(57)【要約】  本発明によって、ナリジクス酸耐性を示すＥ．ｃｏｌｉ  Ｍ１７細菌株の生物学的に純粋な培養物が提供される。また、本発明の細菌株の治療効果的な量をその必要性のある対象に投与し、それにより、胃腸障害を治療することを含む、胃腸障害を治療する方法、および本発明の細菌株を有効成分として含み、かつ、キャリアまたは希釈剤を含むプロバイオティック組成物も提供される。記載された好ましい実施形態によれば、組成物はさらに抗真菌剤、抗生物質を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナリジクス酸耐性を示すＥ．ｃｏｌｉ  Ｍ１７細菌株の生物学的に純粋な培養物。
【請求項２】
請求項１に記載の細菌株を有効成分として含み、かつ、キャリアまたは希釈剤を含むプロバイオティック組成物。
【請求項３】
１グラムの組成物あたり、前記細菌株の１０３個〜１０１０個の細菌細胞を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記キャリアは、前記細菌株の生存能を維持するための配合物を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記配合物は植物抽出物の揮発性分画物を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
さらに抗真菌剤を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
さらに抗生物質を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項８】
さらに、酵母細胞、カビおよび細菌細胞からなる群から選択されるプロバイオティック微生物を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項９】
前記キャリアはコロニー形成キャリアである、請求項２に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の細菌株を有効成分として含み、かつ、ヒトが消費するために好適なキャリアを含む食品添加物。
【請求項１１】
前記キャリアは、多糖、修飾多糖およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１０に記載の食品添加物。
【請求項１２】
請求項１に記載の細菌株を有効成分として含み、かつ、動物が消費するために好適なキャリアを含む飼料添加物。
【請求項１３】
前記キャリアは、石灰石、多糖およびあらびき小麦粉からなる群から選択される、請求項１２に記載の飼料添加物。
【請求項１４】
請求項１に記載の細菌株を含む食料品。
【請求項１５】
乳製品である、請求項１４に記載の食料品。
【請求項１６】
胃腸障害を治療する方法であって、請求項１に記載の細菌株の治療効果的な量をその必要性のある対象に投与し、それにより、胃腸障害を治療することを含む方法。
【請求項１７】
胃腸障害は、回腸嚢炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、炎症性腸疾患、セリアック病、小腸細菌過剰増殖、胃食道逆流性疾患、下痢、クロストリジウム・ディフィシル大腸炎および／または抗生物質関連下痢、過敏性腸症候群、過敏性嚢症候群、急性下痢、旅行者下痢、乳糖不耐症、ＨＩＶ関連下痢、スクロースイソマルターゼ欠損症、発癌、経腸栄養法関連下痢、ならびに、腸病原体に関連する障害、非びらん性食道逆流性疾患（ＮＥＲＤ）および関連した小腸細菌過剰増殖、機能性消化不良、壊死性腸炎、糖尿病性胃疾患および便秘からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細菌株はＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７２９５の同定特徴のすべてを含む、請求項１、２、１０、１２、１５および１６に記載の生物学的に純粋な培養物、組成物、食品添加物、飼料添加物、食料品および方法。
【請求項１９】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｍ１７はＡＴＣＣ寄託番号２０２２２６（ＤＳＭ１２７９９）である、請求項１、２、１０、１２、１５および１６に記載の生物学的に純粋な培養物、組成物、食品添加物、飼料添加物、食料品および方法。
【請求項２０】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｍ１７は、ＢＵ−２３９、ＢＵ−２３０−９８、ＢＵ２３０−０１およびＡＴＣＣ寄託番号２０２２２６（ＤＳＭ１２７９９）からなる群から選択される、請求項１、２、１０、１２、１５および１６に記載の生物学的に純粋な培養物、組成物、食品添加物、飼料添加物、食料品および方法。
【請求項２１】
前記細菌株は、配列番号１〜９からなる群から選択されるゲノム核酸配列を含む、請求項１、２、１０、１２、１５および１６に記載の生物学的に純粋な培養物、組成物、食品添加物、飼料添加物、食料品および方法。
【請求項２２】
前記細菌株は、哺乳動物の胃腸管において増殖およびコロニー形成することができる、請求項１、２、１０、１２、１５および１６に記載の生物学的に純粋な培養物、組成物、食品添加物、飼料添加物、食料品および方法。
【請求項２３】
ナリジクス酸の存在下における細菌の成長を検出し、それにより、便サンプルにおける請求項１に記載の細菌株の存在を検出することを含む、便サンプルにおける請求項１に記載の細菌株の存在を検出する方法。
【請求項２４】
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７２９５の同定特徴のすべてを有するＥ．ｃｏｌｉの生物学的に純粋な培養物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な細菌株、この細菌株を含む組成物、および、胃腸障害のプロバイオティック治療におけるそのような菌株を使用する方法に関連する。
【背景技術】
【０００２】
プロバイオティックは、宿主の胃腸（ＧＩ）系に対する好ましい効果を及ぼす生きた生物として定義される。最も一般的に使用されているプロバイオティックは乳酸菌（ＬＡＢ）の菌株であり、特に、ラクトバチルス属、ラクトコックス属およびエンテロコックス属に分類される菌株である。
【０００３】
抵抗力が低い期間（例えば、ストレスもしくは疾患のとき、出生時または抗生物質処置後）に、望ましくない微生物が胃腸管で増殖し得ることが広く知られている。従って、正常かつ健康な微生物叢を胃腸（ＧＩ）管において維持することはストレスの多い期間のときには重要である。
【０００４】
プロバイオティック治療の目標は、健康を増進させる微生物の数および活性を、正常なＧＩ叢が再び確立されるまで増大させることである。
【０００５】
プロバイオティックの保護的作用を担う機構がいくつか提案されている。これらには、（ｉ）細胞の生存能力を低下させ、細菌の代謝に影響を及ぼし、また、トキシンの産生を低下させることができる阻害性物質（例えば、抗生物質、有機酸、過酸化水素およびバクテリオシン）の産生；（ｉｉ）腸上皮表面における細菌接着部位の競合的阻害による接着部位の阻止［Ｃｏｎａｗａｙ（１９８７）、Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．、７０：１〜１２；Ｇｏｌｄｉｎ（１９９２）、Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．、３７：１２１〜１２８；ＫｌｅｅｍａｎおよびＫｌａｅｎｈａｍｍｅｒ（１９８２）、Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．、１９８２：６５：２０６３〜２０６９］；（ｉｉｉ）栄養分についての競合；（ｉｖ）トキシン受容体の分解、これは、Ｓ．ｂｏｕｌａｒｄｉｉが腸粘膜上のトキシン受容体の分解によってＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの腸疾患から保護する仮定された機構である［Ｃａｓｔａｇｌｉｕｏｌｏ（１９９６）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６４：５２２５〜５２３２；Ｃａｓｔａｇｌｉｕｏｌｏ、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９９）、６７：３０２〜３０７；Ｐｏｔｈｏｕｌａｋｉｓ（１９９３）、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１０４：１１０８〜１１１５］；および（ｖ）非特異的免疫性の刺激［Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９８）、４２：３９〜４４；Ｌｉｎｋ−Ａｍｓｔｅｒ、ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９４）、１０：５５〜６３；Ｍａｌｉｎ、Ａｎｎ．Ｎｕｔｒ．Ｍｅｔａｂ．（１９９６）、４０：１３７〜１４５］が含まれる。
【０００６】
プロバイオティック治療の有効性が数多くの研究によって明らかにされており、従って、今では、数多くの障害に対する好適な治療として受け入れられているが、プロバイオティック治療は、全身感染、有害な代謝活性、感受性個体における過度な免疫刺激、および遺伝子移入をはじめとする数多くの副作用をもたらし得る［Ｍａｒｔｅａｕ（２００１）、プロバイオティック製造物の安全性局面、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．、４５、１、２２〜２４］。例えば、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓの２つの事例が、可能なプロバイオティックの摂取にさかのぼって調べられた［Ｒａｕｔｉｏ（１９９９）、Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、２８：１１５９〜６０；Ｍａｃｋａｙ（１９９９）、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．、５：２９０〜２９２］。１３例のサッカロミセス真菌血症が血管カテーテル汚染によって引き起こされ［Ｈｅｎｎｅｑｕｉｎ（２０００）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１９：１６〜２０］、また、バチルス感染症が、根本的な疾患を有する患者においてすべて、プロバイオティック摂取に関連づけられた［Ｓｐｉｎｏｓａ（２０００）、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｅｃｏｌ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｄｉｓ．、１２：９０〜１０１；Ｏｇｇｉｏｎｉ（１９９８）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３６：３２５〜３２６］。あるいは、エンテロコックス属が院内感染症の重要な原因として出現しつつあり、単離体がますますバンコマイシン耐性になっている。
【０００７】
非病原性のラクトース陽性Ｅ．ｃｏｌｉは、微生物学的バランスを提供し、また、栄養および免疫における重要な役割を果たす、ヒトおよび動物の腸における健全な好気性ミクロフローラの主要な群を構成する。
【０００８】
本発明者らは以前に、様々な哺乳動物および鳥類の正常なＧＩフローラを回復することができる、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＵ−２３０−９８（ＡＴＣＣ寄託番号２０２２２６（ＤＳＭ１２７９９））として示される非病原性プロバイオティック微生物の単一種（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｍ１７）を見出している。配合物に懸濁されたこのプロバイオティック生物を含むプロバイオティック組成物は、様々な胃腸障害の治療および予防において効果的であることが見出された。このプロバイオティック配合物はそれ自体で、哺乳動物および鳥類において、体重増加強化剤として、また、免疫刺激剤として効果的であることが同様にまた見出された（米国特許第６５００４２３号（本特許権はＴｈｅ  Ｂｉｏ  Ｂａｌａｎｃｅ  Ｃｏｒｐ．に譲渡されている）および関連出願を参照。それらのそれぞれが参考として本明細書中に組み込まれる）。
【０００９】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＵ−２３０−９８（ＡＴＣＣ寄託番号２０２２２６（ＤＳＭ１２７９９））のプロバイオティック活性は、この菌株を、数多くの胃腸障害および胃腸関連障害を治療するための好ましい治療ツールにする。このことは、この細菌種のアッセイ可能な抗生物質耐性菌株が調節において重要であり得ること、また、抗生物質治療との併用で使用され得ることを示唆する。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の１つの局面によれば、ナリジクス酸耐性を示すＥ．ｃｏｌｉ  Ｍ１７細菌株の生物学的に純粋な培養物が提供される。
【００１１】
本発明の別の局面によれば、本発明の細菌株を有効成分として含み、かつ、キャリアまたは希釈剤を含むプロバイオティック組成物が提供される。
【００１２】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、組成物は、１グラムの組成物あたり、本発明の細菌株の１０３個〜１０１０個の細菌細胞を含む。
【００１３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、キャリアは、本発明の細菌株の生存能を維持するための配合物を含む。
【００１４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、配合物は植物抽出物の揮発性分画物を含む。
【００１５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、組成物はさらに抗真菌剤を含む。
【００１６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、組成物はさらに抗生物質を含む。
【００１７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、組成物はさらに、酵母細胞、カビおよび細菌細胞からなる群から選択されるプロバイオティック微生物を含む。
【００１８】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、キャリアはコロニー形成キャリアである。
【００１９】
本発明のさらに別の局面によれば、本発明の細菌株を有効成分として含み、かつ、ヒトが消費するために好適なキャリアを含む食品添加物が提供される。
【００２０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、コロニー形成キャリアは、多糖、修飾多糖およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【００２１】
本発明のなおさらに別の局面によれば、本発明の細菌株を有効成分として含み、かつ、動物が消費するために好適なキャリアを含む飼料添加物が提供される。
【００２２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、キャリアは、石灰石、多糖およびあらびき小麦粉（ｗｈｅａｔ  ｍｉｄｄｓ）からなる群から選択される。
【００２３】
本発明のさらなる局面によれば、本発明の細菌株を含む食料品が提供される。
【００２４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、食料品は乳製品である。
【００２５】
本発明のさらにさらなる局面によれば、本発明の細菌株の治療効果的な量をその必要性のある対象に投与し、それにより、胃腸障害を治療することを含む、胃腸障害を治療する方法が提供される。
【００２６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、胃腸障害は、回腸嚢炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、炎症性腸疾患、セリアック病、小腸細菌過剰増殖、胃食道逆流性疾患、下痢、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）大腸炎および／または抗生物質関連下痢、過敏性腸症候群、過敏性嚢症候群、急性下痢、旅行者下痢、乳糖不耐症、ＨＩＶ関連下痢、スクロースイソマルターゼ欠損症、発癌、経腸栄養法関連下痢、ならびに、腸病原体に関連する障害、非びらん性食道逆流性疾患（ＮＥＲＤ）および関連した小腸細菌過剰増殖、機能性消化不良、壊死性腸炎、糖尿病性胃疾患および便秘からなる群から選択される。
【００２７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、本発明の細菌株はＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７２９５の同定特徴のすべてを含む。
【００２８】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｍ１７はＡＴＣＣ寄託番号２０２２２６（ＤＳＭ１２７９９）である。
【００２９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｍ１７は、ＢＵ−２３９、ＢＵ−２３０−９８、ＢＵ２３０−０１およびＡＴＣＣ寄託番号２０２２２６（ＤＳＭ１２７９９）からなる群から選択される。
【００３０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、本発明の細菌株は、配列番号１〜９からなる群から選択されるゲノム核酸配列を含む。
【００３１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、本発明の細菌株は、哺乳動物の胃腸管において増殖およびコロニー形成することができる。
【００３２】
本発明のなおさらにさらなる局面によれば、ナリジクス酸の存在下における細菌の成長を検出し、それにより、便サンプルにおける本発明の細菌株の存在を検出することを含む、便サンプルにおける本発明の細菌株の存在を検出する方法が提供される。
【００３３】
本発明のさらなる局面によれば、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７２９５の同定特徴のすべてを有するＥ．ｃｏｌｉの生物学的に純粋な培養物が提供される。
【００３４】
本発明は、新規な細菌株、新規な細菌株を含む組成物、およびそのプロバイオティック使用を提供することによって、現在知られている形態の欠点を対処することに成功している。
【００３５】
本明細書で使用される技術用語と科学用語はすべて、特に断らない限り、本発明の属する技術分野の当業者が共通して理解しているのと同じ意味を持っている。本明細書に記載されているのと類似の又は均等の方法と材料は本発明を実施又は試験するのに使用できるが、適切な方法と材料は以下に述べる。争いが生じた場合、定義を含めて本特許明細書が基準である。さらに、本明細書の材料、方法及び実施例は例示することだけを目的とし本発明を限定するものではない。
【００３６】
本明細書では本発明を単に例示し図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の好ましい実施態様を例示考察することだけを目的としており、本発明の原理や概念の側面の最も有用でかつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示していることを強調するものである。この点について、本発明を基本的に理解するのに必要である以上に詳細に本発明の構造の詳細は示さないが、図面について行う説明によって本発明のいくつもの形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】Ｍ１７親菌株、および、本発明の教示に従って作製されたナリジクス酸耐性（Ｍ１７ＳＮＡＲ）誘導体のパルスフィールドゲル電気泳動を示す。それぞれの菌株をＸｂａＩにより消化した。マーカーはラムダコンカテマーからなる。ＭＣ１０６１（これはＥ．ｃｏｌｉのＫ−１２誘導体であり、Ｍ１７とは遺伝子的に無関係である）を陰性コントロールとして泳動した。これらの菌株が画像の関連したレーンの上部に示される。
【図２】Ｍ１７親菌株およびＭ１７ＳＮＡＲ菌株の増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）分析を示す。Ｍ１７菌株、Ｍ１７ＳＮＡＲ菌株およびＥＣＯＲ菌株から得られるＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ−Ａ＋ＭｓｅＩ  ＧＡのプライマー組合せを使用するＡＦＬＰ分析に供した。反応生成物をＬｉ−Ｃｏｒ／ＮＥＮ４２００グローバルアナライザーでの変性ゲルポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離した。菌株が、分離された反応生成物を含有する適切なレーンの上方に示される。
【図３ａ】Ｍ１７ＳＮＡＲが与えられたイヌ（イヌ３０２８、オス）の便サンプルにおける総大腸菌群およびＭ１７ＳＮＡＲの流出（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）を示すグラフである。動物には、１Ｘ１０１３コロニー形成ユニットのＭ１７ＳＮＡＲが、０日目以降、１４日連続して与えられた（Ｒｉｃｅｒｃａ研究における高用量摂取）。便サンプルを集め、総大腸菌群をＶＲＢＡ培地において二連で計数し、一方、Ｍ１７ＳＮＡＲをＶＲＢＡ＋２５μｌ／ｍｌナリジクス酸において計数した。ナリジクス酸耐性コロニーをコンティグ１２７ＰＣＲアッセイにより確認した。結果がそれぞれの動物について別々に示される。
【図３ｂ】Ｍ１７ＳＮＡＲが与えられたイヌ（イヌ３０２９、オス）の便サンプルにおける総大腸菌群およびＭ１７ＳＮＡＲの流出（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）を示すグラフである。動物には、１Ｘ１０１３コロニー形成ユニットのＭ１７ＳＮＡＲが、０日目以降、１４日連続して与えられた（Ｒｉｃｅｒｃａ研究における高用量摂取）。便サンプルを集め、総大腸菌群をＶＲＢＡ培地において二連で計数し、一方、Ｍ１７ＳＮＡＲをＶＲＢＡ＋２５μｌ／ｍｌナリジクス酸において計数した。ナリジクス酸耐性コロニーをコンティグ１２７ＰＣＲアッセイにより確認した。結果がそれぞれの動物について別々に示される。
【図３ｃ】Ｍ１７ＳＮＡＲが与えられたイヌ（イヌ３０３２、メス）の便サンプルにおける総大腸菌群およびＭ１７ＳＮＡＲの流出（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）を示すグラフである。動物には、１Ｘ１０１３コロニー形成ユニットのＭ１７ＳＮＡＲが、０日目以降、１４日連続して与えられた（Ｒｉｃｅｒｃａ研究における高用量摂取）。便サンプルを集め、総大腸菌群をＶＲＢＡ培地において二連で計数し、一方、Ｍ１７ＳＮＡＲをＶＲＢＡ＋２５μｌ／ｍｌナリジクス酸において計数した。ナリジクス酸耐性コロニーをコンティグ１２７ＰＣＲアッセイにより確認した。結果がそれぞれの動物について別々に示される。
【図３ｄ】Ｍ１７ＳＮＡＲが与えられたイヌ（イヌ３０３３、メス）の便サンプルにおける総大腸菌群およびＭ１７ＳＮＡＲの流出（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）を示すグラフである。動物には、１Ｘ１０１３コロニー形成ユニットのＭ１７ＳＮＡＲが、０日目以降、１４日連続して与えられた（Ｒｉｃｅｒｃａ研究における高用量摂取）。便サンプルを集め、総大腸菌群をＶＲＢＡ培地において二連で計数し、一方、Ｍ１７ＳＮＡＲをＶＲＢＡ＋２５μｌ／ｍｌナリジクス酸において計数した。ナリジクス酸耐性コロニーをコンティグ１２７ＰＣＲアッセイにより確認した。結果がそれぞれの動物について別々に示される。
【図４】Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｍ１７ＳＮＡＲについての全ゲノムショットガン配列決定アプローチを示すスキームである。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明は、胃腸障害および免疫関連障害の治療に使用されることができる細菌株の発明である。
【００３９】
本発明の原理および操作は、図面および添付された説明を参照してより良く理解することができる。
【００４０】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示される細部または実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は、他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実施することができ、または様々な方法で実施される。また、本明細書中で用いられる表現および用語は説明のためであり、従って限定として見なされるべきではないことを理解しなければならない。
【００４１】
本発明者らは、様々な哺乳動物および鳥類の正常なＧＩフローラを回復することができる非病原性プロバイオティック微生物の１つの種（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＵ２３０−９８、ＡＴＣＣ寄託番号２０２２２６（ＤＳＭ１２７９９））を以前に見出している。このプロバイオティック生物を含むプロバイオティック組成物は、様々な胃腸障害の治療および予防において効果的であることが見出された。このプロバイオティック組成物はまた、哺乳動物および鳥類において、体重増加強化剤として、また、免疫刺激剤として効果的であることが見出された（米国特許第６５６００４２３号（本特許権はＴｈｅ  Ｂｉｏ  Ｂａｌａｎｃｅ  Ｃｏｒｐ．に譲渡されている）および関連出願を参照。それらのそれぞれが参考として本明細書中に組み込まれる）。
【００４２】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＵ２３０−９８（ＡＴＣＣ寄託番号２０２２２６（ＤＳＭ１２７９９））（Ｍ１７）のプロバイオティック活性は、この菌株を、数多くの胃腸障害および胃腸関連障害（例えば、免疫関連障害）を治療するための好ましい治療ツールにする。このことは、この細菌種の抗生物質耐性菌株が調節において重要であり得ること、また、抗生物質治療との併用で使用され得ることを示している。
【００４３】
本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、労力を要する実験により、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＵ２３０−９８（ＡＴＣＣ寄託番号２０２２２６（ＤＳＭ１２７９９））の自然発生するナリジクス酸耐性変異誘導体（これはＭ１７ＳＮＡＲと呼ばれる）を単離し、また、便サンプルにおけるこの菌株の特異的な計数および確認のための方法を開発している。
【００４４】
本明細書中下記において、また、下記の実施例の節において例示されるように、本発明者らは、自然発生する様々なナリジクス酸耐性変異体を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＵ２３０−９８（ＡＴＣＣ寄託番号２０２２２６（ＤＳＭ１２７９９））の親菌株ストックから濃縮および選択している。Ｍ１７ＳＮＡＲと呼ばれるナリジクス酸耐性菌株（ＡＴＣＣ寄託番号７２９５）は、ＰＦＧＥ分析およびＡＦＬＰ分析によってその親菌株から区別不可能である。その後、Ｍ１７ＳＮＡＲゲノムの特有な核酸配列が、全ゲノム配列決定およびコンピューターによる分析、その後の、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株のパネルに対するＰＣＲ分析によって特定された。Ｍ１７ＳＮＡＲを混成便サンプルに導入し、その後、ＶＲＢＡにおける選択的平板培養、および、核酸分析による確認を行うことにより、Ｍ１７ＳＮＡＲが、添加された便サンプルにおいて特異的に定量され得ることが示された。アッセイの検出限界が、便サンプルにおいて３３ＣＦＵ／ｍｌのＭ１７ＳＮＡＲであることが推定された。ＶＲＢＡ＋ナリジクス酸における選択的平板培養と、核酸分析による確認との組合せを考えると、このアッセイは、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｍ１７ＳＮＡＲを便サンプルにおいて検出および定量することについて非常に特異的であるようである。
【００４５】
従って、本発明の１つの局面によれば、ナリジクス酸耐性を示すＥ．ｃｏｌｉ  Ｍ１７細菌株の生物学的に純粋な培養物が提供される（下記の実施例の節の実施例１を参照）。
【００４６】
本明細書中で使用される「Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｍ１７細菌株」は、この菌株それ自体、ならびに、下記の表１〜３に示されるようなプロバイオティック活性および生化学的特徴を維持する非病原性の誘導された菌株を示す。
【００４７】
本明細書中で使用される「プロバイオティック活性」は、少なくとも１つの病原体の成長を阻害する性質を示す。病原体成長阻害の試験を固体培地において行うことができ、この場合、候補の単離された細菌の培養上清が、その培養上清が固体培地の表面に適用されたときに病原体の成長を阻害するその性質について観測される。典型的には、候補プロバイオティック菌株の培養上清を含浸させたペーパーディスクが、病原体が播種された寒天平板の表面に置かれる。プロバイオティック性の細菌上清は、ディスクの近傍における病原体の阻害を示す透明な寒天の輪または低下した成長密度の輪を生じさせる。利用可能であるか、または、考案され得る、阻害についての他の様々な試験が存在し、これらには、本明細書中に記載されるパネルに類似するプロバイオティク細菌のパネルをもたらし得る直接的な成長競合試験（インビトロまたはインビボ）が含まれる。任意のそのような試験によって同定される細菌株は、この用語が本明細書中で使用されるように、プロバイオティック細菌の範疇内である。
【００４８】
そのような菌株の例およびそのような菌株のインビトロ特性が下記の表１〜３に示される。本発明のこの局面の好ましい実施形態によれば、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｍ１７細菌株は、ＢＵ２３９、ＢＵ２３０−９８、ＢＵ−２３０−０１およびＡＴＣＣ寄託番号２０２２２６（ＤＳＭ１２７９９）である。
2009537138.tif 000002
2009537138.tif 000003
2009537138.tif 000004
【００４９】
述べられたように、本発明のＥ．ｃｏｌｉ  ＢＵ−２３９細菌株はナリジクス酸耐性を示す。
【００５０】
本明細書中で使用される表現「ナリジクス酸耐性」は、本発明のこの局面の培養物がキノロン系抗生物質のナリジクス酸（ＮｅｇＧｒａｍ）の存在下においてさえ増殖することができることを示す。本発明の培養物は、好ましくは、少なくとも５μｇ／ｍｌのナリジクス酸に対して耐性であり、より好ましくは、少なくとも１５μｇ／ｍｌのナリジクス酸に対して耐性であり、一層より好ましくは、２５μｇ／ｍｌのナリジクス酸に対して耐性であり、一層より好ましくは、５０μｇ／ｍｌのナリジクス酸に対して耐性であり、一層より好ましくは、１００μｇ／ｍｌのナリジクス酸に対して耐性である。
【００５１】
本発明の細菌株（すなわち、ナリジクス酸耐性ＢＵ−２３９菌株）の単離、同定および培養を、標準的な微生物学的技術を使用して行うことができる。そのような技術の様々な例が、Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｐ．（編）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４））、および、Ｌｅｎｎｅｔｔｅ，Ｅ．Ｈ．（編）、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（第３版）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８０））に見出され得る。
【００５２】
本発明の細菌株の単離は好ましくは、本明細書中上記で記載される表現型形質（例えば、グラム陰性、ラクトース発酵が可能であること、ナリジクス酸耐性）を特徴とする単一コロニーを得るために、また、汚染されている培養物、および／または、蓄積した変異を有する培養物を用いて作業することの可能性を軽減するために、試料（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＵ−２３０−９８）を固体培地（例えば、栄養寒天平板）に画線培養することによって行われる。
【００５３】
本発明の細菌株は、実施例の節に記載される条件のもと、液体培地において増殖することができる。
【００５４】
本発明の細菌株を成長させるための培地は、炭素源、窒素源および無機塩、ならびに、特別に要求される物質（例えば、ビタミン、アミノ酸および核酸など）を含む（下記の実施例の節の実施例１には、本発明に従って使用することができる培地組成の様々な実施形態が記載される）。
【００５５】
本発明の細菌株を成長させるため使用することができる好適な炭素源の例には、デンプン、ペプトン、酵母抽出物、アミノ酸、糖（例えば、グルコース、アラビノース、マンノース、グルコサミンおよびマルトースなど）、有機酸（例えば、酢酸、フマル酸、アジピン酸、プロピオン酸、クエン酸、グルコン酸、リンゴ酸、ピルビン酸およびマロン酸など）の塩、アルコール（例えば、エタノールおよびグリセロールなど）、オイルまたは脂肪（例えば、ダイズ油、米ぬか油、オリーブ油、トウモロコシ油、ゴマ油など）が含まれるが、これらに限定されない。加えられる炭素源の量は炭素源の種類に従って変化し、典型的には、培地１リットルあたり１〜１００グラムの間である。好ましくは、グルコース、デンプンおよび／またはペプトンが、０．１％〜５％（ｗ／ｖ）の濃度で、主要な炭素源として培地に含有される。
【００５６】
本発明の細菌株を成長させるため使用することができる好適な窒素源の例には、アミノ酸、酵母抽出物、トリプトン、牛肉抽出物、ペプトン、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、アンモニアまたはそれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。窒素源の量は窒素源に従って変化し、典型的には、培地１リットルあたり０．１〜３０グラムの間である。
【００５７】
無機塩として、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水素二ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸第二鉄、硫酸第一鉄、塩化第二鉄、塩化第一鉄、硫酸マンガン、塩化マンガン、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸第二銅、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムを単独または組合せで使用することができる。無機塩の量は無機塩の種類に従って変化し、典型的には、培地１リットルあたり０．００１〜１０グラムの間である。
【００５８】
特別に要求される物質の例には、ビタミン、核酸、酵母抽出物、ペプトン、肉抽出物、麦芽抽出物、乾燥酵母およびこれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。
【００５９】
培養が、本発明のプロバイオティック細菌株の成長を可能にする温度において行われ、典型的には、２８℃〜４６℃の間の温度で行われる。好ましい温度範囲が３０℃〜３７℃である。
【００６０】
最適な成長のために、培地は好ましくは、ｐＨ７．０〜ｐＨ７．４に調節される。
【００６１】
市販されている培地もまた、本発明の細菌株を培養するために使用され得ることが理解される（例えば、Ｄｉｆｃｏ（Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）から入手可能なＬ培地など）。
【００６２】
このようにして得られる細菌細胞は、この分野では広く知られている方法を使用して単離される。例には、膜ろ過および遠心分離による分離が含まれるが、これらに限定されない。
【００６３】
ｐＨを、水酸化ナトリウムなどを使用して調節することができ、また、培養物を、水分含有量が４％以下になるように、風乾することができ、または、凍結乾燥機を使用して乾燥することができる。
【００６４】
１ロット分の本発明の細菌株が得られると、このロットは好ましくは品質検定される。そのような検定には、ナリジクス酸に対する耐性、ラクトース発酵、胃の酸性度に対する抵抗性、胃腸管でのコロニー形成、胆汁酸に対する抵抗性（これは、インビボにおける胃生存性と相関する）、粘膜および／またはヒト上皮細胞およびヒト上皮細胞株に対する接着性、潜在的に病原性の細菌に対する抗菌活性、表面への病原体接着を低下させる能力、ならびに、胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を試験することが含まれ得る［Ｃｏｎｗａｙ（１９８７）、Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．、７０：１〜１２］。
【００６５】
新しく単離された菌株は好ましくは、ナリジクス酸耐性を依然として示す一方で、親菌株から分子的に区別可能であることをさらに特徴とする。これは、例えば、配列番号１〜９に示されるゲノム配列、または、相同的な配列（例えば、約８０％を越える同一性、９０％を越える同一性、または、９５％を越える同一性の相同的な配列）の存在に起因すると考えられ得る。
【００６６】
上記の方法論を使用して、本発明者らは、下記の表７に列挙されるような様々なレベルの抗生物質耐性を呈する本発明の菌株を単離することができた。
【００６７】
本発明のこの局面の好ましい実施形態によれば、本発明の菌株は、ブタペスト条約に従ってＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に２００５年１２月２２日に菌株ＰＴＡ−７２９５（これは本明細書中ではＭ１７ＳＮＡＲとして示される）として寄託された菌株の同定特徴のすべてを有する。
【００６８】
本発明のプロバイオティック細菌株は抗生物質耐性を示しており、また、そのようなものとして、様々な胃腸障害を治療するために調節的観点から都合よく使用することができる。これは単に、この細菌株を便サンプルにおいて追跡することが今回、可能になるからである。加えて、今回、ナリジクス酸と併用した本発明の菌株による同時治療が可能になり、従って、これにより、生存可能な胃腸フローラが、尿路感染などのための抗生物質治療を実施しながら維持される。
【００６９】
従って、本発明のさらに別の局面によれば、胃腸障害を対象において治療または予防する方法が提供される。
【００７０】
この方法は、その必要性のある対象に本発明のプロバイオティック細菌株の治療効果的な量を投与することによって行われる。
【００７１】
本明細書中で使用される用語「治療する」は、障害に関連する症状を緩和または軽減することを示す。好ましくは、治療することにより、障害に関連する症状が治療され、例えば、障害に関連する症状が実質的に除かれる。
【００７２】
本発明の細菌培養物により治療され得る対象には、ヒト、および、プロバイオティック治療から利益を受けることができる動物が含まれる。例には、哺乳動物、ハ虫類、鳥類および魚類などが含まれるが、これらに限定されない。
【００７３】
本発明のプロバイオティック菌株を使用して治療することができる胃腸障害の例には、回腸嚢炎（例えば、潰瘍性大腸炎後の回腸嚢肛門吻合術に関連する回腸嚢炎）、潰瘍性大腸炎、クローン病、炎症性腸疾患、セリアック病および関連した小腸細菌過剰増殖、胃食道逆流性疾患および関連した小腸細菌過剰増殖、小腸細菌過剰増殖、回腸造瘻術の患者における下痢および高排便量、抗生物質関連下痢、クロストリジウム・ディフィシレ大腸炎および／または抗生物質関連下痢、過敏性腸症候群、過敏性嚢症候群、急性下痢、旅行者下痢、乳糖不耐症、ＨＩＶ関連下痢、スクロースイソマルターゼ欠損症、発癌、経腸栄養法関連下痢、ならびに、様々な腸病原体に関連する障害（例えば、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｌｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、エンテロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｏｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、シトロバクター・フロインディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）およびシュードモナス・マルトフィリア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、サルモネラ種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．）、ウイルス（例えば、ロタウイルスなど）および真菌（例えば、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）およびアスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｔｕｓ）、ならびに、これらの組合せに関連する障害など）が含まれるが、これらに限定されない。
【００７４】
本発明の菌株を使用して治療することができるさらなる障害には、非びらん性食道逆流性疾患（ＮＥＲＤ）および関連する小腸細菌過剰増殖、機能性消化不良、壊死性腸炎、糖尿病性胃疾患、便秘（胃腸の微生物叢における変化に関連する便秘）、泌尿生殖路関連疾患、膀胱感染症（子宮感染症、ならびに、子宮頸部、膣および外陰部の感染症が、特に出生後において、ヒトおよび飼育動物で一般に発生する）が含まれるが、これらに限定されない。子宮内膜（すなわち、子宮粘膜）、および、下部生殖管における隣接する粘膜表面の典型的な感染性生物には、例えば、β溶血性連鎖球菌、カンジダ・アルビカンス、肺炎桿菌、大腸菌を含む大腸菌群細菌、コリネバクテリウム・ピオゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびＣ．ｖａｇｉｎａｌｅ、ならびに、様々なカンピロバクター種またはトリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）種（例えば、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓなど）などが含まれる（米国特許第５６６７８１７号を参照のこと）。他の泌尿生殖器病原体には、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、単純ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、パピローマウイルスおよび梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）が含まれるが、これらに限定されない。黄色ブドウ球菌、肺炎連鎖球菌、β溶血性連鎖球菌およびインフルエンザ菌（これらに限定されない）をはじめとする病原性細菌に関連する呼吸器疾患；関節リウマチ［Ｍａｌｉｎ（１９９６）、Ｂｒ  Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ、３５：６８９〜９４］、西洋社会の生活様式（すなわち、衛生状態の改善および家族構成の縮小）に伴う微生物刺激の低下に関連するアレルギー。アトピー性疾患、例えば、より多くのクロストリジウム種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｓｐ）と組み合わせたラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属およびユーバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の減少に関連するアトピー性疾患［Ｂｉｏｒｋｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ（１９９９）、２９：３４２〜３４６］など。
【００７５】
当然のことながら、本発明の細菌株は、プロバイオティック物によって治療され得る他の疾患または障害（すなわち、腸外の疾患または障害）を治療するために使用され得る。
【００７６】
本発明の細菌株が、他の器官における細菌感染症、真菌感染症またはウイルス感染症を治療することができることは、潜在的な病原体の転位を阻害し、従って、血流および他の組織または器官の感染を予防することができる非免疫学的な腸防御バリアを促進させることを含めて、多数の防御機構［これは、Ｉｓｏｌａｕｒｉ（２００１）、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔ．、７３：４４４Ｓ〜４５０Ｓによって総説される］を刺激することの結果である。別の防御機構が、特に、腸の安定化作用をもたらす腸内の免疫グロブリンＡ応答および腸内炎症応答の緩和を介した腸の免疫学的バリアの改善であり、同様にまた、前炎症性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインのバランス制御を介した免疫調節によるものである。
【００７７】
本発明のプロバイオティック培養物により治療され得る腸外疾患の例には、虫垂炎、自己免疫障害、多発性硬化症、関節リウマチ、セリアック病、糖尿病性胃疾患に関連する小腸または胃の過剰増殖、臓器移植、歯周疾患、泌尿生殖器疾患（膣、尿道および会陰部）、手術関連外傷、手術誘発転移性疾患、敗血症、体重減少、食欲不振、発熱抑制、悪液質、創傷治癒、潰瘍、腸バリア機能、アレルギー、喘息、呼吸器障害、ライノウイルス関連疾患（例えば、中耳炎、副鼻腔炎、喘息および肺疾患）、肝疾患（例えば、肝性脳症）、便秘、栄養障害、表皮障害、乾癬、炭疽および／または尋常性ざ瘡が含まれるが、これらに限定されない［米国特許出願公開第２００３０１１３３０６号の実施例５〜８；Ｒｏｌｆｅ（２０００）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ、１３０：３９６Ｓ〜４０２Ｓ；および背景の節を参照］。
【００７８】
投与されるプロバイオティック微生物の典型的な濃度範囲は、本発明のこの局面によれば、１日あたり１０３個〜１０１３個の細胞である。好ましくは、１日あたり少なくとも約１０６個の細胞、少なくとも約１０７個の細胞、少なくとも約１０１０個の細胞が、プロバイオティック物の投与において使用される（米国特許第６２２１３５０号および同第６４１０３０５号を参照）。しかしながら、当然、投与される細菌の数は、対象の大きさ、障害のタイプおよび症状の重症度をはじめとする数多くの要因に従って変化する。
【００７９】
本発明の細菌培養物は栄養学的組成物（例えば、食料品、食品添加物または飼料添加物）に配合することができる。例えば、本発明の細菌株は発酵乳製品（すなわち、栄養補助食品）（例えば、米国特許第６１５６３２０号に記載される発酵乳製品など）に含ませることができる。
【００８０】
代替として、本発明の細菌株は医薬組成物に配合することができ、この場合、本発明の細菌株は、意図された使用に従って選択される、好ましくは経口または経腸投与経路のための医薬的に許容され得るキャリアと混合される。
【００８１】
本明細書中において、用語「有効成分」は、生物学的効果を説明することができる細菌調製物を示す。
【００８２】
本明細書中で使用される「医薬組成物」は、本明細書中に記載される有効成分の１つまたは複数と、他の化学的成分（例えば、生理学的に好適なキャリアおよび賦形剤）との調製物を示す。医薬組成物の目的は、生物に対する化合物の投与を容易にすることである。
【００８３】
以降、表現「生理学的に許容され得るキャリア」および表現「医薬的に許容され得るキャリア」は交換可能に使用することができ、生物に対する著しい刺激を生じさせず、かつ、投与された化合物の生物学的活性および生物学的性質を阻害しないキャリアまたは希釈剤を示す。佐剤がこれらの表現に含まれる。医薬的に許容され得るキャリアに含まれる成分の１つが、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、すなわち、有機媒体および水性媒体の両方において広範囲の溶解性を有する生体適合性ポリマーであり得る。
【００８４】
本明細書中において、用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが含まれる。
【００８５】
薬物の配合および投与のための技術が“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）（これは参考として本明細書中に組み込まれる）に見出され得る。
【００８６】
キャリアに加えて、本発明の医薬組成物または栄養学的組成物はまた、コロニー形成キャリア、細菌株の生存能を維持するための配合物（例えば、植物抽出物の揮発性分画物、米国特許第６５００４２３号を参照のこと）、栄養物、抗生物質、抗真菌剤、抗酸化剤、植物抽出物、緩衝剤、着色剤、矯味矯臭剤、ビタミンおよびミネラルを含むことができ、これらは、意図された使用および用いられる投与経路に従って選択される。
【００８７】
コロニー形成キャリア：本発明の組成物は、プロバイオティック微生物を大腸または胃腸管の他の領域に輸送するコロニー形成キャリアを含むことができる。典型的には、このようなキャリアは、アミロース、イヌリン、ペプチン、グアールガム、キトサン、デキストラン、シクロデキストリン、アルギン酸塩およびコンドロイチン硫酸などの糖類である［ＣｈｏｕｒａｓｉａおよびＪａｉｎ（２００３）、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｓｃｉ．、６：３３〜６６］。
【００８８】
好ましくは、修飾型および／または非修飾型の抵抗性デンプンがコロニー形成キャリアとして使用される（米国特許第６２２１３５０号を参照のこと）。
【００８９】
表現「抵抗性デンプン」は、Ｂｒｏｗｎ、ＭｃＮａｕｇｈｔおよびＭｏｌｏｎｅｙ（１９９５）、Ｆｏｏｄ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ、４７：２７２〜２７５において定義されるような、ＲＳ１、ＲＳ２、ＲＳ３およびＲＳ４として定義されるデンプンの形態である。典型的には、抵抗性デンプンは大腸に達するまでは本質的には分解されないので、抵抗性デンプンがプロバイオティック組成物において使用される。従って、抵抗性デンプンは、プロバイオティック微生物が大腸に達すると、プロバイオティック微生物による発酵のための直ちに利用可能な基質を提供する。好ましくは、抵抗性デンプンは高アミロースデンプンであり、これには、限定されないが、アミロース含有量が５０％ｗ／ｗ以上（特に８０％ｗ／ｗ以上）であるトウモロコシデンプン、アミロース含有量が２７％ｗ／ｗ以上であるコメデンプンおよびコムギデンプンが含まれ、また、５０％以上のアミロース含有量および強化された抵抗性デンプン含有量を有する特定の粒状サイズ範囲のデンプンが含まれる。これらのデンプンには、トウモロコシ、オオムギ、コムギおよびマメ科植物が含まれる。バナナまたは他の果実タイプ（すなわち、ジャガイモなどの塊茎）などの供給源に由来する他の形態の抵抗性デンプン、およびその混合物または組合せもまた本発明に従って使用することができる。
【００９０】
そのようなデンプンを、微生物と抵抗性デンプンとの間での結合適合性を強化するために、顆粒および／または顆粒表面の荷電、密度または疎水性を変更することなどによって化学的に修飾することが好都合であり得ることが理解される。エーテル化、エステル化および酸性化などの化学的修飾がこの分野では広く知られており、これらは、デンプンを修飾するために利用することができる。あるいは、様々な修飾を、米国特許第６２２１３５０号などに記載されるように物理的または酵素的に誘導することができる。
【００９１】
コロニー形成キャリアはまた、オリゴ糖であり得る。オリゴ糖は、胃腸管におけるプロバイオティック微生物の数を増大させることが知られている。コロニー形成キャリアとして使用することができる市販のオリゴ糖の例には、フルクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、マルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、ゲンチオオリゴ糖、キシロオリゴ糖、パラチノースオリゴ糖、ダイズオリゴ糖（ラフィノースおよびスタキオースを含む）、キトオリゴ糖、アガロオリゴ糖、ネオアガロオリゴ糖、α−グルコオリゴ糖、β−グルコオリゴ糖、シクロイヌロオリゴ糖、グリコシルスクロース、ラクツロース、ラクトスクロースおよびキシルスクロースが含まれるが、これらに限定されない。
【００９２】
オリゴ糖は約０．０１％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）の濃度で組成物において使用することができる。好ましくは、オリゴ糖の濃度は約０．０５％〜５％である。
【００９３】
好ましくは、デンプンおよびオリゴ糖の組合せが本発明のこの局面の定着用因子として使用することができる。
【００９４】
抗生物質：本発明の組成物は、好ましくは０．１μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬから選択される範囲でナリジクス酸を含むことができる。
【００９５】
抗真菌剤：本発明の組成物は治療効果的な量の抗真菌剤を含むことができる。利用することができる典型的な抗真菌剤には、クロトリマゾール、フルコナゾール、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、ナイスタチン、テルビナフィン、テルコナゾールおよびチオコナゾールなどが含まれるが、これらに限定されない。
【００９６】
抗酸化剤、緩衝剤、植物抽出物、着色剤、矯味矯臭剤、ビタミンおよびミネラル：本発明の組成物は、抗酸化剤、緩衝剤、植物抽出物および他の薬剤（例えば、着色剤、矯味矯臭剤、ビタミンまたはミネラルなど）を含むことができる。例えば、本発明の組成物は下記ミネラルの１つまたは複数を含むことができる：クエン酸カルシウム（１５ｍｇ〜３５０ｍｇ）；グルコン酸カリウム（５ｍｇ〜１５０ｍｇ）；クエン酸マグネシウム（５ｍｇ〜１５ｍｇ）；およびピコリン酸クロム（５μｇ〜２００μｇ）。加えて、様々な塩を利用することができ、これらには、クエン酸カルシウム、グルコン酸カリウム、クエン酸マグネシウムおよびピコリン酸クロムが含まれる。様々な化学物質が、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．（Ｇａｒｄｅｎａ、Ｃａｌｉｆ．）、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）、Ｓｅｌｔｚｅｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）およびＪａｒｃｈｅｍ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｗａｒｋ、Ｎ．Ｊ．）から市販されている。本発明に従って使用することができる植物抽出物の例には、ＦＤＡにより承認されているカモミル、センダングサ、オトギリソウ、ジンジャー、および他の承認された植物抽出物が含まれるが、これらに限定されない［総説については、Ｏ’Ｈａｒａ  Ｍ、Ｋｉｅｆｅｒ  Ｄ、Ｆａｒｒｅｌｌ  Ｋ、Ｋｅｍｐｅｒ  Ｋ、Ａｒｃｈ  Ｆａｍ  Ｍｅｄ．（１９９８）１１月−１２月、７（６）：５２３〜３６；Ｍｏｄｅｓｔｏ  Ａ、Ｌｉｍａ  ＫＣ、ｄｅ  Ｕｚｅｄａ  Ｍ、ＡＳＤＣ  Ｊ  Ｄｅｎｔ  Ｃｈｉｌｄ．（２０００）９月−１０月、６７（５）：３３８〜４４、３０２；Ｌｅｅ  ＫＧ、Ｓｈｉｂａｍｏｔｏ  Ｔ、Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．（２００２）８月１４日、５０（１７）：４９４７〜５２を参照のこと］。
【００９７】
増粘剤：増粘剤を組成物に加えることができる（例えば、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールまたはカルボキシメチルセルロースなど）。
【００９８】
キャリア：本発明の組成物の活性な薬剤（例えば、細菌細胞）は、組成物が投与される生物種の組織と生理学的に適合し得る（すなわち、ヒトの摂取または動物の摂取のために好適である）キャリアと組み合わされる。本発明のこの局面によるキャリアは、錠剤形態、カプセル形態または粉末化形態に配合するための固体に基づく乾燥物であり得る。あるいは、キャリアは、液体形態またはゲル形態への配合のための液体またはゲル型物質であり得る。キャリアの具体的なタイプ、ならびに最終的な配合は、部分的には、選択された投与経路に依存する。
【００９９】
乾燥配合物のための典型的なキャリアには、アルギン酸塩（例えば、アルギン酸カルシウム）、トレハロース、マルトデキストリン、コメ粉、微結晶セルロース（ＭＣＣ）、ステアリン酸マグネシウム、イノシトール、フルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、グルコオリゴ糖（ＧＯＳ）、デキストロースおよびスクロースなどが含まれるが、これらに限定されない。組成物が乾燥状態であり、組成物を固まらせることができる（すなわち、成分の胞子、塩、粉末およびオイルの接着を引き起こし得る）蒸発油を含む場合、成分を分配し、かつ固化を妨げる乾燥フィラーを含むことが好まれる。例示的な固化防止剤には、ＭＣＣ、タルク、珪藻土、非晶質シリカ、ゼラチン、サッカロース、脱脂粉乳およびデンプンなどが含まれ、これらは典型的には重量比で約１％〜９５％の量で加えられる。乾燥配合物はその後に再水和される（例えば、液体配合物）か、または乾燥状態（例えば、咀嚼オブラート、ペレットまたは錠剤）で与えられるので、乾燥配合物が、最初に水和された配合物よりも好まれることが理解される。乾燥配合物（例えば、粉末）は、市販の食品（例えば、液体の処方物、裏ごし食品または飲料水供給物）を補うために加えることができる。
【０１００】
好適な液体キャリアまたはゲル系キャリアには、水および生理学的な塩溶液；尿素；アルコールおよび誘導体（例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール）；グリコール（例えば、エチレングリコールおよびプロピレングリコールなど）が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、水系キャリアは中性のｐＨ値（すなわち、ｐＨ７．０）を有する。
【０１０１】
保存剤もまた、キャリアに含められることがあり、保存剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコールおよびエチレンジアミン四酢酸塩が含まれる。本発明の組成物はまた、グリセロールまたはポリエチレングリコール（好ましい分子量はＭＷ＝８００〜２００００である）などの可塑剤を含むことができる。キャリアの組成は、有効成分の薬理学的活性または本発明の細菌株の生存能力を著しく妨害しない限り変化させることができる。本発明のこの局面に従って使用することができる他のタイプのキャリアが本明細書中下記に記載される。
【０１０２】
栄養補助物：本発明の組成物の栄養補助物成分には、ビタミン、ミネラル、必須アミノ酸および非必須アミノ酸、炭水化物、脂質、食品および食事補助物などをはじめとするこの分野で広く知られている様々な栄養学的因子のいずれかが含まれ得る。従って、本発明の組成物は、繊維、酵素および他の栄養素を含むことができる。好ましい繊維には、オオバコ種子、米ぬか、オートブラン、トウモロコシブラン、ふすまおよび果実繊維などが含まれるが、これらに限定されない。食事性酵素および補助的酵素（例えば、ラクターゼ、アミラーゼ、グルカナーゼおよびカタラーゼなど）もまた含めることができる。本発明の組成物において使用されるビタミンには、ビタミンＢ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、葉酸、ビタミンＫおよびナイアシンなどが含まれる。典型的なビタミンは、毎日の摂取のために、かつ、１日あたりの推奨量（ＲＤＡ）で勧められるビタミンである。
【０１０３】
本発明の医薬組成物は、意図される用途に応じて配合されることができる。伝統的な配合技術の総説は、例えば「Ｔｈｅ  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」（Ｌａｃｈｍａｎ  Ｌ．ら編、１９８６）またはＬａｕｌｕｎｄ（１９９４）に見出すことができる。
【０１０４】
好ましくは、本発明の組成物は経腸投与のために配合される。
【０１０５】
本明細書中で使用される表現「経腸投与」は、胃腸管の任意の部分を介する薬学的作用因の投与（例えば、直腸投与、結腸投与、腸管投与（近位または遠位）および胃投与など）を示す。
【０１０６】
経口投与の場合、化合物は、活性な化合物を、この分野で十分に知られている薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせることによって容易に配合することができる。そのようなキャリアにより、本発明の化合物は、患者によって経口摂取される錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー剤、懸濁物などとして配合することが可能になる。経口使用される薬学的調製物は、錠剤または糖衣錠コアを得るために、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し、そして所望する場合には好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製することができる。好適な賦形剤は、具体的には、アルギン酸塩（例えば、アルギン酸カルシウム）、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に受容可能なポリマーである。所望する場合には、架橋型ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤を加えることができる。
【０１０７】
糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有し得る。色素または顔料が、活性な化合物の量を明らかにするために、または活性な化合物の量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに添加され得る。
【０１０８】
経口使用され得る医薬組成物には、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセル、ならびにゼラチンおよび可塑剤（グリセロールまたはソルビトールなど）から作製された軟密閉カプセルが含まれる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤（ラクトースなど）、結合剤（デンプンなど）、滑剤（タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）および場合により安定化剤と混合された有効成分を含有し得る。軟カプセルでは、有効成分を好適な液体（脂肪油、流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁させることができる。さらに、安定化剤を加えることができる。経口投与される配合物はすべて、選ばれた投与経路に好適な投薬形態でなければならない。
【０１０９】
本発明の組成物は腸溶性被覆された徐放性のカプセルまたは錠剤中に包入されることができることは理解されるであろう。腸溶性被覆は、カプセル／錠剤が胃腸管を通過して小腸に到達するまでの間、無傷で（即ち溶解せずに）あることを可能にする。
【０１１０】
口内投与の場合、組成物は、従来の様式で配合された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。
【０１１１】
生きた細菌細胞の非経口投与の多数の例がこの分野で公知である（例えば、Ｔｊｕｖａｊｅｖ（２００１）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７４（１−３）：３１３−５．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２５：２１８−２５；Ｓｈｅｉｌ（２００４）Ｇｕｔ  ５３（５）：６９４−７００；およびＭａｔｓｕｚａｋｉ（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７８（１）：６７−７３参照）。本発明の細菌細胞は、免疫応答を調節するために弱毒化された形態で投与されることもできることは理解されるであろう（Ｍａｔｓｕｚａｋｉ（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７８（１）：６７−７３）。
【０１１２】
本発明の調製物はまた、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの従来の座薬基剤を使用して、座薬または停留浣腸剤などの直腸用組成物に配合することができる。
【０１１３】
生殖器適用のための好適な配合は、溶液を含む。
【０１１４】
本発明の医薬組成物は、この分野で十分に知られている様々なプロセスによって、例えば、混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥の従来のプロセスによって製造することができる。
【０１１５】
膣投与のために好適な配合物は、適切であることがこの分野では知られているような膣坐薬、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、ゼリー、フォームまたはスプレー剤、あるいは水性または油性の懸濁物、溶液またはエマルジョン（すなわち、液体配合物）、あるいは、キャリアを含有するフィルムとして提供され得る（詳しくは米国特許第５７５６６８１号に記載される）。
【０１１６】
膣への適用のために好適な組成物が、米国特許第２１４９２４０号、同第２３３０８４６号、同第２４３６１８４号、同第２４６７８８４号、同第２５４１１０３号、同第２６２３８３９号、同第２６２３８４１号、同第３０６２７１５号、同第３０６７７４３号、同第３１０８０４３号、同第３１７４９００号、同第３２４４５８９号、同第４０９３７３０号、同第４１８７２８６号、同第４２８３３２５号、同第４３２１２７７号、同第４３６８１８６号、同第４３７１５１８号、同第４３８９３３０号、同第４４１５５８５号、同第４５５１１４８号、同第４９９９３４２号、同第５０１３５４４号、同第５２２７１６０号、同第５２２９４２３号、同第５３１４９１７号、同第５３８０５２３号および同第５３８７６１１号に開示される。
【０１１７】
経尿道投与のために、組成物は、１つまたは複数の選択されたキャリア、賦形剤（例えば、水、シリコーン、ワックス、ワセリン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、プロピレングリコール（ＰＧ）、リポソーム、糖（例えば、マンニトールおよびラクトースなど）および／または様々な他の物質など）をポリエチレングリコールおよびその誘導体とともに含有する。医薬組成物は１つまたは複数の経尿道浸透促進剤（すなわち、選択された薬物が尿道膜を通り抜ける速度を増大させるように作用する化合物）を含有することが好まれる。好適な浸透促進剤の例には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、デシルメチルスルホキシド、ポリエチレングリコールモノラウラート（ＰＥＧＭＬ）、グリセロールモノラウラート、レシチン、１−置換アザシクロヘプタン−２−オン（特に、１−ｎ−ドデシルシクラザ−シクロヘプタン−２−オン［これはＡｚｏｎｅＲＴＭの商標でＮｅｌｓｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏ．（Ｉｒｖｉｎｅ、Ｃａｌｉｆ．）から入手可能である］、ＳＥＰＡＲＴＭ［これはＭａｃｒｏｃｈｅｍ  Ｃｏ．（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）から入手可能である］）、アルコール（例えば、エタノール）、界面活性剤（これには、例えば、ＴｅｒｇｉｔｏｌＲＴＭ、Ｎｏｎｏｘｙｎｏｌ−９ＲＴＭおよびＴＷＥＥＮ−８０ＲＴＭが含まれる）、および低級アルカノール（例えば、エタノールなど）が含まれる。ＷＯ９１／１６０２１に開示されるように、薬剤の経尿道投与は多数の異なる方法で行うことができる。例えば、薬剤を、柔軟なチューブ、スクイーズボトル、ポンプまたはエアロゾルスプレーから尿道内に導入することができる。薬剤はまた、尿道内で吸収、融解または生体侵食される被覆物、ペレットまたは坐薬に含有させることができる。特定の実施形態において、薬剤は陰茎挿入体の外側表面における被覆物に含まれる。
【０１１８】
本発明の配合物は、細菌の生存能を維持するように選択される。しかしながら、弱毒化された細菌が望まれる場合、本発明の配合物はより広い範囲から選択されることができる。
【０１１９】
本発明に関連した使用のために好適な医薬組成物には、有効成分が、意図された目的を達成するために効果的な量で含有される組成物が含まれる。より具体的には、治療効果的な量は、治療されている対象の疾患の症状を防止、軽減または改善するために、あるいは、治療されている対象の生存を延ばすために効果的な有効成分の量を意味する。
【０１２０】
治療効果的な量の決定は十分に当業者の範囲内である。
【０１２１】
典型的には、本発明の細菌種（すなわち、有効成分）は、最終組成物の１重量％〜９０重量％（より好ましくは５重量％〜９０重量％、さらにより好ましくは１０重量％〜９０重量％）を構成し、なおさらに好ましくは、投与に好適な配合物に含有される重量比で１５％〜８８％を構成する。あるいは、本発明の組成物は組成物の１回の服用について少なくとも１０６個（より好ましくは少なくとも１０８個、さらにより好ましくは少なくとも１０１０個）の生細菌を含有することができる。
【０１２２】
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、インビトロ、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手法によって明らかにすることができる（下記の実施例の節の実施例１〜実施例４を参照のこと）。これらのインビトロアッセイおよび細胞培養アッセイならびに動物研究から得られたデータは、ヒトへの使用のための投薬量範囲を定める際に使用することができる。投薬量は、用いられる投薬形態物および利用される投与経路に依存して変化し得る。正確な配合、投与経路および投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選ぶことができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ他、１９７５、“Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”（第１章、１頁）を参照のこと）。
【０１２３】
治療される状態の重篤度および応答性に依存して、投薬は単回投与または多回投与が可能であり、処置の経過が、数日から数週間まで、あるいは、治癒が達成されるまで、または、疾患状態の縮小が達成されるまで続く。
【０１２４】
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、治療されている対象、苦痛の重篤度、投与様式、主治医の判断などに依存する。
【０１２５】
適合し得る医薬用キャリアに配合された本発明の調製物を含む組成物はまた、適応状態の治療のために調製し、適切な容器に入れ、表示することができる。
【０１２６】
本発明の組成物は、所望される場合には、活性成分を含有する一つ以上の単位投薬形態物を含有し得る、ＦＤＡ承認キットなどのパックまたはディスペンサーデバイスで提供され得る。パックは、例えば、金属箔またはプラスチック箔を含むことができ、例えば、ブリスターパックなどである。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が添付され得る。パックまたはディスペンサーにはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局により定められた形式で容器に付けられた通知が伴い得る。この場合、そのような通知は、組成物の形態またはヒトもしくは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物についての米国食品医薬品局により承認されたラベル書きであり得るか、または承認された製品添付文書であり得る。
【０１２７】
本発明の細菌が、製品製造の条件（例えば、食品産業の有害な条件）、製品（医薬組成物、食品添加物、飼料のいずれか）の貯蔵寿命、および、胃腸管の通過に耐えることができることを確実にするために、細菌細胞は好ましくはカプセル化される。
【０１２８】
生きている細菌細胞をカプセル化する様々な方法がこの分野では広く知られている（例えば、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｌｌｓ  Ｉｎｃ．の特許、例えば、米国特許第６７２３３５８号などを参照）。例えば、アルギン酸塩およびＨｉ−Ｍａｉｚｅ（商標）デンプンによるマイクロカプセル化、その後の凍結乾燥が、乳製品における細菌細胞の貯蔵寿命を延ばすことにおいて成功していることが判明している［例えば、Ｋａｉｌａｓａｐａｔｈｙ他、Ｃｕｒｒ  Ｉｓｓｕｅｓ  Ｉｎｔｅｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２００２（Ｓｅｐ）、３（２）：３９〜４９を参照］。代替として、生存可能なプロバイオティック物をゴマ油エマルションへの封入もまた使用することができる［例えば、Ｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．、８６：４２４〜４２８を参照］。
【０１２９】
本明細書中上記で述べられたように、本発明のプロバイオティック組成物は、この分野では広く知られている方法を使用して動物に与えることができる。
【０１３０】
典型的には、プロバイオティック組成物は、飼料食に加えられる飼料添加物を介して動物の胃腸管に導入される。代替となる投与方法には、液体摂取、ペーストまたはゲルの摂取、ボール（ｂｏｌｅ）、粉末を動物の体表面に散布することなどがある。
【０１３１】
プロバイオティック細菌細胞に加えて、飼料添加物は、例えば、キャリア物質（例えば、石灰石およびあらびき小麦粉など）を含むことができる（米国特許第６４１０３０５号を参照のこと）。飼料添加物は、動物飼料１トンあたり０．０１〜１０ポンド（好ましくは約０．５〜２．５ポンド）の添加物の割合で動物の通常の規定食に加えることができる。
【０１３２】
飼料添加物は約０．３重量％〜約２０重量％のプロバイオティック細菌細胞を含有することができる。好ましくは、飼料添加物は約７重量％〜１５重量％のプロバイオティックプレミックスを含有し、最も好ましくは約１０重量％〜１３重量％のプロバイオティックプレミックスを含有する。
【０１３３】
さらに当然のことながら、本発明のプロバイオティック微生物は腸の上皮に接着しなくてもよい。従って、反復投薬が行われない場合、細菌は、およそ３〜５日の最大期間にわたって胃腸管に留まったままであり、一時的なフローラであると見なされる（図３ａ〜３ｄを参照）。本発明の菌株は、胃腸クリアランス時間が比較的速く、胃腸上皮に接着することができないために、例えば、免疫低下個体における菌血症のその後の発生を予防するという利点を有する。実施例の節の実施例６において示されるような便流出（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）アッセイを、処置された対象からの細菌の排除を評価するために使用することができる。
【０１３４】
本発明の細菌株および／または組成物は、特定の障害（例えば、上記のような障害など）を処置するために特定された製造物に含めることができる。典型的には、製造物は、細菌細胞または細菌細胞を含む組成物の形態であるか、または、包装材料との組合せでの包装物の形態である。包装材料は、細菌の生存能力を保持するように選択され、また、例えば、包装物の成分の使用のための標識または説明書を含む。説明書により、本発明の方法または組成物について本明細書中に記載されるような包装されている成分の意図された使用、内容物（例えば、属、種、菌株表示）、保存期限終了時における生細菌の最少数、適正な貯蔵条件、および、消費者情報に対する企業の契約詳細が示される。標識はまた、製造物の鮮度に関連する情報を提供し得る。この情報には、製造日、「販売」期限または「有効期限」が含まれる。「販売」期限は、そのような日時までに製造物が消費者に販売されていなければならないことを指定する。「有効」期限は、そのときまでに製造物が供給業者または消費者によって処理されなければならないことを指定する。あるいは、または、さらに、「積極的な標識表示」を使用することができる。例えば、米国特許第４２９２９１６号、同第５０５３３３９号、同第５４４６７０５号および同第５６３３８３５号には、傷みやすい製造物の保存期限をモニターするための色変化デバイスが記載される。このようなデバイスは、反応が開始するように反応層を物理的に接触させることによって起動させられ、この作用は好都合には包装時に行うことができるだけである。この方法は、流通網全体を通して鮮度を失う食品の劣化をモニターするために好適である。米国特許第５５５５２２３号には、製造したまさにそのときにタイマークロックを設定する工程を含む、包装に対する計時インジケーターを取り付けるためのプロセスが記載される。
【０１３５】
意図された使用に依存して、製造物は、必要に応じて、下記成分の１つまたは複数を、一体として、または別個の包装で含有することができる：コロニー形成キャリア、矯味矯臭剤、キャリア、および同様な成分。例えば、製造物は、プロバイオティックを治療的方法における使用のために処方物と組み合わせるための説明書と一緒に、従来の液体製造物との組合せで使用するための胞子を含むことができる。
【０１３６】
本発明の細菌株はまた、医薬送達システムとして使用することができる。そのような送達システムは本質的には、乳児、高齢者、および、免疫機能が損なわれている個体を含むヒトにおける弱毒化病原体の使用よりも安全である［Ｇｒａｎｇｅｔｔｅ（２００１）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６９：１５４７〜１５５３］。
【０１３７】
本発明の細菌株はまた、この分野では広く知られている発現システムを使用して異種の発現産物を発現させるために改変することができる。この方法は、ＩＬ−１０を分泌するＬ．ｌａｃｔｉｓ株を胃内に投与されたマウスにおいて大腸炎を軽減させるために使用された［Ｓｔｅｉｄｌｅｒ（２０００）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８９：１３５２〜１３５５］。
【０１３８】
本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を示す。
【０１３９】
本発明の追加の目的、利点及び新規な特徴は、下記実施例を考察すれば、当業技術者には明らかになるであろう。なお、これら実施例は本発明を限定するものではない。さらに、先に詳述されかつ本願の特許請求の範囲の項に特許請求されている本発明の各種実施態様と側面は各々、下記実施例の実験によって支持されている。
【実施例】
【０１４０】
上記説明とともに、以下の実施例を参照して本発明を例示する。なおこれら実施例によって本発明は限定されない。
【０１４１】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学及び組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技法は文献に詳細に説明されている［例えば以下の諸文献を参照されたい。「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ    ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９年；Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｒ．Ｍ．編１９９４年「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻；Ａｕｓｕｂｅｌら著１９８９年「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，米国メリーランド州バルチモア；Ｐｅｒｂａｌ著「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，米国ニューヨーク１９８８年；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク１９９８年；米国特許の４６６６８２８号、４６８３２０２号、４８０１５３１号、５１９２６５９号及び５２７２０５７号に記載される方法；Ｃｅｌｌｉｓ，  Ｊ．Ｅ．編「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｃｏｌｉｇａｎ，  Ｊ．Ｅ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク１９９４年；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニューヨーク１９８０年；また利用可能な免疫検定法は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている。米国特許の３７９１９３２号、３８３９１５３号、３８５０７５２号、３８５０５７８号、３８５３９８７号、３８６７５１７号、３８７９２６２号、３９０１６５４号、３９３５０７４号、３９８４５３３号、３９９６３４５号、４０３４０７４号、４０９８８７６号、４８７９２１９号、５０１１７７１号及び５２８１５２１号；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」１９８４年；Ｈａｍｅｓ，  Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」１９８５年；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」１９８４年；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｒ．Ｉ．編「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」１９８６年；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９８６年；Ｐｅｒｂａｌ，  Ｂ．著「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ���ｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」１９８４年及び「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ１９９０年；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６年；なお、これらの文献類は、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである］。その外の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。本明細書に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。これらの文献中に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１４２】
背景
本研究の全体的目的は、大腸菌のＭ１７菌株（Ｍ１７）を哺乳動物供給源から集められた便サンプルにおいて検出するためのアッセイを開発することである。用いられたアプローチは、最初に、Ｍ１７の自然発生したナリジクス酸耐性変異誘導体を単離することであり、次いで、便サンプルからのこの菌株の特異的な計数および確認のための方法を開発することであった。
【０１４３】
材料
材料−化学物質の製造供給元が下記の表４に示される。
2009537138.tif 000005
【０１４４】
生物学的材料の製造供給元の詳細が下記の表５に示される。
2009537138.tif 000006
【０１４５】
使い捨て材料−使い捨て材料の製造供給元の詳細が下記の表６に示される。
2009537138.tif 000007
【０１４６】
装置−実験装置の製造供給元の詳細が下記に列記される。
【０１４７】
自動化ＤＮＡシーケンサー：Ｌｉ−Ｃｏｒ／ＮＥＮモデル４２００Ｇｌｏｂａｌ  ＩＲ２自動化ＤＮＡシーケンサー（品番９９４２−１５５）。Ｎｅｔｗｉｎｄｅｒサーバー（８０Ｇｂ記憶、サーバーソフトウエア、操作システム）を備えたデュアルレーザー／検出器（シリコンアバランシェフォトダイオード検出器を備えた、６８５ｎｍおよび７８５ｎｍのダイオードレーザー）。操作ソフトウエア：ｅ−Ｓｅｑバージョン（品番９９４２−１５４）。
【０１４８】
パルスフィールドゲル電気泳動：Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＨＥＦ  ＤＲＩＩパルスフィールドゲル電気泳動システム＋冷却装置システム（品番１７０−３７２５）。駆動モジュールを備えた１００／１２０Ｖ電気泳動セル、制御モジュール、可変速度ポンプ、フレームおよびプラットホームを伴う１４ｘ１３ｃｍの採型用スタンド、コームホルダー、１５ウエルの１．５ｍｍ厚のコーム、遮蔽キャップ、使い捨てプラグ鋳型、ならびに、１２ｆｔのＴｙｇｏｎ管。
【０１４９】
水平アガロースゲル電気泳動：Ｏｗｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍｏｄｅｌ  Ａ１  Ｇａｔｏｒ（商標）Ｌａｒｇｅ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ
ゲルサイズ：１３ｃｍ（Ｗ）ｘ２５ｃｍ
【０１５０】
Ｏｗｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍｏｄｅｌ  Ｂ１Ａ  ＥａｓｙＣａｓｔ（商標）Ｍｉｎｉ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ
ゲルサイズ：７ｃｍ（Ｗ）ｘ８ｃｍ
【０１５１】
ポリメラーゼ連鎖反応サーモサイクラー（製造者、所在地）：Ｗｈａｔｍａｎ−Ｂｉｏｍｅｔｒａ  Ｔ１、９６ウエルのプログラム可能なサーモサイクラー（品番０５０−９１）。
【０１５２】
Ｗｈａｔｍａｎ−Ｂｉｏｍｅｔｒａ  Ｔ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ、９６ウエルのプログラム可能な温度勾配サーモサイクラー（品番０５０−８０１）
【０１５３】
画像化システム：Ｓｙｎｇｅｎｅ  Ｉｎｇｅｎｉｏｕｓ画像化システム、７６８ｘ５８２ピクセルの解像度を有する８ビットモノクロム画像化カメラ、マニュアルズームレンズ、暗室＋２０×３０ｃｍのＶＵ２（３０２ｎｍ／３６５ｎｍの波長）トランスイルミネーター、ＧｅｎｅＳｎａｐ画像捕獲ソフトウエアおよびＧｅｎｅＴｏｏｌｓ画像分析ソフトウエア。
【０１５４】
実施例１
Ｍ１７大腸菌株のナリジクス酸耐性変異体の単離
実験手順
大腸菌のＭ１７菌株は、抗生物質のナリジクス酸に対して感受性であることが知られている。ヒトの臨床サンプルから単離されたほんの少数のＥ．ｃｏｌｉ菌株が、ナリジクス酸および他のキノロン系抗生物質に対して耐性であることが知られている（４、８、９）。ナリジクス酸耐性（これはｇｙｒＡまたはｐａｒＣにおける変異に関連する）がインビトロにおいて自然発生し、臨床サンプルでは低い頻度で観測されるだけであるので、ナリジクス酸耐性は、Ｍ１７菌株を特徴づけるための簡便な手段として十分に適する。
【０１５５】
Ｍ１７のナリジクス酸耐性変異誘導体を単離するために、Ｍ１７のＥ．ｃｏｌｉ培養物をＬ培地において３７℃で１６時間成長させ、その後、培養物の０．１ｍＬずつを、１５μｇ／ｍＬのナリジクス酸が補充されたＬ寒天の表面に広げた。その後、寒天平板３７℃で１６時間インキュベートした。その後、２個のコロニー（Ｍ１７  １５−１およびＭ１７  １５−２）を選択し、１５μｇ／ｍＬのナリジクス酸が補充されたＬ寒天に画線し、また、１５μｇ／ｍＬのナリジクス酸を含む５ｍＬのＬ培地に接種し、３７℃で１６時間インキュベートした。その後、Ｌ培地培養物の０．１ｍＬずつを、５０μｇ／ｍＬのナリジクス酸が補充されたＬ寒天の表面に広げた。合計で４個のコロニーをそれぞれの元の親菌（Ｍ１７  １５−１またはＭ１７  １５−２）から選び、これらのコロニーを、Ｍ１７  ５０−１〜Ｍ１７  ５０−４（これらはＭ１７  １５−１親菌に由来する）、および、Ｍ１７  ５０−５〜Ｍ１７  ５０−８（これらはＭ１７  １５−２親菌に由来する）とラベルを付けた。その後、Ｍ１７  ５０−１〜Ｍ１７  ５０−８の各コロニーを、５０μｇ／ｍＬのナリジクス酸を含むＬ寒天に画線し、また、５０μｇ／ｍＬのナリジクス酸が補充されたＬ培地に接種し、３７℃で１６時間インキュベートした。その後、それぞれのＬ培地培養物の一部（０．１ｍＬ）を、１００μｇ／ｍＬのナリジクス酸が補充されたＬ寒天平板の表面に広げた。平板を３７℃で一晩インキュベートした。それぞれの親菌株（Ｍ１７  ５０−１〜Ｍ１７  ５０−８）に由来する、１００μｇ／ｍＬのナリジクス酸を含むＬ寒天からの１個のコロニーを選び、Ｍ１７  １００−１〜Ｍ１７  １００−８とラベルを付け、１００μｇ／ｍＬのナリジクス酸が補充されたＬ寒天に画線し、３７℃で１６時間成長させた。
【０１５６】
ナリジクス酸耐性Ｍ１７誘導体の冷凍庫ストック物の調製。Ｍ１７  １５−１、Ｍ１７  １５−２、Ｍ１７  ５０−１〜Ｍ１７  ５０−８、および、Ｍ１７  １００−１〜Ｍ１７  １００−８に由来する単一コロニーを、適量のナリジクス酸（１５μ／ｍＬ、５０μ／ｍＬまたは１００μ／ｍＬ）が補充されたＬ培地において成長させ、０．５の光学濃度（６００ｎｍ）に成長させた。それぞれの培養物から、０．７ｍＬを無菌の極低温保存用チューブに取り出し、０．３ｍＬの無菌の５０％グリセロールと混合し、室温で４５分間ゆすった。その後、グリセロール処理された細胞を−８０℃で貯蔵した。
【０１５７】
結果
親のナリジクス酸感受性Ｍ１７菌株から、１５μｇ／ｍＬのナリジクス酸に対して耐性である２個の単一コロニーを選んだ。その後、５０μｇ／ｍＬのナリジクス酸に対して耐性である一連の４個の誘導体（それぞれがＭ１７  １５−１親菌株およびＭ１７  １５−２親菌株に由来する）を単離した。その後、１００μｇ／ｍＬのナリジクス酸に対して耐性である１個の誘導体をＭ１７  ５０−１菌株〜Ｍ１７  ５０−８菌株のそれぞれから得た。その後、下記の表７に示されるそれぞれのＭ１７ナリジクス酸耐性誘導体の１ｍＬアリコートを長期保存のために−８０℃で凍結した。
2009537138.tif 000008
【０１５８】
実施例２
本発明のＭ１７ＳＮＡＲ菌株の特徴づけ
一連の分子遺伝学および生化学的アッセイを、本発明の菌株を特徴づけるために行った。
【０１５９】
実験手順
ナリジクス酸耐性Ｍ１７誘導体のパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）確認：ＰＦＧＥを、Ｍ１７のナリジクス酸耐性誘導体が実際にＭ１７誘導体であることを確認するために行った。ＰＦＧＥを、ＣＤＣプロトコルの「パルスフィールドゲル電気泳動による大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の分子的亜型決定のための実験プロトコル」を使用して行った。ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｐｕｌｓｅｎｅｔ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ｈｔｍｌ、疾病対策予防センター、パルスフィールドゲル電気泳動による食品媒介細菌病原体の標準化された分子的亜型決定：マニュアル（Ａｔｌａｎｔａ：国立感染病センター；１９９６年（２０００年更新））を参照のこと。簡単に記載すると、Ｌ寒天平板がＭ１７親菌株の凍結されたストック培養物から画線され、Ｍ１７  １００−１〜Ｍ１７  １００−８のナリジクス酸耐性誘導体を、Ｌ寒天、または、１０μｇ／ｍＬのナリジクス酸が補充されたＬ寒天に画線し、３７℃で１６時間成長させた。無菌の微生物学用ループを使用して、約２０μＬの細胞をそれぞれの平板から１ｍＬの懸濁緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を含有するチューブに移した。懸濁物を、さらなる細胞または懸濁緩衝液を必要に応じて使用して、１．３５の６１０ｎｍでの吸光度値に調節した。その後、それぞれの菌株からの細胞懸濁物（０．４ｍＬ）を２０μＬのプロテイナーゼＫ（ストック濃度、２０ｍｇ／ｍＬ）と混合し、数回反転させた。その後、０．４ｍＬの融解されたアガロースを細胞と混合し、直ちに、ＣＨＥＦ  ＩＩ−ＤＲ  ＰＦＧＥ装置のプラグ鋳型に分注した。固化後、その後、プラグを、へらおよび５ｍＬの細胞溶解緩衝液［５０ｍＭ  ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％サルコシル（ラウリル硫酸ナトリウム）、ｐＨ８．０］を使用して５０ｍＬのスクリューキャップチューブに取り出した。その後、２５マイクロリットル（２５μｌ）のプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍＬのストック濃度）を加え、プラグを５４℃で２時間インキュベートした。溶解緩衝液をデカンテーションによって除き、プラグを、１０ｍＬの無菌水において旋回させることによって簡単に洗浄した。その後、水をデカンテーションし、プラグを、１０ｍＬのＴＥ緩衝液で、それぞれ１５分間、４回洗浄した。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）（ＴＥ）での最後の洗浄の後、プラグを無菌のＴＥ緩衝液において４℃で保存した。
【０１６０】
プラグの２ｍｍのスライス片を無菌の１．５ｍＬ微量遠心分離チューブに入れ、０．１ｍＬの制限緩衝液を加えることによって制限消化を行った。ＸｂａＩ制限酵素のための制限緩衝液は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭジチオスレイトールを含んでいた（ｐＨ７．９）。３７℃での１５分のインキュベートの後、制限緩衝液をデカンテーションし、０．１ｍＬの制限緩衝液＋３０ユニットのＸｂａＩ制限酵素を加えた。その後、サンプルを３７℃で２時間インキュベートした。インキュベート後、サンプルをデカンテーションし、０．２ｍＬの０．５ＸＴＢＥ緩衝液を加えた。
【０１６１】
分析用アガロースゲルを、０．５ＸＴＢＥにおける１％ＳＫＧアガロースのスラリーを混合し、アガロースを融解することによって注入成形した。６０℃の湯浴において冷却した後、その後、アガロースをＣＨＥＦ  ＩＩ−ＤＲゲルフォームに注ぎ、コームを融解ゲルの中に慎重に入れた。室温での１時間の固化の後、コームを除き、制限消化されたプラグを適切なウエルに入れ、ゲルスライス片をウエルの前方に確実に押しつけ、気泡を除いた。その後、少量の融解アガロースを加えて、ウエルにおける残余領域を満たした。その後、ゲルをＣＨＥＦ  ＤＲＩＩ  ＰＦＧＥタンクに入れ、ゲルをチャンバーのゲルフレームの中に確実に入れた。その後、チャンバーを０．５ＸＴＢＥ（電気泳動用の水により０．５Ｘ濃度に希釈された、１Ｍ  Ｔｒｉｓ、１Ｍホウ酸、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）で満たし、下記の条件のもとで電気泳動した。
初期Ａ時間：２．２ｓ
最終Ａ時間：５４．２ｓ
開始比：１．０
電圧：２００Ｖ（６Ｖ／Ｃｍ）
泳動時間：２２ｈｒ
【０１６２】
電気泳動後、ゲルを０．０２μｇ／ｍｌの臭化エチジウムの溶液において１５分間染色し、水において３０分間脱染色した。染色されたＤＮＡを、ゲルを３０２ｎｍのＵＶライトボックスに置くことによって可視化し、ＣＣＤカメラで画像取得した。
【０１６３】
増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）：ＡＦＬＰ反応をＬｉ−Ｃｏｒ，Ｉｎｃ．の文献＃９８８−０７３０４（Ｒｅｖ．１）に従って行った。テンプレートＤＮＡを標準的な方法によって調製し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）に再溶解した。ゲノムＤＮＡを標準的な方法（５）によって細菌株から抽出した。ＤＮＡサンプルを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）に溶解した。それぞれのサンプルからの合計で１００ｎｇのＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＭｓｅＩにより消化した。その後、二本鎖の合成ＤＮＡアダプター（これは、ＥｃｏＲＩおよびＭｓｅＩの突出部に相補的な短い一本鎖配列を含有する）を消化されたＤＮＡフラグメントに連結した。その後、連結されたアダプターを有するフラグメントを希釈し、アダプターについて特異的なＰＣＲプライマーを使用する前増幅反応においてＰＣＲによって増幅した。その後、この増幅されたフラグメントは、蛍光標識されたプライマーが未標識プライマーとともに使用される選択的増幅のためのテンプレートとして役立った。選択的増幅では、さらに２つの塩基を３’末端に有するアダプター配列に対して相補的であるプライマーが使用される。これにより、元のＥｃｏＲＩ部位またはＭｓｅＩ部位にすぐに隣接する２つの塩基がプライマーの３’塩基に対して相補的であるＤＮＡフラグメントが選択的に増幅された（標識される）。最後に、標識された選択的増幅生成物をＬｉ−Ｃｏｒ／ＮＥＮ４２００グローバルアナライザー（自動化ＤＮＡシーケンサー）での変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離した。
【０１６４】
結果
元のＭ１７親菌株に対するＭ１７  １００−１〜Ｍ１７  １００−８の各菌株の遺伝学的関係を確認するために、ＰＦＧＥ分析をそれぞれの菌株および親のＭ１７菌株に対して行った。図に示されるように、Ｍ１７  １００−１〜Ｍ１７  １００−８の各誘導体はすべてが、Ｍ１７親菌株と区別不可能である。
【０１６５】
ＰＦＧＥ確認に基づいて、すべてのナリジクス酸耐性誘導体がＭ１７親菌株と遺伝学的に区別不可能である。その後、Ｍ１７親菌株およびＭ１７  １００−１〜Ｍ１７  １００−８の各誘導体菌株をバイオレットレッド胆汁寒天に画線し、ラクトース発酵について試験した。すべての菌株がラクトース陽性であった。従って、Ｍ１７  １００−８菌株を、すべてのさらなる研究のためのナリジクス酸耐性Ｍ１７誘導体として選んだ。この菌株をＭ１７ＳＮＡＲ（スクロース陽性、ナリジクス酸耐性）と称した。
【０１６６】
Ｍ１７およびＭ１７ＳＮＡＲ誘導体の遺伝学的関連性のさらなる分析をＡＦＬＰ分析によって行った。Ｍ１７親菌株、Ｍ１７ＳＮＡＲ菌株、１４の種々のＥＣＯＲ菌株（６）および２つの遺伝学的に無関係な血清型Ｏ２の菌株（ＡＯＳ１およびＡＯＳ１９）からの総ＤＮＡを、蛍光標識されたＥｃｏＲＩ−Ａプライマーおよび未標識のＭｓｅＩ−ＧＡプライマーを使用するＡＦＬＰに供した。反応生成物をゲル電気泳動によって分離し、得られた画像を使用して、バンド形成パターンを比較した。図２に示されるように、Ｍ１７およびＭ１７ＳＮＡＲに由来する溶解可能な蛍光標識されたＡＦＬＰ生成物のすべてがサイズにおいて同一であり、これに対して、種々のＥＣＯＲ菌株およびＡＯＳ菌株から生じたフラグメントパターンは、Ｍ１７およびＭ１７ＳＮＡＲと比較して、いくつかの違いを示す。従って、Ｍ１７親菌株およびＭ１７ＳＮＡＲ誘導体はＰＦＧＥおよびＡＦＬＰの両方によって区別可能である。
【０１６７】
実施例３
Ｍ１７ＳＮＡＲゲノムの特有な遺伝子形跡を特定するためのＤＮＡ配列分析
実験手順
ＤＮＡ配列分析のためのゲノムＤＮＡの調製：ＤＮＡ配列決定のために、Ｍ１７  １００−８ＳＮＡＲ単離体からの総ゲノムＤＮＡを調製した。このクローンを、１００μｇ／ｍＬのナリジクス酸を含むＬ寒天において一晩成長させた。３７℃での１６時間の成長の後、ループ１つ分の細胞を、１００μｇ／ｍＬのナリジクス酸が補充された５００ｍＬのＬ培地に移し、２００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１８時間成長させた。その後、細胞を、ＪＡ１０ローターにおいて２５０ｍＬボトルを使用し６０００ｒｐｍでの１０分間のＢｅｃｋｍａｎ  Ｊ２高速遠心分離機における遠心分離によって集めた。その後、細胞を、２ｍｇ／ｍＬのリゾチームを含む２５ｍＬの１０ｍＬ  Ｔｒｉｓ−１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）に再懸濁した。室温での１０分のインキュベーションの後、５ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫが補充された２．５ｍＬの１％ドデシル硫酸ナトリウムを加え、５０℃で９０分間インキュベートした。その後、（１０ｍＭ  ｔｒｉｓ−１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を飽和させた）２５ｍＬのフェノールを加え、ボトルを高速度で３時間ゆすった。その後、相を、ＪＡ１０ローターを用いてＢｅｃｋｍａｎ  Ｊ２高速遠心分離機８０００ｒｐｍでの１５分間の遠心分離によって分離した。その後、水相（２０ｍＬ）をビーカーに取り出し、２ｍＬの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を加え、かき混ぜながら混合した。その後、ＤＮＡを、４０ｍＬのエタノールを加えることによって沈殿させた。沈殿したＤＮＡを界面からガラス棒に巻き取り、巻き取ったＤＮＡを、７０％エタノールに数回沈めることによって洗浄した。最後に、ＤＮＡを１ｍＬの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−１ｍＭ  ＥＤＴＡに溶解した。その後、溶解したＤＮＡを、水を３回連続して交換しながら滅菌水（１リットル）に対して２時間透析した。その後、ＤＮＡを配列分析のためにＶｉｖｅｋ  Ｋａｐｕｒ博士（Ｔｈｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｅｎｔｅｒ、ミネソタ大学）に送った。
【０１６８】
ゲノム配列からのＭ１７ＳＮＡＲ特有的配列の特定：Ｍ１７ＳＮＡＲライブラリーに由来するショットガン読取りのアラインメントから得られる集められたＤＮＡ配列（コンティグ）のすべてを含有する１つのファイルをＶｉｖｅｋ  Ｋａｐｕｒ博士から得た（Ａ．Ｂｅｎｓｏｎコンピューター、Ｄ：／Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ／ＢｉｏＢａｌａｎｃｅ／Ｍ１７  Ｇｅｎｏｍｅ  ｄａｔａ￥０８１２＿０００３．ｃｏｎｔｉｇｓ．ｆａｓｔａ．ｔｘｔ）。２００を越える配列ラン（ｒｕｎ）のアラインメントから生じる個々のコンティグがファイルから得られ、これらを使用して、ｆａｓｔＡ形式でのテキストファイルを作製した。その後、ｆａｓｔＡファイルを、ＮＣＢＩのウエブサイト（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｗｂｌａｓｔ２．ｃｇｉ）において入手可能なＢＬＡＳＴ２アルゴリズム（７）を使用してＥ．ｃｏｌｉ  ＣＦＴ０７３のゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ００４４３１）に対してＢＬＡＳＴ検索した。その後、アラインメントからの座標をＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌのスプレッドシートに入力し、非アラインメントのセグメントを、ＢＬＡＳＴアラインメントをもたらさない配列セグメントの座標を特定することによって求めた。１０００塩基を越える非アラインメントのセグメントのみをさらなる分析のために検討した。
【０１６９】
アラインメントされない領域に対応するそれぞれのＭ１７ＳＮＡＲコンティグに由来するセグメントを、ミネソタ大学のＰａｔｈｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ施設から入手可能なＥｘｔｒａｃｔ  ＤＮＡプログラム（ｗｗｗ．ｐａｔｈｏｇｅｎｏｍｉｃｓ．ａｈｃ．ｕｍｎ．ｅｄｕ／ＥｘｔｒａｃｔＤｎａ．ｈｔｍｌ）を使用してコンティグファイルから得た。その後、アラインメントされないセグメントのそれぞれを、ｆａｓｔＡ形式での．ｔＥｘｔファイルを作製するために使用し、最後に、ＢＬＡＳＴｎアルゴリズム（１、２）を使用してＮＣＢＩにおけるＧｅｎＢａｎｋデータベース全体を検索するために使用した。その後、有意なアライメントをもたらさないセグメントを、Ｍ１７ＳＮＡＲに特有なゲノム配列の領域についての候補と見なした。
【０１７０】
Ｍ１７ＳＮＡＲに特有なゲノム領域を増幅するためのＰＣＲプライマーの設計：Ｍ１７ＳＮＡＲの特有なセグメントを含有するテキストファイルから、ＰＣＲプライマーを、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐパッケージ、ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｇｃｇ／）から得られるＰＲＩＭＥプログラムを使用して設計した。プライマーを設計する際に用いたパラメーターは下記の通りである：
【０１７１】
ＰＣＲプライマーは、生成物を、長さが５００塩基〜３キロ塩基の間でもたらさなければならない。
【０１７２】
ＰＣＲプライマーは特有な配列の領域の内部に位置しなければならない。
【０１７３】
ＰＣＲプライマー対は、互いに２℃の範囲内である融点を有しなければならない。
【０１７４】
それぞれの特有な領域に由来するＰＣＲプライマーは、生成物が多重化され得るように、サイズが異なる生成物を与えなければならない。可能性のあるプライマー組合せが下記の表１１に示される。
【０１７５】
ＰＣＲによるＭ１７ＳＮＡＲ特有ゲノム領域の最適化およびバリデーション：
Ｍ１７ＳＮＡＲに特異的なゲノムセグメント（Ｍ１７ＳＳＧＳ）を検出するためのＰＣＲ反応を最適化するために、候補物のリスト（下記の表１１を参照のこと）からの１つのＰＣＲプライマー組合せを、予想サイズの特異的な生成物が生じたかを明らかにするために、Ｍ１７ＳＮＡＲ染色体ＤＮＡに対して試験した。反応を、ＴＧｒａｄｉｅｎｔサーモサイクラー（Ｂｉｏｍｅｔｒａ）を使用して異なる融解温度で行った。勾配は、５９℃に中心があり、１５℃の変動が低温側および高温側にあった。反応を、１ｎｇのＭ１７ＳＮＡＲ  ＤＮＡを使用して、１ＸＰＣＲ緩衝液（２．５ｍＭのＭｇＣｌ２最終濃度を含有する）、２５０μＭのｄＮＴＰｓ、１ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、および、１μＭの各プライマーを伴う２０μＬの反応体積において行った。反応体積を、滅菌水を使用してそれぞれの反応について２０μＬにした。反応液を９５℃に２．５分間加熱し、その後、９５℃で３０秒間、融解温度（プライマー組に依存して５６℃または６３℃）で４５秒間、７２℃で４５秒間の３０サイクルに供した。３０サイクル後、反応を７２℃で５分間伸長させ、ゲル電気泳動について準備が整うまで４℃で保った。
【０１７６】
終結すると、ＰＣＲ反応液には、２μＬの負荷用色素（０．２１％ブロムフェノールブルー、０．２１％キシレンシアノール、５０％グリセロール）が補充された。その後、合計で１５μＬの反応液を、１ｎｇ／ｍＬの臭化エチジウムを含有する１Ｘ  ＴＡＥにおいて調製された０．８％アガロースゲルに負荷した。その後、ゲルを１００ボルト／Ｃｍで１．５時間電気泳動した。その後、電気泳動されたＰＣＲ生成物を、ゲルを３０２ｎｍのＵＶライトボックスに置くことによって可視化し、ＣＣＤカメラで画像取得した。
【０１７７】
結果
異なるＡＦＬＰプライマー組合せに由来するフラグメントパターンにより、Ｍ１７ＳＮＡＲが種々のＥ．ｃｏｌｉ菌株と区別され得るが、Ｍ１７ＳＮＡＲを他のＥ．ｃｏｌｉ菌株と区別するためのより単純なアプローチは、ナリジクス酸耐性（この場合、ナリジクス酸耐性の形質は、耐性の細菌を選択的に成長させるために（すなわち、ナリジクス酸の存在下において成長することができる便中のそのような細菌のみを特定するために）、次いで、それらの正体を、特異的な遺伝子試験を使用してＭ１７ＳＮＡＲとして確認するために使用される）と、ナリジクス酸耐性細菌を便サンプルから選択的に成長させ、それらの正体を、Ｍ１７親菌株およびＭ１７ＳＮＡＲ誘導体に対して特有であるＤＮＡセグメントについての遺伝子試験を使用してＭ１７ＳＮＡＲとして確認することとの組合せを使用することである。Ｍ１７およびＭ１７ＳＮＡＲに特有なＤＮＡのセグメントを特定するために、Ｍ１７ＳＮＡＲのゲノムを全ゲノムＤＮＡ配列分析に供した。ゲノムＤＮＡをＭ１７ＳＮＡＲから抽出した。ＤＮＡを続いて、異なるサイズのフラグメント長さに物理的に剪断し、３つの異なるクローンライブラリーを作製した（それぞれが異なる平均インサートサイズ（４キロ塩基、１０キロ塩基および４０キロ塩基）を有した）。その後、これらのライブラリーのそれぞれをハイスループットショットガンＤＮＡ配列分析に供し、配列の読取りを、それらの重なりに基づいて、大きい連続するＤＮＡ配列を集めた。一般的な実施であるように、ショットガンＤＮＡ配列決定の段階では、ゲノム全体のそれぞれのセグメントが、独立した重複するクローンで多数回、配列決定されるように、十分なクローンのＤＮＡ配列分析が含まれた。
【０１７８】
下記の表８に例示されるように［Ｅｗｉｎｇ，Ｂ．、Ｌ．Ｈｉｌｌｉｅｒ、Ｍ．ＷｅｎｄｌおよびＰ．Ｇｒｅｅｎ、１９９８、Ｂａｓｅ−ｃａｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔｒａｃｅｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｐｈｒｅｄ．Ｉ．Ａｃｃｕｒａｃｙ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ、第８巻（３）、１７５〜１８５］、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｍ１７ＳＮＡＲゲノムのハイスループットショットガン配列決定段階は、良好な品質スコアを有する３６２６５５３８個の塩基を表す５７４０８個の異なった高品質の「読取り」をもたらした（これはゲノムのおよそ８倍の配列重複率をもたらす）。Ｐｈｒｅｄ２０塩基の総数に基づいて、４Ｋｂゲノムライブラリーから得られる、末端が対形成する配列読取りにより、ゲノム配列のほとんどの範囲がもたらされた。１０ｋｂライブラリーおよびフォスミドライブラリーは、末端が対形成する「読取り」からのより大きい物理的連結をもたらし、連続する配列「ブロック」を集合プロセスにおいて整列および配向させることを容易にした。
2009537138.tif 000009
【０１７９】
集合作業中に、配列データ、ベクター配列が除かれ、配列がＰｈｒｅｄ品質スコア情報に基づいて品質スクリーニングされた［Ｅｗｉｎｇ  Ｂ、Ｇｒｅｅｎ  Ｐ、ｐｈｒｅｄを使用する自動化シーケンサー記録の塩基呼出し．ＩＩ．エラー確率、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、８：１８６〜１９４（１９９８）；Ｅｗｉｎｇ  Ｂ、Ｈｉｌｌｉｅｒ  Ｌ、Ｗｅｎｄｌ  Ｍ、Ｇｒｅｅｎ  Ｐ、Ｂａｓｅ−ｃａｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔｒａｃｅｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｐｈｒｅｄ．Ｉ．Ａｃｃｕｒａｃｙ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、８：１７５〜１８５（１９９８）を参照のこと］。
【０１８０】
ライブラリーから得られる配列「読取り」のすべてが最初に、相互に比較された。異なる「読取り」の配列の間におけるいくつかの一致が認められ、次いで、これらを使用して、配列を、コンティグと呼ばれる連続する配列区域にアラインメントした。独立した読取りからの配列の品質における小さい変動のために、ＤＮＡの同じセグメントの２つの異なる「読取り」が同一にならない場合がある。従って、異なるライブラリーからの十分なクローンが、それぞれの塩基の多数の重複する読取りをもたらし、その結果、それぞれの塩基が独立して確認されるようにするために配列決定される。
【０１８１】
コンティグ構築ソフトウエア（これにより、コンティグが「読取り」におけるそれぞれの塩基の「品質」に基づいて構築される）を使用して、ＤＮＡ配列を大きい連続する配列区域に最終的に構築した。配列における何らかのギャップ、不一致または曖昧な部分もまた特定された。その後、異なるコンティグに存在する対形成した「読取り」を使用することによって、コンティグを整列し、連結して、より大きいスーパーコンティグにまとめた。このアプローチを使用して、合計で４６４個のコンティグが集められた。その詳細が下記の表９に示される。全ゲノムの集合を、ＡｇｅｎｃｏｕｒｔのＬＩＭＳシステムと組み合わせてＰａｒａｃｅｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ（商標）（バージョン２．６．２）を使用して行い、一方で、Ｐａｒａｃｅｌの足場ビューアーおよびＣｏｎｓｅｄ（バージョン１３．０）を使用して、集合を完成させた。
2009537138.tif 000010
【０１８２】
特有的配列をＭ１７ＳＮＡＲ菌株において特定するための戦略：並列アプローチを、可能性のある特有的配列を特定するために使用した。
【０１８３】
４６４個の全コンティグのすべてがＦＡＳＴＡ形式（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｈｔｍｌ／ｓｅａｒｃｈ．ｈｔｍｌ）での個々のコンティグ配列の＊．ｔｘｔファイルとして電子的に提供された。コンティグ全体の対毎のＢＬＡＳＴ分析が結果的には、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＣＦＴ０７３のゲノム配列に対して行われ、続いて、アラインメントされない領域がＭ１７のコンティグから特定された。その後、これらのアラインメントされない配列を対毎のＢＬＡＳＴにおいて使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５（Ｋ−１２）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＤＬ９３３（Ｏ１５７：Ｈ７）およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｓａｋａｉ（Ｏ１５７：Ｈ７）のゲノム配列に対する何らかの配列相同性を特定した。その後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＣＦＴ０７３、Ｋ−１２またはＯ１５７：Ｈ７のいずれかのゲノムに対する有意なアラインメント（配列相同性）を示さないセグメントを、ｎｒＮＣＢＩデータベース全体（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）に対するＢＬＡＳＴ検索において使用した。
【０１８４】
並行したアプローチにおいて、ＢＬＡＳＴ分析を、２００ｂｐ（塩基対）のフラグメントに最初に分割された４６４個のコンティグのそれぞれに関して行い、その後、２つの特化したデータベースに対して個々にｂｌａｓｔ分析した。構築された第１のデータベースは「Ｅ．ｃｏｌｉ」データベースであり、この場合、Ｅ．ｃｏｌｉの４つの菌株（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ｌｐｒｏｋｓ．ｃｇｉ）が、ＮＣＢＩｒｅｆｓｅｑ＿ｅｃｏｌｉ．ｄｎａと呼ばれるデータベースを作製するために含まれた（含まれる大腸菌株は、ＣＦＴ０７３、Ｋ１２、Ｏ１５７：Ｈ７  ＳａｋａｉおよびＯ１５７：Ｈ７  ＥＤＬ９３３であった）。第２のデータベースについては、ＮＣＢＩデータベースに存在するすべての細菌ゲノムが、「Ｂａｃｔｅｒｉａｌ」データベースを作製するために統合され、ＮＣＢＩｒｅｆｓｅｑ＿ｂａｃｔｅｒｉａ．ｄｎａと呼ばれた。次に、２００ｂｐフラグメントのそれぞれを、上記のＥ．ｃｏｌｉおよび細菌の両方の統合されたＮＣＢＩデータベースに対するｂｌａｓｔｎ分析に供した。「ヒットなし」の配列を特有な配列であると特定した。
【０１８５】
アラインメントの結果：Ｍ１７ＳＮＡＲに特有なゲノムセグメントの特定。大きいフラグメントの対毎のアライメントアプローチを使用して、Ｍ１７ＳＮＡＲのゲノム配列の異なるコンティグに由来する数個のセグメントが特定され、これらは、ＮＣＢＩのｎｒデータベースにおけるすべての公開されている配列に由来するどの配列に対しても有意なアライメントをもたらさなかった。これらの候補の特有セグメントが下記の表１０に示される。その後、これらのセグメントは候補のＭ１７ＳＮＡＲ特有配列と呼ばれた。
2009537138.tif 000011
【０１８６】
Ｍ１７ＳＮＡＲ特有セグメントについてのＰＣＲ分析の最適化およびバリデーションからの結果：試験の特異性、候補のＭ１７ＳＮＡＲ特有配列の特異性を実験的に調べるために、ＰＣＲプライマーを、いくつかの特有な領域内においてセグメントを増幅するために設計した。その後、ＰＣＲプライマーを、ＰＣＲ反応を最初に最適化するために、Ｍ１７菌株およびＭ１７ＳＮＡＲ菌株に対して行われるＰＣＲ反応において使用した。最適化を、５９℃に中心を有し、この温度の高温側および低温側において＋／−７．５℃での温度勾配を使用して行った。それぞれの反応からのＰＣＲ生成物を分析用アガロースゲルにおいて互いに並べて泳動し、臭化エチジウムにより染色し、ＣＣＤカメラを使用して３０２ｎｍのＵＶライトボックスで画像取得した。染色されたＤＮＡバンドからの蛍光の相対的強度を、ＧｅｎｅＴｏｏｌｓソフトウエア（Ｓｙｎｇｅｎｅ）ソフトウエアを使用して定量化した。下記の表１１に示されるように、最適なＰＣＲ条件が、特有な領域を、コンティグ１０、コンティグ１１、コンティグ１３、コンティグ３６、コンティグ４１、コンティグ１２７およびコンティグ２９１において検出するＰＣＲプライマーについて開発された。続いて、コンティグ１２７のＰＣＲプライマー（これは最も高い平均融解温度を有し、最適なＰＣＲ反応を最適化曲線の上端側でもたらした）を、天然に存在するＥ．ｃｏｌｉ集団の遺伝的多様性を表すＥ．ｃｏｌｉ菌株に対するさらなるバリデーションのために選んだ。
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【０１８７】
実施例４
本発明のＭ１７ＳＮＡＲ菌株は他のＥ．ｃｏｌｉ菌株とは分子的に異なる
実験手順
反応がそれぞれのＰＣＲプライマー組合せについて最適化されると、これらの組合せを、それらを、Ｅ．ｃｏｌｉ集団全体の遺伝的多様性を表すために設計されたＥ．ｃｏｌｉ菌株のパネル（ＥＣＯＲコレクション）、および、共通する血清型Ｏ２の菌株を表すために設計されたＥ．ｃｏｌｉ菌株のパネルに対するＰＣＲ反応において試験することによって確認した。このコレクションは７２のＥＣＯＲ菌株からなり、これはＯｃｈｍａｎおよびＳｅｌａｎｄｅｒによって１９８４年に最初に記載され（６）、これまで広範囲に研究されており、また、一般には、種の集団構造を表すと見なされる。Ｏ２血清型を有する５つの異なる菌株からなる１組もまた、Ｏ２血清型をＭ１７ＳＮＡＲとともに有する、遺伝的に関連性がないＥ．ｃｏｌｉ菌株におけるＭ１７ＳＮＡＲセグメントの特有さについて試験するために使用した。７７菌株の１組のそれぞれの菌株をＬ培地において３７℃で１６時間成長させ、細胞をＪＡ１０ローターでの遠心分離によって集めた。その後、ＤＮＡを標準的な方法（５）に従ってそれぞれの菌株から抽出した。ＤＮＡサンプルを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）に溶解し、４℃で保存した。それぞれのＰＣＲ反応のために、ＤＮＡサンプルを滅菌水において１：１００で希釈し、希釈されたＤＮＡの２μＬの体積を反応液に加えた。反応混合物はそれぞれが、２μＬの希釈ＤＮＡ、それぞれ１μＬの関連するプライマー（１ｕＭの最終濃度）、２μＬの１０Ｘ  ＰＣＲ緩衝液（Ｔａｋａｒａ）、２μＬの２５０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物（Ｔａｋａｒａ）、１ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）および１１μＬの滅菌水を含有した。その後、反応を、下記のサイクル処理条件を使用してＢｉｏｍｅｔｒａサーマルサイクラーにおいてサイクル処理した：９５℃で２．５分、続いて、９５℃で３０秒、５３℃（プライマー組合せ、Ｃ１２７）または５６℃（プライマー組合せ、Ｃ２９１）で４５秒、７２℃で４５秒の３０サイクル。７２℃で５分の最後の伸長を３０サイクルの後で行い、反応液を、ゲル電気泳動について準備が整うまで４℃で保った。
【０１８８】
完了したＰＣＲ反応液に、２μＬの負荷用色素（０．２１％ブロムフェノールブルー、０．２１％キシレンシアノール、５０％グリセロール）を加えた。その後、反応液の合計で１５μＬを、１ｎｇ／ｍＬの臭化エチジウムを含有する１ｘＴＡＥにおいて調製された０．８％アガロースゲルに負荷した。その後、ゲルを１００ボルト／Ｃｍで１．５時間電気泳動した。その後、電気泳動されたＰＣＲ生成物を、ゲルを３０２ｎｍのＵＶライトボックスに置くことによって可視化し、ＣＣＤカメラで画像取得した。
【０１８９】
候補のＭ１７ＳＮＡＲ特有配列を実験的に調べるために、ＰＣＲプライマーを、いくつかの特有な領域内においてセグメントを増幅するために設計した。その後、ＰＣＲプライマーを、ＰＣＲ反応を最初に最適化するために、Ｍ１７菌株およびＭ１７ＳＮＡＲ菌株に対して行われるＰＣＲ反応において使用した。最適化を、５９℃に中心を有し、この温度の高温側および低温側において＋／−７．５℃での温度勾配を使用して行った。それぞれの反応からのＰＣＲ生成物を分析用アガロースゲルにおいて互いに並べて泳動し、臭化エチジウムにより染色し、ＣＣＤカメラを使用して３０２ｎｍのＵＶライトボックスで画像取得した。染色されたＤＮＡバンドからの蛍光の相対的強度を、ＧｅｎｅＴｏｏｌｓソフトウエア（Ｓｙｎｇｅｎｅ）ソフトウエアを使用して定量化した。表５に示されるように、最適なＰＣＲ条件が、特有な領域を、コンティグ１０、コンティグ１１、コンティグ１３、コンティグ３６、コンティグ４１、コンティグ１２７およびコンティグ２９１において検出するＰＣＲプライマーについて開発された。続いて、コンティグ１２７のＰＣＲプライマー（これは最も高い平均融解温度を有し、最適なＰＣＲ反応を最適化曲線の上端側でもたらした）を、天然に存在するＥ．ｃｏｌｉ集団の遺伝的多様性を表すＥ．ｃｏｌｉ菌株に対するさらなるバリデーションのために選んだ。
【０１９０】
コンティグ１２７のＰＣＲアッセイの特異性を確認するために、最適化されたコンティグ１２７のＰＣＲ反応を次に、天然に存在するＥ．ｃｏｌｉ集団の遺伝的多様性を表すＥ．ｃｏｌｉ菌株のパネル（ＥＣＯＲコレクション）、ならびに、血清型Ｏ２のＭ１７ＳＮＡＲ菌株と遺伝的に関連性がないさらなる血清型Ｏ２菌株（ＡＯＳ菌株）から得られるゲノムＤＮＡに対して試験した。７２のＥＣＯＲ菌株のそれぞれ、それぞれのＡＯＳ菌株、Ｍ１７ＳＮＡＲ菌株およびＭ１７親菌株からの精製されたゲノムＤＮＡを、下記の条件を使用して、コンティグ１２７プライマーを伴う個々の反応におけるＰＣＲに供した：
テンプレートＤＮＡ  １００ｎｇ
Ｃ１２７ＦＯＲ      １ｐｍｏｌ／ｕＬ
Ｃ１２７ＲＥＶ      １ｐｍｏｌ／ｕＬ
１ＸＰＣＲ緩衝液
ｄＮＴＰｓ          ２５０ｕＭ
Ｔａｑポリメラーゼ  １ユニット
水                  ２０μＬにする
【０１９１】
ＰＣＲ反応液を９５℃で２．５分間加熱し、続いて、９５℃で３０秒間、６３℃で４５秒間、７２℃で４５秒間の３０サイクルに供した。反応を７２℃で５分間伸長させ、最後に、反応液を電気泳動による分離まで４℃で保った。アガロースゲル電気泳動のために、負荷用色素を加え、反応液を０．８％アガロースゲルに負荷した。電気泳動後、ゲルを、ＣＣＤカメラを使用してＵＶライトボックスで画像取得した。表１２に示されるように、Ｍ１７およびＭ１７ＳＮＡＲのみが、予想された１１５５塩基のＰＣＲ生成物をコンティグ１２７のＰＣＲアッセイからもたらした。すべての他の菌株はＰＣＲ生成物をこの反応から何らもたらさなかった。このバリデーションにおいて試験された菌株に基づいて、本発明者らの結果は、コンティグ１２７のＰＣＲアッセイがＭ１７ＳＮＡＲについて非常に選択的であることを示している。
【０１９２】
結果
下記の表１２は、本発明の菌株および試験された他のＥ．ｃｏｌｉ菌株におけるコンティグ１２７分析の結果の要約である。
2009537138.tif 000013
2009537138.tif 000014
【０１９３】
実施例５
添加された便サンプルにおけるＭ１７ＳＮＡＲの計数および確認
実験手順
バイオレットレッド胆汁寒天（ＶＲＢＡ）における選択的平板培養と、ＰＣＲ確認との組合せを、Ｍ１７ＳＮＡＲが添加便サンプルにおいて選択的に計数され得るかを明らかにするために使用した。これらの実験のために、混成便サンプルを、１００個の独立したヒト便サンプルに由来する１０グラムのサンプルを１つの混成物に混合することによって調製した。この混成物をワーリングブレンダーにおいて３回の１分間のパルスのために混合し、得られたスラリーをおよそ２５ｍＬのアリコートで無菌の５０ｍＬの円錐チューブに分配した。本明細書中では、これらのサンプルは便混成物サンプルとして示される。混成物サンプルのアリコートを−８０℃で保存した。
【０１９４】
試験のために、便サンプルのアリコートを解凍し、連続１０倍希釈によって無菌の０．１％ペプトンに三連で希釈した。その後、それぞれの希釈物の０．１ｍＬサンプルを、Ｌ寒天、Ｌ寒天＋７５μｇ／ｍＬナリジクス酸、ＶＲＢＡ、ＶＲＢＡ＋２５μｇ／ｍＬナリジクス酸の表面に二連で置床した。Ｍ１７ＳＮＡＲ細胞を２つの独立した便混成物アリコートの１０−１希釈物に加えた。添加実験のために、Ｍ１７ＳＮＡＲ細胞の懸濁物を、Ｍ１７ＳＮＡＲ細胞の単一コロニーを、Ｌ寒天＋７５μｇ／ｍＬナリジクス酸に画線培養されている培養物からかき取ることによって調製した。このコロニーを、ボルテックスミキサーを使用して３０秒間のボルテックス混合によって５ｍｌの無菌の０．１％ペプトンに再懸濁した。Ｍ１７ＳＮＡＲ懸濁物に存在するＭ１７ＳＮＡＲ細胞を、無菌の０．１％ペプトンへの懸濁物の連続１０倍希釈を行い、それぞれの希釈物の０．１ｍＬ部分を、Ｌ寒天、Ｌ寒天＋７５μｇ／ｍＬナリジクス酸、ＶＲＢＡ、ＶＲＢＡ＋２５μｇ／ｍＬナリジクス酸に置床することによって計数した。このＭ１７ＳＮＡＲ細胞懸濁物を使用して、便混成物サンプルの１０−１希釈物を、Ｍ１７ＳＮＡＲ懸濁物の１０倍希釈物または１０００倍希釈物の０．１ｍＬを独立した便混成物アリコートの１０−１希釈物に加えることによって２つの異なる濃度で添加した。その後、添加された１０−１希釈物を連続１０倍希釈によって０．１％ペプトンに希釈した。その後、それぞれの希釈物の０．１ｍＬアリコートを、Ｌ寒天、Ｌ寒天＋７５μｇ／ｍＬナリジクス酸、ＶＲＢＡ、ＶＲＢＡ＋２５μｇ／ｍＬナリジクス酸の表面に二連で置床した。
【０１９５】
細胞を成長培地の表面に展開した後、平板を３７℃で３６時間インキュベートした。コロニーを、関連する希釈物からの平板のそれぞれの二連セットについて計数し、平均化した。Ｍ１７ＳＮＡＲを確認するために、関連する希釈物の、ＶＲＢＡ＋２５μｇ／ｍＬナリジクス酸の平板のそれぞれのセットからの１０個のコロニーをつま楊枝で採取し、９６ウエル培養プレートにおいて１００μＬのＬ培地に接種した。プレートを３７℃で１６時間インキュベートした。その後、それぞれの培養物から、５０μＬの細胞を９６ウエルＰＣＲプレートに取り出し、５０μＬの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−０．２ｍＭＥＤＴＡと混合した。その後、細胞をサーモサイクラーにおいて９５℃に１０分間加熱した。加熱された細胞懸濁物から、２μＬを取り出し、新鮮な９６ウエルＰＣＲプレートに分配し、１８μＬのＰＣＲミックスを加えた。ＰＣＲミックスは、１ＸＰＣＲ緩衝液（Ｔａｋａｒａ）、２５０ｍＭのｄＮＴＰｓ（Ｔａｋａｒａ）、１．４ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、１ｕＭの各プライマー（コンティグ１２７プライマー、上記）からなる。その後、プレートを９６ウエルのふたで覆い、サーモサイクラーに入れた。反応液を９５℃に２．５分間加熱し、続いて、９５℃で３０秒間、６３℃で４５秒間、７２℃で４５秒間の４０サイクルに供した。その後、７２℃で５分間の最後のサイクルを行い、サンプルを、ゲル電気泳動の準備が整うまで４℃で保った。
【０１９６】
完了したＰＣＲ反応液に、２μＬの負荷用色素（０．２１％ブロムフェノールブルー、０．２１％キシレンシアノール、５０％グリセロール）を加えた。その後、反応液の合計で１５μＬを、１ｎｇ／ｍＬの臭化エチジウムを含有する１Ｘ  ＴＡＥにおいて調製された０．８％アガロースゲルに負荷した。その後、ゲルを１００ボルト／Ｃｍで１．５時間電気泳動した。その後、電気泳動されたＰＣＲ生成物を、ゲルを３０２ｎｍのＵＶライトボックスに置くことによって可視化し、ＣＣＤカメラで画像取得した。
【０１９７】
結果
組み合わされたナリジクス酸耐性選択およびコンティグ１２７ＰＣＲ確認の感受性および選択性を計測するために、実験を、ヒト便サンプルを用いて行った。混成便サンプルを１００個のヒト便サンプルの１０グラムサンプルから調製した。その後、混成物のサンプルをＭ１７ＳＮＡＲ細胞の調整された量と混合し、連続希釈に供し、続いて、それぞれの希釈物の一部を、ＶＲＢＡ＋２５μｇ／ｍＬナリジクス酸、ならびに、コントロール培地（ＶＲＢＡ、Ｌ寒天、および、７５μｇ／ｍＬのナリジクス酸を含むＬ寒天）に置床した。インキュベーション後、コロニーの数をそれぞれの希釈物の二連の平板から平均化した。表１３に示されるように、７５μｇ／ｍＬのナリジクス酸がＬ寒天に配合された場合、この培地は、Ｌ寒天単独とほぼ同じくらい多くのコロニーをもたらしたので、便サンプルからのＭ１７ＳＮＡＲについて選択的ではなかった。従って、ナリジクス酸選択は単独では、Ｍ１７ＳＮＡＲ検出のための十分な選択性を提供しない。Ｌ寒天とは対照的に、ＶＲＢＡ＋ナリジクス酸はＭ１７ＳＮＡＲについて完全に選択的であった。これは、（Ｍ１７ＳＮＡＲが加えられていない）便混成物サンプルだけが、１０ＣＦＵ／ｍｌの検出限界より少ないラクトース発酵性のナリジクス酸耐性コロニーをもたらしたからである。便混成物サンプルがＶＲＢＡにおいて１Ｘ１０４のラクトース発酵性ＣＦＵ／ｍｌを含有したことを考えると、これらの結果は、１００００個の大腸菌群細菌において１個未満がＶＲＢＡ＋ナリジクス酸において成長およびラクトース発酵を行うことができることを示す。しかしながら、Ｍ１７ＳＮＡＲ細胞が導入されているサンプルは、ナリジクス酸耐性のラクトース発酵性コロニーを、予想された希釈度で、ＶＲＢＡ＋２５μｇ／ｍＬナリジクス酸の培地においてもたらした。投入されたＭ１７ＳＮＡＲ細胞の数に基づいて、ＶＲＢＡ＋２５μｇ／ｍＬナリジクス酸は２３％（１．３Ｘ１０５の投入量のサンプルについて）〜４２％（１．３Ｘ１０３の投入量のサンプルについて）の間での検出効率を与えた。従って、ＶＲＢＡ＋２５μｇ／ｍＬナリジクス酸におけるＭ１７ＳＮＡＲ菌株の平板培養効率は３２．５％で見積もられる。希釈されていない便サンプルからの１０ＣＦＵ／ｍＬ未満の検出限界を、ＶＲＢＡ＋２５μｇ／ｍＬナリジクス酸におけるＭ１７ＳＮＡＲの３２．５％の平板培養効率と組み合わせると、便サンプルにおけるＭ１７ＳＮＡＲの３３ＣＦＵ／ｍｌ未満の検出限界が求められた。結果が下記の表１３にまとめられる。
【０１９８】
ＶＲＢＡ＋ナリジクス酸において成長するコロニーがＭ１７ＳＮＡＲのみであることを確認するために、コンティグ１２７ＰＣＲアッセイを、Ｍ１７ＳＮＡＲを含有するサンプルの希釈物に由来する、ＶＲＢＡ＋ナリジクス酸の平板からの合計で８４個の無作為に選ばれたコロニーに対して行った。平板培養の選択性を明らかにするために、抗生物質を含まないＶＲＢＡ平板からの１３２個のコロニーもまた無作為に選び、コンティグ１２７ＰＣＲアッセイにより試験した。ＶＲＢＡ平板から選ばれたコロニーのうち、４８個を、Ｍ１７ＳＮＡＲがサンプルに加えられていなかった平板から採取し、また、８４個を、Ｍ１７ＳＮＡＲが導入されていたサンプルに由来する希釈物の計数可能な平板から選んだ。下記の表１３に示されるように、コンティグ１２７ＰＣＲ陽性コロニーが、予期されたように、非添加サンプルに由来するＶＲＢＡ平板から試験されたコロニーからは得られなかった。そのうえ、予想されたように、コンティグ１２７陽性コロニーおよびコンティグ１２７陰性コロニーの両方が、抗生物質を含まないＶＲＢＡ平板において検出され、陰性のコンティグ１２７ＰＣＲコロニーに対する陽性のコンティグ１２７ＰＣＲコロニーのより大きい比率が、より大きい数の添加Ｍ１７ＳＮＡＲを含有するサンプルから得られた。ＶＲＢＡ＋２５μｇ／ｍＬナリジクス酸からのコロニーが試験されたときには、予期されたように、コンティグ１２７陽性コロニーのみが得られた。従って、ＶＲＢＡ＋ナリジクス酸における選択的平板培養と、コンティグ１２７ＰＣＲ確認との組合せは、Ｍ１７ＳＮＡＲを便サンプルから計数するための非常に高感度で、非常に選択的な方法を提供する。
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【０１９９】
実施例６
プロバイオティク物の投与前、投与期間中および投与後のイヌから得られた便サンプルにおけるＭ１７ＳＮＡＲの検出
本研究の全体的目的は、ヒト便サンプルにおけるＥ．ｃｏｌｉ  Ｍ１７ＳＮＡＲの定量化のためのツール、ならびに、便サンプルにおけるプロバイオティックＥ．ｃｏｌｉ  Ｍ１７ＳＮＡＲ菌株の流出の程度および持続期間を測定する方法を開発することであった。１４日間の毒性学研究（これはＲｉｃｅｒｃａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＬＬＣ（Ｃｏｎｃｏｒｄ、ＯＨ）によって行われた）の過程の期間中にＭ１７ＳＮＡＲ培養物が与えられたイヌから集められた便サンプルを、この方法をモデル化するために使用した。使用されたアプローチは、総大腸菌群数およびＭ１７ＳＮＡＲを、（上記の実施例５において、添加されたヒト便サンプルについて示されるように）バイオレットレッド胆汁寒天（ＶＲＢＡ）、および、２５μｇ／ｍＬのナリジクス酸が補充されたＶＲＢＡにおける選択的平板培養を使用して計数することであった。Ｍ１７ＳＮＡＲの確認を、Ｍ１７ＳＮＡＲに特異的なコンティグ１２７ＰＣＲアッセイを使用して、ＶＲＢＡ＋２５μｇ／ｍＬナリジクス酸において成長するコロニーに対して行った。
【０２００】
実験手順
便サンプルの示差的平板培養：便サンプルを、Ｒｉｃｅｒｃａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＬＬＣ（Ｃｏｎｃｏｒｄ、ＯＨ）によって行われたＧＬＰでのイヌ毒性学研究の過程の期間中に集めた。それぞれのサンプルの１０グラムを無菌の５０ｍＬの円錐チューブにおいて１０ｍＬの無菌の生理的食塩水＋１５％グリセロールと混合した。その後、スラリーを−８０℃で凍結し、ドライアイスにおいて輸送した。それぞれのサンプルをマスター集計表に記録し、続いて、処理まで−８０℃で保存した。処理のために、サンプルを室温で１時間にわたって解凍し、さらに１０ｍＬの無菌の０．１％ペプトンと３０秒間振とうすることによって激しく混合した。この得られたスラリーは非希釈サンプルと呼ばれる。
【０２０１】
非希釈サンプルの０．５ｍＬ部分をＰ−１０００マイクロピペッターにより取り出し、４．５ｍＬの無菌の０．１％ペプトンに分注した。その後、希釈サンプルを１０−６の最終希釈度に連続希釈した。平板培養のために、非希釈サンプルおよび１０−１希釈物〜１０−６希釈物の０．１ｍＬ部分をＶＲＢＡおよびＶＲＢＡ＋２５μｇ／ｍＬナリジクス酸に二連で置床した。平板を、コロニーを計数する前に３７℃で３６時間インキュベートした。推定総大腸菌群を、［ＶＲＢＡにおけるラクトース陽性コロニーの数］Ｘ［希釈度の逆数］としてスコア化した。推定Ｍ１７ＳＮＡＲを、［ＶＲＢＡ＋２５μｇ／ｍＬナリジクス酸におけるラクトース陽性コロニーの数］×［希釈度の逆数］としてスコア化した。
【０２０２】
ＰＣＲ確認：Ｍ１７ＳＮＡＲの存在を確認するために、コロニーをＶＲＢＡまたはＶＲＢＡ＋２５μｇ／ｍＬナリジクス酸から採取し、コンティグ１２７ＰＣＲアッセイを使用して試験した。試験されるコロニーを、無菌のつま楊枝を使用して採取し、無菌の９６ウエルアッセイプレートにおいてＬ培地の２００μＬの培養液に接種した。Ｍ１７ＳＮＡＲおよびＤＨ５αを含むコントロールもまた、適切なウエルに接種した。その後、プレートを無菌のプラスチックふたで覆い、３７℃で１５時間インキュベートした。インキュベート後、それぞれのウエルからの５０μＬの細胞を、その後、９６ウエルＰＣＲプレートの対応するウエルに移し、５０μＬの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−０．２ｍＭ  ＥＤＴＡと混合した。その後、細胞をサーモサイクラーにおいて９５℃に１０分間加熱した。加熱された細胞懸濁物から、２μＬを取り出し、新鮮な９６ウエルＰＣＲプレートに分配し、１８μＬのＰＣＲミックスを加えた。ＰＣＲミックスは、１Ｘ  ＰＣＲ緩衝液（Ｔａｋａｒａ）、２５０ｍＭのｄＮＴＰｓ（Ｔａｋａｒａ）、１．４ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、１ｕＭの各プライマーからなる。その後、プレートを９６ウエルのふたで覆い、サーモサイクラーに入れた。反応液を９５℃で２．５分間加熱し、続いて、９５℃で３０秒間、６３℃で４５秒間、７２℃で４５秒間の４０サイクルに供した。その後、７２℃で５分間の最後のサイクルを行い、サンプルを、ゲル電気泳動の準備が整うまで４℃で保った。
【０２０３】
完了したＰＣＲ反応液に、２μＬの負荷用色素（０．２１％ブロムフェノールブルー、０．２１％キシレンシアノール、５０％グリセロール）を加えた。その後、反応液の合計で１５μＬを、１ｎｇ／ｍＬの臭化エチジウムを含有する１Ｘ  ＴＡＥにおいて調製された０．８％アガロースゲルに負荷した。その後、ゲルを１００ボルト／Ｃｍで１．５時間電気泳動した。その後、電気泳動されたＰＣＲ生成物を、ゲルを３０２ｎｍのＵＶライトボックスに置くことによって可視化し、ＣＣＤカメラで画像取得した。
【０２０４】
結果
イヌ便サンプルにおけるＭ１７ＳＮＡＲの推定検出および確認検出。個々の動物に、Ｍ１７ＳＮＡＲを胃への胃管栄養法によって１４日間毎日与えた。動物には、餌が、Ｍ１７ＳＮＡＲ服用後２時間以内に与えられた。便サンプルが、０日目に開始して、また、研究群に依存して、１４日目または２８日目の終わりまで継続して毎日集められた。服用が２つの異なる用量レベル（１日あたり５Ｘ１０９ｃｆｕ／服用および１Ｘ１０１３ＣＦＵ／服用）で行われた。高用量群におけるいくつかの動物については、服用が１４日目以降は中止され、便サンプルがさらに１４日間にわたって集め続けられた。高用量群からの選択された動物の便におけるＭ１７ＳＮＡＲの計数のために、０日目、ならびに、服用期間の１日目、４日目、７日目、１０日目および１３日目、ならびに、投与期間後の１６日目、１８日目、２０日目、２２日目、２５日目および２８日目からの便サンプルを、ＶＲＢＡおよびＶＲＢＡ＋２５μｇ／ｍＬナリジクス酸における示差的平板培養によって試験した。
【０２０５】
その後、計数可能なコロニー（３０個〜３００個のコロニー）を生じさせるＶＲＢＡ＋２５μｇ／ｍＬナリジクス酸の平板の最大希釈度からの１０個のコロニーを、Ｍ１７ＳＮＡＲの存在を確認するために、コンティグ１２７ＰＣＲ分析に供した。サンプルが、非希釈サンプルでさえ、ナリジクス酸耐性コロニーを何らもたらさなかったときには、１０個のコロニーがまた、ＶＲＢＡ平板から試験された。表１４は、推定総大腸菌群のカウント数、推定Ｍ１７ＳＮＡＲ、および、コンティグ１２７ＰＣＲアッセイの結果を示す。それぞれの場合において、コンティグ１２７陽性コロニーのみがＶＲＢＡ＋ナリジクス酸の平板から回収され、一方、コンティグ１２７陽性コロニーが、ＶＲＢＡ＋ナリジクス酸においてコロニーをもたらさなかったサンプルの中に１つも見出されなかった。従って、推定Ｍ１７ＳＮＡＲ（ＶＲＢＡ＋ナリジクス酸におけるコロニーの成長）との間での相関は１．０であった。
2009537138.tif 000016
【０２０６】
Ｍ１７ＳＮＡＲの検出可能な流出。４匹の動物についての総大腸菌群カウント数および総Ｍ１７ＳＮＡＲカウント数が図３ａ〜図３ｄにプロットされる。動物あたりの総大腸菌群カウント数は１０４ＣＦＵ／ｇ便〜１０７ＣＦＵ／ｇ便の間に及んだ。Ｍ１７ＳＮＡＲの流出が、１３日目の終わりまで４匹すべての動物において検出可能であった。２匹の動物が、検出可能なレベルのＭ１７ＳＮＡＲを１６日目まで流出し続けた（図３ｃ〜図３ｄ）。１６日目を越えると、Ｍ１７ＳＮＡＲを便サンプルにおいてもはや検出することができなかった。従って、服用を中止した後（１４日目以降）、Ｍ１７ＳＮＡＲ集団はアッセイの検出限界（１０１．４８または３０ＣＦＵ／ｇ）よりも低いレベルに急速に排除された。
【０２０７】
服用期間の期間中に、変動が総大腸菌群カウント数およびＭ１７ＳＮＡＲカウント数の両方で認められた。これが統計学的なサンプリング誤差または他の要因を反映するかどうかは不明である。流出が検出可能であった期間の後、総大腸菌群のレベルは一般に、レベルが服用後においておよそ４対数単位より大きかった動物３０３３を除いて、投与前のレベルに達した。
【０２０８】
本研究は、Ｍ１７ＳＮＡＲが、Ｍ１７ＳＮＡＲが与えられたイヌの便において特異的に検出され得ることを示している。Ｍ１７ＳＮＡＲは、これらの動物のフローラの一部として腸に安定にコロニー形成しないようであり、また、服用期間後の２日〜４日のうちに検出不能なレベルに低下する。総大腸菌群集団に対するＭ１７ＳＮＡＲの影響は、絶対数に関して、ほとんど認められなかった。だが、データは、フローラの多様性に対する影響を何ら評価することができなかった。それにもかかわらず、服用期間後の４日〜６日のうちに、総大腸菌群レベルは投与前のレベルとほぼ同じくらい大きいか、または、投与前のレベルよりも大きい。
【０２０９】
注目すべきことに、服用期間の最初の数日の期間中に認められ得るいくらかの用量応答関係が存在する。これらのより大きい用量では、Ｍ１７ＳＮＡＲによって占められ得る腸内の隙間が迅速に飽和することが考えられる。本研究において記載されるアッセイ方法は高感度であり、便におけるＭ１７ＳＮＡＲの出現、持続期間および消失を検出することができる。従って、これは、ヒトでの臨床試験の期間中にＥ．ｃｏｌｉ  Ｍ１７ＳＮＡＲのコロニー形成および排除をモニターするために使用することができる効果的なアッセイ形式である。
【０２１０】
実施例７
Ｍ１７ＳＮＡＲのゲノム配列決定
大腸菌Ｍ１７ＳＮＡＲの完全なゲノム配列を、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｍ１７ＳＮＡＲに特有なゲノム配列を特定するために得た。これを達成するために、ゲノムＤＮＡが、配列「読取り」が重なり、集められたとき、ゲノムの完全な配列をもたらすように、十分な配列「読取り」を伴って「ばらばらにされる」全ゲノムショットガン配列決定戦略を使用した。大腸菌Ｍ１７ＳＮＡＲゲノムの８倍の配列重複率が、包括的な数の配列「読取り」を得るために成し遂げられ、ショットガン集合がこれらの配列「読取り」からもたらされた。この作業を完了させるために、下記の段階が順次取られた。
１．ゲノムＤＮＡの物理的剪断；
２．３つの別個のライブラリーの構築：１つの高力価の小インサートライブラリー、１つの１０ｋｂインサートライブラリーおよび１つの４０ｋｂインサートライブラリー；
３．ゲノムのおよそ８倍の配列重複率を得るためのランダムショットガン配列決定；および
４．非常に特殊化されたゲノム配列集合コンピュータープログラムを使用するショットガン配列データの集合。
【０２１１】
実験手順
ＤＮＡの物理的剪断：
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｍ１７ＳＮＡＲのゲノムＤＮＡを分子量について調べた。パルスフィールゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）を、サンプルの分子量を求めるための高分子量マーカー（ＢｉｏＲａｄ  ＣｈｅｆＭａｐｐｅｒ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）とともに行った。その後、高分子量のゲノムＤＮＡを、Ｈｙｄｒｏｓｈｅａｒ（商標）デバイス（Ｇｅｎｅｍａｃｈｉｎｅｓ、Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ）により、およそ４．０ｋｂ、１０．０ｋｂおよび４０．０ｋｂの所望されるサイズに機械的に剪断した。Ｈｙｄｒｏｓｈｅａｒ（商標）装置は、ランダムなＤＮＡフラグメントを生じさせるために利用することができる、制御された、再現性のある方法を提供する。このソフトウエア駆動デバイス（Ｈｙｄｒｏｓｈｅａｒソフトウエアｖ．１．０．６ａ）では、流体力学的剪断力が、ＤＮＡ鎖を指定のサイズにフラグメント化するために使用される。
【０２１２】
ライブラリー構築
経験により、小さいサイズのＤＮＡインサートおよび大きいサイズのＤＮＡインサートの両方を含む数個のライブラリーを構築する必要性があることが明らかにされている。小さいインサートのライブラリーは、ゲノムの適切な解読範囲を得るために使用され、大きいインサートのライブラリーは、配列決定プロジェクトの終了段階の期間中に使用されるゲノムの「足場」を得るために使用される。すなわち、小さいインサートのライブラリーからの「読取り」は配列情報の「塊」を提供し、一方、大きいインサートのライブラリーからの「読取り」は、配列情報を正しい順序で集合ことにおいて役立つ。
【０２１３】
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｍ１７ＳＮＡＲの全ゲノムショットガン配列決定のために、４ｋｂ、１０ｋｂおよび４０ｋｂのＤＮＡインサートを含有する３つの別個のライブラリーを、剪断された大腸菌Ｍ１７ＳＮＡＲＤＮＡを使用して構築した（図４）。３ｋｂ〜４ｋｂおよび１０．０ｋｂのフラグメントを単離および配列決定のためのｐＡＧＥＮベクターシステム（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）にクローン化した。集合を改善し、また、確認するために、大きいインサートのフォスミドライブラリーを、ＣｏｐｙＣｏｎｔｒｏｌ（商標）ｐＣＣ１ＦＯＳ（商標）ベクターシステム（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して４０ｋｂのフラグメントを用いて作製した。フォスミドはプラスミド（環状ＤＮＡ）と類似しているが、プラスミドにおける約１０ｋｂと比較して、５０ｋｂまでのはるかにより大きいサイズのＤＮＡインサートを含有することができる。フォスミドライブラリーの大きいインサートサイズ（４０ｋｂ）は、フォスミドライブラリーを特に魅力的なものにする。これは、フォスミドクローンは、小さい物理的ギャップを、小さいインサートのライブラリーとの比較において、より少ないウォーキング工程によりふさぐことができ、従って、余分な配列決定を減らすことができるからである。
【０２１４】
ライブラリーを構築している間、それぞれの組換えクローンが１つだけのゲノムＤＮＡインサートを含有することが不可欠である。多数のインサートが１つのクローンに存在すると、間違った結果がゲノム集合時に生じる。このことを確実にするために、ランダムに剪断されたＤＮＡを、アダプターに基づくクローニング方法を使用してプラスミドライブラリーの構築において使用した。本明細書中では、クローニングベクターをＢｓｔＸ１部位の対称的な対において切断して、ベクターフラグメントがその結果として再び環状化できない非相補的な４塩基の突出端を作製した。機械的に剪断されたインサートＤＮＡを末端修復し、ベクター末端に対して相補的な突出端を有するが、自身に対しては相補的でないアダプターに連結（または「結合」）した。その後、調製されたインサートをベクターに連結または挿入した。自己非相補性アダプターの使用はバックグランドを小さくし、また、クローン同胞物の発生を実質的に低下させた。
【０２１５】
続いてハイスループット配列決定を行う前に、形質転換されたライブラリーの完全性を確認した。合計で７６８個のクローンを採取し、両方向での配列決定に供した。ＢＬＡＳＴ２．２．１０（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）分析を１５３６個の配列決定「読取り」に対して行った（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ／ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）。ＢＬＡＳＴプログラムは配列間における局所的類似性の領域を見つける。ＢＬＡＳＴプログラムはヌクレオチド配列またはタンパク質配列を配列データベースに対して比較し、一致部分の統計学的有意性を計算し、それにより、「質問」配列の、可能性のある同一性および完全性に関する有益な情報を提供する。
【０２１６】
ランダムショットガン配列決定
配列決定用テンプレートの調製：ゲノムＤＮＡを含有するプラスミドを、固相可逆的固定化技術（ＳＰＲＩ（登録商標））を使用してライブラリー培養物から単離した［Ｈａｗｋｉｎｓ，ＴＬ．、Ｋ．Ｊ．ＭｃＫｅｒｎａｎ、Ｌ．Ｂ．Ｊａｃｏｔｏｔ、Ｊ．Ｂ．ＭａｃＫｅｎｚｉｅ、Ｐ．Ｍ．ＲｉｃｈａｒｄｓｏｎおよびＥ．Ｓ．Ｌａｎｄｅｒ、１９９７、Ａ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ａｔｔｒａｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７６（５３２０）、１８８７〜１１８９］。高コピープラスミドのテンプレート（３ｋｂ〜４ｋｂおよび１０ｋｂのインサートのプラスミド）を、ＳｐｒｉｎｔＰｒｅｐ（商標）ＳＰＲＩプロトコルを使用して精製し、一方、低コピー（４０ｋｂのフォスミド）のテンプレートを、ＳＰＲＩ（登録商標）プロトコルを使用して精製した（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）。ＳＰＲＩ（登録商標）（固相可逆的固定化）技術では、カルボキシラートにより覆われた、鉄コアの常磁性粒子が、同調させた緩衝化条件に基づいて、所望されるフラグメント長さのＤＮＡを捕捉するために使用される。所望のＤＮＡが粒子に捕捉されると、粒子は磁石により濃縮および分離することができ、その結果、混入物を洗浄により除くことができる。この手順では、プラスミドＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの両方を官能基化ビーズ粒子に捕まえ、プラスミドＤＮＡのみを選択的に溶出することによって、プラスミドＤＮＡが、溶解された細菌培養物から直接に集められる。
【０２１７】
ショットガン配列決定：ＤＮＡテンプレートを、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）バージョン３．１の反応を使用する３８４ウエル形式で、ＡＢＩ３７３０装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）において配列決定した。ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）バージョン３．１は、新規な高感度色素により標識された色素ターミネーターを含有する。このＢｉｇＤｙｅターミネーター化学は、ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅアクセプター色素に連結されたフルオレセインドナー色素を伴い、標準的な色素ターミネーターよりも２倍〜３倍明るく、また、より少ないバックグラウンドノイズを与える、より狭い放射スペクトルを有する。このことは、キャピラリー分析手順の感度における４倍〜５倍の全体的な改善をもたらす。配列決定のためのサンプル調製の期間中に、ＤＮＡフラグメントは、ＤＮＡの検出および特定を容易にするこれらの蛍光性色素により化学的に標識される。
【０２１８】
この手順では、標識されたＤＮＡサンプルが９６ウエルプレートまたは３８４ウエルプレートにおいて調製され、ＡＢＩ３７３０Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ装置に置かれ、この装置において、キャピラリー電気泳動が、ＤＮＡフラグメントの混合物をそれらの長さに従って分離し、これにより、分離のプロフィルを提供すること、および、４つのデオキシリボヌクレオチド塩基の順序を決定することにおいて使用される。サンプルからのＤＮＡ分子が、ポリマーで満たされている薄い溶融シリカキャピラリーに注入される。ＤＮＡフラグメントがキャピラーの反対側の端に向かって移動し、このとき、より短いフラグメントは、より長いフラグメントよりも速く移動する。フラグメントが検出セルに入るにつれ、フラグメントは、フラグメント上の色素に蛍光を放射させるレーザービームの光路の中を移動する。この蛍光が電荷結合デバイス（ＣＣＤ）カメラによって捕捉される。ＣＣＤカメラはこの蛍光情報を電子的情報に変換し、その後、この電子的情報は、相対的な色素濃度を、ＤＮＡフラグメントを標識するために使用された色素のそれぞれについて時間に対してプロットするエレクトロフェログラムを生じさせるための３７００データ収集ソフトウエアによる処理のためにコンピューターワークステーションに転送される。エレクトロフェログラムの位置および形状が、ＤＮＡフラグメントの塩基配列を決定するために使用される。配列決定反応のための熱サイクル処理を、３８４ウエルのＴｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒｓ（ＡＢＩ、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用して行った。配列決定反応液を、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから得られるＣｌｅａｎＳｅｑ（登録商標）色素ターミネーター除去キットを使用して精製した。
【０２１９】
集合
ショットガン配列決定段階が完了すると、ランダムなサブクローンからもたらされる配列決定「読取り」がコンティグ（連続した配列）に集められ、その後、その集合が、正しさについて、また、様々な種類のデータ異常（例えば、混入する「読取り」、除かれなかったベクター配列、および、キメラな「読取り」または欠失した「読取り」など）について調べられる、管理された、すなわち、仕上げの段階が続き、さらなるデータが、ギャップをふさぐために、また、低品質の領域を解消するために集められ、編集が、集合または塩基呼出しの誤りを正すために行われる。
【０２２０】
配列「読取り」のバリデーション：ハイスループット配列決定から得られるすべての「読取り」は、Ｐｈｒｅｄ塩基呼出しソフトウエア（バージョン０．０２０４２５ｃ）を使用して処理され、ＰｈｒｅｄＱ２０（ワシントン大学）を使用して品質行列に対して絶えずモニターされた。Ｐｈｒｅｄは、ＤＮＡ配列のクロマトグラムファイルを読み込み、塩基を呼び出すためにピークを分析し、品質スコアをそれぞれのヌクレオチドに割り当てる、ワシントン大学ゲノムセンターで開発された塩基呼出しソフトウエアである（２）。ＰｈｒｅｄＱ２０は、Ｐｈｒｅｄ品質値が２０以上である塩基を呼び出す。２０のＰｈｒｅｄスコアは、１００塩基において１つの誤りが存在することを示す。それぞれの泳動についての品質スコアが、Ｇａｌａｘｙ  ＬＩＭＳシステム（Ｏｒａｃｌｅに基づく最先端の研究室情報管理システム（ＬＩＭＳ）（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ））によってモニターされ、正常な範囲からの何らかの実質的なずれが直ちに調査された。
【０２２１】
集合工程：数個のコンティグ（連続する配列）にされる非常に多数の配列データの集合では、検討する必要がある３つの大きな事項によってさらに複雑化される複雑なコンピューター計算プロセスが要求される。
１．それぞれの配列の品質スコア、
２．得られた配列そのものまたはその相補体の使用、および
３．その誤った集合が回避される必要がある反復した配列の存在。
【０２２２】
複雑なアルゴリズムを有する様々なコンピューターソフトウエアプログラムが今や、完全なゲノムを集めることを達成するために利用可能である。重なり合う配列のクラスターが構築され、コンセンサス配列がこれらのクラスターから推定される。ＬＩＭＳシステム（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）と一緒になったＰａｒａｃｅｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ（商標）バージョン２．６．２（Ｐａｒａｃｅｌ、Ｐａｓａｄｅｎａ、ＣＡ）が、このプロジェクトのために、配列データを集めるために使用された。Ｐａｒａｃｅｌの足場ビューアーおよびＣｏｎｓｅｄ（バージョン１３．０）（配列集合物を調べ、編集するためのグラフィックツール（ワシントン大学））を使用して、集合を完成させた［Ｇｏｒｄｏｎ，Ｄ．、Ｃ．ＡｂａｊｉａｎおよびＰ．Ｇｒｅｅｎ、１９９８、Ｃｏｎｓｅｄ：ａ  ｇｒａｐｈｉｃａｌ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｆｉｎｉｓｈｉｎｇ．、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ、第８巻（３）、１９５〜２０２］。
【０２２３】
結果
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｍ１７ＳＮＡＲの全ゲノム配列決定を、ショットガン配列決定法を使用して達成した。集合時における反復エレメントおよび他の人為的誤りの存在を改善するために役立ったマルチライブラリー戦略を利用した。大きいインサートのライブラリーはクローン重複率およびゲノム集合の足場形成を増大させる。３ｋｂ〜４ｋｂのインサートの高コピー数プラスミドのライブラリーに加えて、１０ｋｂインサートのプラスミドライブラリーおよび４０ｋｂインサートのフォスミドライブラリーもまた構築した。これら３つのライブラリーのショットガン配列決定を行い、合計で３６２６５５３８個のＰｈｒｅｄ２０塩基を得て、ゲノムのおよそ８倍の配列重複率を得た。配列「読取り」を連続配列のブロックに集合、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｍ１７ＳＮＡＲに特有な配列を特定するためのＢＬＡＳＴ分析に供した。
【０２２４】
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｍ１７ＳＮＡＲゲノムＤＮＡのパルスフィールドゲル電気泳動
全ゲノムショットガン戦略では、ＤＮＡを様々なサイズのセグメントに無作為に分断すること、および、これらのフラグメントをベクターに配列決定のためにクローン化することを伴う。この戦略の成功は、出発材料として使用されるゲノムＤＮＡの品質および完全性に非常に依存する。パルスフィールドゲル電気泳動を、ゲノムＤＮＡの品質を調べるために、また、ＤＮＡが高分子量であったかを明らかにするために行った。
【０２２５】
連続場電気泳動のとき、３０ｋｂ〜５０ｋｂを越えるＤＮＡは、サイズにかかわらず、同じ移動度により移動し、１つの大きいぼやけたバンドとしてゲルにおいて認められる。パルス場の方法では、ＤＮＡは、向きが電気泳動期間中に変化させられ、このぼやけたバンドに含まれる異なるサイズのフラグメントが互いに分離し始める。ゲルに対する電場のそれぞれの再配向により、より小さいサイズのＤＮＡは、より大きいＤＮＡよりも迅速に新しい方向で動き始める。従って、より大きいＤＮＡは遅れて移動し、これにより、より小さいＤＮＡからの分離がもたらされる。従って、任意の低分子量ＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡを特定することができる。
【０２２６】
ハイスループット配列決定
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｍ１７ＳＮＡＲのハイスループットショットガン配列決定は、良好な品質スコアを有する３６２６５５３８個の塩基を表し、これにより、ゲノムのおよそ８倍の配列重複率をもたらす５７４０８個の明瞭な高品質「読取り」をもたらした。構築された３つの異なるライブラリーにまたがるこれらの配列の分布が下記の表１５に示される。高コピーの標準的な３ｋｂ〜４ｋｂのゲノムライブラリーは、ゲノムの、末端が対形成する配列解読範囲をもたらすための最も費用効率的な方法を提供し、一方、１０ｋｂライブラリーおよびフォスミドライブラリーは、連続配列「ブロック」を集合プロセスにおいて整列し、配向させることにおいて有用である、末端が対形成する「読取り」からのより大きい物理的連結を提供した。
2009537138.tif 000017
【０２２７】
集合
集合段階では、配列データが、Ｐｈｒｅｄ品質スコア情報に基づいて、ベクターおよび品質についてスクリーニングされた。ライブラリーからのすべての配列「読取り」が最初に相互に比較された。異なる「読取り」の配列の間における同一部分が認められ、その後、これらを使用して、配列を、コンティグと呼ばれる連続する配列区域にアラインメントした。ＤＮＡの同じセグメントの２つの異なる「読取り」の配列は、配列決定反応分析の品質のために同一でない場合がある。従って、コンティグにおけるそれぞれの塩基について、それぞれの塩基が両方向からの多数の重複する「読取り」から独立して確認されることを必要とすることが通常である。
【０２２８】
「読取り」におけるそれぞれの塩基の「品質」を考慮に入れるために設計されたコンティグ構築ソフトウエア（この場合、品質は、塩基が正しく呼び出されているという、Ｐｈｒｅｄソフトウエアが有する信頼度の尺度である）が使用された。配列における何らかのギャップ、不一致または曖昧な部分もまた特定された。その後、異なるコンティグに存在する対形成した「読取り」を使用することによって、コンティグを整列し、連結して、より大きいスーパーコンティグにまとめた。合計で４６４個のコンティグが集められた。その詳細が下記の表１６に示される。全ゲノムの集合を、ＡｇｅｎｃｏｕｒｔのＬＩＭＳシステムと一緒になったＰａｒａｃｅｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ（商標）（バージョン２．６．２）を使用してこのように行い、一方で、Ｐａｒａｃｅｌの足場ビューアーおよびＣｏｎｓｅｄ（バージョン１３．０）を使用して、集合を完成させた。
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【０２２９】
Ｍ１７ＳＮＡＲに特有な配列の特定
可能性のある特有な配列を特定するために、ＢＬＡＳＴ分析を、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｍ１７ＳＮＡＲに特有な配列を明らかにすることを助けるために行った。ＢＬＡＳＴは、「Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ」の略であり（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）、配列間における局所的類似性の領域（アラインメント）を見つけるプログラムである。このプログラムはヌクレオチド配列またはタンパク質配列を配列データベースに対して比較し、一致部分の統計学的有意性を計算する。ＢＬＡＳＴを使用して、配列間における機能的関係および進化論的関係を推測することができ、同様にまた、遺伝子ファミリーのメンバーを特定することを助けることができる。ＢＬＡＳＴ分析は、５つの異なったｂｌａｓｔ比較を行うことを可能にする。本研究のために、ｂｌａｓｔｎ分析が使用された。これは、与えられたヌクレオチド配列を、データベースに存在する他のヌクレオチド配列と比較する。
【０２３０】
ＢＬＡＳＴプログラムが、「質問（ｑｕｅｒｙ）」配列に対するアラインメントを見出すとき、ＢＬＡＳＴプログラムはそのアラインメントを「ヒット（ｈｉｔ）」と呼び、その場合、そのアライメントを、異なる統計学的パラメーターを使用して、２つの配列の間における類似性に基づいてスコア化する。これらの１つがＥｘｐｅｃｔ値（Ｅ）であり、これは、特定サイズのデータベースを検索したとき、単に偶然に認めることが「予想」され得るヒットの数を表すパラメーターとして定義される。Ｅ値は、２つの配列の間における一致に割り当てられるＳｃｏｒｅ（Ｓ）に関して指数的に低下する。本質的には、Ｅ値は、配列間の様々な一致について存在するランダムなバックグラウンドノイズを表す。例えば、ヒットに割り当てられる１のＥ値は、現在のサイズのデータベースにおいて、類似するスコアを有する１つの一致が単に偶然に認められることが予想され得ることを意味するとして解釈することができる。このことは、Ｅ値が低いほど、または、Ｅ値が「０」に近いほど、一致がより「有意」であることを意味する。
【０２３１】
配列類似性が、特定のデータベースに対する「質問」配列のＢＬＡＳＴ分析において何ら見出されないとき、それは、「ヒットが見出されない」として記録される。このことは、質問配列がデータベースにおいてどこにも見出されないことを意味し、このことはその質問配列を特有な配列にする。
【０２３２】
特有な配列を特定するために考案された戦略：
４６４個の全コンティグのすべてが、ＦＡＳＴＡ形式（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｈｔｍｌ／ｓｅａｒｃｈ．ｈｔｍｌ）での個々のコンティグ配列の＊．ｔｘｔファイルとして電子的に提供された。これらのファイルを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＣＦＴ０７３のゲノム配列に対するコンティグ全体の対毎のＢＬＡＳＴ分析において使用し、続いて、アラインメントされない領域をＭ１７コンティグから特定するために使用した。その後、これらのアラインメントされない配列を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５（Ｋ−１２）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＤＬ９３３（Ｏ１５７：Ｈ７）およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｓａｋａｉ（Ｏ１５７：Ｈ７）のゲノム配列に対する何らかの配列相同性を特定するために対毎のＢＬＡＳＴにおいて使用した。その後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＣＦＴ０７３、Ｋ−１２またはＯ１５７：Ｈ７のいずれかのゲノムに対する有意なアラインメント（配列相同性）を示さないセグメントを、ｎｒＮＣＢＩデータベース全体（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）に対するＢＬＡＳＴ検索において使用した。
並行したアプローチにおいて、ＢＬＡＳＴ分析を、２００ｂｐ（塩基対）のフラグメントに最初に分割された４６４個のコンティグのそれぞれに関して行い、その後、２つの特化したデータベースに対して個々にｂｌａｓｔ分析した。構築された第１のデータベースは「Ｅ．ｃｏｌｉ」データベースであり、この場合、Ｅ．ｃｏｌｉの４つの菌株（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ｌｐｒｏｋｓ．ｃｇｉ）が、ＮＣＢＩｒｅｆｓｅｑ＿ｅｃｏｌｉ．ｄｎａと呼ばれるデータベースを作製するために含まれた（含まれる大腸菌株は、ＣＦＴ０７３、Ｋ１２、Ｏ１５７：Ｈ７およびＯ１５７：Ｈ７  ＥＤＬ９３３であった）。第２のデータベースについては、ＮＣＢＩデータベースに２００５年８月１９日において存在するすべての細菌ゲノムが、「Ｂａｃｔｅｒｉａｌ」データベースを作製するために統合され、ＮＣＢＩｒｅｆｓｅｑ＿ｂａｃｔｅｒｉａ．ｄｎａと呼ばれた。次に、２００ｂｐフラグメントのそれぞれを、上記で記載される、Ｅ．ｃｏｌｉおよび細菌の両方の統合されたＮＣＢＩデータベースに対するｂｌａｓｔｎ分析に供した。「ヒットなし」の配列を特有な配列であると特定した。
【０２３３】
９個の特有な２００ｂｐの配列フラグメントがこのようにして特定された。９個の配列のすべてが、「Ｅ．ｃｏｌｉ」データベースに対するヒットを何ら有さず、しかし、「ヒット」が「Ｂａｃｔｅｒｉａ」データベースに対して見出されたが、ほとんどが不良なスコアを有していた。
【０２３４】
結論
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｍ１７ＳＮＡＲの全ゲノムショットガン配列決定が首尾よく完了し、ゲノムのおよそ８倍の配列重複率に至った。この生物に特有な配列を、ＢＬＡＳＴ分析を使用して特定した。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｍ１７ＳＮＡＲのゲノムに見出される特有な配列の記録される存在位置が下記の表１７に示される。９個の特有な配列のそれぞれについて、下記の詳細が実施例８に示される。
配列、長さが２００塩基対。
ＢＬＡＳＴ２．２．１０の結果
Ｅ．ｃｏｌｉデータベースのＮＣＢＩｒｅｆｓｅｑ＿ｅｃｏｌｉ．ｄｎａに対して：ヒットが９個の配列のいずれについても記録されなかった。
ＢａｃｔｅｒｉａｌデータベースのＮＣＢＩｒｅｆｓｅｑ＿ｂａｃｔｅｒｉａ．ｄｎａに対して：上位１０個の最高スコア化ヒットがそれぞれの「Ｅ値」と一緒に表にされる。
【０２３５】
「ｂｌａｓｔｎ」分析に基づいて、９個の２００塩基対の特有な配列フラグメントはどれも、統合されたＥ．ｃｏｌｉデータベースに対する何らかの相同性を示さなかった。これらの同じ配列フラグメントが、統合されたＢａｃｔｅｒｉａｌデータベースに対して比較されたとき、たとえ、配列相同性がほとんどの場合において不良であったとしても、相同性が見出された。９個の配列のうちの８個について、Ｅ．ｃｏｌｉ以外の細菌に対する配列相同性は７％の塩基対一致から１４．５％の塩基対一致にまで変化した（それぞれの配列に対する最高の「ｂｌａｓｔｎ」ヒットについてのパーセント相同性が下記の表１７に示される）。
2009537138.tif 000019
【０２３６】
特有な配列の０８１２０５．ａｓｍ．Ｃ２５０＿３００１＿３２００について、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｎｔｅｒｉｃａ）亜種に対する９０％の塩基対一致が見出された。
【０２３７】
まとめると、大腸菌Ｍ１７ＳＮＡＲの全ゲノム配列決定が完了した。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｍ１７ＳＮＡＲに特有な配列が首尾よく特定されている。
【０２３８】
実施例８
配列情報
実施例８．１
ＢＬＡＳＴ分析を用いて特定された特有的配列
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【０２３９】
実施例８．２
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【０２４０】
実施例８．３
2009537138.tif 000022
【０２４１】
実施例８．４
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【０２４２】
実施例８．５
2009537138.tif 000024
【０２４３】
実施例８．６
2009537138.tif 000025
【０２４４】
実施例８．７
2009537138.tif 000026
【０２４５】
実施例８．８
2009537138.tif 000027
【０２４６】
実施例８．９
2009537138.tif 000028
【０２４７】
明確にするため別個の実施態様で説明されている本発明の特定の特徴は単一の実施態様に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施態様で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
【０２４８】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。本明細書中で言及した刊行物、特許および特許願ならびにＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号はすべて、個々の刊行物、特許もしくは特許願またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
【０２４９】
2009537138.tif 000029
【配列表フリーテキスト】
【０２５０】
配列番号１０〜２３は、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列である。
【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図４】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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