(57)【要約】  本発明は少なくとも一部はＴ−ｂｅｔがＩＬ−２生産を調節するメカニズムの同定に基づく。本発明はキナーゼ媒介型のＴ−ｂｅｔとＲｅｌＡとの相互作用を調節する作用物質の同定方法、ならびにその使用方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン２（ＩＬ−２）の生産を調節する化合物の同定方法であって、化合物の存在下、セリン−トレオニンキナーゼ分子とＴ−ｂｅｔとの相互作用を可能とする条件下でＴ−ｂｅｔおよびセリン−トレオニンキナーゼ分子を接触させる工程；およびＴ−ｂｅｔと該キナーゼ分子との相互作用を検出する工程を含んでなり、ここでＩＬ−２の生産を増加する化合物の能力が、該化合物の不存在下での相互作用の量と比べた時の相互作用の減少により示され、そしてＩＬ−２の生産を減少する化合物の能力が、該化合物の不存在下での相互作用の量と比べた時の相互作用の増加により示される、上記同定方法。
【請求項２】
Ｔ−ｂｅｔとキナーゼ分子との相互作用がＴ−ｂｅｔとキナーゼとの間の複合体の形成を測定することにより決定される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｔ−ｂｅｔとキナーゼ分子の相互作用がＴ−ｂｅｔのリン酸化を測定することにより決定される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｔ−ｂｅｔのリン酸化がＴ−ｂｅｔのアミノ酸５０８（Ｓ５０８）位のセリン残基のリン酸化を測定することにより決定される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
キナーゼ分子がカゼインキナーゼＩ（ＣＫＩ）である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
キナーゼ分子がグリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ−３）である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＩＬ−２の生産がＩＬ−２ｍＲＮＡレベルを決定することにより測定される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＩＬ−２の生産がＩＬ−２タンパク質レベルを決定することにより測定される請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＩＬ−２の生産の調節に有用な化合物の同定方法であって、
ａ）Ｔ−ｂｅｔ、ＲｅｌＡおよびＩＬ−２調節領域を含んでなる指示組成物を準備する工程；
ｂ）指示組成物を試験化合物のライブラリーの各メンバーと接触させる工程；
ｃ）試験化合物のライブラリーから、Ｔ−ｂｅｔ媒介型のＲｅｌＡとＩＬ−２調節領域との相互作用を減少させる目的化合物を選択し、これによりＩＬ−２の生産を調節する化合物を同定する工程を含んでなり、ここでＩＬ−２の生産を増加する化合物の能力が、該化合物の不存在下での相互作用の量と比べた時の相互作用の減少により示され、そしてＩＬ−２の生産を減少する化合物の能力が、該化合物の不存在下での相互作用の量と比べた時の相互作用の増加により示される、上記同定方法。
【請求項１０】
Ｔ−ｂｅｔ−媒介型のＲｅｌＡとＩＬ−２との相互作用が、ＲｅｌＡとＩＬ−２調節領域との間の複合体の形成を測定することにより決定される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
指示組成物が、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドを発現する細胞である請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ＩＬ−２調節領域がＴ−ｂｏｘ結合部位を含んでなる請求項９に記載方法。
【請求項１３】
Ｔ細胞中のＲｅｌＡとＩＬ−２調節領域との相互作用を調節する化合物の同定方法であって、化合物およびＴ−ｂｅｔの存在下、Ｔ−ｂｅｔ媒介型のＲｅｌＡのＩＬ−２調節領域への結合により複合体を形成することを可能とする条件下でＲｅｌＡおよびＩＬ−２調節領域を接触させる工程；およびＲｅｌＡとＩＬ−２調節領域との複合体の形成を検出する工程を含んでなり、ここでＴ−ｂｅｔおよび化合物の存在下でＲｅｌＡとＩＬ−２調節領域との間の相互作用を阻害する化合物の能力が、Ｔ−ｂｅｔおよび該化合物の不存在下で形成される複合体の量と比べた時の複合体の形成の低下により示される、上記同定方法。
【請求項１４】
化合物が複合体の形成または安定性を上昇させる請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
化合物が複合体の形成または安定性を減少させる請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、「Ｔ−ｂｅｔによるＩＬ−２の生産の調節（Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−２  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｔ−ｂｅｔ）」という表題の２００５年１１月７日に出願された特許文献１の利益を主張する。本出願は１９９９年６月２日に出願された特許文献２の優先権を主張する英語のＰＣＴ条項２１に従い公開された２０００年（失効）６月１日に出願された特許文献３の一部継続出願である２００１年１２月３日に出願された特許文献４（係属中）の一部継続出願である２００２年１２月３日に出願された特許文献５（係属中）に関する。また本出願は、２００５年５月３１日に出願された特許文献６（係属中）、および２００５年１月２０日に出願された特許文献７（係属中）にも関する。これら各々の全内容は引用により本明細書に編入する。
【０００２】
政府の補助金
本明細書に記載する本研究は、少なくともその一部分が米国立衛生研究所により供与された補助金ＣＡ４８１２６およびＡＩ５６２９６により支援された。従って、米国政府は本発明における一定の権利を有することができる。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
Ｔ細胞増殖因子ＩＬ−２は、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞の一次応答中に生産される主要サイトカインである。２種のＴｈエフェクター細胞、Ｔｈ１およびＴｈ２の１つに分化する際、ＩＬ−２の生産は下降し、そしてＴｈ１様（ＩＦＮγ）またはＴｈ２−様（ＩＬ−４）サイトカインの生産に置き換えられる。ＩＬ−２はその受容体（ＩＬ−２Ｒ）を介して作用して、細胞の増殖に関与するシグナリング分子を活性化し；リガンドまたは受容体のいずれかの欠損で自己免疫を生じる（非特許文献１）。ＩＬ−２はすでにＴｈ１様サイトカインとして特徴付けられたが、増大する証拠はＩＬ−２およびその下流のシグナリング分子  Ｓｔａｔ５が１次応答中に抗炎症Ｔｈ２サイトカインの誘導にも極めて重要であることを示す（非特許文献２）。
【０００４】
ＩＬ−２発現は転写レベルで厳格に制御されているが、コード配列を介する翻訳後の制御も起こる（非特許文献３）。ＩＬ−２遺伝子の徹底的な解析により、転写開始部位に対して−３００ｂｐに広がる最小プロモーター領域が確立され、インビトロでのＴ細胞の活性化でＩＬ−２の誘導に十分であることが知られるようになった（非特許文献４；非特許文献５）（そして非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９で総説されている）。ＮＦＡＴ、ＯＣＴ−１、ＡＰ−１、ＨＭＧ  Ｉ（Ｙ）およびＮＦ−κＢファミリーのメンバーであるｐ６５およびｃ−Ｒｅｌのような抗原誘導性因子に結合するこの領域内の多くのシス調節要素が同定された。これらの因子は一過性のレポーターアッセイでＩＬ−２プロモーターをトランス活性化することが示され（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９で総説されている）、それらの中の幾つかはインビボでのＩＬ−２発現に必要である（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）。ＮＦ−κＢファミリーのメンバーは、ＩＬ−２遺伝子の転写を調節する（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９で総説されている）。ｐ５０／ｐ５０ホモダイマーは非刺激細胞中に大量に存在するが、それらは抑制的であり、そしてＴ細胞の活性化でｐ５０／ｐ６５またはｐ５０／ｃ−ｒｅｌヘテロダイマーにより置き換えられる。ｃ−Ｒｅｌはクロマチンを核に凝集させ、ＩＬ−２プロモーターをわたり改造する（ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）（非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０）。興味深いことには、Ｔｈ２よりもＴｈ１細胞の核で増大した量のＮＦ−κＢｐ６５（ＲｅｌＡ）因子が報告され、これはＴｈ１細胞によるＩＬ−２の優先的な分泌と合致する（非特許文献２１；非特許文献２２）。
【０００５】
トランスジェニックマウスの系統では、内因性ＩＬ−２発現を忠実に写すインビボでの発現を達成するためのさらなるＩＬ−２上流配列の必要性が明らかとなった（非特許文献２３）。最小プロモーターを超えた領域の貢献も、Ｔ細胞活性化でＩＬ−２エンハンサーの６００ｂｐ領域の選択的脱メチル化が迅速に生じることを示す実験から明らかである（非特許文献２４）。ＩＬ−２プロモーターＤＮＡに結合する個々の因子の機能、およびＴ細胞の活性化に応答したＩＬ−２遺伝子のクロマチン改造の開始は、幾つかの報告の主題となってきた（非特許文献２５；非特許文献２６；非特許文献２７；非特許文献２８；非特許文献２９）。ＮＦ−κＢサブユニットのｃ−Ｒｅｌは、近位プロモーターをわたるクロマチン改造に必要であり、そしてｃ−ＲｅｌはＨＭＧ  Ｉ（Ｙ）とＣＤ２８応答要素に結合する（非特許文献３０；非特許文献３１）。ｃ−Ｒｅｌを欠くマウスは、減損したＩＬ−２発現を現し、そしてｃ−Ｒｅｌインヒビターであるペントキシフィリンでの処置はＩＬ−２ｍＲＮＡレベルを下げる（非特許文献３２；非特許文献３３；非特許文献３４）。
【０００６】
ＩＬ−２遺伝子転写のネガティブ調節も、その発現を制御する重要なメカニズムである。一次Ｔｈ１細胞分化中、ＩＬ−２は急速に誘導され、そしてＴＣＲ刺激後、２、３日の間にピークとなり、次いで次第に減少する。ＮＦ−κＢメンバーであるｐ５０のホモダイマーは、静止しているＴｈ細胞中のＩＬ−２遺伝子転写を抑制すると考えられ（非特許文献３５；非特許文献３６）、そしてドミナントネガティブＣＲＥＢ導入遺伝子の発現は、インビボで減損したＩＬ−２の生産を生じた（非特許文献３７）。ＣＲＥＭ転写リプレッサーはＣａＭＫＩＶにより活性化されて、−１８０位でＣＲＥに結合し、ＳＬＥ患者のＩＬ−２の生産を抑制し（非特許文献３８；非特許文献３９）、そしてまたＣＲＥＭはアネルギー状態の樹立にも関与する（非特許文献４０）。ＺＥＢという名のジンクフィンガータンパク質は、ＩＬ−２遺伝子の転写リプレッサーになると考えられるが、その初代Ｔｈ細胞における機能は確立されていない（非特許文献４１）。抗増殖因子Ｔｏｂは、ＩＬ−２プロモーターの−１０５ネガティブ調節要素へのＳｍａｄ結合の強化を介してＩＬ−２を抑制する（非特許文献４２）。
【０００７】
Ｔ−ｂｏｘ転写因子であるＴ−ｂｅｔは、３つの分離可能な機能を有する：１）これはＴｈｐからＴｈ１の発生に必要とされる、２）チロシンがリン酸化されたＴ−ｂｅｔとＧＡＴＡ−３との物理的相互作用を介して、ＧＡＴＡ−３活性を阻害することによりＴｈ２経路に沿ったＴｈｐ分化を抑制する、および３）ＩＬ−２遺伝子活性化を抑制する（非特許文献４３；非特許文献４４；非特許文献４５；非特許文献４６）。結果として、Ｔ−ｂｅｔ−／−マウスは減損したＴｈ１細胞の発生、増加したＴｈ２サイトカイン生産、そして興味深いことには増加したＩＬ−２の生産をＣＤ４およびＣＤ８細胞の双方で現す（非特許文献４４；非特許文献４７；非特許文献４８）。実際にＴ−ｂｅｔは元々、基質として４００ｂｐのＩＬ−２プロモーターを利用した酵母ワンハイブリットスクリーニングで単離され、そして続いてＩＬ−２プロモーターの活性化を抑制することが示された（非特許文献４３）。さらにＴ−ｂｅｔ−／−Ｔｈ細胞中でのＴ−ｂｅｔの過剰発現は、ＩＬ−２の生産を抑制した（非特許文献４３；非特許文献４６）。Ｔ−ｂｅｔの最初の２つの機能は分子レベルで解明されているが、Ｔ−ｂｅｔがＩＬ−２の生産を制御するメカニズムは明らかになっていない。Ｔ−ｂｅｔがＩＬ−２の生産を制御するメカニズムの同定は大いに有益となろう。
【参考文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許仮出願第６０／７３４，３２４号明細書
【特許文献２】米国特許仮出願第６０／１３７，０８５号明細書
【特許文献３】国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／１５３４５号パンフレット
【特許文献４】米国特許出願第１０／００８，２６４号明細書
【特許文献５】米国特許出願第１０／３０９，７４７号明細書
【特許文献６】米国特許仮出願第６０／６８６，２２２号明細書
【特許文献７】米国特許仮出願第６０／６４５，６９８号明細書
【非特許文献１】Ｓｃｈｉｍｐｌ，Ａ．，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ  １３：３６９−３７８，２００２
【非特許文献２】Ｚｈｕ，Ｊ．，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９：７３９−７４８，２００３
【非特許文献３】Ｒａｇｈｅｂ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６３；１２０−１２９，１９９９
【非特許文献４】Ｄｕｒａｎｄ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：１７１５−１７２４，１９９８
【非特許文献５】Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ，Ｕ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：３０４２−３０４９，１９８６
【非特許文献６】Ｊａｉｎ，Ｊ．，Ｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７：３３３−３４２，１９９５
【非特許文献７】Ｓｅｒｆｌｉｎｇ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２６３：１８１−２００，１９９５
【非特許文献８】Ｐｏｗｅｌｌ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  １６５：２８７−３００，１９９８
【非特許文献９】Ｎｏｖａｋ，Ｔ．Ｊ．，Ｐ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １８：４５２３−４５３３，１９９０
【非特許文献１０】Ｐｅｎｇ，Ｓ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｕｉｔｙ  １４：１３−２０，２００１
【非特許文献１１】Ｋｏｎｔｇｅｎ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．９：１９６５−１９７７，１９９５
【非特許文献１２】Ｌｉｏｕ，Ｈ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：３６１−３７１，１９９９
【非特許文献１３】Ｇｒｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９：８４６０−８４６８，２００４
【非特許文献１４】Ｌａｉ，Ｊ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５：４２６０−４２７１，１９９５
【非特許文献１５】Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｅｍｂｏ  Ｊ  １４：１９９１−２００４，１９９５
【非特許文献１６】Ｇｈｏｓｈ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：１６９６−１７００，１９９３
【非特許文献１７】Ｐａｒｒａ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６０：５３７４−５３８１，１９９８
【非特許文献１８】Ｈｅｒｎｄｏｎ，Ｔ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０３：１４５−１５３，２００２
【非特許文献１９】Ｒａｏ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７０：３７２４−３７３１，２００３
【非特許文献２０】Ｋａｈｎ−Ｐｅｒｌｅｓ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２：２１７７４−２１７８３，１９９７
【非特許文献２１】Ｌｅｄｅｒｅｒ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：７７−８６，１９９４
【非特許文献２２】Ｄｏｒａｄｏ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２８：２２３４−２２４４，１９９８
【非特許文献２３】Ｙｕｉ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６６：１７３０−１７３９，２００１
【非特許文献２４】Ｂｒｕｎｉｑｕｅｌ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｒ．Ｈ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４：２３５−２４０，２００３
【非特許文献２５】Ｗａｒｄ，Ｓ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２６：２９２３−２９３４，１９９８
【非特許文献２６】Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ，Ｅ．Ｖ．，ａｎｄ  Ｓ．Ｂ．Ｗａｒｄ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：９３５８−９３６５，１９９６
【非特許文献２７】Ａｔｔｅｍａ，Ｊ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９：２４６６−２４７６，２００２
【非特許文献２８】Ｃｈｅｎ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２５：３２０９−３２１９，２００５
【非特許文献２９】Ｒａｏ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６７：４４９４−４５０３，２００１
【非特許文献３０】Ｒａｏ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７０：３７２４−３７３１，２００３
【非特許文献３１】Ｈｉｍｅｓ，Ｓ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ５：４７９−４８９，１９９６
【非特許文献３２】Ｋｏｎｔｇｅｎ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．９：１９６５−１９７７，１９９５
【非特許文献３３】Ｌｉｏｕ，Ｈ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：３６１−３７１，１９９９
【非特許文献３４】Ｗａｎｇ，Ｗ．，Ｗ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６：１６５−１７４，１９９７
【非特許文献３５】Ｇｒｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９：８４６０−８４６８，２００４
【非特許文献３６】Ｓｕｎｄｓｔｅｄｔ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：９７９−９８４，１９９６
【非特許文献３７】Ｂａｒｔｏｎ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３７９：８１−８５，１９９６
【非特許文献３８】Ｊｕａｎｇ，Ｙ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１５：９９６−１００５，２００５
【非特許文献３９】Ｔｅｎｂｒｏｃｋ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９：４１４７−４１５２，２００２
【非特許文献４０】Ｐｏｗｅｌｌ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６３：６６３１−６６３９，１９９９
【非特許文献４１】Ｙａｓｕｉ，Ｄ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：４４３３−４４４０，１９９８
【非特許文献４２】Ｔｚａｃｈａｎｉｓ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２：１１７４−１１８２，２００１
【非特許文献４３】Ｓｚａｂｏ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  １００：６５５−６６９，２０００
【非特許文献４４】Ｓｚａｂｏ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９５：３３８−３４２，２００２
【非特許文献４５】Ｓｚａｂｏ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：７１３−７５８，２００３
【非特許文献４６】Ｈｗａｎｇ，Ｅ．Ｓ．，Ｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０７：４３０−４３３，２００５
【非特許文献４７】Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｂ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００：１５８１８−１５８２３，２００３
【非特許文献４８】Ｊｕｅｄｅｓ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９：１１５３−１１６２，２００４
【発明の開示】
【０００９】
発明の要約
本発明は、少なくともその一部分は、Ｔ−ｂｅｔがＩＬ−２の生産を抑制するメカニズムの同定に基づく。Ｔ−ｂｅｔは、Ｔ−ｂｅｔＳ５０８を必要とし、そしてＴ−ｂｅｔＳ５０８リン酸化に関連するＲｅｌＡ  ＮＦ−κＢ転写因子との相互作用により、発生しているＴｈ１細胞におけるＩＬ−２遺伝子転写のリプレッサーとして作用する。ＲｅｌＡ／Ｔ−ｂｅｔヘテロダイマーはＲｅｌＡのＩＬ−２プロモーターＤＮＡへの結合、したがってそのＩＬ−２遺伝子発現のトランス活性化を調節する。
【００１０】
本発明の１つの観点は、インターロイキン２（ＩＬ−２）の生産を調節する化合物の同定方法を特徴とし、この方法は化合物の存在下、セリン−トレオニンキナーゼ分子とＴ−ｂｅｔとの相互作用を可能とする条件下でＴ−ｂｅｔおよびセリン−トレオニンキナーゼ分子を接触させる工程、およびＴ−ｂｅｔとキナーゼ分子との相互作用を検出する工程を含んでなり、ここでＩＬ−２の生産を増加する化合物の能力が、該化合物の不存在下での相互作用の量と比べた時の相互作用の減少により示され、そしてＩＬ−２の生産を減少させる化合物の能力が、該化合物の不存在下での相互作用の量と比べた時の相互作用の増加により示される。
【００１１】
１つの態様では、Ｔ−ｂｅｔとキナーゼ分子との相互作用は、Ｔ−ｂｅｔとキナーゼとの間の複合体の形成を測定することにより決定される。別の態様では、Ｔ−ｂｅｔとキナーゼ分子の相互作用がＴ−ｂｅｔのリン酸化を測定することにより決定される。１つの態様では、Ｔ−ｂｅｔのリン酸化がＴ−ｂｅｔのアミノ酸５０８（Ｓ５０８）位のセリン残基のリン酸化を測定することにより決定される。１つの態様では、キナーゼ分子がカゼインキナーゼＩ（ＣＫＩ）である。別の態様では、キナーゼ分子はグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ−３）である。１つの態様では、ＩＬ−２の生産がＩＬ−２ｍＲＮＡレベルを決定することにより測定される。別の態様では、ＩＬ−２の生産はＩＬ−２タンパク質レベルを決定することにより測定される。
【００１２】
本発明の別の観点は、ＩＬ−２の生産を調節するために有用な化合物の同定法を特徴とし、この方法は：ａ）Ｔ−ｂｅｔ、ＲｅｌＡおよびＩＬ−２調節領域を含んでなる指示組成物を準備し；ｂ）指示組成物を試験化合物のライブラリーの各メンバーと接触させ；ｃ）試験化合物のライブラリーから、Ｔ−ｂｅｔ媒介型のＲｅｌＡとＩＬ−２調節領域との相互作用を減少させる目的化合物を選択し、これによりＩＬ−２の生産を調節する化合物を同定することを含んでなり、ここでＩＬ−２の生産を増加する化合物の能力が、化合物の不存在下での相互作用の量と比べた時の相互作用の減少により示され、そしてＩＬ−２の生産を減少する化合物の能力が、化合物の不存在下での相互作用の量と比べた時の相互作用の増加により示される。
【００１３】
１つの態様では、Ｔ−ｂｅｔ媒介型のＲｅｌＡとＩＬ−２との相互作用が、ＲｅｌＡとＩＬ−２調節領域との間の複合体の形成を測定することにより決定される。１つの態様で指示組成物は、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドを発現する細胞である。１つの態様では、ＩＬ−２調節領域はＴ−ｂｏｘ結合部位を含んでなる。
【００１４】
本発明の別の観点は、Ｔ細胞中のＲｅｌＡとＩＬ−２調節領域の相互作用を調節する化合物の同定方法を特徴とし、この方法は化合物およびＴ−ｂｅｔの存在下で、ＲｅｌＡおよびＩＬ−２を、Ｔ−ｂｅｔ媒介型のＲｅｌＡのＩＬ−２調節領域への結合により複合体の形成を可能とする条件下で接触させ；そしてＲｅｌＡとＩＬ−２調節領域との複合体の形成を検出することを含んでなり、ここでＴ−ｂｅｔおよび化合物の存在下でＲｅｌＡとＩＬ−２調節領域との間の相互作用を阻害する化合物の能力が、Ｔ−ｂｅｔおよび化合物の不存在下で形成される複合体の量と比べた時に複合体の形成の低下により示される。
【００１５】
１つの態様では化合物が複合体の形成または安定性を増加させる。別の態様では、化合物が複合体の形成または安定性を減少させる。
【００１６】
１つの態様では、作用物質はＴ−ｂｅｔのセリンのリン酸化を増加させる。
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は、少なくともその一部分は、Ｔ−ｂｅｔがＩＬ−２の生産を調節するメカニズムの同定に基づく。本発明は、とりわけキナーゼが媒介するＴ−ｂｅｔとＲｅｌＡとの相互作用を調節する作用物質の同定法、ならびにその使用法に関する（添付する実施例を参照にされたい）。以下に詳細に検討するように、Ｔ−ｂｅｔは種々の細胞外シグナルの重要な細胞内トランスデューサーまたはメディエーターである。より詳細には、Ｔ−ｂｅｔは異なる細胞型で細胞外シグナルを遺伝子発現の特異的パターンに伝達するために作動する転写因子である。特にＴ−ｂｅｔはＴｈ１およびＴｈ２サイトカインの両方の遺伝子発現において中枢的役割を果たすことが証明された。種々の細胞応答を調節するために役立つ種々の細胞型および種々の遺伝子が、Ｔ−ｂｅｔに応答する。またＴ−ｂｅｔは数種の遺伝子、これら遺伝子の発現および同様に影響を受ける他のものの発現も、Ｔ−ｂｅｔの発現および／または活性を制御することにより調節することができる（例えば強化または減少）。
【００１８】
ＢｒａｃｈｙｕｒｙまたはＴは、Ｔ−ｂｏｘと呼ばれる２００アミノ酸のＤＮＡ結合ドメインを共有する転写因子のファミリーの創始メンバーである（総説は、Ｓｍｉｔｈ，１９９７；Ｐａｐａｉｏａｎｎｏｕ，１９９７；Ｍｅｉｓｌｅｒ，１９９７中）。Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（「短尾」のギリシャ語）突然変異は、短くて少しねじれた尾を持った異型接合変異動物内で、１９２７年に最初に記載された（Ｈｅｒｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ  Ｔ−ｂｏｘタンパク質のアミノ−末端の半分（アミノ酸１〜２２９）は、配列特異的なＤＮＡ結合活性を表すことが示されたＴ−ｂｏｘとして知られる保存ドメインを含む（Ｋｉｓｐｅｒｔ，Ａ．＆  Ｈｅｒｒｍａｎｎ，Ｂ．Ｇ．１９９３，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：３２１１；Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．１９９７，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４０９：２０１；Ｋｉｓｐｅｒｔ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９５，ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：４７６３）。Ｃ−末端の半分は、トランス活性化および抑制ドメインの２対を含む。オルソログ種内のＴ−ｂｏｘ領域の間の配列の類似性は、９９％と高く、そして非オルソログ遺伝子間では４０〜７０％である。Ｔ−ｂｏｘドメインは最近ＤＮＡと同時結晶化され、そしてタンパク質がＤＮＡと深いほうの溝および浅いほうの溝の内の両方で接触する新規の配列特異性ＤＮＡ認識構造を示す（Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｃ．Ｗ．＆  Ｈｅｒｒｍａｎｎ，Ｂ．Ｇ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ  ３８９，８８４）。
【００１９】
酵母ワンハイブリッド（ｙｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｈｙｂｒｉｄ）法を、Ｔｈ−１特異的転写因子を同定するために使用した。酵母細胞は、ＩＬ−２プロモーター−レポーター遺伝子構築物を発現するように作製され、そして抗−ＣＤ３活性化Ｔｈ１細胞クローンから作製されたｃＤＮＡライブラリーを用いて形質転換された。ＩＬ−２プロモーターの検査は、ＮＦκＢ部位の５’の丁度−２４０−２２０に優れたＴ−ｂｏｘ結合部位を明らかにした。添付の実施例に記載するように、Ｔ−ｂｅｔはＩＬ−２プロモーターを結合する能力に基づいて酵母ワンハイブリッドスクリーニングアッセイで単離された。
【００２０】
本発明のＴ−ｂｅｔタンパク質は、Ｔ−ｂｏｘタンパク質と相同性を有する。現在、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙを含まずにマウスにおいて８種より多くのＴ−ｂｏｘ遺伝子が存在する。これらには、Ｔｂｘ１〜６、Ｔ−ｂｒａｉｎ−１（Ｔｂｒ−１）、Ｅｏｍｅｓ、Ｔ−ｐｉｔおよびＴ−ｂｅｔを含み、それぞれ明確で通常は複雑な発現パターンを有する。例えば、Ｔ−ｂｒａｉｎ−１発現は、大部分が大脳皮質内の明確なドメインに限定される（Ｂｕｌｆｏｎｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｎｅｕｒｏｎ  １５，６３）。Ｔ−ｂｅｔはＴｂｒ−１の配列に最も類似している。Ｔ−ｂｏｘの外で、本発明のＴ−ｂｅｔタンパク質は他のＴ−ｂｏｘタンパク質と一致性を有していない。
【００２１】
Ｔ−ｂｅｔは、Ｔｂｒ−１に配列が最も類似している。他の種もＢｒａｃｈｙｕｒｙ様の遺伝子を発現する。そのような脊椎動物種は、ゼノプス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）、ミノカサゴ（Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ）、ヒヨコおよびヒトであり（Ｒａｏ，１９９４；Ｈｏｒｂ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｓｅｎ，１９９７；Ｃｏｎｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｓｃｈｕｌｔｅ−Ｍｅｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；  Ｅｄｗａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｌａｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｃａｍｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）ならびにさらに遠位の種、例えばナメクジウオ（ａｍｐｈｉｏｘｕｓ）、ホヤ（ａｓｃｉｄｉａｎｓ）、キョク皮動物（ｅｃｈｉｎｏｄｅｒｍ）、Ｃ．エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ショウジョウバエ（ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）などの昆虫である（Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。これらの遺伝子は配列でも発現パターンでも保存されている。
【００２２】
本発明をより容易に理解できるようにするために、特定の用語を最初に定義する。
【００２３】
本明細書でＴ−ｂｅｔに関連して使用する用語「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅｄ）」には、Ｔ−ｂｅｔの発現、活性または機能を、同じ条件下で自然に生じるＴ−ｂｅｔの発現、機能または活性とは異なる様式に変化させることを含む。例えば発現、機能または活性は、例えば結合特異性における変化により自然に生じるＴ−ｂｅｔの発現、機能または活性よりも大きく、または小さくすることができる。本明細書で使用するように、様々な形の用語「調節する」には、刺激（例えば特定の応答または活性の増加またはアップレギュレーション）、および阻害（例えば特定の応答または活性の減少またはダウンレギュレーション）を含む。
【００２４】
本明細書で使用する用語「Ｔ−ｂｅｔ分子」には、配列番号１および３に記載の核酸分子と構造的特徴を共有するＴ−ｂｅｔ核酸分子、および配列番号２および４に記載のＴ−ｂｅｔタンパク質の際立った構造および機能的特徴を共有するＴ−ｂｅｔタンパク質を含む。Ｔ−ｂｅｔタンパク質は、タンパク質のＴ−ｂｏｘファミリーのメンバーであり、そしてＢｒａｎｃｈｙｕｒｙ、Ｔｂｘｌ−６、Ｔ−ｂｒａｉｎ−１（Ｔｂｒ−１）といくらかのアミノ酸配列相同を共有する。Ｔ−ｂｏｘタンパク質は、Ｔ−ｂｏｘ結合部位でＤＮＡに結合するＴ−ｂｏｘドメインを含んでなる。さらにＴ−ｂｅｔタンパク質の構造および機能的特徴を以下に提供する。
【００２５】
本明細書で使用する用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）を含むと考える。核酸分子は、一本鎖状または二本鎖状でもよいが、しかし好ましくは二本鎖状ＤＮＡである。用語「等価物」とは、機能的に等価のＴ−ｂｅｔタンパク質、すなわち相互作用、例えばＴ−ｂｅｔの自然な結合パートナーへ結合する能力を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むことを意図している。
【００２６】
本明細書中に使用するように、「単離された核酸分子」は、核酸が誘導された生物体のゲノムＤＮＡ内の核酸に本来的に近接する遺伝子配列（すなわち、核酸が誘導された生物体のゲノムＤＮＡ内の単離された核分子に対する遺伝子に近接して位置する遺伝子配列）を含まない核酸分子を指す。例えば種々の態様において、単離されたＴ−ｂｅｔ核酸分子は、典型的には、核酸が誘導された細胞のゲノムＤＮＡ内の核酸分子に本来的に近接するヌクレオチド配列の約１０ｋｂ以下を含み、そしてさらに好ましくは、本来的に近接するヌクレオチド配列の約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ以下を含む。しかし、「単離された」Ｔ−ｂｅｔ核酸分子は、ゲノムＤＮＡ内のＴ−ｂｅｔ配列に正常では近接しない他のヌクレオチド配列に連結してもよい（例えば、Ｔ−ｂｅｔヌクレオチド配列はベクター配列に連結してもよい）。特定の好適な態様では、「単離された」核酸分子、例えばｃＤＮＡ分子は、他の細胞物質を含まなくてもよい。しかし、Ｔ−ｂｅｔ核酸分子が「単離された」と考えられるために他の細胞物質を含まないという必要はない（例えば、他の哺乳類から分離され、そして細菌細胞内に挿入されたＴ−ｂｅｔ  ＤＮＡ分子は、まだ「単離された」と考えられる）。
【００２７】
本発明の核酸は、例えば標準的な組換えＤＮＡ技法により調製することができる。本発明の核酸は、標準的技法を使用して化学的に合成することもできる。ポリデオキシヌクレオチドを化学的に合成する様々な方法が知られており、そしてそれらには市販されているＤＮＡ合成器で自動化された固相合成がある（例えばＩｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，５９８，０４９号明細書；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，４５８，０６６号明細書；およびＩｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，４０１，７９６号および同第４，３７３，０７１号明細書を参照にされたい。これらは引用により編入する）。
【００２８】
本明細書で使用する用語「高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする」は、互いに実質的な相同性（例えば典型的には７０％以上の相同性）を有するヌクレオチド配列が互いに安定してハイブリダイズされたままであるようなハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を説明することを意図する。高いストリンジェンシー条件の好ましい非限定的例は、６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウムを含むハイブリダイゼーション緩衝液（ＳＳＣ）中、温度約４５℃で数時間から一晩ハイブリダイゼーションし、次いで０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む洗浄緩衝液中、温度約５０〜６５℃での１もしくは複数回の洗浄である。
【００２９】
用語「パーセント（％）同一性」は、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の内容で使用される場合（例えば、一つのアミノ酸配列が他のアミノ酸配列にＸ％同一である場合）に、最適に配列された時の２個の配列の間で共有する同一の残基の百分率を指す。２個のヌクレオチドまたはアミノ酸配列の同一性の百分率を決定するために、配列を最適比較の目的で整列する（例えば一つの配列をもう１つの配列と最適に整列するためにギャップを挿入してもよい）。次いで、相当する位置にある残基を比較し、そして一方の配列内の位置がもう１つの配列の相当する位置に対応して同じ残基で占められている場合に、分子はその位置で同一である。従って、２個の配列の間の同一性の百分率は、２個の配列が共有する同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝（同一の位置の数＃／位置の全数＃）ｘ１００）。
【００３０】
当該技術分野で公知のコンピューターアルゴリズムは、２個のヌクレオチドまたはアミノ酸配列を最適に整列しそして比較して、２個の配列間の同一性の百分率を決定するために使用できる。２個の配列の比較のために使用される数学アルゴリズムの好ましいが非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−６８、変更はＫａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３−７７のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム中に組み込まれている（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０）。比較のためにギャップ入りのアライメントを得るためには、ギャップ入りＢＬＡＳＴをＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．に記載されているように使用できる（（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５（１７）：３３８９−３４０２）。ＢＬＡＳＴおよびギャップ入りＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合に、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用できる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照。例えば、本発明のヌクレオチド配列は、ギャップペナルティーをｅｘｉｓｔａｎｃｅ  ５およびｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ２に設定したデフォルトＢｌａｓｔｎマトリックス１−３を使用してｂｌａｓｔ処理した。本発明のアミノ酸配列は、下記のデフォルト設定を用いてｂｌａｓｔ処理した：ギャップペナルティーをｅｘｉｓｔａｎｃｅ  １１およびｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  １に設定したＢｌｏｓｕｍ６２マトリックス。
【００３１】
配列の比較のために使用した数学アルゴリズムの別の好ましい非限定的例は、Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）のアルゴリズムである。このアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）内に組み込まれている。アミノ酸配列比較のためにＡＬＩＧＮプログラムを用いる場合には、ＰＡＭ１２加重残基表（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、１２のｇギャップ長ペナルティ（ｇａｐ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｅｎａｌｔｙ）および４のギャップペナルティを使用できる。配列比較のために複数のプログラムを使用する場合には、最適の整列（例えば２個の配列間の最高の一致パーセント）を与えるプログラムが比較の目的で使用される。
【００３２】
本明細書で使用するように、「天然に存在する」核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子を指す（例えば天然のタンパク質をコードする）。
【００３３】
本明細書で使用する用語「プロモーター」、「調節領域」または「プロモーター要素」は、プロモーター／調節配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現に必要な核酸配列を意味する。幾つかの場合では、この配列は中心のプロモーター配列であることができ、そして他の場合、この配列はエンハンサー配列および遺伝子産物の発現に必要な例えばＴ−ｂｏｘ結合部位のような他の調節配列を含んでもよい。プロモーター／調節配列は、例えば遺伝子産物を場所的に、または一時的に限定された様式で発現できるものでよい。
【００３４】
本明細書で使用するように、「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的、例えば二本鎖ｃＤＮＡ分子のコーディング鎖に相補的、ｍＲＮＡ配列に相補的または遺伝子のコーディング鎖に相補的なヌクレオチド配列を含んでなる。従って、アンチセンス核酸は、センス核酸に水素結合できる。
【００３５】
１つの態様では、本発明の核酸分子はｓｉＲＮＡ分子である。１つの態様では、本発明の核酸分子はＲＮＡｉを媒介する。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、ｄｓＲＮＡと同じ配列を含有するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に分解するために、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を使用する翻訳後の標的化遺伝子サイレンシング法である（Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ａ．ａｎｄ  Ｚａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．２８７，２４３１−２４３２（２０００）；Ｚａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １０１，２５−３３（２０００）．Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ，１３，３１９１−３１９７（１９９９）；Ｃｏｔｔｒｅｌｌ  ＴＲ，ａｎｄ  Ｄｏｅｒｉｎｇ  ＴＬ．２００３．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１：３７−４３；Ｂｕｓｈｍａｎ  Ｆ．２００３．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ．７：９−１０；ＭｃＭａｎｕｓ  ＭＴ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ  ＰＡ．２００２．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．３：７３７−４７）。このプロセスは、内因性のリボヌクレアーゼが長いｄｓＲＮＡを短い、例えば２１−もしくは２２−ヌクレオチド長のＲＮＡ（小干渉ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを呼ばれる）に分解する場合に起こる。次いで、より短いＲＮＡセグメントは、標的をｍＲＮＡの分解を媒介する。ＲＮＡｉ合成のためのキットは、例えばニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ）またはアンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）から市販されている。１つの態様では、アンチセンスＲＮＡに使用するための上記の１もしくは複数の化学を、ＲＮＡｉを媒介する分子に使用することができる。
【００３６】
本明細書で使用する用語「コード領域」は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含んでなるヌクレオチド配列の領域を指し、一方用語「非コード領域」は、アミノ酸に翻訳されないヌクレオチド配列の領域を指す（例えば５’および３’非翻訳領域）。これら非コード領域は、種々の調節要素を含むことができる。
【００３７】
本明細書で使用する用語「プロモーター」、「調節領域」、「プロモーター要素」または「調節要素」は、プロモーター／調節配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現に必要な核酸配列を意味する。幾つかの場合では、この配列は中心のプロモーター配列であることができ、そして他の場合、この配列はエンハンサー配列および遺伝子産物の発現に必要な例えばＴ−ｂｏｘ結合部位のような他の調節配列を含んでもよい。プロモーター／調節配列は、例えば遺伝子産物を場所的に、または一時的に限定された様式で発現できるものでよい。
【００３８】
本明細書で使用する用語「ベクター」は、それが連結している他の核酸を輸送できる核酸分子を指す。ベクターの一つの種類は「プラスミド」であり、これはその中にさらなるＤＮＡセグメントを連結することができる環状二本鎖ＤＮＡループを称する。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、ここでさらなるＤＮＡセグメントをウイルスゲノム内に連結することができる。ある種のベクターは、それらが導入された宿主細胞内で自律複製することができる（例えば細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーマル哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば非−エピソーマル哺乳類ベクター）は、宿主細胞内への導入の際に宿主細胞のゲノム内に組み込まれ、そしてこれにより宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに特定のベクターは、それらが作動可能に連結している遺伝子の発現を指令できる。そのようなベクターは、本明細書中では「組換え発現ベクター」または単に「発現ベクター」と呼ぶ。一般に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形である。本明細書中で、「プラスミド」および「ベクター」は互換的に使用されるが、それはプラスミドがベクターの最も普通に使用される形であるからである。しかし本発明は、同等の機能に役立つ発現ベクター、例えばウイルスベクター（例えば複製欠失レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のような他の形も含むと考える。
【００３９】
本明細書で使用する用語「宿主細胞」は、本発明の核酸、例えば本発明の組換え発現ベクターが導入された細胞を指すものとする。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中では互換的に使用される。このような用語は、特定の主題の細胞を指すだけでなく、そのような細胞の後代または可能な後代も指すものと理解すべきである。ある種の変化が、突然変異または環境の影響により後続世代に起こるかもしれないので、このような後代は実際には親細胞と同等ではないが、しかし本明細書中に使用される用語の範囲内に含まれる。
【００４０】
本明細書で使用するように、「トランスジェニック動物」は動物の１個もしくは複数の細胞が「導入遺伝子」を含む非−ヒト動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはマウスを指す。用語「導入遺伝子」は、これからトランスジェニック動物が発生し、そして成熟動物のゲノム内に残る細胞のゲノム内に組み込まれる外因性ＤＮＡを指し、例えばトランスジェニック動物の１もしくは複数の細胞タイプまたは組織内にコードされた遺伝子産物の発現を指令する。
【００４１】
本明細書で使用するように、「相同的組換え動物」は、動物の発生に先立って、内因性遺伝子が、内因性遺伝子とその動物の細胞、例えば動物の胚細胞内に導入された外因性ＤＮＡ分子との間の相同性組換えにより改変されている種類のトランスジェニック非ヒト動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはマウスを指す。
【００４２】
本明細書中に使用される場合に、「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」は、細胞から単離されるかまたは組換えＤＮＡ技術により生産された場合に他のタンパク質、ポリペプチド、細胞物質および培地を、あるいは化学的に合成された場合に化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まないタンパク質またはポリペプチドを指す。「単離された」または「精製された」タンパク質またはその生物学的に活性な部分は、タンパク質が誘導された細胞または組織源から細胞物質または他の混入タンパク質を実質的に含まないか、あるいは化学的に合成された場合に化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。用語「細胞物質を実質的に含まない」とは、タンパク質が単離または組換え的に生産された細胞の細胞成分から分離されているＴ−ｂｅｔタンパク質の調製物を含む。
【００４３】
本明細書で使用する用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫学的に活性な免疫グロブリン分子の部分、すなわちＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントのような抗原に特異的に結合（免疫反応）する抗原結合部位を含む分子である。本明細書で使用する用語「モノクローナル抗体」および「モノクローナル抗体組成物」は、抗原の特定のエピトープと免疫反応できる抗原結合部位の一種のみを含む抗体分子の集団を指し、一方「ポリクローナル抗体」および「ポリクローナル抗体組成物」という用語は、特定の抗原と相互作用可能な抗原結合部位の複数の種類を含む抗体分子の集団を指す。従って、モノクローナル抗体組成物は典型的には、これが免疫反応する特定の抗原に対する単一結合親和性を示す。
【００４４】
本明細書で使用する用語「イントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）」は、細胞内側の標的、例えばＴ−ｂｅｔのような細胞内タンパク質に対し向けられた細胞内で発現される抗体構築物、通常は一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体を指す。
【００４５】
本明細書で使用する用語「ドミナントネガティブＴ−ｂｅｔタンパク質」は、天然の（すなわち自然に生じる野生型）Ｔ−ｂｅｔ分子と競合するがＴ−ｂｅｔ活性を持たないＴ−ｂｅｔ分子（例えばその部分もしくはバリアント）を含む。そのような分子は細胞中のＴ−ｂｅｔ活性を効果的に減少させる。本明細書で使用する「ドミナントネガティブＴ−ｂｅｔタンパク質」は、Ｔ−ｂｅｔ活性の強力なインヒビターである修飾された形態のＴ−ｂｅｔを指す。
【００４６】
本明細書で使用する用語「細胞」は、原核生物および真核生物の細胞を含む。１つの態様では本発明の細胞は細菌細胞である。別の態様では本発明の細胞は酵母細胞のような真菌細胞である。別の態様では本発明の細胞は脊椎動物細胞、例えば鳥類もしくは哺乳動物細胞である。好適な態様では、本発明の細胞はマウスもしくはヒト細胞である。
【００４７】
本明細書で使用する用語「免疫細胞」は造血起源の細胞であり、そして免疫応答に役割を果たす細胞を含む。免疫細胞には、Ｂ細胞およびＴ細胞のようなリンパ球；ナチュラルキラー細胞；および単球、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球および顆粒球のような骨髄性細胞を含む。
【００４８】
用語「抗原提示細胞」および「ＡＰＣ」は、本明細書では互換的に使用し、専門的な抗原提示細胞（例えばＢリンパ球、単球、樹状細胞およびランゲルハンス細胞）、ならびに他の抗原提示細胞（例えば、ケラチノサイト、内皮細胞、星状細胞、繊維芽細胞および希突起膠細胞）を含む。
【００４９】
本明細書で使用する用語「Ｔ細胞」（すなわちＴリンパ球）という用語は、哺乳動物（例えばヒト）からの胸腺細胞、未熟Ｔ細胞、成熟Ｔ細胞などを包含するＴ細胞系列内のすべての細胞を含むものとする。Ｔ細胞は、ＣＤ４またはＣＤ８のいずれか（しかし両方ではない）、およびＴ細胞受容体を発現する成熟Ｔ細胞を含む。本明細書に記載する種々のＴ細胞群は、それらのサイトカインプロファイルおよびそれらの機能に基づき定義することができる。
【００５０】
本明細書で使用する「前駆Ｔ細胞」（“Ｔｈｐ”）は、ＣＤ４を発現するナイーブな多能性細胞である。
【００５１】
本明細書で使用する用語「ナイーブなＴ細胞」には、コグネイト抗原に暴露されたことがなく、したがって活性化されないＴ細胞または記憶細胞を含む。ナイーブなＴ細胞は循環せず、そしてヒトのナイーブなＴ細胞はＣＤ４５ＲＡ＋である。ナイーブなＴ細胞が限定するわけではないが抗原の量、投与の経路および投与時期に依存して抗原を認識し、そしてさらなるシグナルを受けるならば、それらは増殖し、そしてＴ細胞の種々のサブセット、例えばエフェクターＴ細胞に分化する可能性がある。
【００５２】
本明細書で使用する用語「末梢Ｔ細胞」は、胸腺を離れかつ末梢循環に入る成熟シングルポジティブＴ細胞を指す。
【００５３】
本明細書で使用する用語「分化した」とは、刺激剤と接触したＴ細胞を指し、そしてエフェクターＴ細胞（例えばＴｈ１、Ｔｈ２）および記憶Ｔ細胞を含む。分化したＴ細胞はナイーブなＴ細胞と比べて数種の表面タンパク質の発現が異なり、そして他の細胞を活性化するサイトカインを分泌する。
【００５４】
本明細書で使用する用語「記憶Ｔ細胞」は、抗原への暴露後に機能的に静止となり、そして抗原の不存在下で長期間、生存することができるリンパ球を含む。ヒトの記憶Ｔ細胞はＣＤ４５ＲＡ−である。
【００５５】
本明細書で使用する用語「エフェクターＴ細胞」には、抗原を排除するために機能するＴ細胞を含む（例えば他の細胞の活性化を調節するサイトカインを生産することにより、または細胞傷害活性により）。用語「エフェクターＴ細胞」には、Ｔヘルパー細胞（例えばＴｈ１およびＴｈ２細胞）および細胞傷害性Ｔ細胞を含む。Ｔｈ１細胞は遅延型の過敏応答およびマクロファージの活性化を媒介し、一方Ｔｈ２細胞はＢ細胞に対する援助を提供し、そしてアレルギー性応答に重要である（Ｍｏｓｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｃｏｆｆｍａｎ，１９８９，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７，１４５−１７３；Ｐａｕｌ  ａｎｄ  Ｓｅｄｅｒ，１９９４，Ｃｅｌｌ  ７６，２４１−２５１；Ａｒｔｈｕｒ  ａｎｄ  Ｍａｓｏｎ，１９８６，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６３，７７４−７８６；Ｐａｌｉａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１，８４９−８５５；Ｆｉｎｋｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１，２３３５−２３４１）。本明細書で使用する用語「Ｔヘルパー１型応答」（Ｔｈ１応答）は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ、ならびにリンホトキシン（ＬＴ）、およびＴｈ２細胞よりむしろＴｈ１細胞により優先的にもしくは排他的に生産される他のサイトカインから選択される１もしくは複数のサイトカインの生産を特徴とする応答を指す。
【００５６】
本明細書で使用する用語「調節Ｔ細胞」には、低レベルのＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１２を生産するＴ細胞を含む。調節Ｔ細胞はエフェクターＴ細胞よりも低レベルにもかかわらずＴＮＦα、ＴＧＦβ、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０を生産する。ＴＧＦβは調節Ｔ細胞により生産される優勢なサイトカインであるが、このサイトカインはＴｈ１またはＴｈ２細胞よりも低いレベルで生産され、例えばその規模はＴｈ１またはＴｈ２細胞よりも１次元低い。調節Ｔ細胞は細胞のＣＤ４＋ＣＤ２５＋群に見い出すことができる（例えばＷａｌｄｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｃｏｂｂｏｌｄ．２００１．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．１４：３９９を参照にされたい）。調節Ｔ細胞は培養中に活性化シグナル（例えば抗原および抗原提示細胞、またはＭＨＣの内容において抗原を模するシグナルを用いて、例えば−ＣＤ３抗体に−抗−ＣＤ２８抗体を加えて）で刺激されたＴｈ１またはＴｈ２またはナイーブなＴ細胞の増殖およびサイトカイン生産を活発に抑制する。
【００５７】
本明細書で使用する用語「細胞分化」には、細胞の発生能が制限され、そして細胞が特異的な発生の運命を獲得するプロセスを含む。分化した細胞は他の細胞型から異なって認識できるように分化する。
【００５８】
本明細書で使用する用語「受容体」は、抗原、複合化抗原（例えばＭＨＣ分子の内容において）、または抗体に結合する免疫細胞受容体を含む。活性化受容体には、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、サイトカイン受容体、ＬＰＳ受容体、補体受容体およびＦｃ受容体を含む。例えばＴ細胞受容体はＴ細胞上に提示され、そしてＣＤ３分子と会合する。Ｔ細胞受容体は、ＭＨＣ分子の内容では抗原により刺激される（ならびにポリクローナルＴ細胞活性化試薬により）。ＴＣＲを介するＴ細胞の活性化は多くの変化、例えばタンパク質リン酸化、膜脂質の変化、イオンの流動、環式ヌクレオチドの改変、ＲＮＡ転写の変化、タンパク質合成の変化、および細胞容量の変化をもたらす。
【００５９】
本明細書で使用する用語「免疫応答」は、免疫細胞活性化の調節により影響を受ける免疫細胞媒介型の（例えばＴ細胞媒介型および／もしくはＢ細胞媒介型）免疫応答を含む。例示的免疫応答はＢ細胞応答（例えば抗体生産、例えばＩｇＡ生産）、Ｔ細胞応答（例えば増殖、サイトカイン生産および細胞傷害性）、およびサイトカイン応答性細胞、例えばマクロファージの活性化を含む。本発明の１つの態様では、免疫応答はＴ細胞媒介型である。本発明の別の態様では、免疫応答はＢ細胞媒介型である。免疫応答と関連して本明細書で使用する用語「ダウンレギュレーション」は、任意の１もしくは複数の免疫応答、好ましくはＴ細胞応答における減損を含むが、免疫応答と関連して用語「アップレギュレーション」は、任意の１もしくは複数の免疫応答、好ましくはＴ細胞応答における上昇を含む。１つのタイプの免疫応答のアップレギュレーションは、別のタイプの免疫応答において対応するダウンレギュレーションを導く可能性がある。例えば特定のサイトカイン（例えばＩＬ−１０）の生産のアップレギュレーションは、細胞性免疫応答のダウンレギュレーションを導く可能性がある。
【００６０】
本明細書で使用する用語「Ｔヘルパー１型応答」は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦおよびリンホトキシン（ＬＴ）、およびＴｈ２細胞よりむしろＴｈ１細胞により優先的に、または排他的に生産される他のサイトカインから選択される１もしくは複数のサイトカインの生産により特徴つけられる応答を称する。
【００６１】
本明細書で使用する用語「Ｔヘルパー２型応答」（Ｔｈ２応答）は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０から選択される１もしくは複数のサイトカインの生産を特徴とし、かつＴｈ２細胞により提供される効率的なＢ細胞の「援助（ｈｅｌｐ）」（例えば高められたＩｇＧ１および／もしくはＩｇＥ生産）を特徴とするＣＤ４＋  Ｔ細胞による応答を称する。
【００６２】
本明細書で使用する用語「接触させること」（すなわち細胞、たとえば１個の細胞を化合物と接触させること）という用語は、化合物および細胞をインビトロで一緒にインキュベーションすること（例えば化合物を培養物中の細胞に添加すること）、ならびに化合物および個体の細胞がインビボで接触するように個体に化合物を投与することを含む。「接触させること」という用語は個体中に自然に存在しうるＴ−ｂｅｔ調節物質への細胞の曝露（すなわち自然な生理学的過程の結果として起こりうる曝露）を含まない。
【００６３】
添付する実施例に記載するように、Ｔ−ｂｅｔはＩＬ−２の生産を調節する。１つの態様では、Ｔ−ｂｅｔ活性はＴ−ｂｅｔ−標的分子またはＴ−ｂｅｔと結合パートナー例えばＲｅｌＡまたはキナーゼ、例えばセリン−トレオニンキナーゼ、例えばＣＫＩまたはＧＳＫ−３キナーゼとの複合体との会合のような直接的活性である。本明細書で使用する用語「標的分子」または「結合パートナー」は、Ｔ−ｂｅｔが自然に結合または相互作用し、そしてその相互作用が生物学的応答を生じる分子である。標的分子はタンパク質または核酸分子であることができる。本発明の例示的標的分子には、Ｔ−ｂｅｔタンパク質と同じシグナリング経路中のタンパク質、例えば上流（活性の刺激物質および阻害物質の両方を含む）、または例えばＩＬ−２の生産の調節に関与する経路におけるＴ−ｂｅｔタンパク質の下流で機能することができるタンパク質を含む。Ｔ−ｂｅｔ標的分子の例には、キナーゼ、例えばセリン−トレオニンキナーゼ、例えばＣＫＩまたはＧＳＫ−３キナーゼ、またはＴ−ｂｅｔが相互作用して遺伝子の転写を調節するＤＮＡ配列を含む。
【００６４】
本明細書で使用する用語「その転写がＴ−ｂｅｔにより調節される遺伝子」には、Ｔ−ｂｅｔにより調節される制御領域を有する遺伝子を含む。そのような遺伝子はＴ−ｂｅｔにより正もしくは負に調節される可能性がある。この用語は、Ｔ−ｂｅｔにより間接的に調節される、すなわちＴ−ｂｅｔが関与するシグナリング経路の活性化の結果として調節される遺伝子も包含する。Ｔ−ｂｅｔにより調節される例示的遺伝子は、例えばＧＡＴＡ３、およびサイトカイン遺伝子、例えばＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＴＮＦα、ＴＧＦ−β、ＬＴ（リンホトキシン）およびＩＬ−１０を含む。
【００６５】
本明細書で使用する用語「Ｔｈ１−関連サイトカイン」とは、Ｔｈ２細胞というよりはむしろＴｈ１細胞により優先的または排他的に生産されるサイトカインを指すものとする。Ｔｈ１−関連サイトカインの例には、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦおよびリンホトキシン（ＬＴ）を含む。
【００６６】
本明細書で使用する用語「Ｔｈ２−関連サイトカイン」とは、Ｔｈ１細胞というよりはむしろＴｈ２細胞により優先的または排他的に生産されるサイトカインを指すものとする。Ｔｈ１−関連サイトカインの例には、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０を含む。
【００６７】
本明細書で使用する用語「相互作用する」とは、例えば酵母２ハイブリッドアッセイもしくは同時免疫沈降を使用して検出できるような分子間の検出可能な相互作用を含むことを意味する。また相互作用するという用語は、分子間の「結合」相互作用も含む。相互作用は自然なタンパク質−タンパク質またはタンパク質−核酸でよい。
【００６８】
「作用物質」もしくは「化合物」もしくは「試験化合物」という用語は、本発明の方法もしくはアッセイで使用されるか、または組成物中に存在する試薬もしくは試験作用物質を含む。「作用物質」もしくは「化合物」もしくは「試験化合物」という用語は、Ｔ−ｂｅｔ発現もしくは活性の調節物質として以前に同定もしくは認識されていない化合物を含む。１つの態様では、１種以上の化合物、例えば複数の化合物を、Ｔ−ｂｅｔまたはシグナル伝達経路中のＴ−ｂｅｔの上流もしくは下流で作用する分子の発現および／もしくは活性を調節するそれらの能力についてのスクリーニングアッセイで同時に試験し得る。「試験化合物のライブラリー」という用語は多数の試験化合物を含んでなるパネルを指す。
【００６９】
１つの態様において、「作用物質」もしくは「化合物」もしくは「試験化合物」という用語はサイトカインのような自然に存在する化合物を除外する。別の態様において、作用物質という用語は、自然に存在するサイトカインに結合する抗体を除外する。別の態様において、「作用物質」という用語はサイトカイン受容体に結合する抗体を除外する。さらに別の態様において、「作用物質」という用語はＴ細胞受容体を介してシグナルを伝達する作用物質、例えばＴ細胞受容体複合体の成分に対するＭＨＣ分子もしくは抗体の内容における抗原を除外する。１つの態様では、作用物質もしくは試験化合物は、Ｔ−ｂｅｔと直接相互作用するか、もしくはＴ−ｂｅｔが相互作用する分子と直接相互作用する化合物（例えばＴ−ｂｅｔとＴ−ｂｅｔ標的分子との間の相互作用を阻害もしくは刺激する化合物、例えばＤＮＡもしくは他のタンパク質）である。別の態様において、化合物は例えばＴ−ｂｅｔが関与するシグナル伝達経路中でＴ−ｂｅｔの上流もしくは下流にある分子の活性を調節することによりＴ−ｂｅｔ発現および／もしくは活性を間接的に調節するものである。そのような化合物は下に詳細に記述するように、そのような化合物を選択するスクリーニングアッセイを使用して同定することができる。
【００７０】
「低分子」という用語は当該技術分野の一用語であり、そして約１０００分子量未満もしくは約５００分子量未満である分子を含む。１つの態様において、低分子はペプチド結合を排他的に含むわけではない。別の態様において、低分子はオリゴマーでない。活性についてスクリーニング可能な例示的低分子化合物には、限定するわけではないがペプチド、ペプチド模倣物、核酸、炭水化物、低有機分子（例えばポリケチド）（Ｃａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：６３）および天然産物抽出物ライブラリーを挙げることができる。別の態様では、化合物は低分子有機非ペプチド化合物である。さらなる態様において、低分子は生合成的でない。
【００７１】
本明細書で使用する用語「試験化合物」は、Ｔ−ｂｅｔ活性および／または発現の調節物質、および／または細胞増殖、生存、分化および／または運動の調節物質とこれまでに同定されたことがないか、または認識されるべき化合物を含む。
【００７２】
用語「試験化合物のライブラリー」は、複数の試験化合物を含んでなるパネルを指すものとする。
【００７３】
本明細書で使用する用語「工作された」（工作された細胞でのような）は、Ｔ−ｂｅｔタンパク質をコードする核酸分子が導入された細胞を指す。
【００７４】
本明細書で使用する用語「レポーター遺伝子」という用語は検出可能な遺伝子産物、例えばＲＮＡもしくはタンパク質を発現する任意の遺伝子を指す。好適なレポーター遺伝子は容易に検出可能であるものである。またレポーター遺伝子は、所望の転写制御配列を含むか、または他の所望の特性を表す遺伝子との融合遺伝子の形態の構築物中に包含されてもよい。レポーター遺伝子の例は、限定するわけではないがＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）（Ａｌｔｏｎ  ａｎｄ  Ｖａｐｎｅｋ（１９７９）、Ｎａｔｕｒｅ  ２８２：８６４−８６９）ルシフェラーゼ、ならびにベータ−ガラクトシダーゼ；ホタルルシフェラーゼ（ｄｅＷｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：７２５−７３７）；細菌のルシフェラーゼ（Ｅｎｇｅｂｒｅｃｈｔ  ａｎｄ  Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ（１９８４）、ＰＮＡＳ  １：４１５４−４１５８；Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３：３６６３−３６６７）；アルカリホスファターゼ（Ｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８２：２３１−２３８、Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．２：１０１）、ヒト胎盤分泌型アルカリホスファターゼ（Ｃｕｌｌｅｎ  ａｎｄ  Ｍａｌｉｍ（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１６：３６２−３６８）、および緑色蛍光タンパク質（米国特許第５，４９１，０８４号明細書；国際公開第９６／２３８９８号パンフレット）のような他の酵素検出系を挙げることができる。
【００７５】
本明細書で使用する用語「Ｔ−ｂｅｔ−応答要素」とは、Ｔ−ｂｅｔの活性により直接的または間接的に調節されるＤＮＡ配列を指す（これにより例えばレポーター遺伝子の転写を介してＴ−ｂｅｔの活性を監視することができる）。
【００７６】
本明細書で使用する用語「Ｔ−ｂｅｔが欠損の細胞」という用語は、Ｔ−ｂｅｔが自然に欠損している個体の細胞、ならびに非ヒトＴ−ｂｅｔ欠損動物、例えばそれらがＴ−ｂｅｔが欠損するように変えられたマウスの細胞を含むことを意図している。また「Ｔ−ｂｅｔが欠損の細胞」という用語はｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養される非ヒトのＴ−ｂｅｔ欠損動物もしくは個体から単離された細胞も包含することを意図している。
【００７７】
本明細書で使用する用語「無細胞組成物」は、完全な（ｉｎｔａｃｔ）細胞を含有しない単離された組成物を指す。無細胞組成物の例には、細胞抽出物および単離されたタンパク質を含有する組成物を含む。
【００７８】
本明細書で使用する用語「指示組成物」という用語は目的のタンパク質（例えばＴ−ｂｅｔ）を含む組成物、例えばタンパク質を自然に発現する細胞、タンパク質をコードする発現ベクターを細胞中に導入することによりタンパク質を発現するよう工作された細胞、または該タンパク質を含有する無細胞組成物（例えば精製された自然に存在するタンパク質もしくは組換え的に工作されたタンパク質）を指す。
【００７９】
本明細書で使用する用語「Ｔ−ｂｅｔの調節物質」という用語は、Ｔ−ｂｅｔの発現、プロセシング、翻訳後修飾もしくは活性の調節物質を包含する。この用語は、Ｔ−ｂｅｔ遺伝子の転写、Ｔ−ｂｅｔ  ｍＲＮＡのプロセシング、Ｔ−ｂｅｔ  ｍＲＮＡの翻訳、Ｔ−ｂｅｔタンパク質の翻訳後修飾（例えばグリコシル化、ユビキチン化もしくはリン酸化）またはＴ−ｂｅｔタンパク質の活性を調節する作用物質、例えば化合物（１もしくは複数）を含む。「Ｔ−ｂｅｔ活性の調節物質」はＴ−ｂｅｔ活性を直接もしくは間接的に調節する化合物を包含する。例えば、Ｔ−ｂｅｔ活性の間接的調節物質はＴ−ｂｅｔを含むシグナル伝達経路を調節することができる。Ｔ−ｂｅｔ活性を直接調節する調節物質の例は、Ｔ−ｂｅｔ  ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡに結合するアンチセンス核酸分子、Ｔ−ｂｅｔに細胞内で結合しかつＴ−ｂｅｔ活性を調節（すなわち阻害）する細胞内抗体、標的分子とＴ−ｂｅｔの相互作用を阻害するＴ−ｂｅｔペプチド、および細胞中でのＴ−ｂｅｔ活性の増大された発現を可能とするＴ−ｂｅｔをコードする発現ベクター、ドミナントネガティブの形態のＴ−ｂｅｔ、Ｔ−ｂｅｔの活性を特異的に調節するよう作用する化合物を包含する。
【００８０】
本明細書で使用するＴ−ｂｅｔタンパク質の「アゴニスト」は、自然に存在する形態のＴ−ｂｅｔタンパク質の生物学的活性と実質的に同じ生物学的活性もしくはその１サブセットを保持し得る。Ｔ−ｂｅｔタンパク質の「アンタゴニスト」は、例えばＴ−ｂｅｔタンパク質の細胞活性を競合的に調節することにより自然に存在する形態の１もしくは複数のＴ−ｂｅｔタンパク質活性を阻害することができる。
【００８１】
本明細書で互換的に使用されるように、「Ｔ−ｂｅｔ活性」、「Ｔ−ｂｅｔの生物学的活性」または「Ｔ−ｂｅｔの機能的活性」には、標準的な技術に従いインビボもしくはインビトロで測定されるようなＴ−ｂｅｔタンパク質がＴ−ｂｅｔ応答細胞もしくは組織（例えばＴ細胞）、またはＴ−ｂｅｔ標的分子（例えば核酸分子もしくはタンパク質標的分子）に発揮する活性を含む。１つの態様では、Ｔ−ｂｅｔ活性はＴ−ｂｅｔ−標的分子との会合のような直接的活性である。あるいはＴ−ｂｅｔ活性は、Ｔ−ｂｅｔタンパク質とＴ−ｂｅｔ標的分子との相互作用に媒介される下流の生物学的な出来事のような間接的活性である。Ｔ−ｂｅｔの生物学的活性は本明細書に記載され、かつ／または当該技術分野で公知である。これらの知見は薬剤標的として、および種々の疾患、障害もしくは状態における治療的介入の標的としてのＴ−ｂｅｔ（およびＴ−ｂｅｔが関与する経路の他の分子）の使用を提供する。さらに本発明は、ワクチンのようなＴ−ｂｅｔ活性を調節する作用物質を含んでなる免疫調節組成物を提供する。
【００８２】
本明細書で使用する用語「シグナル伝達経路」は、細胞が細胞外の影響すなわちシグナル（例えばサイトカイン受容体もしくは抗原受容体のような細胞の表面上の受容体により伝達されるシグナル）を細胞応答（例えば遺伝子転写の調節）に転換する手段を含む。例示的シグナル伝達経路は、ＪＡＫ１／ＳＴＡＴ−１経路（Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｗ．２００１．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．７３：２７１）およびＴＧＦ−β経路（Ａｔｔｉｓａｎｏ  ａｎｄ  Ｗｒａｎａ．２００２．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２９６：１６４６）を含む。「Ｔ−ｂｅｔが関与するシグナル伝達経路」は、Ｔ−ｂｅｔがシグナルを伝達する一シグナル伝達分子であるものである。
【００８３】
本明細書で使用する「キナーゼ」は、高エネルギーリン酸基の供与体化合物（例えばＡＴＰまたはＧＴＰ）から受容化合物（アルコール、カルボキシル、窒素含有基または他のリン酸基）への転移を触媒するトランスフェラーゼクラス［ＥＣ２．７．１−６］のホスホトランスフェラーゼまたはジホスホトランスフェラーゼである。
【００８４】
本明細書で使用する「セリン−トレオニンキナーゼ」は、ポリペプチド中のセリンまたはトレオニン残基のリン酸化をリン酸の供与体としてＡＴＰ分子または他のヌクレオチドを使用して触媒するキナーゼである。セリン−トレオニンキナーゼの例には限定するわけではないが、カゼインキナーゼＩ（ＣＫＩ）およびグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ−３）を含む。
【００８５】
本明細書で使用する「カゼインキナーゼＩ」または「ＣＫＩ」は、哺乳動物で同定された７つのアイソフォームをもつセリン−トレオニンタンパク質キナーゼである（α、β、δ、ε、γ１、γ２およびγ３；Ｇｒｏｓｓ、Ｓ．Ｄ．＆  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ａ．（１９９８）Ｃｅｌｌ．Ｓｉｇｎａｌ．１０，６９９−６７１およびＫｎｉｐｐｓｃｈｉｌｄ  Ｕ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ．１７（６）：６７５−８９に総説されており、各内容は引用により本明細書に編入する）。キナーゼドメインはＣＫ１ファミリーのメンバー間で高度に保存されているが、独自のＮ−およびＣ−末端テイルが各アイソフォームを特徴付ける。酵母では、ＣＫＩの機能がそれら哺乳動物のＣＫＩの機能に比べてさらに一層詳しく研究されてきた。細胞外刺激、ＣＫＩアイソフォームの細胞下の位置、それらの種々の細胞構造およびタンパク質との相互作用、ならびに自己リン酸化およびそれらのＣ−末端調節ドメインのタンパク質分解的開裂は、ＣＫ１のキナーゼ活性に影響する。哺乳動物のＣＫ１アイソフォームは、細胞の分化、増殖、染色体の分離および概日リズムに関与する重要な調節タンパク質の中で多くのことなる基質をリン酸化する。脱調節および／またはＣＫ１アイソフォームのコード配列中の突然変異の発生が、神経変性疾患およびガンと関連付けられた。ヒトＧＳＫ−３のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は知られており、そしてｇｉ：６８３０３５７１；ｇｉ：２０５４４１４３；ｇｉ：２０５４４１４４；ｇｉ：４０５４９３９９；ｇｉ：４０５４９４００；ｇｉ：７１７７３６５３；ｇｉ：７１７７３６９１；ｇｉ：２１３１４７７７；ｇｉ：７３５３２７７７に見いだすことができ；これらすべての内容は引用により本明細書に編入する。マウスＧＳＫ−３のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は知られており、そしてｇｉ：２２１６５３８１；ｇｉ：７６４９６４８９；ｇｉ：３１５４２４２４；ｇｉ：７１７７３５６２；ｇｉ：１９５２７２２３；ｇｉ：２２７７９８９６に見いだすことができ；これらすべての内容は引用により本明細書に編入する。
【００８６】
本明細書で使用する「グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３」または「ＧＳＫ」は、哺乳動物で同定された２つのアイソフォーム（アルファおよびベータ）を持つセリン−トレオニンタンパク質キナーゼである（Ｂｒａｄｌｙ  Ｗ．Ｄｏｂｌｅ  ａｎｄ  Ｊａｍｅｓ  Ｒ．Ｗｏｏｄｇｅｔｔ（２００３）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１６，１１７５−１１８６に総説され、その内容は引用により本明細書に編入する）。ＧＳＫ−３はすべての真核生物に見いだされる多機能性セリン／トレオニンキナーゼである。この酵素は、Ｗｎｔ、受容体であるチロシンキナーゼおよびＧ−タンパク質共役受容体に対する細胞性の応答を含め多くのシグナル伝達経路の重要なレギュレーターであり、グリコーゲン代謝から細胞サイクルの調節および増殖に至る広い範囲の細胞プロセスに関与している。ＧＳＫ−３は通常、細胞内で活性であり、そして主にその活性の阻害を介して調節される点で普通ではない。さらに他のタンパク質キナーゼと比較して、これはプライムされた基質（ｐｒｉｍｅｄ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、すなわち別のキナーゼにより事前にリン酸化されている基質を優先する。ヒトＧＳＫ−３のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は知られており、そしてｇｉ：４９５７４５３１；ｇｉ：２１３６１３３９に見いだすことができ；このすべての内容は引用により本明細書に編入する。マウスＧＳＫ−３のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は知られており、そしてｇｉ：５８０００４３２に見いだすことができ；このすべての内容は引用により本明細書に編入する。
【００８７】
本明細書で使用する「ＲｅｌＡ」は、ＮＦ−κＢ／Ｒｅｌ転写因子ファミリーのメンバーであり、そのメンバーはインヒビターＩκＢタンパク質のファミリーにより細胞の細胞質中で潜在的に維持されるダイマーとして機能する（Ｓｈａ  ＷＣ．（１９９８）Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９：１８７（２）：１４３−６に総説され、その内容は引用により本明細書に編入する）。５つの既知の哺乳動物ＮＦ−κＢ／Ｒｅｌタンパク質が知られている：Ｒｅｌ（ｃ−Ｒｅｌ）、ｐ６５（ＲｅｌＡ）、ＲｅｌＢ、ｐ５０（ＮＦＫＢ１）、およびｐ５２（ＮＦＫＢ２）。ｐ５０のｐ１０５前駆体およびｐ５２のｐ１００前駆体の両方が、ＩκＢとして機能するドメインを保有し、そして少なくとも５つの異なるＩκＢタンパク質：ＩκＢα、ＩκＢβ、ＩκＢε、ＩκＢγおよびｂｃｌ−３が存在する。
【００８８】
ＮＦ−κＢ／Ｒｅｌ転写因子は、免疫機能および発生が関与する驚くべき多種多様なシグナリング経路により活性化される。これらの因子を活性化する先天的免疫応答に関与するシグナリング経路には、新たに同定されたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｐｈｉｌａ）Ｔｏｌｌのヒト相同体、サイトカインＴＮＦ−αおよびＩＬ−１α、走化性ペプチドｆＭｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ、ならびに種々の細菌およびウイルス産物を含む。これらの因子を活性化する適応免疫応答に関与するシグナリング経路には、ＢおよびＴ細胞上の抗原受容体、Ｔ細胞上のＣＤ２８、およびＢ細胞上のＣＤ４０のような鍵となるリンパ球受容体シグナリング経路を含む。これらのシグナリング経路はＩκＢのリン酸化および分解に収束し、これはＮＦ−κＢ／Ｒｅｌダイマーの核へのトランスロケーションを導く核局在化シグナルを暴露する。ヒトＲｅｌＡのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は知られており、そしてｇｉ：４６４３０４９８に見いだすことができ、その内容は引用により本明細書に編入する。マウスＲｅｌＡのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は知られており、そしてｇｉ：６２８９９０５７に見いだすことができ、その内容は引用により本明細書に編入する。
【００８９】
本明細書で使用する「インターロイキン−２」または「ＩＬ−２」は、Ｔｈ１関連サイトカインである。ＩＬ−２は、最初の２０個のアミノ末端のアミノ酸が疎水性の分泌シグナル配列として機能する１５３個のアミノ酸の前駆体タンパク質として合成されるわずかに塩基性のｐＩの１３３アミノ酸のタンパク質（１５．４ｋＤａ）である。このタンパク質は、生物活性に必須な１つのジスルフィド結合（Ｃｙｓ５８／１０５位）を含む。ＩＬ−２は他の因子と配列相同性を示さないが、マウスおよびヒトのＩＬ−２は約６５パーセントの相同性を表す。ＩＬ−２は３位のトレオニンでＯ−グリコシル化されている。異なる分子量および電荷を持つバリアントは、種々のグリコシル化によるものである。非グリコシル化ＩＬ２も生物学的に活性である。ＩＬ−２は、例えばＴｈ１細胞増殖のような多くの生物学的機能を有する。ヒトＩＬ−２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は知られており、そしてｇｉ：２８１７８８６０に見いだすことができ；その内容は引用により本明細書に編入する。マウスＩＬ−２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は知られており、そしてｇｉ：３１９８２８３７に見いだすことができ；その内容は引用により本明細書に編入する。
【００９０】
様々な態様において、ＩＬ−２遺伝子の調節領域を本発明の方法に使用することができる。例えばＩＬ−２は、例えばＮＦＡＴファミリーメンバーの結合部位、ｐ６５およびＲｅｌフィミリーメンバーのようなＮＦ−κＢファミリーメンバーの結合部位、Ｔ−ｂｏｘ結合部位、ＯＣＴ−１結合部位、ＡＰ−１結合部位およびＨＭＧＩ（Ｙ）結合部位のような多くの調節要素および結合部位をプロモーター領域の近位に含む。したがって本発明はさらにＴ−ｂｏｘ結合ドメインを含むＩＬ−２の調節領域を包含する。様々な態様において、この調節領域はヒトＴ−ｂｅｔのインターロイキン−２遺伝子の転写開始部位＋１に対して少なくとも−２５４から−１８８のヌクレオチドを包含する。
【００９１】
本発明の様々な観点を以下の小区分でさらに詳細に記載する。
【００９２】
Ｉ．単離された核酸分子
本発明の１つの観点はＴ−ｂｅｔをコードする単離された核酸分子に関する。好適な態様において、本発明の核酸分子は配列番号１もしくは配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含んでなる。別の態様において、本発明の核酸分子は配列番号１の少なくとも約７００の連続するヌクレオチドもしくは配列番号３の少なくとも約５００の連続するヌクレオチドを含んでなる。好適な態様において、本発明の核酸分子は配列番号１の少なくとも約８００、少なくとも約１０００、少なくとも約１２００、少なくとも約１４００もしくは少なくとも約１６００の連続するヌクレオチドを含んでなる。別の好適な態様において、本発明の核酸分子は配列番号３の少なくとも約６００、少なくとも約８００、少なくとも約１０００、少なくとも約１２００もしくは少なくとも約１４００の連続するヌクレオチドを含んでなる。
【００９３】
他の態様において、核酸分子は：配列番号１の少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約１０００、少なくとも約１２００、少なくとも約１４００もしくは少なくとも約１６００の連続するヌクレオチドを含んでなる核酸分子と少なくとも７０％の同一性、より好ましくは８０％の同一性、そしてさらにより好ましくは９０％の同一性を有する。他の態様において、核酸分子は：配列番号３の少なくとも約６００、少なくとも約８００、少なくとも約１０００、少なくとも約１２００もしくは少なくとも約１４００の連続するヌクレオチドを含んでなる核酸分子と少なくとも７０％の同一性、より好ましくは８０％の同一性、そしてさらにより好ましくは９０％のヌクレオチド同一性を有する。
【００９４】
遺伝暗号の縮重により配列番号１もしくは３と異なり、かつ従って配列番号１および３によりコードされるものと同一のＴ−ｂｅｔタンパク質をコードする核酸分子は本発明に含まれる。従って、別の態様では、本発明の単離された核酸分子は配列番号２もしくは配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【００９５】
加えて、Ｔ−ｂｅｔタンパク質をコードする核酸分子は標準的な分子生物学技術および本明細書に提供される配列情報を使用して他の供給源から単離され得る。例えば、Ｔ−ｂｅｔ  ＤＮＡは、ハイブリダイゼーションプローブとして配列番号１もしくは３の全部もしくは部分、および標準的ハイブリダイゼーション技術（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅ  ａｌ．モレキュラークローニング：ア  ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）第２版、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９に記述される）を使用してヒトゲノムＤＮＡライブラリーから単離することができる。さらにＴ−ｂｅｔ遺伝子の全部もしくは一部分を包含する核酸分子は配列番号１もしくは３の配列に基づき設計したオリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応により単離し得る。例えば、ｍＲＮＡを（例えばＣｈｉｒｇｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８：５２９４−５２９９のチオシアン酸グアニジウム抽出手順により）細胞から単離し得、そして逆転写酵素（例えばギブコ／ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、メリーランド州ベセスダから入手可能なモロニーＭＬＶ逆転写酵素；もしくはセイカガク  アメリカ  インク（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．）、フロリダ州セントピーターズバーグから入手可能なＡＭＶ逆転写酵素）を使用してｃＤＮＡを調製し得る。ＰＣＲ増幅のための合成オリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１もしくは３に示されるヌクレオチド配列に基づき設計が可能である。本発明の核酸は標準的ＰＣＲ増幅技術に従い、鋳型としてのｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡおよび適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅し得る。そのように増幅した核酸を適切なベクターにクローン化し、そしてＤＮＡ配列分析により特徴づけが可能である。さらに、Ｔ−ｂｅｔヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは例えば自動ＤＮＡ合成装置を使用する標準的合成技術により製造し得る。
【００９６】
配列番号１および３に示されるＴ−ｂｅｔヌクレオチド配列に加え、Ｔ−ｂｅｔのヌクレオチドもしくはアミノ酸配列の小さな変化につながるＤＮＡ配列の多形が集団内に存在しうることが当業者により認識されるであろう。Ｔ−ｂｅｔ遺伝子中のこうした遺伝子多形は自然な対立遺伝子変異により集団内の個体間で存在しうる。こうした自然の対立遺伝子変異は典型的には１遺伝子のヌクレオチド配列中に１〜２％の変化をもたらし得る。自然の対立遺伝子変異の結果であり、かつＴ−ｂｅｔの機能的活性を変えないＴ−ｂｅｔ中のありとあらゆるこうしたヌクレオチド変異および生じるアミノ酸の多形も、本発明の範囲内にあることを意図している。
【００９７】
本発明のＴ−ｂｅｔ  ＤＮＡの自然な対立遺伝子バリアントに対応する核酸分子は、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で標準的ハイブリダイゼーション技術に従って、ハイブリダイゼーションプローブとしてヒトＤＮＡもしくはその一部分を使用して本明細書に開示されるＴ−ｂｅｔ核酸分子に対するそれらの相同性に基づき単離が可能である。例示的な高ストリンジェンシー条件は、約４５℃の温度で数時間ないし一夜の６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）を含有するハイブリダイゼーションバッファー中でのハイブリダイゼーション、次いで約５０〜６５℃の温度での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含有する洗浄バッファー中での１もしくは複数回の洗浄を含む。従って、別の態様において、本発明の単離された核酸分子は配列番号１もしくは３のヌクレオチド配列を含んでなる第二の核酸分子に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。好ましくは、配列番号１もしくは３の配列番号の配列に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする本発明の単離された核酸分子。１つの態様では、こうした核酸分子は長さが少なくとも約７００、８００、９００、１０００、１２００、１３００、１４００、１５００もしくは１６００ヌクレオチドである。別の態様では、こうした核酸分子は配列番号１の少なくとも約７００、８００、９００、１０００、１２００、１３００、１４００、１５００もしくは１６００の連続するヌクレオチド、または配列番号３の少なくとも約５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００もしくは１５００の連続するヌクレオチドを含んでなる。好ましくは、単離された核酸分子はＴ−ｂｅｔ核酸分子の自然に生じる対立遺伝子バリアントに対応する。
【００９８】
集団中に存在し得るＴ−ｂｅｔ配列の自然に生じる対立遺伝子バリアントに加え、当業者は、配列番号１もしくは３のヌクレオチド配列中に突然変異により小さな変化を導入し、それによりＴ−ｂｅｔタンパク質の機能的活性を変えることなくコードされるタンパク質のアミノ酸配列に変化を導くことができるとさらに認識するであろう。例えば、「非必須の」アミノ酸残基でアミノ酸置換を導くヌクレオチド置換を配列番号１もしくは３の配列中に作成することができる。「非必須の」アミノ酸残基はＤＮＡと相互作用するその能力、またはＩＦＮ−γプロモーターからの転写を高めるその能力のようなＴ−ｂｅｔの機能的活性を変えることなくＴ−ｂｅｔの野性型配列（例えば配列番号１もしくは３の配列）から改変することができる残基であり、一方、「必須の」アミノ酸残基は機能的活性に必要とされる。
【００９９】
従って本発明の別の観点は、Ｔ−ｂｅｔ活性に必須でないアミノ酸残基の変化を含有するＴ−ｂｅｔタンパク質をコードする核酸分子に関する。そのようなＴ−ｂｅｔタンパク質は配列番号２もしくは４とアミノ酸配列が異なるが、それでもなおＴ−ｂｅｔ活性を保持する。Ｔ−ｂｅｔタンパク質の非天然のバリアントをコードする単離された核酸分子は、コードされるタンパク質に１もしくは複数のアミノ酸の置換、付加もしくは欠失が導入されるように配列番号１もしくは３のヌクレオチド配列中に１もしくは複数のヌクレオチドの置換、付加もしくは欠失を導入することにより作成することができる。突然変異は位置指定突然変異誘発およびＰＣＲ媒介性突然変異誘発のような標準的技術により配列番号１もしくは３に導入可能である。好ましくは、保存的アミノ酸置換を１もしくは複数の非必須アミノ酸残基で行う。「保存的アミノ酸置換」はアミノ酸残基を類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えるものである。塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝状側鎖（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当該技術分野で定義されている。従って、Ｔ−ｂｅｔ中の非必須なアミノ酸残基は、好ましくは同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置き換える。
【０１００】
あるいは別の態様では、突然変異は飽和突然変異誘発によるようにＴ−ｂｅｔのコーディング配列の全部もしくは一部に沿って無作為に導入可能であり、そして結果として生じる変異体は、ＤＮＡに結合するおよび／もしくは転写を活性化するそれらの能力についてスクリーニングして機能的活性を保持する突然変異体を同定することができる。突然変異誘発後に、コードされるＴ−ｂｅｔ変異体タンパク質を宿主細胞中で組換え的に発現させることができ、そしてＴ−ｂｅｔ活性を評価するための当該技術分野で利用可能なアッセイを使用して（例えばＤＮＡ中に存在するＴ−ｂｏｘ結合配列に結合する該タンパク質の能力を測定することにより、またはＩＬ−２の生産を調節する該タンパク質の能力を測定することにより）突然変異体タンパク質の機能的活性を測定することができる。
【０１０１】
本発明の別の観点はＴ−ｂｅｔ  ｍＲＮＡもしくは遺伝子のコーディング鎖に対しアンチセンスである単離された核酸分子に関する。本発明のアンチセンス核酸はＴ−ｂｅｔコーディング鎖全体もしくはその一部分のみに相補的であることができる。１つの態様では、アンチセンス核酸分子はタンパク質のＴ−ｂｅｔファミリーに独特であるか、または特定の種からのＴ−ｂｅｔ配列に独特であるＴ−ｂｅｔをコードするヌクレオチド配列のコーディング鎖のコーディング領域に対しアンチセンスである。別の態様において、アンチセンス核酸分子はタンパク質のＴ−ｂｅｔファミリーに独特であるか、または特定の種からのＴ−ｂｅｔ配列に独特であるＴ−ｂｅｔをコードするヌクレオチド配列のコーディング鎖の非コーディング領域に対しアンチセンスである。好適な態様では、本発明のアンチセンス分子は配列番号１の非コーディング鎖の少なくとも約７００の連続するヌクレオチド、より好ましくは配列番号１の非コーディング鎖の少なくとも８００、１０００、１２００、１４００もしくは１６００の連続するヌクレオチド、または配列番号３の非コーディング鎖の少なくとも約５００の連続するヌクレオチド、より好ましくは配列番号３の非コーディング鎖の少なくとも６００、８００、１０００、１２００もしくは１４００の連続するヌクレオチドを含んでなる。
【０１０２】
本明細書に開示されるＴ−ｂｅｔをコードするコーディング鎖配列（例えば配列番号１および３）が与えられれば、本発明のアンチセンス核酸はワトソンとクリックの塩基対形成の規則に従って設計が可能である。アンチセンス核酸分子はＴ−ｂｅｔ  ｍＲＮＡのコーディング領域全体に相補的であってよく、あるいはＴ−ｂｅｔ  ｍＲＮＡのコーディングもしくは非コーディング領域の一部分のみに対しアンチセンスであるオリゴヌクレオチドであることができる。例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｔ−ｂｅｔ  ｍＲＮＡの翻訳開始部位の周囲の領域に相補的である可能性がある。アンチセンスオリゴヌクレオチドは例えば長さが約１５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０ヌクレオチドであり得る。本発明のアンチセンス核酸は当該技術分野で既知の手順を使用した化学合成および酵素的連結反応を使用して構築し得る。例えば、アンチセンス核酸（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、自然に存在するヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増大させるかもしくはアンチセンスとセンス核酸との間で形成される二重鎖の物理的安定性を増大させるよう設計された様々に修飾されたヌクレオチドを使用して化学的合成が可能であり、例えばホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが使用可能である。あるいは、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンスの方向でサブクローニングされた発現ベクターを使用して生物学的に製造し得る（すなわち、挿入された核酸から転写されるＲＮＡは、以下の小区分にさらに記述される目的の標的核酸に対しアンチセンス方向のものであることができる）。
【０１０３】
別の態様では、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、それらが相補的領域を有するｍＲＮＡのような一本鎖核酸を切断することが可能であるリボヌクレアーゼ活性をもつ触媒的ＲＮＡ分子である。Ｔ−ｂｅｔをコードする核酸に対する特異性を有するリボザイムは、本明細書に開するＴ−ｂｅｔ遺伝子のヌクレオチド配列に基づき設計し得る。例えば、活性部位の塩基配列がＴ−ｂｅｔをコードするｍＲＮＡ中で切断される塩基配列に相補的であるテトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）のＬ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡの誘導体を構築し得る。例えばＣｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第４，９８７，０７１号明細書；およびＣｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第５，１１６，７４２号明細書を参照されたい。あるいは、Ｔ−ｂｅｔ  ｍＲＮＡを使用してＲＮＡ分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒的ＲＮＡを選択し得る。例えばＢａｒｔｅｌ，Ｄ．ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１４１１−１４１８を参照されたい。
【０１０４】
別の態様では、ＲＮＡｉを使用してＴ−ｂｅｔ発現を阻害することができる。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を使用してｄｓＲＮＡと同じ配列を含有するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分解する転写後の標的を定められた遺伝子サイレンシング技術である（Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ａ．ａｎｄ  Ｚａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．２８７、２４３１−２４３２（２０００）；Ｚａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １０１、２５−３３（２０００）。Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３、３１９１−３１９７（１９９９））。このプロセスは、内因性リボヌクレアーゼが、より長いｄｓＲＮＡを低分子干渉ＲＮＡすなわちｓｉＲＮＡと命名される、より短い２１もしくは２２ヌクレオチド長のＲＮＡに切断する場合に起こる。このより小さいＲＮＡセグメントがその後標的ｍＲＮＡの分解を媒介する。
【０１０５】
ＲＮＡｉのアンチセンスＲＮＡ鎖は、Ｔ−ｂｅｔのコーディング領域の少なくとも一部分またはＴ−ｂｅｔ遺伝子の５’もしくは３’非翻訳領域の少なくとも一部分に対しアンチセンスであり得る。１つの態様において、ｓｉＲＮＡ二重鎖は２ｎｔの３’オーバーハングを有するための様式で対にされた２１ｎｔのセンスおよび２１ｎｔのアンチセンス鎖から構成される。１つの態様ではオーバーハング中にＴＴを伴うｓｉＲＮＡ配列。標的領域は例えば開始コドンの５０ないし１００ｎｔ下流であり得、３’−ＵＴＲもまた標的とされうる。１つの態様において、２３ｎｔの配列モチーフＡＡ（Ｎ１９）ＴＴ（Ｎ、任意のヌクレオチド）を探索し、そして約３０〜７０％の間のＧ／Ｃ含量を伴うヒットを選択し得る。適する配列が見出されない場合は、モチーフＮＡ（Ｎ２１）を使用して検索を拡大する。ｓｉＲＮＡは好ましくは適切に保護されたリボヌクレオシドホスホルアミダイトおよび通例のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を使用して化学的に合成する。ｓｉＲＮＡは例えばダーマコン（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ゼラゴン社（Ｘｅｒａｇｏｎ  Ｉｎｃ）、プロリゴ（Ｐｒｏｌｉｇｏ）およびアムビオン（Ａｍｂｉｏｎ）からも商業的に入手可能である。１つの態様において、アンチセンスＲＮＡでの使用について上述された化学の１もしくは複数を使用することができる。
【０１０６】
本発明のさらに別の観点は、Ｔ−ｂｅｔ融合タンパク質をコードする単離された核酸分子に関する。非Ｔ−ｂｅｔタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列に作動可能に連結されたＴ−ｂｅｔタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドをコードする少なくとも１種の第一のヌクレオチド配列を含んでなるこうした核酸分子が、標準的組換えＤＮＡ技術により調製可能である。Ｔ−ｂｅｔ融合タンパク質は下の小区分ＩＩＩにさらに詳細に記述する。
【０１０７】
ＩＩ．組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明の別の観点は、Ｔ−ｂｅｔ（もしくはその一部分）をコードする核酸を含有するベクター、好ましくは組換え発現ベクターに関する。本発明の発現ベクターは宿主細胞中での核酸の発現に適する形態の本発明の核酸を含んでなり、これは組換え発現ベクターが、発現されるべき核酸配列に作動可能に連結されている、発現に使用されるべき宿主細胞に基づいて選択された１もしくは複数の制御配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター内で、「作動可能に連結される」は、目的のヌクレオチド配列が（例えばインビトロ転写／翻訳系で、またはベクターが宿主細胞中に導入される場合は宿主細胞中で）、ヌクレオチド配列の発現を可能とする様式で制御配列（１もしくは複数）に連結されることを意味することを意図している。「調節配列」という用語はプロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節要素（例えばポリアデニル化シグナル）を包含する。そのような調節配列は例えばＧｏｅｄｄｅｌ；遺伝子発現技術（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、アカデミック  プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）に記載されている。調節配列は、多くの型の宿主細胞中でのヌクレオチド配列の構成的発現を指図するもの、および特定の宿主細胞中でのみ該ヌクレオチド配列の発現を指図するもの（例えば組織特異的調節配列）を含む。発現ベクターの設計は形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベル等のような因子に依存しうることが当業者により認識されるであろう。本発明の発現ベクターを宿主細胞中に導入し、それにより本明細書に記述される核酸によりコードされる融合タンパク質もしくはペプチド（例えばＴ−ｂｅｔタンパク質、突然変異体の形態のＴ−ｂｅｔタンパク質、Ｔ−ｂｅｔ融合タンパク質など）を含むタンパク質またはペプチドを生産することができる。
【０１０８】
本発明の組換え発現ベクターは原核生物もしくは真核生物細胞中でのＴ−ｂｅｔタンパク質発現のために設計することができる。例えば、Ｔ−ｂｅｔは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用する）、酵母細胞もしくは哺乳動物細胞中で発現させることができる。適切な宿主細胞はＧｏｅｄｄｅｌ、遺伝子発現技術：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、アカデミック  プレス、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）でさらに論考されている。あるいは組換え発現ベクターは、例えばＴ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを使用してインビトロで転写し、そして翻訳してもよい。
【０１０９】
原核生物中でのタンパク質の発現は、融合もしくは非融合のいずれかのタンパク質の発現を指図する構成的もしくは誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で最も多く行われる。融合ベクターは、その中にコードされるタンパク質に、通常は該組換えタンパク質のアミノ末端に多数のアミノ酸を付加する。そのような融合ベクターは１もしくは複数の目的、すなわち：１）組換えタンパク質の発現を増大させる；２）組換えタンパク質の溶解性を増大させる；３）アフィニティ精製においてリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製を補助する；４）タンパク質の検出および／もしくは精製を補助するためのエピトープ標識を提供する；かつ／または５）タンパク質の検出を補助するためのマーカー（例えばβ−ガラクトシダーゼ融合物を使用する色マーカー）を提供する、にかなうことができる。しばしば融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解性切断部位が融合部分および組換えタンパク質の接合部に導入され、融合タンパク質の精製後に融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能にする。そのような酵素およびそれらのコグネイト認識配列は、第Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼを含む。典型的な融合発現ベクターは、標的組換えタンパク質にそれぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質もしくはプロテインＡをそれぞれ融合するｐＧＥＸ（ファルマシア  バイオテック社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）；Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（ニュー  イングランド  バイオラボス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、マサチューセッツ州ビバリー）およびｐＲＩＴ５（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を含む。また組換えタンパク質は、上で検討されたもの同じ目的で融合タンパク質として真核生物細胞中でも発現させることができる。
【０１１０】
適切な誘導性の非融合大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ  １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，遺伝子発現技術：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、アカデミック  プレス、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）６０−８９）を含む。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼの転写に依存する。ｐＥＴ  １１ｄベクターからの標的遺伝子発現は、共発現されるウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７  ｇｎｌ）により媒介されるＴ７  ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルスのポリメラーゼはｌａｃＵＶ  ５プロモーターの転写制御下にＴ７  ｇｎｌ遺伝子をもつ常在性λプロファージから宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）もしくはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）により供給される。
【０１１１】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での組換えタンパク質発現を最大にする１つの方法は、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する損なわれた能力をもつ宿主細菌中で該タンパク質を発現することである（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｓ．、遺伝子発現技術：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、アカデミック  プレス、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）１１９−１２８）。別の方法は、各アミノ酸の個々のコドンが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で優先的に利用されるものとなるように、発現ベクター中に挿入されるべき核酸の核酸配列を改変することである（Ｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８）。本発明の核酸配列のそのような改変は標準的ＤＮＡ合成技術により実施可能である。
【０１１２】
別の態様において、Ｔ−ｂｅｔ発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母、ビール酵母菌（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）中での発現のためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ  ａｎｄ  Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、（１９８２）Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３）およびｐＹＥＳ２（インビトロジェン  コーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、カリフォルニア州サンディエゴ）を含む。
【０１１３】
あるいは、Ｔ−ｂｅｔはバキュロウイルス発現ベクターを使用して昆虫細胞中で発現させることができる。培養された昆虫細胞（例えばＳｆ９細胞）中でのタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターは、ｐＡｃ系列（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬ系列（Ｌｕｃｋｌｏｗ，Ｖ．Ａ．ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．，（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９）を含む。
【０１１４】
さらに別の態様では、本発明の核酸は哺乳動物発現ベクターを使用して哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物発現ベクターの例には、ｐＭｅｘ−ＮｅｏＩ、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．，（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）、ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７−１９５）を含む。哺乳動物細胞中で使用される場合、発現ベクターの制御機能はしばしばウイルスの調節要素により提供される。例えば、通常に使用されるプロモーターはポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびＳＶ４０由来である。
【０１１５】
別の態様において、組換え哺乳動物発現ベクターは特定の細胞型中で優先的に核酸の発現を指図することが可能である（例えば核酸を発現させために組織特異的調節要素を使用する）。組織特異的調節要素は当該技術分野で既知である。適する組織特異的プロモーターの非限定的例には、リンパ組織特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ  ａｎｄ  Ｅａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、とりわけＴ細胞受容体（Ｗｉｎｏｔｏ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ．８：７２９−７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７２９−７４０；Ｑｕｅｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７４１−７４８）のプロモーター、アルブミンプロモーター（肝特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、ニューロン特異的プロモーター（例えばニューロフィラメントプロモーター；Ｂｙｒｎｅ  ａｎｄ  Ｒｕｄｄｌｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５４７３−５４７７）、膵特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９１２−９１６）ならびに乳腺特異的プロモーター（例えばミルクホエイプロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号明細書および欧州特許出願公開第２６４，１６６号明細書）を含む。発生的に調節されるプロモーター、例えばマウスｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ  ａｎｄ  Ｇｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（ＣａｍｐｅｓとＴｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）もまた包含される。
【０１１６】
さらに、哺乳動物細胞中で使用するための誘導性の調節系、例えば遺伝子発現が重金属イオン（例えばＭａｙｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８２）Ｃｅｌｌ  ２９：９９−１０８；Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２；Ｓｅａｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５：１４８０−１４８９を参照されたい）、熱ショック（例えばＮｏｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ、Ｎｏｕｅｒ，Ｌ．編、ＣＲＣ、フロリダ州ボカレイトン中、ｐｐ１６７−２２０を参照されたい）、ホルモン（例えばＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９４：２２８−２３２；Ｈｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０３８−２０４２；Ｋｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：７３４−７３６；Ｉｓｒａｅｌ  ａｎｄ  Ｋａｕｆｍａｎ（１９８９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７：２５８９−２６０４；およびＰＣＴ国際公開第Ｏ  ９３／２３４３１号パンフレットを参照されたい）、ＦＫ−５０６関連分子（例えばＰＣＴ国際公開第Ｏ  ９４／１８３１７号パンフレットを参照されたい）、もしくはテトラサイクリン（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．ａｎｄ  Ｂｕｊａｒｄ，Ｈ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５５４７−５５５１；Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：１７６６−１７６９；ＰＣＴ国際公開第９４／２９４４２号パンフレット；およびＰＣＴ国際公開第９６／０１３１３号パンフレットを参照されたい）により調節される系が当該技術分野で既知である。従って別の態様では、本発明はＴ−ｂｅｔ  ＤＮＡが誘導性の真核生物プロモーターに作動可能に連結されてそれにより真核生物細胞中でのＴ−ｂｅｔタンパク質の誘導性発現を可能にする組換え発現ベクターを提供する。
【０１１７】
本発明はさらに、発現ベクターにアンチセンスの向きでクローン化された本発明のＤＮＡ分子を含んでなる組換え発現ベクターを提供する。すなわち、ＤＮＡ分子はＴ−ｂｅｔ  ｍＲＮＡに対しアンチセンスであるＲＮＡ分子の（ＤＮＡ分子の転写による）発現を可能とする様式で制御配列に作動可能に連結される。多様な細胞型でのアンチセンスＲＮＡ分子の継続的発現を指図する、アンチセンス方向でクローン化された核酸に作動可能に連結された調節配列を選ぶことができ、例えばアンチセンスＲＮＡの構成的、組織特異的もしくは細胞型特異的発現を指図するウイルスプロモーターおよび／もしくはエンハンサーまたは調節配列を選ぶことができる。アンチセンス発現ベクターは、高効率の調節領域の制御下にアンチセンス核酸が生産される組換えプラスミド、ファジェミドもしくは弱毒化ウイルスの形態にあることができ、その活性はベクターが導入される細胞型により決定され得る。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の論考についてはＷｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，遺伝子分析用の分子ツールとしてのアンチセンスＲＮＡ（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｓ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ）、Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｖｏｌ．１（１）１９８６を参照されたい。
【０１１８】
本発明の別の観点は、本発明のベクター、好ましくは組換え発現ベクターが導入されている組換え宿主細胞に関する。宿主細胞は任意の原核生物もしくは真核生物細胞でよい。例えば、Ｔ−ｂｅｔタンパク質は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌細胞、昆虫細胞、酵母もしくは哺乳動物細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）もしくはＣＯＳ細胞のような）中で発現させることができる。他の適する宿主細胞が当業者に既知である。ベクターＤＮＡは通常の形質転換もしくはトランスフェクション技術を介して原核生物もしくは真核生物細胞中に導入し得る。本明細書で使用される用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介型トランスフェクション、リポフェクションまたは電気穿孔法を含め、宿主細胞中に外来核酸（例えばＤＮＡ）を導入するための多様な技術的に認識される技術を指すことを意図している。宿主細胞の適切な形質転換もしくはトランスフェクション法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（モレキュラークローニング：ア  ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第２版、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー  プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ）（１９８９））および他の実験室手引き書に見出すことができる。
【０１１９】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションのために、使用する発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞の小部分のみがそれらのゲノム中に外来ＤＮＡを組込み得ることが知られている。これらの組込み体を同定かつ選択するために、選択可能なマーカー（例えば抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子を一般に目的の遺伝子と一緒に宿主細胞に導入する。好ましい選択可能なマーカーはＧ４１８、ヒグロマイシンおよびメトトレキサートのような化合物に対する耐性を賦与するものを含む。選択可能なマーカーをコードする核酸は、Ｔ−ｂｅｔをコードするものと同じベクター上で宿主細胞に導入してよく、または別個のベクター上で導入してよい。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は化合物選択により同定可能である（例えば、選択可能なマーカー遺伝子を組込んだ細胞は生き残ることができる一方、他の細胞は死ぬ）。
【０１２０】
培養物中の原核生物もしくは真核生物宿主細胞のような本発明の宿主細胞を使用して、Ｔ−ｂｅｔタンパク質を生産（すなわち発現）させることができる。従って本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用したＴ−ｂｅｔタンパク質の製造方法を提供する。１つの態様では、この方法は本発明の宿主細胞（Ｔ−ｂｅｔをコードする組換え発現ベクターが導入されている）をＴ−ｂｅｔが生産されるまで適する培地中で培養することを含んでなる。別の態様では、この方法は培地もしくは宿主細胞からＴ−ｂｅｔを単離することをさらに含んでなる。自然な形態で、Ｔ−ｂｅｔタンパク質は細胞内タンパク質であり、従って組換えＴ−ｂｅｔタンパク質は組換え宿主細胞中で細胞内で発現され得、そして次いで例えば宿主細胞を溶解すること、そしてライセートから組換えＴ−ｂｅｔタンパク質を回収することにより宿主細胞から単離することができる。あるいは、組換えＴ−ｂｅｔタンパク質はタンパク質が宿主細胞から分泌されるように、タンパク質のアミノ末端に異種シグナル配列を作動可能に連結することにより細胞外タンパク質として調製することができる。この場合、組換えＴ−ｂｅｔタンパク質は細胞を培養する培地基から回収可能である。
【０１２１】
本発明のある宿主細胞は非ヒトトランスジェニック動物を作出するためにもまた使用可能である。例えば１つの態様において、本発明の宿主細胞は、Ｔ−ｂｅｔコーディング配列が導入されている受精卵母細胞もしくは胚幹細胞である。次いでそのような宿主細胞を使用して、外因性のＴ−ｂｅｔ配列がそれらのゲノム中に導入されている非ヒトトランスジェニック動物、または内因性のＴ−ｂｅｔ配列が改変されている相同的組換え動物を作出することができる。こうした動物はＴ−ｂｅｔの機能および／または活性を研究するため、ならびにＴ−ｂｅｔ活性の調節物質を同定かつ／または評価するために有用である。従って本発明の別の観点は、Ｔ−ｂｅｔタンパク質もしくはＴ−ｂｅｔタンパク質の一部分をコードする導入遺伝子を運ぶ細胞を含有する非ヒトトランスジェニック動物に関する。本発明のトランスジェニック動物の一下位態様（ｓｕｂｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）において、導入遺伝子は内因性のＴ−ｂｅｔタンパク質をコードする内因性遺伝子を改変する（例えば、内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子が機能的に破壊もしくは「ノックアウト」されているか、または内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子のヌクレオチド配列が突然変異されているか、または内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子の転写調節領域が改変されている相同的組換え動物）。
【０１２２】
本発明のトランスジェニック動物は、Ｔ−ｂｅｔをコードする核酸を例えば微小注入法により受精卵母細胞の雄性前核中に導入すること、そしてこの卵母細胞を偽妊娠の雌性育成動物中で発生させることにより作出することができる。配列番号１もしくは３のＴ−ｂｅｔヌクレオチド配列を導入遺伝子として非ヒト動物のゲノム中に導入することができる。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルもまた、導入遺伝子の発現の効率を増大させるために導入遺伝子中に包含し得る。組織特異的調節配列（１もしくは複数）をＴ−ｂｅｔ導入遺伝子に作動可能に連結してＴ−ｂｅｔタンパク質の発現を特定の細胞に向かわせることが可能である。胚操作および微小注入を介するトランスジェニック動物、とりわけマウスのような動物の作出方法は当該技術分野で常法となっており、そして例えば、双方ともＬｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，による米国特許第４，７３６，８６６号および同第４，８７０，００９号明細書、Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，による米国特許第４，８７３，１９１号明細書、ならびにＨｏｇａｎ，Ｂ．、マウス胚の操作（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ）、（コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー  プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８６）に記載されている。類似の方法を他のトランスジェニック動物の作出で使用する。トランスジェニック創始体動物はそのゲノム中のＴ−ｂｅｔ導入遺伝子の存在および／または動物の組織もしくは細胞中でのＴ−ｂｅｔ  ｍＲＮＡの発現に基づき同定することができる。次いでトランスジェニック創始体動物を使用して導入遺伝子を持つさらなる動物を繁殖させることができる。さらに、Ｔ−ｂｅｔをコードする導入遺伝子を持つトランスジェニック動物を、他の導入遺伝子を持つ他のトランスジェニック動物とさらに交配させることができる。
【０１２３】
相同的組換え動物を作出するために、欠失、付加もしくは置換が導入され、それにより内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子を改変する、例えば機能的に破壊する、Ｔ−ｂｅｔ遺伝子の少なくとも一部分を含有するベクターを調製する。１つの態様では、相同的組換えに際して内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子が機能的に破壊される（すなわちもはや機能的タンパク質をコードしない；「ノックアウト」ベクターともまた称される）ように、相同的組換えベクターを設計する。あるいは相同的組換えに際して内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子が該Ｔ−ｂｅｔ遺伝子で置き換えるためにベクターを設計することができる。相同的組換えベクターにおいて、Ｔ−ｂｅｔ遺伝子の改変された部分は、その５’および３’端でＴ−ｂｅｔ遺伝子のさらなる核酸により隣接され、該ベクターにより運搬される外因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子と胚幹細胞中の内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子との間で相同的組換えを起こさせる。さらなる隣接するＴ−ｂｅｔ核酸は内因性遺伝子との成功裏の相同的組換えに十分な長さのものである。典型的には、数キロ塩基の隣接ＤＮＡ（５’および３’双方の端で）がベクター中に包含される（例えば、相同的組換えベクターの記載についてＴｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ．ａｎｄ  Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．（１９８７）Ｃｅｌｌ  ５１：５０３を参照されたい）。ベクターを（例えば電気穿孔法により）胚幹細胞系に導入し、そして導入されたＴ−ｂｅｔ遺伝子が内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子と相同的に組換わった細胞を選択する（例えばＬｉ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６９：９１５を参照されたい）。次いで選択された細胞を動物（例えばマウス）の胚盤胞に注入して凝集キメラを形成させる（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．、奇形ガンおよび胚性幹細胞：実践的取り組み（Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）、Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（ＩＲＬ、オックスフォード、１９８７）中、ｐｐ．１１３−１５２を参照されたい）。次いでキメラ胚を適する偽妊娠雌性育成動物に埋植し、そして胚を分娩までもたらし得る。それらの生殖細胞中に相同的に組換えられたＤＮＡを持つ子孫を使用して、動物の全細胞が導入遺伝子の生殖系列伝達により相同的に組換えられたＤＮＡを含有する動物を繁殖することができる。相同的組換えベクターおよび相同的組換え動物の構築方法は、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２：８２３−８２９ならびにＬｅ  Ｍｏｕｅｌｌｅｃ  ｅｔ  ａｌ．による国際公開第９０／１１３５４号パンフレット；Ｓｍｉｔｈｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．による同第９１／０１１４０号パンフレット；Ｚｉｊｌｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．による同第９２／０９６８号パンフレット；およびＢｅｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．による同第９３／０４１６９号パンフレットにさらに記載されている。
【０１２４】
前述に加え、当業者は相同的組換えのための当該技術分野で既知の他の取り組みが本発明に適用し得ることを認識するであろう。酵素支援型の部位特異的組込み系が当該技術分野で既知であり、そして第二の標的ＤＮＡ分子中の予め決められた位置にＤＮＡ分子を組込むために応用可能である。こうした酵素支援型の組込み系の例は、Ｃｒｅリコンビナーゼ−ｌｏｘ標的系（例えばＢａｕｂｏｎｉｓ，Ｗ．ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，Ｂ．（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：２０２５−２０２９；およびＦｕｋｕｓｈｉｇｅ，Ｓ．ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，Ｂ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７９０５−７９０９に記載されているような）、ならびにＦＬＰリコンビナーゼ−ＦＲＴ標的系（例えばＤａｎｇ，Ｄ．Ｔ．ａｎｄ  Ｐｅｒｒｉｍｏｎ，Ｎ．（１９９２）Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１３：３６７−３７５：およびＦｉｅｒｉｎｇ，Ｓ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：８４６９−８４７３に記載されているような）を含む。ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／２９４４２号パンフレットおよびＰＣＴ公開第ＷＯ９６／０１３１３号パンフレットに記載されるようなテトラサイクリン調節型の誘導性の相同的組換え系もまた使用することができる。
【０１２５】
別の態様では、Ｔ−ｂｅｔが例えばＣＤ４エンハンサーを使用して全Ｔ細胞中で発現されるトランスジェニック動物を作出し得る（Ｚｈｅｎｇ，Ｗ−Ｐ．＆  Ｆｌａｖｅｌｌ，Ｒ．Ａ．１９９７．Ｃｅｌｌ  ８９、５８７）。最近の研究は，ＣＤ２エンハンサーもまた使用し得ることを示唆している。事実、それはＴ細胞中での高レベル発現を達成するためにさらに有力であり、発現は変動せず、しかも導入遺伝子発現はコピー数依存性である（Ｚｈｕｍａｂｅｋｏｖ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１８５、１３３；Ｓｈａｒｐ，Ｌ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７、６０９）。Ｔ−ｂｅｔ  ＲＮＡの高レベル発現を伴うマウス（導入遺伝子に駆動されるＴ−ｂｅｔ  ＲＮＡを内因性のＴ−ｂｅｔと識別するためのプローブとしてヒト成長ホルモンイントロンを使用する）は、十分な数の創始体をスクリーニングすることにより同定可能である。
【０１２６】
別の取り組みにおいて、ドミナントリプレッサー（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）トランスジェニックを作出することができる。例えば、ドミナントリプレッサーのＴ−ｂｅｔは近位ｌｃｋエンハンサーを使用することにより作成することができ（Ａｌｂｅｒｏｌａ−Ｉｌａ，Ｊ．ら  １９９６  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４、９）、Ｔ−ｂｅｔおよびｅｎｇｒａｉｌｅｄの融合の駆動を作成することができる（Ｔａｙｌｏｒ，Ｄ．、１９９６．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１０、２７３２；Ｌｉ，Ｊ．、Ｔｈｕｒｍ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１０８８５）。この構築物は多量体化したＴ−ｂｅｔレポーターのＴ−ｂｅｔトランス活性化を特異的に抑制し、しかもＮＦＡＴ依存性のレポーターのトランス活性化に影響を及ぼさない。
【０１２７】
あるいは、無発現変異をＥＳ細胞中での標的を定めた突然変異誘発により生成し得る（Ｒａｎｇｅｒ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｎａｔｕｒｅ  ３９２、１８６；Ｈｏｄｇｅ，Ｍ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．１９９６．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４：１．、１４４；Ｇｒｕｓｂｙ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．１９９１．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３、１４１７；Ｒｅｉｍｏｌｄ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６．Ｎａｔｕｒｅ  ３７９：２６２；Ｋａｐｌａｎ，Ｍ．Ｈ．、１９９６．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ：３１３；Ｋａｐｌａｎ，Ｍ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．１９９６．Ｎａｔｕｒｅ  ３８２、１７４；Ｓｍｉｌｅｙ，Ｓ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５、９７７）。例えば当該技術分野で既知である技術を使用して、ゲノムＴ−ｂｅｔクローンをゲノムライブラリーから単離し、イントロン−エキソンの構成を描き、そして第一のエキソンおよび上流のプロモーター配列の４５０ｂｐが欠失されているはずであるｃｒｅ−ｌｏｘベクター（下の検討を参照されたい）中のターゲッティング構築物を作成することができる。この構築物をＥＳ細胞系中に電気穿孔し、そしてサザンブロット分析により二重化合物耐性（例えばネオマイシン、ガンシクロビル）クローンを同定することができる。次いでＴ−ｂｅｔ遺伝子座に相同的組換え事象をもつクローンを同定し、そして第３．５日のＢＡＬＢ／ｃ妊娠マウスから得られた胚盤胞に注入することができる。次いでキメラマウスを作出することができ、そして野性型ＢＡＬＢ／ｃマウスと交配して破壊されたＴ−ｂｅｔ遺伝子の生殖系列伝達を生成できる。
【０１２８】
別の態様では、ＲＡＧ−２欠損胚盤胞中への埋植（Ｃｈｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．１９９３．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０、４５２８）もしくはｃｒｅ−ｌｏｘ誘導性の欠失取り組みを使用して、免疫系中でのみＴ−ｂｅｔを欠いているマウスを発生させることができる。例えば、ターゲッティング構築物をｃｒｅ−ｌｏｘベクター中で作成し得る。胚盤胞補完系を使用してＮＦＡＴｃ（胚の致死的表現型）が研究されている（Ｒａｎｇｅｒ，Ａ．Ｍ．ら  １９９８．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ８：１２５）。この取り組みはＥＳ細胞中の双方の染色体上のＴ−ｂｅｔ遺伝子を破壊させることを必要とし、それは例えば記載されている（Ｃｈｅｎ，Ｊ．１９９３．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０；４５２８）とおり、変異体ネオマイシン遺伝子を使用すること、およびＥＳ培養物中のＧ４１８濃度を上昇させることにより、あるいはｎｅｏ遺伝子にｃｒｅ−ｌｏｘ部位を隣接させることにより達成することができる。第二の対立遺伝子を破壊するために、ＥＳクローンをｃｒｅリコンビナーゼでトランスフェクトすることによりネオマイシン遺伝子を欠失させることができ、次いでＥＳクローンを同じターゲッティング構築物で再トランスフェクトして双方の対立遺伝子上にＴ−ｂｅｔ欠失を伴うクローンを選択し得る。ｃｒｅリコンビナーゼでの第三のトランスフェクションが所望の二重欠損ＥＳ細胞を生じる。次いでそのような二重にターゲッティングしたＥＳ細胞をＲＡＧ２胚盤胞に埋植し、そしてこのように生成させたキメラマウスのリンパ系器官は移入されたＥＳ細胞により完全にコロニー形成される。これはＴ−ｂｅｔの不存在が致死性を引き起こすかもしれない他の器官系に影響を及ぼすことなくリンパ系の細胞に対するＴ−ｂｅｔの不存在の影響の評価を可能にする。
【０１２９】
ｃｒｅ−ｌｏｘ系を使用する条件消失（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ａｂｌａｔｉｏｎ）の取り組みもまた使用可能である。簡単に説明すると、欠失されるべきエキソンに隣接するイントロン領域中に、ｌｏｘ組換え配列が置かれているターゲッティング構築物を生成する。次いでこの構築物をＥＳ細胞にトランスフェクトし、そして変異体マウスを上記のとおり作出する。生じる変異体マウスは次いで、誘導性プロモーターにより駆動されるｃｒｅリコンビナーゼに関してトランスジェニックのマウスと交配させる。ｃｒｅが発現される場合にそれはＴ−ｂｅｔ遺伝子中に導入されたｌｏｘ部位間の組換えを誘導し、従って遺伝子機能を効果的に破壊する。このアプローチの重要な特徴は、ｃｒｅリコンビナーゼを活性化することにより、成体動物中で随意に遺伝子破壊を誘導し得ることである。
【０１３０】
組織特異的プロモーターは免疫系の外の器官の異常を回避するために使用することができる。ｃｒｅを発現する導入遺伝子は誘導可能なプロモーターにより駆動され得る。いくつかの誘導性の系が現在ｃｒｅ−ｌｏｘ組換え法で使用されており、最も一般的なものはテトラサイクリンおよびエクジソン系である。Ｔ−ｂｅｔヌルマウスで胚の致死性が存在する場合には、組織特異的な誘導性プロモーターの使用が可能である。
【０１３１】
代替的取り組みは、調節されたＴ−ｂｅｔ遺伝子をもつトランスジェニックマウスを作出し（例えばテトラサイクリンオフプロモーターを使用して；例えばＳｔ−Ｏｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９６．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２４、３８７５−３８７７）、次いでこのトランスジェニックをＴ−ｂｅｔ欠損マウスと交配させることである。この取り組みは正常なＴ−ｂｅｔ機能をもつマウスの作出を可能にし；テトラサイクリンを成体動物に投与して末梢Ｔ細胞でのＴ−ｂｅｔ機能の破壊を誘導することができ、次いでＴ−ｂｅｔ欠損の影響を長期間にわたり検査することができる。化合物（テトラサイクリン）の供給およびその後の除去の反復周期が、Ｔ−ｂｅｔ遺伝子のスイッチを随意に入れるおよび切ることを可能にする。
【０１３２】
ＩＩＩ．単離されたＴ−ｂｅｔタンパク質および抗Ｔ−ｂｅｔ抗体
本発明の別の観点は単離されたＴ−ｂｅｔタンパク質に関する。好ましくは、Ｔ−ｂｅｔタンパク質は配列番号１もしくは３によりコードされるアミノ酸配列を含んでなる。別の好ましい態様において、該タンパク質は配列番号２もしくは４のアミノ酸配列を含んでなる。他の態様において、該タンパク質は配列に番号２もしくは４に示されるアミノ酸配列と最低６０％のアミノ酸同一性、より好ましくは７０％のアミノ酸同一性、より好ましくは８０％、およびなおより好ましくは９０％もしくは９５％のアミノ酸同一性を有する。
【０１３３】
他の態様において、本発明はＴ−ｂｅｔタンパク質の単離された部分を提供する。例えば、本発明はＴ−ｂｏｘドメインを含むＴ−ｂｅｔのアミノ末端部分をさらに包含する。多様な態様において、このアミノ末端部分はヒトＴ−ｂｅｔの少なくともアミノ酸１３８〜３２７、またはマウスＴ−ｂｅｔの少なくともアミノ酸１３７〜３２６を包含する。本発明により提供されるＴ−ｂｅｔの別の単離された部分は、チロシンリン酸化部位を包含する一部分である。この部分はＴ−ｂｅｔの少なくとも約２０、少なくとも約５０、少なくとも約１００、または少なくとも約２００アミノ酸を含んでなり、またヒトＴ−ｂｅｔの少なくともアミノ酸Ｔｙｒ７６、Ｔｙｒ１１９および／もしくはＴｙｒ５３１、またはマウスＴ−ｂｅｔのアミノ酸Ｔｙｒ５２５を含む。本明細書で提供されるＴ−ｂｅｔのさらに別の単離された部分は、ヒトＴ−ｂｅｔのアミノ酸４９８〜５０１、またはマウスＴ−ｂｅｔの４９３〜４９６に示される核局在化配列を包含する一部分である。本明細書で提供する別の単離されたＴ−ｂｅｔの部分は、セリンリン酸化部位を包含する部分である。この部分は少なくとも約２０、少なくとも約５０、少なくとも約１００、または少なくとも約２００個のＴ−ｂｅｔのアミノ酸を含んでなり、そして少なくともヒトＴ−ｂｅｔのアミノ酸Ｓｅｒ５０８、またはマウスＴ−ｂｅｔのアミノ酸Ｓｅｒ５０７を含む。
【０１３４】
本発明のＴ−ｂｅｔタンパク質は好ましくは組換えＤＮＡ技術により製造される。例えば、タンパク質をコードする核酸分子を発現ベクター（上記のような）にクローン化し、発現ベクターを宿主細胞（上記のような）に導入し、そしてＴ−ｂｅｔタンパク質を宿主細胞中で発現させる。次いで標準的タンパク質精製技術を使用する適切な精製スキームによりＴ−ｂｅｔタンパク質を細胞から単離することができる。組換え発現に代わり、標準的ペプチド合成技術を使用してＴ−ｂｅｔポリペプチドを化学的に合成することができる。さらに、天然のＴ−ｂｅｔタンパク質は例えば抗Ｔ−ｂｅｔ抗体を使用する免疫沈降により細胞（例えばＴ細胞）から単離することができる。
【０１３５】
本発明はＴ−ｂｅｔアゴニスト（模倣物）もしくはＴ−ｂｅｔアンタゴニストのいずれかとして機能するＴ−ｂｅｔタンパク質のバリアントにもまた関する。Ｔ−ｂｅｔタンパク質のバリアントはＴ−ｂｅｔタンパク質の突然変異誘発、例えば別個の点突然変異もしくは短縮により生成することができる。すなわち制限された機能のバリアントでの処置により特異的な生物学的影響を誘導することができる。１つの態様において、自然に存在する形態のタンパク質の生物学的活性の１サブセットを有するバリアントでの個体の処置は、自然に存在する形態のＴ−ｂｅｔタンパク質での処置に比べて個体中でより少ない副作用を有する。１つの態様において、本発明は酸化、還元もしくは当該技術分野で既知の他の誘導体化方法によりＴ−ｂｅｔの少なくとも１個のアミノ酸残基を修飾することにより形成し得るＴ−ｂｅｔの誘導体に関する。
【０１３６】
１つの態様において、Ｔ−ｂｅｔアゴニスト（模倣物）もしくはＴ−ｂｅｔアンタゴニストのいずれかとして機能するＴ−ｂｅｔタンパク質のバリアントは、Ｔ−ｂｅｔタンパク質の突然変異体、例えば短縮突然変異体のコンビナトリアルライブラリーを、Ｔ−ｂｅｔタンパク質アゴニストもしくはアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることにより同定することができる。１つの態様において、Ｔ−ｂｅｔバリアントの多様なライブラリーは核酸レベルでのコンビナトリアル突然変異誘発により生成され、そして多様な遺伝子ライブラリーによりコードされる。Ｔ−ｂｅｔバリアントの多様なライブラリーは例えば潜在的なＴ−ｂｅｔ配列の縮重組を個々のポリペプチドとしてあるいはその中にＴ−ｂｅｔ配列の組を含有する一組のより大きい融合タンパク質（例えばファージディスプレイのために）として発現可能となるように、遺伝子配列中に合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素的に連結することにより製造し得る。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的Ｔ−ｂｅｔバリアントのライブラリーを製造するために使用できる多様な方法が存在する。縮重遺伝子配列の化学合成は自動ＤＮＡ合成装置で行い、そして合成遺伝子をその後に適切な発現ベクターに連結することができる。遺伝子の縮重組の使用は所望の組の潜在的Ｔ−ｂｅｔ配列をコードする配列の全部の一混合物での供給を可能とする。縮重オリゴヌクレオチドの合成方法は当該技術分野で既知である（例えばＮａｒａｎｇ，Ｓ．Ａ．、１９８３、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．、１９８４、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．、１９８４  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６；Ｉｋｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９８３、Ｎｕｃｌｅｉｄ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１１：４７７を参照されたい）。
【０１３７】
加えて、Ｔ−ｂｅｔタンパク質コーディング配列のフラグメントのライブラリーを使用して、Ｔ−ｂｅｔタンパク質のバリアントのスクリーニングおよびその後の選択のためにＴ−ｂｅｔフラグメントの多様な集団を生成させることができる。１つの態様において、ニッキングが１分子あたり約１回のみ起こる条件下で、Ｔ−ｂｅｔコーディング配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントをヌクレアーゼで処理すること、二本鎖ＤＮＡを変性させること、ＤＮＡを再生させて多様なニックの生成物からセンス／アンチセンス対を包含し得る二本鎖ＤＮＡを形成させること、再形成された二重鎖からＳ１ヌクレアーゼでの処理により一本鎖部分を除去すること、および生じるフラグメントライブラリーを発現ベクターに連結することにより、コーディング配列のフラグメントのライブラリーを生成させることができる。この方法により、多様な大きさのＴ−ｂｅｔタンパク質のＮ末端、Ｃ末端および内的フラグメントをコードする発現ライブラリーを生成することができる。
【０１３８】
点突然変異もしくは短縮により作成したコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、および選択された特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのいくつかの技術が当該技術分野で既知である。そのような技術はＴ−ｂｅｔタンパク質のコンビナトリアル突然変異誘発により生成させた遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適応可能である。大型遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための高処理量分析に応じやすい最も広範に使用される技術には、典型的には遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローン化すること、生じたベクターのライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、および所望の活性の検出がその産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を促進する条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現させることを包含する。ライブラリー中の機能的突然変異体の頻度を高める新たな技術である再帰アンサンブル突然変異誘発（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＲＥＭ）を、Ｔ−ｂｅｔバリアントを同定するためのスクリーニングアッセイと組み合わせて使用することができる（Ａｒｋｉｎ  ａｎｄ  Ｙｏｕｒｖａｎ、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９９３、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６（３）：３２７−３３１）。
【０１３９】
本発明はまたＴ−ｂｅｔ融合タンパク質も提供する。本明細書で使用するように、Ｔ−ｂｅｔ「融合タンパク質」はＴ−ｂｅｔ以外のポリペプチドに作動可能に連結されたＴ−ｂｅｔポリペプチドを含んでなる。「Ｔ−ｂｅｔポリペプチド」はＴ−ｂｅｔタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはＴ−ｂｅｔタンパク質に独特であるそのペプチドフラグメントを指し、一方、「Ｔ−ｂｅｔ以外のポリペプチド」は別のタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。融合タンパク質内で、「作動可能に連結される」という用語はＴ−ｂｅｔポリペプチドおよび他のポリペプチドが相互に同じ読み枠で融合されることを示すことを意図している。他のポリペプチドはＴ−ｂｅｔポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端に融合されてよい。例えば、１つの態様において、融合タンパク質はＴ−ｂｅｔ配列がＧＳＴ配列のＣ末端に融合されているＧＳＴ−Ｔ−ｂｅｔ融合タンパク質である。別の態様において融合タンパク質は、Ｔ−ｂｅｔ配列がインフルエンザヘマグルチニンエピトープ標識に同じ読み枠で融合されているようなｐＣＥＰ４−ＨＡベクター（Ｈｅｒｒｓｃｈｅｒ，Ｒ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．９：３０６７−３０８２）のようなベクター中に、Ｔ−ｂｅｔヌクレオチド配列が挿入されるＴ−ｂｅｔ−ＨＡ融合タンパク質である。そのような融合タンパク質は組換えＴ−ｂｅｔの精製を促進することができる。
【０１４０】
好ましくは、本発明のＴ−ｂｅｔ融合タンパク質は標準的組換えＤＮＡ技術により製造される。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、通常の技術（例えば連結のための平滑端もしくはねじれ型の（ｓｔａｇｇｅｒ）端にされた末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、適切なように付着端を埋めること、望ましくない結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理および酵素的連結を使用すること）に従って一緒に同じ読み枠で連結する。別の態様では、融合遺伝子は自動ＤＮＡ合成装置を含む通常技術により合成し得る。あるいは、２種の連続した遺伝子フラグメント間で相補的オーバーハングを生じさせるアンカープライマーを使用して遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を実施することができ、これはその後アニーリングし、そして再増幅してキメラ遺伝子配列を生成することができる（例えば分子生物学の現在のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，編、ジョン  ワイリー  アンド  サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）：１９９２を参照されたい）。さらに、融合部分（例えばＧＳＴポリペプチドもしくはＨＡエピトープ標識）を既にコードしている多くの発現ベクターが商業的に入手可能である。Ｔ−ｂｅｔをコードする核酸は、融合部分がＴ−ｂｅｔタンパク質に同じ読み枠で連結されているようなこうした発現ベクターにクローン化し得る。
【０１４１】
単離されたＴ−ｂｅｔタンパク質もしくはそのフラグメントは、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製のための標準的技術を使用して、Ｔ−ｂｅｔに特異的に結合する抗体を生成させるための免疫原として使用可能である。Ｔ−ｂｅｔタンパク質を使用して抗体を生成することができる。例えばポリクローナル抗血清は、完全長の組換え的に細菌で生産されたＴ−ｂｅｔを免疫原として使用してウサギで生産することができる。この同じ免疫原を使用してマウスを免疫感作し、そして免疫感作したマウスから脾細胞を取り出すことによりｍＡｂを製造することができる。Ｔ−ｂｅｔに対する免疫応答が高まったマウスからの脾細胞を、骨髄腫細胞例えばＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫に融合することができる。添付する実施例に記述されるとおり、本方法を使用してＴ−ｂｅｔに結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体が作成された。１つの態様では、該抗体はＴ−ｂｅｔノックアウト動物のようなＴ−ｂｅｔを発現しない動物中で生産され得る。別の態様では、抗体は例えば戻し交雑することにより達成されるとおり、特定の遺伝的バックグラウンドを有する非ヒト動物中で生成することができる。
【０１４２】
あるいは、Ｔ−ｂｅｔの抗原性ペプチドフラグメントを免疫原として使用することができる。Ｔ−ｂｅｔの抗原性ペプチドフラグメントは、配列番号２もしくは４に示されるアミノ酸配列の少なくとも８アミノ酸残基を典型的に含んでなり、そしてペプチドに対し生じた抗体がＴ−ｂｅｔと特異的免疫複合体を形成するようなＴ−ｂｅｔのエピトープを包含する。好ましくは抗原性ペプチドは少なくとも１０アミノ酸残基、より好ましくは少なくとも１５アミノ酸残基、さらにより好ましくは少なくとも２０アミノ酸残基、そして最も好ましくは少なくとも３０アミノ酸残基を含んでなる。抗原性ペプチドにより包含される好適なエピトープはタンパク質の表面（例えば親水性領域）上に位置し、そしてＴ−ｂｅｔに独特であるＴ−ｂｅｔの領域である。１つの態様では、そのようなエピトープはマウスもしくはヒトのような１種からのＴ−ｂｅｔタンパク質に特異的であり得る（すなわち、種を横断して保存されないＴ−ｂｅｔの一領域にわたる抗原性ペプチドを免疫原として使用する；こうした保存されない残基は本明細書に提供されるもののようなアライメントを使用して決定可能である）。Ｔ−ｂｅｔタンパク質の標準的疎水性分析を実施して親水性領域を同定することができる。
【０１４３】
Ｔ−ｂｅｔ免疫原は、典型的には適切な個体（例えばウサギ、ヤギ、マウスもしくは他の哺乳動物）を該免疫原で免疫感作することにより抗体を調製するのに使用する。適切な免疫原性調製物は、例えば組換え的に発現されたＴ−ｂｅｔタンパク質もしくは化学的に合成されたＴ−ｂｅｔペプチドを含有し得る。該調製物はフロイントの完全もしくは不完全アジュバントのようなアジュバント、または類似の免疫賦活剤をさらに含むことができる。免疫原性Ｔ−ｂｅｔ調製物での適する個体の免疫感作は、ポリクローナル抗Ｔ−ｂｅｔ抗体応答を誘導する。
【０１４４】
従って、本発明の別の観点は抗Ｔ−ｂｅｔ抗体に関する。ポリクローナル抗Ｔ−ｂｅｔ抗体は上記のように適する個体をＴ−ｂｅｔ免疫原で免疫することにより調製可能である。免疫感作された個体中での抗Ｔ−ｂｅｔ抗体力価は、固定化したＴ−ｂｅｔを使用する酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を用いるような標準的技術により長期間にわたって監視することができる。所望の場合は、Ｔ−ｂｅｔに対し向けられた抗体分子を哺乳動物から（例えば血液から）単離し、そしてＩｇＧ画分を得るためプロテインＡクロマトグラフィーのような公知の技術によりさらに精製することができる。免疫感作後の適切な時点で、例えば抗Ｔ−ｂｅｔ抗体力価が最高である時に、抗体生産細胞を個体から得、そしてＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７）により元々は記述されたハイブリドーマ技術（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２７：５３９−４６；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５５：４９８０−８３；Ｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６）ＰＮＡＳ  ７６：２９２７−３１；およびＹｅｈら（１９８２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２９：２６９−７５もまた参照されたい）、より最近ではヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）、モノクローナル抗体および癌療法（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、アラン  Ｒ．リス  社（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）、ｐｐ．７７−９６）もしくはトリオーマ技術のような標準的技術によりモノクローナル抗体を調製するために使用することができる。モノクローナル抗体ハイブリドーマの製造技術は周知である（全般的に、モノクローナル抗体：生物学的分析における新規ひろがり（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ）、プレナム出版社（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．）、ニューヨーク州ニューヨーク（１９８０）中、Ｒ．Ｈ．Ｋｅｎｎｅｔｈ；Ｅ．Ａ．Ｌｅｒｎｅｒ（１９８１）Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，５４：３８７−４０２；Ｍ．Ｌ．Ｇｅｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７７）Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．、３：２３１−３６を参照されたい）。簡単に説明すると、不死化細胞株（典型的には骨髄腫）を上記のＴ−ｂｅｔ免疫原で免疫感作した哺乳動物からのリンパ球（典型的には脾細胞）と融合し、そして生じるハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングして、Ｔ−ｂｅｔに特異的に結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを同定する。
【０１４５】
リンパ球および不死化細胞株を融合するのに使用される多くの公知のプロトコールのいずれも、抗Ｔ−ｂｅｔモノクローナル抗体を生成させる目的上応用することができる（例えば、Ｇ．Ｇａｌｆｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ  ２６６：５５０５２；Ｇｅｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．、同上；Ｌｅｒｎｅｒ、Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、同上；Ｋｅｎｎｅｔｈ、モノクローナル抗体（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、同上を参照されたい）。さらに当業者はこうした方法の多くの変法が存在し、それらもまた有用であると考えるだろう。典型的には、不死細胞株（例えば骨髄腫細胞株）はリンパ球と同じ哺乳動物種由来である。例えばマウスハイブリドーマは、本発明の免疫原性調製物で免疫感作したマウスからのリンパ球を、不死化マウス細胞株と融合することにより作成し得る。好適な不死化細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培地（「ＨＡＴ培地」）に対し感受性であるマウス骨髄腫細胞株である。多数の任意の骨髄腫細胞株、例えばＰ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３もしくはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫株を標準的技術に従って融合パートナーとして使用することができる。これらの骨髄腫株はアメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）、メリーランド州ロックビルから入手可能である。典型的にはＨＡＴ感受性のマウス骨髄腫細胞が、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を使用してマウス脾細胞と融合される。融合から生じるハイブリドーマ細胞をその後、融合されていない、および非生産的に融合された骨髄腫細胞を殺すＨＡＴ培地を使用して選択する（融合されない脾細胞は形質転換されていないためそれらは数日後に死亡する）。本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞は、例えば標準的ＥＬＩＳＡアッセイを使用してＴ−ｂｅｔに結合する抗体について、ハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることにより検出される。
【０１４６】
こうした方法を使用してＴ−ｂｅｔに対する数種の抗体が生成されてきた。完全長の組換えの細菌に生産されたＴ−ｂｅｔタンパク質に対するモノクローナルおよびポリクローナル双方の抗体が生成された。３Ｄ１０抗体はＩｇＧサブタイプのものであり、また４Ｂ１０抗体はＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫へのマウス脾細胞の融合により生産され、そしてＩｇＧサブタイプのものである。３９Ｄ抗体はヒトおよびマウス双方のＴ−ｂｅｔを認識する。
【０１４７】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製することに代わり、モノクローナル抗Ｔ−ｂｅｔ抗体は、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば抗体ファージディスプレイライブラリー）をＴ−ｂｅｔでスクリーニングしてそれによりＴ−ｂｅｔを結合する免疫グロブリンライブラリーのメンバーを単離することにより同定かつ単離可能である。ファージディスプレイライブラリーを生成し、そしてスクリーニングするためのキットが市販されている（例えばファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の組換えファージ抗体系（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）、カタログ番号２７−９４００−０１；およびストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＳｕｒｆＺＡＰ（商標）ファージディスプレイキット（Ｐｈａｒｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｋｉｔ）、カタログ番号２４０６１２）。加えて、抗体ディスプレイライブラリーの生成およびスクリーニングにおける使用にとりわけ応じやすい方法および試薬の例は、例えばＬａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第５，２２３，４０９号明細書；Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第  ９２／１８６１９号明細書；Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第  ９１／１７２７１号明細書；Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第９２／２０７９１号明細書；Ｍａｒｋｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第９２／１５６７９号明細書；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第９３／０１２８８号明細書；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第９２／０１０４７号明細書；Ｇａｒｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第９２／０９６９０号明細書；Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第９０／０２８０９号明細書；Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５；Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｒｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １９：４１３３−４１３７；Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）ＰＮＡＳ  ８８：７９７８−７９８２；およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４に見出しすことができる。
【０１４８】
加えて、標準的組換えＤＮＡ技術を使用して作成し得るヒトおよび非ヒト双方の部分を含んでなるキメラおよびヒト化モノクローナル抗体のような組換え抗Ｔ−ｂｅｔ抗体が本発明の範囲内にある。こうしたキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当該技術分野で既知の組換えＤＮＡ技術により、例えばＲｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．国際特許公開第ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号明細書；Ａｋｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．欧州特許出願第１８４，１８７号明細書；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．欧州特許出願第１７１，４９６号明細書；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．欧州特許出願第１７３，４９４号明細書；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ＰＣＴ出願第ＷＯ  ８６／０１５３３号明細書；Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．欧州特許出願第１２５，０２３号明細書；Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＰＮＡＳ  ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＰＮＡＳ  ８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６−４４９；およびＳｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４；Ｗｉｎｔｅｒ  米国特許第５，２２５，５３９号明細書；Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４；ならびにＢｅｉｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０に記述される方法を使用して製造可能である。
【０１４９】
別の態様において、完全にヒトの抗体を当該技術分野で既知である技術を使用して作成することができる。例えば、特定の１抗原に対する完全にヒトの抗体は、抗原対抗に応答してこうした抗体を生産するよう修飾されているが、その内因性の遺伝子座が不能にされているトランスジェニック動物に抗原を投与することにより調製することができる。抗体を作成するために使用できる例示的技術は米国特許第６，１５０，５８４号；同第６，４５８，５９２号；同第６，４２０，１４０号明細書に記載されている。他の技術は当該技術分野で既知である。
【０１５０】
抗Ｔ−ｂｅｔ抗体（例えばモノクローナル抗体）を使用して、アフィニティークロマトグラフィーもしくは免疫沈降法のような標準的技術によりＴ−ｂｅｔを単離することができる。抗Ｔ−ｂｅｔ抗体は細胞由来の天然のＴ−ｂｅｔおよび宿主細胞中で発現された組換え的に生産されたＴ−ｂｅｔの精製を促進する可能性がある。さらに、抗Ｔ−ｂｅｔ抗体を使用して（例えば細胞ライセートもしくは細胞上清中の）Ｔ−ｂｅｔタンパク質を検出できる。検出は検出可能な基質に抗体をカップリング（すなわち物理的に連結）することにより促進され得る。従って、１つの態様において、本発明の抗Ｔ−ｂｅｔ抗体を検出可能な基質で標識する。検出可能な物質の例には、多様な酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質および放射活性物質を含む。適する酵素の例は西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼもしくはアセチルコリンエステラーゼを含み；適する補欠分子団複合体の例にはストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含み；適する蛍光物質の例はウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドもしくはフィコエリトリンを含み；発光物質の一例はルミノールを含み；そして適する放射活性物質の例は１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓもしくは３Ｈを含む。
【０１５１】
さらに別の本発明の観点は：
（ａ）動物を免疫原性のＴ−ｂｅｔタンパク質もしくはＴ−ｂｅｔタンパク質に独特のその免疫原性の部分で免疫感作し；そして
（ｂ）動物からＴ−ｂｅｔタンパク質に特異的に結合する抗体を単離する
ことを含んでなる方法により得られる抗Ｔ−ｂｅｔ抗体に関する。
【０１５２】
免疫感作および特異的抗Ｔ−ｂｅｔ抗体の回収方法は上にさらに記載されている。
【０１５３】
さらに別の観点では、本発明はＴ−ｂｅｔイントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）に関する。イントラボディは細胞の内側の標的、例えばＴ−ｂｅｔのような細胞内タンパク質に対し向けられた細胞内で発現される抗体構築物、通常は一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体である（Ｇｒａｕｓ−Ｐｏｒｔａ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５（１）：１８２−９１）。例えば、イントラボディ（例えばおよびｓｃＦｖ）は柔軟性リンカーにより連結され、そして単一遺伝子から発現された重鎖および軽鎖の可変領域を含むことができる。重鎖および軽鎖の可変ドメインは、ｓｃＦｖの特異性を決定する親抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）すなわち主抗原結合ドメインを含む。ｓｃＦｖ遺伝子を細胞中に移入することができ、ここでｓｃＦｖタンパク質発現はその標的例えばＴ−ｂｅｔの特性を調節することができる。従って１つの態様では、本発明は例えば細胞
をこうしたイントラボディを発現するよう改変するインビボもしくはエクスビボの取り組みにおいて、細胞中でＴ−ｂｅｔ活性を防止するためのこうしたＴ−ｂｅｔイントラボディの使用方法を提供する。１つの特定の態様において、本発明のＴ−ｂｅｔイントラボディを使用してＴ−ｂｅｔ活性を直接阻害することができる。別の態様において、Ｔ−ｂｅｔイントラボディを使用してＴ−ｂｅｔおよびＴ−ｂｅｔが相互作用するタンパク質の相互作用を阻害することができる。このように本発明のＴ−ｂｅｔイントラボディは、Ｔ−ｂｅｔが関与するシグナリング経路の調節において有用である。
【０１５４】
Ｔ−ｂｅｔイントラボディは当該技術分野で既知の技術を使用して調製することができる。例えば、ファージディスプレイ技術を使用してｓｃＦｖをライブラリーから単離できる（Ｌｏｗｍａｎ，ＨＢ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０（１０）：８３２−８）。特定の抗原に結合するｓｃＦｖを選択するために、ｓｃＦｖを外被タンパク質、典型的には繊維状Ｍ１３ファージのｐＩＩＩ（ｇ３ｐ）に融合する。固定化された抗原に結合するファージ上のｓｃＦｖが、結合、溶出および増幅の連続周期の間に濃縮される。別の例において、リボソームディスプレイを使用してＴ−ｂｅｔイントラボディを調製できる（Ｈａｎｅｓ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４（１）：９３７−４４）。リボソームディスプレイはペプチドを遺伝情報（ｍＲＮＡ）に直接連結するインビトロの方法である。転写翻訳系を使用してｓｃＦｖ  ＣＤＮＡライブラリーをインビトロで発現させる。翻訳されたＳｃＦｖを、コーディングｍＲＮＡに連結されたリボソームに閉入する。次いで固定された抗原にｓｃＦｖを結合させ、そして非特異的リボソーム複合体を徹底的な洗浄により除去する。残存する複合体を溶出し、そしてＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡに逆転写し、そしてその後ＰＣＲにより再増幅する。さらに別の例では、タンパク質フラグメント補足アッセイ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）（ＰＣＡ）を使用して本発明のＴ−ｂｅｔイントラボディを調製できる（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，ＪＮ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５（１２）：１４１−６．）これはマウスタンパク質（ｍＤＨＦＲ）による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中の変異体ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の補完に基づく細胞選択手順である。マウスＤＨＦＲを２部分に切断し、これらを潜在的に相互作用性のペプチドとの融合タンパク質として発現させる。融合タンパク質の相互作用がｍＤＨＦＲの酵素活性、および従って細菌増殖を復帰させる。抗体および抗原の特定の１相互作用のみがｓｃＦｖの選択に応じやすい系を作成するＤＨＦＲの機能補完を可能にする（Ｍｏｓｓｎｅｒ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０８：１１５−２２）。
【０１５５】
Ｖ．本発明の方法
Ａ．Ｔ−ｂｅｔ組成物の検出
本発明の別の観点は、本発明の多様なＴ−ｂｅｔ組成物の使用方法に関する。例えば、本発明は生物学的サンプル中のＴ−ｂｅｔ活性の存在の検出方法を提供する。この方法はＴ−ｂｅｔ活性の存在が生物学的サンプル中で検出されるように、Ｔ−ｂｅｔタンパク質もしくはＴ−ｂｅｔ  ｍＲＮＡのようなＴ−ｂｅｔ活性を検出することが可能な作用物質と生物学的サンプルを接触させることが関与する。
【０１５６】
Ｔ−ｂｅｔ  ｍＲＮＡの検出のための好ましい作用物質は、Ｔ−ｂｅｔ  ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズすることが可能な標識核酸プローブである。核酸プローブは例えば長さが少なくとも約５００、６００、８００、９００、１０００、１２００、１４００もしくは１６００ヌクレオチドで、しかもストリンジェントな条件下でＴ−ｂｅｔ  ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドのような、配列番号１もしくは３のＴ−ｂｅｔ  ＤＮＡであることができる。
【０１５７】
Ｔ−ｂｅｔタンパク質の検出のための好ましい作用物質は、Ｔ−ｂｅｔタンパク質に結合することが可能な標識抗体である。抗体はポリクローナルもしくはより好ましくはモノクローナルであり得る。完全な抗体またはそのフラグメント（例えばＦａｂもしくはＦ（ａｂ’）２）を使用することができる。プローブもしくは抗体に関して「標識」という用語は、検出可能な物質をプローブもしくは抗体にカップリング（すなわち物理的に連結）することによるプローブもしくは抗体の直接標識、ならびに直接標識される別の試薬との反応性によるプローブもしくは抗体の間接標識を包含することを意図している。間接標識の例は蛍光標識二次抗体を使用する一次抗体の検出、および蛍光標識されたストレプトアビジンで検出され得るようなビオチンでのＤＮＡプローブの末端標識を包含する。「生物学的サンプル」という用語は組織、細胞および生物学的流体を包含することを意図している。例えばＴ−ｂｅｔ  ｍＲＮＡの検出のための技術には、ノーザンハイブリダイゼーションおよびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを包含する。Ｔ−ｂｅｔタンパク質の検出のための技術には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光を包含する。
【０１５８】
Ｂ．スクリーニング法
本発明はさらに、例えばＩＬ−２の生産を調節、例えば増加または減少させる化合物、すなわち候補または試験化合物または作用物質（例えばペプチド模造物、低分子または他の薬剤）を同定する方法を提供する。ＩＬ−２の調節物質は知ることができるか（例えばＴ−ｂｅｔ活性のドミナントネガティブインヒビター、アンチセンスＴ−ｂｅｔ、Ｔ−ｂｅｔ活性を妨害する細胞内抗体、またはＴ−ｂｅｔまたはＴｂｅｔ核酸もしくはタンパク質分子から誘導化されるペプチドインヒビター）、あるいは本明細書に記載する方法を使用して同定することができる。
例えば１つの態様では、相互作用、例えばＴ−ｂｅｔのキナーゼ、例えばセリン−トレオニンキナーゼへの結合を調節する分子を同定することができる。例えばキナーゼ、例えばセリン−トレオニンキナーゼはＴ−ｂｅｔとＲｅｌＡ分子との相互作用を媒介し、したがって任意のこれらの分子を本スクリーニングアッセイにおいて使用することができる。以下のこの章および他の章で記載する特定の態様は、例としてこれら分子の１つを挙げるが、Ｔ−ｂｅｔが関与するシグナル伝達経路と相互作用し、かつ／または関与する他の分子も本スクリーニングアッセイに使用することができる。
【０１５９】
１つの態様では、化合物がＴ−ｂｅｔとキナーゼ、例えばセリン−トレオニンキナーゼ、例えばＣＫＩまたはＧＳＫ−３キナーゼとの間の複合体の形成を直接調節する、例えば増加または安定化する、または減少または不安定化（ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｅ）する能力を測定する。別の態様では、Ｔ−ｂｅｔの翻訳後修飾（例えばリン酸化）またはＴ−ｂｅｔをリン酸化するキナーゼもしくはＴ−ｂｅｔの発現および／または活性が、本発明のスクリーニングアッセイを使用して指示組成物中で測定される。さらに別の態様では、ＲｅｌＡとＴ−ｂｅｔとの間の複合体の形成が測定される。さらなる態様では、ＩＬ−２サイトカイン生産が測定される。
【０１６０】
指示組成物は、Ｔ−ｂｅｔタンパク質またはＴ−ｂｅｔと相互作用する分子またはＴ−ｂｅｔが関与するシグナル伝達経路の分子を発現する細胞、例えば自然に発現する細胞、さらに好ましくはタンパク質をコードする発現ベクターを細胞に導入することによりタンパク質を発現するように工作された細胞であり得る。好ましくは細胞は哺乳動物細胞、例えばヒトの細胞である。１つの態様では、細胞はＴ細胞である。１つの好適な態様では、細胞はＴ細胞系列への分化能を有する（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）。別の好適な態様では、細胞は未だＴ細胞系列への分化能をもたない。別の態様では細胞はＢ細胞である。さらに別の態様では、細胞はＮＫ細胞である。あるいは指示組成物は、タンパク質（例えば細胞抽出物または例えば精製された天然もしくは組換えタンパク質のいずれかを含む組成物）を含む無細胞組成物である。
【０１６１】
ＩＬ−２の生産を調節する化合物の能力は、例えばＩＬ−２  ｍＲＮＡ生産を、例えば定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定することにより、および／またはＩＬ−２タンパク質生産を、例えばウエスタンブロット分析を使用して測定することにより決定することができる。
【０１６２】
１つの態様において、本発明は調節物質、すなわちＴ−ｂｅｔポリペプチドに結合する；Ｔ−ｂｅｔ発現に刺激または阻害効果を有する；Ｔ−ｂｅｔプロセシング；Ｔ−ｂｅｔ翻訳後修飾（例えばグリコシル化、ユビキチン化もしくはリン酸化）；またはＴ−ｂｅｔ活性；あるいはＴ−ｂｅｔ結合パートナーまたは標的分子の発現、プロセシングもしくは活性に刺激もしくは阻害効果を有する候補もしくは試験化合物もしくは作用物質（例えば酵素、ペプチド、ペプチド模倣物、小分子、リボザイムもしくはＴ−ｂｅｔアンチセンス分子）の同定方法を提供する。
【０１６３】
１つの好適な態様では、本発明はＩＬ−２の生産を調節する化合物の同定法を特徴とし、この方法は化合物の存在下で、Ｔ−ｂｅｔおよびセリン−トレオニンキナーゼ分子をキナーゼ分子とＴ−ｂｅｔとの相互作用を可能とする条件下で接触させ；そしてＴ−ｂｅｔおよびキナーゼ分子の相互作用を検出することを含んでなり、ここでＩＬ−２の生産を増加する化合物の能力が、化合物の不存在下での相互作用の量と比べた時の相互作用の減少により示され、そしてＩＬ−２の生産を減少する化合物の能力が、化合物の不存在下での相互作用の量と比べた時の相互作用の上昇により示される。
【０１６４】
別の好適な態様では、本発明はＩＬ−２の生産の調節に有用な化合物の同定方法を特徴とし；
ａ）Ｔ−ｂｅｔ、ＲｅｌＡおよびＩＬ−２調節領域を含んでなる指示組成物を準備し；
ｂ）指示組成物を試験化合物のライブラリーの各メンバーと接触させ；
ｃ）試験化合物のライブラリーから、Ｔ−ｂｅｔが媒介するＲｅｌＡとＩＬ−２調節領域の相互作用を下げる目的化合物（１もしくは複数）を選択し、これによりＩＬ−２の生産を調節する化合物を同定することを含んでなり、ここでＩＬ−２の生産を増加する化合物の能力が、化合物の不存在下での相互作用の量と比べた時の相互作用の減少により示され、そしてＩＬ−２の生産を減少する化合物の能力が、化合物の不存在下での相互作用の量と比べた時の相互作用の上昇により示される。
【０１６５】
さらに別の好適な態様では、本発明はＴ細胞中のＲｅｌＡとＩＬ−２調節領域との相互作用を調節する化合物の同定方法を特徴とし、この方法は化合物およびＴ−ｂｅｔの存在下、ＲｅｌＡおよびＩＬ−２調節領域をＴ−ｂｅｔ媒介型のＲｅｌＡのＩＬ−２調節領域への結合により複合体を形成することを可能とする条件下で接触させ；そしてＲｅｌＡとＩＬ−２調節領域の複合体の形成を検出することを含んでなり、ここでＴ−ｂｅｔおよび化合物の存在下でＲｅｌＡとＩＬ−２調節領域との間の相互作用を阻害する化合物の能力は、Ｔ−ｂｅｔおよび化合物の不存在下で形成された複合体の量と比べた複合体形成の減少により示される。
【０１６６】
さらに別の好適な態様では、本発明はＴ細胞によるＩＬ−２サイトカイン生産の増加法を特徴とし、この方法はＴ細胞によるＩＬ−２の生産が増加するように、細胞をキナーゼ媒介型のＴ細胞中のＴ−ｂｅｔおよびＲｅｌＡの結合をダウンモジュレートする化合物と接触させることを含んでなる。
【０１６７】
本明細書に記載するアッセイを使用して同定される化合物は、異常なＴ−ｂｅｔ発現、プロセシング、翻訳後修飾、またはＴ細胞系列への分化能の活性、調節、サイトカイン生産の調節、ＴＧＦ−β媒介型シグナリングの調節、Ｊａｋ１／ＳＴＡＴ−１経路の調節、ＩｇＧクラススイッチングの調節、Ｂリンパ球機能の調節に関連する障害を処置するために有用となり得る。
【０１６８】
Ｔ−ｂｅｔとＲｅｌＡおよび／またはキナーゼ，例えばセリン−トレオニンキナーゼとの間の複合体の形成および／または安定性を減少させることによりＩＬ−２の生産のアップモジュレーションから利益を得る可能性がある状態には、特定の免疫不全障害の障害またはＴｈ１サイトカインの生産が高すぎる可能性がある障害を含む。
【０１６９】
Ｔ−ｂｅｔとＲｅｌＡおよび／またはキナーゼ、例えばセリン−トレオニンキナーゼとの間の複合体の形成および／または安定性を増加させることによりＩＬ−２の生産のダウンレギュレーションから利益を得る可能性がある状態には：糖尿病、慢性関節リウマチ、若年性慢性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、アトピー性皮膚炎および湿疹性皮膚炎、乾癬、シェーグレン症候群、円形脱毛症、節足動物の咬傷反応によるアレルギー応答、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、アレルギー性喘息、皮膚エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、化合物発疹、らい境界反応、らい性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側性進行性知覚神経性聴覚障害、再生不良性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ヴェグナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーヴンズ−ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、クローン病、グレーヴス眼症、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、間隙性肺線維症、ホジキン病、移植片に対する宿主の反応、多発性硬化症、重篤な火傷外傷および同種異系骨髄移植を含む自己免疫障害を包含する。
【０１７０】
Ｔ−ｂｅｔとＲｅｌＡおよび／またはキナーゼ、例えばセリン−トレオニンキナーゼとの間の複合体の形成および／または安定性を減少させることによりＩＬ−２の生産のアップレギュレーションから利益を得る可能性がある状態には、例えば従来の処置に不応であるガンのような種々のタイプのガンを含む。例えば全身的に投与されるＩＬ−２との併用療法は、転移性の腎臓細胞癌腫の患者の３０％に長期の寛解をもたらし、これについては標準的な処置はない。他覚的および長期生存の臨床的応答が、メラノーマまたは急性白血病の患者群でも記録された。
【０１７１】
個体のスクリーニングアッセイを他の作用物質の存在もしくは非存在下で実施することができる。例えば、スクリーニングされている細胞の活性化状態を調節する様々な作用物質の存在下で個体のアッセイを実施することができる。例えば１つの態様において、Ｔ細胞受容体を介してシグナルを伝達する作用物質が含まれる。別の態様において、サイトカインもしくはサイトカイン受容体に対する抗体が含まれる。別の態様では、リン酸化を阻害する作用物質も含まれる。
【０１７２】
別の観点では、本発明は本明細書に記載する２以上のアッセイの組合せに関する。例えば、細胞に基づくもしくは無細胞アッセイを使用して調節剤を同定することができ、そしてＩＬ−２の生産を調節する作用物質の能力を、ｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば動物で確認することができる。
【０１７３】
さらに本明細書に記載するように同定されたＩｌ−２生産の調節物質（例えばドミナントネガティブＴ−ｂｅｔ分子、Ｔ−ｂｅｔ核酸もしくはポリペプチド分子、アンチセンスＴ−ｂｅｔ核酸分子、Ｔ−ｂｅｔ特異的抗体または低分子）を動物モデルで使用して、こうした調節物質での処置の効力、毒性もしくは副作用を決定し得る。あるいは本明細書に記載するように同定された調節物質を動物モデルで使用して、そのような調節物質の作用機序を決定することができる。
【０１７４】
別の態様において、類似のスクリーニングアッセイを使用して、例えば上記のようなスクリーニングアッセイを行うが、しかしＴ−ｂｅｔが相互作用する分子、すなわちキナーゼのようなシグナル伝達経路中でＴ−ｂｅｔの上流もしくは下流いずれかで作用する分子を使用することにより、Ｔ−ｂｅｔ発現および／または活性を間接的に調節する化合物を同定することができる。
【０１７５】
従って以下に記載するように、本発明はＴ−ｂｅｔおよびＴ−ｂｏｘ結合領域（例えばＩＬ−２のようなサイトカイン遺伝子調節領域）の相互作用、あるいはＲｅｌＡ（またはＴ−ｂｅｔとＲｅｌＡおよびキナーゼとの間の複合体）がＤＮＡに結合する能力を調節する化合物を同定するためのスクリーニングアッセイを提供する。標的ＤＮＡ配列とのＤＮＡ結合タンパク質の相互作用を検出するアッセイは当該技術分野で既知である（例えば電気泳動移動度シフトアッセイ、ＤＮアーゼＩフットプリンティングアッセイ，クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰアッセイ）等）。試験化合物の存在および不存在下でそのようなアッセイを行うことにより、これらのアッセイを使用してその標的ＤＮＡ配列とのＤＮＡ結合タンパク質の相互作用を調節する（例えば阻害するもしくは高める）化合物を同定し得る。
【０１７６】
本発明の細胞に基づくおよび無細胞アッセイを以下により詳細に記載する。
【０１７７】
ｉ．細胞に基づくアッセイ
本発明の指示組成物は、Ｔ−ｂｅｔポリペプチド（および／またはキナーゼのような１もしくは複数の非−Ｔ−ｂｅｔポリペプチド）を発現する細胞、例えば内因性のＴ−ｂｅｔを自然に発現する細胞、またはより好ましくは該ポリペプチドをコードする発現ベクターを細胞中に導入することにより外因性のＴ−ｂｅｔポリペプチドを発現するよう工作されている細胞であり得る。あるいは指示組成物は、Ｔ−ｂｅｔおよび／またはキナーゼ、１もしくは複数の非Ｔ−ｂｅｔポリペプチドを含む無細胞組成物（例えばＴ−ｂｅｔ発現細胞からの細胞抽出物または精製されたＴ−ｂｅｔ（天然もしくは組換えいずれかのポリペプチド）を包含する組成物）であり得る。
【０１７８】
ＩＬ−２の生産を調節する化合物は、様々な「読み出し」を使用して同定することができる。
【０１７９】
例えば、指標細胞をＴ−ｂｅｔ発現ベクターでトランスフェクトし、試験化合物の存在および不存在下でインキュベートし、そして分子の発現またはＴ−ｂｅｔにより調節される生物学的応答に対する化合物の影響を測定することができる。Ｔ−ｂｅｔの生物学的活性は、標準的技術に従ってインビボもしくはインビトロで測定される活性を含む。Ｔ−ｂｅｔ活性はＴ−ｂｅｔ標的分子（例えばサイトカイン遺伝子またはポリペプチド、例えばキナーゼまたはＲｅｌＡの転写調節領域のようなＴ−ｂｅｔが結合する核酸分子）と、Ｔ−ｂｅｔとの会合のように直接の活性であり得る。あるいはＴ−ｂｅｔ活性は、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドとＴ−ｂｅｔ標的分子との相互作用の下流で起こる細胞のシグナリング活性、またはその相互作用により誘発されたシグナリングカスケードの結果として起こる生物学的影響のような下流の活性である。例えば本明細書に記載されるＴ−ｂｅｔの生物学的活性は：Ｔ細胞系列への分化能の調節、直接的に調節する、サイトカインの生産を調節すること、ＴＧＦ−β媒介シグナリングを調節すること、Ｊａｋ１／ＳＴＡＴ−１経路を調節すること、ＩｇＧクラススイッチングを調節すること、およびＢリンパ球の機能を調節することを含む。Ｔ−ｂｅｔの多様な生物学的活性は当該技術分野で既知である技術を使用して測定可能である。例示的技術は実施例により詳細に記載する。
【０１８０】
試験化合物がＴ−ｂｅｔ発現を調節するかどうかを決定するために、インビトロ転写アッセイを行うことができる。そのようなアッセイを実施するために、Ｔ−ｂｅｔの完全長のプロモーターおよびエンハンサーをクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）もしくはルシフェラーゼのようなレポーター遺伝子に作動可能に連結し、そして宿主細胞中に導入することができる。
【０１８１】
本明細書で互換的に使用する用語「作動可能に連結される」および「効果的に連結される」とは、ヌクレオチド配列が宿主細胞中での（もしくは細胞抽出物による）このヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で調節配列に連結されていることを意味することを意図している。調節配列は技術的に認識され、かつ適切な宿主細胞中での所望のポリペプチドの発現を指図するように選択し得る。調節配列という用語はプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルおよび他の発現制御要素を包含することを意図している。そのような調節配列は当業者に既知であり、そしてＧｏｅｄｄｅｌ、遺伝子発現技術：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、アカデミック  プレス、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）に記載されている。発現ベクターの設計はトランスフェクトされるべき宿主細胞の選択および／または発現されるべき所望のポリペプチドの型および／または量のような因子に依存し得ると理解されるべきである。
【０１８２】
多様なレポーター遺伝子が当該技術分野で既知であり、そして本発明のスクリーニングアッセイでの使用に適する。適するレポーター遺伝子の例には、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼもしくはルシフェラーゼをコードするものを含む。これらの遺伝子産物の活性の標準的測定方法は当該技術分野で既知である。
【０１８３】
様々な細胞型が該スクリーニングアッセイにおける指標細胞としての使用に適する。好ましくは、Ｔｈ２細胞クローンもしくはノックアウト動物由来の細胞のような通常はＴ−ｂｅｔを発現しない細胞株を使用する。ＨｅｐＧ２肝癌細胞株のような非リンパ系細胞株もまた指標細胞として使用可能である。酵母細胞もまた指標細胞として使用可能である。
【０１８４】
本アッセイで使用する細胞は、真核生物または原核生物起源であり得る。例えば、１つの態様では細胞は細菌細胞である。別の態様では細胞は酵母細胞のような真菌細胞である。別の態様において細胞は脊椎動物細胞、例えば鳥類細胞または哺乳動物細胞である。好適な態様では、細胞はヒトの細胞である。
【０１８５】
１つの態様において、試験化合物の存在下で指標細胞中のレポーター遺伝子の発現レベルは、試験化合物の不存在下での指標細胞中のレポーター遺伝子の発現のレベルより高く、そして該試験化合物はＴ−ｂｅｔの発現を刺激する化合物と同定される。別の態様では、試験化合物の存在下での指標細胞中のレポーター遺伝子の発現のレベルは、試験化合物の不存在下での指標細胞中のレポーター遺伝子の発現のレベルより低く、そして該試験化合物はＴ−ｂｅｔの発現を阻害する化合物と同定される。
【０１８６】
１つの態様において、本発明はＴ−ｂｅｔが関与する細胞応答を調節する化合物の同定方法を提供する。
【０１８７】
標的分子へのＴ−ｂｅｔ結合を調節する、またはＴ−ｂｅｔに結合する試験化合物の能力もまた測定し得る。標的分子（例えば結合パートナー）へのＴ−ｂｅｔ結合を調節する試験化合物の能力を測定することは、例えば複合体中の標識Ｔ−ｂｅｔ標的分子を検出することによりＴ−ｂｅｔへのＴ−ｂｅｔ標的分子の結合が測定可能であるように、放射性同位体、酵素もしくは蛍光標識とＴ−ｂｅｔ標的分子をカップリングすることにより達成し得る。あるいは、Ｔ−ｂｅｔを放射性同位体、酵素もしくは蛍光標識とカップリングして、複合体中のＴ−ｂｅｔ標的分子へのＴ−ｂｅｔ結合を調節する試験化合物の能力を監視することができる。Ｔ−ｂｅｔを結合する試験化合物の能力を測定することは、例えば複合体中の標識Ｔ−ｂｅｔ化合物を検出することによりＴ−ｂｅｔへの化合物の結合が測定可能となるように、放射性同位体、酵素もしくは蛍光標識と化合物をカップリングすることにより達成することができる。例えば、Ｔ−ｂｅｔ標的は直接もしくは間接のいずれかで１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃもしくは３Ｈで標識可能であり、そして放射能発射の直接計数もしくはシンチレーション計数により放射性同位元素を検出できる。あるいは化合物を例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼもしくはルシフェラーゼで酵素的に標識可能でき、そして適切な基質の産物への転換の測定により酵素標識を検出し得る。
【０１８８】
相互作用体のいずれの標識も伴わずに、Ｔ−ｂｅｔと相互作用する化合物の能力を測定することもまた本発明の範囲内にある。例えば、微小生理機能測定器を使用して化合物もしくはＴ−ｂｅｔいずれの標識も伴わずにＴ−ｂｅｔとの化合物の相互作用を検出することができる（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ｈ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：１９０６−１９１２）。本明細書で使用されように「微小生理機能測定器」（例えばサイトセンサー（Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ））は、光接近可能な電位測定センサー（ＬＡＰＳ）を使用して細胞がその環境を酸性化する速度を測定する分析機器である。この酸性化速度の変化は、化合物とＴ−ｂｅｔとの間の相互作用の指標として使用できる。
【０１８９】
別の態様において、Ｔ−ｂｅｔの上流もしくは下流で作用する、Ｔ−ｂｅｔが関与する経路中で作用する異なる（すなわち非Ｔ−ｂｅｔ）分子を、スクリーニングアッセイでの使用に指示組成物中に含むことができる。こうした分子を使用するスクリーニングアッセイで同定される化合物もまた、間接的にではあろうともＴ−ｂｅｔ活性の調節において有用となり得る。Ｔ−ｂｅｔが相互作用する例示的一分子にはキナーゼを包含する。
【０１９０】
本発明の細胞は内因性のＴ−ｂｅｔ（もしくはＴ−ｂｅｔが関与するシグナリング経路中の別のポリペプチド）を発現し得るか、またはそうするように工作してもよい。Ｔ−ｂｅｔポリペプチドまたはＴ−ｂｅｔの上流もしくは下流で作用する非Ｔ−ｂｅｔポリペプチドを発現するよう工作されている細胞は、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドもしくはＴ−ｂｅｔの上流もしくは下流で作用する非Ｔ−ｂｅｔポリペプチドをコードする発現ベクターを細胞中に導入することにより生成することができる。
【０１９１】
指標細胞中でＴ−ｂｅｔポリペプチドまたはＴ−ｂｅｔの上流もしくは下流で作用するＴ−ｂｅｔポリペプチドまたは非Ｔ−ｂｅｔポリペプチドの発現に使用し得る組換え発現ベクターは、当該技術分野で既知である。１つの態様では、指標細胞中でのＴ−ｂｅｔの誘導性または構成的発現を可能にする調節配列（例えばサイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサーのようなウイルス調節配列を使用できる）に、発現ベクター内でＴ−ｂｅｔコーディング配列を効果的に連結する。指標細胞中でのＴ−ｂｅｔの誘導性または構成的発現を可能にする組換え発現ベクターの使用が、Ｔ−ｂｅｔの活性を高めるもしくは阻害する化合物の同定に好ましい。代替的態様において、発現ベクター内でＴ−ｂｅｔコーディング配列を内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子の調節配列（すなわち内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子由来のプロモーター調節領域）に作動可能に連結する。Ｔ−ｂｅｔ発現が内因性制調節列により制御される組換え発現ベクターの使用は、Ｔ−ｂｅｔの転写発現を高めるもしくは阻害する化合物の同定に好ましい。
【０１９２】
Ｔ−ｂｅｔはＩＬ−２プロモーターに結合するその能力に基づく酵母１ハイブリッドスクリーニングアッセイで単離した。従って１つの態様では、本発明の方法は近位ＩＬ−２プロモーターのこの領域、最も好ましくはＩＬ−２プロモーターのヌクレオチド−２４０ないし−２２０を含有するレポーター遺伝子構築物を利用する。使用し得る他の配列には：ヒトＩＬ−２プロモーター、マウスＩＬ−２プロモーターを包含する。
【０１９３】
１つの態様では、誘導性の系を構築し、そして高処理量の細胞に基づくスクリーニングに使用して、Ｔ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性に影響を及ぼす標的化合物を同定し、そして特徴づけることができる。誘導性の系は、例えば、エクジソンに駆動されるＴ−ｂｅｔ発現プラスミドとコトランスフェクトしたエクジソン受容体、およびＩＦＮ−γプロモータールシフェラーゼレポーターを発現する接着性２９３Ｔヒト胚腎細胞株のサブクローンを使用することにより、通常はＩＦＮ−γを生産しない細胞株を使用して構築可能である。（Ｗａｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３１：４１４；Ｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ９３：３３４６；Ｇｒａｈａｍ．２００２  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：５２５）。昆虫ホルモンエクジソンでの処理に際してＴ−ｂｅｔが発現され、ＩＦＮ−γレポーターが活性化され、そしてルシフェラーゼ活性が生成される。この系において、Ｔ−ｂｅｔは細胞株に内因性のＩＦＮ−γを産生する能力を与える。
【０１９４】
ｉｉ．無細胞アッセイ
別の態様において、指示組成物は無細胞組成物である。宿主細胞もしくは培地基中で組換え法により発現されたＴ−ｂｅｔが関与する経路において、Ｔ−ｂｅｔの上流もしくは下流で作用するＴ−ｂｅｔもしくは非Ｔ−ｂｅｔポリペプチドを、ポリペプチドの標準的精製方法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、およびＴ−ｂｅｔに特異的な抗体との免疫親和性精製を使用して宿主細胞もしくは細胞培地から単離して、無細胞組成物中で使用できるタンパク質を生成することが可能である。あるいは、無細胞組成物として使用するために、Ｔ−ｂｅｔもしくは非Ｔ−ｂｅｔ発現細胞の抽出物を調製するとができる。
【０１９５】
１つの態様では、Ｔ−ｂｅｔ活性を特異的に調節する化合物は、Ｔ−ｂｅｔが結合する標的分子とＴ−ｂｅｔとの相互作用を調節するそれらの能力に基づき同定される。標的分子はＤＮＡ分子、例えばサイトカイン遺伝子の調節領域のようなＴ−ｂｅｔ応答性要素）、またはポリペプチド分子、例えばキナーゼであり得る。タンパク質−タンパク質相互作用（例えば免疫沈降、例えばクロマチン免疫沈降、蛍光偏光もしくはエネルギー伝達、２ハイブリッドアッセイ等）の検出を可能とする、または標的ＤＮＡ配列とＤＮＡ結合タンパク質との間の相互作用の検出を可能とする（例えば電気泳動移動度シフトアッセイ、ＤＮアーゼＩフットプリンティングアッセイ等）適切なアッセイが当該技術分野で既知である。試験化合物の存在および不存在下でそのようなアッセイを行うことにより、これらのアッセイを使用して標的分子とＴ−ｂｅｔとの相互作用を調節する（例えば阻害するもしくは高める）化合物を同定することができる。
【０１９６】
１つの態様において、試験化合物の存在下での標的分子へのＴ−ｂｅｔの結合の量は、試験化合物の不存在下での標的分子へのＴ−ｂｅｔの結合の量より大きく、この場合は試験化合物がＴ−ｂｅｔの結合を高める、または安定化する化合物と同定される。別の態様では、試験化合物の存在下での標的分子へのＴ−ｂｅｔの結合の量は、試験化合物の不存在下での標的分子へのＴ−ｂｅｔの結合の量より少なく、この場合は試験化合物がＴ−ｂｅｔの結合を阻害する、または不安定化する化合物と同定される。
【０１９７】
Ｔ−ｂｅｔポリペプチドへの試験化合物の結合は、上記のように直接もしくは間接的いずれかで測定できる。試験化合物に結合するＴ−ｂｅｔポリペプチドの能力を測定することはまた、リアルタイム生体分子相互作用分析（Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＢＩＡ）のような技術を使用しても達成し得る（Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，Ｓ．ａｎｄ  Ｕｒｂａｎｉｃｚｋｙ，Ｃ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５；Ｓｚａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５）。本明細書で使用されるところの「ＢＩＡ」は相互作用体のいずれも標識することなくリアルタイムで生物特異的相互作用を研究するための技術である（例えばバイアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ））。表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）の光学的現象の変化を、生物学的分子間のリアルタイム反応の表示として使用することができる。
【０１９８】
Ｔ−ｂｅｔポリペプチドと標的分子との間の相互作用を調節する試験化合物を同定する本発明の方法において、完全長のＴ−ｂｅｔポリペプチドを方法で使用することができ、あるいはＴ−ｂｅｔの部分のみを使用することができる。Ｔ−ｂｅｔポリペプチドと標的分子との間の相互作用の程度は、例えばポリペプチドの一方を検出可能な物質（例えば放射標識）で標識し、非標識ポリペプチドを単離し、そして非標識ポリペプチドと会合するようになった検出可能な物質の量を定量することにより測定可能である。このアッセイを使用してＴ−ｂｅｔタンパク質と標的分子との間の相互作用を刺激もしくは阻害するいずれかの試験化合物を同定することができる。Ｔ−ｂｅｔポリペプチドと標的分子との間の相互作用を刺激する試験化合物は、試験化合物の不存在下での相互作用の程度と比較して、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドと標的分子との間の相互作用の程度を増大させるその能力に基づいて同定される。Ｔ−ｂｅｔポリペプチドと標的分子との間の相互作用を阻害する試験化合物は、化合物の不存在下での相互作用の程度と比較して、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドと標的分子との間の相互作用の程度を減少させるその能力に基づいて同定される。
【０１９９】
本発明の上記アッセイ方法の１より多くの態様において、例えば複合体形成されない形態のポリペプチドの一方もしくは双方からの複合体形成された形態の分離を促進するため、またはアッセイの自動化に適応させるために、Ｔ−ｂｅｔもしくはＴ−ｂｅｔ標的分子、キナーゼのいずれかを固定することが望ましいかもしれない。試験化合物の存在および不存在下での試験化合物のＴ−ｂｅｔポリペプチドへの結合、またはＴ−ｂｅｔポリペプチドのＴ−ｂｅｔ標的分子との相互作用は、反応物質を含有するのに適する任意の容器中で行うことができる。こうした容器の例にはマイクロタイタープレート、試験管および微小遠心管を含む。１つの態様において、ポリペプチドの一方もしくは双方をマトリックスに結合させるドメインを付加する融合タンパク質を提供し得る。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／Ｔ−ｂｅｔ融合タンパク質もしくはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ（シグマ  ケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、ミズーリ州セントルイス）もしくはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着させることができ、これらは次いで試験化合物または試験化合物および吸着されない標的ポリペプチドもしくはＴ−ｂｅｔポリペプチドのいずれかと組合せ、そして混合物を複合体形成に伝導性の条件下で（例えば塩およびｐＨについて生理学的条件で）インキュベーションする。インキュベーション後にビーズもしくはマイクロタイタープレートのウェルを洗浄していかなる未結合の化合物も除去し、ビーズの場合はマトリックスを固定し、そして例えば上記のような直接もしくは間接的のいずれかで複合体形成を測定する。あるいは複合体をマトリックスから解離させ、そして標準的技術を使用してＴ−ｂｅｔ結合もしくは活性のレベルを測定できる。
【０２００】
マトリックス上にポリペプチドを固定するための他の技術もまた本発明のスクリーニングアッセイで使用可能である。例えば、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドもしくはＴ−ｂｅｔ標的分子のいずれかをビオチンおよびストレプトアビジンの結合を利用して固定化することができる。ビオチニル化Ｔ−ｂｅｔポリペプチドもしくは標的分子を、当該技術分野で既知の技術（例えばビオチニル化キット、ピアス  ケミカルズ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、イリノイ州ロックフォード）を使用してビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から調製することができ、そしてストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート（ピアス  ケミカル）のウェル中に固定化することができる。あるいは、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドもしくは標的分子と反応性であるが、しかしＴ−ｂｅｔポリペプチドのその標的分子への結合を妨害しない抗体をプレートのウェルに誘導体化することができ、そして未結合の標的もしくはＴ−ｂｅｔポリペプチドを抗体結合によりウェル中で捕捉する。そのような複合体の検出方法は、ＧＳＴ固定化複合体について上記のものに加え、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドもしくは標的分子と反応性の抗体を使用する複合体の免疫検出、ならびにＴ−ｂｅｔポリペプチドもしくは標的分子と関連する酵素活性を検出することに依存する酵素結合アッセイを含む。
【０２０１】
本発明のさらに別の観点では、Ｔ−ｂｅｔに結合するかもしくはそれと相互作用し（「Ｔ−ｂｅｔ結合タンパク質」もしくは「Ｔ−ｂｅｔ」）、そしてＴ−ｂｅｔ活性に関与する他のポリペプチドを同定するための２ハイブリッドアッセイもしくは３ハイブリッドアッセイ（例えば米国特許第５，２８３，３１７号明細書；Ｚｅｒｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１６９３−１６９６；およびＢｒｅｎｔ  第ＷＯ９４／１０３００号明細書を参照されたい）において、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドもしくはそのフラグメントを「餌（ｂａｉｔ）タンパク質」として使用することができる。そのようなＴ−ｂｅｔ結合タンパク質もまた、例えばＴ−ｂｅｔ媒介型のシグナリング経路の下流の要素としてＴ−ｂｅｔポリペプチドもしくはＴ−ｂｅｔ標的によるシグナルの伝播に関与していると思われる。あるいはそのようなＴ−ｂｅｔ結合ポリペプチドはＴ−ｂｅｔインヒビターであるらしい。
【０２０２】
２ハイブリッド系は、分離可能なＤＮＡ結合および活性化ドメインよりなる大部分の転写因子のモジュールの性質に基づく。簡単に説明すると、このアッセイは２種の異なるＤＮＡ構築物を利用する。１つの構築物において、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドをコードする遺伝子を既知の転写因子（例えばＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合する。もう１つの構築物において、未同定のタンパク質（「餌食（ｐｒｅｙ）」もしくは「サンプル」）をコードするＤＮＡ配列のライブラリーからのＤＮＡ配列を既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合する。「餌」および「餌食」タンパク質はインビボで相互作用することが可能であり、Ｔ−ｂｅｔ依存性の複合体を形成し、転写因子のＤＮＡ結合および活性化ドメインが近い近接にもたらされる。この近接が、転写因子に応答性の転写調節部位に作動可能に連結されているレポーター遺伝子（例えばＬａｃＺ）の転写を可能にする。レポーター遺伝子の発現を検出することができ、そして機能的転写因子を含有する細胞コロニーを単離することができ、そしてＴ−ｂｅｔポリペプチドと相互作用するポリペプチドをコードするクローン化された遺伝子を得るのに使用することができる。
【０２０３】
別の態様において、Ｔ−ｂｅｔ標的遺伝子を単離するためのリプレゼンテーショナル  ディファレンス  アナリシス（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＲＤＡ）およびマイクロチップＤＮＡアレイ分析。例えば、減算（ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ）もしくは未減算プローブを使用するＰＣＲと結合したディファレンシャルディスプレイもしくはサブトラクション法（ＲＤＡ；例えばＨｕｂａｎｋ，Ｍ．ａｎｄ  Ｓｃｈａｔｚ，Ｄ．Ｇ．１９９４．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２２、５６４０−５６４８；Ｃｈａｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．１９９４．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６、１８６５；ｖｏｎ  Ｓｔｅｉｎ，Ｏ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２５、２５９８；Ｌｉｓｉｔｓｙｎ，Ｎ．ａｎｄ  Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．１９９３．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９、９４６を参照されたい）、またはより最近ではＤＮＡマイクロチップアレイハイブリダイゼーション（Ｗｅｌｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１５：３０５９）を使用することができる。こうしたアッセイの実施において多様な細胞を使用でき、例えば正常細胞、Ｔ−ｂｅｔを発現するよう工作された細胞、またはＴ−ｂｅｔを欠くか、もしくはＴ−ｂｅｔを過剰発現するマウス由来（例えばトランスジェニック非ヒト動物から）の細胞を使用することができる。
【０２０４】
さらに別の態様において、Ｔ−ｂｅｔ標的タンパク質を記載するためのプロテオミクスのアプローチを実施することができる。例えば、減算分析、発現パターンの分析、タンパク質レベルでの遺伝子型変異の同定およびタンパク質同定ならびに翻訳後修飾の検出を、例えばＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｍｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．７８２（１−２）：２９１−３０６；Ｌｕｂｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｍｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．７８２（１−２）：１８３−９６；およびＲａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．１２６（１２）：１５１８−２６に記載されているとおりに行うことができる。
【０２０５】
Ｃ．Ｔ−ｂｅｔ欠損細胞を使用するアッセイ
別の態様において、本発明はＴ−ｂｅｔが欠損の細胞を使用したＴ−ｂｅｔの生物学的影響を調節する化合物の同定方法を提供する。前に記載したとおり、Ｂ細胞における（例えばＴ−ｂｅｔ遺伝子の破壊による）Ｔ−ｂｅｔ活性の阻害は、ＩｇＧ２ａ産生の欠損をもたらす。従ってＴ−ｂｅｔが欠損の細胞を使用して、Ｔ−ｂｅｔそれ自身を調節すること以外の手段によりＴ−ｂｅｔにより調節される生物学的応答を調節する作用物質を同定し得る（すなわちＴ−ｂｅｔ欠損表現型を「救助する」化合物）。あるいは、Ｔ−ｂｅｔ遺伝子が条件付様式で非機能的にされている「条件付ノックアウト」系を使用して、スクリーニングアッセイでの使用のためのＴ−ｂｅｔ欠損細胞を作成し得る。例えば国際公開第９４／２９４４２号明細書および米国特許第５，６５０，２９８号明細書に記載されている遺伝子の条件付破壊のためのテトラサイクリンに調節される系を使用して細胞もしくはそれから細胞を単離可能であるＴ−ｂｅｔ欠損動物を作出することができ、それらは細胞と接触するテトラサイクリン濃度の調節を介して制御された様式でＴ−ｂｅｔ欠損にされることができる。Ｔ−ｂｅｔの他の生物学的効果に関するアッセイに、類似の条件付破壊の取り組みを使用することができ、あるいはＲＡＧ−２欠損胚盤胞補完系を使用して、Ｔ−ｂｅｔ遺伝子のホモ接合性突然変異を伴う胚幹細胞から生じるリンパ系器官をもつマウスを作出することができる。こうした動物からのＴ−ｂｅｔ欠損リンパ系細胞（例えば胸腺、脾および／もしくはリンパ節細胞）または精製されたＴ−ｂｅｔ欠損Ｂ細胞をスクリーニングアッセイで使用し得る。
【０２０６】
スクリーニング法では、Ｔ−ｂｅｔが欠損の細胞を試験化合物と接触させ、そしてＴ−ｂｅｔにより調節される生物学的応答を監視する。Ｔ−ｂｅｔ欠損細胞における応答の調節（例えば未処理細胞もしくは対照作用物質で処理した細胞のような適切な対照と比較した）が、試験化合物をＴ−ｂｅｔに調節される応答の調節物質と同定する。
【０２０７】
１つの態様において、試験化合物を非ヒトＴ−ｂｅｔ欠損動物、好ましくはマウス（例えばＴ−ｂｅｔ遺伝子が上記の手段により条件付で破壊されているマウス、もしくはリンパ系器官が上記のようＴ−ｂｅｔが欠損であるキメラマウス）に直接投与して、Ｔ−ｂｅｔが欠損の細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ応答を調節する試験化合物を同定する。別の態様では、Ｔ−ｂｅｔが欠損の細胞を非ヒトＴ−ｂｅｔ欠損動物から単離し、そしてｅｘ  ｖｉｖｏで試験化合物と接触させてＴ−ｂｅｔが欠損の細胞中でＴ−ｂｅｔにより調節される応答を調節する試験化合物を同定する。
【０２０８】
Ｔ−ｂｅｔが欠損の細胞はＴ−ｂｅｔが欠損であるように作出された非ヒト動物から得ることができる。好適な非ヒト動物にはサル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヤギおよびヒツジを含む。好適な態様では、Ｔ−ｂｅｔ欠損動物はマウスである。Ｔ−ｂｅｔが欠損のマウスは実施例に記述されるとおり作出し得る。特定の１遺伝子産物が欠損の非ヒト動物は、典型的には相同的組換えにより作出する。簡単に説明すると、欠失、付加もしくは置換が導入され、それにより内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子を変える、例えば機能的に破壊するＴ−ｂｅｔ遺伝子の少なくとも一部分を含有するベクターを調製する。Ｔ−ｂｅｔ遺伝子は好ましくはマウスＴ−ｂｅｔ遺伝子である。例えば、マウスＴ−ｂｅｔ遺伝子はマウスＴ−ｂｅｔ  ｃＤＮＡをプローブとして使用してマウスゲノムＤＮＡライブラリーから単離し得る。次いでマウスＴ−ｂｅｔ遺伝子を使用してマウスゲノム中の内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子を改変するのに適する相同的組換えベクターを構築し得る。好適な態様では、相同的組換えに際して内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子が機能的に破壊されるようなベクターを設計する（すなわち、機能的ポリペプチドをもはやコードしない；「ノックアウト」ベクターともまた称される）。あるいは相同的組換えに際して、内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子が突然変異されるか、またはそうではなく改変されるがしかし機能的ポリペプチドをなおコードするようなベクターを設計し得る（例えば上流の制御領域を変えてそれにより内因性のＴ−ｂｅｔポリペプチドの発現を変えることができる）。相同的組換えベクターにおいて、Ｔ−ｂｅｔ遺伝子の改変部分はその５’および３’端でＴ−ｂｅｔ遺伝子の付加的な核酸により隣接されて、該ベクターにより運ばれ外因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子と胚幹細胞中の内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子との間で相同的組換えを可能とする。付加的な隣接するＴ−ｂｅｔ核酸は内因性遺伝子との成功裏の相同的組換えに十分な長さのものである。典型的には、数キロ塩基の隣接ＤＮＡ（５’および３’双方の端で）がベクターに包含される（例えば、相同的組換えベクターの記述についてＴｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ．ａｎｄ  Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．（１９８７）Ｃｅｌｌ  ５１：５０３を参照されたい）。ベクターを胚幹細胞株に（例えば電気穿孔法により）導入し、そして導入されたＴ−ｂｅｔ遺伝子が内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子と相同的に組換わった細胞を選択する（例えばＬｉ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６９：９１５を参照されたい）。次いで選択された細胞を動物（例えばマウス）の胚盤胞に注入して凝集キメラを形成させる（例えば、奇形ガンおよび胚性幹細胞：実践的取り組み（Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）、Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（ＩＲＬ、オックスフォード、１９８７）中、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．、ｐｐ．１１３−１５２を参照されたい）。次いでキメラ胚を適する偽妊娠雌性育成動物中に埋植し、そして胚を分娩までもたらすことができる。それらの生殖細胞中に相同的に組換えられたＤＮＡをもつ子孫を使用して、動物の全細胞が導入遺伝子の生殖系列��達により相同的に組換えられたＤＮＡを含有する動物を繁殖し得る。相同的組換えベクターおよび相同的組換え動物の構築方法は、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２：８２３−８２９ならびにＬｅ  Ｍｏｕｅｌｌｅｃ  ｅｔ  ａｌ．によるＰＣＴ国際公開第９０／１１３５４号明細書；Ｓｍｉｔｈｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．による同第９１／０１１４０号明細書；Ｚｉｊｌｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．による同第９２／０９６８号明細書；およびＢｅｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．による同第９３／０４１６９号明細書にさらに記載されている。
【０２０９】
別の態様において、野性型およびＴ−ｂｅｔヌル双方のマウスからのドナー骨髄細胞のレトロウイルス形質導入を、照射されたＲＡＧレシピエントを再構成するためにＤＮすなわちドミナントネガティブ構築物を用いて行うことができる。これは、そのリンパ系細胞がドミナントネガティブバージョンのＴ−ｂｅｔのみを発現するマウスの生産をもたらすことができる。次いでこれらのマウスからのＢ細胞を、Ｔ−ｂｅｔにより調節される生物学的応答を調節する化合物について試験することができる。
【０２１０】
スクリーニングアッセイの１つの態様において、Ｔ−ｂｅｔにより調節される生物学的応答を調節するそれらの能力について試験された化合物を、非ヒトＴ−ｂｅｔ欠損動物に試験化合物をｉｎ  ｖｉｖｏで投与することによりＴ−ｂｅｔ欠損細胞と接触させ、そして該動物における応答に対する該試験化合物の影響を評価する。試験化合物は製薬学的組成物として非ヒトＴ−ｂｅｔ欠損動物に投与できる。こうした組成物は、典型的には試験化合物および製薬学的に許容し得る担体を含んでなる。本明細書で使用する用語「製薬学的に許容できる担体」は、製薬学的投与と適合性のありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌性化合物、等張および吸収を遅らせる化合物等を含むことを意図している。製薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および化合物の使用は当該技術分野で周知である。任意の通常の媒体もしくは化合物が有効成分と不適合性である場合を除き、組成物中でのそれらの使用が企図されている。補助的に活性な化合物もまた組成物中に包含することが可能である。
【０２１１】
Ｄ．試験化合物
本明細書に記載するスクリーニングアッセイを使用して、種々の試験化合物を評価することができる。ある態様では、試験されるべき化合物はライブラリーに由来することができる（すなわち化合物の１ライブラリーのメンバーである）。ペプチドのライブラリーの使用が当該技術分野で十分に確立されている一方、ベンゾジアゼピン（Ｂｕｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１０９８７；ＤｅＷｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６９０９）ペプトイド（Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ．（１９９４）．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８）オリゴカルバメート（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２６１：１３０３−）、およびヒダントイン（ＤｅＷｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．上記）のような他の化合物の混合物の製造を可能にした新たな技術が開発された。１０４〜１０５の多様性をもつ低有機分子の分子ライブラリーの合成のための１つの取り組みが記載されている（Ｃａｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９−；Ｃａｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１−）。
【０２１２】
本発明の化合物は：生物学的ライブラリー；空間的に接近可能な平行固相もしくは液相ライブラリー、デコンヴォリューションを必要とする合成ライブラリー法、「１ビーズ１化合物（ｏｎｅ−ｂｅａｄ  ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」ライブラリー法およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法を含む当該技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリー法における多数の取り組みのいずれを使用しても得ることができる。生物学的ライブラリーの取り組みは、ペプチドのライブラリーに制限される一方、他の４つの取り組みは化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマーもしくは低分子ライブラリーに応用可能である（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｍｐｏｎｄ  Ｄｅｓ．１２：１４５）。分子ライブラリーの他の例示的合成方法は当該技術分野において、例えば：Ｅｒｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２−；Ｈｏｒｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ／（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ３３：６８−；およびＧａｌｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３−に見出すことができる。
【０２１３】
化合物のライブラリーは、溶液中（例えばＨｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１）、またはビーズ（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ  米国特許第５，２２３，４０９号明細書）、スポア（Ｌａｄｎｅｒ  米国特許第’４０９号）、プラスミド上（Ｃｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１８６５−１８６９）もしくはファージ上（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０）；（Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６）；（Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６３７８−６３８２）；（Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０）に提示されているかもしれない；さらに別の態様において、コンビナトリアルポリペプチドはｃＤＮＡライブラリーから作成される。
【０２１４】
活性についてスクリーニングできる例示的化合物は、限定するわけではないがペプチド、核酸、炭水化物、低有機分子および天然産物抽出物ライブラリーを含む。
【０２１５】
候補／試験化合物は、例えば、１）Ｉｇ尾部をつけられた（ｔａｉｌｅｄ）融合ペプチドならびにＤ−および／もしくはＬ−配置アミノ酸より作成されるランダムペプチドライブラリー（例えばＬａｍ，Ｋ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．ら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８４−８６を参照されたい）およびコンビナトリアルケミストリー由来の分子ライブラリーのメンバーを包含する可溶性ペプチドのようなペプチド；２）ホスホペプチド（例えば無作為かつ部分的に縮重の定方向ホスホペプチドライブラリーのメンバー、例えばＳｏｎｇｙａｎｇ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７２：７６７−７７８を参照されたい）；３）抗体（例えばポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラおよび一本鎖抗体ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ発現ライブラリーフラグメントおよび抗体のエピトープ結合フラグメント）；４）低有機および無機分子（例えばコンビナトリアルおよび天然産物のライブラリーから得られる分子）；５）酵素（例えばエンドリボヌクレアーゼ、加水分解酵素、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、合成酵素、異性化酵素、ポリメラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、酸化還元酵素およびＡＴＰアーゼ）、ならびに６）変異体の形態もしくはＴ−ｂｅｔ分子、例えばドミナントネガティブ突然変異体の形態の分子を含む。
【０２１６】
本発明の試験化合物は：生物学的ライブラリー；空間的に接近可能な平行固相もしくは液相ライブラリー；デコンヴォリューションを必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物（ｏｎｅ−ｂｅａｄ  ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」ライブラリー法：およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法を含む当該技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリー法における多数の取り組みのいずれを使用しても得ることができる。生物学的ライブラリーの取り組みはペプチドのライブラリーに制限される一方、他の４つの取り組みは化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマーもしくは低分子ライブラリーに応用可能である（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｍｐｏｎｄ  Ｄｅｓ．１２：１４５）。
【０２１７】
分子ライブラリーの合成方法の例は、当該技術分野で例えば：ＤｅＷｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３；Ｃａｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３に見出し得る。
【０２１８】
化合物のライブラリーは、溶液中（例えばＨｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１）またはビーズ（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ  米国特許第５，２２３，４０９号明細書）、スポア（Ｌａｄｎｅｒ  米国特許第’４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１８６５−１８６９）もしくはファージ上（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６３７８−６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０；Ｌａｄｎｅｒ  上記）に提示されているかもしれない。
【０２１９】
主題のスクリーニングアッセイで同定される化合物は、Ｔ−ｂｅｔにより調節される生物学的応答の１もしくは複数の調節方法で使用することができる。こうした化合物（１もしくは複数）を細胞と接触させる前にそれらを製薬学的組成物（上記のような）として配合することが望ましいかもしれないことが理解されるであろう。
【０２２０】
Ｔ−ｂｅｔ発現および／もしくは活性を直接もしくは間接的に調節する試験化合物が、上記の多様な方法の１つによりいったん同定されれば、選択された試験化合物（もしくは「目的の化合物」）を次いで例えばインビボ（例えば目的の化合物を個体に投与することにより）もしくはエクスビボ（例えば個体から細胞を単離し、そして単離された細胞を目的の化合物と接触させることにより、あるいは目的の化合物を細胞株と接触させることにより）のいずれかで細胞と目的の化合物を接触させること、および適切な対照（未処理の細胞または生物学的応答を調節しない対照化合物もしくは担体で処理した細胞のような）と比較して細胞に対する目的の化合物の影響を決定することにより、細胞に対するその影響についてさらに評価することができる。目的の化合物はまた当該技術分野で既知の技術を使用した構造に基づく薬物設計を使用しても同定可能である。
【０２２１】
また本発明は上のアッセイで同定される化合物に関する。
【０２２２】
ＶＩＩ．本発明のキット
本発明の別の観点は、本発明のスクリーニングアッセイを行うためのキットに関する。例えば、本発明のスクリーニングアッセイを実施するためのキットには、Ｔ−ｂｅｔを含有する指示組成物、読み取り（例えばポリペプチド分泌）を測定するための手段、およびＴ−ｂｅｔの生物学的影響の調節物質を同定するためのキットの使用説明書を含むことができる。別の態様において、本発明のスクリーニングアッセイを実施するためのキットは、Ｔ−ｂｅｔ欠損細胞、読み出しを測定するための手段およびＴ−ｂｅｔの生物学的影響の調節物質を同定するためのキットの使用説明書を含んでなる。
【０２２３】
本発明は以下の実施例によりさらに具体的に説明され、これらは制限すると解釈されるべきでない。本出願を通じて引用される全部の参考文献、特許および公開特許出願の内容、ならびに図および配列表は引用することにより本明細書に編入する。さらに本明細書で参照する公的データベースに寄託されたすべての核酸およびアミノ酸配列は、引用により本明細書に編入する。
【０２２４】
ｐＪＧ４−５ベクターのＥｃｏＲＩ部位にクローン化されたマウスＴ−ｂｅｔ  ｃＤＮＡを含んでなる核酸分子を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（バージニア州、マナッサス）に、１９９９年１１月９日に寄託し、そして寄託番号ＰＴＡ−９３０を得たＰＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにクローン化されたヒトＴ−ｂｅｔ  ｃＤＮＡ（ヒトＴｈ１クローンＲＯＴ−１０に由来するＲＮＡから調製した）を含んでなる核酸分子を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（バージニア州、マナッサス）に、２０００年１月２８日に寄託し、そして寄託番号ＰＴＡ−１３３９を得た。両寄託ともブダペスト条約の下になされた。
【実施例】
【０２２５】
実施例では以下の材料および方法を使用した：
【０２２６】
マウス、細胞株および試薬
Ｃ５７ＢＬ／６の遺伝的背景に７世代以上、戻し交配したＴ−ｂｅｔ−／−マウスを、野生型対照Ｃ５７ＢＬ／６マウスと使用した。このマウスＴｈ１細胞クローン、ＡＥ７およびマウス胸腺腫細胞、ＥＬ４細胞をＲＰＭＩ１６４０完全培地中で培養した。組換えマウスのサイトカインはファミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）（サンディエゴ、カリフォルニア州）から購入した。マウス抗−ＩＬ−２抗体により認識されないヒト組換えＩＬ−２は、カイロン（Ｃｈｉｒｏｎ）（エメリーヴィレ、カリフォルニア州）から得た。ＥＬＩＳＡ用のすべの捕捉およびビオチン標識化抗−サイトカイン抗体は、ファミンゲンから得た。すべてのマウスはハーバード大学公衆衛生スクール（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ）で発熱物質を含まないバリオセイフティレベル３の施設で維持され、そして水およびマウスの餌を与えられた。マウスはマウスの病原体に関する歩哨動物の試験により示されるように、すべての病原体について陰性であった。マウスの取り扱いおよび実験手順は、動物の管理および使用に関する研究所および国立衛生研究所のガイドラインに従った。
【０２２７】
ＣＤ４＋Ｔｈ細胞の単離およびインビトロ分化
ＣＤ４＋Ｔ細胞は磁気ビーズ精製（ＭＡＣＳ、ミルッテニー  バイオテック社（Ｍｉｌｒｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．）、オーバーン、カリフォルニア州）により、６〜８週齢のＴ−ｂｅｔ−／−および野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスのリンパ節から単離し、そして組換えヒトＩＬ−２（１００単位／ｍｌ）を含むプレートに結合した抗−ＣＤ３（２μｇ／ｍｌ）および抗ＣＤ２８（２μｇ／ｍｌ）で刺激した。Ｔｈ１細胞の分化については、抗−ＩＬ−４（５μｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１２（２ｎｇ／ｍｌ）を０日に与えた。
【０２２８】
リン酸化マッピング
７２時間刺激したＴｈ１細胞を回収し、そして核抽出物をＴ−ｂｅｔタンパク質の免疫沈降に使用した。解像したＴ−ｂｅｔタンパク質はＧｅｌＣｏｄｅ（商標）ブルー染色液（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）、ロックフォード、イリノイ州）により染色し、そして質量分析用に切り出した。ゲル片はゲル中でトリプシンにより消化し、そして逆相ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによりタプリンバイオロジカルマススペクトロメトリー施設（Ｔｌａｐｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）（ボストン、マサチューセッツ州）により分析した。
【０２２９】
レトロウイルスの形質導入およびＥＬＩＳＡ
ｗｔおよびセリン変異体Ｔ−ｂｅｔを生産するレトロウイルスを、Ｔ−ｂｅｔ−／−Ｔｈｐ細胞に導入し、そして３日にＧＦＰで分類した細胞をさらに３日間、拡大した。細胞を一晩、プレートに結合した抗−ＣＤ３（２μｇ／ｍｌ）で再刺激した。全細胞抽出物は再刺激した細胞から調製した。上清をサイトカインを捕捉する抗体とインキュベーションし、次いでビオチン化２次抗体、アビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ、そして検出用ホスファターゼ基質（シグマ：Ｓｉｇｍａ）と順次インキュベーションした。
【０２３０】
インビトロでのキナーゼアッセイ
Ｆｌａｇ−標識化Ｔ−ｂｅｔタンパク質は２９３Ｔ細胞中で過剰に発現され、次いでＦＬＡＧ−Ｍ２アガロースを使用して免疫沈降させた。組換えタンパク質キナーゼをＴ−ｂｅｔタンパク質と１〜４時間、γ−［３２Ｐ］ＡＴＰの存在または不存在下でインキュベーションした。反応はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析し、そしてリン酸化されたＴ−ｂｅｔは、ラジオグラフィーにより検出した。
【０２３１】
ＤＮＡプルダウンアッセイ
全細胞抽出物は、ＨＫＭＧバッファー（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．９、１００ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０％グリセロール、０．１％ＮＰ−４０および１ｍＭ  ＤＴＴ）で調製し、そしてビオチン化二本鎖ＤＮＡおよび沈殿用のストレプトアビジン−アガロースとインキュベーションした。沈殿物をＨＫＭＧバッファーで３回洗浄し、そしてイムノブロットアッセイのためにＳＤＳ−ＰＡＧＥに乗せた。
【０２３２】
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）
ＣｈＩＰアッセイは、製造元の使用説明（アップステートバイオテクノロジー：Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に従い行った。細胞（６ｘ１０７）は１．１％ホルムアルデヒドで架橋結合し、氷冷したＰＢＳですすぎ、そして溶解バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００およびプロテアーゼインヒビター）に再懸濁した。核をペレットとし、そして超音波処理して５００ｂｐのクロマチン断片を得た。超音波処理した抽出物を抗−ＲｅｌＡおよび抗−Ｔ−ｂｅｔポリクローナルＡｂｓとインキュベーションした。免疫複合体はリチウムクロライドを含む洗浄バッファーで洗浄した。最後の洗浄後、抗体／タンパク質／ＤＮＡ複合体を溶出し、そして６７℃で一晩インキュベーションして、ホルムアルデヒドの架橋を戻した。ＤＮＡはＱＩＡＧＥＮ  ＰＣＲ精製キット（キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）、バレンシア、カリフォルニア州）を使用して精製し、溶出し、そしてＰＣＲに使用した。以下のプライマーの組を使用してＩＬ−２プロモーターを増幅した；ＩＬ２ｐ−ＦＷＤ：５’−ｇｔｔｔｃａｔａｃａｇｃａｇｇｃｇｔｔｃａｔｔｇ−３’。ＩＬ２ｐ−ＲＥＶ：５’−ｔｔｔｃｃｔｃｔｔｃｔｇａｔｇａｃｔｃｔｃｔｇｇ−３’。
【０２３３】
実施例１．新規転写因子Ｔ−ｂｅｔのクローニング
ＩＬ−２プロモーターのＴｈ１特異的領域は十分に限局されているため（Ｂｒｏｍｂａｃｈｅｒ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．１９９４．Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１８９−１９７；Ｒｏｏｎｅｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．１９９５．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５、６２９９−６３１０；Ｌｅｄｅｒｅｒ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．１９９４．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２、７７−８６；Ｄｕｒａｎｄ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．１９８８．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８、１７１５−１７２４；Ｈｏｙｏｓ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．１９８９．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４、４５７−４５０）、Ｔｈ１特異的転写因子を同定するためにＩＬ−２プロモーター−レポーター、およびＯＦ６  Ｔｈ１クローンから作成したｃＤＮＡライブラリーを使用する酵母１ハイブリッドアプローチを選んだ。この取り組みを検証するために、ＩＬ−４プロモーターのＴｈ２特異的領域を酵母中で発現させ、そしてｃ−Ｍａｆの導入によりトランス活性化されることが示されたが、しかし数種の他の転写因子（例えばＮＦＡＴ）によってはされなかった。ｃ−Ｍａｆ応答因子（ＭＡＲＥ）を突然変異させた場合にｃ−Ｍａｆのトランス活性化は起こらなかった。すなわち酵母１ハイブリッドアプローチを利用した。
【０２３４】
ＥＧＹ４８酵母株をＩＬ−２プロモーター／ヒスチジン構築物で安定に組込み、そして抗ＣＤ３で活性化したＴｈ１細胞クローンＯＦ６から作成したｃＤＮＡライブラリーで形質転換した。スクリーニングした５．６×１０６クローンのうち４８８個が一次スクリーニングで陽性であった。二次スクリーニング中に試験した２１０クローンのうち７２個がＩＬ−２プロモーターに特異的であることが判明した。陽性クローンの数を減少させるため、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞株で差別的に発現されたｃＤＮＡと酵母クローンｃＤＮＡをハイブリダイズさせた。これらのＴｈ１−Ｔｈ２およびＴｈ２−Ｔｈ１  ｃＤＮＡは、放射標識し、かつ１６個の最も強く陽性の酵母クローンをスクリーニングするためのパイロット実験で最初に使用したクロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）ＰＣＲ選択キットを使用して作成した。それら１６クローンのうち８個がＴｈ１（ＰＬ１７）特異的ｃＤＮＡ産物プローブで陽性であり、そしてＴｈ２（Ｄ１０）特異的ｃＤＮＡ産物プローブで陽性でなかった。ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４へのプローブの対照ハイブリダイゼーションを用いた１６個の陽性クローンでのＴｈ１−Ｔｈ２プローブを用いる発現差解析法（ＲＤＡ；例えばＬｉｓｉｔｓｙｎ．１９９３．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２５９：９４６；Ｏ’Ｎｅｉｌ  ａｎｄ  Ｓｉｎｃｌａｉｒ．１９９７．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：２６８１；Ｈｕｂａｎｋ  ａｎｄ  Ｓｃｈａｔｚ．１９９４．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２２：５６４０；Ｗｅｌｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２６：３０５９）を実施した。Ｔｈ１およびＴｈ２を減算したｃＤＮＡプローブの特異性はＩＬ−４に対するそれぞれＩＬ−２およびＩＦＮ−γのそれらの検出により示される。
【０２３５】
制限酵素分析およびシークエンシングデータは、全部で８個のクローンが関係づけられたことを示した。それらは５’および３’非翻訳領域中の差異に基づき３つのグループ分けに入り、これらの範疇の各々は独立したｃＤＮＡ分子を表した。これらのクローンの配列をＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ配列データベースと比較することにより、転写因子のＴ−ｂｏｘファミリーとの相同性を生じた。
【０２３６】
実施例２．Ｔ−ｂｅｔはＴ−ｂｏｘファミリーのメンバーＴ−ｂｒａｉｎおよびエオメソデルミン（ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ）と相同な１領域を共有する
ＢｒａｃｈｙｕｒｙもしくはＴはＴ−ｂｏｘと呼ばれる２００アミノ酸のＤＮＡ結合ドメインを共有する転写因子の１ファミリーの創設メンバーである（Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．１９９７．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ７、４７４−４８０；Ｐａｐａｉｏａｎｎｏｕ  ａｎｄ  Ｓｉｌｖｅｒ．１９９８．Ｂｉｏｅｓｓａｙ．２０：９；Ｍｅｉｓｌｅｒ，Ｍ．Ｈ．１９９７．Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  ８、７９９−８００に総説される。）。Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（「短い尾」のギリシア語）突然変異は、短いわずかにもつれた尾部を有したヘテロ接合性の変異体動物で１９２７年に最初に記載された（Ｈｅｒｒｍａｎｎ，Ｂ．Ｇ．、１９９０．Ｎａｔｕｒｅ  ３４３、６１７−６２２）。マウスでＢｒａｃｈｙｕｒｙを包含せずに今や８種のＴ−ｂｏｘ遺伝子が存在する。これらはＴｂｘ１−６、Ｔ−ｂｒａｉｎ−１（Ｔｂｒ−１）および今やＴ−ｂｅｔを包含し、それぞれまるで異なり、しかも通常は複雑な発現パターンをもつ。転写因子のＴ−ｂｏｘファミリーはＤＮＡ結合ドメイン中のファミリーメンバーの相同性により定義される。Ｔ−ｂｅｔ  ＤＮＡ結合ドメイン（マウスＴ−ｂｅｔの残基１３８〜３２７）は、マウスＴ−ｂｒａｉｎおよびアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）エオメソデルミンのＴ−ｂｏｘドメインに最も類似し、従ってＴ−ｂｅｔをＴ−ｂｏｘ遺伝子ファミリーのＴｂｒ１サブファミリーに置く。マウスＴ−ｂｅｔタンパク質のヒト相同物はマウスＴ−ｂｅｔとおよそ８８％同一である。Ｔ−ｂｅｔはＴ−ｂｏｘファミリーメンバーのＴ−ｂｒａｉｎおよびエオメソデルミンと相同な１領域を共有する。マウスＴ−ｂｅｔ  ＤＮＡ結合ドメインは、マウスＴ−ｂｒａｉｎおよびアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）エオメソデルミンのＴ−ｂｏｘドメインに最も類似である。３種のＴ−ｂｏｘ領域間におよそ６９％のアミノ酸の同一性が存在する。Ｔ−ｂｅｔはＴ−ｂｏｘドメイン以外では他のＴ−ｂｏｘファミリーメンバーに対する配列の相同性をもたない。
【０２３７】
実施例３．Ｔ−ｂｅｔはインビボでセリン残基５０８でリン酸化される
Ｔ−ｂｅｔはＡＥ７、Ｔｈ１細胞クローン中で高レベルに発現される。興味深いことには、ＡＥ７抽出物にはＴ−ｂｅｔの３つの免疫反応性種があり、Ｔ−ｂｅｔが翻訳後に修飾されるかもしれないことを示唆している。Ｔ−ｂｅｔは残基５２５でチロシンリン酸化されており（Ｈｗａｎｇ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０７：４３０−４３３）、この単一のリン酸化チロシンは検出される多くの種の原因ではないらいしい。リン酸化が観察される３重複合体の原因かどうかを試験するために、ＡＥ７細胞をホスファターゼインヒビターの存在または不存在下でウシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理した。ホスファターゼインヒビターの不存在下ではＣＩＰ処理で上の２つのバンドが消えたが、存在下では消えず、特異的リン酸化部位の同定を促進した。初代Ｔｈ１細胞中の内因性Ｔ−ｂｅｔは、抗−Ｔ−ｂｅｔＡｂを使用して免疫沈降させ、うＳＤＳ−ＰＡＧＥで解像され、そして引き続きゲルは染色された。Ｔ−ｂｅｔ−／−Ｔｈ１細胞は陰性対照として使用した。特異的Ｔ−ｂｅｔタンパク質バンドはウエスタンブロットにより検出され、そしてリン酸化ペプチドを分析するために質量分析（ＭＳ）用に切り出された。質量分析は特異的にリン酸化されたペプチドを同定し、これはＴ−ｂｅｔのセリン（Ｓ）５０８でリン酸化された。Ｓ５０８リン酸化は、２９３Ｔ細胞中で過剰に発現されるＴ−ｂｅｔのＭＳ分析によっても観察された。これらの結果はＴ−ｂｅｔが初代Ｔｈ１細胞中でキナーゼによりセリンでリン酸化され、非−Ｔ細胞でも発現されることを示している。
【０２３８】
実施例４．Ｔ−ｂｅｔのセリンリン酸化は、ＣＫ１およびＧＳＫ−３キナーゼにより媒介される
Ｔ−ｂｅｔのＳ５０８をリン酸化する特異的な上流のセリン／トレオニンキナーゼを同定するために、Ｔ−ｂｅｔのＣ−末端配列は、キナーゼ／リン酸化部位を予想するスキャンサイト（ｓｃａｎｓｉｔｅ）プログラム（ｓｃａｎｓｉｔｅ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）で分析した。ヒトとマウスとの間でよく保存されているＴ−ｂｅｔのＣ−末端ペプチドは、数個のセリン残基を含む：スキャンサイトプログラムはカゼインキナーゼＩ（ＣＫＩ）のリン酸化部位としてＳ５０８を予想した。したがってＴ−ｂｅｔのインビトロリン酸化を、組換えプロテインキナーゼのパネルを使用して分析した。Ｔ−ｂｅｔタンパク質はＴ−ｂｅｔ発現ベクターでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞から免疫沈降により精製した。組換えプロテインキナーゼ（１０Ｕ）を沈殿したＴ−ｂｅｔおよび１０μＣｉのγ−［３２Ｐ］ＡＴＰ（６０００Ｃｉ／ｍＭ）と３７℃で１時間インキュベーションした。反応混合物はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析し、そして得られたゲルを乾燥させ、そしてオートラジオグラフィーにかけた。活性なＥＲＫではなくＣＫＩが、Ｔ−ｂｅｔタンパク質をインビトロでリン酸化した。またＴ−ｂｅｔはＰＫＡによってもリン酸化されたが、ＣＫＩよりも１０００倍低い効率であった。すべての組換えキナーゼは対照基質を効率的にリン酸化した。ＣＫＩがＳ５０８を特異的にリン酸化するのかどうかを試験するために、セリンからアラニンへの変異体Ｔ−ｂｅｔ（Ｓ５０８Ａ）ならびに対照としてＳ４９８Ａ変異体を構築し、次いでこれらタンパク質のインビトロリン酸化を比較した。Ｔ−ｂｅｔタンパク質は２９３Ｔ細胞中で過剰に発現され、免疫沈降し、ウエスタンブロットにより確認される比較可能な発現レベルおよび溶解物、そしてさらなる実験に基質として使用した。ＰＫＡ−誘導型のリン酸化はｗｔ、Ｓ５０８ＡおよびＳ４９８Ａ  Ｔ−ｂｅｔタンパク質、Ｓ５０８Ａ変異体のＣＫＩ−媒介型リン酸化の間では変わらなかったが、Ｓ４９８Ａ対照変異体では変わり、この変化はｗｔと比較して劇的に減少した。これらのデータはＴ−ｂｅｔＳ５０８がＣＫＩの特異的リン酸化部位であるが、大変低いレベルでＣＫＩによるＴ−ｂｅｔＳ５０８の残存するリン酸化も存在したので、さらにＣＫＩリン酸化部位もＴ−ｂｅｔに存在するらしいことを示唆している。
【０２３９】
ＣＫＩ媒介型のリン酸化は、ＧＳＫ−３のようなキナーゼによるさらなるリン酸化を誘導する。ＧＳＫ−３はプレリン酸化基質を認識し、そしてｓｅｒ／ｔｈｒの５個の反復（ＳＸＸＸＳ）を含む基質をプロセッシブに超リン酸化（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅｌｙ  ｈｙｐｅｒｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅ）するプロリン指向的（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）セリン／トレオニンキナーゼである（Ｄａｊａｎｉ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｃｅｌｌ  １０５：７２１−７３２；Ｃｏｈｅｎ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｓ．Ｆｒａｍｅ．２００１．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２：７６９−７７６）。興味深いことには、Ｓ５０８の近くに位置するＴ−ｂｅｔ中に保存されたＧＳＫ−３リン酸化部位がある。Ｔ−ｂｅｔがＧＳＫ−３により超リン酸化され得るのかどうかを決定するために、同量のＴ−ｂｅｔタンパク質をＣＫＩとプレリン酸化用のＡＴＰの存在下でプレインキュベーションし、ＰＢＳで洗浄して余分のＡＴＰおよびＣＫＩを除去し、次いでＧＳＫ−３およびγ−［３２Ｐ］ＡＴＰと反応させた。ＧＳＫ−３によるＴ−ｂｅｔの超リン酸化は明白であった。ＧＳＫ−３はＳ４９８Ａ変異体にｗｔレベルのリン酸化を誘導したが、ＧＳＫ−３が媒介するリン酸化はＳ５０８Ａ変異体では顕著に減少した。さらにＴ−ｂｅｔは、ＣＫＩによるインビトロでのプレリン酸化無しでＧＳＫ−３によりリン酸化され、Ｔ−ｂｅｔが２９３Ｔ細胞中で内因性のＣＫＩによりリン酸化されることを示唆した。これは我々のＭＳによる２９３Ｔ細胞中でのＴ−ｂｅｔＳ５０８リン酸化の検出と一致する。したがってＴ−ｂｅｔＳ５０８の内因性または外因性ＣＫＩ−媒介型リン酸化は、インビトロでのＧＳＫ−３によるその後のリン酸化を進行させる。
【０２４０】
実施例５．Ｔ−ｂｅｔＳ５０８はＩＬ−２遺伝子転写のリプレッサーとしての機能に必要である
セリンでリン酸化されたＴ−ｂｅｔのインビボでの機能を確立するために、ｗｔ、Ｓ４９８Ａ対照変異体およびＳ５０８Ａ変異体Ｔ−ｂｅｔＧＦＰレトロウイルスを、Ｔ−ｂｅｔ−／−初代ＣＤ４＋Ｔｈ細胞に導入し、そして刺激した。ウエスタンブロット分析では、３種の形質導入されたＴ−ｂｅｔタンパク質の発現レベルが類似することが確認された。Ｔ−ｂｅｔはＴｈ細胞中で多くのサイトカインの発現を制御する。これはＩＦＮγ遺伝子の転写を直接的に活性化し、Ｔｈ２サイトカイン、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３の転写を間接的に抑制し、そして未知のメカニズムを介してＩＬ−２の発現を抑制する。ＴＣＲの活性化で、すべての３つのＴ−ｂｅｔレトロウイルスは、ＩＦＮγ生産を比較的上昇させ、そしてＴｈ２サイトカイン生産を効率的に抑制した。しかしセリン５０８のアラニンへの突然変異は、ＩＬ−２をコードするｍＲＮＡ転写物およびＩＬ−２タンパク質の両方の発現を抑制するＴ−ｂｅｔの能力を完全に破壊した。これらのデータは、Ｔ−ｂｅｔＳ５０８ＡがＩＬ−２の生産を抑制するその機能に選択的に必要であることを示す。
【０２４１】
実施例６．Ｔ−ｂｅｔはＩＬ−２遺伝子の近位プロモーター内のＴ−ｂｏｘ部位に特異的に結合し、そして結合はＳ５０８を必要としない
そのような抑制のメカニズムを調査するために、Ｔ−ｂｅｔがＴ−ｂｅｔ結合部位を含むＩＦＮγおよびＩＬ−２プロモーターレポーターに直接結合し、そしてトランス活性化するか、または抑制するかを決定した。内因性ＩＦＮγ生産を指令するその能力と一致して、Ｔ−ｂｅｔ  Ｓ５０８Ａ変異体はｗｔおよびＳ４９８Ａ対照Ｔ−ｂｅｔに匹敵してＩＦＮγプロモーターレポーターをトランス活性化した。対照的に、Ｔ−ｂｅｔおよびＳ４９８Ａ対照変異体はＩＬ−２プロモーター活性を抑制するが、Ｓ５０８Ａ変異体Ｔ−ｂｅｔはそうすることができなかった。この失敗はＴ−ｂｅｔの細胞下の位置における変化によるものではなく；Ｔ−ｂｅｔおよびその変異体が核で排他的に発現されるからであった。ＩＬ−２遺伝子プロモーター内のＴ−ｂｅｔ結合部位の調査では、近位ＩＬ−２遺伝子プロモーター内のＮＦＡＴとＮＦ−κＢ結合部位との間に推定上のＴ−ｂｏｘ結合配列が生じた。したがってＤＮＡプルダウンアッセイを行ってＴ−ｂｅｔのＤＮＡ結合活性を調査した。Ｔ−ｂｅｔを発現するタンパク質抽出物を、ビオチン化ｗｔまたは変異体Ｔ−ｂｅｔ結合部位のＤＮＡ（Ｔ−ｂｏｘ）とインキュベーションした。以下のようなＩＬ−２プロモーター内のｗｔまたは変異体（ｍｔ）Ｔ−ｂｏｘ部位は、ビオチンで５’末端を標識化し、そしてＴ−ｂｅｔタンパク質とインキュベーションした。複合体はストレプトアビジン−アガロースビーズでインキュベーションすることにより沈殿させ、そしてＴ−ｂｅｔのイムノブロッティングにかけた。ｗｔのＴ−ｂｏｘ部位：５’ｂｉｏ−ａｔｔａａａａｃｔｇｃｃａｃｃｔａａｇｔｇｔｇｇｇｃｔａａｃｃｃｇ−３’；ｍｔ  Ｔ−ｂｏｘ部位：５’ｂｉｏ−ａｔｔａａａａｃｔｇｃｔｃｔｃｔａａｃｔａａｇｇｇｃｔａａｃｃｃｇ−３’。ｗｔのＴ−ｂｏｘ含有ＤＮＡはＴ−ｂｅｔをプルダウンしたが、Ｔ−ｂｏｘ変異ＤＮＡはせず、Ｔ−ｂｅｔのＩＬ−２プロモーターへの配列特異的結合が示された。クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイでは、Ｔ−ｂｅｔがＩＬ−２プロモーターＤＮＡへ結合することが確認された。中でもＳ５０８ＡおよびＳ４９８Ａの両方のＴ−ｂｅｔ変異体が、ｗｔＴ−ｂｅｔに等しいＤＮＡ結合活性を有することに注目されたい。この結果は、Ｔ−ｂｅｔＳ５０８がＴ−ｂｅｔのＤＮＡへの結合能力に必要ではなく、Ｓ５０８Ａ変異体によるＩＦＮγ遺伝子転写の同等な誘導と一致する結果であることを示した。
【０２４２】
実施例７．Ｔ−ｂｅｔはＲｅｌＡとヘテロダイマー化し、そしてこの相互作用はＳ５０８のリン酸化と相関する
ＤＮＡ結合活性の改変では、Ｓ５０８Ａ変異体Ｔ−ｂｅｔのＩＬ−２遺伝子発現の抑制の失敗を説明することができなかったので、Ｔ−ｂｅｔがＩＬ−２遺伝子発現を調節する他の因子の活性を制御する可能性があった。Ｔ−ｂｅｔとＮＦＡＴおよびＮＦ−κＢのようなＩＬ−２活性化転写因子との間の物理的相互作用が起こるかどうかが最初に決定された。ＮＦＡＴはＩＬ−２遺伝子転写の重要なアクチベーターであり、そして５個の別個の必須ＮＦＡＴ結合部位がＩＬ−２近位プロモーターにマップされた（Ｒｏｏｎｅｙ，Ｊ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．１９９５．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５：６２９９−６３１０）。最近の実験では、Ｔ−ｂｅｔがＮＦＡＴｃ２と物理的に会合することが示された（Ｍｅｈｔａ，Ｄ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２：２０１６−２０２１）；しかしその相互作用はＴ−ｂｅｔＳ５０８に依存していない。ＮＦ−κＢファミリーのメンバーもＩＬ−２遺伝子の活性化に参加する。過剰発現したＴ−ｂｅｔとＲｅｌＡタンパク質との共免疫沈降アッセイでは、Ｔ−ｂｅｔがＲｅｌＡと物理的に相互作用することが明らかとなった。注目すべきは、Ｓ５０８Ａ変異体Ｔ−ｂｅｔがＲｅｌＡと共免疫沈降できないことが明らかとなったので、この相互作用にはＴ−ｂｅｔＳ５０８が必要な点である。ＩＬ−２の遺伝子発現を調節することが知られている別のＮＦ−κＢファミリーであるＣ−ＲｅｌもＴ−ｂｅｔと相互作用した；しかしこの相互作用はＴ−ｂｅｔＳ５０８を必要としなかった。Ｔ−ｂｅｔとＲｅｌＡとの内的相互作用も、以下に記載するようにＴｈ１細胞内で検出された。
【０２４３】
実施例８．Ｔ−ｂｅｔは、ＲｅｌＡ媒介型のＩＬ−２遺伝子転写を抑制するためにＴ−ｂｅｔ結合（Ｔ−ｂｏｘ）部位が必要である
Ｔ−ｂｅｔとＲｅｌＡとの物理的会合が、ＲｅｌＡによるＩＬ−２遺伝子のトランス活性化を調節するかどうかを決定した。Ｔ−ｂｅｔと４５０ｂｐのＩＬ−２プロモーターレポーターを含むＲｅｌＡとの同時発現は、Ｔ−ｂｅｔがＲｅｌＡによるＩＬ−２プロモーターのトランス活性化で妨害されることが明らかとなった。Ｔ−ｂｅｔのＲｅｌＡ依存的ＩＬ−２プロモーター活性化の抑制は、Ｔ−ｂｅｔのＴ−ｂｏｘ部位への結合およびＲｅｌＡのその標的部位への結合を必要とするかどうかが決定された。Ｔ−ｂｅｔは、ＮＦ−κＢ結合部位に連結したレポーター構築物の３つのコピーを使用した時、ＮＦ−κＢ媒介型の遺伝子活性化を抑制することができなかった。この結果は、ＮＦ−κＢ−依存的な遺伝子活性化を妨害するためにＴ−ｂｅｔがＴ−ｂｏｘ部位のようなさらなる配列を必要とすることを示唆している。我々はＩＬ−２プロモーターの５’欠損構築物を利用することによりこれを試験した。Ｔ−ｂｅｔの過剰発現は、Ｔ−ｂｏｘおよびＮＦ−κＢ部位の両方を含む２ｋｂおよび２５０ｂｐのＩＬ−２プロモーター構築物の外因性および内因性のＲｅｌＡ媒介型トランス活性化を阻害した。しかしＴ−ｂｏｘ部位が削除された２１０ｂｐのＩＬ−２プロモーター構築物の活性化は、Ｔ−ｂｅｔ発現により抑制されなかった。またＲｅｌＡがＴ−ｂｅｔ活性を同様に阻害する可能性があるかどうかも決定された。Ｔ−ｂｅｔおよびＴ−ｂｏｘ部位に連結されたレポーター構築物または４５０ｂｐのＩＦＮγプロモーター−レポーターを含むＲｅｌＡのＥＬ４細胞中での同時発現は、ＲｅｌＡがＴ−ｂｅｔ誘導型ＩＦＮγプロモーター活性に対して効果が無いことを示した。Ｔ−ｂｅｔはＮＦ−κＢ媒介型の遺伝子転写を抑制するためにＴ−ｂｏｘ結合部位が必要であると結論付けられた。さらにＴ−ｂｅｔ／ＲｅｌＡヘテロダイマーはＲｅｌＡを調節するために機能するだけで、少なくともここで問題となっている遺伝子に関してはＴ−ｂｅｔ媒介型の遺伝子活性化を調節するためには機能しない。
【０２４４】
実施例９．Ｔ−ｂｅｔは、ＮＦ−κＢ  ＤＮＡのＩＬ−２遺伝子への結合活性を調節する：ＲｅｌＡ  ＤＮＡ結合活性はＴ−ｂｅｔ−／−Ｔｈ１細胞中で上昇する
Ｔ−ｂｅｔとＲｅｌＡとの物理的相互作用、およびそのＲｅｌＡ媒介型のＩＬ−２遺伝子活性化の抑制が、ＲｅｌＡのＤＮＡへの結合に影響を及ぼすのかどうかを決定した。実際には、Ｔ−ｂｅｔのＩＬ−２１遺伝子転写のリプレッサー機能は、Ｔ−ｂｅｔとそのＤＮＡへの結合を妨害するＮＦＡＴｃ２との相互作用に従属的であった（Ｍｅｈｔａ，Ｄ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２：２０１６−２０２１）。ＮＦＡＴのＩＬ−２プロモーターへの結合活性は同時のＴ−ｂｅｔ発現により影響を受けなかったが、ＲｅｌＡのＩＬ−２プロモーターへのＤＮＡ結合活性はＴ−ｂｅｔの存在で顕著に減少することが見いだされた。中でもｗｔ  Ｔ−ｂｅｔとは対照的に、Ｓ５０８Ａ変異体Ｔ−ｂｅｔがＩＬ−２プロモーターへのＲｅｌＡ  ＤＮＡの結合を阻害しなかったことに注目されたい。Ｔ−ｂｅｔタンパク質の相当する発現レベルおよびＤＮＡ結合活性は、ウエスタンブロット分析により確認された。すなわちＴ−ｂｅｔのセリン５０８は、ＤＮＡとそれ自体の相互作用に必要ではない。代わりに、セリン５０８はＴ−ｂｅｔがＲｅｌＡのＩＬ−２プロモーターへの結合を妨害するために必要である。
【０２４５】
この現象の生理学的関連性を確立するために、ＲｅｌＡ  ＤＮＡ結合活性をｗｔ  Ｔｈ１細胞と比べて経時的にＴ−ｂｅｔ−／−中で測定した。ｗｔとＴ−ｂｅｔ−／−Ｔｈ１細胞との間にＲｅｌＡのタンパク質発現レベルに明白な差異は無く、そしてＲｅｌＡはＴｈ１細胞の分化のすべての段階で連続的に発現された。しかしＲｅｌＡのＤＮＡ結合活性は、ＴＣＲ刺激から２日後までＴ−ｂｅｔ−／−Ｔｈ１細胞で実質的に増加した。対照的に、ｃ−Ｒｅｌは初期の発生しているＴｈ１細胞で発現され、そしてＴｈ１細胞分化の３日後に減少した。同様にｃ−Ｒｅｌ  ＤＮＡの結合活性は３日まで増加し続けたが、発生しているＴｈ１細胞で３日後にはもはや検出されず、しかし異なるＤＮＡ結合活性を有する２種のｃ−Ｒｅｌが存在した。ＮＦ−κＢ  ｐ５０サブユニットは、ＲｅｌＡと同様に発生しているＴｈ１細胞中で経時的に持続して発現された。ＲｅｌＡの増大したＤＮＡ結合は、ｗｔおよびＴ−ｂｅｔ−／−Ｔｈ１細胞から調製した核抽出物のウエスタンブロット分析がＲｅｌＡの等しい発現を示したので、核のＲｅｌＡタンパク質の増大した量に帰することはできなかった。ＲｅｌＡとＴ−ｂｅｔとの間の生理学的関連を調査するために、発生しているＴｈ１細胞中のＴ−ｂｅｔおよびＲｅｌＡの内的相互作用を検出する実験を行った。ｄ６で行ったＴｈ１分化の予備実験では、内因性Ｔ−ｂｅｔとＲｅｌＡとの会合が明らかとなった。この会合のタイムコース分析で、これが３日まで起こらず、次いで６日まで持続し、後期発生中のＴｈ１細胞で観察される減少したＩＬ−２発現とよく相関することが明らかとなった。まとめると、これらの結果はＲｅｌＡとＴ−ｂｅｔとの相互作用が後期にＩＬ−２の生産をダウンレギュレートするが、初期のＴｈ１細胞分化ではしないという考えと一致する。
【０２４６】
実施例１０．ＲｅｌＡ  ＤＮＡの結合活性は内因性ＩＬ−２ｍＲＮＡ転写物およびタンパク質と相互作用する
Ｔｈ１分化中、Ｔ−ｂｅｔが制御するＲｅｌＡ  ＤＮＡ結合活性とＩＬ−２遺伝子転写との間の関係を次に調査した。ｗｔおよびＴ−ｂｅｔ−／−Ｔｈ細胞のＴｈ１細胞分化中のＩＬ−２タンパク質および転写物のレベルを比較した。２日目にｗｔおよびＴ−ｂｅｔ−／−Ｔｈ細胞により生産されるＩＬ−２のレベルに差異は無いことに注目されたい。これはマウスのＲｅｌＡ−／−胚由来の胎児肝臓での再構成が、１８時間でＩＬ−２生産に欠損が無いことを示した報告と一致し、そして初期の時点でＲｅｌＡではなくｃ−Ｒｅｌの主要な役割を強く示唆している（Ｄｏｉ，Ｔ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９７  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８５：９５３−９６１）。しかし３日までに、ｗｔ  Ｔｈ１細胞に比べてＩＬ−２はＴ−ｂｅｔ−／−により、有意により多く分泌された。ＩＬ−２タンパク質は、恐らく活性化Ｔｈ細胞により増大したその蓄積のために後期の時点ではＥＬＩＳＡにより検出できなかったので、Ｔｈ１細胞分化中のＩＬ−２ｍＲＮＡ発現の動力学を測定した。ＩＬ−２転写物はＴＣＲ刺激により誘導されたが、発生しているｗｔＴｈ１細胞では次第に減少し、ＩＬ−２遺伝子発現の抑制と一致する。対照的に、ＩＬ−２転写物はＴ−ｂｅｔ−／−Ｔｈ１細胞で存続し、分化のその段階でのＴ−ｂｅｔのリプレッサーの役割と合致する。Ｔｈ１の分極は、ｗｔ  Ｔｈ１細胞で増加するＩＦＮγタンパク質を測定することにより確認され、３日にピークに達し、そして次第に低下したが、ＩＦＮγ転写物は経時的に増加し続けた。予想どおり、ＩＦＮγのタンパク質およびｍＲＮＡレベルは、Ｔ−ｂｅｔ−／−Ｔｈ１細胞中ではほぼ完全に存在しなかった（Ｓｚａｂｏ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９５：３３８−３４２）（使用した特異的プライマーは：ＩＦＮγ−ＦＷＤ５’−ａｇｃａａｃａｇｃａａｇｇｃｇａａａａ−３’、ＩＦＮγ−ＲＥＶ、５’−ｃｔｇｇａｃｃｔｇｔｇｇｇｔｔｇｔｔｇａ−３’）。さらにｗｔ  Ｔｈ１細胞と比べて、再刺激したＴ−ｂｅｔ−／−Ｔｈ１細胞中で実質的に増加したレべルのＩＬ−２をコードする転写物ならびに増加したＩＬ−２タンパク質が観察された。これはＴ−ｂｅｔ過剰発現で観察されたＩＬ−２ｍＲＮＡおよびタンパク質の抑制と一致する。
【０２４７】
Ｔ−ｂｅｔ発現がＲｅｌＡのＩＬ−２プロモーターＤＮＡへの結合を制御するかどうかを直接試験するために、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイを使用した。後期発生中のｗｔおよびＴ−ｂｅｔ−／−Ｔｈ１細胞中のＤＮＡ／タンパク質複合体は、抗−ＲｅｌＡポリクローナル抗体と免疫沈降させ、そしてＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲにより検出された。Ｔ−ｂｅｔ−／−Ｔｈ１細胞中でＲｅｌＡの増加したＩＬ−２プロモーター結合は、ＰＣＲ反応で観察された。リアルタイムＰＣＲは、投入したＤＮＡに比べてＲｅｌＡのＩＬ−２プロモーター結合を定量的に測定し、そしてＴ−ｂｅｔ−／−Ｔｈ１細胞中で４．５倍の増加を示した。したがってＲｅｌＡ  ＤＮＡ結合活性はＴ−ｂｅｔを欠くＴｈ１細胞で上昇し、そして内因性ＩＬ−２ｍＲＮＡ転写物およびタンパク質の増加と相関する。まとめると、これらの実験はＴ−ｂｅｔとＲｅｌＡとの相互作用がＲｅｌＡのＩＬ−２プロモーターＤＮＡへの結合を妨害し、したがってＲｅｌＡによるＩＬ−２遺伝子発現の同時活性化を妨害することの確固とした証明を提供する。さらにこのプロセスはＴ−ｂｅｔのセリン５０８に依存し、そしてその残基のリン酸化に緊密に関連する。
【０２４８】
等価物
当業者は日常的な実験を行うだけで、本明細書に記載する具体的態様の多くの等価物を認識し、または確かめることができる。そのような等価物は添付する特許請求の範囲に包含されることを意図している。
【配列表】
2009514550000001.app
【国際調査報告】
2009514550.tif 000002