(57)【要約】本発明は、機械的な刺激システムを用いて、多孔性および引っ張り強度の優れたコラーゲンマトリックスの調製方法に関する。特に、本発明において、細胞生息ゲルは、物理的な刺激が周期的又は非連続的にマトリックスを動かすように付加される条件下で培養される。得られたコラーゲンマトリックスは、人工皮膚又は人工臓器に調製に使用される。なお、コラーゲンマトリックスは美容又は治療目的でフィラーを用いることができる。
2009514546.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）コラーゲン、線維素及びこれらの混合物を含む群から選択された物質を含む溶液と哺乳類の細胞とを混合し哺乳類細胞を含むゲルを調製する工程と、
ｂ）良好な多孔性及び引っ張り強度を有するコラーゲンマトリックスを作製するために、コラーゲンゲルに物理的な力を周期的に及び非連続的に負荷される条件下でゲルを刺激する工程と、
を有する哺乳動物の細胞を含むコラーゲンマトリックスの調製方法。
であって、
【請求項２】
請求項１に記載の哺乳動物の細胞を含むコラーゲンマトリックスの調製方法において、
哺乳類の細胞によりコラーゲンの生成を増加させるために、ゲルの底面に物理的な力を加えることを特徴とする、哺乳動物の細胞を含むコラーゲンマトリックスの調製方法。
【請求項３】
請求項１に記載の哺乳動物の細胞を含むコラーゲンマトリックスの調製方法において、
前記コラーゲンは、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン及びＩＶ型コラーゲンから成る群から選択される１種以上の物質であることを特徴とする、哺乳動物の細胞を含むコラーゲンマトリックスの調製方法。
【請求項４】
請求項１に記載の哺乳動物の細胞を含むコラーゲンマトリックスの調製方法において、
前記物理的力は、コラーゲンのプレートの１個所以上にコラーゲンのプレートを横切るように加えられことを特徴とする、哺乳動物の細胞を含むコラーゲンマトリックスの調製方法。
【請求項５】
請求項１に記載の哺乳動物の細胞を含むコラーゲンマトリックスの調製方法において、
前記コラーゲンマトリックスは、０．１μｍから１００μｍの径で気孔率が１０％から９０％である気孔を有し、引っ張り強度が１Ｎ／ｃｍ２から２００Ｎ／ｃｍ２であることを特徴とする、哺乳動物の細胞を含むコラーゲンマトリックスの調製方法。
【請求項６】
請求項１に記載の哺乳動物の細胞を含むコラーゲンマトリックスの調製方法において、
前記刺激の強さは、１×１０−７Ｎ／ｍ２から１×１０−１Ｎ／ｍ２であることを特徴とする、哺乳動物の細胞を含むコラーゲンマトリックスの調製方法。
【請求項７】
請求項１に記載の哺乳動物の細胞を含むコラーゲンマトリックスの調製方法において、
前記刺激の頻度は、１分間当たり０．０１回から５００回であることを特徴とする、哺乳動物の細胞を含むコラーゲンマトリックスの調製方法。
【請求項８】
請求項１に記載の哺乳動物の細胞を含むコラーゲンマトリックスの調製方法において、
前記ｂ）工程は、弾性体により製造された培養容器において、細胞を含むゲルを刺激することにより行われることを特徴とする、哺乳動物の細胞を含むコラーゲンマトリックスの調製方法。
【請求項９】
請求項８に記載の哺乳動物の細胞を含むコラーゲンマトリックスの調製方法において、
前記弾性体が、ポリエチレン、ポリプロピレン、エチレン−プロピレンコポリマーやシリコ−ンから成ることを特徴とする、哺乳動物の細胞を含むコラーゲンマトリックスの調製方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の哺乳動物の細胞を含むコラーゲンマトリックスの調製方法において、
前記ゲルは、ゲルの周囲側面において固定され、コラーゲンゲルの中央部分を含むコラーゲンゲルの底面の１個所以上に物理的な力が負荷されることを特徴とする、哺乳動物の細胞を含むコラーゲンマトリックスの調製方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の哺乳動物の細胞を含むコラーゲンマトリックスの調製方法において、
前記刺激は、独立的にコラーゲンゲルの底面の２個所以上に負荷されることを特徴とする、哺乳動物の細胞を含むコラーゲンマトリックスの調製方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の哺乳動物の細胞を含むコラーゲンマトリックスの調製方法において、
前記刺激は、カム−シャフトに装着された少なくとも１つのカムにより生成される、哺乳動物の細胞を含むコラーゲンマトリックスの調製方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の哺乳動物の細胞を含むコラーゲンマトリックスの調製方法において、
前記カム−シャフトは、１分間当たり０．０１回から５００回の速度で回転することを特徴とする、哺乳動物の細胞を含むコラーゲンマトリックスの調製方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の哺乳動物の細胞を含むコラーゲンマトリックスの調製方法において、
前記細胞は、１ｍｌの溶液当たり１×１０３細胞から１×１０７細胞の濃度で混合されることを特徴とする、哺乳動物の細胞を含むコラーゲンマトリックスの調製方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の哺乳動物の細胞を含むコラーゲンマトリックスの調製方法において、
前記細胞は、線維芽細胞、真皮毛包細胞（ｄｅｒｍａｌ  ｓｈｅａｔｈ  ｃｅｌｌ）、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ、ＥＰＣ）、角質形成細胞、メラニン細胞、毛髪細胞、血液から由来するランゲルハンス細胞、血液から由来する内皮細胞、血液細胞、マクロファージ、リンパ球、脂肪細胞、皮脂腺細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞および血液から由来する上皮性触覚細胞に至る細胞群から選択されることを特徴とする、哺乳動物の細胞を含むコラーゲンマトリックスの調製方法。
【請求項１６】
０．１μｍから１００μｍの径で気孔率が１０％から９０％である気孔を有し、引っ張り強度が１Ｎ／ｃｍ２から２００Ｎ／ｃｍ２であるコラーゲンマトリックス。
【請求項１７】
請求項１６に記載のコラーゲンマトリックスにおいて、
前記コラーゲンマトリックスは、請求項１から請求項１５のいずれか１項に記載の方法により調製された哺乳類の細胞を含むコラーゲンマトリックスであることを特徴とする、コラーゲンマトリックス。
【請求項１８】
請求項１から請求項１５のいずれか１項に記載の方法により調製されたコラーゲンマトリックスを含む、人工皮膚又は人工臓器の培養に使用するコラーゲン足場（ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）。
【請求項１９】
請求項１から請求項１５のいずれか１項に記載の方法により調製されたコラーゲンマトリックスを含む、美容又は治療用フィラー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機械的な刺激システムを利用し多孔性及び引っ張り強度（ｔｅｎｓｉｌｅ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ）の優れたコラーゲンマトリックスの培養方法に関するものである。本発明では特に、細胞が含まれたゲルを、コラーゲンゲルの底面に対して周期的に及び非連続的に物理的な力を加える条件にて刺激する。物理的力は、コラーゲンゲルを横切るように加え（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅｌｙ  ｌｏａｄｅｄ）、これにより、細胞とコラーゲンマトリックスに同時に異なる力を加える。加えられた力は、細胞に複合的なシグナルを伝達し、その結果、コラーゲンの生成及び同化（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）を制御して、多孔性及び引っ張り強度を改善したコラーゲンマトリックスを生成する。改善されたコラーゲンマトリックスは、フィラーや基材などの真皮代用物や人工臓器の調整のために使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
特に、コラーゲンのような生物材料は、製薬分野において益々用いられ、損傷した連結組織の再生や遺伝子治療に適用されている。コラーゲンマトリックスは、多用な細胞生成に好適であり、マトリックス、ゲル又は膜などの形態で再生された組織を生成するために広く用いることができる。しかしながら、コラーゲン溶液のゲル化により調製されたコラーゲンマトリックスは、人工皮膚、軟骨組織や骨などのような人工臓器の培養には適当ではなかった。上記問題を解決するために、ナイロンを含むポリマーやコラーゲンメッシュ及びコラーゲンとキトサンとの混合物などを利用する多くの技術が開発されているが、得られた生成物は、十分なものではなかった。この点で、よりコンパクトなコラーゲンマトリックスを作製する方法が、組織工学目的のために急がれ、また重要である。
【０００３】
生物は、呼吸し、運動し、外部の環境と常に相互作用を続けながら生活している。実験条件において、細胞は、外界の刺激なしでコントロールされた条件下で反応機内で培養される。言い換えると、大気、温度、湿度などの培養条件は、細胞の自然の条件から大きく乖離している。したがって、培養システムにおいて、物理的な刺激が、より生体内の（ｉｎ−ｖｉｖｏ）刺激に類似した刺激を提供するために使用され始めている。
【０００４】
異なる機械的な刺激は、異なる組織の応答を引き起こすことが報告されている。骨細胞において、剪断力は、コネキシン（ｃｏｎｎｅｘｉｎ）４３のトランスロケーション（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）を膜表面にて誘発し、機械的な引っ張りに応じてプロスタグランジンＥ２（ＰＥＧ２）の遊離のために新規なポータルとして、コネキシン４３によって形成された閉じたままの半チャネルを供給する（Ｃｈｅｒｉａｎ  ＰＰ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ，  １６（７）：３１００−６，  ２００５）。さらに、長期に亘る断続的な圧縮刺激は、コラーゲンの合成を促進し、組織−形成された軟骨組織の機械的な特性を向上させるということが報告されている（Ｗａｌｄｍａｎ  ＳＤ  ｅｔ  ａｌ，  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．  Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；  １０（９−１０）：  １３２３−３１，  ２００４）。これらの結果に基づき、機械的な刺激は、引っ張る方法を含み（Ｗａｎｇ  ＪＧ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｎｎ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｅｎｇ，  ３３（３）：  ３３７−４２，  ２００５；  Ｋａｔｓｕｍｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２８０（１７）：  １６５４６−９，  ２００５）、また細胞培養溶液中に、流体静力学における流体圧力（ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｃ  ｆｌｕｉｄ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ：ＨＲＰ）を加える方法（Ｍｉｚｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，  １９３（３）：３１９−７，  ２００２）も含み、機械的な刺激は、骨や軟骨組織の培養のために用いられてきた。
【０００５】
【非特許文献１】Ｃｈｅｒｉａｎ  ＰＰ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ，  １６（７）：３１００−６，  ２００５
【非特許文献２】Ｗａｌｄｍａｎ  ＳＤ  ｅｔ  ａｌ，  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．  Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；  １０（９−１０）：  １３２３−３１，  ２００４
【非特許文献３】Ｗａｎｇ  ＪＧ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｎｎ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｅｎｇ，  ３３（３）：  ３３７−４２，  ２００５
【非特許文献４】Ｋａｔｓｕｍｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２８０（１７）：  １６５４６−９，  ２００５
【非特許文献５】Ｍｉｚｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，  １９３（３）：３１９−７，  ２００２
【非特許文献５】Ｓａｒａｓａ−Ｒｅｎｅｄｏ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ｓｐｏｒｔｓ，  Ａｕｇ；１５（４）：２２３−２３０，  ２００５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、機械的刺激が線維芽細胞にどのような効果をもたらすかについてはあまり研究がなされていない。文献上、機械的刺激は、線維芽細胞の細胞外のマトリックス遺伝子発現を規制することができる。機械的な刺激の作用メカニズムは知られていないが、筋肉の収縮又は重力が細胞外のマトリックスを介して細胞骨格に伝達され、細胞内の信号に片合に変換されると推測される（Ｓａｒａｓａ−Ｒｅｎｅｄｏ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ｓｐｏｒｔｓ，  Ａｕｇ；１５（４）：２２３−２３０，  ２００５）
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明において、本発明者は、発明者が良好な多孔性及び引っ張り強度を有するコラーゲンマトリックスを培養することができる方法を確立するよう試みられた。組織再生技術のために、良好な多孔性及び引っ張り強度を有するコラーゲンマトリックスが早急に必要とされている。本発明では、発明者は、コラーゲンマトリックスの培養（ｃｕｌｔｕｒｅ）のために『横断刺激負荷』（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ  ｉｍｐｕｌｓｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）を用い、『横断刺激負荷』がコラーゲン合成とコラーゲンマトリックスの再構築を劇的に増進させることを発見した。その結果、『横断刺激負荷』は、良好な多孔性及び引っ張り強度を有するコラーゲンマトリックスを生成することができる。
【０００８】
第１の態様において、本発明は、哺乳類の細胞を含むコラーゲンマトリックスを調製する方法を提供し、この方法は、ａ）コラーゲン、線維素（フィブリン）及びこれらの混合物を含む群から選択された物質を含む溶液と哺乳類の細胞とを混合し哺乳類細胞を含むゲルを調製する工程と、ｂ）良好な多孔性及び引っ張り強度を有するコラーゲンマトリックスを作製するために、コラーゲンゲルに物理的な力を周期的に及び非連続的に負荷される条件下でゲルを刺激する工程とを有する。前記物理的な力は、哺乳類の製造によってコラーゲン生成を増進するためにゲルの底面から負荷される。また、前記物理的な力は、コラーゲンゲルの水平面の１個所又はそれ以上に対する横断刺激負荷である。前記ゲルは、ゲルの周囲側面において固定され、コラーゲンゲルの中央部分を含むコラーゲンゲルの底面の少なくとも１個所に物理的な力が負荷される。刺激は、独立的にコラーゲンゲルの底面の少なくとも２個所に負荷される。刺激の強さは、１×１０−７Ｎ／ｍ２から１×１０−１Ｎ／ｍ２であり、刺激の頻度は、１分間当たり０．０１回から５００回である。刺激は、１分間当たり０．０１回から５００回の速度で回転するカム−シャフト（ｃａｍ−ｓｈａｆｔ）に装着された少なくとも１つのカムにより生成される。
【０００９】
ｂ）工程では、ポリエチレン、ポリプロピレン、エチレン−プロピレンコポリマーやシリコ−ン（ｓｉｌｉｃｏｎ）から成る弾性体により製造された培養容器において、細胞を含むゲルを刺激することにより行われる。
【００１０】
細胞は、１ｍｌの溶液当たり１×１０３細胞から１×１０７細胞の濃度で混合される。コラーゲンは、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン及びＩＶ型コラーゲンからなる群から選択された１種以上のコラーゲンである。
【００１１】
他の態様において、本発明は、上述した製造方法により調製された多孔性及び引っ張り強度が増進したコラーゲンマトリックスを提供する。本発明は、０．１μｍから１００μｍの径で、気孔率が１０％から９０％である気孔を有し、引っ張り強度が１Ｎ／ｃｍ２から２００Ｎ／ｃｍ２であるコラーゲンマトリックスを提供する。
【００１２】
第３の態様において、本発明は、本発明の方法にしたがって調製されたコラーゲンマトリックスを有する人工皮膚又は人工臓器を培養（ｃｕｌｔｕｒｅ）するために足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）を用いてなる人工皮膚又は人工臓器を提供する。本発明の他の目的は、改善されたコラーゲンマトリックスを用いて人工皮膚又は人工臓器を培養する方法である。本発明は、本発明の方法にしたがって調製されたコラーゲンマトリックスを含む人工皮膚又は人工臓器を培養するために用いるコラーゲン足場を提供する。
【００１３】
第４の態様において、本発明は、本発明の方法にしたがって調製されたコラーゲンマトリックスを含む美容又は治療目的のフィラーを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
コラーゲンは、線維芽細胞から生成される主要な細胞外マトリックス蛋白質である。コラーゲンは、生体の総蛋白質の３０％を占め、強固な３重らせん構造からなっている。コラーゲンは、細胞支持のための足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）を供給するための重要な役目を果たし、これにより、細胞の付着、移動、増殖、分化および生存に影響を与える。
【００１５】
文献では、細胞を含むコラーゲンやフィブリンゲルが直接刺激されることについて方向されていない。なお、物理的な力が周期的にコラーゲンゲルやフィブリンゲルの底面に負荷されることについて研究されていない。本発明の実施の形態において、ゲルの底面には、機械的な刺激を用いコラーゲンゲルに対して、本願発明者により立案された『横断刺激負荷』（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ  ｉｍｐｕｌｓｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）の形態の物理的な力が負荷される。本願発明者は、コラーゲンの合成と引っ張り強度が周期的に細胞を含むゲルに物理的な力を負荷することによって劇的に増大することを見出し、これにより本発明を完成させた。
【００１６】
『横断刺激負荷』は下方からコラーゲンゲルに負荷されるので、コラーゲンゲルは、刺激サイクル毎に上下運動をする。例えば、刺激は打撃と短い休息期とから構成されている。各刺激は、カム−シャフトに連結された２つのカムを有する機械的刺激器を回転することによって達成される２つの打撃を有し、以下に示すように各々の刺激サイクルは２回の打撃と短い休息期とからなり、コラーゲンマトリックスは上下運動する。『横断刺激負荷』の特徴により、コラーゲンマトリックスは３次元的に複合的な力の組み合わせが加えられることになる。
【００１７】
刺激が加えられる部位としてコラーゲンの全ての部位が可能ではある。好ましくは、ゲルはその縁にて固定され、少なくとも中央部を含む部位は、ゲル全体に刺激を伝達するように刺激される。さらに、コラーゲンゲルが大きい場合には、同時又は時差で少なくとも２個所以上で刺激することが好ましい。
【００１８】
本発明における１つの実施の形態において、周期的な機械的刺激は、様々な方法により負荷することができる。例えば、刺激は、１分間当たり０．０１ｒｐｍから５００ｒｐｍの速度、またより好ましくは１分間当たり５０ｒｐｍから１００ｒｐｍの速度で回転する機械的刺激器によって負荷される。刺激の頻度が過度に低い場合には、刺激はコラーゲンマトリックスの多孔性及び引っ張り強度に影響を与えない。極めて高い頻度はコラーゲンマトリックスを変形させることがある。
【００１９】
刺激の強さは、１×１０−７Ｎ／ｍ２から１×１０−１Ｎ／ｍ２であり、より好ましくは１．０×１０−４Ｎ／ｍ２から２．０×１０−２Ｎ／ｍ２である。刺激の強さが１×１０−７Ｎ／ｍ２未満の場合には、その刺激は多孔性及び引っ張り強度を示すには十分ではない。また刺激の強さが１×１０−１Ｎ／ｍ２を超える場合には、過度な刺激によりコラーゲンマトリックスが培養容器から分離してしまう。
【００２０】
好ましくは、本発明で用いられるコラーゲンは、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン及びＩＶ型コラーゲンを含み、より好ましくはＩ型コラーゲンである。
【００２１】
本発明の細胞は、線維芽細胞、真皮毛包細胞（ｄｅｒｍａｌ  ｓｈｅａｔｈ  ｃｅｌｌ）、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ、ＥＰＣ）、角質形成細胞、メラニン細胞、毛髪細胞、血液から由来するランゲルハンス細胞、血液から由来する内皮細胞、血液細胞、マクロファージ、リンパ球、脂肪細胞、皮脂腺細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞および血液から由来する上皮性触覚細胞に至る細胞群から選択することができる。好ましくは、細胞は、特に若者の細胞が望ましい。前記細胞は、正常細胞、遺伝的に改良された細胞あるいは悪性の生体細胞を含んでいる。各組織から得た細胞達は当分野において公知の一般な方法により培養される。
【００２２】
細胞は、１ｍｌのコラーゲン溶液当たり１×１０３細胞から１×１０７細胞の濃度、より好ましくは１×１０５細胞から１×１０６細胞の濃度、さらに好ましくは３×１０５細胞から８×１０５細胞の濃度で混合される。コラーゲン溶液中に細胞が１×１０３細胞未満の場合には、マトリックス蛋白質の合成が不十分になる。細胞濃度が１×１０７細胞を超える場合には、コラーゲンマトリックスの収縮が生じてしまう。混合されたコラーゲン溶液は、従来公知の方法にしたがって調製することができる。Ｉ型コラーゲンは、マウスの尾由来の組織から抽出することができる。細胞−埋め込み型コラーゲンゲルは、培養された細胞をコラーゲン溶液に懸濁させことにより調製される。また、前記コラーゲン溶液は、１０×の濃縮されたＤＭＥＭの１容量と中性緩衝液の１容量とにＩ型コラーゲン溶液を８容量混合することにより調製される。
【００２３】
本発明の実施の形態では、皮膚由来の線維芽細胞コラーゲンゲルと混合され、弾性膜から形成された培養容器において生体外で（ｉｎｖｉｔｒｏ）で培養される。培養容器の材質は、弾性を有し、動物細胞を培養するために使用できるものである。培養容器の形状は、例えば円形、長方形、プレート状またはチューブ状などであるが、これに限るものではない。培養容器は、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンとポリプロピレンのコポリマー、シリコーン（ｓｉｌｉｃｏｎｅ）およびこれらの混合物からなる群から選択される材料から形成されているが、これに限るものではない。
【００２４】
本発明におけるコラーゲンマトリックスの培養方法は、周期的に刺激を負荷することによりコラーゲンマトリックスの引っ張り強度を増進させる方法である。本発明において、刺激方法は、簡単であって高価な機械や試薬を必要としない。したがって、本発明の培養方法は、コスト的に有効（経済的）であり、高い多孔性及び高い引っ張り強度を有するコラーゲンマトリックスを生成することができる。
【００２５】
本発明における他の実施の形態は、上述の方法により調製された多孔性及び引っ張り強度が改善されたコラーゲンマトリックスに関係する。コラーゲンマトリックスは、０．１μｍから１００μｍの径で、気孔率が２０％から７０％である気孔を有し、引っ張り強度が５Ｎ／ｃｍ２から２００Ｎ／ｃｍ２、好ましくは７Ｎ／ｃｍ２から１００Ｎ／ｃｍ２である。
【００２６】
気孔率の測定は、通常、対象を水で飽和させたのち、総容積（乾燥物質（ｄｒｙ  ｍａｔｅｒｉａｌ））に対する孔容積（水容積）の比により算出される。しかし、コラーゲンマトリックスの親水性のために、気孔率は、２次元的電子顕微鏡写真から得られる総面積に対する気孔の面積の百分率非で規定した。
【００２７】
本発明において、引っ張り強度は、コラーゲンマトリックスから残留した培養液を除去した後、水を含む飽和状態で測定した。コラーゲンマトリックスの引っ張り強度は機械的な刺激により増加する結果が得られた。
【００２８】
これらの知見のメカニズムを理解するために、多様な分子量の発現レベルを分析した。予期していたように、Ｉ型プロコラーゲンとフィブロネクチンのｍ−ＲＮＡの発現レベルが増加し、ＭＭＰ−１の発現レベルの増加も観察された。膜に結合したＭＭＰ群に属するＭＭＰ−１は、Ｉ型プロコラーゲンとフィブロネクチンのような細胞外マトリックス蛋白質を分解することができる。ＭＭＰ−１活性は、メタロプロティナーゼ−１（ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１、ＴＩＭＰ−１）やＴＩＭＰ−２の組織阻害物質によって抑制される。本発明において、Ｉ型プロコラーゲンの増加レベルが観察された。したがって、ＴＩＭＰ−１及びＴＩＭＰ−２の増加レベルによって均衡が保たれたＭＭＰ−１の発現増加は、コラーゲンマトリックスを改造する（ｒｅｍｏｄｅｌ）と言える。
【００２９】
得られた多孔性及び引っ張り強度が改善されたコラーゲンマトリックスは、人工皮膚や人工臓器の培養に用いることができる。本発明の実施の形態において、表皮細胞、好ましくは角質形成細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）を培養する。コラーゲンマトリックスは、皮膚基材であって、皮膚のための機械的な足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）を提供する。好ましくは、本発明の皮膚基材は、上記周期的な機械的な刺激によって培養して調製されたコラーゲンマトリックスである。
【００３０】
本発明のさらに他の実施の形態では、ａ）上述した本発明の方法により細胞を含むコラーゲンマトリックスを調製する工程と、ｂ）前記コラーゲンマトリックスに対して２×１０４細胞／ｃｍ２から２×１０５細胞／ｃｍ２の濃度で角質形成細胞を植え付け培養する工程と、を有し、前記ａ）工程では、上述した本発明のコラーゲンマトリックスを培養する方法を実行して、人工皮膚を調製する方法が提供される。
【００３１】
本発明は、細胞を含むコラーゲン及び／又はフィブリンゲルを刺激することによってコラーゲンマトリックスを提供する。機械的な刺激を用いることにより、本発明は、ヒト組織のコラーゲンマトリックスと類似した良好な多孔性及び引っ張り強度を有するコラーゲンマトリックスを提供することができる。
【００３２】
以下に本発明の望ましい実施例を記載する。しかしながら、下記の実施例は本発明の望ましい実施例であるのみで本発明がこの実施例に限られているわけではないことを付記する。
【実施例】
【００３３】
実施例１．多孔性及び引っ張り強度が回線されたコラーゲンマトリックスの調製：
１−１：機械的な刺激；
図１Ａ及び図１Ｂに示すように、機械的な刺激器は、カム−シャフトに連結された２つの楕円形カムを有する。前記カム−シャフトは、ゴム板に対応する位置に配置され、ゴム板に接触することによってゴム板に対し上方に力を負荷する。ゴム板は、ハウジングボックスの上部に配置され、培養容器の底面と同じ大きさを有する。カム−シャフトが回転する間、２つのカムが培養容器の底面に存在するゴム板の中央部に対して上向きの物理的な力を負荷する。
【００３４】
これにより、培養容器に付着したコラーゲンゲルは周期的に動く。培養容器がゴム板にぴったりと固定され付着することにより、特に培養容器の底面の縁が固定される。培養容器の底面に加えられる刺激のサイクルは、７２ｒｐｍ（０．８３５６秒／サイクル、１．２Ｈｚ）である。図２に示すように、物理的な力は、『横断刺激負荷』として記載することができる。
【００３５】
さらに、刺激パターンの限定要件分析は、培養容器の底面に加えられた実験負荷に対して、Ｗｉｎｄｏｗ２００３（アメリカ合衆国カリフォルニアのＭＳＣソフトウェアコーポレーション（ＭＳＣ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））のための「ＭＳＣ．Ｎａｓｔｒａｎ」（登録商標）を用いて実施された。その結果、最大負荷力は１．７×１０−３Ｎ／ｃｍ２であり、刺激の頻度は１分間当たり６０ｒｐｍであった。
【００３６】
１−２：細胞と細胞を含有するマトリックスの培養；
ヒトの角質形成細胞と皮膚の線維芽細胞は、包茎手術（ｃｉｒｃｕｍｃｉｓｉｏｎ）の際に採取されたヒトの包皮から単離した。皮膚の検体は、加熱分解器（ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ）（ミズーリー州、セントルイスのＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ.,）を使用する我々の研究室にて改造されたＲｈｅｉｎｗａｒｄ及びＧｒｅｅｎの方法にしたがい処理された。角質形成細胞は、角質形成細胞成長培地（ＫＧＭ、カリフォルニア州サンディエゴのＣｌｏｎｅｔｉｃｓ）で培養され、Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改良Ｅａｇｌｅ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ、ＤＭＥＭ）内の線維芽細胞は、１０％のウシ胎児の血清（ＦＢＳ）に添加された。Ｉ型コラーゲンは、４℃で４８時間１／１０００氷酢酸において撹拌することにより、マウスの尾の腱から単離された。細胞含有コラーゲンマトリックスは、１０×の濃縮されたＤＭＥＭの１容量と中性緩衝液（０．０５Ｎ  ＮａＯＨ，  ０．２６ｍＭ  ＮａＨＣＯ３および２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）の１容量とにＩ型コラーゲン溶液を８容量混合し、各ミリセル（ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ）当たり線維芽細胞が５×１０５個になるよう添加して作製された。次いで、３０ｍｍポリカーボネートフィルタチェンバ（３．０ｃｍ  Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ；マサチューセッツ州ベッドフォードのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）内に前記混合液の３ｍｌを注入し、３７℃でゲル化した後培地を加えた。次に、細胞含有コラーゲンマトリックスは、実施例１−１に記載された方法を用いて刺激された。
【００３７】
実施例２：引っ張り強度が増加した人工皮膚の培養；
ＳＥｓを再構築するために、角質形成細胞は、ＤＭＥＭとハムズ栄養混合物Ｆ１２（Ｈａｍ’ｓＦ１２）（混合比＝３：１）の混合物に付加され植え付けられ、５％ＦＢＳ、０．４μｇ／ｍｌハイドロコルチゾン、１μＭイソプレテレノール、５μｇ／ｍｌインシュリン、１０ｎｇ／ｍｌ表皮成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、カリフォルニア州、カールバドのＩｎｖｉｒｏｇｅｎ  Ｃｏ.,）、及び１ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（アメリカ合衆国、セントルイスのＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ.,）、及び２５μｇ／ｍｌアスコルビン酸を加えた。ＳＥｓは、１日培地に沈殿させ、さらに１２日間空気及び液体（ａｉｒ−ｌｉｑｕｉｄ）に露出して培養した。培養後、ＳＥｓは、パラフィンブロックに生成するように固定し、ヘマトキシリンおよびエオシン染色を行った。
【００３８】
実験例１：コラーゲンマトリックスの乾燥重量；
サンプル（１ｃｍ×１ｃｍ）の乾燥重量は、凍結乾燥後測定した。乾燥重量は、乾燥前の総重量に対する百分率で測定して計算した。
【００３９】
図４に示すように、刺激グループの乾燥重量％は、７．１±０．９％［３１．３±５．７ｍｇの乾燥重量（１回目２６ｍｇ，２回目３０．１ｍｇ，３回目３７．３ｍｇ）、４４２．８±７２．２ｍｇの乾燥前の総重量（１回目３６０．４ｍｇ，２回目４９５．３ｍｇ，３回目４７２．６ｍｇ）］であった。刺激を加えなかったグループの乾燥重量％は、５．１±０．２％［２８．８±４．６ｍｇの乾燥重量（１回目２５．６ｍｇ，２回目２６．４ｍｇ，３回目３３．９ｍｇ）と５５９．５±１１４．４ｍｇの乾燥前の総重量（１回目４８１．４ｍｇ，２回目５０６．２ｍｇ，３回目６９０．８ｍｇ）］であった。この結果は、機械的な調製により乾燥重量％が増加したことを示す（５．１±０．２％から７．１±０．９％に増加）。
【００４０】
実験例２：多孔性の分析；
機械的な刺激の効果を検証するために、コラーゲンマトリックスの多孔性を評価した。特に、断面は操作電子顕微鏡を用いて観察した（図５）。気孔率の測定は、通常、対象を水で飽和させたのち、総容積（乾燥物質（ｄｒｙ  ｍａｔｅｒｉａｌ））に対する孔容積（水容積）の比により算出される。しかし、コラーゲンマトリックスの親水性のために、気孔率は、２次元的電子顕微鏡写真から得られる総面積に対する気孔の面積の百分率比で規定した。
【００４１】
実施例１−２にて得られたコラーゲンマトリックスは、平均５９．１±４．７％（実験の１回目６２．９％，２回目５８．７％，３回目５３．４％，４回目６４．５％，５回目５５．９％）であり、対象群の気孔率の平均３４．３±３．０％（実験の１回目２９．８％，２回目３５．６％，３回目３７．３％，４回目３６．１％，５回目３２．８％）より高かった。気孔のサイズは、様々ではあるが、刺激グループでは一般に小型であった。図５に示すように、新たに合成されたと見られる多数の線維束（ｂｕｎｄｌｅｓ）が刺激されたグループにて観察され、刺激されたグループは刺激がなかったグループに比べより小さい気孔が観察された。
【００４２】
実験例３：引っ張り強度の測定；
コラーゲンマトリックスの引っ張り強度は、テクスチャーアナライザー（イギリス、ゴッダルミング（Ｇｏｄａｌｍｉｎｇ）、Ｓｔａｂｌｅ  Ｍｉｃｒｏ  ＳｙｓｔｅｍｓのＴＡ−ＸＴ２ｉ  Ｔｅｘｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｅｒ）を用いることによって測定される。図６に示すように、刺激されたグループのコラーゲンマトリックスは、刺激をしなかったグループのコラーゲンマトリックスに比べ伸ばすのにより大きな力が必要であった。
【００４３】
この実験において、引っ張り強度は、コラーゲンマトリックスから残留培養液を除去した後水で飽和された状態で測定した。対照グループと刺激されたグループとの引っ張り係数（ｔｅｎｓｉｌｅ  ｍｏｄｕｌｅｓ）は、それぞれ１２．３±３．４Ｎ／ｃｍ２（実験の１回目８．２Ｎ／ｃｍ２，２回目９．０Ｎ／ｃｍ２，３回目１５．７Ｎ／ｃｍ２，４回目１１．３Ｎ／ｃｍ２，５回目１７．１  Ｎ／ｃｍ２），２３．５±４．８Ｎ／ｃｍ２（実験の１回目１８．４Ｎ／ｃｍ２，２回目１７．６Ｎ／ｃｍ２，３回目２８．１Ｎ／ｃｍ２，４回目２２．５Ｎ／ｃｍ２，５回目２３．５Ｎ／ｃｍ２）であった。これらの実験において、刺激されたグループの引っ張り係数は、対照グループの引っ張り係数の約２倍であった。
【００４４】
実験例４：細胞外マトリックスタンパクの発現；
コラーゲン合成における周期的な刺激の効果及び細胞外間トリイクス蛋白質の発現を調べるため、実施例１−２で得たコラーゲンマトリックス５００ｍｇと対照サンプルのコラーゲンマトリックス５００ｍｇを用意し、ＴＲＩｚｏｌ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１５５９６−０２６，Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ／Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）試薬を使用してＲＮＡを用意した。少量のＲＮＡは、凝固させた後短時間で得られた対照コラーゲンゲルから抽出された。２０μｇのＲＮＡは実施例１−２から得られたコラーゲンマトリックスから抽出された。抽出されたＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）により増幅され、結果は図７Ａに示されている。特に、総ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ試薬（ニューヨーク州グランドアイランドのＧｉｂｃｏ）を用いて分離され、２μｇのＲＮＡは製造元の指示にしたがい、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（ウイスコンシン州マディソン）から提供される逆転写システムを用いて逆転写した。得られたｃＤＮＡは以下のプイマーを用いて増幅された。
【００４５】
＊Ｉ型プロコラーゲン；
フォーワードプライマー（forward primer）：5‘-CTCGAGGTGGACACCACCCT-3’
リバースプライマー（reverse primer）：5‘-CAGCTGGATGGCCACATCGG-3’ 
＊ＭＭＰ−１；
フォーワードプライマー（forward primer）：5‘-ATTCTACTGATATCGGGGCTTTGA-3’ 
リバースプライマー（reverse primer）：5‘-ATGTCCTTGGGGTATCCGTGTAG-3’
＊フィブロネクチン；
フォーワードプライマー（forward primer）：5‘-AGGTTCGGGAAGAGGTTGTT-3’ 
リバースプライマー（reverse primer）：5‘-TGGCACCGAGATATTCCTTC-3’ 
【００４６】
ＰＣＲ生成物は、エチジウムブロミド染色と１．５％アガロースゲル上での電気泳動によって視覚化される。得られたｃＤＮＡも、以下に示すようにＧＡＰＤＨのための特定のプライマーを用いて増幅される。
【００４７】
フォーワードプライマー（Forward primer）：5‘-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3’
リバースプライマー（Reverse primer）：5‘-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3’
【００４８】
図７Ａには、Ｉ型プロコラーゲンのｍ−ＲＮＡレベルとフィブロネクチンが対照グループに比べ刺激されたグループより増加することが示されている。
【００４９】
蛋白質発現レベルは、ウエスタンブロッティング方法によって分析された。培養された皮膚基材は、緩衝液［６２．５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％のＳＤＳ、５％のβ−メルカプトエタノール、２ｍＭのフェニルメチルスルホニルフロライド、プロテアーゼ阻害剤（ドイツ、ミューヘン、ＲｏｃｈｅのＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ）、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、５０ｍＭのＮａＦ、１０ｍＭのＥＤＴＡ］に溶解させる。１レーン当たり２０μｇの蛋白質は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離され、０．４％のトリス−緩衝生理的食塩水中に５％乾燥ミルクを飽和させたニトロセルロール膜にブロットされた。ブロットは、１：１０００の希釈に適当な初期抗体をインキュベートし、その後、さらにホースラデイッシュ・ペルオキシダーゼ接合第２抗体をインキュベートした。結合した抗体は、増強された化学発光パルスキット（イギリス、リトルカルフォントのＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いて検出された。以下の抗体を用いた：Ｉ型プロコラーゲンに対するモノクローン系の抗体（ＳＰ１．Ｄ８，Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  ＭｅｄｉｃｉｎｅのＤｒ．Ｈｅｉｎｚ  Ｆｕｒｔｈｍａｙｒによって供給された）、ＭＭＰ−１（カリフォルニア州ラジョラのＯｎｃｏｇｅｎｅ，ＩＭ３５Ｌ）、ＴＩＭＰ−１（カリフォルニア州サンタクルーズのＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ.,ｓｃ−６８３２）、ＴＩＭＰ−２（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ.,ｓｃ−２１７３５）及びアクチンに対するゴースト抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ.,ｓｃ−１６１６）。
【００５０】
結果として、物理的な刺激は、対照サンプルに比べ劇的にＩ型プロコラーゲンのレベルを増大させた。なお、ＭＭＰ−１活性を抑制するＴＩＭＰ−１とＴＩＭＰ−２のレベルは、対照サンプルに比べ増加した。これらの知見は、ＭＭＰ−１のｍ−ＲＮＡレベルは刺激されたグループより高かったが、ＭＭＰ−１のレベルは刺激されたグループと対照グループとでは同等であることを説明している。したがって、Ｉ型プロコラーゲン蛋白質の生成を増加させ、より微細な気孔とより強い引っ張り強度を有するコラーゲンマトリックスから生成されたＭＭＰ−１タンパク質によって消化（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）が制御されたと言える。
【００５１】
本発明は、好ましい実施の形態を引用して詳細に記載したが、当業者であれば本願の請求の範囲に記載されている発明の精神及び範囲から外れることなく様々な改良及び代替を行うことができるものと認められる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１Ａ】刺激システムの概要図である。
【図１Ｂ】刺激システムの概要図である。
【図２】実施例１−１における物理的な調整の後における代表的な変位のサイクルを示す図である。
【図３】実施例２における対照モデルと刺激モデルのマトリックス上に培養した人工皮膚の写真である。
【図４】実験例１における機械的な刺激によって培養されたマトリックスゲルの乾燥重量の増加を示した図である。
【図５】実験例２における機械的な刺激によって培養されたマトリックスゲルの多孔性の増加を示した図である。
【図６】実験例３における機械的な刺激によって培養されたマトリックスゲルの引っ張り強さの増加を示した図である。
【図７Ａ】機械的な刺激のもとで培養されたコラーゲンゲルにおけるＩ型コラーゲン、ＭＭＰ−１、線維結合素（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）のｍＲＮＡ発現の増加を示す図である。
【図７Ｂ】実験例４における機械的な刺激により培養されたコラーゲンゲルにおけるＩ型コラーゲン、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２の蛋白質レベルの増加を示す図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図４】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
2009514546.tif 000009
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2009514546.tif 000011
【配列表】
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【国際調査報告】
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2009514546.tif 000013
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