(57)【要約】  細胞、例えば、哺乳動物細胞を細胞培養プロセスに適応させる方法を提供する。適応させた細胞を遺伝子改変し、蛋白の生成のために使用すると、これらの細胞は、より高い細胞密度に達することおよび／または蛋白生成のより高い全体的な収率を達成することができる等、有利な特徴を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を蛋白生成条件に適応させるための方法であって、
細胞を適応培地にて培養する工程；
該細胞をスクリーニングし、蛋白生成条件下で増殖した場合に改善された細胞培養特徴を示す細胞の亜集団を選択する工程を含み、ここでその特徴は適応培地でない培地での細胞増殖にて観察される対応する細胞培養特徴と異なり、その改善された細胞培養特徴は、増殖の改善、生存率の上昇、生細胞の集積密度の増加、タイターの増加、細胞の特異的な生産性の向上およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、ところの適応方法。
【請求項２】
スクリーニング工程に付す前に、細胞の継代工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
継代工程がスクリーニング工程に付す前に細胞を２回以上継代することを含む、請求項２または３記載の方法。
【請求項４】
継代工程が約３または４日後に適応培地にて細胞を継代することを含む、請求項１−３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
継代工程が約７または８日後に適応培地にて細胞を継代することを含む、請求項１−３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
継代工程の後で、適応培地ではない培地にて細胞を培養する工程をさらに含む、請求項１−５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
適応培地ではない培地が標準的な増殖培地である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
細胞が形質移入されていない、請求項１−７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
細胞が目的とする蛋白を発現するように形質移入されている、請求項１−７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
目的とする蛋白が抗体である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
目的とする蛋白が蛋白性治療剤である、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
適応培地が生成培地を含む、請求項１−１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
生成培地が、標準的な増殖培地と比べて、高いレベルの１種または複数の培地成分を含み、その培地成分が、栄養素、ビタミン、微量元素およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
適応培地が乳酸、アンモニア、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される二次代謝産物を含む、請求項１−１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
二次代謝産物が細胞培養を開始する際に適応培地に添加される、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
二次代謝産物のレベルが細胞培養の進行に合わせて増加する、請求項１４または１５記載の方法。
【請求項１７】
二次代謝産物のレベルが細胞の代謝活性に起因して増加する、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
二次代謝産物のレベルが二次代謝産物の細胞培養物への添加を介して増加する、請求項１６または１７記載の方法。
【請求項１９】
選択された細胞の亜集団が二次代謝産物を取り込み、その結果、適応された細胞が生成培地にて増殖される場合に、該代謝産物のレベルが減少する、請求項１４−１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
適応培地が、乳酸、アンモニア、アラニン、グルタミン、アセト乳酸およびそれらの組み合わせからなる群より選択される１種または複数の阻害剤を含む、請求項１−１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
乳酸が約２ないし約１０ｇ／Ｌの濃度にて存在する、請求項１４−２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
乳酸が細胞培養の開始時に約２ないし約１０ｇ／Ｌの濃度にて存在する、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
アンモニアが約０．１ないし約０．５ｇ／Ｌの濃度にて存在する、請求項１４−２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
アンモニアが細胞培養の開始時に約０．１ないし約０．５ｇ／Ｌの濃度にて存在する、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
適応培地がインスリンを欠く、請求項１ないし２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
適応培地がインスリンを約１０ｍｇ／Ｌより低い濃度で含む、請求項１ないし２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
細胞が哺乳動物細胞である、請求項１ないし２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
蛋白生成条件がバイオリアクターにて使用される条件を含む、請求項１ないし２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
バイオリアクターが生成用バイオリアクターである、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
蛋白生成条件が、流加式蛋白生成プロセスにて細胞を培養することを含む、請求項１ないし２９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００５年１１月２日出願の米国仮特許出願第６０／７３２８１８号と、同時係属中であり、少なくとも１人の共通の発明者を共有し、その優先権を主張するものであり、その内容を出典明示により本明細書の一部とする。
【０００２】
技術分野
本願開示は、一般に、哺乳動物細胞、例えば、非形質移入哺乳動物細胞を、目的の治療用蛋白の生成に関して、適応させる方法に関する。具体的には、本願開示は、バイオリアクターにて、非形質移入哺乳動物細胞をより優れた性能に対して適応させることに関する。
【背景技術】
【０００３】
蛋白は周知の組換え技術を使用して生成され得る。通常、形質転換細胞は、バイオリアクター等の制御された環境にて培養される。大部分の大規模な商業的製造戦略では、大きな攪拌タンクのリアクター中で増殖をした懸濁細胞培養物を利用する。しかし、ほとんどの細胞系が、高い細胞密度の蛋白の生成プロセス（例えば、流加式プロセス）では、良好な性能を得ることは容易でなく、かつ／または所望の高い細胞密度に達することができない。生成運転の間に、細胞培養培地中に多くの阻害剤が存在または蓄積する。これらの阻害剤は、とりわけ、乳酸またはアンモニア等、代謝過程から生じる副産物である場合がある。通常、細胞系を、最初は、これらの細胞系の増殖および／または生存を支援するように設計した条件で増殖させ、維持する。しかし、蛋白生成の間に使用する条件（例えば、生成用バイオリアクター中で遭遇する条件）が、非常に異なる、例えば、二次代謝産物および／またはその他の成分が、蛋白生成が進行するにつれて存在するかつ／または蓄積する場合があり、これらは、細胞系に対して有害な作用を有する恐れがある可能性がある。非限定的な例として、そのような有害な作用は、生細胞密度の減少および／または最終的なタイターの減少、ならびに生成した蛋白の量および／または品質の低下を含む場合がある。
【０００４】
バイオリアクター中の流加式プロセス等の蛋白の生成プロセスにおける増殖および／または生成に細胞系が適応しているか否かを決定するために、通常の方法を実施して、多数の実験が行われる。そのような実験では、しばしば、複数のクローン細胞系および／または形質移入プールを必要とし、次いで、通常、生成用バイオリアクター中で使用するであろう培地（例えば、無血清懸濁液または「既知組成培地」）中での増殖に細胞を適応させる。細胞系が適応したら、通常、ベンチスケールのバイオリアクター中で、スクリーニングおよび最適化の追加のラウンドを行う。次いで、通常、予備研究で良好な発現の表現型を示した個々のクローンに、追加の実験を行い、どのクローンがバイオリアクター、例えば、流加式バイオリアクター中でもまた、許容範囲にある増殖および／または生存率の特徴を示すかを決定する。そのような広範なスクリーニングのプロセスは、費用がかかり、特に、担当者には骨の折れるプロセスである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、求められているのは、これらに限定されないが、バイオリアクターの条件をはじめとする、蛋白を生成する条件に細胞を適応させるための方法である。さらに求められているのは、非形質移入宿主細胞を、形質転換させるのに先立って、形質移入して蛋白を生成する条件に移行した後に、１つまたは複数の細胞培養物の特徴（例えば、タイター、生存率、蛋白の質等）に対して不利な効果が全くまたはほとんどないように適応させる方法である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、哺乳動物細胞を、流加式プロセス等の高密度蛋白生成プロセスに適応させるための方法に関する。発明のプロセスは、非形質移入哺乳動物細胞および遺伝子操作した宿主細胞の両方が関わることができる。特定の実施形態では、非形質移入哺乳動物細胞を、蛋白の生成の間に使用する条件等、生成と一致した条件に適応させる。例えば、非形質移入哺乳動物細胞を、生成運転の間にバイオリアクター中で使用する生成培地に適応させることができる。
【０００７】
種々の方法を使用して、非形質移入哺乳動物細胞を、生成の条件に適応させることができる。特定の実施形態では、細胞を、生成培地および／または適応培地中で培養する。特定の実施形態では、細胞を、適応培地中で培養し、標準的な分割のサイクルを反復して行う。例えば、細胞の亜集団を、例えば、３または４日毎に１回または複数回継代することができる。特定の実施形態では、生成培地および／または適応培地は、一般に、標準的な増殖培地と比較して、より高いレベルの栄養素、ビタミンおよび／または微量元素を有する。特定の実施形態では、次いで、継代と継代との間、例えば、サイクルのうちの１つの間、継代した細胞を標準的な増殖培地中で増殖させる回復期間を与えた後、細胞を生成培地および／または適応培地に戻す。
【０００８】
特定の実施形態では、細胞をバッチ−リフィード様式で継代することによって、細胞を適応させ、その場合、細胞の亜集団を、７または８日毎に分割または継代する。特定の実施形態では、そのようなより長い期間の後に細胞を継代すると、細胞培養培地中に二次代謝産物が蓄積する。特定の実施形態では、適応させた細胞が、そのような二次代謝産物に対する耐性を獲得するかつ／またはそれらの吸収を開始する。特定の実施形態では、そのような二次代謝産物が、生成運転の間にバイオリアクター中に通常蓄積する、例えば、乳酸および／またはアンモニア等の阻害剤および／または代謝産物を含む。特定の実施形態では、これらに限定されないが、乳酸、アンモニア、アラニン、グルタミンおよび／またはアセト乳酸をはじめとする、１種または複数の阻害剤を含む培地中で増殖させることによって、細胞を適応させる。特定の実施形態では、そのような阻害剤および／または代謝産物は、生成運転の間にバイオリアクター中に通常見い出される阻害剤および／または代謝産物と一致する。
【０００９】
特定の実施形態では、非形質移入哺乳動物細胞を、アラニン、グルタミン、アセト乳酸、アンモニアおよび乳酸等の阻害剤を補った標準的な増殖培地中で培養する（かつ所望により、３から４日毎に分割する）ことによって適応させることができる。特定の実施形態では、そのようにして適応させた細胞を、３から４日毎に継代する。特定の実施形態では、そのような阻害剤の濃度は、蛋白の生成のために使用する条件の間にバイオリアクター中に通常見い出される濃度に対応する。特定の実施形態では、いくつかの阻害剤の濃度は、通常のバイオリアクターの条件を模倣して、約２から約１０ｇ／Ｌの乳酸、または約０．１から約０．５ｇ／Ｌのアンモニアを含む。特定の実施形態では、１つまたは複数の本発明の方法によってバイオリアクターの条件に適応させた細胞が、特定の特徴または表現型を示し、かつ／あるいはそのような表現型を発生させることができ、その場合、当該細胞は、乳酸および／またはその他の二次代謝産物を取り込み始め、その結果、生成運転の間の１つまたは複数の時間枠の間に乳酸および／またはその他の二次代謝産物のレベルが実際に減少する。そのような表現型は、高密度流加式生成用バイオリアクターに望ましい質を示すので、それらについて、スクリーニングすることができる。
【００１０】
特定の実施形態では、１つまたは複数の本発明の方法によって適応させた細胞は、目的の蛋白を生成するように形質移入されていない宿主細胞である。特定の実施形態では、次いで、そのような適応させた宿主細胞を、１つまたは複数の所望の特徴についてスクリーニングする。特定の実施形態では、亜集団を、１つまたは複数の所望の特徴についていったんスクリーニングしたら、その後、細胞を遺伝子操作（例えば、形質移入）して、目的の蛋白を生成する細胞系を生み出すことができる。特定の実施形態では、そのような適応させた細胞系を、当該細胞系が、例えば、流加式プロセス等の高い細胞密度の蛋白生成プロセスに容易に適応するバイオリアクター中に置く。特定の実施形態では、非形質移入宿主細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞を事前に適応させた結果として、遺伝子操作した細胞系は、標準的な増殖培地から生成培地へ移行させる必要がない、かつ／あるいは移行させても、より少ないおよび／またはより程度が低い有害な作用を伴う。特定の実施形態では、事前の適応は、細胞系に対する、生じうる有害な作用を最小限に抑え、かつ細胞系の性能を保証するのに役立ち、発育の時系列を加速させる。特定の実施形態では、そのような適応させた細胞系は、蛋白の生成運転の間に、二次代謝産物を取り込むことができる。細胞培養技術における当業者であれば、どの成分が標準的な増殖培地および標準的な生成培地を構成するかを容易に決定することができる。特定の実施形態では、増殖条件と蛋白生成条件とが、使用する細胞培養培地の組成の点で異なる。増殖期および／または蛋白生成期の間に、バイオリアクターの条件を変化させることができ、かつ／あるいは生産性の向上および／または細胞系の生存率の維持のために補助剤を添加することができる。補助剤は、供給培地および／または１種もしくは複数の添加剤を含むことができる。当業者であれば、適切な培地補助剤を選択することができるであろう。培地へのさらなる補助剤は、所望の蛋白産物、細胞培養培地のパラメーター（例えば、成分、ｐＨ等）、増殖プロセスおよび／または生成プロセスを通して使用する方法、ならびに／あるいは当業者に知られる多様なその他の要因のうちのいずれかによって異なるであろう。
【００１１】
特定の実施形態では、非形質移入哺乳動物細胞を適応培地中で培養するステップと、１回または複数回の反復分割サイクルを（例えば、３から４日毎に）行うステップとを含む方法によって、非形質移入哺乳動物細胞を適応させる。当該反復分割サイクルは、非形質移入哺乳動物細胞を適応培地中で分割することと、細胞を標準的な増殖培地中で培養する回復期間を与えることと、細胞をスクリーニングし、生成用バイオリアクターの条件下で培養した場合、細胞の適応させていない種類と比較し、増殖および／または生存率が改善された表現型を示す亜集団を選択することとを含む。特定の実施形態では、目的の蛋白をコードする遺伝子を細胞に形質移入し、それを生成用バイオリアクター中で培養して、目的の蛋白を発現させる。特定の実施形態では、適応培地は、当該の標準的な増殖培地と比較して、増加したレベルの栄養素、ビタミンおよび／または微量元素を含有する。特定の実施形態では、適応培地は、細胞培養前の標準的な生成培地と比較して、増加した量の阻害性の代謝産物を含有する。
【００１２】
特定の実施形態では、非形質移入哺乳動物細胞を炭素の一次代謝の副産物を補った適応培地中で培養するステップと、１回または複数回の反復分割サイクルを行うステップとを含む方法によって、非形質移入哺乳動物細胞を適応させる。当該反復分割サイクルは、非形質移入哺乳動物細胞を適応培地中で約３から４日毎に分割することと、細胞を標準的な増殖培地中で培養する回復期間を与えることと、何らかのレベルの副産物を蓄積させることと、非形質移入哺乳動物細胞をスクリーニングし、当該適応培地中で培養した場合に、非形質移入哺乳動物細胞の適応させていない種類と比較し、改善された表現型を示す亜集団を選択することとを含む。特定の実施形態では、そのような副産物は、乳酸、アンモニア、アラニン、グルタミンおよび／またはアセト乳酸のうちの１種または複数である。特定の実施形態では、乳酸は、最初は約２から約１０ｇ／Ｌの濃度で存在する。特定の実施形態では、アンモニアは、最初は約０．１から約０．５ｇ／Ｌの濃度で存在する。特定の実施形態では、非形質移入哺乳動物細胞を、一次炭素源の当該副産物を吸収するように適応させる。
【００１３】
特定の実施形態では、少なくとも１種の阻害性代謝産物の蓄積を有する、事前に条件付けた培地中で約７から８日の期間にわたって非形質移入哺乳動物細胞を、培養した後、非形質移入哺乳動物細胞を分割するステップと、非形質移入哺乳動物細胞をスクリーニングして、生成用バイオリアクター中で改善された表現型を示す亜集団を選択するステップとを含む方法によって、非形質移入哺乳動物細胞を適応させる。特定の実施形態では、標準的な増殖培地中で約３日から約４日の期間にわたって細胞を培養することによって、細胞に回復期間を与えた後、細胞を分割する。特定の実施形態では、条件培地は、非形質移入哺乳動物細胞の少なくとも１つの代謝過程からの阻害性代謝産物の蓄積を含有する。特定の実施形態では、そのような阻害性代謝産物は、アンモニア、アラニン、グルタミン、アセト乳酸および／または乳酸のうちの１種または複数である。特定の実施形態では、そのような阻害性代謝産物は、通常の商業規模のバッチ−リフィード式プロセスの終わりに生成用バイオリアクター中に見い出される阻害性の代謝産物と一致する。
【００１４】
蛋白の生成プロセスにおいて、多様で適切な培養の手順および／または培地（例えば、接種培地、供給培地等）のうちのいずれかを使用して、細胞を培養することができる。血清含有培地および無血清培地の両方を使用することができる。例えば、特定の実施形態では、細胞を、既知組成培地中で増殖させる。特定の実施形態では、細胞を、複合培地中で増殖させる。その上、１種または複数の特異的な培養方法を使用し、変化させかつ／または最適化して、特異的な細胞型および蛋白産物に適した細胞を培養することができる。そのような手順は、細胞培養技術における労働者および通常の技術者には、周知であり、理解されている。本開示のその他の特色および利点が、特定の実施形態の以下の記載および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００１５】
定義
長年の慣習に従って、特許請求の範囲も含めて、本出願で使用する場合、「ａ」および「ａｎ」という用語は、「１つまたは複数（「ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ」）」を意味する。本発明は、ある程度の特殊性をもって記載されているが、本開示に照らして、多くの代替形態、改変形態および変形形態が、当業者には明らかであろうことが明白である。したがって、そのような代替例、改変例および変形例の全てが、本発明の精神および範囲のうちにあり、特許請求の範囲によって包含されるものとする。
【００１６】
「宿主細胞」という句は、遺伝子操作することができる細胞ならびに／または細胞培養培地中で増殖および生存できる細胞を指す。通常、この細胞は、内因性または異種性の目的の蛋白を大量に発現することができ、かつ蛋白を、保持することができるか、または細胞培養培地中へ分泌することができるかのいずれかである。
【００１７】
宿主細胞は、通常、「哺乳動物細胞」であり、これは、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト腎臓（２９３）細胞、アカゲザル胎仔正常二倍体（ＦＲｈＬ−２）細胞およびマウス骨髄腫（例えば、ＳＰ２／０およびＮＳ０）細胞をはじめとする、脊椎動物細胞の非限定的な例を含む。当業者であれば、本発明の方法および組成物に従って使用することができる、その他の宿主細胞が分かるであろう。
【００１８】
「細胞培養培地」という用語は、細胞が増殖することおよび／または所望の蛋白を生成することができる条件下で、細胞の生存を支持する栄養素を含有する溶液中の細胞を指す。「接種培地（「ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ」または「ｉｎｏｃｕｌｕｍ  ｍｅｄｉｕｍ」）」という句は、細胞の培養を開始する、栄養素を含有する溶液または物質を指す。特定の実施形態では、細胞培養物に「供給培地」を１回または複数回補い、これは、培養開始後に細胞に与える。特定の実施形態では、「供給培地」という句は、接種培地と同様の栄養素を含有するが、これは、培養開始に続いて細胞に与える溶液または物質である。特定の実施形態では、供給培地は、接種培地には存在しない１種または複数の成分を含有する。特定の実施形態では、供給培地は、接種培地には存在する１種または複数の成分を欠く。細胞培養技術における当業者であれば、過度の実験をせずとも、どの成分がそのような接種培地および供給培地を構成するかが分かるであろう。通常、これらの溶液は、細胞が増殖および生存のために必要とする、必須および非必須のアミノ酸、ビタミン、エネルギー源、脂質、ならびに／または微量元素を提供する。
【００１９】
本明細書で使用する場合、「細胞培養物の特徴」という用語は、細胞培養物の観察可能および／または測定可能な特徴を指す。本発明の方法および組成は、１つまたは複数の細胞培養物の特徴を改善するために、有利に使用される。特定の実施形態では、細胞培養物の特徴の改善は、細胞培養物の特徴の大きさの増加を含む。特定の実施形態では、細胞培養物の特徴の改善は、細胞培養物の特徴の大きさの減少を含む。非限定的な例として、細胞培養物の特徴は、増殖の改善、生存率の上昇、生細胞の集積密度の増加、タイターの増加および／または細胞の特異的な生産性の向上であることができる。当業者であれば、本発明の方法および組成物を使用して改善することができる、その他の細胞培養物の特徴が分かるであろう。
【００２０】
「増殖培地」または「標準的な増殖培地」という句は、細胞または細胞系の分裂および増殖を可能にする栄養素および補助剤を含有する培地を指す。特定の実施形態では、「生成培地」という句は、高いレベルの目的の蛋白の発現を可能にする、強化した増殖培地を指す。特定の実施形態では、一般に、生成培地は、標準的な増殖培地と比較して、より高いレベルの栄養素、ビタミン、微量元素および／またはその他の培地の成分を含有する。「適応培地」という句は、細胞をバイオリアクター（例えば、後期生成用バイオリアクター）中に存在する、蛋白生成条件に曝し、細胞を蛋白生成条件に向けて準備し、かつ／または細胞を増殖条件から蛋白生成条件へ移行させる場合の生じうる有害な作用を最小限に抑える培地を指す。特定の実施形態では、適応培地は、１種または複数の二次代謝産物の存在、例えば、これらに限定されないが、乳酸および／またはアンモニアをはじめとする、代謝過程から生じる代謝産物を含む。特定の実施形態では、適応培地は、これらに限定されないが、乳酸、アンモニア、アラニン、グルタミンおよび／またはアセト乳酸をはじめとする、１種または複数の阻害剤を含む。特定の実施形態では、適応培地は、生成培地を含む。特定の実施形態では、適応培地は、生成培地の１つまたは複数の特徴を模倣する。特定の実施形態では、細胞を適応培地中で適応させると、そのような適応させた細胞を増殖培地または適応培地から生成培地へ切り換えたときに、減少したまたはより程度が低い有害な作用を示す細胞が得られる。そのような適応培地は、例えば、生成培地にそのような代謝産物および／または阻害剤を補うこと、ならびに／あるいはそのような代謝産物および／または阻害剤を長期に細胞培養物中に蓄積させることによって、生成と一致させることができる。
【００２１】
本明細書で使用する場合、「既知組成培地」という用語は、培地の組成が既知でありかつ制御されている培地を指す。
【００２２】
本明細書で使用する場合、「複合培地」という用語は、本質または量のいずれかが未知または未制御のいずれかである、少なくとも１種の成分を含有する培地を指す。
【００２３】
「細胞系」という句は、一般に、外因性のＤＮＡ、例えば、所望の目的の蛋白をコードするＤＮＡが形質移入されている、初代宿主細胞を指す。特定の実施形態では、細胞系からの遺伝子改変細胞に由来する細胞を、細胞培養培地中に置いて、増殖させ、目的の蛋白産物を生成する。いくつかの実施形態では、所望の蛋白をコードするおよび／または内因性にしても異種性にしても、連結している配列の発現を活性化する調節配列を含有する外因性のＤＮＡを、初代宿主細胞に形質移入する。特定の実施形態では、細胞系は、外因性のＤＮＡが形質移入されており、異種性の目的の蛋白を発現する、初代宿主細胞を含む。特定の実施形態では、細胞系は、外因性のＤＮＡが形質移入されておらず、内因性の目的の蛋白を発現する、初代宿主細胞を含む。
【００２４】
細胞培養培地の「増殖期」とは、細胞が、急速に分裂し、指数関数的にまたはほぼ指数関数的に増殖する期間を指す。増殖期の条件は、約３５℃から４２℃、一般的に、約３７℃の温度を含むことができる。増殖期の長さおよび増殖期中の培養条件は、異なることができるが、細胞培養技術における当業者には、一般的に知られている。通常、増殖期の間に、「増殖培地」または「標準的な増殖培地」中で、細胞を増殖させる。特定の実施形態では、増殖期の細胞培養培地に、供給培地を補う。
【００２５】
「移行期」は、細胞培養培地を、増殖期に一致した条件から、生成期に一致した条件へシフトさせている期間に生じる。移行期の間は、とりわけ、温度のような要因を変化させることが多い。特定の実施形態では、移行期の細胞培養培地に、供給培地を補う。本発明の方法は、細胞培養を増殖期の条件から生成期の条件へ移行させる場合の生じうる有害な作用を最小限に抑える点で有用である。
【００２６】
「生成期」は、増殖期および移行期の両方の後に生じる。細胞の指数関数的な増殖が終わり、蛋白の生成が主要な目的となる。通常、生成期の間は、生成培地中で細胞を増殖させる。生成培地に補って、生成を開始させることができる。特定の実施形態では、生成期の細胞培養培地に、供給培地を補う。特定の実施形態では、一般的に、生成期の間の細胞培養培地の温度は、増殖期よりも低い。当技術分野で知られているように、多くの場合、そのような温度の低下は、蛋白の生成を容易にする。生成期は、所望のエンドポイントに到達するまで続く。
【００２７】
「分割」、「継代」および「サブカルチャー」という句は、細胞集団を２つ以上の亜集団に分けるプロセスを指す。例えば、細胞培養培地から細胞の亜集団を取り出し、その亜集団をより低い生細胞密度まで希釈することによって、細胞培養培地中で増殖している細胞の集団を継代またはサブカルチャーすることができる。特定の実施形態では、細胞の亜集団を、新鮮な培地を用いて、同様の容量に希釈することができる。特定の実施形態では、細胞の亜集団を、元々の細胞集団が増殖していた細胞培養培地と同様または同一である細胞培養培地を用いて希釈する。例えば、元々の細胞集団が生成培地中で増殖していたとすると、亜集団を、同一または同様の生成培地を用いて希釈することができる。特定の実施形態では、細胞の亜集団を、元々の細胞集団が増殖していた細胞培養培地とは異なる細胞培養培地を用いて希釈する。例えば、元々の細胞集団が増殖培地中で増殖していたとすると、細胞の亜集団を、生成培地または適応培地を用いて希釈することができる。特定の実施形態では、亜集団を継代またはサブカルチャーする前に、元々の細胞集団が増殖（例えば、細胞数の増加）を停止している。特定の実施形態では、集団を、適応プロセスの間に、２回以上継代する。例えば、集団を、適応プロセスの間に、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０回以上継代することができる。標準的な慣行では、標準的な増殖培地を使用して、３から４日毎に、細胞培養培地を継代または「分割」して維持する。特定の実施形態では、継代する前に長期間にわたって細胞集団を増殖させることによって、蛋白生成条件に細胞を適応させる。例えば、継代する前に５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４日以上、細胞を増殖させることができる。
【００２８】
「生細胞の密度」という句は、特定の容量の細胞培養培地中で生存している細胞の全数を指す。「細胞の生存率」という句は、死細胞および生存細胞の両方の細胞の全数に対する生存細胞の数を指し、パーセントとして表す。
【００２９】
「生細胞の集積密度」、「ＩＶＣＤ」：本明細書で使用する場合、「生細胞の集積密度」または「ＩＶＣＤ」という用語は、培養が進行する間の生細胞の平均密度に、培養運転時間の長さを乗じたものを指す。生成する蛋白の量が、培養が進行する間に存在する生細胞の数に比例する場合には、生細胞の集積密度は、培養が進行する間に生成する蛋白の量を推定するための有用な道具になる。
【００３０】
本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、少なくとも１つ、典型的には２つのＶＨドメインもしくはその一部および／または少なくとも１つ、典型的には２つのＶＬドメインもしくはその一部を含む蛋白を含む。特定の実施形態では、抗体は、２本の免疫グロブリン重鎖および２本の免疫グロブリン軽鎖からなる四量体であり、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖とが、例えば、ジスルフィド結合によって、相互接続している。抗体またはその一部を、これらに限定されないが、げっ歯類、霊長類（例えば、ヒトおよび非ヒトの霊長類）、ラクダ科をはじめとする、いずれかの起源から得ることができ、さらに、本明細書でより詳細に記載するように、組換えによって、例えば、キメラ抗体もしくはヒト化抗体として生成することもでき、かつ／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製することもできる。
【００３１】
抗体の「抗原結合断片」という用語の範囲内に包含される結合断片の例として、これらに限定されないが、（ｉ）Ｆａｂ断片、すなわち、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、すなわち、ヒンジ領域においてジスルフィド橋によって連結されている２つのＦａｂ断片を含む二価の断片；（ｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）ｄＡｂ断片、これは、ＶＨドメインからなる；（ｖｉ）ラクダまたはラクダ化の重鎖可変ドメイン（ＶＨＨ）；（ｖｉｉ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）；（ｖｉｉｉ）二重特異性抗体；ならびに（ｉｘ）Ｆｃ領域に融合した、免疫グロブリン分子の１つまたは複数の断片があげられる。さらに、Ｆｖ断片の２種のドメインであるＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子がコードするが、組換えの方法を使用して、合成リンカーによって、それらをつなぎ合わせることができる。この合成リンカーによって、それらのドメインを単一の蛋白鎖として作製することができ、そこでは、ＶＬ領域とＶＨ領域とが対になって一価の分子を形成している（これは、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている。例えば、Ｂｉｒｄら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−２６；Ｈｕｓｔｏｎら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：５８７９−８３を参照）。そのような単鎖の抗体もまた、抗体の「抗原結合断片」という用語の範囲内に包含されるものとする。これらの断片を、当業者に知られている従来の技法を使用して得ることができ、未処理の抗体の場合と同じように、それらの断片の機能を評価する。
【００３２】
「抗原結合断片」は、所望により、例えば、安定性、エフェクター細胞の機能、または補体結合の１種または複数を増強する部分をさらに含むこともできる。例えば、抗原結合断片は、ペグ化部分、アルブミン、または重鎖および／もしくは軽鎖の定常部をさらに含むこともできる。
【００３３】
「二重特異性」または「二機能性」の抗体を除き、抗体は、その各結合部位が同一であると理解されている。「二重特異性抗体」または「二機能性抗体」は、２つの重鎖／軽鎖の異なる対および２つの異なる結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である。二重特異性抗体を、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結をはじめとする、多様な方法によって生成することができる。例えば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉおよびＬａｃｈｍａｎｎ、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１（１９９０）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，１５４７−１５５３（１９９２）を参照されたい。
【００３４】
「スクリーン」または「スクリーニング」という句は、１つまたは複数の有利な特徴を示す、特定の表現型を有する細胞の亜集団を選択する方法を指す。特定の実施形態では、これらに限定されないが、増殖の改善、生存率の上昇、生細胞の集積密度の増加、タイターの増加および／または細胞の特異的な生産性の向上をはじめとする、蛋白生成プロセスにおいて有利である、１つまたは複数の細胞培養物の特徴について、細胞系をスクリーニングする。特定の実施形態では、細胞系において、スクリーニングするのは、流加式バイオリアクターのプロセスにおいて有利である、１つまたは複数の細胞培養物の特徴、例えば、強力な増殖および／または生存率についてである。
【００３５】
「バイオリアクター」という句は、細胞培養培地を含有することができ、内部条件、例えば、ｐＨおよび温度を培養期間の間に制御することができる容器を指す。当業者であれば、制御することができる有用および／または適切なバイオリアクターの条件、ならびにそのようなバイオリアクターの条件を制御する方法が分かるであろう。「生成用バイオリアクター」は、蛋白を生成するプロセスの間に利用するバイオリアクターを指す。例えば、生成用バイオリアクターは、大量の蛋白を生成することができる、大きな商業規模の容器を含むことができるが、生成用バイオリアクターは、そのような大きな商業規模の容器に制限されない。特定の実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも１リットルであり、１０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、８，０００、１０，０００または１２，０００リットル以上、あるいはこれらの間のいずれかの容量であることができる。その上、使用することができるバイオリアクターとして、これらに限定されないが、攪拌タンク型バイオリアクター、流動床式リアクター、中空糸型バイオリアクターまたはローラーボトルがあげられる。
【００３６】
「二次的な副産物」および「二次代謝産物」という句は、細胞の代謝活性の結果として通常生じる小型分子を指す。当業者に理解されているように、そのような二次的な副産物は、細胞の増殖および／生存率に対して不利であることが多い。したがって、それらを最低限に抑えるまたは細胞培養から排除することが望ましい。二次的な副産物の非限定的な例として、乳酸およびアンモニアイオンがあげられる。特定の実施形態では、細胞をそのような二次的な副産物の存在下で増殖させることによって、蛋白生成条件に細胞を適応させる。特定の実施形態では、蛋白生成条件に適応させた細胞は、そのような二次的な副産物を吸収する能力を示し、その結果、二次的な副産物のレベルが時間と共に減少する。細胞培養技術における当業者であれば、本発明に従って細胞を適応させるのに使用することができる、その他の代謝副産物が分かるであろう。
【００３７】
「流加培養法」は、まず、接種培地を有するバイオリアクター中に細胞を接種する細胞培養法を指す。次いで、生成運転を通して、１回または複数の時点で、細胞培養培地に、栄養成分および／またはその他の補助剤を含有する供給培地を補う。
【００３８】
「回分培養法」とは、生成運転全体で必要とする栄養素および補助剤の全てを有するバイオリアクター中に細胞を接種する細胞培養法を指す。細胞培養の開始後に、細胞培養培地に栄養素、培地等を添加することはない。
【００３９】
「灌流培養法」とは、回分培養法とも流加培養法とも異なる細胞培養法を指し、この場合、発現した目的の蛋白の単離および／または精製に先立って、培養を終了または必ずしも終了するわけではなく、新たな栄養素およびその他の成分を定期的または連続的に培地に添加し、この間に、発現した蛋白を定期的または連続的に収集する。添加する栄養素の組成を、細胞の必要性、最適な蛋白生成の要件および／または当業者に既知の多様なその他の要因によって、細胞培養の進行の間に変化させることができる。
【００４０】
「バッチ−リフィード」という句は、バイオリアクターを動作する様式または細胞を継代する方法を指す。特定の実施形態では、バッチ−リフィード式プロセスは、細胞を７から８日毎に継代するステップを含み、それに対して、バイオリアクター中のその他の様式では、細胞を継代しないか、より少ない頻度で継代する。標準的な分割方法を利用する、より小さな規模では、一般的に、細胞を、バッチ−リフィードと比較して、より早めに、例えば、３から４日毎に継代する。特定の実施形態では、バッチ−リフィード法を使用して、細胞培養物が、これらに限定されないが、増殖速度の改善、生存率の上昇、生細胞の集積密度の増加、タイターの増加および／または細胞の特異的な生産性の向上をはじめとする、細胞培養物の特徴を達成できるように、細胞培養物を適応させる。特定の実施形態では、バッチ−リフィード式プロセスは、細胞を蛋白生成条件に適応させるために、より強化した培養物ならびに／あるいは二次代謝産物および／またはその他の阻害剤を含有する培地を利用する。「二次代謝産物」という句は、細胞機能の代謝過程の副産物を指す。
【００４１】
「発現」という句は、宿主細胞内で生じる転写および翻訳を指す。発現のレベルは、一般的に、宿主細胞が生成する蛋白の量に関係する。
【００４２】
「蛋白」または「蛋白産物」という句は、アミノ酸の１本または複数の鎖を指す。本明細書で使用する場合、「蛋白」という用語は、「ポリペプチド」と同義であり、当技術分野で一般的に理解されているように、連続的なペプチド結合を介して連結しているアミノ酸の少なくとも１本の鎖を指す。特定の実施形態では、「目的の蛋白」は、宿主細胞中に形質転換された外因性の核酸分子がコードする蛋白である。特定の実施形態では、「目的の蛋白」は、宿主細胞に形質移入されている、外因性のＤＮＡがコードし、外因性のＤＮＡの核酸配列が、アミノ酸の配列を決定する。特定の実施形態では、「目的の蛋白」は、宿主細胞にとって内因性である核酸分子がコードする蛋白である。特定の実施形態では、例えば、１つまたは複数の制御配列を含有することおよび／あるいは目的の蛋白の発現を増強する蛋白をコードすることができる、外因性の核酸分子を宿主細胞に形質移入することによって、そのような内因性の目的の蛋白の発現を変化させる。本発明の方法および組成物を使用して、これらに限定されないが、薬学的特性、診断用特性、農業用特性ならびに／あるいは商業的、実験的および／またはその他の適用例において有用である多様なその他の特性のいずれかを有する蛋白をはじめとする、目的の蛋白のいずれをも生成することができる。その上、目的の蛋白は、蛋白性治療薬であることもできる。すなわち、蛋白性治療薬は、それが作用する体内の領域またはそれが中間体を介して間接的に作用する体の領域に対して、生物学的効果を有する蛋白である。蛋白性治療薬の例を、以下で、より詳細に議論する。特定の実施形態では、本発明の方法および／または組成物を使用して生成する蛋白を、加工および／または改変することができる。例えば、本発明に従って生成しようとする蛋白を、グリコシル化することができる。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「タイター」という用語は、所与の容量の培地中で細胞培養によって生成した、組換え発現させた蛋白の全量を指す。タイターは、通常、１ミリリットルの培地あたりの蛋白のミリグラムまたはマイクログラムの単位で表す。
【００４４】
当業者であれば、本明細書に開示する方法を使用して、当技術分野で日常的に使用および培養される周知の哺乳動物細胞の多くを培養することができること、すなわち、本明細書に開示する方法は、本開示に関する使用のみに制限されないことを認識するであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞をはじめとする、哺乳動物細胞、例えば、非形質移入哺乳動物細胞を、生成用バイオリアクターの条件と一致した環境に適応させて、目的の蛋白のそれに続く生成の間の細胞の増殖を改善することができることが発見されている。また、そのような方法は、非形質移入哺乳動物細胞および形質移入哺乳動物細胞（例えば、ｃＤＮＡを形質移入した哺乳動物細胞、または発現ベクターからのように、所望の組換え蛋白の発現を起こすゲノム構築物）の両方に適用することができる。本発明を使用して、例えば、薬学的または商業的に適切な酵素、受容体、抗体（例えば、モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体）、Ｆｃ融合蛋白、サイトカイン、ホルモン、制御因子、増殖因子、凝固因子、抗原結合物質等、いずれかの治療用蛋白の有利な生成のために、細胞を適応させることができる。当業者であれば、本発明に従って生成することができる、その他の蛋白が分かり、本明細書に開示する方法を使用して、そのような蛋白を生成することができるであろう。
【００４６】
非形質移入哺乳動物細胞を適応させるための本発明の方法は、優れた生産性をもたらしかつ／または優れた蛋白生成の特徴を示す細胞系を、同定する可能性を有する。さらに、本発明の方法は、細胞系の適切な候補を、標準的な細胞系の開発手順と比較して、より迅速に、かつより少しの努力で同定するのに役立つことができる。例えば、細胞系の候補を同定するための標準的なプロセスは、通常、異なる規模での多数の実験および強さに関する追加の試験が必要である。
【００４７】
宿主細胞は、形質転換する前は、非形質移入であるとみなされる。従来、開発のために新しい細胞系を生み出す場合、目的の蛋白を発現させたるために、非形質移入宿主細胞に外因性ＤＮＡを最初に形質移入または形質転換した。そのような以前の方法を使用する場合、一般的に、形質移入に先立っては、宿主細胞を用いて実験することも、宿主細胞を変化させることもなかった。蛋白産物を生成するために宿主細胞を遺伝子操作してから、細胞系の開発に関する実験および研究を開始した。
【００４８】
特定の実施形態では、１つまたは複数の本発明の方法に従って、蛋白生成条件に非形質移入哺乳動物細胞を適応させて、回分式、流加式および／または灌流式のバイオリアクターのプロセスにおける改善された性能を得ることができる。特定の実施形態では、そのような開発によって、そのような適応させた細胞は、改善された表現型を維持することができ、例えば、より強力な増殖、生存率の上昇、生細胞の集積密度の増加、タイターの増加、細胞の特異的な生産性の向上および／またはより高い細胞密度を示す。本明細書に記載する発明の方法の特定の実施形態を利用して、回分式、流加式および／または灌流式の蛋白生成プロセスに、非形質移入哺乳動物細胞を適応させて、優れた性能をもたせることができる。
【００４９】
例えば、Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ製）、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ製）またはダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ製）等、多様な市販の培地のいずれかを、基本培地として使用することができる。次いで、そのような基本培地に、アミノ酸、ビタミン、無機塩、微量元素および／またはその他の成分を補い、増殖培地および／または生成培地を生成することができる。特定の実施形態では、形質移入哺乳動物細胞または非形質移入哺乳動物細胞を、生成培地と同様または同一である生成培地中で培養することによって、細胞を適応させることができる。特定の実施形態では、回分様式、流加様式および／または灌流様式で動作するバイオリアクター中の生成条件下において通常遭遇する条件と同様または同一である条件下（例えば、バイオリアクター中で通常見い出される培地と一致する培地中）で細胞を増殖させることによって、細胞を適応させる。特定の実施形態では、適応させようとする細胞は、形質移入されていない。特定の実施形態では、適応させようとする細胞は、外因性の核酸分子、例えば、目的の蛋白を発現させる核酸分子を用いて形質移入されている。特定の実施形態では、外因性の核酸分子を用いた形質移入に先立って蛋白生成条件に細胞を適応させることによって、蛋白生成期の間の１つまたは複数の細胞培養物の特徴を改善する。特定の実施形態では、そのような改善した細胞培養物の特徴として、制限はないが、増殖の改善、全体的な細胞の生存率の改善、生細胞の集積密度の増加、タイターの増加および／または細胞の特異的な生産性の向上があげられる。通常、生成培地は、増殖培地よりも強化されており、例えば、増殖培地と比較して、より高いレベルの栄養素、ビタミン、微量元素および／またはその他の培地成分が補われている。
【００５０】
細胞系を発育させる間、増殖培地中で細胞を連続的に培養し、流加法による生成アッセイを開始するまで、細胞が生成培地に遭遇することがないことは、当技術分野における通常の慣行である。特定の実施形態では、形質移入に先立って、増殖培地および／または増殖条件ではなく、蛋白生成培地中および／または蛋白生成条件下で非形質移入哺乳動物細胞を適応させて、細胞を１つの環境から別の環境へ、例えば、増殖条件から形質移入後の蛋白生成条件へ移行させる場合の生じうる有害な作用を最小限に抑える。
【００５１】
特定の実施形態では、本発明の方法は、蛋白生成条件に適応させた宿主細胞系を作製するために有用である。そのような適応させた宿主細胞系に、多様な目的の蛋白のうちのいずれかを形質移入することができる。特定の実施形態では、そのような適応させた形質移入細胞系を、蛋白生成条件内に直接置く。特定の実施形態では、そのような適応させた形質移入細胞系を、増殖期の間に、所望の細胞密度および／または所望の細胞数まで増殖させ、その後、細胞系を、蛋白生成期へ移行させる。本発明によると、そのような適応させた形質移入細胞系は、移行期の間に、適応させていない形質移入細胞系と比較して、より少ないおよびより程度が低い有害な作用を示す。
【００５２】
特定の実施形態では、目的の蛋白を生成するために、適応させた宿主細胞に、外因性の核酸分子を形質移入する。特定の実施形態では、細胞内に導入した核酸分子が、本発明による発現が望まれる蛋白をコードする。特定の実施形態では、核酸分子は、制御配列を含有する、あるいは細胞が所望の蛋白を発現するのを誘導または増強する遺伝子産物をコードする。非限定的な例として、そのような遺伝子産物は、目的の蛋白の発現を増加させる転写因子であることができる。
【００５３】
特定の実施形態では、蛋白の発現を導く核酸を、宿主細胞内に安定に導入する。特定の実施形態では、蛋白の発現を導く核酸を、宿主細胞内に一過性に導入する。当業者であれば、実験的、商業的またはその他の必要性に基づいて、核酸を細胞内に安定または一過性のいずれの状態で導入すべきかを選ぶことができるであろう。
【００５４】
目的の蛋白をコードする遺伝子を、所望により、１つまたは複数の、遺伝子の制御調節要素に連結させることができる。いくつかの実施形態では、遺伝子の調節要素は、蛋白の構造的な発現を導く。いくつかの実施形態では、目的の蛋白をコードする遺伝子の誘導性発現を提供する遺伝子の調節要素を使用することができる。誘導性の遺伝子の調節要素（例えば、誘導性のプロモーター）を使用すると、細胞中での蛋白の生成を調節することができる。真核細胞中で使用する場合に有用である可能性が高い誘導性の遺伝子の調節要素の非限定的な例として、ホルモン制御領域（例えば、Ｍａｄｅｒ，Ｓ．およびＷｈｉｔｅ，Ｊ．Ｈ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５６０３−５６０７，１９９３を参照）、合成リガンド制御領域（例えば、Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１０１９−１０２４，１９９３を参照）、および電離放射線制御領域（例えば、Ｍａｎｏｍｅ，Ｙ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：１０６０７−１０６１３，１９９３；Ｄａｔｔａ，Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０１４９−１０１５３，１９９２を参照）があげられる。当技術分野で知られる、追加の、細胞に特異的なまたはその他の制御系も、本明細書に記載する方法および組成物に従って使用することができる。
【００５５】
宿主細胞中で発現可能であるいずれかの蛋白を、本発明の方法および組成物に従って生成することができる。蛋白を、宿主細胞にとって内因性である遺伝子からまたは宿主細胞中に導入した異種性の遺伝子から発現させることができる。蛋白は、自然に存在するものであってもよいし、代わりに、人工的に操作または選択した配列を有してもよい。生成しようとする蛋白を、個々に自然に発生する蛋白の断片から組み立てることができる。それに加えてまたはそれに代わって、操作した蛋白は、１つまたは複数の自然に発生しない断片を含むことができる。
【００５６】
細胞培養および蛋白の発現に敏感ないずれかの宿主細胞を、本発明に従って利用することができる。特定の実施形態では、宿主細胞は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の哺乳動物細胞である。本発明に従って使用することができる、哺乳動物細胞のその他の非限定的な例として、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫細胞系（ＮＳＯ／Ｉ、ＥＣＡＣＣ番号：８５１１０５０３）；ヒト網膜芽細胞腫（ＰＥＲ．Ｃ６（ＣｒｕＣｅｌｌ製、Ｌｅｉｄｅｎ、オランダ））、ＳＶ４０によって形質転換したサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）、ヒト胚腎臓系（２９３細胞または懸濁培養での増殖用にサブクローンした２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１  ５８７）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞癌系（Ｈｅｐ  Ｇ２）があげられる。
【００５７】
特定の実施形態では、阻害剤を補った増殖培地中で細胞（例えば、非形質移入哺乳動物細胞）を培養することによって、細胞を適応させる。特定の実施形態では、そのような阻害剤は、細胞を蛋白生成条件下で増殖させる場合に通常見い出される阻害剤を含む。そのような阻害剤の非限定的な例として、乳酸、アンモニア、アラニン、グルタミンおよび／またはアセト乳酸があげられる。当業者であれば、細胞を蛋白生成条件に適応させるために本発明に従って使用することができる、その他の阻害剤が分かるであろう。
【００５８】
特定の実施形態では、生成培地中に従来見い出された１種または複数の成分を欠く、または減少した濃度で含む適応培地中で細胞（例えば、非形質移入哺乳動物細胞）を培養することによって、細胞を適応させる。例えば、従来の生成培地は、通常、インスリンを約１０ｍｇ／Ｌ以上の濃度で含有する。したがって、特定の実施形態では、インスリンを欠く適応培地中で細胞を培養することによって、細胞を適応させる。特定の実施形態では、生成培地中で従来見い出されたインスリン濃度より低い濃度でインスリンを含有する適応培地中で細胞を培養することによって、細胞を適応させる。当業者であれば、生成培地中に通常存在するその他の成分が分かり、本発明の方法を使用して、そのような成分を欠く、または減少した濃度で含む培地に細胞を適応させることができるであろう。
【００５９】
特定の実施形態では、１種または複数の阻害剤を補った増殖培地中で非形質移入哺乳動物細胞を培養（例えば、連続培養）することによって、細胞を適応させる。そのような阻害剤の非限定的な例として、一次炭素源の二次的な副産物があげられる。例えば、いくつかの二次的な副産物として、これらに限定されないが、乳酸、アラニン、グルタミン、アセト乳酸および／またはアンモニアがあげられる。特定の実施形態では、適応培地中に存在するおよび／または添加する、そのような二次的な副産物の濃度は、例えば、約２．０から約１０．０ｇ／Ｌの乳酸および／または約０．１から約０．５ｇ／Ｌのアンモニア等、バイオリアクター条件中で通常遭遇する濃度を模倣する。特定の実施形態では、乳酸の適応培地中の濃度が約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５ｇ／Ｌ以上である条件下で、細胞を適応させる。それに加えてまたはそれに代わって、特定の実施形態では、アンモニアの適応培地中の濃度が約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４または１．５ｇ／Ｌ以上である条件下で、細胞を適応させる。
【００６０】
特定の実施形態では、１つまたは複数の本発明の方法に従って蛋白生成条件に適応させてある、個々の非形質移入哺乳動物細胞および／または非形質移入哺乳動物細胞の亜集団は、そのような二次的な副産物の取り込みに一致した表現型を示すことができ、その結果、二次的な副産物のレベルが時間と共に実際に減少する。特定の実施形態では、そのような適応させた非形質移入細胞は、目的の蛋白を生成するために外因性の核酸分子細胞を形質移入した後でも、二次的な副産物を吸収する能力を保有する。特定の実施形態では、一般的に、そのような適応させた形質移入細胞は、それに続く蛋白生成プロセス（例えば、流加式バイオリアクターのプロセス）において、副産物を取り込まない非形質移入哺乳動物細胞および／またはそのような二次的な副産物を取り込むようには適応させていない非形質移入哺乳動物細胞と比較して、より良好に振舞う。例えば、そのような適応させた形質移入哺乳動物細胞は、それに続く回分式、流加式および／または灌流式の蛋白生成プロセスにおいて、より良好に振舞う。生成用リアクター（例えば、流加式生成用リアクター）中に、そのような二次的な副産物が、その後の細胞の増殖および／または生存率を一般に阻害するレベルまで蓄積する場合がしばしばある。特定の実施形態では、本発明の方法に従って適応させて、補足した培地中で増殖させてある非形質移入哺乳動物細胞の亜集団は、生成用バイオリアクター中で通常遭遇する、阻害性およびストレスの多い条件下で、良好に増殖することができる。
【００６１】
細胞培養技術において知られているように、細胞培養の温度を下げる多くの場合、細胞培養を、増殖条件から蛋白生成条件へ切り換える。特定の形態では、蛋白産物の生成を促進する温度で細胞を培養することによって、細胞を適応させる。特定の形態では、約３１℃の温度で細胞を培養することによって、細胞を適応させるが、本発明の方法は、そのような温度に限定されない。例えば、約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４または４５°Ｃの温度で細胞を培養することによって、細胞を適応させることができる。当業者であれば、蛋白生成に適した温度が分かるであろう。そのような温度は、少なくもと部分的には、細胞系、生成しようとする蛋白、その他の培養条件および／または当業者が重要であるとみなす、いずれかのその他の要因によって異なる。
【００６２】
特定の実施形態では、「バッチ−リフィード」様式で、より長期間、非形質移入哺乳動物細胞を連続培養することによって、細胞を適応させる。特定の実施形態では、そのような「バッチ−リフィード」による適応法によって、非形質移入細胞を適応させる。特定の実施形態では、そのような「バッチ−リフィード」による適応法によって、形質移入細胞を適応させる。通常の細胞培養の操作は、３から４日毎に細胞培養物を、分割、継代またはサブカルチャーすることからなる細胞培養の管理法を利用することができる。「バッチ−リフィード」による適応法の特定の実施形態では、非形質移入哺乳動物細胞を、サブカルチャーする前に、７または８日間等、より長期間培養する。特定の実施形態では、哺乳動物細胞を、サブカルチャーする前に、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４日以上にわたり培養する。そのようなより長期間の培養は、細胞が適応することできる条件培地中で、細胞密度を増加させることおよび／またはより高いレベルの二次代謝産物を蓄積することによって、蛋白生成条件に細胞を適応させる、二重の効果を有する。
【００６３】
特定の実施形態では、「生成と一致した」条件下で、非形質移入哺乳動物細胞を連続的に培養することができる。特定の実施形態では、生成と一致した条件下での細胞培養と、それに続く、増殖培地を所望により用いる、「回復」条件または標準的な増殖条件下での３または４日を経た後の、細胞の亜集団の継代とからなる反復サイクルを用いて、非形質移入細胞を培養することができる。特定の実施形態では、集団を、適応プロセスの間に、複数回継代する。例えば、集団を、適応プロセスの間に、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０回以上継代することができる。特定の実施形態では、継代する前に、細胞集団を、より長期間増殖させることによって、細胞を蛋白生成条件に適応させる。例えば、継代する前に、細胞を、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４日以上増殖させることができる。そのような継代した亜集団を、１つまたは複数の望ましい特徴についてスクリーニングすることができる。特定の実施形態では、生成と一致した条件において、数サイクルの反復性の適応または連続的な適応を行うと、適応させていない出発集団よりも、例えば、改善された増殖および／または生存率をはじめとする、優れた特徴を示す細胞の亜集団が出現するであろう。その上、特定の実施形態では、特定の亜集団が、副産物、例えば、乳酸を吸収し始め、その結果、副産物のレベルが時間と共に減少し、生成用バイオリアクター中での細胞系の性能を増強する。特定の実施形態では、１つまたは複数の望ましい特徴（例えば、強力な増殖）を示す、１つまたは複数のスクリーニングした、細胞の亜集団を、次いで、目的の蛋白を生成するように形質転換し、それから、形質移入した亜集団を蛋白生成条件（例えば、細胞が適応している条件と一致した条件）中に置く。
【００６４】
特定の実施形態では、それぞれが２００５年８月２５日に出願されており、それぞれの全内容が参照によって本明細書に組み入れられている、米国特許出願第１１／２１３３０８号、第１１／２１３３１７号および第１１／２１３６３３号に記載されている細胞培養法のうちのいずれかに従って、細胞を増殖させる。例えば、特定の実施形態では、累積アミノ酸の濃度が約７０ｍＭ超である培地中で、細胞を増殖させることができる。特定の実施形態では、累積グルタミンの累積アスパラギンに対するモル比が、約２未満である培地中で、細胞を増殖させることができる。特定の実施形態では、累積グルタミンの累積全アミノ酸に対するモル比が、約０．２未満である培地中で、細胞を増殖させることができる。特定の実施形態では、累積無機イオンの累積全アミノ酸に対するモル比が、約０．４と約１との間である培地中で、細胞を増殖させることができる。特定の実施形態では、累積グルタミン濃度と累積アスパラギン濃度との合計が、約１６ｍＭと約３６ｍＭの間である培地中で、細胞を増殖させることができる。特定の実施形態では、前述の培地条件のうちの２つ、３つ、４つまたは５つの全てを有する培地中で、細胞を増殖させることができる。そのような培地を使用すると、高いレベルの蛋白の生成が可能になり、アンモニウムおよび／または乳酸等の特定の望ましくない要因の蓄積が減少する。
【００６５】
いくつかの実施形態では、全内容が参照によって本明細書に組み入れられている、２００６年７月１３日出願の米国仮特許出願第６０／８３０６５８号に記載されている１つまたは複数の条件下で、細胞を増殖させる。例えば、いくつかの実施形態では、マンガンを約１０ｎＭと約６００ｎＭとの間の濃度で含有する培地中で、細胞を増殖させる。いくつかの実施形態では、マンガンを約２０ｎＭと約１００ｎＭとの間の濃度で含有する培地中で、細胞を増殖させる。いくつかの実施形態では、マンガンを約４０ｎＭの濃度で含有する培地中で、細胞を増殖させる。糖蛋白を増やす場合にそのような培地を使用すると、改善されたグリコシル化のパターン（例えば、１本または複数のオリゴ糖鎖中のより多くの数の共有結合した糖残基）を有する糖蛋白の生成をもたらす。
【００６６】
生成培地および増殖培地の成分および／または補助剤を、細胞培養技術における当業者であれば容易に決定することができる。当技術分野で知られているように、成分および／または補助剤は、使用する宿主細胞および所望の目的の蛋白によって異なることができる。その上、バイオリアクターの条件および各細胞系が異なれば、生成する副産物の状態および量も異なる可能性がある場合もあれば、異なる場合もある。本開示を、以下の非限定的な実施例によってさらに例示する。異なる蛋白を生成する場合に、哺乳動物細胞を細胞培養培地に適応させる経過において必要になる可能性がある何らかの改変もまた、本細胞培養技術に十分に含まれる。
【実施例】
【００６７】
実施例１：非形質移入チャイニーズハムスター卵巣細胞の、生成と一致した条件への適応
非形質移入ＣＨＯＫ１細胞を、成分を以下の表１に列挙する増殖培地中での標準的な３日／４日間のバッチ−リフィード条件、または成分を以下の表２に列挙する強化した生成培地中での７日間のバッチ−リフィード様式のいずれかで、複数サイクル培養した。細胞を、１０から約３０ｍｌの作業容量、３７℃で培養した。実験からの細胞数を、図１ａおよび１ｂに示す。図１ａのバッチ−リフィード法の第５８日付近では、細胞を７日間ではなく９日間継代したところ、それに続く継代では、増殖が良好でなかった。しかし、この７日間の良好でない継代の後、細胞は回復することができた。
【００６８】
【表１−１】
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【００６９】
【表１−２】
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【００７０】
【表２−１】
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【００７１】
【表２−２】
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【００７２】
次いで、細胞を、流加法による生成アッセイで評価した。このアッセイでは、作業容量は、１０ｍｌと３０ｍｌとの間であった。細胞を、３７℃で４日間培養し、次いで、温度を、３１℃にシフトさせ、この温度に、アッセイが完了する第１２日まで保った。細胞の密度および生存率を比較し、結果を図１ｃに示す。７日間のバッチ−リフィード様式で培養した細胞は、標準的な３日／４日間のバッチ−リフィード様式で培養した細胞よりも高い細胞密度を示した。同様に、成分を以下の表３に列挙する生成培地中での増殖に適応させた、２つの異なる群の細胞は、適応させていない対照の出発集団よりも高い細胞密度を達成した。
【００７３】
【表３−１】
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【００７４】
【表３−２】
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【００７５】
実施例２：形質移入産物である細胞系の、生成と一致した条件への適応
モノクローナル抗体の重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を発現する細胞系を、成分を表１に列挙した標準的な増殖培地、または２種類の生成培地「Ａ」および「Ｂ」のいずれかを使用して、標準的な３日／４日間のバッチフィード条件下で培養した。成分を表２に列挙した生成培地Ａは、増殖培地と比較して、中等度に強化されており、成分を以下の表４に列挙する生成培地Ｂは、増殖培地と比較して、顕著に強化されていた。また、生成培地「Ｂ」中で、メトトレキサート（ＭＴＸ）の効果も試験し、１．５μＭのＭＴＸを、生成培地「Ｂ」を有する１つの培養物中に添加し、もう１つの培養物中には添加しなかった。細胞を、１０から約３０ｍｌの作業容量、３７℃で培養した。これらの培地中での適応の間の増殖速度を、図２ａに示す。
【００７６】
【表４−１】
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【００７７】
【表４−２】
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【００７８】
これらの培地中での連続培養後、細胞系を、流加法による生成アッセイで評価した。このアッセイでは、細胞を、生成培地Ｂ中で評価し、図２ｂに示す。細胞を、３７℃で４日間培養し、次いで、温度を、３１℃にシフトさせ、この温度に、アッセイが完了する第１２日まで保った。結果は、組換え蛋白を過剰発現する細胞系もまた、生成と一致した条件に適応し、流加法による生成アッセイにおいて優れた増殖の特徴を達成することができることを示している。
【００７９】
実施例３：非形質移入チャイニーズハムスター卵巣細胞の低インスリン条件への適応
インスリンは、哺乳動物細胞によるグルコースの代謝に直接影響を与える。細胞培養でのグルコースの迅速な消費は、代謝老廃物としての乳酸の排泄と頻繁に関連する。乳酸は、細胞の増殖を阻害することができ、細胞の生存率に対して負の作用を有する。また、インスリンは、哺乳動物細胞の増殖因子であるとも報告されている。
【００８０】
ＣＨＯＫ１宿主細胞系からの細胞を、（１０ｍｇ／Ｌ  ｎｕｃｅｌｌｉｎを含有する）通常の増殖培地から取り、完全にインスリンを欠く培地中に入れた。細胞が増殖の減少を示す初期の遅滞期を過ぎると、増殖速度は、インスリンを含有する培地中のＣＨＯＫ１対照培養物の増殖速度に匹敵する速度まで最終的に上昇し、これは、インスリンの非存在下で培養した細胞がこれらの条件に適応していることを示唆した。細胞の生存率は影響を受けず、適応を通して９０代の半ばを維持した。この適応は、約１００の集団の倍増に関して、継続した。適応させたＣＨＯＫ１−インスリン細胞を保存し、次いで解凍したところ、これらの細胞は、インスリンを欠く培地中で増殖する能力を維持した。インスリンを欠く培地中に解凍したＣＨＯＫ１対照細胞は、増殖速度の低下を示し、これは、Ｋ１−インスリン適応はまさしく細胞を変化させて、細胞の、外因性インスリンに非依存性の増殖を可能にすることを示唆した。インスリンに影響されない表現型と７日間の継代による適応の表現型との組合せ含んだを調査を継続する。
【００８１】
第１の流加法による生成アッセイを、ｐＨを調製しない形式で行った。実験は、陽性の対照として、標準的な生成培地（２０ｍｇ／ｍＬ  ｎｕｃｅｌｌｉｎ）中の適応させていないＣＨＯＫ１細胞、および負の対照として、インスリンを欠く培地中で培養した適応させていないＣＨＯＫ１細胞を含んだ。インスリンに影響されない適応させたＣＨＯＫ１細胞を、インスリンを欠く生成培地中で培養した。第３および７日には、供給培地中に、（０．００６ｍｇ／ｍＬの最終濃度で）インスリンを含めた。データを検討すると、インスリンを欠く培地中で増殖するように適応させたＣＨＯＫ１細胞は、ＣＨＯＫ１陽性対照検体と比較して、増殖、生存率およびＩＶＣＤの点で、非常に類似する特徴を有することが示唆されている（図３〜５を参照）。陰性対照であるＣＨＯＫ１検体は、増殖速度の低下を示した（図３を参照）。これらの結果から、インスリンを含有しない培地中で良好に増殖する能力から、インスリンを欠く増殖に適応させたＣＨＯＫ１細胞は、適応させていないＣＨＯＫ１細胞とは、本質的に異なることが確認されている。
【００８２】
次いで、インスリンに影響されない適応させたＣＨＯＫ１細胞を、第２の流加法による実験において、ｐＨを制御する条件下で評価した。この実験では、適応させていないＣＨＯＫ１細胞およびインスリンに影響されない適応させたＣＨＯＫ１細胞を、３種の別々の条件に置いた。第１の条件は、基本培地およびフィードの両方の中にインスリン（それぞれ、５０ｍｇ／Ｌおよび０．００６ｍｇ／ｍＬ）を含有し、図６〜９中に（＋／＋）の記号で表示した。第２の条件は、インスリンを含有するフィードを加えた、インスリンを欠く基本培地を含有し（図６〜９中に（−／＋）の記号で表示した）、第３の条件は、インスリンを欠く基本培地およびインスリンを欠く供給培地を含有した（図６〜９中に（−／−）の記号で表示した）。インスリンを欠く培地中で培養すると、インスリンに影響されない適応させたＣＨＯＫ１細胞は、適応させていないＣＨＯＫ１細胞と比較して、より良好な増殖、生存率およびＩＶＣＤを示した（図６〜９を参照）。ＣＨＯＫ１−インスリン適応細胞系は、より少ない乳酸を産生し、それらの細胞がいかなる乳酸を産生するにしても、それらはほとんど完全に消費されるようである（図９を参照）。このように不利な副産物が排除されるので、より健常な細胞培養物が得られ、これは、非常に見込みのある表現型とみなされる。この見込みのある表現型は、より良好な増殖条件を提供し、細胞が関連の対照よりも高い密度に達するのを可能にする。インスリンを含有する培地中で培養すると、ＣＨＯＫ１−インスリン適応細胞系が、対照の検体と同様の乳酸生成速度を有することから、この表現型は、培地からインスリンを排除したことと直接的な関係があることに留意されたい。
【００８３】
実施例３は、ＣＨＯＫ１細胞のインスリンを欠く条件への適応が、細胞を工業的に適切な生成の様式で培養した場合、望ましい表現型をもたらすことを実証している。改善した代謝性の表現型は、細胞の増殖および生存率の増加をもたらし、これには、組換えＣＨＯ細胞培養の容量に関する生産性に対して、顕著に正の影響を有することが期待される。
【００８４】
本開示の特定の実施形態を、本明細書に記載してきたが、上記の記載は、単に例示的なものに過ぎない。本明細書に開示した実施形態のさらなる改変例を、細胞培養技術における当業者であればもたらすことができるであろう。添付の特許請求の範囲が定義するように、そのような改変例の全てを、実施形態の範囲のうちに属するものとみなす。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１ａ】７日間のバッチ−リフィードの場合の生細胞の密度を示す図である。
【図１ｂ】標準的に分割した場合の生細胞の密度を示す図である。
【図１ｃ】生細胞の密度を示す図である。
【図２ａ】モノクローナル抗体細胞系の増殖速度を示す図である。
【図２ｂ】流加法の間の累積生細胞集積密度を示す図である。
【図３】インスリン欠如に適応させた細胞培養物および対照細胞培養物の細胞密度を示す図である。
【図４】インスリン欠如に適応させた細胞培養物および対照細胞培養物の生存率を示す図である。
【図５】インスリン欠如に適応させた細胞培養物および対照細胞培養物の累積ＩＶＣＤを示す図である。
【図６】インスリン欠如に適応させた細胞培養物および対照細胞培養物の細胞密度を示す図である。
【図７】インスリン欠如に適応させた細胞培養物および対照細胞培養物の生存率を示す図である。
【図８】インスリン欠如に適応させた細胞培養物および対照細胞培養物の累積ＩＶＣＤを示す図である。
【図９】インスリン欠如に適応させた細胞培養物および対照細胞培養物の特異的乳酸消費速度を示す図である。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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