(57)【要約】  キナーゼ活性を調節する植物の化合物を開示する。開示する化合物及び方法はまた、ＣＯＸ−２の発現を阻害し、標的細胞におけるプロスタグランジンの合成を選択的に阻害し、そして炎症応答を選択的に阻害する。本組成物は、ホップ又はＡｃａｃｉａより単離されるか又は由来する少なくとも１つの分画を含有する。
2009504657.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の疾患関連プロテインキナーゼの活性の調節を、それを必要としている被検者においてする方法であって、ここで前記プロテインキナーゼ調節は、該被検者の健康にとって有益であり、アルファ酸、ベータ酸、プレニルフラボノイド、カルコン、イソアルファ酸、還元イソアルファ酸、使用済ホップ（spent hops）、及びアカシア由来の化合物又は抽出物からなる群より選択される化合物を含んでなる組成物の治療有効量を必要としている該被検者へ投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項２】
必要としている被検者が、自己免疫障害、アレルギー又は炎症障害、代謝症候群又は糖尿病関連障害、癌、眼障害、及び神経系障害からなる群より選択される状態を有する、請求項１の方法。
【請求項３】
疾患関連プロテインキナーゼが、ＡＢＬ、ＡＫＴ、ＡＵＲＯＲＡ、ＣＤＫ、ＤＢＦ２／２０、ＥＧＦＲ、ＥＰＨ／ＥＬＫ／ＥＣＫ、ＥＲＫ／ＭＡＰＫＦＧＦＲ、ＧＳＫ３、ＩＫＫＢ、ＩＮＳＲ、ＪＡＫ  ＤＯＭ  １／２、ＭＡＲＫ／ＰＲＫＡＡ、ＭＥＫ／ＳＴＥ７、ＭＥＫＫ／ＳＴＥ１１、ＭＬＫ、ｍＴＯＲ、ＰＡＫ／ＳＴＥ２０、ＰＤＧＦＲ、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＣ、ＰＯＬＯ、ＳＲＣ、ＴＥＣ／ＡＴＫ、及びＺＡＰ／ＳＹＫからなる群より選択される、請求項２の方法。
【請求項４】
アルファ酸が、フムロン、コフムロン、アドフムロン、プレフムロン、及びポストフムロンからなる群より選択される、請求項１の方法。
【請求項５】
ベータ酸が、ルプロン、コルプロン、アドルプロン、及びプレルプロンからなる群より選択される、請求項１の方法。
【請求項６】
イソアルファ酸が、イソフムロン、イソアドフムロン、及びイソコフムロンからなる群より選択される、請求項１の方法。
【請求項７】
還元イソアルファ酸が、ジヒドロ−イソフムロン、ジヒドロ−イソコフムロン、ジヒドロ−アドフムロン、テトラヒドロ−イソフムロン、テトラヒドロ−イソコフムロン、テトラヒドロ−アドフムロン、ヘキサヒドロ−イソフムロン、ヘキサヒドロ−イソコフムロン、ヘキサヒドロ−アドフムロン、及びｒｈｏ−イソアルファ酸からなる群より選択される、請求項１の方法。
【請求項８】
カルコンが、キサントフモール又はイソキサントフモールである、請求項１の方法。
【請求項９】
プレニルフラボノイドが、６−プレニルナリンゲニン又は８−プレニルナリンゲニンである、請求項１の方法。
【請求項１０】
アカシア由来の化合物又は抽出物が、Acacia catechu 又は Acacia nilotica に由来する、請求項１の方法。
【請求項１１】
Acacia catechu 又は Acacia nilotica の化合物が、ゴム樹脂、樹皮粉末、芯材粉末、及び Acacia catechu 又は Acacia nilotica 抽出物からなる群より選択される、請求項１の方法。
【請求項１２】
Acacia catechu 又は Acacia nilotica 抽出物が、酸性、アルカリ性、極性の溶媒、非極性溶媒、及び胃液抽出物より選択される、請求項１の方法。
【請求項１３】
組成物が、コーティング剤、等張剤及び吸収遅延剤、結合剤、接着剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、芳香剤、甘味剤、吸収剤、界面活性剤（detergents）、及び乳化剤からなる群より選択される医薬的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項の方法。
【請求項１４】
組成物が、抗酸化薬、ビタミン、無機物、タンパク質、脂肪、及び炭水化物からなる群より選択される１以上の成分（members）をさらに含む、請求項１３の方法。
【請求項１５】
組成物が、ロシグリタゾン、トログリタゾン、ピオグリタゾン、及びメトホルミンからなる群より選択される抗糖尿病薬をさらに含む、請求項１の方法。
【請求項１６】
複数の代謝症候群関連プロテインキナーゼの活性の調節を、それを必要としている被検者においてする方法であって、ここで前記プロテインキナーゼ調節は、該被検者の健康にとって有益であり、５：１比のｒｈｏ−イソアルファ酸と Acacia nilotica 芯材粉末抽出物を含んでなる組成物の治療有効量を必要としている該被検者へ投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項１７】
複数の疾患関連プロテインキナーゼの活性の調節を、それを必要としている被検者においてする組成物であって、ここで前記プロテインキナーゼ調節は、該被検者の健康にとって有益であり、アルファ酸、ベータ酸、プレニルフラボノイド、カルコン、イソアルファ酸、還元イソアルファ酸、使用済ホップ、及びアカシア由来の化合物又は抽出物からなる群より選択される化合物を含んでなる組成物の治療有効量を含んでなる、前記組成物。
【請求項１８】
必要としている被検者が、自己免疫障害、アレルギー又は炎症障害、代謝症候群又は糖尿病関連障害、癌、眼障害、及び神経系障害からなる群より選択される状態を有する、請求項１７の組成物。
【請求項１９】
疾患関連プロテインキナーゼが、ＡＢＬ、ＡＫＴ、ＡＵＲＯＲＡ、ＣＤＫ、ＤＢＦ２／２０、ＥＧＦＲ、ＥＰＨ／ＥＬＫ／ＥＣＫ、ＥＲＫ／ＭＡＰＫＦＧＦＲ、ＧＳＫ３、ＩＫＫＢ、ＩＮＳＲ、ＪＡＫ  ＤＯＭ  １／２、ＭＡＲＫ／ＰＲＫＡＡ、ＭＥＫ／ＳＴＥ７、ＭＥＫＫ／ＳＴＥ１１、ＭＬＫ、ｍＴＯＲ、ＰＡＫ／ＳＴＥ２０、ＰＤＧＦＲ、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＣ、ＰＯＬＯ、ＳＲＣ、ＴＥＣ／ＡＴＫ、及びＺＡＰ／ＳＹＫからなる群より選択される、請求項１７の組成物。
【請求項２０】
アルファ酸が、フムロン、コフムロン、アドフムロン、プレフムロン、及びポストフムロンからなる群より選択される、請求項１７の組成物。
【請求項２１】
ベータ酸が、ルプロン、コルプロン、アドルプロン、及びプレルプロンからなる群より選択される、請求項１７の組成物。
【請求項２２】
イソアルファ酸が、イソフムロン、イソアドフムロン、及びイソコフムロンからなる群より選択される、請求項１７の組成物。
【請求項２３】
還元イソアルファ酸が、ジヒドロ−イソフムロン、ジヒドロ−イソコフムロン、ジヒドロ−アドフムロン、テトラヒドロ−イソフムロン、テトラヒドロ−イソコフムロン、テトラヒドロ−アドフムロン、ヘキサヒドロ−イソフムロン、ヘキサヒドロ−イソコフムロン、ヘキサヒドロ−アドフムロン、及びｒｈｏ−イソアルファ酸からなる群より選択される、請求項１７の組成物。
【請求項２４】
カルコンが、キサントフモール又はイソキサントフモールである、請求項１７の組成物。
【請求項２５】
プレニルフラボノイドが、６−プレニルナリンゲニン又は８−プレニルナリンゲニンである、請求項１７の組成物。
【請求項２６】
アカシア由来の化合物又は抽出物が、Acacia catechu 又は Acacia nilotica に由来する、請求項１７の組成物。
【請求項２７】
Acacia catechu 又は Acacia nilotica の化合物が、ゴム樹脂、樹皮粉末、芯材粉末、及び Acacia catechu 又は Acacia nilotica 抽出物からなる群より選択される、請求項１７の組成物。
【請求項２８】
Acacia catechu 又は Acacia nilotica 抽出物が、酸性、アルカリ性、極性の溶媒、非極性溶媒、及び胃液抽出物より選択される、請求項１７の組成物。
【請求項２９】
コーティング剤、等張剤及び吸収遅延剤、結合剤、接着剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、芳香剤、甘味剤、吸収剤、界面活性剤、及び乳化剤からなる群より選択される医薬的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１７〜２８のいずれか１項の組成物。
【請求項３０】
抗酸化薬、ビタミン、無機物、タンパク質、脂肪、及び炭水化物からなる群より選択される１以上の成分をさらに含む、請求項２９の組成物。
【請求項３１】
ロシグリタゾン、トログリタゾン、ピオグリタゾン、及びメトホルミンからなる群より選択される抗糖尿病薬をさらに含む、請求項１７の組成物。
【請求項３２】
複数の代謝症候群関連プロテインキナーゼの活性の調節を、それを必要としている被検者においてする組成物であって、ここで前記プロテインキナーゼ調節は、該被検者の健康にとって有益であり、５：１比のｒｈｏ−イソアルファ酸と Acacia nilotica 芯材粉末抽出物を含んでなる組成物の治療有効量を含んでなる、前記組成物。
【請求項３３】
複数の眼障害関連プロテインキナーゼの活性の調節を、それを必要としている被検者においてする組成物であって、ここで前記プロテインキナーゼ調節は、該被検者の健康にとって有益であり：
ａ．約１ｍｇ〜約１０００ｍｇのビタミンＣ；
ｂ．約１ＩＵ〜約１０００ＩＵのビタミンＥ；
ｃ．約０．１ｍｇ〜約２．５ｍｇのセレン；
ｄ．約１ｍｇ〜約５０ｍｇの亜鉛；
ｅ．約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇの銅；
ｆ．約１ｍｇ〜約１５ｍｇのルテイン；
ｇ．約０．０５ｍｇ〜約１ｍｇのゼアキサンチン；及び
ｈ．約１ｍｇ〜約１０００ｍｇの Acacia nilotica 芯材粉末抽出物を含んでなる組成物の治療有効量を含んでなる、前記組成物。
【請求項３４】
複数の癌関連プロテインキナーゼの活性の調節を、それを必要としている被検者においてする組成物であって、ここで前記プロテインキナーゼ調節は、該被検者の健康にとって有益であり：
ａ．約０．０１ｍｇ〜約１０，０００ｍｇのキサントフモール；
ｂ．約０．０１ｍｇ〜約１０，０００ｍｇのＴＨＩＡＡ；
ｃ．約０．０１ｍｇ〜約１０，０００ｍｇのＨＨＩＡＡ；
ｄ．約０．０１ｍｇ〜約１０，０００ｍｇのＲＩＡＡ；
ｅ．約０．０１ｍｇ〜約１０，０００ｍｇのＩＡＡ；
ｆ．約０．０１ｍｇ〜約１０，０００ｍｇのベータ酸；及び
ｇ．約０．０１ｍｇ〜約１０，０００ｍｇのアルファ酸からなる群より選択される少なくとも１つの成分の治療有効量を含んでなる、前記組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、米国仮特許出願６０／７０６，９８４号（２００５年８月９日出願）及び６０／７４８，９３１号（２００５年１２月９日出願）に対する優先権を主張する。
【０００２】
発明の背景
技術分野
本出願は、プロテインキナーゼ活性の組織特異的な活性化及び／又は炎症に関連した病理学的状態を治療又は阻害するために使用し得る方法及び組成物に、プロテインキナーゼ活性を細胞において調節する方法に、そして炎症を調節する方法に概して関する。より具体的には、本発明は、ホップから、又はＡｃａｃｉａ植物属のメンバーのいずれか又はその組合せより単離する抽出物、誘導体、又は分画を利用する方法及び組成物に関する。
【０００３】
関連技術の記載
シグナル伝達は、正常なホメオスタシスを維持すること、又は、混乱したならば、数多くの疾患の疾患病理及び状態に関連する起因又は貢献機序として作用することに重要な支配的な調節機序を提供する。細胞レベルでは、シグナル伝達は、細胞の外側から細胞の内側へのシグナル又はシグナリング成分の動きに関連する。シグナルは、その受容体標的に達するとすぐに、多くの細胞イベントに必須のリガンド−受容体相互作用を始動させる場合があり、その中には、後続のシグナルとしてさらに作用し得るものもある。そのような相互作用は、一連のカスケードとしてだけでなく、ホメオスタシスプロセスの微調整制御をもたらすことが可能なシグナルイベントの複雑な相互作用ネットワーク又はウェブとしてもさらに役立つ。しかしながら、このネットワークは、調整不全（dysregulated）になって、それにより細胞活性の改変や応答細胞内で発現される遺伝子のプログラムの変化をもたらする場合がある。例えば、インスリンの感受性及び抵抗性を調節する相互作用キナーゼウェブの簡略化バージョンを表示する図１を参照のこと。
【０００４】
一般に、シグナル伝達受容体は、３つの群へ分類される。第一群の受容体は、形質膜を貫通して、内因性の酵素活性を有する受容体である。内因性の酵素活性を有する代表的な受容体には、チロシンキナーゼ（例、ＰＤＧＦ、インスリン、ＥＧＦ、及びＦＧＦの受容体）、チロシンホスファターゼ（例、Ｔ細胞及びマクロファージのＣＤ４５［クラスター決定因子−４５］タンパク質）、グアニル酸シクラーゼ（例、ナトリウム利尿ペプチド受容体）、及びセリン／スレオニンキナーゼ（例、アクチビン及びＴＧＦ−βの受容体）であるものが含まれる。内因性チロシンキナーゼ活性のある受容体は、他の基質のリン酸化だけでなく自己リン酸化が可能である。
【０００５】
第二群の受容体は、細胞の内部にあって、ＧＴＰの結合及び加水分解タンパク質（Ｇタンパク質と呼ばれる）に共役しているものである。Ｇタンパク質と相互作用するこの群の受容体は、７つの膜貫通ドメインを特徴とする構造を有する。これらの受容体は、セルペンチン［蛇行貫通型］受容体と呼ばれる。この群の例は、アドレナリン受容体、嗅覚受容体、およびある種のホルモン（例、グルカゴン、アンジオテンシン、バソプレッシン、及びブラジキニン）受容体である。
【０００６】
第三群の受容体は、細胞内に見出されて、リガンド結合と同時に核へ移行する（そこでリガンド−受容体複合体が遺伝子転写に直接影響を及ぼす）受容体として記載してよい。
受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）をコードするタンパク質は、４つの主要ドメインを含有して、それらは、ａ）膜貫通ドメイン、ｂ）細胞外リガンド結合ドメイン、ｃ）細胞内調節ドメイン、及びｄ）細胞内チロシンキナーゼドメインである。ＲＴＫのアミノ酸配列は、ｃＡＭＰ依存型プロテインキナーゼの（ＡＴＰ及び基質結合領域内の）配列で高度に保存されている。ＲＴＫタンパク質は、システインリッチドメイン、免疫グロブリン様ドメイン、カドヘリンドメイン、ロイシンリッチドメイン、Ｋｒｉｎｇｌｅドメイン、酸性ドメイン、フィブロネクチンＩＩＩ型リピート、ジスコイジンＩ様ドメイン、及びＥＧＦ様ドメインが含まれる、その細胞外部分の構造特徴に基づいて、種々のファミリーへ分類されている。これらの様々な細胞外ドメインの存在に基づいて、ＲＴＫは、少なくとも１４種の異なるファミリーへ細分されてきた。
【０００７】
リン酸化時に内因性のチロシンキナーゼ活性を有する多くの受容体は、シグナル伝達カスケードの他のタンパク質と相互作用する。これらの他のタンパク質は、ｃ−Ｓｒｃ癌原遺伝子において最初に同定されたドメインに相同であるアミノ酸配列のドメインを含有する。これらのドメインは、ＳＨ２ドメインと呼ばれる。
【０００８】
ＳＨ２ドメイン含有タンパク質のＲＴＫ又は受容体関連チロシンキナーゼとの相互作用は、ＳＨ２含有タンパク質のチロシンリン酸化をもたらす。生じるリン酸化は、その活性の改変（陽性又は陰性のいずれか）をもたらす。内因性の酵素活性を有するいくつかのＳＨ２含有タンパク質には、ホスホリパーゼＣ−γ（ＰＬＣ−γ）、癌原遺伝子ｃ−Ｒａｓ関連ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ｒａｓＧＡＰ）、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ−３Ｋ）、タンパク質チロシンホスファターゼ−１Ｃ（ＰＴＰ１Ｃ）、並びに、タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）のＳｒｃファミリーのメンバーが含まれる。
【０００９】
非受容体タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）は、概ね、酵素活性をそれ自体は欠いている細胞受容体へ結合する。タンパク相互作用を介した受容体−シグナル伝達の例は、インスリン受容体（ＩＲ）に関連する。この受容体は、内因性のチロシンキナーゼ活性を有するが、自己リン酸化に続いて、ＳＨ２ドメインを含有する酵素活性タンパク質（例、ＰＩ−３Ｋ又はＰＬＣ−γ）と直接的には相互作用しない。むしろ、主要なＩＲ基質は、ＩＲＳ−１と呼ばれるタンパク質である。
【００１０】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーの受容体は、原型的な受容体セリン／スレオニンキナーゼ（ＲＳＴＫ）を代表する。ＴＧＦ−βスーパーファミリーの多機能タンパク質には、アクチビン、インヒビン、及び骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）が含まれる。これらのタンパク質は、細胞の増殖又は分化を誘導及び／又は阻害して、様々な細胞種の遊走及び接着を調節することができる。ＴＧＦ−βの１つの主要効果は、細胞周期の進行の調節である。追加的に、細胞のＴＧＦ−βへの応答に関与する１つの核タンパク質はｃ−Ｍｙｃであり、これは、Ｍｙｃ結合要素を収容する遺伝子の発現に直接影響を及ぼす。ＰＫＡ、ＰＫＣ、及びＭＡＰキナーゼは、非受容体セリン／スレオニンキナーゼの３つの主要クラスを代表する。
【００１１】
現在、多くの研究室において、キナーゼ活性と疾患状態の間の関連性が検討されている。そのような関連性は、疾患そのものの原因となる場合もあれば、疾患関連の総体症状の発現及び進行に緊密に関連する場合もある。自己免疫疾患の慢性関節リウマチは、キナーゼと疾患の間の関連性が現在検討されている１つの例である。
【００１２】
自己免疫疾患は、身体がそれ自身の臓器、組織、及び細胞を攻撃する自己抗体を産生する（タンパクリン酸化により仲介されるプロセス）、免疫系の機能不全より生じる。
８０種を超える臨床的に識別される自己免疫疾患が確認されて、合わせると、米国ではほぼ２４００万人が罹患している。自己免疫疾患は、身体のどの組織又は臓器にも影響を及ぼす可能性がある。この多様性のために、それらは、自己免疫攻撃の部位に依存して、広範囲の症状及び臓器損傷を引き起こす可能性がある。多くの自己免疫疾患に種々の治療法が存在するが、そのどれにも決定的な治癒法はない。重篤さを抑える治療法には、しばしば有害な副作用がある。
【００１３】
慢性関節リウマチ（ＲＡ）は、自己免疫疾患の中で最も罹患率が高くて最もよく研究されている。全世界人口の約１％がこれに罹患して、他の自己免疫疾患のように、不明の理由により、増加中である。ＲＡは、関節の進行性の骨及び軟骨破壊を生じる、慢性の滑膜炎症を特徴とする。サイトカイン、ケモカイン、及びプロスタグランジンが炎症の主要メディエーターであり、活動性の疾患を抱える患者の関節と血液の両方で多量に見出すことができる。例えば、ＰＧＥ２は、ＲＡ患者の滑液に豊富に存在する。増加したＰＧＥ２レベルは、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）及び誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の炎症部位での誘導により仲介される［例えば、van der Kraan PM and van den Berg WB.「骨関節炎における同化性及び破壊性メディエーター（Anabolic and destructive mediators in osteoarthritis）」Curr Opin Clin Nutr Metab Care, 3: 205-211, 2000；Choy EHS and Panayi GS.「慢性関節リウマチにおけるサイトカイン経路及び関節炎症（Cytokine pathways and joint inflammation in rheumatoid arthritis）」N Eng J Med. 344: 907-916, 2001；及び、Wong BR, et al.「アレルギー及び自己免疫障害への治療法としてＳｙｋへ標的指向すること（Targeting Syk as a treatment for allergic and autoimmune disorders）」Expert Opin Investig Drugs 13: 743-762, 2004. を参照のこと］。
【００１４】
ヒトにおけるＲＡの病因及び病理発生は、依然としてあまり理解されていないが、３つの相で進行すると見られている。初期相では、樹状細胞が自己抗原を自己反応性Ｔ細胞へ提示する。このＴ細胞がサイトカインを介して自己反応性Ｂ細胞を活性化すると、自己抗体の産生を生じ、次いで、これにより関節に免疫複合体が生成される。エフェクター相では、先の免疫複合体がマクロファージ及び肥満細胞上のＦｃｆ受容体と結合して、サイトカイン及びケモカインの放出、炎症、及び疼痛を生じる。最終相では、サイトカインとケモカインにより、プロテアーゼ、酸、及びＯ２−のようなＲＯＳを放出する、滑液の線維芽細胞、破骨細胞、及び多形核好中球が活性化及び動員されて、不可逆性の軟骨及び骨破壊をもたらす。
【００１５】
コラーゲン誘発性ＲＡ動物モデルでは、この疾患を始動させるのにＴ細胞及びＢ細胞の参画が必要とされる。Ｂ細胞活性化が脾臓のチロシンキナーゼ（Ｓｙｋ）及びホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）を介してシグナル伝達されて、抗原受容体の起動化（triggering）が続く［Ward SG, Finan P.「治療薬剤としてのアイソフォーム特異的ホスホイノシチド３−キナーゼ阻害剤（Isoform-specific phosphoinositide 3-kinase inhibitors as therapeutic agents）」Curr Opin Pharmacol. Aug; 3(4): 426-34, (2003)］。抗原受容体のＢ細胞上での結合（engagement）の後で、Ｓｙｋは、３つのチロシン上でリン酸化される。Ｓｙｋは、免疫認識受容体を多数の下流シグナル伝達経路へ共役させることに中心的な役割を担う、７２ｋＤａのタンパク質−チロシンキナーゼである。この機能は、その触媒活性と、ＳＨ２ドメインを含有するエフェクタータンパク質との相互作用に参画するその能力の両方の特性である。Ｔｙｒ−３１７、３４２、及び３４６のリン酸化により、多数のＳＨ２ドメイン含有タンパク質のためのドッキング部位が創出される。［Hutchcroft, J. E., Harrison, M. L. & Geahlen, R. L. (1992).「７２ｋＤａタンパク質−チロシンキナーゼＰｔｋ７２のＢ細胞抗原受容体との会合（Association of the 72-kDa protein-tyrosine kinase Ptk72 with the B-cell antigen receptor）」J. Biol. Chem. 267: 8613-8619, (1992)、及び Yamada, T., Taniguchi, T., Yang, C., Yasue, S., Saito, H. & Yamamura, H.「Ｂ細胞抗原細胞抗原受容体のタンパク質−チロシンキナーゼ−Ｐ７２（Ｓｙｋ）との会合と膜ＩｇＭの結合による活性化（Association with B-cell antigen cell antigen receptor with protein-tyrosine kinase-P72 (Syk) and activation by engagement of membrane IgM）」Eur. J. Biochem. 213: 455-459, (1993)］。
【００１６】
Ｓｙｋは、Ｂ細胞抗原受容体（ＢＣＲ）とマクロファージ又は好中球のＦｃ受容体の結合が含まれる多様なシグナルへ応答するＰＩ３Ｋの活性化に必要とされることが示されている［Crowley, M. T., et al, J. Exp. Med. 186: 1027-1039, (1997)；Raeder, E. M. et al., J. Immunol. 163, 6785-6793, (1999)；及び、Jiang, K., et al., Blood 101, 236-244, (2003) を参照のこと］。Ｂ細胞では、ＰＩ３ＫのＢＣＲ刺激活性化は、ＢＣＡＰ、ＣＤ１９、又はＧａｂ１のようなアダプタータンパク質のリン酸化を介して達成され得て、それによりＰＩ３Ｋのｐ８５調節サブユニットの結合部位が創出される。多くのＩｇＧ受容体により伝達されるシグナルでは、ＳｙｋとＰＩＫ３の両方の活性と、その密集化（clustered）受容体の部位へのそれらの動員が必要とされる。好中球と単球では、ＦｃｇＲＩＩＡ上のリン酸化免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ配列とＰＩ３Ｋの会合が、ＰＩ３Ｋの該受容体への動員の機序として提唱された。そして最近は、ＳｙｋとＰＩ３Ｋの間の直接的な分子相互作用が報告されている［Moon KD, et al.,「Ｓｙｋタンパク質−チロシンキナーゼとホスホイノシチド３−キナーゼの間の直接相互作用の分子基礎（Molecular Basis for a Direct Interaction between the Syk Protein-tyrosine Kinase and Phosphoinositide 3-Kinase）」J. Biol. Chem. 280, No. 2, Issue of January 14, pp. 1543-1551, (2005)］。
【００１７】
ＣＯＸ−２活性の阻害剤がＰＧＥ２の産生減少をもたらして、ＲＡのような慢性関節炎状態の患者への疼痛緩和に有効であることを多くの研究が示してきた。しかしながら、ＣＯＸ−１とＣＯＸ−２のいずれも胃腸系及び心臓血管系のような組織における重要な維持機能に関与しているので、ＣＯＸ酵素活性を阻害する薬剤の副作用については懸念が表明されてきた。故に、これらの患者における疼痛緩和への安全で長期の治療アプローチを設計することが必要である。ＣＯＸ−２及びｉＮＯＳ合成のインデューサーは、Ｓｙｋ、ＰＩ３Ｋ、ｐ３８、ＥＲＫ１／２、及びＮＦ−κＢに依存した経路を介してシグナル伝達するので、これらの経路の阻害剤は、自己免疫状態において、特にＲＡ患者の炎症状態で変性しつつある関節において治療薬になるかもしれない。
【００１８】
ホップ誘導体のＲｈｏ（ロー）イソアルファ酸（ＲＩＡＡ）は、炎症のＲＡＷ２６４．７マウスマクロファージモデルでのＰＧＥ２阻害のスクリーニングにおいて見出された。本研究において、我々は、ＲＩＡＡが直接的なＣＯＸ酵素阻害剤であるかどうか、及び／又は、それがＣＯＸ−２及びｉＮＯＳの誘導を阻害するのかどうかを検討した。ＲＩＡＡは、ＣＯＸ酵素活性を直接阻害するのではなく、むしろＮＦ−κＢ推進性の酵素誘導を阻害するという我々の知見により、我々は、ＲＩＡＡがキナーゼ阻害剤であるかどうかを検討する。ＲＩＡＡがＳｙｋとＰＩ３Ｋをともに阻害するという我々の知見により、我々は、様々な自己免疫疾患に罹患している患者を対象とするパイロット試験においてその効力を検証する。
【００１９】
疾患の総体症状とのその関連が現在検討されている他のキナーゼには、Ａｕｒｏｒａ、ＦＧＦＢ、ＭＳＫ、ＲＳＥ、及びＳＹＫが含まれる。
Ａｕｒｏｒａは、細胞分裂の重要な調節因子であり、セリン／スレオニンキナーゼのＡｕｒｏｒａファミリーには、Ａｕｒｏｒａ  Ａ、Ｂ、及びＣが含まれる。Ａｕｒｏｒａ  Ａ及びＢキナーゼは、有糸分裂において、直接的であるが識別される役割を有することが確認されている。これら３種のアイソフォームの過剰発現は、白血病、結直腸癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、メラノーマ、及び頚部癌が含まれる、多様な範囲のヒト腫瘍型に関連づけられてきた。
【００２０】
線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）は、受容体チロシンキナーゼである。この受容体における突然変異は、受容体の二量体化、キナーゼ活性化、及びＦＧＦへの親和性増加を介した構成的な活性化をもたらす場合がある。ＦＧＦＲは、軟骨形成不全、血管新生、及び先天性疾患との関連が示唆されている。
【００２１】
ＭＳＫ（マイトジェン及びストレス活性化プロテインキナーゼ）１及びＭＳＫ２は、ＥＲＫ（細胞外シグナル調節キナーゼ）１／２又はｐ３８  ＭＡＰＫ（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）経路のいずれか一方の下流で in vivo 活性化されるキナーゼであり、ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答要素結合タンパク質）及びヒストンＨ３のリン酸化に必要とされる。
【００２２】
Ｒｓｅは、大抵は、脳において高度に発現されている。Ｒｓｅは、Ｂｒｔ、ＢＹＫ、Ｄｔｋ、Ｅｔｋ３、Ｓｋｙ、Ｔｉｆ、又はｓｅａ関連受容体チロシンキナーゼとしても知られる受容体チロシンキナーゼであり、その主要な役割は、ニューロンをアポトーシスより保護することである。Ｒｓｅ、Ａｘｌ、及びＭｅｒは、細胞接着分子関連の受容体チロシンキナーゼの新たに同定されたファミリーに属する。ＧＡＳ６は、このチロシンキナーゼ受容体、Ｒｓｅ、Ａｘｌ、及びＭｅｒのリガンドである。ＧＡＳ６は、安定期のＥＣにより産生されて、好炎症刺激がＥＣの好接着機構を始動させるときに枯渇する、生理学的な抗炎症剤として機能する。
【００２３】
２つのアイソフォームで存在するグリコゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ−３）は、グリコゲン代謝の制御に関与する酵素として同定されて、細胞増殖及び細胞死の調節因子として作用する可能性がある。多くのセリン−スレオニンプロテインキナーゼと違って、ＧＳＫ−３は、構成的に活性であり、インスリン又は増殖因子に応答して阻害される。筋肉グリコゲン合成のインスリン刺激におけるその役割が、それを糖尿病及び代謝症候群における治療介入の魅力的な標的としている。
【００２４】
ＧＳＫ−３調節不全（dysregulation）は、インスリン抵抗性の発症における焦点であることが示されてきた。ＧＳＫ３の阻害は、グルコース処理速度の増加によるだけでなく、ホスホエノールピルビン酸カルボキシナーゼ及びグルコース−６−ホスファターゼのような糖新生遺伝子の肝細胞における阻害により、インスリン抵抗性を改善する。さらに、選択的ＧＳＫ３阻害剤は、グルコース輸送のインスリン依存的な活性化と筋肉における利用を in vitro と in vivo で増強する。ＧＳＫ３はまた、インスリン受容体基質−１のセリン／スレオニン残基を直接リン酸化して、それによりインスリンシグナル伝達の障害をもたらす。ＧＳＫ３は、インスリンシグナル伝達経路において重要な役割を担っていて、それは、インスリンの非存在下で、グリコゲンシンターゼをリン酸化して阻害する［Parker, P. J., Caudwell, F. B., and Cohen, P. (1983) Eur. J. Biochem. 130: 227-234］。増える証拠は、骨格筋のグルコース輸送活性の調節におけるＧＳＫ−３の負の役割を裏付ける。例えば、インスリン抵抗性の齧歯動物を選択的ＧＳＫ−３阻害剤で急性治療すると、全身のインスリン感受性と筋肉グルコース輸送に対するインスリン作用が改善される。インスリン抵抗性のプレ糖尿病肥満Ｚｕｃｋｅｒラットを特異的なＧＳＫ−３阻害剤で慢性治療すると、経口グルコース耐性と全身インスリン感受性が高められて、脂質異常症の回復と骨格筋におけるＩＲＳ−１依存性インスリンシグナル伝達の改善に関連する。これらの結果は、筋肉におけるＧＳＫ−３の選択的標的指向が肥満関連のインスリン抵抗性の治療に有効な介入法になり得るという証拠を提供するものである。
【００２５】
Ｓｙｋは、Ｂ細胞受容体及びＩｇＥ受容体からのシグナル伝達に関わるＺＡＰ−７０に関連した非受容体チロシンキナーゼである。Ｓｙｋは、これら受容体内のＩＴＡＭモチーフへ結合して、Ｒａｓ、ＰＩ３−キナーゼ、及びＰＬＣｇシグナル伝達経路を介したシグナル伝達を始動させる。Ｓｙｋは、細胞内シグナル伝達において不可欠の役割を担うので、炎症疾患及び呼吸障害の重要な標的になる。
【００２６】
故に、単数又は多数の選択キナーゼの発現又は活性を調節させ得る方法及び組成物を同定することは有用であろう。様々なプロテインキナーゼ及びキナーゼ経路の間の関連性やその間の相互作用の複雑性を理解することは、多数のキナーゼ又は多数のキナーゼ経路に対して有益な活性を有するプロテインキナーゼ調節剤、調整剤、又は阻害剤として作用することが可能な医薬剤を開発することへの緊急ニーズを高めるものである。１つのキナーゼ又は１つのキナーゼ経路に特異的に標的指向する単剤のアプローチは、例えば、糖尿病や代謝症候群のような、非常に複雑な疾患、状態、及び障害を治療するには不十分であろう。追加的に、多数のキナーゼの活性を調節することは、単一のキナーゼ調節では獲得不能な相乗的な治療効果をもたらすかもしれない。
【００２７】
このような調節及び使用は、慢性状態への連続使用を要求しても、例えば、それ自身の状態として、又は多くの疾患及び状態の必須要素としての炎症において必要とされるように、間欠使用を要求してもよい。追加的に、キナーゼの調節剤として作用する組成物は、哺乳動物の身体における多種多様な障害に影響を及ぼすことができる。本発明は、キナーゼ活性を調整して、それにより数多くの疾患関連症状を治療する手段を提供すると同時に生命の質を増加させるために使用し得る、ホップ又はＡｃａｃｉａ（アカシア）に由来する化合物及び抽出物について記載する。
【００２８】
発明の要約
本発明は、疾患関連プロテインキナーゼを必要としている細胞又は哺乳動物において調節する方法及び組成物に概して関する。いくつかの例において、必要としている哺乳動物は、自己免疫障害、アレルギー又は炎症障害（骨が含まれる）、老化が含まれるインスリン抵抗性関連障害、心臓血管系疾患、脂質貯留障害、代謝症候群又は糖尿病関連障害、癌、眼障害、及び神経系障害からなる群より選択される状態を有する。より具体的には、本発明は、ホップから、又はＡｃａｃｉａ植物属のメンバーからのいずれか又はその組合せより単離する抽出物、誘導体、又は分画を含んでなる方法及び組成物に関する。さらに本発明は、ＣＯＸ−２又はプロスタグランジンのような炎症メディエーター化合物を選択的に阻害するか又は選択した標的細胞においてプロテインキナーゼ調節を介して炎症応答を阻害するための方法及び組成物に関する。追加的に記載するのは、自己免疫障害、アレルギー又は炎症障害（骨が含まれる）、老化が含まれるインスリン抵抗性関連障害、心臓血管系疾患、脂質貯留障害、代謝症候群又は糖尿病関連障害、癌、眼障害、及び神経系障害からなる群より選択される疾患又は状態に関連した総体症状を治療するための方法及び組成物である。
【００２９】
本発明の第一の態様は、複数の疾患関連プロテインキナーゼの活性の調節を、それを必要としている被検者においてする方法について記載し、ここで前記プロテインキナーゼ調節は、該被検者の健康にとって有益である。この態様において、該方法は、アルファ酸、ベータ酸、プレニルフラボノイド、カルコン、イソアルファ酸、還元イソアルファ酸、使用済ホップ、及びアカシア由来の化合物又は抽出物からなる群より選択される化合物を含んでなる組成物の治療有効量を必要としている該被検者へ投与することを含む。
【００３０】
本発明の第二の態様は、複数の代謝症候群関連プロテインキナーゼの活性の調節を、それを必要としている被検者においてする方法について記載し、ここで前記プロテインキナーゼ調節は、該被検者の健康にとって有益である。この方法は、５：１比のｒｈｏ−イソアルファ酸と Acacia nilotica 芯材又は樹皮粉末抽出物を含んでなる組成物の治療有効量を必要としている該被検者へ投与することを含む。
【００３１】
本発明のさらなる態様は、複数の疾患関連プロテインキナーゼの活性の調節を、それを必要としている被検者においてする組成物について記載し、ここで前記プロテインキナーゼ調節は、該被検者の健康にとって有益である。この態様において、該組成物は、アルファ酸、ベータ酸、プレニルフラボノイド、カルコン、イソアルファ酸、還元イソアルファ酸、使用済ホップ、及びアカシア由来の化合物又は抽出物からなる群より選択される化合物を含んでなる組成物の治療有効量を含む。
【００３２】
本発明の別の態様は、複数の代謝症候群関連プロテインキナーゼの活性の調節を、それを必要としている被検者においてする組成物について記載し、ここで前記プロテインキナーゼ調節は、該被検者の健康にとって有益である。この組成物は、５：１比のｒｈｏ−イソアルファ酸と Acacia nilotica 芯材又は樹皮粉末抽出物を含んでなる組成物の治療有効量を含む。
【００３３】
さらなる態様において、複数の眼障害関連プロテインキナーゼの活性の調節を、被検者においてする組成物について記載し、ここで前記プロテインキナーゼ調節は、該被検者の健康にとって有益である。ここで、該組成物は、約１ｍｇ〜約１０００ｍｇのビタミンＣ；約１ＩＵ〜約１０００ＩＵのビタミンＥ；約０．１ｍｇ〜約２．５ｍｇのセレン；約１ｍｇ〜約５０ｍｇの亜鉛；約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇの銅；約１ｍｇ〜約１５ｍｇのルテイン；約０．０５ｍｇ〜約１ｍｇのゼアキサンチン；及び約１ｍｇ〜約１０００ｍｇの Acacia nilotica 芯材粉末又は樹皮抽出物を含んでなる組成物の治療有効量を含む。
【００３４】
本発明の別の態様は、複数の癌関連プロテインキナーゼの活性の調節を、それを必要としている被検者においてする組成物を開示し、ここで前記プロテインキナーゼ調節は、該被検者の健康にとって有益である。この態様において、該組成物は、
ａ．約０．０１ｍｇ〜約１０，０００ｍｇのキサントフモール；
ｂ．約０．０１ｍｇ〜約１０，０００ｍｇのテトラヒドロイソアルファ酸（ＴＨＩＡＡ）；
ｃ．約０．０１ｍｇ〜約１０，０００ｍｇのヘキサヒドロイソアルファ酸（ＨＨＩＡＡ）；
ｄ．約０．０１ｍｇ〜約１０，０００ｍｇのＲＩＡＡ；
ｅ．約０．０１ｍｇ〜約１０，０００ｍｇのイソアルファ酸（ＩＡＡ）；
ｆ．約０．０１ｍｇ〜約１０，０００ｍｇのベータ酸；及び
ｇ．約０．０１ｍｇ〜約１０，０００ｍｇのアルファ酸からなる群より選択される少なくとも１つの成分の治療有効量を含む。
【００３５】
発明の詳細な説明
本発明は、必要としている細胞又は哺乳動物においてプロテインキナーゼを調節する方法及び組成物を提供する。いくつかの例において、必要としている哺乳動物は、自己免疫障害、アレルギー又は炎症障害、代謝症候群又は糖尿病関連障害、癌、及び神経系障害からなる群より選択される状態を有する。より具体的には、本発明は、ホップから、又はＡｃａｃｉａ植物属のメンバーのいずれか又はその組合せより単離する抽出物、誘導体、又は分画を含んでなる組成物、方法、及びキットに関する。さらに本発明は、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）又はプロスタグランジンのような炎症メディエーター化合物を選択的に阻害するか又は選択した標的細胞におけるプロテインキナーゼ調節を介して炎症応答を阻害するための方法及び組成物に関する。
【００３６】
本明細書に言及する特許、公開公報出願、及び学術文献は、当業者の知識を確実なものとして、それぞれが具体的かつ個別に参照により組み込まれることが意図されるかのように、その全体が同じ程度まで参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に引用するあらゆる参考文献と本明細書の具体的な教示との間のあらゆる相違も、後者に有利なように解決されよう。同様に、当該技術分野で理解されている単語又は語句の定義と本明細書で具体的に教示される単語又は語句の定義との間のあらゆる相違は、後者に有利なように解決されよう。
【００３７】
本明細書に使用する技術及び科学の用語は、他に定義されなければ、本発明が関連する当該技術分野の当業者により通常理解される意味を有する。本明細書では、当業者に知られている様々な方法論及び材料を参考にする。組換えＤＮＡ技術の一般原理を説明する標準の参考書目には、Sambrook et al,,「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、ニューヨーク（1989）；Kaufman et al. 監修「生物学、医学における分子及び細胞の方法の手引き（Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology in Medicine）」ＣＲＣプレス、ボカラトン（1995）；McPherson 監修「特異的突然変異誘発：実践アプローチ（Directed Mutagenesis: A Practical Approach）」ＩＲＬプレス、オックスフォード（1991）が含まれる。薬理学の一般原理を説明する標準の参考書目には、「グッドマン・アンド・ギルマンの治療薬の薬理学的基礎（Goodman and Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics）」第１１版、マクグローヒルカンパニーズ社、ニューヨーク（2006）が含まれる。
【００３８】
本明細書と付帯の特許請求項において、単数形には、文脈が明らかに他のやり方で指定しなければ、複数の指示物が含まれる。本明細書に使用するように、単数形の冠詞（「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」）には、特に、文脈が明らかに他のやり方で指定しなければ、それらが指示する用語の複数形が含まれる。追加的に、本明細書に使用するように、具体的に他のやり方で指定しなければ、単語「又は（ｏｒ）」は、「及び／又は」の「包含的な」意味で使用されて、「どちらか一方」の「排他的な」意味では使用しない。用語「約」は、本明細書において、「おおよそ」又は「ほぼ」の範囲で「概ね」を意味するために使用する。用語「約」を数的範囲と一緒に使用する場合、それは、示した数値の上下の境界を広げることによって、その範囲を変化させる。一般に、用語「約」は、本明細書において、述べた数値の上下の数値を２０％の変動だけ変化させるために使用する。
【００３９】
本明細書に使用するように、ある変数に対する数的範囲の掲載（recitation）は、本発明がその範囲内の数値のいずれにも等しい変数で実施し得ることを伝えるためのものである。このように、本来的に不連続である変数では、変数は、その数的範囲のどの整数値にも等しい場合があり、その範囲の末端点も含まれる。同様に、本来的に連続である変数では、変数は、その数的範囲のどの実数値にも等しくてよく、その範囲の末端点も含まれる。例として、０と２の間の数値を有すると記載される変数は、本来的に不連続である変数では、０、１、又は２であり得て、本来的に連続である変数では、０．０、０．１、０．０１、０．００１、又はあらゆる他の実数値であってよい。
【００４０】
以下、本発明の特定の態様について詳細に言及する。これら特定の態様に関連して本発明を記載しても、本発明をそのような特定の態様に限定することを企図するものではないと理解されたい。むしろ、付帯の特許請求項により定義されるような、本発明の精神及び範囲内に含まれる場合がある代替物、修飾物、及び同等物が含まれることが企図される。以下の記載では、本発明の徹底的な理解をもたらすために、数多くの特定の詳細を示す。本発明は、これらの特定の詳細の一部又は全部を伴わずに実施してよい。他の例では、よく知られた方法の操作については詳しく記載しなかったが、本発明を不必要にわかりにくくするためではない。
【００４１】
本発明を行うときには、当業者に知られたどの好適な材料及び／又は方法も利用してよい。しかしながら、好ましい材料及び方法について記載する。以下の記載及び実施例において言及する材料、試薬、等は、他に注目しなければ、市販の供給元より入手可能である。
【００４２】
本発明の第一の態様は、複数の疾患関連プロテインキナーゼの活性をの調節を、それを必要としている被検者においてする方法を開示して、ここで前記プロテインキナーゼ調節は、該被検者の健康にとって有益である。この態様の方法は、アルファ酸、ベータ酸、プレニルフラボノイド、カルコン、イソアルファ酸、還元イソアルファ酸、使用済ホップ、及びアカシア由来の化合物又は抽出物からなる群より選択される化合物を含んでなる組成物の治療有効量を必要としている該被検者へ投与することを含む。
【００４３】
この態様のいくつかの側面において、必要としている該被検者は、自己免疫障害、アレルギー又は炎症障害、代謝症候群又は糖尿病関連障害、癌、眼障害、及び神経系障害からなる群より選択される状態を有する一方、他の側面において、疾患関連プロテインキナーゼは、ＡＢＬ、ＡＫＴ、ＡＵＲＯＲＡ、ＣＤＫ、ＤＢＦ２／２０、ＥＧＦＲ、ＥＰＨ／ＥＬＫ／ＥＣＫ、ＥＲＫ／ＭＡＰＫＦＧＦＲ、ＧＳＫ３、ＩＫＫＢ、ＩＮＳＲ、ＪＡＫ  ＤＯＭ  １／２、ＭＡＲＫ／ＰＲＫＡＡ、ＭＥＫ／ＳＴＥ７、ＭＥＫＫ／ＳＴＥ１１、ＭＬＫ、ｍＴＯＲ、ＰＡＫ／ＳＴＥ２０、ＰＤＧＦＲ、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＣ、ＰＯＬＯ、ＳＲＣ、ＴＥＣ／ＡＴＫ、及びＺＡＰ／ＳＹＫからなる群より選択される。
【００４４】
なお他の側面において、アルファ酸は、フムロン、コフムロン、アドフムロン、プレフムロン、及びポストフムロンからなる群より選択されるか、又はベータ酸は、ルプロン、コルプロン、アドルプロン、及びプレルプロンからなる群より選択される。
【００４５】
なお他の側面において、使用する組成物のイソアルファ酸は、イソフムロン、イソアドフムロン、及びイソコフムロンからなる群より選択される。該組成物がＲＩＡＡを利用する場合、ＲＩＡＡは、ジヒドロ−イソフムロン、ジヒドロ−イソコフムロン、ジヒドロ−アドフムロン、テトラヒドロ−イソフムロン、テトラヒドロ−イソコフムロン、テトラヒドロ−アドフムロン、ヘキサヒドロ−イソフムロン、ヘキサヒドロ−イソコフムロン、及びヘキサヒドロ−アドフムロンからなる群より選択される。この態様のなお他の側面では、ｒｈｏ−イソアルファ酸の配置を利用する。
【００４６】
この態様のいくつかの側面において、カルコンは、キサントフモール又はイソキサントフモールであるか、又はプレニルフラボノイドは、６−プレニルナリンゲニン又は８−プレニルナリンゲニンである。
【００４７】
なお他の側面において、アカシア由来の化合物又は抽出物は、Acacia catechu 又は Acacia nilotica に由来する。アカシア由来の化合物又は抽出物が、Acacia catechu 又は Acacia nilotica に由来する側面において、Acacia catechu 又は Acacia nilotica の化合物は、ゴム樹脂、樹皮粉末、芯材粉末、及び Acacia catechu 又は Acacia nilotica 抽出物からなる群より選択される。アカシア由来の化合物が、Acacia catechu 又は Acacia nilotica 抽出物である側面において、該抽出物は、酸性、アルカリ性、極性の溶媒、非極性溶媒、及び胃液抽出物より選択される。
【００４８】
この態様の方法に使用する組成物は、抗酸化薬、ビタミン、無機物、タンパク質、脂肪、及び炭水化物からなる群より選択される１以上の成分、又はコーティング剤、等張剤及び吸収遅延剤、結合剤、接着剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、芳香剤、甘味剤、吸収剤、界面活性剤、及び乳化剤からなる群より選択される医薬的に許容される賦形剤をさらに含んでよい。
【００４９】
この態様のいくつかの方法において、使用する組成物は、ロシグリタゾン、トログリタゾン、ピオグリタゾン、及びメトホルミンからなる群より選択される抗糖尿病薬をさらに含む。
【００５０】
本明細書に使用するように、「疾患関連キナーゼ」は、疾患の直接の原因であるか、又はその活性化が問題の疾患の症状を増悪させることに役立つ経路に関連している個別のプロテインキナーゼ又はキナーゼの群若しくはファミリーを意味する。さらに、本明細書に使用するように、「疾患」、「状態」、又は「障害」は、交換可能的に使用してよい。
【００５１】
句「プロテインキナーゼ調節は、被検者の健康に有益である」は、キナーゼ調節（アップ又はダウンいずれかのレギュレーション）が疾患の症状を抑制する、予防する、及び／又は逆転させることを生じるか、又は二次治療モダリティの活性を増強する事例を意味する。
【００５２】
本明細書に使用するように、接続句においても、又は特許請求項の本体においても、用語「〜を含む」及び「〜を含んでなる」は、制限なしの意味を有するものと解釈されるべきである。即ち、この用語は、「〜を少なくとも有する」又は「〜が少なくとも含まれる」と同義に解釈されたい。ある方法の文脈において使用する場合、用語「〜を含んでなる」は、この方法に引用の工程が少なくとも含まれるが、追加の工程が含まれてもよいことを意味する。化合物又は組成物の文脈において使用するとき、用語「〜を含んでなる」は、化合物又は組成物に引用の特徴又は化合物が少なくとも含まれるが、追加の特徴又は化合物も含まれてもよいことを意味する。
【００５３】
本明細書に使用するように、用語「誘導体」又は「〜由来の」物質は、別の物質に構造的に関連して、理論的にはそれより入手可能な化学物質、即ち、別の物質より作製することができる物質を意味する。誘導体には、化学反応を介して入手される化合物を含めることができる。
【００５４】
本明細書に使用するように、用語「ホップ抽出物」は、（１）ホップ植物産物を溶媒へ曝露すること、（２）この溶媒をホップ植物産物より分離すること、及び（３）該溶媒を消失させることより生じる固体材料を意味する。「使用済ホップ」は、ホップ抽出手順の後で残るホップ植物産物を意味する。ホップ化学の詳細な考察については、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Verzele, M. and De Keukeleire, D.「食品科学の開発  ２７：ホップ及びビール苦味酸の化学及び分析（Developments in Food Science 27: Chemistry and Analysis of Hop and Beer Bitter Acids）」Elsevier Science Pub. Co., 1991（ニューヨーク、アメリカ）を参照のこと。本明細書においてＲＩＡＡに関連するときに使用されるように、「Ｒｈｏ」は、その還元イソアルファ酸を意味し、ここで還元は、４−メチル−３−ペンテノイル側鎖中のカルボニル基の還元である。
【００５５】
本明細書に使用するように、用語「溶媒」は、ホップ植物産物より固体材料を抽出するのに必要な特徴を保有する水系又は有機系の液体を意味する。溶媒の例には、限定されないが、水、蒸気、超加熱水、メタノール、エタノール、ヘキサン、クロロホルム、液体ＣＯ２、液体Ｎ２、又はそのような材料のあらゆる組合せが含まれる。
【００５６】
本明細書に使用するように、用語「ＣＯ２抽出物」は、ホップ植物産物を液体若しくは超臨界ＣＯ２調製物へ曝露することに続く、後続のＣＯ２の除去より生じる固体材料を意味する。
【００５７】
用語「医薬的に許容される」は、組成物の他の成分と適合していて、そのレシピエントへ有害でないという意味で使用する。
本明細書に使用するように、「化合物」は、その化学構造、化学名、又は一般名のいずれでも同定してよい。化学構造と化学若しくは一般名が矛盾するとき、化学構造が化合物の同一性（identity）を決定する。本明細書に記載する化合物は、１以上のキラル中心、及び／又は二重結合を含有してよく、それ故に、二重結合異性体（即ち、幾何異性体）、エナンチオマー、又はジアステレオマーのような立体異性体として存在してよい。従って、本明細書に図示する化学構造には、例示又は同定される化合物のすべての可能なエナンチオマー及び立体異性体が含まれ、それには、立体異性体として純粋な形態（例、幾何学的に純粋、エナンチオマーとして純粋、又はジアステレオマーとして純粋な）とエナンチオマー及び立体異性体の混合物が含まれる。エナンチオマー及び立体異性体の混合物は、当業者によく知られた分離技術又はキラル合成技術を使用して、それらの成分のエナンチオマー又は立体異性体へ分解ずることができる。本化合物は、エノール型、ケト型、及びこれらの混合物が含まれるいくつかの互変異性型で存在してもよい。従って、本明細書に図示する化学構造には、例示又は同定される化合物のすべての可能な互変異性型が含まれる。記載される化合物には、１以上の原子が天然で慣用的に見出される原子量とは異なる原子量を有する同位体標識化合物も含まれる。本発明の化合物へ取り込んでよい同位体の例には、限定されないが、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ、等が含まれる。化合物は、非溶媒和型だけでなく、水和型が含まれる溶媒和型において、そしてＮ−オキシドとして存在してよい。一般に、化合物は、水和、溶媒和、又はＮ−オキシドであってよい。ある種の化合物は、多数の結晶型又は非結晶型で存在してよい。また、本発明の範囲内に考慮されるのは、化合物の同属体（congeners）、類似体、加水分解産物、代謝産物、及び前駆体若しくはプロドラッグである。一般に、他に示さなければ、すべての物理形態は、本明細書において考慮する使用について同等であり、本発明の範囲内にあると企図される。
【００５８】
本発明による化合物は、塩として存在してよい。特に、化合物の医薬的に許容される塩が考慮される。本発明の「医薬的に許容される塩」は、本発明の化合物と、塩（例えば、本明細書において「Ｍｇ」又は「Ｍａｇ」として示されるマグネシウム塩のような）を形成して、治療条件下の被検者により忍容される酸又は塩基のいずれかの組合せである。一般に、本発明の化合物の医薬的に許容される塩は、１以上の治療指数（最低有毒量の最低治療有効量に対する比）を有するものである。当業者は、最低治療有効量が被検者ごとに、そして適応症ごとに変動するので、それに従って調整するものであることを理解されよう。
【００５９】
本明細書に使用するように、「ホップ（複数）」は、細菌作用を妨げて、特徴的な苦味をビールへ加えるために醸造業界で使用される苦い芳香族オイルを含有する、Humulus 属の植物の実（cones）を意味する。より好ましくは、使用するホップは、Humulus lupulus に由来する。
【００６０】
本明細書に使用する用語「アカシア（acacia）」は、Acacia 属のマメ科の高木及び低木のあらゆるメンバーを意味する。好ましくは、アカシア由来の植物化合物は、Acacia catechu 又は Acacia nilotica に由来する。
【００６１】
本発明による化合物は、希釈剤及び賦形剤が含まれる、よく知られた医薬的に許容される担体のいずれとも一緒に、医薬的に許容される運搬体において任意選択的に製剤化される（「レミントン製薬科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」第18版、Gennaro, Mack Publishing Co., ペンシルヴェニア州イーストン、1990 及び「レミントン：調剤の科学及び実践（Remington: The Science and Practice of Pharmacy）」Lippincott, Williams & Wilkins, 1995 を参照のこと）。本発明の組成物を作製するのに利用する医薬的に許容される担体／運搬体の種類は、該組成物の哺乳動物への投与の形式に依って変化するものであるが、一般には、医薬的に許容される担体は、生理学的に不活性であり、無毒である。本発明による組成物の製剤は、本発明の化合物の１より多い種類を含有してよく、同様に、治療される症状／状態の治療に有用な他のあらゆる薬理学的に有効な成分も含有してよい。
【００６２】
この態様のいくつかの側面において、調節されるキナーゼは、Ａｂｌ、Ａｂｌ（Ｔ３１５Ｉ）、ＡＬＫ、ＡＬＫ４、ＡＭＰＫ、Ａｒｇ、Ａｒｇ、ＡＲＫ５、ＡＳＫ１、Ａｕｒｏｒａ−Ａ、Ａｘｌ、Ｂｌｋ、Ｂｍｘ、ＢＲＫ、ＢｒＳＫ１、ＢｒＳＫ２、ＢＴＫ、ＣａＭＫＩ、ＣａＭＫＩＩ、ＣａＭＫＩＶ、ＣＤＫ１／サイクリンＢ、ＣＤＫ２／サイクリンＡ、ＣＤＫ２／サイクリンＥ、ＣＤＫ３／サイクリンＥ、ＣＤＫ５／ｐ２５、ＣＤＫ５／ｐ３５、ＣＤＫ６／サイクリンＤ３、ＣＤＫ７／サイクリンＨ／ＭＡＴ１、ＣＤＫ９／サイクリンＴ１、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、ＣＫ１（ｙ）、ＣＫ１δ、ＣＫ２、ＣＫ２α２、ｃＫｉｔ（Ｄ８１６Ｖ）、ｃＫｉｔ、ｃ−ＲＡＦ、ＣＳＫ、ｃＳＲＣ、ＤＡＰＫ１、ＤＡＰＫ２、ＤＤＲ２、ＤＭＰＫ、ＤＲＡＫ１、ＤＹＲＫ２、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ（Ｌ８５８Ｒ）、ＥＧＦＲ（Ｌ８６１Ｑ）、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４、ＥｒｂＢ４、Ｆｅｒ、Ｆｅｓ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、Ｆｇｒ、Ｆｌｔ１、Ｆｌｔ３（Ｄ８３５Ｙ）、Ｆｌｔ３、Ｆｌｔ４、Ｆｍｓ、Ｆｙｎ、ＧＳＫ３β、ＧＳＫ３α、Ｈｃｋ、ＨＩＰＫ１、ＨＩＰＫ２、ＨＩＰＫ３、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＫＫβ、ＩＫＫα、ＩＲ、ＩＲＡＫ１、ＩＲＡＫ４、ＩＲＲ、ＩＴＫ、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＪＮＫ１α１、ＪＮＫ２α２、ＪＮＫ３、ＫＤＲ、Ｌｃｋ、ＬＩＭＫ１、ＬＫＢ１、ＬＯＫ、Ｌｙｎ、Ｌｙｎ、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ２、ＭＡＰＫ２、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ３、ＭＡＲＫ１、ＭＥＫ１、ＭＥＬＫ、Ｍｅｔ、ＭＩＮＫ、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７β、ＭＬＣＫ、ＭＬＫ１、Ｍｎｋ２、ＭＲＣＫβ、ＭＲＣＫα、ＭＳＫ１、ＭＳＫ２、ＭＳＳＫ１、ＭＳＴ１、ＭＳＴ２、ＭＳＴ３、ＭｕＳＫ、ＮＥＫ２、ＮＥＫ３、ＮＥＫ６、ＮＥＫ７、ＮＬＫ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＡＫ２、ＰＡＫ３、ＰＡＫ４、ＰＡＫ６、ＰＡＲ−１Ｂα、ＰＤＧＦＲβ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＫ１、ＰＩ３Ｋｂｅｔａ、ＰＩ３Ｋｄｅｌｔａ、ＰＩ３Ｋｇａｍｍａ、Ｐｉｍ−１、Ｐｉｍ−２、ＰＫＡ（ｂ）、ＰＫＡ、ＰＫＢβ、ＰＫＢα、ＰＫＢγ、ＰＫＣμ、ＰＫＣβＩ、ＰＫＣβＩＩ、ＰＫＣα、ＰＫＣγ、ＰＫＣδ、ＰＫＣε、ＰＫＣζ、ＰＫＣη、ＰＫＣθ、ＰＫＣι、ＰＫＤ２、ＰＫＧ１β、ＰＫＧ１α、Ｐｌｋ３、ＰＲＡＫ、ＰＲＫ２、ＰｒＫＸ、ＰＴＫ５、Ｐｙｋ２、Ｒｅｔ、ＲＩＰＫ２、ＲＯＣＫ−Ｉ、ＲＯＣＫ−ＩＩ、ＲＯＣＫ−ＩＩ、Ｒｏｎ、Ｒｏｓ、Ｒｓｅ、Ｒｓｋ１、Ｒｓｋ１、Ｒｓｋ２、Ｒｓｋ３、ＳＡＰＫ２ａ、ＳＡＰＫ２ａ（Ｔ１０６Ｍ）、ＳＡＰＫ２ｂ、ＳＡＰＫ３、ＳＡＰＫ４、ＳＧＫ、ＳＧＫ２、ＳＧＫ３、ＳＩＫ、Ｓｎｋ、ＳＲＰＫ１、ＳＲＰＫ２、ＳＴＫ３３、Ｓｙｋ、ＴＡＫ１、ＴＢＫ１、Ｔｉｅ２、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴＳＳＫ１、ＴＳＳＫ２、ＷＮＫ２、ＷＮＫ３、Ｙｅｓ、ＺＡＰ−７０、及びＺＩＰＫからなる群より選択される。
【００６３】
好ましい側面において、調節されるキナーゼは、Ａｕｒｏｒａ−Ａ、ＣＤＫ２／サイクリンＡ、ＤＡＰＫ１、ＤＡＰＫ２、ＥｐｈＡ３、ＦＧＦＲ４、ＧＳＫ３β、ＧＳＫ３α、Ｈｃｋ、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２、ＭＳＫ２、ＭＳＳＫ１、ＰＩ３Ｋｂｅｔａ、ＰＩ３Ｋｄｅｌｔａ、ＰＩ３Ｋｇａｍｍａ、Ｒｓｅ、Ｒｓｋ２、Ｓｙｋ、及びＴｉｅ２からなる群より選択される。より好ましい側面において、調節されるキナーゼは、ＡＢＬ、ＡＫＴ、ＡＵＲＯＲＡ、ＣＤＫ、ＤＢＦ２／２０、ＥＧＦＲ、ＥＰＨ／ＥＬＫ／ＥＣＫ、ＥＲＫ／ＭＡＰＫＦＧＦＲ、ＧＳＫ３、ＩＫＫＢ、ＩＮＳＲ、ＪＡＫ  ＤＯＭ  １／２、ＭＡＲＫ／ＰＲＫＡＡ、ＭＥＫ／ＳＴＥ７、ＭＥＫＫ／ＳＴＥ１１、ＭＬＫ、ｍＴＯＲ、ＰＡＫ／ＳＴＥ２０、ＰＤＧＦＲ、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＣ、ＰＯＬＯ、ＳＲＣ、ＴＥＣ／ＡＴＫ、及びＺＡＰ／ＳＹＫからなる群より選択される。
【００６４】
いくつかの側面において、必要としている哺乳動物は、自己免疫障害、アレルギー又は炎症障害、代謝症候群又は糖尿病関連障害、癌、眼障害、及び神経系障害からなる群より選択される状態を有する。必要としている哺乳動物が自己免疫障害を有する側面において、その障害は、自己免疫溶血性貧血、クローン病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、重症筋無力症、慢性関節リウマチ、及び全身性紅斑性狼瘡からなる群より選択される。
【００６５】
この態様の他の側面において、アレルギー又は炎症障害は、喘息、鼻炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、膵炎、胃炎、良性腫瘍、ポリープ、遺伝性ポリポーシス症候群、結腸癌、直腸癌、乳癌、前立腺癌、胃癌、消化器官の潰瘍性疾患、狭心症、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、狭心症又は心筋梗塞の後遺症、老年性痴呆、微生物感染（例、真菌、細菌、又はウイルス）に関連した炎症、及び脳血管系疾患からなる群より選択される。なお他の側面において、代謝症候群又は糖尿病関連障害は、代謝症候群、１型糖尿病、２型糖尿病、インスリン非感受性、及び肥満からなる群より選択される。
【００６６】
いくつかの側面において、癌は、脳、乳房、結腸、腎臓、白血病、肝臓、肺、及び前立腺の癌からなる群より選択される。この態様のなお他の側面において、眼障害は、網膜症、糖尿病性網膜症、及び黄斑変性からなる群より選択される。この態様のなお他の側面において、神経系障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ又はルー・ゲーリック病）、ハンチントン病、神経認知機能不全、老人性痴呆、及び情緒異常疾患からなる群より選択される。
【００６７】
用語「調節する」又は「調節」は、本明細書において、酵素の発現又は活性をそれに関連する化合物、成分、等により上方又は下方に調整することを意味するために使用する。
本明細書に使用するように、用語「プロテインキナーゼ」は、ドナー分子由来のリン酸基をタンパク質のアミノ酸残基へ移すことができるトランスフェラーゼ群の酵素を表す。プロテインキナーゼとファミリー／群の命名法の詳細な考察については、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Kostich, M., et al.「真核プロテインキナーゼファミリーのヒトメンバー（Human Members of the Eukaryotic Protein Kinase Family）」Genome Biology 3(9): research0043.1-0043.12, 2002 を参照のこと。
【００６８】
プロテインキナーゼの代表的で非限定的な例には、Ａｂｌ、Ａｂｌ（Ｔ３１５Ｉ）、ＡＬＫ、ＡＬＫ４、ＡＭＰＫ、Ａｒｇ、Ａｒｇ、ＡＲＫ５、ＡＳＫ１、Ａｕｒｏｒａ−Ａ、Ａｘｌ、Ｂｌｋ、Ｂｍｘ、ＢＲＫ、ＢｒＳＫ１、ＢｒＳＫ２、ＢＴＫ、ＣａＭＫＩ、ＣａＭＫＩＩ、ＣａＭＫＩＶ、ＣＤＫ１／サイクリンＢ、ＣＤＫ２／サイクリンＡ、ＣＤＫ２／サイクリンＥ、ＣＤＫ３／サイクリンＥ、ＣＤＫ５／ｐ２５、ＣＤＫ５／ｐ３５、ＣＤＫ６／サイクリンＤ３、ＣＤＫ７／サイクリンＨ／ＭＡＴ１、ＣＤＫ９／サイクリンＴ１、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、ＣＫ１（ｙ）、ＣＫ１δ、ＣＫ２、ＣＫ２α２、ｃＫｉｔ（Ｄ８１６Ｖ）、ｃＫｉｔ、ｃ−ＲＡＦ、ＣＳＫ、ｃＳＲＣ、ＤＡＰＫ１、ＤＡＰＫ２、ＤＤＲ２、ＤＭＰＫ、ＤＲＡＫ１、ＤＹＲＫ２、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ（Ｌ８５８Ｒ）、ＥＧＦＲ（Ｌ８６１Ｑ）、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４、ＥｒｂＢ４、Ｆｅｒ、Ｆｅｓ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、Ｆｇｒ、Ｆｌｔ１、Ｆｌｔ３（Ｄ８３５Ｙ）、Ｆｌｔ３、Ｆｌｔ４、Ｆｍｓ、Ｆｙｎ、ＧＳＫ３β、ＧＳＫ３α、Ｈｃｋ、ＨＩＰＫ１、ＨＩＰＫ２、ＨＩＰＫ３、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＫＫβ、ＩＫＫα、ＩＲ、ＩＲＡＫ１、ＩＲＡＫ４、ＩＲＲ、ＩＴＫ、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＪＮＫ１α１、ＪＮＫ２α２、ＪＮＫ３、ＫＤＲ、Ｌｃｋ、ＬＩＭＫ１、ＬＫＢ１、ＬＯＫ、Ｌｙｎ、Ｌｙｎ、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ２、ＭＡＰＫ２、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ３、ＭＡＲＫ１、ＭＥＫ１、ＭＥＬＫ、Ｍｅｔ、ＭＩＮＫ、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７β、ＭＬＣＫ、ＭＬＫ１、Ｍｎｋ２、ＭＲＣＫβ、ＭＲＣＫα、ＭＳＫ１、ＭＳＫ２、ＭＳＳＫ１、ＭＳＴ１、ＭＳＴ２、ＭＳＴ３、ＭｕＳＫ、ＮＥＫ２、ＮＥＫ３、ＮＥＫ６、ＮＥＫ７、ＮＬＫ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＡＫ２、ＰＡＫ３、ＰＡＫ４、ＰＡＫ６、ＰＡＲ−１Ｂα、ＰＤＧＦＲβ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＫ１、ＰＩ３Ｋｂｅｔａ、ＰＩ３Ｋｄｅｌｔａ、ＰＩ３Ｋｇａｍｍａ、Ｐｉｍ−１、Ｐｉｍ−２、ＰＫＡ（ｂ）、ＰＫＡ、ＰＫＢβ、ＰＫＢα、ＰＫＢγ、ＰＫＣμ、ＰＫＣβＩ、ＰＫＣβＩＩ、ＰＫＣα、ＰＫＣγ、ＰＫＣδ、ＰＫＣε、ＰＫＣζ、ＰＫＣη、ＰＫＣθ、ＰＫＣι、ＰＫＤ２、ＰＫＧ１β、ＰＫＧ１α、Ｐｌｋ３、ＰＲＡＫ、ＰＲＫ２、ＰｒＫＸ、ＰＴＫ５、Ｐｙｋ２、Ｒｅｔ、ＲＩＰＫ２、ＲＯＣＫ−Ｉ、ＲＯＣＫ−ＩＩ、ＲＯＣＫ−ＩＩ、Ｒｏｎ、Ｒｏｓ、Ｒｓｅ、Ｒｓｋ１、Ｒｓｋ１、Ｒｓｋ２、Ｒｓｋ３、ＳＡＰＫ２ａ、ＳＡＰＫ２ａ（Ｔ１０６Ｍ）、ＳＡＰＫ２ｂ、ＳＡＰＫ３、ＳＡＰＫ４、ＳＧＫ、ＳＧＫ２、ＳＧＫ３、ＳＩＫ、Ｓｎｋ、ＳＲＰＫ１、ＳＲＰＫ２、ＳＴＫ３３、Ｓｙｋ、ＴＡＫ１、ＴＢＫ１、Ｔｉｅ２、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴＳＳＫ１、ＴＳＳＫ２、ＷＮＫ２、ＷＮＫ３、Ｙｅｓ、ＺＡＰ−７０、及びＺＩＰＫが含まれる。いくつかの態様において、キナーゼは、ＡＬＫ、Ａｕｒｏｒａ−Ａ、Ａｘｌ、ＣＤＫ９／サイクリンＴ１、ＤＡＰＫ１、ＤＡＰＫ２、Ｆｅｒ、ＦＧＦＲ４、ＧＳＫ３β、ＧＳＫ３α、Ｈｃｋ、ＪＮＫ２α２、ＭＳＫ２、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＡＫ３、ＰＩ３Ｋｄｅｌｔａ、ＰＩ３Ｋｇａｍｍａ、ＰＫＡ、ＰＫＢβ、ＰＫＢα、Ｒｓｅ、Ｒｓｋ２、Ｓｙｋ、Ｔｒｋ１、及びＴＳＳＫ１であってよい。なお他の態様において、キナーゼは、ＡＢＬ、ＡＫＴ、ＡＵＲＯＲＡ、ＣＤＫ、ＤＢＦ２／２０、ＥＧＦＲ、ＥＰＨ／ＥＬＫ／ＥＣＫ、ＥＲＫ／ＭＡＰＫＦＧＦＲ、ＧＳＫ３、ＩＫＫＢ、ＩＮＳＲ、ＪＡＫ  ＤＯＭ  １／２、ＭＡＲＫ／ＰＲＫＡＡ、ＭＥＫ／ＳＴＥ７、ＭＥＫＫ／ＳＴＥ１１、ＭＬＫ、ｍＴＯＲ、ＰＡＫ／ＳＴＥ２０、ＰＤＧＦＲ、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＣ、ＰＯＬＯ、ＳＲＣ、ＴＥＣ／ＡＴＫ、及びＺＡＰ／ＳＹＫからなる群より選択される。
【００６９】
本発明の方法及び組成物は、本発明の方法の利益を体験する可能性があるどの哺乳動物での使用にも企図される。そのような哺乳動物の中で一番はヒトであるが、本発明は、そのように限定されることを企図せず、獣医学の使用に適用可能である。このように、本発明によれば、「哺乳動物」又は「必要としている哺乳動物」には、ヒトだけでなく非ヒト哺乳動物、特に、限定なしに、ネコ、イヌ、及びウマが含まれる家畜動物が含まれる。
【００７０】
本明細書に使用するように、「自己免疫障害」は、宿主系が宿主自身の免疫系により攻撃されるときに生じる疾患、病気、又は状態を意味する。自己免疫疾患の代表的で非限定的な例には、円形脱毛症、強直性脊椎炎、関節炎、抗リン脂質症候群、自己免疫アジソン病、自己免疫溶血性貧血、自己免疫内耳疾患（メニエール病としても知られる）、自己免疫リンパ増殖症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫血小板減少性紫斑病、自己免疫溶血性貧血、自己免疫肝炎、ベーチェット病、クローン病、１型真性糖尿病、糸球体腎炎、グレイブス病、ギラン・バレ症候群、炎症性腸疾患、ループス腎炎、多発性硬化症、重症筋無力症、天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性筋炎、原発性胆管性肝硬変症、乾癬、リウマチ熱、慢性関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性紅斑性狼瘡、潰瘍性大腸炎、眩暈、及びウェジナー肉芽腫症が含まれる。自己免疫障害に関連するキナーゼの代表的で非限定的な例には、ＢＴＫ、ＥＲＫ、ＦＧＦＲ、ＦＭＳ、ＧＳＫ、ＩＧＦＲ、ＩＫＫ、ＪＡＫ、ＰＤＧＦＲ、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＣ、ＰＬＫ、ＲＯＣＫ、及びＶＥＧＦＲが含まれる。
【００７１】
本明細書に使用する「アレルギー障害」は、平均的な個体に対しては匹敵する効果のない物質、状況、又は身体状態に対する過激又は病理学的な反応（くしゃみ、呼吸困難、痛痒、又は皮膚発疹によるような）を意味する。本明細書に使用するように、「炎症障害」は、毛細血管拡張、白血球浸潤、発赤、発熱、疼痛、腫脹、及びしばしば機能喪失を特徴として、有害な作用体や傷害された組織の消失を始動させる機序として役立つ、細胞損傷への（通常は局所的な）応答を意味する。アレルギー又は炎症障害の例には、限定なしに、喘息、鼻炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、膵炎、胃炎、良性腫瘍、ポリープ、遺伝性ポリポーシス症候群、結腸癌、直腸癌、乳癌、前立腺癌、胃癌、消化器官の潰瘍性疾患、狭心症、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、狭心症又は心筋梗塞の後遺症、老年性痴呆、及び脳血管系疾患が含まれる。アレルギー障害に関連するキナーゼの代表的で非限定的な例には、ＡＫＴ、ＢＴＫ、ＥＧＦＲ、ＦＹＮ、ＩＫＫＢ、ＩＴＫ、ＪＡＫ、ＫＩＴ、ＬＣＫ、ＬＹＮ、ＭＡＰＫ、ＭＥＫ、ｍＴＯＲ、ＰＤＧＦＲ、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＣ、ＰＰＡＲ、ＲＯＣＫ、ＳＲＣ、ＳＹＫ、及びＺＡＰが含まれる。
【００７２】
本明細書に使用するように、「代謝症候群」及び「糖尿病関連障害」は、インスリン関連障害、即ち、インスリンへの応答がその疾患の原因であるか、又はその疾患若しくは状態の進行若しくは抑制に関与する可能性がある疾患又は状態を意味する。インスリン関連障害の代表的な例には、限定なしに、糖尿病合併症、インスリン感受性、多嚢胞性卵巣疾患、高血糖症、脂質異常症、インスリン抵抗性、代謝症候群、肥満、体重増加、炎症疾患、消化器官の疾患、狭心症、心筋梗塞、狭心症又は心筋梗塞の後遺症、老人性痴呆、及び脳血管系痴呆が含まれる。「ハリソン内科学原理（Harrison's Principles of Internal Medicine）」16版、マクグロー・ヒル・カンパニー社、ニューヨーク（2005）を参照のこと。炎症状態の例には、限定なしに、消化器官の疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病、膵炎、胃炎、消化器官の良性腫瘍、消化性ポリープ、遺伝性ポリポーシス症候群、結腸癌、直腸癌、胃癌、及び消化器官の潰瘍性疾患のような）、狭心症、心筋梗塞、狭心症又は心筋梗塞の後遺症、老人性痴呆、脳血管系痴呆、免疫系疾患、及び癌全般が含まれる。代謝症候群に関連するキナーゼの非限定的な例には、ＡＫＴ、ＡＭＰＫ、ＣＤＫ、ＥＲＫ、ＧＳＫ、ＩＧＦＲ、ＪＮＫ、ＭＡＰＫ、ＭＥＫ、ＰＩ３Ｋ、及びＰＫＣが含まれる。
【００７３】
「インスリン抵抗性」は、身体のインスリン依存性プロセスによるインスリンへの感受性の低下を意味し、これらのプロセスの活動低下、又はインスリン産生の増加、又はその両方をもたらす。インスリン抵抗性は、２型糖尿病に典型的であるが、糖尿病の非存在時に起こる場合もある。
【００７４】
本明細書に使用するように、「糖尿病合併症」には、限定なしに、網膜症、筋梗塞、特発性骨格骨化過剰症及び骨損失、足の潰瘍、ニューロパシー、動脈硬化症、呼吸性自律神経異常症と胸郭及び肺実質の構造障害、左心室肥大、心臓血管系の罹患状態、腎機能の進行性損失、及び貧血が含まれる。
【００７５】
本明細書に使用するように、「癌」は、悪性になると、周囲の組織に浸潤して、新たな身体部位へ転移する傾向がある未分化細胞の増殖を特徴とする、様々な良性又は悪性の新生物のいずれをも意味する。本発明の範囲内で考慮される癌の代表的で非限定的な例には、脳、乳房、結腸、腎臓、白血病、肝臓、肺、及び前立腺の癌が含まれる。本発明の範囲内で考慮される癌関連プロテインキナーゼの非限定的な例には、ＡＢＬ、ＡＫＴ、Ａｕｒｏｒａ、ＢＲＫ、ＣＤＫ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢ、ＦＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＫＩＴ、ＭＡＰＫ、ｍＴＯＲ、ＰＤＧＦＲ、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＣ、及びＳＲＣが含まれる。
【００７６】
「眼障害」は、発達性の異常、疾患、損傷、加齢、又は毒素より生じる、眼の構造又は機能における障害を意味する。本発明の範囲内で考慮される眼障害の非限定的な例には、網膜症、黄斑変性、又は糖尿病性網膜症が含まれる。眼障害関連キナーゼには、限定なしに、Ａｕｒｏｒａ、ＥＰＨ、ＥＲＢ、ＥＲＫ、ＦＭＳ、ＩＧＦＲ、ＭＥＫ、ＰＤＧＦＲ、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＣ、ＳＲＣ、及びＶＥＧＦＲが含まれる。
【００７７】
本明細書に使用する「神経系障害」は、発達性の異常、疾患、損傷、又は毒素より生じる、中枢神経系の構造又は機能におけるあらゆる障害を意味する。神経系障害の代表的で非限定的な例には、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ又はルー・ゲーリック病）、ハンチントン病、神経認知機能不全、老人性痴呆、及び情緒異常疾患が含まれる。神経系障害に関連するプロテインキナーゼには、限定なしに、ＣＤＫ、ＦＹＮ、ＪＮＫ、ＭＡＰＫ、ＰＫＣ、ＲＯＣＫ、ＲＴＫ、ＳＲＣ、及びＶＥＧＦＲを含めてよい。
【００７８】
本明細書に使用するように、「心臓血管系疾患」又は「ＣＶＤ」は、心臓組織又は血管の機能を妨げるか又はそれを破壊する病理又は状態を意味する。心臓血管系疾患関連キナーゼには、限定なしに、ＡＫＴ、ＧＲＫ、ＧＳＫ、ＩＫＫＢ、ＪＡＫ、ＪＵＮ、ＭＡＰＫ、ＰＫＣ、ＲＨＯ、ＲＯＣＫ、及びＴＯＲが含まれる。
【００７９】
本明細書に使用する「骨粗鬆症」は、骨がきわめて多孔性になることにより、骨が骨折をより受けやすくなって、治癒がより遅れる疾患を意味する。骨粗鬆症に関連するプロテインキナーゼには、限定なしに、ＡＫＴ、ＣＡＭＫ、ＩＲＡＫ−Ｍ、ＭＡＰＫ、ｍＴＯＲ、ＰＰＡＲ、ＲＨＯ、ＲＯＳ、ＳＲＣ、ＳＹＲ、及びＶＥＧＦＲが含まれる。
【００８０】
本発明の態様は、複数の代謝症候群関連プロテインキナーゼの活性の調節を、それを必要としている被検者においてする方法を記載し、ここで前記プロテインキナーゼ調節は、該被検者の健康にとって有益である。この方法は、５：１（ｗ／ｗ）比のｒｈｏ−イソアルファ酸と Acacia nilotica 芯材粉末抽出物を含んでなる組成物の治療有効量を必要としている該被検者へ投与することを含む。
【００８１】
本発明のさらなる態様は、複数の疾患関連プロテインキナーゼの活性の調節を、それを必要としている被検者においてする組成物を開示し、ここで前記プロテインキナーゼ調節は、該被検者の健康にとって有益である。この態様の組成物は、アルファ酸、ベータ酸、プレニルフラボノイド、カルコン、イソアルファ酸、還元イソアルファ酸、使用済ホップ、及びアカシア由来の化合物又は抽出物からなる群より選択される化合物の治療有効量を含む。
【００８２】
この態様のいくつかの側面において、必要としている被検者は、自己免疫障害、アレルギー又は炎症障害、代謝症候群又は糖尿病関連障害、癌、眼障害、及び神経系障害からなる群より選択される状態を有し、一方、他の側面において、疾患関連プロテインキナーゼは、ＡＢＬ、ＡＫＴ、ＡＵＲＯＲＡ、ＣＤＫ、ＤＢＦ２／２０、ＥＧＦＲ、ＥＰＨ／ＥＬＫ／ＥＣＫ、ＥＲＫ／ＭＡＰＫＦＧＦＲ、ＧＳＫ３、ＩＫＫＢ、ＩＮＳＲ、ＪＡＫ  ＤＯＭ  １／２、ＭＡＲＫ／ＰＲＫＡＡ、ＭＥＫ／ＳＴＥ７、ＭＥＫＫ／ＳＴＥ１１、ＭＬＫ、ｍＴＯＲ、ＰＡＫ／ＳＴＥ２０、ＰＤＧＦＲ、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＣ、ＰＯＬＯ、ＳＲＣ、ＴＥＣ／ＡＴＫ、及びＺＡＰ／ＳＹＫからなる群より選択される。
【００８３】
なお他の側面において、アルファ酸は、フムロン、コフムロン、アドフムロン、プレフムロン、及びポストフムロンからなる群より選択されるか、又はベータ酸は、ルプロン、コルプロン、アドルプロン、及びプレルプロンからなる群より選択される。
【００８４】
なお他の側面において、使用する組成物のイソアルファ酸は、イソフムロン、イソアドフムロン、及びイソコフムロンからなる群より選択される。該組成物がＲＩＡＡを利用する場合、ＲＩＡＡは、ジヒドロ−イソフムロン、ジヒドロ−イソコフムロン、ジヒドロ−アドフムロン、テトラヒドロ−イソフムロン、テトラヒドロ−イソコフムロン、テトラヒドロ−アドフムロン、ヘキサヒドロ−イソフムロン、ヘキサヒドロ−イソコフムロン、ヘキサヒドロ−アドフムロンからなる群より選択される。この態様のなお他の側面では、ｒｈｏ−イソアルファ酸の配置を利用する。
【００８５】
この態様のいくつかの側面において、カルコンは、キサントフモール又はイソキサントフモールであるか、又はプレニルフラボノイドは、６−プレニルナリンゲニン又は８−プレニルナリンゲニンである。
【００８６】
なお他の側面において、アカシア由来の化合物又は抽出物は、Acacia catechu 又は Acacia nilotica に由来する。アカシア由来の化合物又は抽出物が、Acacia catechu 又は Acacia nilotica に由来する側面において、Acacia catechu 又は Acacia nilotica の化合物は、ゴム樹脂、樹皮粉末、芯材粉末、及び Acacia catechu 又は Acacia nilotica 抽出物からなる群より選択される。アカシア由来の化合物が、Acacia catechu 又は Acacia nilotica 抽出物である側面において、該抽出物は、酸性、アルカリ性、極性の溶媒、非極性溶媒、及び胃液抽出物より選択される。
【００８７】
この態様の組成物は、抗酸化薬、ビタミン、無機物、タンパク質、脂肪、及び炭水化物からなる群より選択される１以上の成分、又はコーティング剤、等張剤及び吸収遅延剤、結合剤、接着剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、芳香剤、甘味剤、吸収剤、界面活性剤、及び乳化剤からなる群より選択される医薬的に許容される賦形剤をさらに含んでよい。
【００８８】
この態様のいくつかの方法において、使用する組成物は、ロシグリタゾン、トログリタゾン、ピオグリタゾン、及びメトホルミンからなる群より選択される抗糖尿病薬をさらに含む。
【００８９】
この態様のいくつかの側面において、調節されるキナーゼは、Ａｂｌ、Ａｂｌ（Ｔ３１５Ｉ）、ＡＬＫ、ＡＬＫ４、ＡＭＰＫ、Ａｒｇ、Ａｒｇ、ＡＲＫ５、ＡＳＫ１、Ａｕｒｏｒａ−Ａ、Ａｘｌ、Ｂｌｋ、Ｂｍｘ、ＢＲＫ、ＢｒＳＫ１、ＢｒＳＫ２、ＢＴＫ、ＣａＭＫＩ、ＣａＭＫＩＩ、ＣａＭＫＩＶ、ＣＤＫ１／サイクリンＢ、ＣＤＫ２／サイクリンＡ、ＣＤＫ２／サイクリンＥ、ＣＤＫ３／サイクリンＥ、ＣＤＫ５／ｐ２５、ＣＤＫ５／ｐ３５、ＣＤＫ６／サイクリンＤ３、ＣＤＫ７／サイクリンＨ／ＭＡＴ１、ＣＤＫ９／サイクリンＴ１、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、ＣＫ１（ｙ）、ＣＫ１δ、ＣＫ２、ＣＫ２α２、ｃＫｉｔ（Ｄ８１６Ｖ）、ｃＫｉｔ、ｃ−ＲＡＦ、ＣＳＫ、ｃＳＲＣ、ＤＡＰＫ１、ＤＡＰＫ２、ＤＤＲ２、ＤＭＰＫ、ＤＲＡＫ１、ＤＹＲＫ２、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ（Ｌ８５８Ｒ）、ＥＧＦＲ（Ｌ８６１Ｑ）、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４、ＥｒｂＢ４、Ｆｅｒ、Ｆｅｓ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、Ｆｇｒ、Ｆｌｔ１、Ｆｌｔ３（Ｄ８３５Ｙ）、Ｆｌｔ３、Ｆｌｔ４、Ｆｍｓ、Ｆｙｎ、ＧＳＫ３β、ＧＳＫ３α、Ｈｃｋ、ＨＩＰＫ１、ＨＩＰＫ２、ＨＩＰＫ３、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＫＫβ、ＩＫＫα、ＩＲ、ＩＲＡＫ１、ＩＲＡＫ４、ＩＲＲ、ＩＴＫ、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＪＮＫ１α１、ＪＮＫ２α２、ＪＮＫ３、ＫＤＲ、Ｌｃｋ、ＬＩＭＫ１、ＬＫＢ１、ＬＯＫ、Ｌｙｎ、Ｌｙｎ、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ２、ＭＡＰＫ２、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ３、ＭＡＲＫ１、ＭＥＫ１、ＭＥＬＫ、Ｍｅｔ、ＭＩＮＫ、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７β、ＭＬＣＫ、ＭＬＫ１、Ｍｎｋ２、ＭＲＣＫβ、ＭＲＣＫα、ＭＳＫ１、ＭＳＫ２、ＭＳＳＫ１、ＭＳＴ１、ＭＳＴ２、ＭＳＴ３、ＭｕＳＫ、ＮＥＫ２、ＮＥＫ３、ＮＥＫ６、ＮＥＫ７、ＮＬＫ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＡＫ２、ＰＡＫ３、ＰＡＫ４、ＰＡＫ６、ＰＡＲ−１Ｂα、ＰＤＧＦＲβ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＫ１、ＰＩ３Ｋｂｅｔａ、ＰＩ３Ｋｄｅｌｔａ、ＰＩ３Ｋｇａｍｍａ、Ｐｉｍ−１、Ｐｉｍ−２、ＰＫＡ（ｂ）、ＰＫＡ、ＰＫＢβ、ＰＫＢα、ＰＫＢγ、ＰＫＣμ、ＰＫＣβＩ、ＰＫＣβＩＩ、ＰＫＣα、ＰＫＣγ、ＰＫＣδ、ＰＫＣε、ＰＫＣζ、ＰＫＣη、ＰＫＣθ、ＰＫＣι、ＰＫＤ２、ＰＫＧ１β、ＰＫＧ１α、Ｐｌｋ３、ＰＲＡＫ、ＰＲＫ２、ＰｒＫＸ、ＰＴＫ５、Ｐｙｋ２、Ｒｅｔ、ＲＩＰＫ２、ＲＯＣＫ−Ｉ、ＲＯＣＫ−ＩＩ、ＲＯＣＫ−ＩＩ、Ｒｏｎ、Ｒｏｓ、Ｒｓｅ、Ｒｓｋ１、Ｒｓｋ１、Ｒｓｋ２、Ｒｓｋ３、ＳＡＰＫ２ａ、ＳＡＰＫ２ａ（Ｔ１０６Ｍ）、ＳＡＰＫ２ｂ、ＳＡＰＫ３、ＳＡＰＫ４、ＳＧＫ、ＳＧＫ２、ＳＧＫ３、ＳＩＫ、Ｓｎｋ、ＳＲＰＫ１、ＳＲＰＫ２、ＳＴＫ３３、Ｓｙｋ、ＴＡＫ１、ＴＢＫ１、Ｔｉｅ２、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴＳＳＫ１、ＴＳＳＫ２、ＷＮＫ２、ＷＮＫ３、Ｙｅｓ、ＺＡＰ−７０、及びＺＩＰＫからなる群より選択される。
【００９０】
好ましい側面において、調節されるキナーゼは、Ａｕｒｏｒａ−Ａ、ＣＤＫ２／サイクリンＡ、ＤＡＰＫ１、ＤＡＰＫ２、ＥｐｈＡ３、ＦＧＦＲ４、ＧＳＫ３β、ＧＳＫ３α、Ｈｃｋ、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２、ＭＳＫ２、ＭＳＳＫ１、ＰＩ３Ｋｂｅｔａ、ＰＩ３Ｋｄｅｌｔａ、ＰＩ３Ｋｇａｍｍａ、Ｒｓｅ、Ｒｓｋ２、Ｓｙｋ、及びＴｉｅ２からなる群より選択される。より好ましい側面において、調節されるキナーゼは、ＡＢＬ、ＡＫＴ、ＡＵＲＯＲＡ、ＣＤＫ、ＤＢＦ２／２０、ＥＧＦＲ、ＥＰＨ／ＥＬＫ／ＥＣＫ、ＥＲＫ／ＭＡＰＫＦＧＦＲ、ＧＳＫ３、ＩＫＫＢ、ＩＮＳＲ、ＪＡＫ  ＤＯＭ  １／２、ＭＡＲＫ／ＰＲＫＡＡ、ＭＥＫ／ＳＴＥ７、ＭＥＫＫ／ＳＴＥ１１、ＭＬＫ、ｍＴＯＲ、ＰＡＫ／ＳＴＥ２０、ＰＤＧＦＲ、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＣ、ＰＯＬＯ、ＳＲＣ、ＴＥＣ／ＡＴＫ、及びＺＡＰ／ＳＹＫからなる群より選択される。
【００９１】
いくつかの側面において、必要としている哺乳動物は、自己免疫障害、アレルギー又は炎症障害、代謝症候群又は糖尿病関連障害、癌、眼障害、及び神経系障害からなる群より選択される状態を有する。必要としている哺乳動物が自己免疫障害を有する側面において、その障害は、自己免疫溶血性貧血、クローン病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、重症筋無力症、慢性関節リウマチ、及び全身性紅斑性狼瘡からなる群より選択される。
【００９２】
この態様の他の側面において、アレルギー又は炎症障害は、喘息、鼻炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、膵炎、胃炎、良性腫瘍、ポリープ、遺伝性ポリポーシス症候群、結腸癌、直腸癌、乳癌、前立腺癌、胃癌、消化器官の潰瘍性疾患、狭心症、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、狭心症又は心筋梗塞の後遺症、老年性痴呆、及び脳血管系疾患からなる群より選択される。なお他の側面において、代謝症候群又は糖尿病関連障害は、代謝症候群、１型糖尿病、２型糖尿病、インスリン非感受性、及び肥満からなる群より選択される。
【００９３】
いくつかの側面において、癌は、脳、乳房、結腸、腎臓、白血病、肝臓、肺、及び前立腺の癌からなる群より選択される。この態様のなお他の側面において、眼障害は、網膜症、糖尿病性網膜症、及び黄斑変性からなる群より選択される。この態様のなお他の側面において、神経系障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ又はルー・ゲーリック病）、ハンチントン病、神経認知機能不全、老人性痴呆、及び情緒異常疾患からなる群より選択される。
【００９４】
本発明の別の態様は、複数の代謝症候群関連プロテインキナーゼの活性の調節を、それを必要としている被検者においてする組成物を記載し、ここで前記プロテインキナーゼ調節は、該被検者の健康にとって有益である。これらの組成物は、５：１（ｗ／ｗ）比のｒｈｏ−イソアルファ酸と Acacia nilotica 芯材粉末抽出物を含んでなる組成物の治療有効量を含む。
【００９５】
本発明の別の態様は、複数の疾患関連プロテインキナーゼの活性の調節を、それを必要としている被検者においてする組成物を開示し、ここで前記プロテインキナーゼ調節は、該被検者の健康にとって有益である。この態様において、組成物は：
ａ．約０．０１ｍｇ〜約１０，０００ｍｇのキサントフモール；
ｂ．約０．０１ｍｇ〜約１０，０００ｍｇのＴＨＩＡＡ；
ｃ．約０．０１ｍｇ〜約１０，０００ｍｇのＨＨＩＡＡ；
ｄ．約０．０１ｍｇ〜約１０，０００ｍｇのＲＩＡＡ；
ｅ．約０．０１ｍｇ〜約１０，０００ｍｇのＩＡＡ；
ｆ．約０．０１ｍｇ〜約１０，０００ｍｇのベータ酸；及び
ｇ．約０．０１ｍｇ〜約１０，０００ｍｇのアルファ酸からなる群より選択される少なくとも１つの成分の治療有効量を含む。
【００９６】
本明細書に使用するように、「治療すること」は、本発明の化合物が投与された個体における症状を、本発明により治療されていない個体の症状と比較して、抑制する、予防する、及び／又は逆転させることを意味する。実施者は、本明細書に記載の化合物、組成物、及び方法を熟練実施者（医師又は獣医師）による連続した臨床評価と随伴して使用して、後続の療法を決定することができることを理解されよう。従って、治療に続いて、実施者は、標準の方法論による肺の炎症の治療における改善を評価することができる。そのような評価は、特別な治療の用量、投与の形式、等を増加、減少、又は継続させるべきかどうかを評価するのに役立ち、その情報を与えるものである。
【００９７】
本発明の化合物が投与される被検者は、特定の外傷状態に罹患している必要はないと理解されよう。実際、本発明の化合物は、症状の発現に先立って、予防的に投与してよい。用語「療法の」、「療法的に」、及びこれらの用語の置き換えは、療法的、緩和的、並びに予防的な使用を包含するために使用する。従って、本明細書に使用するように、「症状を治療するか又は緩和すること」は、本発明の化合物が投与された個体の症状を、そのような投与を受けていない個体の症状と比較して、抑制する、予防する、及び／又は逆転させることを意味する。
【００９８】
用語「治療有効量」は、求める治療結果を達成するのに有効な投与量での治療を示すために使用する。さらに、当業者は、本発明の化合物の治療有効量は、微調整によって、及び／又は本発明の化合物の１より多くを投与することによって、又は本発明の化合物を別の化合物とともに投与することによって低下又は増加させてよいことを理解されよう。例えば、Meiner, C. L.「臨床治験：設計、実施、及び解析（Clinical Trials: Design, Conduct, and Analysis）」疫学及び生物統計学の研究論文（Monographs in Epidemiology and Biostatistics）第８巻、オックスフォード大学出版局、アメリカ（1986）を参照のこと。故に本発明は、所与の哺乳動物に特定の特別な事情に対して投与／治療を設計するための方法を提供する。以下の実施例に例示するように、治療有効量は、例えば、比較的少ない量で開始することによって、そして有益な効果の同時評価に伴う段階増加によって経験的に容易に決定することができる。
【００９９】
当業者には、本発明による化合物の投与の回数は、年齢、体重、及び該哺乳動物の状態、及び選択する投与の経路といった他の臨床要因が含まれる、ある所与の時期でのその患者の特別な医学的状態に基づいて、患者ごとに変動するものであることが理解されよう。
【０１００】
本明細書に使用するように、「症状」は、患者により体験されて、特別な疾患に関連している、身体機能のあらゆる感覚又は変化、即ち、「Ｘ」に付随して、「Ｘ」の存在の印とみなされるものを意味する。症状は、疾患ごとに、又は状態ごとに変化するものであることが認められて、理解される。非限定的な例を挙げれば、自己免疫障害に関連した症状には、疲労、眠気、不定愁訴、臓器若しくは組織の大きさの増加（例えば、グレイブス病における甲状腺肥大）、又は臓器若しくは組織の機能低下をもたらす臓器若しくは組織の破壊（例えば、糖尿病では、膵臓の島細胞が破壊される）が含まれる。
【０１０１】
アレルギーに関連した疾患又は状態の代表的な総体症状には、放心状態、アナフィラキシー、喘息、眼の充血（burning eyes）、便秘、空咳、眼の下又は周囲の黒ずみ、皮膚炎、うつ、下痢、嚥下困難、散漫又は集中困難、眠気、湿疹、当惑、疲労、紅潮、頭痛、心悸亢進、蕁麻疹、嗅覚低下、過敏性／行動上の問題、鼻、皮膚、又は喉の痒み、関節痛、筋肉痛、鼻鬱血、鼻ポリープ、悪心、鼻後方排膿（鼻後方滴下）、速脈、鼻漏（粘液分泌の鼻）、耳鳴り（耳のポン鳴り、又は充満感）、息切れ、皮膚発疹、睡眠障害、くしゃみ、腫脹（血管浮腫）、喉の嗄声、鼻の刺痛、疲労感、眩暈、嘔吐、涙目、目の痒み、痂皮のような目、又は血走った目、及び喘鳴が含まれる。
【０１０２】
本明細書に使用する「炎症」又は「炎症状態」は、毛細血管拡張、白血球浸潤、発赤、発熱、疼痛、腫脹、及びしばしば機能喪失を特徴として、有害な作用体や傷害された組織の消失を始動させる機序として役立つ、細胞損傷への局所応答を意味する。炎症又は炎症状態の代表的な症状には、関節に限定すれば、発赤、触ると温かい腫脹関節、関節の疼痛及び硬直、及び関節機能の損失が含まれる。全身性の炎症応答は、例えば、発熱、悪寒、疲労／体力喪失、頭痛、食欲喪失、及び筋肉硬直のような、「風邪様の」症状をもたらす場合がある。
【０１０３】
糖尿病及び代謝症候群は、その症状の多くが無害のように見えるので、しばしば、診断未確定である。例えば、いくつかの糖尿病症状には、限定なしに、頻尿、過剰な渇き、過度の空腹、異常な体重減少、疲労の増加、過敏性、及び視界のぼやけが含まれる。
【０１０４】
神経系障害の総体症状は多様であり得て、限定なしに、痺れ、刺痛、知覚過敏（感受性の増加）、麻痺、局在性の虚弱、構語障害（言語障害）、失語症（話し得ないこと）、嚥下障害（呑み込み困難）、複視（二重視）、認知障害（例えば、集中し得ないこと）、記憶喪失、一過性黒内障（片目の一時的な視覚喪失）、歩行困難、協調運動障害、振戦、発作、混乱、嗜眠、痴呆、譫妄、及び昏睡が含まれる場合がある。
【０１０５】
さらなる態様において、複数の眼障害関連プロテインキナーゼの活性の調節を被検者においてする組成物（ここで前記プロテインキナーゼ調節は、該被検者の健康にとって有益である）について記載する。ここで該組成物は、約１ｍｇ〜約１０００ｍｇのビタミンＣ；約１ＩＵ〜約１０００ＩＵのビタミンＥ；約０．１ｍｇ〜約２．５ｍｇのセレン；約１ｍｇ〜約５０ｍｇの亜鉛；約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇの銅；約１ｍｇ〜約１５ｍｇのルテイン；約０．０５ｍｇ〜約１ｍｇのゼアキサンチン；及び約１ｍｇ〜約１０００ｍｇの Acacia nilotica 芯材粉末又は樹皮抽出物を含んでなる組成物の治療有効量を含む。
【０１０６】
以下の実施例は、本発明のいくつかの好ましい態様をさらに例示することを企図していて、本発明を決して限定するものではない。当業者は、定型的な実験だけを使用して、本明細書に記載の特定の物質及び手順に対する数多くの同等物を認めるか、又はそれを確かめることができよう。
【０１０７】
実施例
実施例１
プロテインキナーゼに対する修飾ホップ成分の効果
上記に述べたように、キナーゼは、ドナー分子（通常、ＡＴＰ）由来のリン酸基をタンパク質のアミノ酸残基（通常、スレオニン、セリン、又はチロシン）へ移すことが可能であるトランスフェラーゼ群の酵素を表す。キナーゼは、酵素の調節のためのシグナル伝達において使用される。即ち、それらは、コレステロール生合成、アミノ酸変換、又はグリコゲン代謝回転におけるように、酵素の活性を阻害するか又は活性化することができる。ほとんどのキナーゼは単一種のアミノ酸残基へ特化しているが、２つの異なる種類のアミノ酸をリン酸化することができるという点で、二元的な活性を明示するキナーゼもある。図１に示すように、キナーゼは、シグナルの伝達及び翻訳において機能する。
【０１０８】
方法−本発明の１０μｇ  ＲＩＡＡ／ｍｌの、ヒトキナーゼ活性に及ぼす阻害効果について、ＫｉｎａｓｅＰｒｏｆｉｌｅｒＴＭ  Ａｓｓａｙ（Upstate Cell Signaling Solutions，Ｕｐｓｔａｔｅ  ＵＳＡ社、バージニア州シャーロッツビル、アメリカ）において、２００を超えるキナーゼのパネルで検査した。特定のキナーゼのアッセイプロトコールについては、http://www.upstate.com/img/pdf/kp_protocols_full.pdf（最終更新日：2006年6月12日）に要約されている。
【０１０９】
結果−２０５種よりやや多いヒトキナーゼについて無細胞系でアッセイした。驚くべきことに、我々は、試験したホップ化合物が２０５種のキナーゼのうち２５種を１０％以上阻害することを発見した。２０５種のうち８種は、２０％より高く阻害され；２０５種のうち５種は、３０％より高く阻害され；そして２種は、約５０％より高く阻害された。
【０１１０】
具体的には、ＰＩ３キナーゼ経路において、ホップは、ＰＩ３Ｋγ、ＰＩ３Ｋδ、ＰＩ３Ｋβ、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β、Ｐ７０Ｓ６Ｋを阻害する。ｍＴＯＲは、試験に利用できなかったことに留意されたい。
【０１１１】
試験したキナーゼに対するホップ化合物、ＲＩＡＡの阻害効果を以下の表１に示す。
表１
ＫｉｎａｓｅＰｒｏｆｉｌｅｒＴＭ  Ａｓｓａｙにおいて１０μｇ／ｍｌで試験したＲＩＡＡによるキナーゼ阻害
【０１１２】
【表１】
2009504657.tif 000003
【０１１３】
【表２】
2009504657.tif 000004
【０１１４】
【表３】
2009504657.tif 000005
【０１１５】
ＰＩ３Ｋ経路のいくつかのキナーゼがＲＩＡＡにより選好的に阻害される（例えば、Ａｋｔ１は、５１％阻害）ことに注目されたい。３種のＡｋｔアイソフォームが存在することに注目することは興味深い。Ａｋｔ１ヌル（null）マウスは生存可能であるが、成長が遅れる［Cho et al., Science 292: 1728-1731 (2001)］。Ａｋｔ１を欠損するキイロショウジョウバエの眼細胞は、サイズが抑制される［Verdu et al., Nat cell Biol 1: 500-505 (1999)］；過剰発現は、正常からのサイズ増加をもたらす。Ａｋｔ２ヌルマウスは生存可能であるが、グルコース制御に障害がある［Cho et al., J Biol Chem 276: 38345-38352 (2001)］。従って、Ａｋｔ１は、サイズ決定に役割を担い、Ａｋｔ２は、インスリンシグナル伝達に関与しているようである。
【０１１６】
ＰＩ３Ｋ経路は、ｍＲＮＡ安定性とｍＲＮＡ翻訳選択において主要な役割を担い、様々な腫瘍遺伝子タンパク質及び炎症経路タンパク質の差異的な（differential）タンパク発現をもたらすことが知られている。５’−ＴＯＰと示される特別な５’ｍＲＮＡ構造は、ｍＲＮＡ翻訳選択の調節において主要な構造であることが示されている。
【０１１７】
ｃＰＬＡの文献及びＤＮＡ配列に関する概説は、ヒトｃＰＬＡ２の５’ｍＲＮＡがコンセンサス（同様に調節される既知の腫瘍因子に対して８２％相同である）配列を含有して、それも５’ＴＯＰ構造を有することを示す。炎症に関連している可能性があることも知られているｓＰＬＡも、この同じ５’−ＴＯＰを有する。さらに、このことは、ｃＰＬＡ２とおそらくは他のＰＬＡがｃＰＬＡ２  ｍＲＮＡの翻訳選択を高めることを介してＰＩ３Ｋ経路によりアップレギュレートされて、ｃＰＬＡ２タンパク質の増加をもたらすことを示す。逆に言えば、ＰＩ３Ｋの阻害剤は、ｃＰＬＡ２の量を低下させて、ＣＯＸ２経路を介して作られるＰＧＥ２形成を抑えるはずである。
【０１１８】
先のキナーゼデータと、ホップ化合物がｃＰＬＡ２のｍＲＮＡではなくタンパク発現（ウェスタンブロット、データ示さず）を阻害することを発見した我々自身のデータをともに考慮すると、ホップ化合物の作用の抗炎症様式は、ｃＰＬＡタンパク質レベルを低下させることによって、そしておそらくはより具体的には、ＰＩ３Ｋ経路を阻害することによって、ＣＯＸ２に対する基質の利用可能性を抑えることを介して、ＴＯＰ  ｍＲＮＡ翻訳の活性化の阻害をもたらすと示唆される。
【０１１９】
活性の正確な経路は、依然として不明である。リボソームタンパク質Ｓ６（ＲＰＳ６）の６つのアイソフォームの１以上のリン酸化を介して活性化が起こるというモデルに一致する報告もある。ＲＰＳ６は、５’ＴＯＰ  ｍＲＮＡを分解して、タンパク質への効率的な翻訳を可能にすると報告されている。しかしながら、Stolovich et al. Mol Cell Biol Dec, 8101-8113 (2002) は、このモデルを否定して、Ａｋｔが未知の翻訳因子、Ｘをリン酸化して、これがＴＯＰ  ｍＲＮＡ翻訳を可能にすると提唱している。
【０１２０】
実施例２
選択プロテインキナーゼに対するホップ又はアカシア成分の用量応答効果
実施例１のプロトコールに従って、６０種を超える選択プロテインキナーゼに対するｍｇＲｈｏの用量応答性についてほぼ１０、５０、及び１００μｇ／ｍｌで試験して、以下の表２に提示する。最も多く阻害された５種のキナーゼを図２としてグラフで図示する。
【０１２１】
以下の表３に提示するように、８６種の選択キナーゼに対するＴＨＩＡＡ調製物のキナーゼ阻害の用量応答性についてほぼ１、１０、２５、及び５０μｇ／ｍｌで試験した。同様に、実施例１のプロトコールに従って、２３０種を超える選択プロテインキナーゼに対してアカシア調製物をほぼ１、５、及び２５μｇ／ｍｌで試験して、以下の表４に提示する。イソアルファ酸（ＩＡＡ）、ヘキサヒドロイソアルファ酸（ＨＨＩＡＡ）、ベータ酸、及びキサントフモールの調製物についても、８６種の選択キナーゼに対してほぼ１、１０、２５、及び５０μｇ／ｍｌで試験して、用量応答性の結果をそれぞれ以下の表５〜８に提示する。
【０１２２】
表２
選択プロテインキナーゼに対するｍｇＲｈｏの用量応答効果（対照の％として）
【０１２３】
【表４】
2009504657.tif 000006
【０１２４】
表３
選択プロテインキナーゼに対するＴＨＩＡＡの用量応答効果（対照の％として）
【０１２５】
【表５】
2009504657.tif 000007
【０１２６】
【表６】
2009504657.tif 000008
【０１２７】
【表７】
2009504657.tif 000009
【０１２８】
表４
選択プロテインキナーゼに対するアカシアの用量応答効果（対照の％として）
【０１２９】
【表８】
2009504657.tif 000010
【０１３０】
【表９】
2009504657.tif 000011
【０１３１】
【表１０】
2009504657.tif 000012
【０１３２】
表５
選択プロテインキナーゼに対するＩＡＡの用量応答効果（対照の％として）
【０１３３】
【表１１】
2009504657.tif 000013
【０１３４】
【表１２】
2009504657.tif 000014
【０１３５】
表６
選択プロテインキナーゼに対するＨＨＩＡＡの用量応答効果（対照の％として）
【０１３６】
【表１３】
2009504657.tif 000015
【０１３７】
【表１４】
2009504657.tif 000016
【０１３８】
表７
選択プロテインキナーゼに対するベータ酸の用量応答効果（対照の％として）
【０１３９】
【表１５】
2009504657.tif 000017
【０１４０】
【表１６】
2009504657.tif 000018
【０１４１】
表８
選択プロテインキナーゼに対するキサントフモールの用量応答効果（対照の％として）
【０１４２】
【表１７】
2009504657.tif 000019
【０１４３】
【表１８】
2009504657.tif 000020
【０１４４】
結果−試験した様々な化合物によるキナーゼ活性調節に対する効果は、試験した特定のキナーゼ及び化合物に依って広範囲の調節効果を表示し（表２〜８）、その代表例を以下に列挙する。
【０１４５】
ＰＩ３Ｋδは、例えば、慢性関節リウマチ及び紅斑性狼瘡のような自己免疫疾患との関連が強く示唆されているキナーゼであり、ＭｇＲｈｏの１０、５０、及び１００μｇ／ｍｌでそれぞれキナーゼ活性の３６％、７８％、及び８７％を阻害する応答を明示した。ＭｇＲｈｏは、１０、５０、及び１００μｇ／ｍｌで、それぞれ２１％、５４％、及び７２％の阻害という用量依存的なやり方でＳｙｋを阻害した。追加的に言うと、ＧＳＫ又はグリコゲンシンターゼキナーゼ（ＧＳＫα及びβの両方）は、ｍｇＲｈｏ曝露に続いて阻害を表示した（１０、５０、１００μｇ／ｍｌで、それぞれα：３５、３６、８７％の阻害；β：３５、８３、７４％の阻害）。表２を参照のこと。
【０１４６】
ＴＨＩＡＡは、試験したキナーゼの多くで用量依存性のキナーゼ活性阻害を表示して、ＦＧＦＲ２の阻害は、１、５、２５、及び５０μｇ／ｍｌで、それぞれ７％、１６％、７７％、及び９１％であった。１、５、２５、及び５０μｇ／ｍｌでは、ＦＧＦＲ３（それぞれ、０％、６％、６１％、及び８４％）とＴｒｋＡ（それぞれ、２４％、４５％、９３％、及び９４％）について、同様の結果が観察された。表３を参照のこと。
【０１４７】
検査したアカシア（A. nilotica）抽出物は、試験した中でキナーゼ活性の最も強い阻害剤であるらしく（表４）、いずれも１μｇ／ｍｌの曝露で、Ｓｙｋ（９８％）、Ｌｙｎ（９６％）、ＧＳＫ３α（９５％）、Ａｕｒｏｒａ−Ａ（９２％）、Ｆｌｔ４（８８％）、ＭＳＳＫ１（８８％）、ＧＳＫ３β（８７％）、ＢＴＫ（８５％）、ＰＲＡＫ（８２％）、及びＴｒｋＡ（８０％）のようなキナーゼについて８０％以上の活性阻害を明示した。
【０１４８】
実施例３
ＰＩ３Ｋ活性に対するホップ成分の効果
実施例１の手順及びプロトコールに従って、ヒトＰＩ３Ｋ−β、ＰＩ３Ｋ−γ、及びＰＩ３Ｋ−δに対するホップ成分のキサントフモールとベータ酸のマグネシウム塩、イソアルファ酸のマグネシウム塩（Ｍｇ−ＩＡＡ）、テトラヒドロイソアルファ酸のマグネシウム塩（Ｍｇ−ＴＨＩＡＡ）、及びヘキサヒドロ−イソアルファ酸のマグネシウム塩（Ｍｇ−ＨＨＩＡＡ）の阻害効果を試験した。Acacia nilotica 芯材抽出物を追加的に試験した。すべての化合物を５０μｇ／ｍｌで試験した。この結果を図３としてグラフで図示する。
【０１４９】
試験したホップ化合物のすべてがＰＩ３Ｋ活性の＞５０％阻害を示して、Ｍｇ−ＴＨＩＡＡは、最大の全体阻害（試験したすべてのＰＩ３Ｋアイソフォームで＞８０％阻害）をもたらしたことに注目すべきである。さらに、キサントフモールとＭｇ−ベータ酸がともに、ＰＩ３Ｋ−β又はＰＩ３Ｋ−δに対するよりもＰＩ３Ｋ−γに対してより阻害的であったことに注目されたい。Ｍｇ−ＩＡＡは、ＰＩ３Ｋ−γ又はＰＩ３Ｋ−δに対するよりＰＩ３Ｋ−βに対して３倍阻害的であった。Acacia nilotica 芯材抽出物は、ＰＩ３Ｋ−β又はＰＩ３Ｋ−δの活性を刺激するように見えた。Ｓｙｋ及びＧＳＫキナーゼでは、同等の結果を得た（データ示さず）。
【０１５０】
実施例４
ホップ化合物及び誘導体による、刺激及び非刺激マウスマクロファージにおけるＰＧＥ２合成の阻害
本実施例の目的は、マウスＲＡＷ２６４．７マクロファージモデルにおいて、ホップ誘導体が、ＰＧＥ２のＣＯＸ−１合成より選好的にＰＧＥ２のＣＯＸ−２合成を阻害する程度を評価することであった。ＲＡＷ２６４．７細胞系は、試験薬剤の抗炎症活性を評価するための十分に確立されたモデルである。ＲＡＷ２６４．７細胞を細菌リポ多糖で刺激すると、ＣＯＸ−２の発現とＰＧＥ２の産生を引き起こす。ＰＧＥ２合成の阻害は、試験薬剤の抗炎症活性の測定基準として使用する。機器、化学品及び試薬、ＰＧＥ２アッセイ、及び計算について以下に記載する。
【０１５１】
機器−本実施例に使用する機器には、ＯＨＡＳ  Ｍｏｄｅｌ  ＃Ｅ０１１４０分析天秤、Ｆｏｒｍａ  Ｍｏｄｅｌ  ＃Ｆ１２１４生物学的安全キャビネット（オハイオ州マリエッタ）、０．１〜１００μｌを配分する様々なピペット（ＶＷＲ，ニューヨーク州ロチェスター）、細胞手動カウンター（ＶＷＲ  カタログ＃２３６０９−１０２，ニューヨーク州ロチェスター）、Ｆｏｒｍａ  Ｍｏｄｅｌ  ＃Ｆ３２１０  ＣＯ２インキュベーター（オハイオ州マリエッタ）、血球計（Ｈａｕｓｓｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ＃１４９２，ペンシルヴェニア州ホーシャム）、Ｌｅｉｃａ  Ｍｏｄｅｌ  ＃ＤＭ  ＩＬ倒立顕微鏡（Ｗｅｔｚｌａｒ，ドイツ）、ＰＵＲＥＬＡＢ  Ｐｌｕｓ  Ｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｕ．Ｓ．Ｆｉｌｔｅｒ，マサチューセッツ州ローウェル）、４℃冷蔵庫（Ｆｏｒｍａ  Ｍｏｄｅｌ  ＃Ｆ３７７５，オハイオ州マリエッタ）、ボルテックス・ミキサー（ＶＷＲ  カタログ＃３３９９４−３０６，ニューヨーク州ロチェスター）、及び３７℃水浴（Ｓｈｅｌ  Ｌａｂ  Ｍｏｄｅｌ  ＃１２０３，オレゴン州コルネリウス）。
【０１５２】
化学品及び試薬−細菌リポ多糖（ＬＰＳ；B E coli 055: B5）は、シグマ（ミズーリ州セントルイス）からのものであった。加熱不活性化胎仔ウシ血清（ＦＢＳ−ＨＩ  Ｃａｔ．＃３５−０１１ＣＶ）、及びダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ  Ｃａｔ＃１０−０１３ＣＶ）は、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ（バージニア州ヘーンドン）より購入した。ホップ分画（１）アルファホップ（１％アルファ酸；ＡＡ）、（２）アロマホップ  ＯＥ（１０％ベータ酸及び２％異性化アルファ酸）、（３）イソホップ（異性化アルファ酸；ＩＡＡ）、（４）ベータ酸溶液（ベータ酸；ＢＡ）、（５）ヘキサホップゴールド（ヘキサヒドロ異性化アルファ酸；ＨＨＩＡＡ）、（６）レジホップ（還元異性化アルファ酸；ＲＩＡＡ）、（７）テトラホップ（テトラヒドロイソアルファ酸；ＴＨＩＡＡ）、及び（８）使用済ホップは、Ｂｅｔａｔｅｃｈ  Ｈｏｐｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（ワシントンＤ．Ｃ．，アメリカ）より入手した。使用済ホップは、当量の無水エタノールで２回抽出した。４０℃で加熱することによってエタノールを除去すると、濃厚な茶褐色の残渣だけが残った。この残渣を、ＲＡＷ２６４．７細胞での試験用に、ＤＭＳＯに溶かした。
【０１５３】
試験材料−表１２に記載のようなホップ誘導体を使用した。ＣＯＸ−１選択阻害剤のアスピリンとＣＯＸ−２選択阻害剤のセレコキシブを陽性対照として使用した。アスピリンは、シグマ（ミズーリ州セントルイス）より入手して、セレコキシブの市販製剤（ＣｅｌｅｒｂｒｅｘＴＭ，サール社、イリノイ州シカゴ）を使用した。
【０１５４】
細胞培養と試験材料での処理−Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより入手したＲＡＷ２６４．７細胞（Ｃａｔａｌｏｇ  ＃ＴＩＢ−７１，バージニア州マナッサス）をダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，バージニア州ヘーンドン）で増殖させて、対数期に維持した。ＤＭＥＭ増殖培地は、５００ｍｌボトル量のＤＭＥＭへ５０ｍｌの加熱不活性化ＦＢＳと５ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを加えて、４℃で保存することによって作製した。この増殖培地は、使用前に、水浴において３７℃へ温めた。
【０１５５】
ＣＯＸ−２関連のＰＧＥ２合成では、１日目に調製した細胞プレートの各ウェルより１００μｌの培地を取り出して、平衡化２Ｘ最終濃度の１００μｌの試験化合物と交換した。次いで、細胞を９０分間インキュベートした。刺激する細胞の各ウェルへ２０μｌのＬＰＳを加えて１μｇ  ＬＰＳ／ｍｌの最終濃度を達成して、この細胞を４時間インキュベートした。細胞を５μＭアラキドン酸とともに１５分間さらにインキュベートした。培地へ放出されたＰＧＥ２の定量のために、各ウェルより２５μｌの上清培地を清浄なミクロ分離管へ移した。
【０１５６】
ＣＯＸ−１関連のＰＧＥ２合成では、１日目に調製した細胞プレートの各ウェルより１００μｌの培地を取り出して、平衡化２Ｘ最終濃度の１００μｌの試験化合物と交換した。次いで、細胞を９０分間インキュベートした。次に、ＬＰＳ刺激をせずに、細胞を１００μＭアラキドン酸とともに１５分間インキュベートした。培地へ放出されたＰＧＥ２の定量のために、各ウェルより２５μｌの上清培地を清浄なミクロ分離管へ移した。
【０１５７】
細胞の外観を観察して、生存能力を視覚的に評価した。どの化合物でも、試験した最高濃度で、明らかな毒性を観察しなかった。培地へ放出されたＰＧＥ２の定量のために、各ウェルより２５μｌの上清培地を清浄なミクロ分離管へ移した。既報のようにＰＧＥ２を定量して、下記に報告する。
【０１５８】
ＰＧＥ２アッセイ−ＰＧＥ２定量用の市販の非放射活性手順（Ｃａｙｍｅｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，ミシガン州アンアーバー）を利用して、製造業者の推奨手順を変更なしに使用した。簡潔に言えば、２５μｌの培地を、ＰＧＥ２標準試料の系列希釈液とともに、適正量のアセチルコリンエステラーゼ標識トレーサー及びＰＧＥ２抗血清と混合して、室温で１８時間インキュベートした。ウェルを空にして洗浄緩衝液で濯ぎ、アセチルコリンエステラーゼの基質を含有するＥｌｌｍａｎ試薬の２００μｌを加えた。この反応物をスローシェーカー上に室温で１時間維持して、４１５ｎｍでの吸光度をＢｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｍｏｄｅｌ  ＃Ｅｌｘ８００，バーモント州ウィノオスキ）ＥＬＩＳＡプレートリーダーで定量した。ＰＧＥ２濃度は、ピコグラム／ｍｌとして表した。このアッセイへの製造業者の仕様書には、１０％未満のアッセイ内変動係数、１％未満のＰＧＤ２及びＰＧＦ２との交差反応性、及び１０〜１０００ｐｇ／ｍｌの範囲での直線性が含まれる。ＣＯＸ−２とＣＯＸ−１の両方からのＰＧＥ２合成についてのメジアン阻害濃度（ＩＣ５０）について以下に記載のように計算した。
【０１５９】
計算−ＣａｌｃｕＳｙｎ（ＢＩＯＳＯＦＴ，ミズーリ州ファーガソン）を使用して、ＰＧＥ２合成についてのメジアン阻害濃度（ＩＣ５０）を計算した。計算には、それぞれの試験材料又は陽性対照の少なくとも４点の濃度を使用した。この統計学パッケージは、Ｔ．Ｃ．ＣｈｏｕとＰ．Ｔａｌａｌａｙ［Chou, T. C. and P. Talalay「用量−効果関係の定量解析；多数の薬物又は酵素阻害剤の組合せ効果（Quantitative analysis of dose-effect relationships; the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors）」Adv Enzyme Regul 22: 27-55, (1984)］により記載されるメジアン効果法を使用する多数の薬物用量−効果の計算を実施して、参照により本明細書に組み込まれる。実験は、３つの異なる日付で３回繰り返した。各用量での阻害パーセントを３回の独立実験で平均して、これを使用して、報告するメジアン阻害濃度を計算した。
【０１６０】
メジアン阻害濃度を４種の任意カテゴリーへ順位付けた：（１）０．１という０．３μｇ／ｍｌ以内のＩＣ５０値の薬剤は、最高の抗炎症応答；（２）０．７〜１．０μｇ／ｍｌのＩＣ５０値の薬剤は、高い抗炎症応答；（３）２〜７μｇ／ｍｌのＩＣ５０値の薬剤は、中間の抗炎症応答；（４）１２μｇ／ｍｌ（試験した最高濃度）より大きいＩＣ５０値の薬剤は、低い抗炎症応答。
【０１６１】
結果−アスピリンとセレコキシブの陽性対照は、このモデル系において、そのそれぞれのシクロオキシゲナーゼ選択性を明示した（表９）。アスピリンがＣＯＸ−１に対してほぼ１０００倍より選択的であるのに対して、セレコキシブは、ＣＯＸ−２に対して１１４倍より選択的であった。すべてのホップ材料はＣＯＸ−２選択的であり、Ｒｈｏイソアルファ酸とイソアルファ酸が最高のＣＯＸ−２選択性（それぞれ、３６３倍と１３８倍）を明示した。低いメジアン阻害濃度と組み合わされたそのような高いＣＯＸ−２選択性は、他の供給源からの天然産物ではこれまで報告されていない。残るホップ誘導体の中では、アロマホップオイルだけがかろうじて３倍のＣＯＸ−２選択性を明示した。in vitro データを臨床効果へ外挿するには、一般に、５倍以上のＣＯＸ−２選択性が臨床的に重要な胃粘膜保護の潜在能力を示すと仮定されている。この判定基準では、ベータ酸、ＣＯ２ホップ抽出物、使用済ホップＣＯ２／エタノール、テトラヒドロイソアルファ酸、及びヘキサヒドロイソアルファ酸が潜在的に臨床意義のあるＣＯＸ−２選択性を表示した。
【０１６２】
表９
ホップ分画及び誘導体による、ＲＡＷ２６４．７細胞におけるＣＯＸ−２及びＣＯＸ−１阻害
【０１６３】
【表１９】
2009504657.tif 000021
【０１６４】
実施例５
還元異性化アルファ酸又は異性化アルファ酸による、ＬＰＳ刺激Ｒａｗ２６４．７細胞における直接的なＰＧＥ２阻害の不足
本試験の目的は、ＲＡＷ２６４．７細胞の炎症モデルにおいて、ＣＯＸ−２仲介性ＰＧＥ２生合成の直接的な阻害剤として独立的に機能する、ホップ誘導体の還元イソアルファ酸及び異性化アルファ酸の能力を評価することであった。この実施例では、実施例４に記載のようなＲＡＷ２６４．７細胞系を使用した。機器、化学品及び試薬、ＰＧＥ２アッセイ、及び計算は、実施例４に記載の通りであった。
【０１６５】
試験材料−表１２に記載のようなホップ誘導体の還元イソアルファ酸及び異性化アルファ酸を使用した。ＣＯＸ−１選択陽性対照のアスピリンは、シグマ（ミズーリ州セントルイス）より入手した。
【０１６６】
細胞培養と試験材料での処理−ＲＡＷ２６４．７細胞（ＴＩＢ−７１）をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（バージニア州マナッサス）より入手して、実施例４に記載のように継代培養した。５％  ＣＯ２とともに３７℃で一晩のインキュベーションに続いて、増殖培地を吸引して、ＦＢＳもペニシリン／ストレプトマイシンも含まない２００μｌ  ＤＭＥＭに置き換えた。ＲＡＷ２６４．７細胞をＬＰＳで刺激して一晩インキュベートして、ＣＯＸ−２発現を誘導した。ＬＰＳ刺激から１８時間後、試験材料を加えて、６０分後に、カルシウムイオノフォアのＡ２３１８７の添加を続けた。試験材料をＤＭＳＯに溶かして、２５０倍のストック溶液とした。この２５０倍ストック試験材料調製物の４μｌを１ｍｌのＤＭＥＭへ加えて、引き続き、この溶液の２００μｌを試験材料の各用量につき８つのウェルへ加えた。３０分後に、ＰＧＥ２定量のために上清培地をサンプリングした。実施例４に記載のように、２つの独立した実験での少なくとも４点の濃度よりメジアン阻害濃度を計算した。
【０１６７】
ＰＧＥ２の定量−実施例４に記載のように、ＰＧＥ２定量には、ＰＧＥ２定量用の市販の非放射活性手順（Ｃａｙｍｅｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，ミシガン州アンアーバー）を利用して、製造業者の推奨手順を変更なしに使用した。
【０１６８】
細胞生存度−ＰＧＥ２アッセイ用の培地をサンプリングすることに先立つか又はその直後に細胞を顕微鏡で視察することによって、細胞生存度を評価した。試験した濃度のいずれでも、明らかな細胞死は認められなかった。
【０１６９】
計算−４点の濃度（０．１０、１．０、１０、及び１００μｇ／ｍｌ）を使用して用量−応答曲線を導いて、ＣａｌｃｕＳｙｎ（ＢＩＯＳＯＦＴ，ミズーリ州ファーガソン）を使用して９５％信頼区間でメジアン阻害濃度（ＩＣ５０）を計算した。
【０１７０】
結果−ＲＡＷ２６４．７細胞におけるＰＧＥ２産生のＬＰＳ刺激は、非刺激細胞に比べて、１．４倍〜２．１倍に及んだ。アスピリン陽性対照について計算した８．７μｇ／ｍｌ（９５％  ＣＬ＝３．９〜１９）のＩＣ５０値は、１．４〜５０μｇ／ｍｌに及ぶ直接的なＣＯＸ−２阻害の公表値［Warner, T. D. et al.「非ステロイド薬の（シクロオキシゲナーゼ−２ではなく）シクロオキシゲナーゼ−１への選択性は、ヒトの胃腸毒性に関連する：完全な in vitro 分析（Nonsteroidal drug selectivities for cyclo-oxygenase-1 rather than cyclo-oxygenase-2 are associated with human gastrointestinal toxicity: A full in vitro analysis）」Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 7563-7568, (1999)］と、Ａ５４９細胞系での３．２μｇ／ｍｌ（９５％  ＣＬ＝０．５５〜１９）という本研究所のこれまでのデータに一致した。
【０１７１】
ＲＡＷ２６４．７細胞でのＬＰＳによるＣＯＸ−２誘導に続いて加えるとき、ＲＩＡＡとＩＡＡは、ともに、ごくわずかな、用量関連性のＰＧＥ２阻害をもたらした。試験材料の濃度を１０００倍増加しても、ＲＩＡＡ及びＩＡＡで、それぞれ１４及び１０％の阻害の増加しか認められなかった。用量応答の傾きが浅いために、ＲＩＡＡ（３６ｍｇ／ｍｌ）とＩＡＡ（＞１０００ｍｇ／ｍｌ）では、ｍｇ／ｍｌ範囲のＩＣ５０値（表１０）をもたらした。わずかな変化が３つの対数単位の用量に及ぶ応答で観察されたことは、この細胞ベースのアッセイにおいて観察されたホップ誘導体のＰＧＥ２阻害効果がこの細胞に対する二次的な効果であって、ＣＯＸ−２酵素活性の直接的な阻害ではない可能性があることを示唆する。
【０１７２】
図４Ａ及び４Ｂは、それぞれＲＩＡＡ及びＩＡＡの用量応答データを白い棒として、そしてこの実施例からの用量応答データを灰色の棒として図示する。添加の順番の効果が明らかに見られて、ＲＩＡＡとＩＡＡが直接のＣＯＸ−２酵素阻害剤ではないという推論を裏付ける。
【０１７３】
（１）ホップ材料は、ＰＧＥ２生合成を in vitro で阻害するその能力により評価されるように、試験した中で最も活性のある、抗炎症性の天然産物であった：（２）ＲＩＡＡとＩＡＡは、ＣＯＸ−２誘導に関するその阻害の様式に基づけば、直接的なＣＯＸ−２酵素阻害剤ではないらしい；そして（３）ＲＩＡＡとＩＡＡは、ＣＯＸ−２酵素阻害ではなく、ＣＯＸ−２発現の阻害に基づくように見えるＣＯＸ−２選択性を有すると考えられる。この選択性は、その選択性が差異的な酵素阻害に基づくセレコキシブとは異なるものである。
【０１７４】
表１０
ＲＡＷ２６４．７細胞において一晩のＬＰＳ刺激後に試験材料を加えるときのＲＩＡＡ、ＩＡＡのメジアン阻害濃度
【０１７５】
【表２０】
2009504657.tif 000022
【０１７６】
実施例６
ホップの化合物及び誘導体は、Ａ５４９肺上皮細胞において直接的なシクロオキシゲナーゼ酵素阻害剤ではない
化学品−本実施例において使用するホップとホップ誘導体は、実施例４ですでに記載した。他の化学品は、いずれも実施例４に記載のような供給業者より入手した。
【０１７７】
機器、ＰＧＥ２アッセイ、及び計算は、実施例４に記載の通りであった。
細胞−Ａ５４９（ヒト肺上皮）細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（バージニア州マナッサス）より入手して、供給業者の指示書に従って継代培養した。この細胞を、５０ユニットペニシリン／ｍｌ、５０μｇストレプトマイシン／ｍｌ、５ｍＭピルビン酸ナトリウム、及び５ｍＭ  Ｌ−グルタメートとともに１０％  ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ  １６４０において、５％  ＣＯ２とともに３７℃で定型的に培養した。実験の当日、指数的に増殖する細胞を採取して、無血清ＲＰＭＩ  １６４０で洗浄した。
【０１７８】
対数期のＡ５４９細胞を９６ウェル組織培養プレートの各ウェルにつき０．２ｍｌ増殖培地に８ｘ１０４細胞／ウェルでプレート培養した。試験化合物によるＰＧＥ２阻害の定量については、ＷＨＭＡ−ＣＯＸ−２プロトコールとしても知られる、Warner et al.［「非ステロイド薬の（シクロオキシゲナーゼ−２ではなく）シクロオキシゲナーゼ−１への選択性は、ヒトの胃腸毒性に関連する：完全な in vitro 分析（Nonsteroidal drug selectivities for cyclo-oxygenase-1 rather than cyclo-oxygenase-2 are associated with human gastrointestinal toxicity: A full in vitro analysis）」Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 7563-7568, (1999)］の手順に変更なしで従った。簡潔に言えば、Ａ５４９細胞のプレート培養から２４時間後、インターロイキン−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）を加えて、ＣＯＸ−２の発現を誘導した。２４時間後、この細胞を無血清ＲＰＭＩ  １６４０で洗浄した。引き続き、ＤＭＳＯと無血清ＲＰＭＩに溶かした試験材料をウェルへ加えて、２５、５．０、０．５、及び０．０５μｇ／ｍｌの最終濃度とした。各濃度につき、同一２検体で実施した。対照ウェルへは、試験ウェルに含まれるものと等しい量でＤＭＳＯを加えた。６０分後、Ａ２３１８７（５０μＭ）をウェルへ加えて、アラキドン酸を放出させた。３０分後に、ＰＧＥ２定量用に２５μｌの培地をウェルよりサンプリングした。
【０１７９】
細胞生存度を視覚的に評価すると、どの化合物でも、試験した最高濃度で明らかな毒性を観察しなかった。すでに実施例４で記載したようにして、上清培地中のＰＧＥ２を定量して報告した。すでに実施例４で記載したようにして、ＰＧＥ２合成についてのメジアン阻害濃度（ＩＣ５０）を計算した。
【０１８０】
結果−この実験プロトコールは、試験した用量で、ホップの抽出物又は誘導体のいずれでも、メジアン有効濃度をとらえることができなかった。このプロトコールは試験化合物の添加に先立つＣＯＸ−２発現の刺激を必要とするので、試験材料がＰＧＥ２合成を阻害することができなかったのは、その作用機序がＣＯＸ−２アイソザイムの発現を阻害することにあって、活性を直接阻害するわけではないことにあると考えられる。このＷＨＭＡ−ＣＯＸ−２プロトコールを使用していくらかの直接的な阻害が観察されたが、この手順では、ホップ化合物又はホップ化合物の誘導体の抗炎症特性を評価するのに不適切であるらしい。
【０１８１】
実施例７
ホップ誘導体は、Ａ５４９肺上皮細胞において、ＰＧＥ２生合成のダニ埃アレルゲン活性化を阻害する
化学品−本実施例において使用するホップとホップ誘導体、（１）アルファホップ（１％アルファ酸；ＡＡ）、（２）アロマホップ  ＯＥ（１０％ベータ酸及び２％異性化アルファ酸）、（３）イソホップ（異性化アルファ酸；ＩＡＡ）、（４）ベータ酸溶液（ベータ酸；ＢＡ）、（５）ヘキサホップゴールド（ヘキサヒドロ異性化アルファ酸；ＨＨＩＡＡ）、（６）レジホップ（還元異性化アルファ酸；ＲＩＡＡ）、及び（７）テトラホップ（テトラヒドロイソアルファ酸；ＴＨＩＡＡ）については、実施例１ですでに記載した。他の化学品は、いずれも実施例４に記載のような供給業者より入手した。試験材料は、１０μｇ／ｍｌの最終濃度で、ダニ埃アレルゲンの添加６０分前に加えた。
【０１８２】
機器、ＰＧＥ２アッセイ、及び計算は、実施例４に記載の通りであった。
ダニ埃アレルゲンの単離−Dermatophagoides farinae は、アメリカのハウスダスト・ダニである。D. farinae を１：１比のＰｕｒｉｎａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｈｏｗ（Ｒａｌｓｔｏｎ  Ｐｕｒｉｎａ社、ミズーリ州セントルイス）とＦｌｅｉｓｃｈｍａｎｎの造粒ドライイースト（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｂｒａｎｄｓ社、ニューヨーク州ニューヨーク）に室温、湿度７５％で育てた。生きているダニを培地から移動中に培養器より吸引し、凍結によって殺し、乾燥させて、０℃の湿度で保存した。埃ダニのアレルゲン成分を周囲温度に水で抽出した。５００ｍｇのダニ粉末を１５ｍｌコニカル遠心分離管（ＶＷＲ，ニューヨーク州ロチェスター）中５ｍｌの水へ加え（１：１０  ｗ／ｖ）、１分間振り混ぜて、そのまま周囲温度で一晩静置させた。翌日、０．２μｍの使い捨てシリンジフィルター（Ｎａｌｇｅｎｅ，ニューヨーク州ロチェスター）を使用して、水相を濾過した。この濾液をダニ埃アレルゲンと呼び、Ａ５４９肺上皮細胞におけるＰＧＥ２生合成の誘導を試験するために使用した。
【０１８３】
細胞の培養及び処理−実施例６ですでに記載のように、ヒト気道上皮細胞系、Ａ５４９（Ａｍａｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，メリーランド州ベセスダ）を培養して処理した。ダニアレルゲンを培養基へ加えて、１０００ｎｇ／ｍｌの最終濃度とした。１８時間後、ＰＧＥ２定量用に培地をサンプリングした。
【０１８４】
結果−表１１は、ダニ埃アレルゲンにより刺激したＡ５４９肺細胞におけるＰＧＥ２生合成のホップ誘導体による阻害の程度を図示する。試験したすべてのホップ誘導体は、ダニ埃アレルゲンの刺激効果を有意に阻害することが可能であった。
【０１８５】
表１１
ダニ埃アレルゲンにより刺激されたＡ５４９肺上皮細胞における、ホップ誘導体によるＰＧＥ２阻害
【０１８６】
【表２１】
2009504657.tif 000023
【０１８７】
この実施例は、ホップ誘導体が、Ａ５４９肺細胞におけるダニ埃アレルゲンのＰＧＥ２刺激効果を阻害することが可能であることを明示する。
【０１８８】
実施例８
還元イソアルファ酸による直接的なＣＯＸ−２阻害の不足
本実施例の目的は、マグネシウム−還元イソアルファ酸がＣＯＸ−２酵素活性の直接的な阻害剤として作用することができるかどうかを判定することであった。
【０１８９】
材料−試験化合物は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）において調製して、−２０℃で保存した。ＬＰＳは、シグマ−アルドリッチ（ミズーリ州セントルイス）より購入した。ＭｇＲＩＡＡは、Ｍｅｔａｇｅｎｉｃｓ（カリフォルニア州サンクレメンテ）より供給され、セレコキシブの市販製剤（ＣｅｌｅｒｂｒｅｘＴＭ，サール社、イリノイ州シカゴ）を使用した。
【０１９０】
細胞培養−マウスマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞系をＡＴＣＣ（バージニア州マナッサス）より購入して、その指示書に従って維持した。細胞を８ｘ１０４細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートにおいて継代培養して、ほぼ２日間、そのまま９０％の集密に達せしめた。ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）又はＰＢＳ単独を細胞培地へ加えて、１２時間インキュベートした。培地をウェルより除去して、ＤＭＳＯと無血清ＲＰＭＩに溶かした試験化合物をウェルへ加えて、ＭｇＲＩＡＡの最終濃度を２０、５．０、１．０、及び０．１μｇ／ｍｌとセレコキシブの最終濃度を１００、１０、１、及び０．１ｎｇ／ｍｌとした。各濃度を８つの同一２検体で実施した。試験化合物との１時間のインキュベーションに続いて、細胞培地を取り出して、試験化合物とＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）入りの新鮮培地に置き換えて、１時間インキュベートした。培地をウェルより取り出して、ＰＧＥ２合成を分析した。
【０１９１】
ＰＧＥ２アッセイ−ＰＧＥ２定量用の市販の非放射活性手順（Ｃａｙｍｅｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，ミシガン州アンアーバー）を利用した。試料をＥＩＡ緩衝液で１０倍希釈して、製造業者の推奨手順を変更なしに使用した。ＰＧＥ２濃度は、ピコグラム／ｍｌとして表した。このアッセイへの製造業者の仕様書には、１０％未満のアッセイ内変動係数、１％未満のＰＧＤ２及びＰＧＦ２との交差反応性、及び１０〜１０００ｐｇ／ｍｌの範囲での直線性が含まれる。
【０１９２】
ＣＯＸ−２特異的な阻害剤のセレコキシブ（１００、１０、１、及び０．１ｎｇ／ｍｌ）がＣＯＸ−２仲介性ＰＧＥ２合成を用量依存的に阻害したのに対し、ＭｇＲＩＡＡでは、有意なＰＧＥ２阻害を観察しなかった。このデータは、ＭｇＲＩＡＡが、セレコキシブと違って、直接的なＣＯＸ−２酵素阻害剤ではないことを示唆する。
【０１９３】
実施例９
ｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２タンパク発現のＭｇＲＩＡＡによる阻害
ＭｇＲＩＡＡで処理してＬＰＳで刺激したＲＡＷ２６４．７細胞由来の細胞抽出物について、ウェスタンブロットによりｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２タンパク質をアッセイした。
【０１９４】
材料−試験化合物は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）において調製して、−２０℃で保存した。ＭｇＲＩＡＡは、Ｍｅｔａｇｅｎｉｃｓ（カリフォルニア州サンクレメンテ）より供給された。パーセノライドは、シグマ−アルドリッチ（ミズーリ州セントルイス）より購入した。ＰＩ３Ｋ阻害剤のウォルトマンニン及びＬＹ２９４００２は、ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（カリフォルニア州サンディエゴ）より購入した。ＣＯＸ−２及びｉＮＯＳに対して産生した抗体は、Ｃａｙｍｅｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（ミシガン州アンアーバー）より購入した。ＧＡＰＰＨに対して産生した抗体は、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（コロラド州リットルトン）より購入した。西洋ワサビペルオキシダーゼへ共役する二次抗体は、アマーシャム・バイオサイエンス（ニュージャージー州ピスカタウェイ）より購入した。
【０１９５】
細胞培養−マウスマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞系をＡＴＣＣ（バージニア州マナッサス）より購入して、その指示書に従って維持した。細胞を増殖させて、３ｘ１０５細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートにおいて継代培養して、ほぼ２日間、そのまま９０％の集密に達せしめた。無血清培地中のこの細胞へ０．４％  ＤＭＳＯの最終濃度で試験化合物を加えた。試験化合物との１時間のインキュベーションに続いて、細胞ウェルへＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）又はリン酸緩衝化生理食塩水単独を加えて、インキュベーションを指定時間の間続けた。
【０１９６】
ウェスタンブロット−細胞抽出物を緩衝液Ｅ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．０；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１％  ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム；アプロチニン５μｇ／ｍｌ；ペプスタチンＡ  １μｇ／ｍｌ；ロイペプチン  ５μｇ／ｍｌ；フッ化フェニルメタンスルホニル  １ｍＭ）において調製した。簡潔に言えば、細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄して緩衝液Ｅを加えた。細胞を清浄な試験管へ掻き入れて、１４，０００ｒｐｍで、４℃で１０分間の遠心分離を続けて、上清を全細胞抽出物として取った。細胞抽出物（５０μｇ）を、予め固化させた４％〜２０％  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，カリフォルニア州ヘルクレス）を通して、先端の移動色素がゲルの底から５ｍｍに達するまで電気泳動させた。Ｂｉｏ−Ｒａｄ（カリフォルニア州ヘルクレス）からの半乾燥システムを使用して、タンパク質をニトロセルロース膜へ移した。この膜を洗浄して、５％乾燥ミルク粉末を用いて、室温で１時間固定した。一次抗体に続く二次抗体とのインキュベーションは、室温でそれぞれ１時間であった。ピアス・バイオテクノロジー（イリノイ州ロックフォード）からのＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを使用して、等量のルミノール／エンハンサー溶液と安定ペルオキシド溶液の室温で５分間のインキュベーションによって、化学発光を実施した。冷却ＣＣＤ  Ｋｏｄａｋ（登録商標）（ニューヨーク州ロチェスター）ＩＳＩ１０００イメージングシステムを使用して、ウェスタンブロットイメージを捕捉した。Ｋｏｄａｋ（登録商標）ソフトウェアを使用して、デンシトメトリーを実施した。
【０１９７】
ウェスタンブロット検出を使用して、ＣＯＸ−２及びｉＮＯＳタンパク発現のパーセントを評価した。ＣＯＸ−２の発現は、ＬＰＳでの刺激後２０時間で観察された。ＤＭＳＯの溶媒対照と比較すると、ＭｇＲＩＡＡによって、ＣＯＸ−２タンパク発現の５５％低下が見られた（図６）。特異的なＮＦ−κＢ阻害剤であるパーセノライドがタンパク発現を２２．５％阻害したのに対して、ＰＩ３−キナーゼ阻害剤は、ＣＯＸ−２発現を約４７％減少させた（図６）。追加的に言えば、ＭｇＲＩＡＡによって、ＬＰＳでの刺激後２０時間でｉＮＯＳタンパク発現の７３％の低下が観察された（図７）。
【０１９８】
実施例１０
ＮＦ−κＢの核移行及びＤＮＡ結合
ＭｇＲＩＡＡで処理してＬＰＳで４時間刺激したＲＡＷ２６４．７細胞からの核抽出物について、ＮＦ−κＢのＤＮＡへの結合をアッセイした。
【０１９９】
材料−試験化合物は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）において調製して、−２０℃で保存した。ＭｇＲＩＡＡは、Ｍｅｔａｇｅｎｉｃｓ（カリフォルニア州サンクレメンテ）より供給された。パーセノライド（ＮＦ−κＢ活性化の特異的な阻害剤）は、シグマ−アルドリッチ（ミズーリ州セントルイス）より購入した。ＰＩ３Ｋ阻害剤のＬＹ２９４００２は、ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（カリフォルニア州サンディエゴ）より購入した。
【０２００】
細胞培養−マウスマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞系をＡＴＣＣ（バージニア州マナッサス）より購入して、その指示書に従って維持した。細胞を１．５ｘ１０６細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートにおいて継代培養して、ほぼ２日間、そのまま９０％の集密に達せしめた。無血清培地中のこの細胞へ０．４％  ＤＭＳＯの最終濃度で、試験化合物、ＭｇＲＩＡＡ（５５及び１４μｇ／ｍｌ）、パーセノライド（８０μＭ）、及びＬＹ２９４００２（２５μＭ）を加えた。試験化合物との１時間のインキュベーションに続いて、細胞培地へＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）又はＰＢＳ単独を加えて、インキュベーションをさらに４時間続けた。
【０２０１】
ＮＦ−κＢ−ＤＮＡ結合−核抽出物は、本質的に Dignam, et al [Nucl Acids Res 11:1475-1489, (1983)] に記載のように調製した。簡潔に言えば、細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄してから、緩衝液Ａ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．０；１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；１０ｍＭ  ＫＣｌ；０．１％  ＮＰ−４０；アプロチニン５μｇ／ｍｌ；ペプスタチンＡ  １μｇ／ｍｌ；ロイペプチン  ５μｇ／ｍｌ；フッ化フェニルメタンスルホニル  １ｍＭ）を加えて、そのまま氷上に１５分間静置させた。次いで、細胞を清浄な試験管へ掻き入れて、凍結／融解の３サイクルで処理した。１０，０００ｘｇ、４℃で５分間の遠心分離後の上清層を細胞質分画とした。残存するペレットを緩衝液Ｃ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．０；１．５ｍＭ  ＫＣｌ；４２０ｍＭ  ＫＣｌ；２５％グリセロール；０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ；アプロチニン５μｇ／ｍｌ；ペプスタチンＡ  １μｇ／ｍｌ；ロイペプチン  ５μｇ／ｍｌ；フッ化フェニルメタンスルホニル  １ｍＭ）に再懸濁して、そのまま氷上に１５分間静置させた。１０，０００ｘｇ、４℃で５分間の遠心分離後の上清層として核抽出分画を採取した。Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ（カリフォルニア州カールスバッド）からのＴｒａｎｓＡＭ  ＮＦ−κＢキットを製造業者の説明書のように使用して、核抽出物のＮＦ−κＢ  ＤＮＡ結合を評価した。図８に見られるように、ＴｒａｎｓＡＭキットは、９６ウェルフォーマットにおいて、ＮＦ−κＢのｐ５０サブユニットのコンセンサス配列への結合を検出した。タンパク濃度を測定して（Ｂｉｏ−Ｒａｄアッセイ）、１０μｇの核タンパク抽出物を同一２検体でアッセイした。
【０２０２】
核抽出物（１０μｇ  タンパク質）の分析を同一２検体で実施して、その結果を図９にグラフで示す。ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）での刺激は、ＮＦ−κＢ  ＤＮＡ結合の２倍増加をもたらした。ＬＹ２９４００２（ＰＩ３キナーゼ阻害剤）での処理は、これまでの文献報告から予測されるように、ＮＦ−κＢ結合のわずかな減少をもたらした。パーセノライドも、予測されるように、ＮＦ−κＢ結合の有意な低下をもたらした。ＭｇＲＩＡＡでは、ＮＦ−κＢ結合の大きな低下が観察された。この効果は、用量−応答のやり方で観察された。ＮＦ−κＢ結合の低下は、ＣＯＸ−２、ｉＮＯＳ、及びＴＮＦαが含まれる標的遺伝子の転写活性化の低下をもたらす可能性がある。
【０２０３】
上記の結果は、ＭｇＤＨＩＡＡで観察されるＮＦ−κＢ結合の減少がＣＯＸ−２タンパク発現の減少をもたらし、最終的にはＰＧＥ２産生の減少をもたらす可能性があることを示唆する。
【０２０４】
実施例１１
Ａｃａｃｉａ樹皮の水系抽出物のジメチルスルホキシド可溶性分画により誘発される、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞における脂肪生成の増加
モデル−３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを使用して、脂肪細胞の分化及び脂肪生成に対する化合物の潜在効果を試験する。この細胞系により、前脂肪細胞の複製を調整する刺激及び機序について、脂肪細胞への分化を調整するそれとは別に検討することが可能になる［Fasshauer, M., Klein, J., Neumann, S., Eszlinger, M., and Paschke, R.「３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるアジポネクチン遺伝子発現のホルモン調節（Hormonal regulation of adiponectin gene expression in 3T3-L1 adipocytes）」Biochem Biophys Res Commun, 290: 1084-1089, (2002)；Li, Y. and Lazar, M. A.「ＰＰＡＲγアゴニストと構成的に活性なＰＰＡＲγ２による差異的な遺伝子調節（Differntial gene regulation by PPARgamma agonist and constitutively active PPARgamma2）」Mol Endocrinol, 16: 1040-1048, (2002)］だけでなく、試験薬剤のインスリン増感能力及びトリグリセリド低下能力の検討が可能になる［Raz, I., Eldor, R., Cernea, S., and Shafrir, E.「糖尿病：インスリン抵抗性と脂質代謝における障害。脂肪の輸送及び保存への介入による治癒（Diabetes: insulin resistance and derangements in lipid metabolism. Cure through intervention in fat transport and storage）」Diabetes Metab Res Rev, 21: 3-14］。
【０２０５】
３Ｔ３−Ｌ１細胞は、前脂肪細胞として、線維芽細胞の外観を有する。それらは、培養において、集密した単層を形成するまで増殖して、その後で、細胞−細胞接触により、Ｇ０／Ｇ１増殖停止が引き起こされる。３Ｔ３−Ｌ１細胞の脂肪細胞への最終分化は、集密の前と後の前脂肪細胞の増殖に依存する。３−イソブチル−１−メチルキサンタン、デキサメタゾン、及び高用量のインスリン（ＭＤＩ）で２日間の後続の刺激は、これらの細胞が集密後の有糸分裂クローン膨張を起こし、細胞周期を出て、脂肪細胞特異的な遺伝子を発現し始めることを促進する。分化の誘導からほぼ５日後、この細胞の９０％より多くが特徴的な脂質充満の脂肪細胞の表現型を表示する。３Ｔ３−Ｌ１細胞のトリグリセリド合成を評価することは、試験薬剤のインスリン増感能力の検証されたモデルを提供する。
【０２０６】
脂肪細胞における脂質取込みを促進する薬剤がインスリン感受性を改善することは、逆説的に見える。この矛盾を説明しようとして、いくつかの仮説が提唱されてきた。研究の裏付けを獲得し続けている１つの仮説は、「脂肪酸盗流（fatty acid steal）」、または脂肪酸が血漿より脂肪細胞へ取り込まれることによって、筋肉中の脂肪酸の相対的な枯渇を引き起こして、グルコース取込みを同時に改善するという概念である［Martin, G., K. Schoonjans, et al.「ＰＰＡＲγアクチベータは、脂肪細胞における脂肪酸取込みを刺激することによってグルコースのホメオスタシスを改善する（PPARgamma activators improve glucose homeostasis by stimulating fatty acid uptake in the adipocytes）」Atherosclerosis 137 Suppl: S75-80, (1998)］。トログリタゾン及びピオグリタゾンのようなチアゾリジンジオンは、脂肪細胞における脂肪生成活性を選択的に刺激して、脂肪分解又は脂肪酸の血漿への放出のインスリン抑制を高めることが示されている［Yamauchi, T., J. Kamon, et al.「異種接合ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γ（ＰＰＡＲγ）の欠乏とＰＰＡＲγアゴニストの両方がインスリン耐性を改善する機序（The mechanisms by which both heterozygous peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) deficiency and PPARgamma agonist improve insulin resistance）」J Biol Chem 276(44): 41245-54, (2001); Oakes, N. D., P. G. Thalen, et al.「チアゾリジンジオンは、血漿−脂肪組織ＦＦＡの交換能力を増やして、全身ＦＦＡ利用度のインスリン仲介性の制御を高める（Thiazolidinediones increase plasma- adipose tissue FFA exchange capacity and enhance insulin-mediated control of systemic FFA availability）」Diabetes 50(5): 1158-65, (2001)］。この作用は、他の組織に利用可能な遊離脂肪酸を少なくするはずである［Yang, W. S., W. J. Lee, et al.「減量は、脂肪由来の抗炎症性タンパク質、アジポネクチンの血漿レベルを高める（Weight reduction increases plasma levels of an adipose-derived anti-inflammatory protein, adiponectin）」J Clin Endocrinol Metab 86(8): 3815-9, (2001)］。従って、筋肉及び肝臓における遊離脂肪酸のインスリン脱感作効果は、チアゾリジンジオン処理の結果として抑制されるのであろう。これら in vitro の結果は、臨床的に確かめられている［Boden, G.「インスリン抵抗性及びＮＩＤＤＭの病理発生における脂肪酸の役割（Role of fatty acids in the pathogenesis of insulin resistance and NIDDM）」Diabetes 46(1): 3-10, (1997)；Stumvoll, M. and H. U. Haring 「グリタゾン：臨床効果と分子機序（Glitazones: clinical effects and molecular mechanisms）」Ann Med 34(3): 217-24, (2002)］。
【０２０７】
試験材料−トログリタゾンは、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ミシガン州アンアーバー）より入手して、メチルイソブチルキサンチン、デキサメタゾン、インドメタシン、オイルレッドＯ、及びインスリンは、シグマ（ミズーリ州セントルイス）より入手した。試験材料は、Ａｃａｃｉａ（ＡｃＥ）試料＃４９０９のゴム樹脂の５０：５０（ｖ／ｖ）水／アルコール抽出物より生成した濃褐色の粉末であり、Ｂａｙｉｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｎｏ．６８，Ｓｏｕｔｈ  Ｃｒｏｓｓ  Ｒｏａｄ，Ｂａｓａｖａｎａｇｕｄｉ，インド）より入手した。この抽出物を、２０％以上のアペカテキンを含有するように標準化した。本実施例で使用するバッチ番号Ａ  Ｃａｔ／２３０４は、ＵＶ分析により定量されるように、２０．８％のアペカテキンを含有した。ペニシリン、ストレプトマイシン、ダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）は、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ（バージニア州ヘーンドン）から、そして１０％  ＦＢＳ−ＨＩ（胎仔ウシ血清−熱不活性化）は、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ及びＨｙｃｌｏｎｅ（ユタ州ローガン）からのものであった。他に述べなければ、他の標準試薬はいずれもシグマより購入した。
【０２０８】
細胞培養と処理−マウス線維芽細胞系、３Ｔ３−Ｌ１は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（バージニア州マナッサス）より購入して、供給業者の説明書に従って継代培養した。実験に先立って、５０ユニット／ｍｌのペニシリンと５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを加えた１０％  ＦＢＳ−ＨＩを含有するＤＭＥＭにおいて細胞を培養して、実験設定に先立って、対数期に維持した。細胞を５％  ＣＯ２加湿インキュベーターにおいて、３７℃で増殖させた。プレ集密培地の成分には、（１）４．５ｇ／Ｌのグルコースを含有する１０％  ＦＢＳ／ＤＭＥＭ；（２）５０Ｕ／ｍｌのペニシリン；及び（３）５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンが含まれた。５００ｍｌ  ＤＭＥＭへ５０ｍｌの熱不活性化ＦＢＳと５ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを加えることによって、増殖培地を作製した。この培地を４℃で保存した。使用前に、培地を水浴において３７℃へ温めた。
【０２０９】
３Ｔ３−Ｔ１細胞を２４ウェルプレートにおいて６ｘ１０４細胞／ｃｍ２の初期密度で播いた。２日間、この細胞をそのまま増殖させて、集密に達せしめた。集密に続いて、分化培地の添加によって、この細胞を強制的に脂肪細胞へ分化させた；この培地は、（１）１０％  ＦＢＳ／ＤＭＥＭ（高グルコース）；（２）０．５ｍＭメチルイソブチルキサンチン；（３）０．５μＭデキサメタゾン、及び（４）１０μｇ／ｍｌインスリン（ＭＤＩ培地）より構成された。３日後、この培地を、１０％  ＦＢＳ／ＤＭＥＭ中の１０μｇ／ｍｌインスリンからなる分化後培地へ交換した。
【０２１０】
ＡｃＥをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に一部溶かして、培養基へ加えて、分化の０日目と成熟期（６〜７日目（Ｄ６／７））を通して５０μｇ／ｍｌの濃度を達成した。新鮮な培地を加えるときはいつでも、新鮮な試験材料も加えた。ＤＭＳＯを選択したのは、その極性と、それが水系の細胞培養基と混和するという事実のためである。陽性対照として、インドメタシンとトログリタゾンを加えて、それぞれ５．０及び４．４μｇ／ｍｌの最終濃度とした。分化したＤ６／Ｄ７  ３Ｔ３−Ｌ１細胞を０．３６％オイルレッドＯ又は０．００１％  ＢＯＤＩＰＹで染色した。細胞の分化と試験材料での処理についての完全な手順を図１０に図式的に概説する。
【０２１１】
オイルレッドＯ染色−Kasturi and Joshi［Kasturi, R. and Joshi, V. C.「ステアロイル補酵素Ａデサチュラーゼ活性のホルモン調節と３Ｔ３−Ｌ１細胞の脂肪変換の間の脂肪生成（Hormonal regulation of stearoyl coenzyme A desaturase activity and lipogenesis during adipose conversion of 3T3-L1 cells）」J Biol Chem, 257: 12224-12230, 1982］の方法に従って、Ｄ６／Ｄ７分化３Ｔ３−Ｌ１細胞のトリグリセリド含量をオイルレッドＯで推定した。単層細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）で洗浄して、１０％ホルムアミドで１０分間固定した。固定した細胞を、３分量の０．６％オイルレッドＯ／イソプロパノールストック溶液と２分量の水からなるオイルレッドＯ作業溶液で１時間染色して、過剰の染色を水で１回洗浄した。生じる染色した油滴をこの細胞よりイソプロパノールで抽出して、５４０ｎｍでの分光学的分析（ＭＥＬ３１２ｅ  ＢＩＯ−ＫＩＮＥＴＩＣＳ  ＲＥＡＤＥＲ，Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，バーモント州ウィノオスキ）により定量した。試験材料と陽性対照のインドメタシン及びトログリタゾンの結果を溶媒対照の５４０ｎｍ吸光度に対して表した。
【０２１２】
ＢＯＤＩＰＹ染色−４，４−ジフルオロ−ｌ，３，５，７，８−ペンタメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（ＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，オレゴン州ユージーン）を、細胞の中性及び非極性の脂質の定量に使用した。簡潔に言えば、培地を除去して、細胞を非滅菌ＰＢＳで１回洗浄した。１ｍｇのＢＯＤＩＰＹを１ｍｌ  ＤＭＳＯに溶かすことによって、１０００ｘＢＯＤＩＰＹ／ＤＭＳＯストック溶液（１，０００μｇ  ＢＯＤＩＰＹ／ｍｌ）を作製した。次いで、１０μｌのストック溶液を９９０μｌ  ＰＢＳへ加えることによってＢＯＤＩＰＹ作業溶液を作製して、作業溶液中の最終ＢＯＤＩＰＹ濃度を０．０１μｇ／μｌとした。この作業溶液の１００μｌ（１μｇ  ＢＯＤＩＰＹ）を９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルへ加えた。オービタルシェーカー（ＤＳ−５００，ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ニュージャージー州サウスプレインフィールド）上に周囲温度で１５分後、細胞を１００μｌ  ＰＢＳで洗浄し、続いて、ＢＯＤＩＰＹの細胞中への取込みを分光蛍光測定で定量する読取りのために１００μｌ  ＰＢＳを添加した。ＢＯＤＩＰＹ蛍光の定量のために、４８５ｎｍ励起と５３０ｎｍ放射で設定したＰａｃｋａｒｄ  Ｆｌｕｏｒｏｃｏｕｎｔ分光蛍光計（ＭｏｄｅＩ＃ＢＦ１００００，コネチカット州メリダン）を使用した。試験材料、インドメタシン、及びトログリタゾンの結果を溶媒対照の蛍光に対して報告した。
【０２１３】
すべての中性及び非極性脂質のＢＯＤＩＰＹ定量とＤ７の３Ｔ３−Ｌ１細胞中のトリグリセリド含量のオイルレッドＯ定量との間の関係についてのカイ二乗分析は、２つの方法の間の有意な相関性をｐ＜０．００１と４．６４のオッズ比で示した。
【０２１４】
統計計算と解釈−ＡｃＥとインドメタシンについては、同一２検体で少なくとも３回アッセイした。溶媒とトログリタゾン対照についても、同一２検体で８回繰り返した。非極性脂質の取込みは、完全に分化した細胞の溶媒対照における非極性脂質蓄積に対して表した。陽性応答は、オイルレッドＯ又はＢＯＤＩＰＹ染色により評価される脂質蓄積が溶媒対照の９５％信頼区間の各上限より大きく増加することと定義した（片側、Ｅｘｃｅｌ；マイクロソフト、ワシントン州レドモンド）。ＡｃＥは、溶媒応答に対するトログリタゾンの陽性対照と同等以上に脂肪生成を高めるものとしてさらに特徴づけた。この評価には、Ｅｘｃｅｌのスチューデントｔ検定関数を使用した。
【０２１５】
結果−陽性対照のインドメタシン及びトログリタゾンは、３Ｔ３−Ｌ１細胞において同程度に脂肪生成を誘導した（図１１）。意外にも、ＡｃＥは、陽性対照のインドメタシン及びトログリタゾンのいずれよりも大きい脂肪生成応答を引き起こした。
【０２１６】
３Ｔ３−Ｌ１細胞、水系Ａｃａｃｉａ試料＃４９０９抽出物のジメチルスルホキシド可溶性成分において実証された脂肪生成の可能性は、インスリンへの非感受性の徴候又は症状を明示するヒトや他の動物においてインスリン感受性を高める潜在能力を示すものである。
【０２１７】
実施例１２
Ａｃａｃｉａの水系抽出物のジメチルスルホキシド可溶性分画により誘発される、インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞からのアジポネクチン分泌の増加
モデル−これらの実験では、実施例１１に記載のような３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを使用した。
【０２１８】
試験材料−トログリタゾンは、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ミシガン州アンアーバー）より入手して、メチルイソブチルキサンチン、デキサメタゾン、及びインスリンは、シグマ（ミズーリ州セントルイス）より入手した。試験材料は、Ａｃａｃｉａ試料＃４９０９のゴム樹脂の５０：５０（ｖ／ｖ）水／アルコール抽出物より生成した濃褐色の粉末であり、Ｂａｙｉｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｎｏ．６８，Ｓｏｕｔｈ  Ｃｒｏｓｓ  Ｒｏａｄ，Ｂａｓａｖａｎａｇｕｄｉ，インド）より入手した。この抽出物を、２０％以上のアペカテキンを含有するように標準化した。本実施例で使用するバッチ番号Ａ  Ｃａｔ／２３０４は、ＵＶ分析により定量されるように、２０．８％のアペカテキンを含有した。ペニシリン、ストレプトマイシン、ダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）は、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ（バージニア州ヘーンドン）から、そして１０％  ＦＢＳ−ＨＩ（胎仔ウシ血清−熱不活性化）は、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ及びＨｙｃｌｏｎｅ（ユタ州ローガン）からのものであった。他に述べなければ、他の標準試薬はいずれもシグマより購入した。
【０２１９】
細胞培養と処理−マウス線維芽細胞系３Ｔ３−Ｌ１を培養して６日目に分化した脂肪細胞を産生することを実施例１０に記載のように実施した。３Ｔ３−Ｔ１細胞を９６ウェルプレートにおいて１ｘ１０４細胞／ｃｍ２の初期密度で播いた。２日間、この細胞をそのまま増殖させて、集密に達せしめた。集密に続いて、分化培地の添加によって、この細胞を強制的に脂肪細胞へ分化させた；この培地は、（１）１０％  ＦＢＳ／ＤＭＥＭ（高グルコース）；（２）０．５ｍＭメチルイソブチルキサンチン；（３）０．５μＭデキサメタゾン、及び（４）１０μｇ／ｍｌインスリン（ＭＤＩ培地）より構成された。３日目〜５日目に、この培地を、１０％  ＦＢＳ／ＤＭＥＭ中の１０μｇ／ｍｌインスリンからなる分化後培地へ交換した。
【０２２０】
インスリン抵抗性の成熟３Ｔ３−Ｌ１細胞に対するＡｃａｃｉａの効果を評価することは、Fasshauer et al．［Fasshauer, M., Klein, J., Neumann, S., Eszlinger, M., and Paschke, R.「３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるアジポネクチン遺伝子発現のホルモン調節（Hormonal regulation of adiponectin gene expression in 3T3-L1 adipocytes）」BBRC, 290: 1084-1089, (2002)］に記載の手順の改良法を使用して実施した。簡潔に言えば、６日目に、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する無血清培地に細胞を３時間維持してから、１μｇインスリン／ｍｌ＋溶媒、又はインスリン＋試験材料で処理した。トログリタゾンをジメチルスルホキシドに溶かして、５、２．５、１．２５、及び０．６２５μｇ／ｍｌの濃度を達成するように加えた。Ａｃａｃｉａ抽出物は、５０、２５、１２．５、及び６．２５μｇ／ｍｌで試験した。２４時間後、上清の培地をアジポネクチン定量のためにサンプリングした。細胞の分化と試験材料での処理の全手順を図１２に図式的に概説する。
【０２２１】
アジポネクチンアッセイ-培地へ分泌されるアジポネクチンは、Ｍｏｕｓｅ  Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ミネソタ州ミネアポリス）を変更なしに使用して定量した。製造業者により提供される情報は、マウス細胞培養基においてスパイクされるアジポネクチンの回収が平均１０３％であり、最低の検出可能なアジポネクチン濃度が０．００１〜０．００７ｎｇ／ｍｌの範囲であることを示した。
【０２２２】
統計計算と解釈−すべてのアッセイを同一２検体で実施した。統計解析のために、Ａｃａｃｉａのアジポネクチン分泌に対する効果を溶媒対照に比較して計算した。スチューデントのｔ検定を多変量比較の補正なしに使用して用量間の違いを決定して、第Ｉ種誤差の名義５％確率を選択した。
【０２２３】
見かけのミカエリス定数と最大速度を決定するためのＨｏｆｓｔｅｅの方法［Hofstee, B. H.「酵素反応速度論における非逆数対逆数のプロット（Non-inverted versus inverted plots in enzyme kinetics）」Nature 184:1296-1298, (1959)］の変法を使用して、試験材料の効力を評価した。独立変数ｖ／［Ｓ］に｛相対アジポネクチン分泌／［濃度］｝を、そして従属変数｛ｖ｝に｛相対アジポネクチン分泌｝を代入して、式：ｙ＝ｍｘ＋ｂの関係を得た。溶媒対照に対する最大アジポネクチン分泌をｙ切片より推定する一方で、半最大アジポネクチン分泌に必要な試験材料の濃度を傾きの負値より計算した。
【０２２４】
結果−陽性対照のトログリタゾンについて試験したすべての濃度で、インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１細胞においてアジポネクチン分泌が亢進されて、２．５μｇ／ｍｌでは、溶媒対照に比較して２．４４倍の最大刺激があった（図１３）。５０及び２５μｇ／ｍｌ濃度のＡｃａｃｉａは、いずれも溶媒対照に比較してアジポネクチン分泌を高めた（それぞれ、１．７６及び１．７０倍）。これらの濃度のＡｃａｃｉａは、トログリタゾンで観測された最大アジポネクチン分泌にはいずれも同等でなかったが、それらは、１．２５及び０．６２５μｇ／ｍｌ濃度のトログリタゾンに匹敵するものであった。
【０２２５】
改良Ｈｏｆｓｔｅｅプロットより導かれる最大アジポネクチン分泌の推定は、半最大刺激に必要とされる濃度に大きな違いがある、アジポネクチン分泌の比較可能な相対増加を示した。トログリタゾン及び Acacia catechu のｙ切片より推定される最大アジポネクチン分泌は、溶媒対照に対して、それぞれ２．２９及び１．８８倍であった。しかしながら、インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１細胞における半最大アジポネクチン分泌の刺激に必要とされる濃度は、トログリタゾンで０．０８５μｇ／ｍｌであり、Ａｃａｃｉａで５．３８μｇ／ｍｌであった。２０％の最少アペカテキン含量に基づいて計算すると、後者のＡｃａｃｉａの数字は、ほぼ１．０μｇ／ｍｌになる。
【０２２６】
インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌｌ細胞におけるアジポネクチン分泌を高めるその能力に基づけば、Ａｃａｃｉａ及び／又はアペカテキンは、血漿アジポネクチン濃度が低下している臨床病理に対して陽性の効果を及ぼすことが期待されよう。
【０２２７】
実施例１３
Ａｃａｃｉａの水系抽出物のジメチルスルホキシド可溶性分画により誘発される、ＴＮＦα処理３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞からのアジポネクチン分泌の増加
モデル−これらの実験では、実施例１１に記載のような３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを使用した。
【０２２８】
試験材料−インドメタシン、メチルイソブチルキサンチン、デキサメタゾン、及びインスリンは、シグマ（ミズーリ州セントルイス）より入手した。試験材料は、Ａｃａｃｉａ試料＃４９０９のゴム樹脂の５０：５０（ｖ／ｖ）水／アルコール抽出物より生成した濃褐色の粉末であり、Ｂａｙｉｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｎｏ．６８，Ｓｏｕｔｈ  Ｃｒｏｓｓ  Ｒｏａｄ，Ｂａｓａｖａｎａｇｕｄｉ，インド）より入手した。この抽出物を、２０％以上のアペカテキンを含有するように標準化した。本実施例で使用するバッチ番号Ａ  Ｃａｔ／２３０４は、ＵＶ分析により定量されるように、２０．８％のアペカテキンを含有した。ペニシリン、ストレプトマイシン、ダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）は、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ（バージニア州ヘーンドン）から、そして１０％  ＦＢＳ−ＨＩ（胎仔ウシ血清−熱不活性化）は、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ及びＨｙｃｌｏｎｅ（ユタ州ローガン）からのものであった。他に述べなければ、他の標準試薬はいずれもシグマより購入した。
【０２２９】
細胞培養と処理−マウス線維芽細胞系３Ｔ３−Ｌ１を培養して３日目に分化した脂肪細胞を産生することを実施例１０に記載のように実施した。３Ｔ３−Ｔ１細胞を９６ウェルプレートにおいて１ｘ１０４細胞／ｃｍ２の初期密度で播いた。２日間、この細胞をそのまま増殖させて、集密に達せしめた。集密に続いて、分化培地の添加によって、この細胞を強制的に脂肪細胞へ分化させた；この培地は、（１）１０％  ＦＢＳ／ＤＭＥＭ（高グルコース）；（２）０．５ｍＭメチルイソブチルキサンチン；（３）０．５μＭデキサメタゾン、及び（４）１０μｇ／ｍｌインスリン（ＭＤＩ培地）より構成された。３日目〜５日目に、この培地をＤＭＥＭ中１０％  ＦＢＳからなる分化後培地へ交換した。５日目に、培地を、インドメタシン又はＡｃａｃｉａ抽出物を含むか又は含めない１０％  ＦＢＳ／ＤＭＥＭ中に１０、２又は０．５ｎｇ  ＴＮＦα／ｍｌを含有する試験培地へ交換した。インドメタシンをジメチルスルホキシドに溶かして、５、２．５、１．２５、及び０．６２５μｇ／ｍｌの濃度を達成するように加えた。Ａｃａｃｉａ抽出物は、５０、２５、１２．５、及び６．２５μｇ／ｍｌで試験した。６日目に、上清の培地をアジポネクチン定量のためにサンプリングした。細胞の分化と試験材料での処理の全手順を図１４に図式的に概説する。
【０２３０】
アジポネクチンアッセイ−培地へ分泌されるアジポネクチンは、Ｍｏｕｓｅ  Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ミネソタ州ミネアポリス）を変更なしに使用して定量した。製造業者により提供される情報は、マウス細胞培養基においてスパイクされるアジポネクチンの回収が平均１０３％であり、最低の検出可能なアジポネクチン濃度が０．００１〜０．００７ｎｇ／ｍｌの範囲であることを示した。
【０２３１】
統計計算と解釈−すべてのアッセイを同一２検体で実施した。統計解析のために、インドメタシン又は Acacia catechu のアジポネクチン分泌に対する効果を溶媒対照に比較して計算した。スチューデントのｔ検定を多変量比較の補正なしに使用して用量及び試験薬剤間の違いを決定して、第Ｉ種誤差の名義５％確率を選択した。
【０２３２】
結果−ＴＮＦαは、１０及び２ｎｇ／ｍｌ濃度で、成熟３Ｔ３−Ｌ１細胞におけるアジポネクチン分泌を溶媒対照に対して有意に（ｐ＜０．０５）それぞれ６５及び２９％低下させて、０．５ｎｇ／ｍｌでは、アジポネクチン分泌に対して明らかな効果がなかった（図１５）。１０及び２ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで、インドメタシンは、試験したすべての用量でＴＮＦα単独に対してアジポネクチン分泌を高めた（ｐ＜０．０５）が、アジポネクチン分泌を溶媒対照のレベルまで回復させることはできなかった。１０ｎｇ  ＴＮＦα／ｍｌの存在下でのＡｃａｃｉａ処理は、インドメタシンよりは弱いが、同様のアジポネクチン増加をもたらした。アジポネクチン刺激における Acacia catechu とインドメタシンの間の差は、４つの増加濃度にわたり、それぞれ１４、２０、３２、及び４１％であった。用量間の倍数はインドメタシンとＡｃａｃｉａで同一であったので、これらの結果は、インドメタシンの効力が超生理学的な濃度のＴＮＦαの存在下の３Ｔ３−Ｌ１細胞に対してアジポネクチン分泌を回復させることでＡｃａｃｉａ中の活性材料より大きかったことを示唆する。
【０２３３】
３Ｔ３−Ｌ１細胞の２ｎｇ  ＴＮＦαとＡｃａｃｉａでの処理は、６．２５、２５、及び５０μｇ／ｍｌで、ＴＮＦα単独に対して有意である（ｐ＜０．０５）アジポネクチン分泌の増加をもたらした。しかしながら、１０ｎｇ  ＴＮＦα／ｍｌ処理とは異なり、Ａｃａｃｉａとインドメタシンの間の差は、より小さくて、用量に明らかに関連するわけではなく、試験した全部で４つの濃度で平均して５．５％であった。インドメタシンで観察されたように、Ａｃａｃｉａは、アジポネクチン分泌を、溶媒対照において観察されるレベルまでは回復させなかった。
【０２３４】
０．５ｎｇ  ＴＮＦα／ｍｌでは、インドメタシンは、２．５及び５．０μｇ／ｍｌの濃度で、有意である（ｐ＜０．０５）アジポネクチン分泌の用量依存的な減少をもたらした。興味深いことに、インドメタシンとは異なり、Acacia catechu は、５０μｇ／ｍｌで、ＴＮＦα及び溶媒処理の両方の３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞に対してアジポネクチン分泌を高めた。従って、生理学的なレベルへ近づくＴＮＦαの濃度では、Acacia catechu は、ＴＮＦαと溶媒対照の両方に対してアジポネクチン分泌を高めて、驚くべきことに、インドメタシンより優れていた。
【０２３５】
ＴＮＦα処理３Ｔ３−Ｌ１細胞においてアジポネクチン分泌を高めるその能力に基づけば、Acacia catechu 及び／又はアペカテキンは、ＴＮＦαレベルが上昇していて、血漿アジポネクチン濃度が低下しているすべての臨床病理に対して陽性の効果を及ぼすことが期待されよう。
【０２３６】
実施例１４
多様な市販のＡｃａｃｉａ試料は、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞モデルにおいて脂肪生成を高める
モデル−これらの実験では、実施例１１に記載のような３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを使用した。使用するすべての化学品及び手順は、オイルレッドＯアッセイを実施して、Acacia catechu 誘導性の細胞トリグリセリド含量を評価すること以外は、実施例１１に記載の通りであった。Acacia catechu 試料＃５６６９は、Ｎａｔｕｒａｌ  Ｒｅｍｅｄｉｅｓ（３６４，２ｎｄ  Ｆｌｏｏｒ，１６ｔｈ  Ｍａｉｎ，４ｔｈ  Ｔ  Ｂｌｏｃｋ  Ｂａｎｇａｌｏｒｅ，Ｋａｒｎａｔａｋａ  ５６００４１  インド）より入手して；試料＃４９０９、＃５６６７、及び＃５６６８は、Ｂａｙｉｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｎｏ．１０，Ｄｏｄｄａｎｎａ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｅｓｔａｔｅ，Ｐｅｎｙａ  ＩＩ  Ｓｔａｇｅ，Ｂａｎｇａｌｏｒｅ，５６００９１  Ｋａｒｎａｔａｋａ，インド）より入手した。Acacia nilotica 試料＃５６３９、＃５６４０、及び＃５６５９は、ＫＤＮ−Ｖｉｔａ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社（１２１  Ｓｔｒｙｋｅｒ  Ｌａｎｅ，Ｕｎｉｔｓ  ４＆６  ニュージャージー州ヒルズバラ、０８８４４）より購入した。試料＃５６４０は、樹皮として、試料＃５６６７は、ゴム樹脂として、試料＃５６６９は、芯材粉末として記載した。他のすべての試料は、他に示さなければ、Acacia catechu 樹皮専用メタノール抽出物として記載した。
【０２３７】
結果−試験したすべてのＡｃａｃｉａ試料は、陽性の脂肪生成応答をもたらした（図１６）。最高の脂肪生成応答が達成されたのは、試料＃５６６９の芯材粉末（１．２７）、＃５６５９のメタノール抽出物（１．３１）、＃５６４０のＤＭＳＯ抽出物（１．２９）、及び、＃４９０９のメタノール抽出物（１．３１）であった。
【０２３８】
本実施例は、インスリン作用の増加を支援する、脂肪細胞生理の陽性修飾を可能にする、多数の化合物が Acacia catechu に存在することをさらに証明する。
【０２３９】
実施例１５
多様な市販のＡｃａｃｉａ試料は、ＴＮＦα−３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞モデルにおいてアジポネクチン分泌を高める
モデル−これらの実験では、実施例１１に記載のような３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを使用した。標準の化学品を使用して、細胞の処理は、実施例１１及び１３に記載のように実施した。しかしながら、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞のＴＮＦαでの処理は、細胞を２又は１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαだけに曝露した点で、実施例１２とは異なっていた。培養６日目に、実施例１２に詳述したように、上清培地についてアジポネクチンをアッセイした。Ａｃａｃｉａ試料＃４９０９、＃５６３９、＃５６５９、＃５６６７、＃５６６８、＃５６４０、及び＃５６６９の製剤は、実施例１３に記載の通りであった。
【０２４０】
結果−２ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαは、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞のアジポネクチン分泌を、溶媒対照より２７％抑制したが、アジポネクチン分泌は、１．２５μｇ／ｍｌのインドメタシンによって、ＴＮＦα溶媒対照より最大１１％上昇した（表１２）。Ａｃａｃｉａ製剤＃５５５９だけが試験した４つの用量のいずれでもアジポネクチン分泌を高めることができなかった。他のすべてのＡｃａｃｉａ製剤は、１０〜１５％に及ぶアジポネクチン分泌の同等の最大増加をもたらした。しかしながら、様々なＡｃａｃｉａ製剤により最大アジポネクチン分泌が誘発される濃度に関しては、差が観察された。最も強力な製剤は、１２．５μｇ／ｍｌでアジポネクチン刺激の最大刺激を達成した＃５６４０であり、＃４９０９及び＃５６６８（２５μｇ／ｍｌ）と、最後に＃５６３９、＃５６６７、及び＃５６６９（５０μｇ／ｍｌ）が続いた。
【０２４１】
表１２
２ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαの存在下で様々なＡｃａｃｉａ製剤により誘発される、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞からの相対最大アジポネクチン分泌
【０２４２】
【表２２】
2009504657.tif 000024
【０２４３】
１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαは、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞のアジポネクチン分泌を溶媒対照より５４％低下させ、一方、アジポネクチン分泌は、５．０μｇインドメタシン／ｍｌによって、ＴＮＦα溶媒対照より最大６７％上昇した（表１３）。トログリタゾンは、試験した最低濃度の０．６２５μｇ／ｍｌでアジポネクチン分泌を最大５１％増加させた。Ａｃａｃｉａ製剤＃５５５９は、２５μｇ／ｍｌで１２％の最低の有意（ｐ＜０．０５）増加をもたらした。他のすべてのＡｃａｃｉａ製剤は、５０μｇ／ｍｌで、１７〜４１％に及ぶアジポネクチン分泌の最大増加をもたらした。最も強力な製剤は、＃４９０９と＃５６６９であり、ＴＮＦα溶媒対照に対して、アジポネクチン分泌をそれぞれ４１及び４０％増加させた。
【０２４４】
表１３
１０ｎｇ  ＴＮＦα／ｍｌの存在下で様々なＡｃａｃｉａ製剤により誘発される、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞からの相対最大アジポネクチン分泌
【０２４５】
【表２３】
2009504657.tif 000025
【０２４６】
Ａｃａｃｉａの異なる試料又は製剤がこの代謝症候群の第二のモデルにおいて類似の応答を誘発するという観察事実は、インスリン作用の増加を支援する、脂肪細胞生理の陽性修飾を可能にする、多数の化合物がＡｃａｃｉａに存在することをさらに証明する。
【０２４７】
実施例１６
ＴＮＦα／３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞モデルにおいてアジポネクチン分泌を高めることが可能な Acacia catechu 由来の極性及び非極性溶媒抽出化合物
モデル−これらの実験では、実施例１１に記載のような３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを使用した。使用する標準の化学品は、実施例１１及び１３に記載の通りである。実施例１３に記載のように、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を１０ｎｇ  ＴＮＦα／ｍｌで処理した。実施例１３に詳述したように、６日目に培養基の上清についてアジポネクチンをアッセイした。
【０２４８】
試験材料−Acacia catechu 試料＃５６６９芯材の大きなチップ（各チップは、５〜１０グラムの重さ）を、標準のパワードリルを低速で使用する５／８”金属ドリルビットでの粉砕へ処した。この木の削り屑モーターへ採取して、液体Ｎ２下に凍結させながら、微細粉末へ粉砕した。次いで、この粉末を２５０ミクロン篩いで篩いにかけて、ほぼ１０ｇの浮遊性の微細粉末とした。
【０２４９】
表１４
３Ｔ３−Ｌ１アジポネクチンアッセイ用の Acacia catechu 抽出試料の記載
【０２５０】
【表２４】
2009504657.tif 000026
【０２５１】
この粉末を６つの琥珀色のガラス瓶へ分配して（１５０ｍｇ／バイアル）、表１４に列挙した溶媒の２ｍｌを用いて、４０℃でほぼ１０時間抽出した。この抽出に続いて、芯材／溶媒の懸濁液を遠心分離（５８００ｘｇ，１０分）へ処した。遠心分離からの上清分画を０．４５ミクロンＰＴＦＥシリンジフィルターに通して、別々の琥珀色のガラス瓶へ濾過した。これら試料のそれぞれを真空で濃縮した。表７に見られるように、ＤＭＳＯは、Acacia catechu 芯材よりほとんどの材料を抽出して、クロロホルムは、最も少なく抽出した。すべての抽出試料を５０、２５、１２．５、及び６．２５μｇ／ｍｌで試験した。
【０２５２】
ピオグリタゾンは、４５ｍｇピオグリタゾン錠剤として、Ａｃｔｏｓ（登録商標）（Ｔａｋｅｄａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，イリノイ州リンカーンシア）の市販品より入手した。この錠剤を微細粉末へ粉砕して、５．０、２．５、１．２５、及び０．６２５μｇピオグリタゾン／ｍｌで試験した。インドメタシンも、追加の陽性対照として含めた。
【０２５３】
結果−陽性対照のピオグリタゾンとインドメタシンは、いずれも、ＴＮＦαの存在下での脂肪細胞によるアジポネクチン分泌を高めた（それぞれ、１１５及び９４％）（図１７）。最適のピオグリタゾン及びインドメタシン濃度は、それぞれ１．２５及び２．５μｇ／ｍｌであった。Acacia catechu 試料＃５６６９のすべての抽出物は、ＴＮＦα処理に対してアジポネクチン分泌を増加させた。種々の抽出物の中では、ＤＭＳＯ抽出物が最も強力なアジポネクチン分泌の誘導剤であり、６．２５μｇ抽出物／ｍｌで最大活性を観察した。この結果は、様々な極性の広範囲の材料を抽出するＤＭＳＯの能力によるのかもしれない。図１７の検討は、水抽出物（極性化合物）とクロロホルム抽出物（非極性化合物）が、ＴＮＦα／３Ｔ３−Ｌｌ脂肪細胞モデルにおいてアジポネクチン分泌を高めるその能力において同等であったことを示す。これらの抽出物が類似の化合物を含有していた可能性は低い。本実施例は、好炎症刺激の存在下に脂肪細胞からのアジポネクチン分泌を高めることが可能である、Acacia catechu 芯材由来の化合物を抽出する、異なる極性の溶媒の能力を例示するものである。
【０２５４】
実施例１７
ＴＮＦα／３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞モデルにおいてアジポネクチン分泌を高めることが可能な Acacia catechu の酸性及び塩基性分画
モデル−これらの実験では、実施例１１に記載のような３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを使用した。使用する標準の化学品は、実施例１１及び１３に記載の通りであった。実施例１３に記載のように、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を１０ｎｇ  ＴＮＦα／ｍｌで処理した。実施例１３に詳述したように、６日目に培養基の上清についてアジポネクチンをアッセイした。
【０２５５】
試験材料−Acacia catechu 試料＃５６６９を以下の手順に従って抽出した：５０ｍｌ試験管中ほぼ５０ｍｇの乾燥 Acacia catechu 芯材粉末＃５６６９へアルカリ性イソプロピルアルコール溶液（イソプロパノール中１％（ｖ／ｖ）１．５Ｎ  ＮａＯＨ）を加えた。次いで、この試料を軽く混合し、３０分間音波処理し、１時間遠心分離させて、残る固体材料をペレットにした。次いで、上清の液体を０．４５ミクロン濾紙に通して濾過した。使用する塩基性イソプロパノールのｐＨはｐＨ８．０であり、採取した液体のｐＨはｐＨ７．０であった。澄明な、濾過した液体の一部を真空で乾燥させると、白い固形物のように見えた。この試料を乾燥アルカリ抽出物と名づけた。
【０２５６】
残るペレット状の材料を酸性イソプロピルアルコール溶液（イソプロパノール中１％（ｖ／ｖ）１０％  ＨＣｌ）へ赤い溶液として入れた。この試料を、ペレット材料が液体中に十分に分散するまで混合してから、３０分間遠心分離させて、残る固形物を再びペレットにした。この薄黄色い上清の溶液を０．４５ミクロン濾紙に通した。採取した液体のｐＨはｐＨ３．０であり、この試料のｐＨをｐＨ８〜９へ高めるときに、赤茶色〜茶褐色の沈殿（乾燥沈殿）が生成されることがわかった。この沈殿を採取して乾燥させて、赤茶色〜茶褐色の固形物を得た。この上清液を再び０．４５ミクロンフィルターに通過させて、あらゆる残存沈殿を除去した。この液体は、深黄色であった。この残る液体を乾燥させると茶褐色の固体試料を生じ、乾燥酸性抽出物と名づけた。３つの分画の回収量を表１５に列挙する。試験材料はいずれも５０、２５、１２．５、及び６．２５μｇ／ｍｌでアッセイして、ピオグリタゾン陽性対照は、５．０、２．５、１．２５、及び０．６２５μｇ／ｍｌで検査した。
【０２５７】
表１５
Acacia catechu 芯材粉末からの試験材料の回収
【０２５８】
【表２５】
2009504657.tif 000027
【０２５９】
結果：ＴＮＦαは、溶媒対照に比較してアジポネクチン分泌を４６％抑制した。アジポネクチン分泌のピオグリタゾンによる最大回復は、１．２５μｇ／ｍｌで観察された、ＴＮＦα処理の１．４７倍であった（表１６）。試験材料の中では、ＴＮＦαのみの対照より有意に高くアジポネクチン分泌を増加させることができなかったのは、乾燥沈殿物だけである。酸性抽出物と芯材粉末（出発材料）は、ＴＮＦαの存在下でのアジポネクチン分泌を高める能力において類似していたが、アルカリ抽出物がアジポネクチン分泌を高めたのは、最高用量の５０μｇ／ｍｌでだけである。
【０２６０】
表１６
ＴＮＦα／３Ｔ３−Ｌｌモデルにおいて４つの用量で誘発される最大アジポネクチン分泌
【０２６１】
【表２６】
2009504657.tif 000028
【０２６２】
実施例１８
Ａｃａｃｉａの水系抽出物のジメチルスルホキシド可溶性分画による、ＴＮＦα処理３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞からのインターロイキン−６分泌の減少
インターロイキン−６（ＩＬ−６）は、宿主防御、急性期の反応、免疫応答、神経細胞機能、造血、及び代謝症候群において重要な役割を担う多機能性サイトカインである。これは、脂肪細胞のような、多様な正常及び形質転換のリンパ様及び非リンパ様細胞により発現される。ＩＬ−６の産生は、マイトジェン又は抗原刺激、リポ多糖、カルシウムイオノフォア、サイトカイン、及びウイルスのような数多くのシグナルによりアップレギュレートされる［Hibi, M., Nakajima, K., Hirano T.「ＩＬ−６サイトカインファミリーとシグナル伝達：サイトカイン系のモデル（IL-6 cytokine family and signal transduction: a model of the cytokine system）」J MoI Med. 74(1): 1-12, (Jan 1996)］。細菌及びウイルスの感染症、外傷、自己免疫疾患、悪性腫瘍、及び代謝症候群が含まれる数多くの病理学的状態では、上昇した血清レベルが観察されている［Arner, P.「２型糖尿病におけるインスリン抵抗性−アジポカインの役割（Insulin resistance in type 2 diabetes -- role of the adipokines）」Curr MoI Med.;5(3):333-9, (May 2005)］。
【０２６３】
モデル−これらの実験では、実施例１１に記載のような３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを使用した。使用する標準の化学品は、実施例１１及び１３に記載の通りであった。実施例１３に記載のように、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を１０ｎｇ  ＴＮＦα／ｍｌで処理した。実施例１３に詳述したように、６日目に培養基の上清についてアジポネクチンをアッセイした。
【０２６４】
試験材料−インドメタシン、メチルイソブチルキサンチン、デキサメタゾン、及びインスリンは、シグマ（ミズーリ州セントルイス）より入手した。試験材料は、Acacia catechu 試料＃４９０９のゴム樹脂の５０：５０（ｖ／ｖ）水／アルコール抽出物より生成した濃褐色の粉末であり、Ｂａｙｉｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｎｏ．６８，Ｓｏｕｔｈ  Ｃｒｏｓｓ  Ｒｏａｄ，Ｂａｓａｖａｎａｇｕｄｉ，インド）より入手した。この抽出物を、２０％以上のアペカテキンを含有するように標準化した。本実施例で使用するバッチ番号Ａ  Ｃａｔ／２３０４は、ＵＶ分析により定量されるように、２０．８％のアペカテキンを含有した。ペニシリン、ストレプトマイシン、ダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）は、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ（バージニア州ヘーンドン）から、そして１０％  ＦＢＳ−ＨＩ（胎仔ウシ血清−熱不活性化）は、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ及びＨｙｃｌｏｎｅ（ユタ州ローガン）からのものであった。他に述べなければ、他の標準試薬はいずれもシグマより購入した。
【０２６５】
インターロイキン−６アッセイ−培地へ分泌されるＩＬ−６を、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）Ｍｏｕｓｅ  ＩＬ−６  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ミネソタ州ミネアポリス）を変更なしに使用して定量した。製造業者により提供される情報は、マウス細胞培養基においてスパイクされるＩＬ−６の回収が１：２希釈液で平均９９％であり、最低の検出可能なＩＬ−６濃度が１．３〜１．８ｐｇ／ｍｌの範囲であることを示した。上清の培地試料は、いずれも希釈せずにアッセイした。
【０２６６】
統計計算と解釈−すべてのアッセイを同一２検体で実施した。統計解析のために、Ａｃａｃｉａのアジポネクチン又はＩＬ−６分泌に対する効果を溶媒対照に比較して計算した。スチューデントのｔ検定を多変量比較の補正なしに使用して用量間の違いを決定して、第Ｉ種誤差（片側）の名義５％確率を選択した。
【０２６７】
結果−これまでの実施例で見られたように、ＴＮＦαがアジポネクチン分泌を劇的に低下させた一方で、インドメタシンと Acacia catechu 抽出物は、ＴＮＦαの存在下でともにアジポネクチン分泌を高めた。インドメタシン陽性対照と Acacia catechu 抽出物は、いずれもアジポネクチン分泌の用量に関連した増加を明示したが、いずれの材料も、ＴＮＦαのないジメチルスルホキシド対照で見られる濃度までアジポネクチン濃度を回復させなかった（表１７）。Acacia catechu 抽出物は、ＴＮＦαの存在下に、強力で用量に関連したＩＬ−６分泌阻害を明示したが、インドメタシンは、抗炎症効果を明示しなかった。
【０２６８】
抗炎症性アジポネクチンの好炎症性ＩＬ−６の比の検討は、インドメタシンと Acacia catechu 抽出物の両方について、相対的な抗炎症活性の優れた用量関連の増加をもたらした。
【０２６９】
表１７
ＴＮＦα／３Ｔ３−Ｌｌモデルにおいて Acacia catechu 試料＃４９０９により誘発されるＩＬ−６分泌の減少とアジポネクチン分泌の増加
【０２７０】
【表２７】
2009504657.tif 000029
【０２７１】
Acacia catechu 試料＃４９０９は、ＴＮＦα／３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞モデルにおいて二元的な抗炎症作用を明示した。Acacia catechu 抽出物の成分は、アジポネクチン分泌を高める一方で、ＩＬ−６分泌を低下させた。Acacia catechu の全体的な効果は、ＴＮＦα対照に比べて強く抗炎症性であった。これらの結果は、インスリン抵抗性の体重増加、肥満、心臓血管系疾患、及び癌を減少させるための脂肪細胞生理の改善への Acacia catechu の使用を支持するものである。
【０２７２】
実施例１９
インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞からのアジポネクチン、ＩＬ−６、及びレジスチンの分泌に及ぼす、Ａｃａｃｉａ水系抽出物のジメチルスルホキシド可溶性分画の効果
モデル−これらの実験では、実施例１１に記載のような３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを使用した。使用する標準化学品及び統計処理は、実施例１１及び１２に記載の通りであった。ＩＬ−６は、実施例１８に記載のようにアッセイした。
【０２７３】
レジスチンアッセイ−培地へ分泌されるレジスチンの量を、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）Ｍｏｕｓｅ  Ｒｅｓｉｓｔｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ミネソタ州ミネアポリス）を変更なしに使用して定量した。製造業者により提供される情報は、マウス細胞培養基においてスパイクされるレジスチンの回収が１：２希釈液で平均９９％であり、最低の検出可能なレジスチン濃度が１．３〜１．８ｐｇ／ｍｌの範囲であることを示した。上清の培地試料は、いずれも、製造業者により供給される希釈培地でアッセイ前に２０倍希釈した。
【０２７４】
統計計算と解釈−すべてのアッセイを同一２検体で実施した。統計解析のために、Acacia catechu のアジポネクチン又はＩＬ−６分泌に対する効果を溶媒対照に比較して計算した。スチューデントのｔ検定を多変量比較の補正なしに使用して用量間の違いを決定して、第Ｉ種誤差（片側）の名義５％確率を選択した。
【０２７５】
結果−トログリタゾンとＡｃａｃｉａ試料＃４９０９は、高濃度のインスリンの存在下で用量に関連したやり方でアジポネクチン分泌をともに高めた（表１８）。Acacia catechu がＩＬ−６の低下による抗炎症効果を６．２５μｇ／ｍｌの濃度だけで明示したのに対し、トログリタゾンは、５．００及び１．２５μｇ／ｍｌの濃度で好炎症性であり、他の２つの濃度では、効果が観察されなかった。レジスチン分泌は、トログリタゾンにより用量依存的なやり方で増加したが、Acacia catechu は、レジスチン発現を同じように用量依存的なやり方で減少させた。
【０２７６】
実施例１８で見られたように、Acacia catechu 試料＃４９０９は、高インスリン血症／３Ｔ３−Ｌｌ脂肪細胞モデルにおいて再び二元的な抗炎症作用を明示した。Acacia catechu 抽出物の成分は、アジポネクチン分泌を増加させる一方で、ＩＬ−６分泌を減少させた。従って、Acacia catechu の全体効果は、高インスリン対照に比べて抗炎症性であった。高インスリン濃度の存在下でのレジスチン分泌に対するAcacia catechu の効果は、トログリタゾンのそれと反対であった。トログリタゾンがレジスチン発現を増加させたのに対し、Acacia catechu は、レジスチン発現をさらに減少させたのである。これらのデータは、複雑な Acacia catechu 抽出物がＰＰＡＲγ受容体を介して機能しているのではないことを示唆する。これらの結果は、インスリン抵抗性の体重増加、肥満、心臓血管系疾患、及び癌を減少させるための脂肪細胞生理の改善への Acacia catechu の使用をさらに支持するものである。
【０２７７】
表１８
インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１モデルにおけるアジポネクチン、ＩＬ−６、及びレジスチン分泌に対する Acacia catechu 抽出物の効果
【０２７８】
【表２８】
2009504657.tif 000030
【０２７９】
実施例２０
ホップに由来する植物化学品による、脂肪細胞における脂肪生成の増加
モデル−これらの実験では、実施例１１に記載のような３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを使用した。使用する標準化学品及び統計処理は、実施例１１に記載の通りであった。
【０２８０】
試験材料−この試験に使用したホップの植物化学品は、表１９に記載されて、Ｂｅｔａｔｅｃｈ  Ｈｏｐｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（ワシントン、Ｄ．Ｃ．アメリカ）より購入した。
【０２８１】
表１９
ホップ試験材料の記載
【０２８２】
【表２９】
2009504657.tif 000031
【０２８３】
細胞培養と処理−ホップ化合物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶かして、分化の０日目に１０、５、４又は２μｇ／ｍｌの濃度になるように加えて、成熟期（６又は７日目）を通して維持した。使用済ホップは、５０μｇ／ｍｌで試験した。新鮮な培地を加えるときはいつでも、新鮮な試験材料も加えた。ＤＭＳＯを選択したのは、その極性と、それが水系の細胞培養基と混和するという事実のためである。陽性対照として、インドメタシンとトログリタゾンを加えて、それぞれ５．０及び４．４μｇ／ｍｌの最終濃度とした。分化したＤ６／Ｄ７  ３Ｔ３−Ｌ１細胞を０．３６％オイルレッドＯ又は０．００１％  ＢＯＤＩＰＹで染色した。
【０２８４】
結果−陽性対照のインドメタシン及びトログリタゾンは、３Ｔ３−Ｌ１細胞において脂肪生成を同程度に誘導した（図１８）。意外にも、４つのホップ成分（genera）は、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞において、陽性対照のインドメタシン及びトログリタゾンより大きく脂肪生成応答をもたらした。これら４つの成分には、イソアルファ酸、Ｒｈｏ−イソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、及びヘキサヒドロイソアルファ酸が含まれた。この知見は、個々のイソフムロンのＰＰＡＲγとの結合は、強力なＰＰＡＲγアゴニスト、ピオグリタゾンのほぼ１／３〜１／４であったという公知の報告［Yajima, H., Ikeshima, E., Shiraki, M., Kanaya, T., Fujiwara, D., Odai, H., Tsuboyama-Kasaoka, N., Ezaki, O., Oikawa, S., and Kondo, K.「ホップ由来苦味酸のイソフムロンは、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体α及びγをともに活性化して、インスリン抵抗性を低下させる（Isohumulones, bitter acids derived from hops, activate both peroxisome proliferator-activated receptor alpha and gamma and reduce insulin resistance）」J Biol Chem, 279: 33456-33462, (2004)］に照らせば、驚きである。
【０２８５】
キサントフモール、アルファ酸、及びベータ酸の脂肪生成応答は、インドメタシンやトログリタゾンに匹敵したが、使用済ホップとヘキサヒドロコルプロンは、溶媒対照より大きな脂肪生成応答を誘発することができなかった。
【０２８６】
３Ｔ３−Ｌ１細胞におけるその脂肪生成の潜在能力に基づけば、異性化アルファ酸、アルファ酸、ベータ酸、並びにキサントフモールが含まれる、この試験での陽性ホップの植物化学成分には、インスリンへの非感受性の徴候又は症状を明示するヒトや他の動物において、インスリン感受性を増加させて血清トリグリセリドを減少させることが期待されよう。
【０２８７】
実施例２１
ホップ植物化学品は、インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞においてアジポネクチン分泌を増加させる。
【０２８８】
モデル−本実施例では、実施例１１及び１２に記載のような３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを使用した。標準化学品、ホップ化合物のＲＩＡＡ、ＩＡＡ、ＴＨＩＡＡ、ＨＨＩＡＡ、キサントフモール、ヘキサヒドロコルプロン、使用済ホップについては、実施例１２及び２０にそれぞれ記載した通りである。
【０２８９】
細胞培養と処理−細胞を実施例１２に記載のように培養して、先に記載のようなホップ植物化学品で処理した。アジポネクチンアッセイと統計解析は、実施例１２に記載する通りであった。見かけのミカエリス定数と最大速度を決定するためのＨｏｆｓｔｅｅの方法の変法を使用して、試験材料の効力を評価した。独立変数ｖ／［Ｓ］に｛相対アジポネクチン分泌／［濃度］｝を、そして従属変数｛ｖ｝に｛相対アジポネクチン分泌｝を代入して、式：ｙ＝ｍｘ＋ｂの関係を得た。溶媒対照に対する最大アジポネクチン分泌をｙ切片より推定する一方で、半最大アジポネクチン分泌に必要な試験材料の濃度を傾きの負値より計算した。
【０２９０】
結果−陽性対照のトログリタゾンは、インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１細胞において、アジポネクチン分泌を２．５μｇ／ｍｌで溶媒対照に対して２．４４倍の最大亢進させた（図１９）。試験したすべてのホップ植物化学品は、溶媒対照に対して亢進されたアジポネクチン分泌を明示して、イソアルファ酸は、トログリタゾンより有意に大きい（対照に対して２．９７倍）アジポネクチン分泌をもたらした。試験した４つの用量の中で、最大のアジポネクチン分泌が観測されたのは、イソアルファ酸、Ｒｈｏイソアルファ酸、ヘキサヒドロイソアルファ酸、及びテトラヒドロイソアルファ酸では、最高用量の５μｇ／ｍｌである。キサントフモール、使用済ホップ、及びヘキサヒドロコルプロンでは、アジポネクチン分泌の最大増加が観測されたのは、それぞれ１．２５、２５、及び１２．５μｇ／ｍｌである。キサントフモール、Ｒｈｏイソアルファ酸、及び使用済ホップでは、観測される最大相対アジポネクチン発現がトログリタゾンに匹敵していたが、ヘキサヒドロイソアルファ酸、ヘキサヒドロコルプロン、及びテトラヒドロイソアルファ酸では、対照より大きいものの、トログリタゾンよりは小さかった。
【０２９１】
表２０
Ｈｏｆｓｔｅｅプロットのｙ切片と傾きよりそれぞれ推定される、最大アジポネクチン分泌と半最大アジポネクチン分泌に必要な試験材料の濃度
【０２９２】
【表３０】
2009504657.tif 000032
【０２９３】
表２０に見られるように、改良Ｈｏｆｓｔｅｅプロットより導かれる最大アジポネクチン分泌の推定値は、上記の観察事実を裏付けた（図２０）。最大アジポネクチン分泌のｙ切片推定値は、ほぼ３つの群へ分類された：（１）イソアルファ酸、（２）キサントフモール、Ｒｈｏイソアルファ酸、トログリタゾン、及び使用済ホップ、並びに（３）ヘキサヒドロイソアルファ酸、ヘキサヒドロコルプロン、及びテトラヒドロイソアルファ酸。インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１細胞における半最大アジポネクチン分泌の刺激に必要とされる試験材料の濃度はほぼ０．１μｇ／ｍｌであり、トログリタゾン、Ｒｈｏイソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、及びヘキサヒドロイソアルファ酸で同等であった。イソアルファ酸の半最大アジポネクチン分泌での濃度は０．４９μｇ／ｍｌであり、ほぼ５倍大きかった。キサントフモールは０．０３７μｇ／ｍｌと推定される、半最大アジポネクチン分泌の最低用量を明示した。使用済ホップとヘキサヒドロコルプロンでは、推定される半最大アジポネクチン分泌変数の最高濃度が見られ、それぞれ２．８及び３．２μｇ／ｍｌであった。
【０２９４】
インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌｌ細胞においてアジポネクチン分泌を高めるその能力に基づけば、本試験で見られた陽性のホップ植物化学成分であるイソアルファ酸、Ｒｈｏ−イソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、ヘキサヒドロイソアルファ酸、キサントフモール、使用済ホップ、及びヘキサヒドロコルプロンは、血漿アジポネクチン濃度が低下しているすべての臨床病理に対して陽性の効果を及ぼすことが期待されよう。
【０２９５】
実施例２２
ホップ植物化学品は、インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞において、アジポネクチン分泌の亢進とインターロイキン−６分泌の阻害を介して抗炎症活性を明示する。
【０２９６】
モデル−本実験では、実施例１１に記載のような３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを使用した。アジポネクチンとＩＬ−６は、それぞれ実施例１２及び１８に記載のようにアッセイした。標準化学品、ホップ化合物のＲＩＡＡ、ＩＡＡ、ＴＨＩＡＡ、ＨＨＩＡＡ、キサントフモール、ヘキサヒドロコルプロン、使用済ホップについては、実施例１２及び２０に記載の通りであった。
【０２９７】
統計計算と解釈−すべてのアッセイを同一２検体で実施した。統計解析のために、アジポネクチン又はＩＬ−６分泌に対するホップ誘導体の効果を溶媒対照に比較して計算した。分散分析を多変量比較の補正なしに使用して用量間の違いを決定して、第Ｉ種誤差の名義５％確率を選択した。
【０２９８】
結果−トログリタゾンと試験したすべてのホップ誘導体は、高濃度のインスリンの存在下でアジポネクチン分泌を高めた（表２１）。トログリタゾンは、このモデルにおいて、ＩＬ−６分泌を減少させなかった。事実、トログリタゾンとＨＨＣＬがＩＬ−６分泌を高める２つの濃度を明示したのに対して、ＴＨＩＡＡと使用済ホップは、最高濃度でＩＬ−６を増加させたが、他の濃度では、効果がなかった。他のホップ誘導体のＩＬ−６分泌に対する効果は、概ね二相性であった。試験した最高濃度で、ＲＩＡＡ、ＨＨＩＡＡ、及びＸＮは、ＩＬ−６分泌を増加させたが、ＩＡＡだけがそれを増加させなかった。ＲＩＡＡ、ＩＡＡ、ＴＨＩＡＡ、及びＸＮでは、ＩＬ−６分泌の有意な減少が認められた。
【０２９９】
表２１
インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるアジポネクチン及びインターロイキン−６の分泌に対するホップ化合物の効果
【０３００】
【表３１】
2009504657.tif 000033
【０３０１】
アジポネクチン／ＩＬ−６比（全体的な抗炎症効果の測定基準）は、ＲＩＡＡ、ＩＡＡ、ＨＨＩＡ、及びＸＮできわめて陽性（＞２．００）であった。ＴＨＩＡＡ、ＨＨＣＬ、及び使用済ホップは、より低いが、陽性のアジポネクチン／ＩＬ−６比を明示した。トログリタゾンでは、アジポネクチン／ＩＬ−６比は、２．５及び０．６２５μｇ／ｍｌでの強い陽性の応答と５．０又は１．２５μｇ／ｍｌでの無効が混在していた。
【０３０２】
このデータは、脂肪細胞における高インスリン血症の好炎症効果をホップ誘導体のＲＩＡＡ、ＩＡＡ、ＨＨＩＡ、ＴＨＩＡＡ、ＸＮ、ＨＨＣＬ、及び使用済ホップで弱めることができることを示唆する。概して言えば、高インスリン血症状態（ＴＮＦαによる併発症を伴わない高インスリン血症）におけるホップ誘導体の抗炎症効果は、トログリタゾンのそれより首尾一貫していた。
【０３０３】
実施例２３
ホップ植物化学品は、ＴＮＦα処理３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞においてアジポネクチン分泌を増加させる。
【０３０４】
モデル−本実験では、実施例１１に記載のような３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを使用した。標準化学品とホップ化合物のＩＡＡ、ＲＩＡＡ、ＨＨＩＡＡ、及びＴＨＩＡＡは、それぞれ実施例１３及び２０に記載の通りであった。ホップ誘導体は、０．６２５、１．２５、２．５、及び５．０μｇ／ｍｌの濃度で試験した。アジポネクチンは、実施例１２に記載のようにアッセイした。
【０３０５】
結果−５日目（Ｄ５）の３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を１０ｎｇ  ＴＮＦα／ｍｌで一晩処理すると、アジポネクチン分泌を顕著に抑制した（図２１）。ホップ誘導体のＩＡＡ、ＲＩＡＡ、ＨＨＩＡＡ、及びＴＨＩＡＡは、いずれもＴＮＦα／溶媒対照に比べてアジポネクチン分泌を増加させた。ＲＩＡＡとＨＨＩＡＡでは線形の用量−応答曲線が観察されて、試験した最高濃度の５．０μｇ／ｍｌで最大の阻害を生じた。ＩＡＡがアジポネクチンの最大分泌を１．２５μｇ／ｍｌで誘発したのに対し、ＴＨＩＡＡは、曲線の応答を明示して、最大のアジポネクチン分泌は５．０μｇ／ｍｌであった。
【０３０６】
超生理学的な濃度のＴＮＦαの存在下に脂肪細胞アジポネクチン分泌を増加させる、ホップ誘導体のＩＡＡ、ＲＩＡＡ、ＨＨＩＡＡ、及びＴＨＩＡＡの能力は、次善の脂肪細胞機能が関与する炎症状態の予防又は治療におけるこれらの化合物の有用性を支持するものである。
【０３０７】
実施例２４
３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞における脂肪生成及びアジポネクチン分泌を改変させる、Acacia catechu 製剤のホップ誘導体との相乗的な相互作用
モデル−本実験では、実施例１１及び１３に記載のような３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを使用した。
【０３０８】
試験化学品と処理−使用する標準化学品は、実施例１１及び１３に記載の通りであった。３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を、脂肪生成指数を計算するために、実施例１１のように分化に先立って処理するか、又はアジポネクチン指数を評価するために、実施例１２に記載のようにＴＮＦαで処理した。実施例１４に記載のような Acacia catechu 試料＃５６６９を先に記載のようなホップ誘導体のＲｈｏ−イソアルファ酸及びイソアルファ酸とともに使用した。Acacia catechu と、Ａｃａｃｉａ：ＲＩＡＡ及びＡｃａｃｉａ：ＩＡＡの５：１及び１０：１の組合せを、５０、１０、５．０、及び１．０μｇ／ｍｌで試験した。ＲＩＡＡとＩＡＡは、５．０、２．５、１．２５、及び０．６２５μｇ／ｍｌで独立して試験した。
【０３０９】
計算−Ａｃａｃｉａ／ホップ組合せの予測される脂肪生成応答及びアジポネクチン分泌の評価は、先に記載のように行なった。
結果−試験したすべての組合せが、試験した１以上の濃度で、脂肪生成シナジーを明示した（表２２）。Ａｃａｃｉａ：ＲＩＡＡの組合せは、Ａｃａｃｉａ：ＩＡＡの組合せより全般により活性であり、Ａｃａｃｉａ：ＲＩＡＡ［５：１］は、すべての用量でシナジーを明示して、Ａｃａｃｉａ：ＲＩＡＡ［１０：１］は、１０及び５．０μｇ／ｍｌで相乗的であって、試験したどの濃度でも拮抗的ではなかった。Ａｃａｃｉａ：ＩＡＡ［１０：１］の組合せも、２つの中間用量で相乗的で、拮抗作用を示さなかった。Ａｃａｃｉａ：ＩＡＡ［５：１］は、５０μｇ／ｍｌの濃度では相乗的であったが、５．０μｇ／ｍｌ用量では、拮抗的であった。
【０３１０】
同様に、すべての組合せが、試験した１以上の濃度で、アジポネクチン分泌を増加させることに関してシナジーを明示した（表２３）。Ａｃａｃｉａ：ＩＡＡ［１０：１］はすべての用量でシナジーを明示したが、Ａｃａｃａ：ＲＩＡＡ［５：１］とＡｃａｃｉａ：ＲＩＡＡ［１０：１］は、３つの用量で相乗的で、１つの濃度で拮抗的であった。Ａｃａｃｉａ：ＩＡＡ［５：１］の組合せは、１．０μｇ／ｍｌで相乗的で、１０μｇ／ｍｌより高い濃度では、拮抗的であった。
【０３１１】
表２２
インスリン抵抗性３Ｔ３−１モデルにおいて Acacia catechu とホップ誘導体により誘発される脂肪生成応答の観測値と予測値
【０３１２】
【表３２】
2009504657.tif 000034
【０３１３】
表２３
ＴＮＦα／３Ｔ３−１モデルにおいて Acacia catechu とホップ誘導体により誘発されるアジポネクチン分泌の観測値と予測値
【０３１４】
【表３３】
2009504657.tif 000035
【０３１５】
Acacia catechu とホップ誘導体のＲｈｏイソアルファ酸又はイソアルファ酸の組合せは、脂肪細胞における脂質取込みを増加させることと脂肪細胞からのアジポネクチン分泌を増加させることに関して、相乗的な組合せとごくわずかな拮抗の組合せを明示する。
【０３１６】
実施例２５
リポ多糖／３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞モデルにおけるホップ誘導体の抗炎症活性
モデル−本実験では、実施例１１及び１３に記載のような３Ｔ３−Ｌ１マウス脂肪細胞モデルを使用した。
【０３１７】
試験化学品と処理−標準化学品は、実施例１１及び１３に記載の通りであったが、Ｄ５には、ＴＮＦαの代わりに１００ｎｇ／ｍｌの細菌リポ多糖（ＬＰＳ，シグマ、ミズーリ州セントルイス）を使用した。使用するホップ誘導体のＲｈｏ−イソアルファ酸及びイソアルファ酸は、実施例２０に記載の通りであった。非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）のアスピリン、サリチル酸、及びイブプロフェンをシグマより入手した。セレコキシブの市販カプセル製剤（ＣｅｌｅｂｒｅｘＴＭ，Ｇ．Ｄ．サール社、イリノイ州シカゴ）を使用して、有効成分の含量に基づいて、細胞に投薬した。ホップ誘導体、イブプロフェン、及びセレコキシブは、５．００、２．５０、１．２５、及び０．６２５μｇ／ｍｌで投薬した。インドメタシン、トログリタゾン、及びピオグリタゾンは、１０、５．０、１．０、及び０．５０μｇ／ｍｌで試験した。アスピリンの濃度は、１００、５０．０、２５．０、及び１２．５μｇ／ｍｌであり、一方、サリチル酸のそれは、２００、１００、５０．０、及び２５．０μｇ／ｍｌであった。ＩＬ−６とアジポネクチンについてアッセイして、データを解析して、ＩＬ−６については実施例１８に、そしてアジポネクチンについては実施例１３にすでに記載のように作表した。
【０３１８】
結果−ＬＰＳは、Ｄ５脂肪細胞において、ＩＬ−６の１２倍の刺激をもたらした。すべての試験薬剤が、ＬＰＳ刺激脂肪細胞によるＩＬ−６分泌を様々な度合いで抑制した。ＩＬ−６の最大阻害と、この最大阻害を観測した濃度を表２４に提示する。処理内の比較的大きな変動のために、ＩＬ−６の最大阻害の程度は、試験材料間で差がなかった。しかしながら、最大阻害が起こる用量は、著しく異なっていた。ＩＬ−６阻害の効力の順位は、イブプロフェン＞ＲＩＡＡ＝ＩＡＡ＞セレコキシブ＞ピオグリタゾン＝インドメタシン＞トログリタゾン＞アスピリン＞サリチル酸であった。定性的なベースで言えば、インドメタシン、トログリタゾン、ピオグリタゾン、イブプロフェン、及びセレコキシブは、試験したすべての濃度でＩＬ−６分泌を阻害したが、ＲＩＡＡ、ＩＡＡ、及びアスピリンは、最低濃度では、ＩＬ−６を有意には阻害しなかった（データ示さず）。
【０３１９】
Ｄ５  ３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞のＬＰＳ処理は、ＤＭＳＯ対照に対してアジポネクチン分泌を減少させた（表２５）。すべての化合物が分泌をある程度阻害したＩＬ−６阻害とは違って、アスピリン、サリチル酸、及びセレコキシブは、試験したいずれの用量でも、ＬＰＳ処理３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞においてアジポネクチン分泌を誘導することができなかった。トログリタゾン、ＲＩＡＡ、ＩＡＡ、及びイブプロフェンでは、０．６２５μｇ／ｍｌで、それぞれ１５、１７、２０、及び２２％の最大アジポネクチン刺激を観測した。ピオグリタゾンは、アジポネクチン刺激の効力の順位で二番手にあり、１．２５μｇ／ｍｌで１２％の刺激であった。インドメタシンは、２．５０μｇ／ｍｌでアジポネクチン分泌を９％刺激して、活性のある試験材料の中では、最も弱い効力であった。
【０３２０】
ＬＰＳ／３Ｔ３−Ｌ１モデルにおいて、ホップ誘導体のＲＩＡＡ及びＩＡＡ、並びにイブプロフェンは、in vivo で得られる可能性がある濃度で、ＩＬ−６分泌を減少させて、アジポネクチン分泌を増加させた。チアゾリジンジオンのトログリタゾン及びピオグリタゾンは、ＩＬ−６分泌の阻害剤としてさほど強力ではなく、ホップ誘導体より高用量を必要としたが、アジポネクチン刺激に関しては、ホップ誘導体と同等であった。ＮＳＡＩＤのインドメタシン、アスピリン、イブプロフェン、及びセレコキシブでは、マクロファージモデルと脂肪細胞モデルの抗炎症活性の間に、首尾一貫した関係が観察されなかった。
【０３２１】
表２４
ホップ誘導体と選択されたＮＳＡＩＤによる、ＬＰＳ／３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるＩＬ−６分泌の最大阻害
【０３２２】
【表３４】
2009504657.tif 000036
【０３２３】
表２５
ホップ誘導体と選択されたＮＳＡＩＤによる、ＬＰＳ／３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるアジポネクチン分泌の最大刺激
【０３２４】
【表３５】
2009504657.tif 000037
【０３２５】
実施例２６
ＴＮＦα／３Ｔ３−１モデルにおける、クルクミン又はキサントフモールと組み合わせた Acacia catechu 又はホップ誘導体のシナジー
モデル−本実験では、実施例１１及び１３に記載のような３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを使用した。
【０３２６】
試験化学品と処理−使用する標準化学品は、実施例１１及び１３に記載の通りであった。３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を、アジポネクチン指数を評価するために実施例１３に記載のようにＴＮＦαで処理した。本実験では、実施例１４に記載のような Acacia catechu 試料＃５６６９、実施例２０に記載のようなホップ誘導体Ｒｈｏ−イソアルファ酸及びキサントフモール、そしてＭｅｔａｇｅｎｉｃｓ（ワシントン州ギグ・ハーバー）により提供されるクルクミンを使用した。Acacia catechu と、Ａｃａｃｉａ：クルクミン及びＡｃａｃｉａ：キサントフモールの５：１の組合せを５０、１０、５．０、及び１．０μｇ／ｍｌで試験した。ＲＩＡＡと、クルクミン及びＸＮでの１：１の組合せを１０、５、１．０、及び０．５０μｇ／ｍｌで試験した。
【０３２７】
計算−この組合せの予測アジポネクチン指数の評価とシナジーの決定を先に記載のように行なった。
結果−ＴＮＦαは、アジポネクチン分泌を溶媒だけの対照の約５０パーセントまで低下させた。陽性対照のピオグリタゾンは、アジポネクチン分泌を８０パーセント増加させた（表２６）。Ａｃａｃｉａのクルクミン又はＸＮとの組合せは、より高い濃度で拮抗的であり、より低い濃度で相乗的であることがわかった。同様に、ＲＩＡＡとクルクミンは、３つの高用量で拮抗的であるが、最低用量の１．０μｇ／ｍｌでは、きわめて相乗的であった。２つのホップ誘導体、ＲＩＡＡとＸＮは、ＴＮＦα刺激３Ｔ３−Ｌ１細胞からのアジポネクチン分泌においてシナジーを明示しなかった。
【０３２８】
ＴＮＦα処理３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞において、ＡｃａｃｉａとＲＩＡＡは、アジポネクチン分泌を相乗的に増加させたが、ＸＮとのシナジーを明示したのは、Ａｃａｃｉａだけである。
【０３２９】
表２６
ＴＮＦα／３Ｔ３−１モデルにおける、クルクミン又はキサントフモールと組み合わせた Acacia catechu 及びホップ誘導体のシナジー
【０３３０】
【表３６】
2009504657.tif 000038
【０３３１】
実施例２７
インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞モデルにおける、ホップ誘導体のＲｈｏ−イソアルファ酸と組み合わせた共役リノール酸による脂肪生成の in vitro シナジー
モデル−本実験では、実施例１１及び１３に記載のような３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを使用した。
【０３３２】
試験化学品と処理−使用する標準化学品は、実施例１１に記載の通りであった。３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を、脂肪生成指数を計算するために実施例１１のように分化に先立って処理した。粉末化ＣＬＡをＬｉｐｉｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ（イリノイ州シャンナホン）より入手して、ｃ９ｔ１１及びｔ１０ｃ１２の異性体の１：１混合物として記載した。ＣＬＡと、ＣＬＡ：ＲＩＡＡの５：１の組合せを５０、１０、５．０、及び１．０μｇ／ｍｌで試験した。ＲＩＡＡについては、先に記載のような予測脂肪生成指数の計算のために１０、１．０、及び０．１μｇ／ｍｌで試験した。
【０３３３】
結果−ＲＩＡＡは、ＣＬＡとの組合せにおいてトリグリセリド含量を相乗的に増加させた。すべての用量でシナジーを認めた（表２７）。
ＣＬＡとＲＩＡＡの間のシナジーは、広範囲の用量で観察されて、ＣＬＡのインスリン増感効力を高めるために潜在的に使用することができる。
【０３３４】
表２７
インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞モデルにおける、Ｒｈｏ−イソアルファ酸と組み合わせた共役リノール酸による脂肪生成のシナジー
【０３３５】
【表３７】
2009504657.tif 000039
【０３３６】
実施例２８
ホップ植物化学品は、ＴＮＦα処理３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞においてＮＦ−κＢ活性化を阻害する
モデル−本実験では、実施例１１に記載のような３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを使用した。
【０３３７】
細胞培養と処理−分化に続いて、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を分化後培地にさらに４０日間維持した。標準化学品、培地、及びホップ化合物のＲＩＡＡ及びキサントフモールは、実施例１３及び２０に記載の通りであった。ホップ誘導体と陽性対照のピオグリタゾンについて、２．５及び５．０μｇ／ｍｌの濃度で試験した。ＴＮＦαでの処理に先立つ１時間前に試験材料を加えて、その処理の３及び２４時間後に核抽出物を調製した。
【０３３８】
ＥＬＩＳＡ−３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を増殖培地に分化後４０日間維持した。Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ（カリフォルニア州カールスバッド）からのＴｒａｎｓＡＭＴＭＮＦ−ｋＢキットを変更なしに使用して、核のＮＦ−κＢｐ６５を定量した。このキットに提供されるＪｕｒｋａｔ核抽出物は、５０ｎｇ／ｍｌ  ＴＰＡ（ホルボール、１２−ミリステート、１３−アセテート）及び０．５μＭカルシウムイオノフォアＡ２３１８７を補充した培地に３７℃で２時間培養した直後に採取する細胞に由来した。
【０３３９】
タンパク質アッセイ−Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（活性モチーフ蛍光タンパク定量キット）を使用して、核タンパク質を定量した。
【０３４０】
統計解析−スチューデントの片側ｔ検定を使用して、比較を実施した。第Ｉ種誤差の確率を名義５％水準に設定した。
結果−ＴＰＡ処理Ｊｕｒｋａｔ核抽出物は、ＮＦ−ｋＢｐ６５の予測された増加を明示して、キット試薬の十分な性能を示した（図２２）。Ｄ４０  ３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を１０ｎｇ  ＴＮＦα／ｍｌで３時間（図２２Ａ）又は２４時間（図２２Ｂ）処理すると、核ＮＦ−ｋＢｐ６５をそれぞれ２．１及び２．２倍増加させた。予測されるように、ＰＰＡＲγアゴニストのピオグリタゾンは、ＴＮＦα処理後３時間でも２４時間でも核ＮＦ−ｋＢｐ６５の量を阻害しなかった。５．０及び２．５μｇ  ＲＩＡＡ／ｍｌでは、ＴＮＦαの３時間後に、ＮＦ−ｋＢｐ６５の核移行がそれぞれ９．４及び２５％阻害された。２４時間では、５．０  ＲＩＡＡ／ｍｌの処理だけがＮＦ−ｋＢｐ６５の核移行の有意な（ｐ＜０．０５）阻害を明示した。キサントフモールは、ＮＦ−ｋＢｐ６５の核移行を、５．０及び２．５μｇ／ｍｌで、ＴＮＦα処理後３時間ではそれぞれ１５．６及び６．９％、そして２４時間では１３．４及び８．０％阻害した。
【０３４１】
ＲＩＡＡとキサントフモールはともに、ＴＮＦαで処理したインスリン抵抗性の成熟脂肪細胞において、ＮＦ−ｋＢｐ６５の核移行の、わずかであるが首尾一貫した阻害を明示した。この結果は、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるＮＦ−ｋＢｐ６５の核移行を阻害することが示されたことはないとする、ＰＰＡＲγアゴニストについて記載されている結果とは異なるものである。
【０３４２】
実施例２９
Acacia catechu 抽出物とメトホルミンは、インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるトリグリセリド取込みを相乗的に増加させる。
【０３４３】
モデル−本実験では、実施例１１に記載のような３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを使用した。使用するすべての化学品及び手順は、実施例１１に記載の通りであった。
試験化学品と処理−メトホルミンは、シグマ（ミズーリ州セントルイス）より入手した。試験材料は、ジメチルスルホキシドにおいて、分化の０日目と成熟期（６／７日目）を通して２日毎に加えた。陽性対照として、トログリタゾンを加えて、４．４μｇ／ｍｌの最終濃度とした。メトホルミン、Acacia catechu 試料＃５６６９、及びメトホルミン／Ａｃａｃｉａの１：１（ｗ／ｗ）の組合せについて、５０μｇ／ｍｌの試験材料で試験した。分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞を０．２％オイルレッドＯで染色した。生じる染色した油滴をイソプロパノールで溶かして、５３０ｎｍでの分光光度分析により定量した。完全に分化した細胞の溶媒対照中での相対トリグリセリド含量として結果を表した。
【０３４４】
計算−関係式：１／ＬＩ＝Ｘ／ＬＩｘ＋Ｙ／ＬＩｙ（ここでＬＩ＝脂肪生成指数、ＸとＹは、試験混合物中の各成分の相対分数であり、Ｘ＋Ｙ＝１）を使用して、メトホルミン／Acacia catechu 抽出物の予測脂肪生成効果の推定を行なった。推定ＬＩの平均が対応する観測分数の推定値の９５％信頼区間の外側にあれば、シナジーが推量された。シナジーの定義は、成分の各効果と組合せの効果の比較に関わるものであり、Berenbaum［Berenbaum, M. C.「シナジーとは何か？（What is synergy ?）」Pharmacol Rev 41 (2), 93-141, (1989)］により記載された。
【０３４５】
結果−Acacia catechu 抽出物は、きわめて脂肪生成であり、３Ｔ３−Ｌ１細胞のトリグリセリド含量を３２パーセント高めて（図２３）、１．３２の脂肪生成指数を生じた。メトホルミン単独では、０．７９の脂肪生成指数であり、脂肪生成でなかった。メトホルミン／Acacia catechu 抽出物の組合せは、１．３５の観測脂肪生成指数を明示した。メトホルミン／Acacia catechu 抽出物は、９８の予測脂肪生成指数であり、観測脂肪生成指数が予測値の２つの９５％信頼限界の外側にあったので、シナジーを明示した。
【０３４６】
３Ｔ３−Ｌ１細胞において明示された脂肪生成の潜在能力に基づけは、メトホルミン及び Acacia catechu 抽出物の１：１の組合せは、臨床使用において相乗的に挙動することが期待されよう。そのような組合せは、血漿トリグリセリドを減少させること、又はメトホルミン効果の期間を延長させることといった、メトホルミン療法のポジティブな利益の範囲を増加させることに有用であろう。
【０３４７】
実施例３０
インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞モデルにおける、ホップ誘導体とチアゾリジンジオンによる脂肪生成の in vitro シナジー
モデル−本実験では、実施例１１及び１３に記載のような３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを使用した。
【０３４８】
試験化学品と処理−使用する標準化学品は、実施例１１に記載の通りであった。３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を、脂肪生成指数を計算するために実施例１１に記載のように分化に先立って処理した。トログリタゾンは、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（イリノイ州シカゴ）より入手した。ピオグリタゾンは、市販の錠剤製剤（ＡＣＴＯＳＥ（登録商標）（Ｔａｋｅｄａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，イリノイ州リンカーンシア）として入手した。この錠剤を粉砕して、全粉末をアッセイに使用した。すべての結果は、有効成分含量に基づいて計算した。使用するホップ誘導体のＲｈｏ−イソアルファ酸及びイソアルファ酸は、実施例２０に記載の通りであった。トログリタゾンは、ＲＩＡＡ及びＩＡＡと組み合わせて４．０μｇ／ｍｌで試験し、一方、より強力なピオグリタゾンは、ＲＩＡＡ及びＩＡＡとの１：１の組合せにおいて２．５μｇ／ｍｌで試験した。また、実施例３４に記載のような予測脂肪生成指数の計算のために、すべての材料を４．０及び２．５μｇ／ｍｌで独立して試験した。
【０３４９】
結果−トログリタゾン又はピオグリタゾンとともにそれぞれ４．０及び２．５μｇ／ｍで試験するとき、Ｒｈｏ−イソアルファ酸とイソアルファ酸は、インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞モデルにおいて、このチアゾリジンジオンと相乗的にトリグリセリド合成を高めた（表２８）。
【０３５０】
ホップ誘導体のＲｈｏ−イソアルファ酸及びイソアルファ酸は、チアゾリジンジオンのインスリン増感効果を相乗的に高めて、用量低下又は好ましく応答する患者数の増加という潜在的な臨床上の利益をもたらす可能性がある。
【０３５１】
表２８
インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞モデルにおけるホップ誘導体及びチアゾリジンジオンの in vitro 合成
【０３５２】
【表３８】
2009504657.tif 000040
【０３５３】
実施例３１
ＴＮＦα／３Ｔ３−Ｌｌ脂肪細胞モデルにおけるＲｈｏ−イソアルファ酸及びメトホルミンの in vitro シナジー
モデル−本実験では、実施例１１に記載のような３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを使用した。使用する標準化学品と脂肪細胞の１０ｎｇ  ＴＮＦα／ｍｌでの処理は、それぞれ実施例１１及び１３に記載する通りであった。
【０３５４】
試験材料と細胞処理−メトホルミンは、シグマ（ミズーリ州セントルイス）より入手して、Ｒｈｏ−イソアルファ酸は、実施例２０に記載の通りであった。１μｇ  ＲＩＡＡ／ｍｌを伴うか又は伴わずにメトホルミンを５０、１０、５．０、又は１．０μｇ／ｍｌで、１０ｎｇ  ＴＮＦα／ｍｌと同時にＤ５  ３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞へ加えた。実施例１１に詳述したように、６日目に培養基上清についてＩＬ−６をアッセイした。メトホルミン：ＲＩＡＡ混合物のＩＬ−６阻害に対する予測効果の推定を先に記載のように行なった。
【０３５５】
結果−ＴＮＦαは、Ｄ５脂肪細胞中でのＩＬ−６分泌において６倍の増加をもたらした。トログリタゾンが１μｇ／ｍｌでＩＬ−６分泌を対照に対して３４パーセント阻害する一方で、１μｇのＲＩＡＡは、ＩＬ−６分泌を対照に対して２４パーセント阻害した（表２９）。メトホルミンは、１μｇ  ＲＩＡＡ／ｍｌとの組合せにおいて、５０μｇ／ｍｌの濃度でシナジーを、１μｇ／ｍｌの濃度で強いシナジーを明示した。メトホルミン５０μｇ／ｍｌでは、１μｇのＲＩＡＡがこの混合物においてさらに１０パーセント阻害をもたらしたのに対し、１μｇのメトホルミンでは、１μｇのＲＩＡＡがＩＬ−６阻害を３５パーセント増加させた。メトホルミン：ＲＩＡＡの組合せでは、２つの中間用量で拮抗作用と無効がそれぞれ見られた。
【０３５６】
メトホルミンとＲｈｏ−イソアルファ酸の組合せは、高い濃度と低い濃度の両方で相乗的に機能して、ＴＮＦα処理３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞からのＩＬ−６分泌を低下させる。
【０３５７】
表２９
ＴＮＦα／３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるＩＬ−６分泌の、ホップＲｈｏ−イソアルファ酸及びメトホルミンによる相乗阻害
【０３５８】
【表３９】
2009504657.tif 000041
【０３５９】
実施例３２
癌細胞増殖に対する試験化合物の in vitro 効果
本実験は、本発明のいくつかの試験化合物について、癌細胞増殖に対する in vitro での直接的な阻害効果を実証する。
【０３６０】
方法−本発明の試験化合物の癌細胞増殖に及ぼす阻害効果をＲＬ９５−２子宮内膜癌細胞モデル（ＡＫＴキナーゼの過剰発現体）とＨＴ−２９（ＣＯＸ−２を構成的に発現する）及びＳＷ４８０（活性化ＡＫＴキナーゼを構成的に発現する）結腸癌細胞モデルにおいて検証した。簡潔に言えば、標的細胞を９６ウェル組織培養プレートへプレート培養して、そのまま亜周密まで増殖させた。次いで、この細胞を実施例４に記載のような様々な量の試験化合物で７２時間処理して、ＣｙＱｕａｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州カールスバッド）の市販蛍光アッセイによって相対的な細胞増殖を定量した。
【０３６１】
結果−ＲＬ９５−２細胞を１０μｇ／ｍｌのＭｇＤＨＩＡＡ（ｍｇＲｈｏ）、ＩＡＡ、ＴＨＩＡＡ、ＴＨ−ＨＨＩＡＡ（ＴＨＩＡＡ及びＨＨＩＡＡの１：１混合物）、Ｘｎ（キサントフモール）、ＬＹ（ＬＹ２４９００２，ＰＤＫ阻害剤）、ＥｔＯＨ（エタノール）、アルファ（アルファ酸混合物）、及びベータ（ベータ酸混合物）で７２時間処理した。細胞増殖に対する相対阻害を図２４として提示して、キサントフモールでは、ＤＭＳＯ溶媒対照に比べて５０％より大きい阻害を示す。図２５及び２６は、様々な濃度のＲＩＡＡ又はＴＨＩＡＡの、それぞれＨＴ−２９及びＳＷ４８０癌細胞に対する用量応答の結果を表示する。ＲＩＡＡ及びＴＨＩＡＡのメジアン阻害濃度は、ＨＴ−２９細胞系で３１及び１０μＭであり、ＳＷ４８０細胞系で３８及び３．２μＭであった。
【０３６２】
実施例３３
ＫＫ−Ａｙマウス糖尿病モデルにおける Acacia nilotica 及びホップ誘導体の in vivo 血糖降下作用
モデル−雄性、９週齢、平均４０±５グラムのＫＫ−Ａｙ／Ｔａマウスを使用して、絶食時血清グルコース又はインスリンの濃度を低下させる試験材料の潜在能力を評価した。このマウスの系統は、１９４０年代に糖尿病のモデルとして開発されたＫＫ系統とモデルＡｙ／遺伝子型の系統の間の交雑の結果である。観察される表現型は、まだ完全には特徴づけられていないが、少なくとも４つの定量的な形質の遺伝子座が同定された多遺伝子突然変異の結果である。このうちの１つは、レプチン受容体中のミスセンス突然変異に関連している。この突然変異があるにもかかわらず、この受容体は、十分に効率的ではないかもしれないが、依然として機能的である。ＫＫ系統は、インスリン非感受性とグルコース不耐性に関連するが、明白な高血糖症とは関連しない糖尿病を発症する。Ａｙ突然変異の導入は、肥満と高血糖症を引き起こす。Ａｙ突然変異は、アグーチ遺伝子座に対して５’にあって、アグーチをＲａｌｙプロモーターの制御下に置くＲａｌｙ遺伝子の１７０ｋｂの欠失である。ホモ接合体の動物は、着床前に死亡する。
【０３６３】
試験材料−実施例１４に記載のような Acacia nilotica 試料＃５６５９と実施例２０に記載のようなホップ誘導体のＲｈｏ−イソアルファ酸、イソアルファ酸、及びキサントフモールを使用した。Acacia nilotica、ＲＩＡＡ、及びＩＡＡを１００ｍｇ／ｋｇ／日で投与する一方で、ＸＮは２０ｍｇ／ｋｇで投薬した。追加的に、Acacia nilotica のＲＩＡＡ、ＩＡＡ、及びＸＮとの５：１及び１０：１の組合せを製剤化して、１００ｍｇ／ｋｇ／日で投薬した。
【０３６４】
試験手順−試験物質は、各群５匹の動物へ０．２％  Ｔｗｅｅｎ−８０中のガバージュにより毎日投与した。初回投薬の前と第三回及び最終投薬の９０分後に血清を後眼窩より採取した。ムタロターゼ／グルコースオキシダーゼ法により非絶食時血清グルコースを酵素的に定量して、マウス特異的ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定）により血清インスリンを定量した。
【０３６５】
データ解析−試験物質が対照に対して血清グルコース又はインスリンを減少させるかどうかを評価するために、各マウスについて、はじめに、投薬後グルコース及びインスリンの数値を処理前パーセントとして投薬前濃度に対して正規化した。処理前パーセントの限界値（片側、対照マウスの９５％信頼区間より低い）をグルコース及びインスリンの変数の両方に対して計算した。試験材料のそれぞれの処理前パーセント値を対照の限界値と比較した。対照の限界値より低い試験材料の処理前パーセント値を対照より有意に異なる（ｐ＜０．０５）とみなした。
【０３６６】
結果−３日の処理期の間、非絶食の血清グルコースが２．６％増加する一方、血清インスリンは、対照マウスにおいて６．７％減少した。ロシグリタゾン、Acacia nilotica、ＸＮ：Ａｃａｃｉａ［１：５］、ＸＮ：Ａｃａｃｉａ［１：１０］、Ａｃａｃｉａ：ＲＩＡＡ［５：１］、キサントフモール、Ａｃａｃｉａ：ＩＡＡ［５：１］、異性化アルファ酸、及びＲｈｏ−イソアルファ酸は、いずれも対照に比べて、非絶食時血清グルコースを減少させたが、血清インスリンに対しては無効であった。Ａｃａｃｉａ：ＲＩＡＡ［１０：１］とＡｃａｃｉａ：ＩＡＡ［１０：１］は、血清グルコースにもインスリンにも効果がなかった（表３０）。
【０３６７】
２型糖尿病のＫＫ−Ａｙマウスモデルにおける Acacia nilotica 試料＃５６５９、キサントフモール、異性化アルファ酸、Ｒｈｏ−イソアルファ酸、及びそれらの様々な組合せの速やかな血糖降下効果は、高血糖症と関連したヒト疾患の治療における臨床効果への潜在能力を裏付ける。
【０３６８】
表３０
ＫＫ−Ａｙ糖尿病マウスの非絶食時血清グルコース及びインスリンに対する Acacia nilotica 及びホップ誘導体の効果
【０３６９】
【表４０】
2009504657.tif 000042
【０３７０】
実施例３４
糖尿病ｄｂ／ｄｂマウスモデルにおける Acacia nilotica 及びホップ誘導体の in vivo シナジー
モデル−雄性のＣ５７ＢＬＫＳ／Ｊ  ｍ＋／ｍ＋  Ｌｅｐｒｄｂ（ｄｂ／ｄｂ）マウスを使用して、絶食時血清グルコース又インスリンの濃度を低下させる試験材料の潜在能力について評価した。この系統のマウスは、機能性レプチン受容体の非存在のためにレプチンに対して抵抗性である。血漿インスリンの上昇は、１０〜１４日目に、そして血糖の上昇は、４〜８週目に始まる。試験時（９週目）には、動物が顕著に肥満（５０±５ｇ）になり、島肥大の証拠を明示した。
【０３７１】
試験材料−陽性対照のメトホルミンとロシグリタゾンをそれぞれ３００ｍｇ／ｋｇ／日と１．０ｍｇ／ｋｇ／日で３連続日の毎日投薬した。Acacia nilotica 試料＃５６５９、ホップ誘導体、及びそれらの組合せを先に記載のように投薬した。
【０３７２】
試験手順−試験物質は、０．２％  Ｔｗｅｅｎ−８０中のガバージュにより毎日投与した。初回投薬の前と第三回及び最終投薬の９０分後に血清を後眼窩より採取した。ムタロターゼ／グルコースオキシダーゼ法により非絶食時血清グルコースを酵素的に定量して、マウス特異的ＥＬＩＳＡにより血清インスリンを定量した。
【０３７３】
結果−陽性対照のメトホルミン及びロシグリタゾンは、血清グルコース及びインスリンの濃度を対照に対してともに減少させた（表３１）。単一の試験材料として許容される結果を示したのは、ＲＩＡＡとＸＮだけである。ＲＩＡＡが血清インスリンを低下させる一方で、ＸＮは、血清グルコースの低下をもたらして、インスリンに対しては無効であった。Ａｃａｃｉａ：ＲＩＡＡ［５：１］は、血清インスリン濃度を低下させることについて試験した中で最も有効な薬剤であり、ビグアニドのメトホルミンによる血清インスリンレベルの１７パーセント低下とチアゾリジンジオンのロシグリタゾンによる１５％減少に対して、血清インスリンレベルの２１パーセント低下をもたらした。このＡｃａｃｉａ：ＲＩＡＡ［５：１］組合せの応答は、個々の成分のいずれの応答よりも大きかったので、シナジーの潜在能力を明示した。Acacia nilotica だけでは、血清グルコースもインスリンも低下させることができなかったが、ＲＩＡＡは、血清インスリンをメトホルミンと同様の程度まで抑制した。残る試験材料の中では、Ａｃａｃｉａ：ＩＡＡ［１０：１］の組合せも、血清インスリン濃度を低下させるのに有効であった。
【０３７４】
２型糖尿病のｄｂ／ｄｂマウスモデルにおける、Ｒｈｏ−イソアルファ酸により影響される血清インスリンの速やかな低下と、キサントフモールによる血清グルコースの低下は、インスリン非感受性及び高血糖症に関連したヒト疾患の治療における臨床効果へのその潜在能力を裏付けるものである。さらに、Ｒｈｏ−イソアルファ酸及び Acacia catechu の５：１組合せは、ｄｂ／ｄｂマウス糖尿病モデルにおいて相乗的に見えた。２つの独立した糖尿病の動物モデルと３つの in vitro モデルにおいてＲｈｏ−イソアルファ酸、キサントフモール、及びＡｃａｃｉａ：ＲＩＡＡ［５：１］製剤により明示された陽性の応答は、血清グルコースの低下又はインスリン感受性の亢進が求められる臨床状況におけるそれらの潜在的な有用性を裏付ける。
【０３７５】
表３１
ｄｂ／ｄｂ糖尿病マウスの非絶食時血清グルコース及びインスリンに対する Acacia nilotica 及びホップ誘導体の効果
【０３７６】
【表４１】
2009504657.tif 000043
【０３７７】
実施例３５
糖尿病ｄｂ／ｄｂマウスモデルにおける Acacia nilotica 及びホップ誘導体の比の in vivo 最適化
モデル−雄性のＣ５７ＢＬＫＳ／Ｊ  ｍ＋／ｍ＋  Ｌｅｐｒｄｂ（ｄｂ／ｄｂ）マウスを使用して、絶食時血清グルコース又インスリンの濃度を低下させる試験材料の潜在能力について評価した。この系統のマウスは、機能性レプチン受容体の非存在のためにレプチンに対して抵抗性である。血漿インスリンの上昇は、１０〜１４日目に、そして血糖の上昇は、４〜８週目に始まる。試験時（９週目）には、動物が顕著に肥満（５０±５ｇ）になり、島肥大の証拠を明示した。
【０３７８】
試験材料−陽性対照のメトホルミンとロシグリタゾンをそれぞれ３００ｍｇ／ｋｇ／日と１．０ｍｇ／ｋｇ／日で５連続日の毎日投薬した。１：９９、１：５、１：２、１：１、２：１、及び５:１の比のホップ誘導体ＲＩＡＡ及び Acacia nilotica 試料＃５６５９を１００ｍｇ／ｋｇで投薬した。
【０３７９】
試験手順−試験物質は、０．２％  Ｔｗｅｅｎ−８０中のガバージュにより毎日投与した。初回投薬の前と第五回及び最終投薬の９０分後に血清を後眼窩より採取した。ムタロターゼ／グルコースオキシダーゼ法により非絶食時血清グルコースを酵素的に定量して、マウス特異的ＥＬＩＳＡにより血清インスリンを定量した。
【０３８０】
結果−陽性対照のメトホルミン及びロシグリタゾンは、血清グルコース及びインスリンの濃度を対照に対してともに減少させた（ｐ＜０．０５、結果を示さず）。個別には、ＲＩＡＡとＡｃａｃｉａは、１００ｍｇ／ｋｇ、５日間で血清グルコースを対照に対してそれぞれ７．４及び７．６パーセント低下させた（ｐ＜０．０５）。ＲＩＡＡ及びＡｃａｃｉａの１：９９、１：５、又は１：１での組合せは拮抗的に見えたが、２：１及び５：１の比のＲＩＡＡ：Ａｃａｃｉａは、血清グルコースを対照に対してそれぞれ１１及び２２パーセント減少させた。この応答は、ＲＩＡＡ又はＡｃａｃｉａ単独のいずれよりも大きくて、２つの成分間での相乗効果を示唆する。血清インスリン濃度の低下でも同様の効果が見られた（図２７）。
【０３８１】
このモデルにおいて、糖尿病の治療に現在使用されている２つの医薬品、メトホルミン及びロシグリタゾンに対して、Ｒｈｏ−イソアルファ酸及びＡｃａｃｉａの５：１の組合せについてさらに試験した。この結果（図２８）は、Ｒｈｏ−イソアルファ酸及びＡｃａｃｉａの５：１の組合せが、血清グルコース（パネルＡ）及び血清インスリン（パネルＢ）を低下させることにおいてこれらの医薬品に匹敵する結果をもたらしたことを示す。
【０３８２】
ｄｈ／ｄｂマウス糖尿病モデルにおいて、Ｒｈｏ−イソアルファ酸及びＡｃａｃｉａの２：１及び５：１の組合せは、相乗的に見え、血清グルコースの低下又はインスリン感受性の亢進が求められる臨床状況における潜在的な有用性を裏付ける。
【０３８３】
実施例３６
コラーゲン誘発性慢性関節リウマチマウスモデルにおけるホップ試験化合物の効果
本実施例は、２つのホップ化合物、ＭｇＲｈｏ及びＴＨＩＡＡの、慢性関節リウマチモデルにおいて炎症と関節炎の総体症状を抑制する効果を実証する。そのような炎症及び症状には、いくつかのプロテインキナーゼが一部仲介することが知られている。
【０３８４】
モデル−雌性ＤＢＡ／Ｊマウス（１０匹／群）を明暗の標準条件下に収容して、食餌を自由に摂らせた。このマウスに、０日目に、スクワレン中に１００μｇのＩＩ型コラーゲンと１００μｇの結核菌（Mycobacterium tuberculos）を含有する混合物を皮内注射した。２１日目に追加注射を繰り返した。２２〜２７日目に、マウスについて関節炎の徴候を検査して、非応答性のマウスをこの試験から除外した。２８日目に始めて４２日目に終わる１４日間、マウスを試験化合物のガバージュにより毎日処理した。本実施例に使用する試験化合物は、１０ｍｇ／ｋｇ（低）、５０ｍｇ／ｋｇ（中間）又は２５０ｍｇ／ｋｇ（高）のＲＩＡＡ（ＭｇＲｈｏ）；１０ｍｇ／ｋｇ（低）、５０ｍｇ／ｋｇ（中間）、又は２５０ｍｇ／ｋｇ（高）のＴＨＩＡＡ；２０ｍｇ／ｋｇのセレコキシブ；及び１０ｍｇ／ｋｇのプレドニゾロンであった。
【０３８５】
以下に記載の関節炎指標を使用して、関節炎の総体症状についてそれぞれの爪を評価した（０〜４でスコア付け）。この関節炎指標では、０＝目につく徴候なし；１＝浮腫及び／又は紅斑：１つの指；２＝浮腫及び／又は紅斑：２つの関節；３＝浮腫及び／又は紅斑：２より多い関節；及び４＝爪全体の重度関節炎と指の硬直症及び変形
結果−関節炎指標に対するＲＩＡＡの効果を図２９のようにグラフで提示する。１０ｍｇ／ｋｇのプレドニゾロン（３０〜４２日目）、２０ｍｇ／ｋｇのセレコキシブ（３２〜４２日目）、２５０ｍｇ／ｋｇのＲＩＡＡ（３４〜４２日目）、及び５０ｍｇ／ｋｇのＲＩＡＡ（３８〜４０日目）で有意な低下（ｐ＜０．０５，両側検定）が観察され、ＲＩＡＡでは、５０又は２５０ｍｇ／ｋｇで抗関節炎効果が実証された。図３０は、関節炎指標に対するＴＨＩＡＡの効果を表示する。ここでも、セレコキシブ（３２〜４２日目）、２５０ｍｇ／ｋｇのＴＨＩＡＡ（３４〜４２日目）、及び５０ｍｇ／ｋｇのＴＨＩＡＡ（３４〜４０日目）で有意な低下が観察されて、抗関節炎剤としてのＴＨＩＡＡの有効性が実証された。
【０３８６】
実施例３７
ヒトの代謝症候群に対するＲＩＡＡ：Ａｃａｃｉａ（１：５）の効果
本実験では、代謝症候群のあるボランティア患者におけるいくつかの臨床意義マーカーに対する、ＲＩＡＡ：Ａｃａｃｉａ（１：５）製剤での治療の効果を検証した。
【０３８７】
方法と治験デザイン−本治験は、単一の試験施設（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，ワシントン州ギグハーバー）で実施した無作為化、プラセボ対照の二重盲検試験であった。本試験への適格規準は、被検者（１８〜７０歳）が以下を満たすことを求めた：（ｉ）ＢＭＩが２５と４２．５ｋｇ／ｍ２の間であること；（ｉｉ）ＴＧ／ＨＤＬ−Ｃ比≧３．５；（ｉｉｉ）絶食時インスリン＞１０ｍｃＩＵ／ｍＬ。さらに、被検者は、以下の５つの判定基準のうち３つを満たさなければならない：（ｉ）腰回り＞３５”（女性）及び＞４０”（男性）；（ｉｉ）ＴＧ≧１５０ｍｇ／ｄＬ；（ｉｉｉ）ＨＤＬ＜５０ｍｇ／ｄＬ（女性）、及び＜４０ｍｇ／ｄＬ（男性）；（ｉｖ）血圧≧１３０／８５、又は投薬時に高血圧と診断されること；及び（ｖ）絶食時グルコース≧１００ｍｇ／ｄＬ。
【０３８８】
上記の適格規準を満たす被検者を４つのアーム：（ｉ）ＲＩＡＡ／Ａｃａｃｉａの組合せ（１錠につき１００ｍｇ  ＲＩＡＡと５００ｍｇ Acacia nilotica 芯材抽出物を含有する）を１錠、１日３回服用する被検者；（ｉｉ）ＲＩＡＡ／Ａｃａｃｉａ組合せを２錠、１日３回服用する被検者；（ｉｉｉ）プラセボ、１錠、１日３回；及び（ｉｖ）プラセボ、２錠、１日３回の１つへ無作為化した。治験の全期間は、１２週であった。被検者より血液を１日目、８週目、及び１２週目で採取して、代謝症候群の様々な変数に対する（薬剤）補給の効果を評価した。
【０３８９】
結果−本治験に登録された被検者（プラセボ群とＲＩＡＡ／Ａｃａｃｉａを１日３錠服用する被検者をプールした）の最初の人口学的及び生化学的特徴を表３２に示す。最初の絶食時血糖と食後２時間（２ｈｐｐ）血糖値は、ＲＩＡＡ／Ａｃａｃｉａ群とプラセボ群で同様であった（それぞれ、９９．０対９６．５ｍｇ／ｄＬと１２８．４対１０９．２ｍｇ／ｄＬ）。さらに、いずれの血糖値も、概ね研究基準範囲（絶食時血糖は４０〜１１０ｍｇ／ｄＬ、２ｈｐｐ血糖値は７０〜１５０ｍｇ／ｄＬ）内にあった。２ｈｐｐインスリン応答の変化は、後期の代謝症候群や明らかな糖尿病において見られる血糖及び絶食時インスリンの上昇に先行するので、このことは予測されていた。
【０３９０】
表３２
人口学的特徴とベースラインでの生化学的特徴
【０３９１】
【表４２】
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【０３９２】
絶食時の血中インスリン測定値は同様で、やはり基準範囲内にあり、初期値は、ＲＩＡＡ／Ａｃａｃｉａ群で１７．５ｍｃＩＵ／ｍＬであり、プラセボ群で１３．２ｍｃＩＵ／ｍＬであった（基準範囲３〜３０ｍｃＩＵ／ｍＬ）。２ｈｐｐインスリン値は、基準範囲を超えて上昇して（９９．３対８０．２ｍｃＩＵ／ｍＬ）、絶食時インスリン又は血糖測定値より大きな変動を示した。初期値は同様であったが、ＲＩＡＡ／Ａｃａｃｉａ群は、絶食時インスリンと２ｈｐｐインスリンにおいて、並びにプロトコールで８週後の２ｈｐｐ血糖において大きな減少を示した（図３１及び３２）。
【０３９３】
ホメオスタシスモデル評価（ＨＯＭＡ）スコアは、公知のインスリン抵抗性の尺度である。全被検者のＨＯＭＡスコアの変化を図３３に示す。代謝症候群被検者のインスリン及び血糖値に見られる変動性により、絶食時インスリン＞１５ｍｃＩＵ／ｍＬの被検者だけの亜群についても評価した。この亜群のＨＯＭＡスコアを表３３に示すと、プラセボ群に比較して、ＲＩＡＡ／Ａｃａｃｉａ群では、有意な減少が観察されたことが示される。
【０３９４】
表３３
初期の絶食時インスリンが１５ｍｃＩＵ／ｍＬ以上である被検者のＨＯＭＡスコアに対するＲＩＡＡ／Ａｃａｃｉａ補給（３錠／日）の効果
【０３９５】
【表４３】
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【０３９６】
両群間の差は、８週目で有意であった（ｐ＜０．０５）。絶食時インスリン及び血糖より公知の方法［（インスリン（ｍｃＩＵ／ｍＬ）＊血糖（ｍｇ／ｄＬ））／４０５］によってＨＯＭＡスコアを計算した。
【０３９７】
トリグリセリド（ＴＧ）の上昇も、代謝症候群の重要な裏付け指標である。表３４と図３４は、ＲＩＡＡ／Ａｃａｃｉａ補給が８週後にプラセボに比較して有意な（ｐ＜０．０５）ＴＧ減少をもたらしたことを示す。ＲＩＡＡ／Ａｃａｃｉａ群では、ＴＧ／ＨＤＬ−Ｃ比も実質的に減少する（６．４０から５．２８へ）ことが示されたが、プラセボ群では、減少を認めなかった（５．８１から５．９２へ）。
【０３９８】
表３４
ＴＧレベル及びＴＧ／ＨＤＬ−コレステロール比に対するＲＩＡＡ／Ａｃａｃｉａ補給（３錠／日）の効果
【０３９９】
【表４４】
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【０４００】
代謝症候群の患者に１００ｍｇのｒｈｏ−イソアルファ酸と５００ｍｇ Acacia nilotica 芯材抽出物からなる組合せ錠剤を１日３錠、８週の間補給すると、プラセボに比較して、２ｈｐｐインスリンレベルのより大きな低下をもたらした。さらに、ＲＩＡＡ／Ａｃａｃｉａ補給（３錠／日）を服用している被検者では、プラセボを服用している被検者に対して、絶食時インスリン、絶食時及び２ｈｐｐ血糖、絶食時トリグリセリド、及びＨＯＭＡスコアのより大きな減少が観察された。これらの結果は、ＲＩＡＡ／Ａｃａｃｉａ補給が代謝症候群の被検者においてインスリンのホメオスタシスを維持するのに有用である可能性があることを示す。
【０４０１】
本発明を十分記載してきたが、当業者には、付帯の特許請求項の精神又は範囲より逸脱することなくそれに対して多くの変更及び修飾を行うことが可能であることが明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０４０２】
【図１】図１は、インスリン感受性及び抵抗性を調節するキナーゼネットワークの一部を図解的に図示する。
【図２】図２は、５種の選択キナーゼのＭｇＲＩＡＡ（ｍｇＲｈｏ）による阻害をグラフで図示する。
【図３】図３は、５種のホップ成分と Acacia nilotica 抽出物によるＰＩ３Ｋアイソフォームの阻害をグラフで図示する。
【図４】図４は、ＣＯＸ−２発現のＬＰＳ刺激前の前に加えるとき（白い棒）、又は試験材料の添加に先立つ一晩のＬＰＳ刺激に続いて加えるとき（灰色の棒）のＲＩＡＡ［パネルＡ］及びＩＡＡ［パネルＢ］のＰＧＥ２生合成の用量関連阻害を図示する。
【図５】図５は、ＲＡＷ２６４．７細胞において分析した、ＬＰＳ誘導ＣＯＸ−２仲介性ＰＧＥ２産生に対するセレコキシブ［パネルＡ］及びＭｇＲＩＡＡ［パネルＢ］の直接的な酵素阻害のグラフ表現を提供する。ＰＥＧ２を測定してｐｇ/ｍｌで表した。誤差の棒は標準偏差を示す（ｎ＝８）。
【図６】図６は、ＣＯＸ−２タンパク発現のウェスタンブロット検出を提供する。ＲＡＷ２６４．７細胞をＬＰＳで指定時間の間刺激して、その後で全細胞抽出物を、ＣＯＸ−２及びＧＡＰＤＨの発現についてのウェスタンブロットにより可視化した［パネルＡ］。ＣＯＸ−２及びＧＡＰＤＨのバンドのデンシトメトリーを実施した。グラフ［パネルＢ］は、ＣＯＸ−２のＧＡＰＤＨに対する比を表す。
【図７】図７は、ｉＮＯＳタンパク発現のウェスタンブロット検出を提供する。ＲＡＷ２６４．７細胞をＬＰＳで指定時間の間刺激して、その後で全細胞抽出物を、ｉＮＯＳ及びＧＡＰＤＨの発現についてのウェスタンブロットにより可視化した［パネルＡ］。ｉＮＯＳ及びＧＡＰＤＨのバンドのデンシトメトリーを実施した。グラフ［パネルＢ］は、ｉＮＯＳのＧＡＰＤＨに対する比を表す。
【図８】図８は、９６ウェルフォーマットを利用するＴｒａｎｓＡＭ  ＮＦ−κＢキットの代表的な概略図を提供する。プレートへ結合したオリゴヌクレオチドは、ＮＦ−κＢのコンセンサス結合部位を含有する。一次抗体は、ＮＦ−κＢのｐ５０サブユニットを検出した。
【図９】図９は、ＴｒａｎｓＡＭ  ＮＦ−κＢキットにより定量した、ＮＦ−κＢの代表的な結合活性を提供する。ＤＮＡ結合のパーセントは、ＬＰＳ対照（１００％）に対して計算した。誤差の棒は、標準偏差（ｎ＝２）を表す。実施例のセクションに記載のように、ＲＡＷ２６４．７細胞を試験化合物とＬＰＳで４時間処理した。
【図１０】図１０は、発達中の脂肪細胞と成熟脂肪細胞に対する、Ａｃａｃｉａ試料＃４９０９抽出物の脂肪生成効果を評価するための代表的な試験手順の概略図である。この３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを使用して、脂肪細胞の脂肪生成に対する試験化合物の潜在効果を試験した。
【図１１】図１１は、Ａｃａｃｉａ試料＃４９０９抽出物又は陽性対照のインドメタシン及びトログリタゾンで処理した３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞の非極性脂質含量を溶媒対照に比較して図示するグラフ図である。誤差の棒は、９５％信頼区間（片側）を表す。
【図１２】図１２は、Ａｃａｃｉａ試料＃４９０９の水系抽出物のジメチルスルホキシド可溶性分画の、インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞からのアジポネクチンの分泌に対する効果を評価するための代表的な試験手順の概略図である。
【図１３】図１３は、トログリタゾンの３用量と、Ａｃａｃｉａ試料＃４９０９の水系抽出物のジメチルスルホキシド可溶性分画の４用量により２４時間誘発されたインスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１細胞による最大アジポネクチン分泌を図示する代表的な棒グラフである。提示する数値は溶媒対照に対するパーセントであり；誤差の棒は、９５％信頼区間を表す。
【図１４】図１４は、Ａｃａｃｉａ試料＃４９０９の水系抽出物のジメチルスルホキシド可溶性分画の、試験材料＋１０、２、又は０．５ｎｇ  ＴＮＦα／ｍｌで処理した３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞からのアジポネクチンの分泌に対する効果を評価するための代表的な試験プロトコールの概略図である。
【図１５】図１５は、インドメタシン又はＡｃａｃｉａ試料＃４９０９抽出物により誘発した、ＴＮＦα処理した成熟３Ｔ３−Ｌ１細胞によるアジポネクチン分泌を表す代表的な棒グラフを図示する。提示する数値は溶媒対照に対するパーセントであり；誤差の棒は、９５％信頼区間を表す。＊ＴＮＦα単独処理より有意差あり（ｐ＜０．０５）。
【図１６】図１６は、異なる市販源からの Acacia catechu 及び A. nilotica の様々な組成物による、インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるトリグリセリド含量の相対的な増加をグラフにより明示する。提示する数値は、溶媒対照に対するパーセントであり；誤差の棒は、９５％信頼区間を表す。
【図１７】図１７は、Acacia catechu の様々な抽出物により誘発される最大の相対アジポネクチン分泌の表示をグラフにより図示する。提示する数値は、溶媒対照に対するパーセントであり；誤差の棒は、９５％信頼区間を表す。
【図１８】図１８は、ホップ化合物又は陽性対照のインドメタシン及びトログリタゾンで処理した３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞の脂質含量（溶媒対照に対する）をグラフにより図示する。この３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを使用して、脂肪細胞の脂肪生成に対する試験化合物の潜在効果を試験した。結果は、対照細胞の相対的な非極性脂質含量として表し；誤差の棒は、９５％信頼区間を表す。
【図１９】図１９は、試験化合物により４用量で２４時間誘発されたインスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１細胞による最大アジポネクチン分泌の代表的な棒グラフである。提示する数値は、溶媒対照に対するパーセントであり；誤差の棒は、９５％信頼区間を表す。ＩＡＡ＝イソアルファ酸、ＲＩＡＡ＝Ｒｈｏイソアルファ酸、ＨＨＩＡ＝ヘキサヒドロイソアルファ酸、及びＴＨＩＡＡ＝テトラヒドロイソアルファ酸。
【図２０】図２０は、Ｒｈｏイソアルファ酸、イソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、ヘキサヒドロイソアルファ酸、キサントフモール、使用済ホップ、ヘキサヒドロコルプロン、及び陽性対照トログリタゾンについてのホフスティー（Hofstee）プロットを図示する。溶媒対照に対する最大アジポネクチン分泌をｙ切片より推定する一方で、半最大アジポネクチン分泌に必要な試験材料の濃度を傾きの負値より計算した。
【図２１】図２１は、イソアルファ酸とＲｈｏイソアルファ酸［パネルＡ］、そしてヘキサヒドロイソアルファ酸とテトラヒドロイソアルファ酸［パネルＢ］により誘発した、ＴＮＦα処理した成熟３Ｔ３−Ｌ１細胞による相対的なアジポネクチン分泌を表す２つの棒グラフを表示する。提示する数値は、溶媒対照に対するパーセントであり；誤差の棒は、９５％信頼区間を表す。＊ＴＮＦαのみの処理より有意差あり（ｐ＜０．０５）。
【図２２】図２２は、１０ｎｇ  ＴＮＦα／ｍｌの添加後３時間［パネルＡ］及び２４時間［パネルＢ］のインスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるＮＦ−κＢ核移行（translocation）を図示する。ピオグリタゾン、ＲＩＡＡ、及びキサントフモールを５．０（黒い棒）及び２．５（縞の棒）μｇ／ｍｌで加えた。Ｊｕｒｋａｔ核抽出物は、５０ｎｇ／ｍｌ  ＴＰＡ（ホルボール、１２−ミリステート、１３−アセテート）及び０．５μＭカルシウムイオノフォア、Ａ２３１８７（ＣＩ）を補充した培地において３７℃で２時間培養した直後に採取する細胞に由来する。
【図２３】図２３は、溶媒、メトホルミン、Ａｃａｃｉａ試料＃５６５９水系抽出物、又はメトホルミン／Acacia catechu 抽出物の１：１組合せで処理したインスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１細胞の相対的なトリグリセリド含量についてグラフにより記載する。結果は、溶媒対照において完全に分化した細胞の相対トリグリセリド含量として表す。
【図２４】図２４は、ＲＬ９５−２子宮内膜細胞系における細胞増殖に対する、１０μｇ／ｍｌの溶媒対照（ＤＭＳＯ）、ＲＩＡＡ、イソアルファ酸（ＩＡＡ）、テトラヒドロイソアルファ酸（ＴＨＩＡＡ）、ＴＨＩＡＡ及びヘキサヒドロイソアルファ酸（ＨＨＩＡＡ）の１：１混合物、キサントフモール（ＸＮ）、ＬＹ２４９００２（ＬＹ）、エタノール（ＥＴＯＨ）、アルファ酸（ＡＬＰＨＡ）、及びベータ酸（ＢＥＴＡ）の効果をグラフにより図示する。
【図２５】図２５は、ＨＴ−２９細胞系における細胞増殖に対する、様々な濃度のＴＨＩＡＡ又は還元イソアルファ酸（ＲＩＡＡ）の効果をグラフにより図示する。
【図２６】図２６は、ＳＷ４８０細胞系における細胞増殖に対する、様々な濃度のＴＨＩＡＡ又は還元イソアルファ酸（ＲＩＡＡ）の効果をグラフにより図示する
【図２７】図２７は、ｄｂ／ｄｂマウスモデルにおいて血清グルコース［パネルＡ］及び血清インスリン［パネルＢ］を低下させることについての、還元イソアルファ酸（ＲＩＡＡ）及びＡｃａｃｉａの様々な組合せの用量応答をグラフにより図示する。
【図２８】図２８は、ｄｂ／ｄｂマウスモデルにおいて、ＲＩＡＡ：Ａｃａｃｉａの５：１の組合せがもたらした、血清グルコース［パネルＡ］及び血清インスリン［パネルＢ］の低下を医薬品の抗糖尿病化合物、ロジグリタゾン及びメトホルミンに比較してグラフにより図示する。
【図２９】図２９は、マウスの慢性関節リウマチモデルにおける還元イソアルファ酸（ＲＩＡＡ）の関節炎指標に対する効果をグラフにより図示する。
【図３０】図３０は、マウスの慢性関節リウマチモデルにおけるＴＨＩＡＡの関節炎指標に対する効果をグラフにより図示する。
【図３１】図３１は、絶食時及び食後（ｐｐ）２時間のインスリンレベルに対するＲＩＡＡ／Ａｃａｃｉａ（１：５）補給（３錠／日）の効果をグラフにより図示する。ｐｐ２時間インスリンレベルの評価では、被検者を１０〜１２時間絶食にした後で、７５ｇグルコース（Ｔｒｕｔｏｌ  １００，ＣＡＳＣＯ  ＮＥＲＬ（登録商標）Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を含有する溶液を消費させた。このグルコースチャレンジから２時間後、血液を採取して、インスリンレベルをアッセイした（Ｌａｎｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ，ワシントン州タコマ）。
【図３２】図３２は、絶食時及び食後（ｐｐ）２時間の血糖値に対するＲＩＡＡ／Ａｃａｃｉａ（１：５）補給（３錠／日）の効果をグラフにより図示する。食後２時間血糖値の評価では、被検者を１０〜１２時間絶食にした後で、７５ｇグルコース（Ｔｒｕｔｏｌ  １００，ＣＡＳＣＯ  ＮＥＲＬ（登録商標）Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を含有する溶液を消費させた。このグルコースチャレンジから２時間後、血液を採取して、血糖値をアッセイした（Ｌａｎｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ，ワシントン州タコマ）。
【図３３】図３３は、ＨＯＭＡスコアに対するＲＩＡＡ／Ａｃａｃｉａ（１：５）補給（３錠／日）の効果をグラフにより図示する。ＨＯＭＡスコアは、公知の方法により、絶食時インスリン及びグルコースより計算した［（インスリン（ｍｃＩＵ／ｍＬ）＊グルコース（ｍｇ／ｄＬ））／４０５］。
【図３４】図３４は、血清ＴＧレベルに対するＲＩＡＡ／Ａｃａｃｉａ（１：５）補給（３錠／日）の効果をグラフにより図示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【国際調査報告】
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