(57)【要約】本発明は、単鎖鋳型に沿った二本鎖伸長の連続的サイクルを行なうことにより、核酸配列を決定する方法を提供する。該サイクルは、伸長、ライゲーション、および好ましくは、切断の工程を含む。ある特定の実施形態において、該方法では、ホスホロチオレート結合を含有する伸長プローブを利用し、かかる連結を切断するのに適した試薬を用いる。ある特定の実施形態において、該方法では、無塩基残基または損傷塩基を含有する伸長プローブを利用し、ヌクレオシドと無塩基残基間の連結を切断するのに適した試薬および／または損傷塩基を核酸から除去するのに適した試薬を用いる。本発明は、少なくとも２つの識別可能に標識されたプローブファミリーを用いて配列に関する情報を決定する方法を提供する。ある特定の実施形態において、該方法により、各サイクルで複数の鋳型内のヌクレオチドの各々から２ビット未満の情報が取得される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
鋳型ポリヌクレオチドチド内のヌクレオチドの配列の同定方法であって、以下：
（ａ）  オリゴヌクレオチドプローブを該鋳型ポリヌクレオチドにライゲートさせ、伸長された二本鎖を形成することにより、初期オリゴヌクレオチドを該鋳型ポリヌクレオチドチドに沿って伸長させる工程、ここで、該オリゴヌクレオチドプローブは微粒子に結合し、該微粒子は基材に結合し、該微粒子は半固体支持体に固定化されていない、工程；
（ｂ）  該ポリヌクレオチドチドの１つ以上のヌクレオチドを同定する工程；ならびに
（ｃ）  該ヌクレオチドの配列が決定されるまで工程（ａ）および（ｂ）を反復する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドプローブはホスホロチオレート結合を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記同定する工程が、最も新しくライゲートされたオリゴヌクレオチドプローブに結合された標識を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ホスホロチオレート結合を、Ａｇ、Ｈｇ、Ｃｕ、Ｍｎ、ＺｎおよびＣｄからなる群より選択される原子を含む切断剤で切断することにより、伸長可能なプローブ末端を生成させる工程をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記切断剤がＡｇＮＯ３である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記鋳型ポリヌクレオチドを伸長させる前に、該鋳型ポリヌクレオチドとブロッキングオリゴヌクレオチドとを接触させる工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが酵素的に伸長させることができない、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記微粒子が、ビオチンおよびビオチン結合タンパク質を含む連結によって前記基材に結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
一本鎖鋳型が、ビオチンおよびビオチン結合タンパク質を含む連結によって前記微粒子を前記基材に繋いでいる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記微粒子が、ビオチンおよびビオチン結合タンパク質を含む連結によって前記基材に結合し、該ビオチン結合タンパク質が、該基材に結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記微粒子が、ビオチンおよびビオチン結合タンパク質を含む連結によって前記基材に結合し、該ビオチン結合タンパク質が、該基材に結合し、前記鋳型がビオチンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記基材が実質的に平面状で剛性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
鋳型ポリヌクレオチドチドのヌクレオチドの配列の決定方法であって、以下：
（ａ）  鋳型ポリヌクレオチドチドにハイブリダイズされたプローブであって、伸長可能な末端を有するプローブを含むプローブ−鋳型二本鎖を提供する工程；
（ｂ）  伸長オリゴヌクレオチドプローブを該伸長可能な末端にライゲートし、伸長されたオリゴヌクレオチドプローブを含有する伸長された二本鎖を形成する工程であって、ここで、該オリゴヌクレオチドプローブは微粒子に結合し、該微粒子は基材に結合し、該微粒子は半固体支持体に固定化されていない、工程；
（ｃ）  該伸長された二本鎖において、（１）ライゲートしたばかりの該伸長プローブに相補的であるか、もしくは（２）該伸長されたオリゴヌクレオチドプローブのすぐ下流にある該鋳型ポリヌクレオチドチド内のヌクレオチド残基であるかのであるかのいずれかである、該鋳型ポリヌクレオチドチド内の少なくとも１つのヌクレオチドを同定する工程；
（ｄ）もし伸長可能な末端が既に存在しない場合は、生成される末端が、最後の伸長プローブがライゲートされた末端と異なるように、該伸長されたオリゴヌクレオチドプローブ上に伸長可能な末端を生成させる工程；ならびに
（ｅ）  該鋳型ポリヌクレオチドチドのヌクレオチドの配列が決定されるまで、工程（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を反復する工程、
を含む、方法。
【請求項１４】
前記伸長プローブはホスホロチオレート結合を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
各伸長プローブが伸長不可能な部分を一方の末端に有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記同定する工程が、最も新しくライゲートされた伸長プローブに結合された標識を検出することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記同定する工程が、前記伸長不可能な部分を除去すること、および前記伸長されたオリゴヌクレオチドプローブを核酸ポリメラーゼにより、１種類以上の標識された連鎖停止ヌクレオシド三リン酸の存在下で伸長させることを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記ライゲーション工程において伸長プローブが前記伸長可能な末端にライゲートされなかった場合はいつでも、伸長されたオリゴヌクレオチドプローブをキャッピングする工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記生成させる工程が、前記ホスホロチオレート結合を、Ａｇ、Ｈｇ、Ｃｕ、Ｍｎ、ＺｎおよびＣｄからなる群より選択される原子を含む切断剤で切断することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記切断剤がＡｇＮＯ３である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
（ｆ）前記ライゲートされたプローブおよび前記初期オリゴヌクレオチドを前記鋳型から除去する工程；（ｇ）前記鋳型ポリヌクレオチドチドと異なる配列に結合させた第２のオリゴヌクレオチドを用いて工程（ａ）を反復する工程；ならびに（ｈ）工程（ｂ）〜（ｅ）を反復する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
前記鋳型ポリヌクレオチドチドと異なる配列に結合させた初期オリゴヌクレオチドを用いて複数回反復される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記伸長プローブが伸長不可能な部分を一方の末端に有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
各反復で、前記同定する工程が、最も新しくライゲートされた伸長プローブに結合された標識を検出することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記ライゲーション工程において、伸長プローブが前記伸長可能な末端にライゲートされなかった場合はいつでも、伸長されたオリゴヌクレオチドプローブをキャッピングする工程をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記生成させる工程が、前記ホスホロチオレート結合を、Ａｇ、Ｈｇ、Ｃｕ、Ｍｎ、ＺｎおよびＣｄからなる群より選択される原子を含む切断剤で切断することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記切断剤がＡｇＮＯ３である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記プローブ−鋳型二本鎖を提供する前に、前記鋳型ポリヌクレオチドとブロッキングオリゴヌクレオチドとを接触させる工程を包含する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２９】
前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが酵素的に伸長させることができない、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記プローブ−鋳型二本鎖を提供する前に、
（ａ）  前記鋳型ポリヌクレオチドとブロッキングオリゴヌクレオチドとを接触させる工程、および
（ｂ）  プローブ−鋳型二本鎖を形成する工程
を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項３１】
鋳型ポリヌクレオチド内のヌクレオチドの配列の同定方法であって、以下：
（ａ）  半固相支持体内または該支持体上に固定化されているか、あるいは実質的に平面状で剛性の基材に結合されている微粒子に結合された鋳型ポリヌクレオチドを提供する工程、
（ｂ）該鋳型ポリヌクレオチドとブロッキングオリゴヌクレオチドとを接触させる工程
（ｃ）  オリゴヌクレオチドプローブを該鋳型ポリヌクレオチドにライゲートさせ、伸長された二本鎖を形成することにより、初期オリゴヌクレオチドを該鋳型ポリヌクレオチドに沿って伸長させる工程であって、ここで、オリゴヌクレオチドプローブは必要に応じて切れやすい連結を含む、工程；
（ｄ）  該ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドを同定する工程；ならびに
（ｅ）  該ヌクレオチドの配列が決定されるまで工程（ｃ）および（ｄ）を反復する工程
を含む、方法。
【請求項３２】
前記伸長させる工程が半固相支持体内で行なわれる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記鋳型が、実質的に平面状で剛性の基材に結合された微粒子に結合されている、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記微粒子が、ビオチンおよびビオチン結合タンパク質を含む連結によって前記基材に結合している、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
一本鎖鋳型が、ビオチンおよびビオチン結合タンパク質を含む連結によって前記微粒子を前記基材に繋いでいる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記微粒子が、ビオチンおよびビオチン結合タンパク質を含む連結によって前記基材に結合し、該ビオチン結合タンパク質が、該基材に結合している、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記ビーズに結合した一本鎖鋳型が、前記微粒子を前記基材に繋いでいる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
鋳型ポリヌクレオチドのヌクレオチドの配列の決定方法であって、以下：
（ａ）  該鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズされるプローブであって、伸長可能な末端を有するプローブを含むプローブ−鋳型二本鎖を提供する工程であって、ここで、該鋳型は、それにハイブリダイズしたブロッキングオリゴヌクレオチドを有し、該プローブ鋳型二本鎖は、半固相支持体内または該支持体上に包埋されているか、あるいは基材に結合している微粒子に結合されている、工程；
（ｂ）  伸長オリゴヌクレオチドプローブを該伸長可能な末端にライゲートし、伸長されたオリゴヌクレオチドプローブを含有する伸長された二本鎖を形成する工程であって、ここで、該伸長プローブはホスホロチオレート結合を含む、工程；
（ｃ）  該伸長された二本鎖において、（１）ライゲートされたばかりの該伸長プローブに相補的であるか、もしくは（２）該伸長されたオリゴヌクレオチドプローブのすぐ下流にある該鋳型ポリヌクレオチド内のヌクレオチド残基であるかのいずれかである鋳型ポリヌクレオチド内の少なくとも１つのヌクレオチドを同定する工程；
（ｄ）もし該伸長可能な末端が既に存在しない場合は、生成される末端が、最後の伸長プローブがライゲートされた末端と異なるように、伸長されたオリゴヌクレオチドプローブ上に伸長可能な末端を生成させる工程；ならびに
（ｅ）  鋳型ポリヌクレオチドのヌクレオチドの配列が決定されるまで工程（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を反復する工程
を含む、方法。
【請求項３９】
工程（ａ）の前に、鋳型とブロッキングオリゴヌクレオチドとを接触させる工程を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ライゲートする工程および前記生成させる工程が、半固相支持体内で行なわれる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記鋳型が、実質的に平面状で剛性の基材に結合された微粒子に結合されている、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記微粒子が、ビオチンおよびビオチン結合タンパク質を含む連結によって前記基材に結合している、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記微粒子が、ビオチンおよびビオチン結合タンパク質を含む連結によって前記基材に結合し、該ビオチン結合タンパク質が、該基材に結合している、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記微粒子に結合した一本鎖鋳型が、該微粒子を前記基材に繋いでいる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
鋳型ポリヌクレオチドのヌクレオチドの配列の決定方法であって、以下：
（ａ）  微粒子の存在下、エマルジョンの区画内で、該微粒子に結合した鋳型ポリヌクレオチドのクローン性の集団を有する微粒子が生成されるように、鋳型ポリヌクレオチド分子を増幅する工程；
（ｂ）  該微粒子を該エマルジョンから回収する工程；
（ｃ）  該微粒子を、半固相支持体内または該支持体上に包埋させるか、該微粒子を基材に結合させる工程；
（ｄ）  オリゴヌクレオチドプローブを該鋳型ポリヌクレオチドにライゲートさせ、伸長された二本鎖を形成することにより、初期オリゴヌクレオチドを該鋳型ポリヌクレオチドに沿って伸長させる工程であって、ここで、該オリゴヌクレオチドプローブは切れやすい連結を含む、工程；
（ｅ）  該ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドを同定する工程；ならびに
（ｆ）  該ヌクレオチドの配列が決定されるまで工程（ｄ）および（ｅ）を反復する工程
を含む、方法。
【請求項４６】
（ｉ）異なる配列を含む複数の鋳型ポリヌクレオチド分子がエマルジョンの個々の区画内で増幅され；（ｉｉ）各々が自身に結合され鋳型ポリヌクレオチドのクローン性の集団を有し、該クローン性の集団が異なる配列を有する複数の微粒子が、エマルジョンから回収され、前記支持体内または該支持体上に包埋され、そして（ｉｉｉ）  工程（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）が、複数の配列が並行して決定されるように、包埋または結合された微粒子に結合されたクローン性の集団において並行して行なわれる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
工程（ｃ）の前に、前記鋳型ポリヌクレオチドとブロッキングオリゴヌクレオチドとを接触させる工程を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記微粒子が、ビオチンおよびビオチン結合タンパク質を含む連結によって前記基材に結合している、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記微粒子が、ビオチンおよびビオチン結合タンパク質を含む連結によって前記基材に結合し、該ビオチン結合タンパク質が、該基材に結合している、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記微粒子に結合した一本鎖鋳型が、該微粒子を前記基材に繋いでいる、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
少なくとも２つの識別可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブファミリーの第１のコレクションを用いて、鋳型ポリヌクレオチド内のヌクレオチドの配列に関する情報を決定する方法であって、
（ａ）  オリゴヌクレオチドプローブを該鋳型ポリヌクレオチドにライゲートさせ、伸長された二本鎖を形成することにより、初期オリゴヌクレオチドを該鋳型ポリヌクレオチドに沿って伸長させる工程であって、ここで、オリゴヌクレオチドプローブは、識別可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブファミリーのコレクションのメンバーであり、それにハイブリダイズしたブロッキングオリゴヌクレオチドを有する、工程；
（ｂ）  該オリゴヌクレオチドプローブと会合した標識を検出する工程；ならびに
（ｃ）  プローブファミリーの序列リスト名が得られるまで工程（ａ）および（ｂ）を反復する工程；ならびに
（ｄ）  該ヌクレオチドの配列に対する１つ以上の可能性を排除するためにプローブファミリーの該序列リスト名を使用する工程
を含む、方法。
【請求項５２】
工程（ｄ）が、前記配列を決定するためにプローブファミリーの前記序列リスト名をデコード化することを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズされた初期オリゴヌクレオチドプローブであって、伸長可能な末端を有するプローブを含むプローブ−鋳型二本鎖を提供することを含み、伸長させる工程が、該オリゴヌクレオチドプローブを該伸長可能な末端にライゲートさせて、伸長されたオリゴヌクレオチドプローブを含有する伸長された二本鎖を形成させることを含み、さらに、伸長させる工程においてオリゴヌクレオチドプローブが該伸長可能な末端にライゲートされなかった場合はいつでも、任意の残留する伸長可能な末端をキャッピングする工程を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
各プローブファミリー内の前記オリゴヌクレオチドプローブが伸長不可能な部分を一方の末端に含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
各検出工程後に、（ｆ）もし伸長可能な末端が既に存在しない場合は、生成される末端が、前記最も新しくライゲートされたオリゴヌクレオチドプローブがライゲートされた末端と異なるように、伸長可能な末端を、該最も新しくライゲートされたオリゴヌクレオチドプローブ上に生成させることをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
前記オリゴヌクレオチドプローブがホスホロチオレート結合を含み、前記伸長可能なプローブ末端が、該ホスホロチオレート結合を、Ａｇ、Ｈｇ、Ｃｕ、Ｍｎ、ＺｎおよびＣｄからなる群より選択される原子を含む切断剤で切断させることにより生成される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記切断剤がＡｇＮＯ３である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記伸長させる工程が半固相支持体内または該支持体上で行なわれる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５９】
前記鋳型が、実質的に平面状で剛性の基材に結合された微粒子に結合されている、請求項５１に記載の方法。
【請求項６０】
前記コレクションが２つの識別可能に標識されたプローブファミリーを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項６１】
前記コレクションが３つの識別可能に標識されたプローブファミリーを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項６２】
前記コレクションが４つの識別可能に標識されたプローブファミリーを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項６３】
前記コレクションが、４つより多くの識別可能に標識されたプローブファミリーを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項６４】
前記オリゴヌクレオチドプローブが、ヌクレオシドが独立しては選択されない拘束部分を含み、配列が異なる拘束部分を有するオリゴヌクレオチドプローブが、コード化に従ってプローブファミリーに割り当てられる、請求項５１に記載の方法。
【請求項６５】
オリゴヌクレオチドプローブが、表１に示す２４個のコード化の１つに従って第１、第２、第３および第４のプローブファミリーに割り当てられる、請求項５１に記載の方法。
【請求項６６】
鋳型内の少なくとも１つのヌクレオチドが既知の正体を有し、デコード化する工程が：
（ｉ）  正体を、どの正体が既知ヌクレオチドの正体と一致するか、およびその近位ヌクレオチドが、既知の正体のヌクレオチドに隣接するヌクレオチドに対向してライゲートされたプローブの拘束部分の可能な配列を調べることにより、既知の正体のヌクレオチドに隣接する該鋳型内の該ヌクレオチドに割り当てる工程；
（ｉｉ）  どの正体が、その近位ヌクレオチドが後続のヌクレオチドに対向してライゲートされたプローブの拘束部分の可能な配列と一致するかを調べることにより、正体を後続のヌクレオチドに割り当てる工程；ならびに
（ｉｉｉ）  配列が決定されるまで工程（ｉｉ）を反復する工程
を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項６７】
（ａ）  ヌクレオチドが既知の正体を有するように、前記鋳型内のヌクレオチドの該正体を決定する工程をさらに含み、ここで前記デコード化する工程は：
（ｉ）  正体を、どの正体が既知ヌクレオチドの正体と一致するか、およびその近位ヌクレオチドが、既知の正体のヌクレオチドに隣接するヌクレオチドに対向してライゲートされたプローブの拘束部分の可能な配列を調べることにより、既知の正体のヌクレオチドに隣接する該鋳型内のヌクレオチドに割り当てる工程；
（ｉｉ）  どの正体が、その近位ヌクレオチドが後続のヌクレオチドに対向してライゲートされたプローブの拘束部分の可能な配列と一致するかを調べることにより、正体を後続のヌクレオチドに割り当てる工程；ならびに
（ｉｉｉ）  配列が決定されるまで工程（ｉｉ）を反復する工程
を含む
をさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項６８】
前記決定する工程が、鋳型プローブ二本鎖を標識されたヌクレオチドと、ポリメラーゼの存在下、該二本鎖に隣接する位置の該鋳型に相補的である場合は、標識されたヌクレオチドの組込みを可能にする条件下で接触させることを含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記デコード化する工程が、少なくとも１つの候補配列をプローブファミリーの前記序列リスト名から生成させること；および前記鋳型内のヌクレオチドの配列として候補配列を選択することを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項７０】
前記生成させる工程が、少なくとも４つの候補配列を生成させることを含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記生成させる工程が、
（ｉ）  正体をヌクレオチドの配列内の第１のヌクレオチドと仮定すること；
（ｉｉ）  可能な正体を該第１のヌクレオチドに対応するプローブファミリー名に基づいて隣接するヌクレオチドと決定することにより、正体を第１のヌクレオチドに隣接するヌクレオチド割り当てること；
（ｉｉｉ）  その正体が最も新しく割り当てられたヌクレオチドに対応するプローブファミリー名に基づいて可能な正体を後続のヌクレオチドと決定することにより、正体を後続のヌクレオチドに割り当てること；
（ｉｖ）  候補配列が生成されるまで工程（ｉｉｉ）を反復すること；ならびに
（ｖ）  工程（ｉ）〜（ｉｖ）を反復することであって、ここで、各反復において、所望数の候補配列が生成されるまで、異なる正体を該第１のヌクレオチドと仮定すること
を含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
前記選択工程が、少なくとも１つの候補配列を１つ以上の既知配列と比較すること、および該既知配列の１つ以上と所定の程度の同一性を示すか、またはほとんどほぼ同一である候補配列を選択することを含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
前記鋳型が、目的の生物体由来のものであり、前記比較工程が、少なくとも１つの候補配列を、該生物体から得られた配列を含むデータベース内の配列と比較することを含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記比較工程が、少なくとも１つの候補配列を、各々が、測定対象のポリヌクレオチドの配列の可能な択一的な配列を含む複数の比較配列を含むデータベース内の配列と比較することを含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記選択工程が、
（ｉ）  第２のプローブファミリーの序列リスト名を、前記鋳型から、識別可能に標識されたコードされたプローブのファミリーの第２のコレクションを用いて得ることであって、ここで、該プローブファミリーの該第２のコレクション内のプローブファミリーは、プローブファミリーの前記第１のコレクション内のプローブファミリーと異なるようにコードされていること；
（ｉｉ）  少なくとも１つの比較配列を、該第２のプローブファミリーの序列リスト名から生成させること；
（ｉｉｉ）  候補配列の少なくとも１つの一部分を比較配列の少なくとも１つの一部分と比較すること；ならびに
（ｉｖ）  所定のレベルの同一性を示すか、または該鋳型内のヌクレオチドの配列として工程（ｃ）で比較される部分において、該比較配列とほとんどほぼ同一である候補配列を選択すること
を含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７６】
前記比較される部分が単一のジヌクレオチドである、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記第２のプローブファミリーの序列リスト名が、単一の要素のみを含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
各プローブファミリー内のオリゴヌクレオチドプローブが、構造５’−（ＸＹ）（Ｎ）ｋＮＢ＊−３’または３’−（ＸＹ）（Ｎ）ｋＮＢ＊−５’（式中、Ｎは任意のヌクレオシド表し、ＮＢはリガーゼによって伸長可能でない部分を表し、＊は検出可能な部分を表し、ＸＹはプローブの拘束部分であり、ここで、ＸおよびＹは、同一または異なるが独立しては選択されないヌクレオシドを表し、ＸおよびＹは少なくとも２重に縮重しており、少なくとも１つのヌクレオシド間結合は切れやすい連結であり、ｋは１〜１００（両端を含む）であり、ただし、検出可能な部分は、Ｙ上に、または（Ｎ）ｋの任意のヌクレオシド上に、ＮＢの代わりまたはこれに加えて存在し得るものとする）
を有する、請求項５０に記載の方法。
【請求項７９】
前記切れやすい連結がホスホロチオレート連結である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記検出可能な部分が、切断可能なリンカーに結合されているか、光退色性であるか、またはその両方である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記切断可能なリンカーがジスルフィド結合を含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
４つの識別可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブファミリーが使用され、プローブの拘束部分の異なる配列を有するオリゴヌクレオチドプローブが、表１に示す２４個のコード化の１つに従って第１、第２、第３および第４のプローブファミリーに割り当てられる、請求項７８に記載の方法。
【請求項８３】
前記検出工程が、平均２ビットの情報を同時に、任意の個々のヌクレオチドの２ビットの情報を取得することなく、少なくとも２つの前記鋳型内のヌクレオチドの各々から取得することを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項８４】
前記検出工程が、２ビット未満の情報を同時に、前記鋳型内の少なくとも２つのヌクレオチドの各々から取得することを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項８５】
少なくとも２つの識別可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブファミリーの第１のコレクションを用いて、鋳型ポリヌクレオチド内のヌクレオチドの配列に関する情報を決定する方法であって、
（ａ）  二本鎖部分を含むプローブ−鋳型複合体を伸長可能な末端と、および目的の配列決定対象の単鎖部分を少なくとも２つの識別可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブファミリーと、ハイブリダイゼーションが該鋳型の該二本鎖部分に直接隣接する部分に相補的な部分を含むオリゴヌクレオチドプローブ間で起こるように接触させる工程であって、該鋳型は、それにハイブリダイズしたブロッキングオリゴヌクレオチドを有する、工程；
（ｂ）  ハイブリダイズされた該オリゴヌクレオチドプローブを該伸長可能な末端にライゲートさせ、それにより、伸長された二本鎖を含むプローブ−鋳型複合体を生成させる工程；
（ｃ）  該ライゲートされたプローブと会合した標識を検出する工程；
（ｄ）  伸長可能なプローブ末端が既に存在しない場合は、該伸長可能なプローブ末端を該伸長された二本鎖上に生成させる工程；ならびに
（ｅ）  プローブファミリーの序列リスト名が得られるまで（ａ）〜（ｄ）を反復する工程
を含む、方法。
【請求項８６】
前記検出工程が、平均２ビットの情報を同時に、任意の個々のヌクレオチドの２ビットの情報を取得することなく、少なくとも２つの前記鋳型内のヌクレオチドの各々から取得することを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記検出工程が、２ビット未満の情報を同時に、前記鋳型内の少なくとも２つのヌクレオチドの各々から取得することを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
オリゴヌクレオチドプローブファミリーの第１のコレクションを用いて、鋳型ポリヌクレオチド内のヌクレオチドの配列に関する情報を決定する方法であって、
（ａ）  伸長、ライゲーション、検出および切断の連続的サイクルを行なう工程であって、ここで、該検出工程が、平均２ビットの情報を同時に、任意の個々のヌクレオチドの２ビットの情報を取得することなく、少なくとも２つの該鋳型内のヌクレオチドの各々から取得することを含み、該鋳型は、それにハイブリダイズしたブロッキングオリゴヌクレオチドを有する、工程；ならびに
（ｂ）  工程（ａ）で得られた情報を少なくとも１ビットのさらなる情報と組み合わせて該配列を決定する工程
を含む、方法。
【請求項８９】
前記少なくとも１ビットのさらなる情報が、前記鋳型内のヌクレオチドの正体、候補配列を少なくとも１つの既知配列と比較することにより得られる情報；およびオリゴヌクレオチドプローブファミリーの第２のコレクションを用いて該方法を反復することにより得られる情報からなる群より選択される項目を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
複数の鋳型ポリヌクレオチドの調製方法であって、
（ａ）  複数の微粒子と半固相支持体とを接触させる工程であって、該微粒子の少なくとも一部は、それに結合した鋳型を有し、該半固相支持体は、該半固相支持体に結合しているか、または該半固相支持体内に包埋したプライマーを有し、該鋳型が該プライマーにハイブリダイズする、工程；ならびに
（ｂ）  該プライマーを伸長して、該微粒子に結合した該鋳型に相補的な鋳型を形成する工程
を含む、方法。
【請求項９１】
前記プライマーを伸長させることによって生成した前記鋳型を増幅する工程をさらに含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
増幅する工程が、ＲＣＡを実行することを含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記半固相支持体から前記微粒子を放出させる工程をさらに含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９４】
前記鋳型を増幅する工程の後で、必要に応じて、前記プライマーを伸長させることによって生成した該鋳型を配列決定する工程をさらに含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９５】
微粒子の集団を調製するための成分のコレクションであって、
（ａ）  個々の微粒子が、該微粒子に結合されたプライマーの少なくとも第１および第２の集団を有し、該第１の集団のプライマーが、該第２の集団のプライマーと異なる配列を有する、微粒子の集団；
（ｂ）  各核酸断片が目的の第１および第２の核酸セグメントを含み、該第１および第２のプライマーが、該目的の第１および第２の核酸セグメントの外部に位置する普遍配列に対応する、核酸断片のライブラリー；ならびに
（ｃ）  該核酸断片の共通領域に結合するブロッキングオリゴヌクレオチド
を含む、コレクション。
【請求項９６】
前記目的の第１および第２の核酸セグメントが５’および３’タグの１対のタグである、請求項９５に記載の成分のコレクション。
【請求項９７】
前記核酸断片が、核酸セグメントの各々がＰＣＲを用いて増幅され得るように、増幅プライマーのための１つ以上のプライマー結合部位を含む内部アダプターを含む、請求項９５に記載の成分のコレクション。
【請求項９８】
前記内部アダプター内のプライマー結合部位に相補的なプライマーをさらに含む、請求項９７に記載の成分のコレクション。
【請求項９９】
実質的に同一な鋳型分子の集団を含む鋳型であって、該鋳型分子は、少なくとも１つの共通領域および少なくとも１つの目的のセグメントを含み、該鋳型分子の少なくとも一部は、該共通領域にハイブリダイズしたブロッキングオリゴヌクレオチドを有する、鋳型。
【請求項１００】
前記鋳型分子が、対合したタグライブラリーのメンバーである、請求項９９に記載の鋳型。
【請求項１０１】
前記鋳型分子が、ＲＣＡを使用して増幅される、請求項９９に記載の鋳型。
【請求項１０２】
前記鋳型分子は、少なくとも２つの共通領域および少なくとも１つの目的のセグメントを含み、該鋳型分子の少なくとも一部は、少なくとも２つの共通領域の各々にハイブリダイズしたブロッキングオリゴヌクレオチドを有する、請求項９９に記載の鋳型。
【請求項１０３】
請求項９９に記載の集団が結合した、支持体または基材。
【請求項１０４】
微粒子である、請求項１０１に記載の支持体または基材。
【請求項１０５】
半固相支持体である、請求項１０１に記載の支持体または基材。
【請求項１０６】
実質的に平面状で剛性の支持体である、請求項１０１に記載の支持体または基材。
【請求項１０７】
前記鋳型が、目的の種々のセグメントを含む、請求項９９に記載の鋳型のコレクション。
【請求項１０８】
請求項１０４に記載の微粒子の集団を含むアレイであって、該微粒子は、それに結合した目的の種々のセグメントを含む鋳型を有する、アレイ。
【請求項１０９】
前記微粒子は、半固相支持体内または該支持体上に包埋されているか、あるいは基材に結合している、請求項１０８に記載のアレイ。
【請求項１１０】
基材に結合した微粒子であり、該微粒子は、それに結合した鋳型を有する、微粒子。
【請求項１１１】
前記微粒子が、ビオチンおよびビオチン結合タンパク質を含む連結によって前記基材に結合している、請求項１１０に記載の微粒子。
【請求項１１２】
前記微粒子が、ビオチンおよびビオチン結合タンパク質を含む連結によって前記基材に結合し、該ビオチン結合タンパク質が、該基材に結合している、請求項１１０に記載の微粒子。
【請求項１１３】
前記微粒子が、前記基材に結合した一本鎖鋳型に結合しており、それによって前記鋳型が該微粒子を該基材に繋いでいる、請求項１１０に記載の微粒子。
【請求項１１４】
前記微粒子が、前記基材に結合した一本鎖鋳型に結合しており、それによって前記鋳型が該微粒子を該基材に繋ぎ、該鋳型が、ビオチンおよびビオチン結合タンパク質を含む連結によって該基材および該微粒子に結合している、請求項１１０に記載の微粒子。
【請求項１１５】
請求項１１０に記載の微粒子の集団であって、目的の種々のセグメントと共通配列とを含む鋳型が、異なる微粒子に結合している、微粒子の集団。
【請求項１１６】
アレイを調製するための方法であって、
鋳型が結合した微粒子の集団を提供する工程であって、該鋳型がビオチンを含む、工程；ならびに
ビオチンがビオチン結合タンパク質に結合する条件下で、該微粒子と該ビオチン結合タンパク質を含む基材とを接触させ、それによって微粒子のアレイを生成する工程；
を含む、方法。
【請求項１１７】
前記鋳型にブロッキングオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる工程をさらに含む、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記鋳型を配列決定する工程をさらに含む、請求項１１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の支援
本発明は、ＮＩＨによって与えられた助成金番号Ｒ０１−ＨＧ−００３５７０の下、米国政府の支援によって為された。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
（関連出願の引用）
本願は、２００６年４月１９日に出願された米国仮特許出願第６０／７９３，７０２号（この全内容は、参考として本明細書に援用される）の利益、およびそれに対する優先権を主張する。本願は、２００５年２月１日に出願された米国仮特許出願第６０／６４９，２９４号；２００５年２月２５日に出願された米国仮特許出願第６０／６５６，５９９号；２００５年４月２１日に出願された米国仮特許出願第６０／６７３，７４９号；２００５年７月１５日に出願された米国仮特許出願第６０／６９９，５４１号；２００５年９月３０日に出願された米国仮特許出願第６０／７２２，５２６号；および米国特許出願第１１／３４５，９７９号に関する。これらは全て、本明細書中に参考として援用される。
【０００３】
（発明の背景）
核酸配列決定手法は、基礎研究から臨床診断にわたる広範で多様な分野において非常に重要である。かかる手法から入手可能な結果としては、種々の程度の特異性の情報が挙げられ得る。例えば、有用な情報は、ある特定のポリヌクレオチドが参照ポリヌクレオチドと配列が異なるか否かの判定、試料中のある特定のポリヌクレオチド配列の存在の確認、部分配列情報、例えば、ポリヌクレオチド内の１つ以上のヌクレオチドの正体の決定、ポリヌクレオチド内のヌクレオチドの正体および順序の決定などからなるものであり得る。
【０００４】
ＤＮＡ鎖は、典型的には、４種類のサブユニット、すなわち、塩基アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびチミジン（Ｔ）を含有するデオキシリボヌクレオチドで構成されるポリマーである。これらのサブユニットは、一方のデオキシリボース基の５’炭素を次の基の３’炭素に連結するホスホジエステル共有結合によって互いに結合されている。ほとんどの天然に存在するＤＮＡは２つのかかる鎖からなり、これらは、逆平行の向きに整列され、相補的塩基間、すなわち、ＡとＴ間およびＧとＣ間で形成される水素結合によって互いに保持されている。
【０００５】
ＤＮＡ配列決定は、最初、連鎖停止またはジデオキシヌクレオチド方法（非特許文献１）および化学的分解方法（非特許文献２）の開発によって大きさ規模において可能になり、このうち前者は、最も広く使用され、改良され、自動化されている。特に、蛍光標識された連鎖停止剤の使用が、自動ＤＮＡ配列決定装置の開発において主に重要であった。上記のアプローチの両方に共通するのは、大きさの異なる標識されたＤＮＡ断片の１つ以上のコレクションの作製であり、これは、次いで、該断片の３’末端のヌクレオチドの正体（連鎖停止法において）または該断片から最も新しく除去されたヌクレオチドの正体（化学的分解方法の場合）を決定するために、長さに基づいて分離されなければならない。
【０００６】
現在利用可能な配列決定手法は、いくつかの完全ゲノムの配列決定などの主要な目的の達成を可能にするが、これらの手法は、いくつかの不都合点を有し、いくつかの領域において改善の相当な必要性がなお残っている。標識されたＤＮＡ断片の分離は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いてなされている。しかしながら、この工程は、多くの状況で配列決定のスピードと精度の両方を制限する大きな障害であることが示されている。キャピラリー電気泳動（ＣＡＥ）は、ヒトゲノムプロジェクトの完成を可能にした飛躍的進歩であることが示されたが（非特許文献３）、大きな欠点がなお残っている。例えば、ＣＡＥは、依然として時間のかかる分離工程を必要とし、依然として大きさに基づく区別を伴ない、これらは、不正確となり得る。
【０００７】
連鎖停止方法に対するさまざまな代替法が提案されている。多くの場合、「合成による配列決定」とよばれるアプローチの一例では、オリゴヌクレオチドプライマーを、まず標的鋳型にハイブリダイズさせる。次いで、プライマーを、種々に標識したヌクレオチドのポリメラーゼ触媒型付加の連続的サイクルによって伸長させる。成長鎖内へのその組込みを検出する。標識の正体は、鋳型内の相補的ヌクレオチドを同定する機能を果たす。あるいはまた、多数の反応が、各ヌクレオチドを用いて並行して行なわれ得、ある特定のヌクレオチドを使用する反応内への標識されたヌクレオチドの組込みにより、鋳型内の相補的ヌクレオチドが同定される（例えば、Ｍｅｌａｍｅｄｅ，特許文献１；Ｃｈｅｅｓｅｍａｎ，特許文献２；Ｔｓｉｅｎら，特許文献３；Ｒｏｓｅｎｔｈａｌら，特許文献４；非特許文献４；非特許文献５参照のこと）。
【０００８】
任意の有意な長さのポリヌクレオチドを効率的に配列決定するため、ポリメラーゼは、各サイクルにおいて正確に１つのヌクレオチドを組み込むことが望ましい。したがって、一般的に、連鎖停止剤として作用するヌクレオチド使用すること、すなわち、その組込みにより、ポリメラーゼによるさらなる伸長が抑制されることが必要である。組み込まれたヌクレオチドは、次いで、ポリメラーゼが次のヌクレオチドを組み込むことが可能になるように酵素的または化学的のいずれかで修飾されなければならない。連鎖停止剤としての機能を果たし得るが、後続の工程で伸長され得るようにその組込み後に修飾され得るさまざまなヌクレオチドアナログが提案されている。かかる「可逆的停止剤」は、例えば特許文献２；特許文献５〜７に記載されている。しかしながら、高効率でポリメラーゼ組み込まれ得る可逆的停止剤を同定することは、おそらく、ヌクレオチドの大きさが小さいことを考慮すると、ヌクレオチドが停止剤としての機能を果たす能力に影響する修飾はまた、成長ポリヌクレオチド鎖内へのその組込みにも影響するという事実のため、困難であることが示されている。
【０００９】
他の配列決定アプローチとしては、ピロシーケンスが挙げられ、これは、ＤＮＡ重合中に放出されるピロリン酸塩（ＰＰｉ）の検出に基づくものである（例えば、特許文献８および９参照のこと）。電気泳動による分離の必要性は回避されるが、ピロシーケンスは、今のところその広範な適用可能性を制限している多数の欠点を有する（非特許文献６）。ハイブリダイゼーションによる配列決定もまた、代替法として提案されている（特許文献１０〜１２；非特許文献７）が、いくつかの不都合点（例えば、高度に類似した配列間の識別におけるエラーに可能性など）を有する。エクソヌクレアーゼによる単一分子配列決定は、１つの鎖内の塩基ごとの標識、次いで、試料流中の切断された３’末端ヌクレオチドの連続的な検出を伴うものであるが、これは、理論的には、長鎖ＤＮＡ分子の配列を速やかに決定するに非常に強力な方法である（非特許文献８）。しかしながら、この潜在性を実現する前に克服すべき種々の技術的な障害がなお残っている（非特許文献８）。
【００１０】
特定の配列異型に基づく診断用試験は、さまざまな種々の疾患のために既に使用されている。ヒトゲノムの配列決定は、治療（予防的治療を含む）が患者の特定のゲノム構成にあつらえられるか、または特定の対立遺伝子もしくは変異の同定に基づいて選択される個別化医療の時代の到来を告げると広く考えられている。ＨＩＶなどの感染性因子の配列バリアントの迅速かる正確な決定の必要性が増大している。したがって、近い将来、正確かつ迅速な配列決定に対する要望が大きく拡大することは明白である。したがって、あらゆる型の改善された配列決定法が必要とされている。
【特許文献１】米国特許第４，８６３，８４９号明細書
【特許文献２】米国特許第５，３０２，５０９号明細書
【特許文献３】国際公開第９１／０６６７８号パンフレット
【特許文献４】国際公開第９３／２１３４０号パンフレット
【特許文献５】米国特許第６，２５５，４７５号明細書
【特許文献６】米国特許第６，３０９，８３６号明細書
【特許文献７】米国特許第６，６１３，５１３号明細書
【特許文献８】米国特許第６，２１０，８９１号明細書
【特許文献９】米国特許第６，２５８，５６８号明細書
【特許文献１０】米国特許第５，２０２，２３１号明細書
【特許文献１１】国際公開第９９／６０１７０号パンフレット
【特許文献１２】国際公開第００／５６９３７号パンフレット
【非特許文献１】Ｓａｎｇｅｒら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７４：５４６３−５４６７，１９７７
【非特許文献２】Ｍａｘａｍ＆Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７４：５６０−５６４，１９７７
【非特許文献３】Ｖｅｎｔｅｒら．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９１：１３０４−１３５１，２００１；Ｌａｎｄｅｒら．，Ｎａｔｕｒｅ，４０９：８６０−９２１，２００１
【非特許文献４】Ｃａｎａｒｄら，Ｇｅｎｅ，１４８：１−６（１９９４）
【非特許文献５】Ｍｅｔｚｋｅｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４２５９−４２６７（１９９４）
【非特許文献６】Ｆｒａｎｃａら．，Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，３５（２）：１６９−２００，２００２
【非特許文献７】Ｄｒｍａｎａｃら．，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７７：７６−１０１，２００２
【非特許文献８】Ｓｔｅｐｈａｎら．，Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８６：２５５−２６７，２００１
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、断片分離を行なう必要性を回避する、またある特定の実施形態においては、ポリメラーゼ酵素の使用の必要性を回避する新しい改善された配列決定法を提供する。背景の項目に記載の方法の代替法は、Ｍａｃｅｖｉｃｚ（Ｍａｃｅｖｉｃｚ）の米国特許第５，７４０，３４１号および同第６，３０６，５９７号に記載されている。この方法は、単鎖鋳型に沿った二本鎖伸長の反復サイクルに基づくものである。これらの方法の好ましい実施形態において、ヌクレオチドは各サイクルで同定される。本発明は、これらの方法に対する改善を提供する。該改善により、該方法の効率的な実施が可能になり、ハイスループット配列決定に特に好適である。また、本発明は、単鎖鋳型に沿った二本鎖伸長の反復サイクルを伴うが、各サイクル中での個々のヌクレオチドの同定をなんら伴わない配列決定法を提供する。
【００１２】
一態様において、本発明は、単鎖鋳型に沿った二本鎖伸長、標識された伸長プローブのライゲーションおよび標識の検出の連続的サイクルに基づく配列決定のための改善された方法を提供する。一般に、伸長は、初期化（ｉｎｉｔｉａｌｉｚｉｎｇ）オリゴヌクレオチドおよび鋳型によって形成された二本鎖から開始される。初期オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドプローブをその末端にライゲートして伸長された二本鎖を形成させ、次いで、これを、ライゲーションの連続的サイクルによって反復的に伸長させることにより伸長される。各サイクル中、鋳型内の１つ以上のヌクレオチドの正体が、成功裏にライゲートされたオリゴヌクレオチドプローブ上またはこれと会合した標識を同定することにより決定される。新たに付加されたプローブの標識はまた、ライゲーション前、あるいはそれに加えて、ライゲーション後に検出され得る。一般的に、ライゲーション後に標識を検出することが好ましい。
【００１３】
好ましい実施形態において、伸長された二本鎖のたった１回の伸長が１サイクルで起こるように、プローブは伸長不可能な部分を、末端位置に（二本鎖の成長核酸鎖にライゲートされたヌクレオチドと反対のプローブ末端に）有する。「伸長不可能な」により、該部分が、修飾のないリガーゼ基質としての機能を果たさないことが意図される。例えば、該部分は、５’リン酸基または３’ヒドロキシル基がない。該部分は、ライゲーションを抑制するブロッキング基が自身に結合されたヌクレオチドであり得る。本発明の好ましい実施形態において、伸長不可能な部分は、ライゲーション後に除去され、伸長可能な末端が生成され、その結果、二本鎖は後続のサイクルでさらに伸長され得る。
【００１４】
伸長不可能な部分の除去を可能にするため、本発明のある特定の実施形態において、プローブに、ホスホジエステル結合が実質的に切断されない条件下で切断され得る少なくとも１つのヌクレオシド間結合を含有させる。かかる連結は、本明細書において「切れやすいヌクレオシド間結合」または「切れやすい連結」という。切れやすいヌクレオシド間結合の切断により、伸長不可能な部分が除去され、伸長可能なプローブ末端が再生されるか、または修飾されて伸長可能なプローブ末端を形成する末端残基が残るかのいずれかとなる。切れやすいヌクレオシド間結合は、プローブ内の任意の２つのヌクレオシド間に位置し得る。好ましくは、切れやすい連結は、新たに形成された結合から少なくとも数個のヌクレオチド離れて（すなわち、遠位に）位置する。伸長可能な末端ライゲートされた末端ヌクレオチドと切れやすい連結間の伸長プローブ内のヌクレオチドは、鋳型に完璧にハイブリダイズする必要はない。これらのヌクレオチドは、「スペーサー」としての機能を果たし、鋳型に沿った区間に位置するヌクレオチドの同定を、該区間該の各ヌクレオチドについてサイクルを行なうことなく可能にし得る。
【００１５】
切れやすいヌクレオシド間結合および標識は、好ましくは、切れやすいヌクレオシド間結合の切断により、標識された部分内の伸長プローブと成長核酸鎖の一部のままである部分とが分離され、標識された部分の核酸が可能になる（例えば、温度上昇時）ように配置させる。例えば、標識は、伸長プローブの末端ヌクレオチドのライゲートされるヌクレオチドと反対の末端に結合させ得る。あるいはまた、標識は、任意のいくつかのアプローチを用いて除去してもよい。
【００１６】
本発明者らは、ホスホジエステル結合内の橋絡酸素原子の１つがイオウ原子で置き換えられたホスホロチオレート結合が、特に好都合な切れやすいヌクレオシド間結合であることを見出した。ホスホロチオレート結合内のイオウ原子は、一方のヌクレオシドの３’炭素または隣接するヌクレオシドの５’炭素のいずれかに結合され得る。
【００１７】
上記の方法のある特定の実施形態では、複数の配列決定反応が行なわれる。該反応では、最初のライゲーションが起こる末端が、鋳型に対して異なる位置に位置するように、鋳型の異なる配列にハイブリダイズする初期オリゴヌクレオチドが使用される。例えば、最初のライゲーションが起こる位置は、１個のヌクレオチド増加によって、互いに対してシフトまたは「位相ずれ（ｏｕｔ  ｏｆ  ｐｈａｓｅ）」させ得る。したがって、同じ長さのオリゴヌクレオチドプローブを用いた各伸長サイクル後、同じ相対位相が、異なる鋳型上の初期オリゴヌクレオチドの両末端間に存在する。該反応は、並行して、各々が同じ鋳型コピーを含む独立した区画において、または順次（すなわち、第１の初期オリゴヌクレオチドを用いて配列情報を得た後、伸長された二本鎖を鋳型から除去し、次いで鋳型の異なる配列にハイブリダイズする初期オリゴヌクレオチドを用いてさらなる反応（１つまたは複数）を行なうことにより）行なわれ得る。
【００１８】
別の態様において、本発明は、さまざまな核酸操作に有用な溶液を提供する。一実施形態において、本発明は、１．０〜３．０％ＳＤＳ、１００〜３００ｍＭ  ＮａＣｌおよび５〜１５ｍＭ重硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ４）を水中に含有するか、またはそれらから本質的になる溶液を提供する。該溶液は、約２％ＳＤＳ、約２００ｍＭ  ＮａＣｌおよび約１０ｍＭ重硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ４）を水中に含有するものであるか、または本質的にそれらからなるものであり得る。例えば、一実施形態において、該溶液は、２％ＳＤＳ、２００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭ重硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ４）を水中に含有するものである。別の実施形態において、該溶液は、２％ＳＤＳ、２００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭ重硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ４）を含む水から本質的になるものである。ある特定の実施形態において、該溶液は、２．０〜３．０、例えば２．５のｐＨを有する。該溶液は、二本鎖核酸、例えば二本鎖ＤＮＡを個々の鎖に分離、すなわち、二本鎖核酸を変性（融解）させるのに有用である。ある特定の実施形態において、両方の鎖がＤＮＡである。他の実施形態において、両方の鎖がＲＮＡである。他の実施形態において、一方の鎖がＤＮＡであり、他方の鎖はＲＮＡである。他の実施形態において、一方または両方の鎖がＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含有する。他の実施形態において、該鎖の一方または両方がＡ、Ｇ、ＣまたはＴ以外の少なくとも１つのヌクレオチドを含有する。ある一部の実施形態において、該鎖の一方または両方が、非天然に存在するヌクレオチドを含有する。また他の実施形態において、該残基の１つ以上がトリガー（ｔｒｉｇｇｅｒ）残基、例えば、無塩基残基または損傷塩基である。ある一部の実施形態において、１つ以上の残基が、普遍（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）塩基を含有する。ある一部の実施形態において、該鎖の一方または両方が切れやすい連結を含有する。
【００１９】
二本鎖核酸は、完全な二本鎖または部分二本鎖であり得る。これは、溶液中で遊離状態であり得るか、または一方もしくは両方の鎖が固相もしくは半固相支持体もしくは基材と物理的に会合（例えば、共有結合もしくは非共有結合）  された状態であり得る。特に注目すべきことには、このような溶液中でインキュベートされた二本鎖核酸は、ゲル離層を引き起こし得る（例えば、核酸が、ポリアクリルアミドゲルなどの半固相支持体内に位置するか、これに結合されている場合）か、またはストレプトアビジン（ＳＡ）−ビオチン結合（例えば、核酸が支持体もしくは基材にＳＡ−ビオチン結合によって結合されている場合）などの非共有結合を破壊し得る熱または刺激の強い変性剤の非存在下で効果的に単鎖に分離される。一実施形態において、該溶液は、核酸の一方がビーズにＳＡ−ビオチン結合によって結合されている二本鎖核酸を分離するために使用される。
【００２０】
本発明はまた、二本鎖核酸と任意の前述の溶液、例えば、約１．０〜３．０％ＳＤＳ、約１００〜３００ｍＭ  ＮａＣｌおよび約５〜１５ｍＭ重硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ４）を含有する水溶液、例えば、１．０〜３．０％ＳＤＳ、１００〜３００ｍＭ  ＮａＣｌおよび５〜１５ｍＭ重硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ４）を含有する水溶液と接触させる工程を含む、二本鎖核酸の鎖を分離する方法を提供する。一実施形態において、該溶液は、約２％ＳＤＳ、２００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭ重硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ４）、例えば、２％ＳＤＳ、２００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭ重硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ４）  を含有するものである。別の実施形態において、該溶液は、２％ＳＤＳ、２００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭ重硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ４）を含む水から本質的になるものである。ある特定の実施形態において、該溶液は、２．０〜３．０、例えば２．５のｐＨを有する。ある一部の実施形態において、二本鎖核酸は、溶液中でインキュベートされる。他の実施形態において、二本鎖核酸（好ましくは、支持体または基材に結合されている）を該溶液で洗浄する。ある一部の実施形態において、二本鎖核酸を該溶液と、二本鎖核酸分子の少なくとも１０％が単鎖に分離されるのに充分な時間接触させる。ある一部の実施形態において、二本鎖核酸を該溶液と、二本鎖核酸少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上が単鎖に分離されるのに充分な時間接触させる。例示的な実施形態において、二本鎖核酸を該溶液と１５秒間〜３時間接触させる。別の実施形態において、二本鎖核酸を該溶液と１分間〜１時間接触させる。ある特定の実施形態において、二本鎖核酸を該溶液と、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５または６０分間接触させる。該方法は、インキュベーション期間後に、該溶液を除去または一部もしくは全部の核酸を該溶液から除去するさらなる工程を含むものであってもよい。
【００２１】
該溶液には、いくつかの本明細書に記載した配列決定法の１つ以上の工程における用途が見出され、任意のこれらの方法において使用され得る。例えば、該溶液は、伸長された二本鎖を鋳型から分離するために使用され得る。該溶液は、切れやすい連結を切断して伸長プローブの伸長された二本鎖にもはや結合されていない部分を除去した後に使用され得る。該溶液はまた、三重鎖核酸の分離、または単一の核酸鎖の互いににハイブリダイズした自己相補性部分を含有する二本鎖領域の分離に有用である。
【００２２】
別の態様において、本発明は、少なくとも２つの識別可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブファミリーのコレクションを用いて、配列に関する情報を得るための方法を提供する。該プローブファミリー内のプローブは、非拘束部分および拘束部分を含有する。上記の方法のように、伸長は、初期オリゴヌクレオチドおよび鋳型によって形成された二本鎖から開始される。初期オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドプローブをその末端にライゲートして伸長された二本鎖を形成させ、次いで、これを、ライゲーションの連続的サイクルによって反復的に伸長させることにより伸長される。伸長された二本鎖のたった１回の伸長が１サイクルで起こるように、プローブは伸長不可能な部分を、末端位置に（二本鎖の成長核酸鎖にライゲートされたヌクレオチドと反対のプローブ末端に）有する。各サイクル中、成功裏にライゲートされたプローブ上の、またはこれと会合させた標識が検出され、伸長不可能な部分が除去または修飾されて、伸長可能な末端が生成する。標識は、該プローブが属するプローブファミリーに対応する。
【００２３】
伸長、ライゲーションおよび検出の連続的サイクルにより、連続的な成功裏にライゲートされたプローブが属するプローブファミリーの序列リスト（ｏｒｄｅｒｅｄ  ｌｉｓｔ）がもたらされる。プローブファミリーの序列リストは、配列に関する情報を得るために使用される。しかしながら、新たにライゲートされたプローブがどのプローブファミリーに属するのかがわかることは、それ自体では、鋳型内のヌクレオチドの正体を決定するのに充分でない。それどころか、新たにライゲートされたプローブがどのプローブファミリーに属するのかがわかることは、ある特定の配列がプローブの拘束部分の配列である可能性を排除し、各位置におけるヌクレオチドの正体の少なくとも２つの可能性を残す。したがって、新たにライゲートされたプローブの拘束部分内のヌクレオチド（すなわち、プローブの拘束部分内のヌクレオチドに相補的なヌクレオチド）と反対の位置に位置する鋳型内のヌクレオチドの正体には少なくとも２つの可能性がある。
【００２４】
ある特定の実施形態において、所望回数サイクルを行なった後、該一連の序列のプローブファミリー正体を用いて１組の候補配列を作製する。この組の候補配列により、目的を達成するのに充分な情報が提供され得る。本発明の好ましい実施形態において、候補配列の中から正確な配列を選択するため、１つ以上のさらなる工程を行なう。例えば、該配列が既知配列のデータベースと比較され得、データベース内の該配列の１つに最も近い候補配列を正確な配列として選択する。他の実施形態において、異なるようにコード化された組のプローブファミリー用い、鋳型を、伸長、ライゲーション、検出および切断の連続的サイクルによるさらなる回の配列決定に供し、２回目で得られた情報を用いて正確な配列を選択する。他の実施形態において、少なくとも１つの情報項目を、プローブファミリー正体の序列リストから得られた情報と組み合わせ、配列を決定する。
【００２５】
本発明はまた、プローブファミリーを用いて鋳型を配列決定する場合のエラーチェックを行なう方法を提供する。該方法のある特定のものは、一塩基多型（ＳＮＰ）と配列決定エラーを識別する。
【００２６】
本発明はまた、目的の少なくとも２つのセグメント（例えば、少なくとも２つのタグ）および少なくとも３つのプライマー結合領域（ＰＢＲ）を、各々が目的のセグメントに対応する少なくとも２つの異なる鋳型が各断片から増幅され得るように含有する核酸断片（例えば、ＤＮＡ断片）を提供する。「プライマー結合領域」は、オリゴヌクレオチドが、該オリゴヌクレオチドが増幅プライマー、配列決定プライマー、初期オリゴヌクレオチドなどとしての機能を果たし得るようにハイブリダイズし得る核酸の一部分である。したがって、プライマー結合領域は、適当な相補的オリゴヌクレオチドの選択を可能にするため、既知配列を有するものであるのがよい。本明細書および図面で用いる場合、本発明の方法に用いられる核酸鎖の一部分は、該方法の実施において、プライマーが実際に、該領域に結合するか、核酸鎖の相補鎖の対応する部分に結合するかに関係なく、プライマー結合領域とよばれ得る。したがって、核酸の一部分は、本発明の方法に用いられる場合、プライマーが実際に、該領域に結合するのか（この場合、プライマーの配列は、該領域のものに相補的または実質的に相補的である）、または該領域の相補的部分に結合するのか（この場合、プライマーの配列は、プライマー結合領域の配列と同一または実質的に同一である）とは無関係にプライマー結合領域とよばれ得る。目的のセグメントは、その配列情報が所望される核酸の任意のセグメントである。例えば、目的の配列は、タグであり得、本発明の開示の目的のためには、目的のセグメントがタグである（本明細書および他で「末端タグ」とも称する）ことが想定される。しかしながら、本発明は、目的のセグメントがタグであることに限定されないことを理解されたい。ある特定の実施形態において、少なくとも２つのタグは１対のタグである。該核酸断片は、１対以上のタグ、例えば、１つ以上の対のタグ、例えば、２、３、４、５対以上の対のタグを含有するものであり得る。本発明は、さらに、かかる核酸断片を含有するライブラリー、ならびに該鋳型およびライブラリーの作製方法を提供する。
【００２７】
本発明は、さらに、自身に結合された核酸の少なくとも２つの異なる集団を有する微粒子（例えば、ビーズ）であって、該少なくとも２つの集団の各々は複数の実質的に同一の核酸からなり、該集団は、単一の核酸断片からの増幅（例えば、ＰＣＲ増幅）によって生成されたものである微粒子（例えば、ビーズ）を提供する。ある一部の実施形態において、単一の核酸断片は、１対のタグである５’タグおよび３’タグを含有する。単一の核酸断片が対である５’タグおよび３’タグを含有するある一部の実施形態において、微粒子に結合された核酸の集団の１つが５’タグの少なくとも一部分を含み、微粒子に結合された核酸の集団の１つが３’タグの少なくとも一部分を含む。好ましい実施形態において、該集団の１つが完全な５’タグを含み、該集団の１つが完全な３’タグを含む。
【００２８】
該核酸断片は多数のＰＢＲを含有するものであり、その少なくとも１つがタグ間に位置し、その少なくとも２つが、該核酸断片の該タグを含有する一部分と隣接し、その結果、５’タグの少なくとも一部分を含む領域が増幅され得、３’タグの少なくとも一部分を含む領域が増幅され得、２つの異なる核酸集団がもたらされる。好ましい実施形態において、５’タグ全体および３’タグ全体が増幅され得る。例えば、該核酸断片は、５’タグと隣接する第１および第２のプライマー結合部位、さらに３’タグと隣接する第３および第４のプライマー結合部位を含有するものであり得る。第１および第２のプライマー結合部位に結合するプライマーを用いるＰＣＲ増幅により、５’タグが増幅される。第３および第４のプライマー結合部位に結合するプライマーを用いるＰＣＲ増幅により、３’タグが増幅される。プライマーは、各プライマーからの伸長により、増幅されるタグを含有するＤＮＡ断片の領域に向かって進行するように選択されるのがよいことは認識されよう。あるいはまた、第１のプライマー結合部位を一方のタグの上流に配置させ得、第２のプライマー結合部位を他方のタグの下流に配置させ得、第３のプライマー結合部位を、この２つのタグ間に配置させ得る。第３のプライマー結合部位は、一方のタグを増幅させるＰＣＲ増幅のためのフォワードプライマーの結合部位としての機能を果たし、他方のタグを増幅させるＰＣＲ増幅のためのリバースプライマー結合部位としての機能を果たす。したがって、一実施形態において、本発明は、自身に結合された核酸の少なくとも２つの異なる集団を有する微粒子（例えば、ビーズ）であって、該少なくとも２つの集団の各々は複数の実質的に同一の核酸からなり、第１の異なる集団が５’タグを含み、第２の異なる集団が３’タグを含む微粒子（例えば、ビーズ）を提供する。
【００２９】
本発明は、さらに、個々の微粒子が自身に結合された核酸の少なくとも２つの異なる集団を有し、該少なくとも２つの集団の各々は複数の実質的に同一の核酸からなり、該集団が単一のＤＮＡ断片からの増幅（例えば、ＰＣＲ増幅）によって生成されたものである微粒子（例えば、ビーズ）の集団を提供する。実質的に同一の集団は、例えば、５’タグと３’タグであり得る。本発明は、さらに、かかる微粒子のアレイ、および実質的に同一の核酸の集団の配列決定を伴う配列決定法を提供する。例えば、一実施形態において、個々の微粒子に結合された２つの実質的に同一の核酸の集団の各々が異なるプライマー結合領域（ＰＢＲ）を含み、その結果、異なる配列決定プライマーを用いることにより、一方の集団は、他方の集団から障害されることなく配列決定され得る。実質的に同一の核酸の２つより多くの実質的に同一の集団が単一の微粒子に結合されている場合、該集団の各々が特有のＰＢＲ有し得、その結果、所与のＰＢＲに結合するプライマーは、微粒子に結合された核酸の他方の実質的に同一の集団内に存在するＰＢＲに結合しない。したがって、本発明の方法は、自身に結合された核酸の少なくとも２つの異なる実質的に同一の集団（例えば、５’タグを含有する多コピーの鋳型と３’タグを含有する多コピーの鋳型）を有する微粒子であって、タグが対のタグである微粒子の作製を可能にする。本発明の方法によれば、鋳型は、配列決定プライマーの結合部位を提供する異なるＰＢＲを含むものである。したがって、５’タグを含有する鋳型内のＰＢＲに相補的な配列決定プライマーを選択することにより、配列情報は５’タグから、３’タグを含有する鋳型もまた同じ微粒子上に存在していても３’タグを含有する鋳型から障害されることなく得られ得る。３’タグを含有する鋳型内のＰＢＲに相補的な配列決定プライマーを選択することにより、配列情報は３’タグから、５’タグを含有する鋳型もまた同じ微粒子上に存在していても５’タグを含有する鋳型から障害されることなく得られ得る。対のタグの両方が同じ微粒子上に存在するという事実は、先行技術において単一の鋳型内に存在した場合に起こり得るように、５’および３’の対のタグの配列が互いに会合し得ることを意味する。
【００３０】
基材に付着した微粒子のアレイも提供される。一実施形態において、微粒子は、一方の末端が微粒子に付着し、他方の末端が基材に付着した一本鎖鋳型によって基材に繋がれる。一端または両端における付着手段は、共有結合的である場合もあれば、非共有結合的である場合もある。ある実施形態において、一端または両端の付着手段は、ビオチン結合部分およびビオチンを含む。
【００３１】
また、微粒子に付着した鋳型を複製し、場合によりその複製した鋳型を増幅させることによって作成される核酸コロニーを含むアレイも提供される。さらにまた、ブロッキングオリゴヌクレオチドとその使用方法、ならびにブロッキングオリゴヌクレオチドを含む組成物も提供される。
【００３２】
本発明はまた、例えば、実質的に平面状の支持体内または該支持体上のアレイ状の鋳型を配列決定するために使用され得る自動配列決定システムを提供する。本発明は、さらに、コンピュータ可読媒体、例えば、ハードディスク、ＣＤ、ジップディスク、フュラッシュメモリーなど上に保存され得る画像処理方法を提供する。ある特定の実施形態において、該システムは、１秒当たり４０，０００個のヌクレオチド以上の同定を達成する。ある特定の好ましい実施形態において、該システムは、１日（２４時間）あたり、８．６ギガバイト（Ｇｂ）以上の配列データをもたらす。ある特定の好ましい実施形態において、該システムは、１日あたり、４８Ｇｂ以上の配列情報（ヌクレオチド同定）をもたらす。
【００３３】
また、本発明は、本発明の配列決定法を適用することによってもたらされる情報を保存するコンピュータ可読媒体を提供する。情報は、データベースに保存してもよい。
【００３４】
本出願書類において、種々の特許、特許出願、学術論文および他の刊行物に言及するが、これらはすべて、引用により本明細書に組み込まれる。また、以下の標準的な参考文献の研究：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎ．Ｙ．，編集２００２年７月；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ＲｕｓｓｅｌｌおよびＳａｍｂｒｏｏｋ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，２００１は、引用により本明細書に組み込まれる。本明細書と引用により組み込まれる任意の文献とで矛盾する場合は、本明細書が支配するものとし、本発明者らの裁量に矛盾または不一致が存在するか否かの決定は、任意の時点で行なわれ得ることを理解されたい。
【００３５】
図１〜３５の多くは、米国特許出願第１１／３４５，９７９号ではカラーとなっており、これらの図が参考として本明細書で援用され、本明細書に示す図の代わりに使用できることに留意されたい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
定義
本発明の記載の理解を助長するために、以下に定義を示す。一般に、特に定義のない用語は、当該技術分野で一般的に認められている意味（１つまたは複数）を示すものとすることを理解されたい。
【００３７】
本明細書で用いる場合、「無塩基残基」は、窒素含有塩基の除去または窒素含有塩基の充分な部分の除去後に残留し、得られた分子が、もはや、ヌクレオシドまたはヌクレオチドに特徴的な水素結合に関与しないようなヌクレオシドまたはヌクレオチドの一部分の構造を有する残基である。無塩基残基は、窒素含有塩基をヌクレオシドまたはヌクレオチドから除去することにより生成させ得る。しかしながら、用語「無塩基」は、該残基の構造的特徴をいうために使用され、残基が生成される様式とは無関係である。用語「無塩基残基」および「無塩基部位」は、本明細書において、プリンまたはピリミジン塩基がない核酸内の残基をいうために使用される。
【００３８】
「無プリン（ａｐｕｒｉｎｉｃ）／無ピリミジン（ａｐｙｒｉｍｉｄｉｎｉｃ）（ＡＰ）エンドヌクレアーゼ」は、本明細書で用いる場合、ポリヌクレオチド内の無塩基残基の５’側、３’側または５’および３’側両方いずれかの結合を切断する酵素をいう。本発明のある特定の実施形態において、ＡＰエンドヌクレアーゼは、ＡＰリアーゼである。ＡＰエンドヌクレアーゼの例としては、限定されないが、大腸菌エンドヌクレアーゼＶＩＩＩおよびその類縁体ならびに大腸菌エンドヌクレアーゼＩＩＩおよびその類縁体が挙げられる。特定の酵素、例えば、大腸菌Ｅｎｄｏ  ＶＩＩＩ、Ｅｎｄｏ  Ｖなどのエンドヌクレアーゼに対する言及は、当該技術分野において類縁体であると、および損傷塩基の除去および／または無塩基残基もしくは他のトリガー残基を含有するＤＮＡの切断に関して類似した生化学的活性を有すると認められる他の種由来の類縁体を包含することが意図されることを理解されたい。
【００３９】
本明細書で用いる場合、用語「アレイ」は、支持体マトリックス全体または該マトリックス内に分布された正体のコレクションをいい、好ましくは、個々の正体は、任意のさまざまな手法によってアレイの個別の特徴の同定を可能にするのに充分な距離で互いに間隔があいている。正体は、例えば、核酸分子、核酸分子のクローン性の集団、微粒子（任意選択で、自身に結合された核酸分子のクローン性の集団を有する）などであり得る。動詞で用いる場合、用語「アレイ」およびその変形体は、アレイを形成するため、例えば、正体を支持体マトリックス全体または該マトリックス内に分布させるための任意のプロセスをいう。
【００４０】
「損傷塩基」は、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴがＤＮＡグリコシラーゼによるＤＮＡからの除去のための基質となるような様式で異なるプリンまたはピリミジン塩基である。ウラシルは、本発明の目的のために損傷塩基とみなす。本発明のある一部の実施形態において、損傷塩基はヒポキサンチンである。
【００４１】
ポリヌクレオチド集団うちの１つのポリヌクレオチド内の位置に関する「縮重している」は、該位置を占めるヌクレオシドの一部を構成する塩基の正体が、該集団の種々のメンバー間で異なることを意味する。したがって、該集団は、その配列が縮重位置において異なる個々のメンバーを含む。用語「位置」は、一般的に、５’または３’末端に関してポリヌクレオチド内の各ヌクレオシドに割り当てられた数値をいう。例えば、伸長プローブの３’末端のヌクレオシドには１位が割り当てられ得る。したがって、構造３’−ＸＸＸＮＸＸＸＸ−５’の伸長プローブのプールにおいて、Ｎは４位である。４位は、該プールの異なるメンバーにおいてＮの正体が異なり得る場合、縮重しているとみなされる。また、該伸長プローブのプールはＮ位が縮重していると言える。位置は、任意のｋ個の異なる正体を有するヌクレオシドによって占められ得る場合、ｋ重に縮重していると言える。例えば、２つの異なる塩基のいずれかを含むヌクレオシドによって占められ得る位置は、２重に縮重している。
【００４２】
「配列に関する情報を調べること」は「配列決定」を包含し、また、他のレベルの情報、例えば、配列に関する１つ以上の可能性の排除なども包含する。ポリヌクレオチドにおいて配列決定を行なうことにより、典型的には、完璧に相補的（１００％相補的）なポリヌクレオチドの配列に関して等価な情報がもたらされる。したがって、完璧に相補的なポリヌクレオチドにおいて直接行なわれる配列決定と等価である。
【００４３】
複数の要素、例えば、オリゴヌクレオチドプローブ分子またはその部分内のヌクレオシドに関する「独立して」は、各要素の正体が、任意の他方の要素の正体を制限しないこと、およびそれらに制限されないことを意味し、例えば、各要素の正体は、任意の他方の要素（１つまたは複数）の正体とは無関係に選択される。したがって、１つ以上の要素の正体がわかることは、任意のその他の要素の正体に関する任意の情報を提供することにはならない。例えば、配列ＮＮＮＮ内のヌクレオシドは、各Ｎの正体が任意の他のＮの正体とは無関係にＡ、Ｇ、ＣまたはＴであり得る場合、独立している。
【００４４】
「ライゲーション」は、鋳型駆動型反応において、２つ以上の核酸、例えば、オリゴヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチドの末端間に、共有結合または連結を形成することを意味する。結合または連結の性質は広く異なり得、ライゲーションは、酵素的または化学的に行なわれ得る。
【００４５】
用語「微粒子」は、本明細書において、５０ミクロン以下、好ましくは１０ミクロン以下の最小の断面寸法を有する粒子をいうために用いる。ある特定の実施形態において、最小断面寸法は、およそ３ミクロン以下、およそ１ミクロン以下、およそ０．５ミクロン以下、例えば、およそ０．１、０．２、０．３または０．４ミクロンである。微粒子は、さまざまな無機または有機材料、例えば、限定されないが、ガラス（例えば、細孔性ガラス）、シリカ、ジルコニア、架橋ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリメチルメタクリレート、二酸化チタン、ラテックス、ポリスチレンなど作製されたものであり得る。例えば、種々の適当な材料および他の考慮事項については、米国特許第６，４０６，８４８号を参照のこと。Ｄｙｎａビーズ（Ｄｙｎａｌ（オスロ、ノルウェー）から入手可能）は、本発明に有用な市販の微粒子の一例である。磁気応答性微粒子も使用され得る。ある種の好ましい微粒子磁気応答性により、増幅後の微粒子結合鋳型の容易な回収および濃縮が可能になり、さらなる工程（例えば、洗浄、試薬除去など）が容易になる。本発明のある特定の実施形態において、異なる形状（例えば、いくらか球状および他の非球状のもの）を有する微粒子の集団
が使用される。
【００４６】
用語「ミクロスフィア」または「ビーズ」は、本明細書において、５０ミクロン以下、好ましくは１０ミクロン以下の直径を有する実質的に球状の微粒子をいうために用いる。ある特定の実施形態において、直径は、およそ３ミクロン以下、およそ１ミクロン以下、およそ０．５ミクロン以下、例えば、およそ０．１、０．２、０．３、または０．４ミクロンである。本発明のある特定の実施形態において、単分散性ミクロスフィアの集団が使用される、すなわち、ミクロスフィアは、実質的に均一な大きさのものである。例えば、微粒子の直径は、５％未満、例えば２％以下、１％以下などの変動係数を有し得る。しかしながら、他の実施形態において、微粒子集団の変動係数は、５％以上、例えば、５％、５％〜１０％（両端を含む）、１０％〜２５％（両端を含む）などである。ある特定の実施形態において、微粒子の混合集団が使用される。例えば、各々が５％未満の変動係数を有する２つの集団の混合物を用い、単分散性でない混合集団がもたらされ得る。一例として、１ミクロンおよび３ミクロンの直径を有するミクロスフィアの混合物が使用され得る。本発明のある特定の実施形態において、配列決定が、単分散性でない集団のミクロスフィアに結合された鋳型を用いて行なわれる場合、さらなる情報がミクロスフィアの大きさによって提供される。例えば、鋳型の異なるライブラリーを、異なる大きさのミクロスフィアに結合させ得る。また、より少数の鋳型分子をより小さい粒子に結合させ得るため、シグナル強度は異なり得、これにより多重配列決定が容易になり得る。
【００４７】
用語「核酸配列」は、本明細書で用いる場合、核酸材料それ自体をいうことがあり得る。特定の核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を生化学的にキャラクタライズする配列情報（すなわち５つの塩基の文字Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵから選択される文字の連続）に限定されない。本明細書に示す核酸は、特に記載のない限り、５’→３’方向で示す。
【００４８】
「ヌクレオシド」は、糖分子に連結された窒素含有塩基を含む。本明細書で用いる場合、該用語は、その２’−デオキシおよび２’−ヒドロキシル形態において天然のヌクレオシド（ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ，  ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，  第２版．（Ｆｒｅｅｍａｎ，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９９２）に記載のものなど）ならびにヌクレオシド類縁体を含む。例えば、天然ヌクレオシドとしては、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシンおよびデオキシシチジンが挙げられる。ヌクレオシド「類縁体」は、修飾された塩基部分および／または修飾された糖部分を有する合成ヌクレオシドをいい、例えば、Ｓｃｈｅｉｔ，  ヌクレオチドＡｎａｌｏｇｓ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８０）に一般的に記載されている。かかる類縁体としては、結合特性の増強、縮重の低減、特異性の増大などのために設計された合成ヌクレオシドが挙げられる。ヌクレオシド類縁体としては、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、Ｃ５−プロピニルシチジン、Ｃ５−プロピニルウリジン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−メチルシチジン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、２−チオシチジンなどが挙げられる。ヌクレオシド類縁体は、本明細書に記載する任意の普遍塩基を含むものであり得る。
【００４９】
用語「生物体」は、本明細書において、複製可能であり、配列決定の対象となる核酸を含む、任意の生体的（ｌｉｖｉｎｇ）または非生体的正体を示すために用いる。これには、プラスミド；ウイルス；原核生物、古細菌および真核生物の細胞、細胞株、真菌、原生動物、植物、動物などが含まれる。
【００５０】
プローブおよび鋳型ポリヌクレオチドの突出した鎖に関する「完璧にマッチングした二本鎖」は、一方の突出した鎖が他方と二本鎖構造を、該二本鎖構造内の各ヌクレオシドが、対向する鎖上のヌクレオシドとワトソン−クリック塩基対合を行なうように形成することを意味する。該用語はまた、ヌクレオシド類縁体の対合（例えば、デオキシイノシン、ヌクレオシドと２−アミノプリン塩基となど）を包含し、これは、プローブの縮重を低減させるために使用され得る（かかる対合が水素結合の形成を伴うものであってもそうでなくても）。
【００５１】
用語「複数」は、１つより多いことを意味する。
【００５２】
用語「多型」は、当該技術分野におけるその通常の意味で示され、同じ種の個体間でのゲノム配列における差をいう。「一塩基多型」（ＳＮＰ）は、単一の位置における多型をいう。
【００５３】
「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオシド間結合によって連結されたヌクレオシド（デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシドまたはその類縁体を含む）の線状ポリマーをいう。典型的には、ポリヌクレオチドは少なくとも３個のヌクレオシドを含む。本発明のある特定の実施形態において、伸長プローブ内の１個以上のヌクレオシドは普遍塩基を含む。通常、オリゴヌクレオチドは、大きさが数個のモノマー単位（例えば、３〜４個）から数百個のモノマー単位の範囲に及ぶ。オリゴヌクレオチドなどのポリヌクレオチドが「ＡＴＧＣＣＴＧ」などの一列の文字で表される場合はいつでも、特に記載のない限り、ヌクレオチドは、左から右に向かって５’→３’の順であること、および「Ａ」はデオキシアデノシンを表し、「Ｃ」はデオキシシチジンを表し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを表し、「Ｔ」はチミジンを表すことは理解されよう。Ａ、Ｃ、ＧおよびＴの文字は、当該技術分野において標準的であるように、塩基自体、ヌクレオシドまたは該塩基を含むヌクレオチドをいうために使用され得る。
【００５４】
天然に存在するポリヌクレオチドでは、ヌクレオシド間結合は、典型的にはホスホジエステル結合であり、サブユニットは「ヌクレオチド」とよばれる。しかしながら、ホスホロチオレート結合などの他のヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドプローブが、本発明のある特定の実施形態において使用される。非ホスホジエステル結合を有するかかるオリゴヌクレオチドプローブを構成するサブユニットの１つ以上は、リン酸基を含むものであり得ることは認識されよう。ヌクレオチドのかかる類縁体は、本明細書で用いる用語「ヌクレオチド」の範囲に含まれるとみなし、ホスホジエステル結合でない１個以上のヌクレオシド間結合を含む核酸もやはり、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」などとよばれる。他の実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブなどのポリヌクレオチドは、ＡＰエンドヌクレアーゼ感受性部位を含有する連結部を含む。例えば、オリゴヌクレオチドプローブは、無塩基残基、ＤＮＡグリコシラーゼによる除去のための基質である損傷塩基を含有する残基、またはＡＰエンドヌクレアーゼによる切断のための基質である別の残基または連結部を含有するものであり得る。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは、二糖ヌクレオシドを含有するものである。
【００５５】
用語「プライマー」は、短鎖ポリヌクレオチドをいい、典型的には、約１０〜１００ヌクレオチド長であり、標的ポリヌクレオチド、すなわち「鋳型」に、該標的とハイブリダイズすることにより結合するものである。プライマーは、好ましくは、標的に相補的なポリヌクレオチドの鋳型指向型合成（これは、適切な酵素（１種類または複数種）、補因子、基質、例えば、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドなどの存在下で行なわれ得る）の開始点を提供するものである。プライマーは、典型的には、伸長が行なわれ得る起点となる末端を提供する。ＤＮＡポリメラーゼなどのポリメラーゼ酵素によって触媒される合成のためのプライマーの場合（例えば、「合成による配列決定」、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）  増幅などにおいて）、プライマーは、典型的には、遊離３’ＯＨ基を有するものであるか、またはこれを有するように修飾されたものであり得る。典型的には、ＰＣＲ反応では、増幅される領域の境界を定める１対のプライマー（第１および第２の増幅プライマー）、例えば、「上流」（または「フォワード」）プライマーおよび「下流」（または「リバース」）  プライマーが使用される。伸長、ライゲーション（および任意選択で、切断）の連続的サイクルによる合成のためのプライマーの場合、プライマー典型的には、ＤＮＡリガーゼの基質としての機能を果たす遊離５’リン酸基または３’ＯＨ基を有するものであるか、またはこれらを有するように修飾されたものであり得る。
【００５６】
本明細書で用いる場合、「プローブファミリー」は、その各々が同じ標識を含む一群のプローブをいう。
【００５７】
本明細書で用いる場合、ポリヌクレオチドに関する「配列の決定）」、「ヌクレオチド配列を決定すること」、「配列決定」などの用語は、ポリヌクレオチドの部分配列ならびに完全な配列の情報の決定を含む。すなわち、該用語は、配列の比較、フィンガープリンティングなどのレベルの標的ポリヌクレオチドに関する情報、ならびに同定という表示（ｅｘｐｒｅｓｓ）および目的の領域内の標的ポリヌクレオチド各ヌクレオシドの順序を含む。本発明のある特定の実施形態において、「配列の決定」は、単一のヌクレオチドを同定することを含み、一方、他の実施形態においては、１個より多くのヌクレオチドが同定される。本発明のある特定の実施形態において、それ自体では１サイクルにおいて任意のヌクレオチドを同定するのに不充分な配列情報が収集される。ヌクレオシド、ヌクレオチドおよび／または塩基の同定は、本明細書において等価とみなす。ポリヌクレオチドにおいて配列決定を行なうことにより、典型的には、完璧に相補的（１００％相補的）なポリヌクレオチドの配列に関して等価な情報がもたらされ、したがって、完璧に相補的なポリヌクレオチドにおいて直接行なわれる配列決定と等価であることに注意されたい。
【００５８】
「配列決定反応」は、本明細書で用いる場合、伸長、ライゲーションおよび検出の１組のサイクルをいう。伸長された二本鎖が鋳型から除去され、第２の組のサイクルが該鋳型において行なわれる場合、各組みのサイクルは、独立した配列決定反応とみなすが、得られる配列情報を組み合わせて単一の配列を生成させ得る。
【００５９】
「半固形」は、本明細書で用いる場合、固形および液状の両方の成分を有し、液状成分が固形マトリックス要素間の細孔、空間または他の隙間を占めている圧縮性のマトリックスをいう。例示的な半固形マトリックスとしては、ポリアクリルアミド、セルロース、ポリアミド（ナイロン）、および架橋アガロース、デキストランおよびポリエチレングリコールで構成されたマトリックスが挙げられる。半固相支持体は、該半固相支持体を支持する第２の支持体、例えば、実質的に平面状で剛性の支持体（基材ともいう）上に設けられたものであってもよい。
【００６０】
「支持体」は、本明細書で用いる場合、その上面または内部に核酸分子、微粒子などが固定化され得るマトリックス、すなわち、これらが互いに対して自由に拡散または移動することが広くまたは全体的に妨げられるように、これらが共有結合または非共有結合され得るか、またはその内部もしくは上面にこれらが部分的または完全に包埋され得るマトリックスをいう。
【００６１】
「トリガー残基」は、核酸内に存在する場合、それ以外は同一であるトリガー残基を含有しない核酸のおそらくの場合よりも、該核酸を、切断剤（例えば、酵素、硝酸銀など）または薬剤の組合せによる切断（例えば、核酸主鎖の切断）に対してより感受性にする残基、および／または該核酸をかかる切断に対してより感受性にする残基を生成させる修飾に対して感受性である残基である。したがって、核酸内のトリガー残基の存在は、該核酸内に切れやすい連結の存在をもたらし得る。例えば、無塩基残基は、核酸内の無塩基残基の存在によって該核酸がＡＰエンドヌクレアーゼなどの酵素による切断に対して感受性となるため、トリガー残基である。損傷塩基を含有するヌクレオシドは、核酸内に損傷塩基を含むヌクレオシドの存在によってもまた、例えば、ＤＮＡグリコシラーゼによる損傷塩基の除去後、該核酸がＡＰエンドヌクレアーゼなどの酵素による切断に対してより感受性となるため、トリガー残基である。切断部位は、トリガー残基と隣接残基間の結合部分であり得るか、またはトリガー残基から除去される１つ以上の残基である結合部分であり得る。例えば、デオキシイノシンは、核酸内のデオキシイノシンの存在によって、該核酸が大腸菌エンドヌクレアーゼＶおよびその類縁体による切断に対してより感受性となるため、トリガー残基である。かかる酵素は、デオキシイノシンに対して３’側の第２のホスホジエステル結合を切断する。本明細書に開示された任意のプローブは、１つ以上のトリガー残基を含有し得る。トリガー残基は、リボースまたはデオキシリボース部分を含むものであり得るが、そうである必要はない。好ましくは、切断剤は、トリガー残基の非存在下では実質的に核酸を切断しないが、同じ条件下（該条件は、該核酸が切断剤に対して感受性となるように修正する薬剤の存在を含み得る）で、トリガー残基を含有する核酸に対して有意な切断活性を示すものである。例えば、好ましくは、切断剤が一方がトリガー残基を含有し、他方がトリガー残基を含有しない以外は長さと組成が同一である核酸を含有する組成物内に存在する場合、トリガー残基を含有する核酸が切断される尤度は、少なくとも：１０；２５；５０；１００；２５０；５００；１０００；２５００；５０００；１０，０００；２５，０００；５０，０００；１００，０００；２５０，０００；５００，０００；１，０００，０００またはそれより大きく、トリガー残基を含有しない核酸が切断される尤度と同定度に大きく、例えば、トリガー残基を含有する核酸の切断の尤度の、トリガー残基を含有しないがそれ以外は同一である核酸の切断の尤度に対する比は１０〜１０６または任意のその整数（ｉｎｔｅｇｒａｌ）部分的範囲である。この比は、トリガー残基の具体的な核酸および位置およびヌクレオチド状況に応じて異なり得ることは認識されよう。
【００６２】
好ましくは、トリガー残基を含有する核酸が、該核酸を切断剤による切断に対して感受性とするために修飾される必要がある場合、かかる修飾は、適当な修飾剤（１種類または複数種）の存在下で、容易に行なわれ、例えば、該修飾は、適度な収率および適度な時間行なわれる。例えば、本発明のある特定の実施形態において、トリガー残基を含有する核酸の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、少なくとも９０％またはより好ましくは少なくとも９５％が、例えば、２４時間以内に、好ましくは１２時間以内、より好ましくは１分未満〜４時間以内に修飾される。
【００６３】
さまざまな適当なトリガー残基および対応する切断試薬を本明細書において例示する。本明細書に記載のものと類似した活性を有する任意のトリガー残基および切断試薬が使用され得る。当業者なら、ある特定のトリガー残基および切断試薬組合せが本発明における使用に適しているか否か、例えば、切断の効率および速度、トリガー残基を含有する核酸の切断剤の選択性などが本発明における使用に適しているか否かを判定することができよう。「トリガー残基」は、単に制限酵素部位の一部を構成するヌクレオチドとは、トリガー残基が切断に対する感受性の増大を与える能力は、一般的に、トリガー残基が見出される特定の配列状況に有意に依存しないが、上記のように、該状況は修飾および／または切断に対する感受性に対し、ある程度の影響を及ぼし得るという点において区別されることに注意されたい。もちろん、その周囲のヌクレオチドに応じて、トリガー残基は、制限部位の一部を構成し得る。したがって、ほとんどの場合、切断剤は制限酵素ではないが、制限酵素であることと、非配列特異的切断可能性を有することの両方である酵素の使用は除外されない。
【００６４】
「普遍塩基」は、本明細書で用いる場合、天然に存在する核酸内に典型的に見られる塩基の１つより多くと「対合し」得、したがって、二本鎖内のかかる天然に存在する塩基に代用され得る塩基である。該塩基は、天然に存在する塩基の各々と対合できるものである必要はない。例えば、ある特定の塩基は、プリンのみと、もしくはこれと選択的に、またはピリミジンのみと、もしくはこれと選択的に対合する。ある特定の好ましい普遍塩基（完全普遍塩基）は、天然に存在する核酸内に典型的に見られる任意の塩基と対合し得るものであり、したがって、二本鎖内の任意のこれらの塩基に代用され得る塩基である。該塩基は、天然に存在する塩基の各々と等しく対合できるものである必要はない。プローブミックスが、天然に存在するヌクレオチドのすべてとは対合しない普遍塩基を（１つ以上の位置に）含むプローブを含有する場合、該普遍塩基の少なくとも１つがＡと対合するか、該普遍塩基の少なくとも１つがＧと対合するか、該普遍塩基の少なくとも１つがＣと対合するか、該普遍塩基の少なくとも１つがＴと対合するように、その特定のプローブ内の該位置に２つ以上の普遍塩基を用いることが望ましいことがあり得る。
【００６５】
いくつかの普遍塩基が、当該技術分野で知られており、限定されないが、ヒポキサンチン、３−ニトロピロール、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、４−ニトロベンズイミダゾール、５−ニトロインダゾール、８−アザ−７−デアザアデニン、６Ｈ，８Ｈ−３，４−ジヒドロピリミド［４，５−ｃ］［ｌ，２］オキサジン−７−オン（Ｐ．Ｋｏｎｇ  Ｔｈｏｏ  Ｌｉｎ．およびＤ．Ｍ．Ｂｒｏｗｎ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９８９，  １７，１０３７３−１０３８３）、２−アミノ−６−メトキシアミノプリン（Ｄ．Ｍ．ＢｒｏｗｎおよびＰ．Ｋｏｎｇ  Ｔｈｏｏ  Ｌｉｎ，  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９１，２１６，１２９−１３９）などが挙げられる。ヒポキサンチンは、好ましい完全普遍塩基の一例である。ヒポキサンチンを含むヌクレオシドとしては、限定されないが、イノシン、イソイノシン、２’−デオキシイノシンおよび７−デアザ−２’−デオキシイノシン、２−アザ−２’デオキシイノシンが挙げられる。
【００６６】
さらなる普遍塩基が当該技術分野で知られており、例えば、Ｌｏａｋｅｓ，  Ｄ．およびＢｒｏｗｎ，  Ｄ．Ｍ．，  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４０３９−４０４３，  １９９４；Ｏｈｔｓｕｋａ，  Ｅ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６０（５）：２６０５−２６０８，１９８５；Ｌｉｎ，  Ｐ．Ｋ．Ｔ．およびＢｒｏｗｎ，  Ｄ．Ｍ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０（１９）：５１４９−５１５２，１９９２；Ｎｉｃｈｏｌｓ，  Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６９（６４８０）：４９２−４９３，１９９４；Ｒａｈｍｏｎ，  Ｍ．Ｓ．およびＨｕｍａｙｕｎ，  Ｎ．Ｚ．，  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３７７（２）：２６３−８，１９９７；Ｂｅｒｇｅｒ，  Ｍ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２８（１５）：２９１１−２９１４，２０００；Ａｍｏｓｏｖａ，  Ｏ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１０）：１９３０−１９３４，  １９９７；ならびにＬｏａｋｅｓ，  Ｄ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９（１２）：２４３７−４７，２００１の関連部分に記載されている。普遍塩基は、対向する位置にある塩基と水素結合を形成し得るが、そうである必要はない。普遍塩基は、ワトソン−クリックまたは非ワトソン−クリック相互作用（例えば、フーグスティーン相互作用）により水素結合を形成し得る。
【００６７】
本発明のある特定の実施形態において、普遍塩基を含むオリゴヌクレオチドプローブを使用するのではなく、無塩基残基を含むオリゴヌクレオチドプローブが使用される。無塩基残基は、任意の４つの天然に存在するヌクレオチドと対向する位置を占めることができ、したがって、普遍塩基を含むヌクレオチドと同じ機能を果たし得る。本発明のある一部の実施形態において、無塩基残基に隣接する連結部は、ＡＰエンドヌクレアーゼによって切断されるが、無塩基残基はまた、他の切れやすい連結（例えば、ホスホロチオレート）が存在し、他の切断試薬が使用される実施形態においても、本明細書に記載のように有用である（すなわち、普遍塩基の機能を果たすため）。
【００６８】
本発明のある特定の実施形態の詳細な説明
Ａ．伸長、ライゲーションおよび切断の連続的サイクルによる配列決定
本発明の一態様の全体的なスキームを、図１Ａに図式的に示すが、これは、一般的に、米国特許第５，７４０，３４１号および同第６，３０６，５９７号（ともにＭａｃｅｖｉｃｚに対して発行）に教示された方法と類似する。便宜上の目的のため、これらの特許を本明細書において集合的に「Ｍａｃｅｖｉｃｚ」という。特に、Ｍａｃｅｖｉｃｚには、ポリヌクレオチド内のヌクレオチドの配列を同定するための方法が教示されており、該方法は、（ａ）  プローブを自身にライゲートさせ、伸長された二本鎖を形成することにより、初期オリゴヌクレオチドを、ポリヌクレオチドオリゴヌクレオチドに沿って伸長させる工程；（ｂ）  該ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドを同定する工程；および（ｃ）  該ヌクレオチドの配列が決定されるまで工程（ａ）および（ｂ）を反復する工程を含む。
【００６９】
Ｍａｃｅｖｉｃｚには、さらに、鋳型ポリヌクレオチド内のヌクレオチドの配列決定するための方法が教示されており、該方法は、（ａ）鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせた初期オリゴヌクレオチドプローブを含むプローブ−鋳型二本鎖提供する工程（ここで、前記プローブは伸長可能なプローブ末端を有する）；（ｂ）伸長オリゴヌクレオチドプローブを前記伸長可能なプローブ末端にライゲートさせ、伸長されたオリゴヌクレオチドプローブを含む伸長された二本鎖を形成する工程；（ｃ）伸長された二本鎖において、（１）  ライゲートされたばかりの伸長プローブに相補的であるか、もしくは（２）  伸長されたオリゴヌクレオチドプローブのすぐ下流にある鋳型ポリヌクレオチド内のヌクレオチド残基であるかのいずれかである鋳型ポリヌクレオチド内の少なくとも１つのヌクレオチドを同定する工程；（ｄ）もし伸長可能なプローブ末端が既に存在しない場合は、生成される末端が最後の伸長プローブがライゲートされた末端と異なるように、伸長可能なプローブ末端を伸長されたプローブ上に生成させる工程；ならびに（ｅ）標的ポリヌクレオチド内のヌクレオチドの配列が決定されるまで工程（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を反復する工程を含む。これらの方法のある特定の実施形態において、各伸長プローブは、連鎖停止部分を、初期オリゴヌクレオチドプローブに対して遠位の末端に有する。ある特定の実施形態において、再生させる工程は、伸長されたオリゴヌクレオチドプローブ内の化学的に切れやすいヌクレオシド間結合を切断することを含む。
【００７０】
図１Ａを参照すると、未知配列のポリヌクレオチド領域５０と結合領域４０とを含むポリヌクレオチド鋳型２０は、支持体１０に結合されている。結合領域４０の遠位端のヌクレオチド４１およびポリヌクレオチド領域５０の近位端のヌクレオチド５１は、互いに隣接している。結合領域４０とハイブリダイズし、結合領域４０内のある位置に二本鎖を形成する初期オリゴヌクレオチド３０が提供される。初期オリゴヌクレオチド３０はまた、本明細書において「プライマー」ともいい、結合領域４０は、「プライマー結合領域」ということがある。二本鎖は、完璧にマッチングした二本鎖であり得るが、そうである必要はない。初期オリゴヌクレオチドは伸長可能な末端３１を有する。図１Ａにおいて、初期オリゴヌクレオチドは結合領域に、伸長可能な末端３１がヌクレオチド４１と反対の位置に位置するように結合する。しかしながら、初期オリゴヌクレオチドは、結合領域内の別の場所に結合し得、これは以下にさらに論考する。長さＮの伸長オリゴヌクレオチドプローブ６０は、初期オリゴヌクレオチドに隣接する鋳型にハイブリダイズされる。伸長オリゴヌクレオチドプローブの末端ヌクレオチド６１は、伸長可能な末端３１にライゲートされる。
【００７１】
末端ヌクレオチド６１は、ポリヌクレオチド領域５０内の第１の未知ヌクレオチドに相補的である。したがって、末端ヌクレオチド６１の正体によりヌクレオチド５１の正体が特定される。好ましくは、ヌクレオチド５１は、末端ヌクレオチド６１としてＡ、Ｇ、ＣまたはＴを有することがわかっている伸長プローブと会合した標識（図示せず）検出することをにより同定される。標識は、検出後に除去される。図２は、異なる標識（例えば、異なる色のフルオロフォア）を、異なる３’末端ヌクレオチドを有する伸長プローブに割り当てるためのスキームを示す。
【００７２】
ライゲーションおよび検出の後、もしプローブ６０が既にかかる末端を有しない場合は、伸長可能なプローブ末端を伸長プローブ６０上に生成させる。第２の伸長プローブ７０（好ましくは、これも長さＮである）を伸長プローブ６０に隣接する鋳型にアニーリングさせ、プローブ６０の伸長可能な末端にライゲートさせる。伸長プローブ７０の末端ヌクレオチド７１の正体により、対向する位置にあるポリヌクレオチド５０内のヌクレオチド５２の正体が特定される。したがって、末端ヌクレオチド７１は伸長プローブの「配列決定部分」を構成し、これは、プローブの該部分は、そのハイブリダイゼーション特異性が鋳型内の１つ以上のヌクレオチドの正体を決定する基準として利用されることを意味することは認識されよう。典型的には、伸長プローブ内のさらなるヌクレオチドが鋳型とハイブリダイズするが、プローブ内のその正体がある特定の標識と会合しているヌクレオチドのみが、鋳型内のヌクレオチドを同定するために利用される。
【００７３】
本発明の好ましい実施形態において、伸長可能な末端の生成は、ヌクレオシド間結合の切断を伴い、これは以下にさらに記載する。好ましくは、切断により標識もまた除去される。切断により、いくつかのヌクレオチドＭが伸長プローブから除去される（図示せず）。したがって、二本鎖は、各サイクルにおいてＮ−Ｍヌクレオチドによって伸長され、鋳型内のＮ−Ｍの区間内に位置するヌクレオチドが同定される。多コピーの所与の鋳型は、典型的には単一の支持体に結合され、配列決定反応が、これらの鋳型において同時に行なわれることを理解されたい。
【００７４】
Ｍａｃｅｖｉｃｚには、オリゴヌクレオチドプローブは、一般的に、初期オリゴヌクレオチドまたは伸長された二本鎖にライゲートされ、次の伸長サイクルの伸長された二本鎖を生成させ得るものであるべきであること；ライゲーションは、プローブがライゲーション前に鋳型と二本鎖を形成すべきであるという点で、鋳型駆動型べきであること；プローブは、単一の伸長サイクルにおける同じ鋳型での多重プローブライゲーションを抑制するためのブロッキング部分を有するものであるべきこと；プローブは、ライゲーション後に伸長可能な末端を再生させるために処理または修飾され得るものであるべきこと；およびプローブは、成功裏のライゲーション後に、鋳型に関する配列情報の取得を可能にするシグナル伝達部分（すなわち、検出可能な部分）  を有するものであるべきことが教示されている。
【００７５】
Ｍａｃｅｖｉｃｚには、一部の特定の好適な初期オリゴヌクレオチド、伸長オリゴヌクレオチドプローブ、鋳型、結合部位の特性、およびかかる成分を剛性、設計、作製または入手するための種々の方法が教示されている。Ｍａｃｅｖｉｃｚには、さらに、一部の特定の好適なリガーゼ、ライゲーション条件およびさまざまな適当な標識が教示されている。Ｍａｃｅｖｉｃｚにはまた、標識された連鎖停止ヌクレオチドを新たにライゲートされた伸長プローブに付加させるためにポリメラーゼ伸長を用いる同定の代替方法が教示されている。付加されたヌクレオチドの正体により、反対の位置に位置する鋳型内のヌクレオチドが特定される。
【００７６】
当業者には認識されるように、鋳型、初期オリゴヌクレオチド、伸長プローブ、プライマーなどに対する言及は、一般的に、単一の分子ではなく、関連する領域内で実質的に同一である核酸分子の集団またはプールを意味する。したがって、例えば、「鋳型」は、一般的に、複数の実質的に同一の鋳型分子を意味し、「プローブ」は、一般的に、複数の実質的に同一のプローブ分子を意味するなどである。１つ以上の位置で縮重しているプローブの場合、ある特定のプローブを含むプローブ分子の配列は、縮重位置において異なる、すなわち、ある特定のプローブを構成するプローブ分子の配列は、非縮重位置（１つまたは複数）においてのみ、実質的に同一であり得ることは認識されよう。記載の目的のため、単数形は、単一の分子群および実質的に同一の分子の集団を含むと理解されたい。単一の核酸分子（すなわち、１つの分子）に言及することが意図される場合、用語「鋳型分子」、「プローブ分子」、「プライマー分子」などを用いる。ある特定の状況において、実質的に同一の核酸分子の一集団の複数の性質は、明白に表示する。
【００７７】
実質的に同一の核酸分子の集団は、任意のさまざまな既知の方法、例えば、化学合成、細胞内での生物学的合成、１種類以上の出発核酸分子からの酵素的インビトロ増幅などを用いて入手および作製され得る。例えば、当該技術分野でよく知られた方法を用い、目的の核酸を、適当な発現ベクター（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡプラスミド）内に挿入し、次いで、細胞（例えば、細菌細胞）内に導入して複製させることによりクローニングされ得る。次いで、目的の核酸コピーを含有するプラスミドＤＮＡまたはＲＮＡを該細胞から単離する。ウイルス、細胞などから単離されたゲノムＤＮＡ、またはｍＲＮＡ）の逆転写により作製されたｃＤＮＡもまた、クローニングまたはインビトロ増幅の中間工程なしで、実質的に同一の核酸分子の集団（例えば、その配列が決定される鋳型ポリヌクレオチド）の供給源となり得るが、一般的には、かかる中間工程を行なうことが好ましい。
【００７８】
集団のメンバーは、１００％同一である必要はなく、例えば、ある特定数の「エラー」が、合成過程中に起こり得ることは理解されよう。好ましくは、集団のメンバーの少なくとも５０％が、参照核酸分子（すなわち、配列比較のための基準として用いられる規定配列の分子）と少なくとも９０％、またはより好ましくは少なくとも９５％同一である。より好ましくは、集団のメンバーの少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％またはそれ以上が、参照核酸分子と少なくとも９０％、またはより好ましくは少なくとも９５％同一であるか、さらにより好ましくは少なくとも９９％同一である。好ましくは、参照核酸分子に対して少なくとも９５％またはより好ましくは少なくとも９９％の同一性割合の集団のメンバーは、少なくとも９８％、９９％、９９．９％またはそれ以上である。同一性割合は、２つの最適にアライメントされた配列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、ＵまたはＩ）が両方の配列に存在する位置の数を測定してマッチングした位置の数を得、マッチングした位置の数を位置の合計数で除算し、結果に１００を積算して配列の同一性割合を得ることによりコンピュータ計算され得る。ある特定の状況において、鋳型、プローブ、プライマーなどの核酸分子は、より大きな核酸分子（これはまた、鋳型、プローブまたはプライマーの機能を果たさない部分も含有する）の一部分であり得ることは認識されよう。その場合、個々の集団のメンバーは、該部分に関して実質的に同一である必要はない。
【００７９】
Ｍａｃｅｖｉｃｚには、図１Ａに示すような、鋳型がビーズなどの支持体に結合され、伸長が、支持体の遠位に位置する鋳型の末端に向かって進行する方法が教示されている。したがって、結合領域は未知配列よりも支持体の近くに位置し、伸長された二本鎖は、支持体から離れる方法に成長する。しかしながら、本発明者らは、予期に反して、該方法は、結合領域が支持体の遠位に鋳型の末端に位置し、伸長が支持体に向かって内方に進行する別のアプローチを用いて好都合に行なわれ得ることを見出した。この実施形態を図１Ｂに示す。図において、種々の要素は図１Ａと同様に番号付けしている。本発明者らは、鋳型の遠位端から支持体に向かう「内方への」配列決定により、優れた結果が得られることを調べた。特に、鋳型の遠位端からビーズなどの支持体に向かう配列決定により、支持体から外方への配列決定よりも高いライゲーション効率がもたらされる。
【００８０】
Ｍａｃｅｖｉｃｚによってさらに教示されているように、好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブは鋳型に、所定の長さの可能な全ての配列のオリゴヌクレオチドを含む混合物として適用する。例えば、構造ＮＮＮＮＮＮ（これは、（Ｎ）ｋ（式中、ｋ＝６）とも表示され得る）の６ヌクレオチド長（六量体）の可能な全ての配列を含有するプローブの混合物は、４６（４０９６）のプローブ種を含有し得る。一般的に、プローブは、構造Ｘ（Ｎ）ｋＮ＊（式中、Ｎは任意のヌクレオチドを表し、ｋは１〜１００であり、＊は標識を表し、Ｘは、その正体が標識に対応するヌクレオチドを表す）のものである。ある特定の実施形態において、ｋは、１〜１００、１〜５０、１〜３０、１〜２０、例えば、４〜１０である。該ヌクレオチドの１つ以上は普遍塩基を含むものであり得る。一般的に、プローブは、Ｎで表される位置において４重に縮重しているか、またはＮで表される１つ以上の位置に縮重低減性ヌクレオチドを含む。所望の場合は、混合物を、プローブ（「ストリンジェンシー類型」）の部分集団に分けてもよい。それらの相補配列完璧にマッチングした二本鎖は、類似した安定性または結合自由エネルギーを有する。部分集団は、Ｍａｃｅｖｉｃｚに教示されているように、独立したハイブリダイゼーション反応に使用され得る。
【００８１】
プローブ混合物の複雑度（ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ）（すなわち、異なる配列の数）は、いくつかの方法によって、例えば、いわゆる縮重低減性のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを用いることにより低減させ得る。例えば、８ヌクレオチドの可能な全ての配列を含有するプローブのライブラリーは、４８のプローブを含み得る。プローブの数は、２つの位置に普遍塩基を用いることにより、例えば、長さなどの八量体ライブラリーの種々の望ましい特徴を維持したまま４６に低減させ得る。本発明は、任意の上記または上記参考文献に記載の普遍塩基の使用を包含する。
【００８２】
実施形態に応じて、伸長された二本鎖または初期オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドプローブによって５’→３’方向または３’→５’方向のいずれかに伸長され得、これは以下にさらに記載する。一般的に、オリゴヌクレオチドプローブは、鋳型と完璧にマッチングした二本鎖を形成する必要はないが、かかる結合が好ましいことがあり得る。鋳型内の単一のヌクレオチドが各伸長サイクルで同定される実施形態では、完璧な塩基対合だけが、その特定のヌクレオチドを同定するために必要とされる。例えば、オリゴヌクレオチドプローブが伸長された二本鎖に酵素的にライゲートされる実施形態では、完璧な塩基対合、すなわち適正なワトソン−クリック塩基対合が、ライゲートされるプローブの末端ヌクレオチドと、鋳型内のその相補配列との間に必要とされる。一般的に、かかる実施形態では、プローブの残余ヌクレオチドは、次のライゲーションが鋳型に沿った所定の部位または塩基数で起こることを確実にする「スペーサー」としての機能を果たす。すなわち、その対合またはその欠如は、さらなる配列情報を提供しない。同様に、塩基同定をポリメラーゼ伸長に依存する実施形態では、プローブは、主に、スペーサーとしての機能を果たすため、鋳型への特異的ハイブリダイゼーションは不可欠ではない。
【００８３】
上記の方法により、配列の部分決定、すなわち、鋳型内で互いに間隔があいている個々のヌクレオチドの同定が可能になる、本発明の好ましい実施形態において、より完全な情報を取得するため、各反応で異なる初期オリゴヌクレオチドｉが使用される複数の反応が行なわれる。初期オリゴヌクレオチドｉは、結合領域の異なる部分に結合する。好ましくは、初期オリゴヌクレオチドは、結合領域にハイブリダイズされるとき、異なる初期オリゴヌクレオチドのかかる伸長可能な末端が互いに１ヌクレオチドずれた位置に結合する。例えば、図３に示すように、配列決定反応１．．．Ｎが行なわれる。初期オリゴヌクレオチドｉｉ．．．ｉｎは同じ長さを有し、その末端ヌクレオチド３１、３２、３３などが、結合領域４０内の連続的な隣接する位置４１、４２、４３などにハイブリダイズするように結合する。したがって、伸長プローブｅ１．．．ｅｎは、鋳型の連続的な隣接する領域に結合し、初期オリゴヌクレオチドの伸長可能な末端にライゲートされる。ｉπにライゲートされたプローブｅｎの末端ヌクレオチド６１は、ポリヌクレオチド領域５０のヌクレオチド５５、すなわち、鋳型内の第１の未知ポリヌクレオチドに相補的である。伸長、ライゲーションおよび検出の第２のサイクルでは、プローブｅ１２の末端ヌクレオチド７１は、ポリヌクレオチド領域５０のヌクレオチド５６、すなわち、未知配列の第２のヌクレオチドに相補的である。同様に、初期オリゴヌクレオチドｉ２、ｉ３、ｉ４などにより初期化された二本鎖にライゲートされた伸長プローブの末端ヌクレオチドは、未知配列５０の第３、第４および第５のヌクレオチドに相補的である。初期オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチド領域５０に対し、進行的に近づくのではなく進行的にさらに離れる領域に結合され得ることは認識されよう。
【００８４】
非伸長プローブの末端ヌクレオチドのスペーサー機能により、初期オリゴヌクレオチドが結合する位置から相当除去される鋳型内の位置の配列情報の取得が、相応する多数回のサイクルが任意の所与の鋳型において行なわれることを要することなく可能になる。例えば、長さＮのプローブのライゲーションの連続的サイクル後、単一の末端ヌクレオチドを伸長プローブから除去するための切断によって、Ｎ−１ヌクレオチド区間のヌクレオチドが連続回数で同定され得る。例えば、鋳型内の１、Ｎ、２Ｎ−１、３Ｎ−２、４Ｎ−３および５Ｎ−４位のヌクレオチドが、６サイクルで同定され得、この場合、鋳型内の１位のヌクレオチドは、鋳型への初期オリゴヌクレオチドの結合によって形成される二本鎖内の伸長可能なプローブ末端にライゲートされるヌクレオチドと反対のヌクレオチドである。同様に、切断により２つのヌクレオチドが長さＮの伸長プローブから除去される場合、互いにＮ−２ヌクレオチド離れた位置のヌクレオチドが連続回数で同定され得る。例えば、鋳型内の１、Ｎ−１、２Ｎ−３、３Ｎ−５、４Ｎ−７位のヌクレオチドが６サイクルで同定され得る。したがって、プローブが８ヌクレオチド長であり、２個のヌクレオチドが各サイクルで除去される場合、１位、７、１３、１９および２５位のヌクレオチドが同定される。したがって、鋳型内の第１のヌクレオチドからＸ離れたヌクレオチドを同定するのに必要とされるサイクル数は、およそＸではなく、およそＸ／Ｍ（式中、Ｍは、切断後に残存する伸長プローブの長さである）である。
【００８５】
例えば、図３Ｂに示す概略は、鋳型を６塩基ごとに読み出されるように設計された伸長プローブを用いた伸長、ライゲーションおよび切断方法の使用の最終結果を示す。結合領域内でずれる位置に結合する初期化６ヌクレオチドを用いて鋳型を逐次ストリッピングおよび配列決定し、結果を組み合わせることにより、すべての鋳型塩基が、規定された長さにわたって解明される。例えば、１０回の逐次ライゲーションが、６回の反応の各々で行なわれる場合、得られる読出し長さは６０個の連続塩基対であるが、１５回の逐次ライゲーションが各反応で行なわれる場合、得られる読出し長さは９０個の連続塩基対である。
【００８６】
なんら理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、このアプローチとは対照的に、合成方法によるほとんどの逐次配列決定では、長い読出し長さに対する可能性を最終的に制限するエラー蓄積に取り組んでいることを提案する。ある特定の本明細書に記載の方法の好都合な特徴は、所与のサイクル数（ｙ）後、ｎ＊ｙ−（ｎ−ｌ）番目の塩基に達する（例えば、１５サイクル後に前述の例において７１番目の塩基、または切断部位の３’側で６塩基のプローブを用いて２０サイクル後に１１５番目の塩基）ように、第ｎ塩基ごと（プローブ内の切断可能な部分の位置による）の同定を可能にすることである。ｎ−１、ｎ−２などの位置の初期オリゴヌクレオチドを「リセット」できることは、鋳型からの伸長鎖のストリッピングおよび新たな初期オリゴヌクレオチドのハイブリダイズのプロセスにより、バックグラウンドシグナルがゼロに有効にリセットされるため、所与の読出し長さのための逐次エラー蓄積（位相の散逸または自然減（ａｔｔｒｉｔｉｏｎ）により）が大いに最小化される。例えば、合成によるポリメラーゼ系配列決定と、本明細書に記載のライゲーション系アプローチを比較すると、各伸長サイクルでの信号対雑音比が９９：１である場合、１００サイクル後の比は、ポリメラーゼ系アプローチで３７：６３であり、リガーゼ系の方法では８５：１５である。リガーゼ系の方法での最終結果は、ポリメラーゼ系の方法よりも読出し長さにおいて大きく増大する。
【００８７】
鋳型内の先行する各ヌクレオチドのためのサイクルを行なう必要がある場合に必要とされ得るよりも少ないサイクルを用いてヌクレオチドを同定できることは、いくつかの理由で重要である。特に、該方法において各工程が１００％効率で行なわれることはあり得ない。例えば、一部の鋳型は、伸長プローブに成功裏にライゲートされないことがあり得、一部の伸長プローブは切断されないことがあり得るなどである。したがって、各サイクルにおいて、異なる鋳型コピーにおいて行なわれる反応は、進行的に位相の散逸となり、有用で正確な情報が取得され得る鋳型の数が低減される。したがって、初期オリゴヌクレオチドの伸長可能な末端から数個より多く離れた位置に位置するヌクレオチドの読み出しに必要とされサイクル数を最小限にすることは特に望ましい。しかしながら、伸長プローブの長さを増大させることは、潜在的にプローブ混合物のより大きな複雑度をもたらし、これは、個々の各プローブ配列の有効濃度を低減させる。本明細書に記載のように、縮重低減性ヌクレオチドは、複雑度を低減させるために使用され得るが、ハイブリダイゼーション強度の減少および／またはライゲーション効率の減少をもたらし得る。本発明者らは、結果を最適化するために、これらの競合する要素を均衡させる必要性を認識した。したがって、本発明の好ましい実施形態において、８ヌクレオチド長の伸長プローブを使用し、選択した位置に縮重低減性ヌクレオチドを用いる。また、本発明者らは、適切な切れやすい連結ならびに切断条件ならびに切断工程の効率（すなわち、各切断工程において成功裏に切断された連結の割合）およびその適切な連結に対する特異性を最適化するタイミングを選択することの重要性を認識した。
【００８８】
Ｂ．オリゴヌクレオチド伸長プローブ設計
Ｍａｃｅｖｉｃｚには、縮重低減性ヌクレオシド類縁体が、オリゴヌクレオチド伸長プローブに使用され得ることは記載されているが、かかる残基を含む残基を伸長プローブ内に含めるのに特に望ましい具体的な位置は教示されておらず、縮重低減性ヌクレオシドが組み込まれた具体的なプローブ構造（すなわち、配列）は教示されていない。本発明者らは、縮重低減性ヌクレオシド（例えば、普遍塩基を含むヌクレオシド）を、オリゴヌクレオチド伸長プローブ内の特定の位置に特定の数で利用することが特に好都合であり得ると認識した。例えば、本発明のある特定の実施形態において、６位以降の（Ｘから数えて）のヌクレオチドの大部分または全部が普遍塩基を含む。例えば、６位以降のヌクレオチド少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％が、普遍塩基を含有するものであり得る。ヌクレオチドは、すべてが同じ普遍塩基を含有するものである必要はない。本発明のある特定の実施形態において、ヒポキサンチンおよび／またはニトロ−インドールが普遍塩基として使用される。例えば、イノシンなどのヌクレオシドが使用され得る。
【００８９】
本発明者らは、優れた結果は、６ヌクレオチド長より大きく、プローブの近位末端から（ライゲートされるヌクレオチドから数えて）伸長可能なプローブ末端までの６位以降のヌクレオチドの１つ以上が縮重低減性ヌクレオチドである、例えば、普遍塩基を含む（すなわち、最も近位ヌクレオチドを１位とみなした場合、６位以降のヌクレオチドの１つ以上が普遍塩基を含む）、例えば、八量体プローブの場合は、６位以降のヌクレオチドの１、２または３個が普遍塩基を含む伸長プローブを用いて達成され得ると認識した。例えば、３’→５’方向における配列決定では、構造３’−ＸＮＮＮＮｓＩＮＩ−５’  を有するプローブが使用され得、式中、ＸおよびＮは任意のヌクレオチドを表し、「ｓ」は、切れやすい連結を表し、切断は３’末端から数えて第５と第６の間の残基で起こるようになっており、切れやすい連結と５’末端間の残基の少なくとも１つは、好ましくは、Ｘの正体に対応する標識を有する。別の設計は、３’−ＸＮＮＮＮｓＮＩＩ−５’  である。また別のプローブ設計は、３’−ＸＮＮＮＮｓＩＩＩ−５’  である。この設計により、中程度の複雑度を有する１０２４個の異なる種プローブ混合物がもたらされ、有意なアデニル化産物の形成を抑制するのに充分長く（実施例１参照）、切断後に残留する得られる伸長産物が非修飾ＤＮＡからなるものであり得るという利点を有する。欠点の１つは、このプローブがプライマーを一度に５塩基しか伸長させないことである。読出し長さは、伸長長さ×サイクル数の関数であるため、伸長長さにおける各追加の塩基は、読出し長さが１×サイクル数分増加する可能性を有する（例えば、２０  サイクルを用いる場合は２０塩基）。別のプローブ設計は、切断後に１つ以上イノシン（または他の普遍塩基）を伸長プローブの末端に残し、６塩基以上の長さの伸長された二本鎖を創製させるものである。例えば、プローブ３’−ＸＮＮＮＮＩｓＩＩ−５’により、二本鎖は一度に６塩基伸長され得、接合に５’イノシンが残る。これらの設計の各々において、切れやすい連結と５’末端間の残基の少なくとも１つは、好ましくは、Ｘの正体に対応する標識を有する。本発明のある特定の実施形態において、プローブの遠位末端から（ライゲートされるヌクレオチドと反対の末端から数えて）伸長可能なプローブ末端までの第３のヌクレオチドが普遍塩基を含む（すなわち、遠位末端を位置Ｋとみなした場合、位置Ｋ−２のヌクレオチドが普遍塩基を含む）。
【００９０】
本発明のある特定の実施形態において、ロックド核酸（ＬＮＡ）塩基が、初期オリゴヌクレオチドプローブ、伸長プローブまたは両方内の１つ以上の位置に使用される。ロックド核酸は、例えば、米国特許第６，２６８，４９０号；Ｋｏｓｈｋｉｎ，  ＡＡら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，  ５４：３６０７−３６３０，１９９８；Ｓｉｎｇｈ，  ＳＫら、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，４：４５５−４５６，１９９８に記載されている。ＬＮＡは、自動ＤＮＡ合成装置によって標準的なホスホロアミダイト化学反応を用いて合成され得、天然に存在するヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログもまた含有するオリゴヌクレオチド内に組み込まれ得る。これらもまた、以下に記載のものなどの標識を用いて合成され得る。
【００９１】
Ｃ．鋳型、ライブラリー、担体、ブロッカー、およびそれらの調製および使用方法
本発明は、核酸鋳型および担体を調製する種々の方法を提供する。本発明はまた、ライゲーションに基づく配列決定での使用、または他の目的のためのライブラリーも提供する。本発明はまた、ブロッカーオリゴヌクレオチド、ならびに他の目的でオリゴヌクレオチドのライゲーション、検出および開裂のサイクルを連続して行うことにより、配列決定においてそれらを使用する方法も提供する。
【００９２】
Ｍａｃｅｖｉｃｚには、複数の実質的に同一の鋳型分子を含む鋳型を最初に、例えば、慣用的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法のようなチューブまたは他の容器内で増幅によって合成する方法が教示されている。Ｍａｃｅｖｉｃｚには、増幅させた鋳型分子を、好ましくは、合成後に磁気微粒子（例えば、ビーズ）などの支持体に結合させることが教示されている。
【００９３】
本発明者らは、配列決定される鋳型は、望ましくは、支持体自体の上またはその内部で、例えば、１対の増幅プライマーの一方を、ＰＣＲ反応を行なう前に結合させる微粒子などの支持体または種々の半固相支持体材料ゲルマトリックスを用いることにより合成させるのがよいと認識した。このアプローチにより、合成後に、鋳型分子を支持体に結合させる別途の工程の必要性が回避される。したがって、異なる配列の複数の鋳型種が、並行して簡便に増幅され得る。例えば、以下に記載する方法によれば、微粒子上での合成により、各々が自身に結合された多コピーのある特定の鋳型分子（またはその相補体）を有する個々の微粒子の集団がもたらされ、各微粒子に結合された鋳型分子は、他の微粒子に結合された鋳型分子と配列が異なる。したがって、支持体の各々は、自身に結合された鋳型のクローン性の集団を有する、例えば、支持体Ａは、自身に結合された多コピーの鋳型Ｘを有し、支持体Ｂは、自身に結合された多コピーの鋳型Ｙを有し、支持体Ｃは、自身に結合された多コピーの鋳型Ｚを有するなどである。「鋳型のクローン性の集団」、「核酸のクローン性の集団」などにより、好ましくは、目的の単一の鋳型分子（出発鋳型）から開始される連続回数の増幅によって生成される、実質的に同一の鋳型分子の集団が意図される。実質的に同一の鋳型分子は、出発鋳型またはその相補体と実質的に同一であり得る。
【００９４】
増幅は、典型的には、ＰＣＲを用いて行なわれるが、他の増幅方法もまた使用され得る（下記参照）。クローン性の集団のメンバーは１００％同一である必要はなく、例えば、ある特定数の「エラー」が、合成過程中（例えば、増幅中）に起こり得ることは理解されよう。クローン性の集団のメンバーの好ましくは少なくとも５０％が、出発鋳型分子（またはその相補体）と少なくとも９０％、またはより好ましくは少なくとも９５％同一である。より好ましくは、集団のメンバーの少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％またはそれ以上が、出発鋳型分子（またはその相補体）と少なくとも９０％、またはより好ましくは少なくとも９５％同一であるか、またはさらにより好ましくは少なくとも９９％同一である。好ましくは、出発鋳型分子（またはその相補体）に対して少なくとも９５％またはより好ましくは少なくとも９９％の同一性割合の集団のメンバーは、少なくとも９８％、９９％、９９．９％またはそれ以上である。
【００９５】
増幅プライマーは、任意のさまざまな手法を用いて支持体に結合させ得る。例えば、プライマー（５’末端）の一方の末端を結合ペアの一メンバー（例えば、ビオチン）で官能性付与させ、支持体を、結合ペア他方のメンバー（例えば、ストレプトアビジン）で官能性付与させ得る。任意の類似した結合ペアが使用され得る。例えば、規定配列の核酸タグを、相補的核酸タグを有する支持体およびプライマーに結合させ得、支持体に結合された核酸タグにハイブリダイズさせ得る。種々のリンカーおよび架橋剤もまた使用され得る。
【００９６】
ＰＣＲを行なうための方法は、当該技術分野でよく知られており、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号および同第４，９６５，１８８号、ならびにＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，  Ｃ．およびＤｖｅｋｓｌｅｒ，  ＧＳ，  ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，２００３に記載されている。微粒子上で核酸を増幅させるための方法は、当該技術分野でよく知られ、報告されており、例えば、標準的なＰＣＲは、マイクロタイタープレート（ｄｉｓｈ）のウェルまたはチューブ内で、自身に結合されたプライマーを有するビーズ（例えば、実施例１２のようにして調製されるビーズ）上で行なわれ得る。ＰＣＲは簡便な増幅方法であるが、当該技術分野で知られた任意の数多くの他の方法もまた使用され得る。例えば、多重鎖置換型増幅、ヘリカーゼ置換型増幅（ＨＤＡ）、ニックトランスレーション、Ｑβレプリカーゼ増幅、ローリングサークル型増幅、および他の等温増幅方法などが使用され得る。
【００９７】
鋳型分子は、任意のさまざまな供給源から得られ得る。例えば、ＤＮＡは、被験体から入手され得るか、またはこれに由来であり得る試料から単離され得る。用語「試料」は、配列決定が行なわれる鋳型の任意の供給源を表すために広義で用いる。語句「に由来する」は、被験体から直接得られた試料および／または試料中の核酸は、鋳型分子を得るためにさらに加工処理されたものであり得ることを示すために用いる。試料の供給源は、任意のウイルス、原核生物、古細菌または真核生物種であり得る。本発明のある特定の実施形態において、供給源はヒトである。試料は、例えば、細胞を含有する血液または別の体液；精子；生検試料などであり得る。目的の任意の生物体のゲノムまたはミトコンドリアのＤＮＡが配列決定されてもよい。ｃＤＮＡが配列決定されてもよい。また、例えば、ＲＴ−ＰＣＲなどの当該技術分野で知られた方法を用いて最初に逆転写することによってｃＤＮＡを得ることによりＲＮＡが配列決定されてもよい。異なる試料および／または被験体由来のＤＮＡの混合物を合わせてもよい。試料は、任意のさまざまな様式で加工処理され得る。核酸は試料から、既知の方法を用いて単離、精製および／または増幅され得る。もちろん、生物体に由来しない完全に人工的な合成核酸、組換え核酸もまた配列決定され得る。
【００９８】
鋳型は、二本鎖または単鎖形態で提供され得る。典型的には、まず、鋳型を二本鎖形態で提供し、続いて、この二本鎖を分離する（例えば、ＤＮＡを変性させる）場合、該二本鎖の一方だけを増幅して鋳型の局在クローン性の集団分子（例えば、微粒子に結合、半固相支持体内または該支持体上にに固定化など）を生成させる。
【００９９】
鋳型は、さまざまなさらなる様式で選択または加工処理され得る。例えば、メチル感受性制限酵素（例えば、Ｍｓｐｌ）による処理に供されたＤＮＡから得られる鋳型が使用され得る。かかる処理は、ＤＮＡ断片をもたらすものであり、増幅前に行なわれ得る。メチル化塩基を含有する断片は増幅されない。低メチル化（ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ）鋳型から得られる配列情報を、同じ供給源に由来する低メチル化の選択に供しなかった鋳型から得られる配列情報と比較し得る。
【０１００】
鋳型は、ライブラリー内に挿入されるか、これで提供されるか、またはこれに由来するものであり得る。例えば、低メチル化ライブラリーは当該技術分野で知られている。ライブラリー内への鋳型の挿入により、鋳型の末端へのさらなるヌクレオチド配列の簡便な連鎖（例えば、タグ、プライマーまたは初期オリゴヌクレオチド結合部位など）が可能となり得る。例えば、ある特定のストラテジーにより、複数の結合部位（例えば、増幅プライマーの結合部位、初期オリゴヌクレオチドの結合部位、捕捉剤の結合部位など）を有するタグの付加が可能になる。
【０１０１】
さまざまな適当なライブラリーが、当該技術分野で知られている。例えば、特定の目的のライブラリー、およびその構築方法は、ＵＳＳＮ１０／９７８，２２４、ＰＣＴ公開公報ＷＯ２００５０４２７８１およびＷＯ２００５０８２０９８ならびにＳｈｅｎｄｕｒｅ，  Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９（５７４１）：１７２８−３２，２００５，  Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ（２００５年８月４日）（ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ．ｏｒｇ）に記載されている。もちろん、かかるライブラリーの他の作製方法もまた使用され得ることは理解されよう。特定の目的のある特定のライブラリーは、複数の核酸断片（典型的には、ＤＮＡ）を含み、その各々は、配列決定工程で使用される増幅および／または配列決定用プライマーに相補的な配列によって分断された目的の２つの核酸セグメントを含有する、すなわち、これらの配列は、プライマー結合領域（ＰＢＲ）としての機能を果たす。特定の目的の実施形態において、核酸セグメントは、天然に存在するＤＮＡの連続片の一部分である。例えば、セグメントは、前述の参考文献に記載のようなゲノムＤＮＡの連続片の５’および３’末端由来のものであり得る。かかる核酸セグメントを本明細書において、前述の参考文献と一致する様式で、「タグ」または「末端タグ」という。単一の連続核酸に由来する（例えば、その５’および３’末端に由来する）２つのタグを、「１対のタグ」、「対のタグ」または「ジタグ（ｄｉｔａｇ）」とよぶ。「対のタグ」は、単数形で使用されていても２つのタグを含むことは認識されよう。１対のタグであるタグが由来するＤＮＡの連続片を所定の大きさの範囲内で選択することにより、該２つのタグが離れる間隔が限定される。
【０１０２】
配列決定および／または増幅用プライマーに相補的な配列によって分断されることに加え、ライブラリーの核酸断片はまた、典型的には、タグと隣接する配列決定および／または増幅用プライマーに相補的な配列を含む。すなわち、第１のかかる配列は、該断片の５’末端により近いタグの５’側に位置し得、第２のかかる配列は、該断片の３’末端により近いタグの３’側に位置し得る。タグが由来する連続核酸内に存在する２つのタグの位置は、種々の実施形態において、ライブラリーのＤＮＡ断片内のタグの位置に対応するものであり得るが、そうである必要はないことに注意されたい。
【０１０３】
核酸断片およびタグは、異なる範囲の大きさを有するものであり得る。典型的には、核酸断片は、例えば、８０〜３００ヌクレオチド長、例えば１００〜２００、１００〜１５０、およそ１５０ヌクレオチド長、およそ２００ヌクレオチド長などであり得る。タグは、例えば、１５〜２５ヌクレオチド長、例えばおよそ１７〜１８ヌクレオチド長などであり得る。これらの長さは、例示であって、限定を意図しないことに注意されたい。より短鎖またはより長鎖の断片および／またはタグが使用され得る。
【０１０４】
また、対のタグを単一の連続核酸から得ることによりライブラリー構築の簡便な方法が提供されるが、対のタグの重要な点は、これらが、自身が元々由来する核酸内である間隔（「分断間隔」）だけ互いに離れており、この分断間隔が所定範囲内に含まれる間隔であることに注意されたい。両タグが所定範囲内に含まれる分断間隔だけ離れていることにより、タグの配列を参照配列（例えば、参照ゲノム配列）に対してアライメントさせることが可能になる。なんら理論に拘束されることを望まないが、このことは、ゲノム再配列決定などのある特定の適用用途に好都合であり得、この場合、参照ゲノムに対する配列の正確な配置が依然として可能なまま、より短い読出し長さの使用が可能になる。５’および３’タグの１対のタグは、より大きな核酸片（例えば、ゲノムＤＮＡ）のセグメントとなり（すなわち、その配列を有する）、該セグメントは、天然に存在するＤＮＡ片内（例えば、ゲノムＤＮＡ片内）において互いから予め規定された間隔内に位置する。例えば、本発明のある特定の実施形態において、５’および３’タグの１対のタグは、天然に存在するＤＮＡ片内で、互いに５００ヌクレオチドまで以内、互いに１ｋＢまで以内、互いに２ｋＢまで以内、互いに５ｋＢまで以内、互いに１０ｋＢまで以内、互いに２０ｋＢまで以内に位置するＤＮＡセグメントである。ある特定の実施形態において、５’および３’タグの１対のタグは、天然に存在するＤＮＡ片内で、５００ヌクレオチド〜２ｋＢ離れて、例えば、７００ヌクレオチド〜１．２ｋＢ離れて（およそ１ｋＢ離れてなど）位置する。１対のタグの２つのタグが離れている正確な間隔はあまり重要性ではなく、典型的には未知であることに注意されたい。また、タグは、元々は、より大きな核酸片から得られたものであるが、用語「タグ」は、タグの配列を有する任意の核酸セグメント、元々の配列状況に存在したもの、ライブラリー断片で存在したもの、ライブラリー断片からの増幅産物、配列決定対象の鋳型など、いずれも適用される。
【０１０５】
核酸断片（例えば、ライブラリー分子）は、下記の構造を有するものであり得る。
【０１０６】
リンカー１−タグ１−リンカー３−タグ１−リンカー２
タグ１およびタグ２は、は、５’および３’タグの１対のタグであり得る。タグのいずれかが５’タグまたは３’タグであり得る。リンカー１およびリンカー２は、１つ以上のプライマーのプライマー結合領域を含む。ある特定の実施形態において、リンカー１および２は、各々が増幅プライマーのＰＢＲおよび配列決定プライマーのＰＢＲを含む。各リンカー内のプライマーは、配列決定プライマーＰＢＲが増幅プライマーＰＢＲに対して内部に位置するようにネスト化（ｎｅｓｔｅｄ）されたものであり得る。リンカー３は、タグ１およびタグ２の配列決定を可能にするため、１つ以上配列決定プライマーのＰＢＲを含むものであり得る。核酸断片のライブラリーに関して使用される用語「リンカー」は、ライブラリーの多数の核酸断片（例えば、ライブラリーの実質的にすべての断片）内に存在する核酸配列をいう。リンカーは、ライブラリーの構築中に実際に連結機能を果たしたものであってもそうでなくてもよく、単に、所与のライブラリーの大部分または全部のメンバーに共通する規定配列とみなされるものであってもよい。かかる配列はまた、「普遍配列」ともいう。したがって、リンカーまたはその一部分に相補的な核酸は、ライブラリーの多数のメンバーにハイブリダイズされ得、ライブラリー内の大部分または全部の分子の増幅プライマーまたは配列決定プライマーとして使用され得る。
【０１０７】
本発明のある特定の実施形態において、核酸断片は下記の構造を有する。
【０１０８】
リンカー１−タグ１−内部アダプター−タグ２−リンカー２
タグ１およびタグ２ならびにリンカー１およびリンカー２は、上記のようなＰＢＲを含む。内部アダプターは、ＩＡおよびＩＢ（以下にさらに論考する）ということがある２つのプライマー結合領域を含む。これらのＰＢＲは、一方の集団の核酸がタグ１を含み、他方の集団の核酸がタグ２を含む自身に結合された核酸の２つの異なる実質的に同一の集団を有する微粒子生成させるのに有用である。核酸の２つの異なる集団は少なくとも部分的に異なる配列を有し、例えば、これらはタグの配列領域が異なる。内部アダプターは、スペーサー領域を２つのプライマー結合領域間に含むものであり得る。スペーサー領域は無塩基残基を含み得、これにより、該スペーサーを介するポリメラーゼの伸長が抑制される。もちろん、スペーサーを介するポリメラーゼ伸長が抑制され得る任意の他のブロッキング基を含有するスペーサー領域が使用され得る。
【０１０９】
他の実施形態において、核酸断片は、１つ以上（例えば、２、４、６など）のさらなるタグおよび１つ以上のさらなる内部アダプターを含む。例えば、核酸断片は下記の構造を有する。
【０１１０】
リンカー１−タグ１−内部アダプター１−タグ２−リンカー２−タグ３−内部アダプター２−タグ４−リンカー３
本発明の核酸断片およびかかる断片のライブラリー、核酸の２つ以上の実質的に同一の集団を含有する微粒子、ならびにかかる微粒子のアレイは、本明細書に記載のライゲーション系配列決定法以外の広範なさまざまな配列決定法に使用され得ることに注意されたい。例えば、ＦＩＳＳＥＱ、ピロシーケンスなどの配列決定法が使用され得る。例えば、ＷＯ２００５０８２０９８を参照のこと。もちろん、ライゲーション系の方法もまた好都合に使用され得る。本明細書に記載のライゲーション系の方法の状況では、用語「配列決定プライマー」は、「初期オリゴヌクレオチド」を意味すると理解され得ることは認識されよう。
【０１１１】
本発明のある特定の実施形態において、配列決定対象の鋳型は、ＰＣＲによって、エマルジョンの個々の水性区画（「反応器」ともいう）内で合成される。好ましくは、該区画は、各々が適当な自身に結合された第１の増幅プライマー、第１の鋳型コピー、第２の増幅プライマーおよびＰＣＲ反応に必要な成分（例えば、ヌクレオチド、ポリメラーゼ、補因子など）を有するビーズなどの微粒状の支持体を含む。エマルジョンの調製方法は、例えば、米国特許第６，４８９，１０３号（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ）；同第５，８３０，６６３号（Ｅｍｂｌｅｔｏｎ）；および米国特許公開公報第２００４０２５３７３１号（Ｇｈａｄｅｓｓｙ）に記載されている。ＰＣＲをエマルジョンの個々の区画内で行ない、微粒子に結合された鋳型のクローン性の集団を生成させる方法（「エマルジョンＰＣＲ」）は、例えば、Ｄｒｅｓｓｍａｎ，  Ｄ．ら，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，１００（１５）：８８１７−８８２２，２００３およびＰＣＴ公開公報ＷＯ２００５０１０１４５に記載されている。
【０１１２】
前述の参考文献に記載の方法またはその変形法は、配列決定のために微粒子に結合された鋳型のクローン性の集団を生成させるために使用され得る。好ましい非限定的な実施形態において、ＰＣＲに適した短鎖（＜５００ヌクレオチド）鋳型が、普遍アダプター配列を異なる標的配列（鋳型）の集団の各末端に結合させることにより（例えば、ライゲーションによって）創製される（この状況における普遍は、同じアダプター配列が各鋳型に結合され、単一の１対のＰＣＲ増幅プライマーを用いて増幅され得る「アダプター付加」鋳型創製されることを意味する）。バルクＰＣＲ反応液は、アダプター付加鋳型、１種類の遊離増幅プライマー、自身に結合された第２の増幅プライマーを有する微粒子、および他のＰＣＲ試薬（例えば、ポリメラーゼ、補因子、ヌクレオチドなど）を用いて調製される。水性ＰＣＲ反応液を油相（低分子（ｌｉｇｈｔ）鉱油および界面活性剤を含有）と１：２の比で混合する。この混合物をボルテックスして油中水型エマルジョンを創製する。４×１０９より多い水性区画（各々が潜在的ＰＣＲ反応器）をエマルジョン内に創製するのに１ミリリットルの混合物で充分である。エマルジョン試料のアリコートを、マイクロタイタープレート（例えば、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレートなど）のウェル内に分配し、サーマルサイクルに供し、微粒子上での固相ＰＣＲ増幅を行なう。クローン性を確保するため、微粒子および鋳型の濃度は、反応器が１つより多くのビーズまたは鋳型分子を含むことは稀であるように注意深く制御する。例えば、本発明のある特定の実施形態において、反応器の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上が単一のビーズおよび単一の鋳型を含む。したがって、各鋳型のクローン性の集団のメンバーは、その微粒子への結合の結果、空間的に互いに近接して局在化される。一般に、鋳型の結合点は、該粒子の表面上に実質的に均一に分布され得る。増幅手順後の微粒子に付着したクローン性の集団（代表的に数千から数百万コピーの鋳型）の鋳型を有する微粒子は、鋳型増幅を受けたという。
【０１１３】
個々の微粒子が、自身に結合された５’タグおよび３’タグの１対のタグを含む増幅された核酸断片の異なる集団を有する微粒子の集団を生成させるためにＰＣＲエマルジョン法を用いることは、特に重要である。換言すると、個々の粒子がライブラリー由来の異なる核酸断片（例えば、増幅され、自身に結合された上記のものなど）を有する微粒子の集団生成させることは、特に重要である。
【０１１４】
ＤＮＡをエマルジョン中で増幅させるための当該技術分野で知られた方法（例えば、上記の参考文献に記載のもの）は、大きな核酸分子の増幅およびこれらの分子の微粒子への結合を達成するその能力に関して制限がある。例えば、より長いアンプリコンを用いると、ＰＣＲ効率は指数関数的に減少することが示されている。このＰＣＲ効率の減少により、対のタグおよびプライマー結合部位を含有する核酸断片（例えば、上記のものなど）が、ＰＣＲエマルジョンで増幅され得、かかる増幅によって微粒子に結合される効率が低下する。したがって、第１および第２のタグの１対のタグを含有する実質的に同一の核酸断片の単一の集団がＰＣＲエマルジョンで増幅され、かかる増幅によってビーズに結合される方法は、いくつかの制限があるという欠点を有する。
【０１１５】
本発明は、５’および３’タグの１対のタグを含有する単一の核酸断片を増幅によって微粒子に結合させた場合にもたらされる対のタグ情報は依然として保存されたまま、より小さいアンプリコンの使用を可能にするアプローチを提供する。本発明は、自身に結合された核酸の少なくとも２つの異なる集団を有する微粒子（例えば、ビーズ）を提供し、ここで、該少なくとも２つの集団の各々は複数の実質的に同一の核酸からなり、第１の実質的に同一の核酸の集団は、第１の核酸の目的のセグメント（例えば、５’タグ）を含み、核酸の第２の集団は、第２の核酸の目的のセグメント（例えば、３’タグ）を含む。第１および核酸の第２の集団は、該２つのタグを含み、かつ該タグと隣接し分断する適切に配置されたプライマー結合部位も含む単一の大きな核酸断片から増幅され、その結果、２つの増幅反応は、連続的または（好ましくは）同時のいずれかで、ＰＣＲエマルジョン単一の反応器内にて微粒子および増幅試薬の存在下で行なわれ得る。微粒子は自身に結合されたプライマーの２つの異なる集団を有し、該集団の一方は、該核酸断片内の一方のタグの外部のプライマー結合領域を有する配列に対応し、他方は、該核酸断片内の他方のタグの外部のプライマー結合領域を有する配列に対応する。すなわち、プライマー結合領域は該２つのタグと隣接している。
【０１１６】
また、２つの独立したＰＣＲ反応が行なわれ、各々が、核酸断片の一方のタグを含有する部分を増幅し得るように、該２つのタグ間に位置するプライマー結合領域に結合するプライマーが提供される。増幅された核酸セグメントは、互いに異なるさらなるプライマー結合領域を含み、これらのさらなるプライマー結合領域は、核酸断片内に存在し、増幅プライマーのＰＢＲに対して内部に位置する、すなわち、これらはネスト化されている。これらのさらなるＰＢＲは、２つの異なる配列決定プライマーの結合領域としての機能を果たす。したがって、２つの異なる配列決定プライマーの一方または他方を自身に結合された実質的に同一の核酸セグメントの２つの集団を有する微粒子に適用することにより、２つの核酸セグメントの一方または他方のいずれかが、他方の核酸セグメントの存在による障害なく配列決定され得る。核酸セグメントの各々は、増幅された核酸断片よりも有意に短く、したがって、対のタグを含有する断片のライブラリーを用いてエマルジョン系ＰＣＲが行なわれ得る効率は改善されるが、１対のタグのタグ間の会合は依然として保持されたままである。
【０１１７】
上記の方法は、図３４および３５の種々のパネルを参照することによって、より良好に理解され得る。図において、同じ配列を有する核酸の部分には同じ色を割り当てている。上記の記載は、図３４および３５と一致するよう解釈されたい。図３４Ａおよび３５Ａは図３５Ａと同じ工程を示すが、さらなる詳細を提供する。図３４Ａおよび３５Ａに示すように、２つのタグ（タグ１およびタグ２）を含有する対末端ライブラリー断片は、内部アダプターカセット（ＩＡ−ＩＢ）および特有の隣接リンカー配列（Ｐ１およびＰ２）を有するように構築される（すなわち、Ｐ１およびＰ２は互いに異なる）。内部アダプターカセットおよび隣接リンカー配列はともに、ＰＣＲ増幅およびＤＮＡ配列決定の両方をもたらすヌクレオチド配列を含む。ＰＣＲプライマー領域は、ネスト化されたＤＮＡ配列決定プライマーの使用が可能になるように設計される。ＤＮＡ捕捉微粒子（ビーズ）は、同一である２つのオリゴヌクレオチド配列を特有の隣接リンカー配列に結合させることにより生成させる。ＰＣＲ増幅のため、Ｐ１およびＰ２  配列を有するオリゴヌクレオチドに結合させたＤＮＡ捕捉微粒子を、単一のジタグライブラリー断片（すなわち、５’タグおよび３’タグの１対のタグを含有するライブラリー断片）および溶液系ＰＣＲプライマーを含有する反応液にシード（ｓｅｅｄ）する。
【０１１８】
溶液系隣接リンカープライマー（Ｐ１およびＰ２）は、内部アダプタープライマー（ＩＡおよびＩＢ）と比べて限定的な量で添加され、ＰＣＲ生成タグ産物の効率的なビーズ駆動型（ｄｒｉｖｅ−ｔｏ−ｂｅａｄ）増幅を促進する機能を果たす（すなわち、［Ｐ１＜＜ＩＢ］，  ［Ｐ２＜＜ＩＡ］）。所望の場合は、プライマーの量を適切に制御することによってもまた、核酸の集団が実質的に同じ数の核酸を含むことが確保され得る（例えば、個々の微粒子上のおよそ半数の核酸が第１の集団に属し、個々の微粒子上のおよそ半数の核酸が第２の集団に属する）。したがって、所望により、種々の集団の比を制御するため、非対称形態のＰＣＲが使用され得る。
【０１１９】
増幅中、図３４Ｂおよび３５Ｂに示すように（この場合も、図３５Ｂは、図３４Ｂに関するさらなる詳細を提供する）、単一の対末端ライブラリー断片が、４種類のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐｌ、Ｐ２、ＩＡおよびＩＢ）の存在下で、２種類の特有のＰＣＲ産物を生成させる。一方の集団は、Ｐ１とＩＡに隣接したタグ１を含み、第２の集団は、Ｐ２とＩＢに隣接したタグ２を含む。
【０１２０】
増幅微後、粒子には、最初のライブラリー断片から生成されたタグ１およびタグ２に対応する２つの特有のＰＣＲ集団が負荷される。したがって、各タグは、図３４Ｃ、３５Ｃおよび３５Ｄに示すような、各タグの逐次配列決定を可能にする特有の組のプライマー（ｐｒｉｍｉｎｇ）領域を含む。図３５Ｃおよび３５Ｄは、異なる配列決定プライマーを用いたタグ１および２の連続的配列決定を示す。任意のさまざまな配列決定法が使用され得る。
【０１２１】
上記の方法は、（例えば、４、６、８、１２、１６、２０の集団であって、例えば、該集団は、２、３、４、６、８、１０の対のタグを含む）自身に結合された２つより多くの異なる核酸配列の集団を有する微粒子を生成させるために使用され得る。各集団は、２つのタグの場合で記載のようにして、特有のプライマー結合領域を各配列内に提供することにより個々に配列決定され得る。
【０１２２】
本発明は、図３４および３５に示す上記の構造を有する核酸断片、かかる断片のライブラリー、自身に結合されたかかる断片由来の核酸セグメントを有する微粒子、かかる微粒子の集団（個々の微粒子は、他の微粒子のものと異なる核酸の集団が自身に結合されている）、微粒子のアレイ、核酸断片からの核酸セグメント（タグ）の増幅のための増幅プライマー、微粒子に結合された核酸セグメントの配列決定のための配列決定プライマー、該断片、ライブラリーおよび微粒子の作製方法、ならびに微粒子に結合された核酸の配列決定法を包含する。本発明は、前述の成分の任意の組合せを含み、任意選択で１種類以上の酵素、バッファーまたは増幅、配列決定などに有用な他の試薬もまた含むキットを包含する。
【０１２３】
所望の場合は、さまざまな方法が、自身に結合された鋳型を有する微粒子の富化のために使用され得る。例えば、増幅産物（鋳型）の微粒子に結合された部分に相補的なオリゴヌクレオチド（捕捉剤）を、別の（好ましくは、より大きな）微粒子、マイクロタイターウェルまたは他の表面などの捕捉実体に結合させるハイブリダイゼーション系の方法が使用され得る。増幅産物の該部分は標的領域とよばれ得る。標的領域は、増幅中、鋳型内に、例えば、鋳型の未知配列を有する部分の末端に組み込まれ得る。例えば、標的領域は、微粒子に結合されない増幅プライマー内に存在し得、その結果、相補的部分が増幅された鋳型内に存在する。したがって、多数の異なる鋳型が、同じ標的領域を含み得るため、単一の捕捉剤が、多数の異なる鋳型にハイブリダイズし、１つだけのオリゴヌクレオチド配列を捕捉剤として用い、多数の微粒子の捕捉が可能になる。増幅に供された微粒子は、ハイブリダイゼーションが起こり得る条件下で捕捉剤に曝露され、その結果、自身に結合された増幅された鋳型を有する微粒子が、捕捉剤により捕捉実体に結合される。次いで、未結合微粒子を除去し、保持された微粒子を放出させる（例えば、昇温により）。微粒状の捕捉実体が使用されるある特定の実施形態において、自身に結合された微粒子を有する捕捉実体からなる凝集体を、ハイブリダイゼーション後に、結合された微粒子のない微粒状の捕捉実体から、および捕捉実体に結合されていない微粒子から、例えば、粘性溶液（例えば、グリセロール）中での遠心分離によって分離する。大きさ、密度などに基づく他の分離方法もまた使用され得る。しかし、ハイブリダイゼーションは、富化に使用され得るいくつかの方法のうちの１つである。例えば、鋳型内に組み込まれ得る（例えば、合成中）任意のいくつかの異なるリガンドに対して親和性を有する捕捉剤が使用され得る。多数回の富化が使用され得る。
【０１２４】
図１４Ａは、ＰＣＲ反応が、自身に結合された第１の増幅プライマーを有するビーズ上で、蛍光標識された第２の増幅プライマーおよび過剰の鋳型を用いて行なわれた油中水型エマルジョンの区画の画像を示す。水性反応器は、拡散した遊離プライマーから弱い蛍光を発するが、ビーズは、固相増幅の結果としてビーズ上に蓄積されるプライマーから強い蛍光を発する（すなわち、蛍光プライマーが、ビーズに結合された増幅された鋳型内に第１の増幅プライマーによって組み込まれている）。ビーズシグナルは、種々の大きさの反応器において不均一である。
【０１２５】
増幅後、微粒子を回収し（例えば、磁気粒子の場合は磁石の使用によって）、本明細書に記載の伸長、ライゲーションおよび切断の反復サイクルによる配列決定に使用する。本発明のある特定の実施形態において、微粒子は、配列決定前に半固相支持体内または該支持体上にアレイ状にする（これは、後述する）。実施例１２、１３、１４および１５は、（ｉ）  微粒子上での鋳型の合成のための自身に結合された増幅プライマーを有する微粒子の調製（実施例１２）；（ｉｉ）ＰＣＲを行なうための複数の反応器を含むエマルジョンの調製（実施例１３）；（ｉｉｉ）エマルジョンの区画内でのＰＣＲ増幅（実施例１３）；（ｉｖ）エマルジョンの破壊および微粒子の回収（実施例１３）；（ｖ）  自身に結合されたクローン鋳型集団を有する微粒子の富化（実施例１４）；（ｖｉ）  半固形ポリアクリルアミド支持体の基材として供するガラススライドの調製（実施例１５）；ならびに（ｖｉｉ）  微粒子と非重合アクリルアミドとの混合による自身に結合された鋳型を有する微粒子のアレイの形成、基材上のアクリルアミド内への包埋（実施例１５）ために使用され得る代表的で非限定的な方法のさらなる詳細を提供する。また、実施例１５には、ポリメラーゼトラッピング（ｔｒａｐｐｉｎｇ）のプロトコルを記載しており、これは、半固相支持体内でＰＣＲ行なう場合のある特定の方法で使用される。当業者には、これらの方法に対する数多くの変形法が使用され得ることが認識されよう。
【０１２６】
本発明の他の実施形態において、鋳型は、内部に固定化された適当な増幅プライマーを有するゲルなどの半固相支持体内でのＰＣＲによって増幅される。鋳型、さらなる増幅プライマー、およびＰＣＲ反応に必要な試薬を半固相支持体内に存在させる。１対の増幅プライマーの一方または両方を半固相支持体に、適当な連結部分、例えば、アクリダイト基によって結合させる。結合は、重合中に行なわれ得る。さらなる試薬（例えば、鋳型、第２の増幅プライマー、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、補因子など）を、半固相支持体の形成の前に存在させてもよく（例えば、ゲル形成前に液体中）、または試薬の１種類以上をその形成後に半固相支持体中に拡散させてもよい。半固相支持体の細孔径は、かかる拡散を可能にするように選択される。当該技術分野でよく知られているように、ポリアクリルアミドゲルの場合は、細孔径は、主にアクリルアミドモノマー濃度によって、および程度は低いが架橋剤によって決定される。同様の考慮事項が、他の半固相支持体材料の場合に適用される。所望の細孔径を得るために適切な架橋剤および濃度が選択され得る。本発明のある特定の実施形態において、カチオン脂質、ポリアミン、ポリカチオンなどの添加剤を、重合前に該溶液中に含め、ゲル内ミセルを形成させるか、または微粒子周囲に凝集させる。米国特許第５，７０５，６２８号、同第５，８９８，０７１号、および同第６，５３４，２６２号に記載の方法もまた使用され得る。例えば、種々の「クラウディング（ｃｒｏｗｄｉｎｇ）試薬」が、クローンＰＣＲ用のビーズ付近にＤＮＡをクラウディングさせるために使用され得るＳＰＲＩ（登録商標）磁気ビーズ手法および／または条件もまた使用され得る。例えば、１０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の存在下での有効なＰＣＲ増幅を示した米国特許第５，６６５，５７２号を参照のこと。本発明の方法のある特定の実施形態において、増幅（例えば、ＰＣＲ）、ライゲーションまたは両方が、ベタイン、ポリエチレングリコール、ＰＶＰ−４０などの存在下で行なわれる。これらの試薬は、溶液に添加しても、エマルジョン中に存在させても、および／または半固相支持体中に拡散させてもよい。
【０１２７】
半固相支持体は、実質的に平面状の剛性の基材に配置するか、またはその上面に配設する。ある特定の好ましい実施形態において、該基材は、典型的な標識（例えば、蛍光標識、量子ドット、プラスモン共鳴粒子、ナノクラスター）の励起および検出に使用される励起および発光波長（例えば、およそ４００〜９００ｎｍ）の放射線に対して透過性である。ガラス、プラスチック、石英などの材料が適当である。半固相支持体を基材に接着してもよく、任意選択で、任意のさまざまな方法を用いて基材に固定させ得る。
基質は、接着または結合を増強する物質（例えば、シラン、ポリリシンなど）でコーティングされたものであってもそうでなくてもよい。米国特許第６，５１１，８０３号には、半固相支持体内でのＰＣＲを用いて鋳型のクローン性の集団合成するための方法、実質的に平面状の基材上に半固相支持体を作製するための方法などが記載されている。同様の方法が本発明に使用され得る。基材は、半固形基材の形成前の液体を入れるためのウェルまたは凹部を有するものであってもよい。あるいはまた、高くした障壁またはマスクがこの目的のために使用され得る。
【０１２８】
上記のアプローチは、空間的に局在化されるクローン鋳型の集団を生成させるためのエマルジョン中の反応器（ｒｅａｃｔｏｒ）の使用の代替法を提供する。クローン性の集団は半固相支持体内の別個の位置に、新たにライゲートされた伸長プローブを検出する（例えば、画像化によって）目的のために、シグナルが、配列決定中に各集団から取得され得るように存在する。本発明のある一部の実施形態において、２つ以上の異なるクローン性の集団が単一の核酸断片から増幅され、半固相支持体内の別個の位置に混合物として存在する。混合物中のクローン性の集団の各々は、例えば、別個の位置に５’タグを含有する断片および３’タグを含有する断片が含まれるようにタグを含み得る。５’タグおよび３’タグを含むクローン鋳型は異なる配列決定プライマーを含み、その結果、これらは、互いに独立して配列決定され得る。このアプローチは、多数の実質的に同一の核酸の集団を微粒子上に生成させ、単一の微粒子から１対のタグの両方のメンバーの配列決定情報得るための上記のアプローチ同一である。
【０１２９】
一般に、任意の本発明の方法における使用のための半固相支持体は、約１００ミクロン以下の厚さ、例えば約５０ミクロン厚以下、例えば約２０〜４０ミクロン厚（両端を含む）の層を形成したものである。カバースリップまたは実質的に平面状の表面を有する他の類似した物体を、半固相支持体材料の上に、好ましくは重合前に配設し得、均一なゲル層の作製、例えば、実質的に平面状および／または実質的に均一な厚さのゲル層の作製が補助される。
【０１３０】
また本発明の他の実施形態において、上記の方法に対し、鋳型が、自身に結合された適当な増幅プライマーを有する微粒子上でのＰＣＲによって合成され、該微粒子が鋳型合成前に半固相支持体内または該支持体上に固定化される、すなわち、これらは、完全または部分的に半固相支持体内に包埋される変形法が使用される。一般的に、微粒子は半固相支持体材料に完全に囲まれるが、基材上に載っていてもその下方にあってもよい。したがって、微粒子は、半固相支持体が破壊されな限り、互いに対して実質的に固定された位置に維持される。このアプローチは、空間的に局在化されるクローン鋳型の集団を生成させるためのエマルジョンの使用別の代替法を提供する。微粒子は、半固相支持体の形成前に液体と混合してもよい。あるいはまた、微粒子を、実質的に平面状の基材上でアレイ状にし、重合、架橋などの前に液体を微粒子アレイに添加してもよい。微粒子は、自身に結合された第１の増幅プライマーを有する。第２の増幅プライマーは、半固相支持体に結合されたものであり得るが、そうである必要はない。さらなる試薬（例えば、鋳型、第２の増幅プライマー、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、補因子など）を、半固相支持体の形成前に存在させてもよく（例えば、ゲル形成前に液体中）、またはこれらの試薬の１種類以上をゲル形成後に半固相支持体中に拡散させてもよい。半固形基材は、一般的に、上記のようにして例えばガラススライド上に形成される。
【０１３１】
本発明のある特定の実施形態において、ゲルは、鋳型合成後に、クローン鋳型集団が結合された微粒子が簡便に回収され得るように（例えば、磁気粒子の場合は磁石の使用によって）、可溶化（例えば、消化または解重合または溶解）させ得る。可溶化、消化、解重合、溶解させなどさせ得るゲルを、本明細書において「可逆的」という。慣用的なポリアクリルアミド重合は、Ｎ−Ｎ’メチレンビスアクリルアミド（ＢＩＳ）を架橋剤と、重合を開始させる適当な触媒（例えば、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ））と一緒に使用する。可逆的ゲルを作製するため、代替的な架橋剤、例えば、Ｎ−Ｎ’ジアリル酒石酸ジアミド（ＤＡＴＤ）などが使用され得る。この化合物は、ＢＩＳに構造的に類似しているが、過ヨウ素酸によって（例えば、過ヨウ素酸ナトリウムを含有する溶液中）切断され得るシス−ジオール基を有する（Ａｎｋｅｒ，  Ｈ．Ｓ．：Ｆ．Ｅ．Ｂ．Ｓ．Ｌｅｔｔ．，  ７：２９３，１９７０）。したがって、ＤＡＴＤゲルは、容易に可溶化され得る。架橋剤としてＤＡＴＤを用いて作製されたゲルは、高度に透明であり、ガラスに良好に結合する。可逆的ゲルを形成するＤＡＴＤ様特性を有する別の架橋剤は、エチレンジアクリレートである（Ｃｈｏｕｌｅｓ，  Ｇ．Ｌ．およびＺｉｍｍ，  Ｂ．Ｓ．：Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３：３３６−３３９，１９６５）。Ｎ，Ｎ’−ビスアクリリルシスタミン（ＢＡＣ）は、可逆的ポリアクリルアミドゲルを形成するために使用され得る別の架橋剤である。過ヨウ素酸塩に溶解されるゲルを形成するために使用され得る別の架橋剤はＮ，Ｎ’−（１，２−ジヒドロキシエチレン）ビス−アクリルアミド（ＤＨＥＢＡ）である。可逆的半固相支持体を形成する任意のさまざまな他の材料もまた使用され得る。例えば、熱可逆的ポリマー、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（ＢＡＳＦから入手可能）  などが使用され得る。Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓは、ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロックコポリマーのファミリーの１つである（Ｎａｃｅ，  Ｖ．Ｍ．ら、Ｎｏｎｉｏｎｉｃ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ，  Ｍａｒｃｅｌ−Ｄｅｋｋｅｒ，  ＮＹ，１９９６）。これらの材料は、高温（例えば、室温より高い温度）で半固形（ゲル）になり、冷却すると液化する。種々の方法が、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓを化学的に誘導体化し、例えば、プライマーとの結合を助長するために使用され得る（例えば、Ｎｅｆｆ，  Ｊ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，４０：５１１，１９９８；Ｐｒｕｄ’ｈｏｍｍｅ，  ＲＫら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ，１２：４６５１，１９９６を参照）。
【０１３２】
可溶化後、微粒子を回収し、伸長、ライゲーションおよび切断の反復サイクルを用いた配列決定に供し得る。配列決定前に、微粒子を第２の半固相支持体内または該支持体上に、例えば、第１の半固相支持体内または該支持体上に存在したときより高い密度でアレイ状にしてもよい。半固相支持体は、典型的には、それ自体が、実質的に平面状で剛性の基材、例えばガラススライドによって支持されている。
【０１３３】
したがって、２つの一般的なアプローチは、半固相支持体内または該支持体上に包埋されたクローン鋳型集団を担持する微粒子のアレイを有する半固相支持体を作製するために使用され得る。第１のアプローチは、半固相支持体内に存在しない微粒子上で増幅を行ない（例えば、エマルジョン系ＰＣＲによって）、次いで、微粒子を半固相支持体内または該支持体上に固定化することを伴う。第２の一般的なアプローチは、微粒子を半固相支持体内または該支持体上に固定化し、次いで、増幅を行なうことを伴う。いずれの場合も、微粒子の凝集を低減させるため、および／または微粒子を実質的に単一の焦点面に整列させるための手順を用いることが望ましいことがあり得る。例えば、粒子をポリアクリルアミドゲル内に固定化させる場合、モノマーおよび架橋剤の濃度は、重合が完了する前に粒子が溶液の底面に沈降し、その結果、下方の平面状の基材上に沈殿し、したがって、単一の平面状に整列するように選択される。本発明のある特定の実施形態において、カバースリップなどの実質的に平面状の表面を有する物体を、微粒子を含有する液状アクリルアミド（または半固相支持体を形成できる他の材料）の上面に配置し、アクリルアミドが２つの層間に捕捉され「サンドイッチ」構造となるようにする。次いで、該サンドイッチを裏返し、重力の作用によって、微粒子が下方に沈降し、カバースリップ（実質的に平面状の表面を有する他の物体）上に堆積するようにする。重合後、カバースリップを取り除く。したがって、微粒子は、実質的に単一の平面状に半固相支持体の表面に近接して（例えば、表面に接して（ｔａｎｇｅｎｔ））包埋される。
【０１３４】
上記のように微粒子などの支持体を半固形マトリックス内に固定化するのではなく、本発明のある特定の実施形態では、微粒子を、固定化のための半固相支持体を使用することなく、共有結合または非共有結合のいずれかで実質的に平面状で剛性の基材に結合させ、それによって「ゲル非含有」または「ゲル無し」微粒子アレイをもたらす。微粒子を基材、例えば、ガラス、プラスチック、石英、シリコンなどなどに結合させるためのさまざまな方法が、当該技術分野で知られている。基材は、コーティングされたものであってもそうでなくてもよく（例えば、スピンコーティング）、または結合を助長する材料（例えば、任意のさまざまなポリマー）もしくは薬剤により官能性付与させたものであってもよい。コーティングは、薄膜、自己組織型単層などであり得る。微粒子、微粒子に付着した部分、または微粒子に付着したオリゴヌクレオチド（例えば、鋳型）のいずれかを基材に付着させることができる。本発明のある実施形態において、基材はシラン化剤で処理されず、あるいはそのように処理されたとしても、その処理は有効なシラン化をもたらさず、すなわち例えば、本明細書に記載のライゲーションに基づく配列決定を複数回繰り返す時に行われるような、その後の操作および／または流体との接触に対して安定した形で、平坦なガラス表面上のポリアクリルアミド層により固定された微粒子のアレイを形成するように、シラン化が有効に作用しない。この文脈において「安定」とは、一般的に、操作および／または流体との接触時にゲルが基材に固着したまま維持され、著しい屈曲や、脱離、離層を生じないことを意味する。本発明者等は、微粒子アレイの作成にゲルなどの半固形培地の使用を避けることにより、多くの利点が得られることを認識した。例えば、（ｉ）半固形培地の非存在下では、試薬の拡散がより早くなり、かつライゲーションされていないプローブや酵素などの望ましくない種の除去もより早くなり、（ｉｉ）有効なシラン化が行われなければ、アクリルアミドなどのゲルが基材に安定して固着される状態が維持されず、（ｉｉｉ）重合は酸素などの環境特性に敏感であることから、重合手順を排除することで、アレイ生成プロセスにおける不均一性の潜在的な原因が除去され、（ｉｖ）半固形培地を使用しないことで、一つの焦点面により多くの微粒子が収まるようになり、（ｖ）微粒子は、基材に付着した場合の方が、半固形培地（特に重合が損なわれるもの）に埋め込まれた場合よりも、適切な位置により安定して固着される。
【０１３５】
一般的に、当該技術分野で既知の多様な方法のいずれを使用しても、このような核酸が微粒子あるいはその他の担体または基材に付着しやすくなるように、オリゴヌクレオチドプライマー、プローブ、鋳型などの核酸を修飾することができる。さらに、当該技術分野で既知の多様な方法のいずれを使用しても、核酸が付着しやすくなるように微粒子またはその他の担体を修飾して、担体や基材などに微粒子が付着しやすくなるようにすることができる。所望の官能基が付着しやすくなるような界面化学物質を有するミクロスフェアが使用可能である。これらの界面化学物質のいくつかの例には、アミノ基（例えば、脂肪族および芳香族アミン）、カルボン酸、アルデヒド、アミド、クロロメチル基、ヒドラジド、ヒドロキシル基、スルホン酸塩、および硫酸塩が含まれるが、これらに限定されない。これらの基は核酸中に存在する基と反応する場合があり、あるいは核酸が反応基の付着によって修飾される場合もある。さらに、ホモ二官能性およびヘテロ二官能性リンカーを含めた多くの安定した二官能基も当該技術分野で周知である。例えば、ＵＲＬ：ｗｗｗ．ｐｉｅｒｃｅｎｅｔ．ｃｏｍのウェブサイトで閲覧可能なＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ（１９９４−９５  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇに最初に公開）、およびＧ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９６を参照されたい。また、米国特許第６，６３２，６５５号も参照されたい。
【０１３６】
一般に、結合ペアを形成するように互いに対して親和性を示す任意の対の分子が、微粒子または鋳型を基材に結合させるために使用され得る。結合ペアの第１のメンバーを共有結合または非共有結合により基材に結合させ、結合ペアの第２のメンバーを共有結合または非共有結合により微粒子または鋳型に結合させる。説明上、結合対の第１のメンバー、すなわち基材に付着した結合パートナーは、本明細書でＢＰ１と呼び、結合対の第２のメンバー、すなわち微粒子または鋳型に付着した結合パートナーは、（ＢＰ２）と呼ぶ。第１の結合パートナー（ＢＰ１）をリンカーによって基材に結合させてもよい。第２の結合パートナー（ＢＰ２）をリンカーによって微粒子または鋳型に結合させてもよい。例えば、アプローチの一例によれば、スライドまたは他の適当な基質をアミン反応性基（例えば、アミン反応性基を含有するＰＥＧリンカーを使用）で修飾する。アミン反応性基は、水性条件で（例えば、ｐＨ８．０で）任意のタンパク質（例えば、ストレプトアビジン）中のアミン（例えば、リシン）と反応する。したがって、アミンを担持する部分により官能性付与させた微粒子は、基材上に固定化された状態になる。アミン担持する部分は、タンパク質または適当に官能性付与された核酸、例えば、ＤＮＡ鋳型であり得る。多数の部分がビーズに結合され得る。例えば、ビーズは、ＮＨＳエステルと反応してビーズを基材に結合させる自身に結合されたタンパク質を有し得、また、ＤＮＡ自身に結合された鋳型を有し得、これは、ビーズが基材に結合された後、配列決定され得る。アミン反応性ＮＨＳ部分を一方の末端に有するポリマーテザー（ｔｅｔｈｅｒ）  を担持する適当にコーティングされスライドは、例えば、Ｓｃｈｏｔｔ  Ｎｅｘｔｅｒｉｏｎ，  Ｓｃｈｏｔｔ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ，  Ｉｎｃ．，  Ｅｌｍｓｆｏｒｄ，  ＮＹ  １０５２３から市販されている。あるいはまた、コーティングされたスライド（例えば、ビオチン−コートスライド）が、Ａｃｃｅｌｒ８  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｄｅｎｖｅｒ，  ＣＯから市販されている。そのＯｐｔｉＣｈｅｍＴＭ技術は、基材への微粒子の結合方法の代表であるが一例である。例えば、米国特許第６，８４４，０２８号を参照のこと。あるいはまた、微粒子は基材に、ビーズ上のポリヌクレオチドをビオチンにより官能性付与し（例えば、末端トランスフェラーゼとビオチン−ジデオキシＡＴＰおよび／またはビオチン−デオキシＡＴＰの使用によって）、次いで、これをストレプトアビジン−コーティングされたスライドのような基材（例えば、Ａｃｃｅｌｒ８  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｄｅｎｖｅｒ，  ＣＯから入手可能）（米国特許第６，８４４，０２８号を参照のこと）と、ビオチン−ストレプトアビジン結合の形成を促進する条件下で接触させることにより結合させ得る。一実施形態において、ストレプトアビジンは、ＰＥＧリンカーを使用して基材に付着する。一実施形態において、微粒子結合ポリヌクレオチドは、合成後にビオチンで官能基化される。別の実施形態において、ビオチンは、例えばエマルジョンＰＣＲを実施する時などの増幅時に、ビオチン化プライマーを使用することに��り、合成時にポリヌクレオチドに組み込まれる。例えば、第１のプライマーＰ１は、微粒子に共有結合的にまたは非共有結合的に付着する。微粒子に結合していない第２のプライマーＰ２はビオチン部分を含み、したがって、得られるＰＣＲ産物はビオチンを含む。
【０１３７】
そのため、本発明は、核酸鋳型が付着した微粒子を捕捉し、基材（例えば、ガラススライドなどの実質的に平面状で剛性の基材）の表面に、それらの微粒子を繋ぐ方法を提供する。特に興味深い実施形態においては、鋳型の種々のクローン群が付着した微粒子の群が作成され（例えば、エマルジョンＰＣＲを使用して）、鋳型がビオチン部分を含む。ビオチンは、増幅後に標準的な方法を使用して鋳型に付着する場合がある。次に、微粒子は、ビオチン結合部分（例えば、ストレプトアビジンなどのビオチン結合性タンパク質）が付着したガラススライドなど、実質的に平面状で剛性の基材と接触する。鋳型分子上のビオチンは、ビオチン結合部分に結合し、それによってビオチンおよびビオチン結合性タンパク質を含む連結を介して、微粒子を基材に付着させる。したがって、微粒子の基材への付着は、鋳型がテザーの役割を果たす間接的なものである場合がある。一実施形態において、鋳型分子の一端は、ビーズに付着したビオチン結合部分に付着し、鋳型分子の他端は、基材に付着したビオチン結合部分に付着する。
【０１３８】
ある実施形態において、一本鎖鋳型の一方の末端は微粒子に付着し、一本鎖鋳型の他方の末端は基材に付着する。したがって、一実施形態においては、一本鎖鋳型の３’および５’の両末端が、微粒子を基材に付着させる役割を果たす連結に関与し、第１の連結は微粒子と鋳型の間にあり、第２の連結は鋳型と基材との間にある。得られる構造は、ハイブリダイズした核酸が解離しやすくなる傾向があるとされる熱や他の条件に対しても安定している。
【０１３９】
実施例１６に記載の通り、ストレプトアビジンでコーティングされた微粒子に付着した鋳型は、合成後のエマルジョンＰＣＲ時にビオチン化することができ、得られるビオチン化した鋳型は、ストレプトアビジンでコーティングされた基材に効率的かつ強固に結合することが発見されている。一実施形態において、ビオチンとストレプトアビジンの連結は、本方法において以下の２つの段階で使用される：（ｉ）鋳型の増幅前に（例えば、エマルジョンＰＣＲ前に）、ビオチン化プライマーをストレプトアビジンでコーティングされた微粒子に付着させる；（ｉｉ）増幅後、自由端（微粒子に付着していない端部）がビオチン化された微粒子結合鋳型をストレプトアビジンでコーティングされた基材に付着させ、それによって微粒子も基材に固定する。場合により、手順（ｉ）の後、エマルジョンＰＣＲ（またはその他の増幅方法）を行った微粒子群において、増幅された微粒子を濃縮することもできる。手順（ｉｉ）の前、そして場合により濃縮の後には、ストレプトアビジンを露出した微粒子表面の部分を被覆するために、微粒子をビオチン化オリゴヌクレオチドとともにインキュベートすることもできる。これらの方法により、半固形培地を必要とすることなく、基材の表面に安定して付着した微粒子のアレイをもたらされる。特に興味深い実施形態において、基材は、ガラススライドなどの実質的に平面状で剛性の基材である。本明細書ではビオチンとストレプトアビジンの相互作用が例示されているが、ストレプトアビジンは、ビオチンに結合するいくつかのタンパク質の内の１つにすぎず、これらのタンパク質はいずれも本発明で使用できることが理解される。例えば、アビジンは卵白タンパク質であり、細菌性ストレプトアビジンのように、高い親和性と選択性を持ってビオチンに結合する。ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎは、炭水化物を除去する処理を行ったアビジンの誘導体である。ＣａｐｔＡｖｉｄｉｎは、ｐＨ９を超えるビオチン化分子に対する親和性を減少させたアビジンの誘導体である。したがって、ビオチン化分子は、中性のｐＨで結合させることができ、約ｐＨ１０で解放することができる。ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎおよびＣａｐｔＡｖｉｄｉｎについては、オンライン版のＴｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｂｅｓ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｈａｎｄｂｏｏｋ／ｓｅｃｔｉｏｎｓ／０７０６．ｈｔｍｌ；２００６年４月１７日閲覧）に記載されており、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（米国カリフォルニア州カールズバッド）から入手することができる。さらに、本発明は、特異的かつ高親和性の相互作用を示すいずれかの分子対の使用を包含する。例えば、特異的結合対のメンバーは、抗体と抗原、受容体と受容体リガンド（例えば、小分子またはペプチド）、金属と金属結合剤（例えば、Ｎｉ＋と６ＸＨｉｓタグ）などであると考えられる。本発明は、上述のいずれかの方法を使用して基材に付着した微粒子を提供し、さらに、種々の鋳型が付着している、基材に付着した微粒子を含むアレイも提供する。
【０１４０】
本発明のある実施形態において、ゲル非含有微粒子アレイの形成は、鋳型の複数の複製が付着した（例えば、鋳型の少なくとも数千、典型的には数百万の複製が付着した）微粒子を、鋳型の複数の複製が付着していない微粒子から分離する役割を果たす。一実施形態において、基材には第１の結合パートナー（ＢＰ１）が付着し、微粒子に付着した鋳型分子は第２の結合パートナー（ＢＰ２）を含み、ＢＰ１とＢＰ２は互いに特異的に結合し、すなわち、これらは特異的結合対のメンバーである。上述のようにゲル非含有微粒子アレイが形成されると、ＢＰ２が付着した鋳型を有する微粒子のみが基材に付着することになる。別の実施形態において、基材には第１の反応部分（Ｒ１）が付着しており、微粒子に付着した鋳型分子は第２の反応部分（Ｒ２）を含み、Ｒ１とＲ２は互いに反応して、共有結合を形成する。上述のようにゲル非含有微粒子アレイが形成されると、ＢＰ２またはＲ２が付着した鋳型を有する微粒子のみが基材に付着することになる。結合または反応させた後、付着していない微粒子は、例えば軽い攪拌および／または洗浄によって除去することができる。本方法は、典型的には、鋳型の種々のクローン群が付着した微粒子を含み、また鋳型の複数の複製が付着していない微粒子も含む、微粒子群に適用される。例えば、本方法は、鋳型の増幅が行われた（例えば、エマルジョンＰＣＲ時に）微粒子を、実質的な鋳型増幅が行われていない微粒子から分離させるために使用される場合がある。一実施形態において、本方法は以下の手順を含む：（ｉ）特異的結合対の第１のメンバーまたは反応部分が付着した基材を提供する（ｉｉ）（結合対のメンバー間、あるいは反応部分間で）結合を行うのに好適な条件下で、特異的結合対の第２のメンバーまたは反応部分が付着した鋳型の複数の複製を少なくともいくつか有する微粒子群と、基材を接触させる；（ｉｉｉ）非結合微粒子を除去する。強い非共有結合連結を形成する特異的結合パートナー（例えば、ストレプトアビジンとビオチン）は、濃縮を達成するのに特に興味深い。別の実施形態において、相補性オリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーションが使用される。例えば、一実施形態においては、エマルジョンＰＣＲ時に鋳型に組み込まれる遊離ＰＣＲプライマー（遊離ＰＣＲプライマーとは、微粒子に付着していないプライマーである）の一部と相補的であるように選択されるオリゴヌクレオチドが、基材に付着する。遊離ＰＣＲプライマーは、増幅が成功した場合にのみ微粒子上に存在するため、鋳型増幅に成功した微粒子のみが基材に付着する。リガーゼを使用して、ハイブリダイゼーション事象の品質を確認し、ビオチン化スプリントまたはプライマーをビーズ上の鋳型の３’端に共有結合的に結合させる場合もある。例えば、以下の一連の手順を実施することができるが、これらの手順において、「ビーズ」とは微粒子を表し、Ｐ２とは増幅プライマー配列の少なくとも一部を表し、「ｄｓ」とは「二本鎖」を意味し、「アレイ」とは、増幅に成功した微粒子がビオチンを介して付着することができる基材を指す。二本鎖鋳型が付着した微粒子が提供される。第１の手順では、例えば温度を上昇させることによって、非結合鋳型が除去される。第２の手順では、一本鎖伸長物を有する二本鎖核酸が、鋳型にハイブリダイズされる。二本鎖核酸は、ビオチンを鋳型に安定して結合させることができるブリッジまたはスプリントの役割を果たす。一本鎖伸長物を有さない二本鎖核酸の鎖は、一本鎖伸長物とは反対の末端にビオチン部分が付着している。第３の手順では、リガーゼが存在する。ビオチンを含む二本鎖核酸は、ハイブリダイゼーションに成功した場合に鋳型にライゲーションされ、それによってビオチンを鋳型に安定して結合させる。第４の手順では、鋳型にライゲーションされなかったスプリントの鎖が、例えば温度を上昇させることによって解放される。ビオチンと、基材または担体に結合したストレプトアビジンとの相互作用によって、微粒子のアレイが作成される。
【数１】
2009538123.tif 000002
本方法は、複数の鋳型が付着した微粒子を、複数の鋳型が付着していない、あるいは実質的により少ない鋳型が付着した微粒子から分離させるために使用することができ、これらの鋳型は増幅または合成後に微粒子に付着する。分離させる微粒子は、微粒子結合鋳型の増幅または合成を行うか、あるいは増幅された鋳型の複数の複製が微粒子に付着することができるいずれかの種類の条件にさらされている場合がある。増幅方法は、ＰＣＲ増幅、ローリングサークル増幅、またはその他いずれかの種類の核酸増幅である場合がある。本方法は、本発明の他の方法および組成物のいずれかと組み合わせる、および／または併用することができる。接触手順は、典型的には液体培地内で行われる。本発明のある実施形態において、接触手順では、微粒子を含有する液体を、特異的結合対または反応部分が付着した基材に流す。基材は、例えば、流体入口と流体出口とを有するフローセルなどのチャンバー内に配置される場合がある。微粒子は、基材に付着した微粒子の所望の密度または数に達するまで、基材を流す場合がある。一定期間、密度または数の変化を監視する場合もある（例えば、画像化による）。特に興味深い実施形態において、本方法は、エマルジョンＰＣＲ時に増幅が行われた微粒子を、エマルジョンＰＣＲ時に実質的な鋳型の増幅が行われなかった微粒子から分離させるために使用される。本方法では、鋳型の増幅が行われた微粒子を濃縮する。基材に結合した微粒子に付着した鋳型には、種々のさらなる反応または操作を行うことができる。これらは、例えば、本明細書に記載のようなライゲーションに基づく配列決定、またはＦＩＳＳＥＱやパイロシーケンシングなどの他の配列決定法などの配列決定であってよい。例えば、半固形培地を使用せずに、および／または半固形培地の非存在下で、基材に付着した微粒子に付着した鋳型に対して、本明細書に記載の本発明の配列法のいずれも実施することができる。
【０１４１】
微粒子が基材または半固形培地に付着する本発明の実施形態のいずれにおいても、微粒子はその後に解放し、場合により除去することができる（例えば、洗浄による）。微粒子を解放するのに適切な方法は、微粒子が基材または半固形培地に付着する上で介する特定の共有結合または非共有結合連結によって異なる。ＤＮＡ鋳型を実質的に損傷しない限り、あるいは基材または半固形培地からＤＮＡ鋳型を解放しない限り、いずれの好適な方法も使用することができる。例えば、一実施形態において、微粒子は、例えばジスルフィドまたはエステル連結を含有するリンカーなどの開裂可能なリンカーによって基材または半固形培地に付着する。
【０１４２】
本発明のある実施形態において、微粒子は、半固形培地に安定して付着した鋳型のクローン群のアレイを作成するために使用される。本方法では、１つ以上の鋳型分子が付着した微粒子が、例えば実質的に平面状で剛性の基材上に位置するポリアクリルアミドゲルなど、基材上に位置する半固形培地の存在下でインキュベートされ、半固形培地に固定したおよび／または付着したプライマーに鋳型がハイブリダイズされる。次にプライマーが伸長され（例えば、ＤＮＡポリメラーゼを使用）、半固形培地に付着したまたは固定した相補性鋳型の合成を生じる。微粒子は、例えばインキュベーションのストリンジェンシーを上昇させることによって（例えば、温度を上昇させることによって）解放され、それによって２本の相補性鋳型鎖が分離する。例えば、微粒子に付着した鋳型を開裂させることによって、あるいは微粒子を鋳型から脱離させることによって、微粒子を解放する代替の方法を使用することもできると考えられる。
【０１４３】
本プロセスは、微粒子結合鋳型の複製または「インプリント」を半固形培地に転写する。本プロセスの効率は、微粒子から半固形培地に複製した鋳型分子の数を、微粒子に付着した鋳型分子の数で除算したものとして定義される場合がある。幾何学的および物理的考察に基づくと、決して本発明を限定するものではないが、２００ｂｐのサイズの鋳型分子約１５０，０００個が付着した直径１μｍの微粒子は、図４０に示す通り、直径約５００ｎｍの接触パッチを有する場合がある。接触パッチは、半固形培地または基材の中または上に位置するプライマーを伸長することによって、微粒子に付着したものと相補的な鋳型を合成できるように、培地の表面上に位置するかあるいは培地に部分的に埋め込んだ微粒子に十分に近接している、半固形培地または基材の領域を指す。具体的には、直径１ミクロンのビーズは、３．１×１０６ｎｍ２の面積を有し、したがってビーズ上の１５０，０００個のＤＮＡ分子は、平均面積２０．９ｎｍ２または平均距離４．５７ｎｍとなる。Ｂ−ＤＮＡの直径は約１．９ｎｍであり、２００ｂｐのＢ−ＤＮＡの長さは６８ｎｍである。したがって、６８ｎｍの分離点までの１ミクロンビーズの接触パッチは、半径２５２ｎｍまたは面積１９９，０００ｎｍ２である。ＤＮＡ分子１個当たり２０．９ｎｍ２で、パッチは９，５００個もの分子、またはビーズの下半分上の分子の数の約１３％を含有すると予想される。
【０１４４】
場合により、半固形培地と連結したままの鋳型の増幅が１回以上行われる。一実施形態において、増幅はローリングサークル増幅（ＲＣＡ；米国特許第５，８５４，０３３号；第６，１４３，４９５号）である。ＲＣＡを行う前に、（ｉ）鋳型の２つの非近接領域への環状化可能プローブ（「パドロックプローブ」）のハイブリダイゼーション、（ｉｉ）ポリメラーゼを使用した、発生したギャップの充填、（ｉｉｉ）末端のライゲーション、を含む手順が行われる場合がある。ＲＣＡで使用する鋳型分子は、配列決定する部分だけでなく、環状化可能なプローブと相補的な領域も含まなければならないことが理解される。
【０１４５】
プライマー伸長と場合による増幅によって、半固形培地に付着または固定した、「スポット」のアレイまたは核酸「コロニー」がもたらされる。コロニーは、微粒子を沈着した位置に対応する場所に位置する。コロニーの多くまたはほとんどは、鋳型の単一のクローン群、あるいは本発明のある実施形態においては、鋳型の２つまたは数個までのクローン群（微粒子に複数種類の鋳型が付着していた場合）から構成される。類似の手法を使用して、プライマーを、基材上に位置する半固形培地ではなく、基材自体に付着させることによって、半固形培地を使用することなく、ガラススライドなどの基材上に核酸コロニーのアレイを直接作成することもできると考えられる。
【０１４６】
いかなる理論にも拘束されるものではないが、上述のように微粒子を使用して核酸コロニーのアレイを形成することで、多くの利点が得られる。微粒子は、アレイを形成するために使用する前に、鋳型の増幅を行うことができ、場合により濃縮も行うことができ、それによって各核酸スポットは、単一の鋳型の増幅によってではなく、単一の微粒子に由来する鋳型の複数の複製の増幅によって生じることになる。さらに、半固形培地の表面上に互いに対して近接して配置できる微粒子を使用することで、半固形培地の表面の効果的な使用が可能になるとともに、検出時に互いに容易に区別できる離散したスポットももたらされる。スポットは、典型的には微粒子よりもサイズが小さく、互いにより明確に区別できるようになる。例えば、粒子と平坦な表面との接点の２５０ｎｍ以内に位置する直径１ミクロンの粒子上のＤＮＡが、平坦な表面に付着し、複製される場合には、粒子が解放された後に、直径５００ｎｍのＤＮＡパッチが表面にできることになる。１ミクロンのビーズ２つが接している場合には、あとにできるＤＮＡパッチの中心が１ミクロン離れており、各パッチの最も近い端部の間に５００ｎｍの空間ができる。ガラススライドなどの小さな基材の表面上に数百万の微粒子を充填する能力により、本プロセスは、近隣のコロニーに干渉されずに容易に画像化でき、また複数の配列決定サイクルにわたって簡単かつ信頼性の高い検出が可能となる十分な数の鋳型分子を含有する、鋳型コロニーの高密度アレイを実現する効率的な手段を提供する。
【０１４７】
基材に結合した微粒子に付着した鋳型には、種々のさらなる反応または操作を行うことができる。これは、例えば、本明細書に記載のようなライゲーションに基づく配列決定、またはＦＩＳＳＥＱやパイロシーケンシングなどの他の配列決定方法などの配列決定であってよい。例えば、上述のように微粒子を使用して形成される、半固形培地内の核酸コロニーに存在する鋳型に対して、本明細書に記載の本発明の配列法のいずれも実施することができる。
【０１４８】
本明細書に記載の方法に従って形成される微粒子または核酸コロニーのアレイは、一般的にランダムであり得る。本明細書で用いる場合、用語「ランダムパターンの」または「ランダム」は、不規則な非Ｃａｒｔｅｓｉａｎ分布（換言すると、格子のｘ軸およびｙ軸に沿った所定の点もしくは位置、または放射状パターンの中心からの角度もしくは半径の規定の「時計位置」で整列していない）支持体上での正体（特徴）であって、意図的な設計（もしくはかかる設計が達成され得るプログラム）または個々の正体の配置によって得られないものをいう。かかる「ランダムパターンの」または「ランダム」アレイの正体は、正体のプールを含む溶液、エマルジョン、エーロゾル、気体状のまたは乾燥した調製物を、支持体上または支持体内に滴下、噴霧、めっき、塗布、分布などさせ、支持体内または支持体上の特定の部位に指向させるなんらかの様式の介在なく支持体上または支持体内に沈降させることにより得られ得る。例えば、正体は、半固相支持体の前駆物質（例えば、アクリルアミドモノマー）を含有する溶液中に懸濁させ得る。次いで、この溶液を、第２の支持体上に分布させ、半固相支持体を第２の支持体上に形成させる。正体は、半固相支持体内または該支持体上に包埋される。もちろん、非ランダムアレイもまた使用され得る。微粒子の密接な充填は、規則正しいグリッド様のアレイの微粒子またはそれから合成される核酸コロニーをもたらし得る。一般的に、本明細書において使用されるアレイを形成するための方法は、例えば、ポリヌクレオチドの合成が、基質上の予め規定された位置の個々のヌクレオチドサブユニットの逐次適用によって行なわれる方法と異なる。
【０１４９】
図１４Ｂ（上）は、その上面にポリアクリルアミドゲルを有するスライド（１インチ×３インチ）の蛍光画像を示す。ビーズに結合させた鋳型にハイブリダイズされた蛍光標識されたオリゴヌクレオチドを有するビーズ（１ミクロン直径）は、ゲル内に固定化されている。この画像は、およそ２８０００００００ビーズ／スライドの画像化に充分なビーズ表面密度（すなわち、ビーズが位置する領域内の基材の単位面積あたりのビーズの数）を示す。表面密度および画像化可能な領域は、単一のスライド上で少なくとも５００００００００ビーズの画像化に充分である。例えば、図１４Ｂ（下）は、ビーズが半固相支持体層内に包埋されるポリアクリルアミドゲルなどの透明な領域を覆うテフロン（登録商標）マスクを有するスライドの概略図を示す。このマスクの面積は８６４ｍｍ２である。５００００００００個のビーズで、表面密度は５７８，０００ビーズ／ｍｍ２である。１ミクロンビーズの最密六方アレイでは１，１５５，０００ビーズ／ｍｍ２となるため、この実施形態は、理論最大密度の５２％を有するアレイをもたらす。この特定の実施形態より少数およびより多数のビーズ、およびより大きいかより小さいビーズ表面密度が使用され得ることは認識されよう。
【０１５０】
微粒子は、実質的に平面状の半固相支持体内もしくは該支持体上で、または別の支持体もしくは基材上で、いくつかの様式で規定され得るさまざまな密度でアレイ状であり得る。例えば、密度は、実質的に平面状のアレイの単位面積あたりの微粒子の数（例えば、球状微粒子）に関して表示され得る。本発明のある特定の実施形態において、実質的に平面状のアレイの単位面積あたりの微粒子の数は、六方アレイ内の微粒子の数の少なくとも８０％である。（「六方アレイ」により、米国特許第６，４０６，８４８号に記載のようなアレイ内のどの微粒子も少なくとも６個の他の隣接微粒子と等しい面積で接触している微粒子の実質的に平面状のアレイが意図される）。しかしながら、本発明の他の実施形態において、微粒子密度は低く、例えば、実質的に平面状のアレイの単位面積あたりの微粒子の数は、六方アレイ内の微粒子の数の８０％未満、７０％未満、６０％未満または５０％未満である。なんら理論に拘束されることを望まないが、例えば、酵素、プライマー、補因子などの試薬の充分な拡散を可能にするため、およびある種の試薬が微粒子に対して異なる親和性を有するか、その内部の捕捉された場合に起こり得る試薬分配効果を回避するため、これらなどより小さい密度を用いることが好ましいこと場合があり得る。かかる効果は、アレイ上の異なる位置で異なる反応条件をもたらし得、これらの試薬がアレイ上のある特定の位置に接近するのを妨げることすらあり得る。このような問題は、反応がフローセル内で行なわれる場合、試薬がフローセル内を方向的に移動するため、悪化し得る。本発明のある特定の実施形態において、混合装置、例えば、機械的または音波的手段によって液体混合を行なう装置をフローセルのチャンバ内に含める。いくつかの適当な混合装置が、当該技術分野で知られている。
【０１５１】
本発明の配列決定法は、あらゆる型（例えば、ランダムおよび非ランダム両方のアレイ）のアレイ形式に整列させた鋳型を用いて行なわれ、アレイは、微粒子のアレイまたは鋳型自体のアレイであり得る。例えば、その上面にアレイ状の鋳型を有する支持体は、米国特許第５，６４１，６５８号およびＰＣＴ公開公報ＷＯ００１８９５７に記載されている。アレイは、広範なさまざまな基材、例えば、フィルター、膜（例えば、ナイロン）、金属表面などの上に配置させ得る。その上面で伸長、ライゲーションおよび切断の反復サイクルによる配列決定が行なわれ得るアレイ形式のさらなる例は、ウェル内で光ファイバーの束の個々の光ファイバーの末端または遠位端に配置したビーズのアレイである。例えば、ＵＳ公開公報および特許、例えば、６，０２３，５４０；６，４２９，０２７、２００４０１８５４８３、２００２１８７５１５、ＰＣＴ出願ＵＳ９８／０５０２５およびＰＣＴ  ＵＳ９８／０９１６３ならびにＰＣＴ公開公報ＷＯ００３９５８７に記載されたビーズアレイおよび「アレイのアレイ」を参照のこと。自身に結合された鋳型を有するビーズは、本明細書に記載のようなアレイ状であり得る。増幅は、好ましくは、アレイの形成前に行なわれる。かかる基材上に形成されたアレイは、必ずしも実質的に平面状である必要はない。
【０１５２】
他の実施形態において、ＰＣＲは、基材または支持体に結合されたオリゴヌクレオチドを含むアレイ上で行なわれる（例えば、米国特許第５，７４４，３０５号；同第５，８００，９９２号；同第６，６４６，２４３号および関連特許（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）；ＰＣＴ公開公報ＷＯ２００４０２９５８６；ＷＯ０３０６５０３８；ＷＯ０３０４０４１０（Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ）  を参照）。一般に、かかるオリゴヌクレオチドは、遊離３’または５’末端を有する。所望の場合は、該末端は、例えば、リン酸基またはＯＨ基を３’末端に（既に存在しない場合）付加することにより修飾され得る。支持体または基材に結合されたオリゴヌクレオチドに相補的な領域を含む鋳型分子は、該オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされ、ＰＣＲがアレイ上でインサイチュで行なわれ、クローン鋳型集団がアレイ上の各位置にもたらされる。アレイに結合されたオリゴヌクレオチドは、増幅プライマーの１つとしての機能を果たし得る。次いで、鋳型を本明細書に記載のライゲーション系の方法を用いて配列決定する。配列決定はまた、Ｕ．Ｓ．公開公報２００３００６８６２９に記載のように、アレイ内の鋳型上で行なわれ得る。
【０１５３】
表面上へのＤＮＡアレイの作製のためのさらに他の方法が使用され得る。例えば、末端アルデヒド基で修飾されたアルカンチオールが、自己組織型単層（ＳＡＭ）を金表面上に作製するために使用され得る。該単層のアルデヒド基は、アミン修飾オリゴヌクレオチドまたは他のアミン担持生体分子と反応し、シッフ塩基を形成し得、次いで、これは、シアノ水素化ホウ素ナトリウムでの処理によって安定な第２級アミンに還元され得る（Ｐｅｅｌｅｎ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，  Ｌａｎｇｍｕｉｒ，  ２１（１）：２６６−７１，  ２００５）。次いで、鋳型のＰＣＲ増幅が行なわれ得る。あるいはまた、自身に結合された鋳型のクローン性の集団を有する微粒子を、微粒子または鋳型上のアミン基または粒子に結合されたオリゴヌクレオチドをかかる表面と反応させることによりにより表面に結合させ得る。
【０１５４】
自身に結合されたクローン鋳型集団を有する微粒子を得るさらに別の方法は、米国特許第５，６０４，０９７号に記載された「固相クローニング」アプローチであり、これは、同じ配列のポリヌクレオチドだけが任意の特定の微粒子に結合されるような、微粒子上のポリヌクレオチドを分取するためのオリゴヌクレオチドタグを利用する。
【０１５５】
本発明のある特定の実施形態において、伸長、ライゲーションおよび切断の反復サイクルによる配列決定は、配列決定試薬（例えば、伸長プローブ、リガーゼ、ホスファターゼなど）を支持体内または支持体上に固定化された鋳型のクローン性の集団を有する半固相支持体（例えば、ゲル）中に、各クローン性の集団が支持体の空間的に異なる領域に局在化されるように拡散させることによって行なわれる。ある特定の実施形態において、鋳型は、上記のように、半固相支持体に直接結合させる。しかしながら、他の実施形態では、代わりに半固相支持体内または該支持体上に固定化させた微粒子などの第２の支持体に、鋳型を固定化させる（これも上記のようのとおり）。
【０１５６】
実施例１に記載のように、本発明者らは、ロバスト（ｒｏｂｕｓｔ）なライゲーションおよび切断が、ポリアクリルアミドゲル内に固定化した鋳型結合ビーズ上で行なわれ得ることを示した。したがって、本発明は、（ａ）半固相支持体内または該支持体上に固定化された第１のポリヌクレオチドを提供する工程；（ｂ）第１のポリヌクレオチドを第２のポリヌクレオチドおよびリガーゼと接触させる工程；および（ｃ）第１および第２のポリヌクレオチドを、リガーゼの存在下ライゲーションに適した条件下で維持する工程を含む、第１のポリヌクレオチドを第２のポリヌクレオチドにライゲートさせる方法を提供する。好適な条件としては、使用される具体的なリガーゼに適切なバッファー、補因子、温度、時間などの提供が挙げられる。好ましい実施形態において、半固相支持体は、アクリルアミドゲルなどのゲルである。さらに好ましい実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、それ自体が、例えば、部分的または完全に包埋させることにより支持体マトリックス内に半固相支持体内または該支持体上に固定化されたビーズなどの支持体への結合の結果、半固相支持体内または該支持体上に固定化されている。あるいはまた、第１のポリヌクレオチドは、アクリダイト部分などの連結部によって半固相支持体に直接結合させ得る。連結は共有結合または非共有結合であり得る（例えば、ビオチン−アビジン相互作用による）。米国特許第６，５１１，８０３号には、核酸分子を本発明の好ましい支持体、すなわち、ポリアクリルアミドゲルに（ａ）結合させるために使用され得るさまざまな方法が記載されている。
【０１５７】
本発明は、さらに、（ａ）半固相支持体内または該支持体上に固定化され、切れやすい連結を含むポリヌクレオチドを提供する工程；（ｂ）該ポリヌクレオチドを切断剤と接触させる工程；および（ｃ）該ポリヌクレオチドを該切断剤の存在下、切断に適した条件下で維持する工程を含む、ポリヌクレオチドを切断する方法を提供する。好適な条件としては、特定の切断剤に適切なバッファー、温度、時間などの提供が挙げられる。好ましい実施形態において、半固相支持体は、アクリルアミドゲルなどのゲルである。さらに好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、それ自体が半固相支持体内に固定化されたビーズなどの支持体への結合の結果、半固相支持体に固定化されている。あるいはまた、ポリヌクレオチドは、アクリダイト部分などの連結部によって半固相支持体に直接結合させ得る。連結は共有結合または非共有結合であり得る（例えば、ビオチン−アビジン相互作用による）。当然ながら、本明細書に記載の多くの方法にしたがって調製されるＤＮＡ鋳型は、典型的には配列決定する領域を含有し、また３’端および５’端のいずれかまたは両方に保存プライミング領域も含有する（ＰＢＲ）。「保存」または「共通」領域とは、配列決定する種々の領域を含有する複数の鋳型に共通する配列を指し、すなわち、鋳型は、配列の一部は異なるものの、同一の部分も含有する。鋳型は、１つ以上の保存内部アダプター配列を含有する場合もある。さらに、ＤＮＡ鋳型のローリングサークル増幅（ＲＣＡ）は、これらの保存配列のさらなる複製を作成するだけでなく、ＲＣＡプローブからさらに別の領域の保存配列の複製も導入する。そのため、配列決定するライブラリー分子の部分（「標的領域」、「対象部分」などとも呼ばれる）は、実際の鋳型核酸の半分未満に相当する場合がある。本発明は、これらの既知の／共通する非標的領域が、一本鎖の場合に、配列決定プローブを封鎖することができ、また配列決定プライマー（例えば、開始オリゴヌクレオチド）のミスプライムの可能性がある部位であるという認識を包含する。本発明は、ポリヌクレオチド鋳型中に存在する非標的配列と相補的なブロッキングオリゴヌクレオチドを提供する。本明細書で使用される「ブロッキングオリゴヌクレオチド」とは、鋳型の非標的配列に安定してハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであり、この非標的配列は、配列決定に好適な条件下で種々の標的領域を含む複数の鋳型に共通する。非標的領域は、開始オリゴヌクレオチドが結合するとされる領域とは異なる。本発明はさらに、１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドがハイブリダイズするポリヌクレオチド鋳型も提供する。
【０１５８】
本発明のある実施形態において、鋳型はエマルジョンＰＣＲを使用して合成される。
【０１５９】
特に興味深い実施形態において、ＤＮＡ鋳型は、断片ライブラリーのメンバーであり、図３６Ｂに示す通り前方および後方アダプターを含有する。第１のブロッキングオリゴヌクレオチドは前方アダプターと相補的であり、第２のブロッキングオリゴヌクレオチドは後方アダプターと相補的である。他の実施形態において、ＤＮＡ鋳型は、対合末端ライブラリーのメンバーであり、図３６Ａに示す通り、前方および後方アダプターと、さらに内部アダプターも含有する。第１のブロッキングオリゴヌクレオチドは前方アダプターと相補的であり、第２のブロッキングオリゴヌクレオチドは後方アダプターと相補的であり、第３のブロッキングオリゴヌクレオチドは内部アダプターと相補的である。他の実施形態において、鋳型は、ＲＣＡを使用して増幅され、図３６Ｃおよび図３７に示す通りアダプター領域とパドロック領域とを含有する。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、鋳型に存在するアダプター領域およびパドロック領域と相補的である。ＲＣＡでは、パドロックプローブがポリメラーゼによって複製され、その相補体が生成されることが理解される。したがって、鋳型に存在するＲＣＡ相補体をブロックするために、パドロックプローブと同じ配列が、ブロッキングオリゴヌクレオチドとして使用される。図３６および図３７に示す特異的なオリゴヌクレオチドとそれらの相補体は、本発明の態様であるが、ブロッキングオリゴヌクレオチドの配列は、鋳型中に存在し、様々に異なることがある特定の保存配列と相補的になるように選択されることが認識される。さらに、本発明には、図３６または図３７に示すものと１個、２個、３個、４個または５個のヌクレオチドのみ配列が異なるオリゴヌクレオチドが含まれる。
【０１６０】
決して本発明を限定するものではないが、本発明者等は、例えば、鋳型の複雑性を低減させるツールとして作用する、ミスプライムの可能性がある部位を排除する、および／または鋳型の標的領域への伸長オリゴヌクレオチドのアクセスを容易にすることにより、前述の問題、あるいはこれらの共通配列の多くの複製が存在するために生じる場合があるその他の問題に対抗するために、ブロッキングオリゴヌクレオチドが使用される場合があることを認識した。本発明のある実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、例えばシグナル／ノイズ比の向上など、配列決定効率の向上をもたらす。
【０１６１】
ブロッキングオリゴヌクレオチドは、典型的には、配列決定プライマーのアニーリング前に一本鎖鋳型ＤＮＡにハイブリダイズされ、これらの領域がその後に配列決定プライマー（例えば、ライゲーションに基づく配列決定における開始オリゴヌクレオチド）またはプローブ（例えば、ライゲーションに基づく配列決定における伸長プローブ）のいずれかとハイブリダイズするのが防止される。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的にはライゲーション、検出、（および、伸長オリゴヌクレオチドが開裂される本発明の実施形態においては、開裂）の連続サイクルを通して存在し続けるとされる。本発明のある実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼまたはリガーゼの基材ではなく、例えば、これらのオリゴヌクレオチドは、典型的なポリメラーゼまたはリガーゼ酵素によって酵素的に伸長可能ではない。一実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、３’ヒドロキシル基および５’リン酸塩が欠損している。これらの基は、存在しない場合もあれば、合成後に除去される場合もあり、あるいはオリゴヌクレオチドの３’端および／または５’端が、伸長またはライゲーションの基材ではない部分でキャップまたはブロックされる場合もある。本発明のある実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、３’末端ジデオキシヌクレオシドを含む。本発明のある実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、３’末端ジデオキシシトシン（３‘ｄｄＣ）を含む。本発明のある実施形態において、対合タグライブラリーとともに使用するパドロックプローブは、単一タグそれぞれ（タグ１のみ、タグ２のみ）の、あるいは両タグの間（タグ１‐内部‐タグ２）のＲＣＡが可能となるように設計される（図３７）。
【０１６２】
ブロッキングオリゴヌクレオチドは、保存領域よりも短くてよく、すなわち、これらのオリゴヌクレオチドは、保存領域の一部のみと相補的であってよい。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、保存領域と完全に相補的である必要はないが、そうであるのが好ましい場合がある。典型的には、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、保存領域のすべてまたは一部と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％相補的となる。ブロッキングオリゴヌクレオチドのサイズは、ブロックする共通配列の長さによって変動する場合がある。典型的な長さは、１０〜５０ヌクレオチドである。それぞれがブロックする保存領域の一部と相補的である複数のブロッキングオリゴヌクレオチドが、単一のより長いオリゴヌクレオチドの代わりに使用される場合もある。
【０１６３】
ブロッキングオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載のようなライゲーションに基づく配列決定において特定の用途を見出す場合がある。したがって、本明細書に記載のいずれの方法も、鋳型を開始オリゴヌクレオチドと接触させる前に、プローブと鋳型の二本鎖を形成または提供する前に、および／または伸長した二本鎖を形成する前に、鋳型ポリヌクレオチドを１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドと接触させる手順を含む場合がある。但し、ブロッキングオリゴヌクレオチドはまた、ＦＩＳＳＥＱやパイロシーケンシングなどの他の配列決定法を実施する場合に使用される場合もある。
【０１６４】
Ｄ．種々の初期オリゴヌクレオチドを用いた再度初期化を伴う配列決定
本発明の好ましい実施形態において、第１の初期オリゴヌクレオチドを伸長させることによって生成された伸長鎖は、充分なサイクル数の後、鋳型から除去され、第２の初期オリゴヌクレオチドが結合領域にアニーリングされた後、伸長、ライゲーションおよび検出のサイクルが行なわれる。該プロセスは、任意の数の異なる初期オリゴヌクレオチドを用いて反復される。伸長プローブが切断される実施形態では、好ましくは、使用される異なる初期オリゴヌクレオチドの数（したがって、反応の数）は、プローブの遠位部分の放出後に鋳型にハイブリダイズされたままの伸長プローブの部分の長さに等しい。したがって、この実施形態によれば、配列情報（例えば、各ヌクレオチドの順番および正体）は、単一の支持体に結合された鋳型から得られ得るが、連続したヌクレオチドが各サイクルで同定される場合に必要とされ得るよりも実質的に少ないサイクルを用いて、さらに深く読み出しが行なわれる。
【０１６５】
初期オリゴヌクレオチドが同じ鋳型に連続的に結合される実施形態は、Ｍａｃｅｖｉｃｚにより教示された方法などの、鋳型を多数のアリコートに分割することを要するアプローチと比べてある種の利点を有する。例えば、初期オリゴヌクレオチドを同じ鋳型に適用することにより、多数のアリコートから取得されたデータを追跡し、後で組み合わせる必要性が回避される。個々の支持体の位置が所定でないような支持体がランダム様式のアレイ状である実施形態では、各々が自身に結合された同じ配列の鋳型を有する多数の支持体からの部分配列情報を信頼できるように組み合わせることは困難または不可能であり得る。
【０１６６】
Ｅ．単一の鋳型における各サイクルでの多数のヌクレオチドの同定
Ｍａｃｅｖｉｃｚには、伸長、ライゲーションおよび検出の各サイクルにおける鋳型内の単一のヌクレオチドの同定が教示されている。しかしながら、本発明者らは、該方法は、各サイクルで鋳型内の多数のヌクレオチドの同定が可能となるように変形し得ると認識した。この場合、伸長プローブは、伸長された二本鎖に接合された２つ以上の、好ましくは連続したヌクレオチドの正体が標識から決定され得るように標識される。換言すると、伸長プローブの配列決定部分は、１つより多くのヌクレオチドであり、典型的には、近位ヌクレオチド、直接隣接ヌクレオチド、およびおそらく１つ以上のさらなる、好ましくは連続したヌクレオチドを含み、これらはすべて、鋳型に特異的にハイブリダイズする。例えば、塩基Ａ、Ｇ、ＣおよびＴを特定する４つの標識を用いるのではなく、１６個の識別可能に標識されたプローブまたはプローブの組合せが、１６個の可能なジヌクレオチドＡＡ、ＡＧ、ＡＣ、ＡＴ、ＧＡ、ＧＧ、ＧＣ、ＧＴ、ＣＡ、ＣＧ、ＣＣ、ＣＴ、ＴＡ、ＴＧ、ＴＣおよびＴＴを特定するために使用される。各識別可能に標識された伸長プローブの配列決定部分は、これらのジヌクレオチドの１つに相補的である。より多くの標識を用いる同様の方法により、各サイクルで、より長鎖のヌクレオチド配列の同定が可能になる。
【０１６７】
Ｆ．標識
用語「標識」は、本明細書において、プローブと結合または会合した任意の検出可能な部分または複数の検出可能な部分であって、それにより異なる種のプローブ（例えば、異なる末端ヌクレオチドを有するプローブ）が互いに識別され得る部分を表すために広義で用いる。したがって、標識と特異的検出可能な部分との間に１対１の対応がある必要はない。例えば、多数の検出可能な部分が単一のプローブに結合され得、プローブが、自身に結合された異なる検出可能な部分または検出可能な部分の組を有するプローブと識別されるのを可能にする複合シグナルがもたらされ得る。例えば、検出可能な部分の組合せが、米国特許第６，６３２，６０９号およびＳｐｅｉｃｈｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２：３６８−３７５，１９９６に記載された「コンビナトリアルマルチカラーコーディング（Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ  Ｃｏｄｉｎｇ）」とよばれる標識スキームに従って使用され得る。
【０１６８】
本発明のプローブは、さまざまな様式、例えば、基質と接触させると検出可能なシグナルを生成する蛍光性または化学発光性部分、比色性部分、酵素性部分などの直接または間接的結合によって標識され得る。Ｍａｃｅｖｉｃｚには、プローブを蛍光染料、例えば、Ｍｅｎｃｈｅｎら，米国特許第５，１８８，９３４号；Ｂｅｇｏｔら  ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９０１０５５６５に開示されているもので標識させ得ることが教示されている。用語「蛍光染料」および「フルオロフォア」は、本明細書で用いる場合、規定の励起波長の光エネルギーを吸収し、異なる波長の光エネルギーを放出する部分をいう。好ましくは、所与のプローブ混合物での使用のために選択される標識は、スペクトルにより分離可能なものである。本明細書で用いる場合、「スペクトルにより分離可能な」は、標識が、作業条件下で、そのスペクトル特性、特に蛍光発光波長に基づいて識別され得ることを意味する。例えば、１つ以上の末端ヌクレオチドの正体は、最大光発光強度の異なる波長、またはおそらく異なる波長での強度比と相関し得る。標識を検出および同定するために用いられる標識のスペクトル特性（１つまたは複数）を、本明細書では「色」という。標識が、特異的スペクトル特性、例えば、単一の検出可能な部分からなる標識の場合は最大発光強度の周波数、または、多数の検出可能な部分からなる標識の場合は発光ピークの周波数に基づいて高頻度で同定されることは認識されよう。
【０１６９】
好ましくは、４種類のスペクトルにより分離可能な蛍光染料の各々と、４つの可能なプローブ末端ヌクレオチドとの１対１対応を可能にする４種類のプローブが提供される。スペクトルにより分離可能な色素の組は、米国特許第４，８５５，２２５号および同第５，１８８，９３４号；国際出願ＰＣＴ７ＵＳ９０／０５５６５；ならびにＬｅｅら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈｓ，２０：２４７１−２４８３（１９９２）に開示されている。ある特定の実施形態において、ＦＩＴＣ、ＨＥＸＴＭ、テキサスレッドおよびＣｙ５からなる組が好ましい。数多くの好適な蛍光染料が、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｅｕｇｅｎｅ  ＯＲから市販されている。蛍光染料の具体例としては、限定されないが、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０  ａｎｄ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０）、ＡＭＣＡ、ＡＭＣＡ−Ｓ、ＢＯＤＩＰＹ色素（ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５）、ＣＡＬ色素、カルボキシローダミン６Ｇ、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ、シアニン色素（Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５．５）、Ｄａｎｓｙｌ、Ｄａｐｏｘｙｌ、ジアルキルアミノクマリン、４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシ−フルオレセイン、ＤＭ−ＮＥＲＦ、エオシン、エリスロシン、フロレセイン、ＦＡＭ、ヒドロキシクマリン、ＩＲＤｙｅｓ（ＩＲＤ４０、ＩＲＤ  ７００、ＩＲＤ  ８００）、ＪＯＥ、リサミンローダミンＢ、マリンブルー、メトキシクマリン、ナフトフルオレセイン、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、Ｏｙｓｔｅｒ色素、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、ＰｙＭＰＯ、ピレン、ローダミン６Ｇ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、Ｒｈｏｄｏｌ  Ｇｒｅｅｎ、２’，４’，５’，７’−テトラ−ブロモスルホン−フルオレセイン、テトラメチル−ローダミン（ＴＭＲ）、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テキサスレッド、テキサスレッド−Ｘが挙げられる。Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，第９版，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｃ．，  ｆｏｒ  ｆｕｒｔｈｅｒ  ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎを参照のこと。
【０１７０】
それ自身が直接検出可能であるのではなく、一部の蛍光基は、非放射性蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）のプロセスにてエネルギーを別の基に転移させ、第２の基が、検出されるシグナルを生成する。すなわち、消光剤の使用もまた本発明の範囲内である。用語「消光剤」は、可視光を発光せずに励起された蛍光標識のエネルギーを、これに近接して配置された場合に吸収でき、消散できる部分をいう。消光剤の例としては、限定されないが、ＤＡＢＣＹＬ（４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸）スクシンイミジルエステル、ジアリールローダミンカルボン酸、スクシンイミジルエステル（ＱＳＹ−７）および４’，５’−ジニトロフルオレセインカルボン酸、スクシンイミジルエステル（ＱＳＹ−３３）（すべて、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ製）、消光剤１（Ｑｌ；  Ｅｐｏｃｈ製）または「ブラックホール（Ｂｌａｃｋ  ｈｏｌｅ）消光剤」ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２およびＢＨＱ−３（ＢｉｏＳｅａｒｃｈ，  Ｉｎｃ製）が挙げられる。
【０１７１】
上記の種々の検出可能な部分に加え、本発明はまた、スペクトルにより分離可能な量子ドット、金属ナノ粒子またはナノクラスターなどの使用の使用を包含し、これらは、オリゴヌクレオチドプローブに直接結合されたものであり得るか、または高分子マトリックス内に包埋もしくはこれと会合させ、次いでプローブに結合させたものであり得るかのいずれかである。上記のように、検出可能な部分は、それ自体が直接検出可能である必要はない。例えば、これらは、検出される基質に対して作用するものであってもよく、検出可能となるために修飾を必要とするものであってもよい。
【０１７２】
上記のように、本発明のある特定の実施形態において、標識は、複数の検出可能な部分からなる。これらの検出可能な部分からの複合シグナルにより色がもたらされ、これを、プローブの同定のために使用する。例えば、ある特定の配列の「紫色」のプローブは、「青色」および「赤色」の検出可能な部分を結合することにより構築され得る。あるいはまた、同じ配列を有するが異なる検出可能な部分で標識された２種類のプローブを組み合わせて混合プローブを作製することにより異なる色が生成され得る。したがって、ある特定の配列の「紫色」のプローブは、該配列を有する２種類のプローブを構築することにより作製され得る。「赤色」の検出可能な部分を第１の種に結合させ、「青色」の検出可能な部分を第２の種に結合させる。これらの２種類のアリコートを混合する。種々の濃度（ｓｈａｄｅ）の紫色が、アリコートを種々の比率で混合することにより生成され得る。このアプローチはいくつかの利点をもたらす。第１に、より少数の検出可能な部分を用いて多数の識別可能なプローブの生成を可能にする。第２に、混合プローブの使用により、特定の検出可能な部分と特定のヌクレオチド間の相互作用に起因し得る偏重の低減を補助し得る冗長（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）度が提供され得る。
【０１７３】
本発明のある特定の実施形態において、検出可能な部分は、ライゲーションおよび検出後に検出可能な部分の除去を可能にする切断可能な連結によってオリゴヌクレオチド伸長プローブ内のヌクレオチドに結合させる。任意のさまざまな異なる切断可能な連結が使用され得る。本明細書で用いる場合、オリゴヌクレオチドプローブにおける検出可能な部分およびヌクレオチドの文脈において、用語「切断可能な連結」は、検出可能な部分をヌクレオチドに接合させ、所望の場合は、結合されたヌクレオチドまたは核酸分子を本質的に改変することなく、切断されて検出可能な部分をヌクレオチドから除去し得る化学的部分をいう。切断は、連結の性質に応じて、例えば、酸もしくは塩基処理、または連結の酸化もしくは還元、または光処理（光切断）によってなされ得る。切断可能な連結および切断剤の例は、Ｓｈｉｒｎｋｕｓら．，１９８５，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：２５９３−２５９７；Ｓｏｕｋｕｐら．，１９９５，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．６：１３５−１３８；Ｓｈｉｍｉｋｕｓら．，１９８６，  ＤＮＡ  ５：２４７−２５５；ならびにＨｅｒｍａｎおよびＦｅｎｎ，１９９０，  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８４：５８４−５８８に記載されている。より一般的には、「開裂可能な連結」とは、２つの分子または正体を連結するために使用できる部分であって、容易に開裂できることによって、例えば分子または正体の安定性と両立する条件下で、構造を実質的に変更することなく、分子または正体の分離を可能にする部分を指す。
【０１７４】
例えば、米国特許第６，５１１，８０３号に記載のように、ジスルフィド結合が、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）などのチオール化合物還元剤を用いて還元され、それにより切断され得る。ヌクレオチドと反応性アリールアミノ基（例えば、ｄＣＴＰ）のように、フルオロフォアが、コンジュゲーションに利用され得るスルフヒドリル（ＳＨ）基とともに利用可能である（例えば、シアニン５またはシアニン３フルオロフォアとＳＨ基；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ−ＤｕＰｏｎｔ）。反応性ピリジルジチオールは、スルフヒドリル基と反応してスルフヒドリル結合をもたらし、これは、ジチオトレイトールなどの還元剤により切断可能である。ＮＨＳ−エステルヘテロ二官能性架橋剤（Ｐｉｅｒｃｅ）は、反応性アリールアミノ基を含むデオキシヌクレオチドをピリジルジチオール基に連結させるために使用され得、これは、次いでフルオロフォア上のＳＨと反応性となり、本発明の方法に有用なジスルフィド結合された切断可能なヌクレオチドフルオロフォア複合体をもたらす。あるいはまた、ヌクレオチドとフルオロフォア間のシス−グリコール連結は過ヨウ素酸塩によって切断され得る。さまざまな切断可能な連結が、米国特許第６，６６４，０７９号および同第６，６３２，６５５号、ＵＳ出願公開公報２００３０１０４４３７、ＷＯ  ０４／１８４９７およびＷＯ  ０３／４８３８７に記載されている。
【０１７５】
本発明の他の実施形態において、光などの電磁エネルギーへの曝露によって非検出可能となり得る検出可能な部分（光退色性）が使用される。
【０１７６】
切断可能な連結によってプローブに結合された標識を有するか、または光退色性となり得る標識を有する伸長プローブを用いる本発明の実施形態において、配列決定法は、典型的には、ライゲーションおよび標識検出が行なわれた後、１回以上のサイクルにおいて切断または光退色工程を含む。上記のように、オリゴヌクレオチド伸長プローブ内に存在する切れやすい連結の切断は、完結するまで進行し得ない（すなわち、新たにライゲートされたプローブの１００％未満が、ライゲートされたサイクルにおいて切断され得る）。かかるプローブは一般的に、伸長不可能な末端を含むか、またはキャップされているため、連続的サイクルに寄与しない。しかしながら、プローブが切断されないことは、標識が、プローブライゲートされる鋳型分子と会合したままであることを意味し、これは、後続のサイクルにおけるノイズを増大させ得るバックグラウンドシグナル（すなわち、バックグラウンド蛍光）に寄与する。標識を除去するため、または非検出可能とするための切断または光退色の工程を組み込むことは、このバックグラウンドを低減させ、信号対雑音比が改善される。切断または光退色は、各サイクルごとにできるだけ多く行なってもよく、サイクル１回おき、３回に１回、５回以上に１回などの低頻度で行なってもよい。本発明のある特定の実施形態において、切断可能なリンカーの切断を達成するための任意のさらなる工程を実際に加える必要はない。例えば、ＤＴＴなどの切断剤を、非ライゲート伸長プローブを除去するために使用され得る洗浄バッファー中に既に存在させてもよい。
【０１７７】
Ｇ．好ましい切れやすい連結
本発明者は、少なくとも１つのホスホロチオレート結合を有する伸長プローブが、伸長、ライゲーション、検出および切断の連続的サイクルによる配列決定のための方法の実施において特に有用であることを見出した。かかる連結では、ホスホジエステル結合の橋絡酸素原子の１つがイオウ原子で置き換えられている。ホスホロチオレート結合は、図４Ａに示すような５’−Ｓ−ホスホロチオレート結合（３’−Ｏ−Ｐ−Ｓ−５’）または図４Ｂに示すような３’−Ｓ−ホスホロチオレート結合（３’−Ｓ−Ｐ−Ｏ−５’）のいずれかであり得る。図４Ａおよび４Ｂに示すように、３’−Ｏ−Ｐ−Ｓ−５’または３’−Ｓ−Ｐ−Ｏ−５’で表される連結内のリン原子は、２つの非橋絡酸素原子に結合され得ることを理解されたい（典型的なホスホジエステル結合の場合と同様）。あるいはまた、リン原子は、任意のさまざまな他の原子または基、例えば、Ｓ、ＣＨ３、ＢＨ３などに結合され得る。したがって、本発明の一態様は、ホスホロチオレート結合を含む標識されたオリゴヌクレオチドプローブである。プローブには、本明細書に記載した配列決定法において具体的な用途が見られるが、さまざまな他の目的にもまた使用され得る。特に、本発明は、（ｉ）形態５’−Ｏ−Ｐ−Ｏ−Ｘ−Ｏ−Ｐ−Ｓ−（Ｎ）ｋＮＢ＊−３’のオリゴヌクレオチド；および（ｉｉ）形態５’−ＮＢ＊（Ｎ）ｋ−Ｓ−Ｐ−Ｏ−Ｘ−３’のオリゴヌクレオチドを提供する。これらのプローブの各々において、Ｎは任意のヌクレオチドを表し、ＮＢはリガーゼによって伸長可能でない部分を表し、＊は検出可能な部分を表し、Ｘはヌクレオチドを表し、ｋは１〜１００である。ある特定の実施形態において、ｋは、１〜５０、１〜３０、１〜２０、例えば４〜１０である、ただし、検出可能な部分は、（Ｎ）ｋの任意のヌクレオシド上にＮＢの代わりまたはこれに加えて存在するものとする。任意のこれらのプローブ内の末端ヌクレオチドは、リン酸基またはヒドロキシル基を含むものであってもそうでなくてもよい。さらにまた、該リン原子は、好ましい実施形態において、一般的に、２つのさらなる（非橋絡）酸素原子に結合されていることは認識されよう。
【０１７８】
５’−Ｓ−ホスホロチオレートまたは３’−Ｓ−ホスホロチオレート結合を含有するオリゴヌクレオチドを合成するための方法は、当該技術分野で知られており、これらの方法のある特定のものは、自動固相オリゴヌクレオチド合成に適している。合成手順は、例えば、Ｃｏｏｋ，  ＡＦ，  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，９２：１９０−１９５，１９７０；Ｃｈｌａｄｅｋ，  Ｓ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，９４：２０７９−２０８４，１９７２；Ｒｙｂａｋｏｖ，  ＶＮら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，９：１８９−２０１，１９８１；Ｃｏｓｓｔｉｃｋ，  Ｒ．およびＶｙｌｅ，  ＪＳ，  Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．ＣＨｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，９９２−９９２，１９８８；Ｍａｇ，  Ｍ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １９（７）；１４３７−１４４１，１９９１；Ｘｕ，  Ｙ，およびＫｏｏｌ，  ＥＴ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２６（１３）：３１５９−３１６４，１９９８；Ｃｏｓｓｔｉｃｋ，  Ｒ．およびＶｙｌｅ，  ＪＳ，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３０：４６９３−４６９６，１９８９；Ｃｏｓｓｔｉｃｋ，  Ｒ．およびＶｙｌｅ，  ＪＳ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８：８２９−８３５，  １９９０；Ｓｕｎ，  ＳＧおよびＰｉｃｃｉｒｉｌｌｉ，  ＪＡ，  Ｎｕｃｌ．Ｎｕｃｌ，１６：１５４３−１５４５，１９９７；Ｓｕｎ  ＳＧら、ＲＮＡ，３：１３５２−１３６３，１９９７；Ｖｙｌｅ，  ＪＳら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３３：３０１７−３０２０，１９９２；Ｌｉ，  Ｘ．ら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．，１：２１２３−２２１２９，１９９４；Ｌｉｕ，  ＸＨ  ａｎｄ  Ｒｅｅｓｅ，  ＣＢ，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  ３７：９２５−９２８，１９９６；Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，  ＬＢら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１１８：１０３４１−１０３５０，１９９６；ならびにＳａｂｂａｇｈ，  Ｇ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３２（２）：４９５−５０１，２００４に記載されている。また、本発明者らは、新たな合成方法を開発した。例えば、図７は、ｄＡの３’−ホスホロアミデートの合成スキームを示す。同様のスキームが、ｄＧの３’−ホスホロアミデートの合成に使用され得る。これらのホスホロアミデートは、プリンヌクレオシドと会合した３’−Ｓ−ホスホロチオレート結合を含有するオリゴヌクレオチドを、例えば、自動ＤＮＡ合成装置を用いて合成するために使用され得る。
【０１７９】
ホスホロチオレート連結は、さまざまな金属含有薬剤を用いて切断され得る。金属は、例えば、Ａｇ、Ｈｇ、Ｃｕ、Ｍｎ、ＺｎまたはＣｄであり得る。好ましくは、該薬剤は、Ａｇ＋、Ｈｇ＋＋、Ｃｕ＋＋、Ｍｎ＋＋、Ｚｎ＋またはＣｄ＋アニオンを提供する水溶性の塩である（他の酸化状態のイオンを提供する塩もまた使用され得る）。Ｉ２もまた使用され得る。硝酸銀（ＡｇＮＯ３）などの銀含有塩またはＡｇ＋イオンを提供する他の塩，は特に好ましい。好適な条件としては、例えば、５０ｍＭ  ＡｇＮＯ３、約２２〜３７℃で１０分以上（例えば、３０分間）が挙げられる。好ましくは、ｐＨは、４．０〜１０．０、より好ましくは５．０〜９．０、例えば約６．０〜８．０、例えば約７．０である。例えば、Ｍａｇ，  Ｍ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９（７）：１４３７−１４４１，１９９１を参照のこと。例示的なプロトコルを実施例１に示す。
【０１８０】
５’→３’方向の配列決定は、３’−Ｏ−Ｐ−Ｓ−５’連結を含有する伸長プローブを用いて行なわれ得る。図５Ａは、形態５’−Ｏ−Ｐ−Ｏ−Ｘ−Ｏ−Ｐ−Ｓ−ＮＮＮＮＮＢ＊−３’（式中、Ｎは任意のヌクレオチドを表し、ＮＢはリガーゼによって伸長可能でない部分を表し（例えば、ＮＢは、３’ヒドロキシル基がないヌクレオチドであるか、またはブロッキング部分が結合されている）、＊は検出可能な部分を表し、Ｘは、その正体が検出可能な部分に対応するヌクレオチドを表す）の伸長プローブを用いたハイブリダイゼーション、ライゲーションおよび切断１サイクルを示す。あるいはまた、多重ライゲーションを抑制するため、任意の多数のブロッキング部分を３’末端ヌクレオチドに結合させ得る。例えば、バルキー基をヌクレオチドの糖鎖部分、例えば、２’位または３’位に結合させることにより、ライゲーションが抑制される。蛍光標識は、適切なバルキー基としての機能を果たし得る。
【０１８１】
結合領域４０および未知配列のポリヌクレオチド領域５０を含有する鋳型を支持体、例えば、ビーズに結合させる。好ましい実施形態において、図５Ａに示すように、結合領域は、支持体への結合点と反対の鋳型の末端に位置する。伸長可能な末端（この場合は、遊離３’ＯＨ基）を有する初期オリゴヌクレオチド３０を、結合領域４０にアニーリングさせる。伸長プローブ６０をポリヌクレオチド領域５０内の鋳型にハイブリダイズさせる。ヌクレオチドＸは、鋳型内の未知ヌクレオチドＹと相補塩基対を形成する。伸長プローブ６０を初期オリゴヌクレオチドにライゲートさせる（例えば、Ｔ４リガーゼを用いて）。ライゲーション後、伸長プローブ６０に結合された標識を検出する（図示せず）。標識は、ヌクレオチドＸの正体に対応する。したがって、ヌクレオチドＹが、ヌクレオチドＸに相補的なヌクレオチドとして同定される。次いで、伸長プローブ６０をホスホロチオレート結合で切断し（例えば、ＡｇＮＯ３またはＡｇ＋イオンを提供する別の塩を用いて）、伸長された二本鎖が得られる。切断によりリン酸基が伸長された二本鎖の３’末端に生じる。ホスファターゼ処理が、伸長可能なプローブ末端を伸長された二本鎖に生成させるために使用される。該プロセスを所望回数サイクル反復する。
【０１８２】
好ましい実施形態では、配列決定は、３’→５’方向に３’−Ｓ−Ｐ−Ｏ−５’連結を含有する伸長プローブを用いて行なわれる。図５Ｂは、形態５’−ＮＢ＊−ＮＮＮＮ−Ｓ−Ｐ−Ｏ−Ｘ−３’（式中、Ｎは任意のヌクレオチドを表し、ＮＢはリガーゼによって伸長可能でない部分を表し（例えば、ＮＢは、５’リン酸基がないヌクレオチドであるか、またはブロッキング部分が結合されている）、＊は検出可能な部分を表し、Ｘは、その正体が検出可能な部分に対応するヌクレオチドを表す）の伸長プローブを用いたハイブリダイゼーション、ライゲーションおよび切断の１サイクルを示す。
【０１８３】
結合領域４０および未知配列のポリヌクレオチド領域５０を含有する鋳型を支持体、例えば、ビーズに結合させる。好ましい実施形態において、図５Ｂに示すように、結合領域は、支持体への結合点と反対の鋳型の末端に位置する。伸長可能な末端（この場合は、遊離５’リン酸基）を有する初期オリゴヌクレオチド３０を、結合領域４０にアニーリングさせる。伸長プローブ６０をポリヌクレオチド領域５０内の鋳型にハイブリダイズさせる。ヌクレオチドＸは、鋳型内の未知ヌクレオチドＹと相補塩基対を形成する。伸長プローブ６０を初期オリゴヌクレオチドにライゲートさせる（例えば、Ｔ４リガーゼを用いて）。ライゲーション後、伸長プローブ６０に結合された標識を検出する（図示せず）。標識は、ヌクレオチドＸの正体に対応する。したがって、ヌクレオチドＹが、ヌクレオチドＸに相補的なヌクレオチドとして同定される。次いで、伸長プローブ６０をホスホロチオレート結合で切断し（例えば、ＡｇＮＯ３またはＡｇ＋イオンを提供する別の塩を用いて）、伸長された二本鎖が得られる。切断により伸長可能な一リン酸基が伸長された二本鎖の５’末端に生じ、したがって、伸長可能な末端を生成させるためのさらなる工程を行なうことは不必要である。該プロセスを所望回数サイクル反復する。
【０１８４】
このスキームのいくつかの変形例が使用され得ることは認識されよう。例えば、プローブは６ヌクレオチドよりも短くても長くてもよく、標識は３’末端ヌクレオチド上である必要はなく、Ｐ−Ｓ連結は任意の２つの隣接するヌクレオチド間に位置し得るなどである。上記の実施形態では、伸長、ライゲーション、検出および切断の連続的サイクルにより、隣接して位置するヌクレオチドの同定がもたらされる。しかしながら、Ｐ−Ｓ連結を伸長プローブの遠位端（すなわち、ライゲーションが起こる末端と反対の末端）に対してより近くに配置することによって、上記ならびに図１および６に示すように、連続的に同定されるヌクレオチドは鋳型に沿って間隔があく。
【０１８５】
図６Ａ〜６Ｆは、単一の鋳型において連続的に行なわれるいくつかの配列決定反応のより詳細な概略図である。配列決定は、３’→５’方向に３’−Ｓ−Ｐ−Ｏ−５’連結を含有する伸長プローブを用いて行なわれる。各配列決定反応は、伸長、ライゲーション、検出および切断の多数のサイクルを含む。該反応では、鋳型の異なる部分に結合する初期オリゴヌクレオチドを用いる。伸長プローブは８ヌクレオチド長であり、プローブの３’末端から数えて６番目と７番目のヌクレオチド間に位置するホスホロチオレート結合を含有する。ヌクレオチド２〜６は、各反応で、鋳型に沿って間隔があいている複数のヌクレオチドの同定が可能となるようにスペーサーとしての機能を果たす。多数の反応を順次行ない、各反応で得られた部分配列情報を適切に組み合わせることにより、鋳型の一部分完全な配列が決定される。
【０１８６】
図６Ａは、伸長可能な二本鎖を得るための、鋳型内のアダプター配列（図６Ａ〜６Ｆでは結合領域という）にハイブリダイズさせた第１の初期オリゴヌクレオチド（図６Ａ〜６Ｆではプライマーという）を用いた初期化を示す。図６Ｂ〜６Ｄは、ヌクレオチド同定のいくつかのサイクルを示し、この場合、鋳型は６塩基ごとに読み出しされる。図６Ｂでは、第１の未知鋳型内のヌクレオチド配列に相補的な３’末端ヌクレオチドを有する第１の伸長プローブが鋳型に結合し、プライマーの伸長可能な末端にライゲートされる。伸長プローブに結合された標識により、プローブは３’末端ヌクレオチドとしてＡを有すると同定され、したがって、鋳型配列内の第１の未知ヌクレオチドはＡであると同定される。図６Ｃは、ホスホロチオレート結合でのＡｇＮＯ３による伸長オリゴヌクレオチドの切断および伸長プローブの標識が結合された部分の放出を示す。図６Ｄは、伸長、ライゲーションおよび切断のさらなるサイクルを示す。プローブは５ヌクレオチド長のスペーサーを含むため、配列決定反応により、鋳型は６ヌクレオチドごとに同定される。
【０１８７】
所望回数サイクル後、第１の初期化ヌクレオチドを含む伸長鎖が除去され、第１の初期オリゴヌクレオチドが結合した部分と異なる結合領域の部分に結合する第２の初期オリゴヌクレオチドが、鋳型にハイブリダイズされる。図６Ｅは、第２の配列決定反応を示し、この場合、初期化は、第２の初期オリゴヌクレオチドにより行なわれ、その後、数回サイクルのヌクレオチド同定が行なわれる。図６Ｆは、第３の初期オリゴヌクレオチドを用いた初期化後、数回サイクルのヌクレオチド同定を示す。第２の初期オリゴヌクレオチドからの伸長により、第１の配列決定反応同定されたヌクレオチドと異なる「フレーム」内で６塩基ごとの同定が可能になる。
【０１８８】
ホスホロチオレート結合を含む伸長プローブは、本発明のある特定の実施形態において好ましいが、さまざまな他の切れやすい連結が好都合に使用され得る。例えば、天然に存在する核酸に見られるＯ−Ｐ−Ｏ連結に対する多数のバリエーションが知られている（例えば、Ｍｉｃｋｌｅｆｉｅｌｄ，  Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，８：１１５７−１１７９，２００１を参照）。本明細書に記載されたＰ−Ｏ結合を含む任意の構造は、切れやすいＰ−Ｓ結合を含むように修飾され得る。例えば、ＮＨ−Ｐ−Ｏ結合をＮＨ−Ｐ−Ｓ結合に変更してもよい。
【０１８９】
本発明のある一部の実施形態において、伸長プローブは、核酸を、切断剤またはその組合せによる切断に対して感受性とする（任意選択で、修飾剤によるトリガー残基の修飾後）トリガー残基を含む。特に、本発明者らは、ＤＮＡ修復に関与する酵素は、伸長、ライゲーション、検出および切断の連続的サイクルによる配列決定のための方法の実施における使用のための好都合な切断試薬であることを見出した。一般に、伸長プローブ内における損傷塩基または無塩基残基などのトリガー残基の存在により、プローブは、１種類以上のＤＮＡ修復酵素による切断に対して感受性となり得る（任意選択で、ＤＮＡグリコシラーゼによる修飾後）。したがって、ＡＰエンドヌクレアーゼなどのＤＮＡ修復に関与する酵素による切断の基質である連結を含む伸長プローブは、本発明において有用である。修飾によりプローブがＡＰエンドヌクレアーゼによる切断に対して感受性となるＤＮＡグリコシラーゼなどのＤＮＡ修復に関与する酵素による修飾の基質である残基を含有する伸長プローブもまた、本発明に特に有用である。ある一部の実施形態において、伸長プローブは、無塩基残基を含む、すなわちプリンまたはピリミジン塩基がない。無塩基残基と隣接ヌクレオシド間の連結は、ＡＰエンドヌクレアーゼによって切断に対して感受性であり、したがって、切れやすい連結である。本発明のある特定の実施形態において、無塩基残基は２’デオキシリボースを含む。ある一部の実施形態において、伸長プローブは損傷塩基を含む。損傷塩基は、ＤＮＡグリコシラーゼなどの損傷塩基を除去する酵素の基質である。損傷塩基の除去後、得られる無塩基残基と隣接ヌクレオシド間の連結は、ＡＰエンドヌクレアーゼによる切断に対して感受性であり、したがって、本発明に従う切れやすい連結とみなされる。
【０１９０】
多くの異なるＡＰエンドヌクレアーゼが本発明における切断試薬として有用である。ＡＰエンドヌクレアーゼの２つの主な類型が、無塩基残基に隣接する連結を切断する機構に基づいて識別されている。類型ＩのＡＰエンドヌクレアーゼ、例えば、大腸菌のエンドヌクレアーゼＩＩＩ（Ｅｎｄｏ  ＩＩＩ）およびエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ（Ｅｎｄｏ  ＶＩＩＩ）ならびにヒト類縁体ｈＮＴＨ１、ＮＥＩＬ１、ＮＥＩＬ２およびＮＥＩＬ３などは、ＡＰ残基の３’側のＤＮＡを切断し、３’末端リン酸基を有する５’部分および５’末端リン酸基を担持する３’部分をもたらすＡＰリアーゼである。類型ＩＩのＡＰエンドヌクレアーゼ、例えば、例えば、大腸菌のエンドヌクレアーゼＩＶ（Ｅｎｄｏ  ＩＶ）およびエクソヌクレアーゼＩＩＩ（Ｅｘｏ  ＩＩＩ）などは、ＡＰ部位の５’のＤＮＡを切断し、３’ＯＨおよび５’デオキシリボースリン酸基部分を生じる断片の末端に生成させる。種々の類型Ｉおよび類型ＩＩのＡＰエンドヌクレアーゼならびに損傷塩基のＤＮＡからのを除去および／または無塩基残基含有ＤＮＡの切断の条件のさらなる論考については、例えば、Ｄｏｕｂｌｉｅ，  Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  １０１（２８），１０２８４−１０２８９，２００４；Ｈａｌｔｉｗａｎｇｅｒ，  Ｂ．Ｍ．ら，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，３４５，８５−８９，２０００；Ｌｅｖｉｎ，  Ｊ．ａｎｄ  Ｄｅｍｐｌｅ，  Ｂ．，  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ，１８（１７），１９９０、および前記文献中の参考文献を参照のこと。当業者には、これらの酵素のさまざまな類縁体が、他の生物体（例えば、酵母）に存在し、本発明において有用であることが認識されよう。
【０１９１】
ある種の酵素は、グリコシラーゼ活性を有し、損傷塩基を除去してＡＰ残基を生成させ、また、グリコシラーゼ活性によって生成されたＡＰ部位の３’側でホスホジエステル主鎖を切断するリアーゼ活性を示すという両方の点で二官能性である。したがって、このような二重活性酵素は、ＡＰエンドヌクレアーゼとＤＮＡグリコシラーゼの両方である。例えば、Ｅｎｄｏ  ＶＩＩＩは、Ｎ−グリコシラーゼとＡＰ−リアーゼの両方として作用する。Ｎ−グリコシラーゼ活性により損傷ピリミジンが二本鎖ＤＮＡから放出され、無プリン（ＡＰ部位）をもたらされる。ＡＰ−リアーゼ活性により、ＡＰ部位の３’および５’側が切断され、５’リン酸基および３’リン酸基が生じる。エンドヌクレアーゼＶＩＩＩによって認識および除去される損傷塩基としては、尿素、５，６−ジヒドロキシチミン、チミングリコール、５−ヒドロキシ−５−メチルヒダントン、ウラシルグリコール、６−ヒドロキシ−５、６−ジヒドロチミンおよびメチルタートロニル（ｔａｒｔｒｏｎｙｌ）尿素が挙げられる。例えば、Ｄｉｚｄａｒｏｇｌｕ，  Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，１２１０５−１２１１１，１９９３およびＨａｔａｈｅｔ，  Ｚ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１８８１４−１８８２０，１９９４；Ｊｉａｎｇ，  Ｄ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２７２（５１），３２２２０−３２２２９，１９９７；Ｊｉａｎｇ，  Ｄ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔ，１７９（１１），  ３７７３−３７８２，  １９９７を参照のこと。
【０１９２】
Ｆｐｇ（ホルムアミドピリミジン［ｆａｐｙ］−ＤＮＡグリコシラーゼ）（８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼとしても知られる）もまた、Ｎ−グリコシラーゼとＡＰ−リアーゼの両方として作用する。Ｎ−グリコシラーゼ活性により損傷プリンが二本鎖ＤＮＡから放出され、無プリン（ＡＰ部位）がもたらされる。ＡＰ−リアーゼ活性により、ＡＰ部位の３’および５’側両方が切断され、それによりＡＰ部位が除去され、１塩基ギャップが生じる。Ｆｐｇ認識および除去される損傷塩基の一例としては、７，８−ジヒドロ−８−オキソグアニン（８−オキソグアニン）、８−オキソアデニン、ｆａｐｙ−グアニン、メチル−ｆａｐｙ−グアニン、ｆａｐｙ−アデニン、アフラトキシンＢ１−ｆａｐｙ−グアニン、５−ヒドロキシ−シトシンおよび５−ヒドロキシ−ウラシルが挙げられる。例えば、Ｔｃｈｏｕ，  Ｊ．ら．Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２６９，１５３１８−１５３２４，１９９４；Ｈａｔａｈｅｔ，  Ｚ．ら．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１８８１４−１８８２０，  １９９４；Ｂｏｉｔｅｕｘ，  Ｓ．ら，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，５，３１７７−３１８３，１９８７；Ｊｉａｎｇ，  Ｄ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２（５１），３２２２０−３２２２９，１９９７；Ｊｉａｎｇ，  Ｄ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔ，  １７９（１１），３７７３−３７８２，１９９７を参照のこと。
【０１９３】
いくつかのＤＮＡグリコシラーゼおよびＡＰエンドヌクレアーゼは、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｐｓｗｉｃｈ，  ＭＡから市販されている。
【０１９４】
本発明のある一部の実施形態において、ＡＰエンドヌクレアーゼによる切断のための基質である部位を含む伸長プローブが、ホスホロチオレート結合を含有する伸長プローブの上記のような配列決定法、または配列決定法ＡＢ（下記参照）に使用される。任意のこれらの方法では、伸長プローブのライゲーションにより核酸鎖を成長させた後、伸長プローブをＡＰエンドヌクレアーゼを用いて切断し、プローブの標識を含む部分を除去する。
【０１９５】
具体的なＡＰエンドヌクレアーゼに応じて、および配列決定が３’→５’または５’→３’方向のどちらで行なわれるかに応じて、切断後、伸長された二本鎖をポリヌクレオチドキナーゼまたはホスファターゼで処理し、伸長可能なプローブ末端を伸長された二本鎖上に生成させることが必要または望ましいことがある（伸長可能なプローブ末端を示す図５Ａおよび５Ｂ参照）。したがって、本発明のある特定の方法では、伸長可能な末端を、ポリヌクレオチドキナーゼまたはホスファターゼでの処理によって生成させる。当業者には、種々の酵素に適切なバッファーが使用され、酵素を除去し、該方法の後続の工程に適切な条件を提供するための洗浄するさらなる工程を含め得ることが認識されよう。
【０１９６】
他の実施形態において、伸長プローブは、ＤＮＡグリコシラーゼによる除去のための基質である損傷塩基を含む。広範な細胞傷害性および変異原性ＤＮＡ塩基が、ＤＮＡの損傷後に塩基切除修復経路を起始させる種々のＤＮＡグリコシラーゼによって除去される（Ｋｒｏｋａｎ，  Ｈ．Ｅ．ら，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，３２５（Ｐｔ  １）：１−１６，１９９７）。ＤＮＡグリコシラーゼは、損傷塩基とデオキシリボース間のＮ−グリコシド結合を切断し、したがって、遊離塩基を放出させ無プリン／無ピリミジン（ＡＰ）部位をもたらす。ある一部の実施形態において、伸長プローブは、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）によって除去されるウラシル残基を含む。ＵＤＧは、これまでに研究されたあらゆる生きた生物体に見られ、これらの酵素の多くが当該技術分野で知られており、本発明に有用である（Ｆｒｅｄｅｒｉｃａら，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９，  ２３５３−２５３７，１９９０；Ｋｒｏｋａｎ、前掲）。例えば、哺乳動物は、少なくとも４種類のＵＤＧ：ミトコンドリアＵＮＧ１および核ＵＮＧ２、ＳＭＵＧ１、ＴＤＧおよびＭＢＤ４を含む（Ｋｒｏｋａｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２１，８９３５−８９４８，２００２）。ＵＮＧ１およびＵＮＧ２は、大腸菌Ｕｎｇに代表される高度に保存されたファミリーに属する。伸長プローブが損傷塩基を含む実施形態では、伸長可能なプローブ末端への伸長プローブのライゲーション後、伸長された二本鎖を、損傷塩基除去するグリコシラーゼと接触させ、それにより無塩基残基を生成させる。グリコシラーゼによる除去に供された損傷塩基を含む伸長プローブは、「切れやすい連結を含むように容易に修飾可能である」とみなされる。次いで、伸長された二本鎖を、上記のような無塩基残基と隣接ヌクレオシド間の連結を切断するＡＰエンドヌクレアーゼと接触させる。本発明のある特定の実施形態において、ＤＮＡグリコシラーゼとＡＰエンドヌクレアーゼの両方である二重活性酵素は、これらの反応の両方を行うために使用される。ある一部の実施形態では、損傷塩基を含有する伸長された二本鎖を、ＤＮＡグリコシラーゼおよびＡＰエンドヌクレアーゼと接触させる。これらの酵素は、本発明の種々の実施形態において、組合せて、または連続的に（すなわち、グリコシラーゼの後エンドヌクレアーゼ）使用され得る。
【０１９７】
本発明のある一部の実施形態において、伸長プローブは、デオキシイノシンであるトリガー残基を含む。上記のように、大腸菌エンドヌクレアーゼＶ（Ｅｎｄｏ  Ｖ）（デオキシイノシン３’エンドヌクレアーゼともいわれる）およびその類縁体は、デオキシイノシン含有する核酸を、デオキシイノシン残基の３’側の第２のホスホジエステル結合で切断し、３’ＯＨおよび５’リン酸基末端をもたらす。したがって、この結合は、伸長プローブ内の切れやすい連結としての機能を果たす。Ｅｎｄｏ  Ｖおよびその切断特性は、当該技術分野で知られている（Ｙａｏ，  Ｍ．およびＫｏｗ  Ｙ．Ｗ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，３０６７２−３０６７３（１９９６）；Ｙａｏ，  Ｍ．およびＫｏｗ  Ｙ．Ｗ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２８６０９−２８６１６（１９９５）；Ｈｅ，  Ｂら、Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ．，  ４５９，  １０９−１１４（２０００）。デオキシイノシンに加え、Ｅｎｄｏ  Ｖはまた、デオキシウリジン、デオキシキサントシンおよびデオキシオキサノシンを認識する（Ｈｉｔｃｈｃｏｃｋ，  Ｔ．ら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３２（１３），３２（１３）（２００４）。ｍＥｎｄｏ  Ｖなどの哺乳動物の類縁体もまた切断活性を示す（Ｍｏｅ，  Ａ．ら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３１（１４），３８９３−３９００（２００４）。Ｅｎｄｏ  Ｖは、デオキシイノシンを含むプローブの好ましい切断剤であるが、他の切断試薬もまた、デオキシイノシンを含むプローブを切断するために使用され得る。例えば、損傷塩基としてヒポキサンチンが、適切なＤＮＡグリコシラーゼによる除去に供され得、生じた無塩基残基含有伸長プローブが、次いで、エンドヌクレアーゼによる切断に供される。
【０１９８】
デオキシイノシンがトリガー残基として使用される場合、プローブ内のどこか、特に、伸長可能なプローブ末端にライゲートされる末端とトリガー残基間の位置でのデオキシイノシンの使用を回避することが望ましいことがあり得ることは認識されよう。したがって、プローブが１つ以上の普遍塩基を含む場合、デオキシイノシン以外のヌクレオシドが使用され得る。また、トリガー残基を含有する核酸を、ある特定の切断剤による切断に感受性にするトリガー残基が伸長プローブ内に使用される場合、同じ切断剤による切断を誘発し得る他の残基をプローブ内に（または該伸長プローブとともに配列決定反応に使用され得る他のプローブ内に）を含めることを回避することが望ましいことがあり得ることも認識されよう。
【０１９９】
本発明は、トリガー残基を含む核酸を切断する任意の酵素の使用を包含する。さらなる酵素は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標），  Ｉｎｃ．などの酵素供給業者のカタログを調べることにより特定され得る。Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログ，  ２００５版（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｐｓｗｉｃｈ，  ＭＡ  ０１９３８−２７２３）は、引用により本明細書に組み込まれ、本発明では、そこに開示されたトリガー残基を含有する核酸を切断する任意の酵素、またはかかる酵素の類縁体の使用が想定される。有用な他の酵素としては、例えば、ｈＯＧＧ１およびその類縁体が挙げられる（Ｒａｄｉｃｅｌｌａ，  ＪＰら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｅｉ  ＵＳＡ．，９４（１５）：８０１０−５，１９９７）。
【０２００】
損傷塩基、無塩基残基などのトリガー残基を含有するオリゴヌクレオチドを合成するための方法は、当該技術分野で知られている。ＡＰエンドヌクレアーゼの基質である部位を含有するオリゴヌクレオチド、例えば、無塩基残基を含有するオリゴヌクレオチド合成するための方法は、当該技術分野で知られており、一般的に自動固相オリゴヌクレオチド合成に適している。ある一部の実施形態において、ウリジンを無塩基残基の所望の位置に含有するオリゴヌクレオチドを合成する。次いで、該オリゴヌクレオチドを、ＵＤＧなどのウラシルを除去する酵素で処理し、それにより、該オリゴヌクレオチド内のどこかにウリジンが存在した無塩基残基を生成させる。
【０２０１】
本発明のある一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは、Ｎａｕｗｅｌａｅｒｔｓ，  Ｋ．ら，  Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，３１（２３），２００３に記載された二糖ヌクレオシドを含む。ライゲーション後、伸長された二本鎖を、過ヨウ素酸塩（ＮａＩＯ４）を用いて切断した後、塩基（例えば、ＮａＯＨ）で処理して標識を除去し、遊離３’ＯＨおよびＰ５−ＯＰＯ３Ｈ２基を生成させる。配列決定が３’→５’または５’→３’方向のどちらで行なわれるかに応じて、伸長された二本鎖をポリヌクレオチドキナーゼまたはホスファターゼで処理し、伸長可能な末端を生成させることが必要または望ましいことがある。したがって、本発明のある特定の方法では、伸長可能な末端は、ポリヌクレオチドキナーゼまたはホスファターゼでの処理によって生成される。
【０２０２】
二糖ヌクレオシドを含むポリヌクレオチドは、無塩基残基を含むとみなされる。例えば、一方のヌクレオチドの３’ＯＨと次のヌクレオチドの５’リン酸基との間に挿入されたリボース残基を含有するポリヌクレオチドは、無塩基残基を含むとみなされる。
【０２０３】
キャッピング  
場合によっては、伸長可能な末端を有するプローブの全部未満が、伸長、ライゲーションおよび切断の各サイクルにおいて成功裏のライゲーション反応に関与する。かかるプローブが継続されるサイクルに関与する場合、各ヌクレオチド同定工程の精度が進行的に低下し得ることは認識されよう。本発明者らは、ホスホロチオレート連結を含有する伸長プローブの使用により、高効率でのライゲーションが可能になることを示したが、本発明のある特定の実施形態では、ライゲーションを行なわない伸長可能な末端が後続のサイクルに関与するのを抑制するためにキャッピング工程を含める。３’−Ｏ−Ｐ−Ｓ−５’ホスホロチオレート結合を含有する伸長プローブを用いる５’→３’方向における配列決定の場合、キャッピングは、例えばライゲーションまたは検出工程後に、ライゲートされない伸長可能な末端をＤＮＡポリメラーゼで伸長させ、伸長不可能な部分（例えば、ジデオキシヌクレオチドまたはヌクレオチドなどの連鎖停止ヌクレオチド）にブロッキング部分を結合させることにより行なわれ得る。３’−Ｓ−Ｐ−Ｏ−５’ホスホロチオレート結合が伸長プローブを用いる３’→５’方向の配列決定の場合、キャッピングは、例えばライゲーションまたは検出工程後に、例えば、鋳型をホスファターゼで処理することにより行なわれ得る。他のキャッピング方法もまた使用され得る。
【０２０４】
Ｈ．オリゴヌクレオチドプローブファミリーを用いる配列決定
上記の配列決定法を集合的に「方法Ａ」といい、該方法では、任意の特定の伸長プローブ結合された標識と、プローブの近位末端（すなわち、伸長された二本鎖の伸長可能なプローブ末端ライゲートされた末端）の１つ以上のヌクレオチドの正体との間に直接的で既知の対応がある。したがって、新たにライゲートされた伸長プローブの標識を
同定することは、鋳型内の１つ以上ヌクレオチドを同定するのに充分である。本発明は、集合的に「方法ＡＢ」と称し、これもまた、伸長、ライゲーションおよび、好ましくは切断の連続的サイクルを伴い、ヌクレオチド同定に対する異なるアプローチが採用された、さらなる配列決定法を提供する。
【０２０５】
本発明は、少なくとも２つの識別可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブファミリーのコレクションを使用する配列決定法ＡＢを提供する。各プローブファミリーは、標識に基づいた名称、例えば、「赤色」、「青色」、「黄色」、「緑色」に割り当てられる。上記の方法のように、伸長は、初期オリゴヌクレオチドおよび鋳型によって形成された二本鎖から開始される。初期オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドプローブをその末端にライゲートして伸長された二本鎖を形成させ、次いで、これを、ライゲーションの連続的サイクルによって反復的に伸長させることにより伸長される。伸長された二本鎖のたった１回の伸長が１サイクルで起こるように、プローブは伸長不可能な部分を、末端位置に（二本鎖の成長核酸鎖にライゲートされたヌクレオチドと反対のプローブ末端に）有する。各サイクル中、成功裏にライゲートされたプローブ上の、またはこれと会合させた標識が検出され、伸長不可能な部分が除去または修飾されて、伸長可能な末端が生成する。標識の検出により、プローブが属するプローブファミリー名が特定される。
【０２０６】
伸長、ライゲーションおよび検出の連続的なサイクルにより、一連の標識名の序列がもたらされる。標識は、連続的な位置の鋳型にハイブリダイズする成功裏にライゲートされたプローブが属するプローブファミリーに対応する。プローブは、ライゲーション後、鋳型内の異なるヌクレオチドと反対の位置に位置する近位末端を有する。したがって、プローブファミリー名の順序と鋳型内のヌクレオチドの順序との間に対応がある。
【０２０７】
切れやすい連結が、伸長プローブ内の近位ヌクレオシドと隣接するヌクレオシド間に位置する本発明の実施形態では、プローブファミリーの序列リスト名は、伸長されたオリゴヌクレオチドプローブが、各サイクルで１つのヌクレオチドによって伸長されるため、単一の初期オリゴヌクレオチドから開始される伸長、ライゲーション、検出および切断の連続的サイクルによって得られ得る。切れやすい連結がその他の２つのヌクレオシド間に位置する場合は、プローブファミリーの序列リスト名は、配列決定法Ａで記載のような、結合反応において異なる位置にハイブリダイズする初期オリゴヌクレオチドが使用される複数の配列決定反応から得られる結果から合成される。
【０２０８】
新たにライゲートされたプローブがどのプローブファミリーに属するかがわかることは、それ自体では、鋳型内のヌクレオチドの正体を決定するのに充分でない。それどころか、それどころか、プローブファミリー名が決定されることは、ヌクレオチドのある特定の組合せが、プローブの少なくとも一部分の配列である可能性を排除するが、各ヌクレオチドの正体に少なくとも２つの可能性が残る。したがって、さらなる情報の非存在下で、プローブファミリー名がわかることにより、新たにライゲートされたプローブ内のヌクレオチドと反対の位置に位置する鋳型内のヌクレオチドの正体に少なくとも２つの可能性が残されたままになる。したがって、伸長、ライゲーション、検出（および、任意選択で切断）任意の１サイクルは、それ自体では、任意の鋳型内のヌクレオチドが同定されない。しかしながら、鋳型の配列の１つ以上の可能性の排除は可能にし、それにより配列に関する情報が提供される。本発明のある特定の実施形態において、後述のようなプローブおよびプローブファミリーの適切な設計により、鋳型の配列が、さらに決定され得る。したがって、本発明のある特定の実施形態において、配列決定法ＡＢは、２つの段階：プローブファミリーの序列リスト名を得る第１の段階、および序列リストをデコード化して鋳型の配列を決定する第２の段階を含む。
【０２０９】
特に記載のない限り、配列決定法ＡおよびＡＢでは、一般的に、プローブの合成、鋳型の調製、ならびに伸長、ライゲーション、切断および検出の工程の実施に、類似した方法を用いる。
【０２１０】
配列決定方法ＡＢのためのオリゴヌクレオチド伸長プローブおよびプローブファミリーの特徴
配列決定法ＡＢにおける使用のためのプローブファミリーは、各プローブファミリーが、異なる配列の複数の標識されたオリゴヌクレオチドプローブを配列内の各位置に含み、プローブファミリーが、該位置に異なる塩基を有する少なくとも２つのプローブを含むことを特徴とする。各プローブファミリー内のプローブは同じ標識を含む。好ましくは、プローブは切れやすいヌクレオシド間結合を含む。切れやすい連結は、プローブ内の任意の場所に位置し得る。好ましくは、プローブは、リガーゼによって伸長可能でない部分を一方の末端に有する。好ましくは、プローブは、切れやすい連結と、リガーゼによって伸長可能でない部分との間の位置で標識されており、その結果、伸長可能なプローブ末端へのプローブのライゲーション後、切れやすい連結の切断により、伸長可能なプローブ末端にライゲートされる非標識部分、および非標識部分にはもはや結合されない標識された部分がもたらされる。
【０２１１】
各プローブファミリー内のプローブは、好ましくは、少なくともｊ個のヌクレオシドＸを含み、ここで、ｊは少なくとも２であり、このとき各Ｘは、プローブファミリー内のプローブにおいて少なくとも２重に縮重している。各プローブファミリー内のプローブは、さらに、少なくともｋ個のヌクレオシドＮを含み、ここで、ｋは少なくとも２であり、Ｎは、任意のヌクレオシド表す。一般に、ｊ＋ｋは１００以下であり、典型的には３０以下である。ヌクレオシドＸは、プローブ内の任意の場所に位置し得る。ヌクレオシドＸは、連続的な位置する必要はない。同様に、ヌクレオシドＮは、連続的な位置する必要はない。換言すると、ヌクレオシドＸおよびＮは散在させ得る。それにもかかわらず、ヌクレオシドＸは、５’→３’配列を有するとみなされ得る。ヌクレオシドは連続的である必要はないと理解され得る。例えば、構造ＸＡＮＸＧＮＮＸＣＮのプローブ内のヌクレオシドＸは、配列ＡＧＣを有するとみなされ得る。同様に、ヌクレオシドＮは、配列を有するとみなされ得る。
【０２１２】
ヌクレオシドＸ同一であっても異なっていてもよいが、独立して選択されない、すなわち、各Ｘの正体は、プローブ内の１つ以上他のヌクレオシドＸの正体によって拘束される。したがって、一般的に、ヌクレオシドＸのある特定の組合せのみが、任意の特定のプローブおよび任意の特定のプローブファミリー内のプローブにおいて存在する。換言すると、各プローブにおいて、ヌクレオシドＸの配列は、長さｊの可能な全ての配列の部分集団のみを表し得る。したがって、Ｘの１つ以上のヌクレオチドの正体により、他方のヌクレオシドの１つ以上の可能な正体が制限される。
【０２１３】
ヌクレオシドＮは、好ましくは、独立して選択され、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ（あるいは、任意選択で縮重低減性ヌクレオシド）であり得る。好ましくは、ヌクレオシドＮの配列は、１つ以上のＮが縮重低減性ヌクレオシドであり得る以外は、長さｋの可能な全ての配列を表し、したがって、プローブは、２つの部分を含有し、そのうち、ヌクレオシドＮからなる部分は非拘束部分とよばれ、ヌクレオシドＸからなる部分は、拘束部分とよばれる。上記のように、該部分は、連続的なヌクレオシドである必要はない。拘束部分および非拘束部分を含有するプローブは、本明細書において部分拘束プローブという。好ましくは、拘束部分内の１個以上のヌクレオシドは、プローブの近位端、すなわち、伸長可能なプローブ末端にライゲートされるヌクレオシドを含有する末端（これは、種々の本発明の実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブ５’または３’末端のいずれかであり得る）に存在する。
【０２１４】
任意のオリゴヌクレオチドプローブの拘束部分は、ある特定の配列のみを有するものであり得るため、プローブの拘束部分内のヌクレオシドの１つ以上の正体がわかることは、他方のヌクレオシドの１つ以上に関する情報を提供する。該情報は、他方のヌクレオシドの１つ以上を正確に同定するのに充分である場合もそうでない場合もあるが、拘束部分の他方のヌクレオシドの１つ以上の正体の１つ以上の可能性を排除するには充分である。配列決定法ＡＢのある特定の好ましい実施形態において、プローブの拘束部分の１つのヌクレオシドの正体がわかることは、拘束部分の他方のヌクレオシドの各々を正確に同定する、すなわち、拘束部分を含むヌクレオシドの正体および順序を決定するのに充分である。
【０２１５】
上記の配列決定法のように、鋳型に相補的な伸長プローブ内の最も近位ヌクレオシドは、初期オリゴヌクレオチドの伸長可能な末端にライゲートされ（伸長、ライゲーションおよび検出の第１のサイクル）、伸長、ライゲーションおよび検出の後続のサイクルでは、伸長されたオリゴヌクレオチドプローブの伸長可能な末端にライゲートされる。検出により、新たにライゲートされたプローブが属するプローブファミリー名が決定される。プローブの拘束部分内の各位置は、少なくとも２重に縮重しているため、プローブファミリー名は、それ自体では、拘束部分内の任意のヌクレオチドが同定されない。しかしながら、拘束部分の配列は、長さｊの可能な全ての配列の部分集団の１つであるため、プローブファミリーが同定されることにより、拘束部分の配列のある特定の可能性が排除される。プローブの拘束部分は、その配列決定部分を構成する。したがって、属するプローブファミリーが同定されることによってプローブの拘束部分の１個以上のヌクレオシドの
正体の１つ以上の可能性が排除されることにより、伸長プローブハイブリダイズする鋳型内のヌクレオチドの正体１つ以上の可能性が排除される。本発明の好ましい実施形態において、部分拘束プローブは、切れやすい連結を任意の２つのヌクレオシド間に含む。
【０２１６】
ある特定の実施形態において、部分拘束プローブは、一般構造（Ｘ）ｊ（Ｎ）ｋを有し、式中、Ｘは、ヌクレオシドを表し、（Ｘ）ｊは各位置で少なくとも２重に縮重しており、そのため、Ｘは、異なる塩基対合特異性を有する任意の少なくとも２ヌクレオシドであり得、Ｎは任意のヌクレオシドを表し、ｊは少なくとも２であり、ｋは１〜１００であり、少なくとも１つのＮまたはプローブ末端のＸ以外のＸは検出可能な部を含む。好ましくは、（Ｎ）ｋ独立して、各位置で４重に縮重しており、そのため、各プローブにおいて、（Ｎ）ｋは、（Ｎ）ｋの１つ以上の位置が縮重低減性ヌクレオチドで占められ得る以外は、長さｋの可能な全ての配列を表す。（Ｘ）ｊ内のヌクレオシドは同一であっても異なっていてもよいが、独立して選択されない。換言すると、各プローブにおいて、（Ｘ）ｊは、長さｊの可能な全ての配列の部分集団のみを表し得る。したがって、（Ｘ）ｊの１つ以上のヌクレオチドの正体により、他方のヌクレオシドの１つ以上の可能な正体が制限される。したがって、プローブは２つの部分を含有し、その（Ｎ）ｋは非拘束部分であり、（Ｘ）ｊは拘束部分である。
【０２１７】
本発明のある特定の好ましい実施形態において、部分拘束プローブは、構造５’−（Ｘ）ｊ（Ｎ）ｋＮＢ＊−３’または３’−（Ｘ）ｊ（Ｎ）ｋＮＢ＊−５’（式中、Ｎは任意のヌクレオシド表し、ＮＢはリガーゼによって伸長可能でない部分を表し、＊は検出可能な部分を表し、（Ｘ）ｊは、各位置で少なくとも２重に縮重しているプローブの拘束部分であり、（Ｘ）ｊ内のヌクレオシドは同一であっても異なっていてもよいが、独立して選択されない、少なくとも１つのヌクレオシド間結合は切れやすい連結であり、ｊは少なくとも２であり、ｋは１〜１００である、ただし、検出可能な部分は、任意のヌクレオシドＮまたはプローブ末端のＸ以外のＸ上に、ＮＢの代わりまたはこれに加えて存在し得るものとする）を有する。切れやすい連結は、（Ｘ）ｊ内の２つのヌクレオシド間、（Ｘ）ｊ内の最も遠位ヌクレオチドと（Ｎ）ｋの最も近位ヌクレオシド間、（Ｎ）ｋ内のヌクレオシド間、または（Ｎ）ｋ内の末端ヌクレオシドとＮＢ間に存在し得る。好ましくは、切れやすい連結はホスホロチオレート結合である。
【０２１８】
別のより好ましい本発明の実施形態では、プローブは、構造５’−（ＸＹ）（Ｎ）ｋＮＢ＊−３’または３’−（ＸＹ）（Ｎ）ｋＮＢ＊−５’（式中、Ｎは任意のヌクレオシド表し、ＮＢはリガーゼによって伸長可能でない部分を表し、＊は検出可能な部分を表し、ＸＹはプローブの拘束部分であり、ここで、ＸおよびＹは、同一または異なるが独立して選択されないヌクレオシドを表し、ＸおよびＹは少なくとも２重に縮重しており、少なくとも１つのヌクレオシド間結合は切れやすい連結であり、ｋは１〜１００（両端を含む）である、ただし、検出可能な部分は、任意のヌクレオシドＮまたはプローブ末端のＸ以外のＸ上に、ＮＢの代わりまたはこれに加えて存在し得るものとする）を有する。好ましくは、切れやすい連結はホスホロチオレート結合である。構造５’−（ＸＹ）（Ｎ）ｋＮＢ＊−３’を有するプローブは、５’→３’方向の配列決定に有用である。構造３’−（ＸＹ）（Ｎ）ｋＮＢ＊−５’  を有するプローブは、３’→５’方向の配列決定に有用である。
【０２１９】
ある特定の好ましいプローブの構造を、以下により詳細に示す。５’→３’方向の配列決定には、構造５’−Ｏ−Ｐ−Ｏ−（Ｘ）ｊ（Ｎ）ｋ−Ｏ−Ｐ−Ｓ−（Ｎ）ｉＮＢ＊−３’（式中、Ｎは任意のヌクレオシドを表し、ＮＢはリガーゼによって伸長可能でない部分を表し、＊は検出可能な部分を表し、（Ｘ）ｊは、各位置で少なくとも２重に縮重しているプローブの拘束部分であり、（Ｘ）ｊ内のヌクレオシドは同一であっても異なっていてもよいが、独立して選択されない、ｊは少なくとも２であり、（ｋ＋ｉ）は１〜１００であり、ｋは１〜１００であり、ｉは０〜９９である、ただし、検出可能な部分は、（Ｎ）ｉの任意のヌクレオシド上にＮＢの代わりまたはこれに加えて存在し得るものとする）を有する部分拘束プローブ。本発明のある特定の実施形態において、（Ｘ）ｊは（ＸＹ）であり、ここで、ＸおよびＹは、少なくとも２重に縮重しており、同一または異なるが独立して選択されないヌクレオチドを表す。本発明のある特定の実施形態において、ｉは０である。
【０２２０】
５’→３’方向の配列決定のための他の好ましいプローブは、構造５’−Ｏ−Ｐ−Ｏ−（Ｘ）ｊ−Ｏ−Ｐ−Ｓ−（Ｎ）ｉＮＢ＊−３’を有し、式中、Ｎは任意のヌクレオシドを表し、ＮＢはリガーゼによって伸長可能でない部分を表し、＊は検出可能な部分を表し、（Ｘ）ｊは、各位置で少なくとも２重に縮重しているプローブの拘束部分であり、（Ｘ）ｊ内のヌクレオチドは同一であっても異なっていてもよいが、独立して選択されない、ｊは少なくとも２であり、ｉは１〜１００である、ただし、（Ｎ）ｉの任意のヌクレオシド上に、ＮＢの代わりまたはこれに加えて存在し得るものとする。本発明のある特定の実施形態において、（Ｘ）ｊは（ＸＹ）であり、ここで、位置ＸおよびＹは少なくとも２重に縮重しており、ＸおよびＹは、同一または異なるが独立して選択されないヌクレオシドを表す。５’→３’方向の配列決定のためのまた他の好ましいプローブは、構造５’−Ｏ−Ｐ−Ｏ−（Ｘ）ｊ−Ｏ−Ｐ−Ｓ−（Ｘ）ｋ（Ｎ）ｉＮＢ＊−３’を有し、式中、Ｎは任意のヌクレオシドを表し、ＮＢはリガーゼによって伸長可能でない部分を表し、＊は検出可能な部分を表し、（Ｘ）ｊ−Ｏ−Ｐ−Ｓ−（Ｘ）ｋは、各位置で少なくとも２重に縮重しているプローブの拘束部分であり、（Ｘ）ｊ−Ｏ−Ｐ−Ｓ−（Ｘ）ｋ内の位置は少なくとも２重に縮重しており、同一であっても異なっていてもよいが、独立して選択されない、ｊおよびｋはともに少なくとも１であり、（ｊ＋ｋ）は少なくとも２（例えば、２、３、４または５）であり、ｉは１〜１００である、ただし、検出可能な部分は、（Ｎ）ｉの任意のヌクレオシド上に、ＮＢの代わりまたはこれに加えて存在し得るものとする。
【０２２１】
本発明のある特定の実施形態において、ｊおよびｋはともに１である。
【０２２２】
３’→５’方向の配列決定では、構造５’−ＮＢ＊（Ｎ）ｉ−Ｓ−Ｐ−Ｏ−（Ｎ）ｋ−Ｏ−Ｐ−Ｏ−（Ｘ）ｊ−３’（式中、Ｎは任意のヌクレオシドを表し、ＮＢはリガーゼによって伸長可能でない部分を表し、＊は検出可能な部分を表し、（Ｘ）ｊは、各位置で少なくとも２重に縮重しているプローブの拘束部分であり、（Ｘ）ｊ内のヌクレオシドは同一であっても異なっていてもよいが、独立して選択されない、ｊは少なくとも２であり、（ｋ＋ｉ）は１〜１００であり、ｋは１〜１００であり、ｉは０〜９９である、ただし、検出可能な部分は、（Ｎ）ｉの任意のヌクレオシド上に、ＮＢの代わりまたはこれに加えて存在し得るものとする）を有する部分拘束プローブ。本発明のある特定の実施形態において、（Ｘ）ｊは（ＸＹ）であり、ここで、ＸおよびＹ少なくとも２重に縮重しており、同一または異なるが独立して選択されないヌクレオシドを表す。本発明のある特定の実施形態において、ｉは０である。
【０２２３】
３’→５’方向の配列決定のための他の好ましいプローブは、構造５’−ＮＢ＊（Ｎ）ｉ−Ｓ−Ｐ−Ｏ−（Ｘ）ｊ−３’を有し、式中、Ｎは任意のヌクレオシドを表し、ＮＢはリガーゼによって伸長可能でない部分を表し、＊は検出可能な部分を表し、（Ｘ）ｊは、各位置で少なくとも２重に縮重しているプローブの拘束部分であり、（Ｘ）ｊ内のヌクレオシドは同一であっても異なっていてもよいが、独立して選択されない、ｊは少なくとも２であり、ｉは１〜１００である、ただし、検出可能な部分は、（Ｎ）ｉの任意のヌクレオシド上に、ＮＢの代わりまたはこれに加えて存在し得るものとする。本発明のある特定の実施形態において、（Ｘ）ｊは（ＸＹ）であり、ここで、ＸおよびＹ少なくとも２重に縮重しており、同一または異なるが独立して選択されないヌクレオシドを表す。本発明のある特定の実施形態において、ｊは２〜５であり、例えば、任意の部分拘束プローブにおいて２、３、４または５である。
【０２２４】
３’→５’方向の配列決定のためのまた他の好ましいプローブは、構造５’−ＮＢ＊（Ｎ）ｉ−Ｓ−Ｐ−Ｏ−（Ｘ）ｋ−Ｏ−Ｐ−Ｏ−（Ｘ）ｊ−３’（式中、Ｎは任意のヌクレオシドを表し、ＮＢはリガーゼによって伸長可能でない部分を表し、＊は検出可能な部分を表し、−（Ｘ）ｋ−Ｏ−Ｐ−Ｏ−（Ｘ）ｊは、各位置で少なくとも２重に縮重しているプローブの拘束部分であり、−（Ｘ）ｋ−Ｏ−Ｐ−Ｏ−（Ｘ）ｊ内のヌクレオシドは同一であっても異なっていてもよいが、独立して選択されない、ｊおよびｋはともに少なくとも１であり、（ｊ＋ｋ）は少なくとも２（例えば、２、３、４または５）であり、ｉは１〜１００である、ただし、検出可能な部分は、（Ｎ）ｉの任意のヌクレオシド上に、ＮＢの代わりまたはこれに加えて存在し得るものとする）を有する。ある特定の実施形態において、ｊ＝１およびｋ＝１である。
【０２２５】
切れやすい連結が（Ｘ）ｊの最も近位ヌクレオシドと（Ｘ）ｊの次に最も近位ヌクレオシドとの間に位置する本発明の実施形態では、プローブファミリーの序列リスト名は、伸長されたオリゴヌクレオチドプローブが、各サイクルで１つのヌクレオチドによって伸長されるため、単一の初期オリゴヌクレオチドから開始される伸長、ライゲーション、検出および切断の連続的サイクルによって得られ得る。切れやすい連結が、その他の２つのヌクレオシド間に位置する本発明の実施形態では、プローブファミリーの序列リスト名は、配列決定法Ａで記載のような、結合反応において異なる位置にハイブリダイズする初期オリゴヌクレオチドが使用される複数の配列決定反応から得られる結果から合成される。
【０２２６】
上記のもの以外の任意の多数の構造を有するプローブが、配列決定法ＡＢに使用され得ることは理解されよう。例えば、プローブは、ＸＮＹ（Ｎ）ｋ（式中、拘束されたヌクレオシドＸおよびＹは隣接してない）、またはＸＩＹ（Ｎ）ｋ（式中、Ｉは普遍塩基である）などの構造を有するものであり得る。（Ｎ）ｋＸ（Ｎ）ｌ、（Ｎ）ｉＸ（Ｎ）ｊＹ（Ｎ）ｋＺ（Ｎ）ｌ、（Ｎ）ｉＸ（Ｎ）ｊＹＩＺ（Ｎ）ｌおよび（Ｎ）ｉＸ（Ｎ）ｊＹ（Ｎ）ｋＺ（Ｉ）ｌは、さらなる可能性を表す。上記のプローブのように、これらのプローブは、切れやすい連結、検出可能な部分、および一方の末端にリガーゼによって伸長可能でない部分を含む。好ましくは、プローブは、リガーゼによって伸長可能でない部分と反対のプローブ末端のヌクレオチドに結合された検出可能な部分含まない。任意のこれらの構造または他のものを有するプローブを含むプローブファミリーは、各プローブファミリーが異なる配列の複数の標識されたプローブを含み、配列内の各位置において、プローブファミリーが、該位置に異なる塩基を有する少なくとも２つのプローブを含むという基準を満たす。好ましくは、各プローブ内のヌクレオシドの総数は１００以下、例えば３０以下である。
【０２２７】
オリゴヌクレオチド伸長プローブファミリーのコード化。本発明の配列決定法は、コード化されたプローブファミリーを利用するものである。「コード化」は、ある特定の標識を、規定の１組の配列の１つを有する部分を含むプローブと会合させ、その結果、該規定の組の配列のメンバーである配列を有する部分を含むプローブが該標識で標識されるスキームをいう。一般に、コード化では、複数の識別可能な標識の各々を１つ以上プローブと会合させ、その結果、各識別可能な標識が異なる群のプローブと会合され、各プローブがたった１つの標識（これは、検出可能な部分の組合せを含み得る）によって標識される。好ましくは、各プローブ群のプローブは、各々、同じ規定の組の配列のメンバーである配列を有する部分を含む。該部分は、単一のヌクレオシドであってもよく、多くのヌクレオシド長、例えば、２、３、４、５またはそれ以上のヌクレオシド長であってもよい。該部分の長さは、完全長のプローブ小画分のみを構成するものであってもよく、プローブ全体を構成するものであってもよい。規定の組の配列は、単一の配列のみを含むものであってもよく、該部分の長さに応じて、任意の数の異なる配列を含むものであってもよい。例えば、該部分が単一のヌクレオシドである場合、規定の組の配列は、最大４つの要素（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）  を有し得る。部分が２つのヌクレオシド長である場合、規定の組の配列は、１６個までの要素（ＡＡ、ＡＧ、ＡＣ、ＡＴ、ＧＡ、ＧＧ、ＧＣ、ＧＴ、ＣＡ、ＣＧ、ＣＣ、ＣＴ、ＴＡ、ＴＧ、ＴＣ、ＴＴ）  を有し得る。一般に、規定の組の配列は、可能な配列の総数よりも少数の要素を含み、コード化では、１つより多くの規定の組の配列を用いる。
【０２２８】
本明細書に記載した配列決定法Ａでは、一般的に、近位ヌクレオシドプローブ内の（すなわち、伸長可能なプローブ末端にライゲートされたヌクレオシド）と標識の正体との間に直接的な対応がある単一のコード化を有する１組のプローブを利用する。近位ヌクレオシドは、鋳型内でハイブリダイズするヌクレオチドに相補的であり、そのため、新たにライゲートされたプローブの近位ヌクレオシドの正体により、伸長された二本鎖の位置と反対側に位置する鋳型内のヌクレオチドの正体が決定される。一般的な意味において、本明細書に記載の他方の配列決定法に有用なプローブは、構造Ｘ（Ｎ）ｋを有し、式中、Ｘは近位ヌクレオシドであり、各ヌクレオシドＮは４重に縮重しており、そのため、長さｋの可能な全ての配列が、該プローブを構成するオリゴヌクレオチドプローブ分子のプールに提示される。したがって、例えば、一部のオリゴヌクレオチドプローブ分子がＡを位置ｋ＝１に含有する場合、あるものはＧを位置ｋ＝１に含有し、あるものはＣを位置ｋ＝１に含有し、あるものはＴを位置ｋ＝１に含有し、他の位置ｋについても同様であり、（Ｎ）ｋ内のＸに隣接するヌクレオシドは位置ｋ＝１を占めるとみなされる；（Ｎ）ｋ内の次のヌクレオシドは位置ｋ＝２を占めるとみなされるなどである。しかしながら、任意の所与のオリゴヌクレオチドプローブにおいて、Ｘは、たった１つの塩基対合特異性を表し、これは、典型的には、ある特定のヌクレオシドの正体、例えば、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴに対応する。したがって、Ｘは、典型的には、ある特定のプローブを構成するプローブ分子のプール内で均一にＡ、Ｇ、ＣまたはＴである。図２は、構造Ｘ（Ｎ）ｋを有するプローブの適当なコード化を示す。このコード化によれば、Ｘ＝Ｃを有するプローブは標識「赤色」に割り当てられる；Ｘ＝Ａを有するプローブは標識「黄色」に割り当てられる；Ｘ＝Ｇを有するプローブは標識「緑色」に割り当てられる；およびＸ＝Ｔを有するプローブは標識「青色」に割り当てられる。したがって、プローブの配列決定部分とその標識間に１対１対応が存在する。
【０２２９】
新たにライゲートされた伸長プローブの標識の正体が、伸長プローブの最も近位ヌクレオシドの正体に対応する上記のアプローチは、標識の正体が伸長プローブ最も近位ヌクレオシドのみの正体に対応するのではなく、伸長プローブ内の最も近位の２つ以上のヌクレオシドの配列に対応し、その結果、鋳型内の多数のヌクレオチドの正体が、伸長、ライゲーションおよび検出の１サイクルで決定され得る（典型的には、その後、切断を行なう）コード化を包含するように拡張され得ることは認識されよう。しかしながら、かかるコード化は、依然として標識をオリゴヌクレオチド伸長プローブ内の単一の配列に会合させるものであり得、そのため、対向する位置にある鋳型内の相補的なヌクレオチドの正体が同定され得る。例えば、上記のように、１サイクルで２つのヌクレオチドを同定するためには、各々が対応する標識を有する（すなわち、１６種類の識別可能な標識）１６種類の異なるオリゴヌクレオチドプローブが必要とされ得る。
【０２３０】
配列決定法ＡＢでは、標識をプローブと会合させる代替的なアプローチを用いる。標識の正体とプローブの配列決定部分の配列間の１対１対応ではなく、同じ標識を、異なる配列決定部分を有する多数のプローブに割り当てる。プローブは部分的に拘束されており、プローブの拘束部分がその配列決定部分である。したがって、同じ標識が、各々が異なる配列拘束部分を有し、該配列が規定の１組の配列の１つである複数の異なるプローブに割り当てられる。上記のように、同じ標識を含むプローブは、「プローブファミリー」を構成する。該方法では、各々が異なる配列の拘束部分を有し、該配列が規定の１組の配列の１つである複数のプローブを含む複数のかかるプローブファミリーを用いる。
【０２３１】
複数のプローブファミリーをプローブファミリーの「コレクション」という。プローブファミリーのコレクション内の各プローブファミリー内のプローブは、該コレクション内の他のプローブファミリーを標識するために使用される標識と識別可能な標識で標識されている。各プローブファミリーは、好ましくは、その独自の規定の組の配列を有する。好ましくは、各プローブファミリー内のプローブの拘束部分は同じ長さであり、好ましくは、プローブファミリーのコレクション内のプローブファミリーの拘束部分は同じ長さである。好ましくは、プローブファミリーのコレクション内のプローブファミリーの規定配列の組の組合せは、拘束部分の長さの可能な全ての配列を含む。好ましくは、プローブファミリーのコレクションは、４つの識別可能に標識されたプローブファミリーを含むか、または外ファミリーからなる。好ましくは、プローブの拘束部分は２ヌクレオシド長である。
【０２３２】
広範なさまざまな異なるようにコード化された識別可能に標識されたプローブファミリーのコレクションが上記の基準を満足し、本発明の方法を実施するために使用され得る。しかしながら、ある特定のプローブファミリーのコレクションが好ましい。部分拘束プローブを含む４つの識別可能に標識されたプローブファミリーの好ましいコレクションの例示的なコード化を図２５Ａに示す。図２５Ａに示すように、拘束部分は、プローブ内の２つの最も３’側のヌクレオシドからなる。プローブファミリーは、「赤色」、「黄色」、「緑色」および「青色」に標識される。各プローブファミリー内のプローブは、その配列が規定の１組の配列の１つであり、該規定の組は各プローブファミリーで異なる拘束部分を含む。例えば、プローブの近位端であるみなされる各配列の３’末端からから始めると、「赤色」プローブファミリーの規定の組の配列は｛ＣＴ、ＡＧ、ＧＡ、ＴＣ｝である；「黄色」のプローブファミリーの規定の組の配列は｛ＣＣ、ＡＴ、ＧＧ、ＴＡ｝である；「緑色」のプローブファミリーの規定の組の配列は｛ＣＡ、ＡＣ、ＧＴ、ＴＧ｝である；「青色」のプローブファミリーの規定の組の配列は｛ＣＧ、ＡＡ、ＧＣ、ＴＴ｝である。各規定の組は、その他の組の１つに存在する任意のメンバーを含まず、好ましい特徴である。また、プローブファミリーのコレクション内のプローブファミリーの規定配列の組の組合せは、長さ２の可能な全ての配列、すなわち、可能な全てのジヌクレオシドを含む。このプローブファミリーのコレクションの別の特徴（好ましいが必要ではない）は、プローブの拘束部分内の各位置が、４重に縮重している、すなわちＡ、Ｇ、ＣまたはＴのいずれかで占められ得ることである。このプローブファミリーのコレクションの別の特徴（好ましいが必要ではない）は、規定配列の組の各々において、たった１つの配列が、任意の特異的ヌクレオシドを任意の位置に、例えば、最も近位の位置または任意の他の位置に有することである。規定配列の組の各々において、たった１つの配列が、任意の特異的ヌクレオシドを拘束部分内の２位以降に（最も近位ヌクレオシドを１位とみなす）を有することは特に好ましいが必要ではない。例えば、赤色プローブファミリーの規定の組の配列において、たった１つの配列がＴを２位に有する；たった１つの配列がＧを２位に有する；たった１つの配列がＡを２位に有する；たった１つの配列がＣを２位に有する。
【０２３３】
図２５Ａに示したものなどの任意の特定のコード化が与えられると、プローブファミリーの１つのプローブの拘束部分内の１個以上のヌクレオシドの正体がわかることにより、該プローブの拘束部分内の他方のヌクレオチドに関する情報が提供される。最も一般的な意味において、プローブファミリー内のプローブの拘束部分内の１個以上のヌクレオシドの正体がわかることにより、該プローブファミリーの規定の組の配列は、該正体を該位置を有するヌクレオシドを有する配列を含まないため、他方の位置の１つにおけるヌクレオシドの１つ以上の可能な正体を排除するのに充分な情報が提供される。典型的には、プローブファミリー内のプローブの拘束部分内の１個以上のヌクレオシドの正体がわかることにより、複数のヌクレオシド、例えば、その他のヌクレオシドの各々の１つ以上の可能な正体を排除するのに充分な情報が提供される。好ましいコード化では、プローブファミリー内のプローブの含有された部分の１個以上のヌクレオシドの正体がわかることにより、プローブ内のその他のヌクレオシドの各々の１つ以外すべての可能性が排除される。例えば、図２５Ａに示すコード化されたプローブファミリーの場合、プローブが赤色ファミリーのメンバーであることがわかっている場合、また、最も近位ヌクレオシドがＣであることもわかっている場合、隣接するヌクレオシドはＴのはずである。同様に、プローブが緑色ファミリーのメンバーであることがわかっている場合、また、最も近位ヌクレオシドがＧであることもわかっている場合、隣接するヌクレオシドはＴのはずである。したがって、拘束部分の１つのヌクレオシドの正体がわかることは、他方のヌクレオシドの１つ以外すべての可能性を排除するのに充分であり、そのため、他方のヌクレオシドの正体が完全に特定化される。しかし、プローブの拘束部分の少なくとも１つのヌクレオシドの正体がわからないと、拘束部分の各位置のヌクレオシドがＡ、Ｇ、ＣまたはＴであり得るため、属する  プローブファミリー名がわかったことに基づいて、プローブ内の特異的ヌクレオシドの正体に関する情報を取得することはまったくできない。図２５Ｂは、プローブファミリーの好ましいコレクション（上側パネル）および配列決定法ＡＢを用いたライゲーション、検出および切断のサイクル（下側パネル）を示す。
【０２３４】
本発明者は、図２５Ａに示すような、２ヌクレオシド長であって、プローブファミリーのコレクションの好都合な特徴を有する拘束部分を含む２４個のプローブファミリーのコレクションを設計した。これらのプローブファミリーは、プローブが属するプローブファミリー名がわかること、およびプローブ内の１つのヌクレオシドの正体がわかることが、拘束部分の他方のヌクレオシドを正確に同定するのに充分であるという点で最大の情報を与える。これは、すべてのプローブおよび各拘束部分内のすべてのヌクレオシドについてそうである。プローブファミリーの２４個の好ましいコレクションの各々のコード化スキームを表１に示す。表１では、１〜２４の範囲のコード化ＩＤを各プローブファミリーのコレクションに割り当てている。各コード化により、配列決定法ＡＢにおける使用のための一般構造（ＸＹ）Ｎｋの好ましいプローブファミリーのコレクションの拘束部分が規定され、それによりコレクションそれ自体が規定される。表１において、コード化ＩＤの下の欄の値１は、該コード化に従って、それぞれ第１および第２の欄に示されたヌクレオシドＸおよびＹを含むプローブが、第１のプローブファミリーに割り当てられることを示す；（ｉｉ）コード化ＩＤの下の欄の値２は、該コード化に従って、それぞれ第１および第２の欄に示されたヌクレオシドＸおよびＹを含むプローブが、第２のプローブファミリーに割り当てられることを示す；（ｉｉｉ）コード化ＩＤの下の欄の値３は、該コード化に従って、それぞれ第１および第２の欄に示されたヌクレオシドＸおよびＹを含むプローブが、第３のプローブファミリーに割り当てられることを示す；ならびに（ｉｖ）コード化ＩＤの下の欄の値４は、該コード化に従って、それぞれ第１および第２の欄に示されたヌクレオシドＸおよびＹを含むプローブが、第４のプローブファミリーに割り当てられることを示す。値１、２、３および４は各々、標識を表す。例えば、コード化９により図２５Ａに示すプローブファミリーのコレクションが規定され、この場合、１は青色を表し、２は緑色を表し、３は赤色を表し、４は黄色を表す。標識に対する値の割り当ては随意であり、例えば、１は、充分等しく緑色、赤色または黄色を表し得ることは認識されよう。値１、２、３および４と標識との関連を変更することによって各プローブファミリー内のプローブの組は変更され得ず、単に、異なる標識が各プローブファミリーと関連することになり得るだけである。
【０２３５】
表１：オリゴヌクレオチドプローブファミリーコード化
【０２３６】
【表１】
2009538123.tif 000003
好ましいプローブファミリーのコレクションを規定する表１の使用をさらに説明するため、コード化１７を考察する。このコード化によれば、拘束部分ＡＡ、ＧＣ、ＴＧおよびＣＴを有するプローブが標識１（例えば、赤色）に割り当てられ、拘束部分ＣＡ、ＡＣ、ＧＧおよびＴＴを有するプローブが標識２（例えば、黄色）に割り当てられ、拘束部分ＴＡ、ＣＣ、ＡＧおよびＧＴを有するプローブが標識３（例えば、緑色）に割り当てられ、拘束部分ＧＡ、ＴＣ、ＣＧおよびＡＴを有するプローブが標識４（例えば、青色）に割り当てられている。得られるプローブファミリーのコレクションを図２６に示す。
【０２３７】
図２７Ａ〜２７Ｃは、プローブファミリーの２４個の好ましいコレクションを図式的に規定する代替法を表す。該方法では、図２７Ａのものなどのダイアグラムを利用する。かかるダイアグラム内の第１の欄は第１の塩基を表す。各標識は、４種類の異なる塩基配列に結合されている。その各々は、第１の欄の塩基を選択された標識の欄の塩基と並置させて示されている。例えば、項目「第１の塩基」の欄にＡがある場合、配列ＡＡを有する拘束部分を有するプローブは、プローブファミリー１（標識１）に割り当てられ、配列ＡＣを有する拘束部分を有するプローブは、プローブファミリー２（標識２）に割り当てられ、配列ＡＧを有する拘束部分を有するプローブは、プローブファミリー３（標識３）  に割り当てられ、配列ＡＴを有する拘束部分を有するプローブは、プローブファミリー４（標識４）に割り当てられる。プローブファミリーに対する割り当ては、Ｃ、ＧまたはＴで始まる拘束部分を有するプローブと同様にして行なわれる。したがって、図２７Ａに示すように塩基で空欄を埋めたダイアグラムは、図２７Ｂに示すようなコード化に翻訳され、ここでは、｛ＡＡ、ＣＣ、ＧＧ、ＴＴ｝の組の拘束部分を有するプローブはプローブファミリー１に割り当てられ、｛ＡＣ、ＣＡ、ＧＴ、ＴＧ｝の組の拘束部分を有するプローブはプローブファミリー２に割り当てられ、｛ＡＧ、ＣＴ、ＧＣ、ＴＡ｝の組の拘束部分を有するプローブはプローブファミリー３に割り当てられ、｛ＡＴ、ＣＧ、ＧＡ、ＴＣ｝の組の拘束部分を有するプローブはプローブファミリー４に割り当てられる。図２７Ｃは、プローブファミリーの２４個の好ましいコレクションの各々を作製するために、図２７Ａダイアグラムの陰影部分の代わりに挿入され得るダイアグラムを示す。配列決定法ＡＢにおいて好ましいプローブファミリーのコレクションを使用する方法は、以下にさらに記載する。
【０２３８】
表１に規定されるコード化されたプローブファミリーの２４個のコレクションは、配列決定法ＡＢにおける使用のためのプローブファミリーのコレクションの好ましい実施形態のみを表す。プローブファミリー名がわかることとともに、拘束部分内の１個以上のヌクレオシドの正体がわかることによって、１つ以上他のヌクレオシドに関する情報が提供される同じ基本原理を用いる広範なさまざまな他のコード化スキーム、プローブファミリーおよびプローブ構造が使用され得る。プローブファミリーの好ましいコレクションと比較すると、プローブファミリーのやや好ましいコレクションは、一般的に、（ｉ）少なくとも一部プローブに関して、プローブファミリー名がわかることによってもたらされる情報の量およびヌクレオシドの正体が少ない；または（ｉｉ）少なくとも一部のプローブに関して、プローブファミリー名がわかることによってもたらされる情報の量がより多いため、やや好ましい。
【０２３９】
一般に、プローブファミリーのやや好ましいコレクションは、配列決定法ＡＢを、好ましいプローブファミリーのコレクションが使用される様式と同様にして行うために使用され得る。しかしながら、デコード化に必要とされる該工程が異なり得る。例えば、状況によっては、候補配列を互いに比較することが、配列の少なくとも一部分を決定するのに充分であり得る。
【０２４０】
プローブが２ヌクレオシド長である拘束部分を含むプローブファミリーのやや好ましいコレクションの一例を図２８に示す。このコード化によれば、｛ＡＡ、ＡＣ、ＧＡ、ＧＣ｝の組の拘束部分を有するプローブはプローブファミリー１に割り当てられ、｛ＣＡ、ＣＣ、ＴＡ、ＴＣ｝の組の拘束部分を有するプローブはプローブファミリー２に割り当てられ、｛ＡＧ、ＡＴ、ＧＧ、ＧＴ｝の組の拘束部分を有するプローブはプローブファミリー３に割り当てられ、｛ＣＧ、ＣＴ、ＴＧ、ＴＴ｝の組の拘束部分を有するプローブはプローブファミリー４に割り当てられる。このプローブファミリーのコレクションでは、プローブファミリー名がわかることにより、プローブファミリー名を決定するためにその標識が検出された新たにライゲートされた伸長プローブ内の近位ヌクレオシドと反対の位置に位置する鋳型内のヌクレオチドの正体についてのある特定の可能性が排除される。例えば、プローブファミリー名が１である場合、新たにライゲートされた伸長プローブ内の近位ヌクレオシドはＡまたはＧのはずであり、そのため、相補的鋳型内のヌクレオチドはＴまたはＣのはずである。拘束部分内の各位置において少なくとも２つの可能性があるため、ヌクレオチドは正確には同定され得ないが、好ましいプローブファミリーのコレクションが使用される場合とは対照的に、一部の可能性を排除するのには充分な情報が１サイクルから得られる。
【０２４１】
本発明のある特定の実施形態において、拘束部分が３ヌクレオシド長である部分拘束プローブが使用される。その拘束部分が長さ３可能な全ての配列を含む（これは、好ましい）プローブを含めるため、プローブファミリーのコレクションは、４３＝６４種の異なるプローブを含むものであるのがよい。図２９Ａは、拘束部分３ヌクレオシド長（トリヌクレオシド）を有するプローブを含むプローブファミリーのコレクション拘束部分を作製するために使用され得るダイアグラムを示す。この図は、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴで表示された４組の列、ならびにプローブファミリー名１、２、３および４の４つの欄を示す。各組みの４列は、内部にヌクレオシドの正体を有するボックスと反対である。トリヌクレオシドのプローブファミリーを決定するため、トリヌクレオシドの最後のヌクレオシドを含むボックスをまず選択する。該ボックスに隣接する４つの列内で、トリヌクレオシド内の第１のヌクレオシドを特定する文字が標示された列を選択する。該列内で、トリヌクレオシドの第２のヌクレオシドを含む欄を選択する。該トリヌクレオシドは、該欄の上部に標示されたプローブファミリーに割り当てられる。例えば、以下の手順に従って、トリヌクレオシド「ＴＣＧ」をプローブファミリーに割り当てる。最後のヌクレオシドが「Ｇ」であるため、「Ｇ」を含むボックスと対向する位置に位置する４列の組、すなわち、第３の組の列に注目する。第１のヌクレオシド「Ｔ」であるため、考慮事項を４つの組の最後の列にさらに限定する。プローブファミリー割り当ては、真ん中のヌクレオシドを含む欄の表題によって決定される。真ん中のヌクレオシドは「Ｃ」であるため、トリヌクレオシドはプローブファミリー１に割り当てられる。類似したプロセスにより、プローブファミリー割り当て：ＡＡＡ＝１；ＡＴＡ＝２；ＡＧＡ＝３；ＧＴＡ＝４；ＧＡＧ＝１；ＴＧＧ＝２などがもたらされる。このプロセスは、可能な全てのトリヌクレオシドがプローブファミリーに割り当てられるまで継続される。
【０２４２】
図２９Ｂは、３ヌクレオシド長の拘束部分を有するプローブを含むプローブファミリーのコレクションさらなる拘束部分を構築するための手順を示す。該手順は、かかるコレクションを拘束部分が２ヌクレオシド長でありコレクションが４つのプローブファミリーを含む上記のプローブファミリーの２４個の好ましいコレクションの各々から構築するために使用される。プローブファミリーの好ましいコレクションを示す例示的なダイアグラムを図の上側部分に示す。このダイアグラムの欄を、上側のダイアグラムの各欄に割り当てられた色に従って、図の下側部分の欄に直接マッピングしている。したがって、上側のダイアグラムの欄は、左から右に向かって青色、緑色、黄色および赤色である。下側のダイアグラムの欄１のエントリーは、上から下に向かって青色、緑色、黄色および赤色であり、４ヌクレオシドの各組は、上側のダイアグラム欄に対応する。下側ダイアグラムの第２、３および４欄は、欄１の４ヌクレオシドの各組を下方に進行的に移動させることにより作製される。
【０２４３】
「プローブファミリー」は、各々が同じ標識を有する複数の異なるプローブを含む単一の「スーパープローブ」であるとみなされ得ることは認識されよう。この場合、プローブを構成するプローブ分子は、一般的に、該プローブの任意の部分において実質的に同一の分子の実質的に同一の分子集団ではない。用語「プローブファミリー」の使用は、任意の限定的な効果を有することを意図するものではなく、かかる「スーパープローブ」を構成し得るプローブの特徴の記載の便宜上のために用いる。
【０２４４】
デコード化
上記のように、少なくとも２つの識別可能に標識されたプローブファミリーを含むプローブファミリーのコレクションを用いる伸長、ライゲーション、検出および切断の連続的サイクルにより、プローブファミリーの序列リスト名が、単一の配列決定反応、または序列リスト内の鋳型内の異なる部位から開始される多重配列決定反応で決定されたプローブファミリー名の合成のいずれかからもたらされる。実施されるサイクル数は、所望の配列の長さおよそ同等であるはずである。序列リストは、相当な量の情報を含むが、直接的に目的の配列が得られる形態ではない。おそらく目的の配列を表す配列を得るため、さらなる工程（１つまたは複数）（その少なくとも１つは、さらなる配列に関する情報の少なくとも１つの項目の収集を伴う）を行なわなければならない。おそらく目的の配列を表す配列は、本明細書において「正確な」配列といい、正確な配列をプローブファミリーの序列リストから抽出するプロセスは、を「デコード化」という。上記の「序列リスト」内の要素は、リストの作製中またはその後のいずれかで再編成され得ることは認識されよう。ただし、リスト内の要素と鋳型内のヌクレオチド間の対応を含む情報の内容は保持されるものとし、また、再編成、再分化および／または置換（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）は、デコード化プロセス中に適切に考慮されるものとする（後述）。したがって、用語「序列リスト」は、上記のようにして作製された再編成、再分化および／または置換された変形例の序列リストを包含することが意図される（ただし、かかる再分化および／または置換された変形例は実質的に同じ情報内容を含むものとする）。
【０２４５】
序列リストは、さまざまなアプローチを用いてデコード化され得る。一部のこれらのアプローチは、プローブファミリーの序列リスト名からの１組の少なくとも１つの候補配列の作製を伴う。候補配列の組により、目的を達成するのに充分な情報が提供され得る。好ましい実施形態において、おそらく目的の配列を表す配列を候補配列の中から、または候補配列と比較される１組の配列から選択するために、１つ以上のさらなる工程が行なわれる。例えば、アプローチの一例において、少なくとも１つの候補配列の少なくとも一部分を、少なくとも１つの他の配列と比較する。正確な配列は、比較に基づいて選択される。本発明のある特定の実施形態において、デコード化は、該方法を反復すること、および元のプローブファミリーのコレクションと異なるようにコード化されたプローブファミリーのコレクションを用いて第２のプローブファミリーの序列リスト名を得ることを伴う。第２のプローブファミリーの序列リストからの情報は、正確な配列を決定するために使用される。ある一部の実施形態において、別のコード化されたプローブファミリーのコレクションを用いて伸長、ライゲーションおよび検出の１サイクルという少ないサイクルから得られる情報は、正確な配列の選択の可能にするのに充分である。換言すると、別のコード化されたプローブファミリーを用いて同定された第１のプローブファミリーにより、どの候補配列が正確であるかを決定するのに充分な情報が提供される。
【０２４６】
他のデコード化アプローチは、任意の利用可能な配列決定法、例えば、１サイクルの配列決定法Ａによって鋳型内の少なくとも１つのヌクレオチドを特異的に同定することを伴う。１つ以上のヌクレオチド（１つまたは複数）に関する情報が、プローブファミリーの序列リスト名をデコード化するための「鍵」として用いられる。あるいはまた、鋳型の配列決定される部分は、その配列が未知である領域に加えて、既知配列の領域を含むものであり得る。配列決定法ＡＢが、未知配列と既知配列の少なくとも１つのヌクレオチドとの両方を含む鋳型の部分に適用される場合、既知配列が、プローブファミリーの序列リスト名をデコード化するための「鍵」として用いられ得る。以下のセクションに候補配列を作製するプロセスを記載する。その後のセクションに、既知配列との比較、第２の組の候補配列との比較、および既知ヌクレオチド正体の利用によって正確な配列を選択するための候補配列の使用を記載する。
【０２４７】
候補配列の作製
鋳型の配列決定される領域は、伸長、ライゲーションおよび切断の連続的サイクルによって生成される伸長された二本鎖に相補的であることは認識されよう。したがって、伸長された二本鎖の候補配列を作製することは、鋳型の配列決定される領域の候補配列を作製することに等価である。実際には、鋳型の配列決定される領域の候補配列を作製し得るか、または伸長された二本鎖の候補配列を作製し、その相補配列を得て鋳型の配列決定される領域の候補配列を決定し得る。後者のアプローチをここに記載する。候補配列をプローブファミリー名のリストから作製するため、プローブファミリーのリストの第１のメンバーを考慮する。該プローブファミリーと関連する拘束部分の組により、配列内の最初のヌクレオチドの可能性が、拘束部分の長さに相当する長さに限定される。例えば、拘束部分がジヌクレオチドである場合、伸長された二本鎖内の最初のジヌクレオチドの可能な配列は、該プローブファミリーに含まれるプローブ内に存在する拘束部分に限定される（したがって、鋳型の配列決定される領域内の第１のジヌクレオチドの可能な配列は、該プローブファミリーに含まれるプローブ内に存在する拘束部分に相補的な組合せに限定される）。最初のジヌクレオチドの可能性は、典型的にはコンピュータによって記録される。同様に、伸長された二本鎖内の第２のジヌクレオチド（すなわち、第１のジヌクレオチドから１ヌクレオチドずれたジヌクレオチド）の可能な配列が、第２のプローブファミリーに含まれるプローブ内に存在する拘束部分に限定される（したがって、鋳型内の第２のジヌクレオチド、すなわち、第１のジヌクレオチドから１ヌクレオチドずれたジヌクレオチドの可能な配列が、第２のプローブファミリーに含まれるプローブ内に存在する拘束部分に相補的な組合せに限定される）。第２のジヌクレオチドの可能な配列もまた記録される。続くジヌクレオチドの可能な配列（ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）も同様に、決定対象の配列の所望の長さに相当するまで、またはリスト内のプローブファミリーがなくなるまでジヌクレオチドの可能な配列が記録される。
【０２４８】
可能な配列の記録プロセスの代表例を図３０に示す。図において、プローブファミリー名のリストは、図２５Ａに示すプローブファミリーコレクションを用いて作製されたものと想定している。図３０の左端の欄はプローブファミリーのリストを示し、上から下の順に、黄色、緑色、赤色、青色である。リスト内の各プローブファミリーに対応するジヌクレオチドの配列可能性を図の右側に示す。ヌクレオチド位置を配列可能性の上部に示す。配列は１位から始まり、そのため、第１のジヌクレオチドは１位と２位を占める；第２のジヌクレオチドは２位と３位を占めるなどである。黄色プローブファミリーでは、該可能性は、図３０に示すようにＣＣ、ＡＴ、ＧＧおよびＴＡである。緑色プローブファミリーでは、該可能性は、ＣＡ、ＡＣ、ＧＴおよびＴＧであるなどである。各ジヌクレオチドの可能な配列の記録プロセスは、所望の配列長さに達するまで継続される。
【０２４９】
可能性の組を作製した後、第１の仮定を、候補配列内の第１のヌクレオチドの正体において行ない、これは、図３０において１位と表示する配列の５’位置であると仮定するものである。第１の仮定は、該ヌクレオチドがＡである、該ヌクレオチドがＧである、該ヌクレオチドがＣであるまたは該ヌクレオチドがＴであるとするものであり得る。
【０２５０】
各ジヌクレオチドの可能な配列は、隣接するジヌクレオチドが重複する、すなわち、第１のジヌクレオチドの第２のヌクレオチドはまた、第２のジヌクレオチドの第１のヌクレオチドであるため、隣接するジヌクレオチドの可能な配列によって限定されることが観察される。例えば、第１のヌクレオチドをＣと仮定した場合、第１のジヌクレオチドはＣＣとなるはずである。第１のジヌクレオチドがＣＣであるならば、第２のジヌクレオチドは、Ｃをその第１の位置に有するはずである。Ｃをその第１の位置に有する第２のジヌクレオチドの唯一可能な配列はＣＡであるため、第２のジヌクレオチドがＣＡのはずであることは明白である。したがって、最初のの３つのヌクレオチドの配列は、ＣＣＡのはずである。同様に、第３のジヌクレオチドの可能な配列は、第２のジヌクレオチドの可能な配列によって限定される。第２のジヌクレオチドがＣＡであるならば、第３のジヌクレオチドは、その第１の位置にＡを有することが唯一の可能性であるため、ＡＧのはずである。したがって、最初の４つのヌクレオチドの配列はＣＣＡＧのはずである。このプロセスを継続すると、最初の５つヌクレオチドに対して５’−ＣＣＡＧＣ−３’の配列がもたらされる。したがって、ＣＣＡＧＣは第１の候補配列である。
【０２５１】
第２の候補配列は、第１のヌクレオチドがＡであると仮定することによりもたらされる。この仮定により、ＡＴが第１のジヌクレオチドとなる。ＴＧは、ＡＴが第１のジヌクレオチドの配列と整合する第２のジヌクレオチドの唯一の可能な配列である。ＧＡは、ＴＧが第２のジヌクレオチドの配列と整合する第３のジヌクレオチドの唯一の可能な配列である。ＡＡは、ＧＡが第３のジヌクレオチドの配列と整合する第４のジヌクレオチドの唯一の可能な配列である。これらのジヌクレオチドを完全長の候補配列に合成すると、ＡＴＧＡＡが得られる。同様に、第１のヌクレオチドがＧであるという仮定により、候補配列ＧＧＴＣＧが得られ、第１のヌクレオチドがＴであるという仮定により、候補配列ＴＡＣＴＴが得られる。したがって、各々、仮定された配列の第１のヌクレオチドの異なるヌクレオチドで始まる４つの候補配列がもたらされる。
【０２５２】
仮定は、その他のヌクレオチドの１つではなく第１のヌクレオチドで行なわなければならないとする要件はない。例えば、仮定は、充分等しく第４のヌクレオチドの正体において行なわれたものであり得、この場合、候補配列は、鋳型に沿って「逆行方向」（すなわち、３’→５’方向）に移動させることによりもたらされ得る。例えば、第４のヌクレオチドがＴであると仮定することは、第４のジヌクレオチドはＴＴのはずであり、第３のジヌクレオチドはＣＴのはずであり、第２のジヌクレオチドはＡＣのはずであり、第１のジヌクレオチドはＣＣのはずであることを意味する（ヌクレオチドは、５’→３の向きに記載されるが、その正体は、配列において３’→５’に移動させることによりもたらされる）。あるいはまた、仮定は、配列の中央の任意のヌクレオチドにおいて行なわれ得、ジヌクレオチドの正体は、５’→３’および３’→５の両方向に移動させることによりもたらされる。ヌクレオチドの１つに対する仮定の非存在下では、各位置がＡ、Ｇ、ＣまたはＴで占められ得るため、各ヌクレオチドの正体が完全に決定されない状態になることは認識されよう。
【０２５３】
好ましいプローブファミリーのコレクションを用いる場合、任意の単一のヌクレオチド（例えば、第１のヌクレオチド）の正体を仮定すると、唯一の候補配列が生成される。しかしながら、プローブファミリーのやや好ましいコレクションを用いる場合、１つより多くのヌクレオチドの正体を仮定することが必要であり得る。すなわち、第１のヌクレオチドの正体を仮定することでは、残りの配列は完全には特定されない。例えば、プローブファミリーのやや好ましいコレクションは、その規定配列がＡＡおよびＡＣであるメンバーファミリーを含むものであり得る。かかる場合では、第１のヌクレオチドがＡであると仮定することにより、第２のヌクレオチドに対して２つの可能性が残る。プローブファミリーのやや好ましいコレクションを用いる配列決定を以下にさらに論考する。拘束部分が非連続的なヌクレオチドからなる場合、上記のアプローチは、若干の修正を伴ってやはり使用され得ることは認識されよう。
【０２５４】
候補配列と既知配列との比較による配列同定
一般的に、上記のようにして、伸長された二本鎖の候補配列が決定された場合、鋳型の配列決定される領域に対応する候補配列は、その相補配列を得ることにより得られる。場合によっては、候補配列自体が、目的を達成するのに充分な情報を提供する。例えば、配列決定の目的が、単にある特定の配列可能性を排除することである場合、候補配列とその可能な配列とを比較することで充分であり得る。例えば、図３０に示す候補配列は、配列決定対象の領域はポリＡテイルの一部でないという決定を可能にし得るものである。より長い配列により、配列決定対象の領域がベクターの一部でないことが確認され得る。
【０２５５】
多くの場合、正確な配列を明確に決定することが望ましい。好ましい本発明の実施形態によれば、正確な配列は、鋳型の配列決定される領域の候補配列を１組の既知配列と比較することにより同定される。既知配列の組は、例えば、ある特定の目的の生物体の１組の配列であり得る。例えば、ヒトＤＮＡを配列決定する場合、候補配列を、Ｈｕｍａｎ  Ｄｒａｆｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅと比較し得る。公的に入手可能なヒトゲノム配列情報源の案内については、ＵＲＬ  ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ／ｇｕｉｄｅ／ｈｕｍａｎ／のウェブサイトを参照のこと。別の例として、感染因子（例えば、被験体から単離された細菌またはウイルス）由来の核酸が配列決定される場合、該細菌またはウイルスのバリアント株の配列を含むデータベースが検索され得る。完全または部分配列のいずれかを含む多くのかかる生物体指定データベースが、当該技術分野で知られており、配列決定作業が加速されると、より多くが利用可能となる。一部の代表的な例としては、マウス（例えば、ウェブサイトＵＲＬ  ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ／ｓｅｑ／ＭｍＨｏｍｅ．ｈｔｍｌを参照）、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、ウェブサイトＵＲＬ  ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｈｉｖ−ｄｂ／ｍａｉｎｐａｇｅ．ｈｔｍｌを参照）、マラリア種Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（例えば、ウェブサイトＵＲＬ  ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｔｄｂ／ｅｄｂ２／ｐｆａｌ／ｈｔｍｌｓ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌを参照）などのデータベースが挙げられる。もちろん、生物体指定の組の配列を用いる必要はない。広範なさまざまな生物体およびウイルス由来の配列を含むＧｅｎＢａｎｋ（ウェブサイトＵＲＬ  ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｇｅｎｂａｎｋ／）などのデータベースを検索してもよい。データベースは、鋳型を誘導した生物体またはウイルス由来の任意の配列を含むものである必要はない。一般に、配列はゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、ＥＳＴｓなどであり得る。多数の配列が検索され得る。
【０２５６】
単純に検索を行なうことは、目的を達するのに充分であり得る。例えば、ウイルス系核酸が患者から単離された場合、候補配列を該ウイルスの１組の既知配列と比較することにより、該ウイルス系核酸が、該ウイルス由来の配列を含むか含まないかいずれであるかが、配列のマッチングを調べられない場合であっても、決定され得る。マッチングの存在により、患者が該ウイルスに感染していることが確認され得、一方、マッチングの欠如は、患者が該ウイルスに感染していないことを示し得る。
【０２５７】
ある特定の実施形態において、既知配列の組は、より狭い範囲の配列を含み、これは、配列決定が行なわれる目的に特別に調整されたものであり得る。したがって、配列決定される核酸に関する情報は、既知配列の組を選択するために使用され得る。例えば、鋳型がある特定の遺伝子の配列を示すものであることがわかっている場合、既知配列は、所与の目的の遺伝子座の遺伝子、変異型および野生型配列の異なる対立遺伝子を表すものなどであり得る。候補配列のどれが正確であるかを決定するためには、候補配列を単一の既知配列と比較することだけが必要であり得る。例えば、本発明のある特定の実施形態において、鋳型は、目的の領域を含むＤＮＡ増幅することにより得られる（例えば、目的の領域に隣接するプライマーを用いて）。目的の領域は、変異または多型（例えば、ある特定の疾患と関連する変異または多型）が存在し得る部位を包含する。鋳型が、ある特定の目的の領域由来の配列を示すものであることがわかっている場合、候補配列を該領域の単一の参照配列と、例えば、野生型または変異型形態の配列と比較するだけでよい。換言すると、鋳型の配列の一部または全部がわかっている場合は、複数の既知配列との比較を行なうことは必要とされ得ない。それどころか、既知配列の一部または全部を含む候補配列が適宜選択される。例えば、ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２遺伝子内の変異は、乳癌リスクの増大と関連していることがわかっており、被験体がかかる変異を保有している否かの決定において重要な関心となる。鋳型がＢＲＣＡｌ遺伝子由来の配列を含むことがわかっている場合、例えば、該遺伝子の一部分を包含する目的の領域と隣接するプライマーが鋳型のクローン性の集団を作製するために使用された場合、正確な配列を決定するためには、候補配列を野生型または変異型ＢＲＣＡ１配列と比較するだけでよい。
【０２５８】
より一般的な場合では、候補配列を既知配列の組と比較することにより、任意の候補配列類似する任意の既知配列が同定される。ただし、候補配列は充分な長さのものであり、データベースが１つより多くの候補配列と同一のであるか非常に類似する配列を含む尤度は非常に小さいものとする。換言すると、候補配列が充分に長い場合、その１つより多くが既知配列の組に提示されることは考えにくい。候補配列は、「マッチング」しているとみなされる任意の配列と比較される。典型的には、マッチングが存在することが確立される必要とされる同一性の程度の閾値を設定することが望ましい。例えば、既知配列は、候補配列と既知配列が少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％またはまさに１００％同一である場合、マッチングしているとみなされ得る。典型的には、同一性割合は、少なくとも１０ヌクレオチド長、例えば１０〜１５ヌクレオチド、１５〜２０ヌクレオチド、２０〜２５ヌクレオチド、２５〜３０ヌクレオチドなどの領域で評価する。該領域の長さは、さまざまな異なる基準、例えば、限定されないが、複数の既知配列内の配列の数、複数の既知配列の正体または供給源などに応じて選択され得る。例えば、候補配列をＧｅｎＢａｎｋなどの大きなデータベースの配列と比較する場合、より少ない配列を含むデータベースが利用される場合は、長鎖の使用が望ましいことがあり得る。本発明のある特定の実施形態では、配列を、必ずしも互いに隣接していない複数の異なる領域において比較する。好ましくは、合わせた領域の長さは、少なくとも１０ヌクレオチド長、例えば１０〜１５ヌクレオチド、１５〜２０ヌクレオチド、２０〜２５ヌクレオチド、２５〜３０ヌクレオチドなどである。場合によっては、既知配列の組内の多数の配列がマッチングし得る。配列は、例えば、鋳型を誘導したものと同じ生物体に見られる相同遺伝子、異なる生物体由来の相同遺伝子、、偽遺伝子、ｃＤＮＡおよびゲノム配列などを示すものであり得る。
【０２５９】
一般に、既知配列の組内の配列にもっとも類似する候補配列が適宜選択される。あるいはまた、例えば、配列決定法が高エラー率に供されたかもしれないと思われる理由がある場合、適宜データベースから対応する配列を選択することが好ましいことがある。例えば、エラー率が所定の閾値より高いことがわかっている場合、正確な配列としてデータベースから配列を選択することが好ましいことがある。
【０２６０】
マッチングの尤度が多数の候補配列に見られることを確実にするために必要とされる長さは、さまざまな考慮事項、例えば、限定されないが、既知配列の具体的な組、許容されるマッチングの閾値などに依存する。一般に、典型的な生物体のゲノムにおいて、１回で提示される配列の長さは約２５〜２６ヌクレオチドにすぎない。したがって、およそこの長さの候補配列の作製が、正確な配列を同定するのに充分である。一般に、候補配列は、少なくとも１０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１５、少なくとも２０ヌクレオチド長、例えば、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４５〜５０またはさらに長鎖であるのがよい。
【０２６１】
第１の組の候補配列と第２の組の候補配列との比較による配列同定
本発明のある特定の実施形態において、デコード化は、第１のコード化に従ってコード化されたプローブファミリーの第１のコレクションを用いて第１のプローブファミリーの序列リスト作製し、これから第１の組の候補配列を作製し、次いで、第２のプローブファミリーの序列リストを同じ鋳型から、第２のコード化に従ってコード化されたプローブファミリーの第２のコレクションを用いて作製し、これから第２の組の候補配列を作製することにより行なわれる。新たに合成されたＤＮＡ鎖を２つの配列決定反応の間で鋳型から取り出すか、または同一の配列の鋳型を、プローブファミリーの第２のコレクションを用いて配列決定する。候補配列の組を比較する。どのプローブファミリーのコレクションが使用されるかとは無関係に、候補配列の１つが正確な配列であり、その他は正確でない（または、よくても部分的に正確である）ことは認識されよう。したがって、どの候補配列の組も正確な配列を含むが、ほとんどの場合、候補配列の任意の所与の組のその他の候補配列は、候補配列の別の組に見られるものと異なる。したがって、候補配列の２つの組を単純に比較することにより、正確な配列が決定され得る。２種類の異なるようにコード化されたプローブファミリーのコレクションを用いて等しい長さの候補配列を作製する必要はない。本発明の好ましい実施形態において、プローブファミリーの第２のコレクションを用いて作製された候補配列は２ヌクレオチドという短いものであり得、または同等に、プローブファミリーの第２のコレクションを用いて作製されたプローブファミリーの序列リストは、１要素（すなわち、ライゲーションおよび検出の１サイクル）という短いものであり得る。
【０２６２】
図３１Ａ〜３１Ｃは、２種類の識別可能に標識された好ましいプローブファミリーを用いた候補配列の作製およびデコード化の一例を示す。図３１  Ａは、第１のコード化に従ってコード化されたプローブファミリーの好ましいコレクションを示す。図３１Ｂは、プローブファミリー黄色、緑色、赤色、青色（これは、「２３１４」と表示され得、ここで、赤色＝１、黄色＝２、グリーン＝３および青色＝４である）の序列リストからの４種類の候補配列の作製を示し、その正確な配列をＣＡＧＧＣ（太字で示す）と仮定している。図３１Ｃは、第２のコード化に従ってコード化されたプローブファミリーの好ましいコレクションを示す。鋳型内の第１のジヌクレオチドはＣＡであるため、黄色プローブファミリーの最上のプローブが伸長の第１のサイクルにおいて伸長可能な末端にライゲートされる。これにより、第１のジヌクレオチドに対して下記の組の候補配列：ＣＡ、ＴＣ、ＧＧ、ＡＴがもたらされる。第１のプローブファミリーのコレクションを用いて作製された候補配列のうち、配列ＣＡＧＧＣだけが、任意のこれらのジヌクレオチドで始まる。したがって、これは正確な配列のはずである。一般に、第１および第２のプローブファミリーのコレクションは、下記の基準：第１と第２のプローブファミリーのコレクションを比較する場合、（ｉ）第１のコレクション内の各プローブファミリーの４種類のプローブのうち３種類が第２のコレクションの新たなプローブファミリーに割り当てられるべきである；および（ｉｉ）３種の再割り当されたプローブの各々が第２のコレクションの異なるプローブファミリーに割り当てられるべきであるを満たすべきであることが好ましい。
【０２６３】
既知ヌクレオチド正体を用いたプローブファミリーの序列リストのデコード化
上記のように、候補配列は、伸長された二本鎖または鋳型内の単一のヌクレオチドの正体を仮定することにより作製され得る。使用される具体的なプローブファミリーコレクションに応じて、一般的に、少なくとも４種類の候補配列を作製することが必要である。しかしながら、多数の候補配列の作製は、鋳型内の少なくとも１つのヌクレオチドの正体がわかっている場合は（したがって、伸長された二本鎖の場合も）回避され得る。その場合は、単一の候補配列を作製するだけでよい。候補配列を作製するための方法は、上記のものと同一である。鋳型内の少なくとも１つのヌクレオチドの正体は、任意の配列決定法、例えば、限定されないが、配列決定法Ａ、１組の識別可能に標識されたヌクレオチドおよびポリメラーゼを用いる初期オリゴヌクレオチドからのプライマー伸長などを用いて決定され得る。鋳型内の１つ以上のヌクレオチドが、まず、配列決定法ＡＢ以外の配列決定法を用いて配列決定され得、次いで、初期オリゴヌクレオチドおよび任意の伸長産物が除去され得、同じ鋳型が配列決定法ＡＢを用いる配列決定に供され得ることは認識されよう（または逆も同様）。
【０２６４】
別のアプローチは、その配列が決定される部分に加えて既知の正体の１つ以上の既知ヌクレオチドを含む鋳型を単純に配列決定することである。例えば、鋳型の初期オリゴヌクレオチドが結合する領域と未知配列が始まる領域との間の部分に、１つ以上の既知の正体のヌクレオチドが含まれ得る。鋳型のこの部分を配列決定法ＡＢに供することにより、配列内の１つ以上のヌクレオチドの正体が予め決定され、したがって、単一の候補配列を作製するために使用され得、これは正確な配列である。
【０２６５】
したがって、上記の方法は、（ｉ）どの正体が既知ヌクレオチドの正体と一致するか、およびその近位ヌクレオチドが、既知の正体のヌクレオチドに隣接するヌクレオチドに対向してライゲートされたプローブの拘束部分の可能な配列を調べることにより、正体を、既知の正体のヌクレオチドに隣接する鋳型内のヌクレオチドに割り当てる工程；（ｉｉ）  どの正体が、その近位ヌクレオチドが後続のヌクレオチドに対向してライゲートされたプローブの拘束部分の可能な配列と一致するかを調べることにより、正体を後続のヌクレオチドに割り当てる工程；ならびに（ｉｉｉ）  配列が決定されるまで工程（ｉｉ）を反復する工程を含む。伸長された二本鎖と鋳型の配列決定される領域との間に正確な対応があるため、これらの工程は、同じ工程を伸長された二本鎖において行なうことと等価であることを理解されたい。
【０２６６】
やや好ましいプローブファミリーを用いる配列決定
やや好ましいプローブファミリーのコレクションは、配列決定法ＡＢを、好ましいプローブファミリーのコレクションが使用される様式と同様にして行なうために使用され得る。しかしながら、結果はいくつかの点で異なり得る。例えば、配列のある特定部分は候補配列から、さらなる情報を必要せずに完全に同定され得る。図３２は、図２８に示すようにしてコード化されたプローブファミリーのやや好ましいコレクションを用いる配列決定の一例を示す。配列の決定は、一般的に、好ましいプローブファミリーのコレクションで記載したようにして行なう。目的の鋳型は配列「ＧＣＡＴＧＡ」を有し、これは、プローブファミリーの序列リストでは「１２３４１」となる。１位のヌクレオチドをＡと仮定すると、「ＡＣＡＴＧＡ」が候補配列として得られる。しかしながら、好ましいプローブファミリーのコレクションの場合とは異なり、標識「１」は、第１のヌクレオチドとしてＡを有する２つの異なるジヌクレオチド、すなわち「ＡＡ」および「ＡＧ」と関連するため、第２のヌクレオチドに対して２つの可能性がある。したがって、１位のヌクレオチドがＡであると仮定すること、「ＡＣＡＴＧＣ」が第２の候補配列として得られる。１位のヌクレオチドがＧであると仮定すると、「ＧＣＡＴＧＡ」が候補配列として得られ、また、「ＧＣＡＴＧＣ」が候補配列として得られる。標識「１」は、ＣまたはＴを１位に有するジヌクレオチドとはなんら関連しないため、「Ｃ」または「Ｔ」で始まる候補配列は得られない。図３２は、互いにアライメントさせた４つの候補配列を示す。すべての候補配列の中央の４つのヌクレオチドがＣＡＴＧであることが観察される。したがって、正確な配列は、ＣＡＴＧを２〜５位に含むものであるはずである。もし、これらのヌクレオチドが目的のものでない場合は、さらなるデコード工程を行なう必要はない。
【０２６７】
上記のように、プローブファミリーのコレクションは、４種類の異なるプローブファミリーからなるものである必要はく、２つよりより多く４Ｎ（ここで、Ｎは拘束部分の長さである）までの任意の数からなるものであり得る。しかしながら、４つより少ないファミリーを用いる場合、４つより多くの候補配列作製することが必要であり得、一方、４つより多くのプローブファミリーを用いる場合は、さらなる標識が必要とされる。これらおよび他の理由により、４つのプローブファミリーからなるコレクションが好ましい。
【０２６８】
候補配列を互いに比較することによる配列同定
本発明のある特定の実施形態において、目的の配列の一部または全部は、候補配列を互いに比較することにより決定され得る。一般に、かかる比較は、その全長において候補配列のどれが正確であるかを決定するのに充分でないことがあり得る。しかしながら、候補配列の２つ以上が該配列の一部分において同一であるか充分類似している場合、この情報は、鋳型の上記の部分内のヌクレオチドの配列を明確に同定するのに充分であり得る。
【０２６９】
所望の場合、鋳型は、同定された配列を有するさらなる部分を得るため、さらに１回以上、別のコード化されたプローブファミリーを用いて配列決定され得る。これらの部分を組み合わせ、所望の長さの配列が合成され得る。
【０２７０】
プローブファミリーを用いたエラー補正。多くの場合、同じＤＮＡ  配列の一部または全部を提示する多数の鋳型を配列決定し、該配列をアライメントすることが望ましい。鋳型が目的の領域の一部しか含まない場合、重複断片を合成することによって、より長い配列を得る。例えば、生物体のゲノムを配列決定する場合、典型的には、ＤＮＡを断片化し、充分な断片を、各ＤＮＡ鎖がいくつかの（例えば、４〜１２個の）異なる断片内に提示されるように配列決定する。重複配列を合成してより長い配列にするためのコンピュータソフトウエアが当業者に知られている。
【０２７１】
慣用的な配列決定法が用いられる場合、ほとんどの場合、ある領域において、断片の１つ（異常断片という）がその他のものと該領域内の単一の位置で異なる場合以外は、多数の断片が完璧にアライメントされる。孤立性の差が配列決定エラーを表すか否か、または真性の差（例えば、一塩基多型）が該位置に存在するか否かを調べることは、問題となり得る。
【０２７２】
本発明は、配列決定法ＡＢを用いてエラーチェックを行なうこと新規な方法を提供する。該方法によれば、同じＤＮＡ鎖を示す断片を含む鋳型が、上記のような識別可能に標識されたプローブファミリーのコレクションを用いて配列決定され、各鋳型のプローブファミリーの序列リストがもたらされる。プローブファミリーの序列リストをアライメントする。いくつかのリストが、単一の位置でその他の断片異なる１つのリスト以外、リスト内の所定の長さ、例えば、１０、１５、２０または２５それ以上の要素において完璧にアライメントされたら、その差は、配列決定エラーに起因する。実際に多型が存在する場合、異常断片から得られた序列プローブリストは、２つ以上の隣接する位置で、その他の断片から得られた序列プローブリストと異なる。
【０２７３】
例えば、表１のコード化４を用いたプローブファミリーの好ましいコレクションを使用する配列決定法ＡＢを、配列５’−ＣＡＧＡＣＧＡＣＡＡＧＴＡＴＡＡＴＧ−３’を含む鋳型に適用すると、下記のプローブファミリーの序列リスト：「２３３２４３２２１３２４４４１４２」が得られ、これを以下に示す。
【０２７４】
【化１】
2009538123.tif 000004
実際にＳＮＰが存在する場合（例えば、ＣＡＧＡＣＧＡＧＡＡＧＴＡＴＡＡＴＧ、式中、下線のヌクレオチが多型性部位を表す）、リスト内の２つの連続する要素に変化がもたらされる：２３３２４３３３１３２４４４１４２式中、下線は、ＳＮＰの結果として生じた変化を示す。プローブファミリーの序列リストとＳＮＰを含む配列間の対応を以下に示す。
【０２７５】
【化２】
2009538123.tif 000005
しかしながら、ライゲートされた伸長プローブと会合した標識の同定におけるエラーは、プローブファミリーの序列リストにおける単一のエラーおよびその点の前方（ｆｏｒｗａｒｄ）から得られる候補配列における変化をもたらす。例えば、７回目にライゲートされ伸長プローブ２３３２４３３２１３２４４４１４２（式中、下線の数字は誤同定された標識を表す）と会合した標識の決定におけるエラーによって、得られる候補配列はＣＡＧＡＣＧＡＧＴＴＣＡＴＡＴＴＡＣに変化する（式中、下線部分は、配列決定エラーの結果として生じた変化を示す）。プローブファミリーの序列リストと配列間の対応を以下に示す。
【０２７６】
【化３】
2009538123.tif 000006
３塩基、４標識スキームを用いる場合、ＳＮＰを含む断片により、異常断片のプローブファミリーの序列リストにおいて３連続の差がもたらされるが、配列決定エラーでは、１つの差しかもたらされない。例えば、図２９に示すようにしてコード化されたプローブファミリーのコレクションを用いる場合、配列ＣＡＧＡＣＧＡＣＡＡＧＴＡＴＡＡＴＧのプローブファミリー正体の序列リストを以下に示す。
【０２７７】
【化４】
2009538123.tif 000007
ＳＮＰを含む異常断片、例えば、ＣＡＧＡＣＧＡＧＡＡＧＴＡＴＡＡＴＧは、ＳＮＰを含まない断片から得られる序列リストと比べて３つの連続する位置が異なるプローブファミリーの序列リストをもたらし得、これを以下に示す。
【０２７８】
【化５】
2009538123.tif 000008
配列決定エラーは、たった１つの差をプローブファミリーの序列リスト内にもたらし得、エラー点の前方と完全に異なる候補配列が作製され得る。
【０２７９】
したがって、断片（異常断片）から作製されたプローブファミリーの序列リストを、同じＤＮＡ鎖を示すが、他方の序列リストと単一の孤立性の位置で異なる他の断片から作製されたプローブファミリーの序列リストとアライメントさせる場合、差を含む序列リストが配列決定エラーを表すことがあり得る（プローブファミリーの誤同定）。断片（異常断片）から作製されたプローブファミリーの序列リストを、同じＤＮＡ鎖を示すが、他方の序列リストと２つ以上の連続する位置で異なる他の断片から作製されたプローブファミリーの序列リストとアライメントさせる場合、異常断片がＳＮＰを含むものであることがあり得る。好ましくは、プローブファミリーの序列リストのアライメントされる部分は、少なくとも３または４要素の長さ、好ましくは少なくとも６、８またはそれ以上の要素の長さである。好ましくは、アライメントされる部分は、少なくとも６６％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、またはそれ以上、例えば１００％同一である。
【０２８０】
同様に、断片の候補配列を、配列の第１の部分において同じＤＮＡ鎖を示すが、他の断片の候補配列と配列の第２の部分において実質的に異なる他の断片の候補配列とアライメントさせる場合、配列決定エラーが起こることがあり得る。ある断片の候補配列を、配列の２つの部分において同じＤＮＡ鎖を示すが単一の位置で異なる他の断片の候補配列とアライメントさせる場合、異常断片がＳＮＰを含むものであることがあり得る。好ましくは、候補配列のアライメントされる部分は、少なくとも４ヌクレオチド長である。好ましくは、アライメントされる部分は、少なくとも６６％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、またはそれ以上、例えば１００％同一である。
【０２８１】
したがって、本発明は、（ａ）配列決定法ＡＢを用いて複数の鋳型を配列決定する工程、ここで、鋳型は、単一の核酸配列の重複断片を表す；（ｂ）工程（ａ）で得られた配列アライメントする工程；および（ｃ）配列が第１の部分と全体的に実質的に同一であり、第２の部分と実質的に異なる場合（各部分は少なくとも３ヌクレオチド長を有する）、配列間の差が配列決定エラーを表すと決定する工程を含む、一塩基多型を配列決定エラーと識別する方法を提供する。本発明は、さらに、（ａ）単一の核酸配列の重複断片を表す複数の鋳型を用いて配列決定法ＡＢを行なうことにより、プローブファミリーの複数の序列リスト得る工程；（ｂ）工程（ａ）で得られたプローブファミリーの序列リストをアライメントし、該リストが少なくとも９０％同一であるアライメント領域を得る工程；および（ｃ）該リストがアライメント領域内のたった１つの位置で異なる場合、プローブファミリーの序列リスト間の差は、配列決定エラーを表すと決定する工程；または（ｄ）該リストがアライメント領域内の２つ以上の隣接する位置で異なる場合、プローブファミリーの序列リスト間の差は一塩基多型を表すと決定する工程を含む、一塩基多型を配列決定エラーと識別する方法を提供する。
【０２８２】
非局在化情報収集
当該技術分野でよく知られているように、「ビット」（２進数）は、基数を２とする、換言すると、１または０のいずれかである１桁をいい、デジタルデータの最小単位を表す。ヌクレオチドは任意の４種類の異なる正体を有し得るため、ヌクレオチドの正体の指定には２ビットが必要であることは認識されよう。例えば、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴは、それぞれ００、０１、１０および１１で表され得る。識別可能に標識されたプローブファミリーの好ましいコレクションにおけるプローブファミリー名の指定では、４つの識別可能に標識されたプローブファミリーがあるため、２ビットが必要である。
【０２８３】
最も慣用的な配列決定の形態および配列決定法Ａでは、各ヌクレオチドは、別個の単位として同定され、１つのヌクレオチドに対応する情報が一度に収集される。各検出工程では、２ビットの情報が単一のヌクレオチドから取得される。対照的に、配列決定法ＡＢでは、各検出工程において、２ビット未満の情報が複数のヌクレオチドの各々から取得されるが、プローブファミリーの好ましいコレクションが使用される場合は、やはり１回の検出工程で２ビットの情報が取得される。プローブファミリーの序列リスト内の各プローブファミリー名は、鋳型内の少なくとも２つのヌクレオチドの正体を表し、その正確な数は、プローブの配列決定部分の長さによって決定される。例えば、配列５’−ＣＡＧＡＣＧＡＣＡＡＧＴＡＴＡＡＴＧ−Ｓ’から、表１のコード化４に従ってコード化されたプローブファミリーのコレクションを用いて得られるプローブファミリーの序列リストを考察されたい。
【０２８４】
【化６】
2009538123.tif 000009
プローブファミリー２は、ジヌクレオチドＣＡが、プローブファミリー２のプローブ内に存在する指定される部分の１つであるため、リスト内の第１のプローブファミリーである。プローブファミリー３は、ジヌクレオチドＡＧが、プローブファミリー３のプローブ内に存在する指定される部分の１つであるため、リスト内の第２のプローブファミリーである。上記のように、４つのプローブファミリーがあるため、各プローブファミリー正体は、２ビットの情報で表される。したがって、各検出工程では、２つのヌクレオチドに関する２ビットの情報が収集され、平均１ビットの情報が各ヌクレオチドからもたらされる。
【０２８５】
したがって、本発明は、多数の伸長、ライゲーションおよび検出のサイクルを含む、配列決定方法であって、検出工程が、平均２ビットの情報を同時に、任意の個々のヌクレオチドの２ビットの情報を取得することなく、鋳型内の少なくとも２つのヌクレオチドの各々から取得することを含む配列決定方法を提供する。本発明は、さらに、（ａ）伸長、ライゲーション、検出および切断の連続的サイクルを行なう工程、ここで、検出工程が、平均２ビットの情報を同時に、任意の個々のヌクレオチドの２ビットの情報を取得することなく、鋳型内の少なくとも２つのヌクレオチドの各々から取得することを含む；ならびに（ｂ）工程（ａ）で得られた情報を少なくとも１ビットのさらなる情報と組み合わせて配列を決定する工程を含む、オリゴヌクレオチドプローブファミリーの第１のコレクションを用いて、鋳型ポリヌクレオチド内のヌクレオチドの配列を決定する方法を提供する。種々の本発明の実施形態において、少なくとも１ビットのさらなる情報は、鋳型内のヌクレオチドの正体、候補配列を少なくとも１つの既知配列と比較することにより得られる情報；およびオリゴヌクレオチドプローブファミリーの第２のコレクションを用いて該方法を反復することにより得られる情報からなる群より選択される項目を含む。
【０２８６】
したがって、該方法では、個々のヌクレオチドから２ビットの情報は取得されないが、平均２ビットの情報が鋳型から各サイクルで収集され、プローブファミリーの好ましいコレクションが使用される場合は、非局在化様式で収集される。２または３つのプローブファミリーのコレクションが使用される場合は、２ビット未満の情報が各サイクル中で収集される。
【０２８７】
非局在化情報の収集はいくつかの利点を有し、例えば、上記のものなどのエラーチェック法の適用が可能になる。また、各鋳型内のヌクレオチドは、好ましい実施形態では、非局在化情報の収集によって、１回より多くのインテロゲーションが行なわれる（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅ）ため、特定のヌクレオチドと会合したフルオロフォアの検出における系統的偏重（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｂｉａｓ）の回避が補助され得る。
【０２８８】
本明細書に記載のプローブファミリーおよびプローブファミリーのコレクションは、プローブの伸長、ライゲーションおよび切断の連続的サイクルを伴う方法に加え、さまざまな配列決定法に使用され得る。本発明はまた、上記のような配列および構造を有し、プローブが任意選択で切れやすい連結を含まないプローブファミリーおよびプローブファミリーのコレクションを提供する。例えば、プローブは、ホスホジエステル主鎖連結のみを含むものであり得、および／またはトリガー残基含まないものであり得る。本発明のある一部の実施形態において、プローブファミリーは、伸長およびライゲーションの連続的サイクルを用いるが、各サイクル中で切断を伴わない配列決定を行うために使用される。例えば、プローブファミリーは、ＷＯ２００５０２１７８６および当該技術分野において他に記載されたものなどのライゲーション系の方法に使用され得る。プローブファミリーをかかる方法で使用するためには、プローブ上の標識は、例えば、ＷＯ２００５０２１７８６に開示のように、核酸の切れやすい連結を切断することなく除去され得るように、切断可能なリンカーによって結合されているのがよい。かかる方法は、例えば、ＷＯ２００５０２１７８６に記載されたライゲーションカセットではなくプローブファミリーを用い、多数の反応を並行して、または連続的に行ない、次いで、プローブファミリーのリストを合成することにより、プローブファミリーの序列リスト作製するために使用され得る。リストは、上記のようにしてデコード化される。
【０２８９】
Ｉ．キット
本発明の種々の実施形態を行なためのさまざまなキットが提供され得る。キットのある特定のものは、ホスホロチオレート結合を含む伸長オリゴヌクレオチドプローブを含む。キットは、１種類以上の初期オリゴヌクレオチドをさらに含むものであり得る。キットは、ホスホロチオレート連結の切断に適した切断試薬（例えば、ＡｇＮＯ３）および該切断を行なうための適切なバッファーを含むものであり得る。キットのある特定のものは、トリガー残基、例えば、損傷塩基または無塩基残基を含有するヌクレオシドを含む伸長オリゴヌクレオチドプローブを含む。キットは、１種類以上の初期オリゴヌクレオチドをさらに含むものであり得る。キットは、ヌクレオシドと隣接する無塩基残基間の連結の切断に適した切断試薬および／または損傷塩基をポリヌクレオチドから除去するのに適した試薬（例えば、ＤＮＡグリコシラーゼ）を含むものであり得る。ある特定のキットは、二糖ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブを含み、切断試薬として過ヨウ素酸塩を含む。ある特定の実施形態において、キットは、識別可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブファミリーのコレクションを含む。
【０２９０】
キットは、ライゲーション試薬（例えば、リガーゼ、バッファーなど）および具体的な本発明の実施形態を行なうための取扱い説明書を含むものであり得る。使用され得るその他の酵素、例えば、ホスファターゼ、ポリメラーゼに適切なバッファーを含めてもよい。場合によっては、これらのバッファーは同一であり得る。キットはまた、鋳型を固定するための支持体、例えば、磁気ビーズを含むものであり得る。ビーズは、ＰＣＲ増幅を行なうためにプライマーにより官能性付与されていてもよい。他の任意選択的な成分としては、洗浄溶液；ＰＣＲ増幅のための鋳型の挿入用ベクター；ＰＣＲ試薬、例えば、増幅プライマー、熱安定性ポリメラーゼ、ヌクレオチドなど；エマルジョン調製のための試薬；ゲル調製のための試薬などが挙げられる。
【０２９１】
ある特定の好ましいキットには、ホスホロチオレート結合を含む蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブが、該プローブの異なる末端ヌクレオチドに対応するプローブが異なるスペクトルにより分離可能な蛍光染料を担持するように提供される。より好ましくは、４種類のかかるプローブが提供され、これは、４種類のスペクトルにより分離可能な蛍光染料の各々と、プローブの４種類の可能な末端ヌクレオチドとの間の１対１対応を可能にする。
【０２９２】
キットは、対合末端または断片ライブラリーを生成するのに好適なオリゴヌクレオチドおよび／またはベクターを含有する場合がある。キットは、ライブラリーのメンバーである鋳型分子の相補的な共通部分である１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドを含有する場合がある。
【０２９３】
識別物、例えば、バーコード、高周波ＩＤタグなどをキット内またはキット上に存在させてもよい。識別物は、例えば、品質管理、在庫管理、追跡、ワークステーション間の移動などの目的でキットを固有に識別するために使用され得る。
【０２９４】
キットは、一般的に、ある種の個々の試薬が個別に収容され得るように、１つ以上の容器（ｖｅｓｓｅｌ）または収容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）を含む。キットはまた、個々の収容器を、市販用に比較的コンパクトに（ｃｌｏｓｅ  ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ）封入するための手段、例えば、取扱い説明書、発泡スチレンなどのパッケージング材料などが封入され得るプラスチックボックスを含むものであり得る。
【０２９５】
Ｊ．Ｐａｒａｌｌｅｌ配列決定および自動配列決定システム
Ｍａｃｅｖｉｃｚは、特定の配列を有する単一鋳型種の配列決定を開示しているが、種々の配列を有する複数の鋳型の同時配列決定と並行してこの方法を実施する可能性については述べていない。本発明者等は、高いスループットで配列決定を効率的に実施するためには、上述のように、複数の担体（例えば、ビーズ）を、それぞれの担体に特定の配列の鋳型が付着するように調製し、それぞれの担体に付着した鋳型に対して、本明細書に記載の方法を同時に実施することが望ましいことを認識した。本手法のある実施形態において、複数のこのような担体は、スライドなどの平面の基材の中または上に配列される。ある実施形態において、担体は、ゲルなどの半固形培地の中または上に配列される。担体は、無作為に配列される場合があり、すなわち、基材上の各担体の位置は既定されていない。担体は、規則的な間隔を置いて位置する必要もなければ、列や行などの規則正しい配置に配置する必要もない。好ましくは、担体の多くまたはほとんどから個々のシグナルを検出することが可能な密度で、担体が配列される。ある好ましい実施形態において、担体は、主として単一の焦点面に分布する。同じ配列の鋳型が付着した複数の担体が、例えば品質管理の目的で含まれる場合もある。配列決定反応は、担体のそれぞれに付着した鋳型において、並行して実施される。
【０２９６】
シグナルは、種々のイメージング様式を含めた種々の手段のいずれかを使用して収集される場合がある。好ましくは、検出前に基材（例えば、基材上に配置された半固形担体に埋め込まれたビーズ）上に配列される微粒子に対して配列決定が実施される実施形態の場合、画像化装置の分解能は１μｍ以下である。例えば、ＣＣＤカメラを取り付けた走査型顕微鏡、または十分な分解能を有するマイクロアレイスキャナーを使用できると考えられる。あるいは、蛍光検出のために装備される顕微鏡に取り付けたフローセルまたは流体工学ワークステーションにビーズを通過させることもできる。その他のシグナル収集方法には光ファイバー束が含まれる。適切な画像収集処理ソフトウェアが使用される場合もある。
【０２９７】
本発明のある実施形態において、配列決定はマイクロ流体デバイスで行われる。例えば、鋳型が付着したビーズをデバイスに充填し、その中に試薬を流す場合がある。例えばＰＣＲを使用した鋳型合成もデバイスで行うことができる。米国特許第６，６３２，６５５号では、好適なマイクロ流体デバイスの例が記載されている。
【０２９８】
本発明は、配列情報を複数の鋳型から並行して、すなわち、実質的に同時に収集するために使用され得るさまざまな自動配列決定システムを提供する。好ましくは、鋳型は、実質的に平面状の基材上でアレイ状である。図２１は、本発明のシステムの一例の写真を示す。上側の写真に示すように、本発明のシステムは、ＣＣＤ  カメラ、蛍光顕微鏡、可動ステージ、Ｐｅｌｔｉｅｒフローセル、温度制御装置、液体操作装置および専用のコンピュータを備える。これらの構成要素の種々の置き換えがなされ得ることは認識されよう。例えば、代替的に画像捕捉装置が使用され得る。このシステムのさらなる詳細は実施例９に示す。
【０２９９】
本発明の自動配列決定システムならびに関連する画像処理方法およびソフトウエアは、さまざまな配列決定法、例えば、本明細書に記載のライゲーション系の方法ならびに他の方法、例えば、限定されないが、合成方法による配列決定、例えば、合成による蛍光インサイチュで配列決定（ＦＩＳＳＥＱ）など（例えば、を参照  Ｍｉｔｒａ  ＲＤら．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３２０（ｌ）：５５−６５，２００３）の両方を行うために使用され得ることは認識されよう。本明細書に記載のライゲーション系の配列決定法の場合のように、ＦＩＳＳＥＱは、半固相支持体内または該支持体上に直接固定化された鋳型上、半固相支持体内または該支持体上の微粒子上に固定化された鋳型上、基材に直接結合された鋳型上などで行なわれ得る。
【０３００】
本発明のシステムの重要な態様の１つは、フローセルである。一般に、フローセルは、内部を流体が流動し得る流入ポートおよび流出ポートを有するチャンバを含む。種々のフローセルならびにその製造のための材料および方法の論考については、例えば、米国特許第６，４０６，８４８号および同第６，６５４，５０５号ならびにＰＣＴ公開公報ＷＯ９８０５３３００を参照のこと。流体の流動により、種々の試薬をフローセル内に位置する実体（例えば、鋳型、微粒子、解析物など）に添加し、これらから除去することが可能になる。
【０３０１】
好ましくは、本発明の配列決定システムにおける使用に適したフローセルは、流体がその表面を流動するような基材、例えば、スライドなどの実質的に平面状の基材が取り付けられる位置、および照光、励起、シグナル取得などを可能にする窓を備える。本発明の方法によれば、微粒子などの実体は、典型的にはフローセル内に配置する前に、基材上にアレイ状にする。
【０３０２】
本発明のある特定の実施形態において、フローセルは垂直に配向させ、これにより、気泡をフローセルの上面から散逸させることが可能になる。フローセルは、流体経路がフローセルの下部から上に流れるように、例えば、流入ポートがセルの下部に存在し、流出ポートがセルの上に存在するように配設する。導入され得る気泡は浮揚性であるため、これは、照光窓を障害することなく速やかに流出ポートに浮揚する。気泡を液体の表面まで、その密度が該液体のものより低いことによって上昇させるこのアプローチを、本明細書では「重量測定気泡移動」という。したがって、本発明は、重量測定気泡移動が可能になるように配向させたフローセルを含む配列決定システムを含むを提供する。好ましくは、自身に直接もしくは間接的に結合された微粒子（例えば、共有結合もしくは非共有結合により基材に結合）、または基材に接着もしくは固定された半固相支持体内または該支持体上に固定化された微粒子を有する基材をフローセル内に垂直になるように、すなわち、基材の最大の平面状の表面が、設置面に対して垂直になるように取り付ける。好ましい実施形態では、微粒子は、支持体または基材内またはその上面に固定化されているため、互いに対して実質的に固定された位置に維持され、これにより逐次的な画像取得と画像レジストレーションが容易になる。
【０３０３】
図２４Ａ〜Ｊは、種々の向きの本発明のフローセルまたはその一部分の概略図を示す。本発明のフローセルは、任意のさまざまな目的、例えば、限定されないが、解析方法（例えば、配列決定、ハイブリダイゼーションアッセイなどの核酸解析法；タンパク質解析法、結合アッセイ、スクリーニングアッセイなどに使用され得る。フローセルはまた、合成を行うため、例えば、コンビナトリアルライブラリーを作製するためなどに使用され得る。
【０３０４】
図２２は、別の本発明の自動配列決定システムの概略図を示す。フローセルは、自動温度制御ステージ（実施例９に記載のものと類似）上に取り付けられ、液体操作システム（例えば、マルチポートバルブを有するシリンジポンプなど）に接続されている。該ステージは、他の工程、例えば、伸長、ライゲーションおよび切断などが別のフローセルで行なわれている間に、１つのフローセルが画像化されるのを可能にするために、多数のフローセルを収容する。このアプローチは、高価な光学システム  の利用を最大限にするとともに、処理量を増大させる。
【０３０５】
流体ラインには、気泡を検出ため、および試薬の使用をモニターするための光学および／または伝導性センサーが設置されている。流体工学システム内の温度制御およびセンサーにより、試薬が、長時間の安定に適切な温度に維持されるが、フローセル内に侵入するとき作業温度またはで上昇せず、アニーリング、ライゲーションおよび切断工程中での温度変動が回避されることが確保される。試薬は、好ましくは、誤負荷を回避するためキット内に予め装填しておく。
【０３０６】
光学装置としては、４つのカメラが含まれ、各々が、４つのフィルターセットの１つから１つの画像を撮影する。光退色性効果を低減させるため、照光光学装置は、画像化される領域だけに照光されるように、視野周辺の多重照光が回避されるように設計されたものであり得る。画像化光学装置は、標準的な無限遠補正顕微鏡対物レンズおよび標準的なビームスプリッタおよびフィルターから構成されたものであり得る。標準的な２，０００×２，０００ピクセルＣＣＤカメラは、画像を取得するために使用され得る。該システムには、光学装置のための適切な機械的支持体が組み込まれれている。照光強度は、好ましくは、後の解析ソフトウエアによる使用のためにモニターされ、記録される。
【０３０７】
複数の画像（例えば、代表的な実施形態において、およそ１８００以上の非重複画像フィールド）を速やかに取得するため、該システムには、好ましくは、高速オートフォーカスシステムを用いる。画像自体の解析に基づくオートフォーカスシステムは、当該技術分野でよく知られている。これは、一般的に、１回のフォーカシング事象に少なくとも５フレームを必要とする。これは、フォーカシング画像を取得するために余分な照光が必要とされるという点で、低速および高価の両方である（光退色性が増大する）。本発明のある特定の実施形態において、択一的なオートフォーカスシステム、例えば、該機械的システムが応答し得るのと同等に高速にフォーカシングし得る独立した光学装置に基づくシステムが使用される。かかるシステムは当該技術分野で知られており、例えば、コンシューマＣＤプレイヤーに用いられるフォーカシングシステム（これは、ＣＤ回転時にリアルタイムでサブミクロンフォーカシングを維持する）が挙げられる。
【０３０８】
本発明のある特定の実施形態において、該システムは、遠隔操作される。特定のプロトコルを実行するためのスクリプトは、セントラルデータベース内に保存し、各配列決定実行のためにダウンロードされ得る。試料は、バーコードを付けて、試料追跡の完全性および試料と最終データとの関連付けが維持され得る。リアルタイムのセントラルモニタリングにより、プロセスエラーの迅速な解決が可能になる。ある特定の実施形態において、機器によって収集された画像は、直ちにセントラルマルチテラバイト保存システムおよび１つ以上のプロセッサバンクにアップロードされる。セントラルデータベースからの追跡データを用い、プロセッサ（１つまたは複数）により画像が解析され、配列データが作製され、任意選択で、例えば、機器の性能を調節するために、バックグラウンド蛍光レベルおよびビーズ密度などのメトリクスが処理される。
【０３０９】
制御ソフトウエアは、ポンプ、ステージ、カメラ、フィルター、温度制御を適正にシーケンス処理するため、ならびに画像データの注記付けおよび保存のために使用される。ユーザーインターフェースは、例えば、作業者が機器をセットアップし、維持するのを補助するために設けられ、好ましくは、スライドの負荷／取り出しおよび流体ラインの準備（ｐｒｉｍｉｎｇ）のためのステージを位置合わせする機能を含むものである。例えば、作業者に、種々の実行パラメータ、例えば、温度、ステージ位置、光学フィルター構成の現状、実行プロトコルの状態などを示すためのディスプレイ機能を含め得る。好ましくは、試薬ロットおよび試料ＩＤなどの追跡データを記録するデータベースへのインターフェースを含める。
【０３１０】
Ｋ．画像およびデータ処理方法
本発明は、少なくとも一部は、コンピュータ可読媒体上に保存されたコンピュータコード（すなわち、ソフトウエア）として行なわれ得るさまざまな画像およびデータ処理方法を提供する。さらなる詳細は、実施例９および１０に示す。また、一般に、配列決定法ＡおよびＢでは、ともに、一般的に、例えば、多重配列決定反応で収集されたデータの追跡管理、かかるデータの合成、候補配列の作製、配列比較の実施などを伴う該処理工程を行なうための適切なコンピュータソフトウエアが使用される。
【０３１１】
Ｌ．配列情報を保存するコンピュータ可読媒体
また、本発明は、本発明の配列決定法を適用することにより得られた情報を保存するコンピュータ可読媒体を提供する。情報としては、生データ（すなわち、さらなる処理または解析がされていないデータ）、処理または解析されデータなどが挙げられる。データには、画像、数値も含まれる。情報は、典型的には、検索が容易なように配設された、例えば、コンピュータメモリ内に保存されたデータベース、すなわち、情報（例えば、データ）のコレクションに保存され得る。情報としては、例えば、配列および配列に関する任意の情報（例えば、部分配列）、配列と参照配列との比較、配列解析の結果、ゲノム情報、例えば、多型情報など（例えば、ある特定の鋳型が多型を含むか否か）または変異情報など、連鎖情報（すなわち、例えば、染色体内での核酸配列の別の核酸配列に対する物理的な位置に関する情報）、疾患関連情報（すなわち、疾患の存在または疾患に対する感受性を、被験体の身体的形質、例えば、被験体の対立遺伝子と相関させる情報）などが挙げられる。情報は、試料ＩＤ、被験体ＩＤなどと関連したものであり得る。試料、被験体などに関するさらなる情報は、例えば、限定されないが、試料の供給源、試料において行なわれた処理工程、情報の解釈、試料または被験体の供給源などに含まれ得る。本発明はまた、前述の任意の情報をコンピュータ可読形式に受信する、例えば、コンピュータ可読媒体に保存することを含む方法を含む。該方法は、該情報にに基づく診断的、予後的もしくは予測的情報を提供する工程、または第３者に、好ましくはコンピュータ可読媒体に保存された情報を単に提供する工程をさらに含み得る。
【０３１２】
以下の実施例は例示の目的で提供され、本発明を限定することは意図されない。
【０３１３】
（実施例１：ホスホロチオレート含有オリゴヌクレオチドの効率的な切断およびライゲーション）
この実施例では、３’−Ｓホスホロチオレート結合を含有する伸長オリゴヌクレオチドの効率的なライゲーションおよび切断を示す実験を記載する。
【０３１４】
材料および方法
ライゲーション配列決定プロトコル
鋳型調製：サイクル的オリゴヌクレオチドライゲーションおよび切断による配列決定の可能性の評価を示すため、および該方法のある特定の態様の変形の効果を検討するため、２組のモデルビーズ系鋳型集団を調製した。実施例に記載したような好ましい実施では、サイクル的オリゴヌクレオチドライゲーションおよび切断により、鎖は３’→５’方向に伸長される。したがって、ライゲーション効率を評価するため、モデル鋳型を、ビーズに５’末端において結合させ、同じ結合領域を３’末端に有するように設計した。１組は、二重ビオチン部分によってストレプトアビジンコート磁気ビーズ（１ミクロン）に結合させた短鎖（７０ｂｐ）オリゴヌクレオチドで構成されたものであった。これらの短鎖鋳型集団の各々は、同一のプライマー結合領域（４０ｂｐ）および特有の配列領域（３０ｂｐ）を３’末端に有するように設計した。この短鎖オリゴヌクレオチド鋳型集団をライゲーション配列決定鋳型１〜７（ＬＳＴ１〜７）と命名した。
【０３１５】
第２の組のビーズ系鋳型集団は、１８３ｂｐのスペーサー配列（ヒトｐ５３エキソン由来）を各鋳型集団内に挿入することにより誘導した長鎖のＰＣＲ生成ＤＮＡ断片（２３２ｂｐ）から設計した。鋳型は、二重ビオチン含有フォワードプライマー、および短鎖鋳型集団と同じ３０塩基の特有３’末端配列を含有するリバースプライマーを用いて増幅させた。鋳型は、水酸化ナトリウム含有バッファーを用いて一方の鎖を融解して離すことにより単鎖に作製した。これらの長鎖鋳型集団は、係属中の特許出願に記載された短鎖断片対末端ライブラリーから生成される種を模倣するように設計し、長鎖ＬＳＴ１〜７と命名した。
【０３１６】
プライマーハイブリダイゼーション：２．５μＬの１００μＭ  ＦＡＭ標識プライマーを、１００μＬの１×クレノウバッファーと予備混合した。この溶液を、バッファーの除去後、鋳型が結合された磁気ビーズ（１０６／μＬ）のアリコート３０μＬに添加し、得られた溶液を充分混合した。鋳型／プライマーハイブリダイゼーションを行なわせた後（ハイブリダイゼーション反応は６５℃で２分間、４０℃で２分間および氷上で２分間行なった）、プライマー／バッファーを除去し、ビーズを、３×洗浄ＩＥバッファーを用いて洗浄し、次いで、３００μＬ（１０６／ｍＬ）をＴＥＮＴバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，２ｍＭ  ＥＤＴＡ，３０ｍＭ  ＮａＯＡｃおよび０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有）に再懸濁した。
【０３１７】
ライゲーション１：次いで、ＬｉｇＳｅｑ−ＦＡＭがハイブリダイズした２．５×１０６のＬＳＴ７ビーズを、３０分間３７℃で、１μＬの１００μＭ  ＬＳＴ７−１九量体，４μＬの５×Ｔ４リガーゼバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），１４μＬのＨ２Ｏおよび１μＬのＴ４リガーゼ（１ｕ／μＬ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する混合物中でインキュベートした。
【０３１８】
切断１：次いで、ビーズを１００μＬのＬＳＷａｓｈ１（１×ＴＥ，３０ｍＭ酢酸ナトリウム，０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００含有）で３回洗浄し；この溶液の１０μＬアリコートを取り出し、解析のために保存した。次いで、ビーズ（ＩＸ）を１００μＬの３０ｍＭ酢酸ナトリウム中で洗浄した。５０μＬの５０ｍＭ  ＡｇＮＯ３をこの溶液に添加し、得られた混合物を３７℃で２０分間インキュベートした。ＡｇＮＯ３を除去し、ビーズを１回、１００μＬの３０ｍＭ酢酸ナトリウム中で洗浄した。次いで、ビーズを１００μＬのＬＳＷａｓｈ１で３回洗浄し、９０μＬの洗浄。（ＴＥＮＴバッファー）に再懸濁し、この溶液の１０μＬアリコートを取り出し、解析のために保存した。
【０３１９】
ライゲーション２：ＴＥＮＴバッファーの除去後、ビーズを１４μＬのＨ２Ｏに再懸濁し、３７℃で３０分間、１μＬの１００μＭ  ＬＳＴ７−５九量体，４μＬの５×Ｔ４リガーゼバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１μＬのＴ４リガーゼ（１ｕ／μＬ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する混合物とともにインキュベートした。
【０３２０】
切断２：ビーズを、１００μＬのＬＳＷａｓｈ１（１×ＴＥ，３０ｍＭ酢酸ナトリウム，０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００）中で３回洗浄し、４５μＬのＷａｓｈｌＥに再懸濁した。この混合物の１５μＬアリコートを取り出して解析のために保存した。次いで、ビーズを１００μＬの３０ｍＭ酢酸ナトリウムで１回洗浄し、５μＬの２０ｍＭ酢酸ナトリウムに再懸濁した。５０μＬの５０ｍＭ  ＡｇＮＯ３をビーズに添加し、混合物を３７℃で２０分間インキュベートした。ＡｇＮＯ３の除去後、ビーズを、１００μＬの３０ｍＭ酢酸ナトリウムで１回洗浄した。次いで、ビーズを、１００μＬのＬＳＷａｓｈ１中で３回洗浄し、３０μＬのＷａｓｈｌＥに再懸濁した。この混合物  ２０μＬアリコートを取り出して解析のために保存した。
【０３２１】
結果
この実験は、図８を参照すると、より良好に理解されよう。図８の上側のセクションは、実験手順の全体的な概要を示す。初期オリゴヌクレオチド（プライマー）を、ビオチン結合によってビーズ結合された鋳型（ＬＳＴ７で示す）にハイブリダイズさせた。初期オリゴヌクレオチドには５’リン酸基を含め、その３’末端をＦＡＭで蛍光標識した。２種類の９量体（九量体）オリゴヌクレオチドプローブ（第１切断可能なオリゴおよび第２切断可能なオリゴ）を、内部にホスホロチオレート含有チミジン塩基（ｓＴ）（下線）を含むように合成した。第１の切断可能なプローブをプライマーの伸長可能な末端に、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いてライゲートし、次いで、硝酸銀を用いて切断した。切断により、伸長プローブの末端の５ヌクレオチドが除去され、伸長可能な末端が、プローブのプライマーにライゲートされたままの部分上に生成した。次いで、第２の切断可能なプローブを伸長可能な末端にライゲートさせ、次いで、同様に切断させた。
【０３２２】
蛍光キャピラリー電気泳動ゲルシフトアッセイを、ライゲーションおよび切断の工程をモニタリングするために使用した。このアッセイでは、プライマーを鋳型鎖に、
５’リン酸基が、接近する（ｉｎｃｏｍｉｎｇ）オリゴヌクレオチドプローブのライゲーション基質としての機能を果たし得る（フルオロフォアは、移動度型キャピラリーゲル電気泳動のレポーターとしての機能を果たす）ようにハイブリダイズさせる。各工程後、ビーズのアリコートを解析のために取り出した。オリゴヌクレオチドプローブのライゲーション後、磁気ビーズを磁石を用いて回収し、ライゲートされたプライマーおよびプローブ（１つまたは複数）からなるライゲート種を、鋳型ビーズから熱変性によって放出させ、自動ＤＮＡ配列決定機器（ＡＢＩ  ３７３０）を用いる蛍光キャピラリー電気泳動に供した。標識されたサイズ標準（リサミンラダー；  １５〜１２０ヌクレオチドのサイズ範囲；クロマトグラムにおいて１組の橙色ピークとして出現、図８参照）。典型的なゲルシフトにおいて、潜在ピークとしては、ｉ）プライマーピーク（無伸長またはプライマー伸長の不足による）、ｉｉ）アデニル化ピーク（ＤＮＡリガーゼの作用による非生産的ライゲーション接合部の５’末端アデノシン残基の結合による−図８Ｆの機構を参照、また、Ｌｅｈｍａｎ，Ｉ．Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８６：７９０−７９７，１９７４も参照）、およびｉｉｉ）終了ピーク（オリゴプローブの結合による）が挙げられる。ライゲーション効率を評価するためのゲルシフトアッセイの使用の利点の１つは、ピーク下面積が、各種の濃度と直接相関することである。
【０３２３】
図８Ａは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼおよびホスホジエステル結合のみを含有する正確にマッチングしたプローブ（図８Ａの左に示す）を用いて行なわれる対照ライゲーションを示す。橙色ピークはサイズマーカーを表す。左の青色ピークは、ライゲーションの非存在下のプライマー位置を示す。正確にマッチングしたプローブライゲーションは、左へのシフトをもたらす（矢印）。図８Ｂは、同じ条件下で、内部に  チオレート含有Ｔ塩基を含有するプローブ（図８Ｂの左に示す）を用いて行なわれるライゲーションを示す。対照プローブで観察されるものと同一のシフトが見られた（矢印）。ライゲートされたホスホロチオレート含有プローブを含有するビーズ連結鋳型集団を、次いで、硝酸銀とともにインキュベートし、プローブ切断を誘導した。ゲルシフト解析により、左にシフトされた４ｂｐ切断産物（図８Ｃ）の標示によって効率的な切断を確認した。予測される切断産物を図８Ｃの左に示す。切断されたビーズ系鋳型集団を、次いで、第２の回目のライゲーションに曝露し、右にシフトされた１３ｂｐ伸長産物（図８Ｄ）の出現によって生産的ライゲーションが示された。予測される切断産物を図８Ｄの左に示す。２回目の切断により、予測された左にシフトされた８ｂｐ切断産物（図８Ｅ）によって示されるように、効率的な多数の切断工程がなされ得ることが確認された。これらの結果は、成功裏のライゲーションおよびホスホロチオレート結合を含有するプローブの切断を示す。
【０３２４】
これらの実験で、ライゲーションが１００％完了まで進行しなかったことは明白であるが、より高い完了度が、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いた他の実験において観察された（下記参照）。確かに、ライゲーションが完了まで進行することは望ましいが、必須要件ではない。例えば、上記のようなライゲーション工程後、任意の非ライゲート５’末端を５’−ホスファターゼで処理することにより有効に「キャッピングする」ことが可能である。しかしながら、その場合、ライゲーション可能な分子の自然減により、行なわれ得る連続ライゲーションの回数が制限され得る。所与の回数の連続ライゲーションについて、読出し長さは、各ライゲーション／切断サイクル後に残ったプローブの長さ、および
配列決定反応の回数（各々の後には、プライマーの除去およびプライマー結合部位の異なる部分に結合するプライマーのハイブリダイゼーションが起こり、これらは、所与の鋳型において行なわれ得、「リセット」回数ともよばれる）に依存する。これは、プローブの５’末端側に位置する切断可能な連結を有するより長鎖のプローブの使用の場合に論じられる。本発明者らの実験では、六量体プローブにより、八量体およびより長鎖のプローブよりも多量の非ライゲーション可能アデニル化産物をもたらす。したがって、八量体およびより長鎖プローブは、実質的に完了までライゲートされる（下記参照）。また、六量体プローブの５’末端への蛍光部分の付加により、ライゲーション効率が低下するようであるが、八量体プローブへの蛍光部分の付加は、影響はほとんどまたは全くない。これらの理由のため、八量体またはより長鎖のプローブは好ましいとみなされる。
【０３２５】
さらなる実験（後述）により、ホスホロチオレート結合および縮重低減性ヌクレオチドを含有するプローブのライゲーションおよび切断；ライゲートされた伸長プローブの３’末端特異性および選択性；ゲル内ライゲーションおよび切断；最小シグナル損失でのプライマーハイブリダイゼーションおよび除去の連続的サイクル；３’→５’伸長でのＴ４またはＴａｑリガーゼの１００％忠実度；ならびにライゲートされた伸長プローブの４色スペクトル分離可能性を示した。該方法を行なうための自動システムを構築した。
【０３２６】
（実施例２：縮重低減性ヌクレオチドを含有するホスホロチオレート含有オリゴヌクレオチドの効率的な切断およびライゲーション）
しかしながら、プローブ長さと競合する考慮事項は、伸長オリゴヌクレオチドの忠実度およびその後続のライゲーション効率に対する影響である。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの忠実度は、接合後、第５番目の塩基以降で急速に低下することが示されている（Ｌｕｏら．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２４：３０７１−３０７８および３０７９−３０８５，１９９６）。ミスマッチを新たなライゲーション接合部の５’側に導入した場合、ライゲーション効率は自然減により低下し得るが、バックグラウンドシグナルにおける位相の散逸または増大は生じない（合成方法によるポリメラーゼ系配列決定に見られる大きな障害）。
【０３２７】
プローブの組は、キャラクタライズされていないＤＮＡのデノボ（ｄｅ  ｎｏｖｏ）配列決定を可能にするため、好ましくは、任意のＤＮＡ配列にハイブリダイズできるものであるのがよい。しかしながら、標識されたプローブの組の複雑度は、４重縮重塩基の長さおよび数にともなって指数関数的に増大する。また、複合プローブの組は、あらゆるプローブ種のほぼ等しい提示を維持したまま、合成するのはより困難であり、生成することよりも困難である。また、これは、各種を一定濃度に維持するのに、より高濃度のプローブ混合物を必要とする。この複雑度に対処するための方法の一例は、４重縮重塩基の代わりに普遍塩基、例えば、デオキシイノシンなどがある特定の位置に組み込まれたヌクレオチドの使用である。
【０３２８】
４重縮重塩基（Ｎ；等モル量のＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）および普遍塩基イノシン（Ｉ）を、八量体内の種々の位置に有する１２種類のオクタヌクレオチドプローブを設計した（イノシンは、Ｂ−ＤＮＡ内の任意の４つの標準塩基と二座に配位した水素結合をすることができる；イノシン塩基対の安定性の順は、Ｉ：Ｃ＞Ｉ：Ａ＞Ｉ：Ｔ≒Ｉ：Ｇである）。これらのプローブ設計の評価の目的の１つは、依然としてイノシン塩基の存在下での効率的なライゲーションを支持したまま、どれだけ低い八量体複雑度が達成され得るかを調べることであった。
【０３２９】
最初の研究では、いくつかのオリゴヌクレオチドプローブを、ビーズ系鋳型（長鎖−ＬＳＴ１）にＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いてライゲートさせた。ライゲーションされると、フルオロフォア標識プライマー（３’ＦＡＭプライマー）は、ライゲートされたオリゴヌクレオチドプローブの量に比例して右にシフトする。設計プローブＮＩ８−９は最高レベル完了を示し、プローブの効率的なライゲーションにより、＞９９％のプライマー集団が右にシフトした（図９参照）。これらの反応は２５℃で行なった；反応温度を３７℃に上げると、ライゲーションは、いくぶん効率が下がり、完了率はより変動的であった。
【０３３０】
データをより詳細に調べると、接合部の３’側の最初の５つのヌクレオチド内により少数のイノシン塩基を有するプローブ（下線）は、より高いライゲーション効率を示すことが示された。ライゲーション効率に対する配列状況の潜在的効果をさらに検討し、評価するため、ライゲーション接合部の３’側の最初の５つの塩基内にたった１つのイノシン残基を有する４種類の設計オリゴヌクレオチドプローブを、すべての鋳型においてスクリーニングした。図１０は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用し、多数の鋳型上の選択したプローブ組成物でのゲルシフトアッセイを用いて評価したときのライゲーション完了を示す。これらの最初の実験のデータにより、ライゲーション効率、したがって完了は、イノシン残基がライゲーション接合部３’側の最初の５つの位置（下線）に配置された場合、変動的であり配列依存性であることが示された。八量体の効率的なライゲーションは、一貫して観察されたが、設計オリゴヌクレオチドプローブＮＩ８−９では、本明細書に示すように、試験したすべての鋳型において＞９９％完了であった。
【０３３１】
なんら理論に拘束されることを望まないが、このデータ（アデニル化中間体の存在を含む）は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼのためのコアＤＮＡ結合部位内の好ましくないイノシン塩基対により、ＤＮＡタンパク質複合体が不安定化され、酵素結合および後続のライゲーションが充分に低減されるという結論を裏付ける。しかしながら、興味深い疑問は、かかるイノシン塩基対の不安定化が、ライゲートされるオリゴヌクレオチドプローブの忠実度に影響し得るのかどうかということであった。
【０３３２】
（実施例３：プローブライゲーションの忠実度）
Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼなどの細菌ＮＡＤ依存性リガーゼは、ライゲーション接合部において高い配列忠実度を有し、３’側のミスマッチは本質的にニック閉鎖（ｎｉｃｋ−ｃｌｏｓｕｒｅ）活性を有しないが、５’側のミスマッチはある程度許容性（ｔｏｌｅｒａｔｅｄ）であることが報告されている（Ｌｕｏら．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２４：３０７１−３０７８および３０７９−３０８５，１９９６）。他方、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼは、いくぶんストリンジェンシーが低く、ミスマッチが接合部の３’および５’の両側で許容されることが報告されている。したがって、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いてプローブライゲーションの忠実度を、本発明者らのシステムの状況におけるＴａｑ  ＤＮＡリガーゼとの比較において評価することは、興味深かった。
【０３３３】
本発明者らは、標準的なＡＢＩ配列決定手法を用いてライゲートされるオリゴヌクレオチドの配列忠実度を評価する２つの方法を開発した。第１の方法は、ライゲーション産物をクローニングし、配列決定するように設計した。この方法では、ライゲーション伸長産物をアダプター配列に結合し、クローニングし、細菌内で形質転換した。個々のクローンを採取し、配列決定して、ライゲーション接合部における各位置でのミスマッチ頻度の定量的評価を得た。第２の方法は、ライゲーション産物を直接配列決定するように設計した。該アプローチでは、単鎖ライゲーション産物をビーズ系鋳型から変性させ、相補プライマーを用いて直接配列決定した。精度の低い位置は配列図（ｔｒａｃｅ）において多数の重複ピークを示し、該位置における配列忠実度を示す定性的評価が得られる。
【０３３４】
第１の方法を用いて、Ｔ４およびＴａｑ  ＤＮＡリガーゼによるプローブライゲーションの相対忠実度を評価した。単一のビーズ系鋳型集団（ＬＳＴ１）を普遍配列決定プライマーにハイブリダイズさせ、これを初期オリゴヌクレオチドとして用いた。次いで、溶液系ライゲーション反応を、縮重オリゴヌクレオチドプローブ（Ｎ７Ａ、３ΑＮＮＮＮＮＮＮ５’、２０００ｐｍｏｌ）の存在下で３７℃、３０分間、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（１５Ｕ／１×１０６  ビーズ）またはＴａｑ  ＤＮＡリガーゼ（６０Ｕ／１×１０６  ビーズ）のいずれかを用いて行なった（図１１、パネルＡ）。ライゲーション産物をクローニングし、配列決定して、そのライゲーション接合部の３’側（１〜８位）の各ＤＮＡリガーゼの位置ごとの忠実度を評価した（図１１、パネルＢおよびＣ）。その結果、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼは、最初の５つ位置ではＴａｑ  ＤＮＡリガーゼと本質的に同じレベルの忠実度を有するが、６〜８位では忠実度が低いことが示された。これらの結果は、３種類の縮重イノシン含有設計プローブ（３’−ＮＮＮＮＮＩＩＩ−５’、３’−ＮＮＮＮＮＩＮＩ−５’および３’−ＮＮＮＩＮＮＮＩ−５’）での、７種類すべての鋳型（ＬＳＴ１〜７）のライゲーション接合部におけるＤＮＡ配列を評価した後続のクローニング実験によってさらに支持された。これらの研究により、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼはライゲーション接合部において６〜８位では低い配列忠実度を有することが確認されたが、最初の５つ位置では試験したすべての鋳型において高い忠実度が示される（データ示さず）。
【０３３５】
直接配列決定法を使用し、縮重イノシン含有プローブを用いてＴ４  ＤＮＡリガーゼの忠実度を評価した。オリゴヌクレオチドプローブは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼおよびビーズ系鋳型を含むライゲーション反応物において、２５℃および３７℃で評価した。オリゴヌクレオチドプローブライゲーション効率は、ゲルシフトアッセイを用いて評価した（図１２、パネルＡ）。オリゴヌクレオチドプローブライゲーションにおけるＴ４  ＤＮＡリガーゼの忠実度を評価するため、ＡＢＩ３７３０ｘｌ  ＤＮＡ解析装置を用いたライゲーション反応の直接配列決定を行なった（図１２、パネルＢ）。正確にマッチングしたオリゴプローブと２種類の代表的な縮重イノシン含有オリゴプローブ（ＮＩ８−９およびＮＩ８−１１）のライゲーションにより、＞９９％完了および非常に低頻度のミスマッチ（配列図における多重ピークの非存在）が得られた。このデータにより、プローブが効率的にライゲートされることによっても高い配列忠実度がもたらされることが示される。
【０３３６】
さらなる実験において、単一のビーズ系鋳型集団（ＬＳＴ１）を、５’リン酸基を含む普遍配列決定プライマーにハイブリダイズさせ、これを初期オリゴヌクレオチドとして用いた。溶液系ライゲーション反応を３７℃で３０分間、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（１Ｕ／  ２５０，０００ビーズ）を用い、縮重イノシン含有オリゴヌクレオチドプローブ（３’ＮＮＮＮＮｉｉｉ５’、３’ＮＮＮＮＮｉＮｉ５’または３’ＮＮＮｉＮＮＮｉ５’、６００ｐｍｏｌ）の存在下で行なった。ライゲーション産物をクローニングし、コロニーを採取し、配列決定した。配列忠実度は、ライゲーション接合部における各位置に提示されたクローンの数を計算することにより決定した。結果を図１２のパネルＣ〜Ｆに表で示す。これらの研究は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いた縮重イノシン含有プローブの３’→５’ライゲーションが、最初の１〜５位で高レベルの忠実度を有することを示す。
【０３３７】
（実施例４：ゲル内ライゲーションおよび切断）
サイクル的オリゴヌクレオチドライゲーション方法を検討、開発および最適化するための最初の実験は、上記のように、溶液中でビーズ系鋳型を用いて行なった。第２の組の実験では、ライゲーションおよび切断を、スライド上のポリアクリルアミドゲル内に包埋したビーズ系鋳型において行なった。
【０３３８】
スライドは、各々が自身に結合された単鎖ＤＮＡ鋳型のクローン性の集団を有する数百万個のビーズを５％ポリアクリルアミドと混合し、ガラススライド上で重合を行なわせることにより調製した。テフロン（登録商標）マスクを用いてビーズ含有ポリアクリルアミド溶液を封入した。図１４（上）は、Ｃｙ３標識プライマーがハイブリダイズされた鋳型が結合されたビーズがポリアクリルアミドゲル内に固定化されたスライドの一部分の蛍光画像を示す（このスライドは、異なる実験に使用したが、ここで使用したスライドの典型である）。図１４（下）は、ポリアクリルアミド溶液を封入するためのテフロン（登録商標）マスクを設けたスライドの概略図を示す。
【０３３９】
反応体をスライド内に、適切な溶液中への手作業によるスライドの浸漬、または自動層流型フローセル内へのスライドの配置のいずれかによって導入した。最初の研究により、効率的なゲル内ライゲーションが実際に、かかるスライド上のポリアクルルアミドマトリックス内に固定化されたビーズに結合された鋳型において行なわれ得ることが確認された。図１５に示す実験では、単鎖ＤＮＡ鋳型ビーズをアクリルアミドおよびＤＡＴＤを含むスライド上に固定化した。重合後、３’フルオロフォア標識された普遍５’リン酸化プライマー（Ｓｅｑプライマー）をゲル内に拡散させ、ハイブリダイズさせた（パネルＡ）。スライドを洗浄して非結合ｓｅｑプライマーを除去し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（１０Ｕ）およびオリゴヌクレオチドプローブを含むライゲーションカクテルを重層し、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、スライドを、過ヨウ素酸ナトリウム（０．１Ｍ）を含有するバッファー中でインキュベートし、アクリルアミドポリマーを消化させ、ビーズ系鋳型集団を放出させた。ライゲーション産物を熱により鋳型鎖から変性させ、回収し、上記のゲルシフトアッセイを用いて解析した。ゲル内ライゲーション反応をＴ４  ＤＮＡリガーゼの非存在下で行ない、非ライゲート配列決定プライマーに代表的な単一のピークが示された（パネルＢ）。ライゲーション反応は、八量体プローブを用い、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの存在下で行ない、効率的なゲル内オリゴヌクレオチドライゲーションが示され、＞９９％のビーズ系鋳型集団が効率的にライゲートされた（パネルＣ）。
【０３４０】
（実施例５：４色検出）
検出効率を最大にするには、各可能な塩基付加産物に対応する異なる標識を有する１組のオリゴヌクレオチドプローブを用いることが望ましい。これを、図１５に概略を示し、適切な励起および発光フィルターを備えた本発明者らの自動配列決定機器においてモデル化した。プローブの特異性および選択性の課題に取り組むため、３組の八量体プローブを設計した。第１の組は、４種類の特有の鋳型集団に相補的で、異なる３’塩基および５’色素標識を有する４種類の八量体を含むものとした。第２の組は、特有の３’塩基および５’色素を有する７種類の特有の八量体を含むものとした。第３の組は、各々が異なる５’色素標識で同定される特有の３’末端塩基を有する４種類の縮重イノシン含有八量体設計プローブに対応させた。
【０３４１】
４色スペクトル正体を確認するため、プローブ組番号１を用いて、４種類の特有の鋳型集団（図１６参照）を検出した。ポリアクリルアミド内に包埋されたビーズに結合された４種類の特有の単鎖鋳型集団を含むスライドを調製した（パネルＡ）。各ビーズは、自身に結合された鋳型のクローン性の集団を有した。５’リン酸基を含有する普遍配列決定プライマーをインサイチュでハイブリダイズさせ、ライゲーション反応を、４種類の特有のフルオロフォアプローブ（Ｃｙ５、ＣＡＬ  ６１０、ＣＡＬ  ５６０、ＦＡＭ；各１００ｐｍｏｌ）およびＴ４  ＤＮＡリガーゼ（１０Ｕ／スライド）を含むオリゴヌクレオチドプローブ混合物を用いて行なった。スライドを３７℃で３０分間インキュベートし、洗浄して非結合プローブを除去した。スライドを明るい光で画像化し、白色光塩基画像（パネルＢ）を得た。蛍光励起には、４種類の帯域通過フィルター（ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、ＴｘＲｅｄおよびＣｙ５）を用いた。蛍光画像捕捉をライゲーションの前後で行なった。個々の集団を擬似カラー表示し（パネルＣ）、画像値のスペクトル正体をプロットし、最小シグナル重複を確認した（パネルＤ）。
【０３４２】
（実施例６：ゲル内でのライゲーション特異性および選択性の実証）
３’末端特異性を確認するため、プローブ組番号２を用いて、単一の鋳型集団のインテロゲーションを行なった（図１７参照）。ポリアクリルアミドゲル内に包埋された自身に結合され単一の鋳型集団（ＬＳＴ１．Ｔ）を有するビーズを有するスライドを調製し、普遍配列決定プライマーとインサイチュでハイブリダイズさせた（パネルＡ）。ゲル内ライゲーション反応を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（１０Ｕ／スライド）を使用し、単一の３’塩基だけが異なる４種類の５’末端−標識されたプローブで構成されたオリゴヌクレオチドプローブ混合物を用いて行なった。スライドを３７℃で３０分間インキュベートし、洗浄して非結合プローブ集団を除去した。スライドを白色光で画像化し、塩基画像を得（パネルＢ）、蛍光励起には、４種類の帯域通過フィルター（ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、ＴｘＲｅｄおよびＣｙ５）を用いた。蛍光画像捕捉をライゲーションの前後で行ない、単一のＦＡＭ系プローブ集団（青色スポット）がＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いたゲル内ライゲーション後に存在し、スペクトル重複がないことを確認した（パネルＣ、Ｄ）。このデータは、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを用いたプローブ特異性がストリンジェントであり、ライゲーション接合部の最初の３’末端塩基によって決定されることを示す。
【０３４３】
３’末端特異性および選択性をさらに実証するため、プローブ組番号２を用いて、単一の塩基差を含み異なる量で存在するビーズ系鋳型集団の混合物を同定した。図１８のパネルＡに示すような、各々が自身に結合された４つの鋳型集団（各々は一塩基多型を有する（ＬＳＴ１；Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ））の１つを有するビーズの混合物を有するスライドを調製した。ビーズを、スライド上のポリアクリルアミドゲル内に包埋した。ビーズ系鋳型集団は、パネルＤに概略を示すように、種々の異なる頻度で用いた。スライドをインサイチュで普遍配列決定プライマーとハイブリダイズさせた。ゲル内ライゲーション反応を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（１０Ｕ／スライド）および等モル量（各１００ｐｍｏｌ）の４種類の５’末端標識プローブ（単一の３’塩基だけ異なる）を含有するオリゴヌクレオチドプローブ混合物を用いて行なった。スライドを３７℃で３０分間インキュベートし、洗浄して非結合プローブ集団を除去した。スライドを白色光で画像化し、塩基画像を得（パネルＢ）、蛍光励起には、４種類の帯域通過フィルター（ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、ＴｘＲｅｄおよびＣｙ５）を用いた。個々のプローブ画像を重ね撮りし、擬似カラー表示した（パネルＣ）。蛍光画像を、ビーズ呼び出し（ｃａｌｌｉｎｇ）ソフトウエアを用いて一覧にした。結果をパネルＤに示す。観察されたライゲーション頻度（Ｏｂｓ）は、予測した頻度（Ｅｘｐ）と相関したことが確認される。このデータは、ライゲーション後、多数の鋳型の存在下での高いプローブ特異性およびプローブ選択性を示し、ライゲーションによって、一塩基多型（ＳＮＰ）、すなわち、集団の異なる個体のゲノムＤＮＡ鎖内の単一のヌクレオチド塩基内に生じた改変を検出できる能力を示す。
【０３４４】
（実施例７：４色縮重イノシン含有伸長プローブを用いたゲル内でのライゲーション特異性および選択性の実証）
別の組の実験をプローブ組番号３を用いて行ない、プローブライゲーションの特異性および選択性を、４色縮重イノシン含有オリゴヌクレオチドプローブプールを用いてを評価した。結果を図１９に示す。ビーズ系スライドを上記のようにして調製したが、４種類の特有の単鎖鋳型集団をビーズ上に異なる量で存在せ、これを、次いで、普遍配列決定プライマーとインサイチュでハイブリダイズさせた（パネルＡ）。ゲル内ライゲーション反応を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（１０Ｕ／スライド）の存在下、５種類の縮重塩基（Ｎ；複雑度４５＝１０２４）、２種類の普遍塩基（Ｉ、イノシン）および単一の既知ヌクレオチドを、特異的５’フルオロフォア（Ｇ−Ｃｙ５、Ａ−ＣＡＬ  ６１０、Ｔ−ＣＡＬ５６０、Ａ−ＦＡＭ；各６００ｐｍｏｌ）に対応する３’末端に有するように設計された八量体からなるプローブプールを用いて行なった。スライドを３７℃で３０分間インキュベートし、洗浄して非結合プローブ集団を除去した。スライドを白色光で画像化し、塩基画像を得（パネルＢ）、蛍光励起には、４種類の帯域通過フィルター（ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、ＴｘＲｅｄおよびＣｙ５）を用いた。個々のプローブ画像を重ね撮りし、擬似カラー表示した（パネルＣ）。蛍光画像を一覧にし、各ライゲーション産物の頻度を、ビーズ呼び出しソフトウエアを用いて表で示した（パネルＤ）；ビーズシグナル値の上部９０％表す未処理生データおよびフィルター処理データのスペクトル散布図をパネルＥに示す。このデータは、観察されたライゲーション頻度（Ｏｂｓ）が、各鋳型の既知濃度に基づいて予測した頻度（Ｅｘｐ）と相関したことを示す。これにより、縮重した普遍塩基含有プローブプールをＴ４  ＤＮＡリガーゼとともに使用すると、特異的および選択的なゲル内ライゲーションがもたらされ得ることが確認される。
【０３４５】
（実施例８：  ゲル内での初期オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよび除去の反復サイクルの実証）
自動フローセル内に取り付けた顕微鏡スライド上のゲル内に固定化された鋳型において実験を行ない（下記参照）、初期オリゴヌクレオチドのアニーリングおよびストリッピングの多数のサイクルが、スライド上のゲル内に包埋されたビーズに結合された鋳型に適用され得、シグナル損失は最少であることを確認した。４４塩基蛍光標識初期オリゴヌクレオチドを使用した。図２０に示すように、１０サイクルで生じたシグナル損失は最少であった。初期オリゴヌクレオチドを、図２０ではプライマーという。上記のように、合成手順によるポリメラーゼ系配列決定の大きな欠点の１つは正（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）および負（ｎｅｇａｔｉｖｅ）の両方の位相の散逸が個々の鋳型鎖において起こる傾向である。正の位相の散逸は、ヌクレオチドが成長鎖内に誤って組み込まれ、したがって、該特定の鎖の塩基配列が残りの鋳型から得られる配列より前で実行（ｒｕｎ  ａｈｅａｄ）され、ｎ＋１塩基呼び出し分位相ずれが引き起こされた場合に起こる。負の位相の散逸は、より一般的であり、鎖が充分に伸長されず、バックグラウンド塩基呼び出しがもたらされ、成長鎖より後ろ（ｎ−１）で実行された場合に起こる。伸長産物効率的にストリッピングできること、および差次的に位置する初期オリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることにより鋳型を「リセット」できることで、シグナル自然減がほとんどまたは全くなしで、非常に長い読出し長さが可能になる。
【０３４６】
（実施例９：自動配列決定システム）
この実施例では、１つ以上の鋳型から配列情報を収集するために使用され得る代表的な本発明の自動配列決定システムを記載する。好ましくは、鋳型を、実質的に平面状の基材、例えば、ガラス顕微鏡スライド上に配置させる。例えば、鋳型は、基材上でアレイ状であるビーズに結合されたものであり得る。該システムの写真を図２１に示す。該システムは、Ｏｌｙｍｐｕｓエピ蛍光顕微鏡本体（横向きに設置）を主部とし、自動オートフォーカシングステージおよびＣＣＤカメラを備える。回転式ホルダ内の４つのフィルタキューブにより、さまざまな励起および発光波長での４色検出が可能である。ペルチェ（ｐｅｌｔｉｅｒ）温度制御を伴うフローセルは、スライドなどの基材を収容するように開放および閉鎖が可能であり（ゲルなどの半固相支持体を含む領域の縁部周囲を密閉するためのガスケットを有する）、ステージ上に設置されている。フローセルの垂直配向は、本発明のシステムの重要な態様であり、気泡がフローセルの上部から散逸するのを可能にする。セルは、各洗浄工程前にすべての試薬が噴出されるように、空気が充分充填されたものであり得る。フローセルは、４種類の差次的に標識されたプローブ混合物、切断試薬、任意の他の所望の試薬、酵素並行化バッファー、洗浄バッファーおよび単一のポートを介するフローセルへの空気の送達を可能にする２つの９−ポートＣａｖｒｏシリンジポンプを有する流体取り扱い部と接続されている。システムの操作は完全に自動化されており、多数のＩ／Ｏポートを有する専用のコンピュータを用いて、制御ソフトウエアによりプログラミング可能である。Ｃｏｏｋｅ  Ｓｅｎｓｉｃａｍカメラには１．３メガピクセル冷却ＣＣＤが組み込まれているが、より低いまたはより高い感度を有するカメラもまた使用され得る（例えば、４メガピクセル、８メガピクセルなども使用され得る）。フローセルには、０．２５ミクロンステージが用いられており、形状は１ミクロンである。
【０３４７】
（実施例１０：画像取得および処理方法）
この実施例では、自身に結合された標識された核酸を有するビーズのアレイからの画像の取得および処理のための代表的な方法を記載する。正確な素性の同定およびアライメントは、各取得画像の信頼できる解析に重要である。素性は、まず、各ビーズについて最も強いピクセル以外は排除するにより同定される。所与の画像のピクセル値をヒストグラムにプロットする；バックグラウンドに対応するピクセルを排除し、残りのピクセル値を分取する。均一な画像では、すべてのビーズがほぼ同じ強度であり、アルゴリズムにより、ピクセル値の下部８０〜９０％を除外する。次いで、上部１０〜２０％値を有するピクセルをスキャンし、４ピクセル半径内で極大のものを同定する。次いで、該領域内の平均強度および周辺の平均強度を記録する。これらの値により正規分布を形成し、次いで、その値が該分布から外れるピクセルを除く。最初に無視したピクセルの割合、該円形領域の大きさ、および正規分布内の可能なビーズを排除した切り捨て値を、すべてパラメータ化し、必要であれば調整し得る。該組の各画像について素性行列を作製することによりアライメントを行なう。次いで、得られた行列を、最も高頻度のｘ、ｙ座標オフセットについて検索し、最適なアライメントを同定する。
【０３４８】
ビーズ画像を、伸長プローブ添加の前に、Ｃｙ５チャネル（配列決定プライマーに対応）に収集する。これらの画像を用いて、各ビーズについて位置的座標および蛍光単位（ＲＦＵ値）としての生シグナル強度の両方をマーキングする（ｍａｒｋｉｎｇ）素性マップを作製する。各後続の二本鎖伸長後、画像の組を、Ｃｙ３−標識ヌクレオチドを添加する前と後の両方で取得する。これらの画像を元のＣｙ５  画像に対してアライメントし、次いで、ＲＦＵ値をビーズの各々に割り当て、記録する。各塩基付加の非標識（伸長前）および標識（蛍光付加）画像間の強度を差を差し引くことによりベースライン補正を適用する。これらのベースラインを差し引いた値を、次いで、各素性でＣｙ５画像において見られた強度によって標準化し、ビーズが伸長された、またはされていないとみなす（すなわち、ビーズは、該ビーズに結合された二本鎖が伸長された場合、伸長されたとみなす）基準を形成する。これらの方法を用い、約１，３００画像／スライドで１つの画像あたり数千の素性が解析され、１回の実験で５〜１００００００００鋳型種の解析がもたらされ得る。アルゴリズムは、さらなる効率増強のために、後日でも容易にＭＡＴＬＡＢからＣ＋にポート移動（ｐｏｒｔ）され得るように設計した。
【０３４９】
（実施例１１：ビーズアライメントおよび追跡および配列でコード化）
この実施例では、自身に結合された標識され核酸を有するビーズのアレイからの画像処理および取得されデータからの配列決定のための代表的な方法を記載する。
【０３５０】
画像解析は、ビーズサイズに適合した直径を有するゼロインテグラルサーキュラートップハットカーネル（ｚｅｒｏ−ｉｎｔｅｇｒａｌ  ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｔｏｐ−ｈａｔ  ｋｅｒｎｅｌ）を用いて画像を回転させることにより開始する。これは、自動的にバックグラウンドをゼロに標準化すると同時に、個々のビーズの中心を極大によりを同定する。最大値を位置し、他の極大から孤立性のものが、アライメント点として使用される。これらのアライメント点は、各画像について時系列でコンピュータ計算される。各対の画像について、アライメント点を比較し、変位ベクトルを、すべての共通アライメント点の平均変位に基づいてコンピュータ計算する。これにより、サブピクセル分解によるペアワイズ画像変位が提供される。
【０３５１】
Ｎ個の画像では、Ｎ＊（Ｎ−ｌ）／２のペアワイズ変位があるが、これらのうちＮ−１だけは、残りが非依存的な組から計算され得るため、非依存的である。例えば、画像１と２間および画像１と３間の変位を測定すると、画像２と３間の変位が示唆される。画像２と３間の測定された変位が示唆された変位と同じでない場合、測定値は不一致である。この不一致の大きさは、どれだけ良好にアライメントアルゴリズムが機能しているかを測るための測定基準として使用され得る。本発明者らの最初の試験は、各寸法において、一般的に、０．１ピクセル未満である不一致を示す（図２３参照）。
【０３５２】
いったん、時系列の画像がアライメントされたら、個々のビーズを追跡するのに２つの方法がある。ビーズ密度が、別のビーズと接触していないビーズの大部分で低い場合、個々の各ビーズの光学質量中心が同定され得、ビーズ周囲の領域が積分され、ビーズ強度がコンピュータ計算される。ビーズ密度が非常に高いため、ビーズの大部分が接触している場合は、その周囲にある暗いバックグラウンドバンドによって個々のビーズを同定することは可能でない。しかしながら、サブピクセル分解のためアライメントされたすべての画像で、隣接するピクセルの相関性を経時的にコンピュータ計算することにより、同じビーズに属するピクセルを同定することが可能である。高度に相関するピクセル対は、確信的に同じビーズに割り当てられ得る。同様の手法がＤＮＡ配列決定ゲル内でのレーン追跡に適用され、良好な結果が得られている（Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，Ａ．Ｐ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｉｎｃｏｅｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｂｙ  ａ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔ７  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９３）。いったんビーズが全４色時系列により追跡されたら、配列は、どの色がプローブオリゴヌクレオチドのどの最も３’側の塩基に対応するかがわかることによりデコード化される。
【０３５３】
（実施例１１：処理量計算）
一般に、配列決定システムの処理量は、主に、装置が１日あたりにもたらすことができる画像の数および１つの画像あたりの配列データのヌクレオチド（塩基）の数によって規定される。装置は、好ましくは、カメラが常時作動中で維持されるように設計され、計算は、１００％カメラ利用に基づいて行なう。１つの塩基の正体を決定するのに各ビーズが４色で画像化される実施において、１つのカメラで４画像、２つのカメラで２画像、または４つのカメラで１画像のいずれかが使用され得る。４つのカメラでの画像化により、他の選択肢よりも劇的に高い処理量が可能になり、好ましいシステムでは、該アプローチが用いられる。
【０３５４】
本発明者らの最初の試験は、５０ピクセル／ビーズのピクセル密度（５．４平方ミクロンを表す）は、標準的な画像解析に適度な（ｃｏｍｆｏｒｔａｂｌｅ）密度を提供することを示す。４メガピクセルＣＣＤ  カメラ（現在では、一般的）を用いることにより、単一のＣＣＤフレームで約８０，０００個のビーズの画像化ができる（本発明者らの現在の画像データに基づく）。別個のカメラでの４種類の画像の捕捉およびフローセル上の次のフィールドへの移動に１．５秒より多くかからない。７５％のビーズにより有用な情報が得られる場合、本発明者らは、およそ８０，０００ビーズ＊０．７５／１．５＝４０，０００塩基／秒の生配列データのデータを収集することができる。
【０３５５】
１００％カメラ利用の維持における大きな問題の１つは、ライゲーション／切断化学反応の１サイクルを行なうのにかかる時間全フローセルの画像化に必要とされる時間に適合させることである。伸長、切断およびライゲーションの１サイクルにかかる時間の適度な推定は１．５時間（５，４００秒間）である。５，４００秒間は１，８００画像フィールドまたは約１５ｍｍ×４５ｍｍの面積に適応し、これは、フローセルに適度なサイズである。４種類のカメラを用いるシステムの処理量の伸長な推定は、１５ｍｍ×４５ｍｍフローセルで４０，０００塩基／秒である。これは、２８実行／日で約６５０塩基読出し長さ（２０塩基／秒）の処理量に基づくと、およそ２，０００  ＡＢＩ３７３０ｘｌ配列決定装置に相当し、本発明者らは、これらの装置を用いて達成した。ビーズ密度を２００，０００／画像に２．５倍増大させると、１００，０００塩基／秒への処理量の全体的な増加が可能になり、これは、ほぼ５，０００  ＡＢＩ３７３０ｘｌ装置に相当する。この処理量レベルでの全出力／日は、約８．６Ｇｂ／日であり、１２×ヒトゲノム配列決定を完了するのに必要とされる時間は、約４．２日となり得る。
【０３５６】
本発明の配列決定本明細書に記載の方法は、さまざまな異なる配列決定システム、画像捕捉および処理方法などを用いて実施され得ることに注意されたい。例えば、米国特許第６，４０６，８４８号および同第６，６５４，５０５号ならびにＰＣＴ公開公報ＷＯ９８０５３３００の論考を参照のこと。
【０３５７】
（実施例１２：その上面で鋳型合成を微粒子の調製方法）
この実施例では、鋳型分子のクローン性の集団が各微粒子に結合されるように鋳型が増幅され得る（例えば、ＰＣＲにより）ように自身に結合された増幅プライマーを有する微粒子（この実施例では磁気ビーズ）のプロトコル調製を記載する。一般に、増幅ビーズは、クローンＰＣＲ反応に必要とされる１つのプライマーが自身に結合されている。このプライマーは、共有結合によりカップリングさせてもよく、または例えば、ビオチン標識し、ビーズ表面上のストレプトアビジンに結合させてもよい。ビーズは、標準的なＰＣＲ反応（例えば、マイクロタイタープレートのウェル、チューブ内など）、実施例１３に記載のエマルジョンＰＣＲ反応などに使用され、自身に結合された鋳型分子のクローン性の集団を有するビーズが得られ得る。
【０３５８】
材料
１×ＴＥ：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）１ｍＭ  ＥＤＴＡ
１×ＰＣＲバッファー：（ＴｈｅｒｍｏＰｏｌバッファー，ＮＥＢ）
２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）
１０ｍＭ  ＫＣｌ
１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４
２ｍＭ  ＭｇＳＯ４
０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００
１Ｍ  ベタイン（  １×ＰＣＲ−Ｂバッファーの場合のみ添加）
１×結合および洗浄バッファー
５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ  
１  ＭＮａＣｌ
ＤＮＡ捕捉プライマー（２０量体，５００μＭストック）
二重ビオチン−（ＨＥＧ）５−Ｐ１：５’−二重ビオチン−（ＨＥＧ）５−ＣＴＡ  ＡＧＧ  ＴＡＧ  ＣＧＡ  ＣＴＧ  ＴＣＣ  ＴＡ−３’
（ＨＥＧ）５＝ヘキサエチレングリコールリンカー、１８炭素含有スペーサー、使用され得るいくつかの異なるスペーサー部分の１種類。例えば、ビーズの表面から離れるオリゴのＰ１プライマー部分を増大させるため、スペーサーを含めることが有用である。本明細書に記載の任意のプライマーには、かかるスペーサー部分が組み込まれ得る。
Ｄｙｎａｌストック磁気ビーズ（１μｍ直径）＝１０ｍｇ／ｍｌ（７〜１２×１０６ビーズ／μｌ）。
【０３５９】
方法
１．５０μｌビーズ（約４５０×１０６  ビーズ）を除去。
２．２００μｌ  １×ＴＥバッファーを添加、充分混合。磁石で分離。
３．１×ｗｉｔｈ  ２００μｌ  １×ＴＥバッファー洗浄。磁石で分離。
４．１００μｌ  Ｂ／Ｗバッファー中に再懸濁。
５．３μｌのＰ１オリゴ（５００μＭストック＝１５００ｐｍｏｌ）を添加。
６．室温で＞３０分間回転。
７．２００μｌ  １×ＴＥバッファーで３回洗浄。
８．５０μｌ（初期容量）１×ＴＥバッファー中に再懸濁。
９．使用前にＤＮＡ捕捉ビーズを４℃保存または氷上に配置。ビーズは、１週間以内に使用するのがよい（ビーズは、＞１週間の保存期間で凝集する傾向がある）。
【０３６０】
（実施例１３：エマルジョン中の微粒子上でＰＣＲを行なうための方法）
この実施例では、エマルジョン中の微粒子上でＰＣＲを行ない、自身に結合されたクローン鋳型を有する微粒子を生成させるために使用され得る方法を記載する。微粒子（以下、ＤＮＡビーズをいう名称を用いる）を、まず、第１のプライマー（Ｐ１）により官能性付与させる。第２のプライマー（Ｐ２）を水相中に存在させ、そこでＰＣＲ反応を行なわせる。所望の場合は、低濃度をＰ１を水相中に含め得る（例えば、２０倍低い）。そうすることにより、鋳型の水相中での迅速な構築が可能になり、これは，さらなる増幅のための基材となる。Ｐ１が溶液中ですると、反応は、微粒子に結合されたＰ１の利用に向かって誘導される。Ｐ１＿Ｐ２  ｄｅｇｅｎ１０は、Ｐ１およびＰ２にハイブリダイズしてＰＣＲによる増幅をもたらす配列およびオリゴヌクレオチド集団に４１０の複雑度を与える１０縮重塩基鎖（オリゴヌクレオチド合成中に組み込まれる）を有するオリゴヌクレオチド鋳型（１００ｂｐ）である。
Ｉ．エマルジョンプロトコル（１μｍビーズ）
１．油相の調製：
Ｓｐａｎ  ８０（７％）
Ｔｗｅｅｎ  ８０（０．４％）
低分子鉱油中で調製
新たに作製した油相のみ使用
全油相＝４５０μｌ
２．水相の調製：（２×１０９滴が作製されたと概算，１１５μＬ／滴）
【０３６１】
【化７】
2009538123.tif 000010
全水性容量＝３２０μｌ
最終反応＝２５５μｌ  水相  ：４５０μｌ  油相  
３．エマルジョンの添加まで水相チューブを氷に移動。
４．４５０μｌ  油相を２ｍｌクリオバイアルに添加。
５．クリオバイアルＵＰＲＩＧＨＴをＩＫＡ  ボルテックスに取り付けた発泡アダプター内に配置。ボルテックスを２５００ｒｐｍに設定。
６．アリコート水相（３  アリコート，各８５μｌ＝２５５μｌ）を油相に入れて振とうする。単分散性水相を、先端をチューブ内に配置し、ゆっくりと水相を先端から振とう油相内に分配することにより攪拌２ｍｌクリオバイアルに添加。残留水相に２回添加を反復。
７．エマルジョンの振とうを２４分間  ２５００ｒｐｍで継続、
８．エマルジョンの約１００μｌ  アリコートを９６ウェルプレート内に移す（合計＝４ウェル）。また、残留水相のアリコート（６５μｌ）を、溶液系ＰＣＲ対照反応のために別のウェルに。プレートを密封し、次のセクションに概略を示すようにサイクルさせる。
ＩＩ．エマルジョン増幅（１μｍ  ビーズ）
１．１μｍ  ビーズエマルジョン（プライマー使用Ｔｍｓ＝６２Ｃ）のＰＣＲサイクリングパラメータ：
プログラム：ＤＴＢ−ＰＣＲ
９４Ｃ，２分  ｎ＝ｌ
９４Ｃ，１５秒  
５７Ｃ，３０ｓ  ｎ＝１００
７０Ｃ，６０秒
５５Ｃ，５分  ｎ＝ｌ
１０Ｃ，随意時間
２．サイクリング時間は約６時間である。
３．サイクリング後のエマルジョンを観察。良好なエマルジョンは均一な琥珀色に見え、分離水相は観察されない。「破断」したエマルジョン（溶液から分離）は、チューブの底部に異なる水相を有する。ビーズのこの集団はクローン性でないため、この段階での回収は回避。
４．明るい視野での顕微鏡検査を用いてサイクル後エマルジョンを評価。サイクル的エマルジョンの２μｌアリコートを取り出し、ガラススライドに１滴落とす。エマルジョンアンプルに２２×６０ｍｍガラスカバースリップを重層。
５．２０×対物レンズを用いてエマルジョンを観察。ビーズは、好ましくは、単分散性であり、液滴の大部分が単一のビーズを含む。
注：エマルジョンアンプルが多数の多ビーズ液滴を含む場合、プールエマルジョン反応を単一の１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れ、６０００ｒｐｍで１５秒間回転させる。チューブの底部に蓄積したビーズ懸濁液を取り出す。この集団は、遊離ビーズおよび単一ビーズ液滴より重い多ビーズ液滴の両方で構成され、したがって、短時間のスピン後、チューブの底部に沈降する、このビーズ集団はクローンでない、したがって、後続の処理前に回避するのがよい。工程４および５を反復することによりエマルジョンを再評価し、
エマルジョンアンプル中での単一のビーズ含有液滴の完全性を確認する。
６．次のセクションに概要を示すプロトコルを用いたエマルジョンの破壊（崩壊）
ＩＩＩ．エマルジョン破壊および融解（１μｍビーズ’）
ビーズ破壊洗浄（ＢＢＷ）バッファー
２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ２％Ｔｗｅｅｎ  ２０；１０ｍＭ  ＥＤＴＡ
融解溶液  １００ｍＭ  ＮａＯＨ
１×ＴＥ：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）１ｍＭ  ＥＤＴＡ
１×結合および洗浄（Ｂ／Ｗ）バッファー
５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ
１Ｍ  ＮａＣｌ
１．各エマルジョンセット（４  アリコート）を単一の１．５ｍｌエッペンドルフチューブ中にプール。
２．８００μｌ  ＢＢＷバッファーを添加。反応チューブの１０秒間のボルテックスによりエマルジョンの破壊。
３．８０００ｒｐｍで２分間スピン。
４．上部８００μｌ（主に油相）の除去。チューブの底部でＤＮＡビーズをペレット化。
５．８００μｌ  ＢＢＷを添加、ボルテックスおよび８０００ｒｐｍで２分間スピン、上部６００μｌ除去。
６．
さらに２回６００μｌ  １×ＴＥで洗浄、磁石を用いて各洗浄液を交換。
８．５０μｌ  融解溶液をビーズペレットに添加、激しいペッティイングにより再懸濁試料。融解溶液中で５分間室温でビーズのインキュベート。チューブ断続的に打つ。
９．チューブを磁石に配置して融解溶液を除去。１×１００μｌ  融解溶液で洗浄し、第２鎖の完全な除去を確保。
１０．ビーズペレットを２回１×ＴＥで洗浄、２０μｌ  ＴＥバッファー中に再懸濁して４Ｃで保存または２０μｌ  １×Ｂ／Ｗバッファー（次の工程が富化の場合）。ビーズが凝集しているようであれば、１×ＰＣＲ−  Ｂバッファーに交換。
１１．富化プロトコルを継続（任意選択的）。
【０３６２】
（実施例１４：自身に結合されたクローン鋳型集団を有する微粒子の富化方法）
この実施例では、上面での鋳型増幅が例えばＰＣＲエマルジョンで成功裏に行なわれた微粒子富化方法を記載する。該方法は、自身に結合された捕捉オリゴヌクレオチドを有する大きな微粒子を利用する。捕捉オリゴヌクレオチドは鋳型内に存在するヌクレオチド領域に相補的なヌクレオチド領域を含む。
Ｉ  ．エマルジョン富化（ｌｕｍ）
Ａ．富化ビーズ（捕捉実体）の調製
富化ビーズ：
Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈストレプトアビジンコートされたポリスチレンビーズ（約６．５ｕｍ）
ビーズストック（０．５％ｗ／ｖ）：３３，１２５  ビーズ／μｌ
Ｐｅｒ  プロトコル：（３３，１２５  ビーズ／μｌ）（８００μｌ）＝２６．５×１０６  ビーズ
使用：
１１９００００００ビーズ／エマルジョン−エマルジョンクローン性の概算（２％）：約３Ｍ  鋳型−陽性ビーズ／エマルジョン。２〜３富化ビーズ／概算鋳型陽性エマルジョンビーズ＝１０００００００  富化ビーズ／エマルジョン反応を添加。
富化オリゴヌクレオチド（捕捉剤）：
Ｐ２−富化（３５量体，Ｔｍ＝７３Ｃ）
５’−二重ビオチン−１８−炭素スペーサー−ｔｔａｇｇａｃｃｇｔｔａｔａｇｔｔａｇｇｔｇａｔｇｃａｔｔａｃｃｃｔｇ  ３’
（または）
Ｐ２−富化（例えば、３５量体まで，Ｔｍ＝５２Ｃ）
５’−二重ビオチン−１８−炭素スペーサー−ｇｇｔｇａｔｇｃａｔｔａｃｃｃｔｇ  ３’
グリセロール溶液  −  ６０％（ｖ／ｖ）
６ｍｌ  グリセロール
４ｍｌ  ヌクレアーゼ無含有Ｈ２Ｏ
１．８００μｌのビーズを除去、１３，０００ｒｐｍで１分間の遠心分離によりＢ／Ｗバッファーに交換。１×の５００μｌ  Ｂ／Ｗバッファーでの洗浄、および１００μｌ  Ｂ／Ｗバッファーへの再懸濁。
２．２０μｌ  富化オリゴを添加。（５００μＭストック＝１０，０００ｐｍｏｌ／ｒｘｎ）。
３．ビーズ反応物を室温で１時間回転。
４．ビーズを３回、５００μｌ  １×ＴＥバッファーを用いて洗浄。１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離により洗浄間でビーズをペレット化。
５．ビーズを２５μｌ  Ｂ／Ｗバッファーに再懸濁。濃度＝１Ｍ  富化ビーズ／μｌ。注：４種類の富化エマルジョン集団を２０〜３０μｌ  １×Ｂ／Ｗバッファーにプールし、約４０Ｍ  鋳型陽性ビーズを得る。次いで、多数のスライドに行ない得る。
Ｂ．富化手順
１．２０μｌの富化ビーズを、エマルジョン誘導型ビーズ（２０μｌ）を含有するチューブに添加。
穏和なピペッティングによりビーズ混合物を再懸濁（または概算鋳型陽性エマルジョンビーズごとに２〜３  富化ビーズ増大を与える比を使用）。
２．ビオチン化Ｐ２−富化プライマーでコーティングされた富化ビーズを用いる場合、ビーズ混合物を６５Ｃで２分間インキュベート。チューブを氷に１０分間取り出す。
注：最初の実験は、１００−サイクルＰＣＲ（例えば、Ｐ２ＰＣＲ）に使用されるプライマー配列を含有する富化ビーズの使用は、富化すると、プライマーを含有するビーズを富化能力により効率的が低くなり得ることを示した。液滴中の２量体種誘導ビーズは鋳型がなかった。上記のＰ２−富化プライマーが負荷された富化ビーズを用いる場合、この短鎖プライマーのＴｍの低下によりビーズ混合物を５０Ｃ  ２分間インキュベートする。
３．ビーズ混合物を、３００μｌ  ６０％グリセロール溶液を含む１．５ｍｌエッペンドルフチューブに重層。
４．１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離
５．スピン後、陰性ビーズは、チューブの底部にペレット化する。結合された鋳型ビーズを含む富化ビーズは、グリセロール相上部に浮遊する。上相ビーズ集団を改修し、きれいな１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移す。
注：チューブの底部ペレット化したビーズ（鋳型なしのビーズ）は洗浄し、鋳型陽性ビーズで概略を示した同じ洗浄レジメン後、磁石を用いて解析され得る。
６．ビーズを相から引き出すため、１ｍｌ  ヌクレアーゼ無含有Ｈ２０を添加し、グリセロール濃度を希釈する。穏和なピペッティングを用いてビーズ混合物を再懸濁する。１３，０００ｒｐｍで１分間スピンする。
７．スピン後、上清みを除去し、２回１００μｌ  ＴＥを用いて洗浄。
８．１００μｌ  融解溶液を添加し、ビーズペレットを洗浄。チューブを５分間室温で回転。
９．さらに１００μｌ  融解溶液を添加、鋳型ビーズを磁石を用いて単離。
１０．２回１００μｌ  ＴＥ洗浄により非磁石性富化ビーズを除去し、磁石でＤＮＡビーズを富化ビーズから離す。
１１．鋳型ビーズを１０〜２０μｌ  １×ＴＥに再懸濁。ビーズ凝集しているようであれば、１×ＰＣＲ−Ｂバッファー中に含むで希釈。
１２．鋳型含有ビーズは、他の富化集団でプールされ得、次の実施例で記載のようにしてスライド上に負荷し得る。
【０３６３】
（実施例１５：半固相支持体に固定化された微粒子アレイ調製方法）
この実施例では、スライド上に位置する半固相支持体内に自身に結合された鋳型微粒子が固定化され（例えば、包埋され）スライドの調製を記載する。かかるスライドは、ポロニルスライドとよばれ得る。この実施例に使用される半固相支持体は、ポリアクリルアミドである。プロトコルの一例では、ポリメラーゼ分子を鋳型付近に捕捉して増幅を増強する方法を用いる。
【０３６４】
スライドの調製
Ａ．ガラススライド：結合シラン処理
結合シラン処理により、ガラススライド表面へのアクリルアミドゲル結合が容易になる。スライドは、使用前に結合シラン処理で前処理するのがよい。
注：
＊＊  結合シラン処理溶液を化学的結合で保存。
＊＊  結合シラン処理は刺激性である。溶液調製時は化学的に作業する。
＊＊    ストック結合シラン処理溶液がきれないように確保する。
＊＊  ラックへの出し入れの移動時は、スライドの表面に触れないようにする。
【０３６５】
結合シラン処理溶液の調製：
１．１−Ｌ  プラスチック容器内に添加：
１  Ｌ  ｄＨ２０，１  攪拌バー
２２０ｕｌ濃酢酸を添加（ｐＨ３．５にする）。４ｍｌ結合シラン試薬混合溶液を＞１５分間、攪拌プレートを用いて添加。
スライド処理：
２．スライド（同じ方向に向ける）を裏返したプラスチック  ３８４ウェルプレートに負荷。
３．ｄＨ２Ｏでリンス処理によりスライド洗浄、ウェルをドレイン。
４，１００％エタノールでリンス。ウェルをドレイン。
５．再度ｄＨ２Ｏでリンス、ウェルをドレイン、ベンチをを有する組織培養フード内に配置、ＵＶ光照射。スライドを洗浄して乾燥させる（約３０分）。
６．プレートをプラスチック容器内に配置し、スライドを結合シラン処理溶液で覆う。
７．溶液およびスライドを１時間反応させる。容器を断続的に攪拌し、ガラスへの結合シラン処理の均一なコーティングを確保。
８．インキュベーション後、スライドを３回ｄＨ２Ｏでリンス処理。
９．１回１００％エタノールでリンス処理。ウェルをドレイン。
１０．使用前にスライドを充分乾燥させる。
１１．結合シラン処理スライドをデシケータ内で乾燥。
【０３６６】
Ｂ．アクリルアミド系スライド（小さいマスク）
・  非捕捉プロトコル
１．すべての試薬氷上に配置。以下の冷却試薬を１．５ｍｌエッペンドルフチューブに添加：
【０３６７】
【化８】
2009538123.tif 000011
混合物を激しくピペッティングしてビーズをかき回す。ガラスカバースリップ下で１７μｌ／スライド負荷。
上下に重合。室温で６０分間．
きれいなかみそり刃でカバースリップを除く。
スライドを浸漬し。２回ＩＥバッファー中で１５分間洗浄（非結合ビーズを除去）。
包埋ビーズを有するスライドを４ＣでＩＥ保存。
２．フルオロフォア−標識配列決定プライマーを包埋ビーズ集団にハイブリダイズさせる。
洗浄１Ｅから１×ＰＣＲ−Ｂバッファーに、１×ＰＣＲ−Ｂバッファーを含有するＣｏｐｌｉｎ  ｊａｒ短時間浸漬させることによりスライドを平衡化させる。
３．１．５ｍｌエッペンドルフチューブ内で、１〜６μｌ（１００μＭストック）プライマーを９９μｌ  １×ＰＣＲバッファーに添加する。アクリルアミドマトリックス上に、１００μｌ  プライマー溶液を滴下し、ガラスカバースリップを重層するか、ガスケットを封止する。
４．＜ＤＥＶＩＮ＞プログラムを用いてスライドを加熱することにより、プライマーを包埋されたビーズにハイブリダイズさせる。（６５Ｃで２分間、３０Ｃまで低速アニーリング）。スライド２回２分間洗浄ＩＥ中で洗浄。スライドは、ライゲーション系配列決定に供する準備ができている。
【０３６８】
・捕捉プロトコル
１．ｓｓＤＮＡ鋳型ビーズは、１Ｍ／μｌで調製する。［ポロニルスライド、４−５Ｍ
ビーズ／スライド］。
２．ビーズ混合物を３０μｌ  １×ＰＣＲバッファー中に再懸濁。
３．１ｕｌの配列決定プライマー（ｌ００μＭストック）を添加；充分混合
４．６５Ｃまで２分間加熱
５．氷上に５分間取り出す
６．８０μｌで１×ＴＥ洗浄
７．すべての固形分を磁石を用いて除去
８．以下に概要を示すようにして試薬を添加：
【０３６９】
【化９】
2009538123.tif 000012
混合物を激しくピペッティングしてビーズをかき回す。ガラスカバースリップ下で１７μｌ  ／スライド負荷。
９．重合、  好ましくは、上下にする（例えば、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｔｒａｄ  ＰＣＲ装置で＜Ｐｏｌ−ｌ＞サイクリングプロフィールを使用）
１０．かみそり刃でカバースリップを除くスライドを２回１Ｅバッファー中に１０分間浸漬および洗浄（非結合ビーズを除去するため）。
１１．ポロニルスライドはライゲーション系配列決定に供する準備ができている。
１２．包埋されたビーズを有するポロニルスライドは、ガスケット内に４Ｃで洗浄ＩＥ中に保存され得る。
【０３７０】
（実施例１６：固相支持体に結合された微粒子アレイ調製方法）
この実施例では、その上面に自身に結合された鋳型を有する微粒子が固相支持体に結合されたスライド調製を記載する。
【０３７１】
１．反応性ＮＨＳを有するポリマーテザーを用いて調製されたガラススライドを
−２０Ｃで保存する（スライドＨ，製造番号１０７０９３６；Ｓｃｈｏｔｔ  Ｎｅｘｔｅｒｉｏｎ；Ｓｃｈｏｔｔ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．，Ｅｌｍｓｆｏｒｄ，ＮＹ）
２．乾燥剤の存在下、使用前にスライドを室温に平衡化させる。
【０３７２】
３．５０ｍｌ  １×ＰＢＳ（３００ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ８．７）中で５分間スライドを洗浄する。洗浄を２回繰り返す。
【０３７３】
４．スライドを溶液から取り出し、接着性ガスケットで覆う（試料負荷を可能にするため）。
【０３７４】
５．別のチューブで、アリコート１００〜４００００００００タンパク質コートまたはＤＮＡコートビーズを１×ＰＢＳ，ｐＨ８．７に。ＤＮＡは、例えば、配列決定用のＤＮＡ鋳型であり得る。ＤＮＡは、例えば、ＮＨＳとの反応用のアミンリンカーを含むものであり得る。
【０３７５】
６．バッファー交換によってビーズ試料を３回１×ＰＢＳ，ｐＨ８．７で洗浄する。
【０３７６】
７．ビーズを１２５ｍｌ  １×ＰＢＳ，ｐＨ８．７中に再懸濁する。
【０３７７】
８．ビーズ溶液をスライドガスケット内に負荷し、スライド表面を均一にコートする。
【０３７８】
９．スライドを暗室チャンバ内に封鎖し、インキュベーションのために１〜２時間室温で反応させる。
【０３７９】
１０．インキュベーション後、非結合ビーズ溶液を除去し、スライドを５０ｍｌ  １×ＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８）に移す。
【０３８０】
１１．１５分間／洗浄で定常的攪拌により、５０ｍｌ  １×ＴＥを用いて５回スライドを洗浄する。
【０３８１】
１２．スライドは、１×ＴＥ中に４Ｃで数週間保存され得る。
【０３８２】
１３．所望の場合は、ビーズ集団は、白色光（ＷＬ）を用いる明るい視野での画像解析により、または蛍光により、フルオロフォア系色素に結合された相補ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いて評価され得る。ＤＮＡ鋳型は、例えば、ライゲーション系配列決定を用いて配列決定され得る。
【０３８３】
図３３Ａは、自身にビーズが結合されたスライドの概略図を示す。ほんの少量の割合のＤＮＡ鋳型分子がスライドに結合されていることに注意されたい。１ミクロンビーズ（ＤｙｎａビーズＭｙＯｎｅ  ストレプトアビジンビーズ；Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，製造番号６５０．０１）を使用した。しかしながら、広範なさまざまなビーズた使用され得る。
【０３８４】
図３３Ｂは、スライドに結合されたビーズ集団を示す。下側パネルは、白色光下でのスライドの同じ領域（左）および蛍光顕微鏡検査を示す。上側パネルは、ビーズ密度の範囲を示す。
【０３８５】
（実施例１６）  ゲル非含有ビーズに基づくアレイを使用した、オリゴヌクレオチド伸長およびライゲーションによる配列決定
本実施例では、ビオチンとストレプトアビジンの相互作用を介して基材（ガラススライド）に付着した微粒子のアレイの調製について記載し、ライゲーション、開裂および検出のサイクルによる配列決定の成功を実証する。ビオチン化鋳型が付着した微粒子は、エマルジョンＰＣＲを使用して調製し、後述の通り、半固形培地の非存在下で、ＰＥＧを含む連結を介して、ストレプトアビジンで官能基化した基材に付着させた。本方法では、増幅前にビオチン化プライマーを付着させたストレプトアビジンコートビーズを使用する。生産的な鋳型増幅が行われた粒子の増幅と濃縮の後、鋳型をビオチン化した。次いで、ビオチン化した鋳型が付着した微粒子を、ストレプトアビジンコートスライドとともにインキュベートした。したがって、本方法では、ビオチンとストレプトアビジンの連結を２回使用した。その他の手法では、プライマーを微粒子に連結させるか、あるいは増幅させた鋳型を基材に連結させる代替手段が使用されると考えられる。
【０３８６】
材料および方法：
ＢＡＣ  Ｅｃｏ  ｖ２．１ビーズの調製
ＭｙＯｎｅストレプトアビジンビーズ（１ミクロン）をビオチン化Ｐ１プライマーでコーティングし（図を参照）、エマルジョンＰＣＲにおいて、本発明者等のＢＡＣ−Ｅｃｏ（ｖ２．１）ライブラリーの鋳型が付着したビーズ群を作り出すために使用した。エマルジョンを破壊し、ビーズを標準的な方法でエクソヌクレアーゼにより精製および処理した。完全に伸長したＰＣＲ産物を有するビーズを、Ｐ２濃縮オリゴで被覆した濃縮ビーズに結合させることにより濃縮した（図を参照）。濃縮したビーズの溶液中の挙動を改善するために、これらのビーズをビオチン化Ｐ１オリゴとともにインキュベートして、ストレプトアビジンコーティングを露出したビーズの部分を被覆した。
【０３８７】
スライドへのＢＡＣ  Ｅｃｏ  ｖ２．１ビーズの沈着
ｓｓＤＮＡを含有する濃縮したＢＡＣ−Ｅｃｏ  ｖ２．１ビーズを、ストレプトアビジンでコーティングしたＯｐｔｉ−Ｃｈｅｍスライド（Ａｃｃｅｌ８  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）上に沈着した。本プロセスの準備として、ビーズをターミナルトランスフェラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）およびビオチン−１１−ｄｄＡＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）とともにインキュベートし、ビオチン部分をＤＮＡ鋳型分子の３’端に共有結合的に付着させた。ビーズを等しい数のＭｙＯｎｅ  Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  Ａｃｉｄビーズ（Ｄｙｎａｌ）と混合し、５ｍＭのトリス塩酸塩（ｐＨ８．０）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０００５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、および１０％のＰＥＧ８０００（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を含有する沈着緩衝液に入れた。懸濁液をＣｏｖａｒｉｓ  Ｓ２ソニケーターで短時間超音波処理し、ストレプトアビジンでコーティングしたＯｐｔｉ−Ｃｈｅｍスライド（Ａｃｃｅｌ８  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）上に沈着させた。スライドをＴＥ緩衝液で３回洗浄し、使用前に圧縮空気で乾燥させた。懸濁液をＬｉｆｔｅｒＳｌｉｐ（Ｅｒｉｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ）で被覆し、スライド上に平坦な水層を生成し、蒸発を減少させた。これらのスライドを高湿度チャンバーに入れて室温にて４５分間インキュベートし、端部の蒸発を減少させつつ、ビーズを表面に定着させ、結合させた。ＴＥ緩衝液を充填したトレーにスライドを上下逆にして浸漬することにより、カバースリップを除去した。約１分間軽く攪拌すると、ほとんどのカルボン酸ビーズが除去された（別の実験で示された通り）。これらのスライドを即座にアセトンに浸漬し、圧縮空気を使用して乾燥させた。
【０３８８】
ゲル非含有スライド上でのサイクル式ライゲーション配列決定で使用した試薬は、Ｒｅｓｅｔ緩衝液を除けばアクリルアミド系ゲルの場合と同じであった。非ゲルアレイでは、１０ｍＭのＮａＯＨおよび０．１％のドデシルスルホン酸ナトリウム（Ｆｌｕｋａ）を含有するアルカリ系Ｒｅｓｅｔ緩衝液を使用した。図３８および図３９に示す通り、３００パネルゲル非含有アレイ（約１８×１８ｍｍ）に濃縮ＢＡＣ−Ｅｃｏライブラリービーズを播種し、自動小型フローセル器に入れ、アルカリ性Ｒｅｓｅｔに５０回暴露させて、ゲル非含有環境におけるビーズの安定性を検証した。５０サイクルの流動プログラムの後、ゲル非含有アレイはパネル１枚当たり２６，０００個を超えるビーズを含有した（４メガピクセルカメラ）。次いで、サイクル式ライゲーションおよび開裂を使用して、ゲル非含有アレイの配列決定を行った。各蛍光チャネルの高いＲＦＵ値によって証明されているように、サイクル１のデータの評価によって、本発明者等の２塩基４色プローブセットの効率的なライゲーションが裏付けられた。その後、ビーズ群をベースコールし、スペクトル純度プロットにプロットし、Ｓａｔａｙ分析および密度プロット評価によって優れた配列決定性能を示した。
【０３８９】
均等物および範囲
当該技術分野業者には、単に常套的な実験手法を用いることで、本明細書に記載した本発明の具体的な実施形態に対する多くの均等物が認識され、または確認できよう。本発明の範囲は、上記の記載に限定されることは意図されるのではなく、添付の特許請求の範囲に示されるとおりである。以下の特許請求の範囲において、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」などの冠詞は、そうでないと特に記載のない限り、あるいは文脈から明白にそうでない場合以外は、１つではなく、１つ以上を意味し得る。１つの群内の１つ以上のメンバー間の「または」を含む請求項または詳細説明は、そうでないと特に記載のない限り、あるいは文脈から明白にそうでない場合以外は、１つ、１つより多く、またはその群のメンバーすべてが、所与の生成物またはプロセスに存在し、使用され、あるいは、関連する場合が満たされるとみなされる。請求項における「場合により」の使用は、任意の特徴が存在する実施形態と、任意の特徴が存在しない実施形態とを本発明が包含することを示している。
【０３９０】
さらにまた、本発明は、記載の１つ以上の請求項からの１つ以上の限定、要素、原因、記述用語などが別の請求項に導入されたあらゆる変形例、組合せおよび置換を包含することを理解されたい。特に、別の請求項に従属する任意の請求項は、ベースとなる同じ請求項に従属する任意の他の請求項に見られる１つ以上の限定を含むように変形され得る。
【０３９１】
また、任意の１つ以上の実施形態は、具体的な除外が本明細書に明白に示されていない場合であっても、特許請求の範囲から明確に除外されることがあり得ることを理解されたい。また、本明細書および／または特許請求の範囲に配列決定に有用な試薬（例えば、鋳型、ミクロスフィア、プローブ、プローブファミリーなど）が開示されている場合、かかる開示はまた、該試薬を、当業者が別なふうに理解し得る場合、または本発明に特に記載のない限り、本明細書に開示された具体的な方法、または当該技術分野で知られた他の方法のいずれかに従って用いる配列決定方法も包含することを理解されたい。また、本明細書および／または特許請求の範囲に配列決定法が開示されている場合、当業者が別なふうに理解し得る場合、または本明細書においてかかる方法におけるその試薬の使用が明白に除外されている場合を除き、本明細書に開示された任意の１種類以上の試薬が該方法に使用され得る。さらに、配列決定に有用な特定の成分が本明細書および特許請求の範囲に開示されている場合、本発明は、その試薬の作製方法もまた包含することを理解されたい。用語「成分」は、配列決定に用いられる任意の要素、例えば、鋳型、自身に結合された鋳型を有する微粒子、ライブラリーなどをいうために広義で使用される。さらにまた、図面は、本明細書に組み込まれた一部分であり、本発明は、図面に示された構造、例えば、自身に結合された鋳型を有する微粒子、および図面に開示された方法を含む。
【０３９２】
本明細書において範囲を示す場合、両端を含む。さらにまた、ことを理解されたい。特に記載のない限り、あるいは文脈から明白にそうでない場合以外、および当業者に理解される場合、範囲として標示される値は、本発明の異なる実施形態において記載された範囲内の任意の具体的な値または下位範囲が、特に文脈においてそうでないと明白に記載されていない限り、該範囲の下限の単位の１０分の１まで想定され得る。
【図面の簡単な説明】
【０３９３】
【図１Ａ】図１Ａは、初期化後、２サイクルの伸長、ライゲーションおよび同定を概略的に示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、伸長が鋳型の自由末端から支持体に向かって内方に進行する実施形態における初期化後、２サイクルの伸長、ライゲーションおよび同定を概略的に示す。
【図２】図２は、オリゴヌクレオチドプローブに対する色の割り当てのスキームを示し、この場合、プローブの３’塩基の正体が、フルオロフォアの色を同定することにより決定される。
【図３Ａ】図３Ａは、鋳型の結合領域内の異なる位置における初期オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション後、伸長プローブのライゲーションにより得られる伸長された二本鎖を概略的に示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、鋳型分子を６塩基ごとに読み出されるように設計された伸長プローブを用いて伸長、ライゲーションおよび切断方法を使用することにより、連続配列の合成を概略的に示す。
【図４Ａ】図４Ａは、５’−Ｓ−ホスホロチオレート結合（３’−Ｏ−Ｐ−Ｓ−５’）  を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、３’−Ｓ−ホスホロチオレート結合（３’−Ｓ−Ｐ−Ｏ−５’）  を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、３’−Ｏ−Ｐ−Ｓ−５’ホスホロチオレート結合を有する伸長プローブを用いた５’→３’方向における配列決定のための１サイクルの伸長、ライゲーションおよび切断を概略的に示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、３’−Ｓ−Ｐ−Ｏ−５’ホスホロチオレート結合を有する伸長プローブを用いた３’→５’方向における配列決定のための１サイクルの伸長、ライゲーションおよび切断を概略的に示す。
【図６】図６Ａ〜６Ｆは、単一の鋳型において行なわれた数個の配列決定反応のより詳細な概略図である。この反応では、鋳型の異なる部分に結合する初期オリゴヌクレオチドを用いている。
【図７】図７は、ｄＡおよびｄＧの３’−ホスホロアミデートの合成スキームを示す概略である。
【図８−１】図８Ａ〜８Ｅは、ホスホロチオレート結合を含有する伸長プローブの成功裏のライゲーションおよび切断の２サイクルを示すゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図８−２】図８Ｆは、ＤＮＡリガーゼによるライゲーションの機構の概略図を示す。
【図９】図９は、縮重イノシン含有オリゴヌクレオチドプローブのライゲーション効率を示すゲルシフトアッセイの結果である。
【図１０】図１０は、多数の鋳型における縮重イノシン含有オリゴヌクレオチドプローブのライゲーション効率を示すゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図１１】図１１は、３’→５’伸長での２つのＤＮＡリガーゼ（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼおよびＴａｑＤＮＡリガーゼ）の各々の忠実度を評価するために行なった解析の結果を示す。
【図１２】図１２は、（Ａ）  縮重イノシン含有オリゴヌクレオチドプローブおよびライゲーション反応の直接配列決定解析のライゲーション効率を示す（Ｂ）  オリゴヌクレオチドプローブライゲーションにおけるＴ４  ＤＮＡリガーゼの忠実度を評価するために行なったゲルシフトアッセイの結果を示す。結果をパネルＣ〜Ｆに表で示す。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｃは、ビーズ系鋳型をスライド上のポリアクリルアミドゲル内に包埋した場合のゲル内ライゲーションを示す実験の結果を示す。図１３Ａは、ライゲーション反応の概略を示す。ゲル内ライゲーション反応は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの非存在下（Ｂ）および存在下（Ｃ）で行なった。
【図１４Ａ】図１４Ａは、第１の増幅プライマーが結合されたビーズ上で、蛍光標識された第２の増幅プライマーおよび過剰の鋳型を用いて行なったエマルジョンＰＣＲ反応の画像を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂ（上）は、Ｃｙ３−標識オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする鋳型結合された結合されたビーズがポリアクリルアミドゲル固定化されたスライドの一部分の蛍光画像を示す（このスライドは、異なる実験に使用したが、ここで使用したスライドの典型である）。図１４Ｂ（下）は、ポリアクリルアミド溶液を封入するためのテフロン（登録商標）マスクを設けたスライドの概略図を示す。
【図１５】図１５は、プローブの特異性および選択性の課題に取り組むために設計され３組の標識されたオリゴヌクレオチドプローブを示し、また、１組の４つのスペクトルにより分離可能な標識の励起および発光の値を示す。
【図１６】図１６は、オリゴヌクレオチドプローブの４色スペクトルの正体を確認する実験の結果を示す。４つの特有の単鎖鋳型集団を含むスライド（Ａ）をハイブリダイゼーションに供し、４種類の特有のフルオロフォアプローブを含有するオリゴヌクレオチドプローブ混合物を用いたライゲーション反応物を、明るい光の下で、および（Ｂ）  ４種類の帯域通過フィルターを用いた蛍光励起によりライゲーションの前と後で画像化した。個々の集団は擬似カラー表示した（Ｃ）。スペクトルの正体（これは、最小シグナル重複を示した）を（Ｄ）にプロットする。
【図１７】図１７は、オリゴヌクレオチド伸長プローブのライゲーション特異性を確認する実験を示す。図１７（Ａ）は、ライゲーションの概略的概要を示す。図１７（Ｂ）は、明るい光での画像であり、図１７（Ｃ）は、ライゲーション後のポリアクリルアミドゲル内に包埋されたビーズ集団の対応する蛍光画像である。図１７（Ｄ）は、ライゲーション前（ｐｒｅ）または後（ｐｏｓｔ）の各標識から検出された蛍光を示す。
【図１８】図１８は、オリゴヌクレオチド伸長プローブのライゲーションの特異性および選択性を確認する別の実験を示す。図１８（Ａ）は、ライゲーションの概略的概要を示す。図１７（Ｂ）は、明るい光での画像であり、図１８（Ｃ）は、ライゲーション後のポリアクリルアミドゲル内に包埋されたビーズ集団の対応する蛍光画像である。図１８（Ｄ）は、ライゲーション頻度の予測対観察結果を示し、集団内の特定の伸長プローブの割合に基づいて予測した頻度と、観察された頻度との高い相関性を示す。
【図１９】図１９は、オリゴヌクレオチド伸長プローブプールを含有する縮重した普遍塩基を用いて、特異的および選択的なゲル内ライゲーションがもたらされ得ることを確認する実験を示す。図１９（Ａ）は、ライゲーションの概略的概要実験を示し、ライゲーション後の４種類の差次的に標識された縮重イノシン含有プローブプールを示す。図１９（Ｂ）明るい光での画像であり、図１９（Ｃ）は、ライゲーション後のポリアクリルアミドゲル内に包埋されたビーズ集団の対応する蛍光画像である。図１９（Ｄ）は、ライゲーション頻度の予測対観察結果を示し、集団内の特定の伸長プローブの割合に基づいて予測した頻度と、観察された頻度との高い相関性を示す。図１９（Ｅ）は、生の未処理のデータおよびビーズシグナル値の上部９０％を表すフィルター処理データの散布図を示す。
【図２０】図２０は、鋳型に対する初期オリゴヌクレオチド（プライマー）のハイブリダイゼーションとストリッピングの連続的サイクルにおいて検出されたシグナルを示すチャートである。図に示されるように、１０サイクルで生じたシグナル損失は最少であった。
【図２１】図２１は、配列情報を、例えば、実質的に平面状の支持体内または該支持体上のアレイ状の鋳型から収集するために使用され得る自動配列決定システムの写真である。また、該システムの種々の構成部品の動作を制御するため、収集した画像データを処理および保存するため、ユーザーインターフェースを提供するためなどの専用のコンピュータを示す。図の下側部分に、重量測定気泡移動（ｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃ  ｂｕｂｂｌｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）が達成されるように配設されたフローセルの拡大図を示す。
【図２２】図２２は、実質的に平面状の支持体内または該支持体上のアレイ状の鋳型の配列を決定するために使用され得るハイスループット自動配列決定機器の概略図を示す。
【図２３】図２３は、アライメントの不一致の散布図を示し、３０フレームで最少の不一致を示す。
【図２４】図２４Ａ〜Ｉは、さまざまな異なる方向から見た本発明フローセルまたはその一部分の概略図を示す。
【図２５Ａ】図２５Ａは、２ヌクレオチド長である拘束部分を含む部分拘束プローブを含むプローブファミリーの好ましいコレクションの例示的なコード化を示す。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、プローブファミリーの好ましいコレクション（上側パネル）およびライゲーション、検出および切断のサイクル（下側パネル）  を示す。
【図２６】図２６は、２ヌクレオチド長である拘束部分を含む拘束プローブを含むプローブファミリーの別の好ましいコレクション例示的なコード化を示す。
【図２７Ａ】図２７Ａは、表１に示すプローブファミリーの２４個の好ましいコレクションを図式的に規定するための代替法を表す。
【図２７Ｂ】図２７Ｂは、表１に示すプローブファミリーの２４個の好ましいコレクションを図式的に規定するための代替法を表す。
【図２７Ｃ】図２７Ｃは、表１に示すプローブファミリーの２４個の好ましいコレクションを図式的に規定するための代替法を表す。
【図２８】図２８は、プローブが、２ヌクレオチド長である拘束部分を含むプローブファミリーのやや好ましいコレクションを示す。
【図２９Ａ】図２９Ａは、拘束部分３ヌクレオチド長を有するプローブを含むプローブファミリーのコレクションのための拘束部分を作製するために使用され得るダイアグラムを示す。
【図２９Ｂ】図２９Ｂは、拘束部分３ヌクレオチド長を有するプローブを含むプローブファミリーのコレクションのための拘束部分を、プローブファミリーの２４個の好ましいコレクションから作製するために使用され得るマッピングスキームのダイアグラムを示す。
【図３０】図３０は、配列決定がプローブファミリーのコレクションを用いて行なわれる方法を示す。好ましい組のプローブファミリーを用いた実施形態を示す。
【図３１Ａ】図３１Ａ〜３１Ｃは、配列決定が、プローブファミリーの第１のコレクションを用いて候補配列を作製し、プローブファミリーの第２のコレクションを用いてデコード化することで行なわれる方法を示す。
【図３１Ｂ】図３１Ｂは、配列決定が、プローブファミリーの第１のコレクションを用いて候補配列を作製し、プローブファミリーの第２のコレクションを用いてデコード化することで行なわれる方法を示す。
【図３１Ｃ】図３１Ｃは、配列決定が、プローブファミリーの第１のコレクションを用いて候補配列を作製し、プローブファミリーの第２のコレクションを用いてデコード化することで行なわれる方法を示す。
【図３２】図３２は、配列決定が、プローブファミリーのやや好ましいコレクションを用いて行なわれる方法を示す。
【図３３】図３３Ａは、自身にビーズが結合されたスライドの概略図を示す。ＤＮＡ鋳型がビーズに結合されている。図３３Ｂは、スライドに結合されたビーズ集団を示す。下側パネルは、白色光下（左）および蛍光顕微鏡検査でのスライドの同じ領域を示す。上側パネルは、ビーズ密度の範囲を示す。
【図３４】図３４Ａ〜３４Ｃは、核酸の個々の集団としての核酸断片（鋳型）内に存在する１対のタグの両方のタグを増幅し、これを、増幅プロセスにより微粒子に捕捉するためのスキームを示す。
【図３５−１】図３５Ａおよび３５Ｂは、図３５のスキームのプライマー設計および増幅の詳細を示す。明確にするために核酸断片（鋳型）の両方の鎖を示す。同じ配列を有するプライマーおよびプライマー結合領域を同じ色で示す。例えば、Ｐ１を紺色で表し、微粒子上および溶液中に存在するプライマーＰ１が、鋳型の標示した鎖と対応させて着色した部分と同じ配列を有することを示す。Ｐ１と標示した鋳型の紺色領域は、対応するプライマー（Ｐ１）が、実際には他方の鎖の相補的部分に結合し、プライマーＰ１と同じ配列を有するものであっても、プライマー結合領域とよばれ得る。
【図３５−２】図３５Ｃおよび３５Ｄは、それぞれ、図３５Ａおよび３５Ｂの方法によって生成された微粒子に結合された第１および第２のタグの配列決定を示す。
【図３６】図３６Ａは、対合末端ライブラリーの鋳型分子を示し、ライブラリーのメンバーに共通する、鋳型の前方アダプター部分、後方アダプター部分、および内部アダプター部分にハイブリダイズするブロッキングオリゴヌクレオチドを示している。図の下部には、アダプターとブロッキングオリゴヌクレオチドの例示的な配列が示されている。図３６Ａ〜図３６Ｃの「ｄｄＢａｓｅ」とは、ジデオキシヌクレオシドを示す。「固有のＤＮＡ配列」とは、配列決定する標的領域を表す。図３６Ｂは、断片ライブラリーの鋳型分子を示し、ライブラリーのメンバーに共通する、鋳型分子の前方アダプター、後方アダプター、および内部アダプター部分にハイブリダイズするブロッカーオリゴヌクレオチドを示している。図の下部には、アダプターおよび相補性ブロッキングオリゴヌクレオチドの例示的な配列が示されている。図３６Ｃは、鋳型分子にローリングサークル増幅（ＲＣＡ）が行われたライブラリーの分子を示す。ＲＣＡは、鋳型分子の固有部分（２）、ならびにアダプター領域（１）とパドロック領域（３）の複数の複製を作成する。この図は、ライブラリーのメンバーに共通する、鋳型のアダプター部分およびパドロック部分にハイブリダイズするブロッキングオリゴヌクレオチドを示している。
【図３７】いくつかのパドロックプローブ配列と、ＲＣＡを使用した鋳型分子の合成後にパドロック領域をブロックするとされるオリゴヌクレオチドの例示的な配列を示す。
【図３８】半固形培地を使用せずに基材上に作成される微粒子のアレイ（ゲル非含有微粒子アレイ）を示す。
【図３９】ゲル非含有微粒子アレイを使用した、ライゲーションに基づく配列決定の結果を示す。
【図４０】表面上に位置する微粒子の概略図を示し、鋳型の伸長によって生じるとされる接触パッチと核酸コロニーの予想されるサイズを例示する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
2009538123.tif 000023
【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
2009538123.tif 000041
【図２４Ａ】
2009538123.tif 000042
【図２４Ｂ】
2009538123.tif 000043
【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２４Ｅ】
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【図２４Ｆ】
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【図２４Ｇ】
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【図２４Ｈ】
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【図２４Ｉ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５−１】
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【図３５−２】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年1月13日(2009.1.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009538123000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年1月14日(2009.1.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の支援
本発明は、ＮＩＨによって与えられた助成金番号Ｒ０１−ＨＧ−００３５７０の下、米国政府の支援によって為された。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
（関連出願の引用）
本願は、２００６年４月１９日に出願された米国仮特許出願第６０／７９３，７０２号（この全内容は、参考として本明細書に援用される）の利益、およびそれに対する優先権を主張する。本願は、２００５年２月１日に出願された米国仮特許出願第６０／６４９，２９４号；２００５年２月２５日に出願された米国仮特許出願第６０／６５６，５９９号；２００５年４月２１日に出願された米国仮特許出願第６０／６７３，７４９号；２００５年７月１５日に出願された米国仮特許出願第６０／６９９，５４１号；２００５年９月３０日に出願された米国仮特許出願第６０／７２２，５２６号；および米国特許出願第１１／３４５，９７９号に関する。これらは全て、本明細書中に参考として援用される。
【０００３】
（発明の背景）
核酸配列決定手法は、基礎研究から臨床診断にわたる広範で多様な分野において非常に重要である。かかる手法から入手可能な結果としては、種々の程度の特異性の情報が挙げられ得る。例えば、有用な情報は、ある特定のポリヌクレオチドが参照ポリヌクレオチドと配列が異なるか否かの判定、試料中のある特定のポリヌクレオチド配列の存在の確認、部分配列情報、例えば、ポリヌクレオチド内の１つ以上のヌクレオチドの正体の決定、ポリヌクレオチド内のヌクレオチドの正体および順序の決定などからなるものであり得る。
【０００４】
ＤＮＡ鎖は、典型的には、４種類のサブユニット、すなわち、塩基アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびチミジン（Ｔ）を含有するデオキシリボヌクレオチドで構成されるポリマーである。これらのサブユニットは、一方のデオキシリボース基の５’炭素を次の基の３’炭素に連結するホスホジエステル共有結合によって互いに結合されている。ほとんどの天然に存在するＤＮＡは２つのかかる鎖からなり、これらは、逆平行の向きに整列され、相補的塩基間、すなわち、ＡとＴ間およびＧとＣ間で形成される水素結合によって互いに保持されている。
【０００５】
ＤＮＡ配列決定は、最初、連鎖停止またはジデオキシヌクレオチド方法（非特許文献１）および化学的分解方法（非特許文献２）の開発によって大きさ規模において可能になり、このうち前者は、最も広く使用され、改良され、自動化されている。特に、蛍光標識された連鎖停止剤の使用が、自動ＤＮＡ配列決定装置の開発において主に重要であった。上記のアプローチの両方に共通するのは、大きさの異なる標識されたＤＮＡ断片の１つ以上のコレクションの作製であり、これは、次いで、該断片の３’末端のヌクレオチドの正体（連鎖停止法において）または該断片から最も新しく除去されたヌクレオチドの正体（化学的分解方法の場合）を決定するために、長さに基づいて分離されなければならない。
【０００６】
現在利用可能な配列決定手法は、いくつかの完全ゲノムの配列決定などの主要な目的の達成を可能にするが、これらの手法は、いくつかの不都合点を有し、いくつかの領域において改善の相当な必要性がなお残っている。標識されたＤＮＡ断片の分離は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いてなされている。しかしながら、この工程は、多くの状況で配列決定のスピードと精度の両方を制限する大きな障害であることが示されている。キャピラリー電気泳動（ＣＡＥ）は、ヒトゲノムプロジェクトの完成を可能にした飛躍的進歩であることが示されたが（非特許文献３）、大きな欠点がなお残っている。例えば、ＣＡＥは、依然として時間のかかる分離工程を必要とし、依然として大きさに基づく区別を伴ない、これらは、不正確となり得る。
【０００７】
連鎖停止方法に対するさまざまな代替法が提案されている。多くの場合、「合成による配列決定」とよばれるアプローチの一例では、オリゴヌクレオチドプライマーを、まず標的鋳型にハイブリダイズさせる。次いで、プライマーを、種々に標識したヌクレオチドのポリメラーゼ触媒型付加の連続的サイクルによって伸長させる。成長鎖内へのその組込みを検出する。標識の正体は、鋳型内の相補的ヌクレオチドを同定する機能を果たす。あるいはまた、多数の反応が、各ヌクレオチドを用いて並行して行なわれ得、ある特定のヌクレオチドを使用する反応内への標識されたヌクレオチドの組込みにより、鋳型内の相補的ヌクレオチドが同定される（例えば、Ｍｅｌａｍｅｄｅ，特許文献１；Ｃｈｅｅｓｅｍａｎ，特許文献２；Ｔｓｉｅｎら，特許文献３；Ｒｏｓｅｎｔｈａｌら，特許文献４；非特許文献４；非特許文献５参照のこと）。
【０００８】
任意の有意な長さのポリヌクレオチドを効率的に配列決定するため、ポリメラーゼは、各サイクルにおいて正確に１つのヌクレオチドを組み込むことが望ましい。したがって、一般的に、連鎖停止剤として作用するヌクレオチド使用すること、すなわち、その組込みにより、ポリメラーゼによるさらなる伸長が抑制されることが必要である。組み込まれたヌクレオチドは、次いで、ポリメラーゼが次のヌクレオチドを組み込むことが可能になるように酵素的または化学的のいずれかで修飾されなければならない。連鎖停止剤としての機能を果たし得るが、後続の工程で伸長され得るようにその組込み後に修飾され得るさまざまなヌクレオチドアナログが提案されている。かかる「可逆的停止剤」は、例えば特許文献２；特許文献５〜７に記載されている。しかしながら、高効率でポリメラーゼ組み込まれ得る可逆的停止剤を同定することは、おそらく、ヌクレオチドの大きさが小さいことを考慮すると、ヌクレオチドが停止剤としての機能を果たす能力に影響する修飾はまた、成長ポリヌクレオチド鎖内へのその組込みにも影響するという事実のため、困難であることが示されている。
【０００９】
他の配列決定アプローチとしては、ピロシーケンスが挙げられ、これは、ＤＮＡ重合中に放出されるピロリン酸塩（ＰＰｉ）の検出に基づくものである（例えば、特許文献８および９参照のこと）。電気泳動による分離の必要性は回避されるが、ピロシーケンスは、今のところその広範な適用可能性を制限している多数の欠点を有する（非特許文献６）。ハイブリダイゼーションによる配列決定もまた、代替法として提案されている（特許文献１０〜１２；非特許文献７）が、いくつかの不都合点（例えば、高度に類似した配列間の識別におけるエラーに可能性など）を有する。エクソヌクレアーゼによる単一分子配列決定は、１つの鎖内の塩基ごとの標識、次いで、試料流中の切断された３’末端ヌクレオチドの連続的な検出を伴うものであるが、これは、理論的には、長鎖ＤＮＡ分子の配列を速やかに決定するに非常に強力な方法である（非特許文献８）。しかしながら、この潜在性を実現する前に克服すべき種々の技術的な障害がなお残っている（非特許文献８）。
【００１０】
特定の配列異型に基づく診断用試験は、さまざまな種々の疾患のために既に使用されている。ヒトゲノムの配列決定は、治療（予防的治療を含む）が患者の特定のゲノム構成にあつらえられるか、または特定の対立遺伝子もしくは変異の同定に基づいて選択される個別化医療の時代の到来を告げると広く考えられている。ＨＩＶなどの感染性因子の配列バリアントの迅速かる正確な決定の必要性が増大している。したがって、近い将来、正確かつ迅速な配列決定に対する要望が大きく拡大することは明白である。したがって、あらゆる型の改善された配列決定法が必要とされている。
【特許文献１】米国特許第４，８６３，８４９号明細書
【特許文献２】米国特許第５，３０２，５０９号明細書
【特許文献３】国際公開第９１／０６６７８号パンフレット
【特許文献４】国際公開第９３／２１３４０号パンフレット
【特許文献５】米国特許第６，２５５，４７５号明細書
【特許文献６】米国特許第６，３０９，８３６号明細書
【特許文献７】米国特許第６，６１３，５１３号明細書
【特許文献８】米国特許第６，２１０，８９１号明細書
【特許文献９】米国特許第６，２５８，５６８号明細書
【特許文献１０】米国特許第５，２０２，２３１号明細書
【特許文献１１】国際公開第９９／６０１７０号パンフレット
【特許文献１２】国際公開第００／５６９３７号パンフレット
【非特許文献１】Ｓａｎｇｅｒら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７４：５４６３−５４６７，１９７７
【非特許文献２】Ｍａｘａｍ＆Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７４：５６０−５６４，１９７７
【非特許文献３】Ｖｅｎｔｅｒら．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９１：１３０４−１３５１，２００１；Ｌａｎｄｅｒら．，Ｎａｔｕｒｅ，４０９：８６０−９２１，２００１
【非特許文献４】Ｃａｎａｒｄら，Ｇｅｎｅ，１４８：１−６（１９９４）
【非特許文献５】Ｍｅｔｚｋｅｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４２５９−４２６７（１９９４）
【非特許文献６】Ｆｒａｎｃａら．，Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，３５（２）：１６９−２００，２００２
【非特許文献７】Ｄｒｍａｎａｃら．，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７７：７６−１０１，２００２
【非特許文献８】Ｓｔｅｐｈａｎら．，Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８６：２５５−２６７，２００１
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、断片分離を行なう必要性を回避する、またある特定の実施形態においては、ポリメラーゼ酵素の使用の必要性を回避する新しい改善された配列決定法を提供する。背景の項目に記載の方法の代替法は、Ｍａｃｅｖｉｃｚ（Ｍａｃｅｖｉｃｚ）の米国特許第５，７４０，３４１号および同第６，３０６，５９７号に記載されている。この方法は、単鎖鋳型に沿った二本鎖伸長の反復サイクルに基づくものである。これらの方法の好ましい実施形態において、ヌクレオチドは各サイクルで同定される。本発明は、これらの方法に対する改善を提供する。該改善により、該方法の効率的な実施が可能になり、ハイスループット配列決定に特に好適である。また、本発明は、単鎖鋳型に沿った二本鎖伸長の反復サイクルを伴うが、各サイクル中での個々のヌクレオチドの同定をなんら伴わない配列決定法を提供する。
【００１２】
一態様において、本発明は、単鎖鋳型に沿った二本鎖伸長、標識された伸長プローブのライゲーションおよび標識の検出の連続的サイクルに基づく配列決定のための改善された方法を提供する。一般に、伸長は、初期化（ｉｎｉｔｉａｌｉｚｉｎｇ）オリゴヌクレオチドおよび鋳型によって形成された二本鎖から開始される。初期オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドプローブをその末端にライゲートして伸長された二本鎖を形成させ、次いで、これを、ライゲーションの連続的サイクルによって反復的に伸長させることにより伸長される。各サイクル中、鋳型内の１つ以上のヌクレオチドの正体が、成功裏にライゲートされたオリゴヌクレオチドプローブ上またはこれと会合した標識を同定することにより決定される。新たに付加されたプローブの標識はまた、ライゲーション前、あるいはそれに加えて、ライゲーション後に検出され得る。一般的に、ライゲーション後に標識を検出することが好ましい。
【００１３】
好ましい実施形態において、伸長された二本鎖のたった１回の伸長が１サイクルで起こるように、プローブは伸長不可能な部分を、末端位置に（二本鎖の成長核酸鎖にライゲートされたヌクレオチドと反対のプローブ末端に）有する。「伸長不可能な」により、該部分が、修飾のないリガーゼ基質としての機能を果たさないことが意図される。例えば、該部分は、５’リン酸基または３’ヒドロキシル基がない。該部分は、ライゲーションを抑制するブロッキング基が自身に結合されたヌクレオチドであり得る。本発明の好ましい実施形態において、伸長不可能な部分は、ライゲーション後に除去され、伸長可能な末端が生成され、その結果、二本鎖は後続のサイクルでさらに伸長され得る。
【００１４】
伸長不可能な部分の除去を可能にするため、本発明のある特定の実施形態において、プローブに、ホスホジエステル結合が実質的に切断されない条件下で切断され得る少なくとも１つのヌクレオシド間結合を含有させる。かかる連結は、本明細書において「切れやすいヌクレオシド間結合」または「切れやすい連結」という。切れやすいヌクレオシド間結合の切断により、伸長不可能な部分が除去され、伸長可能なプローブ末端が再生されるか、または修飾されて伸長可能なプローブ末端を形成する末端残基が残るかのいずれかとなる。切れやすいヌクレオシド間結合は、プローブ内の任意の２つのヌクレオシド間に位置し得る。好ましくは、切れやすい連結は、新たに形成された結合から少なくとも数個のヌクレオチド離れて（すなわち、遠位に）位置する。伸長可能な末端ライゲートされた末端ヌクレオチドと切れやすい連結間の伸長プローブ内のヌクレオチドは、鋳型に完璧にハイブリダイズする必要はない。これらのヌクレオチドは、「スペーサー」としての機能を果たし、鋳型に沿った区間に位置するヌクレオチドの同定を、該区間該の各ヌクレオチドについてサイクルを行なうことなく可能にし得る。
【００１５】
切れやすいヌクレオシド間結合および標識は、好ましくは、切れやすいヌクレオシド間結合の切断により、標識された部分内の伸長プローブと成長核酸鎖の一部のままである部分とが分離され、標識された部分の核酸が可能になる（例えば、温度上昇時）ように配置させる。例えば、標識は、伸長プローブの末端ヌクレオチドのライゲートされるヌクレオチドと反対の末端に結合させ得る。あるいはまた、標識は、任意のいくつかのアプローチを用いて除去してもよい。
【００１６】
本発明者らは、ホスホジエステル結合内の橋絡酸素原子の１つがイオウ原子で置き換えられたホスホロチオレート結合が、特に好都合な切れやすいヌクレオシド間結合であることを見出した。ホスホロチオレート結合内のイオウ原子は、一方のヌクレオシドの３’炭素または隣接するヌクレオシドの５’炭素のいずれかに結合され得る。
【００１７】
上記の方法のある特定の実施形態では、複数の配列決定反応が行なわれる。該反応では、最初のライゲーションが起こる末端が、鋳型に対して異なる位置に位置するように、鋳型の異なる配列にハイブリダイズする初期オリゴヌクレオチドが使用される。例えば、最初のライゲーションが起こる位置は、１個のヌクレオチド増加によって、互いに対してシフトまたは「位相ずれ（ｏｕｔ  ｏｆ  ｐｈａｓｅ）」させ得る。したがって、同じ長さのオリゴヌクレオチドプローブを用いた各伸長サイクル後、同じ相対位相が、異なる鋳型上の初期オリゴヌクレオチドの両末端間に存在する。該反応は、並行して、各々が同じ鋳型コピーを含む独立した区画において、または順次（すなわち、第１の初期オリゴヌクレオチドを用いて配列情報を得た後、伸長された二本鎖を鋳型から除去し、次いで鋳型の異なる配列にハイブリダイズする初期オリゴヌクレオチドを用いてさらなる反応（１つまたは複数）を行なうことにより）行なわれ得る。
【００１８】
別の態様において、本発明は、さまざまな核酸操作に有用な溶液を提供する。一実施形態において、本発明は、１．０〜３．０％ＳＤＳ、１００〜３００ｍＭ  ＮａＣｌおよび５〜１５ｍＭ重硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ４）を水中に含有するか、またはそれらから本質的になる溶液を提供する。該溶液は、約２％ＳＤＳ、約２００ｍＭ  ＮａＣｌおよび約１０ｍＭ重硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ４）を水中に含有するものであるか、または本質的にそれらからなるものであり得る。例えば、一実施形態において、該溶液は、２％ＳＤＳ、２００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭ重硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ４）を水中に含有するものである。別の実施形態において、該溶液は、２％ＳＤＳ、２００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭ重硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ４）を含む水から本質的になるものである。ある特定の実施形態において、該溶液は、２．０〜３．０、例えば２．５のｐＨを有する。該溶液は、二本鎖核酸、例えば二本鎖ＤＮＡを個々の鎖に分離、すなわち、二本鎖核酸を変性（融解）させるのに有用である。ある特定の実施形態において、両方の鎖がＤＮＡである。他の実施形態において、両方の鎖がＲＮＡである。他の実施形態において、一方の鎖がＤＮＡであり、他方の鎖はＲＮＡである。他の実施形態において、一方または両方の鎖がＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含有する。他の実施形態において、該鎖の一方または両方がＡ、Ｇ、ＣまたはＴ以外の少なくとも１つのヌクレオチドを含有する。ある一部の実施形態において、該鎖の一方または両方が、非天然に存在するヌクレオチドを含有する。また他の実施形態において、該残基の１つ以上がトリガー（ｔｒｉｇｇｅｒ）残基、例えば、無塩基残基または損傷塩基である。ある一部の実施形態において、１つ以上の残基が、普遍（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）塩基を含有する。ある一部の実施形態において、該鎖の一方または両方が切れやすい連結を含有する。
【００１９】
二本鎖核酸は、完全な二本鎖または部分二本鎖であり得る。これは、溶液中で遊離状態であり得るか、または一方もしくは両方の鎖が固相もしくは半固相支持体もしくは基材と物理的に会合（例えば、共有結合もしくは非共有結合）  された状態であり得る。特に注目すべきことには、このような溶液中でインキュベートされた二本鎖核酸は、ゲル離層を引き起こし得る（例えば、核酸が、ポリアクリルアミドゲルなどの半固相支持体内に位置するか、これに結合されている場合）か、またはストレプトアビジン（ＳＡ）−ビオチン結合（例えば、核酸が支持体もしくは基材にＳＡ−ビオチン結合によって結合されている場合）などの非共有結合を破壊し得る熱または刺激の強い変性剤の非存在下で効果的に単鎖に分離される。一実施形態において、該溶液は、核酸の一方がビーズにＳＡ−ビオチン結合によって結合されている二本鎖核酸を分離するために使用される。
【００２０】
本発明はまた、二本鎖核酸と任意の前述の溶液、例えば、約１．０〜３．０％ＳＤＳ、約１００〜３００ｍＭ  ＮａＣｌおよび約５〜１５ｍＭ重硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ４）を含有する水溶液、例えば、１．０〜３．０％ＳＤＳ、１００〜３００ｍＭ  ＮａＣｌおよび５〜１５ｍＭ重硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ４）を含有する水溶液と接触させる工程を含む、二本鎖核酸の鎖を分離する方法を提供する。一実施形態において、該溶液は、約２％ＳＤＳ、２００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭ重硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ４）、例えば、２％ＳＤＳ、２００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭ重硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ４）  を含有するものである。別の実施形態において、該溶液は、２％ＳＤＳ、２００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭ重硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ４）を含む水から本質的になるものである。ある特定の実施形態において、該溶液は、２．０〜３．０、例えば２．５のｐＨを有する。ある一部の実施形態において、二本鎖核酸は、溶液中でインキュベートされる。他の実施形態において、二本鎖核酸（好ましくは、支持体または基材に結合されている）を該溶液で洗浄する。ある一部の実施形態において、二本鎖核酸を該溶液と、二本鎖核酸分子の少なくとも１０％が単鎖に分離されるのに充分な時間接触させる。ある一部の実施形態において、二本鎖核酸を該溶液と、二本鎖核酸少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上が単鎖に分離されるのに充分な時間接触させる。例示的な実施形態において、二本鎖核酸を該溶液と１５秒間〜３時間接触させる。別の実施形態において、二本鎖核酸を該溶液と１分間〜１時間接触させる。ある特定の実施形態において、二本鎖核酸を該溶液と、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５または６０分間接触させる。該方法は、インキュベーション期間後に、該溶液を除去または一部もしくは全部の核酸を該溶液から除去するさらなる工程を含むものであってもよい。
【００２１】
該溶液には、いくつかの本明細書に記載した配列決定法の１つ以上の工程における用途が見出され、任意のこれらの方法において使用され得る。例えば、該溶液は、伸長された二本鎖を鋳型から分離するために使用され得る。該溶液は、切れやすい連結を切断して伸長プローブの伸長された二本鎖にもはや結合されていない部分を除去した後に使用され得る。該溶液はまた、三重鎖核酸の分離、または単一の核酸鎖の互いににハイブリダイズした自己相補性部分を含有する二本鎖領域の分離に有用である。
【００２２】
別の態様において、本発明は、少なくとも２つの識別可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブファミリーのコレクションを用いて、配列に関する情報を得るための方法を提供する。該プローブファミリー内のプローブは、非拘束部分および拘束部分を含有する。上記の方法のように、伸長は、初期オリゴヌクレオチドおよび鋳型によって形成された二本鎖から開始される。初期オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドプローブをその末端にライゲートして伸長された二本鎖を形成させ、次いで、これを、ライゲーションの連続的サイクルによって反復的に伸長させることにより伸長される。伸長された二本鎖のたった１回の伸長が１サイクルで起こるように、プローブは伸長不可能な部分を、末端位置に（二本鎖の成長核酸鎖にライゲートされたヌクレオチドと反対のプローブ末端に）有する。各サイクル中、成功裏にライゲートされたプローブ上の、またはこれと会合させた標識が検出され、伸長不可能な部分が除去または修飾されて、伸長可能な末端が生成する。標識は、該プローブが属するプローブファミリーに対応する。
【００２３】
伸長、ライゲーションおよび検出の連続的サイクルにより、連続的な成功裏にライゲートされたプローブが属するプローブファミリーの序列リスト（ｏｒｄｅｒｅｄ  ｌｉｓｔ）がもたらされる。プローブファミリーの序列リストは、配列に関する情報を得るために使用される。しかしながら、新たにライゲートされたプローブがどのプローブファミリーに属するのかがわかることは、それ自体では、鋳型内のヌクレオチドの正体を決定するのに充分でない。それどころか、新たにライゲートされたプローブがどのプローブファミリーに属するのかがわかることは、ある特定の配列がプローブの拘束部分の配列である可能性を排除し、各位置におけるヌクレオチドの正体の少なくとも２つの可能性を残す。したがって、新たにライゲートされたプローブの拘束部分内のヌクレオチド（すなわち、プローブの拘束部分内のヌクレオチドに相補的なヌクレオチド）と反対の位置に位置する鋳型内のヌクレオチドの正体には少なくとも２つの可能性がある。
【００２４】
ある特定の実施形態において、所望回数サイクルを行なった後、該一連の序列のプローブファミリー正体を用いて１組の候補配列を作製する。この組の候補配列により、目的を達成するのに充分な情報が提供され得る。本発明の好ましい実施形態において、候補配列の中から正確な配列を選択するため、１つ以上のさらなる工程を行なう。例えば、該配列が既知配列のデータベースと比較され得、データベース内の該配列の１つに最も近い候補配列を正確な配列として選択する。他の実施形態において、異なるようにコード化された組のプローブファミリー用い、鋳型を、伸長、ライゲーション、検出および切断の連続的サイクルによるさらなる回の配列決定に供し、２回目で得られた情報を用いて正確な配列を選択する。他の実施形態において、少なくとも１つの情報項目を、プローブファミリー正体の序列リストから得られた情報と組み合わせ、配列を決定する。
【００２５】
本発明はまた、プローブファミリーを用いて鋳型を配列決定する場合のエラーチェックを行なう方法を提供する。該方法のある特定のものは、一塩基多型（ＳＮＰ）と配列決定エラーを識別する。
【００２６】
本発明はまた、目的の少なくとも２つのセグメント（例えば、少なくとも２つのタグ）および少なくとも３つのプライマー結合領域（ＰＢＲ）を、各々が目的のセグメントに対応する少なくとも２つの異なる鋳型が各断片から増幅され得るように含有する核酸断片（例えば、ＤＮＡ断片）を提供する。「プライマー結合領域」は、オリゴヌクレオチドが、該オリゴヌクレオチドが増幅プライマー、配列決定プライマー、初期オリゴヌクレオチドなどとしての機能を果たし得るようにハイブリダイズし得る核酸の一部分である。したがって、プライマー結合領域は、適当な相補的オリゴヌクレオチドの選択を可能にするため、既知配列を有するものであるのがよい。本明細書および図面で用いる場合、本発明の方法に用いられる核酸鎖の一部分は、該方法の実施において、プライマーが実際に、該領域に結合するか、核酸鎖の相補鎖の対応する部分に結合するかに関係なく、プライマー結合領域とよばれ得る。したがって、核酸の一部分は、本発明の方法に用いられる場合、プライマーが実際に、該領域に結合するのか（この場合、プライマーの配列は、該領域のものに相補的または実質的に相補的である）、または該領域の相補的部分に結合するのか（この場合、プライマーの配列は、プライマー結合領域の配列と同一または実質的に同一である）とは無関係にプライマー結合領域とよばれ得る。目的のセグメントは、その配列情報が所望される核酸の任意のセグメントである。例えば、目的の配列は、タグであり得、本発明の開示の目的のためには、目的のセグメントがタグである（本明細書および他で「末端タグ」とも称する）ことが想定される。しかしながら、本発明は、目的のセグメントがタグであることに限定されないことを理解されたい。ある特定の実施形態において、少なくとも２つのタグは１対のタグである。該核酸断片は、１対以上のタグ、例えば、１つ以上の対のタグ、例えば、２、３、４、５対以上の対のタグを含有するものであり得る。本発明は、さらに、かかる核酸断片を含有するライブラリー、ならびに該鋳型およびライブラリーの作製方法を提供する。
【００２７】
本発明は、さらに、自身に結合された核酸の少なくとも２つの異なる集団を有する微粒子（例えば、ビーズ）であって、該少なくとも２つの集団の各々は複数の実質的に同一の核酸からなり、該集団は、単一の核酸断片からの増幅（例えば、ＰＣＲ増幅）によって生成されたものである微粒子（例えば、ビーズ）を提供する。ある一部の実施形態において、単一の核酸断片は、１対のタグである５’タグおよび３’タグを含有する。単一の核酸断片が対である５’タグおよび３’タグを含有するある一部の実施形態において、微粒子に結合された核酸の集団の１つが５’タグの少なくとも一部分を含み、微粒子に結合された核酸の集団の１つが３’タグの少なくとも一部分を含む。好ましい実施形態において、該集団の１つが完全な５’タグを含み、該集団の１つが完全な３’タグを含む。
【００２８】
該核酸断片は多数のＰＢＲを含有するものであり、その少なくとも１つがタグ間に位置し、その少なくとも２つが、該核酸断片の該タグを含有する一部分と隣接し、その結果、５’タグの少なくとも一部分を含む領域が増幅され得、３’タグの少なくとも一部分を含む領域が増幅され得、２つの異なる核酸集団がもたらされる。好ましい実施形態において、５’タグ全体および３’タグ全体が増幅され得る。例えば、該核酸断片は、５’タグと隣接する第１および第２のプライマー結合部位、さらに３’タグと隣接する第３および第４のプライマー結合部位を含有するものであり得る。第１および第２のプライマー結合部位に結合するプライマーを用いるＰＣＲ増幅により、５’タグが増幅される。第３および第４のプライマー結合部位に結合するプライマーを用いるＰＣＲ増幅により、３’タグが増幅される。プライマーは、各プライマーからの伸長により、増幅されるタグを含有するＤＮＡ断片の領域に向かって進行するように選択されるのがよいことは認識されよう。あるいはまた、第１のプライマー結合部位を一方のタグの上流に配置させ得、第２のプライマー結合部位を他方のタグの下流に配置させ得、第３のプライマー結合部位を、この２つのタグ間に配置させ得る。第３のプライマー結合部位は、一方のタグを増幅させるＰＣＲ増幅のためのフォワードプライマーの結合部位としての機能を果たし、他方のタグを増幅させるＰＣＲ増幅のためのリバースプライマー結合部位としての機能を果たす。したがって、一実施形態において、本発明は、自身に結合された核酸の少なくとも２つの異なる集団を有する微粒子（例えば、ビーズ）であって、該少なくとも２つの集団の各々は複数の実質的に同一の核酸からなり、第１の異なる集団が５’タグを含み、第２の異なる集団が３’タグを含む微粒子（例えば、ビーズ）を提供する。
【００２９】
本発明は、さらに、個々の微粒子が自身に結合された核酸の少なくとも２つの異なる集団を有し、該少なくとも２つの集団の各々は複数の実質的に同一の核酸からなり、該集団が単一のＤＮＡ断片からの増幅（例えば、ＰＣＲ増幅）によって生成されたものである微粒子（例えば、ビーズ）の集団を提供する。実質的に同一の集団は、例えば、５’タグと３’タグであり得る。本発明は、さらに、かかる微粒子のアレイ、および実質的に同一の核酸の集団の配列決定を伴う配列決定法を提供する。例えば、一実施形態において、個々の微粒子に結合された２つの実質的に同一の核酸の集団の各々が異なるプライマー結合領域（ＰＢＲ）を含み、その結果、異なる配列決定プライマーを用いることにより、一方の集団は、他方の集団から障害されることなく配列決定され得る。実質的に同一の核酸の２つより多くの実質的に同一の集団が単一の微粒子に結合されている場合、該集団の各々が特有のＰＢＲ有し得、その結果、所与のＰＢＲに結合するプライマーは、微粒子に結合された核酸の他方の実質的に同一の集団内に存在するＰＢＲに結合しない。したがって、本発明の方法は、自身に結合された核酸の少なくとも２つの異なる実質的に同一の集団（例えば、５’タグを含有する多コピーの鋳型と３’タグを含有する多コピーの鋳型）を有する微粒子であって、タグが対のタグである微粒子の作製を可能にする。本発明の方法によれば、鋳型は、配列決定プライマーの結合部位を提供する異なるＰＢＲを含むものである。したがって、５’タグを含有する鋳型内のＰＢＲに相補的な配列決定プライマーを選択することにより、配列情報は５’タグから、３’タグを含有する鋳型もまた同じ微粒子上に存在していても３’タグを含有する鋳型から障害されることなく得られ得る。３’タグを含有する鋳型内のＰＢＲに相補的な配列決定プライマーを選択することにより、配列情報は３’タグから、５’タグを含有する鋳型もまた同じ微粒子上に存在していても５’タグを含有する鋳型から障害されることなく得られ得る。対のタグの両方が同じ微粒子上に存在するという事実は、先行技術において単一の鋳型内に存在した場合に起こり得るように、５’および３’の対のタグの配列が互いに会合し得ることを意味する。
【００３０】
基材に付着した微粒子のアレイも提供される。一実施形態において、微粒子は、一方の末端が微粒子に付着し、他方の末端が基材に付着した一本鎖鋳型によって基材に繋がれる。一端または両端における付着手段は、共有結合的である場合もあれば、非共有結合的である場合もある。ある実施形態において、一端または両端の付着手段は、ビオチン結合部分およびビオチンを含む。
【００３１】
また、微粒子に付着した鋳型を複製し、場合によりその複製した鋳型を増幅させることによって作成される核酸コロニーを含むアレイも提供される。さらにまた、ブロッキングオリゴヌクレオチドとその使用方法、ならびにブロッキングオリゴヌクレオチドを含む組成物も提供される。
【００３２】
本発明はまた、例えば、実質的に平面状の支持体内または該支持体上のアレイ状の鋳型を配列決定するために使用され得る自動配列決定システムを提供する。本発明は、さらに、コンピュータ可読媒体、例えば、ハードディスク、ＣＤ、ジップディスク、フュラッシュメモリーなど上に保存され得る画像処理方法を提供する。ある特定の実施形態において、該システムは、１秒当たり４０，０００個のヌクレオチド以上の同定を達成する。ある特定の好ましい実施形態において、該システムは、１日（２４時間）あたり、８．６ギガバイト（Ｇｂ）以上の配列データをもたらす。ある特定の好ましい実施形態において、該システムは、１日あたり、４８Ｇｂ以上の配列情報（ヌクレオチド同定）をもたらす。
【００３３】
また、本発明は、本発明の配列決定法を適用することによってもたらされる情報を保存するコンピュータ可読媒体を提供する。情報は、データベースに保存してもよい。
【００３４】
本出願書類において、種々の特許、特許出願、学術論文および他の刊行物に言及するが、これらはすべて、引用により本明細書に組み込まれる。また、以下の標準的な参考文献の研究：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎ．Ｙ．，編集２００２年７月；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ＲｕｓｓｅｌｌおよびＳａｍｂｒｏｏｋ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，２００１は、引用により本明細書に組み込まれる。本明細書と引用により組み込まれる任意の文献とで矛盾する場合は、本明細書が支配するものとし、本発明者らの裁量に矛盾または不一致が存在するか否かの決定は、任意の時点で行なわれ得ることを理解されたい。
【００３５】
図１〜３５の多くは、米国特許出願第１１／３４５，９７９号ではカラーとなっており、これらの図が参考として本明細書で援用され、本明細書に示す図の代わりに使用できることに留意されたい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
定義
本発明の記載の理解を助長するために、以下に定義を示す。一般に、特に定義のない用語は、当該技術分野で一般的に認められている意味（１つまたは複数）を示すものとすることを理解されたい。
【００３７】
本明細書で用いる場合、「無塩基残基」は、窒素含有塩基の除去または窒素含有塩基の充分な部分の除去後に残留し、得られた分子が、もはや、ヌクレオシドまたはヌクレオチドに特徴的な水素結合に関与しないようなヌクレオシドまたはヌクレオチドの一部分の構造を有する残基である。無塩基残基は、窒素含有塩基をヌクレオシドまたはヌクレオチドから除去することにより生成させ得る。しかしながら、用語「無塩基」は、該残基の構造的特徴をいうために使用され、残基が生成される様式とは無関係である。用語「無塩基残基」および「無塩基部位」は、本明細書において、プリンまたはピリミジン塩基がない核酸内の残基をいうために使用される。
【００３８】
「無プリン（ａｐｕｒｉｎｉｃ）／無ピリミジン（ａｐｙｒｉｍｉｄｉｎｉｃ）（ＡＰ）エンドヌクレアーゼ」は、本明細書で用いる場合、ポリヌクレオチド内の無塩基残基の５’側、３’側または５’および３’側両方いずれかの結合を切断する酵素をいう。本発明のある特定の実施形態において、ＡＰエンドヌクレアーゼは、ＡＰリアーゼである。ＡＰエンドヌクレアーゼの例としては、限定されないが、大腸菌エンドヌクレアーゼＶＩＩＩおよびその類縁体ならびに大腸菌エンドヌクレアーゼＩＩＩおよびその類縁体が挙げられる。特定の酵素、例えば、大腸菌Ｅｎｄｏ  ＶＩＩＩ、Ｅｎｄｏ  Ｖなどのエンドヌクレアーゼに対する言及は、当該技術分野において類縁体であると、および損傷塩基の除去および／または無塩基残基もしくは他のトリガー残基を含有するＤＮＡの切断に関して類似した生化学的活性を有すると認められる他の種由来の類縁体を包含することが意図されることを理解されたい。
【００３９】
本明細書で用いる場合、用語「アレイ」は、支持体マトリックス全体または該マトリックス内に分布された正体のコレクションをいい、好ましくは、個々の正体は、任意のさまざまな手法によってアレイの個別の特徴の同定を可能にするのに充分な距離で互いに間隔があいている。正体は、例えば、核酸分子、核酸分子のクローン性の集団、微粒子（任意選択で、自身に結合された核酸分子のクローン性の集団を有する）などであり得る。動詞で用いる場合、用語「アレイ」およびその変形体は、アレイを形成するため、例えば、正体を支持体マトリックス全体または該マトリックス内に分布させるための任意のプロセスをいう。
【００４０】
「損傷塩基」は、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴがＤＮＡグリコシラーゼによるＤＮＡからの除去のための基質となるような様式で異なるプリンまたはピリミジン塩基である。ウラシルは、本発明の目的のために損傷塩基とみなす。本発明のある一部の実施形態において、損傷塩基はヒポキサンチンである。
【００４１】
ポリヌクレオチド集団うちの１つのポリヌクレオチド内の位置に関する「縮重している」は、該位置を占めるヌクレオシドの一部を構成する塩基の正体が、該集団の種々のメンバー間で異なることを意味する。したがって、該集団は、その配列が縮重位置において異なる個々のメンバーを含む。用語「位置」は、一般的に、５’または３’末端に関してポリヌクレオチド内の各ヌクレオシドに割り当てられた数値をいう。例えば、伸長プローブの３’末端のヌクレオシドには１位が割り当てられ得る。したがって、構造３’−ＸＸＸＮＸＸＸＸ−５’の伸長プローブのプールにおいて、Ｎは４位である。４位は、該プールの異なるメンバーにおいてＮの正体が異なり得る場合、縮重しているとみなされる。また、該伸長プローブのプールはＮ位が縮重していると言える。位置は、任意のｋ個の異なる正体を有するヌクレオシドによって占められ得る場合、ｋ重に縮重していると言える。例えば、２つの異なる塩基のいずれかを含むヌクレオシドによって占められ得る位置は、２重に縮重している。
【００４２】
「配列に関する情報を調べること」は「配列決定」を包含し、また、他のレベルの情報、例えば、配列に関する１つ以上の可能性の排除なども包含する。ポリヌクレオチドにおいて配列決定を行なうことにより、典型的には、完璧に相補的（１００％相補的）なポリヌクレオチドの配列に関して等価な情報がもたらされる。したがって、完璧に相補的なポリヌクレオチドにおいて直接行なわれる配列決定と等価である。
【００４３】
複数の要素、例えば、オリゴヌクレオチドプローブ分子またはその部分内のヌクレオシドに関する「独立して」は、各要素の正体が、任意の他方の要素の正体を制限しないこと、およびそれらに制限されないことを意味し、例えば、各要素の正体は、任意の他方の要素（１つまたは複数）の正体とは無関係に選択される。したがって、１つ以上の要素の正体がわかることは、任意のその他の要素の正体に関する任意の情報を提供することにはならない。例えば、配列ＮＮＮＮ内のヌクレオシドは、各Ｎの正体が任意の他のＮの正体とは無関係にＡ、Ｇ、ＣまたはＴであり得る場合、独立している。
【００４４】
「ライゲーション」は、鋳型駆動型反応において、２つ以上の核酸、例えば、オリゴヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチドの末端間に、共有結合または連結を形成することを意味する。結合または連結の性質は広く異なり得、ライゲーションは、酵素的または化学的に行なわれ得る。
【００４５】
用語「微粒子」は、本明細書において、５０ミクロン以下、好ましくは１０ミクロン以下の最小の断面寸法を有する粒子をいうために用いる。ある特定の実施形態において、最小断面寸法は、およそ３ミクロン以下、およそ１ミクロン以下、およそ０．５ミクロン以下、例えば、およそ０．１、０．２、０．３または０．４ミクロンである。微粒子は、さまざまな無機または有機材料、例えば、限定されないが、ガラス（例えば、細孔性ガラス）、シリカ、ジルコニア、架橋ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリメチルメタクリレート、二酸化チタン、ラテックス、ポリスチレンなど作製されたものであり得る。例えば、種々の適当な材料および他の考慮事項については、米国特許第６，４０６，８４８号を参照のこと。Ｄｙｎａビーズ（Ｄｙｎａｌ（オスロ、ノルウェー）から入手可能）は、本発明に有用な市販の微粒子の一例である。磁気応答性微粒子も使用され得る。ある種の好ましい微粒子磁気応答性により、増幅後の微粒子結合鋳型の容易な回収および濃縮が可能になり、さらなる工程（例えば、洗浄、試薬除去など）が容易になる。本発明のある特定の実施形態において、異なる形状（例えば、いくらか球状および他の非球状のもの）を有する微粒子の集団
が使用される。
【００４６】
用語「ミクロスフィア」または「ビーズ」は、本明細書において、５０ミクロン以下、好ましくは１０ミクロン以下の直径を有する実質的に球状の微粒子をいうために用いる。ある特定の実施形態において、直径は、およそ３ミクロン以下、およそ１ミクロン以下、およそ０．５ミクロン以下、例えば、およそ０．１、０．２、０．３、または０．４ミクロンである。本発明のある特定の実施形態において、単分散性ミクロスフィアの集団が使用される、すなわち、ミクロスフィアは、実質的に均一な大きさのものである。例えば、微粒子の直径は、５％未満、例えば２％以下、１％以下などの変動係数を有し得る。しかしながら、他の実施形態において、微粒子集団の変動係数は、５％以上、例えば、５％、５％〜１０％（両端を含む）、１０％〜２５％（両端を含む）などである。ある特定の実施形態において、微粒子の混合集団が使用される。例えば、各々が５％未満の変動係数を有する２つの集団の混合物を用い、単分散性でない混合集団がもたらされ得る。一例として、１ミクロンおよび３ミクロンの直径を有するミクロスフィアの混合物が使用され得る。本発明のある特定の実施形態において、配列決定が、単分散性でない集団のミクロスフィアに結合された鋳型を用いて行なわれる場合、さらなる情報がミクロスフィアの大きさによって提供される。例えば、鋳型の異なるライブラリーを、異なる大きさのミクロスフィアに結合させ得る。また、より少数の鋳型分子をより小さい粒子に結合させ得るため、シグナル強度は異なり得、これにより多重配列決定が容易になり得る。
【００４７】
用語「核酸配列」は、本明細書で用いる場合、核酸材料それ自体をいうことがあり得る。特定の核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を生化学的にキャラクタライズする配列情報（すなわち５つの塩基の文字Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵから選択される文字の連続）に限定されない。本明細書に示す核酸は、特に記載のない限り、５’→３’方向で示す。
【００４８】
「ヌクレオシド」は、糖分子に連結された窒素含有塩基を含む。本明細書で用いる場合、該用語は、その２’−デオキシおよび２’−ヒドロキシル形態において天然のヌクレオシド（ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ，  ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，  第２版．（Ｆｒｅｅｍａｎ，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９９２）に記載のものなど）ならびにヌクレオシド類縁体を含む。例えば、天然ヌクレオシドとしては、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシンおよびデオキシシチジンが挙げられる。ヌクレオシド「類縁体」は、修飾された塩基部分および／または修飾された糖部分を有する合成ヌクレオシドをいい、例えば、Ｓｃｈｅｉｔ，  ヌクレオチドＡｎａｌｏｇｓ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８０）に一般的に記載されている。かかる類縁体としては、結合特性の増強、縮重の低減、特異性の増大などのために設計された合成ヌクレオシドが挙げられる。ヌクレオシド類縁体としては、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、Ｃ５−プロピニルシチジン、Ｃ５−プロピニルウリジン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−メチルシチジン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、２−チオシチジンなどが挙げられる。ヌクレオシド類縁体は、本明細書に記載する任意の普遍塩基を含むものであり得る。
【００４９】
用語「生物体」は、本明細書において、複製可能であり、配列決定の対象となる核酸を含む、任意の生体的（ｌｉｖｉｎｇ）または非生体的正体を示すために用いる。これには、プラスミド；ウイルス；原核生物、古細菌および真核生物の細胞、細胞株、真菌、原生動物、植物、動物などが含まれる。
【００５０】
プローブおよび鋳型ポリヌクレオチドの突出した鎖に関する「完璧にマッチングした二本鎖」は、一方の突出した鎖が他方と二本鎖構造を、該二本鎖構造内の各ヌクレオシドが、対向する鎖上のヌクレオシドとワトソン−クリック塩基対合を行なうように形成することを意味する。該用語はまた、ヌクレオシド類縁体の対合（例えば、デオキシイノシン、ヌクレオシドと２−アミノプリン塩基となど）を包含し、これは、プローブの縮重を低減させるために使用され得る（かかる対合が水素結合の形成を伴うものであってもそうでなくても）。
【００５１】
用語「複数」は、１つより多いことを意味する。
【００５２】
用語「多型」は、当該技術分野におけるその通常の意味で示され、同じ種の個体間でのゲノム配列における差をいう。「一塩基多型」（ＳＮＰ）は、単一の位置における多型をいう。
【００５３】
「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオシド間結合によって連結されたヌクレオシド（デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシドまたはその類縁体を含む）の線状ポリマーをいう。典型的には、ポリヌクレオチドは少なくとも３個のヌクレオシドを含む。本発明のある特定の実施形態において、伸長プローブ内の１個以上のヌクレオシドは普遍塩基を含む。通常、オリゴヌクレオチドは、大きさが数個のモノマー単位（例えば、３〜４個）から数百個のモノマー単位の範囲に及ぶ。オリゴヌクレオチドなどのポリヌクレオチドが「ＡＴＧＣＣＴＧ」などの一列の文字で表される場合はいつでも、特に記載のない限り、ヌクレオチドは、左から右に向かって５’→３’の順であること、および「Ａ」はデオキシアデノシンを表し、「Ｃ」はデオキシシチジンを表し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを表し、「Ｔ」はチミジンを表すことは理解されよう。Ａ、Ｃ、ＧおよびＴの文字は、当該技術分野において標準的であるように、塩基自体、ヌクレオシドまたは該塩基を含むヌクレオチドをいうために使用され得る。
【００５４】
天然に存在するポリヌクレオチドでは、ヌクレオシド間結合は、典型的にはホスホジエステル結合であり、サブユニットは「ヌクレオチド」とよばれる。しかしながら、ホスホロチオレート結合などの他のヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドプローブが、本発明のある特定の実施形態において使用される。非ホスホジエステル結合を有するかかるオリゴヌクレオチドプローブを構成するサブユニットの１つ以上は、リン酸基を含むものであり得ることは認識されよう。ヌクレオチドのかかる類縁体は、本明細書で用いる用語「ヌクレオチド」の範囲に含まれるとみなし、ホスホジエステル結合でない１個以上のヌクレオシド間結合を含む核酸もやはり、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」などとよばれる。他の実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブなどのポリヌクレオチドは、ＡＰエンドヌクレアーゼ感受性部位を含有する連結部を含む。例えば、オリゴヌクレオチドプローブは、無塩基残基、ＤＮＡグリコシラーゼによる除去のための基質である損傷塩基を含有する残基、またはＡＰエンドヌクレアーゼによる切断のための基質である別の残基または連結部を含有するものであり得る。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは、二糖ヌクレオシドを含有するものである。
【００５５】
用語「プライマー」は、短鎖ポリヌクレオチドをいい、典型的には、約１０〜１００ヌクレオチド長であり、標的ポリヌクレオチド、すなわち「鋳型」に、該標的とハイブリダイズすることにより結合するものである。プライマーは、好ましくは、標的に相補的なポリヌクレオチドの鋳型指向型合成（これは、適切な酵素（１種類または複数種）、補因子、基質、例えば、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドなどの存在下で行なわれ得る）の開始点を提供するものである。プライマーは、典型的には、伸長が行なわれ得る起点となる末端を提供する。ＤＮＡポリメラーゼなどのポリメラーゼ酵素によって触媒される合成のためのプライマーの場合（例えば、「合成による配列決定」、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）  増幅などにおいて）、プライマーは、典型的には、遊離３’ＯＨ基を有するものであるか、またはこれを有するように修飾されたものであり得る。典型的には、ＰＣＲ反応では、増幅される領域の境界を定める１対のプライマー（第１および第２の増幅プライマー）、例えば、「上流」（または「フォワード」）プライマーおよび「下流」（または「リバース」）  プライマーが使用される。伸長、ライゲーション（および任意選択で、切断）の連続的サイクルによる合成のためのプライマーの場合、プライマー典型的には、ＤＮＡリガーゼの基質としての機能を果たす遊離５’リン酸基または３’ＯＨ基を有するものであるか、またはこれらを有するように修飾されたものであり得る。
【００５６】
本明細書で用いる場合、「プローブファミリー」は、その各々が同じ標識を含む一群のプローブをいう。
【００５７】
本明細書で用いる場合、ポリヌクレオチドに関する「配列の決定）」、「ヌクレオチド配列を決定すること」、「配列決定」などの用語は、ポリヌクレオチドの部分配列ならびに完全な配列の情報の決定を含む。すなわち、該用語は、配列の比較、フィンガープリンティングなどのレベルの標的ポリヌクレオチドに関する情報、ならびに同定という表示（ｅｘｐｒｅｓｓ）および目的の領域内の標的ポリヌクレオチド各ヌクレオシドの順序を含む。本発明のある特定の実施形態において、「配列の決定」は、単一のヌクレオチドを同定することを含み、一方、他の実施形態においては、１個より多くのヌクレオチドが同定される。本発明のある特定の実施形態において、それ自体では１サイクルにおいて任意のヌクレオチドを同定するのに不充分な配列情報が収集される。ヌクレオシド、ヌクレオチドおよび／または塩基の同定は、本明細書において等価とみなす。ポリヌクレオチドにおいて配列決定を行なうことにより、典型的には、完璧に相補的（１００％相補的）なポリヌクレオチドの配列に関して等価な情報がもたらされ、したがって、完璧に相補的なポリヌクレオチドにおいて直接行なわれる配列決定と等価であることに注意されたい。
【００５８】
「配列決定反応」は、本明細書で用いる場合、伸長、ライゲーションおよび検出の１組のサイクルをいう。伸長された二本鎖が鋳型から除去され、第２の組のサイクルが該鋳型において行なわれる場合、各組みのサイクルは、独立した配列決定反応とみなすが、得られる配列情報を組み合わせて単一の配列を生成させ得る。
【００５９】
「半固形」は、本明細書で用いる場合、固形および液状の両方の成分を有し、液状成分が固形マトリックス要素間の細孔、空間または他の隙間を占めている圧縮性のマトリックスをいう。例示的な半固形マトリックスとしては、ポリアクリルアミド、セルロース、ポリアミド（ナイロン）、および架橋アガロース、デキストランおよびポリエチレングリコールで構成されたマトリックスが挙げられる。半固相支持体は、該半固相支持体を支持する第２の支持体、例えば、実質的に平面状で剛性の支持体（基材ともいう）上に設けられたものであってもよい。
【００６０】
「支持体」は、本明細書で用いる場合、その上面または内部に核酸分子、微粒子などが固定化され得るマトリックス、すなわち、これらが互いに対して自由に拡散または移動することが広くまたは全体的に妨げられるように、これらが共有結合または非共有結合され得るか、またはその内部もしくは上面にこれらが部分的または完全に包埋され得るマトリックスをいう。
【００６１】
「トリガー残基」は、核酸内に存在する場合、それ以外は同一であるトリガー残基を含有しない核酸のおそらくの場合よりも、該核酸を、切断剤（例えば、酵素、硝酸銀など）または薬剤の組合せによる切断（例えば、核酸主鎖の切断）に対してより感受性にする残基、および／または該核酸をかかる切断に対してより感受性にする残基を生成させる修飾に対して感受性である残基である。したがって、核酸内のトリガー残基の存在は、該核酸内に切れやすい連結の存在をもたらし得る。例えば、無塩基残基は、核酸内の無塩基残基の存在によって該核酸がＡＰエンドヌクレアーゼなどの酵素による切断に対して感受性となるため、トリガー残基である。損傷塩基を含有するヌクレオシドは、核酸内に損傷塩基を含むヌクレオシドの存在によってもまた、例えば、ＤＮＡグリコシラーゼによる損傷塩基の除去後、該核酸がＡＰエンドヌクレアーゼなどの酵素による切断に対してより感受性となるため、トリガー残基である。切断部位は、トリガー残基と隣接残基間の結合部分であり得るか、またはトリガー残基から除去される１つ以上の残基である結合部分であり得る。例えば、デオキシイノシンは、核酸内のデオキシイノシンの存在によって、該核酸が大腸菌エンドヌクレアーゼＶおよびその類縁体による切断に対してより感受性となるため、トリガー残基である。かかる酵素は、デオキシイノシンに対して３’側の第２のホスホジエステル結合を切断する。本明細書に開示された任意のプローブは、１つ以上のトリガー残基を含有し得る。トリガー残基は、リボースまたはデオキシリボース部分を含むものであり得るが、そうである必要はない。好ましくは、切断剤は、トリガー残基の非存在下では実質的に核酸を切断しないが、同じ条件下（該条件は、該核酸が切断剤に対して感受性となるように修正する薬剤の存在を含み得る）で、トリガー残基を含有する核酸に対して有意な切断活性を示すものである。例えば、好ましくは、切断剤が一方がトリガー残基を含有し、他方がトリガー残基を含有しない以外は長さと組成が同一である核酸を含有する組成物内に存在する場合、トリガー残基を含有する核酸が切断される尤度は、少なくとも：１０；２５；５０；１００；２５０；５００；１０００；２５００；５０００；１０，０００；２５，０００；５０，０００；１００，０００；２５０，０００；５００，０００；１，０００，０００またはそれより大きく、トリガー残基を含有しない核酸が切断される尤度と同定度に大きく、例えば、トリガー残基を含有する核酸の切断の尤度の、トリガー残基を含有しないがそれ以外は同一である核酸の切断の尤度に対する比は１０〜１０６または任意のその整数（ｉｎｔｅｇｒａｌ）部分的範囲である。この比は、トリガー残基の具体的な核酸および位置およびヌクレオチド状況に応じて異なり得ることは認識されよう。
【００６２】
好ましくは、トリガー残基を含有する核酸が、該核酸を切断剤による切断に対して感受性とするために修飾される必要がある場合、かかる修飾は、適当な修飾剤（１種類または複数種）の存在下で、容易に行なわれ、例えば、該修飾は、適度な収率および適度な時間行なわれる。例えば、本発明のある特定の実施形態において、トリガー残基を含有する核酸の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、少なくとも９０％またはより好ましくは少なくとも９５％が、例えば、２４時間以内に、好ましくは１２時間以内、より好ましくは１分未満〜４時間以内に修飾される。
【００６３】
さまざまな適当なトリガー残基および対応する切断試薬を本明細書において例示する。本明細書に記載のものと類似した活性を有する任意のトリガー残基および切断試薬が使用され得る。当業者なら、ある特定のトリガー残基および切断試薬組合せが本発明における使用に適しているか否か、例えば、切断の効率および速度、トリガー残基を含有する核酸の切断剤の選択性などが本発明における使用に適しているか否かを判定することができよう。「トリガー残基」は、単に制限酵素部位の一部を構成するヌクレオチドとは、トリガー残基が切断に対する感受性の増大を与える能力は、一般的に、トリガー残基が見出される特定の配列状況に有意に依存しないが、上記のように、該状況は修飾および／または切断に対する感受性に対し、ある程度の影響を及ぼし得るという点において区別されることに注意されたい。もちろん、その周囲のヌクレオチドに応じて、トリガー残基は、制限部位の一部を構成し得る。したがって、ほとんどの場合、切断剤は制限酵素ではないが、制限酵素であることと、非配列特異的切断可能性を有することの両方である酵素の使用は除外されない。
【００６４】
「普遍塩基」は、本明細書で用いる場合、天然に存在する核酸内に典型的に見られる塩基の１つより多くと「対合し」得、したがって、二本鎖内のかかる天然に存在する塩基に代用され得る塩基である。該塩基は、天然に存在する塩基の各々と対合できるものである必要はない。例えば、ある特定の塩基は、プリンのみと、もしくはこれと選択的に、またはピリミジンのみと、もしくはこれと選択的に対合する。ある特定の好ましい普遍塩基（完全普遍塩基）は、天然に存在する核酸内に典型的に見られる任意の塩基と対合し得るものであり、したがって、二本鎖内の任意のこれらの塩基に代用され得る塩基である。該塩基は、天然に存在する塩基の各々と等しく対合できるものである必要はない。プローブミックスが、天然に存在するヌクレオチドのすべてとは対合しない普遍塩基を（１つ以上の位置に）含むプローブを含有する場合、該普遍塩基の少なくとも１つがＡと対合するか、該普遍塩基の少なくとも１つがＧと対合するか、該普遍塩基の少なくとも１つがＣと対合するか、該普遍塩基の少なくとも１つがＴと対合するように、その特定のプローブ内の該位置に２つ以上の普遍塩基を用いることが望ましいことがあり得る。
【００６５】
いくつかの普遍塩基が、当該技術分野で知られており、限定されないが、ヒポキサンチン、３−ニトロピロール、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、４−ニトロベンズイミダゾール、５−ニトロインダゾール、８−アザ−７−デアザアデニン、６Ｈ，８Ｈ−３，４−ジヒドロピリミド［４，５−ｃ］［ｌ，２］オキサジン−７−オン（Ｐ．Ｋｏｎｇ  Ｔｈｏｏ  Ｌｉｎ．およびＤ．Ｍ．Ｂｒｏｗｎ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．，１９８９，  １７，１０３７３−１０３８３）、２−アミノ−６−メトキシアミノプリン（Ｄ．Ｍ．ＢｒｏｗｎおよびＰ．Ｋｏｎｇ  Ｔｈｏｏ  Ｌｉｎ，  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９１，２１６，１２９−１３９）などが挙げられる。ヒポキサンチンは、好ましい完全普遍塩基の一例である。ヒポキサンチンを含むヌクレオシドとしては、限定されないが、イノシン、イソイノシン、２’−デオキシイノシンおよび７−デアザ−２’−デオキシイノシン、２−アザ−２’デオキシイノシンが挙げられる。
【００６６】
さらなる普遍塩基が当該技術分野で知られており、例えば、Ｌｏａｋｅｓ，  Ｄ．およびＢｒｏｗｎ，  Ｄ．Ｍ．，  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４０３９−４０４３，  １９９４；Ｏｈｔｓｕｋａ，  Ｅ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６０（５）：２６０５−２６０８，１９８５；Ｌｉｎ，  Ｐ．Ｋ．Ｔ．およびＢｒｏｗｎ，  Ｄ．Ｍ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０（１９）：５１４９−５１５２，１９９２；Ｎｉｃｈｏｌｓ，  Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６９（６４８０）：４９２−４９３，１９９４；Ｒａｈｍｏｎ，  Ｍ．Ｓ．およびＨｕｍａｙｕｎ，  Ｎ．Ｚ．，  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３７７（２）：２６３−８，１９９７；Ｂｅｒｇｅｒ，  Ｍ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２８（１５）：２９１１−２９１４，２０００；Ａｍｏｓｏｖａ，  Ｏ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１０）：１９３０−１９３４，  １９９７；ならびにＬｏａｋｅｓ，  Ｄ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９（１２）：２４３７−４７，２００１の関連部分に記載されている。普遍塩基は、対向する位置にある塩基と水素結合を形成し得るが、そうである必要はない。普遍塩基は、ワトソン−クリックまたは非ワトソン−クリック相互作用（例えば、フーグスティーン相互作用）により水素結合を形成し得る。
【００６７】
本発明のある特定の実施形態において、普遍塩基を含むオリゴヌクレオチドプローブを使用するのではなく、無塩基残基を含むオリゴヌクレオチドプローブが使用される。無塩基残基は、任意の４つの天然に存在するヌクレオチドと対向する位置を占めることができ、したがって、普遍塩基を含むヌクレオチドと同じ機能を果たし得る。本発明のある一部の実施形態において、無塩基残基に隣接する連結部は、ＡＰエンドヌクレアーゼによって切断されるが、無塩基残基はまた、他の切れやすい連結（例えば、ホスホロチオレート）が存在し、他の切断試薬が使用される実施形態においても、本明細書に記載のように有用である（すなわち、普遍塩基の機能を果たすため）。
【００６８】
本発明のある特定の実施形態の詳細な説明
Ａ．伸長、ライゲーションおよび切断の連続的サイクルによる配列決定
本発明の一態様の全体的なスキームを、図１Ａに図式的に示すが、これは、一般的に、米国特許第５，７４０，３４１号および同第６，３０６，５９７号（ともにＭａｃｅｖｉｃｚに対して発行）に教示された方法と類似する。便宜上の目的のため、これらの特許を本明細書において集合的に「Ｍａｃｅｖｉｃｚ」という。特に、Ｍａｃｅｖｉｃｚには、ポリヌクレオチド内のヌクレオチドの配列を同定するための方法が教示されており、該方法は、（ａ）  プローブを自身にライゲートさせ、伸長された二本鎖を形成することにより、初期オリゴヌクレオチドを、ポリヌクレオチドオリゴヌクレオチドに沿って伸長させる工程；（ｂ）  該ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドを同定する工程；および（ｃ）  該ヌクレオチドの配列が決定されるまで工程（ａ）および（ｂ）を反復する工程を含む。
【００６９】
Ｍａｃｅｖｉｃｚには、さらに、鋳型ポリヌクレオチド内のヌクレオチドの配列決定するための方法が教示されており、該方法は、（ａ）鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせた初期オリゴヌクレオチドプローブを含むプローブ−鋳型二本鎖提供する工程（ここで、前記プローブは伸長可能なプローブ末端を有する）；（ｂ）伸長オリゴヌクレオチドプローブを前記伸長可能なプローブ末端にライゲートさせ、伸長されたオリゴヌクレオチドプローブを含む伸長された二本鎖を形成する工程；（ｃ）伸長された二本鎖において、（１）  ライゲートされたばかりの伸長プローブに相補的であるか、もしくは（２）  伸長されたオリゴヌクレオチドプローブのすぐ下流にある鋳型ポリヌクレオチド内のヌクレオチド残基であるかのいずれかである鋳型ポリヌクレオチド内の少なくとも１つのヌクレオチドを同定する工程；（ｄ）もし伸長可能なプローブ末端が既に存在しない場合は、生成される末端が最後の伸長プローブがライゲートされた末端と異なるように、伸長可能なプローブ末端を伸長されたプローブ上に生成させる工程；ならびに（ｅ）標的ポリヌクレオチド内のヌクレオチドの配列が決定されるまで工程（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を反復する工程を含む。これらの方法のある特定の実施形態において、各伸長プローブは、連鎖停止部分を、初期オリゴヌクレオチドプローブに対して遠位の末端に有する。ある特定の実施形態において、再生させる工程は、伸長されたオリゴヌクレオチドプローブ内の化学的に切れやすいヌクレオシド間結合を切断することを含む。
【００７０】
図１Ａを参照すると、未知配列のポリヌクレオチド領域５０と結合領域４０とを含むポリヌクレオチド鋳型２０は、支持体１０に結合されている。結合領域４０の遠位端のヌクレオチド４１およびポリヌクレオチド領域５０の近位端のヌクレオチド５１は、互いに隣接している。結合領域４０とハイブリダイズし、結合領域４０内のある位置に二本鎖を形成する初期オリゴヌクレオチド３０が提供される。初期オリゴヌクレオチド３０はまた、本明細書において「プライマー」ともいい、結合領域４０は、「プライマー結合領域」ということがある。二本鎖は、完璧にマッチングした二本鎖であり得るが、そうである必要はない。初期オリゴヌクレオチドは伸長可能な末端３１を有する。図１Ａにおいて、初期オリゴヌクレオチドは結合領域に、伸長可能な末端３１がヌクレオチド４１と反対の位置に位置するように結合する。しかしながら、初期オリゴヌクレオチドは、結合領域内の別の場所に結合し得、これは以下にさらに論考する。長さＮの伸長オリゴヌクレオチドプローブ６０は、初期オリゴヌクレオチドに隣接する鋳型にハイブリダイズされる。伸長オリゴヌクレオチドプローブの末端ヌクレオチド６１は、伸長可能な末端３１にライゲートされる。
【００７１】
末端ヌクレオチド６１は、ポリヌクレオチド領域５０内の第１の未知ヌクレオチドに相補的である。したがって、末端ヌクレオチド６１の正体によりヌクレオチド５１の正体が特定される。好ましくは、ヌクレオチド５１は、末端ヌクレオチド６１としてＡ、Ｇ、ＣまたはＴを有することがわかっている伸長プローブと会合した標識（図示せず）検出することをにより同定される。標識は、検出後に除去される。図２は、異なる標識（例えば、異なる色のフルオロフォア）を、異なる３’末端ヌクレオチドを有する伸長プローブに割り当てるためのスキームを示す。
【００７２】
ライゲーションおよび検出の後、もしプローブ６０が既にかかる末端を有しない場合は、伸長可能なプローブ末端を伸長プローブ６０上に生成させる。第２の伸長プローブ７０（好ましくは、これも長さＮである）を伸長プローブ６０に隣接する鋳型にアニーリングさせ、プローブ６０の伸長可能な末端にライゲートさせる。伸長プローブ７０の末端ヌクレオチド７１の正体により、対向する位置にあるポリヌクレオチド５０内のヌクレオチド５２の正体が特定される。したがって、末端ヌクレオチド７１は伸長プローブの「配列決定部分」を構成し、これは、プローブの該部分は、そのハイブリダイゼーション特異性が鋳型内の１つ以上のヌクレオチドの正体を決定する基準として利用されることを意味することは認識されよう。典型的には、伸長プローブ内のさらなるヌクレオチドが鋳型とハイブリダイズするが、プローブ内のその正体がある特定の標識と会合しているヌクレオチドのみが、鋳型内のヌクレオチドを同定するために利用される。
【００７３】
本発明の好ましい実施形態において、伸長可能な末端の生成は、ヌクレオシド間結合の切断を伴い、これは以下にさらに記載する。好ましくは、切断により標識もまた除去される。切断により、いくつかのヌクレオチドＭが伸長プローブから除去される（図示せず）。したがって、二本鎖は、各サイクルにおいてＮ−Ｍヌクレオチドによって伸長され、鋳型内のＮ−Ｍの区間内に位置するヌクレオチドが同定される。多コピーの所与の鋳型は、典型的には単一の支持体に結合され、配列決定反応が、これらの鋳型において同時に行なわれることを理解されたい。
【００７４】
Ｍａｃｅｖｉｃｚには、オリゴヌクレオチドプローブは、一般的に、初期オリゴヌクレオチドまたは伸長された二本鎖にライゲートされ、次の伸長サイクルの伸長された二本鎖を生成させ得るものであるべきであること；ライゲーションは、プローブがライゲーション前に鋳型と二本鎖を形成すべきであるという点で、鋳型駆動型べきであること；プローブは、単一の伸長サイクルにおける同じ鋳型での多重プローブライゲーションを抑制するためのブロッキング部分を有するものであるべきこと；プローブは、ライゲーション後に伸長可能な末端を再生させるために処理または修飾され得るものであるべきこと；およびプローブは、成功裏のライゲーション後に、鋳型に関する配列情報の取得を可能にするシグナル伝達部分（すなわち、検出可能な部分）  を有するものであるべきことが教示されている。
【００７５】
Ｍａｃｅｖｉｃｚには、一部の特定の好適な初期オリゴヌクレオチド、伸長オリゴヌクレオチドプローブ、鋳型、結合部位の特性、およびかかる成分を剛性、設計、作製または入手するための種々の方法が教示されている。Ｍａｃｅｖｉｃｚには、さらに、一部の特定の好適なリガーゼ、ライゲーション条件およびさまざまな適当な標識が教示されている。Ｍａｃｅｖｉｃｚにはまた、標識された連鎖停止ヌクレオチドを新たにライゲートされた伸長プローブに付加させるためにポリメラーゼ伸長を用いる同定の代替方法が教示されている。付加されたヌクレオチドの正体により、反対の位置に位置する鋳型内のヌクレオチドが特定される。
【００７６】
当業者には認識されるように、鋳型、初期オリゴヌクレオチド、伸長プローブ、プライマーなどに対する言及は、一般的に、単一の分子ではなく、関連する領域内で実質的に同一である核酸分子の集団またはプールを意味する。したがって、例えば、「鋳型」は、一般的に、複数の実質的に同一の鋳型分子を意味し、「プローブ」は、一般的に、複数の実質的に同一のプローブ分子を意味するなどである。１つ以上の位置で縮重しているプローブの場合、ある特定のプローブを含むプローブ分子の配列は、縮重位置において異なる、すなわち、ある特定のプローブを構成するプローブ分子の配列は、非縮重位置（１つまたは複数）においてのみ、実質的に同一であり得ることは認識されよう。記載の目的のため、単数形は、単一の分子群および実質的に同一の分子の集団を含むと理解されたい。単一の核酸分子（すなわち、１つの分子）に言及することが意図される場合、用語「鋳型分子」、「プローブ分子」、「プライマー分子」などを用いる。ある特定の状況において、実質的に同一の核酸分子の一集団の複数の性質は、明白に表示する。
【００７７】
実質的に同一の核酸分子の集団は、任意のさまざまな既知の方法、例えば、化学合成、細胞内での生物学的合成、１種類以上の出発核酸分子からの酵素的インビトロ増幅などを用いて入手および作製され得る。例えば、当該技術分野でよく知られた方法を用い、目的の核酸を、適当な発現ベクター（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡプラスミド）内に挿入し、次いで、細胞（例えば、細菌細胞）内に導入して複製させることによりクローニングされ得る。次いで、目的の核酸コピーを含有するプラスミドＤＮＡまたはＲＮＡを該細胞から単離する。ウイルス、細胞などから単離されたゲノムＤＮＡ、またはｍＲＮＡ）の逆転写により作製されたｃＤＮＡもまた、クローニングまたはインビトロ増幅の中間工程なしで、実質的に同一の核酸分子の集団（例えば、その配列が決定される鋳型ポリヌクレオチド）の供給源となり得るが、一般的には、かかる中間工程を行なうことが好ましい。
【００７８】
集団のメンバーは、１００％同一である必要はなく、例えば、ある特定数の「エラー」が、合成過程中に起こり得ることは理解されよう。好ましくは、集団のメンバーの少なくとも５０％が、参照核酸分子（すなわち、配列比較のための基準として用いられる規定配列の分子）と少なくとも９０％、またはより好ましくは少なくとも９５％同一である。より好ましくは、集団のメンバーの少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％またはそれ以上が、参照核酸分子と少なくとも９０％、またはより好ましくは少なくとも９５％同一であるか、さらにより好ましくは少なくとも９９％同一である。好ましくは、参照核酸分子に対して少なくとも９５％またはより好ましくは少なくとも９９％の同一性割合の集団のメンバーは、少なくとも９８％、９９％、９９．９％またはそれ以上である。同一性割合は、２つの最適にアライメントされた配列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、ＵまたはＩ）が両方の配列に存在する位置の数を測定してマッチングした位置の数を得、マッチングした位置の数を位置の合計数で除算し、結果に１００を積算して配列の同一性割合を得ることによりコンピュータ計算され得る。ある特定の状況において、鋳型、プローブ、プライマーなどの核酸分子は、より大きな核酸分子（これはまた、鋳型、プローブまたはプライマーの機能を果たさない部分も含有する）の一部分であり得ることは認識されよう。その場合、個々の集団のメンバーは、該部分に関して実質的に同一である必要はない。
【００７９】
Ｍａｃｅｖｉｃｚには、図１Ａに示すような、鋳型がビーズなどの支持体に結合され、伸長が、支持体の遠位に位置する鋳型の末端に向かって進行する方法が教示されている。したがって、結合領域は未知配列よりも支持体の近くに位置し、伸長された二本鎖は、支持体から離れる方法に成長する。しかしながら、本発明者らは、予期に反して、該方法は、結合領域が支持体の遠位に鋳型の末端に位置し、伸長が支持体に向かって内方に進行する別のアプローチを用いて好都合に行なわれ得ることを見出した。この実施形態を図１Ｂに示す。図において、種々の要素は図１Ａと同様に番号付けしている。本発明者らは、鋳型の遠位端から支持体に向かう「内方への」配列決定により、優れた結果が得られることを調べた。特に、鋳型の遠位端からビーズなどの支持体に向かう配列決定により、支持体から外方への配列決定よりも高いライゲーション効率がもたらされる。
【００８０】
Ｍａｃｅｖｉｃｚによってさらに教示されているように、好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブは鋳型に、所定の長さの可能な全ての配列のオリゴヌクレオチドを含む混合物として適用する。例えば、構造ＮＮＮＮＮＮ（これは、（Ｎ）ｋ（式中、ｋ＝６）とも表示され得る）の６ヌクレオチド長（六量体）の可能な全ての配列を含有するプローブの混合物は、４６（４０９６）のプローブ種を含有し得る。一般的に、プローブは、構造Ｘ（Ｎ）ｋＮ＊（式中、Ｎは任意のヌクレオチドを表し、ｋは１〜１００であり、＊は標識を表し、Ｘは、その正体が標識に対応するヌクレオチドを表す）のものである。ある特定の実施形態において、ｋは、１〜１００、１〜５０、１〜３０、１〜２０、例えば、４〜１０である。該ヌクレオチドの１つ以上は普遍塩基を含むものであり得る。一般的に、プローブは、Ｎで表される位置において４重に縮重しているか、またはＮで表される１つ以上の位置に縮重低減性ヌクレオチドを含む。所望の場合は、混合物を、プローブ（「ストリンジェンシー類型」）の部分集団に分けてもよい。それらの相補配列完璧にマッチングした二本鎖は、類似した安定性または結合自由エネルギーを有する。部分集団は、Ｍａｃｅｖｉｃｚに教示されているように、独立したハイブリダイゼーション反応に使用され得る。
【００８１】
プローブ混合物の複雑度（ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ）（すなわち、異なる配列の数）は、いくつかの方法によって、例えば、いわゆる縮重低減性のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを用いることにより低減させ得る。例えば、８ヌクレオチドの可能な全ての配列を含有するプローブのライブラリーは、４８のプローブを含み得る。プローブの数は、２つの位置に普遍塩基を用いることにより、例えば、長さなどの八量体ライブラリーの種々の望ましい特徴を維持したまま４６に低減させ得る。本発明は、任意の上記または上記参考文献に記載の普遍塩基の使用を包含する。
【００８２】
実施形態に応じて、伸長された二本鎖または初期オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドプローブによって５’→３’方向または３’→５’方向のいずれかに伸長され得、これは以下にさらに記載する。一般的に、オリゴヌクレオチドプローブは、鋳型と完璧にマッチングした二本鎖を形成する必要はないが、かかる結合が好ましいことがあり得る。鋳型内の単一のヌクレオチドが各伸長サイクルで同定される実施形態では、完璧な塩基対合だけが、その特定のヌクレオチドを同定するために必要とされる。例えば、オリゴヌクレオチドプローブが伸長された二本鎖に酵素的にライゲートされる実施形態では、完璧な塩基対合、すなわち適正なワトソン−クリック塩基対合が、ライゲートされるプローブの末端ヌクレオチドと、鋳型内のその相補配列との間に必要とされる。一般的に、かかる実施形態では、プローブの残余ヌクレオチドは、次のライゲーションが鋳型に沿った所定の部位または塩基数で起こることを確実にする「スペーサー」としての機能を果たす。すなわち、その対合またはその欠如は、さらなる配列情報を提供しない。同様に、塩基同定をポリメラーゼ伸長に依存する実施形態では、プローブは、主に、スペーサーとしての機能を果たすため、鋳型への特異的ハイブリダイゼーションは不可欠ではない。
【００８３】
上記の方法により、配列の部分決定、すなわち、鋳型内で互いに間隔があいている個々のヌクレオチドの同定が可能になる、本発明の好ましい実施形態において、より完全な情報を取得するため、各反応で異なる初期オリゴヌクレオチドｉが使用される複数の反応が行なわれる。初期オリゴヌクレオチドｉは、結合領域の異なる部分に結合する。好ましくは、初期オリゴヌクレオチドは、結合領域にハイブリダイズされるとき、異なる初期オリゴヌクレオチドのかかる伸長可能な末端が互いに１ヌクレオチドずれた位置に結合する。例えば、図３に示すように、配列決定反応１．．．Ｎが行なわれる。初期オリゴヌクレオチドｉｉ．．．ｉｎは同じ長さを有し、その末端ヌクレオチド３１、３２、３３などが、結合領域４０内の連続的な隣接する位置４１、４２、４３などにハイブリダイズするように結合する。したがって、伸長プローブｅ１．．．ｅｎは、鋳型の連続的な隣接する領域に結合し、初期オリゴヌクレオチドの伸長可能な末端にライゲートされる。ｉπにライゲートされたプローブｅｎの末端ヌクレオチド６１は、ポリヌクレオチド領域５０のヌクレオチド５５、すなわち、鋳型内の第１の未知ポリヌクレオチドに相補的である。伸長、ライゲーションおよび検出の第２のサイクルでは、プローブｅ１２の末端ヌクレオチド７１は、ポリヌクレオチド領域５０のヌクレオチド５６、すなわち、未知配列の第２のヌクレオチドに相補的である。同様に、初期オリゴヌクレオチドｉ２、ｉ３、ｉ４などにより初期化された二本鎖にライゲートされた伸長プローブの末端ヌクレオチドは、未知配列５０の第３、第４および第５のヌクレオチドに相補的である。初期オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチド領域５０に対し、進行的に近づくのではなく進行的にさらに離れる領域に結合され得ることは認識されよう。
【００８４】
非伸長プローブの末端ヌクレオチドのスペーサー機能により、初期オリゴヌクレオチドが結合する位置から相当除去される鋳型内の位置の配列情報の取得が、相応する多数回のサイクルが任意の所与の鋳型において行なわれることを要することなく可能になる。例えば、長さＮのプローブのライゲーションの連続的サイクル後、単一の末端ヌクレオチドを伸長プローブから除去するための切断によって、Ｎ−１ヌクレオチド区間のヌクレオチドが連続回数で同定され得る。例えば、鋳型内の１、Ｎ、２Ｎ−１、３Ｎ−２、４Ｎ−３および５Ｎ−４位のヌクレオチドが、６サイクルで同定され得、この場合、鋳型内の１位のヌクレオチドは、鋳型への初期オリゴヌクレオチドの結合によって形成される二本鎖内の伸長可能なプローブ末端にライゲートされるヌクレオチドと反対のヌクレオチドである。同様に、切断により２つのヌクレオチドが長さＮの伸長プローブから除去される場合、互いにＮ−２ヌクレオチド離れた位置のヌクレオチドが連続回数で同定され得る。例えば、鋳型内の１、Ｎ−１、２Ｎ−３、３Ｎ−５、４Ｎ−７位のヌクレオチドが６サイクルで同定され得る。したがって、プローブが８ヌクレオチド長であり、２個のヌクレオチドが各サイクルで除去される場合、１位、７、１３、１９および２５位のヌクレオチドが同定される。したがって、鋳型内の第１のヌクレオチドからＸ離れたヌクレオチドを同定するのに必要とされるサイクル数は、およそＸではなく、およそＸ／Ｍ（式中、Ｍは、切断後に残存する伸長プローブの長さである）である。
【００８５】
例えば、図３Ｂに示す概略は、鋳型を６塩基ごとに読み出されるように設計された伸長プローブを用いた伸長、ライゲーションおよび切断方法の使用の最終結果を示す。結合領域内でずれる位置に結合する初期化６ヌクレオチドを用いて鋳型を逐次ストリッピングおよび配列決定し、結果を組み合わせることにより、すべての鋳型塩基が、規定された長さにわたって解明される。例えば、１０回の逐次ライゲーションが、６回の反応の各々で行なわれる場合、得られる読出し長さは６０個の連続塩基対であるが、１５回の逐次ライゲーションが各反応で行なわれる場合、得られる読出し長さは９０個の連続塩基対である。
【００８６】
なんら理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、このアプローチとは対照的に、合成方法によるほとんどの逐次配列決定では、長い読出し長さに対する可能性を最終的に制限するエラー蓄積に取り組んでいることを提案する。ある特定の本明細書に記載の方法の好都合な特徴は、所与のサイクル数（ｙ）後、ｎ＊ｙ−（ｎ−ｌ）番目の塩基に達する（例えば、１５サイクル後に前述の例において７１番目の塩基、または切断部位の３’側で６塩基のプローブを用いて２０サイクル後に１１５番目の塩基）ように、第ｎ塩基ごと（プローブ内の切断可能な部分の位置による）の同定を可能にすることである。ｎ−１、ｎ−２などの位置の初期オリゴヌクレオチドを「リセット」できることは、鋳型からの伸長鎖のストリッピングおよび新たな初期オリゴヌクレオチドのハイブリダイズのプロセスにより、バックグラウンドシグナルがゼロに有効にリセットされるため、所与の読出し長さのための逐次エラー蓄積（位相の散逸または自然減（ａｔｔｒｉｔｉｏｎ）により）が大いに最小化される。例えば、合成によるポリメラーゼ系配列決定と、本明細書に記載のライゲーション系アプローチを比較すると、各伸長サイクルでの信号対雑音比が９９：１である場合、１００サイクル後の比は、ポリメラーゼ系アプローチで３７：６３であり、リガーゼ系の方法では８５：１５である。リガーゼ系の方法での最終結果は、ポリメラーゼ系の方法よりも読出し長さにおいて大きく増大する。
【００８７】
鋳型内の先行する各ヌクレオチドのためのサイクルを行なう必要がある場合に必要とされ得るよりも少ないサイクルを用いてヌクレオチドを同定できることは、いくつかの理由で重要である。特に、該方法において各工程が１００％効率で行なわれることはあり得ない。例えば、一部の鋳型は、伸長プローブに成功裏にライゲートされないことがあり得、一部の伸長プローブは切断されないことがあり得るなどである。したがって、各サイクルにおいて、異なる鋳型コピーにおいて行なわれる反応は、進行的に位相の散逸となり、有用で正確な情報が取得され得る鋳型の数が低減される。したがって、初期オリゴヌクレオチドの伸長可能な末端から数個より多く離れた位置に位置するヌクレオチドの読み出しに必要とされサイクル数を最小限にすることは特に望ましい。しかしながら、伸長プローブの長さを増大させることは、潜在的にプローブ混合物のより大きな複雑度をもたらし、これは、個々の各プローブ配列の有効濃度を低減させる。本明細書に記載のように、縮重低減性ヌクレオチドは、複雑度を低減させるために使用され得るが、ハイブリダイゼーション強度の減少および／またはライゲーション効率の減少をもたらし得る。本発明者らは、結果を最適化するために、これらの競合する要素を均衡させる必要性を認識した。したがって、本発明の好ましい実施形態において、８ヌクレオチド長の伸長プローブを使用し、選択した位置に縮重低減性ヌクレオチドを用いる。また、本発明者らは、適切な切れやすい連結ならびに切断条件ならびに切断工程の効率（すなわち、各切断工程において成功裏に切断された連結の割合）およびその適切な連結に対する特異性を最適化するタイミングを選択することの重要性を認識した。
【００８８】
Ｂ．オリゴヌクレオチド伸長プローブ設計
Ｍａｃｅｖｉｃｚには、縮重低減性ヌクレオシド類縁体が、オリゴヌクレオチド伸長プローブに使用され得ることは記載されているが、かかる残基を含む残基を伸長プローブ内に含めるのに特に望ましい具体的な位置は教示されておらず、縮重低減性ヌクレオシドが組み込まれた具体的なプローブ構造（すなわち、配列）は教示されていない。本発明者らは、縮重低減性ヌクレオシド（例えば、普遍塩基を含むヌクレオシド）を、オリゴヌクレオチド伸長プローブ内の特定の位置に特定の数で利用することが特に好都合であり得ると認識した。例えば、本発明のある特定の実施形態において、６位以降の（Ｘから数えて）のヌクレオチドの大部分または全部が普遍塩基を含む。例えば、６位以降のヌクレオチド少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％が、普遍塩基を含有するものであり得る。ヌクレオチドは、すべてが同じ普遍塩基を含有するものである必要はない。本発明のある特定の実施形態において、ヒポキサンチンおよび／またはニトロ−インドールが普遍塩基として使用される。例えば、イノシンなどのヌクレオシドが使用され得る。
【００８９】
本発明者らは、優れた結果は、６ヌクレオチド長より大きく、プローブの近位末端から（ライゲートされるヌクレオチドから数えて）伸長可能なプローブ末端までの６位以降のヌクレオチドの１つ以上が縮重低減性ヌクレオチドである、例えば、普遍塩基を含む（すなわち、最も近位ヌクレオチドを１位とみなした場合、６位以降のヌクレオチドの１つ以上が普遍塩基を含む）、例えば、八量体プローブの場合は、６位以降のヌクレオチドの１、２または３個が普遍塩基を含む伸長プローブを用いて達成され得ると認識した。例えば、３’→５’方向における配列決定では、構造３’−ＸＮＮＮＮｓＩＮＩ−５’  を有するプローブが使用され得、式中、ＸおよびＮは任意のヌクレオチドを表し、「ｓ」は、切れやすい連結を表し、切断は３’末端から数えて第５と第６の間の残基で起こるようになっており、切れやすい連結と５’末端間の残基の少なくとも１つは、好ましくは、Ｘの正体に対応する標識を有する。別の設計は、３’−ＸＮＮＮＮｓＮＩＩ−５’  である。また別のプローブ設計は、３’−ＸＮＮＮＮｓＩＩＩ−５’  である。この設計により、中程度の複雑度を有する１０２４個の異なる種プローブ混合物がもたらされ、有意なアデニル化産物の形成を抑制するのに充分長く（実施例１参照）、切断後に残留する得られる伸長産物が非修飾ＤＮＡからなるものであり得るという利点を有する。欠点の１つは、このプローブがプライマーを一度に５塩基しか伸長させないことである。読出し長さは、伸長長さ×サイクル数の関数であるため、伸長長さにおける各追加の塩基は、読出し長さが１×サイクル数分増加する可能性を有する（例えば、２０  サイクルを用いる場合は２０塩基）。別のプローブ設計は、切断後に１つ以上イノシン（または他の普遍塩基）を伸長プローブの末端に残し、６塩基以上の長さの伸長された二本鎖を創製させるものである。例えば、プローブ３’−ＸＮＮＮＮＩｓＩＩ−５’により、二本鎖は一度に６塩基伸長され得、接合に５’イノシンが残る。これらの設計の各々において、切れやすい連結と５’末端間の残基の少なくとも１つは、好ましくは、Ｘの正体に対応する標識を有する。本発明のある特定の実施形態において、プローブの遠位末端から（ライゲートされるヌクレオチドと反対の末端から数えて）伸長可能なプローブ末端までの第３のヌクレオチドが普遍塩基を含む（すなわち、遠位末端を位置Ｋとみなした場合、位置Ｋ−２のヌクレオチドが普遍塩基を含む）。
【００９０】
本発明のある特定の実施形態において、ロックド核酸（ＬＮＡ）塩基が、初期オリゴヌクレオチドプローブ、伸長プローブまたは両方内の１つ以上の位置に使用される。ロックド核酸は、例えば、米国特許第６，２６８，４９０号；Ｋｏｓｈｋｉｎ，  ＡＡら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，  ５４：３６０７−３６３０，１９９８；Ｓｉｎｇｈ，  ＳＫら、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，４：４５５−４５６，１９９８に記載されている。ＬＮＡは、自動ＤＮＡ合成装置によって標準的なホスホロアミダイト化学反応を用いて合成され得、天然に存在するヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログもまた含有するオリゴヌクレオチド内に組み込まれ得る。これらもまた、以下に記載のものなどの標識を用いて合成され得る。
【００９１】
Ｃ．鋳型、ライブラリー、担体、ブロッカー、およびそれらの調製および使用方法
本発明は、核酸鋳型および担体を調製する種々の方法を提供する。本発明はまた、ライゲーションに基づく配列決定での使用、または他の目的のためのライブラリーも提供する。本発明はまた、ブロッカーオリゴヌクレオチド、ならびに他の目的でオリゴヌクレオチドのライゲーション、検出および開裂のサイクルを連続して行うことにより、配列決定においてそれらを使用する方法も提供する。
【００９２】
Ｍａｃｅｖｉｃｚには、複数の実質的に同一の鋳型分子を含む鋳型を最初に、例えば、慣用的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法のようなチューブまたは他の容器内で増幅によって合成する方法が教示されている。Ｍａｃｅｖｉｃｚには、増幅させた鋳型分子を、好ましくは、合成後に磁気微粒子（例えば、ビーズ）などの支持体に結合させることが教示されている。
【００９３】
本発明者らは、配列決定される鋳型は、望ましくは、支持体自体の上またはその内部で、例えば、１対の増幅プライマーの一方を、ＰＣＲ反応を行なう前に結合させる微粒子などの支持体または種々の半固相支持体材料ゲルマトリックスを用いることにより合成させるのがよいと認識した。このアプローチにより、合成後に、鋳型分子を支持体に結合させる別途の工程の必要性が回避される。したがって、異なる配列の複数の鋳型種が、並行して簡便に増幅され得る。例えば、以下に記載する方法によれば、微粒子上での合成により、各々が自身に結合された多コピーのある特定の鋳型分子（またはその相補体）を有する個々の微粒子の集団がもたらされ、各微粒子に結合された鋳型分子は、他の微粒子に結合された鋳型分子と配列が異なる。したがって、支持体の各々は、自身に結合された鋳型のクローン性の集団を有する、例えば、支持体Ａは、自身に結合された多コピーの鋳型Ｘを有し、支持体Ｂは、自身に結合された多コピーの鋳型Ｙを有し、支持体Ｃは、自身に結合された多コピーの鋳型Ｚを有するなどである。「鋳型のクローン性の集団」、「核酸のクローン性の集団」などにより、好ましくは、目的の単一の鋳型分子（出発鋳型）から開始される連続回数の増幅によって生成される、実質的に同一の鋳型分子の集団が意図される。実質的に同一の鋳型分子は、出発鋳型またはその相補体と実質的に同一であり得る。
【００９４】
増幅は、典型的には、ＰＣＲを用いて行なわれるが、他の増幅方法もまた使用され得る（下記参照）。クローン性の集団のメンバーは１００％同一である必要はなく、例えば、ある特定数の「エラー」が、合成過程中（例えば、増幅中）に起こり得ることは理解されよう。クローン性の集団のメンバーの好ましくは少なくとも５０％が、出発鋳型分子（またはその相補体）と少なくとも９０％、またはより好ましくは少なくとも９５％同一である。より好ましくは、集団のメンバーの少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％またはそれ以上が、出発鋳型分子（またはその相補体）と少なくとも９０％、またはより好ましくは少なくとも９５％同一であるか、またはさらにより好ましくは少なくとも９９％同一である。好ましくは、出発鋳型分子（またはその相補体）に対して少なくとも９５％またはより好ましくは少なくとも９９％の同一性割合の集団のメンバーは、少なくとも９８％、９９％、９９．９％またはそれ以上である。
【００９５】
増幅プライマーは、任意のさまざまな手法を用いて支持体に結合させ得る。例えば、プライマー（５’末端）の一方の末端を結合ペアの一メンバー（例えば、ビオチン）で官能性付与させ、支持体を、結合ペア他方のメンバー（例えば、ストレプトアビジン）で官能性付与させ得る。任意の類似した結合ペアが使用され得る。例えば、規定配列の核酸タグを、相補的核酸タグを有する支持体およびプライマーに結合させ得、支持体に結合された核酸タグにハイブリダイズさせ得る。種々のリンカーおよび架橋剤もまた使用され得る。
【００９６】
ＰＣＲを行なうための方法は、当該技術分野でよく知られており、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号および同第４，９６５，１８８号、ならびにＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，  Ｃ．およびＤｖｅｋｓｌｅｒ，  ＧＳ，  ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，２００３に記載されている。微粒子上で核酸を増幅させるための方法は、当該技術分野でよく知られ、報告されており、例えば、標準的なＰＣＲは、マイクロタイタープレート（ｄｉｓｈ）のウェルまたはチューブ内で、自身に結合されたプライマーを有するビーズ（例えば、実施例１２のようにして調製されるビーズ）上で行なわれ得る。ＰＣＲは簡便な増幅方法であるが、当該技術分野で知られた任意の数多くの他の方法もまた使用され得る。例えば、多重鎖置換型増幅、ヘリカーゼ置換型増幅（ＨＤＡ）、ニックトランスレーション、Ｑβレプリカーゼ増幅、ローリングサークル型増幅、および他の等温増幅方法などが使用され得る。
【００９７】
鋳型分子は、任意のさまざまな供給源から得られ得る。例えば、ＤＮＡは、被験体から入手され得るか、またはこれに由来であり得る試料から単離され得る。用語「試料」は、配列決定が行なわれる鋳型の任意の供給源を表すために広義で用いる。語句「に由来する」は、被験体から直接得られた試料および／または試料中の核酸は、鋳型分子を得るためにさらに加工処理されたものであり得ることを示すために用いる。試料の供給源は、任意のウイルス、原核生物、古細菌または真核生物種であり得る。本発明のある特定の実施形態において、供給源はヒトである。試料は、例えば、細胞を含有する血液または別の体液；精子；生検試料などであり得る。目的の任意の生物体のゲノムまたはミトコンドリアのＤＮＡが配列決定されてもよい。ｃＤＮＡが配列決定されてもよい。また、例えば、ＲＴ−ＰＣＲなどの当該技術分野で知られた方法を用いて最初に逆転写することによってｃＤＮＡを得ることによりＲＮＡが配列決定されてもよい。異なる試料および／または被験体由来のＤＮＡの混合物を合わせてもよい。試料は、任意のさまざまな様式で加工処理され得る。核酸は試料から、既知の方法を用いて単離、精製および／または増幅され得る。もちろん、生物体に由来しない完全に人工的な合成核酸、組換え核酸もまた配列決定され得る。
【００９８】
鋳型は、二本鎖または単鎖形態で提供され得る。典型的には、まず、鋳型を二本鎖形態で提供し、続いて、この二本鎖を分離する（例えば、ＤＮＡを変性させる）場合、該二本鎖の一方だけを増幅して鋳型の局在クローン性の集団分子（例えば、微粒子に結合、半固相支持体内または該支持体上にに固定化など）を生成させる。
【００９９】
鋳型は、さまざまなさらなる様式で選択または加工処理され得る。例えば、メチル感受性制限酵素（例えば、Ｍｓｐｌ）による処理に供されたＤＮＡから得られる鋳型が使用され得る。かかる処理は、ＤＮＡ断片をもたらすものであり、増幅前に行なわれ得る。メチル化塩基を含有する断片は増幅されない。低メチル化（ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ）鋳型から得られる配列情報を、同じ供給源に由来する低メチル化の選択に供しなかった鋳型から得られる配列情報と比較し得る。
【０１００】
鋳型は、ライブラリー内に挿入されるか、これで提供されるか、またはこれに由来するものであり得る。例えば、低メチル化ライブラリーは当該技術分野で知られている。ライブラリー内への鋳型の挿入により、鋳型の末端へのさらなるヌクレオチド配列の簡便な連鎖（例えば、タグ、プライマーまたは初期オリゴヌクレオチド結合部位など）が可能となり得る。例えば、ある特定のストラテジーにより、複数の結合部位（例えば、増幅プライマーの結合部位、初期オリゴヌクレオチドの結合部位、捕捉剤の結合部位など）を有するタグの付加が可能になる。
【０１０１】
さまざまな適当なライブラリーが、当該技術分野で知られている。例えば、特定の目的のライブラリー、およびその構築方法は、ＵＳＳＮ１０／９７８，２２４、ＰＣＴ公開公報ＷＯ２００５０４２７８１およびＷＯ２００５０８２０９８ならびにＳｈｅｎｄｕｒｅ，  Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９（５７４１）：１７２８−３２，２００５，  Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ（２００５年８月４日）（ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ．ｏｒｇ）に記載されている。もちろん、かかるライブラリーの他の作製方法もまた使用され得ることは理解されよう。特定の目的のある特定のライブラリーは、複数の核酸断片（典型的には、ＤＮＡ）を含み、その各々は、配列決定工程で使用される増幅および／または配列決定用プライマーに相補的な配列によって分断された目的の２つの核酸セグメントを含有する、すなわち、これらの配列は、プライマー結合領域（ＰＢＲ）としての機能を果たす。特定の目的の実施形態において、核酸セグメントは、天然に存在するＤＮＡの連続片の一部分である。例えば、セグメントは、前述の参考文献に記載のようなゲノムＤＮＡの連続片の５’および３’末端由来のものであり得る。かかる核酸セグメントを本明細書において、前述の参考文献と一致する様式で、「タグ」または「末端タグ」という。単一の連続核酸に由来する（例えば、その５’および３’末端に由来する）２つのタグを、「１対のタグ」、「対のタグ」または「ジタグ（ｄｉｔａｇ）」とよぶ。「対のタグ」は、単数形で使用されていても２つのタグを含むことは認識されよう。１対のタグであるタグが由来するＤＮＡの連続片を所定の大きさの範囲内で選択することにより、該２つのタグが離れる間隔が限定される。
【０１０２】
配列決定および／または増幅用プライマーに相補的な配列によって分断されることに加え、ライブラリーの核酸断片はまた、典型的には、タグと隣接する配列決定および／または増幅用プライマーに相補的な配列を含む。すなわち、第１のかかる配列は、該断片の５’末端により近いタグの５’側に位置し得、第２のかかる配列は、該断片の３’末端により近いタグの３’側に位置し得る。タグが由来する連続核酸内に存在する２つのタグの位置は、種々の実施形態において、ライブラリーのＤＮＡ断片内のタグの位置に対応するものであり得るが、そうである必要はないことに注意されたい。
【０１０３】
核酸断片およびタグは、異なる範囲の大きさを有するものであり得る。典型的には、核酸断片は、例えば、８０〜３００ヌクレオチド長、例えば１００〜２００、１００〜１５０、およそ１５０ヌクレオチド長、およそ２００ヌクレオチド長などであり得る。タグは、例えば、１５〜２５ヌクレオチド長、例えばおよそ１７〜１８ヌクレオチド長などであり得る。これらの長さは、例示であって、限定を意図しないことに注意されたい。より短鎖またはより長鎖の断片および／またはタグが使用され得る。
【０１０４】
また、対のタグを単一の連続核酸から得ることによりライブラリー構築の簡便な方法が提供されるが、対のタグの重要な点は、これらが、自身が元々由来する核酸内である間隔（「分断間隔」）だけ互いに離れており、この分断間隔が所定範囲内に含まれる間隔であることに注意されたい。両タグが所定範囲内に含まれる分断間隔だけ離れていることにより、タグの配列を参照配列（例えば、参照ゲノム配列）に対してアライメントさせることが可能になる。なんら理論に拘束されることを望まないが、このことは、ゲノム再配列決定などのある特定の適用用途に好都合であり得、この場合、参照ゲノムに対する配列の正確な配置が依然として可能なまま、より短い読出し長さの使用が可能になる。５’および３’タグの１対のタグは、より大きな核酸片（例えば、ゲノムＤＮＡ）のセグメントとなり（すなわち、その配列を有する）、該セグメントは、天然に存在するＤＮＡ片内（例えば、ゲノムＤＮＡ片内）において互いから予め規定された間隔内に位置する。例えば、本発明のある特定の実施形態において、５’および３’タグの１対のタグは、天然に存在するＤＮＡ片内で、互いに５００ヌクレオチドまで以内、互いに１ｋＢまで以内、互いに２ｋＢまで以内、互いに５ｋＢまで以内、互いに１０ｋＢまで以内、互いに２０ｋＢまで以内に位置するＤＮＡセグメントである。ある特定の実施形態において、５’および３’タグの１対のタグは、天然に存在するＤＮＡ片内で、５００ヌクレオチド〜２ｋＢ離れて、例えば、７００ヌクレオチド〜１．２ｋＢ離れて（およそ１ｋＢ離れてなど）位置する。１対のタグの２つのタグが離れている正確な間隔はあまり重要性ではなく、典型的には未知であることに注意されたい。また、タグは、元々は、より大きな核酸片から得られたものであるが、用語「タグ」は、タグの配列を有する任意の核酸セグメント、元々の配列状況に存在したもの、ライブラリー断片で存在したもの、ライブラリー断片からの増幅産物、配列決定対象の鋳型など、いずれも適用される。
【０１０５】
核酸断片（例えば、ライブラリー分子）は、下記の構造を有するものであり得る。
【０１０６】
リンカー１−タグ１−リンカー３−タグ１−リンカー２
タグ１およびタグ２は、は、５’および３’タグの１対のタグであり得る。タグのいずれかが５’タグまたは３’タグであり得る。リンカー１およびリンカー２は、１つ以上のプライマーのプライマー結合領域を含む。ある特定の実施形態において、リンカー１および２は、各々が増幅プライマーのＰＢＲおよび配列決定プライマーのＰＢＲを含む。各リンカー内のプライマーは、配列決定プライマーＰＢＲが増幅プライマーＰＢＲに対して内部に位置するようにネスト化（ｎｅｓｔｅｄ）されたものであり得る。リンカー３は、タグ１およびタグ２の配列決定を可能にするため、１つ以上配列決定プライマーのＰＢＲを含むものであり得る。核酸断片のライブラリーに関して使用される用語「リンカー」は、ライブラリーの多数の核酸断片（例えば、ライブラリーの実質的にすべての断片）内に存在する核酸配列をいう。リンカーは、ライブラリーの構築中に実際に連結機能を果たしたものであってもそうでなくてもよく、単に、所与のライブラリーの大部分または全部のメンバーに共通する規定配列とみなされるものであってもよい。かかる配列はまた、「普遍配列」ともいう。したがって、リンカーまたはその一部分に相補的な核酸は、ライブラリーの多数のメンバーにハイブリダイズされ得、ライブラリー内の大部分または全部の分子の増幅プライマーまたは配列決定プライマーとして使用され得る。
【０１０７】
本発明のある特定の実施形態において、核酸断片は下記の構造を有する。
【０１０８】
リンカー１−タグ１−内部アダプター−タグ２−リンカー２
タグ１およびタグ２ならびにリンカー１およびリンカー２は、上記のようなＰＢＲを含む。内部アダプターは、ＩＡおよびＩＢ（以下にさらに論考する）ということがある２つのプライマー結合領域を含む。これらのＰＢＲは、一方の集団の核酸がタグ１を含み、他方の集団の核酸がタグ２を含む自身に結合された核酸の２つの異なる実質的に同一の集団を有する微粒子生成させるのに有用である。核酸の２つの異なる集団は少なくとも部分的に異なる配列を有し、例えば、これらはタグの配列領域が異なる。内部アダプターは、スペーサー領域を２つのプライマー結合領域間に含むものであり得る。スペーサー領域は無塩基残基を含み得、これにより、該スペーサーを介するポリメラーゼの伸長が抑制される。もちろん、スペーサーを介するポリメラーゼ伸長が抑制され得る任意の他のブロッキング基を含有するスペーサー領域が使用され得る。
【０１０９】
他の実施形態において、核酸断片は、１つ以上（例えば、２、４、６など）のさらなるタグおよび１つ以上のさらなる内部アダプターを含む。例えば、核酸断片は下記の構造を有する。
【０１１０】
リンカー１−タグ１−内部アダプター１−タグ２−リンカー２−タグ３−内部アダプター２−タグ４−リンカー３
本発明の核酸断片およびかかる断片のライブラリー、核酸の２つ以上の実質的に同一の集団を含有する微粒子、ならびにかかる微粒子のアレイは、本明細書に記載のライゲーション系配列決定法以外の広範なさまざまな配列決定法に使用され得ることに注意されたい。例えば、ＦＩＳＳＥＱ、ピロシーケンスなどの配列決定法が使用され得る。例えば、ＷＯ２００５０８２０９８を参照のこと。もちろん、ライゲーション系の方法もまた好都合に使用され得る。本明細書に記載のライゲーション系の方法の状況では、用語「配列決定プライマー」は、「初期オリゴヌクレオチド」を意味すると理解され得ることは認識されよう。
【０１１１】
本発明のある特定の実施形態において、配列決定対象の鋳型は、ＰＣＲによって、エマルジョンの個々の水性区画（「反応器」ともいう）内で合成される。好ましくは、該区画は、各々が適当な自身に結合された第１の増幅プライマー、第１の鋳型コピー、第２の増幅プライマーおよびＰＣＲ反応に必要な成分（例えば、ヌクレオチド、ポリメラーゼ、補因子など）を有するビーズなどの微粒状の支持体を含む。エマルジョンの調製方法は、例えば、米国特許第６，４８９，１０３号（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ）；同第５，８３０，６６３号（Ｅｍｂｌｅｔｏｎ）；および米国特許公開公報第２００４０２５３７３１号（Ｇｈａｄｅｓｓｙ）に記載されている。ＰＣＲをエマルジョンの個々の区画内で行ない、微粒子に結合された鋳型のクローン性の集団を生成させる方法（「エマルジョンＰＣＲ」）は、例えば、Ｄｒｅｓｓｍａｎ，  Ｄ．ら，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，１００（１５）：８８１７−８８２２，２００３およびＰＣＴ公開公報ＷＯ２００５０１０１４５に記載されている。
【０１１２】
前述の参考文献に記載の方法またはその変形法は、配列決定のために微粒子に結合された鋳型のクローン性の集団を生成させるために使用され得る。好ましい非限定的な実施形態において、ＰＣＲに適した短鎖（＜５００ヌクレオチド）鋳型が、普遍アダプター配列を異なる標的配列（鋳型）の集団の各末端に結合させることにより（例えば、ライゲーションによって）創製される（この状況における普遍は、同じアダプター配列が各鋳型に結合され、単一の１対のＰＣＲ増幅プライマーを用いて増幅され得る「アダプター付加」鋳型創製されることを意味する）。バルクＰＣＲ反応液は、アダプター付加鋳型、１種類の遊離増幅プライマー、自身に結合された第２の増幅プライマーを有する微粒子、および他のＰＣＲ試薬（例えば、ポリメラーゼ、補因子、ヌクレオチドなど）を用いて調製される。水性ＰＣＲ反応液を油相（低分子（ｌｉｇｈｔ）鉱油および界面活性剤を含有）と１：２の比で混合する。この混合物をボルテックスして油中水型エマルジョンを創製する。４×１０９より多い水性区画（各々が潜在的ＰＣＲ反応器）をエマルジョン内に創製するのに１ミリリットルの混合物で充分である。エマルジョン試料のアリコートを、マイクロタイタープレート（例えば、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレートなど）のウェル内に分配し、サーマルサイクルに供し、微粒子上での固相ＰＣＲ増幅を行なう。クローン性を確保するため、微粒子および鋳型の濃度は、反応器が１つより多くのビーズまたは鋳型分子を含むことは稀であるように注意深く制御する。例えば、本発明のある特定の実施形態において、反応器の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上が単一のビーズおよび単一の鋳型を含む。したがって、各鋳型のクローン性の集団のメンバーは、その微粒子への結合の結果、空間的に互いに近接して局在化される。一般に、鋳型の結合点は、該粒子の表面上に実質的に均一に分布され得る。増幅手順後の微粒子に付着したクローン性の集団（代表的に数千から数百万コピーの鋳型）の鋳型を有する微粒子は、鋳型増幅を受けたという。
【０１１３】
個々の微粒子が、自身に結合された５’タグおよび３’タグの１対のタグを含む増幅された核酸断片の異なる集団を有する微粒子の集団を生成させるためにＰＣＲエマルジョン法を用いることは、特に重要である。換言すると、個々の粒子がライブラリー由来の異なる核酸断片（例えば、増幅され、自身に結合された上記のものなど）を有する微粒子の集団生成させることは、特に重要である。
【０１１４】
ＤＮＡをエマルジョン中で増幅させるための当該技術分野で知られた方法（例えば、上記の参考文献に記載のもの）は、大きな核酸分子の増幅およびこれらの分子の微粒子への結合を達成するその能力に関して制限がある。例えば、より長いアンプリコンを用いると、ＰＣＲ効率は指数関数的に減少することが示されている。このＰＣＲ効率の減少により、対のタグおよびプライマー結合部位を含有する核酸断片（例えば、上記のものなど）が、ＰＣＲエマルジョンで増幅され得、かかる増幅によって微粒子に結合される効率が低下する。したがって、第１および第２のタグの１対のタグを含有する実質的に同一の核酸断片の単一の集団がＰＣＲエマルジョンで増幅され、かかる増幅によってビーズに結合される方法は、いくつかの制限があるという欠点を有する。
【０１１５】
本発明は、５’および３’タグの１対のタグを含有する単一の核酸断片を増幅によって微粒子に結合させた場合にもたらされる対のタグ情報は依然として保存されたまま、より小さいアンプリコンの使用を可能にするアプローチを提供する。本発明は、自身に結合された核酸の少なくとも２つの異なる集団を有する微粒子（例えば、ビーズ）を提供し、ここで、該少なくとも２つの集団の各々は複数の実質的に同一の核酸からなり、第１の実質的に同一の核酸の集団は、第１の核酸の目的のセグメント（例えば、５’タグ）を含み、核酸の第２の集団は、第２の核酸の目的のセグメント（例えば、３’タグ）を含む。第１および核酸の第２の集団は、該２つのタグを含み、かつ該タグと隣接し分断する適切に配置されたプライマー結合部位も含む単一の大きな核酸断片から増幅され、その結果、２つの増幅反応は、連続的または（好ましくは）同時のいずれかで、ＰＣＲエマルジョン単一の反応器内にて微粒子および増幅試薬の存在下で行なわれ得る。微粒子は自身に結合されたプライマーの２つの異なる集団を有し、該集団の一方は、該核酸断片内の一方のタグの外部のプライマー結合領域を有する配列に対応し、他方は、該核酸断片内の他方のタグの外部のプライマー結合領域を有する配列に対応する。すなわち、プライマー結合領域は該２つのタグと隣接している。
【０１１６】
また、２つの独立したＰＣＲ反応が行なわれ、各々が、核酸断片の一方のタグを含有する部分を増幅し得るように、該２つのタグ間に位置するプライマー結合領域に結合するプライマーが提供される。増幅された核酸セグメントは、互いに異なるさらなるプライマー結合領域を含み、これらのさらなるプライマー結合領域は、核酸断片内に存在し、増幅プライマーのＰＢＲに対して内部に位置する、すなわち、これらはネスト化されている。これらのさらなるＰＢＲは、２つの異なる配列決定プライマーの結合領域としての機能を果たす。したがって、２つの異なる配列決定プライマーの一方または他方を自身に結合された実質的に同一の核酸セグメントの２つの集団を有する微粒子に適用することにより、２つの核酸セグメントの一方または他方のいずれかが、他方の核酸セグメントの存在による障害なく配列決定され得る。核酸セグメントの各々は、増幅された核酸断片よりも有意に短く、したがって、対のタグを含有する断片のライブラリーを用いてエマルジョン系ＰＣＲが行なわれ得る効率は改善されるが、１対のタグのタグ間の会合は依然として保持されたままである。
【０１１７】
上記の方法は、図３４および３５の種々のパネルを参照することによって、より良好に理解され得る。図において、同じ配列を有する核酸の部分には同じ色を割り当てている。上記の記載は、図３４および３５と一致するよう解釈されたい。図３４Ａおよび３５Ａは図３５Ａと同じ工程を示すが、さらなる詳細を提供する。図３４Ａおよび３５Ａに示すように、２つのタグ（タグ１およびタグ２）を含有する対末端ライブラリー断片は、内部アダプターカセット（ＩＡ−ＩＢ）および特有の隣接リンカー配列（Ｐ１およびＰ２）を有するように構築される（すなわち、Ｐ１およびＰ２は互いに異なる）。内部アダプターカセットおよび隣接リンカー配列はともに、ＰＣＲ増幅およびＤＮＡ配列決定の両方をもたらすヌクレオチド配列を含む。ＰＣＲプライマー領域は、ネスト化されたＤＮＡ配列決定プライマーの使用が可能になるように設計される。ＤＮＡ捕捉微粒子（ビーズ）は、同一である２つのオリゴヌクレオチド配列を特有の隣接リンカー配列に結合させることにより生成させる。ＰＣＲ増幅のため、Ｐ１およびＰ２  配列を有するオリゴヌクレオチドに結合させたＤＮＡ捕捉微粒子を、単一のジタグライブラリー断片（すなわち、５’タグおよび３’タグの１対のタグを含有するライブラリー断片）および溶液系ＰＣＲプライマーを含有する反応液にシード（ｓｅｅｄ）する。
【０１１８】
溶液系隣接リンカープライマー（Ｐ１およびＰ２）は、内部アダプタープライマー（ＩＡおよびＩＢ）と比べて限定的な量で添加され、ＰＣＲ生成タグ産物の効率的なビーズ駆動型（ｄｒｉｖｅ−ｔｏ−ｂｅａｄ）増幅を促進する機能を果たす（すなわち、［Ｐ１＜＜ＩＢ］，  ［Ｐ２＜＜ＩＡ］）。所望の場合は、プライマーの量を適切に制御することによってもまた、核酸の集団が実質的に同じ数の核酸を含むことが確保され得る（例えば、個々の微粒子上のおよそ半数の核酸が第１の集団に属し、個々の微粒子上のおよそ半数の核酸が第２の集団に属する）。したがって、所望により、種々の集団の比を制御するため、非対称形態のＰＣＲが使用され得る。
【０１１９】
増幅中、図３４Ｂおよび３５Ｂに示すように（この場合も、図３５Ｂは、図３４Ｂに関するさらなる詳細を提供する）、単一の対末端ライブラリー断片が、４種類のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐｌ、Ｐ２、ＩＡおよびＩＢ）の存在下で、２種類の特有のＰＣＲ産物を生成させる。一方の集団は、Ｐ１とＩＡに隣接したタグ１を含み、第２の集団は、Ｐ２とＩＢに隣接したタグ２を含む。
【０１２０】
増幅微後、粒子には、最初のライブラリー断片から生成されたタグ１およびタグ２に対応する２つの特有のＰＣＲ集団が負荷される。したがって、各タグは、図３４Ｃ、３５Ｃおよび３５Ｄに示すような、各タグの逐次配列決定を可能にする特有の組のプライマー（ｐｒｉｍｉｎｇ）領域を含む。図３５Ｃおよび３５Ｄは、異なる配列決定プライマーを用いたタグ１および２の連続的配列決定を示す。任意のさまざまな配列決定法が使用され得る。
【０１２１】
上記の方法は、（例えば、４、６、８、１２、１６、２０の集団であって、例えば、該集団は、２、３、４、６、８、１０の対のタグを含む）自身に結合された２つより多くの異なる核酸配列の集団を有する微粒子を生成させるために使用され得る。各集団は、２つのタグの場合で記載のようにして、特有のプライマー結合領域を各配列内に提供することにより個々に配列決定され得る。
【０１２２】
本発明は、図３４および３５に示す上記の構造を有する核酸断片、かかる断片のライブラリー、自身に結合されたかかる断片由来の核酸セグメントを有する微粒子、かかる微粒子の集団（個々の微粒子は、他の微粒子のものと異なる核酸の集団が自身に結合されている）、微粒子のアレイ、核酸断片からの核酸セグメント（タグ）の増幅のための増幅プライマー、微粒子に結合された核酸セグメントの配列決定のための配列決定プライマー、該断片、ライブラリーおよび微粒子の作製方法、ならびに微粒子に結合された核酸の配列決定法を包含する。本発明は、前述の成分の任意の組合せを含み、任意選択で１種類以上の酵素、バッファーまたは増幅、配列決定などに有用な他の試薬もまた含むキットを包含する。
【０１２３】
所望の場合は、さまざまな方法が、自身に結合された鋳型を有する微粒子の富化のために使用され得る。例えば、増幅産物（鋳型）の微粒子に結合された部分に相補的なオリゴヌクレオチド（捕捉剤）を、別の（好ましくは、より大きな）微粒子、マイクロタイターウェルまたは他の表面などの捕捉実体に結合させるハイブリダイゼーション系の方法が使用され得る。増幅産物の該部分は標的領域とよばれ得る。標的領域は、増幅中、鋳型内に、例えば、鋳型の未知配列を有する部分の末端に組み込まれ得る。例えば、標的領域は、微粒子に結合されない増幅プライマー内に存在し得、その結果、相補的部分が増幅された鋳型内に存在する。したがって、多数の異なる鋳型が、同じ標的領域を含み得るため、単一の捕捉剤が、多数の異なる鋳型にハイブリダイズし、１つだけのオリゴヌクレオチド配列を捕捉剤として用い、多数の微粒子の捕捉が可能になる。増幅に供された微粒子は、ハイブリダイゼーションが起こり得る条件下で捕捉剤に曝露され、その結果、自身に結合された増幅された鋳型を有する微粒子が、捕捉剤により捕捉実体に結合される。次いで、未結合微粒子を除去し、保持された微粒子を放出させる（例えば、昇温により）。微粒状の捕捉実体が使用されるある特定の実施形態において、自身に結合された微粒子を有する捕捉実体からなる凝集体を、ハイブリダイゼーション後に、結合された微粒子のない微粒状の捕捉実体から、および捕捉実体に結合されていない微粒子から、例えば、粘性溶液（例えば、グリセロール）中での遠心分離によって分離する。大きさ、密度などに基づく他の分離方法もまた使用され得る。しかし、ハイブリダイゼーションは、富化に使用され得るいくつかの方法のうちの１つである。例えば、鋳型内に組み込まれ得る（例えば、合成中）任意のいくつかの異なるリガンドに対して親和性を有する捕捉剤が使用され得る。多数回の富化が使用され得る。
【０１２４】
図１４Ａは、ＰＣＲ反応が、自身に結合された第１の増幅プライマーを有するビーズ上で、蛍光標識された第２の増幅プライマーおよび過剰の鋳型を用いて行なわれた油中水型エマルジョンの区画の画像を示す。水性反応器は、拡散した遊離プライマーから弱い蛍光を発するが、ビーズは、固相増幅の結果としてビーズ上に蓄積されるプライマーから強い蛍光を発する（すなわち、蛍光プライマーが、ビーズに結合された増幅された鋳型内に第１の増幅プライマーによって組み込まれている）。ビーズシグナルは、種々の大きさの反応器において不均一である。
【０１２５】
増幅後、微粒子を回収し（例えば、磁気粒子の場合は磁石の使用によって）、本明細書に記載の伸長、ライゲーションおよび切断の反復サイクルによる配列決定に使用する。本発明のある特定の実施形態において、微粒子は、配列決定前に半固相支持体内または該支持体上にアレイ状にする（これは、後述する）。実施例１２、１３、１４および１５は、（ｉ）  微粒子上での鋳型の合成のための自身に結合された増幅プライマーを有する微粒子の調製（実施例１２）；（ｉｉ）ＰＣＲを行なうための複数の反応器を含むエマルジョンの調製（実施例１３）；（ｉｉｉ）エマルジョンの区画内でのＰＣＲ増幅（実施例１３）；（ｉｖ）エマルジョンの破壊および微粒子の回収（実施例１３）；（ｖ）  自身に結合されたクローン鋳型集団を有する微粒子の富化（実施例１４）；（ｖｉ）  半固形ポリアクリルアミド支持体の基材として供するガラススライドの調製（実施例１５）；ならびに（ｖｉｉ）  微粒子と非重合アクリルアミドとの混合による自身に結合された鋳型を有する微粒子のアレイの形成、基材上のアクリルアミド内への包埋（実施例１５）ために使用され得る代表的で非限定的な方法のさらなる詳細を提供する。また、実施例１５には、ポリメラーゼトラッピング（ｔｒａｐｐｉｎｇ）のプロトコルを記載しており、これは、半固相支持体内でＰＣＲ行なう場合のある特定の方法で使用される。当業者には、これらの方法に対する数多くの変形法が使用され得ることが認識されよう。
【０１２６】
本発明の他の実施形態において、鋳型は、内部に固定化された適当な増幅プライマーを有するゲルなどの半固相支持体内でのＰＣＲによって増幅される。鋳型、さらなる増幅プライマー、およびＰＣＲ反応に必要な試薬を半固相支持体内に存在させる。１対の増幅プライマーの一方または両方を半固相支持体に、適当な連結部分、例えば、アクリダイト基によって結合させる。結合は、重合中に行なわれ得る。さらなる試薬（例えば、鋳型、第２の増幅プライマー、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、補因子など）を、半固相支持体の形成の前に存在させてもよく（例えば、ゲル形成前に液体中）、または試薬の１種類以上をその形成後に半固相支持体中に拡散させてもよい。半固相支持体の細孔径は、かかる拡散を可能にするように選択される。当該技術分野でよく知られているように、ポリアクリルアミドゲルの場合は、細孔径は、主にアクリルアミドモノマー濃度によって、および程度は低いが架橋剤によって決定される。同様の考慮事項が、他の半固相支持体材料の場合に適用される。所望の細孔径を得るために適切な架橋剤および濃度が選択され得る。本発明のある特定の実施形態において、カチオン脂質、ポリアミン、ポリカチオンなどの添加剤を、重合前に該溶液中に含め、ゲル内ミセルを形成させるか、または微粒子周囲に凝集させる。米国特許第５，７０５，６２８号、同第５，８９８，０７１号、および同第６，５３４，２６２号に記載の方法もまた使用され得る。例えば、種々の「クラウディング（ｃｒｏｗｄｉｎｇ）試薬」が、クローンＰＣＲ用のビーズ付近にＤＮＡをクラウディングさせるために使用され得るＳＰＲＩ（登録商標）磁気ビーズ手法および／または条件もまた使用され得る。例えば、１０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の存在下での有効なＰＣＲ増幅を示した米国特許第５，６６５，５７２号を参照のこと。本発明の方法のある特定の実施形態において、増幅（例えば、ＰＣＲ）、ライゲーションまたは両方が、ベタイン、ポリエチレングリコール、ＰＶＰ−４０などの存在下で行なわれる。これらの試薬は、溶液に添加しても、エマルジョン中に存在させても、および／または半固相支持体中に拡散させてもよい。
【０１２７】
半固相支持体は、実質的に平面状の剛性の基材に配置するか、またはその上面に配設する。ある特定の好ましい実施形態において、該基材は、典型的な標識（例えば、蛍光標識、量子ドット、プラスモン共鳴粒子、ナノクラスター）の励起および検出に使用される励起および発光波長（例えば、およそ４００〜９００ｎｍ）の放射線に対して透過性である。ガラス、プラスチック、石英などの材料が適当である。半固相支持体を基材に接着してもよく、任意選択で、任意のさまざまな方法を用いて基材に固定させ得る。
基質は、接着または結合を増強する物質（例えば、シラン、ポリリシンなど）でコーティングされたものであってもそうでなくてもよい。米国特許第６，５１１，８０３号には、半固相支持体内でのＰＣＲを用いて鋳型のクローン性の集団合成するための方法、実質的に平面状の基材上に半固相支持体を作製するための方法などが記載されている。同様の方法が本発明に使用され得る。基材は、半固形基材の形成前の液体を入れるためのウェルまたは凹部を有するものであってもよい。あるいはまた、高くした障壁またはマスクがこの目的のために使用され得る。
【０１２８】
上記のアプローチは、空間的に局在化されるクローン鋳型の集団を生成させるためのエマルジョン中の反応器（ｒｅａｃｔｏｒ）の使用の代替法を提供する。クローン性の集団は半固相支持体内の別個の位置に、新たにライゲートされた伸長プローブを検出する（例えば、画像化によって）目的のために、シグナルが、配列決定中に各集団から取得され得るように存在する。本発明のある一部の実施形態において、２つ以上の異なるクローン性の集団が単一の核酸断片から増幅され、半固相支持体内の別個の位置に混合物として存在する。混合物中のクローン性の集団の各々は、例えば、別個の位置に５’タグを含有する断片および３’タグを含有する断片が含まれるようにタグを含み得る。５’タグおよび３’タグを含むクローン鋳型は異なる配列決定プライマーを含み、その結果、これらは、互いに独立して配列決定され得る。このアプローチは、多数の実質的に同一の核酸の集団を微粒子上に生成させ、単一の微粒子から１対のタグの両方のメンバーの配列決定情報得るための上記のアプローチ同一である。
【０１２９】
一般に、任意の本発明の方法における使用のための半固相支持体は、約１００ミクロン以下の厚さ、例えば約５０ミクロン厚以下、例えば約２０〜４０ミクロン厚（両端を含む）の層を形成したものである。カバースリップまたは実質的に平面状の表面を有する他の類似した物体を、半固相支持体材料の上に、好ましくは重合前に配設し得、均一なゲル層の作製、例えば、実質的に平面状および／または実質的に均一な厚さのゲル層の作製が補助される。
【０１３０】
また本発明の他の実施形態において、上記の方法に対し、鋳型が、自身に結合された適当な増幅プライマーを有する微粒子上でのＰＣＲによって合成され、該微粒子が鋳型合成前に半固相支持体内または該支持体上に固定化される、すなわち、これらは、完全または部分的に半固相支持体内に包埋される変形法が使用される。一般的に、微粒子は半固相支持体材料に完全に囲まれるが、基材上に載っていてもその下方にあってもよい。したがって、微粒子は、半固相支持体が破壊されな限り、互いに対して実質的に固定された位置に維持される。このアプローチは、空間的に局在化されるクローン鋳型の集団を生成させるためのエマルジョンの使用別の代替法を提供する。微粒子は、半固相支持体の形成前に液体と混合してもよい。あるいはまた、微粒子を、実質的に平面状の基材上でアレイ状にし、重合、架橋などの前に液体を微粒子アレイに添加してもよい。微粒子は、自身に結合された第１の増幅プライマーを有する。第２の増幅プライマーは、半固相支持体に結合されたものであり得るが、そうである必要はない。さらなる試薬（例えば、鋳型、第２の増幅プライマー、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、補因子など）を、半固相支持体の形成前に存在させてもよく（例えば、ゲル形成前に液体中）、またはこれらの試薬の１種類以上をゲル形成後に半固相支持体中に拡散させてもよい。半固形基材は、一般的に、上記のようにして例えばガラススライド上に形成される。
【０１３１】
本発明のある特定の実施形態において、ゲルは、鋳型合成後に、クローン鋳型集団が結合された微粒子が簡便に回収され得るように（例えば、磁気粒子の場合は磁石の使用によって）、可溶化（例えば、消化または解重合または溶解）させ得る。可溶化、消化、解重合、溶解させなどさせ得るゲルを、本明細書において「可逆的」という。慣用的なポリアクリルアミド重合は、Ｎ−Ｎ’メチレンビスアクリルアミド（ＢＩＳ）を架橋剤と、重合を開始させる適当な触媒（例えば、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ））と一緒に使用する。可逆的ゲルを作製するため、代替的な架橋剤、例えば、Ｎ−Ｎ’ジアリル酒石酸ジアミド（ＤＡＴＤ）などが使用され得る。この化合物は、ＢＩＳに構造的に類似しているが、過ヨウ素酸によって（例えば、過ヨウ素酸ナトリウムを含有する溶液中）切断され得るシス−ジオール基を有する（Ａｎｋｅｒ，  Ｈ．Ｓ．：Ｆ．Ｅ．Ｂ．Ｓ．Ｌｅｔｔ．，  ７：２９３，１９７０）。したがって、ＤＡＴＤゲルは、容易に可溶化され得る。架橋剤としてＤＡＴＤを用いて作製されたゲルは、高度に透明であり、ガラスに良好に結合する。可逆的ゲルを形成するＤＡＴＤ様特性を有する別の架橋剤は、エチレンジアクリレートである（Ｃｈｏｕｌｅｓ，  Ｇ．Ｌ．およびＺｉｍｍ，
Ｂ．Ｓ．：Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３：３３６−３３９，１９６５）。Ｎ，Ｎ’−ビスアクリリルシスタミン（ＢＡＣ）は、可逆的ポリアクリルアミドゲルを形成するために使用され得る別の架橋剤である。過ヨウ素酸塩に溶解されるゲルを形成するために使用され得る別の架橋剤はＮ，Ｎ’−（１，２−ジヒドロキシエチレン）ビス−アクリルアミド（ＤＨＥＢＡ）である。可逆的半固相支持体を形成する任意のさまざまな他の材料もまた使用され得る。例えば、熱可逆的ポリマー、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（ＢＡＳＦから入手可能）  などが使用され得る。Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓは、ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロックコポリマーのファミリーの１つである（Ｎａｃｅ，  Ｖ．Ｍ．ら、Ｎｏｎｉｏｎｉｃ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ，  Ｍａｒｃｅｌ−Ｄｅｋｋｅｒ，  ＮＹ，１９９６）。これらの材料は、高温（例えば、室温より高い温度）で半固形（ゲル）になり、冷却すると液化する。種々の方法が、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓを化学的に誘導体化し、例えば、プライマーとの結合を助長するために使用され得る（例えば、Ｎｅｆｆ，  Ｊ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，４０：５１１，１９９８；Ｐｒｕｄ’ｈｏｍｍｅ，  ＲＫら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ，１２：４６５１，１９９６を参照）。
【０１３２】
可溶化後、微粒子を回収し、伸長、ライゲーションおよび切断の反復サイクルを用いた配列決定に供し得る。配列決定前に、微粒子を第２の半固相支持体内または該支持体上に、例えば、第１の半固相支持体内または該支持体上に存在したときより高い密度でアレイ状にしてもよい。半固相支持体は、典型的には、それ自体が、実質的に平面状で剛性の基材、例えばガラススライドによって支持されている。
【０１３３】
したがって、２つの一般的なアプローチは、半固相支持体内または該支持体上に包埋されたクローン鋳型集団を担持する微粒子のアレイを有する半固相支持体を作製するために使用され得る。第１のアプローチは、半固相支持体内に存在しない微粒子上で増幅を行ない（例えば、エマルジョン系ＰＣＲによって）、次いで、微粒子を半固相支持体内または該支持体上に固定化することを伴う。第２の一般的なアプローチは、微粒子を半固相支持体内または該支持体上に固定化し、次いで、増幅を行なうことを伴う。いずれの場合も、微粒子の凝集を低減させるため、および／または微粒子を実質的に単一の焦点面に整列させるための手順を用いることが望ましいことがあり得る。例えば、粒子をポリアクリルアミドゲル内に固定化させる場合、モノマーおよび架橋剤の濃度は、重合が完了する前に粒子が溶液の底面に沈降し、その結果、下方の平面状の基材上に沈殿し、したがって、単一の平面状に整列するように選択される。本発明のある特定の実施形態において、カバースリップなどの実質的に平面状の表面を有する物体を、微粒子を含有する液状アクリルアミド（または半固相支持体を形成できる他の材料）の上面に配置し、アクリルアミドが２つの層間に捕捉され「サンドイッチ」構造となるようにする。次いで、該サンドイッチを裏返し、重力の作用によって、微粒子が下方に沈降し、カバースリップ（実質的に平面状の表面を有する他の物体）上に堆積するようにする。重合後、カバースリップを取り除く。したがって、微粒子は、実質的に単一の平面状に半固相支持体の表面に近接して（例えば、表面に接して（ｔａｎｇｅｎｔ））包埋される。
【０１３４】
上記のように微粒子などの支持体を半固形マトリックス内に固定化するのではなく、本発明のある特定の実施形態では、微粒子を、固定化のための半固相支持体を使用することなく、共有結合または非共有結合のいずれかで実質的に平面状で剛性の基材に結合させ、それによって「ゲル非含有」または「ゲル無し」微粒子アレイをもたらす。微粒子を基材、例えば、ガラス、プラスチック、石英、シリコンなどなどに結合させるためのさまざまな方法が、当該技術分野で知られている。基材は、コーティングされたものであってもそうでなくてもよく（例えば、スピンコーティング）、または結合を助長する材料（例えば、任意のさまざまなポリマー）もしくは薬剤により官能性付与させたものであってもよい。コーティングは、薄膜、自己組織型単層などであり得る。微粒子、微粒子に付着した部分、または微粒子に付着したオリゴヌクレオチド（例えば、鋳型）のいずれかを基材に付着させることができる。本発明のある実施形態において、基材はシラン化剤で処理されず、あるいはそのように処理されたとしても、その処理は有効なシラン化をもたらさず、すなわち例えば、本明細書に記載のライゲーションに基づく配列決定を複数回繰り返す時に行われるような、その後の操作および／または流体との接触に対して安定した形で、平坦なガラス表面上のポリアクリルアミド層により固定された微粒子のアレイを形成するように、シラン化が有効に作用しない。この文脈において「安定」とは、一般的に、操作および／または流体との接触時にゲルが基材に固着したまま維持され、著しい屈曲や、脱離、離層を生じないことを意味する。本発明者等は、微粒子アレイの作成にゲルなどの半固形培地の使用を避けることにより、多くの利点が得られることを認識した。例えば、（ｉ）半固形培地の非存在下では、試薬の拡散がより早くなり、かつライゲーションされていないプローブや酵素などの望ましくない種の除去もより早くなり、（ｉｉ）有効なシラン化が行われなければ、アクリルアミドなどのゲルが基材に安定して固着される状態が維持されず、（ｉｉｉ）重合は酸素などの環境特性に敏感であることから、重合手順を排除することで、アレイ生成プロセスにおける不均一性の潜在的な原因が除去され、（ｉｖ）半固形培地を使用しないことで、一つの焦点面により多くの微粒子が収まるようになり、（ｖ）微粒子は、基材に付着した場合の方が、半固形培地（特に重合が損なわれるもの）に埋め込まれた場合よりも、適切な位置により安定して固着される。
【０１３５】
一般的に、当該技術分野で既知の多様な方法のいずれを使用しても、このような核酸が微粒子あるいはその他の担体または基材に付着しやすくなるように、オリゴヌクレオチドプライマー、プローブ、鋳型などの核酸を修飾することができる。さらに、当該技術分野で既知の多様な方法のいずれを使用しても、核酸が付着しやすくなるように微粒子またはその他の担体を修飾して、担体や基材などに微粒子が付着しやすくなるようにすることができる。所望の官能基が付着しやすくなるような界面化学物質を有するミクロスフェアが使用可能である。これらの界面化学物質のいくつかの例には、アミノ基（例えば、脂肪族および芳香族アミン）、カルボン酸、アルデヒド、アミド、クロロメチル基、ヒドラジド、ヒドロキシル基、スルホン酸塩、および硫酸塩が含まれるが、これらに限定されない。これらの基は核酸中に存在する基と反応する場合があり、あるいは核酸が反応基の付着によって修飾される場合もある。さらに、ホモ二官能性およびヘテロ二官能性リンカーを含めた多くの安定した二官能基も当該技術分野で周知である。例えば、ＵＲＬ：ｗｗｗ．ｐｉｅｒｃｅｎｅｔ．ｃｏｍのウェブサイトで閲覧可能なＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ（１９９４−９５  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇに最初に公開）、およびＧ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９６を参照されたい。また、米国特許第６，６３２，６５５号も参照されたい。
【０１３６】
一般に、結合ペアを形成するように互いに対して親和性を示す任意の対の分子が、微粒子または鋳型を基材に結合させるために使用され得る。結合ペアの第１のメンバーを共有結合または非共有結合により基材に結合させ、結合ペアの第２のメンバーを共有結合または非共有結合により微粒子または鋳型に結合させる。説明上、結合対の第１のメンバー、すなわち基材に付着した結合パートナーは、本明細書でＢＰ１と呼び、結合対の第２のメンバー、すなわち微粒子または鋳型に付着した結合パートナーは、（ＢＰ２）と呼ぶ。第１の結合パートナー（ＢＰ１）をリンカーによって基材に結合させてもよい。第２の結合パートナー（ＢＰ２）をリンカーによって微粒子または鋳型に結合させてもよい。例えば、アプローチの一例によれば、スライドまたは他の適当な基質をアミン反応性基（例えば、アミン反応性基を含有するＰＥＧリンカーを使用）で修飾する。アミン反応性基は、水性条件で（例えば、ｐＨ８．０で）任意のタンパク質（例えば、ストレプトアビジン）中のアミン（例えば、リシン）と反応する。したがって、アミンを担持する部分により官能性付与させた微粒子は、基材上に固定化された状態になる。アミン担持する部分は、タンパク質または適当に官能性付与された核酸、例えば、ＤＮＡ鋳型であり得る。多数の部分がビーズに結合され得る。例えば、ビーズは、ＮＨＳエステルと反応してビーズを基材に結合させる自身に結合されたタンパク質を有し得、また、ＤＮＡ自身に結合された鋳型を有し得、これは、ビーズが基材に結合された後、配列決定され得る。アミン反応性ＮＨＳ部分を一方の末端に有するポリマーテザー（ｔｅｔｈｅｒ）  を担持する適当にコーティングされスライドは、例えば、Ｓｃｈｏｔｔ  Ｎｅｘｔｅｒｉｏｎ，  Ｓｃｈｏｔｔ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ，  Ｉｎｃ．，  Ｅｌｍｓｆｏｒｄ，  ＮＹ  １０５２３から市販されている。あるいはまた、コーティングされたスライド（例えば、ビオチン−コートスライド）が、Ａｃｃｅｌｒ８  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｄｅｎｖｅｒ，  ＣＯから市販されている。そのＯｐｔｉＣｈｅｍＴＭ技術は、基材への微粒子の結合方法の代表であるが一例である。例えば、米国特許第６，８４４，０２８号を参照のこと。あるいはまた、微粒子は基材に、ビーズ上のポリヌクレオチドをビオチンにより官能性付与し（例えば、末端トランスフェラーゼとビオチン−ジデオキシＡＴＰおよび／またはビオチン−デオキシＡＴＰの使用によって）、次いで、これをストレプトアビジン−コーティングされたスライドのような基材（例えば、Ａｃｃｅｌｒ８  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｄｅｎｖｅｒ，  ＣＯから入手可能）（米国特許第６，８４４，０２８号を参照のこと）と、ビオチン−ストレプトアビジン結合の形成を促進する条件下で接触させることにより結合させ得る。一実施形態において、ストレプトアビジンは、ＰＥＧリンカーを使用して基材に付着する。一実施形態において、微粒子結合ポリヌクレオチドは、合成後にビオチンで官能基化される。別の実施形態において、ビオチンは、例えばエマルジョンＰＣＲを実施する時などの増幅時に、ビオチン化プライマーを使用することに��り、合成時にポリヌクレオチドに組み込まれる。例えば、第１のプライマーＰ１は、微粒子に共有結合的にまたは非共有結合的に付着する。微粒子に結合していない第２のプライマーＰ２はビオチン部分を含み、したがって、得られるＰＣＲ産物はビオチンを含む。
【０１３７】
そのため、本発明は、核酸鋳型が付着した微粒子を捕捉し、基材（例えば、ガラススライドなどの実質的に平面状で剛性の基材）の表面に、それらの微粒子を繋ぐ方法を提供する。特に興味深い実施形態においては、鋳型の種々のクローン群が付着した微粒子の群が作成され（例えば、エマルジョンＰＣＲを使用して）、鋳型がビオチン部分を含む。ビオチンは、増幅後に標準的な方法を使用して鋳型に付着する場合がある。次に、微粒子は、ビオチン結合部分（例えば、ストレプトアビジンなどのビオチン結合性タンパク質）が付着したガラススライドなど、実質的に平面状で剛性の基材と接触する。鋳型分子上のビオチンは、ビオチン結合部分に結合し、それによってビオチンおよびビオチン結合性タンパク質を含む連結を介して、微粒子を基材に付着させる。したがって、微粒子の基材への付着は、鋳型がテザーの役割を果たす間接的なものである場合がある。一実施形態において、鋳型分子の一端は、ビーズに付着したビオチン結合部分に付着し、鋳型分子の他端は、基材に付着したビオチン結合部分に付着する。
【０１３８】
ある実施形態において、一本鎖鋳型の一方の末端は微粒子に付着し、一本鎖鋳型の他方の末端は基材に付着する。したがって、一実施形態においては、一本鎖鋳型の３’および５’の両末端が、微粒子を基材に付着させる役割を果たす連結に関与し、第１の連結は微粒子と鋳型の間にあり、第２の連結は鋳型と基材との間にある。得られる構造は、ハイブリダイズした核酸が解離しやすくなる傾向があるとされる熱や他の条件に対しても安定している。
【０１３９】
実施例１６に記載の通り、ストレプトアビジンでコーティングされた微粒子に付着した鋳型は、合成後のエマルジョンＰＣＲ時にビオチン化することができ、得られるビオチン化した鋳型は、ストレプトアビジンでコーティングされた基材に効率的かつ強固に結合することが発見されている。一実施形態において、ビオチンとストレプトアビジンの連結は、本方法において以下の２つの段階で使用される：（ｉ）鋳型の増幅前に（例えば、エマルジョンＰＣＲ前に）、ビオチン化プライマーをストレプトアビジンでコーティングされた微粒子に付着させる；（ｉｉ）増幅後、自由端（微粒子に付着していない端部）がビオチン化された微粒子結合鋳型をストレプトアビジンでコーティングされた基材に付着させ、それによって微粒子も基材に固定する。場合により、手順（ｉ）の後、エマルジョンＰＣＲ（またはその他の増幅方法）を行った微粒子群において、増幅された微粒子を濃縮することもできる。手順（ｉｉ）の前、そして場合により濃縮の後には、ストレプトアビジンを露出した微粒子表面の部分を被覆するために、微粒子をビオチン化オリゴヌクレオチドとともにインキュベートすることもできる。これらの方法により、半固形培地を必要とすることなく、基材の表面に安定して付着した微粒子のアレイをもたらされる。特に興味深い実施形態において、基材は、ガラススライドなどの実質的に平面状で剛性の基材である。本明細書ではビオチンとストレプトアビジンの相互作用が例示されているが、ストレプトアビジンは、ビオチンに結合するいくつかのタンパク質の内の１つにすぎず、これらのタンパク質はいずれも本発明で使用できることが理解される。例えば、アビジンは卵白タンパク質であり、細菌性ストレプトアビジンのように、高い親和性と選択性を持ってビオチンに結合する。ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎは、炭水化物を除去する処理を行ったアビジンの誘導体である。ＣａｐｔＡｖｉｄｉｎは、ｐＨ９を超えるビオチン化分子に対する親和性を減少させたアビジンの誘導体である。したがって、ビオチン化分子は、中性のｐＨで結合させることができ、約ｐＨ１０で解放することができる。ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎおよびＣａｐｔＡｖｉｄｉｎについては、オンライン版のＴｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｂｅｓ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｈａｎｄｂｏｏｋ／ｓｅｃｔｉｏｎｓ／０７０６．ｈｔｍｌ；２００６年４月１７日閲覧）に記載されており、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（米国カリフォルニア州カールズバッド）から入手することができる。さらに、本発明は、特異的かつ高親和性の相互作用を示すいずれかの分子対の使用を包含する。例えば、特異的結合対のメンバーは、抗体と抗原、受容体と受容体リガンド（例えば、小分子またはペプチド）、金属と金属結合剤（例えば、Ｎｉ＋と６ＸＨｉｓタグ）などであると考えられる。本発明は、上述のいずれかの方法を使用して基材に付着した微粒子を提供し、さらに、種々の鋳型が付着している、基材に付着した微粒子を含むアレイも提供する。
【０１４０】
本発明のある実施形態において、ゲル非含有微粒子アレイの形成は、鋳型の複数の複製が付着した（例えば、鋳型の少なくとも数千、典型的には数百万の複製が付着した）微粒子を、鋳型の複数の複製が付着していない微粒子から分離する役割を果たす。一実施形態において、基材には第１の結合パートナー（ＢＰ１）が付着し、微粒子に付着した鋳型分子は第２の結合パートナー（ＢＰ２）を含み、ＢＰ１とＢＰ２は互いに特異的に結合し、すなわち、これらは特異的結合対のメンバーである。上述のようにゲル非含有微粒子アレイが形成されると、ＢＰ２が付着した鋳型を有する微粒子のみが基材に付着することになる。別の実施形態において、基材には第１の反応部分（Ｒ１）が付着しており、微粒子に付着した鋳型分子は第２の反応部分（Ｒ２）を含み、Ｒ１とＲ２は互いに反応して、共有結合を形成する。上述のようにゲル非含有微粒子アレイが形成されると、ＢＰ２またはＲ２が付着した鋳型を有する微粒子のみが基材に付着することになる。結合または反応させた後、付着していない微粒子は、例えば軽い攪拌および／または洗浄によって除去することができる。本方法は、典型的には、鋳型の種々のクローン群が付着した微粒子を含み、また鋳型の複数の複製が付着していない微粒子も含む、微粒子群に適用される。例えば、本方法は、鋳型の増幅が行われた（例えば、エマルジョンＰＣＲ時に）微粒子を、実質的な鋳型増幅が行われていない微粒子から分離させるために使用される場合がある。一実施形態において、本方法は以下の手順を含む：（ｉ）特異的結合対の第１のメンバーまたは反応部分が付着した基材を提供する（ｉｉ）（結合対のメンバー間、あるいは反応部分間で）結合を行うのに好適な条件下で、特異的結合対の第２のメンバーまたは反応部分が付着した鋳型の複数の複製を少なくともいくつか有する微粒子群と、基材を接触させる；（ｉｉｉ）非結合微粒子を除去する。強い非共有結合連結を形成する特異的結合パートナー（例えば、ストレプトアビジンとビオチン）は、濃縮を達成するのに特に興味深い。別の実施形態において、相補性オリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーションが使用される。例えば、一実施形態においては、エマルジョンＰＣＲ時に鋳型に組み込まれる遊離ＰＣＲプライマー（遊離ＰＣＲプライマーとは、微粒子に付着していないプライマーである）の一部と相補的であるように選択されるオリゴヌクレオチドが、基材に付着する。遊離ＰＣＲプライマーは、増幅が成功した場合にのみ微粒子上に存在するため、鋳型増幅に成功した微粒子のみが基材に付着する。リガーゼを使用して、ハイブリダイゼーション事象の品質を確認し、ビオチン化スプリントまたはプライマーをビーズ上の鋳型の３’端に共有結合的に結合させる場合もある。例えば、以下の一連の手順を実施することができるが、これらの手順において、「ビーズ」とは微粒子を表し、Ｐ２とは増幅プライマー配列の少なくとも一部を表し、「ｄｓ」とは「二本鎖」を意味し、「アレイ」とは、増幅に成功した微粒子がビオチンを介して付着することができる基材を指す。二本鎖鋳型が付着した微粒子が提供される。第１の手順では、例えば温度を上昇させることによって、非結合鋳型が除去される。第２の手順では、一本鎖伸長物を有する二本鎖核酸が、鋳型にハイブリダイズされる。二本鎖核酸は、ビオチンを鋳型に安定して結合させることができるブリッジまたはスプリントの役割を果たす。一本鎖伸長物を有さない二本鎖核酸の鎖は、一本鎖伸長物とは反対の末端にビオチン部分が付着している。第３の手順では、リガーゼが存在する。ビオチンを含む二本鎖核酸は、ハイブリダイゼーションに成功した場合に鋳型にライゲーションされ、それによってビオチンを鋳型に安定して結合させる。第４の手順では、鋳型にライゲーションされなかったスプリントの鎖が、例えば温度を上昇させることによって解放される。ビオチンと、基材または担体に結合したストレプトアビジンとの相互作用によって、微粒子のアレイが作成される。
【数１】
2009538123.tif 000074
本方法は、複数の鋳型が付着した微粒子を、複数の鋳型が付着していない、あるいは実質的により少ない鋳型が付着した微粒子から分離させるために使用することができ、これらの鋳型は増幅または合成後に微粒子に付着する。分離させる微粒子は、微粒子結合鋳型の増幅または合成を行うか、あるいは増幅された鋳型の複数の複製が微粒子に付着することができるいずれかの種類の条件にさらされている場合がある。増幅方法は、ＰＣＲ増幅、ローリングサークル増幅、またはその他いずれかの種類の核酸増幅である場合がある。本方法は、本発明の他の方法および組成物のいずれかと組み合わせる、および／または併用することができる。接触手順は、典型的には液体培地内で行われる。本発明のある実施形態において、接触手順では、微粒子を含有する液体を、特異的結合対または反応部分が付着した基材に流す。基材は、例えば、流体入口と流体出口とを有するフローセルなどのチャンバー内に配置される場合がある。微粒子は、基材に付着した微粒子の所望の密度または数に達するまで、基材を流す場合がある。一定期間、密度または数の変化を監視する場合もある（例えば、画像化による）。特に興味深い実施形態において、本方法は、エマルジョンＰＣＲ時に増幅が行われた微粒子を、エマルジョンＰＣＲ時に実質的な鋳型の増幅が行われなかった微粒子から分離させるために使用される。本方法では、鋳型の増幅が行われた微粒子を濃縮する。基材に結合した微粒子に付着した鋳型には、種々のさらなる反応または操作を行うことができる。これらは、例えば、本明細書に記載のようなライゲーションに基づく配列決定、またはＦＩＳＳＥＱやパイロシーケンシングなどの他の配列決定法などの配列決定であってよい。例えば、半固形培地を使用せずに、および／または半固形培地の非存在下で、基材に付着した微粒子に付着した鋳型に対して、本明細書に記載の本発明の配列法のいずれも実施することができる。
【０１４１】
微粒子が基材または半固形培地に付着する本発明の実施形態のいずれにおいても、微粒子はその後に解放し、場合により除去することができる（例えば、洗浄による）。微粒子を解放するのに適切な方法は、微粒子が基材または半固形培地に付着する上で介する特定の共有結合または非共有結合連結によって異なる。ＤＮＡ鋳型を実質的に損傷しない限り、あるいは基材または半固形培地からＤＮＡ鋳型を解放しない限り、いずれの好適な方法も使用することができる。例えば、一実施形態において、微粒子は、例えばジスルフィドまたはエステル連結を含有するリンカーなどの開裂可能なリンカーによって基材または半固形培地に付着する。
【０１４２】
本発明のある実施形態において、微粒子は、半固形培地に安定して付着した鋳型のクローン群のアレイを作成するために使用される。本方法では、１つ以上の鋳型分子が付着した微粒子が、例えば実質的に平面状で剛性の基材上に位置するポリアクリルアミドゲルなど、基材上に位置する半固形培地の存在下でインキュベートされ、半固形培地に固定したおよび／または付着したプライマーに鋳型がハイブリダイズされる。次にプライマーが伸長され（例えば、ＤＮＡポリメラーゼを使用）、半固形培地に付着したまたは固定した相補性鋳型の合成を生じる。微粒子は、例えばインキュベーションのストリンジェンシーを上昇させることによって（例えば、温度を上昇させることによって）解放され、それによって２本の相補性鋳型鎖が分離する。例えば、微粒子に付着した鋳型を開裂させることによって、あるいは微粒子を鋳型から脱離させることによって、微粒子を解放する代替の方法を使用することもできると考えられる。
【０１４３】
本プロセスは、微粒子結合鋳型の複製または「インプリント」を半固形培地に転写する。本プロセスの効率は、微粒子から半固形培地に複製した鋳型分子の数を、微粒子に付着した鋳型分子の数で除算したものとして定義される場合がある。幾何学的および物理的考察に基づくと、決して本発明を限定するものではないが、２００ｂｐのサイズの鋳型分子約１５０，０００個が付着した直径１μｍの微粒子は、図４０に示す通り、直径約５００ｎｍの接触パッチを有する場合がある。接触パッチは、半固形培地または基材の中または上に位置するプライマーを伸長することによって、微粒子に付着したものと相補的な鋳型を合成できるように、培地の表面上に位置するかあるいは培地に部分的に埋め込んだ微粒子に十分に近接している、半固形培地または基材の領域を指す。具体的には、直径１ミクロンのビーズは、３．１×１０６ｎｍ２の面積を有し、したがってビーズ上の１５０，０００個のＤＮＡ分子は、平均面積２０．９ｎｍ２または平均距離４．５７ｎｍとなる。Ｂ−ＤＮＡの直径は約１．９ｎｍであり、２００ｂｐのＢ−ＤＮＡの長さは６８ｎｍである。したがって、６８ｎｍの分離点までの１ミクロンビーズの接触パッチは、半径２５２ｎｍまたは面積１９９，０００ｎｍ２である。ＤＮＡ分子１個当たり２０．９ｎｍ２で、パッチは９，５００個もの分子、またはビーズの下半分上の分子の数の約１３％を含有すると予想される。
【０１４４】
場合により、半固形培地と連結したままの鋳型の増幅が１回以上行われる。一実施形態において、増幅はローリングサークル増幅（ＲＣＡ；米国特許第５，８５４，０３３号；第６，１４３，４９５号）である。ＲＣＡを行う前に、（ｉ）鋳型の２つの非近接領域への環状化可能プローブ（「パドロックプローブ」）のハイブリダイゼーション、（ｉｉ）ポリメラーゼを使用した、発生したギャップの充填、（ｉｉｉ）末端のライゲーション、を含む手順が行われる場合がある。ＲＣＡで使用する鋳型分子は、配列決定する部分だけでなく、環状化可能なプローブと相補的な領域も含まなければならないことが理解される。
【０１４５】
プライマー伸長と場合による増幅によって、半固形培地に付着または固定した、「スポット」のアレイまたは核酸「コロニー」がもたらされる。コロニーは、微粒子を沈着した位置に対応する場所に位置する。コロニーの多くまたはほとんどは、鋳型の単一のクローン群、あるいは本発明のある実施形態においては、鋳型の２つまたは数個までのクローン群（微粒子に複数種類の鋳型が付着していた場合）から構成される。類似の手法を使用して、プライマーを、基材上に位置する半固形培地ではなく、基材自体に付着させることによって、半固形培地を使用することなく、ガラススライドなどの基材上に核酸コロニーのアレイを直接作成することもできると考えられる。
【０１４６】
いかなる理論にも拘束されるものではないが、上述のように微粒子を使用して核酸コロニーのアレイを形成することで、多くの利点が得られる。微粒子は、アレイを形成するために使用する前に、鋳型の増幅を行うことができ、場合により濃縮も行うことができ、それによって各核酸スポットは、単一の鋳型の増幅によってではなく、単一の微粒子に由来する鋳型の複数の複製の増幅によって生じることになる。さらに、半固形培地の表面上に互いに対して近接して配置できる微粒子を使用することで、半固形培地の表面の効果的な使用が可能になるとともに、検出時に互いに容易に区別できる離散したスポットももたらされる。スポットは、典型的には微粒子よりもサイズが小さく、互いにより明確に区別できるようになる。例えば、粒子と平坦な表面との接点の２５０ｎｍ以内に位置する直径１ミクロンの粒子上のＤＮＡが、平坦な表面に付着し、複製される場合には、粒子が解放された後に、直径５００ｎｍのＤＮＡパッチが表面にできることになる。１ミクロンのビーズ２つが接している場合には、あとにできるＤＮＡパッチの中心が１ミクロン離れており、各パッチの最も近い端部の間に５００ｎｍの空間ができる。ガラススライドなどの小さな基材の表面上に数百万の微粒子を充填する能力により、本プロセスは、近隣のコロニーに干渉されずに容易に画像化でき、また複数の配列決定サイクルにわたって簡単かつ信頼性の高い検出が可能となる十分な数の鋳型分子を含有する、鋳型コロニーの高密度アレイを実現する効率的な手段を提供する。
【０１４７】
基材に結合した微粒子に付着した鋳型には、種々のさらなる反応または操作を行うことができる。これは、例えば、本明細書に記載のようなライゲーションに基づく配列決定、またはＦＩＳＳＥＱやパイロシーケンシングなどの他の配列決定方法などの配列決定であってよい。例えば、上述のように微粒子を使用して形成される、半固形培地内の核酸コロニーに存在する鋳型に対して、本明細書に記載の本発明の配列法のいずれも実施することができる。
【０１４８】
本明細書に記載の方法に従って形成される微粒子または核酸コロニーのアレイは、一般的にランダムであり得る。本明細書で用いる場合、用語「ランダムパターンの」または「ランダム」は、不規則な非Ｃａｒｔｅｓｉａｎ分布（換言すると、格子のｘ軸およびｙ軸に沿った所定の点もしくは位置、または放射状パターンの中心からの角度もしくは半径の規定の「時計位置」で整列していない）支持体上での正体（特徴）であって、意図的な設計（もしくはかかる設計が達成され得るプログラム）または個々の正体の配置によって得られないものをいう。かかる「ランダムパターンの」または「ランダム」アレイの正体は、正体のプールを含む溶液、エマルジョン、エーロゾル、気体状のまたは乾燥した調製物を、支持体上または支持体内に滴下、噴霧、めっき、塗布、分布などさせ、支持体内または支持体上の特定の部位に指向させるなんらかの様式の介在なく支持体上または支持体内に沈降させることにより得られ得る。例えば、正体は、半固相支持体の前駆物質（例えば、アクリルアミドモノマー）を含有する溶液中に懸濁させ得る。次いで、この溶液を、第２の支持体上に分布させ、半固相支持体を第２の支持体上に形成させる。正体は、半固相支持体内または該支持体上に包埋される。もちろん、非ランダムアレイもまた使用され得る。微粒子の密接な充填は、規則正しいグリッド様のアレイの微粒子またはそれから合成される核酸コロニーをもたらし得る。一般的に、本明細書において使用されるアレイを形成するための方法は、例えば、ポリヌクレオチドの合成が、基質上の予め規定された位置の個々のヌクレオチドサブユニットの逐次適用によって行なわれる方法と異なる。
【０１４９】
図１４Ｂ（上）は、その上面にポリアクリルアミドゲルを有するスライド（１インチ×３インチ）の蛍光画像を示す。ビーズに結合させた鋳型にハイブリダイズされた蛍光標識されたオリゴヌクレオチドを有するビーズ（１ミクロン直径）は、ゲル内に固定化されている。この画像は、およそ２８０００００００ビーズ／スライドの画像化に充分なビーズ表面密度（すなわち、ビーズが位置する領域内の基材の単位面積あたりのビーズの数）を示す。表面密度および画像化可能な領域は、単一のスライド上で少なくとも５００００００００ビーズの画像化に充分である。例えば、図１４Ｂ（下）は、ビーズが半固相支持体層内に包埋されるポリアクリルアミドゲルなどの透明な領域を覆うテフロン（登録商標）マスクを有するスライドの概略図を示す。このマスクの面積は８６４ｍｍ２である。５００００００００個のビーズで、表面密度は５７８，０００ビーズ／ｍｍ２である。１ミクロンビーズの最密六方アレイでは１，１５５，０００ビーズ／ｍｍ２となるため、この実施形態は、理論最大密度の５２％を有するアレイをもたらす。この特定の実施形態より少数およびより多数のビーズ、およびより大きいかより小さいビーズ表面密度が使用され得ることは認識されよう。
【０１５０】
微粒子は、実質的に平面状の半固相支持体内もしくは該支持体上で、または別の支持体もしくは基材上で、いくつかの様式で規定され得るさまざまな密度でアレイ状であり得る。例えば、密度は、実質的に平面状のアレイの単位面積あたりの微粒子の数（例えば、球状微粒子）に関して表示され得る。本発明のある特定の実施形態において、実質的に平面状のアレイの単位面積あたりの微粒子の数は、六方アレイ内の微粒子の数の少なくとも８０％である。（「六方アレイ」により、米国特許第６，４０６，８４８号に記載のようなアレイ内のどの微粒子も少なくとも６個の他の隣接微粒子と等しい面積で接触している微粒子の実質的に平面状のアレイが意図される）。しかしながら、本発明の他の実施形態において、微粒子密度は低く、例えば、実質的に平面状のアレイの単位面積あたりの微粒子の数は、六方アレイ内の微粒子の数の８０％未満、７０％未満、６０％未満または５０％未満である。なんら理論に拘束されることを望まないが、例えば、酵素、プライマー、補因子などの試薬の充分な拡散を可能にするため、およびある種の試薬が微粒子に対して異なる親和性を有するか、その内部の捕捉された場合に起こり得る試薬分配効果を回避するため、これらなどより小さい密度を用いることが好ましいこと場合があり得る。かかる効果は、アレイ上の異なる位置で異なる反応条件をもたらし得、これらの試薬がアレイ上のある特定の位置に接近するのを妨げることすらあり得る。このような問題は、反応がフローセル内で行なわれる場合、試薬がフローセル内を方向的に移動するため、悪化し得る。本発明のある特定の実施形態において、混合装置、例えば、機械的または音波的手段によって液体混合を行なう装置をフローセルのチャンバ内に含める。いくつかの適当な混合装置が、当該技術分野で知られている。
【０１５１】
本発明の配列決定法は、あらゆる型（例えば、ランダムおよび非ランダム両方のアレイ）のアレイ形式に整列させた鋳型を用いて行なわれ、アレイは、微粒子のアレイまたは鋳型自体のアレイであり得る。例えば、その上面にアレイ状の鋳型を有する支持体は、米国特許第５，６４１，６５８号およびＰＣＴ公開公報ＷＯ００１８９５７に記載されている。アレイは、広範なさまざまな基材、例えば、フィルター、膜（例えば、ナイロン）、金属表面などの上に配置させ得る。その上面で伸長、ライゲーションおよび切断の反復サイクルによる配列決定が行なわれ得るアレイ形式のさらなる例は、ウェル内で光ファイバーの束の個々の光ファイバーの末端または遠位端に配置したビーズのアレイである。例えば、ＵＳ公開公報および特許、例えば、６，０２３，５４０；６，４２９，０２７、２００４０１８５４８３、２００２１８７５１５、ＰＣＴ出願ＵＳ９８／０５０２５およびＰＣＴ  ＵＳ９８／０９１６３ならびにＰＣＴ公開公報ＷＯ００３９５８７に記載されたビーズアレイおよび「アレイのアレイ」を参照のこと。自身に結合された鋳型を有するビーズは、本明細書に記載のようなアレイ状であり得る。増幅は、好ましくは、アレイの形成前に行なわれる。かかる基材上に形成されたアレイは、必ずしも実質的に平面状である必要はない。
【０１５２】
他の実施形態において、ＰＣＲは、基材または支持体に結合されたオリゴヌクレオチドを含むアレイ上で行なわれる（例えば、米国特許第５，７４４，３０５号；同第５，８００，９９２号；同第６，６４６，２４３号および関連特許（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）；ＰＣＴ公開公報ＷＯ２００４０２９５８６；ＷＯ０３０６５０３８；ＷＯ０３０４０４１０（Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ）  を参照）。一般に、かかるオリゴヌクレオチドは、遊離３’または５’末端を有する。所望の場合は、該末端は、例えば、リン酸基またはＯＨ基を３’末端に（既に存在しない場合）付加することにより修飾され得る。支持体または基材に結合されたオリゴヌクレオチドに相補的な領域を含む鋳型分子は、該オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされ、ＰＣＲがアレイ上でインサイチュで行なわれ、クローン鋳型集団がアレイ上の各位置にもたらされる。アレイに結合されたオリゴヌクレオチドは、増幅プライマーの１つとしての機能を果たし得る。次いで、鋳型を本明細書に記載のライゲーション系の方法を用いて配列決定する。配列決定はまた、Ｕ．Ｓ．公開公報２００３００６８６２９に記載のように、アレイ内の鋳型上で行なわれ得る。
【０１５３】
表面上へのＤＮＡアレイの作製のためのさらに他の方法が使用され得る。例えば、末端アルデヒド基で修飾されたアルカンチオールが、自己組織型単層（ＳＡＭ）を金表面上に作製するために使用され得る。該単層のアルデヒド基は、アミン修飾オリゴヌクレオチドまたは他のアミン担持生体分子と反応し、シッフ塩基を形成し得、次いで、これは、シアノ水素化ホウ素ナトリウムでの処理によって安定な第２級アミンに還元され得る（Ｐｅｅｌｅｎ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，  Ｌａｎｇｍｕｉｒ，  ２１（１）：２６６−７１，  ２００５）。次いで、鋳型のＰＣＲ増幅が行なわれ得る。あるいはまた、自身に結合された鋳型のクローン性の集団を有する微粒子を、微粒子または鋳型上のアミン基または粒子に結合されたオリゴヌクレオチドをかかる表面と反応させることによりにより表面に結合させ得る。
【０１５４】
自身に結合されたクローン鋳型集団を有する微粒子を得るさらに別の方法は、米国特許第５，６０４，０９７号に記載された「固相クローニング」アプローチであり、これは、同じ配列のポリヌクレオチドだけが任意の特定の微粒子に結合されるような、微粒子上のポリヌクレオチドを分取するためのオリゴヌクレオチドタグを利用する。
【０１５５】
本発明のある特定の実施形態において、伸長、ライゲーションおよび切断の反復サイクルによる配列決定は、配列決定試薬（例えば、伸長プローブ、リガーゼ、ホスファターゼなど）を支持体内または支持体上に固定化された鋳型のクローン性の集団を有する半固相支持体（例えば、ゲル）中に、各クローン性の集団が支持体の空間的に異なる領域に局在化されるように拡散させることによって行なわれる。ある特定の実施形態において、鋳型は、上記のように、半固相支持体に直接結合させる。しかしながら、他の実施形態では、代わりに半固相支持体内または該支持体上に固定化させた微粒子などの第２の支持体に、鋳型を固定化させる（これも上記のようのとおり）。
【０１５６】
実施例１に記載のように、本発明者らは、ロバスト（ｒｏｂｕｓｔ）なライゲーションおよび切断が、ポリアクリルアミドゲル内に固定化した鋳型結合ビーズ上で行なわれ得ることを示した。したがって、本発明は、（ａ）半固相支持体内または該支持体上に固定化された第１のポリヌクレオチドを提供する工程；（ｂ）第１のポリヌクレオチドを第２のポリヌクレオチドおよびリガーゼと接触させる工程；および（ｃ）第１および第２のポリヌクレオチドを、リガーゼの存在下ライゲーションに適した条件下で維持する工程を含む、第１のポリヌクレオチドを第２のポリヌクレオチドにライゲートさせる方法を提供する。好適な条件としては、使用される具体的なリガーゼに適切なバッファー、補因子、温度、時間などの提供が挙げられる。好ましい実施形態において、半固相支持体は、アクリルアミドゲルなどのゲルである。さらに好ましい実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、それ自体が、例えば、部分的または完全に包埋させることにより支持体マトリックス内に半固相支持体内または該支持体上に固定化されたビーズなどの支持体への結合の結果、半固相支持体内または該支持体上に固定化されている。あるいはまた、第１のポリヌクレオチドは、アクリダイト部分などの連結部によって半固相支持体に直接結合させ得る。連結は共有結合または非共有結合であり得る（例えば、ビオチン−アビジン相互作用による）。米国特許第６，５１１，８０３号には、核酸分子を本発明の好ましい支持体、すなわち、ポリアクリルアミドゲルに（ａ）結合させるために使用され得るさまざまな方法が記載されている。
【０１５７】
本発明は、さらに、（ａ）半固相支持体内または該支持体上に固定化され、切れやすい連結を含むポリヌクレオチドを提供する工程；（ｂ）該ポリヌクレオチドを切断剤と接触させる工程；および（ｃ）該ポリヌクレオチドを該切断剤の存在下、切断に適した条件下で維持する工程を含む、ポリヌクレオチドを切断する方法を提供する。好適な条件としては、特定の切断剤に適切なバッファー、温度、時間などの提供が挙げられる。好ましい実施形態において、半固相支持体は、アクリルアミドゲルなどのゲルである。さらに好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、それ自体が半固相支持体内に固定化されたビーズなどの支持体への結合の結果、半固相支持体に固定化されている。あるいはまた、ポリヌクレオチドは、アクリダイト部分などの連結部によって半固相支持体に直接結合させ得る。連結は共有結合または非共有結合であり得る（例えば、ビオチン−アビジン相互作用による）。当然ながら、本明細書に記載の多くの方法にしたがって調製されるＤＮＡ鋳型は、典型的には配列決定する領域を含有し、また３’端および５’端のいずれかまたは両方に保存プライミング領域も含有する（ＰＢＲ）。「保存」または「共通」領域とは、配列決定する種々の領域を含有する複数の鋳型に共通する配列を指し、すなわち、鋳型は、配列の一部は異なるものの、同一の部分も含有する。鋳型は、１つ以上の保存内部アダプター配列を含有する場合もある。さらに、ＤＮＡ鋳型のローリングサークル増幅（ＲＣＡ）は、これらの保存配列のさらなる複製を作成するだけでなく、ＲＣＡプローブからさらに別の領域の保存配列の複製も導入する。そのため、配列決定するライブラリー分子の部分（「標的領域」、「対象部分」などとも呼ばれる）は、実際の鋳型核酸の半分未満に相当する場合がある。本発明は、これらの既知の／共通する非標的領域が、一本鎖の場合に、配列決定プローブを封鎖することができ、また配列決定プライマー（例えば、開始オリゴヌクレオチド）のミスプライムの可能性がある部位であるという認識を包含する。本発明は、ポリヌクレオチド鋳型中に存在する非標的配列と相補的なブロッキングオリゴヌクレオチドを提供する。本明細書で使用される「ブロッキングオリゴヌクレオチド」とは、鋳型の非標的配列に安定してハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであり、この非標的配列は、配列決定に好適な条件下で種々の標的領域を含む複数の鋳型に共通する。非標的領域は、開始オリゴヌクレオチドが結合するとされる領域とは異なる。本発明はさらに、１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドがハイブリダイズするポリヌクレオチド鋳型も提供する。
【０１５８】
本発明のある実施形態において、鋳型はエマルジョンＰＣＲを使用して合成される。
【０１５９】
特に興味深い実施形態において、ＤＮＡ鋳型は、断片ライブラリーのメンバーであり、図３６Ｂに示す通り前方および後方アダプターを含有する。第１のブロッキングオリゴヌクレオチドは前方アダプターと相補的であり、第２のブロッキングオリゴヌクレオチドは後方アダプターと相補的である。他の実施形態において、ＤＮＡ鋳型は、対合末端ライブラリーのメンバーであり、図３６Ａに示す通り、前方および後方アダプターと、さらに内部アダプターも含有する。第１のブロッキングオリゴヌクレオチドは前方アダプターと相補的であり、第２のブロッキングオリゴヌクレオチドは後方アダプターと相補的であり、第３のブロッキングオリゴヌクレオチドは内部アダプターと相補的である。他の実施形態において、鋳型は、ＲＣＡを使用して増幅され、図３６Ｃおよび図３７に示す通りアダプター領域とパドロック領域とを含有する。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、鋳型に存在するアダプター領域およびパドロック領域と相補的である。ＲＣＡでは、パドロックプローブがポリメラーゼによって複製され、その相補体が生成されることが理解される。したがって、鋳型に存在するＲＣＡ相補体をブロックするために、パドロックプローブと同じ配列が、ブロッキングオリゴヌクレオチドとして使用される。図３６および図３７に示す特異的なオリゴヌクレオチドとそれらの相補体は、本発明の態様であるが、ブロッキングオリゴヌクレオチドの配列は、鋳型中に存在し、様々に異なることがある特定の保存配列と相補的になるように選択されることが認識される。さらに、本発明には、図３６または図３７に示すものと１個、２個、３個、４個または５個のヌクレオチドのみ配列が異なるオリゴヌクレオチドが含まれる。
【０１６０】
決して本発明を限定するものではないが、本発明者等は、例えば、鋳型の複雑性を低減させるツールとして作用する、ミスプライムの可能性がある部位を排除する、および／または鋳型の標的領域への伸長オリゴヌクレオチドのアクセスを容易にすることにより、前述の問題、あるいはこれらの共通配列の多くの複製が存在するために生じる場合があるその他の問題に対抗するために、ブロッキングオリゴヌクレオチドが使用される場合があることを認識した。本発明のある実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、例えばシグナル／ノイズ比の向上など、配列決定効率の向上をもたらす。
【０１６１】
ブロッキングオリゴヌクレオチドは、典型的には、配列決定プライマーのアニーリング前に一本鎖鋳型ＤＮＡにハイブリダイズされ、これらの領域がその後に配列決定プライマー（例えば、ライゲーションに基づく配列決定における開始オリゴヌクレオチド）またはプローブ（例えば、ライゲーションに基づく配列決定における伸長プローブ）のいずれかとハイブリダイズするのが防止される。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的にはライゲーション、検出、（および、伸長オリゴヌクレオチドが開裂される本発明の実施形態においては、開裂）の連続サイクルを通して存在し続けるとされる。本発明のある実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼまたはリガーゼの基材ではなく、例えば、これらのオリゴヌクレオチドは、典型的なポリメラーゼまたはリガーゼ酵素によって酵素的に伸長可能ではない。一実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、３’ヒドロキシル基および５’リン酸塩が欠損している。これらの基は、存在しない場合もあれば、合成後に除去される場合もあり、あるいはオリゴヌクレオチドの３’端および／または５’端が、伸長またはライゲーションの基材ではない部分でキャップまたはブロックされる場合もある。本発明のある実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、３’末端ジデオキシヌクレオシドを含む。本発明のある実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、３’末端ジデオキシシトシン（３‘ｄｄＣ）を含む。本発明のある実施形態において、対合タグライブラリーとともに使用するパドロックプローブは、単一タグそれぞれ（タグ１のみ、タグ２のみ）の、あるいは両タグの間（タグ１‐内部‐タグ２）のＲＣＡが可能となるように設計される（図３７）。
【０１６２】
ブロッキングオリゴヌクレオチドは、保存領域よりも短くてよく、すなわち、これらのオリゴヌクレオチドは、保存領域の一部のみと相補的であってよい。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、保存領域と完全に相補的である必要はないが、そうであるのが好ましい場合がある。典型的には、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、保存領域のすべてまたは一部と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％相補的となる。ブロッキングオリゴヌクレオチドのサイズは、ブロックする共通配列の長さによって変動する場合がある。典型的な長さは、１０〜５０ヌクレオチドである。それぞれがブロックする保存領域の一部と相補的である複数のブロッキングオリゴヌクレオチドが、単一のより長いオリゴヌクレオチドの代わりに使用される場合もある。
【０１６３】
ブロッキングオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載のようなライゲーションに基づく配列決定において特定の用途を見出す場合がある。したがって、本明細書に記載のいずれの方法も、鋳型を開始オリゴヌクレオチドと接触させる前に、プローブと鋳型の二本鎖を形成または提供する前に、および／または伸長した二本鎖を形成する前に、鋳型ポリヌクレオチドを１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドと接触させる手順を含む場合がある。但し、ブロッキングオリゴヌクレオチドはまた、ＦＩＳＳＥＱやパイロシーケンシングなどの他の配列決定法を実施する場合に使用される場合もある。
【０１６４】
Ｄ．種々の初期オリゴヌクレオチドを用いた再度初期化を伴う配列決定
本発明の好ましい実施形態において、第１の初期オリゴヌクレオチドを伸長させることによって生成された伸長鎖は、充分なサイクル数の後、鋳型から除去され、第２の初期オリゴヌクレオチドが結合領域にアニーリングされた後、伸長、ライゲーションおよび検出のサイクルが行なわれる。該プロセスは、任意の数の異なる初期オリゴヌクレオチドを用いて反復される。伸長プローブが切断される実施形態では、好ましくは、使用される異なる初期オリゴヌクレオチドの数（したがって、反応の数）は、プローブの遠位部分の放出後に鋳型にハイブリダイズされたままの伸長プローブの部分の長さに等しい。したがって、この実施形態によれば、配列情報（例えば、各ヌクレオチドの順番および正体）は、単一の支持体に結合された鋳型から得られ得るが、連続したヌクレオチドが各サイクルで同定される場合に必要とされ得るよりも実質的に少ないサイクルを用いて、さらに深く読み出しが行なわれる。
【０１６５】
初期オリゴヌクレオチドが同じ鋳型に連続的に結合される実施形態は、Ｍａｃｅｖｉｃｚにより教示された方法などの、鋳型を多数のアリコートに分割することを要するアプローチと比べてある種の利点を有する。例えば、初期オリゴヌクレオチドを同じ鋳型に適用することにより、多数のアリコートから取得されたデータを追跡し、後で組み合わせる必要性が回避される。個々の支持体の位置が所定でないような支持体がランダム様式のアレイ状である実施形態では、各々が自身に結合された同じ配列の鋳型を有する多数の支持体からの部分配列情報を信頼できるように組み合わせることは困難または不可能であり得る。
【０１６６】
Ｅ．単一の鋳型における各サイクルでの多数のヌクレオチドの同定
Ｍａｃｅｖｉｃｚには、伸長、ライゲーションおよび検出の各サイクルにおける鋳型内の単一のヌクレオチドの同定が教示されている。しかしながら、本発明者らは、該方法は、各サイクルで鋳型内の多数のヌクレオチドの同定が可能となるように変形し得ると認識した。この場合、伸長プローブは、伸長された二本鎖に接合された２つ以上の、好ましくは連続したヌクレオチドの正体が標識から決定され得るように標識される。換言すると、伸長プローブの配列決定部分は、１つより多くのヌクレオチドであり、典型的には、近位ヌクレオチド、直接隣接ヌクレオチド、およびおそらく１つ以上のさらなる、好ましくは連続したヌクレオチドを含み、これらはすべて、鋳型に特異的にハイブリダイズする。例えば、塩基Ａ、Ｇ、ＣおよびＴを特定する４つの標識を用いるのではなく、１６個の識別可能に標識されたプローブまたはプローブの組合せが、１６個の可能なジヌクレオチドＡＡ、ＡＧ、ＡＣ、ＡＴ、ＧＡ、ＧＧ、ＧＣ、ＧＴ、ＣＡ、ＣＧ、ＣＣ、ＣＴ、ＴＡ、ＴＧ、ＴＣおよびＴＴを特定するために使用される。各識別可能に標識された伸長プローブの配列決定部分は、これらのジヌクレオチドの１つに相補的である。より多くの標識を用いる同様の方法により、各サイクルで、より長鎖のヌクレオチド配列の同定が可能になる。
【０１６７】
Ｆ．標識
用語「標識」は、本明細書において、プローブと結合または会合した任意の検出可能な部分または複数の検出可能な部分であって、それにより異なる種のプローブ（例えば、異なる末端ヌクレオチドを有するプローブ）が互いに識別され得る部分を表すために広義で用いる。したがって、標識と特異的検出可能な部分との間に１対１の対応がある必要はない。例えば、多数の検出可能な部分が単一のプローブに結合され得、プローブが、自身に結合された異なる検出可能な部分または検出可能な部分の組を有するプローブと識別されるのを可能にする複合シグナルがもたらされ得る。例えば、検出可能な部分の組合せが、米国特許第６，６３２，６０９号およびＳｐｅｉｃｈｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２：３６８−３７５，１９９６に記載された「コンビナトリアルマルチカラーコーディング（Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ  Ｃｏｄｉｎｇ）」とよばれる標識スキームに従って使用され得る。
【０１６８】
本発明のプローブは、さまざまな様式、例えば、基質と接触させると検出可能なシグナルを生成する蛍光性または化学発光性部分、比色性部分、酵素性部分などの直接または間接的結合によって標識され得る。Ｍａｃｅｖｉｃｚには、プローブを蛍光染料、例えば、Ｍｅｎｃｈｅｎら，米国特許第５，１８８，９３４号；Ｂｅｇｏｔら  ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９０１０５５６５に開示されているもので標識させ得ることが教示されている。用語「蛍光染料」および「フルオロフォア」は、本明細書で用いる場合、規定の励起波長の光エネルギーを吸収し、異なる波長の光エネルギーを放出する部分をいう。好ましくは、所与のプローブ混合物での使用のために選択される標識は、スペクトルにより分離可能なものである。本明細書で用いる場合、「スペクトルにより分離可能な」は、標識が、作業条件下で、そのスペクトル特性、特に蛍光発光波長に基づいて識別され得ることを意味する。例えば、１つ以上の末端ヌクレオチドの正体は、最大光発光強度の異なる波長、またはおそらく異なる波長での強度比と相関し得る。標識を検出および同定するために用いられる標識のスペクトル特性（１つまたは複数）を、本明細書では「色」という。標識が、特異的スペクトル特性、例えば、単一の検出可能な部分からなる標識の場合は最大発光強度の周波数、または、多数の検出可能な部分からなる標識の場合は発光ピークの周波数に基づいて高頻度で同定されることは認識されよう。
【０１６９】
好ましくは、４種類のスペクトルにより分離可能な蛍光染料の各々と、４つの可能なプローブ末端ヌクレオチドとの１対１対応を可能にする４種類のプローブが提供される。スペクトルにより分離可能な色素の組は、米国特許第４，８５５，２２５号および同第５，１８８，９３４号；国際出願ＰＣＴ７ＵＳ９０／０５５６５；ならびにＬｅｅら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈｓ，２０：２４７１−２４８３（１９９２）に開示されている。ある特定の実施形態において、ＦＩＴＣ、ＨＥＸＴＭ、テキサスレッドおよびＣｙ５からなる組が好ましい。数多くの好適な蛍光染料が、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｅｕｇｅｎｅ  ＯＲから市販されている。蛍光染料の具体例としては、限定されないが、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０
ａｎｄ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０）、ＡＭＣＡ、ＡＭＣＡ−Ｓ、ＢＯＤＩＰＹ色素（ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５）、ＣＡＬ色素、カルボキシローダミン６Ｇ、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ、シアニン色素（Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５．５）、Ｄａｎｓｙｌ、Ｄａｐｏｘｙｌ、ジアルキルアミノクマリン、４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシ−フルオレセイン、ＤＭ−ＮＥＲＦ、エオシン、エリスロシン、フロレセイン、ＦＡＭ、ヒドロキシクマリン、ＩＲＤｙｅｓ（ＩＲＤ４０、ＩＲＤ  ７００、ＩＲＤ  ８００）、ＪＯＥ、リサミンローダミンＢ、マリンブルー、メトキシクマリン、ナフトフルオレセイン、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、Ｏｙｓｔｅｒ色素、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、ＰｙＭＰＯ、ピレン、ローダミン６Ｇ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、Ｒｈｏｄｏｌ  Ｇｒｅｅｎ、２’，４’，５’，７’−テトラ−ブロモスルホン−フルオレセイン、テトラメチル−ローダミン（ＴＭＲ）、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テキサスレッド、テキサスレッド−Ｘが挙げられる。Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，第９版，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｃ．，  ｆｏｒ  ｆｕｒｔｈｅｒ
ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎを参照のこと。
【０１７０】
それ自身が直接検出可能であるのではなく、一部の蛍光基は、非放射性蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）のプロセスにてエネルギーを別の基に転移させ、第２の基が、検出されるシグナルを生成する。すなわち、消光剤の使用もまた本発明の範囲内である。用語「消光剤」は、可視光を発光せずに励起された蛍光標識のエネルギーを、これに近接して配置された場合に吸収でき、消散できる部分をいう。消光剤の例としては、限定されないが、ＤＡＢＣＹＬ（４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸）スクシンイミジルエステル、ジアリールローダミンカルボン酸、スクシンイミジルエステル（ＱＳＹ−７）および４’，５’−ジニトロフルオレセインカルボン酸、スクシンイミジルエステル（ＱＳＹ−３３）（すべて、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ製）、消光剤１（Ｑｌ；
Ｅｐｏｃｈ製）または「ブラックホール（Ｂｌａｃｋ  ｈｏｌｅ）消光剤」ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２およびＢＨＱ−３（ＢｉｏＳｅａｒｃｈ，  Ｉｎｃ製）が挙げられる。
【０１７１】
上記の種々の検出可能な部分に加え、本発明はまた、スペクトルにより分離可能な量子ドット、金属ナノ粒子またはナノクラスターなどの使用の使用を包含し、これらは、オリゴヌクレオチドプローブに直接結合されたものであり得るか、または高分子マトリックス内に包埋もしくはこれと会合させ、次いでプローブに結合させたものであり得るかのいずれかである。上記のように、検出可能な部分は、それ自体が直接検出可能である必要はない。例えば、これらは、検出される基質に対して作用するものであってもよく、検出可能となるために修飾を必要とするものであってもよい。
【０１７２】
上記のように、本発明のある特定の実施形態において、標識は、複数の検出可能な部分からなる。これらの検出可能な部分からの複合シグナルにより色がもたらされ、これを、プローブの同定のために使用する。例えば、ある特定の配列の「紫色」のプローブは、「青色」および「赤色」の検出可能な部分を結合することにより構築され得る。あるいはまた、同じ配列を有するが異なる検出可能な部分で標識された２種類のプローブを組み合わせて混合プローブを作製することにより異なる色が生成され得る。したがって、ある特定の配列の「紫色」のプローブは、該配列を有する２種類のプローブを構築することにより作製され得る。「赤色」の検出可能な部分を第１の種に結合させ、「青色」の検出可能な部分を第２の種に結合させる。これらの２種類のアリコートを混合する。種々の濃度（ｓｈａｄｅ）の紫色が、アリコートを種々の比率で混合することにより生成され得る。このアプローチはいくつかの利点をもたらす。第１に、より少数の検出可能な部分を用いて多数の識別可能なプローブの生成を可能にする。第２に、混合プローブの使用により、特定の検出可能な部分と特定のヌクレオチド間の相互作用に起因し得る偏重の低減を補助し得る冗長（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）度が提供され得る。
【０１７３】
本発明のある特定の実施形態において、検出可能な部分は、ライゲーションおよび検出後に検出可能な部分の除去を可能にする切断可能な連結によってオリゴヌクレオチド伸長プローブ内のヌクレオチドに結合させる。任意のさまざまな異なる切断可能な連結が使用され得る。本明細書で用いる場合、オリゴヌクレオチドプローブにおける検出可能な部分およびヌクレオチドの文脈において、用語「切断可能な連結」は、検出可能な部分をヌクレオチドに接合させ、所望の場合は、結合されたヌクレオチドまたは核酸分子を本質的に改変することなく、切断されて検出可能な部分をヌクレオチドから除去し得る化学的部分をいう。切断は、連結の性質に応じて、例えば、酸もしくは塩基処理、または連結の酸化もしくは還元、または光処理（光切断）によってなされ得る。切断可能な連結および切断剤の例は、Ｓｈｉｒｎｋｕｓら．，１９８５，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：２５９３−２５９７；Ｓｏｕｋｕｐら．，１９９５，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．６：１３５−１３８；Ｓｈｉｍｉｋｕｓら．，１９８６，  ＤＮＡ  ５：２４７−２５５；ならびにＨｅｒｍａｎおよびＦｅｎｎ，１９９０，  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８４：５８４−５８８に記載されている。より一般的には、「開裂可能な連結」とは、２つの分子または正体を連結するために使用できる部分であって、容易に開裂できることによって、例えば分子または正体の安定性と両立する条件下で、構造を実質的に変更することなく、分子または正体の分離を可能にする部分を指す。
【０１７４】
例えば、米国特許第６，５１１，８０３号に記載のように、ジスルフィド結合が、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）などのチオール化合物還元剤を用いて還元され、それにより切断され得る。ヌクレオチドと反応性アリールアミノ基（例えば、ｄＣＴＰ）のように、フルオロフォアが、コンジュゲーションに利用され得るスルフヒドリル（ＳＨ）基とともに利用可能である（例えば、シアニン５またはシアニン３フルオロフォアとＳＨ基；Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ−ＤｕＰｏｎｔ）。反応性ピリジルジチオールは、スルフヒドリル基と反応してスルフヒドリル結合をもたらし、これは、ジチオトレイトールなどの還元剤により切断可能である。ＮＨＳ−エステルヘテロ二官能性架橋剤（Ｐｉｅｒｃｅ）は、反応性アリールアミノ基を含むデオキシヌクレオチドをピリジルジチオール基に連結させるために使用され得、これは、次いでフルオロフォア上のＳＨと反応性となり、本発明の方法に有用なジスルフィド結合された切断可能なヌクレオチドフルオロフォア複合体をもたらす。あるいはまた、ヌクレオチドとフルオロフォア間のシス−グリコール連結は過ヨウ素酸塩によって切断され得る。さまざまな切断可能な連結が、米国特許第６，６６４，０７９号および同第６，６３２，６５５号、ＵＳ出願公開公報２００３０１０４４３７、ＷＯ  ０４／１８４９７およびＷＯ  ０３／４８３８７に記載されている。
【０１７５】
本発明の他の実施形態において、光などの電磁エネルギーへの曝露によって非検出可能となり得る検出可能な部分（光退色性）が使用される。
【０１７６】
切断可能な連結によってプローブに結合された標識を有するか、または光退色性となり得る標識を有する伸長プローブを用いる本発明の実施形態において、配列決定法は、典型的には、ライゲーションおよび標識検出が行なわれた後、１回以上のサイクルにおいて切断または光退色工程を含む。上記のように、オリゴヌクレオチド伸長プローブ内に存在する切れやすい連結の切断は、完結するまで進行し得ない（すなわち、新たにライゲートされたプローブの１００％未満が、ライゲートされたサイクルにおいて切断され得る）。かかるプローブは一般的に、伸長不可能な末端を含むか、またはキャップされているため、連続的サイクルに寄与しない。しかしながら、プローブが切断されないことは、標識が、プローブライゲートされる鋳型分子と会合したままであることを意味し、これは、後続のサイクルにおけるノイズを増大させ得るバックグラウンドシグナル（すなわち、バックグラウンド蛍光）に寄与する。標識を除去するため、または非検出可能とするための切断または光退色の工程を組み込むことは、このバックグラウンドを低減させ、信号対雑音比が改善される。切断または光退色は、各サイクルごとにできるだけ多く行なってもよく、サイクル１回おき、３回に１回、５回以上に１回などの低頻度で行なってもよい。本発明のある特定の実施形態において、切断可能なリンカーの切断を達成するための任意のさらなる工程を実際に加える必要はない。例えば、ＤＴＴなどの切断剤を、非ライゲート伸長プローブを除去するために使用され得る洗浄バッファー中に既に存在させてもよい。
【０１７７】
Ｇ．好ましい切れやすい連結
本発明者は、少なくとも１つのホスホロチオレート結合を有する伸長プローブが、伸長、ライゲーション、検出および切断の連続的サイクルによる配列決定のための方法の実施において特に有用であることを見出した。かかる連結では、ホスホジエステル結合の橋絡酸素原子の１つがイオウ原子で置き換えられている。ホスホロチオレート結合は、図４Ａに示すような５’−Ｓ−ホスホロチオレート結合（３’−Ｏ−Ｐ−Ｓ−５’）または図４Ｂに示すような３’−Ｓ−ホスホロチオレート結合（３’−Ｓ−Ｐ−Ｏ−５’）のいずれかであり得る。図４Ａおよび４Ｂに示すように、３’−Ｏ−Ｐ−Ｓ−５’または３’−Ｓ−Ｐ−Ｏ−５’で表される連結内のリン原子は、２つの非橋絡酸素原子に結合され得ることを理解されたい（典型的なホスホジエステル結合の場合と同様）。あるいはまた、リン原子は、任意のさまざまな他の原子または基、例えば、Ｓ、ＣＨ３、ＢＨ３などに結合され得る。したがって、本発明の一態様は、ホスホロチオレート結合を含む標識されたオリゴヌクレオチドプローブである。プローブには、本明細書に記載した配列決定法において具体的な用途が見られるが、さまざまな他の目的にもまた使用され得る。特に、本発明は、（ｉ）形態５’−Ｏ−Ｐ−Ｏ−Ｘ−Ｏ−Ｐ−Ｓ−（Ｎ）ｋＮＢ＊−３’のオリゴヌクレオチド；および（ｉｉ）形態５’−ＮＢ＊（Ｎ）ｋ−Ｓ−Ｐ−Ｏ−Ｘ−３’のオリゴヌクレオチドを提供する。これらのプローブの各々において、Ｎは任意のヌクレオチドを表し、ＮＢはリガーゼによって伸長可能でない部分を表し、＊は検出可能な部分を表し、Ｘはヌクレオチドを表し、ｋは１〜１００である。ある特定の実施形態において、ｋは、１〜５０、１〜３０、１〜２０、例えば４〜１０である、ただし、検出可能な部分は、（Ｎ）ｋの任意のヌクレオシド上にＮＢの代わりまたはこれに加えて存在するものとする。任意のこれらのプローブ内の末端ヌクレオチドは、リン酸基またはヒドロキシル基を含むものであってもそうでなくてもよい。さらにまた、該リン原子は、好ましい実施形態において、一般的に、２つのさらなる（非橋絡）酸素原子に結合されていることは認識されよう。
【０１７８】
５’−Ｓ−ホスホロチオレートまたは３’−Ｓ−ホスホロチオレート結合を含有するオリゴヌクレオチドを合成するための方法は、当該技術分野で知られており、これらの方法のある特定のものは、自動固相オリゴヌクレオチド合成に適している。合成手順は、例えば、Ｃｏｏｋ，  ＡＦ，  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，９２：１９０−１９５，１９７０；Ｃｈｌａｄｅｋ，  Ｓ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，９４：２０７９−２０８４，１９７２；Ｒｙｂａｋｏｖ，  ＶＮら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，９：１８９−２０１，１９８１；Ｃｏｓｓｔｉｃｋ，  Ｒ．およびＶｙｌｅ，  ＪＳ，  Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．ＣＨｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，９９２−９９２，１９８８；Ｍａｇ，
Ｍ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １９（７）；１４３７−１４４１，１９９１；Ｘｕ，  Ｙ，およびＫｏｏｌ，  ＥＴ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２６（１３）：３１５９−３１６４，１９９８；Ｃｏｓｓｔｉｃｋ，  Ｒ．およびＶｙｌｅ，  ＪＳ，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３０：４６９３−４６９６，１９８９；Ｃｏｓｓｔｉｃｋ，  Ｒ．およびＶｙｌｅ，  ＪＳ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８：８２９−８３５，  １９９０；Ｓｕｎ，  ＳＧおよびＰｉｃｃｉｒｉｌｌｉ，  ＪＡ，  Ｎｕｃｌ．Ｎｕｃｌ，１６：１５４３−１５４５，１９９７；Ｓｕｎ  ＳＧら、ＲＮＡ，３：１３５２−１３６３，１９９７；Ｖｙｌｅ，  ＪＳら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３３：３０１７−３０２０，１９９２；Ｌｉ，  Ｘ．ら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．，１：２１２３−２２１２９，１９９４；Ｌｉｕ，  ＸＨ  ａｎｄ  Ｒｅｅｓｅ，  ＣＢ，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  ３７：９２５−９２８，１９９６；Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，  ＬＢら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１１８：１０３４１−１０３５０，１９９６；ならびにＳａｂｂａｇｈ，  Ｇ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３２（２）：４９５−５０１，２００４に記載されている。また、本発明者らは、新たな合成方法を開発した。例えば、図７は、ｄＡの３’−ホスホロアミデートの合成スキームを示す。同様のスキームが、ｄＧの３’−ホスホロアミデートの合成に使用され得る。これらのホスホロアミデートは、プリンヌクレオシドと会合した３’−Ｓ−ホスホロチオレート結合を含有するオリゴヌクレオチドを、例えば、自動ＤＮＡ合成装置を用いて合成するために使用され得る。
【０１７９】
ホスホロチオレート連結は、さまざまな金属含有薬剤を用いて切断され得る。金属は、例えば、Ａｇ、Ｈｇ、Ｃｕ、Ｍｎ、ＺｎまたはＣｄであり得る。好ましくは、該薬剤は、Ａｇ＋、Ｈｇ＋＋、Ｃｕ＋＋、Ｍｎ＋＋、Ｚｎ＋またはＣｄ＋アニオンを提供する水溶性の塩である（他の酸化状態のイオンを提供する塩もまた使用され得る）。Ｉ２もまた使用され得る。硝酸銀（ＡｇＮＯ３）などの銀含有塩またはＡｇ＋イオンを提供する他の塩，は特に好ましい。好適な条件としては、例えば、５０ｍＭ  ＡｇＮＯ３、約２２〜３７℃で１０分以上（例えば、３０分間）が挙げられる。好ましくは、ｐＨは、４．０〜１０．０、より好ましくは５．０〜９．０、例えば約６．０〜８．０、例えば約７．０である。例えば、Ｍａｇ，  Ｍ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９（７）：１４３７−１４４１，１９９１を参照のこと。例示的なプロトコルを実施例１に示す。
【０１８０】
５’→３’方向の配列決定は、３’−Ｏ−Ｐ−Ｓ−５’連結を含有する伸長プローブを用いて行なわれ得る。図５Ａは、形態５’−Ｏ−Ｐ−Ｏ−Ｘ−Ｏ−Ｐ−Ｓ−ＮＮＮＮＮＢ＊−３’（式中、Ｎは任意のヌクレオチドを表し、ＮＢはリガーゼによって伸長可能でない部分を表し（例えば、ＮＢは、３’ヒドロキシル基がないヌクレオチドであるか、またはブロッキング部分が結合されている）、＊は検出可能な部分を表し、Ｘは、その正体が検出可能な部分に対応するヌクレオチドを表す）の伸長プローブを用いたハイブリダイゼーション、ライゲーションおよび切断１サイクルを示す。あるいはまた、多重ライゲーションを抑制するため、任意の多数のブロッキング部分を３’末端ヌクレオチドに結合させ得る。例えば、バルキー基をヌクレオチドの糖鎖部分、例えば、２’位または３’位に結合させることにより、ライゲーションが抑制される。蛍光標識は、適切なバルキー基としての機能を果たし得る。
【０１８１】
結合領域４０および未知配列のポリヌクレオチド領域５０を含有する鋳型を支持体、例えば、ビーズに結合させる。好ましい実施形態において、図５Ａに示すように、結合領域は、支持体への結合点と反対の鋳型の末端に位置する。伸長可能な末端（この場合は、遊離３’ＯＨ基）を有する初期オリゴヌクレオチド３０を、結合領域４０にアニーリングさせる。伸長プローブ６０をポリヌクレオチド領域５０内の鋳型にハイブリダイズさせる。ヌクレオチドＸは、鋳型内の未知ヌクレオチドＹと相補塩基対を形成する。伸長プローブ６０を初期オリゴヌクレオチドにライゲートさせる（例えば、Ｔ４リガーゼを用いて）。ライゲーション後、伸長プローブ６０に結合された標識を検出する（図示せず）。標識は、ヌクレオチドＸの正体に対応する。したがって、ヌクレオチドＹが、ヌクレオチドＸに相補的なヌクレオチドとして同定される。次いで、伸長プローブ６０をホスホロチオレート結合で切断し（例えば、ＡｇＮＯ３またはＡｇ＋イオンを提供する別の塩を用いて）、伸長された二本鎖が得られる。切断によりリン酸基が伸長された二本鎖の３’末端に生じる。ホスファターゼ処理が、伸長可能なプローブ末端を伸長された二本鎖に生成させるために使用される。該プロセスを所望回数サイクル反復する。
【０１８２】
好ましい実施形態では、配列決定は、３’→５’方向に３’−Ｓ−Ｐ−Ｏ−５’連結を含有する伸長プローブを用いて行なわれる。図５Ｂは、形態５’−ＮＢ＊−ＮＮＮＮ−Ｓ−Ｐ−Ｏ−Ｘ−３’（式中、Ｎは任意のヌクレオチドを表し、ＮＢはリガーゼによって伸長可能でない部分を表し（例えば、ＮＢは、５’リン酸基がないヌクレオチドであるか、またはブロッキング部分が結合されている）、＊は検出可能な部分を表し、Ｘは、その正体が検出可能な部分に対応するヌクレオチドを表す）の伸長プローブを用いたハイブリダイゼーション、ライゲーションおよび切断の１サイクルを示す。
【０１８３】
結合領域４０および未知配列のポリヌクレオチド領域５０を含有する鋳型を支持体、例えば、ビーズに結合させる。好ましい実施形態において、図５Ｂに示すように、結合領域は、支持体への結合点と反対の鋳型の末端に位置する。伸長可能な末端（この場合は、遊離５’リン酸基）を有する初期オリゴヌクレオチド３０を、結合領域４０にアニーリングさせる。伸長プローブ６０をポリヌクレオチド領域５０内の鋳型にハイブリダイズさせる。ヌクレオチドＸは、鋳型内の未知ヌクレオチドＹと相補塩基対を形成する。伸長プローブ６０を初期オリゴヌクレオチドにライゲートさせる（例えば、Ｔ４リガーゼを用いて）。ライゲーション後、伸長プローブ６０に結合された標識を検出する（図示せず）。標識は、ヌクレオチドＸの正体に対応する。したがって、ヌクレオチドＹが、ヌクレオチドＸに相補的なヌクレオチドとして同定される。次いで、伸長プローブ６０をホスホロチオレート結合で切断し（例えば、ＡｇＮＯ３またはＡｇ＋イオンを提供する別の塩を用いて）、伸長された二本鎖が得られる。切断により伸長可能な一リン酸基が伸長された二本鎖の５’末端に生じ、したがって、伸長可能な末端を生成させるためのさらなる工程を行なうことは不必要である。該プロセスを所望回数サイクル反復する。
【０１８４】
このスキームのいくつかの変形例が使用され得ることは認識されよう。例えば、プローブは６ヌクレオチドよりも短くても長くてもよく、標識は３’末端ヌクレオチド上である必要はなく、Ｐ−Ｓ連結は任意の２つの隣接するヌクレオチド間に位置し得るなどである。上記の実施形態では、伸長、ライゲーション、検出および切断の連続的サイクルにより、隣接して位置するヌクレオチドの同定がもたらされる。しかしながら、Ｐ−Ｓ連結を伸長プローブの遠位端（すなわち、ライゲーションが起こる末端と反対の末端）に対してより近くに配置することによって、上記ならびに図１および６に示すように、連続的に同定されるヌクレオチドは鋳型に沿って間隔があく。
【０１８５】
図６Ａ〜６Ｆは、単一の鋳型において連続的に行なわれるいくつかの配列決定反応のより詳細な概略図である。配列決定は、３’→５’方向に３’−Ｓ−Ｐ−Ｏ−５’連結を含有する伸長プローブを用いて行なわれる。各配列決定反応は、伸長、ライゲーション、検出および切断の多数のサイクルを含む。該反応では、鋳型の異なる部分に結合する初期オリゴヌクレオチドを用いる。伸長プローブは８ヌクレオチド長であり、プローブの３’末端から数えて６番目と７番目のヌクレオチド間に位置するホスホロチオレート結合を含有する。ヌクレオチド２〜６は、各反応で、鋳型に沿って間隔があいている複数のヌクレオチドの同定が可能となるようにスペーサーとしての機能を果たす。多数の反応を順次行ない、各反応で得られた部分配列情報を適切に組み合わせることにより、鋳型の一部分完全な配列が決定される。
【０１８６】
図６Ａは、伸長可能な二本鎖を得るための、鋳型内のアダプター配列（図６Ａ〜６Ｆでは結合領域という）にハイブリダイズさせた第１の初期オリゴヌクレオチド（図６Ａ〜６Ｆではプライマーという）を用いた初期化を示す。図６Ｂ〜６Ｄは、ヌクレオチド同定のいくつかのサイクルを示し、この場合、鋳型は６塩基ごとに読み出しされる。図６Ｂでは、第１の未知鋳型内のヌクレオチド配列に相補的な３’末端ヌクレオチドを有する第１の伸長プローブが鋳型に結合し、プライマーの伸長可能な末端にライゲートされる。伸長プローブに結合された標識により、プローブは３’末端ヌクレオチドとしてＡを有すると同定され、したがって、鋳型配列内の第１の未知ヌクレオチドはＡであると同定される。図６Ｃは、ホスホロチオレート結合でのＡｇＮＯ３による伸長オリゴヌクレオチドの切断および伸長プローブの標識が結合された部分の放出を示す。図６Ｄは、伸長、ライゲーションおよび切断のさらなるサイクルを示す。プローブは５ヌクレオチド長のスペーサーを含むため、配列決定反応により、鋳型は６ヌクレオチドごとに同定される。
【０１８７】
所望回数サイクル後、第１の初期化ヌクレオチドを含む伸長鎖が除去され、第１の初期オリゴヌクレオチドが結合した部分と異なる結合領域の部分に結合する第２の初期オリゴヌクレオチドが、鋳型にハイブリダイズされる。図６Ｅは、第２の配列決定反応を示し、この場合、初期化は、第２の初期オリゴヌクレオチドにより行なわれ、その後、数回サイクルのヌクレオチド同定が行なわれる。図６Ｆは、第３の初期オリゴヌクレオチドを用いた初期化後、数回サイクルのヌクレオチド同定を示す。第２の初期オリゴヌクレオチドからの伸長により、第１の配列決定反応同定されたヌクレオチドと異なる「フレーム」内で６塩基ごとの同定が可能になる。
【０１８８】
ホスホロチオレート結合を含む伸長プローブは、本発明のある特定の実施形態において好ましいが、さまざまな他の切れやすい連結が好都合に使用され得る。例えば、天然に存在する核酸に見られるＯ−Ｐ−Ｏ連結に対する多数のバリエーションが知られている（例えば、Ｍｉｃｋｌｅｆｉｅｌｄ，  Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，８：１１５７−１１７９，２００１を参照）。本明細書に記載されたＰ−Ｏ結合を含む任意の構造は、切れやすいＰ−Ｓ結合を含むように修飾され得る。例えば、ＮＨ−Ｐ−Ｏ結合をＮＨ−Ｐ−Ｓ結合に変更してもよい。
【０１８９】
本発明のある一部の実施形態において、伸長プローブは、核酸を、切断剤またはその組合せによる切断に対して感受性とする（任意選択で、修飾剤によるトリガー残基の修飾後）トリガー残基を含む。特に、本発明者らは、ＤＮＡ修復に関与する酵素は、伸長、ライゲーション、検出および切断の連続的サイクルによる配列決定のための方法の実施における使用のための好都合な切断試薬であることを見出した。一般に、伸長プローブ内における損傷塩基または無塩基残基などのトリガー残基の存在により、プローブは、１種類以上のＤＮＡ修復酵素による切断に対して感受性となり得る（任意選択で、ＤＮＡグリコシラーゼによる修飾後）。したがって、ＡＰエンドヌクレアーゼなどのＤＮＡ修復に関与する酵素による切断の基質である連結を含む伸長プローブは、本発明において有用である。修飾によりプローブがＡＰエンドヌクレアーゼによる切断に対して感受性となるＤＮＡグリコシラーゼなどのＤＮＡ修復に関与する酵素による修飾の基質である残基を含有する伸長プローブもまた、本発明に特に有用である。ある一部の実施形態において、伸長プローブは、無塩基残基を含む、すなわちプリンまたはピリミジン塩基がない。無塩基残基と隣接ヌクレオシド間の連結は、ＡＰエンドヌクレアーゼによって切断に対して感受性であり、したがって、切れやすい連結である。本発明のある特定の実施形態において、無塩基残基は２’デオキシリボースを含む。ある一部の実施形態において、伸長プローブは損傷塩基を含む。損傷塩基は、ＤＮＡグリコシラーゼなどの損傷塩基を除去する酵素の基質である。損傷塩基の除去後、得られる無塩基残基と隣接ヌクレオシド間の連結は、ＡＰエンドヌクレアーゼによる切断に対して感受性であり、したがって、本発明に従う切れやすい連結とみなされる。
【０１９０】
多くの異なるＡＰエンドヌクレアーゼが本発明における切断試薬として有用である。ＡＰエンドヌクレアーゼの２つの主な類型が、無塩基残基に隣接する連結を切断する機構に基づいて識別されている。類型ＩのＡＰエンドヌクレアーゼ、例えば、大腸菌のエンドヌクレアーゼＩＩＩ（Ｅｎｄｏ  ＩＩＩ）およびエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ（Ｅｎｄｏ  ＶＩＩＩ）ならびにヒト類縁体ｈＮＴＨ１、ＮＥＩＬ１、ＮＥＩＬ２およびＮＥＩＬ３などは、ＡＰ残基の３’側のＤＮＡを切断し、３’末端リン酸基を有する５’部分および５’末端リン酸基を担持する３’部分をもたらすＡＰリアーゼである。類型ＩＩのＡＰエンドヌクレアーゼ、例えば、例えば、大腸菌のエンドヌクレアーゼＩＶ（Ｅｎｄｏ  ＩＶ）およびエクソヌクレアーゼＩＩＩ（Ｅｘｏ  ＩＩＩ）などは、ＡＰ部位の５’のＤＮＡを切断し、３’ＯＨおよび５’デオキシリボースリン酸基部分を生じる断片の末端に生成させる。種々の類型Ｉおよび類型ＩＩのＡＰエンドヌクレアーゼならびに損傷塩基のＤＮＡからのを除去および／または無塩基残基含有ＤＮＡの切断の条件のさらなる論考については、例えば、Ｄｏｕｂｌｉｅ，  Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  １０１（２８），１０２８４−１０２８９，２００４；Ｈａｌｔｉｗａｎｇｅｒ，  Ｂ．Ｍ．ら，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，３４５，８５−８９，２０００；Ｌｅｖｉｎ，  Ｊ．ａｎｄ  Ｄｅｍｐｌｅ，  Ｂ．，  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ，１８（１７），１９９０、および前記文献中の参考文献を参照のこと。当業者には、これらの酵素のさまざまな類縁体が、他の生物体（例えば、酵母）に存在し、本発明において有用であることが認識されよう。
【０１９１】
ある種の酵素は、グリコシラーゼ活性を有し、損傷塩基を除去してＡＰ残基を生成させ、また、グリコシラーゼ活性によって生成されたＡＰ部位の３’側でホスホジエステル主鎖を切断するリアーゼ活性を示すという両方の点で二官能性である。したがって、このような二重活性酵素は、ＡＰエンドヌクレアーゼとＤＮＡグリコシラーゼの両方である。例えば、Ｅｎｄｏ  ＶＩＩＩは、Ｎ−グリコシラーゼとＡＰ−リアーゼの両方として作用する。Ｎ−グリコシラーゼ活性により損傷ピリミジンが二本鎖ＤＮＡから放出され、無プリン（ＡＰ部位）をもたらされる。ＡＰ−リアーゼ活性により、ＡＰ部位の３’および５’側が切断され、５’リン酸基および３’リン酸基が生じる。エンドヌクレアーゼＶＩＩＩによって認識および除去される損傷塩基としては、尿素、５，６−ジヒドロキシチミン、チミングリコール、５−ヒドロキシ−５−メチルヒダントン、ウラシルグリコール、６−ヒドロキシ−５、６−ジヒドロチミンおよびメチルタートロニル（ｔａｒｔｒｏｎｙｌ）尿素が挙げられる。例えば、Ｄｉｚｄａｒｏｇｌｕ，  Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，１２１０５−１２１１１，１９９３およびＨａｔａｈｅｔ，  Ｚ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１８８１４−１８８２０，１９９４；Ｊｉａｎｇ，  Ｄ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２７２（５１），３２２２０−３２２２９，１９９７；Ｊｉａｎｇ，  Ｄ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔ，１７９（１１），  ３７７３−３７８２，  １９９７を参照のこと。
【０１９２】
Ｆｐｇ（ホルムアミドピリミジン［ｆａｐｙ］−ＤＮＡグリコシラーゼ）（８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼとしても知られる）もまた、Ｎ−グリコシラーゼとＡＰ−リアーゼの両方として作用する。Ｎ−グリコシラーゼ活性により損傷プリンが二本鎖ＤＮＡから放出され、無プリン（ＡＰ部位）がもたらされる。ＡＰ−リアーゼ活性により、ＡＰ部位の３’および５’側両方が切断され、それによりＡＰ部位が除去され、１塩基ギャップが生じる。Ｆｐｇ認識および除去される損傷塩基の一例としては、７，８−ジヒドロ−８−オキソグアニン（８−オキソグアニン）、８−オキソアデニン、ｆａｐｙ−グアニン、メチル−ｆａｐｙ−グアニン、ｆａｐｙ−アデニン、アフラトキシンＢ１−ｆａｐｙ−グアニン、５−ヒドロキシ−シトシンおよび５−ヒドロキシ−ウラシルが挙げられる。例えば、Ｔｃｈｏｕ，  Ｊ．ら．Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２６９，１５３１８−１５３２４，１９９４；Ｈａｔａｈｅｔ，  Ｚ．ら．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１８８１４−１８８２０，  １９９４；Ｂｏｉｔｅｕｘ，  Ｓ．ら，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，５，３１７７−３１８３，１９８７；Ｊｉａｎｇ，  Ｄ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２（５１），３２２２０−３２２２９，１９９７；Ｊｉａｎｇ，  Ｄ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔ，  １７９（１１），３７７３−３７８２，１９９７を参照のこと。
【０１９３】
いくつかのＤＮＡグリコシラーゼおよびＡＰエンドヌクレアーゼは、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｐｓｗｉｃｈ，  ＭＡから市販されている。
【０１９４】
本発明のある一部の実施形態において、ＡＰエンドヌクレアーゼによる切断のための基質である部位を含む伸長プローブが、ホスホロチオレート結合を含有する伸長プローブの上記のような配列決定法、または配列決定法ＡＢ（下記参照）に使用される。任意のこれらの方法では、伸長プローブのライゲーションにより核酸鎖を成長させた後、伸長プローブをＡＰエンドヌクレアーゼを用いて切断し、プローブの標識を含む部分を除去する。
【０１９５】
具体的なＡＰエンドヌクレアーゼに応じて、および配列決定が３’→５’または５’→３’方向のどちらで行なわれるかに応じて、切断後、伸長された二本鎖をポリヌクレオチドキナーゼまたはホスファターゼで処理し、伸長可能なプローブ末端を伸長された二本鎖上に生成させることが必要または望ましいことがある（伸長可能なプローブ末端を示す図５Ａおよび５Ｂ参照）。したがって、本発明のある特定の方法では、伸長可能な末端を、ポリヌクレオチドキナーゼまたはホスファターゼでの処理によって生成させる。当業者には、種々の酵素に適切なバッファーが使用され、酵素を除去し、該方法の後続の工程に適切な条件を提供するための洗浄するさらなる工程を含め得ることが認識されよう。
【０１９６】
他の実施形態において、伸長プローブは、ＤＮＡグリコシラーゼによる除去のための基質である損傷塩基を含む。広範な細胞傷害性および変異原性ＤＮＡ塩基が、ＤＮＡの損傷後に塩基切除修復経路を起始させる種々のＤＮＡグリコシラーゼによって除去される（Ｋｒｏｋａｎ，  Ｈ．Ｅ．ら，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，３２５（Ｐｔ  １）：１−１６，１９９７）。ＤＮＡグリコシラーゼは、損傷塩基とデオキシリボース間のＮ−グリコシド結合を切断し、したがって、遊離塩基を放出させ無プリン／無ピリミジン（ＡＰ）部位をもたらす。ある一部の実施形態において、伸長プローブは、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）によって除去されるウラシル残基を含む。ＵＤＧは、これまでに研究されたあらゆる生きた生物体に見られ、これらの酵素の多くが当該技術分野で知られており、本発明に有用である（Ｆｒｅｄｅｒｉｃａら，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９，  ２３５３−２５３７，１９９０；Ｋｒｏｋａｎ、前掲）。例えば、哺乳動物は、少なくとも４種類のＵＤＧ：ミトコンドリアＵＮＧ１および核ＵＮＧ２、ＳＭＵＧ１、ＴＤＧおよびＭＢＤ４を含む（Ｋｒｏｋａｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２１，８９３５−８９４８，２００２）。ＵＮＧ１およびＵＮＧ２は、大腸菌Ｕｎｇに代表される高度に保存されたファミリーに属する。伸長プローブが損傷塩基を含む実施形態では、伸長可能なプローブ末端への伸長プローブのライゲーション後、伸長された二本鎖を、損傷塩基除去するグリコシラーゼと接触させ、それにより無塩基残基を生成させる。グリコシラーゼによる除去に供された損傷塩基を含む伸長プローブは、「切れやすい連結を含むように容易に修飾可能である」とみなされる。次いで、伸長された二本鎖を、上記のような無塩基残基と隣接ヌクレオシド間の連結を切断するＡＰエンドヌクレアーゼと接触させる。本発明のある特定の実施形態において、ＤＮＡグリコシラーゼとＡＰエンドヌクレアーゼの両方である二重活性酵素は、これらの反応の両方を行うために使用される。ある一部の実施形態では、損傷塩基を含有する伸長された二本鎖を、ＤＮＡグリコシラーゼおよびＡＰエンドヌクレアーゼと接触させる。これらの酵素は、本発明の種々の実施形態において、組合せて、または連続的に（すなわち、グリコシラーゼの後エンドヌクレアーゼ）使用され得る。
【０１９７】
本発明のある一部の実施形態において、伸長プローブは、デオキシイノシンであるトリガー残基を含む。上記のように、大腸菌エンドヌクレアーゼＶ（Ｅｎｄｏ  Ｖ）（デオキシイノシン３’エンドヌクレアーゼともいわれる）およびその類縁体は、デオキシイノシン含有する核酸を、デオキシイノシン残基の３’側の第２のホスホジエステル結合で切断し、３’ＯＨおよび５’リン酸基末端をもたらす。したがって、この結合は、伸長プローブ内の切れやすい連結としての機能を果たす。Ｅｎｄｏ  Ｖおよびその切断特性は、当該技術分野で知られている（Ｙａｏ，  Ｍ．およびＫｏｗ  Ｙ．Ｗ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，３０６７２−３０６７３（１９９６）；Ｙａｏ，  Ｍ．およびＫｏｗ
Ｙ．Ｗ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２８６０９−２８６１６（１９９５）；Ｈｅ，  Ｂら、Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ．，  ４５９，  １０９−１１４（２０００）。デオキシイノシンに加え、Ｅｎｄｏ  Ｖはまた、デオキシウリジン、デオキシキサントシンおよびデオキシオキサノシンを認識する（Ｈｉｔｃｈｃｏｃｋ，  Ｔ．ら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３２（１３），３２（１３）（２００４）。ｍＥｎｄｏ  Ｖなどの哺乳動物の類縁体もまた切断活性を示す（Ｍｏｅ，  Ａ．ら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３１（１４），３８９３−３９００（２００４）。Ｅｎｄｏ  Ｖは、デオキシイノシンを含むプローブの好ましい切断剤であるが、他の切断試薬もまた、デオキシイノシンを含むプローブを切断するために使用され得る。例えば、損傷塩基としてヒポキサンチンが、適切なＤＮＡグリコシラーゼによる除去に供され得、生じた無塩基残基含有伸長プローブが、次いで、エンドヌクレアーゼによる切断に供される。
【０１９８】
デオキシイノシンがトリガー残基として使用される場合、プローブ内のどこか、特に、伸長可能なプローブ末端にライゲートされる末端とトリガー残基間の位置でのデオキシイノシンの使用を回避することが望ましいことがあり得ることは認識されよう。したがって、プローブが１つ以上の普遍塩基を含む場合、デオキシイノシン以外のヌクレオシドが使用され得る。また、トリガー残基を含有する核酸を、ある特定の切断剤による切断に感受性にするトリガー残基が伸長プローブ内に使用される場合、同じ切断剤による切断を誘発し得る他の残基をプローブ内に（または該伸長プローブとともに配列決定反応に使用され得る他のプローブ内に）を含めることを回避することが望ましいことがあり得ることも認識されよう。
【０１９９】
本発明は、トリガー残基を含む核酸を切断する任意の酵素の使用を包含する。さらなる酵素は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標），  Ｉｎｃ．などの酵素供給業者のカタログを調べることにより特定され得る。Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログ，  ２００５版（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｐｓｗｉｃｈ，  ＭＡ  ０１９３８−２７２３）は、引用により本明細書に組み込まれ、本発明では、そこに開示されたトリガー残基を含有する核酸を切断する任意の酵素、またはかかる酵素の類縁体の使用が想定される。有用な他の酵素としては、例えば、ｈＯＧＧ１およびその類縁体が挙げられる（Ｒａｄｉｃｅｌｌａ，  ＪＰら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｅｉ  ＵＳＡ．，９４（１５）：８０１０−５，１９９７）。
【０２００】
損傷塩基、無塩基残基などのトリガー残基を含有するオリゴヌクレオチドを合成するための方法は、当該技術分野で知られている。ＡＰエンドヌクレアーゼの基質である部位を含有するオリゴヌクレオチド、例えば、無塩基残基を含有するオリゴヌクレオチド合成するための方法は、当該技術分野で知られており、一般的に自動固相オリゴヌクレオチド合成に適している。ある一部の実施形態において、ウリジンを無塩基残基の所望の位置に含有するオリゴヌクレオチドを合成する。次いで、該オリゴヌクレオチドを、ＵＤＧなどのウラシルを除去する酵素で処理し、それにより、該オリゴヌクレオチド内のどこかにウリジンが存在した無塩基残基を生成させる。
【０２０１】
本発明のある一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは、Ｎａｕｗｅｌａｅｒｔｓ，  Ｋ．ら，  Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，３１（２３），２００３に記載された二糖ヌクレオシドを含む。ライゲーション後、伸長された二本鎖を、過ヨウ素酸塩（ＮａＩＯ４）を用いて切断した後、塩基（例えば、ＮａＯＨ）で処理して標識を除去し、遊離３’ＯＨおよびＰ５−ＯＰＯ３Ｈ２基を生成させる。配列決定が３’→５’または５’→３’方向のどちらで行なわれるかに応じて、伸長された二本鎖をポリヌクレオチドキナーゼまたはホスファターゼで処理し、伸長可能な末端を生成させることが必要または望ましいことがある。したがって、本発明のある特定の方法では、伸長可能な末端は、ポリヌクレオチドキナーゼまたはホスファターゼでの処理によって生成される。
【０２０２】
二糖ヌクレオシドを含むポリヌクレオチドは、無塩基残基を含むとみなされる。例えば、一方のヌクレオチドの３’ＯＨと次のヌクレオチドの５’リン酸基との間に挿入されたリボース残基を含有するポリヌクレオチドは、無塩基残基を含むとみなされる。
【０２０３】
キャッピング  
場合によっては、伸長可能な末端を有するプローブの全部未満が、伸長、ライゲーションおよび切断の各サイクルにおいて成功裏のライゲーション反応に関与する。かかるプローブが継続されるサイクルに関与する場合、各ヌクレオチド同定工程の精度が進行的に低下し得ることは認識されよう。本発明者らは、ホスホロチオレート連結を含有する伸長プローブの使用により、高効率でのライゲーションが可能になることを示したが、本発明のある特定の実施形態では、ライゲーションを行なわない伸長可能な末端が後続のサイクルに関与するのを抑制するためにキャッピング工程を含める。３’−Ｏ−Ｐ−Ｓ−５’ホスホロチオレート結合を含有する伸長プローブを用いる５’→３’方向における配列決定の場合、キャッピングは、例えばライゲーションまたは検出工程後に、ライゲートされない伸長可能な末端をＤＮＡポリメラーゼで伸長させ、伸長不可能な部分（例えば、ジデオキシヌクレオチドまたはヌクレオチドなどの連鎖停止ヌクレオチド）にブロッキング部分を結合させることにより行なわれ得る。３’−Ｓ−Ｐ−Ｏ−５’ホスホロチオレート結合が伸長プローブを用いる３’→５’方向の配列決定の場合、キャッピングは、例えばライゲーションまたは検出工程後に、例えば、鋳型をホスファターゼで処理することにより行なわれ得る。他のキャッピング方法もまた使用され得る。
【０２０４】
Ｈ．オリゴヌクレオチドプローブファミリーを用いる配列決定
上記の配列決定法を集合的に「方法Ａ」といい、該方法では、任意の特定の伸長プローブ結合された標識と、プローブの近位末端（すなわち、伸長された二本鎖の伸長可能なプローブ末端ライゲートされた末端）の１つ以上のヌクレオチドの正体との間に直接的で既知の対応がある。したがって、新たにライゲートされた伸長プローブの標識を
同定することは、鋳型内の１つ以上ヌクレオチドを同定するのに充分である。本発明は、集合的に「方法ＡＢ」と称し、これもまた、伸長、ライゲーションおよび、好ましくは切断の連続的サイクルを伴い、ヌクレオチド同定に対する異なるアプローチが採用された、さらなる配列決定法を提供する。
【０２０５】
本発明は、少なくとも２つの識別可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブファミリーのコレクションを使用する配列決定法ＡＢを提供する。各プローブファミリーは、標識に基づいた名称、例えば、「赤色」、「青色」、「黄色」、「緑色」に割り当てられる。上記の方法のように、伸長は、初期オリゴヌクレオチドおよび鋳型によって形成された二本鎖から開始される。初期オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドプローブをその末端にライゲートして伸長された二本鎖を形成させ、次いで、これを、ライゲーションの連続的サイクルによって反復的に伸長させることにより伸長される。伸長された二本鎖のたった１回の伸長が１サイクルで起こるように、プローブは伸長不可能な部分を、末端位置に（二本鎖の成長核酸鎖にライゲートされたヌクレオチドと反対のプローブ末端に）有する。各サイクル中、成功裏にライゲートされたプローブ上の、またはこれと会合させた標識が検出され、伸長不可能な部分が除去または修飾されて、伸長可能な末端が生成する。標識の検出により、プローブが属するプローブファミリー名が特定される。
【０２０６】
伸長、ライゲーションおよび検出の連続的なサイクルにより、一連の標識名の序列がもたらされる。標識は、連続的な位置の鋳型にハイブリダイズする成功裏にライゲートされたプローブが属するプローブファミリーに対応する。プローブは、ライゲーション後、鋳型内の異なるヌクレオチドと反対の位置に位置する近位末端を有する。したがって、プローブファミリー名の順序と鋳型内のヌクレオチドの順序との間に対応がある。
【０２０７】
切れやすい連結が、伸長プローブ内の近位ヌクレオシドと隣接するヌクレオシド間に位置する本発明の実施形態では、プローブファミリーの序列リスト名は、伸長されたオリゴヌクレオチドプローブが、各サイクルで１つのヌクレオチドによって伸長されるため、単一の初期オリゴヌクレオチドから開始される伸長、ライゲーション、検出および切断の連続的サイクルによって得られ得る。切れやすい連結がその他の２つのヌクレオシド間に位置する場合は、プローブファミリーの序列リスト名は、配列決定法Ａで記載のような、結合反応において異なる位置にハイブリダイズする初期オリゴヌクレオチドが使用される複数の配列決定反応から得られる結果から合成される。
【０２０８】
新たにライゲートされたプローブがどのプローブファミリーに属するかがわかることは、それ自体では、鋳型内のヌクレオチドの正体を決定するのに充分でない。それどころか、それどころか、プローブファミリー名が決定されることは、ヌクレオチドのある特定の組合せが、プローブの少なくとも一部分の配列である可能性を排除するが、各ヌクレオチドの正体に少なくとも２つの可能性が残る。したがって、さらなる情報の非存在下で、プローブファミリー名がわかることにより、新たにライゲートされたプローブ内のヌクレオチドと反対の位置に位置する鋳型内のヌクレオチドの正体に少なくとも２つの可能性が残されたままになる。したがって、伸長、ライゲーション、検出（および、任意選択で切断）任意の１サイクルは、それ自体では、任意の鋳型内のヌクレオチドが同定されない。しかしながら、鋳型の配列の１つ以上の可能性の排除は可能にし、それにより配列に関する情報が提供される。本発明のある特定の実施形態において、後述のようなプローブおよびプローブファミリーの適切な設計により、鋳型の配列が、さらに決定され得る。したがって、本発明のある特定の実施形態において、配列決定法ＡＢは、２つの段階：プローブファミリーの序列リスト名を得る第１の段階、および序列リストをデコード化して鋳型の配列を決定する第２の段階を含む。
【０２０９】
特に記載のない限り、配列決定法ＡおよびＡＢでは、一般的に、プローブの合成、鋳型の調製、ならびに伸長、ライゲーション、切断および検出の工程の実施に、類似した方法を用いる。
【０２１０】
配列決定方法ＡＢのためのオリゴヌクレオチド伸長プローブおよびプローブファミリーの特徴
配列決定法ＡＢにおける使用のためのプローブファミリーは、各プローブファミリーが、異なる配列の複数の標識されたオリゴヌクレオチドプローブを配列内の各位置に含み、プローブファミリーが、該位置に異なる塩基を有する少なくとも２つのプローブを含むことを特徴とする。各プローブファミリー内のプローブは同じ標識を含む。好ましくは、プローブは切れやすいヌクレオシド間結合を含む。切れやすい連結は、プローブ内の任意の場所に位置し得る。好ましくは、プローブは、リガーゼによって伸長可能でない部分を一方の末端に有する。好ましくは、プローブは、切れやすい連結と、リガーゼによって伸長可能でない部分との間の位置で標識されており、その結果、伸長可能なプローブ末端へのプローブのライゲーション後、切れやすい連結の切断により、伸長可能なプローブ末端にライゲートされる非標識部分、および非標識部分にはもはや結合されない標識された部分がもたらされる。
【０２１１】
各プローブファミリー内のプローブは、好ましくは、少なくともｊ個のヌクレオシドＸを含み、ここで、ｊは少なくとも２であり、このとき各Ｘは、プローブファミリー内のプローブにおいて少なくとも２重に縮重している。各プローブファミリー内のプローブは、さらに、少なくともｋ個のヌクレオシドＮを含み、ここで、ｋは少なくとも２であり、Ｎは、任意のヌクレオシド表す。一般に、ｊ＋ｋは１００以下であり、典型的には３０以下である。ヌクレオシドＸは、プローブ内の任意の場所に位置し得る。ヌクレオシドＸは、連続的な位置する必要はない。同様に、ヌクレオシドＮは、連続的な位置する必要はない。換言すると、ヌクレオシドＸおよびＮは散在させ得る。それにもかかわらず、ヌクレオシドＸは、５’→３’配列を有するとみなされ得る。ヌクレオシドは連続的である必要はないと理解され得る。例えば、構造ＸＡＮＸＧＮＮＸＣＮのプローブ内のヌクレオシドＸは、配列ＡＧＣを有するとみなされ得る。同様に、ヌクレオシドＮは、配列を有するとみなされ得る。
【０２１２】
ヌクレオシドＸ同一であっても異なっていてもよいが、独立して選択されない、すなわち、各Ｘの正体は、プローブ内の１つ以上他のヌクレオシドＸの正体によって拘束される。したがって、一般的に、ヌクレオシドＸのある特定の組合せのみが、任意の特定のプローブおよび任意の特定のプローブファミリー内のプローブにおいて存在する。換言すると、各プローブにおいて、ヌクレオシドＸの配列は、長さｊの可能な全ての配列の部分集団のみを表し得る。したがって、Ｘの１つ以上のヌクレオチドの正体により、他方のヌクレオシドの１つ以上の可能な正体が制限される。
【０２１３】
ヌクレオシドＮは、好ましくは、独立して選択され、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ（あるいは、任意選択で縮重低減性ヌクレオシド）であり得る。好ましくは、ヌクレオシドＮの配列は、１つ以上のＮが縮重低減性ヌクレオシドであり得る以外は、長さｋの可能な全ての配列を表し、したがって、プローブは、２つの部分を含有し、そのうち、ヌクレオシドＮからなる部分は非拘束部分とよばれ、ヌクレオシドＸからなる部分は、拘束部分とよばれる。上記のように、該部分は、連続的なヌクレオシドである必要はない。拘束部分および非拘束部分を含有するプローブは、本明細書において部分拘束プローブという。好ましくは、拘束部分内の１個以上のヌクレオシドは、プローブの近位端、すなわち、伸長可能なプローブ末端にライゲートされるヌクレオシドを含有する末端（これは、種々の本発明の実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブ５’または３’末端のいずれかであり得る）に存在する。
【０２１４】
任意のオリゴヌクレオチドプローブの拘束部分は、ある特定の配列のみを有するものであり得るため、プローブの拘束部分内のヌクレオシドの１つ以上の正体がわかることは、他方のヌクレオシドの１つ以上に関する情報を提供する。該情報は、他方のヌクレオシドの１つ以上を正確に同定するのに充分である場合もそうでない場合もあるが、拘束部分の他方のヌクレオシドの１つ以上の正体の１つ以上の可能性を排除するには充分である。配列決定法ＡＢのある特定の好ましい実施形態において、プローブの拘束部分の１つのヌクレオシドの正体がわかることは、拘束部分の他方のヌクレオシドの各々を正確に同定する、すなわち、拘束部分を含むヌクレオシドの正体および順序を決定するのに充分である。
【０２１５】
上記の配列決定法のように、鋳型に相補的な伸長プローブ内の最も近位ヌクレオシドは、初期オリゴヌクレオチドの伸長可能な末端にライゲートされ（伸長、ライゲーションおよび検出の第１のサイクル）、伸長、ライゲーションおよび検出の後続のサイクルでは、伸長されたオリゴヌクレオチドプローブの伸長可能な末端にライゲートされる。検出により、新たにライゲートされたプローブが属するプローブファミリー名が決定される。プローブの拘束部分内の各位置は、少なくとも２重に縮重しているため、プローブファミリー名は、それ自体では、拘束部分内の任意のヌクレオチドが同定されない。しかしながら、拘束部分の配列は、長さｊの可能な全ての配列の部分集団の１つであるため、プローブファミリーが同定されることにより、拘束部分の配列のある特定の可能性が排除される。プローブの拘束部分は、その配列決定部分を構成する。したがって、属するプローブファミリーが同定されることによってプローブの拘束部分の１個以上のヌクレオシドの
正体の１つ以上の可能性が排除されることにより、伸長プローブハイブリダイズする鋳型内のヌクレオチドの正体１つ以上の可能性が排除される。本発明の好ましい実施形態において、部分拘束プローブは、切れやすい連結を任意の２つのヌクレオシド間に含む。
【０２１６】
ある特定の実施形態において、部分拘束プローブは、一般構造（Ｘ）ｊ（Ｎ）ｋを有し、式中、Ｘは、ヌクレオシドを表し、（Ｘ）ｊは各位置で少なくとも２重に縮重しており、そのため、Ｘは、異なる塩基対合特異性を有する任意の少なくとも２ヌクレオシドであり得、Ｎは任意のヌクレオシドを表し、ｊは少なくとも２であり、ｋは１〜１００であり、少なくとも１つのＮまたはプローブ末端のＸ以外のＸは検出可能な部を含む。好ましくは、（Ｎ）ｋ独立して、各位置で４重に縮重しており、そのため、各プローブにおいて、（Ｎ）ｋは、（Ｎ）ｋの１つ以上の位置が縮重低減性ヌクレオチドで占められ得る以外は、長さｋの可能な全ての配列を表す。（Ｘ）ｊ内のヌクレオシドは同一であっても異なっていてもよいが、独立して選択されない。換言すると、各プローブにおいて、（Ｘ）ｊは、長さｊの可能な全ての配列の部分集団のみを表し得る。したがって、（Ｘ）ｊの１つ以上のヌクレオチドの正体により、他方のヌクレオシドの１つ以上の可能な正体が制限される。したがって、プローブは２つの部分を含有し、その（Ｎ）ｋは非拘束部分であり、（Ｘ）ｊは拘束部分である。
【０２１７】
本発明のある特定の好ましい実施形態において、部分拘束プローブは、構造５’−（Ｘ）ｊ（Ｎ）ｋＮＢ＊−３’または３’−（Ｘ）ｊ（Ｎ）ｋＮＢ＊−５’（式中、Ｎは任意のヌクレオシド表し、ＮＢはリガーゼによって伸長可能でない部分を表し、＊は検出可能な部分を表し、（Ｘ）ｊは、各位置で少なくとも２重に縮重しているプローブの拘束部分であり、（Ｘ）ｊ内のヌクレオシドは同一であっても異なっていてもよいが、独立して選択されない、少なくとも１つのヌクレオシド間結合は切れやすい連結であり、ｊは少なくとも２であり、ｋは１〜１００である、ただし、検出可能な部分は、任意のヌクレオシドＮまたはプローブ末端のＸ以外のＸ上に、ＮＢの代わりまたはこれに加えて存在し得るものとする）を有する。切れやすい連結は、（Ｘ）ｊ内の２つのヌクレオシド間、（Ｘ）ｊ内の最も遠位ヌクレオチドと（Ｎ）ｋの最も近位ヌクレオシド間、（Ｎ）ｋ内のヌクレオシド間、または（Ｎ）ｋ内の末端ヌクレオシドとＮＢ間に存在し得る。好ましくは、切れやすい連結はホスホロチオレート結合である。
【０２１８】
別のより好ましい本発明の実施形態では、プローブは、構造５’−（ＸＹ）（Ｎ）ｋＮＢ＊−３’または３’−（ＸＹ）（Ｎ）ｋＮＢ＊−５’（式中、Ｎは任意のヌクレオシド表し、ＮＢはリガーゼによって伸長可能でない部分を表し、＊は検出可能な部分を表し、ＸＹはプローブの拘束部分であり、ここで、ＸおよびＹは、同一または異なるが独立して選択されないヌクレオシドを表し、ＸおよびＹは少なくとも２重に縮重しており、少なくとも１つのヌクレオシド間結合は切れやすい連結であり、ｋは１〜１００（両端を含む）である、ただし、検出可能な部分は、任意のヌクレオシドＮまたはプローブ末端のＸ以外のＸ上に、ＮＢの代わりまたはこれに加えて存在し得るものとする）を有する。好ましくは、切れやすい連結はホスホロチオレート結合である。構造５’−（ＸＹ）（Ｎ）ｋＮＢ＊−３’を有するプローブは、５’→３’方向の配列決定に有用である。構造３’−（ＸＹ）（Ｎ）ｋＮＢ＊−５’  を有するプローブは、３’→５’方向の配列決定に有用である。
【０２１９】
ある特定の好ましいプローブの構造を、以下により詳細に示す。５’→３’方向の配列決定には、構造５’−Ｏ−Ｐ−Ｏ−（Ｘ）ｊ（Ｎ）ｋ−Ｏ−Ｐ−Ｓ−（Ｎ）ｉＮＢ＊−３’（式中、Ｎは任意のヌクレオシドを表し、ＮＢはリガーゼによって伸長可能でない部分を表し、＊は検出可能な部分を表し、（Ｘ）ｊは、各位置で少なくとも２重に縮重しているプローブの拘束部分であり、（Ｘ）ｊ内のヌクレオシドは同一であっても異なっていてもよいが、独立して選択されない、ｊは少なくとも２であり、（ｋ＋ｉ）は１〜１００であり、ｋは１〜１００であり、ｉは０〜９９である、ただし、検出可能な部分は、（Ｎ）ｉの任意のヌクレオシド上にＮＢの代わりまたはこれに加えて存在し得るものとする）を有する部分拘束プローブ。本発明のある特定の実施形態において、（Ｘ）ｊは（ＸＹ）であり、ここで、ＸおよびＹは、少なくとも２重に縮重しており、同一または異なるが独立して選択されないヌクレオチドを表す。本発明のある特定の実施形態において、ｉは０である。
【０２２０】
５’→３’方向の配列決定のための他の好ましいプローブは、構造５’−Ｏ−Ｐ−Ｏ−（Ｘ）ｊ−Ｏ−Ｐ−Ｓ−（Ｎ）ｉＮＢ＊−３’を有し、式中、Ｎは任意のヌクレオシドを表し、ＮＢはリガーゼによって伸長可能でない部分を表し、＊は検出可能な部分を表し、（Ｘ）ｊは、各位置で少なくとも２重に縮重しているプローブの拘束部分であり、（Ｘ）ｊ内のヌクレオチドは同一であっても異なっていてもよいが、独立して選択されない、ｊは少なくとも２であり、ｉは１〜１００である、ただし、（Ｎ）ｉの任意のヌクレオシド上に、ＮＢの代わりまたはこれに加えて存在し得るものとする。本発明のある特定の実施形態において、（Ｘ）ｊは（ＸＹ）であり、ここで、位置ＸおよびＹは少なくとも２重に縮重しており、ＸおよびＹは、同一または異なるが独立して選択されないヌクレオシドを表す。５’→３’方向の配列決定のためのまた他の好ましいプローブは、構造５’−Ｏ−Ｐ−Ｏ−（Ｘ）ｊ−Ｏ−Ｐ−Ｓ−（Ｘ）ｋ（Ｎ）ｉＮＢ＊−３’を有し、式中、Ｎは任意のヌクレオシドを表し、ＮＢはリガーゼによって伸長可能でない部分を表し、＊は検出可能な部分を表し、（Ｘ）ｊ−Ｏ−Ｐ−Ｓ−（Ｘ）ｋは、各位置で少なくとも２重に縮重しているプローブの拘束部分であり、（Ｘ）ｊ−Ｏ−Ｐ−Ｓ−（Ｘ）ｋ内の位置は少なくとも２重に縮重しており、同一であっても異なっていてもよいが、独立して選択されない、ｊおよびｋはともに少なくとも１であり、（ｊ＋ｋ）は少なくとも２（例えば、２、３、４または５）であり、ｉは１〜１００である、ただし、検出可能な部分は、（Ｎ）ｉの任意のヌクレオシド上に、ＮＢの代わりまたはこれに加えて存在し得るものとする。
【０２２１】
本発明のある特定の実施形態において、ｊおよびｋはともに１である。
【０２２２】
３’→５’方向の配列決定では、構造５’−ＮＢ＊（Ｎ）ｉ−Ｓ−Ｐ−Ｏ−（Ｎ）ｋ−Ｏ−Ｐ−Ｏ−（Ｘ）ｊ−３’（式中、Ｎは任意のヌクレオシドを表し、ＮＢはリガーゼによって伸長可能でない部分を表し、＊は検出可能な部分を表し、（Ｘ）ｊは、各位置で少なくとも２重に縮重しているプローブの拘束部分であり、（Ｘ）ｊ内のヌクレオシドは同一であっても異なっていてもよいが、独立して選択されない、ｊは少なくとも２であり、（ｋ＋ｉ）は１〜１００であり、ｋは１〜１００であり、ｉは０〜９９である、ただし、検出可能な部分は、（Ｎ）ｉの任意のヌクレオシド上に、ＮＢの代わりまたはこれに加えて存在し得るものとする）を有する部分拘束プローブ。本発明のある特定の実施形態において、（Ｘ）ｊは（ＸＹ）であり、ここで、ＸおよびＹ少なくとも２重に縮重しており、同一または異なるが独立して選択されないヌクレオシドを表す。本発明のある特定の実施形態において、ｉは０である。
【０２２３】
３’→５’方向の配列決定のための他の好ましいプローブは、構造５’−ＮＢ＊（Ｎ）ｉ−Ｓ−Ｐ−Ｏ−（Ｘ）ｊ−３’を有し、式中、Ｎは任意のヌクレオシドを表し、ＮＢはリガーゼによって伸長可能でない部分を表し、＊は検出可能な部分を表し、（Ｘ）ｊは、各位置で少なくとも２重に縮重しているプローブの拘束部分であり、（Ｘ）ｊ内のヌクレオシドは同一であっても異なっていてもよいが、独立して選択されない、ｊは少なくとも２であり、ｉは１〜１００である、ただし、検出可能な部分は、（Ｎ）ｉの任意のヌクレオシド上に、ＮＢの代わりまたはこれに加えて存在し得るものとする。本発明のある特定の実施形態において、（Ｘ）ｊは（ＸＹ）であり、ここで、ＸおよびＹ少なくとも２重に縮重しており、同一または異なるが独立して選択されないヌクレオシドを表す。本発明のある特定の実施形態において、ｊは２〜５であり、例えば、任意の部分拘束プローブにおいて２、３、４または５である。
【０２２４】
３’→５’方向の配列決定のためのまた他の好ましいプローブは、構造５’−ＮＢ＊（Ｎ）ｉ−Ｓ−Ｐ−Ｏ−（Ｘ）ｋ−Ｏ−Ｐ−Ｏ−（Ｘ）ｊ−３’（式中、Ｎは任意のヌクレオシドを表し、ＮＢはリガーゼによって伸長可能でない部分を表し、＊は検出可能な部分を表し、−（Ｘ）ｋ−Ｏ−Ｐ−Ｏ−（Ｘ）ｊは、各位置で少なくとも２重に縮重しているプローブの拘束部分であり、−（Ｘ）ｋ−Ｏ−Ｐ−Ｏ−（Ｘ）ｊ内のヌクレオシドは同一であっても異なっていてもよいが、独立して選択されない、ｊおよびｋはともに少なくとも１であり、（ｊ＋ｋ）は少なくとも２（例えば、２、３、４または５）であり、ｉは１〜１００である、ただし、検出可能な部分は、（Ｎ）ｉの任意のヌクレオシド上に、ＮＢの代わりまたはこれに加えて存在し得るものとする）を有する。ある特定の実施形態において、ｊ＝１およびｋ＝１である。
【０２２５】
切れやすい連結が（Ｘ）ｊの最も近位ヌクレオシドと（Ｘ）ｊの次に最も近位ヌクレオシドとの間に位置する本発明の実施形態では、プローブファミリーの序列リスト名は、伸長されたオリゴヌクレオチドプローブが、各サイクルで１つのヌクレオチドによって伸長されるため、単一の初期オリゴヌクレオチドから開始される伸長、ライゲーション、検出および切断の連続的サイクルによって得られ得る。切れやすい連結が、その他の２つのヌクレオシド間に位置する本発明の実施形態では、プローブファミリーの序列リスト名は、配列決定法Ａで記載のような、結合反応において異なる位置にハイブリダイズする初期オリゴヌクレオチドが使用される複数の配列決定反応から得られる結果から合成される。
【０２２６】
上記のもの以外の任意の多数の構造を有するプローブが、配列決定法ＡＢに使用され得ることは理解されよう。例えば、プローブは、ＸＮＹ（Ｎ）ｋ（式中、拘束されたヌクレオシドＸおよびＹは隣接してない）、またはＸＩＹ（Ｎ）ｋ（式中、Ｉは普遍塩基である）などの構造を有するものであり得る。（Ｎ）ｋＸ（Ｎ）ｌ、（Ｎ）ｉＸ（Ｎ）ｊＹ（Ｎ）ｋＺ（Ｎ）ｌ、（Ｎ）ｉＸ（Ｎ）ｊＹＩＺ（Ｎ）ｌおよび（Ｎ）ｉＸ（Ｎ）ｊＹ（Ｎ）ｋＺ（Ｉ）ｌは、さらなる可能性を表す。上記のプローブのように、これらのプローブは、切れやすい連結、検出可能な部分、および一方の末端にリガーゼによって伸長可能でない部分を含む。好ましくは、プローブは、リガーゼによって伸長可能でない部分と反対のプローブ末端のヌクレオチドに結合された検出可能な部分含まない。任意のこれらの構造または他のものを有するプローブを含むプローブファミリーは、各プローブファミリーが異なる配列の複数の標識されたプローブを含み、配列内の各位置において、プローブファミリーが、該位置に異なる塩基を有する少なくとも２つのプローブを含むという基準を満たす。好ましくは、各プローブ内のヌクレオシドの総数は１００以下、例えば３０以下である。
【０２２７】
オリゴヌクレオチド伸長プローブファミリーのコード化。本発明の配列決定法は、コード化されたプローブファミリーを利用するものである。「コード化」は、ある特定の標識を、規定の１組の配列の１つを有する部分を含むプローブと会合させ、その結果、該規定の組の配列のメンバーである配列を有する部分を含むプローブが該標識で標識されるスキームをいう。一般に、コード化では、複数の識別可能な標識の各々を１つ以上プローブと会合させ、その結果、各識別可能な標識が異なる群のプローブと会合され、各プローブがたった１つの標識（これは、検出可能な部分の組合せを含み得る）によって標識される。好ましくは、各プローブ群のプローブは、各々、同じ規定の組の配列のメンバーである配列を有する部分を含む。該部分は、単一のヌクレオシドであってもよく、多くのヌクレオシド長、例えば、２、３、４、５またはそれ以上のヌクレオシド長であってもよい。該部分の長さは、完全長のプローブ小画分のみを構成するものであってもよく、プローブ全体を構成するものであってもよい。規定の組の配列は、単一の配列のみを含むものであってもよく、該部分の長さに応じて、任意の数の異なる配列を含むものであってもよい。例えば、該部分が単一のヌクレオシドである場合、規定の組の配列は、最大４つの要素（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）  を有し得る。部分が２つのヌクレオシド長である場合、規定の組の配列は、１６個までの要素（ＡＡ、ＡＧ、ＡＣ、ＡＴ、ＧＡ、ＧＧ、ＧＣ、ＧＴ、ＣＡ、ＣＧ、ＣＣ、ＣＴ、ＴＡ、ＴＧ、ＴＣ、ＴＴ）  を有し得る。一般に、規定の組の配列は、可能な配列の総数よりも少数の要素を含み、コード化では、１つより多くの規定の組の配列を用いる。
【０２２８】
本明細書に記載した配列決定法Ａでは、一般的に、近位ヌクレオシドプローブ内の（すなわち、伸長可能なプローブ末端にライゲートされたヌクレオシド）と標識の正体との間に直接的な対応がある単一のコード化を有する１組のプローブを利用する。近位ヌクレオシドは、鋳型内でハイブリダイズするヌクレオチドに相補的であり、そのため、新たにライゲートされたプローブの近位ヌクレオシドの正体により、伸長された二本鎖の位置と反対側に位置する鋳型内のヌクレオチドの正体が決定される。一般的な意味において、本明細書に記載の他方の配列決定法に有用なプローブは、構造Ｘ（Ｎ）ｋを有し、式中、Ｘは近位ヌクレオシドであり、各ヌクレオシドＮは４重に縮重しており、そのため、長さｋの可能な全ての配列が、該プローブを構成するオリゴヌクレオチドプローブ分子のプールに提示される。したがって、例えば、一部のオリゴヌクレオチドプローブ分子がＡを位置ｋ＝１に含有する場合、あるものはＧを位置ｋ＝１に含有し、あるものはＣを位置ｋ＝１に含有し、あるものはＴを位置ｋ＝１に含有し、他の位置ｋについても同様であり、（Ｎ）ｋ内のＸに隣接するヌクレオシドは位置ｋ＝１を占めるとみなされる；（Ｎ）ｋ内の次のヌクレオシドは位置ｋ＝２を占めるとみなされるなどである。しかしながら、任意の所与のオリゴヌクレオチドプローブにおいて、Ｘは、たった１つの塩基対合特異性を表し、これは、典型的には、ある特定のヌクレオシドの正体、例えば、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴに対応する。したがって、Ｘは、典型的には、ある特定のプローブを構成するプローブ分子のプール内で均一にＡ、Ｇ、ＣまたはＴである。図２は、構造Ｘ（Ｎ）ｋを有するプローブの適当なコード化を示す。このコード化によれば、Ｘ＝Ｃを有するプローブは標識「赤色」に割り当てられる；Ｘ＝Ａを有するプローブは標識「黄色」に割り当てられる；Ｘ＝Ｇを有するプローブは標識「緑色」に割り当てられる；およびＸ＝Ｔを有するプローブは標識「青色」に割り当てられる。したがって、プローブの配列決定部分とその標識間に１対１対応が存在する。
【０２２９】
新たにライゲートされた伸長プローブの標識の正体が、伸長プローブの最も近位ヌクレオシドの正体に対応する上記のアプローチは、標識の正体が伸長プローブ最も近位ヌクレオシドのみの正体に対応するのではなく、伸長プローブ内の最も近位の２つ以上のヌクレオシドの配列に対応し、その結果、鋳型内の多数のヌクレオチドの正体が、伸長、ライゲーションおよび検出の１サイクルで決定され得る（典型的には、その後、切断を行なう）コード化を包含するように拡張され得ることは認識されよう。しかしながら、かかるコード化は、依然として標識をオリゴヌクレオチド伸長プローブ内の単一の配列に会合させるものであり得、そのため、対向する位置にある鋳型内の相補的なヌクレオチドの正体が同定され得る。例えば、上記のように、１サイクルで２つのヌクレオチドを同定するためには、各々が対応する標識を有する（すなわち、１６種類の識別可能な標識）１６種類の異なるオリゴヌクレオチドプローブが必要とされ得る。
【０２３０】
配列決定法ＡＢでは、標識をプローブと会合させる代替的なアプローチを用いる。標識の正体とプローブの配列決定部分の配列間の１対１対応ではなく、同じ標識を、異なる配列決定部分を有する多数のプローブに割り当てる。プローブは部分的に拘束されており、プローブの拘束部分がその配列決定部分である。したがって、同じ標識が、各々が異なる配列拘束部分を有し、該配列が規定の１組の配列の１つである複数の異なるプローブに割り当てられる。上記のように、同じ標識を含むプローブは、「プローブファミリー」を構成する。該方法では、各々が異なる配列の拘束部分を有し、該配列が規定の１組の配列の１つである複数のプローブを含む複数のかかるプローブファミリーを用いる。
【０２３１】
複数のプローブファミリーをプローブファミリーの「コレクション」という。プローブファミリーのコレクション内の各プローブファミリー内のプローブは、該コレクション内の他のプローブファミリーを標識するために使用される標識と識別可能な標識で標識されている。各プローブファミリーは、好ましくは、その独自の規定の組の配列を有する。好ましくは、各プローブファミリー内のプローブの拘束部分は同じ長さであり、好ましくは、プローブファミリーのコレクション内のプローブファミリーの拘束部分は同じ長さである。好ましくは、プローブファミリーのコレクション内のプローブファミリーの規定配列の組の組合せは、拘束部分の長さの可能な全ての配列を含む。好ましくは、プローブファミリーのコレクションは、４つの識別可能に標識されたプローブファミリーを含むか、または外ファミリーからなる。好ましくは、プローブの拘束部分は２ヌクレオシド長である。
【０２３２】
広範なさまざまな異なるようにコード化された識別可能に標識されたプローブファミリーのコレクションが上記の基準を満足し、本発明の方法を実施するために使用され得る。しかしながら、ある特定のプローブファミリーのコレクションが好ましい。部分拘束プローブを含む４つの識別可能に標識されたプローブファミリーの好ましいコレクションの例示的なコード化を図２５Ａに示す。図２５Ａに示すように、拘束部分は、プローブ内の２つの最も３’側のヌクレオシドからなる。プローブファミリーは、「赤色」、「黄色」、「緑色」および「青色」に標識される。各プローブファミリー内のプローブは、その配列が規定の１組の配列の１つであり、該規定の組は各プローブファミリーで異なる拘束部分を含む。例えば、プローブの近位端であるみなされる各配列の３’末端からから始めると、「赤色」プローブファミリーの規定の組の配列は｛ＣＴ、ＡＧ、ＧＡ、ＴＣ｝である；「黄色」のプローブファミリーの規定の組の配列は｛ＣＣ、ＡＴ、ＧＧ、ＴＡ｝である；「緑色」のプローブファミリーの規定の組の配列は｛ＣＡ、ＡＣ、ＧＴ、ＴＧ｝である；「青色」のプローブファミリーの規定の組の配列は｛ＣＧ、ＡＡ、ＧＣ、ＴＴ｝である。各規定の組は、その他の組の１つに存在する任意のメンバーを含まず、好ましい特徴である。また、プローブファミリーのコレクション内のプローブファミリーの規定配列の組の組合せは、長さ２の可能な全ての配列、すなわち、可能な全てのジヌクレオシドを含む。このプローブファミリーのコレクションの別の特徴（好ましいが必要ではない）は、プローブの拘束部分内の各位置が、４重に縮重している、すなわちＡ、Ｇ、ＣまたはＴのいずれかで占められ得ることである。このプローブファミリーのコレクションの別の特徴（好ましいが必要ではない）は、規定配列の組の各々において、たった１つの配列が、任意の特異的ヌクレオシドを任意の位置に、例えば、最も近位の位置または任意の他の位置に有することである。規定配列の組の各々において、たった１つの配列が、任意の特異的ヌクレオシドを拘束部分内の２位以降に（最も近位ヌクレオシドを１位とみなす）を有することは特に好ましいが必要ではない。例えば、赤色プローブファミリーの規定の組の配列において、たった１つの配列がＴを２位に有する；たった１つの配列がＧを２位に有する；たった１つの配列がＡを２位に有する；たった１つの配列がＣを２位に有する。
【０２３３】
図２５Ａに示したものなどの任意の特定のコード化が与えられると、プローブファミリーの１つのプローブの拘束部分内の１個以上のヌクレオシドの正体がわかることにより、該プローブの拘束部分内の他方のヌクレオチドに関する情報が提供される。最も一般的な意味において、プローブファミリー内のプローブの拘束部分内の１個以上のヌクレオシドの正体がわかることにより、該プローブファミリーの規定の組の配列は、該正体を該位置を有するヌクレオシドを有する配列を含まないため、他方の位置の１つにおけるヌクレオシドの１つ以上の可能な正体を排除するのに充分な情報が提供される。典型的には、プローブファミリー内のプローブの拘束部分内の１個以上のヌクレオシドの正体がわかることにより、複数のヌクレオシド、例えば、その他のヌクレオシドの各々の１つ以上の可能な正体を排除するのに充分な情報が提供される。好ましいコード化では、プローブファミリー内のプローブの含有された部分の１個以上のヌクレオシドの正体がわかることにより、プローブ内のその他のヌクレオシドの各々の１つ以外すべての可能性が排除される。例えば、図２５Ａに示すコード化されたプローブファミリーの場合、プローブが赤色ファミリーのメンバーであることがわかっている場合、また、最も近位ヌクレオシドがＣであることもわかっている場合、隣接するヌクレオシドはＴのはずである。同様に、プローブが緑色ファミリーのメンバーであることがわかっている場合、また、最も近位ヌクレオシドがＧであることもわかっている場合、隣接するヌクレオシドはＴのはずである。したがって、拘束部分の１つのヌクレオシドの正体がわかることは、他方のヌクレオシドの１つ以外すべての可能性を排除するのに充分であり、そのため、他方のヌクレオシドの正体が完全に特定化される。しかし、プローブの拘束部分の少なくとも１つのヌクレオシドの正体がわからないと、拘束部分の各位置のヌクレオシドがＡ、Ｇ、ＣまたはＴであり得るため、属する  プローブファミリー名がわかったことに基づいて、プローブ内の特異的ヌクレオシドの正体に関する情報を取得することはまったくできない。図２５Ｂは、プローブファミリーの好ましいコレクション（上側パネル）および配列決定法ＡＢを用いたライゲーション、検出および切断のサイクル（下側パネル）を示す。
【０２３４】
本発明者は、図２５Ａに示すような、２ヌクレオシド長であって、プローブファミリーのコレクションの好都合な特徴を有する拘束部分を含む２４個のプローブファミリーのコレクションを設計した。これらのプローブファミリーは、プローブが属するプローブファミリー名がわかること、およびプローブ内の１つのヌクレオシドの正体がわかることが、拘束部分の他方のヌクレオシドを正確に同定するのに充分であるという点で最大の情報を与える。これは、すべてのプローブおよび各拘束部分内のすべてのヌクレオシドについてそうである。プローブファミリーの２４個の好ましいコレクションの各々のコード化スキームを表１に示す。表１では、１〜２４の範囲のコード化ＩＤを各プローブファミリーのコレクションに割り当てている。各コード化により、配列決定法ＡＢにおける使用のための一般構造（ＸＹ）Ｎｋの好ましいプローブファミリーのコレクションの拘束部分が規定され、それによりコレクションそれ自体が規定される。表１において、コード化ＩＤの下の欄の値１は、該コード化に従って、それぞれ第１および第２の欄に示されたヌクレオシドＸおよびＹを含むプローブが、第１のプローブファミリーに割り当てられることを示す；（ｉｉ）コード化ＩＤの下の欄の値２は、該コード化に従って、それぞれ第１および第２の欄に示されたヌクレオシドＸおよびＹを含むプローブが、第２のプローブファミリーに割り当てられることを示す；（ｉｉｉ）コード化ＩＤの下の欄の値３は、該コード化に従って、それぞれ第１および第２の欄に示されたヌクレオシドＸおよびＹを含むプローブが、第３のプローブファミリーに割り当てられることを示す；ならびに（ｉｖ）コード化ＩＤの下の欄の値４は、該コード化に従って、それぞれ第１および第２の欄に示されたヌクレオシドＸおよびＹを含むプローブが、第４のプローブファミリーに割り当てられることを示す。値１、２、３および４は各々、標識を表す。例えば、コード化９により図２５Ａに示すプローブファミリーのコレクションが規定され、この場合、１は青色を表し、２は緑色を表し、３は赤色を表し、４は黄色を表す。標識に対する値の割り当ては随意であり、例えば、１は、充分等しく緑色、赤色または黄色を表し得ることは認識されよう。値１、２、３および４と標識との関連を変更することによって各プローブファミリー内のプローブの組は変更され得ず、単に、異なる標識が各プローブファミリーと関連することになり得るだけである。
【０２３５】
表１：オリゴヌクレオチドプローブファミリーコード化
【０２３６】
【表１】
2009538123.tif 000075
好ましいプローブファミリーのコレクションを規定する表１の使用をさらに説明するため、コード化１７を考察する。このコード化によれば、拘束部分ＡＡ、ＧＣ、ＴＧおよびＣＴを有するプローブが標識１（例えば、赤色）に割り当てられ、拘束部分ＣＡ、ＡＣ、ＧＧおよびＴＴを有するプローブが標識２（例えば、黄色）に割り当てられ、拘束部分ＴＡ、ＣＣ、ＡＧおよびＧＴを有するプローブが標識３（例えば、緑色）に割り当てられ、拘束部分ＧＡ、ＴＣ、ＣＧおよびＡＴを有するプローブが標識４（例えば、青色）に割り当てられている。得られるプローブファミリーのコレクションを図２６に示す。
【０２３７】
図２７Ａ〜２７Ｃは、プローブファミリーの２４個の好ましいコレクションを図式的に規定する代替法を表す。該方法では、図２７Ａのものなどのダイアグラムを利用する。かかるダイアグラム内の第１の欄は第１の塩基を表す。各標識は、４種類の異なる塩基配列に結合されている。その各々は、第１の欄の塩基を選択された標識の欄の塩基と並置させて示されている。例えば、項目「第１の塩基」の欄にＡがある場合、配列ＡＡを有する拘束部分を有するプローブは、プローブファミリー１（標識１）に割り当てられ、配列ＡＣを有する拘束部分を有するプローブは、プローブファミリー２（標識２）に割り当てられ、配列ＡＧを有する拘束部分を有するプローブは、プローブファミリー３（標識３）  に割り当てられ、配列ＡＴを有する拘束部分を有するプローブは、プローブファミリー４（標識４）に割り当てられる。プローブファミリーに対する割り当ては、Ｃ、ＧまたはＴで始まる拘束部分を有するプローブと同様にして行なわれる。したがって、図２７Ａに示すように塩基で空欄を埋めたダイアグラムは、図２７Ｂに示すようなコード化に翻訳され、ここでは、｛ＡＡ、ＣＣ、ＧＧ、ＴＴ｝の組の拘束部分を有するプローブはプローブファミリー１に割り当てられ、｛ＡＣ、ＣＡ、ＧＴ、ＴＧ｝の組の拘束部分を有するプローブはプローブファミリー２に割り当てられ、｛ＡＧ、ＣＴ、ＧＣ、ＴＡ｝の組の拘束部分を有するプローブはプローブファミリー３に割り当てられ、｛ＡＴ、ＣＧ、ＧＡ、ＴＣ｝の組の拘束部分を有するプローブはプローブファミリー４に割り当てられる。図２７Ｃは、プローブファミリーの２４個の好ましいコレクションの各々を作製するために、図２７Ａダイアグラムの陰影部分の代わりに挿入され得るダイアグラムを示す。配列決定法ＡＢにおいて好ましいプローブファミリーのコレクションを使用する方法は、以下にさらに記載する。
【０２３８】
表１に規定されるコード化されたプローブファミリーの２４個のコレクションは、配列決定法ＡＢにおける使用のためのプローブファミリーのコレクションの好ましい実施形態のみを表す。プローブファミリー名がわかることとともに、拘束部分内の１個以上のヌクレオシドの正体がわかることによって、１つ以上他のヌクレオシドに関する情報が提供される同じ基本原理を用いる広範なさまざまな他のコード化スキーム、プローブファミリーおよびプローブ構造が使用され得る。プローブファミリーの好ましいコレクションと比較すると、プローブファミリーのやや好ましいコレクションは、一般的に、（ｉ）少なくとも一部プローブに関して、プローブファミリー名がわかることによってもたらされる情報の量およびヌクレオシドの正体が少ない；または（ｉｉ）少なくとも一部のプローブに関して、プローブファミリー名がわかることによってもたらされる情報の量がより多いため、やや好ましい。
【０２３９】
一般に、プローブファミリーのやや好ましいコレクションは、配列決定法ＡＢを、好ましいプローブファミリーのコレクションが使用される様式と同様にして行うために使用され得る。しかしながら、デコード化に必要とされる該工程が異なり得る。例えば、状況によっては、候補配列を互いに比較することが、配列の少なくとも一部分を決定するのに充分であり得る。
【０２４０】
プローブが２ヌクレオシド長である拘束部分を含むプローブファミリーのやや好ましいコレクションの一例を図２８に示す。このコード化によれば、｛ＡＡ、ＡＣ、ＧＡ、ＧＣ｝の組の拘束部分を有するプローブはプローブファミリー１に割り当てられ、｛ＣＡ、ＣＣ、ＴＡ、ＴＣ｝の組の拘束部分を有するプローブはプローブファミリー２に割り当てられ、｛ＡＧ、ＡＴ、ＧＧ、ＧＴ｝の組の拘束部分を有するプローブはプローブファミリー３に割り当てられ、｛ＣＧ、ＣＴ、ＴＧ、ＴＴ｝の組の拘束部分を有するプローブはプローブファミリー４に割り当てられる。このプローブファミリーのコレクションでは、プローブファミリー名がわかることにより、プローブファミリー名を決定するためにその標識が検出された新たにライゲートされた伸長プローブ内の近位ヌクレオシドと反対の位置に位置する鋳型内のヌクレオチドの正体についてのある特定の可能性が排除される。例えば、プローブファミリー名が１である場合、新たにライゲートされた伸長プローブ内の近位ヌクレオシドはＡまたはＧのはずであり、そのため、相補的鋳型内のヌクレオチドはＴまたはＣのはずである。拘束部分内の各位置において少なくとも２つの可能性があるため、ヌクレオチドは正確には同定され得ないが、好ましいプローブファミリーのコレクションが使用される場合とは対照的に、一部の可能性を排除するのには充分な情報が１サイクルから得られる。
【０２４１】
本発明のある特定の実施形態において、拘束部分が３ヌクレオシド長である部分拘束プローブが使用される。その拘束部分が長さ３可能な全ての配列を含む（これは、好ましい）プローブを含めるため、プローブファミリーのコレクションは、４３＝６４種の異なるプローブを含むものであるのがよい。図２９Ａは、拘束部分３ヌクレオシド長（トリヌクレオシド）を有するプローブを含むプローブファミリーのコレクション拘束部分を作製するために使用され得るダイアグラムを示す。この図は、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴで表示された４組の列、ならびにプローブファミリー名１、２、３および４の４つの欄を示す。各組みの４列は、内部にヌクレオシドの正体を有するボックスと反対である。トリヌクレオシドのプローブファミリーを決定するため、トリヌクレオシドの最後のヌクレオシドを含むボックスをまず選択する。該ボックスに隣接する４つの列内で、トリヌクレオシド内の第１のヌクレオシドを特定する文字が標示された列を選択する。該列内で、トリヌクレオシドの第２のヌクレオシドを含む欄を選択する。該トリヌクレオシドは、該欄の上部に標示されたプローブファミリーに割り当てられる。例えば、以下の手順に従って、トリヌクレオシド「ＴＣＧ」をプローブファミリーに割り当てる。最後のヌクレオシドが「Ｇ」であるため、「Ｇ」を含むボックスと対向する位置に位置する４列の組、すなわち、第３の組の列に注目する。第１のヌクレオシド「Ｔ」であるため、考慮事項を４つの組の最後の列にさらに限定する。プローブファミリー割り当ては、真ん中のヌクレオシドを含む欄の表題によって決定される。真ん中のヌクレオシドは「Ｃ」であるため、トリヌクレオシドはプローブファミリー１に割り当てられる。類似したプロセスにより、プローブファミリー割り当て：ＡＡＡ＝１；ＡＴＡ＝２；ＡＧＡ＝３；ＧＴＡ＝４；ＧＡＧ＝１；ＴＧＧ＝２などがもたらされる。このプロセスは、可能な全てのトリヌクレオシドがプローブファミリーに割り当てられるまで継続される。
【０２４２】
図２９Ｂは、３ヌクレオシド長の拘束部分を有するプローブを含むプローブファミリーのコレクションさらなる拘束部分を構築するための手順を示す。該手順は、かかるコレクションを拘束部分が２ヌクレオシド長でありコレクションが４つのプローブファミリーを含む上記のプローブファミリーの２４個の好ましいコレクションの各々から構築するために使用される。プローブファミリーの好ましいコレクションを示す例示的なダイアグラムを図の上側部分に示す。このダイアグラムの欄を、上側のダイアグラムの各欄に割り当てられた色に従って、図の下側部分の欄に直接マッピングしている。したがって、上側のダイアグラムの欄は、左から右に向かって青色、緑色、黄色および赤色である。下側のダイアグラムの欄１のエントリーは、上から下に向かって青色、緑色、黄色および赤色であり、４ヌクレオシドの各組は、上側のダイアグラム欄に対応する。下側ダイアグラムの第２、３および４欄は、欄１の４ヌクレオシドの各組を下方に進行的に移動させることにより作製される。
【０２４３】
「プローブファミリー」は、各々が同じ標識を有する複数の異なるプローブを含む単一の「スーパープローブ」であるとみなされ得ることは認識されよう。この場合、プローブを構成するプローブ分子は、一般的に、該プローブの任意の部分において実質的に同一の分子の実質的に同一の分子集団ではない。用語「プローブファミリー」の使用は、任意の限定的な効果を有することを意図するものではなく、かかる「スーパープローブ」を構成し得るプローブの特徴の記載の便宜上のために用いる。
【０２４４】
デコード化
上記のように、少なくとも２つの識別可能に標識されたプローブファミリーを含むプローブファミリーのコレクションを用いる伸長、ライゲーション、検出および切断の連続的サイクルにより、プローブファミリーの序列リスト名が、単一の配列決定反応、または序列リスト内の鋳型内の異なる部位から開始される多重配列決定反応で決定されたプローブファミリー名の合成のいずれかからもたらされる。実施されるサイクル数は、所望の配列の長さおよそ同等であるはずである。序列リストは、相当な量の情報を含むが、直接的に目的の配列が得られる形態ではない。おそらく目的の配列を表す配列を得るため、さらなる工程（１つまたは複数）（その少なくとも１つは、さらなる配列に関する情報の少なくとも１つの項目の収集を伴う）を行なわなければならない。おそらく目的の配列を表す配列は、本明細書において「正確な」配列といい、正確な配列をプローブファミリーの序列リストから抽出するプロセスは、を「デコード化」という。上記の「序列リスト」内の要素は、リストの作製中またはその後のいずれかで再編成され得ることは認識されよう。ただし、リスト内の要素と鋳型内のヌクレオチド間の対応を含む情報の内容は保持されるものとし、また、再編成、再分化および／または置換（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）は、デコード化プロセス中に適切に考慮されるものとする（後述）。したがって、用語「序列リスト」は、上記のようにして作製された再編成、再分化および／または置換された変形例の序列リストを包含することが意図される（ただし、かかる再分化および／または置換された変形例は実質的に同じ情報内容を含むものとする）。
【０２４５】
序列リストは、さまざまなアプローチを用いてデコード化され得る。一部のこれらのアプローチは、プローブファミリーの序列リスト名からの１組の少なくとも１つの候補配列の作製を伴う。候補配列の組により、目的を達成するのに充分な情報が提供され得る。好ましい実施形態において、おそらく目的の配列を表す配列を候補配列の中から、または候補配列と比較される１組の配列から選択するために、１つ以上のさらなる工程が行なわれる。例えば、アプローチの一例において、少なくとも１つの候補配列の少なくとも一部分を、少なくとも１つの他の配列と比較する。正確な配列は、比較に基づいて選択される。本発明のある特定の実施形態において、デコード化は、該方法を反復すること、および元のプローブファミリーのコレクションと異なるようにコード化されたプローブファミリーのコレクションを用いて第２のプローブファミリーの序列リスト名を得ることを伴う。第２のプローブファミリーの序列リストからの情報は、正確な配列を決定するために使用される。ある一部の実施形態において、別のコード化されたプローブファミリーのコレクションを用いて伸長、ライゲーションおよび検出の１サイクルという少ないサイクルから得られる情報は、正確な配列の選択の可能にするのに充分である。換言すると、別のコード化されたプローブファミリーを用いて同定された第１のプローブファミリーにより、どの候補配列が正確であるかを決定するのに充分な情報が提供される。
【０２４６】
他のデコード化アプローチは、任意の利用可能な配列決定法、例えば、１サイクルの配列決定法Ａによって鋳型内の少なくとも１つのヌクレオチドを特異的に同定することを伴う。１つ以上のヌクレオチド（１つまたは複数）に関する情報が、プローブファミリーの序列リスト名をデコード化するための「鍵」として用いられる。あるいはまた、鋳型の配列決定される部分は、その配列が未知である領域に加えて、既知配列の領域を含むものであり得る。配列決定法ＡＢが、未知配列と既知配列の少なくとも１つのヌクレオチドとの両方を含む鋳型の部分に適用される場合、既知配列が、プローブファミリーの序列リスト名をデコード化するための「鍵」として用いられ得る。以下のセクションに候補配列を作製するプロセスを記載する。その後のセクションに、既知配列との比較、第２の組の候補配列との比較、および既知ヌクレオチド正体の利用によって正確な配列を選択するための候補配列の使用を記載する。
【０２４７】
候補配列の作製
鋳型の配列決定される領域は、伸長、ライゲーションおよび切断の連続的サイクルによって生成される伸長された二本鎖に相補的であることは認識されよう。したがって、伸長された二本鎖の候補配列を作製することは、鋳型の配列決定される領域の候補配列を作製することに等価である。実際には、鋳型の配列決定される領域の候補配列を作製し得るか、または伸長された二本鎖の候補配列を作製し、その相補配列を得て鋳型の配列決定される領域の候補配列を決定し得る。後者のアプローチをここに記載する。候補配列をプローブファミリー名のリストから作製するため、プローブファミリーのリストの第１のメンバーを考慮する。該プローブファミリーと関連する拘束部分の組により、配列内の最初のヌクレオチドの可能性が、拘束部分の長さに相当する長さに限定される。例えば、拘束部分がジヌクレオチドである場合、伸長された二本鎖内の最初のジヌクレオチドの可能な配列は、該プローブファミリーに含まれるプローブ内に存在する拘束部分に限定される（したがって、鋳型の配列決定される領域内の第１のジヌクレオチドの可能な配列は、該プローブファミリーに含まれるプローブ内に存在する拘束部分に相補的な組合せに限定される）。最初のジヌクレオチドの可能性は、典型的にはコンピュータによって記録される。同様に、伸長された二本鎖内の第２のジヌクレオチド（すなわち、第１のジヌクレオチドから１ヌクレオチドずれたジヌクレオチド）の可能な配列が、第２のプローブファミリーに含まれるプローブ内に存在する拘束部分に限定される（したがって、鋳型内の第２のジヌクレオチド、すなわち、第１のジヌクレオチドから１ヌクレオチドずれたジヌクレオチドの可能な配列が、第２のプローブファミリーに含まれるプローブ内に存在する拘束部分に相補的な組合せに限定される）。第２のジヌクレオチドの可能な配列もまた記録される。続くジヌクレオチドの可能な配列（ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）も同様に、決定対象の配列の所望の長さに相当するまで、またはリスト内のプローブファミリーがなくなるまでジヌクレオチドの可能な配列が記録される。
【０２４８】
可能な配列の記録プロセスの代表例を図３０に示す。図において、プローブファミリー名のリストは、図２５Ａに示すプローブファミリーコレクションを用いて作製されたものと想定している。図３０の左端の欄はプローブファミリーのリストを示し、上から下の順に、黄色、緑色、赤色、青色である。リスト内の各プローブファミリーに対応するジヌクレオチドの配列可能性を図の右側に示す。ヌクレオチド位置を配列可能性の上部に示す。配列は１位から始まり、そのため、第１のジヌクレオチドは１位と２位を占める；第２のジヌクレオチドは２位と３位を占めるなどである。黄色プローブファミリーでは、該可能性は、図３０に示すようにＣＣ、ＡＴ、ＧＧおよびＴＡである。緑色プローブファミリーでは、該可能性は、ＣＡ、ＡＣ、ＧＴおよびＴＧであるなどである。各ジヌクレオチドの可能な配列の記録プロセスは、所望の配列長さに達するまで継続される。
【０２４９】
可能性の組を作製した後、第１の仮定を、候補配列内の第１のヌクレオチドの正体において行ない、これは、図３０において１位と表示する配列の５’位置であると仮定するものである。第１の仮定は、該ヌクレオチドがＡである、該ヌクレオチドがＧである、該ヌクレオチドがＣであるまたは該ヌクレオチドがＴであるとするものであり得る。
【０２５０】
各ジヌクレオチドの可能な配列は、隣接するジヌクレオチドが重複する、すなわち、第１のジヌクレオチドの第２のヌクレオチドはまた、第２のジヌクレオチドの第１のヌクレオチドであるため、隣接するジヌクレオチドの可能な配列によって限定されることが観察される。例えば、第１のヌクレオチドをＣと仮定した場合、第１のジヌクレオチドはＣＣとなるはずである。第１のジヌクレオチドがＣＣであるならば、第２のジヌクレオチドは、Ｃをその第１の位置に有するはずである。Ｃをその第１の位置に有する第２のジヌクレオチドの唯一可能な配列はＣＡであるため、第２のジヌクレオチドがＣＡのはずであることは明白である。したがって、最初のの３つのヌクレオチドの配列は、ＣＣＡのはずである。同様に、第３のジヌクレオチドの可能な配列は、第２のジヌクレオチドの可能な配列によって限定される。第２のジヌクレオチドがＣＡであるならば、第３のジヌクレオチドは、その第１の位置にＡを有することが唯一の可能性であるため、ＡＧのはずである。したがって、最初の４つのヌクレオチドの配列はＣＣＡＧのはずである。このプロセスを継続すると、最初の５つヌクレオチドに対して５’−ＣＣＡＧＣ−３’の配列がもたらされる。したがって、ＣＣＡＧＣは第１の候補配列である。
【０２５１】
第２の候補配列は、第１のヌクレオチドがＡであると仮定することによりもたらされる。この仮定により、ＡＴが第１のジヌクレオチドとなる。ＴＧは、ＡＴが第１のジヌクレオチドの配列と整合する第２のジヌクレオチドの唯一の可能な配列である。ＧＡは、ＴＧが第２のジヌクレオチドの配列と整合する第３のジヌクレオチドの唯一の可能な配列である。ＡＡは、ＧＡが第３のジヌクレオチドの配列と整合する第４のジヌクレオチドの唯一の可能な配列である。これらのジヌクレオチドを完全長の候補配列に合成すると、ＡＴＧＡＡが得られる。同様に、第１のヌクレオチドがＧであるという仮定により、候補配列ＧＧＴＣＧが得られ、第１のヌクレオチドがＴであるという仮定により、候補配列ＴＡＣＴＴが得られる。したがって、各々、仮定された配列の第１のヌクレオチドの異なるヌクレオチドで始まる４つの候補配列がもたらされる。
【０２５２】
仮定は、その他のヌクレオチドの１つではなく第１のヌクレオチドで行なわなければならないとする要件はない。例えば、仮定は、充分等しく第４のヌクレオチドの正体において行なわれたものであり得、この場合、候補配列は、鋳型に沿って「逆行方向」（すなわち、３’→５’方向）に移動させることによりもたらされ得る。例えば、第４のヌクレオチドがＴであると仮定することは、第４のジヌクレオチドはＴＴのはずであり、第３のジヌクレオチドはＣＴのはずであり、第２のジヌクレオチドはＡＣのはずであり、第１のジヌクレオチドはＣＣのはずであることを意味する（ヌクレオチドは、５’→３の向きに記載されるが、その正体は、配列において３’→５’に移動させることによりもたらされる）。あるいはまた、仮定は、配列の中央の任意のヌクレオチドにおいて行なわれ得、ジヌクレオチドの正体は、５’→３’および３’→５の両方向に移動させることによりもたらされる。ヌクレオチドの１つに対する仮定の非存在下では、各位置がＡ、Ｇ、ＣまたはＴで占められ得るため、各ヌクレオチドの正体が完全に決定されない状態になることは認識されよう。
【０２５３】
好ましいプローブファミリーのコレクションを用いる場合、任意の単一のヌクレオチド（例えば、第１のヌクレオチド）の正体を仮定すると、唯一の候補配列が生成される。しかしながら、プローブファミリーのやや好ましいコレクションを用いる場合、１つより多くのヌクレオチドの正体を仮定することが必要であり得る。すなわち、第１のヌクレオチドの正体を仮定することでは、残りの配列は完全には特定されない。例えば、プローブファミリーのやや好ましいコレクションは、その規定配列がＡＡおよびＡＣであるメンバーファミリーを含むものであり得る。かかる場合では、第１のヌクレオチドがＡであると仮定することにより、第２のヌクレオチドに対して２つの可能性が残る。プローブファミリーのやや好ましいコレクションを用いる配列決定を以下にさらに論考する。拘束部分が非連続的なヌクレオチドからなる場合、上記のアプローチは、若干の修正を伴ってやはり使用され得ることは認識されよう。
【０２５４】
候補配列と既知配列との比較による配列同定
一般的に、上記のようにして、伸長された二本鎖の候補配列が決定された場合、鋳型の配列決定される領域に対応する候補配列は、その相補配列を得ることにより得られる。場合によっては、候補配列自体が、目的を達成するのに充分な情報を提供する。例えば、配列決定の目的が、単にある特定の配列可能性を排除することである場合、候補配列とその可能な配列とを比較することで充分であり得る。例えば、図３０に示す候補配列は、配列決定対象の領域はポリＡテイルの一部でないという決定を可能にし得るものである。より長い配列により、配列決定対象の領域がベクターの一部でないことが確認され得る。
【０２５５】
多くの場合、正確な配列を明確に決定することが望ましい。好ましい本発明の実施形態によれば、正確な配列は、鋳型の配列決定される領域の候補配列を１組の既知配列と比較することにより同定される。既知配列の組は、例えば、ある特定の目的の生物体の１組の配列であり得る。例えば、ヒトＤＮＡを配列決定する場合、候補配列を、Ｈｕｍａｎ  Ｄｒａｆｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅと比較し得る。公的に入手可能なヒトゲノム配列情報源の案内については、ＵＲＬ  ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ／ｇｕｉｄｅ／ｈｕｍａｎ／のウェブサイトを参照のこと。別の例として、感染因子（例えば、被験体から単離された細菌またはウイルス）由来の核酸が配列決定される場合、該細菌またはウイルスのバリアント株の配列を含むデータベースが検索され得る。完全または部分配列のいずれかを含む多くのかかる生物体指定データベースが、当該技術分野で知られており、配列決定作業が加速されると、より多くが利用可能となる。一部の代表的な例としては、マウス（例えば、ウェブサイトＵＲＬ  ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ／ｓｅｑ／ＭｍＨｏｍｅ．ｈｔｍｌを参照）、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、ウェブサイトＵＲＬ  ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｈｉｖ−ｄｂ／ｍａｉｎｐａｇｅ．ｈｔｍｌを参照）、マラリア種Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（例えば、ウェブサイトＵＲＬ  ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｔｄｂ／ｅｄｂ２／ｐｆａｌ／ｈｔｍｌｓ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌを参照）などのデータベースが挙げられる。もちろん、生物体指定の組の配列を用いる必要はない。広範なさまざまな生物体およびウイルス由来の配列を含むＧｅｎＢａｎｋ（ウェブサイトＵＲＬ  ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｇｅｎｂａｎｋ／）などのデータベースを検索してもよい。データベースは、鋳型を誘導した生物体またはウイルス由来の任意の配列を含むものである必要はない。一般に、配列はゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、ＥＳＴｓなどであり得る。多数の配列が検索され得る。
【０２５６】
単純に検索を行なうことは、目的を達するのに充分であり得る。例えば、ウイルス系核酸が患者から単離された場合、候補配列を該ウイルスの１組の既知配列と比較することにより、該ウイルス系核酸が、該ウイルス由来の配列を含むか含まないかいずれであるかが、配列のマッチングを調べられない場合であっても、決定され得る。マッチングの存在により、患者が該ウイルスに感染していることが確認され得、一方、マッチングの欠如は、患者が該ウイルスに感染していないことを示し得る。
【０２５７】
ある特定の実施形態において、既知配列の組は、より狭い範囲の配列を含み、これは、配列決定が行なわれる目的に特別に調整されたものであり得る。したがって、配列決定される核酸に関する情報は、既知配列の組を選択するために使用され得る。例えば、鋳型がある特定の遺伝子の配列を示すものであることがわかっている場合、既知配列は、所与の目的の遺伝子座の遺伝子、変異型および野生型配列の異なる対立遺伝子を表すものなどであり得る。候補配列のどれが正確であるかを決定するためには、候補配列を単一の既知配列と比較することだけが必要であり得る。例えば、本発明のある特定の実施形態において、鋳型は、目的の領域を含むＤＮＡ増幅することにより得られる（例えば、目的の領域に隣接するプライマーを用いて）。目的の領域は、変異または多型（例えば、ある特定の疾患と関連する変異または多型）が存在し得る部位を包含する。鋳型が、ある特定の目的の領域由来の配列を示すものであることがわかっている場合、候補配列を該領域の単一の参照配列と、例えば、野生型または変異型形態の配列と比較するだけでよい。換言すると、鋳型の配列の一部または全部がわかっている場合は、複数の既知配列との比較を行なうことは必要とされ得ない。それどころか、既知配列の一部または全部を含む候補配列が適宜選択される。例えば、ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２遺伝子内の変異は、乳癌リスクの増大と関連していることがわかっており、被験体がかかる変異を保有している否かの決定において重要な関心となる。鋳型がＢＲＣＡｌ遺伝子由来の配列を含むことがわかっている場合、例えば、該遺伝子の一部分を包含する目的の領域と隣接するプライマーが鋳型のクローン性の集団を作製するために使用された場合、正確な配列を決定するためには、候補配列を野生型または変異型ＢＲＣＡ１配列と比較するだけでよい。
【０２５８】
より一般的な場合では、候補配列を既知配列の組と比較することにより、任意の候補配列類似する任意の既知配列が同定される。ただし、候補配列は充分な長さのものであり、データベースが１つより多くの候補配列と同一のであるか非常に類似する配列を含む尤度は非常に小さいものとする。換言すると、候補配列が充分に長い場合、その１つより多くが既知配列の組に提示されることは考えにくい。候補配列は、「マッチング」しているとみなされる任意の配列と比較される。典型的には、マッチングが存在することが確立される必要とされる同一性の程度の閾値を設定することが望ましい。例えば、既知配列は、候補配列と既知配列が少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％またはまさに１００％同一である場合、マッチングしているとみなされ得る。典型的には、同一性割合は、少なくとも１０ヌクレオチド長、例えば１０〜１５ヌクレオチド、１５〜２０ヌクレオチド、２０〜２５ヌクレオチド、２５〜３０ヌクレオチドなどの領域で評価する。該領域の長さは、さまざまな異なる基準、例えば、限定されないが、複数の既知配列内の配列の数、複数の既知配列の正体または供給源などに応じて選択され得る。例えば、候補配列をＧｅｎＢａｎｋなどの大きなデータベースの配列と比較する場合、より少ない配列を含むデータベースが利用される場合は、長鎖の使用が望ましいことがあり得る。本発明のある特定の実施形態では、配列を、必ずしも互いに隣接していない複数の異なる領域において比較する。好ましくは、合わせた領域の長さは、少なくとも１０ヌクレオチド長、例えば１０〜１５ヌクレオチド、１５〜２０ヌクレオチド、２０〜２５ヌクレオチド、２５〜３０ヌクレオチドなどである。場合によっては、既知配列の組内の多数の配列がマッチングし得る。配列は、例えば、鋳型を誘導したものと同じ生物体に見られる相同遺伝子、異なる生物体由来の相同遺伝子、、偽遺伝子、ｃＤＮＡおよびゲノム配列などを示すものであり得る。
【０２５９】
一般に、既知配列の組内の配列にもっとも類似する候補配列が適宜選択される。あるいはまた、例えば、配列決定法が高エラー率に供されたかもしれないと思われる理由がある場合、適宜データベースから対応する配列を選択することが好ましいことがある。例えば、エラー率が所定の閾値より高いことがわかっている場合、正確な配列としてデータベースから配列を選択することが好ましいことがある。
【０２６０】
マッチングの尤度が多数の候補配列に見られることを確実にするために必要とされる長さは、さまざまな考慮事項、例えば、限定されないが、既知配列の具体的な組、許容されるマッチングの閾値などに依存する。一般に、典型的な生物体のゲノムにおいて、１回で提示される配列の長さは約２５〜２６ヌクレオチドにすぎない。したがって、およそこの長さの候補配列の作製が、正確な配列を同定するのに充分である。一般に、候補配列は、少なくとも１０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１５、少なくとも２０ヌクレオチド長、例えば、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４５〜５０またはさらに長鎖であるのがよい。
【０２６１】
第１の組の候補配列と第２の組の候補配列との比較による配列同定
本発明のある特定の実施形態において、デコード化は、第１のコード化に従ってコード化されたプローブファミリーの第１のコレクションを用いて第１のプローブファミリーの序列リスト作製し、これから第１の組の候補配列を作製し、次いで、第２のプローブファミリーの序列リストを同じ鋳型から、第２のコード化に従ってコード化されたプローブファミリーの第２のコレクションを用いて作製し、これから第２の組の候補配列を作製することにより行なわれる。新たに合成されたＤＮＡ鎖を２つの配列決定反応の間で鋳型から取り出すか、または同一の配列の鋳型を、プローブファミリーの第２のコレクションを用いて配列決定する。候補配列の組を比較する。どのプローブファミリーのコレクションが使用されるかとは無関係に、候補配列の１つが正確な配列であり、その他は正確でない（または、よくても部分的に正確である）ことは認識されよう。したがって、どの候補配列の組も正確な配列を含むが、ほとんどの場合、候補配列の任意の所与の組のその他の候補配列は、候補配列の別の組に見られるものと異なる。したがって、候補配列の２つの組を単純に比較することにより、正確な配列が決定され得る。２種類の異なるようにコード化されたプローブファミリーのコレクションを用いて等しい長さの候補配列を作製する必要はない。本発明の好ましい実施形態において、プローブファミリーの第２のコレクションを用いて作製された候補配列は２ヌクレオチドという短いものであり得、または同等に、プローブファミリーの第２のコレクションを用いて作製されたプローブファミリーの序列リストは、１要素（すなわち、ライゲーションおよび検出の１サイクル）という短いものであり得る。
【０２６２】
図３１Ａ〜３１Ｃは、２種類の識別可能に標識された好ましいプローブファミリーを用いた候補配列の作製およびデコード化の一例を示す。図３１  Ａは、第１のコード化に従ってコード化されたプローブファミリーの好ましいコレクションを示す。図３１Ｂは、プローブファミリー黄色、緑色、赤色、青色（これは、「２３１４」と表示され得、ここで、赤色＝１、黄色＝２、グリーン＝３および青色＝４である）の序列リストからの４種類の候補配列の作製を示し、その正確な配列をＣＡＧＧＣ（太字で示す）と仮定している。図３１Ｃは、第２のコード化に従ってコード化されたプローブファミリーの好ましいコレクションを示す。鋳型内の第１のジヌクレオチドはＣＡであるため、黄色プローブファミリーの最上のプローブが伸長の第１のサイクルにおいて伸長可能な末端にライゲートされる。これにより、第１のジヌクレオチドに対して下記の組の候補配列：ＣＡ、ＴＣ、ＧＧ、ＡＴがもたらされる。第１のプローブファミリーのコレクションを用いて作製された候補配列のうち、配列ＣＡＧＧＣだけが、任意のこれらのジヌクレオチドで始まる。したがって、これは正確な配列のはずである。一般に、第１および第２のプローブファミリーのコレクションは、下記の基準：第１と第２のプローブファミリーのコレクションを比較する場合、（ｉ）第１のコレクション内の各プローブファミリーの４種類のプローブのうち３種類が第２のコレクションの新たなプローブファミリーに割り当てられるべきである；および（ｉｉ）３種の再割り当されたプローブの各々が第２のコレクションの異なるプローブファミリーに割り当てられるべきであるを満たすべきであることが好ましい。
【０２６３】
既知ヌクレオチド正体を用いたプローブファミリーの序列リストのデコード化
上記のように、候補配列は、伸長された二本鎖または鋳型内の単一のヌクレオチドの正体を仮定することにより作製され得る。使用される具体的なプローブファミリーコレクションに応じて、一般的に、少なくとも４種類の候補配列を作製することが必要である。しかしながら、多数の候補配列の作製は、鋳型内の少なくとも１つのヌクレオチドの正体がわかっている場合は（したがって、伸長された二本鎖の場合も）回避され得る。その場合は、単一の候補配列を作製するだけでよい。候補配列を作製するための方法は、上記のものと同一である。鋳型内の少なくとも１つのヌクレオチドの正体は、任意の配列決定法、例えば、限定されないが、配列決定法Ａ、１組の識別可能に標識されたヌクレオチドおよびポリメラーゼを用いる初期オリゴヌクレオチドからのプライマー伸長などを用いて決定され得る。鋳型内の１つ以上のヌクレオチドが、まず、配列決定法ＡＢ以外の配列決定法を用いて配列決定され得、次いで、初期オリゴヌクレオチドおよび任意の伸長産物が除去され得、同じ鋳型が配列決定法ＡＢを用いる配列決定に供され得ることは認識されよう（または逆も同様）。
【０２６４】
別のアプローチは、その配列が決定される部分に加えて既知の正体の１つ以上の既知ヌクレオチドを含む鋳型を単純に配列決定することである。例えば、鋳型の初期オリゴヌクレオチドが結合する領域と未知配列が始まる領域との間の部分に、１つ以上の既知の正体のヌクレオチドが含まれ得る。鋳型のこの部分を配列決定法ＡＢに供することにより、配列内の１つ以上のヌクレオチドの正体が予め決定され、したがって、単一の候補配列を作製するために使用され得、これは正確な配列である。
【０２６５】
したがって、上記の方法は、（ｉ）どの正体が既知ヌクレオチドの正体と一致するか、およびその近位ヌクレオチドが、既知の正体のヌクレオチドに隣接するヌクレオチドに対向してライゲートされたプローブの拘束部分の可能な配列を調べることにより、正体を、既知の正体のヌクレオチドに隣接する鋳型内のヌクレオチドに割り当てる工程；（ｉｉ）
どの正体が、その近位ヌクレオチドが後続のヌクレオチドに対向してライゲートされたプローブの拘束部分の可能な配列と一致するかを調べることにより、正体を後続のヌクレオチドに割り当てる工程；ならびに（ｉｉｉ）  配列が決定されるまで工程（ｉｉ）を反復する工程を含む。伸長された二本鎖と鋳型の配列決定される領域との間に正確な対応があるため、これらの工程は、同じ工程を伸長された二本鎖において行なうことと等価であることを理解されたい。
【０２６６】
やや好ましいプローブファミリーを用いる配列決定
やや好ましいプローブファミリーのコレクションは、配列決定法ＡＢを、好ましいプローブファミリーのコレクションが使用される様式と同様にして行なうために使用され得る。しかしながら、結果はいくつかの点で異なり得る。例えば、配列のある特定部分は候補配列から、さらなる情報を必要せずに完全に同定され得る。図３２は、図２８に示すようにしてコード化されたプローブファミリーのやや好ましいコレクションを用いる配列決定の一例を示す。配列の決定は、一般的に、好ましいプローブファミリーのコレクションで記載したようにして行なう。目的の鋳型は配列「ＧＣＡＴＧＡ」を有し、これは、プローブファミリーの序列リストでは「１２３４１」となる。１位のヌクレオチドをＡと仮定すると、「ＡＣＡＴＧＡ」が候補配列として得られる。しかしながら、好ましいプローブファミリーのコレクションの場合とは異なり、標識「１」は、第１のヌクレオチドとしてＡを有する２つの異なるジヌクレオチド、すなわち「ＡＡ」および「ＡＧ」と関連するため、第２のヌクレオチドに対して２つの可能性がある。したがって、１位のヌクレオチドがＡであると仮定すること、「ＡＣＡＴＧＣ」が第２の候補配列として得られる。１位のヌクレオチドがＧであると仮定すると、「ＧＣＡＴＧＡ」が候補配列として得られ、また、「ＧＣＡＴＧＣ」が候補配列として得られる。標識「１」は、ＣまたはＴを１位に有するジヌクレオチドとはなんら関連しないため、「Ｃ」または「Ｔ」で始まる候補配列は得られない。図３２は、互いにアライメントさせた４つの候補配列を示す。すべての候補配列の中央の４つのヌクレオチドがＣＡＴＧであることが観察される。したがって、正確な配列は、ＣＡＴＧを２〜５位に含むものであるはずである。もし、これらのヌクレオチドが目的のものでない場合は、さらなるデコード工程を行なう必要はない。
【０２６７】
上記のように、プローブファミリーのコレクションは、４種類の異なるプローブファミリーからなるものである必要はく、２つよりより多く４Ｎ（ここで、Ｎは拘束部分の長さである）までの任意の数からなるものであり得る。しかしながら、４つより少ないファミリーを用いる場合、４つより多くの候補配列作製することが必要であり得、一方、４つより多くのプローブファミリーを用いる場合は、さらなる標識が必要とされる。これらおよび他の理由により、４つのプローブファミリーからなるコレクションが好ましい。
【０２６８】
候補配列を互いに比較することによる配列同定
本発明のある特定の実施形態において、目的の配列の一部または全部は、候補配列を互いに比較することにより決定され得る。一般に、かかる比較は、その全長において候補配列のどれが正確であるかを決定するのに充分でないことがあり得る。しかしながら、候補配列の２つ以上が該配列の一部分において同一であるか充分類似している場合、この情報は、鋳型の上記の部分内のヌクレオチドの配列を明確に同定するのに充分であり得る。
【０２６９】
所望の場合、鋳型は、同定された配列を有するさらなる部分を得るため、さらに１回以上、別のコード化されたプローブファミリーを用いて配列決定され得る。これらの部分を組み合わせ、所望の長さの配列が合成され得る。
【０２７０】
プローブファミリーを用いたエラー補正。多くの場合、同じＤＮＡ  配列の一部または全部を提示する多数の鋳型を配列決定し、該配列をアライメントすることが望ましい。鋳型が目的の領域の一部しか含まない場合、重複断片を合成することによって、より長い配列を得る。例えば、生物体のゲノムを配列決定する場合、典型的には、ＤＮＡを断片化し、充分な断片を、各ＤＮＡ鎖がいくつかの（例えば、４〜１２個の）異なる断片内に提示されるように配列決定する。重複配列を合成してより長い配列にするためのコンピュータソフトウエアが当業者に知られている。
【０２７１】
慣用的な配列決定法が用いられる場合、ほとんどの場合、ある領域において、断片の１つ（異常断片という）がその他のものと該領域内の単一の位置で異なる場合以外は、多数の断片が完璧にアライメントされる。孤立性の差が配列決定エラーを表すか否か、または真性の差（例えば、一塩基多型）が該位置に存在するか否かを調べることは、問題となり得る。
【０２７２】
本発明は、配列決定法ＡＢを用いてエラーチェックを行なうこと新規な方法を提供する。該方法によれば、同じＤＮＡ鎖を示す断片を含む鋳型が、上記のような識別可能に標識されたプローブファミリーのコレクションを用いて配列決定され、各鋳型のプローブファミリーの序列リストがもたらされる。プローブファミリーの序列リストをアライメントする。いくつかのリストが、単一の位置でその他の断片異なる１つのリスト以外、リスト内の所定の長さ、例えば、１０、１５、２０または２５それ以上の要素において完璧にアライメントされたら、その差は、配列決定エラーに起因する。実際に多型が存在する場合、異常断片から得られた序列プローブリストは、２つ以上の隣接する位置で、その他の断片から得られた序列プローブリストと異なる。
【０２７３】
例えば、表１のコード化４を用いたプローブファミリーの好ましいコレクションを使用する配列決定法ＡＢを、配列５’−ＣＡＧＡＣＧＡＣＡＡＧＴＡＴＡＡＴＧ−３’を含む鋳型に適用すると、下記のプローブファミリーの序列リスト：「２３３２４３２２１３２４４４１４２」が得られ、これを以下に示す。
【０２７４】
【化１】
2009538123.tif 000076
実際にＳＮＰが存在する場合（例えば、ＣＡＧＡＣＧＡＧＡＡＧＴＡＴＡＡＴＧ、式中、下線のヌクレオチが多型性部位を表す）、リスト内の２つの連続する要素に変化がもたらされる：２３３２４３３３１３２４４４１４２式中、下線は、ＳＮＰの結果として生じた変化を示す。プローブファミリーの序列リストとＳＮＰを含む配列間の対応を以下に示す。
【０２７５】
【化２】
2009538123.tif 000077
しかしながら、ライゲートされた伸長プローブと会合した標識の同定におけるエラーは、プローブファミリーの序列リストにおける単一のエラーおよびその点の前方（ｆｏｒｗａｒｄ）から得られる候補配列における変化をもたらす。例えば、７回目にライゲートされ伸長プローブ２３３２４３３２１３２４４４１４２（式中、下線の数字は誤同定された標識を表す）と会合した標識の決定におけるエラーによって、得られる候補配列はＣＡＧＡＣＧＡＧＴＴＣＡＴＡＴＴＡＣに変化する（式中、下線部分は、配列決定エラーの結果として生じた変化を示す）。プローブファミリーの序列リストと配列間の対応を以下に示す。
【０２７６】
【化３】
2009538123.tif 000078
３塩基、４標識スキームを用いる場合、ＳＮＰを含む断片により、異常断片のプローブファミリーの序列リストにおいて３連続の差がもたらされるが、配列決定エラーでは、１つの差しかもたらされない。例えば、図２９に示すようにしてコード化されたプローブファミリーのコレクションを用いる場合、配列ＣＡＧＡＣＧＡＣＡＡＧＴＡＴＡＡＴＧのプローブファミリー正体の序列リストを以下に示す。
【０２７７】
【化４】
2009538123.tif 000079
ＳＮＰを含む異常断片、例えば、ＣＡＧＡＣＧＡＧＡＡＧＴＡＴＡＡＴＧは、ＳＮＰを含まない断片から得られる序列リストと比べて３つの連続する位置が異なるプローブファミリーの序列リストをもたらし得、これを以下に示す。
【０２７８】
【化５】
2009538123.tif 000080
配列決定エラーは、たった１つの差をプローブファミリーの序列リスト内にもたらし得、エラー点の前方と完全に異なる候補配列が作製され得る。
【０２７９】
したがって、断片（異常断片）から作製されたプローブファミリーの序列リストを、同じＤＮＡ鎖を示すが、他方の序列リストと単一の孤立性の位置で異なる他の断片から作製されたプローブファミリーの序列リストとアライメントさせる場合、差を含む序列リストが配列決定エラーを表すことがあり得る（プローブファミリーの誤同定）。断片（異常断片）から作製されたプローブファミリーの序列リストを、同じＤＮＡ鎖を示すが、他方の序列リストと２つ以上の連続する位置で異なる他の断片から作製されたプローブファミリーの序列リストとアライメントさせる場合、異常断片がＳＮＰを含むものであることがあり得る。好ましくは、プローブファミリーの序列リストのアライメントされる部分は、少なくとも３または４要素の長さ、好ましくは少なくとも６、８またはそれ以上の要素の長さである。好ましくは、アライメントされる部分は、少なくとも６６％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、またはそれ以上、例えば１００％同一である。
【０２８０】
同様に、断片の候補配列を、配列の第１の部分において同じＤＮＡ鎖を示すが、他の断片の候補配列と配列の第２の部分において実質的に異なる他の断片の候補配列とアライメントさせる場合、配列決定エラーが起こることがあり得る。ある断片の候補配列を、配列の２つの部分において同じＤＮＡ鎖を示すが単一の位置で異なる他の断片の候補配列とアライメントさせる場合、異常断片がＳＮＰを含むものであることがあり得る。好ましくは、候補配列のアライメントされる部分は、少なくとも４ヌクレオチド長である。好ましくは、アライメントされる部分は、少なくとも６６％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、またはそれ以上、例えば１００％同一である。
【０２８１】
したがって、本発明は、（ａ）配列決定法ＡＢを用いて複数の鋳型を配列決定する工程、ここで、鋳型は、単一の核酸配列の重複断片を表す；（ｂ）工程（ａ）で得られた配列アライメントする工程；および（ｃ）配列が第１の部分と全体的に実質的に同一であり、第２の部分と実質的に異なる場合（各部分は少なくとも３ヌクレオチド長を有する）、配列間の差が配列決定エラーを表すと決定する工程を含む、一塩基多型を配列決定エラーと識別する方法を提供する。本発明は、さらに、（ａ）単一の核酸配列の重複断片を表す複数の鋳型を用いて配列決定法ＡＢを行なうことにより、プローブファミリーの複数の序列リスト得る工程；（ｂ）工程（ａ）で得られたプローブファミリーの序列リストをアライメントし、該リストが少なくとも９０％同一であるアライメント領域を得る工程；および（ｃ）該リストがアライメント領域内のたった１つの位置で異なる場合、プローブファミリーの序列リスト間の差は、配列決定エラーを表すと決定する工程；または（ｄ）該リストがアライメント領域内の２つ以上の隣接する位置で異なる場合、プローブファミリーの序列リスト間の差は一塩基多型を表すと決定する工程を含む、一塩基多型を配列決定エラーと識別する方法を提供する。
【０２８２】
非局在化情報収集
当該技術分野でよく知られているように、「ビット」（２進数）は、基数を２とする、換言すると、１または０のいずれかである１桁をいい、デジタルデータの最小単位を表す。ヌクレオチドは任意の４種類の異なる正体を有し得るため、ヌクレオチドの正体の指定には２ビットが必要であることは認識されよう。例えば、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴは、それぞれ００、０１、１０および１１で表され得る。識別可能に標識されたプローブファミリーの好ましいコレクションにおけるプローブファミリー名の指定では、４つの識別可能に標識されたプローブファミリーがあるため、２ビットが必要である。
【０２８３】
最も慣用的な配列決定の形態および配列決定法Ａでは、各ヌクレオチドは、別個の単位として同定され、１つのヌクレオチドに対応する情報が一度に収集される。各検出工程では、２ビットの情報が単一のヌクレオチドから取得される。対照的に、配列決定法ＡＢでは、各検出工程において、２ビット未満の情報が複数のヌクレオチドの各々から取得されるが、プローブファミリーの好ましいコレクションが使用される場合は、やはり１回の検出工程で２ビットの情報が取得される。プローブファミリーの序列リスト内の各プローブファミリー名は、鋳型内の少なくとも２つのヌクレオチドの正体を表し、その正確な数は、プローブの配列決定部分の長さによって決定される。例えば、配列５’−ＣＡＧＡＣＧＡＣＡＡＧＴＡＴＡＡＴＧ−Ｓ’から、表１のコード化４に従ってコード化されたプローブファミリーのコレクションを用いて得られるプローブファミリーの序列リストを考察されたい。
【０２８４】
【化６】
2009538123.tif 000081
プローブファミリー２は、ジヌクレオチドＣＡが、プローブファミリー２のプローブ内に存在する指定される部分の１つであるため、リスト内の第１のプローブファミリーである。プローブファミリー３は、ジヌクレオチドＡＧが、プローブファミリー３のプローブ内に存在する指定される部分の１つであるため、リスト内の第２のプローブファミリーである。上記のように、４つのプローブファミリーがあるため、各プローブファミリー正体は、２ビットの情報で表される。したがって、各検出工程では、２つのヌクレオチドに関する２ビットの情報が収集され、平均１ビットの情報が各ヌクレオチドからもたらされる。
【０２８５】
したがって、本発明は、多数の伸長、ライゲーションおよび検出のサイクルを含む、配列決定方法であって、検出工程が、平均２ビットの情報を同時に、任意の個々のヌクレオチドの２ビットの情報を取得することなく、鋳型内の少なくとも２つのヌクレオチドの各々から取得することを含む配列決定方法を提供する。本発明は、さらに、（ａ）伸長、ライゲーション、検出および切断の連続的サイクルを行なう工程、ここで、検出工程が、平均２ビットの情報を同時に、任意の個々のヌクレオチドの２ビットの情報を取得することなく、鋳型内の少なくとも２つのヌクレオチドの各々から取得することを含む；ならびに（ｂ）工程（ａ）で得られた情報を少なくとも１ビットのさらなる情報と組み合わせて配列を決定する工程を含む、オリゴヌクレオチドプローブファミリーの第１のコレクションを用いて、鋳型ポリヌクレオチド内のヌクレオチドの配列を決定する方法を提供する。種々の本発明の実施形態において、少なくとも１ビットのさらなる情報は、鋳型内のヌクレオチドの正体、候補配列を少なくとも１つの既知配列と比較することにより得られる情報；およびオリゴヌクレオチドプローブファミリーの第２のコレクションを用いて該方法を反復することにより得られる情報からなる群より選択される項目を含む。
【０２８６】
したがって、該方法では、個々のヌクレオチドから２ビットの情報は取得されないが、平均２ビットの情報が鋳型から各サイクルで収集され、プローブファミリーの好ましいコレクションが使用される場合は、非局在化様式で収集される。２または３つのプローブファミリーのコレクションが使用される場合は、２ビット未満の情報が各サイクル中で収集される。
【０２８７】
非局在化情報の収集はいくつかの利点を有し、例えば、上記のものなどのエラーチェック法の適用が可能になる。また、各鋳型内のヌクレオチドは、好ましい実施形態では、非局在化情報の収集によって、１回より多くのインテロゲーションが行なわれる（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅ）ため、特定のヌクレオチドと会合したフルオロフォアの検出における系統的偏重（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｂｉａｓ）の回避が補助され得る。
【０２８８】
本明細書に記載のプローブファミリーおよびプローブファミリーのコレクションは、プローブの伸長、ライゲーションおよび切断の連続的サイクルを伴う方法に加え、さまざまな配列決定法に使用され得る。本発明はまた、上記のような配列および構造を有し、プローブが任意選択で切れやすい連結を含まないプローブファミリーおよびプローブファミリーのコレクションを提供する。例えば、プローブは、ホスホジエステル主鎖連結のみを含むものであり得、および／またはトリガー残基含まないものであり得る。本発明のある一部の実施形態において、プローブファミリーは、伸長およびライゲーションの連続的サイクルを用いるが、各サイクル中で切断を伴わない配列決定を行うために使用される。例えば、プローブファミリーは、ＷＯ２００５０２１７８６および当該技術分野において他に記載されたものなどのライゲーション系の方法に使用され得る。プローブファミリーをかかる方法で使用するためには、プローブ上の標識は、例えば、ＷＯ２００５０２１７８６に開示のように、核酸の切れやすい連結を切断することなく除去され得るように、切断可能なリンカーによって結合されているのがよい。かかる方法は、例えば、ＷＯ２００５０２１７８６に記載されたライゲーションカセットではなくプローブファミリーを用い、多数の反応を並行して、または連続的に行ない、次いで、プローブファミリーのリストを合成することにより、プローブファミリーの序列リスト作製するために使用され得る。リストは、上記のようにしてデコード化される。
【０２８９】
Ｉ．キット
本発明の種々の実施形態を行なためのさまざまなキットが提供され得る。キットのある特定のものは、ホスホロチオレート結合を含む伸長オリゴヌクレオチドプローブを含む。キットは、１種類以上の初期オリゴヌクレオチドをさらに含むものであり得る。キットは、ホスホロチオレート連結の切断に適した切断試薬（例えば、ＡｇＮＯ３）および該切断を行なうための適切なバッファーを含むものであり得る。キットのある特定のものは、トリガー残基、例えば、損傷塩基または無塩基残基を含有するヌクレオシドを含む伸長オリゴヌクレオチドプローブを含む。キットは、１種類以上の初期オリゴヌクレオチドをさらに含むものであり得る。キットは、ヌクレオシドと隣接する無塩基残基間の連結の切断に適した切断試薬および／または損傷塩基をポリヌクレオチドから除去するのに適した試薬（例えば、ＤＮＡグリコシラーゼ）を含むものであり得る。ある特定のキットは、二糖ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブを含み、切断試薬として過ヨウ素酸塩を含む。ある特定の実施形態において、キットは、識別可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブファミリーのコレクションを含む。
【０２９０】
キットは、ライゲーション試薬（例えば、リガーゼ、バッファーなど）および具体的な本発明の実施形態を行なうための取扱い説明書を含むものであり得る。使用され得るその他の酵素、例えば、ホスファターゼ、ポリメラーゼに適切なバッファーを含めてもよい。場合によっては、これらのバッファーは同一であり得る。キットはまた、鋳型を固定するための支持体、例えば、磁気ビーズを含むものであり得る。ビーズは、ＰＣＲ増幅を行なうためにプライマーにより官能性付与されていてもよい。他の任意選択的な成分としては、洗浄溶液；ＰＣＲ増幅のための鋳型の挿入用ベクター；ＰＣＲ試薬、例えば、増幅プライマー、熱安定性ポリメラーゼ、ヌクレオチドなど；エマルジョン調製のための試薬；ゲル調製のための試薬などが挙げられる。
【０２９１】
ある特定の好ましいキットには、ホスホロチオレート結合を含む蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブが、該プローブの異なる末端ヌクレオチドに対応するプローブが異なるスペクトルにより分離可能な蛍光染料を担持するように提供される。より好ましくは、４種類のかかるプローブが提供され、これは、４種類のスペクトルにより分離可能な蛍光染料の各々と、プローブの４種類の可能な末端ヌクレオチドとの間の１対１対応を可能にする。
【０２９２】
キットは、対合末端または断片ライブラリーを生成するのに好適なオリゴヌクレオチドおよび／またはベクターを含有する場合がある。キットは、ライブラリーのメンバーである鋳型分子の相補的な共通部分である１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドを含有する場合がある。
【０２９３】
識別物、例えば、バーコード、高周波ＩＤタグなどをキット内またはキット上に存在させてもよい。識別物は、例えば、品質管理、在庫管理、追跡、ワークステーション間の移動などの目的でキットを固有に識別するために使用され得る。
【０２９４】
キットは、一般的に、ある種の個々の試薬が個別に収容され得るように、１つ以上の容器（ｖｅｓｓｅｌ）または収容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）を含む。キットはまた、個々の収容器を、市販用に比較的コンパクトに（ｃｌｏｓｅ  ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ）封入するための手段、例えば、取扱い説明書、発泡スチレンなどのパッケージング材料などが封入され得るプラスチックボックスを含むものであり得る。
【０２９５】
Ｊ．Ｐａｒａｌｌｅｌ配列決定および自動配列決定システム
Ｍａｃｅｖｉｃｚは、特定の配列を有する単一鋳型種の配列決定を開示しているが、種々の配列を有する複数の鋳型の同時配列決定と並行してこの方法を実施する可能性については述べていない。本発明者等は、高いスループットで配列決定を効率的に実施するためには、上述のように、複数の担体（例えば、ビーズ）を、それぞれの担体に特定の配列の鋳型が付着するように調製し、それぞれの担体に付着した鋳型に対して、本明細書に記載の方法を同時に実施することが望ましいことを認識した。本手法のある実施形態において、複数のこのような担体は、スライドなどの平面の基材の中または上に配列される。ある実施形態において、担体は、ゲルなどの半固形培地の中または上に配列される。担体は、無作為に配列される場合があり、すなわち、基材上の各担体の位置は既定されていない。担体は、規則的な間隔を置いて位置する必要もなければ、列や行などの規則正しい配置に配置する必要もない。好ましくは、担体の多くまたはほとんどから個々のシグナルを検出することが可能な密度で、担体が配列される。ある好ましい実施形態において、担体は、主として単一の焦点面に分布する。同じ配列の鋳型が付着した複数の担体が、例えば品質管理の目的で含まれる場合もある。配列決定反応は、担体のそれぞれに付着した鋳型において、並行して実施される。
【０２９６】
シグナルは、種々のイメージング様式を含めた種々の手段のいずれかを使用して収集される場合がある。好ましくは、検出前に基材（例えば、基材上に配置された半固形担体に埋め込まれたビーズ）上に配列される微粒子に対して配列決定が実施される実施形態の場合、画像化装置の分解能は１μｍ以下である。例えば、ＣＣＤカメラを取り付けた走査型顕微鏡、または十分な分解能を有するマイクロアレイスキャナーを使用できると考えられる。あるいは、蛍光検出のために装備される顕微鏡に取り付けたフローセルまたは流体工学ワークステーションにビーズを通過させることもできる。その他のシグナル収集方法には光ファイバー束が含まれる。適切な画像収集処理ソフトウェアが使用される場合もある。
【０２９７】
本発明のある実施形態において、配列決定はマイクロ流体デバイスで行われる。例えば、鋳型が付着したビーズをデバイスに充填し、その中に試薬を流す場合がある。例えばＰＣＲを使用した鋳型合成もデバイスで行うことができる。米国特許第６，６３２，６５５号では、好適なマイクロ流体デバイスの例が記載されている。
【０２９８】
本発明は、配列情報を複数の鋳型から並行して、すなわち、実質的に同時に収集するために使用され得るさまざまな自動配列決定システムを提供する。好ましくは、鋳型は、実質的に平面状の基材上でアレイ状である。図２１は、本発明のシステムの一例の写真を示す。上側の写真に示すように、本発明のシステムは、ＣＣＤ  カメラ、蛍光顕微鏡、可動ステージ、Ｐｅｌｔｉｅｒフローセル、温度制御装置、液体操作装置および専用のコンピュータを備える。これらの構成要素の種々の置き換えがなされ得ることは認識されよう。例えば、代替的に画像捕捉装置が使用され得る。このシステムのさらなる詳細は実施例９に示す。
【０２９９】
本発明の自動配列決定システムならびに関連する画像処理方法およびソフトウエアは、さまざまな配列決定法、例えば、本明細書に記載のライゲーション系の方法ならびに他の方法、例えば、限定されないが、合成方法による配列決定、例えば、合成による蛍光インサイチュで配列決定（ＦＩＳＳＥＱ）など（例えば、を参照  Ｍｉｔｒａ  ＲＤら．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３２０（ｌ）：５５−６５，２００３）の両方を行うために使用され得ることは認識されよう。本明細書に記載のライゲーション系の配列決定法の場合のように、ＦＩＳＳＥＱは、半固相支持体内または該支持体上に直接固定化された鋳型上、半固相支持体内または該支持体上の微粒子上に固定化された鋳型上、基材に直接結合された鋳型上などで行なわれ得る。
【０３００】
本発明のシステムの重要な態様の１つは、フローセルである。一般に、フローセルは、内部を流体が流動し得る流入ポートおよび流出ポートを有するチャンバを含む。種々のフローセルならびにその製造のための材料および方法の論考については、例えば、米国特許第６，４０６，８４８号および同第６，６５４，５０５号ならびにＰＣＴ公開公報ＷＯ９８０５３３００を参照のこと。流体の流動により、種々の試薬をフローセル内に位置する実体（例えば、鋳型、微粒子、解析物など）に添加し、これらから除去することが可能になる。
【０３０１】
好ましくは、本発明の配列決定システムにおける使用に適したフローセルは、流体がその表面を流動するような基材、例えば、スライドなどの実質的に平面状の基材が取り付けられる位置、および照光、励起、シグナル取得などを可能にする窓を備える。本発明の方法によれば、微粒子などの実体は、典型的にはフローセル内に配置する前に、基材上にアレイ状にする。
【０３０２】
本発明のある特定の実施形態において、フローセルは垂直に配向させ、これにより、気泡をフローセルの上面から散逸させることが可能になる。フローセルは、流体経路がフローセルの下部から上に流れるように、例えば、流入ポートがセルの下部に存在し、流出ポートがセルの上に存在するように配設する。導入され得る気泡は浮揚性であるため、これは、照光窓を障害することなく速やかに流出ポートに浮揚する。気泡を液体の表面まで、その密度が該液体のものより低いことによって上昇させるこのアプローチを、本明細書では「重量測定気泡移動」という。したがって、本発明は、重量測定気泡移動が可能になるように配向させたフローセルを含む配列決定システムを含むを提供する。好ましくは、自身に直接もしくは間接的に結合された微粒子（例えば、共有結合もしくは非共有結合により基材に結合）、または基材に接着もしくは固定された半固相支持体内または該支持体上に固定化された微粒子を有する基材をフローセル内に垂直になるように、すなわち、基材の最大の平面状の表面が、設置面に対して垂直になるように取り付ける。好ましい実施形態では、微粒子は、支持体または基材内またはその上面に固定化されているため、互いに対して実質的に固定された位置に維持され、これにより逐次的な画像取得と画像レジストレーションが容易になる。
【０３０３】
図２４Ａ〜Ｊは、種々の向きの本発明のフローセルまたはその一部分の概略図を示す。本発明のフローセルは、任意のさまざまな目的、例えば、限定されないが、解析方法（例えば、配列決定、ハイブリダイゼーションアッセイなどの核酸解析法；タンパク質解析法、結合アッセイ、スクリーニングアッセイなどに使用され得る。フローセルはまた、合成を行うため、例えば、コンビナトリアルライブラリーを作製するためなどに使用され得る。
【０３０４】
図２２は、別の本発明の自動配列決定システムの概略図を示す。フローセルは、自動温度制御ステージ（実施例９に記載のものと類似）上に取り付けられ、液体操作システム（例えば、マルチポートバルブを有するシリンジポンプなど）に接続されている。該ステージは、他の工程、例えば、伸長、ライゲーションおよび切断などが別のフローセルで行なわれている間に、１つのフローセルが画像化されるのを可能にするために、多数のフローセルを収容する。このアプローチは、高価な光学システム  の利用を最大限にするとともに、処理量を増大させる。
【０３０５】
流体ラインには、気泡を検出ため、および試薬の使用をモニターするための光学および／または伝導性センサーが設置されている。流体工学システム内の温度制御およびセンサーにより、試薬が、長時間の安定に適切な温度に維持されるが、フローセル内に侵入するとき作業温度またはで上昇せず、アニーリング、ライゲーションおよび切断工程中での温度変動が回避されることが確保される。試薬は、好ましくは、誤負荷を回避するためキット内に予め装填しておく。
【０３０６】
光学装置としては、４つのカメラが含まれ、各々が、４つのフィルターセットの１つから１つの画像を撮影する。光退色性効果を低減させるため、照光光学装置は、画像化される領域だけに照光されるように、視野周辺の多重照光が回避されるように設計されたものであり得る。画像化光学装置は、標準的な無限遠補正顕微鏡対物レンズおよび標準的なビームスプリッタおよびフィルターから構成されたものであり得る。標準的な２，０００×２，０００ピクセルＣＣＤカメラは、画像を取得するために使用され得る。該システムには、光学装置のための適切な機械的支持体が組み込まれれている。照光強度は、好ましくは、後の解析ソフトウエアによる使用のためにモニターされ、記録される。
【０３０７】
複数の画像（例えば、代表的な実施形態において、およそ１８００以上の非重複画像フィールド）を速やかに取得するため、該システムには、好ましくは、高速オートフォーカスシステムを用いる。画像自体の解析に基づくオートフォーカスシステムは、当該技術分野でよく知られている。これは、一般的に、１回のフォーカシング事象に少なくとも５フレームを必要とする。これは、フォーカシング画像を取得するために余分な照光が必要とされるという点で、低速および高価の両方である（光退色性が増大する）。本発明のある特定の実施形態において、択一的なオートフォーカスシステム、例えば、該機械的システムが応答し得るのと同等に高速にフォーカシングし得る独立した光学装置に基づくシステムが使用される。かかるシステムは当該技術分野で知られており、例えば、コンシューマＣＤプレイヤーに用いられるフォーカシングシステム（これは、ＣＤ回転時にリアルタイムでサブミクロンフォーカシングを維持する）が挙げられる。
【０３０８】
本発明のある特定の実施形態において、該システムは、遠隔操作される。特定のプロトコルを実行するためのスクリプトは、セントラルデータベース内に保存し、各配列決定実行のためにダウンロードされ得る。試料は、バーコードを付けて、試料追跡の完全性および試料と最終データとの関連付けが維持され得る。リアルタイムのセントラルモニタリングにより、プロセスエラーの迅速な解決が可能になる。ある特定の実施形態において、機器によって収集された画像は、直ちにセントラルマルチテラバイト保存システムおよび１つ以上のプロセッサバンクにアップロードされる。セントラルデータベースからの追跡データを用い、プロセッサ（１つまたは複数）により画像が解析され、配列データが作製され、任意選択で、例えば、機器の性能を調節するために、バックグラウンド蛍光レベルおよびビーズ密度などのメトリクスが処理される。
【０３０９】
制御ソフトウエアは、ポンプ、ステージ、カメラ、フィルター、温度制御を適正にシーケンス処理するため、ならびに画像データの注記付けおよび保存のために使用される。ユーザーインターフェースは、例えば、作業者が機器をセットアップし、維持するのを補助するために設けられ、好ましくは、スライドの負荷／取り出しおよび流体ラインの準備（ｐｒｉｍｉｎｇ）のためのステージを位置合わせする機能を含むものである。例えば、作業者に、種々の実行パラメータ、例えば、温度、ステージ位置、光学フィルター構成の現状、実行プロトコルの状態などを示すためのディスプレイ機能を含め得る。好ましくは、試薬ロットおよび試料ＩＤなどの追跡データを記録するデータベースへのインターフェースを含める。
【０３１０】
Ｋ．画像およびデータ処理方法
本発明は、少なくとも一部は、コンピュータ可読媒体上に保存されたコンピュータコード（すなわち、ソフトウエア）として行なわれ得るさまざまな画像およびデータ処理方法を提供する。さらなる詳細は、実施例９および１０に示す。また、一般に、配列決定法ＡおよびＢでは、ともに、一般的に、例えば、多重配列決定反応で収集されたデータの追跡管理、かかるデータの合成、候補配列の作製、配列比較の実施などを伴う該処理工程を行なうための適切なコンピュータソフトウエアが使用される。
【０３１１】
Ｌ．配列情報を保存するコンピュータ可読媒体
また、本発明は、本発明の配列決定法を適用することにより得られた情報を保存するコンピュータ可読媒体を提供する。情報としては、生データ（すなわち、さらなる処理または解析がされていないデータ）、処理または解析されデータなどが挙げられる。データには、画像、数値も含まれる。情報は、典型的には、検索が容易なように配設された、例えば、コンピュータメモリ内に保存されたデータベース、すなわち、情報（例えば、データ）のコレクションに保存され得る。情報としては、例えば、配列および配列に関する任意の情報（例えば、部分配列）、配列と参照配列との比較、配列解析の結果、ゲノム情報、例えば、多型情報など（例えば、ある特定の鋳型が多型を含むか否か）または変異情報など、連鎖情報（すなわち、例えば、染色体内での核酸配列の別の核酸配列に対する物理的な位置に関する情報）、疾患関連情報（すなわち、疾患の存在または疾患に対する感受性を、被験体の身体的形質、例えば、被験体の対立遺伝子と相関させる情報）などが挙げられる。情報は、試料ＩＤ、被験体ＩＤなどと関連したものであり得る。試料、被験体などに関するさらなる情報は、例えば、限定されないが、試料の供給源、試料において行なわれた処理工程、情報の解釈、試料または被験体の供給源などに含まれ得る。本発明はまた、前述の任意の情報をコンピュータ可読形式に受信する、例えば、コンピュータ可読媒体に保存することを含む方法を含む。該方法は、該情報にに基づく診断的、予後的もしくは予測的情報を提供する工程、または第３者に、好ましくはコンピュータ可読媒体に保存された情報を単に提供する工程をさらに含み得る。
【０３１２】
以下の実施例は例示の目的で提供され、本発明を限定することは意図されない。
【０３１３】
（実施例１：ホスホロチオレート含有オリゴヌクレオチドの効率的な切断およびライゲーション）
この実施例では、３’−Ｓホスホロチオレート結合を含有する伸長オリゴヌクレオチドの効率的なライゲーションおよび切断を示す実験を記載する。
【０３１４】
材料および方法
ライゲーション配列決定プロトコル
鋳型調製：サイクル的オリゴヌクレオチドライゲーションおよび切断による配列決定の可能性の評価を示すため、および該方法のある特定の態様の変形の効果を検討するため、２組のモデルビーズ系鋳型集団を調製した。実施例に記載したような好ましい実施では、サイクル的オリゴヌクレオチドライゲーションおよび切断により、鎖は３’→５’方向に伸長される。したがって、ライゲーション効率を評価するため、モデル鋳型を、ビーズに５’末端において結合させ、同じ結合領域を３’末端に有するように設計した。１組は、二重ビオチン部分によってストレプトアビジンコート磁気ビーズ（１ミクロン）に結合させた短鎖（７０ｂｐ）オリゴヌクレオチドで構成されたものであった。これらの短鎖鋳型集団の各々は、同一のプライマー結合領域（４０ｂｐ）および特有の配列領域（３０ｂｐ）を３’末端に有するように設計した。この短鎖オリゴヌクレオチド鋳型集団をライゲーション配列決定鋳型１〜７（ＬＳＴ１〜７）と命名した。
【０３１５】
第２の組のビーズ系鋳型集団は、１８３ｂｐのスペーサー配列（ヒトｐ５３エキソン由来）を各鋳型集団内に挿入することにより誘導した長鎖のＰＣＲ生成ＤＮＡ断片（２３２ｂｐ）から設計した。鋳型は、二重ビオチン含有フォワードプライマー、および短鎖鋳型集団と同じ３０塩基の特有３’末端配列を含有するリバースプライマーを用いて増幅させた。鋳型は、水酸化ナトリウム含有バッファーを用いて一方の鎖を融解して離すことにより単鎖に作製した。これらの長鎖鋳型集団は、係属中の特許出願に記載された短鎖断片対末端ライブラリーから生成される種を模倣するように設計し、長鎖ＬＳＴ１〜７と命名した。
【０３１６】
プライマーハイブリダイゼーション：２．５μＬの１００μＭ  ＦＡＭ標識プライマーを、１００μＬの１×クレノウバッファーと予備混合した。この溶液を、バッファーの除去後、鋳型が結合された磁気ビーズ（１０６／μＬ）のアリコート３０μＬに添加し、得られた溶液を充分混合した。鋳型／プライマーハイブリダイゼーションを行なわせた後（ハイブリダイゼーション反応は６５℃で２分間、４０℃で２分間および氷上で２分間行なった）、プライマー／バッファーを除去し、ビーズを、３×洗浄ＩＥバッファーを用いて洗浄し、次いで、３００μＬ（１０６／ｍＬ）をＴＥＮＴバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，２ｍＭ  ＥＤＴＡ，３０ｍＭ  ＮａＯＡｃおよび０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有）に再懸濁した。
【０３１７】
ライゲーション１：次いで、ＬｉｇＳｅｑ−ＦＡＭがハイブリダイズした２．５×１０６のＬＳＴ７ビーズを、３０分間３７℃で、１μＬの１００μＭ  ＬＳＴ７−１九量体，４μＬの５×Ｔ４リガーゼバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），１４μＬのＨ２Ｏおよび１μＬのＴ４リガーゼ（１ｕ／μＬ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する混合物中でインキュベートした。
【０３１８】
切断１：次いで、ビーズを１００μＬのＬＳＷａｓｈ１（１×ＴＥ，３０ｍＭ酢酸ナトリウム，０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００含有）で３回洗浄し；この溶液の１０μＬアリコートを取り出し、解析のために保存した。次いで、ビーズ（ＩＸ）を１００μＬの３０ｍＭ酢酸ナトリウム中で洗浄した。５０μＬの５０ｍＭ  ＡｇＮＯ３をこの溶液に添加し、得られた混合物を３７℃で２０分間インキュベートした。ＡｇＮＯ３を除去し、ビーズを１回、１００μＬの３０ｍＭ酢酸ナトリウム中で洗浄した。次いで、ビーズを１００μＬのＬＳＷａｓｈ１で３回洗浄し、９０μＬの洗浄。（ＴＥＮＴバッファー）に再懸濁し、この溶液の１０μＬアリコートを取り出し、解析のために保存した。
【０３１９】
ライゲーション２：ＴＥＮＴバッファーの除去後、ビーズを１４μＬのＨ２Ｏに再懸濁し、３７℃で３０分間、１μＬの１００μＭ  ＬＳＴ７−５九量体，４μＬの５×Ｔ４リガーゼバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１μＬのＴ４リガーゼ（１ｕ／μＬ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する混合物とともにインキュベートした。
【０３２０】
切断２：ビーズを、１００μＬのＬＳＷａｓｈ１（１×ＴＥ，３０ｍＭ酢酸ナトリウム，０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００）中で３回洗浄し、４５μＬのＷａｓｈｌＥに再懸濁した。この混合物の１５μＬアリコートを取り出して解析のために保存した。次いで、ビーズを１００μＬの３０ｍＭ酢酸ナトリウムで１回洗浄し、５μＬの２０ｍＭ酢酸ナトリウムに再懸濁した。５０μＬの５０ｍＭ  ＡｇＮＯ３をビーズに添加し、混合物を３７℃で２０分間インキュベートした。ＡｇＮＯ３の除去後、ビーズを、１００μＬの３０ｍＭ酢酸ナトリウムで１回洗浄した。次いで、ビーズを、１００μＬのＬＳＷａｓｈ１中で３回洗浄し、３０μＬのＷａｓｈｌＥに再懸濁した。この混合物  ２０μＬアリコートを取り出して解析のために保存した。
【０３２１】
結果
この実験は、図８を参照すると、より良好に理解されよう。図８の上側のセクションは、実験手順の全体的な概要を示す。初期オリゴヌクレオチド（プライマー）を、ビオチン結合によってビーズ結合された鋳型（ＬＳＴ７で示す）にハイブリダイズさせた。初期オリゴヌクレオチドには５’リン酸基を含め、その３’末端をＦＡＭで蛍光標識した。２種類の９量体（九量体）オリゴヌクレオチドプローブ（第１切断可能なオリゴおよび第２切断可能なオリゴ）を、内部にホスホロチオレート含有チミジン塩基（ｓＴ）（下線）を含むように合成した。第１の切断可能なプローブをプライマーの伸長可能な末端に、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いてライゲートし、次いで、硝酸銀を用いて切断した。切断により、伸長プローブの末端の５ヌクレオチドが除去され、伸長可能な末端が、プローブのプライマーにライゲートされたままの部分上に生成した。次いで、第２の切断可能なプローブを伸長可能な末端にライゲートさせ、次いで、同様に切断させた。
【０３２２】
蛍光キャピラリー電気泳動ゲルシフトアッセイを、ライゲーションおよび切断の工程をモニタリングするために使用した。このアッセイでは、プライマーを鋳型鎖に、
５’リン酸基が、接近する（ｉｎｃｏｍｉｎｇ）オリゴヌクレオチドプローブのライゲーション基質としての機能を果たし得る（フルオロフォアは、移動度型キャピラリーゲル電気泳動のレポーターとしての機能を果たす）ようにハイブリダイズさせる。各工程後、ビーズのアリコートを解析のために取り出した。オリゴヌクレオチドプローブのライゲーション後、磁気ビーズを磁石を用いて回収し、ライゲートされたプライマーおよびプローブ（１つまたは複数）からなるライゲート種を、鋳型ビーズから熱変性によって放出させ、自動ＤＮＡ配列決定機器（ＡＢＩ  ３７３０）を用いる蛍光キャピラリー電気泳動に供した。標識されたサイズ標準（リサミンラダー；  １５〜１２０ヌクレオチドのサイズ範囲；クロマトグラムにおいて１組の橙色ピークとして出現、図８参照）。典型的なゲルシフトにおいて、潜在ピークとしては、ｉ）プライマーピーク（無伸長またはプライマー伸長の不足による）、ｉｉ）アデニル化ピーク（ＤＮＡリガーゼの作用による非生産的ライゲーション接合部の５’末端アデノシン残基の結合による−図８Ｆの機構を参照、また、Ｌｅｈｍａｎ，Ｉ．Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８６：７９０−７９７，１９７４も参照）、およびｉｉｉ）終了ピーク（オリゴプローブの結合による）が挙げられる。ライゲーション効率を評価するためのゲルシフトアッセイの使用の利点の１つは、ピーク下面積が、各種の濃度と直接相関することである。
【０３２３】
図８Ａは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼおよびホスホジエステル結合のみを含有する正確にマッチングしたプローブ（図８Ａの左に示す）を用いて行なわれる対照ライゲーションを示す。橙色ピークはサイズマーカーを表す。左の青色ピークは、ライゲーションの非存在下のプライマー位置を示す。正確にマッチングしたプローブライゲーションは、左へのシフトをもたらす（矢印）。図８Ｂは、同じ条件下で、内部に  チオレート含有Ｔ塩基を含有するプローブ（図８Ｂの左に示す）を用いて行なわれるライゲーションを示す。対照プローブで観察されるものと同一のシフトが見られた（矢印）。ライゲートされたホスホロチオレート含有プローブを含有するビーズ連結鋳型集団を、次いで、硝酸銀とともにインキュベートし、プローブ切断を誘導した。ゲルシフト解析により、左にシフトされた４ｂｐ切断産物（図８Ｃ）の標示によって効率的な切断を確認した。予測される切断産物を図８Ｃの左に示す。切断されたビーズ系鋳型集団を、次いで、第２の回目のライゲーションに曝露し、右にシフトされた１３ｂｐ伸長産物（図８Ｄ）の出現によって生産的ライゲーションが示された。予測される切断産物を図８Ｄの左に示す。２回目の切断により、予測された左にシフトされた８ｂｐ切断産物（図８Ｅ）によって示されるように、効率的な多数の切断工程がなされ得ることが確認された。これらの結果は、成功裏のライゲーションおよびホスホロチオレート結合を含有するプローブの切断を示す。
【０３２４】
これらの実験で、ライゲーションが１００％完了まで進行しなかったことは明白であるが、より高い完了度が、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いた他の実験において観察された（下記参照）。確かに、ライゲーションが完了まで進行することは望ましいが、必須要件ではない。例えば、上記のようなライゲーション工程後、任意の非ライゲート５’末端を５’−ホスファターゼで処理することにより有効に「キャッピングする」ことが可能である。しかしながら、その場合、ライゲーション可能な分子の自然減により、行なわれ得る連続ライゲーションの回数が制限され得る。所与の回数の連続ライゲーションについて、読出し長さは、各ライゲーション／切断サイクル後に残ったプローブの長さ、および
配列決定反応の回数（各々の後には、プライマーの除去およびプライマー結合部位の異なる部分に結合するプライマーのハイブリダイゼーションが起こり、これらは、所与の鋳型において行なわれ得、「リセット」回数ともよばれる）に依存する。これは、プローブの５’末端側に位置する切断可能な連結を有するより長鎖のプローブの使用の場合に論じられる。本発明者らの実験では、六量体プローブにより、八量体およびより長鎖のプローブよりも多量の非ライゲーション可能アデニル化産物をもたらす。したがって、八量体およびより長鎖プローブは、実質的に完了までライゲートされる（下記参照）。また、六量体プローブの５’末端への蛍光部分の付加により、ライゲーション効率が低下するようであるが、八量体プローブへの蛍光部分の付加は、影響はほとんどまたは全くない。これらの理由のため、八量体またはより長鎖のプローブは好ましいとみなされる。
【０３２５】
さらなる実験（後述）により、ホスホロチオレート結合および縮重低減性ヌクレオチドを含有するプローブのライゲーションおよび切断；ライゲートされた伸長プローブの３’末端特異性および選択性；ゲル内ライゲーションおよび切断；最小シグナル損失でのプライマーハイブリダイゼーションおよび除去の連続的サイクル；３’→５’伸長でのＴ４またはＴａｑリガーゼの１００％忠実度；ならびにライゲートされた伸長プローブの４色スペクトル分離可能性を示した。該方法を行なうための自動システムを構築した。
【０３２６】
（実施例２：縮重低減性ヌクレオチドを含有するホスホロチオレート含有オリゴヌクレオチドの効率的な切断およびライゲーション）
しかしながら、プローブ長さと競合する考慮事項は、伸長オリゴヌクレオチドの忠実度およびその後続のライゲーション効率に対する影響である。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの忠実度は、接合後、第５番目の塩基以降で急速に低下することが示されている（Ｌｕｏら．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２４：３０７１−３０７８および３０７９−３０８５，１９９６）。ミスマッチを新たなライゲーション接合部の５’側に導入した場合、ライゲーション効率は自然減により低下し得るが、バックグラウンドシグナルにおける位相の散逸または増大は生じない（合成方法によるポリメラーゼ系配列決定に見られる大きな障害）。
【０３２７】
プローブの組は、キャラクタライズされていないＤＮＡのデノボ（ｄｅ  ｎｏｖｏ）配列決定を可能にするため、好ましくは、任意のＤＮＡ配列にハイブリダイズできるものであるのがよい。しかしながら、標識されたプローブの組の複雑度は、４重縮重塩基の長さおよび数にともなって指数関数的に増大する。また、複合プローブの組は、あらゆるプローブ種のほぼ等しい提示を維持したまま、合成するのはより困難であり、生成することよりも困難である。また、これは、各種を一定濃度に維持するのに、より高濃度のプローブ混合物を必要とする。この複雑度に対処するための方法の一例は、４重縮重塩基の代わりに普遍塩基、例えば、デオキシイノシンなどがある特定の位置に組み込まれたヌクレオチドの使用である。
【０３２８】
４重縮重塩基（Ｎ；等モル量のＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）および普遍塩基イノシン（Ｉ）を、八量体内の種々の位置に有する１２種類のオクタヌクレオチドプローブを設計した（イノシンは、Ｂ−ＤＮＡ内の任意の４つの標準塩基と二座に配位した水素結合をすることができる；イノシン塩基対の安定性の順は、Ｉ：Ｃ＞Ｉ：Ａ＞Ｉ：Ｔ≒Ｉ：Ｇである）。これらのプローブ設計の評価の目的の１つは、依然としてイノシン塩基の存在下での効率的なライゲーションを支持したまま、どれだけ低い八量体複雑度が達成され得るかを調べることであった。
【０３２９】
最初の研究では、いくつかのオリゴヌクレオチドプローブを、ビーズ系鋳型（長鎖−ＬＳＴ１）にＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いてライゲートさせた。ライゲーションされると、フルオロフォア標識プライマー（３’ＦＡＭプライマー）は、ライゲートされたオリゴヌクレオチドプローブの量に比例して右にシフトする。設計プローブＮＩ８−９は最高レベル完了を示し、プローブの効率的なライゲーションにより、＞９９％のプライマー集団が右にシフトした（図９参照）。これらの反応は２５℃で行なった；反応温度を３７℃に上げると、ライゲーションは、いくぶん効率が下がり、完了率はより変動的であった。
【０３３０】
データをより詳細に調べると、接合部の３’側の最初の５つのヌクレオチド内により少数のイノシン塩基を有するプローブ（下線）は、より高いライゲーション効率を示すことが示された。ライゲーション効率に対する配列状況の潜在的効果をさらに検討し、評価するため、ライゲーション接合部の３’側の最初の５つの塩基内にたった１つのイノシン残基を有する４種類の設計オリゴヌクレオチドプローブを、すべての鋳型においてスクリーニングした。図１０は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用し、多数の鋳型上の選択したプローブ組成物でのゲルシフトアッセイを用いて評価したときのライゲーション完了を示す。これらの最初の実験のデータにより、ライゲーション効率、したがって完了は、イノシン残基がライゲーション接合部３’側の最初の５つの位置（下線）に配置された場合、変動的であり配列依存性であることが示された。八量体の効率的なライゲーションは、一貫して観察されたが、設計オリゴヌクレオチドプローブＮＩ８−９では、本明細書に示すように、試験したすべての鋳型において＞９９％完了であった。
【０３３１】
なんら理論に拘束されることを望まないが、このデータ（アデニル化中間体の存在を含む）は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼのためのコアＤＮＡ結合部位内の好ましくないイノシン塩基対により、ＤＮＡタンパク質複合体が不安定化され、酵素結合および後続のライゲーションが充分に低減されるという結論を裏付ける。しかしながら、興味深い疑問は、かかるイノシン塩基対の不安定化が、ライゲートされるオリゴヌクレオチドプローブの忠実度に影響し得るのかどうかということであった。
【０３３２】
（実施例３：プローブライゲーションの忠実度）
Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼなどの細菌ＮＡＤ依存性リガーゼは、ライゲーション接合部において高い配列忠実度を有し、３’側のミスマッチは本質的にニック閉鎖（ｎｉｃｋ−ｃｌｏｓｕｒｅ）活性を有しないが、５’側のミスマッチはある程度許容性（ｔｏｌｅｒａｔｅｄ）であることが報告されている（Ｌｕｏら．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２４：３０７１−３０７８および３０７９−３０８５，１９９６）。他方、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼは、いくぶんストリンジェンシーが低く、ミスマッチが接合部の３’および５’の両側で許容されることが報告されている。したがって、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いてプローブライゲーションの忠実度を、本発明者らのシステムの状況におけるＴａｑ  ＤＮＡリガーゼとの比較において評価することは、興味深かった。
【０３３３】
本発明者らは、標準的なＡＢＩ配列決定手法を用いてライゲートされるオリゴヌクレオチドの配列忠実度を評価する２つの方法を開発した。第１の方法は、ライゲーション産物をクローニングし、配列決定するように設計した。この方法では、ライゲーション伸長産物をアダプター配列に結合し、クローニングし、細菌内で形質転換した。個々のクローンを採取し、配列決定して、ライゲーション接合部における各位置でのミスマッチ頻度の定量的評価を得た。第２の方法は、ライゲーション産物を直接配列決定するように設計した。該アプローチでは、単鎖ライゲーション産物をビーズ系鋳型から変性させ、相補プライマーを用いて直接配列決定した。精度の低い位置は配列図（ｔｒａｃｅ）において多数の重複ピークを示し、該位置における配列忠実度を示す定性的評価が得られる。
【０３３４】
第１の方法を用いて、Ｔ４およびＴａｑ  ＤＮＡリガーゼによるプローブライゲーションの相対忠実度を評価した。単一のビーズ系鋳型集団（ＬＳＴ１）を普遍配列決定プライマーにハイブリダイズさせ、これを初期オリゴヌクレオチドとして用いた。次いで、溶液系ライゲーション反応を、縮重オリゴヌクレオチドプローブ（Ｎ７Ａ、３ΑＮＮＮＮＮＮＮ５’、２０００ｐｍｏｌ）の存在下で３７℃、３０分間、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（１５Ｕ／１×１０６  ビーズ）またはＴａｑ  ＤＮＡリガーゼ（６０Ｕ／１×１０６  ビーズ）のいずれかを用いて行なった（図１１、パネルＡ）。ライゲーション産物をクローニングし、配列決定して、そのライゲーション接合部の３’側（１〜８位）の各ＤＮＡリガーゼの位置ごとの忠実度を評価した（図１１、パネルＢおよびＣ）。その結果、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼは、最初の５つ位置ではＴａｑ  ＤＮＡリガーゼと本質的に同じレベルの忠実度を有するが、６〜８位では忠実度が低いことが示された。これらの結果は、３種類の縮重イノシン含有設計プローブ（３’−ＮＮＮＮＮＩＩＩ−５’、３’−ＮＮＮＮＮＩＮＩ−５’および３’−ＮＮＮＩＮＮＮＩ−５’）での、７種類すべての鋳型（ＬＳＴ１〜７）のライゲーション接合部におけるＤＮＡ配列を評価した後続のクローニング実験によってさらに支持された。これらの研究により、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼはライゲーション接合部において６〜８位では低い配列忠実度を有することが確認されたが、最初の５つ位置では試験したすべての鋳型において高い忠実度が示される（データ示さず）。
【０３３５】
直接配列決定法を使用し、縮重イノシン含有プローブを用いてＴ４  ＤＮＡリガーゼの忠実度を評価した。オリゴヌクレオチドプローブは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼおよびビーズ系鋳型を含むライゲーション反応物において、２５℃および３７℃で評価した。オリゴヌクレオチドプローブライゲーション効率は、ゲルシフトアッセイを用いて評価した（図１２、パネルＡ）。オリゴヌクレオチドプローブライゲーションにおけるＴ４  ＤＮＡリガーゼの忠実度を評価するため、ＡＢＩ３７３０ｘｌ  ＤＮＡ解析装置を用いたライゲーション反応の直接配列決定を行なった（図１２、パネルＢ）。正確にマッチングしたオリゴプローブと２種類の代表的な縮重イノシン含有オリゴプローブ（ＮＩ８−９およびＮＩ８−１１）のライゲーションにより、＞９９％完了および非常に低頻度のミスマッチ（配列図における多重ピークの非存在）が得られた。このデータにより、プローブが効率的にライゲートされることによっても高い配列忠実度がもたらされることが示される。
【０３３６】
さらなる実験において、単一のビーズ系鋳型集団（ＬＳＴ１）を、５’リン酸基を含む普遍配列決定プライマーにハイブリダイズさせ、これを初期オリゴヌクレオチドとして用いた。溶液系ライゲーション反応を３７℃で３０分間、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（１Ｕ／  ２５０，０００ビーズ）を用い、縮重イノシン含有オリゴヌクレオチドプローブ（３’ＮＮＮＮＮｉｉｉ５’、３’ＮＮＮＮＮｉＮｉ５’または３’ＮＮＮｉＮＮＮｉ５’、６００ｐｍｏｌ）の存在下で行なった。ライゲーション産物をクローニングし、コロニーを採取し、配列決定した。配列忠実度は、ライゲーション接合部における各位置に提示されたクローンの数を計算することにより決定した。結果を図１２のパネルＣ〜Ｆに表で示す。これらの研究は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いた縮重イノシン含有プローブの３’→５’ライゲーションが、最初の１〜５位で高レベルの忠実度を有することを示す。
【０３３７】
（実施例４：ゲル内ライゲーションおよび切断）
サイクル的オリゴヌクレオチドライゲーション方法を検討、開発および最適化するための最初の実験は、上記のように、溶液中でビーズ系鋳型を用いて行なった。第２の組の実験では、ライゲーションおよび切断を、スライド上のポリアクリルアミドゲル内に包埋したビーズ系鋳型において行なった。
【０３３８】
スライドは、各々が自身に結合された単鎖ＤＮＡ鋳型のクローン性の集団を有する数百万個のビーズを５％ポリアクリルアミドと混合し、ガラススライド上で重合を行なわせることにより調製した。テフロン（登録商標）マスクを用いてビーズ含有ポリアクリルアミド溶液を封入した。図１４（上）は、Ｃｙ３標識プライマーがハイブリダイズされた鋳型が結合されたビーズがポリアクリルアミドゲル内に固定化されたスライドの一部分の蛍光画像を示す（このスライドは、異なる実験に使用したが、ここで使用したスライドの典型である）。図１４（下）は、ポリアクリルアミド溶液を封入するためのテフロン（登録商標）マスクを設けたスライドの概略図を示す。
【０３３９】
反応体をスライド内に、適切な溶液中への手作業によるスライドの浸漬、または自動層流型フローセル内へのスライドの配置のいずれかによって導入した。最初の研究により、効率的なゲル内ライゲーションが実際に、かかるスライド上のポリアクルルアミドマトリックス内に固定化されたビーズに結合された鋳型において行なわれ得ることが確認された。図１５に示す実験では、単鎖ＤＮＡ鋳型ビーズをアクリルアミドおよびＤＡＴＤを含むスライド上に固定化した。重合後、３’フルオロフォア標識された普遍５’リン酸化プライマー（Ｓｅｑプライマー）をゲル内に拡散させ、ハイブリダイズさせた（パネルＡ）。スライドを洗浄して非結合ｓｅｑプライマーを除去し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（１０Ｕ）およびオリゴヌクレオチドプローブを含むライゲーションカクテルを重層し、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、スライドを、過ヨウ素酸ナトリウム（０．１Ｍ）を含有するバッファー中でインキュベートし、アクリルアミドポリマーを消化させ、ビーズ系鋳型集団を放出させた。ライゲーション産物を熱により鋳型鎖から変性させ、回収し、上記のゲルシフトアッセイを用いて解析した。ゲル内ライゲーション反応をＴ４  ＤＮＡリガーゼの非存在下で行ない、非ライゲート配列決定プライマーに代表的な単一のピークが示された（パネルＢ）。ライゲーション反応は、八量体プローブを用い、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの存在下で行ない、効率的なゲル内オリゴヌクレオチドライゲーションが示され、＞９９％のビーズ系鋳型集団が効率的にライゲートされた（パネルＣ）。
【０３４０】
（実施例５：４色検出）
検出効率を最大にするには、各可能な塩基付加産物に対応する異なる標識を有する１組のオリゴヌクレオチドプローブを用いることが望ましい。これを、図１５に概略を示し、適切な励起および発光フィルターを備えた本発明者らの自動配列決定機器においてモデル化した。プローブの特異性および選択性の課題に取り組むため、３組の八量体プローブを設計した。第１の組は、４種類の特有の鋳型集団に相補的で、異なる３’塩基および５’色素標識を有する４種類の八量体を含むものとした。第２の組は、特有の３’塩基および５’色素を有する７種類の特有の八量体を含むものとした。第３の組は、各々が異なる５’色素標識で同定される特有の３’末端塩基を有する４種類の縮重イノシン含有八量体設計プローブに対応させた。
【０３４１】
４色スペクトル正体を確認するため、プローブ組番号１を用いて、４種類の特有の鋳型集団（図１６参照）を検出した。ポリアクリルアミド内に包埋されたビーズに結合された４種類の特有の単鎖鋳型集団を含むスライドを調製した（パネルＡ）。各ビーズは、自身に結合された鋳型のクローン性の集団を有した。５’リン酸基を含有する普遍配列決定プライマーをインサイチュでハイブリダイズさせ、ライゲーション反応を、４種類の特有のフルオロフォアプローブ（Ｃｙ５、ＣＡＬ  ６１０、ＣＡＬ  ５６０、ＦＡＭ；各１００ｐｍｏｌ）およびＴ４  ＤＮＡリガーゼ（１０Ｕ／スライド）を含むオリゴヌクレオチドプローブ混合物を用いて行なった。スライドを３７℃で３０分間インキュベートし、洗浄して非結合プローブを除去した。スライドを明るい光で画像化し、白色光塩基画像（パネルＢ）を得た。蛍光励起には、４種類の帯域通過フィルター（ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、ＴｘＲｅｄおよびＣｙ５）を用いた。蛍光画像捕捉をライゲーションの前後で行なった。個々の集団を擬似カラー表示し（パネルＣ）、画像値のスペクトル正体をプロットし、最小シグナル重複を確認した（パネルＤ）。
【０３４２】
（実施例６：ゲル内でのライゲーション特異性および選択性の実証）
３’末端特異性を確認するため、プローブ組番号２を用いて、単一の鋳型集団のインテロゲーションを行なった（図１７参照）。ポリアクリルアミドゲル内に包埋された自身に結合され単一の鋳型集団（ＬＳＴ１．Ｔ）を有するビーズを有するスライドを調製し、普遍配列決定プライマーとインサイチュでハイブリダイズさせた（パネルＡ）。ゲル内ライゲーション反応を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（１０Ｕ／スライド）を使用し、単一の３’塩基だけが異なる４種類の５’末端−標識されたプローブで構成されたオリゴヌクレオチドプローブ混合物を用いて行なった。スライドを３７℃で３０分間インキュベートし、洗浄して非結合プローブ集団を除去した。スライドを白色光で画像化し、塩基画像を得（パネルＢ）、蛍光励起には、４種類の帯域通過フィルター（ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、ＴｘＲｅｄおよびＣｙ５）を用いた。蛍光画像捕捉をライゲーションの前後で行ない、単一のＦＡＭ系プローブ集団（青色スポット）がＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いたゲル内ライゲーション後に存在し、スペクトル重複がないことを確認した（パネルＣ、Ｄ）。このデータは、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを用いたプローブ特異性がストリンジェントであり、ライゲーション接合部の最初の３’末端塩基によって決定されることを示す。
【０３４３】
３’末端特異性および選択性をさらに実証するため、プローブ組番号２を用いて、単一の塩基差を含み異なる量で存在するビーズ系鋳型集団の混合物を同定した。図１８のパネルＡに示すような、各々が自身に結合された４つの鋳型集団（各々は一塩基多型を有する（ＬＳＴ１；Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ））の１つを有するビーズの混合物を有するスライドを調製した。ビーズを、スライド上のポリアクリルアミドゲル内に包埋した。ビーズ系鋳型集団は、パネルＤに概略を示すように、種々の異なる頻度で用いた。スライドをインサイチュで普遍配列決定プライマーとハイブリダイズさせた。ゲル内ライゲーション反応を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（１０Ｕ／スライド）および等モル量（各１００ｐｍｏｌ）の４種類の５’末端標識プローブ（単一の３’塩基だけ異なる）を含有するオリゴヌクレオチドプローブ混合物を用いて行なった。スライドを３７℃で３０分間インキュベートし、洗浄して非結合プローブ集団を除去した。スライドを白色光で画像化し、塩基画像を得（パネルＢ）、蛍光励起には、４種類の帯域通過フィルター（ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、ＴｘＲｅｄおよびＣｙ５）を用いた。個々のプローブ画像を重ね撮りし、擬似カラー表示した（パネルＣ）。蛍光画像を、ビーズ呼び出し（ｃａｌｌｉｎｇ）ソフトウエアを用いて一覧にした。結果をパネルＤに示す。観察されたライゲーション頻度（Ｏｂｓ）は、予測した頻度（Ｅｘｐ）と相関したことが確認される。このデータは、ライゲーション後、多数の鋳型の存在下での高いプローブ特異性およびプローブ選択性を示し、ライゲーションによって、一塩基多型（ＳＮＰ）、すなわち、集団の異なる個体のゲノムＤＮＡ鎖内の単一のヌクレオチド塩基内に生じた改変を検出できる能力を示す。
【０３４４】
（実施例７：４色縮重イノシン含有伸長プローブを用いたゲル内でのライゲーション特異性および選択性の実証）
別の組の実験をプローブ組番号３を用いて行ない、プローブライゲーションの特異性および選択性を、４色縮重イノシン含有オリゴヌクレオチドプローブプールを用いてを評価した。結果を図１９に示す。ビーズ系スライドを上記のようにして調製したが、４種類の特有の単鎖鋳型集団をビーズ上に異なる量で存在せ、これを、次いで、普遍配列決定プライマーとインサイチュでハイブリダイズさせた（パネルＡ）。ゲル内ライゲーション反応を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（１０Ｕ／スライド）の存在下、５種類の縮重塩基（Ｎ；複雑度４５＝１０２４）、２種類の普遍塩基（Ｉ、イノシン）および単一の既知ヌクレオチドを、特異的５’フルオロフォア（Ｇ−Ｃｙ５、Ａ−ＣＡＬ  ６１０、Ｔ−ＣＡＬ５６０、Ａ−ＦＡＭ；各６００ｐｍｏｌ）に対応する３’末端に有するように設計された八量体からなるプローブプールを用いて行なった。スライドを３７℃で３０分間インキュベートし、洗浄して非結合プローブ集団を除去した。スライドを白色光で画像化し、塩基画像を得（パネルＢ）、蛍光励起には、４種類の帯域通過フィルター（ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、ＴｘＲｅｄおよびＣｙ５）を用いた。個々のプローブ画像を重ね撮りし、擬似カラー表示した（パネルＣ）。蛍光画像を一覧にし、各ライゲーション産物の頻度を、ビーズ呼び出しソフトウエアを用いて表で示した（パネルＤ）；ビーズシグナル値の上部９０％表す未処理生データおよびフィルター処理データのスペクトル散布図をパネルＥに示す。このデータは、観察されたライゲーション頻度（Ｏｂｓ）が、各鋳型の既知濃度に基づいて予測した頻度（Ｅｘｐ）と相関したことを示す。これにより、縮重した普遍塩基含有プローブプールをＴ４  ＤＮＡリガーゼとともに使用すると、特異的および選択的なゲル内ライゲーションがもたらされ得ることが確認される。
【０３４５】
（実施例８：  ゲル内での初期オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよび除去の反復サイクルの実証）
自動フローセル内に取り付けた顕微鏡スライド上のゲル内に固定化された鋳型において実験を行ない（下記参照）、初期オリゴヌクレオチドのアニーリングおよびストリッピングの多数のサイクルが、スライド上のゲル内に包埋されたビーズに結合された鋳型に適用され得、シグナル損失は最少であることを確認した。４４塩基蛍光標識初期オリゴヌクレオチドを使用した。図２０に示すように、１０サイクルで生じたシグナル損失は最少であった。初期オリゴヌクレオチドを、図２０ではプライマーという。上記のように、合成手順によるポリメラーゼ系配列決定の大きな欠点の１つは正（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）および負（ｎｅｇａｔｉｖｅ）の両方の位相の散逸が個々の鋳型鎖において起こる傾向である。正の位相の散逸は、ヌクレオチドが成長鎖内に誤って組み込まれ、したがって、該特定の鎖の塩基配列が残りの鋳型から得られる配列より前で実行（ｒｕｎ  ａｈｅａｄ）され、ｎ＋１塩基呼び出し分位相ずれが引き起こされた場合に起こる。負の位相の散逸は、より一般的であり、鎖が充分に伸長されず、バックグラウンド塩基呼び出しがもたらされ、成長鎖より後ろ（ｎ−１）で実行された場合に起こる。伸長産物効率的にストリッピングできること、および差次的に位置する初期オリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることにより鋳型を「リセット」できることで、シグナル自然減がほとんどまたは全くなしで、非常に長い読出し長さが可能になる。
【０３４６】
（実施例９：自動配列決定システム）
この実施例では、１つ以上の鋳型から配列情報を収集するために使用され得る代表的な本発明の自動配列決定システムを記載する。好ましくは、鋳型を、実質的に平面状の基材、例えば、ガラス顕微鏡スライド上に配置させる。例えば、鋳型は、基材上でアレイ状であるビーズに結合されたものであり得る。該システムの写真を図２１に示す。該システムは、Ｏｌｙｍｐｕｓエピ蛍光顕微鏡本体（横向きに設置）を主部とし、自動オートフォーカシングステージおよびＣＣＤカメラを備える。回転式ホルダ内の４つのフィルタキューブにより、さまざまな励起および発光波長での４色検出が可能である。ペルチェ（ｐｅｌｔｉｅｒ）温度制御を伴うフローセルは、スライドなどの基材を収容するように開放および閉鎖が可能であり（ゲルなどの半固相支持体を含む領域の縁部周囲を密閉するためのガスケットを有する）、ステージ上に設置されている。フローセルの垂直配向は、本発明のシステムの重要な態様であり、気泡がフローセルの上部から散逸するのを可能にする。セルは、各洗浄工程前にすべての試薬が噴出されるように、空気が充分充填されたものであり得る。フローセルは、４種類の差次的に標識されたプローブ混合物、切断試薬、任意の他の所望の試薬、酵素並行化バッファー、洗浄バッファーおよび単一のポートを介するフローセルへの空気の送達を可能にする２つの９−ポートＣａｖｒｏシリンジポンプを有する流体取り扱い部と接続されている。システムの操作は完全に自動化されており、多数のＩ／Ｏポートを有する専用のコンピュータを用いて、制御ソフトウエアによりプログラミング可能である。Ｃｏｏｋｅ  Ｓｅｎｓｉｃａｍカメラには１．３メガピクセル冷却ＣＣＤが組み込まれているが、より低いまたはより高い感度を有するカメラもまた使用され得る（例えば、４メガピクセル、８メガピクセルなども使用され得る）。フローセルには、０．２５ミクロンステージが用いられており、形状は１ミクロンである。
【０３４７】
（実施例１０：画像取得および処理方法）
この実施例では、自身に結合された標識された核酸を有するビーズのアレイからの画像の取得および処理のための代表的な方法を記載する。正確な素性の同定およびアライメントは、各取得画像の信頼できる解析に重要である。素性は、まず、各ビーズについて最も強いピクセル以外は排除するにより同定される。所与の画像のピクセル値をヒストグラムにプロットする；バックグラウンドに対応するピクセルを排除し、残りのピクセル値を分取する。均一な画像では、すべてのビーズがほぼ同じ強度であり、アルゴリズムにより、ピクセル値の下部８０〜９０％を除外する。次いで、上部１０〜２０％値を有するピクセルをスキャンし、４ピクセル半径内で極大のものを同定する。次いで、該領域内の平均強度および周辺の平均強度を記録する。これらの値により正規分布を形成し、次いで、その値が該分布から外れるピクセルを除く。最初に無視したピクセルの割合、該円形領域の大きさ、および正規分布内の可能なビーズを排除した切り捨て値を、すべてパラメータ化し、必要であれば調整し得る。該組の各画像について素性行列を作製することによりアライメントを行なう。次いで、得られた行列を、最も高頻度のｘ、ｙ座標オフセットについて検索し、最適なアライメントを同定する。
【０３４８】
ビーズ画像を、伸長プローブ添加の前に、Ｃｙ５チャネル（配列決定プライマーに対応）に収集する。これらの画像を用いて、各ビーズについて位置的座標および蛍光単位（ＲＦＵ値）としての生シグナル強度の両方をマーキングする（ｍａｒｋｉｎｇ）素性マップを作製する。各後続の二本鎖伸長後、画像の組を、Ｃｙ３−標識ヌクレオチドを添加する前と後の両方で取得する。これらの画像を元のＣｙ５  画像に対してアライメントし、次いで、ＲＦＵ値をビーズの各々に割り当て、記録する。各塩基付加の非標識（伸長前）および標識（蛍光付加）画像間の強度を差を差し引くことによりベースライン補正を適用する。これらのベースラインを差し引いた値を、次いで、各素性でＣｙ５画像において見られた強度によって標準化し、ビーズが伸長された、またはされていないとみなす（すなわち、ビーズは、該ビーズに結合された二本鎖が伸長された場合、伸長されたとみなす）基準を形成する。これらの方法を用い、約１，３００画像／スライドで１つの画像あたり数千の素性が解析され、１回の実験で５〜１００００００００鋳型種の解析がもたらされ得る。アルゴリズムは、さらなる効率増強のために、後日でも容易にＭＡＴＬＡＢからＣ＋にポート移動（ｐｏｒｔ）され得るように設計した。
【０３４９】
（実施例１１：ビーズアライメントおよび追跡および配列でコード化）
この実施例では、自身に結合された標識され核酸を有するビーズのアレイからの画像処理および取得されデータからの配列決定のための代表的な方法を記載する。
【０３５０】
画像解析は、ビーズサイズに適合した直径を有するゼロインテグラルサーキュラートップハットカーネル（ｚｅｒｏ−ｉｎｔｅｇｒａｌ  ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｔｏｐ−ｈａｔ  ｋｅｒｎｅｌ）を用いて画像を回転させることにより開始する。これは、自動的にバックグラウンドをゼロに標準化すると同時に、個々のビーズの中心を極大によりを同定する。最大値を位置し、他の極大から孤立性のものが、アライメント点として使用される。これらのアライメント点は、各画像について時系列でコンピュータ計算される。各対の画像について、アライメント点を比較し、変位ベクトルを、すべての共通アライメント点の平均変位に基づいてコンピュータ計算する。これにより、サブピクセル分解によるペアワイズ画像変位が提供される。
【０３５１】
Ｎ個の画像では、Ｎ＊（Ｎ−ｌ）／２のペアワイズ変位があるが、これらのうちＮ−１だけは、残りが非依存的な組から計算され得るため、非依存的である。例えば、画像１と２間および画像１と３間の変位を測定すると、画像２と３間の変位が示唆される。画像２と３間の測定された変位が示唆された変位と同じでない場合、測定値は不一致である。この不一致の大きさは、どれだけ良好にアライメントアルゴリズムが機能しているかを測るための測定基準として使用され得る。本発明者らの最初の試験は、各寸法において、一般的に、０．１ピクセル未満である不一致を示す（図２３参照）。
【０３５２】
いったん、時系列の画像がアライメントされたら、個々のビーズを追跡するのに２つの方法がある。ビーズ密度が、別のビーズと接触していないビーズの大部分で低い場合、個々の各ビーズの光学質量中心が同定され得、ビーズ周囲の領域が積分され、ビーズ強度がコンピュータ計算される。ビーズ密度が非常に高いため、ビーズの大部分が接触している場合は、その周囲にある暗いバックグラウンドバンドによって個々のビーズを同定することは可能でない。しかしながら、サブピクセル分解のためアライメントされたすべての画像で、隣接するピクセルの相関性を経時的にコンピュータ計算することにより、同じビーズに属するピクセルを同定することが可能である。高度に相関するピクセル対は、確信的に同じビーズに割り当てられ得る。同様の手法がＤＮＡ配列決定ゲル内でのレーン追跡に適用され、良好な結果が得られている（Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，Ａ．Ｐ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｉｎｃｏｅｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｂｙ  ａ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔ７  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９３）。いったんビーズが全４色時系列により追跡されたら、配列は、どの色がプローブオリゴヌクレオチドのどの最も３’側の塩基に対応するかがわかることによりデコード化される。
【０３５３】
（実施例１１：処理量計算）
一般に、配列決定システムの処理量は、主に、装置が１日あたりにもたらすことができる画像の数および１つの画像あたりの配列データのヌクレオチド（塩基）の数によって規定される。装置は、好ましくは、カメラが常時作動中で維持されるように設計され、計算は、１００％カメラ利用に基づいて行なう。１つの塩基の正体を決定するのに各ビーズが４色で画像化される実施において、１つのカメラで４画像、２つのカメラで２画像、または４つのカメラで１画像のいずれかが使用され得る。４つのカメラでの画像化により、他の選択肢よりも劇的に高い処理量が可能になり、好ましいシステムでは、該アプローチが用いられる。
【０３５４】
本発明者らの最初の試験は、５０ピクセル／ビーズのピクセル密度（５．４平方ミクロンを表す）は、標準的な画像解析に適度な（ｃｏｍｆｏｒｔａｂｌｅ）密度を提供することを示す。４メガピクセルＣＣＤ  カメラ（現在では、一般的）を用いることにより、単一のＣＣＤフレームで約８０，０００個のビーズの画像化ができる（本発明者らの現在の画像データに基づく）。別個のカメラでの４種類の画像の捕捉およびフローセル上の次のフィールドへの移動に１．５秒より多くかからない。７５％のビーズにより有用な情報が得られる場合、本発明者らは、およそ８０，０００ビーズ＊０．７５／１．５＝４０，０００塩基／秒の生配列データのデータを収集することができる。
【０３５５】
１００％カメラ利用の維持における大きな問題の１つは、ライゲーション／切断化学反応の１サイクルを行なうのにかかる時間全フローセルの画像化に必要とされる時間に適合させることである。伸長、切断およびライゲーションの１サイクルにかかる時間の適度な推定は１．５時間（５，４００秒間）である。５，４００秒間は１，８００画像フィールドまたは約１５ｍｍ×４５ｍｍの面積に適応し、これは、フローセルに適度なサイズである。４種類のカメラを用いるシステムの処理量の伸長な推定は、１５ｍｍ×４５ｍｍフローセルで４０，０００塩基／秒である。これは、２８実行／日で約６５０塩基読出し長さ（２０塩基／秒）の処理量に基づくと、およそ２，０００  ＡＢＩ３７３０ｘｌ配列決定装置に相当し、本発明者らは、これらの装置を用いて達成した。ビーズ密度を２００，０００／画像に２．５倍増大させると、１００，０００塩基／秒への処理量の全体的な増加が可能になり、これは、ほぼ５，０００  ＡＢＩ３７３０ｘｌ装置に相当する。この処理量レベルでの全出力／日は、約８．６Ｇｂ／日であり、１２×ヒトゲノム配列決定を完了するのに必要とされる時間は、約４．２日となり得る。
【０３５６】
本発明の配列決定本明細書に記載の方法は、さまざまな異なる配列決定システム、画像捕捉および処理方法などを用いて実施され得ることに注意されたい。例えば、米国特許第６，４０６，８４８号および同第６，６５４，５０５号ならびにＰＣＴ公開公報ＷＯ９８０５３３００の論考を参照のこと。
【０３５７】
（実施例１２：その上面で鋳型合成を微粒子の調製方法）
この実施例では、鋳型分子のクローン性の集団が各微粒子に結合されるように鋳型が増幅され得る（例えば、ＰＣＲにより）ように自身に結合された増幅プライマーを有する微粒子（この実施例では磁気ビーズ）のプロトコル調製を記載する。一般に、増幅ビーズは、クローンＰＣＲ反応に必要とされる１つのプライマーが自身に結合されている。このプライマーは、共有結合によりカップリングさせてもよく、または例えば、ビオチン標識し、ビーズ表面上のストレプトアビジンに結合させてもよい。ビーズは、標準的なＰＣＲ反応（例えば、マイクロタイタープレートのウェル、チューブ内など）、実施例１３に記載のエマルジョンＰＣＲ反応などに使用され、自身に結合された鋳型分子のクローン性の集団を有するビーズが得られ得る。
【０３５８】
材料
１×ＴＥ：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）１ｍＭ  ＥＤＴＡ
１×ＰＣＲバッファー：（ＴｈｅｒｍｏＰｏｌバッファー，ＮＥＢ）
２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）
１０ｍＭ  ＫＣｌ
１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４
２ｍＭ  ＭｇＳＯ４
０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００
１Ｍ  ベタイン（  １×ＰＣＲ−Ｂバッファーの場合のみ添加）
１×結合および洗浄バッファー
５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ  
１  ＭＮａＣｌ
ＤＮＡ捕捉プライマー（２０量体，５００μＭストック）
二重ビオチン−（ＨＥＧ）５−Ｐ１：５’−二重ビオチン−（ＨＥＧ）５−ＣＴＡ  ＡＧＧ  ＴＡＧ  ＣＧＡ  ＣＴＧ  ＴＣＣ  ＴＡ−３’
（ＨＥＧ）５＝ヘキサエチレングリコールリンカー、１８炭素含有スペーサー、使用され得るいくつかの異なるスペーサー部分の１種類。例えば、ビーズの表面から離れるオリゴのＰ１プライマー部分を増大させるため、スペーサーを含めることが有用である。本明細書に記載の任意のプライマーには、かかるスペーサー部分が組み込まれ得る。
Ｄｙｎａｌストック磁気ビーズ（１μｍ直径）＝１０ｍｇ／ｍｌ（７〜１２×１０６ビーズ／μｌ）。
【０３５９】
方法
１．５０μｌビーズ（約４５０×１０６  ビーズ）を除去。
２．２００μｌ  １×ＴＥバッファーを添加、充分混合。磁石で分離。
３．１×ｗｉｔｈ  ２００μｌ  １×ＴＥバッファー洗浄。磁石で分離。
４．１００μｌ  Ｂ／Ｗバッファー中に再懸濁。
５．３μｌのＰ１オリゴ（５００μＭストック＝１５００ｐｍｏｌ）を添加。
６．室温で＞３０分間回転。
７．２００μｌ  １×ＴＥバッファーで３回洗浄。
８．５０μｌ（初期容量）１×ＴＥバッファー中に再懸濁。
９．使用前にＤＮＡ捕捉ビーズを４℃保存または氷上に配置。ビーズは、１週間以内に使用するのがよい（ビーズは、＞１週間の保存期間で凝集する傾向がある）。
【０３６０】
（実施例１３：エマルジョン中の微粒子上でＰＣＲを行なうための方法）
この実施例では、エマルジョン中の微粒子上でＰＣＲを行ない、自身に結合されたクローン鋳型を有する微粒子を生成させるために使用され得る方法を記載する。微粒子（以下、ＤＮＡビーズをいう名称を用いる）を、まず、第１のプライマー（Ｐ１）により官能性付与させる。第２のプライマー（Ｐ２）を水相中に存在させ、そこでＰＣＲ反応を行なわせる。所望の場合は、低濃度をＰ１を水相中に含め得る（例えば、２０倍低い）。そうすることにより、鋳型の水相中での迅速な構築が可能になり、これは，さらなる増幅のための基材となる。Ｐ１が溶液中ですると、反応は、微粒子に結合されたＰ１の利用に向かって誘導される。Ｐ１＿Ｐ２  ｄｅｇｅｎ１０は、Ｐ１およびＰ２にハイブリダイズしてＰＣＲによる増幅をもたらす配列およびオリゴヌクレオチド集団に４１０の複雑度を与える１０縮重塩基鎖（オリゴヌクレオチド合成中に組み込まれる）を有するオリゴヌクレオチド鋳型（１００ｂｐ）である。
Ｉ．エマルジョンプロトコル（１μｍビーズ）
１．油相の調製：
Ｓｐａｎ  ８０（７％）
Ｔｗｅｅｎ  ８０（０．４％）
低分子鉱油中で調製
新たに作製した油相のみ使用
全油相＝４５０μｌ
２．水相の調製：（２×１０９滴が作製されたと概算，１１５μＬ／滴）
【０３６１】
【化７】
2009538123.tif 000082
全水性容量＝３２０μｌ
最終反応＝２５５μｌ  水相  ：４５０μｌ  油相  
３．エマルジョンの添加まで水相チューブを氷に移動。
４．４５０μｌ  油相を２ｍｌクリオバイアルに添加。
５．クリオバイアルＵＰＲＩＧＨＴをＩＫＡ  ボルテックスに取り付けた発泡アダプター内に配置。ボルテックスを２５００ｒｐｍに設定。
６．アリコート水相（３  アリコート，各８５μｌ＝２５５μｌ）を油相に入れて振とうする。単分散性水相を、先端をチューブ内に配置し、ゆっくりと水相を先端から振とう油相内に分配することにより攪拌２ｍｌクリオバイアルに添加。残留水相に２回添加を反復。
７．エマルジョンの振とうを２４分間  ２５００ｒｐｍで継続、
８．エマルジョンの約１００μｌ  アリコートを９６ウェルプレート内に移す（合計＝４ウェル）。また、残留水相のアリコート（６５μｌ）を、溶液系ＰＣＲ対照反応のために別のウェルに。プレートを密封し、次のセクションに概略を示すようにサイクルさせる。ＩＩ．エマルジョン増幅（１μｍ  ビーズ）
１．１μｍ  ビーズエマルジョン（プライマー使用Ｔｍｓ＝６２Ｃ）のＰＣＲサイクリングパラメータ：
プログラム：ＤＴＢ−ＰＣＲ
９４Ｃ，２分  ｎ＝ｌ
９４Ｃ，１５秒  
５７Ｃ，３０ｓ  ｎ＝１００
７０Ｃ，６０秒
５５Ｃ，５分  ｎ＝ｌ
１０Ｃ，随意時間
２．サイクリング時間は約６時間である。
３．サイクリング後のエマルジョンを観察。良好なエマルジョンは均一な琥珀色に見え、分離水相は観察されない。「破断」したエマルジョン（溶液から分離）は、チューブの底部に異なる水相を有する。ビーズのこの集団はクローン性でないため、この段階での回収は回避。
４．明るい視野での顕微鏡検査を用いてサイクル後エマルジョンを評価。サイクル的エマルジョンの２μｌアリコートを取り出し、ガラススライドに１滴落とす。エマルジョンアンプルに２２×６０ｍｍガラスカバースリップを重層。
５．２０×対物レンズを用いてエマルジョンを観察。ビーズは、好ましくは、単分散性であり、液滴の大部分が単一のビーズを含む。
注：エマルジョンアンプルが多数の多ビーズ液滴を含む場合、プールエマルジョン反応を単一の１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れ、６０００ｒｐｍで１５秒間回転させる。チューブの底部に蓄積したビーズ懸濁液を取り出す。この集団は、遊離ビーズおよび単一ビーズ液滴より重い多ビーズ液滴の両方で構成され、したがって、短時間のスピン後、チューブの底部に沈降する、このビーズ集団はクローンでない、したがって、後続の処理前に回避するのがよい。工程４および５を反復することによりエマルジョンを再評価し、
エマルジョンアンプル中での単一のビーズ含有液滴の完全性を確認する。
６．次のセクションに概要を示すプロトコルを用いたエマルジョンの破壊（崩壊）
ＩＩＩ．エマルジョン破壊および融解（１μｍビーズ’）
ビーズ破壊洗浄（ＢＢＷ）バッファー
２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ２％Ｔｗｅｅｎ  ２０；１０ｍＭ  ＥＤＴＡ
融解溶液  １００ｍＭ  ＮａＯＨ
１×ＴＥ：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）１ｍＭ  ＥＤＴＡ
１×結合および洗浄（Ｂ／Ｗ）バッファー
５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ
１Ｍ  ＮａＣｌ
１．各エマルジョンセット（４  アリコート）を単一の１．５ｍｌエッペンドルフチューブ中にプール。
２．８００μｌ  ＢＢＷバッファーを添加。反応チューブの１０秒間のボルテックスによりエマルジョンの破壊。
３．８０００ｒｐｍで２分間スピン。
４．上部８００μｌ（主に油相）の除去。チューブの底部でＤＮＡビーズをペレット化。５．８００μｌ  ＢＢＷを添加、ボルテックスおよび８０００ｒｐｍで２分間スピン、上部６００μｌ除去。
６．
さらに２回６００μｌ  １×ＴＥで洗浄、磁石を用いて各洗浄液を交換。
８．５０μｌ  融解溶液をビーズペレットに添加、激しいペッティイングにより再懸濁試料。融解溶液中で５分間室温でビーズのインキュベート。チューブ断続的に打つ。
９．チューブを磁石に配置して融解溶液を除去。１×１００μｌ  融解溶液で洗浄し、第２鎖の完全な除去を確保。
１０．ビーズペレットを２回１×ＴＥで洗浄、２０μｌ  ＴＥバッファー中に再懸濁して４Ｃで保存または２０μｌ  １×Ｂ／Ｗバッファー（次の工程が富化の場合）。ビーズが凝集しているようであれば、１×ＰＣＲ−  Ｂバッファーに交換。
１１．富化プロトコルを継続（任意選択的）。
【０３６２】
（実施例１４：自身に結合されたクローン鋳型集団を有する微粒子の富化方法）
この実施例では、上面での鋳型増幅が例えばＰＣＲエマルジョンで成功裏に行なわれた微粒子富化方法を記載する。該方法は、自身に結合された捕捉オリゴヌクレオチドを有する大きな微粒子を利用する。捕捉オリゴヌクレオチドは鋳型内に存在するヌクレオチド領域に相補的なヌクレオチド領域を含む。
Ｉ  ．エマルジョン富化（ｌｕｍ）
Ａ．富化ビーズ（捕捉実体）の調製
富化ビーズ：
Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈストレプトアビジンコートされたポリスチレンビーズ（約６．５ｕｍ）
ビーズストック（０．５％ｗ／ｖ）：３３，１２５  ビーズ／μｌ
Ｐｅｒ  プロトコル：（３３，１２５  ビーズ／μｌ）（８００μｌ）＝２６．５×１０６  ビーズ
使用：
１１９００００００ビーズ／エマルジョン−エマルジョンクローン性の概算（２％）：約３Ｍ  鋳型−陽性ビーズ／エマルジョン。２〜３富化ビーズ／概算鋳型陽性エマルジョンビーズ＝１０００００００  富化ビーズ／エマルジョン反応を添加。
富化オリゴヌクレオチド（捕捉剤）：
Ｐ２−富化（３５量体，Ｔｍ＝７３Ｃ）
５’−二重ビオチン−１８−炭素スペーサー−ｔｔａｇｇａｃｃｇｔｔａｔａｇｔｔａｇｇｔｇａｔｇｃａｔｔａｃｃｃｔｇ  ３’
（または）
Ｐ２−富化（例えば、３５量体まで，Ｔｍ＝５２Ｃ）
５’−二重ビオチン−１８−炭素スペーサー−ｇｇｔｇａｔｇｃａｔｔａｃｃｃｔｇ  ３’
グリセロール溶液  −  ６０％（ｖ／ｖ）
６ｍｌ  グリセロール
４ｍｌ  ヌクレアーゼ無含有Ｈ２Ｏ
１．８００μｌのビーズを除去、１３，０００ｒｐｍで１分間の遠心分離によりＢ／Ｗバッファーに交換。１×の５００μｌ  Ｂ／Ｗバッファーでの洗浄、および１００μｌ  Ｂ／Ｗバッファーへの再懸濁。
２．２０μｌ  富化オリゴを添加。（５００μＭストック＝１０，０００ｐｍｏｌ／ｒｘｎ）。
３．ビーズ反応物を室温で１時間回転。
４．ビーズを３回、５００μｌ  １×ＴＥバッファーを用いて洗浄。１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離により洗浄間でビーズをペレット化。
５．ビーズを２５μｌ  Ｂ／Ｗバッファーに再懸濁。濃度＝１Ｍ  富化ビーズ／μｌ。注：４種類の富化エマルジョン集団を２０〜３０μｌ  １×Ｂ／Ｗバッファーにプールし、約４０Ｍ  鋳型陽性ビーズを得る。次いで、多数のスライドに行ない得る。
Ｂ．富化手順
１．２０μｌの富化ビーズを、エマルジョン誘導型ビーズ（２０μｌ）を含有するチューブに添加。
穏和なピペッティングによりビーズ混合物を再懸濁（または概算鋳型陽性エマルジョンビーズごとに２〜３  富化ビーズ増大を与える比を使用）。
２．ビオチン化Ｐ２−富化プライマーでコーティングされた富化ビーズを用いる場合、ビーズ混合物を６５Ｃで２分間インキュベート。チューブを氷に１０分間取り出す。
注：最初の実験は、１００−サイクルＰＣＲ（例えば、Ｐ２ＰＣＲ）に使用されるプライマー配列を含有する富化ビーズの使用は、富化すると、プライマーを含有するビーズを富化能力により効率的が低くなり得ることを示した。液滴中の２量体種誘導ビーズは鋳型がなかった。上記のＰ２−富化プライマーが負荷された富化ビーズを用いる場合、この短鎖プライマーのＴｍの低下によりビーズ混合物を５０Ｃ  ２分間インキュベートする。
３．ビーズ混合物を、３００μｌ  ６０％グリセロール溶液を含む１．５ｍｌエッペンドルフチューブに重層。
４．１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離
５．スピン後、陰性ビーズは、チューブの底部にペレット化する。結合された鋳型ビーズを含む富化ビーズは、グリセロール相上部に浮遊する。上相ビーズ集団を改修し、きれいな１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移す。
注：チューブの底部ペレット化したビーズ（鋳型なしのビーズ）は洗浄し、鋳型陽性ビーズで概略を示した同じ洗浄レジメン後、磁石を用いて解析され得る。
６．ビーズを相から引き出すため、１ｍｌ  ヌクレアーゼ無含有Ｈ２０を添加し、グリセロール濃度を希釈する。穏和なピペッティングを用いてビーズ混合物を再懸濁する。１３，０００ｒｐｍで１分間スピンする。
７．スピン後、上清みを除去し、２回１００μｌ  ＴＥを用いて洗浄。
８．１００μｌ  融解溶液を添加し、ビーズペレットを洗浄。チューブを５分間室温で回転。
９．さらに１００μｌ  融解溶液を添加、鋳型ビーズを磁石を用いて単離。
１０．２回１００μｌ  ＴＥ洗浄により非磁石性富化ビーズを除去し、磁石でＤＮＡビーズを富化ビーズから離す。
１１．鋳型ビーズを１０〜２０μｌ  １×ＴＥに再懸濁。ビーズ凝集しているようであれば、１×ＰＣＲ−Ｂバッファー中に含むで希釈。
１２．鋳型含有ビーズは、他の富化集団でプールされ得、次の実施例で記載のようにしてスライド上に負荷し得る。
【０３６３】
（実施例１５：半固相支持体に固定化された微粒子アレイ調製方法）
この実施例では、スライド上に位置する半固相支持体内に自身に結合された鋳型微粒子が固定化され（例えば、包埋され）スライドの調製を記載する。かかるスライドは、ポロニルスライドとよばれ得る。この実施例に使用される半固相支持体は、ポリアクリルアミドである。プロトコルの一例では、ポリメラーゼ分子を鋳型付近に捕捉して増幅を増強する方法を用いる。
【０３６４】
スライドの調製
Ａ．ガラススライド：結合シラン処理
結合シラン処理により、ガラススライド表面へのアクリルアミドゲル結合が容易になる。スライドは、使用前に結合シラン処理で前処理するのがよい。
注：
＊＊  結合シラン処理溶液を化学的結合で保存。
＊＊  結合シラン処理は刺激性である。溶液調製時は化学的に作業する。
＊＊    ストック結合シラン処理溶液がきれないように確保する。
＊＊  ラックへの出し入れの移動時は、スライドの表面に触れないようにする。
【０３６５】
結合シラン処理溶液の調製：
１．１−Ｌ  プラスチック容器内に添加：
１  Ｌ  ｄＨ２０，１  攪拌バー
２２０ｕｌ濃酢酸を添加（ｐＨ３．５にする）。４ｍｌ結合シラン試薬混合溶液を＞１５分間、攪拌プレートを用いて添加。
スライド処理：
２．スライド（同じ方向に向ける）を裏返したプラスチック  ３８４ウェルプレートに負荷。
３．ｄＨ２Ｏでリンス処理によりスライド洗浄、ウェルをドレイン。
４，１００％エタノールでリンス。ウェルをドレイン。
５．再度ｄＨ２Ｏでリンス、ウェルをドレイン、ベンチをを有する組織培養フード内に配置、ＵＶ光照射。スライドを洗浄して乾燥させる（約３０分）。
６．プレートをプラスチック容器内に配置し、スライドを結合シラン処理溶液で覆う。
７．溶液およびスライドを１時間反応させる。容器を断続的に攪拌し、ガラスへの結合シラン処理の均一なコーティングを確保。
８．インキュベーション後、スライドを３回ｄＨ２Ｏでリンス処理。
９．１回１００％エタノールでリンス処理。ウェルをドレイン。
１０．使用前にスライドを充分乾燥させる。
１１．結合シラン処理スライドをデシケータ内で乾燥。
【０３６６】
Ｂ．アクリルアミド系スライド（小さいマスク）
・  非捕捉プロトコル
１．すべての試薬氷上に配置。以下の冷却試薬を１．５ｍｌエッペンドルフチューブに添加：
【０３６７】
【化８】
2009538123.tif 000083
混合物を激しくピペッティングしてビーズをかき回す。ガラスカバースリップ下で１７μｌ／スライド負荷。
上下に重合。室温で６０分間．
きれいなかみそり刃でカバースリップを除く。
スライドを浸漬し。２回ＩＥバッファー中で１５分間洗浄（非結合ビーズを除去）。
包埋ビーズを有するスライドを４ＣでＩＥ保存。
２．フルオロフォア−標識配列決定プライマーを包埋ビーズ集団にハイブリダイズさせる。
洗浄１Ｅから１×ＰＣＲ−Ｂバッファーに、１×ＰＣＲ−Ｂバッファーを含有するＣｏｐｌｉｎ  ｊａｒ短時間浸漬させることによりスライドを平衡化させる。
３．１．５ｍｌエッペンドルフチューブ内で、１〜６μｌ（１００μＭストック）プライマーを９９μｌ  １×ＰＣＲバッファーに添加する。アクリルアミドマトリックス上に、１００μｌ  プライマー溶液を滴下し、ガラスカバースリップを重層するか、ガスケットを封止する。
４．＜ＤＥＶＩＮ＞プログラムを用いてスライドを加熱することにより、プライマーを包埋されたビーズにハイブリダイズさせる。（６５Ｃで２分間、３０Ｃまで低速アニーリング）。スライド２回２分間洗浄ＩＥ中で洗浄。スライドは、ライゲーション系配列決定に供する準備ができている。
【０３６８】
・捕捉プロトコル
１．ｓｓＤＮＡ鋳型ビーズは、１Ｍ／μｌで調製する。［ポロニルスライド、４−５Ｍ
ビーズ／スライド］。
２．ビーズ混合物を３０μｌ  １×ＰＣＲバッファー中に再懸濁。
３．１ｕｌの配列決定プライマー（ｌ００μＭストック）を添加；充分混合
４．６５Ｃまで２分間加熱
５．氷上に５分間取り出す
６．８０μｌで１×ＴＥ洗浄
７．すべての固形分を磁石を用いて除去
８．以下に概要を示すようにして試薬を添加：
【０３６９】
【化９】
2009538123.tif 000084
混合物を激しくピペッティングしてビーズをかき回す。ガラスカバースリップ下で１７μｌ  ／スライド負荷。
９．重合、  好ましくは、上下にする（例えば、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｔｒａｄ
ＰＣＲ装置で＜Ｐｏｌ−ｌ＞サイクリングプロフィールを使用）
１０．かみそり刃でカバースリップを除くスライドを２回１Ｅバッファー中に１０分間浸漬および洗浄（非結合ビーズを除去するため）。
１１．ポロニルスライドはライゲーション系配列決定に供する準備ができている。
１２．包埋されたビーズを有するポロニルスライドは、ガスケット内に４Ｃで洗浄ＩＥ中に保存され得る。
【０３７０】
（実施例１６：固相支持体に結合された微粒子アレイ調製方法）
この実施例では、その上面に自身に結合された鋳型を有する微粒子が固相支持体に結合されたスライド調製を記載する。
【０３７１】
１．反応性ＮＨＳを有するポリマーテザーを用いて調製されたガラススライドを
−２０Ｃで保存する（スライドＨ，製造番号１０７０９３６；Ｓｃｈｏｔｔ  Ｎｅｘｔｅｒｉｏｎ；Ｓｃｈｏｔｔ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．，Ｅｌｍｓｆｏｒｄ，ＮＹ）
２．乾燥剤の存在下、使用前にスライドを室温に平衡化させる。
【０３７２】
３．５０ｍｌ  １×ＰＢＳ（３００ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ８．７）中で５分間スライドを洗浄する。洗浄を２回繰り返す。
【０３７３】
４．スライドを溶液から取り出し、接着性ガスケットで覆う（試料負荷を可能にするため）。
【０３７４】
５．別のチューブで、アリコート１００〜４００００００００タンパク質コートまたはＤＮＡコートビーズを１×ＰＢＳ，ｐＨ８．７に。ＤＮＡは、例えば、配列決定用のＤＮＡ鋳型であり得る。ＤＮＡは、例えば、ＮＨＳとの反応用のアミンリンカーを含むものであり得る。
【０３７５】
６．バッファー交換によってビーズ試料を３回１×ＰＢＳ，ｐＨ８．７で洗浄する。
【０３７６】
７．ビーズを１２５ｍｌ  １×ＰＢＳ，ｐＨ８．７中に再懸濁する。
【０３７７】
８．ビーズ溶液をスライドガスケット内に負荷し、スライド表面を均一にコートする。
【０３７８】
９．スライドを暗室チャンバ内に封鎖し、インキュベーションのために１〜２時間室温で反応させる。
【０３７９】
１０．インキュベーション後、非結合ビーズ溶液を除去し、スライドを５０ｍｌ  １×ＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８）に移す。
【０３８０】
１１．１５分間／洗浄で定常的攪拌により、５０ｍｌ  １×ＴＥを用いて５回スライドを洗浄する。
【０３８１】
１２．スライドは、１×ＴＥ中に４Ｃで数週間保存され得る。
【０３８２】
１３．所望の場合は、ビーズ集団は、白色光（ＷＬ）を用いる明るい視野での画像解析により、または蛍光により、フルオロフォア系色素に結合された相補ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いて評価され得る。ＤＮＡ鋳型は、例えば、ライゲーション系配列決定を用いて配列決定され得る。
【０３８３】
図３３Ａは、自身にビーズが結合されたスライドの概略図を示す。ほんの少量の割合のＤＮＡ鋳型分子がスライドに結合されていることに注意されたい。１ミクロンビーズ（ＤｙｎａビーズＭｙＯｎｅ  ストレプトアビジンビーズ；Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，製造番号６５０．０１）を使用した。しかしながら、広範なさまざまなビーズた使用され得る。
【０３８４】
図３３Ｂは、スライドに結合されたビーズ集団を示す。下側パネルは、白色光下でのスライドの同じ領域（左）および蛍光顕微鏡検査を示す。上側パネルは、ビーズ密度の範囲を示す。
【０３８５】
（実施例１６）  ゲル非含有ビーズに基づくアレイを使用した、オリゴヌクレオチド伸長およびライゲーションによる配列決定
本実施例では、ビオチンとストレプトアビジンの相互作用を介して基材（ガラススライド）に付着した微粒子のアレイの調製について記載し、ライゲーション、開裂および検出のサイクルによる配列決定の成功を実証する。ビオチン化鋳型が付着した微粒子は、エマルジョンＰＣＲを使用して調製し、後述の通り、半固形培地の非存在下で、ＰＥＧを含む連結を介して、ストレプトアビジンで官能基化した基材に付着させた。本方法では、増幅前にビオチン化プライマーを付着させたストレプトアビジンコートビーズを使用する。生産的な鋳型増幅が行われた粒子の増幅と濃縮の後、鋳型をビオチン化した。次いで、ビオチン化した鋳型が付着した微粒子を、ストレプトアビジンコートスライドとともにインキュベートした。したがって、本方法では、ビオチンとストレプトアビジンの連結を２回使用した。その他の手法では、プライマーを微粒子に連結させるか、あるいは増幅させた鋳型を基材に連結させる代替手段が使用されると考えられる。
【０３８６】
材料および方法：
ＢＡＣ  Ｅｃｏ  ｖ２．１ビーズの調製
ＭｙＯｎｅストレプトアビジンビーズ（１ミクロン）をビオチン化Ｐ１プライマーでコーティングし（図を参照）、エマルジョンＰＣＲにおいて、本発明者等のＢＡＣ−Ｅｃｏ（ｖ２．１）ライブラリーの鋳型が付着したビーズ群を作り出すために使用した。エマルジョンを破壊し、ビーズを標準的な方法でエクソヌクレアーゼにより精製および処理した。完全に伸長したＰＣＲ産物を有するビーズを、Ｐ２濃縮オリゴで被覆した濃縮ビーズに結合させることにより濃縮した（図を参照）。濃縮したビーズの溶液中の挙動を改善するために、これらのビーズをビオチン化Ｐ１オリゴとともにインキュベートして、ストレプトアビジンコーティングを露出したビーズの部分を被覆した。
【０３８７】
スライドへのＢＡＣ  Ｅｃｏ  ｖ２．１ビーズの沈着
ｓｓＤＮＡを含有する濃縮したＢＡＣ−Ｅｃｏ  ｖ２．１ビーズを、ストレプトアビジンでコーティングしたＯｐｔｉ−Ｃｈｅｍスライド（Ａｃｃｅｌ８  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）上に沈着した。本プロセスの準備として、ビーズをターミナルトランスフェラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）およびビオチン−１１−ｄｄＡＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）とともにインキュベートし、ビオチン部分をＤＮＡ鋳型分子の３’端に共有結合的に付着させた。ビーズを等しい数のＭｙＯｎｅ
Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  Ａｃｉｄビーズ（Ｄｙｎａｌ）と混合し、５ｍＭのトリス塩酸塩（ｐＨ８．０）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０００５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、および１０％のＰＥＧ８０００（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を含有する沈着緩衝液に入れた。懸濁液をＣｏｖａｒｉｓ  Ｓ２ソニケーターで短時間超音波処理し、ストレプトアビジンでコーティングしたＯｐｔｉ−Ｃｈｅｍスライド（Ａｃｃｅｌ８  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）上に沈着させた。スライドをＴＥ緩衝液で３回洗浄し、使用前に圧縮空気で乾燥させた。懸濁液をＬｉｆｔｅｒＳｌｉｐ（Ｅｒｉｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ）で被覆し、スライド上に平坦な水層を生成し、蒸発を減少させた。これらのスライドを高湿度チャンバーに入れて室温にて４５分間インキュベートし、端部の蒸発を減少させつつ、ビーズを表面に定着させ、結合させた。ＴＥ緩衝液を充填したトレーにスライドを上下逆にして浸漬することにより、カバースリップを除去した。約１分間軽く攪拌すると、ほとんどのカルボン酸ビーズが除去された（別の実験で示された通り）。これらのスライドを即座にアセトンに浸漬し、圧縮空気を使用して乾燥させた。
【０３８８】
ゲル非含有スライド上でのサイクル式ライゲーション配列決定で使用した試薬は、Ｒｅｓｅｔ緩衝液を除けばアクリルアミド系ゲルの場合と同じであった。非ゲルアレイでは、１０ｍＭのＮａＯＨおよび０．１％のドデシルスルホン酸ナトリウム（Ｆｌｕｋａ）を含有するアルカリ系Ｒｅｓｅｔ緩衝液を使用した。図３８および図３９に示す通り、３００パネルゲル非含有アレイ（約１８×１８ｍｍ）に濃縮ＢＡＣ−Ｅｃｏライブラリービーズを播種し、自動小型フローセル器に入れ、アルカリ性Ｒｅｓｅｔに５０回暴露させて、ゲル非含有環境におけるビーズの安定性を検証した。５０サイクルの流動プログラムの後、ゲル非含有アレイはパネル１枚当たり２６，０００個を超えるビーズを含有した（４メガピクセルカメラ）。次いで、サイクル式ライゲーションおよび開裂を使用して、ゲル非含有アレイの配列決定を行った。各蛍光チャネルの高いＲＦＵ値によって証明されているように、サイクル１のデータの評価によって、本発明者等の２塩基４色プローブセットの効率的なライゲーションが裏付けられた。その後、ビーズ群をベースコールし、スペクトル純度プロットにプロットし、Ｓａｔａｙ分析および密度プロット評価によって優れた配列決定性能を示した。
【０３８９】
均等物および範囲
当該技術分野業者には、単に常套的な実験手法を用いることで、本明細書に記載した本発明の具体的な実施形態に対する多くの均等物が認識され、または確認できよう。本発明の範囲は、上記の記載に限定されることは意図されるのではなく、添付の特許請求の範囲に示されるとおりである。以下の特許請求の範囲において、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」などの冠詞は、そうでないと特に記載のない限り、あるいは文脈から明白にそうでない場合以外は、１つではなく、１つ以上を意味し得る。１つの群内の１つ以上のメンバー間の「または」を含む請求項または詳細説明は、そうでないと特に記載のない限り、あるいは文脈から明白にそうでない場合以外は、１つ、１つより多く、またはその群のメンバーすべてが、所与の生成物またはプロセスに存在し、使用され、あるいは、関連する場合が満たされるとみなされる。請求項における「場合により」の使用は、任意の特徴が存在する実施形態と、任意の特徴が存在しない実施形態とを本発明が包含することを示している。
【０３９０】
さらにまた、本発明は、記載の１つ以上の請求項からの１つ以上の限定、要素、原因、記述用語などが別の請求項に導入されたあらゆる変形例、組合せおよび置換を包含することを理解されたい。特に、別の請求項に従属する任意の請求項は、ベースとなる同じ請求項に従属する任意の他の請求項に見られる１つ以上の限定を含むように変形され得る。
【０３９１】
また、任意の１つ以上の実施形態は、具体的な除外が本明細書に明白に示されていない場合であっても、特許請求の範囲から明確に除外されることがあり得ることを理解されたい。また、本明細書および／または特許請求の範囲に配列決定に有用な試薬（例えば、鋳型、ミクロスフィア、プローブ、プローブファミリーなど）が開示されている場合、かかる開示はまた、該試薬を、当業者が別なふうに理解し得る場合、または本発明に特に記載のない限り、本明細書に開示された具体的な方法、または当該技術分野で知られた他の方法のいずれかに従って用いる配列決定方法も包含することを理解されたい。また、本明細書および／または特許請求の範囲に配列決定法が開示されている場合、当業者が別なふうに理解し得る場合、または本明細書においてかかる方法におけるその試薬の使用が明白に除外されている場合を除き、本明細書に開示された任意の１種類以上の試薬が該方法に使用され得る。さらに、配列決定に有用な特定の成分が本明細書および特許請求の範囲に開示されている場合、本発明は、その試薬の作製方法もまた包含することを理解されたい。用語「成分」は、配列決定に用いられる任意の要素、例えば、鋳型、自身に結合された鋳型を有する微粒子、ライブラリーなどをいうために広義で使用される。さらにまた、図面は、本明細書に組み込まれた一部分であり、本発明は、図面に示された構造、例えば、自身に結合された鋳型を有する微粒子、および図面に開示された方法を含む。
【０３９２】
本明細書において範囲を示す場合、両端を含む。さらにまた、ことを理解されたい。特に記載のない限り、あるいは文脈から明白にそうでない場合以外、および当業者に理解される場合、範囲として標示される値は、本発明の異なる実施形態において記載された範囲内の任意の具体的な値または下位範囲が、特に文脈においてそうでないと明白に記載されていない限り、該範囲の下限の単位の１０分の１まで想定され得る。
【図面の簡単な説明】
【０３９３】
【図１Ａ】図１Ａは、初期化後、２サイクルの伸長、ライゲーションおよび同定を概略的に示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、伸長が鋳型の自由末端から支持体に向かって内方に進行する実施形態における初期化後、２サイクルの伸長、ライゲーションおよび同定を概略的に示す。
【図２】図２は、オリゴヌクレオチドプローブに対する色の割り当てのスキームを示し、この場合、プローブの３’塩基の正体が、フルオロフォアの色を同定することにより決定される。
【図３Ａ】図３Ａは、鋳型の結合領域内の異なる位置における初期オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション後、伸長プローブのライゲーションにより得られる伸長された二本鎖を概略的に示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、鋳型分子を６塩基ごとに読み出されるように設計された伸長プローブを用いて伸長、ライゲーションおよび切断方法を使用することにより、連続配列（配列番号７として配列表に記載される）の合成を概略的に示す。
【図４Ａ】図４Ａは、５’−Ｓ−ホスホロチオレート結合（３’−Ｏ−Ｐ−Ｓ−５’）  を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、３’−Ｓ−ホスホロチオレート結合（３’−Ｓ−Ｐ−Ｏ−５’）  を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、３’−Ｏ−Ｐ−Ｓ−５’ホスホロチオレート結合を有する伸長プローブを用いた５’→３’方向における配列決定のための１サイクルの伸長、ライゲーションおよび切断を概略的に示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、３’−Ｓ−Ｐ−Ｏ−５’ホスホロチオレート結合を有する伸長プローブを用いた３’→５’方向における配列決定のための１サイクルの伸長、ライゲーションおよび切断を概略的に示す。
【図６】図６Ａ〜６Ｆは、単一の鋳型において行なわれた数個の配列決定反応のより詳細な概略図である。この反応では、鋳型の異なる部分に結合する初期オリゴヌクレオチドを用いている。図６Ｆに示される配列は、配列番号８として記載される。
【図７】図７は、ｄＡおよびｄＧの３’−ホスホロアミデートの合成スキームを示す概略である。
【図８−１】図８Ａ〜８Ｅは、ホスホロチオレート結合を含有する伸長プローブの成功裏のライゲーションおよび切断の２サイクルを示すゲルシフトアッセイの結果を示す。示される配列は、配列番号１０、６２および８３として記載される。
【図８−２】図８Ｆは、ＤＮＡリガーゼによるライゲーションの機構の概略図を示す。
【図９】図９は、縮重イノシン含有オリゴヌクレオチドプローブのライゲーション効率を示すゲルシフトアッセイの結果を示す。示される配列は、配列番号１４および６２として記載される。
【図１０】図１０は、多数の鋳型における縮重イノシン含有オリゴヌクレオチドプローブのライゲーション効率を示すゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図１１】図１１は、３’→５’伸長での２つのＤＮＡリガーゼ（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼおよびＴａｑＤＮＡリガーゼ）の各々の忠実度を評価するために行なった解析の結果を示す。示される配列は、配列番号１６および６２として記載される。
【図１２】図１２は、（Ａ）  縮重イノシン含有オリゴヌクレオチドプローブおよびライゲーション反応の直接配列決定解析のライゲーション効率を示す（Ｂ）  オリゴヌクレオチドプローブライゲーションにおけるＴ４  ＤＮＡリガーゼの忠実度を評価するために行なったゲルシフトアッセイの結果を示す。結果をパネルＣ〜Ｆに表で示す。図１２Ｂに示される配列は、配列番号５６〜６２および８４として記載される。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｃは、ビーズ系鋳型をスライド上のポリアクリルアミドゲル内に包埋した場合のゲル内ライゲーションを示す実験の結果を示す。図１３Ａは、ライゲーション反応の概略を示す。ゲル内ライゲーション反応は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの非存在下（Ｂ）および存在下（Ｃ）で行なった。示される配列は、配列番号６２および６６として記載される。
【図１４Ａ】図１４Ａは、第１の増幅プライマーが結合されたビーズ上で、蛍光標識された第２の増幅プライマーおよび過剰の鋳型を用いて行なったエマルジョンＰＣＲ反応の画像を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂ（上）は、Ｃｙ３−標識オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする鋳型結合された結合されたビーズがポリアクリルアミドゲル固定化されたスライドの一部分の蛍光画像を示す（このスライドは、異なる実験に使用したが、ここで使用したスライドの典型である）。図１４Ｂ（下）は、ポリアクリルアミド溶液を封入するためのテフロン（登録商標）マスクを設けたスライドの概略図を示す。
【図１５】図１５は、プローブの特異性および選択性の課題に取り組むために設計され３組の標識されたオリゴヌクレオチドプローブを示し、また、１組の４つのスペクトルにより分離可能な標識の励起および発光の値を示す。
【図１６】図１６は、オリゴヌクレオチドプローブの４色スペクトルの正体を確認する実験の結果を示す。４つの特有の単鎖鋳型集団を含むスライド（Ａ）をハイブリダイゼーションに供し、４種類の特有のフルオロフォアプローブを含有するオリゴヌクレオチドプローブ混合物を用いたライゲーション反応物を、明るい光の下で、および（Ｂ）  ４種類の帯域通過フィルターを用いた蛍光励起によりライゲーションの前と後で画像化した。個々の集団は擬似カラー表示した（Ｃ）。スペクトルの正体（これは、最小シグナル重複を示した）を（Ｄ）にプロットする。示される配列は、配列番号６２〜７０として記載される。
【図１７】図１７は、オリゴヌクレオチド伸長プローブのライゲーション特異性を確認する実験からの結果を示す。図１７（Ａ）は、ライゲーションの概略的概要を示す。図１７（Ｂ）は、明るい光での画像であり、図１７（Ｃ）は、ライゲーション後のポリアクリルアミドゲル内に包埋されたビーズ集団の対応する蛍光画像である。図１７（Ｄ）は、ライゲーション前（ｐｒｅ）または後（ｐｏｓｔ）の各標識から検出された蛍光を示す。示される配列は、配列番号６３および７８として記載される。
【図１８】図１８は、オリゴヌクレオチド伸長プローブのライゲーションの特異性および選択性を確認する別の実験からの結果を示す。図１８（Ａ）は、ライゲーションの概略的概要を示す。図１８（Ｂ）は、明るい光での画像であり、図１８（Ｃ）は、ライゲーション後のポリアクリルアミドゲル内に包埋されたビーズ集団の対応する蛍光画像である。図１８（Ｄ）は、ライゲーション頻度の予測対観察結果を示し、集団内の特定の伸長プローブの割合に基づいて予測した頻度と、観察された頻度との高い相関性を示す。図１８（Ａ）に示される配列は、配列番号６２、６６および７１〜７８として記載される。
【図１９】図１９は、オリゴヌクレオチド伸長プローブプールを含有する縮重した普遍塩基を用いて、特異的および選択的なゲル内ライゲーションがもたらされ得ることを確認する実験からの結果を示す。図１９（Ａ）は、ライゲーションの概略的概要実験を示し、ライゲーション後の４種類の差次的に標識された縮重イノシン含有プローブプールを示す。図１９（Ｂ）明るい光での画像であり、図１９（Ｃ）は、ライゲーション後のポリアクリルアミドゲル内に包埋されたビーズ集団の対応する蛍光画像である。図１９（Ｄ）は、ライゲーション頻度の予測対観察結果を示し、集団内の特定の伸長プローブの割合に基づいて予測した頻度と、観察された頻度との高い相関性を示す。図１９（Ｅ）は、生の未処理のデータおよびビーズシグナル値の上部９０％を表すフィルター処理データの散布図を示す。図１９（Ａ）に示される配列は、配列番号６２、６６、６７、６８、７０および７９〜８２として記載される。
【図２０】図２０は、鋳型に対する初期オリゴヌクレオチド（プライマー）のハイブリダイゼーションとストリッピングの連続的サイクルにおいて検出されたシグナルを示すチャートである。図に示されるように、１０サイクルで生じたシグナル損失は最少であった。
【図２１】図２１は、配列情報を、例えば、実質的に平面状の支持体内または該支持体上のアレイ状の鋳型から収集するために使用され得る自動配列決定システムの写真である。また、該システムの種々の構成部品の動作を制御するため、収集した画像データを処理および保存するため、ユーザーインターフェースを提供するためなどの専用のコンピュータを示す。図の下側部分に、重量測定気泡移動（ｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃ  ｂｕｂｂｌｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）が達成されるように配設されたフローセルの拡大図を示す。
【図２２】図２２は、実質的に平面状の支持体内または該支持体上のアレイ状の鋳型の配列を決定するために使用され得るハイスループット自動配列決定機器の概略図を示す。
【図２３】図２３は、アライメントの不一致の散布図を示し、３０フレームで最少の不一致を示す。
【図２４】図２４Ａ〜Ｉは、さまざまな異なる方向から見た本発明フローセルまたはその一部分の概略図を示す。
【図２５Ａ】図２５Ａは、２ヌクレオチド長である拘束部分を含む部分拘束プローブを含むプローブファミリーの好ましいコレクションの例示的なコード化を示す。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、プローブファミリーの好ましいコレクション（上側パネル）およびライゲーション、検出および切断のサイクル（下側パネル）  を示す。
【図２６】図２６は、２ヌクレオチド長である拘束部分を含む拘束プローブを含むプローブファミリーの別の好ましいコレクション例示的なコード化を示す。
【図２７Ａ】図２７Ａは、表１に示すプローブファミリーの２４個の好ましいコレクションを図式的に規定するための代替法を表す。
【図２７Ｂ】図２７Ｂは、表１に示すプローブファミリーの２４個の好ましいコレクションを図式的に規定するための代替法を表す。
【図２７Ｃ】図２７Ｃは、表１に示すプローブファミリーの２４個の好ましいコレクションを図式的に規定するための代替法を表す。
【図２８】図２８は、プローブが、２ヌクレオチド長である拘束部分を含むプローブファミリーのやや好ましいコレクションを示す。
【図２９Ａ】図２９Ａは、拘束部分３ヌクレオチド長を有するプローブを含むプローブファミリーのコレクションのための拘束部分を作製するために使用され得るダイアグラムを示す。
【図２９Ｂ】図２９Ｂは、拘束部分３ヌクレオチド長を有するプローブを含むプローブファミリーのコレクションのための拘束部分を、プローブファミリーの２４個の好ましいコレクションから作製するために使用され得るマッピングスキームのダイアグラムを示す。
【図３０】図３０は、配列決定がプローブファミリーのコレクションを用いて行なわれる方法を示す。好ましい組のプローブファミリーを用いた実施形態を示す。
【図３１Ａ】図３１Ａ〜３１Ｃは、配列決定が、プローブファミリーの第１のコレクションを用いて候補配列を作製し、プローブファミリーの第２のコレクションを用いてデコード化することで行なわれる方法を示す。
【図３１Ｂ】図３１Ｂは、配列決定が、プローブファミリーの第１のコレクションを用いて候補配列を作製し、プローブファミリーの第２のコレクションを用いてデコード化することで行なわれる方法を示す。
【図３１Ｃ】図３１Ｃは、配列決定が、プローブファミリーの第１のコレクションを用いて候補配列を作製し、プローブファミリーの第２のコレクションを用いてデコード化することで行なわれる方法を示す。
【図３２】図３２は、配列決定が、プローブファミリーのやや好ましいコレクションを用いて行なわれる方法を示す。
【図３３】図３３Ａは、自身にビーズが結合されたスライドの概略図を示す。ＤＮＡ鋳型がビーズに結合されている。図３３Ｂは、スライドに結合されたビーズ集団を示す。下側パネルは、白色光下（左）および蛍光顕微鏡検査でのスライドの同じ領域を示す。上側パネルは、ビーズ密度の範囲を示す。
【図３４】図３４Ａ〜３４Ｃは、核酸の個々の集団としての核酸断片（鋳型）内に存在する１対のタグの両方のタグを増幅し、これを、増幅プロセスにより微粒子に捕捉するためのスキームを示す。
【図３５−１】図３５Ａおよび３５Ｂは、図３５のスキームのプライマー設計および増幅の詳細を示す。明確にするために核酸断片（鋳型）の両方の鎖を示す。同じ配列を有するプライマーおよびプライマー結合領域を同じ色で示す。例えば、Ｐ１を紺色で表し、微粒子上および溶液中に存在するプライマーＰ１が、鋳型の標示した鎖と対応させて着色した部分と同じ配列を有することを示す。Ｐ１と標示した鋳型の紺色領域は、対応するプライマー（Ｐ１）が、実際には他方の鎖の相補的部分に結合し、プライマーＰ１と同じ配列を有するものであっても、プライマー結合領域とよばれ得る。
【図３５−２】図３５Ｃおよび３５Ｄは、それぞれ、図３５Ａおよび３５Ｂの方法によって生成された微粒子に結合された第１および第２のタグの配列決定を示す。
【図３６】図３６Ａは、対合末端ライブラリーの鋳型分子を示し、ライブラリーのメンバーに共通する、鋳型の前方アダプター部分、後方アダプター部分、および内部アダプター部分にハイブリダイズするブロッキングオリゴヌクレオチドを示している。図の下部には、アダプターとブロッキングオリゴヌクレオチドの例示的な配列が示されている。図３６Ａ〜図３６Ｃの「ｄｄＢａｓｅ」とは、ジデオキシヌクレオシドを示す。「固有のＤＮＡ配列」とは、配列決定する標的領域を表す。図３６Ｂは、断片ライブラリーの鋳型分子を示し、ライブラリーのメンバーに共通する、鋳型分子の前方アダプター、後方アダプター、および内部アダプター部分にハイブリダイズするブロッカーオリゴヌクレオチドを示している。図の下部には、アダプターおよび相補性ブロッキングオリゴヌクレオチドの例示的な配列が示されている。図３６Ｃは、鋳型分子にローリングサークル増幅（ＲＣＡ）が行われたライブラリーの分子を示す。ＲＣＡは、鋳型分子の固有部分（２）、ならびにアダプター領域（１）とパドロック領域（３）の複数の複製を作成する。この図は、ライブラリーのメンバーに共通する、鋳型のアダプター部分およびパドロック部分にハイブリダイズするブロッキングオリゴヌクレオチドを示している。
【図３７】いくつかのパドロックプローブ配列と、ＲＣＡを使用した鋳型分子の合成後にパドロック領域をブロックするとされるオリゴヌクレオチドの例示的な配列を示す。
【図３８】半固形培地を使用せずに基材上に作成される微粒子のアレイ（ゲル非含有微粒子アレイ）を示す。
【図３９】ゲル非含有微粒子アレイを使用した、ライゲーションに基づく配列決定の結果を示す。
【図４０】表面上に位置する微粒子の概略図を示し、鋳型の伸長によって生じるとされる接触パッチと核酸コロニーの予想されるサイズを例示する。
【国際調査報告】
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