(57)【要約】本発明は合成のための発現構築体及びその合成方法に関し、該構築体及び方法は、真核細胞にトランスフェクションされた後、これらの細胞中でRNA干渉により規定のタンパク質の形成を標的を定めた方法により抑制するのに好適である。その様なベクターを生成する方法はPCRステップを含まず、一つの反応器中で3ステップの工程で行われ、数時間で実施することができる。更に本発明はRNA干渉の手段により遺伝子の発現を標的を定めた方法で抑制するのに好適なDNA発現構築体に関し、これらの発現構築体は、複数遺伝子の発現抑制にも好適な構築体である。【選択図】図４
2009521210.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
RNA干渉により遺伝子発現を標的を定めて抑制するDNA発現構築体であって、
a)  第一末端DNAヘアーピン  ループであり、それはデオキシリボヌクレオチドの一本鎖がそれ自身の上に折畳まれて二本鎖領域を形成しており、後者はその一端が結合性張出し部を持ち、反対側の末端では一本鎖ループを持ち；
b)  第二末端ヘアーピン  ループであり、それは第一末端ヘアーピン  ループに類似様に構築されており；
c)  ホリデイ  接合（Holiday  junction）により互いに結合されている3つの二本鎖DNAアームを持つ少なくとも一つのT-型DNA構造であり、
i)  一つのアームは転写される配列を含み、このDNA二本鎖アームの個々の鎖は、他のアームと接合している部分と反対側の末端で、一本鎖DNAループによりお互いに結合されており、及び
ii)  ２つの他のアームは結合性末端を持ち、その1つのアームは好適な終止配列を持ち、他のアームは好適なプロモータ配列を持つ、
を含む前記発現構築体。
【請求項２】
RNA干渉により遺伝子発現を標的を定めて抑制するDNA発現構築体であって、
a)  第一末端DNAヘアーピン  ループであり、それはデオキシリボヌクレオチドの一本鎖がそれ自身の上に折畳まれて二本鎖領域を形成しており、後者は結合性張出し部を持つ一端を形成し、反対側の末端では二本鎖を形成する個々の鎖が、一本鎖ループによってお互いに結合されており；
b)  第二末端ヘアーピン  ループであり、それは第一末端ヘアーピン  ループと類似様に構築されており、その二本鎖及び一本鎖領域は、転写される配列よりなり;
c)  好適なプロモータ配列及び好適な逆相補的終止配列であり、これらはDNAの二本鎖中の、a)及びb)の末端ヘアーピン  ループの間に位置する、
を含む前記発現構築体。
【請求項３】
幾つかのT型DNA構造がそれぞれの場合において、ホリデイ  接合（Holiday  junction）により末端でリンカーによって結合される、請求項１のDNA発現構築体。
【請求項４】
幾つかの線状DNA構造がそれぞれの場合において、ホリデイ  接合（Holiday  junction）により末端でリンカーによって結合される、請求項２のDNA発現構築体。
【請求項５】
他の構成部分と標的を定めた結合をするための、個々の構成部分の結合性末端は、特異的であり、かつお互いに異なる様に選択される、請求項１乃至４のいずれか１項のDNA発現構築体。
【請求項６】
請求項１乃至４のいずれか１項の一又は幾つかの遺伝子の発現を標的を定めて抑制するDNA発現構築体であって、転写される配列が同一又は異なる遺伝子をコードする、前記発現構築体。
【請求項７】
請求項１乃至４のいずれか１項に記載の、一又は幾つかの遺伝子の発現を標的を定めて抑制するDNA発現構築体であって、エクソヌクレアーゼ分解に対する保護が、３から８のデオキシヌクレオチドの短一本鎖領域により達成され、短一本鎖領域は線状二本鎖領域の２つの鎖を互いに共有結合でリンクする、前記構築体。
【請求項８】
請求項１乃至４のいずれか１項の一又は幾つかの遺伝子の発現を標的を定めて抑制するDNA発現構築体であって、一又は幾つかの遺伝子が、短一本鎖領域で、一又は幾つかのペプチド、タンパク質、炭水化物、抗体又はステロイドと共有結合している、前記構築体。
【請求項９】
真核細胞にトランスフェクトされた後、RNA干渉により規定のタンパク質の形成を標的を定めた方法により抑制するベクターの合成方法であって、
a)  １９から２３塩基の、遺伝子配列又はその逆相補配列の単一コピー及びRNAポリメラーゼの終止コドンを含み、及び８から１２塩基配列ループにより一つの末端が閉じられているDNA二本鎖であり、DNA二本鎖はその対向する塩基はお互いに相補的でなく、隣接するDNA一本鎖はお互いに結合されDNA二本鎖を形成されるように選択され、DNA二本鎖はその他方の末端で短い突出する、DNA一本鎖を持つ、二本鎖を、
b)その末端に一本鎖DNAの短い突出する末端を持つヘアーピン型オリゴデオキシヌクレオチドと混合し、及び
c)  一本鎖DNAの短い突出する末端を持つプロモータであり、プロモータの一本鎖５’末端は、ヘアーピン型のオリゴデオキシヌクレオチド又は１０から１０００塩基の二本鎖と対を成すことができ、プロモータの一本鎖３’末端は、a)  に記載のDNA二本鎖の一本鎖５’末端に相補的であり、及び
d)  続いてDNA断片の結紮し、及び
e)  合成されたベクターを最終的に精製する、
ステップを含む前記ベクターの合成方法。
【請求項１０】
請求項９の合成方法であって、ステップｂ）の後に、一本鎖DNAの短い突出する末端を持つ非コード配列の１０から１０００（＝n）塩基のDNA二本鎖が加えられ、そして一本鎖３’末端はプロモータの一本鎖５’末端と対を成すことができ、そして一本鎖５’末端はヘアーピン型オリゴデオキシヌクレオチドの一本鎖３’末端に相補的である、前記合成方法。
【請求項１１】
ベクターが真核細胞にトランスフェクトされた後、規定のタンパク質の形成をRNA干渉により標的を定めた方法により抑制するベクターの合成方法であって、
ａ）１９から２３塩基の、5’から3’方向の遺伝子配列の単一コピー及びRNAポリメラーゼの終止コドンを含み、８から１２塩基の配列ループにより一つの末端が閉じられているT型DNA二本鎖であり、そしてその対向する塩基はお互いに相補的でなく、隣接するDNA二本鎖領域は、２つのDNA一本鎖でお互いに結合される様に選択され、他の末端で短い突出する二本のDNA一本鎖、及びオリゴデオキシヌクレオチドを持ち、オリゴデオキシヌクレオチドはその配列が２つの短い突出するDNA一本鎖と相補的であり、一本鎖DNAの２つの短い突出する末端を形成するT型DNA二本鎖を,
ｂ）末端に一本鎖DNAの短い突出する末端を持つヘアーピン型オリゴデオキシヌクレオチドと混合し、及び
ｃ）更に、末端にa)のT型DNA二本鎖に相補的である一本鎖DNAの短い突出する末端を持つヘアーピン型のオリゴデオキシヌクレオチド、
ｄ）一本鎖DNAの短い突出する末端を持つプロモータであり、プロモータの
一本鎖５’末端はｂ）のヘアーピン型オリゴデオキシヌクレオチドと対を成すことができ、そしてプロモータの一本鎖３’末端はT型DNA二本鎖の一本鎖５’末端に相補的であり、
ｅ）続いてDNA断片の結紮が行われ、及び
ｆ）合成されたベクターが最終的に精製される、
ステップを含む前記ベクターの合成方法。
【請求項１２】
請求項１１の合成方法であり、ステップｃ）の後に、一本鎖DNAの短い突出する末端を持つ非コード配列の１０から1000塩基（=n）DNA二本鎖が加えられ、一本鎖３’末端はプロモータの一本鎖５’末端と対になることができ、及び一本鎖５’末端は、ステップｂ）のヘアーピン型オリゴデオキシヌクレオチドの一本鎖３’末端と相補的であり、及び/又は一本鎖DNAの短い突出する末端を持つ非コード配列の１０から1000塩基（=n）DNA二本鎖を加え、一本鎖５’末端はT型DNA二本鎖の一本鎖３’末端と対になることができ、一本鎖３’末端はステップｃ）のヘアーピン型オリゴデオキシヌクレオチドの一本鎖５’末端に相補的である、ステップを含む前記合成方法。
前記合成方法。
【請求項１３】
請求項９乃至１２のいずれか１項に記載の合成方法であって、その方法が開始される前に、部分的に相補的な一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドがハイブリッドされリンカー分子を形成し、ハイブリッドは不完全であるため、同じ又は異なる塩基配列を持つ結合性末端を持つ２以上の二本鎖領域がホリデー接合により互いに結合され、そしてこれに続いて各記載方法のステップが実施される前記合成方法。
【請求項１４】
請求項９乃至１３のいずれか１項に記載の方法であって、前記プロモータが細菌により増幅可能なプラスミドの一部であり、プラスミドは構成部分を混合する前に、プラスミド上のプロモータに隣接する、合成される発現構築体上に存在しないインターフェイスを認識する制限エンドヌクレアーゼを用いて切除される、前記方法。
【請求項１５】
関連する結紮ステップが、プロモータをプラスミドからスプライスする制限エンドヌクレアーゼの存在下で起きる、請求項１４の方法。
【請求項１６】
反応混合物の消化が、３’DNA末端又は５’DNA末端に特異な制限エクソヌクレアーゼを用いて最終精製ステップの前に実施される、請求項１４又は１５の方法。
【請求項１７】
制限エンドヌクレアーゼは、制限エンドヌクレアーゼのクラスIIの酵素、好ましくはBbsI,  BbvI,  BbvII,  BpiI;  BpII,  BsaI,  BsmAI,  BsmBI,  BsmFI,  BspMI,  Eam1104I,  EarI,  Eco31I,  Esp3I,  FokI,  HgaI,  SfaNI又はそのアイソシゾマー（iso-schizomer）の酵素であるのが良い、請求項１４乃至１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項９乃至１７のいずれか１項に記載の方法であって、DNA二本鎖が構成部分の混合物に添加され、二本鎖は一つの部分的に自己相補的オリゴデオキシヌクレオチド又は少なくとも２つのオリゴデオキシヌクレオチドの部分的アニールにより生成される、前記方法。
【請求項１９】
ヘアーピン型オリゴデオキシヌクレオチドは、二本鎖領域に制限エンドヌクレアーゼの認識配列を持つ、請求項９乃至１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
精製が、クロマトグラフィー又はゲル電気泳動法により行われる、請求項９乃至１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
請求項９乃至２０のいずれか１項に記載の方法により、真核細胞にトランスフェクトされた後、RNA干渉により規定のタンパク質の形成をこれらの細胞において標的を定めた方法により抑制するのに好適なベクターの合成のためのキットであって、少なくとも一つのプロモータ、ヘアーピン型オリゴデオキシヌクレオチド及び酵素を含む、前記キット。
【請求項２２】
請求項１乃至４のいずれか１項に記載の発現構築体の合成のためのキットであって、少なくとも、末端ヘアーピン  ループの形成に好適なオリゴデオキシヌクレオチド、リンカーの形成に好適なオリゴデオキシヌクレオチド、その転写される配列が挿入されるT型DNA構造、及び酵素、及び結紮、スプライシング、DNA分解及び精製を実施する手段を含む、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は真核細胞にトランスフェクション後に、RNA干渉により一又は幾つかのタンパク質の形成を、標的を定めた方法により抑制するための好適なベクターの生成方法及びまたそのベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の発現を抑制するための可能性として最近提示されたものの一つは、二本鎖RNA分子の合成に基づくものがある。個々の遺伝子は、この二本鎖（dsRNA）を用いて他のどの様な方法よりも非常に効果的に及び速く、隣接する遺伝子のタンパク質形成を妨げることなく変換されうる。この基礎となる原理はRNA干渉と呼ばれ、略称RNAiと言われる。この現象を起すdsRNA配列はsiRNA（小干渉RNA）と呼ばれる。
【０００３】
siRNAは遺伝子の読取を防止するものではなく、細胞の機構を作動させ、それにより遺伝子から読み取られるmRNA分子の生成を阻止し、及び対応するタンパク質の形成を阻止する（転写後過程遺伝子抑制）。
【０００４】
標的とされたmRNAの分解はその長さが１９から２３RNA塩基の短siRNA分子により引起され、siRNA分子はそのタンパク質への転写が阻止される標的mRNAと同族（homologous）である。このsiRNA分子は特定のエンドリボヌクレアーゼと結合し「RISC」（RNA誘発抑制複合体）と呼ばれる細胞のRNAタンパク質複合体を形成する。これらの複合体が作られると、RNAの2本鎖が分離し、いわゆる活性RISCが出来、その各々がsiRNA分子の一本鎖を含む。標的mRNAに相補的なアンチセンス鎖を含む活性RISCは後者に結合し、そしてRNAタンパク質複合体のエンドリボヌクレアーゼはmRNAの配列特異な分解を確かなものとする。
【０００５】
siRNAは細胞において実験的に生成することができ、又は外部から輸送することができる。これは合成により生成されたsiRNA分子を用いて実施され、siRNA分子はインビトロ及びインビボの両方で投与することができる。
【０００６】
しかし、この方法は技術的な限界がある。媒体中及びまた細胞中において合成されたsiRNAが一般に不安定であることとともに、合成siRNAを用いた抑制は原則的として一時的にしか可能でなく、多くの細胞（例えば、神経細胞）は非常に非効率的にしかトランスフェクトすることができない。したがって、合成siRNAのトランスフェクションに基づく研究は、時間的に１から5日の範囲に限られ、及び細胞の種類によって限定される。更に、生成コスト及び生成に時間を要するという不利益もある。
【０００７】
他の方法には細胞中でベクターを用いてsiRNAを作る方法がある。これらは、ベクターが細胞中に入ると発現によりsiRNA配列を形成することのみを行うウイルス又はプラスミドベース  ベクターである。合成siRNAによるトランスフェクションと比べた利益としては、より安定しており、対応するsiRNA配列をより制御された形で転写することである。
【０００８】
しかし、プラスミドベース  ベクターはトランスフェクション効率が低いばかりでなく、その生成プロセスが込み入っている。そのため安定的クローンを選択する必要がある。このプロセスはしばしば時間が掛かり、週単位で又は数ヶ月を要することもあり、しばしばクローニングの実験につきものの、数多くの潜在的困難な問題が生ずる。製品のチェックのためには、配列決定手続きが必要であり、これはまた人の手数を必要としコストが掛かる。
【０００９】
更に、プラスミドベース  ベクターは抗生物質耐性遺伝子を含み、これらを選択することが必要である。このため、その様なベクターは生体に応用するには不適当である。有機体で発生する何処にでもいる細菌と組み換えすることは、抗生物質に対する細菌耐性の増大する発生リスクを有している。抗生物質への耐性の拡大は深刻な問題であり、是認されない。
【００１０】
ウイルスベクターは効果的及び標的を定めトランスフェクションが可能であるため、合成siRNA分子及びプラスミドベース  ベクターに比べて有利である。
【００１１】
しかし、この方法は治療においてその様なウイルスベクターの使用を制限すると言う留保条件下で使用が可能である。新しい、病原性ハイブリッドウイルスの生成は不安を持って見られており、この点で、ウイルス配列を天然ウイルスにより組み換えすることは安全上で固有のリスクがある。更に、その生産は手数を要し又コストが掛かる。
【００１２】
ただ一つの遺伝子製品の発現を発現システムによって抑制することでさえ、多くの複雑な問題が絡んでおり、細胞又は組織中で幾つかの遺伝子製品の発現を同時に遮断することは更に一層複雑なものであり、したがって、これを実現することはより困難である。
【００１３】
遺伝子の発現をRNA干渉により多重的に抑制することの主要な問題の一つは、幾つかの独立した構築体が使用される場合、細胞がただ一つの構築体によってトランスフェクトされる可能性が低いことである。この可能性の低さは用いられる構築体の数により幾何級数的に減少する。しかし、遺伝子治療におけるアプローチによっては、しばしば遺伝子配列の抑制が制御され同時に行われることが必要となる。
【００１４】
細胞中で幾つかのRNA分子の同時転写（cotranscription）を可能とする多くの方法が存在する。最も簡単な方法は、２つの独立した発現構築体（以下ではまたベクターと呼ぶ）を同時トランスフェクションすることである。他の方法は2つの独立発現カセットを持つベクターによりトランスフェクションすることよりなる。その様な構築体はまたsiRNA分子の合成に用いることができる。
【００１５】
上の2つの可能性があるが、転写は、その数、プロセス、半減期及び翻訳効率との関係で、したがって、発現されるタンパク質の質において本質的に異なり、その結果、それらを使用した結果は非効率な及び低い再生産性となってあらわれる。したがって、その様な発現システムを使用することによりまた、siRNAの転写は種々異なるレベルとなり、結局、関連する遺伝子の抑制は不均等なものになる。
【００１６】
ジシストロン（dicistronic）及び多シストロンRNA分子をIRES  (内部リボソーム侵入部位（Internal  Ribosome  Entry  Site）)要素を用いて構築することは、幾つかの遺伝子を共発現させるための他の可能性を示す。
【００１７】
後者は、mRNAキャップ構造（mRNA-cap-structure）とは独立のリボソームにより、配列要素によってその翻訳を開始することを可能にする。
【００１８】
IRES要素はピコルナ  ウイルス（Picornavirus）のmRNA中に最初に発見された(Pelletier及びSonenberg,  1988,  Nature  334:  320-325,  Jang他、1988,  Journal  Virology  62:  2636-2643)。
【００１９】
バイシストロン（bicistronic）ベクターの構築には、ポリオウイルス及びEMCV  （エンセファロ心筋炎ウイルス(Encephalomyocarditis  Virus)）のIRES要素が最も頻繁に用いられる(Dirks他、1993,  Gene  128:  247-249)。不幸なことには、これらの効果は使用される細胞株により大きく異なる(Borman他、1997,  Nucleic  Acids  Res.  25:  925-932)使用可能なバイシストロン発現カセットの大半は選択可能なマーカー又はレポータ−遺伝子よりなり、これらのカセットは所望の遺伝子を挿入するためにIRES要素の３’側及びMCS  (複数クローン部位（Multiple  Cloning  Site）)に配置されている(Dirks他、1993,  Gene  128:  247-249)。IRES要素を用いるトリシストロン(tricistronic）及び多シストロン発現システムも知られている(Zitvogel他、1994,  Hum  Gene  Ther  5:  1493-1506,  Fussenegger他、1998a,  Nature  Biotechnol.  16:  468-472,  Mielke他、2000,  Gene  254.  1-  8)。
【００２０】
しかし、これらは治療での応用においてウイルスIRES要素の使用を制限すると言う留保条件下で使用が可能である。新しい、病原性ハイブリッドウイルスの生成は不安を持って見られており、この点で、ウイルス配列を天然ウイルスにより組み換えすることとは安全上で固有のリスクがある。
【００２１】
多シストロンベクターはまた、IRES要素を使用しないで転写ユニットを結合することにより構築することが出来る。他方、所望の遺伝子は種々のMCSによりプラスミドベクターにクローンすることができ、他方、プラスミドから分離された発現カセットはDNAリンカーにより結合され、線状多シストロンベクターを形成することができる(Tsang他、1997,  Bio  Techniques  22:  68)。
【００２２】
しかし、線状cis結合遺伝子の発現率を調査した結果、この方法により配置された発現カセットの転写に対して強い否定的な影響を示すことが分かった(Esperet他、2000,  J  Biol  Chem  275:  25831-25839)。
【００２３】
同義遺伝子（multiple  gene）の発現のためのプラスミドベクターは、クローンされた転写ユニットの数において従来のプラスミドベクターと異なる。この文意においては、同一又は異なる出所を持つプロモータ又はポリ(A)配列は転写ユニットに使用することができる。
【００２４】
異なるプロモータを使用することによる不利益は、プロモータ毎にその力が異なり、したがって、個々の遺伝子の発現率が異なるが、同一のプロモータを使用した場合は二次DNA構築を形成することとなり得、その結果プロモータの機能を失わせることとなりうる。
【００２５】
ここに述べた、同義的遺伝子の発現のためのベクターは全ての、それらがプラスミド又はウイルスベクターに基づいている点で共通する。本件の複数コードするベクターについて述べている欠点と並び、それらは更に、このタイプのベクターの持つ不利な点を持つ。ウイルス  ベクターの不利な点は、弱まるワクチン株の不安定性、及び使用に伴う抗生物質に対する耐性遺伝子の拡大（詳細はEP  0  941  318  B1に記載されている）の様な、プラスミドDNAベクターの欠点を含み、非常に良く知られている。
【００２６】
したがって、また、幾つかの遺伝子の遺伝子発現を同時に抑制することのできるsiRNAの発現システムを持つことが望ましい。この課題を解決するための最大の問題は、恐らくsiRNA分子を生成するために配列を結合するリンカーにあり、リンカーは各々の場合において、これらの配列の遺伝子発現を抑制するための十分な転写を保証する。
【００２７】
DNA結合要素を用いてDNA断片をリンクする一つの方法は文献から知ることができる。Seemanは、Holliday-接合（Holiday  junction）と呼ばれる、天然に生じる分枝接合の調査のためのDNA配列について記載しており、この接合はねじり応力の下でB-DNAの特殊な位相的形態を採ると言われている(Seeman:  1982,  J  Theor  Biol  99:  237-247;  Annu.  Rev.  Biophys.  Biomol.  Struct.  1998.  27:225-248)。これまで、この構造の応用面はDNA構造の形態の調査のための短オリゴヌクレオチド部分に限定されていた。
【００２８】
多官能性結合はDE  100  48  417  A1の記載より知ることができ、この文献は2つの反応性官能基をリンカーにより接合することについて記載する。核酸はまたこの方法によって連結することのできる生物学的物質として記載されているが、実施例ではこの発明の応用はペプチドの接合の場合のみを示す。WO  01/87348  A2は効果的な発現のために幾つかの遺伝子を細胞に輸送する他のアプローチについて記載する。核酸はデンドリマー（dendrimer）と呼ばれる超分子構造を形成するために共有結合によりリンクされる必要がある。
【００２９】
siRNAのためのベクターを生成する更なる可能性についてはhttp://www.ambion.comに示されている。このプロセスは上に述べた不利益を避ける。しかし、この生成プロセスはまた、時間を要し、関係する配列をPCR法（ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase  chain  reaction）により複製する多くのステップが必要となるため、エラーが非常に起き易くなる。所望されない突然変異、及び気が付かない突然変異を共に起す可能性が非常に高く、これらはPCRプロセスで増幅される。そこではまた、配列を制御する手段が必要となり、そのため生成プロセスを引伸ばしコストを増大させることになる。
【００３０】
この様な技術の現状に鑑み、本発明は一つの又は幾つかの規定されるsiRNA配列のインビトロ又はインビボ合成の好適な方法、この様に生成された発現構築体及び合成を実行するためのキットを提供することを課題とする。
【００３１】
この課題は独立請求項に記載された特徴により解決される。
【００３２】
したがって、本発明では発現構築体は以下のものを含む：すなわち、第一末端DNAヘアーピン  ループ（hairpin  loop）であり、デオキシリボヌクレオチドの一本鎖がそれ自身の上に折畳まれて二本鎖領域を形成しており、後者はその一端が結合性張出し部を持ち、反対側の末端では二本鎖を形成している個々の鎖が、一本鎖ループによってお互いに結合されており；及び、第二末端ヘアーピン  ループであり、それは第一末端ヘアーピン  ループと類似様に構築されており；及びホリデイ  接合（Holiday  junction）により結合されている3つの二本鎖DNAアームを持つT-型DNA構造であり、少なくとも一つのアームは転写される配列を含み、他のアームと結合している部分と反対側の末端で、この二本鎖DNAアームの個々の鎖は、一本鎖DNAループによりお互いに結合されており、そして２つの他のアームは結合性末端を持ち、その1つのアームは好適な終止配列を持ち、他のアームは好適なプロモータ配列を持つ。
【００３３】
上に述べた構成部分は、本発明の構築体の必須の部分である。本発明はまたこれらの構成部分を持つ発現構築体を含むが、構成部分はDNA構造の他の組み合わせより生じる。
【００３４】
更に本発明では、発現構築体は遺伝子発現を、RNA干渉により標的と定めて抑制することを意図しており、これは以下のものを含む。すなわち、第一末端DNAヘアーピン  ループ（hairpin  loop）であり、それはデオキシリボヌクレオチドの一本鎖がそれ自身の上に折畳まれて二本鎖領域を形成しており、後者は結合性張出し部を持つ一端を形成し、反対側の末端では二本鎖を形成する個々の鎖が、一本鎖ループによってお互いに結合されており；更に、第二末端ヘアーピン型ループであり、それは第一末端ヘアーピン  ループと類似様に構築されており、その二本鎖及び一本鎖領域は、転写される配列及び好適なプロモータ配列及び好適な逆相補的終止配列よりなり、これらはDNAの二本鎖中の、上に述べた2つの末端ヘアーピン  ループの間に位置する。
【００３５】
その様な発現構築体は合成されるsiRNAの唯一の二本鎖コピーを持つ。唯一つのコピーの存在する場合のsiRNAの生成は、転写される配列が、一本鎖ループを超えてもRNAポリメラーゼにより読み取られ転写されるため、この構築体によって可能である。これは二本鎖プラスミドによっては不可能であろう。
【００３６】
本発明の両発現構築は、幾つかのT型又は線状DNA構造がそれぞれの場合において、ホリデイ  接合（Holiday  junction）により末端でリンカーによって結合されると考えられている。この場合転写される配列は同一又は異なる遺伝子をコードすると考えられる。
【００３７】
リンカーはDNA発現カセットを連結するオリゴヌクレオチドであると理解されている。本発明のリンカーは、以下のリンカーの例について説明されている様に、2以上の鎖よりなり、３つの発現カセットによりお互いに連結されたA,B及びC鎖にリンクされた３つのオリゴヌクレオチドから形成されており；Aの５’末端はBの３’末端に相補的な配列を持ち、二本鎖を形成し、Aの３’末端はCの５’末端と対を成し、最後にBの５’末端はCの３’末端と対を成す。DNA二本鎖のこのタイプの結合はまたホリデイ  接合（Holiday  junction）と呼ばれ(F.W.  Stahl:  Genetics.  1994  Oct;138(2):241-6)、これは天然発生の成分のみが発現カセットをリンクするために用いられるという有利な点を持ち、本発明が毒物学上の理由で医療目的で用いられる場合は特に有利である。
【００３８】
分枝DNA接合に用いられるオリゴデオキシヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの5’末端でのハイブリッドにおいてそれぞれ（例えば）4つの塩基の長さの、一つの張り出し結合性末端が生成される様選択される。結合性末端の配列は接合の各アームにより異なっていても良いが必ずしもその必要はない。T型又は線状DNA構造は結合性末端と相補的な張出しを持つ。これにより発現カセットを接合の個々の「アーム」に目標を定めて結紮することができる。
【００３９】
その様な本発明の発現構築体は、種々の遺伝子の遺伝子発現を目標を定め、多重的に抑制するのに適している。siRNA分子を生成する各々の場合において必要な配列を含むT型構造の構築が同一であるため、異なるsiRNA分子が同じ量合成される。そのタンパク質の発現が抑制される遺伝子の数は、リンカーにより結合されるT型構造の数による。
【００４０】
本発明の、発現構築体の他の実施の態様においては、個々の構成部分の結合性末端は、他の構成部分と標的を定めた結合をするためには、特異的であり、かつお互いに異なる様に選択されるのが有利である。この様にすることにより所望の発現構築体の標的を定めた構築ができる。
【００４１】
一以上のsiRNA分子を合成するための配列を含むDNA発現構築体は標的を定めた方法により細胞へのトランスフェクトが可能である。
【００４２】
トランスフェクションは、生物学的、化学的又は物理的方法により核酸配列を細胞に導入することと理解されており、その結果、トランスフェクトされた細胞中でこれらの配列によりコードされた触媒活性を持つRNA転写物を長時間又は一時的に発現させる。
【００４３】
本発明の発現構築体の更なる発展形態では、本発明の発現構築体は一又は幾つかの共有結合したペプチド、タンパク質、炭水化物、抗体又はステロイドである。
【００４４】
本発明はまた、真核細胞にトランスフェクトされた後、RNA干渉により規定のタンパク質の形成を標的を定めた方法により抑制する発現構築体の生成方法に関する。
【００４５】
方法は線状発現構築を意図するもので、この方法はステップa)から始まり以下のステップを含む；
a) １９から２３塩基の、遺伝子配列又はその逆相補配列の単一コピー及びRNAポリメラーゼの終止コドンを含み、及び８から１２塩基の配列ループにより一つの末端が閉じられているDNA二本鎖であり、DNA二本鎖はその対向する塩基はお互いに相補的でなく、隣接するDNA一本鎖はお互いに結合されDNA二本鎖を形成されるように選択され、DNA二本鎖はその他方の末端で短い突出するDNA一本鎖を持つ、
b) 二本鎖をその末端に一本鎖DNAの短い突出する末端を持つヘアーピン型オリゴデオキシヌクレオチドと混合し、
c) 一本鎖DNAの短い突出する末端を持つプロモータであり、プロモータの一本鎖５’末端は、ヘアピン型オリゴデオキシヌクレオチド又は１０から１０００塩基の二本鎖と対を成すことができ、プロモータの一本鎖３’末端は、a)  に記載のDNA二本鎖の一本鎖の５’末端に相補的であり、
d) 続いてDNA断片の結紮を実施し、最後に、
e) 合成されたベクターを最終的に精製する。
【００４６】
本発明の方法は、任意選択的に線状発現構築体を合成するためにデザインされても良く、ステップｃ）でのヘアーピン型オリゴデオキシヌクレオチドを加える前に、一本鎖DNAの短い突出する末端を持つ非コード配列の１０から１０００（＝n）塩基のDNA二本鎖が加えられ、そして一本鎖３’末端はプロモータの一本鎖５’末端と対を成すことができ、そして一本鎖５’末端はヘアピン型オリゴデオキシヌクレオチドの一本鎖３’末端に相補的である。
【００４７】
T型発現構築体の合成は、同構築体が真核細胞にトランスフェクトされた後、規定のタンパク質の形成をRNA干渉により標的を定めた方法により抑制するが、この方法はステップa)で始まる以下のステップを含む。
【００４８】
a)１９から２３塩基の、5’から3’方向の遺伝子配列の単一コピー及びRNAポリメラーゼの終止コドンを含み、８から１２塩基の配列ループにより一つの末端が閉じられているT型DNA二本鎖であり、そしてその対向する塩基はお互いに相補的でなく、隣接するDNA二本鎖領域は、２つのDNA一本鎖でお互いに結合される様に選択され、他の末端で短い突出する二本のDNA一本鎖、及びオリゴデオキシヌクレオチドを持ち、オリゴデオキシヌクレオチドはその配列が２つの短い突出するDNA一本鎖と相補的であり、DNA一本鎖の２つの短い突出する末端を形成する、T型DNA二本鎖、ステップ
ｂ）で末端に一本鎖DNAの短い突出する末端を持つヘアーピン型オリゴデオキシヌクレオチドと混合し、
ｃ）更に、ヘアピン型オリゴデオキシヌクレオチドを持ち、オリゴデオキシヌクレオチドは末端にa)のT型DNA二本鎖に相補的である一本鎖DNAの短い突出する末端を持ち、
ｄ）一本鎖DNAの短い突出する末端を持つプロモータであり、プロモータの
一本鎖５’末端はｂ）のヘアーピン型オリゴデオキシヌクレオチドと対を成すことができ、そしてプロモータの一本鎖３’末端はT型DNA二本鎖の一本鎖５’末端に相補的であり、
e)続いてDNA断片の結紮が行われ、構築体はまた１０から1000塩基DNA二本鎖を用いないで合成することができ、
ｆ）合成されたベクターは最終ステップで最終的に精製される。
【００４９】
本発明によればこの生産方法は、ステップｃ）の後に、一本鎖DNAの短い突出する末端を持つ非コード配列の１０から1000塩基（=n）DNA二本鎖を加えることを含み、一本鎖３’末端はプロモータの一本鎖５’末端と対になることができ、及びステップｂ）のヘアーピン型オリゴデオキシヌクレオチドの一本鎖３’末端に相補的である一本鎖５’末端を加え、及び/又は一本鎖DNAの短い突出する末端を持つ非コード配列の１０から1000塩基（=n）DNA二本鎖を、一本鎖５’末端はT型DNA二本鎖の一本鎖３’末端と対になることができ、一本鎖３’末端はステップｃ）のヘアーピン型オリゴデオキシヌクレオチドの一本鎖５’末端に相補的である、ステップを含む。
【００５０】
ある好ましい実施の態様においては、本発明の方法はプロモータが細菌により増幅可能なプラスミドの一部であることが意図されており、プラスミドは構成部分を混合する前に、プラスミド上のプロモータに隣接する、合成される分子上に存在しないインターフェイスを認識する制限エンドヌクレアーゼを用いて切除される。
【００５１】
原則として、考慮されるべきプロモータは標的細胞,すなわち、遺伝子の発現が抑制される細胞の中で、動作可能なプロモータであればどの様なものでも良い。
【００５２】
これらのプロモータは、もしヒトの細胞又は組織が本発明の発現構築体によりトランスフェクトされる場合には、ヒトから得られるプロモータが好ましい。しかし、例えば、ウイルス、細菌又は寄生種又は標的種以外の種のものであっても良い。考慮されるべきプロモータは、特にヒトのU6プロモータ、ヒトのH1プロモータ、ネズミのU6プロモータ、CMVプロモータ、及び７SKプロモータであるが、これに限定されるものではない。
【００５３】
更に、本発明は、プロモータが細菌により増幅可能なプラスミドの一部として用いられる場合、結紮ステップは、それによりプロモータがプラスミドから切除される制限エンドヌクレアーゼの存在下で起きることを予想している。
【００５４】
ある実施の態様においては、反応混合物の消化は、３’DNA末端又は５’DNA末端に特異な制限エクソヌクレアーゼを用いて最終精製ステップの前に実施される。
【００５５】
本発明の方法では、混合の最初に加えられるDNA二本鎖は、一つの部分的に自己相補的なオリゴデオキシヌクレオチド又は2つの相補的オリゴデオキシヌクレオチドのアニーリングから得られることもある。アニーリングは反応混合物中で起こることもあるため、したがって、本発明の方法の最初に一本鎖相補的オリゴデオキシヌクレオチドのみが加えられる。
【００５６】
好ましい実施の態様においては、オリゴデオキシヌクレオチドの配列は、できたヘアーピンがその二本鎖領域に、制限エンドヌクレアーゼの認識配列を持つ様に選択される。
【００５７】
本発明の方法を用いて合成されるベクターの最終的精製は、クロマトグラフィー又はゲル電気泳動法により行うのが好ましい。
【００５８】
もしプロモータが、本発明の生産方法において細菌による増幅可能なプラスミドの一部として用いられる場合は、プロモータをプラスミドから切除する制限エンドヌクレアーゼは、制限エンドヌクレアーゼのクラスIIの酵素、好ましくはBbsI,  BbvI,  BbvII,  BpiI;  BpII,  BsaI,  BsmAI,  BsmBI,  BsmFI,  BspMI,  Eam1104I,  EarI,  Eco31I,  Esp3I,  FokI,  HgaI,  SfaNI又はそのアイソシゾマー（iso-schizomer）から選択されるのが良い。
【００５９】
本発明はまた、本発明の方法を実行するためのキットに関し、少なくとも一つのプロモータ、ヘアピン型オリゴデオキシヌクレオチド及び酵素を含む。酵素はリガーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、制限エクソヌクレアーゼ、キナーゼ及びポリメラーゼ又は酵素ミックスの形のこれらから選択された組み合わせである。更に、実施の態様によってはキットはまた酵素反応を実行する手段及び生成されたベクターを精製する手段を含むこともある。プロモータは、好適な制限エンドヌクレアーゼを用いて切除されるプラスミドの一部としてキットに含んでも良い。
【００６０】
更にキットは複数RNAi発現構築体合成をすることができる様意図されており、発現構築体は本明細書に記載のT型構造を含む。既に述べた構成部分に加えてキットはまた、転写される配列を持つその二本鎖アームに所望の配列が挿入されるT型構造を含む。
【００６１】
ホリデイ  接合（Holiday  junction）を持つリンカーが使用される場合、RNA干渉により遺伝子の発現を標的を定めた抑制をする本発明の発現構築体は一よりも多い遺伝子の発現抑制に好適である。本発明の構築体の特殊な構造により、siRNAを形成するための転写される配列はRNAポリメラーゼにより同程度に読み取られる。
【００６２】
本発明の複数抑制構築のトランスフェクション後に抑制される遺伝子の数は、リンカーが示す二本鎖アームの数による。
【００６３】
本発明との関係では、2つ別々のベクターの共トランスフェクションも、コーディング遺伝子配列を必要な制御要素（プロモータ、ポリ（A）シグナル）と化学的にリンクする、DE  100  48  417  A1に記載の方法も本発明に近い先行技術ではない。
【００６４】
リポフェクションを用いる共トランスフェクションでは、また異なるベクターが事実お互いの物理的近接する位置に運ばれ、細胞に輸送されるが、この方法での基本原理は異なる。更に、都合の悪いことには、発現構築体について記載の化学的共役は、より大きい分子量を持つ構造を生み、これは細胞に輸送することがより困難となることが知られている。同様のことが、核酸を含むデンドリマーを構築するためのWO  01/87348  A2に記載の方法についても当てはまる。更にデンドリマーの構築について記載された方法は、幾つかの段階よりなる手数を要する生成プロセスである。
【００６５】
本発明はまた、本発明の発現構築体の一つを含む薬剤、好ましくはワクチンに関する。その様な薬剤はヒト及び動物に対し局所的に及び全身的に応用することができ、そして、感染症、例えば、ヘルペス  ウイルス、乳頭腫  ウイルス及びレンチ  ウイルスによる感染治療、例えば、パーキンソン病、及びのう胞性線維症の様な代謝異常の治療、循環器疾患の治療、例えば、癌腫、黒色腫、肉腫の様な癌の治療、例えば、加齢に関係する染みの様な他の疾病の治療、及び脊髄、脳及び他の器官に影響する炎症、傷又は外科手術の後の治療に好適である。
【００６６】
更に、有利な方法については、その他の従属項に記載されており、本発明は実施例及び以下の図面を用いて詳細に説明される；図面は以下の内容を示す：
図１は線状siRNAベクターの構成部分を示す。
【００６７】
A：  本方法で使用される、標的mRNAに相同なsiRNA配列。配列はセンス又はアンチセンス領域（標的）、８から１２塩基の配列ループ、及び逆相補的終止配列よりなる。siRNA配列は個々のODN断片よりなることもあり、断片はアニールされ、結紮されそして、もし適用される場合は酵素ミックスの助けによりリン酸化される必要があり、またそれは完全ODN断片として既に存在していることもある。
【００６８】
更に、構成部分はリガーゼ酵素によりODN断片に結紮される。これらの構成部分は対応する相補的張り出し及びヘアーピン型オリゴジヌクレオチド（oligodinucleotide）を持つプロモータ配列であり、ヘアーピン型オリゴデジヌクレオチドの、各4つの塩基のそれ自身と相補的な独特の張り出しが、共有結合的に閉じた線状ベクターから生ずるものとなり、ベクターはプロモータ、標的配列及び終止配列よりなり、閉じたヘアーピン型末端を持つ。
【００６９】
プロモータ及び末端オリゴヌクレオチドの間に、一本鎖DNAの短い突出末端を持つ非コード配列の１０から１０００塩基（＝n）のDNA二本鎖が使用されることもある。
【００７０】
B．トランスフェクションのため最終製品
図２はT型siRNAベクターの構成部分を表わす。
【００７１】
A.  本方法で使用される、標的mRNAに相同なsiRNA  。配列はセンス又はアンチセンス領域（標的）、塩基８から１２の配列ループ、及び終止配列よりなる。siRNA配列は個々のODN断片よりなることもあり、ODN断片はアニールされ、結紮されそして、もし適用される場合は酵素ミックスの助けによりリン酸化される必要があり、またそれは完全ODN断片として既に存在していることもある。
【００７２】
B/C.  更に、構成部分はリガーゼ酵素によりODN断片に結紮されている。これらの構成部分は対応する相補的張り出し及びヘアーピン型オリゴジヌクレオチドを持つプロモータ配列であり、ヘアーピン型オリゴジヌクレオチドの、各4つの塩基のそれ自身と相補的な、独特の張り出しが共有結合的に閉じた線状ベクターから生ずるものとなり、ベクターはプロモータ、センス又はアンチセンスループ及び終止配列よりなり、閉じたヘアーピン型末端を持つ。
【００７３】
プロモータ及び末端オリゴヌクレオチドの間、及び終止配列と末端オリゴヌクレオチドの間に、一本鎖DNAの短い突出末端を持つ非コード配列の１０から１０００塩基（＝n）のDNA二本鎖が使用されることもある。
【００７４】
D:  トランスフェクションのための最終製品
図３はT型複数siRNAベクター（二構築体）の構成部分を示す。
【００７５】
A/B/C/D：本方法で使用される、標的mRNAに相同なsiRNA配列。
【００７６】
2つの配列はセンス又はアンチセンス領域（標的A、標的B）、８から１２塩基の配列ループ、及び終止配列よりなる。siRNA配列は個々のDNA断片よりなることもあり、ODN断片はアニールされ、結紮されそして、もし適用される場合は酵素ミックスの助けによりリン酸化される必要があり、またそれは完全ODN断片として既に存在していることもある。
【００７７】
更に、構成部分はリガーゼ酵素によりODN断片に結紮される。これらの構成部分は対応する相補的張り出し、DNA二本鎖リンカー及びヘアーピン型オリゴジヌクレオチドを持つプロモータ配列であり、ヘアーピン型オリゴジヌクレオチドは、各4つの塩基毎のそれ自身に相補的な、独特の張り出しが共有結合的に閉じた線状ベクターから生ずるものとなり、ベクターはプロモータ、センス又はアンチセンスループ及び終止配列よりなり、閉じたヘアーピン型末端を持つ。
【００７８】
プロモータ及び末端オリゴヌクレオチドの間、及び終止配列と終止オリゴヌクレオチドの間に、及びそれぞれの場合リンカーとプロモータと間に一本鎖DNAの短い突出末端を持つ非コード配列の１０から１０００塩基（＝n）のDNA二本鎖が使用されることもある。
【００７９】
E:トランスフェクションのための最終製品
図４はT型複数siRNAベクター（三構築）の構成部分を示す。
【００８０】
A/B/C/D:  本方法で使用される、標的mRNAに相同なsiRNA配列。３つの配列はセンス又はアンチセンス領域（標的A、標的B）、８から１２塩基の配列ループ、及び終止配列よりなる。siRNA配列は個々のODN断片よりなることもあり、ODN断片はアニールされ、結紮されそして、もし適用される場合は酵素ミックスの助けによりリン酸化される必要があり、またそれは完全ODN断片として既に存在していることもある。
【００８１】
更に、構成部分はリガーゼ酵素によりODN断片に結紮される。これらの構成部分は対応する相補的張り出し、DNA二本鎖リンカー及びヘアーピン型オリゴジヌクレオチドを持つプロモータ配列であり、ヘアーピン型オリゴジヌクレオチドは、各4つの塩基のそれ自身に相補的な、独特の張り出しが共有結合的に閉じた線状ベクターから生ずるものとなり、ベクターはプロモータ、センス又はアンチセンスループ及び終止配列よりなり、閉じたヘアーピン型末端を持つ。
【００８２】
プロモータ及び終止オリゴヌクレオチドの間、終止配列と末端オリゴヌクレオチドの間に、及びそれぞれの場合リンカーとプロモータと間に一本鎖DNAの短い突出末端を持つ非コード配列の１０から１０００塩基（＝n）のDNA二本鎖が使用されることもある。
【００８３】
F:    トランスフェクションのための最終製品
図５はT型構築体の標的配列ループの詳細を示す。
【００８４】
図６は、本発明のT型siRNA発現ベクター(T-siRNA-CDC2)を同一の標的配列を持つ合成RNA(CDC2-RNA)と比較した実験結果を示す。
【００８５】
CDC2  mRNAはHeL  a細胞のトランスフェクション後、定量リアルタイムPCRを用いて決定された。以下のものが使用された：  本発明の方法を用いて生成されたT型siRNAベクターで、CDC2標的配列、同じCDC2標的配列の合成RNA及び非処理細胞を含む。数値は複数決定されたものから計算された平均値である。非処理細胞においては、予期された様にCDC2  mRNAの抑制は見られなかった。対照的に、T型siRNAベクター及び合成RNAで処理された細胞は、極めて少量のCDC2  mRNAを示した。これは正の調節（positive  control）（非処理細胞）と比べて96.7%まで低減されている。
【００８６】
図７は本発明の、T型siRNA発現ベクター(T-siRNA-CDC2)を同一の標的配列を持つ合成RNA(CDC2-RNA)と比較した実験結果を示す。
【００８７】
CDC2タンパク質はHeLa細胞のトランスフェクション後にウエスタンブロットにより決定された。以下のものが用いられた：本発明の方法を用いて生成されたT型siRNAベクターで、CDC2標的配列を、同じCDC2標的配列の合成RNA及び非処理細胞含む。βチューブリンが内部標準として使用された。非処理細胞（バンド４）においては予想通りCDC2  mRNAの抑制は見られなかった。対照的にT型siRNA構築体（バンド２）及び合成RNA（バンド３）により処理された細胞は極めて少量のCDC2タンパク質しか見られなかった。
【００８８】
本発明の方法を用いた「siRNA発現ベクターキット」により生成されたT型siRNA構築体による遺伝子の発現抑制は、合成RNAトランスフェクションの効果と比肩されるものである。遺伝子発現の抑制は何れのトランスフェクションにおいても94  -96%の範囲である。
【００８９】
実施例１：CDC2発現を抑制するT型siRNAベクターの生成
CDC2のsiRNAをコードするベクターは以下の様に得られた：
CDC2のための2つのODN断片が90℃で3分加熱され、ゆっくり冷却することでアニールされた。この様にしてCDC2をコードする以下の配列が得られた。
【００９０】
配列番号１：TGGGGTCAGCTCGTTACTCTCTC
ここで１９の塩基がセンス鎖を形成し、続く4つの塩基（下線部分）がループ配列の最初の部分を形成する。
【００９１】
続いてPNキナーゼによりリン酸化がなされた。１０ミクログラムの最終製品を得るために３．９ミクログラムのCDC2が使用された。５．２ミクログラムのH1プロモータ（配列番号２）及び５−リン酸化ヘアーピンオリゴデオキシヌクレオチド（配列番号3及び４）の添加に続いて：
配列番号２：  ATATTTGCAT  GTCGCTATGT  GTTCTGGGAA  ATCACCATAA  ACGTGAAATG  TCTTTGGATT  TGGGAATCTT  ATAAGTTCTGT  ATGAGAGCAC  AGATAGGG  
配列番号３：  5'-PH-GGG  AAA  GCT  TAG  TTT  TCT  AAG  CTT-3'  (1.3  ミクログラム)及び
配列番号４：  5'−PH-GTT  GGA  ATT  CAG  TTT  TCT  GAA  TTC-3'  (1.3  ミクログラム)
個々の断片がT4  DNAリガーゼ酵素の助けにより結紮された。出来た核酸の混合物はT7  DNA-ポリメラーゼ酵素により処理された。最終製品、siRNALuc発現T7  DNAベクターがカラムクロマトグラフィーにより精製され、トランスフェクションのために備えられた。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】線状siRNAベクターの構成部分
【図２】T型siRNAベクターの構成部分
【図３】T型二重siRNAベクターの構成部分
【図４】T型三重siRNAベクターの構成部分
【図５】T型構築体の標的配列ル−プの詳細図。
【図６】本発明のT型siRNA発現ベクター(T-  siRNA-CDC2)と同一標的配列を持つ合成RNA  (CDC2-RNA)との比較の実験結果
【図７】本発明のT型siRNA発現ベクター(T-  siRNA-CDC2)と同一標的配列を持つ合成RNA  (CDC2-RNA)との比較の実験結果
【図１】
2009521210.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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