(57)【要約】本発明は、ＮｇＲ１アンタゴニストの投与によって、乏突起膠細胞死、脱髄、および髄鞘形成異常を伴う脊髄損傷などの疾患、障害、または損傷を治療する方法を提供する。本発明は、ＮｇＲ１の一定のアンタゴニストが、乏突起膠細胞の生存を促進するとともに、ニューロンの脱髄を低減するという発見に基づいている。これらの発見に基づいて、本発明は、一般的に、ＮｇＲ１アンタゴニストを投与することによって、脱髄を低減し、乏突起膠細胞の生存を促進する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
乏突起膠細胞の生存を促進する方法であって、該乏突起膠細胞を、以下の（ｉ）〜（ｖ）の群から選択されるＮｇＲ１アンタゴニストを含む有効量の組成物に接触させることを含む方法：
（ｉ）可溶型ＮｇＲ１ポリペプチド；
（ｉｉ）ＮｇＲ１抗体またはその断片；
（ｉｉｉ）ＮｇＲ１アンタゴニストのポリヌクレオチド；
（ｉｖ）ＮｇＲ１アプタマー；および
（ｖ）該ＮｇＲ１アンタゴニストの２つ以上の組み合わせ。
【請求項２】
ニューロンの脱髄を低減する方法であって、ニューロンと乏突起膠細胞との混合物を、以下の（ｉ）〜（ｖ）の群から選択されるＮｇＲ１アンタゴニストを含む組成物に接触させることを含む方法：
（ｉ）可溶型ＮｇＲ１ポリペプチド；
（ｉｉ）ＮｇＲ１抗体またはその断片；
（ｉｉｉ）ＮｇＲ１アンタゴニストのポリヌクレオチド；
（ｉｖ）ＮｇＲ１アプタマー；および
（ｖ）該ＮｇＲ１アンタゴニストの２つ以上の組み合わせ。
【請求項３】
哺乳動物における乏突起膠細胞の生存を促進する方法であって、それを必要とする哺乳動物に、以下の（ｉ）〜（ｖ）の群から選択されるＮｇＲ１アンタゴニストを含む有効量の組成物を投与することを含む方法：
（ｉ）可溶型ＮｇＲ１ポリペプチド；
（ｉｉ）ＮｇＲ１抗体またはその断片；
（ｉｉｉ）ＮｇＲ１アンタゴニストのポリヌクレオチド；
（ｉｖ）ＮｇＲ１アプタマー；および
（ｖ）該ＮｇＲ１アンタゴニストの２つ以上の組み合わせ。
【請求項４】
哺乳動物におけるニューロンの脱髄を低減する方法であって、それを必要とする哺乳動物に、以下の（ｉ）〜（ｖ）の群から選択されるＮｇＲ１アンタゴニストを含む有効量の組成物を投与することを含む方法：
（ｉ）可溶型ＮｇＲ１ポリペプチド；
（ｉｉ）ＮｇＲ１抗体またはその断片；
（ｉｉｉ）ＮｇＲ１アンタゴニストのポリヌクレオチド；
（ｉｖ）ＮｇＲ１アプタマー；および
（ｖ）該ＮｇＲ１アンタゴニストの２つ以上の組み合わせ。
【請求項５】
哺乳動物における髄鞘形成異常または脱髄を伴う疾患、障害、または損傷を治療する方法であって、それを必要とする哺乳動物に、以下の（ｉ）〜（ｖ）の群から選択されるＮｇＲ１アンタゴニストを含む治療上有効量の組成物を投与することを含む方法：
（ｉ）可溶型ＮｇＲ１ポリペプチド；
（ｉｉ）ＮｇＲ１抗体またはその断片；
（ｉｉｉ）ＮｇＲ１アンタゴニストのポリヌクレオチド；
（ｉｖ）ＮｇＲ１アプタマー；および
（ｖ）該ＮｇＲ１アンタゴニストの２つ以上の組み合わせ。
【請求項６】
哺乳動物における乏突起膠細胞死を伴う疾患、障害、または損傷を治療する方法であって、それを必要とする哺乳動物に、以下の（ｉ）〜（ｖ）の群から選択されるＮｇＲ１アンタゴニストを含む治療上有効量の組成物を投与することを含む方法：
（ｉ）可溶型ＮｇＲ１ポリペプチド；
（ｉｉ）ＮｇＲ１抗体またはその断片；
（ｉｉｉ）ＮｇＲ１アンタゴニストのポリヌクレオチド；
（ｉｖ）ＮｇＲ１アプタマー；および
（ｖ）該ＮｇＲ１アンタゴニストの２つ以上の組み合わせ。
【請求項７】
前記ＮｇＲ１アンタゴニストが可溶型ＮｇＲ１ポリペプチドを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記可溶型ＮｇＲ１ポリペプチドが、以下の（ｉ）から（ｘｉ）の群から選択される参照アミノ酸配列に９０％同一である、請求項７に記載の方法：
（ｉ）配列番号：２の２６位から３１０位のアミノ酸；
（ｉｉ）配列番号：２の２６位から３４４位のアミノ酸；
（ｉｉｉ）配列番号：２の２７位から３１０位のアミノ酸；
（ｉｖ）配列番号：２の２７位から３４４位のアミノ酸；
（ｖ）配列番号：２の２７位から４４５位のアミノ酸；
（ｖｉ）配列番号：２の２７位から３０９位のアミノ酸；
（ｖｉｉ）配列番号：２の１位から３１０位のアミノ酸；
（ｖｉｉｉ）配列番号：２の１位から３４４位のアミノ酸；
（ｉｘ）配列番号：２の１位から４４５位のアミノ酸；
（ｘ）配列番号：２の１位から３０９位のアミノ酸；および
（ｘｉ）該参照アミノ酸配列の１つ以上の組み合わせ。
【請求項９】
前記可溶型ＮｇＲ１ポリペプチドが、以下の（ｉ）から（ｘｉｉ）の群から選択される、請求項８に記載の方法：
（ｉ）配列番号：２の２６位から３１０位のアミノ酸；
（ｉｉ）配列番号：２の２６位から３４４位のアミノ酸；
（ｉｉｉ）配列番号：２の２７位から３１０位のアミノ酸；
（ｉｖ）配列番号：２の２７位から３４４位のアミノ酸；
（ｖ）配列番号：２の２７位から４４５位のアミノ酸；
（ｖｉ）配列番号：２の２７位から３０９位のアミノ酸；
（ｖｉｉ）配列番号：２の１位から３１０位のアミノ酸；
（ｖｉｉｉ）配列番号：２の１位から３４４位のアミノ酸；
（ｉｘ）配列番号：２の１位から４４５位のアミノ酸；
（ｘ）配列番号：２の１位から３０９位のアミノ酸；
（ｘｉ）該ポリペプチド断片のいずれかの変異体または誘導体；および
（ｘｉｉ）該ポリペプチド断片またはそれらの変異体もしくは誘導体の２つ以上の組み合わせ。
【請求項１０】
前記可溶型ＮｇＲ１ポリペプチドが、配列番号：２の２７位から３１０位のアミノ酸を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記可溶型ＮｇＲ１ポリペプチドが、配列番号：２の２６位から３１０位のアミノ酸を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記可溶型ＮｇＲ１ポリペプチドの少なくとも１つのシステイン残基が別のアミノ酸に置換されている、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つのシステイン残基がＣ２６６である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つのシステイン残基がＣ３０９である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つのシステイン残基がＣ３３５である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１つのシステイン残基がＣ３３６である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記別のアミノ酸が、アラニン、セリン、およびスレオニンからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記別のアミノ酸が、アラニンである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記可溶型ＮｇＲ１ポリペプチドが環状ポリペプチドである、請求項７〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記環状ポリペプチドが、Ｎ末端に結合した第１の分子、およびＣ末端に結合した第２の分子をさらに含み、前記第１の分子および前記第２の分子が互いに結合して前記環状分子を形成している、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１および第２の分子が、ビオチン分子、システイン残基、およびアセチル化システイン残基からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１の分子が、ポリペプチドのＮ末端に結合したビオチン分子であり、前記第２の分子が、ポリペプチドのＣ末端に結合したシステイン残基である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１の分子が、ポリペプチドのＮ末端に結合したアセチル化システイン残基であり、前記第２の分子が、ポリペプチドのＣ末端に結合したシステイン残基である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｃ末端のシステインにＮＨ２部分が結合している、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記可溶型ＮｇＲ１ポリペプチドが、非ＮｇＲ１部分をさらに含む、請求項７〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記非ＮｇＲ１部分が、可溶型ＮｇＲ１ポリペプチドに融合したポリペプチドである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記非ＮｇＲ１部分が、抗体のＩｇ部分、血清アルブミン部分、標的部分、レポーター部分、および精製促進化部分からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記非ＮｇＲ１部分が抗体のＩｇ部分である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗体のＩｇ部分が、ヒンジおよびＦｃ部分である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記可溶型ＮｇＲ１ポリペプチドがポリマーに結合している、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記ポリマーが、ポリアルキレングリコール、ポリマー糖、およびポリペプチドからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ポリマーが、ポリアルキレングリコールである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記可溶型ＮｇＲ１ポリペプチドが、１個、２個、３個または４個のポリマーに結合している、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
ポリマーの総分子量が５，０００Ｄａから１００，０００Ｄａである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＮｇＲ１アンタゴニストが、ＮｇＲ１抗体またはその断片を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＮｇＲ１抗体またはその断片が、以下の（ｉ）〜（ｘ）の群から選択されるポリペプチド断片に特異的に結合する、請求項３６に記載の方法：
（ｉ）配列番号：２の２６位から３１０位のアミノ酸；
（ｉｉ）配列番号：２の２６位から３４４位のアミノ酸；
（ｉｉｉ）配列番号：２の２７位から３１０位のアミノ酸；
（ｉｖ）配列番号：２の２７位から３４４位のアミノ酸；
（ｖ）配列番号：２の２７位から４４５位のアミノ酸；
（ｖｉ）配列番号：２の２７位から３０９位のアミノ酸；
（ｖｉｉ）配列番号：２の１位から３１０位のアミノ酸；
（ｖｉｉｉ）配列番号：２の１位から３４４位のアミノ酸；
（ｉｘ）配列番号：２の１位から４４５位のアミノ酸；および
（ｘ）配列番号：２の１位から３０９位のアミノ酸。
【請求項３８】
前記ＮｇＲ１アンタゴニストが、ＮｇＲ１アンタゴニストのポリヌクレオチドを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＮｇＲ１アンタゴニストのポリヌクレオチドが以下の（ｉ）〜（ｉｖ）の群から選択される、請求項３８に記載の方法：
（ｉ）アンチセンスポリヌクレオチド；
（ｉｉ）リボザイム；
（ｉｉｉ）低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；および
（ｉｖ）低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）。
【請求項４０】
前記ＮｇＲ１アンタゴニストのポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡのコード部位に相補的な塩基を少なくとも１０個含むアンチセンスポリヌクレオチドである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＮｇＲ１アンタゴニストのポリヌクレオチドがリボザイムである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＮｇＲ１アンタゴニストのポリヌクレオチドがｓｉＲＮＡである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＮｇＲ１アンタゴニストのポリヌクレオチドがｓｈＲＮＡである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡがＮｇＲ１の発現を阻害する、請求項４２または４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、ＣＵＡＣＵＵＣＵＣＣＣＧＣＡＧＧＣＧＡ（配列番号：８）に少なくとも９０％同一のポリヌクレオチド配列を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、ヌクレオチド配列：ＣＵＡＣＵＵＣＵＣＣＣＧＣＡＧＧＣＧＡ（配列番号：８）を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、配列：ＧＡＴＧＡＡＧＡＧＧＧＣＧＴＣＣＧＣＴ（配列番号：９）を含むポリヌクレオチドによって産生されるｍＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、ＣＣＣＧＧＡＣＣＧＡＣＧＵＣＵＵＣＡＡ（配列番号：１０）に少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、ヌクレオチド配列：ＣＣＣＧＧＡＣＣＧＡＣＧＵＣＵＵＣＡＡ（配列番号：１０）を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、配列：ＧＧＧＣＣＴＧＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＴＴ（配列番号：１１）を含むポリヌクレオチドによって産生されるｍＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項５１】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、ＣＵＧＡＣＣＡＣＵＧＡＧＵＣＵＵＣＣＧ（配列番号：１２）に少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項５２】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、ヌクレオチド配列：ＣＵＧＡＣＣＡＣＵＧＡＧＵＣＵＵＣＣＧ（配列番号：１２）を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、配列：ＧＡＣＴＧＧＴＧＡＣＴＣＡＧＡＡＧＧＣ（配列番号：１３）を含むポリヌクレオチドによって産生されるｍＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＮｇＲ１アンタゴニストが、ＮｇＲ１のアプタマーを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記哺乳動物が、脱髄、髄鞘形成異常、または神経変性を伴う疾患、障害、または損傷を有すると診断されている、請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記疾患、障害、または損傷が、脊髄損傷（ＳＣＩ）、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中心髄鞘融解（ＣＰＭ）、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、ペリツェウス・メルツバッハー病（ＰＭＺ）、ウォーラー変性、視神経炎、横断性脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、アルツハーマー病、パーキンソン病、外傷性脳損傷、放射線照射後損傷、化学療法による神経学的合併症、脳卒中、急性虚血性視神経症、ビタミンＥ欠乏症、ビタミンＥ単独欠乏症候群、ＡＲ、バッセン・コーンツヴァイク症候群、マルキアファーヴァ・ビニャミ症候群、異染性白質ジストロフィー、三叉神経痛、およびベル麻痺からなる群から選択される、請求項５〜６、または５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記疾患、障害、または損傷が脊髄損傷（ＳＣＩ）である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
ＮｇＲ１アンタゴニストを、ボーラス注射または長期輸液によって投与する、請求項３〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＮｇＲ１アンタゴニストを中枢神経系内に直接投与する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記アンタゴニストをＭＳの慢性病変部内に直接投与する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
（ａ）発現調節配列への操作可能な結合を介してＮｇＲ１アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドで、乏突起膠細胞をトランスフェクトすること、および（ｂ）ＮｇＲ１アンタゴニストを発現させることを含む、請求項１または２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
（ａ）発現調節配列への操作可能な結合を介してＮｇＲ１アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを哺乳動物に投与すること、および（ｂ）ＮｇＲ１アンタゴニストを発現させることを含む、請求項３〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記ポリヌクレオチドを発現ベクターとして投与する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記発現ベクターがウイルスベクターである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
請求項３〜５７のいずれか１項に記載の方法であって、投与が、（ａ）ポリヌクレオチドを含む培養宿主細胞であって、ＮｇＲ１アンタゴニストを発現する細胞を提供すること、および（ｂ）培養宿主細胞を哺乳動物に導入して、ＮｇＲ１アンタゴニストが該哺乳動物で発現されるようにすることを含む方法。
【請求項６６】
前記培養宿主細胞を、神経系の疾患、障害、または損傷の部位、またはその近傍で前記哺乳動物に導入する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記培養宿主細胞が、（ａ）レシピエントである宿主細胞を、請求項６２に記載のポリヌクレオチドまたは請求項６４に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトすること、および（ｂ）形質転換またはトランスフェクトされた該宿主細胞を培養することを含む方法によって作製されている、請求項６５または６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記培養宿主細胞が、治療すべき哺乳動物に由来する、請求項６５〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
神経系の疾患、障害、または損傷の部位、またはその近傍において、ＮｇＲ１アンタゴニストが乏突起膠細胞の生存の阻害を低減するのに十分な量で発現される、請求項３〜６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
神経系の疾患、障害、または損傷の部位、またはその近傍において、ＮｇＲ１アンタゴニストが脱髄を低減するのに十分な量で発現される、請求項３〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、エンテロウイルスベクター、ペスチウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、パポバウイルスベクター、およびポックスウイルスベクターからなる群から選択される、請求項６４に記載の方法。
【請求項７２】
前記ヘルペスウイルスベクターが、単純ヘルペスウイルスベクターおよびエプスタイン−バーウイルスベクターからなる群から選択される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記ポックスウイルスベクターがワクシニアウイルスベクターである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
前記ベクターを、局所投与、眼内投与、非経口投与、髄腔内投与、硬膜下投与、および皮下投与からなる群から選択される経路によって投与する、請求項６３、６４、または７１〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経生物学、神経学、および薬理学に関する。より具体的には、Ｎｏｇｏ受容体−１（ＮｇＲ１）アンタゴニストの投与によって、乏突起膠細胞の生存を促進させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乏突起膠細胞は、脊髄損傷（ＳＣＩ）の後にアポトーシス細胞死を起こすが、これが、生き残った軸索の脱髄をもたらし、機能回復を妨げる（非特許文献１および非特許文献２）。ニューロトロフィン受容体であるｐ７５が、ＳＣＩ後にアップレギュレートされ、乏突起膠細胞死に関与する（非特許文献３および非特許文献４）。ｐ７５は、ＮｇＲ／Ｌｉｎｇｏ−１（Ｓｐ３５）／Ｔａｊ／ｐ７５受容体複合体の共受容体として同定されている（非特許文献５、非特許文献６、および非特許文献７）。ｐ７５が介在する細胞死は、細胞内ＧＰａｓｅであるＲｈｏ−Ａとも関連づけられている（非特許文献８）。これまでの研究で、Ｎｏｇｏ受容体（ＮｇＲ１）インヒビタである可溶型ＮｇＲ−３１０−Ｆｃが、Ｎｏｇｏシグナル伝達経路を遮断することによって、ＳＣＩ後の運動機能の回復および軸索再生を有意に改善したことが明らかになっている（非特許文献９）。しかし、脊髄損傷後の乏突起膠細胞の細胞死および軸索の脱髄、ならびに乏突起膠細胞死および脱髄に伴う他の疾患を予防するための治療法も必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｃａｓｈａら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １０３：２０３−２１８（２００１）
【非特許文献２】Ｃｒｏｗｅら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：７３−７６（１９９７）
【非特許文献３】Ｂｅａｔｔｉｅら、Ｎｅｕｒｏｎ  ３５：３７５−３８６（２００２）
【非特許文献４】Ｄｕｂｒｅｕｉｌら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６２（２）：２３３−２４３（２００３）
【非特許文献５】Ｗａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ４２０（６９１１）：７４−７８（２００２）
【非特許文献６】Ｐａｒｋら、Ｎｅｕｒｏｎ  ４５（５）：８１５（２００５）
【非特許文献７】Ｓｈａｏら、Ｎｅｕｒｏｎ  ４５（３）：３５３−３５９（２００５）
【非特許文献８】Ｌｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４（４６）：１０５１１−１０５２０（２００４）
【非特許文献９】Ｆｏｕｒｎｉｅｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２２：８８７６−８８８３（２００２）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、ＮｇＲ１の一定のアンタゴニストが、乏突起膠細胞の生存を促進するとともに、ニューロンの脱髄を低減するという発見に基づいている。これらの発見に基づいて、本発明は、一般的に、ＮｇＲ１アンタゴニストを投与することによって、脱髄を低減し、乏突起膠細胞の生存を促進する方法に関する。
【０００５】
一定の実施形態において、本発明は、乏突起膠細胞の生存を促進する方法であって、乏突起膠細胞を有効量のＮｇＲ１アンタゴニストと接触させることを含む方法を提供する。
【０００６】
さらなる実施形態において、本発明は、哺乳動物において乏突起膠細胞の生存を促進する方法であって、治療上有効量のＮｇＲ１アンタゴニストを投与することを含む方法を含む。
【０００７】
一定の実施形態において、本発明は、ニューロンの脱髄を低減する方法であって、ニューロンと乏突起膠細胞との混合物を、ＮｇＲ１アンタゴニストを含む組成物と接触させることを含む方法を含む。
【０００８】
別の実施形態において、本発明は、哺乳動物においてニューロンの脱髄を低減する方法であって、治療上有効量のＮｇＲ１アンタゴニストを投与することを含む方法を含む。一定の実施形態において、哺乳動物は、乏突起膠細胞死、脱髄、または髄鞘形成異常を伴う疾患、障害、損傷、または症状であると診断されている。いくつかの実施形態において、疾患、障害、損傷、または症状は、脊髄損傷、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中心髄鞘融解（ＣＰＭ）、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、ペリツェウス・メルツバッハー病（ＰＭＺ）、グロボイド細胞白質ジストロフィー（クラッベ病）、ウォーラー変性、視神経炎、横断性脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、アルツハーマー病、パーキンソン病、外傷性脳損傷、放射線照射後損傷、化学療法による神経学的合併症、脳卒中、急性虚血性視神経症、ビタミンＥ欠乏症、ビタミンＥ単独欠乏症候群、ＡＲ、バッセン・コーンツヴァイク症候群、マルキアファーヴァ・ビニャミ症候群、異染性白質ジストロフィー、三叉神経痛、およびベル麻痺からなる群から選択される。一実施形態において、疾患、障害、損傷、または症状は、脊髄損傷である。
【０００９】
さらに、本発明は、哺乳動物において、乏突起膠細胞またはミエリンの破壊を伴う疾患、障害、または損傷を治療する方法であって、治療上有効量の、ＮｇＲ１アンタゴニストを含む組成物を投与することを含む方法を含む。更なる実施形態は、哺乳動物において、乏突起膠細胞またはミエリンの破壊を伴う疾患、障害、または損傷を治療する方法であって、（ａ）組換えＮｇＲ１アンタゴニストを発現する培養宿主細胞を提供すること、および（ｂ）宿主細胞を、哺乳動物の神経系の疾患、障害、または損傷の部位、またはその近傍に導入することを含む方法を含む。いくつかの実施形態において、疾患、障害、または損傷は、脊髄損傷、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中心髄鞘融解（ＣＰＭ）、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、ペリツェウス・メルツバッハー病（ＰＭＺ）、グロボイド細胞白質ジストロフィー（クラッベ病）およびウォーラー変性、視神経炎、横断性脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、アルツハーマー病、パーキンソン病、外傷性脳損傷、放射線照射後損傷、化学療法による神経学的合併症、脳卒中、急性虚血性視神経症、ビタミンＥ欠乏症、ビタミンＥ単独欠乏症候群、ＡＲ、バッセン・コーンツヴァイク症候群、マルキアファーヴァ・ビニャミ症候群、異染性白質ジストロフィー、三叉神経痛、ならびにベル麻痺からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、培養宿主細胞は、治療を受ける哺乳動物に由来する。
【００１０】
本発明のさらなる実施形態は、インビボ遺伝子治療法によって、乏突起膠細胞またはミエリンの破壊を伴う疾患、障害、または損傷を治療する方法であって、ＮｇＲ１アンタゴニストをコードする塩基配列を含むベクターを、哺乳動物の疾患、障害、または損傷の部位、またはその近傍に投与して、その哺乳動物において、ＮｇＲ１アンタゴニストが、損傷の部位、またはその近傍においてニューロンの髄鞘形成を促進するのに十分な量でその塩基配列から発現されるようにすることを含む方法を含む。一定の実施形態において、ベクターは、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、エンテロウイルスベクター、ペスチウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、エプスタイン−バーウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルスベクターからなる群から選択されるベクターである。いくつかの実施形態において、疾患、障害、または損傷は、脊髄損傷、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中心髄鞘融解（ＣＰＭ）、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、ペリツェウス・メルツバッハー病（ＰＭＺ）、グロボイド細胞白質ジストロフィー（クラッベ病）、ウォーラー変性、視神経炎、横断性脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、アルツハーマー病、パーキンソン病、外傷性脳損傷、放射線照射後損傷、化学療法による神経学的合併症、脳卒中、急性虚血性視神経症、ビタミンＥ欠乏症、ビタミンＥ単独欠乏症候群、ＡＲ、バッセン・コーンツヴァイク症候群、マルキアファーヴァ・ビニャミ症候群、異染性白質ジストロフィー、三叉神経痛、およびベル麻痺からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ベクターは、局所投与、眼内投与、非経口投与、髄腔内投与、硬膜下投与、および皮下投与からなる群から選択される経路によって投与される。
【００１１】
上記方法のさまざまな実施形態において、ＮｇＲ１アンタゴニストは、可溶型ＮｇＲ１ポリペプチド、ＮｇＲ１抗体、およびＮｇＲ１アンタゴニストポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ干渉）、ＮｇＲ１アプタマー、または２種類以上のＮｇＲ１アンタゴニストを組み合わせからなる群から選択される。
【００１２】
本発明の方法において使用するための一定の可溶型Ｓｐ３５ポリペプチドは、配列番号：２の２６位から３１０位のアミノ酸；配列番号：２の２６位から３４４位のアミノ酸；配列番号：２の２７位から３１０位のアミノ酸；配列番号：２の２７位から３４４位のアミノ酸；配列番号：２の２７位から４４５位のアミノ酸；配列番号：２の２７位から３０９位のアミノ酸；配列番号：２の１位から３１０位のアミノ酸；配列番号：２の１位から３４４位のアミノ酸；配列番号：２の１位から４４５位のアミノ酸；配列番号：２の１位から３０９位のアミノ酸；および前記参照アミノ酸配列の１つ以上の組み合わせからなる群から選択される参照配列と９０％同一である可溶型ＮｇＲ１ポリペプチドなどであるが、これらに限定されない。一定の実施形態において、本発明の方法において使用される可溶型ＮｇＲ１ポリペプチドは、配列番号：２の２６位から３１０位のアミノ酸；配列番号：２の２６位から３４４位のアミノ酸；配列番号：２の２７位から３１０位のアミノ酸；配列番号：２の２７位から３４４位のアミノ酸；配列番号：２の２７位から４４５位のアミノ酸；配列番号：２の２７位から３０９位のアミノ酸；配列番号：２の１位から３１０位のアミノ酸；配列番号：２の１位から３４４位のアミノ酸；配列番号：２の１位から４４５位のアミノ酸；配列番号：２の１位から３０９位のアミノ酸；前記ポリペプチド断片のいずれかの変異体または誘導体；および前記ポリペプチド断片、またはそれらの変異体もしくは誘導体の２つ以上の組み合わせからなる群から選択される。一定の実施形態において、本発明の方法において使用されるＮｇＲ１アンタゴニストは、ＮｇＲ１抗体、またはその断片であって、可溶型ＮｇＲ１ポリペプチドに結合するものを含む。
【００１３】
上記方法のさまざまな実施形態において、Ｎｇｒ１アンタゴニストは、少なくとも１個のシステイン残基が別のアミノ酸に置換されている可溶型ＮｇＲ１ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１個のシステイン残基はＣ２６６である。いくつかの実施形態において、少なくとも１個のシステイン残基はＣ３０９である。いくつかの実施形態において、少なくとも１個のシステイン残基はＣ３３５である。いくつかの実施形態において、少なくとも１個のシステイン残基はＣ３３６である。いくつかの実施形態において、少なくとも１個のシステイン残基は、アラニン、セリン、およびスレオニンからなる群から選択される別のアミノ酸に置換されている。いくつかの実施形態において、置換アミノ酸はアラニンである。
【００１４】
一定の実施形態において、本発明の方法において使用されるＮｇＲ１アンタゴニストは、アンチセンスポリヌクレオチド；リボザイム；低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；および低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）からなる群から選択されるＮｇＲ１アンタゴニストポリヌクレオチドを含む。
【００１５】
いくつかの実施形態において、本発明の方法において使用されるＮｇＲ１アンタゴニストポリヌクレオチドは、ＮｇＲ１ｍＲＮＡのコード部位に相補的な塩基を少なくとも１０個含むアンチセンスポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドはリボザイムである。
【００１６】
さらなる実施形態において、本発明の方法において使用されるＮｇＲ１アンタゴニストはｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである。いくつかの実施形態において、本発明は、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡがＮｇＲ１発現を阻害すると規定している。いくつかの実施形態において、本発明は、さらに、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、ＣＵＡＣＵＵＣＵＣＣＣＧＣＡＧＧＣＧＡ（配列番号：８）またはＣＣＣＧＧＡＣＣＧＡＣＧＵＣＵＵＣＡＡ（配列番号：１０）またはＣＵＧＡＣＣＡＣＵＧＡＧＵＣＵＵＣＣＧ（配列番号：１２）を含むヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であると規定している。別の実施形態において、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのヌクレオチド配列は、ＣＵＡＣＵＵＣＵＣＣＣＧＣＡＧＧＣＧＡ（配列番号：８）またはＣＣＣＧＧＡＣＣＧＡＣＧＵＣＵＵＣＡＡ（配列番号：１０）またはＣＵＧＡＣＣＡＣＵＧＡＧＵＣＵＵＣＣＧ（配列番号：１２）である。
【００１７】
いくつかの実施形態において、本発明は、さらに、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのヌクレオチド配列が、ポリヌクレオチド配列であるＧＡＴＧＡＡＧＡＧＧＧＣＧＴＣＣＧＣＴ（配列番号：９）またはＧＧＧＣＣＴＧＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＴＴ（配列番号：１１）またはＧＡＣＴＧＧＴＧＡＣＴＣＡＧＡＡＧＧＣ（配列番号：１３）によって産生されるｍＲＮＡに相補的であると規定している。
【００１８】
いくつかの実施形態において、ＮｇＲ１アンタゴニストは、ボーラス注射または長期輸液によって投与される。いくつかの実施形態において、可溶型ＮｇＲ１ポリペプチドを中枢神経系に直接投与する。いくつかの実施形態において、ＭＳの慢性病変部に可溶型ＮｇＲ１ポリペプチドを直接投与する。
【００１９】
いくつかの実施形態において、本発明の方法において使用されるＮｇＲ１アンタゴニストは、環状の可溶型ＮｇＲ１ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、環状ポリペプチドは、Ｎ末端に結合した第１の分子、およびＣ末端に結合した第２の分子を含み、第１の分子および第２の分子が互いに結合して前記環状分子を形成している。いくつかの実施形態において、第１および第２の分子は、ビオチン分子、システイン残基、およびアセチル化システイン残基からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第１の分子は、本発明のポリペプチドのＮ末端に結合したビオチン分子であり、第２の分子は、本発明のポリペプチドのＣ末端に結合したシステイン残基である。いくつかの実施形態において、第１の分子は、本発明のポリペプチドのＮ末端に結合したアセチル化システイン残基であり、第２の分子は、本発明のポリペプチドのＣ末端に結合したシステイン残基である。いくつかの実施形態において、第１の分子は、本発明のポリペプチドのＮ末端に結合したアセチル化システイン残基であり、第２の分子は、本発明のポリペプチドのＣ末端に結合したシステイン残基である。いくつかの実施形態において、Ｃ末端のシステインには、ＮＨ２部分が結合している。
【００２０】
いくつかの実施形態において、本発明の方法において使用されるＮｇＲ１アンタゴニストは、非ＮｇＲ１部分を含む融合ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、非ＮｇＲ１部分は、抗体のＩｇ部分、血清アルブミン部分、標的部分、レポーター部分、および精製促進化部分からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、抗体のＩｇ部分は、ヒンジおよびＦｃ部分である。
【００２１】
いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドおよび抗体は、ポリマーに結合している。いくつかの実施形態において、このポリマーは、ポリアルキレングリコール、ポリマー糖、およびポリペプチドからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ポリアルキレングリコールはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドおよび抗体は、１個、２個、３個または４個のポリマーに結合している。いくつかの実施形態において、ポリマーの総分子量は５，０００Ｄａから１００，０００Ｄａである。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１Ａ〜Ｂは、脊髄損傷（ＳＣＩ）後の乏突起膠細胞のアポトーシスに対するＮｇＲ１−３１０−Ｆｃの効果を示している。
【図２】図２Ａ〜Ｂは、ＳＡＰＫ／ＪＮＫリン酸化およびＡＫＴ活性に対するＮｇＲ１−３１０−Ｆｃの効果を示している。
【図３】図３Ａ〜Ｂは、ＳＣＩ後の乏突起膠細胞におけるカスパーゼ−３の活性化に対するＮｇＲ１−３１０−Ｆｃの効果を示している。
【図４】ＳＣＩ後の分解ミエリン塩基性タンパク質（ｄＭＢＰ）に対するＮｇＲ１−３１０−Ｆｃの効果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
定義
別段の記載がない限り、本明細書において使用されるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野において当業者に広く理解されている意味と同じ意味をもつ。不一致がある場合は、その定義を含む本出願が基準となる。文脈上別段の規定がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書に記載されているすべての刊行物、特許、およびその他の文献は、あらゆる点で、各個別の刊行物または特許出願が、参照により具体的かつ個別に組み込まれると記載されているものとして、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
【００２４】
本明細書に記載されている方法および材料に類似または同等の方法および材料を、実際に、または本発明をテストする際に使用することができるが、適当な方法および材料が下記に記載されている。材料、方法、および実施例は、例示的なものにすぎず、限定するためのものではない。本発明のその他の特徴および利点は、詳細な説明および請求の範囲から明らかになろう。
【００２５】
本発明をさらに特定するために、以下の用語および定義を記載する。
【００２６】
「１つの」物という用語は、その物が１つ以上あることを意味し、例えば、「１つの免疫グロブリン分子」は、１つ以上の免疫グロブリン分子を意味していると理解されることに留意すべきである。したがって、「１つの」、「１つ以上の」、および「少なくとも１つの」という用語は、本明細書において互換的に使用することができる。
【００２７】
本明細書および請求の範囲を通じて、「含む」という語、またはその変形である「（三人称の）含む」または「含んでいる」などの語は、記載されている整数または整数群を含むことを表しているが、別の整数または整数群を排除することを表してはいない。
【００２８】
本明細書において、「からなる」という用語、またはその変形である「（複数形を受けた）からなる」または「からなっている」などの語は、本明細書および請求の範囲を通じて、記載されている整数または整数群を含むことを表しており、その他の整数または整数群を、特定された方法、構造、または組成物に追加することはできないことを表している。
【００２９】
本明細書において、「本質的に〜からなる」という用語、またはその変形である「（複数形を受けた）本質的に〜からなる」または「本質的に〜からなっている」などの語は、本明細書および請求の範囲を通じて、記載されている整数または整数群を含むこと、および特定された方法、構造、または組成物の基本的性質または新規の性質を実質的に変えない任意の整数または整数群を任意で含むことを表す。
【００３０】
本明細書および米国出願第６０／４０２，８６６号において、「Ｎｏｇｏ受容体」、「ＮｏｇｏＲ」、「ＮｏｇｏＲ−１」、「ＮｇＲ」、「ＮｇＲ−１」、「ＮｇＲ１」、および「ＮＧＲ」は、それぞれＮｏｇｏ受容体−１を意味する。
【００３１】
本明細書において、「治療上有効量」は、必要な投薬量で、また必要な期間内に所望の治療結果を達成するのに有効な量を意味する。治療結果は、例えば、症状の緩和、生存期間の延長、運動性の改善などであろう。治療結果は、「治癒」である必要はない。
【００３２】
本明細書において、「予防上有効量」は、必要な投薬量で、また必要な期間内に所望の予防結果を達成するのに有効な量を意味する。一般的に、予防投与量は、疾患の前か、その初期段階で被験体に使用されるため、予防上有効量は、治療上有効量よりも少ない。
【００３３】
本明細書において、「ポリヌクレオチド」は、５’側および３’側の非翻訳配列、コード配列などを含む全長ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列、また核酸配列の断片、エピトープ、ドメイン、および変異体を含むことができる。ポリヌクレオチドは、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドから構成されていてよく、非修飾のＲＮＡもしくＤＮＡ、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい。例えば、ポリヌクレオチドは、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖領域および２本鎖領域が混ざっているＤＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、ならびに１本鎖領域および２本鎖領域が混ざっているＲＮＡ、ならびに、１本鎖であってもよいが、より典型的には、２本鎖、または１本鎖領域および２本鎖領域が混ざっているＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子から構成されていてよい。また、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡもしくはＲＮＡおよびＤＮＡの双方を含む３本鎖領域から構成されていてよい。ポリヌクレオチドは、１つ以上の修飾塩基、または安定性もしくはその他の理由で修飾されているＤＮＡ骨格またはＲＮＡ骨格を含んでいてもよい。「修飾された」塩基には、例えば、トリチル化塩基、およびイノシンなどの特殊な塩基が含まれる。ＤＮＡおよびＲＮＡに対し多様な修飾を作出することができため、「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的、または代謝的に修飾されている型も包含する。
【００３４】
本発明において、ポリペプチドは、ペプチド結合、または、例えばペプチドアイソスターなどの修飾ペプチド結合によって互いに結合しているアミノ酸から構成されていてよく、２０種類の遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸（例えば、非天然型アミノ酸）を含んでいてよい。本発明のポリペプチドは、翻訳後プロセシングなど、天然のプロセスによって、または当技術分野において周知されている化学修飾法によって修飾することができる。このような修飾については、基本書およびより詳しいモノグラフ、ならびに大量の研究文献に十分に記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、アミノ末端、およびカルボキシ末端など、ペプチド中の如何なる場所にも存在することができる。当然のことながら、同じ種類の修飾が、所定のポリペプチド中のいくつかの部位において同一程度または異なった程度に存在しうる。また、所定のポリペプチドは、多くの種類の修飾を含むことができる。ポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として分岐させることができ、分岐の有無に関わらず、環状であってもよい。環状、分岐状、および分岐環状のポリペプチドは、翻訳後の天然のプロセシングによって得ることができ、または、合成法によって作出することも可能である。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環状化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレン酸化、硫酸化、タンパク質への転移ＲＮＡによるアミノ酸付加、例えばアルギニン化、およびユビキチン化などがある（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、第２版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎら、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐｇｓ．１−１２（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら、Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎら、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ６６３：４８−６２（１９９２）参照）。
【００３５】
本発明のＮｇＲ１アンタゴニストについて言う場合、「断片」、「変異体」、「誘導体」、および「類似体」という用語は、ＮｇＲ１活性を阻害する、少なくとも一部の能力を保持しているアンタゴニスト分子を含む。本明細書記載のＮｇＲ１アンタゴニストは、ＮｇＲ１アンタゴニストがその機能を果たす限り、制限されないが、断片、変異体、または誘導体であってもよい。本発明の可溶型ＮｇＲ１ポリペプチドには、ＮｇＲ１のタンパク質分解による断片、欠失断片、および、特に、動物に送達されたときに、より簡単に作用部位に到達する断片などがある。ポリペプチド断片は、さらに、直線状エピトープおよび三次元エピトープなど、天然型ポリペプチドの抗原エピトープまたは免疫原性エピトープを含む、ポリペプチドの任意の部位であってもよい。本発明の可溶型ＮｇＲ１ポリペプチドには、上記したような断片などの変異ＮｇＲ１領域を含むことができ、およびアミノ酸の置換、欠失、または挿入によって変化したアミノ酸配列をもつポリペプチドを含むこともできる。変異体は、対立遺伝子変異体などの自然に生じる場合がある。「対立遺伝子変異体」とは、ある生物の染色体上にある所定の遺伝子座を占める遺伝子の別の型を意味する。Ｇｅｎｅｓ  ＩＩ、Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８５）。非天然型の変異体は、当技術分野において既知の変異誘発法を用いて産生することができる。可溶型ＮｇＲ１ポリペプチドは、保存型または非保存型のアミノ酸置換、欠失、または付加を含むことができる。本発明のＮｇＲ１アンタゴニストには、誘導体分子を挙げることもできる。例えば、本発明の可溶型ＮｇＲ１ポリペプチドは、天然型のポリペプチドでは見られない付加的特徴を示すように改変されたＮｇＲ１領域を含むことも可能である。例えば、融合タンパク質およびタンパク質複合体などがある。
【００３６】
本発明において、「ポリペプチド断片」は、ＮｇＲ１ポリペプチドの短いアミノ酸配列を意味する。タンパク質断片は、「独立型」であっても、その断片が一部の領域を形成する、より大きなポリペプチドの内部に含まれるものであってもよい。本発明のポリペプチド断片の代表例は、例えば、長さが約５個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸、約１５個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸、約７０個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸、約９０個のアミノ酸、および約１００個のアミノ酸を含む断片などである。
【００３７】
一定の実施形態において、本明細書に開示されている治療法で使用するためのＮｇＲ１アンタゴニストは、「抗体」分子もしくは「免疫グロブリン」分子、またはその免疫特異的断片であり、例えば、天然の抗体もしくは免疫グロブリン分子、または人為的に改変された抗体分子、もしくは抗体分子と同様に抗原に結合する断片などである。「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、本明細書では互換的に使用される。抗体または免疫グロブリンは、少なくとも、重鎖の可変ドメインを含み、通常は、重鎖および軽鎖の少なくとも可変ドメインを含む。脊椎動物系における基本的な免疫グロブリン構造は比較的よく分かっている。例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）参照。
【００３８】
後により詳しく検討するように、「免疫グロブリン」という用語は、生化学的に区別することができる５つの広義のクラスを含む。５つのクラスすべてが、明らかに本発明の範囲に含まれるが、以下の考察は、一般的に、免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスを対象とする。ＩｇＧでは、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量が約２３，０００ダルトンの２つの同一の軽鎖ポリペプチド、および分子量が５３，０００〜７０，０００の２つの同一の重鎖ポリペプチドを含んでいる。この４つの鎖は、典型的には、ジスルフィド結合によって結合して、軽鎖が重鎖を、「Ｙ」字の開口部から始まり、可変領域のところまで囲んでいる「Ｙ」字構造になる。
【００３９】
軽鎖も重鎖も、構造的および機能的に相同な領域に分けられる。「定常」および「可変」という用語は機能的に用いられている。これに関連して、当然ながら、軽鎖部位および重鎖部位の可変ドメイン（それぞれＶＬおよびＶＨ）が、抗原の認識および特異性を決定する。逆に、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖の定常部位（ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３）は、分泌、経胎盤移行、Ｆｃ受容体結合、補体結合など、重要な生物学的性質を付与する。慣例により、定常領域ドメインの番号は、抗体の抗原結合部位またはアミノ酸末端から離れるにしたがって数が多くなる。Ｎ末端部位は可変領域であり、Ｃ末端部位が定常領域となっている。すなわち、ＣＨ３ドメインおよびＣＬドメインがそれぞれ、実際に、重鎖および軽鎖のカルボキシ末端を含んでいる。
【００４０】
軽鎖は、カッパまたはラムダ（κ、λ）のいずれかに分類される。各重鎖クラスには、κ軽鎖またはλ軽鎖のいずれか結合している。一般的に、軽鎖および重鎖は互いに共有結合しており、２つの重鎖の「尾」部位が、共有結合によるジスルフィド結合で互いに結合しているか、または、免疫グロブリンがハイブリドーマ、Ｂ細胞、または遺伝子操作された宿主細胞によって生成される場合には非共有結合によって互いに結合している。重鎖では、アミノ酸配列は、Ｙ字型構造の分岐末端のＮ末端から、各鎖の底部にあるＣ末端まで続いている。当業者は、重鎖が、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）に分類され、その中にいくつかのサブクラス（例えば、γ１〜γ４）があることを理解していよう。この鎖の性質によって、抗体の「クラス」が、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＥとして決定される。免疫グロブリンのサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１などは、特徴が十分に分かっており、機能的分化を付与することが知られている。当業者は、本開示を鑑みて、これらのクラスおよびアイソタイプのそれぞれの修飾型を容易に識別することができるため、それらも、本発明の範囲に含まれる。
【００４１】
上記したように、可変領域によって、抗体は、抗原上のエピトープを選択的に識別し、特異的に結合することができる。すなわち、抗体のＶＬドメインおよびＶＨドメインが結合して、三次元の抗原結合部位を規定する可変領域を形成する。この４つの鎖からなる抗体構造が、Ｙ字型の各アームの末端に存在する抗原結合部位を形成する。より具体的には、抗原結合部位は、ＶＨ鎖およびＶＬ鎖のそれぞれにある３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって規定されている。場合によっては、例えば、ラクダ種由来の一定の免疫グロブリン分子、またはラクダ免疫グロブリンに基づいて改変したものなどでは、完全な免疫グロブリン分子が、軽鎖を有さず、重鎖だけからなっている場合がある。例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ５５５：４４６−４４８（１９９３）参照。
【００４２】
天然型の抗体では、各抗原結合ドメインに存在する６つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、短く不連続なアミノ酸配列であって、水性環境におけるその三次元構造であると抗体が想定した通りに抗原結合ドメインを形成するよう特異的に位置が決められているアミノ酸配列である。抗原結合ドメインのそれ以外のアミノ酸は、「フレームワーク」領域と呼ばれ、より低い分子間変異を示す。フレームワーク領域は、主に、βシート構造を採り、ＣＤＲが、βシート構造を結合するループを形成し、場合によってはβシート構造の一部を形成する。このように、フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合的相互作用によって適正な方向にＣＤＲを位置づけるための足場を形成する働きをする。位置が決められたＣＤＲによって形成された抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープに相補的な表面を規定する。この相補的表面は、抗体が、その同種エピトープに非共有結合的に結合するのを促進する。ＣＤＲおよびフレームワーク領域をそれぞれ含むアミノ酸は正確に定義されているため、所定の重鎖または軽鎖の可変領域について、当業者によって簡単に同定することができる（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｋａｂａｔ，Ｅ．ら、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９８３）；ならびにＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７）参照。これらの文献は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
【００４３】
しかし、ラクダ種では、重鎖の可変領域はＶＨＨと呼ばれ、ＣＤＲ全体を形成している。ＶＨＨ可変領域と常套の抗体の可変領域（ＶＨ）との主な違いは、（ａ）ＶＨの軽鎖との接触面には、ＶＨＨの対応する領域よりも疎水性アミノ酸が多いこと、（ｂ）ＶＨＨではＣＤＲ３がより長いこと、および（ｃ）ＶＨＨでは、ＣＤＲ１とＣＤＲ３との間にジスルフィド結合が頻繁に存在することなどである。
【００４４】
一実施形態において、本発明の抗原結合分子は、抗体分子の少なくとも１つの重鎖または軽鎖のＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗原結合分子は、１つ以上の抗体分子の少なくとも２つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗原結合分子は、１つ以上の抗体分子の少なくとも３つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗原結合分子は、１つ以上の抗体分子の少なくとも４つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗原結合分子は、１つ以上の抗体分子の少なくとも５つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗原結合分子は、１つ以上の抗体分子の少なくとも６つのＣＤＲを含む。本発明の抗原結合分子に含まれうるＣＤＲを少なくとも１つ含む抗体分子の例は、当技術分野において知られており、例示的な分子が本明細書に記載されている。
【００４５】
本発明の方法において使用するための抗体またはその免疫特異的断片は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、またはキメラ抗体、単鎖抗体、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’および（Ｆａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖｓ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）などのエピトープ結合断片、ＶＬドメインまたＶＨドメインを含む断片、Ｆａｂ発現によって産生される断片、および抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書に開示されている結合分子に対する抗−Ｉｄ抗体）などであるが、これらに限定されない。ＳｃＦｖ分子は、当技術分野において知られており、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。本発明の免疫グロブリン分子または抗体分子は、如何なるタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスの免疫グロブリン分子であってもよい。
【００４６】
単鎖抗体などの抗体断片は、可変領域を単独で含むことも、以下の領域の全部または一部を合わせて含むことも可能である：ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン。また、可変領域と、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインのいずれかとの組み合わせを含む抗原結合断片も本発明に含まれる。本明細書で開示する診断法および治療法で使用するためのそれらの抗体または免疫特異的断片は、鳥類および哺乳動物などの動物に由来していてもよい。好ましくは、抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、またはニワトリの抗体である。別の実施形態において、可変領域は軟骨魚（例えば、サメ）に由来するものであってもよい。本明細書において、上記されているように、および例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８号に記載されているように、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンのライブラリーから単離された抗体、もしくは１つ以上のヒト免疫グロブリンについて遺伝子組換えされて、内因性免疫グロブリンを発現しなくなった動物から単離された抗体を含む。
【００４７】
本明細書において、「重鎖部位」という用語は、免疫グロブリンの重鎖から得られたアミノ酸配列を含む。重鎖部位を含むポリペプチドは、少なくとも１つのＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上部、中央部、および／または下部のヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはこれらの変異体または断片を含む。例えば、本発明で使用するための結合ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分、およびＣＨ２ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分、およびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖；またはＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含むことができる。別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。さらに、本発明で使用するための結合ポリペプチドは、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部分（例えば、ＣＨ２ドメインの全部または一部）を欠いていてもよい。さらに、上記に記載したように、これらのドメイン（例えば、重鎖部位）を修飾して、それらが、天然に存在する免疫グロブリン分子とはアミノ酸配列が異なるようにできることは、当業者にとって当然である。
【００４８】
本明細書に開示されている治療法で使用するための一定のＮｇＲ１アンタゴニスト抗体、またはその免疫特異的断片において、多量体の１つのポリペプチド鎖の重鎖部位は、多量体の別のポリペプチド鎖上にある重鎖部位と同一である。あるいは、本発明の方法で使用される重鎖部位含有単量体同士は同一ではない。例えば、各単量体は、異なった標的結合部位を含み、例えば、二重特異性抗体を形成することも可能である。
【００４９】
本明細書に開示されている診断法および治療法で使用するための結合ポリペプチドの重鎖部位は、異なった免疫グロブリン分子に由来していてもよい。例えば、ポリペプチドの重鎖部位は、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ１ドメイン、およびＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含むことができる。別の例では、重鎖部位は、一部がＩｇＧ１分子に由来し、一部がＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含むこともできる。別の例では、重鎖部位は、一部がＩｇＧ１分子に由来し、一部がＩｇＧ４分子に由来するキメラヒンジを含むこともできる。
【００５０】
本明細書において、「軽鎖部位」という用語は、免疫グロブリンの軽鎖に由来するアミノ酸配列を含む。好ましくは、軽鎖部位は、少なくとも１つのＶＬドメインまたはＣＬドメインを含む。
【００５１】
ある免疫グロブリンに由来するポリペプチド（例えば、免疫グロブリンの重鎖部位または軽鎖部位）の非天然型変異体をコードする単離核酸分子は、免疫グロブリンのヌクレオチド配列に１個以上のヌクレオチドの置換、付加、または欠失を導入して、それにコードされているタンパク質に１つ以上のアミノ酸の置換、付加、または欠失が導入されるようにすることによって作出することができる。突然変異は、部位特異的変異誘発法およびＰＣＲによる変異誘発法などの標準的な技術によって導入することができる。好ましくは、１つ以上の非必須のアミノ酸残基で保存的なアミノ酸置換を行う。
【００５２】
本明細書に開示されている治療法で使用するための抗体またはその免疫特異的断片を、本発明のポリペプチドに対する結合親和性の点から説明または特定することもできる。好適な結合親和性は、解離定数すなわちＫｄが５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍよりも小さいものを含む。
【００５３】
本明細書に開示されている治療法で使用するための抗体またはその免疫特異的断片は、本明細書に記載されているようなＮｇＲ１のアンタゴニストとして作用する。例えば、本発明の方法において使用される抗体はアンタゴニストとして機能して、ＮｇＲ１ポリペプチドの抑制活性を遮断または阻害することができる。
【００５４】
本明細書において、「キメラ抗体」という用語は、免疫反応性領域または部位が、第１種から得られ、定常領域（本発明に従って元のままであるか、一部であるか、修飾されている場合がある）が第２の種から得られる任意の抗体を意味すると考えられる。好適な実施形態において、標的結合領域または部位は、非ヒト（例えば、マウスまたは霊長類）源に由来し、定常領域がヒトに由来する。
【００５５】
本明細書において、「改変抗体」という用語は、重鎖および軽鎖のどちらか、またはその両方における可変ドメインが、既知の特異性をもつ抗体に由来する１つ以上のＣＤＲの少なくとも部分的な置換、ならびに必要であれば、フレームワーク領域の部分置換および配列変異によって改変されている抗体を意味する。ＣＤＲは、フレームワーク領域が由来する抗体と同じクラスまたは同じサブクラスの抗体から得ることができるが、ＣＤＲは、異なったクラスの抗体、好ましくは、異なった種から得られた抗体に由来することが想定されている。既知の特異性をもつ非ヒト抗体に由来する１つ以上の「ドナー」ＣＤＲが、ヒトの重鎖または軽鎖のフレームワーク領域に移植されている改変抗体を、本明細書では「ヒト化抗体」と呼ぶ。ある可変ドメインの抗原結合能力を別の可変ドメインに移すためには、すべてのＣＤＲを、ドナーである可変領域の完全長ＣＤＲと置換する必要はない場合がある。むしろ、標的結合部位の活性を維持するのに必要な残基を移行させる必要がある場合がある。例えば、米国特許第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号、および第６，１８０，３７０号に記載されている説明を考えると、機能的な改変抗体またはヒト化抗体を得ることは、日常的な実験を行うことによって、または試行錯誤による試験によって当業者が十分に行いうることである。
【００５６】
本明細書において、「結合した」、「融合した」、または「融合」という用語は互換的に使用される。これらの用語は、２つ以上の要素または成分を、化学的結合または組換え手段など何らかの方法によって一緒につなげることを意味する。「インフレーム融合」は、２つ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を繋げて、元のＯＲＦの正しい読み枠を維持するやり方で、連続したより長いＯＲＦを形成することを意味する。したがって、得られた組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦによってコードされているポリペプチドに相当する２つ以上のセグメントを含む単一のタンパク質である（このようなセグメントは、通常、自然ではそのようなつながり方をしていない）。この読み枠は、融合されたセグメント全部を通して連続するようになっているが、セグメントは、例えば、インフレームのリンカー配列によって物理的または空間的に分離されていてもよい。
【００５７】
ポリペプチドに関連して、「直鎖配列」または「配列」は、ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシ末端に向かって並んでいるアミノ酸の順番であり、そこでは、配列内で互いに隣り合う残基が、ポリペプチドの一次構造内で連続している。
【００５８】
本明細書において「発現」という用語は、遺伝子が、例えば、ＲＮＡまたはポリペプチドなどの生化学物質を生み出すプロセスを意味する。プロセスは、遺伝子が細胞内で機能する存在であることを示すことを含み、遺伝子ノックダウン、ならびに一過性発現および安定的発現などがあるが、これらに限定されない。プロセスは、遺伝子をメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、またはその他のＲＮＡ産物に転写すること、およびこのようなｍＲＮＡをポリペプチドに翻訳することを含むが、これらに限定されない。最終的な所望の産物が生化学物質である場合には、発現には、その生化学物質および任意の前駆体を作出することを含む。
【００５９】
「被験体」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」は、診断、予後、または治療が望まれる任意の被験体、特に哺乳動物の被験体を意味する。哺乳動物被験体は、ヒト、家庭で飼われている動物、農場で飼われている動物、動物園の動物、スポーツ用の動物、ペット用の動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、雌牛など；類人猿、サル、オランウータン、およびチンパンジーなどの霊長類；イヌおよびオオカミなどのイヌ科動物；ネコ、ライオン、およびトラなどのネコ科動物；ウマ、ロバ、およびシマウマなどのウマ科動物；ウシ、ブタ、およびヒツジなどの食用動物；シカおよびキリンなどの有蹄動物；マウス、ラット、ハムスター、およびモルモットなどの齧歯動物；などであるが、これらに限定されない。一定の実施形態において、哺乳動物はヒト患者である。
【００６０】
「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」という用語は、ｓｉＲＮＡによって遺伝子発現をなくすこと、または低減することを意味する。これは、その二重鎖領域が、なくされる遺伝子の配列に相同なｓｉＲＮＡによって開始される、動物および植物における配列特異的な転写後の遺伝子サイレンシングのプロセスである。この遺伝子は、その生物について内因性または外因性であってもよく、染色体に組み込まれても、ゲノムに組み込まれない形質転換用ベクターに存在していてもよい。遺伝子の発現は、完全に、または部分的に阻害されていてよい。また、ＲＮＡｉは、標的ＲＮＡの機能を阻害すると考えられるが、標的ＲＮＡの機能は完全または部分的であってよい。
ＮｇＲ１
本発明は、ＮｇＲ１のアンタゴニストが、乏突起膠細胞の生存を促進させることによって、それらの数を増加させるという発見に基づいている。
【００６１】
ラットのＮｇＲ１ポリペプチドを以下の配列番号：１に示す。
【００６２】
全長ラット（配列番号：１）：
ＭＫＲＡＳＳＧＧＳＲＬＬＡＷＶＬＷＬＱＡＷＲＶＡＴＰＣＰＧＡＣＶＣＹＮＥＰＫＶＴＴＳＣＰＱＱＧＬＱＡＶＰＴＧＩＰＡＳＳＱＲＩＦＬＨＧＮＲＩＳＨＶＰＡＡＳＦＱＳＣＲＮＬＴＩＬＷＬＨＳＮＡＬＡＲＩＤＡＡＡＦＴＧＬＴＬＬＥＱＬＤＬＳＤＮＡＱＬＨＶＶＤＰＴＴＦＨＧＬＧＨＬＨＴＬＨＬＤＲＣＧＬＲＥＬＧＰＧＬＦＲＧＬＡＡＬＱＹＬＹＬＱＤＮＮＬＱＡＬＰＤＮＴＦＲＤＬＧＮＬＴＨＬＦＬＨＧＮＲＩＰＳＶＰＥＨＡＦＲＧＬＨＳＬＤＲＬＬＬＨＱＮＨＶＡＲＶＨＰＨＡＦＲＤＬＧＲＬＭＴＬＹＬＦＡＮＮＬＳＭＬＰＡＥＶＬＭＰＬＲＳＬＱＹＬＲＬＮＤＮＰＷＶＣＤＣＲＡＲＰＬＷＡＷＬＱＫＦＲＧＳＳＳＥＶＰＣＮＬＰＱＲＬＡＤＲＤＬＫＲＬＡＡＳＤＬＥＧＣＡＶＡＳＧＰＦＲＰＩＱＴＳＱＬＴＤＥＥＬＬＳＬＰＫＣＣＱＰＤＡＡＤＫＡＳＶＬＥＰＧＲＰＡＳＡＧＮＡＬＫＧＲＶＰＰＧＤＴＰＰＧＮＧＳＧＰＲＨＩＮＤＳＰＦＧＴＬＰＳＳＡＥＰＰＬＴＡＬＲＰＧＧＳＥＰＰＧＬＰＴＴＧＰＲＲＲＰＧＣＳＲＫＮＲＴＲＳＨＣＲＬＧＱＡＧＳＧＡＳＧＴＧＤＡＥＧＳＧＡＬＰＡＬＡＣＳＬＡＰＬＧＬＡＬＶＬＷＴＶＬＧＰＣ
ヒトのＮｇＲ１ポリペプチドを以下の配列番号：２に示す。
【００６３】
全長ヒト（配列番号：２）：
ＭＫＲＡＳＡＧＧＳＲＬＬＡＷＶＬＷＬＱＡＷＱＶＡＡＰＣＰＧＡＣＶＣＹＮＥＰＫＶＴＴＳＣＰＱＱＧＬＱＡＶＰＶＧＩＰＡＡＳＱＲＩＦＬＨＧＮＲＩＳＨＶＰＡＡＳＦＲＡＣＲＮＬＴＩＬＷＬＨＳＮＶＬＡＲＩＤＡＡＡＦＴＧＬＡＬＬＥＱＬＤＬＳＤＮＡＱＬＲＳＶＤＰＡＴＦＨＧＬＧＲＬＨＴＬＨＬＤＲＣＧＬＱＥＬＧＰＧＬＦＲＧＬＡＡＬＱＹＬＹＬＱＤＮＡＬＱＡＬＰＤＤＴＦＲＤＬＧＮＬＴＨＬＦＬＨＧＮＲＩＳＳＶＰＥＲＡＦＲＧＬＨＳＬＤＲＬＬＬＨＱＮＲＶＡＨＶＨＰＨＡＦＲＤＬＧＲＬＭＴＬＹＬＦＡＮＮＬＳＡＬＰＴＥＡＬＡＰＬＲＡＬＱＹＬＲＬＮＤＮＰＷＶＣＤＣＲＡＲＰＬＷＡＷＬＱＫＦＲＧＳＳＳＥＶＰＣＳＬＰＱＲＬＡＧＲＤＬＫＲＬＡＡＮＤＬＱＧＣＡＶＡＴＧＰＹＨＰＩＷＴＧＲＡＴＤＥＥＰＬＧＬＰＫＣＣＱＰＤＡＡＤＫＡＳＶＬＥＰＧＲＰＡＳＡＧＮＡＬＫＧＲＶＰＰＧＤＳＰＰＧＮＧＳＧＰＲＨＩＮＤＳＰＦＧＴＬＰＧＳＡＥＰＰＬＴＡＶＲＰＥＧＳＥＰＰＧＦＰＴＳＧＰＲＲＲＰＧＣＳＲＫＮＲＴＲＳＨＣＲＬＧＱＡＧＳＧＧＧＧＴＧＤＳＥＧＳＧＡＬＰＳＬＴＣＳＬＴＰＬＧＬＡＬＶＬＷＴＶＬＧＰＣ
マウスのＮｇＲ１ポリペプチドを以下の配列番号：３に示す。
【００６４】
全長マウス（配列番号：３）：
ＭＫＲＡＳＳＧＧＳＲＬＬＡＷＶＬＷＬＱＡＷＲＶＡＴＰＣＰＧＡＣＶＣＹＮＥＰＫＶＴΓＳＣＰＱＱＧＬＱＡＶＰＴＧＩＰＡＳＳＱＲＩＦＬＨＧＮＲＩＳＨＶＰＡＡＳＦＱＳＣＲＮＬＴＩＬＷＬＨＳＮＡＬＡＲＩＤＡＡＡＦＴＧＬＴＬＬＥＱＬＤＬＳＤＮＡＱＬＨＶＶＤＰＴＴＦＨＧＬＧＨＬＨＴＬＨＬＤＲＣＧＬＲＥＬＧＰＧＬＦＲＧＬＡＡＬＱＹＬＶＬＱＤＮＮＬＱＡＬＰＤＮＴＦＲＤＬＧＮＬＴＨＬＦＬＨＧＮＲＩＰＳＶＰＥＨＡＦＲＧＬＨＳＬＤＲＬＬＬＨＱＮＨＶＡＲＶＨＰＨＡＦＲＤＬＧＲＬＭＴＬＹＬＦＡＮＮＬＳＭＬＰＡＥＶＬＭＰＬＲＳＬＱＹＬＲＬＮＤＮＰＷＶＣＤＣＲＡＲＰＬＷＡＷＬＱＫＦＲＧＳＳＳＥＶＰＣＮＬＰＱＲＬＡＤＲＤＬＫＲＬＡＡＳＤＬＥＧＣＡＶＡＳＧＰＦＲＰＩＱＴＳＱＬＴＤＥＥＬＬＳＬＰＫＣＣＱＰＤＡＡＤＫＡＳＶＬＥＰＧＲＰＡＳＡＧＮＡＬＫＧＲＶＰＰＧＤＴＰＰＧＮＧＳＧＰＲＨＩＮＤＳＰＦＧＴＬＰＳＳＡＥＰＰＬＴＡＬＲＰＧＧＳＥＰＰＧＬＰＴＴＧＰＲＲＲＰＧＣＳＲＫＮＲＴＲＳＨＣＲＬＧＱＡＧＳＧＡＳＧＴＧＤＡＥＧＳＧＡＬＰＡＬＡＣＳＬＡＰＬＧＬＡＬＶＬＷＴＶＬＧＰＣ
全長のＮｏｇｏ受容体−１は、シグナル配列、Ｎ末端領域（ＮＴ）、８つのロイシンリッチ反復配列（ＬＲＲ）、ＬＲＲＣＴ領域（８つのロイシンリッチ反復のＣ末端側にあるロイシンリッチ反復配列ドメイン）、Ｃ末端領域（ＣＴ）、およびＧＰＩアンカーからなる。
【００６５】
本明細書において用いられるＮｇＲ１ドメインの表示は、以下の通りに定義されている。
【００６６】
表１．ＮｇＲ１ドメインの例
【００６７】
【表１】
2009538282.tif 000002
ＮｇＲ１のアンタゴニストを用いた治療法
本発明の一実施形態は、脱髄を伴う疾患、障害、または損傷、例えば脊髄損傷を治療する方法であって、可溶型ＮｇＲ１ポリペプチド、ＮｇＲ１抗体、およびＮｇＲ１アンタゴニストポリヌクレオチドからなる群から選択された有効量のＮｇＲ１アンタゴニストを動物に投与することを含むか、本質的にそのことからなるか、またはそのことからなる方法を提供する。
【００６８】
さらに、本発明は、哺乳動物におけるニューロンの脱髄を低減する方法であって、可溶型ＮｇＲ１ポリペプチド、ＮｇＲ１抗体、ＮｇＲ１アンタゴニストポリヌクレオチド、ＮｇＲ１アプタマー、および前記ＮｇＲ１アンタゴニストの２つ以上の組み合わせからなる群から選択された治療上有効量のＮｇＲ１アンタゴニストを投与することを含むか、本質的にそのことからなるか、またはそのことからなる方法を目的とする。
【００６９】
本発明の更なる実施形態は、乏突起膠細胞死を伴う疾患、障害、または損傷、例えば脊髄損傷、多発性硬化症、ペリツェウス・メルツバッハー病、またはグロボイド細胞白質ジストロフィー（クラッベ病）を治療する方法であって、可溶型ＮｇＲ１ポリペプチド、ＮｇＲ１抗体、ＮｇＲ１アンタゴニストポリヌクレオチド、ＮｇＲ１アプタマー、および前記ＮｇＲ１アンタゴニストの２つ以上の組み合わせからなる群から選択された有効量のＮｇＲ１アンタゴニストを動物に投与することを含むか、本質的にそのことからなるか、またはそのことからなる方法を提供する。
【００７０】
本発明の別の態様は、哺乳動物の乏突起膠細胞の生存を促進させる方法であって、可溶型ＮｇＲ１ポリペプチド、ＮｇＲ１抗体、ＮｇＲ１アンタゴニストポリヌクレオチド、ＮｇＲ１アプタマー、およびこれらを組み合わせからなる群から選択される治療上有効量のＮｇＲ１アンタゴニストを投与することを含むか、本質的にそのことからなるか、またはそのことからなる方法を含む。
【００７１】
例えば、可溶型ＮｇＲ１ポリペプチド、ＮｇＲ１抗体、ＮｇＲ１アンタゴニストポリヌクレオチド、またはＮｇＲ１アプタマーなど、本明細書に開示された治療法で使用されるＮｇＲ１アンタゴニストは、軸索の脱髄を停止、低減、予防、または阻害する治療薬として調製され、使用され得る。更に、本明細書に開示された治療法で使用されるＮｇＲ１アンタゴニストは、乏突起膠細胞死を停止、低減、予防、または阻害する治療薬として調製され、使用され得る。
【００７２】
本発明の更なる実施形態は、乏突起膠細胞またはミエリンの破壊を伴う疾患、障害、または損傷（例えば、脊髄損傷）を治療するために乏突起膠細胞の生存を誘発する方法であって、疾患、障害、または損傷の部位またはその近傍で、髄鞘形成を促進するのに十分な量で投与することを含む方法を含む。
【００７３】
本発明の方法において、ＮｇＲ１アンタゴニストは、可溶型ＮｇＲ１ポリペプチド、ＮｇＲ１抗体、ＮｇＲ１アンタゴニストポリヌクレオチド、またはＮｇＲ１アプタマーを患者に直接投与することによって投与され得る。あるいは、特異的なＮｇＲ１アンタゴニストを産生する発現ベクターによって、ＮｇＲ１アンタゴニストを投与することができる。本発明の一定の実施形態において、ＮｇＲ１アンタゴニストは、（１）移植可能な宿主細胞を、例えば、ベクターなどのＮｇＲ１アンタゴニストを発現する核酸で形質転換またはトランスフェクトすること；および（２）形質転換された宿主細胞を、疾患、障害、または損傷の部位において、哺乳動物に移植することを含む治療法において投与される。例えば、形質転換された宿主細胞を、ＭＳの慢性病変部位に移植することができる。本発明のいくつかの実施形態において、移植可能な宿主細胞を哺乳動物から採取して、一時的に培養し、アンタゴニストをコードする単離核酸によって形質転換またはトランスフェクトし、細胞が由来したのと同じ哺乳動物に戻し移植することができる。この細胞は、それが移植される部位と同じ部位から採取することができるが、そうする必要があるわけではない。エクスビボ遺伝子治療としても知られる、このような実施形態は、一定の期間、作用部位に局在化されたアンタゴニストの連続的供給を提供することができる。
【００７４】
本発明の方法によって治療または改善することができる疾患または障害には、哺乳動物のニューロンの髄鞘形成異常または脱髄に関係する疾患、障害、または損傷などがある。すなわち、ニューロンを取り囲むミエリンが存在しないか、不完全であるか、適切に形成されていないか、または悪化している疾患または障害である。このような疾患には、再発寛解型、二次進行型、および一次進行型の多発性硬化症（ＭＳ）；進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中心髄鞘融解（ＣＰＭ）、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、ペリツェウス・メルツバッハー病（ＰＭＺ）、グロボイド細胞白質ジストロフィー（クラッベ病）、ウォーラー変性、視神経炎、および横断性脊髄炎などがあるが、これらに限定されない。
【００７５】
本発明の方法によって治療または改善することができる疾患または障害には、乏突起膠細胞の死に関係する疾患、障害、または損傷などがある。このような疾患には、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中心髄鞘融解（ＣＰＭ）、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、ペリツェウス・メルツバッハー病（ＰＭＺ）、グロボイド細胞白質ジストロフィー（クラッベ病）、およびウォーラー変性などがあるが、これらに限定されない。
【００７６】
本発明の方法によって治療または改善することができる疾患または障害には、神経変性性の疾患または障害などがある。このような疾患には、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、アルツハーマー病、およびパーキンソン病などがあるが、これらに限定されない。
【００７７】
本発明の方法によって治療または改善することができる、さらに別の疾患、障害、または損傷の例には、脊髄損傷、慢性の脊髄症もしくは神経根障害、外傷性脳損傷、運動ニューロン疾患、軸索の剪断、挫傷、麻痺、放射線照射後損傷もしくはその他化学療法の神経学的合併症、脳卒中、大きなラクナ（ｌａｃｕｎｅｓ）、中型から大型の血管閉塞、白質希薄化、急性虚血性視神経症、ビタミンＥ欠乏症（ビタミンＥ単独欠乏症候群、ＡＲ、バッセン・コーンツヴァイク症候群）、Ｂ１２、Ｂ６（ピリドキシン−ペラグラ）、チアミン、葉酸、ニコチン酸の欠乏症、マルキアファーヴァ・ビニャミ症候群、異染性白質ジストロフィー、三叉神経痛、ベル麻痺、または軸索の再生、再ミエリン化、または乏突起膠細胞の生存を必要とする神経損傷などがあるが、これらに限定されない。
可溶型ＮｇＲ１ポリペプチド
いくつかの実施形態は、本発明の方法で使用するための可溶型Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチドを提供する。本発明の方法で使用される可溶型Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチドは、ＮＴドメイン、８つのＬＲＲ、およびＬＲＲＣＴドメインを含み、シグナル配列および機能性ＧＰＩアンカーを持たない（すなわち、ＧＰＩアンカーが全くないか、細胞膜に効率的に結合する能力を持たないＧＰＩ）。上記表１には、ＮｇＲ１ポリペプチドのさまざまなドメインが記載されている。
【００７８】
いくつかの実施形態において、本発明の方法で使用するための可溶型Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチドは、異種性ＬＲＲを含む。本方法のいくつかの実施形態では、可溶型Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチドは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、または８個の異種性ＬＲＲを含む。異種性ＬＲＲとは、Ｎｏｇｏ受容体−１以外のタンパク質から得られたＬＲＲを意味する。異種性ＬＲＲを得ることができるタンパク質の例は、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ１．２）；Ｔ細胞活性化ロイシンリッチリピートタンパク質；デセオリン（ｄｅｃｅｏｒｉｎ）、乏突起膠細胞ミエリン糖タンパク質（ＯＭｇｐ）＋；インスリン様増殖因子結合タンパク質の酸不安定性サブユニットであるｓｌｉｔおよびｒｏｂｏ；およびｔｏｌｌ様受容体４である。
【００７９】
本発明の方法で使用するためのさらに別の可溶型ＮｇＲ１ポリペプチドは、本発明の方法で使用するための３１９アミノ酸の可溶型Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチド（可溶型Ｎｏｇｏ受容体−１  ３４４、ｓＮｏｇｏＲ１−３４４、またはｓＮｏｇｏＲ３４４）（配列番号：４および６の２６〜３４４番目の残基、または配列番号：６の２７〜３４４番目の残基）などである。いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の方法で使用するために、２８５アミノ酸の可溶型Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチド（可溶型Ｎｏｇｏ受容体−１  ３１０、ｓＮｏｇｏＲ１−３１０、またはｓＮｏｇｏＲ３１０）（配列番号：５および７の２６〜３４４番目の残基、または配列番号：７の２７〜３１０番目の残基）を提供する。
【００８０】
表２  ヒトおよびラットのＮｏｇｏ受容体−１ポリペプチドの配列
【００８１】
【表２Ａ】
2009538282.tif 000003
【００８２】
【表２Ｂ】
2009538282.tif 000004
本発明の方法で使用するためのさらに別の可溶型ＮｇＲ１ポリペプチドとして、アミノ酸置換を有する可溶型ＮｇＲ１ポリペプチドが挙げられる。この実施形態による、ポリペプチド断片に対する典型的なアミノ酸置換として、本発明のポリペプチド内の個々のシステイン残基を別のアミノ酸で置換することが挙げられる。任意の異種アミノ酸で、本発明のポリペプチドにおけるシステインを置換することができる。どのアミノ酸を使用するかは、例えば、ポリペプチド断片の立体構造に及ぼす置換の効果、ポリペプチド断片の電荷、またはポリペプチド断片の親水性など、いくつかの基準に応じて決まる。一定の実施形態において、システインを、ポリペプチドの三次元構造を変える可能性が最も低い低分子で非荷電のアミノ酸、例えば、アラニン、セリン、スレオニン、好ましくはアラニンで置換する。置換することができるシステイン残基は、Ｃ２６６、Ｃ３０９、Ｃ３３５、およびＣ３３６などであるが、これらに限定されない。ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドの改変によってこのような置換を行うことは、当業者の日常的な専門技術に含まれる。
【００８３】
本発明の一定の実施形態において、本発明の方法で可溶型Ｎｏｇｏ受容体−１ポリペプチドを使用して、乏突起膠細胞のアポトーシス死を阻害し、ニューロンの脱髄を減少させる。一定の実施形態において、ニューロンはＣＮＳニューロンである。
【００８４】
本明細書に記載した本発明の方法で使用するための可溶型ＮｇＲ１ポリペプチドは環状であってよい。可溶型ＮｇＲ１ポリペプチドを環状化すると、直鎖状ペプチドの立体構造上の自由度が低下するため、より構造的に制約された分子になる。ペプチドを環状化する多くの方法が当技術分野において知られており、例えば、ペプチドのＮ末端のアミノ酸残基とＣ末端のアミノ酸残基との間にアミド結合を形成させて行う、「骨格−骨格」環状化法がある。「骨格−骨格」環状化法は、２つのω−チオアミノ酸残基（例えば、システイン、ホモシステイン）の間にジスルフィド架橋を形成することを含む。本発明の一定の可溶型ＮｇＲ１ペプチドは、環状ＮｇＲ１ポリペプチドを形成するためにペプチドのＮ末端およびＣ末端を修飾したものを含む。このような修飾は、システイン残基に対する修飾、アセチル化システイン残基、ＮＨ２部分およびビオチンを有するシステイン残基などであるが、これらに限定されない。ペプチドを環状化する別の方法が、ＬｉおよびＲｏｌｌｅｒ．Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３：３２５−３４１（２００２）、および米国公開第２００５−０２６０６２６  Ａ１に記載されており、これらの文献は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
【００８５】
本明細書記載の配列番号：２のポリペプチドに、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一である、可溶型ＮｇＲ１ポリペプチドの対応断片も想定されている。
【００８６】
当技術分野において知られているように、２つのポリペプチド間の「配列同一性」は、一方のポリペプチドのアミノ酸配列を、他方のポリペプチドの配列と比較して決定される。本明細書で検討されている場合、任意の特定のポリペプチドが別のポリペプチドと少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一であるか否かは、例えば、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１）などであるが、これに限定されない方法、およびコンピュータプログラム／ソフトウェアを用いて決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列間でもっとも良好なセグメントを見つける。ＢＥＳＴＦＩＴまたは別の配列アラインメントプログラムを用いて、特定の配列が、本発明に記載された参照配列と、例えば９５％同一であるか否かを判定する場合、パラメータは、当然であるが、一致率が、参照ポリペプチド配列の全長にわたって計算され、相同性におけるギャップが、参照配列における総アミノ酸数の最大５％までは許容されるように設定される。
【００８７】
本発明の方法で使用するためのさらに可溶型ＮｇＲ１ポリペプチドとして、２種類以上の可溶型ＮｇＲ１ポリペプチドの任意に組み合わせを挙げることができる。
それらの抗体または免疫特異的断片
本発明の方法で使用するためのＮｇＲ１アンタゴニストには、ＮｇＲ１特異的抗体または抗原結合断片、変異体、または誘導体も含まれる。本明細書に記載された方法で使用される一定のアンタゴニスト抗体は、特異的または選択的に特定のＮｇＲ１ポリペプチド断片またはドメインに結合する。
【００８８】
一定の実施形態において、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、上記のＮｇＲ１または断片または変異体の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する。すなわち、無関係またはランダムなエピトープに結合するよりもより速やかにそのようなエピトープに結合する。または、上記した断片または変異体の少なくとも１つのエピトープに選択的に結合する。すなわち、関連するか、同様か、相同か、または類似したエピトープに結合するよりも迅速にそのようなエピトープに結合する。または、それ自体が、上記したＮｇＲ１または断片または変異体の一定のエピトープに特異的または選択的に結合する参照抗体の結合を競合的に阻害するか、または、上記したＮｇＲ１または断片または変異体の少なくとも１つのエピトープに、以下より少ない解離定数ＫＤを特徴とする親和性で結合する：約５×１０−２Ｍ、約１０−２Ｍ、約５×１０−３Ｍ、約１０−３Ｍ、約５×１０−４Ｍ、約１０−４Ｍ、約５×１０−５Ｍ、約１０−５Ｍ、約５×１０−６Ｍ、約１０−６Ｍ、約５×１０−７Ｍ、約１０−７Ｍ、約５×１０−８Ｍ、約１０−８Ｍ、約５×１０−９Ｍ、約１０−９Ｍ、約５×１０−１０Ｍ、約１０−１０Ｍ、約５×１０−１１Ｍ、約１０−１１Ｍ、約５×１０−１２Ｍ、約１０−１２Ｍ、約５×１０−１３Ｍ、約１０−１３Ｍ、約５×１０−１４Ｍ、約１０−１４Ｍ、約５×１０−１５Ｍ、または約１０−１５Ｍ。特定の態様において、抗体またはその断片は、マウスのポリペプチドまたはその断片と比較すると、ヒトＮｇＲ１ポリペプチド、またはその断片に優先的に結合する。
【００８９】
抗体の結合解離定数に関連して使用される場合、「約」という用語は、抗体の親和性を測定するために利用される方法に内在する変動の度合いを許容する。例えば、使用する器具の精度、測定する試料の数に基づく標準誤差、および四捨五入による誤差に応じて、「約１０−２Ｍ」という用語は、例えば、０．０５Ｍ〜０．００５Ｍを包含する場合がある。
【００９０】
具体的な実施形態において、本発明の抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、５×１０−２ｓｅｃ−１、１０−２ｓｅｃ−１、５×１０−３ｓｅｃ−１、または１０−３ｓｅｃ−１以下のオフ速度（ｏｆｆ  ｒａｔｅ：ｋ（ｏｆｆ））でＮｇＲ１ポリペプチド、またはその断片もしくは変異体に結合する。あるいは、本発明の抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、５×１０−４ｓｅｃ−１、１０−４ｓｅｃ−１、５×１０−５ｓｅｃ−１、１０−５ｓｅｃ−１、５×１０−６ｓｅｃ−１、または１０−６ｓｅｃ−１、５×１０−７ｓｅｃ−１、または１０−７ｓｅｃ−１以下のオフ速度（ｋ（ｏｆｆ））でＮｇＲ１ポリペプチド、またはその断片もしくは変異体に結合する。
【００９１】
別の実施形態において、本発明の抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１、５×１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１、１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１、または５×１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１以上のオン速度（ｏｎ  ｒａｔｅ：ｋ（ｏｎ））でＮｇＲ１ポリペプチド、またはその断片もしくは変異体に結合する。あるいは、本発明の抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１、５×１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１、１０６Ｍ−１ｓｅｃ−１、または５×１０６Ｍ−１ｓｅｃ−１、または５×１０７Ｍ−１ｓｅｃ−１以上のオン速度（ｋ（ｏｎ））でＮｇＲ１ポリペプチド、またはその断片もしくは変異体に結合する。
【００９２】
一実施形態において、本発明の方法で使用するためのＮｇＲ１アンタゴニストは、抗体分子、またはその免疫特異的断片である。特段の記載がない限り、本明細書において、抗体について「その断片」というのは、免疫特異的断片、すなわち、抗原特異的断片を意味する。一実施形態において、本発明の抗体は、二重特異性結合分子、結合ポリペプチド、または抗体であり、例えば、二重特異性抗体、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ドメイン欠失抗体、または１つよりも多いエピトープ、例えば、１つのよりも多い抗原、または同一抗原の１つよりも多いエピトープに対して結合特異性を有する融合タンパク質である。一実施形態において、二重特異性抗体は、ＮｇＲ１上の少なくとも１つのエピトープに特異的である少なくとも１つの結合ドメインを有する。二重特異性抗体は、ＮｇＲ１のエピトープに対して２つの標的結合ドメインを有し、別の標的に対して２つの標的結合ドメインを有する四価抗体であってもよい。すなわち、四価の二重特異性抗体は、それぞれの特異性に関しては二価であり得る。
【００９３】
本発明の一定の実施形態は、１つ以上の定常領域ドメインの少なくとも一部が欠失しているか、さもなければ、ほぼ同じ免疫原性をもつ完全な非改変抗体と比較して、低減されたエフェクター機能、非共有結合的に二量体化する能力、腫瘍部位に局在する能力、低減した血清半減期、または増加した血清半減期などという所望の生化学的特徴を提供するように改変されているアンタゴニスト抗体、またはその免疫特異的断片を投与することを含む。例えば、本明細書に記載された治療法で使用するための一定の抗体は、免疫グロブリン重鎖に類似したポリペプチド鎖を含むが、重鎖ドメインの１つ以上の少なくとも一部を失っているドメイン欠失抗体である。例えば、一定の抗体では、修飾抗体の定常領域の１つの全ドメインが削除される。例えば、ＣＨ２ドメインの全部または一部が削除される。
【００９４】
本明細書に記載されている治療法で使用するための一定のＮｇＲ１アンタゴニスト抗体またはその免疫特異的断片において、当技術分野において既知の技術を用いて、Ｆｃ部位を変異させてエフェクター機能を低下させることができる。例えば、定常領域の欠失または不活性化（点突然変異またはその他の方法による）は、循環する修飾抗体のＦｃ受容体結合を低減して、腫瘍の局在化を増大することができる。別の場合には、本発明と一致する定常領域の修飾は、補体結合を抑えて、血清の半減期を低減させ、結合されたサイトトキシンの非特異的会合を低減する場合がある。定常領域のなお別の修飾物を用いて、抗原特異性もしくは抗体の融通性の増加による局在化の促進を可能にするジスルフィド結合または多糖部分を修飾することができる。修飾物について得られた生理学的特徴、生体利用性、および他の生化学的作用、例えば、腫瘍の局在化、生体分布、および血清の半減期などは、過度な実験を要することなく、周知の免疫学的技術を用いて容易に測定および定量することができる。
【００９５】
本明細書に開示されている診断法および治療法において使用するための抗体またはその免疫特異的断片の修飾形態は、当技術分野において既知の技術を用いて、完全な前駆体または元の抗体から作製することができる。本明細書において技術の例をより詳しく検討する。
【００９６】
一定の実施形態において、本明細書に開示されている治療法で使用するためのＮｇＲ１アンタゴニスト抗体またはその免疫特異的断片の可変領域および定常領域はともに完全にヒトのものである。完全なヒト抗体は、当技術分野において既知であり、本明細書に記載されているような技術を用いて作製することができる。例えば、特異的抗原に対する完全なヒト抗体は、抗原投与に反応してそのような抗体を産生するよう修飾されているが、その内因性遺伝子座が無効化されているトランスジェニック動物にその抗原を投与することによって調製することができる。このような抗体を作製するために利用できる技術の例が、米国特許第６，１５０，５８４号；第６，４５８，５９２号；第６，４２０，１４０号に記載されている。別の技術も、当技術分野において知られている。同様に、本明細書の別所にてより詳細に記載されているように、さまざまなディスプレイ技術、例えば、ファージディスプレイまたは別のウイルスディスプレイシステムによって、完全なヒト抗体を作出することができる。
【００９７】
本明細書に開示されている診断法および治療法において使用するためのＮｇＲ１アンタゴニスト抗体またはその免疫特異的断片は、当技術分野において既知の技術を用いて作製または製造することができる。一定の実施形態において、抗体分子またはその断片は、「組換えによって作製」される、すなわち、組換えＤＮＡ技術を用いて作製される。抗体分子またはその断片を作製するための技術の例は、本明細書の別所でより詳細に検討されている。
【００９８】
本明細書に開示されている治療法で使用するためのＮｇＲ１アンタゴニスト抗体またはその免疫特異的断片には、例えば、共有結合が、抗体がその同族のエピトープに特異的に結合するのを妨げないように、任意のタイプの分子を抗体に共有結合させることによって修飾されている誘導体も含まれる。限定されないが、例えば、抗体の誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／封鎖基による誘導体化、タンパク質分解による切断、細胞リガンドまたはその他のタンパク質への結合などによって修飾された抗体が含まれる。特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などであるが、これらに限定されない既知の技術によって、数多くの化学修飾法のいずれかを実施することができる。さらに、誘導体は、１つ以上の非従来型のアミノ酸を含むことも可能である。
【００９９】
好適な実施形態において、本明細書に開示されている治療法で使用するためのＮｇＲ１アンタゴニスト抗体またはその免疫特異的断片は、治療される動物、例えば、ヒトにおいて有害な免疫反応を誘発することはない。一実施形態において、本明細書に開示されている治療法で使用するためのアンタゴニスト抗体またはその免疫特異的断片は、当技術分野において既知の技術を用いて、それらの免疫原性を低下させるよう修飾することができる。例えば、抗体をヒト化、霊長類化、脱免役することができ、あるいは、キメラ抗体を作製することができる。これらのタイプの抗体は、元の抗体の抗原結合特性を保持、または実質的に保持しているが、ヒトにおいて免疫原性がより低い非ヒト抗体、典型的には、マウスまたは霊長類の抗体に由来する。これは、（ａ）完全な非ヒト可変ドメインをヒト定常領域上に移植して、キメラ抗体を生成させること、（ｂ）重要なフレームワーク残基を保持するまたはしないに関わらず、１つ以上の非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一部をヒトフレームワークおよび定常領域に移植すること、または（ｃ）完全な非ヒト可変ドメインを移植するが、表面残基の置換によって、ヒト様切片でそれらを「覆い隠す」ことなど、さまざまな方法により行うことができる。このような方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：６５−９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２５：４８９−４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．３７：１６９−２１７（１９９４），および米国特許第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号、および第６，１９０，３７０，号に開示されている。また、これらはすべて、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０１００】
脱免疫も、抗体の免疫原性を低下させるために利用することができる。本明細書において、「脱免疫」という用語は、Ｔ細胞エピトープを修飾するために抗体を変えることを含む（例えば、ＷＯ９８５２９７６Ａ１、ＷＯ００３４３１７Ａ２参照）。例えば、最初の抗体のＶＨおよびＶＬの配列を解析して、配列内の相補性決定領域（ＣＤＲ）および他の主な残基に関してエピトープの位置を示す、各Ｖ領域のヒトＴ細胞エピトープ「マップ」。最終的な抗体の活性を変化させるリスクが低い別のアミノ酸置換を確認するために、Ｔ細胞エピトープマップから個々のＴ細胞エピトープを解析する。アミノ酸置換の組み合わせを含む、さまざまな代替的なＶＨおよびＶＬの配列を設計し、その後、これらの配列を、さまざまな結合ポリペプチド、例えば、本明細書に開示されている診断法および治療法において使用するためのＮｇＲ１アンタゴニスト抗体、またはその免疫特異的断片に取り込ませ、次に、これらの機能をテストする。典型的には、１２〜２４個の変異抗体を作製して調べる。そして、完全な抗体を産生させるために、修飾されたＶ領域およびヒトＣ領域を含む完全長の重鎖および軽鎖の遺伝子を、発現ベクター内にクローニングし、この結果生じたプラスミドを細胞株に導入する。そして、抗体を適当な生化学的および生物学的なアッセイ法で比較して、最適な変異体を確認する。
【０１０１】
本発明の方法で使用するためのＮｇＲ１アンタゴニスト抗体またはその断片は、当技術分野において既知の適当な方法によって作出することができる。当技術分野において周知されているさまざまな方法によって、ポリクローナル抗体を作出することができる。例えば、免疫特異的断片を、ウサギ、マウス、ラットなどであるが、これらに限定されない多様な宿主動物に投与して、抗原に特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導することができる。免疫学的反応を増大するために、宿主の種に応じて、さまざまなアジュバントを用いることができ、アジュバントは、フロインド（完全または不完全）、水酸化アルミニウムなどのゲル状鉱物、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・パルバムなどの潜在的に有用なヒトアジュバントなどであるが、これらに限定されない。このようなアジュバントも、当技術分野において周知されている。
【０１０２】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え体、およびファージディスプレイ技術、またはこれらの組み合わせなど、当技術分野において既知のさまざまな技術を用いて調製することができる。例えば、当技術分野において既知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．（１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−ＣｅＩｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，５６３−６８１（１９８１）（これらは、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。）に記載されているようなハイブリドーマ技術を用いて、モノクローナル抗体を産生することができる。本明細書において、「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術によって産生される抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、真核生物、原核生物、またはファージのクローンなど、単一のクローンに由来する抗体を意味するのであって、それが産生される方法を意味するのではない。したがって、「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術によって産生される抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え体、およびファージディスプレイ技術を使用するなど、さまざまな技術を用いて調製することができる。
【０１０３】
一例において、当技術分野において既知のプロトコールを用いて、関連抗原（例えば、精製されたＮｇＲ１抗原、またはこのような抗原を含む細胞もしくは細胞抽出物）およびアジュバントを複数回皮下または腹腔内に注射することにより、哺乳動物において抗体を生じさせる。この免疫は、典型的には、活性化された脾細胞またはリンパ球から抗原反応性抗体を産生させることを含む免疫反応を誘発する。得られた抗体を動物の血清から回収して、ポリクローナル調製物を提供することができるが、個々のリンパ球を脾臓、リンパ節、または末梢血から単離して、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の均一な調製物を提供することがしばしば望ましい。好ましくは、リンパ球を脾臓から得る。
【０１０４】
この周知のプロセス（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５））では、抗原を注入された哺乳動物に由来する比較的短命すなわち死すべき運命にあるリンパ球を、不死の腫瘍細胞株（例えば、ミエローマ細胞株）と融合させて、不死であり、かつＢ細胞の遺伝子的にコードされた抗体を産生することができるハイブリッド細胞すなわち「ハイブリドーマ」を産生することができる。得られたハイブリッドを、選抜、希釈、および再増殖によって単一の遺伝子系統に分離し、各々の個々の系統が、単一の抗体を形成する特異的遺伝子を含むようにする。これらは、所望の抗原に対して均一な抗体を産生するため、これらの純粋な遺伝的起源に準拠して「モノクローナル」と呼ばれている。
【０１０５】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、未融合の親ミエローマ細胞の増殖または生存を阻害する１種類以上の物質を好ましくは含む適当な培養培地に播種して増殖させる。当業者には、ハイブリドーマの形成、選抜、および増殖を行うための細胞株および培地がいくつかの供給源から市販されており、また、標準化されたプロトコールが十分に確立されていることが理解されよう。通常、ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地をアッセイして、所望の抗原に対するモノクローナル抗体の産生を調べる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈殿、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、または酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロアッセイによって決定することができる。所望の特異性、親和性、および／または活性をもつ抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、そのクローンを限界希釈法によってサブクローニングし、標準的な方法によって増殖させることができる（（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．５９−１０３（１９８６））。さらに、サブクローンから分泌されるモノクローナル抗体を、例えば、タンパク質−Ａ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、または親和性クロマトグラフィなど通常の精製法によって、培養培地、腹水、または血清から分離できることも理解されよう。
【０１０６】
既知の技術によって、特異的エピトープを認識する抗体断片を作製することができる。例えば、Ｆａｂ断片およびＦ（ａｂ’）２断片は、パパイン（Ｆａｂ断片を産出する）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を産出する）などの酵素を用いて免疫グロブリン分子をタンパク質切断することによって産出することができる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、可変領域、軽鎖定常領域、および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。
【０１０７】
また、当業者には、抗体または抗体断片（例えば、抗原結合部位）をコードするＤＮＡも、抗体ファージライブラリーから得ることができることも理解されよう。特に、このようなファージを利用して、（例えば、ヒトまたはマウスの）レパートリー抗体ライブラリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリーから発現される抗原結合ドメインを提示することができる。目的とする抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原、例えば、標識された抗原、または固相表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉されている抗原を用いて選択または確認することができる。これらの方法で使用されるファージは、通常、ファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質またはファージ遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のどちらかに組換えによって融合されたＦａｂ、Ｆｖ、またはジスルフィド安定化Ｆｖの抗体ドメインを有するファージから発現されるｆｄ結合ドメインおよびＭ１３結合ドメインなどの繊維状ファージである。これらの方法の例が、例えば、ＥＰ  ３６８  ６８４  Ｂ１；米国特許第５，９６９，１０８号、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．およびＣｈａｍｅｓ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２１：３７１（２０００）；Ｎａｇｙら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：８０１（２００２）；Ｈｕｉｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．ＵＳＡ  ９５：２６８２（２００１）；Ｌｕｉら、Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．３１５：１０６３（２００２）に記載されており、これらは、それぞれが参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの刊行物（例えば、（例えば、Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２））には、鎖シャフリングによる高親和性ヒト抗体の産生、ならびに大規模なファージライブラリーを構築するための方策として組み合わせ感染法（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）およびインビボ組み換え法がすでに記載されている。別の実施形態において、リボゾームディスプレイ法を用いて、提示用のプラットホームとしてバクテリオファージに代わるものとすることができる（例えば、Ｈａｎｅｓら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１２８７（２０００）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：３７５０（２００１）；またはＩｒｖｉｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８：３１（２００１）参照）。さらに別の実施形態において、抗体について細胞表面ライブラリーをスクリーニングすることができる（Ｂｏｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１０７０１（２０００）；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４３：２１１（２０００））。このような方法は、モノクローナル抗体を単離およびその後クローニングするための伝統的なハイブリドーマ技術の代替法を提供する。
【０１０８】
ファージディスプレイ法では、機能的抗体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を担持するファージ粒子の表面に提示される。特に、ＶＬ領域およびＶＨ領域をコードするＤＮＡ配列を、動物のｃＤＮＡライブラリー（例えば、ヒトまたはマウスのリンパ組織のｃＤＮＡライブラリー）または合成ｃＤＮＡライブラリーから増幅する。一定の実施形態において、ＶＬ領域およびＶＨ領域をコードするＤＮＡ配列をＰＣＲでｓｃＦｖリンカーによって共に結合させて、ファージミドベクター（例えば、ｐＣＡＮＴＡＢ６またはｐＣｏｍｂ３ＨＳＳ）にクローニングする。ベクターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）にエレクトロポレートしてから、大腸菌をヘルパーファージに感染させる。これらの方法で使用されるファージは、ｆｄおよびＭ１３などの繊維状ファージであり、ＶＬ領域およびＶＨ領域は、通常、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかに組換えによって融合されている。目的とする抗原（例えば、ＮｇＲ１ポリペプチドまたはその断片）に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原、例えば、標識された抗原、または固相表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉されている抗原を用いて選択または確認することができる。
【０１０９】
抗体を作製するために使用することができるファージディスプレイ法の別の例は、Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ  １８７：９−１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５７：１９１−２８０（１９９４）；ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ公開番号：ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；および米国特許第５，６９８，４２６号；第５，２２３，４０９号；第５，４０３，４８４号；第５，５８０，７１７号；第５，４２７，９０８号；第５，７５０，７５３号；第５，８２１，０４７号；第５，５７１，６９８号；第５，４２７，９０８号；第５，５１６，６３７号；第５，７８０，２２５号；第５，６５８，７２７号；第５，７３３，７４３号；および第５，９６９，１０８号に開示されている。これらは、それぞれが参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０１１０】
上記文献に記載されているように、ファージ選択後、抗体をコードする領域をファージから単離して、ヒト抗体などの完全な抗体、または任意の他の所望の抗原結合断片を作製し、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌など、所望の宿主において発現させることができる。また、例えば、Ｆａｂ断片およびＦ（ａｂ’）２断片を組み換えによって産出する技術を、ＰＣＴ公開番号：ＷＯ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１２（６）：８６４−８６９（１９９２）；およびＳａｗａｉら、ＡＪＲＩ  ３４：２６−３４（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）（前記文献はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている方法など、当技術分野において既知の方法を用いて利用することもできる。
【０１１１】
単鎖のＦｖおよび抗体を産出するために使用できる技術の例には、米国特許第４，９４６，７７８号および第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３：４６−８８（１９９１）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ  ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；およびＳｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に記載されている技術などがある。ヒトにおけるインビボでの抗体の使用、およびインビトロ検出アッセイ法など、いくつかの用途にとっては、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体を使用することが好ましい場合がある。キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域、およびヒトの免疫グロブリン定常領域を有する抗体などの抗体の異なった部位が、異なった動物種に由来する分子である。キメラ抗体を作製する方法は当技術分野において既知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１−２０２（１９８９）；米国特許第５，８０７，７１５号；第４，８１６，５６７号；および第４，８１６３９７号を参照。これらの文献は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。ヒト化抗体は、非ヒト種に由来する１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）、およびヒト免疫グロブリン分子に由来するフレームワーク領域を有する所望の抗原に結合する、非ヒト種の抗体から得られる抗体分子である。しばしば、ヒトのフレームワーク領域におけるフレームワーク残基は、抗原結合を変えるため、好ましくは、改善するために、ＣＤＲドナー抗体の対応する残基で置換されている。これらのフレームワーク置換は、例えば、抗原結合にとって重要なフレームワーク残基を確認するために、ＣＤＲとフレームワーク残基との相互作用をモデリングすること、特定の位置における異常なフレームワーク残基を確認するために配列比較することなど、当技術分野において周知された方法によって確認される。（例えば、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）参照。これらの文献は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。）抗体は、例えば、ＣＤＲ移植法（ＥＰ２３９，４００；ＰＣＴ公開番号：ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５３０，１０１号；および第５，５８５，０８９号）、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（ＥＰ５９２，１０６；ＥＰ５１９，５９６；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ  ９１：９６９−９１３（１９９４））、および鎖シャフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）など、当技術分野において知られているさまざまな技術を用いてヒト化することができる。
【０１１２】
ヒト患者を治療するには完全なヒト抗体が特に望ましい。ヒト抗体は、ヒトの免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いて、上記したファージディスプレイ法など、当技術分野において知られているさまざまな技術によって作製することができる。米国特許第４，４４４，８８７号および第４，７１６，１１１号；ならびにＰＣＴ公開番号：ＷＯ９８／４６６４５、ＷＯ９８／５０４３３、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５、およびＷＯ９１／１０７４１も参照のこと。これらの各文献は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０１１３】
機能的な内因性免疫グロブリンを発現することはできないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを用いてヒト抗体を作製することもできる。例えば、ヒトの重鎖および軽鎖の免疫グロブリン遺伝子複合体を、ランダムに、または相同的組換えによって、マウスの胚性幹細胞に導入することができる。あるいは、ヒトの重鎖および軽鎖の遺伝子に加えて、ヒトの可変領域、定常領域、および多様性領域を導入することもできる。相同的組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入と別個または同時に、マウスの重鎖および軽鎖の免疫グロブリン遺伝子を無機能化することができ、特に、ＪＨ領域のホモ接合欠失によって、内因性抗体の産生が阻害される。修飾された胚性幹細胞を拡大して、胚盤胞にマイクロインジェクトしてキメラマウスを作製する。そして、キメラマウスを繁殖させて、ヒト抗体を発現するホモ接合の子孫マウスを生み出す。トランスジェニックマウスを、選択された抗原、例えば、所望の標的ポリペプチドの全部または一部を用いて通常のやり方で免疫する。免疫されたトランスジェニックマウスから、この抗原に対するモノクローナル抗体を常套のハイブリドーマ技術を用いて得ることができる。トランスジェニックマウス内に存在するヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化の過程で再配列し、その後、クラス転換および体細胞変異を起こす。こうして、このような技術を用いて、治療上有用なＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体、およびＩｇＥ抗体を産生することができる。このヒト抗体を産生する技術を概観するには、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術、およびこのような抗体を産生するためのプロトコールの詳細な検討については、例えば、ＰＣＴ公開番号：ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；米国特許第５，４１３，９２３号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，５６９，８２５号；第５，６６１，０１６号；第５，５４５，８０６号；第５，８１４，３１８号；および第５，９３９，５９８号を参照。これらの文献は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。また、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．）およびＧｅｎＰｈａｒｍ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．）などの会社に依頼して、選択された抗原に対するヒト抗体を、上記した技術と同様の技術を用いて提供してもらうことができる。
【０１１４】
選択されたエピトープを認識する完全なヒト抗体は、「誘導選択法（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる技術を用いて作製することができる。この方法では、選択された非ヒト型モノクローナル抗体、例えば、マウス抗体を用いて、同じエピトープを認識する完全なヒト抗体の選択を誘導する（Ｊｅｓｐｅｒｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７２：８９９−９０３（１９８８））。また、米国特許第５，５６５，３３２号も参照。
【０１１５】
別の実施形態において、常套の方法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いて）、所望のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを容易に単離して配列決定することができる。単離されサブクローニングされたハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好適な供給源となる。単離したら、ＤＮＡを発現ベクター内に入れ、その後、それ以外では免疫グロブリンを産生しない大腸菌細胞、シミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはミエローマ細胞などの原核細胞または真核細胞にトランスフェクトさせる。より具体的には、単離ＤＮＡ（本明細書に記載されているような合成物であってよい）を用いて、１９９５年１月２５日出願のＮｅｗｍａｎら、米国特許第５，６５８，５７０号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているような抗体を製造するために定常領域および可変領域配列をクローニングすることができる。本質的には、これは、選択された細胞からＲＮＡを抽出すること、ｃＤＮＡに変換すること、およびＩｇ特異的プライマーを用いてＰＣＲにより増幅することを必要とする。この目的に適したプライマーも、米国特許第５，６５８，５７０号に記載されている。より詳しく後述するように、所望の抗体を発現する形質転換細胞を比較的大量に増殖させて、免疫グロブリンの臨床用および商業用の供給物を提供することも可能である。
【０１１６】
具体的な実施形態において、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列を調べて、例えば、別の重鎖および軽鎖の可変領域の既知のアミノ酸配列と比較して、配列超可変領域を決定するなど、当技術分野において周知の方法により、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を確認することができる。通常の組換えＤＮＡ技術を用いて、１つ以上のＣＤＲを、例えば、ヒトフレームワーク領域などのフレームワーク領域内に挿入して非ヒト抗体をヒト化することができる。このフレームワーク領域は、天然型または共通のフレームワーク領域であってよく、好ましくはヒトフレームワーク領域である（ヒトフレームワーク領域のリストについては、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１９９８）参照）。好ましくは、フレームワーク領域とＣＤＲとを組み合わせて作出されたポリヌクレオチドは、所望のポリペプチド、例えば、ＮｇＲ１の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する抗体をコードしている。好ましくは、１つ以上のアミノ酸置換をフレームワーク領域内に作ることができ、好ましくは、そのアミノ酸置換は、抗体がその抗原に結合するのを促進する。さらに、このような方法を用いて、鎖内ジスルフィド結合に関与する１つ以上の可変領域システイン残基のアミノ酸置換体または欠失体を作製して、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合を欠く抗体分子を作製することができる。ポリヌクレオチドに対する別の改変も、本発明に包含され、当業者の技術範囲内にある。
【０１１７】
さらに、適当な抗原特異性をもつマウス抗体分子の遺伝子を、適当な生物活性をもつヒト抗体遺伝子由来の遺伝子と共にスプライシングすることによって「キメラ抗体」を作製するために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５７：８５１−８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４（１９８５））を用いることができる。本明細書において、キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域、およびヒトの免疫グロブリン定常領域を有する抗体、例えばヒト化抗体などの、抗体の異なった部位が、異なった動物種に由来している分子である。
【０１１８】
あるいは、単鎖抗体を作出するために記載された技術（米国特許第４，６９４，７７８号；Ｂｉｒｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４４２（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４−５５４（１９８９））を採用して、単鎖抗体を作出することができる。単鎖抗体は、Ｆｖ領域の重鎖断片と軽鎖断片とをアミノ酸架橋によって結合して形成させることができ、単鎖抗体が得られる。大腸菌において機能的Ｆｖ断片を集合させる技術を用いることも可能である（Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。
【０１１９】
また、ＮｇＲ１アンタゴニスト抗体は、内因性免疫グロブリンを産生することができないトランスジェニック動物（例えば、マウス）において生成されるヒト抗体または実質的にヒト抗体であってもよい（例えば、米国特許第６，０７５，１８１号、第５，９３９，５９８号、第５，５９１，６６９号、および第５，５８９，３６９号を参照。これらの各文献は、参照により本明細書に組み込まれる）。例えば、キメラの生殖系列変異マウスにおける抗体の重鎖結合領域のホモ接合体欠失によって、内因性抗体の産生を完全に阻害できることが記載されている。ヒト免疫グロブリン遺伝子アレイをこのような生殖系列変異マウスに移入すると、抗原投与によってヒト抗体の産生がもたらさせるはずである。ＳＣＩＤマウスを用いてヒト抗体を作製する別の好適な方法は、米国特許第５，８１１，５２４号に記載されている。この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。当然のことながら、これらのヒト抗体に関係する遺伝物質も、本明細書に記載されているように単離および操作することができる。
【０１２０】
組換え抗体を作製する、さらに別のより効率的な方法が、Ｎｅｗｍａｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１４５５−１４６０（１９９２）に開示されている。具体的には、この技術は、サルの可変ドメインとヒトの定常配列とを含む霊長類化抗体の生成をもたらす。この文献は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。さらに、この技術は、同一出願人による米国特許第５，６５８，５７０号、第５，６９３，７８０号、および第５，７５６，０９６号にも記載されており、これらの各文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２１】
別の実施形態において、顕微操作によってリンパ球を選択し、可変遺伝子を単離することができる。例えば、免疫した哺乳動物から末梢血単核球を単離し、インビトロで約７日間培養することができる。スクリーニング基準を満たす特異的ＩｇＧを得るために、培養物をスクリーニングすることができる。陽性のウェルから細胞を単離することができる。ＦＡＣＳによって、または補体媒介の溶血プラークアッセイで確認することによって、個々のＩｇ産生Ｂ細胞を単離することができる。Ｉｇ産生Ｂ細胞を顕微操作によってチューブ内に入れ、ＶＬ遺伝子およびＶＨ遺伝子を、例えば、ＲＴ−ＰＣＲを用いて増幅することができる。ＶＬ遺伝子およびＶＨ遺伝子は、抗体発現ベクターにクローニングして、発現のために細胞（例えば、真核細胞または原核細胞）にトランスフェクトすることができる。
【０１２２】
あるいは、当業者に周知の方法を用いて、抗体産生細胞株を選択して培養することができる。このような技術は、さまざまな実験用マニュアルおよび一次出版物に記載されている。この点について、後述するような、本発明で使用するのに適した技術が、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）に記載されており、この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２３】
本明細書に開示されている治療法で使用するための抗体は、抗体を合成するための既知の方法によって、特に、化学合成法、または好ましくは、本明細書に記載されているような組換え発現技術によって、作製することができる。
【０１２４】
さらに当然のことながら、本発明の範囲は、抗原結合ＤＮＡ配列のすべての対立遺伝子、変異体、および突然変異体をさらに包含する。
【０１２５】
周知のように、グアニジンイソチオシアネート抽出および沈殿、その後の遠心分離またはクロマトグラフィなど、標準的な技術によって、元のハイブリドーマ細胞から、または、別の形質転換細胞からＲＮＡを単離することができる。所望であれば、オリゴｄＴセルロースに対するクロマトグラフィなどの標準的な技術によって、全ＲＮＡからｍＲＮＡを単離することができる。適当な技術は当技術分野において周知されている。
【０１２６】
一実施形態において、周知の方法に従って、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを用いて、同時または別々に、抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡを作製することができる。コンセンサス定常領域プライマーによって、または、公開されている重鎖および軽鎖のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列に基づくより特異的なプライマーによって、ＰＣＲを開始することができる。上記で検討したように、ＰＣＲを用いて、抗体の重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡを単離することも可能である。この場合、コンセンサスプライマー、またはマウスの定常領域プローブなど、より大きな相同プローブによってライブラリーをスクリーニングすることができる。
【０１２７】
当技術分野において既知の技術を用いて、ＤＮＡ、典型的にはプラスミドＤＮＡを細胞から単離し、例えば、組換えＤＮＡ技術に関する前記した参考文献に詳細に示されている標準的な周知の技術に従って、制限酵素マッピングおよび配列決定を行うことができる。当然ながら、単離プロセスまたはその後の解析の如何なる時点であっても、本発明に従ってＤＮＡを合成することができる。
【０１２８】
抗体、またはその断片、誘導体、もしくは類似体、例えば、ＮｇＲ１アンタゴニストである抗体の重鎖または軽鎖を組換え発現させるには、その抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを構築する必要がある。本発明の抗体分子または抗体の重鎖または軽鎖をコードするポリヌクレオチド、またはその一部（好ましくは、重鎖または軽鎖の可変ドメインを含む）が得られたら、当技術分野において周知の技術を用いて、抗体分子を産生するベクターを組換えＤＮＡ技術によって作製することができる。そのため、抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを発現させることによりタンパク質を調製する方法が本明細書に記載されている。当業者に周知されている方法を用いて、抗体をコードする配列、ならびに適当な転写用および翻訳用の調節シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換え法などである。したがって、本発明は、本発明の抗体分子、またはその重鎖または軽鎖、または重鎖または軽鎖の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を、操作可能にプロモータを結合して含む複製可能なベクターを提供する。このようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むことができ（例えば、ＰＣＴ公開番号：ＷＯ８６／０５８０７；ＰＣＴ公開番号：ＷＯ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２２，４６４号を参照）、完全な重鎖または軽鎖を発現させるために、そのようなベクターに、抗体の可変ドメインをクローニングすることができる。
【０１２９】
常套の技術により、発現ベクターを宿主細胞に移行させることができ、次に、トランスフェクトされた細胞を常套の技術によって培養して、本明細書に記載されている方法で使用するための抗体を産生させる。したがって、本発明は、異種プロモータに操作可能に結合した、本発明の抗体またはその重鎖もしくは軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を包含する。二重鎖抗体を発現させるための好適な実施形態において、下記で詳しく説明するように、完全な免疫グロブリン分子を発現させるために、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターを宿主細胞において同時発現させることができる。
【０１３０】
さまざまな宿主−発現ベクター系を利用して、本明細書に記載する方法で使用するための抗体分子を発現させることができる。このような宿主−発現ベクター系は、目的とするコード配列を産生し、その後精製する媒体を代表し、また、適当なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされると、本発明の抗体分子をインサイチュで発現する細胞も代表する。これらは、抗体をコードする配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡの発現ベクターによって形質転換された細菌（例えば、大腸菌、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））などの微生物；抗体をコードする配列を含む組換え酵母発現ベクターによって形質転換された酵母（例えば、サッカロマイセス属、ピキア属）；抗体をコードする配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；抗体をコードする配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を感染させた植物細胞系、または抗体をコードする配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）によって形質転換された植物細胞系；または、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモータ（例えば、メタロチオネインプロモータ）もしくは哺乳動物のウイルスに由来するプロモータ（例えば、アデノウイルス後期プロモータ、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモータ）を含む組換え発現コンストラクトを内部にもつ哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＬＫ細胞、２９３細胞、３Ｔ３細胞）などであるが、これらに限定されない。好ましくは、大腸菌などの細菌細胞、より好ましくは、特に完全な組換え抗体分子を発現させるための真核細胞が、組換え抗体分子を発現させるために使用される。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳動物細胞は、ヒトサイトメガロウイルスに由来する主要中初期（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子プロモータ要素などのベクターと併用すると、抗体にとって有効な発現系となる（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ  ４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２（１９９０））。
【０１３１】
細菌の系では、発現される抗体分子について想定された用途に応じて、いくつかの発現ベクターが有利に選択される。例えば、抗体分子の薬学的組成物を作製するために、そのようなタンパク質を大量に産生させる場合には、簡単に精製される融合タンパク質産物を高濃度で発現させるベクターが望ましい。このようなベクターには、抗体をコードする配列を個別に、ｌａｃＺをコードする配列と同じ読み枠になるようにベクターにライゲーションして、融合タンパク質をさせることができる大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．２：１７９１（１９８３））；ｐＩＮベクター（ＩｎｏｕｙｅおよびＩｎｏｕｙｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．７５：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ  ＨｅｅｋｅおよびＳｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９（１９８９））などがあるが、これらに限定されない。また、ｐＧＥＸベクターを用いて、外来ポリペプチドを、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させることもできる。一般的に、このような融合タンパク質は可溶性であるため、基質であるグルタチオン−アガロースビーズに吸着および結合させた後、遊離グルタチオン存在下で溶出することにより、溶解した細胞から簡単に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物がＧＳＴ部分から放出され得るよう、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼの切断部位を含むように設計されている。
【０１３２】
昆虫系では、アウトグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）の核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現させるためのベクターとして通常使用される。ウイルスは、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）の細胞内で増殖する。ウイルスの非必須領域（例えば、ポリへドリン遺伝子）内に、抗体をコードする配列を個別にクローニングして、ＡｃＮＰＶのプロモータ（例えば、ポリへドリンプロモータ）の調節下に置くことができる。
【０１３３】
哺乳動物の宿主細胞では、いくつかのウイルスによる発現系を利用することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合には、目的とする抗体コード配列を、アデノウイルスの転写／翻訳調節複合体、例えば、後期プロモータおよび３つの部分からなるリーダー配列にライゲーションすることができる。そして、このキメラ遺伝子を、インビトロまたはインビボにおける組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１領域またはＥ３領域）への挿入によって、生存力があり、また、感染した宿主内で抗体分子を発現することができる組換えウイルスが得られる（例えば、ＬｏｇａｎとＳｈｅｎｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３５５−３５９（１９８４）参照）。また、挿入された抗体コード配列を効率的に翻訳するには、特異的開始シグナルも必要である場合がある。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドン、および隣接配列が含まれる。さらに、全挿入配列の翻訳を確実にするためには、開始コドンが、所望のコード配列の読み枠と一致している必要がある。これらの外因性翻訳調節シグナルおよび開始コドンは、天然および合成など、さまざまな起源のものでよい。適当な転写促進要素、転写終結因子などを含ませることによって、発現の効率を向上させることができる（Ｂｉｔｔｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４（１９８７）参照）。
【０１３４】
さらに、挿入配列の発現を調節するか、または、所望の特異的方法で遺伝子産物を修飾および処理する宿主細胞系統を選択することも可能である。タンパク質産物のこのような修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセッシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。さまざまな宿主細胞が、タンパク質および遺伝子産物を翻訳後プロセシングおよび修飾する性質および特異的機構を有している。適当な細胞株または宿主系を選択して、発現された外来タンパク質の適正な修飾およびプロセシングを確実に行うことができる。そのために、一次転写産物を適切にプロセシングし、遺伝子産物をグリコシル化およびリン酸化するための細胞機構を有する真核宿主細胞を使用することができる。そのような宿主細胞には、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８などがあり、特に、例えば、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０、およびＴ４７Ｄなどの乳癌細胞株、ならびに、例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔなどの正常な乳腺細胞株などがあるが、これらに限定されない。
【０１３５】
組換えタンパク質の産生を長期間高収率で行うためには、安定した発現が好適である。例えば、抗体分子を安定して発現する細胞株を設計することができる。ウイルスの複製開始点を含む発現ベクターを使用するのではなく、宿主細胞を、適当な発現調節要素（例えば、プロモータ配列、エンハンサ配列、転写終結因子、ポリアデニル化部位など）および選択可能マーカーによって調節されるＤＮＡで形質転換することができる。外来ＤＮＡを導入した後、改変した細胞を富栄養培地において１〜２日間増殖させてから、選択性培地に切り換える。組換えプラスミド中の選択可能マーカーは、選択に対する抵抗性を付与し、細胞が、プラスミドをその染色体の中に安定して組み込んで、次にクローニングして細胞株に展開することができる増殖巣を形成できるようにする。この方法を有利に利用して、抗体分子を安定して発現する細胞株を設計することができる。
【０１３６】
単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ  １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン−グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＳｚｙｂａｌｓｋａおよびＳｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：２０２（１９９２））、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ  ２２：８１７，１９８０）など、いくつかのを用いることができるが、これらの遺伝子は、それぞれ、ｔｋ−細胞、ｈｇｐｒｔ−細胞、またはａｐｒｔ−細胞で使用することができる。また、以下の遺伝子では、代謝拮抗物質耐性を選択の基礎として利用することができる：メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：３５７（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１５２７（１９８１））；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（ＭｕｌｌｉｇａｎおよびＢｅｒｇ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０７２（１９８１））；アミノグリコシド系抗生物質Ｇ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５；ＷｕおよびＷｕ、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５２：１９１−２１７（１９９３）；ＴＩＢ  ＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５（Ｍａｙ，１９９３）；および、ハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ  ３０：１４７（１９８４）。組換えＤＮＡ技術の分野で広く知られている利用可能な方法が、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）；およびＤｒａｃｏｐｏｌｉら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）の第１２および１３章；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）に記載されている。これらの文献は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０１３７】
ベクター増幅により、抗体分子の発現量を増加させることができる（概説については、ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ，Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．３．（１９８７））参照。抗体を発現するベクター系のマーカーが増幅可能であるとき、宿主細胞の培養物中に存在するインヒビタの濃度が上昇すると、マーカー遺伝子のコピー数が増加する。増幅領域は、抗体遺伝子に結合しているため、抗体の産生も増加する（Ｃｒｏｕｓｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７（１９８３））。
【０１３８】
宿主細胞を、重鎖由来のポリペプチドをコードする第１のベクター、および軽鎖由来のポリペプチドをコードする第２のベクターという、本発明の２種類の発現ベクターで同時トランスフェクトすることができる。２種類のベクターは、重鎖および軽鎖のポリペプチドの等量発現を可能にする同一の選択可能マーカーを含むことができる。あるいは、重鎖および軽鎖のポリペプチドを両方ともコードする単一のベクターを使用することも可能である。そのような場合、軽鎖を重鎖の前に有利に位置させて、毒性のある遊離重鎖が過剰にならないようにする（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：５２（１９８６）；Ｋｏｈｌｅｒ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：２１９７（１９８０））。重鎖および軽鎖のコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含む。
【０１３９】
本発明の抗体分子が組換え発現されたら、免疫グロブリン分子を精製するための、当技術分野において既知の方法、例えば、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換クロマトグラフィ、親和性クロマトグラフィ、特に、タンパク質Ａの後の特異的抗原に対する親和性によるもの、およびサイズ分離カラムクロマトグラフィ）、遠心分離、示差溶解性によって、またはその他、タンパク質を精製するための標準的技術によって抗体分子を精製することができる。あるいは、本発明の抗体の親和性を増大するための好適な方法が米国第２００２  ０１２３０５７  Ａ１号に記載されている。
【０１４０】
一実施形態において、本発明の方法で使用するための結合分子または抗原結合分子は、１つ以上のドメインが部分的または完全に欠失している合成定常領域（「ドメイン欠失抗体」）を含む。一定の実施形態において、適合可能な修飾抗体は、全ＣＨ２ドメインが削除されているドメイン欠失コンストラクトすなわち変異体（ΔＣＨ２コンストラクト）を含む。別の実施形態では、短い連結ペプチドを欠失ドメインの代わりに用いて、可変領域の動きに柔軟性および自由度をもたらすことができる。当業者は、ＣＨ２ドメインが抗体の異化率に対して制御特性をもつため、このようなコンストラクトが特に好適であることを理解できよう。
【０１４１】
一定の実施形態において、本明細書に開示されている方法で使用するための修飾抗体はミニボディである。ミニボディは、当技術分野において記載された方法を用いて作製することができる（例えば、米国特許第５，８３７，８２１号またはＷＯ９４／０９８１７Ａ１を参照）。
【０１４２】
別の実施形態において、本明細書に開示されている方法で使用するための修飾抗体は、当技術分野において既知のＣＨ２ドメイン欠失抗体である。ドメイン欠失コンストラクトは、ＩｇＧ１ヒト定常ドメインをコードするベクター（例えば、Ｂｉｏｇｅｎ  ＩＤＥＣ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄから得られる）を用いて派生させることができる（例えば、ＷＯ０２／０６０９５５Ａ２およびＷＯ０２／０９６９４８Ａ２参照）。この例示的なベクターは、ＣＨ２ドメインを欠失するように改変されていたため、ドメインを欠失したＩｇＧ１定常領域を発現するベクターを提供する。
【０１４３】
一実施形態において、本明細書に開示されている治療法で使用するためのＮｇＲ１アンタゴニスト抗体またはその断片は、単量体サブユニット間の結合を可能にするものであれば、数個または単一のアミノ酸が欠失または置換されている免疫グロブリン重鎖を含む。例えば、実質的にＦｃ結合を低減させて、腫瘍の局在化を高めるためには、ＣＨ２ドメインの選択された領域における単一アミノ酸の変異で十分である場合がある。同様に、調節されるエフェクター機能（例えば、補体結合）を制御する１つ以上の定常領域のその部分を単に欠失することが望ましい場合がある。定常領域のこのような部分的欠失によって、抗体の選択された特性（血清半減期）は改善するが、対象である定常領域ドメインに関係する、その他の望ましい機能は元のままである。さらに、上記で示唆したように、開示された抗体の定常領域は、得られるコンストラクトの特徴をさらに向上させる、１つ以上のアミノ酸の変異または置換によって合成されていてよい。この点について、修飾抗体の立体構造および免疫原プロフィールを実質的に維持しつつ、保存された結合部位（例えば、Ｆｃ結合）によってもたらされる活性を破壊することが可能である。さらに別の実施形態は、定常領域に１つ以上のアミノ酸を付加して、エフェクター機能などの所望の特徴を向上させるか、または、より多くのサイトトキシンまたは糖の結合をもたらすことを含む。そのような実施形態においては、選択された定常領域ドメインに由来する特異的配列を挿入または複製することが望ましい場合がある。
【０１４４】
本発明は、本明細書に記載された抗体分子（例えば、ＶＬ領域および／またはＶＨ領域）の変異体（誘導体を含む）を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる抗体であって、その抗体または断片がポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体の用途を提供する。アミノ酸置換をもたらす部位特異的変異誘発法およびＰＣＲ媒介の変異誘発法など、当業者に既知の標準的な技術を用いて、結合分子をコードするヌクレオチド配列に変異を導入することができる。好ましくは、変異体（誘導体を含む）は、参照用のＶＨ領域、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬ領域、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、またはＶＬＣＤＲ３と比較して、５０アミノ酸の置換よりも少ない、４０アミノ酸の置換よりも少ない、３０アミノ酸の置換よりも少ない、２５アミノ酸の置換よりも少ない、２０アミノ酸の置換よりも少ない、１５アミノ酸の置換よりも少ない、１０アミノ酸の置換よりも少ない、５アミノ酸の置換よりも少ない、４アミノ酸の置換よりも少ない、３アミノ酸の置換よりも少ない、または２アミノ酸の置換よりも少ないものをコードしている。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、同じような電荷の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されている置換である。同じような電荷の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが、当技術分野において定義されている。これらのファミリーとして、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）などがある。あるいは、変異は、飽和突然変異誘発法によるなどして、コード配列の全部または一部にランダムに導入することができ、得られた変異体を、生物活性についてスクリーニングして、活性を保持している変異体を確認することができる。
【０１４５】
例えば、抗体分子のフレームワーク領域のみに、またはＣＤＲ領域のみに変異を導入することが可能である。導入された変異は、サイレント変異または中立的なミスセンス変異で、すなわち、抗体が抗原に結合する能力に影響を全く与えない、または、ほとんど与えない場合がある。これらのタイプの変異は、コドン使用を最適化させるか、ハイブリドーマの抗体産生を向上させるのに役立ち得る。あるいは、非中立的なミスセンス変異は、抗体が抗原に結合する能力を変える場合がある。ほとんどのサイレント変異および中立的ミスセンス変異の位置は、フレームワーク領域にある可能性が高いが、ほとんどの非中立的ミスセンス変異の位置は、ＣＤＲの中にある可能性が高い。ただし、これは絶対的な要件ではない。当業者は、抗原結合活性に変化がない、または結合活性が変化する（例えば、抗原結合活性の向上、または抗体特異性の変化）など、所望の性質を有する変異分子を設計してテストすることができるであろう。変異誘発後、コードされたタンパク質を常法的に発現させ、本明細書記載の技術を用いて、または当技術分野において既知の常法的修飾技術によって、コードされたタンパク質の機能的活性および／または生物活性を決定することができる。
融合タンパク質および複合ポリペプチドおよび抗体
本明細書に開示されている治療法で使用するためのＮｇＲ１ポリペプチド、アプタマー、および抗体を、さらに、Ｎ末端またはＣ末端で組換えによって異種ポリペプチドに融合させるか、または、ポリペプチドまたは別の組成物に化学的に結合させることができる（共有結合的結合および非共有結合的結合を含む）。例えば、ＮｇＲ１アンタゴニストのポリペプチド、アプタマー、および抗体を、検出アッセイで標識として役立つ分子、および、異種ポリペプチド、薬剤、放射性核種、または毒素などのエフェクター分子に組換えによって融合または結合させることができる。例えば、ＰＣＴ公開番号：ＷＯ９２／０８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９９５号；およびＥＰ  ３９６，３８７を参照。
【０１４６】
本明細書に開示されている治療法で使用するためのＮｇＲ１アンタゴニストのポリペプチド、アプタマー、および抗体は、修飾された誘導体、すなわち、ＮｇＲ１アンタゴニストのポリペプチド、アプタマー、および抗体がＮｇＲ１の生物学的機能を阻害するのを共有結合によって妨げられないように、任意の種類の分子を共有結合させることによって修飾された誘導体を含む。制限する意図ではなく、単に例として、本発明のＮｇＲ１アンタゴニストのポリペプチド、アプタマー、および抗体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、ホスフィレーション（ｐｈｏｓｐｈｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化、アミド化、既知の保護基／封鎖基による誘導体化、タンパク質分解による切断、細胞リガンドまたはその他のタンパク質への結合などによって修飾することができる。特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などであるが、これらに限定されない既知の技術によって、数多くの化学修飾法のいずれかを実施することができる。さらに、この誘導体は、１つ以上の非従来型のアミノ酸を含むことも可能である。
【０１４７】
本明細書に開示されている治療法で使用するためのＮｇＲ１アンタゴニストのポリペプチド、アプタマー、および抗体は、ペプチド結合、または修飾ペプチド結合すなわちペプチドアイソスターによって互いに結合しているアミノ酸から構成され得、２０種類の遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸を含み得る。ＮｇＲ１アンタゴニストのポリペプチド、アプタマー、および抗体は、翻訳後プロセシングなど天然のプロセスによって、または当技術分野において周知されている化学修飾法によって修飾することができる。このような修飾については、基本書およびより詳しいモノグラフ、ならびに大量の研究文献に十分に記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸の側鎖、アミノ末端、およびカルボキシ末端など、アンタゴニストポリペプチドまたは抗体中、または糖鎖などの部分の如何なる場所にも存在することができる。当然のことながら、同じ種類の修飾が、所定のＮｇＲ１アンタゴニストのポリペプチド、アプタマー、または抗体の中のいくつかの部位において同一程度または異なった程度に存在しうる。また、所定のＮｇＲ１アンタゴニストのポリペプチド、アプタマー、または抗体は、多くの種類の修飾を含むことができる。ＮｇＲ１アンタゴニストのポリペプチド、アプタマー、または抗体は、例えば、ユビキチン化の結果として分岐させることができ、分岐の有無に関わらず、環状でもあり得る。環状、分岐状、および分岐環状のＮｇＲ１アンタゴニストのポリペプチド、アプタマー、および抗体は、翻訳後の天然のプロセシングによって得ることができ、または、合成法によって作出することも可能である。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環状化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレン酸化、硫酸化、タンパク質への転移ＲＮＡによるアミノ酸付加、例えばアルギニン化、およびユビキチン化などがある（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎら、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２ｎｄ  Ｅｄ．，（１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐｇｓ．１−１２（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら、Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎら、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ６６３：４８−６２（１９９２）参照）。
【０１４８】
ＮｇＲ１アンタゴニストのポリペプチド、アプタマー、および抗体が融合する異種ポリペプチドは、機能にとって有用であり、ＮｇＲ１アンタゴニストのポリペプチド、アプタマー、または抗体を標的するのに役立つ。ＮｇＲ１アンタゴニストの融合タンパク質、アプタマー、および抗体を用いて、さまざまな目的、例えば、血清半減期の延長、生体利用効率の向上、特定の器官または組織型に対するインビボ標的、組換え発現効率の向上、宿主細胞分泌の向上、精製の容易さ、およびより高い結合活性などを実現するために用いることができる。達成すべき目的に応じて、異種部分は不活性であるか、生物学的に活性であり得る。また、それは、切断可能なＮｇＲ１アンタゴニストのポリペプチド、アプタマー、または抗体に、インビトロまたはインビボで安定して融合するよう選択することができる。これら別の目的を達成するための異種部分は、当技術分野において知られている。
【０１４９】
ＮｇＲ１アンタゴニスト融合ポリペプチド、アプタマー、または抗体に代わるものとして、選択した異種部分を予め形成して、アンタゴニストのポリペプチド、アプタマー、または抗体に化学的に結合することができる。ほとんどの場合、選ばれた異種部分は、ＮｇＲ１アンタゴニスト融合ポリペプチド、アプタマー、または抗体に融合しても結合しても、同じように機能する。したがって、以下の異種アミノ酸配列についての考察では、別段の記載がない限り、異種配列は、融合タンパク質の形でも、化学的結合体としても、ＮｇＲ１アンタゴニスト融合ポリペプチド、アプタマー、または抗体に結合することができるものと理解されたい。
【０１５０】
ＮｇＲ１アンタゴニスト融合ポリペプチド、アプタマー、または抗体などの薬理学的に活性のあるポリペプチドは、しばしば、インビボで急速なクリアランスを示すため、体内で治療上有効な濃度となるには大量の投薬が必要となる。さらに、約６０ｋＤａよりも小さなポリペプチドは、潜在的に糸球体ろ過されるため、腎障害をもたらすことがある。このような腎障害のリスクを低減または回避するために、ＮｇＲ１アンタゴニストのポリペプチド、アプタマー、または抗体などの比較的低分子のポリペプチドの融合または結合を採用することができる。治療用ポリペプチドのインビボにおける安定性、すなわち血清半減期を延長させるさまざまな異種アミノ酸配列、すなわちポリペプチド部分または「担体」が知られている。
【０１５１】
その半減期が長く、インビボで広範に分布し、酵素的または免疫学的な機能を持たないことから、本質的に全長のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはＨＳＡ断片が異種部分として広く使用されている。Ｙｅｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１９０４−０８（１９９２）およびＳｙｅｄら、Ｂｌｏｏｄ  ８９：３２４３−５２（１９９７）に記載されているような方法および材料を使用することによって、ＨＡＳを用いて、この異種部分のおかげで、インビボにおける例えば１０倍から１００倍高い顕著な安定性を示しつつ、薬理学的活性を示すＮｇＲ１アンタゴニスト融合ポリペプチド、アプタマー、抗体、またはポリペプチド／抗体複合体を形成することができる。ＨＡＳのＣ末端は、可溶性部分のＮ末端に融合させることができる。ＨＳＡは、天然の分泌タンパク質であるから、融合タンパク質を真核生物の、例えば哺乳動物の発現系で産生させる場合には、ＨＳＡのシグナル配列を利用して、可溶性融合タンパク質を細胞培養培地内に分泌させることができる。
【０１５２】
一定の実施形態において、本発明の方法において使用するためのＮｇＲ１アンタゴニストのポリペプチド、アプタマー、抗体、およびその断片は、さらに標的部分を含む。標的部分は、身体の一定の部分、例えば、脳またはその一部への局在化を指令するタンパク質またはペプチドである。一定の実施形態において、本発明の方法において使用するためのＮｇＲ１アンタゴニストのポリペプチド、アプタマー、抗体、またはその断片は、脳標的部分に結合または融合されている。脳標的部分は共有結合的に（例えば、直接的な翻訳による融合、または直接的に、もしくはスペーサ分子を介した化学結合であって、任意では切断可能な結合によって）、または非共有結合的に（例えば、アビジン、ビオチン、タンパク質Ａ、ＩｇＧなどの可逆的な相互作用を介して）結合している。別の実施形態において、本発明の方法において使用するためのＮｇＲ１アンタゴニストのポリペプチド、アプタマー、抗体、またはその断片は、１つ以上の脳標的部分に結合している。更なる実施形態において、脳標的部分は、本発明の方法において使用するためのＮｇＲ１アンタゴニストのポリペプチド、アプタマー、抗体、またはその断片の複数に結合している。
【０１５３】
ＮｇＲ１アンタゴニストのポリペプチド、アプタマー、抗体、またはその断片に結合した脳標的部分は、該ＮｇＲ１アンタゴニストのポリペプチド、アプタマー、抗体、またはその断片の脳への送達を促進する。タンパク質または治療薬と融合すると、そのタンパク質または治療薬を、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して送達する多くのポリペプチドが記載されてきた。非限定的な例は、単一ドメイン抗体ＦＣ５（Ａｂｕｌｒｏｂら（２００５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．９５，１２０１−１２１４）；ヒトインスリン受容体に対するモノクローナル抗体であるｍＡＢ  ８３−１４（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら（１９９５）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．１２，８０７−８１６）；ヒトトランスフェリン受容体に結合するＢ２ペプチド、Ｂ６ペプチド、およびＢ８ペプチド（ｈＴｆＲ）（Ｘｉａら（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，１１３５９−１１３６６）；トランスフェリン受容体に対するＯＸ２６モノクローナル抗体（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら（１９９１）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２５９，６６−７０）；および米国特許第６，３０６，３６５号記載の配列番号：１〜１８などである。上記文献の内容は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０１５４】
ＮｇＲ１組成物の増強された脳送達は、当技術分野において確立している多くの手段で測定することができる。例えば、脳標的部分に結合した放射活性標識されたＮｇＲ１アンタゴニストのポリペプチド、アプタマー、抗体、またはその断片を動物に投与すること；脳内局在を判定すること；および脳標的部分に結合していない等量の放射活性標識されたＮｇＲ１アンタゴニストのポリペプチド、アプタマー、抗体、またはその断片と局在とを比較すること。向上された標的化を測定する別の方法が、上記文献に記載されている。
【０１５５】
シグナル配列は、小胞体の膜を通過してタンパク質の輸送を開始させるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。免疫融合体を構築するのに役立つシグナル配列は、抗体軽鎖のシグナル配列、例えば、抗体１４．１８（Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１２５：１９１−２０２（１９８９））、抗体重鎖のシグナル配列、例えば、ＭＯＰＣ１４１抗体の重鎖のシグナル配列（Ｓａｋａｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ  ２８６：５１１４（１９８０））などである。あるいは、別のシグナル配列を使用することもできる。例えば、Ｗａｔｓｏｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．７２：５１４５（１９８４）を参照。シグナルペプチドは、通常、小胞体の内腔でシグナルペプチダーゼによって切断される。その結果、Ｆｃ領域と可溶性ＮｇＲ１部分とを含む免疫融合タンパク質が分泌される。
【０１５６】
一定の実施形態において、ＤＮＡ配列は、分泌カセットと可溶性ＮｇＲ１部分との間にタンパク質切断部位をコードすることができる。このような切断部位は、例えば、コードされた融合タンパク質のタンパク質切断をもたらして、標的タンパク質からＦｃドメインを分離させるのを可能にする。有用なタンパク質切断部位は、トリプシン、プラスミン、トロンビン、第Ｘａ因子、またはエンテロキナーゼＫなどのタンパク質分解酵素によって認識されるアミノ酸配列などである。
【０１５７】
分泌カセットを複製可能な発現ベクター内に組み込むことができる。有用なベクターは、直鎖状核酸、プラスミド、ファージミド、コスミドなどである。発現ベクターの例は、免疫融合体ＤＮＡの転写が、ヒトサイトメガロウイルスのエンハンサおよびプロモータの調節を受けるｐｄＣである。例えば、Ｌｏら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０８８：１１２（１９９１）；およびＬｏら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１：４９５−５００（１９９８）を参照。適当な宿主細胞を、可溶型ポリペプチドをコードするＤＮＡで形質転換して、可溶型ＮｇＲ１ポリペプチドを発現および分泌させるために利用することができる。通常使用される宿主細胞は、不死化したハイブリドーマ細胞、ミエローマ細胞、２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＣＯＳ細胞などである。
【０１５８】
一実施形態において、可溶型ＮｇＲ１ポリペプチドをヒンジ領域およびＦｃ領域、すなわち、Ｉｇの重鎖定常領域のＣ末端側部位に融合させる。ＮｇＲ１−Ｆｃ融合体の潜在的な利点として、可溶性、インビボにおける安定性、および多価性、例えば、二量体化などが挙げられる。用いられるＦｃ領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＧのＦｃ領域（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）であってよい。あるいは、ＩｇＥまたはＩｇＭのＦｃ領域（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４）であってよい。一般的には、ＩｇＧのＦｃ領域、例えば、ＩｇＧ１のＦｃ領域またはＩｇＧ４のＦｃ領域が用いられる。一実施形態において、ＩｇＧのＦｃ領域を化学的に画定するパパイン切断部位のすぐ上流にあるヒンジ領域（すなわち、カバットの体系により、重鎖定常領域の最初の残基が１１４位であるとすると２１６位の残基）、または他の免疫グロブリンの同様の部位から始まる配列が融合に用いられる。融合が行われる正確な部位は重要ではないが、具体的な部位はよく知られており、分子の生物活性、分泌、または結合特性を最適化するように選択することができる。Ｆｃ融合体をコードするＤＮＡを構築または発現するための材料および方法は、当技術分野において知られており、過度の実験を行うことなく可溶型ＮｇＲ１融合体を得るために利用することができる。本発明のいくつかの実施形態では、Ｃａｐｏｎら、米国特許第５，４２８，１３０号および第５，５６５，３３５号に記載されているようなＮｇＲ１融合体が使用される。
【０１５９】
完全に元のままの野生型Ｆｃ領域は、本発明の方法で使用されるＦｃ融合タンパク質においては、普通は不必要で望ましくないエフェクター機能を示す。したがって、分泌カセットを構築する過程で、一定の結合部位は、通常、Ｆｃ領域から削除される。例えば、軽鎖との同時発現は必要でないため、重鎖結合タンパク質のＢｉｐに対する結合部位（Ｈｅｎｄｅｒｓｈｏｔら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ５：１１１−１４（１９８７））が、ＩｇＥのＦｃ領域のＣＨ２ドメインから削除される。そのため、この部位が、免疫融合体の効率的な分泌を妨げることはない。ＩｇＭに存在する膜貫通ドメインの配列なども、通常は削除できる。
【０１６０】
ＩｇＧ１のＦｃ領域がもっとも頻繁に使用される。あるいは、その他のサブクラスのγ免疫グロブリン（γ−２、γ−３、およびγ−４）のＦｃ領域を分泌カセットで使用することができる。一般的には、免疫グロブリンγ−１のＩｇＧ１のＦｃ領域が分泌カセットに使用され、ヒンジ領域の少なくとも一部、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含む。いくつかの実施形態において、免疫グロブリンγ−１のＩｇＧ１のＦｃ領域は、ＣＨ２欠失Ｆｃであり、これは、ヒンジ領域の一部、およびＣＨ３領域を含むが、ＣＨ２領域は含まない。ＣＨ２欠失Ｆｃは、Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  １：４７（１９９０）に記載されている。いくつかの実施形態において、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭの１つのＦｃ領域が使用される。
【０１６１】
ＮｇＲ１−Ｆｃ融合タンパク質は、いくつかの異なった構造に構築することができる。１つの構造では、可溶性ＮｇＲ１部分のＣ末端が、Ｆｃヒンジ部分のＮ末端に直接融合している。少し異なった構造では、例えば、２〜１０アミノ酸の短いポリペプチドが、可溶性ＮｇＲ１部分のＮ末端とＦｃヒンジ部分のＣ末端との間に組み込まれている。別の構造では、短いポリペプチドが、融合体のＮｇＲポリペプチド部分のＣ末端とＦｃ部分のＮ末端との間に組み込まれている。このようなリンカーは、立体構造上の可動性をもたらし、それにより、環境によっては生物活性を改善させることができる。ヒンジ領域の十分な部位がＦｃ部分に保持されていると、ＮｇＲ１−Ｆｃ融合体は二量体化して、二価分子を形成する。単量体のＦｃ融合体の均質な集団からは、単一特異性の二価二量体が得られる。各々が異なる特異性を有する２つの単量体のＦｃ融合体の混合物からは、二重特異性の二価二量体が得られる。
【０１６２】
対応するアミノ反応基とチオール反応基とを含む多くの架橋剤のいずれかを用いて、ＮｇＲ１アンタゴニストのポリペプチドを血清アルブミンに結合することができる。適当なリンカーの例は、チオール反応性マレイミド、例えば、ＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳ、およびＧＭＢＳを挿入するアミノ反応性架橋剤などである。別の適当なリンカーは、チオール反応性ハロ酢酸基、例えば、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢを挿入する。スルフヒドリル基と反応させるための保護されたチオールまたは保護されていないチオールを提供して還元可能な結合を生じさせるリンカーは、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡ、およびＳＡＴＰなどがある。このような試薬は市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。
【０１６３】
結合体は、可溶型ポリペプチドのＮ末端、または血清アルブミン上のチオール部分を含む必要はない。例えば、可溶型ＮｇＲ１−アルブミン融合体は、遺伝子操作技術を用いて得ることができ、可溶性ＮｇＲ１部分が血清アルブミン遺伝子に、そのＮ末端、Ｃ末端、または両端で融合される。
【０１６４】
可溶型ＮｇＲ１ポリペプチドを異種ペプチドに融合させて、可溶性ＮｇＲ１部分の精製または確認を容易にすることができる。例えば、ヒスチジンタグを可溶型ＮｇＲ１ポリペプチドに融合させて、市販されているクロマトグラフィ媒体を用いた精製を容易にすることができる。
【０１６５】
本発明のいくつかの実施形態において、可溶型ＮｇＲ１融合コンストラクトを用いて、細菌における可溶性ＮｇＲ１部分の産生を促進する。このようなコンストラクトにおいては、高濃度で正常に発現および／または分泌される細菌タンパク質を、可溶性ポリペプチドのＮ末端融合パートナーとして使用する。例えば、Ｓｍｉｔｈら、Ｇｅｎｅ  ６７：３１（１９８８）；Ｈｏｐｐら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４（１９８８）；ＬａＶａＩｌｉｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１８７（１９９３）参照。
【０１６６】
適当な融合パートナーのアミノ末端およびカルボキシ末端で可溶性ＮｇＲ１部分を融合することにより、可溶型ＮｇＲ１ポリペプチドの二価型または四価型が得られ得る。例えば、可溶性ＮｇＲ１部分を、Ｉｇ部分のアミノ末端およびカルボキシ末端に融合して、２つの可溶性ＮｇＲ１部分を含む二価性単量体ポリペプチドを産生することができる。これらの単量体の２つを二量体化すると、Ｉｇ部分があるために、可溶型ＮｇＲ１タンパク質の四価型が得られる。このような多価型を用いて、標的に対する結合親和性の強化を達成することができる。可溶性ＮｇＲ１部分を直列に並べてコンカテマーを形成させることにより、可溶性ＮｇＲ１の多価型も得ることができ、それを単独で使用するか、ＩｇまたはＨＳＡなどの融合パートナーに融合させて使用することができる。
複合ポリマー（ポリペプチドを除く）
本発明のいくつかの実施形態は、１つ以上のポリマーが、本発明の方法で使用するためのＮｇＲ１のポリペプチド、アプタマー、または抗体に結合（共有結合）している可溶型ＮｇＲ１ポリペプチド、ＮｇＲ１アプタマー、またはＮｇＲ１抗体を含む。このような結合に適したポリマーの例には、ポリペプチド（上記）、アプタマー、糖ポリマー、およびポリアルキレングリコール鎖などがある。一般的には、ただし常にではなく、以下の１つ以上を向上させるために、ポリマーを可溶型ＮｇＲ１ポリペプチドまたはＮｇＲ１抗体に結合させる：可溶性、安定性、または生体利用効率。
【０１６７】
ＮｇＲ１アンタゴニストのポリペプチド、アプタマーまたは抗体との結合に一般的に利用されるポリマーのクラスは、ポリアルキレングリコールである。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が最もよく利用される。ＰＥＧ部分、例えば、１、２、３、４、または５個のＰＥＧポリマーをＮｇＲ１アンタゴニストのポリペプチド、アプタマーまたは抗体のそれぞれと結合させて、単独のＮｇＲ１アンタゴニストのポリペプチド、アプタマーまたは抗体と比較して、血清半減期を延長することができる。ＰＥＧ部分は非抗原性であり、本質的には生物学的に非活性である。本発明の実施で使用されるＰＥＧ部分は分岐型であっても非分岐型であってもよい。
【０１６８】
ＮｇＲ１アンタゴニストのポリペプチド、アプタマー、または抗体に結合しているＰＥＧ部分の個数、および個々のＰＥＧ鎖の分子量は変動し得る。一般的には、ポリマーの分子量が大きいほど、ポリペプチドに結合するポリマー鎖の数は少なくなる。通常、ＮｇＲ１アンタゴニストのポリペプチド、アプタマー、または抗体に結合するポリマーの総質量は２０ｋＤａ〜４０ｋＤａである。したがって、１つのポリマー鎖を結合させる場合、鎖の分子量は、一般的には２０〜４０ｋＤａである。２つの鎖を結合させる場合、それぞれの鎖の分子量は、一般的には１０〜２０ｋＤａである。３つの鎖を結合させる場合には、それぞれの鎖の分子量は、一般的には７〜１４ｋＤａである。
【０１６９】
ポリマー、例えば、ＰＥＧは、ポリペプチド上の適当な露出した反応基を介して、ＮｇＲ１アンタゴニストのポリペプチド、アプタマー、または抗体に結合することができる。露出した反応基は、例えば、Ｎ末端アミノ基、または内部にあるリジン残基のεアミノ基、またはその両方であってもよい。活性化ポリマーは反応して、ＮｇＲ１アンタゴニストのポリペプチド、アプタマー、または抗体上の遊離アミノ基に共有結合することができる。ＮｇＲ１アンタゴニストのポリペプチド、アプタマー、または抗体の遊離カルボン酸基、適切に活性化されたカルボニル基、ヒドロキシル部分、グアニジル部分、イミダゾール部分、酸化糖部分、およびメルカプト基も、ポリマー結合用の反応基として利用することができる。
【０１７０】
結合反応において、ポリペプチド濃度に応じて、ポリペプチド１モルあたり約１．０モル〜約１０モルの活性化ポリマーを一般的に使用する。通常、選択された比率は、反応を最大化しつつ、ＮｇＲ１アンタゴニストのポリペプチド、アプタマー、または抗体の所望の薬理学的活性を損ない得る（しばしば非特異的な）副作用を最小化するということの間のバランスを表している。好ましくは、ＮｇＲ１アンタゴニストのポリペプチド、アプタマー、または抗体の（例えば、本明細書に記載されているか、当技術分野において知られているアッセイ法のいずれかにおいて実証されているような）生物活性の少なくとも５０％、最も好ましくは、ほぼ１００％が保持される。
【０１７１】
従来の化学法を用いて、ポリマーを、ＮｇＲ１アンタゴニストのポリペプチド、アプタマー、または抗体に結合させることができる。例えば、ポリアルキレングリコール部分を、ＮｇＲ１アンタゴニストのポリペプチドまたは抗体のリジンεアミノ基に結合させることができる。リジン側鎖への結合は、ＰＥＧスクシンイミジルスクシネート（ＳＳ−ＰＥＧ）およびスクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ−ＰＥＧ）などのＮ‐ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）活性エステルを用いて行うことができる。適当なポリアルキレングリコール部分は、例えば、カルボキシメチル−ＮＨＳおよびノルロイシン−ＮＨＳ、ＳＣなどである。これらの試薬は市販されている。さらに別のアミン反応性ＰＥＧリンカーを、スクシンイミジル部分の代わりに用いることができる。それらは、例えば、イソチオシアン酸、ニトロフェニルカルボン酸（ＰＮＰ）、エポキシド、ベンゾトリアゾールカルボン酸、ＳＣ−ＰＥＧ、トレシレート（ｔｒｅｓｙｌａｔｅ）、アルデヒド、エポキシド、カルボニルイミダゾール、およびＰＮＰカルボネートなどである。条件は、通常、反応の選択性および程度が最大になるよう最適化される。このように反応を最適化することは、通常の技術の範囲内である。
【０１７２】
ＰＥＧ化は、当技術分野で周知のＰＥＧ化反応のいずれによっても行うことができる。例えば、Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ３：４−１０（１９９２）、ならびに欧州特許出願第ＥＰ０  １５４  ３１６号および第ＥＰ０  ４０１  ３８４号参照。ＰＥＧ化は、反応性ポリエチレングリコール分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を用いて行うこともできる。
【０１７３】
アシル化によるＰＥＧ化は、一般的に、ポリエチレングリコールの活性エステル誘導体を反応させることを含む。任意の反応性ＰＥＧ分子をＰＥＧ化に使用することができる。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）でエステル化されたＰＥＧが、頻繁に使用される活性ＰＥＧエステルである。本明細書において、「アシル化」として、限定されないが、治療用タンパク質と、ＰＥＧなどの水溶性ポリマーとの間の以下のタイプの結合が挙げられる：アミド、カルバメート、ウレタンなど。例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ，５：１３３−１４０，１９９４参照。反応パラメータは、一般的には、可溶性ポリペプチドを損なうか不活性化させる温度、溶媒、およびｐＨ条件を回避するように選択される。
【０１７４】
通常、連結させる結合はアミド結合であり、一般的には、得られる反応物の少なくとも９５％がモノＰＥＧ化、ジＰＥＧ化、またはトリＰＥＧ化されている。しかし、ＰＥＧ化の程度がより高い分子種を、用いられる具体的な反応条件に応じた量で形成できることもある。任意には、精製されたＰＥＧ化種を、例えば、透析法、塩析法、限外濾過法、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、疎水性交換クロマトグラフィ、および電気泳動など、従来の精製法によって、混合物、特に未反応の種から分離する。
【０１７５】
アルキル化によるＰＥＧ化は、一般的には、還元剤の存在下で、ＰＥＧの末端アルデヒド誘導体を、ＮｇＲ１アンタゴニストのポリペプチド、アプタマー、または抗体と反応させることを含む。さらに、反応条件を操作して、ＮｇＲ１アンタゴニストのポリペプチド、アプタマー、または抗体の実質的にＮ末端アミノ基のみでＰＥＧ化を行いやすくする、すなわち、モノ−ＰＥＧ化タンパク質を得られるようにすることができる。モノ−ＰＥＧ化またはポリ−ＰＥＧ化のいずれにおいても、ＰＥＧ基は、一般的には、ＣＨ２−ＮＨ−基を介してタンパク質に結合している。特にＣＨ２−基に関し、このタイプの結合は「アルキル」結合として知られている。
【０１７６】
Ｎ末端を標的とするモノ−ＰＥＧ化反応物を生成するための還元的アルキル化による誘導体化は、誘導体化に利用可能な様々なタイプの第１級アミノ基の示差反応性（リジン対そのＮ末端）を利用する。反応は、リジン残基のε−アミノ基とタンパク質のＮ末端アミノ基のε−アミノ基とのｐＫａの差異を利用できるｐＨにて行う。このような選択的誘導体化によって、アルデヒドなどの反応基を含む水溶性ポリマーが、タンパク質に結合するのを調節して、ポリマーとの結合が、主として、タンパク質のＮ末端で起こり、その他の反応基、例えば、リジン側鎖などの有意な修飾が起こらないようにする。
【０１７７】
アシル化法およびアルキル化法のいずれでも利用されるポリマー分子は、水溶性ポリマーから選択される。選択されるポリマーは、本方法におけるように重合度を調節することができるよう、通常、アシル化の場合は活性エステル、アルキル化の場合はアルデヒドなどの単一の反応基をもつように修飾される。活性ＰＥＧアルデヒドの例は、耐水性であるポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、またはそのモノＣ１〜Ｃ１０アルキル誘導体またはアリールオキシ誘導体である（例えば、Ｈａｒｒｉｓら、米国特許第５，２５２，７１４号参照）。ポリマーは分岐型でも非分岐型でもよい。アシル化反応では、選択されるポリマーは、通常、単一の反応性エステル基を持っている。還元的アルキル化では、選択されるポリマーは、通常、単一の反応性アルデヒド基を持っている。一般的には、水溶性ポリマーは、天然のグリコシル残基からは選択されない。なぜなら、これらは通常、哺乳動物の組換え発現系によって適宜作られるからである。
【０１７８】
ＰＥＧ化された可溶性ＮｇＲ１ポリペプチド、アプタマーまたは抗体を調製する方法は、一般的に、（ａ）分子が１つ以上のＰＥＧ基に結合する条件下で、ＮｇＲ１アンタゴニストのポリペプチドまたは抗体を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧの反応性のエステルまたはアルデヒド誘導体など）と反応させる工程、および（ｂ）反応産物を得る工程を含む。一般的に、アシル化反応にとって最適な反応条件は、既知のパラメータおよび所望の結果に基づいてケースバイケースで決定される。例えば、タンパク質に対するＰＥＧの比が大きいほど、一般的には、ポリ−ＰＥＧ化産物の比率が高くなる。
【０１７９】
モノ−ポリマー／可溶型ＮｇＲ１ポリペプチド、ＮｇＲ１アプタマー、またはＮｇＲ１抗体の実質的に均一な集団を生成させる還元的アルキル化は、一般的には、（ａ）ポリペプチドまたは抗体のＮ末端アミノ基の選択的修飾を可能にするのに適したｐＨにて、還元的アルキル化条件下で、可溶型ＮｇＲ１タンパク質もしくはポリペプチドを反応性ＰＥＧ分子と反応させる工程、および（ｂ）反応生成物を得る工程を含む。
【０１８０】
モノ−ポリマー／ＮｇＲ１ポリペプチド、ＮｇＲ１アプタマー、またはＮｇＲ１抗体の実質的に均一な集団について、還元的アルキル化反応条件は、水溶性ポリマー部分を、ポリペプチドまたは抗体のＮ末端に選択的に結合させることができる条件である。このような反応条件は、一般的に、リジン側鎖のアミノ基とＮ末端アミノ基との間にｐＫａの差異をもたらす。本発明の目的にとって、ｐＨは、通常、３〜９、典型的には３〜６である。
【０１８１】
可溶型ＮｇＲ１のポリペプチド、アプタマー、または抗体は、タグ、例えば、タンパク質分解後に遊離することができる部分を含むことができる。したがって、まず、リジンともＮ末端とも反応するトラウト試薬（Ｔｒａｕｔ’ｓ  ｒｅａｇｅｎｔ，Ｐｉｅｒｃｅ）のような低分子量リンカーによって修飾されたＨｉｓ−タグを反応させてから、Ｈｉｓ−タグを遊離させることによって、リジン部分を選択的に修飾することができる。すると、このポリペプチドは、マレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基、または遊離型もしくは保護型のＳＨ基などのチオール反応性の頭部基を含むＰＥＧによって選択的に修飾することができる遊離ＳＨ基を含むようになる。
【０１８２】
トラウト試薬の代わりに、ＰＥＧ結合用の特定の部位を設定する任意のリンカーを用いることができる。例えば、トラウト試薬を、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡ、またはＳＡＴＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）に換えることができる。同様に、タンパク質を、マレイミド基（例えば、ＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳ、またはＧＭＢＳ）、ハロアセテート基（ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ）、またはビニルスルホン基を挿入するアミン反応性リンカーと反応させ、得られた反応産物を、遊離型ＳＨを含むＰＥＧと反応させることができるであろう。
【０１８３】
いくつかの実施形態において、ポリアルキレングリコール部分は、ＮｇＲ１アンタゴニストのポリペプチド、アプタマー、または抗体のシステイン基と結合する。結合は、例えば、マレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基、またはチオール基を用いて生じさせることができる。
【０１８４】
任意には、可溶型ＮｇＲ１アンタゴニストのポリペプチド、アプタマー、または抗体は、不安定な結合を介してポリエチレングリコール部分と結合している。この不安定な結合は、例えば、生化学的加水分解、タンパク質分解、またはスルフヒドリル切断で切断することができる。例えば、この結合は、インビボ（生理学的）条件下で切断することができる。
【０１８５】
これらの反応は、反応基がＮ末端のαアミノ基上にある場合には、通常、約ｐＨ５〜８、例えば、ｐＨ５、ｐＨ６、ｐＨ７、またはｐＨ８にて、生物活性物質を不活性ポリマーと反応させるために用いられる適当な方法によって生じさせることができる。一般的に、この過程は、活性ポリマーを調製すること、および、その後、タンパク質を活性化ポリマーと反応させて、製剤に適した可溶性タンパク質を生成することとを含む。
ＮｇＲ１ポリヌクレオチドアンタゴニスト
具体的な実施形態には、ＮｇＲ１をコードするポリヌクレオチドに特異的に結合する核酸分子を含む有効量のポリヌクレオチドアンタゴニストを投与することを含む、脱髄障害または髄鞘形成不全障害を治療する方法が含まれる。ＮｇＲ１ポリヌクレオチドアンタゴニストは、ＮｇＲ１の発現を防止（ノックダウン）する。ＮｇＲ１ポリヌクレオチドアンタゴニストには、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびＲＮＡｉなどがあるが、これらに限定されない。一般的には、このような結合分子は動物に別々に投与される（例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）参照）が、このような結合分子を、宿主細胞によって取り込まれたポリヌクレオチドからインビボで発現させたり、インビボで発現させたりすることもできる。Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）も参照。
【０１８６】
ＲＮＡｉとは、標的となるｍＲＮＡの発現を阻害するＲＮＡが発現することを意味する。具体的には、ＲＮＡｉは、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）によって特異的ｍＲＮＡ（例えば、ＮｇＲ１）と相互作用することにより、標的遺伝子を発現停止させる。すると、ｄｓＲＮＡ複合体が細胞による分解の標的となる。さらに別のＲＮＡｉ分子には、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、すなわち、低分子干渉ヘアピンなどがある。ｓｈＲＮＡ分子は、ループによって結合された標的遺伝子由来のセンス配列およびアンチセンス配列を含む。ｓｈＲＮＡは、核から細胞質へ輸送され、ｍＲＮＡとともに分解される。ＰｏｌＩＩＩプロモータまたはＵ６プロモータを用いて、ＲＮＡｉのためにＲＮＡを発現させることができる。
【０１８７】
ＲＮＡｉは、その「標的」ｍＲＮＡと配列特異的相同性を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子によって仲介される（Ｃａｐｌｅｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：９７４２−９７４７，２００１）。ショウジョウバエ無細胞ライセートにおける生化学実験によって、ＲＮＡ依存性遺伝子サイレンシングのメディエータは、２１〜２５ヌクレオチドの「低分子干渉」ＲＮＡ二重鎖（ｓｉＲＮＡ）であることが示されている。そのため、ｓｉＲＮＡ分子が、本発明の方法において有利に使用される。ｓｉＲＮＡは、ＤＩＣＥＲ（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３−３６６，２００１）として知られているＲＮａｓｅによってｄｓＲＮＡを処理して得られる。ｓｉＲＮＡ二本鎖産物は、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）と呼ばれる多タンパク質ｓｉＲＮＡ複合体に補充されると考えられる。如何なる特定の理論にも拘泥するつもりはないが、ＲＩＳＣは標的ｍＲＮＡに誘導され、そこでｓｉＲＮＡ二重鎖が配列特異的に相互作用して触媒的に切断を媒介すると考えられている（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３−３６６，２００１；Ｂｏｕｔｌａら、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １１：１７７６−１７８０，２００１）。
【０１８８】
ＲＮＡｉは、非限定的な例としてはニューロン（Ｋｒｉｃｈｅｖｓｋｙら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：１１９２６−１１９２９，２００２）などの哺乳動物細胞において遺伝子の機能を解析して必須遺伝子を確認するために利用されてきた（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５：１９９−２１３，２００２；Ｈａｒｂｏｒｔｈら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１４：４５５７−４５６５，２００１）。また、ＲＮＡｉは、治療法、例えば、非限定的に、ポリオウイルス（Ｇｉｔｌｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：３７９−３８０，２００２）およびＨＩＶ（Ｃａｐｏｄｉｃｉら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９：５１９６−５２０１，２００２）などのウイルスの感染、複製、および／または増殖を阻害もしくは遮断すること、ならびに発癌遺伝子（例えば、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子；Ｓｃｈｅｒｒら、Ｂｌｏｏｄ  １０１（４）：１５６６−９，２００２）の発現を低下させることなどについても評価されているところである。ＲＮＡｉは、哺乳類（マウス）および両生類（アフリカツメガエル）の胚（それぞれ、Ｃａｌｅｇａｒｉら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：１４２３６−１４２４０，２００２；およびＺｈｏｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０：１６６４−１６６９，２００２）において、ならびに出生後マウス（Ｌｅｗｉｓら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ５２：１０７−１０８，２００２）において遺伝子発現を調節したり、成体トランスジェニックマウスにおいて導入遺伝子の発現を低下させたり（ＭｃＣａｆｆｒｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：３８−３９，２００２）するために利用されている。細胞培養およびインビボにおいてｓｉＲＮＡの有効性および特異性を判定する方法が説明されている（例えば、Ｂｅｒｔｒａｎｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２９６：１０００−１００４，２００２；Ｌａｓｓｕｓら、Ｓｃｉ  ＳＴＫＥ  ２００２（１４７）：ＰＬ１３，２００２；およびＬｅｉｒｄａｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２９５：７４４−７４８，２００２参照）。
【０１８９】
非限定的にｓｉＲＮＡなど、ＲＮＡｉを媒介する分子は、化学合成（Ｈｏｈｊｏｈ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５２１：１９５−１９９，２００２）、ｄｓＲＮＡの加水分解（Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ＰＰ：９９４２−９９４７，２００２）によってインビトロで、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いるインビトロ転写（Ｄｏｎｚｅｅｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０：ｅ４６，２００２；Ｙｕら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ＰＰ：６０４７−６０５２，２００２）によって、および、大腸菌ＲＮａｓｅＩＩＩなどのヌクレアーゼを用いた二本鎖ＲＮＡの加水分解（Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ＰＰ：９９４２−９９４７，２００２）によって作製することができる。
【０１９０】
また、ｓｉＲＮＡ分子は、２本のオリゴヌクレオチドを互いにアニールさせて形成させることもでき、一般的には、二本鎖部分および一本鎖部分の両方を含む、以下の一般構造を有する：
【０１９１】
【化１】
2009538282.tif 000005
式中、Ｎ、ＸおよびＹはヌクレオチドであり、ＸはＹに水素結合している。「：」は２つの塩基の間の水素結合を表し、ｘは１から約１００の間の値を有する自然数であり、ｍおよびｎは、独立して、０から約１００の間の値を有する全て整数である。いくつかの実施形態において、Ｎ、ＸおよびＹはそれぞれ、Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴまたはＵである。特に合成ｓｉＲＮＡ（すなわち、２つのオリゴヌクレオチドをアニールした産物）の場合には、非天然型の塩基およびヌクレオチドが存在することもある。二本鎖の中央部は「コア」と呼ばれ、塩基対（ｂｐ）が測定単位系であるが、一本鎖部分は突出部で、ヌクレオチド（ｎｔ）が測定単位である。示されている突出部は、３’側突出であるが、５’側突出部を有する分子も、本発明の範囲に含まれる。本発明の範囲には、突出部を有さないｓｉＲＮＡ分子（すなわち、ｍ＝０かつｎ＝０）、およびコアの片側だけに突出部を有するｓｉＲＮＡ分子も含まれる（例えば、ｍ＝０かつｎ＞１、逆もまた同じ）。
【０１９２】
当初、ＲＮＡｉ技術は、哺乳動物系に容易に適用できるとは思われなかった。それは、哺乳動物では、ｄｓＲＮＡはｄｓＲＮＡ活性化プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）を活性化させて、アポトーシスカスケードおよび細胞死を引き起こすからである（Ｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：３２７９−３２８３，１９９７）。そのうえ、ｄｓＲＮＡが、哺乳動物細胞においてインターフェロンカスケードを活性化させて、細胞生理学に変化をもたらしうることが長い間知られてきたからである（Ｃｏｌｂｙら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：３３３，１９７１；Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４１：５１１，１９７２；Ｌａｍｐｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ５８Ｌ７８２，１９６７；Ｌｏｍｎｉｃｚｉら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８：５５，１９７０；およびＹｏｕｎｇｅｒら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．９２：８６２，１９６６）。しかし、ＰＫＲのｄｓＲＮＡ媒介の活性化およびインターフェロンカスケードには、約３０塩基対よりも長いｄｓＲＮＡが必要である。対照的に、長さが３０塩基対よりも短いｄｓＲＮＡは、哺乳動物細胞においてＲＮＡｉを引き起こすことが明らかになっている（Ｃａｐｌｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：９７４２−９７４７，２００１）。したがって、長いｄｓＲＮＡを実質的に含まない短いＲＮＡを調製することによって、長いｄｓＲＮＡ分子に伴う、望ましくない非特異的影響を回避することができると期待できる。
【０１９３】
ｓｉＲＮＡに関する参考文献：Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３−３６６，２００１；Ｂｏｕｔｌａら、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １１：１７７６−１７８０，２００１；Ｃｕｌｌｅｎ，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：５９７−５９９，２００２；Ｃａｐｌｅｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：９７４２−９７４７，２００１；Ｈａｍｉｌｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：９５０−９５２，１９９９；Ｎａｇａｓｅら、ＤＮＡ  Ｒｅｓ．６：６３−７０，１９９９；Ｎａｐｏｌｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：２７９−２８９，１９９０；Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ  １３：６７−７３，２００２；Ｐａｒｒｉｓｈら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ６：１０７７−１０８７，２０００；Ｒｏｍａｎｏら、ＭｏＩ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５：３３４３−３３５３，１９９２；Ｔａｂａｒａら、Ｃｅｌｌ  ９９：１２３−１３２，１９９９；およびＴｕｓｃｈｌ，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．２：２３９−２４５，２００１。
【０１９４】
Ｐａｄｄｉｓｏｎら（Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．７５：９４８−９５８，２００２）は、ＲＮＡｉをもたらす手段として、ヘアピン型に折り畳まれた低分子ＲＮＡ分子を使用している。その結果、そのように短いヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子も、本発明の方法において有利に使用される。機能的なｓｈＲＮＡのステムおよびループの長さは変動する。すなわち、ステムの長さは約２５から約３０ｎｔのいずれであってもよく、またループのサイズは、発現停止活性に影響を与えない４〜約２５ｎｔの間であればよい。特定の理論に拘泥するつもりはないが、これらのｓｈＲＮＡは、ＤＩＣＥＲ  ＲＮａｓｅのｄｓＲＮＡ産物に類似し、いずれにしても、特定の遺伝子の発現を阻害する同様の能力をもつと考えられている。
【０１９５】
いくつかの実施形態において、本発明は、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡがＮｇＲ１の発現を阻害すると規定している。いくつかの実施形態において、本発明は、さらに、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、ＣＵＡＣＵＵＣＵＣＣＣＧＣＡＧＧＣＧＡ（配列番号：８）またはＣＣＣＧＧＡＣＣＧＡＣＧＵＣＵＵＣＡＡ（配列番号：１０）またはＣＵＧＡＣＣＡＣＵＧＡＧＵＣＵＵＣＣＧ（配列番号：１２）を含むヌクレオチド配列と少なくとも８０％、９０％、または９５％同一であると規定している。別の実施形態においては、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのヌクレオチド配列はＣＵＡＣＵＵＣＵＣＣＣＧＣＡＧＧＣＧＡ（配列番号：８）またはＣＣＣＧＧＡＣＣＧＡＣＧＵＣＵＵＣＡＡ（配列番号：１０）もしくはＣＵＧＡＣＣＡＣＵＧＡＧＵＣＵＵＣＣＧ（配列番号：１２）である。
【０１９６】
いくつかの実施形態において、本発明は、さらに、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのヌクレオチド配列が、ポリヌクレオチド配列のＧＡＴＧＡＡＧＡＧＧＧＣＧＴＣＣＧＣＴ（配列番号：９）またはＧＧＧＣＣＴＧＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＴＴ（配列番号：１１）またはＧＡＣＴＧＧＴＧＡＣＴＣＡＧＡＡＧＧＣ（配列番号：１３）によって産生されるｍＲＮＡに相補的であると規定している。
【０１９７】
本発明のいくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡはレンチウイルスベクターから発現される。
【０１９８】
修飾（塩基、糖および／またはリン酸）を有する核酸分子を化学的に合成することで、それらが血清リボヌクレアーゼによって分解されるのを防ぐことができ、それらの有効性を高めることができる（例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎら、ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：５６５（１９９０）；Ｐｉｅｋｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：３１４（１９９１）；ＵｓｍａｎおよびＣｅｄｅｒｇｒｅｎ、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７：３３４（１９９２）；Ｕｓｍａｎら、ＷＯ９３／１５１８７号；およびＲｏｓｓｉら、ＷＯ９１／０３１６２；Ｓｐｒｏａｔ、米国特許第５，３３４，７１１号；Ｇｏｌｄら、米国特許第６，３００，０７４号；およびＢｕｒｇｉｎら、上掲を参照。これらの文献は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）。上記の文献はすべて、本明細書に記載されている核酸分子の塩基部分、リン酸部分、および／または糖部分に加えることができる、さまざまな化学的修飾を説明している。細胞内で効力を高める修飾、および核酸から塩基を除去して、オリゴヌクレオチドの合成時間を短縮し、かつ化学的必要条件を減らすことが望ましい。
【０１９９】
当技術分野には、ヌクレアーゼ安定性と効力とを顕著に向上させながら、核酸分子に導入することができる、糖、塩基、およびリン酸の修飾を説明している例がいくつかある。例えば、オリゴヌクレオチドを修飾して、例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｈなどのヌクレアーゼ耐性基による修飾、すなわち、ヌクレオチド塩基修飾によって安定性を高め、および／または生物活性を高める（概説については、ＵｓｍａｎおよびＣｅｄｅｒｇｒｅｎ，ＴＩＢＳ．１７：３４（１９９２）；Ｕｓｍａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１：１６３（１９９４）；Ｂｕｒｇｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：１４０９０（１９９６）を参照）。核酸分子の糖鎖修飾については、当技術分野において広範に説明されている（ｓｅｅ  Ｅｃｋｓｔｅｉｎら、ＰＣＴ国際公開番号：：ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：５６５−５６８（１９９０）；Ｐｉｅｋｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：３１４−３１７（１９９１）；ＵｓｍａｎおよびＣｅｄｅｒｇｒｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ  １７：  ３３４−３３９（１９９２）；Ｕｓｍａｎら、ＰＣＴ国際公開番号：：ＷＯ９３／１５１８７；Ｓｐｒｏａｔ、米国特許第５，３３４，７１１号およびＢｅｉｇｅｌｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２５１０２（１９９５）；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら、ＰＣＴ国際公開番号：：ＷＯ９７／２６２７０；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら、米国特許第５，７１６，８２４号；Ｕｓｍａｎら、米国特許第５，６２７，０５３号；Ｗｏｏｌｆら、ＰＣＴ国際公開番号：：ＷＯ９８／１３５２６；Ｋａｒｐｅｉｓｋｙら、１９９８，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３９：１１３１（１９９８）；ＥａｒｎｓｈａｗおよびＧａｉｔ、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）４８：３９−５５（１９９８）；ＶｅｒｍａおよびＥｃｋｓｔｅｉｎ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：９９−１３４（１９９８）；ならびにＢｕｒｌｉｎａら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５：１９９９−２０１０（１９９７）を参照。これらの文献は、本明細書において参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）。このような刊行物は、触媒を調節することなしに糖、塩基、および／またはリン酸の修飾などを核酸分子に組み込む位置を決定するための一般的な方法および戦略を説明しており、参照により本明細書に組み込まれる。このような記載から、本明細書に記載されているように、同じような修飾を用いて、細胞においてＲＮＡｉを促進するｓｉＲＮＡの能力が顕著に阻害されない限り、本発明のｓｉＲＮＡ核酸分子を修飾することができる。
【０２００】
本発明は、１つ以上のホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、モルホリノ、アミド化カルバメート、カルボキシメチル、アセトアミド酸、ポリアミド、スルホン酸、スルホアミド、スルファミン酸、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、および／またはアルキルシリルの置換を含むリン酸骨格の修飾を有する、修飾ｓｉＲＮＡを特徴とする。オリゴヌクレオチド骨格の修飾の概説については、ＨｕｎｚｉｋｅｒおよびＬｅｕｍａｎｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｉｎ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ＶＣＨ，３３１−４１７（１９９５）、およびＭｅｓｍａｅｋｅｒら、Ｎｏｖｅｌ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ｉｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＡＣＳ，２４−３９（１９９４）を参照。
【０２０１】
ホスホロチオエートおよび／または５’−メチルホスホネートによる、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合の化学的修飾は、安定性を向上させるが、過度の修飾は毒性を生じたり、活性を減少させたりすることがある。したがって、核酸分子を設計する際には、これらのヌクレオチド間結合の量を最小にする必要がある。これらの結合の濃度が減少すると毒性が低下し、その結果、これらの分子の効力が増進し、特異性が高まるはずである。
【０２０２】
活性を維持または増強する化学的修飾を有するｓｉＲＮＡ分子が提供される。このような核酸も、一般的には、非修飾核酸よりもヌクレアーゼに対して抵抗性である。その結果、インビトロおよび／またはインビボでの活性が有意には低下しないはずである。調節することが目的である場合、外部から送達される治療用核酸分子は、標的ＲＮＡの翻訳を、望ましくないタンパク質の量が減少するのに十分長く調節して、細胞内で最適に安定している必要がある。この期間は、病状に依存して数時間から数日間まで変動する。ＲＮＡおよびＤＮＡの化学合成法が改良されたため（Ｗｉｎｃｏｔｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：２６７７（１９９５）；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２１１：３−１９（１９９２）（これらは参照により本明細書に組み込まれる））、上記したように、ヌクレオチド修飾を導入してそのヌクレアーゼ安定性を高めることによって、核酸分子を修飾する能力が拡大した。
【０２０３】
本発明のポリヌクレオチドは、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のＧ−クランプヌクレオチドを含むことができる。Ｇ−クランプヌクレオチドは修飾シトシンのアナログであり、修飾によって二重鎖内部にある相補的なグアニンのワトソン−クリック型の面でもフーグスティーン型の面でも水素結合させることできるようになっている。例えば、ＬｉｎおよびＭａｔｔｅｕｃｃｉ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０：８５３１−８５３２（１９９８）参照。オリゴヌクレオチド内部での単一のＧ−クランプアナログの置換によって、らせん構造の熱安定性が実質的に高まり、相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズした場合、ミスマッチを識別しやすくなっている。本発明のポリヌクレオチドにこのようなヌクレオチドが含まれていると、核酸標的、相補配列、または鋳型鎖に対する親和性および特異性が向上する。本発明のポリヌクレオチドは、２’，４’−Ｃミチレンビシクロヌクレオチド（ｍｙｔｈｙｌｅｎｅ  ｂｉｃｙｃｌｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）など、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のＬＮＡ、すなわち「ロックト核酸」のヌクレオチドも含むことができる（例えば、Ｗｅｎｇｅｌら、ＰＣＴ国際公開番号：ＷＯ００／６６６０４およびＷＯ９９／１４２２６を参照）。
【０２０４】
本発明は、本発明のｓｉＲＮＡ分子の結合体および／または複合体も特徴とする。そのような結合体および／または複合体を用いて、細胞などの生体系へのｓｉＲＮＡ分子の送達を促進することができる。本発明によって提供される結合体および複合体は、細胞膜を通過して治療化合物を移動させること、薬物動態を変えること、および／または本発明の核酸分子の局在性を調節することによって治療活性を与えることができる。本発明は、細胞膜を通過して、低分子、脂質、リン脂質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、抗体、毒素、負荷電ポリマーおよびその他のポリマー、例えば、タンパク質、ペプチド、ホルモン、炭水化物、ポリエチレングリコール、またはポリアミンなどの分子を送達するための新規の結合体および複合体を設計することおよび合成することを含む。一般的には、記載の輸送体は、分解性リンカーの有無を問わず、個別または多成分系の一部のいずれかとして用いられるように設計されている。これらの化合物は、血清の有無を問わず、さまざまな組織に由来する多くの細胞型への本発明の核酸分子の送達および／または局在性を改善すると期待されている（ＳｕｌｌｅｎｇｅｒおよびＣｅｃｈ、米国特許第５，８５４，０３８号参照）。本明細書に記載されている分子の結合体は、生物分解性のリンカー、例えば、生物分解性核酸リンカー分子などを介して生物活性分子に結合させることができる。
【０２０５】
外部から最適に送達される治療用ポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ分子）は、ＲＮＡ転写物の量が減少するのに十分長くＲＮＡの逆転写を調節して、細胞内部で安定的している。有効な細胞内治療薬として機能するためには、核酸分子はヌクレアーゼに抵抗性をもつ。本発明および当技術分野において記載されている核酸分子の化学合成法の改善によって、上記したようなヌクレオチド修飾を導入してそのヌクレアーゼ安定性を高めることによって核酸分子を修飾する能力が拡張されてきた。
【０２０６】
また、本発明は、ＲＮＡｉに関与するタンパク質の酵素活性を維持しまたは高める化学修飾を有するｓｉＲＮＡ分子も提供する。このような核酸も、一般的には、非修飾核酸よりもヌクレアーゼに抵抗性である。したがって、インビトロおよび／またはインビボにおいて活性は顕著に低下しないはずである。
【０２０７】
本発明のポリヌクレオチドベースの分子を使用すれば、併用療法（例えば、さまざまな遺伝子を標的とする複数のｓｉＲＮＡ分子；既知の低分子モジュレータに結合した核酸分子；または、さまざまなモチーフおよび／またはその他の化学合成分子もしくは生体分子などの分子の併用による間歇的治療）の可能性を与えることによって疾患の進行により良好に対処できるようになるであろう。また、ｓｉＲＮＡ分子による被験体の治療も、さまざまなタイプの核酸分子、例えば、酵素的核酸分子（リボザイム）、アロザイム、アンチセンス、２，５−Ａオリゴアデニル酸、デコイ、アプタマーなどを併用することを含みうる。
【０２０８】
別の態様において、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、１つ以上の５’キャップ構造および／または３’キャップ構造を、例えば、センスｓｉＲＮＡ鎖、アンチセンスｓｉＲＮＡ鎖、または両ｓｉＲＮＡ鎖のみに含むことができる。「キャップ構造」とは、オリゴヌクレオチドのどちらかの末端に組み込まれている化学修飾を意味する（例えば、Ａｄａｍｉｃら、米国特許第５，９９８，２０３号参照。これは参照により本明細書に組み込まれる）。これらの末端修飾は、エキソヌクレアーゼによる分解から核酸分子を保護し、かつ細胞内における送達および／または局在化を助けることができる。キャップは、５’末端に存在すること（５’−キャップ）も、３’末端に存在すること（３’−キャップ）も、両末端に存在することも可能である。非限定的な例において：５’−キャップは、逆位型（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）脱塩基残基（部分）；４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（β−Ｄ−エリトロフラノシル）ヌクレオチド；４’−チオヌクレオチド；炭素環ヌクレオチド；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ型ヌクレオチド；α−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート結合；トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−ｓｅｃｏヌクレオチド；非環式３’，４’−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；非環式３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド；３’，３’−逆位ヌクレオチド部分；３’，３’−逆位型脱塩基部分；３’，２’−逆位型ヌクレオチド部分；３’，２’−逆位型脱塩基成分；１，４−ブタンジオールホスフェート；３’−ホスホルアミデート；ヘキシルリン酸；アミノヘキシルリン酸；３’−リン酸；３’−ホスホロチオエート；ホスホロジチオエート；または架橋型もしくは非架橋型のメチルホスホン酸からなる群から選択される。
【０２０９】
３’−キャップは、４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（β−Ｄ−エリトロフラノシル）ヌクレオチド；４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド；５’−アミノ−アルキルホスフェート；１，３−ジアミノ−２−プロピルホスフェート；３−アミノプロピルホスフェート；６−アミノヘキシルホスフェート；１，２−アミノドデシルホスフェート；ヒドロキシプロピルホスフェート：１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ型ヌクレオチド；α−ヌクレオチド；修飾塩基型ヌクレオチド；ホスホロジチオエート；トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−ｓｅｃｏヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド；５’，５’−逆位型ヌクレオチド部分；５’，５’−逆位型脱塩基部分；５’−ホスホルアミデート；５’−ホスホロチオエート；１，４−ブタンジオールホスフェート；５’−アミノ；架橋型および／または非架橋型の５’−ホスホルアミデート、ホスホロチオエートおよび／またはホスホロジチオエート、架橋型または非架橋型のメチルホスホン酸、ならびに５’−メルカプト成分（さらに詳しくはＢｅａｕｃａｇｅおよびＩｙｅｒ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９：１９２５（１９９３）参照。この文献は参照により、本明細書に組み込まれる）。
【０２１０】
核酸ｓｉＲＮＡ構造体にさまざまな修飾を加えて、これらの分子の有用性を高めることができる。このような修飾によって、保存期間、インビトロでの半減期、安定性が増し、例えば、細胞膜の透過を促進するために、このようなオリゴヌクレオチドを標的部位に導入することを容易にし、また、標的細胞を認識してそれに結合する能力を与える。
【０２１１】
アンチセンス技術を利用して、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡによって、または三重らせん形成によって遺伝子発現を調節することができる。アンチセンス技術は、例えば、Ｏｋａｎｏ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）で検討されている。三重らせん形成は、例えば、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：３０１３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：１３００（１９９１）で検討されている。これらの方法は、ポリヌクレオチドの相補的なＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づいている。
【０２１２】
例えば、コードするポリヌクレオチドの５’コード部分を利用して、長さが約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計することができる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、転写に関与する遺伝子領域に相補的になるよう設計し、それによって標的タンパク質の転写および産生を妨げる。このアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡとハイブリダイズして、ｍＲＮＡ分子が標的ポリペプチドに翻訳されるのを阻止する。
【０２１３】
一実施形態において、本発明の方法で使用するための、ＮｇＲ遺伝子に特異的なアンチセンス核酸は、外来配列からの転写によって細胞内部で産生される。例えば、ベクターまたはその一部は、転写されてアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を産生する。このようなベクターは、転写されて所望のアンチセンスＲＮＡを産生することができる限り、エピソームのままでいても、染色体に組み込まれてもよい。このようなベクターは、当技術分野において標準的な組換えＤＮＡ技術的方法によって構築することができる。ベクターはプラスミド、ウイルス、またはその他当技術分野において既知のものであり、脊椎動物細胞内で複製および発現させるために用いられる。アンチセンス分子の発現は、脊椎動物細胞、好ましくはヒト細胞、例えば、本明細書の別の箇所に記載れているものなどで作用する、当技術分野において既知のプロモータによればよい。
【０２１４】
アンチセンス分子の絶対的な相補性は好ましいが必要ではない。ＮｇＲ１をコードするＲＮＡの少なくとも一部に相補的な配列は、このＲＮＡとハイブリダイズして安定的な二本鎖を形成するのに十分な相補性を有する配列を意味する。あるいは、三本鎖の形成をアッセイすることもできる。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さに依存するであろう。一般的には、ハイブリダイズする核酸が大きいほど、多くの塩基ミスマッチを含んでも安定した二本鎖（場合によっては三本鎖）を形成することができる。当業者はハイブリダイズした複合体の融点を測定する標準的な手法を用いて、許容可能なミスマッチの程度を確かめることができる。
【０２１５】
メッセンジャーＲＮＡの５’末端、例えば、ＡＵＧ開始コドンまでの、またはこれを含む５’側非翻訳配列に相補的なオリゴヌクレオチドは、翻訳を阻害するのに最も効率的に役立つはずである。しかし、ｍＲＮＡの３’側非翻訳配列に相補的な配列も、ｍＲＮＡの翻訳の阻害に効果があることが示されている。一般的には、Ｗａｇｎｅｒ．Ｒ、Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：３３３−３３５（１９９４）参照。このように、５’側または３’側いずれかの非翻訳領域、すなわち非コード領域に相補的なヌクレオチドをアンチセンス法で利用して、ＮｇＲ１の翻訳を阻害することができるであろう。ｍＲＮＡの５’側非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの相補部分を含む必要がある。ｍＲＮＡのコード領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、あまり効率的な翻訳インヒビタではないが、本発明に基づいて使用することができよう。アンチセンス核酸は長さが少なくとも６ヌクレオチドである必要があるが、好ましくは長さが６〜約５０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドである。具体的な態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、または少なくとも５０ヌクレオチドである。
【０２１６】
下記のアプタマーなど、本明細書に開示されている治療法で使用するためのポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはそのキメラ混合物もしくは誘導体もしくは修飾体であってもよい。また、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。オリゴヌクレオチドは、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを改善するために、塩基部分、糖部分、またはリン酸部分を修飾することができる。オリゴヌクレオチドは、ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞受容体を標的するためのもの）、細胞膜を通過する輸送を促進する因子（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３−６５５６（１９８９）；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８−６５２（１９８７））；１９８８年１２月１５日に公開されたＰＣＴ国際公開番号：ＷＯ８８／０９８１０参照）、血液脳関門を通過する輸送を促進する因子（例えば、１９８８年４月２５日に公開されたＰＣＴ国際公開番号：ＷＯ８９／１０１３４参照）、ハイブリダイゼーションによって誘発される切断因子（例えば、Ｒｒｏｌら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８−９７６（１９８８））など、または挿入剤（例えば、Ｚｏｎ、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９（１９８８））など、他の付加基を含むことができる。この目的を達成するためには、オリゴヌクレオチドを別の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーションによって誘発される架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーションによって誘発される切断剤などと結合させてもよい。
【０２１７】
アプタマーなど、本明細書に開示されている治療法で使用するためのポリヌクレオチドは、以下の群から選択されるが、それらに限定されない、少なくとも１つの修飾塩基部分を含むことができる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルケオシン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ−６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ−６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトオキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン、５’メトオキシカルボキシメチルウラシル、５−メトオキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ−６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３（３−アミノ−３−Ｎ２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。
【０２１８】
また、アプタマーなど、本明細書に開示されている治療法で使用するためのポリヌクレオチドは、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソースなどを含む群から選択される、少なくとも１つの修飾された糖部分を含むこともできる。
【０２１９】
さらに別の実施形態において、本明細書に開示されている治療法で使用するためのアプタマーなどのポリヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホルムアセタール、またはそれらのアナログなどを含む群から選択される、少なくとも１つの修飾されたリン酸骨格を含む。
【０２２０】
さらに別の実施形態において、本明細書に開示されている治療法で使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、α−アノマーオリゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的なＲＮＡと、通常の状況とは逆に、鎖が互いに並行している特異的な二本鎖ハイブリッドを形成する（Ｇａｕｔｉｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１（１９８７））。このオリゴヌクレオチドは２’−０−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．７５：６１３１−６１４８（１９８７））、またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０（１９８７））である。
【０２２１】
本発明の方法で使用するための、アプタマーなどのポリヌクレオチドは、当技術分野で既知の標準的な方法によって、例えば、自動ＤＮＡ合成装置（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどから市販されているものなど）を用いて合成することができる。例としては、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを、Ｓｔｅｉｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３２０９（１９８８）の方法によって合成することができ、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドを、制御細孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）ポリマー支持体を用いて調製することができる（Ｓａｒｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：７４４８−７４５１（１９８８））。
【０２２２】
本明細書に開示されている治療法で使用するためのポリヌクレオチド組成物は、さらに、触媒性ＲＮＡ、すなわちリボザイムを含む（例えば、１９９０年１０月４日公開のＰＣＴ国際公開番号：ＷＯ９０／１１３６４；Ｓａｒｖｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１２２２−１２２５（１９９０参照）。ハンマーヘッド型リボザイムを使用することが好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補塩基対を形成する隣接領域によって決定される部位でｍＲＮＡを切断する。唯一必要なのは、標的ｍＲＮＡが次のような２つの塩基からなる配列：５’−ＵＧ−３’を有することである。ハンマーヘッド型リボザイムの構築および製造は当技術分野で周知されており、ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９１（１９８８）により詳細に説明されている。好ましくは、リボザイムは、切断認識部位が標的ｍＲＮＡの５’末端付近に位置するように、すなわち、効率を向上させ、かつ非機能的なｍＲＮＡ転写物が細胞内に蓄積するのを最小化するように設計される。
【０２２３】
アンチセンス法と同様、本明細書に開示されている診断法および治療法で使用するためのリボザイムは、修飾オリゴヌクレオチド（例えば、安定性、ターゲティングを向上させるため）から構成され、インビボで発現する細胞に送達することができる。リボザイムをコードするＤＮＡコンストラクトを、アンチセンスをコードするＤＮＡの導入について上記したやり方と同じ方法で細胞に導入することができる。好適な送達法は、形質転換された細胞が、内因性メッセージを破壊して翻訳を阻害するのに十分な量のリボザイムを産生するよう、リボザイムを、強力な構成的プロモータ、例えば、ｐｏｌ  ＩＩＩプロモータまたはｐｏｌ  ＩＩプロモータなどの制御下で「コード」するＤＮＡコンストラクトを使用することを含む。アンチセンス分子とは異なり、リボザイムには触媒作用があるため、より低い細胞内濃度が効率にとっては必要である。
アプタマー
別の実施形態において、本発明の方法で使用するためのＮｇＲ１アンタゴニストはアプタマーである。アプタマーは、ユニークな配列を有し、所望の標的（例えば、ポリペプチド）に特異的に結合する性質を有し、かつ所定の標的の特異的リガンドであるヌクレオチドまたはポリペプチドである。本発明のヌクレオチドアプタマーには、ＮｇＲ１に結合する二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＲＮＡなどがある。
【０２２４】
核酸アプタマーは、当技術分野において既知の方法を用いて、例えば、指数関数的濃縮によるリガンドの系統的発生（ＳＥＬＥＸ）法によって選択される。ＳＥＬＥＸ法とは、例えば、米国特許第５，４７５，０９６号、第５，５８０，７３７号、第５，５６７，５８８号、第５，７０７，７９６号、第５，７６３，１７７号、第６，０１１，５７７号、および第６，６９９，８４３号に記載されているような、標的分子に対して高度に特異的に結合する核酸分子をインビトロで進化させる方法である。上記特許は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。アプタマーを確認するための別のスクリーニング法が米国特許第５，２７０，１６３号に記載されている（これも参照により本明細書に組み込まれる）。ＳＥＬＥＸ法は、核酸が、モノマーであってもポリマーであっても、別の核酸分子およびポリペプチドなど、実質的に如何なる化合物ともリガンドとして働く（特異的な結合対を形成する）ためのさまざまな二次元および三次元の構造体を形成する核酸の能力、およびヌクレオチドモノマー内で利用可能な化学的な多用途性に基づいている。いかなるサイズまたは組成の分子であっても、標的として作用する。
【０２２５】
ＳＥＬＥＸ法は、所望の結合親和性および結合選択性を達成するために、候補オリゴヌクレオチドの混合物から選択すること、および同じ一般的な選択法を用いて、結合、分離、および増幅の工程を段階的に反復することを含む。好ましくはランダム化された配列のセグメントを含む核酸混合物から出発して、ＳＥＬＥＸ法は、この混合物を、結合に有利な条件下で標的に接触させる工程；標的分子に特異的に結合している核酸から非結合核酸を分離する工程；核酸−標的複合体を解離させる工程；核酸−標的複合体から解離した核酸を増幅して、リガンドを多く含む核酸混合物を得る工程を含む。結合、分離、解離、および増幅の各工程を所望のサイクル繰り返し続けて、標的分子に対し高度に特異的で高親和性の核酸リガンドを得る。
【０２２６】
ヌクレオチドアプタマーは、例えば、診断ツール、または細胞内シグナル伝達および輸送経路を細かく分析するための特異的インヒビタとして利用することができる（Ｊａｍｅｓ（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１：５４０−５４６）。ヌクレオチドアプタマーは、親和性および特異性が高いため、創薬にとって優れた候補物質となっている。例えば、毒素であるリシンに対するアプタマーアンタゴニストが単離されており、そのＩＣ５０値はナノモル範囲にある（Ｈｅｓｓｅｌｂｅｒｔｈ  ＪＲら（２０００）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５：４９３７−４９４２）。ヌクレオチドアプタマーを、感染症、悪性腫瘍、およびウイルス表面タンパク質に使用して、細胞への感染を低減することもできる。
【０２２７】
本発明の方法で使用するための核酸アプタマーは、本明細書で他のポリヌクレオチドについて記載されているように修飾することができる（例えば、骨格もしくは塩基を修飾すること、またはペプチドに結合されることによる）。
【０２２８】
ＮｇＲ１のタンパク質構造を利用すれば、ＳＥＬＥＸプロセスを用いた、ＮｇＲ１に作用するアプタマーのスクリーニングによって、ＮｇＲ１媒介プロセス（例えば、ＮｇＲ１媒介の、軸索再生の阻害）を阻害するアプタマーを同定することが可能になろう。
【０２２９】
本発明の方法で使用するためのポリペプチドアプタマーは、ＮｇＲ１に結合して、その作用を阻止する能力について選択されたランダムなペプチドである。ポリペプチドアプタマーは、両端でタンパク質の足場に結合している、短い可変ペプチドドメインを含むことがある。この二重の構造上の制約によって、ペプチドアプタマーの結合親和性は、抗体に匹敵するレベルにまで大きく増加する（ナノモル範囲）。例えば、Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ  Ｆ  ら（２０００）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ７８（８）：４２６−４３０参照。短い可変ペプチドの長さは、一般的には、約１０〜２０アミノ酸であり、足場は、良好な溶解特性および緻密特性を有する任意のタンパク質であろう。足場タンパク質の非限定的な一例は細菌タンパク質のチオレドキシンＡである。例えば、Ｃｏｈｅｎ  ＢＡら、（１９９８）ＰＮＡＳ  ９５（２４）：１４２７２−１４２７７参照。
【０２３０】
ポリペプチドアプタマーとは、タンパク質機能の主なインヒビタとして働くペプチドまたは低分子ポリペプチドある。ペプチドアプタマーは標的タンパク質に特異的に結合して、その機能的能力を阻止する（Ｋｏｌｏｎｉｎら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：１４，２６６−１４，２７１）。標的タンパク質と高い親和性および特異性で結合するペプチドアプタマーは、当技術分野周知の技術によって単離することができる。ペプチドアプタマーは、酵母ツーハイブリッドスクリーニング法（Ｘｕ，Ｃ．Ｗ．ら、（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：１２，４７３−１２，４７８）によって、またはリボソームディスプレイ法（Ｈａｎｅｓら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：４９３７−４９４２）によってランダムペプチドライブラリーから単離することができる。それらは、ファージライブラリー（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．ら（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：１−２０）または化学合成ペプチドライブラリーから単離することもできる。また、ポリペプチドアプタマーは、リガンドに調節されるペプチドアプタマー（ＬｉＲＰＡ）の選択を利用して選択することができる。例えば、Ｂｉｎｋｏｗｓｋｉ，ＢＦら（２００５）Ｃｈｅｍ  ＆  Ｂｉｏｌ  １２（７）：８４７−８５５参照、これは参照により本明細書に組み込まれる。ペプチドアプタマーを合成する手段が難しいため、それらの使用は、ポリヌクレオチドアプタマーよりも複雑であるが、それらには無限の化学的多様性がある。ポリヌクレオチドアプタマーは４種類のヌクレオチド塩基しか利用しないために限界があるが、ペプチドアプタマーならば、ずっと広範なレパートリーをもつであろう（すなわち、２０種類のアミノ酸）。
【０２３１】
本発明の方法で使用するためのペプチドアプタマーは、本明細書の別の箇所で別のポリペプチドについて記載されているように、修飾することができる（例えば、ポリマーと結合され、またはタンパク質に融合されることによる）。
ベクター
ＮｇＲ１アンタゴニストをコードする核酸を含むベクターを用いて、本発明の方法で使用するためのＮｇＲ１アンタゴニストを産生することができる。このような核酸が機能できるように結合しているベクターおよび発現調節配列の選択は、所望の機能特性、例えば、タンパク質発現、および形質転換させる宿主細胞に依存する。
【０２３２】
操作可能に結合したコード配列の発現を制御するのに有用な発現調節因子が当技術分野で知られている。その例には、誘導性プロモータ、構成的プロモータ、分泌シグナル、およびその他の制御要素などがある。誘導性プロモータを使用する場合、例えば、宿主細胞の培地の栄養状態の変化または温度変化によって、これを調節することができる。
【０２３３】
ベクターは、原核生物のレプリコン、すなわち、細菌宿主細胞において染色体外で組換えＤＮＡ分子の自己複製および維持を指令できるＤＮＡ配列を含むことができる。このようなレプリコンは当技術分野でよく知られている。また、原核生物のレプリコンを含むベクターは、その発現によって薬物耐性などの検出可能なマーカーを付与する遺伝子も含むことができる。細菌の薬物耐性遺伝子の例には、アンピシリンおよびテトラサイクリンに対する耐性を付与する遺伝子である。
【０２３４】
原核生物のレプリコンを含むベクターは、細菌宿主細胞内でコード遺伝子配列の発現を指令する、原核生物またはバクテリオファージのプロモータを含むこともできる。細菌宿主に適合可能なプロモータ配列は、一般的に、発現させるべきＤＮＡ断片の挿入に便利な制限部位を含むプラスミドベクターに提供されている。このようなプラスミドベクターの例は、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９，ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９（登録商標ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ｐＰＬおよびｐＫＫ２２３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）である。適当な任意の原核宿主細胞を用いて、本発明の方法で使用するタンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子を発現させることができる。
【０２３５】
本発明の目的にとっては、多数の発現ベクター系を利用することができる。例えば、１つのクラスのベクターは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶまたはＭＯＭＬＶ）またはＳＶ４０ウイルスなどの動物ウイルスに由来するＤＮＡ要素を利用する。他は、内部にリボソーム結合部位を有する多シストロン系の使用を含む。さらに、その染色体内にＤＮＡが組み込まれた細胞を、形質転換宿主細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカーを導入することによって選択することができる。マーカーは、栄養要求性の宿主に原栄養性を、また殺生物剤（例えば、抗生物質）耐性、または銅などの重金属に対する耐性を提供することができる。選択可能なマーカー遺伝子は、発現させるＤＮＡ配列に直接結合させるか、または同時形質転換によって同じ細胞に導入することができる。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子は、選択可能なマーカー遺伝子の一例である（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、Ｊ．ＭｏＩ．Ａｎａｌ．Ｇｅｎｅｔ．７：３２７−３４１（１９８２））。ｍＲＮＡを最適に合成するためには、さらに別の要素も必要である場合がある。そのような要素は、転写プロモータ、エンハンサ、および終止シグナル以外に、シグナル配列、スプライスシグナルなどを含み得る。
【０２３６】
一実施形態において、ＮＥＯＳＰＬＡ（米国特許第６，１５９，７３０号）と呼ばれる、Ｂｉｏｇｅｎ  ＩＤＥＣ，Ｉｎｃ．，の専有発現ベクターを使用することができる。このベクターは、サイトメガロウイルスのプロモータ／エンハンサ、マウスβグロビンの主要プロモータ、ＳＶ４０複製開始点、ウシ成長ホルモンのアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのエキソン１およびエキソン２、ジヒドロ葉酸還元酵素の遺伝子およびリーダー配列を含む。このベクターは、ＣＨＯ細胞に形質転換すると非常な高発現をもたらすことが分かっており、その後Ｇ４１８含有倍地中で選択し、メトトレキサート増幅する。いうまでもなく、本発明においては、真核細胞において発現を誘発できる任意の発現ベクターを使用することができる。適当なベクターの例は、ｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦｌ／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｒｏ−ＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸｌ、およびｐＺｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから発売）などのプラスミド、ならびにｐＣＩプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから発売）などであるが、これらに限定されない。さらなる真核細胞発現ベクターが当技術分野において知られており、市販されている。一般的には、このようなベクターは、所望のＤＮＡ断片を挿入するのに便利な制限部位を含んでいる。代表的なベクターには、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢＰＶ−１、ｐｍｌ２ｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ  ３１２５５）、レトロウイルス発現ベクターｐＭＩＧおよびｐＬＬ３．７、アデノウイルスシャトルベクターｐＤＣ３１５、ならびにＡＡＶベクターなどがある。その他のベクター系の例は、例えば、米国特許第６，４１３，７７７号に開示されている。
【０２３７】
一般的に、適切に大量のアンタゴニストを発現する細胞を得るために、数多くの形質転換細胞をスクリーニングすることは、例えば、ロボットシステムによって行うことができる日常的な実験である。
【０２３８】
哺乳動物宿主細胞での発現にしばしば使用される制御配列は、哺乳動物細胞において高レベルのタンパク質発現を指令するウイルス要素、例えば、以下のウイルスに由来するプロモータおよびエンハンサ：レトロウイルスＬＴＲ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶプロモータ／エンハンサなど）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（ＳＶ４０プロモータ／エンハンサなど）、アデノウイルス、（例えば、アデノウイルス主要後期プロモータ（ＡｄｍｌＰ））、ポリオーマ；ならびに天然型の免疫グロブリンプロモータおよびアクチンプロモータなどの強力な哺乳動物プロモータなどである。ウイルス制御要素およびその配列についてのさらに詳しい説明については、例えば、Ｓｔｉｎｓｋｉ、米国特許第５，１６８，０６２号；Ｂｅｌｌ、米国特許第４，５１０，２４５号；およびＳｃｈａｆｆｈｅｒ、米国特許第４，９６８，６１５号参照。
【０２３９】
組換え発現ベクターは、宿主細胞内でベクターの複製を制御する配列（例えば、複製開始点）および選択可能なマーカー遺伝子を有することができる。選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする（例えば、Ａｘｅｌ、米国特許第４，３９９，２１６号；第４，６３４，６６５号および第５，１７９，０１７号参照）。例えば、一般的には、選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入された細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、およびメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する。頻繁に使用される選択可能なマーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（ｄｈｆｒ−宿主細胞において使用し、メトトレキサート選択／増幅を行う）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）などがある。
【０２４０】
ＮｇＲ１アンタゴニストをコードするベクターを、適当な宿主細胞の形質転換に用いることができる。形質転換は、任意の適切な方法であればよい。哺乳動物細胞に外因性ＤＮＡを導入する方法が当技術分野においてよく知られており、デキストラン媒介の形質転換法、リン酸カルシウム沈殿法、ポリブレン媒介の形質転換法、プロトプラスト融合法、電気穿孔法、リポソーム内にポリヌクレオチドを封入する法、および核内へのＤＮＡの直接顕微注入法などがある。さらに、ウイルスベクターによって核酸分子を哺乳動物細胞に導入することができる。
【０２４１】
宿主細胞の形質転換は、使用されるベクターおよび宿主細胞に適した従来の技術によって行うことができる。原核宿主細胞を形質転換するには、電気穿孔法および塩処理法を用いることができる（Ｃｏｈｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：２１１０−１４（１９７２））。脊椎動物細胞の形質転換には、電気穿孔法、カチオン性脂質処理法、または塩処理法を用いることができる。例えば、Ｇｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６−４６７（１９７３）；Ｗｉｇｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：１３１３−７６（１９７９）を参照。
【０２４２】
タンパク質発現に用いられる宿主細胞は、最も好ましくは、哺乳動物由来のものである；当業者は、そこで発現される所望の遺伝子産物に最適な具体的宿主細胞株を選択して決定する能力があると考えられている。宿主細胞株の例は、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、Ａ５４９細胞であるＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣株、ＤＨＦＲ−）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）、ＣＶＩ（サル腎臓株）、ＣＯＳ（ＳＶ４０Ｔ抗原を有するＣＶＩの派生株）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓株）、ＳＰ２／Ｏ（マウスミエローマ）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウスミエローマ）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）、および２９３（ヒト腎臓）などであるが、これらに限定されない。宿主細胞株は、一般的には、商業サービス、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、公開献から利用することができる。
【０２４３】
産生細胞株からのポリペプチド発現は、既知の技術を用いて促進することができる。例えば、グルタミン合成酵素（ＧＳ）系が、一定の条件下で発現を促進するために広く利用されている。例えば、欧州特許第０  ２１６  ８４６号、第０  ２５６  ０５５号、および第０  ３２３  ９９７号ならびに欧州特許出願第８９３０３９６４．４号参照。
宿主細胞
本発明の方法で使用するためのＮｇＲ１アンタゴニストを発現させるための宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であってよい。真核宿主細胞の例は、酵母および哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＡＴＣＣ受託番号：ＣＣＬ６１）、ＮＩＨ  Ｓｗｉｓｓマウス胚細胞ＮＩＨ−３Ｔ３（ＡＴＣＣ受託番号：ＣＲＬ１６５８）、および仔ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）などであるが、これらに限定されない。その他の有用な真核宿主細胞には、昆虫細胞および植物細胞がある。原核宿主細胞の例は大腸菌およびストレプトミセスである。
遺伝子療法
ＮｇＲ１アンタゴニストは、乏突起膠細胞の生存を促進するか、ニューロンの脱髄を低減することが治療上有益である、神経系の疾患、障害、または損傷の治療に対する遺伝子治療アプローチを用いて、哺乳動物、例えば、ヒト患者の体内でインビボ産生させることができる。これは、適当な発現調節配列に操作可能に結合している、適当なＮｇＲ１アンタゴニストをコードする核酸を投与することを含む。通常、これらの配列はウイルスベクターに組み込まれている。このような遺伝子治療に適したウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、エンテロウイルスベクター、ペスチウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、エプスタイン−バーウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルスベクターなどである。ウイルスベクターは、複製欠損型ウイルスベクターであってもよい。Ｅ１遺伝子またはＥ３遺伝子を欠失したアデノウイルスベクターが一般的には使用される。アデノウイルスベクターを用いる場合、このベクターは通常、選択可能なマーカー遺伝子を有していない。
薬学的組成物
本発明の方法で使用されるＮｇＲ１アンタゴニストを調合して、ヒトなど哺乳動物に投与するための薬学的組成物にすることができる。本発明の方法で使用される薬学的組成物は、薬学的に許容される担体、例えば、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和型植物脂肪酸の部分的グリセリド（ｐａｒｔｉａｌ  ｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）混合物、水、塩または電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素２ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、３ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸塩、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および羊毛脂などを含む。
【０２４４】
本発明方法で使用される組成物は、適当な方法によって、例えば、非経口的に、脳室内に、経口的に、吸入噴霧により、局所的に、直腸内に、鼻腔内に、頬側に、膣内に、または埋込型リザーバーを介して投与することができる。本明細書において「非経口」という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、髄鞘内、肝内、病巣内、および頭蓋内への注射または注入技術を含む。前述したように、本発明の方法で使用されるＮｇＲ１アンタゴニストは、神経系内で作用して、乏突起膠細胞の生存を促進し、ニューロンの脱髄を低減する。したがって、本発明の方法においては、ＮｇＲ１アンタゴニストが血液脳関門を通過するようにこれを投与する。この通過は、ＮｇＲ１アンタゴニスト分子自体に固有の物理化学的特性、医薬製剤中の他の成分、または、針、カニューレまたは手術器具などの機械的装置を使用して血管脳関門を破壊することによってもたらされる。ＮｇＲ１アンタゴニストが本質的に血管脳関門を通過しない分子である場合、例えば、通過を促進する部分との融合、適切な投与経路は、例えば、髄鞘内または頭蓋内へ、例えば、ＭＳの慢性病巣内への直接的投与することである。ＮｇＲ１アンタゴニストが本質的に血管脳関門を通過する分子である場合、投与経路は下記のさまざまな経路のうちの１つ以上によればよい。
【０２４５】
本発明の方法で使用される組成物の滅菌注入可能形態は、水性または油性の懸濁液であり得る。これらの懸濁液は、適当な分散剤または湿潤剤、および懸濁剤を用い、当技術分野において既知の技術に従って調合することができる。また、滅菌された注入用調製物は、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒に入れた、滅菌された注入用の溶液または懸濁液、例えば、１，３−ブタンジオール中の懸濁液などであってもよい。使用することができる許容可能な賦形剤および溶媒には、水、リンゲル溶液、および生理食塩水がある。さらに、滅菌された固定油が、溶媒または懸濁用培地として従来から使用されている。この目的では、合成されたモノグリセリドおよびジグリセリドなど、無刺激性の固定油を用いることができる。注入物質の調製には、天然で薬学的に許容される油、例えば、オリーブ油またはヒマシ油などで、特に、ポリオキシエチル化されたものと同じように、オレイン酸およびそのグリセリド誘導体などの脂肪酸が有用である。これらの油性の溶液または懸濁液は、カルボキシメチルセルロース、または同様の分散剤で、乳剤および懸濁剤などの薬学的に許容される投薬形態を調合するのに広く用いられているものなどの長鎖アルコール希釈剤または分散剤も含むことができる。Ｔｗｅｅｎ、Ｓｐａｎなど、その他広く用いられている界面活性剤、およびその他の乳化剤または生体利用効率エンハンサで、薬学的に許容される固体、液体、またはその他の投薬形態の製造において広く用いられているものも、調合目的で使用することができる。
【０２４６】
非経口用調合剤は、単回ボーラス投与、注入、または負荷（ｌｏａｄｉｎｇ）ボーラス投与とその後の保持投与されるものであってもよい。これらの組成物は、例えば、１日に１回、または「必要に応じて」という基本で、特定の一定間隔または変動的な間隔で投与することができる。
【０２４７】
本発明の方法で使用される一定の薬学的組成物は、例えば、カプセル剤、錠剤、水性懸濁液、または溶液などの許容される投薬形態にして経口投与することができる。一定の薬学的組成物は、鼻エアロゾルまたは吸入によって投与することもできる。このような組成物は、ベンジルアルコールまたはその他の保存剤、生態利用効率を高めるための吸収促進剤、および／もしくはその他の従来からの可溶化剤または分散剤を使用して、塩水中の溶液として調製することができる。
【０２４８】
１回分の投薬形態を作成するために担体材料と混合することができるＮｇＲ１アンタゴニストの量は、治療される宿主、使用されるアンタゴニストのタイプ、および具体的な投与方式に応じて変化するであろう。組成物は、１回分の用量、複数回分の用量、または点滴では、設定された期間にわたり投与することができる。投与計画も、所望の最適な反応（例えば、治療反応または予防反応）をもたらすように調整することができる。
【０２４９】
本発明の方法は、「治療上有効量」または「予防上有効量」のＮｇＲ１アンタゴニストを使用する。このような治療上または予防上有効な量は、各人の病状、年齢、性別、および体重などの因子に応じて変わりうる。治療上または予防上有効な量とは、治療上有益な効果が毒性または有害な作用を上回る量でもある。
【０２５０】
特定の患者に対する具体的な投薬および治療計画は、使用される具体的なＮｇＲ１アンタゴニスト、患者の年齢、体重、全体的な健康、性別、および食餌、ならびに投与時間、排出速度、薬剤の組み合わせ、および治療中の具体的な疾患の重症度など、さまざまな因子に依存して決められる。医療介護者によるこのような因子の判定は、当技術分野の通常の技術の範囲内に含まれる。投与量も、治療すべき個々の患者、投与経路、製剤の種類、使用される化合物の特性、疾患の重症度、および所望の効果に依存するであろう。使用量は、当技術分野においてよく知られている薬理学的および薬物動態学的な原理によって決定することができる。
【０２５１】
本発明の方法では、ＮｇＲ１アンタゴニストは、通常、神経系に直接、脳室内に、または髄腔内に、例えば、ＭＳの慢性病変部に投与する。本発明の方法に従って投与するための組成物は、ＮｇＲ１アンタゴニストポリペプチドが１日あたり体重１ｋｇにつき０．００１〜１０ｍｇの用量で投与されるように調合することができる。本発明のいくつかの実施形態において、投薬量は１日当たり体重１ｋｇにつき０．０１〜１．０ｍｇである。いくつかの実施形態において、投薬量は１日当たり体重１ｋｇにつき０．００１〜０．５ｍｇである。
【０２５２】
ＮｇＲ１アンタゴニスト抗体による治療では、投薬量は、宿主の体重で、例えば、約０．０００１から１００ｍｇ／ｋｇ、より普通には、０．０１から５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇなど）の範囲になりうる。例えば、投薬量は、体重１ｋｇにつき１ｍｇもしくは１０ｍｇでもよく、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内、好ましくは、少なくとも１ｍｇ／ｋｇであってもよい。上記範囲の中間の用量も、本発明の範囲に含まれるものとする。このような用量を毎日、１日おきに、毎週、または経験的な分析によって決められた、これ以外のスケジュールに従って、被験体に投与することができる。典型的な治療では、長期間にわたる、例えば、少なくとも６ヶ月間の反復投与が必要となる。さらに別の典型的な治療法では、２週間毎に１回、または月に１回、または３ヶ月から６ヶ月毎に１回の投与を必要とする。典型的な投薬計画には、連日１〜１０ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇ、隔日で３０ｍｇ／ｋｇ、または毎週６０ｍｇ／ｋｇなどがある。いくつかの方法では、異なった結合特異性を有する２種類以上のモノクローナル抗体を同時に投与するが、この場合には、投与される各抗体の投与量は上記の範囲内に含まれる。
【０２５３】
一定の実施形態において、被験体を、ＮｇＲ１アンタゴニストポリペプチドをコードする核酸分子で治療することができる。核酸の投与量は、患者あたり約１０ｎｇ〜１ｇ、１００ｎｇ〜１００ｍｇ、１μｇ〜１０ｍｇ、または３０〜３００μｇのＤＮＡである。感染型ウイルスベクターの投与量は、１回あたり１０〜１００個のウイルス粒子、またはそれ以上である。
【０２５４】
補助的な活性化合物も、本発明の方法で使用される組成物に組み込むことができる。例えば、可溶性ＮｇＲ１ポリペプチドまたは融合タンパク質を、１つ以上の追加的な治療薬と同時に調合、および／または同時に投与することができる。
【０２５５】
本発明は、水性溶液のボーラス注射または放出制御系の埋め込みなど、選択された標的組織へＮｇＲ１アンタゴニストを送達するための適切な方法を含む。放出制御インプラントを利用すると、反復注射の必要が少なくなる。
【０２５６】
本発明の方法で使用されるＮｇＲ１アンタゴニストは、脳に直接注入することができる。化合物を脳に直接注入するためのさまざまなインプラントが当技術分野において知られており、神経障害を患っているヒト患者に治療化合物を送達する上で有効である。これらは、ポンプを用いて脳に周期的に注入するもの、定位的に埋め込まれたもの、短期挿入型カテーテル、永久型頭蓋内カテーテルインプラント、および外科的に埋め込まれた生分解性インプラントなどがある。例えば、Ｇｉｌｌら、上掲；Ｓｃｈａｒｆｅｎら、”Ｈｉｇｈ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｏｄｉｎｅ−１２５  Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔ  Ｆｏｒ  Ｇｌｉｏｍａｓ，”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｌ  Ｐｈｙｓ．２４（４）：５８３−５９１（１９９２）；Ｇａｓｐａｒら、”Ｐｅｒｍａｎｅｎｔ  １２５Ｉ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｇｌｉｏｍａｓ，”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．４３（５）：９７７−９８２（１９９９）；ｃｈａｐｔｅｒ  ６６，ｐａｇｅｓ  ５７７−５８０，Ｂｅｌｌｅｚｚａら”Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  Ｂｒａｃｈｙｔｈｅｒａｐｙ，”ｉｎ  Ｇｉｌｄｅｎｂｅｒｇら、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ（１９９８）；およびＢｒｅｍら、”Ｔｈｅ  Ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ＢＣＮＵ−Ｌｏａｄｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｆｏｌｌｏｗｅｄ  ｂｙ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｅｗｌｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｅｄ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｇｌｉｏｍａｓ：  Ｐｈａｓｅ  Ｉ  Ｔｒｉａｌ，”Ｊ．Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２６：１１１−２３（１９９５）参照。
【０２５７】
これらの組成物は、化合物の適切な送達系または支持系として機能する生分解性担体物質中に分散されたＮｇＲ１アンタゴニストを含むこともできる。持続放出型担体の適当な例には、座薬またはカプセル剤などの形成品の形態になった半透過性ポリマー基質などがある。埋め込み型またはマイクロカプセル型の持続放出性基質には、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，３１９号；欧州特許第５８，４８１号）；Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸の共重合体（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｖｍｅｒｓ  ２２：５４７−５６（１９８５））；ポリ（２−ヒドロキシエチル−メトアクリレート）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．７５：１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））、またはポリ−Ｄ−（−）−３ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号）などがある。
【０２５８】
本発明のいくつかの実施形態において、ＮｇＲ１アンタゴニストを、脳の適当な部位に直接注入することによって患者に投与する。例えば、Ｇｉｌｌら、”Ｄｉｒｅｃｔ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．９：５８９−９５（２００３）参照。代替的技術が利用でき、本発明に従ってＮｇＲ１アンタゴニストを投与するのに適用することができる。例えば、カテーテルまたはインプラントの定位的な配置は、Ｒｉｅｃｈｅｒｔ−ＭｕｎｄｉｎｇｅｒユニットおよびＺＤ（Ｚａｍｏｒａｎｏ−Ｄｕｊｏｖｎｙ）多目的局在化ユニットを用いて行うことができる。造影強化型コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャン法は、１２０ｍｌのオムニパーク、３５０ｍｇのヨウ素／ｍｌを注入し、２ｍｍのスライス厚で、三次元多平面治療プラニング（ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｍｕｌｔｉｐｌａｎａｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｐｌａｎｎｉｎｇ：ＳＴＰ，  Ｆｉｓｃｈｅｒ，  Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を可能にし得る。この装置によって、明確な標的確認のためにＣＴおよびＭＲＩの標的情報を併合して、磁気共鳴画像化実験に基づいてプラニングすることが可能になる。
【０２５９】
ＧＥ  ＣＴスキャナー（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）での使用のために改変されたレクセル定位システム（Ｌｅｋｓｅｌｌ  ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ）（Ｄｏｗｎｓ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｃａｔｕｒ，ＧＡ）、およびブラウン−ロバート−ウエルズ（ＢＲＷ）定位システム（Ｒａｄｉｏｎｉｃｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）もこの目的に利用することができる。したがって、埋め込み当日の朝に、ＢＲＷ定位フレームの環状ベースリングを患者の頭蓋に装着することができる。連続ＣＴ断面を、ベースプレートに固定されたグラファイトロッドのローカライザーフレームによって（標的組織）領域全体を３ｍｍ間隔で得ることができる。グラファイトロッド影像のＣＴ座標を利用してＣＴスペースとＢＲＷスペースとの間をマッピングする、コンピューター治療計画プログラムをＶＡＸ  １１／７８０コンピューター（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｙｎａｒｄ，Ｍａｓｓ．）で動かすことができる。
【０２６０】
本明細書に記載されているような脱髄または髄鞘形成異常という障害を治療する方法は、ヒトに使用する前に、所望の治療作用または予防作用について、一般的には、インビトロで、次いで、許容される動物モデルにおいてインビボで試験される。トランスジェニック動物など、適当な動物モデルが当業者に知られている。インビボ試験は、実施例に記載されているように、ＮｇＲ１アンタゴニストを発現するトランスジェニックマウスを作出し、ＮｇＲ１アンタゴニストをモデルとなるマウスまたはラットに投与して行うことができる。
【０２６１】
本発明の実施には、別段の記載がない限り、当技術分野の範囲にある細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学が利用される。このような技術は文献の中で十分に説明されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３−Ｖｏｌｕｍｅ  Ｓｅｔ），Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）；Ｇｅｎｅｓ  ＶＩＩＩ，Ｂ．Ｌｅｗｉｎ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ（２００３）；ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ，ＣＷ．Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｇ．Ｓ．Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（２００３）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｐ．Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ（Ｅｄ．），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２００４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ（２０００）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（Ｅｄ．），（１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．（１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｍ．Ｌ．Ｍ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９９９）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ，ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（２００４）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ），Ｊ．Ｗｏｏｄｗａｒｄ，ＩｒＩ  Ｐｒ（１９９２）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ（Ｅｄｓ．）（１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．（１９８８）；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ���１９８７）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ＶｏＩｓ．１５４  ａｎｄ  １５５，Ｗｕら（Ｅｄｓ．）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，（Ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ，Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ（Ｅｄｓ．），（１９８６）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ：Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（４  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｓｅｔ），１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００２）；およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）参照。
【０２６２】
抗体工学の一般原理は、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｂ．Ｌ．Ｌｏ（Ｅｄ．），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２００３）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｒ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｓ．Ｄｕｂｅｌ（Ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（２００１）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃ．Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ（Ｅｄ．），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（１９９５）に記載されている。タンパク質工学の一般原理は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｒｉｃｋｗｏｏｄ，Ｄ．，ら（Ｅｄｓ．），ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇ．（１９９５）に記載されている。抗体および抗体−ハプテン結合の一般原理は：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）；Ｎｉｓｏｎｏｆｆ，Ａ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８４）；およびＳｔｅｗａｒｄ，Ｍ．Ｗ．、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｔｈｅｉｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８４）に記載されている。さらに、当技術分野では知られているが特に説明されていない、免疫学の標準的な方法は、一般的には、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｓｔｉｔｅｓら（Ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｄ．Ｐｏｕｎｄ（Ｅｄ．），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９９８），Ｗｅｉｒ’ｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ（Ｅｄ．），Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９６），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｂｏｔｒａｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）；Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）およびＭｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ（Ｅｄｓ．），Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）に収められている。
【０２６３】
免疫学の一般原理を示す標準的な参考資料は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｋｌｅｉｎ，Ｊ．；Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒ．Ａ．Ｇｏｌｄｓｂｙ，ら、Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．（２０００）；Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｍ．Ｐｅａｋｍａｎ，ら、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ（１９９７）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｉ．Ｒｏｉｔｔ，ら、Ｍｏｓｂｙ，Ｌｏｎｄｏｎ（２００１）；Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ；Ａ．Ｋ．Ａｂｂａｓ，Ａ．Ｈ．Ｌｉｃｈｔｍａｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ−Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（２００５）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ：Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（４  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｓｅｔ），１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒ．Ａ．Ｇｏｌｄｓｂｙ，ら、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ（２００２）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｗ．Ｇｏｄｉｎｇ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）；Ｋｅｎｎｅｔｔ，Ｒ．，ら（Ｅｄｓ．），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ａ．、”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”ｉｎ  Ｂｕｒｄｅｎ，Ｒ．，ら（Ｅｄｓ．），Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３，Ｅｌｓｅｖｅｒｅ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８４）などである。
【０２６４】
上記に引用された参考文献はすべて、本明細書で引用されている全ての参考文献と同様に、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０２６５】
以下の実施例で、本発明をさらに詳しく説明する。これらの実施例は、説明目的のためだけに提供され、決して、本発明の範囲または内容を限定するものと解してはならない。
【０２６６】
（実施例１）
ＮｇＲ１−３１０−Ｆｃは、ラットで脊髄切断損傷によって誘発されたアポトーシス細胞死を抑制する。
【０２６７】
乏突起膠細胞は、脊髄損傷（ＳＣＩ）後にアポトーシス細胞死を起こす。したがって、ＮｇＲ１−３１０−Ｆｃを、ＳＣＩ後のアポトーシス細胞死を防止するその能力について評価した。Ｌｏｎｇ  ＥｖａｎｓラットにＴ６半切断損傷を与えて、皮下空間に埋め込んだ浸透圧ミニポンプを介した連続髄腔内注入によって、損傷時からＮｇＲ１−３１０−Ｆｃを投与した。例えば、Ｊｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２（３）：５８７−５９４（２００５）参照。ＳＣＩ後、それぞれ３日目および７日目に採集した脊髄切片（病変部位に対して吻側５ｍｍおよび尾側５ｍｍ）に対して、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｓｉｇｍａ）およびＴＵＮＥＬ染色（Ｐｒｏｍｅｇａ）を行い、ＴＵＮＥＬ陽性細胞、すなわち、アポトーシス細胞の数を数えた。アポトーシス細胞の数は、ＰＢＳ処理対照と比較すると、ＮｇＲ１−Ｉｇ処理ラットの脊髄で有意に減少していた（＊Ｐ＜０．０５、ｔ検定、ｎ＝３）。図１Ａ〜Ｂ。これらの結果は、ＮｇＲ１（３１０）−Ｆｃが、ＳＣＩ後の乏突起膠細胞のアポトーシス死を有意に低減することを示していた。
【０２６８】
（実施例２）
ＮｇＲ１−３１０−Ｆｃは、ＳＡＰＫ／ＪＮＫリン酸化を阻害し、ＡＫＴ活性を増大する。
【０２６９】
乏突起膠細胞のｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）依存型アポトーシスは、Ｊｕｎキナーゼ（ＪＮＫ）活性の増大およびカスパーゼ活性化に関係している。Ｂｈａｋａｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２３（２６）：１１３７３−１１３８１（２００３）。また、Ａｋｔが、リン酸化によってアポトーシス経路を負に制御することが分かっている。Ｄａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７Ｐ（７）：５４０５−５４１２（２００４）。したがって、ＳＡＰＫ／ＪＮＫリン酸化を低減し、ＡＫＴ活性を増大する能力について、ＮｇＲ１−３１０−Ｆｃを評価した。Ｌｏｎｇ  ＥｖａｎｓラットにＴ６半切断損傷を与えて、皮下空間に埋め込んだ浸透圧ミニポンプを介した連続髄腔内注入によって、損傷時からＮｇＲ１−３１０−Ｆｃを投与した。例えば、Ｊｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２（３）：５８７−５９４（２００５）参照。損傷後３日目に病変領域近くの脊髄組織を回収して、ウエスタンブロット解析のためにタンパク質を抽出した。例えば、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手できる抗−ＪＮＫ抗体、抗−ホスフォ−ＪＮＫ抗体、抗−ＡＫＴ抗体、または抗−ホスフォ−ＡＫＴ抗体をプローブとしてブロットを行った。デンシトメトリーによって、これらのタンパク質の発現レベルを定量し、リン酸化型（活性化型）のレベルを、全ＪＮＫレベルまたは全ＡＫＴレベルの割合として表示した。図２Ａ〜Ｂ。ＮｇＲ１−Ｉｇ処理によって、脊髄ホモジネートにおいて、ホスフォ−ＪＮＫ発現のレベルが有意に低下し、ホスフォ−ＡＫＴのレベルが有意に上昇した。このことは、ＮｇＲ１−Ｉｇ処理が、ＳＣＩ後の乏突起膠細胞の細胞死を抑制することを示している。
【０２７０】
（実施例３）
ＮｇＲ１−３１０−Ｆｃは、脊髄損傷後の乏突起膠細胞におけるカスパーゼ−３の活性化を阻害する。
【０２７１】
上記したように、乏突起膠細胞のｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）依存型アポトーシスは、Ｊｕｎキナーゼ（ＪＮＫ）活性の増大およびカスパーゼ活性化に関係している。Ｂｈａｋａｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２３（２６）：１１３７３−１１３８１（２００３）。したがって、カスパーゼ−３の活性化を阻害する能力について、ＮｇＲ１−３１０−Ｆｃを評価した。Ｌｏｎｇ  ＥｖａｎｓラットにＴ６半切断損傷を与えて、皮下空間に埋め込んだ浸透圧ミニポンプを介した連続髄腔内注入によって、損傷時からＮｇＲ１−３１０−Ｆｃを投与した。例えば、Ｊｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２（３）：５８７−５９４（２００５）参照。ＳＣＩ後３日目および７日目のラットからの脊髄切片を、抗−切断カスパーゼ−３抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および乏突起膠細胞特異的マーカーであるＣＣ１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で二重染色し、Ｈｏｅｃｈｓｔで対比染色した（Ｓｉｇｍａ）。細胞数の計測は、病変部位に対し、それぞれ吻側５ｍｍおよび尾側１５ｍｍの０．２５ｍｍ２の領域で行った。ＣＣ１陽性細胞の全数に対するＣＣ１およびカスパーゼ−３の両方に陽性の細胞の数の割合として表された、乏突起膠細胞における活性化カスパーゼ−３の発現レベルを測定した。その結果、ＰＢＳ処理対照と比較すると、ＮｇＲ１−Ｉｇ処理ラットでは、カスパーゼ−３の活性化が有意に阻害されたことが示され、このことは、損傷脊髄のＮｇＲ１−Ｉｇ処理後の乏突起膠細胞の細胞死が低減されたことを示した（図３Ａ−Ｂ）。
【０２７２】
（実施例４）
ＮｇＲ１−３１０−Ｆｃ処理によって、脊髄損傷後の脊髄における分解されたミエリン塩基性タンパク質（ｄＭＢＰ）の発現が低減される。
【０２７３】
乏突起膠細胞は、脊髄損傷（ＳＣＩ）後にアポトーシス細胞死を起こし、生き残った軸索の脱髄の原因となることがある。ｄＭＢＰは、ミエリン形成の低下の指標である。Ｌｏｎｇ  ＥｖａｎｓラットにＴ６半切断損傷を与えて、皮下空間に埋め込んだ浸透圧ミニポンプを介した連続髄腔内注入によって、損傷時からＮｇＲ１−３１０−Ｆｃを投与した。例えば、Ｊｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２（３）：５８７−５９４（２００５）参照。ＳＣＩ後２８日目のラットからの脊髄切片を、抗−分解ミエリン塩基性タンパク質（ｄＭＢＰ）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）で染色した。組織学的スコアとして表示されるｄＭＢＰの定量によって、ＰＢＳ処理対照と比較して、ＮｇＲ１−Ｉｇ処理群では、陽性に染色される細胞の数が有意に少なかった。図４。これらのデータは、ＮｇＲ１−Ｉｇ処理によって、ＳＣＩ後の乏突起膠細胞の細胞死が阻害されることを明らかにした。
【０２７４】
上記発明を、明確な把握を目的として具体例および実施例によっていくらか詳細に説明したが、添付の請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなく、一定の変更および修飾を加えることができることは、本発明の記載から当業者には明白であろう。
【０２７５】
本明細書に記載されているすべての刊行物および特許出願は、各刊行物または特許出願が参照により本明細書に組み込まれる場合、具体的かつ個別に記載されていると同じ程度まで、参照されることにより本明細書に組み込まれる。
【図１】
2009538282.tif 000006
【図２】
2009538282.tif 000007
【図３】
2009538282.tif 000008
【図４】
2009538282.tif 000009
【配列表】
2009538282000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成21年3月11日(2009.3.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009538282000001.app
【国際調査報告】
2009538282.tif 000025