(57)【要約】  本発明は、公知のガエグリンペプチドと比較して小さい構造を有し、強い抗菌及び抗癌の活性を示す、韓国のカエル（ツチガエル）から単離されたガエグリン５を用いた、抗菌性及び抗癌性のペプチドの工学に関する。特に、最も長さが短いガエグリン５から合成された、本発明の抗菌性及び抗癌性のペプチドは、グラム陽性菌株及びグラム陰性菌株に対する強い抗菌力、溶血活性が非常に低いという優れた安全性、有利な構造特性による薬剤吸収や薬剤輸送などの好ましい利点を示すので、強い抗菌又は抗癌剤として有用性がある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガエグリン５から合成され取り出された、配列番号１（Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｗ−Ｌ−Ｆ−Ｋ−Ｗ−Ａ−Ｋ−Ｋ）によって表される抗菌性及び抗癌性の新規ペプチド類縁体。
【請求項２】
ガエグリン５から合成され取り出された、配列番号２（Ｆ−Ｌ−Ｋ−Ｗ−Ｌ−Ｆ−Ｋ−Ｗ−Ａ−Ｋ−Ｋ）によって表される抗菌性及び抗癌性の新規ペプチド類縁体。
【請求項３】
ガエグリン５から合成され取り出された、配列番号３（Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｗ−Ｌ−Ｆ−Ｋ−Ｗ−Ａ−Ｗ−Ｋ）によって表される抗菌性及び抗癌性の新規ペプチド類縁体。
【請求項４】
ガエグリン５から合成され取り出された、配列番号４（Ｆ−Ｌ−Ｗ−Ｗ−Ｌ−Ｆ−Ｋ−Ｗ−Ａ−Ｗ−Ｋ）によって表される抗菌性及び抗癌性の新規ペプチド類縁体。
【請求項５】
ペプチドが、ペプチドの両親媒性な境界面をトリプトファンに置換した事を特徴とする方法で合成された、請求項１〜４のいずれかに記載の類縁体。
【請求項６】
ペプチドが、ペプチドの両親媒性な境界面をリシンに置換した事を特徴とする方法で合成された、請求項１〜４のいずれかに記載の類縁体。
【請求項７】
有効成分としての請求項１〜４に記載の抗菌性及び抗癌性のペプチドと、薬学的に許容しうる担体若しくはアジュバントとを含む、微生物起因の感染症の治療および予防のための薬学的組成物。
【請求項８】
微生物起因の感染症が、ブドウ球菌食中毒、蜂巣炎、尿路感染、髄膜炎、腹膜炎、膀胱炎、リンパ管炎、ひょう疽、中耳炎、呼吸器疾患、肺炎、化膿性炎、及び敗血症からなる群から選ばれる、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
有効成分としての請求項１〜４に記載の抗菌性及び抗癌性のペプチドと、薬学的に許容しうる担体若しくはアジュバントとを含む、癌疾患の治療および予防のための薬学的組成物。
【請求項１０】
癌疾患が、子宮頸癌、肺癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、肝臓癌、結腸癌、骨癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚のまたは眼球内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、胃癌、肛門部癌、乳癌、卵管癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰部癌、ホジキン病、食道癌、小腸腫瘍、内分泌腺癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道腫瘍、陰茎癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓および尿管の癌からなる群から選ばれた、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
ガエグリン５から合成され取り出された請求項１〜４に記載の抗菌性及び抗癌性のペプチドの有効量を、薬学的に許容しうる担体とともに投与することを含む、人間及び哺乳動物の、微生物起因の感染症及び癌疾患を治療又は予防する方法。
【請求項１２】
ガエグリン５から合成され取り出された請求項１〜４に記載の抗菌性及び抗癌性のペプチドを含む組成物の、哺乳動物における、微生物起因の感染症及び癌疾患用の薬剤製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガエグリン５（Ｇａｅｇｕｒｉｎ５）から合成され取り出された抗菌性及び抗癌性のペプチド類縁体に関する。
【０００２】
【背景技術】
【０００３】
現在、細胞膜に作用する抗菌ペプチドが、世界中の多くの生物種から発見されている。近年、従来の抗生物質の問題、すなわち抗生物質耐性菌の増加の問題を解決するために、抗菌ペプチドが研究者から注目されている。特に、１９６９年にキバラスズガエル（Ｂｏｍｂｉｎａ  ｖａｒｉｅｇａｔｅ）からボンビニン（ｂｏｍｂｉｎｉｎｓ）が初めて発見されてからは、無尾目（カエルとヒキガエル）の皮膚から広い抗菌活性スペクトルを有する抗菌ペプチドが豊富に供給されることが分かってきた。アフリカツメガエル（Ａｆｒｉｃａｎ  ｔｏｅｎａｉｌ  ｆｒｏｇ）から抗菌ペプチドが発見された後、すなわち１９８７年のマゲイニン（ｍａｇａｉｎｉｎ）の発見の後には、カエルの皮膚由来の抗菌ペプチドは治療薬としての可能性があるものとして、ますます注目されてきている。
【０００４】
抗菌ペプチドは、バクテリアの細胞膜に作用して選択的に膜を破壊することによってバクテリアを殺すので、抗菌ペプチドの作用機序は既存の抗生物質の作用機序と全く異なっており、また、耐性問題を解決するための代案として有用である。更に、抗菌ペプチドは、グラム陽性菌、グラム陰性菌、菌類、ウイルスおよび腫瘍細胞に対する広い抗菌活性スペクトルを有しているので、天然資源から単離された天然の物は、副作用のない優れた抗生物質になることが期待される。又、抗菌ペプチドは、両親媒性、すなわち水と脂質との両方に対して可溶性であるので、医薬の吸収および医薬の輸送などに関して非常に有利であることが期待される。しかしながら、抗菌ペプチドのそれらの好ましい利点にもかかわらず、抗菌ペプチドを医薬品として開発するにおいて、構造的安定性や大きく扱い難い分子量などのいくつかの問題が残っている。抗菌性抗生物質の大きな問題は、次のような、安定性と分子量である。まず第一に、安定性の面では、抗菌ペプチドは、生体内に存在する多くのタンパク質融解酵素に抵抗できずに、容易に分解してしまう。それらの問題は、Ｄ−アミノ酸、β−アミノ酸などの非天然由来のアミノ酸を導入して、それらの化学構造を修飾すること等によって解決できる。しかしながら、別の問題、すなわち、抗菌ペプチドの分子量が３，０００以上で嵩高いという問題は、医薬の吸収及び医薬の輸送等に関して解決すべき問題として依然として残っている。
【０００５】
抗癌物質は３種類に分類できる。すなわち、遺伝子、酵素、ワクチンなどを使った抗癌剤の様なバイオ工学医薬品、合成医薬品、及び天然物由来の医薬品に分類できる。しかしながら、いくつかの問題が残っている。例えば、バイオ工学医薬品のほとんどは臨床の抗癌剤として開発されたことがないという問題；多くの化学療法薬は、癌の種類によって種々の異なった薬理学的作用機序（ギルマンら、治療学の薬理学的基礎（Ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、Ｍａｘｗｅｌｌ  Ｍａｃｍｉｌｌａｎ．、１８、ｐ１２０２、１９８６）、および有毒な副作用（チャンら、Ｊ．Ｗｏｎｋｗａｎｇ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉ．，３，ｐｐ１３−３４，１９８７））を有するという問題がある。特に抗癌物質は、癌細胞だけではなく正常な細胞にも有毒な効果を示し、また、いくつかの因子、すなわち癌細胞の成長、増殖、及び転移の過程における突然変異によって引き起こされた抗癌物質に対する耐性を示している。大部分の抗癌物質の分子量は１，０００ダルトン未満なので、投与された抗癌物質は、癌細胞に吸収されるのと同様に正常な細胞組織にも吸収され、その結果として、正常な細胞、特に細胞分裂が活発な正常細胞に損傷をもたらし、例えば、骨髄の機能不全、胃腸疾患、脱毛症などを引き起こす。大部分の抗癌物質は、その分子量が小さいために、尿を通して容易に排出されるので、望ましい医学的効果を得るためには多量の薬品が要求される。
【０００６】
そこで、本発明者らは、先に述べた抗菌ペプチドと抗癌物質の問題を解決するために努力し、今日まで、強力な効能を示す有用で新規なペプチドを見出すために研究を行ってきた。そしてついに、本発明者らは、韓国のカエルから単離されたガエグリンと呼ばれる６種類の抗菌ペプチド、すなわちガエグリン１〜６の中で最も長さが短い、ガエグリン５を基にして合成した新規類縁体が、強力な抗菌性、抗癌性、及び非溶血活性を示すことを見出した。
【０００７】
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、広域スペクトルでの強い抗菌性及び抗癌性を示し且つ溶血性の副作用をほとんど示さない、ガエグリン５から合成され取り出された抗菌性及び抗癌性の新規ペプチド類縁体、及び、該新規ペプチド類縁体を含む、微生物起因の感染症や癌疾患の治療用および予防用の薬学的組成物を提供する。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
かくして、本発明の目的は、配列番号１（Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｗ−Ｌ−Ｆ−Ｋ−Ｗ−Ａ−Ｋ−Ｋ；以後、「モデル２５」と呼ぶ。）、配列番号２（Ｆ−Ｌ−Ｋ−Ｗ−Ｌ−Ｆ−Ｋ−Ｗ−Ａ−Ｋ−Ｋ；以後、「モデル２６」と呼ぶ。）、配列番号３（Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｗ−Ｌ−Ｆ−Ｋ−Ｗ−Ａ−Ｗ−Ｋ；以後、「モデル２７」と呼ぶ。）、および配列番号４（Ｆ−Ｌ−Ｗ−Ｗ−Ｌ−Ｆ−Ｋ−Ｗ−Ａ−Ｗ−Ｋ；以後、「モデル２８」と呼ぶ。）で表される、ガエグリン５から合成され取り出された抗菌性及び抗癌性の新規ペプチド類縁体を提供することにある。
【００１１】
上記ペプチドは、トリプトファンとリジン（ｌｙｓｉｎｅ）でペプチドの特定部分を置換することを特徴とする方法で合成される。
【００１２】
本発明の目的は、有効成分としての上記のガエグリン５から合成され取り出された抗菌性及び抗癌性のペプチド、及び薬学的に許容しうる担体若しくはアジュバントを含む、微生物起因の感染症や癌疾患の治療用および予防用の薬学的組成物を提供することにある。
【００１３】
本発明の目的は、ガエグリン５から合成され取り出された上記の抗菌性及び抗癌性のペプチドの有効量を、薬学的に許容しうる担体とともに投与することを含む、人間及び哺乳動物の、微生物起因の感染症や癌疾患を治療又は予防する方法を提供することにある。
【００１４】
更に、本発明は、ガエグリン５から合成され取り出された上記の抗菌性及び抗癌性のペプチドを含む組成物の、薬学的に許容しうる担体と一緒に、哺乳動物における微生物起因の感染症及び癌疾患用の薬剤製造のための使用を提供する。
【００１５】
本明細書に開示された用語「微生物起因の感染症」は、ブドウ球菌食中毒、蜂巣炎、尿路感染、髄膜炎、腹膜炎、膀胱炎、リンパ管炎、ひょう疽、中耳炎、呼吸器疾患、肺炎、化膿性炎、敗血症などを含み、好ましくは、ブドウ球菌食中毒、呼吸器疾患、又は肺炎を含む。
【００１６】
本明細書に開示された用語「癌疾患」は、子宮頸癌、肺癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、肝臓癌、結腸癌、骨癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚のまたは眼球内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、胃癌、肛門部癌、乳癌、卵管癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰部癌、ホジキン病、食道癌、小腸腫瘍、内分泌腺癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道腫瘍、陰茎癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓および尿管の癌を含み、好ましくは、子宮頸癌、肺癌、肝臓癌、結腸癌、皮膚癌、胃癌、前立腺癌、又は腎臓癌を含む。更に、本発明の組成物は、上記の癌疾患以外の癌腫を治療する際に有用である。
【００１７】
【００１８】
以下に、本発明について詳細に説明する。
【００１９】
ガエグリン５から合成され取り出された、本発明の抗菌性及び抗癌性のペプチド類縁体は、以下に詳細に示す手順で製造することができる。
【００２０】
本発明の抗菌性及び抗癌性のペプチドは、韓国のカエル、すなわちツチガエル（Ｒａｎａ  ｒｕｇｏｓａ）から単離された６種類のペプチド（ガエグリン１〜ガエグリン６）の中から選択された、最も短い残基（２４残基）を有するガエグリン５の構造を修飾することで調製合成することができる。
【００２１】
特に、最適化された抗菌性及び抗癌性のペプチド類縁体の合成のために、ペプチド類縁体が、Ｆｍｏｃアミノ基保護管ならびに親構造としてのガエグリン４および５を使った固相合成法によって合成することができる。
【００２２】
好ましくは、本発明のペプチド類縁体は、抗生物質活性をスクリーニングしながらガエグリン４のＣ−末端残基を取り除く工程；Ｎ−末端に２３残基だけが残った場合にそれらの抗生物質活性がなくなる程度までＣ−末端１４残基を除去する工程；不活性なガエグリン４類縁体中の第１６位の残基を、トリプトファン残基で置換して、抗生物質活性を示すガエグリン４類縁体（Ｄ１６Ｗ−ＧＧＮ４Ｎ２３）を合成する工程、から成る方法で調製することができる。そして、その結果、その部位へのトリプトファンの導入が重要な要件であることが分かった。
【００２３】
上記のガエグリン４用の方法と同じ方法で、ガエグリン５のＣ−末端残基を取り除きながら抗生物質活性をスクリーニングした結果、その活性のための必須要件は、１３残基を有する類縁体であることが分かった。
上述した通り、トリプトファンの導入はペプチド技術開発において重要であるので、１１種類のトリプトファン置換ガエグリン５類縁体を提供するために、ガエグリン５の活性な１３残基のフラグメントの代わりに、不活性な１１残基のフラグメントに、トリプトファン残基を導入してもよい。
類縁体の生物活性を確認した結果、トリプトファンが導入された２つの新規類縁体、すなわち、第４位に導入されたＡ４Ｗ−ＧＧ５１１、および第８位に導入されたＶ８Ｗ−ＧＧＮ５Ｎ１１は、ガエグリン５と同様の活性を示した。
その上、トリプトファンの第４位と第８位だけへの導入が特異的であるか否かに係りなく、他のアミノ酸、好ましくは、疎水性残基を有するロイシン、親水性でカチオン性イオンを有するリジン（ｌｙｓｉｎｅ）、及びトリプトファンと類似の芳香環を有するフェニルアラニンの導入によって、ガエグリン５由来の７種類の新規アミノ酸置換体の合成が行われた。
【００２４】
上記の方法で調製された類縁体Ａ４Ｗ−ＧＧ５１１及びＶ８Ｗ−ＧＧＮ５Ｎ１１の抗菌及び抗癌活性力を高めるために、トリプトファンの数を増やし、そして親水性の終端側と疎水性の始端側の間に位置する残基をリジンに置換することによって、新しいモデリングペプチド類縁体を調製することができた。
【００２５】
さらに、上記の合成法と同様に、遺伝子組換技術による方法、例えば上記の抗菌性及び抗癌性のペプチドを発現するのに適したペプチドのためにコード化されたＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含む遺伝子クローンを調製し、その遺伝子クローンを、本発明の目的とする抗菌性及び抗癌性のペプチドを得るためのペプチドを発現する適切な細胞に導入する方法を含む方法によっても、本発明の抗菌性及び抗癌性のペプチド類縁体を調製することができる。
【００２６】
また、本発明は、上記の方法で調製された抗菌性及び抗癌性のペプチド類縁体を提供する。
【００２７】
更に、本発明は、有効成分としての上記のガエグリン５から合成され取り出された抗菌性及び抗癌性のペプチド類縁体、および薬学的に許容しうる担体若しくはアジュバントを含む、微生物起因の感染症や癌疾患の治療および予防のための薬学的組成物を提供する。
【００２８】
上記の調製方法で得られたペプチドの中で、分子量と安定性に関して最も最適化された抗生ペプチド類縁体を調べるために、その類縁体の抗菌性、抗癌性および溶血活性を試験した。その結果、次のペプチド類縁体は、ガエグリン５から合成され取り出された類縁体Ａ４Ｗ−ＧＧ５１１およびＶ８Ｗ−ＧＧＮ５Ｎ１１と類似した抗菌性、抗癌性および溶血活性を有することが示された。
【００２９】
モデル２５：Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｗ−Ｌ−Ｆ−Ｋ−Ｗ−Ａ−Ｋ−Ｋ
【００３０】
モデル２６：Ｆ−Ｌ−Ｋ−Ｗ−Ｌ−Ｆ−Ｋ−Ｗ−Ａ−Ｋ−Ｋ
【００３１】
モデル２７：Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｗ−Ｌ−Ｆ−Ｋ−Ｗ−Ａ−Ｗ−Ｋ
【００３２】
モデル２８：Ｆ−Ｌ−Ｗ−Ｗ−Ｌ−Ｆ−Ｋ−Ｗ−Ａ−Ｗ−Ｋ
【００３３】
【００３４】
下記のペプチド類縁体は、ガエグリン５と類似した抗菌性及び抗癌活性を示しているにもかかわらず、強い溶血活性を示す：
【００３５】
Ｗ４，８−ＧＧＮ５Ｎ１３：Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｗ−Ｌ−Ｆ−Ｋ−Ｗ−Ａ−Ｓ−Ｋ−Ｖ−Ｌ
【００３６】
【００３７】
抗菌性及び抗癌性のペプチド類縁体がガエグリン５との構造的な類似性を示すか、並びに抗菌性、抗癌性および溶血活性に関する好ましい利点を示すかなどの様々な因子を検査した結果、目的の効果を満たすためにアミノ酸中の２３残基のうちで残基の最少数は１１であり、その類縁体が両親媒性を示す必要があり、そして、第４位と第８位での置換が最も活性を増加させるということが確かめられた。
加えて、強い抗菌性および抗癌活性を得るためには２より多くのトリプトファン残基の置換が必要だが、溶血活性の相対的な増加を引き起こし、そして更に、ペプチドの両親媒性の境界面に位置する残基をリジンに置換すると活性を増加させることができる。
【００３８】
【００３９】
ここで、以下の製剤方法と医薬品添加物は単なる例であって、本発明を限定するものではない。
【００４０】
本発明による組成物は、薬学的に許容しうる担体、アジュバント、又は希釈剤、例えば乳糖、ブドウ糖、蔗糖、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、スターチ、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、珪酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニールピロリドン、水、メチルヒドロキシ安息香酸、プロピルヒドロキシ安息香酸、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び鉱油を含む薬学的組成物として提供することができる。製剤には更に、充填剤、凝集防止剤、滑剤、湿潤剤、香料添加剤、乳化剤、保存料などを含ませることができる。本発明の組成物は、当該技術分野において周知の方法を採用することによって、その組成物を患者へ投与した後に、有効成分が迅速供給、持続的放出又は遅延放出されるように、調合することができる。
【００４１】
例えば、本発明の組成物は、油類、プロピレングリコール、又は注射剤の製造において一般的に使われる他の溶媒で溶解させることができる。担体の適切な例は、生理食塩水、ポリエチレングリコール、エタノール、植物油、イソプロピルミリステートなどを含むが、これらに制限されるものではない。局所性投与用として、本発明の化合物は、軟膏とクリームの形態で調合することができる。
【００４２】
本組成物を含む製剤は、経口投薬の剤形（粉薬、錠剤、カプセル、軟質のカプセル、水薬、シロップ、エリキシル丸剤、粉薬、小袋、顆粒）または、局所用の調合薬（クリーム、軟膏、ローション、ゲル、香油、パッチ、練り物、噴霧液、エアゾールなど）または、注射剤（溶液、懸濁液、乳液）などのいずれの形態にも調製することができる。
【００４３】
薬の剤形における本発明の組成物は、それらの薬学的に許容できる塩の形で使うことができ、また、単独、又は他の薬学活性のある化合物との組み合わせを始めとした適切な組合わせで使うこともできる。
【００４４】
本発明の組成物の好ましい投与量は、投与対象の状態と体重、重篤性、薬剤の形状、投与の経路と期間によって変わり、又、この技術分野の熟練者によって選ぶことができる。しかしながら、望ましい効果を得るためには、本発明の類縁体の一日当りの重さで、通常０．０１〜１０ｇ／ｋｇの範囲、好ましくは１〜５ｇ／ｋｇの範囲の量で投与することが一般に薦められる。投与は、１日１回、又は１日数回に分けてすることができる。組成物に換算して、本発明の組成物の量は、組成物の総重量に対して０．０１〜８０重量％、好ましくは０．５〜５０重量％である。
【００４５】
本発明の薬学的組成物は、様々な投与経路を通して、哺乳動物（ネズミ、マウス、家畜又は人間）などの対象動物に投与することができる。すべての投与の態様が想定される。例えば、投与は、経口で、直腸で、又は静脈、筋肉内、皮下、皮内、髄腔内、硬膜外、若しくは脳室内への注射で行うことができる。
【００４６】
【００４７】
本発明について、以下の例によって、より詳細に説明するが、本発明は、これらの例によって限定されることはない。
【００４８】
【００４９】
【発明の効果】
【００５０】
本発明の、ガエグリン５から合成され取り出された抗菌性及び抗癌性のペプチド類縁体は、グラム陽性菌株及び陰性菌株に対する強い抗菌活性、８種類の癌細胞株に対する強い抗癌活性、非常に低い溶血活性があるという優れた安全性、及び、従来から知られている抗菌性及び抗癌性のペプチドの中で最も短い構造という有利な構造特性によって医薬吸収や医薬輸送などにおいて好ましい利点を示す。
【００５１】
【図面の簡単な説明】
【００５２】
上記及び他の部分の事、及び本発明の特徴は、添付図面を参照することによって下記の発明についての説明から明確に理解できるようになる。：
【００５３】
【００５４】
【図１】ＳＤＳミセル中のＧＧＮ５の全体構造の側面図である。
【００５５】
【図２】ＳＤＳミセル中の両親媒性α−ヘリックス領域にあるＮ−末端部（Ｇ３〜Ｖ１３）の上面図である。
【００５６】
【図３】モデルペプチド２５のヘリカルホイール図である。
【００５７】
【図４】モデルペプチド２６のヘリカルホイール図である。
【００５８】
【図５】モデルペプチド２７のヘリカルホイール図である。
【００５９】
【図６】モデルペプチド２８のヘリカルホイール図である。
【００６０】
【図７】癌細胞株ＳＫ−ＭＥＬ−２に対するモデルペプチド２５の抗癌活性を示す図である。
【００６１】
【図８】癌細胞株Ａ５４９に対するモデルペプチド２５の抗癌活性を示す図である。
【００６２】
【図９】癌細胞株ＳＫ−ＯＶ−３に対するモデルペプチド２５の抗癌活性を示す図である。
【００６３】
【図１０】癌細胞株ＨＣＴ１１６に対するモデルペプチド２５の抗癌活性を示す図である。
【００６４】
【図１１】癌細胞株ＭＫＮ４５に対するモデルペプチド２５の抗癌活性を示す図である。
【００６５】
【図１２】癌細胞株ＰＣ−３に対するモデルペプチド２５の抗癌活性を示す図である。
【００６６】
【図１３】癌細胞株Ａ４９８に対するモデルペプチド２５の抗癌活性を示す図である。
【００６７】
【図１４】癌細胞株ＳＫ−ＭＥＬ−２に対するモデルペプチド２６の抗癌活性を示す図である。
【００６８】
【図１５】癌細胞株Ａ５４９に対するモデルペプチド２６の抗癌活性を示す図である。
【００６９】
【図１６】癌細胞株ＳＫ−ＯＶ−３に対するモデルペプチド２６の抗癌活性を示す図である。
【００７０】
【図１７】癌細胞株ＨＣＴｌ１６に対するモデルペプチド２６の抗癌活性を示す図である。
【００７１】
【図１８】癌細胞株ＭＫＮ４５に対するモデルペプチド２６の抗癌活性を示す図である。
【００７２】
【図１９】癌細胞株ＰＣ−３に対するモデルペプチド２６の抗癌活性を示す図である。
【００７３】
【図２０】癌細胞株Ａ４９８に対するモデルペプチド２６の抗癌活性を示す図である。
【００７４】
【図２１】癌細胞株ＳＫ−ＭＥＬ−２に対するモデルペプチド２７の抗癌活性を示す図である。
【００７５】
【図２２】癌細胞株Ａ５４９に対するモデルペプチド２７の抗癌活性を示す図である。
【００７６】
【図２３】癌細胞株ＳＫ−ＯＶ−３に対するモデルペプチド２７の抗癌活性を示す図である。
【００７７】
【図２４】癌細胞株ＨＣＴ１１６に対するモデルペプチド２７の抗癌活性を示す図である。
【００７８】
【図２５】癌細胞株ＭＫＮ４５に対するモデルペプチド２７の抗癌活性を示す図である。
【００７９】
【図２６】癌細胞株ＰＣ−３に対するモデルペプチド２７の抗癌活性を示す図である。
【００８０】
【図２７】癌細胞株Ａ４９８に対するモデルペプチド２７の抗癌活性を示す図である。
【００８１】
【図２８】癌細胞株ＳＫ−ＭＥＬ−２に対するモデルペプチド２８の抗癌活性を示す図である。
【００８２】
【図２９】癌細胞株Ａ５４９に対するモデルペプチド２８の抗癌活性を示す図である。
【００８３】
【図３０】癌細胞株ＳＫ−ＯＶ−３に対するモデルペプチド２８の抗癌活性を示す図である。
【００８４】
【図３１】癌細胞株ＨＣＴ１１６に対するモデルペプチド２８の抗癌活性を示す図である。
【００８５】
【図３２】癌細胞株ＭＫＮ４５に対するモデルペプチド２８の抗癌活性を示す図である。
【００８６】
【図３３】癌細胞株ＰＣ−３に対するモデルペプチド２８の抗癌活性を示す図である。
【００８７】
【図３４】癌細胞株Ａ４９８に対するモデルペプチド２８の抗癌活性を示す図である。
【００８８】
【図３５】癌細胞株ＳＫ−ＭＥＬ−２に対するＡ４Ｗ，Ｖ８Ｗ−ＧＧＮ５Ｎ１１の抗癌活性示す図である。
【００８９】
【図３６】癌細胞株Ａ５４９に対するＡ４Ｗ，Ｖ８Ｗ−ＧＧＮ５Ｎ１１の抗癌活性を示す図である。
【００９０】
【図３７】癌細胞株ＳＫ−ＯＶ−３に対するＡ４Ｗ，Ｖ８Ｗ−ＧＧＮ５Ｎ１１の抗癌活性を示す図である。
【００９１】
【図３８】癌細胞株ＨＣＴ１１６に対するＡ４Ｗ，Ｖ８Ｗ−ＧＧＮ５Ｎ１１の抗癌活性を示す図である。
【００９２】
【図３９】癌細胞株ＭＫＮ４５に対するＡ４Ｗ，Ｖ８Ｗ−ＧＧＮ５Ｎ１１の抗癌活性を示す図である。
【００９３】
【図４０】癌細胞株ＰＣ−３に対するＡ４Ｗ，Ｖ８Ｗ−ＧＧＮ５Ｎ１１の抗癌活性を示す図である。
【００９４】
【図４１】癌細胞株Ａ４９８に対するＡ４Ｗ，Ｖ８Ｗ−ＧＧＮ５Ｎ１１の抗癌活性を示す図である。
【００９５】
【図４２】癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ６３０に対するＡ４Ｗ，Ｖ８Ｗ−ＧＧＮ５Ｎ１１の抗癌活性を示す図である。
【００９６】
【発明を実施するための最良の形態】
【００９７】
本発明の趣旨および範囲から逸脱せずに、本発明の組成物、使用及び調製について、様々な修正および変形を行うことができることは当業者にとって明らかである。
【００９８】
以下の実施例によって、本発明について、より詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００９９】
【実施例】
【０１００】
以下の実施例と試験例は、本発明を更に説明することを意図するものであって、本発明の範囲を制限するものではない。
【０１０１】
【０１０２】
実施例１  ペプチドの合成および精製
【０１０３】
両親媒性を示す最も最適化された抗菌性及び抗癌性のペプチド類縁体を調製するために、新規で小型の抗菌性及び抗癌性のペプチドを、文献（Ｗｅｌｌｉｎｓ  Ｄ．Ａ．  ａｎｄ  Ａｔｈｅｒｔｏｎ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２８９，ｐｐ４４−６７，１９９７）に開示されている一般的なＦｍｏｃ化学を用いる固相法によって、親分子、すなわち、韓国のカエル（ツチガエル（Ｒａｎａ  ｒｕｇｏｓａ））の皮から単離されたガエグリン５ペプチドに基づいて詳細に調べた。
【０１０４】
ペプチドは、ペプチド合成機（Ｍｏｄｅｌ９０，アドバンスドケムテック社（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．））によって自動的に合成した。アドバンスドケムテック社から入手した７０ｍＭリンク樹脂を、反応容器に加えた。アミノ酸に対して、２当量のアミノ酸、３当量のＨＯＢＴ（１−ヒドロキシベンゾトリゾール）および２当量のＤＩＣ（１，３−ジイソプロピルカルボジイミド）の混合物を、アミノ酸用容器に加え、１０ｍｌのＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）で溶解した。ＤＭＦ溶媒を用いて、反応容器中の樹脂を膨潤させた。２５％ピペリジン／ＤＭＦ混合溶媒を用いて、樹脂中のＦｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）部分を除去した。アミノ酸用容器の中のアミノ酸溶液を反応容器に移して、２又は３時間樹脂と反応させた。そのアミノ酸にいくつかのアミノ酸を連結するために、上記の工程を繰り返し行い、新しいアミノ酸を連結すると伴に、２５％ピペリジン／ＤＭＦ混合溶媒を用いて、最後のアミノ酸のＮ−末端部分のＦｏｍｃ残基を除去した。リジンまたはセリン残基に付けられた保護基を除去し、２０ｍｌの１０％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）／ＤＣＭと４時間反応させて、合成されたペプチドを樹脂から単離した。固体樹脂を溶液から濾別し、該濾液を丸底フラスコに加え蒸留した。その溶媒を除去した後、０．１％ＴＦＡを含む２０％アセトニトリル１０ｍｌをそれに加え再溶解した。残った溶液を、遠心分離機又は濾紙を用いて濾過した。その上澄み液を凍結乾燥し、Ｃ−１８カラム（溶離液：アセトニトリルと０．１％トリフルオロ酢酸水溶液の混合液、流速：１ｍｌ／分）がセットされた分析逆相ＨＰＬＣ（ＷＥ  Ｊ５５Ｂ５、日立社製）を用いて、４５分間精製し、目的のペプチドだけを含む検出された画分を採取した。該ペプチドを凍結乾燥して、ガエグリン５由来の目的の合成ペプチド類縁体、すなわち、モデル２５（Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｗ−Ｌ−Ｆ−Ｋ−Ｗ−Ａ−Ｋ−Ｋ）、モデル２６（Ｆ−Ｌ−Ｋ−Ｗ−Ｌ−Ｆ−Ｋ−Ｗ−Ａ−Ｋ−Ｋ）、モデル２７（Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｗ−Ｌ−Ｆ−Ｋ−Ｗ−Ａ−Ｗ−Ｋ）、およびモデル２８（Ｆ−Ｌ−Ｗ−Ｗ−Ｌ−Ｆ−Ｋ−Ｗ−Ａ−Ｗ−Ｋ）を得た。
【０１０５】
【０１０６】
試験例１  抗菌活性の測定
【０１０７】
抗菌活性について、実施例１で調製した類縁体の抗菌効果を測定するために、次の実験を行った。
【０１０８】
【０１０９】
１-１  ＭＩＣの測定
【０１１０】
抗菌活性は、標準的な微量液体希釈法を用いて、種々の微生物に対するＭＩＣ値を測定することにより決定した。手短に、ルリア−ベルターニ培地（ＬＢ培地）を肉汁培地として用いた。実施例１で調製したサンプル（２ｍｇ／ｍｌ）３０μｌと液状培地２７０μｌを、９６穴マイクロタイタープレートのレーン１のウエルに加え、そして、残りのレーンのウエルに、１５０μｌの培地だけを加えた。レーン１の１５０μｌの試料液をレーン２と混合して、希釈溶液（ｘ２）を調製した。上記の方法と同様の希釈法で、各ウエルにおいて、次々に希釈して、最終薬物濃度の範囲が１．６〜２００μｇ／ｍｌの範囲となる程度の１５０μｌの希釈薬液（ｘ２）を調製した。
３ｍｌの培養液で１０6〜１０8コロニー形成ユニット／ｍｌになるまで培養した培養細胞２５μｌづつを、各ウエルに加え、そのマイクロタイタープレートを、一晩、３７℃の条件下で培養した。バクテリアの成長は、各試料液の６３０ｎｍにおける紫外線吸収度を評価することによって測定し、ＭＩＣ値は、細胞の成長を完全に阻害した最小ペプチド濃度として決定した。
【０１１１】
その結果、表１に示した様に、すべてのモデルペプチド類縁体は、ガエグリン５のペプチドと比べて、種々の菌株に対し強い抗菌活性を示した。
【０１１２】
【０１１３】
１-２  溶血性の測定
【０１１４】
ペプチド類縁体の溶血活性は以下の通り測定された。
【０１１５】
健康な男性から集められた血液サンプル３ｍｌを、１：１（ｖ／ｖ）の比率でＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、等張液）と混合し、遠心分離によって軟膜と血しょうを除去した。生理食塩水で３回洗浄し純粋な赤血球を単離した。該赤血球を、２０ｍｌのＰＢＳに懸濁させて、１５分間、３７℃の水浴で前培養した。
１０ｍｌのペプチド液を１９０ｍｌの赤血球溶液に混合してペプチドの最終濃度、すなわち、１００、５０、２５ｍｇ／ｍｌ、からなる種々の混合溶液を調製した。該溶液を、１５分間、３７℃の水浴で培養した。上澄み液を遠心分離機で遠心分離して、その上澄み液１００ｍｌを１ｍｌのＰＢＳで希釈して、５５０ｎｍでの吸光度を測定した。溶血性の百分率（％）は、サンプルの吸光度の、０．２％トリトンＸ−１００で処理した懸濁液の吸光度に対する相対的減衰から決定した。
【０１１６】
その結果、モデルペプチド類縁体は、表１に示すように、それらの親分子、すなわちガエグリン５、と類似のわずかな溶血活性を示した。従って、本発明のペプチド類縁体は安全で創薬に適しており、特にモデル２６は他のものよりはるかに少ない溶血性を示すことが確認された。
【０１１７】
【０１１８】
【表１】
2009537511.tif 000002
【０１１９】
【０１２０】
試験例２  抗癌活性の測定
【０１２１】
実施例１で調製した類縁体の癌細胞増殖における阻害活性を決定するために、次の実験を行った。
【０１２２】
実施例１で調製した類縁体の抗癌活性を確認するために、Ａ５４９（肺癌細胞株、ＡＴＣＣ、米国）、Ａ４９８（腎臓癌細胞株、韓国細胞株バンク、韓国）、ＨＣＴ１１６（結腸癌細胞株、韓国細胞株バンク、韓国）、ＭＫＮ４５（胃癌細胞株、韓国細胞株バンク、韓国）、ＮＣＩ−Ｈ６３０（肝臓癌細胞株、韓国細胞株バンク、韓国）、ＰＣ−３（前立腺癌細胞株、韓国細胞株バンク、韓国）、ＳＫ−ＭＥＬ−２（皮膚癌細胞株、韓国細胞株バンク、韓国）、及びＳＫ−ＯＶ−３（人間の固形癌細胞株、韓国細胞株バンク、韓国）を用いて、文献（アンジェリーナ  キンテロら、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ  Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．２，Ｎｏ．３，ｐｐ１０８−１１２，１９９９；アシュトシュ  Ｋ．パサークら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｎｕｔｒ．，Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．５，ｐｐ４１６−４２１，２００２）に記載された手順で、標準的な微量培養ＭＴＴ法を行った。
【０１２３】
各細胞株を、９６穴マイクロタイタープレートに注ぎ込み、２４時間３７℃で培養した。細胞が指数関数的成長期に達したときに、試験試料を各プレートに加え、各細胞を、溶解している及び溶解していないＤＭＳＯの両方が加えられたプレートに植え付けて、３日間培養した。５０□のＭＴＴ（２ｍｇ／ｍｌ）（Ｍ５６５５、ＳＩＧＭＡ、米国）を、それに加えて３時間培養した。上澄み液を除去して、そしてウエルを静かに震動させてホルマザンの結晶を溶解させた。１５０□のＤＭＳＯをそれに加えた。細胞で処理されていないウエルはブランクに設定し、そして、薬剤で処理されていないウエルは細胞の生存力に基づく標準に設定した。紫外線吸収度を、マイクロプレートリーダー（ＳＡＦＩＲＥ、Ｔｅｃａｎ、オーストリア）を用いて５７０ｎｍで測定し、細胞の生存力を算出した。細胞成長の阻害率（Inhibition）を下記の数式１に従って計算した。
【０１２４】
【０１２５】
数式１:
細胞成長の阻害率（％）＝
｛１−（処理された細胞の吸収度／未処理の細胞の吸収度）}  ×  １００
【０１２６】
【０１２７】
各細胞のＩＣ50値を、未処理の細胞の吸収度と比較して、吸収度が５０％減少する薬剤量によって算出した。
【０１２８】
その結果、表２及び図７〜４２に示すように、全てのモデルペプチド類縁体は、それらの親分子、すなわちガエグリン５と類似の抗癌活性を示すことが判った。
【０１２９】
【０１３０】
【表２】
2009537511.tif 000003
【０１３１】
【０１３２】
以下に、調合方法と医薬品添加物の種類について説明するが、本発明はそれらに限定されない。代表的な調製例を以下に示す。
【０１３３】
【０１３４】
粉薬の調製
【０１３５】
実施例１のペプチド類縁体  ５０ｍｇ
【０１３６】
乳糖  １００ｍｇ
【０１３７】
タルク  １０ｍｇ
【０１３８】
粉薬は、上記成分を混合し、密封包装に充填して、調製した。
【０１３９】
【０１４０】
錠剤の調製
【０１４１】
実施例１のペプチド類縁体  ５０ｍｇ
【０１４２】
コーンスターチ  １００ｍｇ
【０１４３】
乳糖  １００ｍｇ
【０１４４】
ステアリン酸マグネシウム  ２ｍｇ
【０１４５】
錠剤は、上記成分を混合し、錠剤化することによって、調製された。
【０１４６】
【０１４７】
カプセル剤の調製
【０１４８】
実施例１のペプチド類縁体  ５０ｍｇ
【０１４９】
コーンスターチ  １００ｍｇ
【０１５０】
乳糖  １００ｍｇ
【０１５１】
ステアリン酸マグネシウム  ２ｍｇ
【０１５２】
カプセル剤は、上記成分を混合し、ゼラチンカプセルに従来のゼラチン調製法によって充填して、調製した。
【０１５３】
【０１５４】
注射剤の調製
【０１５５】
実施例１のペプチド類縁体  ５０ｍｇ
【０１５６】
蒸留水  注射のための最適量
【０１５７】
ｐＨ調整剤  最適量
【０１５８】
注射剤は、有効成分を溶解し、ｐＨを約７．５に調整し、そして次に、全成分を２ｍｌのアンプルに充填し、従来の注射剤調製法で滅菌して、調製した。
【０１５９】
【０１６０】
液剤の調製
【０１６１】
実施例１のペプチド類縁体  ０．１〜８０ｇ
【０１６２】
砂糖  ５〜１０ｇ
【０１６３】
クエン酸  ０．０５〜０．３％
【０１６４】
カラメル  ０．００５〜０．０２％
【０１６５】
ビタミンＣ  ０．１〜１％
【０１６６】
蒸留水  ７９〜９４％
【０１６７】
ＣＯ2ガス  ０．５〜０．８２％
【０１６８】
液剤は、有効成分を溶解し、全成分を充填し、従来の液剤調製法で滅菌して調製した。
【０１６９】
この様に記載された本発明は、様々に変形できることは自明である。そういった変形例は、本発明の趣旨と範囲を超えるものとはみなされず、また、そのような、当業者にとって自明の修正は、以下の特許請求の範囲に含まれるものである。
【０１７０】
【産業上の利用可能性】
【０１７１】
本発明の、ガエグリン５から合成され取り出された抗菌性及び抗癌性のペプチド類縁体は、グラム陽性菌株及び陰性菌株に対する強い抗菌活性、８種類の癌細胞株に対する強い抗癌活性、非常に低い溶血活性であるという優れた安全性、および従来から知られている抗菌性及び抗癌性のペプチドの中で最も短い構造という有利な構造特性によって医薬吸収や医薬輸送などにおいて好ましい利点を示す。
【０１７２】
配列表
【０１７３】
配列番号１：Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｗ−Ｌ−Ｆ−Ｋ−Ｗ−Ａ−Ｋ−Ｋ  は、ガエグリン５から合成された「モデル２５」である。
配列番号２：Ｆ−Ｌ−Ｋ−Ｗ−Ｌ−Ｆ−Ｋ−Ｗ−Ａ−Ｋ−Ｋ  は、ガエグリン５から合成された「モデル２６」である。
配列番号３：Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｗ−Ｌ−Ｆ−Ｋ−Ｗ−Ａ−Ｗ−Ｋ  は、ガエグリン５から合成された「モデル２７」である。
配列番号４：Ｆ−Ｌ−Ｗ−Ｗ−Ｌ−Ｆ−Ｋ−Ｗ−Ａ−Ｗ−Ｋ  は、ガエグリン５から合成された「モデル２８」である。
【図１】
2009537511.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2009537511.tif 000008
【図６】
2009537511.tif 000009
【図７】
2009537511.tif 000010
【図８】
2009537511.tif 000011
【図９】
2009537511.tif 000012
【図１０】
2009537511.tif 000013
【図１１】
2009537511.tif 000014
【図１２】
2009537511.tif 000015
【図１３】
2009537511.tif 000016
【図１４】
2009537511.tif 000017
【図１５】
2009537511.tif 000018
【図１６】
2009537511.tif 000019
【図１７】
2009537511.tif 000020
【図１８】
2009537511.tif 000021
【図１９】
2009537511.tif 000022
【図２０】
2009537511.tif 000023
【図２１】
2009537511.tif 000024
【図２２】
2009537511.tif 000025
【図２３】
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【図２４】
2009537511.tif 000027
【図２５】
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【図２６】
2009537511.tif 000029
【図２７】
2009537511.tif 000030
【図２８】
2009537511.tif 000031
【図２９】
2009537511.tif 000032
【図３０】
2009537511.tif 000033
【図３１】
2009537511.tif 000034
【図３２】
2009537511.tif 000035
【図３３】
2009537511.tif 000036
【図３４】
2009537511.tif 000037
【図３５】
2009537511.tif 000038
【図３６】
2009537511.tif 000039
【図３７】
2009537511.tif 000040
【図３８】
2009537511.tif 000041
【図３９】
2009537511.tif 000042
【図４０】
2009537511.tif 000043
【図４１】
2009537511.tif 000044
【図４２】
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【国際調査報告】
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2009537511.tif 000047
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