(57)【要約】本明細書では、望ましい特性を有する改変ＯＢフォールドドメインと、改変ＯＢフォールドドメインのライブラリを作製する方法と、このような方法によって作成される改変ＯＢフォールドドメインのライブラリと、所望の生物活性についてこのような改変ＯＢフォールドドメインのライブラリをスクリーニングする方法と、このようなライブラリから同定される改変ＯＢフォールドドメインを提供する。また、本明細書では、改変された結合相互作用を示す、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍから得られる改変ＯＢフォールドドメインも提供する。
2009539346.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然に存在するＯＢフォールドドメインから取得可能な単離された改変ＯＢフォールドドメインであって、該改変ＯＢフォールドドメインは、
（ａ）該天然に存在するＯＢフォールドドメインと比較して、該ＯＢフォールドドメイン結合表面のβストランド内の少なくとも１つの改変アミノ酸残基、または
（ｂ）該ＯＢフォールドドメイン結合表面のβストランド内の少なくとも１つの改変アミノ酸残基、および該ＯＢフォールドドメインループ領域のストランド内の少なくとも１つの改変アミノ酸残基、または
（ｃ）該ＯＢフォールドドメインループ領域のストランド内の少なくとも１つの改変アミノ酸残基
を含み、該改変ＯＢフォールドドメインが、該天然に存在するＯＢフォールドドメインと比較して、変化した結合特性を有する、
改変ＯＢフォールドドメイン。
【請求項２】
前記ドメインが、前記天然に存在するＯＢフォールドドメインとは異なる結合パートナーに特異的に結合するか、またはその天然に存在する結合パートナーとの改変された結合を有する、請求項１に記載の改変ＯＢフォールドドメイン。
【請求項３】
前記天然に存在するＯＢフォールドドメインが、ブドウ球菌ヌクレアーゼタンパク質、細菌性エンテロトキシン、ＴＩＭＰ様タンパク質、ヘムシャペロンＣｃｍＥタンパク質、尾結合リゾチームｇｐ５、Ｎ末端ドメインタンパク質、核酸結合タンパク質、無機ピロホスファターゼ、Ｍｏｐ様タンパク質、ＣｈｅＷ様タンパク質、ｔＲＮＡ＿ａｎｔｉ（ＯＢフォールド核酸結合ドメイン）、Ｔｅｌｏ＿ｂｉｎｄ（テロメア結合タンパク質αサブユニット、中心ドメイン）、ＳＳＢ（一本鎖結合タンパク質ファミリーのＯＢフォールドドメイン）、ＤＵＦ３３８のＯＢフォールドドメイン、ＤＮＡ＿ｌｉｇａｓｅ＿ａｄｅｎ（ＮＡＤ依存性ＤＮＡリガーゼＯＢフォールドドメイン）、Ｓｔａｐ‐Ｓｔｒｐ毒素（ブドウ球菌／連鎖球菌毒素、ＯＢフォールドドメイン）、ＥＩＦ‐５ａ（真核生物開始因子５Ａ  Ｈｙｐｕｓｉｎｅ、ＤＮＡ結合ＯＢフォールドドメイン）、ＧＰ５＿ＯＢ（ＧＰ５  Ｎ末端ＯＢフォールドドメイン）、ＣＳＤ、ＤＮＡ＿ｌｉｇａｓｅ＿ＯＢ、ＤＵＦ３８８、ＥＦＰ、ｅＩＦ‐１ａ、ｍＲＮＡ＿ｃａｐ＿Ｃ、ＯＢ＿ＲＮＢ、Ｐｈａｇｅ＿ＤＮＡ＿ｂｉｎｄ、Ｒｅｐ‐Ａ＿Ｎ、Ｒｈｏ＿ＲＮＡ＿ｂｉｎｄ、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ＿Ｌ２、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ＿Ｓ１２、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ＿Ｓ１７、ＲＮＡ＿ｐｏｌ＿Ｒｐｂ８、ＲｕｖＡ＿Ｎ、Ｓ１、ＴＯＢＥ、ＴＯＢＥ＿２、およびｔＲＮＡ＿ｂｉｎｄからなる群から選択されるタンパク質またはタンパク質クラス内に存在する、請求項１または請求項２の改変ＯＢフォールドドメイン。
【請求項４】
前記天然に存在するＯＢフォールドドメインが好熱性生物に由来する、請求項１または請求項２に記載の改変ＯＢフォールドドメイン。
【請求項５】
前記好熱性生物がＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍである、請求項４に記載の改変ＯＢフォールドドメイン。
【請求項６】
前記改変アミノ酸残基が、フォールド関連結合表面のβストランド内に存在する、請求項１〜５のいずれかに記載の改変ＯＢフォールドドメイン。
【請求項７】
前記改変ＯＢフォールドドメインの前記結合パートナーが、核酸、オリゴ糖、タンパク質、ホルモン、および有機小分子からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれかに記載の改変ＯＢフォールドドメイン。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の改変ＯＢフォールドドメインを取得する方法であって、
ａ）天然に存在するＯＢフォールドドメインをコードする核酸あるいは結合表面のストランドおよび／またはループのストランドを含む天然に存在するＯＢフォールドドメインの一部分をコードする核酸を取得する工程と、
ｂ）該天然に存在するＯＢフォールドドメインと比較して、該結合表面のβストランド上の少なくとも１つの改変アミノ酸残基および／またはループのストランド上の少なくとも１つの改変アミノ酸をコードするように該核酸を変化させる工程であって、ここで、改変ＯＢフォールドドメインが得られ、該改変ＯＢフォールドドメインが、該天然に存在するＯＢフォールドドメインと比較して、変化した結合を有する、工程と、
を含む、方法。
【請求項９】
前記改変ＯＢフォールドドメインをコードする核酸を変化させる工程、および／または該改変ＯＢフォールドドメインを含むタンパク質の少なくとも１つのアミノ酸をコードする核酸を変化させる工程もさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ディスプレイのための改変ＯＢフォールドドメインタンパク質のライブラリを作製する方法であって、
ａ）ＯＢフォールドドメインまたはその一部分をコードする核酸を取得する工程と、
ｂ）該核酸をランダムな変化に供することにより、少なくとも１つのランダム化したアミノ酸残基を有する改変ＯＢフォールドドメインをコードする変化させた核酸の集合体を生成する工程と、
を含む、方法。
【請求項１１】
前記核酸が、前記ＯＢフォールドドメイン結合表面のストランドおよび／またはＯＢフォールドドメインのループのストランドの少なくとも１つのアミノ酸残基をコードする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
改変ＯＢフォールドドメインをコードする変化させた核酸の前記ライブラリを、前記改変ＯＢフォールドドメインをその表面に提示し得る宿主細胞の集団に導入する工程もさらに含む、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれかに記載の改変ＯＢフォールドドメインをコードする、単離された核酸。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれかに記載の改変ＯＢフォールドドメインをコードする核酸を含む、宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれかに記載の改変ＯＢフォールドドメインをコードする核酸を含む、ファージ。
【請求項１６】
請求項１〜７のいずれかに記載の改変ＯＢフォールドドメインをコードする核酸を含む、組成物。
【請求項１７】
改変ＯＢフォールドドメインのライブラリを、結合パートナーとの結合についてスクリーニングする方法であって、
ａ）改変ＯＢフォールドドメインのライブラリをその表面に提示する宿主細胞またはウイルス粒子の集団を取得する工程と、
ｂ）該改変ＯＢフォールドドメインと該結合パートナーとの結合に適した条件下で、該宿主細胞またはウイルス粒子の集団を該結合パートナーと接触させる工程と、
ｃ）該結合パートナーと該改変ＯＢフォールドドメインとの結合を決定する工程と、
を含む、方法。
【請求項１８】
前記宿主細胞またはウイルス粒子が、前記改変ＯＢフォールドドメインをその表面に提示するファージである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜７のいずれかに記載の改変ＯＢフォールドドメインのファージライブラリであって、該改変ＯＢフォールドドメインがＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍから取得可能である、ファージライブラリ。
【請求項２０】
細胞またはウイルス粒子の表面に提示される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の改変ＯＢフォールドドメイン。
【請求項２１】
前記細胞またはウイルス粒子が、ファージ、細菌、または酵母である、請求項２０に記載の改変ＯＢフォールドドメイン。
【請求項２３】
固体支持体に結合した、請求項１〜７のいずれかに記載の改変ＯＢフォールドドメイン。
【請求項２４】
前記支持体が、ビーズ、ガラス、スライド、チップ、およびゼラチンからなる群から選択される、請求項２３に記載の改変ＯＢフォールドドメイン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
この出願は、２００６年５月２６日に出願された表題「ＯＢ  Ｆｏｌｄ  Ｄｏｍａｉｎｓ」の米国仮特許出願第６０／８０９，１０５号の優先権の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
分子認識は、シグナル伝達経路の高親和性のタンパク質‐リガンド相互作用からより一過性のタンパク質‐タンパク質認識事象までに至る生物学的プロセスの中心をなす。このような事象は、生物の進化に伴い新たな役割に適応しているタンパク質の多様性に依存する。一例として、外来抗原を捕らえるために、（約１０７個の変異体を含む）免疫系のナイーブライブラリに由来する少数の抗体が、抗原を認識し、中等度の親和性でその抗原に結合する。選択とマチュレーションによってさらなる変異が導入され、抗原の除去に必要な強固で特異的な結合がもたらされる。このようにして、膨大な数の結合様式を基本的な抗体スキャフォールドにグラフトして、小分子から細胞全体までの種々の標的を捕捉することができる。
【０００３】
この方式を実験室で繰り返して、抗体変異体の非常に大きなライブラリ（１０１０種類を超えるクローン）（２、３）を作成することが可能であり、次いで特定の標的に対する結合についてこれらを選択することができる。増幅と結合選択のサイクルを繰り返し行うことで、強固で特異的な分子結合特性を有する試験管抗体を「発見」することができる。このｉｎ  ｖｉｔｒｏ手法はまた他のスキャフォールドにも適用することができる。例えば、成長ホルモンおよび増殖因子ヘレグリンとそれらの各受容体との結合を研究および改善するに当たっては、ファージディスプレイ法によるランダム化と選択がこれまで使用されており（４、５）、ブドウ球菌タンパク質Ａ由来の３本へリックスバンドルドメインのライブラリからは「Ａｆｆｉｂｏｄｙ」が開発されている（６、７）。この全般的な領域がいくつかのレビューでテーマとなっている（８〜１０）。
【０００４】
ＯＢフォールドドメインは一般的に、広範なタンパク質に認められる小さな構造モチーフであり、その名前は元々、それ自体が有するオリゴヌクレオチド‐オリゴ糖結合特性に由来している。ＯＢフォールドドメインは５つのストランドからなる閉鎖型βバレルであり、大多数のＯＢフォールドドメインタンパク質は、リガンド結合にまたは活性部位として同じ面を使用する。種々のＯＢフォールドドメインは、オリゴ糖、オリゴヌクレオチド、タンパク質、金属イオン、および触媒基質の結合にこの「フォールド関連結合表面」を使用する。ＯＢフォールドドメインについては、例えば、非特許文献１および非特許文献２に記載されている。特許文献１には、結合特性を有するβプリーツシートタンパク質の記載がある。
【０００５】
本明細書で引用されるすべての特許、特許出願、特許出願公開、学術刊行物、およびその他の刊行物は、全体が参考として本明細書で援用される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】カナダ特許公開第２３７８８７１号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ａｒｃｕｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，（２００２）Ｖｏｌ．１２：７９４‐８０１
【非特許文献２】Ｔｈｅｏｂａｌｄ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．，（２００３）Ｖｏｌ．，３２：１１５‐３３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要旨
本発明は、所望の特性を有する改変ＯＢフォールドドメイン、および改変ＯＢフォールドドメインのライブラリを作製する方法を提供する。本発明はまた、このような方法によって作成される改変ＯＢフォールドドメインのライブラリ、およびこのような改変ＯＢフォールドドメインのライブラリを所望の生物活性についてスクリーニングする方法も提供する。さらに、本発明は、このようなライブラリから同定される改変ＯＢフォールドドメインも提供する。本明細書ではまた、改変された結合相互作用を示す、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍから得られる改変ＯＢフォールドドメインも提供される。改変ＯＢフォールドドメインは、天然ＯＢフォールドドメインと比較して、同じ基質に結合することもできれば、あるいは天然ＯＢフォールドドメインと比較して、異なる基質に結合することもでき、あるいは天然ＯＢフォールドドメインと比較して、同じ基質と異なる基質の両方に結合することもできる。あるいは、天然ＯＢフォールドドメインと結合する既知の基質がない改変ＯＢフォールドドメインを作成することもでき、この改変ＯＢフォールドドメインは基質と結合する。
【０００９】
したがって、一態様において、本発明は、天然ＯＢフォールドドメインから得られる単離された改変ＯＢフォールドドメインであって、前記改変ＯＢフォールドドメインが、ａ）天然ＯＢフォールドドメインと比較して、ＯＢフォールドドメイン結合表面のβストランド内の少なくとも１つの改変アミノ酸残基、またはｂ）ＯＢフォールドドメイン結合表面のβストランド内の少なくとも１つの改変アミノ酸残基、およびＯＢフォールドドメインループ領域のストランド内の少なくとも１つの改変アミノ酸残基、またはｃ）ＯＢフォールドドメインループ領域のストランド内の少なくとも１つの改変アミノ酸残基を含み、前記改変ＯＢフォールドドメインが、天然ＯＢフォールドドメインと比較して、変化した結合特性を有する、改変ＯＢフォールドドメインである。一実施形態において、天然ＯＢフォールドドメインの結合パートナーが既知である場合に、本発明は、改変ＯＢフォールドドメインであって、前記ドメインが、天然ＯＢフォールドドメインとは異なる結合パートナーに特異的に結合するか、あるいはその天然に存在する結合パートナーとの改変された結合を有する、改変ＯＢフォールドドメインである。別の実施形態において、改変された結合は、対応する天然ＯＢフォールドドメインと比較して、改変ＯＢフォールドドメインとその天然に存在する結合パートナーとの解離定数における少なくとも約２５％、約５０％、または約７５％の低下を含む。別の実施形態において、改変された結合は、対応する天然ＯＢフォールドドメインと比較して、改変ＯＢフォールドドメインとその天然に存在する結合パートナーとの解離定数における少なくとも約２分の１、約３分の１、約４分の１、約５分の１、約６分の１、約８分の１、約１０分の１、約１５分の１、約２０分の１、約２５分の１、約５０分の１、約１００分の１、約２００分の１、約５００分の１、約１０００分の１、約５０００分の１、約１０，０００分の１、約５０，０００分の１、または約１００，０００分の１の低下を含む。別の実施形態において、本発明は、天然ＯＢフォールドドメインが、以下からなる群から選択されるタンパク質またはタンパク質クラスに生じる、改変ＯＢフォールドドメインである：ブドウ球菌ヌクレアーゼタンパク質、細菌性エンテロトキシン、ＴＩＭＰ様タンパク質、ヘムシャペロンＣｃｍＥタンパク質、尾結合リゾチームｇｐ５、Ｎ末端ドメインタンパク質、核酸結合タンパク質、無機ピロホスファターゼ、Ｍｏｐ様タンパク質、ＣｈｅＷ様タンパク質、ｔＲＮＡ＿ａｎｔｉ（ＯＢフォールド核酸結合ドメイン）、Ｔｅｌｏ＿ｂｉｎｄ（テロメア結合タンパク質αサブユニット、中心ドメイン）、ＳＳＢ（一本鎖結合タンパク質ファミリーのＯＢフォールドドメイン）、ＤＵＦ３３８のＯＢフォールドドメイン、ＤＮＡ＿ｌｉｇａｓｅ＿ａｄｅｎ＿（ＮＡＤ依存性ＤＮＡリガーゼＯＢフォールドドメイン）、Ｓｔａｐ‐Ｓｔｒｐ毒素（ブドウ球菌／連鎖球菌毒素、ＯＢフォールドドメイン）、ＥＩＦ‐５ａ（真核生物開始因子５Ａ  Ｈｙｐｕｓｉｎｅ、ＤＮＡ結合ＯＢフォールドドメイン）、ＧＰ５＿ＯＢ（ＧＰ５  Ｎ末端ＯＢフォールドドメイン）、ＣＳＤ、ＤＮＡ＿ｌｉｇａｓｅ＿ＯＢ、ＤＵＦ３８８、ＥＦＰ、��ＩＦ‐１ａ、ｍＲＮＡ＿ｃａｐ＿Ｃ、ＯＢ＿ＲＮＢ、Ｐｈａｇｅ＿ＤＮＡ＿ｂｉｎｄ、Ｒｅｐ‐Ａ＿Ｎ、Ｒｈｏ＿ＲＮＡ＿ｂｉｎｄ、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ＿Ｌ２、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ＿Ｓ１２、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ＿Ｓ１７、ＲＮＡ＿ｐｏｌ＿Ｒｐｂ８、ＲｕｖＡ＿Ｎ、Ｓ１、ＴＯＢＥ、ＴＯＢＥ＿２、およびｔＲＮＡ＿ｂｉｎｄ。別の実施形態において、本発明は、天然ＯＢフォールドドメインが好熱性生物に由来する、改変ＯＢフォールドドメインである。さらに別の実施形態において、本発明は、好熱性生物がＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍである、改変ＯＢフォールドドメインである。別の実施形態において、本発明は、改変アミノ酸残基が、結合表面のβストランド内に存在する、改変ＯＢフォールドドメインである。
【００１０】
改変ＯＢフォールドドメインの結合パートナーは、核酸、オリゴ糖、タンパク質、ホルモン、および有機小分子からなる群から選択される場合がある。
【００１１】
別の態様において、本発明は、改変ＯＢフォールドドメインを取得する方法であって、ａ）結合表面のストランドおよび／またはループのストランドを含む、天然ＯＢフォールドドメインをコードするまたはその一部分をコードする核酸を取得する工程と、ｂ）天然ＯＢフォールドドメインと比較して、結合表面のβストランド上の少なくとも１つの改変アミノ酸残基および／またはループのストランド上の少なくとも１つの改変アミノ酸残基をコードするように核酸を変化させる工程とを含み、改変ＯＢフォールドドメインが得られ、改変ＯＢフォールドドメインが、天然ＯＢフォールドドメインと比較して、変化した結合を有する、方法である。別の実施形態において、天然ＯＢフォールドドメインの結合パートナーが既知である場合に、改変された結合は、対応する天然ＯＢフォールドドメインと比較して、改変ＯＢフォールドドメインとその天然に存在する結合パートナーとの解離定数における少なくとも約２５％、約５０％、または約７５％の低下を含む。別の実施形態において、改変された結合は、対応する天然ＯＢフォールドドメインと比較して、改変ＯＢフォールドドメインとその天然に存在する結合パートナーとの解離定数における少なくとも約２分の１、約３分の１、約４分の１、約５分の１、約６分の１、約８分の１、約１０分の１、約１５分の１、約２０分の１、約２５分の１、約５０分の１、約１００分の１、約２００分の１、約５００分の１、約１０００分の１、約５０００分の１、約１０，０００分の１、約５０，０００分の１、または約１００，０００分の１の低下を含む。一実施形態において、前記方法は、改変ＯＢフォールドドメインをコードする核酸を変化させる工程、および／または改変ＯＢフォールドドメインを含むタンパク質の少なくとも１つのアミノ酸をコードする核酸を変化させる工程もさらに含む。
【００１２】
別の態様において、本発明は、ディスプレイのための改変ＯＢフォールドドメインタンパク質のライブラリを作製する方法であって、ａ）ＯＢフォールドドメインまたはその一部分をコードする核酸を取得する工程と、ｂ）その核酸をランダムな変化に供することにより、少なくとも１つのランダム化したアミノ酸残基を有する改変ＯＢフォールドドメインをコードする変化させた核酸の集合体を生成する工程とを含む。一実施形態において、本発明は、ディスプレイのための改変ＯＢフォールドドメインタンパク質のライブラリを作製する方法であって、核酸が、ＯＢフォールドドメイン結合表面のストランドおよび／またはＯＢフォールドドメインのループのストランドの少なくとも１つのアミノ酸残基をコードする、方法を提供する。別の実施形態において、前記方法は、改変ＯＢフォールドドメインをコードする変化させた核酸のライブラリを、前記改変ＯＢフォールドドメインをその表面に提示し得る宿主細胞またはウイルス粒子の集団に導入する工程もさらに含む。
【００１３】
別の態様において、本発明は、天然ＯＢフォールドドメインから得られる改変ＯＢフォールドドメインをコードする単離された核酸であって、前記改変ＯＢフォールドドメインが、ａ）天然ＯＢフォールドドメインと比較して、ＯＢフォールドドメイン結合表面のβストランド内の少なくとも１つの改変アミノ酸残基、またはｂ）ＯＢフォールドドメイン結合表面のβストランド内の少なくとも１つの改変アミノ酸残基、およびＯＢフォールドドメインループ領域のストランド内の少なくとも１つの改変アミノ酸残基、またはｃ）ＯＢフォールドドメインループ領域のストランド内の少なくとも１つの改変アミノ酸残基を含み、前記改変ＯＢフォールドドメインが、天然ＯＢフォールドドメインと比較して、変化した結合特性を有する、核酸を提供する。別の実施形態において、天然ＯＢフォールドドメインの結合パートナーが既知である場合に、変化した結合特性は、対応する天然ＯＢフォールドドメインと比較して、改変ＯＢフォールドドメインとその天然に存在する結合パートナーとの解離定数における少なくとも約２５％、約５０％、または約７５％の低下を含む。別の実施形態において、変化した結合特性は、対応する天然ＯＢフォールドドメインと比較して、改変ＯＢフォールドドメインとその天然に存在する結合パートナーとの解離定数における少なくとも約２分の１、約３分の１、約４分の１、約５分の１、約６分の１、約８分の１、約１０分の１、約１５分の１、約２０分の１、約２５分の１、約５０分の１、約１００分の１、約２００分の１、約５００分の１、約１０００分の１、約５０００分の１、約１０，０００分の１、約５０，０００分の１、または約１００，０００分の１の低下を含む。
【００１４】
別の態様において、本発明は、上述の改変ＯＢフォールドドメインの核酸をコードする核酸を含む、宿主細胞またはウイルス粒子を提供する。さらに別の態様において、本発明は、上述の改変ＯＢフォールドドメインの核酸をコードする核酸を含む組成物を提供する。
【００１５】
別の態様において、本発明は、改変ＯＢフォールドドメインのライブラリを、結合パートナーとの結合についてスクリーニングする方法であって、ａ）改変ＯＢフォールドドメインのライブラリをその表面に提示する宿主細胞またはウイルス粒子の集団を取得する工程と、ｂ）結合パートナーと改変ＯＢフォールドドメインとの結合に適した条件下で、宿主細胞またはウイルス粒子の集団を結合パートナーと接触させる工程と、ｃ）結合パートナーと改変ＯＢフォールドドメインとの結合を決定する工程とを含む、方法を提供する。一実施形態において、宿主細胞またはウイルス粒子は、改変ＯＢフォールドドメインをその表面に提示するファージである。
【００１６】
別の態様において、本発明は、改変ＯＢフォールドドメインのファージライブラリであって、改変ＯＢフォールドドメインがＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍから得られる、ファージディスプレイを提供する。
【００１７】
別の態様において、本発明は、細胞またはウイルス粒子の表面に提示される改変ＯＢフォールドドメインを提供する。一実施形態において、細胞またはウイルス粒子は、ファージ、細菌、または酵母である。
【００１８】
別の態様において、本発明は、固体支持体に結合した改変ＯＢフォールドドメインを提供する。一実施形態において、支持体は、ビーズ、ガラス、スライド、チップ、およびゼラチンからなる群から選択される。
【００１９】
別の態様において、本発明は、付表ＩＩに列挙する、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ９、Ｓ６８、Ｓ８１、ｐＭＢ１６、ｐＭＢ１７、ｐＭＢ１２、ｐＭＢ１８、ｐＭＢ１５、Ｄ０５、Ｄ０７、Ｄ０９、Ｄ０４、Ｌ１４、Ｌ８、Ｌ４、Ｌ１６、Ｌ３４、Ｌ４２、Ｌ６、Ｌ５、またはＬ４４という名称の配列を有する改変ＯＢフォールドドメインタンパク質を提供する。別の態様において、本発明は、付表ＩＩに列挙する、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ９、Ｓ６８、Ｓ８１、ｐＭＢ１６、ｐＭＢ１７、ｐＭＢ１２、ｐＭＢ１８、ｐＭＢ１５、Ｄ０５、Ｄ０７、Ｄ０９、Ｄ０４、Ｌ１４、Ｌ８、Ｌ４、Ｌ１６、Ｌ３４、Ｌ４２、Ｌ６、Ｌ５、またはＬ４４という名称の配列との約９０％、約９５％、約９８％、または約９９％の配列相同性を有するタンパク質を提供する。別の態様において、本発明は、付表ＩＩに列挙する、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ９、Ｓ６８、Ｓ８１、ｐＭＢ１６、ｐＭＢ１７、ｐＭＢ１２、ｐＭＢ１８、ｐＭＢ１５、Ｄ０５、Ｄ０７、Ｄ０９、Ｄ０４、Ｌ１４、Ｌ８、Ｌ４、Ｌ１６、Ｌ３４、Ｌ４２、Ｌ６、Ｌ５、またはＬ４４という名称の配列との約９０％、約９５％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有するタンパク質を提供する。上記の態様のすべてにおいて、タンパク質は、単離するか、精製するか、または単離および精製することができる。
【００２０】
別の態様において、本発明は、付表ＩＩに列挙する、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ９、Ｓ６８、Ｓ８１、ｐＭＢ１６、ｐＭＢ１７、ｐＭＢ１２、ｐＭＢ１８、ｐＭＢ１５、Ｄ０５、Ｄ０７、Ｄ０９、Ｄ０４、Ｌ１４、Ｌ８、Ｌ４、Ｌ１６、Ｌ３４、Ｌ４２、Ｌ６、Ｌ５、またはＬ４４という名称の配列によって指定されるタンパク質をコードする核酸を提供する。別の態様において、本発明は、付表ＩＩに列挙する、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ９、Ｓ６８、Ｓ８１、ｐＭＢ１６、ｐＭＢ１７、ｐＭＢ１２、ｐＭＢ１８、ｐＭＢ１５、Ｄ０５、Ｄ０７、Ｄ０９、Ｄ０４、Ｌ１４、Ｌ８、Ｌ４、Ｌ１６、Ｌ３４、Ｌ４２、Ｌ６、Ｌ５、またはＬ４４という名称の配列との約９０％、約９５％、約９８％、または約９９％の配列相同性を有するタンパク質をコードする核酸を提供する。別の態様において、本発明は、付表ＩＩに列挙する、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ９、Ｓ６８、Ｓ８１、ｐＭＢ１６、ｐＭＢ１７、ｐＭＢ１２、ｐＭＢ１８、ｐＭＢ１５、Ｄ０５、Ｄ０７、Ｄ０９、Ｄ０４、Ｌ１４、Ｌ８、Ｌ４、Ｌ１６、Ｌ３４、Ｌ４２、Ｌ６、Ｌ５、またはＬ４４という名称の配列との約９０％、約９５％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】連鎖球菌スーパー抗原ＳＭＥＺ‐２由来のＯＢフォールドドメインを示す（２５）。図１Ａは、くぼんだ結合表面を示す。
【図１Ｂ】連鎖球菌スーパー抗原ＳＭＥＺ‐２由来のＯＢフォールドドメインを示す（２５）。図１Ｂは、Ｎ末端およびＣ末端とともに標識したβシートおよびループを有する概略構造である。β２、β４、およびβ５は、分断化されたβストランドであり、これらの各要素の間に突出部またはループを有する。
【図１Ｃ】連鎖球菌スーパー抗原ＳＭＥＺ‐２由来のＯＢフォールドドメインを示す（２５）。図１Ｃは、このタンパク質の対応するトポロジー図である（２４）。残基は円で示し、水素結合は点線で示す。また、ループを標識し、せん断数Ｓを示す。
【図２Ａ】ａｓｐＲＳ‐ＯＢのライブラリ構築に使用されるオリゴヌクレオチドの概略図である。図２Ａは、オリゴヌクレオチドの上のボックス内に示したａｓｐＲＳ‐ＯＢの二次構造エレメントを示す。下の矢印と数字は、使用したプライマーを示す。十字マークはランダム化したコドンを示す。フラグメント１〜４は、２回目のＰＣＲ工程で連結させる。この図では、１３ｍＲＬライブラリの構築を示している（表４も参照）。
【図２Ｂ】ａｓｐＲＳ‐ＯＢのライブラリ構築に使用されるオリゴヌクレオチドの概略図である。図２Ｂは、ＩＦ５Ａ‐ＯＢのライブラリ構築に使用されるオリゴヌクレオチドの概略図を示す。１１ｍ、９ｍ、２ＲＬおよび２ＲＬ＋２ライブラリの３つの独立した方法で、異なるライブラリの構築を行っている。記号は図２Ａと同じである。
【図３】Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ（１ＢＫＢ、３４）由来の開始因子ＩＦ‐５Ａを示す。ＩＦ‐５Ａのこのリボンモデル図は、Ｃ末端側に位置し、リンカーによってＮ末端ドメインから分離されるＯＢフォールドを示す。βストランドおよびαへリックスは、それぞれ矢印とらせん状のリボンで示す。βストランド１〜３は、ＯＢフォールドの提案した一本鎖ＤＮＡ結合表面を形成する。
【図４】大腸菌ａｓｐ‐ｔＲＮＡシンテターゼの結晶構造を示す（１Ｃ０Ａ、（３７））。このリボンモデル図はａｓｐＲＳの構造を示し、ＯＢフォールドとＣ末端側酵素ドメインの関係を示す。βストランドおよびαへリックスは、それぞれ矢印とらせん状のリボンで示す。βストランド１〜３、およびβストランド４と５の間のループ４／５を含む結合表面を示している（３６）。
【図５Ａ】種々の種に由来するａｓｐＲＳＯＢフォールドドメインの配列アラインメントを示す。図５Ａは、ＯＢフォールドの二次構造（配列の下に示す）を示し、βストランドを標識する。矢印で示した残基は、結合表面上に保存された残基であり、いくつかのライブラリでランダム化されている。ヒトおよび酵母の配列は長いＮ末端を有し、いずれの場合も残基１から始まらないことに留意されたい。右側の数字は、各タンパク質におけるアミノ酸の位置を示す。
【図５Ｂ】種々の種に由来するａｓｐＲＳＯＢフォールドドメインの配列アラインメントを示す。図５Ｂは、種々の種に由来するＩＦ‐５ＡのＯＢフォールドドメインの配列アラインメントを示す。
【図５Ｃ】種々の種に由来するａｓｐＲＳＯＢフォールドドメインの配列アラインメントを示す。図５Ｃは、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ（Ｐ．ａ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ（Ｐ．ｋｏｄａｋ．）、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のａｓｐＲＳ‐ＯＢの配列アラインメントを示す。配列同一性はアスタリスクで示す。ＯＢフォールドの二次構造は配列の下に示し、ｌはストランド４と５の間のループ、ループ４／５である。
【図６】ａｓｐＲＳ‐ＯＢおよび誘導体のファージディスプレイ法に使用されるｐＲＰＳＰ２の概略図である。ファージショックプロモーター（ｐｓｐ）、ｐｅｌＢリーダー配列、ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ制限部位を含むクローニング部位、ウェスタン解析に使用されるｃ‐ｍｙｃタグ、およびｐＩＩＩタンパク質をコードするｇＩＩＩ遺伝子が示されている。ファージディスプレイ法に供した融合タンパク質は、クローニング部位に挿入した遺伝子の遺伝子産物、ｃ‐ｍｙｃタグ、およびｐＩＩＩタンパク質から構成される。ｐＲＰＳＰ２はまた、アンピシリンでの選択に使用するβラクタマーゼ遺伝子も含む（図６には示さず）。
【図７】ファージディスプレイ法に供したａｓｐＲＳ‐ＯＢのウェスタン解析である。左側の列（インサートなし）は、ＴＤＰの調製に空のベクターｐＲＰＳＰ２を使用したためｐＩＩＩのみを表しており、中央の列はＶＣＳＭ１３に提示したｐＩＩＩと融合したａｓｐＲＳ‐ＯＢを示し、右側の列はｇＩＩＩ欠失ファージＶｄ３に提示したａｓｐＲＳ‐ＯＢである。１０１１個のＴＤＰをＳＤＳおよびＢＭＢの存在下でボイルし、１０％ＳＤＳ‐ＰＡＧＥで分離した後、０．４５μｍのニトロセルロース膜に転写した。そしてマウス抗ｃ‐ｍｙｃ抗体とＨＲＰ結合ウサギ抗マウス抗体を使用して検出を行った。
【図８】ａｓｐ‐ｔＲＮＡへの結合によってａｓｐＲＳ由来の野生型ＯＢフォールドの機能的提示を示すを目的とした、ａｓｐＲＳ‐ＯＢ提示ＴＤＰと野生型ＶＣＳ‐Ｍ１３による模擬ファージ実験を示す。固定化したｔＲＮＡをＶＣＳ‐Ｍ１３（野生型ファージ、提示なし）とａｓｐＲＳ‐ＯＢ提示ＴＤＰともにインキュベートした。ＶＣＳ‐Ｍ１３とＴＤＰの比率は１０００：１超であった。洗浄後、ＲＮａｓｅＡによるＲＮＡ消化を行うことによって、結合した粒子を溶出した。ＶＣＳ‐Ｍ１３およびＴＤＰそれぞれと、ビーズのみまたは固定化ｔＲＮＡについて、入出力を除算して回収率を算出した。入出力データについては表６を参照されたい。
【図９】ａｓｐ‐ｔＲＮＡでのライブラリＲＬ（黒丸、実線）、およびａｓｐ‐ｔＲＮＡ（黒丸、点線）またはリゾチーム（白丸、破線）でのライブラリ１３ｍＬの１回目〜６回目の選択によるファージの濃縮（−対数（出力ファージ／入力ファージ）として）である。
【図１０】ａｓｐ‐ｔＲＮＡで選択したＯＢＲＬ由来の選択クローンの配列解析の概要である。１２個のクローンの内１０個が１番目の位置にＲまたはＫを、７個が２番目の位置にＧを、８個が３番目の位置にＣを、６個が４番目の位置にＲを含んでいた。コンセンサス配列はＲ／Ｋ  Ｇ  Ｃ  Ｒであることが示唆された。
【図１１】選択したクローンのａｓｐ‐ｔＲＮＡへの結合をモノクローナルファージ結合実験により解析した結果を示す。ビオチン化ａｓｐ‐ｔＲＮＡをストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズ上に固定化し、モノクローナルファージ試料とともにインキュベートした。ＲＮＡ結合粒子をＲＮＡ消化によって特異的に溶出させ、細菌感染によりカウントした。Ｙ軸は、入力ファージ、ビーズのみからの出力ファージ、およびｔＲＮＡから溶出したファージの数を使用して算出した回収率を示す。実験は２回行い、エラーバーは±標準偏差を表す。ｐＩＩＩは融合体なし、ＯＢ３ｗｔは野生型ａｓｐＲＳ‐ＯＢ、Ｄ０７、Ｄ０９はａｓｐ‐ｔＲＮＡで選択した１３ｍＲＬ由来の変異体、１６、１７はａｓｐ‐ｔＲＮＡで選択したａｓｐ‐ＲＳ‐ＯＢのＲＬ由来の変異体ｐＭＢ１６およびｐＭＢ１７であり、Ｌ６およびＬ３３はリゾチームで選択した１３ｍＲＬ由来の変異体である。
【図１２】選択前および選択後のａｓｐＲＳ‐ＯＢライブラリの配列の概要である。Ａは選択前であり、Ｕ１〜Ｕ６は１３ｍＲＬライブラリに由来し、Ｕ８、Ｕ９はＲＬライブラリに由来する。Ｂは、１３ｍＲＬ由来の可溶性の非選択変異体である。Ｃは、ａｓｐ‐ｔＲＮＡで選択したＲＬ由来の変異体である。Ｄは、ａｓｐ‐ｔＲＮＡで選択した１３ｍＲＬ由来の変異体である。Ｅは、リゾチームで選択した１３ｍＲＬ由来の変異体である。ａｓｐ‐ＯＢ野生型の配列は、対応する残基番号と位置とともに一番上に示す。
【図１３】リゾチームへの結合体についてのマイクロパニングプレスクリーニングを示す。９６ウェルのプレートをリゾチーム（黒色のバー）またはＢＳＡ（白色のバー）でコーティングし、６回の選択後にピックアップしたクローン由来のモノクローナルファージ試料とともにインキュベートした。結合したファージを溶出し、細菌感染によってカウントした。ｙ軸の数値は回収したファージの数を示し、ｘ軸にはクローン番号を示し、ｐＩＩＩは融合体なし（空のベクター）を示し、ＯＢｗｔは提示した野生型ａｓｐ‐ＯＢを示す。
【図１４】選択したクローンのリゾチームへの結合に関するＥＬＩＳＡ解析を示す。ＢＳＡ（白色）、ＲＮａｓｅＡ（斜線）、およびニワトリ卵白リゾチーム（黒色）を固定化し、モノクローナルファージ試料とともにインキュベートした。結合した粒子を、マウス抗Ｍ１３一次抗体とＨＲＰ結合抗マウス二次抗体により検出した。実験は２回行い、エラーバーは±標準偏差を表す。ｐＩＩＩは提示した融合体なしであり、ＯＢｗｔは野生型ａｓｐＲＳ‐ＯＢフォールドである。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｂは、リゾチームで選択した精製ａｓｐＲＳ‐ＯＢ変異体を使用したプルダウンアッセイを示す。図１５Ａでは、変異体をＧＳＴ融合体としてグルタチオンビーズ上に固定化し、リゾチームとともにインキュベートした。洗浄後、ビーズをＳＤＳ‐ＰＡＧＥで解析した。１列目は１３ｍＲＬ８１（非選択変異体、陰性対照）、２列目はＬ５、３列目はＬ１６、４列目はＬ４（Ｌ１８）、５列目はＬ８（Ｌ２１）、６列目はビーズのみ（二重陰性対照）である。図１５Ｂでは、Ｌ６（１列目の可溶性画分）を固定化し、上記と同じ方法でリゾチームとともにインキュベートした。ＴＢＳ（２列目）、ＴＢＳ‐Ｔ（３列目）、ＴＢＳ‐Ｔ５００ｍＭのＮａＣｌ（４列目）で洗浄後、ビーズを充填し、ゲル上で解析した。
【図１６】選択したＯＢフォールドドメインＬ６とリゾチーム間の結合のＫｄを判定するために表面プラズモン共鳴を使用した結合曲線を示す。この実験から算出したＫｄは、３．６×１０−５Ｍであった。
【図１７】ＯＢｏｄｙとリゾチームの複合体の構造を示す。ＯＢｏｄｙは、二次構造エレメントを示す図（左側）として示す。リゾチームは（右側の）図として示す。（ＯＢｏｄｙの）Ａｒｇ３９は、リゾチームの活性部位の方向へ向いていた棒と点で示す。この残基は、リゾチームの活性部位の酸性残基（Ｇｌｕ３５およびＡｓｐ５２）との水素結合を形成する（図２０を参照）。
【図１８】ＯＢｏｄｙとリゾチームの複合体のタンパク質間境界面における水素結合の相互作用の例を示す。残基を棒で示し、標識した（Ｄ３６およびＹ３７はＯｂｏｄｙに由来し、Ｗ６３、Ｄ１０１、およびＮ１０３はリゾチームに由来）。水素結合は点線で示す。Ｄ３６からＷ６３への水素結合が、骨格のＤ３６のカルボニルとＷ６３の側鎖のＮＨ基の間にあることに留意されたい。
【図１９】ＯｂｏｄｙＬ８がリゾチームインヒビターである可能性を示す図である。Ｅ３５とＤ５２は、リゾチームの活性部位の触媒残基であり、Ｈ６０はリゾチームの天然インヒビターに由来する。Ｈｉｓ６０は、リゾチームＧｌｕ３５との水素結合を形成し、それによって酵素を阻害する。ＯＢｏｄｙのＲ３９は、Ｅ３５とＤ５２の両方との水素結合を同じように形成する。ＯＢｏｄｙの骨格とリゾチームの天然インヒビターは、α炭素のトレースとして示す。リゾチームのα炭素のトレースは、分かりやすくするために省略している。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
配列表の簡単な説明
【００２３】
【化１】
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【００２４】
【化２】
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【００２５】
【化３】
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（発明の詳細な説明）
元々、オリゴ糖‐オリゴヌクレオチド結合特性が観察されたことからその名が付けられた、「ＯＢフォールドドメイン」または「ＯＢフォールド」または「ＯＢフォールドタンパク質ドメイン」は、改変ＯＢフォールドドメインを作成するために、ならびに所望の生物活性（例えば、所望の標的への結合）および変化した酵素特性についてスクリーニングが可能な改変ＯＢフォールドドメインのライブラリを作製するために、分子認識ドメインまたはスキャフォールドとして使用できることを、本発明者等は発見した。ＯＢフォールドドメインは元々、それ自体が有するオリゴ糖‐オリゴヌクレオチド結合特性からその名が付けられたが、その後、タンパク質間の境界面にも認められている（Ｔｈｅｏｂａｌｄら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．，Ｖｏｌ．３２：１１５‐３３（２００３））。したがって、本発明は、所望の特性を有する改変ＯＢフォールドドメインの作成方法における、ＯＢフォールドドメインまたはその一部分の使用と、改変ＯＢフォールドドメインのライブラリを作製する方法と、このような方法によって作成される改変ＯＢフォールドドメインのライブラリと、このような改変ＯＢフォールドドメインのライブラリを所望の生物活性についてスクリーニングする方法と、このようなライブラリから同定される改変ＯＢフォールドドメインと、に部分的に関する。例えば、このような改変ＯＢフォールドドメインのライブラリは、１つ以上の特定の対象標的（例えば、ヌクレオチド、タンパク質、または炭水化物）との増加または低下した結合相互作用、あるいは増加または低下した酵素活性を有する、改変ＯＢフォールドドメインまたはその一部分についてスクリーニングすることができる。
【００２６】
本明細書に開示する説明例では、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来のアスパラギン酸ｔＲＮＡシンテターゼ（ＡｓｐＲＳ）のｔＲＮＡアンチコドン結合ドメインに基づく改変ＯＢフォールドドメインのファージディスプレイライブラリの作成、作成されたＡｓｐＲＳ改変ＯＢフォールドドメインの安定性、および作成されたＡｓｐＲＳ改変ＯＢフォールドドメインの適切なフォールディングを、本発明者等が実証した。また、本明細書に開示する説明例では、本発明者等は、ファージの表面でのＡｓｐＲＳ改変ＯＢフォールドドメインの機能的提示を実証し、それによって所望の特性を有する改変ＯＢフォールドドメインに関するライブラリのスクリーニングを実現した。本明細書に示す通り、本発明者等は、本明細書に開示する組成物および方法を使用して、核酸結合ドメインから天然の状態のままリゾチームタンパク質結合分子へと変換した改変ＡｓｐＲＳＯＢフォールドドメインの作成、スクリーニングおよび選択を実現した。本明細書に開示する他の説明例では、ＯＢフォールドドメインを含有するＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来の開始因子ＩＦ‐５Ａを、改変ＯＢフォールドドメインライブラリの作成に使用した。
【００２７】
タンパク質のＯＢフォールドドメインは、改変ＯＢフォールドドメインまたは改変ＯＢフォールドドメインのライブラリの作成や分子認識事象についてのスクリーニングのためのプラットフォームとして使用できるという発見は、診断方法や治療方法に応用でき、本明細書で記載の通り、抗体またはその他のタンパク質のスキャフォールドを使用した当該技術分野で既知の手法よりも優る利点を有する。当業者であれば理解するように、本明細書に開示する、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来のＡｓｐＲＳまたはＩＦ５Ａの改変ＯＢフォールドドメインのライブラリ作成方法は、本明細書に記載し当該技術分野で既知の他のＯＢフォールドドメインに適用することができる。当業者であれば理解するように、当該技術分野で既知のさらなる提示およびスクリーニング方法は、所望の特性を有する改変ＯＢフォールドドメインを同定するために使用することができる。改変ＯＢフォールドドメインは、固定および／または固体表面に結合し、結合相互作用についてのスクリーニングに使用できることも企図される。例えば、ＯＢフォールドタンパク質は、固定表面に共有結合させることもできれば、あるいはアフィニティータグ（例えば、６×Ｈｉｓタグ）を使用して表面に結合させることもできると考えられる。タンパク質を表面に共有結合させる方法は当業者に既知であり、表面にタンパク質を付着させるのに使用できるアフィニティータグは当業者に既知である。さらに、ＯＢフォールドタンパク質は、ビーズ、ガラス、スライド、チップ、およびゼラチンを含むがこれらに限定されない固体表面に結合させることできる。したがって、一連のＯＢフォールドタンパク質は、当業者に既知の技法を使用して固体表面上にアレイを作製するのに使用することができる。例えば、米国特許出願公開第２００４／０００９５３０号には、アレイの作成方法が開示されている。
【００２８】
一般的な技法
本発明の実施においては、特に記載がない限り、当該技術分野の範囲に含まれる分子生物学（遺伝子組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来技法が使用される。このような技法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ＆Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ）、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ＆Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ，１９８７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．，１９８７）、ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓら、ｅｄｓ．，１９９４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら、ｅｄｓ．，１９９１），Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｄａｖｉｄ  Ｗｉｌｄ，ｅｄ．，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ  ＮＹ，１９９４）、およびＭｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｒ．Ｍａｓｓｅｙｅｆｆ，Ｗ．Ｈ．Ａｌｂｅｒｔ，ａｎｄ  Ｎ．Ａ．Ｓｔａｉｎｅｓ，ｅｄｓ．，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ：ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇｓ  ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  ｍｂＨ，１９９３），およびＧｅｎｎａｒｏら、２０００，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  Ｅｄ．Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ：Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤのような文献に詳細に説明されている。
【００２９】
定義
本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語とその同種の用語は、包括的な意味で使用され、すなわち、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語とその対応する同種の用語に等しい。
【００３０】
本明細書で使用される単数形（“ａ”、“ａｎ”および“ｔｈｅ”）は、特に記載がない限り複数の言及を含む。
【００３１】
ＯＢフォールドドメインを含むことを特徴とする各種タンパク質は、当該技術分野で既知であり、本明細書に記載されている。本明細書で詳述する通り、「ＯＢフォールドドメイン」は、保存されたフォールドと結合表面の構造的特徴を共有するファミリーメンバーを包含する。ＯＢフォールドドメインメンバーは配列関連性も共有する場合がある。任意のＯＢフォールドドメインまたはその一部分は、改変ＯＢフォールドドメインの作成に使用できることが企図される。本明細書で使用される「天然」のＯＢフォールドドメインとは、核酸またはアミノ酸改変を含むように遺伝子操作されていないＯＢフォールドドメインを指す。本明細書で使用される「改変ＯＢフォールドドメイン」は、天然ＯＢフォールドドメインと比較して、少なくとも１つの改変アミノ酸残基を含む。改変ＯＢフォールドドメインがフォールド関連結合表面を保持し、結合パートナーとの相互作用に利用可能である限り、改変には、１つ以上の残基の欠失、置換、または付加、またはそれらの組み合わせが含まれる。「改変ＯＢフォールドドメイン」が、天然ＯＢフォールドドメインの厳密な構造的特徴を保持する必要はない。改変ＯＢフォールドドメインがフォールド関連結合表面を保持し、結合パートナーとの相互作用に利用可能である限り、改変ＯＢフォールドドメインは、結合表面（結合表面はβシートおよび隣接するループを含む）、ループストランド、コア領域（水溶性溶媒にさらされない、タンパク質の疎水性内部にある領域）のアミノ酸残基内の改変を含めた、任意のアミノ酸残基内の改変を含む場合があり、ＯＢフォールドドメインを含むタンパク質のいずれかの部分におけるアミノ酸改変もさらに含む場合がある。いくつかの実施例において、改変ＯＢフォールドドメインは、天然ＯＢフォールドドメインが結合しない結合パートナーを結合できることを特徴とする。他の実施例において、改変ＯＢフォールドドメインは、その天然に存在する結合パートナーとの改変された結合を有する。いくつかの実施例において、ＯＢフォールドドメインは単離され、すなわち、そのＯＢフォールドドメインが含まれている天然のタンパク質の少なくとも一部分から取り出される。他の実施例において、改変ＯＢフォールドドメインは、非天然のタンパク質と結合している。他の実施例において、改変ＯＢフォールドドメインは、天然ＯＢフォールドドメインが結合しないか、または天然ＯＢフォールドドメインが非特異的にのみ結合する、天然または非天然のタンパク質と結合している。他の実施例においては、天然ＯＢフォールドドメインが既知の結合パートナーを有さない改変ＯＢフォールドドメインを作成することができる。特定の結合パートナーへの結合について改変ＯＢフォールドドメインをスクリーニングする場合に、天然ＯＢフォールドドメインに対する結合パートナー（該当する場合）は、先験的に知られていない場合があることが理解されるであろう。
【００３２】
変化した結合特性を有する天然ＯＢフォールドドメインの天然の基質と結合する改変ＯＢフォールドドメインを作成することができる。このような変化した結合特性は、天然ＯＢフォールドドメインと同じ条件下で示すことができる。あるいは、変化した結合特性は、熱安定性結合（例えば、改変ＯＢフォールドドメインは、天然ＯＢフォールドドメインよりも、高温における天然基質へのより強力な結合を示す）、熱不安定性結合（例えば、改変ＯＢフォールドドメインは、天然ＯＢフォールドドメインよりも、高温における天然基質へのより弱い結合を示す）、種々のｐＨ条件下での改変された結合（例えば、改変ＯＢフォールドドメインは、天然ＯＢフォールドドメインよりも、高ｐＨ条件下における天然基質へのより強力な結合を示すか、または天然ＯＢフォールドドメインよりも、高ｐＨ条件下における天然基質へのより弱い結合を示すか、または低ｐＨにおける天然基質へのより天然ＯＢフォールドドメインよりも強力な結合を示すか、または低ｐＨにおける天然基質へのより弱い結合を示す）、あるいは種々のイオン強度条件下における改変された結合（例えば、改変ＯＢフォールドドメインは、天然ＯＢフォールドドメインよりも、高イオン強度における天然基質へのより強力な結合を示すか、または天然ＯＢフォールドドメインよりも、高イオン強度における天然基質へのより弱い結合を示すか、または天然ＯＢフォールドドメインよりも、低イオン強度における天然基質へのより強力な結合を示すか、または天然ＯＢフォールドドメインよりも、低イオン強度における天然基質へのより弱い結合を示す）の内の１つ以上である場合がある（がこれらに限定されない）。改変された結合特性または変化した結合特性は、対応する天然ＯＢフォールドドメインと比較して、改変ＯＢフォールドドメインとその天然に存在する結合パートナーとの解離定数における少なくとも約２５％、約５０％、または約７５％の低下を含む場合がある（すなわち、改変ＯＢフォールドドメインは、天然ＯＢフォールドドメインよりも少なくとも約１．３３倍、２倍、または３倍強力に結合する場合がある）。一実施形態において、改変された結合は、対応する天然ＯＢフォールドドメインと比較して、改変ＯＢフォールドドメインとその天然に存在する結合パートナーとの解離定数における少なくとも約２分の１、約３分の１、約４分の１、約５分の１、約６分の１、約８分の１、約１０分の１、約１５分の１、約２０分の１、約２５分の１、約５０分の１、約１００分の１、約２００分の１、約５００分の１、約１０００分の１、約５０００分の１、約１０，０００分の１、約５０，０００分の１、または約１００，０００分の１の低下を含む（すなわち、改変ＯＢフォールドドメインは、天然ＯＢフォールドドメインよりも少なくとも約２、約３、約４、約５、約６、約８、約１０、約１５、約２０、約２５、約５０、約１００、約２００、約５００、約１０００、約５０００、約１０，０００、約５０，０００、または約１００，０００倍強力に結合する場合がある）。
【００３３】
改変ＯＢフォールドドメインの「ライブラリ」とは、天然ＯＢフォールドドメインと比較して、高い割合で改変ＯＢフォールドドメインを含むＯＢフォールドドメインの集合体を指す。すなわち、改変ＯＢフォールドドメインのライブラリは、前記集合体が改変ＯＢフォールドドメインのみを含むことを含意しない。改変ＯＢフォールドドメインのライブラリは、いくらかの割合の非改変または天然ＯＢフォールドドメインを含む場合がある。前記ライブラリは、１つ以上または複数のランダム化したアミノ酸残基を有するＯＢフォールドドメインを含む場合がある。例えば、改変ＯＢフォールドドメインのライブラリは、１つ以上の構造領域、例えば、結合表面、および／またはループ領域、および／またはコア領域中に存在し得る、１つのアミノ酸残基におけるランダムな改変（前記改変は、１種類の改変（例えば、単一のアミノ酸置換）、または複数種の改変（例えば、単一のアミノ酸と複数のランダムなアミノ酸との置換である場合がある）、または複数のアミノ酸残基におけるランダムな改変を含む、ＯＢフォールドドメインを含む場合がある。フォールド関連結合表面が結合パートナーとの相互作用に利用可能である限り、改変ＯＢフォールドドメインは、さらなる改変を有する場合もあれば、あるいは改変ＯＢフォールドドメインを含むタンパク質は、アミノ酸残基中に改変を有する場合もある。改変ＯＢフォールドドメインの「ライブラリ」は、集合体のメンバーの数にいかなる特定の大きさの制限も含意しない。ライブラリは、わずか約１０個の変異体を含む場合があり、１０２０個以上の変異体にまで及ぶ場合がある。いくつかの実施形態において、前記ライブラリは、最大約１０８個の変異体を有し、またいくつかの実施形態において、前記ライブラリは、最大約１０１２個の変異体を有する。改変ＯＢフォールドドメインの「ライブラリ」は、核酸の変化によってコードされる、すなわち、発現系への導入前の遺伝子の構築段階にある、改変ＯＢフォールドドメインの集合体、ならびに発現系に導入され、発現し、および／または提示される集合体を指す。
【００３４】
本明細書で交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー（すなわち、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれか）を指す。これらの用語には、一本鎖、二本鎖、または三本鎖ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ‐ＲＮＡハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基を含むポリマー、またはその他の天然の、化学的・生化学的に改変された、非天然の、または誘導体化されたヌクレオチド塩基が含まれる。ポリヌクレオチドの骨格は、糖およびリン酸基（ＲＮＡまたはＤＮＡに典型的に認められるような）、または改変もしくは置換された糖もしくはリン酸基を含むことができる。あるいは、ポリヌクレオチドの骨格は、ホスホルアミダートのような合成サブユニットのポリマーを含むこともでき、したがって、オリゴデオキシヌクレオシドホスホルアミダート（Ｐ‐ＮＨ２）または混合ホスホルアミダート‐ホスホジエステルオリゴマーであってよい。Ｐｅｙｒｏｔｔｅｓら、（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：１８４１‐８、Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉら、（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：２３１８‐２３、Ｓｃｈｕｌｔｚら、（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：２９６６‐７３。ホスホロチオエート結合は、ホスホジエステル結合の代わりに使用することができる。Ｂｒａｕｎら、（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：２０８４‐９、Ｌａｔｉｍｅｒら、（１９９５）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：１０５７‐１０６４。さらに、適切な条件下で相補鎖を合成しアニーリングするか、または適切なプライマーを有するＤＮＡポリメラーゼを使用して新規に相補鎖を合成するかのいずれかによって、化学合成の一本鎖ポリヌクレオチド産物から二本鎖ポリヌクレオチドを取得することができる。ポリヌクレオチド配列の言及（配列番号の言及など）は相補性配列も含む。
【００３５】
以下は、ポリヌクレオチドの非限定例である：遺伝子または遺伝子断片、エクソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、改変ヌクレオチド（例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体）、ウラシル、その他の糖および結合基（例えば、フルオロリボースやチオエート）、およびヌクレオチドの分枝を含む場合がある。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド要素によって遮断される場合がある。ポリヌクレオチドは、例えば標識成分との接合などによって重合後にさらに改変される場合がある。本定義に含まれるその他の種類の改変には、キャップ、１つ以上の天然ヌクレオチドと類似体との置換、ならびにポリヌクレオチドをタンパク質、金属イオン、標識成分、他のポリヌクレオチド、または固体支持体に結合する手段の導入がある。好ましくは、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。本明細書で使用される「ＤＮＡ」は、塩基Ａ、Ｔ、ＣおよびＧを含むだけでなく、それらの類似体のいずれかまたはこれらの塩基の改変体（例えば、メチル化ヌクレオチド）、ヌクレオチド間の改変（例えば、非荷電性結合およびチオエート）、糖類似体の使用、ならびに改変されたおよび／または代替の骨格構造（例えば、ポリアミド）も含む。
【００３６】
「転写制御下」とは、当該技術分野で十分に理解される用語であり、通常はＤＮＡ配列であるポリヌクレオチド配列の転写が、転写の開始に寄与するか転写を促進するエレメントに前記配列が操作可能（操作的）に連結されていることに依存することを示す。「操作可能に連結される」とは、エレメントが機能できるように配置されている並列を指す。
【００３７】
「宿主細胞」は、ＯＢフォールドドメインを、およびいくつかの実施例においては改変ＯＢフォールドドメインをコードする核酸のレシピエントであってもよいか、レシピエントであった、個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含み、前記子孫は、自然、偶発的または意図的な変異および／または変化によって、必ずしも元々の親細胞と（形態または全体のＤＮＡ相補性において）完全に同一であるわけではない。宿主細胞には、ＯＢフォールドドメインをコードする核酸によりｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにてトランスフェクトまたは感染した細胞が含まれる。いくつかの実施例において、宿主細胞は、ＯＢフォールドドメインをその表面に発現および提示する能力（例えば、ファージディスプレイ能力）を有する。「発現」には転写および／または翻訳が含まれる。
【００３８】
ＯＢフォールドドメインまたはその一部分を「コードする」核酸とは、ＯＢフォールドドメインまたはその一部分を作成するために転写および／または翻訳が可能な核酸である。このような核酸のアンチセンス鎖も、ＯＢフォールドドメインをコードすると言われている。
【００３９】
Ｉ．ＯＢフォールドタンパク質ドメイン
最も一般的なレベルでは、ＯＢフォールドドメインは、５つのストランドからなる混合型βバレルである。例えば、Ａｒｃｕｓ，２００２，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ  １２：７９４‐８０１を参照されたい。ＯＢフォールドドメインは、３つすべての界に認められ、本明細書に詳述する通り、配列および構造学的データベースの両方で表される。一般的に言うと、ＯＢフォールドドメインには、フォールドと機能的結合表面が保存されている。種々のＯＢフォールドドメインは、それらのフォールド関連結合表面を使用して、オリゴ糖、オリゴヌクレオチド、タンパク質、金属イオン、および触媒基質と様々に結合する。
【００４０】
ＯＢフォールドドメインはいくつかの特徴を有しており、これらの特徴によって、前記ドメインは、アミノ酸位置のランダム化や所望の特性を有する改変ＯＢフォールドドメインの選択に使用するスキャフォールドとして非常に適したものとなっている。ＯＢフォールドドメインは、通常は小さく安定したタンパク質であり、容易に作成およびランダム化される。Ｔｈｅｏｂａｌｄら、２００３，ｓｕｐｒａには、ＯＢフォールドドメインの長さが７０〜１５０個のアミノ酸に及ぶことが開示されている。さらに、ＯＢフォールドドメインタンパク質の面は、進化の過程で多様であることがすでに示されており、ランダム化に利用可能である。ＯＢフォールドドメインは、３つすべての界に遍在しており、そのため、特定の応用に適合するようにＯＢフォールドドメインを選択することができる。例えば、改変ＯＢフォールドドメインのライブラリの作成に使用する熱安定性微生物由来のＯＢフォールドドメインが本明細書に記載されている。ＯＢフォールドドメインは治療用途に選択することができ、例えば、酵素的ＯＢフォールドドメインは、新たな酵素活性を有するタンパク質の作成に選択することができる。これらの特徴は、より従来の抗体およびタンパク質のスキャフォールドよりも優る利点をもたらす。
【００４１】
ＯＢフォールドタンパク質ドメインの全体構造は、５つのストランドからなる混合型ｆｃ‐バレルであり、２つの可変ループ領域が隣接する外側の結合表面として凹型ｆｃ‐シートを提示している。ほとんどの場合、前記バレルは、グリークキー型のトポロジーを有し、バレルの一端はαへリックスでキャップされている（２３）。βバレルは、ストランドの数ｎとせん断数Ｓ（２６、２７）とによって固有に記述される。せん断数は、バレルの軸からのストランドの傾きの度合いを表すものである。図１Ａ〜１Ｃには、Ｓ＝１０の６バレルが示されている。これは、形式上βシートの一部である（故にβ突出部を含まない）残基の数であり、ＡからＡ＊までストランドに沿ってカウントされる。ＯＢフォールドには２つの可能性（Ｓ＝８またはＳ＝１０）があり、これらは両方とも観察されている。例として、ｔＲＮＡを結合するアスパルチルｔＲＮＡシンテターゼ（ａｓｐＲＳ）のＯＢフォールドドメインはＳ＝１０であるのに対し、コールドショックＯＢフォールドドメインＤＮＡ結合ドメインはＳ＝８である。ＯＢフォールドドメイン結合表面は、中央にβストランド２および３を有し、ループ１によって左下部で、ループ４によって上部で、およびループ２によって右上部で結合されている（図１Ａ〜１Ｃを参照）。種々のＯＢフォールドドメイン構造において、ループ２および４は、長さと配列の両方において幅広い変化を示す。Ａｒｃｕｓ，２００２，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ  １２：７９４‐８０１を参照されたい。改変ＯＢフォールドドメインの長さは変化する可能性がある。例えば、ループ２は、２〜４個のアミノ酸の間で変化することが多く、ループ４は、３〜１０個のアミノ酸の間で変化することが多く、また場合によりループ４は、最大３０個のアミノ酸のさらに長い挿入に対応する。
【００４２】
配列解析を行った２０個のゲノムのサーベイでは、最も多く認められる生物学的アーキテクチャーの一覧の２８番目にＯＢフォールドドメインを位置づけている（２７）。ＯＢフォールドドメインは、ヒト、酵母、および細菌を含めた広範なタンパク質に認められている。例えば、細菌性スーパー抗原（Ｓａｇ）において、ＯＢフォールドドメインは、ヒトの免疫系における細菌攻撃時のタンパク質‐タンパク質相互作用を媒介する（２１および２２）。これらのタンパク質において、前記ＯＢフォールドドメインは、タンパク質、オリゴヌクレオチド、およびオリゴ糖を含めた幅広いリガンドを結合する（２３）。ＯＢフォールドドメインタンパク質の多様性の例には、腫瘍遺伝子ＢＲＣＡ２での一本鎖ＤＮＡ結合（Ｙａｎｇ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，２００２  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２９７，１８３７‐１８４８）、酵母タンパク質Ｃｄｃ１３の染色体上におけるテロメア末端結合（Ｌｅｉ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ，２００３  Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．４２６，１９８‐２０３）、および病原菌における細胞表面のオリゴ糖結合（Ｓｔｅｉｎ  Ｐ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ，１９９４，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．２，４５‐４７）が含まれる。タンパク質構造を関連する「ファミリー」および「スーパーファミリー」に分類する基準となるＳｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＣＯＰ）データベースに定められている通り、ＯＢフォールドタンパク質ドメインは９つの関連するスーパーファミリーに認められる。同じ「ファミリー」に属するＯＢフォールドドメインは、配列、構造および機能レベルにおいて進化上の関連性があり、共通の祖先に由来すると考えられている。同じ「スーパーファミリー」に属するＯＢフォールドドメイン「ファミリー」は、明確な配列類似性がなくても、類似の構造的および機能的特徴に基づく進化上の関連性がある。ＳＣＯＰデータベースは、既知の構造のタンパク質で構成されている（すなわち、これらの構造は、Ｘ線結晶学または高分解能ＮＭＲのいずれかを使用して実験により決定されている）。他のＯＢフォールドドメインは、構造的関連性、すなわち、フォールド関連結合表面の存在、または本明細書に記載され当該技術分野で既知である、既知のＯＢフォールドドメインに対する構造的関連性および配列関連性に基づき、当業者が決定することができる。スーパーファミリーおよびファミリーには配列類似性が存在し、これらを、これまでＯＢフォールドアンブレラ下で構造が決定されていない他のタンパク質の同定に使用することができる。例えば、公的に利用可能なＰｆａｍデータベース（＜ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ｐｆａｍ＞）を参照されたい。他の公的に利用可能なデータベースは、Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ（＜ｓｕｐｆａｍ．ｍｒｃｌｍｂ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ＳＵＰＥＲＦＡＭＩＬＹ＞）であり、これはＳＣＯＰ由来の隠れマルコフモデルを使用して、タンパク質の配列をスーパーファミリーに分類している。例えば、「核酸結合タンパク質」は、ＳＣＯＰデータベース内のスーパーファミリーを含む。現在、ＳＣＯＰ内のこのスーパーファミリーには、１１のファミリーと６６の個々のタンパク質構造が存在する。これらの１１のファミリーと６６の構造から、Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙデータベースは、２１，１５８個のタンパク質配列を、「核酸結合タンパク質」スーパーファミリーに属するＯＢフォールドタンパク質として分類する法則を導き出した。同様に、ＣｈｅＷ様スーパーファミリーは、ＳＣＯＰ内の１つのファミリーと２つのタンパク質構造を有するだけであるが、Ｓｐｅｒｆａｍｉｌｙデータベースではこれが拡大されて、８９８個のタンパク質を含んでいる。
【００４３】
ｉ．ＳＣＯＰにおけるＯＢフォールドドメインの分類
ｎ＝５およびＳ＝１０またはＳ＝８であり、グリークキーモチーフを有し、すべてがβの閉鎖型または部分開放型のバレル構造としてＳＣＯＰによって特徴付けられているＯＢフォールドドメインのクラスに関しては、ＳＣＯＰは現在、以下のスーパーファミリーを同定している（括弧内の数字はＳＣＯＰ照合番号である）：
１．ブドウ球菌ヌクレアーゼ（５０１９９）
ブドウ球菌ヌクレアーゼに関しては現在のところこのファミリーの単独のメンバーが存在するが、ブドウ球菌ヌクレアーゼのデータベースには多くの構造が存在する。ＯＢフォールドは閉鎖型βバレルであり、ｎ＝５、Ｓ＝１０である。
【００４４】
２．細菌性エンテロトキシン（５０２０３）
細菌性エンテロトキシンの場合、このスーパーファミリーには、細菌性ＡＢ５毒素（Ｂサブユニット）およびスーパー抗原毒素のＮ末端ドメインという２つのファミリーが存在する。細菌性ＡＢ５毒素には、大腸菌由来の易熱性毒素、コレラ毒素、および百日咳毒素が含まれる。すべてが閉鎖型βバレルトポロジーを有し、ｎ＝５でＳ＝１０であるが、バレルが部分開放型のコレラ毒素が唯一の例外である。スーパー抗原様毒素およびスーパー抗原毒素のＮ末端ドメインは、黄色ブドウ球菌および化膿性連鎖球菌由来のすべてのタンパク質であり、典型的にｎ＝５、Ｓ＝１０の閉鎖型バレルのトポロジーを有する。これらの微生物のゲノムにコードされこれらのタンパク質は数多く存在する。ブドウ球菌のタンパク質は、“Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｂｙ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ．”Ｇｅｒａｒｄ  Ｌｉｎａ，Ｇｒｅｇｏｒｙ  Ａ．Ｂｏｈａｃｈ，Ｓｅａｎ  Ｐ．Ｎａｉｒ，Ｋｅｉｉｃｈｉ  Ｈｉｒａｍａｔｓｕ，Ｅｖｅｌｙｎｅ  Ｊｏｕｖｉｎ‐Ｍａｒｃｈｅ，ａｎｄ  Ｒｏｙ  Ｍａｒｉｕｚｚａ，ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎｓ  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ２００４；１８９：２３３４‐６に基づき、近年名称が改められた。
【００４５】
３．ＴＩＭＰ様
ＴＩＭＰ様タンパク質は、現在３つのファミリーに分類される真核生物のタンパク質であり、すべてｎ＝５、Ｓ＝１０の閉鎖型バレルのトポロジーを有する：
ａ．組織メタロプロテイナーゼインヒビター、ＴＩＭＰ（５０２４３）（Ｃ末端伸長部に不規則なα＋βサブドメインを含む）。
【００４６】
ｂ．Ｎｅｔｒｉｎ様ドメイン（ＮＴＲ／Ｃ３４５Ｃモジュール）（８９３２０）
ｃ．アグリンのラミニン結合ドメイン（６３７６７）
４．ヘムシャペロンＣｃｍＥ（８２０９３）
ヘムシャペロンＣｃｍＥに関しては、このスーパーファミリーにアノテーションを付けた１つのファミリーが存在する。代表的な構造は、大腸菌およびＳ．ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓに由来する。
【００４７】
５．尾結合リゾチームｇｐ５、Ｎ末端ドメイン（６９２５５）
尾結合リゾチームｇｐ５、Ｎ末端ドメインについては、ファミリーとこのスーパーファミリーの両方を表す１つの構造が存在する。このタンパク質はバクテリオファージＴ４に由来し、Ｎ末端ドメインは、ファージの細胞貫通部を形成するさらに大きなタンパク質複合体の一部である。
【００４８】
６．核酸結合タンパク質（５０２４９）
核酸結合タンパク質は、多数のタンパク質を包含する大きなスーパーファミリーである。以下はファミリーの区分と記述子である：
ａ．アンチコドン結合ドメイン（５０２５０）
バレル、閉鎖型、ｎ＝５、Ｓ＝１０
ｂ．ＲｅｃＧ「ウェッジ」ドメイン（６９２５９）
ｃ．ＤＮＡヘリカーゼＲｕｖＡサブユニット、Ｎ末端ドメイン（５０２５９）
バレル、閉鎖型、ｎ＝５、Ｓ＝１０
ｄ．一本鎖ＤＮＡ結合ドメイン、ＳＳＢ（５０２６３）
バレル、閉鎖型、ｎ＝５、Ｓ＝１０
ｅ．Ｍｙｆドメイン（５０２７７）
ｆ．コールドショックＤＮＡ結合ドメイン様（５０２８２）
バレル、閉鎖型、ｎ＝５、Ｓ＝８
ｇ．Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＭＴＨ１（ＭＴ０００１）、インサートドメイン（７４９５５）
ｈ．ＤＮＡリガーゼ／ｍＲＮＡキャッピング酵素、ドメイン２（５０３０７）
ｉ．ファージｓｓＤＮＡ結合タンパク質（５０３１５）（４）
バレル、開放型、ｎ＊＝５、Ｓ＊＝８、メンバーの構造は、細胞性生物由来のものよりも大きく変化する。
【００４９】
ｊ．ＤＮＡ複製イニシエーター（ｃｄｃ２１／ｃｄｃ５４）Ｎ末端ドメイン（８９３３２）
ｋ．ＲＮＡポリメラーゼサブユニットＲＢＰ８（５０３２１）
二重。２つの不完全なＯＢフォールドのタンデムリピートを含む。単一のバレルを形成、ｎ＝８、Ｓ＝１０。
【００５０】
７．無機ピロホスファターゼ（５０３２４）
無機ピロホスファターゼについては、このスーパーファミリーに唯一のファミリーが存在する。このファミリーは、細菌、古細菌、および真核生物の例があるように、非常に古くからの系統を有する。
【００５１】
１．無機ピロホスファターゼ（５０３２５）
バレル、閉鎖型、ｎ＝５、Ｓ＝８
１．無機ピロホスファターゼ（５０３２６）
真核生物の酵素は、Ｎ末端およびＣ末端の両方に他の二次構造を有する。
【００５２】
ａ．パン酵母（サッカロミセス・セレビシエ）（５０３２７）
ｂ．古細菌Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ（５０３２８）
ｃ．大腸菌（５０３２９）
ｄ．Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（５０３３０）
８．ＭＯＰ様（５０３３１）
ＭＯＰ様グループ分類には３つのファミリーが存在し、すべてが類似の機能性を有し、すべて細菌に由来する。
【００５３】
ａ．モリブデン酸塩／タングステン酸塩結合タンパク質ＭＯＰ（５０３３２）
ｂ．ＢｉＭＯＰ、モリブデン酸塩結合二重ドメイン（５０３３５）
二重。Ｃ末端ストランドにスワッピングを生じた２つのＯＢフォールドドメインのタンデムリピート。
【００５４】
ｃ．ＡＢＣトランスポーター追加ドメイン（５０３３８）
おそらくｂｉＭＯＰドメインに由来。
【００５５】
９．ＣｈｅＷ様（５０３４１）
これはＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ由来の２つの構造（ＣｈｅＷおよびＣｈｅＡ）を有する１つのファミリーで表される。
【００５６】
ｉｉ．配列データベースＰｆａｍおよびＳｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ
ＳＣＯＰの記載は、Ｘ線結晶学またはＮＭＲのいずれかによってその３次元構造が決定されている、タンパク質由来のＯＢフォールドドメインに関する。Ｐｆａｍデータベースに配列類似性に基づき、およびＳｕｐｅｒｆａｍｉｌｙデータベースにＳＣＯＰ由来の配列プロファイルに基づき同定された後、主要な配列データに適用されている、他のＯＢフォールドタンパク質ドメインは、本発明の適用範囲内に包含される。本発明は、当業者に既知の他のＯＢフォールドドメインを包含する。
【００５７】
後述の通り、Ｐｆａｍには、ともにＯＢフォールドドメインを表す多くのファミリーが存在する。アノテーションは以下の通りである。
【００５８】
ファミリー名
アノテーション
Ｐｆａｍ受入番号
Ｐｆａｍデータベースにおけるこのファミリー内のタンパク質の総数
ｔＲＮＡ＿ａｎｔｉ
ＯＢフォールド核酸結合ドメイン
受入番号：ＰＦ０１３３６
タンパク質数：１３５１
Ｔｅｌｏ＿ｂｉｎｄ
テロメア結合タンパク質αサブユニット、コアドメイン
受入番号：ＰＦ０２７６５
タンパク質数：３３
ＳＳＢ
一本鎖結合タンパク質ファミリー
受入番号：ＰＦ００４３６
タンパク質数：４１５
ＤＵＦ３８８
機能が未知のドメイン（ＤＵＦ３８８）
受入番号：ＰＦ０４０７６
タンパク質数：４９
ＤＮＡ＿ｌｉｇａｓｅ＿ａｄｅｎ
ＮＡＤ依存性ＤＮＡリガーゼＯＢフォールドドメイン
受入番号：ＰＦ０３１２０
タンパク質数：１９０
Ｓｔａｐ＿Ｓｔｒｐ＿ｔｏｘｉｎ
ブドウ球菌／連鎖球菌毒素、ＯＢフォールドドメイン
受入番号：ＰＦ０１１２３
タンパク質数：１８０
ｅＩＦ‐５ａ
真核生物開始因子５Ａ  Hｙｐｕｓｉｎ、ＤＮＡ結合ＯＢフォールド
受入番号：ＰＦ０１２８７
タンパク質数：１０４
Ｇｐ５＿ＯＢ
Ｇｐ５  Ｎ末端ＯＢドメイン
受入番号：ＰＦ０６７１４
タンパク質数：６。
【００５９】
本明細書に記載され、当該技術分野で既知であり、後に同定されるＯＢフォールドドメインはすべて、改変ＯＢフォールドドメインを作成するために、ならびに変化した結合特性および変化した機能的特徴についてのスクリーニングに使用できる改変ＯＢフォールドドメインのライブラリを作製するために、スキャフォールドとして使用することができる。
【００６０】
ｉｉｉ．アミノ酸のランダム化に使用されるＯＢフォールド結合表面
改変ＯＢフォールドドメインおよび／または改変ＯＢフォールドドメインのライブラリは、本明細書に記載されるか、当該技術分野で既知であるか、または後に同定されるものを含めたいずれかのＯＢフォールドドメインの構造に基づいて作成することができる。改変ＯＢフォールドドメインのライブラリは、本明細書に記載され、当該技術分野で既知の方法に基づいて作成することができる。例えば、ある任意のＯＢフォールドドメインについて、１つ以上のアミノ酸残基（例えば、外側の結合表面のストランド内のアミノ酸残基、および／またはループのストランド内のアミノ酸残基、および／またはＯＢフォールドドメインを含むタンパク質の他の部分内のアミノ酸残基）をコードする核酸は、アミノ酸残基のランダム化（すなわち、核酸の改変による１つ以上のアミノ酸残基のランダム変異）の標的とすることができる。いくつかの実施例において、ＯＢフォールドドメインの外側の結合表面のストランド内のアミノ酸残基は、アミノ酸残基のランダム化の標的とされる。他の実施例において、ＯＢフォールドドメイン内の特定の構造をアミノ酸残基のランダム化の標的とすることができる。例えば、ＯＢフォールドドメイン結合表面のストランド内に存在する１つ以上のアミノ酸残基は、ランダム化の標的とすることができる。ＯＢフォールドドメイン結合表面は、βストランド１、βストランド２、βストランド３からなるＣ末端側の半分と、βストランド４およびβストランド５からなるＣ末端側の半分を含む。図１Ａ〜１Ｃを参照されたい。別の実施例において、コアＯＢフォールドドメインのβストランド間のループ内のアミノ酸残基は、ランダム変異の標的される場合がある。別の実施例において、ＯＢフォールドコアドメインに隣接するループ領域内に主要な挿入がある場合（例えば、無機ピロフォスファターゼ）、これらの挿入ループ上のアミノ酸残基は、ランダム化のために選択される場合がある。本発明はまた、タンパク質に対する安定性の変化を生じるように改変されたコアの一部分（すなわち、アミノ酸残基）を有する改変ＯＢフォールドドメインも包含する。
【００６１】
ＩＩ．改変ＯＢフォールドドメインの作成と提示方法
本明細書の実施例に記載の例示的実施形態において、変異が導入された２つの好熱性ＯＢフォールドタンパク質ドメイン、翻訳開始因子ＩＦ‐５Ａ（Ｓ＝８）、およびアスパルチルｔＲＮＡシンテターゼａｓｐＲＳ（Ｓ＝１０）を、ＯＢフォールドタンパク質の結合表面内のアミノ酸残基をランダム化することによって、改変ＯＢフォールドドメインのライブラリの作成に使用した。これらのタンパク質はともに、超好熱性クレンアーキアのＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍに由来する。ライブラリは、ＯＢフォールドドメインの結合表面内の特定のアミノ酸位置がランダム化されているロングオリゴヌクレオチドを使用して合成により作成した後、ＰＣＲを使用して遺伝子構築を行った。ライブラリを、それらのコードしたタンパク質の過剰発現率に関して検査し、ライブラリによってコードした可溶性および耐熱性タンパク質の割合に関して計算を行った。本明細書には、ａｓｐＲＳ  ＯＢフォールドドメイン（ａｓｐＲＳ‐ＯＢ）がファージ表面に提示および選択できることが示されている。ｔＲＮＡ、タンパク質、およびセルロースリガンドを含めた種々の基質への結合能を有する改変ＯＢフォールドドメインが作成可能であることを示すために、本明細書の実施例に記載のように、ａｓｐＲＳのスキャフォールドに基づく種々の改変ＯＢフォールドドメインのライブラリを作製し、ファージディスプレイ法に供した。本明細書に開示する一例示的実施形態においては、天然の状態で核酸結合ドメインであった改変ＯＢフォールドドメインと、リゾチームとの間の結合相互作用が示されている。
【００６２】
当業者であれば理解するように、当該技術分野で既知である、核酸の改変を作成する各種方法は、１つ以上のアミノ酸残基における改変を有するＯＢフォールドドメインの作成（コード）に使用することができる。ＯＢフォールドドメインをコードする核酸は、当該技術分野で標準的な方法（例えば、化学合成、遺伝子組換え法）を使用して得る場合もあれば、および／または生物供給源から得る場合もある。対象の核酸は、特定の宿主細胞における発現に必要な１つ以上のエレメントの制御下に配置される場合がある。ＯＢフォールドドメインの増殖には種々の宿主細胞が利用可能であり、表面に改変ＯＢフォールドドメインを提示させるのに使用される場合があるディスプレイ方法は、当該技術分野で既知であり、本明細書で記載される。ディスプレイ方法には、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、およびｍＲＮＡディスプレイが含まれるが、これらに限定されない。
【００６３】
ｉ．ディスプレイ方法
ディスプレイ技術は、発現したタンパク質からなる大きなライブラリを、固定化したリガンドを使用してスクリーニングし、個々のタンパク質と標的リガンドの間の新たな相互作用を特徴付けるまたは発見する工程を伴う。ディスプレイ技術の最も重要な特徴は、スクリーニングしているタンパク質（発現型）をそれらをコードする遺伝情報（遺伝子型）と結び付けることができる点である。すべてのディスプレイ技術において、遺伝情報は、スクリーニングしたタンパク質と同時に単離される。これは一般的に、タンパク質またはタンパク質断片を生物実体（例えば、ファージ、酵母、または細菌）の表面に提示し、ライブラリの増幅に生物の複製系を使用することによって行われる。これらのｉｎ  ｖｉｖｏ系の代わりとして、プロセス全体をｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うことも可能であり、このような技術は、リボソームディスプレイまたはｍＲＮＡディスプレイと呼ばれる。このような場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで作成した転写物は、細胞抽出物に翻訳され、ＲＴ‐ＰＣＲを使用して、ｍＲＮＡ‐リボソーム‐タンパク質複合体のリガンドを媒介した単離後に、遺伝情報の増幅が行われる。
【００６４】
ａ．ファージディスプレイ
糸状バクテリオファージの表面への外来ペプチドおよびタンパク質の提示は、「ファージディスプレイ」と呼ばれ、現在では分子間相互作用の研究に一般的に使用されている方法である。通常、スクリーニングするタンパク質ライブラリは、バクテリオファージ粒子の一端のｇｅｎｅ  ＩＩＩタンパク質産物との融合体として、またはファージ粒子表面のｇＶＩＩＩタンパク質との融合体として発現される。このようなファージライブラリを細菌に感染させると、非常に効率的なライブラリ増幅が可能となる（Ｇｒｉｆｆｉｔｈら、１９９４）。典型的なファージディスプレイプロトコルは、細菌性宿主内でファージ粒子を作成する工程を伴い、各粒子は、自身の外殻タンパク質の内の１種（ｇＩＩＩまたはｇＶＩＩＩタンパク質）との融合体として、遺伝子ライブラリの１メンバーの遺伝子産物を提示する。ファージライブラリの標的への結合、非結合ファージを除去する洗浄工程、および結合粒子の溶出を伴う、固定化した標的分子への結合の選択プロセス（バイオパニング）によって、ファージ粒子のライブラリが得られる。通常は、所望の特性を有する分子の選択には、溶出したファージを細菌性宿主における再増幅と、固定化した標的上での選択とを伴う、複数回のパニングが必要となる。本明細書の実施例に開示する例示的実施形態において、改変ＯＢフォールドドメインの提示およびスクリーニングには、ファージディスプレイ法が使用される。
【００６５】
ｂ．細菌ディスプレイおよび酵母ディスプレイ
細菌ディスプレイおよび酵母ディスプレイ技術によって、酵母細胞サッカロミセス・セレビシエ（Ｂｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｔｔｒｕｐ，１９９７）または細菌（大腸菌、スタフィロコッカス・カルノーサス）（Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、１９９８；Ｗｅｒｎｅｒｕｓら、２００３）の表面に、それぞれアグルチニン酵母接着受容体または細菌性外膜タンパク質（ＯＭＰ）との融合体として、組換えタンパク質を発現させることができる。
【００６６】
発現した融合タンパク質もタグ配列を含み、フローサイトメトリーによるライブラリの表面発現の定量化が可能となる。リガンドの間接的蛍光標識と組み合わせると、抗タグ標識では、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）による細胞選別と、相互作用の結合親和性の判定が可能となる（Ｆｅｌｄｈａｕｓら、２００３；Ｗｅｒｎｅｒｕｓら、２００３）。酵母発現系を他のディスプレイ法よりも価値のあるものとする酵母発現系の特徴とは、細菌またはｉｎ  ｖｉｔｒｏディスプレイ系では問題となる可能性がある、哺乳類タンパク質の正確な翻訳後修飾、プロセッシングおよびフォールディングである。
【００６７】
ｃ．リボソームディスプレイおよびｍＲＮＡディスプレイ
リボソームディスプレイおよびｍＲＮＡディスプレイは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの大きなタンパク質ライブラリの選択や溶出を可能にする技法である。必要となる唯一の生物成分は、タンパク質配列をコードするｉｎ  ｖｉｔｒｏ作成転写物の翻訳に必要な因子を含有する細菌性細胞抽出物である。リボソームディスプレイの遺伝子型と発現型は、リボソーム複合体を介して互いに結合しており、選択に使用される、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソーム、およびコードされたタンパク質から構成されている（Ｈａｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，１９９７）。ｍＲＮＡディスプレイ法では、ｍＲＮＡと翻訳されたタンパク質との結合にピューロマイシンを使用し、それによって遺伝子型および表現型の情報を含有するｍＲＮＡ‐タンパク質複合体の精製を行う。選択後、単離したｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ複合体はＲＴ‐ＰＣＲによって増幅され、別の回の選択のために転写および翻訳することができる（Ｌｉｐｏｖｓｅｋ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，２００４）。ディスプレイ法の参考文献には以下の一覧が含まれ、これらはすべて全体が参考として本明細書で援用される：Ｂｏｄｅｒ  ＥＴ  ａｎｄ  Ｗｉｔｔｒｕｐ  ＫＤ（１９９７）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：５５３−７；Ｆｅｌｄｈａｕｓ  ＭＪら、（２００３）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：１６３−７０；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ＡＤら、（１９９４）ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １３，３２４５−３２６０；Ｈａｎｅｓ  Ｊ，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ（１９９７）ＰＮＡＳ  Ｍａｙ  １３；９４（１０）：４９３７−４２；およびＬｉｐｏｖｓｅｋ  Ｄ，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ａ．，（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈ．２９０  ５１−６７；Ｗｅｒｎｅｒｕｓ  Ｈら、（２００３）Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９（９）：５３２８−３５。
【００６８】
ディスプレイ法は、例えば以下の文献に開示されている：Ｂｏｄｅｒ  ＥＴ  ａｎｄ  Ｗｉｔｔｒｕｐ  ＫＤ（１９９７）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：５５３−７；Ｆｅｌｄｈａｕｓ  ＭＪら、（２００３）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：１６３−７０；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ＡＤら、（１９９４）ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １３，３２４５−３２６０；Ｈａｎｅｓ  Ｊ，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ（１９９７），ＰＮＡＳ  Ｍａｙ  １３；９４（１０）：４９３７−４２；Ｌｉｐｏｖｓｅｋ  Ｄら、（２００４）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈ．２９０  ５１−６７；およびＷｅｒｎｅｒｕｓ  Ｈ，ら、（２００３）Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９（９）：５３２８−３５。
【００６９】
ＩＩＩ．改変ＯＢフォールドドメインのスクリーニングに利用できる可能性がある標的
天然ＯＢフォールドドメインのリガンドは多種多様である。改変ＯＢフォールドドメインのライブラリを作製することにより、ＯＢフォールドドメインに利用できる可能性がある標的の多様性が拡大する。改変ＯＢフォールドドメインのライブラリに対するスクリーニングに有力な標的は、例えば核酸、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、炭水化物、オリゴ糖、およびホルモンを含むがこれらに限定されない種々の分子を包含する。
【００７０】
ｉ．核酸
多数のＯＢフォールドドメインが、一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡへの結合に関与する。これらのドメインには、腫瘍遺伝子ＢＲＣＡ２の一本鎖ＤＮＡ結合ドメイン、ヒト複製タンパク質Ａ由来の複数のドメイン、ならびにアスパルチル‐およびリジル‐ｔＲＮＡシンテターゼのアンチコドン結合ドメインが含まれる。したがって、一本鎖ＤＮＡおよびｔＲＮＡは、改変ＯＢフォールドドメインライブラリのスクリーニングのためのリガンド標的として使用することができる。
【００７１】
ｉｉ．タンパク質標的
改変ＯＢフォールドドメインライブラリのスクリーニングに使用できるタンパク質には、例えば酵素、調節タンパク質、タンパク質およびペプチドホルモン、輸送タンパク質など、種々のものがある。本明細書に開示する例示的実施形態においては、リゾチームがタンパク質標的として使用される。その他の標的には、ユビキチン、補体成分Ｃ４、プラスミノゲン前駆体、アポリポタンパク質Ａ‐ＩＩ、血漿プロテアーゼＣ１インヒビター、トランスサイレチン、および血清アミロイドＰ成分が含まれるが、これらに限定されない。
【００７２】
ｉｉｉ．オリゴ糖標的
オリゴ糖は、すべての生物の生物学において重要な役割を果たす。例えばラミナリヘキソース（ｌａｍｉｎａｒｉｈｅｘｏｓｅ）、マンノペンタオース、およびキシロペンタオースなどがあるがこれらに限定されないオリゴ糖基質が標的として使用可能である。
【００７３】
ｉｖ．ホルモン
ＯＢフォールドドメインライブラリのスクリーニングには、例えばステロイドホルモン（エストロゲン、テストステロン、およびコルチゾール）、カテコールアミン（例えば、エピネフリン）、およびその他同じような分子などがあるがこれらに限定されないホルモンが使用可能である。現在のところ、ＯＢフォールドドメインがステロイドホルモンまたはその他の補因子を天然のリガンドとして有するというエビデンスは存在しない。さらに、ステロイドに対する特異性が高い抗体は、これまでのところ作成が困難であり、ＯＢフォールドドメイン結合表面のようなくぼんだ結合表面が、特定のホルモンに対する結合特異性の向上により優れていることが証明される可能性がある。
【００７４】
ｖ．有機小分子
有機小分子（約１０００ダルトン以下の分子量を有する有機分子として定義される）も、ＯＢフォールドドメインの標的として使用可能である。有機小分子は、天然分子である場合もあれば、非天然の合成分子である場合もある。天然有機小分子は、生物系と関連する場合もあれば（例えば、ステロイドホルモン；上述を参照）、非生物的に発生する場合もある。有機小分子には、汚染物質またはその他の望ましくない物質、例えばＤＤＴまたはポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）が含まれるが、これらに限定されない。有機小分子には、薬物および医薬品、例えばドキソルビシンおよびパクリタキセルが含まれるが、これらに限定されない。
【００７５】
ＩＶ．ＯＢフォールドドメインの応用
本明細書で記載の通り、ＯＢフォールドドメインは、多様な分子認識プラットフォームである。種々のＯＢフォールドドメインが当該技術分野で既知であり、本明細書に開示されており、そしてＳＣＯＰやその他のデータベース、例えばＰｆａｍおよびＳｕｐｅｒｆａｍｉｌｙにおいて同定されている。このようなＯＢフォールドドメインは、改変ＯＢフォールドドメインだけでなく、例えば核酸、タンパク質、ホルモン、炭化水素、およびオリゴ糖などの標的に対してスクリーニングが可能な改変ＯＢフォールドドメインのライブラリを作製する方法においても使用可能である。このようなスクリーニング方法は、所望の特性を有する改変ＯＢフォールドドメインの同定に使用可能である。例えば、ヒトＯＢフォールドドメインは、ヒトへの治療に応用できる可能性があるヒト標的に対するスクリーニングを行うための改変ＯＢフォールドドメインライブラリを作製するスキャフォールドとして使用可能である。別の例において、酵母のＯＢフォールドドメインは、バイオテクノロジーまたは発酵用途に応用できる可能性がある改変ＯＢフォールドドメインライブラリを作製するスキャフォールドとして使用可能である。さらに別の例において、酵素のＯＢフォールドドメインを、新たな酵素特性を有する改変ＯＢフォールドドメインライブラリを作製するスキャフォールドとして使用可能である。
【００７６】
改変ＯＢフォールドドメインで見込まれる用途は、診断用試薬、治療用途、およびツールという３つの大きなカテゴリーに分類される。
【００７７】
改変ＯＢフォールドドメインは幅広い分子生物学ツールで使用可能であり、これには例えば、遺伝子組換え供給源または血清のような天然供給源のいずれかに由来するタンパク質の親和性精製用のタンパク質精製試薬としての使用が含まれる。このような用途では、選択タンパク質に対して特異的な結合親和性を有するＯＢフォールドドメインをビーズ上に固定化した後、標的タンパク質の親和性精製に使用する。その他の用途には、ウェスタンブロット法でのタンパク質検出、蛍光標識ＯＢフォールドドメインを使用したタンパク質検出、ならびに一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡの保護物質での使用が含まれる。このような状況において抗体に優るＯＢフォールドドメインの主な利点としては、試薬に適合するように改変ＯＢフォールドドメインの安定性を調整できる点である。例えば、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｉｏｐｈｉｌｕｍから得られるもののような熱安定性ＯＢフォールドドメインは、親和性精製試薬として抗体よりも効果的であると考えられる。
【００７８】
改変ＯＢフォールドドメインの診断用途には、例えば、血清、培養上清および汚染水のような液体中のタンパク質検出、遺伝子タイピング（多くのＯＢフォールドタンパク質は一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質であり、これらは、遺伝子タイピングのような方法での使用のために、特異的なＤＮＡまたはＲＮＡモチーフを検出するように開発できる可能性がある）、ならびに小分子検出物質が含まれる。
【００７９】
現在、診断および治療の臨床試験段階にあるすべての生体タンパク質の大部分を組換え抗体やそれらの断片が占めていることを考えると、改変ＯＢフォールドドメインのライブラリのような抗体ライブラリに代わるものが、治療薬としての可能性を有している。すでに市販されている組換え抗体の最近の例としては、ハーセプチン（抗ＨＥＲ２抗体）、リツキサン（リツキシマブ）（抗ＣＤ２０抗体）、およびアバスチン（抗ＶＥＧＦ抗体）などの癌治療薬がある。改変ＯＢフォールドドメインのヒト化ライブラリも作成される場合があり、このライブラリから、治療分野での用途が見出される適切な結合特性を有する特異的なものを同定することができる。
【実施例】
【００８０】
（実施例１）  材料および方法
化学物質および生化学物質
標準的なオリゴヌクレオチドはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し、ランダム化ロングオリゴヌクレオチドはすべてＭＷＧ（ドイツ  マルティンスリート）より入手した。ＰｆｘおよびＴａｑポリメラーゼならびにすべての制限酵素はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（米国カリフォルニア州カールズバッド）より入手した。エビ由来アルカリフォスファターゼ（ＳＡＰ）およびＴ４リガーゼはＲｏｃｈｅ（スイス  バーゼル）より入手した。ファージミドベクターｐＲＰＳＰ２ならびにファージＶＣＳ‐Ｍ１３およびＶＣＳＭ‐１３ｄ３（Ｖｄ３）はＤｒ．Ｊ．Ｒａｋｏｎｊａｃより入手した（３１、３２）。ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズおよびＰｒｏｔｅｃｔｏｒ（登録商標）ＲＮａｓｅインヒビターは、ニワトリ卵白リゾチームと同様にＲｏｃｈｅより入手した。ウシ血清アルブミンはＳｉｇｍａより入手した。ビオチン化トランスファーＲＮＡは、Ａｍｂｉｏｎ（米国）のＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写キットと、ＲｏｃｈｅのビオチンＲＮＡ標識ミックスを使用して作成した。ウェスタン解析用のニトロセルロース膜は、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ（ドイツ  ダッセル）より入手し、Ｐｉｅｒｃｅ（米国）のＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）を基質として使用した。
【００８１】
バイオインフォマティクス
Ｓｗｉｓｓ‐ｐｄｂＶｉｅｗｅｒおよびＰｙｍｏｌ（ｐｙｍｏｌ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ）を使用して、構造の観察、解析、またはＰＤＢファイル（３３）から図への変換を行った。ＩＦ‐５Ａの構造解析にはＰＤＢ  ｅｎｔｒｙ  １ｂｋｂ（３４）を使用した。ａｓｐＲＳには、ａｓｐＲＳホモログ１ｂ８ａ（３５）、１ｅｏｖ（３６）、１ｃｏａ（３７）のＰＤＢファイルを使用した。
【００８２】
ａｓｐＲＳ‐ＯＢの構造モデルは、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来のａｓｐＲＳ‐ＯＢのアミノ酸配列を送信することにより、ＳｗｉｓｓＭｏｄｅｌ（３８〜４０）より入手し、ＣｌｕｓｔａｌＷ（バージョン１．８）を使用して、オンラインでＥＢＩサービスのウェブサイト（＜ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／＞）を介してアラインメントを行った。
【００８３】
クローニング
一般的なクローニングはＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ（４１）にしたがって行った。ａｓｐＲＳ‐ＯＢ（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ  ＩＭ２由来のａｓｐ‐ｔＲＮＡシンテターゼ、塩基１〜３２７番、アミノ酸１〜１０９番、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿５５８７８３）およびＩＦ５Ａ‐ＯＢ（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ  ＩＭ２由来のＩＦ‐５Ａ、ＮＰ＿５６０６６８、塩基２０８〜３９９番、アミノ酸７６〜１３９番）の野生型遺伝子は、ａｓｐＲＳ‐ＯＢの場合オリゴヌクレオチド００５および００６を、ＩＦ５Ａ‐ＯＢの場合オリゴヌクレオチド０１１および０１２を使用して、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ  ＩＭ２ゲノムＤＮＡ（ＮＣ００３３６４、（４２））からＰＣＲで増幅した。オリゴヌクレオチドの配列は付表Ｉに列挙する。過剰発現のためのすべてのＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ｐＰｒｏＥｘ‐Ｈｔｂにライゲーションした。ｐＰｒｏＥＸ‐Ｈｔｂは、Ｎ末端にＨｉｓ６タグが付いた融合タンパク質としてタンパク質を作成する。ａｓｐＲＳ‐ＯＢ遺伝子をｐＪＡＲＡ１４０にクローニングする場合は、オリゴヌクレオチド対０５０／０４４を使用してａｓｐＲＳ‐ＯＢをＰＣＲで増幅し、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩを使用して消化した。ｐＪＡＲＡ１４０も同じ酵素で消化し、ライゲーションの前に脱リン酸化した。サブクローニングを行う場合は、ベクターに特異的なプライマーを使用して選択した突然変異遺伝子を増幅し、ドナーベクターｐＤＯＮＲ２２１に挿入した後、ｐＤＥＳＴ１５に挿入した（これらのベクターはいずれもＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）クローニング系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の一部である）。ｐＤＥＳＴ１５は、グルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の融合体としてタンパク質を発現することが可能である。
【００８４】
大腸菌
ｐＰｒｏＥＸから得たすべての構築物のクローニングやプラスミド調製、ならびに小規模のタンパク質合成には、大腸菌Ｋ１２株ＸＬ１‐ｂｌｕｅ（４３）を使用し、すべてのｐＲＰＳＰ２構築物のクローニング、ならびにＶＣＳ‐Ｍ１３ヘルパーファージにより作成したすべてのファージには、大腸菌ＪＭ１０１誘導体ＴＧ１を使用した。ｐＪＡＲＡ１３１およびｐＪＡＲＡ１１２で形質転換した大腸菌Ｋ５６１（大腸菌Ｋ１７６２（４４）を生成）は、多価ディスプレイ用のＶＣＳ‐Ｍ１３ｄ３ヘルパーファージの調製に使用した。大規模なタンパク質作成および精製には大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用した。
【００８５】
遺伝子ライブラリの構築
ライブラリは、コドンＮＮＫ（Ｎ＝Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ、Ｋ＝ＴまたはＧ）を含む変異原性オリゴヌクレオチドを、選択した位置に組み込むことにより構築した。組み込んだ変異を担持するａｓｐＲＳ‐ＯＢ遺伝子断片をＰＣＲで作成し、次いで完全長遺伝子に構築した。ランダム化した位置を組み込むロングオリゴヌクレオチドは表１に列挙する。最初のＰＣＲ工程では、対応するフランキングプライマーを使用し、選択した位置にランダム化したオリゴヌクレオチドを組み込んで遺伝子断片を作成した（３０サイクル、９４℃１分間、５２．５℃３０秒間、６８℃１分間）。第２の工程では、オーバーラップ伸長ＰＣＲ（２５サイクル、９４℃１分間、５２．５℃３０秒間、６８℃１分間）によって遺伝子断片を完全長遺伝子に構築した。その後の工程で１０８の多様性が維持されるようにするため、構築した産物の量は１０１１個の分子をよりも多くなるように分光光度法で算出した。構築した産物を、ａｓｐＲＳ‐ＯＢの場合はベクター特異的プライマー００５／００６を、ＩＦ５Ａ‐ＯＢの場合はベクター特異的プライマー０１１／０１２をそれぞれ使用して、ＰＣＲ（３０サイクル、９４℃１分間、５２．５℃３０秒間、６８℃１分間）で増幅し、消化した後、ｐＰｒｏＥｘ‐Ｈｔｂにライゲーションした。ａｓｐＲＳ‐ＯＢのファージライブラリの場合は、プライマー０５０／０４４を、ｐＲＰＳＰ２へのクローニングに使用した（下記を参照）。野生型遺伝子または構築したライブラリのいずれかを含むプラスミドを、大腸菌ＸＬ１‐Ｂｌｕｅに形質転換し、アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ寒天平板培地上で３７℃にて一晩培養した。個々のコロニーをピックアップし、それらを５０μＬのＬＢ／Ａｍｐ中で数時間培養することにより、診断ＰＣＲを行った。この培養液の１μＬを使用して、ｐＰｒｏＥｘ‐ＨｔｂまたはｐＲＰＳＰ２それぞれの診断プライマーを使用する１０μＬのＰＣＲ増幅（２５サイクル、９４℃１分間、５２．５℃３０秒間、６８℃１分間）を行った。Ｐｆｘポリメラーゼはすべての調製ＰＣＲ反応に使用したのに対し、Ｔａｑポリメラーゼは診断ＰＣＲ反応にのみ使用した。各ＯＢフォールド遺伝子の構築計画を概説するスキームは図２Ａおよび図２Ｂに示す。
【００８６】
ライブラリ由来タンパク質の過剰発現プロファイル
各ライブラリでは、形質転換した細菌を寒天（ＬＢ‐ａｍｐ含有）上に接種し、シングルコロニーをピックアップして、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆのサーモミキサーで１２００ｒｐｍにて振盪しながら、９６ウェルの深型プレートで１００μＬのＬＢ‐ａｍｐ（５０μｇ・ｍＬ−１）中で一晩培養した。これらの培養液を、新しいＬＢ‐ａｍｐを９００μＬ添加して希釈し、さらに６０分間培養した後、１ｍＭのイソプロピル‐Ｄ‐チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を使用して３７℃にて４時間誘導した。細菌細胞を遠心分離により回収し、１５０μＬのトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ：５０ｍＭトリス‐ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）に再懸濁し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ、１５％ポリアクリルアミド）で解析した。表１は、ａｓｐＲＳ‐ＯＢおよびＩＦ５Ａ‐ＯＢライブラリの構築に使用したロングオリゴヌクレオチドの一覧である。それぞれのランダム化したコドンは、ＮＮＫ（Ｎ＝Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ、Ｋ＝Ｔ／Ｇ）またはアンチセンスコドンの場合はＭＮＮ（Ｍ＝Ａ／Ｃ）で定義される。図３および図３Ｂも参照されたい。
【００８７】
【表１】
2009539346.tif 000006
再懸濁した細胞は、凍結融解とリゾチームの添加（０．５ｍｇ・ｍＬ−１）を行うことによって溶解し、不溶性物質の沈降後、可溶性画分もＳＤＳ‐ＰＡＧＥで解析した。小規模の精製工程は、５μＬのＮｉ‐ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）を使用して可溶性タンパク質を結合させることによって行った。Ｎｉ‐ＮＴＡビーズはＴＢＳで洗浄し、結合したタンパク質をＳＤＳ‐ＰＡＧＥを使用して同定した。
【００８８】
タンパク質発現と精製
野生型ＯＢフォールドドメインであるａｓｐＲＳ‐ＯＢおよびＩＦ５Ａ‐ＯＢ、ならびに変異体であるＩＦ５Ａ‐ＯＢ／Ａ２およびａｓｐＲＳ‐ＯＢ／１３ｍＲＬを、ミリグラム量で発現および精製した。大腸菌ＸＬ１‐ＢｌｕｅをＬＢ‐ａｍｐ（５０μｇ・ｍＬ−１）中で一晩培養した２５ｍＬを使用して、５００ｍＬのＬＢ‐ａｍｐ培養液を播種した。ＯＤ６００が０．６になるまで３７℃にて培養物を培養し、１ｍＭのＩＰＴＧで４時間誘導した。細菌を遠心分離により回収し、−２０℃にて保存した。２５ｍＬのＴＢＳ＋１０ｍＭイミダゾールに細胞を再懸濁して、ソニケーションで溶解した。ＩＦ‐５Ａ由来のＯＢフォールドタンパク質を、８５℃３０分間のインキュベーションを含む加熱工程で処理した。これにより、大腸菌タンパク質の大部分が変性する。溶解した細胞をＳｏｒｖａｌｌ  ＳＳ‐３４ローターで１６，０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離した。精製のため、溶解物をＮｉ‐ＮＴＡ  Ｈｉｇｈトラップカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン）に充填した。カラムからの溶出は、イミダゾールグラジエントを使用して行った。精製したタンパク質を、イミダゾールフリーの２０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌで透析し、濃縮した後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用したサイズ排除による２回目の精製工程に供した。
【００８９】
ファージライブラリの作成
ファージの一般的な取扱い工程は、Ｂａｒｂａｓら、（４５）にしたがって行った。選択用のファージａｓｐＲＳ‐ＯＢ‐ｐＩＩＩ‐Ｖｄ３のストックを調製するため、ｐＪＡＲＡ１４０にａｓｐＲＳ‐ＯＢを含む約６×１０９個の大腸菌ＴＧ１細胞を使用して、２００ｍＬの２×ＹＴ‐ａｍｐ（５０μｇ・ｍＬ−１）に播種した。この培養液を３７℃にて振盪しながら１時間培養した後、振盪せずに３７℃にて３０分間約１×１０１２単位のＶｄ３ヘルパーファージを感染させた。次いで細胞を洗浄し、２×ＹＴ‐ａｍｐ中でさらに４時間培養した。次にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿によってファージを培養上清から濃縮し、ＴＢＳに再懸濁した後、４℃にて保存した。ファージの力価は３．０×１０１１ＴＤＰ・ｍＬ−１と判定した。
【００９０】
ａｓｐＲＳ‐ＯＢ遺伝子ライブラリをｐＲＰＳＰ２にクローニングする場合は、オリゴヌクレオチドペア０５０／０４４を使用して、構築した遺伝子ライブラリのＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで消化した。約１０μｇのＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ消化ファージベクターｐＲＰＳＰ２およびインサートを使用し、１：５のモル比にて１ｍＬの反応物中でライゲーションを行った後、スピンカラム（ＲｏｃｈｅまたはＱｉａｇｅｎ（ドイツ  ヒルデン））で精製した。エレクトロポレーションにより、５０μＬの溶出物を１０×５０μＬのエレクトロコンピテントな大腸菌ＴＧ１細胞に形質転換し、約１×１０８個の形質転換細胞を得た。形質転換した細胞を１００ｍＬのＳＯＣ培地中で３７℃にてさらに１時間培養した後、４００ｍＬのＬＢ／Ａｍｐを添加して、３７℃にてさらに１時間培養した。試料を採取し、希釈系列をＬＢ／Ａｍｐ寒天平板培地上に接種して、適切なインサートサイズについて個々のクローンを診断ＰＣＲで解析することによりライゲーションおよび形質転換効率を評価した。コロニーを無作為にピックアップし、個々のコロニーの診断ＰＣＲから適切なインサートの数を測定した。適切なサイズのインサート数は８９％であり、コロニー数は９×１０７個と算出され、適切なサイズのインサートを担持する約８×１０７種類のクローンという多様性が得られた。培養液のＯＤ６００が０．４に到達したところで、培養液に約５×１０１２個のｐｆｕのＶＣＳ‐Ｍ１３ヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を感染させ、攪拌せずに３７℃にて２０分間静置した後、１時間振盪した。最終濃度５０μｇ／ｍＬの培養液にカナマイシンを添加し、培養液を３７℃にて一晩培養した。細菌を沈降させ、２０ｇのＰＥＧ８０００（Ｓｉｇｍａ）および１５ｇのＮａＣｌに溶解した後、４℃にてファージを一晩沈殿させた。遠心分離によりファージをペレット化し、５ｍＬのＰＢＳに溶解した後、０．４５フィルターで濾過して、パニングに使用した。
【００９１】
ビオチン化ＲＮＡ標的の作成
ビオチン標識ａｓｐ‐ｔＲＮＡは、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔキット（Ａｍｂｉｏｎ、米国）およびビオチン‐１６‐ＵＴＰを含むビオチンＲＮＡ標識ミックス（Ｒｏｃｈｅ、スイス）を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を行うことによって作成した。Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来の７８ｂｐのａｓｐ‐ｔＲＮＡ遺伝子（Ｇｅｎｅ＿ＩＤ：１４６４２６３）をカバーする合成オリゴヌクレオチドと、Ｔ７プロモーター領域を３’末端に含むｐＥＴ２８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から増幅した１５０ｂｐのＤＮＡ断片のＰＣＲ構築を行った後、Ｔ７に関する最近のプロモーター認識研究（４２）にしたがって最適なプロモーター活性についてのＧＧを行うことによって、発現ＰＣＲ（４１）に基づきＤＮＡ鋳型を作成した。これにより、２３０ｂｐの産物が構築され、これをエタノールで沈殿し、乾燥させ、ＲＮａｓｅフリーの水に再懸濁し、さらにクローニングを行わずに転写用鋳型として使用した（４１）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写は、製造業者（Ａｍｂｉｏｎ）の取扱説明書にしたがって行い、２５μＬの反応物から約５μｇのビオチン化ａｓｐ‐ｔＲＮＡを得た。
【００９２】
ａｓｐＲＳ‐ＯＢライブラリの選択
ビオチン化ａｓｐ‐ｔＲＮＡは、ライブラリ「ＲＬ」および「１３ｍＲＬ」からの選択で標的として使用し、ニワトリ卵白リゾチーム（Ｒｏｃｈｅ、スイス）は「１３ｍＲＬ」からの選択にのみに使用した。
【００９３】
ＲＮＡでの選択の場合は、ビオチン化ａｓｐ‐ｔＲＮＡを、ストレプトアビジンをコートした常磁性ビーズに結合させることにより固定化した。１０μＬのビーズを４００μＬのＰＢＳ‐Ｔ（ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ）で２回洗浄した後、攪拌し、時折反転させながら室温にて３０分間１００ｎｇのビオチン化ａｓｐ‐ｔＲＮＡとともにインキュベートした。ＰＢＳ‐Ｔでビーズを３回洗浄してから、ＰＢＳ‐Ｔ＋０．５％ＢＳＡ中で１ｍＬの約１０１１ｃｆｕのファージライブラリＲＬまたは１３ｍＲＬとともに２時間インキュベートした。１回目のパニングでは６回、次の回のパニングでは８回ＰＢＳ‐Ｔで洗浄した後、ビーズをＰＢＳでさらに２回洗浄し、１μｇ（５Ｋｕｎｉｔｚユニット）のＲＮａｓｅＡ（ウシ脾臓由来、Ｒｏｃｈｅ）とともに３７℃にて３０分間インキュベートして、ＲＮＡを消化し、ＲＮＡ結合ファージを溶出した。溶出したファージ粒子を細菌感染によってカウントし、次の回のパニングのＴＤＰ作成用に新鮮ＴＧ１培養液３ｍＬの感染に使用した。培養液を攪拌せずに３７℃にて２０分間静置し、振盪しながら１時間インキュベートした後、アンピシリンを添加して一晩培養した。一晩経った培養液を、５００ｍＬの予め温めたＬＢ／Ａｍｐへの播種に使用した。ヘルパーファージの感染およびＴＤＰの作成は、上で概説したファージライブラリ作成と同じ工程に従って行った。パニングを４回行った後、個々のクローンを解析した。
【００９４】
リゾチームでの選択の場合は、２．５ｍＬのリゾチーム溶液（１０μｇ／ｍＬ）含有の２０ｍＭのＮａＣＯ３、ｐＨ９．０中で、４ｍＬのＩｍｍｕｎｏ  Ｔｕｂｅ（Ｎｕｎｃ、デンマーク）を４℃にて一晩コーティングし、４ｍＬの１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで室温にて１時間ブロッキングを行った。ライブラリ１３ｍＲＬ由来のファージを添加した後（２．５ｍＬ中に約２．５×１０１１のｃｆｕを含有）、緩徐に攪拌し、時折反転させながら室温にて２時間インキュベートした。洗浄は、ＰＢＳ‐Ｔ０．１％ＢＳＡによる８回の洗浄工程（１回目の選択では、ＰＢＳ‐Ｔを使用して６回だけ洗浄）と、ＰＢＳによる２回の洗浄よって５分以内に速やかに行った。２．５ｍＬの溶出バッファー（０．２ＭグリシンＨＣｌ  ｐＨ２．２、ブロモフェノールブルー）とともに１０分間インキュベーションすることで、結合したファージを溶出し、５００μＬの１ＭトリスＨＣｌ  ｐＨ９．０を使用して速やかに中和した。溶出したファージをカウントし、ＴＤＰの増幅および次の回のパニングに使用する３ｍＬの新鮮ＴＧ１の感染に使用した。培養液の培養とＴＤＰの作成は、ａｓｐ‐ｔＲＮＡでのパニングについて上に記載したのと同じ方法で行った。選択と増幅を６回行った後、クローンを採取して解析した。
【００９５】
ファージディスプレイタンパク質検出のためのウェスタンブロット
ａｓｐＲＳ‐ＯＢのファージ試料を、ＰＥＧ沈殿によって１×１０１１ＴＤＰ／ｍＬになるよう濃縮し、１０μＬをゲルローディングバッファー（ＳＤＳおよびＢＭＥ含有）と混合し、ボイルして、１０％のＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲル上で分離した。ニトロセルロース膜（Ｐｒｏｔｒａｎ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ、ドイツ）上に転写した後、マウス抗ｃ‐ｍｙｃ一次抗体（Ｚｙｍｅｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＨＲＰ結合抗マウス二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ‐Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン）を使用して、ａｓｐＲＳ‐ＯＢ‐ｐＩＩＩ融合タンパク質を検出した。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）基質（Ｐｉｅｒｃｅ、米国）を使用して可視化を行った。
【００９６】
ファージＥＬＩＳＡ
リゾチームへの結合のために選択したクローンを解析するために、ファージＥＬＩＳＡ実験を行った。９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレートを、５μｇ／ｍＬのニワトリ卵白リゾチーム、５μｇ／ｍＬのＲＮａｓｅＡ、または１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで、４℃にて一晩コーティングした。ＴＢＳで２回洗浄した後、プレートを室温にてブロッキングバッファー（５％スキムミルク含有ＴＢＳ）で１時間ブロッキングして、その後、ファージ（１０９ｃｆｕ／ウェル、ＶＣＳ‐Ｍ１３ｄ３由来）を２．５％のスキムミルク‐ＴＢＳ‐Ｔに添加した。プレートを、攪拌しながら室温にて２時間インキュベートした。水で１０回洗浄した後、ブロッキングバッファーで希釈したマウス抗Ｍ１３タンパク質ＶＩＩＩを添加し、室温にて１時間インキュベートした。プレートを水で４回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ウサギ抗マウス免疫グロブリン（Ｐｉｅｒｃｅ）を含有するブロッキングバッファーをウェルに添加し、室温にて１時間インキュベートした。ウェルを水で４回洗浄し、５０μＬの基質溶液（１ｍｇ／ｍＬのｏ‐フェニレン‐ジアミン含有ＰＢＳ  ０．０３０％Ｈ２Ｏ２）をウェルごとに添加した。約１５分後に２５μＬの２．５ＭＨ２ＳＯ４を添加して反応を停止させ、４９２ｎｍで吸光度を記録した。
【００９７】
ファージの相対定量化（提示した融合タンパク質の定量化）では、ファージ試料をプレートのコーティングに直接使用した。ブロッキングバッファーによるブロッキングの後、マウス抗ｃ‐ｍｙｃ一次抗体（Ｚｙｍｅｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＨＲＰ結合抗マウス二次抗体を使用して、上述の工程に従いファージを検出した。
【００９８】
モノクローナルファージの作成
ファージ結合実験では、ＶＣＳ‐Ｍ１３ｄ３（Ｖｄ３）のｇＩＩＩ欠失変異体（Ｒａｋｏｎｊａｃ  ｅｔ  ａｌ，１９９９）をヘルパーファージとして使用して、モノクローナルファージ試料を多価ディスプレイとして作成した。マイクロパニングによるプレスクリーニングでは、ｗｔＶＣＳ‐Ｍ１３由来の一価ファージを使用した。ヘルパーファージＶＣＳ‐Ｍ１３およびＶｄ３のストックは、一般的なプロトコル（Ｂａｒｂａｓ  ＩＩＩら、２００１）にしたがって、単一のプラークから作成したが、但し、ＶＣＳ‐Ｍ１３はＴＧ１上で培養し、大腸菌Ｋ１７６２（プラスミドｐＪＡＲＡ１３１（ｃａｍ１）およびｐＪＡＲＡ１１２（ａｍｐ１）で形質転換したＫ５６１）上のＶｄ３は、ファージ構築用のｐＩＩＩを供給するための宿主株として使用した。Ｖｄ３試料は６５℃にて２０分間加熱して、細菌性宿主由来のλ溶原菌を死滅させた。
【００９９】
Ｖｄ３またはＶＣＳ‐Ｍ１３上のファージａｓｐＲＳ‐ＯＢのストックを調製するため、対応するｐＲＰＳＰ２誘導体で形質転換した大腸菌ＴＧ１を、１００ｍＬのＬＢ／Ａｍｐ中でＯＤ６００が０．４になるまで培養し、１０１２個のｐｆｕのＶｄ３またはＶＣＳ‐Ｍ１３でそれぞれ感染させた。攪拌せずに３７℃にて２０分間インキュベートした後、培養液を振盪しながらさらに１時間インキュベートした。カナマイシン（最終濃度５０μｇ／ｍＬ）を添加し、培養液を一晩インキュベートした。細胞を沈降させ、最新のプロトコル（Ｂａｒｂａｓ  ＩＩＩら、）に従い、上述の通りに、ＰＥＧ／ＮａＣｌを使用した沈殿によってファージを精製した。ＴＤＰをＰＢＳに再懸濁し、解析に使用した。
【０１００】
ａｓｐ‐ｔＲＮＡでのモノクローナルファージ結合実験
ファージに提示したタンパク質のａｓｐ‐ｔＲＮＡへの結合を試験するため、モノクローナルファージ試料を使用して、Ｖｄ３上で融合タンパク質を多価提示させた。実施した工程は、上で概説した１回目の選択のものと基本的に同じであった。ビオチン化したａｓｐ‐ｔＲＮＡを、ストレプトアビジンでコーティングした常磁性ビーズと結合させ、ＴＤＰ試料を添加した（１０９ｃｆｕ／本）。インキュベーションおよび洗浄工程の後、ＲＮａｓｅＡを添加することによりＲＮＡを消化し、溶出したＴＤＰを細菌感染によってカウントした。
【０１０１】
ＧＳＴの「プルダウン」アッセイ
リゾチームで選択された変異体を、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）のｐＤＥＳＴ１５にサブクローニングし、ＧＳＴ融合タンパク質として発現させた。構築物を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、培養液を３ｍＬのＬＢ／Ａｍｐで培養した。最終濃度１ｍＭにＩＰＴＧを添加して細胞の誘導を行い、３７℃にてさらに４時間培養した。細胞を沈降させ、３００μＬの溶解バッファー（トリス‐ＨＣｌ  ７．５  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に再懸濁した後、ソニケーションで溶解した。不溶性物質を沈降させ、可溶性画分を１０μＬのグルタチオン結合セファロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）とともに４℃にて１時間インキュベートした。ＴＢＳ‐Ｔによる２回の洗浄工程の後、１５０μＬのリゾチーム（１ｍｇ／ｍＬ）と０．１％ＢＳＡとを含む３００μＬのＴＢＳ‐Ｔとともに、ビーズを４℃にて１時間インキュベートした。洗浄は、ＴＳ（５０ｍＭトリス‐ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）、ＴＢＳ‐Ｔ（２０ｍＭ  トリス‐ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）、ＴＢＳ‐Ｔ‐５００（ＴＢＳ‐Ｔ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ）といった異なるバッファーを使用して行った。ビーズをゲルローディングバッファー（ＳＤＳおよびＢＭＥ含有）に再懸濁し、ボイルして、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥで解析した。
【０１０２】
バイオセンサーの結合解析
リガンドリゾチームを、ｐＨ４．３の酢酸ナトリウムバッファー中の３０μｇ／ｍＬでタンパク質の一次アミン基を介して、ＣＭ５  Ｂｉａｃｏｒｅセンサーチップに結合させた。チップ上の４つのフローセルの内の２つ目を、ＥＤＣ：ＮＨＳの１：１（等量）混合液（Ｂｉａｃｏｒｅより販売）３５μＬで５μＬ／分にて活性化した。十分な反応が認められるまで１０〜２０μＬを連続注入することにより、活性化表面にリゾチームを結合させた。チップ上に残された非結合活性基を、エタノールアミン‐ＨＣｌを注入して失活させた。解析のため、ＯＢ３  １３ｍＲＬ  Ｌ６を、ランニングバッファーに３７０μＭを含む濃度から始めて、バッファーのみのブランクも含めた６段階濃度の１：２希釈系列に調整した。７つの試料それぞれを順不同に２５μＬ／分にて１分間２回解析し、最初のフローセルを基準として使用した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して、反応曲線の可視化と処理を行った。Ｓｉｇｍａ  Ｐｌｏｔ（Ｓｙｓｔａｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を使用して、各濃度における相対レスポンスを平均化し、プロットして、ＲｍａｘおよびｋＤを判定した。
【０１０３】
（実施例２）  Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来のＯＢフォールドドメイン
ＯＢフォールドドメインは特異的結合および酵素特性を有するタンパク質を作成するためにスキャフォールドとして使用できるかどうかを試験するために、提案した結合表面全体の変異に対する個々のＯＢフォールドドメインタンパク質の耐性を試験した。超好熱性クレンアーキアのＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ（Ｔｍａｘ＝１０４℃、Ｔｏｐｔ＝１００℃）由来の２つのＯＢフォールドドメインを選択した。この選択は、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍゲノム（４２）中のＯＢフォールドタンパク質の検索にＳｕｐｅｒｆａｍｉｌｙデータベース（バージョン１．６５（４６））を使用したデータベース検索にしたがって行った。このデータベースは、１２９４個のＳＣＯＰスーパーファミリー（ＳＣＯＰ：タンパク質の構造的分類）に区分された既知の構造を有するすべてのタンパク質のライブラリを使用して、隠れマルコフモデルを開発しており、次いでこれらモデルをプロファイルとして使用して、類似のフォールドを含む可能性があるタンパク質の配列決定ゲノムを検索した。この検索により、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ  ＩＭ２のゲノム由来の有力なＯＢフォールドドメインを含むタンパク質配列を表す１４件がヒットした。
【０１０４】
他のドメインと空間的に離れており、そのため独立して安定していることが予想されるＯＢフォールドタンパク質を探し出すため、これらの配列をそれぞれ解析した。さらに、配列からのＯＢフォールドの予測の信頼性をチェックするため、スーパーファミリーを表す３次元モデル、または利用可能な相同性の次元タンパク質構造に配列をアラインメントした。これらの１４の配列の内の８個が基準を満たした（表２を参照）。この８個の候補の内の６つが、ＲＮＡ結合タンパク質の２つの機能クラス、すなわち翻訳開始因子（ＩＦ）とアミノアシル‐ｔＲＮＡシンテターゼ（ａａＲＳ）に属していた。残りの２つの候補は、機能的アノテーションを含んでおらず、「保存されている仮想タンパク質」として分類した。
【０１０５】
選択した配列に由来するＯＢフォールドドメインをクローニングし、配列アラインメントからドメイン境界を同定し、大腸菌での発現と溶解性について試験した。アスパルチルｔＲＮＡシンテターゼ（ａｓｐＲＳ‐ＯＢ）および翻訳開始因子ＩＦ‐５Ａ（ＩＦ５Ａ‐ＯＢ）由来のＯＢフォールドドメインは、良好に発現し、可溶性および熱安定性を有していたため、これらを第一選択とした。
【０１０６】
ＩＦ‐５Ａタンパク質のさらなる利点は、高分解能の３次元構造がＰｆａｍデータベース（３４）で利用できる点であり、これを使用して、表面が露出した残基をランダム化に確実に選択することができた。ＩＦ‐５Ａのこの構造（図３）は、Ｃ末端にＯＢフォールドを有し、リンカー領域によって空間的に分離され、したがって本発明者等の選択基準を満たす２つのドメインを示す。提案した結合表面（β‐ストランド１〜３）は、タンパク質の中心から離れ、溶媒の方向を向いている。ＩＦ‐５ＡのＯＢフォールドは、せん断数がＳ＝８であるため、ＯＢフォールドドメインの１つのサブクラスを代表するものである。
【０１０７】
ａｓｐ‐ｔＲＮＡシンテターゼのＯＢフォールドドメイン（ａｓｐＲＳ‐ＯＢ）は、Ｓ＝１０の特性を有するＯＢフォールドタンパク質の第２のサブクラスの代表として選択した。Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来のａｓｐＲＳの３次元構造は利用できないが、他の生物由来のａｓｐＲＳタンパク質の構造はＰＤＢにいくつか存在する。図４は、大腸菌由来のａｓｐＲＳの結晶構造を示す（３７）。Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来のＯＢフォールドドメインとその大腸菌ホモログの配列アラインメントは、ＯＢフォールドドメインが３０％の配列同一性を有することを示している。それらの全長にわたって、ａｓｐＲＳタンパク質は配列レベルで２０％が同一である。ＯＢフォールドはＮ末端に位置し、より大きなＣ末端ドメインと明らかに空間的に離れている。結合表面は、Ｃ末端ドメインから離れて、溶媒の方向を向いている。Ｎ末端のＯＢフォールドドメインはｔＲＮＡに結合し、アスパルチル‐ｔＲＮＡアンチコドンを特異的に結合するアンチコドン認識ドメインを構成するが（３６）、Ｃ末端ドメインはタンパク質の酵素成分を構成する。表２には、予想されたＯＢフォールドを有するＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来の８つの選択された配列を示す。予想した大きさと提案したせん断数とともにＮＰ受入番号も示す。ＩＦ‐５Ａでは３次元構造も利用可能である。保存されている仮想タンパク質であるＮＰ＿５５９８４６の予想される大きさは、タンパク質全体に相当する。この例では、ＯＢフォールドドメインの境界を正確に予測するのが困難である。
【０１０８】
【表２】
2009539346.tif 000007
これらのＯＢフォールドドメインはいずれも、すべての界にホモログを有するため、種々の生理学的背景における応用の機会がもたらされる（異なる種に由来するａｓｐＲＳ（図５Ａ）およびＩＦ‐５Ａ（図５Ｂ）の配列アラインメントについては、図５Ａ〜５Ｂを参照）。図５Ｃは、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ、および大腸菌由来のａｓｐＲＳ‐ＯＢの配列アラインメントを示す。配列同一性はアスタリスクで示す。ＯＢフォールドの二次構造は配列の下に示し、ｌはストランド４と５の間のループ、ループ４／５である。
【０１０９】
（実施例３）  ランダム化のための残基の選択
２つのＯＢフォールドドメインのランダム化のための残基を、それらの３次元構造に基づいて選択した。ＩＦ‐５Ａの構造は利用可能である。ＳｗｉｓｓＭｏｄｅｌ（３８〜４０）と大腸菌（３６、３７）およびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ（３５）由来の利用可能な構造とを構造鋳型として使用してモデリングを行うことにより、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来のａｓｐＲＳのＯＢフォールドの構造を作成した。
【０１１０】
ＯＢフォールドドメイン結合表面上で、βストランド１〜３から、表面が露出した残基を選択した。ａｓｐＲＳおよびＩＦ５ＡのＯＢフォールドドメインは異なるせん断数を有するため、それらの構造は若干異なっている。特に、βストランド４および５、ならびにこれらのストランド間のループの配置は異なっている。ａｓｐＲＳ‐ＯＢの場合は、ライブラリの１つにおいて、ストランド４と５の間のループもランダム化に含めた。そのため、ａｓｐＲＳ‐ＯＢでは、βストランド１〜４上と、ストランド４と５の間のループ内に位置する、溶媒に露出した１３個の残基を、ランダム化に選択した。これによって、最大数１７個の変異部位がもたらされ、理論上の多様性として２０１７＝１．３×１０２２の変異体が可能となる。
【０１１１】
このような変異に対する耐性を評価するため、結合表面の各部分を個別に扱うライブラリセットを構築した。ＩＦ５Ａ‐ＯＢでは、βストランド１〜３上の９個または１１個の位置をランダム化した（図８）ライブラリを構築し、それぞれ理論上の多様性が２０９＝５．１２×１０１１および２０１１＝２×１０１４の変異体であると算出された２つのライブラリが得られた。導入した２つの残基、セリン‐アスパラギンをランダム化することにより（２ＲＬ）、またはさらなる２つの残基を使用してループを伸長することにより（２ＲＬ＋２）、ストランド１と２の間のループを標的として、２つの小さなライブラリ（それぞれ４００個の変異体）を作成した。選択した残基と、それらのＯＢフォールドドメイン中での位置については、図８および図９を参照されたい。
【０１１２】
（実施例４）  ＯＢフォールドライブラリ
各ＯＢフォールドドメインの所定の領域を扱うライブラリセットを構築した。ａｓｐＲＳ‐ＯＢフォールドドメインでは、βストランドを個別に、また互いを組み合わせて変異させた。野生型ＯＢフォールドドメイン（すなわち、天然ＯＢフォールドドメイン）および完全にランダム化したライブラリでは、ストランド４と５の間のループを個別にランダム化した。その結果、大きさが異なり、ランダム化位置の配置が異なる５つのライブラリが構築された（表３Ａ〜３Ｂを参照）。
【０１１３】
ＩＦ５Ａ‐ＯＢでは、βストランド１〜３ならびにストランド１と２の間のループをランダム化の標的とした。このループ（ストランド１と２の間）をランダム化の標的とし、ランダム化した表面積を伸長する可能性を評価した。この領域のループが伸長した天然ＯＢフォールドタンパク質の例が存在するが、これらの例では、このループに伸長が起こりやすい可能性があることが示唆されている。ａｓｐＲＳ‐ＯＢフォールドドメインに使用されたのと同様の手法で、種々の変異セットを有するライブラリ（表３を参照）をＰＣＲによって構築し、発現ベクターにクローニングし、大腸菌に発現させた。変異を担持するライブラリメンバーを表すクローンをピックアップし、適切なサイズのインサート、Ｈｉｓ６タグ結合タンパク質としての発現、溶解性、およびＮｉ‐ＮＴＡ樹脂への結合について解析した。
【０１１４】
【表３】
2009539346.tif 000008
表３Ａ〜３Ｂは、ａｓｐＲＳ‐ＯＢの遺伝子ライブラリの一覧である。接尾語‘ｍ’はβストランド１〜３をカバーするβシート中の変異を示す。接尾語‘ＲＬ’は、ランダム化したループ領域（ａｓｐＲＳ‐ＯＢの場合はループ４／５、ＩＦ５Ａ‐ＯＢの場合はループ１／２）を示す。
【０１１５】
（実施例５）  ライブラリの構築
基本的にライブラリは、縮重コドンを所望の位置に有する合成オリゴヌクレオチドを組み込むオーバーラップ伸長ＰＣＲに基づいて構築した。まず、遺伝子全体をカバーし、オーバーラップ領域を含む遺伝子断片を通常のＰＣＲ法により作成した。ランダム化した断片は、ランダム化したコドンを含む対応するロングオリゴヌクレオチドを組み込むことによって作成した。等モル量のこれらの遺伝子断片を遺伝子フランキングプライマーと組み合わせて使用して、断片をＰＣＲにより構築し、ランダム化した位置を組み込んだ完全長遺伝子を増幅した。種々の組み合わせの縮重オリゴヌクレオチドを使用して、結合表面の種々の部位にランダムな変異を含む複数のライブラリを作製した。ａｓｐＲＳ‐ＯＢでは、βシート上の残基Ｗ２８、Ｅ２９、Ｒ３１、Ｉ３３、Ｒ３５、Ｖ３６、Ｆ３８、Ｖ４０、Ｒ４２、Ｆ４７、Ｑ４９、Ｔ５１、Ｋ５３、およびループ領域の残基Ｉ８５、Ａ８６、Ｋ８７、Ｓ８８に多様性を生じた。ライブラリＲＬ（ランダム化したループ）は、βストランド４と５の間のループ領域に４つのランダム化した位置を含む。ＲＬライブラリの理論上の多様性は、２０４＝１６００００種類の変異体である。形質転換の後、ライブラリＲＬは約１０７個のクローンを含み、その内の９４％が適切なサイズのインサートを有しており、ライブラリの多様性を完全にカバーした。１３ｍＲＬの理論上の多様性は非常に高く、約５×１０２２種類の変異体である。形質転換の後、８９％の適切なインサートを有する１０８個のクローンが得られた。配列決定した１０個のクローンの内の８個が所望の変異配列を有していたが、２個のクローンには、ナンセンス翻訳をもたらすフレームシフトが認められた。１３ｍＲＬライブラリでは、全体の多様性が約８×１０７種類の変異体と算出された。
【０１１６】
ＩＦ５Ａ‐ＯＢのライブラリを個々に作成した。「９ｍ」および「１１ｍ」ライブラリはそれぞれ、遺伝子に組み込んだ種々のロングオリゴヌクレオチド対を有する。１１ｍライブラリでは、ループ１／２を４つのアミノ酸（Ｓｅｒ‐Ａｓｎ‐Ｇｌｙ‐Ａｌａ）により伸長させて、ランダム化した断片の十分なオーバーラップをもたらした。小さなライブラリである２ＲＬおよび２ＲＬ＋２では、対応する領域をカバーする遺伝子に組み込んだランダム化した位置を含む１つのオリゴヌクレオチドを使用して、ループ領域内のランダム化した領域を作成した。９個および１１個の変異を有するＩＦ‐５Ａライブラリの多様性は、１×１０７種類の変異体と算出され、小さなライブラリ（４００個の変異体）の理論上の多様性は完全にカバーされた。
【０１１７】
（実施例６）  ＯＢフォールド変異タンパク質の発現
いずれの天然ＯＢフォールドドメインも大腸菌で良好に発現し（培養液の１０〜２０ｍｇ・ｌ−１）、細胞溶解後に大部分は可溶性を有する。これらは、熱処理（８５℃にて１５分間）後も可溶性を維持し、Ｎｉ‐ＮＴＡビーズに定量的に結合する。ＯＢフォールドライブラリをクローニングし、Ｎ末端をＨｉｓ６タグで結合したタンパク質として発現させた。一連のタンパク質特性を記録して、タンパク質の安定性と構造的完全性を検討した。
【０１１８】
ＰＣＲライブラリを９０〜９５％の効率（コロニーＰＣＲにより判定）で発現ベクターにクローニングし、ポリヒスチジン融合タンパク質として遺伝子を大腸菌に発現させた。４８個または９６個のコロニーを、発現、溶解性、およびＮｉ結合性についてスクリーニングした。結果を表４にまとめる。
【０１１９】
【表４】
2009539346.tif 000009
ａｓｐＲＳ‐ＯＢのライブラリ構築の概要を表４に示す。各ライブラリについて、ＰＣＲにより作成した遺伝子断片、オリゴヌクレオチド、および鋳型を列挙する。ＰＣＲにより、オリゴヌクレオチドを組み込んだ遺伝子断片を作成した。次に、遺伝子フランキングプライマー（オリゴ００５および００６）を使用したオーバーラップ伸長ＰＣＲによって、ＰＣＲ産物を完全長遺伝子に構築した。図２Ａ〜２Ｂも参照されたい。ａｓｐＲＳ‐ＯＢのすべてのライブラリに由来するクローンの約半分が、大腸菌内で良好に発現した。βシート上のランダム化した位置の数（すなわち、ライブラリを構築するためにランダム化した、結合表面上のアミノ酸位置の数）は、発現する変異体の割合と相関すると考えられた。１３個の変異を有するライブラリである１３ｍＲＬと１３ｍのいずれでも、変異タンパク質の約４５％が良好に発現する。βシート１および２上に９個の変異を含むライブラリは、クローンの５２％に発現を示す。ループ４／５のみをランダム化の標的とするライブラリは、８１％という極めて多い発現クローンを有していたが、面および伸長したループの両方に存在するランダム化位置の組み合わせ（１３ｍＲＬ＋２）では、発現クローンの数はわずか３０％まで低下した。
【０１２０】
ＩＦ５Ａ‐ＯＢの場合は、βシート上に変異を有するライブラリが、１２％という比較的低い割合で発現し、その内の９〜２５％が可溶性を有していた。対照的に、ループ１／２にのみランダム化した位置を有する変異体の７２〜８１％が発現し、この内の約７０％が可溶性を有していた。すべてのＩＦ５Ａ‐ＯＢ変異体を、溶解後に８０℃にて熱処理した。そのため、すべての可溶性かつＮｉ結合性の変異体は熱安定性も有していた。
【０１２１】
少数の変異体を調製用発現および精製用にピックアップした。さらに、ａｓｐＲＳ‐ＯＢ変異体の大規模な精製も行った。表５は、発現、溶解性、およびＮｉ‐ＮＴＡ結合性実験の概要を示す。
【０１２２】
【表５】
2009539346.tif 000010
各ライブラリの３２〜１９２個のコロニーを、発現、溶解性、およびＮｉ‐ＮＴＡへの結合性についてスクリーニングした。表５は、発現クローン数、各ライブラリで算出された発現クローンの割合を示し、発現ＯＢフォールド変異体の溶解性およびＮｉ‐ＮＴＡ結合特性の概算を表す。
【０１２３】
（実施例７）  ファージディスプレイ法に供したａｓｐＲＳ‐ＯＢの解析
ライブラリ作成用のスキャフォールドとしての、タンパク質ドメインの重要な基準は、選択されたディスプレイ系において機能的に提示される能力をもつことである。本明細書に開示する実験ではファージディスプレイを使用した。ａｓｐＲＳ‐ＯＢ変異体の選択用としてのこの技術の実現性を評価するため、繊維状バクテリオファージＭ１３の表面上にｇＩＩＩ融合体として提示させた組換え野生型ａｓｐＲＳ‐ＯＢを評価した。作成したファージ粒子内におけるｐＩＩＩ‐ａｓｐＲＳ‐ＯＢ融合体の存在をウェスタンブロッティングで解析した。提示されたａｓｐＲＳ‐ＯＢの機能的提示を、ａｓｐ‐ｔＲＮＡを標的リガンドとして使用するファージ結合アッセイで検討した。
【０１２４】
野生型ａｓｐＲＳ‐ＯＢの遺伝子を、ｇＩＩＩ遺伝子の上流でファージミドベクターｐＲＰＳＰ２にクローニングし、ａｓｐＲＳ‐ＯＢをＮ末端に持ち、ｐＩＩＩをＣ末端に有する融合タンパク質を作成した（図６を参照）。このファージミドベクターは、大腸菌ホストがヘルパーファージに感染すると活性化される、ファージショックプロモーター（ｐｓｐ）の制御下にあるｇＩＩＩを含む（３１）。ｇＩＩＩ欠失変異体であるヘルパーファージＶＣＳ‐Ｍ１３ｄ３（４４）を使用し、これにより、標的タンパク質の多価提示が可能になった。ｇＩＩＩタンパク質のすべてのコピー（３〜５コピー）は、標的タンパク質ａｓｐＲＳ‐ＯＢとの融合体になる。結合アッセイにおける感受性を高めるために多価提示を使用した（４８）。
【０１２５】
この構築物、ａｓｐＲＳ‐ＯＢの遺伝子を含むｐＲＰＳＰ２を、大腸菌ＴＧ１細胞に形質転換した。得られた培養物にＶｄ３ヘルパーファージを感染させ、形質導入粒子（ＴＤＰ）を作成した。これらの組換えバクテリオファージを回収し、ａｓｐＲＳ‐ＯＢとｐＩＩＩの間に位置するｃ‐ｍｙｃ抗原の配列（後掲の図を参照）に対する抗体を用いて、ウェスタン解析で標的タンパク質の提示についてテストした。これは、融合タンパク質ｐＩＩＩ‐ａｓｐＲＳ‐ＯＢに予測された大きさにおいて強いシグナルを示した。
【０１２６】
提示された野生型ＯＢフォールドがファージの表面上においてなお機能的であるかどうかをテストするため、ａｓｐＲＳ‐ＯＢを提示するこのファージ試料を使用して、固定化したａｓｐ‐ｔＲＮＡに対するファージ結合実験を行った。ａｓｐＲＳ‐ＯＢを提示するＴＤＰ試料を、磁気ビーズ上に固定化したａｓｐ‐ｔＲＮＡとともにインキュベートした。結合していないファージを洗浄し、ＲＮａｓｅＡを使用してｔＲＮＡの消化によって結合したファージを溶出させた。次に、溶出したファージの数を細菌感染によりカウントし、ビーズのみとインキュベートした試料から溶出した数と比較した。結合の特異性を示すため、＞１０００倍過剰量のＶＣＳ‐Ｍ１３野生型をＴＤＰ試料に添加し、溶出した粒子の数をカウントした。入力されたファージに対する、ｔＲＮＡから溶出したファージの割合を各試料について算出した。入力と結果を以下の表にまとめる。
【０１２７】
【表６】
2009539346.tif 000011
ａｓｐＲＳ‐ＯＢを提示するファージの回収（２．４×１０−２）は、ファージのみ（５．７×１０−４、図８を参照）と比べた場合約２００倍高かった。これは、固定化したａｓｐ‐ｔＲＮＡに対する、提示されたａｓｐＲＳ‐ＯＢの有意な親和性を示していた。タンパク質提示のないＶＣＳ‐Ｍ１３の場合では、固定化したｔＲＮＡと比較して、ビーズのみから溶出された粒子の割合は非常に類似しており（１：１．４２）、これはファージが非特異的に結合したことを示唆するものである。この割合は、ａｓｐＲＳ‐ＯＢを提示する粒子では非常に高く（１：１９０．４８）、このドメインのａｓｐ‐ｔＲＮＡに対する結合の特異性を示している。これらの結果は、ａｓｐＲＳ‐ＯＢは、ファージの表面に提示された場合に機能的にインタクトであること示す。
【０１２８】
（実施例８）  ライブラリの選択
ａｓｐ‐ｔＲＮＡでの選択
細菌性ａｓｐＲＳのアンチコドン結合ドメイン内のβシート４と５の間のループ領域は、ｔＲＮＡへの結合にとってだけでなく、アンチコドン内の塩基の特異的認識にとって重要である（４９）。そのため、ａｓｐ‐ｔＲＮＡは、ａｓｐＲＳ‐ＯＢライブラリの実現性をテストするのに好ましい標的であると考えられた。ライブラリａｓｐＲＳ‐ＯＢ  ＲＬを使用したが、これは、このライブラリが理論上の多様性の全範囲を含むため、ｔＲＮＡ標的と良好に結合することが予想された野生型ａｓｐＲＳ‐ＯＢフォールド配列のコピーを含むからである。たとえｔＲＮＡと結合する変異体がなかったとしても、少なくとも野生型はバイオパニングプロセスによって選択されるはずである。ａｓｐＲＳ‐ＯＢ  ＲＬ遺伝子ライブラリをすでに述べたように作成し、ｐＲＰＳＰ２にクローニングして約１０７のクローンを得て、ファージ上に一価提示させた。４回のパニング後、入力ファージに対する出力ファージの割合が表すように著しい濃縮が観察され、これは、標的特異性結合ドメインの濃縮を示すものである（図９）。選択されたフラクションからクローンを無作為にピックアップし、シークエンシングを行った。配列は、ａｓｐ‐ｔＲＮＡと結合するための、ループ領域内の４個のアミノ酸のコンセンサスＲ／Ｋ  Ｇ  Ｃ  Ｒを示した（図１０）。シークエンシングを行った１２のクローンのうち、５つがこのコンセンサスを完全に満たしており、残りの７つの内の３つは、４個のアミノ酸位置の３つが一致した。コンセンサス配列は野生型配列（ＩＡＫＳ）とは著しく異なり、新たなコンセンサス配列が、野生型ドメインと比べるとより強力にａｓｐ‐ｔＲＮＡと結合することを示唆している。これは、モノクローナルファージ調製品を使用するファージ結合実験において確認され、この実験では、２つのクローンが野生型ａｓｐＲＳ‐ＯＢよりもａｓｐ‐ｔＲＮＡに対して強い親和性を有していた（図１６）。この実験では、対応する変異ドメインを提示するファージを固定化ａｓｐ‐ｔＲＮＡとともにインキュベートした。結合したファージは、ＲＮａｓｅＡで特異的に溶出され、カウントされた。回収率Ｒを、［（出力／入力）Ｂ／（出力／入力）ＲＮＡ］として算出し、式中、（出力／入力）は、回収されたファージ（出力）を入力されたファージの数で割った比を意味し、下付き文字‘Ｂ’はビーズのみを意味し、下付き文字‘ＲＮＡ’は固定化ａｓｐ‐ｔＲＮＡを指す。ａｓｐＲＳ‐ＯＢ変異体から得られたファージライブラリから、固定化ａｓｐ‐ｔＲＮＡに対する結合親和性が向上したコンセンサス配列を我々が濃縮したことを結果は示している（図１０および１１）。
【０１２９】
‘ＲＬ’と比べるとさらなる多様性を有する大きなライブラリ‘１３ｍＲＬ’を使用して、同様の手法で固定化ｔＲＮＡに対する選択を行った。濃縮パターンは図９に示し、５回のパニング後の著しい濃縮を示す。配列解析を図１２にまとめる。選択された配列は、正に帯電したアミノ酸を高い割合で含んでおり、これは、負に帯電したａｓｐ‐ｔＲＮＡ骨格への結合によってそれらの変異体が選択されたことを示唆していた。塩基性残基の数が最も多かった変異体（Ｄ０７）は３回認められ、これは選択されたクローンのプール中に豊富に含まれることを示していた。選択されたクローンＤ０７およびＤ０９から調製された、固定化ａｓｐ‐ｔＲＮＡモノクローナルファージ試料でのファージ結合実験では、野生型ａｓｐＲＳ‐ＯＢドメインの数倍の数のこれらのクローンが回収され、提示された変異体のａｓｐ‐ｔＲＮＡに対する結合がより強固であることが示された。これらのファージ結合実験は精密な測定法ではないが、選択プロセスの成功を示し、ファージディスプレイを使用した固定化標的に対する選択に、ａｓｐＲＳ‐ＯＢライブラリが使用可能であることを示す。図１２中の選択されたクローンの全配列を付表ＩＩに示し、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ９、Ｓ６８、Ｓ８１、ｐＭＢ１６、ｐＭＢ１７、ｐＭＢ１２、ｐＭＢ１８、ｐＭＢ１５、Ｄ０５、Ｄ０７、Ｄ０９、Ｄ０４、Ｌ１４、Ｌ８、Ｌ４、Ｌ１６、Ｌ３４、Ｌ４２、Ｌ６、Ｌ５、またはＬ４４と定める。
【０１３０】
（実施例９）  リゾチームでの選択
別のタンパク質に結合する、ナイーブライブラリ由来のＯＢフォールド変異ドメインの選択の原理の証明を示すため、リゾチームを標的として選択した。ニワトリ卵白リゾチームは、販売されている安定した小さいタンパク質であり、多くの医学的に重要なヒトホモログを有する。固定化リゾチームでの４回のパニング後、結合したファージの濃縮が観察された。クローンを無作為にピックアップし、リゾチームに対する結合についてスクリーニングする前に、さらに２回のパニングを行った。次に、モノクローナルファージ試料を調製し、９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレート上に固定化したリゾチームでの結合を特性化するために‘マイクロパニング’手法で検討を行った。結合したファージを溶出しカウントした。２２のクローンのうち９つは、ｐＩＩＩ、ＯＢ野生型、およびＢＳＡバックグラウンドを上回る回収ファージ数を示した（クローンＬ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ８、Ｌ１４、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｌ１８、Ｌ２１、図１３）。これらのクローンのシークエンシングを行った。クローンのうちいくつかの配列は同一であったため（Ｌ１４とＬ１５、Ｌ４とＬ１８、Ｌ８とＬ２１）、ユニークなクローンの数は６つに絞り込まれた。この重複性は、濃縮によって、同一配列を有するクローンが試料中に高い割合で存在することを示していた。さらに２回のパニングを行い、さらなる６つのクローンの配列決定を行った（Ｌ３２、Ｌ３３、Ｌ３４、Ｌ４２、Ｌ４３、Ｌ４４）。３つの配列が前回のクローンと一致した（Ｌ３２＝Ｌ１４＝Ｌ１５、Ｌ３３＝Ｌ８＝Ｌ２１＝Ｌ４３）が、Ｌ４４は、βシート領域においてＬ５と同一であったが、ループ領域では異なるパターンを示した。Ｌ３４およびＬ４２は新たな配列であった。６回の後の選択されたプール中のクローンの数は非常に少なく、図１２、パネルＥに示す９つの配列によってかなりの程度がカバーされることが予想できる。クローンＬ１４（Ｌ３２、Ｌ１５）、Ｌ８（Ｌ３３、Ｌ２１、Ｌ４３）、Ｌ３４、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６を、多価提示を使用するＥＬＩＳＡ手法での結合研究の対象とした（図１４）。結果は、すべてのクローンがリゾチームに結合したが、ａｓｐＲＳ‐ＯＢの提示がない粒子（ｐＩＩＩ）は結合しなかったことを示した。その他の陰性対照には野生型ａｓｐＲＳ‐ＯＢ（ＯＢｗｔ）が含まれた。解析されたすべてのクローンのリゾチームへの結合数は、ＲＮａｓｅまたはＢＳＡに対してのものより多く（ＥＬＩＳＡ実験でＯＤ値がより高かった）、リゾチームに対する結合の特異性を示す。図１１に示すように、クローンＬ６およびＬ３３はｔＲＮＡに結合しなかった。
【０１３１】
（実施例１０）  精製した変異体の発現と解析
クローンＬ４（Ｌ１８）、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ１６、およびＬ３３（Ｌ２１）を発現ベクターにサブクローニングし、‘プルダウン’アッセイでのリゾチーム結合の解析用にＧＳＴ融合タンパク質として発現させた。図１５Ａ〜１５Ｂに示すように、固定化した変異体はリゾチームと結合したが、非選択変異体１３ｍＲＬ８１は結合しなかった。これは、選択された変異体のリゾチームへの結合を確認するものであった。Ｌ６のリゾチームへの結合を、異なるバッファーの存在下で研究した。図１５Ｂは、５００ｍＭのＮａＣｌでの洗浄後に、Ｌ６がリゾチームと結合することを示す。クローンＬ６を発現させ、精製し、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して固定化リゾチーム上での結合反応速度を解析した。結合定数は３．６×１０−５Ｍと算出された（図１６）。
【０１３２】
これらの実験は、ランダム化したコドンを含む、ＯＢフォールドドメインの大きな合成ライブラリの作成を示し、また、これらのライブラリから転写された変異タンパク質が安定で、折りたたまれていることを示す。ＯＢフォールドドメインの機能的提示がファージの表面で提示され、そのため選択した異なる機能について効率的にライブラリをスクリーニングできる。ファージディスプレイを使用した、ＯＢフォールドライブラリからの改変ＯＢフォールドドメインの選択が示される。これらの変異体は、選ばれた結合相互作用であれ、酵素活性であれ、所望の特性を持たなくてはならない。本明細書で示されるように、多様性のキャリアーとしてＯＢフォールドが機能し得ることを示すために、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来のアスパラギン酸ｔＲＮＡシンテターゼ（ＡｓｐＲＳ）のｔＲＮＡアンチコドン結合ドメインを、ＯＢフォールドのスキャフォールドとして選択した。結果は、本明細書に開示する方法を適用することで、このｔＲＮＡアンチコドン結合ドメインを特異的なタンパク質結合分子に変換し得ることを示す。
【０１３３】
タンパク質のフレームワークに組み込んだそれぞれの変異は、その折りたたみに影響を与える可能性があり、そのためその安定性と溶解性にも影響する可能性がある。タンパク質のフレームワーク内の変異に対する耐性を理解するため、異なる変異部位のセット、または組み合わせを含むライブラリを作製し、無作為にピックアップされた変異の発現および溶解性についてスクリーニングした。無制限の多様性を有するライブラリを計画し、作成した。このようなナイーブライブラリは、ランダム化によるすべての可能な組み合わせの変異を含む。分子内の特定の部位に存在する好ましくないアミノ酸の組み合わせに起因する安定性、フォールディング、または溶解性のいずれかの理由のために、多数の変異体が耐性を示さないであろうことが予想される。１３をβシート（βストランド１〜３）上に１３、ストランド４と５の間のループに４つ、１７のランダムなアミノ酸位置を結合表面に有するａｓｐＲＳ‐ＯＢ由来のライブラリを作製した。個々のβストランドまたはループ領域のみを扱う変異のセットを有するライブラリを作製した。
【０１３４】
改変ＯＢフォールドドメインのライブラリを、発現および溶解性についてスクリーニングすると、１７の変異を含むａｓｐＲＳ‐ＯＢのライブラリ内のすべての変異体の約１６％が過剰発現していて、可溶性を有することが見出され、さらにＮＭＲおよびＣＤスペクトロスコピーによって示されるように、少数の選択された変異が正確に折りたたまれることが証明された。これは、このライブラリのかなりの割合を、目的の標的に対しての選択に使用可能であることを示す。ａｓｐＲＳ‐ＯＢライブラリの１３ｍＲＬとＲＬを、ファージディスプレイライブラリとして構築した。１３ｍＲＬの実用上の多様性は、約８×１０７種のクローンであり、１７のランダム位置の可能な組み合わせ（理論上の多様性）である約５×１０２２のごくわずかに相当する。ＲＬの多様性はわずか１．６×１０５（４つのランダム位置）であり、形質転換後の約１×１０７のクローンによって完全にカバーされることが予想される。無作為にピックアップしたクローンのシークエンシングによって、ライブラリの多様性が確認された。
【０１３５】
ファージディスプレイは最も一般的に使用されるディスプレイ技術であり、そのためａｓｐＲＳ‐ＯＢのスキャフォールドのディスプレイに好都合である。ファージの表面でのａｓｐＲＳアンチコドン結合ドメインの提示、またはその他の一般的なＯＢフォールドドメインの提示の報告はない。ファージでのタンパク質の提示には、提示されたタンパク質の完全性のみならず、宿主細胞の増殖に影響を与える可能性がある複数の工程が必要となる。細胞質内での合成後、細胞の還元環境下でタンパク質は安定でなければならず、またｐＩＩＩファージタンパク質への融合に影響を受けないものでなくてはならない。次に、ファージ粒子全体が培養液中に放出される前に、ペリプラズムの酸化環境によって、融合タンパク質がファージ構築の標的となる。あらゆるタンパク質について、このプロセスは複数の段階における環境との相互作用を必要とし、また、もしアンチコドン結合ドメイン由来のスキャフォールドの場合は、宿主の核酸への結合も考慮しなくてはならない。Ｍ１３ファージ上に提示されたａｓｐＲＳ‐ＯＢの検出（ウェスタン解析による）は、良好な発現を示した。ａｓｐＲＳ‐ＯＢライブラリＲＬと、さらに大きい１３ｍＲＬの検出（同じくウェスタンブロッティングによる）では、ファージ上での提示効率ははるかに悪かった。この観察結果は、ナイーブランダムライブラリ内に不安定な変異体が多いことで説明される。これらのデータは、大腸菌の細胞質またはペリプラズムにおける、好ましくない変異体のタンパク質分解を示唆し、これはプロテインＡ由来のＺドメインの研究において以前に観察された効果である（５０）。これは、発現および溶解性のスクリーニングで得られた結果とも相関する。他のスキャフォールドでは、ファージ提示ライブラリでより微弱なシグナルが認められた（炭水化物結合ドメイン、（５１）、セルロース結合ドメイン、（５２））。将来的なライブラリのライブラリデザインは、分解に対する提示される融合体の割合を増加させるためには、この要素を考慮に入れる必要があるだろう。これはナイーブランダムライブラリの一般的な問題であり、ＯＢフォールドにのみ観察される現象ではない。
【０１３６】
ａｓｐ‐ｔＲＮＡでの選択
ナイーブ標的ａｓｐ‐ｔＲＮＡでのファージ結合および選択実験は、Ｍ１３ファージ上でのａｓｐＲＳ‐ＯＢとその誘導体ライブラリの良好かつ機能的な提示を示した。小さいＲＬライブラリから、モノクローナルパニング実験において示されるように、野生型より高い親和性を有する変異体に相当するコンセンサス配列が得られた。得られたコンセンサス配列Ｒ／Ｋ  Ｇ  Ｃ  Ｒは野生型配列とは異なり、２つの正に帯電したアミノ酸を含んでおり、負に帯電するＲＮＡ骨格への結合を示唆する。このループ領域内のグリシンの存在によってループの柔軟性が確保されている可能性があるが、システインの機能は未だに明らかでない。
【０１３７】
非選択クローンの配列はａｓｐＲＳ‐ＯＢライブラリの多様性を示し、選択後の、コンセンサス配列に一致するクローンから得られた配列は対応するＤＮＡコドンのバリエーションを示し、これは遺伝子型よりも表現型に対する選択を示していた。ライブラリ１３ｍＲＬの多様性の範囲が非常に限られていたために、ａｓｐ‐ｔＲＮＡで選択されたクローンの少数の配列からはコンセンサスは得られなかった。実用上の多様性が約１０８クローンであるが、理論上の多様性が約１０２２であるため、これは予想される。そのため、ファージライブラリの多様性の範囲は、理論上可能なそれのごくわずかにすぎない。シークエンシングを行ったすべてのクローンにおいて、多数の正に帯電した残基が観察され（Ｄ０７で９つ、Ｄ０５で５つ、Ｄ０９で６つ）、負に帯電したＲＮＡ骨格への結合による、正に帯電した残基の選択を示す。２つの変異体（Ｄ０７、Ｄ０４）に起こっていたモチーフＲ  Ｘ  Ｇ  Ｓは、野生型ａｓｐＲＳ‐ＯＢの場合と同様に、ｔＲＮＡ結合におけるループの重要な役割を示唆する。モノクローナルファージ試料を使用した結合実験は、野生型ドメインよりも強い、ａｓｐ‐ｔＲＮＡへの結合を示した。これは、固定化標的への結合の際に選択が起こるという結論を裏付けるものであり、我々のＯＢフォールドのスキャフォールドがファージでの提示およびバイオパニングプロセスに非常に適していることを示していた。
【０１３８】
リゾチームでの選択
ニワトリ卵白リゾチームで１３ｍＲＬライブラリの選択を行った。複数回のパニング後、多数のクローンを単離し、配列と標的分子への結合について解析した。プレスクリーニング段階での２２のクローンのうち、ファージＥＬＩＳＡ実験において、最終的に６つがリゾチームに対する検出可能な結合を示した。１４のクローンの配列試験で、２つが２回、また、１つは４回も検出されたことが明らかになった。これは、選択されたフラクションに存在する異なるクローンの数が適度に少ないことを示唆する。９つの異なるクローンの配列は、それらの組成における類似性を示していた。少数の位置はいくつかの興味深い類似性を示しており、例えば９つのうち６つのクローンで２９番は酸性の残基（ＤまたはＥ）であり、９つの配列のうち５つで３１番はバリンであり、３５番には正に帯電した残基が４つのクローンで現れ、５例において３８番は芳香族残基（Ｙ、Ｆ、Ｗ）であり、さらに、５つのクローンで８５番はグリシンである。また、βストランド３では、ＥＴＥＴおよびＰＥＴＥという目を引くパターンがクローンＬ１６およびＬ３４に存在し、βストランド１では、Ｄ  Ｖ／Ｌ  Ａ／ＬがＬ３２、Ｌ２、Ｌ６、Ｌ５、Ｌ４４に存在する。さらに目を引くのは、βシートにおけるＬ５とＬ４４の同一性であるが、ループ領域は異なる。Ｌ６を除くすべての変異体にシステインは存在しない。しかし、より明確なコンセンサス配列は得られず、これはおそらく非常に大きなライブラリの範囲が狭いことと、得られた配列の少なさに起因する。複数のクローンをＧＳＴ融合タンパク質として発現、精製し、プルダウン実験で解析すると、リゾチームへのクローンの結合が示された。クローンＬ６は、５００ｍＭの塩化ナトリウムの存在下であっても結合し、妥当な親和性の結合を示した。クローンＬ６を発現、精製し、結合の反応速度および熱力学を表面プラズモン共鳴によって解析したところ、約３．６×１０−５ＭのＫｄを示した。このナイーブライブラリのサイズの小ささと組成を考慮すると、μＭレンジの結合定数は非常に重要な結果であり、アフィニティーマチュレーション工程による最適化に対して優れた出発点を提供する。
【０１３９】
（実施例１１）  リゾチームとの複合体のＯＢｏｄｙ  Ｌ８の３次元構造
ＧＡＴＥＷＡＹ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、Ｌ８をｐＤＯＮＲ２２１にクローニングした後、発現ベクターｐＤＥＳＴ１５にサブクローニングし、これをＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞に形質転換した。これらの細胞を、５００ｍＬの自動誘導培地に播種し、２Ｌ容量のバッフル付きフラスコ内で３７℃にて振盪した。ＧＳＨアフィニティーカラム（ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、細菌溶解物から融合タンパク質ＧＳＴ‐Ｌ８を精製し、ｒＴＥＶプロテアーゼを使用してＧＳＴタグを取り除き、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓ７５  １６／６０分取用、ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によりＬ８から分離した。次に、溶液中での単分散を向上させるため、再びサイズ排除（Ｓ７５  １０／３００分析用、ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により、Ｌ８の３回目の精製を行った。
【０１４０】
精製タンパク質をＧａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ卵白リゾチーム（Ｒｏｃｈｅ）と約１：１のモル比で混合し、ＴＢＳ（２５ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭＫＣｌ）中での最終濃度が、Ｌ８が３７．５ｍｇ／ｍＬ、リゾチームが４２．９ｍｇ／ｍＬとなるようにした。カスタムスクリーンとシッティングドロップフォーマットを使用して、溶液中の複合体を４８０の結晶化条件についてスクリーニングした。
【０１４１】
単一の大きな結晶が、ＴＢＳ中のタンパク質と沈殿剤（７％ＭＰＥＧ  ５Ｋ、０．２ＭＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．８）の等量混合物から成長した。次にこの結晶を、ナイロンループで収集し、抗凍結剤でコーティングして、低温窒素ガス（１１０Ｋ）の気流中で凍結させた。回転陽極型Ｘ線発生装置と最高２．８Åの回折を生じるＭａｒ３４５検出器を使用して、７００枚の画像のデータセットを収集した。ＤＥＮＺＯを使用して画像を指数化し、Ｓｃａｌｅｐａｃｋを使用してデータのスケーリングを行った。データ収集統計値については、表を参照されたい。リゾチーム（ＰＤＢエントリー１９３Ｌ）およびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ＫｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓのアスパルチルｔＲＮＡシンテターゼ（ＰＤＢエントリー１Ｂ８Ａ）由来のＯＢフォールドコドン認識ドメインの両方をモデルとして組み込んだ分子置換法（ＡＭｏＲｅ）を使用して、構造を解明した。１つのＯＢフォールドドメインとともに２つのリゾチーム分子が非対称単位内に認められた。２つ目のリゾチーム分子の位置を基に非対称単位内に複合体を複製することにより、２つ目のＯＢフォールドを配置した。構造を繰り返し構築し、ＣＯＯＴ、ＣＣＰ４、およびＰＨＥＮＩＸを使用して精密化した。２つ目のデータセットは、ＳＳＲＬで同じ結晶を使用して最高２．６９Åの分解能で収集した。これを同じ空間群に指数化し、前述の構造から得た完全な単位格子を使用して、分子置換法により位相を決定した。構築と精密化は、ＣＯＯＴ、ＣＣＰ４、およびＰＨＥＮＩＸを使用して行った。
【０１４２】
【表７】
2009539346.tif 000012
【０１４３】
【表８】
2009539346.tif 000013
付表Ｉ
【０１４４】
【表９−１】
2009539346.tif 000014
Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来のａｓｐＲＳとＩＦ‐５Ａの野生型ＯＢフォールドのＰＣＲ増幅用オリゴヌクレオチド
【０１４５】
【表９−２】
2009539346.tif 000015
Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来のａｓｐＲＳ‐ＯＢに基づく、ＰＣＲによるライブラリ構築用オリゴヌクレオチド
【０１４６】
【表９−３】
2009539346.tif 000016
Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来のＩＦ５Ａ‐ＯＢに基づく、ＰＣＲによるライブラリ構築用オリゴヌクレオチド
付表ＩＩ
各種Ｏｂｏｄｙのアミノ酸配列。配列のナンバリングは、図１０および図１２のナンバリングと一致する。
【０１４７】
【表１０−１】
2009539346.tif 000017
【０１４８】
【表１０−２】
2009539346.tif 000018
参考文献
【０１４９】
【化４】
2009539346.tif 000019
【０１５０】
【化５】
2009539346.tif 000020
【０１５１】
【化６】
2009539346.tif 000021
【０１５２】
【化７】
2009539346.tif 000022
【図１Ａ】
2009539346.tif 000023
【図１Ｂ】
2009539346.tif 000024
【図１Ｃ】
2009539346.tif 000025
【図２Ａ】
2009539346.tif 000026
【図２Ｂ】
2009539346.tif 000027
【図３】
2009539346.tif 000028
【図４】
2009539346.tif 000029
【図５Ａ】
2009539346.tif 000030
【図５Ｂ】
2009539346.tif 000031
【図５Ｃ】
2009539346.tif 000032
【図６】
2009539346.tif 000033
【図７】
2009539346.tif 000034
【図８】
2009539346.tif 000035
【図９】
2009539346.tif 000036
【図１０】
2009539346.tif 000037
【図１１】
2009539346.tif 000038
【図１２】
2009539346.tif 000039
【図１３】
2009539346.tif 000040
【図１４】
2009539346.tif 000041
【図１５】
2009539346.tif 000042
【図１６】
2009539346.tif 000043
【図１７】
2009539346.tif 000044
【図１８】
2009539346.tif 000045
【図１９】
2009539346.tif 000046
【配列表】
2009539346000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成21年3月10日(2009.3.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009539346000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年3月11日(2009.3.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
この出願は、２００６年５月２６日に出願された表題「ＯＢ  Ｆｏｌｄ  Ｄｏｍａｉｎｓ」の米国仮特許出願第６０／８０９，１０５号の優先権の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
分子認識は、シグナル伝達経路の高親和性のタンパク質‐リガンド相互作用からより一過性のタンパク質‐タンパク質認識事象までに至る生物学的プロセスの中心をなす。このような事象は、生物の進化に伴い新たな役割に適応しているタンパク質の多様性に依存する。一例として、外来抗原を捕らえるために、（約１０７個の変異体を含む）免疫系のナイーブライブラリに由来する少数の抗体が、抗原を認識し、中等度の親和性でその抗原に結合する。選択とマチュレーションによってさらなる変異が導入され、抗原の除去に必要な強固で特異的な結合がもたらされる。このようにして、膨大な数の結合様式を基本的な抗体スキャフォールドにグラフトして、小分子から細胞全体までの種々の標的を捕捉することができる。
【０００３】
この方式を実験室で繰り返して、抗体変異体の非常に大きなライブラリ（１０１０種類を超えるクローン）（２、３）を作成することが可能であり、次いで特定の標的に対する結合についてこれらを選択することができる。増幅と結合選択のサイクルを繰り返し行うことで、強固で特異的な分子結合特性を有する試験管抗体を「発見」することができる。このｉｎ  ｖｉｔｒｏ手法はまた他のスキャフォールドにも適用することができる。例えば、成長ホルモンおよび増殖因子ヘレグリンとそれらの各受容体との結合を研究および改善するに当たっては、ファージディスプレイ法によるランダム化と選択がこれまで使用されており（４、５）、ブドウ球菌タンパク質Ａ由来の３本へリックスバンドルドメインのライブラリからは「Ａｆｆｉｂｏｄｙ」が開発されている（６、７）。この全般的な領域がいくつかのレビューでテーマとなっている（８〜１０）。
【０００４】
ＯＢフォールドドメインは一般的に、広範なタンパク質に認められる小さな構造モチーフであり、その名前は元々、それ自体が有するオリゴヌクレオチド‐オリゴ糖結合特性に由来している。ＯＢフォールドドメインは５つのストランドからなる閉鎖型βバレルであり、大多数のＯＢフォールドドメインタンパク質は、リガンド結合にまたは活性部位として同じ面を使用する。種々のＯＢフォールドドメインは、オリゴ糖、オリゴヌクレオチド、タンパク質、金属イオン、および触媒基質の結合にこの「フォールド関連結合表面」を使用する。ＯＢフォールドドメインについては、例えば、非特許文献１および非特許文献２に記載されている。特許文献１には、結合特性を有するβプリーツシートタンパク質の記載がある。
【０００５】
本明細書で引用されるすべての特許、特許出願、特許出願公開、学術刊行物、およびその他の刊行物は、全体が参考として本明細書で援用される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】カナダ特許公開第２３７８８７１号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ａｒｃｕｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，（２００２）Ｖｏｌ．１２：７９４‐８０１
【非特許文献２】Ｔｈｅｏｂａｌｄ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．，（２００３）Ｖｏｌ．，３２：１１５‐３３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要旨
本発明は、所望の特性を有する改変ＯＢフォールドドメイン、および改変ＯＢフォールドドメインのライブラリを作製する方法を提供する。本発明はまた、このような方法によって作成される改変ＯＢフォールドドメインのライブラリ、およびこのような改変ＯＢフォールドドメインのライブラリを所望の生物活性についてスクリーニングする方法も提供する。さらに、本発明は、このようなライブラリから同定される改変ＯＢフォールドドメインも提供する。本明細書ではまた、改変された結合相互作用を示す、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍから得られる改変ＯＢフォールドドメインも提供される。改変ＯＢフォールドドメインは、天然ＯＢフォールドドメインと比較して、同じ基質に結合することもできれば、あるいは天然ＯＢフォールドドメインと比較して、異なる基質に結合することもでき、あるいは天然ＯＢフォールドドメインと比較して、同じ基質と異なる基質の両方に結合することもできる。あるいは、天然ＯＢフォールドドメインと結合する既知の基質がない改変ＯＢフォールドドメインを作成することもでき、この改変ＯＢフォールドドメインは基質と結合する。
【０００９】
したがって、一態様において、本発明は、天然ＯＢフォールドドメインから得られる単離された改変ＯＢフォールドドメインであって、前記改変ＯＢフォールドドメインが、ａ）天然ＯＢフォールドドメインと比較して、ＯＢフォールドドメイン結合表面のβストランド内の少なくとも１つの改変アミノ酸残基、またはｂ）ＯＢフォールドドメイン結合表面のβストランド内の少なくとも１つの改変アミノ酸残基、およびＯＢフォールドドメインループ領域のストランド内の少なくとも１つの改変アミノ酸残基、またはｃ）ＯＢフォールドドメインループ領域のストランド内の少なくとも１つの改変アミノ酸残基を含み、前記改変ＯＢフォールドドメインが、天然ＯＢフォールドドメインと比較して、変化した結合特性を有する、改変ＯＢフォールドドメインである。一実施形態において、天然ＯＢフォールドドメインの結合パートナーが既知である場合に、本発明は、改変ＯＢフォールドドメインであって、前記ドメインが、天然ＯＢフォールドドメインとは異なる結合パートナーに特異的に結合するか、あるいはその天然に存在する結合パートナーとの改変された結合を有する、改変ＯＢフォールドドメインである。別の実施形態において、改変された結合は、対応する天然ＯＢフォールドドメインと比較して、改変ＯＢフォールドドメインとその天然に存在する結合パートナーとの解離定数における少なくとも約２５％、約５０％、または約７５％の低下を含む。別の実施形態において、改変された結合は、対応する天然ＯＢフォールドドメインと比較して、改変ＯＢフォールドドメインとその天然に存在する結合パートナーとの解離定数における少なくとも約２分の１、約３分の１、約４分の１、約５分の１、約６分の１、約８分の１、約１０分の１、約１５分の１、約２０分の１、約２５分の１、約５０分の１、約１００分の１、約２００分の１、約５００分の１、約１０００分の１、約５０００分の１、約１０，０００分の１、約５０，０００分の１、または約１００，０００分の１の低下を含む。別の実施形態において、本発明は、天然ＯＢフォールドドメインが、以下からなる群から選択されるタンパク質またはタンパク質クラスに生じる、改変ＯＢフォールドドメインである：ブドウ球菌ヌクレアーゼタンパク質、細菌性エンテロトキシン、ＴＩＭＰ様タンパク質、ヘムシャペロンＣｃｍＥタンパク質、尾結合リゾチームｇｐ５、Ｎ末端ドメインタンパク質、核酸結合タンパク質、無機ピロホスファターゼ、Ｍｏｐ様タンパク質、ＣｈｅＷ様タンパク質、ｔＲＮＡ＿ａｎｔｉ（ＯＢフォールド核酸結合ドメイン）、Ｔｅｌｏ＿ｂｉｎｄ（テロメア結合タンパク質αサブユニット、中心ドメイン）、ＳＳＢ（一本鎖結合タンパク質ファミリーのＯＢフォールドドメイン）、ＤＵＦ３３８のＯＢフォールドドメイン、ＤＮＡ＿ｌｉｇａｓｅ＿ａｄｅｎ＿（ＮＡＤ依存性ＤＮＡリガーゼＯＢフォールドドメイン）、Ｓｔａｐ‐Ｓｔｒｐ毒素（ブドウ球菌／連鎖球菌毒素、ＯＢフォールドドメイン）、ＥＩＦ‐５ａ（真核生物開始因子５Ａ  Ｈｙｐｕｓｉｎｅ、ＤＮＡ結合ＯＢフォールドドメイン）、ＧＰ５＿ＯＢ（ＧＰ５  Ｎ末端ＯＢフォールドドメイン）、ＣＳＤ、ＤＮＡ＿ｌｉｇａｓｅ＿ＯＢ、ＤＵＦ３８８、ＥＦＰ、��ＩＦ‐１ａ、ｍＲＮＡ＿ｃａｐ＿Ｃ、ＯＢ＿ＲＮＢ、Ｐｈａｇｅ＿ＤＮＡ＿ｂｉｎｄ、Ｒｅｐ‐Ａ＿Ｎ、Ｒｈｏ＿ＲＮＡ＿ｂｉｎｄ、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ＿Ｌ２、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ＿Ｓ１２、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ＿Ｓ１７、ＲＮＡ＿ｐｏｌ＿Ｒｐｂ８、ＲｕｖＡ＿Ｎ、Ｓ１、ＴＯＢＥ、ＴＯＢＥ＿２、およびｔＲＮＡ＿ｂｉｎｄ。別の実施形態において、本発明は、天然ＯＢフォールドドメインが好熱性生物に由来する、改変ＯＢフォールドドメインである。さらに別の実施形態において、本発明は、好熱性生物がＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍである、改変ＯＢフォールドドメインである。別の実施形態において、本発明は、改変アミノ酸残基が、結合表面のβストランド内に存在する、改変ＯＢフォールドドメインである。
【００１０】
改変ＯＢフォールドドメインの結合パートナーは、核酸、オリゴ糖、タンパク質、ホルモン、および有機小分子からなる群から選択される場合がある。
【００１１】
別の態様において、本発明は、改変ＯＢフォールドドメインを取得する方法であって、ａ）結合表面のストランドおよび／またはループのストランドを含む、天然ＯＢフォールドドメインをコードするまたはその一部分をコードする核酸を取得する工程と、ｂ）天然ＯＢフォールドドメインと比較して、結合表面のβストランド上の少なくとも１つの改変アミノ酸残基および／またはループのストランド上の少なくとも１つの改変アミノ酸残基をコードするように核酸を変化させる工程とを含み、改変ＯＢフォールドドメインが得られ、改変ＯＢフォールドドメインが、天然ＯＢフォールドドメインと比較して、変化した結合を有する、方法である。別の実施形態において、天然ＯＢフォールドドメインの結合パートナーが既知である場合に、改変された結合は、対応する天然ＯＢフォールドドメインと比較して、改変ＯＢフォールドドメインとその天然に存在する結合パートナーとの解離定数における少なくとも約２５％、約５０％、または約７５％の低下を含む。別の実施形態において、改変された結合は、対応する天然ＯＢフォールドドメインと比較して、改変ＯＢフォールドドメインとその天然に存在する結合パートナーとの解離定数における少なくとも約２分の１、約３分の１、約４分の１、約５分の１、約６分の１、約８分の１、約１０分の１、約１５分の１、約２０分の１、約２５分の１、約５０分の１、約１００分の１、約２００分の１、約５００分の１、約１０００分の１、約５０００分の１、約１０，０００分の１、約５０，０００分の１、または約１００，０００分の１の低下を含む。一実施形態において、前記方法は、改変ＯＢフォールドドメインをコードする核酸を変化させる工程、および／または改変ＯＢフォールドドメインを含むタンパク質の少なくとも１つのアミノ酸をコードする核酸を変化させる工程もさらに含む。
【００１２】
別の態様において、本発明は、ディスプレイのための改変ＯＢフォールドドメインタンパク質のライブラリを作製する方法であって、ａ）ＯＢフォールドドメインまたはその一部分をコードする核酸を取得する工程と、ｂ）その核酸をランダムな変化に供することにより、少なくとも１つのランダム化したアミノ酸残基を有する改変ＯＢフォールドドメインをコードする変化させた核酸の集合体を生成する工程とを含む。一実施形態において、本発明は、ディスプレイのための改変ＯＢフォールドドメインタンパク質のライブラリを作製する方法であって、核酸が、ＯＢフォールドドメイン結合表面のストランドおよび／またはＯＢフォールドドメインのループのストランドの少なくとも１つのアミノ酸残基をコードする、方法を提供する。別の実施形態において、前記方法は、改変ＯＢフォールドドメインをコードする変化させた核酸のライブラリを、前記改変ＯＢフォールドドメインをその表面に提示し得る宿主細胞またはウイルス粒子の集団に導入する工程もさらに含む。
【００１３】
別の態様において、本発明は、天然ＯＢフォールドドメインから得られる改変ＯＢフォールドドメインをコードする単離された核酸であって、前記改変ＯＢフォールドドメインが、ａ）天然ＯＢフォールドドメインと比較して、ＯＢフォールドドメイン結合表面のβストランド内の少なくとも１つの改変アミノ酸残基、またはｂ）ＯＢフォールドドメイン結合表面のβストランド内の少なくとも１つの改変アミノ酸残基、およびＯＢフォールドドメインループ領域のストランド内の少なくとも１つの改変アミノ酸残基、またはｃ）ＯＢフォールドドメインループ領域のストランド内の少なくとも１つの改変アミノ酸残基を含み、前記改変ＯＢフォールドドメインが、天然ＯＢフォールドドメインと比較して、変化した結合特性を有する、核酸を提供する。別の実施形態において、天然ＯＢフォールドドメインの結合パートナーが既知である場合に、変化した結合特性は、対応する天然ＯＢフォールドドメインと比較して、改変ＯＢフォールドドメインとその天然に存在する結合パートナーとの解離定数における少なくとも約２５％、約５０％、または約７５％の低下を含む。別の実施形態において、変化した結合特性は、対応する天然ＯＢフォールドドメインと比較して、改変ＯＢフォールドドメインとその天然に存在する結合パートナーとの解離定数における少なくとも約２分の１、約３分の１、約４分の１、約５分の１、約６分の１、約８分の１、約１０分の１、約１５分の１、約２０分の１、約２５分の１、約５０分の１、約１００分の１、約２００分の１、約５００分の１、約１０００分の１、約５０００分の１、約１０，０００分の１、約５０，０００分の１、または約１００，０００分の１の低下を含む。
【００１４】
別の態様において、本発明は、上述の改変ＯＢフォールドドメインの核酸をコードする核酸を含む、宿主細胞またはウイルス粒子を提供する。さらに別の態様において、本発明は、上述の改変ＯＢフォールドドメインの核酸をコードする核酸を含む組成物を提供する。
【００１５】
別の態様において、本発明は、改変ＯＢフォールドドメインのライブラリを、結合パートナーとの結合についてスクリーニングする方法であって、ａ）改変ＯＢフォールドドメインのライブラリをその表面に提示する宿主細胞またはウイルス粒子の集団を取得する工程と、ｂ）結合パートナーと改変ＯＢフォールドドメインとの結合に適した条件下で、宿主細胞またはウイルス粒子の集団を結合パートナーと接触させる工程と、ｃ）結合パートナーと改変ＯＢフォールドドメインとの結合を決定する工程とを含む、方法を提供する。一実施形態において、宿主細胞またはウイルス粒子は、改変ＯＢフォールドドメインをその表面に提示するファージである。
【００１６】
別の態様において、本発明は、改変ＯＢフォールドドメインのファージライブラリであって、改変ＯＢフォールドドメインがＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍから得られる、ファージディスプレイを提供する。
【００１７】
別の態様において、本発明は、細胞またはウイルス粒子の表面に提示される改変ＯＢフォールドドメインを提供する。一実施形態において、細胞またはウイルス粒子は、ファージ、細菌、または酵母である。
【００１８】
別の態様において、本発明は、固体支持体に結合した改変ＯＢフォールドドメインを提供する。一実施形態において、支持体は、ビーズ、ガラス、スライド、チップ、およびゼラチンからなる群から選択される。
【００１９】
別の態様において、本発明は、付表ＩＩに列挙する、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ９、Ｓ６８、Ｓ８１、ｐＭＢ１６、ｐＭＢ１７、ｐＭＢ１２、ｐＭＢ１８、ｐＭＢ１５、Ｄ０５、Ｄ０７、Ｄ０９、Ｄ０４、Ｌ１４、Ｌ８、Ｌ４、Ｌ１６、Ｌ３４、Ｌ４２、Ｌ６、Ｌ５、またはＬ４４という名称の配列を有する改変ＯＢフォールドドメインタンパク質を提供する。別の態様において、本発明は、付表ＩＩに列挙する、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ９、Ｓ６８、Ｓ８１、ｐＭＢ１６、ｐＭＢ１７、ｐＭＢ１２、ｐＭＢ１８、ｐＭＢ１５、Ｄ０５、Ｄ０７、Ｄ０９、Ｄ０４、Ｌ１４、Ｌ８、Ｌ４、Ｌ１６、Ｌ３４、Ｌ４２、Ｌ６、Ｌ５、またはＬ４４という名称の配列との約９０％、約９５％、約９８％、または約９９％の配列相同性を有するタンパク質を提供する。別の態様において、本発明は、付表ＩＩに列挙する、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ９、Ｓ６８、Ｓ８１、ｐＭＢ１６、ｐＭＢ１７、ｐＭＢ１２、ｐＭＢ１８、ｐＭＢ１５、Ｄ０５、Ｄ０７、Ｄ０９、Ｄ０４、Ｌ１４、Ｌ８、Ｌ４、Ｌ１６、Ｌ３４、Ｌ４２、Ｌ６、Ｌ５、またはＬ４４という名称の配列との約９０％、約９５％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有するタンパク質を提供する。上記の態様のすべてにおいて、タンパク質は、単離するか、精製するか、または単離および精製することができる。
【００２０】
別の態様において、本発明は、付表ＩＩに列挙する、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ９、Ｓ６８、Ｓ８１、ｐＭＢ１６、ｐＭＢ１７、ｐＭＢ１２、ｐＭＢ１８、ｐＭＢ１５、Ｄ０５、Ｄ０７、Ｄ０９、Ｄ０４、Ｌ１４、Ｌ８、Ｌ４、Ｌ１６、Ｌ３４、Ｌ４２、Ｌ６、Ｌ５、またはＬ４４という名称の配列によって指定されるタンパク質をコードする核酸を提供する。別の態様において、本発明は、付表ＩＩに列挙する、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ９、Ｓ６８、Ｓ８１、ｐＭＢ１６、ｐＭＢ１７、ｐＭＢ１２、ｐＭＢ１８、ｐＭＢ１５、Ｄ０５、Ｄ０７、Ｄ０９、Ｄ０４、Ｌ１４、Ｌ８、Ｌ４、Ｌ１６、Ｌ３４、Ｌ４２、Ｌ６、Ｌ５、またはＬ４４という名称の配列との約９０％、約９５％、約９８％、または約９９％の配列相同性を有するタンパク質をコードする核酸を提供する。別の態様において、本発明は、付表ＩＩに列挙する、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ９、Ｓ６８、Ｓ８１、ｐＭＢ１６、ｐＭＢ１７、ｐＭＢ１２、ｐＭＢ１８、ｐＭＢ１５、Ｄ０５、Ｄ０７、Ｄ０９、Ｄ０４、Ｌ１４、Ｌ８、Ｌ４、Ｌ１６、Ｌ３４、Ｌ４２、Ｌ６、Ｌ５、またはＬ４４という名称の配列との約９０％、約９５％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸を提供する。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
天然に存在するＯＢフォールドドメインから取得可能な単離された改変ＯＢフォールドドメインであって、この改変ＯＢフォールドドメインは、
（ａ）この天然に存在するＯＢフォールドドメインと比較して、このＯＢフォールドドメイン結合表面のβストランド内の少なくとも１つの改変アミノ酸残基、または
（ｂ）このＯＢフォールドドメイン結合表面のβストランド内の少なくとも１つの改変アミノ酸残基、およびこのＯＢフォールドドメインループ領域のストランド内の少なくとも１つの改変アミノ酸残基、または
（ｃ）このＯＢフォールドドメインループ領域のストランド内の少なくとも１つの改変アミノ酸残基
を含み、この改変ＯＢフォールドドメインが、この天然に存在するＯＢフォールドドメインと比較して、変化した結合特性を有する、
改変ＯＢフォールドドメイン。
（項目２）
上記ドメインが、上記天然に存在するＯＢフォールドドメインとは異なる結合パートナーに特異的に結合するか、またはその天然に存在する結合パートナーとの改変された結合を有する、項目１に記載の改変ＯＢフォールドドメイン。
（項目３）
上記天然に存在するＯＢフォールドドメインが、ブドウ球菌ヌクレアーゼタンパク質、細菌性エンテロトキシン、ＴＩＭＰ様タンパク質、ヘムシャペロンＣｃｍＥタンパク質、尾結合リゾチームｇｐ５、Ｎ末端ドメインタンパク質、核酸結合タンパク質、無機ピロホスファターゼ、Ｍｏｐ様タンパク質、ＣｈｅＷ様タンパク質、ｔＲＮＡ＿ａｎｔｉ（ＯＢフォールド核酸結合ドメイン）、Ｔｅｌｏ＿ｂｉｎｄ（テロメア結合タンパク質αサブユニット、中心ドメイン）、ＳＳＢ（一本鎖結合タンパク質ファミリーのＯＢフォールドドメイン）、ＤＵＦ３３８のＯＢフォールドドメイン、ＤＮＡ＿ｌｉｇａｓｅ＿ａｄｅｎ（ＮＡＤ依存性ＤＮＡリガーゼＯＢフォールドドメイン）、Ｓｔａｐ‐Ｓｔｒｐ毒素（ブドウ球菌／連鎖球菌毒素、ＯＢフォールドドメイン）、ＥＩＦ‐５ａ（真核生物開始因子５Ａ  Ｈｙｐｕｓｉｎｅ、ＤＮＡ結合ＯＢフォールドドメイン）、ＧＰ５＿ＯＢ（ＧＰ５  Ｎ末端ＯＢフォールドドメイン）、ＣＳＤ、ＤＮＡ＿ｌｉｇａｓｅ＿ＯＢ、ＤＵＦ３８８、ＥＦＰ、ｅＩＦ‐１ａ、ｍＲＮＡ＿ｃａｐ＿Ｃ、ＯＢ＿ＲＮＢ、Ｐｈａｇｅ＿ＤＮＡ＿ｂｉｎｄ、Ｒｅｐ‐Ａ＿Ｎ、Ｒｈｏ＿ＲＮＡ＿ｂｉｎｄ、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ＿Ｌ２、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ＿Ｓ１２、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ＿Ｓ１７、ＲＮＡ＿ｐｏｌ＿Ｒｐｂ８、ＲｕｖＡ＿Ｎ、Ｓ１、ＴＯＢＥ、ＴＯＢＥ＿２、およびｔＲＮＡ＿ｂｉｎｄからなる群から選択されるタンパク質またはタンパク質クラス内に存在する、項目１または項目２の改変ＯＢフォールドドメイン。
（項目４）
上記天然に存在するＯＢフォールドドメインが好熱性生物に由来する、項目１または項目２に記載の改変ＯＢフォールドドメイン。
（項目５）
上記好熱性生物がＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍである、項目４に記載の改変ＯＢフォールドドメイン。
（項目６）
上記改変アミノ酸残基が、フォールド関連結合表面のβストランド内に存在する、項目１〜５のいずれかに記載の改変ＯＢフォールドドメイン。
（項目７）
上記改変ＯＢフォールドドメインの上記結合パートナーが、核酸、オリゴ糖、タンパク質、ホルモン、および有機小分子からなる群から選択される、項目１〜６のいずれかに記載の改変ＯＢフォールドドメイン。
（項目８）
項目１〜７のいずれかに記載の改変ＯＢフォールドドメインを取得する方法であって、
ａ）天然に存在するＯＢフォールドドメインをコードする核酸あるいは結合表面のストランドおよび／またはループのストランドを含む天然に存在するＯＢフォールドドメインの一部分をコードする核酸を取得する工程と、
ｂ）この天然に存在するＯＢフォールドドメインと比較して、この結合表面のβストランド上の少なくとも１つの改変アミノ酸残基および／またはループのストランド上の少なくとも１つの改変アミノ酸をコードするようにこの核酸を変化させる工程であって、ここで、改変ＯＢフォールドドメインが得られ、この改変ＯＢフォールドドメインが、この天然に存在するＯＢフォールドドメインと比較して、変化した結合を有する、工程と、
を含む、方法。
（項目９）
上記改変ＯＢフォールドドメインをコードする核酸を変化させる工程、および／またはこの改変ＯＢフォールドドメインを含むタンパク質の少なくとも１つのアミノ酸をコードする核酸を変化させる工程もさらに含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
ディスプレイのための改変ＯＢフォールドドメインタンパク質のライブラリを作製する方法であって、
ａ）ＯＢフォールドドメインまたはその一部分をコードする核酸を取得する工程と、
ｂ）この核酸をランダムな変化に供することにより、少なくとも１つのランダム化したアミノ酸残基を有する改変ＯＢフォールドドメインをコードする変化させた核酸の集合体を生成する工程と、
を含む、方法。
（項目１１）
上記核酸が、上記ＯＢフォールドドメイン結合表面のストランドおよび／またはＯＢフォールドドメインのループのストランドの少なくとも１つのアミノ酸残基をコードする、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
改変ＯＢフォールドドメインをコードする変化させた核酸の上記ライブラリを、上記改変ＯＢフォールドドメインをその表面に提示し得る宿主細胞の集団に導入する工程もさらに含む、項目１０または項目１１に記載の方法。
（項目１３）
項目１〜７のいずれかに記載の改変ＯＢフォールドドメインをコードする、単離された核酸。
（項目１４）
項目１〜７のいずれかに記載の改変ＯＢフォールドドメインをコードする核酸を含む、宿主細胞。
（項目１５）
項目１〜７のいずれかに記載の改変ＯＢフォールドドメインをコードする核酸を含む、ファージ。
（項目１６）
項目１〜７のいずれかに記載の改変ＯＢフォールドドメインをコードする核酸を含む、組成物。
（項目１７）
改変ＯＢフォールドドメインのライブラリを、結合パートナーとの結合についてスクリーニングする方法であって、
ａ）改変ＯＢフォールドドメインのライブラリをその表面に提示する宿主細胞またはウイルス粒子の集団を取得する工程と、
ｂ）この改変ＯＢフォールドドメインとこの結合パートナーとの結合に適した条件下で、この宿主細胞またはウイルス粒子の集団をこの結合パートナーと接触させる工程と、
ｃ）この結合パートナーとこの改変ＯＢフォールドドメインとの結合を決定する工程と、
を含む、方法。
（項目１８）
上記宿主細胞またはウイルス粒子が、上記改変ＯＢフォールドドメインをその表面に提示するファージである、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
項目１〜７のいずれかに記載の改変ＯＢフォールドドメインのファージライブラリであって、この改変ＯＢフォールドドメインがＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍから取得可能である、ファージライブラリ。
（項目２０）
細胞またはウイルス粒子の表面に提示される、項目１〜７のいずれか１項に記載の改変ＯＢフォールドドメイン。
（項目２１）
上記細胞またはウイルス粒子が、ファージ、細菌、または酵母である、項目２０に記載の改変ＯＢフォールドドメイン。
（項目２３）
固体支持体に結合した、項目１〜７のいずれかに記載の改変ＯＢフォールドドメイン。
（項目２４）
上記支持体が、ビーズ、ガラス、スライド、チップ、およびゼラチンからなる群から選択される、項目２３に記載の改変ＯＢフォールドドメイン。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】連鎖球菌スーパー抗原ＳＭＥＺ‐２由来のＯＢフォールドドメインを示す（２５）。図１Ａは、くぼんだ結合表面を示す。
【図１Ｂ】連鎖球菌スーパー抗原ＳＭＥＺ‐２由来のＯＢフォールドドメインを示す（２５）。図１Ｂは、Ｎ末端およびＣ末端とともに標識したβシートおよびループを有する概略構造である。β２、β４、およびβ５は、分断化されたβストランドであり、これらの各要素の間に突出部またはループを有する。
【図１Ｃ】連鎖球菌スーパー抗原ＳＭＥＺ‐２由来のＯＢフォールドドメインを示す（２５）。図１Ｃは、このタンパク質の対応するトポロジー図である（２４）。残基は円で示し、水素結合は点線で示す。また、ループを標識し、せん断数Ｓを示す。
【図２Ａ】ａｓｐＲＳ‐ＯＢのライブラリ構築に使用されるオリゴヌクレオチドの概略図である。図２Ａは、オリゴヌクレオチドの上のボックス内に示したａｓｐＲＳ‐ＯＢの二次構造エレメントを示す。下の矢印と数字は、使用したプライマーを示す。十字マークはランダム化したコドンを示す。フラグメント１〜４は、２回目のＰＣＲ工程で連結させる。この図では、１３ｍＲＬライブラリの構築を示している（表４も参照）。
【図２Ｂ】ａｓｐＲＳ‐ＯＢのライブラリ構築に使用されるオリゴヌクレオチドの概略図である。図２Ｂは、ＩＦ５Ａ‐ＯＢのライブラリ構築に使用されるオリゴヌクレオチドの概略図を示す。１１ｍ、９ｍ、２ＲＬおよび２ＲＬ＋２ライブラリの３つの独立した方法で、異なるライブラリの構築を行っている。記号は図２Ａと同じである。
【図３】Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ（１ＢＫＢ、３４）由来の開始因子ＩＦ‐５Ａを示す。ＩＦ‐５Ａのこのリボンモデル図は、Ｃ末端側に位置し、リンカーによってＮ末端ドメインから分離されるＯＢフォールドを示す。βストランドおよびαへリックスは、それぞれ矢印とらせん状のリボンで示す。βストランド１〜３は、ＯＢフォールドの提案した一本鎖ＤＮＡ結合表面を形成する。
【図４】大腸菌ａｓｐ‐ｔＲＮＡシンテターゼの結晶構造を示す（１Ｃ０Ａ、（３７））。このリボンモデル図はａｓｐＲＳの構造を示し、ＯＢフォールドとＣ末端側酵素ドメインの関係を示す。βストランドおよびαへリックスは、それぞれ矢印とらせん状のリボンで示す。βストランド１〜３、およびβストランド４と５の間のループ４／５を含む結合表面を示している（３６）。
【図５Ａ】種々の種に由来するａｓｐＲＳＯＢフォールドドメインの配列アラインメントを示す。図５Ａは、ＯＢフォールドの二次構造（配列の下に示す）を示し、βストランドを標識する。矢印で示した残基は、結合表面上に保存された残基であり、いくつかのライブラリでランダム化されている。ヒトおよび酵母の配列は長いＮ末端を有し、いずれの場合も残基１から始まらないことに留意されたい。右側の数字は、各タンパク質におけるアミノ酸の位置を示す。
【図５Ｂ】種々の種に由来するａｓｐＲＳＯＢフォールドドメインの配列アラインメントを示す。図５Ｂは、種々の種に由来するＩＦ‐５ＡのＯＢフォールドドメインの配列アラインメントを示す。
【図５Ｃ】種々の種に由来するａｓｐＲＳＯＢフォールドドメインの配列アラインメントを示す。図５Ｃは、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ（Ｐ．ａ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ（Ｐ．ｋｏｄａｋ．）、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のａｓｐＲＳ‐ＯＢの配列アラインメントを示す。配列同一性はアスタリスクで示す。ＯＢフォールドの二次構造は配列の下に示し、ｌはストランド４と５の間のループ、ループ４／５である。
【図６】ａｓｐＲＳ‐ＯＢおよび誘導体のファージディスプレイ法に使用されるｐＲＰＳＰ２の概略図である。ファージショックプロモーター（ｐｓｐ）、ｐｅｌＢリーダー配列、ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ制限部位を含むクローニング部位、ウェスタン解析に使用されるｃ‐ｍｙｃタグ、およびｐＩＩＩタンパク質をコードするｇＩＩＩ遺伝子が示されている。ファージディスプレイ法に供した融合タンパク質は、クローニング部位に挿入した遺伝子の遺伝子産物、ｃ‐ｍｙｃタグ、およびｐＩＩＩタンパク質から構成される。ｐＲＰＳＰ２はまた、アンピシリンでの選択に使用するβラクタマーゼ遺伝子も含む（図６には示さず）。
【図７】ファージディスプレイ法に供したａｓｐＲＳ‐ＯＢのウェスタン解析である。左側の列（インサートなし）は、ＴＤＰの調製に空のベクターｐＲＰＳＰ２を使用したためｐＩＩＩのみを表しており、中央の列はＶＣＳＭ１３に提示したｐＩＩＩと融合したａｓｐＲＳ‐ＯＢを示し、右側の列はｇＩＩＩ欠失ファージＶｄ３に提示したａｓｐＲＳ‐ＯＢである。１０１１個のＴＤＰをＳＤＳおよびＢＭＢの存在下でボイルし、１０％ＳＤＳ‐ＰＡＧＥで分離した後、０．４５μｍのニトロセルロース膜に転写した。そしてマウス抗ｃ‐ｍｙｃ抗体とＨＲＰ結合ウサギ抗マウス抗体を使用して検出を行った。
【図８】ａｓｐ‐ｔＲＮＡへの結合によってａｓｐＲＳ由来の野生型ＯＢフォールドの機能的提示を示すを目的とした、ａｓｐＲＳ‐ＯＢ提示ＴＤＰと野生型ＶＣＳ‐Ｍ１３による模擬ファージ実験を示す。固定化したｔＲＮＡをＶＣＳ‐Ｍ１３（野生型ファージ、提示なし）とａｓｐＲＳ‐ＯＢ提示ＴＤＰともにインキュベートした。ＶＣＳ‐Ｍ１３とＴＤＰの比率は１０００：１超であった。洗浄後、ＲＮａｓｅＡによるＲＮＡ消化を行うことによって、結合した粒子を溶出した。ＶＣＳ‐Ｍ１３およびＴＤＰそれぞれと、ビーズのみまたは固定化ｔＲＮＡについて、入出力を除算して回収率を算出した。入出力データについては表６を参照されたい。
【図９】ａｓｐ‐ｔＲＮＡでのライブラリＲＬ（黒丸、実線）、およびａｓｐ‐ｔＲＮＡ（黒丸、点線）またはリゾチーム（白丸、破線）でのライブラリ１３ｍＬの１回目〜６回目の選択によるファージの濃縮（−対数（出力ファージ／入力ファージ）として）である。
【図１０】ａｓｐ‐ｔＲＮＡで選択したＯＢＲＬ由来の選択クローンの配列解析の概要である。１２個のクローンの内１０個が１番目の位置にＲまたはＫを、７個が２番目の位置にＧを、８個が３番目の位置にＣを、６個が４番目の位置にＲを含んでいた。コンセンサス配列はＲ／Ｋ  Ｇ  Ｃ  Ｒであることが示唆された。
【図１１】選択したクローンのａｓｐ‐ｔＲＮＡへの結合をモノクローナルファージ結合実験により解析した結果を示す。ビオチン化ａｓｐ‐ｔＲＮＡをストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズ上に固定化し、モノクローナルファージ試料とともにインキュベートした。ＲＮＡ結合粒子をＲＮＡ消化によって特異的に溶出させ、細菌感染によりカウントした。Ｙ軸は、入力ファージ、ビーズのみからの出力ファージ、およびｔＲＮＡから溶出したファージの数を使用して算出した回収率を示す。実験は２回行い、エラーバーは±標準偏差を表す。ｐＩＩＩは融合体なし、ＯＢ３ｗｔは野生型ａｓｐＲＳ‐ＯＢ、Ｄ０７、Ｄ０９はａｓｐ‐ｔＲＮＡで選択した１３ｍＲＬ由来の変異体、１６、１７はａｓｐ‐ｔＲＮＡで選択したａｓｐ‐ＲＳ‐ＯＢのＲＬ由来の変異体ｐＭＢ１６およびｐＭＢ１７であり、Ｌ６およびＬ３３はリゾチームで選択した１３ｍＲＬ由来の変異体である。
【図１２】選択前および選択後のａｓｐＲＳ‐ＯＢライブラリの配列の概要である。Ａは選択前であり、Ｕ１〜Ｕ６は１３ｍＲＬライブラリに由来し、Ｕ８、Ｕ９はＲＬライブラリに由来する。Ｂは、１３ｍＲＬ由来の可溶性の非選択変異体である。Ｃは、ａｓｐ‐ｔＲＮＡで選択したＲＬ由来の変異体である。Ｄは、ａｓｐ‐ｔＲＮＡで選択した１３ｍＲＬ由来の変異体である。Ｅは、リゾチームで選択した１３ｍＲＬ由来の変異体である。ａｓｐ‐ＯＢ野生型の配列は、対応する残基番号と位置とともに一番上に示す。
【図１３】リゾチームへの結合体についてのマイクロパニングプレスクリーニングを示す。９６ウェルのプレートをリゾチーム（黒色のバー）またはＢＳＡ（白色のバー）でコーティングし、６回の選択後にピックアップしたクローン由来のモノクローナルファージ試料とともにインキュベートした。結合したファージを溶出し、細菌感染によってカウントした。ｙ軸の数値は回収したファージの数を示し、ｘ軸にはクローン番号を示し、ｐＩＩＩは融合体なし（空のベクター）を示し、ＯＢｗｔは提示した野生型ａｓｐ‐ＯＢを示す。
【図１４】選択したクローンのリゾチームへの結合に関するＥＬＩＳＡ解析を示す。ＢＳＡ（白色）、ＲＮａｓｅＡ（斜線）、およびニワトリ卵白リゾチーム（黒色）を固定化し、モノクローナルファージ試料とともにインキュベートした。結合した粒子を、マウス抗Ｍ１３一次抗体とＨＲＰ結合抗マウス二次抗体により検出した。実験は２回行い、エラーバーは±標準偏差を表す。ｐＩＩＩは提示した融合体なしであり、ＯＢｗｔは野生型ａｓｐＲＳ‐ＯＢフォールドである。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｂは、リゾチームで選択した精製ａｓｐＲＳ‐ＯＢ変異体を使用したプルダウンアッセイを示す。図１５Ａでは、変異体をＧＳＴ融合体としてグルタチオンビーズ上に固定化し、リゾチームとともにインキュベートした。洗浄後、ビーズをＳＤＳ‐ＰＡＧＥで解析した。１列目は１３ｍＲＬ８１（非選択変異体、陰性対照）、２列目はＬ５、３列目はＬ１６、４列目はＬ４（Ｌ１８）、５列目はＬ８（Ｌ２１）、６列目はビーズのみ（二重陰性対照）である。図１５Ｂでは、Ｌ６（１列目の可溶性画分）を固定化し、上記と同じ方法でリゾチームとともにインキュベートした。ＴＢＳ（２列目）、ＴＢＳ‐Ｔ（３列目）、ＴＢＳ‐Ｔ５００ｍＭのＮａＣｌ（４列目）で洗浄後、ビーズを充填し、ゲル上で解析した。
【図１６】選択したＯＢフォールドドメインＬ６とリゾチーム間の結合のＫｄを判定するために表面プラズモン共鳴を使用した結合曲線を示す。この実験から算出したＫｄは、３．６×１０−５Ｍであった。
【図１７】ＯＢｏｄｙとリゾチームの複合体の構造を示す。ＯＢｏｄｙは、二次構造エレメントを示す図（左側）として示す。リゾチームは（右側の）図として示す。（ＯＢｏｄｙの）Ａｒｇ３９は、リゾチームの活性部位の方向へ向いていた棒と点で示す。この残基は、リゾチームの活性部位の酸性残基（Ｇｌｕ３５およびＡｓｐ５２）との水素結合を形成する（図２０を参照）。
【図１８】ＯＢｏｄｙとリゾチームの複合体のタンパク質間境界面における水素結合の相互作用の例を示す。残基を棒で示し、標識した（Ｄ３６およびＹ３７はＯｂｏｄｙに由来し、Ｗ６３、Ｄ１０１、およびＮ１０３はリゾチームに由来）。水素結合は点線で示す。Ｄ３６からＷ６３への水素結合が、骨格のＤ３６のカルボニルとＷ６３の側鎖のＮＨ基の間にあることに留意されたい。
【図１９】ＯｂｏｄｙＬ８がリゾチームインヒビターである可能性を示す図である。Ｅ３５とＤ５２は、リゾチームの活性部位の触媒残基であり、Ｈ６０はリゾチームの天然インヒビターに由来する。Ｈｉｓ６０は、リゾチームＧｌｕ３５との水素結合を形成し、それによって酵素を阻害する。ＯＢｏｄｙのＲ３９は、Ｅ３５とＤ５２の両方との水素結合を同じように形成する。ＯＢｏｄｙの骨格とリゾチームの天然インヒビターは、α炭素のトレースとして示す。リゾチームのα炭素のトレースは、分かりやすくするために省略している。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
配列表の簡単な説明
【００２３】
【化１】
2009539346.tif 000071
【００２４】
【化２】
2009539346.tif 000072
【００２５】
【化３】
2009539346.tif 000073
（発明の詳細な説明）
元々、オリゴ糖‐オリゴヌクレオチド結合特性が観察されたことからその名が付けられた、「ＯＢフォールドドメイン」または「ＯＢフォールド」または「ＯＢフォールドタンパク質ドメイン」は、改変ＯＢフォールドドメインを作成するために、ならびに所望の生物活性（例えば、所望の標的への結合）および変化した酵素特性についてスクリーニングが可能な改変ＯＢフォールドドメインのライブラリを作製するために、分子認識ドメインまたはスキャフォールドとして使用できることを、本発明者等は発見した。ＯＢフォールドドメインは元々、それ自体が有するオリゴ糖‐オリゴヌクレオチド結合特性からその名が付けられたが、その後、タンパク質間の境界面にも認められている（Ｔｈｅｏｂａｌｄら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．，Ｖｏｌ．３２：１１５‐３３（２００３））。したがって、本発明は、所望の特性を有する改変ＯＢフォールドドメインの作成方法における、ＯＢフォールドドメインまたはその一部分の使用と、改変ＯＢフォールドドメインのライブラリを作製する方法と、このような方法によって作成される改変ＯＢフォールドドメインのライブラリと、このような改変ＯＢフォールドドメインのライブラリを所望の生物活性についてスクリーニングする方法と、このようなライブラリから同定される改変ＯＢフォールドドメインと、に部分的に関する。例えば、このような改変ＯＢフォールドドメインのライブラリは、１つ以上の特定の対象標的（例えば、ヌクレオチド、タンパク質、または炭水化物）との増加または低下した結合相互作用、あるいは増加または低下した酵素活性を有する、改変ＯＢフォールドドメインまたはその一部分についてスクリーニングすることができる。
【００２６】
本明細書に開示する説明例では、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来のアスパラギン酸ｔＲＮＡシンテターゼ（ＡｓｐＲＳ）のｔＲＮＡアンチコドン結合ドメインに基づく改変ＯＢフォールドドメインのファージディスプレイライブラリの作成、作成されたＡｓｐＲＳ改変ＯＢフォールドドメインの安定性、および作成されたＡｓｐＲＳ改変ＯＢフォールドドメインの適切なフォールディングを、本発明者等が実証した。また、本明細書に開示する説明例では、本発明者等は、ファージの表面でのＡｓｐＲＳ改変ＯＢフォールドドメインの機能的提示を実証し、それによって所望の特性を有する改変ＯＢフォールドドメインに関するライブラリのスクリーニングを実現した。本明細書に示す通り、本発明者等は、本明細書に開示する組成物および方法を使用して、核酸結合ドメインから天然の状態のままリゾチームタンパク質結合分子へと変換した改変ＡｓｐＲＳＯＢフォールドドメインの作成、スクリーニングおよび選択を実現した。本明細書に開示する他の説明例では、ＯＢフォールドドメインを含有するＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来の開始因子ＩＦ‐５Ａを、改変ＯＢフォールドドメインライブラリの作成に使用した。
【００２７】
タンパク質のＯＢフォールドドメインは、改変ＯＢフォールドドメインまたは改変ＯＢフォールドドメインのライブラリの作成や分子認識事象についてのスクリーニングのためのプラットフォームとして使用できるという発見は、診断方法や治療方法に応用でき、本明細書で記載の通り、抗体またはその他のタンパク質のスキャフォールドを使用した当該技術分野で既知の手法よりも優る利点を有する。当業者であれば理解するように、本明細書に開示する、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来のＡｓｐＲＳまたはＩＦ５Ａの改変ＯＢフォールドドメインのライブラリ作成方法は、本明細書に記載し当該技術分野で既知の他のＯＢフォールドドメインに適用することができる。当業者であれば理解するように、当該技術分野で既知のさらなる提示およびスクリーニング方法は、所望の特性を有する改変ＯＢフォールドドメインを同定するために使用することができる。改変ＯＢフォールドドメインは、固定および／または固体表面に結合し、結合相互作用についてのスクリーニングに使用できることも企図される。例えば、ＯＢフォールドタンパク質は、固定表面に共有結合させることもできれば、あるいはアフィニティータグ（例えば、６×Ｈｉｓタグ）を使用して表面に結合させることもできると考えられる。タンパク質を表面に共有結合させる方法は当業者に既知であり、表面にタンパク質を付着させるのに使用できるアフィニティータグは当業者に既知である。さらに、ＯＢフォールドタンパク質は、ビーズ、ガラス、スライド、チップ、およびゼラチンを含むがこれらに限定されない固体表面に結合させることできる。したがって、一連のＯＢフォールドタンパク質は、当業者に既知の技法を使用して固体表面上にアレイを作製するのに使用することができる。例えば、米国特許出願公開第２００４／０００９５３０号には、アレイの作成方法が開示されている。
【００２８】
一般的な技法
本発明の実施においては、特に記載がない限り、当該技術分野の範囲に含まれる分子生物学（遺伝子組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来技法が使用される。このような技法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ＆Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ）、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ＆Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ，１９８７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．，１９８７）、ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓら、ｅｄｓ．，１９９４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら、ｅｄｓ．，１９９１），Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｄａｖｉｄ  Ｗｉｌｄ，ｅｄ．，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ  ＮＹ，１９９４）、およびＭｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｒ．Ｍａｓｓｅｙｅｆｆ，Ｗ．Ｈ．Ａｌｂｅｒｔ，ａｎｄ  Ｎ．Ａ．Ｓｔａｉｎｅｓ，ｅｄｓ．，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ：ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇｓ  ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  ｍｂＨ，１９９３），およびＧｅｎｎａｒｏら、２０００，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  Ｅｄ．Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ：Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤのような文献に詳細に説明されている。
【００２９】
定義
本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語とその同種の用語は、包括的な意味で使用され、すなわち、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語とその対応する同種の用語に等しい。
【００３０】
本明細書で使用される単数形（“ａ”、“ａｎ”および“ｔｈｅ”）は、特に記載がない限り複数の言及を含む。
【００３１】
ＯＢフォールドドメインを含むことを特徴とする各種タンパク質は、当該技術分野で既知であり、本明細書に記載されている。本明細書で詳述する通り、「ＯＢフォールドドメイン」は、保存されたフォールドと結合表面の構造的特徴を共有するファミリーメンバーを包含する。ＯＢフォールドドメインメンバーは配列関連性も共有する場合がある。任意のＯＢフォールドドメインまたはその一部分は、改変ＯＢフォールドドメインの作成に使用できることが企図される。本明細書で使用される「天然」のＯＢフォールドドメインとは、核酸またはアミノ酸改変を含むように遺伝子操作されていないＯＢフォールドドメインを指す。本明細書で使用される「改変ＯＢフォールドドメイン」は、天然ＯＢフォールドドメインと比較して、少なくとも１つの改変アミノ酸残基を含む。改変ＯＢフォールドドメインがフォールド関連結合表面を保持し、結合パートナーとの相互作用に利用可能である限り、改変には、１つ以上の残基の欠失、置換、または付加、またはそれらの組み合わせが含まれる。「改変ＯＢフォールドドメイン」が、天然ＯＢフォールドドメインの厳密な構造的特徴を保持する必要はない。改変ＯＢフォールドドメインがフォールド関連結合表面を保持し、結合パートナーとの相互作用に利用可能である限り、改変ＯＢフォールドドメインは、結合表面（結合表面はβシートおよび隣接するループを含む）、ループストランド、コア領域（水溶性溶媒にさらされない、タンパク質の疎水性内部にある領域）のアミノ酸残基内の改変を含めた、任意のアミノ酸残基内の改変を含む場合があり、ＯＢフォールドドメインを含むタンパク質のいずれかの部分におけるアミノ酸改変もさらに含む場合がある。いくつかの実施例において、改変ＯＢフォールドドメインは、天然ＯＢフォールドドメインが結合しない結合パートナーを結合できることを特徴とする。他の実施例において、改変ＯＢフォールドドメインは、その天然に存在する結合パートナーとの改変された結合を有する。いくつかの実施例において、ＯＢフォールドドメインは単離され、すなわち、そのＯＢフォールドドメインが含まれている天然のタンパク質の少なくとも一部分から取り出される。他の実施例において、改変ＯＢフォールドドメインは、非天然のタンパク質と結合している。他の実施例において、改変ＯＢフォールドドメインは、天然ＯＢフォールドドメインが結合しないか、または天然ＯＢフォールドドメインが非特異的にのみ結合する、天然または非天然のタンパク質と結合している。他の実施例においては、天然ＯＢフォールドドメインが既知の結合パートナーを有さない改変ＯＢフォールドドメインを作成することができる。特定の結合パートナーへの結合について改変ＯＢフォールドドメインをスクリーニングする場合に、天然ＯＢフォールドドメインに対する結合パートナー（該当する場合）は、先験的に知られていない場合があることが理解されるであろう。
【００３２】
変化した結合特性を有する天然ＯＢフォールドドメインの天然の基質と結合する改変ＯＢフォールドドメインを作成することができる。このような変化した結合特性は、天然ＯＢフォールドドメインと同じ条件下で示すことができる。あるいは、変化した結合特性は、熱安定性結合（例えば、改変ＯＢフォールドドメインは、天然ＯＢフォールドドメインよりも、高温における天然基質へのより強力な結合を示す）、熱不安定性結合（例えば、改変ＯＢフォールドドメインは、天然ＯＢフォールドドメインよりも、高温における天然基質へのより弱い結合を示す）、種々のｐＨ条件下での改変された結合（例えば、改変ＯＢフォールドドメインは、天然ＯＢフォールドドメインよりも、高ｐＨ条件下における天然基質へのより強力な結合を示すか、または天然ＯＢフォールドドメインよりも、高ｐＨ条件下における天然基質へのより弱い結合を示すか、または低ｐＨにおける天然基質へのより天然ＯＢフォールドドメインよりも強力な結合を示すか、または低ｐＨにおける天然基質へのより弱い結合を示す）、あるいは種々のイオン強度条件下における改変された結合（例えば、改変ＯＢフォールドドメインは、天然ＯＢフォールドドメインよりも、高イオン強度における天然基質へのより強力な結合を示すか、または天然ＯＢフォールドドメインよりも、高イオン強度における天然基質へのより弱い結合を示すか、または天然ＯＢフォールドドメインよりも、低イオン強度における天然基質へのより強力な結合を示すか、または天然ＯＢフォールドドメインよりも、低イオン強度における天然基質へのより弱い結合を示す）の内の１つ以上である場合がある（がこれらに限定されない）。改変された結合特性または変化した結合特性は、対応する天然ＯＢフォールドドメインと比較して、改変ＯＢフォールドドメインとその天然に存在する結合パートナーとの解離定数における少なくとも約２５％、約５０％、または約７５％の低下を含む場合がある（すなわち、改変ＯＢフォールドドメインは、天然ＯＢフォールドドメインよりも少なくとも約１．３３倍、２倍、または３倍強力に結合する場合がある）。一実施形態において、改変された結合は、対応する天然ＯＢフォールドドメインと比較して、改変ＯＢフォールドドメインとその天然に存在する結合パートナーとの解離定数における少なくとも約２分の１、約３分の１、約４分の１、約５分の１、約６分の１、約８分の１、約１０分の１、約１５分の１、約２０分の１、約２５分の１、約５０分の１、約１００分の１、約２００分の１、約５００分の１、約１０００分の１、約５０００分の１、約１０，０００分の１、約５０，０００分の１、または約１００，０００分の１の低下を含む（すなわち、改変ＯＢフォールドドメインは、天然ＯＢフォールドドメインよりも少なくとも約２、約３、約４、約５、約６、約８、約１０、約１５、約２０、約２５、約５０、約１００、約２００、約５００、約１０００、約５０００、約１０，０００、約５０，０００、または約１００，０００倍強力に結合する場合がある）。
【００３３】
改変ＯＢフォールドドメインの「ライブラリ」とは、天然ＯＢフォールドドメインと比較して、高い割合で改変ＯＢフォールドドメインを含むＯＢフォールドドメインの集合体を指す。すなわち、改変ＯＢフォールドドメインのライブラリは、前記集合体が改変ＯＢフォールドドメインのみを含むことを含意しない。改変ＯＢフォールドドメインのライブラリは、いくらかの割合の非改変または天然ＯＢフォールドドメインを含む場合がある。前記ライブラリは、１つ以上または複数のランダム化したアミノ酸残基を有するＯＢフォールドドメインを含む場合がある。例えば、改変ＯＢフォールドドメインのライブラリは、１つ以上の構造領域、例えば、結合表面、および／またはループ領域、および／またはコア領域中に存在し得る、１つのアミノ酸残基におけるランダムな改変（前記改変は、１種類の改変（例えば、単一のアミノ酸置換）、または複数種の改変（例えば、単一のアミノ酸と複数のランダムなアミノ酸との置換である場合がある）、または複数のアミノ酸残基におけるランダムな改変を含む、ＯＢフォールドドメインを含む場合がある。フォールド関連結合表面が結合パートナーとの相互作用に利用可能である限り、改変ＯＢフォールドドメインは、さらなる改変を有する場合もあれば、あるいは改変ＯＢフォールドドメインを含むタンパク質は、アミノ酸残基中に改変を有する場合もある。改変ＯＢフォールドドメインの「ライブラリ」は、集合体のメンバーの数にいかなる特定の大きさの制限も含意しない。ライブラリは、わずか約１０個の変異体を含む場合があり、１０２０個以上の変異体にまで及ぶ場合がある。いくつかの実施形態において、前記ライブラリは、最大約１０８個の変異体を有し、またいくつかの実施形態において、前記ライブラリは、最大約１０１２個の変異体を有する。改変ＯＢフォールドドメインの「ライブラリ」は、核酸の変化によってコードされる、すなわち、発現系への導入前の遺伝子の構築段階にある、改変ＯＢフォールドドメインの集合体、ならびに発現系に導入され、発現し、および／または提示される集合体を指す。
【００３４】
本明細書で交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー（すなわち、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれか）を指す。これらの用語には、一本鎖、二本鎖、または三本鎖ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ‐ＲＮＡハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基を含むポリマー、またはその他の天然の、化学的・生化学的に改変された、非天然の、または誘導体化されたヌクレオチド塩基が含まれる。ポリヌクレオチドの骨格は、糖およびリン酸基（ＲＮＡまたはＤＮＡに典型的に認められるような）、または改変もしくは置換された糖もしくはリン酸基を含むことができる。あるいは、ポリヌクレオチドの骨格は、ホスホルアミダートのような合成サブユニットのポリマーを含むこともでき、したがって、オリゴデオキシヌクレオシドホスホルアミダート（Ｐ‐ＮＨ２）または混合ホスホルアミダート‐ホスホジエステルオリゴマーであってよい。Ｐｅｙｒｏｔｔｅｓら、（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：１８４１‐８、Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉら、（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：２３１８‐２３、Ｓｃｈｕｌｔｚら、（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：２９６６‐７３。ホスホロチオエート結合は、ホスホジエステル結合の代わりに使用することができる。Ｂｒａｕｎら、（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：２０８４‐９、Ｌａｔｉｍｅｒら、（１９９５）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：１０５７‐１０６４。さらに、適切な条件下で相補鎖を合成しアニーリングするか、または適切なプライマーを有するＤＮＡポリメラーゼを使用して新規に相補鎖を合成するかのいずれかによって、化学合成の一本鎖ポリヌクレオチド産物から二本鎖ポリヌクレオチドを取得することができる。ポリヌクレオチド配列の言及（配列番号の言及など）は相補性配列も含む。
【００３５】
以下は、ポリヌクレオチドの非限定例である：遺伝子または遺伝子断片、エクソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、改変ヌクレオチド（例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体）、ウラシル、その他の糖および結合基（例えば、フルオロリボースやチオエート）、およびヌクレオチドの分枝を含む場合がある。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド要素によって遮断される場合がある。ポリヌクレオチドは、例えば標識成分との接合などによって重合後にさらに改変される場合がある。本定義に含まれるその他の種類の改変には、キャップ、１つ以上の天然ヌクレオチドと類似体との置換、ならびにポリヌクレオチドをタンパク質、金属イオン、標識成分、他のポリヌクレオチド、または固体支持体に結合する手段の導入がある。好ましくは、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。本明細書で使用される「ＤＮＡ」は、塩基Ａ、Ｔ、ＣおよびＧを含むだけでなく、それらの類似体のいずれかまたはこれらの塩基の改変体（例えば、メチル化ヌクレオチド）、ヌクレオチド間の改変（例えば、非荷電性結合およびチオエート）、糖類似体の使用、ならびに改変されたおよび／または代替の骨格構造（例えば、ポリアミド）も含む。
【００３６】
「転写制御下」とは、当該技術分野で十分に理解される用語であり、通常はＤＮＡ配列であるポリヌクレオチド配列の転写が、転写の開始に寄与するか転写を促進するエレメントに前記配列が操作可能（操作的）に連結されていることに依存することを示す。「操作可能に連結される」とは、エレメントが機能できるように配置されている並列を指す。
【００３７】
「宿主細胞」は、ＯＢフォールドドメインを、およびいくつかの実施例においては改変ＯＢフォールドドメインをコードする核酸のレシピエントであってもよいか、レシピエントであった、個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含み、前記子孫は、自然、偶発的または意図的な変異および／または変化によって、必ずしも元々の親細胞と（形態または全体のＤＮＡ相補性において）完全に同一であるわけではない。宿主細胞には、ＯＢフォールドドメインをコードする核酸によりｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにてトランスフェクトまたは感染した細胞が含まれる。いくつかの実施例において、宿主細胞は、ＯＢフォールドドメインをその表面に発現および提示する能力（例えば、ファージディスプレイ能力）を有する。「発現」には転写および／または翻訳が含まれる。
【００３８】
ＯＢフォールドドメインまたはその一部分を「コードする」核酸とは、ＯＢフォールドドメインまたはその一部分を作成するために転写および／または翻訳が可能な核酸である。このような核酸のアンチセンス鎖も、ＯＢフォールドドメインをコードすると言われている。
【００３９】
Ｉ．ＯＢフォールドタンパク質ドメイン
最も一般的なレベルでは、ＯＢフォールドドメインは、５つのストランドからなる混合型βバレルである。例えば、Ａｒｃｕｓ，２００２，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ  １２：７９４‐８０１を参照されたい。ＯＢフォールドドメインは、３つすべての界に認められ、本明細書に詳述する通り、配列および構造学的データベースの両方で表される。一般的に言うと、ＯＢフォールドドメインには、フォールドと機能的結合表面が保存されている。種々のＯＢフォールドドメインは、それらのフォールド関連結合表面を使用して、オリゴ糖、オリゴヌクレオチド、タンパク質、金属イオン、および触媒基質と様々に結合する。
【００４０】
ＯＢフォールドドメインはいくつかの特徴を有しており、これらの特徴によって、前記ドメインは、アミノ酸位置のランダム化や所望の特性を有する改変ＯＢフォールドドメインの選択に使用するスキャフォールドとして非常に適したものとなっている。ＯＢフォールドドメインは、通常は小さく安定したタンパク質であり、容易に作成およびランダム化される。Ｔｈｅｏｂａｌｄら、２００３，ｓｕｐｒａには、ＯＢフォールドドメインの長さが７０〜１５０個のアミノ酸に及ぶことが開示されている。さらに、ＯＢフォールドドメインタンパク質の面は、進化の過程で多様であることがすでに示されており、ランダム化に利用可能である。ＯＢフォールドドメインは、３つすべての界に遍在しており、そのため、特定の応用に適合するようにＯＢフォールドドメインを選択することができる。例えば、改変ＯＢフォールドドメインのライブラリの作成に使用する熱安定性微生物由来のＯＢフォールドドメインが本明細書に記載されている。ＯＢフォールドドメインは治療用途に選択することができ、例えば、酵素的ＯＢフォールドドメインは、新たな酵素活性を有するタンパク質の作成に選択することができる。これらの特徴は、より従来の抗体およびタンパク質のスキャフォールドよりも優る利点をもたらす。
【００４１】
ＯＢフォールドタンパク質ドメインの全体構造は、５つのストランドからなる混合型ｆｃ‐バレルであり、２つの可変ループ領域が隣接する外側の結合表面として凹型ｆｃ‐シートを提示している。ほとんどの場合、前記バレルは、グリークキー型のトポロジーを有し、バレルの一端はαへリックスでキャップされている（２３）。βバレルは、ストランドの数ｎとせん断数Ｓ（２６、２７）とによって固有に記述される。せん断数は、バレルの軸からのストランドの傾きの度合いを表すものである。図１Ａ〜１Ｃには、Ｓ＝１０の６バレルが示されている。これは、形式上βシートの一部である（故にβ突出部を含まない）残基の数であり、ＡからＡ＊までストランドに沿ってカウントされる。ＯＢフォールドには２つの可能性（Ｓ＝８またはＳ＝１０）があり、これらは両方とも観察されている。例として、ｔＲＮＡを結合するアスパルチルｔＲＮＡシンテターゼ（ａｓｐＲＳ）のＯＢフォールドドメインはＳ＝１０であるのに対し、コールドショックＯＢフォールドドメインＤＮＡ結合ドメインはＳ＝８である。ＯＢフォールドドメイン結合表面は、中央にβストランド２および３を有し、ループ１によって左下部で、ループ４によって上部で、およびループ２によって右上部で結合されている（図１Ａ〜１Ｃを参照）。種々のＯＢフォールドドメイン構造において、ループ２および４は、長さと配列の両方において幅広い変化を示す。Ａｒｃｕｓ，２００２，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ  １２：７９４‐８０１を参照されたい。改変ＯＢフォールドドメインの長さは変化する可能性がある。例えば、ループ２は、２〜４個のアミノ酸の間で変化することが多く、ループ４は、３〜１０個のアミノ酸の間で変化することが多く、また場合によりループ４は、最大３０個のアミノ酸のさらに長い挿入に対応する。
【００４２】
配列解析を行った２０個のゲノムのサーベイでは、最も多く認められる生物学的アーキテクチャーの一覧の２８番目にＯＢフォールドドメインを位置づけている（２７）。ＯＢフォールドドメインは、ヒト、酵母、および細菌を含めた広範なタンパク質に認められている。例えば、細菌性スーパー抗原（Ｓａｇ）において、ＯＢフォールドドメインは、ヒトの免疫系における細菌攻撃時のタンパク質‐タンパク質相互作用を媒介する（２１および２２）。これらのタンパク質において、前記ＯＢフォールドドメインは、タンパク質、オリゴヌクレオチド、およびオリゴ糖を含めた幅広いリガンドを結合する（２３）。ＯＢフォールドドメインタンパク質の多様性の例には、腫瘍遺伝子ＢＲＣＡ２での一本鎖ＤＮＡ結合（Ｙａｎｇ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，２００２  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２９７，１８３７‐１８４８）、酵母タンパク質Ｃｄｃ１３の染色体上におけるテロメア末端結合（Ｌｅｉ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ，２００３  Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．４２６，１９８‐２０３）、および病原菌における細胞表面のオリゴ糖結合（Ｓｔｅｉｎ  Ｐ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ，１９９４，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．２，４５‐４７）が含まれる。タンパク質構造を関連する「ファミリー」および「スーパーファミリー」に分類する基準となるＳｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＣＯＰ）データベースに定められている通り、ＯＢフォールドタンパク質ドメインは９つの関連するスーパーファミリーに認められる。同じ「ファミリー」に属するＯＢフォールドドメインは、配列、構造および機能レベルにおいて進化上の関連性があり、共通の祖先に由来すると考えられている。同じ「スーパーファミリー」に属するＯＢフォールドドメイン「ファミリー」は、明確な配列類似性がなくても、類似の構造的および機能的特徴に基づく進化上の関連性がある。ＳＣＯＰデータベースは、既知の構造のタンパク質で構成されている（すなわち、これらの構造は、Ｘ線結晶学または高分解能ＮＭＲのいずれかを使用して実験により決定されている）。他のＯＢフォールドドメインは、構造的関連性、すなわち、フォールド関連結合表面の存在、または本明細書に記載され当該技術分野で既知である、既知のＯＢフォールドドメインに対する構造的関連性および配列関連性に基づき、当業者が決定することができる。スーパーファミリーおよびファミリーには配列類似性が存在し、これらを、これまでＯＢフォールドアンブレラ下で構造が決定されていない他のタンパク質の同定に使用することができる。例えば、公的に利用可能なＰｆａｍデータベース（＜ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ｐｆａｍ＞）を参照されたい。他の公的に利用可能なデータベースは、Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ（＜ｓｕｐｆａｍ．ｍｒｃｌｍｂ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ＳＵＰＥＲＦＡＭＩＬＹ＞）であり、これはＳＣＯＰ由来の隠れマルコフモデルを使用して、タンパク質の配列をスーパーファミリーに分類している。例えば、「核酸結合タンパク質」は、ＳＣＯＰデータベース内のスーパーファミリーを含む。現在、ＳＣＯＰ内のこのスーパーファミリーには、１１のファミリーと６６の個々のタンパク質構造が存在する。これらの１１のファミリーと６６の構造から、Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙデータベースは、２１，１５８個のタンパク質配列を、「核酸結合タンパク質」スーパーファミリーに属するＯＢフォールドタンパク質として分類する法則を導き出した。同様に、ＣｈｅＷ様スーパーファミリーは、ＳＣＯＰ内の１つのファミリーと２つのタンパク質構造を有するだけであるが、Ｓｐｅｒｆａｍｉｌｙデータベースではこれが拡大されて、８９８個のタンパク質を含んでいる。
【００４３】
ｉ．ＳＣＯＰにおけるＯＢフォールドドメインの分類
ｎ＝５およびＳ＝１０またはＳ＝８であり、グリークキーモチーフを有し、すべてがβの閉鎖型または部分開放型のバレル構造としてＳＣＯＰによって特徴付けられているＯＢフォールドドメインのクラスに関しては、ＳＣＯＰは現在、以下のスーパーファミリーを同定している（括弧内の数字はＳＣＯＰ照合番号である）：
１．ブドウ球菌ヌクレアーゼ（５０１９９）
ブドウ球菌ヌクレアーゼに関しては現在のところこのファミリーの単独のメンバーが存在するが、ブドウ球菌ヌクレアーゼのデータベースには多くの構造が存在する。ＯＢフォールドは閉鎖型βバレルであり、ｎ＝５、Ｓ＝１０である。
【００４４】
２．細菌性エンテロトキシン（５０２０３）
細菌性エンテロトキシンの場合、このスーパーファミリーには、細菌性ＡＢ５毒素（Ｂサブユニット）およびスーパー抗原毒素のＮ末端ドメインという２つのファミリーが存在する。細菌性ＡＢ５毒素には、大腸菌由来の易熱性毒素、コレラ毒素、および百日咳毒素が含まれる。すべてが閉鎖型βバレルトポロジーを有し、ｎ＝５でＳ＝１０であるが、バレルが部分開放型のコレラ毒素が唯一の例外である。スーパー抗原様毒素およびスーパー抗原毒素のＮ末端ドメインは、黄色ブドウ球菌および化膿性連鎖球菌由来のすべてのタンパク質であり、典型的にｎ＝５、Ｓ＝１０の閉鎖型バレルのトポロジーを有する。これらの微生物のゲノムにコードされこれらのタンパク質は数多く存在する。ブドウ球菌のタンパク質は、“Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｂｙ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ．”Ｇｅｒａｒｄ  Ｌｉｎａ，Ｇｒｅｇｏｒｙ  Ａ．Ｂｏｈａｃｈ，Ｓｅａｎ  Ｐ．Ｎａｉｒ，Ｋｅｉｉｃｈｉ  Ｈｉｒａｍａｔｓｕ，Ｅｖｅｌｙｎｅ  Ｊｏｕｖｉｎ‐Ｍａｒｃｈｅ，ａｎｄ  Ｒｏｙ  Ｍａｒｉｕｚｚａ，ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ
Ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎｓ  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ２００４；１８９：２３３４‐６に基づき、近年名称が改められた。
【００４５】
３．ＴＩＭＰ様
ＴＩＭＰ様タンパク質は、現在３つのファミリーに分類される真核生物のタンパク質であり、すべてｎ＝５、Ｓ＝１０の閉鎖型バレルのトポロジーを有する：
ａ．組織メタロプロテイナーゼインヒビター、ＴＩＭＰ（５０２４３）（Ｃ末端伸長部に不規則なα＋βサブドメインを含む）。
【００４６】
ｂ．Ｎｅｔｒｉｎ様ドメイン（ＮＴＲ／Ｃ３４５Ｃモジュール）（８９３２０）
ｃ．アグリンのラミニン結合ドメイン（６３７６７）
４．ヘムシャペロンＣｃｍＥ（８２０９３）
ヘムシャペロンＣｃｍＥに関しては、このスーパーファミリーにアノテーションを付けた１つのファミリーが存在する。代表的な構造は、大腸菌およびＳ．ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓに由来する。
【００４７】
５．尾結合リゾチームｇｐ５、Ｎ末端ドメイン（６９２５５）
尾結合リゾチームｇｐ５、Ｎ末端ドメインについては、ファミリーとこのスーパーファミリーの両方を表す１つの構造が存在する。このタンパク質はバクテリオファージＴ４に由来し、Ｎ末端ドメインは、ファージの細胞貫通部を形成するさらに大きなタンパク質複合体の一部である。
【００４８】
６．核酸結合タンパク質（５０２４９）
核酸結合タンパク質は、多数のタンパク質を包含する大きなスーパーファミリーである。以下はファミリーの区分と記述子である：
ａ．アンチコドン結合ドメイン（５０２５０）
バレル、閉鎖型、ｎ＝５、Ｓ＝１０
ｂ．ＲｅｃＧ「ウェッジ」ドメイン（６９２５９）
ｃ．ＤＮＡヘリカーゼＲｕｖＡサブユニット、Ｎ末端ドメイン（５０２５９）
バレル、閉鎖型、ｎ＝５、Ｓ＝１０
ｄ．一本鎖ＤＮＡ結合ドメイン、ＳＳＢ（５０２６３）
バレル、閉鎖型、ｎ＝５、Ｓ＝１０
ｅ．Ｍｙｆドメイン（５０２７７）
ｆ．コールドショックＤＮＡ結合ドメイン様（５０２８２）
バレル、閉鎖型、ｎ＝５、Ｓ＝８
ｇ．Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＭＴＨ１（ＭＴ０００１）、インサートドメイン（７４９５５）
ｈ．ＤＮＡリガーゼ／ｍＲＮＡキャッピング酵素、ドメイン２（５０３０７）
ｉ．ファージｓｓＤＮＡ結合タンパク質（５０３１５）（４）
バレル、開放型、ｎ＊＝５、Ｓ＊＝８、メンバーの構造は、細胞性生物由来のものよりも大きく変化する。
【００４９】
ｊ．ＤＮＡ複製イニシエーター（ｃｄｃ２１／ｃｄｃ５４）Ｎ末端ドメイン（８９３３２）
ｋ．ＲＮＡポリメラーゼサブユニットＲＢＰ８（５０３２１）
二重。２つの不完全なＯＢフォールドのタンデムリピートを含む。単一のバレルを形成、ｎ＝８、Ｓ＝１０。
【００５０】
７．無機ピロホスファターゼ（５０３２４）
無機ピロホスファターゼについては、このスーパーファミリーに唯一のファミリーが存在する。このファミリーは、細菌、古細菌、および真核生物の例があるように、非常に古くからの系統を有する。
【００５１】
１．無機ピロホスファターゼ（５０３２５）
バレル、閉鎖型、ｎ＝５、Ｓ＝８
１．無機ピロホスファターゼ（５０３２６）
真核生物の酵素は、Ｎ末端およびＣ末端の両方に他の二次構造を有する。
【００５２】
ａ．パン酵母（サッカロミセス・セレビシエ）（５０３２７）
ｂ．古細菌Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ（５０３２８）
ｃ．大腸菌（５０３２９）
ｄ．Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（５０３３０）
８．ＭＯＰ様（５０３３１）
ＭＯＰ様グループ分類には３つのファミリーが存在し、すべてが類似の機能性を有し、すべて細菌に由来する。
【００５３】
ａ．モリブデン酸塩／タングステン酸塩結合タンパク質ＭＯＰ（５０３３２）
ｂ．ＢｉＭＯＰ、モリブデン酸塩結合二重ドメイン（５０３３５）
二重。Ｃ末端ストランドにスワッピングを生じた２つのＯＢフォールドドメインのタンデムリピート。
【００５４】
ｃ．ＡＢＣトランスポーター追加ドメイン（５０３３８）
おそらくｂｉＭＯＰドメインに由来。
【００５５】
９．ＣｈｅＷ様（５０３４１）
これはＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ由来の２つの構造（ＣｈｅＷおよびＣｈｅＡ）を有する１つのファミリーで表される。
【００５６】
ｉｉ．配列データベースＰｆａｍおよびＳｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ
ＳＣＯＰの記載は、Ｘ線結晶学またはＮＭＲのいずれかによってその３次元構造が決定されている、タンパク質由来のＯＢフォールドドメインに関する。Ｐｆａｍデータベースに配列類似性に基づき、およびＳｕｐｅｒｆａｍｉｌｙデータベースにＳＣＯＰ由来の配列プロファイルに基づき同定された後、主要な配列データに適用されている、他のＯＢフォールドタンパク質ドメインは、本発明の適用範囲内に包含される。本発明は、当業者に既知の他のＯＢフォールドドメインを包含する。
【００５７】
後述の通り、Ｐｆａｍには、ともにＯＢフォールドドメインを表す多くのファミリーが存在する。アノテーションは以下の通りである。
【００５８】
ファミリー名
アノテーション
Ｐｆａｍ受入番号
Ｐｆａｍデータベースにおけるこのファミリー内のタンパク質の総数
ｔＲＮＡ＿ａｎｔｉ
ＯＢフォールド核酸結合ドメイン
受入番号：ＰＦ０１３３６
タンパク質数：１３５１
Ｔｅｌｏ＿ｂｉｎｄ
テロメア結合タンパク質αサブユニット、コアドメイン
受入番号：ＰＦ０２７６５
タンパク質数：３３
ＳＳＢ
一本鎖結合タンパク質ファミリー
受入番号：ＰＦ００４３６
タンパク質数：４１５
ＤＵＦ３８８
機能が未知のドメイン（ＤＵＦ３８８）
受入番号：ＰＦ０４０７６
タンパク質数：４９
ＤＮＡ＿ｌｉｇａｓｅ＿ａｄｅｎ
ＮＡＤ依存性ＤＮＡリガーゼＯＢフォールドドメイン
受入番号：ＰＦ０３１２０
タンパク質数：１９０
Ｓｔａｐ＿Ｓｔｒｐ＿ｔｏｘｉｎ
ブドウ球菌／連鎖球菌毒素、ＯＢフォールドドメイン
受入番号：ＰＦ０１１２３
タンパク質数：１８０
ｅＩＦ‐５ａ
真核生物開始因子５Ａ  Hｙｐｕｓｉｎ、ＤＮＡ結合ＯＢフォールド
受入番号：ＰＦ０１２８７
タンパク質数：１０４
Ｇｐ５＿ＯＢ
Ｇｐ５  Ｎ末端ＯＢドメイン
受入番号：ＰＦ０６７１４
タンパク質数：６。
【００５９】
本明細書に記載され、当該技術分野で既知であり、後に同定されるＯＢフォールドドメインはすべて、改変ＯＢフォールドドメインを作成するために、ならびに変化した結合特性および変化した機能的特徴についてのスクリーニングに使用できる改変ＯＢフォールドドメインのライブラリを作製するために、スキャフォールドとして使用することができる。
【００６０】
ｉｉｉ．アミノ酸のランダム化に使用されるＯＢフォールド結合表面
改変ＯＢフォールドドメインおよび／または改変ＯＢフォールドドメインのライブラリは、本明細書に記載されるか、当該技術分野で既知であるか、または後に同定されるものを含めたいずれかのＯＢフォールドドメインの構造に基づいて作成することができる。改変ＯＢフォールドドメインのライブラリは、本明細書に記載され、当該技術分野で既知の方法に基づいて作成することができる。例えば、ある任意のＯＢフォールドドメインについて、１つ以上のアミノ酸残基（例えば、外側の結合表面のストランド内のアミノ酸残基、および／またはループのストランド内のアミノ酸残基、および／またはＯＢフォールドドメインを含むタンパク質の他の部分内のアミノ酸残基）をコードする核酸は、アミノ酸残基のランダム化（すなわち、核酸の改変による１つ以上のアミノ酸残基のランダム変異）の標的とすることができる。いくつかの実施例において、ＯＢフォールドドメインの外側の結合表面のストランド内のアミノ酸残基は、アミノ酸残基のランダム化の標的とされる。他の実施例において、ＯＢフォールドドメイン内の特定の構造をアミノ酸残基のランダム化の標的とすることができる。例えば、ＯＢフォールドドメイン結合表面のストランド内に存在する１つ以上のアミノ酸残基は、ランダム化の標的とすることができる。ＯＢフォールドドメイン結合表面は、βストランド１、βストランド２、βストランド３からなるＣ末端側の半分と、βストランド４およびβストランド５からなるＣ末端側の半分を含む。図１Ａ〜１Ｃを参照されたい。別の実施例において、コアＯＢフォールドドメインのβストランド間のループ内のアミノ酸残基は、ランダム変異の標的される場合がある。別の実施例において、ＯＢフォールドコアドメインに隣接するループ領域内に主要な挿入がある場合（例えば、無機ピロフォスファターゼ）、これらの挿入ループ上のアミノ酸残基は、ランダム化のために選択される場合がある。本発明はまた、タンパク質に対する安定性の変化を生じるように改変されたコアの一部分（すなわち、アミノ酸残基）を有する改変ＯＢフォールドドメインも包含する。
【００６１】
ＩＩ．改変ＯＢフォールドドメインの作成と提示方法
本明細書の実施例に記載の例示的実施形態において、変異が導入された２つの好熱性ＯＢフォールドタンパク質ドメイン、翻訳開始因子ＩＦ‐５Ａ（Ｓ＝８）、およびアスパルチルｔＲＮＡシンテターゼａｓｐＲＳ（Ｓ＝１０）を、ＯＢフォールドタンパク質の結合表面内のアミノ酸残基をランダム化することによって、改変ＯＢフォールドドメインのライブラリの作成に使用した。これらのタンパク質はともに、超好熱性クレンアーキアのＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍに由来する。ライブラリは、ＯＢフォールドドメインの結合表面内の特定のアミノ酸位置がランダム化されているロングオリゴヌクレオチドを使用して合成により作成した後、ＰＣＲを使用して遺伝子構築を行った。ライブラリを、それらのコードしたタンパク質の過剰発現率に関して検査し、ライブラリによってコードした可溶性および耐熱性タンパク質の割合に関して計算を行った。本明細書には、ａｓｐＲＳ  ＯＢフォールドドメイン（ａｓｐＲＳ‐ＯＢ）がファージ表面に提示および選択できることが示されている。ｔＲＮＡ、タンパク質、およびセルロースリガンドを含めた種々の基質への結合能を有する改変ＯＢフォールドドメインが作成可能であることを示すために、本明細書の実施例に記載のように、ａｓｐＲＳのスキャフォールドに基づく種々の改変ＯＢフォールドドメインのライブラリを作製し、ファージディスプレイ法に供した。本明細書に開示する一例示的実施形態においては、天然の状態で核酸結合ドメインであった改変ＯＢフォールドドメインと、リゾチームとの間の結合相互作用が示されている。
【００６２】
当業者であれば理解するように、当該技術分野で既知である、核酸の改変を作成する各種方法は、１つ以上のアミノ酸残基における改変を有するＯＢフォールドドメインの作成（コード）に使用することができる。ＯＢフォールドドメインをコードする核酸は、当該技術分野で標準的な方法（例えば、化学合成、遺伝子組換え法）を使用して得る場合もあれば、および／または生物供給源から得る場合もある。対象の核酸は、特定の宿主細胞における発現に必要な１つ以上のエレメントの制御下に配置される場合がある。ＯＢフォールドドメインの増殖には種々の宿主細胞が利用可能であり、表面に改変ＯＢフォールドドメインを提示させるのに使用される場合があるディスプレイ方法は、当該技術分野で既知であり、本明細書で記載される。ディスプレイ方法には、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、およびｍＲＮＡディスプレイが含まれるが、これらに限定されない。
【００６３】
ｉ．ディスプレイ方法
ディスプレイ技術は、発現したタンパク質からなる大きなライブラリを、固定化したリガンドを使用してスクリーニングし、個々のタンパク質と標的リガンドの間の新たな相互作用を特徴付けるまたは発見する工程を伴う。ディスプレイ技術の最も重要な特徴は、スクリーニングしているタンパク質（発現型）をそれらをコードする遺伝情報（遺伝子型）と結び付けることができる点である。すべてのディスプレイ技術において、遺伝情報は、スクリーニングしたタンパク質と同時に単離される。これは一般的に、タンパク質またはタンパク質断片を生物実体（例えば、ファージ、酵母、または細菌）の表面に提示し、ライブラリの増幅に生物の複製系を使用することによって行われる。これらのｉｎ  ｖｉｖｏ系の代わりとして、プロセス全体をｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うことも可能であり、このような技術は、リボソームディスプレイまたはｍＲＮＡディスプレイと呼ばれる。このような場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで作成した転写物は、細胞抽出物に翻訳され、ＲＴ‐ＰＣＲを使用して、ｍＲＮＡ‐リボソーム‐タンパク質複合体のリガンドを媒介した単離後に、遺伝情報の増幅が行われる。
【００６４】
ａ．ファージディスプレイ
糸状バクテリオファージの表面への外来ペプチドおよびタンパク質の提示は、「ファージディスプレイ」と呼ばれ、現在では分子間相互作用の研究に一般的に使用されている方法である。通常、スクリーニングするタンパク質ライブラリは、バクテリオファージ粒子の一端のｇｅｎｅ  ＩＩＩタンパク質産物との融合体として、またはファージ粒子表面のｇＶＩＩＩタンパク質との融合体として発現される。このようなファージライブラリを細菌に感染させると、非常に効率的なライブラリ増幅が可能となる（Ｇｒｉｆｆｉｔｈら、１９９４）。典型的なファージディスプレイプロトコルは、細菌性宿主内でファージ粒子を作成する工程を伴い、各粒子は、自身の外殻タンパク質の内の１種（ｇＩＩＩまたはｇＶＩＩＩタンパク質）との融合体として、遺伝子ライブラリの１メンバーの遺伝子産物を提示する。ファージライブラリの標的への結合、非結合ファージを除去する洗浄工程、および結合粒子の溶出を伴う、固定化した標的分子への結合の選択プロセス（バイオパニング）によって、ファージ粒子のライブラリが得られる。通常は、所望の特性を有する分子の選択には、溶出したファージを細菌性宿主における再増幅と、固定化した標的上での選択とを伴う、複数回のパニングが必要となる。本明細書の実施例に開示する例示的実施形態において、改変ＯＢフォールドドメインの提示およびスクリーニングには、ファージディスプレイ法が使用される。
【００６５】
ｂ．細菌ディスプレイおよび酵母ディスプレイ
細菌ディスプレイおよび酵母ディスプレイ技術によって、酵母細胞サッカロミセス・セレビシエ（Ｂｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｔｔｒｕｐ，１９９７）または細菌（大腸菌、スタフィロコッカス・カルノーサス）（Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、１９９８；Ｗｅｒｎｅｒｕｓら、２００３）の表面に、それぞれアグルチニン酵母接着受容体または細菌性外膜タンパク質（ＯＭＰ）との融合体として、組換えタンパク質を発現させることができる。
【００６６】
発現した融合タンパク質もタグ配列を含み、フローサイトメトリーによるライブラリの表面発現の定量化が可能となる。リガンドの間接的蛍光標識と組み合わせると、抗タグ標識では、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）による細胞選別と、相互作用の結合親和性の判定が可能となる（Ｆｅｌｄｈａｕｓら、２００３；Ｗｅｒｎｅｒｕｓら、２００３）。酵母発現系を他のディスプレイ法よりも価値のあるものとする酵母発現系の特徴とは、細菌またはｉｎ  ｖｉｔｒｏディスプレイ系では問題となる可能性がある、哺乳類タンパク質の正確な翻訳後修飾、プロセッシングおよびフォールディングである。
【００６７】
ｃ．リボソームディスプレイおよびｍＲＮＡディスプレイ
リボソームディスプレイおよびｍＲＮＡディスプレイは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの大きなタンパク質ライブラリの選択や溶出を可能にする技法である。必要となる唯一の生物成分は、タンパク質配列をコードするｉｎ  ｖｉｔｒｏ作成転写物の翻訳に必要な因子を含有する細菌性細胞抽出物である。リボソームディスプレイの遺伝子型と発現型は、リボソーム複合体を介して互いに結合しており、選択に使用される、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソーム、およびコードされたタンパク質から構成されている（Ｈａｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，１９９７）。ｍＲＮＡディスプレイ法では、ｍＲＮＡと翻訳されたタンパク質との結合にピューロマイシンを使用し、それによって遺伝子型および表現型の情報を含有するｍＲＮＡ‐タンパク質複合体の精製を行う。選択後、単離したｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ複合体はＲＴ‐ＰＣＲによって増幅され、別の回の選択のために転写および翻訳することができる（Ｌｉｐｏｖｓｅｋ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，２００４）。ディスプレイ法の参考文献には以下の一覧が含まれ、これらはすべて全体が参考として本明細書で援用される：Ｂｏｄｅｒ  ＥＴ  ａｎｄ  Ｗｉｔｔｒｕｐ  ＫＤ（１９９７）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：５５３−７；Ｆｅｌｄｈａｕｓ  ＭＪら、（２００３）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：１６３−７０；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ＡＤら、（１９９４）ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １３，３２４５−３２６０；Ｈａｎｅｓ  Ｊ，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ（１９９７）ＰＮＡＳ  Ｍａｙ  １３；９４（１０）：４９３７−４２；およびＬｉｐｏｖｓｅｋ  Ｄ，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ａ．，（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈ．２９０  ５１−６７；Ｗｅｒｎｅｒｕｓ  Ｈら、（２００３）Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９（９）：５３２８−３５。
【００６８】
ディスプレイ法は、例えば以下の文献に開示されている：Ｂｏｄｅｒ  ＥＴ  ａｎｄ  Ｗｉｔｔｒｕｐ  ＫＤ（１９９７）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：５５３−７；Ｆｅｌｄｈａｕｓ  ＭＪら、（２００３）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：１６３−７０；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ＡＤら、（１９９４）ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １３，３２４５−３２６０；Ｈａｎｅｓ  Ｊ，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ（１９９７），ＰＮＡＳ  Ｍａｙ  １３；９４（１０）：４９３７−４２；Ｌｉｐｏｖｓｅｋ  Ｄら、（２００４）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈ．２９０  ５１−６７；およびＷｅｒｎｅｒｕｓ  Ｈ，ら、（２００３）Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９（９）：５３２８−３５。
【００６９】
ＩＩＩ．改変ＯＢフォールドドメインのスクリーニングに利用できる可能性がある標的
天然ＯＢフォールドドメインのリガンドは多種多様である。改変ＯＢフォールドドメインのライブラリを作製することにより、ＯＢフォールドドメインに利用できる可能性がある標的の多様性が拡大する。改変ＯＢフォールドドメインのライブラリに対するスクリーニングに有力な標的は、例えば核酸、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、炭水化物、オリゴ糖、およびホルモンを含むがこれらに限定されない種々の分子を包含する。
【００７０】
ｉ．核酸
多数のＯＢフォールドドメインが、一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡへの結合に関与する。これらのドメインには、腫瘍遺伝子ＢＲＣＡ２の一本鎖ＤＮＡ結合ドメイン、ヒト複製タンパク質Ａ由来の複数のドメイン、ならびにアスパルチル‐およびリジル‐ｔＲＮＡシンテターゼのアンチコドン結合ドメインが含まれる。したがって、一本鎖ＤＮＡおよびｔＲＮＡは、改変ＯＢフォールドドメインライブラリのスクリーニングのためのリガンド標的として使用することができる。
【００７１】
ｉｉ．タンパク質標的
改変ＯＢフォールドドメインライブラリのスクリーニングに使用できるタンパク質には、例えば酵素、調節タンパク質、タンパク質およびペプチドホルモン、輸送タンパク質など、種々のものがある。本明細書に開示する例示的実施形態においては、リゾチームがタンパク質標的として使用される。その他の標的には、ユビキチン、補体成分Ｃ４、プラスミノゲン前駆体、アポリポタンパク質Ａ‐ＩＩ、血漿プロテアーゼＣ１インヒビター、トランスサイレチン、および血清アミロイドＰ成分が含まれるが、これらに限定されない。
【００７２】
ｉｉｉ．オリゴ糖標的
オリゴ糖は、すべての生物の生物学において重要な役割を果たす。例えばラミナリヘキソース（ｌａｍｉｎａｒｉｈｅｘｏｓｅ）、マンノペンタオース、およびキシロペンタオースなどがあるがこれらに限定されないオリゴ糖基質が標的として使用可能である。
【００７３】
ｉｖ．ホルモン
ＯＢフォールドドメインライブラリのスクリーニングには、例えばステロイドホルモン（エストロゲン、テストステロン、およびコルチゾール）、カテコールアミン（例えば、エピネフリン）、およびその他同じような分子などがあるがこれらに限定されないホルモンが使用可能である。現在のところ、ＯＢフォールドドメインがステロイドホルモンまたはその他の補因子を天然のリガンドとして有するというエビデンスは存在しない。さらに、ステロイドに対する特異性が高い抗体は、これまでのところ作成が困難であり、ＯＢフォールドドメイン結合表面のようなくぼんだ結合表面が、特定のホルモンに対する結合特異性の向上により優れていることが証明される可能性がある。
【００７４】
ｖ．有機小分子
有機小分子（約１０００ダルトン以下の分子量を有する有機分子として定義される）も、ＯＢフォールドドメインの標的として使用可能である。有機小分子は、天然分子である場合もあれば、非天然の合成分子である場合もある。天然有機小分子は、生物系と関連する場合もあれば（例えば、ステロイドホルモン；上述を参照）、非生物的に発生する場合もある。有機小分子には、汚染物質またはその他の望ましくない物質、例えばＤＤＴまたはポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）が含まれるが、これらに限定されない。有機小分子には、薬物および医薬品、例えばドキソルビシンおよびパクリタキセルが含まれるが、これらに限定されない。
【００７５】
ＩＶ．ＯＢフォールドドメインの応用
本明細書で記載の通り、ＯＢフォールドドメインは、多様な分子認識プラットフォームである。種々のＯＢフォールドドメインが当該技術分野で既知であり、本明細書に開示されており、そしてＳＣＯＰやその他のデータベース、例えばＰｆａｍおよびＳｕｐｅｒｆａｍｉｌｙにおいて同定されている。このようなＯＢフォールドドメインは、改変ＯＢフォールドドメインだけでなく、例えば核酸、タンパク質、ホルモン、炭化水素、およびオリゴ糖などの標的に対してスクリーニングが可能な改変ＯＢフォールドドメインのライブラリを作製する方法においても使用可能である。このようなスクリーニング方法は、所望の特性を有する改変ＯＢフォールドドメインの同定に使用可能である。例えば、ヒトＯＢフォールドドメインは、ヒトへの治療に応用できる可能性があるヒト標的に対するスクリーニングを行うための改変ＯＢフォールドドメインライブラリを作製するスキャフォールドとして使用可能である。別の例において、酵母のＯＢフォールドドメインは、バイオテクノロジーまたは発酵用途に応用できる可能性がある改変ＯＢフォールドドメインライブラリを作製するスキャフォールドとして使用可能である。さらに別の例において、酵素のＯＢフォールドドメインを、新たな酵素特性を有する改変ＯＢフォールドドメインライブラリを作製するスキャフォールドとして使用可能である。
【００７６】
改変ＯＢフォールドドメインで見込まれる用途は、診断用試薬、治療用途、およびツールという３つの大きなカテゴリーに分類される。
【００７７】
改変ＯＢフォールドドメインは幅広い分子生物学ツールで使用可能であり、これには例えば、遺伝子組換え供給源または血清のような天然供給源のいずれかに由来するタンパク質の親和性精製用のタンパク質精製試薬としての使用が含まれる。このような用途では、選択タンパク質に対して特異的な結合親和性を有するＯＢフォールドドメインをビーズ上に固定化した後、標的タンパク質の親和性精製に使用する。その他の用途には、ウェスタンブロット法でのタンパク質検出、蛍光標識ＯＢフォールドドメインを使用したタンパク質検出、ならびに一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡの保護物質での使用が含まれる。このような状況において抗体に優るＯＢフォールドドメインの主な利点としては、試薬に適合するように改変ＯＢフォールドドメインの安定性を調整できる点である。例えば、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｉｏｐｈｉｌｕｍから得られるもののような熱安定性ＯＢフォールドドメインは、親和性精製試薬として抗体よりも効果的であると考えられる。
【００７８】
改変ＯＢフォールドドメインの診断用途には、例えば、血清、培養上清および汚染水のような液体中のタンパク質検出、遺伝子タイピング（多くのＯＢフォールドタンパク質は一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質であり、これらは、遺伝子タイピングのような方法での使用のために、特異的なＤＮＡまたはＲＮＡモチーフを検出するように開発できる可能性がある）、ならびに小分子検出物質が含まれる。
【００７９】
現在、診断および治療の臨床試験段階にあるすべての生体タンパク質の大部分を組換え抗体やそれらの断片が占めていることを考えると、改変ＯＢフォールドドメインのライブラリのような抗体ライブラリに代わるものが、治療薬としての可能性を有している。すでに市販されている組換え抗体の最近の例としては、ハーセプチン（抗ＨＥＲ２抗体）、リツキサン（リツキシマブ）（抗ＣＤ２０抗体）、およびアバスチン（抗ＶＥＧＦ抗体）などの癌治療薬がある。改変ＯＢフォールドドメインのヒト化ライブラリも作成される場合があり、このライブラリから、治療分野での用途が見出される適切な結合特性を有する特異的なものを同定することができる。
【実施例】
【００８０】
（実施例１）  材料および方法
化学物質および生化学物質
標準的なオリゴヌクレオチドはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し、ランダム化ロングオリゴヌクレオチドはすべてＭＷＧ（ドイツ  マルティンスリート）より入手した。ＰｆｘおよびＴａｑポリメラーゼならびにすべての制限酵素はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（米国カリフォルニア州カールズバッド）より入手した。エビ由来アルカリフォスファターゼ（ＳＡＰ）およびＴ４リガーゼはＲｏｃｈｅ（スイス  バーゼル）より入手した。ファージミドベクターｐＲＰＳＰ２ならびにファージＶＣＳ‐Ｍ１３およびＶＣＳＭ‐１３ｄ３（Ｖｄ３）はＤｒ．Ｊ．Ｒａｋｏｎｊａｃより入手した（３１、３２）。ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズおよびＰｒｏｔｅｃｔｏｒ（登録商標）ＲＮａｓｅインヒビターは、ニワトリ卵白リゾチームと同様にＲｏｃｈｅより入手した。ウシ血清アルブミンはＳｉｇｍａより入手した。ビオチン化トランスファーＲＮＡは、Ａｍｂｉｏｎ（米国）のＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写キットと、ＲｏｃｈｅのビオチンＲＮＡ標識ミックスを使用して作成した。ウェスタン解析用のニトロセルロース膜は、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ（ドイツ  ダッセル）より入手し、Ｐｉｅｒｃｅ（米国）のＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）を基質として使用した。
【００８１】
バイオインフォマティクス
Ｓｗｉｓｓ‐ｐｄｂＶｉｅｗｅｒおよびＰｙｍｏｌ（ｐｙｍｏｌ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ）を使用して、構造の観察、解析、またはＰＤＢファイル（３３）から図への変換を行った。ＩＦ‐５Ａの構造解析にはＰＤＢ  ｅｎｔｒｙ  １ｂｋｂ（３４）を使用した。ａｓｐＲＳには、ａｓｐＲＳホモログ１ｂ８ａ（３５）、１ｅｏｖ（３６）、１ｃｏａ（３７）のＰＤＢファイルを使用した。
【００８２】
ａｓｐＲＳ‐ＯＢの構造モデルは、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来のａｓｐＲＳ‐ＯＢのアミノ酸配列を送信することにより、ＳｗｉｓｓＭｏｄｅｌ（３８〜４０）より入手し、ＣｌｕｓｔａｌＷ（バージョン１．８）を使用して、オンラインでＥＢＩサービスのウェブサイト（＜ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／＞）を介してアラインメントを行った。
【００８３】
クローニング
一般的なクローニングはＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ（４１）にしたがって行った。ａｓｐＲＳ‐ＯＢ（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ  ＩＭ２由来のａｓｐ‐ｔＲＮＡシンテターゼ、塩基１〜３２７番、アミノ酸１〜１０９番、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿５５８７８３）およびＩＦ５Ａ‐ＯＢ（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ  ＩＭ２由来のＩＦ‐５Ａ、ＮＰ＿５６０６６８、塩基２０８〜３９９番、アミノ酸７６〜１３９番）の野生型遺伝子は、ａｓｐＲＳ‐ＯＢの場合オリゴヌクレオチド００５および００６を、ＩＦ５Ａ‐ＯＢの場合オリゴヌクレオチド０１１および０１２を使用して、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ  ＩＭ２ゲノムＤＮＡ（ＮＣ００３３６４、（４２））からＰＣＲで増幅した。オリゴヌクレオチドの配列は付表Ｉに列挙する。過剰発現のためのすべてのＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ｐＰｒｏＥｘ‐Ｈｔｂにライゲーションした。ｐＰｒｏＥＸ‐Ｈｔｂは、Ｎ末端にＨｉｓ６タグが付いた融合タンパク質としてタンパク質を作成する。ａｓｐＲＳ‐ＯＢ遺伝子をｐＪＡＲＡ１４０にクローニングする場合は、オリゴヌクレオチド対０５０／０４４を使用してａｓｐＲＳ‐ＯＢをＰＣＲで増幅し、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩを使用して消化した。ｐＪＡＲＡ１４０も同じ酵素で消化し、ライゲーションの前に脱リン酸化した。サブクローニングを行う場合は、ベクターに特異的なプライマーを使用して選択した突然変異遺伝子を増幅し、ドナーベクターｐＤＯＮＲ２２１に挿入した後、ｐＤＥＳＴ１５に挿入した（これらのベクターはいずれもＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）クローニング系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の一部である）。ｐＤＥＳＴ１５は、グルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の融合体としてタンパク質を発現することが可能である。
【００８４】
大腸菌
ｐＰｒｏＥＸから得たすべての構築物のクローニングやプラスミド調製、ならびに小規模のタンパク質合成には、大腸菌Ｋ１２株ＸＬ１‐ｂｌｕｅ（４３）を使用し、すべてのｐＲＰＳＰ２構築物のクローニング、ならびにＶＣＳ‐Ｍ１３ヘルパーファージにより作成したすべてのファージには、大腸菌ＪＭ１０１誘導体ＴＧ１を使用した。ｐＪＡＲＡ１３１およびｐＪＡＲＡ１１２で形質転換した大腸菌Ｋ５６１（大腸菌Ｋ１７６２（４４）を生成）は、多価ディスプレイ用のＶＣＳ‐Ｍ１３ｄ３ヘルパーファージの調製に使用した。大規模なタンパク質作成および精製には大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用した。
【００８５】
遺伝子ライブラリの構築
ライブラリは、コドンＮＮＫ（Ｎ＝Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ、Ｋ＝ＴまたはＧ）を含む変異原性オリゴヌクレオチドを、選択した位置に組み込むことにより構築した。組み込んだ変異を担持するａｓｐＲＳ‐ＯＢ遺伝子断片をＰＣＲで作成し、次いで完全長遺伝子に構築した。ランダム化した位置を組み込むロングオリゴヌクレオチドは表１に列挙する。最初のＰＣＲ工程では、対応するフランキングプライマーを使用し、選択した位置にランダム化したオリゴヌクレオチドを組み込んで遺伝子断片を作成した（３０サイクル、９４℃１分間、５２．５℃３０秒間、６８℃１分間）。第２の工程では、オーバーラップ伸長ＰＣＲ（２５サイクル、９４℃１分間、５２．５℃３０秒間、６８℃１分間）によって遺伝子断片を完全長遺伝子に構築した。その後の工程で１０８の多様性が維持されるようにするため、構築した産物の量は１０１１個の分子をよりも多くなるように分光光度法で算出した。構築した産物を、ａｓｐＲＳ‐ＯＢの場合はベクター特異的プライマー００５／００６を、ＩＦ５Ａ‐ＯＢの場合はベクター特異的プライマー０１１／０１２をそれぞれ使用して、ＰＣＲ（３０サイクル、９４℃１分間、５２．５℃３０秒間、６８℃１分間）で増幅し、消化した後、ｐＰｒｏＥｘ‐Ｈｔｂにライゲーションした。ａｓｐＲＳ‐ＯＢのファージライブラリの場合は、プライマー０５０／０４４を、ｐＲＰＳＰ２へのクローニングに使用した（下記を参照）。野生型遺伝子または構築したライブラリのいずれかを含むプラスミドを、大腸菌ＸＬ１‐Ｂｌｕｅに形質転換し、アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ寒天平板培地上で３７℃にて一晩培養した。個々のコロニーをピックアップし、それらを５０μＬのＬＢ／Ａｍｐ中で数時間培養することにより、診断ＰＣＲを行った。この培養液の１μＬを使用して、ｐＰｒｏＥｘ‐ＨｔｂまたはｐＲＰＳＰ２それぞれの診断プライマーを使用する１０μＬのＰＣＲ増幅（２５サイクル、９４℃１分間、５２．５℃３０秒間、６８℃１分間）を行った。Ｐｆｘポリメラーゼはすべての調製ＰＣＲ反応に使用したのに対し、Ｔａｑポリメラーゼは診断ＰＣＲ反応にのみ使用した。各ＯＢフォールド遺伝子の構築計画を概説するスキームは図２Ａおよび図２Ｂに示す。
【００８６】
ライブラリ由来タンパク質の過剰発現プロファイル
各ライブラリでは、形質転換した細菌を寒天（ＬＢ‐ａｍｐ含有）上に接種し、シングルコロニーをピックアップして、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆのサーモミキサーで１２００ｒｐｍにて振盪しながら、９６ウェルの深型プレートで１００μＬのＬＢ‐ａｍｐ（５０μｇ・ｍＬ−１）中で一晩培養した。これらの培養液を、新しいＬＢ‐ａｍｐを９００μＬ添加して希釈し、さらに６０分間培養した後、１ｍＭのイソプロピル‐Ｄ‐チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を使用して３７℃にて４時間誘導した。細菌細胞を遠心分離により回収し、１５０μＬのトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ：５０ｍＭトリス‐ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）に再懸濁し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ、１５％ポリアクリルアミド）で解析した。表１は、ａｓｐＲＳ‐ＯＢおよびＩＦ５Ａ‐ＯＢライブラリの構築に使用したロングオリゴヌクレオチドの一覧である。それぞれのランダム化したコドンは、ＮＮＫ（Ｎ＝Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ、Ｋ＝Ｔ／Ｇ）またはアンチセンスコドンの場合はＭＮＮ（Ｍ＝Ａ／Ｃ）で定義される。図３および図３Ｂも参照されたい。
【００８７】
【表１】
2009539346.tif 000074
再懸濁した細胞は、凍結融解とリゾチームの添加（０．５ｍｇ・ｍＬ−１）を行うことによって溶解し、不溶性物質の沈降後、可溶性画分もＳＤＳ‐ＰＡＧＥで解析した。小規模の精製工程は、５μＬのＮｉ‐ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）を使用して可溶性タンパク質を結合させることによって行った。Ｎｉ‐ＮＴＡビーズはＴＢＳで洗浄し、結合したタンパク質をＳＤＳ‐ＰＡＧＥを使用して同定した。
【００８８】
タンパク質発現と精製
野生型ＯＢフォールドドメインであるａｓｐＲＳ‐ＯＢおよびＩＦ５Ａ‐ＯＢ、ならびに変異体であるＩＦ５Ａ‐ＯＢ／Ａ２およびａｓｐＲＳ‐ＯＢ／１３ｍＲＬを、ミリグラム量で発現および精製した。大腸菌ＸＬ１‐ＢｌｕｅをＬＢ‐ａｍｐ（５０μｇ・ｍＬ−１）中で一晩培養した２５ｍＬを使用して、５００ｍＬのＬＢ‐ａｍｐ培養液を播種した。ＯＤ６００が０．６になるまで３７℃にて培養物を培養し、１ｍＭのＩＰＴＧで４時間誘導した。細菌を遠心分離により回収し、−２０℃にて保存した。２５ｍＬのＴＢＳ＋１０ｍＭイミダゾールに細胞を再懸濁して、ソニケーションで溶解した。ＩＦ‐５Ａ由来のＯＢフォールドタンパク質を、８５℃３０分間のインキュベーションを含む加熱工程で処理した。これにより、大腸菌タンパク質の大部分が変性する。溶解した細胞をＳｏｒｖａｌｌ  ＳＳ‐３４ローターで１６，０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離した。精製のため、溶解物をＮｉ‐ＮＴＡ  Ｈｉｇｈトラップカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン）に充填した。カラムからの溶出は、イミダゾールグラジエントを使用して行った。精製したタンパク質を、イミダゾールフリーの２０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌで透析し、濃縮した後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用したサイズ排除による２回目の精製工程に供した。
【００８９】
ファージライブラリの作成
ファージの一般的な取扱い工程は、Ｂａｒｂａｓら、（４５）にしたがって行った。選択用のファージａｓｐＲＳ‐ＯＢ‐ｐＩＩＩ‐Ｖｄ３のストックを調製するため、ｐＪＡＲＡ１４０にａｓｐＲＳ‐ＯＢを含む約６×１０９個の大腸菌ＴＧ１細胞を使用して、２００ｍＬの２×ＹＴ‐ａｍｐ（５０μｇ・ｍＬ−１）に播種した。この培養液を３７℃にて振盪しながら１時間培養した後、振盪せずに３７℃にて３０分間約１×１０１２単位のＶｄ３ヘルパーファージを感染させた。次いで細胞を洗浄し、２×ＹＴ‐ａｍｐ中でさらに４時間培養した。次にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿によってファージを培養上清から濃縮し、ＴＢＳに再懸濁した後、４℃にて保存した。ファージの力価は３．０×１０１１ＴＤＰ・ｍＬ−１と判定した。
【００９０】
ａｓｐＲＳ‐ＯＢ遺伝子ライブラリをｐＲＰＳＰ２にクローニングする場合は、オリゴヌクレオチドペア０５０／０４４を使用して、構築した遺伝子ライブラリのＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで消化した。約１０μｇのＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ消化ファージベクターｐＲＰＳＰ２およびインサートを使用し、１：５のモル比にて１ｍＬの反応物中でライゲーションを行った後、スピンカラム（ＲｏｃｈｅまたはＱｉａｇｅｎ（ドイツ  ヒルデン））で精製した。エレクトロポレーションにより、５０μＬの溶出物を１０×５０μＬのエレクトロコンピテントな大腸菌ＴＧ１細胞に形質転換し、約１×１０８個の形質転換細胞を得た。形質転換した細胞を１００ｍＬのＳＯＣ培地中で３７℃にてさらに１時間培養した後、４００ｍＬのＬＢ／Ａｍｐを添加して、３７℃にてさらに１時間培養した。試料を採取し、希釈系列をＬＢ／Ａｍｐ寒天平板培地上に接種して、適切なインサートサイズについて個々のクローンを診断ＰＣＲで解析することによりライゲーションおよび形質転換効率を評価した。コロニーを無作為にピックアップし、個々のコロニーの診断ＰＣＲから適切なインサートの数を測定した。適切なサイズのインサート数は８９％であり、コロニー数は９×１０７個と算出され、適切なサイズのインサートを担持する約８×１０７種類のクローンという多様性が得られた。培養液のＯＤ６００が０．４に到達したところで、培養液に約５×１０１２個のｐｆｕのＶＣＳ‐Ｍ１３ヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を感染させ、攪拌せずに３７℃にて２０分間静置した後、１時間振盪した。最終濃度５０μｇ／ｍＬの培養液にカナマイシンを添加し、培養液を３７℃にて一晩培養した。細菌を沈降させ、２０ｇのＰＥＧ８０００（Ｓｉｇｍａ）および１５ｇのＮａＣｌに溶解した後、４℃にてファージを一晩沈殿させた。遠心分離によりファージをペレット化し、５ｍＬのＰＢＳに溶解した後、０．４５フィルターで濾過して、パニングに使用した。
【００９１】
ビオチン化ＲＮＡ標的の作成
ビオチン標識ａｓｐ‐ｔＲＮＡは、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔキット（Ａｍｂｉｏｎ、米国）およびビオチン‐１６‐ＵＴＰを含むビオチンＲＮＡ標識ミックス（Ｒｏｃｈｅ、スイス）を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を行うことによって作成した。Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来の７８ｂｐのａｓｐ‐ｔＲＮＡ遺伝子（Ｇｅｎｅ＿ＩＤ：１４６４２６３）をカバーする合成オリゴヌクレオチドと、Ｔ７プロモーター領域を３’末端に含むｐＥＴ２８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から増幅した１５０ｂｐのＤＮＡ断片のＰＣＲ構築を行った後、Ｔ７に関する最近のプロモーター認識研究（４２）にしたがって最適なプロモーター活性についてのＧＧを行うことによって、発現ＰＣＲ（４１）に基づきＤＮＡ鋳型を作成した。これにより、２３０ｂｐの産物が構築され、これをエタノールで沈殿し、乾燥させ、ＲＮａｓｅフリーの水に再懸濁し、さらにクローニングを行わずに転写用鋳型として使用した（４１）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写は、製造業者（Ａｍｂｉｏｎ）の取扱説明書にしたがって行い、２５μＬの反応物から約５μｇのビオチン化ａｓｐ‐ｔＲＮＡを得た。
【００９２】
ａｓｐＲＳ‐ＯＢライブラリの選択
ビオチン化ａｓｐ‐ｔＲＮＡは、ライブラリ「ＲＬ」および「１３ｍＲＬ」からの選択で標的として使用し、ニワトリ卵白リゾチーム（Ｒｏｃｈｅ、スイス）は「１３ｍＲＬ」からの選択にのみに使用した。
【００９３】
ＲＮＡでの選択の場合は、ビオチン化ａｓｐ‐ｔＲＮＡを、ストレプトアビジンをコートした常磁性ビーズに結合させることにより固定化した。１０μＬのビーズを４００μＬのＰＢＳ‐Ｔ（ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ）で２回洗浄した後、攪拌し、時折反転させながら室温にて３０分間１００ｎｇのビオチン化ａｓｐ‐ｔＲＮＡとともにインキュベートした。ＰＢＳ‐Ｔでビーズを３回洗浄してから、ＰＢＳ‐Ｔ＋０．５％ＢＳＡ中で１ｍＬの約１０１１ｃｆｕのファージライブラリＲＬまたは１３ｍＲＬとともに２時間インキュベートした。１回目のパニングでは６回、次の回のパニングでは８回ＰＢＳ‐Ｔで洗浄した後、ビーズをＰＢＳでさらに２回洗浄し、１μｇ（５Ｋｕｎｉｔｚユニット）のＲＮａｓｅＡ（ウシ脾臓由来、Ｒｏｃｈｅ）とともに３７℃にて３０分間インキュベートして、ＲＮＡを消化し、ＲＮＡ結合ファージを溶出した。溶出したファージ粒子を細菌感染によってカウントし、次の回のパニングのＴＤＰ作成用に新鮮ＴＧ１培養液３ｍＬの感染に使用した。培養液を攪拌せずに３７℃にて２０分間静置し、振盪しながら１時間インキュベートした後、アンピシリンを添加して一晩培養した。一晩経った培養液を、５００ｍＬの予め温めたＬＢ／Ａｍｐへの播種に使用した。ヘルパーファージの感染およびＴＤＰの作成は、上で概説したファージライブラリ作成と同じ工程に従って行った。パニングを４回行った後、個々のクローンを解析した。
【００９４】
リゾチームでの選択の場合は、２．５ｍＬのリゾチーム溶液（１０μｇ／ｍＬ）含有の２０ｍＭのＮａＣＯ３、ｐＨ９．０中で、４ｍＬのＩｍｍｕｎｏ  Ｔｕｂｅ（Ｎｕｎｃ、デンマーク）を４℃にて一晩コーティングし、４ｍＬの１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで室温にて１時間ブロッキングを行った。ライブラリ１３ｍＲＬ由来のファージを添加した後（２．５ｍＬ中に約２．５×１０１１のｃｆｕを含有）、緩徐に攪拌し、時折反転させながら室温にて２時間インキュベートした。洗浄は、ＰＢＳ‐Ｔ０．１％ＢＳＡによる８回の洗浄工程（１回目の選択では、ＰＢＳ‐Ｔを使用して６回だけ洗浄）と、ＰＢＳによる２回の洗浄よって５分以内に速やかに行った。２．５ｍＬの溶出バッファー（０．２ＭグリシンＨＣｌ  ｐＨ２．２、ブロモフェノールブルー）とともに１０分間インキュベーションすることで、結合したファージを溶出し、５００μＬの１ＭトリスＨＣｌ  ｐＨ９．０を使用して速やかに中和した。溶出したファージをカウントし、ＴＤＰの増幅および次の回のパニングに使用する３ｍＬの新鮮ＴＧ１の感染に使用した。培養液の培養とＴＤＰの作成は、ａｓｐ‐ｔＲＮＡでのパニングについて上に記載したのと同じ方法で行った。選択と増幅を６回行った後、クローンを採取して解析した。
【００９５】
ファージディスプレイタンパク質検出のためのウェスタンブロット
ａｓｐＲＳ‐ＯＢのファージ試料を、ＰＥＧ沈殿によって１×１０１１ＴＤＰ／ｍＬになるよう濃縮し、１０μＬをゲルローディングバッファー（ＳＤＳおよびＢＭＥ含有）と混合し、ボイルして、１０％のＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲル上で分離した。ニトロセルロース膜（Ｐｒｏｔｒａｎ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ、ドイツ）上に転写した後、マウス抗ｃ‐ｍｙｃ一次抗体（Ｚｙｍｅｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＨＲＰ結合抗マウス二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ‐Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン）を使用して、ａｓｐＲＳ‐ＯＢ‐ｐＩＩＩ融合タンパク質を検出した。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）基質（Ｐｉｅｒｃｅ、米国）を使用して可視化を行った。
【００９６】
ファージＥＬＩＳＡ
リゾチームへの結合のために選択したクローンを解析するために、ファージＥＬＩＳＡ実験を行った。９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレートを、５μｇ／ｍＬのニワトリ卵白リゾチーム、５μｇ／ｍＬのＲＮａｓｅＡ、または１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで、４℃にて一晩コーティングした。ＴＢＳで２回洗浄した後、プレートを室温にてブロッキングバッファー（５％スキムミルク含有ＴＢＳ）で１時間ブロッキングして、その後、ファージ（１０９ｃｆｕ／ウェル、ＶＣＳ‐Ｍ１３ｄ３由来）を２．５％のスキムミルク‐ＴＢＳ‐Ｔに添加した。プレートを、攪拌しながら室温にて２時間インキュベートした。水で１０回洗浄した後、ブロッキングバッファーで希釈したマウス抗Ｍ１３タンパク質ＶＩＩＩを添加し、室温にて１時間インキュベートした。プレートを水で４回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ウサギ抗マウス免疫グロブリン（Ｐｉｅｒｃｅ）を含有するブロッキングバッファーをウェルに添加し、室温にて１時間インキュベートした。ウェルを水で４回洗浄し、５０μＬの基質溶液（１ｍｇ／ｍＬのｏ‐フェニレン‐ジアミン含有ＰＢＳ  ０．０３０％Ｈ２Ｏ２）をウェルごとに添加した。約１５分後に２５μＬの２．５ＭＨ２ＳＯ４を添加して反応を停止させ、４９２ｎｍで吸光度を記録した。
【００９７】
ファージの相対定量化（提示した融合タンパク質の定量化）では、ファージ試料をプレートのコーティングに直接使用した。ブロッキングバッファーによるブロッキングの後、マウス抗ｃ‐ｍｙｃ一次抗体（Ｚｙｍｅｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＨＲＰ結合抗マウス二次抗体を使用して、上述の工程に従いファージを検出した。
【００９８】
モノクローナルファージの作成
ファージ結合実験では、ＶＣＳ‐Ｍ１３ｄ３（Ｖｄ３）のｇＩＩＩ欠失変異体（Ｒａｋｏｎｊａｃ  ｅｔ  ａｌ，１９９９）をヘルパーファージとして使用して、モノクローナルファージ試料を多価ディスプレイとして作成した。マイクロパニングによるプレスクリーニングでは、ｗｔＶＣＳ‐Ｍ１３由来の一価ファージを使用した。ヘルパーファージＶＣＳ‐Ｍ１３およびＶｄ３のストックは、一般的なプロトコル（Ｂａｒｂａｓ  ＩＩＩら、２００１）にしたがって、単一のプラークから作成したが、但し、ＶＣＳ‐Ｍ１３はＴＧ１上で培養し、大腸菌Ｋ１７６２（プラスミドｐＪＡＲＡ１３１（ｃａｍ１）およびｐＪＡＲＡ１１２（ａｍｐ１）で形質転換したＫ５６１）上のＶｄ３は、ファージ構築用のｐＩＩＩを供給するための宿主株として使用した。Ｖｄ３試料は６５℃にて２０分間加熱して、細菌性宿主由来のλ溶原菌を死滅させた。
【００９９】
Ｖｄ３またはＶＣＳ‐Ｍ１３上のファージａｓｐＲＳ‐ＯＢのストックを調製するため、対応するｐＲＰＳＰ２誘導体で形質転換した大腸菌ＴＧ１を、１００ｍＬのＬＢ／Ａｍｐ中でＯＤ６００が０．４になるまで培養し、１０１２個のｐｆｕのＶｄ３またはＶＣＳ‐Ｍ１３でそれぞれ感染させた。攪拌せずに３７℃にて２０分間インキュベートした後、培養液を振盪しながらさらに１時間インキュベートした。カナマイシン（最終濃度５０μｇ／ｍＬ）を添加し、培養液を一晩インキュベートした。細胞を沈降させ、最新のプロトコル（Ｂａｒｂａｓ  ＩＩＩら、）に従い、上述の通りに、ＰＥＧ／ＮａＣｌを使用した沈殿によってファージを精製した。ＴＤＰをＰＢＳに再懸濁し、解析に使用した。
【０１００】
ａｓｐ‐ｔＲＮＡでのモノクローナルファージ結合実験
ファージに提示したタンパク質のａｓｐ‐ｔＲＮＡへの結合を試験するため、モノクローナルファージ試料を使用して、Ｖｄ３上で融合タンパク質を多価提示させた。実施した工程は、上で概説した１回目の選択のものと基本的に同じであった。ビオチン化したａｓｐ‐ｔＲＮＡを、ストレプトアビジンでコーティングした常磁性ビーズと結合させ、ＴＤＰ試料を添加した（１０９ｃｆｕ／本）。インキュベーションおよび洗浄工程の後、ＲＮａｓｅＡを添加することによりＲＮＡを消化し、溶出したＴＤＰを細菌感染によってカウントした。
【０１０１】
ＧＳＴの「プルダウン」アッセイ
リゾチームで選択された変異体を、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）のｐＤＥＳＴ１５にサブクローニングし、ＧＳＴ融合タンパク質として発現させた。構築物を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、培養液を３ｍＬのＬＢ／Ａｍｐで培養した。最終濃度１ｍＭにＩＰＴＧを添加して細胞の誘導を行い、３７℃にてさらに４時間培養した。細胞を沈降させ、３００μＬの溶解バッファー（トリス‐ＨＣｌ  ７．５  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に再懸濁した後、ソニケーションで溶解した。不溶性物質を沈降させ、可溶性画分を１０μＬのグルタチオン結合セファロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）とともに４℃にて１時間インキュベートした。ＴＢＳ‐Ｔによる２回の洗浄工程の後、１５０μＬのリゾチーム（１ｍｇ／ｍＬ）と０．１％ＢＳＡとを含む３００μＬのＴＢＳ‐Ｔとともに、ビーズを４℃にて１時間インキュベートした。洗浄は、ＴＳ（５０ｍＭトリス‐ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）、ＴＢＳ‐Ｔ（２０ｍＭ  トリス‐ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）、ＴＢＳ‐Ｔ‐５００（ＴＢＳ‐Ｔ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ）といった異なるバッファーを使用して行った。ビーズをゲルローディングバッファー（ＳＤＳおよびＢＭＥ含有）に再懸濁し、ボイルして、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥで解析した。
【０１０２】
バイオセンサーの結合解析
リガンドリゾチームを、ｐＨ４．３の酢酸ナトリウムバッファー中の３０μｇ／ｍＬでタンパク質の一次アミン基を介して、ＣＭ５  Ｂｉａｃｏｒｅセンサーチップに結合させた。チップ上の４つのフローセルの内の２つ目を、ＥＤＣ：ＮＨＳの１：１（等量）混合液（Ｂｉａｃｏｒｅより販売）３５μＬで５μＬ／分にて活性化した。十分な反応が認められるまで１０〜２０μＬを連続注入することにより、活性化表面にリゾチームを結合させた。チップ上に残された非結合活性基を、エタノールアミン‐ＨＣｌを注入して失活させた。解析のため、ＯＢ３  １３ｍＲＬ  Ｌ６を、ランニングバッファーに３７０μＭを含む濃度から始めて、バッファーのみのブランクも含めた６段階濃度の１：２希釈系列に調整した。７つの試料それぞれを順不同に２５μＬ／分にて１分間２回解析し、最初のフローセルを基準として使用した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して、反応曲線の可視化と処理を行った。Ｓｉｇｍａ  Ｐｌｏｔ（Ｓｙｓｔａｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を使用して、各濃度における相対レスポンスを平均化し、プロットして、ＲｍａｘおよびｋＤを判定した。
【０１０３】
（実施例２）  Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来のＯＢフォールドドメイン
ＯＢフォールドドメインは特異的結合および酵素特性を有するタンパク質を作成するためにスキャフォールドとして使用できるかどうかを試験するために、提案した結合表面全体の変異に対する個々のＯＢフォールドドメインタンパク質の耐性を試験した。超好熱性クレンアーキアのＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ（Ｔｍａｘ＝１０４℃、Ｔｏｐｔ＝１００℃）由来の２つのＯＢフォールドドメインを選択した。この選択は、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍゲノム（４２）中のＯＢフォールドタンパク質の検索にＳｕｐｅｒｆａｍｉｌｙデータベース（バージョン１．６５（４６））を使用したデータベース検索にしたがって行った。このデータベースは、１２９４個のＳＣＯＰスーパーファミリー（ＳＣＯＰ：タンパク質の構造的分類）に区分された既知の構造を有するすべてのタンパク質のライブラリを使用して、隠れマルコフモデルを開発しており、次いでこれらモデルをプロファイルとして使用して、類似のフォールドを含む可能性があるタンパク質の配列決定ゲノムを検索した。この検索により、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ  ＩＭ２のゲノム由来の有力なＯＢフォールドドメインを含むタンパク質配列を表す１４件がヒットした。
【０１０４】
他のドメインと空間的に離れており、そのため独立して安定していることが予想されるＯＢフォールドタンパク質を探し出すため、これらの配列をそれぞれ解析した。さらに、配列からのＯＢフォールドの予測の信頼性をチェックするため、スーパーファミリーを表す３次元モデル、または利用可能な相同性の次元タンパク質構造に配列をアラインメントした。これらの１４の配列の内の８個が基準を満たした（表２を参照）。この８個の候補の内の６つが、ＲＮＡ結合タンパク質の２つの機能クラス、すなわち翻訳開始因子（ＩＦ）とアミノアシル‐ｔＲＮＡシンテターゼ（ａａＲＳ）に属していた。残りの２つの候補は、機能的アノテーションを含んでおらず、「保存されている仮想タンパク質」として分類した。
【０１０５】
選択した配列に由来するＯＢフォールドドメインをクローニングし、配列アラインメントからドメイン境界を同定し、大腸菌での発現と溶解性について試験した。アスパルチルｔＲＮＡシンテターゼ（ａｓｐＲＳ‐ＯＢ）および翻訳開始因子ＩＦ‐５Ａ（ＩＦ５Ａ‐ＯＢ）由来のＯＢフォールドドメインは、良好に発現し、可溶性および熱安定性を有していたため、これらを第一選択とした。
【０１０６】
ＩＦ‐５Ａタンパク質のさらなる利点は、高分解能の３次元構造がＰｆａｍデータベース（３４）で利用できる点であり、これを使用して、表面が露出した残基をランダム化に確実に選択することができた。ＩＦ‐５Ａのこの構造（図３）は、Ｃ末端にＯＢフォールドを有し、リンカー領域によって空間的に分離され、したがって本発明者等の選択基準を満たす２つのドメインを示す。提案した結合表面（β‐ストランド１〜３）は、タンパク質の中心から離れ、溶媒の方向を向いている。ＩＦ‐５ＡのＯＢフォールドは、せん断数がＳ＝８であるため、ＯＢフォールドドメインの１つのサブクラスを代表するものである。
【０１０７】
ａｓｐ‐ｔＲＮＡシンテターゼのＯＢフォールドドメイン（ａｓｐＲＳ‐ＯＢ）は、Ｓ＝１０の特性を有するＯＢフォールドタンパク質の第２のサブクラスの代表として選択した。Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来のａｓｐＲＳの３次元構造は利用できないが、他の生物由来のａｓｐＲＳタンパク質の構造はＰＤＢにいくつか存在する。図４は、大腸菌由来のａｓｐＲＳの結晶構造を示す（３７）。Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来のＯＢフォールドドメインとその大腸菌ホモログの配列アラインメントは、ＯＢフォールドドメインが３０％の配列同一性を有することを示している。それらの全長にわたって、ａｓｐＲＳタンパク質は配列レベルで２０％が同一である。ＯＢフォールドはＮ末端に位置し、より大きなＣ末端ドメインと明らかに空間的に離れている。結合表面は、Ｃ末端ドメインから離れて、溶媒の方向を向いている。Ｎ末端のＯＢフォールドドメインはｔＲＮＡに結合し、アスパルチル‐ｔＲＮＡアンチコドンを特異的に結合するアンチコドン認識ドメインを構成するが（３６）、Ｃ末端ドメインはタンパク質の酵素成分を構成する。表２には、予想されたＯＢフォールドを有するＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来の８つの選択された配列を示す。予想した大きさと提案したせん断数とともにＮＰ受入番号も示す。ＩＦ‐５Ａでは３次元構造も利用可能である。保存されている仮想タンパク質であるＮＰ＿５５９８４６の予想される大きさは、タンパク質全体に相当する。この例では、ＯＢフォールドドメインの境界を正確に予測するのが困難である。
【０１０８】
【表２】
2009539346.tif 000075
これらのＯＢフォールドドメインはいずれも、すべての界にホモログを有するため、種々の生理学的背景における応用の機会がもたらされる（異なる種に由来するａｓｐＲＳ（図５Ａ）およびＩＦ‐５Ａ（図５Ｂ）の配列アラインメントについては、図５Ａ〜５Ｂを参照）。図５Ｃは、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ、および大腸菌由来のａｓｐＲＳ‐ＯＢの配列アラインメントを示す。配列同一性はアスタリスクで示す。ＯＢフォールドの二次構造は配列の下に示し、ｌはストランド４と５の間のループ、ループ４／５である。
【０１０９】
（実施例３）  ランダム化のための残基の選択
２つのＯＢフォールドドメインのランダム化のための残基を、それらの３次元構造に基づいて選択した。ＩＦ‐５Ａの構造は利用可能である。ＳｗｉｓｓＭｏｄｅｌ（３８〜４０）と大腸菌（３６、３７）およびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ（３５）由来の利用可能な構造とを構造鋳型として使用してモデリングを行うことにより、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来のａｓｐＲＳのＯＢフォールドの構造を作成した。
【０１１０】
ＯＢフォールドドメイン結合表面上で、βストランド１〜３から、表面が露出した残基を選択した。ａｓｐＲＳおよびＩＦ５ＡのＯＢフォールドドメインは異なるせん断数を有するため、それらの構造は若干異なっている。特に、βストランド４および５、ならびにこれらのストランド間のループの配置は異なっている。ａｓｐＲＳ‐ＯＢの場合は、ライブラリの１つにおいて、ストランド４と５の間のループもランダム化に含めた。そのため、ａｓｐＲＳ‐ＯＢでは、βストランド１〜４上と、ストランド４と５の間のループ内に位置する、溶媒に露出した１３個の残基を、ランダム化に選択した。これによって、最大数１７個の変異部位がもたらされ、理論上の多様性として２０１７＝１．３×１０２２の変異体が可能となる。
【０１１１】
このような変異に対する耐性を評価するため、結合表面の各部分を個別に扱うライブラリセットを構築した。ＩＦ５Ａ‐ＯＢでは、βストランド１〜３上の９個または１１個の位置をランダム化した（図８）ライブラリを構築し、それぞれ理論上の多様性が２０９＝５．１２×１０１１および２０１１＝２×１０１４の変異体であると算出された２つのライブラリが得られた。導入した２つの残基、セリン‐アスパラギンをランダム化することにより（２ＲＬ）、またはさらなる２つの残基を使用してループを伸長することにより（２ＲＬ＋２）、ストランド１と２の間のループを標的として、２つの小さなライブラリ（それぞれ４００個の変異体）を作成した。選択した残基と、それらのＯＢフォールドドメイン中での位置については、図８および図９を参照されたい。
【０１１２】
（実施例４）  ＯＢフォールドライブラリ
各ＯＢフォールドドメインの所定の領域を扱うライブラリセットを構築した。ａｓｐＲＳ‐ＯＢフォールドドメインでは、βストランドを個別に、また互いを組み合わせて変異させた。野生型ＯＢフォールドドメイン（すなわち、天然ＯＢフォールドドメイン）および完全にランダム化したライブラリでは、ストランド４と５の間のループを個別にランダム化した。その結果、大きさが異なり、ランダム化位置の配置が異なる５つのライブラリが構築された（表３Ａ〜３Ｂを参照）。
【０１１３】
ＩＦ５Ａ‐ＯＢでは、βストランド１〜３ならびにストランド１と２の間のループをランダム化の標的とした。このループ（ストランド１と２の間）をランダム化の標的とし、ランダム化した表面積を伸長する可能性を評価した。この領域のループが伸長した天然ＯＢフォールドタンパク質の例が存在するが、これらの例では、このループに伸長が起こりやすい可能性があることが示唆されている。ａｓｐＲＳ‐ＯＢフォールドドメインに使用されたのと同様の手法で、種々の変異セットを有するライブラリ（表３を参照）をＰＣＲによって構築し、発現ベクターにクローニングし、大腸菌に発現させた。変異を担持するライブラリメンバーを表すクローンをピックアップし、適切なサイズのインサート、Ｈｉｓ６タグ結合タンパク質としての発現、溶解性、およびＮｉ‐ＮＴＡ樹脂への結合について解析した。
【０１１４】
【表３】
2009539346.tif 000076
表３Ａ〜３Ｂは、ａｓｐＲＳ‐ＯＢの遺伝子ライブラリの一覧である。接尾語‘ｍ’はβストランド１〜３をカバーするβシート中の変異を示す。接尾語‘ＲＬ’は、ランダム化したループ領域（ａｓｐＲＳ‐ＯＢの場合はループ４／５、ＩＦ５Ａ‐ＯＢの場合はループ１／２）を示す。
【０１１５】
（実施例５）  ライブラリの構築
基本的にライブラリは、縮重コドンを所望の位置に有する合成オリゴヌクレオチドを組み込むオーバーラップ伸長ＰＣＲに基づいて構築した。まず、遺伝子全体をカバーし、オーバーラップ領域を含む遺伝子断片を通常のＰＣＲ法により作成した。ランダム化した断片は、ランダム化したコドンを含む対応するロングオリゴヌクレオチドを組み込むことによって作成した。等モル量のこれらの遺伝子断片を遺伝子フランキングプライマーと組み合わせて使用して、断片をＰＣＲにより構築し、ランダム化した位置を組み込んだ完全長遺伝子を増幅した。種々の組み合わせの縮重オリゴヌクレオチドを使用して、結合表面の種々の部位にランダムな変異を含む複数のライブラリを作製した。ａｓｐＲＳ‐ＯＢでは、βシート上の残基Ｗ２８、Ｅ２９、Ｒ３１、Ｉ３３、Ｒ３５、Ｖ３６、Ｆ３８、Ｖ４０、Ｒ４２、Ｆ４７、Ｑ４９、Ｔ５１、Ｋ５３、およびループ領域の残基Ｉ８５、Ａ８６、Ｋ８７、Ｓ８８に多様性を生じた。ライブラリＲＬ（ランダム化したループ）は、βストランド４と５の間のループ領域に４つのランダム化した位置を含む。ＲＬライブラリの理論上の多様性は、２０４＝１６００００種類の変異体である。形質転換の後、ライブラリＲＬは約１０７個のクローンを含み、その内の９４％が適切なサイズのインサートを有しており、ライブラリの多様性を完全にカバーした。１３ｍＲＬの理論上の多様性は非常に高く、約５×１０２２種類の変異体である。形質転換の後、８９％の適切なインサートを有する１０８個のクローンが得られた。配列決定した１０個のクローンの内の８個が所望の変異配列を有していたが、２個のクローンには、ナンセンス翻訳をもたらすフレームシフトが認められた。１３ｍＲＬライブラリでは、全体の多様性が約８×１０７種類の変異体と算出された。
【０１１６】
ＩＦ５Ａ‐ＯＢのライブラリを個々に作成した。「９ｍ」および「１１ｍ」ライブラリはそれぞれ、遺伝子に組み込んだ種々のロングオリゴヌクレオチド対を有する。１１ｍライブラリでは、ループ１／２を４つのアミノ酸（Ｓｅｒ‐Ａｓｎ‐Ｇｌｙ‐Ａｌａ）により伸長させて、ランダム化した断片の十分なオーバーラップをもたらした。小さなライブラリである２ＲＬおよび２ＲＬ＋２では、対応する領域をカバーする遺伝子に組み込んだランダム化した位置を含む１つのオリゴヌクレオチドを使用して、ループ領域内のランダム化した領域を作成した。９個および１１個の変異を有するＩＦ‐５Ａライブラリの多様性は、１×１０７種類の変異体と算出され、小さなライブラリ（４００個の変異体）の理論上の多様性は完全にカバーされた。
【０１１７】
（実施例６）  ＯＢフォールド変異タンパク質の発現
いずれの天然ＯＢフォールドドメインも大腸菌で良好に発現し（培養液の１０〜２０ｍｇ・ｌ−１）、細胞溶解後に大部分は可溶性を有する。これらは、熱処理（８５℃にて１５分間）後も可溶性を維持し、Ｎｉ‐ＮＴＡビーズに定量的に結合する。ＯＢフォールドライブラリをクローニングし、Ｎ末端をＨｉｓ６タグで結合したタンパク質として発現させた。一連のタンパク質特性を記録して、タンパク質の安定性と構造的完全性を検討した。
【０１１８】
ＰＣＲライブラリを９０〜９５％の効率（コロニーＰＣＲにより判定）で発現ベクターにクローニングし、ポリヒスチジン融合タンパク質として遺伝子を大腸菌に発現させた。４８個または９６個のコロニーを、発現、溶解性、およびＮｉ結合性についてスクリーニングした。結果を表４にまとめる。
【０１１９】
【表４】
2009539346.tif 000077
ａｓｐＲＳ‐ＯＢのライブラリ構築の概要を表４に示す。各ライブラリについて、ＰＣＲにより作成した遺伝子断片、オリゴヌクレオチド、および鋳型を列挙する。ＰＣＲにより、オリゴヌクレオチドを組み込んだ遺伝子断片を作成した。次に、遺伝子フランキングプライマー（オリゴ００５および００６）を使用したオーバーラップ伸長ＰＣＲによって、ＰＣＲ産物を完全長遺伝子に構築した。図２Ａ〜２Ｂも参照されたい。ａｓｐＲＳ‐ＯＢのすべてのライブラリに由来するクローンの約半分が、大腸菌内で良好に発現した。βシート上のランダム化した位置の数（すなわち、ライブラリを構築するためにランダム化した、結合表面上のアミノ酸位置の数）は、発現する変異体の割合と相関すると考えられた。１３個の変異を有するライブラリである１３ｍＲＬと１３ｍのいずれでも、変異タンパク質の約４５％が良好に発現する。βシート１および２上に９個の変異を含むライブラリは、クローンの５２％に発現を示す。ループ４／５のみをランダム化の標的とするライブラリは、８１％という極めて多い発現クローンを有していたが、面および伸長したループの両方に存在するランダム化位置の組み合わせ（１３ｍＲＬ＋２）では、発現クローンの数はわずか３０％まで低下した。
【０１２０】
ＩＦ５Ａ‐ＯＢの場合は、βシート上に変異を有するライブラリが、１２％という比較的低い割合で発現し、その内の９〜２５％が可溶性を有していた。対照的に、ループ１／２にのみランダム化した位置を有する変異体の７２〜８１％が発現し、この内の約７０％が可溶性を有していた。すべてのＩＦ５Ａ‐ＯＢ変異体を、溶解後に８０℃にて熱処理した。そのため、すべての可溶性かつＮｉ結合性の変異体は熱安定性も有していた。
【０１２１】
少数の変異体を調製用発現および精製用にピックアップした。さらに、ａｓｐＲＳ‐ＯＢ変異体の大規模な精製も行った。表５は、発現、溶解性、およびＮｉ‐ＮＴＡ結合性実験の概要を示す。
【０１２２】
【表５】
2009539346.tif 000078
各ライブラリの３２〜１９２個のコロニーを、発現、溶解性、およびＮｉ‐ＮＴＡへの結合性についてスクリーニングした。表５は、発現クローン数、各ライブラリで算出された発現クローンの割合を示し、発現ＯＢフォールド変異体の溶解性およびＮｉ‐ＮＴＡ結合特性の概算を表す。
【０１２３】
（実施例７）  ファージディスプレイ法に供したａｓｐＲＳ‐ＯＢの解析
ライブラリ作成用のスキャフォールドとしての、タンパク質ドメインの重要な基準は、選択されたディスプレイ系において機能的に提示される能力をもつことである。本明細書に開示する実験ではファージディスプレイを使用した。ａｓｐＲＳ‐ＯＢ変異体の選択用としてのこの技術の実現性を評価するため、繊維状バクテリオファージＭ１３の表面上にｇＩＩＩ融合体として提示させた組換え野生型ａｓｐＲＳ‐ＯＢを評価した。作成したファージ粒子内におけるｐＩＩＩ‐ａｓｐＲＳ‐ＯＢ融合体の存在をウェスタンブロッティングで解析した。提示されたａｓｐＲＳ‐ＯＢの機能的提示を、ａｓｐ‐ｔＲＮＡを標的リガンドとして使用するファージ結合アッセイで検討した。
【０１２４】
野生型ａｓｐＲＳ‐ＯＢの遺伝子を、ｇＩＩＩ遺伝子の上流でファージミドベクターｐＲＰＳＰ２にクローニングし、ａｓｐＲＳ‐ＯＢをＮ末端に持ち、ｐＩＩＩをＣ末端に有する融合タンパク質を作成した（図６を参照）。このファージミドベクターは、大腸菌ホストがヘルパーファージに感染すると活性化される、ファージショックプロモーター（ｐｓｐ）の制御下にあるｇＩＩＩを含む（３１）。ｇＩＩＩ欠失変異体であるヘルパーファージＶＣＳ‐Ｍ１３ｄ３（４４）を使用し、これにより、標的タンパク質の多価提示が可能になった。ｇＩＩＩタンパク質のすべてのコピー（３〜５コピー）は、標的タンパク質ａｓｐＲＳ‐ＯＢとの融合体になる。結合アッセイにおける感受性を高めるために多価提示を使用した（４８）。
【０１２５】
この構築物、ａｓｐＲＳ‐ＯＢの遺伝子を含むｐＲＰＳＰ２を、大腸菌ＴＧ１細胞に形質転換した。得られた培養物にＶｄ３ヘルパーファージを感染させ、形質導入粒子（ＴＤＰ）を作成した。これらの組換えバクテリオファージを回収し、ａｓｐＲＳ‐ＯＢとｐＩＩＩの間に位置するｃ‐ｍｙｃ抗原の配列（後掲の図を参照）に対する抗体を用いて、ウェスタン解析で標的タンパク質の提示についてテストした。これは、融合タンパク質ｐＩＩＩ‐ａｓｐＲＳ‐ＯＢに予測された大きさにおいて強いシグナルを示した。
【０１２６】
提示された野生型ＯＢフォールドがファージの表面上においてなお機能的であるかどうかをテストするため、ａｓｐＲＳ‐ＯＢを提示するこのファージ試料を使用して、固定化したａｓｐ‐ｔＲＮＡに対するファージ結合実験を行った。ａｓｐＲＳ‐ＯＢを提示するＴＤＰ試料を、磁気ビーズ上に固定化したａｓｐ‐ｔＲＮＡとともにインキュベートした。結合していないファージを洗浄し、ＲＮａｓｅＡを使用してｔＲＮＡの消化によって結合したファージを溶出させた。次に、溶出したファージの数を細菌感染によりカウントし、ビーズのみとインキュベートした試料から溶出した数と比較した。結合の特異性を示すため、＞１０００倍過剰量のＶＣＳ‐Ｍ１３野生型をＴＤＰ試料に添加し、溶出した粒子の数をカウントした。入力されたファージに対する、ｔＲＮＡから溶出したファージの割合を各試料について算出した。入力と結果を以下の表にまとめる。
【０１２７】
【表６】
2009539346.tif 000079
ａｓｐＲＳ‐ＯＢを提示するファージの回収（２．４×１０−２）は、ファージのみ（５．７×１０−４、図８を参照）と比べた場合約２００倍高かった。これは、固定化したａｓｐ‐ｔＲＮＡに対する、提示されたａｓｐＲＳ‐ＯＢの有意な親和性を示していた。タンパク質提示のないＶＣＳ‐Ｍ１３の場合では、固定化したｔＲＮＡと比較して、ビーズのみから溶出された粒子の割合は非常に類似しており（１：１．４２）、これはファージが非特異的に結合したことを示唆するものである。この割合は、ａｓｐＲＳ‐ＯＢを提示する粒子では非常に高く（１：１９０．４８）、このドメインのａｓｐ‐ｔＲＮＡに対する結合の特異性を示している。これらの結果は、ａｓｐＲＳ‐ＯＢは、ファージの表面に提示された場合に機能的にインタクトであること示す。
【０１２８】
（実施例８）  ライブラリの選択
ａｓｐ‐ｔＲＮＡでの選択
細菌性ａｓｐＲＳのアンチコドン結合ドメイン内のβシート４と５の間のループ領域は、ｔＲＮＡへの結合にとってだけでなく、アンチコドン内の塩基の特異的認識にとって重要である（４９）。そのため、ａｓｐ‐ｔＲＮＡは、ａｓｐＲＳ‐ＯＢライブラリの実現性をテストするのに好ましい標的であると考えられた。ライブラリａｓｐＲＳ‐ＯＢ  ＲＬを使用したが、これは、このライブラリが理論上の多様性の全範囲を含むため、ｔＲＮＡ標的と良好に結合することが予想された野生型ａｓｐＲＳ‐ＯＢフォールド配列のコピーを含むからである。たとえｔＲＮＡと結合する変異体がなかったとしても、少なくとも野生型はバイオパニングプロセスによって選択されるはずである。ａｓｐＲＳ‐ＯＢ  ＲＬ遺伝子ライブラリをすでに述べたように作成し、ｐＲＰＳＰ２にクローニングして約１０７のクローンを得て、ファージ上に一価提示させた。４回のパニング後、入力ファージに対する出力ファージの割合が表すように著しい濃縮が観察され、これは、標的特異性結合ドメインの濃縮を示すものである（図９）。選択されたフラクションからクローンを無作為にピックアップし、シークエンシングを行った。配列は、ａｓｐ‐ｔＲＮＡと結合するための、ループ領域内の４個のアミノ酸のコンセンサスＲ／Ｋ  Ｇ  Ｃ  Ｒを示した（図１０）。シークエンシングを行った１２のクローンのうち、５つがこのコンセンサスを完全に満たしており、残りの７つの内の３つは、４個のアミノ酸位置の３つが一致した。コンセンサス配列は野生型配列（ＩＡＫＳ）とは著しく異なり、新たなコンセンサス配列が、野生型ドメインと比べるとより強力にａｓｐ‐ｔＲＮＡと結合することを示唆している。これは、モノクローナルファージ調製品を使用するファージ結合実験において確認され、この実験では、２つのクローンが野生型ａｓｐＲＳ‐ＯＢよりもａｓｐ‐ｔＲＮＡに対して強い親和性を有していた（図１６）。この実験では、対応する変異ドメインを提示するファージを固定化ａｓｐ‐ｔＲＮＡとともにインキュベートした。結合したファージは、ＲＮａｓｅＡで特異的に溶出され、カウントされた。回収率Ｒを、［（出力／入力）Ｂ／（出力／入力）ＲＮＡ］として算出し、式中、（出力／入力）は、回収されたファージ（出力）を入力されたファージの数で割った比を意味し、下付き文字‘Ｂ’はビーズのみを意味し、下付き文字‘ＲＮＡ’は固定化ａｓｐ‐ｔＲＮＡを指す。ａｓｐＲＳ‐ＯＢ変異体から得られたファージライブラリから、固定化ａｓｐ‐ｔＲＮＡに対する結合親和性が向上したコンセンサス配列を我々が濃縮したことを結果は示している（図１０および１１）。
【０１２９】
‘ＲＬ’と比べるとさらなる多様性を有する大きなライブラリ‘１３ｍＲＬ’を使用して、同様の手法で固定化ｔＲＮＡに対する選択を行った。濃縮パターンは図９に示し、５回のパニング後の著しい濃縮を示す。配列解析を図１２にまとめる。選択された配列は、正に帯電したアミノ酸を高い割合で含んでおり、これは、負に帯電したａｓｐ‐ｔＲＮＡ骨格への結合によってそれらの変異体が選択されたことを示唆していた。塩基性残基の数が最も多かった変異体（Ｄ０７）は３回認められ、これは選択されたクローンのプール中に豊富に含まれることを示していた。選択されたクローンＤ０７およびＤ０９から調製された、固定化ａｓｐ‐ｔＲＮＡモノクローナルファージ試料でのファージ結合実験では、野生型ａｓｐＲＳ‐ＯＢドメインの数倍の数のこれらのクローンが回収され、提示された変異体のａｓｐ‐ｔＲＮＡに対する結合がより強固であることが示された。これらのファージ結合実験は精密な測定法ではないが、選択プロセスの成功を示し、ファージディスプレイを使用した固定化標的に対する選択に、ａｓｐＲＳ‐ＯＢライブラリが使用可能であることを示す。図１２中の選択されたクローンの全配列を付表ＩＩに示し、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ９、Ｓ６８、Ｓ８１、ｐＭＢ１６、ｐＭＢ１７、ｐＭＢ１２、ｐＭＢ１８、ｐＭＢ１５、Ｄ０５、Ｄ０７、Ｄ０９、Ｄ０４、Ｌ１４、Ｌ８、Ｌ４、Ｌ１６、Ｌ３４、Ｌ４２、Ｌ６、Ｌ５、またはＬ４４と定める。
【０１３０】
（実施例９）  リゾチームでの選択
別のタンパク質に結合する、ナイーブライブラリ由来のＯＢフォールド変異ドメインの選択の原理の証明を示すため、リゾチームを標的として選択した。ニワトリ卵白リゾチームは、販売されている安定した小さいタンパク質であり、多くの医学的に重要なヒトホモログを有する。固定化リゾチームでの４回のパニング後、結合したファージの濃縮が観察された。クローンを無作為にピックアップし、リゾチームに対する結合についてスクリーニングする前に、さらに２回のパニングを行った。次に、モノクローナルファージ試料を調製し、９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレート上に固定化したリゾチームでの結合を特性化するために‘マイクロパニング’手法で検討を行った。結合したファージを溶出しカウントした。２２のクローンのうち９つは、ｐＩＩＩ、ＯＢ野生型、およびＢＳＡバックグラウンドを上回る回収ファージ数を示した（クローンＬ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ８、Ｌ１４、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｌ１８、Ｌ２１、図１３）。これらのクローンのシークエンシングを行った。クローンのうちいくつかの配列は同一であったため（Ｌ１４とＬ１５、Ｌ４とＬ１８、Ｌ８とＬ２１）、ユニークなクローンの数は６つに絞り込まれた。この重複性は、濃縮によって、同一配列を有するクローンが試料中に高い割合で存在することを示していた。さらに２回のパニングを行い、さらなる６つのクローンの配列決定を行った（Ｌ３２、Ｌ３３、Ｌ３４、Ｌ４２、Ｌ４３、Ｌ４４）。３つの配列が前回のクローンと一致した（Ｌ３２＝Ｌ１４＝Ｌ１５、Ｌ３３＝Ｌ８＝Ｌ２１＝Ｌ４３）が、Ｌ４４は、βシート領域においてＬ５と同一であったが、ループ領域では異なるパターンを示した。Ｌ３４およびＬ４２は新たな配列であった。６回の後の選択されたプール中のクローンの数は非常に少なく、図１２、パネルＥに示す９つの配列によってかなりの程度がカバーされることが予想できる。クローンＬ１４（Ｌ３２、Ｌ１５）、Ｌ８（Ｌ３３、Ｌ２１、Ｌ４３）、Ｌ３４、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６を、多価提示を使用するＥＬＩＳＡ手法での結合研究の対象とした（図１４）。結果は、すべてのクローンがリゾチームに結合したが、ａｓｐＲＳ‐ＯＢの提示がない粒子（ｐＩＩＩ）は結合しなかったことを示した。その他の陰性対照には野生型ａｓｐＲＳ‐ＯＢ（ＯＢｗｔ）が含まれた。解析されたすべてのクローンのリゾチームへの結合数は、ＲＮａｓｅまたはＢＳＡに対してのものより多く（ＥＬＩＳＡ実験でＯＤ値がより高かった）、リゾチームに対する結合の特異性を示す。図１１に示すように、クローンＬ６およびＬ３３はｔＲＮＡに結合しなかった。
【０１３１】
（実施例１０）  精製した変異体の発現と解析
クローンＬ４（Ｌ１８）、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ１６、およびＬ３３（Ｌ２１）を発現ベクターにサブクローニングし、‘プルダウン’アッセイでのリゾチーム結合の解析用にＧＳＴ融合タンパク質として発現させた。図１５Ａ〜１５Ｂに示すように、固定化した変異体はリゾチームと結合したが、非選択変異体１３ｍＲＬ８１は結合しなかった。これは、選択された変異体のリゾチームへの結合を確認するものであった。Ｌ６のリゾチームへの結合を、異なるバッファーの存在下で研究した。図１５Ｂは、５００ｍＭのＮａＣｌでの洗浄後に、Ｌ６がリゾチームと結合することを示す。クローンＬ６を発現させ、精製し、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して固定化リゾチーム上での結合反応速度を解析した。結合定数は３．６×１０−５Ｍと算出された（図１６）。
【０１３２】
これらの実験は、ランダム化したコドンを含む、ＯＢフォールドドメインの大きな合成ライブラリの作成を示し、また、これらのライブラリから転写された変異タンパク質が安定で、折りたたまれていることを示す。ＯＢフォールドドメインの機能的提示がファージの表面で提示され、そのため選択した異なる機能について効率的にライブラリをスクリーニングできる。ファージディスプレイを使用した、ＯＢフォールドライブラリからの改変ＯＢフォールドドメインの選択が示される。これらの変異体は、選ばれた結合相互作用であれ、酵素活性であれ、所望の特性を持たなくてはならない。本明細書で示されるように、多様性のキャリアーとしてＯＢフォールドが機能し得ることを示すために、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来のアスパラギン酸ｔＲＮＡシンテターゼ（ＡｓｐＲＳ）のｔＲＮＡアンチコドン結合ドメインを、ＯＢフォールドのスキャフォールドとして選択した。結果は、本明細書に開示する方法を適用することで、このｔＲＮＡアンチコドン結合ドメインを特異的なタンパク質結合分子に変換し得ることを示す。
【０１３３】
タンパク質のフレームワークに組み込んだそれぞれの変異は、その折りたたみに影響を与える可能性があり、そのためその安定性と溶解性にも影響する可能性がある。タンパク質のフレームワーク内の変異に対する耐性を理解するため、異なる変異部位のセット、または組み合わせを含むライブラリを作製し、無作為にピックアップされた変異の発現および溶解性についてスクリーニングした。無制限の多様性を有するライブラリを計画し、作成した。このようなナイーブライブラリは、ランダム化によるすべての可能な組み合わせの変異を含む。分子内の特定の部位に存在する好ましくないアミノ酸の組み合わせに起因する安定性、フォールディング、または溶解性のいずれかの理由のために、多数の変異体が耐性を示さないであろうことが予想される。１３をβシート（βストランド１〜３）上に１３、ストランド４と５の間のループに４つ、１７のランダムなアミノ酸位置を結合表面に有するａｓｐＲＳ‐ＯＢ由来のライブラリを作製した。個々のβストランドまたはループ領域のみを扱う変異のセットを有するライブラリを作製した。
【０１３４】
改変ＯＢフォールドドメインのライブラリを、発現および溶解性についてスクリーニングすると、１７の変異を含むａｓｐＲＳ‐ＯＢのライブラリ内のすべての変異体の約１６％が過剰発現していて、可溶性を有することが見出され、さらにＮＭＲおよびＣＤスペクトロスコピーによって示されるように、少数の選択された変異が正確に折りたたまれることが証明された。これは、このライブラリのかなりの割合を、目的の標的に対しての選択に使用可能であることを示す。ａｓｐＲＳ‐ＯＢライブラリの１３ｍＲＬとＲＬを、ファージディスプレイライブラリとして構築した。１３ｍＲＬの実用上の多様性は、約８×１０７種のクローンであり、１７のランダム位置の可能な組み合わせ（理論上の多様性）である約５×１０２２のごくわずかに相当する。ＲＬの多様性はわずか１．６×１０５（４つのランダム位置）であり、形質転換後の約１×１０７のクローンによって完全にカバーされることが予想される。無作為にピックアップしたクローンのシークエンシングによって、ライブラリの多様性が確認された。
【０１３５】
ファージディスプレイは最も一般的に使用されるディスプレイ技術であり、そのためａｓｐＲＳ‐ＯＢのスキャフォールドのディスプレイに好都合である。ファージの表面でのａｓｐＲＳアンチコドン結合ドメインの提示、またはその他の一般的なＯＢフォールドドメインの提示の報告はない。ファージでのタンパク質の提示には、提示されたタンパク質の完全性のみならず、宿主細胞の増殖に影響を与える可能性がある複数の工程が必要となる。細胞質内での合成後、細胞の還元環境下でタンパク質は安定でなければならず、またｐＩＩＩファージタンパク質への融合に影響を受けないものでなくてはならない。次に、ファージ粒子全体が培養液中に放出される前に、ペリプラズムの酸化環境によって、融合タンパク質がファージ構築の標的となる。あらゆるタンパク質について、このプロセスは複数の段階における環境との相互作用を必要とし、また、もしアンチコドン結合ドメイン由来のスキャフォールドの場合は、宿主の核酸への結合も考慮しなくてはならない。Ｍ１３ファージ上に提示されたａｓｐＲＳ‐ＯＢの検出（ウェスタン解析による）は、良好な発現を示した。ａｓｐＲＳ‐ＯＢライブラリＲＬと、さらに大きい１３ｍＲＬの検出（同じくウェスタンブロッティングによる）では、ファージ上での提示効率ははるかに悪かった。この観察結果は、ナイーブランダムライブラリ内に不安定な変異体が多いことで説明される。これらのデータは、大腸菌の細胞質またはペリプラズムにおける、好ましくない変異体のタンパク質分解を示唆し、これはプロテインＡ由来のＺドメインの研究において以前に観察された効果である（５０）。これは、発現および溶解性のスクリーニングで得られた結果とも相関する。他のスキャフォールドでは、ファージ提示ライブラリでより微弱なシグナルが認められた（炭水化物結合ドメイン、（５１）、セルロース結合ドメイン、（５２））。将来的なライブラリのライブラリデザインは、分解に対する提示される融合体の割合を増加させるためには、この要素を考慮に入れる必要があるだろう。これはナイーブランダムライブラリの一般的な問題であり、ＯＢフォールドにのみ観察される現象ではない。
【０１３６】
ａｓｐ‐ｔＲＮＡでの選択
ナイーブ標的ａｓｐ‐ｔＲＮＡでのファージ結合および選択実験は、Ｍ１３ファージ上でのａｓｐＲＳ‐ＯＢとその誘導体ライブラリの良好かつ機能的な提示を示した。小さいＲＬライブラリから、モノクローナルパニング実験において示されるように、野生型より高い親和性を有する変異体に相当するコンセンサス配列が得られた。得られたコンセンサス配列Ｒ／Ｋ  Ｇ  Ｃ  Ｒは野生型配列とは異なり、２つの正に帯電したアミノ酸を含んでおり、負に帯電するＲＮＡ骨格への結合を示唆する。このループ領域内のグリシンの存在によってループの柔軟性が確保されている可能性があるが、システインの機能は未だに明らかでない。
【０１３７】
非選択クローンの配列はａｓｐＲＳ‐ＯＢライブラリの多様性を示し、選択後の、コンセンサス配列に一致するクローンから得られた配列は対応するＤＮＡコドンのバリエーションを示し、これは遺伝子型よりも表現型に対する選択を示していた。ライブラリ１３ｍＲＬの多様性の範囲が非常に限られていたために、ａｓｐ‐ｔＲＮＡで選択されたクローンの少数の配列からはコンセンサスは得られなかった。実用上の多様性が約１０８クローンであるが、理論上の多様性が約１０２２であるため、これは予想される。そのため、ファージライブラリの多様性の範囲は、理論上可能なそれのごくわずかにすぎない。シークエンシングを行ったすべてのクローンにおいて、多数の正に帯電した残基が観察され（Ｄ０７で９つ、Ｄ０５で５つ、Ｄ０９で６つ）、負に帯電したＲＮＡ骨格への結合による、正に帯電した残基の選択を示す。２つの変異体（Ｄ０７、Ｄ０４）に起こっていたモチーフＲ  Ｘ  Ｇ  Ｓは、野生型ａｓｐＲＳ‐ＯＢの場合と同様に、ｔＲＮＡ結合におけるループの重要な役割を示唆する。モノクローナルファージ試料を使用した結合実験は、野生型ドメインよりも強い、ａｓｐ‐ｔＲＮＡへの結合を示した。これは、固定化標的への結合の際に選択が起こるという結論を裏付けるものであり、我々のＯＢフォールドのスキャフォールドがファージでの提示およびバイオパニングプロセスに非常に適していることを示していた。
【０１３８】
リゾチームでの選択
ニワトリ卵白リゾチームで１３ｍＲＬライブラリの選択を行った。複数回のパニング後、多数のクローンを単離し、配列と標的分子への結合について解析した。プレスクリーニング段階での２２のクローンのうち、ファージＥＬＩＳＡ実験において、最終的に６つがリゾチームに対する検出可能な結合を示した。１４のクローンの配列試験で、２つが２回、また、１つは４回も検出されたことが明らかになった。これは、選択されたフラクションに存在する異なるクローンの数が適度に少ないことを示唆する。９つの異なるクローンの配列は、それらの組成における類似性を示していた。少数の位置はいくつかの興味深い類似性を示しており、例えば９つのうち６つのクローンで２９番は酸性の残基（ＤまたはＥ）であり、９つの配列のうち５つで３１番はバリンであり、３５番には正に帯電した残基が４つのクローンで現れ、５例において３８番は芳香族残基（Ｙ、Ｆ、Ｗ）であり、さらに、５つのクローンで８５番はグリシンである。また、βストランド３では、ＥＴＥＴおよびＰＥＴＥという目を引くパターンがクローンＬ１６およびＬ３４に存在し、βストランド１では、Ｄ  Ｖ／Ｌ  Ａ／ＬがＬ３２、Ｌ２、Ｌ６、Ｌ５、Ｌ４４に存在する。さらに目を引くのは、βシートにおけるＬ５とＬ４４の同一性であるが、ループ領域は異なる。Ｌ６を除くすべての変異体にシステインは存在しない。しかし、より明確なコンセンサス配列は得られず、これはおそらく非常に大きなライブラリの範囲が狭いことと、得られた配列の少なさに起因する。複数のクローンをＧＳＴ融合タンパク質として発現、精製し、プルダウン実験で解析すると、リゾチームへのクローンの結合が示された。クローンＬ６は、５００ｍＭの塩化ナトリウムの存在下であっても結合し、妥当な親和性の結合を示した。クローンＬ６を発現、精製し、結合の反応速度および熱力学を表面プラズモン共鳴によって解析したところ、約３．６×１０−５ＭのＫｄを示した。このナイーブライブラリのサイズの小ささと組成を考慮すると、μＭレンジの結合定数は非常に重要な結果であり、アフィニティーマチュレーション工程による最適化に対して優れた出発点を提供する。
【０１３９】
（実施例１１）  リゾチームとの複合体のＯＢｏｄｙ  Ｌ８の３次元構造
ＧＡＴＥＷＡＹ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、Ｌ８をｐＤＯＮＲ２２１にクローニングした後、発現ベクターｐＤＥＳＴ１５にサブクローニングし、これをＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞に形質転換した。これらの細胞を、５００ｍＬの自動誘導培地に播種し、２Ｌ容量のバッフル付きフラスコ内で３７℃にて振盪した。ＧＳＨアフィニティーカラム（ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、細菌溶解物から融合タンパク質ＧＳＴ‐Ｌ８を精製し、ｒＴＥＶプロテアーゼを使用してＧＳＴタグを取り除き、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓ７５  １６／６０分取用、ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によりＬ８から分離した。次に、溶液中での単分散を向上させるため、再びサイズ排除（Ｓ７５  １０／３００分析用、ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により、Ｌ８の３回目の精製を行った。
【０１４０】
精製タンパク質をＧａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ卵白リゾチーム（Ｒｏｃｈｅ）と約１：１のモル比で混合し、ＴＢＳ（２５ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭＫＣｌ）中での最終濃度が、Ｌ８が３７．５ｍｇ／ｍＬ、リゾチームが４２．９ｍｇ／ｍＬとなるようにした。カスタムスクリーンとシッティングドロップフォーマットを使用して、溶液中の複合体を４８０の結晶化条件についてスクリーニングした。
【０１４１】
単一の大きな結晶が、ＴＢＳ中のタンパク質と沈殿剤（７％ＭＰＥＧ  ５Ｋ、０．２ＭＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．８）の等量混合物から成長した。次にこの結晶を、ナイロンループで収集し、抗凍結剤でコーティングして、低温窒素ガス（１１０Ｋ）の気流中で凍結させた。回転陽極型Ｘ線発生装置と最高２．８Åの回折を生じるＭａｒ３４５検出器を使用して、７００枚の画像のデータセットを収集した。ＤＥＮＺＯを使用して画像を指数化し、Ｓｃａｌｅｐａｃｋを使用してデータのスケーリングを行った。データ収集統計値については、表を参照されたい。リゾチーム（ＰＤＢエントリー１９３Ｌ）およびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ＫｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓのアスパルチルｔＲＮＡシンテターゼ（ＰＤＢエントリー１Ｂ８Ａ）由来のＯＢフォールドコドン認識ドメインの両方をモデルとして組み込んだ分子置換法（ＡＭｏＲｅ）を使用して、構造を解明した。１つのＯＢフォールドドメインとともに２つのリゾチーム分子が非対称単位内に認められた。２つ目のリゾチーム分子の位置を基に非対称単位内に複合体を複製することにより、２つ目のＯＢフォールドを配置した。構造を繰り返し構築し、ＣＯＯＴ、ＣＣＰ４、およびＰＨＥＮＩＸを使用して精密化した。２つ目のデータセットは、ＳＳＲＬで同じ結晶を使用して最高２．６９Åの分解能で収集した。これを同じ空間群に指数化し、前述の構造から得た完全な単位格子を使用して、分子置換法により位相を決定した。構築と精密化は、ＣＯＯＴ、ＣＣＰ４、およびＰＨＥＮＩＸを使用して行った。
【０１４２】
【表７】
2009539346.tif 000080
【０１４３】
【表８】
2009539346.tif 000081
付表Ｉ
【０１４４】
【表９−１】
2009539346.tif 000082
Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来のａｓｐＲＳとＩＦ‐５Ａの野生型ＯＢフォールドのＰＣＲ増幅用オリゴヌクレオチド
【０１４５】
【表９−２】
2009539346.tif 000083
Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来のａｓｐＲＳ‐ＯＢに基づく、ＰＣＲによるライブラリ構築用オリゴヌクレオチド
【０１４６】
【表９−３】
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Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来のＩＦ５Ａ‐ＯＢに基づく、ＰＣＲによるライブラリ構築用オリゴヌクレオチド
付表ＩＩ
各種Ｏｂｏｄｙのアミノ酸配列。配列のナンバリングは、図１０および図１２のナンバリングと一致する。
【０１４７】
【表１０−１】
2009539346.tif 000085
【０１４８】
【表１０−２】
2009539346.tif 000086
参考文献
【０１４９】
【化４】
2009539346.tif 000087
【０１５０】
【化５】
2009539346.tif 000088
【０１５１】
【化６】
2009539346.tif 000089
【０１５２】
【化７】
2009539346.tif 000090
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然に存在するＯＢフォールドドメインから取得可能な単離された改変ＯＢフォールドドメインであって、該改変ＯＢフォールドドメインは、以下：
（ａ）該天然に存在するＯＢフォールドドメインと比較して、該ＯＢフォールドドメイン結合表面のβストランド内の少なくとも１つの改変アミノ酸残基、または
（ｂ）該ＯＢフォールドドメイン結合表面のβストランド内の少なくとも１つの改変アミノ酸残基、および該ＯＢフォールドドメインループ領域のストランド内の少なくとも１つの改変アミノ酸残基、または
（ｃ）該ＯＢフォールドドメインループ領域のストランド内の少なくとも１つの改変アミノ酸残基
の少なくとも４つの改変アミノ酸残基を含み、該改変ＯＢフォールドドメインが、可溶性であり、かつ該天然に存在するＯＢフォールドドメインと比較して、変化した結合特性を有する、
改変ＯＢフォールドドメイン。
【請求項２】
前記ドメインが、前記天然に存在するＯＢフォールドドメインとは異なる結合パートナーに特異的に結合するか、またはその天然に存在する結合パートナーとの改変された結合を有する、請求項１に記載の改変ＯＢフォールドドメイン。
【請求項３】
前記天然に存在するＯＢフォールドドメインが、ブドウ球菌ヌクレアーゼタンパク質、細菌性エンテロトキシン、ＴＩＭＰ様タンパク質、ヘムシャペロンＣｃｍＥタンパク質、尾結合リゾチームｇｐ５、Ｎ末端ドメインタンパク質、核酸結合タンパク質、無機ピロホスファターゼ、Ｍｏｐ様タンパク質、ＣｈｅＷ様タンパク質、ｔＲＮＡ＿ａｎｔｉ（ＯＢフォールド核酸結合ドメイン）、Ｔｅｌｏ＿ｂｉｎｄ（テロメア結合タンパク質αサブユニット、中心ドメイン）、ＳＳＢ（一本鎖結合タンパク質ファミリーのＯＢフォールドドメイン）、ＤＵＦ３３８のＯＢフォールドドメイン、ＤＮＡ＿ｌｉｇａｓｅ＿ａｄｅｎ（ＮＡＤ依存性ＤＮＡリガーゼＯＢフォールドドメイン）、Ｓｔａｐ‐Ｓｔｒｐ毒素（ブドウ球菌／連鎖球菌毒素、ＯＢフォールドドメイン）、ＥＩＦ‐５ａ（真核生物開始因子５Ａ  Ｈｙｐｕｓｉｎｅ、ＤＮＡ結合ＯＢフォールドドメイン）、ＧＰ５＿ＯＢ（ＧＰ５  Ｎ末端ＯＢフォールドドメイン）、ＣＳＤ、ＤＮＡ＿ｌｉｇａｓｅ＿ＯＢ、ＤＵＦ３８８、ＥＦＰ、ｅＩＦ‐１ａ、ｍＲＮＡ＿ｃａｐ＿Ｃ、ＯＢ＿ＲＮＢ、Ｐｈａｇｅ＿ＤＮＡ＿ｂｉｎｄ、Ｒｅｐ‐Ａ＿Ｎ、Ｒｈｏ＿ＲＮＡ＿ｂｉｎｄ、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ＿Ｌ２、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ＿Ｓ１２、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ＿Ｓ１７、ＲＮＡ＿ｐｏｌ＿Ｒｐｂ８、ＲｕｖＡ＿Ｎ、Ｓ１、ＴＯＢＥ、ＴＯＢＥ＿２、およびｔＲＮＡ＿ｂｉｎｄからなる群から選択されるタンパク質またはタンパク質クラス内に存在する、請求項１または請求項２の改変ＯＢフォールドドメイン。
【請求項４】
前記天然に存在するＯＢフォールドドメインが好熱性生物に由来する、請求項１または請求項２に記載の改変ＯＢフォールドドメイン。
【請求項５】
前記好熱性生物がＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍである、請求項４に記載の改変ＯＢフォールドドメイン。
【請求項６】
前記改変アミノ酸残基が、フォールド関連結合表面のβストランド内に存在する、請求項１〜５のいずれかに記載の改変ＯＢフォールドドメイン。
【請求項７】
前記改変ＯＢフォールドドメインの前記結合パートナーが、核酸、オリゴ糖、タンパク質、ホルモン、および有機小分子からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれかに記載の改変ＯＢフォールドドメイン。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の改変ＯＢフォールドドメインを取得する方法であって、
ａ）天然に存在するＯＢフォールドドメインをコードする核酸あるいは結合表面のストランドおよび／またはループのストランドを含む天然に存在するＯＢフォールドドメインの一部分をコードする核酸を取得する工程と、
ｂ）該天然に存在するＯＢフォールドドメインと比較して、該結合表面のβストランド上の少なくとも１つの改変アミノ酸残基および／またはループのストランド上の少なくとも１つの改変アミノ酸をコードするように該核酸を変化させる工程であって、ここで、改変ＯＢフォールドドメインが得られ、該改変ＯＢフォールドドメインが、該天然に存在するＯＢフォールドドメインと比較して、変化した結合を有する、工程と、
を含む、方法。
【請求項９】
前記改変ＯＢフォールドドメインをコードする核酸を変化させる工程、および／または該改変ＯＢフォールドドメインを含むタンパク質の少なくとも１つのアミノ酸をコードする核酸を変化させる工程もさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ディスプレイのための改変ＯＢフォールドドメインタンパク質のライブラリを作製する方法であって、
ａ）ＯＢフォールドドメインまたはその一部分をコードする核酸を取得する工程と、
ｂ）該核酸をランダムな変化に供して、少なくとも４つのランダム化したアミノ酸残基を有する改変ＯＢフォールドドメインをコードする変化させた核酸の集合体を生成する工程と、
ｃ）該ライブラリのために、可溶性の改変ＯＢフォールドドメインタンパク質を選択する工程
を含む、方法。
【請求項１１】
前記核酸が、前記ＯＢフォールドドメイン結合表面のストランドおよび／またはＯＢフォールドドメインのループのストランドの少なくとも１つのアミノ酸残基をコードする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
改変ＯＢフォールドドメインをコードする変化させた核酸の前記ライブラリを、該改変ＯＢフォールドドメインをその表面に提示し得る宿主細胞の集団に導入する工程もさらに含む、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれかに記載の改変ＯＢフォールドドメインをコードする、単離された核酸。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれかに記載の改変ＯＢフォールドドメインをコードする核酸を含む、宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれかに記載の改変ＯＢフォールドドメインをコードする核酸を含む、ファージ。
【請求項１６】
請求項１〜７のいずれかに記載の改変ＯＢフォールドドメインをコードする核酸を含む、組成物。
【請求項１７】
改変ＯＢフォールドドメインのライブラリを、結合パートナーとの結合についてスクリーニングする方法であって、
ａ）改変ＯＢフォールドドメインのライブラリをその表面に提示する宿主細胞またはウイルス粒子の集団を取得する工程と、
ｂ）該改変ＯＢフォールドドメインと該結合パートナーとの結合に適した条件下で、該宿主細胞またはウイルス粒子の集団を該結合パートナーと接触させる工程と、
ｃ）該結合パートナーと該改変ＯＢフォールドドメインとの結合を決定する工程と、
を含む、方法。
【請求項１８】
前記宿主細胞またはウイルス粒子が、前記改変ＯＢフォールドドメインをその表面に提示するファージである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜７のいずれかに記載の改変ＯＢフォールドドメインのファージライブラリであって、該改変ＯＢフォールドドメインがＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍから取得可能である、ファージライブラリ。
【請求項２０】
細胞またはウイルス粒子の表面に提示される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の改変ＯＢフォールドドメイン。
【請求項２１】
前記細胞またはウイルス粒子が、ファージ、細菌、または酵母である、請求項２０に記載の改変ＯＢフォールドドメイン。
【請求項２２】
固体支持体に結合した、請求項１〜７のいずれかに記載の改変ＯＢフォールドドメイン。
【請求項２３】
前記支持体が、ビーズ、ガラス、スライド、チップ、およびゼラチンからなる群から選択される、請求項２２に記載の改変ＯＢフォールドドメイン。
【国際調査報告】
2009539346.tif 000091
2009539346.tif 000092