(57)【要約】  本発明は、細胞受容体の活性と特異的に相互作用し、そしてモジュレートする薬学的に有効な化合物をスクリーニングおよび同定するための、選択された細胞において発現されるＧｉ共役受容体によってモジュレートされるｃＡＭＰレベルに基づく信頼性がありかつ有効なインビトロアッセイに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞において発現されるＧｉ共役受容体によってモジュレートされるｃＡＭＰレベルに基づくインビトロアッセイを使用して、試験化合物をスクリーニング、同定または選択するための方法であって、以下の工程：
（ａ）場合により、選択された細胞において、細胞内ｃＡＭＰレベルのモジュレーションに関与するＧαｉおよびアデニリルシクラーゼアイソフォームを同定すること、
（ｂ）前記選択された細胞において、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉによる阻害に感受性であるアデニリルシクラーゼアイソフォーム（Ａ）の影響の方を、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激されるが、Ｇαｉによる阻害には感受性でないアデニリルシクラーゼアイソフォーム（Ｂ）の影響よりも優先させること、
（ｃ）前記細胞と、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７および試験化合物とを接触させること；次いで
（ｄ）前記試験化合物と前記細胞とを接触させることにより生じるｃＡＭＰレベルを測定すること、
を含んでなる、方法。
【請求項２】
工程ｂ）が、前記細胞とＮＫＨ−４７７とを接触させることによって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉによる阻害に感受性であるアデニリルシクラーゼアイソフォーム（Ａ）の影響の方を、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７に感受性であるが、Ｇαｉによる阻害には感受性でないアデニリルシクラーゼアイソフォーム（Ｂ）の影響よりも優先させることが、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激されるが、Ｇαｉタンパク質による阻害には感受性でないアデニリルシクラーゼアイソフォームを特異的に不活化することによって達成される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記不活化が、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激されるが、Ｇαｉタンパク質による阻害には感受性でない前記アデニリルシクラーゼアイソフォーム（Ｂ）の発現をダウンレギュレートすることによって得られる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記選択された細胞において発現される、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激されるが、Ｇαｉによる阻害には感受性でない前記アデニリルシクラーゼアイソフォーム（Ｂ）が、特異的ＲＮＡｉによってダウンレギュレートされる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記特異的ＲＮＡｉが特異的ｍｉＲＮＡである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
アデニリルシクラーゼＶＩＩアイソフォームが、特異的ｍｉＲＮＡを使用することによってノックダウンされる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記選択された細胞が、哺乳動物細胞もしくは酵母細胞、またはＣＨＯ系統、ＨＥＫ系統もしくは昆虫ＳＦ９系統から選択される樹立された細胞系統から選択される真核細胞である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記選択された細胞がＣＨＯ−Ｋ１またはＣＨＯ−Ｓ細胞系統である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記試験化合物と前記細胞とを接触させることから生じるｃＡＭＰレベルの測定が、蛍光または発光としての読み取りを使用する技術によって実施される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
細胞受容体の活性と特異的に相互作用し、そしてモジュレートする試験化合物によるｃＡＭＰレベルのモジュレーションを測定するためのアッセイシステムまたはキットであって、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉによる阻害に感受性であるアデニリルシクラーゼアイソフォーム（Ａ）を主に発現する細胞を含んでなる、アッセイシステムまたはキット。
【請求項１２】
前記細胞が、ｉ）特異的なＧαｉタンパク質、あるいはフォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉタンパク質による阻害に感受性である特異的アデニリルシクラーゼアイソフォーム（Ａ）をコードする核酸配列（ｉｉ）およびフォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉタンパク質による阻害には感受性でないアデニリルシクラーゼアイソフォーム（Ｂ）をコードするアデニリルシクラーゼ転写産物を標的化する特異的ｍｉＲＮＡを安定的に同時発現する、請求項１１に記載のアッセイシステムまたはキット。
【請求項１３】
フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉに感受性であるアデニリルシクラーゼアイソフォーム（Ａ）およびフォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉには感受性でないアデニリルシクラーゼアイソフォーム（Ｂ）の両方を発現する選択された細胞から操作された組換え細胞であって、ここで、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉに感受性であるアデニリルシクラーゼアイソフォームの影響の方が、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉには感受性でないアデニリルシクラーゼアイソフォームの影響よりも優先される、組換え細胞。
【請求項１４】
フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉに感受性であるアデニリルシクラーゼアイソフォーム（Ａ）の発現がアップレギュレートされる、請求項１３に記載の組換え細胞。
【請求項１５】
フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉには感受性でないアデニリルシクラーゼアイソフォーム（Ｂ）が不活化される、請求項１４に記載の組換え細胞。
【請求項１６】
フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉには感受性でないアデニリルシクラーゼアイソフォームをコードする遺伝子が欠失される、請求項１５に記載の組換え細胞。
【請求項１７】
フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉには感受性でないアデニリルシクラーゼアイソフォーム（Ｂ）の発現がＲＮＡｉによってダウンレギュレートされる、請求項１６に記載の組換え細胞。
【請求項１８】
前記細胞が、（ｉ）操作されたプレ−ｍｉＲＮＡ一次転写産物、およびｉｉ）前記組換え細胞において安定的に同時発現される特異的なＧαｉタンパク質、あるいはフォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉタンパク質による阻害に感受性である特異的アデニリルシクラーゼアイソフォームをコードする核酸配列を含んでなる組み換えＤＮＡベクターで安定的に形質転換されている、請求項１７に記載の組換え細胞。
【請求項１９】
フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉタンパク質による阻害に感受性である特異的アデニリルシクラーゼアイソフォーム（Ａ）、およびフォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉタンパク質による阻害には感受性でないアデニリルシクラーゼアイソフォーム（Ｂ）をコードするアデニリルシクラーゼ転写産物を標的化する特異的ｍｉＲＮＡを同時発現するように操作されている、請求項１８に記載の組換え細胞。
【請求項２０】
哺乳動物細胞である、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項２１】
ＣＨＯ細胞系統である、請求項２０に記載の組換え細胞。
【請求項２２】
Ｇｉ共役受容体の潜在的リガンドをスクリーニング、同定または選択するためのツールとしての請求項１３〜２１のいずれか一項に記載の組換え細胞の使用。
【請求項２３】
前記細胞は、請求項１３〜２１のいずれか一項において定義されるとおりである、請求項１１または１２に記載のアッセイシステムまたはキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｇｉ共役受容体によってモジュレートされるｃＡＭＰレベルに基づくインビトロアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、ヒトゲノムにおける最も大きなスーパーファミリーの１つに該当する。それらは、多数の生理的障害および疾患に関与し、従って、薬剤および薬物発見のための重要な標的に該当する。現在開発中のすべての薬物のうち約６０％がＧＰＣＲを標的にしている（非特許文献１）。
【０００３】
ＧＰＣＲは、それらの７つの貫通膜スパンニングドメインによって特徴付けられ、神経伝達物質、ホルモン、光および臭気物質のような多様な細胞外刺激物質によって活性化することができる。ヘテロ三量体Ｇタンパク質は、３つのサブユニット：αサブユニット（３５ｋＤａ）ファミリー、βサブユニット（３５〜３６ｋＤａ）ファミリーおよびγ（６〜１０ｋＤａ）サブユニットファミリーよりなる。アゴニスト結合は、グアノシン−５’−二リン酸（ＧＤＰ）との交換におけるグアノシン−５’−三リン酸（ＧＴＰ）のＧαサブユニットへの会合を介する受容体の活性なコンホメーション適応およびＧタンパク質の以後の活性化をもたらす（非特許文献２）。次いで、ＧαのＧβγ二量体からの解離は、アデニリルシクラーゼ、イオンチャネルおよびホスホリパーゼのような下流のエフェクターのＧαまたはＧβγ二量体による活性化をもたらす。
【０００４】
リガンド結合および機能アッセイを含むＧＰＣＲシグナリングプロセスにおける３つの主な工程の活用を含む多様なアレイの適用されたアッセイが利用可能である（検討については、非特許文献３）。これらの工程は、リガンドの受容体への結合、ヌクレオチド変化（ＧαサブユニットにおけるＧＤＰのためのＧＴＰ）を生じる活性なコンホメーションにおける受容体のリガンド仲介安定化、および最後に、異なる細胞内セカンドメッセンジャー経路への以後の共役を含む。
【０００５】
ＧＰＣＲに共役するＧタンパク質は、４つのファミリーＧｑ、Ｇｓ、ＧｉおよびＧ１２／１３を含み（検討については、非特許文献４）、そして特異的セカンドメッセンジャー経路への共役は、受容体および使用するアゴニストの性質のＧタンパク質への指向に依存する（非特許文献５；非特許文献４）。
【０００６】
Ｇｑ共役受容体の活性化は、イノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）の作製を介するカルシウム貯蔵の放出を含むホスホリパーゼＣの活性化をもたらす。この経路の機能アッセイは、主に細胞を基盤とするものであり、そしてカルシウムおよびＩＰ３シグナルを活用する。
【０００７】
ＧｓおよびＧｉ共役受容体の活性化は、アデニリルシクラーゼの活性化（Ｇｓ）または阻害（Ｇｉ）をもたらし、それぞれ細胞内ｃＡＭＰレベルの増加または減少を生じる。蛍光または発光の読み取りを使用する多くの種類のアッセイ形式は、細胞内ｃＡＭＰの測定に適用することができる（検討については、非特許文献６）。それらはＧｓ共役受容体について良好な結果を提供する。
【０００８】
それにもかかわらず、これらの技術を使用するＧｉ共役受容体のための作動可能なアッセイを入手することは、さらなる課題である。Ｇｉ共役受容体によって誘導される効果の検出は、アデニリルシクラーゼを刺激し、そしてｃＡＭＰを産生するためのフォルスコリンによるプレ活性化を必要とし、そしてＧｉ共役受容体に対するアゴニストの結合によって仲介されるｃＡＭＰ産生の阻害が、フォルスコリンによる刺激の６０％を超えることはほとんどない。さらに加えて、アデニリルシクラーゼ活性の優先的なフォルスコリン刺激の結果としてのＧｉ受容体アゴニストによって仲介されるｃＡＭＰ減少のアンタゴニストによる放出を測定することはなお、煩雑さを増大する（非特許文献３）。
【０００９】
これらの制限を克服するための１つの方法は、キメラ（Ｇｑｉ５）またはプロミスカス（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）なＧタンパク質（Ｇ１６／１５）を使用することによって、Ｇｉ共役受容体の正常な薬理学的エフェクターをアデニリルシクラーゼからＰＬＣβ経路に変換することである（非特許文献７）。しかし、非同族（ｎｏｎ−ｃｏｇｎａｔｅ）なＧタンパク質を使用すると、受容体／Ｇタンパク質相互作用の重要な改変を誘導し、それによってアッセイの関連性が減少することが示されている。
【００１０】
ｃＡＭＰ濃度をアッセイするための他のアプローチとして、レポーター遺伝子アッセイが挙げられる（非特許文献８）。しかし、この場合、二次的事象（ここでは、レポーター遺伝子の活性化または阻害）を測定すると、スクリーニングにおいて偽陽性および陰性のヒットが生じ易い。
【００１１】
クルンピンスキー（Ｋｒｕｎｐｉｎｓｋｉ）らによる哺乳動物アデニリルシクラーゼの最初のクローニング（非特許文献９）後、哺乳動物アデニリルシクラーゼの少なくとも９つのアイソフォームがクローニングされている。配列類似性、およびＧタンパク質、カルシウムおよびリン酸化による多様な調節を示す調節特性に基づいて、いくらかのアデニリルシクラーゼファミリーが同定されている（非特許文献１０）。これらの細胞内モジュレーターは、アデニリルシクラーゼアイソザイムに多様な影響を及ぼす。従って、受容体の活性化におけるｃＡＭＰ応答は、所定の細胞に存在する細胞性アデニリルシクラーゼアイソザイムプールに依存する。
【００１２】
哺乳動物細胞系統は、発現される受容体タンパク質のフォールディングおよび翻訳後修飾に適応した細胞機構を有する。従って、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）およびヒト胎児腎（ＨＥＫ）のような細胞系統は、薬物への開発が可能な化学実体をスクリーニングおよび同定するためのツールとして広範に使用されている。しかし、細胞系統において発現されるＧＰＣＲの共役特性の特異性は、しばしば、それらの生来の環境におけるほど有効ではない（非特許文献１１）。さらに、シグナル伝達カスケードにおける各工程の結果は、細胞に存在する特定のアイソザイムプールの調節特性に依存する（非特許文献１２）。
【００１３】
哺乳動物細胞では、組織特異的に発現されるアデニリルシクラーゼの異なるアイソフォームが同定されている。ＧＰＣＲのシグナル伝達経路において使用される哺乳動物細胞系統におけるアデニリルシクラーゼアイソフォームの役割を同定するための最初の研究は、１９９８年にバルガＥ．Ｖ．（Ｖａｒｇａ  Ｅ．Ｖ．）らによって実施された。彼らは、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、ＣＨＯおよびＢ１２細胞中のアデニリルシクラーゼｃＤＮＡを増幅し、次いで同定および配列決定した。彼らは、ＣＨＯ中のアデニリルシクラーゼアイソフォームＶＩおよびＶＩＩならびにＢ１２細胞中のアデニリルシクラーゼアイソフォームＶＩおよびＩＸを同定した（非特許文献１２）。アデニリルシクラーゼアイソフォームＩＩ、ＩＩＩ、ＶＩおよびＩＸもまた、ＨＥＫ−２９３細胞において報告された（非特許文献１３）。
【００１４】
Ｇｓαによる活性化およびＧｉαによる阻害に対するアデニリルシクラーゼアイソフォームの感受性についてのトランスフェクション研究は、エフェクターレベルにおけるシグナリングの集積に関する貴重な情報を提供した（非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６）。Ｇαサブユニットのうち少なくとも１８の異なるサブタイプが同定されている。特に、アデニリルシクラーゼを阻害し、そしてイオンチャネルを調節するＧｉ／ｏサブファミリーとして、Ｇｉ１、Ｇｉ２、Ｇｉ３、Ｇｏ１、Ｇｏ２、Ｇｏ３、Ｇｚ、Ｇｔ１、Ｇｔ２およびＧｇｕｓｔが挙げられる。
【００１５】
注目すべきことに、Ｇαｉは、すべてのアデニリルシクラーゼアイソフォームを阻害するのではないこと、およびアデニリルシクラーゼアイソフォームＩ、ＶおよびＶＩのみがＧｉファミリーに感受性であることが示された。
【００１６】
別の情報は、ｃＡＭＰに基づくＧＰＣＲ細胞アッセイにおけるＧｉ効果の測定に対する予め必要とされるフォルスコリン活性化の影響に関する。この分子は、ｃＡＭＰ形成のインビトロアクチベーターとして広範に使用されている。それは、広範な細胞系統において、ほとんどすべてのアデニリルシクラーゼアイソフォームを直接活性化し、そして環状ＡＭＰレベルを上昇させることが示されている（非特許文献１７）。現在、アデニリルシクラーゼアイソフォームＩＸのみが、フォルスコリンによって刺激されないことが同定されている。
【００１７】
上記のように、Ｇｓ共役受容体を研究するための有用なツールを提供するｃＡＭＰ濃度の変化を測定するための多くの種類の技術が適用されている。しかし、直接アデニリルシクラーゼを活性化して、Ｇｉの効果を検出するフォルスコリンによるプレ活性化が必要であることから、Ｇｉ共役受容体をスクリーニングおよびプロファイリングするための妥当な稼動性のｃＡＭＰ機能アッセイの開発が制限されている。アデニリルシクラーゼ応答性の独特な細胞および組織特異的パターンを説明する９つの主要な同定されたアデニリルシクラーゼアイソフォームの不均一な発現パターン、Ｇｉタンパク質による阻害に対する所定のアデニリルシクラーゼアイソフォームのみの感受性、ならびにＧｉ効果を検出するために予め必要とされるフォルスコリン活性化に添加された有意な数のＧＰＣＲ（非特許文献４）の複数のＧタンパク質共役サブタイプはすべて、Ｇｉ共役受容体に専用の稼動性ｃＡＭＰ機能性スクリーニングアッセイの開発において遭遇する困難に有意に寄与する。
【００１８】
選択的Ｇｉ共役受容体に専用の妥当な稼動性のｃＡＭＰ機能性スクリーニングおよびプロファイリングアッセイの開発において遭遇する困難は、今日、これらの受容体のための新たな薬物候補の首尾良い同定における突破口を提示している。これらの制限の克服を可能にする方法の開発が、Ｇｉ共役受容体に対するヒット物およびリード物の同定に戦略上重要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】ルンドストローム（Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ）ら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００５年、２３，１０３−１０８
【非特許文献２】クリスチャンセン（Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ，Ｋ．）、Ｐｈａｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ，２００４年、１０３，２１−８１
【非特許文献３】グリースリー，Ｐ．Ｊ．（Ｇｒｅａｓｌｅｙ  Ｐ．Ｊ．）およびヤンセン，Ｆ．Ｐ．（Ｊａｎｓｅｎ，Ｆ．Ｐ．）、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ：Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、２００５年、２，２，１６３−１６９
【非特許文献４】ウォン，Ｓ．Ｋ．−Ｆ．（Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｋ．−Ｆ．）、Ｎｅｕｒｏｓｉｇｎａｌｓ，２００３年、１２，１−１２
【非特許文献５】アカム，Ｅ．Ｃ．（Ａｋａｍ，Ｅ．Ｃ．）ら、Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２００１年、１３２，４，９５０−８
【非特許文献６】ウィリアムズ，Ｃ．（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｃ．）ら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．，２００４年、３，２，１２５−３５
【非特許文献７】ルイ，Ａ．Ｍ．（Ｌｕｉ，Ａ．Ｍ．）ら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ，２００３年、８，３９−４９
【非特許文献８】ケント，Ｔ．Ｃ（Ｋｅｎｔ，Ｔ．Ｃ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，２００５年、１０，５，４３７−４４６
【非特許文献９】クルンピンスキー（Ｋｒｕｎｐｉｎｓｋｉ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，１５５８−１５６４
【非特許文献１０】スナハラ（Ｓｕｎａｈａｒａ）ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，１９９６年、３６，４６１−４８０
【非特許文献１１】ケナスキン，Ｔ．（Ｋｅｎａｓｋｉｎ，Ｔ．）、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９６年、４８，４１３−４６３
【非特許文献１２】バルガ，Ｅ．Ｖ．（Ｖａｒｇａ  Ｅ．Ｖ．）ら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９９８年、３４８，Ｒ１−Ｒ２
【非特許文献１３】ヘレベオ，Ｍ．（Ｈｅｌｌｅｖｅｏ，Ｍ．）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９３年、１９２，３１１
【非特許文献１４】スナハラ，Ｒ．Ｋ．（Ｓｕｎａｈａｒａ，Ｒ．Ｋ．）ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１９９６年、３６，４６１−４８０
【非特許文献１５】クーパー，Ｄ．Ｍ．（Ｃｏｏｐｅｒ，Ｄ．Ｍ．）ら、Ａｄｖ．Ｓｅｃ．Ｍｅｓｓ．Ｐｈｏｓｐｈ．Ｒｅｓ．，１９９８年、３２，２３−５１
【非特許文献１６】シモンズ，Ｗ．Ｆ（Ｓｉｍｏｎｄｓ，Ｗ．Ｆ）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ．，１９９９年、２０，２，６６−７３．１９９９
【非特許文献１７】シーモン，Ｋ．Ｂ．（Ｓｅａｍｏｎ，Ｋ．Ｂ．）ら、Ｊ  Ｃｙｃｌｉｃ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．，１９８１年、７，４，，２０１−２４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明の目的は、当該分野における上記の問題を解決することである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
従って、第１の局面では、本発明は、細胞において発現されるＧｉ共役受容体によってモジュレートされるｃＡＭＰレベルに基づくインビトロアッセイを使用して、試験化合物をスクリーニング、同定または選択するための方法であって、以下の工程：
（ａ）場合により、選択された細胞において、細胞内ｃＡＭＰレベルのモジュレーションに関与するＧαｉおよびアデニリルシクラーゼアイソフォームを同定すること、
（ｂ）前記選択された細胞において、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉによる阻害に感受性であるアデニリルシクラーゼアイソフォームの影響の方を、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激されるが、Ｇαｉによる阻害には感受性でないアデニリルシクラーゼアイソフォームの影響よりも優先させること、
（ｃ）前記細胞と、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７および試験化合物とを接触させること；次いで
（ｄ）前記試験化合物と前記細胞とを接触させることにより生じるｃＡＭＰレベルを測定すること、
を含んでなる、上記方法を提供する。
【００２２】
第２の局面では、本発明は、細胞受容体の活性と特異的に相互作用し、そしてモジュレートする試験化合物によるｃＡＭＰレベルのモジュレーションを測定するためのアッセイシステムまたはキットを提供し、前記アッセイシステムまたはキットは、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉによる阻害に感受性であるアデニリルシクラーゼアイソフォームを主に発現する細胞を含んでなる。
【００２３】
別の局面では、本発明は、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉに感受性であるアデニリルシクラーゼアイソフォームおよびフォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉには感受性でないアデニリルシクラーゼアイソフォームの両方を発現する選択された細胞から操作された組換え細胞であって、ここで、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉに感受性であるアデニリルシクラーゼアイソフォームの影響の方が、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉには感受性でないアデニリルシクラーゼアイソフォームの影響よりも優先される、上記組換え細胞を提供する。
【００２４】
本発明は、Ｇｉ共役受容体の潜在的リガンドをスクリーニング、同定または選択するためのツールとして上記のように規定される組換え細胞の使用をさらに提供する。
【００２５】
発明の説明
本発明のさらなる説明の前に、本明細書、実施例および特許請求の範囲において用いられる所定の用語を以下に規定する。
【００２６】
定義
本明細書において使用する「ＤＮＡ構築物」は、１つ以上のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含有し、そしてコードされるタンパク質の発現を容易にし得るポリヌクレオチドに作動可能に連結された任意のプロモーター、転写開始、転写終結、または他のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを意味する。
【００２７】
用語「異種ＤＮＡ」、「異種核酸」または「外来ＤＮＡ」は、それが存在するゲノムの部分としては天然に存在しないＤＮＡに関する。一般的に、必ずしも必要ではないが、そのようなＤＮＡは、それが発現される細胞によって通常は産生されないタンパク質をコードする。異種ＤＮＡは同じ種由来であり得るが、好適な実施態様では、それは異なる種由来である。本明細書では、それが発現される細胞に対して当業者が異種または外来性であると認識またはみなすであろうあらゆるＤＮＡが、異種ＤＮＡという用語に包含される。
【００２８】
本明細書において使用する用語「細胞」は、例えば、ハイブリドーマ細胞を含む哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞のような真核生物から誘導されるすべての正常な（天然の）および形質転換された細胞を指す。哺乳動物種の例として、霊長類（例えば、ヒト、サル、チンパンジー、ヒヒ）、げっ歯類（例えば、ラット、マウス、モルモット、ハムスター）および反芻動物（例えば、ウシ、ウマ）が挙げられる。哺乳動物細胞は、種（例えば、ヒト、げっ歯類）、組織供給源（脳、肝臓、肺、心臓、腎臓、皮膚、筋肉）および細胞の種類（例えば、上皮、内皮）に関するあらゆる認識された供給源から誘導され得る。さらに、組換え遺伝子を発現する形質転換された細胞は、本発明において使用され得る。
【００２９】
本発明の方法の実践において使用すべき細胞は、初代細胞、二次細胞または不死化細胞（即ち、樹立された細胞系統）であってもよい。それらは、当業者に周知の技術によって調製してもよく、または免疫学的および微生物学的商業的供給源（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ、バージニア州）から購入してもよい。代替的にまたはさらに、例えば、アデニリルシクラーゼアイソフォーム、Ｇαｉタンパク質または受容体を発現する遺伝子のような目的の遺伝子を含有するように、細胞を遺伝子操作してもよい。
【００３０】
有用な哺乳動物細胞系統の非制限的例として、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、チャイニーズハムスター肺（ＣＨＬ）細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＴＨＰ細胞系統、ＴＡｇジャーカット細胞、ハイブリドーマ細胞、癌腫細胞系統、肝細胞などのような動物およびヒト細胞系統が挙げられる。
【００３１】
本明細書において使用する「安定的にトランスフェクトされた」は、宿主細胞のゲノム、例えば、宿主染色体への組込みによるか、または少なくとも２週間、好ましくは、４箇月を超えるエピソームトランスフェクションによる外因性ＤＮＡの細胞、もしくは細胞系統への導入および維持を意味する。
【００３２】
本明細書において使用する「一過的にトランスフェクトされた」は、トランスフェクトされた外因性ＤＮＡが宿主細胞のゲノムに組み込まれていないことを意味する。
【００３３】
ｓｉＲＮＡを発現するＤＮＡ構築物は、標準的な技術を使用して、哺乳動物細胞に一過的にトランスフェクトすることができる。しかし、細胞がトランスフェクトされる能力には大きなばらつきがある。従って、異なるトランスフェクション試薬および細胞培養条件を、各細胞の種類について試験する必要がある。
【００３４】
「細胞内ｃＡＭＰレベルのモジュレーション」に関する用語「モジュレーション」は、その多様な文法的形態（例えば、「モジュレートされた」、「モジュレーション」、「モジュレートする」など）におけるモジュレーションを包含することが意図され、そして受容体の下流の１つ以上のシグナル伝達経路の誘導、刺激、増強、阻害を包含することが意図される。
【００３５】
用語「不活化」または「不活化する」は、遺伝子の発現の全体的もしくは部分的のいずれかの阻害（ダウンレギュレーションもしくはノックダウンともいう）またはタンパク質の活性の全体的もしくは部分的のいずれかの阻害に関する。例えば、この用語は、機能性遺伝子産物の産生が防止または阻害されることを意味する。不活化は、例えば、遺伝子の欠失（ノックアウトともいう）、または発現が生じないような遺伝子を制御するプロモーターの変異、もしくは遺伝子産物が不活性であるようなコーディング配列の変異によってか、あるいは「ＲＮＡｉ」技術のいずれかによって、達成され得る。
【００３６】
用語「ＲＮＡｉ」または「ＲＮＡ干渉」技術は、サイレンスしようとするＲＮＡに対して配列において相同である二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって仲介される遺伝子サイレンシングの転写後プロセスを指し、そして動物および植物細胞のような広範な真核細胞において観察される。細胞の種類に依存して、ｄｓＲＮＡは、標的ＲＮＡの配列特異的分解を誘導する２１〜２３ヌクレオチド（ｎｔ）の分子、いわゆる低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）にプロセスされ得る（シャープ（Ｓｈａｒｐ）、２００１年）。さらに加えて、発現が不活化されるべき標的遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡ、または細胞、特に、哺乳動物細胞におけるそのようなｓｉＲＮＡの発現を可能にするベクターのトランスフェクションは、そのような特異的ｓｉＲＮＡが、標的遺伝子の発現のダウンレギュレーションを誘導する場合の哺乳動物遺伝子研究における強力なツールであることが証明されている（エルバシール（Ｅｌｂａｓｈｉｒ）ら、Ｎａｔｕｒｅ．２００１年５月２４日；４１１（６８３６）：４９４−８；「Ｄｕｐｌｅｘｅｓ  ｏｆ  ２１−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＲＮＡｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ」）。さらに加えて、ＲＮＡｉは、治療用と、診断および標的の検証のために使用することができる（欧州特許第１１４４６２３号明細書；欧州特許第１２１４９４５号明細書；欧州特許第１３５２０６１号明細書；米国特許第５８９８０３１号明細書；米国特許第６１０７０９４号明細書）。
【００３７】
本明細書において使用する用語「ｓｉＲＮＡ」は、インビトロで設計された、約２３ヌクレオチド長以下、好ましくは、１９〜２３ヌクレオチド長の二本鎖の短鎖干渉ＲＮＡ分子を意味する。科学文献には、ｓｉＲＮＡが標的ｍＲＮＡの配列特異的分解を仲介するものとして記載されている。
【００３８】
本明細書において使用する用語「ｍｉＲＮＡ」は、ステムループＲＮＡ前駆体（プレ−ｍｉＲＮＡ）からプロセスされた内因性の１５〜３５ヌクレオチド、好ましくは、１９〜３０ヌクレオチド、最も好ましくは、２１〜２４ヌクレオチドの低分子ＲＮＡを意味する。ｍｉＲＮＡは、２つの転写後機構：ｍＲＮＡ切断または翻訳抑制によって、遺伝子発現をダウンレギュレートすることができる。
【００３９】
本明細書において使用する用語「ステムループ」は、相補的塩基配列を伴わない配列によって隔てられた２つの相補的塩基配列を含む一本鎖ポリヌクレオチドを意味し、相補的塩基配列は、対応するポリリボヌクレオチドにおいて重鎖構造の形成を可能にし、一本鎖ループ配列が２つのアニールした塩基配列に連結している。ステムループのステム部分を形成する相補的塩基配列は、少なくとも２、より好ましくは、少なくとも３塩基対の長さよりなる。ステム塩基対が第１および第３の配列の相補配列に対応する特定の実施態様では、第２の配列に相補するステム塩基対の１つ以上が、第１および第３の配列に相補する塩基対としての役割を兼ねることができる。これらの特別な環境下では、第２の配列のステム部分は、ただ１つの相補塩基対を含有するか、または相補塩基対を含有しないと考えられる。
【００４０】
好適なステムループ配列は、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｔＲＮＡ、または構造ＲＮＡ配列のようなＲＮＡ分子に存在することが当業者に既知のステムループ領域に基づく。当業者であれば、Ｍｆｏｌｄ（Ｍ．ズッカー（Ｍ．Ｚｕｋｅｒ）、Ｄ．Ｈ．マシューズ（Ｄ．Ｈ．Ｍａｔｈｅｗｓ）およびＤ．Ｈ．ターナー（Ｄ．Ｈ．Ｔｕｒｎｅｒ）Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｆｏｒ  ＲＮＡ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｉｎ  ＲＮＡ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１−４３、Ｊ．バルシスゼウスキー（Ｊ．Ｂａｒｃｉｓｚｅｗｓｋｉ）およびＢ．Ｆ．Ｃ．クラーク（Ｂ．Ｆ．Ｃ．Ｃｌａｒｋ）編、ＮＡＴＯ  ＡＳＩ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（１９９９年））、ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（マシューズ，Ｄ．Ｈ．（Ｍａｔｈｅｗｓ，Ｄ．Ｈ．）；サビナ，Ｊ．（Ｓａｂｉｎａ，Ｊ．）；ズッカー，Ｍ．（Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．）；およびターナー，Ｄ．Ｈ．（Ｔｕｒｎｅｒ，Ｄ．Ｈ．）、「ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９年、２８８，９１１−９４０）、Ｖｉｅｎｎａ  ＲＮＡ  ＰａｃｋａｇｅのＲＮＡｆｏｌｄ（イボ・ホファッカー（Ｉｖｏ  Ｈｏｆａｃｋｅｒ）、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ｆｕｒ  ｔｈｅｏｒｅｔｉｓｃｈｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｗａｈｒｉｎｇｅｒｓｔｒ．１７，Ａ−１０９０Ｗｉｅｎ、墺国）、Ｔｉｎｏｃｏ  ｐｌｏｔ（チノコ，Ｉ．Ｊｒ．（Ｔｉｎｏｃｏ，Ｉ．Ｊｒ．）、ウーレンベック，Ｏ．Ｃ．（Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，Ｏ．Ｃ．）およびレバイン，Ｍ．Ｄ．（Ｌｅｖｉｎｅ，Ｍ．Ｄ．）（１９７１年）Ｎａｔｕｒｅ２３０，３６３−３６７）、保存された二次構造を探索するＣｏｎＳｔｒｕｃｔ（ラック，Ｒ．（Ｌｕｃｋ，Ｒ．）、スティガー，Ｇ（Ｓｔｅｇｅｒ，Ｇ．）およびリーズナー，Ｄ．（Ｒｉｅｓｎｅｒ，Ｄ．）（１９９６年）、Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ＲＲＥ−ｅｌｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＨＩＶ，ｔＲＮＡ−ｌｉｋｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＣＭＶ，ａｎｄ  ｍＲＮＡ  ｏｆ  ｐｒｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５８，８１３−８２６；ならびにラック，Ｒ．（Ｌｕｃｋ，Ｒ．）、グラフ，Ｓ．（Ｇｒａｆ，Ｓ．）およびスティガー，Ｇ．（Ｓｔｅｇｅｒ，Ｇ．）（１９９９年）、ＣｏｎＳｔｒｕｃｔ：Ａ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１，４２０８−４２１７）、ＦＯＬＤＡＬＩＧＮ，（Ｊ．ゴロドキン（Ｊ．Ｇｏｒｏｄｋｉｎ）、Ｌ．Ｊ．ヘイヤー（Ｌ．Ｊ．Ｈｅｙｅｒ）およびＧ．Ｄ．ストルモ（Ｇ．Ｄ．Ｓｔｏｒｍｏ）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第２５巻、第１８号、３７２４−３７３２頁、１９９７年ａ；ならびにＪ．ゴロドキン（Ｊ．Ｇｏｒｏｄｋｉｎ）、Ｌ．Ｊ．ヘイヤー（Ｌ．Ｊ．Ｈｅｙｅｒ）、およびＧ．Ｄ．ストルモ（Ｇ．Ｄ．Ｓｔｏｒｍｏ）．ＩＳＭＢ５；１２０−１２３，１９９７年ｂ）、ならびにＲＮＡｄｒａｗ（オーレ・マットズラ（Ｏｌｅ  Ｍａｔｚｕｒａ）およびアンダース・ウェンボルグ（Ａｎｄｅｒｓ  Ｗｅｎｎｂｏｒｇ）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＡＢＩＯＳ）、第１２巻、第３号、１９９６年、２４７−２４９）のような推定コンピュータモデリングプログラムを使用して、ステムループＲＮＡ構造を容易に同定することができる。
【００４１】
本明細書において使用する用語「化合物」は、（例えば、「試験化合物」におけるように）外部から添加される試験化合物を含むように意図されている。試験化合物は、細胞と接触させてもよい。活性についてスクリーニングすることができる例示的化合物として、ペプチド、核酸、炭水化物、小さな有機分子および天然産物抽出物ライブラリーが挙げられるが、これらに限定されない。アゴニスト作用およびアンタゴニスト作用を有する化合物の両方とも、本発明においてスクリーニング、同定または選択することが意図される。
【００４２】
本明細書において使用する用語「活性化合物」は、細胞受容体の活性と特異的に相互作用し、そしてモジュレートする薬学的に有効な化合物を指す。この用語はリガンドと均等である。
【００４３】
用語「フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激されるアデニリルシクラーゼアイソフォーム」は、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって潜在的に刺激され得るアデニリルシクラーゼアイソフォームを示す。
【００４４】
本明細書において使用する用語「ｃＡＭＰ形成のインビトロアクチベーター」は、ほとんどすべてのアデニリルシクラーゼアイソフォームを直接活性化するフォルスコリン、およびフォルスコリン誘導体、特に、アデニリルシクラーゼアイソフォームＶおよびＶＩの強力な選択的アクチベーターであるＮＫＨ−４７７とも称される塩酸コルホルシンダロパート（６−（３−ジメチルアミノプロピオニル）フォルスコリン塩酸塩を指す。
【００４５】
本明細書において使用する用語「有効量」は、意図する目的を達成するのに十分であるモジュレーター化合物、または少なくとも１つのそのような化合物を含んでなる薬学的組成物の量を指す。例えば、意図する目的は、被験体の生物体全体または特定の組織におけるｃＡＭＰ蓄積もしくはアデニリルシクラーゼ活性を阻害であってもよく、あるいは増大することであってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】ＣＨＯ細胞におけるＧαｉタンパク質を特徴付けるウエスタンブロットを示す。
【図２】配列番号１０（ＡＣＶＩＩ＿ｍｉＲ＿１７３）の標的化された配列およびプラスミドに挿入されるべきｍｉＲＮＡ構築の例を示す。
【図３】ＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるアデニリルシクラーゼＶＩＩの発現に対する異なるｍｉＲＮＡの抑制効果を示すブロットを表す。
【図４】共焦点蛍光顕微鏡を使用することによって、アデニリルシクラーゼＶＩＩの発現に対する異なるｍｉＲＮＡの抑制効果を確認する。
【図５】アセチルコリンおよびキンピロール（ｑｕｉｍｐｉｒｏｌｅ）によって誘導されるｃＡＭＰの測定を特徴付ける用量−反応曲線を示す。
【図６】２つの細胞系統（Ｍ４／ＣＨＯおよびＭ４／ＣＨＯ／ｍｉＲＮＡ）においてフォルスコリンによって誘導されるｃＡＭＰの産生に対するオキソトレモリンの効果を説明する。
【図７】フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって誘導されるｃＡＭＰの産生の用量依存的シグナルを説明する。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本発明は、細胞受容体の活性と特異的に相互作用し、そしてモジュレートする薬学的に有効な化合物をスクリーニングおよび同定するための、選択された細胞において発現されるＧｉ共役受容体のための信頼性がありかつ有効なインビトロでのｃＡＭＰに基づくアッセイを提供する。
【００４８】
上記のように、Ｇｉ共役受容体による細胞におけるｃＡＭＰレベルのモジュレーションの観察には、従来、フォルスコリン、アデニリルシクラーゼアイソザイムのアクチベーターによる細胞の前処置が必要である。活性化時のｃＡＭＰ応答が特定の細胞または細胞系統に存在する細胞性アイソザイムに依存することを考慮すると、Ｇαｉ効果を検出するのに必要なフォルスコリン仲介アデニリルシクラーゼアイソフォーム刺激の非特異性は、Ｇｉ共役受容体のアゴニストによって仲介されるｃＡＭＰ産生の効率的な阻害の欠如に有意に寄与し得る。結果として、得られるアゴニスト仲介阻害が、フォルスコリンによる刺激の６０％を超えることはほとんどない。そのため、これは、受容体アゴニストによって仲介されるｃＡＭＰ減少のアンタゴニストによる反転を測定することを困難にしている。
【００４９】
本出願人は、ｃＡＭＰ形成のインビトロアクチベーターによって仲介されるｃＡＭＰ産生のアゴニスト阻害を効率的に改善し、従って、Ｇｉ共役受容体を発現する特定の細胞におけるアゴニスト効果の反転（reversal）を介するアンタゴニスト活性の容易な定量化をうまく行うための１つの方法が、ｃＡＭＰ形成のインビトロアクチベーターによって刺激され、Ｇαｉタンパク質に感受性であるアデニリルシクラーゼの影響を優先させることであることを示している。
【００５０】
従って、得られるＧｉ効果の検出は、Ｇαｉファミリーに対して感受性な予め刺激されたアデニリルシクラーゼアイソフォーム活性のアゴニストとの相互作用によって誘導される特異的阻害に主に関連する。
【００５１】
従って、第１の局面では、本発明は、細胞において発現されるＧｉ共役受容体によってモジュレートされるｃＡＭＰレベルに基づくインビトロアッセイを使用して、試験化合物をスクリーニング、同定または選択するための方法であって、以下の工程：
（ａ）場合により、選択された細胞において、細胞内ｃＡＭＰレベルのモジュレーションに関与するＧαｉおよびアデニリルシクラーゼアイソフォームを同定すること、
（ｂ）前記選択された細胞において、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉによる阻害に感受性であるアデニリルシクラーゼアイソフォーム（Ａ）の影響の方を、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激されるが、Ｇαｉによる阻害には感受性でないアデニリルシクラーゼアイソフォーム（Ｂ）の影響よりも優先させること、
（ｃ）前記細胞と、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７および試験化合物とを接触させること；次いで
（ｄ）前記試験化合物と前記細胞とを接触させることにより生じるｃＡＭＰレベルを測定すること、
を含んでなる、上記方法を提供する。
【００５２】
最も適切な細胞の選択は、細胞内ｃＡＭＰレベルのモジュレーションに関与するＧαｉタンパク質およびアデニリルシクラーゼアイソフォームの両方の同定を含んでなる。実際に、異なるアデニリルシクラーゼアイソフォームの発現パターンは細胞または組織特異的であることが示されている。従って、アデニリルシクラーゼアイソフォームの発現に関して文献上データが得られていない細胞について、本発明における使用のために選択される特異的細胞種類において発現されるアデニリルシクラーゼアイソフォームの同定の第１の工程が実行されなければならない。
【００５３】
現在まで、クローニングされた哺乳動物アデニリルシクラーゼのうち、アイソフォームＩＸ以外のすべてについて、フォルスコリンによって刺激されることが同定されている。さらに加えて、ＮＫＨ−４７７はアデニリルシクラーゼアイソフォームＶおよびＶＩの強力な選択的アクチベーターであることが示されている。さらに、アデニリルシクラーゼＩ、ＶおよびＶＩのみが、Ｇαｉファミリーに感受性である。
【００５４】
適切な細胞系統の選択は、特定のアデニリルシクラーゼの有無によって影響される。選択された細胞は、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって活性化され、そしてＧαｉタンパク質による阻害に感受性であることが示される少なくとも１つのアデニリルシクラーゼアイソフォームを発現すべきである。別の実施態様では、本発明の方法において使用される細胞は、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって活性化され、そしてＧαｉタンパク質による阻害に感受性であるアデニリルシクラーゼアイソフォームのみを含有し、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって活性化され、そしてＧαｉタンパク質による阻害には非感受性であるアデニリルシクラーゼアイソフォームは含有しない。
【００５５】
本発明の実施態様は、内因性のＧαｉタンパク質およびアデニリルシクラーゼアイソフォームを発現する天然の細胞ならびに樹立された細胞系統よりなる群から細胞を選択することにある。
【００５６】
本発明の別の実施態様では、樹立された細胞系統は、クローニングされたＧαｉタンパク質および／またはアデニリルシクラーゼアイソフォームを発現する。
【００５７】
特定の実施態様では、宿主細胞は、哺乳動物細胞、酵母細胞、またはＣＨＯ、ＨＥＫもしくは昆虫ＳＦ９系統の中から選択される樹立された細胞系統の中から選択される真核細胞である。好適な実施態様では、宿主細胞はＣＨＯ−Ｋ１またはＣＨＯ−Ｓ系統である。
【００５８】
好適な実施態様では、細胞は、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激されるが、Ｇαｉタンパク質による阻害には感受性でない、１〜４種、より好ましくは４種、より好ましくは３種、より好ましくは２種、および最も好ましくは１種を包含する一定数のアデニリルシクラーゼアイソフォームを発現する。
【００５９】
フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激されるが、Ｇαｉによる阻害には感受性でないアデニリルシクラーゼアイソフォームが、選択された細胞において発現される場合、当該分野に関する説明に記載の方法において遭遇する問題、即ち、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激されるが、Ｇαｉタンパク質による阻害には非感受性であるアデニリルシクラーゼを含む多くのアデニリルシクラーゼのフォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７による活性化の結果としてＧｉ共役受容体によって仲介されるｃＡＭＰ産生の阻害の乏しい誘導を克服するために、それらを不活化しなければならない。
【００６０】
あるいは、選択された細胞は、Ｇαｉタンパク質および／またはアデニリルシクラーゼアイソフォームが天然には発現されない細胞種類に対応し得る。この場合、上記のアイソフォームの所定のアイソフォームの外因性発現は、例えば、発現させるための目的の特異的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターの一過的または安定的なトランスフェクションによって、得ることができる。
【００６１】
本発明の特定の実施態様では、工程ｂ）は、フォルスコリンによって刺激され、Ｇαｉによる阻害に感受性であるアデニリルシクラーゼアイソフォーム（Ａ）の影響の方を、フォルスコリンによって刺激されるが、Ｇαｉによる阻害には感受性でないアデニリルシクラーゼアイソフォーム（Ｂ）の影響よりも優先させることよりなる。
【００６２】
別の特定の実施態様では、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉによる阻害に感受性であるアデニリルシクラーゼアイソフォーム（Ａ）の影響の方を、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激されるが、Ｇαｉによる阻害には感受性でないアデニリルシクラーゼアイソフォーム（Ｂ）の影響よりも優先させることは、選択された細胞とＮＫＨ−４７７とを接触することによって達成される。この実施態様では、工程ｃ）は、前記細胞と試験化合物とを接触させることによって達成されるが、前記細胞とフォルスコリンとを接触させても達成されない。実際、上記のように、工程ｃ）において達成される選択された細胞におけるｃＡＭＰの産生の刺激がもはや必要でないほど、ＮＫＨ−４７７は特異的なアデニリルシクラーゼアイソフォームの強力な選択的アクチベーターであるため、ＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉによる阻害に感受性であるアデニリルシクラーゼアイソフォーム（Ａ）は、工程ｂ）において既に刺激されている。
【００６３】
従って、選択された細胞とＮＫＨ−４７７とを接触させることによって工程ｂ）が達成される場合、工程ｂ）およびｃ）は、連続的または同時のいずれかで実施され得る。
【００６４】
本出願人は、ｃＡＭＰ形成のインビトロアクチベーターとしてフォルスコリンの代わりに化合物ＮＨＫ−４７７を使用すると、驚くべきことに、アデニリルシクラーゼアイソフォームＶおよび／またはＶＩを発現する細胞において２０％までのｃＡＭＰの産生の増加を生じることを示している。
【００６５】
従って、特定の実施態様では、本発明の方法の工程ｂ）は、ＮＫＨ−４７７で特異的にアデニリルシクラーゼアイソフォームＶおよび／またはＶＩを刺激することによって達成される。
【００６６】
別の特定の実施態様では、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉによる阻害に感受性であるアデニリルシクラーゼアイソフォームの影響の方を、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７に感受性であるが、Ｇαｉによる阻害には感受性でないアデニリルシクラーゼアイソフォームの影響よりも優先させることは、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激されるが、Ｇαｉタンパク質による阻害には感受性でないアデニリルシクラーゼアイソフォームを特異的に不活化することによって達成される。そのようなＧαｉ非感受性アデニリルアイソフォームの不活化は、例えば、それらの触媒活性を特異的に阻害することによって、または好ましくはそれらの発現をダウンレギュレートすることによって、達成することができる。
【００６７】
用語「フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激されるが、Ｇαｉタンパク質による阻害には感受性でないアデニリルシクラーゼアイソフォームを特異的に不活化すること」は、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激されるが、Ｇαｉタンパク質による阻害には感受性でないアデニリルシクラーゼアイソフォームの方を、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉによる阻害に感受性であるアデニリルシクラーゼアイソフォームよりも優先的に、そして優先的かつ排他的に不活化することを示す。
【００６８】
本発明の方法では、細胞における遺伝子発現を改変する一方、細胞生存率に影響を及ぼすことなくそのような改変を行うように注意しなければならない。
【００６９】
核酸分子は、当業者に公知の方法によって、場合により、複製、および／または哺乳動物細胞に組入れることができる構築物に挿入することができる。本発明の実践では、分子生物学、微生物学、および組み換えＤＮＡにおける多くの従来の技術を使用することができる。そのような技術を周知であり、そして例えば、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第Ｉおよび第ＩＩ巻、１９８５年（Ｄ．Ｎ．グローバー（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ）編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９８４年、（Ｍ．Ｌ．ゲイト（Ｍ．Ｌ．Ｇａｉｔ）編）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，１９８５年、（ヘイムズ（Ｈａｍｅｓ）およびヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ））；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，１９８４年（ヘイムズ（Ｈａｍｅｓ）およびヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）編）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，１９８６年（Ｒ．Ｉ．フレッシュニー（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）編）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，１９８６年（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）；バーバール（Ｐｅｒｂａｌ）、１９８４年、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，１９８７年（Ｊ．Ｈ．ミラー（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ）およびＭ．Ｐ．カルロス（Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ）編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；ならびにＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５４巻および第１５５巻（それぞれ、ウー（Ｗｕ）およびグロスマン（Ｇｒｏｓｓｍａｎ）、ならびにウー（Ｗｕ）編）において詳細に説明されている。
【００７０】
工程（ｂ）は、多様な方法で達成することができる。例示的実施態様では、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉによる阻害に感受性であるアデニリルシクラーゼアイソフォームの影響の方を、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７に感受性であるが、Ｇαｉによる阻害には感受性でないアデニリルシクラーゼアイソフォームの影響よりも優先させることは、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉタンパク質による阻害は感受性であるアデニリルシクラーゼアイソフォーム遺伝子の発現を増加することによって達成される。
【００７１】
本発明のさらなる実施態様では、Ｇｉ共役受容体特異的経路を干渉することが同定される天然の細胞または樹立された細胞系統由来のすべての種類の遺伝子は、これらの特異的経路を優先させるためにアップレギュレートまたはダウンレギュレートすることができる。さらに、試験化合物に対する応答において目的のＧｉ共役受容体を発現し、そしてＧｉに対するアデニリルシクラーゼアイソフォーム応答を増大することが疑わしい選択される細胞系統に存在しない外因性遺伝子を、アッセイを改善するために、発現させるか、あるいは選択された他の内因性の遺伝子またはｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡを含む任意の種類のオリゴヌクレオチドと共に同時発現させることができる。
【００７２】
所定のアゴニストが、Ｇタンパク質共役の促進によるＧ共役受容体状態のための高い親和性を実証することができることは周知のことである。多くの天然の受容体システムでは、そのような複合体の形成に利用可能なＧタンパク質の量は制限されておらず、そして効果的なアゴニストによって、完全な受容体集団を高親和性の三元複合体に変換することができる（ケナニン，Ｔ．（Ｋｅｎａｎｉｎ，Ｔ．）、ＴｉＰＳ，１９９７年、１８，４５６−４６４）。しかし、例えば、哺乳動物細胞系統を含むいくつかのシステムでは、Ｇｉタンパク質サブタイプとして必要とされるＧタンパク質の利用可能性が制限されている。一方、本発明に関して、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７による同定された内因性アデニリルシクラーゼアイソフォームの予め必要とされる刺激は、Ｇαｉによる阻害の程度を制限し得る（デッサウアー，Ｃ．，Ｗ．（Ｄｅｓｓａｕｅｒ，Ｃ．，Ｗ．）、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２年、２７７，３２，２８８２３−２８８２９）。一方、本発明に従えば、フォルスコリンもしくはＮＫＨ−４７７および／またはＧαｓ刺激アデニリルシクラーゼのＧαｉ阻害を強化するために、同じプラスミドにおいて特異的ｍｉＲＮＡおよび特異的なＧｉサブタイプタンパク質を同時発現することが可能である樹立された安定な宿主細胞系統を開発することができる。これを例示するために、アデニリルシクラーゼＶＩＩ特異的ｍｉＲＮＡを安定的に発現するＣＨＯ−Ｋ１およびＣＨＯ−Ｓを使用して、好ましくは、同じプラスミドにおいて、特異的アデニリルシクラーゼアイソフォームＶＩＩ  ｍｉＲＮＡおよび特異的なＧαｉタンパク質特異的サブタイプを同時発現することによって、特異的なＧｉタンパク質に共役するＧＰＣＲを発現する妥当かつ堅牢なｃＡＭＰに基づく細胞アッセイを開発することができる。
【００７３】
本発明の１つの実施態様では、選択された細胞は、目的のＧｉタンパク質を内因的に発現する。なお他の実施態様では、細胞は、異種のＧｉタンパク質を発現するように操作される。両方の場合、宿主細胞の１つ以上の内因性遺伝子を不活化することが所望され得る。
【００７４】
本発明の方法に従えば、Ｇαｉタンパク質は、アデニリルシクラーゼを阻害し、Ｇｉ１、Ｇｉ２、Ｇｉ３、Ｇ０１、Ｇ０２、Ｇ０３、ＧＺ、Ｇｔ１、Ｇｔ２およびＧｇｕｓｔを含むＧｉ／０サブファミリーの中から選択される。
【００７５】
本発明では、さまざまな真核宿主における発現のために、多くの周知のベクターを使用することができる。例えば、周知の哺乳動物発現ベクターをトランスフェクトすることによって、Ｇαｉタンパク質またはＧｉ共役受容体を発現させてもよい。
【００７６】
当業者は、所定のタンパク質の発現を同定するための多くの技術を自由に使用することができる。例えば、選択された細胞において発現されるアデニリルシクラーゼアイソフォームの同定は、ＰＣＲ、好ましくは、縮重プライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲ増幅によって実施することができる。あるいは、各アイソフォームに特異的な抗体を使用することによって、選択された細胞において、どのアデニリルシクラーゼアイソフォームが発現されるかを同定するために、ウエスタンブロット分析を使用することができる。
【００７７】
これまでに同定された異なる種類のアデニリルシクラーゼは、共通の構造を共有している。それぞれ、大きな細胞質ループによって隔てられた６つの推定膜貫通領域よりなる２つのドメイン、ならびにカルボキシル末端において大きな細胞質ループを有する。アデニリルシクラーゼの異なるアイソフォームについては、タウシッグＲ（Ｔａｕｓｓｉｇ  Ｒ）、ギルマンＡＧ（Ｇｉｌｍａｎ  ＡＧ）（１９９５年）Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ  ａｄｅｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７０およびスナハラＲＫ（Ｓｕｎａｈａｒａ  ＲＫ）、デッサウアーＣＷ（Ｄｅｓｓａｕｅｒ  ＣＷ）、ギルマンＡＧ（Ｇｉｌｍａｎ  ＡＧ）（１９９６年）Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ａｎｄ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ａｄｅｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅｓ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ３６，４６１−８０において検討される。
【００７８】
一本鎖核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴもしくはポリヌクレオチドが相補性によって二本鎖複合体を形成する能力に基づいて、配列類似性を有する核酸の同定のための多様な方法が当該技術分野において公知である。特に、低いストリンジェンシー条件下で、例えば、アデニリルシクラーゼプローブによって二本鎖複合体を形成することが可能な特異的標的核酸の存在について、サンプルをスクリーニングしてもよい。本明細書において使用する「サンプル」として、ゲノムライブラリー、ｃＤＮＡライブラリー、組織由来の核酸分子抽出物、または細胞培養由来の核酸分子抽出物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
複合体形成後、標的核酸分子は、当該技術分野において公知の方法によって単離される。方法にはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）が含まれ、ここで、サンプルＤＮＡまたはｃＤＮＡの領域を増幅するために、標的核酸配列に特異的な２つのプローブが使用される。ＰＣＲはまた、単一のアデニリルシクラーゼプローブ、および既知の遺伝子反復配列に相補的な第２のオリゴヌクレオチドで実施してもよい。
【００８０】
一般的に、ノーザンまたはサザンブロットにおいて使用される場合、アデニリルシクラーゼプローブは、検出マーカー、例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、ビオチン、ＦＩＴＣなどで標識される。
【００８１】
本発明において使用される核酸は、周知の細胞から直接単離してもよい。あるいは、テンプレートとして化学的に合成された鎖またはゲノム材料を使用して、本発明の核酸を生成するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法を使用することができる。ＰＣＲに使用されるプライマーは、本明細書において提供する配列情報を使用して合成することができ、そして適切な新しい制限部位を導入するため、所望であれば、組み換え発現のための所定のベクターへの組み入れを容易にするために、さらに設計することができる。
【００８２】
特定のｍＲＮＡに特異的である標的配列を同定するために、標的ｍＲＮＡ由来の複数の配列を選択することができる。標的ｍＲＮＡに高い相同性を有する他のｍＲＮＡとの配列アラインメントが使用される。選択された細胞においてＧαｉまたはアデニリルシクラーゼアイソフォームを同定することが目的である場合、遺伝子相同技術を使用することができる。本発明の特定の場合では、Ｇｉタンパク質またはアデニリルシクラーゼアイソフォームの配列がＧｅｎｂａｎｋから利用可能である。例えば、マウスアデニリルシクラーゼＶＩ遺伝子（ＮＭ＿００７４０５）を使用して、ＣＨＯ細胞中の相同ハムスター遺伝子を同定することができる。
【００８３】
本発明は、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激されるが、Ｇαｉによる阻害には感受性でないアデニリルシクラーゼアイソフォームの発現を、任意の種類のアプローチによってダウンレギュレートすることができる天然の細胞または樹立された細胞系統の使用を含んでなる。特に好適な細胞は、所定の遺伝子の発現をダウンレギュレートするために、ＲＮＡｉ技術を実行することができる細胞である。この技術は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）として適応されるＲＮＡｉの設計、選択、次いで、使用を含む。
【００８４】
ＲＮＡｉによる不活化は、不活化しようとする所定の標的遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡのような適応されるＲＮＡｉを一過的にトランスフェクトすることによってか、あるいはそのようなｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡをコードする発現ベクターを一過的もしくは安定的のいずれかでトランスフェクトするかのいずれかによって、入手してもよい。
【００８５】
特定の実施態様では、ｍｉＲＮＡの発現が所望される。ｍｉＲＮＡの発現は、操作されたプレ−ｍｉＲＮＡ一次転写産物を含むＤＮＡに基づくベクターによって入手し得る。設計されるポリヌクレオチド配列は、例えば、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ４．１−ＣＭＶ（Ａｍｂｉｏｎ）、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＣＭＶ５もしくはｐＲｃ／ＣＭＶ２、ｐＲＮＡ−ＣＭＶ３．１（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のような真核細胞ベクター、またはｐＲＮＡ−Ｕ６．１（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）もしくはｐＳｉｌｅｎｃｅｒ２．０−Ｕ６（Ａｍｂｉｏｎ）のようなＵ６プロモーター由来のベクター、またはｐＲＮＡ−Ｈ１．１（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびｐＳｉｌｅｎｃｅｒ３．０−Ｈ１（Ａｍｂｉｏｎ）のようなＨｉプロモーター由来のベクターにおける発現のために挿入することができる。
【００８６】
本発明の特定の実施態様では、ｍｉＲＮＡを発現するために設計されるポリヌクレオチドは、ノックダウン効率を大いに増加することが示されているヘアピン構築物に対するＤｒｏｓｈａ切断部位を含む（ボーデン（Ｂｏｄｅｎ）ら、２００４年、シルバ（Ｓｉｌｖａ）ら、２００５年）。
【００８７】
有利なことに、ヘアピンは、１９〜２２ｎｔのｄｓＲＮＡおよびヒトｍｉＲ３０由来の１９ｎｔループよりなり得る。さらに加えて、本発明の別の実施態様では、ヘアピンのいずれかの側にｍｉＲ３０ループおよび／または１２５ｎｔのｍｉＲ３０フランキング配列があると、ｍｉＲＮＡ適応を伴わない従来のｓｈＲＮＡ設計と比較して、発現されるヘアピンのＤｒｏｓｈａおよびＤｉｃｅｒプロセシングが１０倍を超えて増加する（シルバ（Ｓｉｌｖａ）ら、２００５年）。この技術については、実施例のセクションでさらに詳述する。
【００８８】
所定の実施態様では、リガンドが不明な「オーファン受容体」に対して活性化合物を同定するための本明細書に記載の方法が使用される。
【００８９】
本発明の特定の実施態様では、方法は、細胞において発現されるＧｉ−共役受容体に関して、それらのアゴニストもしくはアンタゴニスト活性を確かめるための多数の試験化合物の迅速なスクリーニングまたはプロファイリングを可能にする。
【００９０】
試験化合物は、本発明の方法の工程ｄ）の結果に基づいて、スクリーニング、同定または選択される。具体的には、本発明の方法によってスクリーニング、同定または選択される試験化合物は、前記試験化合物の非存在下で本発明の方法に従って実施される測定に比べて、選択された細胞におけるｃＡＭＰレベルのモジュレーションを生じる化合物である。
【００９１】
試験化合物は、細胞におけるシグナルをモジュレートするために前記試験化合物と相互作用する任意の受容体であり得る受容体タンパク質と相互作用することができる。例えば、標的受容体は細胞表面受容体であってもよい。本発明の方法は、以下のようなＧｉ共役受容体をモジュレートする能力を潜在的に有する化合物の迅速かつ信頼性がある（ｒａｐｉｄ  ａ  ｒｅｌｉａｂｌｅ）同定を可能にするスクリーニング方法であることを理解すべきである：
［α］２−アドレナリン受容体、［α］２Ｂ−アドレナリン受容体、［β］２−アドレナリン受容体、ｍ２ＡＣｈＲ、ｍ４ＡＣｈＲ、Ｄ２ドーパミン受容体、Ｄ３ドーパミン受容体、Ｄ４ドーパミン受容体、Ａ１アデノシン受容体、５−ＨＴ１ａ受容体、５−ＨＴ１ｂ受容体、５ＨＴ１様受容体、５−ＨＴ１ｄ受容体、５ＨＴ１ｄ様受容体、５ＨＴ１ｄβ受容体、ｆＭＬＰ受容体、ｆＭＬＰ様受容体、ソマトスタチンＳＳＴＲ１およびＳＳＴＲ２、ＳＳＴＲ３、カナビノイド受容体（ＣＢ１／ＣＢ２）、Ｃ５ａアナフィラトキシン受容体、インターロイキン８（ＩＬ−８）ＩＬ−８ＲＡ、ＩＬ−８ＲＢ、δオピオイド受容体、κオピオイド受容体、ｍｉｐ−１／ＲＡＮＴＥＳ受容体、ロドプシン、赤オプシン、緑オプシン、青オプシン、代謝型グルタミン酸ｍＧｌｕＲ１−６、ＡＴＰ受容体、ニューロペプチドＹ受容体。
【００９２】
特定の実施態様では、本発明は、上記の方法の工程を実行することによって、選択された細胞におけるＧｉ共役受容体モジュレート活性を潜在的に有する試験化合物をスクリーニング、同定または選択するための方法を提供する。細胞外刺激を細胞内シグナル、即ち、機能的応答をもたらすｃＡＭＰレベルのモジュレーションに変換するために、すべてのＧｉ共役受容体は、Ｇｉタンパク質に物理的に共役しなければならない。従って、本発明の方法において同定されるどの化合物がＧｉ共役受容体のリガンドであるかをさらに決定することについては、二次干渉経路によって細胞のｃＡＭＰに対して作用するそれらの化合物を排除するために、さらなる特徴付けが必要であり得る。この特徴付けは、例えば、同定される試験化合物がどの受容体に結合するかを決定するために、既知のＧｉ共役受容体に対する競合アッセイによって、達成することができる。
【００９３】
本発明に従えば、スクリーニングまたはプロファイリングを、ハイスループット様式で実施することができる。
【００９４】
本発明の方法の特定の実施態様では、Ｇｉ共役受容体に対する試験化合物の潜在的効果は、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって処置された細胞のｃＡＭＰレベルと、試験化合物によって処置されたかもしくは処置されていない細胞のｃＡＭＰレベルとを比較することによって行われる。
【００９５】
細胞内ｃＡＭＰの測定は、当該分野において周知の検出アッセイによって達成してもよい。それらのうち、例えば、ＳＰＡ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＦｌａｓｈｐｌａｔｅｓおよびＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ｌｉｆｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、蛍光偏光（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＤｉｓｃｏｖｅｒｅＸ／ＨｉｔＨｕｎｔｅｒ、β−Ｇａｌ  ＥＦＣ（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ／ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、時間分解ＦＲＥＴ（Ｃｉｓｂｉｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）、ＣａｔｃｈＰｏｉｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）ＡＣＴＯｎｅ  ｃＡＭＰアッセイ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）としてＨＴＳに使用される最も一般的な自動化技術を使用することができる。
【００９６】
前記アッセイは、例えば、サンドイッチアッセイを含むホモジニアスまたはヘテロジニアスアッセイであってもよい。
【００９７】
本発明の別の実施態様では、試験化合物によって誘導される細胞内ｃＡＭＰレベルモジュレーションの測定は、放射能、比色、蛍光または発光を使用する技術による細胞内ｃＡＭＰレベルの変化の測定によって実施することができる。
【００９８】
本発明の特定の実施態様では、選択された細胞が、マルチウェルアッセイプレートの複数のウェルに配置される。細胞は、例えば、条件下の試験化合物を伴うアッセイプレートのいくつかのウェルにおいて、平衡化を可能にするのに十分な時間、インキュベートされ得る。次いで、試験は、例えば、時間分解蛍光（ＴＲＦ）技術および蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）技術を組み合わせる標識アプローチによって読み取られる。ＦＲＥＴは、適切な供与および受容蛍光団との間の非放射性エネルギー移動を指す。
【００９９】
蛍光読み取りの量は、細胞受容体の活性と特異的に相互作用し、そしてモジュレートする有効量の活性化合物によって誘導されるアデニリルシクラーゼ活性に比例する。
【０１００】
本アッセイにおいて使用すべき細胞は、標準的な細胞培養技術に従って培養してもよい。例えば、細胞は、しばしば、滅菌環境の適切な容器中、３７℃で、加湿された９５％空気−５％ＣＯ２雰囲気を含有するインキュベーターにおいて増殖される。容器は、撹拌培養物を含有しても、または静置培養物を含有してもよい。多様な細胞培養培地には、ウシ胎児血清のような組成が明らかでない生物学的液体を含有する培地、ならびに２９３ＳＦＭ無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）のような十分に組成が明らかである培地が含まれ得る。細胞培養技術は、当該技術分野において周知であり、そして多様な細胞の種類の培養について確立されたプロトコルが利用可能である（例えば、Ｒ．Ｉ．フレッシュニー（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）、「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、第２版、１９８７年、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．を参照のこと）。
【０１０１】
好適な実施態様では、本発明は、試験化合物をスクリーニング、選択または同定するための上記の方法においてアデニリルシクラーゼＶＩＩ発現がノックダウンされるＣＨＯ−ＳまたはＣＨＯ−Ｋ１細胞を実装することを含んでなる。
【０１０２】
本発明のさらなる局面は、細胞受容体の活性と特異的に相互作用し、そしてモジュレートする試験化合物によるｃＡＭＰレベルのモジュレーションを測定するためのアッセイシステムまたはキットに関し、前記アッセイシステムまたはキットは、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉによる阻害に感受性であるアデニリルシクラーゼアイソフォームを主に発現する細胞を含んでなる。
【０１０３】
本明細書において使用する用語「主に発現する」は、上記のように、選択された細胞における、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激されるが、Ｇαｉによる阻害には感受性でないアデニリルシクラーゼアイソフォームに対する、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉによる阻害に感受性であるアデニリルシクラーゼアイソフォームのより優勢な影響を示す。
【０１０４】
特定の実施態様では、本発明のアッセイシステムまたはキットは、フォルスコリンもしくはＮＫＨ−４７７によって刺激されるが、Ｇαｉによる阻害には感受性でないアデニリルシクラーゼアイソフォームの発現が、ｍｉＲＮＡによる特異的標的化によって不活化されている細胞を含んでなる。
【０１０５】
本発明のアッセイシステムまたはキットは、その細胞と、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７および試験化合物とを接触させ、次いで、前記接触から生じるｃＡＭＰのレベルを測定することによって実行される。
【０１０６】
特定の実施態様では、本発明は、アッセイシステムまたはキットを提供し、ここで、前記細胞は、ｉ）特異的なＧαｉタンパク質、あるいはフォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉタンパク質による阻害に感受性である特異的アデニリルシクラーゼアイソフォームをコードする核酸配列（ｉｉ）およびフォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉタンパク質による阻害には感受性でないアデニリルシクラーゼアイソフォームをコードするアデニリルシクラーゼ転写産物を標的化する特異的ｍｉＲＮＡを安定的に同時発現する。
【０１０７】
別の特定の実施態様では、本発明のアッセイシステムまたはキットは、上記の組換え細胞を含んでなる。
【０１０８】
別の局面では、本発明は、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉに感受性であるアデニリルシクラーゼアイソフォームおよびフォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉには感受性でないアデニリルシクラーゼアイソフォームの両方を発現する選択された細胞から操作された組換え細胞であって、ここで、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉに感受性であるアデニリルシクラーゼアイソフォームの影響の方が、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉには感受性でないアデニリルシクラーゼアイソフォームの影響よりも優先される、上記組換え細胞を提供する。
【０１０９】
特定の実施態様に従えば、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉに感受性であるアデニリルシクラーゼアイソフォームの発現は、本発明の組換え細胞においてアップレギュレートされる。
【０１１０】
別の特定の実施態様では、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉには感受性でないアデニリルシクラーゼアイソフォームは、本発明の組換え細胞において、例えば、前記アイソフォームをコードする遺伝子の欠失またはＲＮＡｉによるダウンレギュレーションによって、不活化される。
【０１１１】
さらに、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉに感受性であるアデニリルシクラーゼアイソフォームの影響よりも、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉに感受性であるアデニリルシクラーゼアイソフォームの優先される影響の方を達成する異なる方法については、上記で説明した。
【０１１２】
本発明の組換え細胞の特定の実施態様では、前記組換え細胞は、前記細胞が操作される細胞において発現されるアデニリルシクラーゼアイソフォームに特異的な１つ以上のｍｉＲＮＡをコードする少なくとも１つの組み換え発現ベクターで、好ましくは安定的にトランスフェクトされる。別の実施態様では、前記少なくとも１つ以上のｍｉＲＮＡをコードする前記組み換え発現ベクターは、特異的なＧαｉタンパク質か、あるいはフォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉタンパク質による阻害に感受性である特異的なアデニリルシクラーゼアイソフォームをコードする１つ以上の核酸配列を含んでなる組み換え発現ベクターで同時トランスフェクトされる。
【０１１３】
本発明の組換え細胞においてトランスフェクトされる組み換え発現ベクターは、操作されたプレ−ｍｉＲＮＡ構造を含む適切な真核細胞発現ベクターであり得る。有利なことに、組み換え発現ベクターは、ヘアピン構築物においてＤｒｏｓｈａ切断部位をさらに含んでなり得る。ヘアピンステムは、好ましくは、標的遺伝子から誘導される２１〜２２ｎｔのｄｓＲＮＡ（成熟ｍｉＲＮＡ）よりなり、そしてヘアピンループは、好適な実施態様では、１９ｎｔを含んでなり得る。
【０１１４】
本発明の特定の実施態様では、組換え細胞系統が操作され、これは、異種のＧαｉタンパク質、およびフォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉタンパク質による阻害には感受性でないアデニリルシクラーゼアイソフォームをコードするアデニリルシクラーゼ転写産物を標的化する特異的ｍｉＲＮＡを同時発現する。
【０１１５】
特定の実施態様では、本発明の組換え細胞は、（ｉ）操作されたプレ−ｍｉＲＮＡ一次転写産物、およびｉｉ）前記組換え細胞において安定的に同時発現される特異的なＧαｉタンパク質、あるいはフォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉタンパク質による阻害に感受性である特異的アデニリルシクラーゼアイソフォームをコードする核酸配列を含んでなる組み換えＤＮＡベクターで安定的に形質転換されている細胞である。
【０１１６】
特定の実施態様では、本発明の組換え細胞は、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉタンパク質による阻害に感受性である特異的アデニリルシクラーゼアイソフォーム、およびフォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって刺激され、Ｇαｉタンパク質による阻害には感受性でないアデニリルシクラーゼアイソフォームをコードするアデニリルシクラーゼ転写産物を標的化する特異的ｍｉＲＮＡを同時発現するように操作されている細胞である。
【０１１７】
特定の実施態様では、組換え細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞系統である。
【０１１８】
本発明に従う組換え細胞は、Ｇｉ共役受容体によってモジュレートされるｃＡＭＰレベルに基づくインビトロアッセイにおけるツールとして使用することができる。従って、本発明は、Ｇｉ共役受容体の潜在的リガンドをスクリーニング、同定または選択するためのツールとして上記のように規定される組換え細胞の使用をさらに提供する。
【０１１９】
ＣＨＯ−Ｋ１またはＣＨＯ−Ｓ細胞の使用が特に好適である。これらの細胞は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）、Ｐｏｒｔｏｎ  Ｄｏｗｎ、ＵＫ受託番号８５０５１００５から入手可能である。ＨＥＫ−２９３細胞は、受託番号８５１２０６０２（ＥＣＡＣＣ）下で入手可能であり、そしてｓｆ９細胞は、受託番号８９０７０１０１（ＥＣＡＣＣ）下で入手可能である。
【０１２０】
これより本発明について概説するが、それは、本発明の所定の局面および実施態様の単なる例示の目的のために含まれ、本発明を制限することを意図しない以下の実施例を参考にすることによって、さらに容易に理解されるであろう。
【実施例】
【０１２１】
実施例として、および本発明を例示するために、ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−Ｋ１およびＣＨＯ−Ｓ）を適切な細胞系統として選択して、Ｇｉ共役受容体のための堅牢かつ妥当なｃＡＭＰに基づく細胞アッセイを樹立した。これらの細胞系統の特徴付けにより、アデニリルシクラーゼアイソフォームＶＩおよびＶＩＩのみがＣＨＯにおいて発現されることが確認されている。既に記載のように、両方のアイソフォームともフォルスコリンによって活性化されるが、アデニリルシクラーゼアイソフォームＶＩのみがＧαｉに感受性であり、アデニリルシクラーゼアイソフォームＶＩＩはＧαｓによって活性化される。
【０１２２】
アデニリルシクラーゼアイソフォームＶＩは、これらの細胞系統においてフォルスコリンによって刺激されるが、活性型Ｇｉタンパク質によって阻害されないアデニリルシクラーゼＶＩＩをノックダウンするためにｍｉＲＮＡを使用するアプローチに好ましいＣＨＯ細胞系統（ＣＨＯ−Ｋ１またはＣＨＯ−Ｓ）において、優勢に発現される。
【０１２３】
本明細書において例示されるように、ＣＨＯ細胞系統（ＣＨＯ−Ｋ１およびＣＨＯ−Ｓ）におけるアデニリルシクラーゼＶＩＩの発現のノックダウンのためのｍｉＲＮＡの設計を実施した。ＣＨＯ細胞におけるアデニリルシクラーゼＶＩＩの発現を抑制するｍｉＲＮＡ構築物の同定を、培養したＣＨＯ−Ｋ１およびＣＨＯ−Ｓ細胞を、異なる１〜３のｍｉＲＮＡ構築物で同時に一過的にトランスフェクトし、そしてｍｉＲＮＡでトランスフェクトした培養細胞における遺伝子発現（ＱＰＣＲ、ウエスタンブロット）およびフォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７によって誘導されるｃＡＭＰの産生を測定することによって、実施した。適切なｍｉＲＮＡの選択後、本発明者らは、アデニリルシクラーゼＶＩＩの発現がｍｉＲＮＡによって抑制される安定な細胞系統（ＣＨＯ−Ｋ１およびＣＨＯ−Ｓ）を樹立することができた。
【０１２４】
本発明に従えば、Ｇｉ共役受容体特異的経路が、これらの特異的経路を干渉する細胞系統の１つ以上の同定される内因性遺伝子の発現のアップまたはダウンレギュレーションを介して優先される条件の確立は、細胞生存率に対して標的化された遺伝子のアップもしくはダウンレギュレーションの認められないかまたは制限される影響の制御を含む。
【０１２５】
ＣＨＯ−Ｋ１およびＣＨＯ−Ｓ細胞系統について本明細書において例示されるように、アデニリルシクラーゼＶＩおよびＶＩＩの相対量の特徴付けが決定されており、ＣＨＯ細胞系統におけるアイソフォームＶＩの顕著な発現が示されている。これは、フォルスコリンによって刺激されるが、活性型Ｇｉタンパク質によっては阻害されないアデニリルシクラーゼＶＩＩをノックダウンするためにｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを使用するアプローチに好ましい。
【０１２６】
１．イムノブロットによるＣＨＯ細胞におけるＧαｉタンパク質の特徴付け
膜の調製およびウエスタンブロッティング。ＣＨＯ−ＳおよびＣＨＯ−Ｋ１細胞を、ＰＢＳ中、３７℃で洗浄し、全容積で５ｍｌのＰＢＳ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２Ｍ  ＮａＯＨに回収した。細胞を、５分間、５００ｇ、４℃でペレット化し、そしてＴｒｉｓ／ＨＣｌ５０ｍＭ、ＥＧＴＡ／Ｔｒｉｓ１ｍＭ、ＥＤＴＡ１ｍＭ、トリプシン１０μｇ／ｍＬ、ロイペプチン１μｇ／ｍＬ、ＰＭＳＦ７５μｇ／ｍＬ、ペプスタチン１μＭを含有する３ｍＬの緩衝液に再懸濁した。細胞を、−８０℃で凍結し、３７℃で融解し、そして２６ゲージ針を介して１０回通過させることにより破砕した。膜を、４８０００ｇで、２０分間、４℃で遠心分離し、そして２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／ＮａＯＨ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、トリプシン１０μｇ／ｍＬ、ロイペプチン１μｇ／ｍＬ、ＰＭＳＦ７５μｇ／ｍＬ、ペプスタチン１μＭに再懸濁した。タンパク質を、標準としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用するＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイキットで定量した。サンプル（２０〜４０μｇの膜タンパク質）を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（４〜１２％）によって分離し、ＰＶＤＦ膜に移し、そしてブロッキング試薬２％（製造者の推奨条件）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＥＣＬ  Ａｄｖａｎｃｅキット、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、英国）に１／１０００希釈されたウサギポリクローナル抗−αｉ１、マウスモノクローナル抗−αｉ２またはウサギポリクローナル抗−αｉ３抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）と共に４℃でＯ／Ｎインキュベートした。膜を、ブロッキング試薬２％（製造者の推奨条件）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＥＣＬ  Ａｄｖａｎｃｅキット、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、英国）に１／２０００００希釈された二次抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（ＢｉｏＲａｄ）または抗マウスペルオキシダーゼコンジュゲート（ＢｉｏＲａｄ）でプローブした。免疫反応性タンパク質を、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＥＣＬ  Ａｄｖａｎｃｅキット（Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、英国）で可視化した。
【０１２７】
結果を図１に示す。
【０１２８】
リアルタイムＰＣＲ。Ｔｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ）を使用して、培養したＣＨＯ−Ｋ１およびＣＨＯ−Ｓ細胞から全ＲＮＡを精製した。逆転写酵素のためのテンプレートとして全ＲＮＡを使用し、第１鎖ｃＤＮＡを、製造者の指示に従って、ＲＴ−ＰＣＲキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびランダムヘキサマーを使用して、合成した。
【０１２９】
ｉＱ５  Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）においてＭｉｘ  Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、リアルタイムＰＣＲを実施した。
【０１３０】
リアルタイムＰＣＲに使用されるプライマーは以下のとおりである：
Ｇαｉ１に対しＭｍ＿Ｇｎａｉ１  ＱＴ０１０５８６８７  （Ｑｉａｇｅｎ）
Ｇαｉ２に対しＭｍ＿Ｇｎａｉ２  ＱＴ００１４０４６９  （Ｑｉａｇｅｎ）
Ｇαｉ３に対しＭｍ＿Ｇｎａｉ３  ＱＴ０１０６２２７８  （Ｑｉａｇｅｎ）
Ｇαｏに対しＭｍ＿Ｇｎａｏ  ＱＴ００１７１１０８  （Ｑｉａｇｅｎ）
ＧＡＰＤＨに対しＭｍ＿Ｇａｐｄ  ＱＴ００３０９０９９  （Ｑｉａｇｅｎ）
【０１３１】
熱サイクル条件は、９５℃で３分間の変性に続く、９５℃で１５秒間の変性工程、５５℃で１５秒間のアニーリング工程、および７２℃で２０秒間の伸長工程を含んでなる４０サイクルよりなる。融解曲線解析を、６０℃〜９５℃の温度移行（ｒａｍｐ）からのデータコレクションによって実施した。
【０１３２】
結果
ＧＡＰＤＨを、ＰＣＲを正規化するための内部コントロール遺伝子として使用した。
【０１３３】
増幅が指数期にあるポイントとして閾値サイクル（Ｃｔ）を選択した。正規化されたＣｔ（Ｃｔ目的の遺伝子−Ｃｔコントロール遺伝子）値であるΔＣｔを使用して、遺伝子発現の相対量を決定した。
【０１３４】
ＣＨＯ−Ｋ１またはＣＨＯ−Ｓ細胞以外ではＧαｉ１増幅は認められなかったが、これはイムノブロットの結果に対応する。
【０１３５】
Ｇαｉ２、Ｇαｉ３およびＧαｏ遺伝子発現を、ＣＨＯ−Ｋ１およびＣＨＯ−Ｓ細胞におけるリアルタイムＰＣＲによって検出した。表１は、Ｇαｉタンパク質アイソフォームの発現の相対量を示す。
【０１３６】
【表１】
2009539363.tif 000002
【０１３７】
２．縮重プライマーを使用するＰＣＲ増幅によるＣＨＯ細胞系統において発現されるアデニリルシクラーゼアイソザイムの同定
Ｔｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ）を使用して、培養ＣＨＯ−Ｋ１およびＣＨＯ−Ｓ細胞から全ＲＮＡを精製した。逆転写酵素のためのテンプレートとして全ＲＮＡを使用し、第１鎖ｃＤＮＡを、製造者の指示に従って、ＱＲＴ−ＰＣＲ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎキット（Ａｂｇｅｎ）およびランダムヘキサマーを使用して、合成した。
【０１３８】
リチャードＴ．プレモント（Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｔ．Ｐｒｅｍｏｎｔ）（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２３８，１１６−１２７）によって報告されるような９ファミリーのマウスアデニリルシクラーゼの保存領域と一致させることによって、縮重プライマー（配列番号１）を設計した。
【０１３９】
５’−ＣＧＧＣＡＧＣＴＣＧＡＧＡＡ（Ａ／Ｇ）ＡＴ（Ａ／Ｃ／Ｔ）ＡＡ（Ａ／Ｇ）ＡＣ（Ｉ）ＡＴ（Ａ／Ｃ／Ｔ）ＧＧ−３’
（配列番号１）
５’−ＣＣＧＧＧＡＣＴＣＧＡＧＡＣ（Ａ／Ｇ）ＴＴ（Ｉ）ＡＣ（Ｉ）ＧＴ（Ｉ）Ｔ（Ｃ／Ｔ）（Ｉ）ＣＣＣＣＡ−３’
（配列番号２）
【０１４０】
Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅ  Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ２４００においてＡｄｖａｎｔａｇｅ−ＨＦ２ＰＣＲキット（ＢＤ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）により、ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を実施した。
【０１４１】
ＰＣＲ増幅条件は、９４℃で１分間の変性に続く、９４℃で１５秒間の変性工程、５８℃で３０秒間のアニーリング工程、および６８℃で１分間の伸長工程を含んでなる４０サイクルよりなる。サイクル反応の終了時に、６８℃で７分間のさらなる伸長工程を実施した。
【０１４２】
ＰＣＲ産物（約３００ｂｐ）を低融解アガロースゲル電気泳動によって単離し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＳＰＩＮ（Ｂｉｏ１０１）によって精製した。精製されたフラグメントをｐＣＲ２．１ベクターに連結し、そしてＴ／Ａクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、４μｌの連結混合物をＴＯＰ１０コンピテント細胞に形質転換した。
【０１４３】
白色プラスミドクローンをＭｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ精製システム（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で調製し、そしてＥｃｏＲＩ消化およびアガロースゲル電気泳動によりスクリーニングした。陽性のクローン、ＣＨＯ−Ｋ１において１４個のクローンおよびＣＨＯ−Ｓにおいて１２個のクローンを、配列決定した。
【０１４４】
配列を、ＢＬＡＳＴ検索を使用して解析した。異なる２つの配列を、公開されているアデニリルシクラーゼに対して高い相同性で同定した。
【０１４５】
配列番号３および配列番号４の配列を、既知のアデニリルシクラーゼ配列と共に整列し、そしてＤＮＡＳＩＳ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｈｉｔａｃｈｉ）により解析した。
【０１４６】
配列番号３の配列は、マウスアデニリルシクラーゼＶＩ（ＮＭ＿００７４０５）の配列に８９％（２９／２５８ｂｐ）相同である。推定アミノ酸配列の相同性は９９％（１／８５ａａ）である。
【０１４７】
配列番号４の配列は、マウスアデニリルシクラーゼＶＩＩ（ＮＭ＿００７４０６）の配列に９０％（２７／２６９ｂｐ）相同である。推定アミノ酸配列の相同性は９５％（４／８０ａａ）である。
【０１４８】
（配列番号３）
ＡＧＡＡＧＡＴＣＡＡＡＡＣＧＡＴＡＧＧＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＴＧＧＣＴＧＣＣＴＣＴＧＧＧＣＴＡＡＡＴＧＣＣＡＧＣＡＣＣＴＡＴＧＡＴＣＡＧＧＴＧＧＧＣＣＧＴＴＣＣＣＡＣＡＴＣＡＣＴＧＣＣＣＴＧＧＣＡＧＡＣＴＡＴＧＣＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＡＴＧＧＡＧＣＡＧＡＴＧＡＡＡＣＡＴＡＴＣＡＡＣＧＡＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＡＡＣＡＡＴＴＴＣＣＡＧＡＴＧＡＡＧＡＴＴＧＧＡＣＴＧＡＡＣＡＴＧＧＧＴＣＣＡＧＴＴＧＴＧＧＣＣＧＧＴＧＴＣＡＴＴＧＧＧＧＣＣＣＧＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＴＡＴＧＡＣＡＴＣＴＧＧＧＧＣＧＡＣＡＣＣＧＴＣＡＡＣＧＴＣＴ
【０１４９】
（配列番号４）
ＧＡＧＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＣＧＡＴＣＧＧＣＡＧＣＡＣＣＴＡＴＡＴＧＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＧＧＣＴＣＡＧＣＡＴＣＣＣＣＴＣＡＧＧＡＣＡＣＧＡＧＡＡＣＣＡＧＧＡＴＣＴＧＧＡＧＣＧＧＣＡＧＣＡＴＧＣＧＣＡＣＡＴＴＧＧＴＧＴＣＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＡＧＣＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＣＡＡＣＡＧＧＣＡＣＴＣＣＴＴＣＡＡＣＴＣＴＴＴＣＣＧＣＣＴＣＣＧＡＧＴＴＧＧＣＡＴＡＡＡＣＣＡＴＧＧＧＣＣＴＧＴＧＡＴＴＧＣＴＧＧＡＧＴＧＡＴＴＧＧＡＧＣＡＣＧＡＡＡＧＣＣＴＣＡＧＴＡＴＧＡＣＡＴＣＴＧＧＧＧＣＧＡＣＡＣＣＧＴＣＡＡＣ
【０１５０】
表２は、ＣＨＯ−Ｋ１およびＣＨＯ−Ｓ細胞におけるアデニリルシクラーゼアイソフォームの相対量を示す。
【０１５１】
【表２】
2009539363.tif 000003
【０１５２】
結論
文献（エバＶ．バルガ（Ｅｖａ  Ｖ．Ｖａｒｇａ）ら、１９９８年．Ｅｕｒｏ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３４８，Ｒ１−Ｒ２）において報告されるように、アデニリルシクラーゼの２つのアイソフォームは、ＣＨＯ細胞系統（ＣＨＯ−Ｋ１およびＣＨＯ−Ｓ）において発現される。
【０１５３】
ＣＨＯ細胞系統におけるアイソフォームＶＩの優勢な発現は、フォルスコリンによって刺激されるが、活性型Ｇｉタンパク質によっては阻害されないアデニリルシクラーゼＶＩＩをノックダウンするためにｓｉＲＮＡを使用するアプローチが好ましく用いられうる。
【０１５４】
発現がＣＨＯ細胞において少ないアデニリルシクラーゼＶＩＩを抑制しても、細胞の生理機能に影響を及ぼさないであろう。
【０１５５】
３．ＰＣＲによるＣＨＯ細胞系統において発現されるアデニリルシクラーゼＶＩＩの増幅
ｓｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）構築のために、公開されているマウス（ＮＭ＿００７０４６）とラット（ＸＭ２２３６６６）アデニリルシクラーゼアイソフォームＶＩＩ配列との間の相同性研究に従って、３つの組のプライマーを設計した。
【０１５６】
マウスアデニリルシクラーゼアイソフォームＶＩＩの４３〜８０５ｎｔに対応するフラグメントの増幅のためのプライマーは、以下のとおりである（配列番号５および配列番号６）
センス：５’−ＡＴＧＣＣＡＧＣＣＡＡＧＧＧＧＣＧＣＴＡＣ−３’（配列番号５）
アンチセンス：５’−ＡＧＡＴＧＣＴＧＡＣＡＴＴＣＴＧＧＴＧＣ−３（配列番号６）
【０１５７】
マウスアデニリルシクラーゼアイソフォームＶＩＩの６２８〜１６１８ｎｔに対応するフラグメントの増幅のためのプライマーは、以下のとおりである（配列番号７および配列番号８）
センス：５’−ＣＡＣＡＡＧＣＡＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＣＧＣ−３’（配列番号７）
アンチセンス：５’−ＡＧＡＣＴＴＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＴ−３（配列番号８）
【０１５８】
マウスアデニリルシクラーゼアイソフォームＶＩＩの１６８５〜２８１６ｎｔに対応するフラグメントの増幅のためのプライマーは、以下のとおりである（配列番号９および配列番号１０）
センス：５’−ＴＧＡＣＧＡＧＡＴＧＣＴＧＴＣＡＧＣＣＡＴ−３’（配列番号９）
アンチセンス：５’−ＴＧＣＣＡＡＴＧＧＴＣＴＴＧＡＴＣＴＴＣＴＣＣ−３’（配列番号１０）
【０１５９】
Ｔｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ）を使用して、培養ＣＨＯ−Ｋ１およびＣＨＯ−Ｓ細胞から全ＲＮＡを精製した。逆転写酵素のためのテンプレートとして全ＲＮＡを使用し、第１鎖ｃＤＮＡを、製造者の指示に従って、ＱＲＴ−ＰＣＲ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎキット（Ａｂｇｅｎ）およびランダムヘキサマーを使用して、合成した。
【０１６０】
ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を、Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅ  Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ２４００においてＰｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）により、次のとおりに実施した：９８℃で３０秒間；９８℃で１０秒間、６８℃で３０秒間、７２℃で４５秒間の４０サイクル；および７２℃で１０分間。
【０１６１】
ＰＣＲ産物を低融解アガロースゲル電気泳動によって単離し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＳＰＩＮ（Ｂｉｏ１０１）によって精製した。精製したフラグメントについて、配列決定を行った。
【０１６２】
配列決定結果：
マウスアデニリルシクラーゼアイソフォームＶＩＩの４３〜８０５ｎｔに対応するＣＨＯアデニリルシクラーゼアイソフォームＶＩＩのＰＣＲフラグメント
（配列番号１１）
ＧＧＣＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＡＡＡＧＣＴＣＴＡＴＧＡＧＡＡＧＴＡＣＣＧＣＣＴＣＡＣＣＡＧＣＣＡＧＣＡＴＧＧＧＣＣＡＣＴＧＴＴＧＣＴＣＴＴＧＣＴＣＣＴＣＣＴＧＧＴＧＧＣＴＧＴＧＧＣＣＡＣＣＴＧＣＡＴＣＧＣＡＣＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＣＡＴＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＣＣＡＧＡＣＡＣＣＡＧＧＣＴＡＴＣＣＴＧＧＧＣＡＣＴＧＣＧＴＴＣＴＴＣＡＴＧＣＴＧＡＣＧＣＴＧＴＴＴＧＴＧＧＣＴＣＴＣＴＡＴＧＴＧＣＴＧＧＴＡＴＡＴＧＴＴＧＡＧＴＧＣＣＴＧＧＴＧＣＧＧＣＧＡＴＧＧＣＴＧＴＧＧＧＣＣＴＴＧＧＣＴＣＴＡＣＴＣＡＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＣＣＴＣＡＴＧＡＴＧＣＴＣＧＧＣＴＴＴＧＴＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＡＣＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡＡＴＧＡＴＧＣＣＴＧＴＧＣＧＴＧＧＧＡＧＣＡＧＧＴＧＣＣＴＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＡＴＴＧＴＣＴＴＴＧＴＧＧＴＧＴＡＴＧＣＡＴＴＡＣＴＧＣＣＣＣＴＣＡＧＣＡＣＧＡＧＧＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＣＡＧＴＧＧＧＧＡＴＧＧＴＴＴＣＣＡＣＴＧＴＴＴＣＣＣＡＣＣＴＣＣＴＧＡＴＧＴＴＴＧＧＡＧＣＴＧＴＧＡＣＡＧＧＡＧＣＣＴＴＣＡＡＧＡＴＧＴＣＣＧＴＧＴＣＣＧＧＡＧＣＡＣＡＧＣＴＧＧＣＧＣＴＧＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＣＣＡＡＴＧＣＣＡＴＴＡＴＣＣＴＣＣＴＧＧＧＴＧＧＧＡＡＣＴＴＣＡＣＧＧＧＴＧＣＣＴＴＣＣＡＣＡＡＧＣＡＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＴＧＣＴＴＣＣＣＧＧＧＡＣＣＴＣＴＴＣＡＴＣＴＡＣＡＣＡＧＴＣＡＡＧＴＧＣＡＴＣＣＡＧＡＴＣＣＧＣＣＧＧＡＡＧＣＴＧＣＧＴＧＴＧＧＡＧＡＡＧＣＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＣＣＴＧＣＴＧＣＴＴＴＣＧＧＴＧＣＴＣＣＣＡＧＣＴＣＡＣＡＴＡＴＣＣＡＴＧＧＧＣＡＴＧＡＡＧＣＴＧＧＣＣＡＴＣＡＴＴＧＡＧＣＧＣＣＴＣＡＡＡＧＡＧＧＧＴＧＧＴＧＡＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＡＴＧＣＣＴＧＡＣＡＡＣＡＡＣＴ
【０１６３】
マウスアデニリルシクラーゼアイソフォームＶＩＩの６２８〜１６１８ｎｔに対応するＣＨＯアデニリルシクラーゼアイソフォームＶＩＩのＰＣＲフラグメント
（配列番号１２）
ＣＴＣＴＴＣＡＴＣＴＡＣＡＣＡＧＴＣＡＡＧＴＧＣＡＴＣＣＡＧＡＴＣＣＧＣＣＧＧＡＡＧＣＴＧＣＧＴＧＴＧＧＡＧＡＡＧＣＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＣＣＴＧＣＴＧＣＴＴＴＣＧＧＴＧＣＴＣＣＣＡＧＣＴＣＡＣＡＴＡＴＣＣＡＴＧＧＧＣＡＴＧＡＡＧＣＴＧＧＣＣＡＴＣＡＴＴＧＡＧＣＧＣＣＴＣＡＡＡＧＡＧＧＧＴＧＧＴＧＡＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＡＴＧＣＣＴＧＡＣＡＡＣＡＡＣＴＴＴＣＡＣＡＧＣＣＴＣＴＡＴＧＴＣＡＡＧＣＧＧＣＡＣＣＡＧＡＡＴＧＴＣＡＧＴＡＴＣＴＴＧＴＡＴＧＣＡＧＡＣＡＴＴＧＴＧＧＧＣＴＴＣＡＣＡＣＧＧＣＴＧＧＣＣＡＧＴＧＡＣＴＧＣＴＣＧＣＣＣＡＡＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＣＴＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＴＴＣＧＧＧＡＡＡＴＴＴＧＡＣＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＴＧＡＧＴＧＣＡＴＧＣＧＧＡＴＣＡＡＧＡＴＣＣＴＧＧＧＴＧＡＣＴＧＣＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＴＧＴＣＡＧＧＣＣＴＧＣＣＴＧＴＧＴＣＧＣＴＧＣＣＣＡＣＣＣＡＴＧＣＣＣＧＣＡＡＣＴＧＣＧＴＧＡＡＧＡＴＧＧＧＴＣＴＧＧＡＣＡＴＣＴＧＴＧＡＧＧＣＣＡＴＴＡＡＧＣＡＧＧＴＴＣＧＴＧＡＧＧＣＣＡＣＡＧＧＡＧＴＧＧＡＣＡＴＣＡＧＣＡＴＧＣＧＴＧＴＧＧＧＴＡＴＣＣＡＣＴＣＣＧＧＧＡＡＴＧＴＴＣＴＧＴＧＴＧＧＧＧＴＣＡＴＣＧＧＧＣＴＣＣＧＣＡＡＧＴＧＧＣＡＧＴＡＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＴＣＣＣＡＴＧＡＴＧＴＧＴＣＣＣＴＧＧＣＣＡＡＣＡＧＧＡＴＧＧＡＧＧＣＡＧＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＧＣＣＧＧＧＴＧＣＡＣＡＴＣＡＣＡＧＡＧＧＣＧＡＣＡＣＴＧＡＡＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧＧＡＡＣＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＡＣＣＣＣＴＡＴＣＴＧＡＡＡＧＡＧＡＴＧＡＡＣＡＴＣＣＧＡＡＣＣＴＡＣＣＴＧＧＴＧＡＴＣＧＡＣＣＣＣＣＧＧＡＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＣＡＧＣＣＡＴＣＡＣＣＴＣＣＣＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＧＧＧＡＴＧＣＡＡＣＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＣＧＧＧＣＴＴＣＡＧＴＧＣＧＴＧＴＡＡＣＧＣＧＣＴＡＴＣＴＣＧＡＧＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＣＡＧＣＡＣＧＧＣＣＣＴＴＣＧＣＡＣＡＣＣＴＣＡＡＣＣＡＣＣＧＧＧＡＧＡＧＴＧＴＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＡＧＡＣＣＣＣＣＡＧＴＣＣＣＡＣＴＧＧＡＣＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＡＧＣＣＡＣＴＣＣＴＣＴＧＣＧＣＣＧＡＣＡＣＣＧＴＧＣＣＡＴＴＧＡＣＡＧＧＡＧＴＡＣＡＴＣＣＣＣＣＡＡＧＧＧＧＣＧＣＴＴＧＧＡＧＧＡＴＧＡＣＴＧＴＧＡＴＧＡＣＧＡＧＡＴＧＣＴＣＴＣＧＧＣＣＡＴ
【０１６４】
マウスアデニリルシクラーゼアイソフォームＶＩＩの１６８５〜２８１６に対応するＣＨＯアデニリルシクラーゼアイソフォームＶＩＩのＰＣＲフラグメント
（配列番号１３）
ＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＡＡＧＴＣＣＧＡＴＧＡＣＴＴＣＣＡＣＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＣＴＴＴＧＡＧＣＧＴＧＡＧＴＡＴＣＧＣＣＴＧＧＴＧＣＣＴＡＴＣＣＣＣＣＧＧＧＣＴＣＧＣＴＡＣＧＡＣＴＴＴＧＣＣＴＧＴＧＣＣＡＧＣＣＴＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＴＣＣＴＧＣＴＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＧＴＧＡＴＧＣＣＣＡＧＧＡＴＧＧＣＣＡＣＴＣＴＧＧＧＣＧＴＧＴＣＣＴＴＴＧＧＡＣＴＧＧＴＧＧＣＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＧＴＴＴＣＴＧＣＴＴＴＧＣＴＡＣＴＧＡＧＴＴＣＴＣＡＡＧＧＴＧＣＴＴＴＣＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＴＡＣＡＣＴＣＣＡＧＧＣＣＡＴＣＴＣＧＧＡＧＡＧＴＧＴＧＧＡＧＡＣＡＣＡＧＣＣＣＣｔＧＣＴＣＡＧＧＣＴＡＴＣＣＴＴＧＧＴＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＧＴＴＧＧＴＡＧＣＣＴＡＣＴＧＡＣＴＧＴＴＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＡＣＡＴＧＣＣＡＣＴＧＡＴＧＣＴＴＡＧＣＣＣＡＧＧＣＣＣＡＧＡＧＴＧＧＣＣＡＧＧＡＧＧＣＡＡＴＧＡＧＡＣＡＡＧＣＴＣＧＣＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＧＡＡＴＡＧＡＧＴＴＧＧＡＡＴＣＣＣＧＴＧＴＧＡＧＣＴＣＣＴＣＣＴＧＴＡＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＴＣＣＴＧＧＧＣＴＴＣＡＴＣＴＣＧＴＧＣＴＣＣＧＴＴＴＴＣＣＴＧＣＧＧＡＴＧＡＧＣＣＴＧＧＡＡＣＴＧＡＡＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＧＧＴＧＧＣＴＴＡＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＴＣＡＡＣＣＴＣＴＣＣＣＣＣＴＧＣＴＧＧＣＡＴＧＴＴＣＣＡＧＧＣＡＡＣＡＧＣＡＣＴＧＡＡＡＣＣＡＡＣＡＧＴＡＣＡＣＡＣＡＧＧＡＣＡＣＡＡＡＣＡＣＴＣＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＡＧＣＡＣＡＣＣＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＴＴＧＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＴＣＡＧＧＴＧＡＣＴＧＣＣＴＣＣＴＣＣＣＣＴＧＧＣＡＧＡＴＧＴＴＴＡＧＡＧＡＡＡＧＡＴＣＴＧＡＡＧＡＣＣＡＴＧＡＴＣＡＡＣＴＴＣＴＡＣＣＴＧＧＴＣＣＴＧＴＴＣＴＡＴＧＣＣＡＣＣＣＴＣＡＴＣＴＴＧＣＴＧＴＣＴＡＧＡＣＡＧＡＴＴＧＡＣＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＧＣＴＴＧＧＡＴＴＧＴＣＴＧＴＧＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＡＡＡＧＡＧＣＡＴＧＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＡＡＣＡＡＴＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＣＣＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＧＧＡＡＡＡＴＧＴＴＣＴＧＣＣＡＧＣＧＣＡＴＧＴＧＧＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴＣＡＴＴＧＧＣＧＡＣＡＡＧＧＣＧＧＣＴＧＡＧＧＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＣＴＧＴＧＴＣＴＧＴＧＴＣＡＴＧＴＴＴＧＣＣＴＣＧＧＴＴＣＣＧＧＡＣＴＴＣＡＡＡＧＴＧＴＴＣＴＡＣＡＣＴＧＡＧＴＧＣＧＡＴＧＴＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＧＧＧＴＴＧＧＡＧＴＧＣＣＴＴＣＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＧＡＧＡＴＣＡＴＴＧＣＴＧＡＴＴＴｔＧＡＣＧＡＧＣＴＧＣＴ
【０１６５】
配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３の配列を、既知のアデニリルシクラーゼ配列と共に整列し、そしてＤＮＡＳＩＳ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｈｉｔａｃｈｉ）により解析し、そしてｓｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）設計のためのテンプレートとして使用した。
【０１６６】
４．ｍｉＲＮＡ設計
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＢＬＯＣＫ−ｉＴ（商標）ＲＮＡｉ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒを使用して、８つのｍｉＲＮＡ（配列番号１４〜２１）を合成し、そしてｐｃＤＮＡ６．２−ＧＷ／ｍｉＲベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。図２は、構築の例を示す。
【０１６７】
標的ＲＮＡの減少を例示するために、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を適切なベクターでトランスフェクトした。
【０１６８】
ＣＨＯ−アデニリルシクラーゼアイソフォームＶＩＩをノックダウンするためのｍｉＲＮＡ標的化配列（ＡＣＶＩＩ＿ｍｉＲ＿ＮＮＮで示す）は、以下のとおりである：
ＡＣＶＩＩ＿ｍｉＲ＿１７３：ＡＣＡＡＣＴＴＴＣＡＧＣＣＴＣＴＡＴＧ（配列番号１４）
ＡＣＶＩＩ＿ｍｉＲ＿２２０：ＴＧＧＴＧＣＴＧＴＴＴＣＴＧＣＴＴＴＧ（配列番号１５）
ＡＣＶＩＩ＿ｍｉＲ＿４５６：ＴＧＡＣＡＧＧＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＧＴ（配列番号１６）
ＡＣＶＩＩ＿ｍｉＲ＿５５３：ＴＡＴＧＡＴＧＴＧＧＴＣＣＣＡＴＧＡＴ（配列番号１７）
ＡＣＶＩＩ＿ｍｉＲ＿６１９：ＴＴＣＣＡＧＧＣＣＡＧＣＡＣＴＧＡＡＡ（配列番号１８）
ＡＣＶＩＩ＿ｍｉＲ＿１０７１：ＡＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＡＧＴＧＣＣＴＴ（配列番号１９）
ＡＣＶＩＩ＿ｍｉＲ＿２１０２：ＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡ（配列番号２０）
ＡＣＶＩＩ＿ｍｉＲ＿２２６０：ＡＧＣＡＣＴＧＡＣＣＡＡＣＡＧＴＡＣＡ（配列番号２１）
【０１６９】
５．ＣＨＯ細胞におけるアデニリルシクラーゼＶＩＩの発現を抑制するｍｉＲＮＡの同定
トランスフェクション
ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、６ウェルプレートにおいて、１ウェルあたり５０００００個の細胞でプレート化した。プレート化の２４時間後、細胞を、無血清ＤＭＥＭ培地で洗浄した。ｍｉＲＮＡ／脂質複合体を構築するためのｍｉＲＮＡとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００との間の比は、１：２．５であった。トランスフェクションに使用されるｍｉＲＮＡの量は、各構築物、およびＢｌｏｃｋ−ｉＴ  Ｐｏｌ  ＩＩ  ｍｉＲＮＡｉキット（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から調製されるｍｉＲＮＡ陰性コントロールについて１ウェルあたり１．０μｇであった。トランスフェクションの６時間後、培地を５％透析血清を伴うＤＭＥＭに変更した。４８時間後、ＴｒｉＲｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ）を使用して、全ＲＮＡを調製した。ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）により、ｃＤＮＡを合成した。
【０１７０】
ｍｉＲＮＡｓによって処置した培養細胞においてアデニリルシクラーゼＶＩＩメッセンジャーＲＮＡを低了するための従来のポリメラーゼ連鎖反応の使用
図３は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞における一過的トランスフェクションの４８時間後のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるアデニリルシクラーゼＶＩＩの発現に対する異なるｍｉＲＮＡの抑制効果、ならびにｍｉＲＮＡ１７３およびコントロールｍｉＲＮＡによってトランスフェクトされるＣＨＯ−Ｋ１細胞の形態学を示す。
【０１７１】
図４は、共焦点蛍光顕微鏡を使用することによって、アデニリルシクラーゼＶＩＩの発現に対する異なるｍｉＲＮＡの抑制効果を確認する。
【０１７２】
結論：
１：ｍｉＲＮＡ１７３は、４８時間の一過的トランスフェクション後、ＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるアデニリルシクラーゼＶＩＩの９０％を超える発現を阻害する。
２：ｍｉＲＮＡ１７３または陰性のｍｉＲＮＡによって処置した細胞間の有意な形態学的差異は観察されていない。
【０１７３】
６．ｃＡＭＰアッセイ
ヒトムスカリンＭ４またはヒトドーパミンＤ４．４受容体を安定的に発現したＣＨＯ−Ｋ１細胞に対するｃＡＭＰ測定を、ＨＴＲＦ（均一時間分解蛍光）技術（ＣＩＳ  Ｂｉｏ、仏国）を介して実施した。これらのｃＡＭＰアッセイの原理は、モノクローナル抗ｃＡＭＰ−クリプテートコンジュゲートとの結合について、細胞から産生されるｃＡＭＰとｃＡＭＰ−ＸＬ６６５コンジュゲートとの間の競合に基づく。細胞溶解および検出工程を同時に実施することができるように、ＨＴＲＦ（登録商標）コンジュゲートは、溶解緩衝液において調製される。
【０１７４】
細胞および化合物の調製。ヒトムスカリンＭ４またはヒトドーパミンＤ４．４受容体を安定的に発現するＣＨＯ−Ｋ１を、標準的な条件下で培養した。細胞をＥＤＴＡによって回収し、リン酸緩衝食塩水において１回洗浄し、そしてアッセイ緩衝液（０．１％グルコースおよび０．５ｍＭ  ＩＢＭＸを含有するＨＢＳＳ）に再懸濁した。細胞を、黒色９６ハーフウェルプレートに、１０，０００〜１５，０００個の細胞の細胞密度で分配した。３０分間、室温または３７℃でのインキュベーション後、フォルスコリン、次いで、アセチルコリンまたはキンピロール（ｑｕｉｍｐｉｒｏｌｅ）を含有する等容積のアッセイ緩衝液を、細胞に添加した。３０分間、室温または３７℃でのインキュベーション後、上記のプロトコル後にｃＡＭＰ検出を実施した。プレートを、１時間を超えて室温でインキュベートし、次いで、ＲＵＢＹｓｔａｒａ（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）時間分解蛍光リーダー上で測定した。
【０１７５】
実験条件
細胞からのｃＡＭＰの形成を測定するために、細胞を回収し、そしてＨＢＳＳ緩衝液で再懸濁した。多様な濃度の細胞を、９６ウェルプレートにおいてプレート化した。アゴニスト（ドーパミンまたはエピネフリン）の系列希釈を添加し、そして１０分間、室温で細胞と共にインキュベートした。フォルスコリンまたはＮＫＨ４７７を添加し、そしてプレートを３７℃で１０分間、インキュベートした。細胞誘導後、アッセイ試薬を、アッセイ手順において概説したとおりに添加した。
【０１７６】
Ｄ４−ＣＨＯ  Ｋ１細胞系統（ＣＨＯ  Ｋ１宿主細胞系統において安定的にトランスフェクトされたＤ４）では、０．７μＭのＮＫＨ４７７およびフォルスコリンを、１μＭのドーパミンを伴うかまたは伴わずに使用した。
【０１７７】
α２ｃ−ＣＨＯ  Ｓ細胞系統（ＣＨＯ  Ｓ宿主細胞系統において安定的にトランスフェクトしたα２ｃ）では、５μＭのＮＫＨ４７７およびフォルスコリンと共に、１０分間、３７℃で、１μＭのエピネフリンを伴わずにまたは伴って、インキュベートした。
【０１７８】
結果：
ａ）アセチルコリンまたはキンピロール（ｑｕｉｍｐｉｒｏｌｅ）のＥＣ５０値を、図５に示すようなＨｉｌｌによる用量反応曲線から算出した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、３０μＭフォルスコリンの存在下で、０．０１ｎＭ〜１０μＭの範囲の漸増濃度のアセチルコリンまたはキンピロール（ｑｕｉｍｐｉｒｏｌｅ）に暴露した。
【０１７９】
ｂ）２つの細胞系統（Ｍ４／ＣＨＯおよびＭ４／ＣＨＯ／ｍｉＲＮＡ）においてフォルスコリンによって誘導されるｃＡＭＰの産生に対するオキソトレモリンの効果を比較するために、ＨＴＲＦ（Ｃｉｓｂｉｏ）によるｃＡＭＰの測定に基づく機能アッセイを実施した。
【０１８０】
図６は、フォルスコリンに応答する用量依存的シグナルを例示する。
【０１８１】
Ｍ４／ＣＨＯ／ｍｉＲＮＡ細胞系統における１μＭのオキソトレモリンによるフォルスコリン刺激ｃＡＭＰ産生の８５％を超える阻害が得られた。フォルスコリン誘導ｃＡＭＰ産生に対するオキソトレモリンの阻害能力は、Ｍ４受容体を発現する野生型ＣＨＯ細胞において示される結果と比較して、２５〜３０％増加する。
【０１８２】
ｃ）Ｄ４．４、α２ｃ  Ｈ３およびＤ２Ｓ受容体を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を、３０μＭフォルスコリンまたは１０μＭ  ＮＫＨ−４７７の存在下で０．０１ｎＭ〜１０μＭの範囲の漸増濃度のリガンド、それぞれ、ドーパミン、エピネフリン、ヒスタミンおよびドーパミンに暴露した。
【０１８３】
図７は、フォルスコリンまたはＮＫＨ−４７７に応答する用量依存的シグナルの差異を例示する。
【０１８４】
ＣＨＯ−Ｋ１において安定的に発現されるＤ４．４受容体およびＣＨＯ−Ｓにおいて安定的に発現されるα２ｃ受容体において、ＮＫＨ４７７は、１μＭのアゴニストにおけるフォルスコリンより大きなシグナルウインドウを付与する（フォルスコリンの代わりにＮＫＨ４７７を使用すると、ｃＡＭＰ産生阻害を２０％まで増大した）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年2月6日(2009.2.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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2009539363.tif 000012
2009539363.tif 000013