(57)【要約】各々のドメインが機能性タンパク質をコードし、各々のドメインがリンカーペプチドをコードするリンカー（L）セグメントによって線状配列内の次のドメインに連結されている、2〜8個のドメインセグメントDを含むポリヌクレオチドから本質的になり、DおよびLセグメントがすべて同じリーディングフレーム内にあり、ならびにドメインの少なくとも1個が2型プロテアーゼ阻害剤ではない、多重遺伝子発現媒体（MGEV）を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
2〜8個のドメインセグメントDを含むポリヌクレオチドから本質的になる多重遺伝子発現媒体（MGEV）であって、各々のドメインが機能性タンパク質をコードし、各々のドメインがリンカーペプチドをコードするリンカー（L）セグメントによって線状配列内の次のドメインに連結されており、DおよびLセグメントがすべて同じリーディングフレーム内にあり、ならびにドメインの少なくとも1個が2型プロテアーゼ阻害剤ではない、MGEV。
【請求項２】
各々のリンカーが配列番号：17の配列を有する、請求項1記載のMGEV。
【請求項３】
機能性タンパク質のN末端にシグナルペプチド（S）をコードするセグメントをさらに含む、請求項1記載のMGEV。
【請求項４】
液胞標的シグナルペプチドVをコードするセグメントをさらに含む、請求項3記載のMGEV。
【請求項５】
N末端クラスプペプチドをコードするセグメントCNおよびC末端クラスプペプチドをコードするセグメントCCをさらに含み、N末端クラスプペプチドとC末端クラスプペプチドが翻訳後にジスルフィド結合によって相互に連結されてプロテアーゼ阻害剤活性を有する1個のタンパク質を形成する、請求項2記載のMGEV。
【請求項６】
DおよびLをコードするセグメントが（DkLj）と指定される翻訳順序で連結されており、kは1からkまで番号づけられる各々のドメインについての序数であり、kは2〜8の範囲内であり、jは1からk-1まで番号づけられる各々のリンカーについての序数である、請求項2記載のMGEV。
【請求項７】
CN、D、L、およびCCセグメントがCN-Lj-Dk-Lk＋1-CCと指定される翻訳順序で連結されており、kは1からkまで番号づけられる各々のドメインについての序数であり、kは2〜7の範囲内であり、jは1からk＋1まで番号づけられる各々のリンカーについての序数である、請求項5記載のMGEV。
【請求項８】
S-Dk-Ljの順で組み合わされているシグナルペプチドをコードするコードセグメントSをさらに含む、請求項6記載のMGEV。
【請求項９】
S-CN-Lj-Dk-Lk＋1-CCの順で組み合わされているシグナルペプチドをコードするコードセグメントSをさらに含む、請求項7記載のMGEV。
【請求項１０】
コードセグメントVをさらに含み、Vが、D1〜Dkのいずれかをコードするセグメントのいずれかの末端でD1〜Dkのいずれかのコードセグメントと組み合わされている、請求項6記載のMGEV。
【請求項１１】
コードセグメントVをさらに含み、Vが、D1〜Dk＋1、CN、またはCCのいずれかをコードするセグメントのいずれかの末端でD1〜Dk＋1、CN、またはCCのいずれかのコードセグメントと組み合わされている、請求項7記載のMGEV。
【請求項１２】
液胞輸送ペプチドをコードするコードセグメントVをさらに含み、Vが、Dk、CN、またはCCのいずれかをコードするセグメントのいずれかの末端でDkのいずれかと組み合わされている、請求項7記載のMGEV。
【請求項１３】
請求項6または7記載のMGEVを担持し複製する植物形質転換ベクターを含むMGEV発現ベクターであって、該MGEVが、植物活性プロモーターおよび植物活性ターミネーターの発現制御下にあるベクター内の遺伝子座に挿入されている、MGEV発現ベクター。
【請求項１４】
請求項6または7記載のMGEVによってコードされるタンパク質を含み発現する植物細胞。
【請求項１５】
請求項6または7記載のMGEVによって形質転換され、同時に該MGEVによってコードされるタンパク質を発現する、トランスジェニック植物。
【請求項１６】
以下の翻訳順序でセグメントを有する、請求項11記載の多重遺伝子発現媒体（MGEV）：
S-CN-L1-D1-L2-D2-L3-D3-L4-CC-V
ここで、Sはシグナルペプチドをコードし、
CNはN末端クラスプペプチドをコードし、
CCはC末端クラスプペプチドであり、
L1、L2、L3、L4は各々リンカーペプチドをコードし、
D1は2型トリプシン阻害剤をコードし、
D2はPot 1Aをコードし、
D3は2型キモトリプシン阻害剤をコードし、および
Vは液胞標的ペプチドをコードする。
【請求項１７】
植物活性プロモーターの発現制御下に請求項16記載のMGEVを含むMGEV発現ベクター。
【請求項１８】
以下の翻訳順序でコードセグメントを有する請求項10記載のMGEV：
S-D1-L1-D2-L2-D3-V
ここで、Sはシグナルペプチドをコードし、
D1は2型トリプシン阻害剤をコードし、
D2はPot 1Aをコードし、
D3は2型キモトリプシン阻害剤をコードし、
L1およびL2はリンカーペプチドをコードし、
Vは液胞標的ペプチドをコードする。
【請求項１９】
植物活性プロモーターの発現制御下に請求項18記載のMGEVを含むMGEV発現ベクター。
【請求項２０】
以下の翻訳順序でコードセグメントを有する請求項11記載のMGEV：
S-CN-L1-D1-L2-D2-L3-D3-L4-CC-V
ここで、Sはシグナルペプチドをコードし、
CNはN末端クラスプペプチドをコードし、
L1、L2、L3、およびL4は各々リンカーペプチドをコードし、
D1は2型トリプシン阻害剤をコードし、
D2はPot 1Aをコードし、
D3は2型キモトリプシン阻害剤をコードし、
Vは液胞標的ペプチドをコードする。
【請求項２１】
植物活性プロモーターの発現制御下に請求項20記載のMGEVを含むMGEV発現ベクター。
【請求項２２】
以下の翻訳順序でコードセグメントを有する請求項11記載のMGEV：
S-CN-L1-D1-L2-D2-L3-D3-L4-CC-V
ここで、Sはシグナルペプチドをコードし、
CNはN末端クラスプペプチドをコードし、
L1、L2、L3、およびL4は各々リンカーペプチドをコードし、
D1は2型トリプシン阻害剤をコードし、
D2は緑色蛍光タンパク質をコードし、
D3は2型キモトリプシン阻害剤をコードし、
CCはC末端クラスプペプチドをコードし、ならびに
Vは液胞標的ペプチドをコードする。
【請求項２３】
植物活性プロモーターの発現制御下に請求項22記載のMGEVを含むMGEV発現ベクター。
【請求項２４】
以下の翻訳順序でコードセグメントを有する請求項11記載のMGEV：
S-CN-L1-D1-L2-D2-L3-D3-L4-D4-L5-D5-L6-CC-V
ここで、Sはシグナルペプチドをコードし、
CNはN末端クラスプペプチドをコードし、
L1、L2、L3、L4、L5、およびL6は各々リンカーペプチドをコードし、
D1は2型トリプシン阻害剤をコードし、
D2は植物デフェンシンをコードし、
D3およびD4は各々Pot 1Aをコードし、
D5は2型キモトリプシン阻害剤をコードし、
CCはC末端クラスプペプチドをコードし、ならびに
Vは液胞標的ペプチドをコードする。
【請求項２５】
植物活性プロモーターの発現制御下に請求項24記載のMGEVを含むMGEV発現ベクター。
【請求項２６】
以下の翻訳順序でコードセグメントを有する請求項9記載のMGEV：
S-CN-L1-D1-L2-D2-L3-D3-L4-CC
ここで、Sはシグナルペプチドをコードし、
CNはクラスプペプチドをコードし、
D1は2型トリプシン阻害剤をコードし、
D2は緑色蛍光タンパク質をコードし、
D3は2型キモトリプシン阻害剤をコードし、
CCはクラスプペプチドをコードし、ならびに
L1、L2、L3、およびL4は各々リンカーペプチドをコードする。
【請求項２７】
植物活性プロモーターの発現制御下に請求項26記載のMGEVを含む植物形質転換ベクター。
【請求項２８】
以下の翻訳順序でコードセグメントを有する請求項11記載のMGEV：
S-CN-L1-D1-L2-D2-L3-D3-L4-CC-V
ここで、Sはシグナルペプチドをコードし、
CNはクラスプペプチドをコードし、
D1は2型トリプシン阻害剤をコードし、
D2はC末端プロペプチドを有するデフェンシンをコードし、
D3は2型キモトリプシン阻害剤をコードし、
CCはクラスプペプチドをコードし、
L1、L2、L3、およびL4は各々リンカーペプチドをコードし、ならびに
Vは液胞標的ペプチドをコードする。
【請求項２９】
植物活性プロモーターの発現制御下に請求項28記載のMGEVを含むMGEV発現ベクター。
【請求項３０】
以下の翻訳順序でコードセグメントを有する請求項11記載のMGEV：
S-CN-L1-D1-L2-D2-L3-D3-L4-D4-L5-CC-V
ここで、Sはシグナルペプチドをコードし、ならびに
CNはクラスプペプチドをコードし、ならびに
D1は2型トリプシン阻害剤をコードし、ならびに
D2およびD3は各々Pot 1Aをコードし、ならびに
D4はキモトリプシン阻害剤をコードし、ならびに
CCはキモトリプシン阻害剤をコードし、ならびに
L1、L2、L3、L4、およびL5は各々リンカーペプチドをコードし、ならびに
Vは液胞標的ペプチドをコードする。
【請求項３１】
植物活性プロモーターの発現制御下に請求項30記載のMGEVを含む植物形質転換ベクター。
【請求項３２】
以下の翻訳順序でコードセグメントを有する請求項11記載のMGEV：
S-CN-L1-D1-L2-D2-L3-D3-L4-D4-L5-CC-V
ここで、Sはシグナルペプチドをコードし、
CNはN末端クラスプペプチドをコードし、
L1、L2、L3、L4、およびL5は各々リンカーペプチドをコードし、
CCはC末端クラスプペプチドをコードし、
Vは液胞標的ペプチドをコードし、
D1は2型トリプシン阻害剤をコードし、
D2は第一の植物デフェンシンをコードし、
D3は第二の植物デフェンシンをコードし、ならびに
D4は2型キモトリプシン阻害剤をコードする。
【請求項３３】
植物活性プロモーターの発現制御下に請求項32記載のMGEVを含むMGEV発現ベクター。
【請求項３４】
以下の翻訳順序でコードセグメントを有する請求項10記載のMGEV：
S-D1-L1-D2-L2-D3-L3-D4-V
ここで、Sはシグナルペプチドをコードし、
D1は2型トリプシン阻害剤をコードし、
D2およびD3は各々Pot 1Aをコードし、
D4は2型キモトリプシン阻害剤をコードし、
Vは液胞標的ペプチドをコードし、ならびに
L1、L2、およびL3は各々リンカーペプチドをコードする。
【請求項３５】
植物活性プロモーターの発現制御下に請求項34記載のMGEVを含むMGEV発現ベクター。
【請求項３６】
以下の翻訳順序でコードセグメントを有する請求項10記載のMGEV：
S-D1-L1-D2-L2-D3-V
ここで、Sはシグナルペプチドをコードし、
D1は2型トリプシン阻害剤をコードし、
D2は第一の植物デフェンシンをコードし、
D3は2型キモトリプシン阻害剤をコードし、
Vは液胞標的ペプチドをコードし、ならびに
L1およびL2は各々リンカーペプチドをコードする。
【請求項３７】
植物活性プロモーターの発現制御下に請求項36記載のMGEVを含むMGEV発現ベクター。
【請求項３８】
以下の翻訳順序でコードセグメントを有する請求項8記載のMGEV：
S-D1-L1-D2
ここで、Sはシグナルペプチドをコードし、
L1はリンカーペプチドをコードし、
D1およびD2は各々ジャガイモ1型プロテイナーゼ阻害剤をコードする。
【請求項３９】
植物活性プロモーターの発現制御下に請求項38記載のMGEVを含むMGEV発現ベクター。
【請求項４０】
以下の翻訳順序でコードセグメントを有する請求項10記載のMGEV：
S-D1-L1-D2-V
ここで、Sはシグナルペプチドをコードし、
L1はリンカーペプチドをコードし、
D1は2型トリプシン阻害剤をコードし、
D2は植物デフェンシンをコードし、および
Vは液胞標的ペプチドをコードする。
【請求項４１】
植物活性プロモーターの発現制御下に請求項40記載のMGEVを含むMGEV発現ベクター。
【請求項４２】
以下の翻訳順序でコードセグメントを有する請求項10記載のMGEV：
S-D1-L1-D2-V
ここで、Sはシグナルペプチドをコードし、
L1はリンカーペプチドをコードし、
Vは液胞標的ペプチドをコードし、
D1は第一の植物デフェンシンをコードし、および
D2は第二の植物デフェンシンをコードする。
【請求項４３】
植物活性プロモーターの発現制御下に請求項42記載のMGEVを含むMGEV発現ベクター。
【請求項４４】
以下の翻訳順序でコードセグメントを有する請求項10記載のMGEV：
S-D1-L1-D2
ここで、Sはシグナルペプチドをコードし、
L1はリンカーペプチドをコードし、
D1は第一の植物デフェンシンをコードし、および
D2は第二の植物デフェンシンをコードする。
【請求項４５】
植物活性プロモーターの発現制御下に請求項44記載のMGEVを含むMGEV発現ベクター。
【請求項４６】
以下の翻訳順序でコードセグメントを有する請求項10記載のMGEV：
S-D1-L1-D2-L2-D3-V
ここで、Sはシグナルペプチドをコードし、
Vは液胞標的ペプチドをコードし、
L1およびL2は各々リンカーペプチドをコードし、
D1は2型トリプシン阻害剤をコードし、
D2はβ-グルクロニダーゼをコードし、ならびに
D3は2型キモトリプシン阻害剤をコードする。
【請求項４７】
植物活性プロモーターの発現制御下に請求項46記載のMGEVを含む植物形質転換ベクター。
【請求項４８】
MGEV 5、MGEV 8、MGEV 6、MGEV 7、MGEV 9、MGEV 10、MGEV 11、MGEV 12、MGEV 13、MGEV 14、MGEV 15、MGEV 16、MGEV 17、MGEV 18、MGEV 19、MGEV 20からなるMGEVの群より選択される、請求項4記載のMGEV。
【請求項４９】
MGEV 5、MGEV 6、MGEV 7、MGEV 9、MGEV 10、MGEV 11、MGEV 12、MGEV 13からなるMGEVの群より選択される、請求項5記載のMGEV。
【請求項５０】
pHEX 29、pHEX 56、pHEX 31、pHEX 46、pHEX 55、pHEX 45、pHEX 42、pHEX 33、pHEX 39、pHEX 48、pHEX 47、pHEX 35、pHEX 41、pHEX 52、pHEX 51、pHEX 58からなるMGEV発現ベクターの群より選択されるMGEV発現ベクター。
【請求項５１】
以下の工程を含む、植物細胞において2〜8個の所望のタンパク質を同時に発現させる方法：
a. 各々のドメインが機能性タンパク質をコードする、2〜8個のドメインセグメントDkを含むポリヌクレオチドセグメントから本質的になる多重遺伝子発現媒体（MGEV）であって、少なくとも1個のそのようなタンパク質は2型プロテアーゼ阻害剤ではなく、各々のドメインは配列番号：17の配列を有するリンカーペプチドをコードするリンカーセグメントLによって線状配列内の次のドメインに連結されており、DおよびLコードセグメントはすべてDkLjと指定される翻訳順序で同じリーディングフレーム内で連結されており、kは1からkまで番号づけられる各々のドメインについての序数であり、kは2〜8の範囲内であり、jは1からk-1まで番号づけられる各々のリンカーについての序数である、MGEVを構築する工程、
b. 植物活性プロモーターおよび植物活性ターミネーターの発現制御下にあるベクター内の遺伝子座でMGEVを植物形質転換ベクターと組合せる工程であって、それによってMGEV発現ベクターを提供する工程、ならびに
c. MGEV発現ベクターで植物細胞を形質転換する工程であって、それによってMGEV形質転換細胞を提供する工程、ならびに
d. MGEV形質転換細胞およびその子孫を該細胞内での遺伝子発現に適した条件下に保持する工程であって、それによってMGEV形質転換細胞内でコードされる遺伝子を同時に発現させる工程。
【請求項５２】
タンパク質D1〜kが、2型トリプシン阻害剤、2型キモトリプシン阻害剤、Pot Iプロテアーゼ阻害剤、デフェンシン、C末端プロペプチドを有するデフェンシン、緑色蛍光タンパク質、および指標酵素からなるタンパク質の群より個別に選択される、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
MGEV発現ベクターが、pHEX 56、pHEX 48、pHEX 47、pHEX 17、pHEX 18、pHEX 19、pHEX 20からなるMGEV発現ベクターの群より選択される、請求項52記載の方法。
【請求項５４】
MGEV形質転換細胞から成体トランスジェニック植物を再生する工程をさらに含む、請求項52記載の方法。
【請求項５５】
成体形質転換植物が、ワタ、ダイズ、トウモロコシ、およびイネからなる植物の群より選択される、請求項54記載の方法。
【請求項５６】
以下の工程を含む、植物細胞において3〜8個のタンパク質を同時に発現させる方法：
a. 各々のドメインが機能性タンパク質をコードする、3〜8個のドメインセグメントDkを含むポリヌクレオチドセグメントから本質的になる多重遺伝子発現媒体（MGEV）であって、少なくとも1個のそのようなタンパク質は2型プロテアーゼ阻害剤ではなく、各々のドメインは配列番号：17の配列を有するリンカーペプチドをコードするリンカーセグメントLによって線状配列内の次のドメインに連結されており、DおよびLコードセグメントはすべてCN-Lj-Dk-Lk＋1-CCと指定される翻訳順序で同じリーディングフレーム内で連結されており、kは1からkまで番号づけられる各々のドメインについての序数であり、kは3〜7の範囲内であり、jは1からk＋1まで番号づけられる各々のリンカーについての序数である、MGEVを構築する工程、
b. 植物活性プロモーターおよび植物活性ターミネーターの発現制御下にあるベクター内の遺伝子座でMGEVを植物形質転換ベクターと組合せる工程であって、それによってMGEV発現ベクターを提供する工程、ならびに
c. MGEV発現ベクターで植物細胞を形質転換する工程であって、それによってMGEV形質転換細胞を提供する工程、ならびに
d. MGEV形質転換細胞およびその子孫を該細胞内での遺伝子発現に適した条件下に保持する工程であって、それによってMGEV導入細胞内でコードされる遺伝子を同時に発現させる工程。
【請求項５７】
pHEX 10、pHEX 29、pHEX 31、pHEX 46、pHEX 55、pHEX 45、pHEX 42、pHEX 33、およびpHEX 39からなる植物形質転換ベクターの群より選択される植物形質転換ベクター。
【請求項５８】
MGEV形質転換細胞から成体トランスジェニック植物を再生する工程をさらに含む、請求項56記載の方法。
【請求項５９】
成体形質転換植物が、ワタ、ダイズ、トウモロコシ、およびイネからなる植物の群より選択される、請求項56記載の方法。
【請求項６０】
請求項2記載のMGEVで植物細胞を形質転換する工程を含み、該MGEVが1個のプロモーターの発現制御下にある、植物細胞において2〜8個のタンパク質を同時に発現させる方法。
【請求項６１】
リンカーが配列番号：5の配列を有する、請求項60記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
ジャガイモ2型阻害剤は、多くのナス科（Solanaceous）植物において認められるセリンプロテイナーゼ阻害剤のファミリーである。該阻害剤は、記述された最初の成員がジャガイモおよびトマト植物から単離されたためにこのように命名されている［Bryant, J. et al. (1976) Biochemistry 15:3418-3424；Plunkett, G. et al. (1982) Arch. Biochem. Biophys. 213:463-472］。該阻害剤はしばしば、各々のドメインが約6kDaであり、キモトリプシンまたはトリプシンのいずれかに対する反応性部位を有する2個の反復ドメインからなる。これらの2ドメイン阻害剤は、トマト果実およびジャガイモ塊茎、ならびに機械的外傷または昆虫損傷後に両植物の葉において発現されるPin2遺伝子ファミリーと呼ばれる遺伝子によってコードされる［Graham, JS, et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:6561-6564；Keil, M. et al. (1986) Nuc. Acids Res. 14:5641-5650；Thornberg, RW, et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:744-748］。この遺伝子ファミリーのいくつかの成員はジャガイモおよびトマトからクローニングされており、大部分が記述されている元の成員と同じ2ドメイン構造を有する［Sanchez-Serrano, J. et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 203:15-20；Thornberg、前記］。
【０００２】
ジャガイモ2型阻害剤を本明細書において単に「2型」阻害剤と称する。2型阻害剤は、Pin2として公知の遺伝子のファミリーによってコードされる構造的に関連するタンパク質である。少なくとも11個の相同なPin2遺伝子が単子葉および双子葉植物の両方において認められている。Pin 2遺伝子は、1個の6kDaプロテイナーゼ阻害剤(PI)ドメイン、ジャガイモとトマトに共通するもののような2個の6kDa PIドメインまたは、しばしば循環的に置換されたトリプシンもしくはキモトリプシンを阻害するいくつかの高度に相同な反復6kDaドメインのいずれかをコードし得る。配列のカタログおよび構造関係の考察については、Barta et al.,(2002) Trends in Genetics 18:600-603参照。配列は、http://www.ba.itb.cnr.it/Plant-PIsにおいてアクセス可能なデータベースに蓄積されている(DeLeo, F. et al., (2002) Nucl. Acid Res. 30:347-348も参照のこと)。
【０００３】
2ドメインの12kDa阻害剤に加えて、ジャガイモはまた、2ドメインタンパク質の中央部分と配列が同一であり、タンパク質分解産物である可能性が高い[Sanchez-Serrano前記]より低レベルの約6kDaの一連の1ドメイン阻害剤も含む［Hass, GM, et al. (1982) Biochemistry 21:752-756]。類似の1ドメインプロテイナーゼ阻害剤 (PI)がナス[Richardson, M. (1979) FEBS. Lett. 104:322-326]およびタバコ [Pearce, G. et al. (1993) Plant Physiol. 102:639-644] から単離されたが、それらがより大きな前駆体分子に由来するかどうかは不明である。トマトおよびタバコのいずれもが、3ドメイン阻害剤をコードする遺伝子を含み [Taylor, BH, et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23:10 05-1014；Baladin, R. et al. (1995) Plant Mol. Biol. 27:1197-1204]、6ドメイン阻害剤(NaPI-ii)をコードする遺伝子が、観賞用タバコであるニコチアナ・アラタ（Nicotiana alata）の生殖組織から単離された [Atkinson, AH, et al. (1993) Plant Cell 5:203-213]。
【０００４】
NaPI-ii（配列番号：1）は、2個がキモトリプシンに対して反応性であり、4個がトリプシンに対して反応性である6個の阻害ドメインを含む40.3kDa前駆体タンパク質をコードする[Atkinson前記]。前駆体タンパク質のタンパク質分解プロセシングは、6個の成熟活性阻害剤の放出を生じさせるドメインの間のリンカー領域で起こる[Heath, RL, et al. (1995) Eur. J. Biochem. 230:250-257；Lee, MCS, et al. (1999) Nature Struct. Biol. 6:526-530]。プロテイナーゼ阻害ドメインに加えて、前駆体はまた、N末端の推定上のERシグナルペプチドおよびおそらく液胞ソーティングシグナルとして機能するC末端非反復ドメインを有する[Miller, EA, et al, (1999) Plant Cell 11:1499-1508；Nielsen, KJ, et al. (1996) Biochemistry 35:369-378]。以前に本発明者らは、未成熟柱頭が、NaPI-ii cDNAにハイブリダイズする2個のmRNAを発現することを示した [Atkinson前記]。1.4kbの1つのメッセージが6ドメイン阻害剤に対応し、約1.0kbの2番目のメッセージがより小さなアイソフォームをコードする。
【０００５】
NaPI-ivと称される4個の反復プロテイナーゼ阻害剤ドメインを有する第二の2型PIプロテイナーゼ前駆体がN.アラタ柱頭から単離された [Miller, EA, et al. (2000) Plant Mol. Biol. 42:329-333](配列番号：2)。NaPI-iiおよびNaPI-ivのアミノ酸配列は、2個のタンパク質間の高レベルの同一性を明らかにするように整列される（図1参照）。1個のアミノ酸変化が、予測されるシグナルペプチド内に存在する。第二の保存的アミノ酸変化がNaPI-ii内のT1(配列番号：3)と称される第二の反復配列内に存在する。したがって、NaPI-iv内の第二の反復配列はT5(配列番号：4)と称された。NaPI-iiおよびNaPI-ivの機能性ドメインの間の関係を図2に図解する。NaPI-ii とアミノ酸配列が同一であるC末端非反復ドメイン(CTPP)が、NaPI-iv(配列番号：1、アミノ酸374〜397、配列番号：2、アミノ酸268〜281)に関して認められる。
【０００６】
NaPI-iiをコードするcDNAのヌクレオチド配列は、本明細書と矛盾しない限り、参照により本明細書に組み入れられる、国際公開公報第94/138810号、その配列番号：1に開示されている。NaPI-iv cDNA配列、配列番号：2、GenBankアクセッション番号AF105340は、図1に示す2つの保存的アミノ酸変化を生じさせる2つの変更および翻訳されたアミノ酸配列に影響を及ぼさないいくつかのサイレント変化を除き、本質的にNaPI-iiのものである。
【０００７】
NaPI-iiおよびNaPI-ivの両方の発現は、指定されるトリプシン（T）またはキモトリプシン（C）阻害活性を有する個々の成熟6kDaプロテイナーゼ阻害剤(PI)タンパク質を生成するように翻訳後プロセシングされるタンパク質を生じさせる。翻訳後グリコシル化は、植物細胞における発現後には認められなかった。プロセシングされない前駆体PIはCTPPを保持し、細胞の液胞の外側に位置する。ひとたび前駆体タンパク質が液胞内に沈着すれば、C末端ドメインが速やかに取り除かれ、個々の6kDa PIを生成するプロセシングが起こる［Miller (1999) 前記]。
【０００８】
NaPI-ii前駆体PIは、C2N(配列番号：1または2、アミノ酸31〜53)およびC2C(配列番号：1、アミノ酸344〜373、配列番号：2、アミノ酸228〜2587)ドメイン内のcys残基の間でのジスルフィド結合の形成によって環状構造をとることが示された [Lee (1999)前記]。前駆体の環化とそれに続く翻訳後タンパク質分解から生じる産物は、キモトリプシン阻害剤活性を有するユニークなヘテロ二量体PI (C2)である。
【０００９】
2型ファミリーの他の成員と同様に、N.アラタPIはいくつかの昆虫種の消化プロテアーゼを阻害し[Heath, RL, et al. (1997) J. Insect Physiol. 43:833-842]、おそらく害虫による花組織および葉への損傷を制限するように機能する。PIは、人工飼料に組み込まれたときまたはトランスジェニックタバコの葉において発現されたとき、ヘリコベルパ・プンクチゲラ（Helicoverpa punctigera）幼虫の成長と発育を有意に遅滞させる[Heath (1997)前記]。
【００１０】
単一トランスジェニック植物において1つより多い導入遺伝子を発現させるために様々な戦略がとられてきた。1つの手法は、個々の親植物を各々1個の導入遺伝子で形質転換し、その後親を交配することによって単一植物において導入遺伝子を組み合わせることであった [Zhu, Q. et al. (1994)Bio/Technology 12:807-812；Bizily, SP, et al. (2000) Nat. Biotechnol. 18:213-217]。個々の導入遺伝子が異なる遺伝子座で組み換えられる場合、交配は複雑であり得る。この方法は栄養繁殖する植物には適用できない。
【００１１】
連続的な単一遺伝子形質転換が実施されてきたが、各形質転換工程についての選択マーカーの使用可能性が限られているため、その実際的な価値は限定されている。
【００１２】
同じプロモーターのそれ自体のコピーによって各々別々に制御される同じベクター上で連結された複数の導入遺伝子の使用は、予想外の転写サイレンシング [Matzke, AJM, et al. (1998) Curr. Opin. Plant Biol. 1:142-148]または一様でない発現 [Van der Elzen, PJM, et al. (1993) Phil. Trans. R. Soc. Land. B 342:271-278]を生じさせた。複数の連結された導入遺伝子を駆動するための異なる個別プロモーターの使用は、実行可能であると思われるが、おそらく各プロモーターの個々の特徴の影響を受けやすい。
【００１３】
一部の研究者は、ポリタンパク質を発現させ、その後シスでの特異的プロテアーゼ切断によって個々のタンパク質を放出させるためのウイルス系の適応を報告した（たとえばMarcos, JF, et al. (1994) Plant Mol. Biol. 24:495-503；Beck von Bodman, S. et al. (1995) Bio/technology 13:587-591参照）。該系は、ポリタンパク質を切断するためにウイルスプロテアーゼを導入する必要があり、導入されたプロテアーゼの望ましくない副作用の可能性を伴う。
【００１４】
Urwin, PE, et al. (1998) Planta 204:472-479は、シロイヌナズナ（Arabidopsis）において発現させた、エンドウ（Pisum sativum）からのプロテアーゼ感受性プロペプチドによって連結された二重プロテイナーゼ阻害剤構築物を述べた。発現されたポリタンパク質の部分切断だけが報告された。口蹄疫ウイルスからの、2Aと称される20アミノ酸長の連結配列を使用して、Halpin, C. et al. (1999) Plant J. 17:453-459は、単一オープンリーディングフレーム内で2Aによって連結された2つのレポーターコード領域を有するポリタンパク質を構築することを述べた。2Aリンカーは、酵素非依存性反応によってそれ自体のカルボキシ末端で共翻訳切断を媒介することが報告された。ポリタンパク質の発現と切断は起こったが、生じたタンパク質産物の1つは2Aリンカーの19アミノ酸を保持し、20番目のアミノ酸はその他のタンパク質に付着していた。
【００１５】
同様の結果がFrancois, IEJA, et al. (2002) Plant Physiol. 28:1346-1358によって述べられており、彼らは、ホウセンカ（Impatiens balsamina）の種子からの16アミノ酸のプロペプチドを使用して、ダリア・メルキー（Dahlia mercki1）の種子からの植物デフェンシンであるDmAMPIおよびダイコン（Raphanus sativus）からのデフェンシンであるRsAFP2の2つのタンパク質のコード領域を連結した。ホウセンカのプロペプチドは、Tailor, RA, et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:24480-24487によって述べられたポリタンパク質前駆体IbAMPから得られた。記述されたDmAMPIとRsAFP2のポリタンパク質構築物は、シロイヌナズナにおいて発現され、翻訳後切断された；しかし、連結プロペプチドの一部は、リンカーに対するポリタンパク質構築物内でのそれらの方向にかかわりなく、連結されたタンパク質のC末端とN末端に付着することが認められた。
【００１６】
29アミノ酸長の複合リンカーを使用して、Francois, I.F.I.A. et al. (2004) Plant Science 166:113-121は、ポリタンパク質前駆体としてのDmAMP1およびRsAFP2のシロイヌナズナにおける発現を報告した。前駆体はプロセシングされて、主として細胞内抽出物においてDmAMP1 交差反応性タンパク質を生成し、主として細胞外液においてRsAFP2交差反応性タンパク質を生成した。リンカー配列は、ホウセンカリンカーの一部と口蹄疫2Aリンカー配列の一部の複合体であった。複数の遺伝子を植物細胞に導入するための組換えに基づく系は、Chen, Q.-J., et al. (2006) Plant Mol. Biol. 62:927-936によって述べられている。各々の遺伝子はそれ自体のプロモーターとターミネーターを有する。
【発明の概要】
【００１７】
概要
単一プロモーターの制御下で、植物細胞、組織または全植物体において複数の遺伝子を同時に発現させるための多重遺伝子発現媒体（multi-gene expression vehicle, MGEV）を本明細書において述べる。MGEVは、C末端とN末端を共に連結させるために必要な特徴を欠く線状ポリタンパク質を発現するように構築できる。MGEVは、その配列が各々のセグメントによってコードされる機能によって説明される以下のセグメントを含む、1個の単離ポリヌクレオチドを含む：その各々が機能性タンパク質をコードする2〜8個のオープンリーディングフレーム（D2-8）、および各々1個が2つのDセグメントの間に位置する複数のリンカーセグメント（L1-7）。MGEVは、好ましくは、さらに、小胞体シグナル配列（S）をコードする5’末端セグメント、およびC末端液胞標的ペプチド（V）をコードする3’末端セグメントを含む。線状MGEVの翻訳は線状ポリタンパク質を生成し、線状ポリタンパク質はリンカー（L）セグメントでの切断によってさらにプロセシングされて、タンパク質ドメインを互いから分離する。任意で、その環状形態では、MGEVは、SのC末端側の第一の「クラスプ（clasp）」ペプチド（C2N）およびVのN末端側の第二の「クラスプ」ペプチド（C2C）をコードするセグメントを含む。好ましくは、C2NおよびC2Cタンパク質は、ジスルフィド結合の翻訳後形成によって共に共有結合連結され得るヘテロ二量体を形成し、それによって「環状」ポリタンパク質（環状トポロジーを有する）を形成するように相互作用することを可能にする二次および三次構造を有する。1つの態様では、架橋C2N-C2C二量体はキモトリプシン阻害剤（C2）としての活性を有する。環状MGEVは、3〜8個のリーディングフレーム（D3-8）と、各々のドメインの間のリンカーおよび各々の「クラスプ」ペプチド（L4-8）を有し得る。最終的に、環状ポリタンパク質も各々のLセグメントで切断される。線状および環状の両形態で、シグナルポリペプチド（S）および液胞標的ペプチド（V）は、L部位での切断の前に、全長ポリタンパク質の細胞内輸送を制御するように機能する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】NaPI-ii(配列番号：1)およびNaPI-iv(配列番号：2)のアミノ酸アラインメントを示す。
【図２】NaPI-iiおよびNaPI-ivの両方の発現がどのようにして個々の成熟6 kDaプロテイナーゼ阻害剤タンパク質（矢印で示す）を生成するように翻訳後プロセシングされる前駆体タンパク質を生じるかを示す略図である。タンパク質は、トリプシン（T）またはキモトリプシン（C）阻害活性を有する。T1(配列番号：3)およびT5(配列番号：4)のアミノ酸配列を示す。SP、シグナルペプチド；CTPP、C末端プロペプチド；N端(C2N)およびC端(C2C)は、ジスルフィド結合を通して6kDaの2本鎖プロテイナーゼ阻害剤 (C2)を形成するように相互作用するクラスプペプチドである。
【図３】実施例1で使用するpHEX29のプラスミドマップである。  本明細書においてすべてのプラスミドマップ（図3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、および33)において以下の略語を使用する。oriV-複製起点。ColE1 ori-コリシンE1からのDNA複製起点。TDNA RB-アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）からのTDNAの右側境界領域。Nosプロモーター-A. ツメファシエンスのTDNAからのノパリンシンターゼプロモーター。NPTII-ネオマイシンホスホトランスフェラーゼコードセグメント。Nosターミネーター-A. ツメファシエンスのTDNAからのノパリンシンターゼターミネーター。破壊されたlacZ-大腸菌のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子の部分セグメント。CaMV 35Sプロモーター-CaMV 35Sタンパク質をコードするカリフラワーモザイクウイルス(CaMV) 遺伝子のプロモーターセグメント。MGEV内のPot1A-本明細書において述べる。CaMV 35Sターミネーター-CaMV 35Sタンパク質をコードするCaMV遺伝子のターミネーターセグメント。M13 ori-M13バクテリオファージコートタンパク質からの複製起点。TDNA LB-A.ツメファシエンスからのTDNAの左側境界領域。矢印は転写の方向を示す。本明細書において詳細に説明されない限り、省略されている特徴は当業者に周知の標準成分であり、標準的なテキストの中に述べられている。たとえばMolecular Cloning (2001) Sambrook J., and Russell, D.W., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York参照。
【図４】図4A〜4Eは、実施例1で述べるように、ワタにおける2個のNaPIおよびPotIAの発現のための4ドメインMGEVからのデータを提示する。図4Aは、小胞体シグナル配列（棒）、2つの6kDaプロテイナーゼ阻害剤ドメイン（球）、1つのPotIAドメイン（菱形）、および液胞標的配列（らせん）を有する、MGEV-5によってコードされ、pHEX29において発現される環状タンパク質の略図である。3番目のプロテイナーゼ阻害剤ドメインは、クラスプを形成する2個のペプチド［N端 (C2N)およびC端 (C2C)］を連結する3つのジスルフィド結合を示す3本の水平な線を含む球によって表わされている。リンカーペプチドは、各々のタンパク質ドメインを結びつける実線によって示されている。プロセシングされていないMGEV-5産物の予測される大きさは、31.4 kDaマイナスシグナル配列である。図4Bは、実験CT89からの、一次トランスジェニックワタ系統の葉からの抽出物におけるNaPIのELISA検出からのデータの棒グラフである。試料は1:5,000および1:20,000に希釈した。コーカー（Coker）は非トランスジェニック対照である。図4Cは、89.5.1系統のT2植物の葉からの抽出物におけるNaPIのELISA検出からのデータの棒グラフである。試料は1:5,000に希釈した。コーカー（Coker）は非トランスジェニック対照である。NaPI標準品は、ニコチアナ・アラタの花から単離した2、4、または6μgの純粋な6kDa NaPIである。図4Dは、実験CT89およびCT90からの一次トランスジェニックワタ系統（T1）から調製した葉抽出物のタンパク質ブロットである。葉タンパク質を直接NuPAGE LDS試料緩衝液（4x）（NOVEX）中に抽出し、4〜12% Novex Bis-Tris SDSゲル上で分離して、0.22ミクロンのニトロセルロース膜に移した。ブロットをNaPI抗体でプローブした。前駆体タンパク質および6kDa NaPIペプチドを矢印で示す。レーン1:80 ngの精製NaPI、レーン2:89.5、レーン3:89.20、レーン4:89.60、レーン5:89.111、レーン6:89.120、レーン7:89.122、レーン8:90.131、レーン9:形質転換していないコーカー。図4Eは、実験CT89およびCT90からの選択系統からのT1およびT2植物のワタの葉から調製した抽出物の免疫ブロット法のブロットである。タンパク質を試料緩衝液に溶解する前にアセトンで沈殿させ、4〜12% Novex Bis-Tris SDSゲル上で分離して、0.22ミクロンのニトロセルロース膜に移した。ブロットをNaPI抗体でプローブした。前駆体タンパク質および6kDa NaPIペプチド（矢印で示す）は、一次系統（T1）およびそれらの子孫 （T2）の両方で認められた。プロセシングの中間体はレーン3と7において認めることができる。レーン1:150 ngの精製 NaPI、レーン2:89.177 (T1)、レーン3:89.177 (T2)、レーン4:90.73 (T1)、レーン5:90.73 (T2)、レーン6:89.5 (T1)、レーン7:89.5 (T2)、レーン8:形質転換していないコーカー。
【図５】実施例2で使用するpHEX56のプラスミドマップである。
【図６】図6A〜6Dは、実施例2で述べるように、ワタの子葉におけるNaPIおよびPotIAの発現のための3ドメイン線状MGEVの使用に基づくデータを提示する。図6Aは、小胞体シグナル配列（棒）、2つの6kDaプロテイナーゼ阻害剤ドメイン（球）、1つのPotIAドメイン（菱形）、および液胞標的配列（らせん）を有する、MGEV-8によってコードされ、pHEX56において発現される線状タンパク質の略図である。リンカーペプチドは、各々のタンパク質ドメインを結びつける実線によって示されている。プロセシングされていないMGEV-8産物の予測される大きさは、25.4 kDaマイナスシグナル配列である。図6Bは、pHEX56またはPBIN19空ベクターによる一過性発現後のワタ子葉からの抽出物におけるNaPIのELISA検出からのデータの棒グラフである。試料を1:1,000希釈し、様々な量の精製6kDa NaPIと比較した。図6Cは、pHEX56による一過性発現後のワタ子葉からの抽出物におけるPotIAのELISA検出からのデータの棒グラフである。試料を1:20希釈し、精製Pot1A標準品と比較した。図6Dは、pHEX56による一過性発現後のワタ子葉から調製した抽出物のタンパク質ブロットである。タンパク質を試料緩衝液に溶解する前にアセトンで沈殿させ、4〜12% Novex Bis-Tris SDSゲル上で分離して、0.22ミクロンのニトロセルロース膜に移した。ブロットをNaPI抗体でプローブした。レーン1:150 ngの精製NaPI、レーン2:実生1、レーン3:実生2、レーン4:実生3、レーン5:pBIN19空ベクターでトランスフェクトした子葉試料。前駆体タンパク質および6kDa NaPIペプチド（矢印で示す）が、pHEX56構築物を含むアグロバクテリウムを浸潤させた3つの実生すべてにおいて検出された。
【図７】実施例3で使用するpHEX31のプラスミドマップである。
【図８】図8A〜8Gは、実施例3で述べるように、ワタにおけるNaPIおよび成熟NaD1の発現のための4ドメインMGEVの使用に基づくデータを提示する。図8Aは、小胞体シグナル配列（棒）、2つの6kDaプロテイナーゼ阻害剤ドメイン（球）、1つのNaD1ドメイン（三角）、および液胞標的配列（らせん）を有する、MGEV-6によってコードされ、pHEX31において発現される環状タンパク質の略図である。3番目のプロテイナーゼ阻害剤ドメインは、クラスプを形成する2個のペプチド［N端 (C2N)およびC端 (C2C)］を連結する3つのジスルフィド結合を示す3本の水平な線を含む球によって表わされている。リンカーペプチドは、各々のタンパク質ドメインを結びつける実線によって示されている。プロセシングされていないMGEV-6産物の予測される大きさは、28.2 kDaマイナスシグナル配列である。図8Bは、93.4系統のT2植物の葉からの抽出物におけるNaPIのELISA検出からのデータの棒グラフである。試料は1:5,000に希釈した。コーカーは非トランスジェニック対照である。PBS-Tは陰性対照である。NaPI標準品は精製6kDa NaPIの陽性対照である。図8Cは、93.4系統のT2植物の葉からの抽出物におけるNAD1のELISA検出からのデータの棒グラフである。試料は1:50に希釈した。図8Dは、93.279系統のT2植物の葉からの抽出物におけるNaPIのELISA検出からのデータの棒グラフである。試料は1:1,000に希釈した。図8Eは、93.279系統のT2植物の葉からの抽出物におけるNAD1のELISA検出からのデータの棒グラフである。試料は1:50に希釈した。図8Fは、実験CT93からのトランスジェニックワタ系統（T1およびT2）のワタ葉から調製した抽出物のタンパク質ブロットである。タンパク質を4〜12% Novex Bis-Tris SDSゲル上で分離し、0.22ミクロンのニトロセルロース膜に移した。ブロットをNaPI抗体でプローブした。レーン1:150 ngの精製NaPI、レーン2:93.4.1 T2、レーン3:93.36.2 T1、レーン4:93.36.2 T2。前駆体タンパク質および6kDa NaPIペプチド（矢印で示す）の両方が存在した。図8Gは、実験CT93からのトランスジェニックワタ系統（T1およびT2）のワタ葉から調製した抽出物のタンパク質ブロットである。タンパク質を4〜12% Novex Bis-Tris SDSゲル上で分離し、0.22ミクロンのニトロセルロース膜に移した。ブロットをNaD1抗体でプローブした。レーン1および2:93.4.1、レーン3:50ngの成熟NaD1、レーン4:150ngの成熟NaD1。NaD1を矢印で示す。約6kDaのかすかなバンドがレーン1および2で認められ、成熟NaD1がトランスジェニック系統93.4.1に存在し、正しくプロセシングされていたことが確認された。
【図９】実施例4で使用するpHEX46のプラスミドマップである。
【図１０】図10A〜10Fは、実施例4で述べるように、ワタ子葉およびニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）の葉においてGFPを発現し、液胞に標的するためのMGEVの使用に基づくデータを提示する。図10Aは、小胞体シグナル配列（棒）、3つの6kDaプロテイナーゼ阻害剤ドメイン（球）、GFP（円柱）、および液胞標的配列（らせん）を有する、MGEV-7によってコードされ、pHEX46において発現される環状タンパク質の略図である。リンカーペプチドは、各々のタンパク質ドメインを結びつける実線によって示されている。プロセシングされていないMGEV-7産物の予測される大きさは、49.6kDaマイナスシグナル配列である。図10Bは、pHEX46またはBIN19空ベクターによる一過性発現後のワタ子葉からの抽出物におけるNaPIのELISA検出からのデータの棒グラフである。試料を1:1,000希釈し、精製6kDa標準品と比較した。図10Cは、pHEX46による一過性発現後のワタ子葉から調製した抽出物のタンパク質ブロットである。タンパク質を試料緩衝液に溶解する前にアセトンで沈殿させ、4〜12% Novex Bis-Tris SDSゲル上で分離して、0.22ミクロンのニトロセルロース膜に移した。ブロットをNaPI抗体でプローブした。レーン1:pHEX46でトランスフェクトした子葉試料、レーン2:pBIN19空ベクターでトランスフェクトした子葉試料。6kDa NaPIペプチド（矢印で示す）は、pHEX46でトランスフェクトした子葉試料中に存在した。図10Dは、pHEX46（MGEV-7）による一過性発現後のベンタミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）の葉から調製した抽出物のタンパク質ブロットを示す。図10D-1および図10D-2は、レーン1（NaPI）にN.アラタの花から精製した6kD NaPIおよび2番目のレーンにpHEX46(MGEV-7)の一過性発現後のN.ベンタミアナ（N. benthamiana）の葉からの抽出物を含む同じタンパク質ブロットである。図10D-1、NaPI抗体は、レーン1において6kDa PIに、葉抽出物ではMGEV-7についての予想される大きさのタンパク質(約5OkDa、矢印で示す)に結合した。図10D-2は、抗体を除去してGFP抗体で再プローブした後の図10D-1からのブロットである。GFP抗体は6kDa PIに結合しなかったが、MGEV-7の予想された大きさのタンパク質(約50kDa、矢印で示す)に結合した。したがって約50kDaタンパク質(矢印で示す)は、6kDa PIドメインとGFPドメインの両方を有する。図10D-3および図10D-4は、GFP抗体でプローブした（図10D-3）後、除去してNAPI抗体で再プローブした（図10D-4）、2番目のタンパク質ブロットである。ブロットは、レーン1には細菌において発現されたGFPおよび2番目のレーンにはpHEX46(MGEV-7)の一過性発現後のN.ベンタミアナの葉からの抽出物を有する。GFP抗体は、細菌において発現されたGFP（28kDa、矢印で示す）およびMGEV-7を発現する葉からの抽出物における同じ大きさのタンパク質に結合した。また、プロセシングされていないMGEV-7の予想された大きさのタンパク質ならびに約34kDaの潜在的プロセシング中間体にも結合した。NaPI抗体（図10D-4）は葉抽出物中の約50kDaタンパク質（矢印で示す）に結合し、このタンパク質が、プロセシングされていないMGEV-7に関して予想されたようにNaPIおよびGFPドメインの両方を有することが確認された（約50kDa、矢印で示す）。NaPI抗体は、GFP抗体によって明らかにされた葉抽出物中の28kDaタンパク質に結合しなかった。これは、N.ベンタミアナの葉におけるMGEVからの遊離GFPの放出と一致する。図10Eは、ワタ葉の表皮細胞におけるpHEX46からのGFPの一過性発現を示す顕微鏡写真である。GFP蛍光は液胞内に位置する（矢印で示す）。GFP蛍光はOlympus BX50蛍光顕微鏡で検査した。図10Fは、ワタ葉の表皮細胞におけるpHEX45からのGFPの一過性発現を示す顕微鏡写真である。GFP蛍光は細胞外に存在する（矢印で示す）。GFP蛍光はOlympus BX50蛍光顕微鏡で検査した。
【図１１】実施例5で使用するpHEX55のプラスミドマップである。
【図１２】図12A〜12Eは、実施例5で述べるように、ワタ子葉におけるNaPI、NaD1およびPot1Aの発現のための6ドメインMGEVの使用に基づくデータを提示する。図12Aは、小胞体シグナル配列（棒）、2つの6kDaプロテイナーゼ阻害剤ドメイン（球）、2つのPot1Aドメイン（菱形）、1つのNaD1ドメイン（三角）、および液胞標的配列（らせん）を有する、MGEV-9によってコードされ、pHEX55において発現される環状タンパク質の略図である。3番目のプロテイナーゼ阻害剤ドメインは、クラスプを形成する2個のペプチド［N端 (C2N)およびC端 (C2C)］を連結する3つのジスルフィド結合を示す3本の水平な線を含む球によって表わされている。リンカーペプチドは、各々のタンパク質ドメインを結びつける実線によって示されている。プロセシングされていないMGEV-9産物の予測される大きさは、46.6 kDaマイナスシグナル配列である。図12Bは、pHEX55またはpBIN19空ベクターによる一過性発現後のワタ子葉からの抽出物におけるNaPIのELISA検出からのデータの棒グラフである。試料は1:1,000に希釈した。図12Cは、pHEX55またはpBIN19空ベクターによる一過性発現後のワタ子葉からの抽出物におけるNaD1のELISA検出からのデータの棒グラフである。試料は1:100に希釈した。図12Dは、pHEX55またはpBIN19空ベクターによる一過性発現後のワタ子葉からの抽出物におけるPot 1AのELISA検出からのデータの棒グラフである。試料は1:20に希釈した。図12Eは、pHEX55による一過性発現後のワタ子葉から調製した抽出物のタンパク質ブロットである。タンパク質を試料緩衝液に溶解する前にアセトンで沈殿させ、4〜12% Novex Bis-Tris SDSゲル上で分離して、0.22ミクロンのニトロセルロース膜に移した。ブロットをNaPI抗体でプローブした。レーン1:400 ngの精製NaPI、レーン2：pHEX55でトランスフェクトした子葉試料、レーン3：形質転換していないコーカー。6kDa NaPIペプチド（矢印で示す）が、pHEX55でトランスフェクトした子葉試料中に存在した。約17kDa〜38kDaに及ぶいくつかのプロセシング中間体も検出された。
【図１３】実施例6で使用するpHEX45のプラスミドマップである。
【図１４】図14A〜14Fは、実施例6で述べるように、ベンタミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）の葉においてGFPを発現し、細胞外間隙に標的するためのMGEVの使用に基づくデータを提示する。図14Aは、4つの構築物によってコードされるタンパク質の各々の略図である。小胞体シグナル配列は棒で表わされており、クラスプドメインを含む6kDaプロテイナーゼ阻害剤ドメインは球であり、GFPは円柱であり、液胞標的配列（V）はらせんとして表わされている。リンカーペプチドは、各々のタンパク質ドメインを結びつける実線によって示されている。プロセシングされていないコードされるタンパク質マイナスシグナル配列の予測される大きさを図の隣に示す。図14B〜Eは、pHEX45（MGEV 10）およびC1（図14A）からのGFPの一過性発現を示す顕微鏡写真である。Vが存在しない場合、両方の構築物からのGFPは細胞の外側に向かう。GFP蛍光は、Leica TCS SP2共焦点レーザー顕微鏡を用いて検査した。図14B-表皮細胞におけるpHEX45の一過性発現。図14C-葉肉細胞におけるpHEX45の一過性発現。図14D-表皮細胞における対照遺伝子構築物C1の一過性発現。図14E-葉肉細胞における対照遺伝子構築物C1の一過性発現。図14F-pHEX45(MGEV-10)、pHEX 46(MGEV-7)、C1(S-GFP)、およびC2(S-GFP-V)による一過性発現後のベンタミアナタバコの葉から調製した抽出物のタンパク質ブロット。ブロットAおよびBをGFP抗体でプローブする。レーン1、陽性対照。細菌において発現されたGFP。レーン2〜5は、それぞれ、C1、C2、pHEX 46(MGEV-7)、およびpHEX45(MGEV-10)の一過性発現後の葉からの抽出物である。すべての構築物が、GFP抗体に結合する28kDaのタンパク質を生産した。pHEX 46(MGEV-7)およびpHEX45(MGEV-10)も、GFP抗体と反応するMGEV-7およびMGEV-10の予想された大きさである約50kDaのタンパク質を生産した。MGEV-10に対応する約50kDaタンパク質はNaPI抗体、ブロットCにも結合し、このタンパク質がNaPIとGFPドメインの両方を有することを示した。
【図１５】実施例7で使用するpHEX42のプラスミドマップである。
【図１６】図16A〜16Eは、実施例7で述べるように、ワタ子葉におけるNaPIおよびNaD1（CTPPと共に）の発現のための4ドメインMGEVの使用に基づくデータを提示する。図16Aは、小胞体シグナル配列（棒）、3つの6kDaプロテイナーゼ阻害剤ドメイン（球）、1つのNaD1ドメイン（三角）＋CTPP尾部（らせん）、および液胞標的配列（らせん）を有する、MGEV-11によってコードされ、pHEX42において発現される環状タンパク質の略図である。リンカーペプチドは、各々のタンパク質ドメインを結びつける実線によって示されている。プロセシングされていないMGEV-11産物の予測される大きさは、31.8kDaマイナスシグナル配列である。図16Bは、pHEX42または空ベクターによる一過性発現後のワタ子葉からの抽出物におけるNaPIのELISA検出からのデータの棒グラフである。試料は1:100に希釈した。図16Cは、pHEX42による一過性発現後のワタ子葉からの抽出物におけるNaD1のELISA検出からのデータの棒グラフである。試料は1:5,000に希釈した。図16Dは、pHEX42による一過性発現後のワタ子葉から調製した抽出物のタンパク質ブロットである。タンパク質を試料緩衝液に溶解する前にアセトンで沈殿させ、4〜12% Novex Bis-Tris SDSゲル上で分離して、0.22ミクロンのニトロセルロース膜に移した。ブロットをNaPI抗体でプローブした。レーン1:pHEX42でトランスフェクトした子葉試料、レーン2：pBIN19空ベクターでトランスフェクトした子葉試料、レーン3：ブランク、レーン4：200ngの精製NaPI。前駆体および6kDa NaPIペプチド（矢印で示す）が、pHEX42でトランスフェクトした子葉試料中に存在した。図16Eは、pHEX42による一過性発現後のワタ子葉から調製した抽出物のタンパク質ブロットである。タンパク質を試料緩衝液に溶解する前にアセトンで沈殿させ、10〜20% Novex Tricine SDSゲル上で分離して、0.22ミクロンのニトロセルロース膜に移した。ブロットをNaD1抗体でプローブした。レーン1:pHEX42でトランスフェクトした子葉試料、レーン2：pBIN19空ベクターでトランスフェクトした子葉試料、レーン3：ブランク、レーン4：150ngの精製NaD1。前駆体および6kDa NaD1（矢印で示す）が、pHEX42でトランスフェクトした子葉試料中に存在した。
【図１７】実施例8で使用するpHEX33のプラスミドマップである。
【図１８】図18A〜18Cは、ワタ子葉におけるNaPIおよびPotIAの発現のための5ドメインMGEVの使用に基づくデータを提示する。図18Aは、小胞体シグナル配列（棒）、3つの6kDaプロテイナーゼ阻害剤ドメイン（球）、2つのPotIAドメイン（菱形）、および液胞標的配列（らせん）を有する、pHEX33によってコードされる環状タンパク質MGEV-12の略図である。リンカーペプチドは、各々のタンパク質ドメインを結びつける実線によって示されている。プロセシングされていないMGEV-12産物の予測される大きさは、40.4 kDaマイナスシグナル配列である。図18Bは、pHEX33による一過性発現後のワタ子葉からの抽出物におけるNaPIのELISA検出からのデータの棒グラフである。試料は1:1,000に希釈した。図18Cは、pHEX33による一過性発現後のワタ子葉からの抽出物におけるPot 1AのELISA検出からのデータの棒グラフである。試料は1:20に希釈した。
【図１９】実施例9で使用するpHEX39のプラスミドマップである。
【図２０】図20A〜20Cは、ワタ子葉におけるNaPI、成熟NaD1およびNaD2の発現のための5ドメインMGEVの使用に基づくデータを提示する。図20Aは、小胞体シグナル配列（棒）、3つの6kDaプロテイナーゼ阻害剤ドメイン（球）、1つのNaD2ドメイン（三角）、1つのNaD1ドメイン（三角）、および液胞標的配列（らせん）を有する、pHEX39によってコードされる環状タンパク質MGEV-13の略図である。リンカーペプチドは、各々のタンパク質ドメインを結びつける実線によって示されている。プロセシングされていないMGEV-13産物の予測される大きさは、34kDaマイナスシグナル配列である。図20Bは、pHEX39による一過性発現後のワタ子葉からの抽出物におけるNaPIのELISA検出からのデータの棒グラフである。試料は1:1,000に希釈した。図20Cは、pHEX39による一過性発現後のワタ子葉からの抽出物におけるNaD1のELISA検出からのデータの棒グラフである。試料は1:100に希釈した。
【図２１】実施例10で使用するpHEX48のプラスミドマップである。
【図２２】図22A〜22Dは、ワタ子葉におけるNaPIおよびPotIAの発現のための4ドメイン線状MGEVの使用に基づくデータを提示する。図22Aは、小胞体シグナル配列（棒）、2つの6kDaプロテイナーゼ阻害剤ドメイン（球）、2つのPotIAドメイン（菱形）、および液胞標的配列（らせん）を有する、MGEV-14によってコードされ、pHEX48において発現される線状タンパク質の略図である。リンカーペプチドは、各々のタンパク質ドメインを結びつける実線によって示されている。プロセシングされていないMGEV-14産物の予測される大きさは、34.5 kDaマイナスシグナル配列である。図22Bは、pHEX48による一過性発現後のワタ子葉からの抽出物におけるNaPIのELISA検出からのデータの棒グラフである。試料は1:1,000に希釈した。図22Cは、pHEX48による一過性発現後のワタ子葉からの抽出物におけるPot 1AのELISA検出からのデータの棒グラフである。試料は1:20に希釈した。図22Dは、pHEX48による一過性発現後のワタ子葉から調製した抽出物のタンパク質ブロットである。タンパク質を試料緩衝液に溶解する前にアセトンで沈殿させ、4〜12% Novex Bis-Tris SDSゲル上で分離して、0.22ミクロンのニトロセルロース膜に移した。ブロットをNaPI抗体でプローブした。レーン1:150 ngの精製NaPI、レーン2：pHEX48でトランスフェクトした子葉試料、レーン3：pBIN19空ベクターでトランスフェクトした子葉試料。6kDa NaPIペプチドを矢印で示す。pHEX48でトランスフェクトした子葉組織においてNaPIペプチドおよびいくつかのプロセシング中間体が検出された。
【図２３】実施例11で使用するpHEX47のプラスミドマップである。
【図２４】図24A〜24Dは、ワタ子葉におけるNaPIおよび成熟NaD1の発現のための3ドメイン線状MGEVの使用に基づくデータを提示する。図24Aは、小胞体シグナル配列（棒）、2つの6kDaプロテイナーゼ阻害剤ドメイン（球）、1つのNaD1ドメイン（三角）、および液胞標的配列（らせん）を有する、MGEV-15によってコードされ、pHEX47において発現される線状タンパク質の略図である。リンカーペプチドは、各々のタンパク質ドメインを結びつける実線によって示されている。プロセシングされていないMGEV-15産物の予測される大きさは、22.3 kDaマイナスシグナル配列である。図24Bは、pHEX47による一過性発現後のワタ子葉からの抽出物におけるNaPIのELISA検出からのデータの棒グラフである。試料は1:1,000に希釈した。図24Cは、pHEX47による一過性発現後のワタ子葉からの抽出物におけるNaD1のELISA検出からのデータの棒グラフである。試料は1:100に希釈した。図24Dは、pHEX47による一過性発現後のワタ子葉から調製した抽出物のタンパク質ブロットである。タンパク質を試料緩衝液に溶解する前にアセトンで沈殿させ、4〜12% Novex Bis-Tris SDSゲル上で分離して、0.22ミクロンのニトロセルロース膜に移した。ブロットをNaPI抗体でプローブした。レーン1:400 ngの精製NaPI、レーン2：pHEX47でトランスフェクトした子葉試料、レーン3：形質転換していないコーカー。6kDa NaPIペプチド（矢印で示す）は、pHEX47でトランスフェクトした子葉試料中に存在した。
【図２５】実施例12で使用するpHEX35のプラスミドマップである。
【図２６】図26A-26Cは、ワタ子葉におけるPotIAの発現のための2ドメイン線状MGEVの使用に基づくデータを提示する。図26Aは、小胞体シグナル配列（棒）、PotIAプロドメイン（長方形）、および2つのPotIAドメイン（菱形）を有する、MGEV-16によってコードされ、pHEX35において発現される線状タンパク質の略図である。リンカーペプチドは、各々のタンパク質ドメインを結びつける実線によって示されている。プロセシングされていないMGEV-16産物の予測される大きさは、19.4 kDaマイナスシグナル配列である。図26Bは、pHEX35およびpHEX6による一過性発現後のワタ子葉からの抽出物におけるPot1AのELISA検出からのデータの棒グラフである。試料は1:50に希釈した。pHEX6は、Pot1A遺伝子が1コピーしか存在しないことを除いてpHEX35構築物と同じである。評価した3つの実生において、Pot1Aの発現は、単一Pot1Aドメイン（pHEX6）と比較してPot1A二量体を使用したとき（pHEX35）より高かった。pHEX6は公開特許公報（国際公開公報第2004/094630号)に開示されている。図26Cは、pHEX35による一過性発現後のワタ子葉から調製した抽出物のタンパク質ブロットである。タンパク質を試料緩衝液に溶解する前にアセトンで沈殿させ、4〜12% Novex Bis-Tris SDSゲル上で分離して、0.22ミクロンのニトロセルロース膜に移した。ブロットをPotIA抗体でプローブした。レーン1:pHEX35でトランスフェクトした子葉試料（実生2）、レーン2：pBIN19空ベクターでトランスフェクトした子葉試料、レーン3：100ngの精製Pot 1A。成熟Pot 1A（矢印で示す）が、pHEX35でトランスフェクトした子葉実生において生産された。
【図２７】実施例13で使用するpHEX41のプラスミドマップである。
【図２８】図28A〜28Fは、ワタ子葉におけるNaD1の発現のための2ドメイン線状MGEVの使用に基づくデータを提示する。図28Aは、小胞体シグナル配列（棒）、1つの6kDaプロテイナーゼ阻害剤ドメイン（球）、1つのNaD1ドメイン（三角）、および液胞に標的することを可能にするCTPP尾部（らせん）を有する、MGEV-17によってコードされ、pHEX41において発現される線状タンパク質の略図である。リンカーペプチドは、各々のタンパク質ドメインを結びつける実線によって示されている。プロセシングされていないMGEV-17産物の予測される大きさは、15.8 kDaマイナスシグナル配列である。図28Bは、pHEX41およびpHEX3による一過性発現後のワタ子葉からの抽出物におけるNaD1のELISA検出である。試料は1:500に希釈した。pHEX3は、NaPIドメインを含まないことを除いてpHEX41と同じである。評価した2つの実生において、NaD1の発現は、NaD1単独の発現（pHEX6）と比較してNaPIドメインと共に発現したとき（pHEX35）より高かった。pHEX3は米国特許第6,031,087号に開示されている。図28Cは、pHEX41による一過性発現後のワタ子葉からの抽出物におけるNaPIのELISA検出からのデータの棒グラフである。試料は1:1,000に希釈した。図28Dは、pHEX41による一過性発現後のワタ子葉からの抽出物におけるNaD1のELISA検出からのデータの棒グラフである。試料は1:500に希釈した。図28Eは、pHEX41による一過性発現後のワタ子葉から調製した抽出物のタンパク質ブロットである。タンパク質を試料緩衝液に溶解する前にアセトンで沈殿させ、4〜12% Novex Bis-Tris SDSゲル上で分離して、0.22ミクロンのニトロセルロース膜に移した。ブロットをNaP1抗体でプローブした。レーン1:pHEX41でトランスフェクトした子葉試料（実生2）、レーン2：pBIN19空ベクターでトランスフェクトした子葉試料、レーン3：ブランク、レーン4：200ngの精製NaPI。6kDa NaPIペプチド（矢印で示す）が、pHEX41でトランスフェクトした子葉試料中に存在した。図28Fは、pHEX41による一過性発現後のワタ子葉から調製した抽出物のタンパク質ブロットである。タンパク質を試料緩衝液に溶解する前にアセトンで沈殿させ、4〜12% Novex Bis-Tris SDSゲル上で分離して、0.22ミクロンのニトロセルロース膜に移した。ブロットをNaD1抗体でプローブした。レーン1:pHEX41でトランスフェクトした子葉試料（実生2）、レーン2：pBIN19空ベクターでトランスフェクトした子葉試料、レーン3：ブランク、レーン4：150ngの精製NaD1。前駆体および6kDa NaD1（矢印で示す）が、pHEX41でトランスフェクトした子葉試料中に存在した。
【図２９】実施例14で使用するpHEX52のプラスミドマップである。
【図３０】ワタ子葉におけるNaD2およびNaD1の発現のための2ドメイン線状MGEVの使用に基づくデータを提示する。図30Aは、小胞体シグナル配列（棒）、1つのNaD2ドメイン（三角）、1つのNaD1ドメイン（三角）、および液胞に標的することを可能にするCTPP尾部（らせん）を有する、MGEV-18によってコードされ、pHEX52において発現される線状タンパク質の略図である。リンカーペプチドは、各々のタンパク質ドメインを結びつける実線によって示されている。プロセシングされていないMGEV-18産物の予測される大きさは、14.7 kDaマイナスシグナル配列である。図30Bは、pHEX52による一過性発現後のワタ子葉からの抽出物におけるNaD1のELISA検出からのデータの棒グラフである。
【図３１】実施例15で使用するpHEX51のプラスミドマップである。
【図３２】図32A〜32Bは、ワタ子葉におけるNaD2およびNaD1の発現および細胞外間隙への標的のための2ドメイン線状MGEVの使用に基づくデータを提示する。図32Aは、小胞体シグナル配列（棒）、1つのNaD2ドメイン（三角）、および1つのNaD1ドメイン（三角）を有する、MGEV-19によってコードされ、pHEX51において発現される線状タンパク質の略図である。リンカーペプチドは、各々のタンパク質ドメインを結びつける実線によって示されている。プロセシングされていないMGEV-19産物の予測される大きさは、11.1 kDaマイナスシグナル配列である。図32Bは、pHEX51による一過性発現後のワタ子葉からの抽出物におけるNaD1のELISA検出からのデータの棒グラフである。試料は1:100に希釈した。
【図３３】実施例16で使用するpHEX58のプラスミドマップである。
【図３４】図34A〜34Cは、ワタ子葉におけるGUSの発現および液胞への標的のための2ドメイン線状MGEVの使用に基づくデータを提示する。図34Aは、小胞体シグナル配列（棒）、2つの6kDaプロテイナーゼ阻害剤ドメイン（球）、1つのGUS（四角）、および液胞標的配列（らせん）を有する、MGEV-20によってコードされ、pHEX58において発現される線状タンパク質の略図である。リンカーペプチドは、各々のタンパク質ドメインを結びつける実線によって示されている。プロセシングされていないMGEV-20産物の予測される大きさは、84.8 kDaマイナスシグナル配列である。図34Bは、pHEX58による一過性発現後のワタ子葉からの抽出物におけるNaPIのELISA検出からのデータの棒グラフである。試料は1:1,000に希釈した。図34Cは、pHEX58による一過性発現後のワタ子葉から調製した抽出物のタンパク質ブロットである。タンパク質を試料緩衝液に溶解する前にアセトンで沈殿させ、4〜12% Novex Bis-Tris SDSゲル上で分離して、0.22ミクロンのニトロセルロース膜に移した。ブロットをNaPI抗体でプローブした。レーン1:pHEX58でトランスフェクトした子葉試料（実生2）、レーン2：pBIN19空ベクターでトランスフェクトした子葉試料、レーン3：150ngの精製NaPIペプチド。NaPIペプチド（矢印で示す）が、pHEX58でトランスフェクトした子葉実生から生産された。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
発明の詳細な説明
様々なMGEV構造を本明細書においておよび以下の実施例において説明する。環状ポリタンパク質（MGEV-P）をコードする一般的なMGEV構造は、以下のように図式化される：
S-C2N-(LjDk)m-LjC2C-V
［式中、各々の大文字は、その機能に従って称されるアミノ酸のセグメントをコードするポリヌクレオチドを表し、したがって、Sは、シグナルペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するポリヌクレオチドセグメントであり；Dkは、機能性タンパク質（以下「ドメイン」）をコードするオープンリーディングフレームを有するポリヌクレオチドセグメントであり、kは、3からm個の成員を有するドメインの群から選択される任意の1個の機能性ドメインを特定するための序数であり、Dの少なくとも1個は2型プロテアーゼ阻害剤をコードせず；Ljは、リンカーポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するポリヌクレオチドセグメントであり、Ljは、3からm＋1個の成員を有する群から選択される各々1個のリンカー（L）を特定するための序数であり；C2Nは、N末端クラスプペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するポリヌクレオチドセグメントであり；C2Cは、C末端クラスプペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するポリヌクレオチドであり；Vは液胞標的ペプチドであり；mは3〜8の基数であり；およびS、C2N、L、D、C2C、およびVは、すべて互いと同じリーディングフレーム内にある］。一例として、3つの機能性ドメイン（D）をコードするMGEVは上記に示すように図式化することができ、その場合mは3であり、kは1、2、または3であり、jは1、2、3、または4である。以下で述べるもう1つの線状態様では、クラスプタンパク質が除かれているかまたはトランケートされている（truncated）。クラスプペプチドが存在しない場合、いかなるDも2型プロテイナーゼ阻害剤をコードする必要はない。
【００２０】
Ljは、本明細書において述べるリンカーアミノ酸配列をコードする。各々のLjは、同じかまたは異なる配列を有し得る。一般的なリンカーアミノ酸配列を配列番号：17に示す。
【００２１】
植物細胞では、MGEVによってコードされるタンパク質（MGEV-P）はいくつかの工程の翻訳後プロセシングを受ける。これらは、リーダー（S）が存在することを条件とする小胞体への細胞内輸送、次いでSの除去および液胞標的配列（V）が存在することを条件とする細胞内貯蔵液胞へのその後の輸送を含む。Vは液胞において除去される。C2NおよびC2Cが存在する場合、MGEV-Pの末端は共に連結して、以下のように図式化される閉ループを形成する：
2009537155.tif 000002
［式中、C2N、L1-4、D1-3、C2C、およびVは前記で述べたとおりである］。
【００２２】
各々リンカーにおけるおよびC2CとVの間での翻訳後タンパク質分解切断は、別個のタンパク質としてのD1、D2、D3および、1つの態様では、C2の放出を生じさせる。MGEVの発現は、それにより単一プロモーターから少なくとも3つの別個のタンパク質の同時発現を生じさせ、そのうちの少なくとも1つは2型プロテイナーゼ阻害剤ではない。
【００２３】
環状MGEVは、同時発現される3〜8個の機能性ドメイン（D）をコードし得る。同時発現は、本明細書においては1個の転写産物からの複数の機能性タンパク質の細胞内合成を意味すると定義される。同時発現は、植物細胞において多量のタンパク質、たとえば植物保護剤タンパク質、または経済的に重要なタンパク質を生産し蓄積することを所望するまたは必要とするとき、または発現されるタンパク質の相対量を制御することが好都合であるとき、または通常植物細胞では不十分にしか発現されないシステインに富むペプチドのようなある種のタンパク質の発現のために、特に有用である。MGEVが液胞標的ペプチド（V）を含むとき、同時発現されるタンパク質は細胞内の貯蔵液胞に蓄積され、これは2つの目的のために役立ち得る：（1）病原体攻撃が発生した場合には、または植物保護剤の有効量を維持するために濃縮形態でタンパク質を提供するため、または経済的に価値のあるタンパク質の精製を容易にするため；および（2）そのようなタンパク質を発現する植物に付加的な害虫抵抗性および経済的価値を付与し得る、さもなければ毒性のタンパク質を分離するため。Vは発現される任意のドメイン、最も好都合にはMGEVの3’末端に結合し得る。所望する場合は1つより多いVを含み得る。Vが存在しない場合は、タンパク質分解によってMGEV-Pから放出されるタンパク質は細胞から輸出され得る。
【００２４】
MGEVの発現される成分を本明細書においてより詳細に説明する。
【００２５】
MGEVヌクレオチド配列のオープンリーディングフレームによってコードされるタンパク質ドメイン（D）は、原則として、任意のタンパク質であり得る。MGEVの成分として発現可能なタンパク質についての大きさの上限は不明である。約5kDaから65kDaを超えるまでに及ぶタンパク質をコードする個々のドメインの同時発現を明らかにするデータを本明細書において例示する。MGEVを使用する発現のために適切なタンパク質を選択するときには、当業者に公知の実際的な考慮事項が考慮され得る。たとえば非常に大きなタンパク質は、MGEVの部分としてではなく、個別により効率的に発現され得る。ある種のタンパク質は、ある種の条件下で環化を立体的に妨げ得る。各々のタンパク質ドメイン（D）は、該ドメインのN末端およびC末端アミノ酸でペプチド結合によってリンカーペプチド（L）に連結される。
【００２６】
現在、MGEV-Pから個々のタンパク質ドメインを遊離させる翻訳後ペプチド切断の効率は、各ドメインのNおよびC末端ならびに連結リンカーがタンパク質の内部で分離されるのではなく、タンパク質立体配座によってタンパク質の表面で水性環境に暴露されるときに最大化されると考えられている。したがって、MGEV-Pの一部のとしての発現のための候補タンパク質は、好ましくは露出されたNおよびC末端アミノ酸を有する。
【００２７】
MGEVを使用して発現され得るタンパク質の例は（限定されることなく）、ジャガイモ1型PI、ジャガイモ2型PI、植物デフェンシン、動物デフェンシン、タンパク質毒素、キメラおよび融合タンパク質、ならびに緑色蛍光タンパク質（GFP）、28kDa、およびβ-グルクロニダーゼ（GUS）、68kDaのような指標タンパク質を含む。MGEVにおいて発現され得るタンパク質コードドメインの例は、ジャガイモ1型プロテイナーゼ阻害剤（Pot 1A）、植物種子デフェンシン、植物花デフェンシンなどの植物保護タンパク質、サソリ毒素、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）毒素、熱ショックタンパク質、ボーマン・バーク型トリプシン阻害剤、およびシスタチンなどの昆虫毒性ペプチド、ならびに緑色蛍光タンパク質（GFP）およびβ-グルクロニダーゼ（GUS）などのインジケータを含む。植物保護以外の目的のために経済的価値を有するタンパク質は、医学的使用に適する抗菌ペプチド、抗体フラグメント等を含む高い発現レベルを利用して、MGEVを用いて発現され得る。また大きなヘテロ二量体またはヘテロ多量体タンパク質は、同時および正しい比例発現を所望する場合のMGEV発現に特に適する。MGEVによってコードされる少なくとも1つのタンパク質は2型PIではない。MGEVは、植物細胞内の貯蔵液胞への輸送および貯蔵液胞における隔離を提供することにより、それらが発現される細胞に対して毒性であり得るタンパク質の発現のために特に有用である。
【００２８】
リンカー（L）は、各々の隣接ドメインを分離し、個々のドメインの間の翻訳後切断のためのペプチダーゼ感受性部位を露出させる、各ドメインの間に位置する短いペプチドである。アミノ酸配列-EEKKN(配列番号：5）はリンカーペプチドの一例である。他のアミノ酸配列、たとえばEとKがD（asp）もしくはR（arg）のような類似アミノ酸によって置換されている、またはN（asn）がQ（gln）によって置換されている配列はリンカーとして機能できる。コンセンサスリンカー配列は、X1X2X3X4X5［式中、X1はE（glu）またはD（asp）であり、X2はE（glu）またはD（asp）であり、X3はK（lys）またはR（arg）であり、X4はK（lys）またはR（arg）であり、およびX5はN（asn）またはQ（gin）である］（配列番号：17）として発現され得る。リンカーは、タンパク質分解切断部位（N-X）をMGEV-Pの外表面に対して露出させる高度親水性セグメントを提供する。任意の短い高度親水性ペプチドがMGEV-Pにおけるリンカーとして機能できる。本明細書において述べるリンカーペプチドは、リンカーによって連結されたドメインの翻訳後プロセシングがトランスジェニック植物におけるリンカー全体の除去を生じさせ得るので、好都合である(Heath, R.L. et al., (1995) Eur. J. Biochem. 230:250-257参照)。
【００２９】
シグナルペプチド（S）とも呼ばれるリーダーペプチドは、細胞内輸送のための輸送機能を果たす約10から約30個の主として疎水性のアミノ酸の配列である。多くのシグナルペプチドが当技術分野において公知である。任意の公知のシグナルペプチド、ならびに相同なアミノ酸が置換されているその修飾型がMGEV-Pにおいて使用できる。
【００３０】
液胞標的ペプチド（V）はMGEV-PのC末端に位置する。様々な液胞標的決定基が植物細胞に存在することは公知であり、たとえばMaruyama et al. Plant Cell (2006) 18:1253-1273参照。適切な液胞標的ペプチドは、多種多様な公知の候補物質から選択できる。また、適切なVセグメントは必ずしもMGEVのC末端に位置する必要はなく、原則として配列内の別の場所にも位置し得る。たとえばSとC2Nの間、C2NのN末端に結合し得る。1つの態様では、適切な配列は、公知のBP-80液胞ソーティング受容体に結合するものであり得る。BP-80に結合する任意のそのような液胞標的配列またはそのホモログは、MGEV-Pの成分として使用できる。適切な液胞標的配列のもう1つの例は、Millerら、前記、図1、NaPI-iv配列のアミノ酸258〜281（配列番号：2）に示されている。他の例は、NaD1のC末端プロペプチド（配列番号：14、アミノ酸27〜105およびPot1Aプロドメイン、配列番号：20）を含む。
【００３１】
クラスプセグメント、C2NおよびC2Cは、本明細書においてアミノ酸30〜48（C2N）および228〜257（C2C）、配列番号：6によって表わされる。ペプチドC2NおよびC2Cの折りたたまれた立体配置は互いが容易に結合するようになっており、結合によって形成されるヘテロ二量体は、その後、ペプチド間ジスルフィド架橋の形成によって共有結合的に安定化される。架橋［C2N：C2C］タンパク質はキモトリプシン活性を有し、本明細書において単にC2と称される。MGEV-P構造において、C2の形成は、C末端伸長、液胞標的ペプチドVを伴うMGEV-Pの環化を生じさせる。クラスプ構造は、プロテアーゼ特異性にかかわりなく、それらの間の高度の相同性のために、任意の2型阻害剤を使用して形成され得る。これらの阻害剤に共通する4アミノ酸配列PRNP（またはT5の場合はPKNP）の欠失は、クラスプペプチドの適切なN末端およびC末端セグメントを作製する。環状構造の形成はMGEV-Pの活性のために必要ではない。MGEV-Pの環状構造は効率的な細胞内輸送のために好都合であると考えられる。環状立体配置のさらなる利点は、それによって形成される付加的な阻害剤が昆虫損傷に対する有用な植物保護剤であることである。
【００３２】
C2NおよびC2Cの完全なまたは部分的欠失は、環状構造の形成を妨げ、線状立体配置を生じさせ得る。本発明は、MGEV-Pの線状および環状立体配置の両方を含む。線状MGEVは、大型タンパク質、大型と小型タンパク質の混合物、またはコンパクトな三次構造を欠くタンパク質を発現しようとする場合には常に好都合である。ある種の状況では、環状形態の代わりに線状MGEV-Pを使用することによって発現レベルを上昇させ得る。Sによる小胞体への標的およびVによる液胞標的は、先に述べたように起こり得る。線状MGEVは2つのドメインしか有することができない。線状MGEV-Pの翻訳後プロセシングは、個々の活性ドメイン（Dk）の放出を伴って、前述したように起こり得る。C2NおよびC2Cを欠く3つのタンパク質ドメインを有する線状MGEV-Pの図式を示すが、この図式ではC2NおよびC2Cの代わりにそれぞれ非特異的ペプチド、PNおよびPCが提供される。
S-PN-(LjDk)mLjPC-V
［式中、jは1、2、または4であり、kは1、2、または3であり、mは3である］。
【００３３】
PNおよびPCは、それぞれC2NおよびC2Cの修飾または部分的欠失型であり得る。好ましくは、C2NおよびC2Cは、線状3ドメインMGEVが図式的構造、
S-(DkLj)mDk＋1V
［式中、jおよびkは1または2であり、mは2である］
を有するように、完全に欠失している。
【００３４】
先に述べたように、VはC末端にある必要はなく、配列内の別の場所、たとえばSとDの間に位置し得る。
【００３５】
線状MGEV-Pは8個までの機能的タンパク質ドメインを有することができ、そのうちの少なくとも1個は2型プロテイナーゼ阻害剤ではない。環状MGEV-Pの場合と同様に、線状形態は液胞標的配列Vの欠失によって細胞から輸出され得る。
【００３６】
MGEVの構築は、指定された順序で核酸セグメントを組み合わせる公知の方法によって、DNA合成によって、または両方の方法の組合せによって実施できる。好都合な方法は、N.アラタからのNaPI-iv、配列番号：2 [Miller, (2000)前記、GenBankアクセッション番号AF105340]のような天然の2型PI多量体の成分を用いることである。2型PIではない対象となる機能的タンパク質ドメインをコードする一つまたは複数のオープンリーディングフレームを、適切なリンカーと共に天然の多量体に挿入し、それによって発現されるドメインの数を増加させることができ、または既存のドメインを欠失させ、その後、すべてのコードセグメントがあるセグメントから次のセグメントへと同じリーディングフレーム内に存在する限り、ドメインの総数を不変のままに維持するように所望のドメインをコードするセグメントを挿入することができる。MGEVにおいて発現され得るタンパク質コードドメインの例は、本明細書において例示するPot 1Aを含む、たとえば国際公開公報第2004/094630号に開示されているようなジャガイモ1型プロテイナーゼ阻害剤、植物種子デフェンシン、植物花デフェンシンなどの植物保護タンパク質、サソリ毒素、バチルス・チューリンゲンシス毒素、熱ショックタンパク質、ボーマン・バーク型トリプシン阻害剤およびシスタチンなどの昆虫毒性ペプチド、ならびに緑色蛍光タンパク質（GFP）およびβ-グルクロニダーゼ（GUS）などのインジケータを含む。植物保護以外の目的のために経済的価値を有するタンパク質は、医学的使用に適する抗菌ペプチド、抗体フラグメント等を含む高い発現レベルを利用して、MGEVを用いて発現され得る。また大きなヘテロ二量体またはヘテロ多量体タンパク質は、同時および正しい比例発現を所望する場合のMGEV発現に特に適する。
【００３７】
以下の実施例は、植物保護タンパク質をコードするMGEVの構築、MGEVによる植物形質転換、MGEVを含みMGEVを発現するトランスジェニック植物およびMGEV内にコードされる非ジャガイモ2型タンパク質の発現による植物害虫からの保護、および大型と小型タンパク質の混合物をコードするMGEVを明らかにする。これらの実施例は、主張される本発明を説明するために提示するものであり、本発明を限定しない。
【００３８】
MGEVは、植物形質転換ベクターに組み込まれたあと、植物または植物細胞において発現され得る。多くの植物形質転換ベクター、たとえばBIN19(Bevan, (1984) Nucl. Acid Res. 12:8711-8721)、pBI 121 (Chen, P-Y, et al., (2003) Molecular Breeding 11:287-293)、pHEX 22 (米国特許第7,041,877号)および本明細書において例示するベクターが周知であり、当業者に入手可能である。そのようなベクターは当技術分野において周知であり、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterim tumefaciens）などの細菌および植物細胞において複製するそれらの能力からしばしば「バイナリー」ベクターと呼ばれる。本明細書において例示するような典型的な植物形質転換ベクターは、形質転換される植物細胞において活性な、適切なプロモーターまたはターミネーター（以下「植物活性」プロモーターおよびターミネーター）配列の制御下でNPTIIのような選択マーカーを発現するための遺伝因子、適切な植物活性プロモーターおよび植物活性ターミネーター配列の発現制御下にあるMGEVを含む、対象となる遺伝子を挿入するための部位およびMGEVに隣接するT-DNA境界配列、および植物ゲノムへの遺伝子の組み込みを提供するための選択マーカーを含む。
【００３９】
植物は、A.ツメファシエンスの菌株、典型的には広く入手可能なLBA4404菌株を使用して形質転換される。所望のタンパク質をコードするMGEVを担持する植物形質転換ベクターを構築した後、ベクターは、LBA4404のようなA.ツメファシエンス菌株を形質転換するために使用される。その後、形質転換されたLBA4404は、形質転換する植物種に適した当技術分野で公知のプロトコールを用いて所望の植物細胞を形質転換するために使用される。形質転換された植物細胞を選択するため、選択された細胞の増殖および再生のための標準的な当技術分野で認識されているプロトコールが、トランスジェニック植物を得るために使用される。本明細書において実施例は、ワタ植物の形質転換と再生のために使用される方法および材料、ならびに様々なMGEVによって形質転換され様々なMGEVを発現するトランスジェニックワタ植物をさらに開示する。MGEVは、本明細書において例示するもの以外のいくつかの公知の方法のいずれかによって植物細胞に導入され得る。周知の方法の例は、マイクロプロジェクタイル法、電気穿孔法、および他の細菌またはウイルスを含む他の生物学的ベクターを含む。
【００４０】
MGEVは、任意の単子葉または双子葉植物における多重遺伝子発現のために使用できる。特に、有用な植物は、トウモロコシ、コムギ、イネ、オオムギ、ダイズ、およびサトウキビなどの食用作物、ならびにヒマワリおよびナタネなどの油料種子作物である。特に有用な非食用普通作物は、ワタ、アマ、および他の繊維作物を含む。花および観賞用作物は、バラ、カーネーション、ペチュニア、トルコキキョウ、ユリ、アイリス、チューリップ、フリージア、デルフィニウム、スターチス、およびペラルゴニウムを含む。
【００４１】
ベクター、キメラ遺伝子構築物等を細胞に導入するための手法は、CaCl2を用いた形質転換およびその変法、プロトプラストへの直接DNA取込み、プロトプラストへのPEG媒介性取込み、微粒子銃法、電気穿孔法、DNAの微量注入、組織外植体または細胞の微粒子銃法、核酸による組織の真空浸潤、およびアグロバクテリウムから植物組織へのT-DNAを介した導入を含むが、これらに限定されない。
【００４２】
細胞の微粒子銃法に関して、微粒子は、形質転換細胞を生産するために細胞内へと推進される。任意の適切な弾道（ballistic）細胞形質転換法および装置が本発明を実施する際に使用できる。例示的な手順は、Sanford and Wolf (米国特許第4,945,050号、同第5,036,006号、同第5,100,792号、同第5,371,015号)に開示されている。弾道形質転換法を使用するとき、遺伝子構築物は、形質転換する細胞内で複製可能なプラスミドに組み込むことができる。
【００４３】
そのような系における使用に適する微粒子の例は、0.1〜10μm、より詳細には10.5〜5μmのタングステンまたは金の球体を含む。DNA構築物は、沈殿などの任意の適切な手法によって微粒子上に沈着させ得る。
【００４４】
器官形成または胚形成のいずれかにより、その後クローン増殖可能な植物組織は、本明細書において例示するように、本発明のMGEVで形質転換し、それから完全な植物体を生成することができる。選択される特定組織は、形質転換される特定種のために利用可能であり、最も適切なクローン増殖系に依存して異なる。組織標的の例は、葉片、花粉、胚、子葉、胚軸、大形配偶体、カルス組織、既存の分裂組織（たとえば頂端分裂組織、腋芽および根分裂組織）、および誘導される分裂組織（たとえば子葉分裂組織および胚軸分裂組織）を含む。
【００４５】
再生された形質転換植物は、クローン増殖または古典的育種手法などの様々な手段によって増殖させ得る。たとえば第一世代（またはT1）を自家受粉させて同型接合の第二世代（またはT2）形質転換体を生成し、T2植物を、古典的育種法を通してさらに増殖させ得る。
【００４６】
従って、本発明のこの局面は、植物に関する限り、さらにMGEVの核酸を発現するように工作された植物の子孫、ならびに花（切り取られたまたは切断された花を含む）などの植物の生長、繁殖および生殖器部分、植物の部分、植物（たとえばワタ）からの繊維性物質、および挿し木、花粉、種子およびカルスを含む生殖器部分にまで及ぶ。
【００４７】
本発明のもう1つの局面は、遺伝子修飾された植物細胞または多細胞植物またはその子孫または本明細書において述べるようなMGEVによってコードされるタンパク質またはペプチドを生産することができる遺伝子修飾された植物の部分を提供し、該トランスジェニック植物は、該タンパク質またはペプチドの発現に関連して新しい表現型形質を獲得している。
【００４８】
本明細書において例示するMGEV構造およびMGEV発現ベクターを、それらが説明される実施例の番号と共に、表2に列挙する。配列番号表は表3に列挙する。
【００４９】
実施例1
1個の1型PIおよび3個のジャガイモ2型PIを有するMGEVの構築および発現
本実施例において述べるMGEV（MGEV-5）、配列番号：6は、
S-C2N-L1D1-L2D2-L3D3-L4-C2C-V
［式中、L1〜4はリンカーアミノ酸配列-EEKKN-配列番号：5をコードし、D1はジャガイモ2型トリプシン阻害剤、T1、配列番号：3；配列番号：1アミノ酸112〜164をコードし；D2はジャガイモ1型キモトリプシン阻害剤、ジャガイモPot 1A、配列番号：11(配列番号：5、塩基352〜376でもある)をコードし;D3は2型キモトリプシン阻害剤、C1、配列番号：2アミノ酸54〜106をコードし；C2N、配列番号：1アミノ酸31〜48、およびC2C、配列番号：1アミノ酸344〜373は、ジスルフィド架橋によって安定化されるヘテロ二量体C2を形成するように互いに相互作用するペプチドをコードし、架橋タンパク質はジャガイモ2型キモトリプシン阻害剤活性を有する。Sはシグナルペプチドをコードし、Vは液胞転位ペプチドをコードする］
と図式化される構造を有する。
【００５０】
前記で特定したセグメントによってコードされるアミノ酸配列は以下のソースにおいて説明される。
S-C2N-L1D1については、配列番号：2のアミノ酸1〜29(S);30〜48(C2N)；112〜164(D1) 
L2については、アミノ酸EEKKN、配列番号：5
D2については、（配列番号：11）［本明細書と矛盾しない限り参照により本明細書に組み入れられる、国際公開公報第2004/094630号 (2004年11月4日)配列番号：81も参照のこと］
L3D3については、配列番号：2のアミノ酸49〜106
L4C2CVについては、配列番号：2アミノ酸223〜257(L4C2C);および258〜281(V)。
【００５１】
多目的ベクターpRR19を構築した。ベクターは、NaPI-iv、配列番号：2、およびNaPI-ii、配列番号：1 から得た配列 [Miller (2000)、前記]に加えて新しい遺伝子の挿入のための制限部位を含んだ。全長MGEV-1配列を連続的にpRR19に組み込んだ。
【００５２】
ベクターpRR19は、所望の成分の組合せを有するMGEVへのリンカー（L）およびオープンリーディングフレーム（D）の好都合なモジュラー構築を可能にするように設計した。工程1として、NaPI-ivのそれぞれのNおよびC末端セグメント、具体的には S-C2N(配列番号：2アミノ酸1〜48)およびC2C-V(配列番号：2アミノ酸228〜281)を増幅し、Xho1制限部位を提供するためにポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用した。Xho1制限部位は、増幅されたセグメントがそれぞれ図式的構造S-C2NL1-Xho1およびXho1-C2C-Vを有するように、末端セグメントの間の所望のセグメントの連結を可能にするために提供された。切断および連結後、セグメントS-C2N-L1-Xho1-C2C-VをpGEM T-Easy(Promega, Madison, WI)ベクターにクローニングした。
【００５３】
その後、そのNおよびC末端にXho1部位を有する任意の所望のDNAセグメントを、生じたベクターのXho1部位に挿入し得る。
【００５４】
工程2として、並行する調製において、NaPI-iiのT1をコードするDNA(配列番号：1、アミノ酸112〜164)(MGEV-5ではD1位置にある)およびNaPI-ivのC1ドメインをコードするDNA（配列番号：2、アミノ酸54〜106)(MGEV-5ではD3位置にある)を、
Xho1-T1-L1-Xba1、およびXba1-C1-L1-Xho1
と図式化される付加した制限部位と共にPCR増幅した。
【００５５】
構築物の各々をpGEM T-easyベクターに別々にクローニングし、Xba1およびXho1で消化して、精製した。
【００５６】
前記工程からの修飾されたT1およびC1ドメインを、DNA連結反応混合物において最初の工程のXho1消化産物と組み合わせた。連結混合物を大腸菌（E. coli）XL1-Blue細胞（Stratagene, LaJolla, CA）に形質転換し、プロテイナーゼ阻害剤ドメインの所望の方向および順序を確認するために制限消化および配列決定を実施した。予測される連結反応は、以下の成分、
2009537155.tif 000003
をコードするDNAセグメントであった。
【００５７】
この連結産物は、制限消化物の電気泳動および配列解析によって確認されたように、
S-C2N-L1-Xho1-T1-L1-Xba1-C1-L1-Xho1-C2C-V
であった。
【００５８】
連結産物は、両末端にXba1制限部位を有することを条件として、任意の所望コード配列を挿入できるユニークXba1部位（下線を付している）を含んだ。記述した構築物を有するベクターをpRR19と称した。
【００５９】
D2ドメインに関しては、先に述べたPot 1AをコードするDNAを、C末端コード末端のリンカー（L）、次いで3’および5’末端にXba1制限部位と共に提供した。pRR19のXba1部位における挿入は構築物を生じ、次にそれを、MGEV-5を生成するためにpAM9に挿入した（pAM9はpDHAから修飾された、Tabe et al., Journal of Animal Science, 73: 2752-2759, 1995）。pAM9への挿入は、3’末端に35S CaMVプロモーターの結合および5’末端に35S CaMVターミネーターの結合を生じさせた。次にMGEV-5を、EcoR1部位でpBIN19に挿入し、図3に略図を示すベクターpHEX 29を生じさせた。図4Aも参照のこと。
【００６０】
MGEV-5内の制限部位の使用は、所望する場合は、開示されている表1のMGEV-5配列を作製するためのDNA合成を使用することによって回避できる。配列番号：6（DNA配列）および配列番号：12（推定アミノ酸配列）も参照のこと。
【００６１】
（表１）シグナルペプチド(塩基7〜93)、N末端クラスプペプチドドメイン(塩基94〜150(C2N)およびC末端クラスプペプチド778〜864)、(C2C)、T1ドメイン(塩基172〜330)、Pot 1A (塩基352〜576)、C1ドメイン(塩基598〜756)および液胞標的配列(塩基865〜939)
2009537155.tif 000004
【００６２】
ゴシピウム・ヒルスツム（Gossyipium hirsutum）のコーカー315品種の種子を次亜塩素酸ナトリウム（有効塩素2％）中で60分間表面滅菌し、次いで滅菌水中で数回洗浄した。滅菌した種子をワタ種子培地（CSM）［0.22% w/v MS (ムラシゲ・スクーグ塩混合物、Austratec M524)、0.05% w/v B5ビタミン(Sigma G1019)、1.5% w/vグルコース(Austratec G386)、0.2% w/v ゲランガムGelrite、Merck & Co.の商標、(Phyto Technology Laboratories)、pH 5.8］に植え付け、暗所にて30℃で10日間インキュベートした。pHEX29構築物で形質転換したA.ツメファシエンス(LBA4404)を、抗生物質カナマイシン（50μg/mL）を添加したLB培地25mlにおいて28℃で一晩増殖させた。550nmで吸光度を測定し、細胞をMS液体培地（0.43% w/vムラシゲ・スクーグ基本塩、pH 5.8）中で2×108細胞/mlに希釈した。ワタ胚軸を1.5〜2cmの断片に切断し、希釈したアグロバクテリウム培養物中に手早く混合した (0.5〜3分)。外植体を水切りし、滅菌ろ紙を重ね合わせた培地1（0.43% w/vムラシゲ・スクーグ塩混合物、0.1% v/v Gamborg's B5ビタミン溶液(Sigma)、0.1 g/Lミオイノシトール、0.9 g/L MgCl2(六水和物)、1.9 g/L硝酸カリウム、0.2% w/v Gelrite、3% w/vグルコース、pH 5.8）に移し、光下にて26℃で3日間インキュベートした。
【００６３】
共培養後、外植体を培地2（培地1プラス0.1 mg/Lキネチン、0.1 mg/L 2,4-D、500 mg/Lカルベニシリン、35 mg/Lカナマイシン）に移し、弱光下で30℃に保持した。4週間後、外植体を培地3（培地1プラス500 mg/Lカルベニシリン、25 mg/Lカナマイシン）に移し、弱光下で30℃に保持した。外植体とカルスを4週間ごとに培地3で継代培養し、弱光下で30℃に保持した。胚を組織から切り出し、培地4（1.2 mM CaCl22H2O、5.0 mM KNO3、2.0 mM MgSO47H2O、3.0 mM NH4NO3、0.2 mM KH2PO4、4μMニコチン酸、4μMピリドキシンHCl、4μM チアミンHCl、30μM H3BO3、30μM MnSO4H2O、9μM ZnSO47H2O、1.5μM KI、0.9μM Na2MoO42H2O、0.03μM CuSO45H2O、0.03μM CoCl26H2O、15μM FeNaEDTA、0.5% w/vグルコース、0.3% w/vゲランガムGelrite、pH 5.5）において発芽させて、強光下で30℃に保持した。
【００６４】
次に、発芽した胚を、培地4を含むマゼンタ（Magenta）箱に移し、強光下で30℃に保持した。ひとたび植物が良好な根系を形成し、いくつかの新しい葉を生産すれば、ポット内土壌に移し、28℃の育成キャビネット（growth cabinet）において順化させ、次いで（27〜29℃昼間、20〜24℃夜間）の温室で成長させた。
【００６５】
PCR分析
DNA単離：ワタ葉片(0.5〜0.7cm)を、葉脈を避けながら2番目の完全展開葉から採取した。REDExtract-N-Amp Plant PCRキット（Sigma）からの抽出溶液(100μl)を各々の葉片に添加して、確実に組織が完全に浸されるようにした。試料を加熱ブロック上で95℃に10分間加熱した後、ボルテックスした。希釈溶液（100μl,Sigma）を添加し、試料を十分にボルテックスして、氷上に置いた。
【００６６】
PCR反応混合物は以下の成分からなった：10μl PCR ready mix（REDExtract-N-Amp, Sigma）、0.8μlフォワードプライマー、0.8μlリバースプライマー、2.8μl H2O、4μl DNA抽出物（前記より）。PCR条件は、94℃、4分間、次いで94℃、30秒間、62℃、30秒間、72℃、1分間の33サイクル、次いで72℃、10分間であった。試料は4℃で保存した。
プライマー：
2009537155.tif 000005
【００６７】
トランスジェニックワタにおけるNaPIおよびStPot1Aの検出
ELISA
タンパク質抽出物：育成キャビネットまたは温室のいずれかで成長させた植物から葉を切り出した。組織（100mg）を液体窒素中で凍結し、ミキサーミル(Retsch MM300)において周波数30で15秒間ずつ2回摩砕した。2%不溶性PVP(Polyclar)/PBS/0.05% Tween 20を1 mL添加した後、20秒間ボルテックスした。試料を10分間遠心分離し、上清を収集した。
【００６８】
ELISAプレート(Nunc Maxisorp #442404)をPBS中100μL/ウェルの一次抗体で被覆する。
【００６９】
100ng/ウェルの抗NaPI（ポリクローナル抗体は、柱頭から単離した精製NaPIペプチドに対して標準的方法によって作製した）または抗Pot 1A（大腸菌においてC1との二量体として発現させ、その後切断して別々に精製した、Pot 1Aに対して作製した抗体）を、湿潤箱において4℃で一晩インキュベートした。プレートをPBS/0.05% Tween 20で2分間ずつ4回洗浄する。プレートをPBS中200μL/ウェルの3% BSA(Sigma A-7030:98% ELISAグレード)でブロックする。25℃で2時間インキュベートする。プレートをPBS/0.05% Tween 20で2分間ずつ4回洗浄する。抗NaPI抗体はN.アラタのTおよびCプロテアーゼ阻害剤に結合する。
【００７０】
100μL/ウェルのワタタンパク質抽出物（PBS/0.05% Tween 20で希釈）を適用する。25℃で2時間インキュベートする。プレートをPBS/0.05% Tween 20で2分間ずつ4回洗浄する。PBS中100μL/ウェルの二次抗体（50ng/ウェルのビオチン標識化NaPI抗体、200ng/ウェルのビオチン標識化Pot 1A抗体）を適用する。25℃で1時間インキュベートする。ビオチン標識抗体は、EZ-リンクスルホ-NHS-LC-ビオチニル化キット (Pierce)を用いて生成する。プロテインA精製抗体2 mlおよびビオチン試薬2 mgを使用する。
【００７１】
プレートをPBS/0.05% Tween 20で2分間ずつ4回洗浄する。PBS中100μL/ウェルのNeutriAvidin HRP-コンジュゲート（Pierce #31001；1:1000希釈；0.1μL/ウェル）を適用する。25℃で1時間インキュベートする。
【００７２】
プレートをPBS/0.05% Tween 20で2分間ずつ4回、次にH2Oで2分間ずつ2回洗浄する。使用直前に、ImmunoPure OPD(Pierce #34006)1錠をH2O 9 mLに溶解することによって基質を調製し、その後安定過酸化物緩衝液(10×, Pierce #34062)1mLを添加する。100μL/ウェルの基質を添加する。呈色するまで25℃でインキュベートする。2.5M硫酸50μLで反応を停止する。プレートリーダー(Molecular Devices, Milenia Kinetic Analyzer)において490 nmで吸光度を測定する。
【００７３】
免疫ブロット分析
育成キャビネットまたは温室のいずれかで成長させた植物から葉を切り出した。葉組織（100mg）を液体窒素中で凍結し、ミキサーミル(Retsch MM300)において周波数30で15秒間ずつ2回、微細な粉末に摩砕した。粉末を2×試料緩衝液（300μl、Novex NuPAGE LDS試料緩衝液、10% v/vβ-メルカプトエタノール）に添加し、30秒間ボルテックスして、5分間煮沸し、その後14,000 rpmで10分間遠心分離して、上清をSDS-PAGEのために保持した。あるいは、粉末をアセトン1mlに添加し、十分にボルテックスして、14,000 rpm (18,00Og)で2分間遠心分離し、上清を廃棄した。ペレットを、十分にボルテックスすることによって2% Polyclar AT（水溶性ポリビニルポリピロリジン）を有するIP溶解緩衝液(5OmM Tris pH 8、5mM EDTA、15OmM NaCl、0.1% Triton X-100)300μlに再懸濁し、14,000 rpmで10分間遠心分離した後上清を収集した。SDS-PAGEによる分析のために、1×試料緩衝液(Novex NuPAGE LDS試料緩衝液) 中の試料30μlおよび5% v/vβ-メルカプトエタノールを使用した。
【００７４】
抽出した葉タンパク質を、Novex X Cell IIミニセル電気泳動装置において200Vで35分間、あらかじめ形成しておいた4〜12% w/vポリアクリルアミド勾配ゲル(Novex, NuPAGE bis-tris、MES緩衝液)でのSDS-PAGEによって分離した。前染色した分子量マーカー(Novex SeeBlue Plus 2)を標準品として含めた。10% v/vメタノールを有するNuPAGE転写緩衝液中、Novex X Cellミニセル電気泳動装置を使用して30Vで60分間、タンパク質をニトロセルロース膜(Osmonics 0.22ミクロンNitroBind)に移した。転写後、膜をイソプロパノール中で1分間インキュベートし、その後TBS中で5分間洗浄した。
【００７５】
膜を3% w/v BSA中室温で1時間ブロックし、その後一次抗体と共に室温で一晩インキュベートした (NaPI抗体:1 mg/mlストックのTBS/1%BSA中1:2000希釈、Pot 1A抗体:1 mg/mlストックのTBS/1%BSA中1:1000)。膜をTBST中で10分間ずつ5回洗浄した後、ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合したヤギ抗ウサギIgG(Pierce, TBS中1:100,000希釈)と共に室温で60分間インキュベートした。さらに10分間ずつ5回のTBST洗浄を実施した後、製造者の指示に従ってSuperSignal West Pico Chemiluminescent基質(Pierce)と共に膜をインキュベートした。膜をECL Hyperfilm (Amersham)に露光した。
【００７６】
結果
2つの実験（CT 89およびCT 90)から、本発明者らは86の潜在的トランスジェニック植物を生成した。すべての植物を、nptプライマーおよびStPotIAプライマーを使用したPCRによってスクリーニングした。npt IIに関して陽性の植物を、ELISAによってNaPIタンパク質発現に関して評価した。38植物が検出可能なレベルのNaPIを発現していた (図4)。
【００７７】
89.5.1系統を自家受粉させ、T2子孫の種子を成長させて、植物をELISAによってNaPI発現に関して評価した。27植物のうち20（74%）がNaPIを発現しており、7植物（26%）は無効（null）分離個体であり（図4C）、遺伝子が次の世代に遺伝性に導入されたことを明らかにした。
【００７８】
NaPI抗体を使用した選択系統の免疫ブロット分析は、前駆体タンパク質およびプロセシングされたペプチドが存在したことを確認した（図4Dおよび4E）。しかし、PotIの検出は成功せず、アッセイにおける検出感受性が十分ではなかったことを示唆した。
【００７９】
結果は、少なくとも1個が2型プロテアーゼ阻害剤ではない4個のペプチドをコードするMGEVが従来の方法を用いて構築でき、任意の成分DNAセグメントに由来するものとは異なる種の植物（ワタ）を成功裏に形質転換するために使用できることを明らかにする。コードされるタンパク質は、予想される大きさの成分ペプチドを生成するように発現され、翻訳後プロセシングされる。
【００８０】
実施例2
1個の1型PIおよび2個のジャガイモ2型PIを有する線状MGEVの構築および発現
この実施例で述べるMGEV（MGEV-8）は、
S-D1L1D2L2D3L3-V
［式中、D1はNaPI-iiのT1−配列番号：2、アミノ酸112〜164であり、
D2はジャガイモPot 1A-配列番号：11であり、
D3はC1または配列番号：2のアミノ酸200〜252であり、
L1およびL2およびL3は各々EEKKN（配列番号：5）であり、
SはNaPI-ivのシグナルペプチド−配列番号：2、アミノ酸1〜29であり、
ならびにVはNaPI-ivの液胞標的ペプチド−配列番号：2、アミノ酸258〜281である］
と図式化される構造を有する。線状MGEV（MGEV-8）（図6A）は以下のように構築した。NaPI-ivのシグナル配列、配列番号：2、アミノ酸1〜29を、5’末端のBam H1部位および3’末端のXho 1部位と共にPCR増幅した。NaPI-ivの液胞標的ペプチドを5’末端のXho 1部位および3’末端のSal 1部位と共にPCR増幅した。これらのDNAフラグメントを、Bam H1およびSal 1で切断したpAM9に共に連結した（実施例1参照）。
【００８１】
Xho 1に隣接するT1-Xba 1-C1フラグメントを多目的ベクターpRR20 (実施例3参照)から切断し、上述したS-Xho 1-V構築物に連結して、S-Xho 1-T1-Xba 1-C1-Xho 1-V構築物を結果として生じた。この線状多目的ベクターをpSP1と称した。
【００８２】
ジャガイモPot 1Aの成熟ドメイン(実施例1参照)を3’末端のEEKKNリンカー配列（配列番号：5）および両末端のXba 1部位と共にPCR増幅した。次にこれをpSP1のXba 1部位に連結してMGEV-8(図6A)を生成した。MGEV-8をpBIN19に挿入して、図5に略図を示すベクターpHEX 56を生成した。
【００８３】
ワタ子葉における一過性発現
pHEX56をA.ツメファシエンスに導入し、ワタ子葉に関する一過性アッセイによってT1、C1、およびPot 1Aの発現を測定した。アグロバクテリウムの細菌「層（lawn）」を選択プレートに塗布し、暗所にて30℃で3日間増殖させた。その後細菌を浸潤緩衝液（10mM塩化マグネシウムおよび10μMアセトシリンゴン（DMSO中の0.1Mストック）中に1.0のOD600に再懸濁し、室温で2〜4時間インキュベートした。ワタ植物を温度調節された育成キャビネット（25℃、16時間/8時間の明/暗サイクル）において8日間成長させた。1mLシリンジを葉に静かに押し付け、葉腔（leaf cavity）をアグロバクテリウム懸濁液で満たすことによって、子葉の裏側を浸潤させた。浸潤領域（黒ずみによって示される）が葉の上側に認められた。子葉当たり最大4つの浸潤を実施した。植物をさらに4日間成長させた。その後浸潤領域を切り取り、秤量して、液体窒素中で凍結した。実施例1で述べたようにタンパク質発現をELISAおよび免疫ブロット法によって測定した。
【００８４】
結果
NaPI（図6B）およびPot 1A（図6C）をワタ子葉においてELISAによって検出した。NaPI抗体を使用した免疫ブロット分析は、前駆体タンパク質およびプロセシングされたペプチドが存在したことを確認した（図6D）。
【００８５】
結果は、実施例1からの先の結論を確認し、加えて、Pot 1Aの発現を明らかにする。結果はまた、一次MGEV発現産物の環化は、予測される成分ペプチドを産生するためのプロセシングに必要ではないことを示す。
【００８６】
実施例3
1個のデフェンシンおよび3個のジャガイモ2型PIを有するMGEVの構築および発現
注記：実施例3〜16において、リンカーペプチド（L）を、図式を簡略化するためにMGEV図式から省略する。
【００８７】
この実施例で述べるMGEV（MGEV-6）は、
2009537155.tif 000006
と図式化される構造を有する（図8Aも参照のこと）。
【００８８】
1個のデフェンシンおよび3個のジャガイモ2型PIを発現するMGEV-6を、改変した多目的ベクター（pRR20）を使用し、Pot 1Aの代わりにデフェンシンコード配列を挿入したことを除き、本質的にMGEV-5（実施例1）について述べたように構築した。デフェンシンは、成熟デフェンシンドメインを有するがC末端酸性ペプチド尾部を欠き、N末端シグナルペプチドを有さない、米国特許第7,041,877号および本明細書においては配列番号：14、アミノ酸26〜72に記載されているNaD1であった。
【００８９】
改変多目的ベクター（pRR20）は、Xho1-T1-L1-XbaI DNAフラグメントのEEKKNリンカー(配列番号：5)(L1)においてNをコードするコドンがAATからAAC、配列番号：12に変化したことを除き、実施例1で述べた多目的ベクター(pRR19) と同じである。これは、pRR19において存在した望ましくないEco R1制限部位を欠失させた。
【００９０】
NaD1 DNAをpRR20のXba 1部位に連結し、その後Bam H1およびSal 1で切り出して、完全なフラグメントをpAM9に挿入し、MGEV-6を生成した。次にMGEV-6をpBIN19に挿入して、図7に略図を示すベクターpHEX31を生成した。
【００９１】
ワタの形質転換
pHEX31によるワタの形質転換を実施例1で述べたように実施した。
【００９２】
タンパク質の検出
タンパク質発現を、実施例1で述べたようにELISAによって測定した。一次NaD1抗体および二次NaD1-ビオチン抗体を50ng/ウェルで使用した。
【００９３】
免疫ブロット分析を、実施例2で述べた修正を加えて実施例1で述べたように実施した。一次NaD1抗体を1mg/mlストックから1:1,000希釈で希釈し、二次抗体（ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合したヤギ抗ウサギIgG）は1:50,000希釈で使用した。
【００９４】
結果
1つの実験（CT 93）から88の潜在的トランスジェニック植物を生産した。すべての植物を、nptIIプライマーおよびNaD1に特異的なプライマーを使用したPCRによってスクリーニングした。57の植物がnpt II遺伝子の存在に関して陽性であり、これらの植物のうち33個体がNaD1遺伝子も担持していた。PCR陽性植物を、ELISAによってNaPIおよびNaD1タンパク質発現に関して評価した。13の一次トランスジェニック植物が検出可能なレベルのNaPIおよびNaD1を発現していた。
【００９５】
3つのトランスジェニック系統（93.4、93.36、および93.279）をさらなる試験のために選択した。一次トランスジェニック系統を自家受粉させ、T2種子を収集した。これらの系統のうち2つ(93.4および93.279)からのT2植物を、NaPI発現(図8B、8D)およびNaD1発現(8C、8E)に関してELISAによって評価した。両方の系統が、導入された遺伝子と一致する分離集団をメンデル型に生成した。
【００９６】
NaPI抗体を使用した93.4および93.36系統の免疫ブロット分析は、前駆体タンパク質およびプロセシングされたペプチドが存在したことを確認した (図8F)。NaD1抗体による93.4系統のさらなる分析は、低レベルではあるが成熟NaD1タンパク質が存在したことを確認した(図8G)。
【００９７】
結果は、プロテアーゼ阻害剤（NaD1、デフェンシン）以外のタンパク質を同時に発現するためのMGEVの有用性を明らかにする。
【００９８】
実施例4
1個のGFPおよび3個のジャガイモ2型PIを有するMGEVの構築および発現
この実施例で述べるMGEV（MGEV-7）は、
2009537155.tif 000007
と図式化される構造を有する（図10Aも参照のこと）。
【００９９】
MGEV-7は、Pot 1Aの代わりに緑色蛍光タンパク質（GFP）をコードするDNA配列が挿入されたことを除き、MGEV-5（実施例1）と類似の構造を有する。このGFPは、高等植物における使用のための緑色蛍光タンパク質（GFP）の可溶性で高度に蛍光性の変異体である(Davies, SJ and Vierstra, RD: Plant Mol. Biol. 36(4): 521-528 (1998))。DNAはTAIR (the Arabidopsis information resource)から入手した(配列番号：13)。配列情報はGenbankアクセッション番号U70495から入手可能であり、本明細書においては配列番号：13に示されている。
【０１００】
MGEV-7の構築のために、3番目の多目的ベクター(pRR21)を使用した。これは、NaPI-ivのC1ドメインをコードするDNAを3’末端の追加EEKKNリンカー配列（配列番号：5）と共にPCR増幅し、Xba1-L-C1-L-Xho1 DNAフラグメントを生じさせたことを除き、pRR20と同じように作製した。pRR21は以下の構造：S-C2N-L-Xho1-T1-L-Xba1-L-C1-L-Xho1-C2C-Vを有する。加えて、この構築物をpAM9に挿入した後、さらなる挿入を行った。GFPをコードするDNA配列をXba1末端(3’リンカー配列なし)と共にPCR増幅し、pRR21のT1とC1の間のXba1部位に挿入して、MGEV-7を生成した。MGEV-7をpBIN19に挿入して、図9に略図を示すベクターpHEX 46を生成した。
【０１０１】
タバコの葉における一過性発現
pHEX 46をA.ツメファシエンスに導入し、T1、C1、およびGFPの発現をタバコの葉に関する一過性アッセイによって測定した。この方法は、ベンタミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）植物を温度調節された育成キャビネット（25℃、16時間/8時間の明/暗サイクル）において5週間成長させたことを除き、本質的にワタ子葉に関して実施例2で述べた方法であった。葉の裏側を（上端から4〜6節、最大幅6〜10cm）、1mLシリンジを静かに押し付け、葉腔をアグロバクテリウム懸濁液で満たすことによって浸潤させた。各葉に4〜6の浸潤を作製した。植物をさらに4日間成長させた。その後浸潤領域を切り取り、秤量して、液体窒素中で凍結した。タンパク質発現を実施例1で述べたように免疫ブロット法によって測定した。
【０１０２】
ワタ子葉における一過性発現
pHEX 46の発現を、実施例2で前述したようにワタ子葉に関する一過性アッセイにおいても測定した。
【０１０３】
タンパク質検出
NaPIの発現を実施例1で述べたようにELISAによって測定した。
【０１０４】
免疫ブロット分析を、実施例2で述べた修正を加えて実施例1で述べたように実施した。
【０１０５】
顕微鏡検査
A.ツメファシエンスによる浸潤の3日後、N.ベンタミアナおよびワタ植物を24時間暗所に置いた。次に浸潤葉領域を取り除き、表皮ピール（約5mm2）を調製した。小さな断片（表皮または中胚葉組織1〜2mm2）を、封入媒質としての水と共にスライドガラス上に置いた。カバーガラスを上に載せ、高温ろうで密封した。切片を、Olympus BX50蛍光顕微鏡を用いてGFP蛍光に関して検査した。W1Bフィルター(励起範囲460〜490nm)を蛍光励起のために使用し、515nm以上のシグナルを検出するロングパスフィルターを発光のために使用した。GFP蛍光をまた、Leica TCS SP2共焦点レーザー顕微鏡を使用して検査した。アルゴンレーザー励起波長は488nmであった;GFP発光をFITCのためのフィルターセット(505〜530nm)で検出した。
【０１０６】
結果
タバコの葉およびワタ子葉の両方に関するいくつかの一過性アッセイを実施した。NAPIをワタ子葉においてELISAによって検出した（図10B）。NaPI抗体を用いた免疫ブロット分析は、プロセシングされたペプチドがワタ子葉に存在したことを確認した（図10C）。
【０１０７】
一過性発現後のタバコ葉抽出物の免疫ブロット分析は、GFPタンパク質が存在したことを確認した（図10D）。GFPおよびNaD1抗体はどちらも、pHEX 46によってコードされる前駆体タンパク質の予想された大きさと一致する約50kDaのタンパク質に結合した。GFP抗体はまた、細菌において発現されるGFPと同じ大きさであり、したがってpHEX 46によってコードされる前駆体からタンパク質分解によって切り出されたGFPである、約28kDaのタンパク質を明らかにした。
【０１０８】
ワタ葉の表皮細胞におけるMGEV-7の一過性発現から生産されたGFPは液胞内に位置した（図10E）。これは、液胞標的ペプチド（V）が欠失していることを除いてMGEV-7と同一であった構築物（MGEV-7A）から生産されたGFP蛍光と対照的であった（実施例7参照）。MGEV-7Aの一過性発現は、GFP蛍光の細胞外局在を生じさせた（図10F）。
【０１０９】
結果は、種々異なる大きさのタンパク質がMGEVを使用してポリタンパク質として発現され、個々のタンパク質成分を産生するように正しく翻訳後プロセシングされ得ることを明らかにする。本実施例において、約6kDaから約28kDaに及ぶ大きさの4個のタンパク質が共に有効に発現され、正しくプロセシングされた。1個の液胞標的配列が、プロセシングの前に各々の発現されたタンパク質の細胞液胞への転移を生じさせた。MGEVにおけるGFPの使用は、したがって、MGEVにおいて共発現されるタンパク質の細胞内位置を示す好都合な手段である。
【０１１０】
実施例5
1個のデフェンシン、1個の1型PI、および3個のジャガイモ2型PIを有するMGEVの構築および発現
この実施例で述べるMGEV（MGEV-9）は、
2009537155.tif 000008
と図式化される構造を有する（図12Aも参照のこと）。
【０１１１】
6個のタンパク質、1個のデフェンシン、2個のジャガイモ1型PI、および3個のジャガイモ2型PIを発現するMGEV-9を、以下の方法を用いて構築した。NaD1を実施例3のように生成した。Pot 1A二量体をスプライスオーバーラップPCR（splice overlap PCR）によって構築した。最初のPot 1Aを5’XbaI部位および3’リンカー配列と共にPCR増幅した。第二のPot 1Aは、両末端のリンカー配列および3’XbaI部位と共にPCR増幅した。2個のPCRフラグメントを互いにアニーリングし、8サイクル伸長させた；次に、二量体配列をPCR増幅するために外側プライマーを付加した。NaD1およびPot 1A二量体フラグメントを3方向連結でpSP1（実施例2）のXba 1部位に挿入した。新しいより大きなフラグメント（T1-NaD1-Pot 1A-Pot 1A-C1）をXho 1部位で切断してMGEV-9を生成した。MGEV-9をpBIN19に挿入して、図11に略図を示すベクターpHEX55を生成した。
【０１１２】
ワタ子葉における一過性発現
pHEX55の発現を、実施例2で前述したようにワタ子葉に関する一過性アッセイにおいて測定した。
【０１１３】
タンパク質検出
NaPIの発現を実施例1、2、および3で述べたようにELISAによって測定した。
【０１１４】
免疫ブロット分析を、実施例2で述べた修正を加えて実施例1で述べたように実施した。
【０１１５】
結果
NaPI（図12B）、NaD1（図12C）、およびPot 1A（図12D）がワタ子葉においてELISAによって検出された。NaPI抗体を使用した免疫ブロット分析は、前駆体タンパク質およびプロセシングされたNaPI 6kDaペプチドが存在したことを確認した（図12E）。
【０１１６】
結果は、6ドメイン環状MGEVにおけるいくつかの異なるタンパク質の同時発現および正しいプロセシングを明らかにする。
【０１１７】
実施例6
植物組織においてタンパク質を細胞外間隙に標的するMGEVの構築および発現
この実施例で述べるMGEVは、
2009537155.tif 000009
と図式化される構造を有する（図14A、MGEV 10参照）。
【０１１８】
このMGEV（MGEV-10）は、NaPI液胞標的ペプチド（V）を有さず、多目的ベクターpRR20を使用した（実施例3）ことを除いて、MGEV-7（実施例4）と本質的に同じであった。pRR20を、液胞標的ペプチド（V）を除外したリバースプライマーを用いてPCR増幅した。次にXba I隣接GFPをXba I部位に連結した。GFPの詳細は実施例4に示されている。次にフラグメント（S-C2N-T1-GFP-C1-C2C）をpAM9に挿入してMGEV-10を生成した。その後MGEV-10をpBIN19に挿入して、図13に略図を示すベクターpHEX45を生成した。
【０１１９】
一過性発現アッセイ
pHEX45の発現を、実施例4で述べたようにタバコの葉およびワタ子葉に関する一過性アッセイにおいて測定した。タンパク質発現を実施例4で述べたように免疫ブロット法によって測定した。2個の非MGEV構築物、C1およびC2（図14A）を対照として使用した。これらの構築物は、MGEV構築物と同じプロモーターおよびターミネーターを使用し、植物細胞における発現のために同じベクターにクローニングされた。C1のコード配列は、MGEVからのシグナル配列（S）とGFPを含んだ。2番の対照構築物（C2）は、MGEVからの小胞体シグナル配列（S）および液胞標的配列（V）とGFPをコードした。植物組織におけるGFPの位置は、実施例4で述べたように顕微鏡検査によって確認した。
【０１２０】
結果
タバコの葉に関するいくつかの一過性アッセイを実施した。一過性発現後のタバコ葉抽出物の免疫ブロット分析は、GFPタンパク質が両方の対照構築物（C1およびC2）から生産され、28kDaの細菌において発現されるGFPと同じ大きさであったことを確認した（図14F）。加えて、C2構築物は、GFPプラス液胞標的配列（V）に対応するもう1つのわずかにより大きいタンパク質を生産した。GFP抗体は、MGEV-7およびMGEV-10を発現していた葉からの抽出物において約50kDaおよび28kDaのタンパク質を検出した。50kDaタンパク質はまた、MGEVによってコードされるプロセシングされていない産物について予想されたように、NaPI抗体に結合した。遊離GFPに対応する28kDaタンパク質の存在は、個々のPIおよびGFPドメインを放出するMGEV内のリンカーのプロセシングと一致する。
【０１２１】
ワタ葉の表皮細胞におけるMGEV-7の一過性発現から生産されたGFPは液胞内に位置した（実施例4、図10E）。これは、液胞標的ペプチド（V）が欠失していたことを除いてMGEV-7と同一である構築物（MGEV-10）から生産されたGFP蛍光と対照的であった。MGEV-10からの一過性発現は、GFP蛍光の細胞外局在を生じさせた（実施例4、図10F）。
【０１２２】
GFPはまた、MGEV-10がN.ベンタミアナの葉において一過性に発現されたとき細胞外に方向づけられた。図14B、C、D、およびEは、MGEV-10およびGFPとシグナルペプチドだけをコードする対照構築物（C1）がN.ベンタミアナにおいて発現されたときに得られた共焦点画像を示す。どちらの構築物も液胞標的配列（V）を欠き、したがってGFPは表皮および葉肉細胞両方の外に分泌され、液胞には差し向けられなかった。
【０１２３】
結果は、実施例4で得た結果を確認し、拡充する。GFPの液胞標的は、標的配列がGFPタンパク質またはプロセシングされていないMGEVタンパク質に直接結合しているかどうかにかかわりなく認められた。
【０１２４】
実施例7
CTPPと1個のデフェンシンおよび3個のジャガイモ2型PIを有するMGEVの構築および発現
この実施例で述べるMGEV（MGEV-11）は、
2009537155.tif 000010
と図式化される構造を有する（図16Aも参照のこと）。
【０１２５】
1個のデフェンシンおよび3個のジャガイモ2型PIを発現するMGEVを、NaD1デフェンシンがC末端酸性ペプチド尾部を含むことを除いて、本質的にMGEV-7（実施例4）について述べたように構築した。NaD1 CTPP、配列番号：14、アミノ酸26〜105を多目的ベクターpRR21（実施例4）のXba 1部位に挿入してMGEV-11を生成した。次にMGEV-11をpBIN19に挿入して、図15に略図を示すベクターpHEX42を生成した。
【０１２６】
ワタ子葉における一過性発現
pHEX42の発現を、実施例2で述べたようにワタ子葉に関する一過性アッセイにおいて測定した。
【０１２７】
タンパク質検出
タンパク質発現を、実施例4で述べたようにELISAおよび免疫ブロット法によって測定した。
【０１２８】
結果
NaPI（図16B）およびNaD1（図16C）の両方が、pHEX42でトランスフェクトしたワタ子葉においてELISAによって検出された。NaPI抗体を使用した免疫ブロット分析は、前駆体タンパク質およびプロセシングされたNaPI 6kDaペプチドが存在したことを確認した（図16D）。前駆体タンパク質およびNaD1タンパク質はまた、NaD1抗体によっても検出することができた（図16E）。プロセシングされたタンパク質は成熟NaD1タンパク質についての正しい大きさ（約6kDa）であり、CTPP尾部が正しくプロセシングされていたことを示した（図16E）。
【０１２９】
結果は、MGEVの液胞標的配列に加えて、それ自体の液胞標的配列（CTPP）を有するNaD1の発現と正しいプロセシングを明らかにする。
【０１３０】
実施例8
2個の1型PIおよび3個のジャガイモ2型PIを有するMGEVの構築および発現
この実施例で述べるMGEVは、
2009537155.tif 000011
と図式化される構造を有する（図18A参照）。
【０１３１】
2個のジャガイモ1型PIおよび3個のジャガイモ2型PIを発現するMGEVを、pSP2（実施例6）を使用して構築した。Pot 1A二量体を実施例5で述べたように生成し、pSP2に挿入してMGEV-12を生成した。次にMGEV-12をpBIN19に挿入して、図17に略図を示すベクターpHEX33を生成した。
【０１３２】
ワタ子葉における一過性発現
pHEX33の発現を、実施例2で述べたようにワタ子葉に関する一過性アッセイにおいて測定した。
【０１３３】
タンパク質検出
タンパク質発現をELISAによって測定した。
【０１３４】
結果
NaPI（図18B）およびPot 1A（図18C）の両方が、pHEX 33でトランスフェクトしたワタ子葉においてELISAによって検出された。pHEX29（1コピーの遺伝子だけを有する）を使用したPot 1Aの発現は一過性アッセイにおいて検出できなかったので（データは示していない）、Pot 1Aの発現は有意であった。
【０１３５】
結果は、Pot 1AがMGEVにおいて発現され、他のタンパク質と共に正しくプロセシングされることを示す。
【０１３６】
実施例9
2個のデフェンシンおよび3個のジャガイモ2型PIを有するMGEVの構築および発現
この実施例で述べるMGEVは、
2009537155.tif 000012
と図式化される構造を有する（図20A参照）。
【０１３７】
1個のクラス1デフェンシン（NaD2）、配列番号：15および16、1個のクラス2デフェンシン（NaD1）、配列番号：14、アミノ酸26〜72、ならびに3個の2型PIを発現するMGEVを、GFPの代わりに2個のデフェンシンを挿入したことを除いて本質的にMGEV-7（実施例4）について述べたように構築した（クラス1およびクラス2デフェンシンの定義についてはLay, F.T., et al., (2005), Current Proteins and Peptide Science 6:85-101参照）。NaD1は実施例3に述べられている。NaD2-NaD1二量体をスプライスオーバーラップPCRによって構築した。NaD2を5’Xba I部位および3’リンカー配列と共にPCR増幅した。NaD1を5’末端および3’Xba I部位でリンカー配列と共にPCR増幅した。2個のPCRフラグメントを互いにアニーリングし、8サイクル伸長させた；次に、二量体配列をPCR増幅するために外側プライマーを付加した。NaD2-NaD1二量体をpRR21に挿入してMGEV-13を生成した。次にMGEV-13をpBIN19に挿入して、図19に略図を示すベクターpHEX39を生成した。
【０１３８】
ワタ子葉における一過性発現
pHEX39の発現を、実施例2で述べたようにワタ子葉に関する一過性アッセイにおいて測定した。
【０１３９】
タンパク質検出
タンパク質発現を実施例3で述べたようにELISAによって測定した。
【０１４０】
結果
NaPI（図20B）およびNaD1（図20C）の両方が、pHEX39でトランスフェクトしたワタ子葉においてELISAによって検出された。
【０１４１】
結果は、複数の植物保護タンパク質を同時に発現するためにMGEVを使用することの有用性を明らかにする。
【０１４２】
実施例10
2個の1型PIおよび2個のジャガイモ2型PIを有する線状MGEVの構築および発現
この実施例で述べるMGEVは、
S-T1-Pot 1A-Pot 1A-C1-V
と図式化される構造を有する（図22A参照）。
【０１４３】
2個のジャガイモ1型PIおよび2個のジャガイモ2型PIを有する線状MGEVを、2個のPot 1Aを挿入したことを除いて、本質的にMGEV-8（実施例2）について述べたように構築した。Pot 1A-Pot 1A二量体を実施例5で述べたようにオーバーラップPCRによって作製し、線状多目的ベクターpSP1（実施例2）に挿入してMGEV-14を作製した。次にMGEV-14をpBIN19に挿入して、図21に略図を示すベクターpHEX48を作製した。
【０１４４】
ワタ子葉における一過性発現
pHEX48の発現を、実施例2で述べたようにワタ子葉に関する一過性アッセイにおいて測定した。
【０１４５】
タンパク質検出
タンパク質発現を、実施例2で述べたようにELISAおよび免疫ブロット法によって測定した。
【０１４６】
結果
NaPI（図22B）およびPot 1A（図22C）の両方が、pHEX48でトランスフェクトしたワタ子葉においてELISAによって検出された。Pot 1Aの発現レベルは、同じく2コピーのPot 1A遺伝子を含むpHEX33（実施例8）でトランスフェクトしたワタ子葉において生成されたものと同様であった。NaPI抗体を使用した免疫ブロット分析は、プロセシングされたNaPI 6kDaペプチドが存在することを確認した（図22D）。
【０１４７】
結果は、線状MGEVタンパク質の発現が、多数のタンパク質を発現するために少なくとも環状形態と同程度に有効であることを明らかにする。MGEVの効果は「クラスプ」タンパク質の存在に依存しない。
【０１４８】
実施例11
1個のデフェンシンおよび2個のジャガイモ2型PIを有する線状MGEVの構築および発現
この実施例で述べるMGEVは、
S-T1-NaD1-C1-V
と図式化される構造を有する（図24A参照）。
【０１４９】
1個のデフェンシン（NaD1）配列番号：14アミノ酸26-72および2個のジャガイモ2型PI（T1およびC1）を発現する線状MGEVを、Pot 1Aの代わりにデフェンシン（NaD1）を挿入したことを除いて、本質的にMGEV-8（実施例2）について述べたように構築した。NaD1（実施例3で述べた）を線状多目的ベクターpSP1（実施例2）に挿入してMGEV-15を作製した。次にMGEV-15をpBIN19に挿入して、図23に略図を示すベクターpHEX47を作製した。
【０１５０】
ワタ子葉における一過性発現
pHEX47の発現を、実施例2で述べたようにワタ子葉に関する一過性アッセイにおいて測定した。
【０１５１】
タンパク質検出
タンパク質発現を、実施例3で述べたようにELISAおよび免疫ブロット法によって測定した。
【０１５２】
結果
NaPI（図24B）およびNaD1（図24C）の両方が、pHEX47でトランスフェクトしたワタ子葉においてELISAによって検出された。NaPI抗体を使用した免疫ブロット分析は、プロセシングされたNaPI 6kDaペプチドが存在することを確認した（図24D）。
【０１５３】
結果はさらに、発現されたポリタンパク質の環化のためのコード配列を欠く線状MGEVを使用して種々異なる機能を有する多数のタンパク質を同時に発現することの効果を明らかにする。
【０１５４】
実施例12
2個のジャガイモ1型PIを有する線状MGEVの構築および発現
この実施例で述べるMGEVは、
S-ProPot 1A-Pot 1A
と図式化される構造を有する（図26A参照）。
【０１５５】
2個のジャガイモ1型PIを発現する線状MGEVをスプライスオーバーラップPCRによって構築した。Pot 1Aシグナル配列、プロドメイン（配列番号：20）（Pro）および成熟Pot 1Aドメイン（本明細書において配列番号：11）からなる最初のフラグメントを、5’Bam H1部位および3’リンカー配列と共にPCR増幅した。成熟Pot 1A からなる2番目のフラグメントは、5’リンカー配列および3’末端の終結コドン（TAA）とそれに続くSal 1部位と共にPCR増幅した。2個のPCRフラグメントを互いにアニーリングし、8サイクル伸長させた；次に、完全な配列をPCR増幅するために外側プライマーを付加した。その後、S-ProPot 1A-Pot 1AフラグメントをpAM9に挿入してMGEV-16を作製した。次にMGEV-16をpBIN19に挿入して、図25に略図を示すベクターpHEX35を作製した。
【０１５６】
ワタ子葉における一過性発現
pHEX35の発現を、実施例2で述べたようにワタ子葉に関する一過性アッセイにおいて測定した。
【０１５７】
タンパク質検出
Pot 1Aの発現を、異なるPot 1A抗体を使用したことを除いて、実施例1で述べたようにELISAによって測定した。前記抗体は、細菌において発現されたC1-Pot 1A二量体（C1ドメインはNaPI-ii、配列番号：1のアミノ酸54〜106からである）を使用して作製されたものであり、C1およびPot 1Aタンパク質の両方を検出することができる。この抗体は、Pot 1Aを検出する上で実施例1および2で述べたPot 1A特異的抗体よりも良好であるが、C1-Pot 1A抗体は、Pot 1Aタンパク質がNaPIペプチドの存在なしで発現されるときにしか使用できない。一次C1-Pot 1A抗体および二次C1-Pot 1A-ビオチン抗体を100ng/ウェルで使用した。
【０１５８】
Pot 1Aを検出するための免疫ブロット法を、実施例2で述べた修正を加えて実施例1で述べたように実施した。一次C1-Pot 1A抗体は、1mg/mlストックから1：2,000希釈し、二次抗体（ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合したヤギ抗ウサギIgG）は1:50,000希釈で使用した。
【０１５９】
結果
Pot 1Aを、pHEX35でトランスフェクトしたワタ子葉においてELISAによって検出した（図26B）。Pot 1A発現は、1コピーのPot 1A遺伝子によって生成されたPot 1A発現に比べて、2コピーのPot 1A遺伝子を含むこの線状構築物に関してより高かった（図26B）。比較のために、1個の遺伝子としてのPot 1A（MGEVではない）の発現を、ベクターpHEX6（国際公開公報第2004/094630号、実施例6参照)を使用して測定した。pHEX6およびpHEX35の両方における発現を駆動するためにCaMV 35Sプロモーターを使用した。
【０１６０】
C1-Pot 1A抗体を使用した免疫ブロット分析は、Pot 1Aタンパク質が存在することを確認した（図26C）。2つの他のPot 1A特異的バンドがこの試料において検出された。約20kDaのバンドはおそらく前駆体タンパク質である。約49kDaのバンドは、ジャガイモ塊茎から形成される天然PotIタンパク質がオリゴマーを形成することが報告されているので、Pot 1A成熟タンパク質の集合体であると考えられる。
【０１６１】
結果は、MGEV様構造におけるPot 1Aの発現をさらに裏付け、液胞標的配列であるPot 1上のプロペプチドがタンパク質分解によって除去されることを示す。
【０１６２】
実施例13
1個のジャガイモ2型PIおよび1個のデフェンシンを有する線状MGEVの構築および発現
この実施例で述べるMGEVは、
S-T1-NaD1 CTPP
と図式化される構造を有する（図28A参照）。
【０１６３】
1個のジャガイモ2型PI（T1）およびC末端尾部（CTPP）を有する1個のデフェンシン（NaD1）を発現する線状MGEVを構築した。NaD1 CTPP（実施例7参照）を5’Xba 1部位および3’Sal 1部位と共にPCR増幅した。このフラグメントをpSP1（C1-Vを除去した）のXba 1-Sal 1切断部位に挿入してMGEV-17を作製した。次にMGEV-17をpBIN19に挿入して、図27に略図を示すベクターpHEX41を作製した。
【０１６４】
ワタ子葉における一過性発現
pHEX41の発現を、実施例2で述べたようにワタ子葉に関する一過性アッセイにおいて測定した。
【０１６５】
タンパク質検出
NaD1の発現を、実施例3で述べたようにELISAおよび免疫ブロット法によって測定した。
【０１６６】
結果
NaPIおよびNaD1の両方が、pHEX41でトランスフェクトしたワタ子葉においてELISAによって検出された（図28B、C、およびD）。NaD1 CTPPがT1に連結されているこの線状構築物からのNaD1の発現は、NaD1 CTPP単独の発現（pHEX3）（米国特許第7,041,877号参照）と比較して、両者を35Sプロモーターによって駆動したときの一過性ワタアッセイにおいて有意に高い（図28B）。CTPPはNaD1を液胞に標的し、そこでタンパク質分解によって除去されて成熟約6kDa NaD1を放出する。
【０１６７】
NaPI抗体を使用した免疫ブロット分析は、プロセシングされたNaPI 6kDaペプチドが存在することを確認した（図28E）。NaD1抗体は16kDa前駆体と成熟NaD1約6kDaタンパク質の両方を検出し、T1とNaD1の間のリンカーの正しいプロセシングとCTPP尾部の正しいプロセシングを確認した（図28D）。
【０１６８】
実施例14
1個のクラス1デフェンシンおよび1個のクラス2デフェンシンを有する線状MGEVの構築および発現
この実施例で述べるMGEVは、
S-NaD2-NaD1 CTPP
と図式化される構造を有する。
【０１６９】
1個のクラス1デフェンシン（NaD2）および1個のクラス2デフェンシン（C末端尾部を有するNaD1）を発現する線状MGEVを、2個のデフェンシンを使用したことを除いて、本質的に実施例13で述べたようにスプライスオーバーラップPCRによって構築した。NaD2は実施例10に述べられており、NaD1-CTPPは実施例7に述べられている。最初のフラグメントはシグナル配列とNaD2についてのコード配列からなり、2番目のフラグメントは成熟NaD1とNaD1からのCTPP尾部からなった。PCR後、完全なフラグメント（S-NaD2-NaD1 CTPP）をpAM9に挿入してMGEV-18を作製した。次にMGEV-18をpBIN19に挿入して、図29に略図を示すベクターpHEX52を作製した。MGEV-18の略図を図30Aに示す。
【０１７０】
ワタ子葉における一過性発現
pHEX52の発現を、実施例2で述べたようにワタ子葉に関する一過性アッセイにおいて測定した。
【０１７１】
タンパク質検出
NaD1の発現を、実施例3で述べたようにELISAによって測定した。
【０１７２】
結果
NaD1は、pHEX52でトランスフェクトしたワタ子葉においてELISAによって検出された（図30B）。結果は、複数の異なるタンパク質がいかなる2型PIも存在せずに線状MGEVにおいて発現され得ることを明らかにする。
【０１７３】
実施例15
1個のクラス1デフェンシンおよび1個のクラス2デフェンシンを有する（CTPPは欠失している）線状MGEVの構築および発現
この実施例で述べるMGEVは、
S-NaD2-NaD1
と図式化される構造を有する。
【０１７４】
1個のクラス1デフェンシン（NaD2）および1個のクラス2デフェンシン（NaD1）を発現するがCTPP尾部を欠く線状MGEVを、CTPP尾部を増幅しなかったことを除き、実施例15で述べたように構築した。S-NaD2-NaD1フラグメントをpAM9に挿入してMGEV-19を作製した。次にMGEV-19をpBIN19に挿入して、図31に略図を示すベクターpHEX51を作製した。MGEV-19の略図を図32Aに示す。
【０１７５】
ワタ子葉における一過性発現
pHEX51の発現を、実施例2で述べたようにワタ子葉に関する一過性アッセイにおいて測定した。
【０１７６】
タンパク質検出
NaD1の発現を実施例3で述べたようにELISAによって測定した。
【０１７７】
結果
NaD1は、pHEX51でトランスフェクトしたワタ子葉においてELISAによって検出された（図32B）。
【０１７８】
実施例16
1個のβ-グルクロニダーゼGUSおよび2個のジャガイモ2型PIを有する線状MGEVの構築および発現
この実施例で述べるMGEVは、
S-T1-GUSC1-V
と図式化される構造を有する。
【０１７９】
1個のGUSおよび2個のジャガイモ2型PI（T1およびC1）を発現する線状MGEVを、Pot 1Aの代わりにβ-グルクロニダーゼ（GUS）をコードするDNA配列を挿入したことを除き、本質的にMGEV-8（実施例2）について述べたように構築した。GUSは、約68,000Daの分子量を有する大腸菌酵素であり、GUS DNA配列およびアミノ酸配列についてはそれぞれ配列番号：18および配列番号：19のgusA遺伝子によってコードされる。GUSを、各末端にXba 1部位を有するバイナリーベクターpBI121（Invitrogen）からPCR増幅し、線状多目的ベクターpSP1（実施例2）に挿入して、MGEV-20を作製した。次にMGEV-20をpBIN19に挿入して、図33に略図を示すベクターpHEX58を作製した。この構築物においては、GUSとC1の間にリンカーは存在しなかった。発現およびプロセシングは有害な影響を受けなかった。
【０１８０】
ワタ子葉における一過性発現
pHEX58の発現を、実施例2で述べたようにワタ子葉に関する一過性アッセイにおいて測定した。
【０１８１】
タンパク質検出
NaPIの発現を実施例1で述べたようにELISAによって測定した。
【０１８２】
NaPIを検出するための免疫ブロット法を、実施例2で述べた修正を加えて実施例1で述べたように実施した。
【０１８３】
結果
NaPIは、pHEX58でトランスフェクトしたワタ子葉においてELISAによって検出された（図34B）。
【０１８４】
NaPI抗体を使用した免疫ブロット分析は、成熟NaPIペプチドが存在することを確認した（図34C）。結果は、少なくとも68kDaのタンパク質がMGEVにおいて発現され、正しくプロセシングされ得ることを明らかにする。
【０１８５】
本明細書において使用されるとき、「含む（comprising）」は「包含する（including）」、「含有する（cotaining）」または「によって特徴づけられる（characterized by）」の同義語であり、包括的（inclusive）またはオープンエンド（open-ended）であって、付加的な、列挙されていない要素または方法の工程を排除しない。本明細書において使用されるとき、「からなる」は、特許請求要素において規定されないいかなる要素、工程または成分も排除する。本明細書において使用されるとき、「から本質的になる」は、特許請求の基本および新規特徴に著しい影響を及ぼさない物質または工程を排除しない。本明細書における、特に組成物の成分の説明または装置の要素の説明における「含む」という用語のいかなる言及も、本質的に言及される成分または要素からなる、および言及される成分または要素からなる組成物および要素を包含すると理解される。本明細書において説明的に述べた本発明は、本明細書において具体的に開示されないいかなる要素または制限の不在下でも、適切に実施され得る。
【０１８６】
用いられた用語および表現は、説明の用語として使用されるものであり、限定の用語ではなく、そのような用語および表現の使用には、示され、記述される特徴またはその部分のいかなる等価物も排除する意図はなく、主張される本発明の範囲内で様々な修正が可能であることが認識される。したがって、本発明を好ましい態様および任意の特徴によって具体的に開示したが、本明細書において開示される概念の修正および変形が当業者によって主張され得、そのような修正および変形は、付属の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内であるとみなされる。
【０１８７】
一般に、本明細書において使用される用語および成句は、標準テキスト、雑誌参考文献および当業者に公知の背景を参照することによって見出される、それらの当技術分野で認識される意味を有する。本発明の文脈におけるそれらの具体的使用を明らかにするため、以下の定義を提示する。
【０１８８】
本明細書において言及するすべての特許および刊行物は、本開示と矛盾しない限り参照により本明細書に組み入れられ、それらの参考文献は、本発明が属する当業者の技術レベルを反映する。
【０１８９】
本発明は、その対象物を実施し、言及される目的および利益ならびに本発明に固有の目的および利益を得るために良好に適合されることを容易に認識する。現在好ましい態様を代表するものとして本明細書において記述される方法、成分、材料および寸法は例として提供されるものであり、本発明の範囲への限定は意図されない。本発明の中での変更および本発明の精神に包含される他の使用は、当業者に想起され、特許請求の範囲内に包含される。
【０１９０】
本明細書における記述は、ある種の具体的情報および例を含むが、これらは本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではなく、単に本発明の態様の一部の説明を提供するものとみなされるべきである。したがって、付加的な態様は本発明の範囲内であり、以下の特許請求の範囲内である。
【０１９１】
（表２）
2009537155.tif 000013
【０１９２】
（表３）配列番号表
2009537155.tif 000014
【図１】
2009537155.tif 000015
【図２】
2009537155.tif 000016
【図３】
2009537155.tif 000017
【図４Ａ】
2009537155.tif 000018
【図４Ｂ】
2009537155.tif 000019
【図４Ｃ】
2009537155.tif 000020
【図４Ｄ】
2009537155.tif 000021
【図４Ｅ】
2009537155.tif 000022
【図５】
2009537155.tif 000023
【図６Ａ】
2009537155.tif 000024
【図６Ｂ】
2009537155.tif 000025
【図６Ｃ】
2009537155.tif 000026
【図６Ｄ】
2009537155.tif 000027
【図７】
2009537155.tif 000028
【図８Ａ】
2009537155.tif 000029
【図８Ｂ】
2009537155.tif 000030
【図８Ｃ】
2009537155.tif 000031
【図８Ｄ】
2009537155.tif 000032
【図８Ｅ】
2009537155.tif 000033
【図８Ｆ】
2009537155.tif 000034
【図８Ｇ】
2009537155.tif 000035
【図９】
2009537155.tif 000036
【図１０Ａ】
2009537155.tif 000037
【図１０Ｂ】
2009537155.tif 000038
【図１０Ｃ】
2009537155.tif 000039
【図１０Ｄ】
2009537155.tif 000040
【図１０Ｅ】
2009537155.tif 000041
【図１０Ｆ】
2009537155.tif 000042
【図１１】
2009537155.tif 000043
【図１２Ａ】
2009537155.tif 000044
【図１２Ｂ】
2009537155.tif 000045
【図１２Ｃ】
2009537155.tif 000046
【図１２Ｄ】
2009537155.tif 000047
【図１２Ｅ】
2009537155.tif 000048
【図１３】
2009537155.tif 000049
【図１４Ａ】
2009537155.tif 000050
【図１４Ｂ】
2009537155.tif 000051
【図１４Ｃ】
2009537155.tif 000052
【図１４Ｄ】
2009537155.tif 000053
【図１４Ｅ】
2009537155.tif 000054
【図１４Ｆ】
2009537155.tif 000055
【図１５】
2009537155.tif 000056
【図１６Ａ】
2009537155.tif 000057
【図１６Ｂ】
2009537155.tif 000058
【図１６Ｃ】
2009537155.tif 000059
【図１６Ｄ】
2009537155.tif 000060
【図１６Ｅ】
2009537155.tif 000061
【図１７】
2009537155.tif 000062
【図１８Ａ】
2009537155.tif 000063
【図１８Ｂ】
2009537155.tif 000064
【図１８Ｃ】
2009537155.tif 000065
【図１９】
2009537155.tif 000066
【図２０Ａ】
2009537155.tif 000067
【図２０Ｂ】
2009537155.tif 000068
【図２０Ｃ】
2009537155.tif 000069
【図２１】
2009537155.tif 000070
【図２２Ａ】
2009537155.tif 000071
【図２２Ｂ】
2009537155.tif 000072
【図２２Ｃ】
2009537155.tif 000073
【図２２Ｄ】
2009537155.tif 000074
【図２３】
2009537155.tif 000075
【図２４Ａ】
2009537155.tif 000076
【図２４Ｂ】
2009537155.tif 000077
【図２４Ｃ】
2009537155.tif 000078
【図２４Ｄ】
2009537155.tif 000079
【図２５】
2009537155.tif 000080
【図２６Ａ】
2009537155.tif 000081
【図２６Ｂ】
2009537155.tif 000082
【図２６Ｃ】
2009537155.tif 000083
【図２７】
2009537155.tif 000084
【図２８Ａ】
2009537155.tif 000085
【図２８Ｂ】
2009537155.tif 000086
【図２８Ｃ】
2009537155.tif 000087
【図２８Ｄ】
2009537155.tif 000088
【図２８Ｅ】
2009537155.tif 000089
【図２８Ｆ】
2009537155.tif 000090
【図２９】
2009537155.tif 000091
【図３０Ａ】
2009537155.tif 000092
【図３０Ｂ】
2009537155.tif 000093
【図３１】
2009537155.tif 000094
【図３２Ａ】
2009537155.tif 000095
【図３２Ｂ】
2009537155.tif 000096
【図３３】
2009537155.tif 000097
【図３４Ａ】
2009537155.tif 000098
【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【配列表】
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