(57)【要約】本発明は、瘢痕を生じない創傷治癒を促進するために、損傷した組織の細胞で瘢痕形成の間に発現される多様な遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを用いる組成物および方法を記載する。本発明は特に、損傷した皮膚組織の細胞に存在する炎症調節遺伝子または炎症エフェクター遺伝子を標的とする、標的特異的ポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）を提供する。このポリヌクレオチドは一本鎖直鎖ポリヌクレオチド、二本鎖直鎖ポリヌクレオチド、またはヘアピンポリヌクレオチドである。
2009522303.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
損傷した皮膚組織の細胞に存在する炎症調節遺伝子または炎症エフェクター遺伝子を標的とする、標的特異的ポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドは一本鎖直鎖ポリヌクレオチド、二本鎖直鎖ポリヌクレオチド、またはヘアピンポリヌクレオチドである、請求項１に記載の標的指向ポリヌクレオチド。
【請求項３】
表１〜９に開示される配列から選択される配列を標的とする第１のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の標的指向ポリヌクレオチド。
【請求項４】
皮膚の創傷治癒プロセスの間の瘢痕形成を抑制する方法であって、該損傷した組織または細胞を、手術、創傷処置、損傷回復または皮膚移植のときに、請求項１に記載の標的指向ポリヌクレオチドを含む組成物と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項５】
前記標的指向ポリヌクレオチドは請求項２に記載されたものである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記標的指向ポリヌクレオチドは請求項３に記載されたものである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記接触させる工程が、前記組成物の局所的適用を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記接触させる工程が、前記組成物の局部的注射を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物が、請求項１に記載の複数の標的指向ポリヌクレオチドを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
損傷した皮膚組織を接触させる前記工程が、処置における前記創傷治癒プロセスの間に前記炎症調節遺伝子または前記炎症エフェクター遺伝子をダウンレギュレートするのに有効である、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチドは前記組織の細胞における標的遺伝子の発現を阻害する、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
前記組織は皮膚の領域に関連する、請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
前記組織は火傷によって損傷したものである、請求項４に記載の方法。
【請求項１４】
前記組織は化学薬品によって損傷したものである、請求項４に記載の方法。
【請求項１５】
前記組織はレーザーによって損傷したものである、請求項４に記載の方法。
【請求項１６】
前記組織は形成外科術によって損傷したものである、請求項４に記載の方法。
【請求項１７】
前記組織は皮膚移植によって損傷したものである、請求項４に記載の方法。
【請求項１８】
前記組織は手術によって損傷したものである、請求項４に記載の方法。
【請求項１９】
前記組織は身体の切開によって損傷したものである、請求項４に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞は、上皮細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、心筋層（心臓）の細胞および創傷の治癒時に皮膚の組織に存在するパッセンジャー白血球である、請求項４に記載の方法。
【請求項２１】
前記処置はヒトのためのものであるか、または非ヒト哺乳動物のためのものである、請求項４に記載の方法。
【請求項２２】
前記標的指向ポリヌクレオチドは、表１ａおよび表１ｂに列挙される配列から選択されるＣｏｘ−２（シクロオキシゲナーゼ−２）配列を標的とする、請求項６に記載の方法。
【請求項２３】
前記標的指向ポリヌクレオチドは、表２ａおよび表２ｂに列挙される配列から選択されるフィブロネクチン配列を標的とする、請求項６に記載の方法。
【請求項２４】
前記標的指向ポリヌクレオチドは、表３ａおよび表３ｂに列挙される配列から選択されるＨｏｘｂ１３遺伝子配列を標的とする、請求項６に記載の方法。
【請求項２５】
前記標的指向ポリヌクレオチドは、表４ａおよび表４ｂに列挙される配列から選択されるＩＬ−６（インターロイキン−６）配列を標的とする、請求項６に記載の方法。
【請求項２６】
前記標的指向ポリヌクレオチドは、表５ａおよび表５ｂに列挙される配列から選択されるＩＬ−８（インターロイキン−８）配列を標的とする、請求項６に記載の方法。
【請求項２７】
前記標的指向ポリヌクレオチドは、表６ａおよび表６ｂに列挙される配列から選択されるＳｆｒｓ３（スプライシング因子、アルギニン／セリン−リッチ３）配列を標的とする、請求項６に記載の方法。
【請求項２８】
前記標的指向ポリヌクレオチドは、表７ａおよび表７ｂに列挙される配列から選択されるＴＧＦ−β１（トランスホーミング増殖因子β１）配列を標的とする、請求項６に記載の方法。
【請求項２９】
前記組成物はさらにＰｏｌｙＴｒａｎポリマー溶液を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項３０】
前記組成物はさらにＴａｒｇｅＴｒａｎナノ粒子溶液を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項３１】
前記ｓｉＲＮＡは１またはそれより多い遺伝子配列に対する１またはそれより多いｓｉＲＮＡ二本鎖を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項３２】
前記標的指向ポリヌクレオチドは、低分子薬、モノクローナル抗体薬、または他の免疫調節剤と組み合わせて使用される、請求項４に記載の方法。
【請求項３３】
前記組成物は複数の標的指向ポリヌクレオチドを含む、該ポリヌクレオチドは複数の遺伝子配列を標的とする、請求項４に記載の方法。
【請求項３４】
前記標的指向ポリヌクレオチドは、Ｃｏｘ−２、ＴＧＦ−β１およびＩＬ−８遺伝子配列を標的とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記標的指向ポリヌクレオチドは、Ｃｏｘ−２、ＴＧＦ−β１およびＩＬ−６遺伝子配列を標的とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記標的指向ポリヌクレオチドは、Ｃｏｘ−２、ＴＧＦ−β２およびＩＬ−８遺伝子配列を標的とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記標的指向ポリヌクレオチドは、Ｃｏｘ−２、ＴＧＦ−β２およびＩＬ−６遺伝子配列を標的とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
前記標的指向ポリヌクレオチドは、Ｃｏｘ−２、Ｈｏｘｂ１３およびＩＬ−８遺伝子配列を標的とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
前記標的指向ポリヌクレオチドは、Ｃｏｘ−２、Ｈｏｘｂ１３およびＩＬ−６遺伝子配列を標的とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
前記標的指向ポリヌクレオチドは、Ｈｏｘｂ１３、ＴＧＦ−β１およびＳｆｒｓ３遺伝子配列を標的とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項４１】
前記標的指向ポリヌクレオチドは、Ｃｏｘ−２、ＴＧＦ−β１およびフィブロネクチン遺伝子配列を標的とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項４２】
前記標的指向ポリヌクレオチドは、Ｃｏｘ−２、ＴＧＦ−β２およびフィブロネクチン遺伝子配列を標的とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項４３】
前記標的指向ポリヌクレオチドは、Ｃｏｘ−２、ＴＧＦ−β１およびｓｍａｄ３遺伝子配列を標的とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項４４】
前記標的指向ポリヌクレオチドは、３つの遺伝子配列の他の組み合わせを標的とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項４５】
前記標的指向ポリヌクレオチドは、３つより多くの遺伝子配列を標的とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項４６】
前記標的指向ポリヌクレオチドは、治療結果に基づいて、等しい比率で、または異なる比率で混合され得る、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、本明細書においてその全体の開示が参考として援用される米国仮特許出願第６０／７５５，５４９号に対して、優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、皮膚の瘢痕形成を促進する遺伝子の発現をノックダウンするｓｉＲＮＡ薬剤を用いての、創傷治癒プロセスの間の皮膚の瘢痕形成の予防および最小化のための概念、組成物、および方法に関する。このｓｉＲＮＡ薬剤は、単一の二本鎖または複数の二本鎖（カクテル）のいずれかとして、単一または複数の遺伝子のいずれかを標的として、トランスフェクションキャリアを伴って、あるいは伴わずに、用いられ得る。トランスフェクション薬剤が他のスキンケア物質と共に適用される場合、そのトランスフェクション薬剤としては、合成ポリマー、リポソームおよび糖などが挙げられるが、それらに限定されない。このｓｉＲＮＡ薬剤はまた、同じ適用において、他の物質（例えば、低分子およびモノクローナル抗体インヒビター、免疫調節剤、および他の型のオリゴ）と共に用いられ得る。ｓｉＲＮＡ薬剤の注射、局所的投与および経皮的投与は、皮膚組織障害および皮膚移植に続く創傷治癒プロセスのために、全て適用可能である。本発明は、火傷、慢性皮膚潰瘍、一般的な手術、成形術および不慮の切り傷などによって生じる創傷からの、皮膚の瘢痕を生じない治癒を増強する新規の処置である。本発明は、製薬産業および化粧品産業にとって有用である。
【０００３】
（発明の背景）
皮膚の第一の機能は、環境に対する防御バリアとして働くことである。障害または疾病の結果としての皮膚の大きな部分の完全性の欠損は、大きな障害または死さえも導き得る。米国では、毎年、１２５万人以上が火傷を負い、そして６５０万人以上が圧迫、静脈うっ滞、または真性糖尿病により生じる慢性皮膚潰瘍にかかる。創傷の処置の第一の目標は、迅速な創傷の閉鎖ならびに機能的および美学的に満足のできる瘢痕である。細胞生物学および分子生物学における最近の進展が、創傷の修復および組織の再生に関与する生物学的プロセスの本発明者らの理解を大きく広げ、そして創傷管理における改善を導いた。創傷治癒は、可溶性媒介物、血球、細胞外マトリックス、および実質細胞を含む動的で相互に影響しあうプロセスである。創傷治癒には、時期の重なる三つの段階（炎症、組織形成、および組織再構築）がある（１〜３）。
【０００４】
皮膚の創傷治癒プロセスは、胎児の皮膚と成体の皮膚の間で異なることが知られている。成体の皮膚における創傷治癒は、急性の炎症段階で始まり、そして恒久的な瘢痕の形成で終わる。対照的に、早期妊娠胎児の創傷（第一および第二トリメスター）は、ほぼ完全な様式で、迅速に、そして瘢痕の生成をともなわずに治癒する。瘢痕を生じない治癒から、成体様の瘢痕形成表現型（妊娠の第二トリメスターを経過した皮膚に典型的である）への切り換えを担う重要な因子を特徴づけることに、多くの関心がある。治癒の二つの型における相違点の同定が、瘢痕組織生成を促進する因子を同定し得る。瘢痕を生じない治癒において減少していると同定された因子と、成体の創傷において瘢痕形成を減少させる、それらの因子の阻害との間の相関は、トランスホーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）に関して特に当てはまる。このサイトカインは、瘢痕を生じない治癒において差異的に調節されていることが見い出された最初のメディエーターの一つであり、瘢痕を生じない創傷に導入された場合、瘢痕組織の沈着を促進することが示された（４〜７）。これらの発見および線維症におけるＴＧＦ−βに関係する他の発見の結果として、成体の皮膚において、この分子をダウンレギュレートすることの効果が調べられ、そして瘢痕形成を減少させることが見い出された（８〜１５）。
【０００５】
皮膚の傷害に対する胎児の応答は、成体における応答と著しく異なっており、最小の炎症のみ、最小の線維芽細胞の増殖、および必須のコラーゲンの沈着のみを伴って進行する。胎児の創傷部位での細胞の事象および細胞外マトリックスの事象の両方における血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）の影響が研究された。なぜなら、成体の創傷治癒の調節においてＰＤＧＦが重要な役割を果たすことが知られているためである。シラスティック創傷用インプラントが、１日、３日、または５日間のいずれか子宮内に置いた後、摘出された。その標本は、標準的な組織学的な加工を受け、そして評価された。ＰＤＧＦ処理した移植片は、急性の炎症、線維芽細胞の補充、ならびにコラーゲンおよびヒアルロン酸沈着において著しい増加があった。これらの相違点は、大部分が、時間依存性およびＰＤＧＦ投与量依存性であるようであり、そしてそのデータは、胎児の修復はＰＤＧＦの非存在下で進むことを示唆する（１６）。
【０００６】
胎児の瘢痕を生じない治癒の重要な特徴は、創傷事象に応じた炎症の欠損であるようである。対照的に、後期の胎児皮膚および成体の皮膚における創傷治癒の早期段階は、創傷範囲における強い炎症反応、および最終的には恒久的な瘢痕によって特徴づけられる。胎児の創傷修復におけるインターロイキンＩＬ−６（１７）およびインターロイキンＩＬ−８（１８）が研究されたが、瘢痕を生じない治癒における他の典型的な炎症メディエーターの役割は不明である。
【０００７】
アラキドン酸カスケードの代謝産物および酵素（シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）酵素およびその酵素的な産物であるプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）を含む）は、炎症反応の重大なメディエーターであることが知られている（１９〜２２）。ＣＯＸ−２は、調節不全の炎症状態に関連した疾患（例えばリウマチ性関節炎および変形性関節症）、心血管疾患、および発癌過程に関与していることから、最近たいへん注目された。ＣＯＸ−２は、創傷のような炎症刺激に応答して、最初期のアップレギュレーションを受ける。ＣＯＸ−２は、生じる炎症の多くの局面（例えば、血管の透過性の誘導ならびに炎症細胞の浸潤および活性化）を調節するプロスタグランジンを産生することにより機能する。これらの早期の事象が修復の結果を制御することが示されたことから、成体の創傷修復プロセスにおけるＣＯＸ−２経路の役割および炎症の他の局面への関心が増している。炎症へのＣＯＸ−２の関与およびＣＯＸ−２が成体の創傷修復のいくつかの局面の一因となるという最近の証明に基づいて、本発明者らは、胎児の創傷治癒プロセスにおけるＣＯＸ−２の役割を調べた。これらの研究は、早期および後期の妊娠胎児創傷におけるＣＯＸ−２酵素の差異的な発現を示した。さらに、ＣＯＸ−２産物のＰＧＥ２は、早期の胎児創傷中に導入された場合、治癒の遅延および瘢痕の生成を引き起こした。これらのデータは、瘢痕を生じない治癒と通常の修復の間の基本的な相違点についての本発明者らの理解を進め、そして瘢痕組織の生成におけるＣＯＸ−２の関与を示唆する（２３〜２８）。
【０００８】
成体の皮膚の創傷修復とは対照的に、再生のプロセスによる早期妊娠胎児の皮膚の創傷治癒は、わずかな瘢痕しか生じないか、または瘢痕を生じない。研究は、Ｈｏｘ転写因子の高度に保存されたファミリーの一員であるＨｏｘＢ１３タンパク質のダウンレギュレーションが、胎児の瘢痕を生じない創傷治癒の間に起こることを示す（２９〜３０）。成体の創傷ではダウンレギュレーションは示されなかった。Ｈｏｘｂ１３ノックアウト（ＫＯ）マウスにおける成体の皮膚の創傷の治癒を評価する場合、切開性創傷の抗張力を６０日を越える時間経過で測定するために張力測定が用いられた。全般的に、Ｈｏｘｂ１３  ＫＯの創傷は、野生型（ＷＴ）よりも顕著により強い。切開性創傷の組織学的な評価が、ＷＴの創傷と比較した場合、７日齢のＨｏｘｂ１３  ＫＯの創傷は顕著により小さく、そして６０日齢のＨｏｘｂ１３  ＫＯの創傷は、より正常なコラーゲン構造を示すことを明らかにする。切除創傷は、Ｈｏｘｂ１３  ＫＯマウスでは、より早い速度で閉じる。生化学的分析および組織化学的分析は、Ｈｏｘｂ１３  ＫＯの皮膚が、顕著に上昇したレベルのヒアルロナンを含有することを示す。より高レベルのヒアルロナンおよび増強された創傷治癒が胎児の皮膚の特徴であることから、それゆえに、結論は、Ｈｏｘｂ１３の欠失が、より「胎児様の」状態を成体の皮膚において生じさせるというものである（３１）。
【０００９】
Ｓｍａｄ３タンパク質は、トランスホーミング増殖因子−βスーパーファミリーのメンバーによる細胞内シグナル伝達の媒介に関与し、そして細胞の増殖、分化、移動、および皮膚の創傷治癒に枢要なマトリックスの生成において重要な役割を果たす。インビトロでのＳｍａｄ３とホルモンシグナル伝達との間のクロストークは、細胞活性を制御する重要な調節機構であると示唆された；しかしながら、インビボでのそれらの関連性は不明である。Ａｓｈｃｒｏｆｔ  ＧＳらは、生体内でＳｍａｄ３が、創傷治癒のアンドロゲンにより媒介される阻害において役割を果たすが、エストロゲン調節への応答では役割を果たさないことを報告した（３０）。野生型の雌のマウスおよびＳｍａｄ３欠損の雌のマウスの両方が、卵巣摘出に続く治癒の遅延を示したが、それはエストロゲン補充により反転され得る。対照的に、野生型の雄マウスにおける去勢は治癒を加速し、そして外来性のアンドロゲン処置により反転可能であった。興味深いことに、アンドロゲンレベルの調節は、Ｓｍａｄ３欠損マウスでの治癒応答における、認識可能な摂動を結果として生じなかった。変異した単球は、野生型細胞に類似の様式で、リポ多糖類で刺激され得、特異的な炎症誘発性物質（マクロファージ単球阻害因子（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ））を産生し得るが、しかしアンドロゲンで媒介される刺激への抑制された応答を示し、一方、エストロゲンで誘導されるマクロファージ阻害因子（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）による阻害への正常な応答は維持する。これらのデータは、Ｓｍａｄ３が、正常な創傷治癒応答の間にアンドロゲンシグナル伝達を媒介する役割を果たし、そしてアンドロゲンによる炎症細胞活性の調節にＳｍａｄ３が関係することを示唆する。
【００１０】
フィブロネクチン（ＦＮ）は、多機能性の接着タンパク質であり、そして創傷治癒プロセスの複数の段階に関与する。ＦＮタンパク質の多様性は、選択的ＲＮＡスプライシング（発生、年齢、および組織／細胞型で制御される、調整された転写およびＲＮＡプロセシング）により調節されることを、強い証拠が示唆する。ＦＮ遺伝子およびこのモデルにおける、多様なスプライス型の発現、調節、ならびに生物学的な機能は未解明である。気道および皮膚の切開性創傷が、胎児（妊娠日数２１〜２３日）、離乳子畜（４〜６週）、および成体（６ヶ月より多い）のウサギにおいて作られた。ｍＲＮＡディファレンシャルディスプレイを用いて発現プロファイルが得られ、そして目的の遺伝子のｃＤＮＡがクローン化され、配列決定され、そしてリアルタイムＰＣＲにより検証された。Ｆｎ１およびＳｆｒｓ３の両方の転写物の増加したレベルは、離乳子畜の気道粘膜創傷において４８時間まで持続された。出生後の気道粘膜創傷におけるその二つの遺伝子の増強は、皮膚創傷におけるものよりもより突出しており、このことは、Ｓｆｒｓ３およびＦｎ１遺伝子の関与が組織特異的であることを示している（３１）。ＳＲｐ２０は実際にＦＮの選択的スプライシングに関与しており、そして胎児のＦＮの変異体が成体の創傷治癒の間に再出現するという証拠を文献は提供する。出生後の気道粘膜創傷修復の早期の事象の間の、Ｓｆｒｓ３の分子活性の増強と選択的スプライシングによるＦＮ遺伝子発現の制御の間の関係が提案される。Ｄｏｖｉ  ＪＶらは、好中球の激減したマウスでは、加速された創傷の閉鎖が観察されたことを報告した（３２）。
【００１１】
中間体の短い干渉ＲＮＡオリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）であるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）インヒビターは、疾患の原因となる複数の遺伝子を標的とする複数のｓｉＲＮＡ二本鎖の組み合わせを同一の処置で用いるという特有の利点を提供する。これは全てのｓｉＲＮＡ二本鎖が、同一の供給源および同一の製造プロセスを持ち、化学的に同質であるからである（３３、非特許文献１）。本発明者らは、多くの型のヒト疾患（例えば、癌、炎症状態、自己免疫疾患および感染性疾患）が、毒性および安全上の懸念が最小の、非常に有効なｓｉＲＮＡインヒビターを使用して、ずっと優れた臨床的有効性で処置され得ると考える。特定の遺伝子の発現を抑制するためのＲＮＡ干渉の魅力的な技術に基づいて（３４、非特許文献２）、ｓｉＲＮＡ治療は、手術または他の創傷における瘢痕形成を防止する魅力的で強力なアプローチを提示し得る。
【非特許文献１】Ｍａｎｕｓ，Ｍ．Ｔ．  ａｎｄ  Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．３（１０）：７３７−７４７
【非特許文献２】Ｌｕ，Ｐ．Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．５（３）：２２５−２３４
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
本発明は、損傷した皮膚の組織の細胞に存在する炎症調節遺伝子または炎症エフェクター遺伝子を標的とする、ｓｉＲＮＡのような標的指向ポリヌクレオチドを提供する。これらのポリヌクレオチドは、一本鎖の直鎖状構造、二本鎖の直鎖状構造、またはヘアピン構造であり得る。これらの標的指向ポリヌクレオチドの配列は、表１〜表９（下記参照）に列挙された配列に由来し得る。
【００１３】
本発明はまた、損傷した組織または細胞を、手術、創傷処置、傷害の修復または皮膚の移植時に、本発明の標的指向ポリヌクレオチドを含有する組成物と接触させることにより、創傷治癒プロセスの間の瘢痕形成を抑制する方法を提供する。一つの実施形態において、その組成物は局所的に適用される。別の実施形態において、その組成物は局部的に注射される。本発明の方法は、創傷治癒プロセスの間の、炎症調節遺伝子または炎症エフェクター遺伝子のダウンレギュレートまたは阻害に有効であり得る。上記標的指向ポリヌクレオチドを含有する組成物を接触させられる組織は、皮膚の領域に関するものであり得る。その組成物を接触させられる組織は、燃焼、化学薬品、レーザー、形成外科術、皮膚移植、手術または身体の切傷による損傷を受け得る。その組成物を接触させられる細胞としては、上皮細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、心筋層（心臓）の細胞および創傷の治癒時に皮膚の組織に存在するパッセンジャー白血球が挙げられるが、それらに限定されない。本発明の方法は、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物を処置するために用いられ得る。
【００１４】
損傷した組織または細胞に接触させるために用いられる組成物は、本発明の多種の標的指向ポリヌクレオチドを含有し得、そしてそのポリヌクレオチドは多種の遺伝子配列を標的にし得る。その組成物はさらに、ＰｏｌｙＴｒａｎポリマー溶液、ＴａｒｇｅＴｒａｎナノ粒子溶液、低分子薬物、モノクローナル抗体剤、または他の免疫調節剤を含有し得る。その組成物中に見い出される標的指向ポリヌクレオチドは、表１〜表７（下記参照）において見い出されるＣｏｘ−２、フィブロネクチン、Ｈｏｘｂ１３、ＩＬ−６、ＩＬ−８、Ｓｆｒｓ３、およびＴＧＦ−β１のような遺伝子の配列を標的にし得る。標的指向ポリヌクレオチドは、一つまたはそれより多い遺伝子配列（例えば、Ｃｏｘ−２／ＴＧＦ−β１／ＩＬ−８、Ｃｏｘ−２／ＴＧＦ−β１／ＩＬ−６、Ｃｏｘ−２／ＴＧＦ−β２／ＩＬ−８、Ｃｏｘ−２／ＴＧＦ−β２／ＩＬ−６、Ｃｏｘ−２／Ｈｏｘｂ１３／ＩＬ−６、Ｃｏｘ−２／Ｈｏｘｂ１３／ＩＬ−８、Ｈｏｘｂ１３／ＴＧＦ−β１／Ｓｆｒｓ３、Ｃｏｘ−２／ＴＧＦ−β１／フィブロネクチン、Ｃｏｘ−２／ＴＧＦ−β２／フィブロネクチン、Ｃｏｘ−２／ＴＧＦ−β１／ｓｍａｄ３、および三つまたはそれより多い遺伝子配列の他の組み合わせ）に対する一つまたはそれより多いｓｉＲＮＡ二本鎖を含み得る。本発明のポリヌクレオチド配列は、等しい割合、または異なる割合で、混合され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、手術および外傷性の皮膚の創傷に対する炎症性応答を抑制し、したがって瘢痕を生じない治癒を促進する、一つまたはそれより多いｓｉＲＮＡ治療薬剤の使用を開示する。治療用ポリヌクレオチドは以下に示す標的の一つまたはそれより多くを指向する：ＴＧＦ−β−１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＲ６０１７９２）、ＴＧＦ−β−２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｙ０００８３）、Ｃｏｘ−２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ９０１００）、ＩＬ−６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１８４０３）、ＩＬ−８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０００５８４）、Ｈｏｘｂ１３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＢＣ０７０２３３）、フィブロネクチン（Ｕ４２５９４）、Ｓｍａｄ３（Ｕ６８０１９）、およびＳｆｒｓ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ１０７４０５）。
【００１６】
本明細書で用いる場合、「オリゴヌクレオチド」およびこれに基づく類似の用語は、直前の段落に記載したような天然に存在するヌクレオチドからなる短いポリマー、ならびに合成または改変ヌクレオチドからなるポリマーに関する。オリゴヌクレオチドは、１０またはそれより多いヌクレオチド長、または１５、または１６、または１７、または１８、または１９、または２０、またはそれより多いヌクレオチド長、または２１、または２２、または２３、または２４、またはそれより多いヌクレオチド長、または２５、または２６、または２７、または２８、または２９、または３０、またはそれより多いヌクレオチド長、３５またはそれより多い、４０またはそれより多い、４５またはそれより多い、約５０までのヌクレオチドの長さであり得る。ｓｉＲＮＡであるオリゴヌクレオチドは、１５ヌクレオチドと３０ヌクレオチドの間の任意の数のヌクレオチドを有し得る。多くの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、１９ヌクレオチドと２５ヌクレオチドの間の任意の数のヌクレオチドを有し得る（３５）。
【００１７】
用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、本明細書において同義語として用いられる。
【００１８】
（低分子干渉ＲＮＡ）
本発明よって、炎症調節因子遺伝子標的または炎症エフェクター遺伝子標的の遺伝子発現が、ＲＮＡ干渉により弱められる。炎症調節因子遺伝子または炎症エフェクター遺伝子の標的配列の少なくとも一部分に相補的な、特異的な二本鎖ｓｉＲＮＡヌクレオチド配列により、この炎症調節因子遺伝子または炎症エフェクター遺伝子の発現産物が標的とされる。その標的配列は、１５ヌクレオチドと３０ヌクレオチドの間のいずれかの数のヌクレオチドを含有するか、または多くの場合、２１ヌクレオチドと２５ヌクレオチドの間のいずれかの数のヌクレオチドを含有する。その標的は、５’非翻訳（ＵＴ）領域中に存在してもよいし、コード配列中に存在してもよいし、または３’ＵＴ領域中に存在し得る。例えば、本明細書においてその全体が参考として援用される、国際公開第００／４４８９５号、同第９９／３２６１９号、同第０１／７５１６４号、同第０１／９２５１３号、同第０１／２９０５８号、同第０１／８９３０４号、同第０２／１６６２０号、および同第０２／２９８５８号を参照のこと。
【００１９】
本発明の方法により、炎症調節因子遺伝子または炎症エフェクター遺伝子の発現、およびそれによる、皮膚組織の損傷に対する初期の炎症反応による瘢痕形成が、ｓｉＲＮＡを用いて抑制される。本発明による標的指向ポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。そのようなｓｉＲＮＡはまた、意図される配列と同一かまたは類似のヌクレオチド配列の化学合成により調製され得る（３６）。あるいは、標的指向ｓｉＲＮＡは、例えば、標的指向ポリヌクレオチド配列を用いて、炎症調節因子または炎症エフェクターのリボヌクレオチド配列を無細胞系（ショウジョウバエ抽出物が挙げられるが、それに限定されない）内で消化することにより、または組み換え二本鎖ｃＲＮＡの転写により獲得され得る。
【００２０】
有効なサイレンシングは、一般的に、１６ｎｔ〜３０ｎｔのセンス鎖および同じ長さの１６ｎｔ〜３０ｎｔのアンチセンス鎖からなるｓｉＲＮＡ二本鎖を用いて観察される。多くの実施形態において、ｓｉＲＮＡの対になった二本鎖のそれぞれの鎖はさらに、３’末端に１ｎｔ、または２ｎｔ、または３ｎｔ、または４ｎｔ長であり得るオーバーハング（一般的には３’オーバーハングは２ｎｔ長である）を有す。２ｎｔの３’オーバーハングの配列は、ｓｉＲＮＡの標的認識の特異性への付加的な小さな寄与を生じる。一つの実施形態において、３’オーバーハングにおけるヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。代替の実施形態において、３’オーバーハングにおけるヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドである。３’デオキシヌクレオチドの使用は、増強された細胞内安定性を提供する。
【００２１】
本発明の組み換え発現ベクターは、細胞内に導入された場合、細胞内で炎症調節因子遺伝子または炎症エフェクター遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ配列を含有するＲＮＡを提供するように加工される。そのようなベクターは、発現ベクター中にクローン化されたＤＮＡ分子である。この発現ベクターは、発現を可能にする様式で炎症調節因子遺伝子指向配列または炎症エフェクター遺伝子指向配列に隣接して、作動可能に連結された調節配列を含む。ベクターから、標的ＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子が第１のプロモーター（例えば、クローン化されたＤＮＡの３’のプロモーター配列）により転写され、そして標的ＲＮＡに対してセンス鎖であるＲＮＡ分子が第２のプロモーター（例えば、クローン化されたＤＮＡの５’のプロモーター配列）により転写される。そのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、その後、インビボでハイブリダイズして、炎症調節因子遺伝子配列または炎症エフェクター遺伝子配列を標的とするｓｉＲＮＡ構築物を生成する。あるいは、二つの構築物が、ｓｉＲＮＡ構築物のセンス鎖およびアンチセンス鎖を生成するために使用され得る。さらに、クローン化されたＤＮＡは、二次構造を有する転写物をコードし得、一つの転写物が標的遺伝子由来のセンス配列および相補的なアンチセンス配列の両方を有する。この実施形態の一つの例において、ヘアピンＲＮＡｉ産物は、標的遺伝子の全体または一部に類似している。別の例において、ヘアピンＲＮＡｉ産物が、ｓｉＲＮＡである。炎症調節遺伝子または炎症エフェクター遺伝子の配列に隣接する調節配列は、同一でも、または異なっていてもよく、その結果、炎症調節遺伝子または炎症エフェクター遺伝子の発現は、独立して、もしくは時間の経過順または空間的な様式で調節され得る。
【００２２】
特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、例えば低分子核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）  Ｕ６またはヒトＲＮａｓｅ  Ｐ  ＲＮＡ  Ｈ１由来の、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩ転写ユニットを含むベクター中に、炎症調節因子遺伝子または炎症エフェクター遺伝子の配列をクローニングすることにより、細胞内で転写される。ベクターシステムの一つの例は、ＧｅｎｅＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒＴＭ  ＲＮＡ干渉キット（Ｉｍｇｅｎｅｘから市販されている）である。そのＵ６およびＨ１プロモーターは、Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターのＩＩＩ型クラスの一員である。Ｕ６様プロモーターの＋１のヌクレオチドは、常にグアノシンであり、一方、Ｈ１プロモーターの＋１は、アデノシンである。これらのプロモーターについての終結シグナルは、五つの連続したチミジンにより規定される。その転写物は、代表的に、２番目のウリジンの後で切断される。この位置での切断が、発現されたｓｉＲＮＡにおいて、合成ｓｉＲＮＡの３’オーバーハングに類似した３’ＵＵオーバーハングを生じる。４００ヌクレオチド長未満の任意の配列が、これらのプロモーターにより転写され得、それゆえ、それらの配列は、例えば約５０〜１００ヌクレオチドのＲＮＡステムループ転写物中の約１５〜３０ヌクレオチドのｓｉＲＮＡの発現に理想的に適合する。ＲＮＡｉおよびｓｉＲＮＡの効果に影響する因子の特徴が研究された（３７）。
【００２３】
第一の局面において、本発明は、単離されたポリヌクレオチドを提供し、その長さは２００ヌクレオチド以下かつ１５ヌクレオチド以上の、任意の数のヌクレオチド長であり得る。そのポリヌクレオチドは、損傷した組織の皮膚の細胞中に存在し、そして本明細書中で標的として同定された遺伝子配列を標的とする、第１のヌクレオチド配列を含む。そのポリヌクレオチドにおいて、任意のＴ（チミジン）または、任意のＵ（ウリジン）が、その一方により随意に置換され得る。加えて、そのポリヌクレオチドにおいて、第１のヌクレオチド配列は、ａ）１５〜３０の任意の数のヌクレオチド長の配列、またはｂ）ａ）において与えられた配列の相補鎖、から成る。そのようなポリヌクレオチドは、本明細書では、直鎖状ポリヌクレオチドと名付けられ得る。一本鎖のポリヌクレオチドは、しばしば、二本鎖ｓｉＲＮＡの一本の鎖である。
【００２４】
関連した局面において、上述のポリヌクレオチドは、ループ配列により第１のヌクレオチド配列から分離された第２のヌクレオチド配列含む。その第２のヌクレオチド配列は、
ａ）  第１のヌクレオチド配列と実質的に同じ長さを有し、そして
ｂ）  第１のヌクレオチド配列に実質的に相補的である。
【００２５】
ヘアピンポリヌクレオチドと名付けられたこの後者の構造において、上記第１のヌクレオチド配列は、第２のヌクレオチド配列とハイブリダイズして、その相補的な配列がループ配列により連結されたヘアピンを形成する。ヘアピンポリヌクレオチドは、細胞内で消化され、２本鎖ｓｉＲＮＡを形成する。
【００２６】
直鎖状ポリヌクレオチドおよびヘアピンポリヌクレオチドの多くの実施形態において、第１のヌクレオチド配列は、以下のうちのいずれかである：
ａ）  以下の表１ａから表９ｂに記載される配列から選択される配列を標的とする標的指向配列；
ｂ）  項目ａ）で与えられた配列より長い、表１ａから表９ｂより選択された配列を標的とする標的指向配列。
【００２７】
ｃ）  ａ）またはｂ）において与えられた配列のフラグメントであって、該フラグメントは、少なくとも１５ヌクレオチド長の連続する塩基の配列からなり、そして選択された配列より多くて１塩基短い、フラグメント。
【００２８】
ｄ）  ａ）からｃ）で与えられる配列と最大で５ヌクレオチドまで異なる標的指向配列、または
ｅ）  ａ）からｄ）で与えられるいずれかの配列の相補体。
【００２９】
【表１】
2009522303.tif 000003
【００３０】
【表２】
2009522303.tif 000004
【００３１】
【表３】
2009522303.tif 000005
【００３２】
【表４】
2009522303.tif 000006
【００３３】
【表５】
2009522303.tif 000007
【００３４】
【表６】
2009522303.tif 000008
【００３５】
【表７】
2009522303.tif 000009
【００３６】
【表８】
2009522303.tif 000010
【００３７】
【表９】
2009522303.tif 000011
直鎖状ポリヌクレオチドまたはヘアピンポリヌクレオチドの種々の実施形態において、第１のヌクレオチド配列の長さは、２１ヌクレオチドから２５ヌクレオチドのいずれかの数である。多くの実施形態において、直鎖状ポリヌクレオチドまたはヘアピンポリヌクレオチドは、表１ａ〜表９ｂより選択された配列を標的とする標的指向配列からなり、そしてその選択された配列の３’に結合したジヌクレオチドオーバーハングを必要に応じて含む。直鎖状ポリヌクレオチドまたはヘアピンポリヌクレオチドのなおさらなる実施形態において、第１のヌクレオチド配列の３’末端のジヌクレオチド配列は、ＴＴ、ＴＵ、ＵＴ、またはＵＵであり、そしてリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、または両方を含む。さらなる種々の実施形態において、直鎖状ポリヌクレオチドまたはヘアピンポリヌクレオチドはＤＮＡでもよいし、またはＲＮＡであってもよいし、またはデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの両方から構成されてもよい。
【００３８】
本発明のさらなる局面が、二本鎖ポリヌクレオチドを提供する。そのポリヌクレオチドは、上述の第１の直鎖状ポリヌクレオチド鎖、およびこの第１の鎖の少なくとも最初のヌクレオチド配列に相補的であり、そしてそれにハイブリダイズして二本鎖ｓｉＲＮＡ組成物を形成する第２のポリヌクレオチドを含む。
【００３９】
図１は、本発明のポリヌクレオチドの特定の実施形態の概略図を提供する。本発明は、標的配列または、特定の事例においては、標的配列とわずかにミスマッチのｓｉＲＮＡ配列を開示し、それらの全てが表１ａから表９ｂに提示される。その中で開示される配列は、長さが１９ヌクレオチドから２５ヌクレオチドの範囲にある。標的指向配列は、図１において、白抜きのブロックにより表示される。図１、パネルＡ、ａ）は一つの実施形態を説明し、その中で「ＳＥＱ」として示される開示された配列は、全体の長さが２００ヌクレオチドに及び得るより大きなポリヌクレオチド中に必要に応じて含まれ得る。
【００４０】
本発明はさらに、標的指向ポリヌクレオチドにおける標的指向配列を提供する。この標的指向配列は、表１ａから表９ｂより選択される標的配列をし、この標的指向ポリヌクレオチドがＳＥＱにより示される第１のヌクレオチド配列よりも長い配列を標的とするように、より長い標的指向配列の一部であり得る。このことは、図１、パネルＡ、ｂ）に図示され、ここで完全な標的指向配列は、ポリヌクレオチドの上の水平の線、およびＳＥＱブロックを取り囲む灰色によって示される。ポリヌクレオチドの全ての実施例におけるように、このより長い配列は、長さが２００塩基またはより少ない塩基である、さらに大きなポリヌクレオチド中に必要に応じて含まれ得る（図１、パネルＡ、ｂ）。
【００４１】
本発明は、さらに、上記の標的指向配列のいずれかのフラグメントである標的指向配列を提供する。そのようなフラグメントは、少なくとも１５ヌクレオチドの長さの（そして参照配列よりも多くて１塩基短い；図１、パネルＡ、ｃ）に示す）、表１ａから表９ｂで与えられる配列、ならびに表１ａから表９ｂで与えられる標的配列に相補的な配列と最大５ヌクレオチドまで異なり得る標的指向配列（図１、パネルＡ、ｄに図示され、この例では、３本の黒い垂直の棒線により示される三つの異なる塩基を示している）を標的とする。
【００４２】
さらになお本発明は、上述の配列のいずれかに相補的な配列を提供する（図１、パネルＡ、ｅ）に示され、「ＣＯＭＰＬ」として表す）。これらの配列のいずれもが、本発明のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに含まれる。本発明の任意の直鎖状ポリヌクレオチドは、先のａ）〜ｅ）において記載された配列のみから構成され得るか、または２００ヌクレオチドの限度までの付加的な塩基を必要に応じて含み得る。ＲＮＡ干渉は二本鎖ＲＮＡを必要とすることから、標的指向ポリヌクレオチドは、それ自体が少なくとも表１ａから表９ｂにより与えられる配列に相補的であり、その標的指向ポリヌクレオチドにハイブリダイズし得る第２の鎖を含む二本鎖であってもよいし、または相補鎖を生成するために細胞内プロセスに頼ってもよい。
【００４３】
したがって、上記ポリヌクレオチドは、一本鎖であってもよいし、または二本鎖であってもよい。なおさらなる実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドのみを含有するか、またはリボヌクレオチドのみを含有するか、またはデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの両方を含有する。本明細書に記載されたポリヌクレオチドの重要な実施形態において、上記標的配列は、長さが１５ヌクレオチド（ｎｔ）、または１６ｎｔ、または１７ｎｔ、または１８ｎｔ、または１９ｎｔ、または２０ｎｔ、または２１ｎｔ、または２２ｎｔ、または２３ｎｔ、または２４ｎｔ、または２５ｎｔ、または２６ｎｔ、または２７ｎｔ、または２８ｎｔ、または２９ｎｔ、または３０ｎｔのいずれかであり得る配列からなる。さらに付加的な有利な実施形態において、上記標的指向配列は、標的配列への相補性から最大５塩基異なり得る。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載された３’ジヌクレオチドオーバーハングを必要に応じて含む標的指向配列からなるｓｉＲＮＡである。
【００４５】
あるいは、ＲＮＡ干渉における二本鎖ＲＮＡのための必要性の認識において、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、分子内ヘアピンループ二本鎖分子を形成するために調製され得る。そのような分子は、先述の段落の実施形態のいずれかにおいて記載された第１の配列に短いループ配列が続き、そして次にその第１の配列に相補的な第２の配列が続いて形成される。そのような構造が、所望される分子内ヘアピンを形成する。さらに、このポリヌクレオチドはまた２００ヌクレオチドの最大長を持つとして開示され、その結果、列挙された三つの要求される構造は、２００ヌクレオチドまでの任意の全長を有するいずれかのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドから構成され得る。ヘアピンループポリヌクレオチドは、図１、パネルＢに図示される。
【００４６】
（種々の処方でのｓｉＲＮＡの局所的な送達の改善）
本発明は、ＲＮＡ干渉（ｓｉＲＮＡ）を導入することによる標的遺伝子発現のサイレンシングまたはダウンレギュレーションにより、皮膚の組織の損傷に対する炎症反応による創傷治癒プロセスの間の瘢痕形成を予防するための方法を提供する。本発明の方法において、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡカクテルが、治癒プロセスの間に皮膚の創傷の領域に適用または投与される。この処置は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物に提供され得る。細胞生物学および分子生物学における最近の進歩のために、本発明者らは、創傷の修復および組織の再生に関与する生物学的なプロセスの理解を大きく広げ、そして創傷管理における改善を導いた。創傷治癒は、可溶性メディエーター、血球、細胞外マトリックス、および実質細胞、ならびにそれらの細胞おける多くの遺伝子の機能を含む、動的で相互に影響し合うプロセスである。本発明者らは、特定の炎症アクチベーター（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、Ｃｏｘ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、Ｈｏｘｂ１３、フィブロネクチン、Ｓｍａｄ３、およびＳｆｒｓ３等）の発現を制御する、単独または組み合わせのいずれかで使用されるｓｉＲＮＡインヒビターの使用が、瘢痕形成の少ない理想的な創傷治癒プロセスを導くと考える。最適のレジメンでの、このｓｉＲＮＡで媒介される処置は、炎症を最小化し、皮膚組織の形成および組織の再構築を増強する。これらは、創傷治癒プロセスの三つの主要なステップである。
【００４７】
（薬学的組成物）
本明細書で用いる場合、薬学的組成物に言及する「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的な投与に適した任意かつ全ての溶媒、分散媒体、被覆物、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むことが意図される。適切なキャリアは、テキスト(例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｅｎｎａｒｏ  ＡＲ  （Ｅｄ．）２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （２０００）  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  ＰＡ，ＵＳＡおよびＷｉｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｇｉｓｖｏｌｄ’ｓ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｄｅｌｇａｄｏ  ａｎｄ  Ｒｅｍｅｒｓ，Ｌｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ．)に記載され、それらは本明細書で参考として援用される。そのようなキャリアまたは希釈剤中で用いられ得る組成物の好ましい例としては、水、生理食塩水、リン酸塩、カルボン酸塩、アミノ酸溶液、リンガー液、ブドウ糖（グルコースの同義語）溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、それらに限定されない。非限定的な例として、ブドウ糖は、５％または１０％水性溶液として用いられ得る。リポソームおよび固定油のような非水性ビヒクルもまた用いられ得る。薬学的に活性な物質のための、そのような媒体および薬剤の使用は当該分野で周知である。補足的な活性化合物がまた、その組成物中に組み込まれ得る。
【００４８】
本発明の薬学的組成物は、意図される投与経路に適合するように処方される。投与経路の例としては、非経口的（例えば、静脈内、皮内、皮下、口、鼻、吸引、経皮（局所）、経粘膜、および直腸）投与が挙げられる。非経口的、静脈、皮内、または皮下への適用のために用いられる溶液または懸濁物は、以下の成分を含み得る：滅菌希釈剤（例えば、注射のための水、食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒）；抗細菌剤(例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン)；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）；緩衝剤（例えば、アセテート、クエン酸塩またはリン酸塩）、および等張化のための薬剤（例えば塩化ナトリウムまたはブドウ糖）。
【００４９】
吸引による投与のため、上記化合物は、適切な高圧ガス（例えば、二酸化炭素のようなガス）を含む加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザからのエーロゾルスプレーの形態で送達される。
【００５０】
一つの実施形態において、上記活性化合物は、身体からの迅速な排除からその化合物を保護するキャリアとともに調製される（例えば、インプラント、およびマイクロカプセルに包まれた送達システムを含む、制御された放出用処方物（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ））。徐放調製物（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）の適切な例としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性基質が挙げられ、その基質は成形された物品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態である。徐放用基質の例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（メタクリル酸−２−ヒドロキシエチル）、またはポリ(ビニルアルコール)）、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタミン酸塩のコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマーおよびリュープロリド酢酸塩からなる注射可能なミクロスフェア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは１００日を超える分子の放出を可能にする一方で、特定のヒドロゲルは薬学的に活性な薬剤をより短い期間にわたって放出する。有利なポリマーは、生分解性であるか、または生体親和性である。リポソーム懸濁物（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を持つ感染細胞を標的にするリポソームを含む）もまた、薬学的に受容可能なキャリアとして用いられ得る。これらは、当業者に公知の方法（例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載された方法）により調製され得る。有利な形態を有する徐放用調製物(例えば、ミクロスフェア)は、上述されたような物質から調製され得る。
【００５１】
本発明のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、ベクター中に挿入され得、そして遺伝子治療ベクターとして用いられ得る。遺伝子治療ベクターは、多数の経路のうちのいずれかにより被験体に送達され得る（例えば、米国特許第５，７０３，０５５号に記載された経路）。したがって、送達はまた、静脈注射、局所的投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）、または定位的な注射（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３０５４−３０５７を参照のこと）を含み得る。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物は、受容可能な希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含み得るか、または遺伝子送達ビヒクルが中に入れられた遅延放出用の基質を含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクター（例えば、レトロウイルスベクター）が、組み換え細胞から無傷で産生され得る場合、その薬学的調製物は、この遺伝子送達システムを産生する一つ以上の細胞を含み得る。
【００５２】
上記薬学的組成物は、キット（例えば、容器、パック、またはディスペンサー中に、投与のための説明書とともに）中に含まれ得る。
【００５３】
ｓｉＲＮＡインヒビターを含む処方物または薬学的組成物を調製するために供給された種々のキャリアが、局所的な適用、局所的な注射または経皮投与によるｓｉＲＮＡ治療用物質の局所的な送達を改善するために用いられ得る。いくつかの実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、培養中の細胞の中へ、または目的の細胞の中へ、リポソーム媒介トランスフェクション（例えば、市販されている試薬または技術（例えば、ＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅＴＭ、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ２０００ＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いることにより）により、ならびにエレクトロポレーション、および類似の技術により送達される。上記ｓｉＲＮＡを含有する薬学的組成物は、ｓｉＲＮＡの安定性を保護し、ｓｉＲＮＡの半減期を延長し、ｓｉＲＮＡの機能を増強し、またはｓｉＲＮＡを特異的な組織／細胞に指向させる付加的な成分を含む。これらの成分としては、種々の生分解性ポリマー、陽イオン性ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン）、陽イオン性コポリペプチド（例えば、ヒスチジン−リジン（ＨＫ）ポリペプチド）(例えば、Ｍｉｘｓｏｎらの国際公開第０１／４７４９６号、Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘの国際公開第０２／０９６９４１号、およびＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙの国際公開第９９／４２０９１号を参照のこと)、ＰＥＧ化陽イオン性ポリペプチド、およびリガンドの組み込まれたポリマー等、正に荷電したポリペプチド、ＰｏｌｙＴｒａｎ溶液（ＨＫポリマーおよび多糖（例えば、スクレログルカン（ｓｃｌｅｒｏｇｌｕｃａｎ）としても知られる天然の多糖）の、塩溶液または水性溶液）、ＴａｒｇｅＴｒａｎ（標的指向リガンドを含む結合体化ＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＥＩポリマーからなるナノ粒子の、塩または水性懸濁物）、界面活性剤（Ｉｎｆａｓｕｒｆ；Ｆｏｒｅｓｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．；ＯＮＹ  Ｉｎｃ．）、および陽イオン性ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン）（３７〜３９）が挙げられる。Ｉｎｆａｓｕｒｆ（登録商標）（ｃａｌｆａｃｔａｎｔ）は、気管内点滴における使用のために子牛肺から単離された、天然の肺の界面活性物質であり、リン脂質、中性脂肪、およびプロテインＢおよびプロテインＣに関連する疎水性界面活性物質を含有する。そのポリマーは、一次元または多次元のいずれでもよく、そしてまた、直径が、２０ミクロンより小さいか、２０ミクロンと１００ミクロンの間か、または１００ミクロンを超える、微粒子またはナノ粒子でもよい（４０〜４２）。該ポリマーは、特別な組織または細胞のレセプターまたは分子に特異的なリガンド分子を有し得、したがってｓｉＲＮＡの標的指向送達のために用いられ得る。ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドはまた、陽イオン性リポソームを基礎とするキャリア(例えば、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＡＰ／コレステロール（Ｑｂｉｏｇｅｎｓ，Ｉｎｃ．）および他の型の脂質の水性溶液)により送達される。ｓｉＲＮＡインヒビターを含有する天然のクリームが、瘢痕を生じない創傷治癒を増強するために、創傷組織表面に局所的に適用できる。
【００５４】
（ｓｉＲＮＡ媒介遺伝子ノックダウンを評価するＲＴ−ＰＣＲ）
ｓｉＲＮＡインヒビターのインビトロおよびインビボでの遺伝子ノックダウンの有効性を評価するための、よく確立された方法は、ｓｉＲＮＡ処置前と処置後のｍＲＮＡレベルを測定する定量的逆転写ＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）である。種々の実施形態において、ＱＲＴ−ＰＣＲのために有用なプライマーが、細胞培養実験、ならびにマウスモデル、ウサギモデルおよびブタモデルの皮膚組織サンプルから採集された全ＲＮＡサンプル由来のＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、Ｃｏｘ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、Ｈｏｘｂ１３、フィブロネクチン、Ｓｍａｄ３、およびＳｆｒｓ３等のｍＲＮＡレベルの測定に特異的に設計された。
【００５５】
ＴＧＦ−β１のｍＲＮＡのＱＲＴ−ＰＣＲ測定のためのプライマー：
【００５６】
【化１】
2009522303.tif 000012
ＴＧＦ−β２のｍＲＮＡのＱＲＴ−ＰＣＲ測定のためのプライマー：
【００５７】
【化２】
2009522303.tif 000013
Ｃｏｘ−２のｍＲＮＡのＱＲＴ−ＰＣＲ測定のためのプライマー：
【００５８】
【化３】
2009522303.tif 000014
Ｈｏｘｂ１３のｍＲＮＡのＱＲＴ−ＰＣＲ測定のためのプライマー：
【００５９】
【化４】
2009522303.tif 000015
フィブロネクチンのｍＲＮＡのＱＲＴ−ＰＣＲ測定のためのプライマー：
【００６０】
【化５】
2009522303.tif 000016
Ｓｆｒｓ３のｍＲＮＡのＱＲＴ−ＰＣＲ測定のためのプライマー：
【００６１】
【化６】
2009522303.tif 000017
ＩＬ−６のｍＲＮＡのＱＲＴ−ＰＣＲ測定のためのプライマー：
【００６２】
【化７】
2009522303.tif 000018
ＩＬ−８のｍＲＮＡのＱＲＴ−ＰＣＲ測定のためのプライマー：
【００６３】
【化８】
2009522303.tif 000019
Ｓｍａｄ３のｍＲＮＡのＱＲＴ−ＰＣＲ測定のためのプライマー：
【００６４】
【化９】
2009522303.tif 000020
（ｓｉＲＮＡカクテル組成物）
瘢痕形成をともなわない皮膚の創傷治癒改善のための、注射可能な溶液またはクリームを用いる局所的または皮下のいずれかの局所的適用での、特定の遺伝子標的（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、Ｃｏｘ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、Ｈｏｘｂ１３、フィブロネクチン、Ｓｍａｄ３、およびＳｆｒｓ３等）のそれぞれを標的とするｓｉＲＮＡ二本鎖の使用に加えて、本発明は、瘢痕を生じない創傷治癒のより良い臨床的な結果のための治療用物質として、三つ以上のそれらの遺伝子を選択的に標的とするｓｉＲＮＡオリゴカクテル（ｓｉＲＮＡ−ＯＣ）を用いるための概念、方法および組成物を提供する。このｓｉＲＮＡオリゴカクテルは、少なくとも三つのｍＲＮＡ標的を標的とする少なくとも三つの二本鎖を含有する。本発明は、二つの重要な局面に基づく：第一には、ｓｉＲＮＡ二本鎖は、たいへん有力な遺伝子発現インヒビターであり、そしてそれぞれのｓｉＲＮＡ分子は、同じ化学的特性を持つ短い二本鎖ＲＮＡオリゴ（２１ｎｔ〜２３ｎｔ、または２４ｎｔ〜２５ｎｔ、または２６ｎｔ〜２９ｎｔ）から作られる；第二には、皮膚の創傷治癒プロセスは、炎症、組織形成、および組織再構築において機能する複数の因子とともに、可溶性媒体、血球、細胞外マトリックス、および実質細胞が関与する。したがって、複数の疾患原因遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ−ＯＣを用いることは、ｓｉＲＮＡ二本鎖の化学的均一性、および複数の疾患原因遺伝子のダウンレギュレーションに由来する相乗効果により、有利な治療上のアプローチを意味する。ｓｉＲＮＡ−ＯＣは、種々の割合および種々の物理的形態（溶液または粉末）での、そして同時に同じ経路により、または異なる経路および時間(例えば、損傷からの回復の間)で疾患組織に適用される、少なくとも三つの遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二本鎖の組み合わせであると、本発明は定義する。
【００６５】
創傷治癒プロセスは、三つの段階（炎症、組織形成、および組織再構築）で特徴づけることができる。
【００６６】
組織損傷は、血管の崩壊および血液成分の血管外遊出を引き起こす。多数の血管作用性メディエーターおよび走化性因子が、凝固経路および活性化された補体経路によって、ならびに損傷または活性化された間質細胞によって、生成される。これらの物質は、損傷部位へ炎症性白血球を集める。浸潤性好中球が、創傷領域の外来粒子および細菌を取り除き、そして外来粒子および細菌は、その後痂皮とともに追い出されるか、またはマクロファージにより貪食される。特異的な化学誘引物質（例えば、細胞外マトリックスタンパク質のフラグメント、トランスホーミング増殖因子β、および単球遊走因子−１）への応答において、単球もまた、創傷部位へ浸潤し、そして増殖因子(例えば、肉芽組織の形成を開始する血小板由来増殖因子および血管内皮増殖因子)を放出する活性化されたマクロファージとなる。マクロファージは、細胞外マトリックスの特異的なタンパク質に、マクロファージのインテグリンレセプターにより結合し、その作用が、マクロファージによる微生物および細胞外マトリックスのフラグメントの貪食を促進する。細胞外マトリックスへの接着はまた、単球を刺激し、炎症性マクロファージまたは修復性マクロファージへの変態を起こす。接着は、単球およびマクロファージがコロニー刺激因子１（単球およびマクロファージの生存に必要なサイトカイン）、腫瘍壊死因子α（有力な炎症性サイトカイン）、ならびに血小板由来増殖因子（線維芽細胞のための有力な化学誘引物質およびマイトジェン）を発現するように誘導する。単球およびマクロファージにより発現される他の重要なサイトカインは、トランスホーミング増殖因子α、インターロイキン−１、トランスホーミング増殖因子β、およびインスリン様成長因子Ｉである。マクロファージ欠損動物は、不完全な創傷修復を有することから、単球由来増殖因子およびマクロファージ由来増殖因子は、創傷における新しい組織の形成の開始および伝播のために、ほとんど疑いなく必要である。したがって、マクロファージは、炎症と修復との間の移行において重要な役割りを有するようである。明らかに、初期の炎症段階は、複数の因子、特に前炎症性サイトカインおよび増殖因子を必要とする。それゆえに、瘢痕形成の原因であるそれらの前炎症性サイトカインおよび増殖因子（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＣｏｘ−２）を、ｓｉＲＮＡオリゴカクテル（組み合わせにおいて）を用いてダウンレギュレートすることは、非常に有益である。その組み合わせとしては、ＴＧＦ−β１／Ｈｏｘｂ１３／ＩＬ−８、ＴＧＦ−β２／Ｈｏｘｂ１３／ＩＬ−８、ＴＧＦ−β１／Ｓｆｒｓ３／ＩＬ−８、ＴＧＦ−β１／Ｃｏｘ−２／ＩＬ−８、ＴＧＦ−β２／Ｈｏｘｂ１３／ＩＬ−８、およびＴＧＦ−β１／Ｓｍａｄ３／ＩＬ−６が挙げられるが、それらに限定されない。
【００６７】
混合物（カクテル）は、全て１９ｍｅｒのオリゴ、または全て２５ｍｅｒのオリゴ、または、１９ｍｅｒもしくは２５ｍｅｒのいずれかのオリゴから作成され得る。
【００６８】
混合物（カクテル）は、本明細書において同定された遺伝子標的の中から選択された、任意の２遺伝子、または任意の３遺伝子、または任意の４遺伝子、または任意の５遺伝子、またはそれより多い遺伝子から作成され得る。
【００６９】
ｓｉＲＮＡカクテルは、他の物質（例えば、抗生物質、抗体、低分子インヒビター、コルチゾン、天然のクリーム、薬草のクリーム、および他の抗炎症剤）とともに適用され得る。
【００７０】
他に定義しないかぎり、本明細書中で用いる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を持つ。具体例としての方法および材料を以下に記載するが、本明細書中に記載される方法および材料に類似または同一の方法および材料が、本発明の実施または試行において使用され得る。本明細書中で言及される全ての公刊物、および他の引用は、それらの全体が参考として援用される。矛盾する場合においては、定義を含めて本明細書が支配する。多数の文書が本明細書中に引用されるが、この引用は、これらの文書のいずれも当該分野で共通の一般的な知識の一部を形成するという承認を構成しない。本明細書および特許請求の範囲をとおして、用語「含む」または、その変化（例えば、「含む」または「含んでいる」）は、言明された整数または整数群の包含を意味するが、任意の他の整数または整数群の除外を意味するものではないと理解される。材料、方法、および実施例は例示のものであるのみであり、限定することは意図されない。
【実施例】
【００７１】
（実施例１：ＴＧＦ−β１／ＴＧＦ−β２／Ｃｏｘ−２の組み合わせ）
示された配列を標的とする以下の三つのオリゴヌクレオチドを等量（ｗ／ｗ／ｗ）で組み合わせる。
【００７２】
【化１０】
2009522303.tif 000021
これらは、水性溶液中で調製するか、または局所的な適用もしくは皮下注射のための適切なキャリア中に処方する。または、瘢痕形成の有益な最小化を促進するために上述の三つの標的指向オリゴヌクレオチドを、種々の異なる割合で、溶液中で組み合わせるか、または、局所的な適用もしくは皮下注射のための適切なキャリア中に処方する。より一般的には、同じ三つの遺伝子の他の配列を標的にする、他のｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを、治療上の適用のためのカクテルとして混合する。そのような標的指向オリゴヌクレオチドとして、表１．１および表１．２からのＣｏｘ−２配列を標的とするｓｉＲＮＡ、表７．１および表７．２からのＴＧＦ−β１配列を標的とするｓｉＲＮＡ、ならびに表８．１および表８．２からのＴＧＦ−β２配列を標的とするｓｉＲＮＡが挙げられる。
【００７３】
（実施例２：ＴＧＦ−β１／Ｈｏｘｂ１３／Ｃｏｘ−２の組み合わせ）
示された配列を標的とする以下の三つのオリゴヌクレオチドを等量（ｗ／ｗ／ｗ）で組み合わせる。
【００７４】
【化１１】
2009522303.tif 000022
これらを、水性溶液中で調製するか、または局所的な適用もしくは皮下注射のための適切なキャリア中に処方する。または、瘢痕形成の有益な最小化を促進するために上述の三つの標的指向オリゴヌクレオチドを、種々の異なる割合で、溶液中で組み合わせるか、または、局所的な適用もしくは皮下注射のための適切なキャリア中に処方する。より一般的には、同じ三つの遺伝子の他の配列を標的にする他のｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを、治療上の適用のためのカクテルとして混合する。そのような標的指向オリゴヌクレオチドとして、表１．１および表１．２からのＣｏｘ−２配列を標的とするｓｉＲＮＡ、表７．１および表７．２からのＴＧＦ−β１配列を標的とするｓｉＲＮＡ、ならびに表３．１および表３．２からのＨｏｘｂ１３配列を標的とするｓｉＲＮＡが挙げられる。
【００７５】
（実施例３：ＴＧＦ−β１／Ｈｏｘｂ１３／Ｓｆｒｓ３の組み合わせ）
示された配列を標的とする以下の三つのオリゴヌクレオチドを等量（ｗ／ｗ／ｗ）で組み合わせる。
【００７６】
【化１２】
2009522303.tif 000023
これらを、水性溶液中で調製するか、または局所的な適用もしくは皮下注射のための適切なキャリア中に処方する。または、瘢痕形成の有益な最小化を促進するために上述の三つの標的指向オリゴヌクレオチドを、種々の異なる割合で、溶液中で組み合わせるか、または、局所的な適用もしくは皮下注射のための適切なキャリア中に処方する。より一般的には、同じ三つの遺伝子の他の配列を標的にする他のｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを、治療上の適用のためのカクテルとして混合する。そのような標的指向オリゴヌクレオチドとして、表６．１および表６．２からのＳｆｒｓ３配列を標的とするｓｉＲＮＡ、表７．１および表７．２からのＴＧＦ−β１配列を標的とするｓｉＲＮＡ、ならびに表３．１および表３．２からのＨｏｘｂ１３配列を標的とするｓｉＲＮＡが挙げられる。
【００７７】
（実施例４：ＴＧＦ−β１／Ｈｏｘｂ１３／ＩＬ−６の組み合わせ）
示された配列を標的とする以下の三つのオリゴヌクレオチドを等量（ｗ／ｗ／ｗ）で組み合わせる。
【００７８】
【化１３】
2009522303.tif 000024
これらを、水性溶液中で調製するか、または局所的な適用もしくは皮下注射のための適切なキャリア中に処方する。または、瘢痕形成の有益な最小化を促進するために、上述の三つの標的指向オリゴヌクレオチドを、種々の異なる割合で、溶液中で組み合わせるか、または、局所的な適用もしくは皮下注射のための適切なキャリア中に処方する。より一般的には、同じ三つの遺伝子の他の配列を標的にする他のｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを、治療上の適用のためのカクテルとして混合する。そのような標的指向オリゴヌクレオチドとして、表４．１および表４．２からのＩＬ−６配列を標的とするｓｉＲＮＡ、表７．１および表７．２からのＴＧＦ−β１配列を標的とするｓｉＲＮＡ、ならびに表３．１および表３．２からのＨｏｘｂ１３配列を標的とするｓｉＲＮＡが挙げられる。
【００７９】
（文献）
【００８０】
【化１４】
2009522303.tif 000025
【００８１】
【化１５】
2009522303.tif 000026
【００８２】
【化１６】
2009522303.tif 000027
【００８３】
【化１７】
2009522303.tif 000028
【００８４】
【化１８】
2009522303.tif 000029
【００８５】
【化１９】
2009522303.tif 000030
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】図１は、標的配列を灰色のブロックによって現わした、本発明のポリヌクレオチドの特定の実施形態を示す概略図である。ポリヌクレオチドの長さは、１〜２００ヌクレオチドの範囲であり得る。パネルＡは、直鎖状ポリヌクレオチドを示し、そしてパネルＢは、ヘアピンループポリヌクレオチドを示す。開示された標的配列は「ＳＥＱ」と標識され、一方、標的配列に相補的な配列は「ＣＯＭＰＬ」と標識される。パネルＡ、ｂ）において、ポリヌクレオチドの上方の水平の線およびＳＥＱブロックを囲むより黒い影は、完全な標的配列（ＴＡＲＧＥＴ）が「ＳＥＱ」により示される配列よりもより長く、そして「ＳＥＱ」により示される配列を含むことを表わす。パネルＡ、ｃ）において、
【化２０】
2009522303.tif 000031
は、１５ヌクレオチドと開示された参照配列より１ヌクレオチド少ないヌクレオチドの間の範囲にある標的配列を表わす。パネルＡ、ｄ）において、より黒い垂直の棒線は、最大５つのヌクレオチドが開示された参照配列から異なり得ることを表わす。
【図１】
2009522303.tif 000032
【配列表】
2009522303000001.app
【国際調査報告】
2009522303.tif 000033
2009522303.tif 000034
2009522303.tif 000035
2009522303.tif 000036
2009522303.tif 000037