(57)【要約】本発明はインビボプロセスにおける物質の効果をインビトロで検討する方法、免疫調節化合物の効果を検出する方法、及びインビボプロセスにおいて免疫システムの介在によりアポトーシス誘発及び/又は壊死誘発化合物を同定する方法に関する。本発明の方法は、特に免疫システムの介在した細胞上の物質の効果を検討するのに適している。さらに本発明の方法は、免疫調節化合物及びアポトーシス誘発及び/又は壊死誘発化合物の投与の前、投与中、及び/又は投与後のインビボ効果をインビトロでモニターするのに適している。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビボプロセスにおける物質の効果をインビトロで検討する方法であって、以下の一連のステップを含む方法、すなわち、
a)  細胞の分離
b)  検討対象の物質による細胞の第一次培養
c)  浮遊物又は第一次培養から得られる細胞及び浮遊物の混合物の収集
d)  標的細胞の浮遊物による、又は細胞及び浮遊物の混合物による第二次培養
e)  標的細胞の分析。
【請求項２】
第一次培養のために分離された細胞が免疫システムのエフェクター細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第二次培養の標的細胞がヒトの細胞又は高等哺乳動物の細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ1.d)及び1.e)が患者の血液、血清又は血漿を用いて実施される、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
検討される物質が免疫調節及びアポトーシス誘発又は壊死誘発化合物である、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
免疫調節化合物の同定及び/又は免疫調節化合物の効果の検出及びインビボプロセスにおいて免疫システムが介在した、アポトーシス誘発及び/又は壊死誘発化合物の同定に適したインビトロ検出方法であって、前記方法は以下の一連のステップを含む：
a)  免疫システムのエフェクター細胞を、その免疫調節効果が検討される物質又はアポトーシス誘発及び/又は壊死誘発物質による第一次培養、続いて
b)  浮遊物又は第一次培養から得られる細胞及び浮遊物の混合物の収集、続いて
c)  標的細胞の浮遊物による、又は第一次培養から得られる細胞及び浮遊物の混合物による第二次培養、及び最終的に
d)  免疫調節及び/又はアポトーシス誘発及び/又は壊死誘発効果の、適当な検出方法による分析。
【請求項７】
第一次培養のための細胞がステップ1.aにおいて事前に分離される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
第一次培養のための免疫システムのエフェクター細胞は、好ましくは、例えば、B-,  T-  及びNK‐細胞、単球、樹脂状細胞の様なFACS又はMACS  により分類される血液の抹消血単核球細胞、脾臓細胞又は細胞混合物の亜母集団であるのが良い、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
第一次培養のための細胞及び第二次培養の標的細胞がヒトの細胞又は高等哺乳動物の細胞である、請求項６乃至８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ6.c)  及び6.d)が患者の血液、血清又は血漿を用いて実施される、請求項６乃至９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
第二次培養の標的細胞が腫瘍細胞又は遺伝子的に腫瘍由来の細胞株である、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
その効果が検討される免疫調節化合物が、CpG含有オリゴデオキシヌクレオチド又は単鎖領域に少なくとも一つのCpGモチーフを持つ部分的に二重鎖を持つDNA構築体である、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
その効果が検討されるアポトーシス誘発及び/又は壊死誘発化合物が、好ましくはアンチセンス  オリゴデオキシヌクレオチド、si-RNA、抗体又は化学治療剤である、請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
全血、血球、血球亜母集団、血清又は血漿が、治療前、治療中及び/又は治療後に第一次培養で検討される物質として用いられる、請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
培養が培養器で行われる、請求項１乃至１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
浮遊物が遠心分離により収集される、請求項１乃至１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
特異タンパク質の発現がその標的細胞の分析により検討される、請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
規定の遺伝子の発現が標的細胞の分析により検討される、請求項１乃至１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的細胞が分析のために染色される、特にアネキシンＶ又はヨウ化プロピジウム染料により染色される、請求項１乃至１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
アポトーシス及び/又は壊死検出方法が、標的細胞の分析により実施される、請求項１乃至１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
細胞サイクル分析が実施される、請求項１乃至２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
抗体又は他の競合物質が、検討される物質と共に第一次培養に加えられる、請求項１乃至２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
インビボプロセスにおいて免疫調節化合物を同定し、及び/又は免疫調整化合物の効果を検出し、及び免疫システムの介在によるアポトーシス誘発及び/又は壊死誘発化合物を同定するのに適したインビトロ検出方法を実施するためのキットであり、
・ 保存用に調製された一定分量の免疫システムのエフェクター細胞、
・ 第一次及び第二次培養を実施する手段、
・ 検討される化合物により第一次培養中に細胞の培養反応物として放出されるメッセンジャー物質の検出のための、そのウエルの表面が抗体により覆われている２４から９６ウエルを持つ複数ウエルプレート、及び/又は
・ 検討される化合物より誘発される免疫反応による表面分子の発現の変化を検討するために、RT-PCRを実施するための手段であり、キットは表面分子のmRNAを増殖させるために好適なプライマ、増殖のための酵素及び必要な緩衝液、及び/又はFACS分析の手段を含み、そのため、キットは好適な蛍光マークされた抗体であって、表面抗原に向けられる抗体及びさらに、緩衝液及び化学品の様な標的細胞を生成する手段を含む、
前記キット。
【請求項２４】
そのような化合物の投与の前、投与中及び/又は投与後に、免疫調節化合物の効果のインビトロでの提示、及びインビボプロセスにおいて、免疫システムが介在したアポトーシス誘発及び/又は壊死誘発化合物を同定するためのキットであって、少なくとも以下の成分、すなわち、
・ 保存用、及び／又は患者の血液、血清又は血漿による培養のために調製された一定分量の標的細胞、
・ 第二次培養を実施する手段、
・ 検討される化合物による第一次培養中の細胞の培養反応物として放出されるメッセンジャー物質の検出のための、そのウエルの表面が抗体により覆われている２４から９６ウエルを持つ複数ウエルプレート、及び/又は
・ 検討される化合物により誘発される免疫反応による表面分子の発現の変化の検討するための、RT-PCRを実施するための手段であり、キットは表面分子のmRNAを増殖させるために好適なプライマ、増殖のための酵素及び必要な緩衝液及び/又はFACS分析の手段を含み、そのため、キットは好適な蛍光マークされた抗体であって、表面抗原に向けられる抗体及びさらに、緩衝液及び化学品の様な標的細胞を生成する手段を含む、
を含む、前記キット。
【請求項２５】
含まれる標的細胞が、腫瘍細胞又は遺伝子的に腫瘍由来の細胞株である請求項２４のキット
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明はインビボプロセスにおける物質の効果をインビトロでモニターする方法、及びインビボプロセスにおいて免疫システムの介在によりアポトーシス及び/又は壊死を引起す化合物を同定することのみならず、免疫調節化合物を同定し及び/又は免疫調節化合物の効果をインビトロで検出する方法に関する。
【０００２】
製薬工業界では、近年極めて多岐にわたる疾病の治療を目的とした全く新しい種類の物質が開発されている。これらはまた遺伝子治療による薬剤、又は例えば、タンパク質又はDNA構築体の様な遺伝子治療により修飾された、体内で自然に生じる物質を含む。
【０００３】
疾病の薬剤による治療において、これらのまったく新らしい種類の物質の幾つかを用いた治療の例はなく、動物実験や患者に対する臨床的研究に直接頼ることなく、これらの薬剤による効果を試験する方法に対する要望がある。新しい、知られていない物質を用いるその様な実験は、純粋に倫理的な理由により忌避されている。それに代わって、そのためのステップを準備し、これらの物質のインビボ効果に関する見解を示すことのできる結果を得るため、インビトロの検討が示唆されている。この場合インビトロでの実験が、インビボの状態に可能な限り近づくことが極めて重要である。
【０００４】
更に、治療法（例えば、免疫治療又は免疫システムに影響を与える治療）による治療前、治療中及び/又は治療後の患者をモニターする簡単な方法を開発することが重要となり、そこにおいて有機体又は免疫システムの反応が、対応する治療法との関係で検討される。
【０００５】
１９５０年台から、転移を伴った進行した癌の治療唯一の選択肢であった放射線治療及び化学療法の様な従来の癌治療法と並んで、今や患者に対する副作用が少なく、しかし治療目的の達成においては非常に効果がある治療法を開発することが目標となっている。
【０００６】
この一つのアプローチが免疫治療であり、この治療法は遺伝子組み換えにより癌に対する自然免疫反応を高めることを目標とする。すなわち、免疫システムの癌細胞に対する「注目度」に好い影響を与え、そして免疫反応に影響を与え、身体自身が腫瘍と闘うようにさせるものである。
【０００７】
現在、殆んどの臨床研究は腫瘍の除去をベースとしており、それに続いて腫瘍細胞を治療遺伝子によりイクスビボでトランスフェクションし、腫瘍細胞集団を放射線照射し、それに続いて新たに組み換えされた腫瘍細胞を再移植する。この腫瘍細胞のワクチン接種により抗癌反応が増大するが、その程度は移入される治療遺伝子により種々異なる。
【０００８】
しかし腫瘍細胞のトランスフェクションに加え、免疫調節物質もまた開発されつつあり、これは免疫システムが腫瘍細胞と闘うことを誘発することを意図している。これらの免疫調節物質は、腫瘍細胞が特異的に攻撃され、最終的には破壊される様に免疫システムを誘発し、又は「プログラム」することが意図される。この様なアプローチにおいては、癌治療における免疫調節物質は、免疫システムを通して関係する腫瘍又は下地となっている種類の腫瘍細胞に間接的に働きかける。
【０００９】
新しい物質の、インビボプロセスに対する効果、例えば、腫瘍細胞の破壊をインビボで検討することのできる方法は、一方で主要な倫理的観点からの理由による遠慮を考慮する必要のあるインビボ実験を避け、他方で数多くの物質を、短時間に多くの異なる腫瘍細胞で試験することを可能とする。更に、その様な方法に依れば、誘発されるインビボ効果について、いわゆる「治療モニター」によって治療の進行を示すことが可能になると思われる。
【発明の開示】
【００１０】
この技術の先進性を考慮すれば、本発明の目標は、ヒト又は高等哺乳動物におけるインビボプロセスでの物質の有効性を、インビトロで検討することを可能にする方法を提供することである。
【００１１】
この目標は各独立請求項に記載の特徴により実現される。
【００１２】
本発明においては：
免疫システムのエフェクター細胞は、免疫細胞の混合物であり、例えば、ＰＢＭＣ（抹消血単核球細胞（ヒト又は高等哺乳動物）、脾臓細胞（動物モデル）等）又はFACS又はMACS  により分類される亜母集団、例えば、B-,  T-  及びNK‐細胞、単球、樹脂状細胞等を言う。
【００１３】
CpG-モチーフは、メチル化されていないシトシン  グアニン  モチーフを言う。
【００１４】
dSLIMは、二重ステムループ免疫調節オリゴデオキシリボヌクレオチド（double  Stem-Loop  Ｉmmunomodulating  Oligodeoxyribonucleotide）を言い、各ループはCpG-モチーフを示し、好ましくは３つであるのが良い。
【００１５】
ODNはオリゴデオキシリボヌクレオチドを言う。
【００１６】
PBMCは、抹消血単核球(peripheral  mononuclear  blood  cell)  を言う。
【００１７】
数多くの一般的な概念は以下に記載の様に解される：
本発明の免疫調節化合物は、免疫システム又は単にその個々の細胞、特にエフェクター細胞の反応に影響を与えることのできる物質と理解されるべきである。化合物とともに、これらはまたDNA構築体、タンパク質、抗体、糖分子又は免疫システム又は免疫システムの細胞を反応する様にする特性を示すその他の物質を含む。これは、特に本発明においてエフェクター細胞と呼ばれる免疫システムの細胞に関係し、同細胞は免疫システムの反応に影響を与え又は反応を介在することができる。この介在は特定のメッセンジャー物質の放出により起こる。
【００１８】
したがって、本発明は以下に示すステップを含む方法に関する：
a)  細胞の分離
b)  検討対象の物質による細胞の第一次培養
c)  浮遊物又は第一次培養からえられる細胞及び浮遊物の混合物の収集
d)  標的細胞の浮遊物による、又は細胞及び浮遊物の混合物による第二次培養
e)  標的細胞の分析
代替的実施の態様では、免疫調節化合物の同定及び/又は免疫調節化合物の効果の検出、及びインビボプロセスにおいて免疫システムが介在した、アポトーシス誘発及び/又は壊死誘発化合物の同定を意図したインビトロ検出方法に関し、前記方法は以下の一連のステップを含む：
a)  免疫システムのエフェクター細胞を、その免疫調節効果が検討されるアポトーシス誘発及び/又は壊死誘発物質による第一次培養、続いて
b)  浮遊物又は第一次培養から得られる細胞及び浮遊物の混合物の収集、続いて
c)  標的細胞の浮遊物による、又は第一次培養から得られる細胞及び浮遊物の混合物による第二次培養、及び最終的に
d)  免疫調節及び/又はアポトーシス誘発及び/又は壊死誘発効果を適当な検出方法により分析する。
【００１９】
この方法のステップは、インビボプロセスでの物質の効果を、インビトロで検討することを可能とすることを示す。その結果、新しいタイプの化合物は臨床試験において動物又は患者を危険に曝すことなく、インビボの状態に非常に近い状態で試験することができる。さらに、既に計画され/実施された治療の影響をモニター（関係するパラメータを分析することにより）することができる。本発明のこの方法は、また、本発明の持つ意味より「治療モニター」（therapy  monitoring）とも呼ばれる。この用語はインビボ治療効果をインビトロモニターする場合についてのみ用いられる。本発明のこの方法自体は、治療が旨く行くかどうかについてモニターすることができることを除いては、治療そのものとは関係しない。
【００２０】
本発明の好ましい実施の態様においては、分離された細胞は上記の定義に従えば免疫システムのエフェクター細胞である。本発明の方法は、免疫システムが介在した細胞上の物質の効果を検討する場合特に好適である。
【００２１】
第一次培養において免疫システムの細胞と物質が、後者に効果を及ぼすことが可能となった後に、第二次培養では物質のインビボ効果が、中でも免疫システムの分泌生成物を含む、第一次培養から得られた浮遊物又は細胞及び浮遊物の混合物を標的細胞と共に培養することにより明らかとなる。
【００２２】
好ましい標的細胞にはヒトの細胞又は高等動物の細胞である。本発明の特に好ましい実施の態様における方法では、分離された細胞、特に免疫システムの細胞が第一次培養で用いられ、第二次培養では標的細胞として、腫瘍細胞又は遺伝子的に腫瘍細胞由来の細胞株が使用される。本発明の、この方法の実施の態様においては、後者は「インビトロ免疫アッセイの機能物」(Functional  in  vitro  immunoassay)と呼ぶことができる。
【００２３】
原則的に、元の出所が異なる腫瘍細胞の何れのタイプのものも、腫瘍細胞と考えることができる。「インビトロ免疫アッセイの機能物」の目的は、免疫システムにより腫瘍細胞中のアポトーシス又は壊死を引起すのに適した物質を同定し又は調査、検討することである。
【００２４】
しかし、本発明の方法の他の目的は、MHC-I  (例えば、HLA-ABC)及び接着分子(例えば、ICAM-1)の腫瘍細胞表面での発現の増強を契機として、免疫システムにより腫瘍細胞を認識することを調査、検討することである。本発明の方法の決定的に有利な点は、インビボ効果が、その実施に不都合を伴う臨床研究において動物及び/又は患者において実験をすることなく検出されることである。
【００２５】
本発明の方法を実施するために、免疫調節物質により誘発される免疫反応による表面分子の発現の変化を検討するためのキットが提供される。キットは保存用に調製された一定分量の細胞を含み、好ましくは検討される物質による第一次培養のための免疫システムのエフェクター細胞、第一次及び第二次培養を実施する手段、及び第二次培養から得られる細胞の表面分子の、発現パターンの分析のための手段を含む。第二次培養の標的細胞の、表面抗原の発現パターンの分析用に、本発明のキットはRT-PCRを実施するための手段を含み、キットは表面分子からmRNAを増殖させるために好適なプライマ、増殖のための酵素及び必要な緩衝液及び/又はFACS分析の手段を含み、そのため、キットは好適な蛍光マークされた抗体であって、表面抗原に向けられる抗体及びアポトーシス/壊死マーカー、及びさらに、緩衝液及び化学品の様な標的細胞を生成する手段を含む。
【００２６】
さらに本発明の方法は治療のモニターにも適しており、その場合、患者の全血、血球、血清又は血漿が、治療の前、治療中及び/又は治療後（例えば、免疫システムを変え又は免疫システムに影響を与える免疫療法又は治療）に第一次培養で検討される物質として用いられる。
【００２７】
この更なら本発明の手段によって、患者に投与された治療薬であって、好ましくは免疫システムに刺激作用を与える治療薬が既にインビボ効果を生み出しているか否かを調べることができる。この方法では患者の血液が、そこに含まれる細胞及び/又はメッセンジャー物質又はその部分（例えば、血清及び/又は血漿又は細胞亜母集団）によって調査、検討されるが、この実施の態様においては、本発明の方法は、結局治療において、好ましくは免疫治療において患者に投与された物質のインビボ効果を間接的に検出するのに役立つ。
【００２８】
本発明の方法での「治療モニター」で使用することのできる抗体が特に知られていない場合は、治療薬の投与後の血液中（血漿/血清）のサイトカインの変化、又は免疫システムの反応に続いて生成される特異の抗体の変化によってインビボ効果をモニターすることが可能である。
【００２９】
本発明の方法による治療において、それぞれのケースで使用される治療薬の効果の治療モニター法として提供される治療法は、癌、感染、アレルギー及び自己免疫疾患の様な疾病に適している。
【００３０】
上に述べた有利な点を持つため、また免疫調節効果を持ち又はアポトーシス又は壊死を誘発することの可能な化合物は、本発明の方法において用いることが望ましい。
【００３１】
本発明によれば、CpGモチーフ含有オリゴデオキシヌクレオチド及びdSLIM（二重ステムループ免疫調節オリゴデオキシリボヌクレオチド(double  Stem-Loop  immunomodula-ting  Oligodeoxyribonucleotides),  EP  1  196  178  BIを参照）は免疫調節化合物として望ましい。しかし、本発明の範囲において、他の生分子、例えば、天然又は遺伝子組み換えされた抗体、DNAベース及び/又はRNAベース物質（アンチセンス  オリゴデオキシヌクレオチド、si-RNA等)、アミノ酸化合物、メッセンジャ−物質又は他の免疫調節剤（例えば、アルミニウム塩、イミダゾキノリン、リポ多糖類、サポニン誘導体、リン脂質、スクアレン等）もまた使用しても良い。
【００３２】
本発明によれば、特にこれらの化合物は細胞の維持に必要なプロセスを恒久的に中断するのに適したアポトーシス誘発及び/又は壊死誘発化合物と考えることができる。ここで特にDNAベース及び/又はRNAベース物質（アンチセンス  オリゴデオキシヌクレオチド、si-RNA等）、抗体又は化学治療剤が考えられる。
【００３３】
さらに本発明の方法は、第一次培養において免疫調節又はアポトーシス誘発及び/又は壊死誘発物質により、分離された細胞を培養するのに続き、細胞により放出されるメッセンジャ−物質を同定するのに使用することができる。このため、第二次培養の標的細胞に加えられる前に、第一次培養からの浮遊物はメッセンジャ−物質の可能性のある物質を特に認識する抗体により事前培養される。抗体とメッセンジャ−物質のエピトープの間との相互反応により、メッセンジャ−物質は標的細胞にシグナルを送ることができず、この様にしてその機能がブロックされる。本発明の方法のこの実施の態様は、何れの特定のメッセンジャ−物質が誘発される効果、例えば、アポトーシスを生じさせるかを検出するために重要である。
【００３４】
２４から９６ウエルの複数ウエルプレートは、誘発により放出されたメッセンジャ−物質を同定するために、本発明の方法のキットを使用するのが好ましく、そこではプレートの各ウエルの表面はメッセンジャ−物質（例えば、IFN-y）のエピトープを指向する抗体で覆われており、第一次培養から得られた浮遊物の部分をこの様に事前処理されたプレートによって培養し、そしてその部分を標的細胞で培養した後にメッセンジャ−物質の可能性を持つ多数の物質を短時間に試験し、それらが事実、免疫反応に介在しており、又はアポトーシスを誘発するかを見出すことができる可能性がある。
【００３５】
したがって、本発明はまた調査、研究対象の物質により、第一次培養において細胞の培養の反応結果として放出されるメッセンジャ−物質を同定するための本発明の方法を適用するキットの使用に関する。このタイプのキットは保存用に調製された一定量の細胞を含み、好ましくは免疫システムのエフェクター細胞であるのが良く、第一次培養のための検討される物質を含み、第一次及び第二次培養を実施する手段、及びさらに２４から９６ウエルを持つ複数ウエルプレートを持ち、このウエルの表面は抗体により覆われ、種々異なるウエルの表面は異なる抗体で覆われ、しかし好ましくは少なくとも各２つのウエルは同一の抗体で覆われているのが好ましい。
【００３６】
本発明の方法の必要な培養ステップは、５％のCO２を含む培養器中で実施されるのが好ましい。しかし、各ケースで培養される細胞の必要条件に応じた他の培養条件もまた考慮される。
【００３７】
浮遊物又は第一次培養からの浮遊物及び細胞の混合物の収集は、本発明に従い遠心分離により行われる。しかし、本発明では、例えば、浮遊物は通過させるが、細胞又は他の存在する細胞破片は通さない孔サイズを持つ細胞ろ過装置により、細胞を浮遊物から分離するのに適した他の任意の方法であっても良い。さらに特異抗体を用いる細胞の分離システム及び/又は細胞選定システム、それに続いて磁力(MACS)又は蛍光(FACS)ベースを用いる選定方法も考慮される。
【００３８】
本発明の方法による細胞の分析では、標的細胞中のタンパク質の発現の変化を示すことを可能とすることを意図している。ここで特にFACS測定（蛍光活性化細胞選別(Fluorescent  Activated  Cell  Sorting)）、ウエスタンブロット法、ゲルろ過又はサイトスピン（cytospins）が考慮の対象になる。
【００３９】
更に、ある遺伝子の発現の変化の分析方法、例えば、RT-PCR,  リアルタイム  PCR,  RNaseタンパク質アッセイ及びノーザン及びサザ―ンブロット法が考慮される。
【００４０】
インビボ効果の分析では、最後にアポトーシスアッセイ、例えば、細胞をアネキシン  V又はチューネル（TUNEL）アッセイ又は細胞周期分析、例えば、ヨウ化プロピジウム染色法により染色することも考慮される。
【００４１】
以下に記載する実施例及び実験結果は、本発明の方法はインビトロの検討によりインビトロ  プロセスにおける物質の効果を示すことができるばかりでなく、また、むしろ本発明の方法を競合アッセイに拡張することにより見出された効果の特異性を試験し及び記録するのにも適していることを示している。
【００４２】
本発明のさらに有利な実施の態様は、従属請求項及び明細書に基づく。本発明の方法の実行可能性を含み、本発明の態様の実施例及び図面を用いて以下に更に詳説するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４３】
短核細胞の収集
本発明の方法の実施するため、抹消血短核細胞(PBMC)が全血あるいは「淡黄色被覆」（buffy  coat）と呼ばれるものから抽出された。これは全血からの赤血球の濃縮物の生成中に生じる副産物である。
【００４４】
PBMCは、赤血球、顆粒球及び死細胞を分離するためにFicoll勾配を用いて遠心分離された。Ficollは非電荷のスクロース  ポリマーであり、その密度は、そのポリマーが全血又は淡黄色被覆で被覆され、そして遠心分離された場合、密度の低い部分はFicoll層を通り底に集まるが、リンパ球及び単球は血漿（上部）及びFicoll（下部）の間の中間相に集まる様に設定される。中間相は遠心分離後の細胞を含んでいるが、分離されそしてPBSで数度洗浄された。これに続いて、分離された細胞は細胞培養媒体中に取り上げられミリリットル当り1  -  4  x  106  の細胞濃度に調節された。
【００４５】
二重ステムループ免疫調節オリゴデオキシリボヌクレオチド（double  Stem-Loop  Ｉmmunomodulating  Oligodeoxyribonucleotide）
二重ステムループ免疫調節オリゴデオキシリボヌクレオチドはCpG配列を持つ分子である。これはヌクレオチドループにより線状オリゴデオキシヌクレオチド(ODN)を共有結合によって閉じることにより得られるため、エクソヌクレアーゼによる分解から保護される。したがって、dSLIM、「二重ステムループ免疫調節剤」（double  stem  loop  immunomodulator）と呼ばれるダンベル型分子が得られる。免疫調節活性は、トール様受容体、中でもdSLIM分子の特別な構造に結合する非メチル化CpG配列による免疫システムの非特異的活性化に基づく。dSLIMの各ループは、３つの非メチル化CpGモチーフを含む。
【００４６】
ISS30タイプの二重鎖ステムループ免疫調節剤（dSLIM）（例えば、dSLIM30L1）はSOPにより合成され、続く配列の品質管理はBクラス実験に拠った。このために一本鎖ヘアピン型５’−リン酸化オリゴデオキシリボヌクレオチド(ODN)はT4-DNAリガーゼで結紮された。残っている開始材料をT7DNAポリメラーゼ及びクロマトグラフィー精製により消化した後、残りのdSLIMがエタノール/ナトリウム  マグネシウムアセテート沈殿により濃縮され、PBS中で溶解された。抽出手順はWO  01/07055に記載されている。
【００４７】
dSLIMによる免疫細胞(PBMC)の第一次培養
分離された細胞(PBMC)は複数ウエルプレートに播種された。バッチサイズ、及び、したがって、ウエルサイズは、後に集菌される培養浮遊物が標的細胞による第二次培養に必要な、正確な容積を持つ様選択された。
【００４８】
最初のバッチは非刺激細胞を含んでいた（ネガティブ  コントロール）。第二のバッチは0.1  -  10  μM  dSLIM-30L1で刺激された。さらに２回のバッチ細胞が、最大可能なポジティブな結果を与え、機器の較正及びFACSの補償をするために0.1  -  10  μMのオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)で刺激を与えられた。更なるバッチ細胞は、比較のため他の0.1  -  10  μMのODNで刺激された。各バッチは37℃でCO2培養器中で48時間培養された。これらのバッチの浮遊物は遠心分離により回収され、その後の作業のため-80℃で冷凍された。
【００４９】
標的細胞（例えば、HT-29）による二次培養
標的細胞による第二次培養では、最適な濃度及び容積は標的細胞が播種される濃度及び容積を考慮して事前に決定されねばならなかった。その目的は第二次培養の後に、分析のために各ウエルで少なくとも5  x  105の標的細胞が利用できることである。ここで細胞は3日間最適な成長条件が確保され、必要な密度を保ち且つ可能な限り間隔が開いている様に種を蒔き、そして３日後に殆んど密集する状態であることが確実となる様にすべきである。非最適成長条件はまた壊死又はアポトーシスを引起し、その結果実験結果を損なう。本件の場合、HT-  29結腸癌細胞が標的細胞として使用された。
【００５０】
細胞は、対応するサイズのバッチで事前に決定された最適密度で播種され、37℃でCO2培養器中で一夜培養された（例えば、２４ウエルプレートで各ウエル700  μl中2.4  x  105細胞）。
【００５１】
次の日、粘着性を持つようになった細胞から媒体を除去し、第一次培養からの浮遊物を添加し（間接刺激）、又は指示された物質(dSLIM-  30L1  ,  lin30L1)を直接に媒体に添加する（直接刺激）ことで刺激が与えられた。ネガティブ  コントロールとして間接バッチに媒体のみが添加された。これらの細胞は、刺激されていない細胞（第一次培養からの刺激されていない浮遊物の添加）から区別するために非処理細胞と呼ばれた。
【００５２】
バッチ−直接刺激及び間接刺激―は再び37℃でCO2培養器中で48時間培養された。その後、各々の場合について、所望の分析が細胞上で実施された。そのためにまず浮遊物が細胞から除去され、そして細胞はPBSで洗浄された。細胞はトリプシン/  EDTAを用いてウエルから除去され、そして更に洗浄ステップを経た後、続く細胞数の決定のために遠心分離管に移された。
【００５３】
表面抗原の染色
刺激バッチからの細胞は遠心分離され、特別の染色緩衝液で洗浄された。その後、細胞懸濁液はミリリットル当り1  x  106細胞の濃度に調製された。
【００５４】
この細胞懸濁液500  μi  (0.5  x  106細胞)はFACSチューブにおいて遠心分離され、50μlの染色緩衝液に取り出された後、抗体（例えば、FITCと接合したICAM-1  (CD54)及びPEと接合したHLA-ABC）が添加された。機器の較正及び補正のため個々に染色された陽性試料が与えられると同様に、各抗体に対応するイソタイプコントロールが与えられた。培養ステップの後に、細胞は2度PBSで洗浄され、測定のため500  -  1000  μl  PBS中で再懸濁された。死んだ細胞を判別するために7-AADが加えられ、更に10分間培養された。続いてFACS測定が行われた。
【００５５】
アポトーシス/壊死細胞の染色
アポトーシス細胞はアネキシンV-PEで染色された。これは細胞内のアポトーシスプロセスを示す。これらの細胞を壊死細胞から区別するために7-AADにより対比染色がされた。
【００５６】
刺激されたバッチ細胞は遠心分離されて除かれ、PBSで2度洗浄された。その後細胞は特別なアネキシン結合バッファーで希釈され、ミリリットル当り1  x  106の細胞濃度に調整された。この細胞懸濁液100  μl  (1  x  10  5  細胞)当り5  μl  アネキシンV-PE  及び7-AADが加えられ、完全に混合した後に室温で15分間培養された。その後400  μlの結合バッファーが加えられ、直ちにFACS測定が実施された。
【００５７】
FACSによるフローサイトメトリー測定
Ａ．アポトーシス/壊死
蛍光２(アネキシンV-PE)  及び蛍光３(7-AAD)が測定された。そのための機器は、非刺激細胞（直接バッチ）及び/又は非処理細胞（間接バッチ）を用いて較正された。
【００５８】
SSC（側方散乱＝細胞粒度；side  scatter=cell  granulatity）に対するFSC（前方散乱＝細胞サイズ；forward  scatter=  cell  size）のドットプロットでは、細胞集団が中心の位置になる様に調整された。続いて蛍光２及び蛍光３のＰＭＴ較正及び補償がなされた。その後全てのサンプルが測定され(5000  細胞)。
【００５９】
B. 表面抗原
蛍光１(ICAM  1  -FITC)、蛍光２((HLA-ABC-PE)  及び蛍光３(7-AAD)が測定された。
【００６０】
機器は非特異結合の比較のために対応するアイソタイプコントロール（ダブル染色）及び蛍光標的を付した抗体（シングル染色）によりlin-30L1によって刺激された細胞を用いて較正された。
【００６１】
FSCのSSCに対するドットプロットでは、細胞集団が中心となる様に調整された。そして、アイソタイプコントロール、及びシングル染色による補償を用いて蛍光１、２及び３のPMT較正を行った。この後全てサンプルが測定された（10000細胞）。ここで死んだ細胞（７−AAP陽性細胞）は除外された（ドットプロット中の蛍光３対FSC）。
【００６２】
結果の解釈
A.  アポトーシス/壊死
7-AAD対アネキシンVを示すドットプロットが作られた。その後非処理細胞に基づいて四分円が作られた。各四分円中の細胞の位置により、それぞれアポトーシス部分又は壊死部分に属する。
【００６３】
・ 生細胞はアネキシン陰性及び7AAD陰性である（LL四分円）
・ アポトーシス細胞はアネキシン陽性及び7AAD陰性である（LR四分円）
・ 壊死細胞はアネキシン陽性及び7AAD陽性である（UR四分円）、又は
・ アネキシン陰性及び7AAD陽性である（UL四分円）
B.表面マーカ−
2ドットプロット（蛍光１対FSC,及び蛍光２対FSC）は生細胞によって作られた。細胞の蛍光強度（蛍光１/  ICAM-1又は2  /  HLA-ABC）は、各ドットプロット中の細胞の位置に応じて読み取られた。そして関連するコントロールとの対比がなされた。
【００６４】
以下についてテストバッチとコントロールとの対比を行った。
【００６５】
・ 表面マーカー陽性細胞の数（対応する表面マーカーを持つ細胞の数）
・ 表面マーカーの蛍光強度（細胞表面の表面マーカー分子の数）
本発明の方法を用いた実施例の結果を図面に示す。
【００６６】
図面の内容は以下の通りである。
【００６７】
図１は、本発明の方法による各ステップの順序を示す図表である。左側のA部分は、インビボの典型的な応用例を表わし、右側のB部分は、「インビトロ免疫アッセイの機能」を表わす本発明の実施の態様に関わる方法を示す。
【００６８】
図２は、本発明の方法を応用したdSLIM免疫調節剤のインビトロ効果の分析結果を示す。図の右側に示す様に、dSLIMで培養されたPBMCの浮遊物を用いることによりHT-29腫瘍細胞（結腸癌）中にアポトーシス及び壊死が誘発される。ここでアポトーシスは、直接dSLIMで処理された細胞の例から、浮遊物で処理された細胞の例への増加に見られるように、１７％から４６．7％に増大している。
【００６９】
図３は、HT-29細胞中でのdSLIM免疫調節剤のインビトロ効果を分析したものである。dSLIMで培養されたPBMCの浮遊物を使用することによりHLA-ABC表面マーカーの発現増強が誘発される。細胞集団の移動が図面中の最右翼の図に見ることが出来る。
【００７０】
本発明の方法を用いたHT-29で得られた実験結果を確認するために、同様な実験がHEK-293で実施された。結果を図4及び５に示す。
【００７１】
図４は、dSLIMがアポトーシス（アネキシンV）及び壊死(7-AAD)を誘発することを示す。そこで、アポトーシス細胞の数が、ODNを含まない浮遊物で処理された細胞に比べて、dSLIMで処理された細胞からの浮遊物のために12.1  %  から21  .7  %に上昇している。壊死細胞の数は9.2  %から16  %へ上昇している。
【００７２】
図５は、PBMCのdSLIM浮遊物によって標的細胞(HT-29)を培養することにより
HLA-ABC表面マーカーを誘発の増大することを示す。図の上の部分は、ODNで処理されてないPBMCから得られた浮遊物で処理された細胞集団の、dSLIMで処理されたPBMCから得られた浮遊物で培養された細胞へのシフト（発現の増加）を示す。
【００７３】
図６は、本発明の方法を適用したHT-  29細胞中でのdSLIMの作用機構、及びアポトーシス及び壊死の検出の分析結果を示す。ここでは、PBMCの第一次培養のステップで、dSLIMの効果を無効にすることのできる抗体(anti-IFN-γ、緑色のフレーム)が加えられる。比較のため特異性を証明するために抗体(anti-IFN-α,  anti-TNFα)で実験を行った。容易に分かる様に（緑色フレーム）、anti-IFN-γ抗体はアポトーシス細胞及び壊死細胞の数を両者ともに減少させる。
【００７４】
図７での、本発明の方法の応用は図６の方法に対応するが、標的細胞(HT-29)上の表面マーカーICAM-1  (CD54)の発現が分析される。細胞集団のシフトを比較のために図の下部に示す。
【００７５】
図８及び９は、本発明の方法をRenca腫瘍細胞に応用した実験結果を示し、dSLIMと線状ODNの効果が比較のため検討された。しかしCpGを含む線状オリゴデオキシヌクレオチドは又dSLIMと異なる配列を持ち、ホスホロチオリン酸エステルによる分解から保護される。
【００７６】
図８は、標的細胞のdSLIMによる処理によって表面マーカーHLA-ABC（上の部分）の発現が増強され、一方線状CpG-ODNは効果を持たないことを示す。図の右の表は数値による違いを示す。図９に示すように、dSLIMは線状CpG-ODNよりも明らかにアポトーシス及び壊死を誘発させる可能性がある。アポトーシスの誘発の違いは下の部分にパーセントで示す。
【００７７】
図10及び１１は、本発明の方法を適用して標的細胞としたHT-29中で、dSLIMと線状CpG-ODNを比較したものである。これらの実験結果はRenca腫瘍細胞により得られ、図８及び９に示す結果に対応する。図の配置は図8及び９に対応する。
【００７８】
図12、13及び１４は、癌患者の治療において、本発明の方法を、成長腫瘍細胞（図１２）及びアポトーシス/壊死細胞（図１３）の数及びICAM-1/HLA-ABC表面マーカー（図１４）の発現の変化をインビトロモニターに適用したものを示す。
【００７９】
治療の最初の週の最初の5日間の各日は、２．５mg  dSLIMが直腸癌患者で、肝臓に転移した患者に投与された。第1週の6日目に放射線照射をし、その後化学療法を施した。インビボ効果をインビトロ分析するため、最初の週の、最初の6日の各日に血液サンプルが患者から採取された。化学療法の間、血液サンプルが各週末にかけて採取された。
【００８０】
血漿が血液サンプルから分離され、腫瘍細胞株HT-  29の細胞により培養された。その後成長可能な細胞（図１２）及びアポトーシス/壊死細胞の数が決定され、表面マーカーICAM-1  /  HLA-ABCの発現が調査された。
【００８１】
図１２は、HT-29細胞を8つの血液サンプルから採取した血漿で培養した結果を示す。成長可能なHT-29細胞の数が既にdSLIM投与の2日目に明確に減少していることが、見ることができる。成長可能な細胞の数は2日目に1日目の細胞の数の半分未満になっており、これはコントロール中の成長可能な細胞の数に匹敵する。
【００８２】
図１３は、癌患者の治療中の１，２，５及び20日目のアポトーシス/壊死腫瘍細胞のインビトロモニターを示す。このインビボ効果のモニターにおいて、dSLIM投与後の一日目にアポトーシス/壊死細胞の数が既に明確に増加していることが見られる。
【００８３】
図１４は、血液サンプル1，2，3及び８中の血液から採取した血漿を用いて、癌患者を治療する間の表面マーカーICAM-1  /  HLA-ABCの発現の変化を調査した結果を示す。ここでサンプル１は2つの表面マーカーの発現の変化を示す参考値として用いられた。
【００８４】
治療の2日目に既にICAM-1は更に強く発現しており、これは蛍光強度の位置のシフトにより、図の下の部分に見ることが出来、これにより、ICAM-1はより強く発現していることが分かる。
【００８５】
HLA-ABCでは、2日目ではまだ蛍光強度のシフトは起きていない。これは治療の3日目まで起きず、またHLA-ABCは発現強度がより大きいことを示す。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】本発明の方法の概略図である。
【図２】HT-29腫瘍細胞中のアポトーシス及び壊死の検出によるdSLIM免疫調節剤のインビトロ効果の分析を示す。
【図３】HT-29腫瘍細胞中のHLA-ABC表面マーカーの発現の検出によるdSLIM免疫調節剤のインビトロ効果の分析を示す。
【図４】HEK-293腫瘍細胞中のアポトーシス及び壊死の検出によるdSLIM免疫調節剤のインビトロ効果の分析を示す。
【図５】HEK-293腫瘍細胞中のHLA-ABC表面マーカーの発現の検出によるdSLIM免疫調節剤のインビトロ効果の分析を示す。
【図６】本発明の方法を用いたHT-29腫瘍細胞中のアポトーシス及び壊死の検出によるdSLIM免疫調節剤の作用機構の分析を示す。
【図７】本発明の方法を用いたHT-29腫瘍細胞中のHLA-ABC表面マーカーの発現の検出によるdSLIM免疫調節剤の作用機構の分析を示す。
【図８】Renca腫瘍細胞中のHLA-ABC表面マーカーの発現の検出によるdSLIMと線状CpG-ODNの効果の比較を示す。
【図９】Renca腫瘍細胞中のアポトーシス及び壊死の検出によるdSLIMと線状CpG-ODNの効果の比較を示す。
【図１０】HT-29腫瘍細胞中の、HLA-ABC表面マーカーの発現の検出によるdSLIMと線状CpG-ODNの効果の比較を示す。
【図１１】HT-29腫瘍細胞中のアポトーシス及び壊死の検出によるdSLIM  dSLIMと線状CpG-ODNの効果の比較を示す。
【図１２】癌患者を治療する間の成長腫瘍細胞のインビトロモニターを示す。
【図１３】癌患者を治療する間のアポトーシス/壊死腫瘍細胞のインビトロモニターを示す。
【図１４】癌患者を治療する間の腫瘍細胞の表面マーカーのインビトロモニターを示す。
【符号の説明】
【００８７】
A：  インビボの状況
B：  インビトロ免疫アッセイ
１：  患者
２：  標的組織、例えば、腫瘍
３：  免疫細胞
４：  試験材料、例えば、dSLIM
５：  活性化免疫細胞
６：  ドナー
７：  免疫細胞、例えば、PBMC
８：  試験材料、例えば、dSLIM
９：  活性化免疫細胞、例えば、PBMC
１０：  浮遊物
１１：  標的細胞、例えば、腫瘍細胞
１２：  分析
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2009506780.tif 000009
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2009506780.tif 000015
【図１４】
2009506780.tif 000016
【国際調査報告】
2009506780.tif 000017
2009506780.tif 000018
2009506780.tif 000019
2009506780.tif 000020
2009506780.tif 000021
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