(57)【要約】  本発明は、被検試料中に混入している微生物を簡便な操作で迅速かつ正確に判定することができる微生物検出器具、微生物検出方法および微生物検出キットを提供する。本発明に係る微生物検出器具は、対象となる微生物が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されたマイクロアレイ型の器具である。被検試料から調製したプローブと上記基板表面に固定化されたオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの成立の有無により、被検試料中の微生物を簡便、迅速かつ正確に検出および／または同定することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜６４の核酸配列のいずれかを含んでなるオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
被検試料中の微生物の存在を検出するためのプローブとして用いる、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
核酸配列が配列番号１〜６４の配列のうちのいずれかを含有し、以下の微生物のグループ（ｉ）〜（ｖｉｉ）：
（ｉ）ブレタノマイセス（デッケラ）・ブリュクセレンシス（Brettanomyces (Dekkera) bruxellensis）に属する微生物、
（ｉｉ）ブレタノマイセス（デッケラ）・アノマラ（Brettanomyces (Dekkera) anomala）に属する微生物、
（ｉｉｉ）サッカロマイセス・セレヴィシエ（(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロマイセス・ディアスタティカス（Saccharomyces diastaticus）サッカロマイセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）、もしくはサッカロマイセス・バイヤヌス（Saccharomyces bayanus）に属する微生物、
（ｉｖ）ピキア・アノマラ（Pichia anomala）に属する微生物、
（ｖ）ハンセニアスポウバウムウバラム（Hanseniaspora uvarum）もしくはハンセニアスポラ・グイリアモンディ（Hanseniaspora guilliermondii）に属する微生物、および
（ｖｉ）キャンディダ・バリダ（Candida valida）もしくはピキア・メンブラナエファシエンス（Pichia membranaefaciens）に属する微生物、および
（ｖｉｉ）ブレタノマイセス（デッケラ）・ブリュクセレンシス（Brettanomyces (Dekkera) bruxellensis）もしくはブレタノマイセス（デッケラ）・アノマラ（Brettanomyces (Dekkera) anomala）に属する微生物、
の中から選択された１つのグループに属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得る、またはグループ（ｉ）〜（ｖｉｉ）から選択された複数のグループのそれぞれに属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
被検試料中の微生物の存在を検出するためのオリゴヌクレオチドアレイであって、
支持体に固定された、配列番号１〜６４の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを備える、
オリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項５】
被検試料中の微生物の存在を検出するためのオリゴヌクレオチドアレイであって、支持体に固定された、以下の（Ａ）〜（Ｇ）：
（Ａ）配列番号１〜６、８、および１０〜１４の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号１５〜２２、および２５〜２９の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号３０〜４３の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、
（Ｄ）配列番号４４〜５２の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、
（Ｅ）配列番号５３〜５６の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、
（Ｆ）配列番号５７〜６４の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、もしくは
（Ｇ）配列番号７、９、２３、および２４の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、
のいずれか、またはこれらの任意の組み合わせを備える、オリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項６】
少なくとも前記（Ａ）のオリゴヌクレオチドを備える、請求項５に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項７】
前記微生物が、少なくともブレタノマイセス（デッケラ）・ブリュクセレンシス（Brettanomyces (Dekkera) bruxellensis）に属する微生物である、請求項６に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項８】
少なくとも前記（Ｂ）のオリゴヌクレオチドを備える、請求項５に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項９】
前記微生物が、少なくともブレタノマイセス（デッケラ）・アノマラ（Brettanomyces (Dekkera) anomala）に属する微生物である、請求項８に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項１０】
少なくとも前記（Ｃ）のオリゴヌクレオチドを備える、請求項５に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項１１】
前記微生物が、少なくともサッカロマイセス・セレヴィシエ（(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロマイセス・ディアスタティカス（Saccharomyces diastaticus）サッカロマイセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）、もしくはサッカロマイセス・バイヤヌス（Saccharomyces bayanus）に属する微生物である、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項１２】
少なくとも前記（Ｄ）のオリゴヌクレオチドを備える、請求項５に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項１３】
前記微生物が、少なくともピキア・アノマラ（Pichia anomala）に属する微生物である、請求項１２に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項１４】
少なくとも前記（Ｅ）のオリゴヌクレオチドを備える、請求項５に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項１５】
前記微生物が、少なくともハンセニアスポラ・ウバラム（Hanseniaspora uvarum）もしくはハンセニアスポラ・グイリアモンディ（Hanseniaspora guilliermondii）に属する微生物である、請求項１４に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項１６】
少なくとも前記（Ｆ）のオリゴヌクレオチドを備える、請求項５に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項１７】
前記微生物が、少なくともキャンディダ・バリダ（Candida valida）もしくはピキア・メンブラナエファシエンス（Pichia membranaefaciens）に属する微生物である、請求項１６に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項１８】
少なくとも前記（Ｇ）のオリゴヌクレオチドを備える、請求項５に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項１９】
前記微生物が、少なくともブレタノマイセス（デッケラ）・ブリュクセレンシス（Brettanomyces (Dekkera) bruxellensis）に属する微生物、またはブレタノマイセス（デッケラ）・アノマラ（Brettanomyces (Dekkera) anomala）に属する微生物のいずれかである、請求項１８に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項２０】
前記被検試料が食品である、請求項４〜１９のいずれか１項に記載のアレイ。
【請求項２１】
被検試料中の微生物が、以下の微生物のグループ（ｉ）〜（ｖｉｉ）：
（ｉ）ブレタノマイセス（デッケラ）・ブリュクセレンシス（Brettanomyces (Dekkera) bruxellensis）に属する微生物、
（ｉｉ）ブレタノマイセス（デッケラ）・アノマラ（Brettanomyces (Dekkera) anomala）に属する微生物、
（ｉｉｉ）サッカロマイセス・セレヴィシエ（(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロマイセス・ディアスタティカス（Saccharomyces diastaticus）サッカロマイセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）、もしくはサッカロマイセス・バイヤヌス（Saccharomyces bayanus）に属する微生物、
（ｉｖ）ピキア・アノマラ（Pichia anomala）に属する微生物、
（ｖ）ハンセニアスポラ・ウバラム（Hanseniaspora uvarum）もしくはハンセニアスポラ・グイリアモンディ（Hanseniaspora guilliermondii）に属する微生物、および
（ｖｉ）キャンディダ・バリダ（Candida valida）もしくはピキア・メンブラナエファシエンス（Pichia membranaefaciens）に属する微生物、および
（ｖｉｉ）ブレタノマイセス（デッケラ）・ブリュクセレンシス（Brettanomyces (Dekkera) bruxellensis）もしくはブレタノマイセス（デッケラ）・アノマラ（Brettanomyces (Dekkera) anomala）に属する微生物、
の中から選択される１つのグループの微生物であること、または複数のグループのうちのいずれかのグループの微生物であることを検出・同定するための器具であって、
選択された１つのグループに属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得る少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、または選択された複数のグループのそれぞれに属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得る少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを固定した支持体を備える、器具。
【請求項２２】
前記グループ（ｉ）に属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが、配列番号１〜６、８、および１０〜１４の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなるオリゴヌクレオチドである、請求項２１に記載の器具。
【請求項２３】
前記グループ（ｉｉ）に属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが、配列番号１５〜２２、および２５〜２９の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなるオリゴヌクレオチドである、請求項２１に記載の器具。
【請求項２４】
前記グループ（ｉｉｉ）に属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが、配列番号３０〜４３の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなるオリゴヌクレオチドである、請求項２１に記載の器具。
【請求項２５】
前記グループ（ｉｖ）に属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが、配列番号４４〜５２の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなるオリゴヌクレオチドである、請求項２１に記載の器具。
【請求項２６】
前記グループ（ｖ）に属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが、配列番号５３〜５６の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなるオリゴヌクレオチドである、請求項２１に記載の器具。
【請求項２７】
前記グループ（ｖｉ）に属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが、配列番号５７〜６４の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなるオリゴヌクレオチドである、請求項２１に記載の器具。
【請求項２８】
前記グループ（ｖｉｉ）に属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが、配列番号７、９、２３、および２４の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなるオリゴヌクレオチドである、請求項２１に記載の器具。
【請求項２９】
前記支持体表面にカルボジイミド基またはイソシアネート基を有し、当該カルボジイミド基またはイソシアネート基と前記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド末端に付加されたリンカーとの反応により共有結合が形成されることにより、前記オリゴヌクレオチドが前記支持体に固定されていることを特徴とする、請求項２１〜２８のいずれか１項に記載の器具。
【請求項３０】
被検試料中の微生物の検出、被検試料中の微生物が属するグループの同定、または被検試料中の微生物の検出と該微生物が属するグループの同定とを行うための方法であって、
被検試料中の微生物の核酸を調製する核酸調製工程と、
当該核酸を鋳型として標識プローブを調製するプローブ調製工程と、
請求項１〜３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、請求項４〜２０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアレイ、または請求項２１〜２９のいずれか１項に記載の器具を用いて、支持体表面に固定されたオリゴヌクレオチドと前記標識プローブとのハイブリダイゼーションを行うハイブリダイゼーション工程と、
ハイブリダイゼーションシグナルを検出するシグナル検出工程と、
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項３１】
前記被検試料が食品であることを特徴とする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
請求項３０または３１に記載の方法を実施するための微生物検出キットであって、
請求項１〜３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、請求項４〜２０のいずれか１項に記載のアレイ、または請求項２１〜２９のいずれか１項に記載の器具を含む、
キット。
【請求項３３】
さらに、前記ハイブリダイゼーション工程およびシグナル検出工程で用いる試薬を含む、
請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
さらに、前記プローブ調製工程および／または前記核酸調製工程で用いる試薬を含む、請求項３２または３３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物検出用オリゴヌクレオチドおよびそのアレイ、微生物検出器具、微生物検出方法ならびに微生物検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
食品中に有害微生物が混入すると、品質劣化の原因となる。例えば、麦芽アルコール飲料中に有害な微生物が混入した場合、濁りや風味劣化などが生じる。さらに、例えば、ビールにおいては、ブレタノマイセス（デッケラ）（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  （Ｄｅｋｋｅｒａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ハンセニアスポラ（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ）属、醸造用酵母以外のサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属といった非醸造用酵母が混入すると、ビールの品質が低下し、混濁やオフフレーバーの原因となる。これらの有害微生物を検出する方法として、現在最も一般的なものは、対象となるビールをメンブランフィルターでろ過後、適当な培地中で培養し、生育するコロニーを検出する方法である。
【０００３】
さらに、このコロニーが上記有害微生物であるかどうかを判定する方法としては、コロニーから抽出したＤＮＡを鋳型として、上記有害微生物に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物が得られるかどうかを電気泳動で判定する方法（例えば、特開平７−２８９２９５号公報を参照）が用いられている。しかしながら、この方法では、菌種ごとに多数のプライマーを用いてＰＣＲを複数回行う必要があるため、操作が極めて煩雑であり、迅速性に問題がある。また、要する時間を短縮するために多数のプライマーを混合して１つのチューブで増幅反応を行うことは可能であるが、使用できるプライマーの数には限界があり、微量な検体に基づいて正確な判定を行う事は困難である。
【０００４】
上記問題点を解決するために、それぞれの菌種に普遍的に存在している遺伝子の種特異的な配列を含む部分が増幅されるようにプライマーを設計し、増幅後に種特異的な配列を認識する制限酵素で増幅産物を切断し、電気泳動で得られるバンドサイズからどの菌種の遺伝子であるかを特定する方法が用いられている。しかしながら、必ずしも対象となる全ての菌種について判別可能な制限酵素が存在するとは限らず、また、得られた増幅産物を数種類の制限酵素で各々切断し、電気泳動に供するという極めて煩雑な操作が必要であり、迅速性、簡便性という面では問題がある。
【０００５】
さらに、上記のような問題点を解決するために、種特異的な配列をプローブとして用い、被検体中のＤＮＡまたはＲＮＡにその配列と相補的な配列が存在するかどうかをハイブリダイゼーションによって判定する方法も行われている。
【特許文献１】特開平７−２８９２９５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記ハイブリダイゼーションによって判定する方法でも、非常に近縁でＤＮＡの相同性が高い菌種では、別の種と誤ってハイブリダイズしてしまうクロスハイブリダイゼーションが頻繁に生じるという問題があり、正確に菌種を同定することが困難となる場合も生じる。
【０００７】
したがって、特定の微生物の存在の有無をより正確かつ簡便または迅速に判定するための菌種の判別方法が求められている。
【０００８】
特に、上記方法に用いることのできるクロスハイブリダイゼーションの問題を生じない、特異的な核酸プローブが求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、麦芽アルコール飲料の代表的な汚染微生物のＩＴＳ領域（微生物の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子と２５ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の間のスペーサー領域）に対応する塩基配列において、特定の属または特定の種に特異的な配列を見出し、この塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドをプローブとして用いることにより、迅速かつ正確に被検試料中の目的の微生物を検出および／または同定できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下に示すオリゴヌクレオチド、被検試料中の微生物の存在を検出するためのオリゴヌクレオチドアレイ、そのようなアレイを備える微生物検出用器具、キット、および被検試料中の微生物の存在を検出する方法を提供する。
（１）配列番号１〜６４の核酸配列のいずれかを含んでなるオリゴヌクレオチド。
（１ａ）配列番号１〜６４の核酸配列のいずれかからなるオリゴヌクレオチド。
（２）被検試料中の微生物の存在を検出するためのプローブとして用いる、上記（１）または（１ａ）に記載のオリゴヌクレオチド。
（２ａ）上記被検試料が食品である、上記（２）に記載のオリゴヌクレオチド。
（２ｂ）上記被検試料が麦芽アルコール飲料である、上記（２）に記載のオリゴヌクレオチド。
（３）核酸配列が配列番号１〜６４の配列のうちのいずれかを含有し、以下の微生物のグループ（ｉ）〜（ｖｉｉ）：
（ｉ）ブレタノマイセス（デッケラ）・ブリュクセレンシス（Brettanomyces (Dekkera) bruxellensis）に属する微生物、
（ｉｉ）ブレタノマイセス（デッケラ）・アノマラ（Brettanomyces (Dekkera) anomala）に属する微生物、
（ｉｉｉ）サッカロマイセス・セレヴィシエ（(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロマイセス・ディアスタティカス（Saccharomyces diastaticus）サッカロマイセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）、もしくはサッカロマイセス・バイヤヌス（Saccharomyces bayanus）に属する微生物、
（ｉｖ）ピキア・アノマラ（Pichia anomala）に属する微生物、
（ｖ）ハンセニアスポウバウムウバラム（Hanseniaspora uvarum）もしくはハンセニアスポラ・グイリアモンディ（Hanseniaspora guilliermondii）に属する微生物、および
（ｖｉ）キャンディダ・バリダ（Candida valida）もしくはピキア・メンブラナエファシエンス（Pichia membranaefaciens）に属する微生物、および
（ｖｉｉ）ブレタノマイセス（デッケラ）・ブリュクセレンシス（Brettanomyces (Dekkera) bruxellensis）もしくはブレタノマイセス（デッケラ）・アノマラ（Brettanomyces (Dekkera) anomala）に属する微生物、
の中から選択された１つのグループに属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得る、またはグループ（ｉ）〜（ｖｉｉ）から選択された複数のグループのそれぞれに属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド。
【００１１】
（４）被検試料中の微生物の存在を検出するためのオリゴヌクレオチドアレイであって、
支持体に固定された、配列番号１〜６４の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、
オリゴヌクレオチドアレイ。
（４ａ）被検試料中の微生物の存在を検出するためのオリゴヌクレオチドアレイであって、
支持体に固定された、配列番号１〜６４の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列からなる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、
オリゴヌクレオチドアレイ。
（５）被検試料中の微生物の存在を検出するためのオリゴヌクレオチドアレイであって、支持体に固定された、以下の（Ａ）〜（Ｇ）：
（Ａ）配列番号１〜６、８、および１０〜１４の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号１５〜２２、および２５〜２９の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号３０〜４３の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、
（Ｄ）配列番号４４〜５２の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、
（Ｅ）配列番号５３〜５６の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、
（Ｆ）配列番号５７〜６４の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、もしくは
（Ｇ）配列番号７、９、２３、および２４の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、
のいずれか、またはこれらの任意の組み合わせを含む、オリゴヌクレオチドアレイ。
（５ａ）被検試料中の微生物の存在を検出するためのオリゴヌクレオチドアレイであって、支持体に固定された、以下の（Ａ）〜（Ｇ）：
（Ａ）配列番号１〜６、８、および１０〜１４の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列からなる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号１５〜２２、および２５〜２９の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列からなる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号３０〜４３の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列からなるオリゴヌクレオチド、
（Ｄ）配列番号４４〜５２の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列からなる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、
（Ｅ）配列番号５３〜５６の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列からなる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、
（Ｆ）配列番号５７〜６４の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列からなる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、もしくは
（Ｇ）配列番号７、９、２３、および２４の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列からなる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、
のいずれか、またはこれらの任意の組み合わせからなる、オリゴヌクレオチドアレイ。
（６）少なくとも上記（Ａ）のオリゴヌクレオチドを含む、上記（５）に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
（７）上記微生物が、少なくともブレタノマイセス（デッケラ）・ブリュクセレンシス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  （Ｄｅｋｋｅｒａ）  ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ）に属する微生物である、上記（６）に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
（８）少なくとも上記（Ｂ）のオリゴヌクレオチドを含む、上記（５）に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
（９）上記微生物が、少なくともブレタノマイセス（デッケラ）・アノマラ（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  （Ｄｅｋｋｅｒａ）  ａｎｏｍａｌａ）に属する微生物である、上記（８）に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
（１０）少なくとも上記（Ｃ）のオリゴヌクレオチドを含む、上記（５）に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
（１１）上記微生物が、少なくともサッカロマイセス・セレヴィシエ（（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ディアスタティカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）サッカロマイセス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）、もしくはサッカロマイセス・バイヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）に属する微生物である、上記（１０）に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
（１２）少なくとも上記（Ｄ）のオリゴヌクレオチドを含む、上記（５）に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
（１３）上記微生物が、少なくともピキア・アノマラ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｏｍａｌａ）に属する微生物である、上記（１２）に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
（１４）少なくとも上記（Ｅ）のオリゴヌクレオチドを含む、上記（５）に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
（１５）上記微生物が、少なくともハンセニアスポラ・ウバラム（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｕｖａｒｕｍ）もしくはハンセニアスポラ・グイリアモンディ（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）に属する微生物である、上記（１４）に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
（１６）少なくとも上記（Ｆ）のオリゴヌクレオチドを含む、上記（５）に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
（１７）上記微生物が、少なくともキャンディダ・バリダ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｖａｌｉｄａ）もしくはピキア・メンブラナエファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）に属する微生物である、上記（１６）に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
（１８）少なくとも上記（Ｇ）のオリゴヌクレオチドを含む、上記（５）に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
（１９）上記微生物が、少なくともブレタノマイセス（デッケラ）・ブリュクセレンシス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  （Ｄｅｋｋｅｒａ）  ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ）に属する微生物、またはブレタノマイセス（デッケラ）・アノマラ（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  （Ｄｅｋｋｅｒａ）  ａｎｏｍａｌａ）に属する微生物のいずれかである、上記（１８）に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
（２０）上記被検試料が食品である、上記（４）〜（１９）のいずれかに記載のアレイ。
（２０ａ）上記被検試料が麦芽アルコール飲料である、上記（４）〜（１９）のいずれかに記載のアレイ。
【００１２】
（２１）被検試料中の微生物が、以下の微生物のグループ（ｉ）〜（ｖｉｉ）：
（ｉ）ブレタノマイセス（デッケラ）・ブリュクセレンシス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  （Ｄｅｋｋｅｒａ）  ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ）に属する微生物、
（ｉｉ）ブレタノマイセス（デッケラ）・アノマラ（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  （Ｄｅｋｋｅｒａ）  ａｎｏｍａｌａ）に属する微生物、
（ｉｉｉ）サッカロマイセス・セレヴィシエ（（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ディアスタティカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）サッカロマイセス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）、もしくはサッカロマイセス・バイヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）のいずれかに属する微生物、
（ｉｖ）ピキア・アノマラ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｏｍａｌａ）に属する微生物、
（ｖ）ハンセニアスポラ・ウバラム（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｕｖａｒｕｍ）もしくはハンセニアスポラ・グイリアモンディ（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）のいずれかに属する微生物、および
（ｖｉ）キャンディダ・バリダ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｖａｌｉｄａ）もしくはピキア・メンブラナエファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）のいずれかに属する微生物、および
（ｖｉｉ）ブレタノマイセス（デッケラ）・ブリュクセレンシス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  （Ｄｅｋｋｅｒａ）  ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ）もしくはブレタノマイセス（デッケラ）・アノマラ（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  （Ｄｅｋｋｅｒａ）  ａｎｏｍａｌａ）のいずれかに属する微生物、
の中から選択される１つのグループの微生物であること、または複数のグループのうちのいずれかのグループの微生物であることを検出および／または同定するための器具であって、
選択された１つのグループに属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得る少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、または選択された複数のグループのそれぞれに属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得る少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを固定した支持体を備える、器具。
（２２）上記グループ（ｉ）に属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが、配列番号１〜６、８、および１０〜１４の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなるオリゴヌクレオチドである、上記（２１）に記載の器具。
（２２ａ）上記グループ（ｉ）に属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが、配列番号１〜６、８、および１０〜１４の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列からなるオリゴヌクレオチドである、上記（２１）に記載の器具。
（２３）上記グループ（ｉｉ）に属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが、配列番号１５〜２２、および２５〜２９の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなるオリゴヌクレオチドである、上記（２１）に記載の器具。
（２３ａ）上記グループ（ｉｉ）に属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが、配列番号１５〜２２、および２５〜２９の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列からなるオリゴヌクレオチドである、上記（２１）に記載の器具。
（２４）上記グループ（ｉｉｉ）に属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが、配列番号３０〜４３の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなるオリゴヌクレオチドである、上記（２１）に記載の器具。
（２４ａ）上記グループ（ｉｉｉ）に属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが、配列番号３０〜４３の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列からなるオリゴヌクレオチドである、上記（２１）に記載の器具。
（２５）上記グループ（ｉｖ）に属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが、配列番号４４〜５２の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなるオリゴヌクレオチドである、上記（２１）に記載の器具。
（２５ａ）上記グループ（ｉｖ）に属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが、配列番号４４〜５２の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列からなるオリゴヌクレオチドである、上記（２１）に記載の器具。
（２６）上記グループ（ｖ）に属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが、配列番号５３〜５６の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなるオリゴヌクレオチドである、上記（２１）に記載の器具。
（２６ａ）上記グループ（ｖ）に属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが、配列番号５３〜５６の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列からなるオリゴヌクレオチドである、上記（２１）に記載の器具。
（２７）上記グループ（ｖｉ）に属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが、配列番号５７〜６４の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなるオリゴヌクレオチドである、上記（２１）に記載の器具。
（２７ａ）上記グループ（ｖｉ）に属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが、配列番号５７〜６４の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列からなるオリゴヌクレオチドである、上記（２１）に記載の器具。
（２８）上記グループ（ｖｉｉ）に属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが、配列番号７、９、２３、および２４の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなるオリゴヌクレオチドである、上記（２１）に記載の器具。
（２８ａ）上記グループ（ｖｉｉ）に属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが、配列番号７、９、２３、および２４の核酸配列からなる群から選択されるいずれか核酸配列からなるオリゴヌクレオチドである、上記（２１）に記載の器具。
（２９）上記支持体表面にカルボジイミド基またはイソシアネート基を有し、当該カルボジイミド基またはイソシアネート基と上記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド末端に付加されたリンカーとの反応により共有結合が形成されることにより、上記オリゴヌクレオチドが支持体に固定されていることを特徴とする、上記（２１）〜（２８ａ）のいずれか１項に記載の器具。
【００１３】
（３０）被検試料中の微生物の検出、被検試料中の微生物が属するグループの同定、または被検試料中の微生物の検出と該微生物が属するグループの同定とを行うための方法であって、
被検試料中の微生物の核酸を調製する核酸調製工程と、
当該核酸を鋳型として標識プローブを調製するプローブ調製工程と、
上記（１）〜（３）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、上記（４）〜（２０）のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアレイ、または上記（２１）〜（２９）のいずれか１項に記載の器具を用いて、支持体表面に固定されたオリゴヌクレオチドと上記標識プローブとのハイブリダイゼーションを行うハイブリダイゼーション工程と、
ハイブリダイゼーションシグナルを検出するシグナル検出工程と、
を含むことを特徴とする、方法。
（３１）上記被検試料が食品であることを特徴とする、上記（３０）に記載の方法。
（３１ａ）上記被検試料が麦芽アルコール飲料であることを特徴とする、上記（３０）に記載の方法。
【００１４】
（３２）上記（３０）〜（３１ａ）のいずれか１項に記載の方法を実施するための微生物検出キットであって、
上記（１）〜（３）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、上記（４）〜（２０）のいずれか１項に記載のアレイ、または上記（２１）〜（２９）のいずれか１項に記載の器具を含む、
キット。
（３３）さらに、上記ハイブリダイゼーション工程およびシグナル検出工程で用いる試薬を含む、
上記（３２）に記載のキット。
（３４）さらに、上記プローブ調製工程および／または上記核酸調製工程で用いる試薬を含む、上記（３２）または（３３）に記載のキット。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、被検試料中の微生物を検出および／または同定する方法において、クロスハイブリダイゼーションの問題を最小限に抑えることができるオリゴヌクレオチドプローブが提供される。
【００１６】
本発明に係る微生物検出用オリゴヌクレオチドアレイまたは微生物検出器具によれば、対象となる微生物が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドを使用して当該オリゴヌクレオチドと被検試料に由来する核酸とのハイブリダイゼーションを行うことにより、被検試料中の微生物を検出および／または同定するため、正確かつ簡便に微生物の検出および／または同定を行うことができる。
【００１７】
また、基板表面に複数の微生物種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドを含むアレイを使用することにより、網羅的な検査を行うことができる。
【００１８】
さらに、本発明に係る微生物検出キットは、上記微生物検査オリゴヌクレオチドアレイまたは微生物検査器具および必要な試薬を含むものであるため、向上した操作性が提供され、従来よりも一層簡便に微生物の検出および／または同定を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、１つの局面において、配列番号１〜６４の核酸配列のいずれかを含んでなるオリゴヌクレオチドを提供する（表１−１および表１−２を参照）。これらのオリゴヌクレオチドは、被検試料中の微生物の存在を検出するためのプローブとして用いることができる。上記被検試料は、好ましくは、食品であり、より好ましくは、麦芽アルコール飲料である。
【００２０】
本発明のオリゴヌクレオチドを使用して検出し得る被検試料中の微生物は、（ｉ）ブレタノマイセス（デッケラ）・ブリュクセレンシス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  （Ｄｅｋｋｅｒａ）  ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ）に属する微生物、（ｉｉ）ブレタノマイセス（デッケラ）・アノマラ（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  （Ｄｅｋｋｅｒａ）  ａｎｏｍａｌａ）に属する微生物、（ｉｉｉ）サッカロマイセス・セレヴィシエ（（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ディアスタティカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）サッカロマイセス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）、もしくはサッカロマイセス・バイヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）のいずれかに属する微生物、（ｉｖ）ピキア・アノマラ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｏｍａｌａ）に属する微生物、（ｖ）ハンセニアスポラ・ウバラム（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｕｖａｒｕｍ）もしくはハンセニアスポラ・グイリアモンディ（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）のいずれかに属する微生物、（ｖｉ）キャンディダ・バリダ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｖａｌｉｄａ）もしくはピキア・メンブラナエファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）のいずれかに属する微生物、および（ｖｉｉ）ブレタノマイセス（デッケラ）・ブリュクセレンシス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  （Ｄｅｋｋｅｒａ）  ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ）もしくはブレタノマイセス（デッケラ）・アノマラ（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  （Ｄｅｋｋｅｒａ）  ａｎｏｍａｌａ）のいずれかに属する微生物である。
【００２１】
また、本発明は、別の局面において、被検試料中の微生物の存在を検出するためのオリゴヌクレオチドアレイを提供する。このオリゴヌクレオチドアレイは、支持体に固定された、配列番号１〜６４の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。
【００２２】
本発明において、被検試料中の微生物を検出および／または同定するためのプローブとして使用され得るオリゴヌクレオチドは、以下に示すように種または属によってグループ分けすることができる。本発明に係る微生物検出用オリゴヌクレオチドアレイまたは微生物検出器具において、これらのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つ以上が支持体表面に固定されている。
【００２３】
（Ａ）ブレタノマイセス（デッケラ）・ブリュクセレンシス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  （Ｄｅｋｋｅｒａ）  ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ）に属する微生物のＩＴＳ領域に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号１〜６、８、および１０〜１４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００２４】
（Ｂ）ブレタノマイセス（デッケラ）・アノマラ（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  （Ｄｅｋｋｅｒａ）  ａｎｏｍａｌａ）に属する微生物のＩＴＳ領域に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号１５〜２２、および２５〜２９に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００２５】
（Ｃ）サッカロマイセス・セレヴィシエ（（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ディアスタティカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）サッカロマイセス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）、サッカロマイセス・バイヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）に属する微生物のＩＴＳ領域に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号３０ないし４３に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００２６】
（Ｄ）ピキア・アノマラ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｏｍａｌａ）のＩＴＳ領域に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号４４ないし５２に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００２７】
（Ｅ）ハンセニアスポラ・ウバラム（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｕｖａｒｕｍ）もしくはハンセニアスポラ・グイリアモンディ（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）のＩＴＳ領域に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号５３ないし５６に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００２８】
（Ｆ）キャンディダ・バリダ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｖａｌｉｄａ）もしくはピキア・メンブラナエファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）のＩＴＳ領域に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号５７ないし６４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００２９】
上記（Ａ）〜（Ｆ）に記載のオリゴヌクレオチドを支持体（例えば、基板）表面に固定化した本発明の微生物検出用オリゴヌクレオチドアレイまたは微生物検出器具を用いることにより、食品中の汚染菌、特に麦芽アルコール飲料（ビール）、雑酒（発泡酒）、リキュール類、低アルコール飲料（例えば、アルコール分１％未満の麦芽発酵飲料、ビールテイスト飲料）中の汚染菌を網羅的に検出および／または同定することが可能となる。
【００３０】
さらに、上記オリゴヌクレオチドに加えて、下記（Ｇ）に記載のオリゴヌクレオチドを上記基板表面に固定化した本発明のオリゴヌクレオチドアレイまたは微生物検出器具を使用して、食品中の汚染菌を網羅的に検出および／または同定することができる。
【００３１】
（Ｇ）ブレタノマイセス（デッケラ）・ブリュクセレンシス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  （Ｄｅｋｋｅｒａ）  ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ）もしくはブレタノマイセス（デッケラ）・アノマラ（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  （Ｄｅｋｋｅｒａ）  ａｎｏｍａｌａ）のＩＴＳ領域に対応する塩基配列のうち、これらの種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号７、９、２３、および２４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００３２】
表１−１および表１−２に、配列番号１〜６４の配列およびそれらに対応する微生物にちなんで命名したオリゴ名を記載して示す。なお、表１−３は、後に詳述するが、本発明において使用するコントロールオリゴヌクレオチド等の配列を示す。
【表１−１】
2009504134.tif 000002
【表１−２】
2009504134.tif 000003
【表１−３】
2009504134.tif 000004
【００３３】
本発明はまた、被検試料中の微生物を検出および／または同定するための方法を提供し、この方法は、被検試料中の微生物の核酸を調製する核酸調製工程と、当該核酸を鋳型として標識プローブを調製するプローブ調製工程と、上記本発明に係る微生物検出用オリゴヌクレオチドアレイまたは微生物検出器具を用いて、支持体表面に固定化されたオリゴヌクレオチドと上記標識プローブとのハイブリダイゼーションを行うハイブリダイゼーション工程と、ハイブリダイゼーションシグナルを検出するシグナル検出工程とを含むことを特徴としている。
【００３４】
本発明に係る微生物検出方法の被検試料としては、食品が好適であり、なかでも麦芽アルコール飲料等の飲料が最も適している。
【００３５】
本発明はまた、微生物検出キットを提供し、このキットは、代表的には上記本発明に係る微生物検出方法を実施するために使用され、上記本発明に係る微生物検出器具が含まれる。さらに、ハイブリダイゼーション工程、シグナル検出工程、プローブ調製工程、核酸調製工程で用いる試薬を含むことが好ましい。
【００３６】
以下、本発明の実施の形態についてさらに詳細に説明する。なお、本発明は、これらの実施形態に限定されるものではない。
【００３７】
（１）本発明に係る微生物検出用オリゴヌクレオチドアレイまたは微生物検出器具
本発明に係る被検試料中の微生物を検出および／または同定するためのオリゴヌクレオチドアレイまたは器具においては、対象となる微生物が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板のような支持体表面に固定化されており、当該オリゴヌクレオチドと被検試料に由来する核酸とのハイブリダイゼーションにより被検試料中の微生物が検出および／または同定される。
【００３８】
〔支持体〕
本発明に係る微生物検出器具に用いる支持体としては、オリゴヌクレオチドを安定して固定化することができるものであればよい。例えば、ポリカーボネートやプラスチックなどの合成樹脂、ガラス等でできた基板を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。支持体の形態も特に限定されるものではないが、例えば、板状、フィルム状等の基板を好適に用いることができる。
【００３９】
また、支持体にオリゴヌクレオチドを結合させる方法は、当業者に周知のものが使用され得る（例えば、特許公表２００３−５３０８６１；特許公表２００４−５２６４０２などに記載される手順が参照され得る）。本発明に係る微生物検出用オリゴヌクレオチドアレイまたは微生物検出器具においては、上記支持体表面にカルボジイミド基またはイソシアネート基を有し、当該カルボジイミド基またはイソシアネート基と上記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド末端に付加されたリンカーとの反応により共有結合が形成されることが好ましい。
【００４０】
〔支持体表面に固定化されるオリゴヌクレオチド〕
本発明に係るオリゴヌクレオチドアレイまたは微生物検出器具の支持体表面に固定化されるオリゴヌクレオチドは、検出対象微生物が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドであればよい。当該オリゴヌクレオチドと被検試料由来の核酸との間にハイブリダイゼーションが成立することにより、被検試料中に含まれている目的の種または属に属する微生物を検出することが可能となる。なお、上記検出対象微生物が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドを、以下適宜「キャプチャーオリゴ」と称する。
【００４１】
上記特異的な塩基配列は、検出対象微生物のゲノムの塩基配列から属または種特異的な塩基配列を見出せばよいが、検出対象微生物のリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列から見出すことが好ましい。なかでも微生物の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子と２５ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の間のスペーサー領域（ＩＴＳ領域）は属または種特異的な塩基配列を多く有していることが知られており、ＩＴＳ領域に対応するＤＮＡ配列中から属または種特異的な塩基配列を見出すことが特に好ましい。ＩＴＳ領域の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ等のデータベース等から入手することができる。
【００４２】
キャプチャーオリゴは上記属または種特異的な塩基配列に基づいて設計すればよい。したがって、上記属または種特異的な塩基配列そのものであってもよいし、検出対象微生物から調製した核酸と特異的なハイブリダイゼーションが成立する限りにおいて、例えば、数個の塩基の置換、欠失、挿入、および／または付加などの変異が含まれていてもよい。変異の位置は特に限定されるものではない。
【００４３】
キャプチャーオリゴの長さ（塩基数）は特に限定されるものではないが、短すぎるとハイブリダイゼーションの検出が困難になり、長すぎると非特異的ハイブリダイゼーションを許容してしまう。発明者らは、キャプチャーオリゴの長さの最適化について検討を重ね、標準的な長さを１２〜２４塩基とした。より好ましくは１３〜２２塩基である。ただし、これに限定されるものではなく、例えば、この範囲の長さよりも数塩基短いもの（例えば、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基）または数塩基長いもの（例えば、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基）などでもよい。塩基長は主として配列特性（特定の塩基の含有率，同一塩基のリピート）に依存するものであり、結合性の良いものは短鎖でも特異的ハイブリダイゼーションが可能であることが、発明者らにより確認されている。
【００４４】
キャプチャーオリゴが、被検試料由来の核酸とのハイブリダイゼーションを妨害するヘアピン構造、ループ構造、またはそれ以外の立体構造を持つ場合、キャプチャーオリゴを構成する１またはそれ以上のヌクレオチドをイノシンまたはいずれのヌクレオチドとも対合しない核酸に置換することにより、その立体構造を解除することができる。
【００４５】
キャプチャーオリゴの合成法は特に限定されるものではなく、公知の方法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）に記載の方法等）により合成すればよい。一般的には、市販のＤＮＡ合成機を用いて化学合成することができる。
【００４６】
本発明に係るオリゴヌクレオチドアレイまたは微生物検出器具において、上記検出対象微生物が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドのみではなく、それらに加えて、いわゆるコントロール・キャプチャーオリゴを支持体表面に固定化することが好ましい。コントロール・キャプチャーオリゴには、陽性コントロール・キャプチャーオリゴおよび陰性コントロール・キャプチャーオリゴが含まれる（表１−３を参照）。陽性コントロール・キャプチャーオリゴは、後述するプローブ調製工程において増幅反応がうまくいっているかどうかと、ハイブリダイゼーションがうまく行っているかどうかを判定するために用いるものである。陰性コントロール・キャプチャーオリゴは、非特異的ハイブリダイゼーションが生じていないこと、すなわち擬陽性のハイブリダイゼーションシグナルが生じていないことを確認するために用いるものである。これらの陽性コントロール・キャプチャーオリゴおよび陰性コントロール・キャプチャーオリゴが支持体表面に固定化された微生物検出用アレイまたは器具も本発明に含まれる。
【００４７】
陽性コントロール・キャプチャーオリゴは検出対象微生物から調製するプローブに含まれる塩基配列に基づいて設計されるものであればよい。また、複数の検出対象微生物を同時に同一の微生物検出器具を用いて検出する場合には、各検出対象微生物について陽性コントロール・キャプチャーオリゴを設計してもよいが、複数の検出対象微生物から調製するプローブに共通する塩基配列に基づいて設計してもよい。すべての検出対象微生物から調製するプローブに共通する塩基配列がない場合は、いくつかのグループごとに陽性コントロール・キャプチャーオリゴを設計してもよい。あるいは、プライマー配列部分が同じで、対象となる微生物の配列とは異なる人工的な配列を設計し、この配列の一部を陽性コントロール・キャプチャーオリゴとすることもできる。上記人工的な配列を鋳型としてプローブを調製し（本明細書では、このようなプローブをコントロールプローブと称する。）、被検試料から調製したプローブに添加することにより、ハイブリダイゼーションの特異性を検証することが可能となる。なお、上記プローブについては後述する。
【００４８】
陰性コントロール・キャプチャーオリゴは、陽性コントロール・キャプチャーオリゴの塩基配列において、１塩基以上であり、かつ、当該配列の有する塩基数の２０％未満の範囲内で人為的な塩基の置換を含む塩基配列を有するように設計することが好ましい。塩基置換を行う塩基数は、ハイブリダイゼーションの条件との関係で決定され、検出対象微生物由来のプローブがハイブリダイゼーションを生じないような塩基数を選択すればよい。
【００４９】
検出対象微生物は特に限定されるものではなく、目的とする被検試料中から検出しようとする微生物を適宜選択すればよい。例えば、食品中に混入し当該食品を汚染する可能性のある微生物を挙げることができる。食品中に有害な微生物が混入することは、公衆衛生上非常に大きな問題となる。また、ビールや発泡酒に代表される麦芽アルコール飲料においては、有害な微生物が混入した場合、濁りや風味劣化などの品質劣化の原因となるため、これらの有害微生物を迅速かつ正確に検出および／または同定する方法の開発が特に強く望まれている。
【００５０】
麦芽アルコール飲料を含む食品を汚染する微生物、特に真菌としては、ブレタノマイセス（デッケラ）（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  （Ｄｅｋｋｅｒａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ハンセニアスポラ（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ）属、醸造用酵母以外のサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物を挙げることができる。また、ブレタノマイセス（デッケラ）（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  （Ｄｅｋｋｅｒａ）属に属する真菌種としては、ブレタノマイセス（デッケラ）・ブリュクセレンシス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  （Ｄｅｋｋｅｒａ）  ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ）、ブレタノマイセス（デッケラ）・アノマラ（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  （Ｄｅｋｋｅｒａ）  ａｎｏｍａｌａ）を挙げることができる。また、醸造用酵母以外のサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する真菌種としては、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）もしくはサッカロマイセス・ディアスタティカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセス・バイヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）を挙げることができる。
【００５１】
また、食品を汚染する真菌として、上記の他にピキア・アノマラ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｏｍａｌａ）、ハンセニアスポラ・ウバラム（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｕｖａｒｕｍ）、ハンセニアスポラ・グイリアモンディ（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、キャンディダ・バリダ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｖａｌｉｄａ）、ピキア・メンブラナエファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）を挙げることができる。ただし、検出対象微生物はこれらに限定されるものではない。
【００５２】
上記例示した微生物を検出および／または同定するためのキャプチャーオリゴとしては、ブレタノマイセス（デッケラ）・ブリュクセレンシス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  （Ｄｅｋｋｅｒａ）  ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ）、ブレタノマイセス（デッケラ）・アノマラ（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  （Ｄｅｋｋｅｒａ）  ａｎｏｍａｌａ）サッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ディアスタティカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）、サッカロマイセス・バイヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）、ピキア・アノマラ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｏｍａｌａ）、ハンセニアスポラ・ウバラム（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｕｖａｒｕｍ）、ハンセニアスポラ・グイリアモンディ（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、キャンディダ・バリダ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｖａｌｉｄａ）、ピキア・メンブラナエファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のオリゴヌクレオチドのうち、各微生物種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドを挙げることができる。具体的には、配列番号１〜６４に示されたいずれかの塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００５３】
本発明に係る微生物検出器具の支持体（例えば、基板）表面に固定化されるキャプチャーオリゴは、対象とする微生物から調製されたプローブとハイブリダイゼーションが成立するものであれば特に限定されるものではない。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドとしては、配列番号１〜６４に示されたいずれかの塩基配列のみからなるものであってもよく、配列番号１〜６４に示されたいずれかの塩基配列以外の配列を含むものであってもよい。配列番号１〜６４に示されたいずれかの塩基配列以外の配列を含むキャプチャーオリゴとしては、配列番号１〜６４に示された各塩基配列の５’側もしくは３’側またはその両方に対して、各々のＩＴＳ領域の塩基配列に基づいて伸長させた塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを挙げることができ、このようなオリゴヌクレオチドを支持体表面に固定化された微生物検出器具も本発明に含まれる。
【００５４】
１つの支持体上に固定化するキャプチャーオリゴは、少なくとも１種類以上であればよく、特に上限はない。一般に、試料中に混入した微生物を検出する場合は、被検試料中から検出可能な微生物を１つの基板で網羅的に検出できることが、操作の簡便性および検査の迅速性の観点から好ましいといえる。したがって、本発明に係る微生物検出器具も、１つの支持体上に目的の微生物種または属に対応するキャプチャーオリゴを複数固定化した、いわゆるマイクロアレイ型の器具とすることが最も好ましい。例えば、麦芽アルコール飲料を被検試料とする場合には、ブレタノマイセス（デッケラ）（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）属、サッカロマイセス・ディアスタティカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）等に属する微生物に対応したキャプチャーオリゴを支持体表面に固定化することが好ましい。
【００５５】
〔オリゴヌクレオチド（キャプチャーオリゴ）の固定化〕
オリゴヌクレオチドの支持体（例えば、基板）表面への固定化法は特に限定されるものではなく、公知の方法を適宜選択して用いればよい。例えば、物理的吸着、電気的結合または分子共有結合などの一般的なハイブリダイゼーション法に用いられる手法が利用可能である。本発明に係る微生物検出器具においては、表面にカルボジイミド基またはイソシアネート基を有する基材を使用し（米国特許：ＵＳ５，９０８，７４６、特開平８−２３９７５号）、固定化することが好ましい。オリゴヌクレオチドは、支持体上に、アレイ状またはマトリクス状にスポットされ得る。
【００５６】
オリゴヌクレオチドをスポッティングする際に、オリゴヌクレオチドのスポット量が少なすぎると、オリゴヌクレオチドとプローブとの間の反応性を十分に確保することができず、判定が困難になることがある。また、高集積度のスポッティングは技術的な問題と同時にコストがかかり、さらにプローブの蛍光標識や化学発色などを用いたハイブリダイゼーションシグナルの検出にもより精密で高額な検出装置（例えば、スキャナー）が必要となる。したがって、オリゴヌクレオチドは、基板の表面に径１０〜１，０００μｍのサイズに固定することが好ましい。オリゴヌクレオチドの基板上へのスポッティング方法は特に限定されるものではない。例えば、スポッティングマシンを使用して基板上にオリゴヌクレオチド溶液をスポッティングすることにより行うことができる。これによりオリゴヌクレオチド溶液は、通常ほぼ円形にスポッティングされる。キャプチャーオリゴの支持体への固定化方法については、さらに、例えば、特開２００２−６５２７４号（例えば、段落［0062］-［0066］の記載）等が参照され得る。
【００５７】
（２）本発明に係る微生物検出方法
本発明に係る微生物検出方法は、被検試料中の微生物の核酸を調製する核酸調製工程と、当該核酸を鋳型として標識プローブを調製するプローブ調製工程と、対象となる微生物が属する種または属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドと上記標識プローブとのハイブリダイゼーションを行うハイブリダイゼーション工程と、ハイブリダイゼーションシグナルを検出するシグナル検出工程とを含む、被検試料中の微生物を検出および／または同定するための方法である。本検出方法のハイブリダイゼーション工程においては、本発明に係る、配列番号１〜６４のいずれかの核酸配列からなる（またはそれを含んでなる）１つ以上のオリゴヌクレオチド、微生物検出用オリゴヌクレオチドアレイ、または微生物検出器具を用いることができる。本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドアレイまたは微生物検出器具を用いることにより、簡便、迅速かつ正確に網羅的な検出および／または同定を行うことが可能となる。また、本検出方法の被検試料としては、食品であることが好ましい。以下各工程に分けて詳細に説明する。
【００５８】
〔核酸調製工程〕
被検試料中の微生物の核酸を調製する工程である。被検試料からの核酸の調製法は、公知の核酸の調製法を適宜選択して用いることができる。例えば、ＤＮＡの調製は、Ｒ−Ｆ．Ｗａｎｇが紹介する方法に従って抽出することができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（２０００）  １４，１−５）。この方法は標準的な調製法であるが、多くの代替法があり、いずれを採用してもよいことはいうまでもない。また、市販のキットを使用してもよい。
【００５９】
〔プローブ調製工程〕
上記核酸調製工程で調製した核酸を鋳型として標識プローブを調製する工程である。プローブは、例えば、キャプチャーオリゴおよび陽性コントロール・キャプチャーオリゴの塩基配列を含むよう核酸増幅により作製することができる。核酸増幅の方法としては、例えば、ＰＣＲによりＤＮＡとして増幅する方法、あるいはインビトロ・トランスクリプション（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）法によりＲＮＡとして増幅する方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６０】
例えば、ＰＣＲにより標識プローブを調製する場合には、ＰＣＲに用いるプライマーは、プローブがキャプチャーオリゴおよび陽性コントロール・キャプチャーオリゴと相補的な塩基配列を含むように設計される。なお、ハイブリダイゼーションが可能である限りにおいて、プローブはキャプチャーオリゴまたは陽性コントロール・キャプチャーオリゴよりも長くても短くてもよい。標識プローブを得るために、ＰＣＲに用いるプライマーを予め標識しておくことが可能である。また、ＰＣＲの基質（デオキシヌクレオシド三リン酸）を標識しておくことにより標識プローブを得ることもできる。あるいはＰＣＲ終了後にプローブを標識してもよい。標識物質は特に限定されるものではなく、例えば、蛍光物質、ハプテン、放射性物質等、通常のハイブリダイゼーションに用いるプローブと同様の標識物質を使用することができる。具体的には、蛍光物質としてはフルオレセイン（ＦＩＴＣ）、ローダミン（Ｒｏｄａｍｉｎｅ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）、シアニン系蛍光色素等が、ハプテンとしてはビオチン（ＢＩＯＴＩＮ）、ジゴキシゲニン（Ｄｉｇ）、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）、フルオレセイン等を挙げることができる。
【００６１】
〔ハイブリダイゼーション工程〕
ハイブリダイゼーション工程は、対象となる微生物が属する種または属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号１〜６４のいずれかの核酸配列からなる（またはそれを含んでなる）１つ以上のオリゴヌクレオチド）と上記標識プローブとのハイブリダイゼーションを行う工程である。ハイブリダイゼーションは上記オリゴヌクレオチドを固定化したメンブレン上等で行うことができる。あるいは、本発明に係る微生物検出用オリゴヌクレオチドアレイまたは微生物検出器具を用いることができる。当該微生物検出用アレイまたは器具を用いることにより、簡便、迅速かつ正確に網羅的な検出および／または同定を行うことが可能となる。ハイブリダイゼーション工程に用いる方法は特に限定されるものではなく、公知の核酸ハイブリダイゼーション方法を適宜選択して用いることができる。以下に、具体的なハイブリダイゼーション方法の一例を示す。
【００６２】
ＳＳＣ（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｓａｌｉｎｅ  Ｃｉｔｒａｔｅ）などの塩溶液、硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのブロッキング溶液、および融合反応促進のための添加剤からなる融合液に、標識プローブを加える。プローブが２本鎖の場合は熱等による変性を行う。基板上に標識プローブ液を数μＬ添加した後、数時間加熱操作（通常３７〜５０℃）を行い、基板上に固定化されているオリゴヌクレオチドと標識プローブ間でハイブリッドを形成させる。その後、基板上に５×ＳＳＣまたは３Ｍテトラメチルアンモニウムクロライドを加えて加熱し（通常３７〜５０℃）、特異的なハイブリッドを形成していない標識プローブを基板から剥離させ、特異的なハイブリッドのみを選択的に基板上に残す。
【００６３】
ハイブリダイゼーションは、クロスハイブリダイゼーションが生じないために、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で行うことが好ましい。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、その条件下でプローブがその標的となる部分配列にハイブリダイズされるが、他の配列への、あるいはその差異が同定されるような他の配列へのハイブリダイゼーションは実質的には起こらないような条件を意味する。ストリンジェント条件は、配列依存性であり、また周囲の条件により異なり得る。配列が長いほど、より高い温度で特異的にハイブリダイズされる。一般的には、ストリンジェント条件は、規定のイオン強度とｐＨにおいて特定配列の熱融解点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、所定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度の下で、標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズされる温度である。一般的には、標的となる配列が過剰に存在するため、Ｔｍでは、プローブの５０％が平衡状態では標的に占有される。典型的には、ストリンジェント条件は、ｐＨ７．０〜８．３でＮａあるいはその他の塩の濃度が少なくとも約０．０１〜１．０Ｍ、また温度は短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）で少なくとも約３０℃である条件である。ストリンジェント条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化薬剤の添加によっても達成することができる。
【００６４】
本明細書中、「特異的にハイブリダイズする」または「特異的にハイブリダイズし得る」という用語は、その配列がＤＮＡあるいはＲＮＡの複合体混合物の中に存在するとき、ストリンジェント条件下で特定のヌクレオチド配列あるいは配列群に、分子が実質的に、あるいはそれのみに結合、二本鎖化、あるいはハイブリダイズされることを意味する。一般的に、核酸は、温度を上昇させることにより、あるいはその核酸を含有する緩衝液の塩濃度を減少させることにより変性することが分かっている。低ストリンジェント条件（例えば、低温度および／または高塩濃度）下では、ハイブリッド二本鎖（例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＲＮＡ：ＲＮＡあるいはＲＮＡ：ＤＮＡ）が、徐冷再対合された配列が完全に相補的ではない場合であっても、形成されることになる。したがって、ハイブリダイゼーションの特異性は、低ストリンジェント下では減少される。反対に、高ストリンジェント下では（例えば、高温度あるいは低塩濃度）ハイブリダイゼーションを成功裡に行うにはミスマッチがなるべく少ないことが要求される。
【００６５】
当業者であれば、ハイブリダイゼーション条件は任意のストリンジェント性の程度をもたらすように選択することができることを理解する。１つの例示的な態様では、ハイブリダイゼーションは低ストリンジェント下で、例えば、６×ＳＳＰＥ−Ｔで３７℃にて（０．００５％  トリトンＸ−１００）で実施され、ハイブリダイゼーションが確実なものにされる。またその後、引き続いてミスマッチハイブリッド二本鎖を取り除くために洗浄が高ストリンジェント下で（例えば、１×ＳＳＰＥ−Ｔで３７℃にて）実施される。ハイブリダイゼーション特異性の所望されるレベルが得られるまで、連続洗浄を段々と高いストリンジェント性（例えば、０．２５×ＳＳＰＥ−Ｔで３７℃〜５０℃）で実施することができる。ストリンジェント性はまた、ホルムアミドなどの薬剤の添加により上昇させることができる。ハイブリダイゼーション特異性は、存在し得る種々のコントロール（例えば、発現レベルコントロール、標準化コントロール、ミスマッチコントロール、その他）へのハイブリダイゼーションとの、テストプローブに対するハイブリダイゼーションの比較により評価することができる。
【００６６】
ハイブリダイゼーション条件の最適化に関する諸方法は、当業者は周知である（例えば、Ｐ．  Ｔｉｊｓｓｅｎ編『生化学と分子生物学における実験室技術』、第２４巻、核酸プローブによるハイブリダイゼーション（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  Ｖｏｌ．  ２４；  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ）、１９９３年、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ社刊、Ｎ．Ｙ．参照のこと）。
【００６７】
〔シグナル検出工程〕
シグナル検出工程は、上記ハイブリダイゼーション工程においてハイブリダイゼーションの成立の有無を判定する工程であり、通常上記ハイブリダイゼーション工程と連続的に行われる。
【００６８】
ハイブリッド検出工程で用いる方法は、上記プローブ調製工程で調製したプローブに導入された標識物質に依存する。すなわち、ハイブリッドの検出には、プローブに導入されている蛍光物質、ハプテン等の標識物質を使用する。したがって、用いたプローブに導入した標識物質を検出するための公知の方法を適宜選択して使用すればよい。
【００６９】
例えば、ハプテンを使用する場合は、ハプテンを認識するタンパクまたはそれに結合するタンパクと、アルカリフォスファターゼまたはホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ等の結合体（酵素コンジュゲート）を含む溶液を基板上に加え、室温で数１０分間反応させる。なお、このハプテンと酵素コンジュゲートの結合反応を行う前に、オリゴヌクレオチドを固定した領域以外の基板の領域をカゼインなどのタンパクを用いて完全に被覆することによって、酵素コンジュゲートと基板の非特異的吸着反応を阻止することができる。これは、オリゴヌクレオチドを固定した後に基板上にカゼインなどのタンパクの溶液を加え、室温で数１０分間放置することによって行うことができる。酵素コンジュゲートとプローブ中のハプテンとの結合反応終了後、ハプテンと結合しなかった酵素コンジュゲートを、界面活性剤を含む適当な緩衝液で洗浄し排除する。これによって、基板上にはプローブ中のハプテンと結合した酵素コンジュゲートのみが残ることになる。
【００７０】
ハイブリッドの視覚化には、ハプテンと酵素コンジュゲート結合体のみが存在する場合にのみ不溶化合物が形成されるような化合物を添加する。その不溶性化合物の生成は、酵素反応によって増幅され可視化される。添加される化合物として、酵素コンジュゲート中の酵素がアルカリフォスファターゼの場合には、ニトロブルーテトラゾリウムクロライド（ＮＢＴ）とＢＣＩＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸−ｐトルイジン塩）が用いられ、酵素がホースラディッシ・ペルオキシダーゼの場合には、ＴＭＢ（３，３’，５，５’テトラメチルベンチジン）などが用いられる。
【００７１】
キャプチャーオリゴを固定化した位置におけるハイブリッドの色素沈着または蛍光発色等のハイブリダイゼーションシグナルを見ることによって、被検試料中に含まれる微生物種の判定を行う。すなわち、ハイブリダイゼーションシグナルが検出された場合には、当該シグナルがある位置にスポットされたオリゴヌクレオチドに対応する微生物が、被検試料中に含まれていることを意味する。なお、陽性コントロール・キャプチャーオリゴの位置にシグナルが認められれば、本試験が正常に機能していることが確認でき、陰性コントロール・キャプチャーオリゴの位置にシグナルが認められなければ、ハイブリダイゼーションが適当な条件で行われたことが確認できる。
【００７２】
（３）本発明に係る微生物検出キット
本発明に係る微生物検出キットは、上述の本発明に係る微生物検出方法を実施するためのキットである。したがって、本発明に係る微生物検出方法を実施できるものであれば、キットに含まれる構成は特に限定されるものではない。
【００７３】
本発明の微生物検出キットは、代表的には、本発明の配列番号１〜６４のいずれかの核酸配列からなる（もしくはそれを含んでなる）１つ以上のオリゴヌクレオチド、本発明に係る微生物検出用オリゴヌクレオチドアレイ、または微生物検出器具を含む。これらを含むキットとすることにより、簡便、迅速かつ正確に網羅的な検出および／または同定を行うことが可能となる。また、本微生物検出キットには、上記ハイブリダイゼーション工程およびシグナル検出工程で使用する試薬を含むことが好ましい。ハイブリダイゼーション工程で用いる試薬としては、例えば、ＳＳＣ（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｓａｌｉｎｅ  Ｃｉｔｒａｔｅ）などの塩溶液、硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのブロッキング溶液、融合反応促進のための添加剤等を挙げることができ、シグナル検出工程で使用する試薬としては、例えば、ハプテンを認識するタンパクと酵素との結合体（酵素コンジュゲート）や、ＮＢＴ、ＢＣＩＰ、ＴＭＢ等の発色基質等を挙げることができるが、これに限定されるものではなく、目的に適合するように適宜適切な試薬を選択してキットの構成とすればよい。
【００７４】
本発明の微生物検出キットは、上記プローブ調製工程で使用する試薬を含むことが好ましく、さらに、上記核酸調製工程で使用する試薬を含むことが好ましい。プローブ調製工程で使用する試薬としては、例えば、ＰＣＲ用緩衝液、耐熱性ＤＮＡ合成酵素、デオキシヌクレオシド三リン酸混合液等を挙げることができ、核酸調製工程で使用する試薬としては、溶菌用緩衝液、ＤＮＡ回収用カラム、ＤＮＡ抽出用緩衝液等を挙げることができる。ただしこれに限定されるものではなく、目的に適合するように適宜適切な試薬を選択してキットの構成とすればよい。
【００７５】
本発明に係るキット（例えば、本発明に係る微生物検出用アレイまたは器具および各工程に使用する試薬を含むもの）を用いることにより、被検試料受領後約６時間で被検試料中に含まれる微生物の検出および／または同定を実施することができる。
【００７６】
（４）本発明の用途
本発明のオリゴヌクレオチドは、被検試料中の微生物を検出および／または同定するためのプローブとして使用され得る。対象となる微生物は、（１）ブレタノマイセス（デッケラ）・ブリュクセレンシス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  （Ｄｅｋｋｅｒａ）  ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ）、（２）ブレタノマイセス（デッケラ）・アノマラ（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  （Ｄｅｋｋｅｒａ）  ａｎｏｍａｌａ）、（３）サッカロマイセス・セレヴィシエ（（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）もしくはサッカロマイセス・ディアスタティカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）サッカロマイセス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）、もしくはサッカロマイセス・バイヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）に属する微生物が含まれる。
【００７７】
さらに、本発明における検出対象微生物としては、（４）ピキア・アノマラ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｏｍａｌａ）、（５）ハンセニアスポラ・ウバラム（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｕｖａｒｕｍ）もしくはハンセニアスポラ・グイリアモンディ（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、または（６）キャンディダ・バリダ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｖａｌｉｄａ）もしくはピキア・メンブラナエファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）に属する微生物が含まれる。
【００７８】
本発明に係るオリゴヌクレオチド、微生物検出用オリゴヌクレオチドアレイ、微生物検出器具、微生物検出方法、および微生物検出キットの用途は、微生物の判定が必要な用途であれば、特に限定されるものではなく、全てに用いることができる。具体的には、例えば、微生物による汚染が品質に大きな影響を及ぼす各種工業製品の製造工程で、同工業製品やその製造環境等から分離された微生物を迅速かつ正確に検出および／または同定する必要がある場合に好適に用いられる。
【００７９】
判定の対象となる被判定微生物の由来となる上記工業製品としては、代表的なものとして、食品、飲料、医薬品・試薬・医薬部外品、使い捨ての医療用器具等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。本発明は上記例示した工業製品のなかでの食品に応用することが好ましい。食品としては、より具体的には、パン、和洋菓子（冷菓等も含む）、惣菜食品、乳製品、シリアル食品、豆腐・油揚げ類、麺類、弁当類、調味料、小麦粉や食肉等の農産加工品、栄養補助食品（サプリメント等）、長期保存食品（缶詰、冷凍食品、レトルト食品等）等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【００８０】
本発明は、上記例示した食品のなかでも、特にビール、発泡酒、リキュール類、低アルコール飲料（例えば、アルコール分１％未満の麦芽発酵飲料、ビールテイスト飲料等の飲料を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【００８１】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００８２】
〔オリゴヌクレオチドの合成〕
定法に従い、オリゴヌクレオチド合成機（Ｐｅｒｋｉｎ−ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  社製）を用いてオリゴヌクレオチドを合成し、脱保護を施した後乾燥させた。このオリゴヌクレオチド乾燥体を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）・１ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液を用いて溶解し、１００ｐｍｏｌ／μＬのオリゴヌクレオチド溶液を調製した。本実施例に使用したすべてのオリゴヌクレオチドはこの方法で合成した。合成したオリゴヌクレオチドの塩基配列を配列番号１〜６９に示した。これらのうち、配列番号１〜６４がキャプチャーオリゴであり、配列番号６５が陰性コントロール・キャプチャーオリゴであり、配列番号６６〜６７がプライマーであり、配列番号６８がコントロールプローブであり、配列番号６９がコントロールプローブに対する陽性コントロール・キャプチャーオリゴある。キャプチャーオリゴヌクレオチドについては上記合成機を用いて５’末端にアミノ基を結合させ、プライマーは５’末端にビオチンを結合させた。
【００８３】
〔基板へのキャプチャーオリゴヌクレオチドのスポッティング〕
５’末端にアミノ基を有するオリゴヌクレオチド溶液１０μＬに対してマイクロスポッティング溶液（ＴｅｌｅＣｈｅｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．製）を１０μＬ混合し、マイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｃ．製）上に分注した。スポッティングマシンの所定の位置にカルボジイミド樹脂処理スライドグラスＣａｒｂｏｓｔａｔｉｏｎ（日清紡績株式会社製）を配置し、スポッティングマシンを作動させた。スポッティング終了後、スライドグラスに熱水からの蒸気を数秒間あて、その後紫外線を６００ｍＪ照射した。再度蒸気に数秒間曝露した後、ホットプレート上にスライドグラスを置いて水分を除去した。スライドグラスを３％  ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含む１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）・１００ｍＭ  ＮａＣｌ・０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に室温で３０分間浸し、ブロッキングした。その後、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）・１ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液で洗浄した。スライドグラスを室温で乾燥させ、使用まで乾燥状態で冷暗所にて保存した。図１（Ａ）に、本実施例で実際に使用した微生物検出器具の基板上に固定化されているオリゴヌクレオチドの配置を示した。
【００８４】
〔核酸調製工程〕
検体として用いた微生物はブレタノマイセス属２種、サッカロマイセス属４種、キャンディダ属２種、ピキア属２種、ハンセニアスポラ属２種の合計１１種類の微生物である。検体として用いた微生物を表２に示した。
【表２】
2009504134.tif 000005
【００８５】
これらの各微生物に最適な培養条件で培養した菌液から、Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆ．  Ｋｉｔ（ＥｄｇｅＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ製、Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ＃８５１７１）を用いて各微生物のゲノムＤＮＡをそれぞれ調製した。
【００８６】
〔プローブ調製工程〕
得られた各微生物のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲによりプローブ核酸を調製した。ＰＣＲ反応液の組成は、Ｔａｑポリメラーゼ：１ｕｎｉｔ、ビオチン化プライマー（配列番号６６および６７）：各１０  ｐｍｏｌ、反応用緩衝液（１０×）：５μＬ、ｄＮＴＰ：各１０  ｎｍｏｌ、鋳型ＤＮＡ：１００ｎｇに滅菌蒸留水を加えて総量５０μＬとした。サーマルサイクラーを用いて、９５℃で３分間保持した後、９５℃：３０秒間、５５℃：１５秒間、７２℃：１分間の反応を３０サイクル行い、７２℃で５分間保持して反応を終了した。
【００８７】
また、プライマー配列部分が同じで対象となる微生物の配列とは異なる人工的な配列を設計し、これをコントロールプローブとした。これを鋳型としてＰＣＲを行い、ビオチン化コントロールプローブを調製した。ＰＣＲ反応液の組成は、鋳型ＤＮＡを１ｎｇとした点を除いて上記と同様である。また、反応温度およびサイクル数は上記と同一である。プローブの精製は行わず、ＰＣＲ反応液をそのままプローブ溶液として、以下のハイブリダイゼーション工程で使用した。
【００８８】
〔ハイブリダイゼーション工程およびシグナル検出工程〕
上記プローブ核酸溶液３μＬと、ビオチン化コントロールプローブ溶液１μＬと、ＡｒｒａｙＩｔ  Ｕｎｉｈｙｂ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴｅｌｅＣｈｅｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．製）１６μＬ  とを加えて混合し、１００℃で１分間加熱処理を行った後、氷中に５分間浸した。このプローブ核酸溶液を全量とり、キャプチャーオリゴヌクレオチドを固定化した基板に載せ、その上にカバーグラスを載せた。これを保湿箱に入れ、３７℃に設定した恒温器中に１２０分間静置した。基板を取り出し、すばやく室温下で２×ＳＳＣ溶液（２×ＳＳＣ：０．０３３Ｍ  ＮａＣｌ、０．０３３Ｍクエン酸ナトリウム）に浸してカバーグラスを除去し、３７℃に保温した２×ＳＳＣ中に５分間浸した。
【００８９】
基板を２×ＳＳＣから取り出し、遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ社製）にセットして、２，０００ｒｐｍで１分間遠心した。次にＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ  ｋｉｔ（ＶＥＣＴＯＲ社製）を用いてアビジン−ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体を作製し基板上に１．４ｍＬ滴下し、室温で３０分間静置した。その後、ＰＢＳ（１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、０．９％塩化ナトリウム）中で洗浄した。ＴＭＢ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｋｉｔ  ｆｏｒ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  （ＶＥＣＴＯＲ社）を用いて発色溶液を作製し、基板上に１．４ｍＬ滴下して室温で３０分間静置した。基盤を蒸留水で洗浄して発色反応を止めた。
【００９０】
〔判定〕
ＥＰＳＯＮ社製スキャナーＧＴ−８７００Ｆおよびその透過型ユニットを用いてハイブリダイゼーションを行った領域を６００ｄｐｉにてスキャンし、スキャン画像を目視により発色の有無を確認した。図１（Ｂ）にスキャン画像の一例として、Ｄｅｋｋｅｒａ  ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓのスキャン画像を示した。なお、図１（Ａ）は基板上のオリゴヌクレオチドの配置を示している。
【００９１】
〔結果〕
検体として用いた１１種類の各微生物についての結果を表３〜１３に示した。各表とも○印が発色の確認されたスポットを表し、−印が発色の確認されなかったスポットを表す。表３〜１３から明らかなように全ての場合、コントロールプローブではそれに対する陽性コントロール・キャプチャーオリゴ（配列番号６９）に発色が見られ、また、陰性コントロール・キャプチャーオリゴでは発色が認められず、増幅およびハイブリダイゼーションの工程が共に正常に機能していることが確認された。このことより微生物より調整した核酸が増幅されていることも確認された。なお、以下の結果の説明においては陽性コントロール・キャプチャーオリゴ（配列番号６９）の発色は含めないものとする。
【００９２】
表３にはＢｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  （Ｄｅｋｋｅｒａ）  ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓの結果を示した。Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  （Ｄｅｋｋｅｒａ）  ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓは１６個所のＢｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  （Ｄｅｋｋｅｒａ）  ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ検出用キャプチャーオリゴ（配列番号１から１４、および２３、２４）のみで発色が確認された（図１参照）。同様に、表４にはＢｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  （Ｄｅｋｋｅｒａ）  ａｎｏｍａｌａの結果を示した。Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  （Ｄｅｋｋｅｒａ）  ａｎｏｍａｌａは17個所のＢｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  （Ｄｅｋｋｅｒａ）  ａｎｏｍａｌａ検出用キャプチャーオリゴ（配列番号７，９および１５から２９）のみで発色が確認された。表５にはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの結果を示した。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは１４個所のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ検出用キャプチャーオリゴ（配列番号３０から４３）のみで発色が確認された。表６にはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓの結果を示した。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓは１４個所のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ検出用キャプチャーオリゴ（配列番号３０から４３）のみで発色が確認された。表７にはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓの結果を示した。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓは１４個所のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ検出用キャプチャーオリゴ（配列番号３０から４３）の少なくとも５箇所以上で発色が確認された。表８にはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓの結果を示した。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓは１４個所のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ検出用キャプチャーオリゴ（配列番号３０から４３）の少なくとも５箇所以上で発色が確認された。表９にはＰｉｃｈｉａ  ａｎｏｍａｌａの結果を示した。Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｏｍａｌａは９個所のＰｉｃｈｉａ  ａｎｏｍａｌａ検出用キャプチャーオリゴ（配列番号４４から５２）のみで発色が確認された。表１０にはＨａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｕｖａｒｕｍの結果を示した。Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｕｖａｒｕｍは４個所のＨａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｕｖａｒｕｍおよびＨａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ検出用キャプチャーオリゴ（配列番号５３から５６）のみで発色が確認された。表１１にはＨａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉの結果を示した。Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉは４個所のＨａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｕｖａｒｕｍおよびＨａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ検出用キャプチャーオリゴ（配列番号５３から５６）のみで発色が確認された。表１２にはＣａｎｄｉｄａ  ｖａｌｉｄａの結果を示した。Ｃａｎｄｉｄａ  ｖａｌｉｄａは８個所のＣａｎｄｉｄａ  ｖａｌｉｄａおよびＰｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ検出用キャプチャーオリゴ（配列番号５７から６４）のみで発色が確認された。表１３にはＰｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓの結果を示した。Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍ��ｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓは８個所のＣａｎｄｉｄａ  ｖａｌｉｄａおよびＰｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ検出用キャプチャーオリゴ（配列番号５７から６４）のみで発色が確認された。
【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【００９３】
以上の結果は、検体として用いた各微生物において、各微生物に特異的なキャプチャーオリゴを固定化したスポットのみで発色が認められ、非特異的な発色は全く認められなかったことを示すものである。したがって、本実施例において作製した微生物検出器具は、表２に示した微生物を種特異的に検出できる微生物検出器具であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明は、被検試料中に混入している微生物を簡便な操作で迅速かつ正確に判定することができる微生物検出器具、微生物検出方法および微生物検出キットを提供するものである。したがって、本発明は、食品製造業、飲食産業、薬品産業等における衛生管理、工程管理、品質管理に利用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】実施例において使用した、本発明に係る微生物検出器具の基板上に固定化されているオリゴヌクレオチドの配置（Ａ）、および本発明に係る微生物検出器具を用いてＢｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  （Ｄｅｋｋｅｒａ）  ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓを検出した結果（Ｂ）を示す。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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