〜８のいずれかに記載の単独ハーブ・アストラガルス抽出物又はその活性画分。
【請求項１０】
Ｃ型肝炎の治療用抗ウイルス薬としての使用に適しており、該使用を意図することを表示するやり方で、パッケージされて又はその他で販売されるアストラガルス原料物質。
【請求項１１】
Ｃ型肝炎の抗ウイルス治療のための薬剤の製造におけるアストラガルス又はその単独ハーブ抽出物の使用。
【請求項１２】
Ｃ型肝炎の抗ウイルス治療のための食品、栄養補助食品又は食品添加物の製造におけるアストラガルス又はその単独ハーブ抽出物の使用。
【請求項１３】
レプリコン・アッセイにおいて抗ＨＣＶ活性を示し、乾燥原料植物物質に関して少なくとも１０の倍率で精製され、下記：
・アストラガロシドＩ；
・ホルモノネチン−７−ｏ−β−ｄ−グルコシド；及び
・３’−ヒドロキシル−ホルモノネチン−７−ｏ−β−ｄ−グルコシド
から成る群から選択される少なくとも１つのマーカーを含むことを特徴とするアストラガルス抽出物の製造方法であって、下記：
ａ．アルコール抽出（反復可能）；
ｂ．エタノール−水沈降プロセス（反復可能）；及び
ｃ．異なる極性の複数の溶媒による、系統的な溶媒分画工程
を含む方法。
【請求項１４】
アルコール抽出がエタノール抽出である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
異なる極性の複数の溶媒による、系統的な溶媒分画工程が、ジクロロメタン分画又はジクロロメタンと同様な極性の溶媒による分画を含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
単独ハーブ・アストラガルス又はその活性画分の有効量を投与することを含む、Ｃ型肝炎の治療方法。
【請求項１７】
アストラガルス抽出物又はその活性画分を単位投与形で与える、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
単位投与形が経口投与用である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
一日投与量が原料物質９〜６０ｇに相当する、請求項１６〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
該投与が少なくとも１種類の他の免疫調節薬又は抗ウイルス薬と共に行われる、請求項１６〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
該他の薬物がインターフェロン及び／又はリバビリンである、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
乾燥原料植物物質に関して少なくとも１０の倍率で精製されたアストラガルス抽出物を含み、下記：
・アストラガロシドＩ；
・ホルモノネチン−７−ｏ−β−ｄ−グルコシド；及び
・３’−ヒドロキシル−ホルモノネチン−７−ｏ−β−ｄ−グルコシド
から成る群から選択される少なくとも１つのマーカーを含むことを特徴とする、植物性薬物、食品、栄養補助食品又は食品添加物。
【請求項２３】
実質的に図４、５又は６に示したとおりのＴＬＣフィンガープリントを有するアストラガルス抽出物画分。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な抗ウイルス製剤、Ｃ型肝炎の治療におけるその使用及びその製造方法に関する。より詳しくは、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対して抗ウイルス活性を示す特徴的な製剤に関する。該製剤がレプリコン試験と特にポリメラーゼ試験（ＮＳ５Ｂ）の両方において活性を示すことは、例えばフラビ・ウイルス科(Flaviviradae)内のウイルスに対する可能な、広範囲な活性を示唆している。
【背景技術】
【０００２】
ＨＣＶによる慢性的感染は発症率が高く、英国の人口の１％までを冒しており、世界保健機関（ＷＨＯ）は、全世界的に２００万を超える人々がＨＣＶに感染していると推定している。慢性的ＨＣＶ感染が、疲労、上腹部痛及び消化不良を含めた、クォリティ・オブ・ライフを総合的に低下させる、多様な症状を付随することは、充分に認められている。薬剤による慣用的な療法はウイルス負荷を低減させるが、患者の約４０％のみに有効であるに過ぎない。したがって、ＨＣＶ感染に付随する症状を軽減して、それによって、慢性Ｃ型肝炎（ＣＨＣ）患者のより大きな割合のクォリティ・オブ・ライフを改良することができる、効果的な治療法の必要性が存在する。
【０００３】
さらに、病原ウイルスを標的とする（そして該ウイルスの活性を阻害する）、副作用の少ない製剤の必要性が存在する。
本出願人の国際出願WO2005079823では、対症性緩和を与える他に、１／３５０の希釈率で抗ＨＣＶ活性（４１．８％の阻害）を示すことがレプリコン・アッセイによって判明している４薬草組み合わせ製剤(a four herb combination product)を開示する。
【０００４】
該製剤は、４種類の薬草抽出物から成り、次のように処方される：
薬草抽出物：
【０００５】
【表１】
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【０００６】
賦形剤：
【０００７】
【表２】
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【０００８】
出願人は、この製剤をさらに詳しく研究して、意外にも、抗ＨＣＶ活性が１種類のみの植物に由来するように思われることを発見しており、良好な活性があることと検出可能な細胞傷害性を有さないことの両方を実証している。該植物がアストラガルス(Astragalus)であり、１０を超える倍率で、より詳しくは５０を超える倍率で、さらに詳しくは７５をさらに超える倍率で、最も詳しくは７５〜２００の倍率で精製した画分が特に活性であることがさらに判明している。
【０００９】
該活性画分は、下記段階：
Ｉ．アルコール抽出（反復可能）；
ＩＩ．エタノール−水沈降プロセス（反復可能）；及び
ＩＩＩ．異なる極性の複数の溶媒による、系統的な溶媒分画工程
を含む、効果的な３段階方法において良好な収率で得ることができる。
【００１０】
該系統的溶媒分画は、数種類の異なる溶媒を用いて、最低極性で開始して、最大極性で終わることが好ましい。該活性画分は、ジクロロメタン画分又は同様な極性を有する溶媒である。
【００１１】
該活性画分（及びサブ画分）は、その１つ又は組み合わせが抗ＨＣＶ活性及びポリメラーゼ阻害を惹起することができる１つ以上のマーカーに関連して、特徴付けることができる。同定された特定マーカーは下記を包含する：
・アストラガロシドＩ、
・ホルモノネチン−７−Ｏ−β−Ｄ−グルコシド、及び
・３’−ヒドロキシル−ホルモノネチン−７−Ｏ−β−Ｄ−グルコシド。
さらに、これらは、詳細な説明に記載するようなＴＬＣフィンガープリントによって同定することができる。
【００１２】
該活性を示す植物は、レグミノセ目(Leguminosae family)のメンバーであり、さらに詳しくは、コウキ(huang qi)：
薬剤学的名称：ラディクス・アストラガリ・メンブラナセウス（Radix Astragali Membranaceous）；
植物学的名称：アストラガルス・メンブラナセウス（フィッシュ）ビーゲ(Astragalus membranaceus(Fisch)Bge.)又はアストラガルス・メンブラナセウス・ビーゲ・バル・モンゴリカス・サイオ(Astragalus membranaceus Bge.var.Mongholicus Hsiao)（以下では、アストラガルス）である。
【００１３】
該植物は、ヨーロッパではMilkvetchと呼ばれる可能性があり、用いられるのは根である。
伝統的な中国漢方療法では、９〜３０ｇ、時には６０ｇまでの用量（乾燥原料物質に基づく）が用いられる。典型的には、これは煎剤(decoction)として服用される。中国人民共和国の薬局方（英語版２０００）Ｖｏｌ．Ｉによると、冷水抽出法によって、１７％以上の水溶性抽出物が得られる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
Chinese Herbal Medicine, Materia Medica改訂版によると、アストラガルス・メンブラナセウスの根は、化学的に、主要成分として、Ｄ−β−アスパラギン、２’４’−ジヒドロキシ−５，６−ジメトキシイソフラバン、カリコシン、ホルモノネチン、シクロアストラゲノール、アストラガロシド、コリン、ベタイン、クマタケニン、スクロース、グルクロン酸及びβ−シトステロールを含有することが知られている。
【００１５】
その化学成分は、Chinese Drugs of Plant Origin, Springer-Verlagに詳しく考察されており、この書物は、慢性肝炎の治療におけるその薬理学と対症性緩和をさらに考察している。
【００１６】
Chang HM and Blut PP(1987) Pharmacology and applications of Chinese Materia Medica(Vol ii) World Scientific Publishingによると、アストラガルス・メンブラナセウス（Astragalus membranaceus）は免疫機能を高めることができる。さらに詳しくは、肝臓を“保護する”ための１００％煎剤、０．４ｍｌ／日の使用と、コウキ(Huangqi)注射が患者の８０％においてＧＰＴレベルの正常化を達成した（これは対症療法である）という臨床試験が参照される。
【００１７】
参考資料又はその他の刊行文献のいずれも、Ｃ型肝炎の治療における抗ウイルス剤としての、単独の薬草アストラガルス又はその明確な画分(defined fraction)の使用を教えていない。
【００１８】
確認された、他の先行技術を下記に挙げる：
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】CN 1616097、これは、弱毒化Newcastle病ウイルスワクチン又は不活化Newcastle病ウイルスワクチン１０〜１２０血球凝集単位、アストラガルス根１〜２００００ｍｇ、リキリチゲニン１〜１０００ｍｇ、補助物質(supplementary material)及び安定剤を含有するトローチ剤を開示する。該トローチ剤は、ＳＡＲＳ及び他のウイルス感染性気道疾患の予防に適しており、Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎に対して補助的な治療効果を有すると述べられている。
【特許文献２】CN 1607003、これは、Ｃ型肝炎の補助治療薬としての、アストラガルス根（１０〜５０部）と共に冬虫夏草(Chinese caterpillar fungus)（５０〜９０部）を含む組成物の使用を開示する。該組成物は、免疫機能を調節し、治療効果を改良すると述べられている。
【特許文献３】US 2005/0074428、これは、コルジセプス・シネンシス(cordyceps sinensis)５０〜９０重量％とアストラガルス・メンブラナセウス(astragalus memsrancens)１０〜５０重量％を含有する、Ｃ型肝炎の治療のためにインターフェロン及びリビバリンと組み合わせて用いるための補助薬を開示する。
【特許文献４】CN 1448163、これは、Ｃ型肝炎を含めた種々な疾患を治療するための、約１１種類のハーブと共にアストラガルス根を含む漢方処方を開示する。
【特許文献５】CN 1393255、これは、Ｃ型肝炎を治療するための、アストラガルス根を含めた１９種類ハーブのミックスを開示する。
【特許文献６】CN 1593586、これは、少なくとも１５種類のハーブを含み、そのうちの１つが未加工のアストラガルス根である、Ｃ型肝炎を治療するためのピルを開示する。
【特許文献７】US 2005/0147699は、発癌と転移を抑制するためのアストラガルス・ラディクス(astragalus radix)とコドノプシス・ピロスラエ・ラディクス(codonopsis pilosulae radix)混合抽出物の使用を開示する。これは、アストラガルスが、慢性腎炎、蛋白尿、筋炎、抗高血圧性(antihypertensive)、冠動脈疾患、脳梗塞、消化性潰瘍（十二指腸潰瘍と胃潰瘍）、腎臓疾患及び糖尿病を治療するための伝統的な薬局方に記録されていると述べている。これは、抗ウイルス剤としてのその可能な使用には、言及していない。
【００２０】
実際に、いずれの資料も、単一ハーブのアストラガルス抽出物が、肝炎、特にＣ型肝炎を治療するための抗ウイルス剤として単独で使用可能であることを示唆していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明の第１態様によると、Ｃ型肝炎の治療に抗ウイルス剤として用いるための単独ハーブのアストラガルス抽出物又はその活性画分を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
該活性画分が、乾燥植物原料物質に関して少なくとも１０の倍率で精製したアストラガルス抽出物であり、下記：
・アストラガロシドＩ；
・ホルモノネチン−７−ｏ−β−ｄ−グルコシド；及び
・３’−ヒドロキシルーホルモノネチン−７−ｏ−β−ｄ−グルコシド
から成る群から選択される、少なくとも１つのマーカーを含むことを特徴とすることが好ましい。
【００２３】
これが３マーカー全てを含むことが好ましい。
特に好ましい実施態様では、該抽出物を少なくとも５０の倍率で、最も好ましくは７５〜２００の倍率で精製し、該抽出物を、上記で同定した３種類のマーカーの存在によって特徴付けることができる。実際に、この画分では、少なくとも６個の確認されたピークを同定することができる。
【００２４】
好ましい実施態様では、該抽出物を植物性薬品として用いる又は処方する。
代替実施態様では、該抽出物を食品、栄養補助食品又は食品添加物として用いることができる。食品なる用語は、食物又は飲み物と、このような物品の構成成分として用いられる物品を包含する。
【００２５】
本明細書で用いる植物学的用語は、ＦＤＡがかれらのディレクティブ“Guidance for Industry - Botanical Drug Products”(June 2004)に用いている意味を有すると意図される、このディレクティブは本明細書に援用される。しかし、国が異なれば、異なる用語論が用いられうることは、当業者によって理解されるであろう。一貫性のために、ＦＤＡガイダンス用語論への参照を用いることにするが、これを制限するものと見なすべきではない。したがって、例えばＥＭＥＡがかれらのGuidlines on Quality of Herbal Medicinal Products / Traditional Herbal Medicinal Products(CHMP / THMP March 2006に採用)に用いている、異なるが、同等の用語が、本明細書で用いる用語によって包含されることは、当業者によって理解されるであろう。
【００２６】
本発明の第２態様によると、アストラガルス原料物質を、これがＣ型肝炎を治療するための抗ウイルス剤としての使用に適しており、該使用を意図することを表示するやり方で、パッケージされて又はその他で販売されるものとして提供する。
【００２７】
該原料物質を、設計された生産サイトから管理された農業的実施下で培養して、回収することが好ましい。
本発明の第３態様によると、Ｃ型肝炎の抗ウイルス性治療用薬剤の製造におけるアストラガルス又はその単独ハーブ抽出物の使用を提供する。
【００２８】
本発明の第４態様によると、Ｃ型肝炎の抗ウイルス性治療のための食品、栄養補助食品又は食品添加物の製造におけるアストラガルス又はその単独ハーブ抽出物の使用を提供する。
【００２９】
本発明の第５態様によると、レプリコン・アッセイにおいて抗ＨＣＶ活性を示し、乾燥植物原料物質に関して少なくとも１０の倍率で精製され(purified by at least a factor of 10 with reference to dried raw plant material)、
・アストラガロシドＩ；
・ホルモノネチン−７−ｏ−β−ｄ−グルコシド；及び
・３’−ヒドロキシルーホルモノネチン−７−ｏ−β−ｄ−グルコシド
から成る群から選択される、少なくとも１つのマーカーを含むことを特徴とするアストラガルス抽出物の製造方法であって、
（１）アルコール抽出（反復可能）；
（２）エタノール−水沈降プロセス（反復可能）；及び
（３）異なる極性の複数の溶媒による、系統的な溶媒分画工程
を含む方法を提供する。
【００３０】
好ましくは、該アルコール抽出はエタノール抽出である。該エタノール抽出は還流下で行うことが好ましい。該エタノール抽出を反復することが最も好ましい。高濃度のエタノール（５０％を超える濃度）を用いることが好ましい。
【００３１】
アルコール抽出に続いて、エタノール−水沈降を行って、上清を回収する。エタノールを回収して、濃縮物を残す。
次に、該濃縮物を水中に溶解して、水溶液を得て、これに対して異なる極性の溶媒を用いて、系統的な溶媒分画を行う。好ましい溶媒は、石油エーテル、ジクロロメタン及び酢酸エチルである。
【００３２】
活性画分はジクロロメタン抽出物ＡＳ−Ｃである。
本発明の第６態様によると、単独ハーブのアストラガルス抽出物又はその活性画分の有効量を投与することを含む、Ｃ型肝炎の治療方法を提供する。
【００３３】
好ましくは、単独ハーブのアストラガルス又はその活性画分を、単位投与形で提供する。最も好ましくは、単独ハーブのアストラガルス又はその活性画分を、経口投与に適した形で、例えば充填カプセルの形で提供する。代替的に、他の投与形を提示することも可能であることを、当業者は理解するであろう。
【００３４】
好ましくは、該抽出物は１日当り乾燥原料物質９〜６０ｇ量に相当する量で用いられる。
１実施態様では、アストラガルス又はその活性画分を少なくとも１種類の他の免疫調節薬又は抗ウイルス薬（例えば、インターフェロン及び／又はリバビリン）との併用治療として投与する。
【００３５】
該薬物を一緒に同時に又は連続的のいずれでも投与することができる。
本発明の第７実施態様によると、乾燥植物原料物質に関して少なくとも１０の倍率で精製されたアストラガルス抽出物を含み、アストラガロシドＩ、ホルモノネチン−７−ｏ−β−ｄ−グルコシド及び３’−ヒドロキシル−ホルモノネチン−７−ｏ−β−ｄ−グルコシドから成る群から選択される、少なくとも１つのマーカーを含むことを特徴とする、植物性薬物、食品、栄養補助食品又は食品添加物を提供する。
【００３６】
これは、図４〜６のいずれか１つに示すようなＴＬＣフィンガープリントによって見られる特徴的なスポットの存在をさらに特徴とする。
下記方法論とデータを参照しながら、本発明を、実施例のみによってさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、ＳＭＡとＡＭＲの両方の抗Ｃ型肝炎ウイルス活性を毒性データと共に示す；
【図２】図２は、１５重量％未満の出発原料物質を含有する第１抽出物を生成するアルコール抽出プロセスのフローダイアグラムである；
【図３】図３は、さらに濃縮した活性画分又は第２抽出物を得るための第１抽出物の分画を示すフローダイアグラムである；
【図４】図４は、幾つかの異なる画分のＴＬＣフィンガープリント（ＵＶ２５４ｎｍ）である；
【図５】図５は、幾つかの異なる画分のＴＬＣフィンガープリント（ＵＶ３６５ｎｍ）である；
【図６】図６は、幾つかの異なる画分のＴＬＣフィンガープリント（日光）である；
【図７】図７は、レプリコン・アッセイにおける種々な画分の活性を示すグラフである；
【図８】図８は、異なる濃度におけるＡＳＣ７０５（１４）の活性を示すグラフである；
【図９】図９は、第２抽出物のさらなる分画を示すフローダイアグラムである；
【図１０】図１０は、クロロホルム／メタノール（９：１）中の５画分（ＡＳ−Ｃ−Ｉ〜ＡＳ−Ｃ−Ｖ）のＴＬＣフィンガープリントである；
【図１１】図１１は、クロロホルム／メタノール／水（８：２：０．２）中の５画分（ＡＳ−Ｃ−Ｉ〜ＡＳ−Ｃ−Ｖ）のＴＬＣフィンガープリントである；
【図１２】図１２は、異なるＡＳ−Ｃ−Ｉサブ画分中に存在する成分の単離、精製及び化学的同定を示すフローダイアグラムである；
【図１３】図１３は、クロロホルム：エタノール：水（８５：１５：１）中の“ＡＳＣ−Ｉ−１”のＴＬＣフィンガープリントである；
【図１４】図１４は、クロロホルム：エタノール：水（８５：１５：１）中の“ＡＳＣ−Ｉ−２”及び“ＡＳＣ−Ｉ−３”のＴＬＣフィンガープリント（ＵＶ２５４ｎｍ）である；
【図１５】図１５は、クロロホルム：エタノール：水（８５：１５：１）中の“ＡＳＣ−Ｉ−２”及び“ＡＳＣ−Ｉ−３”のＴＬＣフィンガープリント（ヨウ素）である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
方法
【実施例１】
【００３９】
成分ハーブの活性
該４ハーブ組み合わせが抗Ｃ型肝炎活性を示した（レプリコン・アッセイによって）ことを発見してから続いて、本出願人は個別のハーブの活性を調べた。図１は、Ｐｙｎ１７成分：ＡＭＲ（Astragalus membranaceus根）；ＳＣＦ（Schisandra chinensis実）；ＳＭＲ（Salvia miltiorrhiza根）；及びＳＭＦ(Silybum mariamum実)の活性を、対照：ＰＹＮ１７（４ハーブ組み合わせ）（陽性対照）；及びＢＣＳＭＲＯ４０４（非植物抽出物）（陰性対照）に比較して示す。
【００４０】
ＡＭＲとＳＭＲの両方は、ＨＣＶレプリコン・アッセイにおいて阻害活性を示すように思われる。このことは、図１の左手パネルに示すように、高濃度において特に明らかである。図１の右手パネルは、同じレプリコン細胞における細胞傷害性データを示す。これは、ＡＭＲは観察可能な細胞傷害性(cell cytotoxicity)を示さないが、ＳＭＲは高濃度において細胞傷害性であることを示唆する。
【００４１】
Astragalus membranaceusが活性を示し、毒性を示さないことが判明したので、特定の活性画分を同定することを追及した。
【実施例２】
【００４２】
アストラガルス根の抽出方法
根物質を６０℃のオーブン内で３時間乾燥させ、粗粒粉末に粉砕し、篩（１０メッシュ）に通した。次に、図２に記載するように、この物質にアルコール抽出を行った。
【００４３】
簡単には、これは次の工程を含むものであった：
１．粗粒粉末Astragalus membranaceus（１）（１００ｇ）に、７０％エタノール（原料物質の１０倍）を加えた。これを次に、１．５時間還流させ、溶液（２ａ）を残渣（３ａ）から分離した；
２．該残渣に、７０％エタノール（原料物質の８倍）を加えた。これを次に、１時間還流させ、再び溶液（２ｂ）を残渣（３ｂ）から分離した；
３．溶液（２ａと２ｂ）を一緒にして、エタノールを０．０８ＭＰａの圧力における真空下で回収して、濃縮物（４）５０ｍｌを得た；
４．該濃縮物に、９５％エタノールを加えた。該溶液を一晩放置し、濾過によって、沈殿を上清（５）から分離した；
５．再び、エタノールを０．０８ＭＰａの圧力における真空下で回収して、濃縮物（６）を得た；
６．該濃縮物を０．０８ＭＰａの圧力における真空下、６０〜７０℃で乾燥させて、固体抽出物（７）を得た。
【００４４】
７．該固体抽出物を次に摩砕して、粉末（８）にした。この粉末第１抽出物は、出発物質の乾燥重量に比較して、１１．７〜１３重量％の固体収率を有した。即ち、これは約８の倍率で精製されたものであった(It had been purified by a factor of about 8)。
【００４５】
アストラガロシドＩＶ（アストラガルスの標準化学マーカー）の含量は０．４％より大であった。
【実施例３】
【００４６】
図２で説明した方法によって得られた第１抽出物を、図３に示したとおりに分画した。
簡単には、これは次の工程を含むものであった：
１．第１抽出物（８）に、９５％エタノールを加えて、８０％にして、これを再び、一晩放置した。沈殿（９）“ＡＳ−Ｆ”を濾過によって、上清（１０）“ＡＳ−Ａ”から分離した；
２．エタノールを、０．０８ＭＰａの圧力における真空下で回収して、濃縮溶液（１１）を得た；
３．濃縮溶液（１１）に水を加えて、水溶液（１２）を形成して、これを次のように連続的に分画した：
ａ．石油エーテルによって、画分（１３）“ＡＳ−Ｂ”を；
ｂ．ジクロロメタンによって、画分（１４）“ＡＳ−Ｃ”を；及び
ｃ．酢酸エチルによって、画分（１５）“ＡＳ−Ｄ”を；
ｄ．水画分（１６）“ＡＳ−Ｅ”と共に得た。
【００４７】
画分（９）、（１０）、（１３）、（１４）、（１５）及び（１６）に対して、下記表１に記載したように、さらなる活性試験を行った：
表１
【００４８】
【表３】
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【００４９】
図４〜６は、左から右へ、画分（９）、（１０）、（１３）、（１４）、（１５）及び（１６）を示すＴＬＣプレートである。ＴＬＣプレートはシリカゲルであり、展開系はクロロホルム／メタノール／水（８：２：０．２）であった。
【００５０】
図４は、２５４ｎｍにおけるＵＶによる検出を示す；
図５は、３６５ｎｍにおけるＵＶによる検出を示す；
図６は、エタノール中１０％硫酸による処置と続いての加熱後に日光中で観察する。
【００５１】
画分（１４）は、複数個の明確なスポットを示す。２５４ｎｍにおいて少なくとも６個が明白に見られる。
画分１４  ＡＳ−Ｃは、レプリコン・アッセイにおいて特に活性であることが判明した（実施例４−表５）。これは、出発物質の乾燥重量に比較して、約１．１重量％の固体収率を有した。実際に、これは約９０％の倍率で精製されたものであった。
【００５２】
この画分は、図４〜６に示すようなクロマトグラフィー・プロフィルを有した。
【実施例４】
【００５３】
画分ＡＳＡ〜ＡＳＦの活性を試験するために、各サンプル（１０ｍｇ）をＤＭＳＯ（１ｍｌ）中に溶解して、１５分間音波処理した。２つの追加サンプルＰＡ（WO2005079823としての粗アストラガルス抽出物）とＩＮＦα（標準処理）を比較物としてランした。サンプルの溶解性を下記表２に示す：
表２
【００５４】
【表４】
2009539953.tif 000006
【００５５】
次に、該ＤＭＳＯ溶液を組織培養培地中で１／１０に希釈して、濾過した。この濃度をニートと呼ぶ。１０μｌ／ウェルを用いた、試験ウェル中の総量は１００μｌである。全ての濃度は５通りに用意した。該ＤＭＳＯの同じ希釈度を３通り用意した。
【００５６】
抽出物サンプルの希釈度を下記表３に示し、ＩＦＮαに関しては表４に示す。
表３
【００５７】
【表５】
2009539953.tif 000007
【００５８】
表４
【００５９】
【表６】
2009539953.tif 000008
【００６０】
最初のアッセイでは、レプリコン細胞を、９０μｌ中５ｘ１０３／ウェルの濃度でプレートアウトした。次の日に、試験サンプルを１０μｌ中で加えた。該プレートをさらに７２時間インキュベートし、回収して、Dual Luciferase Assay Promegaを用いて分析した。レプリコン細胞系はレニラ・ルシフェラーゼ(Renilla luciferase)を発現する。
【００６１】
各サンプル及び濃度を２通りにして、別の９６ウェル・プレートをセットアップすることによって、サンプルを細胞傷害性に関して試験した。細胞をトリチウム化チミジンによって２４時間標識して、回収した。
【００６２】
第２アッセイのために、上部５濃度を有する、別のプレートをセットアップして、ｗｓｔ−１（Roche）によって２時間標識し、４５０ｎｍと６３０ｎｍにおいてＯＤを読み取った。ｗｓｔ−１は生存細胞染料である。
【００６３】
結果
アッセイ１：薬物を加えない細胞からの読み取り値の平均１９８９０６
読み取り値を表５に示す。
【００６４】
表５
【００６５】
【表７】
2009539953.tif 000009
【００６６】
薬物を加えずに得られた読み取り値は、非常に高かった。
これらの濃度においてインターフェロンによって得られた結果は、このアッセイに特徴的である。
【００６７】
これらの結果から、サンプルの一部では高濃度において阻害が得られるように思われたので、該アッセイを繰り返した。
アッセイ２
結果は表６に示す。
【００６８】
表６
【００６９】
【表８】
2009539953.tif 000010
【００７０】
希釈物をｗｓｔ−１アッセイにおいて細胞傷害性に関して試験し、さらに、このプレートを顕微鏡下でも検査した。このアッセイは、細胞増殖抑制因子(cytostatic agents)を検出しないであろう。
【００７１】
サンプル４は、上部２濃度において細胞を殺した；これらの細胞は第３濃度では正常でないように見えた(looked less healthy)。他の全てのサンプルは、見かけ上正常であった細胞を有した。このことは、ｗｓｔ−１結果に反映される。
【００７２】
アッセイ２ｗｓｔ−１結果
結果は表７に示す。
表７
【００７３】
【表９】
2009539953.tif 000011
【００７４】
ＩＦＮα濃度がｐｇ／ｍｌであることに注目すべきである。
結果は、図７と８にグラフによって示す。
図７は、サンプルの原料レプリコン・スコア(raw replicon scores)を濃度に対して示す。ASC-0705は、明らかに最良のパーフォーマー(performer)であり、ＩＦＮα（標準処理）より機能が優れている。これは、最良の活性が１０μｇ／ｍｌを超える濃度においてであることも実証する。
【００７５】
図８は、濃度に対して活性を示す。明らかに、最適濃度は約１．３６μＭより大である。
【実施例５】
【００７６】
画分（１４ＡＳ−Ｃ）に対して、図９で説明し、以下に記載するような、クロマトグラフィー分離工程を行った。簡単に説明すると、これは下記工程を含むのもであった：
１．アストラガルス根からのジクロロメタン抽出物（１４）“ＡＳ−Ｃ”６．２ｇをシリカゲルカラムによって分離させ、クロロホルム、クロロホルム／メタノール（１００：５）、クロロホルム／メタノール（１００：１０）、クロロホルム／メタノール（１００：１５）、及びメタノールによる勾配溶離で溶出して、得られた２５画分を最初に６プール（１７；１８；１９；２０；２１及び２２）に分割した；
２．プールした画分１〜１４（１７）は有意な化学薬品を含有しなかった；
３．画分１５（１８）は２４１ｍｇの重量を有した、これをさらにSephadexカラム・クロマトグラフィによって２回精製して、メタノールによって溶出して、画分（２３）“ＡＳ−Ｃ−ＩＩ”を得た、これは、毒性をも示した活性ＢＵＴであることが判明した；
４．画分１７（１９）は２３１ｍｇの重量を有した、これをさらに、クロロホルム／メタノール（９４：６）によって溶出するシリカゲル・カラム・クロマトグラフィによって２画分に分離した。該２画分は、１３ｍｇ重量の画分（２４）“ＡＳ−Ｃ−ＩＩＩ”と１４ｍｇ画分（２５）“ＡＳ−Ｃ−ＩＶ”であった；
５．第１８画分（２０）を放置し、白色粉末６４９ｍｇをＡＳ−Ｃ−Ｉとして沈殿させた。これは活性を示し、毒性を示さないことが判明した；
６．２１９ｍｇの重量を有する第２２画分（２１）をSephadexカラム及びSilicaカラムによって分離して、１８ｍｇ画分（２６）“ＡＳ−Ｃ−Ｖ”を得た。
【００７７】
試験した抽出物を下記表８に同定する：
表８
【００７８】
【表１０】
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【００７９】
＊第１抽出物（８）１００ｇが出発物質１２．８５％を含有し、したがって、乾燥原料物質の相当量は７７８．２ｇであるという根拠に基づいて算出。
５関連サブ画分サンプルの各々に対して、ＴＬＣによる分析を行って、結果を図１０と１１に示す。
【００８０】
図１０は、クロロホルム／メタノール（９：１）中で展開させたシリカゲル・プレートを示す。左手プレートは２５４ｎｍにおけるＵＶ下で観察したものであり、右手プレートは日光下で観察したものである（エタノール中１０％硫酸を噴霧し、次に、スポットが明確に見られるまで該プレートを加熱する）。
【００８１】
図１１は、クロロホルム／メタノール／水（８：２：０．２）中で展開させたシリカゲル・プレートを示す。左手プレートは２５４ｎｍにおけるＵＶ下で観察したものであり、右手プレートは日光下で観察したものである（エタノール中１０％硫酸を噴霧し、次に、スポットが明確に見られるまで該プレートを加熱する）。
【００８２】
両方の場合に、サンプルを左から右へ読み取る：ＡＳ−Ｃ−Ｉ；ＡＳ−Ｃ−ＩＩ；ＡＳ−Ｃ−ＩＩＩ；ＡＳ−Ｃ−ＩＶ；ＡＳ−Ｃ−Ｖ．
【実施例６】
【００８３】
６サンプル：“ＡＳ−Ｃ”；“ＡＳ−Ｃ−Ｉ”；“ＡＳ−Ｃ−ＩＩ”；“ＡＳ−Ｃ−ＩＩＩ”；“ＡＳ−Ｃ−ＩＶ”；及び“ＡＳ−Ｃ−Ｖ”の各々をＤＭＳＯ中に溶解して、１０ｍｇ／ｍｌストック溶液を得た。該サンプルを
１．純度と同定に関して分析した；そして
２．抗ＨＣＶ活性に関して試験した。
【００８４】
１．純度と同定
６サンプル、ＡＳ−Ｃ、ＡＳ−Ｃ−Ｉ、ＡＳ−Ｃ−ＩＩ、ＡＳ−Ｃ−ＩＩＩ、ＡＳ−Ｃ−ＩＶ及びＡＳ−Ｃ−Ｖを純度と同定に関して、ＬＣ−ＵＶとＬＣ−ＭＳを用いて分析した。この分析から次のデータを得た：
・ＡＳ−Ｃ画分は幾つか（＞６）の小ピーク（ｍ／ｚ２６９、３０１、３０３等）を含有し、
・ＡＳ−Ｃ−Ｉは２つの主要ピーク（ｍ／ｚ２６９、３０１）を含有し、
・ＡＳ−Ｃ−ＩＩは１つのピーク（ｍ／ｚ３０１）を含有し、
・ＡＳ−Ｃ−ＩＩＩは１つのピーク（ｍ／ｚ３０３）を含有し、
・ＡＳ−Ｃ−ＩＶは１つのピーク（ｍ／ｚ２６９）を含有し、
・ＡＳ−Ｃ−Ｖはピークを含有しなかった。
【００８５】
この段階時には、該ピークに相当する成分は同定されなかったので、実施することができた唯一の推定は、該ピーク面積をＤＭＳＯピーク面積と比較することであった：
Ｉ．“ＡＳ−Ｃ−ＩＩ”と“ＡＳ−Ｃ−ＩＶ”は、ＤＭＳＯピークよりも高い単一ピークを含有した。
【００８６】
ＩＩ．“ＡＳ−Ｃ”と“ＡＳ−Ｃ−Ｉ”は混合物である。 
ＩＩＩ．“ＡＳ−Ｃ−ＩＩＩ”は、ＤＭＳＯピークよりも低い単一ピークを含有する。
ＩＶ．“ＡＳ−Ｃ−Ｖ”は、ＵＶ中で目に見えるピークを含有しない。
【００８７】
純度をＵＶ検出によって分析したこと、そしてＵＶ中で吸光しない化合物は検出されないであろうことに注目すべきである。ピークからの物質をＭＳによって分析して、ｍ／ｚ（上記）を決定した。
【００８８】
２．抗ＨＣＶ活性
サンプルを下記：
（ａ）レプリコン・アッセイ（Reblikon）、
（ｂ）ＮＳ５Ｂアッセイ及び
（ｃ）ＮＳ３／ＮＳ４Ａ全長プロテアーゼ・アッセイ
において抗ＨＣＶ活性に関して試験した。
【００８９】
レプリコン・アッセイにおける任意の“ヒット（hit）”の選択性を推定するために、サンプルをＨｕｈ７細胞において細胞傷害性に関しても試験した。
結果は、下記表９に示す、表９はさらに純度、ピーク面積及び同定データも包含する。
【００９０】
表９
【００９１】
【表１１】
2009539953.tif 000013
【００９２】
この表から、下記を知ることができる：
サンプル、“ＡＳ−Ｃ”（混合物）
・（ａ）レプリコン細胞においてＨＣＶ複製を阻害し、ＥＣ５０＝３．７μｇ／ｍｌを示す；
・（ｂ）９．２μｇ／ｍｌでＮＳ５Ｂを阻害する； 
・（ｃ）ＮＳ３／ＮＳ４アッセイにおいて１００μｇ／ｍｌで９５％阻害を生じる；
・（ｄ）１００μｇ／ｍｌまでの濃度において細胞傷害性を示さない。
ＡＳ−Ｃ−ＩとＡＳ−Ｃ−ＩＩ
・（ａ）レプリコン・アッセイにおいても幾らかの活性を示すが、高濃度においてである。測定されたＥＣ５０値は、それぞれ、３６μｇ／ｍｌと１７μｇ／ｍｌであった。
【実施例７】
【００９３】
最も強い活性を示した“ＡＳ−Ｃ”画分（１４）をさらに特徴付けるために、画分“ＡＳ−Ｃ−Ｉ”（２０）を、これも活性を示し、該活性の原因となる１つ以上の作用を含有し、それによってマーカーとして役立ちうることが結論されたので、参照した。
【００９４】
したがって、図１２を参照して、次のプロトコールに従った：
１．（１４）ＡＳ−Ｃ６．２ｇをシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって分離させ、クロロホルム／メタノール（１００：１５）によって溶出した。第１８画分（２０）から沈殿した白色粉末を“ＡＳ−Ｃ−Ｉ”（６４９ｍｇ）と呼ぶことにした；
２．ＡＳＣ−Ｉ（２０）をメタノール中に超音波処理によって溶解して、次に濾過した。濾液をSephadex LH-20カラムによって分離して、図１３〜１５に図示したＴＬＣプレートに示すように、３主要化合物を得た。
【００９５】
３．プールした画分４〜６（２８）は、硫酸を噴霧して、加熱したときに、スポットを示した； 
４．プールした画分９〜１１（３０）は、該プレートをヨウ素蒸気中に入れて、ＵＶ２５４ｎｍにおいて観察したときに、２スポットを示した。
【００９６】
５．プールした画分４〜６（２８）は、Silicaゲル・カラムによって精製し、クロロホルム／メタノール（９：１）で溶出した後に、微量の顔料を有した（３２）。
６．このサンプル（３２）をアセトン中に溶解し、冷蔵保存し、再結晶して、“ＡＳ−Ｃ−Ｉ−１”（３３）を得た。
【００９７】
７．プールした画分９〜１１（３０）は、ゲル・カラムによって（３４）、次にＴＬＣ法によって（３５）精製したときに、蛍光スポットを示した。２つの蛍光帯を分離した。より高いＲｆ値を有する帯を溶出して、“ＡＳ−Ｃ−Ｉ−２”（３６）を得た；他方では、より低いＲｆ値を有する帯をSephadex LH-20によって精製して、“ＡＳ−Ｃ−Ｉ−３”（３７）を得た。
【００９８】
同定された３化合物を質量スペクトルと核磁気共鳴分光法によって、それぞれ、分析した。該３化合物の構造を、得られたデータを化学構造に関する既存の文献と比較することによって同定した、これらを表１０に示す。
【００９９】
表１０
【０１００】
【表１２】
2009539953.tif 000014
【０１０１】
これらの化合物は、下記構造を示す：
式１：アストラガロシドＩ（ＡＳ−Ｃ−１）
【０１０２】
【化１】
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【０１０３】
式２：ホルモノネチン−７−Ｏ−β−Ｄ−グルコシド（ＡＳ−Ｃ−Ｉ−２）
【０１０４】
【化２】
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【０１０５】
式３：３’−ヒドロキシル−ホルモノネチン−７−Ｏ−β−Ｄ−グルコシド（ＡＳ−Ｃ−Ｉ−３）
【０１０６】
【化３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2009539953.tif 000023
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１２】
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【図１】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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2009539953.tif 000035
2009539953.tif 000036
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