(57)【要約】グルコース輸送を調節するための方法および組成物を本明細書において提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、グルコース輸送関連ポリペプチドの発現または活性を調節する候補薬剤を同定する方法：
(a) 表1もしくは表2記載の遺伝子の遺伝子産物であるグルコース輸送関連ポリペプチド、またはそのポリペプチドをコードする核酸を含む試料を提供する段階；
(b) 試料を被験化合物と接触させる段階；
(c) 試料中のグルコース輸送関連ポリペプチドの発現または活性を評価する段階；および
(d) (c)のグルコース輸送関連ポリペプチドの発現または活性を、被験化合物を欠く対照試料中のグルコース輸送関連ポリペプチドの発現または活性と比較する段階であって、グルコース輸送関連ポリペプチドの発現または活性の変化により、被験化合物がグルコース輸送関連ポリペプチドの発現または活性を調節することができる候補薬剤であることが示される、段階。
【請求項２】
グルコース輸送関連ポリペプチドが表1記載の遺伝子の遺伝子産物である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
グルコース輸送関連ポリペプチドが表2記載の遺伝子の遺伝子産物である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
試料が細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
細胞が脂肪細胞である、請求項4記載の方法。
【請求項６】
試料が無細胞試料である、請求項1記載の方法。
【請求項７】
評価する段階が、無細胞アッセイを実施する段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項８】
評価する段階が、グルコース輸送が被験化合物の存在下で調節されるかどうかを判定する段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
グルコース輸送関連ポリペプチドが、ヒトグルコース輸送関連ポリペプチドである、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
評価する段階が、グルコース取り込みを測定する段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
被験化合物が、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、非核酸有機小分子、無機小分子、および抗体からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
被験化合物が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉RNA(siRNA)、siRNAをコードするDNA、およびリボザイムからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
グルコース輸送の調節が抗体を用いて評価される、請求項8記載の方法。
【請求項１４】
グルコース輸送が被験化合物の存在下で増加する、請求項8記載の方法。
【請求項１５】
グルコース輸送が被験化合物の存在下で減少する、請求項8記載の方法。
【請求項１６】
グルコース輸送関連ポリペプチドがキナーゼである、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
評価する段階が、キナーゼによる基質のリン酸化を測定する段階を含む、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
以下の段階を含む、細胞におけるグルコース輸送を調節する方法：
細胞を提供する段階；
表1もしくは表2の遺伝子産物の発現または活性を調節する薬剤と細胞を接触させ、それにより細胞におけるグルコース輸送を調節する段階。
【請求項１９】
薬剤が、表1記載の遺伝子の遺伝子産物の発現または活性を減少させる、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
薬剤が、表2記載の遺伝子の遺伝子産物の発現または活性を増加させる、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
薬剤が、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、非核酸有機小分子、無機小分子、および抗体からなる群より選択される、請求項18記載の方法。
【請求項２２】
薬剤が阻害的低分子RNA（small inhibitory RNA）である、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
薬剤が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、siRNAをコードするDNA、およびリボザイムからなる群より選択される、請求項21記載の方法。
【請求項２４】
グルコース輸送関連ポリペプチドの発現または活性を調節する第二の薬剤と細胞を接触させる段階をさらに含む、請求項18記載の方法。
【請求項２５】
細胞をインビトロで接触させる、請求項18記載の方法。
【請求項２６】
細胞をインビボで接触させる、請求項18記載の方法。
【請求項２７】
以下の段階を含む、対象においてインスリン刺激によるグルコース取り込みを増加させる方法：
表1記載の遺伝子の遺伝子産物の発現または活性を減少させる薬剤を、対象の細胞におけるグルコース代謝を調節するのに十分な量で対象に投与し、それによって対象におけるインスリン刺激によるグルコース取り込みを増加させる段階。
【請求項２８】
対象がグルコース代謝に関連した障害もしくは状態のリスクを有するか、またはグルコース代謝に関連した障害もしくは状態を患っている、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
障害または状態が、I型糖尿病、II型糖尿病、または肥満である、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
以下の段階を含む、対象におけるグルコース代謝を調節する方法：
表2記載の遺伝子の遺伝子産物の発現または活性を増加させる薬剤を、対象の細胞におけるグルコース代謝を調節するのに十分な量で対象に投与し、それによって対象におけるグルコース代謝を調節する段階。
【請求項３１】
対象がグルコース代謝に関連した障害もしくは状態のリスクを有するか、またはグルコース代謝に関連した障害もしくは状態を患っている、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
障害または状態が、I型糖尿病、II型糖尿病、または肥満である、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
siRNAまたは表1記載の遺伝子によってコードされるRNAを標的とするsiRNAをコードする核酸を含む組成物。
【請求項３４】
表1記載の遺伝子の遺伝子産物の機能を阻害するアンチセンス核酸を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、分子生物学、細胞生物学、グルコース輸送、および糖尿病に関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、2005年7月28日に出願した米国仮特許出願第60/703,280号の優先権の恩典を主張し、その内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
背景
インスリンは、筋肉および脂肪におけるグルコース輸送を促進する。インスリンが活性化する最も重要な経路の1つは、筋肉および脂肪組織における循環からグルコースを迅速に取り込むことである。これらの組織におけるグルコース取り込みに及ぼすインスリンの効果の大部分は、インスリン感受性グルコース輸送体、GLUT4に依存している(Czech and Corvera, J. Biol. Chem., 274:1865-1868, 1999（非特許文献1）、Martin et al., Cell Biochem. Biophys., 30:89-113, 1999（非特許文献2）、Elmendorf et al. Exp. Cell Res., 253:55-62, 1999（非特許文献3）に概説されている)。糖尿病ではインスリン作用の機構が損なわれ、筋肉および脂肪へのグルコース輸送が減少する。これは、II型糖尿病の主要な欠陥であると考えられている。インスリン作用を強化することは、II型糖尿病に有益な効果をもたらす。これは、薬剤レズリン(Rezulin)(トログリタゾン)の作用機序であると考えられている。
【０００４】
II型糖尿病(インスリン非依存性糖尿病)とは、グルコースに対するインスリン分泌反応障害およびインスリン抵抗性を含み得る高血糖を特徴とする障害群である。II型糖尿病で認められる1つの影響は、骨格筋によるグルコース取り込みの促進におけるインスリンの有効性の減少である。II型糖尿病は、全糖尿病症例の約85〜90％を占める。II型糖尿病の症例によっては、根底にある生理的欠陥は多因子性のようである。
【０００５】
【非特許文献１】Czech and Corvera, J. Biol. Chem., 274:1865-1868, 1999
【非特許文献２】Martin et al., Cell Biochem. Biophys., 30:89-113, 1999
【非特許文献３】Elmendorf et al. Exp. Cell Res., 253:55-62, 1999
【発明の開示】
【０００６】
概要
本発明は、少なくとも一部に、細胞におけるグルコース輸送を制御する遺伝子および遺伝子産物の発見に基づく。本明細書に記載する遺伝子および遺伝子産物は、糖尿病などの、グルコース代謝が脱制御される障害の治療を調節するための新規標的である。
【０００７】
したがって、1つの局面において、本発明は、グルコース輸送関連ポリペプチドもしくはそのポリペプチドをコードする核酸の発現または活性を調節する候補薬剤を同定する方法を特徴とする。本方法は、例えば以下の段階を含む：(a) 表1もしくは表2記載の遺伝子の遺伝子産物またはその相同体であるグルコース輸送関連ポリペプチド、またはそのポリペプチドをコードする核酸を含む試料を提供する段階；(b) 試料を被験化合物と接触させる段階；(c) 試料中のグルコース輸送関連核酸もしくはポリペプチドの発現または活性を評価する段階；および(d) (c)のグルコース輸送関連核酸もしくはポリペプチドの発現または活性を、対照試料(例えば被験化合物を欠く試料または参照試料)中のグルコース輸送関連核酸もしくはポリペプチドの発現または活性と比較する段階であって、対照試料に対するグルコース輸送関連核酸もしくはポリペプチドの発現または活性の変化により、被験化合物がグルコース輸送関連核酸もしくはポリペプチドの発現または活性を調節することができる候補薬剤であることが示される、段階。
【０００８】
様々な態様において、グルコース輸送関連ポリペプチドは表1記載の遺伝子の遺伝子産物であり、例えば、サイクリン依存性キナーゼ7(Cdk7)；カルシウム/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼI(Camkl)；c-Srcチロシンキナーゼ(Csk)；カゼインキナーゼ1、α1(Csnklal)；カゼインキナーゼ1、Δ(Csnkld)；カゼインキナーゼ1、γ2(Csnklg2)；カゼインキナーゼ1、γ3(Csnklg3)；カゼインキナーゼII、α1(Csnk2al)；ジスコイジンドメイン受容体ファミリー、メンバー2(Ddr2)；真核生物伸長因子-2キナーゼ(Eef2k)；上皮増殖因子受容体(EGFR)；Ephrin受容体EphA7(キナーゼ1、Epha7)；小胞体(ER)から核へのシグナル伝達1(Ernl)；fps/fes関連チロシンキナーゼ(Fert2)；線維芽細胞増殖因子受容体2(Fgfr2)；Gardner-Rasheedネコ肉腫ウイルス(Fgr)癌遺伝子相同体(Fgr)；グリコーゲン合成酵素キナーゼ3β(Gsk3b)；インターロイキン-1受容体関連キナーゼ1(Irak1)；SH3-結合キナーゼ1(SbK)；精巣特異的キナーゼ2(Tesk2)；ワクシニア関連キナーゼ1(Vrkl)；ワクシニア関連キナーゼ2(Vrk2)；またはワクシニア関連キナーゼ3(Vrk3)である。様々な態様において、グルコース輸送関連ポリペプチドは、表1記載の遺伝子の遺伝子産物と少なくとも50、60、70、80、90、95、96、99、または100％同一であるアミノ酸配列を含む。ポリペプチドは、ヒトポリペプチド(例えば、表1記載の遺伝子または表1記載の遺伝子のヒト相同体によってコードされるヒトポリペプチド)であってよい。
【０００９】
様々な態様において、グルコース輸送関連ポリペプチドは表2に記載の遺伝子の遺伝子産物であり、例えばThe Institute of Physical and Chemical Research(RIKEN)から得た以下のクローンの1つの遺伝子産物である：9130019I15Rik、5830417C01Rik、A430091O22Rik、またはそのヒト相同体；アクチビンA受容体、タイプ1(Acvrl)；カルシウム/カルモジュリン依存性セリンプロテインキナーゼ(Cask)またはセリン/トレオニンキナーゼ38(Stk38)。様々な態様において、グルコース輸送関連ポリペプチドは、表2記載の遺伝子の遺伝子産物と少なくとも50、60、70、80、90、95、96、99、または100％同一であるアミノ酸配列を含む。様々な態様において、ポリペプチドはヒトポリペプチドである。
【００１０】
本方法で使用する試料は細胞(例えば、脂肪細胞)であるか、もしくは細胞を含み得、または無細胞試料であってもよい。グルコース輸送関連核酸もしくはポリペプチドの発現または活性は、例えば無細胞アッセイ法または細胞に基づくアッセイ法を用いて評価することができる。発現の調節は、抗体を用いて評価することができる。1つの態様において、評価段階は、例えばグルコース取り込みを測定することにより、グルコース輸送が被験化合物の存在下で調節されるかどうかを判定する段階を含む。
【００１１】
本方法において評価する被験化合物は、例えばポリヌクレオチド、ポリペプチド、非核酸有機小分子、無機小分子、または抗体であってよい。例えば、被験化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抑制性RNA、またはリボザイムであってよい。
【００１２】
グルコース輸送は、被験化合物の存在下で増加または減少し得る。
【００１３】
様々な態様において、グルコース輸送関連ポリペプチドはキナーゼである。そのような態様では、評価段階は、例えばキナーゼアッセイ法を用いて、キナーゼによる基質のリン酸化を測定する段階を含むことができる。
【００１４】
本方法は、被験化合物がグルコース輸送関連ポリペプチドの発現または活性に及ぼす影響を、例えば肥満または糖尿病の動物モデルなどの動物モデルを用いてインビボで評価する段階を含むことができる。
【００１５】
別の局面において、本発明は、細胞におけるグルコース輸送を調節する方法を特徴とする。これらの方法は、例えば、細胞を提供する段階；グルコース輸送関連ポリペプチドの発現または活性を調節する薬剤と細胞を接触させ(例えば、インビトロまたはインビボで)、それにより細胞におけるグルコース輸送を調節する段階を含む。
【００１６】
グルコース輸送関連核酸もしくはポリペプチドの発現または活性を調節する被験化合物は、例えば以下の段階を含む本明細書に記載の方法によって同定される薬剤であってよい：(a) グルコース輸送関連ポリペプチドまたはそのポリペプチドをコードする核酸を含む試料を提供する段階；(b) 試料を被験化合物と接触させる段階；(c) 試料中のグルコース輸送関連核酸もしくはポリペプチドの発現または活性を評価する段階；および(d) (c)のグルコース輸送関連核酸もしくはポリペプチドの発現または活性を、被験化合物を欠く対照試料中のグルコース輸送関連核酸もしくはポリペプチドの発現または活性と比較する段階であって、グルコース輸送関連核酸もしくはポリペプチドの発現または活性の変化により、被験化合物がグルコース輸送関連核酸もしくはポリペプチドの発現または活性を調節することができる候補薬剤であることが示される、段階。
【００１７】
細胞におけるグルコース輸送を調節する方法で用いられる被験化合物は、表1もしくは表2記載の遺伝子もしくは遺伝子産物の発現または活性を調節することができる。被験化合物は、表1記載の遺伝子もしく遺伝子産物の発現または活性を減少または増加させてもよい。被験化合物は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、非核酸有機小分子、無機小分子、または抗体であってよい。例えば、被験化合物は抑制性低分子RNAであってよい。被験化合物はまた、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抑制性RNA、またはリボザイムであってよい。
【００１８】
細胞におけるグルコース輸送を調節する方法は、グルコース輸送関連ポリペプチド(もしくはそのポリペプチドをコードする核酸)の発現または活性を調節する第二の薬剤と細胞を接触させる段階をさらに含むことができる。
【００１９】
本発明はまた、対象においてインスリン刺激によるグルコース取り込みを増加させる方法を特徴とする。本方法は、対象の細胞におけるグルコース代謝を調節するのに十分な量で、表1記載の遺伝子もしくは遺伝子産物の発現または活性を減少させる薬剤を対象に投与し、それによって対象におけるインスリン刺激によるグルコース取り込みを増加させる段階を含む。例えば、対象は、I型糖尿病、II型糖尿病、もしくは肥満などの、グルコース代謝に関連した障害もしくは状態のリスクを有するか、またはこれらを患っている可能性がある。
【００２０】
本発明はまた、対象の細胞におけるグルコース代謝を調節するのに十分な量で、表2記載の遺伝子もしくは遺伝子産物の発現または活性を増加させる薬剤を対象に投与し、それによって対象におけるグルコース代謝を調節することにより、対象におけるグルコース代謝を調節する方法を提供する。
【００２１】
本明細書では、表1記載の遺伝子によってコードされるRNAを標的とする抑制性RNAをコードする核酸を含む組成物もまた特徴とする。1つの態様において、抑制性RNAは阻害的低分子RNA（small inhibitory RNA）である。
【００２２】
本発明は、表1記載の遺伝子産物の機能を阻害するアンチセンス核酸を含む組成物をさらに提供する。
【００２３】
本発明はまた、表1および2記載の1つもしくは複数の遺伝子もしくは遺伝子産物の発現または活性を評価することにより、グルコース代謝に関連した障害または状態を診断する方法を特徴とする。
【００２４】
特記する場合を除き、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載したのと同様または同等の方法および材料を、本発明の実施または試験に用いることができるが、適切な方法および材料は以下に記載するものである。本明細書で言及されたすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全文が参照により組み入れられる。矛盾が生じる場合は、定義を含め本明細書が優先する。さらに、材料、方法、および実施例は説明のみを目的としており、制限を意図するものではない。引用した特許、特許出願、および参考文献はすべて(公的配列データベースエントリーの参照も含む)、すべての目的のためにその全体が参照により組み入れられる。2005年7月28日に出願した米国仮特許出願第60/703,280号は、すべての目的のためにその全体が参照により組み入れられる。
【００２５】
本発明の一つまたは複数の態様の詳細を、以下の説明において述べる。本発明のその他の特徴、目的、および利点は、説明および特許請求の範囲から明らかとなる。
【００２６】
発明の詳細な説明
本発明者らは、そのポリペプチド産物が、インスリンシグナルに応答して脂肪細胞におけるグルコース輸送を制御する遺伝子を同定した。ここに、これらポリペプチドの発現を調節するための、およびそれらの発現を調節する薬剤を同定するための方法および組成物を提供する。本発明者らが同定したポリペプチドをコードする遺伝子を、以下の表1および2に列挙する。本発明者らが同定した遺伝子の第1サブセットは、グルコース輸送の負の制御因子であるポリペプチドをコードする(表1)。第2サブセットは、グルコース輸送の正の制御因子をコードする(表2)。グルコース輸送の負の制御因子の発現または活性を減少させると(例えば、アンチセンスもしくはsiRNAによる遺伝子発現の阻害を介して、または遺伝子産物の活性を阻害する薬剤を用いて)、グルコース取り込みが増加し得、それによって血糖値を低下させることができる。正の制御因子の発現または活性を増加させると(例えば、遺伝子産物の過剰発現によるか、または制御因子の活性を増加させる薬剤の使用による)、インスリン活性が増強され得、ひいてはグルコース取り込みが促進され得る。
【００２７】
グルコース輸送の負の制御因子
本発明者らは、表1に列挙する遺伝子の1つまたは複数の発現を阻害すると、インスリン刺激によるグルコース取り込みが増加することにより、インスリン作用が強化されることを見出した。インスリン作用の強化は、例えば糖尿病患者における、例えばインビボでの血糖作用の調節において有益である。したがって、表1に記載の遺伝子産物の発現または活性を阻害することは、インスリン活性またはグルコース輸送が脱制御される状態の治療に有益であり得る。
【００２８】
（表１）グルコース輸送の負の制御因子
2009502172.tif 000002
2009502172.tif 000003
【００２９】
サイクリン依存性キナーゼ7(Cdk7)
cdk7などのサイクリン依存性タンパク質キナーゼは、細胞周期の進行の重要な制御因子である。Cdk7は、サイクリンHおよびmenage a trois 1(MATl)と共に多サブユニット複合体を形成する。この複合体はCAK(cdk活性化キナーゼ)と呼ばれ、RNAポリメラーゼIIの最大サブユニットのカルボキシ末端ドメインをリン酸化することにより転写に関与し、同様に他のCDKもリン酸化する(Fisher and Morgan, Cell, 78(4):713-24, 1994; Shiekhattar et al., Nature, 374: 283-287, 1995)。Cdk7の阻害因子には、プリン誘導体、ロスコビチン、および5,6-ジクロロ-1-β-D-リボフラノシルベンズイミダゾール(DRB)が含まれる(Taylor et al., J. Virol., 78(6):2853-62, 2004; te Poele et al., Oncogene, 18(42):5765-72, 1999)。
【００３０】
カルシウム/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼI(CamkI)
CamkIは、シナプシンI、cAMP応答配列結合タンパク質、および嚢胞性線維症コンダクタンス制御因子など複数の基質を伴う、サイトゾルのセリン/トレオニンキナーゼである(Chin et al., J. Biol. Chem. 272: 31235-31240, 1997)。カルシウム/カルモジュリンは、酵素に結合することによって、およびCamkIキナーゼを活性化することによって、CamkIを活性化する。KN-93などの阻害因子によって、または例えばカルミダゾリウムを用いたカルモジュリンの阻害によって、CamkI活性を直接阻害することができる(Kahl and Means, Oncogene, 18(42):5765-72, 1999)。
【００３１】
C-Srcチロシンキナーゼ(Csk)
Cskは、SrcのC末端チロシンのリン酸化によりSrcファミリーキナーゼを負に調節するサイトゾルのチロシンキナーゼである(Wang et al., Biochemistry, 40:2004- 2010, 2001)。Cskは、脂肪細胞においてSrcを介してシグナル伝達するインスリン様成長因子I(IGF-I)を調節する(Sekimoto and Boney, Endocrinology, 144(6):2546-2552, 2003)。
【００３２】
カゼインキナーゼ1 α1、δ、およびγ2(Csnklal、Csnkld、Csnklg2)
Cnsklポリペプチドは、酵母からヒトまで高度に保存されたセリン/トレオニンプロテインキナーゼのファミリーである。Cnsklポリペプチドは、哺乳動物において複数のアイソフォームで存在する。アイソフォームは別々の細胞成分に局在し、これはそれらの各機能にとって重要なことである(Gross and Anderson, Cell Signal., 10(10):699-711, 1998)。Csnklalは、サイトゾルの小胞、紡錘体、および核内の構造に関連する(Gross and Anderson、前記)。CsnklalはレチノイドX受容体(RXR)に結合し、活性化されたRXRによって誘導されるアポトーシスを阻害する(Zhao et al., J. Biol. Chem., 279(29):30844- 30849, 2004)。Liu et al., Cell, 108(6): 837-47, 2002によると、Csnklalはまた、Wnt/βカテニンシグナル伝達に関与する。
【００３３】
Cnskldは、微小管、中心体、および紡錘体装置に結合する(Behrend, et al., Eur. J. Cell Biol., 79, 240-251, 2000)。Cnskldは、別のCnsklアイソフォームであるCnskleと共に、哺乳動物の概日時計を調節する(Akashi et al., Mol Cell Biol, 22(6):1693-703, 2002)。
【００３４】
Cnsklg2は、乳癌細胞の細胞質内のエストロゲン受容体αを分離し、乳癌の悪性度に寄与すると考えられるポリペプチドである、転移関連タンパク質1短型(MTA1s)をリン酸化し、その機能を調節する(Mishra et al., Oncogene, 23(25):4422-9, 2004)。
【００３５】
カゼインキナーゼ2、α1(Csnk2al)
Csnk2は、α、αプライム、および2つのβサブユニットから構成される四量体キナーゼである。αサブユニットはセリン/トレオニンキナーゼ活性を含む。csnk2活性の上方制御は、ヒト細胞の悪性形質転換に関係している(Sarno et al., Pharmacol. Ther., 93(2-3):l59-68, 2002)。Csnk2の阻害因子には、アピゲニン、エモジン、DRB、ならびに4,5,6,7-テトラブロモベンゾトリアゾール(TBB)、およびPagano et al.,に記載されるTBB付加物、例えば4,5,6,7-テトラブロモ-2-(ジメチルアミノ)ベンズイミダゾール(2c)(Pagano et al., J. Med. Chem., 47(25):6239-47, 2004; Song et al., J. Biol. Chem., 275(31):23790-23797, 2000)が含まれる。
【００３６】
ジスコイジンドメイン受容体ファミリー、メンバー2(Ddr2)
Ddr2は、線維性コラーゲンと相互作用する受容体チロシンキナーゼである(Shrivastava et al., Mol. Cell, l(l):25-34, 1997; Vogel et al., Mol. Cell,(l):13-23, 1997)。コラーゲンのDdr2への結合は、Ddr2の自己リン酸化をもたらし、これは次に下流のシグナル伝達事象を引き起こす(Leitinger et al., J. Mol Biol, 344(4): 993 -1003, 2004)。
【００３７】
伸長因子-2キナーゼ(Eef2k)
Eef2kは、サイトゾルのカルシウム/カルモジュリンセリン-トレオニンキナーゼである。ストレス活性化プロテインキナーゼ4およびリボソームプロテインS6キナーゼなどのタンパク質は、Eef2k上の特定のセリンをリン酸化することによって、Eef2k活性を阻害する(Knebel et al., EMBO J., 20:4360-4369, 2001; Wang et al., EMBO J., 20:4370-4379, 2001)。
【００３８】
上皮細胞成長因子受容体(EGFR)
受容体チロシンキナーゼであるEGFRによって変換されるシグナルは、細胞の増殖、分化、および/または生存を刺激する。EGFR阻害因子には以下が含まれる：エルロチニブ(タルセバ)；ゲフィチニブ(イレッサ)；PKI166(Traxler et al., Clin. Cancer Res., 5: 3750s 1999)；Woodburn, Pharmacol Ther, 82(2-3):241-50, 1999に記載の薬剤；およびBianco et al.,に記載のもの(Curr. Drug Targets, 6(3):275-87, 2005；例えばICR62、セツキシマブ(Erbitux(登録商標))、パニツムマブ(ABX- EGF)、EMD72000(matuzamab)、およびIMC-225)などEGFR阻止モノクローナル抗体。
【００３９】
エフリン受容体Eph A7(Epha7；HEKIl)
Epha7は、3つの異なるスプライスバリアントを有する受容体チロシンキナーゼである。Epha7スプライスバリアントの差次的な発現は、胚発生における神経褶形成の間、細胞接着を調節する(Holmberg et al., Nature, 408(6809):203-6, 2000)。
【００４０】
小胞体(ER)から核へのシグナル伝達1(Ernl；IREl)
Ernlは、内因性のキナーゼ活性およびエンドリボヌクレアーゼ活性を有するER局在性膜貫通タンパク質である。Ern-1は、転写因子XBP-1のmRNAを切断し、哺乳動物細胞において折り畳まれていないタンパク質反応を調節する(Calfon et al., Nature, 420(6912):202, 2002)。
【００４１】
Fps/fes関連チロシンキナーゼ(Fert2；FER)
Fert2は、アミノ末端Fps/Fes/Fer/CIP4相同性(FCH)ドメインに続き、予測されるコイルドコイル(オリゴマー形成を調節する可能性がある)、中心のSrc相同性2(SH2)ドメイン(リン酸化チロシン含有ペプチドモチーフとの会合を媒介する)、およびカルボキシ末端触媒ドメインの3つの領域を有する非受容体タンパク質チロシンキナーゼである(Greer, Nature Rev. Mol. Cell Biol, 3:278 -289; 2002)。
【００４２】
線維芽細胞増殖因子受容体2(Fgfr2)
Fgfrsを介したシグナル伝達は、主にマルチドッキングタンパク質複合体のアセンブリーによって媒介される(Schlessinger, Science, 306(5701):1506-7, 2004)。線維芽細胞増殖因子とヘパリン硫酸プロテオグリカンとの結合は、Fgfrの二量体化、活性化、および受容体分子の細胞質ドメイン内の多数のチロシン残基の自己リン酸化を引き起こす。線維芽細胞増殖因子の刺激に応答してリン酸化されるタンパク質には、Shc、ホスホリパーゼ-Cγ、STATl、Gabl、およびFRS2αが含まれる。これらのタンパク質のリン酸化は、細胞増殖、細胞分化、細胞遊走、細胞生存、および細胞形状を制御する細胞内シグナル伝達経路の刺激につながる(Eswarakumar, Cytokine Growth Factor Rev., 16(2): 139-49, 2005)。
【００４３】
Gardner-Rasheedネコ肉腫ウイルス癌遺伝子相同体(Fgr)
Fgrsは、c-Src遺伝子ファミリーのメンバーによってコードされる非受容体チロシンキナーゼである。Fgrは、単核細胞においてβ2インテグリンを介したシグナル伝達およびSykキナーゼ機能を阻害する。これらの阻害性効果は、ケモカインおよび他の炎症性媒介物質によって逆転する(Vines et al., Immunity, 15(4):507-519, 2001)。
【００４４】
グリコーゲン合成酵素キナーゼ3β(Gsk3b)
Gsk3bは、リン酸化され、不活性化されたグリコーゲン合成酵素として最初は同定されたプロリン定方向性セリン-トレオニンキナーゼである。インスリンは、AktによるGsk3b上のN末端セリン残基のリン酸化を刺激することによって、Gsk3bを阻害する(Cross et al., Nature, 378:785-789, 1995)。Gsk3bはまた、真核生物タンパク質合成開始因子2B(eIF2B)をリン酸化し、それによってeIF2Bを阻害する(Welsh et al., Biochem. J., 294:625-629, 1993)。Gsk3bによるリン酸化の他の標的には、Axin、βカテニン、τ、プレセニリン1、サイクリンD1、ムチン1、jun、myc、CREB、およびその他が含まれる(例えばGsk3bのこれらのおよび他の標的を列挙するFrame and Cohen, Biochem. J., 385:1-16, 2001を参照されたい)。Gsk3bの阻害因子には、Coghlan et al.(Chem Biol., 7(10):793-803, 2000)に記載されるマレイミド化合物、SB-216763、およびSB-415286、ならびに塩化リチウムが含まれる。米国特許第 6,800,632号；第6,716,624号；第6,608,063号；第6,489,344号；第6,465,231号；第6,417,185号；および第6,057,117号も同様に参照されたい。
【００４５】
インターロイキン-1受容体関連キナーゼ1(Irak1)
Irak1は、インターロイキン-1(IL-1)シグナル伝達に関与する膜に近接したセリン-トレオニンキナーゼであり、IL-1誘導に応答してリン酸化され、次第に分解される。Irak1は、IL-1への曝露による受容体の刺激の際、IL-1受容体と会合する(Cao et al., Science, 271(5252):1128-1131; 1996)。Irak1は2つの公知の機能性ドメインを有する：MyD88およびToll相互作用タンパク質(Tollip)によるタンパク質-タンパク質相互作用に関与するN末端デスドメイン、ならびに中心に位置するSer/Thrキナーゼドメイン(Jensen and Whitehead, J. Biol. Chem., 276(31):29037-29044, 2001；およびこれらに引用される参考文献を参照されたい)。
【００４６】
SH3結合キナーゼ1(Sbkl)
Sbklは、セリン/トレオニンプロテインキナーゼコンセンサス配列に続き、C末端プロリンリッチ領域を含む。ラットでは、Sbklの大半は脳に発現する(Nara et al., Eur. J. Biochem., 268:2642-2651, 2001)。
【００４７】
精巣特異的キナーゼ2(Tesk2)
Tesk2は、精巣のセルトリ細胞に多く発現するセリン/トレオニンキナーゼである。Tesk2は、コフィリンおよびアクチン脱重合因子(ADF)をリン酸化することができる(Toshima et al., J. Biol. Chem., 276(33):31449-31458, 2001)。コフィリンのリン酸化は、コフィリンのアクチン脱重合機能を不活性化し、アクチンフィラメントの蓄積をもたらす。
【００４８】
ワクシニア関連キナーゼ(Vrkl、Vrk2、Vrk3)
ワクシニア関連キナーゼは、Blキナーゼをコードするワクシニアウイルスとの配列相同性を有するセリン-トレオニンキナーゼである(Nichols and Traktman, J. Biol. Chem., 279(9):7934-7946, 2004に概説される)。Vrklは、増殖組織において高度に発現し、核に局在し、p53のリン酸化を調節する。Vrk2は、小胞体の膜に会合する。VrklおよびVrk2の両方は、細胞内局在を媒介しカゼインをリン酸化するCOOH末端の余分な触媒配列を含む。Vrk3は、キナーゼ活性を欠くが、基質結合に重要なドメインは保持する。
【００４９】
グルコース輸送の正の制御因子
表2に列挙する遺伝子の1つもしくは複数の発現または活性を増加させることで、インスリン刺激によるグルコース取り込みが増加することにより、インスリン作用を強化することができる。上記で負の制御因子について考察したように、インスリン作用の強化は、例えばインビボでの血糖作用の制御において有益である。したがって、これら遺伝子産物の発現または活性を増加させることは、糖尿病などの、インスリン活性またはグルコース輸送が脱制御される状態の治療に有益であり得る。
【００５０】
（表２）グルコース輸送の正の制御因子
2009502172.tif 000004
【００５１】
アクチビンA受容体、タイプ1(Acvrl)
アクチビンは二量体の増殖および分化因子であり、これは構造的に関連するシグナル伝達タンパク質の形質転換成長因子β(TGF-β)スーパーファミリーに属する(Massague, Annu. Rev. Biochem., 67:753-791, 1998)。アクチビンは、膜貫通セリン/トレオニンキナーゼであるアクチビンタイプIおよびタイプII受容体を含む受容体を介して、シグナルを伝達する。アクチビン受容体は、システインリッチ領域を有するリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測されるセリン/トレオニン特異性を有する細胞質ドメインから構成される。
【００５２】
カルシウム/カルモジュリン依存性セリンプロテインキナーゼ(Cask)
Caskは、膜結合型グアニル酸キナーゼ(MAGUK)タンパク質ファミリーのメンバーであり、これはタンパク質-タンパク質相互作用を媒介する多数のドメインを含む。Caskは、N末端CaMキナーゼ様(CKII)ドメイン、L27ドメイン、PDZドメイン、SH3ドメイン、Hookドメイン(4.1結合ドメインとしても公知である)、およびC末端グアニル酸キナーゼ様ドメインを含む(Lee et al., Mol. Cellular Biol, 22(6): 1778- 1791, 2002)。
【００５３】
セリン/トレオニンキナーゼ38(Stk38)
Stk38(核のDbf2関連(NDR)キナーゼとしても公知)は、リン酸化によって、およびCa2+結合タンパク質であるS100Bによって制御される、高度に保存されたセリン/トレオニンプロテインキナーゼである(Millward et al., EMBO J., 17:5913-5922, 1998)。タンパク質ホスファターゼ2A阻害剤であるオカダ酸(OA)によって細胞を処理すると、Stk38は効率的に(20〜100倍)活性化される。Stk38活性はまた、Ca2+イオノフォアA23187による処理によって刺激される(Tamaskovic et al., J. Biol. Chem., 278(9):6710-6718, 2003)。
【００５４】
スクリーニングアッセイ法
グルコース輸送関連核酸もしくはポリペプチドの発現または活性の調節因子を同定する方法を、本明細書において提供する。調節因子には、本明細書に記載するように、1つまたは複数のグルコース輸送関連ポリペプチドもしくは核酸の発現(タンパク質またはmRNA)または活性を調節するポリペプチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド模倣体、炭水化物、または有機小分子もしくは無機小分子などの小分子(例えば、非核酸有機小化合物)が含まれる。一般に、調節因子を同定するためのアッセイ法は、被験化合物が、被験試料(すなわち、グルコース輸送関連核酸またはポリペプチドを含む試料)中のグルコース輸送関連核酸もしくはポリペプチドの発現または活性に及ぼす影響を決定する段階を含む。被験化合物の存在下における発現または活性を、対照試料(例えば、被験化合物または参照試料を含めないこと以外は同条件下でインキュベートした、グルコース輸送関連ポリペプチドを含む試料)中の発現または活性と比較する。被験試料中のグルコース輸送関連核酸またはポリペプチドの発現または活性が、対照と比較して変化していることにより、被験化合物が、グルコース輸送関連核酸もしくはポリペプチドの発現または活性を調節することが示される。
【００５５】
様々な態様において、アッセイ法は、グルコース輸送関連ポリペプチドもしくはそのポリペプチドをコードする核酸、またはそれらの生物活性部分に結合するか、またはそれらの活性を調節する被験化合物をスクリーニングするために提供される。生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な並列固相または液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法；「1ビーズ1化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法を含む、当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリー法における多くのアプローチのいずれかを用いて、スクリーニングする被験化合物を得ることができる。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに有用であり、他の4つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマー、または低分子化合物ライブラリーに有用である(Lam, Anticancer Drug Des., 12:145, 1997)。
【００５６】
分子ライブラリーを合成する方法の例は、文献中見出すことができ、例えば、DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6909, 1993；Erb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:11422, 1994；Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37:2678, 1994；Cho et al., Science 261:1303, 1993；Carrell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059, 1994；Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 33:2061, 1994；およびGallop et al., J. Med. Chem., 37:1233, 1994に見出すことができる。
【００５７】
化合物のライブラリーは溶液中に提示してもよく(例えば、Houghten, Bio/Techniques, 13:412-421, 1992)、またはビーズ(Lam, Nature 354:82-84, 1991)、チップ(Fodor, Nature 364:555-556, 1993)、細菌(米国特許第5,223,409号)、胞子(米国特許第5,571,698号；同第5,403,484号；および同第5,223,409号)、プラスミド(Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:1865-1869, 1992)、もしくはファージ(Scott and Smith, Science, 249:386-390, 1990；Devlin, Science, 249:404-406, 1990；Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378-6382, 1990；およびFelici, J. Mol. Biol., 222:301-310, 1991)上に提示してもよい。
【００５８】
1つの態様において、アッセイ法は、グルコース輸送関連ポリペプチド(例えば、表1または2の遺伝子の遺伝子産物)またはその生物活性部分を細胞表面上に発現している細胞を被験化合物と接触させる、細胞に基づくアッセイ法である。次いで、被験化合物がポリペプチドに結合する能力を決定する。細胞は例えば、酵母細胞または哺乳動物起源の細胞であってよい。被験化合物がポリペプチドに結合する能力は、例えば、複合体中の標識化合物を検出することでポリペプチドまたはその生物活性部分に対する被験化合物の結合が決定され得るように、被験化合物を放射性同位体または酵素標識と結合することによって、決定することができる。例えば、被験化合物は125I、35S、14C、または3Hで直接または間接的に標識することができ、放射線を直接カウントするかまたはシンチレーション計数によって、放射性同位体を検出することができる。
【００５９】
または被験化合物は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素標識することもでき、酵素標識は、適切な基質の産物への変換を測定することにより検出することができる。1つの態様において、アッセイ法は、膜結合型のグルコース輸送関連ポリペプチドまたはその生物活性部分を細胞表面上に発現する細胞を、このポリペプチドに結合する公知化合物と接触させて、アッセイ混合物を形成する段階、アッセイ混合物を被験化合物と接触させる段階、および例えば公知化合物と比較して、被験化合物がポリペプチドまたはその生物活性部分に優先的に結合するかどうかを観察することにより、被験化合物がポリペプチドと相互作用する能力を決定する段階を含む。
【００６０】
別の態様において、本明細書に記載するようなアッセイ法は、膜結合型のグルコース輸送関連ポリペプチドまたはその生物活性部分を細胞表面上に発現している細胞を被験化合物と接触させる段階、および被験化合物がポリペプチドまたその生物活性部分の活性を調節する(例えば、促進するまたは阻害する)能力を決定する段階を含む、細胞に基づくアッセイ法である。被験化合物がポリペプチドまたはその生物活性部分の活性を調節する能力は、例えば、ポリペプチドが標的分子と結合するかまたは相互作用する能力をモニターすることにより決定することができる。
【００６１】
ポリペプチドもしくは核酸が標的分子と結合するかまたは相互作用する能力は、本明細書に記載の直接結合法の1つにより決定することができる。本明細書で使用する「標的分子」とは、選択されたポリペプチドまたは核酸(例えば、表1もしくは表2の遺伝子、またはその遺伝子によってコードされるポリペプチド、またはそれらの相同体)が天然で結合または相互作用する分子、例えば、選択されたタンパク質を発現する細胞の表面上の分子、第2の細胞の表面上の分子、細胞外環境にある分子、細胞膜の内面に結合した分子、または細胞質分子である。標的分子は、グルコース輸送関連ポリペプチドもしくは核酸、または他の何らかのポリペプチド、タンパク質、もしくは核酸であってよい。例えば、標的分子は、細胞外シグナル(例えば、グルコース輸送関連ポリペプチドに対する化合物の結合によって生じるシグナル)の細胞膜を介したおよび細胞内への伝達を促進するシグナル伝達経路の成分、または触媒活性を有する第2の細胞内タンパク質、または下流シグナル伝達分子とグルコース輸送関連ポリペプチドとの会合を促進するタンパク質であってよい。
【００６２】
様々な他の公知の方法によって、ポリペプチドが標的分子と結合するかまたは相互作用する能力を決定することもできる。例えば、標的分子の活性は、標的の細胞二次メッセンジャー(例えば、細胞内Ca2+、ジアシルグリセロール、またはIP3)の誘導を検出する、適切な基質に対する標的の触媒/酵素活性を検出する(例えば、グルコース輸送関連ポリペプチドがキナーゼである場合には、キナーゼ活性を検出する)、レポーター遺伝子(例えば、検出可能なマーカー、例えばルシフェラーゼをコードする核酸に機能的に連結された、グルコース輸送関連ポリペプチドに応答する制御エレメント)の誘導を検出する、または細胞応答、例えばグルコース取り込み、細胞分化、もしくは細胞増殖を検出することにより決定することができる。標的分子が核酸である場合には、化合物は例えばリボザイムまたはアンチセンス分子であってよい。
【００６３】
さらに別の態様において、本明細書に記載のアッセイ法は、グルコース輸送関連ポリペプチド(例えば、表1または2の遺伝子の遺伝子産物)もしくはそのポリペプチドをコードする核酸、またはそれらの生物活性部分を被験化合物と接触させる段階、および被験化合物がポリペプチドまたはその生物活性部分に結合する能力を決定する段階を含む。被験化合物のポリペプチドへの結合は、本明細書に記載するように直接的または間接的のいずれかで決定することができる。1つの態様において、アッセイ法は、ポリペプチドまたはその生物活性部分を、そのポリペプチドに特異的に結合する公知化合物と接触させて、アッセイ混合物を形成する段階、アッセイ混合物を被験化合物と接触させる段階、および被験化合物がポリペプチドと相互作用する能力(例えば、公知化合物の結合と競合する能力)を決定する段階を含む。公知化合物と比較して、被験化合物がポリペプチドまたはその生物活性部分に優先的に結合するかどうかを決定することにより、被験化合物がポリペプチドと相互作用する能力を評価することができる。被験化合物を核酸に標的とする場合、被験化合物の核酸への結合は、例えば、結合により、核酸の断片化により(被験化合物がリボザイムである場合)、または被験化合物の存在下における転写もしくは翻訳の阻害により試験することができる。
【００６４】
別の態様において、アッセイ法は、グルコース輸送関連ポリペプチドまたはその生物活性部分を被験化合物と接触させる段階、および被験化合物がポリペプチドまたはその生物活性部分の活性を調節する(例えば、促進するまたは阻害する)能力を決定する段階を含む無細胞アッセイ法である。例えば、被験化合物がポリペプチドの活性を調節する能力を決定する段階は、ポリペプチドが標的分子を修飾する能力を決定することにより達成され得る。またはそのような方法は、適切な基質に対する標的分子の触媒/酵素活性を測定することができる。
【００６５】
表1および2に記載の多くの遺伝子産物はキナーゼである。これらの遺伝子産物について、キナーゼアッセイ法を使用して、遺伝子産物の活性を調節する薬剤を同定することができる。一般に、ポリペプチド(またはその生物活性部分)の活性の調節は、キナーゼアッセイ法または別の形式のアッセイ法によって、被験化合物の非存在下における活性を、被験化合物の存在下における活性と比較することにより決定される。例えば、被験化合物の存在下におけるキナーゼ(例えば、表1または表2に列挙されるキナーゼ)の活性を決定するには、タンパク質リン酸化に関する任意の標準的なアッセイを行い得る。キナーゼの天然基質、またはキナーゼがリン酸化する別のタンパク質もしくはペプチドを使用することができる。キナーゼ活性のアッセイはまた、キナーゼの生物活性断片(例えば、触媒活性を保持する断片)で行うこともできる。
【００６６】
具体的には、キナーゼ阻害因子およびアゴニストについてのスクリーニング(例えばハイスループットスクリーニング)は、以下によって実施することができる：(a) 1つもしくは複数のタイプの基質タンパク質またはペプチドの、固体支持体(例えばマイクロタイタープレートのウェル)への結合；(b) 遮断剤(ウシ血清アルブミンまたはゼラチンなどの標準的な遮断剤が公知である)への基質の曝露；ならびに(c) キナーゼ、リン酸の供給源(例えば放射活性物質で標識したγリン酸を有するATP)、および被験化合物への基質の曝露。反応の構成要素(例えばキナーゼ、リン酸供給源、および被験化合物)は典型的に、緩衝液中に供給され、ある温度(温度は例えば室温(約23℃)から生理的温度(約37℃)まで変化し得る)で、アッセイの直線範囲内である時間、反応を進行させる。反応は、様々な方法で(例えば支持体を緩衝液で何回かリンスすることによって)終結させることができ、結合基質に取り込まれたリン酸の量を決定することができる(測定には標準的な技術、例えば放射性タグが利用可能である)。キナーゼが基質をリン酸化することが可能であった程度を低下させる物質として、阻害因子を同定する。キナーゼが基質をリン酸化することが可能であった程度を増加させる物質として、アゴニストを同定する。キナーゼの活性またはキナーゼが相互作用する分子の変化を測定するために用いることができる他のアッセイ法の記載について、米国特許第6,258,776号もまた参照されたい。
【００６７】
さらに別の態様において、無細胞アッセイ法は、グルコース輸送関連ポリペプチドもしくはそのポリペプチドをコードする核酸、またはそれらの生物活性部分を、ポリペプチドに結合する公知化合物と接触させて、アッセイ混合物を形成する段階、アッセイ混合物を被験化合物と接触させる段階、およびポリペプチドまたは核酸が標的分子(例えば、ポリペプチドの天然基質であるかまたは結合パートナーである標的分子)に優先的に結合するかまたはその活性を調節する能力をアッセイすることにより、被験化合物がポリペプチドまたは核酸と相互作用する能力を決定する段階を含む。
【００６８】
無細胞アッセイ法は、可溶型または膜結合型のポリペプチド(ポリペプチドが膜含有ポリペプチドである場合)の使用に適している。膜結合型のポリペプチドを含む無細胞アッセイ法の場合には、膜結合型のポリペプチドが溶液中で維持されるように、可溶化剤を使用することが望ましいと考えられる。このような可溶化剤の例には、n-オクチルグルコシド、n-ドデシルグルコシド、n-オクチルマルトシド、オクタノイル-N-メチルグルカミド、デカノイル-N-メチルグルカミド、Triton X-100(登録商標)、Triton X-114(登録商標)、テシット(Thesit)、イソトリデシポリ(エチレングリコールエーテル)n、3-[(3-コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホン酸(CHAPS)、3-[(3-コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホン酸(CHAPSO)、およびN-ドデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホン酸などの非イオン性界面活性剤が含まれる。
【００６９】
新規アッセイ法の特定の態様では、グルコース輸送関連ポリペプチドまたはその標的分子のいずれかを固定化して、これらタンパク質の一方または両方の非複合体型からの複合体型の分離を容易にすること、およびアッセイを自動化することが望ましいと考えられる。被験化合物のポリペプチドへの結合、または、被験薬剤の存在下および非存在下におけるポリペプチドと標的分子との相互作用は、反応物の収容に適した任意の容器中で行うことができる。このような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、および微量遠心管が含まれる。1つの態様では、タンパク質の一方または両方の基質への結合を可能にするドメインを付加した融合タンパク質が提供され得る。例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合タンパク質またはグルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ(Sigma Chemical；ミズーリ州、セントルイス)またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着させ得、次いで被験化合物、または、被験化合物および吸着させていない標的タンパク質もしくはグルコース輸送関連タンパク質のいずれかと混合し、複合体形成を促す条件下で(例えば、塩およびpHの生理的条件で)インキュベートする。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、非結合成分を除去し、複合体形成を例えば上記のように直接または間接的に測定する。または、複合体を基質から解離させてもよく、ポリペプチドの結合または活性のレベルを標準的な技法で決定することができる。
【００７０】
タンパク質を基質上に固定化する他の技術もまた、本スクリーニングアッセイ法において使用することができる。例えば、グルコース輸送関連ポリペプチドまたはその標的分子のいずれかを、ビオチンとストレプトアビジンの結合を用いて固定化することができる。当技術分野で周知の技法を使用して(例えば、ビオチン化キット、Pierce Chemicals；イリノイ州、ロックフォード)、ビオチン-NHS(N-ヒドロキシ-スクシンイミド)からビオチン化ポリペプチドまたは標的分子を調製し、ストレプトアビジンをコーティングした96ウェルプレート(Pierce Chemical)のウェルに固定することができる。または、ポリペプチドまたは標的分子と反応するが、グルコース輸送関連ポリペプチドのその標的分子への結合を妨げない抗体を、プレートのウェルに誘導体化し、非結合の標的またはポリペプチドを抗体結合によりウェルに捕捉することができる。GST固定化複合体などの複合体を検出する方法には、ポリペプチドまたは標的分子と反応する抗体を用いる複合体の免疫検出法、およびポリペプチドまたは標的分子に関連した酵素活性の検出に基づく酵素結合測定法が含まれる。
【００７１】
別の態様においては、細胞を被験化合物と接触させ、細胞内での選択されたmRNAまたはタンパク質(例えば、例えば表1または2記載のグルコース輸送関連ポリペプチドまたはそのポリペプチドをコードする遺伝子に対応するmRNAまたはタンパク質)の発現を決定する方法で、ポリペプチドの発現の調節因子を同定する。被験化合物の存在下における選択されたmRNAまたはタンパク質の発現レベルを、被験化合物の非存在下における選択されたmRNAまたはタンパク質の発現レベルと比較する。次いで、この比較に基づいて、被験化合物をポリペプチドの発現の調節因子(すなわち、候補化合物)として同定することができる。例えば、選択されたmRNAまたはタンパク質の発現が、被験化合物の非存在下よりもその存在下で高い(統計的に有意に高い)場合には、被験化合物は、選択されたmRNAまたはタンパク質の発現の促進因子である候補薬剤として同定される。または、選択されたmRNAまたはタンパク質の発現が、被験化合物の非存在下よりもその存在下で低い(統計的に有意に低い)場合には、被験化合物は、選択されたmRNAまたはタンパク質の発現の阻害因子である候補薬剤と同定される。細胞内での選択されたmRNAまたはタンパク質の発現レベルは、本明細書に記載する方法により決定することができる。
【００７２】
さらに別の局面においては、グルコース輸送関連ポリペプチドをツーハイブリッドアッセイ法またはスリーハイブリッドアッセイ法における「ベイトタンパク質」として用いて(例えば、米国特許第5,283,317号; Zervos et al., Cell, 72:223-232, 1993；Madura et al., J. Biol. Chem. 268:12046-12054, 1993；Bartel et al., Bio/Techniques 14:920-924, 1993；Iwabuchi et al., Oncogene 8:1693-1696, 1993；およびWO 94/10300を参照されたい)、グルコース輸送関連タンパク質と結合するもしくは相互作用する、またはポリペプチドの活性を調節する他のタンパク質を同定することができる。そのような結合タンパク質はまた、例えばグルコース輸送に関するシグナル伝達経路の下流エレメントとして、グルコース輸送関連ポリペプチドによるシグナルの伝播に関与している可能性が高い。
【００７３】
アンチセンス核酸
本明細書に記載のグルコース輸送関連ポリペプチドの発現を調節する薬剤には、アンチセンス核酸分子、すなわちそのヌクレオチド配列がグルコース輸送関連ポリペプチドをコードする遺伝子の配列に基づく(例えば、表1または表2に列挙した遺伝子の配列に基づく)mRNAの全体または一部と相補的である核酸分子が含まれる。アンチセンス核酸分子は、グルコース輸送関連ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の非コード領域の全体または一部に対してアンチセンスであってよい。非コード領域(「5'および3'非翻訳領域」)とは、遺伝子内でコード領域に隣接し、かつアミノ酸に翻訳されない5'および3'配列である。
【００７４】
本明細書に開示する配列に基づき、当業者は、本明細書に記載の遺伝子を標的するための多くの適切なアンチセンス分子のうちのいずれかを容易に選択し、合成することができる。例えば、表1に記載する核酸の長さにわたる15〜30ヌクレオチドの一連のオリゴヌクレオチドを含む「遺伝子歩行」（gene walk）を調製し、続いて遺伝子発現の阻害に関して試験することができる。任意で、合成および試験するオリゴヌクレオチドの数を低減するために、5〜10ヌクレオチドのギャップをオリゴヌクレオチド間に残してもよい。
【００７５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約5、10、15、20、25、30、35、40、45、もしくは50ヌクレオチド長またはそれ以上の長さであってよい。アンチセンス核酸は、当技術分野で公知の手順を使用して、化学合成および酵素による連結反応により構築することができる。例えば、アンチセンス核酸(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド)は、天然ヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増すように、もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間に形成される二重鎖の物理的安定性を増すように設計された様々な修飾ヌクレオチドを用いて化学合成することができ、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる。
【００７６】
アンチセンス核酸の作製に使用することのできる修飾ヌクレオチドの例には、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルケオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルケオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン（wybutoxosine）、シュードウラシル、ケオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)w、および2,6-ジアミノプリンが含まれる。または、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向にサブクローニングされた発現ベクターを使用して、生物学的に生成することもできる(すなわち、挿入された核酸から転写されるRNAは、以下の節でさらに説明するように、関心対象の標的核酸に対してアンチセンス方向となる)。
【００７７】
本明細書に記載のアンチセンス核酸分子は、インビトロで調製し、動物、例えば哺乳動物、例えばヒト患者に投与することができる。または、アンチセンス核酸分子は、本明細書に記載の選択されたポリペプチドをコードするmRNAおよび/またはゲノムDNAとハイブリダイズするかまたはそれに結合し、それによって例えば転写および/または翻訳を阻害することにより発現を阻害するように、インサイチューで作製することもできる。ハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖を形成するための通常のヌクレオチド相補性によってもよいし、または例えば、DNA二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重らせんの主溝における特異的相互作用によってもよい。アンチセンス核酸分子の投与経路の例には、組織部位における直接注射が含まれる。または、アンチセンス核酸分子を選択された細胞を標的とするように修飾して、その後全身投与することもできる。例えば、全身投与のためには、選択された細胞表面上に発現される受容体または抗原にアンチセンス分子が特異的に結合するように、例えば細胞表面の受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体にアンチセンス核酸分子を連結することにより、アンチセンス分子を修飾することができる。アンチセンス核酸分子は、本明細書に記載のベクターを用いて細胞に送達することもできる。例えば、アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を得るために、アンチセンス核酸分子を強力なpol IIまたはpol IIIプロモーターの調節下に置いたベクター構築物を使用することができる。
【００７８】
グルコース輸送関連ポリペプチドの発現または活性を調節するために用いるアンチセンス核酸分子は、α-アノマー核酸分子であってよい。α-アノマー核酸分子は、通常のβ-ユニットとは異なり鎖が相互に平行に走行する、相補的RNAとの特異的な二本鎖ハイブリッドを形成する(Gaultier et al., Nucleic Acids Res. 15:6625-6641, 1987)。アンチセンス核酸分子はまた、2'-o-メチルリボヌクレオチド(Inoue et al., Nucleic Acids Res., 15:6131-6148, 1987)またはキメラRNA-DNA類似体(Inoue et al., FEBS Lett., 215:327-330, 1987)を含み得る。
【００７９】
グルコース輸送関連遺伝子の全体または一部と相補的なアンチセンス分子はまた、当技術分野において公知のハイブリダイゼーション法を用いてそのような遺伝子の発現をアッセイするのに有用である。例えば、アンチセンス分子を標識し(例えば、放射性分子で)、過剰量の標識アンチセンス分子をRNA試料とハイブリダイズさせる。ハイブリダイズしなかった標識アンチセンス分子を除去し(例えば、洗浄により)、ハイブリダイズしたアンチセンス分子の量を測定する。ハイブリダイズした分子の量を測定し、これを用いて、グルコース輸送関連遺伝子の発現量を計算する。一般に、この目的のためのアンチセンス分子は、本明細書に記載するような高ストリンジェンシー条件下でグルコース輸送関連遺伝子の配列とハイブリダイズすることができる。最初にRNA試料を用いてcDNAを合成する場合には、センス分子を使用することができる。二本鎖分子をハイブリダイゼーション前に適切に変性させるのであれば、二本鎖分子をそのようなアッセイにおいて使用することも可能である。
【００８０】
リボザイム
本明細書に記載のグルコース輸送関連遺伝子をコードする配列に対して(例えば、表1または表2記載の遺伝子の配列に対して)特異性を有するリボザイムもまた提供する。リボザイムとは、それらが相補的な領域を有する、mRNAなどの一本鎖核酸を切断することのできる、リボヌクレアーゼ活性を有する触媒RNA分子である。したがって、リボザイム(例えば、ハンマーヘッドリボザイム(Haselhoff and  Gerlach, Nature, 334:585-591, 1988に記載されている))を用いてmRNA転写産物を触媒切断して、それによりmRNAによってコードされるタンパク質の翻訳を阻害することができる。本発明の核酸分子に対して特異性を有するリボザイムは、本明細書に開示するcDNAのヌクレオチド配列に基づいて設計することができる。例えば、活性部位のヌクレオチド配列が、グルコース輸送関連mRNAにおいて切断されるべきヌクレオチド配列に対して相補的である、テトラヒメナL-19 IVS RNAの誘導体を構築することができる(Cech et al. 米国特許第4,987,071号；およびCech et al.、米国特許第5,116,742号)。または、グルコース輸送関連ポリペプチドをコードするmRNAを用いて、RNA分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒RNAを選択することもできる。例えば、Bartel and Szostak, Science, 261:1411-1418, 1993を参照されたい。
【００８１】
三重らせん構造を形成する核酸分子もまた、本明細書において提供する。例えば、ポリペプチドをコードする遺伝子の制御領域(例えば、プロモーターおよび/またはエンハンサー)に相補的なヌクレオチド配列を標的として、標的細胞において遺伝子の転写を妨げる三重らせん構造を形成させることにより、グルコース輸送関連ポリペプチドの発現を阻害することができる。一般的には、Helene, Anticancer Drug Des. 6(6):569-84, 1991；Helene, Ann. N.Y. Acad. Sci., 660:27-36, 1992；およびMaher, Bioassays, 14(12):807-15, 1992を参照されたい。
【００８２】
様々な態様において、核酸分子(例えば、グルコース輸送関連ポリペプチドの発現を調節するために用いられる核酸分子)は、例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解度を改善するために、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格において修飾することができる。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格を修飾して、ペプチド核酸を作製することができる(例えば、Hyrup et al., Bioorganic & Medicinal Chem., 4(1): 5-23, 1996を参照されたい)。ペプチド核酸(PNA)とは、デオキシリボースリン酸骨格が擬ペプチド骨格で置換され、4種類の天然核酸塩基のみが保持されている核酸模倣体、例えばDNA模倣体である。PNAの中性骨格は、低イオン強度の条件下におけるDNAおよびRNAへの特異的ハイブリダイゼーションを可能にする。PNAオリゴマーの合成は、例えば、Hyrup et al., 1996、前記； Perry-O'Keefe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 14670-675, 1996に記載されている標準的な固相ペプチド合成手順を用いて行うことができる。
【００８３】
PNAは治療および診断用途に用いることができる。例えば、PNAは、例えば転写もしくは翻訳停止を誘導するか、または複製を阻害することによって、遺伝子発現を配列特異的に調節するためのアンチセンス剤またはアンチ遺伝子剤として用いることができる。PNAはまた、例えばPNA指向性PCRクランピングにより、例えば遺伝子における単一塩基対の変異の解析において；他の酵素、例えばS1ヌクレアーゼと組み合わせて使用する場合の人工制限酵素として(Hyrup, 1996、前記)；またはDNA配列決定およびハイブリダイゼーションのためのプローブもしくはプライマーとして(Hyrup, 1996、前記；Perry-O'Keefe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 14670-675, 1996)用いることもできる。
【００８４】
PNAは、例えばその安定性または細胞取り込みを増強するために、PNAに親油性基もしくは他の補助基を付加することにより、PNA-DNAキメラの形成により、またはリポソームもしくは当技術分野で公知の他の薬物送達技法の使用により修飾することができる。例えば、PNAとDNAの有利な特性を兼ね備え得るPNA-DNAキメラを作製することができる。このようなキメラにより、PNA部分が高い結合親和性および特異性を提供しつつ、例えばRNaseHおよびDNAポリメラーゼなどのDNA認識酵素がDNA部分と相互作用することが可能になる。PNA-DNAキメラは、塩基のスタッキング、核酸塩基間の結合数、および配向に関して選択される適切な長さのリンカーを用いて連結することができる(Hyrup, 1996、前記)。PNA-DNAキメラの合成は、Hyrup, 1996、前記、およびFinn et al., Nucleic Acids Res., 24:3357-63, 1996に記載されている通りに行うことができる。例えば、DNA鎖は、標準的なホスホラミダイトカップリング化学および修飾ヌクレオシド類似体を用いて固相支持体上で合成することができる。5'-(4-メトキシトリチル)アミノ-5'-デオキシ-チミジンホスホラミダイトなどの化合物を、PNAとDNAの5'末端との間の連結として使用することができる(Mag et al., Nucleic Acids Res., 17:5973-88, 1989)。次いでPNAモノマーを段階的様式で結合させ、5'PNA部分および3'DNA部分を有するキメラ分子を生成する(Finn et al., Nucleic Acids Res., 24:3357-63, 1996)。または、5'DNA部分および3'PNA部分を用いてキメラ分子を合成することもできる(Peterser et al., Bioorganic Med. Chem. Lett., 5:1119-11124, 1975)。
【００８５】
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ペプチド(例えば、インビボで宿主細胞受容体を標的とするための)、または細胞膜(例えば、Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:6553-6556, 1989；Lemaitre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:648-652, 1989；WO 88/09810を参照されたい)もしくは血液脳関門(例えば、WO 89/10134を参照されたい)を介した輸送を促進する薬剤などの他の付属基を含む。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤(例えば、Krol et al., Bio/Techniques, 6:958-976, 1988を参照されたい)または挿入剤(例えば、Zon, Pharm. Res., 5:539-549, 1988を参照されたい)で修飾することもできる。この目的のために、オリゴヌクレオチドを別の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発性架橋剤、輸送剤、またはハイブリダイゼーション誘発性切断剤に結合することができる。
【００８６】
RNA干渉
グルコース輸送関連ポリペプチドの発現を調節することができる別の手段は、RNA干渉(RNAi)による。RNAiとは、mRNAが宿主細胞において特異的に分解され、それによってmRNAをコードする遺伝子の発現をサイレンシングする過程である。様々な方法、例えばRNAヘアピンの内因性発現を実行させることにより(Paddison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:1443-1448, 2002を参照されたい)、または低分子(21〜23 nt)二本鎖(dsRNA)のトランスフェクションにより(例えばカチオン性リポソームトランスフェクションおよびエレクトロポレーションによる)、腔もしくは細胞内空間へのdsRNAの導入により、またはdsRNAをコードするDNAの導入により、RNAを介した遺伝子サイレンシングを哺乳動物細胞に導入することができる。例えばCaplen, Trends in Biotech., 20:49-51, 2002を参照されたい。遺伝子発現をRNAiによって調節する方法は、例えば米国特許第6,506,559号および米国特許出願公開第20030056235号に記載されている。
【００８７】
様々な態様において、サイレンシングする遺伝子(例えばグルコース輸送関連ポリペプチドをコードする遺伝子、例えば表1記載の遺伝子；表1に列挙された遺伝子産物の発現もしくは活性を活性化するポリペプチドをコードする遺伝子；または表2に列挙された遺伝子産物を阻害するポリペプチドをコードする遺伝子)の一部に対応するdsRNA、またはそのdsRNAをコードするDNAを、細胞に導入する。dsRNAは低分子干渉RNA(すなわちsiRNA)と呼ばれる21〜23ヌクレオチド長の二重鎖へと消化され、これがヌクレアーゼ複合体に結合してRNA誘導型サイレンシング複合体(すなわちRISC)として公知のものを形成する。RISCは、siRNA鎖の一方と内因性mRNAとの間の塩基対形成相互作用により、相同的な転写産物を標的とする。これは次いで、siRNAの3'末端から約12ヌクレオチドでmRNAを切断する(Sharp et al., Genes Dev., 15:485-490, 2001、およびHammond et al., Nature Rev. Gen., 2:110-119, 2001を参照されたい)。
【００８８】
標準的な分子生物学技法を用いて、siRNAを作製することができる。低分子干渉RNAは、化学合成すること、例えばプラスミドなどの鋳型DNAからRNAを発現させて組換えにより生成すること、またはDharmaconなどの製造供給元から入手することができる。RNAiを媒介するために使用するRNAは、ホスホロチオエートヌクレオチドなどの合成または修飾ヌクレオチドを含み得る。siRNAまたはsiRNAを作製するように設計されたプラスミドを細胞にトランスフェクションする方法は、当技術分野において日常的である。
【００８９】
グルコース輸送関連ポリペプチドの発現を調節するために用いられるsiRNA分子は、多くの方法において異なってもよい。例えば、siRNA分子は、3'ヒドロキシ基および21、22、または23個の連続したヌクレオチドの鎖を含み得る。それらは平滑末端化されてもよく、または3'末端、5'末端、もしくは両末端のいずれかにおいて突出末端を含んでもよい。例えば、RNA分子の少なくとも一方の鎖は、約1〜約6ヌクレオチド(例えば、1〜5、1〜3、2〜4、または3〜5ヌクレオチド(ピリミジンヌクレオチドまたはプリンヌクレオチドのいずれであっても))長の3'突出部を有することができる。両鎖が突出部を含む場合には、突出部の長さは各鎖について同じであってもまたは異なってもよい。
【００９０】
遺伝子の発現を調節するために用いられるsiRNAは、遺伝子のmRNAにおける標的領域に対して同一であるか、または例えば少なくとも80％(またはそれ以上、例えば85％、90％、95％、もしくは100％)同一、例えば3、2、1、もしくは0個のミスマッチヌクレオチド有するなど、実質的に同一であってよく、他方の鎖は第一の鎖に相補的である。
【００９１】
陰性対照siRNA(「スクランブルされた」)は一般に、選択されたsiRNAと同じヌクレオチド組成物を有するが、適切なゲノムに対する有意な配列相補性は有さない。選択されたsiRNAのヌクレオチド配列をランダムにスクランブルすることによって、そのような陰性対照を設計することができる：相同性検索を実行して、この陰性対照が、適切なゲノムにおける他のいずれの遺伝子に対する相同性も持たないことを確認することができる。適切な数の塩基ミスマッチを、選択されたsiRNA配列に導入することによって、対照も同様に設計することができる
【００９２】
RNA二重鎖の安定性をさらに増強するために、3'突出部を分解に対して安定化することができる(例えば、アデノシンもしくはグアノシンヌクレオチドなどのプリンヌクレオチドを含めること、またはピリミジンヌクレオチドを修飾した類似体で置換することによって(例えば、2'-デオキシチミジンによるウリジン2ヌクレオチド3'突出部の置換は許容され、RNAiの効率に影響しない))。関心対象の標的と十分な相同性を有するのであれば、グルコース輸送関連ポリペプチドを調節する方法において任意のsiRNAを使用することができる。使用することができるsiRNAの長さに上限はない(例えば、siRNAは、遺伝子の約21塩基対から遺伝子の全長またはそれ以上の長さ(例えば、50〜100、100〜250、250〜500、500〜1000、または1000を超える塩基対)の範囲であってよい)。様々な態様において、siRNAは31、30、28、25、または23ヌクレオチド未満の長さを有する。
【００９３】
単離されたポリペプチド
本明細書に記載のグルコース輸送関連遺伝子によってコードされる単離されたポリペプチドもまた提供する。これらのポリペプチドは、例えば抗体を産生させるための免疫原として、スクリーニング法において、または例えばポリペプチドの投与により対象を治療する方法において使用することができる。核酸の翻訳産物を予測する方法は、当技術分野において周知である(例えば、予測されるポリペプチド配列、および3つの読み枠のうちどれが配列のオープンリーディングフレームであるかに関する指示を提供するコンピュータプログラムを用いる)。次いで、これらのポリペプチド配列を生物学的に(例えば、これらをコードする核酸配列を発現ベクター中にインフレームで配置し、適合する発現系にトランスフェクションすることにより)、または当技術分野で公知の方法を用いて化学的に生成することができる。ポリペプチド全体またはその断片を、治療方法において、または例えばスクリーニングアッセイにおいて有用である抗体を産生させるために使用することができる。
【００９４】
「単離された」もしくは「精製された」タンパク質またはその生物活性部分は、そのタンパク質が由来する細胞または組織源からの細胞物質または他の混入タンパク質を実質的に含まず、または化学合成された場合には、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。「細胞物質を実質的に含まない」という用語は、タンパク質が単離されたまたは組換えによって生成された細胞の細胞成分からタンパク質が分離されているタンパク質調製物を含む。したがって、細胞物質を実質的に含まないタンパク質には、(乾燥重量で)約30％、20％、10％、または5％未満の異種タンパク質(本明細書では「混入タンパク質」とも称する)を有するタンパク質調製物が含まれる。一般に、タンパク質およびその生物活性部分が組換えによって生成される場合には、これは同様に培養液を実質的に含まず、すなわち培養液はタンパク質調製物の容量の約20％、10％、または5％未満を表す。一般に、タンパク質が化学合成によって生成される場合には、これは化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まず、すなわちタンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離されている。したがって、このようなタンパク質調製物は、化学的前駆体または関心対象のポリペプチド以外の化合物を(乾燥重量で)約30％、20％、10％、または5％未満有する。
【００９５】
タンパク質およびポリペプチドをアッセイして、関心対象の遺伝子産物の発現レベルを決定することができる。タンパク質発現をアッセイする方法は当技術分野で公知であり、これにはウェスタンブロット法、免疫沈降法、および放射性免疫測定法が含まれる。
【００９６】
グルコース輸送関連ポリペプチドの生物活性部分には、タンパク質のアミノ酸配列と十分に同一であるかまたはその配列に由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、全長タンパク質よりも少数のアミノ酸を含み、かつ対応する全長タンパク質の少なくとも1つの活性を示すポリペプチドが含まれる。典型的に、生物活性部分は、対応するタンパク質の少なくとも1つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。ポリペプチドの生物活性部分は、例えば10、25、50、100アミノ酸長、またはそれ以上の長さであってよい。さらに、所与のタンパク質の他の領域が除去された生物活性部分を組換え技法によって調製し、天然型ポリペプチドの機能活性の1つまたは複数に関して評価することができる。これらの短いポリペプチドは、表1または表2に列挙される遺伝子の遺伝子産物の活性を競合的に阻害する(または表1もしくは表2に列挙される遺伝子の活性もしくは発現を制御する遺伝子産物の活性を阻害する)ための処置において使用することができる。
【００９７】
いくつかの態様において、グルコース輸送関連ポリペプチドは、表1および2記載の遺伝子から選択される遺伝子によってコードされる予測アミノ酸配列を有する。他の有用なタンパク質は、表1および2記載の遺伝子によってコードされるポリペプチドの予測アミノ酸配列と実質的に同一(例えば、少なくとも約45％、好ましくは55％、65％、75％、85％、95％、または99％)であって、(a) 対応する天然タンパク質のタンパク質の機能活性を保持しているが、天然の対立遺伝子変化もしくは変異誘発によってアミノ酸配列が異なるか、または(b) 必要に応じて変化した機能活性(例えば、ドミナントネガティブとして)を示す。
【００９８】
配列の比較および2つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成される。2つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、GCGソフトウェアパッケージ(gcg.comのワールドワイドウェブで利用可能)中のGAPプログラムに組み込まれているNeedleman and Wunsch((1970) J. Mol. Biol. 48:444-453)アルゴリズムを用いて、Blossum 62行列またはPAM250行列のいずれか、ならびにギャップ加重16および長さ加重1を用いて決定される。2つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、GCGソフトウェアパッケージ(gcg.comのワールドワイドウェブで利用可能)中のGAPプログラムを用いて、NWSgapdna.CMP行列ならびにギャップ加重40および長さ加重1を用いて決定される。
【００９９】
一般に、本明細書で参照するアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ncbi.nlm.nih.gov/BLASTのワールドワイドウェブにおいて公的に利用可能なBLAST 2.0プログラムを用いて決定される。配列比較は、ギャップなしのアラインメントを用いて、および初期設定パラメータ(Blossum 62行列、ギャップ存在コスト11、残基あたりのギャップコスト1、およびラムダ比0.85)を用いて行われる。BLASTプログラムで盛りいられる数学的アルゴリズムは、Altschul et al., Nucleic Acids Research 25:3389-3402, 1997に記載されている。
【０１００】
キメラまたは融合タンパク質もまた、本明細書において提供する。本明細書で使用する「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、異種ポリペプチド(すなわち、グルコース輸送関連ポリペプチド以外のポリペプチド)に機能的に連結されたグルコース輸送関連ポリペプチドの全体または一部(例えば、生物活性部分)を含む。融合タンパク質との関連において「機能的に連結した」という用語は、ポリペプチドと異種ポリペプチドが相互にインフレームで融合していることを意味するものとする。異種ポリペプチドは、グルコース輸送関連ポリペプチドのN末端またはC末端に融合させることができる。
【０１０１】
1つの有用な融合タンパク質は、グルコース輸送関連ポリペプチドがGST配列のC末端に融合されているGST融合タンパク質である。そのような融合タンパク質は、組換え体グルコース輸送関連ポリペプチドの精製を容易にすることができる。
【０１０２】
別の態様において、融合タンパク質は、そのN末端で異種シグナル配列を含む。例えば、グルコース輸送関連ポリペプチドの本来のシグナル配列を除去して、別のタンパク質のシグナル配列で置換することができる。例えば、バキュロウイルスエンベロープタンパク質のgp67分泌配列を異種シグナル配列として用いることができる(Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, 1992)。真核生物異種シグナル配列の他の例には、メリチンおよびヒト胎盤アルカリホスファターゼの分泌配列が含まれる(Stratagene；カリフォルニア州、ラ・ホーヤ）。さらに別の例において、有用な原核生物異種シグナル配列には、phoA分泌シグナル(Sambrook et al., eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)およびプロテインA分泌シグナル(Pharmacia Biotech：ニュージャージー州、ピスカタウェイ)が含まれる。
【０１０３】
さらに別の態様において、融合タンパク質は、グルコース輸送関連ポリペプチドの全体または一部が、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーに由来する配列に融合されている免疫グロブリン融合タンパク質である。免疫グロブリン融合タンパク質を薬学的組成物に組み入れ、リガンド(可溶性または膜結合型)と細胞表面上のタンパク質(受容体)との相互作用を阻害して、それによってインビボでのシグナル伝達を抑制するために、対象に投与することができる。免疫グロブリン融合タンパク質を用いて、グルコース輸送関連ポリペプチドの同族リガンドの生物学的利用能に影響を及ぼすことができる。リガンド/受容体相互作用の阻害は、増殖性および分化性の障害を治療するため、ならびに細胞生存を調節する(例えば、促進するまたは阻害する)ために、治療的に有用であり得る。さらに、免疫グロブリン融合タンパク質は、対象においてグルコース輸送関連ポリペプチドに対する抗体を産生させるための免疫原として、リガンドを精製するため、および受容体とリガンドの相互作用を阻害する分子を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて用いることができる。
【０１０４】
キメラおよび融合グルコース輸送関連ポリペプチドは、標準的な組換えDNA技法により生成することができる。別の態様において、融合遺伝子は、自動DNA合成機を含む従来の技法によって合成することができる。または、2つの連続した遺伝子断片間に相補的突出部を生じるアンカープライマーを用いて、遺伝子断片のPCR増幅を行い、その後これをアニーリングおよび再増幅してキメラ遺伝子配列を作製することができる。さらに、既に融合部分(例えば、GSTポリペプチド)を既にコードする多くの発現ベクターが市販されている。グルコース輸送関連ポリペプチドをコードする核酸を、融合部分がポリペプチドとインフレームで連結されるように、そのような発現ベクターにクローニングすることができる。
【０１０５】
ポリペプチドのシグナル配列を用いて、関心対象の分泌タンパク質または他のタンパク質の分泌および単離を容易にすることができる。シグナル配列は典型的に、1つまたは複数の切断事象における分泌過程において成熟タンパク質から一般的に切断される疎水性アミノ酸のコアによって特徴づけられる。そのようなシグナルペプチドは、成熟タンパク質が分泌経路を通過する際にそのタンパク質からのシグナル配列の切断を可能にするプロセシング部位を含む。したがって、シグナル配列を有する記載のポリペプチド、ならびにシグナル配列自体およびシグナル配列の非存在下におけるポリペプチド(すなわち、切断産物)が本明細書において提供される。1つの態様においては、シグナル配列をコードする核酸配列を、発現ベクターにおいて、通常は分泌されないかまたはさもなくば単離が困難であるタンパク質などの関心対象のタンパク質に機能的に連結することができる。シグナル配列は、発現ベクターを形質転換する真核生物宿主からなどのタンパク質の分泌を指向し、シグナル配列はその後または同時に切断される。タンパク質は次いで、当技術分野において公知の方法により、細胞外培地から容易に精製され得る。または、シグナル配列は、GSTドメインのような精製を容易にする配列を用いて、関心対象のタンパク質に連結することができる。
【０１０６】
グルコース輸送関連ポリペプチドの変種もまた提供する。そのような変種は、アゴニスト(模倣体)としてまたはアンタゴニストとして機能することができる変化したアミノ酸配列を有する。変種は、例えば不連続の点突然変異または切断などの突然変異誘発によって作製され得る。アゴニストは、天然型タンパク質の生物活性と実質的に同等であるかまたはその一部の活性を保持することができる。タンパク質のアンタゴニストは、例えば、関心対象のタンパク質を含む細胞シグナル伝達カスケードの下流または上流メンバーに競合的に結合することにより、天然型タンパク質の活性の1つまたは複数を阻害することができる。このように、限定された機能の変種で処置することにより、特定の生物学的効果を誘発することができる。天然型タンパク質の生物活性の一部を有する変種で対象を処置すると、天然型タンパク質で処置した場合と比較して、対象における副作用が少なくなり得る。
【０１０７】
抗体
単離されたグルコース輸送関連ポリペプチドまたはその断片を免疫原として用いて、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製に関する標準的技法により抗体を作製することができる。全長ポリペプチドもしくはタンパク質を用いることができ、または抗原性ペプチド断片を免疫原として用いることもできる。タンパク質の抗原性ペプチドは、例えば表1または表2に列挙されたポリペプチドなど、グルコース輸送関連ポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも8個(例えば、10、15、20、または30個)のアミノ酸残基を含み、ペプチドに対して産生された抗体がタンパク質と特異的免疫複合体を形成するように、タンパク質のエピトープを含む。
【０１０８】
典型的には免疫原を用いて、適切な対象(例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、または他の哺乳動物)を免疫化することにより抗体を調製する。適切な免疫原調製物は、例えば、組換えにより発現されたまたは化学合成されたポリペプチドを含み得る。調製物は、フロイントの完全もしくは不完全アジュバントなどのアジュバント、または同様の免疫刺激剤をさらに含み得る。
【０１０９】
ポリクローナル抗体は、適切な対象を免疫原としてのグルコース輸送関連ポリペプチドで免疫化することにより、上記のように調製することができる。免疫化された対象における抗体力価は、固定化ポリペプチドを使用する酵素結合免疫吸着測定法(ELISA法)などの標準的な技法により、経時的にモニターすることができる。必要に応じて、哺乳動物から(例えば、血液から)抗体分子を単離し、プロテインAクロマトグラフィーなどの周知の技法によりさらに精製して、IgG画分を得ることができる。免疫化後の適切な時点で、例えば特異的抗体力価が最も高い時点で、抗体産生細胞を対象から得て、これを用いてKohler and Milstein, Nature 256:495-497, 1975により最初に記載されたハイブリドーマ技法、ヒトB細胞ハイブリドーマ技法(Kozbor et al., Immunol. Today 4: 72, 1983)、EBV-ハイブリドーマ技法(Cole et al.,  Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96, 1985)、またはトリオーマ技法などの標準的な技法によりモノクローナル抗体を調製することができる。ハイブリドーマを作製する技術は周知である(一般的には、Current Protocols in Immunology, 1994, Coligan et al. (eds.) John Wiley & Sons, Inc., New York, NYを参照されたい)。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば標準的なELISAアッセイ法を使用して、関心対象のポリペプチドと結合する抗体に関してハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることにより検出される。
【０１１０】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製する別の方法として、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー(例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー)を関心対象のポリペプチドでスクリーニングすることにより、ポリペプチドに対するモノクローナル抗体を同定および単離することができる。ファージディスプレイライブラリーを作製しスクリーニングするためのキットは、市販されている(例えば、Pharmacia組換えファージ抗体システム(Recombinant Phage Antibody System)、カタログ番号27-9400-01；およびStratagene SurfZAP(商標) ファージディスプレイキット(Phage Display Kit)、カタログ番号240612)。さらに、抗体ディスプレイライブラリーの作製およびスクリーニングにおける使用に特に適した方法および試薬の例は、例えば、米国特許第5,223,409号；WO 92/18619；WO91/17271；WO 92/20791；WO 92/15679；WO 93/01288；WO 92/01047；WO 92/09690；WO 90/02809；Fuchs et al., Bio/Technology 9:1370-1372, 1991；Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85, 1992；Huse et al., Science 246:1275-1281, 1989；Griffiths et al., EMBO J. 12:725-734, 1993に見出すことができる。
【０１１１】
さらに、標準的な組換えDNA技法を用いて作製することのできる、ヒトおよび非ヒト部分を含むキメラおよびヒト化モノクローナル抗体などの組換え抗体も、本明細書において提供する。このようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当技術分野で公知の組換えDNA技法により、例えば、WO 87/02671；欧州特許出願第184,187号；欧州特許出願第171,496号；欧州特許出願第173,494号；WO 86/01533；米国特許第4,816,567号；欧州特許出願第125,023号；Better et al.,  Science, 240:1041-1043, 1988；Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:3439-3443, 1987；Liu et al., J. Immunol., 139:3521-3526, 1987；Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:214-218, 1987；Nishimura et al., Canc. Res., 47:999-1005, 1987；Wood et al., Nature, 314:446-449, 1985；およびShaw et al., J. Natl. Cancer Inst., 80:1553-1559, 1988)；Morrison, Science, 229:1202-1207, 1985；Oi et al., Bio/Techniques, 4:214, 1986；米国特許第5,225,539号；Jones et al., Nature, 321:552-525, 1986；Verhoeyan et al., Science, 239:1534, 1988；およびBeidler et al., J. Immunol., 141:4053-4060, 1988に記載されている方法を用いて作製することができる。。
【０１１２】
完全なヒト抗体が、ヒト患者の治療的処置にとって特に望ましい。そのような抗体は、内因性免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を発現し得ないが、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを用いて作製することができる。トランスジェニックマウスを、選択した抗原、例えばポリペプチドの全体または一部で通常の様式により免疫化する。抗原に対するモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を用いて得ることができる。トランスジェニックマウスが所有するヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、B細胞分化の過程で再編成し、次いでクラススイッチおよび体細胞変異を起こす。したがって、このような技法を用いて、治療上有用なIgG、IgA、およびIgE抗体を作製することが可能である。ヒト抗体を作製するための本技術の総説に関しては、Lonberg and Huszar (Int. Rev. Immunol., 13:65-93, 1995)を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を作製するための本技術、ならびにそのような抗体を作製するための手順の詳細な考察に関しては、例えば、米国特許第5,625,126号；米国特許第5,633,425号；米国特許第5,569,825号；米国特許第5,661,016号；および米国特許第5,545,806号を参照されたい。さらに、Abgenix, Inc.(カリフォルニア州、フリーモント)などの企業が、上記と類似の技術を用いて、選択された抗原に対するヒト抗体の提供を請け負い得る。
【０１１３】
選択されたエピトープを認識する完全なヒト抗体は、「誘導選択」（"guided selection"）と称される技法を用いて作製することができる。このアプローチでは、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス抗体を用いて、同じエピトープを認識する完全なヒト抗体の選択を誘導する。(Jespers et al., Biotechnology, 12:899-903, 1994)。
【０１１４】
グルコース輸送関連ポリペプチドに対する抗体(例えば、モノクローナル抗体)を用いて、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降法などの標準的技法によりポリペプチドを単離することができる。さらに、そのような抗体を用いて、ポリペプチドの発現の存在量およびパターンを評価するために、(例えば、細胞溶解物または細胞上清中で)タンパク質を検出することができる。抗体を診断において使用して、臨床試験法の一部として組織中のタンパク質レベルをモニターすること、例えば所与の治療計画の有効性を決定することもできる。検出は、抗体を検出可能な物質と結合させることにより容易になり得る。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質が含まれる。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれ；適切な補欠分子団複合体の例には、ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンが含まれ；適切な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリトリンが含まれ；発光物質の例にはルミノールが含まれ；生物発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが含まれ、ならびに適切な放射性物質の例には、125I、131I、35S、または3Hが含まれる。
【０１１５】
治療方法および薬学的組成物
グルコース代謝に関連した障害を治療する方法を本明細書において提供する。「治療」は、障害、障害の症状、または障害の素因を治療する、緩和する、軽減する、改変する、緩解させる、和らげる、改善する、またはそれらに影響を及ぼす方法を含む。本方法は、インビボでまたは培養下の細胞において、例えばインビトロもしくはエクスビボで使用することができる。インビボにおける態様では、本方法は対象、例えばヒトまたは動物において実施され、薬剤が細胞におけるポリペプチドの発現または活性を調節するのに有効な条件下で薬剤を対象に投与する段階を含む。
【０１１６】
インビトロでグルコース輸送関連ポリペプチドの発現または活性を調節する薬剤は、動物モデルにおいてインビボでさらに試験する。例えば、グルコース輸送関連ポリペプチドの調節因子であると同定された被験化合物は、肥満または糖尿病の動物モデル(例えばII型糖尿病、例えばJackson Laboratoriesから入手されるob/obマウス(株名：B6.V-Lepob/J)、db/dbマウス；例えば、Sima AAF, Shafrir E. Animal Models in Diabetes: A Primer. Taylor and Francis, Publ Amsterdam, Netherlands, 2000を参照されたい)などの動物で試験する。被験薬剤の投与後の様々な時点において、グルコース輸送関連ポリペプチドの発現もしくは活性のレベル、またはグルコース、耐糖性、および血漿インスリンのレベルをモニターして、被験化合物が対照と比較してグルコース代謝に有益な効果を有するどうか、すなわち被験化合物が高血糖または血漿インスリンレベルの減少をもたらすかどうかを決定する。
【０１１７】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトに使用するために所与の薬剤の適切な投与量を製剤化する際に用いることができる。薬剤の治療有効量は、客観的徴候(例えば、血糖値)の改善により明らかになろうと、疾患の自覚症状の改善により明らかになろうと、所望の病態の1つもしくは複数の症状の進行を遅らせるか、またはその症状を改善する量である。特定の要因が、対象を有効に治療するために必要な投与量およびタイミングに影響し得る(例えば、疾患または障害の重症度、以前の治療、対象の全般的健康および/または年齢、ならびに存在する他の疾患)。
【０１１８】
グルコース輸送関連ポリペプチドの発現または活性の調節に有用な組成物(公知であろうと、本明細書に記載のスクリーニングアッセイによって同定されたのであろうと)は、薬学的組成物に組み入れ、グルコース代謝に関連した(例えば、I型糖尿病、II型糖尿病、または肥満などの、グルコース代謝の脱制御に関連した)障害もしくは状態を有するか、またはそのような障害もしくは状態を発症するリスクがある対象に投与することができる。このような組成物は、グルコース輸送関連ポリペプチドの発現または活性を調節する1つまたは複数の薬剤、および薬学的に許容される担体(例えば、実質的に非毒性である溶媒、分散媒、コーティング、緩衝液、吸収遅延剤など)を含む。補足的な活性化合物を組成物に組み入れることも可能である。
【０１１９】
薬学的組成物は、経口であろうと非経口(例えば、静脈内、皮内、皮下、経粘膜(例えば、吸入用に経鼻スプレーが製剤化される)、または経皮的(例えば、糖技術分野で一般的に知られている局所軟膏(ointment)、軟膏(salve)、ゲル、パッチ、またはクリーム))であろうと、その目的とする投与経路に適合するように製剤化する。組成物は、滅菌希釈剤(例えば、蒸留水または生理食塩水)、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒；ベンジルアルコールもしくはメチルパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの抗菌剤または抗真菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸、クエン酸、またはリン酸などの緩衝剤；および糖(例えば、デキストロース)、多価アルコール(例えば、マンニトールまたはソルビトール)、または塩(例えば、塩化ナトリウム)などの等張剤を含み得る。リポソーム懸濁液(神経抗原に特異的なモノクローナル抗体により罹患細胞を標的とするリポソームを含む)もまた、薬学的に許容される担体として使用することができる(例えば、米国特許第4,522,811号を参照されたい)。組成物の調製物を製剤化し、アンプル、使い捨てシリンジ、または複数用量バイアル中に封入することができる。必要な場合には(例えば、注射製剤などの場合)、例えばレシチンなどのコーティングまたは界面活性剤を用いることにより、適切な流動性を維持することができる。有効成分の吸収は、吸収を遅延させる薬剤を含めることにより延長することができる(例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン)。または、生分解性の生体適合性ポリマー(例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸；Alza Corporation and Nova Pharmaceutical, Inc.)を含み得る植込錠およびマイクロカプセル化送達系により、制御放出が達成され得る。
【０１２０】
経口投与を意図する場合、薬剤は丸剤、カプセル剤、トローチ剤などに含めることができ、以下の成分のいずれかまたは同様の性質の化合物を含み得る：微結晶セルロース、トラガカントゴム、もしくはゼラチンなどの結合剤；デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、プリモゲル(Primogel)、もしくはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロースもしくはサッカリンなどの甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジフレーバーなどの香料添加剤。
【０１２１】
グルコース輸送関連ポリペプチドを調節する薬剤を含む組成物は、投与単位形態（dosage unit form）(すなわち、投与の容易さおよび投与量の均一性のために、所定量の活性化合物を含む物理的に別個の単位)で経口投与または非経口投与用に製剤化することができる。化合物の毒性および治療有効性は、細胞培養または実験動物において標準的な薬学的手順により決定することができる。例えば、LD50(集団の50％に対して致死的である用量)およびED50(集団の50％において治療上有効な用量)、LD50:ED50比である治療指数を決定することができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。薬剤が望ましくない副作用を示す場合には、薬剤が罹患組織部位を標的とするよう注意すべきである(非罹患細胞に対して生じ得る損傷を最小限に抑えて、それにより副作用を軽減するためである)。毒性および治療有効性は、他の標準的な薬学的手順によって決定することもできる。
【０１２２】
上記のように、本明細書に記載の方法に従って同定および投与される薬剤は、小分子(例えば、ペプチド、ペプチド模倣体(例えば、ペプトイド)、アミノ酸残基(またはその類似体)、ポリヌクレオチド(またはその類似体)、ヌクレオチド(またはその類似体)、または有機もしくは無機化合物(例えば、ヘテロ有機化合物または有機金属化合物))であってよい。典型的にそのような分子は、約10,000グラム/モル未満(例えば、約7,500、5,000、2,500、1,000、または500グラム/モル未満)の分子量を有する。これらの化合物のいずれかの塩、エステル、および他の薬学的に許容される形態をアッセイし、所望の活性が検出された場合に、本明細書に記載の治療法に従って投与することができる。例示的な用量には、対象または試料の重量1キログラム当たりミリグラム量またはマイクログラム量の小分子(例えば、約1μg〜500 mg/kg；約100μg〜500 mg/kg；約100μg〜50 mg/kg；10μg〜5 mg/kg；10μg〜0.5 mg/kg；または1μg〜50μg/kg)が含まれる。これらの用量は広範囲をカバーしているが、当業者は、小分子を含む治療剤は効力が異なり、有効量は当技術分野で公知の方法により決定され得ることを理解すると考えられる。典型的には、最初に比較的低用量を投与し、その後、主治医もしくは獣医(治療用途の場合)または研究者(まだ臨床開発段階で研究している場合)が、適切な応答が得られるまで用量を徐々に増加させ得る。さらに、特定の対象に対する明確な用量レベルは、使用する特定の化合物の活性、対象の年齢、体重、全般的健康、性別、および食事、投与時間、投与経路、排出速度、任意の薬物の組み合わせ、ならびに調節しようとする発現または活性の程度を含む様々な要因に依存することが理解される。
【０１２３】
薬学的組成物は、投与のための説明書と共に、容器、パック、またはディスペンサー中に含めることができる。
【０１２４】
本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、この実施例は特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【０１２５】
実施例
実施例1. RNAiスクリーニングを使用した、グルコース輸送に対するインスリン作用を増強または阻害するポリペプチドの同定
3T3-L1脂肪細胞の細胞培養およびsiRNAオリゴヌクレオチドによるエレクトロポレーション
3T3-L1線維芽細胞を、10％ FBS、50μg/mlストレプトマイシン、および50単位/mlペニシリンを添加したDMEMで培養し、記載される通りに脂肪細胞に分化させた(Jiang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:7569-7574, 2003；Guilherme et al., J. Biol. Chem., 279:10593-10605, 2004)。エレクトロポレーションにより、3T3-L1脂肪細胞にsiRNA二重鎖をトランスフェクションした。簡潔に説明すると、分化を開始させてから4日または5日後に、脂肪細胞をPBS中の0.25％トリプシンおよび0.5 mgコラゲナーゼ/mlを用いて培養皿から剥がし、PBSで2回洗浄した。細胞を洗浄し、計数し、9 x 106細胞/mlの密度でPBSに再懸濁した。典型的には、1枚の150 mmディッシュを6種の異なるsiRNA二重鎖でトランスフェクションした。再懸濁した細胞(0.15 ml)を0.2 cmギャップキュベット(Bio-Rad(登録商標))に入れ、Dharmaconから購入した4ナノモルの各SMARTpool(登録商標) siRNA二重鎖と混合した。siRNAオリゴヌクレオチドは、0.09 kVおよび950μF容量に設定したBio-Rad(登録商標) ジーンパルサーIIシステムにより、エレクトロポレーションのパルスによって細胞に送達した。エレクトロポレーション後、細胞を直ちに新鮮な完全DMEM培地1 mlと混合した。次いで、細胞をキュベットから15 ml Falcon(商標)チューブ中のDMEM培地3 mlに移し、混合した。この細胞懸濁液の一定分量(125μl)を、96ウェルプレートのウェルに播種した。各エレクトロポレーションによる細胞を12個のそのようなウェルに拡大して、インキュベーター中に置き、72時間後に2-デオキシグルコースの取り込みを測定した。それぞれの2-デオキシグルコースアッセイについて、細胞にはまた、対照としてのscrambled(6ナノモル)、Akt1およびAkt2(4および6ナノモル)、ならびにPTEN(6ナノモル)のsiRNAをエレクトロポレーションした。各96ウェルプレートは、これら3つの対照のそれぞれを12ウェル分含んだ。
【０１２６】
2-デオキシグルコース取り込みアッセイ
3T3-L1脂肪細胞におけるインスリン刺激性グルコース輸送を、記載されている通りに2-デオキシグルコースの取り込みを測定することによって評価した(Guilherme et al., J Biol Chem, 279:10593-10605, 2004)。簡潔に説明すると、siRNAをトランスフェクションした細胞を96ウェルプレートに再播種して72時間培養し、2回洗浄して、0.5％ BSAおよび2 mmピルビン酸ナトリウムを添加したクレブス・リンゲルHepes緩衝液(130 mM NaCl、5 mM KCl、1.3 mM CaCl2、1.3 mM MgSO4、25 mM Hepes、pH 7.4)で血清を2時間欠乏させた。次いで、細胞をインスリンで37℃で30分間刺激した。グルコースの取り込みは、[1,2-3H]2-デオキシ-D-グルコースを最終アッセイ濃度500μMになるように添加することによって開始させた。細胞を37℃で5分間インキュベートした。アッセイは、氷冷クレブス・リンゲルHepes緩衝液で3回洗浄することにより停止した。簡潔に説明すると、プレートを、氷冷クレブス・リンゲルHepes緩衝液600 mlを含む容器中に浸漬した。各浸漬後に、束にしたペーパータオル上でプレートを軽くたたくことにより、ウェル中の液体を除去した。次いで、ウェル当たり0.05 mlの1％ SDSを添加することにより、細胞を可溶化した。[3H]の取り込みを、マイクロプレートシンチレーションカウント装置を用いて定量した。20μMサイトカラシンBの存在下でインキュベートした試料中の非特異的デオキシグルコース取り込みを決定し、この対照から得られた値を各実験測定値から減算することにより、特異的取り込みを測定した。
【０１２７】
約500種の異なる遺伝子に対する阻害的低分子RNAを取得し、脂肪細胞にトランスフェクションし、上記のデオキシグルコースの取り込みアッセイ法で試験した。siRNAのトランスフェクションによりノックダウンした場合、多くの遺伝子は、対照と比較してグルコースの取り込みの増加または減少をもたらした。上記表1に列挙した遺伝子を標的とするRNAは、グルコース取り込みを強く増加させた。表2に列挙した遺伝子を標的とするRNAは、グルコース取り込みを強く減少させた。
【０１２８】
実施例2. グルコース輸送に対するインスリン作用を増強または阻害するポリペプチドの検証
siRNAに基づく遺伝子サイレンシングが脂肪細胞においてインスリン刺激性2-デオキシグルコース取り込みを増強したことを確認するため、さらなる実験を行い、インスリン誘導性Aktリン酸化に対する各siRNAの効果を判定するウェスタンブロットアッセイにおいて、スクリーニングによって同定された標的を独立して再試験する。Aktは、インスリンシグナル伝達を媒介することが示されている(Jiang et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 100:7569-7574, 2003；およびそこに引用されている参考文献を参照されたい)。セリン473におけるAktのリン酸化は、活性化の指標となる。
【０１２９】
siRNAをエレクトロポレーションした3T3-L1脂肪細胞を、無血清DMEM培地中で一晩枯渇させる。次いで、インスリンなしでまたは様々な濃度(1、10、100 nM)のインスリンと共に細胞を30分間インキュベートし、1％SDSを含む溶解緩衝液で回収する。タンパク質濃度を定量し、各溶解液試料からの同等量のタンパク質をSDS-PAGEにより分離し、ニトロセルロース膜に転写する。膜を抗体と共に4℃で一晩インキュベートし、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体と共に室温で45分間インキュベートする。次いで、高感度化学発光キットでタンパク質を検出する。
【０１３０】
Aktのセリン473のリン酸化に対する(スクランブルされたsiRNAと比較した)各siRNAの効果を、ウェスタンブロットによって解析する。各siRNAの存在下でのGLUT4発現の調節もまた検討する。Aktリン酸化および/またはGLUT4発現の増加を引き起こすsiRNAは、siRNAが標的とする遺伝子がグルコース輸送の負の制御因子をコードすることを示す。グルコース輸送の負の制御因子の阻害は、例えばII型糖尿病などインスリンシグナル伝達が制御できない障害の治療において有益であり得る。Aktリン酸化および/またはGLUT4発現に対する効果の欠如は、特定のsiRNAが標的とする遺伝子がグルコース輸送を制御しないことを必ずしも示すものではない。グルコース輸送の制御因子はまた、GLUT4触媒活性、原形質膜へのGLUT4の移行に影響を及ぼす可能性もあり、またはGLUTlおよびGLUT3など他のグルコース輸送体に影響を及ぼす可能性もある。例えば脂肪細胞または筋肉細胞の細胞表面のグルコース輸送体タンパク質の量を測定するアッセイ法を実施することによって、これらの効果を判定することができる。
【０１３１】
実施例3. 動物モデルにおける薬剤の評価
グルコース輸送関連ポリペプチドもしくはそのポリペプチドをコードする核酸の発現または活性をインビトロで調節する薬剤は、動物モデルにおいてインビボでさらに試験する。例えば、scrambled siRNAまたは表1に列挙される1つもしくは複数の遺伝子を標的とするsiRNAを、以前に記載されている通りにハイドロダイナミック注射によりob/obマウスに投与する(McCaffrey, Nature, 418:38-39, 2002；米国特許出願公開第20030153519号も参照されたい)。ob/obマウスは、Jackson Laboratoriesから入手することができる(株名：B6.V-Lepob/J)。siRNAの投与後の様々な時点で、表1の標的のmRNAレベルを測定する。さらに、siRNAを標識して、当技術分野で公知の方法により追跡することもできる。また、グルコース、耐糖性、および血漿インスリンのレベルをモニターして、siRNAが対照と比較してグルコース代謝に有益な効果を有するどうか、すなわちsiRNAが高血糖または血漿インスリンレベルの減少をもたらすかどうかを決定することができる。
【０１３２】
1つの態様においては、cdk7を標的とするsiRNAを設計し、作製する。簡潔に説明すると、例えば米国特許出願公開第20040198682号に記載されているように、cdk7遺伝子配列内の特定の長さ(例えば、23ヌクレオチド)の断片を同定する。40〜60％のGC含量およびより弱い内部折り畳み構造(コンピュータ解析によって決定される)を含む断片を含む断片が好ましい。強力なヘアピンおよび3つもしくはそれ以上のCまたはGの連続を含む断片は回避する。4つまたは5つの標的断片を選択し、siRNA二重鎖として合成し、インビトロでスクリーニングして最も活性の高いsiRNAを同定する。
【０１３３】
次に、選択されたcdk7 siRNAをob/obマウスにおいてインビボで試験する。ハイドロダイナミック注射を行うため、各ob/obマウスに、PBS 1.8 mL中の選択されたcdk7 siRNA 40マイクログラムを投与する。siRNA/PBS溶液は、尾静脈から4〜5秒間かけて注射する。注射の24時間、48時間、72時間、または4日後に、組織におけるcdk7 RNAおよび/またはタンパク質レベルを調べることにより、cdk7の発現レベルを決定する。各動物における処置後1〜3日目の血漿グルコースレベルも測定し、対照と比較する(例えば、siRNA処置前のグルコースレベル、ならびにPBSおよびscrambled siRNAで処置した動物におけるグルコースレベル)。高血糖を減少させるcdk7 siRNAは、糖尿病および肥満などのグルコース輸送関連障害の治療において有用であり得る。
【０１３４】
他の態様
本発明の多くの態様を説明してきた。しかしながら、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更がなされ得ることが理解されよう。したがって、他の態様も特許請求の範囲の範囲内である。
【国際調査報告】
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