(57)【要約】  本発明は、３−ヒドロキシカルボン酸からの２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸の酵素的な製造法に関し、その際、３−ヒドロキシカルボン酸を、反応水溶液中で製造し、かつ／又は該反応水溶液に添加し、インキュベートする。該反応水溶液は、３−ヒドロキシカルボン酸−ＣｏＡ−ムターゼ活性を有し、かつ３−ヒドロキシカルボニル−ＣｏＡ−エステル生成活性と３−ヒドロキシカルボニル−ＣｏＡ−エステル異性化活性との双方を有し、かつ３−ヒドロキシカルボン酸を相応する２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸へ変換させるユニットを含有し、ここで、２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸は酸としてか又はその塩の形で取得される。有利な実施態様において、３−ヒドロキシカルボン酸−ＣｏＡ−ムターゼ活性を有するユニットは、単離されたコバラミン依存性ムターゼを含むユニット、及び場合により３−ヒドロキシカルボニル−ＣｏＡ−エステル生成酵素又は酵素系、又はこれらを含有する微生物である。有利に、本発明は２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸の生物工学的な製造法に関し、その際、所望の活性を有する微生物は、水性系中で、単純な天然物を用いて培養され、細胞内で生じる３−ヒドロキシカルボニル−ＣｏＡ−エステルは相応する２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸に変換される。本発明は同様に、不飽和２−メチルカルボン酸の製造を含み、その際、取得された２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸は脱水により相応する不飽和２−メチルカルボン酸（メタクリル酸及び高級同族体）に変換される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
３−ヒドロキシカルボン酸からの２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸の酵素的な製造法において、３−ヒドロキシカルボン酸を、３−ヒドロキシカルボン酸−ＣｏＡ−ムターゼ活性を有し、かつ３−ヒドロキシカルボニル−ＣｏＡ−エステル生成活性と３−ヒドロキシカルボニル−ＣｏＡ−エステル異性化活性との双方を有するユニットを含有する反応水溶液中で製造し、かつ／又は該反応水溶液に添加し、インキュベートし、引き続き、相応して変換された２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸を酸としてか又はその塩の形で取得することを特徴とする方法。
【請求項２】
３−ヒドロキシカルボン酸−ＣｏＡ−ムターゼ活性を有するユニットが、単離されたコバラミン依存性ムターゼを含有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
３−ヒドロキシカルボン酸−ＣｏＡ−ムターゼ活性を有するユニットが、３−ヒドロキシカルボニル−ＣｏＡ−エステル生成酵素又は酵素系を含む、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
３−ヒドロキシカルボン酸−ＣｏＡ−ムターゼ活性を有するユニットが、微生物又はその粗抽出物である、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
コバラミン依存性ムターゼを生成ないし含有し、３−ヒドロキシカルボン酸−ＣｏＡ−ムターゼ活性を有し、かつ３−ヒドロキシカルボニル−ＣｏＡ−エステル生成活性と３−ヒドロキシカルボニル−ＣｏＡ−エステル異性化活性との双方を有する微生物を、３−ヒドロキシカルボン酸から相応する２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸への変換のために水性系中で使用する、請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
ａ）３−ヒドロキシカルボン酸−ＣｏＡ−ムターゼ活性を有し、かつ３−ヒドロキシカルボニル−ＣｏＡ−チオエステル生成活性と３−ヒドロキシカルボニル−ＣｏＡ−チオエステル異性化活性との双方を有する微生物を、炭素源及びエネルギー源としての再生原料又は再生原料の利用から生じる廃棄物を含有する水性系中で培養し、それにより、細胞内で３−ヒドロキシカルボン酸−ＣｏＡ−チオエステルを合成し、かつ相応する２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸に変換し、かつ
ｂ）相応する２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸を酸としてか又はその塩の形で単離する、
請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
反応を外部からの３−ヒドロキシカルボン酸の添加下に行う、請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
微生物が、細菌株HCM-10 DSM 18028、Xanthobacter autotrophicus Py2、Rhodobacter sphaeroides(ATCC17029)又はNocardioides sp. JS614である、請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
微生物の完全な細胞を、そのままで、透過処理して、又は担体に固定して使用する、請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
細胞抽出物及び／又はコバラミン依存性ムターゼ、及び場合により他の酵素、例えばＣｏＡ−エステル合成酵素を、微生物から部分的又は完全に単離した後に、場合により精製された形で使用する、請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
微生物の細胞不含の粗抽出物を使用する、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４を有するタンパク質、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６を有するタンパク質、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０を有するタンパク質、又は配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １３及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １４を有するタンパク質、並びにその少なくとも６０％の相同体を使用する、請求項１から１１までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
酵素的変換のために、培養の間に、糖及び／又はアルコール及び／又は有機酸及び／又は炭化水素又はその誘導体を炭素源及びエネルギー源として使用する、請求項１から１２までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
培養のために、ｔ−ブチル基を有する基質を炭素源及びエネルギー源として使用する、請求項１から１３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
培養のために、ｔ−ブチルアルコールを唯一の炭素源及びエネルギー源として基本培地中で使用する、請求項１から１４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
糖及び／又はアルコール及び／又は有機酸及び／又は炭化水素又はその誘導体から３−ヒドロキシカルボン酸への、及び、３−ヒドロキシカルボン酸から２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸への酵素的反応を唯一の方法工程で行う、請求項１から１５までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
外部からの３−ヒドロキシ酪酸の添加下に２−ヒドロキシイソ酪酸の製造を行う、請求項１から１６までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
Ｃ2〜Ｃ3不飽和イソアルケン酸の製造法において、請求項１から１７までのいずれか１項記載の方法により製造された２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸を脱水することを特徴とする方法。
【請求項１９】
メタクリル酸の製造法において、請求項１から１７までのいずれか１項記載の方法により製造された２−ヒドロキシイソ酪酸を脱水することを特徴とする方法。
【請求項２０】
微生物株ＨＣＭ−１０−ＤＳＭ  １８０２８。
【請求項２１】
以下：
ａ）配列番号２及び／又は配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸分子；
ｂ）配列番号１及び／又は配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子
からなる群から選択された、コバラミン依存性ムターゼの活性を有する酵素をコードする核酸分子。
【請求項２２】
２つの異なるサブユニットから構成されたオリゴマー酵素として、配列番号２及び配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、請求項２１記載の核酸分子。
【請求項２３】
ＤＮＡ分子である、請求項２１又は２２記載の核酸分子。
【請求項２４】
ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡである、請求項２３記載の核酸分子。
【請求項２５】
ＲＮＡ分子である、請求項２１又は２２記載の核酸分子。
【請求項２６】
請求項２１又は２２記載の核酸分子によりコードされたコバラミン依存性ムターゼの活性を有するタンパク質。
【請求項２７】
配列番号２を有するタンパク質及びその少なくとも９９％の相同体。
【請求項２８】
配列番号４を有するタンパク質及びその少なくとも９９％の相同体。
【請求項２９】
配列番号２及び配列番号４を含むヘテロ二量体酵素としてのタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３−ヒドロキシカルボン酸からの２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸の酵素的な製造法に関し、その際、３−ヒドロキシカルボン酸は反応水溶液中で製造され、かつ／又は該反応水溶液に添加され、かつインキュベートされる。反応水溶液は３−ヒドロキシカルボン酸−ＣｏＡ−ムターゼ活性を有し、かつ３−ヒドロキシカルボニル−ＣｏＡ−エステル生成活性と３−ヒドロキシカルボニル−ＣｏＡ−エステル異性化活性との双方を有し、かつ３−ヒドロキシカルボン酸を相応する２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸へ変換させるユニットを含有し、ここで、２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸は酸としてか又はその塩の形で取得される。有利な実施態様において、３−ヒドロキシカルボン酸−ＣｏＡ−ムターゼ活性を有するユニットは、単離されたコバラミン依存性ムターゼ、及び場合により３−ヒドロキシカルボニル−ＣｏＡ−エステル生成酵素又は酵素系を含むか、又はこれらを含有する微生物である。有利に、本発明は２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸の生物工学的な製造法に関し、その際、所望のムターゼ活性を有する微生物は、水性系中で、単純な天然物を用いて培養され、細胞内で生じる３−ヒドロキシカルボニル−ＣｏＡ−エステルは相応する２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸に変換される。本発明は同様に、不飽和２−メチルカルボン酸の製造を含み、その際、取得された２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸は脱水により相応する不飽和２−メチルカルボン酸（メタクリル酸及び高級同族体）に変換される。
【０００２】
本発明の有利な実施態様において、３−ヒドロキシカルボニル−ＣｏＡ−チオエステル生成及び３−ヒドロキシカルボニル−ＣｏＡ−チオエステル異性化微生物として、株ＨＣＭ−１０（ＤＳＭ  １８０２８）が使用される。
【０００３】
メタクリル酸並びに同族不飽和２−メチルカルボン酸は、アクリルガラス板、射出成形品、被覆及び他の多数の製品の製造に幅広く使用されている。
【０００４】
メタクリル酸及びその同族体の多数の製造法は公知である。しかしながら、市販品の世界的規模の大部分が、相応する２−ヒドロキシニトリルから製造されるメタクリル酸及びその同族体のアミドスルファートの加水分解法に基づいている(W. Bauer, "Methacrylic acid and derivatives", Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 第5版, 著者: B. Elvers, S. Hawkins, G. Schulz, VCH, New York, 1990, A16巻, 第441-452頁; A. W. Gross, J. C. Dobson, "Methacrylic acid and derivatives", Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 第4版, 著者: J. I, Kroschwitz, M. Howe-Grant, John Wiley & Sons, New York, 1995, 第16巻, 第474-506頁)。前記方法の場合、例えばメタクリル酸１ｋｇの製造のために約１．６ｋｇの硫酸が必要である。前記理由から、硫酸の回収（及びそれと関連する高いエネルギーコスト）なしでメタクリル酸を商業的に製造するための代替的な方法が有利であろう。
【０００５】
２−ヒドロキシイソ酪酸からメタクリル酸への化学的変換は、特許文献ＵＳ３，６６６，８０５及びＵＳ５，２２５，５９４により開示されている。ここで、２−ヒドロキシイソ酪酸は、金属酸化物、金属水酸化物、イオン交換体樹脂、アルミナ、二酸化ケイ素、アミン、ホスフィン、アルカリ金属アルコキシド及びアルカリ金属カルボン酸塩の使用により脱水される。通常の反応温度は１６０℃〜２５０℃である。前記方法の場合、９６％までのメタクリル酸収率が達成可能であった。
【０００６】
メタクリル酸及びその同族体の代替的な製造法は、ニトリル加水分解酵素の使用下での２−ヒドロキシニトリルから相応する２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸への加水分解によりもたらされる。前記のニトリル加水分解酵素は、ニトリラーゼ又はニトリルヒドラターゼとアミダーゼとからの組み合わせ物である(A. Banerjee, R. Sharma, U. C. Banerjee, 2002, "The nitrile-degrading enzymes: current status and future prospects", Appl. Microbiol. Biotechnol., 60:3344)。前記方法は多数の特許により保護されている（ＵＳ６，５８２，９４３Ｂ１）。前記方法の重大な欠点は、効率的なニトリル加水分解酵素活性のために必要な中性のｐＨ範囲内におけるニトリルの不安定性である。反応混合物中でのニトリルの分解はケトン及びシアニドの蓄積を招き、これらは共にニトリル加水分解酵素活性を阻害する。
【０００７】
双方の方法、即ち、現在支配的であるアミドスルファートをベースとする方法及び酵素的なニトリル加水分解法の一般的な欠点は、２−ヒドロキシニトリルが必要であることである。２−ヒドロキシニトリルは、まず環境に有害な出発物質、即ちケトン及びシアニドから製造されねばならない。
【０００８】
従って、環境に有害でない出発物質をベースとするメタクリル酸及びその同族体の製造法が有利である。
【０００９】
従って本発明は、２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸を製造するための代替的な可能性を見出し、かつ、出来る限り環境に有害でない出発物質の使用に基づいて、エネルギー消費が少なく、かつ廃棄物が少ない方法を提供するという課題に基づいていた。
【００１０】
前記課題は、３−ヒドロキシカルボン酸からの２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸の酵素的な製造法により解決される。本発明によれば、３−ヒドロキシカルボン酸は、３−ヒドロキシカルボン酸−ＣｏＡ−ムターゼ活性を有するユニットを有する反応水溶液中で製造され、かつ／又は該反応水溶液に添加される。３−ヒドロキシカルボン酸−ＣｏＡ−ムターゼ活性を有するユニットとは、本発明の範囲内で、コバラミン依存性ムターゼ、及び場合により３−ヒドロキシカルボニル−ＣｏＡ−エステル生成酵素又は酵素系を含むユニット、ないし、これを含むか又は生成し、かつ３−ヒドロキシカルボン酸−ＣｏＡ−ムターゼ活性を有し、かつ３−ヒドロキシカルボニル−ＣｏＡ−エステル生成活性と３−ヒドロキシカルボニル−ＣｏＡ−エステル異性化活性との双方を有する生物学的系であると解釈される。インキュベート後、引き続き、相応して変換された２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸は酸としてか又はその塩の形で取得される。
【００１１】
有利に、本発明は微生物の使用下での２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸の生物工学的な製造法に関する。前記微生物は、通常、３−ヒドロキシカルボニル−ＣｏＡ−エステル合成活性を有し、かつ、そのようなコバラミン依存性ムターゼを生成又は含むことができ、かつ、３−ヒドロキシカルボン酸−ＣｏＡ−ムターゼ活性により、細胞内で単純な天然物から（出発物質、例えば糖及び／又はアルコール及び／又は有機酸及びその誘導体から）形成された３−ヒドロキシカルボニル−ＣｏＡ−エステルを、相応する２−ヒドロキシ−２−メチルカルボニル−ＣｏＡ−エステルに変換することができる。
【００１２】
本発明による方法は、特に、コバラミン依存性ムターゼを生成ないし含有し、かつ３−ヒドロキシカルボン酸−ＣｏＡ−ムターゼ活性を有する微生物を、３−ヒドロキシカルボン酸から相応する２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸への変換のために水性系中で使用することを特徴とする。
【００１３】
有利な方法変法において、３−ヒドロキシカルボン酸−ＣｏＡ−ムターゼ活性を有し、かつ３−ヒドロキシカルボニル−ＣｏＡ−チオエステル生成活性と３−ヒドロキシカルボニル−ＣｏＡ−チオエステル異性化活性との双方を有する微生物は、炭素源及びエネルギー源としての再生原料又は再生原料の利用から生じる廃棄物を含有する水性系中で培養される。この場合、細胞内で形成される３−ヒドロキシカルボン酸−ＣｏＡ−チオエステルは、相応する２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸に変換される。有利に、該反応は外部からの３−ヒドロキシカルボン酸の添加下に行われる。引き続き、相応する２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸は酸としてか又はその塩の形で単離される。
【００１４】
単純な天然物からの３−ヒドロキシカルボン酸の製造及びその２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸への異性化を利用するこの新規の生物工学的方法により、上記課題を解決することができる。
【００１５】
本発明の有利な実施態様において、方法は以下の工程
（ａ）３−ヒドロキシカルボニル−ＣｏＡ−エステル合成活性及びムターゼ活性を有する適当な生物学的系中で、３−ヒドロキシカルボン酸を単純な天然物から製造し、引き続き２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸へ変換する工程、及び
（ｂ）２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸を遊離酸としてか又はその相応する塩として単離する工程
を含む。
【００１６】
そのように取得された２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸は、有利に、Ｃ2〜Ｃ3不飽和イソアルケン酸（メタクリル酸及びその同族体）の製造のために使用されることができ、これは、（ａ）及び（ｂ）で製造された酸又はその相応する塩の脱水により行われることができる。前記反応を以下に記載する：
−  単純な天然物（例えば再生原料又は再生原料の利用から生じる廃棄物、例えば糖、有機酸又はアルコール）→３−ヒドロキシカルボン酸→２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸（例えば株ＨＣＭ−１０による）
−  ２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸→メタクリル酸及びその同族体（例えばＮａＯＨの存在で、かつ１８５℃の温度で）
反応条件（ｐＨ値、イオン濃度、酸素／二酸化炭素の必要性、微量元素、温度等）は、この場合当然のことながら、微生物が３−ヒドロキシカルボン酸から２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸への最適な変換をし得るように選択される。前記の方法条件下で、コバラミン依存性ムターゼは、天然のミクロ環境内で、即ち細胞内で、単離された酵素よりも高い安定性及び有効性を有することができる。更に、適当な条件下で、細胞増殖、ひいてはムターゼ濃度の増加が可能である。従って、微生物を用いた酵素的変換は、場合により、方法の信頼性、オートメーション化及び容易性並びに最終生成物の品質及び収率に関して卓越した利点を有する。
【００１７】
本発明による３−ヒドロキシカルボン酸から２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸への酵素的変換に関して、３−ヒドロキシカルボン酸−ＣｏＡ−ムターゼ活性を有するユニット、即ちコバラミン依存性ムターゼを、有利にＣｏＡ−エステル合成活性と組み合わせて、精製された形、濃縮された形及び／又は単離された形で反応溶液に導入することも可能であり、その際、酵素は例えば天然源のものであってよい。当然のことながら、酵素は組換えにより製造された遺伝子組換え生物からの酵素であってよい。
【００１８】
酵素は、本発明による方法において、本発明の範囲内で、触媒として、完全な微生物細胞の形のみならず、透過処理された微生物細胞の形でも使用される。他の使用可能性は、微生物細胞抽出物からの（一種以上の）成分の形であるが、しかしまた、部分的に精製された形、又は精製された形である。場合により、他のＣｏＡ−エステル合成酵素、例えばＣｏＡ−トランスフェラーゼ又はＣｏＡ−シンテターゼが本発明により使用される。酵素触媒は固定化されていてよく、又は溶解した又は溶解していない担持材料上に付着されていてよい。
【００１９】
有利な実施変法において、所定の細胞区画又はその部分が相互に分離されるか又は結合され、即ち、ムターゼ活性を有するユニットにプラス又はマイナスの影響を及ぼし得る炭水化物構造、脂質又はタンパク質及び／又はペプチド並びに核酸が組み合わせられるか又は分離されることができる。そのような影響を意図的に利用するために、微生物から例えば当業界による方法で粗抽出物を生成し、該粗抽出物を場合により遠心分離して、本発明による反応を沈澱物又は上澄み液を用いて実施し得るようにする。
【００２０】
３−ヒドロキシカルボン酸（例えば３−ヒドロキシ酪酸）又はより厳密に言えばその細胞内のＣｏＡ−チオエステル  ３−ヒドロキシカルボニル−ＣｏＡは、多数の細菌株により単純な天然物から容易に製造することができる。前記酸は、一般的な細菌性の炭素及びエネルギーの貯蔵物質であるポリ−３−ヒドロキシアルカノアートのための基本構成単位／モノマーである。カルボン酸の骨格内の炭素の転位は、細菌系内において、また別の生物学的系内においても同様に広範囲に及ぶ。しかしながら従来、３−ヒドロキシカルボニル−ＣｏＡ−エステルを相応する２−ヒドロキシ−２−メチルカルボニル−ＣｏＡ−エステルに変換するための生物学的系は検出できなかった。本発明は、コバラミン依存性ムターゼ活性を有する系が双方の特性を有するという驚異的な発見に基づいている。
【００２１】
コバラミン依存性ムターゼを含有する微生物は、例えばMethylibium petroleiphilum PM1、Methylibium sp. R8（株コレクション  UFZ、ライプツィヒ在）、β−プロテオバクテリア株ＨＣＭ−１０、Xanthobacter autotrophicus Py2、Rhodobacter sphaeroides（ＡＴＣＣ  １７０２９）又はNocardioides sp. JS614である。
【００２２】
有利に好適な生物学的系が株ＨＣＭ−１０において見出された。該株は、特許手続上の微生物の寄託に関するブダペスト条約により、Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH、ブラウンシュヴァイク、ドイツ在に、Ｎｏ．  ＤＳＭ  １８０２８で２００６年３月１３日に寄託された。
【００２３】
前記の有利な生物学的系を使用して、２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸、特に２−ヒドロキシイソ酪酸の特に良好な収率を達成することが可能となった。しかしながら、微生物による酵素的反応は決して前記株に限定されるものではない。３−ヒドロキシカルボン酸を２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸に変換することのできる全ての生物を本発明により使用することができる。
【００２４】
該生物は、一方では同一の遺伝子ないし遺伝子産物を有するか、又は他方では類似の、又は同様の活性を有する遺伝子産物をもたらす同様の遺伝子を有する微生物であってよい。即ち、別の由来の３−ヒドロキシカルボニル−ＣｏＡ−ムターゼ活性は、本発明により同様に網羅される。同様に、本発明は、株ＨＣＭ−１０と類似の３−ヒドロキシカルボニル−ＣｏＡ−ムターゼ活性を有するか又は別の由来を有する形質転換された系も含む。
該系には、突然変異株、微生物の遺伝子組換えされた変異体、並びに単離された変異体、例えば、ムターゼをコードするヌクレオチド配列の挿入に基づき所望のコバラミン依存性ムターゼ活性を有する生物が含まれる。
【００２５】
有利に使用される生物学的系（株ＨＣＭ−１０  ＤＳＭ  １８０２８）は、３−ヒドロキシカルボニル−ＣｏＡ−エステルを、チオエステルとして、単純な天然物、例えば糖及び／又は有機酸及び／又はアルコール及びその誘導体から製造する。式１に例示的に（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡの場合に関して示されているように、ここで使用される有利な系において、３−ヒドロキシカルボニル−ＣｏＡ−エステルは、コバラミン依存性の炭素骨格転位ムターゼにより２−ヒドロキシ−２−メチルカルボニル−ＣｏＡ−エステルに変換される。ＣｏＡ−チオエステルは、該系において加水分解され、かつ酸が培地に分泌される。
【００２６】
【化１】
2009538118.tif 000003
【００２７】
本発明による方法に関して、有利な酵素触媒として、コバラミン依存性ムターゼを含有する微生物株ＨＣＭ−１０（ＤＳＭ  １８０２８）、Xanthobacter autotrophicus Py2、Rhodobacter sphaeroides（ＡＴＣＣ  １７０２９）又はNocardioides sp. JS614、その粗抽出物又は部分が使用される。本発明により使用される株は、有利に、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４を有するタンパク質を生成するか、もしくは、核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３を含み（ＨＣＭ−１０）、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６を有するタンパク質を生成するか、もしくは、核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８を含み（Xanthobacter autotrophicus Py2）、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０を有するタンパク質を生成するか、もしくは、核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２を含む（Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029）か、又は、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １３及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １４を有するタンパク質を生成するか、もしくは、核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １５及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １６を含む（Nocardioides sp. JS614）。本発明の範囲内で、上記のタンパク質は濃縮された形、単離された形、又は合成により製造された形で使用されてよい。
【００２８】
本発明の更に有利な実施変法において、酵素触媒、特に微生物、粗抽出物、その部分及び／又は濃縮されたか又は単離された酵素は固定化されて使用される。固定化により、酵素、細胞内器官及び細胞は、不溶性かつ反応空間に限定された状態となる。酵素は例えばポリマーマトリックス中に固定化されていてよい（例えばアルギナート、ポリビニルアルコール又はポリアクリルアミドゲル）。触媒の回収及び再利用を容易にするために、固定化は溶解したか又は溶解していない担持材料（例えばセライト）上で行われてもよい。ポリマーマトリックス中で、又は溶解したか又は溶解していない担体上での細胞固定化のための方法は当業者に公知であり、既に詳細に記載されている。酵素活性物質は同様に微生物細胞から単離されることができる。その後、該物質は直接触媒として、又はポリマーマトリックス中で、又は溶解したか又は溶解していない担体上で固定化して使用されることができる。このために必要な方法は当業者に公知であり、例えばMethods in Biotechnology, 第1巻: Immobilization of enzymes and cells, G. F. Bickerstaff著, Humana出版, トトワ, ニュージャージー, 1997に記載されている。
【００２９】
３−ヒドロキシカルボン酸から２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸への変換は、有利に連続法の範囲内で行われ、該方法は貫流型反応器中で実施されることができ、該反応器中で微生物増殖が、従って生成物形成が生じる。しかしながら、連続法とは、一方では栄養溶液に添加され、他方では酵素的に形成された２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸を含む培養液がそこから排出される、増殖する細胞及び触媒酵素の全ての系であるとも解釈することができる。本発明によれば、方法は半連続法として、又はバッチ法として実施されることもできる。
【００３０】
既に上記したように、２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸のための出発物質である３−ヒドロキシカルボン酸は、有利に、炭化水素及び／又は有機酸及び／又はアルコールないしその誘導体の酵素的な変換により製造される。本発明と関連して、コバラミン依存性ムターゼの他に、場合により更にＣｏＡ−エステル合成酵素が使用され、該酵素は微生物中に存在するか又は添加される。この場合、炭化水素及び／又は炭水化物及び／又は有機酸及び／又はアルコールないしその誘導体から３−ヒドロキシカルボン酸への、及び３−ヒドロキシカルボン酸から２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸への変換は、唯一の方法工程で行われ、即ち、出発基質から３−ヒドロキシカルボン酸までの変換、及び、３−ヒドロキシカルボン酸から相応する２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸への酵素的変換反応は、同時にか又はわずかに時間的にずれて、一つの、又は同一の反応溶液中で進行する。
【００３１】
本発明の極めて特別な実施態様において、培養のために、ｔ−ブチル基を有する基質が炭素源及びエネルギー源として使用され、有利に、ｔ−ブチルアルコールが唯一の炭素源及びエネルギー源として基本培地中で使用される。
【００３２】
本発明による方法は、有利に２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン酸（２−ヒドロキシイソ酪酸）の製造のために用いることができる。２−ヒドロキシイソ酪酸の有利な製造は、更に、外部から３−ヒドロキシ酪酸を添加することを特徴とする。
【００３３】
該方法は好気的に、有利に完全な細胞を用いて実施することができ、また、有利に抽出物又は精製された酵素が使用される場合に、嫌気的に、例えば窒素導通下に実施することもできる。
【００３４】
本発明は、以下：
ａ）配列番号２及び／又は配列番号４に示されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸分子；
ｂ）配列番号１及び／又は配列番号３に示されたヌクレオチド配列を含む核酸分子
からなる群から選択された、コバラミン依存性ムターゼの活性を有する酵素をコードする核酸分子にも関する。
【００３５】
本発明による酵素は、有利に、配列番号２及び配列番号４に示されるサブユニットを含むために卓越した酵素活性を有するヘテロ二量体タンパク質であることが判明した。
【００３６】
核酸分子は、ＤＮＡ分子、有利にｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ及び／又はＲＮＡ分子であってよい。核酸及びタンパク質の双方とも、天然源から、有利にＤＳＭ  １８０２８から、しかし例えばMethylibium petroleiphilum PM 1、Methylibium sp. R8（株コレクションUFZ ライプツィヒ在）、Xanthobacter autotrophicus Py2、Rhodobacter sphaeroides(ATCC17029)又はNocardioides sp. JS614からも単離されることができるか、又は公知の方法により合成されることもできる。
【００３７】
本発明により使用される核酸分子において、自体公知の分子生物学的技術を用いて突然変異を生じさせることができ、これにより、同様に本発明による方法において使用される、同様又は類似の特性を有する他の酵素を合成することができるようになる。突然変異は、短い酵素をもたらす欠失型突然変異であってよい。他の分子機序、例えば、挿入、重複、転位、遺伝子融合、ヌクレオチド交換により、又は種々の微生物株間での遺伝子導入によっても、同様に、類似又は同様の特性を有する修飾酵素を生成することができる。
【００３８】
この種の核酸分子の同定及び単離は、核酸分子又はその部分の使用下に行うことができる。核酸分子とハイブリダイゼーションする分子は、本発明により使用可能な酵素をコードする上記の核酸分子の断片、誘導体及び対立変異株も含む。断片とは、この場合、上記の酵素をコードするのに十分な長さの核酸分子の部分であると解釈される。誘導体とは、前記分子の配列であると解釈され、該配列は上記核酸分子の配列と一つ以上の位置で異なっているが、この上記核酸分子の配列に対して高度の相同性を有する。相同性とはこの場合、核酸レベルで少なくとも４０％の配列同一性、特に少なくとも６０％の、有利に８０％を上回る、特に有利に９０％、９５％、９７％又は９９％を上回る同一性を意味する。この場合、コードされた酵素は、アミノ酸レベルで、少なくとも６０％、有利に少なくとも８０％、特に有利に少なくとも９５％、極めて特に有利に少なくとも９９％の上記のアミノ酸配列に対する配列同一性を有する。この場合、欠失、置換、挿入又は組換えにより相違が生じる。これは、自然発生変異、例えば、別の生物からの配列又は突然変異であってよく、その際、これらの突然変異は自然に生じ得るか、又は意図的な変異誘発（ＵＶ線、Ｘ線、化学的手段又はその他）により生じ得る。更に、変異体は合成により生成された配列であってよい。前記変異体は所定の共通の特性、例えば酵素活性、活性酵素濃度、サブユニット、官能基、免疫反応性、立体配座及び／又は物理的特性、例えばゲル電気泳動における移動挙動、クロマトグラフィー挙動、溶解性、沈降係数、最適ｐＨ、最適温度、分光特性、安定性及び／又はその他を有する。
【００３９】
本発明は更に、配列番号２及び４を有する新規のタンパク質、並びに配列番号２及び配列番号４を含むヘテロ二量体タンパク質、並びにその少なくとも９９％の相同体にも関する。
【００４０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １は、ＤＳＭ  １８０２８からのコバラミン依存性ムターゼの大きなサブユニットのための１６４４  ｂｐを含むヌクレオチド配列を示す。
【００４１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２は、ＤＳＭ  １８０２８からのコバラミン依存性ムターゼの大きなサブユニットの５４８  ａａを含むアミノ酸配列を示す。
【００４２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３は、ＤＳＭ  １８０２８からのコバラミン依存性ムターゼの小さなサブユニットのための部分的なヌクレオチド配列の３６９  ｂｐを示す。
【００４３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４は、ＤＳＭ  １８０２８からのコバラミン依存性ムターゼのサブユニットの１２３  ａａを含む部分配列を示す。
【００４４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５及び６は、Xanthobacter autotrophicus Py2からのコバラミン依存性ムターゼの５６２ないし１３５  ａａを含むアミノ酸配列を示す。
【００４５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７及び８は、Xanthobacter autotrophicus Py2からのコバラミン依存性ムターゼのためのヌクレオチド配列の１６８９ないし４０８  ｂｐを示す。
【００４６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９及び１０は、Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029からのコバラミン依存性ムターゼの５６３ないし１３５  ａａを含むアミノ酸配列を示す。
【００４７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１及び１２は、Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029からのコバラミン依存性ムターゼのためのヌクレオチド配列の１６９２ないし４０８  ｂｐを示す。
【００４８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １３及び１４は、Nocardoides sp.JS614からのコバラミン依存性ムターゼの５６９ないし１６４  ａａを含むアミノ酸配列を示す。
【００４９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １５及び１６は、Nocardoides sp. JS614からのコバラミン依存性ムターゼのためのヌクレオチド配列の１７１０ないし４９５  ｂｐを示す。
【００５０】
本発明により製造された２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸は、（溶解していない成分、例えば微生物細胞を除去した後に）既に公知である方法を用いた培地の処理により単離されることができる。そのような方法は、特に例えば濃縮、イオン交換、蒸留、電気透析、抽出及び結晶化である。生成物は、塩としてか又は（酸性化後に）プロトン化された２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸として単離されることができる。
【００５１】
２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸（又はその相応する塩）は、多数の方法により脱水され、相応する不飽和２−メチルカルボン酸に変換され得る。Ｃ2〜Ｃ3不飽和イソアルケン酸の製造のために、製造された２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸は従来技術の公知の方法により脱水される。２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸の脱水は、金属酸化物、金属水酸化物、イオン交換体樹脂、アルミナ、二酸化ケイ素、アミン、ホスフィン、アルカリ金属アルコキシド及びアルカリ金属カルボン酸塩の使用により行われることができる。通常の反応温度は１６０℃〜２５０℃である。例えば、メタクリル酸の製造は、ＮａＯＨの存在で、約１８５℃の温度で２−ヒドロキシイソ酪酸を脱水することにより行われる。
【００５２】
前記方法により製造されたメタクリル酸及びその同族体により、多数の工業部門において、例えば添加物として、及び被覆において、目的にかなう利用がなされる。該方法は、従来公知の方法とは対照的に、低温プロセスであり、環境に有害でない出発物質を使用し、かつ廃棄物が少ないという所望の利点を併せ持つ。
【００５３】
引き続き、本発明を実施例をもとに詳説するが、しかしながら本発明はこの実施例に限定されるべきではない。
【００５４】
実施例
材料及び方法
微生物酵素触媒
３−ヒドロキシカルボニル−ＣｏＡ−エステル生成活性及び３−ヒドロキシカルボニル−ＣｏＡ−エステル異性化活性により特徴付けられる株ＨＣＭ−１０（ＤＳＭ  １８０２８）からの微生物細胞、又は、そこから単離された、配列番号２及び４を有するタンパク質サブユニット。
【００５５】
微生物酵素触媒の増殖
２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸の製造のために使用される微生物株を、下記の通り単離した。培養株を液体窒素中の２０％グリセリン溶液中で貯蔵する。
株ＨＣＭ−１０を、地下水から、唯一の炭素源及びエネルギー源としてのｔ−ブチルアルコールを含有する基本培地（第１表）に濃縮した。系統発生的に、該株はRubrivivax-Leptothrix群に属する。
【００５６】
【表１】
2009538118.tif 000004
【００５７】
株ＨＣＭ−１０を好気的に以下の条件（第２表）下で３−ヒドロキシカルボニル−ＣｏＡ−ムターゼ活性の試験のために増殖させた。
【００５８】
【表２】
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【００５９】
細胞を採収の直後に使用した。完全な細胞を他の予備処理、例えば透過処理なしに使用することができる。更に、細胞内及び細胞外への物質の拡散速度を改善するために、細胞を（例えばトルエン、洗浄剤を用いた処理により、又は凍結融解サイクルにより）透過処理して使用することができる。
【００６０】
培養液中ないし反応混合物中での２−ヒドロキシイソ酪酸及び３−ヒドロキシ酪酸の濃度を、ＦＦＡＰカラム及びＦＩＤ検出器を用いた酸性メタノリシスによるガスクロマトグラフィーにより測定した。
【００６１】
実施例1：
株ＨＣＭ−１０による３−ヒドロキシ酪酸から２−ヒドロキシイソ酪酸への変換
基本培地１００ｍＬ中の株ＨＣＭ−１０の細胞１ｇ（乾燥質量）の懸濁液を１２０ｍＬ血清瓶中に充填した。前記懸濁液に、３−ヒドロキシ酪酸５０ｍｌを添加し、該懸濁液を回転式振盪器で３０℃でインキュベートした。好気的インキュベートを０．３ｈ行った後、懸濁液に窒素を導通し、振盪下に３０℃で更に４時間インキュベートした。種々の時間に試料を採取し、懸濁液の遠心分離後の細胞不含の上澄み液中の２−ヒドロキシイソ酪酸及び３−ヒドロキシ酪酸の含分を測定した。２−ヒドロキシイソ酪酸を唯一の生成物として確認し、これを嫌気相中に放出した。それに対して、初期の好気相中で、３−ヒドロキシ酪酸は明らかに完全に分解された（図１）。２−ヒドロキシイソ酪酸の収率は、この場合５．１％であり、約８０％の３−ヒドロキシ酪酸が反応液中に残存していた。
【００６２】
実施例２：
株ＨＣＭ−１０の粗抽出物による３−ヒドロキシ酪酸から２−ヒドロキシイソ酪酸への変換
株ＨＣＭ−１０の細胞不含の粗抽出物を、ボールミル中での細胞の崩壊により製造し、細胞砕片を引き続き遠心分離により分離した。５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２で１ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含有）５ｍＬ中のタンパク質１０ｍｇの濃度の細胞不含の粗抽出物を、密閉可能な１０ｍＬガラス容器に入れた。前記抽出物に、更に、０．０１ｍＭ補酵素Ｂ１２、１ｍＭ補酵素Ａ、１ｍＭ  ＡＴＰ及び３−ヒドロキシ酪酸４．２５ｍｇを添加した。反応液に窒素を導通し、反応容器を密閉し、振盪下に３０℃で２時間インキュベートした。反応生成物を上記の通り分析した。２−ヒドロキシイソ酪酸の収率は、この場合９％であり、約８８％の３−ヒドロキシ酪酸が反応液中に残存していた（図２）。
【００６３】
実施例３：
２−ヒドロキシイソ酪酸からメタクリラートへの脱水
実施例２に記載された手法に相応して製造された２−ヒドロキシイソ酪酸の溶液（１ｍｇ／５ｍＬ）を、撹拌下にＮａＯＨ（０．０６ｍｇ）と混合した。溶液を、撹拌及び還流冷却下に１８５〜１９５℃で真空下（３００トール）にインキュベートした。メタクリラートの重合を阻害するために、５時間の期間にわたり、毎時５ｍＬ当たり２−ヒドロキシイソ酪酸０．５ｍｇの更なるアリコートを添加し、ここで、該アリコートは付加的にｐ−メトキシフェノール０．４質量％を含有していた。２４時間のインキュベートの後に反応を終了させた。２−ヒドロキシイソ酪酸からメタクリラートへの変換率は９７％であった。反応混合物からのメタクリル酸の分離を蒸留により行った。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】ＨＣＭ−１０株の完全な細胞による３−ヒドロキシ酪酸からの２−ヒドロキシイソ酪酸の形成における、３−ヒドロキシ酪酸及び２−ヒドロキシイソ酪酸の量の経時変化を示すグラフ。
【図２】ＨＣＭ−１０株の細胞から取得された粗抽出物による３−ヒドロキシ酪酸からの２−ヒドロキシイソ酪酸の形成における、２−ヒドロキシイソ酪酸の量の経時変化を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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