(57)【要約】  本発明は、他の組織または器官に広めるための上皮のまたは間葉の腫瘍またはガンの能力のマーカーとして、スネイル遺伝子またはその発現生成物の段階的な発現レベルに関する。本発明は、さらに、スネイル遺伝子を符号化している核酸配列を含む移植遺伝子をそのゲノムに含んでいる遺伝子導入の非ヒト哺乳動物、および上皮のまたは間葉の腫瘍および／またはガンならびにＤＮＡ損傷に基づく疾患のマーカーとしてのスネイルの使用に関する。加えて、本発明は、前記病態（パソロジーズ）の治療及び診断標的としてのスネイルの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
そのゲノムにスネイル（ＳＮＡＩＬ）タンパク質を符号化している核配配列を含んでいる移植遺伝子を備えていることを特徴とする遺伝子導入非ヒト哺乳動物。
【請求項２】
前記移植遺伝子の発現がエフェクター物質によって外因的に規制されることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子導入非ヒト哺乳動物。
【請求項３】
前記哺乳動物がケッ歯類動物であることを特徴とする請求項１または２に記載の遺伝子導入非ヒト哺乳動物。
【請求項４】
前記ケッ歯類動物がマウスまたはラットであることを特徴とする請求項に３記載の遺伝子導入非ヒト哺乳動物。
【請求項５】
前記哺乳動物が上皮および／または間葉腫瘍および／またはガンを有していることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の遺伝子導入非ヒト哺乳動物。
【請求項６】
ｐ５３タンパク質を符号化している遺伝子に突然変異を保有している他の非ヒト哺乳動物に請求項１乃至５のいずれか１項記載に記載の非ヒト哺乳動物を交配することによって得られることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の遺伝子導入非ヒト哺乳動物。
【請求項７】
前記非ヒト哺乳動物がｐ５３タンパク質を符号化している遺伝子に突然変異を保有していることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の遺伝子導入非ヒト哺乳動物。
【請求項８】
ホモ接合体ｐ５３ゼロ突然変異を特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項に記載の遺伝子導入非ヒト哺乳動物。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれか１項に記載の遺伝子導入非ヒト哺乳動物の子孫。
【請求項１０】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載の遺伝子導入非ヒト哺乳動物または請求項９に記載のその子孫から誘導される１次細胞または組織サンプル。
【請求項１１】
そのゲノム中に、移植遺伝子を含み、該移植遺伝子が請求項１または２に記載の特徴を有する細胞系。
【請求項１２】
請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の遺伝子導入非ヒト哺乳動物、その子孫、または１次細胞または組織サンプルから得られる請求項１１に記載の細胞系。
【請求項１３】
上皮腫瘍および間葉腫瘍から選択された腫瘍の防止および／または治療のための化合物、および／またはＤＮＡ損傷に基づく疾患の防止および／または治療のための化合物をスクリーニング、検索、識別、発見、開発および／または評価するためおよび／または前記腫瘍またはＤＮＡ損傷に基づく疾患を有する被験体に施された治療の効能を評価するため、または前記腫瘍またはＤＮＡ損傷に基づく疾患の進展を監視するため請求項１ないし８のいずれか１項に記載の遺伝子導入非ヒト哺乳動物、請求項９に記載のその子孫、または請求項１０ないし１２のいずれか１項に記載の細胞系、１次細胞または組織サンプルを使用する使用方法。
【請求項１４】
間葉または上皮腫瘍またはＤＮＡ損傷に基づく疾患の防止および／または治療のための化合物をスクリーニング、検索、識別、発見、開発および／または評価するための方法または公知の薬品または化合物の組み合わせを元の位置に戻す方法において、候補の化合物を請求項１ないし８のいずれか１項に記載の遺伝子導入非ヒト哺乳動物または請求項９に記載のその子孫に投与し、そしてその反応を監視することを特徴とする方法。
【請求項１５】
スネイル遺伝子の発現のレベルまたはその発現生成物を抑制または低減する化合物を識別する方法であって、スネイル遺伝子またはその発現生成物のレベルが公知である請求項１ないし８のいずれか１項に記載の遺伝子導入の非ヒト哺乳動物または請求項９に記載のその子孫に候補の化合物を投与し、続いて前記組織中のスネイル遺伝子またはその発現生成物のレベルを定量化し、そして前記スネイル遺伝子またはその発現生成物の既知のレベルを低減できる化合物を選択することを特徴とする方法。
【請求項１６】
間葉または上皮の腫瘍またはＤＮＡ損傷に基づく疾患の防止および／または治療のための化合物を選別、検索、識別、発見、開発および／または評価するためおよび公知の薬品または化合物の組み合わせを元の位置に戻す方法において、細胞系、１次細胞、または請求項１０ないし１２のいずれか１項による組織サンプルを接触させ、かつ反応を監視することを特徴とする方法。
【請求項１７】
スネイル遺伝子の発現のレベルまたはその発現生成物を抑制または低減する化合物を識別する方法において、細胞系、１次細胞、または組織サンプル中のスネイル遺伝子またはその発現生成物のレベルが既知である前記細胞系、１次細胞、または請求項１０ないし１２のいずれか１項による組織サンプルと接触させた候補の化合物を接触させ、続いて、前記組織中の前記スネイル遺伝子またはその発現生成物のレベルを定量化し、そして前記スネイル遺伝子またはその発現生成物のレベルを抑制または低減できる化合物を選択することを特徴とする方法。
【請求項１８】
上皮の腫瘍または間葉の腫瘍またはＤＮＡ損傷に基づく疾患から選ばれた腫瘍の防止および／または治療のための薬学化合物の製造における前記スネイル発現生成物のレベルを抑制または低減しまたは増大したレベルのスネイル発現生成物の効果に立ち戻る化合物を使用する使用方法。
【請求項１９】
前記化合物がアンチセンススネイルｍＲＮＡ、リボザイム、三重螺旋分子、小さい干渉のＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、抗体アンチスネイル、スネイルタンパク質の活性を規定する酵素またはタンパク質およびその混合物からなるグループから選ばれることを特徴とする請求項１８に記載の使用方法。
【請求項２０】
スネイル発現のレベルまたはその発現生成物を抑制または低減しまたは１つまたはそれ以上の薬学的に許容し得る賦形剤または担体とともに増大したレベルのスネイル発現の作用に立ち戻る医療的に効果のある量の化合物を含むことを特徴とする薬学化合物。
【請求項２１】
スネイル発現生成物のレベルを抑制または低減する化合物を含んでいるベクターからなることを特徴とする請求項２０に記載の薬学化合物。
【請求項２２】
スネイル発現生成物のレベルを抑制または低減する化合物がアンチセンススネイルｍＲＮＡ、リボザイム、三重螺旋分子、小さい干渉のＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、抗体アンチスネイル、スネイルタンパク質の活性を規制する酵素またはタンパク質、およびその混合物からなるグループから選ばれることを特徴とする請求項２１または２２に記載の薬学化合物。
【請求項２３】
上皮または間葉の腫瘍の浸潤および／または転移能力、または上皮または間葉の腫瘍の局部的成長能力を測定し、または上皮の腫瘍または間葉の腫瘍またはＤＮＡ損傷に基づく疾患から選ばれる被験体の条件を生体外で診断し、または被験体の前記条件の段階または厳しさを測定し、または前記条件により被験体に施された治療の効果を監視し、またはとくに適当な包装内にスネイルタンパク質を認める抗体、またはスネイルに固有である配列を有している拡散をとくに増幅するように設計されるプライマー対を含む間葉または上皮の腫瘍またはＤＮＡ損傷に基づく疾患の防止および／または治療のための化合物を選別、検索、識別、発見、開発および／または評価するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般的に、ガン成長のマーカー、とくに、スネイル（ＳＮＡＩＬ）遺伝子またはその発現生成物の段階的な発現レベルにより、他の組織または器官に広めるための上皮のまたは間葉（線繊維組織球性）の腫瘍および／またはガンの能力のマーカーに関する。本発明は、上皮または間葉の腫瘍および／またはガンならびにＤＮＡ損傷に基づく疾患のマーカーとしてのスネイルの使用に関する。本発明は前記病状（パソロジーズ）の治療及び診断標的としてのスネイルの使用に関する。加えて、本発明は、制御可能な様式においてスネイルを発現する遺伝子導入の非ヒト哺乳動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ジンクフィンガー転写因子のスネイル族はハエから哺乳動物の幾つかの有機体における中胚葉形成の中心的な役割を占めている。スネイル族、スネイルの第１の要素は中胚葉形成に必須であるように示されたショウジョウバエメラニン腹部に記載された。哺乳動物の上皮細胞におけるスネイルのトランスフェクションおよび原胚形成に必須であるスネイル−突然変異マウスの表現型はこの機能を確認した。スネイルタンパク質は外胚葉成長に含まれる規定の遺伝子の中胚葉内の発現を抑制することによって適切な未発達層境界を維持するように作用する転写抑制体である。ＳＮＡおよびＳＬＵＧ（スラッグ）と名づけられるスネイルの２匹のマウスの同族体がクローン化された。スラッグ遺伝子の無意味な突然変異に関する同型のマウスは実行可能であるが、それらは出生後の成長欠陥を呈することが以前に示されている。
【０００３】
パターン形成および中胚葉の指定におけるそれらの役割に加えて、スネイル上科の幾つかの要素は細胞の生存に関係させられた。生体外研究はスネイルが細胞サイクルを減衰しかつ生き残り因子の取り消し（ベーガ等、２００４）によりまたはＤＮＡ損傷（カジタ等、２００４）により誘起される細胞死に対する抵抗を付与することを示した。ＳＮＡおよびスラッグを発現している細胞は化学療法剤のようなＤＮＡ損傷剤によって誘起されるアポプトシスから保護された。一連の酵素触媒反応の分析はスネイルの転位の発現がプログラムされた細胞死における公知の役割により多数の遺伝子の規制降下（ダウンレギュレーション）を導くことを表した。スネイルによって付与される細胞死に対する抵抗は細胞を第１の場所から分離しかつ移動するような選択的な利点を提供する。スネイル族の遺伝子は発展的に保存され、そして研究は組織培養システムおよび脊髄のあるおよび脊髄のない胎児における上皮−間葉遷移（ＥＭＴ）の調整におけるスネイル族タンパク質に影響を与えた。
【０００４】
上皮−間葉遷移はそれによって上皮細胞が上皮から解離しかつ移動することができるメカニズムである。そのようにＥＭＴは上皮腫瘍の通常の発生および進行に基本的である。従ってスネイル発現はＥＭＴの誘因となることかできかつガンの変質として多いに認められている。ガン死亡のおよそ９０％は腫瘍細胞の局部浸潤および離れた転移から結果として生じる。１つの重要な洞察はガン細胞の増大した運動性および浸潤が胚成長の間中発生するＥＭＴを連想させる発見から現れている。ＥＭＴにおいて、上皮細胞は繊維芽細胞状特性を手に入れかつ減少した細胞間接着および増大した運動性を示している。ＭＤＣＫ細胞の原始型の上皮細胞システムにおけるスネイルの安定した発現は完全な上皮−間葉遷移を誘導しかつスネイルを過剰に発現しているこれらの細胞はほとんど毛の無いマウス（ヌードマウス）に注入されたとき発ガン性の特性を呈する。腫瘍進行におけるスネイルの包含は、また、浸潤ガン細胞系におけるその発現によって、およびマウスの皮膚におよび胸部管ガン、胃ガン、肝細胞ガン（スギマチ等、２００３）、および滑液肉腫（サイトウ等、２００４）に罹っている患者からの生検試料に誘導された腫瘍の浸潤細胞中のスネイルの発現によって支持されている。かくして、スネイルの過発現はヒトガンに潜在的な浸潤成長と関連付けられると思われる。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の１つの態様はスネイル（ＳＮＡＩＬ）遺伝子の異なる発現レベルが上皮および間葉腫瘍および／またはガンの発生についての異なる作用に関連付けられるという発見に基礎を置いている。発明者等はスネイルの定められた発現レベル（しきい値レベル）以上で前記上皮および間葉腫瘍および／またはガンの浸潤および／または転移能力が増加する一方、このしきい値レベル以下のスネイルの発現レベルがこれらの腫瘍の腫瘍形成であるが移動性でない表現型を誘起することを観察した。
【０００６】
形質変換は未分化の細胞をそれらの通常の環境外で成長させる遺伝子変化に依存する。幾つかの環境下で、スネイル発現は細胞移動を容易にすることがここで証明される。さらに、「増加した」スネイル発現は高い頻度でマウスにガンを誘導する。
【０００７】
とくに、本発明者等は事態の通常の推移において、スネイル発現がＰ５３−独自の方法におけるＤＮＡ損傷によって控えめに調整されることを認めた。生体内および生体外の両方において、スネイル発現はＰ５３−独自の方法におけるＤＮＡ損傷に応答して変性される。しかしながら、スネイルがこの調整された発現から解放されるとき、スネイルはガンの普及（広がり）を生じる。本発明者等の結果はガン発生のＥＭＴ調整体の臨界のレベルの要求によりＤＮＡ損傷に関連しかつ同様に、スネイル調整の失敗がここに記載される動物モデルがなぜガンを発生するかを説明すると考える。これらの発見は、さらに、ヒト腫瘍によるスネイルの過発現が遺伝子毒抗ガン剤による細胞死選択に重要であるかもしれないことを示している。実際に、スネイルを過剰に発現するヒトガンは遺伝子毒性、および潜在的にヒトガンの防止および／または治療用のスネイルに基礎を置いた計画（ストラティジー）の可能性を引き起こしているＥＭＴに関して導き出した生理的メカニズムを利用することによる他のストレスの形態に対する生き残りの利点を有するかもしれない。従って、そのさいスネイルが制御可能な方法において発現される遺伝子導入モデルは、このモデルが高い適合度で広まったヒトガンを反復するので、計り知れない利用性がある。
【０００８】
本発明は、また、スネイルが上皮および／または間葉腫瘍および／またはガンならびにＤＮＡ損傷による疾患において発現されるという所見に基礎を置いている。結果として、スネイルは前記病状のマーカーとして使用することができる。
【０００９】
加えて、スネイルの発現の抑制または低減は上皮および間葉腫瘍および／またはガンならびにＤＮＡ損傷による疾患を防止および／または治療するのに使用され得る。結果として、前記病状の防止および／または治療に使用の化合物を検査するためのターゲットとして使用することができる。
【００１０】
本発明において、ガン発生中のスネイルの機能をさらに研究するために、テトラサイクリン−抑制可能なスネイル遺伝子導入を有しているマウスが発生された。これらのマウスは誕生時には形態構造の欠陥を呈さなかったが、ヒトのスネイル発現と関連付けられるガンと同様なガンを発生した。これらの欠陥は、スネイル遺伝子導入の抑制によって補正された。コンビ（Ｃｏｍｂｉ）−ｔＴＡ−スネイル（ＳＮＡＩＬ）マウス繊維芽細胞（ＭＥＦｓ）および複数のマウスが内因性の複製のスネイルよりかなり低いレベルで発現したことが認められた。さらに、コンビ−ｔＴＡ−スネイル、それが腫瘍形成を誘導するけれども、移動性の利点を付与しないことが示される。コンビ−ｔＴＡ−スネイル発現は結果として生体内で増大した放射線防護を生じる。スネイル発現はｐ５３−独自の方法におけるＤＮＡ損傷に追随して抑制される。従って、スネイル発現調整の失敗がコンビ−ｔＴＡ−スネイルマウスがなぜガンを発生するかを説明するものと思われる。これらの結果は細かい段階的なスネイルの増加がガンを誘導し得ることを示唆している。
【発明の詳細な説明】
【００１１】
定義
本明細書の理解を容易にするために、本発明の文脈における幾つかの用語及び表現の意味を以下で説明する。
【００１２】
この明細書で使用されるような、用語「被験体」は哺乳動物の構成種に言及しかつ限定はされないが、家畜、ケッ歯動物、霊長類及びヒトを含み；被験体は好ましくは、あらゆる年令または人種のヒト、雄または雌である。
【００１３】
ここで使用される用語「サンプル」は、液体サンプル、例えば、血液、漿液等、または組織サンプル等のごとき固体サンプルのごとき、被験体からのあらゆる生物学的サンプルであることができる。サンプルは、固体サンプルの場合の外科切除を含んでいる、あらゆる在来の方法によって得られることができる。サンプルは、上皮または間葉腫瘍により、以前に診断されたまたは診断されない被験体から、またはＤＮＡ損傷に基づく疾患により以前に診断されたまたは診断されない被験体から、または、前記あらゆる病状に関して治療を受けている、または以前に治療を受けた被験体から得ることができる。実施例において、サンプルは上皮または間葉腫瘍からの液体または固体の生物学的サンプルである。
【００１４】
本書で使用されるような、用語「上皮ガン」は腫瘍細胞が身体の内外面に整列する細胞であるガンに言及している。本書で使用されるような、用語「間葉ガン」は腫瘍細胞が連結性の組織、血管およびリンパ組織に発生するガンに言及している。前記上皮または間葉ガンの例示の非限定の例は例えば、慢性脊髄白血病、Ｂ−細胞急性リンパ母細胞白血病、Ｔ−細胞急性リンパ母細胞白血病、急性脊髄白血病、慢性脊髄白血病、リンパ増殖症候群、多発性骨髄腫、脂肪性肉腫、およびユーイング肉腫（ベストおよびテイラー。医学的病状の生物学的基礎（バセス・フィジオロジカス・デ・ラ・パトロジア・メディカ。マドリッド：エディトリアル・メディカ・パンアメリカーナ、第１２版、１９９３））のごときリンパ腫、白血病、肉腫およびガンを包含する。
【００１５】
用語「ＤＮＡ損傷に基づく疾患」は、照射、ＤＮＡの塩基により付加化合物を形成する化学品、転写および複製に対する構造的傷害、遺伝子素因および塩基の自然損失による相互作用から発生することができる被験体のＤＮＡ損傷に基礎を置いている疾患に言及している。前記疾患の例示の非限定の例は色素性乾皮症、コケイン症候群、トリコチオジストロフィー、ブルーム症候群、ウェルナー症候群、ナイメーヘン破壊症候群、ファンコーニ貧血、遺伝性ノンポリポシス直腸ガン等（ロブ・イー・モーゼス、２００１、欠陥および疾患を処理するＤＮＡ損傷。Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．ゲノミックス・ハム。Ｇｅｎｅｔ．２：４１−６８）を包含する。
【００１６】
用語「遺伝子」はタンパク質を符号化しているデオキシリボヌクレオチドの分子鎖に言及している。
【００１７】
用語「ＤＮＡ」はデオキシリボ核酸に言及している。ＤＮＡ配列（シーケンス）はデオキシリボヌクレオチド配列である。
【００１８】
用語「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡ配列の補完のヌクレオチド配列に言及している。
【００１９】
用語「ＲＮＡ」はリボ核酸に言及している。ＲＮＡ配列はリボヌクレオチド配列である。
【００２０】
用語「ｍＲＮＡ」はタンパク質に翻訳される合計のＲＮＡの断片であるメッセンジーリボ核酸に言及している。
【００２１】
用語「タンパク質」は生物学的活性をもつアミノ酸の分子鎖に言及している。
【００２２】
用語「スネイル（ＳＮＡＩＬ）タンパク質」は外胚葉の発生に伴なわれる規定の遺伝子の中胚葉内の発現を抑制することによって適正な未発達層境界を維持するのに作用する転写抑制体であるジンク−フィンガー転写要因のスネイル族の一員に言及している。ヒトスネイルタンパク質のアミノ酸配列は知られている（例えば、ＮＣＢＬ，アセッションナンバーＡＡＨ１２９１０参照）。
【００２３】
用語「スネイル遺伝子」はスネイルたんぱく質を暗号化している遺伝子に言及している。ヒトスネイルタンパク質のヌクレオチド配列は知られている（例えば、ＮＣＢＬ，アセッションナンバーＢＣ０１２９１０参照）およびこれは本書で言及される発明の態様における使用に好適な遺伝子である。
【００２４】
用語「スネイル遺伝子の転写生成物」はスネイル遺伝子のｍＲＮＡに言及している。
【００２５】
用語「スネイル遺伝子の翻訳生成物」はスネイルたんぱく質に言及している。再び、ヒトスネイルタンパク質が好まれる。
【００２６】
用語「抗体」は、「抗原」と呼ばれる特定のタンパク質に対する特殊な結合活性を呈するグリコタンパク質に言及している。用語「抗体」は単クローン抗体、多クローン抗体、完全なまたはその部分、組み換え型の抗体等からなり、かつヒト、ヒト化および非ヒト起源の抗体を包含している。「単クローン抗体」は単一の場所および抗原「決定基」に対して向けられる非常に特殊な抗体の同質の個体群である。「多クローン抗体」は異なる抗原決定基に向けられる抗体の同質の個体群である。
【００２７】
用語「エピトープ」は本発明において使用されるとき特殊な抗体によって認識されるタンパク質のアミノ酸配列であるタンパク質の抗原決定基に言及している。
【００２８】
１．ガン発生のマーカーとしてのスネイル遺伝子またはスネイルタンパク質の段階的な発現
前述されたように、本発明は、スネイルの異なる発現レベルが上皮または間葉腫瘍および／またはガンの発生について異なる作用に関連付けられるという発見に基礎を置いている。とくに、本発明者等は、スネイルの定められた発現レベル以上（しきし値レベル）で、前記上皮または間葉腫瘍および／またはガンの浸潤または転移能力が増加し、一方、しきし値レベル以下のスネイル発現レベルが前記腫瘍の発ガン性であるが移動性でない表現型を誘導することを観察した。
【００２９】
１．１  上皮またはリンパ管腫瘍細胞の浸潤または転移能力
１つの態様において、本発明は、スネイル遺伝子またはスネイルタンパク質の異なる発現が上皮または間葉ガンに罹っている被験体における上皮またはリンパ管腫瘍細胞の浸潤または転移能力に関連付けられるという発見に言及している。その通常の規制のメカニズムから変化させられているスネイル発現は普及能力のマーカーとしてここでは識別されている。従って、スネイル遺伝子の発現または抑制、その発現生成物（転写および翻訳両方の生成物、すなわち、ｍＲＮＡまたはスネイルタンパク質を包含する）ならびに前記遺伝子の規定または発現生成物の除去または低下により関連付けられる生成物の発現または抑制がそのガン細胞が浸潤、普及および／または転移を発生するための、スネイル＋である上皮または間葉ガンに罹っている被験体の危険を評価するのに使用することができる。それゆえ、スネイル遺伝子およびその発現生成物（転写および翻訳両方の生成物、すなわち、ｍＲＮＡまたはスネイルタンパク質を包含する）は前記上皮または間葉腫瘍細胞の悪性の有用なマーカーでありそして上皮または間葉ガンの治療、防止及び／または診断に非常に魅力的なターゲットを構成する。
【００３０】
それゆえ、１つの態様において、本発明は、上皮または間葉腫瘍の浸潤、普及および／または転移能力を測定する方法に関し、この方法は、
（ｉ）前記腫瘍から得られた試験サンプルに発現されるスネスルｍＲＮＡのレベルまたはスネイルタンパク質のレベルを定量し、そして
（ｉｉ）前記レベルを対照サンプルのレベルと比較することを含み、
そのさい対照サンプルのレベルに対する前記レベルの増加（この増加は対照サンプルのレベルの少なくとも２０％以上である）は前記腫瘍の浸潤および／または転移能力を示している。対照サンプルのレベル以上の増加は、３０％，４０％，７０％，１００％，１５０％，２００％またはそれ以上である。
【００３１】
上述した方法を実施するために、サンプルが研究中の被験体から得られる。上皮または間葉腫瘍および／またはガンにより以前に診断されたか又は診断されない被験体からまたは上皮または間葉腫瘍および／またはガンを治療するための治療を受けているまたは以前に受けていた被験体から得られる。特定の実施例において、サンプルは前記上皮または間葉（リンパ管）腫瘍からの生物学的サンプルである。サンプルは、関連の医療技術に普通の熟練の者に良く知られる方法を使用することによって、在来の方法、例えば、抽出、外科的切除、生検試料等によって得ることができる。生検試料からサンプルを得る方法は質量の大まかな割り当て、または顕微解剖または他の技術の公知の細胞分離方法を包含する。
【００３２】
病んでいる組織の生検試料材料における細胞型の変異性、および使用される診断方法の感度の変異性のため、分析に必要とされるサンプルサイズは１，１０，５０，１００，２００，３００，５００，１，０００，５，０００，１０，０００ないし５０．０００またはそれ以上の細胞の範囲にし得る。適切なサンプルサイズは生検試料の細胞組成および状態に基づいて定められ、そしてこの測定の標準の製造段階および続いて起こる本発明に使用の核酸の分離は当該技術に普通の熟練の者によく知られている。このサンプルは、限定するようには意味してないが、幾つかの場合に、生検試料からのサンプルが増幅なしのＲＮＡ発現の評価に十分であるが、しかし他の場合に、小さい生検試料領域における適切な細胞の不足がＲＮＡ変換および／または増幅方法または核酸分子の消散を高めるような方法の使用を要求するかもしれないということである。制限された生検試料材料の使用を許容する、このような方法は、当該技術に普通の熟練の者によく知られかつ限定はされないが：直接のＲＮＡ増幅、ｃＤＮＡへのＲＮＡの逆転写、ｃＤＮＡの増幅、または無線で標識かされた核酸の発生を包含する。
【００３３】
特定の実施例において、サンプル中のスネイルｍＲＮＡを定量化するために、上記定義の方法は、サンプルを抽出しかつ合計ＲＮＡ抽出を得る工程を含んでいる。この抽出は次の工程用の作業材料を示している。合計ＲＮＡ抽出のプロトコルは当該技術に熟練した者には知られている（チョモジンスキ・ピー等、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８７，１６２：１５６；チョモジンスキ・ピー、バイオテクニクス、１９９３，１５：５３２）。あらゆる在来の方法は、スネイル遺伝子転写ｍＲＮＡまたはその補完のｃＤＮＡの生体外の測定が分析されるべき被験体（試験サンプル）からおよび対照サンプルから取られたサンプルにおいて実施されるかぎりでは、上皮または間葉（リンパ管）腫瘍の浸潤および／または転移能力を測定するための本発明の枠組み内で使用されることができる。
【００３４】
いったんサンプルが得られかつ合計ＲＮＡが抽出されると、スネイルｍＲＮＡのレベルの定量化が、特定の実施例において、スネイルｍＲＮＡのレベルまたはスネイルｍＲＮＡの対応するｃＤＮＡのレベルを定量化することによって実施され得る。
【００３５】
１つの例において、スネイルｍＲＮＡの検出および定量化は、例えば、ノーザン法のごとき、ブロット技術によってナイロン薄膜上でｍＲＮＡを拭き取り（ブロッティング）、そしてそれをスネイルｍＲＮＡのまたはそのｃＤＮＡの特殊なプローブにより検出することによって実施される。
【００３６】
他の例において、スネイルｍＲＮＡの定量化は、ＲＮＡ、好ましくは、ｍＲＮＡの増幅、またはスネイルｍＲＮＡからの逆転写（ＲＴ）によって合成されたｃＤＮＡの増幅の第１工程、およびスネイルｍＲＮＡの増幅生成物またはその対応するｃＤＮＡの定量化の第２工程を含んでいる２工程方法によって達成され得る。ｍＲＮＡの増幅の１つの例は、適切なオリゴヌクレオチドプライマー（ＵＳ４，６８３，１９５，ＵＳ４，６８３，２０２およびＵＳ４，９６５，１８８）を使用しているポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）が追随する、ｃＤＮＡへのｍＲＮＡの逆転写に存する。ＰＣＲ増幅生成物を検出および定量化する多数の方法が以前に開示されており、その方法のいずれかがこの発明に使用され得る。特定の実施例において、スネイルｍＲＮＡの増幅および定量化は、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）およびそれに続くスネイル用の特殊なプローブによる交配によって実施され、任意に、前記プローブは、プローブに対してターゲット遺伝子を交配し、そしてターゲット−プローブ交配を評価する、例えば、放射能で標識化されたプローブ（例えば、放射性、化学発光、またはフルオロセイン、Ｃｙｅ３−ｄＵＴＰ、およびＣｙｅ５−ｄＵＴＰのごとき蛍光発光タグ）のような、適切なタグにより標識化されている。ターゲット配列に完全に整合する核酸配列をもつプローブは、一般的に、より少ない完全な整合をもつ目標プローブより強力な伝達体分子信号を結果として検出する。
【００３７】
使用されるプローブはスネイルｍＲＮＡまたはそのｃＤＮＡに特有である。前記プローブはあらゆる適切なソフトウエアを使用することによってスネイル遺伝子のヌクレオチド配列に関して当該技術に熟練した者によって容易に設計されることができる。ヒトスネイル遺伝子のヌクレオチド配列は知られている（ＮＣＢＬ，アセッションナンバーＢＣ０１２９１０）。本発明によれば、プローブは、限定はされないが、ＤＮＡ、生活機能に不可欠の遺伝子群を備えたＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを包含する核酸のグループから選ばれ；そして天然または合成であってもよい。オリゴヌクレオチドは、好ましくは、２０ないし２５−ｍｅｒオリゴヌクレオチドであり、一方、ＤＮＡ／ｃＤＮＡプローブは、長さが５００ないし５，０００の塩基であり；それにも拘わらず、両方の場合に、他の長さが使用され得る。
【００３８】
上記で定義した方法の最終工程は、分析中に被験体による前記上皮またはリンパ管腫瘍から得られたサンプル中に定められたスネイルｍＲＮＡまたはそのｃＤＮＡのレベル（量および濃度）を、対照被験体、すなわち、健康な被験体からのサンプルのごとき、対照サンプルまたは上皮または間葉腫瘍および／またはガンのない被験体からのサンプル、（すなわち、上皮または間葉腫瘍および／またはガンの臨床履歴なしの被験体）または同一被験体からの以前のサンプルと比較することにある。
【００３９】
前記生成物（スネイルｍＲＮＡまたはそのｃＤＮＡ）の定量化は、上皮または間葉ガンに罹っている被験体中の上皮または間葉腫瘍の、とくに、上皮または間葉腫瘍の浸潤および／または転移能力の発生状態を示している。この方法において、対照サンプルのレベルに関連して、対照サンプルのレベルの少なくとも２０％以上（または少なくとも３０％，４０％，７０％，１００％，１５０％，２００％またはそれ以上）からなる、スネイル遺伝子（例えば、スネイルｍＲＮＡ）、またはそのｃＤＮＡの転写生成物の増加は前記上皮または間葉腫瘍細胞の浸潤、普及および／または転移能力を示している。
【００４０】
スネイルタンパク質が検出され得る場合において、上記で定義した方法は、サンプルのタンパク質抽出がスネイルタンパク質の１つまたはそれ以上のエピトープに対して１つまたはそれ以上の特殊な抗体の組成物と接触して置かれる第１の工程、およびスネイルタンパク質の抗体によって形成される複合物が定量化される第２の工程を含んでいる。
【００４１】
特殊な抗原−抗体複合物の形成を検出しかつ定量化するのに利用できる免疫アッセイ（検定）は多数あり；多数の競合および非競合タンパク質結合検定が以前に開示され、そして多数のこれらの分析物は市場で入手可能である。それゆえ、スネイルタンパク質は、例えば、単クローン抗体、多クローン抗体、完全なおよびその組み換え部分のいずれも、スネイルタンパク質に対して特有な、組み合わされた抗体およびＦａｂまたはｓｃＦｖ抗体部片のごとき抗体により定量化されることができ；これらの抗体はヒト、ヒト化されたまたは非ヒト起源からなっている。これらの検定に使用される抗体はマークされてもされなくてもよく；マークされない抗体は凝集反応検定に使用されることができ；マークされる抗体は広範囲の検定に使用されることができる。抗体をマークするのに使用され得るマークされた分子は、放射性ヌクレオチド、酵素、フルオロフォレス（蛍光化合物）、化学発光剤、酵素基質またはコファクター、酵素抑制剤、粒子、染料および派生物を包含する。マークされない抗体（１次抗体）およびマークされる抗体（２次抗体）を使用する本発明に使用され得る多数の公知の検定があり；これらの技術に包含されるのは、ウエスタン法、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着剤検定（アッセイ））、ＲＩＡ（放射性免疫検定）、競争的なＥＩＡ（競争的な酵素免疫検定）、ＤＡＳ−ＥＬＩＳＡ（二重抗体サンドイッチ−ＥＬＩＳＡ）、免疫細胞化学および免疫組織化学技術、特殊な抗体または計量棒のごときフォーマット中のコロイド沈殿に基づく検定を包含するタンパク質生体素子またはマイクロアレイの使用に基づく技術である。スネイルタンパク質を検出しかつ定量化する他の方法は親和性クロマトグラフィ技術、リーガンド結合検定またはレチン結合検定を包含する。本発明の方法に好適な免疫検定は二重抗体サンドイッチ−ＥＬＩＳＡ検定である。あらゆる抗体またはスネイルタンパク質の１つまたはそれ以上のエピトープに対する特殊な抗体の組み合わせがこの免疫検定に使用することができる。この検定の多数の考え得るフォーマットの例として、固体相を被覆している単クローンまたは多クローン抗体、またはこの抗体の断片、または抗体の組み合わせが分析されるべきサンプルと接触して置かれそして１時間かつ抗原−抗体複合物を形成するのに適する条件により培養される。信号発生化合物に結合される単クローンまたは多クローン抗体、またはこの抗体の断片、または抗体の組み合わせが、非特有化合物を除去するのに適する条件により洗浄後適切な時間および適切な条件で抗原−抗体複合物により培養された。分析されるべきサンプル中のスネイルタンパク質の存在は、それが存在する場合に、発生された信号を測定することによって検出されかつ定量化される。分析されるべきサンプル中に存在するスネイルタンパク質の量はその信号に比例する。この方法において、対照サンプルのレベルの少なくとも２０％以上（または少なくとも３０％，４０％，７０％，１００％，１５０％，２００％またはそれ以上）からなる、対照サンプル中のスネイルタンパク質のレベルに対する試験サンプル中のスネイルタンパク質のレベルの増加は、前記上皮または間葉腫瘍細胞の浸潤および／または転移能力を示している。
【００４２】
１．２  上皮または間葉腫瘍細胞の局部成長能力
他の態様において、本発明は、スネイル遺伝子またはその発現生成物（転写および翻訳両方の生成物、すなわち、ｍＲＮＡおよびタンパク質）が上皮または間葉ガンに罹っている被験体における上皮または間葉腫瘍細胞の局部成長能力に関連付けられるという発見に言及している。とくに、対照サンプルのレベルを超えて２０％より少ない（または少なくとも３０％，４０％，７０％，１００％，１５０％，２００％またはそれ以上）からなる対照サンプル中のレベルに対するスネイル遺伝子またはその発現生成物のレベルの増加は前記上皮または間葉腫瘍および／またはガンの局部成長を示している。かくして、従って、スネイル遺伝子の発現または抑制、その発現生成物ならびに前記遺伝子の規定または発現生成物の除去または低下により関連付けられる生成物の発現または抑制が局部的に成長するように、上皮または間葉ガンに罹っている被験体における上皮または間葉腫瘍細胞の素因を評価するのに使用することができる。それゆえ、スネイル遺伝子およびその発現生成物、および前記遺伝子またはタンパク質の規定によりまたはその発現生成物（転写および翻訳両方の生成物、すなわち、ｍＲＮＡまたはスネイルタンパク質を包含する）の除去または低下により関連付けられる生成物は局部的に成長している前記上皮または間葉腫瘍細胞の能力の有用なマーカーでありそして上皮または間葉ガンの治療、防止及び／または診断に非常に魅力的なターゲットを構成する。
【００４３】
それゆえ、１つの態様において、本発明は、上皮または間葉腫瘍の局部成長能力を測定する方法に関し、この方法は、
（ｉ）前記腫瘍から得られた試験サンプル中のスネスルｍＲＮＡのレベルまたはスネイルタンパク質のレベルを定量化し、そして
（ｉｉ）前記レベルを対照サンプルのレベルと比較することを含み、
そのさい対照サンプルのレベルに対する前記レベルの増加（この増加は対照サンプルのレベルを超えて２０％以下である）は前記腫瘍の局部成長能力を示している。対照サンプルのレベル以上の増加は少なくとも３０％，４０％，７０％，１００％，１５０％，２００％またはそれ以上である。
【００４４】
ここで使用されるような、浸潤または転移能力と反対の用語「局部成長能力」は腫瘍細胞の制御されない分割が始まった組織または器官に成長する腫瘍の能力に言及しており；従って、前記用語は例えばこれまで浸潤および／または転移能力、すなわち、隣接組織への直接成長（浸潤）または離れた場所への細胞の移動（転移）による、他の組織を浸潤するような前記細胞の能力を発生しなかった腫瘍細胞に適用することができ、かつ、結果として、それらは前記組織または器官に局部的に成長する。
【００４５】
上皮または間葉腫瘍の局部成長能力を測定する方法を実施するために、研究中の被験体からのサンプルが得られねばならない。この方法を行なうのに使用されるサンプルの詳細は上皮または間葉腫瘍の浸潤および／または転移能力を測定するための以前に開示された方法を行なうのに使用されたサンプルの詳細と同様である。
【００４６】
スネイルｍＲＮＡのレベルのまたはスネイルタンパク質のレベルの定量化は上皮または間葉腫瘍の浸潤および／または転移能力を測定するための方法に関連して以前に開示された技術のいずれかによって実施することができる。続いて研究中の被験体のサンプル（試験サンプル）において定量化されたスネイルｍＲＮＡのレベルまたはスネイルタンパク質のレベルは対照サンプル中のスネイルｍＲＮＡのレベルまたはスネイルタンパク質のレベルと比較される。この場合に、対照サンプルのレベルを超える２０％以下である対照サンプルのレベルに関連する前記スネイルｍＲＮＡのレベルまたはスネイルタンパク質のレベルの増加は局部的に成長することができる前記上皮または間葉腫瘍を示している。
【００４７】
上皮の腫瘍および／または間葉の腫瘍および／またはガンまたはＤＮＡ損傷に基づく疾患のマーカーとしてのスネイル（ＳＮＡＩＬ）
本発明は、また、スネイル遺伝子、またはその発現生成物（転写および翻訳両方の生成物、すなわち、スネイルｍＲＮＡまたはスネイルタンパク質を包含する）が上皮の腫瘍および間葉の腫瘍および／またはガンならびにＤＮＡ損傷に基づく疾患に発現される知見に基づいている。従って、サンプル中のスネイル遺伝子、またはその発現生成物の検出は上皮の腫瘍、間葉の腫瘍および／またはガンまたはＤＮＡ損傷に基づく疾患の診断または予後に使用されることができる。実際に、サンプル中のスネイル遺伝子、またはその発現生成物の検出は、上皮の腫瘍、間葉の腫瘍および／またはガンまたはＤＮＡ損傷に基づく疾患、または上皮の腫瘍、間葉の腫瘍および／またはガンまたはＤＮＡ損傷に基づく疾患を発生するような被験体のより大きな危険または素因を示している。それゆえ、上述した発見は、以下の方法：臨床トライアルを監視する、診断決定、予後検定およびここでさらに記載されるようなスクリーニング検定の１つまたはそれ以上に使用することができる。
【００４８】
それゆえ、他の態様において、本発明は被験体における上皮の腫瘍、間葉の腫瘍および／またはガンまたはＤＮＡ損傷に基づく疾患から選ばれている条件の存在を診断するための、または被験体における前記の段階または重大さを決定するための、または前記条件により被験体に施される療法の効果を監視するための生体外方法に言及しており、前記方法は、
（ｉ）前記被験体から得られたサンプル中の診断マーカーの存在を測定し、そして
（ｉｉ）前記診断マーカーの存在を対照サンプルにおけるその不存在と比較することを含み、そのさい存在は上皮のまたは間葉の腫瘍またはＤＮＡ損傷に基づく疾患の存在を示し、
そのさい前記診断マーカーはスネイルｍＲＮＡまたはスネイルタンパク質である。
【００４９】
スネイルｍＲＮＡまたはスネイルタンパク質の検出は、上皮のまたは間葉の腫瘍の浸潤および／または転移能力を測定するための方法に関連して以前に開示された技術のいずれかにによって実施されることができる。続いて、前記生成物、例えば、研究中の被験体のサンプル（試験サンプル）中のスネイルｍＲＮＡまたはスネイルタンパク質が対照サンプル中のその不存在と比較され、前記生成物の存在は研究中の被験体における上皮の腫瘍、間葉の腫瘍およびＤＮＡ損傷に基づく疾患から選ばれる条件の存在（診断）を示している。かくして、この方法は、また、前記条件により被験体に施される療法の効果を監視しかつ必要ならば、さらに他の療法を選択するのに使用することができる。
【００５０】
遺伝子導入の非ヒト哺乳動物
他の態様において、本発明は、以下で、本発明の遺伝子導入の非ヒト哺乳動物として言及される遺伝子導入の非ヒト哺乳動物を提供する。ここで、「遺伝子導入」と呼ばれる非ヒト哺乳動物はそのゲノムに移植遺伝子を含んでいる。本発明によれば、前記移植遺伝子は、スネイルたんぱく質を符号化している核酸配列を含んでおり（すなわち、前記核酸はスネイル遺伝子を含んでいる）、前記移植遺伝子の発現はエフェクター物質によって外因的に規制されている。好ましくは、スネイルたんぱく質は、ネズミに似た形態のごとき、他の形態もまた幾つかの有用性からなり得るけれども、ヒトスネイル遺伝子（例えば、ＮＣＢＬ、アセッションナンバーＢＣ０１２９１０参照）によって符号化された、ヒトスネイルたんぱく質（例えば、ＮＣＢＬ、アセッションナンバーＡＡＨ０１２９１０参照）である。
【００５１】
本発明の幾つかの実施例において、スネイルたんぱく質の断片、または変異体のごとき、スネイルたんぱく質の１部分のみを符号化している配列を移植遺伝子として使用するのが適切であるかもしれない。「断片」によって、我々は、例えば、全長配列の１０％，２０％，３０％，４０％，５０％，６０％，７０％，８０％，９０％，９５％またはそれ以上を含んでいる、全長スネイルタンパク質のいずれかの部分を意味する。例えば、断片はタンパク質構造内の特殊なドメインまたはドメインの組み合わせを含むことができる。「変異体」によって、我々は、例えば、１または多数（例えば、２，３，４，５，６，７，８，９，１０またはそれ以上）の挿入、削除、置換等を含んでいる突然変異形態のごとき、スネイルタンパク質のあらゆる変異体を意味する。
【００５２】
この発明によって提供される遺伝子導入の非ヒト哺乳動物は、結果として、非遺伝子導
入の哺乳動物に比較されるとき上皮の腫瘍および間葉の腫瘍、および／またはＤＮＡ損傷に基づく疾患および／または播種性の（広まった）ガンから選ばれる腫瘍を発生するより大きな傾向を付与する遺伝子型を有している。ここに開示される型の遺伝子導入モデルにおいて発生されるガンの例は上皮および間葉両方の起源のガンを包含する。特殊な例が表１に示されかつ急性白血病、リンパ腫、肺ガン、未発達細胞過形成、肝臓ガン、造血性腫瘍形成および急性脊髄白血病を包含する。
【００５３】
例えば、ここで発生されたすべてのコンビ（Ｃｏｍｂｉ）−ｔＴａ−スネイルマウス（例参照）は、犠牲にする前に、減少した物理的活性、速呼吸、ピロ−エレクション、震えを含みかつ体重損失を維持した臨床的発現によりおよそ５−７ヶ月から（表１）調子が悪かった。ガンは間葉および上皮両方の起源からであった（表１）。間葉ガンは急性白血病（図４Ａ）およびリンパ腫（図４Ｂ）であった。肉腫は、コンビ−ｔＴａ−スネイルの遍在する発現によるとはいえ、分析されたコンビ−ｔＴａ−スネイルマウスのいずれにも見られなかった。上皮腫瘍細胞の詳細な分析は、肺がん（図５Ａ）、未発達細胞過形成（図５Ｂ）および肝臓ガン（図５Ｃ）のような診断を確立した。１つの型の動物ごとのガンが、それらの２０−２５％が、また、造血性の腫瘍形成を発生するけれども、検出された。組織構造的な検査がちょうどガンの広がりを示している。しかしながら、組織構造的な分析は造血および非造血組織のマークされた白血病細胞浸潤を示した。これらの白血病細胞は腎臓、肝臓、および肺臓を優先的に浸潤する（図４Ｃ−Ｅ）。白血病マウスからの末梢血単核細胞は特殊な抗体の組み合わせを使用するフローサイトメトリーによって識別された。これらの研究は急性白血病を急性脊髄白血病として定義した（図４Ａ）。
【００５４】
この型の遺伝子導入の非ヒト哺乳動物は、かくして、他の目標の中で、上皮腫瘍、リンパ管腫瘍および／またはガン、およびＤＮＡ損傷による疾患を研究するのにならびに前記病状を治療、診断および／または防止するのに潜在的に有用な化合物を評価するのに有用である。動物は、広がったヒトガンを誠実に再生するモデルとしてとくに有用である。
【００５５】
スネイルが外因的な要因による規制を許容する方法において発現されるＤＮＡ構造の、モデル動物への導入は、遺伝子の変則を生じる。特定の実施例において、スネイル移植遺伝子の発現によって発生される遺伝子の変則は、結果として上皮腫瘍および間葉腫瘍またはＤＮＡ損傷による疾患、または広まったガンから選ばれる腫瘍を生じ、その場合に、降下（ディセンデンツ）は問題の病状と関連付けられる遺伝子の変則によって作られる活性遺伝子および／または遺伝子の発現を評価するために分析される。
【００５６】
スネイルが通常の発生を達成するために一定のしきい値レベル以上に維持されねばならないことは発明者の結果から明らかである。この解釈と一致して、コンビ−ｔＴａ−スネイルはＭＥＦｓ中に発ガン性のしかし移動性でない表現型を誘起した。これらの発見は、スネイルが、普及が見定め得る前に腫瘍形成を必要としないことを示している。しかしながら、「増加した」スネイル発現は高い頻度でマウス中にガンを誘起する。
【００５７】
とくに、ここで記載される遺伝子導入の動物はヒトガンの特徴を複製する広まったガンを発生することが認められた。従って、これらのモデルはガンの広がりに影響を及ぼしかつ好ましくは、それを防止する要因を研究するのに計り知れない有用性からなる。ここで使用されるような、表現「非ヒト哺乳動物」は哺乳動物の部類に属するあらゆる非ヒト哺乳動物を包含する。非ヒト哺乳動物は好ましくはマウスであるが、他の哺乳動物種、例えば、他のケッ歯動物、例えば、ラット、ハムスターまたはテンジクネズミ、またはモンキー、豚、ウサギ、または犬またはネコ科のごとき他の種、またはヒツジ、ヤギ、ウマ、ウシのごとき有蹄種、または非ヒト哺乳動物の動物種であってもよい。特定の実施例において、本発明によって提供される遺伝子導入非ヒト動物はネズミ科の動物である。用語「ネズミ科」はマウス、ラット、ハムスターまたはテンジクネズミ等を包含する。好適な実施例において、ネズミ科の動物はラットまたはマウスであり；最も好ましくは本発明の非ヒト哺乳動物である。
【００５８】
遺伝子導入動物の使用は倫理的な性質の疑問を有するけれども、ここで記載される型の研究から人間への利益が万物に課せられ得るあらゆる苦しみおよび遺伝子導入動物の試験に勝るために広く検討される。当該技術の熟練者に明らかなように、薬物治療は、臨床トライアルをヒトに開始する前にかつ現行の規定によりそして現在利用し得るモデル系統により動物試験を必要とし、動物試験は省くことはできない。あらゆる新薬は、その一方が大きな非ケッ歯動物でなければならない、少なくとも２つの異なる種類の生きている哺乳動物で試験されねばならない。専門家は、身体に非常に特別な方法において作用する現在開発中の薬の新等級が今後数年に使用されているより多くの動物に、かつより多くの霊長類の使用に至ることを検討する。例えば、科学は「老齢の個体群」を苦しめている神経系疾患に取り組むことを求めているので、我々は次世代ピルの安全性および有効性を試験するためにモンキーの規則的な供給を必要とすることが検討されている。従って、ここに記載されるモデルのような遺伝子導入モデルからのヒトへの利益はマウスに、または一般的には、ケッ歯動物に限定されないが、霊長類を包含する他の哺乳動物を包含する。これらの新薬が働く特殊な方法は、霊長類の脳構造が我々の脳構造に非常に似ているため実験に適する唯一の動物かもしれないことを意味する。
【００５９】
本発明のこの態様は、薬の発見および開発における縮小範囲を低減するのを目途としている。薬が遅い段階で試験に失敗すると、すべての動物実験は、ある意味で、無駄にされてしまう。失敗の薬を停止することはそれゆえ試験動物の命を助ける。それゆえ、本発明は遺伝子導入動物に関連するけれども、かかる動物の使用は薬試験プログラムに使用されねばならない動物の数を低減しかつ人間の臨床検定における縮小率を減少すべきである。
【００６０】
ここで使用されるような、用語「エフェクター物質」は、前記物質が本発明の遺伝子導入非ヒト哺乳動物に投与されるときスネイル遺伝子の発現を規制することができるあらゆる物質に言及している。これらの外因的に規制される発現系は当該技術に熟練した者により良く知られている（マディソン・ケー、クラーク・アーアール、２００５.マウスにおけるガンメカニズムをモデル化するための新規のアプローチ。Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２０５：１８１−１９３）。
【００６１】
本発明の遺伝子導入非ヒト哺乳動物の発生のために、スネイル遺伝子（移植遺伝子）を包含するＤＮＡ構造が作られる。好ましくは、この遺伝子は、好ましくは規定の配列を含んでいる、ＤＮＡ構造として動物に導入される。これらの規定の配列はヒト、動物、原核生物または他の種から引き出すことができる。規定の配列がヒト起源でない場合に、規定の遺伝子は目標動物、例えば、マウスから引き出すことができる。規定の遺伝子により、あらゆるプロモーターまたはエンハンサー配列、５´または３´ＵＴＲｓ，ポリ−Ａ末端配列または関心のある遺伝子の転写に必要である他のＤＮＡ配列を含むことが意味される。ヒト配列の挿入に使用される写しは好ましくはポリＡモチーフによって終端される。本発明は野生型発現の忠実度が発生上一時的にかつ組織の特別な方法において維持されるようにスネイル暗号化遺伝子をもつ外因性のプロモーターを組み込んでもよい。「外因性のプロモーター」によって、関心のある遺伝子の発現を自然に誘導するプロモーターが意味される。外因性のプロモーターは、従って、外因性のヒトプロモーターであってもよく、または代替的に、遺伝子導入動物被験体中のその導入された遺伝子に外因性であるプロモーターであってもよい。
【００６２】
本発明の好適な実施例において、マウスのごとき非ヒト動物は規制し得る方法において
スネイル用の遺伝子導入がなされ、かつまた、Ｐ５３発現（すなわち、Ｐ５３−／−である）に関してゼロである。本発明のこの態様の利点は、最もガン状の細胞がＰ５３−／−であるので、ガンシナリオがモデル有機体中に再生されることができるということである。最も驚くべきことには、本発明は、このモデルにおいて、ヒトガンの特徴が非ヒト動物系統に複製され得ることを認めた。本発明者等はあらゆる理論に結合されることを望まないけれども、通常の非ガン状細胞において、ＤＮＡ損傷はスネイル発現を抑制するように考えられる。しかしながら、Ｐ５３は、ガン発生が生じないようにＤＮＡ損傷を修復する。本発明の二重のモデルにおいて、しかしながら、Ｐ５３は移植遺伝子系統に存在せず、かつそこでＤＮＡ損傷を修復するように作用することができないかまたはガン状成長についてのチェックとして作用することができない。加えて、この系統において、スネイル発現はイベントの通常のコースにおいて普通に発生するように抑制されず、かつ結果として、広まったガンが予想されることができない方法において移植遺伝子のモデル中に発生する。
【００６３】
ここで報告されるのは、ｐ５３に遺伝子欠失があるマウス（同様に「ｐ５３ゼロマウス」または「ｐ５３−／−マウス」と呼ばれる）がコンビｔＴＡ−スネイル−ｐ５３−／−マウスを生じるように、コンビｔＴＡ−スネイルマウスと交配されたとき、これらのマウスが２−３ヶ月の年令（図１１）で非常に大きな胸腺のリンパ腫を発生することが認められたということである。さらに認められたことは、これらの腫瘍が肺臓、心臓、隔膜空間を浸潤しかつ本質的に切断不能であったということである。リンパ腫、肺腫瘍および脂腺腫サンプルの組織構造的な調製の顕微鏡写真が図１２に示されている。
【００６４】
かくして、コンビｔＴＡ−スネイル−ｐ５３−／−マウスがヒトガンの特徴を、同様にかつとくに悪性のヒトガンの広がりおよび転移に関連して再生したことが認められた。これらのコンビｔＴＡ−スネイル−ｐ５３−／−マウスは普及対照を目標にしている治療法を開発するための理想的なモデルを示している。このモデルは、ヒトの広がったガンの特徴のすべてを正確に複製しかつ発生しているかかる広がりを防止する方法および化合物を見つけるように求めている値に対して最大の値からなる。
【００６５】
好ましくは、本発明のＤＮＡ構造として以下で言及される、前記構造は、従って、エフェクター物質によって外因的に規制された発現系統の制御によりスネイルｃＤＮＡを含んでいる。適切な系統は当該技術に熟練した者には明らかである。好適な実施例において、外因的に規制された発現系統はテト−オフ（ｔｅｔ−ｏｆｆ）系統、すなわち、シュルツ等（ネイチャー・バイオテクノロジー１４：４９９−５０３，１９９６）のコンビ−ｔＴＡ（Ｃｏｍｂｉ−ｔＴＡ）ベクター系統、またはその変性されたバージョンに基礎が置かれてもよい。前記ＤＮＡ構造は図１Ａに略示されている。この実施例において、スネイル遺伝子は、好ましくは、テト−オペレーター（ｔｅｔ−ｏｐｅｒａｔｏｒ，ｔｅｔＯ）最小プロモーターの制御下にある。この場合に、スネイル移植遺伝子の発現はテトラサイクリンまたはドキシサイクリンのようなその派生物によって外因的に規制されそして本発明によるエフェクター物質は、好ましくは、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンのようなその派生物である。従って、本発明による遺伝子導入の非ヒト哺乳動物のスネイル移植遺伝子は、好ましくは、テトラサイクリンの存在において抑圧されかつテトラサイクリンの不存在において活性化される。
【００６６】
１実施例において、シュルツ等（ネイチャー・バイオテクノロジー１４：４９９−５０３，１９９６）によって記載されたような最初のコンビ−ｔＴＡベクターは、以下の工程：１）前記最初のベクターからｔｅｔＯ−ルシフェラーゼカセットの除去、および２）ｔｅｔＯ最小プロモーターおよびスネイル遺伝子を含んでいるカセットの導入によって好ましくは変性される。好ましくは、前記カセットはシュルツ等に開示された最初のベクターのアンピシリン抵抗遺伝子（代替的にＡｍｐ，ｂｌａ、またはベータ・ラクタマーゼ遺伝子として言及される）内に導入されるべきである。
【００６７】
本発明は、マウス中のテトラサイクリンによる遺伝子発現の誘導および厳重な制御を許容するように最初の２成分のテトラサイクリンの規制および発現要素を含有しているシュルツ等（１９９６）の単一のプラスミド系統を改良した。本発明者等は、シュルツ系統が効果的に発現されかつ適切に抑圧されるようなターゲット遺伝子を許容するために幾つかの顕著な変性を要求することを認めた。例えば、ここに記載された変性なしに、ターゲット遺伝子発現が、多分、シュルツプラスミドに存在する他のプロモーター（例えば、ＣＭＶおよびＳＶ４０）からの判断のため、テトラサイクリンまたは、例えば、ドキシサイクリンのようなテトラサイクリン派生物の存在において抑圧されないことが認められた。従って、１つ、好ましくは、２つまたはそれ以上のポリ−Ａ配列が、この判断の問題が解決されることを保証するようにターゲット遺伝子のまわりの側面位置に導入される。
【００６８】
加えて、この系統からのターゲットタンパク質の発現を改善するためにＴＡＴＡ配列を導入するのが有用と認められた。好ましくは、ＴＡＴＡ配列はｔｅｔＯ配列とターゲット遺伝子配列との間に横たわる。
【００６９】
好ましくは、前記導入されたカセットは、ポリ−Ａ配列、ｔｅｔＯプロモーター、ＴＡＴＡボックス配列、ターゲット遺伝子、さらに、２つのポリ−Ａ配列、アンピシリン抵抗遺伝子、および第４のポリ−Ａ配列を含んでいる。これらの要素は、好ましくは、上述した順序において前記カセット上に配置される。以下で記載されるような、この変性された構造は、テトラサイクリンまたは、ドキシサイクリンのようなその派生物によって規制され、かつ本発明の独立の態様を形成する方法においてあらゆるターゲット遺伝子の発現に使用され得る。従って、本発明のこの態様は外因性要因による規制を許容する方法におけるターゲット遺伝子の発現に適合されるＤＮＡ構造を提供し、前記構造は、複製の起源、少なくとも１つのプロモーター、外因性要因による規制を伝達することができる少なくとも１つの配列、少なくとも１つのトランス転写活性促進体（トランスアクティベーター）配列およびターゲット遺伝子を符号化している配列を含み、そのさいターゲット遺伝子を符号化している配列は少なくとも１つのポリ−Ａ配列によって両側に配置されている。好ましくは、側面に位置しているポリ−Ａ配列は、図１に設定された形状におけるような、プロモーター配列からの判断を阻止するように配置される。構造は、１つ、２つまたはそれ以上の側面に位置しているポリ−Ａ配列を包含してもよい。ターゲット遺伝子を符号化している配列と直接接触することは側面に位置しているポリ−Ａ配列に必ずしも必須ではない。しかしながら、好適な実施例において、少なくとも１つのポリ−Ａ配列はターゲット遺伝子を符号化している配列に対して直接５’および直接３’に配置される。
【００７０】
「ポリ−Ａ」配列によって、真核生物遺伝学から知られるようなポリアデニレーション信号が意味される。代表的には、哺乳動物の細胞によって認識されるポリアデニレーション配列は翻訳停止コドンに３’に置かれた規定の領域でありかつ従って、プロモーター要素とともに、暗号化している配列を側面に置いている。ポリアデニレーション信号の例は、他のポリアデニレーション信号が当該技術に熟練した者には知られているけれども、ＳＶ４０から引き出されたポリアデニレーション信号を含んでいる。かかる配列は、好ましくは、長さが１０および５００のヌクレオチド、より好ましくは５０および２００のヌクレオチドの間で、アデノシンヌクレオチドのランを含んでいる。
【００７１】
好ましくは、プロモーターは、ＳＶ４０プロモーターおよび／またはＣＭＶプロモーター、より好ましくは、ＳＶ４０プロモーターおよびＣＭＶプロモーターの両方を含んでいる。好ましくは、トランスアクティベーターはウイルスＶＰ１６トランスアクティベータードメインを含んでいる。より好ましくは、トランスアクティベーターはｔｅｔ−抑制体たんぱく質に溶融されたウイルスＶＰ１６トランスアクティベータードメインを含んでいる。しかしながら、他のトランスアクティベーター系が当該技術に熟練した者に知られている。
【００７２】
好ましくは、構造は、追加的に、プロモーター配列、好ましくは、ターゲット遺伝子を
符号化している配列の上流に好ましくは配置される、ＴＡＴＡ配列を含んでいる。好ましくは、プロモーター配列は外因的要因による規制を伝達することができる配列およびターゲット遺伝子を符号化している配列との間に横たわる。
【００７３】
好ましくは、外因的要因による規制を伝達することができる配列はｔｅｔＯ、またはその機能的同等物であり、そして外因的要因はテトラサイクリン、またはドキシサイクリンのようなその派生物である。
【００７４】
好ましくは、オンコジーン、およびスネイルを含んでいる、ガンに対する素因に影響を与えられる遺伝子である。他の有用な例は当該技術に熟練した者には明らかである。
【００７５】
本発明のこの態様の好適な実施例は、スネイルに関して図１に示された実施例に基礎を置いた構造である。とくに好適な実施例において、ターゲット遺伝子はスネイルである。
【００７６】
本発明による遺伝子導入の非ヒト哺乳動物の構成において、好ましくは、ｂｌａ遺伝子
内で、シュルツ等のコンビ−ｔＴＡベクターへの挿入用のカセットは図１Ａに示されている。本発明による最終構造はスネイル遺伝子を包含する前記カセットの挿入から結果として生じるコンビ−ｔＴＡベクターであり、そしてここではコンビ−ｔＴＡ−スネイルベクターとして言及される。前記構造／ベクターの好適な実施例は図１Ｂに示されている。最も好ましくは、ポリ−Ａ配列、ｔｅｔＯプロモーター、ＴＡＴＡボックス配列、スネイル遺伝子、さらに他の２つのポリ−Ａ配列、アンピシリン抵抗遺伝子（ベータ−ラクタマーゼ／ｂｌａ）、および第４のポリ−Ａ配列の配向は、幾つかの実施例によれば、Ａｍｐ（ｂｌａ）がまた反対の相対的な配向にあるかもしれないけれども、図１Ａおよび図１Ｂに示されるようになっている。
【００７７】
本発明のＤＮＡ構造は、次に、非ヒト哺乳動物に、またはそのプレデセッサー（前にあったもの）に、胚状態において、例えば、細胞、または受精された卵母細胞の状態においてかつＧ細胞状態より遅くなく導入される。
【００７８】
当該技術の状態において考えられる異なる意味があり、それによって核酸の配列が、そのすべてが本発明の非ヒト移植遺伝子哺乳動物の発生に適用され得る、活性状態において遺伝子的に組み込まれえるような動物の胚に組み込まれることができる。方法は、自然に発生するような拡散の前記配列と胚を増殖し、かつ前記配列が結果として前記配列の活性化を付与する遺伝子座で染色体上に一体化される遺伝子導入動物を選択することからなる。他の方法は、胚に核酸配列を導入する前の、核酸配列、またはその対照配列の変性を意味する。他の方法は導入されるような核酸配列を包含するベクターを使用して胚を増殖することからなる。
【００７９】
特別な実施例において、非ヒト哺乳動物の生殖系列内の本発明のＤＮＡ構造の導入は非ヒト哺乳動物の受精された卵母細胞内に活性化し得る遺伝子を含む直線ＤＮＡ断片の顕微注射によって実施される。
【００８０】
受精された卵母細胞は、例えば、オスとの交尾に応答してまたは黄体ホルモンを用いる治療による誘発によって、メスの排卵を引き起こす、在来の方法によって分離されることができる。一般に、過排卵がホルモンの作用によってメスに誘発されそしてそれらはオスと交配される。適切な時間周期後、メスは適切な培養媒体中に保持されるそれらの卵管から受精された卵母細胞を分離するために犠牲にされる。受精された卵母細胞は前核の存在により顕微鏡によって認識され得る。直線ＤＮＡ断片の顕微注射はオスの前核に好都合に実施される。
【００８１】
受精された卵母細胞中の本発明のスネイル構造を含む直線ＤＮＡ断片の導入後、それらは、適切な時間周期にわたって生体外で培養されるか、さもなければ偽妊娠乳母（メスを不妊のオスと交尾させることによって得られる）に再び移植される。再移植は例えばメスを麻痺させ、そして偽妊娠乳母の卵管内に、十分な数の胚、例えば、１０ないし２０個の胚を外科的に挿入する、在来の方法によって実施される。いったん懐胎が終了すると、幾つかの胚が懐胎を終了しかつそれらのゲノムに一体にされかつ有機体の細胞のすべてに存在する本発明のＤＮＡ構造を理論的に支持すべきである遺伝子導入の非ヒト哺乳動物を生起する。この子孫はＧ０世代でありそしてそれらの個体は「移植遺伝子の始祖（トランスジェニック・ファンダーズ）」である。個体が注入された核酸を組み込みかつ移植遺伝子であることの確認は子孫の個体を分析することによって得られる。これを行なうために、動物材料のサンプルから、動物の尻尾（それが、マウスである場合に）または血液サンプルからの小さいサンプルから、ＤＮＡが各個体から採取されそして在来の方法によって、例えば、特別なプライマーを使用するＰＣＲによってまたは例えば、少なくとも移植遺伝子の一部に補完するプローブを使用するサウザン法またはノーザン法分析によって、さもなければ、移植遺伝子によって暗号化されたタンパク質に対する抗体を使用するウエスタン法分析によって分析される。移植遺伝子の存在を評価するための他の方法は、限定なしに、酵素および／または免疫検定、特別なマーカー用の組織構造的な汚れ、好ましくは酵素活性等の適切な生化学的検定（アッセイ）を包含する。
【００８２】
本発明の好適な実施例によれば、このようにして発生された遺伝子導入の非ヒト哺乳動
物は、好ましくは、コンビ−ｔＴＡ−スネイルベクターをしようして上述した手順によって得ることができる。この実施例において、本発明の遺伝子導入の非ヒト哺乳動物はここではコンビ−ｔＴＡ−スネイルマウスとして言及される。
【００８３】
一般に、遺伝子導入の動物において、挿入された移植遺伝子はメンデリアン特性として伝達されそして各個体の安定したラインを確立するのは難しくない。Ｇ０個体が親系統と交配され（レトロ交配）かつ移植遺伝子がメンデリアン特性に反応を示すならば、子孫の５０％は挿入された移植遺伝子（ヘミ接合体）に対してヘミ接合である。これらの個体はｇ１子孫およびＧ１世代のヘミ接合体を通常の個体と交配して、無限に維持されることができる移植遺伝子ラインを構成する。代替的に、Ｇ１世代の個体は、それらの間で、挿入された移植遺伝子に対して２５％のヘミ接合体、５０％のヘミ接合体および移植遺伝子が降下（ディセンデンツ）の生存能力に影響を及ぼさないならば、移植遺伝子なしで、２５％を発生するように交配されることができる。
【００８４】
この発明によって提供される遺伝子導入のマウスの子孫のごとき、本発明の遺伝子導入の非ヒト哺乳動物の子孫は、それゆえ、遺伝子導入動物の適切な個体との交接によって、または遺伝子導入動物の卵子および／または精子の生体外の受精によって得られることができる。この明細書で称されるような、用語「子孫」または「遺伝子導入の非ヒト哺乳動物の子孫」は最初に形質変換された遺伝子導入の非ヒト哺乳動物の以前の世代のすべてのディセンデンツに関する。子孫は上述した方法のいずれかによって移植遺伝子の存在を検出するために分析することができる。以下で、本発明の遺伝子導入の非ヒト哺乳動物の子孫として言及される本発明の遺伝子導入の非ヒト哺乳動物の子孫は、本発明のさらに他の態様を構成する。
【００８５】
本発明は、また、本発明の遺伝子導入の非ヒト哺乳動物のまたは本発明の遺伝子導入の非ヒト哺乳動物の子孫の細胞系に、本発明の遺伝子導入の非ヒト哺乳動物のまたは本発明の遺伝子導入の非ヒト哺乳動物の子孫のプライマリー細胞に、または本発明の遺伝子導入の非ヒト哺乳動物のまたは本発明の遺伝子導入の非ヒト哺乳動物の子孫の組織サンプルに関する。前記細胞系、プライマリー細胞または組織サンプルは、そのゲノム上に本発明のＤＮＡ構造、すなわち、スネイル遺伝子を包含するＤＮＡ構造を含んでいる。特別な実施例において、前記細胞系、プライマリー細胞または組織サンプルは、ネズミに似た細胞系、プライマー細胞または組織サンプルである。
【００８６】
本発明の遺伝子導入の非ヒト哺乳動物、その子孫、この発明によって提供される細胞系、プライマリー細胞または組織サンプルは、他の用途の中で、遺伝子変則を治療および／または防止するための潜在的に有用な化合物を評価するのに有用であり、前記遺伝子変則は上皮または間葉腫瘍および／またはガンまたはＤＮＡ損傷に基づく疾患の発生と関係付けられる。
【００８７】
それゆえ、他の態様において、本発明は、上皮腫瘍および間葉腫瘍から選ばれた腫瘍の治療のための、および／またはＤＮＡ損傷に基づく疾患の治療のための潜在的に治癒効果のある化合物を識別し、または前記腫瘍またはＤＮＡ損傷に基づく疾患に罹っている被験体に施される治療の効果を評価し、または前記腫瘍またはＤＮＡ損傷に基づく疾患の発展を監視し、またはガンの広がりに影響を及ぼす、好ましくは、防止するために、本発明の遺伝子導入の非ヒト哺乳動物の、またはその子孫の使用に関する。
【００８８】
薬剤選別（スクリーニング）
本発明は、また、上皮腫瘍および間葉腫瘍から選ばれた腫瘍の予防治療および／ま
たは診断のための、および／またはＤＮＡ損傷に基づく疾患の治療、防止および／または診断のための、および／またはガンの広がりの治療、防止および／または診断のための潜在的に有用な化合物（候補化合物）の選別、識別、実証、最適化および／または評価における、本発明の遺伝子導入の非ヒト哺乳動物、その子孫または本発明の遺伝子導入の非ヒト哺乳動物からの細胞系、プライマー細胞または組織サンプルまたはその子孫の使用に関する。
【００８９】
それゆえ、１つの態様において、本発明は、上皮および間葉腫瘍またはＤＮＡ損傷に基づく疾患の治療および／または防止のための化合物を選別、調査、識別、実証、最適化、発見、開発および／または評価するためのまたは公知の薬剤または化合物の組み合わせを変更するためのまたは本発明の遺伝子導入の非ヒト哺乳動物の、またはその子孫への候補化合物の投与、および反応を監視することを含む、広がりを防止するための方法に関する。
【００９０】
上皮および間葉腫瘍および／またはガンまたはＤＮＡ損傷に基づく疾患のまたは防止および／または治療のための候補化合物の選別、調査、識別、実証、最適化、発見、開発および／または評価、または広がりの防止は、異なる投与量で、本発明の遺伝子導入の非ヒト哺乳動物に候補化合物を投与し、そして時間にわたって動物の組織構造的応答を評価することによって実施されることができる。候補化合物は、他の要因の中で、候補化合物の化学的性質に依存して、代表的には経口または非経口を介して、あらゆる在来のおよび新規な方法によって本発明の遺伝子導入の非ヒト哺乳動物に投与されることができる。幾つかの場合において、化合物の効果を高める共同因子とともに当該の化合物を投与するのが適切であるかもしれない。
【００９１】
１つの実施例において、上記方法は、スネイル遺伝子の発現またはその発現生成物（転写生成物および翻訳生成物の両方、すなわち、スネイルｍＲＮＡまたはスネイルタンパク質）のレベルを抑制または低減する化合物を識別し、実証し、最適化し、そして選択することを含んでいる。前記目的を達成するために、候補化合物は本発明の遺伝子導入の非ヒト哺乳動物またはその子孫に投与され、そのさい組織サンプル中のスネイル発現生成物のレベルは知られており、そして続いて、前記組織中のスネイル発現生成物のレベルが定量され、そしてスネイル発現生成物のレベルを抑制または低減することができる化合物が選択される。
【００９２】
スネイル発現生成物の定量化は、上皮または間葉腫瘍の浸潤および／または転移能力を測定するための方法に示された方法と同様な方法において実施される。
【００９３】
他の態様において、本発明は間葉または上皮腫瘍又はＤＮＡ損傷に基づく疾患の治療および／または防止のための化合物を選別し、調査し、識別し、実証し、最適化し、発見し、開発し、および／または評価するための、または細胞系、プライマリー細胞、または本発明の遺伝子導入の非ヒト哺乳動物、またはその子孫の組織サンプルを接触することからなる、ガンの広がりを防止するための、または応答を監視するための方法に関する。
【００９４】
上皮または間葉腫瘍および／またはガンまたはＤＮＡ損傷に基づく疾患の防止および／または治療のためのまたは広がりを防止するための候補化合物の選別、調査、識別、実証、最適化、発見、開発および／または評価は、細胞系からのまたはプライマリー細胞からのまたは本発明によって提供される組織サンプルからの細胞を含んでいる培養媒体に候補化合物を、適切な時間周期にわたって、異なる濃度で添加し、そして適切な生物化学的および／または組織構造的検定（アッセイ）を使用する時間にわたって候補化合物に対する細胞応答を評価することによって実施されることができる。代替の実施例において、外因性物質によって規定される方法において、スネイルを発現する構造により増殖される細胞が使用され得る。好適な実施例において、ここで記載されるように、コンビ−ＴＡ−スネイルベクターが使用される。適切な細胞の例はＭＥＦｓを含んでいる。時々、化合物の効果を高める共同因子とともに細胞培養媒体に当該の化合物を添加する必要があるかもしれない。
【００９５】
１つの実施例において、上記方法は、スネイル遺伝子の発現またはその発現生成物（転写生成物および翻訳生成物の両方、すなわち、スネイルｍＲＮＡまたはスネイルタンパク質）のレベルを抑制または低減する化合物を識別しかつ選択することを含んでいる。前記目的を達成するために、候補化合物は本発明の遺伝子導入の非ヒト哺乳動物またはその子孫の細胞系と、またはプライマリー細胞と、または組織サンプルと接触させられ、そのさい前記細胞系、プライマリー細胞または組織サンプル中のスネイル発現生成物のレベルは知られており、そして続いて、前記組織中のスネイル発現生成物のレベルが定量され、そしてスネイル発現生成物のレベルを抑制または低減することができる化合物が選択される。
【００９６】
スネイル発現生成物の定量化は、上皮またはリンパ管腫瘍の浸潤および／または転移能力を測定するための方法に示された方法と同様な方法において実施される。
【００９７】
化合物がスネイル発現生成物のレベルを抑制または低減するかまたは前記遺伝子の増加した発現またはスネイルたんぱく質の活性の作用を元に戻す（ｒｅｖｅｒｔ）とき、この化合物は、ガン治療のための、とくに上皮または間葉腫瘍またはガンを治療および／または防止するための候補、またはＤＮＡ損傷に基づく疾患を治療しおよび／または防止するための候補となる。
【００９８】
スネイルｍＲＮＡのレベルを抑制または低減する化合物の例示の、限定しない例は、アンチセンススネイルｍＲＮＡ、リボザイム、三重ラセン分子、小さい干渉のＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）等を含んでいる。
【００９９】
スネイルたんぱく質のレベルを抑制または低減する化合物の例示の、限定しない例は、抗体アンチ−スネイル、酵素またはスネイルたんぱく質の活性を規定するタンパク質等を含んでいる。
【０１００】
他の態様において、本発明は上皮腫瘍または間葉腫瘍から選ばれた腫瘍の、またはＤＮＡ損傷に基づく疾患の防止および／または治療のための薬剤化合物の製造においてスネイル発現生成物のレベルを抑制または低減するか、またはスネイル発現生成物の増加したレベルの作用を元に戻す化合物の使用に関する。化合物の例示の、限定しない例は、アンチセンススネイルｍＲＮＡ、リボザイム、三重ラセン分子、小さい干渉のＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、抗体アンチ−スネイル、酵素またはスネイルたんぱく質の活性を規定するタンパク質等を含んでいる。
【０１０１】
薬剤化合物
さらに、他の態様において、本発明はスネイル発現生成物のレベルを抑制または低減するかまたは１つまたはそれ以上の薬学的に受容し得る賦形剤または担体とともにスネイル発現生成物の増加したレベルの作用を元に戻す薬学的に効果的な量の化合物を含んでいる薬剤化合物に関する。賦形剤、担体および補助的物質は薬学的におよび薬理学てきに許容できねばならず、その結果それらは公式（フォーミュレーション）または調合の他の成分と結合することができかつ治療された有機体に逆作用を生じない。薬学的組成または公式は最良の投与ルートが患者の状態および投与されるべき化合物の性質に依存するけれども、経口または非経口（皮下、皮内、筋肉内または静脈内を含んでいる）投与に適する薬学的組成または公式を含んでいる。公式は単一投与の形にすることができる。公式は薬理学分野で知られる方法に従って調製される。投与すべき活性物質量は治療の詳細に応じて変化することができる。本発明の薬学組成物はまた細胞毒性剤等のごとき、ガンまたはＤＮＡ損傷に基づく疾患を治療するのに有用な１つまたはそれ以上の活性成分を含むことができる。
【０１０２】
実施例において、本発明の薬学組成物は間葉または上皮腫瘍またはＤＮＡ損傷に基づく疾患の治療および／または防止に適する薬剤化合物を含んでいるベクターを含む。前記ベクターはウイルスベクターまたは非ウイルスベクターにすることができる。前記薬剤化合物の例示の、限定しない例は、アンチセンススネイルｍＲＮＡ、リボザイム、三重ラセン分子、小さい干渉のＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、抗体アンチ−スネイル、酵素またはスネイルたんぱく質の活性を規定するタンパク質等を含んでいる。
【０１０３】
ガンのような病状を首尾よく治療および防止するための分子および薬理学的治療の開発は、ヒト治療における適用の前にあらゆる計画の治療可能性の精密な査定を許容する。
【０１０４】
キット
他の態様において、本発明は、本発明を実施例するためのキットに関する。従って、１つの実施例において、本発明のキットは適宜な包み内にスネイルタンパク質を明確に認識する抗体を含んでいる。他の実施例において、本発明のキットはスネイルに特有である配列を有する核酸を明らかに増幅するように設計されたプライマー対を含んでいる。プライマー対の配列はバイオ情報科学的手段を使用することによって対応するスネイル遺伝子の配列から決定することができる。これらのキットは上皮または間葉腫瘍の浸潤および／または転移能力、または上皮または間葉腫瘍の局部成長能力を測定するためにまたは被験体の状態（前記状態は上皮腫瘍、間葉腫瘍およびＤＮＡ損傷に基づく疾患から選ばれている）の存在を生体外で診断するために、または被験体の前記状態の段階または厳しさを測定するために、または前記状態を発生するような被験体の素因を測定するために、または前記状態を有する被験体に投与される治療の効果を監視するために、または間葉又は上皮腫瘍またはＤＮＡ損傷に基づく疾患の治療、防止および／または診断のための化合物を選別、調査、識別、発見、開発および／または評価するために使用することができる。
【０１０５】
以下の例は本発明を示しかつその範囲を限定することは考慮されるべきでない。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１０６】
マウスにおけるスネイルの段階的な発現によって誘発されるガン発生
１．材料および方法
遺伝子導入マウスの発生および治療。マウススネイル用のｃＤＮＡがコンビ−ｔＴＡベクターにクローン化された（シュルツ・エヌ、バーキ・ワイ、ラング・ワイ、セルタ・ユー、ブルースマン・エッチ、遺伝子導入マウスのテトラサイクリン系の単一工程一体化による遺伝子発現の効果的な制御。ネイチャー・バイオテクノロジー１４：４９９−５０３（１９６６））。シュルツ等によって公表されたような最初のコンビ−ｔＴＡベクターが実際に生体内および生体外両方でのｔｅｔ−オペレーターの有効な規制を許容しないことが認められたので、以下の変形が導入された、すなわち、１）ｔｅｔＯ−ルシフェラーゼカセットが前記最初のコンビ−ｔＴＡベクターから除去され、そして２）ポリ−Ａ配列、ｔｅｔＯ最小プロモーター、ＴＡＴＡボックス配列、スネイル遺伝子、さらに他の２つのポリ−Ａ配列、アンピシリン抵抗遺伝子および第４のポリ−Ａ配列を含んでいるカセットが、シュルツ等に開示された最初のベクターのアンピシリン抵抗遺伝子（代替的に、Ａｍｐ．ｂｌａ，またはベータ−ラクタマーゼ遺伝子として言及される）が導入された。
【０１０７】
顕微注射用の直線ＤＮＡ断片がＮｏｔｌ消化によって得られそしてＣＢＡｘＣ５７ＢＬ／６Ｊ受精した卵子に注入された（マウス胚を操作、ラボラトリー・マウアル、第２版。ホーガン、ベディントン、コスタンチン、レーシー。ＣＳＨＬ  ＰＲＥＳＳ，１９９４）。遺伝子導入マウスは以前に記載されたようなＥｃｏＲＩ消化後尻尾小片ＤＮＡのサウザン分析によって識別された（ガルシア−ヘルナンデス等、１９９７。タグ付け後ネズミに似た造血の再構成およびレトロウイルスに形質導入を生じさせられた骨髄細胞の選択。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４，１３２３９−１３２４４）。移植遺伝子の検出はマウススネイルｃＤＮＡを使用して実施された。始祖マウスは共通の同質遺伝子の遺伝子導入マウスを確立するために５世代のＣ５７ＢＬ６マウスに交配された。同様な表現型の特徴が発生されたコンビ−ｔＴＡ−スネイル移植遺伝子系の両方に関するすべての検定（アッセイ）において見られた。年令５〜６週のマウスがセシウム源を使用して照射されかつ殺菌された食物および酸性化された殺菌水に関してマイクロアイゾレーター（小型アイゾレーター）内に維持された。
【０１０８】
組織構造的分析。この研究に包含されるマウスは標準の検死を受けた。すべての主要な器官は切除顕微鏡により検査され、そして各器官のサンプルはパラフィンで処理され、切断されかつ組織構造的に検査された。すべての組織サンプルは病理学者によって切除されたサンプルの同質のかつ生存できる部分から採取されかつ２〜５分内に固定された。比較研究のために、年令の整合したマウスが使用された（野生型またはテトラサイクリンの連続存在によるコンビ−スネイルマウス）。
【０１０９】
細胞培養。使用される細胞系はＢａ／Ｆ３細胞（パラシオスおよびシュタインメッツ、１９８５．Ｂ−２２０表面抗原を発現し、生殖系列形状にＩｇ遺伝子を含みそして生体内でＢ−リンホサイトを発生するＩＬ−３依存マウスクローン。細胞４１：７２７）を包含する。細胞は１０％の胎児の子牛血漿（ＦＣＳ）で補充されたダルベッコの変性されたイーグルの媒体（ＤＭＥＭ）（ボーリンガー・インゲルハイム）内に維持された。要求されるとき、１０％のＷＥＨＩ−３Ｂ調節媒体がＩＬ−３源として添加された。
【０１１０】
細胞トランスフェクションおよび細胞生存検定（生き残りアッセイ）。Ｂａ／Ｆ３細胞は２０μｇの各コンビ−ｔＴＡ−スネイルにより電気穿孔法（エレクトロポーレイション）（９６０μＦ，２２０Ｖ）によってトランスフェクション（核酸を細胞に取り込み増殖）された。細胞（Ｂａ／Ｆ３＋コンビ−ｔＴＡ−スネイル）のネオマイシン抗性プールがテトラサイクリン（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在および不存在におけるコンビ−ｔＴＡ−スネイル発現に関してＲＴ−ＰＣＲによって分析された。これらの細胞はテトラサイクリンの不存在において成長されるときＩＬ−３使用中止に対して抵抗した。細胞はＩＬ−３使用中止に対する抵抗のために選別されそして細胞生存性がトリパンブルー排除によって測定された。
【０１１１】
ＭＥＦｓの培養。異型ｐ５３＋／−（ジャクソンラボラトリーズ）およびｐ２１＋／−（エム・セラノによって提供された）マウス（マーチン−カバレロ等、２００４.オンコジーン２３：８２３１−８２３７）が野生型（ｗｔ）およびゼロｐ５３−／−およびｐ２１−／−胚をそれぞれ得るように交配された。プライマリー胚繊維芽細胞が１３．５ｄ．ｐ．ｃ（交接後数日）の胚から採取された。１３．５日の胚の頭部および器官が切断され；胎児の組織がリン酸−緩衝整理食塩水（ＰＢＳ）内で濯がれ、細分され、かつＰＢＳ中で２度濯がれた。胎児組織はトリプシン／ＥＤＴＡ（エチルジアミンテトラアセテート酸）により処理され、３７°Ｃで３０分間培養されそして続いて媒体中で解離された。大きな組織凝集塊の除去後、残っている細胞は１７５ｃｍ２ フラスコ内で平板培養された。４８時間後、融合性の培養が落ち着かされた。これらの細胞は継代接種（パッセージ）１ＭＥＦｓ（マウス胚繊維芽細胞）であるとして検討された。連続培養のために、ＭＥＦ培養は１：３に分割された。ＭＥＦｓは３７°Ｃで１０％の熱−不活性のＦＣＳ（ボーリンガー・インゲルハイム）で補充されたダルベッコの変性されたイーグルの媒体（ＤＭＥＭ；ボーリンガー・インゲルハイム）内で成長させられた。すべての細胞はマイコプラズマ（マイコアラート（商標）マイコプラズマ検出キット、キャンブレックス）に関して陰性であった。
【０１１２】
ＤＮＡ−損傷実験。細胞は１０ｃｍの皿ごとに１０６細胞で平板培養され、そしてその日後、それらは０．２μｇ／ｍｌのドキソルビシン（シグマ）で処理された。１２時間後、細胞はＲＮＡ調製のために集められた。
【０１１３】
低分子量ＤＮＡ分析。低分子量ＤＮＡが以下のように分離された。細胞は１．５ｍｌの培養液中に集められかつ１，５００ｒｐｍ（４００ｘｇ）で１分間微小遠心分離（マイクロセントリフュージ）され、そしてペレットが３００μｌのプロテイナーゼＫ緩衝液中で懸濁された。５５°Ｃで１昼夜培養後、ＤＮＡはエタノール沈殿され、５０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ  Ａを含有するｐＨ７．４の２００μｌのＴＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ）中に懸濁され、そして３７°Ｃで２時間培養された。ＤＮＡがフェノールおよびクロロフォルムにより抽出されかつエタノールにより沈殿された。ＤＮＡ（２μｇ）のアリコートがａ３２−ｄＣＴＰにより終了標識化されそして２％アガロースゲルで電気泳動された。電気泳動後、ゲルはハイボンド−Ｎ（アメルシャム）上にブロットされそして−７０°Ｃで２時間放射能写真撮影された。
【０１１４】
逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）およびリアルタイムＰＣＲ定量化。マウス細胞系およびマウスのコンビ−ｔＴＡ−スネイルおよび外因性スネイルの発現を分析するために、ＲＴ−ＰＣＲが製造者のプロトコルに従って、５０ｎｇの任意のヘキサマー、３μｇの合計ＲＮＡ、および２００ユニットのスーパースクリプトＩＩＲＮａｓｅＨ−逆トランスクリプターゼ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を含有する２０ｌの反応中で実施された。特有のプライマーの配列は以下のとおりである。
コンビ−ポリＡ−Ｂ１：５´−ＴＴＧＡＧＴＧＣＡＴＴＣＴＡＧＴＴＧＴＧ−３´，
ｍＳｎａｉｌＦ：５´−ＣＡＧＣＴＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＴＣＧＧＴ−３´，
ｍＳｎａｉｌＢ：５´−ＧＣＧＡＧＧＧＣＣＴＣＣＧＧＡＧＣＡ−３´．
【０１１５】
β−アクチンＲＮＡの増幅が各ＲＮＡサンプルの品質を査定するための対照として役立った。コンビ−ｔＴＡ−スネイルおよび外因性スネイルを増幅するのに使用されたＰＣＲ条件は、以下のとおり、すなわち、１分間９０°Ｃ、１分間５６°Ｃ、そして２分間７２°Ｃをそれぞれ、コンビ−ｔＴＡ−スネイルに関しては４０サイクルそして外因性スネイルに関しては３０サイクルであった。ＰＣＲ生成物は特有のないプログラムプローブにより交配によって確認された。リアルタイム定量ＰＣＲはコンビ−ｔＴＡ−スネイルおよび外因性スネイル両方の定量化のために実施された。蛍光性遺伝子（フルオロジェニック）ＰＣＲはＴａｑＭａｎＰＣＲコア・リエージェント・キット（ＰＥバイオシステムズ）を使用して５０μｌの反応量に設定された。ｃＤＮＡ増幅はＰＥアプライド・バイオシステムズ５７００シーケンス・デテクターによって９６穴反応プレートフォーマット中で実施された。熱循環は９５°Ｃで１０分の最初の変性工程により開始された。次の熱プロフィールは１５秒間９０°Ｃ、３０秒間５６°Ｃ、そして１分間７２°Ｃの４０サイクルであった。多数の陰性の水ブランクが試験されかつ較正曲線が各分析と平行に測定された。β−アクチン外因性対照（ＰＥバイオシステム）が各サンプル中の合計ｃＤＮＡにコンビ−ｔＴＡ−スネイルおよび外因性スネイルの両方を関連付けるように包含された。
【０１１６】
表現型分析。ファルミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）からの以下のアンチ−マウス単クローン抗体：ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０，ＩｇＭ，Ｍａｃｌ，Ｇｒ−１，ＣＤ４およびＣＤ８がサイトメトリー汚染のために紙葉された。ありきたりの技術によって得られることなる組織サンプルからの単一細胞懸濁液が、Ｆｃレセプターを介しての結合を阻止するために純化されたアンチ−マウスＣＤ３２／ＣＤ１６（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）によりおよびそれぞれ、室温または４°Ｃで異なる抗体の適切な希釈により培養された。サンプルはＰＢＳで２度洗浄されかつＰＢＳ中に再び懸濁された。死亡細胞はヨウ化プロピジウム汚染（ｓｔａｉｎｉｎｇ）により除外された。サンプルおよびデータはセルクエスト・ソフトウエア（ベクトン・ディキンソン）を使用してＦＡＣＳにおいて分析された。
【０１１７】
腫瘍発生検定（アッセイ）。種々のコンビ−ｔＴＡ−スネイルガンおよびＭＥＦｓの腫瘍発生を試験するために、４−６週年令の無胸腺の（ヌード）オスマウスが２００μｌのＰＢＳ中に再び懸濁された１０６細胞により両側で皮下に注入された。動物は週ごとに腫瘍形成について検査された。
【０１１８】
ルシフェラーゼ検定。スネイルのほぼ４９３５−ｂｐ上流プロモーター配列がスネイル遺伝子（ゲノム・システムズ）を含有するＰ１クローンから分離されかつルシフェラーゼ伝達体プラスミドｐＧＬ３−ベーシック（プロメガ）にクローン化されそしてＰＳＮＡＩＬ−４９３５と名づけられた。ヒトＭＹＢ  ｃＤＮＡがＲＴ−ＰＣＲによって発生されかつヌクレオチド配列がシーケンシングにより実証されそしてｃＤＮＡが発現プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳにクローン化された（ミズシマ・エス、およびナガタ・エス、１９９０．核酸リサーチ、１８：５３２２）。伝達体アッセイに関して、Ｕ２ＯＳ細胞（ヤオ・エフおよびシェーファー、ＰＡ．１９９５。Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６９：６２４９−６２５８）がレニラ・ルシフェラーゼに対する標準化によりデュアル−ルシフェラーゼ（プロメガ）を使用してトランスフェクションされそして平均±標準エラーが少なくとも３つのデータ点から測定された。Ｕ２ＯＳ細胞はＦＣＳで補充されたダルベッコの変性されたイーグルの媒体中に維持された。
【０１１９】
ノーザン法分析。両方法とも未処理のかつ５Ｇｙ−照射された野生型およびｐ５３−／−マウスからの異なるＮＥＤｓおよび脾臓組織の合計の細胞質のＲＮＡがグリオキシレート化されかつ１０ｍＭＮＡ２ ＨＰＯ４ 緩衝液（ｐＨ７．０）中で１．４％アガロースゲルに分別された。電気泳動後、ゲルは、ＵＶ−クロスリンクされた、ハイボンド−Ｎ（アメルシャム）上でブロットされ、そして３ ２ Ｐ−標識化されたマウススネイルｃＤＮＡプローブに交配された。ローディングはＡＲＰＰ−ＰＯプローブ（セージ、ジェイ、等、２０００．Ｇｅｎｓ  Ｄｅｖ．１４：３０３７−３０５０）によりフィルターを再プローブすることによって監視された。
【０１２０】
ウエスタン法分析。骨髄細胞（ＢＭ）が大腿骨の骨髄キャビティをフラッシングすることによって集められた。ウエスタン法検定がレーンごとに１×１０７ ＢＭ細胞からの抽出物を使用して行なわれた。抽出物はブランドフォード分析（バイオ−ラッドラボラトリーズ社、メルビル、ＮＹ，ＵＳＡ）によるタンパク質含量およびコーマシー（Ｃｏｏｍｍａｓｉｅ）ブルーゲル汚染に関して標準化された。ライセート（溶菌液）が１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで実施されかつＰＶＤＦ（ポリビニリデンディフルオライド）に転写された。阻止後、薄膜が以下のプライマリー抗体によりプローブされ：マウスｐ５３は抗体ＦＬ−３９３（サンタクルス）を使用して検出され、そして多クローン抗体Ｃ−１１（サンタクルス）がアクチンを検出するのに使用された。反応帯域がＥＣＬシステム（アメルシャム）により検出された。
【０１２１】
移動アッセイ。トランスフェクタント細胞の移動性／運動性挙動が傷付けられたアッセイ（試薬）によって分析された。融合性培養の単層がギルソンピペット先端で軽く引っ掻かれそして、分離された細胞を除去するように洗浄した後、培養は以前に記載されたように適宜の間隔で観察された（カノ等、２０００．転写因子スネイルはＥ−カドヘリンを抑制することによって上皮−間葉遷移を制御する。ネイチャー・セル・バイオロジー２：７６−８３）。
【０１２２】
ＩＩ．結果
コンビ−ｔＴＡ−スネイルマウスの誘導
ガン発生におけるスネイル発現のアップレギュレーションの作用を測定するために、スネイル遺伝子の発現が外因的に規制され得る、コンビ−ｔＴＡ−システムを使用する、遺伝と導入マウスが発生された。トランスアクティベーターおよび単一プラスミド上で遺伝子発現ユニットを駆動するｔｅｔ−オペレーター最小プロモーターを有する、このシステムは、染色体遺伝子座で直接ｃｉｓ−形状における等しい複写数においてトランスアクティベーターおよび伝達体遺伝子ユニットの一体化を保証しかつ繁殖の間中制御要素の遺伝子的分離を阻止する。
【０１２３】
しかしながら、シュルツ等によって最初に記載されたようなコンビ−ｔＴＡ−ベクターを使用する初期の実験は移植遺伝子の厳しい規制が実際にこの初期のベクターを使用することができないことを示した。これは、移植遺伝子としてＢＣＲ−ＡＢＬｐ １ ９ ０ を使用する前記初期のベクターによる最初の実験で明らかとなった。ＢＣＲ−ＡＢＬｐ １ ９ ０ はドキシサイクリン（テトラサイクリン派生物）の存在において通常ダウンレギュレーションされる。しかしながら、シュルツ等によって記載されたような初期のベクターを使用すると、ＢＣＲ−ＡＢＬｐ １ ９ ０ の発現はドキシサイクリンの存在においてさらに観察され、発現を許容すべきでない状態下でも同様に移植遺伝子の漏出する発現を示している。この作用は、「オリジナルベクター」と標識化された、図１Ｆのノーザン法の離れた右側で２つのレーンにおいて示されている。移植遺伝子の規制は、座および方法によりかつ図１Ａおよび図１Ｂにおけるコンビ−ｔＴＡ−スネイル構造に関して記載された追加の変更が導入されたときだけ可能であった。簡単に言えば、所望の移植遺伝子（例えば、スネイルまたはＢＣＲ−ＡＢＬｐ １ ９ ０ 遺伝子、またはあらゆる他の所望の「遺伝子変更」）とともに追加の特徴を含んでいるカセットが、初期のベクターのｔｅｔＯ−ルシフェラーゼカセットを置き換えるために、初期のベクターのｂｌａ−遺伝子に導入され、生体内及びせいた請求項化成の両方において移植遺伝子の厳しい規制が可能となったことが認められた。かくして、図１Ａおよび図１Ｂにおいて本発明のコンビ−ｔＴＡ−スネイル構造に関して示された順序および配向において、ポリ−Ａ配列、ｔｅｔＯプロモーター、ＴＡＴＡボックス配列、所望の移植遺伝子（例えば、スネイルまたはＢＣＲ−ＡＢＬｐ １ ９ ０ 遺伝子、またはあらゆる他の所望の「遺伝子変更」）、さらに、２つのポリ−Ａ配列、アンピシリン抵抗遺伝子、および第４のポリ−Ａ配列を含んでいるカセットによって所期のベクターのｔｅｔＯ−ルシフェラーゼカセットを置き換える必要があることが認められた。図１は、移植遺伝子の厳しい規制が、前記カセットが移植遺伝子としてＢＣＲ−ＡＢＬｐ １ ９ ０ の例において、所期のベクターのｔｅｔＯ−ルシフェラーゼカセットに置き換えるのに使用されるとき細胞モデルにおいて可能となったことを示している。それゆえ、コンビ−ｔＴＡ−スネイルベクターの構成において、ｍＳＮＡＩＬ遺伝子が、図１Ａおよび図１Ｂ、コンビ−ｔＴＡに示されるような、上述した追加の特徴とともにｔｅｔＯ最小プロモーターの制御下でコンビ−ｔＴＡベクターに挿入された。
【０１２４】
コンビ−ｔＴＡベクターのスネイル遺伝子の発現の規制はネズミに似た造血前駆物質Ｂａ／Ｆ３細胞系を使用して、細胞システムにおいて分析された。テトラサイクリンの不存在において、ｔｅｔ−抑制体タンパク質（ウイルスＶＰ１６トランスアクティベータードメインに融合される）が巧みに処理されたｔｅｔＯ最小プロモーターに結合しそしてスネイル転写（コンビ−ｔＴＡ−スネイル）を活性化する。テトラサイクリンの存在において、結合は無効にされかつプロモーターは抑圧された（図１Ａ）。コンビ−ｔＴＡ−スネイルの発現はテトラサイクリンの存在または不存在において２日間培養した後トランスフェクシヨンされたＢａ／Ｆ３細胞において測定された。コンビ−ｔＴＡ−スネイルはテトラサイクリンなしのＢａ／Ｆ３細胞において検出されるがテトラサイクリン（２０ｎｇ／ｍｌ）で培養された細胞においてではない。生体外研究はスネイルが生き残り因子の使用中止によって誘発される細胞死に対する抵抗を付与することを以前に示した。コンビ−ｔＴＡ−スネイルの発現の生理的関連性はＩＬ−３使用中止後２４時間コンビ−ｔＴＡ−スネイルを発現するＢａ／Ｆ３細胞の生き残りを検定することによって生体外で確認された。細胞成長についてのスネイル発現の効果はアポトーシスのハーフマークである、アガロースゲル中のＤＮＡ段階（ラダー）の形成に導いているインターヌクレオゾマルＤＮＡ開裂を分析することによって評価された。通常、スネイル発現はＩＬ−３使用中止に続いているアポトーシスからＢａ／Ｆ３細胞を保護し（図１Ｃ−図１Ｄ）そしてコンビ−ｔＴＡ−スネイル発現のレベルは細胞死を防止するためにＢａ／Ｆ３細胞において十分である。ＩＬ−３使用中止に対する感度はテトラサイクリンの追加によって回復させられた（図１Ｃ−図１Ｄ）。
【０１２５】
コンビ−ｔＴＡ−スネイルに関する３つの始祖移植遺伝子系（５９Ａ，５９Ｂおよび５９Ｃ）が発生されそして２つの始祖系、５９Ａおよび５９Ｂは移植遺伝子の生殖系列伝送を示した（表１）。両系において、コンビ−ｔＴＡ−スネイル発現が分析されたすべての組織に検出された（図２Ｂ）。コンビ−ｔＴＡ−スネイル発現は検出し得ない値への発現の抑制がマウスが彼等の飲料水にテトラサイクリンが補給されるとき確認されたのでトランスアクティベーションの結果であった（以下で、図６Ａ参照）。
【０１２６】
表１
コンビ−ｔＴＡ−スネイルマウスにおける腫瘍発生（オンセット）
の発生率および年令
移植遺伝子系  死体解剖された  腫瘍を有する    腫瘍発生  腫瘍の型（％）
マウスａ        マウス（％）ｂ  の月年令
ＩＳ５９Ａ        ３４        ３４（１００）  ７−１１  ＡＭＬ（４０％）
リンパ腫（５０％）
肺ガン（１２％）
肝臓ガン（１０％）
生殖細胞過
形成（１０％）
ＩＳ５９Ｂ        ２９        ２９（１００）  ５−１０  ＡＭＬ（３５％）
リンパ腫（４０％）
肺ガン（１５％）
肝臓ガン（１５％）
生殖細胞過
形成（１５％）
ＩＳ５９ＣＣ        １          １（ＮＡ）      １      白血病                                                          
（ａ ）ガンの期間中または後のマウスの数、（ｂ ）ガンで死んだマウスの数および腫瘍発生の百分率、（ｃ ）確率されない血統。
【０１２７】
コンビ−ｔＴＡ−スネイルマウスは形態の異常性を示さない
コンビ−ｔＴＡ−スネイルマウスの同令集団が生体内でスネイル発現の効果を分析するために発生された。合計で６３匹の遺伝子導入動物（３４匹のマウスが系５９Ａにかつ２９匹のマウスが系５９Ｂに対応した）が詳細に分析されそして同様な表現型の特徴が両方の系に見られた。コンビ−ｔＴＡ−スネイルマウスは明白な形態の異常性なしに生きて生まれ、そして子孫に明らかな差異なく十分に受胎した。範囲の広い組織構造的分析を含んでいる、小さいマウスの検視解剖は、コンビ−ｔＴＡ−スネイルマウスの腎臓、皮膚、肝臓、脳、肺臓または胃腸管に異常性がないことを明らかにし、スネイルの過発現のこのレベルが通常の胚発生を混乱させないことを示している。
【０１２８】
コンビ−ｔＴＡ−スネイルマウスにおけるガン発生。
本発明者等は、さらに、コンビ−ｔＴＡ−スネイルマウスがガンを発生するかどうか分析した。すべてのコンビ−ｔＴＡ−スネイルマウスはほぼ５−７ヶ月の年令から前に向かって（表１）、犠牲の前に、減少した物理的活性、速呼吸、ピロ−エレクション、震えおよび抑制した体重損失を含んだ臨床的徴候により良くなかった。ガンは間葉および上皮起源の両方からであった（表１）。間葉ガンは急性白血病（図４Ａ）及び間葉（図４Ｂ）であった。コンビ−ｔＴＡ−スネイルのユビキタス発現によるといえども、分析されたコンビ−ｔＴＡ−スネイルマウスのいずれにも見られなかった。上皮腫瘍細胞の詳細な分析は、肺ガン（図５Ａ）、未発達細胞過形成（図５Ｂ）、および肝臓ガン（図５Ｃ）のような診断を確立した。動物あたりの１つの型のガンは、それらの２０−２５％がまた造血腫瘍形成を発生するけれども、検出された。組織構造的検査はガンの広がりを示すことができなかった。しかしながら、組織構造的分析は造血および非造血組織のマークされた白血病細胞浸透を表した。これらの白血病細胞は腎臓、肝臓および肺臓に優先的に浸透する（図４Ｃ−Ｅ）。白血病マウスからの末梢血単核細胞は、特有の抗体の組み合わせを使用するフローサイトメトリーによって識別された。これらの研究は急性骨髄白血病のような急性白血病を定義した（図４Ａ）。
【０１２９】
コンビ−ｔＴＡ−スネイルマウスの悪性潜在能力を試験するために、コンビ−ｔＴＡ−スネイル白血病からの１×１０６ の末梢血ブラスト（攻撃）細胞が１２匹の４０日年令のヌードマウスに皮下注射された。１２匹のすべてのマウスが移植の４−７週内に進行性の主要を発生した。ヌードマウス中の腫瘍は最初の白血病に組織構造的に一致した。全体的に見て、これのデータは、スネイルがガン発生を誘起し得ることを示している。
【０１３０】
スネイルの生体内抑制はガン発生を阻止しない。
上記結果は、スネイル発現がガン発生を誘発するのに十分であるという観察を支持している。それゆえ、スネイル過発現の無効はスネイル発現細胞の成長および／または広がりを中止するかまたは低減するために期待されるかもしれない。これを査定するために、４０匹の白血病コンビ−ｔＴＡ−スネイルマウスがテトラサイクリン（２週間にわたって飲料水中に４ｇ／ｌ、外因性スネイルの抑制に十分な量）の投与前にまたは投与に続いてフローサイトメトリーによって疾患進行に関して評価された（図６Ａ）。コンビ−ｔＴＡ−スネイルマウスのいずれも、完全なコンビ−ｔＴＡ−スネイル抑制にも拘わらず、白血病表現型の改良を呈したものはなかった：フローサイトメトリー分析は組織構造上に明らかな非造血組織の浸透による末梢血中の白血病細胞の持続性を識別した（図６Ｃ）。かくして、これらの結果はスネイルによって誘発された変更が不可逆であることを示す。
【０１３１】
制限された量のスネイルｍＲＮＡがコンビ−ｔＴＡ−スネイルＭＥＦｓおよびマウスに発現された。
コンビ−ｔＴＡ−スネイルマウスのガン発生に基礎をなしている分子基礎を分析するために、脾臓および外因性スネイルが発現される、コンビ−ｔＴＡ−スネイル胚から引き出されたプライマリーマウス胚繊維芽（ＭＥＦｓ）中の移植遺伝子で符号化されたスネイルの発現が試験された（図７Ａ）。外因性スネイルに関連してマウスの脾臓およびＭＥＦｓ中の移植遺伝子制限された量のスネイルで符号化されたスネイルの発現レベルは野生型レベルの２０％に増加された（図７Ａ）。制限された量のスネイルが試験されたすべての組織中に発現された。実際に、移植遺伝子で符号化されたスネイルの発現はコンビ−ｔＴＡ−スネイルマウスの上皮に（図２Ｂ）そしてコンビ−ｔＴＡ−スネイルマウスに現れているガン（図７Ｂ）に存在した。かくして、これらのマウスは低レベルのスネイルの重要性を研究するための理想的な生体内モデルである。結論において、我々の遺伝子研究は、初めに、ガンマウス発生において必須のＥＭＴ規制体（レギュレーター）の適切な発現レベルに関しての重要な役割に向いている。
【０１３２】
コンビ−ｔＴＡ−スネイルはＭＥＦｓ中に発ガン性であるが移動性でない表現型を誘起する。
上記の結果は、コンビ−ｔＴＡ−スネイルがコンビ−ｔＴＡ−スネイルマウス中のＥＭＴを変更するのに十分なレベルで存在しないことを示唆している。コンビ−ｔＴＡ−スネイルＭＥＦｓの移動性特性を研究するために、傷付けられた培養組織アッセイが分析され、その場合にコンビ−ｔＴＡ−スネイルＭＥＦｓはＭＥＦｓを制御するように同様な移動性の挙動を示した。傷付けられた表面のおよそ８０％が、傷が作られた後１５時間で対照およびコンビ−ｔＴＡ−スネイルＭＥＦｓの両方によってクローン化された（図８Ａ）。コンビ−ｔＴＡ−スネイルＭＥＦｓの腫瘍形成特性を試験するために、１×１０６ の対照およびコンビ−ｔＴＡ−スネイル細胞が４０日年令のヌードマウスに皮下注射された。対照ＭＥＦｓにより注射されたマウスは腫瘍を発生しなかった（１０のうち０）。しかしながら、コンビ−ｔＴＡ−スネイルＭＥＦｓは注入場所で移植の５−９週間内に腫瘍を生起した（１０のうち１０）。これらの結果は、低レベルの転写因子スネイルがＭＥＦｓ中に腫瘍形成であるが移動性でない表現型を誘発することを示している。実際に、転移はガンを持っているコンビ−ｔＴＡ−スネイルマウスに観察された。かくして、移植遺伝子で符号化されたスネイルは、コンビ−ｔＴＡ−スネイルマウスが形態異常性を示さないのはなぜかを説明できる、コンビ−スネイルマウス中のＥＭＴを変更するのに十分なレベルで存在しないかもしれないが、この発現レベルはガンを発生するのに十分であった。
【０１３３】
γ照射に応答してコンビ−ｔＴＡ−スネイルマウスの放射線防護の潜在性。
γ照射によって誘発されるＤＮＡ損傷に応答してコンビ−ｔＴＡ−スネイルの生体外の放射線防護の潜在性を調査するために、コンビ−ｔＴＡ−スネイルおよび対照マウスが９５０ラッド（１ラッド＝０．０１Ｇｙ）で照射された。図９Ａに示されるように、コンビ−ｔＴＡ−スネイルマウスは対照マウスよる長く生き残る。これらの結果はコンビ−ｔＴＡ−スネイル発現が増加した放射線防護を結果として生じることを示している。
【０１３４】
イオン化照射への暴露がｐ５３の細胞間レベルの増加を生じることが知られ、かつ生体外の研究は、また、スネイルおよびスラッグ（ＳＬＵＧ）の変形の過形成がｐ５３のレベルを増加することによって遺伝子毒のストレスに対する応答を変化させることを示した。コンビ−ｔＴＡ−スネイルの放射線防護の潜在性がｐ５３活性による干渉に基礎が置かれるかどうかを調査するために、異なる時間でｐ５３タンパク質レベルが、γ照射によって誘発されたＤＮＡ損傷が測定された後コンビ−ｔＴＡ−スネイルおよび対照マウスの両方から引き出された骨髄細胞に向いている（図９Ｂ）。対照およびコンビ−ｔＴＡ−スネイル細胞の両方におけるｐ５３の活性は同様であり（図９Ｂ）、ＤＮＡ損傷に応答してのｐ５３規制がコンビ−ｔＴＡ−スネイル細胞に左右されないことを示している。
【０１３５】
ＤＮＡ損傷はスネイルｍＲＮＡ発現を規制する。
上述の結果は、スネイル発現がＤＮＡ損傷から細胞を保護することを示唆した。これはＤＮＡ損傷がスネイルｍＲＮＡ発現を規制するかどうかを調査するように発明者等を導いた。ＭＥＦｓは、スネイルがＤＮＡ損傷−仲介の細胞活性に応答して機能的役割を有するかどうかを測定するための生体外研究用のモデルとして使用された（図１０Ａ）。異なる遺伝子型のＭＥＦｓが科学療法剤、ドキソルビシンにより処理され、同時にＤＮＡ損傷を生じる。ｐ５３ターゲット遺伝子ｐ２１は現実の対照として使用された。図１０Ａに示されるように、ＤＮＡ損傷はｐ５３−独自の方法においてＭＥＦｓ中のスネイルの発現を抑制する。この結果を確認するために、ヒトスネイル遺伝子のプロモーター領域のほぼ４，９３５塩基対がルシフェラーゼ伝達体遺伝子（ｐＧＬ３−ベーシック）の上流でクローン化された。スネイルプロモーターに存在するＤＮＡ配列から転写を活性化するためのｐ５３の能力を直接査定するために、ヒトｐ５３ｃＤＮＡ（ノリス・ピーエス、ハース・エム、蛍光ｐ５３ＧＦＰ溶融タンパク質が野生型ｐ５３の特性を維持しながら哺乳動物細胞中の検出を容易にする。オンコジーン。１９９７；１５（１８）：２２４１−２２４７）がスネイルプロモーターを含んでいる伝達体ベクターとともにＵ２ＯＳ細胞に共同でトランスフェクションされた。ｐ５３の共同発現は空のベクターによる活性に比してルシフェラーゼ活性の増加を結果として生じない（図１０Ｂ）。これらの結果は、さらに、ｐ５３がスネイルプロモーターを規制しないことを示している。
【０１３６】
生体内のＤＮＡ損傷に続いているスネイル発現のｐ５３−独自の規制が試験された。野生型およびｐ５３−／−マウスがγ照射の５Ｇｙにより処理されそして脾臓中のスネイルの発現がノーザン方によって分析された（図１０Ｃ）。照射後６時間、スネイルの発現は、対照およびｐ５３−／−マウスの両方でダウンレギュレーションされた。それゆえ、スネイルの発現はＤＮＡ損傷に続いて生体内で同様に変性された。全体としてみれば、上記の結果はガン発生のためにスネイルの臨界レベルの要求を示しそしてスネイルの規制失敗がコンビ−ｔＴＡ−スネイルマウスにおいてガン発生を導くことを示している。
【０１３７】
ｐ５３−／−マウスとコンビ−ｔＴＡ−スネイルマウスとの間の異種交配。
ｐ５３に欠陥を有するマウス（また、「ｐ５３ゼロ（ヌル）マウス」または「ｐ５３−／−マウス」と名づけられる）が、コンビ−ｔＴＡ−スネイル−ｐ５３−／−マウスを産出するように、コンビ−ｔＴＡ−スネイルマウスと交配された。これらのマウスは２−３ヶ月の年令で非常に大きな胸腺リンパ腫を発生することが認められた（図１１）。さらに、これらの腫瘍が肺臓、心臓、隔膜空間に浸透しかつ本質的に切除不能であることが認められた。リンパ腫、肺腫瘍、および脂腺腫サンプルの組織構造的な調製の顕微鏡写真が図１２に示される。
【０１３８】
意外にも、コンビ−ｔＴＡ−スネイル−ｐ５３−／−マウスがヒトガンを同様にかつとくに悪性のヒトガンの広がりおよび転移に関連して再生した。前記コンビ−ｔＴＡ−スネイル−ｐ５３−／−マウスはかくしてヒロガリ制御をターゲットにしている療法を開発するための理想的なモデルを示している。
【０１３９】
検討
本発明は、ヒトガン発生に対するスネイルの関連を理解しようとするためにマウス中のテトラサイクリンによる遺伝子発現の誘導および厳密な制御を許容するような最初の２成分のテトラサイクリンシステムの規制および発現要素を含んでいるシュルツ等（１９９６）の単一プラスミドシステムについて改良した。生体外研究は、スネイルが生き残り因子の使用中止によって誘発される細胞死に対する抵抗を付与することを示した（ベガ等、２００４）。コンビ−ｔＴＡ−スネイル抑制の組織構造的関連はＩＬ−３使用中止後コンビ−ｔＴＡ−スネイルを発現するＢａ／Ｆ３細胞の生き残りを検定することによって生体外で確認された。スネイル発現マウスの分析は、これらのマウスがガン、主として造血性腫瘍を発生することを識別した。スネイルによって付与された細胞死に対する抵抗はガン発生に対して重要な細胞移動に対する選択的な利点を提供すると思われる（ベガ等、２００４）。かくして、コンビ−ｔＴＡ−スネイルマウスに観察された造血性ガンは形質変換がそれらの通常の環境外で未分化の細胞を成長させる遺伝子変化に依存することを生体内で示している。従って、これらの結果はスネイル発現が細胞移動を容易にすることの証拠を提供する。スネイルによって付与され、一方生体外で可逆である生き残り（図１）は生体内でかかる制御を逃れることができる。
【０１４０】
マウスにおいて、スネイル遺伝子はＥＭＴ、上皮固体腫瘍における浸潤表現型の獲得に対する重要な通路（パスウエイ）の誘発において以前に影響を与えられた（バトル等、２０００；カノ等、２０００）。本発明に関連して得られたデータは、上皮変更または非浸潤ガンがコンビ−ｔＴＡ−スネイルマウスに発生しなかったので、この観察を支持しなかった。しかしながら、コンビ−ｔＴＡ−スネイルマウスは限定された量のスネイルを発現した。かくして、成長因子使用中止（図１）により引き出された細胞死に対する抵抗を促進するのに十分なレベルにおいて存在するけれども、移植遺伝子で符号化されたスネイルはコンビ−ｔＴＡ−スネイルマウス中にＥＭＴを変更するのに十分なレベルで存在しないかも知れない。発現のこのレベルは、しかしながら、ガンを誘発するには十分であった。スネイルは通常の発生を達成するように一定のしきい値レベル以上に保持されねばならないと思われる。この解釈と一致して、コンビ−ｔＴＡ−スネイルはＭＥＦｓ中に腫瘍形成ではあるが移動性でない表現型を誘起した。これらの発見はスネイルが、広がりが見分けることができる前に腫瘍形成を要求しないことを示す。しかしながら、これらの結果は上皮細胞が以前の腫瘍変更を示しまたは蓄積する文脈においてガン発生におけるスネイルの役割を除外することができない。
【０１４１】
本発明者等の結果は、「増加した」スネイル発現が高い頻度によりマウス中にガンを誘起することを示している。これらの結果は、スネイル発現が遺伝子不安定性の固有の、基礎的なレベルの結果として遺伝子変更による死滅から細胞を保護していたことを示唆する。本発明者等は、しかしながら、コンビ−ｔＴＡ−スネイル発現が増大した放射能防護を結果として生じることをさらに示した。かくして、スネイルの構成的活性は腫瘍−ターゲット細胞に放射性抵抗性特性を付与することができた。これらの結果と協力して、本発明者等は、生体内および生体外両方のスネイル発現がＤＮＡ損傷に応答して変性されることを示している。しかしながら、生体外研究が、スネイルの変形の発現がｐ５３レベルを増加することによって遺伝子毒ストレス（カジタ等、２００４）に対する応答を変更することを示唆したけれども、ＤＮＡ損傷に対するｐ５３応答はコンビ−ｔＴＡ−スネイルマウスにおいて影響を及ぼされない。本発明者等の結果はガン発生のためのＥＭＴレギュレーターの臨界レベルの要求とＤＮＡ損傷を関連付けておりそしてスネイル規制失敗がコンビ−ｔＴＡ−スネイルマウスがなぜガンを発生するかを説明するのと同様に思われる。これらの発見は、さらに、ヒト主要によるスネイルの過発現が遺伝子毒抗ガン剤による細胞死滅選択に重要であるかもしれないことを示している。
【０１４２】
スネイル−ＤＮＡ損傷相互作用はヒトガンにより利用された組織構造的防衛メカニズムに寄与しないか？  スネイルはＥＭＴ、上皮固体腫瘍における浸潤表現型の獲得に対する重要な通路を誘発することができる。かくして、組織構造的条件により、ＤＮＡ損傷はスネイル発現を減少しかつ腫瘍−ターゲット細胞の移動能力の遷移的抑制に寄与することができた。形質変換中のスネイルの連続発現により、この制御は失われる。従って、スネイルを過発現するヒトガンは遺伝子毒および潜在的にＥＭＴに関して生成された組織構造的メカニズムを利用することによる他の形状のストレスに対する生き残りの利点を有することができ、ヒトガンの治療用のスネイルに基礎が置かれる計画（ストラティジー）の可能性を提起する。
【０１４３】
参考文献
バトル・イー、サンチョ・イー、フランシ・シー、ドミンゲス・ディー、モンファール・エム、バウリダ・ジェイおよびデ・ヘレロス、エー・ジー（２０００）転写因子スネイルは上皮腫瘍細胞中のＥ−カドヘリンの抑制体である。ネイチャー・セル・バイオロジー２：８４−８９。
カノ・エー、ペレス−モレノ、エム・エー、ロドリゴ・アイ、ロカシオ・エー、ブランコ・エムジェイ、デル・バリオ・エム・ジー、ポルティロ・エフ、およびニイート・エム・エー（２０００）転写因子スネイルはＥ−カドヘリン発現を抑制することにより上皮−リンパ管遷移を制御する。ネイチャー・セル・バイオロジー２：７６−８３。
カジタ・エム、マッククリニック・ケー・エヌ、およびワデ・ピー・エー（２００４）
転写因子スネイルおよびスラッグの変形の発現は遺伝子毒ストレスに対する応答を変更する。Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２４（１７）：７５５９−７５６６。
ノリス・ピー・エス、およびハース・エム、（１９９７）蛍光ｐ５３ＧＰＦ溶融タンパク質は野生型ｐ５３を維持しながら哺乳動物細胞中のその検出を容易にする。オンコジーン１５（１８）：２２４１−２２４７。
パラシオス・アール、およびシュタインメッツ・エム、（１９８５）ＩＬ−３依存マウスはＢ−２２０表面抗原を発現し、生殖系列形状にＩｇ遺伝子を含み、そして生体内でＢ−リンパ細胞を発生するようにクローン化する。細胞４１：７２７−７３４。
サイトウ・ティー、オダ・ワイ、カワグチ・ケー、スギマチ・ケー、ヤマモト・エッチ、タテイシ・エヌ、タナカ・ケー、マツダ・エス、イワモト・ワイ、ラダンイ・エム等（２００４）滑液の肉腫におけるＥ−カドヘリン不活性の代替のメカニズムとしてのＥ−カドヘリン突然変異およびスネイル過発現。オンコジーン２３（５３）：８６２９−８６３８.。
シュルツ・エヌ、バーキ・ワイ、ラング・ワイ、セルタ・ユー、およびブルースマン・エッチ、（１９９６）遺伝子導入マウスにおけるテトラサイクリンシステムの単一工程一体化による遺伝子発現の有効な制御。ネイチャー・バイオテクノロジー１４：４９９−５０３。
スギマチ・ケー、タナカ・エス、カメヤマ・ティー、タグチ・ケー、アイシマ・エス、シマダ・エム、スギマチ・ケー、およびツネヨシ・エム、（２００３）転写抑制スネイルおよびヒト肝細胞ガンの進行。Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．９（７）：２６５７−２６６４。
ベガ・エス、モラレス・エー・ヴイ、オカナ・オー・エッチ、バルデス・エフ、ファブレガート・アイ、およびニート・エム・エー（２００４）スネイルは細胞サイクルを阻止しかつ細胞死に対する抵抗を付与する。Ｇｅｎｅｓ．Ｄｅｖ．１８（１０）：１１３１−１１４３。
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１Ａ】シュルツ等（１９９６）によって記載された最初のコンビ−ｔＴＡ−ベクターのｔｅｔＯ−ルシフェラーゼカセットを置き換えるのに使用されるカセットを示す概略図である。
【図１Ｂ】図１Ａに示されたカセットを使用しているシュルツ等（１９９６）によって記載された最初のコンビ−ｔＴＡ−ベクターの変性によって得られるような、この発明に使用されるコンビ−ｔＴＡ−スネイルを示す概略図である。
【図１Ｃ】コンビ−ｔＴＡ−スネイル用Ｂａ／Ｆ３細胞中のＲＴ−ＰＣＲによるテトラサイクリン依存のスネイル発現（媒体中に−ｔｅｔ，＋ｔｅｔ）の分析を示す図である。ＰＣＲ生成物はナイロン薄膜に転写されかつスネイル用の特殊なプローブにより交配によって分析された。ｃＤＮＡ完全性および埋め込みをチェックするのにβ−アクチンが使用された。
【図１Ｄ】ＩＬ−３の不存在におけるスネイルを発現しているＢａ／Ｆ３細胞の生き残りを示す図である。ＩＬ−３を補充された媒体中で急激に成長している細胞はゼロ日５×１０５ 細胞／ｍｌに調整され、そしてＩＬ−３の除去後培養された。実用的な細胞の細胞数はＩＬ−３の不存在で成長させられたスネイル増殖Ｂａ／Ｆ３細胞に関して示されている。
【図１Ｅ】ＩＬ−３の除去後上昇しているヌクレオゾームが細胞死を伴なうことを示す図である。低分子量のＤＮＡがＩＬ−３およびドキシサイクリン（−ｔｅｔ）（レーン１）の不存在において成長させられたＢａ／Ｆ３−コンビ−ｔＴＡ−スネイル、およびＩＬ−３の不存在においてかつドキシサイクリン（＋ｔｅｔ）（レーン２）の存在により成長させられたＢａ／Ｆ３−コンビ−ｔＴＡ−スネイルからＩＬ−３の除去後２４時間分離された。ドキシサイクリンによる処理時間は４８時間であった。ＤＮＡはエンドと名付けられ（ｅｎｄ−ｌａｂｅｌｌｅｄ）、２％アガロースゲル中で電気泳動によって分割され、放射線写真撮影によって可視化された。
【図１Ｆ】移植遺伝子としてＢＣＲ−ＡＢＬｐ １ ９ ０ の例に関して、テトラサイクリン派生のドキシサイクリン（Ｄｏｘ）による移植遺伝子の細かく調整された対照がシュルツ等（１９９６）によって記載された最初のコンビ−ｔＴＡ−ベクターを使用するのを可能としないが、むしろ前記最初のベクターの変性後のみ可能にすることを示す図である。移植遺伝子としてスネイルに実施されたような、最初のベクターの変性は図１Ａおよび図１Ｂに記載されている。
【図２Ａ】ＥｃｏＲＩ消化後のテイルスニップＤＮＡのサウザン分析による遺伝子導入マウスの識別を示す図である。我々は移植遺伝子の検出のためにマウススネイルのｃＤＮＡを使用した。
【図２Ｂ】ＲＴ−ＰＣＲによって示された移植遺伝子の発現を示す図である。コンビ−ｔＴＡ−スネイル及び内因性のスネイルの発現がコンビ−ｔＴＡ−スネイルおよび対照マウスから派生された組織中のＲＴ−ＰＣＲによって分析された。β−アクチンがｃＤＮＡの完全性および埋め込みをチェックするのに使用された。
【図３】コンビ−ｔＴＡ−スネイルマウスの胸腺における遺伝子欠陥のあるＴ−細胞発生を示す図である。これらのマウスの胸腺に存在する細胞の代表的な分析が示される。細胞は野生型（対照）から分離され、そしてコンビ−ｔＴＡ−スネイルマウスは単クローン抗体で汚染されかつフロー血球計算によって分析された。細胞のパーセンテージが示されている。
【図４Ａ】コンビ−ｔＴＡ−スネイルマウスの白血病の表現型の特徴を示す図である。コンビ−ｔＴＡ−スネイルマウスの骨髄（ＢＭ）、末梢血（ｐｂ）および脾臓からの細胞がフロー血球計算によって分析された。細胞は特殊な抗体の組み合わせによって識別された。細胞（１０，０００）が各サンプルに関して集められかつ死亡細胞はヨウ化プロピジウム汚染による分析から除外された。
【図４Ｂ】野生型およびコンビ−ｔＴＡ−スネイルマウスの脾臓のヘマトキシリン／エオシン汚染断片を示す図である。コンビ−ｔＴＡ−スネイルマウスからの脾臓は通常の脾臓構造の取り消しを示している。
【図４Ｃ】白血病コンビ−ｔＴＡ−スネイルマウスの組織の組織構造的な外観を示す図である。白血病細胞は器官境界の社会秩序に反抗しかつ異なる領域（肝臓、腎臓、肺臓）への転移を付与する個々の細胞として移動する。
【図４Ｄ】白血病コンビ−ｔＴＡ−スネイルマウスの組織の組織構造的な外観を示す図である。白血病細胞は器官境界の社会秩序に反抗しかつ異なる領域（肝臓、腎臓、肺臓）への転移を付与する個々の細胞として移動する。
【図４Ｅ】白血病コンビ−ｔＴＡ−スネイルマウスの組織の組織構造的な外観を示す図である。白血病細胞は器官境界の社会秩序に反抗しかつ異なる領域（肝臓、腎臓、肺臓）への転移を付与する個々の細胞として移動する。
【図５Ａ】野生型およびコンビ−ｔＴＡ−スネイルマウスからの代表的な整合した組織断片がヘマトキシリン／エオシンにより汚された。コンビ−ｔＴＡ−スネイル肺臓の組織構造的な断片は腺ガンの存在を示している。
【図５Ｂ】コンビ−ｔＴＡ−スネイル睾丸の組織構造的な断片は未発達の細胞の過形成を示している。
【図５Ｃ】コンビ−ｔＴＡ−スネイル肝臓は肝臓ガンの存在を示している。
【図６Ａ】ＲＴ−ＰＣＲによるコンビ−ｔＴＡ−スネイル（水中の−ｔｅｔ，＋ｔｅｔ）用の移植遺伝子のマウスの末梢血中のテトラサイクリン依存のスネイル発現の分析を示す図である。ｃＤＮＡの完全性及び埋め込みをチェックするのにアクチンが使用された。
【図６Ｂ】４週間のテトラサイクリン処理によるスネイル発現の抑制後のコンビ−ｔＴＡ−スネイルマウスの胸腺、骨髄（ＢＭ）、末梢血（ｐｂ）からの細胞の代表的なフローサイトメトリー表現型の特徴を示す図である。細胞は単クローン抗体により汚されかつフローサイトメトリーによって分析された。細胞のパーセンテージが示されている。
【図６Ｃ】４週間のテトラサイクリン処理によるスネイル発現の抑制後のコンビ−ｔＴＡ−スネイルマウスの組織の代表的なヘマトキシリン／エオシン汚された断片を示す図である。
【図７Ａ】コンビ−ｔＴＡ−スネイル発現が遺伝子導入マウスの内因性スネイルレベルの〜２０％に増加されることを示した脾臓およびＭＥＦ  ＲＮＡサンプルのリアルタイムのＲＴ−ＰＣＲの量的な分析を示す図である。コンビ−ｔＴＡ−スネイルおよび内因性スネイル転写数がβ−アクチン転写のパーセンテージとして示される。
【図７Ｂ】コンビ−ｔＴＡ−スネイル発現がコンビ−ｔＴＡ−スネイルマウスから派生されたハイガン（レーン１）および肝臓ガン（レーン３）組織においてＲＴ−ＰＣＲによって分析されたことを示す図である。ｃＤＮＡの完全性及び埋め込みをチェックするのにアクチンが使用された。
【図８】ＭＥＦｓ中のコンビ−ｔＴＡ−スネイル発現が移動表現型を誘導しないことを示す図である。対照−ＭＥＦｓ（ａ，ｂ，およびｃ）およびコンビ−ｔＴＡ−スネイル−ＭＥＦｓ（ｄ，ｅ，およびｆ）の運動性／移動性行動が生体外で傷付いたモデルにおいて分析された。融合性の培養が傷を発生するためにピペット先端により緩やかに引っ掻かれた。培養の写真が切断（ａ，ｄ）後および培養中に９時間後（ｂ，ｅ）および１５時間後（ｃ，ｆ）直ぐに撮られた。
【図９Ａ】コンビ−ｔＴＡ−スネイル（３０の動物）および対照マウス（３０の動物）ＤＮＡ損傷後それらの生き残りを測定するために９５０ラッド（ｒａｄｓ）で照射されたことを示す図である。照射は、等しい強さの分割された量として、４時間離して、付与された。
【図９Ｂ】γ−照射後ｐ５３−タンパク質がウエスタン法によって検出された後コンビ−ｔＴＡ−スネイルおよび対照ＢＭ細胞中のｐ５３−タンパク質のレベルを示す図である。埋め込み対照としてアクチンが使用された。時間単位は時間である。
【図１０Ａ】ＤＮＡ損傷に続いている異なる遺伝子型からＭＥＦｓにおけるスネイル発現のノーザン法分析を示す図である。ＲＮＡｓがドキソルビシン（＋／−  ｄｏｘ）で処理／処理されない細胞から調製された。スネイルｃＤＮＡプローブによる交配後、同一のノーザン法が正しい対照としてＢｃｌｘＬおよびｐ２１プローブにより再び交配された。ローディング（埋め込み）はＡＲＰＰ−ＰＯにより監視された。
【図１０Ｂ】Ｐ５３がスネイル促進剤を転写促進させないことを示す図である。ルシフェラーゼ伝達体試薬はＰ５３に対するヒトスネイル伝達体の独自の反応性を示している。伝達体構成の左に示された数は５´−境界（ｂｐ最初の場所の上流）を示している。
【図１０Ｃ】ＤＮＡ損傷に応答してスネイル発現の生体内調整を示す図である。γ−照射の５Ｇｙ後６時間のマウスの脾臓において、スネイル発現が野生型およびｐ５３−／−脾臓組織の両方において低減される。ノーザン法は、スネイルにより、かつＡＲＰＰ−ＰＯ（Ｕ，未処理）により交配された。
【図１１Ａ】２〜３ヶ月の年令でコンビ−ｔＴＡ−スネイル−ｐ５３−／−マウスによって発生され、かつ胸腺を浸潤するリンパ腫を示す図である。
【図１１Ｂ】２〜３ヶ月の年令でコンビ−ｔＴＡ−スネイル−ｐ５３−／−マウスによって発生され、かつ隔膜を浸潤するリンパ腫を示す図である。
【図１１Ｃ】２〜３ヶ月の年令でコンビ−ｔＴＡ−スネイル−ｐ５３−／−マウスによって発生され、かつ心臓を浸潤するリンパ腫を示す図である。
【図１１Ｄ】２〜３ヶ月の年令でコンビ−ｔＴＡ−スネイル−ｐ５３−／−マウスによって発生され、かつ肺を浸潤するリンパ腫を示す図である。
【図１２】リンパ腫、肺腫瘍および皮脂腺サンプルの組織構造的調製のマイクロ写真を示す図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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