(57)【要約】  本発明は、２個以上の個々のオリゴマーからなるオリゴマー化合物（当該オリゴマー化合物において個々のオリゴマーが光切断可能なリンカーによって区分されている）の製造法であって、光活性的に前記リンカーを切断する工程を含んでなる方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２個以上の個々のオリゴマーからなるオリゴマー化合物（当該オリゴマー化合物において個々のオリゴマーが光切断可能なリンカーによって区分されている）の製造法であって、光活性的に前記リンカーを切断する工程を含んでなる方法。
【請求項２】
個々のオリゴマーが独立して、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖およびオリゴペプチドからなる群から選択される、請求項１の方法。
【請求項３】
個々のオリゴマーがオリゴヌクレオチドである、請求項１の方法。
【請求項４】
個々のオリゴマーが完全または部分的に相補的なオリゴヌクレオチドである、請求項１の方法。
【請求項５】
個々のオリゴマーが完全または部分的に相補的なオリゴリボヌクレオチドである、請求項１の方法。
【請求項６】
リンカーが各個々のオリゴマーの脱保護条件下で安定である、請求項１の方法。
【請求項７】
リンカー基がＵＶまたは可視光照射によって切断される、請求項１の方法。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドが２個のオリゴリボヌクレオチドである、請求項４の方法。
【請求項９】
リンカーが式Ｉ
【化１】
2009523746.tif 000017
〔式中；
ＰＧは（Ａｒ１）（Ａｒ２）（Ａｒ３）Ｃ−であり、ここでＡｒ１、Ａｒ２、Ａｒ３は独立して；
ＣＨ３ＯＣ６Ｈ４−およびＣ６Ｈ５−
からなる群から選択されるか、または
ＰＧは置換シリル基（Ｒ１’）（Ｒ２’）（Ｒ３’）Ｓｉ−であり、
ここでＲ１’、Ｒ２’、Ｒ３’は独立して、
低級アルキル、アリール、アリール低級アルキル、低級アルキルアリール、低級アルキルオキシおよびアリールオキシ
からなる群から選択され；
ＸはＯ、ＮまたはＳであり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は独立して、水素、低級アルキル、アリール、アリール低級アルキル、低級アルキルアリール、低級アルキルハロゲン、ハロゲン、ＣＮ、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ低級アルキル／アリール、ＣＯＮＲ’Ｒ”、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）低級アルキル／アリール、ＯＨ、Ｏ−低級アルキル／アリール、ＯＣ（Ｏ）低級アルキル／アリール、ＳＨ、Ｓ−低級アルキル／アリール、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２Ｏ−低級アルキル／アリール、ＳＯ２ＮＲ’Ｒ”、ＮＨ２、Ｎ−低級アルキル／アリール、ＮＨＣ（Ｏ）低級アルキル／アリールからなる群から選択され、そして少なくとも１個の置換基Ｒ１−Ｒ５はニトロ、ニトロシル、またはジアゾ基であり；
２個以上の置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４またはＲ５で定義の基で更に置換されていてもよい１個または複数個の環を形成していてもよく；
少なくとも１個の置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４またはＲ５は、成長オリゴヌクレオチド鎖もしくはアミンとのホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合を形成することができる基を有する、ホスホラミダイト、ホスホネート、またはホスホトリエステル、成長オリゴヌクレオチド鎖とのアミド、ウレアまたはチオウレア結合を形成することができる活性化カルボキシルエステル、イソシアネートまたはイソチオシアネートであり；
Ｒ６は、水素、低級アルキル、アリール、アリール低級アルキル、低級アルキルアリール、低級アルキルハロゲン、ＣＮ、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ低級アルキル／アリール、ＣＯＮＲ’Ｒ”、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）低級アルキル／アリール、Ｏ−低級アルキル／アリール、ＯＣ（Ｏ）低級アルキル／アリール、Ｓ−低級アルキル／アリール、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２Ｏ−低級アルキル／アリール、ＳＯ２ＮＲ’Ｒ”、Ｎ−低級アルキル／アリール、ＮＨＣ（Ｏ）低級アルキル／アリールである〕
の化合物である、請求項１〜８のいずれかの方法。
【請求項１０】
リンカーが式ＩＩ
【化２】
2009523746.tif 000018
〔ＰＧは、（Ａｒ１）（Ａｒ２）（Ａｒ３）Ｃ−であり、ここでＡｒ１、Ａｒ２、Ａｒ３は独立して；
ＣＨ３ＯＣ６Ｈ４−、Ｃ６Ｈ５−
からなる群から選択されるか、または
ＰＧは置換シリル基（Ｒ１’）（Ｒ２’）（Ｒ３’）Ｓｉ−であり、
ここでＲ１’、Ｒ２’、Ｒ３’は独立して、
低級アルキル、アリール、アリール低級アルキル、低級アルキルアリール、低級アルキルオキシおよびアリールオキシ
からなる群から選択され；
ＸはＯ、ＮまたはＳであり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は独立して、水素、低級アルキル、アリール、アリール低級アルキル、低級アルキルアリール、低級アルキルハロゲン、ハロゲン、ＣＮ、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ低級アルキル／アリール、ＣＯＮＲ’Ｒ”、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）低級アルキル／アリール、ＯＨ、Ｏ−低級アルキル／アリール、ＯＣ（Ｏ）低級アルキル／アリール、ＳＨ、Ｓ−低級アルキル／アリール、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２Ｏ−低級アルキル／アリール、ＳＯ２ＮＲ’Ｒ”、ＮＨ２、Ｎ−低級アルキル／アリール、ＮＨＣ（Ｏ）低級アルキル／アリールからなる群から選択され、そして少なくとも１個の置換基Ｒ１−Ｒ５はニトロ、ニトロシル、またはジアゾ基であり；
２個以上の置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４またはＲ５で定義の基で更に置換されていてもよい１個または複数個の環を形成していてもよく；
Ｒ６は、水素、低級アルキル、アリール、アリール低級アルキル、低級アルキルアリール、低級アルキルハロゲン、ＣＮ、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ低級アルキル／アリール、ＣＯＮＲ’Ｒ”、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）低級アルキル／アリール、Ｏ−低級アルキル／アリール、ＯＣ（Ｏ）低級アルキル／アリール、Ｓ−低級アルキル／アリール、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２Ｏ−低級アルキル／アリール、ＳＯ２ＮＲ’Ｒ”、Ｎ−低級アルキル／アリール、ＮＨＣ（Ｏ）低級アルキル／アリールであり；
Ｕ、Ｖ、Ｗは、置換基Ｒ１−Ｒ５の１個を一方の末端で、そして置換基Ｒ７−Ｒ１１の１個を他方の末端で置換している鎖を形成し；
Ｕ、Ｖ、Ｗは独立して、存在しないか、またはアルキレン（−Ｒ−）、シクロアルキレン（−Ｒ−）、またはアリーレン（−Ａｒ−）基、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ’−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）ＮＲ”−、−ＯＣ（Ｓ）ＮＲ’−、−ＮＲ’Ｃ（Ｓ）ＮＲ”−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ２）−、−Ｓ（Ｏ２）ＮＲ’−、−ＯＰ（Ｏ２）Ｏ−であり、そして標識またはフルオロフォアまたはオリゴヌクレオチドの薬理学的プロファイルを改善するために用いられる基を含んでいてよい。
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１は独立して、
水素、低級アルキル、アリール、アリール低級アルキル、低級アルキルアリール、低級アルキルハロゲン、ハロゲン、ＣＮ、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ低級アルキル／アリール、ＣＯＮＲ’Ｒ”、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）低級アルキル／アリール、ＯＨ、Ｏ−低級アルキル／アリール、ＯＣ（Ｏ）低級アルキル／アリール、ＳＨ、Ｓ−低級アルキル／アリール、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２Ｏ低級アルキル／アリール、ＳＯ２ＮＲ’Ｒ”、ＮＨ２、Ｎ−低級アルキル／アリール、ＮＨＣ（Ｏ）低級アルキル／アリールからなる群から選択され、そして少なくとも１個の置換基Ｒ７−Ｒ１１はニトロ、ニトロシルまたはジアゾ基であり；
Ｒ１２は、水素、低級アルキル、アリール、アリール低級アルキル、低級アルキルアリール、低級アルキルハロゲン、ＣＮ、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ低級アルキル／アリール、ＣＯＮＲ’Ｒ”、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）低級アルキル／アリール、Ｏ−低級アルキル／アリール、ＯＣ（Ｏ）低級アルキル／アリール、Ｓ−低級アルキル／アリール、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２Ｏ−低級アルキル／アリール、ＳＯ２ＮＲ’Ｒ”、Ｎ−低級アルキル／アリール、ＮＨＣ（Ｏ）低級アルキル／アリールからなる群から選択され；
ＹはＯ、ＮまたはＳであり；
Ｚは、成長オリゴヌクレオチド鎖もしくはアミンとのホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合を形成することができる基を有する、ホスホラミダイト、ホスホネート、またはホスホトリエステル、成長オリゴヌクレオチド鎖とのアミド、ウレアまたはチオウレア結合を形成することができる活性化カルボキシルエステル、イソシアネートまたはイソチオシアネートである〕
の化合物である、請求項１〜８のいずれかの方法。
【請求項１１】
リンカーが式Ｉ
【化３】
2009523746.tif 000019
〔式中、
ＰＧはジメトキシトリフェニルメチルであり；
ＸはＯであり；
Ｒ１はニトロ基であり；
Ｒ３は−ＣＨ２−Ｏ−Ｐ（Ｎ［ｉＰｒ］２）−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＮ）であり；
Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は水素である〕
の化合物である、請求項１〜８のいずれかの方法。
【請求項１２】
リンカーが式ＩＩ
【化４】
2009523746.tif 000020
〔式中、
ＰＧはジメトキシトリフェニルメチルであり；
ＸおよびＹはＯであり；
Ｒ１およびＲ７はニトロ基であり；
Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２は水素であり；
Ｕは酸素でありＲ３を置換しており；
Ｖは−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−であり；
Ｗは酸素でありＲ９を置換しており；
Ｚは−Ｐ（Ｎ［ｉＰｒ］２）−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＮ）である〕
の化合物である、請求項１〜８のいずれかの方法。
【請求項１３】
式Ｉ
【化５】
2009523746.tif 000021
〔式中；
ＰＧは（Ａｒ１）（Ａｒ２）（Ａｒ３）Ｃ−であり、ここでＡｒ１、Ａｒ２、Ａｒ３は独立して；
ＣＨ３ＯＣ６Ｈ４−およびＣ６Ｈ５−
からなる群から選択されるか、または
ＰＧは置換シリル基（Ｒ１’）（Ｒ２’）（Ｒ３’）Ｓｉ−であり、
ここでＲ１’、Ｒ２’、Ｒ３’は独立して、
低級アルキル、アリール、アリール低級アルキル、低級アルキルアリール、低級アルキルオキシおよびアリールオキシ
からなる群から選択され；
ＸはＯ、ＮまたはＳであり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は独立して、水素、低級アルキル、アリール、アリール低級アルキル、低級アルキルアリール、低級アルキルハロゲン、ハロゲン、ＣＮ、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ低級アルキル／アリール、ＣＯＮＲ’Ｒ”、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）低級アルキル／アリール、ＯＨ、Ｏ−低級アルキル／アリール、ＯＣ（Ｏ）低級アルキル／アリール、ＳＨ、Ｓ−低級アルキル／アリール、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２Ｏ−低級アルキル／アリール、ＳＯ２ＮＲ’Ｒ”、ＮＨ２、Ｎ−低級アルキル／アリール、ＮＨＣ（Ｏ）低級アルキル／アリールからなる群から選択され、そして少なくとも１個の置換基Ｒ１−Ｒ５はニトロ、ニトロシル、またはジアゾ基であり；
２個以上の置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４またはＲ５で定義の基で更に置換されていてもよい１個または複数個の環を形成していてもよく；
少なくとも１個の置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４またはＲ５は、成長オリゴヌクレオチド鎖もしくはアミンとのホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合を形成することができる基を有する、ホスホラミダイト、ホスホネート、またはホスホトリエステル、成長オリゴヌクレオチド鎖とのアミド、ウレアまたはチオウレア結合を形成することができる活性化カルボキシルエステル、イソシアネートまたはイソチオシアネートであり；
Ｒ６は、水素、低級アルキル、アリール、アリール低級アルキル、低級アルキルアリール、低級アルキルハロゲン、ＣＮ、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ低級アルキル／アリール、ＣＯＮＲ’Ｒ”、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）低級アルキル／アリール、Ｏ−低級アルキル／アリール、ＯＣ（Ｏ）低級アルキル／アリール、Ｓ−低級アルキル／アリール、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２Ｏ−低級アルキル／アリール、ＳＯ２ＮＲ’Ｒ”、Ｎ−低級アルキル／アリール、ＮＨＣ（Ｏ）低級アルキル／アリールである〕
の化合物。
【請求項１４】
ＰＧがジメトキシトリフェニルメチルであり；
ＸがＯであり；
Ｒ１がニトロ基であり；
Ｒ３が−ＣＨ２−Ｏ−Ｐ（Ｎ［ｉＰｒ］２）−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＮ）であり；
Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６が水素である；
請求項１３の化合物。
【請求項１５】
式ＩＩ
【化６】
2009523746.tif 000022
〔ＰＧは、（Ａｒ１）（Ａｒ２）（Ａｒ３）Ｃ−であり、ここでＡｒ１、Ａｒ２、Ａｒ３は独立して；
ＣＨ３ＯＣ６Ｈ４−、Ｃ６Ｈ５−
からなる群から選択されるか、または
ＰＧは置換シリル基（Ｒ１’）（Ｒ２’）（Ｒ３’）Ｓｉ−であり、
ここでＲ１’、Ｒ２’、Ｒ３’は独立して、
低級アルキル、アリール、アリール低級アルキル、低級アルキルアリール、低級アルキルオキシおよびアリールオキシ
からなる群から選択され；
ＸはＯ、ＮまたはＳであり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は独立して、水素、低級アルキル、アリール、アリール低級アルキル、低級アルキルアリール、低級アルキルハロゲン、ハロゲン、ＣＮ、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ低級アルキル／アリール、ＣＯＮＲ’Ｒ”、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）低級アルキル／アリール、ＯＨ、Ｏ−低級アルキル／アリール、ＯＣ（Ｏ）低級アルキル／アリール、ＳＨ、Ｓ−低級アルキル／アリール、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２Ｏ−低級アルキル／アリール、ＳＯ２ＮＲ’Ｒ”、ＮＨ２、Ｎ−低級アルキル／アリール、ＮＨＣ（Ｏ）低級アルキル／アリールからなる群から選択され、そして少なくとも１個の置換基Ｒ１−Ｒ５はニトロ、ニトロシル、またはジアゾ基であり；
２個以上の置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４またはＲ５で定義の基で更に置換されていてもよい１個または複数個の環を形成していてもよく；
Ｒ６は、水素、低級アルキル、アリール、アリール低級アルキル、低級アルキルアリール、低級アルキルハロゲン、ＣＮ、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ低級アルキル／アリール、ＣＯＮＲ’Ｒ”、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）低級アルキル／アリール、Ｏ−低級アルキル／アリール、ＯＣ（Ｏ）低級アルキル／アリール、Ｓ−低級アルキル／アリール、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２Ｏ−低級アルキル／アリール、ＳＯ２ＮＲ’Ｒ”、Ｎ−低級アルキル／アリール、ＮＨＣ（Ｏ）低級アルキル／アリールであり；
Ｕ、Ｖ、Ｗは、置換基Ｒ１−Ｒ５の１個を一方の末端で、そして置換基Ｒ７−Ｒ１１の１個を他方の末端で置換している鎖を形成し；
Ｕ、Ｖ、Ｗは独立して、存在しないか、またはアルキレン（−Ｒ−）、シクロアルキレン（−Ｒ−）、またはアリーレン（−Ａｒ−）基、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ’−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）ＮＲ”−、−ＯＣ（Ｓ）ＮＲ’−、−ＮＲ’Ｃ（Ｓ）ＮＲ”−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ２）−、−Ｓ（Ｏ２）ＮＲ’−、−ＯＰ（Ｏ２）Ｏ−であり、そして標識またはフルオロフォアまたはオリゴヌクレオチドの薬理学的プロファイルを改善するために用いられる基を含んでいてよい。
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１は独立して、
水素、低級アルキル、アリール、アリール低級アルキル、低級アルキルアリール、低級アルキルハロゲン、ハロゲン、ＣＮ、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ低級アルキル／アリール、ＣＯＮＲ’Ｒ”、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）低級アルキル／アリール、ＯＨ、Ｏ−低級アルキル／アリール、ＯＣ（Ｏ）低級アルキル／アリール、ＳＨ、Ｓ−低級アルキル／アリール、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２Ｏ低級アルキル／アリール、ＳＯ２ＮＲ’Ｒ”、ＮＨ２、Ｎ−低級アルキル／アリール、ＮＨＣ（Ｏ）低級アルキル／アリールからなる群から選択され、そして少なくとも１個の置換基Ｒ７−Ｒ１１はニトロ、ニトロシルまたはジアゾ基であり；
Ｒ１２は、水素、低級アルキル、アリール、アリール低級アルキル、低級アルキルアリール、低級アルキルハロゲン、ＣＮ、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ低級アルキル／アリール、ＣＯＮＲ’Ｒ”、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）低級アルキル／アリール、Ｏ−低級アルキル／アリール、ＯＣ（Ｏ）低級アルキル／アリール、Ｓ−低級アルキル／アリール、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２Ｏ−低級アルキル／アリール、ＳＯ２ＮＲ’Ｒ”、Ｎ−低級アルキル／アリール、ＮＨＣ（Ｏ）低級アルキル／アリールからなる群から選択され；
ＹはＯ、ＮまたはＳであり；
Ｚは、成長オリゴヌクレオチド鎖もしくはアミンとのホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合を形成することができる基を有する、ホスホラミダイト、ホスホネート、またはホスホトリエステル、成長オリゴヌクレオチド鎖とのアミド、ウレアまたはチオウレア結合を形成することができる活性化カルボキシルエステル、イソシアネートまたはイソチオシアネートである〕
の化合物。
【請求項１６】
ＰＧがジメトキシトリフェニルメチルであり；
ＸがＯであり；
Ｒ１がニトロ基であり；
Ｒ３が−ＣＨ２−Ｏ−Ｐ（Ｎ［ｉＰｒ］２）−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＮ）であり；
Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６が水素である；
請求項１５の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
２本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの合成には通常、２種類の独立した多工程プロセス（すなわち、合成、脱保護、精製および性質確認）が含まれる。ほとんどのアプリケーションについて問題ではないが、これは大量のオリゴヌクレオチドを必要とする例えばハイスループットアプリケーションまたは治療的アプリケーションのために、当該技術をスケールアップするための速度制限となる。タンデム合成と言われるＰｏｎ  ｅｔ  ａｌ［１］に記載の１つのアプローチは、合成後に切断可能なリンカーを含む１個の（長い）オリゴヌクレオチドを製造するという原理に基づく。
【背景技術】
【０００２】
その後の切断によって、２個の相補鎖を得る（スキーム１に図示する）。Pon, Richard T.; Yu, Shuyuan. Nucleic Acids Research  2005,  33(6),  1940-1948およびPon, Richard T.; Yu, Shuyuan. PCT Int. Appl. 2002）、ＷＯ  ２００２０２０５３７  Ａ２およびFerreira, Fernando; Meryer, Albert; Vasseur, Jean-Jacques; Morvan, Francois. J. Org. Chem. Online publication, 2005.によると、塩基に不安定なリンカーで分離する２個以上のオリゴヌクレオチドを連続して合成する。リンカーを、オリゴヌクレオチドの切断および塩基／ホスホジエステル脱保護を支持するために用いられる条件下で切断する。この方法の１つの欠点は、５’末端オリゴヌクレオチドのみがこの残基を有するために、トリチル−オンアプローチによってオリゴヌクレオチドを精製することができないことである。オリゴヌクレオチドに光切断可能な残基を取り込むことは、オリゴヌクレオチドの可逆的標識または不動化のために、そしてＳＮＰ遺伝子型決定のようなアプリケーションにおいて（ＷＯ  ９９６７６１９）、またはＲＮＡ合成における保護基として記載されている（Stutz, Alfred; Pitsch, Stefan. Synlett  1999, (Spec.), 930-934）。近年、光活性化型ｓｉＲＮＡまたは「ケージＲＮＡ干渉」が報告された。これらの場合には、ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖がその５’末端で、標識基を有する光切断可能な基の導入によって（ＷＯ２００４０４５５４７）、または内部で４，５−ジメトキシ−２−ニトロフェニル基がオリゴリボヌクレオチドホスホジエステル骨格に共有結合することによって（Shah, Samit ; Rangarajan, Subhashree ; Friedman, Simon, H. Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 1328-1332）修飾された。オリゴヌクレオチドそれ自体が生物学的実験の所望の時点で、例えば細胞へのトランスフェクション後に、光活性化され得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、二本鎖リボ核酸の合成的製造法を簡単にするために使用することができる化合物を見出し、そして既存の方法よりも様々な利点を有する方法を提供する。とりわけ、本発明の化合物の使用によって、二本鎖リボ核酸、例えばｓｉＲＮＡの合成的製造法が簡単になる。本発明の方法を実施することによって、両ストランドのリリース前に照射によって光切断可能なオリゴヌクレオチドを精製することが可能であるから、二本鎖リボ核酸の両ストランドを、試薬の品質を危険にさらすことなく１回の合成から得ることができる。この特徴は、ハイスループットアプリケーション（例えばｓｉＲＮＡライブラリー）または大規模アプリケーション（例えばｓｉＲＮＡ治療）にとりわけ重要であり得る．光切断可能な核酸はまた、それ自体酵素的アプリケーション（例えばプラスミドへの取り込み）または生物学的実験（例えば、細胞アッセイまたは動物モデルアッセイ）において使用することができ、実験の任意の段階でリリースすることができる。最後に、オリゴヌクレオチド間光切断可能リンカーは、薬理学的特性の上昇の検出が可能な、標識基またはカーゴ基のような付加的機能を付け加えるように設計することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は新規光切断可能なリンカーを用いた、複数化合物の１工程合成のための新規合成戦略を見出した。リンカーおよびその使用は、複数のバイオポリマー、例えばポリペプチド、ポリサッカリドまたはポリヌクレオチドまたはその混合物の製造に適用可能である。制御された比の２種以上の試薬が必要なアプリケーションにおいてとりわけ有用であり得る。これに限定されないが、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の製造にとりわけ適している。なぜなら、両ストランドを光切断可能なリンカーを有する１個の長い自己相補的なオリゴヌクレオチドとして合成することができ、これによって、オリゴヌクレオチド脱保護および精製の後に光切断可能な小ヘアピンＲＮＡ（光−ｓｈＲＮＡ）とも呼ぶことができる１個の長いオリゴヌクレオチドを得ることができるからである。
【０００５】
ｓｉＲＮＡ合成について、この戦略は標準的なｓｉＲＮＡ製造に対して下記利点を有する；１個の分子のみを合成、精製、および分析する；光照射を精製光−ｓｈＲＮＡに対して行うことができ、これは結果として、完全な化学量論でｓｉＲＮＡ二本鎖のアニーリングを保証する；非アニール化ストランドが決して存在しないので、個々のストランドのサンプル追跡が必要ない；ｓｉＲＮＡをリリースするための光−ｓｈＲＮＡの光照射を、任意の時点で、生物学的実験中（例えば、トランスフェクション後または注入後、光−ｓｈＲＮＡのインサイチュ放射）にさえ、行うことができる；そして、
リンカーは細胞取り込みまたは組織特異的送達を向上させ得る官能基を有し得る。
【発明の効果】
【０００６】
本明細書に記載の結果は、提案したオルト−ニトロベンジル含有リンカーがホスホラミダイド化学を用いた標準的なＲＮＡまたはＤＮＡオリゴヌクレオチド合成に完全に適合性であることを示している。リンカーは、粗オリゴヌクレオチドをリリースするために必要な切断および脱保護条件下、ならびに末端５’−ジメトキシトリチル基を除去するのに必要な水性酸性条件下で安定である。本発明は複数の精製オリゴヌクレオチドの１回の合成プロセスでの合成を可能とする化合物および当該化合物の使用を提供する。現在の形態において、光照射によるリンカーの切断は、リンカー係留末端で末端リン酸残基を有するオリゴヌクレオチドをリリースする。これは末端ヒドロキシル基を必要とするいくつかのアプリケーションには欠点であり得るが、生物学的機能のためにガイドストランドの５’末端でリン酸基を必要とするｓｉＲＮＡの製造については利点となる（Meister, Gunter; Tuschl, Thomas.  Nature 2004,  431(7006),  343-349）。
【０００７】
本発明の方法の概略を図１に示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
第１の局面において、本発明は、２個以上の個々のオリゴマーからなるオリゴマー化合物（当該オリゴマー化合物において個々のオリゴマーが光切断可能なリンカーによって区分されている）の製造法であって、光活性的に前記リンカーを切断する工程を含んでなる方法に関する。
【０００９】
個々のオリゴマーは独立して、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、オリゴペプチドからなる群から選択され得る。
【００１０】
ひとつの態様において、個々のオリゴマーは相補的であり得るかまたはあり得ないオリゴヌクレオチドである。好ましくは、オリゴマーは完全または部分的に相補的である。部分的に相補とは、オリゴヌクレオチドの５０％〜９９％のヌクレオチドが相補的であることを意味する。
【００１１】
好ましい態様において、個々のオリゴマーは完全または部分的に相補的であり得るオリゴリボヌクレオチドである。
【００１２】
好ましい態様において、リンカーは各個々のオリゴマーの脱保護条件下で安定である。
【００１３】
好ましくは、リンカー基はＵＶまたは可視光放射で切断可能である。
【００１４】
好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは２個のオリゴリボヌクレオチドである。
【００１５】
さらなる態様において、リンカーは式Ｉ
【化１】
2009523746.tif 000002
〔式中；
ＰＧは（Ａｒ１）（Ａｒ２）（Ａｒ３）Ｃ−であり、ここでＡｒ１、Ａｒ２、Ａｒ３は独立して；
ＣＨ３ＯＣ６Ｈ４−およびＣ６Ｈ５−
からなる群から選択されるか、または
ＰＧは置換シリル基（Ｒ１’）（Ｒ２’）（Ｒ３’）Ｓｉ−であり、
ここでＲ１’、Ｒ２’、Ｒ３’は独立して、
低級アルキル、アリール、アリール低級アルキル、低級アルキルアリール、低級アルキルオキシおよびアリールオキシ
からなる群から選択され；
ＸはＯ、ＮまたはＳであり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は独立して、水素、低級アルキル、アリール、アリール低級アルキル、低級アルキルアリール、低級アルキルハロゲン、ハロゲン、ＣＮ、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ低級アルキル／アリール、ＣＯＮＲ’Ｒ”、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）低級アルキル／アリール、ＯＨ、Ｏ−低級アルキル／アリール、ＯＣ（Ｏ）低級アルキル／アリール、ＳＨ、Ｓ−低級アルキル／アリール、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２Ｏ−低級アルキル／アリール、ＳＯ２ＮＲ’Ｒ”、ＮＨ２、Ｎ−低級アルキル／アリール、ＮＨＣ（Ｏ）低級アルキル／アリールからなる群から選択され、そして少なくとも１個の置換基Ｒ１−Ｒ５はニトロ、ニトロシル、またはジアゾ基であり；
２個以上の置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４またはＲ５で定義の基で更に置換されていてもよい１個または複数個の環を形成していてもよく；
少なくとも１個の置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４またはＲ５は、成長オリゴヌクレオチド鎖もしくはアミンとのホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合を形成することができる基を有する、ホスホラミダイト、ホスホネート、またはホスホトリエステル、成長オリゴヌクレオチド鎖とのアミド、ウレアまたはチオウレア結合を形成することができる活性化カルボキシルエステル、イソシアネートまたはイソチオシアネートであり；
Ｒ６は、水素、低級アルキル、アリール、アリール低級アルキル、低級アルキルアリール、低級アルキルハロゲン、ＣＮ、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ低級アルキル／アリール、ＣＯＮＲ’Ｒ”、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）低級アルキル／アリール、Ｏ−低級アルキル／アリール、ＯＣ（Ｏ）低級アルキル／アリール、Ｓ−低級アルキル／アリール、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２Ｏ−低級アルキル／アリール、ＳＯ２ＮＲ’Ｒ”、Ｎ−低級アルキル／アリール、ＮＨＣ（Ｏ）低級アルキル／アリールである〕
の化合物である。
【００１６】
このリンカーは好ましくは、光、例えばＵＶ光または可視光、またはレーザービームで切断可能である。
【００１７】
リンカーが式ＩＩ
【化２】
2009523746.tif 000003
〔ＰＧは、（Ａｒ１）（Ａｒ２）（Ａｒ３）Ｃ−であり、ここでＡｒ１、Ａｒ２、Ａｒ３は独立して；
ＣＨ３ＯＣ６Ｈ４−、Ｃ６Ｈ５−
からなる群から選択されるか、または
ＰＧは置換シリル基（Ｒ１’）（Ｒ２’）（Ｒ３’）Ｓｉ−であり、
ここでＲ１’、Ｒ２’、Ｒ３’は独立して、
低級アルキル、アリール、アリール低級アルキル、低級アルキルアリール、低級アルキルオキシおよびアリールオキシ
からなる群から選択され；
ＸはＯ、ＮまたはＳであり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は独立して、水素、低級アルキル、アリール、アリール低級アルキル、低級アルキルアリール、低級アルキルハロゲン、ハロゲン、ＣＮ、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ低級アルキル／アリール、ＣＯＮＲ’Ｒ”、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）低級アルキル／アリール、ＯＨ、Ｏ−低級アルキル／アリール、ＯＣ（Ｏ）低級アルキル／アリール、ＳＨ、Ｓ−低級アルキル／アリール、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２Ｏ−低級アルキル／アリール、ＳＯ２ＮＲ’Ｒ”、ＮＨ２、Ｎ−低級アルキル／アリール、ＮＨＣ（Ｏ）低級アルキル／アリールからなる群から選択され、そして少なくとも１個の置換基Ｒ１−Ｒ５はニトロ、ニトロシル、またはジアゾ基であり；
２個以上の置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４またはＲ５で定義の基で更に置換されていてもよい１個または複数個の環を形成していてもよく；
Ｒ６は、水素、低級アルキル、アリール、アリール低級アルキル、低級アルキルアリール、低級アルキルハロゲン、ＣＮ、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ低級アルキル／アリール、ＣＯＮＲ’Ｒ”、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）低級アルキル／アリール、Ｏ−低級アルキル／アリール、ＯＣ（Ｏ）低級アルキル／アリール、Ｓ−低級アルキル／アリール、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２Ｏ−低級アルキル／アリール、ＳＯ２ＮＲ’Ｒ”、Ｎ−低級アルキル／アリール、ＮＨＣ（Ｏ）低級アルキル／アリールであり；
Ｕ、Ｖ、Ｗは、置換基Ｒ１−Ｒ５の１個を一方の末端で、そして置換基Ｒ７−Ｒ１１の１個を他方の末端で置換している鎖を形成し；
Ｕ、Ｖ、Ｗは独立して、存在しないか、またはアルキレン（−Ｒ−）、シクロアルキレン（−Ｒ−）、またはアリーレン（−Ａｒ−）基、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ’−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）ＮＲ”−、−ＯＣ（Ｓ）ＮＲ’−、−ＮＲ’Ｃ（Ｓ）ＮＲ”−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ２）−、−Ｓ（Ｏ２）ＮＲ’−、−ＯＰ（Ｏ２）Ｏ−であり、そして標識またはフルオロフォアまたはオリゴヌクレオチドの薬理学的プロファイルを改善するために用いられる基を含んでいてよい。
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１は独立して、
水素、低級アルキル、アリール、アリール低級アルキル、低級アルキルアリール、低級アルキルハロゲン、ハロゲン、ＣＮ、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ低級アルキル／アリール、ＣＯＮＲ’Ｒ”、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）低級アルキル／アリール、ＯＨ、Ｏ−低級アルキル／アリール、ＯＣ（Ｏ）低級アルキル／アリール、ＳＨ、Ｓ−低級アルキル／アリール、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２Ｏ低級アルキル／アリール、ＳＯ２ＮＲ’Ｒ”、ＮＨ２、Ｎ−低級アルキル／アリール、ＮＨＣ（Ｏ）低級アルキル／アリールからなる群から選択され、そして少なくとも１個の置換基Ｒ７−Ｒ１１はニトロ、ニトロシルまたはジアゾ基であり；
Ｒ１２は、水素、低級アルキル、アリール、アリール低級アルキル、低級アルキルアリール、低級アルキルハロゲン、ＣＮ、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ低級アルキル／アリール、ＣＯＮＲ’Ｒ”、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）低級アルキル／アリール、Ｏ−低級アルキル／アリール、ＯＣ（Ｏ）低級アルキル／アリール、Ｓ−低級アルキル／アリール、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２Ｏ−低級アルキル／アリール、ＳＯ２ＮＲ’Ｒ”、Ｎ−低級アルキル／アリール、ＮＨＣ（Ｏ）低級アルキル／アリールからなる群から選択され；
ＹはＯ、ＮまたはＳであり；
Ｚは、成長オリゴヌクレオチド鎖もしくはアミンとのホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合を形成することができる基を有する、ホスホラミダイト、ホスホネート、またはホスホトリエステル、成長オリゴヌクレオチド鎖とのアミド、ウレアまたはチオウレア結合を形成することができる活性化カルボキシルエステル、イソシアネートまたはイソチオシアネートである〕
の化合物である上記方法がより好ましい。
【００１８】
リンカーが式Ｉ
【化３】
2009523746.tif 000004
〔式中、
ＰＧがジメトキシトリフェニルメチルであり；
ＸがＯであり；
Ｒ１がニトロ基であり；
Ｒ３が−ＣＨ２−Ｏ−Ｐ（Ｎ［ｉＰｒ］２）−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＮ）であり；
Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６が水素である〕
の化合物である上記方法がより好ましい。
【００１９】
リンカーが式ＩＩ
【化４】
2009523746.tif 000005
〔式中、
ＰＧがジメトキシトリフェニルメチルであり；
ＸおよびＹがＯであり；
Ｒ１およびＲ７がニトロ基であり；
Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２が水素であり；
Ｕが酸素でありＲ３を置換しており；
Ｖが−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−であり；
Ｗが酸素でありＲ９を置換しており；
Ｚが−Ｐ（Ｎ［ｉＰｒ］２）−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＮ）である〕
の化合物である上記方法がより好ましい。
【００２０】
さらなる態様において、本発明は式Ｉ
【化５】
2009523746.tif 000006
〔式中；
ＰＧは（Ａｒ１）（Ａｒ２）（Ａｒ３）Ｃ−であり、ここでＡｒ１、Ａｒ２、Ａｒ３は独立して；
ＣＨ３ＯＣ６Ｈ４−およびＣ６Ｈ５−
からなる群から選択されるか、または
ＰＧは置換シリル基（Ｒ１’）（Ｒ２’）（Ｒ３’）Ｓｉ−であり、
ここでＲ１’、Ｒ２’、Ｒ３’は独立して、
低級アルキル、アリール、アリール低級アルキル、低級アルキルアリール、低級アルキルオキシおよびアリールオキシ
からなる群から選択され；
ＸはＯ、ＮまたはＳであり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は独立して、水素、低級アルキル、アリール、アリール低級アルキル、低級アルキルアリール、低級アルキルハロゲン、ハロゲン、ＣＮ、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ低級アルキル／アリール、ＣＯＮＲ’Ｒ”、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）低級アルキル／アリール、ＯＨ、Ｏ−低級アルキル／アリール、ＯＣ（Ｏ）低級アルキル／アリール、ＳＨ、Ｓ−低級アルキル／アリール、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２Ｏ−低級アルキル／アリール、ＳＯ２ＮＲ’Ｒ”、ＮＨ２、Ｎ−低級アルキル／アリール、ＮＨＣ（Ｏ）低級アルキル／アリールからなる群から選択され、そして少なくとも１個の置換基Ｒ１−Ｒ５はニトロ、ニトロシル、またはジアゾ基であり；
２個以上の置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４またはＲ５で定義の基で更に置換されていてもよい１個または複数個の環を形成していてもよく；
少なくとも１個の置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４またはＲ５は、成長オリゴヌクレオチド鎖もしくはアミンとのホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合を形成することができる基を有する、ホスホラミダイト、ホスホネート、またはホスホトリエステル、成長オリゴヌクレオチド鎖とのアミド、ウレアまたはチオウレア結合を形成することができる活性化カルボキシルエステル、イソシアネートまたはイソチオシアネートであり；
Ｒ６は、水素、低級アルキル、アリール、アリール低級アルキル、低級アルキルアリール、低級アルキルハロゲン、ＣＮ、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ低級アルキル／アリール、ＣＯＮＲ’Ｒ”、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）低級アルキル／アリール、Ｏ−低級アルキル／アリール、ＯＣ（Ｏ）低級アルキル／アリール、Ｓ−低級アルキル／アリール、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２Ｏ−低級アルキル／アリール、ＳＯ２ＮＲ’Ｒ”、Ｎ−低級アルキル／アリール、ＮＨＣ（Ｏ）低級アルキル／アリールである〕
の化合物を提供する。
【００２１】
式ＩＩ
【化６】
2009523746.tif 000007
〔ＰＧは、（Ａｒ１）（Ａｒ２）（Ａｒ３）Ｃ−であり、ここでＡｒ１、Ａｒ２、Ａｒ３は独立して；
ＣＨ３ＯＣ６Ｈ４−、Ｃ６Ｈ５−
からなる群から選択されるか、または
ＰＧは置換シリル基（Ｒ１’）（Ｒ２’）（Ｒ３’）Ｓｉ−であり、
ここでＲ１’、Ｒ２’、Ｒ３’は独立して、
低級アルキル、アリール、アリール低級アルキル、低級アルキルアリール、低級アルキルオキシおよびアリールオキシ
からなる群から選択され；
ＸはＯ、ＮまたはＳであり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は独立して、水素、低級アルキル、アリール、アリール低級アルキル、低級アルキルアリール、低級アルキルハロゲン、ハロゲン、ＣＮ、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ低級アルキル／アリール、ＣＯＮＲ’Ｒ”、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）低級アルキル／アリール、ＯＨ、Ｏ−低級アルキル／アリール、ＯＣ（Ｏ）低級アルキル／アリール、ＳＨ、Ｓ−低級アルキル／アリール、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２Ｏ−低級アルキル／アリール、ＳＯ２ＮＲ’Ｒ”、ＮＨ２、Ｎ−低級アルキル／アリール、ＮＨＣ（Ｏ）低級アルキル／アリールからなる群から選択され、そして少なくとも１個の置換基Ｒ１−Ｒ５はニトロ、ニトロシル、またはジアゾ基であり；
２個以上の置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４またはＲ５で定義の基で更に置換されていてもよい１個または複数個の環を形成していてもよく；
Ｒ６は、水素、低級アルキル、アリール、アリール低級アルキル、低級アルキルアリール、低級アルキルハロゲン、ＣＮ、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ低級アルキル／アリール、ＣＯＮＲ’Ｒ”、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）低級アルキル／アリール、Ｏ−低級アルキル／アリール、ＯＣ（Ｏ）低級アルキル／アリール、Ｓ−低級アルキル／アリール、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２Ｏ−低級アルキル／アリール、ＳＯ２ＮＲ’Ｒ”、Ｎ−低級アルキル／アリール、ＮＨＣ（Ｏ）低級アルキル／アリールであり；
Ｕ、Ｖ、Ｗは、置換基Ｒ１−Ｒ５の１個を一方の末端で、そして置換基Ｒ７−Ｒ１１の１個を他方の末端で置換している鎖を形成し；
Ｕ、Ｖ、Ｗは独立して、存在しないか、またはアルキレン（−Ｒ−）、シクロアルキレン（−Ｒ−）、またはアリーレン（−Ａｒ−）基、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ’−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）ＮＲ”−、−ＯＣ（Ｓ）ＮＲ’−、−ＮＲ’Ｃ（Ｓ）ＮＲ”−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ２）−、−Ｓ（Ｏ２）ＮＲ’−、−ＯＰ（Ｏ２）Ｏ−であり、そして標識またはフルオロフォアまたはオリゴヌクレオチドの薬理学的プロファイルを改善するために用いられる基を含んでいてよい。
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１は独立して、
水素、低級アルキル、アリール、アリール低級アルキル、低級アルキルアリール、低級アルキルハロゲン、ハロゲン、ＣＮ、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ低級アルキル／アリール、ＣＯＮＲ’Ｒ”、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）低級アルキル／アリール、ＯＨ、Ｏ−低級アルキル／アリール、ＯＣ（Ｏ）低級アルキル／アリール、ＳＨ、Ｓ−低級アルキル／アリール、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２Ｏ低級アルキル／アリール、ＳＯ２ＮＲ’Ｒ”、ＮＨ２、Ｎ−低級アルキル／アリール、ＮＨＣ（Ｏ）低級アルキル／アリールからなる群から選択され、そして少なくとも１個の置換基Ｒ７−Ｒ１１はニトロ、ニトロシルまたはジアゾ基であり；
Ｒ１２は、水素、低級アルキル、アリール、アリール低級アルキル、低級アルキルアリール、低級アルキルハロゲン、ＣＮ、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ低級アルキル／アリール、ＣＯＮＲ’Ｒ”、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）低級アルキル／アリール、Ｏ−低級アルキル／アリール、ＯＣ（Ｏ）低級アルキル／アリール、Ｓ−低級アルキル／アリール、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２Ｏ−低級アルキル／アリール、ＳＯ２ＮＲ’Ｒ”、Ｎ−低級アルキル／アリール、ＮＨＣ（Ｏ）低級アルキル／アリールからなる群から選択され；
ＹはＯ、ＮまたはＳであり；
Ｚは、成長オリゴヌクレオチド鎖もしくはアミンとのホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合を形成することができる基を有する、ホスホラミダイト、ホスホネート、またはホスホトリエステル、成長オリゴヌクレオチド鎖とのアミド、ウレアまたはチオウレア結合を形成することができる活性化カルボキシルエステル、イソシアネートまたはイソチオシアネートである〕
の化合物がより好ましい。
【００２２】
式Ｉ
【化７】
2009523746.tif 000008
〔式中、
ＰＧがジメトキシトリフェニルメチルであり；
ＸがＯであり；
Ｒ１がニトロ基であり；
Ｒ３が−ＣＨ２−Ｏ−Ｐ（Ｎ［ｉＰｒ］２）−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＮ）であり；
Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６が水素である〕
の化合物がより好ましい。
【００２３】
式ＩＩ
【化８】
2009523746.tif 000009
〔式中、
ＰＧがジメトキシトリフェニルメチルであり；
ＸおよびＹがＯであり；
Ｒ１およびＲ７がニトロ基であり；
Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２が水素であり；
Ｕが酸素でありＲ３を置換しており；
Ｖが−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−であり；
Ｗが酸素でありＲ９を置換しており；
Ｚが−Ｐ（Ｎ［ｉＰｒ］２）−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＮ）である〕
の化合物がより好ましい。
【００２４】
有機基または化合物との関係で「低級」なる用語は、８個までの炭素原子、好ましくは１〜６個、またはより好ましくは１〜４個、または２〜６個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖であり得る化合物または基を意味する。低級アルキルは、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチルおよび分枝鎖ペンチル、ｎ−ヘキシルおよび分枝鎖ヘキシル、ｎ−ヘプチル、分枝鎖ヘプチル、ｎ−オクチルおよび分枝鎖オクチルを意味する。
ｉＰｒはイソプロピルを意味する。
【実施例】
【００２５】
材料および方法
光切断可能なホスホラミダイドの合成
スキーム２
【化９】
2009523746.tif 000010
【００２６】
３−ヒドロキシメチル−４−ニトロ−フェノール（１）
化合物１を文献に従って合成した（R. Reinhard, B.F. Schmidt, J. Org. Chem., 1998, 63, 2434-2441）。
【００２７】
｛５−［３−（３−ヒドロキシメチル−４−ニトロ−フェノキシ）−プロポキシ］−２−ニトロ−フェニル｝−メタノール（２）
化合物１（２．０２ｇ、１２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２６ｍｌ）に溶解した。１，３−ジブロモプロパン（５６０μｌ、５，４ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（２．０ｇ、１４．４ｍｍｏｌ）およびヨウ化カリウム（０．２ｇ、１．２ｍｍｏｌ）を加え、橙色懸濁液を９０℃で３時間攪拌した。反応溶液を室温に冷却し、１４０ｍｌの水に注いだ。沈殿を濾取し、水、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、再度水で２回洗浄し、乾燥して淡黄色結晶１．８２ｇを得た。収率８９％。ＴＬＣ（ＡｃＯＥｔ／ヘキサン  １：１）：  Rf 0.21. 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 2.27 (q, J = 6.2, CH2CH2CH2); 4.30 (t, J = 6.2, CH2CH2CH2); 4.84 (s, CH2OH, C’H2OH); 5.59 (s, CH2OH, C’H2OH); 7.05 (dd, J = 9.1, 2.8, 2 arom. H); 7.36 (d, J = 2.8, 2 arom. H); 8.12 (d, J = 9.1, 2 arom. H). 13C-NMR (75 MHz, DMSO-d6): 28.2; 60.3; 65.0; 112.8; 113.2; 127.5; 139.4; 142.4; 162.9. HR-ESI-MS (pos.モード): 401.0959 ([M+Na]+ ; 計算値 401.0960).
【００２８】
［５−（３−｛３−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−４−ニトロ−フェノキシ｝−プロポキシ）−２−ニトロ−フェニル］−メタノール（３）
１．８ｇ（４．７６ｍｍｏｌ）の２を４５ｍｌピリジンに窒素下で溶解した。２０ｍｌ乾燥ピリジン中１．６１ｇ（４．７６ｍｍｏｌ）ＤＭＴＣｌ溶液を室温で加えた。反応混合物を一晩攪拌し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で希釈し、そしてＡｃＯＥｔで２回抽出した。合併した有機相を水および塩水で洗浄し、乾燥し（Ｋ２ＣＯ３）、減圧下で蒸発させた。得られた油状物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル；ＡｃＯＥｔ／ヘキサン  １：３、２％  Ｅｔ３Ｎ→ＡｃＯＥｔ、２％  Ｅｔ３Ｎ）で精製して１．４５ｇの３を黄色泡状物として得た。収率４５％。ＴＬＣ（ＡｃＯＥｔ／ヘキサン  １：１）： Rf 0.43. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 2.40 (q, J = 6.0, CH2CH2CH2); 2.56 (t, J = 6.4, CH2OH); 3.78 (s, 2 OMe); 4.33 (t, J = 6.0, CH2CH2CH2); 4.65 (s, CH2ODMT); 4.99 (d, J = 6.4, CH2OH); 6.8-6.95 (m, 6 arom. H); 7.2-7.4 (m, 8 arom. H); 7.47 (m, 2 arom. H); 7.70 (m, 2 arom. H); 8.12 (d, J = 9.1, 1 arom. H); 8.18 (d, J = 9.1, 1 arom. H). HR-ESI-MS (pos.モード): 703.2264 ([M+Na]+; 計算値 703.2267).
【００２９】
ジイソプロピル−ホスホラミド酸  ５−（３−｛３−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−４−ニトロ−フェノキシ｝−プロポキシ）−２−ニトロ−ベンジルエステル２−シアノ−エチルエステル（４）
１．０ｇ（１．４７ｍｍｏｌ）の３をＣＨ２Ｃｌ２  ６ｍｌに窒素下で溶解した。ヒューニッヒ塩基０．６ｍｌおよび２−シアノエチルジイソプロピルアミドクロリドホスファイト０．３８ｇ（１．６２ｍｍｏｌ）を加え、混合物を３時間室温で攪拌した。反応混合物を直接シリカゲルにアプライし、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル（５０ｇ）；  ＡｃＯＥｔ／ヘキサン  ３：７、２％  Ｅｔ３Ｎ→ＡｃＯＥｔ、２％  Ｅｔ３Ｎ）で精製した。１．０５ｇの４を黄色泡状物として得た。収率８１％。ＴＬＣ（ＡｃＯＥｔ／ヘキサン  １：１）： Rf 0.79. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.21 (d, J = 6.9, 2 MeCHN); 2.40 (q, J = 6.0, CH2CH2CH2); 2.60 (t, J = 6.3, CH2CN); 3.6-4.0 (m, OCH2CH2CN, 2 Me2CHN); 3.78 (s, 2 OMe); 4.32 (t, J = 6.0, CH2CH2CH2); 4.65 (s, CH2ODMT); 5.14 (m, CH2OP); 6.8-6.95 (m, 6 arom. H); 7.2-7.4 (m, 8 arom. H); 7.47 (m, 2 arom. H); 7.70 (m, 2 arom. H); 8.11 (d, J = 9.0, 1 arom. H); 8.18 (d, J = 9.1, 1 arom. H). 31P-NMR (162 MHz, CDCl3): 149.12.  HR-ESI-MS (pos.モード): 903.3326 ([M+Na]+; 計算値 903.3346).
【００３０】
スキーム３
【化１０】
2009523746.tif 000011
【００３１】
｛４−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−３−ニトロ−フェニル｝−メタノール（５）および｛４−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−２−ニトロ−フェニル｝−メタノール（６）
（４−ヒドロキシメチル−２−ニトロ−フェニル）−メタノール（TCI Tokyo Kasei、３．０ｇ、１６．４ｍｍｏｌ）をピリジン（３０ｍｌ）にアルゴン雰囲気下で溶解した。４，４’−ジメトキシトリチルクロライド（５．５５ｇ、１６．４ｍｍｏｌ）を３０分にわたって、溶液を０℃に冷却しながら少量ずつ加えた。反応混合物を一晩室温で攪拌し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で希釈し、ＡｃＯＥｔで２回抽出した。合併した有機相を水および塩水で洗浄し、乾燥し（ＮａＨＣＯ３）、減圧下で蒸発させた。得られた油状物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル；  ＡｃＯＥｔ／ヘキサン  １：４、１％  Ｅｔ３Ｎ→ＡｃＯＥｔ、１％Ｅｔ３Ｎ）で精製して０．９１ｇの５（１１％）および３．１８ｇの６（４０％）を黄色泡状物として得た。
５の分析データ：ＴＬＣ（ＡｃＯＥｔ／ヘキサン  １：２）： Rf 0.11. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.90 (t, J=6.4, CH2OH); 3.70 (s, 2 OMe); 4.52 (s, CH2ODMT); 4.68 (s, CH2OH); 6.72-6.79 (m, 4 arom. H); 7.06-8.03 (m, 12 arom. H). EI-MS: 485 [M+.].
６の分析データ：ＴＬＣ（ＡｃＯＥｔ／ヘキサン  １：２）： Rf 0.24. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1,71 (t, J=6.4, CH2OH); 3.71 (s, 2OMe); 4,19 (s, CH2ODMT); 4,85 (s, CH2OH); 6.73-6.78 (m, 4 arom. H); 7.06-8.03 (m,12 arom. H). EI-MS: 485 [M+.].
【００３２】
ジイソプロピル−ホスホラミド酸  ４−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−３−ニトロ−ベンジルエステル２−シアノ−エチルエステル（７）
アルコール５（３００ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２  ２．４ｍｌにアルゴン雰囲気下で溶解した。ＣＨ２Ｃｌ２（２．４ｍｌ）に溶解した２−シアノエチル−２（ジイソプロピルアミド）ホスファイト（０．２８ｍｌ、０．７７ｍｍｏｌ）およびテトラゾリド（１４５ｍｇ、０．８４６ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で３時間攪拌し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で希釈し、ＣＨ２Ｃｌ２で２回抽出した。合併した有機相を乾燥し（ＮａＨＣＯ３）、減圧下で濃縮した。得られた油状物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル；ＡｃＯＥｔ／ヘキサン  １：４、１％Ｎ−メチル−モルホリン）で精製して、７（２５３ｍｇ、６１％）を黄色泡状物として得た。ＴＬＣ（ＡｃＯＥｔ／ヘキサン  １：２）：Rf 0.50. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.20 (2d, J=6.8, 4MeCHN); 2.65 (t, J=6.4, CH2CN); 3.61-3.69 (m, OCH2CH2CN); 3.77 (s, OMe); 3.79-3.91 (m, 2Me2CHN); 4.57 (s, CH2ODMT); 4.76 (m, CH2OP); 6.78-6.84 (m, 4 arom. H); 7.20-7.48 (m, 10 arom. H) 7.64 (d, J=8.1, 1arom. H); 8.01 (s, 1 arom. H); 8.09 (d, J=8.1, 1 arom. H). 31P-NMR (162 MHz, CDCl3): 150.84. ESI-MS (pos.モード): 708 ([M+Na]+; 計算値 708).
【００３３】
ジイソプロピル−ホスホラミド酸  ４−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−２−ニトロ−ベンジルエステル２−シアノ−エチルエステル（８）
アルコール６（３００ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（２．４ｍｌ）にアルゴン雰囲気下で溶解した。ＣＨ２Ｃｌ２（２．４ｍｌ）に溶解した２−シアノエチル−２（ジイソプロピルアミド）ホスファイト（０．２８ｍｌ、０．７７ｍｍｏｌ）およびテトラゾリド（１４５ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で３時間攪拌し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で希釈し、ＣＨ２Ｃｌ２で２回抽出した。合併した有機相を乾燥し（ＮａＨＣＯ３）、減圧下で濃縮した。得られた油状物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル；ＡｃＯＥｔ／ヘキサン  １：４、１％Ｎ−メチル−モルホリン）で精製して８（３５２ｍｇ、８５％）を黄色泡状物として得た。ＴＬＣ（ＡｃＯＥｔ／ヘキサン  １：２）： Rf 0.42. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.14 (2d, J=6.8, 4 MeCHN); 2.58 (t, J=6.4, CH2CN); 3.54-3.66 (m, OCH2CH2CN); 3.72 (s, OMe); 3.75-3.96 (m, 2Me2CHN); 4.18 (s, CH2ODMT); 5.00 (m, CH2OP); 6.75-6.80 (m, 4 arom. H); 7.12-7.42 (m, 10 arom. H); 7.58 (d, J=8.1, 1 arom. H); 7.71 (d, J=8.1, 1 arom. H); 7.97 (s, 1 arom. H). 31P-NMR (162 MHz, CDCl3): 150.35. ESI-MS (pos.モード): 708 ([M+Na]+; 計算値 708).
【００３４】
オリゴヌクレオチドの合成。
オリゴデオキシヌクレオチドを、ホスホラミダイド化学［６，７］に従って、３９２  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Applied Biosystems）で合成した。デオキシヌクレオシドホスホラミダイトはＴｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ（Glasgow, UK）由来である。オリゴデオキシヌクレオチドを、標準的な合成法（「トリチル−オフ」モード）で合成した。固体支持体からの分離および最終的脱保護を、３０％  アンモニウムヒドロキシドで一晩、５５℃で処理して行った。
【００３５】
オリゴリボヌクレオチドをＴＯＭ保護ＲＮＡホスホラミダイド化学［３］に従って、Ｍｅｒｍａｄｅ  ＤＮＡプレートシンセサイザー（Bioautomation Inc.）で合成した。リボヌクレオシドホスホラミダイドはＱｉａｇｅｎ  ＡＧ（Hombrechtikon, CH）由来である。オリゴヌクレオチドを標準的な合成法（「トリチル−オン」モード）で合成した。固体支持体からの分離および塩基／ホスホジエステル骨格脱保護を、アンモニア／メチルアミン水溶液（１：１）で３０分間、６５℃で処理して行った。２’−ＴＯＭ脱保護を、ＴＥＡ−ＨＦ溶液で１時間、６５℃で処理して行った。
【００３６】
オリゴヌクレオチドの精製
所望により、オリゴヌクレオチドをＯＡＳＩＳカートリッジ（Waters AG）で精製した。第１に、カートリッジを１ｍｌ  アセトニトリル、次に１ｍｌ  ０．１Ｍ  トリエチルアンモニウムアセテート溶液（ＴＥＡＡ）で調整した。粗オリゴヌクレオチドをカートリッジにロードし、これを０．１Ｍ  ＴＥＡＡ中１５％  アセトニトリル溶液で洗浄して、全トリチル−オフ切断配列を除去した。カートリッジ上で脱トリチル化を、３％  ジクロロ酢酸水溶液１ｍｌで行った。カートリッジを０．１Ｍ  ＴＥＡＡまたは水１〜２ｍｌで洗浄した後、精製トリチル−オフオリゴヌクレオチドを１：１  アセトニトリル／水溶液で溶出した。
【００３７】
スキーム３：  オリゴヌクレオチドは光切断可能なリンカーを介して結合した。
【化１１】
2009523746.tif 000012
【００３８】
オリゴヌクレオチドの光切断。
オリゴヌクレオチドの切断を、水（常套のプラスチックキュベット中１０〜１００マイクロリットル）中オリゴヌクレオチド溶液（０．１〜１０光学密度）を光（波長３５２ｎｍ；８ワットチューブ２個）で、１５〜１８０分間照射して行った。当該処理によって、２種の個々のオリゴヌクレオチドが得られた（スキーム４および図１）。
【００３９】
スキーム４：  合成後照射による２種のオリゴデオキシヌクレオチド生成の例。
【化１２】
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表１：  照射前後のオリゴヌクレオチドのＭＳ分析。
【表１】
2009523746.tif 000014
【００４０】
スキーム５：  合成後ＤＮＡ−ＲＮＡオリゴヌクレオチドキメラの照射による２種のオリゴヌクレオチド生成の例。
【化１３】
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表２：  照射前後のオリゴヌクレオチドのＭＳ分析
【表２】
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【００４１】
第１の光切断可能なオリゴデオキシヌクレオチドを、標準的なホスホラミダイド化学を用いて、ペンタデオキシヌクレオチド（配列  ５’−ＡＡＡＡＴ−３’）の５’末端でホスホラミダイト８および７の同時取り込み、ならびにペンタチミジレートによるさらなる伸長によって、製造した。切断／脱保護および脱塩後、光切断可能オリゴデオキシヌクレオチドを３５２ｎｍで２時間、１６Ｗ  ＵＶランプで照射した。照射した溶液を直接エレクトロスプレー質量分析（ＥＳ−ＭＳ）で測定すると、オルトフェニル基の切断によって得られる（スキーム４）両ペンタデオキシヌクレオチド（５’または３’末端に末端リン酸を有する）に対応する２個のピークを示した。
【００４２】
ホスホラミダイト４を用いて、光切断可能なキメラＤＮＡ／ＲＮＡを標準的なホスホラミダイド化学を用いて９６ウェルＭｅｒｍａｄｅシンセサイザーで合成した。オリゴヌクレオチドはドデカチミリデートおよびビス−オルト−ニトロベンジルリンカーからなり、そしてさらに２種のデオキシヌクレオチドで、その後１９ｎｔ長オリゴリボヌクレオチドで伸長した。キメラを「トリチル−オン」モードで製造し、逆相カートリッジで精製し、光照射（３６６ｎｍ、１５分、室温）前後で質量分析で分析した。２個のピークが検出され、これは５’末端にリン酸基を有するドデカチミジレート、そして３’リン酸基を有する２１ｎｔ長ＤＮＡ／ＲＮＡキメラに対応する。
【００４３】
本発明者らは次に、９６ウェルＭｅｒｍａｄｅシンセサイザーで、ビス−オルト−ニトロベンジルリンカーで区分されている２個の相補鎖からなる１個の長ＤＮＡ／ＲＮＡキメラを合成した。各ストランドは、３’末端のデオキシヌクレオチドダイマーおよび１９ｎｔ長オリゴリボヌクレオチドで形成された。キメラを「トリチル−オン」モードで製造し、逆相カートリッジで精製し、光照射（３６６ｎｍ、１５分、室温）前後で質量分析で分析した。照射前に、全長物質に対応する固有のピークを観察した。照射後に、両ストランドに対応する質量が観察され、出発物質が完全に消失した。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明の方法の概略である。
【図１】
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【国際調査報告】
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