(57)【要約】  本発明は、Ｓ４２１位におけるハンチンチンのリン酸化を増加させ、それによりポリＱ−ハンチンチン誘導性毒性を減少させる薬物によりハンチントン病にかかっている患者を処置するための方法に関する。有用な化合物は、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、ＦＫ５２０、Ｌ６８５、８１８、ＦＫ５２３、１５−０−ＤｅＭｅ−ＦＫ５２０、Ｌｉｅ１２０、フェンバレレート、レスメトリン、シペルメトリン、デルタメトリンからなる群から選択される。ハンチントン病にかかっている対象を処置するのに有用な化合物を選択、同定またはスクリーニングするための方法もまた開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓ４２１位におけるハンチンチンの脱リン酸化を阻害することによって、ハンチントン病にかかっている対象におけるポリＱ−ハンチンチンの毒性を阻止するかまたは減少させるための医薬品の製造のためのＦＫ５０６の使用。
【請求項２】
ハンチントン病にかかっている対象におけるポリＱ−ハンチンチンの毒性を阻止するかまたは減少させるための医薬品の製造のための、Ｓ４２１位におけるハンチンチンの脱リン酸化を阻害する薬物の使用。
【請求項３】
Ｓ４２１位におけるハンチンチンの脱リン酸化を阻害する薬物が、カルシニューリン阻害剤であるかまたはカルシニューリンとハンチンチンとの間の相互作用を阻害する薬物である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
カルシニューリン阻害剤が、ＦＫ５０６、シクロスポリンＡ、ＦＫ５２０、Ｌ６８５，８１８、ＦＫ５２３、１５−０−ＤｅＭｅ−ＦＫ−５２０、Ｌｉｅ１２０、フェンバレレート、レスメトリン、シペルメトリン、デルタメトリンおよびそれらの類似体よりなる群から選択される、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
カルシニューリン阻害剤が、ＦＫ５０６、シペルメトリン、デルタメトリンおよびそれらの類似体からなる群から選択される、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
カルシニューリン阻害剤がカルシニューリン特異的なＲＮＡ干渉である、請求項３に記載の使用。
【請求項７】
カルシニューリン阻害剤がカルシニューリンの優勢な干渉形態である、請求項３に記載の使用。
【請求項８】
ハンチントン病にかかっている対象が前駆症状である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
ハンチントン病にかかっている対象がハンチントン病の症状を示す、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
前記Ｓ４２１位におけるハンチンチンのリン酸化を増加させる薬物が、ハンチントン病の症状を緩和する薬物との併用で使用される、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
Ｓ４２１位におけるハンチンチンのリン酸化を増加させることが可能な化合物の選択もしくは同定を含んでなる、ハンチントン病にかかっている対象を処置するのに有用な化合物を選択、同定またはスクリーニングするための方法。
【請求項１２】
前記方法が、
ａ）ハンチンチンタンパク質またはＳ４２１を含んでなる少なくとも５０個の連続アミノ酸のそのフラグメントを提供することであって、前記ハンチンチンタンパク質またはそのフラグメントがリン酸化されたＳ４２１を有すること、
ｂ）カルシニューリンを提供すること、
ｃ）候補化合物と、前記ハンチンチンタンパク質またはそのフラグメントおよび前記カルシニューリンとを接触させること、次いで、
ｄ）カルシニューリンによるハンチンチンＳ４２１の脱リン酸化を阻害する候補化合物を選択すること、
を含んでなる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法が、
ａ）候補化合物と、ハンチンチンタンパク質を発現し、Ｓ４２１位においてハンチンチンをリン酸化するキナーゼおよびカルシニューリンを含む細胞とを接触させること、
ｂ）Ｓ４２１位においてリン酸化されるハンチンチンの量および／またはＳ４２１位においてリン酸化されないハンチンチンの量を評価すること、次いで、
ｃ）候補化合物と接触されていないコントロール細胞を比較して、Ｓ４２１位におけるハンチンチンのリン酸化を増加させる候補化合物を選択すること、
を含んでなる、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハンチントン病を処置するための方法、そのような方法において有用な医薬組成物、およびハンチントン病を処置するのに有用な化合物を同定するためのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ハンチントン病（ＨＤ）は、脳の一定の領域における遺伝的にプログラムされたニューロンの変性から生じる。西洋世界におけるＨＤの罹患率は、１万人中１人である。この変性は、制御されない運動、知能の喪失、および感情障害を生じる。ＨＤは、常染色体優性神経変性疾患である。ＨＤ遺伝子を受け継いでいる人は、遅かれ早かれ疾患を発症する。ＨＤのいくつかの初期症状は、気分変動、うつ、易興奮性、あるいは運転すること、新たに物事を学ぶこと、事実を記憶すること、もしくは決断することにおける困難である。疾患が進行すると、知的作業に対する集中力が次第に困難になり、次いで患者は自分で食事を取ることおよび嚥下することが困難となり得る。疾患の進行速度および発症年齢は人によってばらつきがある。完全な病歴ならびに神経学的および臨床的検査を合わせた遺伝子検査は、医師がＨＤを診断するのに役立つ。ＨＤ遺伝子を保因する危険性のある個体では、発症前検査が利用可能である。ＨＤにかかっている個体の１〜３パーセントでは、ＨＤの家族暦を見出すことができない。
【０００３】
現時点において、ＨＤの経過を停止または反転するための方法は存在しない。ＨＤを処置するために使用される薬物は、症状を緩和するのみであり、疲労、焦燥感、または過剰興奮のような副作用を有する。従って、ＨＤ処置に対する強い必要性が存在している。
【０００４】
ＨＤは、タンパク質のハンチンチン（ｈｔｔ）においてポリグルタミン鎖をコードする染色体４ｐ１６．３に局在するＩＴ１５遺伝子のコーディング領域における異常に伸長したＣＡＧ鎖によって生じる。ハンチンチンが異常なポリＱ伸長を含有する場合、それは毒性になる。ポリＱ−ハンチンチンは細胞質において切断され、その後、核に移動し、ここで、それはユビキチン免疫陽性の核凝集体を形成する。核における場合、ポリＱ−ハンチンチンは、機能機構の獲得を通して、転写調節障害およびニューロン死を誘導する（非特許文献１）。ハンチンチンの保護機能の喪失は、新たな毒性機能の獲得に伴って付随的および／または相乗的に作用し得る（非特許文献２）。これと一致して、ＢＤＮＦ転写の調節障害は、ハンチンチンの正常な機能の喪失に関連する。さらに、ハンチンチンがポリＱ伸長を含有する場合、ＢＤＮＦ含有小胞を輸送し、ニューロン生存を促進する能力は喪失する（非特許文献３）。最終的に、凝集体は神経軸索でも見出され、また、微小管ネットワーク動力学および／または軸索輸送を変化させることによっても、ニューロン機能障害に寄与し得る（非特許文献４）。
【０００５】
タンパク質分解、ユビキチン化およびスモ化のようないくつかの翻訳後修飾は、ハンチンチンの毒性を改変する。疾患において重要な役割を果たす別の翻訳後修飾は、リン酸化である。特に、Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ、Ａｋｔならびに血清およびグルココルチコイド誘導性キナーゼ、ＳＧＫは、セリン４２１（Ｓ４２１）においてハンチンチンをリン酸化する（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７）。Ｓ４２１におけるリン酸化は、続いて、ＨＤの細胞モデルにおいてポリＱ−ハンチンチン誘導性の毒性を無効にする（非特許文献５；非特許文献６）。しかし、Ｓ４２１のリン酸化がインビボにおいて不可欠であるかどうかについては不明である。さらに、ハンチンチンはサイクリン依存性キナーゼＣｄｋ５によりセリン４３４においてリン酸化され、このことがカスパーゼ類によるその切断を減少させる（非特許文献８）。
【０００６】
ＦＫ５０６およびシクロスポリンのようなイムノフィリンリガンドは、最近、神経再生および神経保護のための推定上の治療ストラテジーとして記載されている（非特許文献９；非特許文献１０）。従って、イムノフィリンリガンドは、神経変性疾患を処置することが示唆される。イムノフィリンリガンドは、２種類の活性を示す：１）それらはペプチジル−プロリルイソメラーゼ（ＰＰＩまたはロタマーゼ）を阻害する；２）それらはカルシニューリンを阻害し、それにより免疫抑制機能を示す。しかし、神経保護および神経再生におけるこれらの２種類の活性の役割については、まだ明らかにされていない。
【０００７】
カルシニューリンは、ニューロンの酸化窒素シンターゼ（ｎＮＯＳ）の活性化に関与する。ｎＮＯＳは、脂質、タンパク質、およびＤＮＡに構造的損傷を引き起こす一酸化窒素（ＮＯ）を生成する。その他の点では、カルシニューリンは、ＢＡＤを脱リン酸化し、Ｂｃｌ−ＸＬとのそのヘテロダイマー形成を増進し、アポトーシスを引き起こす。従って、カルシニューリンの阻害は、細胞死の下流メディエーターを阻止することができる。同様に、ミトコンドリア機能の安定化もまた、神経保護を介在することができる。
【０００８】
カルシニューリン阻害活性を有していない非免疫抑制薬イムノフィリンリガンド（例えば、ＧＰＩ−１０４６およびＶ１０，３６７）が神経障害を処置するために開発されている。特に、パーキンソン病を処置するためのＧＰＩ−１０４６およびＶ１０，３６７による臨床治験は成功していない。
【０００９】
ＨＤ処置に関する具体的なデータは、非特許文献１１を除いて報告されていない。この文献は、３ＮＰ（３−ニトロプロピオン酸）により処置された皮質細胞（ハンチンチン変異を再生しないＨＤの化学モデル）におけるインビトロ研究について報告している。３ＮＰ処置は細胞死を誘導し、次いでこの細胞死は、Ｓ４２１位におけるハンチンチンのリン酸化に直接関連しない不明な機構を介するＦＫ５０６により阻害することができる。
【非特許文献１】ロスＣＡ（Ｒｏｓｓ  ＣＡ）（２００２年）Ｎｅｕｒｏｎ３５：８１９−８２２．
【非特許文献２】カッターネオＥ（Ｃａｔｔａｎｅｏ  Ｅ）ら（２００１年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ２４：１８２−１８８．
【非特許文献３】ゴーティエルＬＲ（Ｇａｕｔｈｉｅｒ  ＬＲ）ら（２００４年）Ｃｅｌｌ  １１８：１２７−１３８．
【非特許文献４】チャリンＢＣ（Ｃｈａｒｒｉｎ  ＢＣ）ら（２００５年）Ｐａｔｈｏｌ  Ｂｉｏｌ（Ｐａｒｉｓ）５３：１８９−１９２．
【非特許文献５】ハンバートＳ（Ｈｕｍｂｅｒｔ  Ｓ）ら（２００２年）Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ２：８３１−８３７．
【非特許文献６】ランゴンＨ（Ｒａｎｇｏｎｅ  Ｈ）ら（２００４年）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ１９：２７３−２７９．
【非特許文献７】ワービーＳＣ（Ｗａｒｂｙ  ＳＣ）ら（２００５年）Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．
【非特許文献８】ルオＳ（Ｌｕｏ  Ｓ）ら（２００５年）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ１６９：６４７−６５６．
【非特許文献９】クレットナーＡ（Ｋｌｅｔｔｎｅｒ  Ａ）、ヘルダーゲンＴ（Ｈｅｒｄｅｇｅｎ  Ｔ）（２００３年）Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ＣＮＳ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｄｉｓｏｒｄ２：１５３−１６２．
【非特許文献１０】ポンＫ（Ｐｏｎｇ  Ｋ）、ザレスカＭＭ（Ｚａｌｅｓｋａ  ＭＭ）（２００３年）Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ＣＮＳ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｄｉｓｏｒｄ２：３４９−３５６．
【非特許文献１１】アルメイダＳ（Ａｌｍｅｉｄａ  Ｓ）ら（２００４年）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ｄｉｓ１７：４３５−４４４．
【００１０】
本発明者らは、Ｓ４２１位におけるハンチンチンのリン酸化がインビボにおいて神経保護的であること、およびカルシニューリン（ＣａＮ）がＳ４２１を脱リン酸化することを実証する。ＣａＮ活性の阻害は、Ｓ４２１におけるハンチンチンのリン酸化の増加をもたらし、次いでニューロンのポリＱ−ハンチンチン誘導性死を防止する。従って、本発明者らは、ポリＱ−ハンチンチン誘導性毒性を減少させることによるＨＤを処置する臨床アプローチとして、Ｓ４２１位のハンチンチンのリン酸化を増加させる薬物の利益を示す。
【００１１】
従って、本発明は、ハンチントン病にかかっている対象におけるポリＱ−ハンチンチンの毒性を阻止するかまたは減少させるための医薬品の製造のために、Ｓ４２１位におけるハンチンチンのリン酸化を増加させる薬物の使用に関する。特に、薬物は、ポリＱ−ハンチンチンによって誘導されるニューロン死を阻止するかまたは減少させることを目的としている。Ｓ４２１位におけるハンチンチンのリン酸化を増加させる薬物は、キナーゼＡｋｔ、タンパク質キナーゼＡ、ポロキナーゼ１、オーロラＡおよびオーロラＢならびに／またはＳＧＫの活性を増加させる薬物であり得る。好適な実施態様では、Ｓ４２１位におけるハンチンチンのリン酸化を増加させる薬物は、Ｓ４２１位におけるハンチンチンの脱リン酸化を阻害する薬物である。より好ましくは、Ｓ４２１位におけるハンチンチンの脱リン酸化を阻害する薬物は、カルシニューリン阻害剤またはカルシニューリンとハンチンチンとの間の相互作用を阻害する薬物またはカルシニューリンの優勢な干渉形態である。最も好適な実施態様では、Ｓ４２１位におけるハンチンチンの脱リン酸化を阻害する薬物はカルシニューリン阻害剤である。一の実施態様では、カルシニューリン阻害剤は、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、ＦＫ５２０、Ｌ６８５，８１８、ＦＫ５２３、１５−０−ＤｅＭｅ−ＦＫ−５２０、Ｌｉｅ１２０、フェンバレレート、レスメトリン、シペルメトリン、デルタメトリンおよびそれらの類似体からなる群から選択される。好ましくは、カルシニューリン阻害剤は、ＦＫ５０６、シペルメトリン、デルタメトリンおよびそれらの類似体からなる群から選択される。より好ましくは、カルシニューリン阻害剤はＦＫ５０６である。代替的に、カルシニューリン阻害剤は、カルシニューリンに特異的なＲＮＡ干渉であり得る。ハンチントン病にかかっている対象は、ハンチントン病変異を保因する。特に、ＨＤ変異は、ＩＴ１５遺伝子のコーディング領域におけるＣＡＧ反復の異常な伸長（３５を超える）である。この対象は前駆症状であり得るか、またはＨＤ症状も発症している。この場合、Ｓ４２１位におけるハンチンチンのリン酸化を増加させる薬物は、ハンチントン病の症状を緩和する薬物との併用で使用することができる。
【００１２】
最も好適な実施態様では、本発明は、Ｓ４２１位におけるハンチンチンの脱リン酸化を阻害することによって、ハンチントン病にかかっている対象におけるポリＱ−ハンチンチンの毒性を阻止するかまたは減少させるための医薬品の製造のためのＦＫ５０６の使用に関する。
【００１３】
さらなる実施態様では、本発明は、Ｓ４２１位におけるハンチンチンのリン酸化を増加させることが可能な化合物の選択もしくは同定を含んでなる、ハンチントン病にかかっている対象を処置するのに有用な化合物を同定またはスクリーニングするための方法に関する。
【００１４】
図１。Ｓ４２１におけるポリＱ−ハンチンチンのリン酸化は、インビボにおいて神経保護的である。ラット線条体に、４８０−１７Ｑ（野生型）、４８０−６８Ｑ（ポリＱ）、４８０−６８Ｑ−Ｓ４２１Ａまたは４８０−６８Ｑ−Ｓ４２１Ｄレンチウイルスを注入した。ラット線条体におけるポリＱ−ハンチンチン誘導性病巣を、注入２４週間後に分析した。ＤＡＲＰＰ−３２抗体による免疫組織化学的分析を実施し、病巣のサイズをすべての構築物について調べ、次いで４８０−６８Ｑ構築物によって誘導される病巣の百分率として表した。予想どおり、ＤＡＲＰＰ−３２−免疫応答性ニューロンの極端な喪失が、４８０−６８Ｑ−が感染された線条体において観察されたが、野生型タンパク質の発現は影響を示さなかった（対応のあるステューデントｔ検定；ｔ［７］＝６．９５；＊＊＊Ｐ＜０．００１）。Ｓ４２１におけるリン酸化の不在（４８０−６８Ｑ−Ｓ４２１Ａ）は、ＤＡＲＰＰ−３２−免疫欠失領域のサイズの増加を生じた（対応のあるステューデントｔ検定；ｔ［６］＝３．１７；＊Ｐ＜０．０５）。対照的に、Ｓ４２１における構成性（４８０−６８Ｑ−Ｓ４２１Ｄ）は、ＤＡＲＰＰ−３２−免疫欠失領域のサイズの減少を生じた（対応のあるステューデントｔ検定；ｔ［７］＝３．４６；＊Ｐ＜０．０５）。抗ＨＡ免疫組織化学的分析は、すべての構築物が同様のレベルで発現されることを示した（下方のパネル）。
【００１５】
図２。カルシニューリンは、インビトロでＳ４２１を脱リン酸化する。精製されたカルシニューリンによるＳ４２１の時間経過（図２Ａ）および用量依存的（図２Ｂ）脱リン酸化。ヒトハンチンチンのＧＳＴ−結合フラグメント（アミノ酸３８４−４６７）を、組み換えＡｋｔ（０．２μｇ／サンプル）でリン酸化し、次いで、２μｇ（Ａ）または異なる量（Ｂ）の精製されたカルシニューリンと共に示された時間（Ａ）または６０分間（Ｂ）、インキュベートした。抗ホスホハンチンチン−Ｓ４２１−７６３または抗ハンチンチン（１２５９）抗体を使用して、イムノブロッティング実験を実施した。
【００１６】
図３。カルシニューリンは、細胞においてハンチンチンのＳ４２１を脱リン酸化する。図３Ａ、マウス線条体（＋／＋細胞）を、ハンチンチンのＮ末端フラグメント（４８０−１７Ｑ）、Ａｋｔ、カルシニューリンの構成性活性形態（ＣａＮＡ−ΔＣａＭ／ＣａＮＢ）または対応する空ベクターでトランスフェクトし、抗ホスホハンチンチン−Ｓ４２１−７１４または抗ハンチンチン（１２５９）抗体によるウエスタンブロット分析のために処理した。３つの独立した実験からのデータは、カルシニューリンの構成性活性形態は、Ａｋｔによって誘発されるＳ４２１のリン酸化を有意に減少させることを示す（ステューデントｔ検定；ｔ［３］＝３．６３；＊Ｐ＜０．０５）。図３Ｂ、ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞を、カルシニューリンの触媒不活化形態（ＣａＮＡ−Ｄ１３０Ｎ）、Ａｋｔまたは対応する空ベクターでトランスフェクトし、次いで抗ホスホハンチンチン−Ｓ４２１−７６３で分析した。データは３つの独立した実験から得たものである（分散分析（ＡＮＯＶＡ）；Ｆ［２，６］＝１７．３１；Ｐ＝０．０３２）。Ｓ４２１に対する内因性ハンチンチンのリン酸化は、カルシニューリンの触媒不活化構築物（ステューデントｔ検定；ｔ［４］＝４．３４；＊Ｐ＜０．０５）およびＡｋｔ（ｔ［４］＝５．２６；＊＊Ｐ＜０．０１）によって有意に増加した。
【００１７】
図４。ハンチンチンはカルシニューリンと共局在し、Ｃａ２＋誘導性カルシニューリン活性化により脱リン酸化される。図４Ａ、イオノマイシン（Ｉｏ、下方のパネル）は、野生型ＣａＮＡ／ＣａＮＢでトランスフェクトされた細胞におけるハンチンチンＳ４２１リン酸化を減少させた。ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞を、非処置細胞（Ｎ．Ｔ．、上部パネル）との比較で、野生型形態のＣａＮＡ／ＣａＮＢで共トランスフェクトした。グラフは、３２細胞から放出されるホスホ−Ｓ４２１−ｈｔｔ（７６３抗体）シグナルの平均蛍光強度の定量化に相当し（ＡＮＯＶＡ；Ｆ［３，２８］＝７，０５；Ｐ＝０．００１１）、次いでハンチンチンのイオノマイシン誘導性脱リン酸化が有意であることを示す（フィッシャーの事後検定；＊＊＊Ｐ＜０．００１）。図４Ｂ、ハンチンチンは、小胞構造に対するカルシニューリンの触媒サブユニット（ＣａＮＡ）と共局在する。線条体ニューロンにおけるハンチンチン（１２５９抗体）、ホスホ−Ｓ４２１−ハンチンチン（７１４抗体）およびＣａＮＡに対する免疫染色。神経突起に沿った小胞構造において実質的な共局在が観察された（拡大図を参照のこと）。スケールバー、５μｍ。
【００１８】
図５。カルシニューリンの優勢な干渉形態は、線条体ニューロンにおいて、Ｓ４２１のリン酸化依存的様式でポリＱ−ハンチンチン誘導性毒性を阻害する。図５Ａ、線条体ニューロンにおいて、野生型ハンチンチン（４８０−１７Ｑ）またはポリＱ−ハンチンチン（４８０−６８Ｑ）を、触媒不活性形態のカルシニューリンをコードする発現ベクター（ＣａＮＡ−Ｄ１３０Ｎ）または対応する空ベクターとともに共トランスフェクトした。４つの独立した実験からのデータ（ＡＮＯＶＡ；Ｆ［３，５６］＝６．９９；Ｐ＝０．０００４）は、ＣａＮＡ−Ｄ１３０Ｎが、ポリＱ−ハンチンチン誘導性細胞死を有意に減少させたことを表した（フィッシャーの事後検定；＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図５Ｂ、線条体ニューロンを、ＣａＮＡα、ＣａＮＡβまたは両方のアイソフォームに対するｓｉＲＮＡでヌクレオフェクト（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｄ）し、次いで３０時間後、図５Ａのように４８０−６８Ｑでトランスフェクトした。ＣａＮの両方のアイソフォームに対するｓｉＲＮＡの組み合わせは、ウエスタンブロット分析による検出では、ＣａＮＡ発現を効率的に減少させた。３つの独立した実験からのデータ（ＡＮＯＶＡ；Ｆ［３，６］＝５．３３；Ｐ＝０．０３９）は、ポリＱ依存的毒性に対する保護効果を実証した（フィッシャーの事後検定；＊Ｐ＜０．０５）。図５Ｃ、線条体ニューロンを、４８０−６８Ｑまたはリン酸化不能形態（４８０−６８Ｑ−Ｓ４２１Ａ）およびＣａＮＡ−Ｄ１３０Ｎで共トランスフェクトした。４つの独立した実験からのデータ（ＡＮＯＶＡ；Ｆ［２，４１］＝４．３０；Ｐ＝０．０００４）は、触媒不活形態のカルシニューリンが４８０−６８Ｑ−Ｓ４２１Ａ構築物によって誘発されるポリＱ依存的細胞死を妨げないことを実証し（フィッシャーの事後検定；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）、神経保護がＳ４２１のリン酸化に依存することを示した。
【００１９】
図６。ＦＫ５０６によるカルシニューリンの阻害は、Ｓ４２１の脱リン酸化を防止する。ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞におけるＦＫ５０６による処置（２０分間、１μＭ）は、Ｓ４２１における内因性ハンチンチンのリン酸化を増加させた（左）。カルシウムイオノフォアイオノマイシン（Ｉｏ、２．５μＭ）は、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞におけるＳ４２１の迅速な脱リン酸化を誘導した。Ｉｏ誘発性Ｓ４２１脱リン酸化は、ＦＫ５０６（１μＭ）によって妨げられた（右）。処置されたジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞の全細胞抽出物を、抗ホスホハンチンチン−Ｓ４２１−７６３および抗ハンチンチン（１２５９）抗体で分析した。図６Ｂ、ラット線条体ニューロンのＦＫ５０６処置後のＳ４２１の時間経過および用量依存的リン酸化。ニューロンを、１μＭのＦＫ５０６で異なる時間（上）または示された濃度で２時間（下）処置した。全細胞抽出物を、マウスホスホ特異的（抗ホスホハンチンチン−Ｓ４２１−７１４）および抗ハンチンチン（１２５９）抗体で分析した。
【００２０】
図７。１０９Ｑ／１０９Ｑ細胞は、ＦＫ５０６によって増加され得るＳ４２１におけるハンチンチンのリン酸化の減少を示す。図７Ａ、野生型（＋／＋）または変異マウス（１０９Ｑ／１０９Ｑ）から生じる不死化ノックイン細胞の全細胞抽出物を、マウスホスホ特異的および抗ハンチンチン（１２５９）抗体によるウエスタンブロットによって分析した。図７Ｂ、ＦＫ５０６（０．２μＭ、４８時間）は、野生型およびポリＱ−ハンチンチンにおけるＳ４２１のリン酸化を増加させた。図７Ｃ、ＦＫ５０６は、ニューロンをポリＱ仲介細胞死から保護した。線条体ニューロンを、異なる用量のＦＫ５０６またはビヒクルの存在下で、４８０−６８Ｑでトランスフェクトした。３つの独立した実験からのデータ（ＡＮＯＶＡ；Ｆ［５，６８］＝８．０２；Ｐ＝０．０００１）は、ＦＫ５０６が、４８０−６８Ｑによって誘導されるニューロン死を有意に減少させることを表した（フィッシャーの事後検定；＊Ｐ＜０．０５）。
【００２１】
図８。ＦＫ５０６のマウスへの投与は、脳におけるＳ４２１のリン酸化の増加を生じる。ＦＫ５０６をマウスに腹腔内または経口的に投与した（５ｍｇ／ｋｇ）。動物を、投与後の示された時間に屠殺し、脳を切開し、ホモジェナイズし、次いでウエスタンブロット分析用に処理した。脳全体の抽出物を抗−ホスホ−Ｓ４２１、抗ホスホ−Ｓ４７３−Ａｋｔ、抗全ハンチンチンおよび抗全Ａｋｔ抗体で調べた。下のパネルは、２回反復で実施した２つの独立した実験の濃度測定分析に対応する。合計で１８匹のマウスを屠殺した。上から下へおよび左から右へ：（ＡＮＯＶＡ；Ｆ［３，４］＝１１．５２、Ｐ＝０．０１９）；（ＡＮＯＶＡ；Ｆ［３，４］＝８．６９４、Ｐ＝０．０３１）；（ＡＮＯＶＡ；Ｆ［３，４］＝１，６６８、Ｐ＝０．３１）；（ＡＮＯＶＡ；Ｆ［３，４］＝０．９７、Ｐ＝０．４）；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【００２２】
図９。多様な４８０フラグメントの注入プロトコルの概要を表す図。２９匹の動物に対して実験を行った。注入１週間後、２匹のラットを分析して、ハンチンチンの発現を制御した。注入１２週間後、各グループの１匹の動物において病巣を評価した。この時点では病巣は有意ではなかったため、すべての動物の最終的評価を、注入２４週間後に実施した。グルタミンの数（１７Ｑまたは６８Ｑ）およびハンチンチンの各注入されたフラグメントに対するセリン４２１の変異を、ラット脳切片上の各半球上に示す。ｎは、条件あたりの動物の数を示す。
【００２３】
図１０。４８０−１７Ｑ（野生型）、４８０−６８Ｑ（ポリＱ）、４８０−６８Ｑ−Ｓ４２１Ａまたは４８０−６８Ｑ−Ｓ４２１Ｄレンチウイルスを注入したラット線条体を、注入２４週間後に、抗ＤＡＲＰＰ−３２および抗ホスホ−Ｓ４７３−Ａｋｔ（９２７７，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）抗体を使用する免疫組織化学によって分析した。ポリＱ−ハンチンチン感染領域においてＤＡＲＰＰ−３２のダウンレギュレーションが観察されるが、リン酸化形態のＡｋｔに対するニューロンの免疫陽性の存在によって示されるように、ニューロン喪失の徴候は観察されなかった。
【００２４】
図１１。ＩＧＦ−１およびＡｋｔは、主要なニューロンおよびＨＤニューロン細胞における輸送のポリＱ−ハンチンチン誘導性の変化をレスキューする。図１１Ａ、ＩＧＦ−１は、ＦＬ−ｈｔｔ−７５Ｑを発現する皮質ニューロンの初代培養物において、ＢＤＮＦ含有小胞の平均速度（左）を有意に増加させ、それらの休止時間（右）を減少させた。図１１Ｂ、１０９Ｑ／１０９Ｑ細胞において変化されたＢＤＮＦ輸送は、速度（左）を増加させ、休止時間（右）を減少させるＩＧＦ−１によって改善される。図１１Ｃ、Ａｋｔは、速度（左）を有意に増加させ、休止時間（右）を減少させる（＊Ｐ＜０．０５）ことによって、１０９Ｑ／１０９Ｑ細胞における輸送の欠如を完全に阻害する。
【００２５】
図１２。Ｓ４２１におけるハンチンチンのリン酸化は、輸送を調節し、ポリＱ−ハンチンチンの機能の喪失を回復する。図１２Ａ、コントロール条件（ＢＤＮＦ単独）、ならびにニューロン細胞において１７もしくは７５Ｑを伴うＦＬ−ｈｔｔ、または１７もしくは６８Ｑを伴うＮ末端フラグメント４８０のトランスフェクション後におけるＢＤＮＦ含有小胞の平均速度（左）および休止時間（右）の測定は、４８０アミノ酸のｈｔｔのＮ末端フラグメントが輸送を刺激することができるが、ポリＱ伸長を含有する場合、変化されることを実証する。図１２Ｂ、４８０−Ｓ４２１Ａ構築物の存在下におけるＢＤＮＦ含有小胞の速度（左）における有意な減少および休止時間（右）における増加により示されるように、Ｓ４２１がリン酸化されない場合、輸送を促進する野生型４８０フラグメント（４８０−１７Ｑ）の能力は失われる。図１２Ｃ、４８０−１７Ｑ構築物と比較して、４８０−１７Ｑ−Ｓ４２１Ａ構築物では、Ａｋｔの存在下におけるＢＤＮＦ小胞の平均速度が減少させ、そして小胞の休止時間が増加させるため、ＢＤＮＦ輸送を増強するＡｋｔの能力は、ｈｔｔのＳ４２１のリン酸化により介在される。図１２Ｄ、４８０−６８Ｑ構築物におけるＳ４２１Ｄ変異は、４８０−６８Ｑ構築物と比較して、小胞の平均速度（左）および休止時間（右）をレスキューする。（＊Ｐ＜０．０５）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
線条体においてポリＱ−ハンチンチンフラグメントのレンチウイルス介在の発現に基づくＨＤのラットモデルを使用して、本発明者らは、Ｓ４２１のリン酸化がインビボにおいて神経保護的であることを実証する。本発明者らはまた、カルシニューリン（ＣａＮ）、カルシウム／カルモジュリン調節Ｓｅｒ／Ｔｈｒタンパク質ホスファターゼがインビトロおよび細胞においてＳ４２１を脱リン酸化することを実証する。重要なことに、優勢な干渉形態の過剰発現、ＲＮＡ干渉または特異的インヒビターＦＫ５０６のいずれかによるＣａＮ活性の阻害は、Ｓ４２１におけるハンチンチンのリン酸化の増加をもたらし、線条体ニューロンのポリＱ介在死を防止する。最終的に、本発明者らは、ＦＫ５０６のマウスへの投与が、脳におけるハンチンチンＳ４２１のリン酸化を増加させることを示す。まとめれば、これらのデータは、Ｓ４２１リン酸化の調節におけるＣａＮの重要性を強調し、それがポリＱ誘導性毒性を減少させる場合、ＨＤを処置する臨床アプローチとしてのＣａＮ阻害の使用可能性を示唆する。
【００２７】
タンパク質ホスファターゼ２Ｂ（ＰＰ２Ｂ）としても公知であるカルシニューリン（ＣａＮ）は、Ｃａ２＋−カルモジュリンによって生理学的に活性化されるリン酸化タンパク質Ｓｅｒ／Ｔｈｒホスファターゼである（総説については、マンシー（Ｍａｎｓｕｙ）、２００３年を参照のこと）。従って、それは、細胞内カルシウムと、転写因子（活性化Ｔ細胞の核因子、ＮＦＡＴ）、イオンチャンネル（イノシトール−１，４，５三リン酸受容体）、小胞輸送に関与するタンパク質（アンフィフィシン、ダイナミン）、構造タンパク質（ＡＫＡＰ７９）およびホスファターゼインヒビター（ＤＡＲＰＰ−３２、インヒビター−１）を含む選択された脱リン酸化の基質とを結合させる。ＣａＮは、哺乳動物のすべての組織に存在し、脳においては特に高レベルであり、いくつかの研究は、それが、脳の全タンパク質含有量の１％を占め得ることを示している。触媒サブユニットは、皮質、線条体および海馬において主に発現される。中枢神経系内において、それが長期記憶のためのネガティブ制限と考えられるため、ＣａＮ活性はシナプス可塑性に関与している。神経末端では、ＣａＮは、Ｃａ２＋に応答して、小胞および細胞膜タンパク質を脱リン酸化することによりシナプス小胞エンドサイトーシスを誘発する。最終的に、ＣａＮは、これらの薬物のそれらの適切な受容体（イムノフィリン類）への結合を介し、シクロスポリンＡおよびＦＫ５０６のような薬物によって阻害される；ハマウィ（Ｈａｍａｗｙ）、２００３年）。ＦＫ５０６およびその誘導性イムノフィリンリガンドは、シクロスポリンとは異なり、血液−脳関門を容易に通過することができる（ポン（Ｐｏｎｇ）およびザレスカ（Ｚａｌｅｓｋａ）、２００３年）。
【００２８】
本発明者らは、以前、ハンチンチンが、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）のような小胞の細胞内輸送のための作用因子（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒ）であることを示した。ＨＤでは、皮質ニューロンにおけるＢＤＮＦ小胞の輸送が変化され、線条体における栄養支持の減少およびニューロン毒性がもたらされる。本発明では、本発明者らは、ＩＧＦ−１／Ａｋｔ経路によるＳ４２１におけるハンチンチンのリン酸化がポリＱ伸長によって変化された輸送をレスキューし、次いで外部へのＢＤＮＦの流動を促進することにより、神経栄養の支持を増加させることを実証する。これらの結果は、ＨＤにおけるＳ４２１リン酸化の神経保護効果を解明し、Ｓ４２１のリン酸化が輸送におけるハンチンチン機能をレスキューすることから、ハンチンチンリン酸化を増強する薬物が治療上重要であることを示唆する。さらに、本発明者らは、セリン４２１におけるＡｋｔによるハンチンチンのリン酸化が、正常なハンチンチンだけではなくポリＱ−ハンチンチンの能力を調節して輸送を促進することを実証する。
【００２９】
本発明は、ハンチントン病にかかっている対象におけるポリＱ−ハンチンチンの毒性を阻止するかまたは減少させるための医薬品の製造のために、Ｓ４２１位におけるハンチンチンのリン酸化を増加させる薬物の使用に関する。好ましくは、薬物は、ポリＱ−ハンチンチンによって誘導されるニューロン死を阻止するかまたは減少させることを目的としている。薬物はまた、軸索輸送におけるハンチンチンの活性を回復することを目的としている。
【００３０】
本発明はまた、Ｓ４２１位におけるハンチンチンのリン酸化を増加させる治療量の薬物を投与し、それによりポリＱ−ハンチンチンの毒性を阻止するかまたは減少させることによって、ハンチントン病にかかっている対象を処置するための方法に関する。特に、薬物は、ポリＱ−ハンチンチンによって誘導されるニューロン死を阻止または減少させることを目的としている。薬物はまた、軸索輸送におけるハンチンチンの活性を回復することを目的としている。
【００３１】
ハンチントン病にかかっている対象は、ハンチントン病遺伝子を保因するＨＤ変異を保因する対象である。ハンチントン病を発症する変異は、ハンチンチン遺伝子（ＩＴ１５遺伝子とも呼ばれる）における異常な（ａｎｏｒｍａｌ）ＣＡＧ反復伸長である。実際、正常な個体では、反復は６〜３５回の間で生じる。ＨＤにかかっている対象では、反復は、３６回を超えて、一般的には、４０回〜８０回を超えて生じる。この変異は、ハンチンチンと命名されたタンパク質におけるポリグルタミン（ポリＱ）伸長を生じる。
【００３２】
ハンチントン病にかかっている対象は前駆症状であり得る。前駆症状の対象は、遺伝子検査によって同定される。米国特許第４，６６６，８２８号明細書は、対象におけるハンチントン病の遺伝子の存在を検出するための方法を開示し、それはヒト第４染色体におけるハンチントン病に関連するＤＮＡ多型、特に、ＲＦＬＰの分析を含んでなる。好適な実施態様では、検査は、ハンチントン病変異の存在についてＤＮＡを直接分析する（クレーメル（Ｋｒｅｍｅｒ）ら、１９９４年）。もちろん、対象が異常な（ａｎｏｒｍａｌ）ハンチンチンタンパク質または遺伝子を有するかどうかを調べうる任意の検査が、本発明において想定される。
【００３３】
従って、本発明はＨＤ対象を処置するための方法であって：対象におけるＨＤ変異の存在を検出すること；次いでＳ４２１位におけるハンチンチンのリン酸化を増加させる治療量の薬物をＨＤ変異にかかっている対象に投与し、それによりポリＱ−ハンチンチンによって誘導されるニューロン死を阻止または減少させることを含んでなる方法に関する。特に、対象におけるＨＤ変異の存在を検出することは、ＩＴ１５遺伝子におけるＣＡＧ反復の数の決定を含んでなる。３６を超える反復、好ましくは、４０を超える反復にかかっている対象は、ＨＤ変異を有するものとみなされる。代替的に、対象におけるＨＤ変異の存在を検出することはまた、ポリグルタミン伸長のサイズを決定することにより、ハンチンチンタンパク質レベルにおいても行うことができる。
【００３４】
代替的に、ハンチントン病にかかっている対象はＨＤ症状を示し得る。ＨＤ症状は当業者に周知である。例えば、それらは、制御されない運動、知能の喪失（例えば、認知症）、および感情障害（例えば、うつ）を含んでなる。この場合、Ｓ４２１位におけるハンチンチンのリン酸化を増加させる薬物は、ハンチントン病の症状を緩和する薬物との併用で使用することができる。例えば、ＨＤ症状を処置するそのような薬物は、抗精神病薬（ハロペリドール、クロルプロマジン、オランザピン）、抗うつ薬（フルオキセチン、塩酸セルトラリン、ノルトリプチリン）、精神安定剤（ベンゾジアゼピン系薬剤、パロキセチン、ベンラファキシン、β遮断薬）、気分安定薬（リチウム、バルプロ酸、カルバマゼピン）、およびボツリヌス毒素であり得る。
【００３５】
好ましくは、対象は、霊長類、より好ましくは、高等な霊長類、最も好ましくは、ヒトである。
【００３６】
ＨＤにかかっている対象の処置は、運動協調性の改善、生存率の上昇、前駆症状ＨＤ対象におけるハンチントン病の発症の防止、ＨＤ発達の遅延もしくは停止および／またはＨＤの軽減を生じ得る。実際に、本発明に従う処置により、ポリＱ−ハンチンチンの毒性を阻止しまたは減少させ、それによってポリＱ−ハンチンチンにより誘導されるニューロン死を阻止するかまたは減少させる。従って、前駆症状段階のようなＨＤの初期段階において、ＨＤ発達は防止されるべきである。ＨＤの後期段階において、ＨＤ発達は阻害または減速されるべきである。本発明者らはまた、本発明において、Ｓ４２１におけるハンチンチンのリン酸化の増加は、軸索輸送、特に、正常なハンチンチンの抗アポトーシス作用に関連するＢＤＮＦ輸送におけるその活性の完全または部分回復を生じることを示した。
【００３７】
本発明に従う処置後はその軸索輸送能力の増加によりハンチンチンの抗ニューロン死の役割が増加するため、本発明は、さらに、神経変性疾患にかかっているまたはこの疾患の危険性のある対象におけるハンチンチンによる軸索輸送を増加させるための医薬品の製造のためのＳ４２１位におけるハンチンチンのリン酸化を増加させる薬物の使用を想定する。神経変性疾患は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、およびパーキンソン病からなる群から選択され得る。本発明はまた、神経変性疾患を患うまたはこの疾患の危険性のある対象を処置するための方法であって、Ｓ４２１位におけるハンチンチンのリン酸化を増加させる治療量の薬物を投与し、それによりハンチンチンによる軸索輸送を増加させることを含んでなる方法を想定する。ハンチンチンによる軸索輸送の増加は、抗アポトーシス効果を示すことを目的としている。
【００３８】
Ｓ４２１位におけるハンチンチンのリン酸化を増加させる薬物は、キナーゼＡｋｔ、タンパク質キナーゼＡ、ポロキナーゼ１、オーロラＡ、オーロラＢおよび／またはＳＧＫの活性を増加させる薬物であり得る。しかし、好適な実施態様では、Ｓ４２１位におけるハンチンチンのリン酸化を増加させる薬物は、Ｓ４２１位におけるハンチンチンの脱リン酸化を阻害する薬物である。より好ましくは、Ｓ４２１位におけるハンチンチンの脱リン酸化を阻害する薬物は、カルシニューリン阻害剤またはカルシニューリンとハンチンチンとの間の相互作用を阻害する薬物である。最も好適な実施態様では、Ｓ４２１位におけるハンチンチンの脱リン酸化を阻害する薬物はカルシニューリン阻害剤である。
【００３９】
カルシニューリン阻害剤として、シクロスポリンＡ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＧ、瑞国）、ＦＫ５０６（Ｆｕｊｉｓａｗａ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、イリノイ州、米国）、ＦＫ５２０（Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ，Ｒａｔｈｗａｙ、ニュージャージー州、米国）、Ｌ６８５，８１８（Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ）、ＦＫ５２３、１５−０−ＤｅＭｅ−ＦＫ−５２０（リュウ（Ｌｉｕ）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１：３８９６−３９０２（１９９２年））、Ｌｉｅ１２０、フェンバレレート（Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ）、レスメトリン（Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ）、シペルメトリン（Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ）およびデルタメトリン（Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ）が挙げられるが、これらに限定されない。国際公開第２００５０８７７９８号パンフレットには、カルシニューリンを阻害するシクロスポリン誘導体が記載されている。
【００４０】
カルシニューリンは、触媒サブユニット（カルシニューリンＡ）および調節因子サブユニット（カルシニューリンＢ）からなるヘテロダイマーである。次いで、カルシニューリンの活性はまた、その発現、特に、そのサブユニットの発現を阻止することによっても、阻害することができる。好適な実施態様では、カルシニューリンの活性はまた、調節因子サブユニットＢの発現を阻止することによっても阻害することができる。代替的な好適な実施態様では、カルシニューリンの活性はまた、調節因子サブユニットＡ、ＣａＮＡαまたはＣａＮＡβのいずれかの発現を阻止することによっても阻害することができる。発現は、当業者に公知の任意の手段、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）および短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）のような化学的に合成されたオリゴヌクレオチドによって阻止することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡに相補的であり、典型的には１０〜５０ｍｅｒの長さ、好ましくは１５〜３０ｍｅｒの長さ、より好ましくは１８〜２０ｍｅｒの長さを有する短い一本鎖分子である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、開始コドン、標的遺伝子の転写開始部位またはイントロン−エキソン接合部位を標的として設計される（総説については、カーレック（Ｋｕｒｒｅｃｋ）、２００３年）。リボザイムは、触媒活性を保持する一本鎖ＲＮＡ分子である。リボザイム作用の機構は、リボザイム分子の相補的標的ＲＮＡへの配列特異的相互作用、それに続くエンドヌクレアーゼ切断に関与する。リボザイムは、切断ＮＵＨトリプレット、好ましくはＧＵＣを含んでなる目的の標的ＲＮＡと相互作用するように操作される（総説については、ウスマン（Ｕｓｍａｎ）ら、２０００年）。ｓｉＲＮＡは、通常、２１または２３ヌクレオチド長であり、１９もしくは２１ヌクレオチド二重鎖配列および２ヌクレオチド長の３’オーバーハングを伴う。ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの２本鎖間にループを形成するさらなるいくらかのヌクレオチドを除いて、ｓｉＲＮＡをコードする配列についてのものと同じ規則で設計される。（総説については、ミッタル（Ｍｉｔｔａｌ）、２００４年を参照のこと）。特定の実施態様では、阻害するオリゴヌクレオチドは、ベクター、好ましくは、阻害するオリゴヌクレオチドの発現を可能にする構築物を含んでなるウイルスベクターによって発現される。例えば、ウイルスベクターは、アデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルスまたはＨＳＶであり得る。実施例では、ｓｉＲＮＡによってカルシニューリン阻害を実施するための１つの方法を詳細に開示した。
【００４１】
特定の実施態様では、本発明は、医薬品としてのカルシニューリンに特異的なＲＮＡ干渉に関する。好適な実施態様では、本発明は、ハンチントン病を処置するための医薬品の製造のためのカルシニューリンに特異的なＲＮＡ干渉の使用に関する。そのようなＲＮＡ干渉は、ＣａＮＡα（ＮＭ＿０００９４４）および／またはＣａＮＡβ（ＮＭ＿０２１１３２）が対象とされる。
【００４２】
カルシニューリン阻害剤はまた、カルシニューリン、特に、ＣａＮＡおよび／またはＣａＮＢの優勢な干渉形態であり得る。カルシニューリンの優勢な干渉形態は、例えば、ＣａＮＡ−Ｄ１３０Ｎであり得る。カルシニューリンの優勢な干渉形態の他の例には、ＣａＮＡ−Ｈ１０１Ｑ（ワング（Ｗａｎｇ）ら、１９９９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ２８４、３３９−３４３）、ＣａＮＡ−Ｈ１６０ＱおよびＣａＮＡ−Ｈ２９０Ｑ（シバサキ（Ｓｈｉｂａｓａｋｉ）ら、１９９６年、Ｎａｔｕｒｅ、６５８９、３７０−３７３；ニシムラ（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ）およびタナカ（Ｔａｎａｋａ）、２００１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．．、２７６、１９９２１−１９９２８）、Ｈ１６０Ｑ（チュー（Ｚｈｕ）ら、２０００ｎ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５、１５２３９−１５２４５）、Ｄ１４８−１５２（ヤマシタ（Ｙａｍａｓｈｉｔａ）、２０００年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９１、１８６９−１８８０）ならびにＤｎｔｅｒ−ＤｃａＭ（ムラマツ（ｍｕｒａｍａｔｓｕ）およびキンカイド（Ｋｉｎｃａｉｄ）、１９９６年、ＢＢＲＣ、２１８、４６６−４７２；ムサロ（Ｍｕｓａｒｏ）ら、１９９９年、Ｎａｔｕｒｅ、６７４４、５８１−５８５）がある。従って、カルシニューリンの優勢な干渉形態は、ベクター、好ましくは、その発現を可能にする構築物を含んでなるウイルスベクターによって発現される。例えば、ウイルスベクターは、アデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルスまたはＨＳＶであり得る。
【００４３】
代替的に、カルシニューリンの活性は、カルシニューリンサブユニット間の相互作用、特に、サブユニットＡおよびＢの間の相互作用を阻害する薬物により阻害することができる。カルシニューリンの活性は、カルシニューリンとカルモジュリンとの間の相互作用を阻害する薬物によって阻害することができる。カルシニューリン阻害はまた、キャビン１（ｃａｂｉｎ１）、カルシプレッシン（ｃａｌｃｉｐｒｅｓｓｉｎ）類およびＡＫＡＰ７９を含むカルシニューリンの内因性インヒビターの活性化によっても得ることができる。
【００４４】
薬物の「類似体」とは、類似の構造的特徴を有し、特にカルシニューリンを阻害する同じ生物学的活性を有する化合物が意図される。
【００４５】
カルシニューリンを阻害する他の薬物は、当該技術分野において既に開示されているスクリーニング方法によって同定することができる。例示として、米国特許第６，８７５，５８１号明細書および同第６，３３８，９４６号明細書は、カルシニューリン活性のモジュレーターを同定するのに有用なスクリーニング方法について記載している。
【００４６】
従って、本発明はまた、ハンチントン病にかかっている対象を処置するのに有用な化合物を同定またはスクリーニングするための方法であって、Ｓ４２１位におけるハンチンチンのリン酸化を増加させることが可能な化合物の選択もしくは同定を含んでなる方法に関する。
【００４７】
本方法は以下を含んでなることができる：
ａ）ハンチンチンタンパク質またはＳ４２１を含んでなる少なくとも５０個の連続アミノ酸のそのフラグメントを提供することであって、前記ハンチンチンタンパク質またはそのフラグメントがリン酸化Ｓ４２１を有すること；
ｂ）カルシニューリンを提供すること；
ｃ）候補化合物と、前記ハンチンチンタンパク質またはそのフラグメントおよび前記カルシニューリンとを接触させること；次いで、
ｄ）カルシニューリンによるハンチンチンＳ４２１の脱リン酸化を阻害する候補化合物を選択すること。
【００４８】
代替的に、本方法は以下を含んでなることができる：
ａ）候補化合物と、ハンチンチンタンパク質を発現し、Ｓ４２１位においてハンチンチンをリン酸化するキナーゼおよびカルシニューリンを含んでなる細胞とを接触させること；
ｂ）Ｓ４２１位においてリン酸化されるハンチンチンの量および／またはＳ４２１位においてリン酸化されないハンチンチンの量を評価すること；次いで、
ｃ）候補化合物と接触されていないコントロール細胞を比較して、Ｓ４２１位におけるハンチンチンのリン酸化を増加させる候補化合物を選択すること。
【００４９】
好適な実施態様では、Ｓ４２１位におけるハンチンチンのリン酸化は、Ｓ４２１位においてリン酸化されたハンチンチン特異的な抗体、特にウエスタンブロットにより検出される。好ましくは、細胞はニューロン、特に、線条体ニューロンである。しかし、いかなる種類の細胞が本発明において想定される。
【００５０】
カルシニューリンを阻害する薬物は、様々な起源のもの、天然物および組成物であり得る。それは、単離されたもしくは他の物質との混合において、脂質、ペプチド、ポリペプチド、核酸、小分子などのごときいずれの有機または無機物質であり得る。好適な実施態様では、薬物は小分子である。他の好適な実施態様では、薬物はペプチドまたはポリペプチドである。さらなる実施態様では、薬物は、核酸、例えば、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、リボザイムである。別の実施態様では、薬物はアプタマーである。好適な実施態様では、カルシニューリンを阻害する薬物は、血液−脳関門を通過する。
【００５１】
本発明において使用される薬物は、一般的に医薬上許容されるキャリアを含んでなる医薬組成物として製剤化されうる。医薬上許容されるキャリアとは、処置される哺乳動物に生理学的に許容可能である一方、それと共に投与される薬物の治療特性を保持するキャリアを意図する。例えば、医薬上許容されるキャリアは、生理食塩溶液であり得る。他の医薬上許容されるキャリアは当業者に公知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（第２０版、Ａ．Ｒ．ゲンナロＡＲ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ  ＡＲ．）、２０００年、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ）に記載される。
【００５２】
本発明の組成物は、経口的、非経口的、吸入スプレーにより、局所的、直腸内、経鼻的、頬側的、膣内にまたは移植リザーバを通して投与することができる。本明細書で使用される用語「非経口」は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、肝内、病巣内および頭蓋内注入または輸注技術を含む。好ましくは、組成物は、経口的、腹腔内または静脈内に投与される。血液−脳関門を通過しない薬物については、例えば、定位注入によって脳に薬物を注入することを必要とする。
【００５３】
「治療量」とは、Ｓ４２１位におけるハンチンチンのリン酸化を増加させるのに十分である薬物の量を意図する。薬物の有効量は、投与形態、対象の年齢、体重、性別および総合的な健康状態に依存して変動する。好適な実施態様では、それは、カルシニューリン活性を効率的に阻害し、それによりポリＱ−ハンチンチン毒性を阻止または減少させるのに十分な量である。効果は、ポリＱ−ハンチンチンによって誘導されるニューロン死による、Ｓ４２１位におけるハンチンチンのリン酸化状態によって評価することができる。所定の適用に対する治療量を決定するために当該技術分野に公知の多くの方法が存在することが理解される。例えば、ＦＫ５０６の用量は、０．００１ｍｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは、経口投与による０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の間および静脈内注入による０．００１〜１ｍｇ／ｋｇ／日の間、好ましくは、０．０１〜０．５ｍｇ／ｋｇ／日の間であり得る。投与プロトコルは当業者に周知である。特定の実施態様では、血中ＦＫ５０６レベルは、５〜４０ｎｇ／ｍｌの間、好ましくは、１５〜２０ｎｇ／ｍｌの間に含まれる。従って、ＦＫ５０６の投与用量は、上記の血中ＦＫ５０６レベルを得るために適合されうる。
【実施例】
【００５４】
以下の実施例は本発明を例示する。
【００５５】
材料および方法
構築物。ｐＳＩＮ−４８０−１７Ｑ、ｐＳＩＮ−４８０−６８Ｑ、ｐＳＩＮ−４８０−６８Ｑ−Ｓ４２１ＡおよびｐＳＩＮ−４８０−６８ＱＳ４２１Ｄを、それぞれ、４８０−１７Ｑ、４８０−６８Ｑ、４８０−６８Ｑ−Ｓ４２１Ａおよび４８０−６８Ｑ−Ｓ４２１Ｄプラスミドから作製した（ハンバート（Ｈｕｍｂｅｒｔ）ら、２００２年）。これらのプラスミドは、１７もしくは６８グルタミンおよび４２１位におけるセリンからアラニンへの変異（Ｓ４２１Ａ）またはセリンからアスパラギン酸への変異（Ｓ４２１Ｄ）を伴うハンチンチンの最初の４８０アミノ酸のフラグメントをコードする。最初に、ＰＣＲストラテジーを用いて、順方向プライマー：５’ＧＣＡＧＣＴＣＡＣＴＣＴＧＧＴＴＣＡＡＧＡＡＧＡＧ３’（配列番号１）およびヘマグルチニン−タグ（ＨＡ）を含有する逆方向プライマー：
５’ＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＧＣＧＴＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＡＴＣＧＴＡＴＧＧＧＴＡＧＧＡＴＣＴＡＧＧＣＴＧＣＴＣＡＧＴＧ３’（配列番号２）を使用して、４８０構築物のＣ末端部を改変した（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州、米国）。様々なフラグメントを、親４８０−１７Ｑ／６８Ｑプラスミドにクローン化することにより、Ｃ末端ＨＡタグを有し、Ｓ４２１、Ｓ４２１ＡおよびＳ４２１Ｄ変異を伴うベクター４８０−１７Ｑ／６８Ｑを作製し、次いで、ＳＩＮＷ−ＰＧＫ−ＧＤＮＦにサブクローン化した（ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ；デグロン（Ｄｅｇｌｏｎ）ら、２０００年）。
【００５６】
以前報告したように、レンチウイルス粒子を２９３Ｔ細胞において生成し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）／１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中で再懸濁した。ウイルスバッチの粒子含有量を、ｐ２４抗原ＥＬＩＳＡ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、マサチューセッツ州、米国）により決定した。
【００５７】
野生型Ａｋｔ、構成的に活性なＡｋｔ（Ａｋｔ  ｃ．ａ．）、野生型ＣａＮＡ、構成的に活性な（Ｃａ２＋−非感受性）形態のＣａＮＡ（ＣａＮＡ−ΔＣａＭ）、触媒不活性の優勢な干渉形態のＣａＮＡ（ＣａＮＡ−Ｄ１３０Ｎ）とＣａＮＢ、ＢＤＮＦ−ｅＧＦＰ、ならびに様々なハンチンチン構築物４８０−１７Ｑ、４８０−６８Ｑ、４８０−１７Ｑ−Ｓ４２１Ａ、４８０−６８Ｑ−Ｓ４２１Ａ、４８０−１７Ｑ−Ｓ４２１Ｄ、４８０−６８Ｑ−Ｓ４２１Ｄ、ＷＴおよびポリＱ−ＦＬ−ｈｔｔをコードするベクターをすでに記載している。
【００５８】
動物。体重約１８０〜２００ｇの成体雌のＷｉｓｔａｒラット（Ｉｆｆａ−Ｃｒｅｄｏ／Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｌｅｓ  Ｏｎｃｉｎｓ、仏国）を使用した。動物を１２時間の明／暗サイクルに維持された温度制御された部屋で飼育した。食物および水を自由に摂取させた。
【００５９】
ＦＫ５０６（Ａｌｅｘｉｓ、Ｌａｕｓｅｎ、瑞国）を、５〜６週齢のＣ５７／ＢＬ６雄マウス（Ｉｆｆａ−Ｃｒｅｄｏ／Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｌｅｓ  Ｏｎｃｉｎｓ、仏国）に、経口または腹腔内注入（５ｍｇ／ｋｇ）により投与した（ダン（Ｄｕｎｎ）ら、１９９９年；シング（Ｓｉｎｇｈ）ら、２００３年）。経口投与では、ＦＫ５０６を１００μｌの０．５％カルボキシメチルセルロース（Ｓｉｇｍａ）に溶解した。腹腔内投与では、ＦＫ５０６を２００μｌのＣｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ）に溶解させた。マウスを、投与後の示された時間後に屠殺した。脳全体を、１μＭオカダ酸（Ｓｉｇｍａ）、１μＭ  ＦＫ５０６（Ａｌｅｘｉｓ）、１μＭシクロスポリンＡ（Ｓｉｇｍａ）および４０ｎＭトートマイシン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、独国）を添加した１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶解緩衝液（ウエスタンブロット分析のセクションを参照のこと）中でホモジェナイズし、次いで２０，０００×ｇ（５分間；４℃）で遠心分離した。上清のアリコートを６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離させた。
【００６０】
動物を使用する研究は、ヘルシンキ宣言（Ｄｅｃｌａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｌｓｉｎｋｉ）、ならびに米国の国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）で採用され、推奨される実験動物の管理と使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）に従い実施した。
【００６１】
レンチウイルスの注入。濃縮されたウイルスストックを融解し、ピペッティングの反復により再懸濁させた。レンチウイルスベクターを、３４ゲージのブラントチップ針を伴うＨａｍｉｌｔｏｎシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｒｅｎｏ、ネバダ州、米国）を使用して、ケタミン（７５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）麻酔した動物の線条体に定位注入した（Ｄａｖｉｄ  Ｋｏｐｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｔｕｊｕｎｇａ、カリフォルニア州、米国）。各ベクターについて、粒子含有量を２００，０００ｎｇ  ｐ２４／ｍｌに合わせた。ウイルス懸濁液（４μｌ）を、自動注入機（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｗｏｏｄ  Ｄａｌｅ、イリノイ州、米国）により０．２μｌ／分で注入し、次いで針をさらに５分間留置した。定位座標は：ブレグマに対し０．５ｍｍ吻側；正中線に対し３ｍｍ外側および頭蓋表面より５ｍｍであった。６−０Ｐｒｏｌｅｎｅ（登録商標）縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｂｒｕｓｓｅｌｓ、白国）を用いて皮膚を縫合した。
【００６２】
組織学的処理。レンチウイルス注入１、１２および２４週間後、動物に過剰用量のペントバルビタールナトリウムを投与し、生理食塩水および４％パラホルムアルデヒド／１０％ピクリン酸により心臓潅流（ｔｒａｎｓｃａｒｄｉａｌｌｙ  ｐｅｒｆｕｓｅｄ）した。脳を取り出し、４％パラホルムアルデヒド／１０％ピクリン酸中に約２４時間固定後、最後に、２５％スクロース／０．１Ｍリン酸緩衝液中で４８時間凍結保護した。脳をドライアイスで凍結させ、−２０℃において、スライディングミクロトームクラリオスタット（Ｃｒｙｏｃｕｔ  １８００、Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＧ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、瑞国）上で２５μｍの冠状切片に切断した。線条体全体を通しての切片を採取し、４８ウェルトレイ（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、マサチューセッツ州、米国）において、０．１２μＭアジ化ナトリウムを添加したＰＢＳ中で浮遊切片として貯蔵した。免疫組織学的処理まで、トレイを４℃で貯蔵した。
【００６３】
注入したラット由来の線条体切片を、ドーパミンおよび３２ｋＤａの分子量のｃＡＭＰ調節リン酸化タンパク質（ＤＡＲＰＰ−３２；１：７５００；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．，Ｔｅｍｅｃｕｌａ、カリフォルニア州、米国）について、ならびに以前記載されたベンザドウン（Ｂｅｎｓａｄｏｕｎ）ら、２００１年）のごときＨＡ−タグ（モノクローナル抗ＨＡ抗体；１：１０００；Ｃｏｖａｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  カリフォルニア州、米国）について、免疫化学により処理した。続いて、切片を、ビオチン化された二次ヤギ抗マウスまたはヤギ抗ウサギ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，バーリンガム、カリフォルニア州、米国）によりインキュベートし、以前記載したように視覚化を行った。
【００６４】
ＤＡＲＰＰ−３２欠失領域の定量化および統計解析。ＤＡＲＰＰ−３２のダウンレギュレーションを、病巣を含有する各切片において、画像解析プログラム（ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ１．６３）を用いて測定した。各切片について、最初に、Ｔ値を得るために、線条体の標的化された領域、およびウイルスに感染しなかった線条体の非感染領域（ＮＩ）において、吸光度を調べる。次いで、ＤＡＲＰＰ−３２非発現領域（Ｂ、皮質）からバックグランド値を得る。続いて、以下の式：病巣の％＝１００−（（ＮＩ−Ｂ）／（Ｔ−Ｂ）×１００）を用いて病巣の百分率を算出し、病巣の百分率を表す；１００％病巣は、４８０−６８Ｑ構築物により生じた病巣に相当する。同じ動物に注入された２つの構築物間の比較を、対応のあるｔ検定を用いて行った。２４週間目では、線条体の体積は様々なレンチウイルスにより改変されない（データ示さず）。
【００６５】
インビトロリン酸化／脱リン酸化アッセイ。キナーゼアッセイを、組み換えＡｋｔ（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、シャーロッツビル、米国）および基質として精製された短縮形態のハンチンチンタンパク質（ＧＳＴと融合したアミノ酸３８４〜４６７のヒトハンチンチン；１時間のインキュベーション、３０℃）を用いて記載（ランゴン（Ｒａｎｇｏｎｅ）ら、２００４年）されるように実施した。精製されたカルシニューリン（ウシ脳から単離された天然型タンパク質、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ、カリフォルニア州、米国）を上述のとおり添加した。反応生成物を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離させた。
【００６６】
細胞培養、トランスフェクションおよび薬物処置。線条体ニューロンの初代培養を、Ｅ１７のスプラーグドーリー系ラットから調製し、インビトロ４日で、改変されたリン酸カルシウム技術（サウドウ（Ｓａｕｄｏｕ）ら、１９９８年）によってトランスフェクトした。野生型ハンチンチンマウス（ニューロン細胞、＋／＋）およびＨｄｈＱ１０９ノックインマウス（１０９Ｑ／１０９Ｑ）由来のマウスニューロン細胞を、以前に記載された通りに培養し（トレッテル（Ｔｒｅｔｔｅｌ）ら、２０００年）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂｒｅｄａ、蘭国）でトランスフェクトした。共トランスフェクトした場合（図３Ａ）、４８０−１７Ｑ／Ａｋｔ／ＣａＮＡ−ΔＣａＭ／ＣａＮＢの比率は、１：０．５：１：１であった。ヒトＨＥＫ２９３細胞を、１０％仔ウシ血清（ＢＣＳ）を添加したＤＭＥＭ中で培養し、リン酸カルシウム技術によってトランスフェクトした。ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞およびジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）Ｔ細胞を、１０％ＢＣＳを添加したＲＰＭＩ中で増殖させた。ＦＫ５０６（１μＭ）および／またはイオノマイシン（２．５μＭ）の添加前に、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）Ｔ細胞をタイロード緩衝液（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、５．６ｍＭ  グルコース、０．３ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ；４×１０６細胞／ｍｌ）に移した。
【００６７】
ウエスタンブロット分析。トランスフェクション／薬物とのインキュベーション後、剥離（ｓｃｒａｐｉｎｇ）および溶解の前に、細胞を氷冷リン酸緩衝食塩水で洗浄した。溶解緩衝液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５であり、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＥＧＴＡ、５０ｍＭ  ＮａＦ、１０ｍＭ  β−グリセロリン酸、５ｍＭ  ピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ  オルトバナジン酸ナトリウム、０．１％（ｖ／ｖ）  β−メルカプトエタノール、２５０μＭ  ＰＭＳＦ、１０ｍｇ／ｍｌ  アプロチニンおよびロイペプチンを含有した。細胞溶解物を４℃において２０，０００×ｇで５分間遠心分離させた。等量のタンパク質（４０μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に電気泳動的に移行させた。ブロットしたものを、５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＴＢＳＴ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中でブロックし、次いで抗α−チューブリン（１：１０００；ＤＭ１Ａ，Ｓｉｇｍａ）、抗カルシニューリンＰａｎＡ（１：１０００；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、抗ホスホハンチンチン−Ｓ４２１−７６３（ハンバート（Ｈｕｍｂｅｒｔ）ら、２００２年）、抗ホスホハンチンチン−Ｓ４２１−７１４（以下を参照のこと）、抗ハンチンチン１２５９（１：１０００））およびＭＡＢ２１６６（１：５０００；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）抗体で１時間免疫ブロットした。続いて、ブロットしたものを、抗ウサギＩｇＧ：ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、米国）で標識し、洗浄し、製造業者の説明書に従い、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＷｅｓｔＰｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｅｒｅｍｂｏｄｅｇｅｍ、白国）と５分間インキュベートさせた。この膜をＫｏｄａｋ  Ｂｉｏｍａｘフィルムに感光させ、現像した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用するフィルムの濃度測定走査によりシグナルの定量化を行った。
【００６８】
免疫蛍光実験。ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞を、コーティングされていないガラスカバースリップ上で増殖させ、野生型ＣａＮＡ／Ｂで２４時間トランスフェクトし、次いで１μＭイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ）で１５分処置するか、または処置しないままにした。細胞を（ＰＩＰＥＳ、１２０；ＨＥＰＥＳ、５０、ＥＧＴＡ、２０；酢酸Ｍｇ  ４：ｍＭ中の）４％パラホルムアルデヒド−ＰＨＥＭ緩衝液で２０分間固定し、抗ホスホ−Ｓ４２１−ハンチンチン−７６３（１：１００）および抗ＣａＮＡ（１：２００；カタログ番号Ｃ１９５６、Ｓｉｇｍａ）抗体とインキュベートさせた。先に記載される（ゴーティエル（Ｇａｕｔｈｉｅｒ）ら、２００４年）ように、画像を３次元デコンボリューション画像システムで捕捉した。次に、ホスホ−Ｓ４２１シグナルの平均蛍光強度を、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｐ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ニュージャージー州、米国）を用いて定量化した。各対の細胞（トランスフェクトされた／トランスフェクトされていない）について、トランスフェクされた細胞由来のシグナルを、１００の値をトランスフェクトされていない細胞に付与することにより標準化した。ほとんど同じサイズの非有糸分裂細胞のみを考慮した。合計３０を超える細胞を、２つの独立した実験で解析した。
【００６９】
ニューロンを、ラミニンおよびポリＤ−リジンでコートされたガラスカバースリップ上で増殖させ、先に記載されるように固定し、次いで以下の一次抗体とインキュベートさせた：抗ホスホ−Ｓ４２１−ハンチンチン−７１４（１：１００）、Ｎ−ｔｅｒ１２５９（１／５００）およびＣａＮＡ（１：２００）。二次抗体は、抗マウスＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８（１：２００）および抗ウサギＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−５５５（１：２００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、オレゴン州、米国）であった。３次元デコンボリューション画像システムで画像を捕捉した。
【００７０】
ニューロン生存率の測定。プレーティングの４日後、線条体ニューロンの初代培養物を、野生型またはポリＱ−ハンチンチンおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）でトランスフェクトして、トランスフェクトされた細胞を同定した。ＧＦＰを合成する各ニューロンがハンチンチン構築物を発現することを確実にするためにも、ハンチンチンＤＮＡのＧＦＰ  ＤＮＡとの高い比率（１０：１比）による派生したリン酸カルシウム法（ハンバート（Ｈｕｍｂｅｒｔ）ら、２００２年）を用いてトランスフェクションを行った。これらの条件下で、９５％を超えるＧＦＰ陽性ニューロンがハンチンチン構築物をも発現する（データ示さず）。トランスフェクションの１６時間および３６時間後に、盲験様式で蛍光顕微鏡を用いてＧＦＰ陽性ニューロンをスコア化した。ＧＦＰ陽性細胞内で起こる細胞死を、２時点間の生存ニューロン数の差異として調べ、次いで４８０−１７Ｑ構築物によって誘導される死と比べたニューロン細胞死の増加倍率として表した。各グラフは、３回反復で実施した２〜４回の独立した実験を示す。得られたグラフにおける各バーは、約２０００個のニューロンのスコアに相当する。ＲＮＡ干渉実験では、ニューロン細胞死は、４８０−６８Ｑ／スクランブル条件と比べて、様々なｓｉＲＮＡの存在下において生存した４８０−６８Ｑトランスフェクト細胞の数として表される。データを完全な統計解析にかけた。
【００７１】
カルシニューリンに対するｓｉＲＮＡ。ラットＣａＮＡαおよびＣａＮＡβを標的とするｓｉＲＮＡ配列は各々、コーディング領域６７７〜６９５（受託番号ＮＭ０１７０４１）および４４８〜４６６（受託番号ＮＭ０１７０４２）に対応する。より詳細には、ＣａＮＡαを標的とするｓｉＲＮＡ配列は、以下のとおりである：
５’−ＣＡＧＡＧＵＡＵＵＵＣＡＣＧＵＵＵＡＡｄＴｄＴ−３’（配列番号３）
３’−ｄＴｄＴＧＵＣＵＣＡＵＡＡＡＧＵＧＣＡＡＡＵＵ−５’（配列番号４）
ＣａＮＡβを標的とするｓｉＲＮＡ配列は、以下のとおりである：
５’−ＧＧＧＵＵＧＡＵＧＵＵＣＵＧＡＡＧＡＡｄＴｄＴ−３’（配列番号５）
３’−ｄＴｄＴＣＣＣＡＡＣＵＡＣＡＡＧＡＣＵＵＣＵＵ−５’（配列番号６）
３μｇのｓｉＲＮＡまたはスクランブルＲＮＡを、４×１０６個の新たに単離された線条体ニューロンと混合し、製造者の説明書（Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、独国）に従ってヌクレオフェクトし、１２ウェルプレートに撒き、次いで４０時間インキュベートさせた。スクランブルＲＮＡは、ＣａＮＡα  ｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成を有するが、他のいずれの遺伝子に対して有意な配列相同性を欠如する。
【００７２】
Ｓ４２１をリン酸化されたハンチンチンに対する抗体。ヒト特異的抗ホスホハンチンチン−Ｓ４２１−７６３抗体は、以前に記載されている（ハンバート（Ｈｕｍｂｅｒｔ）ら、２００２年）。マウス特異的抗ホスホハンチンチン−Ｓ４２１−７１４抗体の作製：マウスハンチンチン配列（ＣＡＲＧＲＳＧＳ［ＰＯ３Ｈ２］ＩＶＥＬＬ）に対応するホスホペプチドを合成し、キーホールリンペットヘモシニアン（Ｎｅｏｓｙｓｔｅｍ、Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ、仏国）に結合させ、ウサギに注入した。ポリクローナル抗体を血清から得、ホスホペプチドカラムによりアフィニティー精製した。簡単に説明すると、血清をろ過し（０．２２μｍフィルター）、１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）を１００ｍＭの最終濃度まで添加した後、それをリン酸化ペプチドが結合されたＳｕｌｆｏｌｉｎｋカラム（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｅｒｅｍｂｏｄｅｇｅｍ、白国）に適用した。保持された抗体を１００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ２．７）で溶出し、１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ９でｐＨを迅速に中和した。抗体を濃縮（Ｖｉｖａｓｐｉｎ濃縮装置１００００ＭＷ、Ｖｉｖａ  Ｓｉｅｎｃｅ、Ｈａｎｎｏｖｅｒ、独国）し、５０％グリセロール中で保存した。
【００７３】
ビデオ顕微鏡実験および分析。ビデオ実験では、ラットの一次皮質ニューロン、＋／＋、およびＨｄｈＱ１１１ノックインマウスから樹立された１０９Ｑ／１０９Ｑ細胞を調製し、培養し、次いで先に記載された（ゴーティエル（Ｇａｕｔｈｉｅｒ）ら、２００４年；ハンバート（Ｈｕｍｂｅｒｔ）ら、２００２年；サウドウ（Ｓａｕｄｏｕ）ら、１９９８年；トレッテル（Ｔｒｅｔｔｅｌ）ら、２０００年）ようにトランスフェクトした。いくつかの場合では、皮質ニューロンの初代培養物を、供給者の手引き書（Ａｍａｘａ、Ｃｏｌｏｇｎｅ）に従って、ラットニューロンＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）キットによりエレクトロポレートする。トランスフェクション５時間後に、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（１０Ｍ；Ｓｉｇｍａ）およびＩＢＭＸ（１００Ｍ；Ｓｉｇｍａ）を培養物に添加した。
【００７４】
トランスフェクションの２または４日後に、ビデオ顕微鏡実験を行った。細胞を、ＢＤＮＦ−ｅＧＦＰおよびｈｔｔの様々な構築物または１：４のＤＮＡ比を伴う対応する空ベクターで共トランスフェクトした。先に詳述（ゴーティエル（Ｇａｕｔｈｉｅｒ）ら、２００４年）されている画像化システムを使用して、生体ビデオ顕微鏡を行った。細胞を、Ｌｕｄｉｎチャンバにマウントされたガラスカバースリップ上で増殖させた。顕微鏡およびチャンバを３７℃（ノックイン細胞では３３℃）で保持した。０．３μｍのＺ工程を伴う１０〜１５画像のスタックを、圧電性デバイス（ＰＩ）を繋げた１００×ＰｌａｎＡｐｏＮ．Ａ．１．４油浸対物レンズにより獲得した。画像を、５０〜１００ミリ秒の露光時間（２の頻度）で２×２ビニングに設定されたＣｏｏｌ  Ｓｎａｐ  ＨＱカメラ（Ｒｏｐｐｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ストリームモードで収集した。すべてのスタックを、光学システムのＰＳＦを使用する自動バッチデコンボリューションにより処理した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、投影図、アニメーションおよび解析を作成した。動力学を、特別開発プラグイン（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／ｐｌｕｇｉｎｓ／ｔｒａｃｋ／ｔｒａｃｋ．ｈｔｍｌ）で、時間の関数として細胞におけるｅＧＦＰ小胞の位置を追跡することにより特徴付けた。追跡の間、小胞の中心のデカルト座標を使用して、動力学パラメータ（速度、休止時間、指向性）を算出した。
【００７５】
結果
セリン４２１におけるポリＱ−ハンチンチンのリン酸化は、インビボにおいて神経保護的である
本発明者らは以前、ＩＧＦ１／Ａｋｔ経路が、ＨＤの細胞モデルにおいて神経保護的であることを実証している（ハンバート（Ｈｕｍｂｅｒｔ）ら、２００２年）。実際にＩＧＦ−１活性化時、Ａｋｔは、Ｓ４２１においてポリＱ−ハンチンチンをリン酸化し、線条体ニューロンの初代培養においてその毒性を阻止する。Ｓ４２１におけるリン酸化がインビボにおいて役割を果たし、それにより治療上の標的になり得るかどうかを調べるために、本発明者らは、線条体におけるポリＱ−ハンチンチンのレンチウイルス介在発現に基づくＨＤのラットモデルを使用した。このモデルは、神経炎および核内封入体、ニューロン機能障害および死を呈するＨＤ患者において観察されるいくらかの特徴を再現する。本発明者らは、無傷（ｉｎｔａｃｔ）なＳ４２１、Ｓ４２１からアラニン（Ｓ４２１Ａ）またはＳ４２１からアスパラギン酸（Ｓ４２１Ｄ）への変異のいずれかを伴う１７（野生型、４８０−１７Ｑ）または６８グルタミン残基（変異、４８０−６８Ｑ）を含有するハンチンチンの最初の４８０アミノ酸をコードするＨＡタグ化レンチウイルス構築物を作製した。次いで、レンチウイルスをラット線条体に注入して、４８０−１７Ｑ／４８０−６８Ｑ、４８０−６８Ｑ／４８０−６８Ｑ−Ｓ４２１Ａおよび４８０−６８Ｑ／４８０−６８Ｑ−Ｓ４２１Ｄ構築物間で所定のラットについて直接比較することを可能にした（図９）。注入１週間後、様々なハンチンチン構築物の固有の発現を、抗ハンチンチン免疫染色によって制御したところ、それらの発現レベルにおいて差異が認められなかった（データ示さず）。１２週間目の病巣の中間評価（データ示さず）に従って、本発明者らは、注入２４週間後のラット線条体におけるポリＱ−ハンチンチン誘導性の病巣を分析した。免疫組織化学的分析は、すべての構築物が同様のレベルで発現されたこと、および導入遺伝子の発現が２４週において維持されたことを示した（図１）。この段階で、ＨＡおよびＡｋｔ免疫陽性ニューロンの注入された領域の存在により示されるように、有意な細胞死は検出されなかった（図１および図１０）。次いで、ＤＡＲＰＰ−３２をマーカーとして使用して、病巣を評価した。ＤＡＲＰＰ−３２は、線条体中型有棘ニューロンの約９６％に存在するドーパミンシグナル伝達の調節因子である。ＤＡＲＰＰ−３２のダウンレギュレーションは疾患の様々なモデルで観察されるため、ＤＡＲＰＰ−３２は、ＨＤのこれらの投射ニューロンの機能障害のマーカーである。ＤＡＲＰＰ−３２抗体による免疫組織化学的分析を実施し、病巣のサイズをすべての構築物について調べ、４８０−６８Ｑ構築物により誘導される病巣の百分率として表した。予想どおり、４８０−６８Ｑ構築物は、野生型ハンチンチンとは対照的に、有意な病巣を誘導した。本発明者らは、Ｓ４２１におけるリン酸化の不在が、４８０−６８Ｑ構築物により誘導されるＤＡＲＰＰ−３２欠失領域のサイズの強力な増加（２倍）を生じたことを見出した。対照的に、Ｓ４２１における構成性リン酸化は、ポリＱ誘導性ＤＡＲＰＰ−３２欠失領域における有意な減少（約３０％）をもたらした。まとめて考えると、本発明者らは、ハンチンチンにおけるＳ４２１のリン酸化が疾患の進行をインビボで調節するのに不可欠であると結論付ける。
【００７６】
カルシニューリンは、インビトロにおいてハンチンチンのホスホＳ４２１を脱リン酸化する
ホスファターゼ活性はＳ４２１リン酸化の動的調節を可能にし得るため、本発明者らは、Ｓ４２１を脱リン酸化するホスファターゼを同定することを目的とした。タンパク質ホスファターゼ２Ｂ（ＰＰ２Ｂ）としても公知であるカルシニューリンは、カルシウムおよびカルモジュリン依存性ホスファターゼである（総説については、マンシー（Ｍａｎｓｕｙ）、２００３年を参照のこと）。カルシニューリンがＳ４２１に作用するかどうかを評価するために、本発明者らは、最初に、インビトロでの脱リン酸化実験を行った。このため、本発明者らは、ハンチンチンタンパク質におけるＳ４２１のホスホ−セリンのみに結合するポリクローナル抗体（抗ホスホハンチンチン−Ｓ４２１−７６３）を使用した（ハンバート（Ｈｕｍｂｅｒｔ）ら、２００２年）。さらに、本発明者らは以前、Ｓ４２１上のＡｋｔおよびＳＧＫによりリン酸化されるＧＳＴ融合形態のハンチンチン（ＧＳＴ−ハンチンチン、ＧＳＴに融合したヒトハンチンチンのアミノ酸３８４〜４６７）を作成した（ハンバート（Ｈｕｍｂｅｒｔ）ら、２００２年）。本発明者らは、このハンチンチンフラグメントをＡｋｔの構成性活性形態（Ａｋｔ  ｃ．ａ．）と共にインキュベートして、抗ホスホハンチンチン−Ｓ４２１−７６３抗体で検出されるようなＳ４２１におけるＧＳＴ−ハンチンチンのリン酸化を生じさせた（図２Ａ、Ｂ）。次に、ハンチンチンのこのリン酸化されたフラグメントを、精製されたカルシニューリンと共に異なる時間で（図２Ａ）、および６０分間異なる濃度のカルシニューリンでインキュベートした（図２Ｂ）。観察されるように、カルシニューリンは、時間および用量依存的様式でハンチンチンのＳ４２１をインビトロで脱リン酸化する。
【００７７】
カルシニューリンは、細胞においてハンチンチンのホスホＳ４２１を脱リン酸化する
カルシニューリンは、６０ｋＤａの触媒サブユニット（ＣａＮＡ）および１９ｋＤＡの調節サブユニット（ＣａＮＢ）からなるヘテロダイマーである（ルスナク（Ｒｕｓｎａｋ）およびメルツ（Ｍｅｒｔｚ）、２０００年）。ヘテロダイマーのホロ酵素は、そのホスファターゼ活性に必要である。Ｓ４２１におけるハンチンチンのカルシニューリン脱リン酸化が細胞で生じるかどうかを調べるために、本発明者らは、不死化マウス線条体細胞（＋／＋細胞）を４８０−１７Ｑ、カルシニューリンＡの構成性活性形態（ＣａＮＡ−ΔＣａＭ）、ＣａＮＢおよび／またはＡｋｔで共トランスフェクトした（図３Ａ）。予想どおり、Ａｋｔは、選択的にマウス配列を認識する本発明者らの新たに作製した抗ホスホハンチンチン−Ｓ４２１−７１４抗体によるウエスタンブロッティングにより検出されるようなＳ４２１におけるハンチンチンのリン酸化を誘導した。Ａｋｔによって誘発されるＳ４２１のリン酸化は、活性なカルシニューリン（ＣａＮＡ−ΔＣａＭ／ＣａＮＢ）の共トランスフェクションにより減少した。両方のカルシニューリン構築物は以前、ＮＦＡＴ活性のルシフェラーゼレポーターを使用して検証され、ＣａＮＡ−ΔＣａＭ／ＣａＮＢがＨＥＫ２９３細胞に共トランスフェクトされた場合、１５倍のＮＦＡＴ活性化を誘導した（示さず）。それゆえ、本発明者らは、カルシニューリンが、Ａｋｔ−リン酸化Ｓ４２１においてハンチンチンの４８０−１７Ｑ形態を脱リン酸化することを実証する。
【００７８】
内因性ハンチンチンがカルシニューリンの標的であるかどうかを試験するために、本発明者らは、アスパラギン酸１３０がアスパラギンに変異されるＣａＮＡの優勢な干渉形態（ＣａＮＡ−Ｄ１３０Ｎ）を使用した。ＨＥＫ２９３細胞におけるこの構築物とＮＦＡＴレポーターとの共トランスフェクションは、内因性ＮＦＡＴ活性を６０％まで減少させた（示さず）。ＣａＮＡ−Ｄ１３０Ｎをコードする構築物をヒト神経芽腫ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞系統にトランスフェクトした場合、Ｓ４２１における内因性ハンチンチンのリン酸化が増加した（図３Ｂ）。従って、内因性ハンチンチンのリン酸化Ｓ４２１は、カルシニューリンの生理学的基質である。
【００７９】
カルシニューリンが実際に、細胞で、Ｓ４２１においてハンチンチンを脱リン酸化することをさらに実証するために、本発明者らは、ニューロン細胞を野生型ＣａＮＡ／ＣａＮＢでトランスフェクトし、コントロール条件において抗ホスホハンチンチン−Ｓ４２１−７６３抗体を使用する免疫蛍光により、またはカルシウムイオノフォアイオノマイシンによるカルシニューリンの活性化後に内因性ハンチンチンのリン酸化を分析した（図４Ａ、上のパネル）。ハンチンチンがカルシニューリンの存在下でリン酸化されたままであった一方、本発明者らは、カルシニューリントランスフェクト細胞をイオノマイシンで処置した場合、Ｓ４２１におけるハンチンチンリン酸化の減少を観察した（図４Ａ、下のパネル）。２つの独立した実験からの３０を超える細胞における蛍光強度の定量化は、Ｓ４２１における内因性ハンチンチンリン酸化の統計的に有意な減少を示した（図４、グラフ）。これは、ニューロン細胞におけるＣａ２＋によるカルシニューリンの活性化が、ハンチンチンのＳ４２１の脱リン酸化をもたらすことを実証する。
【００８０】
最終的に、本発明者らは、本発明者らの実験系において、カルシニューリンおよびハンチンチンが同じ線条体ニューロンに存在することを実証することにより、本発明者らの知見したことの関連性を確認した。本発明者らは、線条体ニューロンの初代培養を調製し、続いて、ＣａＮＡ、ハンチンチンおよびホスホＳ４２１−ハンチンチンについて免疫染色した。本発明者らは、すべてではないがほとんどのカルシニューリン免疫陽性線条体細胞が、すべてのおよびＳ４２１においてリン酸化されたハンチンチンについても免疫反応性であることを見出した（図４Ｂ）。細胞内では、ホスホハンチンチンおよびハンチンチンが小胞構造において、細胞体および神経突起に沿って広がっていることが見出された。この突出した小胞の局在に加えて、ハンチンチンはまた、ＧＭ１３０との共局在により示されるようにシス−ゴルジにおいても見出された（示さず）。興味深いことに、本発明者らは、神経突起に沿った小胞において特に認められた内因性ハンチンチンおよびカルシニューリンの部分的な共局在を観察した（図４Ｂにおける拡大図を参照のこと）。
【００８１】
カルシニューリンの優勢な干渉形態はポリＱ−ハンチンチン誘導性の毒性を減少させる
本発明者らは以前、Ｓ４２１におけるハンチンチンのリン酸化が神経保護的であることを示した。従って、本発明者らは、カルシニューリンの優勢な干渉形態が、疾患の主な特徴を再現するＨＤのニューロンモデルを研究することにより神経保護特性を持つかどうかについて調べた（図５Ａ）。本発明者らは、線条体ニューロンの初代培養を、構築物４８０−１７Ｑおよび４８０−６８Ｑ単独かまたはＣａＮＡ−Ｄ１３０Ｎの存在下でトランスフェクトし、次いでトランスフェクション２４時間後のニューロン死を分析した。予想どおり、４８０−６８Ｑ構築物は、４８０−１７Ｑ構築物と比較して、ニューロン死の統計的に有意な増加を誘導した。興味深いことに、ＣａＮＡ−Ｄ１３０Ｎのトランスフェクションは、ハンチンチンの４８０−６８Ｑフラグメントによって誘導されるニューロン死を減少させた（図５Ａ）。これらの知見は、Ｓ４２１においてハンチンチンのリン酸化を増加させるカルシニューリンの優勢な干渉形態が、ポリＱ−ハンチンチンにより誘導されるニューロン死に対して神経保護効果を及ぼすことを示す。
【００８２】
ポリＱ−ハンチンチン誘導性細胞死に対するカルシニューリン阻害の役割をさらに確認するために、本発明者らは、ＲＮＡ干渉によりカルシニューリンのレベルを減少させた。カルシニューリンＡサブユニットの２つのアイソフォームは、脳において見出すことができる（ＣａＮＡαおよびＣａＮＡβ）。従って、本発明者らは、ＲＮＡ干渉によるαおよびβサブユニットの両方を標的とし、両方のｓｉＲＮＡの存在がＣａＮＡのレベルの有意な減少を確実にするのに必要であることを見出した（図５Ｂ）。これらの条件において、本発明者らは、ポリＱ−ハンチンチン誘導性細胞死の有意な減少を観察し、このことはさらにこのプロセスにおけるカルシニューリンの役割を支持する。
【００８３】
ＣａＮＡ−Ｄ１３０Ｎによって仲介される神経保護は、Ｓ４２１に依存するであろうか？この質問に答えるために、本発明者らは、線条体ニューロンにおいてＣａＮＡ−Ｄ１３０Ｎを、４８０−６８Ｑ構築物またはＳ４２１がアラニンに変異されている４８０−６８Ｑ構築物、４８０−６８Ｑ−Ｓ４２１Ａのいずれかで共トランスフェクトした（図５Ｃ）。先に述べたように、ＣａＮＡ−Ｄ１３０Ｎ構築物はポリＱ−ハンチンチン誘導性毒性からニューロンを保護するが、４２１位がリン酸化され得ない場合、この構築物はニューロンを保護することができない。
【００８４】
従って、カルシニューリンは、ポリＱ−ハンチンチン上のＳ４２１の脱リン酸化を通して少なくとも部分的にその効果を及ぼす。
【００８５】
カルシニューリンの阻害は、細胞中のＳ４２１におけるハンチンチンのリン酸化を増加させる。
ＦＫ５０６は、移植後のヒトの処置において日常的に使用される免疫抑制薬である。この化合物は、ＮＦＡＴのＣａＮ介在の脱リン酸化を阻害することにより免疫抑制を調節する。ここで、ＮＦＡＴは、ＩＬ−２の発現を調節し、次いでＴ−リンパ球の増殖を調節する転写因子である。ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）Ｔ細胞系統は、カルシニューリンが関与するカルシウムシグナル伝達経路を研究するために広範に使用されるＴリンパ球細胞系統である。Ｓ４２１上のハンチンチンのリン酸化におけるカルシニューリンを阻害する効果を調べるために、本発明者らは、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）Ｔ細胞をＦＫ５０６で処置した。図６Ａで見られるように、ＦＫ５０６は、内因性ハンチンチンにおけるＳ４２１のリン酸化を増加させた。次に、本発明者らは、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）Ｔ細胞をカルシウムイオノフォアイオノマイシンで処置することによりカルシニューリンを活性化させた（図６Ａ、下のパネル）。このことが、結果としてＦＫ５０６により阻害されたＳ４２１におけるハンチンチンの迅速な脱リン酸化を生じた。
【００８６】
次に、本発明者らは、ＦＫ５０６がまた、疾患により関連する細胞型においてＳ４２１のリン酸化を誘導し得るかどうかについて試験した。それゆえ、本発明者らは、初代培養の線条体ニューロンを、異なる時間および濃度についてＦＫ５０６で処置した（図６Ｂ）。ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞に関して、Ｓ４２１における内因性ハンチンチンのリン酸化が経時的に増加し、少なくとも６時間持続したままであった。本発明者らはまた、ＦＫ５０６の濃度増加がＳ４２１のリン酸化の増加を生じることを見出した。まとめると、これらのデータは、ＦＫ５０６によるＣａＮ活性の阻害がＳ４２１における内因性ハンチンチンのリン酸化の増加を生じることを示す。
【００８７】
ポリＱ伸長は、ＦＫ５０６によって増加させることができるＳ４２１におけるハンチンチンのリン酸化の減少をもたらす：ポリＱ誘導性ニューロン毒性に関する結果
次に、本発明者らは、病理学的状況におけるハンチンチンのリン酸化レベルを評価した。本発明者らは、ノックインマウスに由来するマウスニューロン細胞を使用した。ここで、前記ノックインマウスは、１０９グルタミン残基をコードするＣＡＧ伸長が内因性マウスハンチンチン遺伝子に挿入された（１０９Ｑ／１０９Ｑ）。この細胞系統は、これらの細胞においてポリＱハンチンチンが内在レベルで発現されるため、ＨＤ患者の状況に非常に類似する。本発明者らは、本発明者らの抗ホスホハンチンチン−Ｓ４２１−７１４抗体を用いて＋／＋または１０９Ｑ／１０９Ｑ細胞に対してイムノブロッティング実験を行い、ポリＱ−ハンチンチンのリン酸化が、野生型のハンチンチンと比較して極端に減少したことを観察した（図７Ａ）。このことは、一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞に関する先の研究（ワービー（Ｗａｒｂｙ）ら、２００５年）と一致し、ポリＱ−ハンチンチンのＳ４２１のリン酸化が野生型ハンチンチンより低かったことを示す。次いで、本発明者らは、カルシニューリンを阻害することが、Ｓ４２１におけるポリＱ−ハンチンチンのリン酸化を増加させるかどうかについて求めた。興味深いことに、１０９Ｑ／１０９Ｑ細胞のＦＫ５０６による処置は、Ｓ４２１のリン酸化の増加を生じた（図７Ｂ）。本発明者らは以前、Ｓ４２１におけるハンチンチンのリン酸化が神経保護的であることを示した。従って、ＦＫ５０６がポリＱ−ハンチンチンのリン酸化を増加させることから、本発明者らは、ポリＱ−ハンチンチン誘導性細胞死に対するこの免疫抑制剤の効果について試験した（図７Ｃ）。線条体ニューロンの初代培養を、４８０−６８Ｑ構築物でトランスフェクトし、ビヒクルまたは様々な用量のＦＫ５０６で処置した。０．３および１μＭのＦＫ５０６による細胞の処置は、ポリＱ誘導性ニューロン死の減少を生じた。まとめると、これらのデータは、Ｓ４２１におけるポリＱ−ハンチンチンの脱リン酸化を予防することにより、ＦＫ５０６がＨＤの細胞モデルにおいて神経保護的であることを示す。
【００８８】
ＦＫ５０６の単回投与は脳におけるハンチンチンＳ４２１のリン酸化を増加させる。
ハンチンチンのリン酸化は、インビトロおよびインビボでポリＱ−ハンチンチン誘導性毒性を調節し、疾患モデルにおいてリン酸化が減少することを考慮することが不可欠であることから、本発明者らは、ＦＫ５０６投与がインビボにおけるハンチンチンのリン酸化を誘導し得るかどうかを調べることを目的とした。マウスを、腹腔内または経口的にＦＫ５０６で処置し、投与後、異なる時間で屠殺した。脳を免疫ブロッティングのために処理し、Ｓ４２１におけるハンチンチンのリン酸化について分析した（図８）。特に、ＦＫ５０６の腹腔内および経口投与の両方は、脳におけるＳ４２１での内因性ｈｔｔの持続的なリン酸化を誘導した（２／３倍増加）。ハンチンチンのリン酸化に対するカルシニューリンの特異的効果と一致して、本発明者らは、Ｓ４７３におけるＡｋｔリン酸化のレベルがＦＫ５０６によって調節されないことを見出した。これらの結果は、ＦＫ５０６投与によるカルシニューリンの阻害がインビボで内因性ハンチンチンのリン酸化をもたらすことを実証する。
【００８９】
ＩＧＦ−１およびＡｋｔは、ＨＤにおける輸送欠損をレスキューする
ＩＧＦ−１／Ａｋｔ経路がＨＤに関するハンチンチン介在輸送を調節し得る可能性を試験するために、本発明者らは、高速３Ｄビデオ顕微鏡、続いてデコンボリューションを用いてＢＤＮＦ含有小胞を動力学的に分析した。皮質ニューロンの初代培養を、ＢＤＮＦ−ｅＧＦＰおよび野生型全長ｈｔｔ（ｗｔ−ＦＬ−ｈｔｔ、１７Ｑの場合）、ポリＱ−ＦＬ−ｈｔｔ（７５Ｑの場合）または対応するベクターのいずれかでトランスフェクトした。本発明者らは、３Ｄ画像を取得することによりＢＤＮＦ含有小胞の運動をモニターした。デコンボリューション後、各時点の２Ｄ再構築を行い、個々の小胞を追跡して、細胞内輸送の２つの最も関連する動的パラメータを調べた。第１のパラメータは、それらが（即ち、０を超える速度を伴って）移動している場合、小胞の平均速度であり、第２は、小胞の休止時間（移動を伴わない小胞によって費やされる時間）の百分率に相当する。以前報告されたように、ｗｔ−ＦＬ−ｈｔｔと比較して、ｈｔｔにおけるポリＱ伸長の存在は、ＢＤＮＦ含有小胞の平均速度の減少および休止時間の増加を生じる。ＩＧＦ−１によるニューロンの処置は、ＢＤＮＦ小胞の速度の統計的に有意な増加を誘導し、小胞の休止時間を減少させた（図１１Ａ）。ＩＧＦ−１の存在下において、ポリＱ−ＦＬ−ｈｔｔによる細胞内輸送の動的パラメータが野生型の状況と区別できないことは注目に値し、ＩＧＦ−１処置による輸送において、ハンチンチン機能のほとんど完全な回復が示唆される。
【００９０】
次に、本発明者らは、ノックインマウス由来のニューロン細胞系統を使用して、ＨＤの遺伝学的状況におけるＩＧＦ−１処置の結果を評価した。ここで、前記ノックインマウスはＣＡＧ伸長が内因性マウスｈｔｔ遺伝子に挿入されていた。これらの細胞系統は、野生型ｈｔｔ（野生型ニューロン細胞、＋／＋）の２つのコピーまたは変異ｈｔｔ（ホモ接合変異ニューロン細胞、１０９Ｑ／１０９Ｑ）の２つのコピーのいずれかを保持する。これらの細胞は、これらの細胞において野生型またはポリＱ−ｈｔｔが内因性レベルで発現されるため、これらの細胞系統はＨＤ患者に最も酷似した状況を反映する。ＢＤＮＦ小胞の速度および休止時間が、＋／＋細胞と比較して１０９Ｑ／１０９Ｑ細胞で有意に減少する（図１１Ｂ）一方、本発明者らは、ＩＧＦ−１処置が、ＢＤＮＦ含有小胞の速度を統計的に増加させ、休止時間を減少させることにより小胞輸送を有意に回復することを見出した。
【００９１】
次に、本発明者らは、ＡｋｔがＨＤの病理学的状況における細胞内輸送に対して有益な効果を示すかどうかを試験した。ＡｋｔおよびＢＤＮＦ−ｅＧＦＰの共トランスフェクション実験により、本発明者らは、Ａｋｔが、野生型の値に戻るまでＢＤＮＦ含有小胞の速度を増加させ、休止時間を減少させることにより１０９Ｑ／１０９Ｑ細胞における細胞内輸送を完全にレスキューすることを見出した（図１１Ｃ）。以上より、これらの知見は、ＩＧＦ−１／Ａｋｔ経路が、ＨＤ病理学的状況で観察されるＢＤＮＦ含有小胞の細胞内輸送の変化をレスキューすることが可能であることを示す。
【００９２】
Ｓ４２１のリン酸化は輸送におけるハンチンチンの機能を調節する
次に、本発明者らは、ＩＧＦ−１およびＡｋｔが、ＨＤ変異細胞におけるＢＤＮＦ輸送の欠失をレスキューする機構を調べた。先に、本発明者らは、ＡｋｔがＳ４２１においてハンチンチンをリン酸化し、この残基のリン酸化がニューロン細胞におけるポリＱ−ｈｔｔ−誘導性毒性を調節することを示している｛ハンバート（Ｈｕｍｂｅｒｔ）、２００２年｝。これらの実験では、本発明者らは、ポリＱストレッチを含有するＮ末端４８０アミノ酸フラグメントにより誘導されるニューロン毒性が、Ｓ４２１のリン酸化によってインビトロで廃止されることを見出した。従って、本発明者らは、始めに、そのようなＮ末端フラグメントが輸送を促進することが可能であるかどうか、およびそれがポリＱ伸長により影響されるかどうかについて調べた。本発明者らは、ニューロン細胞において、正常な（１７Ｑ）または伸長されたポリＱストレッチ（６８Ｑ）を伴う４８０フラグメントの能力を分析し、細胞内輸送の動力学を、ｗｔ−およびポリＱ−ＦＬ−ｈｔｔ構築物により得られるものと比較した。興味深いことに、本発明者らは、ｈｔｔの野生型４８０フラグメントが、野生型ｈｔｔの完全長フラグメントと同様に効率的に、ＢＤＮＦ含有小胞の速度を増加させ、休止時間を減少させることが可能であることを見出した（図１２Ａ）。さらに、本発明者らは、そのようなフラグメントがポリＱ伸長を含有する場合、輸送が変化することを見出した。本発明者らは、ｈｔｔの４８０アミノ酸のＮ末端フラグメントが、輸送を促進することができ、輸送動力学について完全長ｈｔｔで観察される特徴を再現すると結論付ける。このことと一致して、このフラグメントはアミノ酸１７１〜２３１に相当するＨＡＰ１干渉領域を含有する。
【００９３】
次に、本発明者らは、セリンからアラニンへの変異を含有する構築物を用いることにより、Ｓ４２１におけるリン酸化の不在の結果を分析した。特に、本発明者らは、野生型ｈｔｔ（４８０〜１７）がＳ４２１においてリン酸化されない場合、速度の減少および休止時間の百分率の増加により示されるように、もはや細胞内輸送を促進することができないことを見出した（図１２Ｂ）。興味深いことに、４８０−１７−Ｓ４２１Ａにより得られる動的パラメータが、セリンを無傷（ｉｎｔａｃｔ）で伴うかまたはアラニンへ変異されたポリＱ伸長を含有する構築物により得られる動的パラメータとは、統計的に有意ではなかったことから、Ｓ４２１におけるリン酸化の不在がｈｔｔを輸送の促進能力について不活性な形態にすることを示す。
【００９４】
リン酸化はハンチンチン機能の喪失を回復する
１０９Ｑ／１０９Ｑ細胞におけるＢＤＮＦ輸送の変化は、Ａｋｔによってレスキューされる（図１１Ｃ）。従って、本発明者らは、この効果がＡｋｔによるＳ４２１のリン酸化によって仲介されるかどうかについて調べたところ、ｈｔｔがＳ４２１においてリン酸化され得ない場合、輸送を促進するＡｋｔの能力が失われることを見出した（図１２Ｃ）。ＡｋｔがＳ４２１におけるｈｔｔのリン酸化によりハンチンチン介在輸送をレスキューすることを示したことから、次に、本発明者らは、Ｓ４２１の構成性リン酸化がＢＤＮＦ含有小胞を輸送するｈｔｔの能力を回復するのに十分である可能性について試験した。特に、本発明者らは、速度の増加および休止時間の減少によって実証されるように、構成性リン酸化を模倣するセリンからアスパラギン酸への変異を伴うポリＱ−ｈｔｔ構築物（４８０−６８−Ｓ４２１Ｄ）が、対応する４８０〜６８構築物とは対照的に、ＢＤＮＦ含有小胞を輸送する能力を完全に回復することを見出した（図１２Ｄ）。
【００９５】
以上より、これらの結果は、輸送に対するｈｔｔの機能的活性が、Ｓ４２１におけるそのリン酸化によって調節されることを示す。さらに、本発明者らは、疾患の状態における輸送の変化が、ｈｔｔのＳ４２１のリン酸化を通してＡｋｔにより回復され得ることを示す。
【００９６】
考察
本発明者らは、本発明において、Ｓ４２１におけるハンチンチンのリン酸化が、インビボで疾患の進行を調節するために不可欠であることを示した。ハンチンチンのＮ末端フラグメントを線条体に直接送達するためにレンチウイルスアプローチを使用して、本発明者らは、構成的にリン酸化されるポリＱ−ハンチンチン（４８０−６８Ｑ−Ｓ４２１Ｄ）をコードする構築物が、無傷（ｉｎｔａｃｔ）なセリン４２１を伴うポリＱ−ハンチンチンと比較して、より小さなＤＡＲＰＰ−３２欠失領域を誘導することを示した。対照的に、リン酸化され得ないポリＱ−ハンチンチン（４８０−６８Ｑ−Ｓ４２１Ａ）はより毒性である。本発明者らは以前、Ｓ４２１上で陽性に作用することができるＡｋｔおよびＳＧＫを同定している（ハンバート（Ｈｕｍｂｅｒｔ）ら、２００２年；ランゴン（Ｒａｎｇｏｎｅ）ら、２００４年）。本発明者らはまた、Ａｋｔが、ＨＤ患者由来の死後脳サンプルにおいて切断されることを報告し（ハンバート（Ｈｕｍｂｅｒｔ）ら、２００２年）、疾患の進行中、Ａｋｔ活性がダウンレギュレーションされることを見出した（コリン（Ｃｏｌｉｎ）ら、２００５年）ことから、さらに、Ａｋｔによるハンチンチンのリン酸化の減少がＨＤにおいて生じ得ることが示される。このことと一致して、Ｓ４２１におけるポリＱ−ハンチンチンのリン酸化の減少が、ポリＱ伸長を含有するＹＡＣトランスジェニックマウスおよびＨＤの細胞モデルにおいて観察される（ワービー（Ｗａｒｂｙ）ら、２００５年）（図７Ａ）。このことは、疾患の進行中に、Ｓ４２１におけるハンチンチンのリン酸化が減少し、それによりポリＱ−ハンチンチンの毒性が増加することを意味する。従って、Ｓ４２１におけるハンチンチンのリン酸化を制御する細胞機構を同定することは、疾患中の過剰なハンチンチンの脱リン酸化を防止するのに役に立ち得る。本発明では、本発明者らは、カルシニューリン（ＣａＮ）がＳ４２１においてハンチンチンを標的とするホスファターゼであることを示した。このことは、カルシニューリンが、Ｓ４２１におけるハンチンチンのリン酸化を制御し、ＨＤの病因に関与し得る新規の細胞エレメントであることを示す。
【００９７】
特定の残基のリン酸化は、通常、厳密に調節されたキナーゼおよびホスファターゼの活性における均衡に依存する。ハンチンチンのリン酸化において観察される減少は、Ａｋｔ活性の減少（コリン（Ｃｏｌｉｎ）ら、２００５年）、さらにまたカルシニューリンホスファターゼ活性の過剰から生じ得る。実際、カルシニューリンホスファターゼは、線条体、特に、中型有棘ニューロン（ＭＳＮ）、ＨＤで変性される最初の細胞（ゴトウ（Ｇｏｔｏ）ら、１９８９年）において強く発現され、それゆえに、これらの細胞においてハンチンチンを脱リン酸化し易くし得る。カルシニューリンはＣａ２＋により活性化され（マンシー（Ｍａｎｓｕｙ）、２００３年）、いくらかの研究は、線条体ニューロンにおける過剰なＣａ２＋進入がＨＤにおいて役割を果たし得ることを示す。ポリＱ−ハンチンチンは、Ｉ型イノシトール１，４，５−三リン酸受容体（ＩｎｓＰ３Ｒ１）およびＮＲ２ＢサブタイプＮＭＤＡ受容体の活性を促進し、それにより細胞質Ｃａ２＋レベルの増加をもたらす。ＭＳＮでは、ＩｎｓＰ３Ｒ上の変異体ハンチンチンの効果には、ハンチンチン関連タンパク質−１、ＨＡＰ１が必要である。乱されたＣａ２＋シグナル伝達とアポトーシスとの間の関連は十分に確立されていることから、皮質線条体の投射ニューロンから放出されるグルタミン酸が、ＨＤ患者由来のＭＳＮにおいて過剰なＣａ２＋応答を誘発し、ミトコンドリア透過性遷移ポア（ＭＰＴＰ）の開口およびカスパーゼ依存性アポトーシスカスケードの活性化を生じることが提唱された。本発明では、本発明者らは、この機構に加えて、カルシニューリンを活性化することによる、Ｃａ２＋が、Ｓ４２１におけるハンチンチンの脱リン酸化をもたらし、病原機構に寄与することを提唱する。これと一致して、本発明者らは、細胞質Ｃａ２＋濃度の増加が、ＦＫ５０６により阻止され得るハンチンチンの脱リン酸化をもたらすことを示し、Ｓ４２１のＣａ２＋依存性脱リン酸化がＣａＮ活性に依存することを実証した。興味深いことに、ＨＤにおいてカルシニューリンが活性化される別の経路は、カルパインに関与し得る。カルパインはＨＤにおいて活性化される。カルパインは、カルシニューリンを切断することにより活性形態に直接的に、またはカルシニューリンの強力な内因性インヒビターであるキャビン１（Ｃａｂｉｎ１）／カイン（ｃａｉｎ）を切断および不活化することにより、カルシニューリン活性を調節することができる。まとめて考えると、本研究は、ＨＤにおいて初めて興奮毒性およびＣａ２＋をハンチンチンのリン酸化と関連付ける。
【００９８】
インビボでの疾患の進行におけるＳ４２１でのハンチンチンリン酸化の有益な役割に関する本発明者らの知見は、ハンチンチンが病理学的ポリＱ伸長を含有する場合、ハンチンチンのリン酸化が減少するため、ハンチンチンのリン酸化を促進することは、ＨＤ患者における疾患の進行に影響を及ぼし得ることを示す（ワービー（Ｗａｒｂｙ）ら、２００５年）（図７Ａ）。ハンチンチンのリン酸化を増加させるための１つのストラテジーは、ＡｋｔまたはＳＧＫ経路を活性化する薬物に関与し得る。しかしながら、Ａｋｔのようなキナーゼの過剰活性は癌に関連し（フランケ（Ｆｒａｎｋｅ）ら、２００３年）、これらの経路を活性化する薬物は、所望しない増殖効果を誘導することによる有害効果を示しうる。従って、Ｓ４２１のリン酸化を増加させるためのより合理的な薬理学的アプローチは、その同一性が既知であれば、ホスファターゼの阻害である。多くのカルシニューリン阻害剤について説明してきたが、これらのうちのシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）およびＦＫ５０６が最も強力、特異的および周知である。
【００９９】
本研究では、本発明者らはＦＫ５０６に注目し、ＦＫ５０６がインビトロおよびインビボの両方でＳ４２１におけるハンチンチンのリン酸化を誘導すること、ならびにポリＱ−ハンチンチン誘導性ニューロン死を阻止することに効果的であることを見出した。このことは、ＦＫ５０６がＨＤ患者による治療上の利益を有することを示唆する。
【０１００】
先に示したように、ＦＫ５０６は血液−脳関門を通過し、ＣｓＡとは異なり、化合物の直接的な脳への輸送を必要としない。ＦＫ５０６が移植手術時に日常的に用いられるという事実は、かかる化合物の安全性および許容性を確立し、それゆえにＨＤにおいて同様の治験のための基礎としての役割を果たし得る。
【０１０１】
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【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】Ｓ４２１におけるポリＱ−ハンチンチンのリン酸化は、インビボにおいて神経保護的である。ラット線条体に、４８０−１７Ｑ（野生型）、４８０−６８Ｑ（ポリＱ）、４８０−６８Ｑ−Ｓ４２１Ａまたは４８０−６８Ｑ−Ｓ４２１Ｄレンチウイルスを注入した。ラット線条体におけるポリＱ−ハンチンチン誘導性病巣を、注入２４週間後に分析した。ＤＡＲＰＰ−３２抗体による免疫組織化学的分析を実施し、病巣のサイズをすべての構築物について調べ、次いで４８０−６８Ｑ構築物によって誘導される病巣の百分率として表した。予想どおり、ＤＡＲＰＰ−３２−免疫応答性ニューロンの極端な喪失が、４８０−６８Ｑ−感染線条体において観察されたが、野生型タンパク質の発現は影響を示さなかった（対応のあるステューデントｔ検定；ｔ［７］＝６．９５；＊＊＊Ｐ＜０．００１）。Ｓ４２１におけるリン酸化の不在（４８０−６８Ｑ−Ｓ４２１Ａ）は、ＤＡＲＰＰ−３２−免疫欠失領域のサイズの増加を生じた（対応のあるステューデントｔ検定；ｔ［６］＝３．１７；＊Ｐ＜０．０５）。対照的に、Ｓ４２１における構成性（４８０−６８Ｑ−Ｓ４２１Ｄ）は、ＤＡＲＰＰ−３２−免疫欠失領域のサイズの減少を生じた（対応のあるステューデントｔ検定；ｔ［７］＝３．４６；＊Ｐ＜０．０５）。抗ＨＡ免疫組織化学的分析は、すべての構築物が同様のレベルで発現されることを示した（下方のパネル）。
【図２】カルシニューリンは、インビトロでＳ４２１を脱リン酸化する。精製されたカルシニューリンによるＳ４２１の時間経過（図２Ａ）および用量依存的（図２Ｂ）脱リン酸化。ヒトハンチンチンのＧＳＴ−結合フラグメント（アミノ酸３８４−４６７）を、組み換えＡｋｔ（０．２μｇ／サンプル）でリン酸化し、次いで、２μｇ（Ａ）または異なる量（Ｂ）の精製されたカルシニューリンと共に示された時間（Ａ）または６０分間（Ｂ）、インキュベートした。抗ホスホハンチンチン−Ｓ４２１−７６３または抗ハンチンチン（１２５９）抗体を使用して、イムノブロッティング実験を実施した。
【図３】カルシニューリンは、細胞においてハンチンチンのＳ４２１を脱リン酸化する。図３Ａ、マウス線条体（＋／＋細胞）を、ハンチンチンのＮ末端フラグメント（４８０−１７Ｑ）、Ａｋｔ、カルシニューリンの構成性活性形態（ＣａＮＡ−ΔＣａＭ／ＣａＮＢ）または対応する空ベクターでトランスフェクトし、抗ホスホハンチンチン−Ｓ４２１−７１４または抗ハンチンチン（１２５９）抗体によるウエスタンブロット分析のために処理した。３つの独立した実験からのデータは、カルシニューリンの構成性活性形態は、Ａｋｔによって誘発されるＳ４２１のリン酸化を有意に減少させることを示す（ステューデントｔ検定；ｔ［３］＝３．６３；＊Ｐ＜０．０５）。図３Ｂ、ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞を、カルシニューリンの触媒不活化形態（ＣａＮＡ−Ｄ１３０Ｎ）、Ａｋｔまたは対応する空ベクターでトランスフェクトし、次いで抗ホスホハンチンチン−Ｓ４２１−７６３で分析した。データは３つの独立した実験から得たものである（分散分析（ＡＮＯＶＡ）；Ｆ［２，６］＝１７．３１；Ｐ＝０．０３２）。Ｓ４２１に対する内因性ハンチンチンのリン酸化は、カルシニューリンの触媒不活化構築物（ステューデントｔ検定；ｔ［４］＝４．３４；＊Ｐ＜０．０５）およびＡｋｔ（ｔ［４］＝５．２６；＊＊Ｐ＜０．０１）によって有意に増加した。
【図４】ハンチンチンはカルシニューリンと共局在し、Ｃａ２＋誘導性カルシニューリン活性化により脱リン酸化される。図４Ａ、イオノマイシン（Ｉｏ、下方のパネル）は、野生型ＣａＮＡ／ＣａＮＢでトランスフェクトされた細胞におけるハンチンチンＳ４２１リン酸化を減少させた。ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞を、非処置細胞（Ｎ．Ｔ．、上部パネル）との比較で、野生型形態のＣａＮＡ／ＣａＮＢで共トランスフェクトした。グラフは、３２細胞から放出されるホスホ−Ｓ４２１−ｈｔｔ（７６３抗体）シグナルの平均蛍光強度の定量化に相当し（ＡＮＯＶＡ；Ｆ［３，２８］＝７，０５；Ｐ＝０．００１１）、次いでハンチンチンのイオノマイシン誘導性脱リン酸化が有意であることを示す（フィッシャーの事後検定；＊＊＊Ｐ＜０．００１）。図４Ｂ、ハンチンチンは、小胞構造に対するカルシニューリンの触媒サブユニット（ＣａＮＡ）と共局在する。線条体ニューロンにおけるハンチンチン（１２５９抗体）、ホスホ−Ｓ４２１−ハンチンチン（７１４抗体）およびＣａＮＡに対する免疫染色。神経突起に沿った小胞構造において実質的な共局在が観察された（拡大図を参照のこと）。スケールバー、５μｍ。
【図５】カルシニューリンの優勢な干渉形態は、線条体ニューロンにおいて、Ｓ４２１リン酸化依存的様式でポリＱ−ハンチンチン誘導性毒性を阻害する。図５Ａ、線条体ニューロンにおいて、野生型ハンチンチン（４８０−１７Ｑ）またはポリＱ−ハンチンチン（４８０−６８Ｑ）を、触媒不活性形態のカルシニューリンをコードする発現ベクター（ＣａＮＡ−Ｄ１３０Ｎ）または対応する空ベクターとともに共トランスフェクトした。４つの独立した実験からのデータ（ＡＮＯＶＡ；Ｆ［３，５６］＝６．９９；Ｐ＝０．０００４）は、ＣａＮＡ−Ｄ１３０Ｎが、ポリＱ−ハンチンチン誘導性細胞死を有意に減少させたことを表した（フィッシャーの事後検定；＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図５Ｂ、線条体ニューロンを、ＣａＮＡα、ＣａＮＡβまたは両方のアイソフォームに対するｓｉＲＮＡでヌクレオフェクト（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｄ）し、次いで３０時間後、図５Ａのように４８０−６８Ｑでトランスフェクトした。ＣａＮの両方のアイソフォームに対するｓｉＲＮＡの組み合わせは、ウエスタンブロット分析による検出では、ＣａＮＡ発現を効率的に減少させた。３つの独立した実験からのデータ（ＡＮＯＶＡ；Ｆ［３，６］＝５．３３；Ｐ＝０．０３９）は、ポリＱ依存的毒性に対する保護効果を実証した（フィッシャーの事後検定；＊Ｐ＜０．０５）。図５Ｃ、線条体ニューロンを、４８０−６８Ｑまたはリン酸化不能形態（４８０−６８Ｑ−Ｓ４２１Ａ）およびＣａＮＡ−Ｄ１３０Ｎで共トランスフェクトした。４つの独立した実験からのデータ（ＡＮＯＶＡ；Ｆ［２，４１］＝４．３０；Ｐ＝０．０００４）は、触媒不活形態のカルシニューリンが４８０−６８Ｑ−Ｓ４２１Ａ構築物によって誘発されるポリＱ依存的細胞死を妨げないことを実証し（フィッシャーの事後検定；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）、神経保護がＳ４２１のリン酸化に依存することを示した。
【図６】ＦＫ５０６によるカルシニューリンの阻害は、Ｓ４２１の脱リン酸化を防止する。ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞におけるＦＫ５０６による処置（２０分間、１μＭ）は、Ｓ４２１における内因性ハンチンチンのリン酸化を増加させた（左）。カルシウムイオノフォアイオノマイシン（Ｉｏ、２．５μＭ）は、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞におけるＳ４２１の迅速な脱リン酸化を誘導した。Ｉｏ誘発性Ｓ４２１脱リン酸化は、ＦＫ５０６（１μＭ）によって妨げられた（右）。処置されたジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞の全細胞抽出物を、抗ホスホハンチンチン−Ｓ４２１−７６３および抗ハンチンチン（１２５９）抗体で分析した。図６Ｂ、ラット線条体ニューロンのＦＫ５０６処置後のＳ４２１の時間経過および用量依存的リン酸化。ニューロンを、１μＭのＦＫ５０６で異なる時間（上）または示された濃度で２時間（下）処置した。全細胞抽出物を、マウスホスホ特異的（抗ホスホハンチンチン−Ｓ４２１−７１４）および抗ハンチンチン（１２５９）抗体で分析した。
【図７】１０９Ｑ／１０９Ｑ細胞は、ＦＫ５０６によって増加され得るＳ４２１におけるハンチンチンのリン酸化の減少を示す。図７Ａ、野生型（＋／＋）または変異マウス（１０９Ｑ／１０９Ｑ）から生じる不死化ノックイン細胞の全細胞抽出物を、マウスホスホ特異的および抗ハンチンチン（１２５９）抗体によるウエスタンブロットによって分析した。図７Ｂ、ＦＫ５０６（０．２μＭ、４８時間）は、野生型およびポリＱ−ハンチンチンにおけるＳ４２１のリン酸化を増加させた。図７Ｃ、ＦＫ５０６は、ニューロンをポリＱ仲介細胞死から保護した。線条体ニューロンを、異なる用量のＦＫ５０６またはビヒクルの存在下で、４８０−６８Ｑでトランスフェクトした。３つの独立した実験からのデータ（ＡＮＯＶＡ；Ｆ［５，６８］＝８．０２；Ｐ＝０．０００１）は、ＦＫ５０６が、４８０−６８Ｑによって誘導されるニューロン死を有意に減少させることを表した（フィッシャーの事後検定；＊Ｐ＜０．０５）。
【図８】ＦＫ５０６のマウスへの投与は、脳におけるＳ４２１のリン酸化の増加を生じる。ＦＫ５０６をマウスに腹腔内または経口的に投与した（５ｍｇ／ｋｇ）。動物を、投与後の示された時間に屠殺し、脳を切開し、ホモジェナイズし、次いでウエスタンブロット分析用に処理した。脳全体の抽出物を抗−ホスホ−Ｓ４２１、抗ホスホ−Ｓ４７３−Ａｋｔ、抗全ハンチンチンおよび抗全Ａｋｔ抗体で調べた。下のパネルは、２回反復で実施した２つの独立した実験の濃度測定分析に対応する。合計で１８匹のマウスを屠殺した。上から下へおよび左から右へ：（ＡＮＯＶＡ；Ｆ［３，４］＝１１．５２、Ｐ＝０．０１９）；（ＡＮＯＶＡ；Ｆ［３，４］＝８．６９４、Ｐ＝０．０３１）；（ＡＮＯＶＡ；Ｆ［３，４］＝１，６６８、Ｐ＝０．３１）；（ＡＮＯＶＡ；Ｆ［３，４］＝０．９７、Ｐ＝０．４）；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図９】多様な４８０フラグメントの注入プロトコルの概要を表す図。２９匹の動物に対して実験を行った。注入１週間後、２匹のラットを分析して、ハンチンチンの発現を制御した。注入１２週間後、各グループの１匹の動物において病巣を評価した。この時点では病巣は有意ではなかったため、すべての動物の最終的評価を、注入２４週間後に実施した。グルタミンの数（１７Ｑまたは６８Ｑ）およびハンチンチンの各注入されたフラグメントに対するセリン４２１の変異を、ラット脳切片上の各半球上に示す。ｎは、条件あたりの動物の数を示す。
【図１０】４８０−１７Ｑ（野生型）、４８０−６８Ｑ（ポリＱ）、４８０−６８Ｑ−Ｓ４２１Ａまたは４８０−６８Ｑ−Ｓ４２１Ｄレンチウイルスを注入したラット線条体を、注入２４週間後に、抗ＤＡＲＰＰ−３２および抗ホスホ−Ｓ４７３−Ａｋｔ（９２７７，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）抗体を使用する免疫組織化学によって分析した。ポリＱ−ハンチンチン感染領域においてＤＡＲＰＰ−３２のダウンレギュレーションが観察されるが、リン酸化形態のＡｋｔに対するニューロンの免疫陽性の存在によって示されるように、ニューロン喪失の徴候は観察されなかった。
【図１１】ＩＧＦ−１およびＡｋｔは、主要なニューロンおよびＨＤニューロン細胞における輸送のポリＱ−ハンチンチン誘導性の変化をレスキューする。図１１Ａ、ＩＧＦ−１は、ＦＬ−ｈｔｔ−７５Ｑを発現する皮質ニューロンの初代培養物において、ＢＤＮＦ含有小胞の平均速度（左）を有意に増加させ、それらの休止時間（右）を減少させる。図１１Ｂ、１０９Ｑ／１０９Ｑ細胞において変化されたＢＤＮＦ輸送は、速度（左）を増加させ、休止時間（右）を減少させるＩＧＦ−１によって改善される。図１１Ｃ、Ａｋｔは、速度（左）を有意に増加させ、休止時間（右）を減少させる（＊Ｐ＜０．０５）ことによって、１０９Ｑ／１０９Ｑ細胞における輸送の欠如を完全に阻害する。
【図１２】Ｓ４２１におけるハンチンチンのリン酸化は、輸送を調節し、ポリＱ−ハンチンチンの機能の喪失を回復する。図１２Ａ、コントロール条件（ＢＤＮＦ単独）、ならびにニューロン細胞において１７もしくは７５Ｑを伴うＦＬ−ｈｔｔ、または１７もしくは６８Ｑを伴うＮ末端フラグメント４８０のトランスフェクション後におけるＢＤＮＦ含有小胞の平均速度（左）および休止時間（右）の測定は、４８０アミノ酸のｈｔｔのＮ末端フラグメントが輸送を刺激することができるが、ポリＱ伸長を含有する場合、変化されることを実証する。図１２Ｂ、４８０−Ｓ４２１Ａ構築物の存在下におけるＢＤＮＦ含有小胞の速度（左）における有意な減少および休止時間（右）における増加により示されるように、Ｓ４２１がリン酸化されない場合、輸送を促進する野生型４８０フラグメント（４８０−１７Ｑ）の能力は失われる。図１２Ｃ、４８０−１７Ｑ構築物と比較して、４８０−１７Ｑ−Ｓ４２１Ａ構築物では、Ａｋｔの存在下におけるＢＤＮＦ小胞の平均速度が減少させ、そして小胞の休止時間が増加させるため、ＢＤＮＦ輸送を増強するＡｋｔの能力は、ｈｔｔのＳ４２１のリン酸化により介在される。図１２Ｄ、４８０−６８Ｑ構築物におけるＳ４２１Ｄ変異は、４８０−６８Ｑ構築物と比較して、小胞の平均速度（左）および休止時間（右）をレスキューする。（＊Ｐ＜０．０５）。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年9月11日(2008.9.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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