(57)【要約】  多数のキメラpRNA分子から形成された多価の多重結合性複合体であって、各々は、少なくとも1つの生物活性部分、検出可能な標識、又は他の異種成分を有する、前記複合体。
2009502198.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一対の二重鎖ヘリックスドメイン及び分子間相互作用ドメインを含むpRNAキメラであって、当該一対の二重鎖ヘリックスドメインがsiRNAを含む異種成分を含む、前記pRNAキメラ。
【請求項２】
前記siRNAが、癌細胞中で発現された遺伝子を停止させるために効果的である、請求項１記載のpRNAキメラ。
【請求項３】
前記遺伝子がサバイビンをコードする、請求項２記載のpRNAキメラ。
【請求項４】
前記siRNAが、ウイルス遺伝子を停止させるために効果的である、請求項１記載のpRNAキメラ。
【請求項５】
一対の二重鎖ヘリックスドメイン、分子間相互作用ドメイン、及びpRNAの5'又は3'末端に連結した異種成分を含むpRNAキメラ。
【請求項６】
前記異種成分が標的部分を含む、請求項５記載のpRNAキメラ。
【請求項７】
前記標的部分が葉酸を含む、請求項６記載のpRNAキメラ。
【請求項８】
前記葉酸が、pRNAの5'オーバーハング末端に連結される、請求項７記載のpRNAキメラ。
【請求項９】
前記異種成分が、検出可能な標識を含む、請求項５記載のpRNAキメラ。
【請求項１０】
一対の二重鎖ヘリックスドメイン、分子間相互作用ドメイン、及びpRNAの5'又は3'末端にアニールされたオリゴヌクレオチドを含むpRNAキメラ。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドがDNAオリゴヌクレオチドを含む、請求項１０記載のpRNAキメラ。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチドが、検出可能な標識を含む、請求項１０又は１１記載のpRNAキメラ。
【請求項１３】
前記検出可能な標識が、ビオチン又は放射性同位体を含む、請求項１２記載のpRNAキメラ。
【請求項１４】
前記pRNAが、3'オーバーハング末端を含み、そして前記オリゴヌクレオチドが3'オーバーハング末端にアニールされる、請求項１０〜１３のいずれか１項記載のpRNAキメラ。
【請求項１５】
多数のpRNAキメラを含む多価多重結合性pRNA複合体であって、少なくとも1つのpRNAキメラが、請求項１〜１４のいずれか１項記載のpRNAキメラを含む、前記pRNA複合体。
【請求項１６】
請求項１〜５及び１０〜１４のいずれか１項記載の第1のpRNAキメラ、及び標的部分を含む第2のpRNAキメラを含む、多価多重結合性pRNA複合体。
【請求項１７】
前記標的部分がRNAアプタマーを含む、請求項１６記載の多価多重結合性pRNA複合体。
【請求項１８】
前記標的部分が抗体を含む、請求項１６記載の多価多重結合性pRNA複合体。
【請求項１９】
前記標的部分が受容体リガンドを含む、請求項１６記載の多価多重結合性pRNA複合体。
【請求項２０】
前記受容体リガンドが葉酸を含む、請求項１９記載の多価多重結合性pRNA複合体。
【請求項２１】
前記第2のpRNAキメラが、環状に並べ替えられたpRNAキメラである、請求項１６〜２０のいずれか１項記載の多価多重結合性pRNA複合体。
【請求項２２】
前記標的部分が、非-環状に並べ替えられたpRNAキメラに結合される、請求項１６〜２０のいずれか１項記載の多価多重結合性pRNA複合体。
【請求項２３】
治療剤を含む少なくとも1つの異種成分を含むpRNAキメラを含む、請求項１５〜２２のいずれか１項記載の多価多重結合性pRNA複合体。
【請求項２４】
エンドソーム破壊剤を含む少なくとも1つの異種成分を含むpRNAキメラを含む、請求項１５〜２３のいずれか１項記載の多価多重結合性pRNA複合体。
【請求項２５】
少なくとも1つの非天然型ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド結合を含む、請求項１５〜２４のいずれか１項記載の多価多重結合性pRNA複合体。
【請求項２６】
前記非天然型ポリヌクレオチドが、2'-NH2-2'-デオキシCTP、2'-CH3-2'-デオキシCTP、2'-F-2'-デオキシCTP、2'-F-2'デオキシUTP及びスピーゲルマーからなる群より選ばれるヌクレオチドを含む、請求項２０記載の多価pRNA複合体。
【請求項２７】
少なくとも1つの環状に並べ替えられたpRNAキメラ、及び少なくとも1つの非-環状に並べ替えられたpRNAキメラを含む、請求項１５〜２６のいずれか１項記載の多価多重結合性pRNA複合体。
【請求項２８】
ダイマー、トリマー又はヘキサマーである、請求項１５〜２７のいずれか１項記載の多価多重結合性pRNAキメラ。
【請求項２９】
少なくとも1つのpRNAが、リボザイム、siRNA、RNAアプタマー、アンチセンスRNA及びペプチド核酸（PNA）からなる群より選ばれる生物活性な部分を含む、請求項１５〜２８のいずれか１項記載の多価多重結合性pRNA複合体。
【請求項３０】
一対の二重鎖ヘリックスドメイン及び分子間相互作用ドメインを含むpRNAキメラであって、1つの非天然型ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド結合を更に含む、前記pRNAキメラ。
【請求項３１】
前記非天然型ポリヌクレオチドが、2'-NH2-2'-デオキシCTP、2'-CH3-2'-デオキシCTP、2'-F-2'-デオキシCTP、2'-F-2'デオキシUTP及びスピーゲルマーからなる群より選ばれるヌクレオチドを含む、請求項３０記載のpRNA複合体。
【請求項３２】
宿主細胞に治療剤を送達する方法であって、以下のステップ：
当該細胞を、請求項１５〜２９のいずれか１項記載の多価多重結合性pRNA複合体と接触させることを含み、
ここで、当該多価多重結合性pRNA複合体は、治療剤を含む第1のpRNAキメラ及び標的部分を含む第2のpRNAキメラを含み、それによって当該多価多重結合性複合体は宿主細胞により獲得される、前記方法。
【請求項３３】
前記標的部分が受容体に結合し、そして前記多価多重結合性複合体が、受容体-介在エンドサイトーシスによって細胞により獲得される、請求請３２記載の方法。
【請求項３４】
前記標的部分が葉酸を含む、請求項３２又は３３記載の方法。
【請求項３５】
前記治療剤が、siRNA、リボザイム又はアンチセンスRNAを含む、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞が、細胞、細胞培養物、組織、臓器又は生物中に存在する、請求項３２〜３５のいずれか１項記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項３２〜３６のいずれか１項記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞がヒト細胞である、請求項３６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本願は、2005年8月1日に出願された米国仮出願第60/704,261号の利益を請求し、2005年6月16日に出願された米国特許出願10/539,241号の継続特許出願であり；米国出願第No. 10/539,241号は、2003年12月16日に出願（2005年1月13日にWO2005/003293として公開）された国際特許出願第PCT/US 2003/039950号の米国国内段階特許出願であり；2002年12月16日に出願された米国仮特許出願第60/433,697号の利益を請求し、2003年2月24日に出願された米国特許出願第10/373,612号の継続特許出願であり、これは、2001年8月23日に出願された国際特許出願第PCT/US01/26333号の継続出願であり、これは、2000年8月23日に出願された米国仮出願第60/227,393号の利益を請求し、特許出願は、その全体が参考として本明細書に援用される。
【０００２】
政府権利の陳述
本発明は、国立衛生研究所からの助成（助成番号GM59944、GM48159及びR01-EB003730）、国防総省（乳癌コンセプト賞BC024308、及び助成番号W81XWH-05-0158及びDAMD17-03-1-0589); 並びに国立科学財団（助成番号MCB-9723923）の下、政府の支持によりなされた。政府は、本発明においてある権利を有する。
【０００３】
背景
ナノテクノロジーは、疾患の検出及び治療のための、かつてない様々な革命的方法をもたらした。その小サイズのために、ナノ粒子は、容易に、細胞表面上又は細胞内のいずれかで生体分子と接触することができる。この利点を利用するためには、特定の細胞又は組織に直接的に複数の治療薬を送達するための生物的バリアを迂回することができる、多機能的に設計された標的複合体を開発することが望ましい。身体の多くの部位へのその容易なアクセスに起因して、多価ナノ粒子は、従来では想像できない方法で検出と治療とを組み合わせるための、潜在力を有する大量の革新的なツールの可能性を提供する。
【０００４】
癌の進行の様々なステージで、異常で、機能不全な細胞は、様々な細胞性因子、シグナル分子、受容体及び他の特定の抗原を発現する。多価治療薬又は検出センサーによる独自の痕跡を有する癌の早期の検出及び治療は、大いに患者に利益を与え、生命を救うことができた（Hood他, Science 2002; 296: 2404-2407)。しかしながら、癌細胞のステージ-に特定の特徴を検出する能力を開発し、それによって標的画像及び多剤送達システムをつくることは、挑戦として残されている。50 nm超の粒子が細胞に入るのは困難であり；エンドサイトーシスの大きさの限界は、約100 nmである。20 nmより小さい分子は、循環中に血管から出て行き、体内でより短い保持時間を有することができた。
【０００５】
小干渉siRNA (Elbashir他. (2001)，Nature, 411, 494-498; McCaffrey他. (2002), Nature, 418, 38-39; Li他, Science 2002; 296: 1319-1321; Ryther他, Gene Ther 2005; 12: 5-11; Brummelkamp, Science 2002; 296; 550-553; Jacque他, Nature 2002; 418; 435-438; Carmichael, Nature 2002; 418: 379-380; Soutschek他, Nature 2004; 432(7014): 173-178)、リボザイム (Hoeprich他, Gene Therapy 2003, 10(15), 1258-1267; Rossi, Adv Drug Deliv Rev 2000; 44: 71-78)、及びアンチセンスRNA (Coleman他, Nature 1985; 315:601-603; Knecht他, Science 1987; 236: 1081-1086; Kumar他 (1998), Microbiol Mol Biol Rev, 62, 1415-1434) はすべて、癌性又はウイルス-感染細胞における特定の遺伝子発現をダウンレギュレートするための新規な分子的アプローチにおいて重要な可能性を示す。
【０００６】
siRNA及びリボザイムRNAは、配列-特異的方法で転写後遺伝子サイレンシングに広く利用されてきた。siRNAの送達は、ウイルスベクター送達 (Devroe他, Expert Opin Biol Ther 2004; 4: 319-327) 及び脂質-カプセル化RNA注入 (Morrissey他, Nat Biotechnol 2005; 23: 1002-1007) を含む、様々な方法によって研究されてきた。近年、コレステロール群に加わったsiRNAは、静脈注射によってマウスでの標的遺伝子発現を停止させることが報告されている (Soutschek他, Nature 2004; 432: 173-178)。siRNAはまた、HIV-関連遺伝子発現をノックダウンするために成功的に使用された (Novina他 (2002), Nat Med, 8, 681-686; Akkina他 (2003), Anticancer Res, 23, 1997-2005; Mariadason他, Cancer Res 2003; 63: 8791-8812)。
【０００７】
リボザイムは、標的RNA分子を開裂することができ、又は他の触媒的及び酵素的機能を奏することができるRNA分子である。構造的には、小ループの何れかの側に配置された2つの「アーム」によって特徴付けられる単一-鎖RNAである。リボゾーム塩基は、2つのアームのヌクレオチド配列と相補的である標的RNA上の部位とペアになる。ループ部位は、標的RNAの開裂機能を達成する活性的触媒中心として働く（図1）。
【０００８】
植物、ヒト及び動物における疾患の治療及び予防のためのリボザイムの使用は、生物工学に革命を起こす可能性を有する。ハンマーヘッド型リボザイムは、例えば、トランスジェニック植物及び動物においてRNAを開裂するために使用されてきた。しかしながら、試験管での研究の結果を報告する多数の刊行物にもかかわらず、生物でのハンマーヘッド型リボザイムの成功的使用に関する報告は、比較的少ない (Perriman他, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6175-6179 (1995))。ハンマーヘッド型リボザイムが試験管での特定のウイルスRNA又はmRNAを開裂することができることは明らかであるが、細胞中のリボザイムの不安定性及びミスフォールディング（misfolding）に起因して、細胞中の開裂効率は劇的に減少する。
【０００９】
細胞内環境におけるリボザイムの不安定性の主な原因は、細胞に存在するエキソヌクレアーゼによるリボザイムの分解である（Cotton他, EMBO J. 8: 3861-3866 (1989)）。エキソヌクレアーゼは、両末端から非-特異的にRNAを切断する酵素である。リボザイムの細胞内分解を妨害するために使用されている1つの方法は、ベクターRNA、例えばtRNAに、1末端でリボザイムを連結することによってリボザイムを保護することである (Vaish他, Nucl. Acids Res. 26: 5237-5242 (1998))。しかしながら、得られたキメラRNAのリフォールディング（refolding）に起因して、非保護リボザイムに比べて効率の点でリボザイムは変化した (Bertrand他, RNA 3: 75-88 (1997))。tRNAの両末端にリボザイムを繋ぐことも既に報告されているが、フォールディング及び/又は活性は解決した (Vaish他, Nucl. Adds Res. 26: 5237-5242 (1998))。
【００１０】
癌及び病原性感染に関連するRNAを開裂するためにリボザイムを使用することにより疾患を治療する可能性は、途方もなく大きい。分解に抵抗性であり、細胞内環境で活性であり続けるように正確に折り畳まれる、安定化されたリボザイムの利用性は、多くの重要な医薬治療の開発のために道を開いただろう。
【００１１】
癌及び他の疾患及び症状の治療のためにsiRNA及びリボザイムの成功的適用は、以下の問題を克服する必要がある：1) 膜透過性のサイズ限界に起因する細胞に入る困難性；2) 細胞内のエキソヌクレアーゼによる分解；3) 好適な細胞区画へのトラフィッキング（trafficking）；4) 担体に融合する場合には細胞内のリボザイム又はsiRNAの正確なフォールディング；及び5) 標的細胞の認識。現下、多数の治療的RNAの送達のための安全、効率的な、特異的かつ非病原性ナノ粒子の開発は、非常に望まれている。
【発明の開示】
【００１２】
発明の概要
本発明は、一対の二重鎖ヘリックスドメイン、分子内相互作用ドメイン、及び異種成分を含むキメラpRNAを提供する。異種成分は、キメラpRNAに対して所望の性質を付与し、生物活性部分（例えば、治療剤）、検出可能な標識、安定剤等の形態をとることがある。
【００１３】
1つの実施態様では、キメラpRNAは、環状に並べ替えられたpRNAキメラ分子である。pRNAキメラは、環状に並べ替えられたpRNA部位及び異種成分を含むスペーサ部位から形成される。異種成分は、化学的構造に限定されないが、好ましくは生物活性部分であり、より好ましくはRNA、例えばリボザイム、siRNA（小さな干渉RNA）、RNAアプタマー又はアンチセンスRNAである。スペーサ部位は、RNA部位に5'及び3'末端で共有結合的に連結される。場合により、スペーサ部位は、生物活性部分とpRNA部位との間に配置された第1及び第2ヌクレオチド列を含む。
【００１４】
他の実施態様では、本発明のpRNAキメラは、一対の二重鎖ヘリックス部位がsiRNAを含み、又はsiRNAから形成されるように、その異種成分としてsiRNAを含む。SiRNAは、細胞、例えば、癌細胞又はウイルスによって感染された細胞、内で発現された遺伝子を停止させるために効果的である。発現停止され得る遺伝子の例は、サバイビン及び様々なウイルス遺伝子を含む。
【００１５】
本発明のpRNAキメラの他の実施態様では、異種成分は、pRNAの5'又は3'末端で又はその近くで、pRNAに共有結合的に又は非共有結合的に連結される。pRNAの5'又は3'末端で又はその近くで連結するための好ましい異種成分は、標的部分、例えば葉酸、及び検出可能な標識、例えばビオチン、蛍光標識及び放射性標識を含む。特に好ましい実施態様では、pRNAは、5'オーバーハング末端を有し、及び異種成分は、5'オーバーハング末端に連結される。
【００１６】
本発明のpRNAキメラの更に他の実施態様では、異種成分は、pRNAの5'又は3'末端に（塩基-対/ハイブリダイゼーションによって）アニールされたオリゴヌクレオチドを含む。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、RNAオリゴヌクレオチドでもよいが、DNAオリゴヌクレオチドである。特に好ましい実施態様では、pRNAは、5'又は3'オーバーハング末端を有し、オリゴヌクレオチドは、オーバーハング末端にアニールし、好ましくは3'オーバーハング末端にアニールする。場合により、オリゴヌクレオチドは、検出可能な標識、例えばビオチン又は放射性標識を含む。
【００１７】
本発明のキメラpRNAは、単結合性でも又は多重結合性でもよい。多重結合性であるときには、pRNAは、好ましくは、多重結合性複合体を多価性にすることができる、ダイマー、トリマー又はヘキサマーである。多価の多重結合性複合体において、複数の異種成分は、同一であっても又は異なってもよい。多重結合性複合体は、有利には、他の構成的キメラpRNAによって運搬される1以上の治療剤を送達するために、特異的ターゲッティングを促進する1以上の生物活性部分、例えば、細胞表面結合、膜拡散又はエンドサイトーシスに関連する生物的部分、を含む。例えば、SELEX法は、細胞表面マーカーに結合するRNAアプタマーを選別するために一般的に使用されている (Ellington他, Nature 346, 818-822 (1990); Tuerk他, Science 249, 505-510 (1990))。かかるRNAアプタマーは、治療剤の送達中に、特異的細胞認識のためのpRNAダイマー、トリマー又はヘキサマーの1以上のサブユニットに結合され得る。多重結合性複合体に含まれ得る他の異種成分は、治療剤、標識成分、安定剤、例えば相補的オリゴヌクレオチド等の細胞内ターゲッティング及び放出に関連するものを含む。
【００１８】
pRNA部位は、バクテリオファージpRNA配列に特徴的な小型の安定な二次構造を有する。従って、pRNAキメラの1つの実施態様では、pRNA部位は、Φ29、SF5'、B103、PZA、M2、NF及びGA1からなる群より選ばれるバクテリオファージのpRNAを含む。pRNAは、環状的に並べ替えられてもよく、又は環状的に並べ替えられなくてもよい。pRNAキメラの別の実施態様では、pRNA部位は以下：
(i) スペーサ部位の3'末端とpRNAとの共有結合で始まる5'から3'方向において、
第1ループ；
第2ループ；及び
バルジ、第1ステム部分及び第3ループを含む下方のステム-ループ構造；
(ii) スペーサ部位とステム-ループ構造との間に配置された第2ステム部分；
(iii) ステム-ループ構造と第1ループとの間に配置された第3ステム部分；
(iv) 第1ループと第2ループとの間に配置された第4ステム部分；並びに
(v) pRNA部位内の至る所に配置された、pRNAキメラの5'及び3'末端を定義する開口部、を含む。
【００１９】
本発明はまた、本発明のpRNAキメラをつくるための方法を提供する。1つの実施態様では、pRNA部位、及び生物活性RNAを含むスペーサ部位を含有するpRNAキメラをコードするDNAは、in vitroで転写されて、pRNAキメラを与える。場合により、pRNAキメラをコードするDNAは、DNA鋳型上でポリメラーゼ連鎖反応を用いてつくられるか、又はDNAは、DNAをプラスミドにクローン化し、プラスミドを複製することによってつくられる。別の実施態様では、pRNAは、小さいRNAフラグメント（モジュラー成分）を用いて化学的に合成される。
【００２０】
本発明は、RNA分子が試験分子と相互作用するか否かを決定するための方法を更に提供する。対象のRNA分子を含むpRNAキメラは、基質に固定され、次いで試験分子と接触される。次いで、試験分子が、例えば対象のRNAと結合することによって、対象のRNAと接触するか否かが検出される。
【００２１】
本発明はまた、pRNA、及び生物活性RNAを含むスペーサを含有するpRNAキメラをコードするヌクレオチド配列を含むDNA分子を提供する。
【００２２】
本発明はまた、生物活性RNAを細胞、好ましくは植物細胞又は動物細胞、例えばヒト細胞、に送達するための方法を提供する。1つの実施態様では、本発明のpRNAキメラを作動的にコードするヌクレオチド配列を有するDNA分子は、細胞に導入され、転写されて、生物活性RNAを与える。別の実施態様では、pRNAキメラは、細胞に直接的にトランスフェクトされる。代わりに、キメラpRNA複合体は、細胞表面マーカーに特異的に結合するRNAアプタマーの導入によって、エンドサイトーシスを介して、細胞に送達され得る (Ellington他, Nature 346, 818-822 (1990); Tuerk他, Science 249, 505-510 (1990))。
【００２３】
詳細な説明
バクテリオファージΦ（phi29）は、二重鎖DNAウイルスである。1987年に、発明者の1人である、Dr. Peixuan Guoは、バクテリオファージΦ29DNAパッキングにおいて重要な役割を果たすウイルスによってコードされた120塩基RNAを発見した (Guo他, Science 236: 690-694 (1987))。このRNAは、パッキングRNA又は「pRNA」と称される。それは、頂点（DNAがプロカプシドに入る部位）でウイルス性プロカプシドに結合し (Guo他, Nucl. Acids Res. 15: 7081-7090 (1987))、成熟Φビリオンに存在しない。
【００２４】
pRNAの6つのコピーは、1つのゲノムDNAをパックするために必要とされる (Trottier他, J. Virol. 70: 55-61 (1996); Trottier他, J. Virol. 71, 487-494 (1997); Guo他, Mol. Cell. 2, 149-155 (1998))。6つの溝の1つが、5'又は3'末端での変異を有する1つの不活性なpRNAによって占有されているときに、DNAパッケージングは、完全に妨害される (Trottier他, J Virol. 70: 55-61 (1996); Trottier他, J. Virol. 71: 487-494 (1997))。バクテリオファージΦ29pRNAは、DNA転座プロセスの間に、プロカプシドと関連する (Chen他, J. Virol. 71: 3864-3871 (1997))。阻害データも、pRNAがDNA転座に本質的役割を果たすことを示唆している (Trottier他, J. Virol. 71 :487-494 (1997)); Trottier他, J. Virol. 70: 55-6 (1996))。PRNAのMg2+-誘導立体配座変化は、頂部へのその結合をもたらす (Chen他, J. Virol. 71, 495-500 (1997))。PRNAモノマー及びダイマーの三次構造も報告されている (Zhang他, Virology 81 :281-93 (2001); Trottier他, SNA 6(9): 1257-1266 (2000); Chen他, J. Biol. Chem. 275(23): 17510-17516 (2000); Garver他, J. Biol. Chem. 275(4): 2817-2824 (2000))。
【００２５】
近年、光-親和性架橋から得られる実験データ (Garver及びGuo, RNA 3: 1068-79 (1997); Chen and Guo, J Virol 71: 495-500(1997)); 化学的修飾及び化学的修飾干渉 (Mat-Arip他, J Biol Chem 276: 32575-84 (2001); Zhang 他., Virology 281 :281-93 (2001); Trottier他, SNA 6: 1257-66 (2000)); 相補的修飾 (Zhang他, RNA 1: 1041-50 (1995); Zhang他, Virology 201: 77-85 (1994); Zhang他, RNA 3: 315-22 (1997); Reid他, J Biol Chem 269: 18656-61 (1994); Wichitwechkarn他, Mol Biol 223: 991-98 (1992)); ヌクレアーゼプロービング (Chen及びGuo, J Virol 71: 495-500 (1997); Reid他, J Biol Chem 269: 5157-62 (1994); Zhang他, Virology 211: 568-76 (1995)); オリゴ標的競合アッセイ (Trottier及びGuo, J Virol 71: 487-94 (1997); Trottier他, J. Virol 70: 55-61(1996)) 及び低温原子力顕微鏡 (Mat-Arip他, J Biol Chem 276: 32575-84 (2001); Trottier他, RNA 6: 1257-66 (2000); Chen他, J Biol Chem 275: 17510-16 (2000)) に基いて、pRNAモノマーの三次元構造のコンピュータモデルが構築された (Hoeprich及びGuo, J. Biol. Chem. 277: 20794-803 (2002))。コネクタ結晶構造を有するpRNAヘキサマー結合は、pRNAの3D構造に関する、入手可能な生物化学的、遺伝子的及び物理的データと非常によい一致を示す (Hoeprich及びGuo, J Biol Chem 277: 20794-803 (2002))。
【００２６】
天然の完全長Φ29pRNAのヌクレオチド配列 (配列番号1) (Guo他, Nucl. Acids Res. 15: 7081-7090 (1987)) 及びその予測された対二次構造は、図2(a)に示されている (Zhang他, RNA 3: 315-323 (1997); Zhang他, Virology 207: 442-451 (1995))。予測された二次構造は、部分的に確認されている (Zhang他, RNA 1: 1041-1050 (1995); Reid他, J. Biol. Chem. 269: 18656-18661 (1994); Zhang他, Virology 201: 77-85 (1994); Chen他, J. Virol. 71: 495-500 (1997))。
【００２７】
図2(b)に示すように、pRNAモノマーは、2つの機能性ドメインを含む。1つのドメインは、カプシド結合ドメインである。このドメインは、pRNA分子の相互作用（例えば、二量化、三量化）を促進する「分子内相互作用ドメイン」（例えば、図45参照）を含む。このドメインは、以下でより詳細に記載する、pRNA間の相互作用において重要な、右手ループ及び左手ループを含む。他のドメインは、本明細書で5'/3'二重鎖 (対となった) ヘリックスドメインとも称されるDNA転座ドメインである。カプシド結合ドメインは、ヌクレオチド23〜97のpRNA分子の中央部分に位置するが (Garver他, RNA 3: 1068-79 (1997); Chen他, J Biol Chem 275: 17510-16 (2000))、DNA転座は、5'/3'対末端に位置する。5'及び3'末端は、近接していることが見出され、いくつかの種類の環状に並べ替えられたpRNAが構築されている (Zhang他, RNA 3: 315-22 (1997); Zhang他, Virology 207: 442-51 (1995); Guo, Prog in Nucl Acid Res & Mole Biol 72: 415-72 (2002))。これらの2つのドメインは、小型で個々に折り畳まれている。このことは、外因性RNAが、pRNAフォールディングに影響を与えることなく、pRNA末端に結合し得、phi29 pRNAが、小さな治療的RNA分子をエスコートする（escort）シャペロンベクターとして使用され得た、ことを示唆する。実際に、DNA転座ドメインの除去は、pRNAの分子間相互作用、すなわち、23番の残基の前又は97番の残基の後にヌクレオチドの置換又は挿入、の性質を変更させず、ダイマー、トリマー及びヘキサマーの形成を妨害しない (Hoeprich他, Gene Therapy, 10(15): 1258-1267 (2003); Chen他, RNA, 5: 805-818 (1999); 並びにShu他, J Nanosci及びNanotech (JNN), 4: 295-302 (2003))。我々は、外因性RNAがpRNAフォールディングに影響を与えることなく、pRNAの3'又は5'末端に結合し得る、ことを確認している；この外因性RNA分子もまた、独立して折り畳む (Hoeprich他, Gene Therapy, 10(15): 1258-1267 (2003); Shu他, Jnanosci及びNanotech (JNN), 4: 295-302 (2003); Guo, J. Nanosci Nanothechnol, 2005, 5(12): 1964-1982)。
【００２８】
ファージSF5'、B103、Φ29、PZA、M2、NF及びGA1 (Chen他, RNA 5: 805-818 (1999)) 由来のpRNAの系統発生分析は、非常に低い配列同一性及び数個の保存的ヌクレオチドを示すが、pRNAのファミリーは、著しく類似した安定な予測二次構造を有するように見える（図3）。バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）由来のバクテリオファージSF5' (配列番号11及び28)、B103 (配列番号12及び29)、Φ29/PZA (配列番号13及び30)、M2/NF (配列番号14及び31)、GA1 (配列番号15及び32) (Chen他, RNA 5: 805-818 (1999)から得られるpRNA；及びaptRNA (配列番号16及び33) は、全て、Φ29 pRNAについて、図2に記載の同一の構造的特徴を本質的に示す二次構造を有すると予測される (Chen他, RNA 5: 805-818 (1999))。全ては、（図3に記載のような）ステム構造の左端に天然の5'及び3'末端を有し、同一の相対的部位に位置する同一の構造的特徴を含む。
【００２９】
バクテリオファージのpRNAは、単一の安定な二次構造を共有しているので、本発明のpRNAキメラのフレームワークを提供する。
【００３０】
RNA分子における二次構造は、リボヌクレオチド間で塩基対により形成される。RNA塩基対は、通常、G-C、A-T及びU-Gを含む。二次構造の予測は、好ましくは、Zuker及びJaegerの方法従ってなされる。例えば、David H. Mathewsにより書かれた商標RNASTRUCTURE 3.6によって知られているプログラムを用いることによりなされる (Mathews他, J. MoI. Biol. 288: 911-940 (1999); 例えば、Zuker, Science 244: 48-52 (1989); Jaeger 他., Proc. Natl. Acad. Sci USA 86: 7706-7710 (1989); Jaeger他, Meth. Enzymol. 183: 281-306 (1990)も参照)。このプログラムは、rna.chem.rochester.edu/RNAstructure.htmlでロチェスター大学のDouglas Turnerの研究室のホームページのワールドワイドウエブで公然と入手でき、MS Windows（登録商標） 95, 98, ME, 2000及びNT4で作動する。このプログラムはまた、レンセラールポリテック大学のMichael Zukerのホームページ (bioinfo.math.rpi.edu/〜ukerm/home.html)のワールドワイドウエブで公然と入手できる；彼のホームページは、オンラインフォールデング、及びSilicon Graphics, Sun又はDEC Alphaワークステーションで編集され得るアルゴリズムの1バージョンを提供する。最低エネルギーを有する構造（すなわち、最適構造）が選択される。
【００３１】
RNAの二次構造は、ステム、ループ及びバルジによって特徴付けられる。「ステム」は、塩基対リボヌクレオチドの2塩基長の二重鎖部分である。ステム部分は、少なくとも2塩基対を含み、RNA分子の長さによってのみサイズが限定される。「ループ」は、少なくとも3リボヌクレオチドを典型的に含み、RNA分子の長さによってのみサイズが限定される、単一鎖部分である。「ステムループ」では、ループの5'及び3'は、塩基対ステム部分の末端と一致する。「バルジループ」では、ループは、ステム部分の長さから現れる。バルジループの5'及び3'末端は、潜在的には塩基対であるかもしれないが、典型的には塩基対を形成していない (例えば、Φ29 pRNA構造のバルジループのG40及びC48；図2を参照)。「バルジ」は、ステム部分の（又はステム部分間の）長さに存在する、約1〜約6リボヌクレオチドの不対の単一標準部分である。大きな「バルジ」と小さな「バルジループ」との間には明確な境界は存在しないことに留意されたい。本明細書では、用語「バルジ」が使用される場合には、当該用語は、小さな「バルジループ」（すなわち、約7リボヌクレオチド未満のバルジループ）も含む。
【００３２】
RNA分子の二次構造は、その長さと共に、塩基対の選択肢の性質及び位置によって決定される。RNA二次構造は、縮退している；すなわち、種々の一次リボヌクレオチド配列は、同一の塩基対構造、及び同一の二次構造を与える。ある意味では、複数のアミノ酸配列が同一の二次構造、例えば、α-ヘリックスをつくる方法と類似している。
【００３３】
単一二次構造は、予測可能なかつよく知られた方法で多数の様々な一次配列によって決定される。例えば、単一の又は対のヌクレオチドは、一般的に、RNA分子内の全体的な塩基対相互作用を変えることなく、及びその生物的機能を妨害することなく、付加し、除き、又は置換され得る。このことは、ヌクレオチドの1又は数個の塩基対が除かれ、付加され、又は二重鎖がハイブリダイズした分子の長さと置換される場合には、あるいは単一鎖ループ部位において、1以上のヌクレオチドが除かれ、付加され又は置換される場合には、特に当てはまる。例えば、GC塩基対及びAT塩基対は、その熱力学的安定性において僅かに相違するが、RNA分子の二次構造を変えることなく、二重鎖長内の部位で、一方は他方と一般的に置換され得る。GC塩基対は、その付加された安定性に起因してステム部分において好まれる。ヌクレオチドの付加、削除又は修飾の結果としての二次構造の変化は、上記のZuker及びJaegerの二次構造予測アルゴリズムを適用することによって容易に評価され得る。PRNAの5'/3'二重鎖ヘリックス部位は、二次構造のかなりの変化なしに、一次配列内の実質的な変化を伴い得る。
【００３４】
本発明のpRNAキメラは、1以上の生物活性部分、検出可能な標識等を標的分子、細胞又は部位に運搬し及び送達するビヒクルとして有用である。生物活性部分、検出可能な標識等は、本明細書では、pRNAキメラの「異種」成分（すなわち、天然pRNAに存在しない）として考慮され、本明細書では、pRNAキメラによって運ばれる「カルゴ」と称されることがある。PRNAそのもの、RNAのような本発明のpRNAキメラの異種成分は、本明細書では、「娘」RNAと称されることがある。カルゴ成分は、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、炭水化物、脂質、ホルモン、標識剤、小有機分子等でよく、限定されない。カルゴ成分から得られ、それに結合し、あるいはそれを含み又はそれに会合しているpRNAは、本発明の「pRNAキメラ」又は「キメラpRNA」と考えられる。以下に詳述するように、キメラpRNAは、所望の適用又は目的のためにテーラーメイドされた多重結合性の多価pRNA複合体を製造するために、カスタマイズし、選択し、混合し及び適合され得る、「構築単位」として有利に考えられる。
【００３５】
本発明のpRNAキメラは、2つの一般的形態のいずれかを取り得る。1つの実施態様では、pRNAキメラは、図3に例示された（及び以下に詳述するように、図4に図解された）二次構造を有し、そして、生物活性部分、好ましくは、細胞表面受容体又はリボザイムをターゲッティングするためのRNAアプタマーのようなRNAを含む異種スペーサ部位を（すなわち、フランキングする）ことによって割り込まれた、pRNA部位から本質的になる。RNAキメラのこの実施態様は、天然の5'及び3'末端に結合された異種スペーサ部位を含み、非天然位置にその5'及び3'末端を有し、以下で詳述するように、天然pRNAと比較したときに、RNA配列の「環状的な並べ替え」を示す。
【００３６】
pRNAキメラのpRNA部位の二次構造は、バクテリオファージΦ29、SF5'、B103、PZA、M2、NF及びGA1由来のpRNAを特徴付ける共通の二次構造である。そのヌクレオチド配列の全て又は一部は、バクテリオファージ以外の生物からつくられ又は得られるので、スペーサ部位は、「異種」と称される。それは、本発明の目的のために構築物「キメラ」を与える異種スペーサ部位の存在である。カルゴRNAの両末端は、pRNAに結合されるので、結合は、感受性カルゴ、例えばリボザイムを分解から保護し、生物活性部分を好適に折り畳むと予想される。
【００３７】
特筆すべきことに、生物活性部分を保護し及び運搬する所望の機能を達成するためのpRNAキメラの能力は、pRNA部位の一次ヌクレオチド配列（一次構造）に依拠するのではなく、pRNA部位がその一次リボヌクレオチド配列の結果として推定する二次構造（塩基対相互作用）に依拠する。PRNAキメラの「pRNA部位」は、必ずしもRNA配列ではないが、天然のバクテリオファージpRNA分子の特徴である二次構造を有するために、そう呼ばれている。従って、他に言及しない場合には、本明細書で使用される「pRNA部位」は、本明細書に記載の天然の（野生型）バクテリオファージpRNAに特徴的な二次構造を与えることを条件に、天然の（野生型）pRNA配列、非天然の（非野生型）配列、及びそれらの組み合わせを含む。言いかえれば、用語「pRNA部位」は、pRNA生来の特定のヌクレオチド配列のみに限定されるものではない。PRNA部位は、従って、図4に示される二次構造をもたらす任意のヌクレオチド配列を含み得る。前述の二次構造を折り畳むヌクレオチド配列は、天然配列を含む。天然pRNA配列を修飾することによって得られるもの、及び新たに設計されるもの、並びにそれらの組み合わせを含む。当業者は、ヌクレオチド配列が、二次構造アルゴリズム、例えば上記のRNASTRUCTUREをヌクレオチド配列に適用することによって、図4に示され及び本明細書に記載されている二次構造を折り畳むか否かを容易に決定することができる。
【００３８】
ヌクレオチド配列が折り畳まれ、本発明のpRNAキメラのpRNA部位の二次構造を生じる場合の、ヌクレオチド配列の例は図3に示される。ヌクレオチド配列は、バクテリオファージ SF5' (配列番号11及び28)、B 103 (配列番号12及び29)、Φ29/PZA (配列番号13及び30)、M2/NF (配列番号14及び31)、GA1 (配列番号15及び32) 、及びaptRNA (配列番号16及び33) 由来のpRNA配列を含む。
【００３９】
環状的に許容されたpRNAキメラであって、pRNA部位が天然pRNAを含み又はそれから得られるpRNAキメラの実施態様では、pRNAキメラのスペーサ部位は、pRNA配列の「天然」5'及び3'末端と考えられるもののpRNA部位に共有結合的に結合し、それによってpRNA部位の天然末端と連結する。PRNAキメラのpRNA部位は、天然バクテリオファージpRNAに比べて場合により切断されており；その実施態様では、結果として、RNA配列の「天然」5'及び3'末端が、切断された天然pRNAの実際の末端で終了する又はそれを含むヌクレオチドを称するにすぎない。開口部は、得られたpRNAキメラを線状化するためにpRNA部位内で形成され、以下に詳述するpRNAの「環状的な並べ替え」に影響を与える。それでもなお、当然のことながら、用語「環状に並べ替えられた」pRNA部位は、環状に並べ替えられた天然pRNAに限定されないが、pRNAキメラの5'及び3'末端を形成するpRNA部位における開口部を含む、図4(c)で示されるpRNA様二次構造を有するpRNAの広い意味を有するように意図する。
【００４０】
本発明のpRNAキメラの例は、スペーサ部位に天然5'及び3'末端を連結し、開口部を本明細書に記載のpRNA部位の他のところに導入することによって、バクテリオファージSF5’ (配列番号11及び28)、B103 (配列番号12及び29)、Φ29/PZA (配列番号13及び30)、M2/NF (配列番号14及び31)、GA1 (配列番号15及び32)、及びaptRNA (配列番号16及び33) のpRNAから形成されるものである。本発明のpRNAキメラの他の例は、以下：
5'-GUUGAUNjGUCAAUCAUGGCAA-スペーサ部位-
UUGUCAUGUGUAUGUUGGGGAUUANjCUGAUUGAGUUCAGCCCACAUAC-3' (それぞれ、配列番号45及び7) （ここで、Nは制限なく任意のヌクレオチドを示し、jは約4〜約8の整数である）である。好ましくは、jは4又は5である。スペーサ部位は、Nm-B-Nn（Nn及びNmは、スペーサ部位に場合により含まれるヌクレオチド列であり、Bは、生物活性部分を含む）によって示される。好ましくは、Bは、生物活性RNAを含むリボヌクレオチド配列である。m及びnは、独立に、0又は任意の整数でよい。好ましくは、m及びnは、独立に、少なくとも約3、より好ましくは少なくとも約5、及び最も好ましくは少なくとも約10である。更に、n及びmは、独立に、好ましくは多くて約300、より好ましくは多くて約50、及び最も好ましくは多くて約30である。
【００４１】
更に、pRNAキメラのpRNA部位はその二次構造によって定義されるので、pRNAキメラの他の例は、得られたヌクレオチド配列が図4に示される全体的な二次構造に折り畳まれることを条件に、ヌクレオチドフラグメント、例えば、特定の二次構造の特徴（バルジ、ループ、ステム-ループ等）に折り畳まれる配列番号1、2、7、11、12、14、15及び16由来のフラグメントを「混合及びマッチング」することによって容易に得られる。例えば、バクテリオファージSF5' pRNA (配列番号11) 由来のバルジループ22をコードするヌクレオチドは、Φ29 pRNA (配列番号1)中のバルジループ22をコードするヌクレオチドと置換され、本明細書に記載のpRNA部位を与える。同様に、任意の数の人工配列は、配列番号1、2、7、11、12、14、15及び16配列番号に置換され、1以上の構造的特徴（又はその部分）に折り畳まれるヌクレオチド配列に置換され、本明細書に記載のpRNA部分を形成する。例えば、Φ29 pRNAからつくられる方法で得られたaptRNA (図3(f)) を参照。包括的な原則は、図4に図解したように、pRNA部位の全体的な二次構造がバクテリオファージpRNAに共通の二次構造であることである。
【００４２】
重要なことに、環状に並べ替えられたpRNAキメラの実施態様は、環状分子ではない；むしろ、pRNA部位の環状的並べ替えに起因して線状化される (Zhang他, RNA 3: 315-323 (1997); Zhang 他., Virology 207: 442-451 (1995))。簡単に言えば、開口部（すなわち、開裂点又は切断点）は、pRNAキメラの実際の5'及び3'末端を形成するために、任意の指定された部位のpRNA部位で提供される。これらの5'及び3'末端は、天然型直線状pRNAに関して「非天然」の位置にある。図5 (a) は、どのように本発明のpRNAキメラがリボザイム及びpRNA部位から形成され得ることを示している。pRNAの5'及び3'末端は、環状に並べ替えられたpRNAキメラ上の任意の所望の部位につくられる。図5(b)は、環状開口部のための様々な位置を示す、例示的な環状に並べ替えられたRNA分子を示す。図4は、本発明の環状に並べ替えられたpRNAキメラを特徴付ける様々な構造的特徴を示す。図4(a)に示すように、直線分子は、pRNA部位１を含み、環状に並べ替えられたpRNAキメラの場合には、スペーサ部位2を含む。スペーサ部位2は、生物活性部分3を含み、リボザイムの場合には、リボヌクレオチド列4によって隣接される。pRNA部位1は、二分される；3'末端及び「天然」5'末端7を有する第1pRNA部分5、並びに「天然」3'末端9及び5'末端10を有する第2pRNA部分8。末端6及び10は、pRNAキメラの実際の終了末端である。開口部11は分子に直線性を付与し、末端6及び10の再配置によってpRNA部位1内の任意の場所に配置され得る。
【００４３】
スペーサ部位2は、図4(b)に詳細に示されている。リボザイム3は、標的-結合配列19によって近接された触媒的ドメイン15からなる。
【００４４】
pRNA部位1は、図4(c)に詳細に示されている。全体的に、pRNA部位1は、ステム-ループ二次構造によって特徴付けられ、そこでは、ヘッドループ、すなわちループ24は、比較的小さく、ステム（本質的に、ステム部分20、21及び23）内の塩基対は、ループ24のいずれかの側の構造によって分断される。バルジループ22、すなわち「右手ループ」は、ループ24の5'に位置付けられる。位置付けられたループ24の3'は、バルジ25、ステム26及びループ27を含むステムループ構造、すなわち「左手ループ」である。
【００４５】
ステム部分20は、任意のリボヌクレオチド長でよく、塩基対がなお形成されることを条件に、非限定的なバルジ数を含み得る。好ましくは、ステム部分20は、少なくとも約4、より好ましくは少なくとも約10塩基対を含み；更に、好ましくは多くて約50、より好ましくは多くて約40塩基対を含む。好ましくは、ステム部分20は、約0〜約8のバルジを含み；より好ましくは約0〜約4バルジを含む。
【００４６】
本発明のpRNAキメラの非-環状に並べ替えられた実施態様において、以下に詳細に述べるように、ステム部分20は、二重鎖siRNAによって置換され得る、ことに留意されたい。キメラpRNAのこの実施態様では、キメラpRNAによって運ばれる「カルゴ」は、ステム部分20自体の形態をとり、生物的活性siRNAを構成する。実施例11及び12に示すように、細胞への送達の際に、siRNAは、pRNA分子から開裂され、標的遺伝子を発現停止させるために効果的である、という証拠が存在する。
【００４７】
非-環状に並べ替えられたキメラpRNAの他の実施態様では、非-環状的に並べ替えられないことによって、「天然」位置の5'及び3'末端又はその近くを示すが、ステム部分20は、生物活性部分、検出可能な標識等で、当該5'及び3'末端のいずれか又は両方においてその異種成分「カルゴ」として誘導体化され得る。例えば、ステム部分20に存在するpRNAの5’末端は、（ターゲッティングを促進するために）葉酸で又は（検出を促進するために）蛍光標識で誘導化され得る。本発明のpRNAキメラを形成する点で採用され得る様々なステム部分20の例のための、実施例11及び図23を参照。
【００４８】
ステム部分21は、好ましくは5〜13塩基対及び0〜2バルジを含む。
バルジループ22は、好ましくは5〜12塩基対を含む。
ステム部分23は、好ましくは3〜12塩基対及び0〜2バルジを含む。
ループ24は、好ましくは5〜8塩基対を含む。
バルジ25は、好ましくは0〜5塩基対を含む。
ステム26は、好ましくは4〜8塩基対及び0〜2バルジを含む。
ループ27は、好ましくは3〜10塩基対を含む。
【００４９】
RNA分子内の三次相互作用は、一次構造内で互いに近くないRNA分子の部位の非局在的相互作用から得られることがある。天然のバクテリファージpRNAは、バルジループ222 (「右手」ループ) とループ27 (「左手」ループ) との三次相互作用を示すようであるが (Chen他, RNA 5: 805-818 (1999); Guo他, Mol. Cell 2: 149-155 (1998))、当然のことながら、本発明のpRNAキメラは、任意の特定の三次相互作用を示すRNA分子に限定されるものではない。一方、当然のことながら、これらの分子内の三次相互作用は、好都合に利用され得る。例えば、本発明によって提供される多重合成pRNA複合体において、様々なモノマーの右手ループと左手ループとの相互作用は、所望の相補性で設計することによって制御され得る。これは、有利には、治療的適用における使用のための、カスタマイズされたダイマー、トリマー及びヘキサマーを生じる；例えば、実施例7参照。
【００５０】
1つの実施態様では、本発明のpRNAキメラは、天然のSF5' pRNA (図3(a))、B 103 pRNA (図3(b))、Φ29/PZA pRNA (図3(c))、M2/NF pRNA (図3(d))、GA1 pRNA (図3(e))、又はaptRNA (図3(f))、好ましくは天然のΦ29 pRNAに見出される、少なくとも8、より好ましくは少なくとも15、最も好ましくは少なくとも30の連続したリボヌクレオチドを含む。最も好ましくは、pRNAキメラのpRNA部位は、Φ29 pRNA配列において、リボヌクレオチド23、好ましくはリボヌクレオチド20で始まり、リボヌクレオチド95、好ましくはリボヌクレオチド97で終わる、少なくともΦ29 pRNA配列を含む (図2)。加えて、又は代わりに、pRNAキメラのpRNA部位のヌクレオチド配列は、対応する天然のSF5' pRNA、B103 pRNA (図3(b))、Φ29/PZA pRNA (図3(c))、M2/NF pRNA (図3(d))、GA1 pRNA (図3(e))、又はaptRNAキメラ (図3(f))、最も好ましくはΦ29 pRNA (特に、塩基20〜97) のヌクレオチド配列と、好ましくは少なくとも60%、より好ましくは80%の同一性、更により好ましくは90%の同一性、最も好ましくは95%の同一性である (図3(a))。
【００５１】
同一性の割合は、同一ヌクレオチドの数を最適化するように、2つのポリヌクレオチドをそのヌクレオチド長に配列させることによって決定される；各配列中のヌクレオチドはそれでもその正確な順序で維持されなければならないが、共有のヌクレオチドの数を最適化するために、配列のいずれか又は両方におけるギャップは、配列をつくるときに省略される。例えば、2つのヌクレオチド配列は、Tatusova他によって記載される、BLAST 2検索アルゴリズムのBlastnプログラムを用いて容易に比較される (FEMS Microbiol Lett 1999, 174: 247-250)。好ましくは、マッチに対するリワード =1、ミスマッチに対するペナルティ = -2、オープンギャップペナルティ = 5、エクステンションギャップペナルティ = 2、ギャップ x_ドロップオフ = 50、イクセプト = 10、ワードサイズ = 11及びフィルターオンを含む、全てのBLAST 2検索パラメータのデフォルト値が使用される。
【００５２】
pRNAキメラの環状に並べ替えられた実施態様では、生物活性部分とpRNA部位との共有結合は、直接的又は間接的でよく、好ましくは間接的である。間接的結合において、スペーサ部位は、生物活性部分の1つ又は2つの末端のリボヌクレオチドの追加の列（複数）を含む。これらのリボヌクレオチド列は、もし存在するならば、好ましくは少なくとも約3のリボヌクレオチド；好ましくは多くて約300、より好ましくは多くて約30のリボヌクレオチドを含む。組成的には、列は、任意の所望のリボヌクレオチドを含み得るが、好ましくは、生物的部分のいずれか一方の側にあるリボヌクレオチド列が、pRNAキメラが互いに又はpRNAキメラの他の部分との塩基対形成しないよいうに、リボヌクレオチド組成が選択される。
【００５３】
生物活性部分の例は、リボザイム、siRNA、RNAアプタマー、又はアンチセンスRNA、ペプチド核酸(PNA)、ペプチド、タンパク質、例えば抗体、多糖、脂質、ウイルス、プラスミド、共因子、あるいはこれらの組み合わせを含む、DNA、RNA、DNA又はRNAアナログを含むがこれらに限定されない。生物活性部分は、制限なく選択され得、所望の活性又は性質を有するもの、例えば、結合活性、酵素活性等を含む。好ましくは、生物活性部分の生物活性は、酵素活性又は結合活性あるいはその両方であり；例えば、生物活性部分は、リボザイム又は他の触媒的部分として機能し、あるいはこれらをコードすることがある。siRNAは、二重鎖RNAであるので、効果的なsiRNA部分は、以下に詳述するように、環状に並べ替えられたpRNAキメラのスペーサ部位に位置付けられる代わりに、5'/3'対のヘリックス部位と置換するための任意の配列を含むことができた。
【００５４】
生物活性部分は好ましくはポリヌクレオチドである。好ましい生物活性ポリヌクレオチドは、ポリリボヌクレオチドであり、より好ましくは、生物活性ポリヌクレオチドは、リボザイム、例えばハンマーヘッド型リボザイム又はヘアピンリボザイムである。アンチセンスRNA及び他の生物活性RNAも好ましい。
【００５５】
当然のことながら、他に言及しない場合には、本明細書で使用される、用語「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は、DNA、RNA又はそれらの組み合わせを包含する。更に、用語DNA及びRNAは、天然の核酸のみならず、ヌクレオチドアナログ又は修飾されたヌクレオチド、例えば、化学的又は酵素的に修飾されたもの、例えばDNAホスホロチオエート、RNAホスホロチオエート、及び2'-O-メチルリボヌクレオチド、を含む配列を含む。
【００５６】
本発明のpRNAキメラの好ましい実施態様では、1以上のヌクレオチド誘導体、例えば、2'-NH2-2'-デオキシCTP、2'-CH3-2'-デオキシCTP、2'-F-2'-デオキシCTP、2'-F-2'デオキシUTP及びスピーゲルマー（L-ヌクレオチドアプタマー）は、RNase消化に抵抗性である安定なRNA転写物を産生するために合成中にpRNAに組み込まれる。安定的な修飾は、好ましくは、リボヌクレオチドの2'位又は他の位置でなされる。ほとんどの場合には、安定的ヌクレオチド誘導体の導入は、多重結合性複合体を形成するために、pRNAの二量化又は三量化に顕著に妨害するとは予想されず、「カルゴ」部分の活性又は機能に逆に働くとも予想されない。pRNA自体の（多重結合性複合体を形成するその能力以外の）生物機能は、無関係であるので、非-天然ヌクレオチド誘導体の包含は好適であり、特に、(例えば、SELEXを用いる)ランダムプールから選択される受容体-結合アプタマーについては好適である。RNase抵抗性ヌクレオチド誘導体の、pRNAに繋がれた治療的RNAへの導入は、生物活性、例えばカルゴRNAの触媒的機能にたまたま干渉する場合には、例えば、カルゴRNAは、通常のヌクレオチドで合成され、pRNA分子にライゲートされ得る。
【００５７】
リボザイムは、一般的に、以下：
アーム1-活性酵素中心-アーム2
[ここで、アーム1及び2は、リボザイムによって開裂されるべき標的基質に相補的な配列であり、活性中心は、標的RNAを開裂する触媒的中心である。] 
によって特徴付けられる。リボザイムの「アーム」は、典型的に、少なくとも約7ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約12ヌクレオチドを含み；典型的には多くて約100ヌクレオチ、好ましくは多くて約30ヌクレオチドを含む。アームのヌクレオチド配列は、任意の所望の標的核酸のヌクレオチド配列にハイブリダイズするように作製され得る。
【００５８】
有利には、生物活性ポリヌクレオチド、例えばリボザイムへの、本発明の環状に並べ替えられたpRNAキメラへの取りこみは、リボザイムの末端を保護し、それによってエキソヌクレアーゼ分解に抵抗性を付与する。更に、pRNAの二次構造は、小型でかつ非常に安定である。Φ29 pRNA のヌクレオチド30〜91によって定義されるpRNAドメインは、特に安定である。
【００５９】
pRNAの小型性及び安定性は、pRNA部位及びリボザイムを各々折り畳ませる。挿入されたRNAの正確なフォールディングは促進され、それによって、その生物活性を維持する。担体pRNA部位の安定構造も同様に維持される。よって、リボザイムを送達するための分子を設計する主な障害、すなわちリボザイムと担体部位との間の相互作用の結果としてのリボザイム及び担体部位のミスフォールディングは、担体として非常に安定なpRNA分子を利用することによって解消されている。リボザイムの活性が環状に並べ替えられたpRNAキメラにおいて保持されることは、pRNAキメラの新規な5'及び3'末端が折り畳まれたpRNA構造中にそれらを「埋没」させるように位置付けられ、それによってpRNAキメラを分解から更に保護する、ことを意味するので、特に重要である。これらの特徴は、医薬上及び獣医的適用におけるリボザイム送達ビヒクルとして本発明のpRNAキメラの使用に大きな展望を示唆する。
【００６０】
以下の実施例で示すように、環状に並べ替えられたpRNAは、pRNAフォールディングに影響を与えることなく構築された。加えて、pRNA 5'/3'末端と変化し得る配列との結合は、そのフォールディング及び機能を妨害しない。2つの共通の問題−細胞中のエキソヌクレアーゼ分解及びミスフォールディングを避けるのに役立つ、これらの固有の特徴は、pRNAを、治療的RNAを担持する理想的ベクターにさせる。
【００６１】
既に言及したように、1つの実施態様では、本発明のpRNAキメラは、バクテリpRNAファージpRNAの「環状的並べ替え」を採用する。「環状に並べ替えられた」RNA分子（cpRNA）は、天然5’及び3’末端が共有結合的に連結される、直線状RNA分子である。この結合は、直接でも、又はスペーサ部位を用いて間接的にでもよい。cpRNA分子は直線状であるので、新規の非天然5’及び3’末端は、異なった位置での分子（すなわち、pRNA配列の不連続）中に開口部を形成することによってつくられる。本発明のpRNAキメラは、所定の部位でのバクテリオファージpRNAフレームワーク中の非天然開口部の結果として直線状であり、バクテリオフレームワークを環状的に並べ替えられ、pRNAキメラの実際の5'及び3'末端を形成する。既に言及したように、非天然開口部は、pRNA部位内の任意の所望の位置でよい。例えば、Φ29 pRNAにおける、選択された位置の例は、Zhang他, RNA 3: 15-323 (1997) and Zhang他, Virology 207: 442-451 (1995) に見られる。また、Garver他, J. Biol. Chem. 275: 2817-2824 (2000); Chen他, J. Virology 71: 495-500 (1997); Trottier他, RNA 6: 1257-1266 (2000); 及びZhang他, Virology 281: 281-293 (2001) 参照。
【００６２】
本発明のpRNAキメラは、標準的な研究室プロトコールを用いて化学的に又は酵素的に合成され得る。pRNA部位は、必要であるならば化学的に合成し得るが、好ましくは、それをコードするDNA鋳型から転写される。代わりに、キメラpRNAは、化学的に合成されたDNAフラグメント（モジュラー成分）からつくられる (例えば、Fang他, Biochemistry, 2005, 44(26): 9348-9358参照)。化学的に合成される場合には、pRNA部位は、場合により、非天然ヌクレオチド（例えば、誘導体化又は置換されたヌクレオチド）、及び/又は天然核酸を特徴付けるホスホジエステル結合についての非天然結合アナログを含む。非天然ヌクレオチド又は非天然結合の包含はpRNAキメラの安定性を増加させ、酵素的分解に対してpRNAキメラをより抵抗性にする。
【００６３】
好ましくは、pRNA部位は、単一のRNA分子として転写又は合成される。本方法の1つの実施態様では、その生成に適用されるので、スペーサ部位は、pRNA部位の「天然」末端に化学的又は酵素的に連結されて、環状キメラ分子を形成する。次いで、pRNAは、所定の部位で開裂されて直線状の環状に並べ替えられたpRNAキメラを形成する。
【００６４】
スペーサ部位がRNAであるときには、本方法の別の実施態様は、環状に並べ替えられたpRNAの生成に適用されるので、キメラ分子全体をコードする単一DNA鋳型からpRNAキメラ全体を転写することを含む。本発明の別の実施態様では、RNAスペーサ部位は、pRNA部位にライゲートされ後に、それ自体の鋳型からの転写又は化学合成のいずれかによって別個につくられる。
【００６５】
「カルゴ」部分（例えば、RNAアプタマー又はリボザイム）をスペーサ部位に位置付けた環状に並べ替えられたpRNAキメラに加えて、本発明はまた、「カルゴ」部分がRNA構造の至るところに取り込まれ又は結合される、pRNAキメラの別の実施態様を提供する。本発明の実施態様は、、環状に並べ替えられた実施態様と類似した直線状pRNAを構築するが、天然phi29 pRNAに相対して環状的に並べ替えられない。いずれの実施態様（すなわち、環状に並べ替えられた及び非-環状に並べ替えられたpRNA）も、以下でより詳細に記載されるように、異種「カルゴ」を含むことを条件に、「キメラpRNA」又は「pRNAキメラ」と呼ばれる。
【００６６】
非-環状に並べ替えられたpRNAキメラの1つの例は、pRNAの5'/3'二重鎖ヘリックス部位の代わりに、siRNAを含むpRNAである (いくつかの例について、図23及び実施例11の添付のテキスト参照)。残基23番の前のヌクレオチド又は残基97番の後のヌクレオチドの置換又は挿入は、鎖が対である限り、ダイマーの形成を妨害しないことが明らかとなった (Chen他, RNA 1999; 5: 805-818)。siRNAは短く（典型的には19〜25ヌクレオチドであるがよ短く手も又は長くてもよい）、従ってpRNAへの取り込みに理想的に適しており、5'/3'対ヘリックス部位を形成する。5'/3'対ヘリックス部位としてsiRNAを含むpRNAキメラは、好ましくは、環状的に並べ替えないが、そうかもしれない；得られたpRNAの環状的な並べ替えがsiRNAの活性を失わせないかもしれない（実施例11）、そのため、場合による、ことに留意されたい。5'/3'対ヘリックス部位としてsiRNAを含むpRNAは、正確に折り畳み、本明細書に記載の他のpRNAキメラと共に使用されて、多価性のダイマー、トリマー又はヘキサマーを形成できる。
【００６７】
pRNAの5'/3'対ヘリックス部位をsiRNAと置換するときに、siRNA鎖が結合され得るpRNA配列の位置に関して、実質的な寛容が観察されている。例えば、ヌクレオチド23の前の5'末端のヌクレオチド、及び残基97番の後の3'末端のヌクレオチドの付加又は削除が、分子間相互作用（プロカプシド結合）ドメインの正確なフォールディングに影響を与えない (Zhang他, RNA 1995; 1: 1041-1050)。例えば、遺伝子サイレンシングは、対のヘリックス部位を形成するために、位置29及び91で結合した相補的siRNAを用いて、そして対のヘリックス部位を形成するために、置21及び99で結合したsiRNAを用いて、達成された（実施例11参照）。pRNAキメラを形成するために「ステム」（例えば、図4cのステム20）としてsiRNAを取り込む点で重要であることは、ダイマー、トリマー及びヘキサマーの形成における右手ループ及び左手ループの相互作用を妨害するように、分子間相互作用部位（右手ループ及び左手ループを含む）にsiRNAが立ち入らないことである。
【００６８】
非-環状に並べ替えられたpRNAの別の例は、生物活性部分、検出可能な標識又は対象の他の部分により、その「天然」5'及び/又は3'末端において又はその近くで誘導体化されたpRNAである。pRNAの5'及び/又は3'末端における又はその近くでの結合のための好ましい部分は、標的部分であり、例えば抗体又は受容体リガンドである。例えば、葉酸分子の共有結合（実施例13参照）は、その細胞表面上に葉酸受容体を有する細胞に修飾されたpRNAを標的する。別の局面では、本発明は、実施例13で例証されるように、RNA、好ましくはpRNAに葉酸を結合させる方法を包含する、ことに留意されたい。
【００６９】
pRNAの5'及び/又は3'末端で又はその近くで結合され得る別の部分は、検出可能な標識である。pRNA又はpRNAキメラの1以上の5'及び/又は3'末端（例えば、対のヘリックス部位としてsiRNAを取り込むpRNA）はまた、検出可能な標識、例えば蛍光標識、放射性標識、又は常磁性標識を含むように誘導体化され得る。多重結合性pRNA複合体の少なくとも1つの成分は、複合体を検出させる。同様に、多重結合性複合体が標的細胞に結合され及び/又は標的細胞により吸収されると、治療剤、例えば放射性核種は、pRNA、pRNAキメラ又は修飾されたpRNAの5'又は3'末端において又はその近くで連結されて、対象の治療に働くことができる。
【００７０】
当然のことながら、5'又は3'末端での又はその近くでのpRNAの誘導体化は、pRNAの5'又は3'末端を如何なるヌクレオチドが現在構築しようとも、カルゴ部分をそれに結合することを包含する。言いかえれば、pRNAは、天然pRNAに関して（5'又は3'末端で）切断され、あるいは天然pRNAと比較したときにその5'又は3'末端に付加される1以上の追加のヌクレオチドを有することがある。いずれかの事象において、本発明によって企画されることは、直線状pRNAの最初の及び/又は最後のヌクレオチド；すなわち、特定のpRNA分子の5'又は3'ヌクレオチドの誘導体化である。更に、当然のことながら、異種成分は、pRNAの5'又は3'末端で又はその近くでpRNAに共有結合的に又は非共有結合的に連結され得る。好ましくは、本明細書の至るところで考察したように、相補的オリゴヌクレオチドが異種成分を構成する場合を除いて、結合は共有結合である。
【００７１】
特に好ましい実施態様では、pRNAの5'又は3'末端は、オーバーハング末端であり；すなわち、対を形成せず、1以上の塩基によって対のヘリックス部位に及び、異種成分は、オーバーハング末端に連結される。好ましくは、異種成分は、5'オーバーハング末端に連結される。
【００７２】
別の実施態様では、pRNAが5'又は3'伸張、好ましくは3'伸張としてアンチセンスRNAを含むようにつくられたときに、オーバーハング末端自身は、異種成分を構成する。
【００７３】
更に、必要ならば、5'/3'対ヘリックス部位状の他のヌクレオチド位置が、カルゴ部分の二量化、三量化又は活性に逆に影響を与えることなしに、カルゴ部分により誘導体化され得る、ことが企画される。
【００７４】
本発明のpRNAキメラの更に別の実施態様では、異種成分は、pRNAの5'又は3'末端にアニールされるオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドとpRNAキメラとの間の相互作用は、好ましくは、非-共有結合であり；すなわち、2分子は、塩基対相互作用によって会合される（例えば、ハイブリダイゼーション）。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、RNAオリゴヌクレオチドであるかもしれないが、DNAオリゴヌクレオチドである。特定の好ましい実施態様において、pRNAは、5'又は3'オーバーハング末端を有し、オリゴヌクレオチドは、オーバーハング末端にアニールされ、好ましくは3'オーバーハング末端にアニールされる。場合により、アニールされたオリゴヌクレオチドは、検出可能な標識、例えばビオチン又は放射性標識を含む。オリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも5ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも10ヌクレオチド長、及び最も好ましくは少なくとも15ヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは、好ましくは多くて70ヌクレオチド長、より好ましくは多くて50ヌクレオチド長、より好ましいくは多くて40ヌクレオチド長である。
【００７５】
最後に、単一pRNAキメラは、1種超の異種成分を含むことがあることに留意されたい。例えば、pRNAキメラは、その5'末端に結合された葉酸、及びその3'末端に結合された検出可能な標識を含むことがある。あるいは、例えば、環状に並べ替えられたpRNAは、スペーサ部位にRNAアプタマー、及びその対ヘリックス部位として治療的siRNAを含むことがある。
【００７６】
本発明はまた、本発明のpRNAキメラをコードするヌクレオチド配列を含むDNA分子である。コードされたキメラのスペーサ部位は、必ず、本発明のこの局面におけるRNAである。DNA分子は、直線状又は環状でよい。二重鎖又は一本鎖でもよく；一本鎖である場合には、その成分も用語「DNA分子」に含まれる。
【００７７】
本発明のpRNAキメラは、多数の異なった方法で宿主細胞に導入され得る。例えば、pRNAキメラは、細胞外で合成され、構成的RNAアプタマー又は他の標的剤が細胞表面の成分と結合するように細胞表面と接触され、そして、受容体-介在エンドサイトーシス、膜拡散、孔による輸送等によって細胞によって捕獲され得る。代わりに、それは、ウイルス性送達剤（RNAウイルス又はDNAウイルス）によって運ばれる遺伝子カルゴの一部分として送達され得る。それは、プラスミド、すなわち所望のpRNAキメラをコードするDNA分子としても送達され得る。宿主細胞にpRNAキメラを直接、トランスフェクトすることもできる。例えば、商標名トランスメッセンジャー・トランスフェクション・リージェント (Qiagenから入手可能)で入手可能な製品は、特定のRNA-縮合エンハンサー及び最適化緩衝剤と組み合わせて使用される脂質-型調合剤であり、pRNAキメラを真核細胞にトランスフェクトするために使用できる。
【００７８】
細胞へのpRNAの導入に使用されるためのDNA分子は、好ましくは、pRNAキメラが作動的にコードされるような調節因子を含む。pRNAキメラを細胞内のDNA分子の転写によって産生させる調節因子をDNA分子が含むときに、pRNAキメラはDNA分子によって「作動的にコードされる。かかる調節因子は、少なくともプロモーターを含む。場合により、DNA分子は、RNA基目らの転写を促進する追加の調節モチーフ、例えば、エンハンサーを含むがこれに限定されない、を含む。DNA分子は、アニオン性又はカチオン性の脂質-介在送達、又はエレクトロポレーション、吸収法、粒子照射法又は微量注入法を含む、他の標準的なメカニズムを用いて、あるいはウイルス又はレトロウイルスベクターの使用によって、宿主細胞に導入され得る。
【００７９】
場合により、DNA分子は、細胞ゲノムへの一体化を可能にする1以上の特徴を含み得る。例えば、トランスポゾン、レトロトランスポゾン又は統合ベクターの形態で送達され；代わりに、異種組換えを介して一体化を可能にするゲノム配列に相同的である配列を含み得る。一方、DNA分子は、非ゲノムDNA、例えば、プラスミド、コスミド、エピソーム等として細胞内に存在するように設計され得る。
【００８０】
キメラRNA分子全体をコードするDNA鋳型からの転写は、in vitro又は細胞内で起こり得る。細胞は、細胞培養物中にあってもよく、又は生物（in vivo）、例えば植物又は動物、特にヒト、又は生物から外植された細胞（ex vivo）、中にあってもよい。
【００８１】
有利に、本発明のpRNAキメラは、細胞内の標的に生物活性RNA分子を送達するために使用できる。環状に並べ替えられたpRNA部位及びスペーサ部位を作動的にコードするヌクレオチド配列を有するDNA分子は、細胞に導入される。スペーサ部位は、生物活性RNAを含み、生物活性RNAを与えるDNAの転写を含む。このように送達された生物活性分子は、好ましくは、リボザイムであり、標的は、好ましくは、その発現が減少されることが望ましい遺伝子と関連するウイルス又はmRNAである。図6(a)は、pRNAリボザイムキメラによって標的RNAの開裂の提案されたメカニズムを示す。HBV ポリAシグナルを標的するリボザイムは、phi29 pRNAの天然5'/3'末端に結合される (図6(b))。アンチセンスRNAは、分子内DNA又はRNAを標的とすることができ、生物活性分子とも称される。
【００８２】
Φ29 pRNAは、ダイマーを形成するための強い駆動部を有し（図7）、ダイマーは、ヘキサマーの構築単位である (Hoeprich and Guo, J Biol Chem 277: 20794-20803 (2001); Mat-Arip他, J Biol Chem 276: 32575-32584 (2001); Trottier他, RNA 6: 1257-1266 (2000); Chen他, RNA 5: 805-818 (1999); Guo他, Mol Cell 2: 149-155 (1998); Zhang他, Mol Cell 2:141-147 (1998); Hendrix, Cell 94: 147-150 (1998))。モノマー又はダイマーの形成は、2つの相互作用するループの配列を操作し及び制御することによって調節され得る (Hoeprich及びGuo., J Biol Chem 277: 20794-20803 (2001); Mat-Arip他, J Biol Chem 276: 32575-32584 (2001); Trottier他, RNA 6: 1257-1266 (2000)); Chen他, RNA 5: 805-818 (1999); 及びZhang他, Mol Cell 2: 141-147 (1998)）。
【００８３】
我々は、pRNAの6個のコピーがヘキサマー環を形成することを先に明らかにした (Guo他, Mol. Cell, 2: 149-155 (1998); Hendrix他, Cell, 94: 147-150 (1998); 及びDNA-パッケージングモーターを駆動するための、Zhang他, Mol. Cell., 2: 141-147 (1998)) (Grimes 他., Adv. Virus Res., 58: 255-294 (2002) 及びGuo, Prog in Nucl Acid Res & Mol. Biol, 72: 415-472 (2002) 参照)。pRNAダイマーは、ヘキサマーの構築単位である (Chen他, J Biol Chem, 275(23): 17510-17516 (2000))。右及び左の連結ループの密な相互作用は、所望の安定なダイマー及びトリマーをつくるために操作され得る (Chen他, RNA, 5: 805-818 (1999); Guo他, Mol. Cell., 2: 149-155 (1998); Shu他, J Nanosci and Nanotech (JNN), 4: 295-302 (2003); 並びにZhang他, Mol. Cell., 2: 141-147 (1998)); ヘキサマーは、2つの連結左手及び右手ループの塩基対形成によってハンド・イン・ハンドな相互作用を介して形成される (Chen他, RNA, 5: 805-818 (1999); Guo他, Mol. Cell., 2: 149-155 (1998); 及びZhang他, Mol. Cell, 2: 141-147 (1998))。従って、pRNAは、それがダイマー、トリマー又ヘキサマーの形態であるにしろ、ハンド・イン・ハンドな相互作用による環状環を形成する強い傾向を有する (Chen他, RNA, 5: 805-818 (1999) 及びShu他, J Nanosci and Nanotech (JNN), 4: 295-302 (2003))。
【００８４】
pRNAの化学量論は、ゲル沈降法 (Shu他, J Nanosci and Nanotech (JNN), 4: 295-302 (2003))、2項式分配法 (Trottier他, J. Virol, 71: 487-494 (1997))、cryo-AFM (原子間力顕微鏡) によって、及び2つの不活性な変異pRNAを相補的なループと分子間的に混合し、次いでDNAパッケージングアッセイにおいて混合物の活性をアッセイする (Guo他, Mol. Cell, 2: 149-155 (1998) 及びZhang他, Mol. Cell., 2: 141-147 (1998)) ことによって研究されてきた。pRNAの予測された二次構造（図19）は、左-及び右-手ループと呼ばれる2つのループを明らかにする（12）。2つの天然ループの配列（右手ループの塩基45〜48、及び左手ループの塩基82〜85）は、相補的である。化学的修飾妨害は、分子間相互作用（すなわち、ダイマー形成）に関連する塩基を関連しないものから識別するために使用された。塩基45〜49、52、54〜55、59〜62、65〜66、68〜71、82〜85及び88〜90は、ダイマー形成と非常に強い関連を示した。化学修飾妨害、化学プロービング及びcryo-AFMは、ダイマーが、ハンド・イン・ハンド及びヘッド・トゥ・ヘッド接触を介して形成され、そして他の報告された相互作用、例えば、HIVの偽結び目構造又はキスイングループ（kissing loops）から区別できる、異常かつ新規なRNA二量化を明らかにした (Chang他, J. Mol Biol, 269(1): 52-66 (1997); Laughrea他, Biochemistry, 35(5): 1589-1598 (1996); Muriaux他, J Biol Chem, 271(52): 33686-33692 (1996); Paillart他, Proc Natl Acad Sci U.S.A, 93: 5572-5577 (1996); 及びPuglisi他, Nature, 331: 283 (1988))。
【００８５】
化学的修飾実験は、C18、C19、A20が他のDNA-パッケージング成分と相互作用するために使用されるバルジとして、pRNA表面上に存在することを示唆する (Trottier他, RNA, 6: 1257-1266 (2000))。化学修飾はまた、ループ及びバルジ内の不対塩基、例えば塩基18〜20、42〜48、55〜57及び82〜86、並び単一-塩基バルジA9、C10、U36、A93及びA100を明らかにした。そして、U72U73U74塩基は、フォールディングに柔軟性を付与し、左手ステムループのねじれのためのヒンジとして働く (Trottier他, RNA, 6: 1257-1266 (2000))。化学的修飾は、主なループの3つがモノマー内で強力に修飾されるが、ダイマー内で修飾から保護された、ことを明らかにした。
【００８６】
送達可能な複合体内のサブユニットの記載を簡単にするために、我々は、pRNAの右手ループを示す大文字及び左手ループを示す小文字を使用する (図7、18)。大文字及び小文字で同一の文字は、相補的配列を示すが、異なった文字は、非-相補的ループを示す。例えば、pRNA A-a'は、相補的な右ループA (5'G45G46A47C48) 及び左ループ'a' (3'C85C84U83G82) を有するpRNAを示し、pRNA A-b'は、不対の右手ループA及び不対の左手ループ'b' (3'C85C84U83G82) を有するpRNAを示す。図18参照。
【００８７】
pRNAダイマーの形成（図7）は、pRNA/リボザイムキメラ分子を安定化させる点でも役立つ。環状に並べ替えられたpRNAの開口部がダイマー形成の部位に近い限り、三次元構造は、エキソヌクレアーゼがpRNA分子の末端に近づかないように役立つことができる。
【００８８】
先行技術の方法を用いて全身的に送達される場合に、生物化性pRNA、例えばsiRNA及びリボザイムが細胞内に入る効率は、RNAの大きなサイズに起因して非常に低い。現在、ほとんどの送達方法は、トランスフェクション及びウイルスベクターに依拠する。化学的に-介在されたトランスフェクション方法は、細胞培養で使用され得るが、患者への送達のために明らかに好適ではないだろう。ウイルスベクターは、有効であるが、特定の細胞を標的する点での問題は解決されないままである。
【００８９】
受容体-介在エンドサイトーシス（RME）細胞外高分子及び粒子の取り込みは、ほとんど全ての真核細胞に共通のプロセスである。受容体-介在エンドサイトーシスのメカニズムは、綿密に調査され (Becerril他, Biochem. Biophys. Res. Commim., 255: 386-393 (1999) 及びPoul他, J Mol. Biol, 301: 1149-1161 (2000))、治療的分子、例えば抗体 (Becerril他, Biochem. Biophys. Res. Commim., 255: 386-393 (1999) 及びPoul他, J Mol. Biol, 301: 1149-1161 (2000))、薬物又はRNAアプタマーの送達の全体的実現性 (Homann他, Bioorg. Med Chem, 9: 2571-2580 (2001)) は、報告されている。しかしながら、治療剤の標的及び送達のための受容体-介在エンドサイトーシス（RME）を探索する点での困難性にぶつかってきた。そして、その困難性は、1) 標的細胞対健常細胞の特性の欠如；2) 細胞内経路における治療的分子のリソソーム分解；3) 体内における標的系及び送達系の不安定性；及び4) 反復投与量に関連する免疫学的応答、を含む。
【００９０】
ダイマー、トリマー及びヘキサマーを形成する本発明のpRNAキメラの能力は、疾患の診断及び治療のための新規な機会を開く。各々のpRNAキメラは、キメラpRNAキメラ「構築単位」と考えられる。これらの構築単位は、カスタマイズされた又は「デザイナー」多重結合性pRNA複合体の成分として働くように設計され及び選択され得る。モノマー型構築単位は、所望の相互作用を促進する分子間相互作用ドメイン内で、右手ループ及び左手ループを含むようにつくられる（例えば、トリマーを形成するための、A-b'、B-e'、E-a')。Shu他, Nano Letters 2004; 4: 1717-1724; 2005年4月21日に公表されたWO2005/035760参照。右手ループは、少なくともヌクレオチド45〜48を含み、左手ループは、少なくともヌクレオチド82〜85を含む（実施例11参照）。
【００９１】
これらの多重結合性複合体の多価性は、治療及び/又は診断への一体化された多面的法を可能にする。実施例11、12及び図23に示すように、本明細書に記載の誘導体化及び修飾を用いて考えられ及び創造される多重結合性pRNA複合体の多数の並べ替えが存在する。pRNAモノマーのライブラリーが設計され、特定の適用のためにカスタマイズされた多重結合性複合体は、ライブラリーから所望のキメラpRNA構築単位を選択することによって容易に構築され得る。例えば、多重結合性複合体は、ヘリックス部位内に治療的siRNAを含むpRNAキメラ、指針及びターゲッティングのためのRNAアプタマーを含むpRNAキメラ、及び/又は検出可能な標識により1つ又は2つの末端で誘導体化されるpRNAキメラからつくられる。
【００９２】
本発明は、よって、治療剤の送達のための受容体-介在エンドサイトーシスを使用する試みにおいて先にぶつかった困難性を解決するためのメカニズムを提供する。pRNAの多重結合性は、特異的細胞認識、エンドソーム脱出及び/又は1以上の治療的分子の送達のための複数分子を箱図、本発明に従う安定な、多価のpRNAキメラ（すなわち、多重結合性pRNA複合体）の構築を促進する。
【００９３】
ダイマー型複合体、例えば、2つのスペーサ部位、ひいては2つの生物活性部分を含み得る。好ましいダイマー型複合体は、標的部分（例えば、RNAアプタマー、及び抗体、又は葉酸炎のような受容体リガンド）を含む第1キメラpRNA、並びに生物活性RNA、例えばsiRNA、リボザイム又はアンチセンスRNAを含む第2キメラpRNAを含むものである。
【００９４】
pRNAダイマー-介在送達の方法は、受容体-結合部分が細胞認識及び次の内在化を介在することであり、治療的RNA、例えばsiRNAは、次いで特定の遺伝子をダウンレギュレートするように放出される。標的部分は、所望の細胞にpRNAダイマーをターゲッティングし、細胞表面受容体に結合する。そうする際に、好ましくは、受容体-介在エンドサイトーシスを刺激し、それによってpRNAダイマーの内在化を引き起こす。治療される疾患が、ウイルス性疾患、例えばHIV又はヘルペスウイルスによる感染である場合に、標的部分は、感染された細胞表面上に取り込まれた特定のウイルス-糖タンパク質をターゲッティングすることがある。生物活性RNAは、細胞機能を調節するRNAであり、それによって、細胞成長、細胞死、生理機能等に影響を与える。好ましくは、生物活性RNAは、治療的siRNA又はリボザイムである。
【００９５】
より複雑なヘキサマー複合体は、図8Aに説明されている。ヘキサマー複合体は、標的部分を含むpRNAに加えて、異なった治療剤を含む複数のpRNAキメラを含む（例えば、siRNAを含むpRNA、リボザイムを含むpRNA）。更に、ヘキサマーは、標識剤、例えば重金属、量子点、蛍光色素又はビーズ、又は放射性同位体を運ぶpRNAキメラを含むことができた。同様に、ヘキサマーは、治療的分子が放出されるようにエンドソーム破壊を亢進することができる、成分、例えば融合ペプチドを運ぶ1以上のpRNAキメラを含むことができた。ヘキサマーはまた、アポトーシスの検出を可能にするように設計されたpRNAキメラを含むことができた。
【００９６】
好ましい実施態様では、多価性pRNAキメラの1サブユニットは、標的剤、好ましくはpRNAアプタマー、例えばCD4アプタマー（以下に詳述する）、抗体、又は細胞表面受容体に結合するリガンドを運び、それによって受容体-介在エンドサイトーシスを誘導する。標的部分はまた、細胞膜又は細胞壁の成分と相互作用し、受容体-介在エンドサイトーシス以外のメカニズムによって細胞に入ることができた。先に言及したように、pRNAキメラによって運搬され得る他の「カルゴ」(異種成分）のような標的部分は、（特に、標的部分がRNAアプタマーのようなRNAから形成される場合には）環状に並べ替えられたpRNAキメラのスペーサ部位に含まれ、あるいは非-環状に並べ替えられたpRNAの5'又は3'末端に共通結合的に連結され得る。標的部分として有用な好ましい受容体リガンドは、葉酸（葉酸）である。葉酸は、通常、癌細胞に過剰発現される葉酸受容体に結合する（実施例13参照）。細胞表面上の葉酸受容体への葉酸の近接性を増加させるために設計された好ましい実施態様では、キメラpRNAは、5'オーバーハングを考慮して設計され、葉酸は、pRNAの5'末端に結合される。このことは、5'末端に塩基を付加するか、又はpRNAの3'末端から塩基を削除することによって達成される。従って、葉酸に結合されたpRNAキメラは、癌を検出するために設計された多重結合性pRNAキメラの好ましい成分である。
【００９７】
pRNA複合体の別の1又は2つのサブユニットは、場合により、エンドソームから送達された治療的分子を放出するためのエンドソーム破壊を亢進する成分を運ぶ。エンドソームを破壊し、治療的分子のエンドソーム脱出を介在する多数の物質は文献に記載されている。
障害性又はソラレン-不活性化アデノウイルス粒子は、かかるのエンドソーム活性を有するので、有望であることがわかっている (Cotton他, Proc Natl Acad Sd USA, 89: 6094-6098 (1992))。インフルエンザウイルスの血球凝集素の膜-融合部位を模倣する合成ペプチドもまた、エンドソーム脱出を容易にするための遺伝子送達系で成功的に使用されている (Mastrobattista他, J Biol Chem, 277: 27135-27143 (2002); Plank他, J Biol Chem, 269: 12918-12924 (1994); 及びVan Rossenberg他, J Biol Chem, 277: 45803-45810 (2002))。ポリマー性エンドソーム破壊遺伝子送達ベクター、例えばポリ(アミノエステル) (n-PAE) (Lim他, Bioconjug.Chem, 13: 952-957 (2002))、又はポリ(DL-乳酸-グルコシド共重合体) (PLGA) (Panyam他, FASEB J, 16: 1217-1226 (2002)) も試験されるだろう。エンドソーム破壊剤は、アンドソーム破壊剤と特異的に結合するように設計されたRNAアプタマー（以下に詳述する）を含む1つのpRNAキメラサブユニットを含むことによって多価性pRNA複合体に共有結合的に連結され得る。従って、pRNAキメラは、好ましくは、エンドソーム破壊剤を含むか、又はエンドソーム破壊剤により同時送達される。
【００９８】
別のpRNAキメラは、標識剤、例えば、重金属、量子点、場合により活性部分（例えば、蛍光標識）、ビオチン、又は放射性同位体を含み得る。かかるpRNAキメラを含む多重結合性pRNA複合体は、感染細胞、例えば癌細胞の検出に有用であり得る。
【００９９】
別のpRNAキメラは、異種成分として、pRNAの5'又は3'末端のアニールした別個のDNA又はRNAオリゴヌクレオチドを含み得る。好ましくは、本実施態様では、RNAキメラは、pRNAキメラの3'末端にアニールしたDNAオリゴヌクレオチドを含む。場合により、DNAオリゴヌクレオチドは、誘導体化される；例えば、検出可能な標識、例えば放射性標識、又はビオチン等を含み得る。
【０１００】
治療剤（複数）（例えば、生物活性RNA、例えばリボザイム又はsiRNA、又は他の薬物）は、ダイマー、トリマー又はヘキサマーの多価性pRNAキメラをつくる別のpRNAキメラによって運ばれ得る。治療剤は、生物活性RNA、酵素、化学療法剤等を含み得る。それらは、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）及びヘルペスウイルス、特にB型肝炎ウイルス（HBV）によって起こる疾患を含む、癌又は感染性疾患に対して効果的であるように選択され得る。抗癌性多重結合性複合体の成分がサバイビンをコードする遺伝子に関するsiRNAであるので、治療剤の例は、使用のためにpRNAキメラに取り込まれる。サバイビンは、ある癌細胞のアポトーシスを阻害し、よって、サバイビンを発現停止させるサバイビンsiRNAは、実施例11及び14に示すように、癌細胞のアポトーシスを誘導する。
【０１０１】
よって、本発明のダイマー、トリマー及びヘキサマーの多価性pRNA複合体は、癌、ウイルス性感染症及び遺伝子疾患の治療のための治療的RNA又は他の化学薬物に理想的に適している。多数の治療剤の適用は、in vivo療法の効率を高めると予想される。
【０１０２】
他の分子（例えば、エンドソーム破壊剤に結合する細胞表面受容体-結合RNA分子又はRNA分子）に結合するRNA分子は、例えば、SELEXによって同定されかつ単離され得る (Tuerk他, Science 249: 505-510 (1990); 及びEllington他, Nature 346: 818-822 (1990))。かかるRNA分子は、「RNAアプタマー」として知られている。ランダムRNA配列を含むライブラリーから出発して、in vitro進化法は、特定の予め同定された基質、例えばリガンド又は受容体に結合することができるRNA分子の選択を可能にする (Ciesiolka他, RNA 1:538-550 (1995); Klug and Famulok, Molecular Biology Reports 20: 97-107 (1994)。受容体-結合（「抗-受容体」）RNAは、本明細書に記載の環状に並べ替えられたpRNAを形成するために、pRNAベクターに挿入され得る。ハンマーヘッド型リボザイムを運ぶキメラRNA及び抗-受容体を運ぶキメラRNAは、先に報告されたRNAループ/ループ間相互作用によってダイマー又は高次構造を形成するために混合され得た (Chen他, J Biol Chem 275: 17510-17516 (2000); Guo他. Mol Cell 2: 149-155 (1998); Zhang他, Mol Cell 2: 141-147 (1998); 及びHendrix, Cell 94: 147-150 (1998))。抗-受容体としてRNAアプタマーを含む多価性RNAの使用は、タンパク質抗-受容体と比較して優れた特異性を与えると予想される。
【０１０３】
加えて、SELEX法の基本原則は、本発明の基本的なpRNAキメラデザインを用いて、RNAアプタマーをつくるために採用され得る。予め同定された基質に結合するRNAアプタマーの同定のために有用なRNA分子は、本発明のpRNAの1末端に存在する、好ましくは天然5'/3'末端が位置する場所に連結される、ランダム配列、好ましくは25〜100塩基を含む。場合により、5'/3'末端の両末端に連結されたランダム配列と連結するリンカー配列が含まれる。かかるRNA分子は、化学的又は酵素的合成によってつくられる。例えば、RNAアプタマーの同定に有用なRNA分子は、3つのプライマー：鋳型プラマー、3'末端プライマー及び5'末端プライマー用いてつくられる（図17参照）。DNAプライマーは、pRNA配列又はその誘導体及びその対応物を参考に設計され、定義される。鋳型プライマーは、3'及び5'末端プライマーに結合する2つのヌクレオチド配列によって隣接されるランダム配列を含む。好ましくは、DNA鋳型の各フランキング配列は、pRNAの5'及び3'末端に対応する3'末端プライマー及び5'末端プライマーの配列に相補的である少なくとも14塩基を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１０４】
3'及び5'末端プライマーは、PCRによってつくられるためにRNAアプタマーの同定及びSELEX法での増幅に有用であるRNA分子をPCRによってつくるために使用できる。3'末端プライマーは、5'末端又はおおよそ5'末端で開始し、新生3'末端、例えば塩基71で終了する、pRNA配列の5'末端をつくるためのRNA配列に相補的である塩基を含む。5'末端プライマーは、3'末端又はおおよそ3'末端（例えば、塩基117近辺）で開始し、新生5'末端、例えば塩基75で終了する、pRNA配列の3'末端でのRNA配列に相補的である塩基を含む（図17）。併せると、5'及び3'末端プライマーは、pRNA配列、転写後に、得られたRNAアプタマー構造が本発明のpRNAキメラの構造であるように、好ましくは野生型pRNA配列の全て又はほとんどに相補的であるヌクレオチド配列を含む。例えば、3'末端プライマーが、野生型pRNAの塩基71で終了し、5'末端プライマーが、野生型pRNAの塩基75で終了する場合、pRNA塩基72〜74のみは、SELEX法で産生されるpRNAキメラから欠落しpRNAキメラの個々のフォールディングに影響を与えないだろう。得られたpRNAキメラの二次構造は、phi29 pRNA構造に等しい（等価構造の例は、図3参照）。例えば、pRNAの5'/3'ヘリックス部位の配列が対の二重鎖部位を形成する限り、pRNAの5'/3'ヘリックス部位の配列は変化し得る。
【０１０５】
この系から得られるRNAアプタマー分子は、予め同定された基質に結合し、cp-pRNAのもとの5'及び3'末端に連結された新たに選択されたRNA配列を含み、そして、更なる修飾なしに、様々な適用において使用できるだろう。pRNA部分を含むかかるRNAアプタマーは、薬物又は遺伝子送達及びナノ装置の構築を含むがこれらに限定されない様々な適用において、予め同定された基質に結合できるだろう。
【０１０６】
SELEX系は、タンパク質、多糖、脂質、ATP、化学物質、及び十分に定義された分子構造を有する理論上任意の物質に特異的に結合するRNAアプタマーを同定するために使用される (Bouvet, Methods Mol. Biol, 148: 603-610 (2001); Ciesiolka他, RNA, 1: 538-550 (1995); Davis他, Methods Enzymol, 267: 302-314 (1996); Gold, Harvey Led., 91: 47-57 (1995); Kraus他, J Immunol., 160: 5209-5212 (1998); Shu他, J. Biol.  Chem., 278(9): 7119-7125 (2003); Shultzaberger他, Nucleic Acids Res., 27: 882-887 (1999); Wang他, Sheng Wu Hua Xue. Yu Sheng Wu Wu Li Xue.Bao. (Shanghai), 30: 402-404 (1998); 及びZhen他, Sheng Wu Hua Xue.Yu Sheng Wu Wu Li Xue.Bao. (Shanghai), 34: 635-642 (2002))。実際に、任意の所望の分子に結合するRNAアプタマーが同定されると、任意の所望の分子（典型的には、非-核酸）をpRNA送達ビヒクルに本質的に連結する方法を提供するので、この方法は、エンドソーム破壊剤を送達し、細胞表面受容体に結合する手段であることを超えて十分に一般化され得る。RNAアプタマーとその標的分子との連結は、非共有結合的であるが、初期の結合ステップが行われた後で、場合によっては必要ならば、架橋が達成され得る。
【０１０７】
あるいは、特異的結合のためのRNAアプタマーを同定するためにSELEXを用いる代わりに（又はそれに加えて）、ビオチン、例えば-SH又は-NH2の官能基は、pRNAの末端に連結され得る。pRNAが誘導体化されると、エンドソーム破壊剤（又は他の所望の分子、特に非-核酸分子）は、ストレプトアビジン-ビオチン相互作用によって又は化学的架橋（-SH/マレイミド、又は-NH2/NHSエステル）によってpRNA末端に連結する。
【０１０８】
本明細書に記載の、プログラムされた意図的方法でヘキサマーに結集するpRNA分子を設計する能力は、プロセスに不一致の多能性を与える。抗-受容体アプタマーに加えて、例えば、ヘキサマーは、最高5つの他の成分を有することができた。これらは、ポリ(アミノエステル)(n-PAE) (Lim他, Bioconjug. Chem, 13: 952-957 (2002))、合成ペプチド (Mastrobattista他, J Biol Chem, 277: 27135-27143 (2002); Plank他, J Biol Cheny 269: 12918-12924 (1994); 及び Van Rossenberg他, J Biol Chem, 277: 45803-45810 (2002))、リソソーム脱出、アジュバント、薬物又は毒物のためのウイルス由来粒子 (Nicklin他, Circulation, 102: 231-237 (2000))。同一の原則を用いて、ダイマー又はトリマーが利用できた。ヘキサマーに結合された空のプロカプシドでさえ、有用であることが明らかになった。送達のための特定の遺伝子をコードするDNAを有するためのナノカプセルとして働く。
【０１０９】
重要なことに、RNAは、タンパク質と複合化される場合を除いて、低い又は検出不可能な免疫原性レベルを有するので、慢性疾患を治療することに使用するためには独自に好適である (Goldsby他. In Immunology, 第5版; W. H. Freeman and Company: New York, 2002; pp 57-61; Madaio他, J. Immunol. 1984; 132:872-876)。本発明の単重合性又は多重合性pRNAキメラは、タンパク質又はペプチドを含まず、よって、免疫応答を避けるためのこのようなタンパク質無しのナノ粒子の使用は、慢性疾患の治療において長期間投与を可能にする。
【０１１０】
図3に示される、バチルス・サブチリスファージSF5、B 103、phi29、PZA、M2、NF及びGA1由来のpRNAの系統発生的分析は、非常に低い配列同一性及び少数の保存的塩基を示すが、pRNAのファミリーは、類似の予測された二次構造を有するように考えられる (Pecenkova他, Gene 199: 157-163 (1997); Chen他, RNA 5: 805-818 (1999); Bailey他, J Biol Chem 265: 22365-22370 (1990))。これらのファージの7種のpRNA全ては、右手ループ及び左手ループを含み、これは、ワトソン-クリック塩基対を介するループ/ループ相互作用を形成する。2つのループ内の相補的配列は、これらのpRNAの各々に見られる。従って、これらのpRNAはまた、小さな治療的RNA分子を運ぶためのベクターとして使用され得た（図3）。
【０１１１】
これらのリボザイム-介在抑制実験から得られた結果は、多くの植物種及び動物種の細胞を含む、他の細胞種に適用された。その後、キメラリボザイム-pRNAが細胞、動物又は植物のゲノムに導入される場合には、トランスジェニック植物及び動物は、様々な目的のために開発された。
【０１１２】
驚くべきことに、リボザイムの両末端がpRNA部位に共有結合的に連結されるように、分岐したpRNA部位へのリボザイムの結合は、リボザイムを不活性化せず、pRNAキメラ部位もしくはリボザイム部位の各々のフォールディングを妨害しないと考えられる。リボザイムRNAの両末端の連結は、エキソヌクレアーゼによる分解を抑制するとも予想されるので、得られたpRNA-リボザイムキメラは、植物及びヒトを含む動物における望ましくないRNAを開裂するために有用であることが予想される。更に、疾患に抵抗性を有するトランスジェニック植物及び動物は、pRNA-リボザイムキメラをコードするDNAを、細胞のゲノムDNAに導入することによって開発され得る。
【０１１３】
本発明のpRNAキメラはまた、in vitro、例えばRNA分子の特徴付けのために有用である。RNA分子、特に小RNA分子は、本発明のpRNAキメラのスペーサ部位での包含によって安定化又は「シャペロン化（chaperoned）」され得る。このことは、RNA分子が正確に折り畳まれ、活性でかつ露出され続けることを保証にする。例えば、対象のRNAが現れるように、対象のRNAを含むpRNAキメラは、基質上に共有結合的又は非共有結合的に固定され得る。固定されたpRNAキメラは、次いで、対象のRNAが結合し又は相互作用する構成成分を同定するために、試験分子、例えば細胞抽出物又は成分と接触され得る。基質上に直接、対象のRNAを固定することが好ましい。なぜなら、直接的な固定は、対象のRNAのフォールディングを妨害し、試験分子との接触から構造の一部を保護できるからである。pRNAキメラはまた、結合アッセイ、開裂アッセイ、診断等においての使用のために溶液中でRNAを安定化させるために使用できる。
【実施例】
【０１１４】
本発明は、以下の実施例によって例証される。当然のことながら、特定の実施例、材料、量、及び手法は、本明細書に記載の本発明の範囲及び精神に従って広く解釈されるべきである。
【０１１５】
実施例 1 3'末端でのphi29 pRNAの伸張及び活性に対する効果
pRNAに更なる負担が課せられるか否かを調べるために、pRNAの3'末端を様々な長さに伸張した。
【０１１６】
RNA産物Eco-pRNA及びXbHi-pRNAは、各々EcoRI又はXbaI/HindIIIで予備開裂されたプラスミドpCRTMII由来のDNA鋳型を用いて、in vitro T7 RNAポリメラーゼ転写によって作製した。プラスミドpCRTM2を生成するために、PCR DNAフラグメントは、pRNAコーディング配列と隣接させるために、プライマー対を用いて作製した (Zhang他, Virology 207: 442-51 (1995))。PCRフラグメントは次いでPCRクローニングベクターpCRTMII (Invitrogen, Carlsbad, CA) にクローン化した。コロニー単離後のDNAシークエンシングにより、プラスミド中にPCRフラグメントの存在を確認した。RNA産物174-pRNAは、Guo 他 (Science 236: 690-94 (1987)) 及びWichitwechkarn他 (Nucl Acids Res. 17: 3459-68 (1989)）によって記載されているようにプロカプシドから抽出するか、又は、Wichitwechkarn他 (Mol Biol 223: 991-98 (1992)) に記載の方法に従って、プラスミドpC13-12A(RNA) を鋳型として用いて作製したPCR DNAフラグメントを用いてin vitroで転写した。pRNAの3'末端由来の120-塩基伸張を有するRNA産物Di-RNAは、PCR反応用の鋳型としてZhang他 (Virology 207: 442-51 (1995))に記載されているcpDNAT7を用いて、PCR DNAフラグメントによりin vitroで転写した。
【０１１７】
pRNA機能の著しい妨害なしに、pRNAの3'末端に少なくとも120塩基を付加させることができた（図9）。かかる付加は、ビオチン、pCp、DIG及びリン酸塩によるpRNAの末端標識を含んだ。pRNAの3'末端に付加された様々な配列長は、ウイルス活性に検出不可能な又は最小限の影響を与えた。これらの結果は、3'末端から伸張された塩基とは無関係に、117-塩基pRNAが折り畳まれたことを示した。
【０１１８】
実施例 2 環状に並べ替えられたΦ29 pRNA
バクテリオファージΦ29由来の環状に並べ替えられたpRNA (cpRNA) は、DNA鋳型からの転写によって合成した。環状に並べ替えられたRNAの構築実現性は、天然Φ29 RNA 5'及び3'末端のほぼ近辺にある (Zhang他, Virology 201: 77-85 (1994))。Φ29 pRNA 5'及び3'末端は、接近している。生物活性な環状に並べ替えられたpRNAの構築は、pRNA内部塩基の妨害がpRNAキメラの折り畳み全体に影響を与えなかったことを明らかにした。
【０１１９】
環状に並べ替えられたpRNAを構築するために、3-塩基又は17-塩基ループ配列によって分離される2つのタンデムpRNA-コーディング配列をプラスミドにクローン化した（図10）(Zhang他, Virology 207: 442-451 (1995)参照）。タンデムpRNAコーディング配列を含むプラスミドcpDNA3 A (I) 及びcpDNAT7 (II) は、3-又は17-塩基合成ループによってそれぞれ連結した。非-天然5'/3'末端を有するdsDNAフラグメントをつくるためにPCRを利用した。次いで、新しい5'/3'末端を有するpRNAをつくるためにin vitro転写を行った。PCRプライマー対、例えばP6/P5、は、pRNAコーディング配列内の様々な位置に相補的であり、cp-pRNAの転写のためのPCRフラグメントを合成するために設計した。PCR DNAフラグメントは、SP6 RNAポリメラーゼによるin vitro転写のために鋳型として直接用いた。得られた直線状のcpRNA転写物は、小ループ：DNA鋳型cpDNA3Aの場合にはAAA、DNA鋳型CpDNAT7の場合にはTAATACGACTCACTATA (配列番号8)によって、pRNAの天然5'末端をその3'末端に連結させた。
【０１２０】
図11は、様々な新規の開口部を示す矢印を有する、一般化された環状に並べ替えられたpRNA構造 (配列番号2) を示す (Zhang他, RNA 3: 315-323 (1997))。5'U1C2及び3'A117G116の野生型配列は、T7 RNAポリメラーゼによる転写を促進し高めるために野性型pRNAに対して、それぞれ、G1G2及びC116C117に改変することができた。
【０１２１】
驚くべきことに、我々は、cpRNAはΦ29集合を依然として触媒することができるので、pRNA分子の天然5'及び3'末端に連結させるための配列の挿入、及び分子のどこかへの5'及び3'末端の再配置が、pRNA活性を妨害しないことを発見した。従って、内部塩基のほとんどは、活性cp-pRNAを構築するための新しい末端として使用できた（Zhang他, Virology 207: 442-451 (1995); Zhang他, RNA 3: 315-322 (1997))。
【０１２２】
pRNAの3'及び5'末端と、様々な長さのヌクレオチド配列との連結は、pRNA活性に影響を与えないので、このことは、pRNA及び連結配列が別個に折り畳むことを示している。これらの発見は、pRNAの3'と5'末端との間に位置し得るリボザイムが、pRNAの配列及びフォールディングによって影響されることなく、折り畳まれる、ことを暗示している。
【０１２３】
実施例 3 pRNA-リボザイムキメラのin vitro活性
実施例2でpRNAの天然末端を連結するために使用されるループは、それ自体、生物活性を有さない。しかしながら、pRNAの両末端にRNA配列が連結される場合に、生物活性を有するRNA配列がその活性を維持するか否か、われわれは疑問を感じた。ハンマーヘッド型リボザイムをループ配列として試験することを決定した。
【０１２４】
Cotton他, (EMBO J. 8: 3861-3866 (1989)) の文献で先に記載されたin vitroモデル系（図12）は、pRNA-リボザイムキメラの機能を試験するための対照として改変し、使用した。 U7snRNA (配列番号4) を標的RNAとして選択した。キメラRNA分子、pRNA-RzU7 (配列番号3) を合成した。この系は、pRNAが基質開裂において機能する他のハンマーヘッド型リボザイムを有するか否かを決定するために使用した (Gotten and Birnstiel, EMBO J 8: 3861-3866 (1989))。
【０１２５】
RNAは、Zhang他, (Virology 201 :77-85 (1994)) に記載のようにして調製した。すなわち、DNAオリゴヌクレオチドは、所望の配列で合成し、PCRによる二重鎖DNAを作製するために使用した。T7プロモーターを含むDNA構築物は、プラスミドにクローン化し、又は直接的なin vitro転写のための基質として使用した。U7基質をコードするアンチセンスDNA及びリボザイムRzU7をコードするDNAは、転写前に、T7センスプロモーターと混合した。リボザイムRzU7-pRNAをコードするdsRNA及びT7プロモーターは、PCRによって作製した。RNAを合成した。RNAは、ランオフ転写によってT7 RNAポリメラーゼで合成し、ポリアクリルアミドゲルから精製した。プラスミド及びPCR産物の配列は、DNAシークエンシングにより確認した。
【０１２６】
U7snRNAフラグメントを開裂するための、U7-標的リボザイム（47塩基）、RzU7、及びU7-標的pRNA-リボザイム (168塩基)、RzU7-pRNAの相対的能力を比較した。修飾することなくリボザイム反応が正確に働くことを証明するための対照実験として、リボザイム開裂反応を行った。この結果は、RzU7-pRNAリボザイムが、対照のRzU7リボザイムに匹敵する結果を有する基質を開裂することができたことを明らかにする（図12）。伸張研究は、pRNAにより担持された特定のハンマーヘッド型リボザイムが他の各々の基質を開裂できたことを明らかにした。
【０１２７】
これらの実験に使用したRNAは、PCRを用いて又はプラスミドへのクローン化のいずれかによって、T7ポリメラーゼin vitro転写によって作製した。転写産物は以下のとおりである：
pRNA-RzU7のT7転写は168マーを与える。
【０１２８】
【表１】
2009502198.tif 000003
【０１２９】
U7鋳型のT7転写は94マーを与える。
【０１３０】
【表２】
2009502198.tif 000004
【０１３１】
RzU7鋳型のT7転写は47マーを与える。
【０１３２】
【表３】
2009502198.tif 000005
【０１３３】
RzU7 (47塩基) (配列番号10) 及びpRNA-RzU7 (168塩基) (配列番号3) の、U7snRNA (配列番号9) を開裂する能力を比較した。RzU7開裂反応は、修飾することなくリボザイム反応が正確に働くことを証明する対照実験として行った。pRNA-RzU7を用いる開裂反応は、pRNAがリボザイム用の担体分子として成功的に使用できたことを確認すうために行った。
【０１３４】
U7-標的リボザイムRzU7及びリボザイムRzU7-pRNA開裂反応は、20 mM Tris pH 7.5、20 mM MgCl2及び150 mM NaClの存在下で、37℃で90分間行った。水をRNAに替えて対照反応を行った。試料は、ミリポア 0.025 μm VS型膜上で30分間、TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) で透析した。TBE (0.09 M Tris-ホウ酸塩, 0.002 M EDTA) 中で、15% PAGE/8M 尿素変性ゲル上に試料を充填する前に、2x ローディング緩衝剤 (8 M 尿素, TBE, 0.08% ブロモフェノールブルー, 0.08% キシレンシアノール) を試料に添加した。ゲルは、エチジウムブロミドで染色し、EAGLE EYE II (Stratagene) で視覚化した。
【０１３５】
図12(b)は、開裂反応の成功的な結果を示す。予測された69マー及び25マーの開裂産物が認められた。
【０１３６】
この実験は、リボザイムの担体分子としてpRNAを用いて成功的に確認した。pRNA-RzU7構築物中でハンマーヘッド型リボザイムが活性を保持するという発見は、重要な暗示である。pRNAの個々のフォールディングは。明らかにかつ有利に、リボザイムに、正確な構造に折り畳ませ、標的RNAを開裂することにおけるその機能を達成させる。更に、リボザイムの両末端は、pRNAに連結されるので、連結は、細胞中でエキソヌクレアーゼ消化からリボザイムを保護すると予想される。従って、リボザイムは、トランスジェニック植物又は動物における発現後に安定であろう。これは、リボザイムの治療的使用として存在する厄介な問題を解決する。
【０１３７】
実施例 4 B型肝炎ウイルスに対するpRNA-リボザイムキメラのin vitro活性
肝炎は、世界中の多くの国々で流行している重大な疾患である。B型肝炎ウイルス（HBV）は、本疾患の1つの原因物質である。HBVは、RNAウイルスである。HBVのRNAゲノムは、キメラpRNA-リボザイムの機能性を試験するための標的として使用した。この仕事は、この重大な感染性疾患を治療する可能性を提供するため、重要である。
【０１３８】
バクテリオファージΦ29に基づくpRNA-型ベクターは、B型肝炎ウイルス (HBV) ポリAシグナルを開裂するハンマーヘッド型リボザイムを運ぶように設計した。Feng他, (Biol. Chem. 382: 655-660 (2001)) により設計されたこのハンマーヘッド型リボザイムは、137-塩基HBV-ポリA基質を、70及び67ヌクレオチドの2つのフラグメントに開裂する。
【０１３９】
我々は、このリボザイムの2つの種類：pRNA部分を含むpRNA-RzA、及びpRNA部分を含まないRzAを試験した。プラスミドpRzAから非修飾リボザイムをコードする配列を除くために、キメラリボザイムをコードするin vitroプラスミドpRNA-RzAは、制限酵素XbaI及びKpnIを用いて構築した、これは、HBV ポリAシグナルをターゲッティングするリボザイムをコードした (Feng他, Biol Chem 382: 655-60 (2001))。次いで、188塩基キメラリボザイムをコードする、PCRによって作製されたdsDNAフラグメントは、Xba I及びKpn Iで二回消化したプラスミドpRzAにライゲートした (図14)。HBV-標的リボザイムは、pRNAの5'及び3'末端に連結し、pRNAは環状に並べ替えられた形態に再編成した。2つのシス-開裂リボザイムは、pRNA及びHBV-標的リボザイムに隣接するように付加した。
【０１４０】
RNAは、Zhang他 (Virology 201: 77-85 (1994)) よって先に記載されたように調製した。すなわち、DNAオリゴヌクレオチドは、所望の配列で合成し、PCRによって二重鎖DNAを作製するために使用した。T7プロモーターを含むDNA産物は、プラスミドにクローン化し、直接的in vitro転写のための基質として使用した。HBV ポリA基質をコードするin vitroプラスミドpTZS (Feng他, Biol Chem 382: 655-660(2001))は、BgIIIにより線状にした。リボザイムRzA及びpRNAキメラリボザイムpRNA-RzAをターゲッティングする、HBV ポリA基質をコードするin vitroプラスミドは、EcoRIで線状にした。RNAは、ランオフ転写物のための鋳型として直線状DNAを用いて、T7ポリメラーゼによるin vitro転写によって作製した。プラスミド及びPCR産物の配列は、DNAシークエンシングによって確認した。
【０１４１】
シス-開裂転写の産物、リボザイムpRN A-RzAは188マーであった。
【０１４２】
【表４】
2009502198.tif 000006
【０１４３】
転写されたリボザイムRzAは66マーであった。
【０１４４】
【表５】
2009502198.tif 000007
【０１４５】
In vitroプラスミドの全カセットは、T7プロモーターの制御下にあった。カセットの転写の間に転写物は自己開裂し、pRNAに連結されるHBV-標的リボザイムを含有するキメラリボザイム (pRNA-RzA) を生成した（図14）。
【０１４６】
開裂反応は、20 mM Tris pH 7.5及び20 mM MgCl2の存在下で、37℃で60分間行った。pRNA-RzA (0.539 nmol) を用いて、HBV-ポリA (0.117 nmol) を開裂した。対照反応は、水をあるRNAと置換することにより行った。水を置換したRNAは、対照の名称から削除した。例えば、pRNA-RzA対照は、HBV-ポリAを有さない。試料は、ミリポア 0.025 μm VS型膜上で30分間、TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) で透析した。TBE (0.09 M Tris-ホウ酸塩, 0.002 M EDTA) 中で、15% PAGE/8M 尿素変性ゲル上に試料を充填する前に、2x ローディング緩衝剤 (8 M 尿素, TBE, 0.08% ブロモフェノールブルー, 0.08% キシレンシアノール) を試料に添加した。ゲルは、エチジウムブロミドで染色し、EAGLE EYE II (Stratagene) で視覚化した。
【０１４７】
pRNAキメラ、pRNA-RzA (表1) をコードするdsDNAフラグメントは、PCRによって作製した。pRNA-RzAリボザイム及びHBV-ポリA基質RNAは、ランオフ転写のための鋳型として直線状DNAを用いて、T7ポリメラーゼによるin vitro転写によって作製した。次いで、このpRNA-RzAリボザイム転写物は、外来RNAフランキング配列からそれ自体を遊離するための2つのシス-開裂反応を受けた。「シス-開裂」とは、リボザイム及び基質の両方が同一の分子の一部である開裂反応を意味する。これらの2つのシス-開裂は、キメラ配列と隣接する2つのリボザイムによって達成された。1つのシス-リボザイム（63 nt）は、キメラの5'側であり、もう一方のシス-リボザイム（46 nt）は、キメラの3'側である (図14))。シス-開裂反応は、pRNA-RzAリボザイムが転写される間に主に起こった (図14)。 
【０１４８】
【表６】
2009502198.tif 000008
【０１４９】
シス-開裂転写物の処理産物、188マーは、ゲルの主なバンドであり、精製された。UV光下でpRNA-RzAリボザイムを精製するために使用されるゲルの試験は、3つの異なった影を生成した。ゆっくりと移動するバンドは、pRNA-RzAリボザイムであった。より速く移動した他の2つのバンドは、5'及び3'-シス開裂リボザイムであった。このことは、シス-開裂が完全であったことを示す。
【０１５０】
機能性キメラpRNA-RzAリボザイムによるHBV-ポリAの開裂は、図13に示す。pRNAキメラ部分を含むリボザイムpRNA-RzAは、基質HBV-ポリAをほぼ100%の効率で開裂することができた。予測された67塩基及び70塩基開裂産物は、HBV-ポリA及びpRNA-RzAリボザイムの両方を含む開裂反応について1つのバンドとして見られた。標識pRNA-RzAのレーンは、HBV-ポリAを含まない対照反応を示し、標識HBV-ポリAのレーンは、pRNA-RzAリボザイムを含まない対照反応を示す。
【０１５１】
図13の標識RzAのレーンは、2つのバンドを示す。上のバンド (66 nt) は、HBV-ポリA基質を開裂するリボザイムである。下のバンド (63 nt) は、RzAリボザイム転写反応で産生されるシス-開裂リボザイムである。2つのリボザイムは、ゲル上で近くに移動する。標識Rz-pRNAのレーンは、1超のバンドを示す。一番上のバンドは、キメラリボザイムpRNA-RzAである。下のバンドは、上述のように、開裂産物である。非-開裂基質は見られなかった。
【０１５２】
開裂反応においてRzA及びpRNA-RzAの等モルを使用するために、大量のpRNA-RzAを使用した。他の物質は、キメラリボザイムと開裂産物との間に見られ、このゲル中の高RNA濃度及びキメラリボザイムの大きさのために、キメラリボザイムに分解した。少ない割合の分解でさえ、目に見える分解物を生じた。二次構造及び尿素による不完全な変性に起因して、RNAの移動率は、サイズと完全に一致しなかった。
【０１５３】
HBV標的のための2つのアームを含むハンマーヘッド型リボザイムが、正確に折り畳まれると同時にpRNAによってエスコートされる、ことが見出された。pRNAベクターを有するリボザイムの開裂効率とそれを有さないリボザイムイの開裂効率との比較は、顕著な相違を示した。リボザイムpRNA-RzAは、pRNA部分を含み、基質HBV-ポリAをほとんど100%の効率で開裂することができた。キメラリボザイムは、in vitroでほとんど完全に、HBV mRNAのポリAシグナルを開裂した。しかしながら、pRNA部分を有さないリボザイムRzAは、70%よりかなり低い効率で基質を開裂した（非表示）。
【０１５４】
実施例 5 細胞培養物におけるB型肝炎ウイルスに対するpRNA-リボザイムキメラの活性
プラスミドpCRzAは、上海のGuorong Qi教授から入手した。このプラスミドは、B型肝炎ウイルスポリAシグナルをターゲッティングする2つの配列によって隣接する、シス-作用ハンマーヘッド型リボザイムをコードする配列を含む。このプラスミドがHBVゲノムを有するHepG2細胞にコトランスフェクトされると、HBV RNAレベルは減少し、B型肝炎ウイルスは用量依存的に阻害された。
【０１５５】
我々は、実質的に実施例3に従ってプラスミドpRNA-CRzAを構築した。pRNA-CRzAにおいて、ハンマーヘッド型リボザイム及びその隣接配列は、phi29 pRNAによって行い、pRNAキメラを生成した。
【０１５６】
細胞培養のために使用されるpRNA-CRzAプラスミドの設計は、in vitro試験で使用したT7プロモーターの代わりにCMVプロモーターが使用されることを除いて、基本的に、in vitroで使用されるものと同一であった（表1）。このリボザイムの2つのバージョン：pRNA部分を含むpRNA-RzAリボザイム、及びそれを含まないRzAリボザイムを試験した。2つのプラスミドは、2つのシス-開裂ハンマーヘッド型リボザイムを含むHBV-ポリAシグナルをターゲッティングするハンマーヘッド型リボザイムをコードする配列を含む。
【０１５７】
キメラリボザイムをコードする組織培養プラスミドpRNA-CRzAは、HBVポリAシグナルをターゲッティングするリボザイムをコードするプラスミドpCRzAから非修飾リボザイムをコードする配列を除くために、XbaI及びKpnIを用いて構築した (Feng他, Biol Chem 382: 655-60 (2001))。次いで、188 ntキメラリボザイムをコードするPCRによって作製されたdsDNAフラグメントは、XbaI及びKpnIで二重消化したプラスミドpCRzAの位置にライゲートした（図14）。
【０１５８】
HepG2細胞を、10%ウシ胎児血清及び抗体を補充したダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) 中で37℃、10%CO2で維持した。リン酸カルシウム沈降の方法を用いて一時的なトランスフェクションを行った。一般的には、60-mmデッシュ中の細胞は、1 μgのHBV発現プラスミドp3.6II (Feng他, Biol Chem 382: 655-660 (2001))、5 μgの発現構築物 (CMVベクター、pCRzAプラスミド (Feng他, Biol Chem 382: 655-660 (2001))、又はpRNA-RzAプラスミド) によって一時的にトランスフェクトした。lacZ遺伝子を運ぶ1 μgのpcDNA4LacZ (Invitrogen) も、内部対照として各トランスフェクションに含めた。β-ガラクトシダーゼ活性は、異なったデッシュの間でトランスフェクション効率を標準化するために検出した。
【０１５９】
トランスフェクションの72時間後にHBVウイルス性RNA転写を分析するために、細胞を採取し、総RNA抽出のためにTRIZOL試薬 (Gibcol-BRL) に溶解した。ノーザンブロットのために、20 μgの変性RNAは、0.6 Mホルムアルデヒド-1%アガロースゲルに溶解し、HYBOND N+ナイロン膜 (Amersham) 上にトランスフェクトした。プローブは、供給者 (Promega, Madison, WI) に従って、プラスミドp3.6 II由来のHBV (adr) の1.8kb XbaIフラグメント及び[α-32P] dATPを用いて、ランダムプライミングによって調製した。HBVプローブでのハイブリダイゼーションの後に、ブロットを剥がし、そして、総細胞RNAのレベルを標準化するための内部対照として働く、GAPDH (グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ) のプローブにより再-ハイブリダイズした。
【０１６０】
トランスフェクションの72時間後に、e-抗原を分析するために、細胞を採集し、緩衝剤に37℃で10分間溶解した (1% NP-40, 50 mM Tris-HCl及び1mM EDTA)。細胞溶解物中のβ-ガラクトシダーゼの活性は、異なった試料間でのトランスフェクション効率の変化を標準化するために測定した。細胞溶解物及び培地中のe-Agは、商業的なELISAキット (Sino-American Co.) でアッセイし、β-ガラクトシダーゼ活性を標準化した。CMVベクター、pCRzA、pRNA-RzA及び障害性リボザイムプラスミドpCdRzAは、HBV発現プラスミドp3.6II、及び内部対照として働くβガラクトシダーゼ発現プラスミドpcDNA4LacZと共にHepG2細胞に形質転換した。表2参照。CMVベクターの量は、任意に1である。
【０１６１】
【表７】
2009502198.tif 000009
【０１６２】
e-抗原アッセイは、pRNAがハンマーヘッド型リボザイムによるHBV複製の阻害を亢進したか否かを調べるために行った。e-Agは、コア抗原としてほとんど同一のアミノ酸配列を有し、同時にタンパク質発現の位置の相違に起因する異なった免疫原性を有する、プレ-コア（pre-c）コーディング部位の上流の開始位置からの翻訳によって発現される。e-Agは、急性HBV感染症の初期に現れ、細胞培養物の抗原アッセイに好適である。
【０１６３】
e-Agのアッセイは、(ハンマーヘッド型リボザイムのみを発現する) プラスミドpcRzA、(pRNAベクターによってキメラリボザイムを発現する）pRNA-RzA、(傷害性リボザイムを発現する）pCdRzA、及びベクターのみによってトランスフェクトされた細胞のe-Agレベルを比較することによって、pRNAがリボザイムの阻害効果を亢進したことを明らかにした（表2）。触媒的に不活性なリボザイムによる阻害は、相補的なHBV配列へのアームI及びアームIIのハイブリダイゼーションを含むアンチセンスメカニズムに起因することがある。細胞培養物中のpRNA-RzAリボザイムの効果を評価するために、リボザイム-発現プラスミドpCRzA、pRNA-RzA、pCdRzA又は空のベクターは、HBVゲノム-発現プラスミドp3.6 IIでコトランスフェクトし、肝臓癌HepG2細胞に導入した。p3.6IIは、1.2コピーのHBV (adr) ゲノムを含み、更なる因子なしで、HepG2細胞中に全てのウイルス転写物 (3.5Kb プレ-コア及びプレーゲノムRNA; 2.4Kb Pre-S RNA, 2.1kb S RNA及び0.8Kb X RNA) を産生する。総細胞RNAは、トランスフェクションの72時間後に抽出した。内部対照としてβ-ガラクトシダーゼ活性を標準化した後に、RNAの匹敵する量（各レーンに充填されたRNA試料の量は、GAPDHレベルによって評価され得る）は、ゲルに適用し、HBV-特異的DNAプローブによるノーザンブロッティングによって検出した。プローブは、示しような3.5 Kb及び2.1/2.4 KbのウイルスRNAを検出するために使用した。pRNA-RzAリボザイムの存在は、3.5及び2.1/2.4 Kb HBV RNAレベルでの明らかな増加を引き起こした。
【０１６４】
この改変されたリボザイムによる阻害は、2.1/2.4 KbウイルスRNAレベルに影響を与える点で、特にCRzAリボザイムに比べて、より顕著であった。Helix IIの1塩基変異を有する (プラスミドpCdRzAによりコードされる）障害性リボザイムCdRzAも、CRzAリボザイム及びpRN A-RzAリボザイムと並行して使用した (図 15)。
【０１６５】
抗原アッセイ及びノーザンブロットは、phi29 pRNAが、細胞中で機能するためのハンマーヘッド型リボザイムをシャペロンし、エスコートし、よってリボザイムのHBVに対する開裂効率及び阻害効果を亢進する、ことができることを証明した。リボザイム活性のこのような増加のメカニズムは、おそらく、pRNAが、リボザイムがミスフォールディングしないようにし、細胞中に存在するエキソヌクレアーゼによる分解からリボザイムを保護できるという事実に起因する。pRNA分子は、2つの独立した機能性ドメイン：プロカプシド結合ドメイン及びDNA-転座ドメイン（図2(a)）を含む。これは、外因性RNAが、pRNAフォールディングに影響を与えることなく、pRNAの末端に連結され得ることを証明した。少なくとも120の非-特異的塩基は、pRNAのフォールディング及び機能を妨害することなしに、aptRNAの3'末端から伸張した。これは、その3'-末端から伸張された塩基に関係なく、117-塩基のpRNAが折り畳まれたことを示している。加えて、生物活性な環状に並べ替えられたpRNAの構築は、pRNA内部塩基の妨害がpRNAの全体的なフォールディングに影響を与えないことを明らかにした。pRNAの3'及び5'末端の、様々な長さのヌクレオチド配列との連結は、pRNA活性に影響を与えないという証明は、pRNA及び連結配列が独立に折り畳むという指標である。
【０１６６】
これらの細胞培養試験はノーザンブロット及びe-抗原アッセイによって証明されるように、pRNAによってエスコートされないリボザイムと比較して、キメラリボザイムGAHBV複製の阻害を増加することができることを示した。pRNAはまた、他のpRNA基質を開裂するために別のハンマーヘッド型リボザイムを運ぶことができた。これらの試験は、リボザイムがpRNAの3'末端と5'末端との間に位置付けられ、元のpRNA配列によって影響されることなく折り畳まれるだろう、ことを示している。これらの発見は、pRNAがリボザイム、細胞倍環境でアンチセンス及び他の治療的RNAモデルに安定性を付与するためのベクターとして使用され得ることを示唆する。
【０１６７】
実施例 6 細胞培養物中の癌に対するpRNA-リボザイムキメラの活性
固形腫瘍の成長及び転移は、しつこい脈管形成を必要とする。脈管形成は、新しい血管が形成される重要なプロセスである。血小板タンパク質におけるタンパク質型12-リポオキシゲナーゼ (12-LOX) は、C-12アラキドン酸にO2を加えることによって、12-HETE (12-ヒドロキシ-5,8,10,14-エイコサトリエン酸) をつくる。12-LOX及びその代謝物は、腫瘍脈管形成における重要な因子であるかもしれない。この方法の適用は、癌細胞が、周囲組織において血管の成長を促進しないようにすることによって腫瘍を縮退することができた。
【０１６８】
Liu他によるin vitro研究は、このリボザイム、121oxRzが基質を効率的に開裂した、ことを示している (Cancer Gene Ther. 7: 671-675 (2000))。反応温度を37℃から50℃に変えると効率は増加した。細胞培養物における試験は、プラスミドからリボザイムを発現する細胞が、ノーザンブロッティングにより検出できなかった12-LOX mRNAのこのような高いレベルを有した、ことを示した。非機能性変異リボザイムのみを有する細胞の対照群は、12-LOX mRNAのレベルが僅かに減少したに過ぎなかった。12-LOX mRNA発現のこの僅かな減少は、12-LOX mRNAを開裂することなく、12-LOX mRNAに単に結合することによる、変異リボザイムによるアンチセンス効果の結果であった。細胞抽出物は、12-LOX酵素活性についてアッセイした。リボザイムを発現する細胞は、親細胞に比べて6ケ月後に13%の12-LOX酵素活性を有した。変異体機能性リボザイムを発現する細胞は、親細胞に比べて80%の12-LOX酵素活性を有した (Liu他, Cancer Gene Ther., 7: 671-675, 2000)。このことは、リボザイムの活性を証明する。
【０１６９】
血小板-型12-リポキシゲナーゼ (12-lox) mRNA (図16) は、キメラ型のハンマーヘッド型リボザイムがヒト赤白血病（HEL）細胞中でmRNAレベルを抑制するように機能できるか否かについて試験するために標的として選択した。我々は、発明者Peixuan Guoが顧問及び客員教授であるウイルス研究所の国立主要研究所の部長であるTien教授からの、リボザイムをコードするin vitroの組織培養プラスミドを入手した。ハンマーヘッド型リボザイムは、実施例3に記載の方法を用いて本質的に我々のpRNAに挿入した。我々は、最初に、T7プロモーター及びpRNA配列に挿入された121oxRzをコードするオリゴヌクレオチドから、2つのステップのPCR反応でdsDNA鋳型を構築することにより、化学的リボザイム121oxRzpRNAを創作した。この鋳型は次いで転写されて、121oxRzpRNAを与えた。
【０１７０】
121oxRzpRNAの活性を試験するための実験を行うであろう。In vitro実験のために、121oxRz及び12lox mRNA (mRNA基質) の標的RNAフラグメントを、実施例2に記載の方法を用いて本質的にオリゴヌクレオチドから作製した。121oxRz及び基質RNAは、各々、2つのハイブリダイズしたDNAオリゴヌクレオチドのそれ自身の群から転写される。1つは、ネガティブセンスT7ポリメラーゼプロモーター及び基質配列又は121oxRz配列をコードする。他のオリゴヌクレオチドは、ポジティブセンスT7プロモーター配列をコードする。RNA基質は、ウシ腸ホスファターゼ（CIP）及び次いでポリヌクレオチドキナーゼ（PNK）を用いて[γ32P]-ATPにより放射性標識する。
【０１７１】
pRNA部分を有する及びこれを有さない2つのリボザイムの開裂は、in vitro及び細胞（細胞培養物）中で評価されるだろう。In vitro試験では、我々は、pH、イオン濃度、RNase及び細胞溶解物に対抗性のリボザイムの安定性を比較するだろう。リボザイムの安定性に影響し、細胞中で機能する因子が存在する。
【０１７２】
12-loxを発現するHEL細胞は、細胞培養実験に使用されるだろう。tRNAvaIプロモーター、121oxRzpRNAキメラ、及び真核生物ポリメラーゼIIターミネーター配列(5 T残基) をコードする発現カセットにおける空の発現カセット又は121oxRzpRNAは、エレクトロポレーションを用いるトランスフェクションによって送達されるだろう。細胞中の121oxRzpRNAキメラ及び12-lox mRNAの発現は、ノーザンブロットによって検出されるだろう。非トランスフェクトされたHEL細胞は、対照として使用されるだろう。12-LOX酵素活性は、HEL細胞中で12-HETEが産生されるか否かの決定によって評価されるだろう。
【０１７３】
In vitro及び細胞培養実験のために、変異体121oxRz及び変異体121oxRzpRNAキメラ対照は、第2対照として使用されるだろう。変異体121oxRzは、他の塩基と置換されたその保存的な触媒コアドメインにそのヌクレオチドの内の1つを有する。これは、リボザイムが基質RNAを開裂させなくする。第2対照としての非-触媒的変異リボザイムの使用は、RNA基質を開裂することとは対照的に、天然リボザイムがRNA基質に結合することによって転座を阻害することができるか否か（すなわち、アンチセンス効果）を明らかにするように設計される。
【０１７４】
実施例 7 活性ダイマー、トリマー及びヘキサマーの構築
右連結ループと左連結ループとのハンド・イン・ハンド相互作用は、安定なダイマー、トリマー又はヘキサマーの形成をもたらす。pRNAは、pRNAが、そのダイマー、トリマー又はヘキサマーの形成にあるか否かに関係なく、ハンド・イン・ハンド相互作用によって環状環を形成する強い蛍光を有する。分子間pRNA/pRNA相互作用に原因となる配列は、残基23〜97に位置する (Chen他, RNA, 5: 805-818 (1999))。残基23番の前又は残基97番の後のヌクレオチドの変化又は挿入は、ダイマー、トリマー及びヘキサマーの形成を妨害しない。ダイマー、トリマー又はヘキサマーを形成する能力は、残基23番の前又は残基97番の後の5'又は3'末端切断によっても影響されない。
【０１７５】
我々の方法は、「混合し及び一致し」得る個々のキメラpRNAモノマーを構築して、治療剤、例えば「娘」RNA分子、例えばsiRNA又はリボザイムを特定の標的細胞に運ぶことである。各モノマーサブユニトは、本明細書に記載されている環状的に並び替えられたpRNAであり、特定の右又は左ループ、例えば、分子間相互作用を促進してマルチマーを形成するように設計されたA(右)-b'(左) を有するように設計される。各pRNAは、特定の「ペイロード」（例えば、受容体-標的アプタマー、エンドソーム溶解試薬、又は治療的RNA）を運ぶ。個々の環状に並べ替えられたキメラpRNAと、好適な連結ループとの混合は、ダイマー、トリマー又はヘキサマー送達可能複合体の効率的な形成をもたらす。
【０１７６】
pRNAダイマーの構築
pRNAダイマーは、連結する右及び左ループの分子間相互作用によって形成される。本明細書に記載の変異体記載を簡単にするために、ぞれぞれ、pRNAの右-及び左-手ループ配列を示す大文字及び小文字が使用される。大文字及び小文字での同一の文字は、一対の相補的配列を表す。例えば、pRNA A-a'では、右ループA (5'GGAC48) 及び左ループa' (3'CCUG82) は相補的であるが、pRNA A-b'では、右ループAの4つの塩基は、左ループb' (3'UGCG82) の配列に相補的でない。相補的ループ配列（例えば、pRNA A/a'）を有する変異体pRNAは、phi29 DNAパッケージングにおいて活性であるが、非-相補的ループ（例えば、pRNA A/b'）は不活性である（図20）。
【０１７７】
我々は、pRNAs A-i'及びI-a'が、DNAパッケージングのみにおいて不活性であるが、A-i'及びI-a'が混合される場合には、DNA-パッケージング活性は回復した、ことを見出した（(図20a; Hoeprich他, J Biol. Chem., 277(23): 20794-20803 (2002))。この結果は、pRNAループのトランス-相補性によって説明され得る。すなわち、pRNA A-i'の右手ループAは、pRNA I-a'の左手ループa'と対を形成した。2つの不活性なpRNAを連結ループとの混合は、例えば、pRNA A-b'及びB-a'が1:1のモル比で混合される場合には、最高100%の効率を有するpRNAダイマーの産生をもたらす。従って、pRNAの化学量論は、2の倍数（6又は12）であると予測される。我々は、in vitroでのDNAパッケージングにおいて活性であることが見出された、数個の共有結合的に連結された二量体のpRNAを構築した (Shu他, JNanosci and Nanotech (JNN), 4: 295-302 (2003))。このことは、更に、ダイマーがヘキサマーの構築単位であることを証明する。これらの3つの完全に活性なpRNAの各々のHill係数の決定は、各プロカプシドについてダイマーの3つの結合部位が存在し、結合部位が協調性である、ことを暗示する。
【０１７８】
pRNAトリマーの構築
変異体の別の群は、3つのpRNAs: A-b'、B-c'及びC-a'からなる（図20b)。この群は、3つの変異体の各々を運ぶ、3-、6-、9-又は12-マー環を形成できると幾何学的には予想される。我々は、トリマーのいくつかの群、例えばA-b'、B-c'及びC-a'を構築した。1つのみを試験したときに、各pRNAは、ほとんど活性を示さないか又は全く活性を示さなかった。3つの変異体の内のいずれか2つが混合される場合には、活性はほとんど検出されないか又は全く検出されなかった。しかしながら、3つのpRNA全てが1:1:1の比で混合される場合には、DNAパッケージング活性は回復した。実際に、安定なpRNAトリマーは、3つの連結pRNAキメラのこのような群を用いて、最高100%の非常に高い効率で形成される (図及び22)。
【０１７９】
3つのpRNAの全ての存在のみが閉環をつくる方法で各RNAの変異体が作製されるので、2つの変異体pRNAのみの混合物の活性の欠如、及び3つの変異体pRNAの混合物の回復された活性は予想された。3つの不活性なpRNAが、混合されるときに完全に活性であるという事実は、DNA-パッケージング複合体におけるpRNAの数が、2の倍数であること加えて3の倍数であることを示唆する（図20b）。従って、DNAパッケージングに必要なpRNAの数は、2及び3の共通の倍数である6（又は12であるが、この数は、5〜6の間のRNA化学量論を明らかにした2項分布及び段階的希釈分析の方法によって除かれている）である (Trottier他, J. Virol., 71: 487-494 (1997))。
【０１８０】
ヘキサマーの構築
DNAパッケージング活性はまた、6つの異なった変異体pRNAであって、その各々は、単独で使用される場合に不活性であるpRNAを混合することによって達成される (図20c)。従って、連結ヘキサマー環は、連結ループの塩基対形成によって形成されると予測され得る。タンパク質無しの溶液中でダイマーからのpRNAヘキサマーの形成効率は、低い（Guo他, Mol.Cell., 2: 149-155 (1998) 及びZhang他, Mol. Cell, 2: 141-147 (1998)。しかしながら、好適な連結ループを有するダイマーpRNAの半分を超えるpRNAは、好適なタンパク質鋳型-コネクタ又はプロカプシドの存在下で、ヘキサマーを形成できた (Chen他, J Biol Chem, 275(23): 17510-17516 (2000)、及びHoeprich他, J Biol.Chem., 277(23): 20794-20803 (2002))。かかるタンパク質鋳型を有するヘキサマーは、プロカプシド粒子のサイズが30 nm x 40 nmに過ぎないので、送達粒子として有用であろう。代わりの方法は、我々の先の文献 (Garver他, J Biol Chem, 275(4): 2817-2824 (2000)、及びMat-Arip他, J Biol Chem, 276: 32575-32584 (2001)) で報告したように、pRNAの右又は左の連結ループに取り込まれた架橋剤の使用によって高収率のタンパク質無しのヘキサマーをつくることであろう。これらのヘキサマーは、タンパク質の存在下で生成され、タンパク質は、ヘキサマーを単離するために架橋後に除かれる。
【０１８１】
実施例 8 生物活性RNAを運ぶpRNA分子
所望の「娘」RNA分子を有するキメラpRNAモノマーが構築され得る。
【０１８２】
ハンマーヘッド型リボザイム
ハンマーヘッド型リボザイム（Forster他, Cell, 50: 9-16 (1987) 及びSarver他, Science, 247: 1222-1225 (1990)) は、標的RNAへの塩基対に対する2つのアームとして相補的ヌクレオチドを用いて、RNA基質配列を標的とする。相補的ヌクレオチドのリボザイムの2つのアームの間には、標的RNAに対する開裂機能を果たす触媒的RNAの短い配列がある。特定の開裂の標的部位は、3-ヌクレオチド配列 NUH (N = A、C、G、U及びH = A, C, Uであるが、グアノシンでない) である。リボザイムが容易に標的に塩基対を形成できるように、標的配列のいずれか一方にあるヌクレオチドは、強力な二次又は三次構造を有するべきでない。ハンマーヘッド型リボザイムの標的の選択方法は、先に公表されている (Mercatanti他, J Comput.Biol, 9: 641-653 (2002))。
【０１８３】
成功的にB型肝炎ウイルスを標的したハンマーヘッド型リボザイムを有するキメラpRNAは、実施例に記載されている。発現カセットの転写は、キメラリボザイムを生成する、転写物の自己-開裂をもたらした（実施例5）。ハンマーヘッド型リボザイムを有する他のキメラpRNAを構築するためには、リゾザイムのRNA配列は、同様に、pRNAの5'及び3'末端に連結され、pRNAは環状的に並べ替えられ、好ましくは元のpRNA配列の残基71/75に再配置される原始的5'/3'-末端を有する。71/75での末端は、堅く-折り畳まれた部位に位置することが明らかになっている (Hoeprich他, J Biol.Chem., 277(23): 20794-20803 (2002))。リボザイムを有するキメラpRNAは、必要ならば、ダイマー、トリマー又はヘキサマー複合体の構築のための好適な右手及び左手ループを含む。2つのシス-作用リボザイムは、(Hoeprich他, Gene Therapy, 10(15): 1258-1267 (2003)) で報告したように、pRN及びリボザイムに隣接するように付加される。カセット全体は、カセットがin vivoで発現される場合には、好ましくは、in vitro転写のためのT7プロモーター又はCMVプロモーターで制御されている。
【０１８４】
ヘアピンリボザイム
ヘアピンリボザイム (Chowrira他, Nature, 354: 320-322 (1991) 及びOjwang他, Proc Natl Acad Sci U S A, 89: 10802-10806 (1992)) もまた、標的に対する2つの相補的アーム塩基対の形成によってRNAを標的とするが、その構造及び標的配列の要件は、非常に制限的である。ヘアピンリボザイムの配列要件は、BN*GUC（ここで、Bは、アデニン以外の任意のヌクレオチドである）である。必要なリボザイムのヘアピンは、リボザイムの残りの部分から、標的結合アームの1つ分だけ離れているので、アームは、通常、リボザイム活性を合理的に維持するために4つのヌクレオチドだけであるようにつくられる。しかしながら、一般的に、特定のヘアピンリボザイムを運ぶキメラpRNAモノマーの構築のための方法及び手法は、ハンマーヘッド型リボザイムに使用されるものと類似している。
【０１８５】
アンチセンスRNA
アンチセンスRNAは、mRNAに相補的な単一鎖RNA分子である。アンチセンスRNAは、細胞中の遺伝子発現を阻害できることを示している (Coleman他, Nature, 315: 601-603 (1985) 及びKnecht他, Science, 236: 1081-1086 (1987))。我々は、少なくとも120の非-特異的塩基が、そのフォールディング及び機能を阻害することなく、pRNAの3'末端から伸張され得ることを先に証明した (Hoeprich他, Gene Therapy, 10(15): 1258-1267 (2003) 及びShu他, J Nanosci andNanotech (JNN), 4: 295-302 (2003))。かかる付加は、ビオチン、pCp、DIG、SH基及びリン酸塩によるpRNAの末端標識を含んだ。我々の結果は、117-塩基pRNAが、その3'末端から伸張された塩基の各々を折り畳んだことを示した。この発見は、単一鎖であるアンチセンスRNAを運ぶキメラpRNAモノマーの構築に適用されるだろう。遺伝子機能を妨害するために使用される全てのアンチセンスRNAは、pRNAの3'末端に配置される。
【０１８６】
siRNA
近年、転写後遺伝子サイレンシング及びRNA干渉は、二重鎖RNAを用いて様々な生物において幅広く研究されている (McCaffrey他, Nature, 418: 38-39 (2002) 及びZilberman他, Science, 299: 716-719 (2003))。このRNAは、19〜25塩基の小干渉二重鎖RNA（siRNA）にプロセシングされる (Coburn他, J Virol, 76: 9225-9231 (2003) 及びElbashir他, Nature, 411: 494-498 (2001))。これは、標的mRNAの開裂に必要とされるサイレンシング酵素的複合体の形成のための指針として働く (Hutvagner他, Science, 297: 2056-2060 (2002) 及びVolpe他, Science, 297: 1833-1837 (2002))。これらのsiRNAは、具体的には、siRNAと同一の配列を有する標的mRNAの発現を抑制する。転写後遺伝子サイレンシング及びRNA干渉の詳細なメカニズムが解明され続けているが、siRNAを採用する特定の遺伝子発現の選択的阻害のためのこの強力な新しい技術は、癌及びウイルス感染症の治療において大きな展望を示した (Carmichael, Nature, 418: 379-380 (2002); Li他, Science, 296: 1319-1321 (2002); 及びVarambally他, Nature, 419: 624-629 (2002))。
【０１８７】
我々は、pRNAの5'及び3'末端が対になって二重鎖ヘリックスを形成することを確認した (Hoeprich他, J. Biol. Chem., 277(23): 20794-20803 (2002) 及びZhang他, Virology, 201: 77-85 (1994))。30超塩基を有するこの二重鎖部位は、独立ドメインである。相補的修飾研究は、一次配列の変更が、2つの鎖が対を形成する限り、pRNA構造及びフォールディングに影響を与えないことを明らかにした。我々は、この二重鎖部位の、他の二重鎖RNAとの置換が、pRNAダイマー、トリマー及びヘキサマーの形成を妨害しない、ことを確認した。従って、この部位は、任意の二重鎖、19〜25塩基siRNAによって置換され得た。siRNAの2つの鎖の両末端に連結するためのループを有するヘアピンsiRNAは、遺伝子サイレンシングにおいて機能し続けたことが、近年、報告された (Brummelkamp他, Science, 296: 550-553 (2002); McManus他, RNA., 8: 842-850 (2002); Murchie他, Mol CeIl, 1: 873-881 (1998); Paddison他, Genes Dev., 16: 948-958 (2002); Paul他, Nat Biotechnol, 20: 505-508 (2002); Sui他, Proc Natl Acad Sd USA, 99: 5515-5520 (2002); 及びYu他, Proc Natl Acad Sci USA, 99: 6047-6052 (2002))。このことは、末端にあるsiRNAを連結ループの部位に連結できることを示唆している。
【０１８８】
受容体-又は分子-結合アプタマー
特定の標的に結合するRNA分子のin vitro選択は、標的分子に特異的に結合するRNA分子、いわゆる「アプタマー」を得るための、ランダム化RNAプールのスクリーニングのための強力なツールとなっている。ランダムRNA配列を含むライブラリーから始めて、in vitro進化法（例えば、SELEX, 試験管内人工進化法（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment））は、特定の受容体又はリガンドに高いアフィニティで効率的に結合するRNA分子の選択を可能にする (Ciesiolka他, RNA, 1: 538-550 (1995) 及びKlug他, Molecular Biology Reports, 20: 97-107 (1994))。この方法を用いて、標的、例えば、有機化合物、核酸、ペプシド、タンパク質及び受容体、の多くの種類を特異的に認識する多数のアプタマーが得られている。
【０１８９】
SELEX系は、強力であるが、その欠点の1つは、得られたRNAアプタマーの中には低効率で基質に結合するものがあることである。かかる低い結果は、ランダムであるよりも予め設定された値（pre-set values）である配列を有する2つのプライマーの使用によって部分的に起こる。我々は、安定な構造及びその標的に対する高いアフィニティを有するRNAアプタマーを選別するために、SELEXを用いて本明細書に記載の独自の系を開発した。この系は、高い特異性及び効率で細胞表面受容体に結合するRNAアプタマーを単離するために使用できる。かかるRNAアプタマーは、次いで、pRNAの元の5'/3'末端への連結を介して、及びpRNAによってエスコートされるハンマーヘッド型リボザイムの構築のために使用されるものと類似の方法の使用によって、pRNAに取り込まれる (Hoeprich他, Gene Therapy, 10(15): 1258-1267 (2003))。我々は、HIVのCD4及びgpl20に結合するアプタマーを含むキメラpRNAを成功的に構築した。これらのアプタマーの各々は、環状に並べ替えられたpRNAモノマーへの個々の取り込みについて選択されるだろう。
【０１９０】
実施例 9 キメラpRNAを形成するためのビオチン/ストレプトアビジンの相互作用
我々は、RNAの5'又は3'末端のいずれかにビオチンを付加する方法を開発した。5'末端RNA標識については、我々は、RNA転写の開始のための基質としてビオチン-アデノシン1リン酸を利用するT7 RNAポリメラーゼ用の特定プロモーターを利用する (Huang, Nucleic Acids Res, 31: e8 (2003))。3'末端RNA標識については、pRNA複合体を、pRNAの3'末端に相補的である合成ビオチン化DNAオリゴにアニールした。この方法では、以下の例示的粒子が、送達可能な複合体に取り込まれ得る：
1) ビオチン-ストレプトアビジン相互作用によってRNA複合体に取り込まれた、50〜200 nmのサイズを有する栄光ストレプトアビジンビーズ；
2) 蛍光及びビオチンで標識され、次いでストレプトアビジン分子によってRNA複合体に連結され、精製された、phi29プロカプシド (40 nm)；
3) ストレプトアビジン分子によってRNA複合体に連結され、次いで精製された、ビオチン化GFP（緑蛍光タンパク質）；及び
4) ビオチン-ストレプトアビジン相互作用によってRNA複合体に取り込まれた、5〜10 nmのサイズを有するストレプトアビジンのナノ金粒子。加えて、RNAは、蛍光、例えば、Bodipy TMR-C5による5'-標識 (Molecular Probe)で直接標識され得る (Homann他, Bioorg. Med Client, 9: 2571-2580 (2001))。キメラpRNAの内在化は、蛍光顕微鏡又は共焦点顕微鏡のいずれかによって調べられる。あるいは、細胞は、フローサイトメトリーによって調べられる。金粒子については、結果は電子顕微鏡によって分析される。
【０１９１】
実施例 10 標的HIV-感染細胞
CD4は、あるT-ヘルパーリンパ球の表面に提示される受容体であり、よって、送達可能なRNA複合体の細胞への特異的送達のための独自の標的である。我々は、CD4（及びgp120）に結合するRNAアプタマーを有するキメラpRNA A-b'及びB-a'モノマーを構築した。A-b'ループを有するこれらのキメラpRNAキメラは、pRNA B-a'を有するダイマーを効率的に形成する。
【０１９２】
このキメラpRNAは、pRNAダイマー、トリマー又はヘキサマーのサブユニットの1つに取り込まれる。CD4-結合RNAアプタマーを運ぶpRNAマルチマーは、CD4との相互作用及びエンドサイトーシスを介してCD4細胞に選択的に入るだろう。細胞CCR5のためにmRNAを特異的に開裂するリボザイム又はsiRNA (Feng他, Virology, 276: 271-278 (2003) 及びGoila他, FEBS, 436: 233-238 (2003))、又はgag、tatのためのHIV mRNAs (Jackson他, Biochem Biophys Res Commun, 245: 81-84 (2003) 及びWyszko他, Intermational Journal of Biological Macromolecules, 28: 373-380 (2003))、rev、env、LTR (Bramlage他. Nucleic Acids Res., 28: 4059-4067 (2003))、又はゲノムRNAの他の位置は、pRNA多価性複合体の他のサブユニットに融合される。ヌクレオチド誘導体は、pRNAに取り込まれて、RNase消化に抵抗性を与えることによってRNAの安定性を亢進できる。これらのキメラpRNAは、多数のCD4-陽性細胞株においてHIV複製を阻害するその有効性を評価することができる（図22）。CD4-結合アプタマーを有する蛍光的に標識されたpRNAを用いて、我々は、このRNA複合体がTリンパ球のCD4に結合することを見出した。
【０１９３】
実施例 11 RNAナノテクノロジーを用いて癌細胞に対する複数の治療分子の特異的送達のためのナノ粒子の制御可能な自己-集合：pRNA/siRNAキメラの使用
RNAナノテクノロジーを用いて、治療的siRNA及び受容体-結合RNAアプタマーは、phi29のモーターの個々のpRNAに設計した。治療的分子を有するRNA構築単位は、次いで、設計された右及び左の連結RNAループの相互作用によってトリマーに構築した。受容体-結合アプタマー又は他のリガンドを含む遊離のナノスケールの粒子のインキュベーションは、細胞への三価の治療的分子の結合及び同時-侵入（co-entry）、次いで、癌細胞及び白血病モデルリンパ球のアポトーシスの調節をもたらした。このような抗原性のない20-nmの粒子の使用は、慢性疾患の反復された長期間治療に展望を与える。
【０１９４】
導入
バクテリオファージphi29がコードする小RNAは、プロカプシドへのDNAのパッケージングに独特の役割を果たし、必須の役割を演じる (Guo他, Science 19S7; 236: 690-694)。
このRNAは、パッケージングRNA又は「pRNA」と称される。pRNAは、左-及び右-手ループの2つの連結の塩基対形成を介して、ハンド・イン・ハンド相互作用により20 nmのサイズのダイマー、トリマー及びヘキサマーを形成する (Chen他, RNA 1999; 5: 805-818; Shu他, JNanosci and Nanotech (JNN) 2003; 5: 295-302; Guo他, Mol. Cell. 1998; 2: 149-155; Zhang他, Mol. Cell. 1998; 2: 141-147)。
【０１９５】
pRNA構築単位の三3次元構造のコンピュータモデルは、光-アフィニティ架橋由来の実験データ (Garver他, RNA. 1997; 3: 1068-1079) 及び化学修飾干渉 (Trottier他, RNA 2000; 5: 1257-1266; Mat-Arip他, J Biol Chem 2001; 276: 32575-32584)、相補的修飾 (Zhang他, RNA 1995; 7: 1041-1050; Zhang他, RNA 1997; 3: 315-322)、ヌクレアーゼプロービング (Reid他, J Biol Chem 1994, 269, 5157-5162)、オリゴ標的 (Zhang他, Virology 1995; 211: 568-576)、競合アッセイ (Trottier他, J. Virol. 1997; 71: 487-494; Trottier他, J. Virol. 1996; 70:55-61) 並びにcryo-原子間力顕微鏡 (Trottier他, RNA 2000, 6, 1257-1266; Mat-Arip他, J Biol Chem 2001, 276, 32575-32584; Chen他, J Biol Chem 2000; 275(23): 17510-17516) に基いて、構築されている (Hoeprich他, J Biol. Chem. 2002; 277(23): 20794-20803)。コネクタ結晶構造とドッキングするpRNAヘキサマーは、pRNAの3D構造に関する入手可能な生物化学的、遺伝子的及び物理的データと強力に一致することが明らかになった (Hoeprich他, J Biol. Chem. 2002; 277(23); 20794-20803)。
【０１９６】
近年、我々は、ロッド、三角形、テトラマー及びサイズが数ミクロンまでの2次元アレイを含む様々な構造及び形状をつくるために、pRNAの構築単位のボトムアップ型（bottom-up）集合特性を使用した (Shu 他., J Nanosci andNanotech (JNN) 2003; 3: 295-302; Shu他, Nano Letters 2004; 4: 1717-1724)。このようなプロセスは、プログラムされたヘリックス部位及びループの相互作用の結果として生じる。この方法によって製造されるアレイは、塩濃度、温度及びpHの幅広い範囲を含む、様々な環境的ストレスに抵抗性であることが示された (Shu 他., J Nanosci and Nanotech (JNN) 2003; 3: 295-302; Shu他, Nano Letters 2004; 4: 1717-1724)。
【０１９７】
117-ヌクレオチドpRNAモノマーは、2つの機能性ドメインを含む：分子間-相互作用ドメイン及び二重鎖ヘリックス状DNA-パッケージングドメイン（図23）。分子間-相互作用ドメインは、pRNA分子の中央部に位置し、ボトム-アップ型集合のために設計された2つの左及び右ループ連結を含むが、二重鎖ヘリックス状DNA-パッケージングドメインは、5'/3'塩基対末端に位置する。入手可能なデータは、これらの2つのドメインが互いに別々に折り畳むことを示唆する。構造的研究は、pRNAの5'及び3'末端が近接しており、二重鎖ヘリックスを形成するように対となる、ことを確認した (Hoeprich他, J Biol. Chem. 2002; 277(23):20794-20803; Shu他, Nano Letters 2004; 4: 1717-1724)。この二重鎖部位（30超の塩基を有する）は、独立したドメインであり、ヌクレオチド23番の前の5'末端及びヌクレオチド97番の後の3'末端でのヌクレオチドの付加又は欠損は、プロカプシド-結合ドメインの正確なフォールディングに影響を与えない。相補的修飾研究は、ヘリックスの任意のヌクレオチドの一次配列の変更は、2つの鎖が対となっている場合には、pRNA構造及びフォールディングに影響を与えない、ことを明らかにした。
【０１９８】
多くの研究は、siRNAが二重鎖（ds）RNAヘリックスであることを示した (Li他, Science 2002; 296: 1319-1321; Brummelkamp他, Science 2002; 296: 550-553; Jacque他, Nature 2002; 418: 435-438; Carmich他, Nature 2002, 418, 379-380; Elbashir他, Nature 2001; 418: 494-498)。pRNAヘリックス部位を二重鎖siRNAと置き換えることができるか否かを試験するために、様々なキメラpRNAを設計した。この報告のために、我々は、pRNAの5'/3'ヘリックス部位とsiRNAとの置換、又はこの部位におけるCD4-結合RNAアプタマー、葉酸又は他の化学成分の結合が、pRNA及びsiRNAのフォールディング、及び挿入された部分の機能を妨害せず、トリマーの形成に影響を与えなかった、ことを見出した。トリマーに設計された3つの試薬が、CD4-結合RNAアプタマーを有するキメラpRNA構築単位及び細胞表面受容体と結合した葉酸の内の1つによって案内される、特定の癌細胞に同時に送達された、ことを見出した。
【０１９９】
30〜40 nmのサイズを有するナノ粒子を使用できることは、短い保持時間に起因するin vivoでの小分子の短い半減期の問題を解決する。加えて、細胞にほとんど送達されない100 nm超の分子を有する問題が解決される。RNAが、タンパク質と複合化されるときに非常に低い又は検出不可能な免疫原性レベルを有することは科学界では知られている (Goldsby他, In Immunology, 第5版; W. H. Freeman and Company: New York, 2002; 57-61頁; Madaio他, J. Immunol. 1984; 732: 872-876)。我々の系は、タンパク質又はペプチドを含まず、よって免疫応答を避けるためのこのようなタンパク質無しのナノ粒子の使用は、慢性疾患の治療における長期間の投与を可能にするだろう。
【０２００】
材料及び方法
RNA構築単位及びpRNAトリマーのボトムアップ型集合体の設計
RNAは、先に記載のようにして (Shu他, J Nanosci and Nanotech (JNN) 2003; 3: 295-302) 調製した。DNAオリゴは、所望の配列で合成し、PCRによる二重鎖DNAを製造するために使用した。T7プロモーターを含むDNA産物は、プラスミドにクローン化し、直接的in vitro転写の基質として使用した。T7 RNAポリメラーゼによって製造した全てのpRNAキメラは、5'-リン酸を除くためにウシ腸アルカリホスファターゼにより処理した (Kim他, Nat. Biotechnol. 2004; 22: 321-325)。
【０２０１】
pRNA/siRNA(GFP)、pRNA/siRNA (ルシフェラーゼ) 及びpRNA/siRNA (サバイビン) を設計するために、pRNAの5'/3'対末端のヘリックス部位は、ヌクレオチド29番及び91番に結合する二重鎖siRNAと置き換えた。CD4-結合アプタマーを有するキメラpRNAを設計するために、CD4結合のためのRNAアプタマーの配列 (Kraus他, J Immunol. 1998; 160: 5209-5212) は、pRNAの5'及び3'末端に結合した。pRNAは、堅く折り畳まれた部位に位置するpRNAヌクレオチド71/75に再配置された原始的5'/3'-末端を有する、勘定的に並べ替えられた形成に再構成した (Hoeprich他, J Biol. Chem. 2002, 277(23); 20794-20803)。このCD4-結合アプタマーを有するキメラpRNAは、好適な右及び左ループ、例えば、トリマーの構築のための、pRNA A-b'用のループA及びb'を保持した。
【０２０２】
構築されたRNAナノ粒子の物理的性質
構築されたRNAナノ粒子の構造及び純度は、以下によって確認した：1) 1O mMマグネシウムを含み、尿素無しの8%天然ポリアクリルアミドゲル；2) 10 mMマグネシウムによる5〜20%ショ糖グラディエントによる沈降；及び3) AFM画像 (Trottier他, RNA 2000; 6: 1257-1266; Mat-Arip他, J Biol Chem 2001;276: 32575-32584; Chen他, J Biol Chem 2000; 275(23): 17510-17516)。
【０２０３】
細胞に対する、設計されたキメラpRNA構築単位の機能性アッセイ
proB FL5.12A細胞については、10% FBSを含む500 μl RPMIに107細胞を懸濁した。D1細胞については、細胞を低浸透緩衝剤に再-懸濁した。エレクトロポレーションは、Electro Square Porator ECM 830を用いて4 mmキュベットで行った。FL5.12A細胞は、200V、3パルスで電気穿孔し、D1細胞は、180V、1パルスで電気穿孔した。氷上での短いインキュベーションの後、サイトカインを含む10 mlの完全培地で細胞を再-懸濁し、37℃、5% CO2で2時間インキュベートした。細胞生存は、Mirus試薬によるトランスフェクションの前にTrypan Blue排除アッセイによって顕微鏡的に測定した。 106細胞をRNA構築物 (10O nM) と共に終夜インキュベートし、ハンクス平衡塩溶液で2回洗浄し、サイトカインを含む又は含まない培地に再-懸濁し、37℃、5% CO2で更に24〜48時間インキュベートした。
【０２０４】
ショウジョウバエS2細胞、GFP-発現プラスミドpMT-GFP及び様々なsiRNAsを、播種24時間後にセルフェクチン (Invitrogen) を用いて、24-ウェルプイレートで細胞にコトランスフェクトした。GFPの発現は、トランスフェクションの24時間後に0.5 mMのCuSO4で終夜のインキュベーションによって誘導した。GFP発現の阻害は、蛍光顕微鏡で観察した。
【０２０５】
構築されたRNAナノ粒子の細胞への送達の機能性アッセイ
p53-/-マウスから単離されたCD4-CD8-マウス(Kim他, J Immunol Methods 2003; 274: 111-184)胸腺細胞から樹立されたIL-7-依存的D1細胞株に関して、当該細胞は、10% FBS (ウシ胎児血清）及びペニシリン及びストレプトマイシンを50 U.I/ml、0.1% β-メルカプトエタノールと共にRPMI1640を含む完全な培地中で増殖させ、50 ng/ml IL-7.FL5.12A細胞は、2 ng/ml IL-3で補充した完全培地中で増殖させた。D1細胞中でのCD4の過剰発現のために、L3T4 (マウスCD4) インサートは、pcDNA 6/V5-HisB (Invitrogen) にサブクローン化した。D1細胞をエレクトロポレーションによってDNAでトランスフェクトした。安定細胞株は、抗生物質耐性によって選択した。高レベルのCD4を発現するD1-CD4hi細胞は、蛍光-活性細胞分類によって更に単離した。D1-CD4hi細胞株は、50 ng/ml IL-7及びブラスチシジン HCl (2.5 mg/ml) で補充した完全培地で維持した。
【０２０６】
葉酸含有トリマーの送達をアッセイするために、ヒト鼻咽腔表皮癌KB細胞株を5% CO2インキュベーター中で、10%FBS (ウシ胎児血清)、ペニシリン及びストレプトマイシンで補充した葉酸無しのRPMI1640培地 (Gibco BRL) 中で維持した。細胞は単層に増殖し、血清は、細胞増殖のための内因性葉酸の通常の捕捉を与えた。細胞力価は、トリパンブルー染色の後に血球計算板により決定した。
【０２０７】
pRNA(A-b')/葉酸、pRNA(B-e')/siRNA(GFP) 及びpRNA(E-a')/siRNA (ホタル)を同一濃度で混合することによって、トリマー型RNA複合体を調製した。次いで、トリマー型複合体は、ゲルから精製し、KB細胞に加え、RNAの結合及び侵入を可能にした。RPMI培地を洗浄した後、細胞を回収し、二重レポーターアッセイ（Promega）に供した。
【０２０８】
キメラpRNA複合体のD1細胞への送達をアッセイするために、CD4hi、CD4l0及びCD4neg細胞を96-ウェル平底プレートに播いた。5 x104細胞/試料を1O mM Mg2+を含むPBSで1回洗浄した。1O mM Mg2+及び400 ng (100 nM) のRNA複合体を含む20 μlのPBS中で、37℃で30分間、細胞をインキュベートした。インキュベーション後に、サイトカインを含む又は含まない完全な培地を100 μlの最終体積に加え、細胞を37℃、5% CO2で、24〜48時間インキュベートした。トリパンブルー排除アッセイによって細胞生存性を測定した。
【０２０９】
キメラpRNA/siRNAプロセシング
細胞溶解物によるRNAのプロセシングは、Bernstein他 (Bernstein 他., Nature 2001; 409 (6818): 363-366)によって使用される方法に従って行った。
【０２１０】
ダイサーによるRNAのプロセシングのために、精製組換え酵素は、Gene Therapy Systems系から購入した。
【０２１１】
共焦点顕微鏡
ポリ-L-リジン (200 μg/ml) でコートされたカバースリップは、サイトカインを補充した完全培地で増殖した細胞で終夜インキュベートした。CD4-陰性プロ-B細胞株F15.12A (CD4neg)、プロ-T細胞株D1 (CD4neg) 及びD1-CD過剰発現細胞株 (CD4hi) は、キメラpRNAトリマーでインキュベートした。トリマー複合体は、1O mM Mg2+の存在下、pRNA(A-b')/アプタマー(CD4)、pRNA(B-e')/FITC及びpRNA(E-a')/ローダミンの同一モーラーRNAを含む混合物を用いてゲルから精製した。カバースリップは、4%パラホルムアルデヒドで固定し、1O mM Mg2+を含むPBSで洗浄し、Gel/MountT (Biomeda, CA) に埋め込んだ。画像は、Zeiss焦点顕微鏡LSM 510 NLOで撮った。
【０２１２】
In vivo動物試験
5週齢の雄性胸腺欠損ヌードマウス (Harlan Sprague Dawley) を病原体無しの環境で飼育した。動物を無作為に実験群に帰属した（n=8）。細胞を注射の1週間前に、抗生物質無しの培地で維持した。注射の第1日目に、細胞をPBSで2回濯ぎ、トリプシン消化によって回収する前の3時間、ダイマー型pRNA複合体と共に37℃でインキュベートした。各マウスの注射のために、2.5x105細胞の0.1 ml培地を使用した。前肢の右脇毛に細胞を皮下的に接種した。異種移植片が見えると、そのサイズを、二次元的に外から腫瘍を測定することによって週に2回測定した。体積は以下の式によって計算した：V=(LxW2) x 0.5（ここで、Lは長さであり、Wは異種移植片の幅である）。
【０２１３】
結果
RNA構築単位の命名：設計されたRNA構築単位を用いてボトムアップ型集合の記載を簡単にするために、pRNAの右手ループを表すために大文字を使用し、左手ループを表すために小文字を用いるだろう（図23）。大文字及び小文字の同一の文字は、ループ/ループ相互作用の相補的配列を示すが、異なった文字は、非-相補的ループを示す。例えば、pRNA A-b'は、右ループA (5'G45G46A47C48) がpRNA E-a'の左ループa' (3'C85C84U83G82) に相補的であるpRNAを示す (Chen他, RNA 1999; 5: 805-818参照)。「pRNA/アプタマー(CD4)」の表示は、CD4に結合するアプタマーを有するpRNAキメラを意味し、一方、「pRNA/siRNA(サバイビン)」は、抗-アポトーシス因子であるサバイビンをターゲッティングするsiRNAを有するpRNAキメラを示す。
【０２１４】
1. 治療分子の送達のためのビヒクルとしてトリマーの構築のための構築単位としてのキメラRNAの設計
第1に、受容体-結合アプタマーを有するキメラpRNA構築単位を設計する可能性を試験した。治療的ビヒクルの細胞への特異的送達のために、細胞表面マーカーを認識できる化学部分を取り込む必要がある。抗体及びファージ-提示ペプチドとは対照的に、RNAアプタマーは、免疫応答の誘導を避ける利点を提供するので、魅力的な代替物である (Goldsby他， Antigens. In Immunology, 第5版; W. H. Freeman and Company: New York, 2002; 57-61頁; Madaio他, J Immunol. 1984; 732: 872-876)。特異的受容体に高いアフィニティで選択的に結合するRNAアプタマーを入手する強力な方法は、ランダムRNA配列を含むライブラリーからのRNA分子のin vitroスクリーニングに基いている (Ellington他, Nature 1990; 345: 818-822; Tuerk他, Science 1990; 249: 505-510)。SELEX法を用いて、特定の細胞表面受容体、例えばCD4を特異的に認識する多数のアプタマーを入手した (Kraus他, J Immunol. 1998; 16O (11): 5209-5212)。1つのCD4-結合アプタマーは、その元のの5'/3'末端への結合を介してpRNAに取り込んだ（図23）。pRNAベクターは、元のpRNA配列の残基71及び残基75にそれぞれ再配置された原始的5'及び3'と共に、環状に並べ替えられた形態に設計し、再構築した。71/75末端は、エキソヌクレアーゼ分解 (Hoeprich他, Gene Therapy 2003; 10(15): 1258-1267) から末端を埋めて保護する、堅く-折り畳まれた部位 (Hoeprich他, J Biol. Chem. 2002; 277(23): 20794-20803) に位置することが明らかになった。このアプタマーを用いるキメラpRNA構築単位はまた、トリマー型複合体の設計及び構築のために必要とされる好適な右及び左ループを含んだ。
【０２１５】
pRNA/アプタマーキメラが特定の細胞に結合できるか否かを試験するために、pRNA/アプタマー(CD4)をFITCで標識し、蛍光顕微鏡によってCD4受容体に結合するその能力をアッセイした。CD4-過剰発現するように設計された胸腺T細胞株、D1 (CD4hi) (以下、参照)、及び文献 （Kim他, J Immunol Methods 2003 ;274: 111-184) 由来の、CD4陰性親株、D1 (CD4neg) を用いる結合アッセイは、キメラpRNA-FITC/アプタマー(CD4)がCD4hi T細胞に効率的に結合できることを明らかにした。結合及び内在化は、「切断」法を用いて共焦点顕微鏡によって観察した。共焦点顕微鏡画像中のT細胞の層は、緑色の円として現れ、FITC-標識キメラpRNA/アプタマー(CD4)の球面のT細胞への結合を確認した（図2-II）。アプタマーの結合特異性は、CD4受容体-陰性D1細胞（図24E、F、G、H、P）、CD4アプタマーを含まない蛍光pRNAダイマー又はpRNAトリマー（非表示）、及びRNAを含まない蛍光色素のみ（非表示）を含む、様々な対照を用いて試験した−これらの全ては、最小の蛍光検出を生じた。CD4hi及びCD4negは、トランスフェリン-テキサスレッド陽性対照を内在化した。これは、細胞が膜-結合分子のエンドサイトーシスに好適であることを示唆する（図24N)。
【０２１６】
次いで、受容体-結合葉酸を担持するキメラpRNA構築単位の設計も試験した。葉酸受容体は、様々な種類の腫瘍で過剰発現し、癌細胞に特異的に治療薬を送達するために使用されている (Zhao他, Adv. Drug Deliv. Rev. 2004; 56: 1193-1204; Lu他, Adv. Drug Deliv. Rev. 2002; 54: 15-693)。従って、葉酸受容体への葉酸-複合pRNAナノ粒子の選択的標的は、癌細胞をターゲッティングする有用な方法である。pRNA及び葉酸（葉酸-pRNA）を担持するキメラRNAは、pRNAの5'末端に葉酸を共有結合的に連結することによって設計した。葉酸-pRNAの特異的細胞結合は、FITCで標識された葉酸-pRNAを用いてフローサイトメトリーによって証明した。葉酸受容体-陽性ヒト鼻咽腔表皮癌細胞をこの二重標識pRNAでインキュベートしたとき、細胞のほとんど全てはFITC-陽性であった。遊離の葉酸をインキュベーション緩衝剤に加えることは、FITC陽性細胞を1%未満に減少させた。このことは、pRNAの細胞への結合が特異的であり、葉酸-依存的であることを示唆している。対照として、葉酸複合体無しのFITC-標識pRNAは、結合を示さなかった。
【０２１７】
2. キメラトリマー形成におけるハンド・イン・ハンドループの配列要件の決定
左-及び右-手ループ内の各々の野生型pRNAの塩基45〜48及び82〜85は、pRNA/pRNA相互作用にかかわることが見出された (Guo他, Mol. Cell. 1998; 2: 149-155; Trottier他, RNA 2000; 6: 1257-1266)。三次元相互作用を考慮することなく、場合によっては、相互作用するループ間の2つのG/C対のみは、pRNAマルチマーの形成を許容した。4つのヌクレオチド全てが対を形成する場合には、少なくとも1つのG/C対は必要とされた。最適なマルチマー形成を許容する2つのループ間の塩基対形成の最大数は、5であった。右-及び左-手ループ内のpRNA/pRNA相互作用に必要とされるヌクレオチドの最小数は、各々、5及び3であった。我々の結果は、75-ヌクレオチドRNA部分、ヌクレオチド23〜97が、pRNAトリマー形成におけるRNA/RNA相互作用に関連する自己-折り畳み型の独立ドメインであるが、ヌクレオチド1〜22及び98〜120は、RNA/RNA相互作用に不要である、ことを示唆する。
【０２１８】
連結ループ/ループ相互作用によるpRNAトリマー形成のメカニズムは、受容体結合RNAアプタマー及び/又は治療的siRNAを担持するキメラpRNAのトリマーの構造を利用した（図23）。個々のキメラpRNA構築単位は、1つの娘RNA分子、例えばsiRNA又は受容体-結合アプタマーを運ぶように設計した。各構築単位は他の構築単位と相互作用するために、特定の右又は左ループ、例えばA-b' (右-左) を有するように意図的に設計した。pRNAの好適なフォールディングの可能性及びそのトリマー形成能力を試験した。個々のキメラpRNAと、好適な連結ループを有する対応パートナーとの混合は、ゲル電気泳動、AFM画像及びショ糖グラディエント沈降によって立証されるように、所望のトリマーの効率的な形成をもたらした（図25）。モノマーの構築単位はより速く天然ゲル中を移動したが、3つのキメラpRNA (A-b')、(B-e') 及び (E-a') (図23-III) からなるトリマー複合体は、天然ゲル中をゆっくりと移動した (図25A)。このことは、5'/3'ヘリックスのds-siRNAとの置換、又は5'/3'末端のCD4-結合アプタマーへの結合にもかかわらず、RNAトリマーがモノマー型構築単位から得られた、ことを示唆する。pRNAキメラの正確なフォールディングはまた、pRNAキメラの正確なフォールディングが、pRNA構築部位のphi29プロカプシドへの競合的結合を保証し、phi29複製の間にphi29 DNAパッケージングを妨害するという発見に基いて、phi29 in vitro集合体阻害アッセイによって確認した (Guo他, Science 1987; 236: 690-694; Guo他, Mol. Cell. 1998; 2: 149-155)。
【０２１９】
3. siRNAを担持するpRNAキメラの構築のためのpRNAベクターの長さの要件の決定
先に記載したように、分子間相互作用ドメイン及びpRNAの二重鎖ヘリックスドメインは別々に折り畳む（図23）。ヘリックスドメインの任意の塩基の一次配列を変更することは、相補性が維持される限り、pRNA構造及びフォールディングに影響を与えない。追加の機能性RNA、例えばハンマーヘッド型リボザイムは、二重鎖ドメインに結合し、リボザイムの高い開裂効率をもたらした (Hoeprich他, Gene Therapy 2003; 70(15): 1258-1267)。siRNAが二重鎖RNAヘリックスであることを広い研究は明らかにした (Li他, Science 2002; 296: 1319-1321; Brummelkamp他, Science 2002; 296: 550-553; Jacque他, Nature 2002; 418: 435-438; Carmichael他, Nature 2002; 475: 379-380; Elbashir他, Nature 2001; 411L494-498)。pRNAヘリックス部位を二重鎖siRNAと置換できるか否かを試験し、及びいずれの構築体が遺伝子サイレンシング及びトリマー形成において最適な機能を有するかを決定するために、いくつかのキメラpRNA/siRNAを構築し、遺伝子サイレンシングにおけるその有効性を試験した。29-bp siRNAは、pRNAの塩基29/91又は21/99に連結した、これは、各々、pRNA/siRNA(GFP)29/91及びpRNA/siRNA(GFP)21/99を生じた。RNaseプロセシングのためのこの部位におけるフレキシビリティーを増加させるために3方接合部に2つの更なるウリジンを挿入した。蛍光顕微鏡によって明らかなように、キメラsiRNAは一時的なトランスフェクションによる細胞への導入後に、GFP発現に対して顕著な阻害を示した（図26）。この阻害は、siRNA配列に突然変異を有する変異体キメラpRNA/siRNAが阻害効果を示さなかったので、高い特異性であった。
【０２２０】
環状に並べ替えられたpRNAキメラも、siRNAを運ぶように構築した。これらの構築体については、その5'/3'末端は、堅く折り畳まれた部位内に再配置し、そのため、エキソヌクレアーゼによって容易に近づくことができないので、RNA全体の安定性を増加させる (Zhang他, Virology 1995; 207: 442-451)。元のpRNAの71/75又は29/30の位置に配置された新しい5'/3'末端を有する、2つの環状に並べ替えられたpRNA/siRNAキメラを構築し、pRNA/siRNA(GFP)71/75、及びpRNA/siRNA(GFP)29/30と名付けた。pRNA/siRNA(GFP)29/30は、pRNA/siRNA(GFP)21/99よりも低い効率でGFP発現を停止させたが、pRNA/siRNA(GFP)71/75は、GFP発現を停止させることに実質的に何の効果も有さなかった (図26)。
【０２２１】
加えて、ルシフェラーゼ用のsiRNAを担持するキメラpRNAも構築した（図23）。二重レポーターアッセイは、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ発現に影響を与えることなく、pRNA/siRNA (ホタル) がホタル・ルシフェラーゼタンパク質の発現を強力かつ特異的に阻害した、ことを証明した。特異的ノックダウンも、pRNA/siRNA (ウミシイタケ) で観察された。
【０２２２】
4. 1つの細胞への3つのpRNAキメラ構築単位の同時-送達を証明すること
a. 共焦点顕微鏡及びフローサイトメトリーによる同時-送達を証明すること。CD4は、Tリンパ球のある亜集団の表面に提示される受容体である。ヘルパーT細胞において、CD4は、過剰発現される場合を除いて、通常、エンドサイトーシスに関連しない (Pelchen-Matthews他, J. Exp. Med. 1991; 173: 575-587)。その成長がIL-7に依拠するネズミ胸腺Tリンパ球細胞数D1 (Kim他, J Immunol Methods 2003; 274: 177-184) は、CD4を介する特異的遺伝子送達の効果を試験するモデル系として使用した。D1細胞は、最小限にCD4を発現する未成熟胸腺細胞であるので、我々は、L3T4 (マウスCD4) を含む哺乳動物の発現ベクターの存在下で、低調緩衝剤中でそれらを電気穿孔することによってD1細胞中でネズミCD4を過剰発現させた。抗生物質の選択は、集合を選別するために使用し、高レベルのCD4（CD4hi）を発現した細胞は、更に蛍光-活性化細胞分類法（FACS）によって選択した。結果として、CD4hi細胞の99%超がCD4受容体を発現した。
【０２２３】
このRNAナノ粒子が複数の治療分子を同時にかつ特異的に送達するビヒクルとして働くことができたか否かを試験するために、pRNA(A-b')/アプタマー(CD4)、pRNA(B-e')/FITC及びpRNA(E-a')/ローダミンからなるトリマー型複合体 (図23、III-C) を構築し、共焦点顕微鏡を用いる選択法によってアッセイした (図24)。トリマーの結合、及びCD4結合を介する細胞への3つのキメラ構築単位の同時-侵入は、CD4hi細胞内の蛍光の検出によって証明した (図24、A-D及び1-L))。蛍光はCD4neg細胞では観察されなかったので、かかる結合及び侵入は特異的である（図24、E-H)。FITCフィルターを使用した場合には、緑蛍光標識は、CD4hiTリンパ球で見えた（図24A及びI)。ローダミンを使用した場合には、CD4hiTリンパ球内でFITC標識と重なる画像上に赤色の標識が見えた (図24B及びJ)。ローダミン画像との類似及びFITC画像の重なり (図24C及びK)、及び細胞の同じ位置での、各々FITC及びローダミンを示す緑及び赤の同時出現は、CD4-結合RNAアプタマーにより、特定の細胞への3つのキメラpRNA構築単位の同時-送達を確認した。これらの結果は、pRNA構築単位の全てがトリマーとして同時-送達され、phi29 pRNAトリマーが、複数の治療的成分の送達のための効果的ビヒクルとして働くことができる、ことを示している。
【０２２４】
構築されたトリマー内の3つの成分の同時-送達は、フローサイトメトリーを用いて細胞の大集団（30,000細胞）を分析することによって更に確認した (図 27-I)。CD4hiT細胞の90〜95%でのFITC及びローダミンの二重取り込みは、当該集団内のCD4-発現細胞のほとんど全てによるpRNAトリマーの成功的取り込みを示す。
【０２２５】
b. pRNA/siRNA(CD4)、pRNA/アプタマー(CD4)、及びpRNA/FITCを担持する同時-送達トリマーの機能性アッセイ
pRNAトリマーの3つの成分の同時-送達を証明してきたので（図24）、pRNAトリマーの取り込みが送達された成分によって介在される生物的効果をもたらすかどうかを試験する必要がある。
【０２２６】
CD4hi及びCD4neg D1 T細胞をインキュベートしたが、pRNA/siRNA(CD4)、pRNA/アプタマー(CD4)、及びpRNA/FITCの構築単位を含むpRNAトリマーを用いてトランスフェクトしなかった（図23）。トリマーに取り込まれたsiRNA(CD4)によるCD4発現の阻害は、PE-標識CD4抗体でCD4の表面発現を測定することによって証明した。CD4neg D1 細胞は、FITC取り込みを評価するときに、pRNAトリマーの検出可能な量を占めなかった。このことは、フローサイトメトリーによって確認した（データ非表示）。対照的に、pRNAトリマーで処理した85%のCD4hiD1細胞は、FITC陽性であった (図27-II)。このことは、CD4アプタマーが選択的にCD4-過剰発現細胞をターゲッティングし、pRNAトリマー複合体を送達することを証明している。
【０２２７】
次に、pRNAトリマー複合体によって送達されたsiRNA(CD4)がCD4表面発現のダウン-レギュレーションをもたらしたか否かを決定するために、CD4hiD1細胞をトリマーと24時間インキュベーし、次いでPEと複合化した抗-CD4抗体で染色し、フローサイトメトリー分析に供した。FITC-陽性及びFITC-陰性細胞を総細胞集団からゲート（gate）した (図27-II)。FITC-陰性細胞のCD4レベルは、42.56%であることを決定したが、FITC-陽性CD4hi D1細胞では17.8%に減少した。従って、FITC-陽性細胞 (CD4hi D1細胞の85%) においてのみならず、FITC-陰性細胞 (CD4hi D1細胞の15%) では、このような程度にCD4発現レベルが減少した。これらの発見は、pRNAトリマーを発現するCD4-発現細胞が、pRNA/FITCの取り込みによって示されるように内在化され、pRNA/siRNA(CD4) 複合体の同時-送達によって示されるようにCD4遺伝子を停止する点で機能し、FITC-陽性細胞のCD4タンパク質の発現の減少をもたらした、ことを示唆する。
【０２２８】
対照を有する広範な研究は、CD4 siRNAが組み込まれなかった場合には、pRNA複合体を含むCD4アプタマーは、CD4減少を起こさなかったので、図27-IIに見られるPE染色のCD4レベルの減少が、pRNAトリマーにおけるpRNA/siRNA(CD4)による遺伝子サイレンシングに特異的に起因し、CD4-結合によって誘発された内在化によって起こるのではない、ことを示した。
【０２２９】
c. CD4-結合RNAアプタマーによって案内される抗-又はプロ-アポトーシス因子をターゲッティングするsiRNAの同時-送達の機能性アッセイ
選択的な送達系の有効性を評価するために、抗-又はプロ-アポトーシス因子をターゲッティングするsiRNAを担持するRNAナノ粒子を設計した。サバイビンは、ほとんどの健常成人ヒト組織で発現されないがほとんどのヒト癌で発現される、抗-アポトーシス因子である (Grossman, Proc Natl Acad Sd 2001; 95: 635-640; Ambrosini他, J Biol Chem 1998; 273(18): 11177-11182; Choi他, Cancer Gene Ther. 2003; 70(2): 87-95)。pRNA/siRNA(サバイビン) を、癌細胞を殺傷する治療的手段としてアポトーシスを誘導する有用性を評価するために試験した。比較のために、例えばBAD及びBIMを有する、プロ-アポトーシス因子をターゲッティングするキメラpRNA/siRNAを設計し、試験した。アポトーシスを誘発する代わりにアポトーシスを抑制することによって、プロ-アポトーシスアッセイは、キメラpRNA複合体の送達が非-特異的毒性反応をつくったか否かについてより明確に決定できた。従来、2つのサイトカイン-依存的細胞株：IL-3依存的プロ-B細胞株 (FL5.12A) 及びCD4hi又はCD4neg非依存的D1細胞株、を採用した。IL-3又はIL-7の除去は、各々、D1又はFL5.12A細胞株のアポトーシスを促進し、FL5.12A細胞におけるBAD及びBIMの発現を誘発できた (Letai他, Cancer Cell 2002; 2: 183-192; Zong他, Genes D ev. 2001; 15: 1481-1486; Liu他, Cancer Res. 2002; 62: 2976-2981 ; Simoes-Wust他, Breast Cancer Res Treat. 2002; 76(2): 157-166; Luzi他, Cancer Gene Ther. 2003; 10(3): 201-208; Kumar他, Science 2002; 297 (5585): 1290-1291; Gibson他, Clin. Cancer Res 20005: 213-222; Klialed他, Nat. Rev. Immunol. 2002; 2: 817-830)。
【０２３０】
モノマー（トランスフェクションによる）、ダイマー（トランスフェクション又はインキュベーションによる）及びトリマー（インキュベーションによる）を含むRNAナノ粒子の広範な試験は、特異的結合、及びCD4-結合RNAアプタマーによって案内されたpRNA複合体の侵入を確認した。アネキシンV-ヨウ化プロピジウム（PI）二重-染色法、続いてフローサイトメトリーは、トランスフェクションがMCF-7細胞においてpRNA/siRNA (サバイビン) によるアポトーシス誘発を確認した12、24、48及び120時間後に行った（データ非表示）。pRNA/siRNA (サバイビン) 及びpRNA/siRNA (BIM) はその標的遺伝子を特異的かつ効率的に発現停止させた、ことが見出された。加えて、pRNA/siRNA (サバイビン) の導入は、癌細胞及びサイトカイン-依存的細胞を死滅させたが、pRNA/siRNA (BIM) の誘導は、IL-3の非存在下でIL-3-依存的細胞を死から保護した (図28)。
【０２３１】
d. 葉酸-pRNAによって案内されたトリマーにおけるpRNA/siRNA (ウミシイタケ) 又はpRNA/siRNA (ホタル) の同時-送達
RNAナノ粒子によって運ばれた特定の細胞への3成分の同時-送達は、pRNA/siRNA (ホタル又はウミシイタケ) を担持するトリマーを用いて更に証明した。二重レポーターアッセイを用いて、ルシフェラーゼの内の1つ、例えばウミシイタケ・ルシフェラーゼは、他のルシフェラーゼ、例えばホタル・ルシフェラーゼのための内部対照として活発に働くだろう。相互の内部対照は、可能性のある非-特異的効果を削除することによってsiRNAの特異的活性を明らかすることができた。ヒト鼻咽腔癌細胞発現葉酸受容体の当該細胞表面上でのトリマーとのインキュベーションによって、特定のルシフェラーゼ活性の減少は、二重アッセイ系によって証明され、このことは、葉酸-pRNAによって案内された細胞へのトリマーの特異的送達を確認した。
【０２３２】
5. 細胞成分又はダイサーによる個々の二重鎖siRNAへのキメラpRNA/siRNA複合体の作用、プロセシングのメカニズム
キメラpRNA/siRNA複合体は、遺伝子サイレンシングにおける特定のsiRNAと同様の役割の点で、細胞内で機能する。これは、重要な問題を提起する：すなわち、個々のsiRNAにキメラ複合体がプロセスされるか。この疑問を解決するために、キメラpRNA/siRNAモノマー又はトリマーキメラを細胞溶解物でインキュベートし (図 28A〜D)、変性ゲルによって分析した。この研究におけるモノマーは、ヌクレオチド29〜91から3方接合部に連結された29-ヌクレオチド二重鎖siRNAを担持した (図 28A)。2つの更なるウリジンは、ループのフォールディングのためのΔGを増加させることによってプロセシング効率を亢進するために、UUU分岐バルジに加えた。細胞溶解物によるインキュベーションは、29-ヌクレオチド二重鎖RNAに匹敵するサイズを有するバンドをもたらした（図28A、C、レーンc〜e)。このことは、単一鎖分岐バルジは、RNase消化に対して二重鎖RNAよりもより感受性であるので、予想されるように、RNaseによる細胞溶解物における開裂後にsiRNAが放出されることを示唆する。
【０２３３】
siRNAのプロセシングの原因となる細胞成分である精製したダイサーによる精製したトリマー型キメラのインキュベーションは、21-ヌクレオチド二重鎖siRNAに匹敵するサイズを有するバンドをもたらした。このことは、トリマーによって誘発される遺伝子サイレンシング効果が、細胞内でダイサーによるトリマーのプロセシングの後で実際にはsiRNAによって起こる、ことを示唆している。
【０２３４】
6. RNAナノ粒子によって運ばれる癌細胞への治療的pRNA/siRNA複合体の特異的送達を証明するための動物試験
葉酸で標識されたpRNA構築単位及びサバイビンsiRNAを運ぶpRNA構築単位を含むpRNA複合体の送達における特異性を試験するために、動物試験を行った。腫瘍形成を抑制するこのRNA複合体の可能性を胸腺欠損ヌードマウスで試験した。脇毛注射によるヌードマウスへの導入の前に、葉酸無し又は葉酸を含むキメラpRNA複合体で、ヒト鼻咽腔表皮癌細胞をインキュベートした。癌細胞のみを与えられたマウスは、3週間以内に腫瘍を発生したが、葉酸-pRNA及びpRNA/siRNA (サバイビン) を含むpRNA複合体で予め処理した癌細胞を与えられたマウス群は、腫瘍を発生しなかった（図29）。葉酸を含まない対照RNA複合体又はサバイビンsiRNAに変異を含むRNA複合体は、他のマウス群において腫瘍発生に影響を与えなかったので、腫瘍形成の阻害は特異的であった。
【０２３５】
考察
我々は、nmからミクロンまでの範囲の大きさを有するツイン、テトラマー、ロッド、三角形及びアレイを含む様々な構造及び形状を形成する目的で、プログラムされたヘリックス部位及びループの相互作用を介してphi29 pRNAを設計及び構築できる (Shu他, J Nanosci and Nanotech (JNN) 2003; 3: 295-302; Shu他, Nano Letters 2004; 4: 1717-1724)。かかる構築RNAナノ粒子は、1、2、3又は6個のコピーから最高数千のコピーまでの範囲の制御可能な化学量論を有する多種多様のRNA構築単位を維持できた。この系の素晴らしさは、構築単位及び最終産物ののサイズ、形状及び化学量論が、操作及び制御できることである。多様性及び分類の特徴は、治療的有効性を亢進するために多価性治療的分子を運ぶことができるこのようなRNAナノ粒子をつくる。いくつかの分子の作用を発揮するための1つの複合体の使用は、特定オリゴヌクレオチド治療的戦略のための複数の因子を開発するという問題を解決するだろう。我々は、本明細書で、pRNAトリマー形成のメカニズムを用いて3成分の同時-送達を報告してきた。ヘキサマー型複合体における6成分の同時-送達もまた、pRNAが同様にヘキサマーを形成するので、可能である (Guo他, Mol. Cell. 1998; 2: 149-155; Zhang他, Mol. Cell. 1998; 2: 141-147; Hoeprich他, J Biol. Chem. 2002; 277(23): 20794-20803)。送達可能なRNA複合体の1つの構築単位は、特定の細胞-表面受容体に結合するRNAアプタマーを運ぶために修飾でき、それによって受容体-介在エンドサイトーシスを誘発する。ヘキサマーの第2の構築単位は、癌検出のための、重金属、量子点、蛍光ビーズ又は放射性同位体を運ぶだろう。ヘキサマーの第3の構築単位は、治療的分子が放出されるように、エンドソーム破壊を亢進するために使用されることになる成分を運ぶために変更されるだろう。RNA複合体の第4及び第5の構築単位は、送達されるべき治療的siRNA、リボザイムRNA、アンチセンスRNA又は他の薬物を運ぶだろう。ヘキサマーの第6の構築単位は、アポトーシス検出を許容するように設計されるだろう。ヌクレオチド誘導体、例えば、2'-F-2'デオキシCTP、2'-F-2'デオキシUTP又はスピーゲルマーは、RNase消化に抵抗性である安定なin vitroRNA転写物を産生するためにRNAに組み込まれただろう。
【０２３６】
癌療法に加えて、この多価性RNA複合体はまた、慢性ウイルス性感染症、例えば、感染された細胞の細胞表面上に組み込まれた特定のウイルス-糖タンパク質でのターゲッティングによって、HIV及びHBV (B型肝炎ウイルス)によって起こるものを治療するために使用され得る。健常な細胞を損傷することによって重大な副作用を起こさない特定の再認法の開発は、HIV、HBV及びその他の関連する慢性及び潜在的疾患の治療を劇的に改善しただろう。RNAは、低い又は検出不可能な抗原性を有するので、慢性疾患には比類なく好適である (Goldsby他, Antigens. In Immunology, 第5版; W. H. Freeman and Company: New York, 2002; 57-61; Madaio他, J. Immunol. 1984; 732: 872-876)。このような30-又は40-nm RNA複合体の使用は、他の小分子が与えるよりも長い体内のターンオーバーを提供するだろう。
【０２３７】
実施例 12 Phi29モーターpRNAの二量化メカニズムを介する細胞への治療剤の特異的送達
治療における小RNAの適用は、特定の細胞を標的する効率的及び安全な送達系の欠如によって妨害されてきた。バクテリオファージphi29のモーターpRNAは、右及び左手ループの連結を介してダイマーを形成するキメラRNAをつくるRNAナノテクノロジーを用いて操作した。pRNAと受容体-結合RNAアプタマー、葉酸、siRNA、リボザイム又は他の化学基との融合は、ダイマー形成を邪魔せず又は挿入された部分の機能を妨害しなかった。pRNAダイマー、その1つのサブユニットは受容体-結合部分を担持し、他のサブユニットは遺伝子サイレンシング分子を担持するが、そのpRNAダイマーによる細胞のインキュベーションは、癌細胞との結合及び癌細胞への侵入をもたらし、次いで抗-プロ-アポトーシス遺伝子のサイレンシングをもたらした。キメラpRNA複合体は、ダイサーによって機能性二重鎖siRNAにプロセスされることが見出された。動物試験は、ex vivo送達によって癌細胞の腫瘍形成能の抑制を確認した。かかるタンパク質無しの30 nmナノ粒子は、繰り返される長期間投与を許容し、30 nm未満の小分子の短い保持時間及び100 nm超の粒子の非送達可能性の問題を解消するだろう。
【０２３８】
我々は、プロカプシドにDNAをパッケージングする点で新規かつ不可欠な役割を果たす、117-ntバクテリオファージphi29-コードRNA (pRNA) を発見した (図30) (Guo他, (1987), Science, 236, 690-694)。pRNAの6個のコピーは、DNA-パッケージングモーターを駆動するためのヘキサマー型環を形成する (Trottier及びGuo (1997), J Virol, 71, 487-494; Guo他, (1998), Mol Cell, 2, 149-155; Zhang他, (1998), Mol Cell, 2, 141-147)。pRNAダイマーは、ヘキサマーの構築単位である (Chen他, (2000), J Biol Chem, 275(23), 17510-17516)。右及び左の連結ループのハンド・イン・ハンド相互作用は、所望の安定なダイマー、トリマー又はヘキサマーをつくるために操作され得る (Guo他, (1998), Mol Cell, 2, 149-155; Zhang他, (1998), Mol Cell, 2, 141-147; Chen他, (1999), RNA, 5, 805-818; Shu他, (2003), J Nanosci and Nanotech (JNN), 3, 295-302)。pRNAダイマーのサイズは、約30 nmである (Hoeprich及びGuo (2002), J Biol Chem, 277(23), 20794-20803; Shu他, (2004), Nano Letters, 4, 1717-1724)。我々の最近の仕事は、RNA特にpRNAがボトムアップ型集合を介してナノ材料を構築するための構築単位として働くことができる、ことを示している (Shu他, (2004), Nano Letters, 4, 1717-1724)。phi29 pRNAの構造的及び分子的特徴は、その簡便な操作を可能にし、遺伝子ターゲッティング及び送達ビヒクルとしてその部分を再設計することを可能にする。pRNA分子は、分子間相互作用ドメイン及び5'/3'ヘリックスドメインを含む (図30) (Zhang他, (1995), RNA, 1, 1041-1050; Garver他, (1997), RNA, 3, 1068-1079; Chen他, (1999), RNA, 5, 805-818; Chen他, (2000), J Biol Chem, 275(23), 17510-17516)。5'/3'ヘリックスドメインの置換又は挿入は、ダイマー形成を妨害しない (Chen他, (1999), RNA, 5, 805-818)。
【０２３９】
これらのアイデアの実現可能性は、キメラpRNAダイマーの構築によって試験した。ダイマーの1つのサブユニットは、受容体-結合RNAアプタマー又は細胞認識のための葉酸を含み、他のサブユニットは、siRNA、リボザイム又は化学基の部分を含んだ。ダイマーは、GFP、ルシフェラーゼ及び様々な癌細胞におけるBCL-2ファミリーのプロ/抗-アポトーシスメンバーのための遺伝子を発現停止させるために特定の細胞に送達された。
【０２４０】
材料及び方法
RNAのin vitro合成及び物理的性質
文献 (Zhang他, (1995), RNA, 1, 1041-1050) に記載のようにRNAを調製した。DNAオリゴは、所望の配列で合成し、PCRによる二重鎖DNAを作製するために使用した。T7プロモーターを含むDNA産物はプラスミドにクローン化し、直接的なin vitro転写のための基質として使用した。pRNAキメラの全ては、5'-リン酸を除き、PKR及びインターフェロン効果を除くために、ウシ腸アルカリホスファターゼ（CIP）によって処理するか (Kim他, (2004), Nat Biotechnol, 22, 321-325)、又はSH-AMP、ビオチンAMP又はCoAの存在下で合成した。電気泳動及びcryo-AFMの方法は記載されている (Chen他, (2000), J Biol Chem, 275(23), 17510-17516; Shu他, (2003), J Nanosci and Nanotech (JNN), 3, 295-302)。10 mMのマグネシウムは、pRNAのフォールディング及びダイマーの形成を維持するために全ての緩衝剤に含めた (Chen他, (2000), J Biol Chem, 275(23), 17510-17516; Mat-Arip他, (2001), J Biol Chem, 276, 32575-32584)。
【０２４１】
モノマー型キメラpRNAサブユニットのトランスフェクションアッセイ
ショウジョウバエS2細胞については、様々なsiRNA及びGFP-コーディングプラスミドpMT-GFPは、セルフェクチン (Invitrogen) を用いて24-ウェルプレートでコトランスフェクトした。GFPの発現は、0.5 mMのCuSO4での終夜のインキュベーションによって誘発した (Li他, (2002), Science, 296, 1319-1321)。
【０２４２】
モノマーpRNA/siRNAのルシフェラーゼアッセイのために、プラスミドDNA pGL3コーディングホタル・ルシフェラーゼ及びpRL-TK (Promega) コーディングウミシイタケ・ルシフェラーゼを用いて、様々なキメラsiRNAをマウス繊維芽細胞PA317-PARにコトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性をトランスフェクションの1日後に二重レポーターアッセイ系（Promega）で測定した。
【０２４３】
サバイビンノックダウンアッセイのために、MDA-231、PC-3、A-549、T47D及びMCF-7細胞は、リポフェクタミン2000 (Invitrogen) を用いて、24-ウェルプレートで、20 pmol/ウェルで様々なRNAでトランスフェクトした。翌日、位相差顕微鏡下で細胞を観察し、生存性をカウントした。
【０２４４】
プロB FL5.12A細胞について、500 μlの10% FBSを含むRPMI1640に再懸濁した。D1細胞について、細胞を低浸透圧緩衝剤に再-懸濁した。Electro Square Porator ECM 830を用いてエレクトロポレーションを行った。FL5.12A細胞を200V、3パルスで電気穿孔し、D1細胞を180V、1パルスで電気穿孔した。氷上で短時間インキュベーションした後、細胞をサイトカインを含む10 mlの完全な培地に再-懸濁し、2時間インキュベートした。Minis試薬でのトランスフェクション前にトリパンブルーアッセイにより、細胞生存性を測定した。106細胞を終夜、RNA構築物（100 nM）でインキュベートし、ハンクス平衡塩溶液で2回洗浄し、サイトカインを含む又はサイトカインを含まない培地中で更に24〜48時間インキュベートした。
【０２４５】
ダイサーによるキメラpRNA/siRNAプロセシング
精製した組換えダイサー (Gene Therapy Systems, Inc.) によってキメラsiRNAを37℃で2時間インキュベートした。RNAは、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（NEB）を用いて5'-末端を[32P]で標識した。
【０２４６】
CD4アプタマー及びサバイビンsiRNAを担持するキメラpRNAダイマーの機能性アッセイ
CD4hi、CD4lo及びCD4neg細胞を96-ウェルプレートに播いた。5 x104細胞/試料を1回洗浄した。細胞を100 nMのRNAダイマーで30分間インキュベートした。濯いだ後、細胞をサイトカインと共に又はサイトカイン無しで24〜48時間更にインキュベートした。トリパンブルーアッセイで細胞生存性を測定した。
【０２４７】
共焦点顕微鏡によるCD4受容体-結合アッセイ
D1細胞は、10% FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン/ストレプトマイシン 50 U.I/ml、0.1% β-メルカプトエタノール及び50 ng/ml IL-7を含むRPMI1640注で増殖させた。FL5.12A細胞は、2 ng/ml IL-3を補充した完全培地で増殖させた。D1細胞中でのCD4の発現のために、L3T4 (マウスCD4) インサートをpcDNA 6/V5-HisB (Invitrogen) にサブクローン化した。安定株は、抗生物質耐性によって選択した。高レベルのCD4を発現するD1〜CD4細胞は、FACSにより更に単離した。D1〜CD4細胞株を50 ng/ml IL-7及びブラスチシジンHCl  (2.5mg/ml) で補充した完全培地で維持した。ポリ-L-リジン (200 μg/ml) でコートしたカバースリップを細胞で終夜インキュベートした。固定前に、細胞を有するカバースリップを濯ぎ、ダイマーRNA複合体の65 nM溶液中で30分間、処理した。細胞を有するカバースリップを4%パラホルムアルデヒドで固定し、Gel/MountT (Biomeda, CA) 中で埋め込んだ。画像をZeiss共焦点顕微鏡LSM 510 NLOによって撮った。
【０２４８】
葉酸受容体によって介在される特定の遺伝子ノックダウン
葉酸-pRNA(7-106) B-a'及びpRNA/siRNA（ホタル・ルシフェラーゼ) A-b'と、10 mM Mg2+とを混合することによって、葉酸-ダイマーを調製した。葉酸-無しの培地で6-ウェルプレートにKB細胞を播いた。MgCl2を加えたPBSで洗浄した後、予め混合したダイマーRNA (1.75 μM) を細胞に加え、37℃で3時間インキュベートした。RNaseインヒビターSUPERRNaseIN (1単位/μl) (Ambion) を結合緩衝剤に加えた。インキュベーション後、遊離のRNAを洗浄し、リポフェクタミン2000 (Promega) を用いてpGL3及びpRL-TKプラスミドを細胞に導入した。ルシフェラーゼ活性を翌日測定した。
【０２４９】
二重標識及びフローサイトメトリー
MCF-7細胞を10O nM濃度のRNA試料でトランスフェクトした。細胞をアネキシンV及びPIで染色し、フローサイトメトリーアッセイを行った。左上、右上、左下及び右下領域は、それぞれ、破壊された細胞、壊死細胞、生存細胞及びアポトーシス細胞を示す。
【０２５０】
動物試験
病原体無しの雄性5週齢胸腺欠損ヌードマウス (Harlan Sprague Dawley, Indianapolis) を特定の病原菌無しの環境で飼育した。餌及び器具は加圧滅菌し、全ての操作は、層流フード内で行った。動物は、無作為に実験群（n=8）に帰属した。前肢の右脇の下に細胞を皮下的に接種した。2次元での外側からの腫瘍の測定によって、週に2回、異種移植片のサイズを決定した。体積は以下の式によって計算した：V=(LxW2) x 0.5（ここで、Lは長さであり、Wは異種移植片の幅である）。
【０２５１】
RNAサブユニットの命名
RNA複合体の構築の記載を簡単にするために、pRNAの右及び左手ループを各々表すために大文字及び小文字を使用した (図30A)。同一の文字は、相補性を示すが、異なった文字は非-相補性ループを示す。例えば、pRNA (A-b') は、それぞれ、pRNA(B-a')の左手ループa'(3'C85C84U83G82) 及び右手ループB(5'A45C46G47C48) と対を形成できる、右手ループA (5'G45G46A47C48) 及び左手ループb' (3'U85G84C83G82) を含む（図30）。pRNA/アプタマー(CD4)は、CD4に結合するアプタマーを担持するpRNAキメラを称し、pRNA/siRNA(GFP) は、siRNAターゲッティング緑蛍光タンパク質（GFP）を担持するpRNAキメラを示す。pRNA/リボザイム (サバイビン) は、サバイビンに対するハンマーヘッド型リボザイムを担持するキメラpRNAを示す。
【０２５２】
1. 外来部分を担持するキメラpRNAサブユニットの構築
a. siRNAを担持するキメラpRNAの構築
pRNAは、二重鎖ヘリックスドメインを5'/3'末端に、及び分子間結合ドメインを含む。これらは互いに無関係に折り畳む。相補性修飾研究は、2つの鎖が対を形成する限り、ヘリックス部位の任意のヌクレオチドの一次配列の変更はpRNA構造及びフォールディングに影響を与えない、ことを明らかにした (図30) (Zhang他, (1994), Virology, 201, 77-85)。広範な研究は、siRNAが二重鎖RNAヘリックスであることを明らかにした (Elbashir他, (2001), Nature, 411, 494-498; Li他, (2002), Science, 296, 1319-1321; Brummelkamp他, (2002), 296, 550-553; Carmichael (2002), Nature, 418, 379-380)。pRNAにおけるヘリックス部位を二重鎖siRNAと置換できるか否かを試験するために、pRNAのヌクレオチド29番及び91番に連結されたsiRNAを運ぶために、異なった標的を有する様々なキメラpRNAを構築した（図30）。これは、RNA(GFP)、pRNA/siRNA (ルシフェラーゼ)、pRNA/siRNA(BAD)及びpRNA/siRNA (サバイビン) を与えた。
【０２５３】
b. 受容体-結合アプタマー又はリボザイムを担持するキメラpRNAの構築
治療的複合体の特異的送達を達成するために、通常、細胞表面上の痕跡分子を認識する部分を組み込む必要がある。抗体及びファージ-提示ペプチドと比較すると、RNAアプタマーは、免疫応答の誘発を避けるので、魅力的な代替物である (Goldsby他, (2002), Antigens. Immunology, W. H. Freeman and Company, New York, 57-61頁)。SELEX法を用いて、特定の細胞表面受容体、例えばCD4を特異的に認識する多数のRNAアプタマーが得られた CD4 (Kraus他, (1998), J Immunol, 160, 5209-5212)。1つのCD4-結合RNAアプタマーは、相互の5'/3'末端結合を介してキメラpRNA/アプタマー(CD4)を構築するように選択した（図30D）。pRNAベクターは、元のpRNA配列のそれぞれ残基71番及び75番に再配置された原始的5'及び3'末端を有する、環状に並べ替えられた形態に再構成した。71/75末端は、末端を埋めてin vivoでのエキソヌクレアーゼ分解から末端を保護するために (Hoeprich他, (2003), Gene Therapy, 10(15), 1258-1267)、堅く-折り畳まれた部位に位置する (Hoeprich及びGuo (2002), J Biol Chem, 277(23), 20794-20803)。キメラpRNA/リボザイム（サバイビン）を構築するために、同様の規則に従った。
【０２５４】
c. 葉酸を担持するキメラpRNAの構築
葉酸受容体は、様々な腫瘍の種類、例えば鼻咽喉表皮癌で過剰発現されるが、健常の成人組織には一般的に存在しない。多くの治療剤、例えば低分子量薬物、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びタンパク質毒素は、葉酸に複合化し、次いで腫瘍細胞に送達される (Sudimack他, (2000), Adv Drug Deliv Rev, 41, 147-162; Lu他, (2003), J Control Release, 91, 17-29)。葉酸受容体-過剰発現腫瘍細胞にsiRNAを送達するために、本研究において同一の方法を採用した。葉酸分子は、特異的送達を達成するために、RNAの5'末端に取り込まれ、pRNA/siRNAキメラを有するダイマーを形成した（図30D）。葉酸分子の細胞表面上への葉酸受容体への接近可能性を増加させるために、葉酸-標識RNAを、pRNAのヌクレオチド107番〜117番が切断されている5'オーバーハングであるように設計した。
【０２５５】
2. ダイサーによるキメラpRNA/siRNA複合体から二重鎖siRNAへのプロセシング
キメラ複合体が機能性siRNAにプロセスされ得るか否かの疑問に答えるために、in vitro及びin vivoで22bp siRNAへの長い二重鎖RNAをプロセシングするその機能がよく知られている、キメラpRNA/siRNAを精製した組換えダイサーによる処理に供した。本研究で基質として使用したキメラpRNA/siRNA複合体は、塩基29〜91のpRNA分子間相互作用ドメインに連結された29-bpの二重鎖siRNAを担持した。2つの更なるウリジンは、ループのフォールディングンΔGを増加させることによってプロセシング効率を亢進するために、pRNAドメインにsiRNAを連結するために使用した。精製されたキメラpRNA/siRNA複合体は、5'末端を[32P]で標識し、ダイサーでインキュベートし、次いで消化物を変性PAGE/尿素によって分析した。図31に示すように、ダイサーによる30分間〜2時間のpRNA/siRNA消化は、22-塩基siRNAの産生を高効率でもたらした。この結果は、キメラpRNA/siRNAが開裂され、5'/3'末端に位置する機能性二重鎖siRNAを放出した、ことを確認する。
【０２５６】
3. トランスフェクションによるキメラpRNAサブユニットの機能性アッセイ
a. pRNA/siRNA(GFP) 
pRNA/siRNA(GFP)の機能を試験するために、GFP-発現プラスミドを様々なRNAキメラを用いて細胞にコトランスフェクトした。蛍光顕微鏡は、pRNA/siRNA(GFP)が用量依存的にGFP遺伝子発現を効率的に阻害した、ことを明らかにした（図32A）。対照的に、かかる阻害効果は、siRNA配列内に部位-指向的変異を有する対照構築物では観察されなかった。pRNAベクターによる非-特異的阻害は、ベクターのみ（塩基番号18〜99）を用いる対照（図32B）によって除外された。mRNAレベルに対する遺伝子サイレンシングの効果は、ノーザンブロットによって更に証明した（図32D）。2つのアッセイにおいて、キメラpRNA/siRNA (GFP) は、化学的に合成された二重鎖siRNA (GFP)と比べて、GFP遺伝子発現に対する等価な又は優れた阻害効果を示した (図32C及びD)。
【０２５７】
b. pRNA/siRNA (ルシフェラーゼ)
GFP特異的キメラsiRNAに加えて、ルシフェラーゼに対するpRNA/siRNA構築物も作製し、試験した。ホタル・ルシフェラーゼ又はウミシイタケ・ルシフェラーゼのいずれかをターゲッティングする2つのキメラpRNA/siRNA構築物は、別個の実験で一時的なトランスフェクションにより細胞に導入し、次いで2つのルシフェラーゼの発現レベルを二重レポーターアッセイで同時に測定した。標的シフェラーゼを試験する場合に、非-標的ルシフェラーゼは、内部対照として役立った。図33Aに示すように、各構築物は、その標的遺伝子を効率的かつ特異的に抑制することが見出された。変異がpRNA複合体のsiRNAに導入されたときに、ルシフェラーゼ遺伝子のサイレンシングは起こらなかった。加えて、pRNA/siRNA（ホタル）のサイレンシング効果は、ヘアピンsiRNA（ホタル）のみよりも効率的であることが見出された（図33B）。
【０２５８】
c. pRNA/siRNA（サバイビン）及びpRNA/リボザイム（サバイビン）は、抗-アポトーシス因子サバイビンをノックダウンし、細胞死を開始した
癌を治療する点での治療的RNA分子の有効性を評価するために、腫瘍発生及び進行に関連する遺伝子を抑制する必要がある。サバイビンはアポトーシスを阻害し、癌細胞のみで検出され、健常な成人組織では検出されないので、サバイビンを標的として選択した。サバイビンの抑制が癌細胞のアポトーシスを誘発することが明らかにされている (Grossman他, (2001), Proc Natl Acad Sci, 98, 635-640)。pRNA/siRNA（サバイビン）の機能及び特異性は、乳癌細胞及び前立腺細胞において最初に試験した。pRNA/siRNA（サバイビン）でトランスフェクトされた乳癌細胞のアポトーシスは、アネキシンN-ヨウ化プロピジウム（PI）二重-染色、次いでフローサイトメトリー分析によって評価した。図34-I-Bに示すように、pRNA/siRNA（サバイビン）でトランスフェクトした細胞は、陰性対照としての変異キメラsiRNA又は5S RNAで処理した細胞に比べて、アポトーシス細胞を示す右下領域においてより高いパーセンテージを示した（図34-I-A、C及びD）。乳癌細胞株MDA-231及び前立腺細胞株PC-3における細胞形態学的試験によって、細胞生存に対するキメラsiRNAの効果も評価した。トランスフェクション後に、細胞のほとんどは縮み、細胞培養プレートから離れたが、対照pRNA/siRNA (変異体) は、細胞死を誘発しなかった（図34-II）。
【０２５９】
pRNA/リボザイム（サバイビン）によるノックダウン効果も試験した。数種類のヒト癌細胞株をpRNA/リボザイム（サバイビン）によってトランスフェクトするときに、トランスフェクションの24時間後に細胞の80%超が死滅した（図35A）。ウェスタンブロットアッセイは、サバイビンタンパク質発現が、トランスフェクション後のキメラRNAによって効果的にノックダウンされたことを明らかにした（図35B）。対照的に、癌細胞で単にインキュベートした場合には、pRNA/siRNA（サバイビン）又はpRNA/リボザイム（サバイビン）は、トランスフェクション試薬の非存在下で最高72時間、細胞死を起こさなかった（図35C）。このことは、キメラpRNAが、インキュベーションの際に非-特異的な細胞毒性を示さなかったことを示す。しかしながら、トランスフェクションによって細胞に導入されるときに、サバイビンに対するキメラsiRNA又はリボザイムは、特異的にサバイビン遺伝子を発現停止させ、細胞死を引き起こすことができた。
【０２６０】
d. pRNA/siRNA (BAD) は、プロ-アポトーシス因子を発現停止させ、細胞死を抑制した
抗-アポトーシス因子をノックダウンすることによる細胞死の誘発は、癌療法において理想的であろうが、RNA送達方法の特異性を証明するには十分でない。なぜなら、細胞死は、潜在的に、もし起こるとすれば、非-特異的効果によって起こり得るからである。プロ-アポトーシス因子のサイレンシングは細胞死を引き起こす代わりにアポトーシスを抑制しただろうから、非-特異的細胞毒性の可能性を除くために、BC1-2ファミリーにおけるプロ-アポトーシス因子BAD (Khaled他, (2001), J Biol Chem, 276, 6453-6462) は、標的として選択された (Kumar 他. (2002), Science, 297, 1290-1291)。従って、siRNAからのノックダウン効果は、RNA成分の非-特異的毒性とは区別され得た。この目的のために、IL-3依存的プロ-B細胞株FL5.12Aが採用された。IL-3の除去は、BADの発現を誘発でき、このことは、FL5.12A細胞のアポトーシスをもたらした (Khaled他，(2002), Nat Rev Immunol, 2, 817-830)。pRNA/siRNA (BAD) を構築し、プロ-B細胞株に導入し、ウェスタンブロットは、BADタンパク質が顕著に減少したこと示したが（図36B）、変異体対照及びpRNAベクターのみは、非処理細胞に比べて、BADタンパク質が僅かに減少したのみであった。生存アッセイは、pRNA/siRNA (BAD) のトランスフェクションが、IL-3除去において細胞死からFL5.12A細胞を保護し、IL-3の存在下で細胞死を引き起こさなかった、ことを明らかにした (図36A)。これらの結果は、キメラpRNA/siRNAが標的されたプロ-アポトーシス遺伝子の発現を特異的に停止させ、成長因子除去-誘発細胞死を抑制できる、ことを証明する。対照的に、細胞死は、変異体キメラsiRNA対照に比べて、IL-3の存在下でpRNA/siRNA（サバイビン）によって誘発され、IL-3除去では増幅された（図36C）。
【０２６１】
4. 個々の機能性サブユニットを担持するキメラサブユニットからなるpRNAダイマーの集合体
効果的な遺伝子療法は、少なくとも2つの特徴を必要とする：特異的細胞認識及び特定の遺伝子（複数）のサイレンシング。2つの機能性を有するRNA分子の構築は、これらの要件を満足しただろうが、1つのRNAの、2以上の部分との直接的融合又は複合化は、ミスフォールディング及び機能の喪失をまねいた。RNAダイマーの構築は、これらの2つの目標を達成するための代替的な方法である。
【０２６２】
phi29 pRNAの広範な研究は、pRNAモノマーの相補的な左右手ループと右手ループとの相互作用によって、2つのpRNAサブユニットがダイマーを形成する、ことを明らかにした。ダイマーの伸張可能な5'/3'末端は、pRNAベクターの二次構造及び挿入された配列を変更することなく、余分な配列を運ぶために2つの別々の部位を提供する (Shu 他. (2004), Nano Letters, 4, 1717-1724)。従って、ダイマー形成メカニズムは、1) 受容体-結合RNAアプタマー又は葉酸によって介在される特異的認識；及び2) siRNA又はリボザイムによって介在される細胞機能の制御（成長、死、生理機能等）のための、機能性部分を送達するためのRNA複合体を構築するために利用した。
【０２６３】
分子間pRNA/pRNA相互作用に起因する配列は、残基23〜97の間に位置する (Chen他, (1999), RNA, 5, 805-818)。キメラモノマーサブユニットは、互いにマッチするために、A-b'又はB-a'のいずれかを有するように意図的に設計した。pRNA A-b'及びB-a'を1O mM Mg2+の存在下で1:1のモル比で混合したときに、ゲル電気泳動及びcryo-AFM画像によって確認されるように、pRNAダイマーが高い効率で産生した（図30C）。AFM画像では、モノマーは、チェックマーク形状を示し、ダイマーはモノマーの2倍の大きさである。このデータは、5'/3'ヘリックスと二重鎖siRNAとの置換、又は5'/3'末端のアプタマーもしくはリボザイムへの連結にもかかわらず、ダイマーが、モノマーサブユニットから生成したことを示した。pRNAキメラの正確なフォールディングはまた、先に記載したphi29 in vitro集合体阻害アッセイ (Guo他, (1987), Science, 236, 690-694; Guo他, (1998), Mol Cell, 2, 149-155) によって確認された。
【０２６４】
5. インキュベーションによるキメラpRNAの機能性アッセイ
a. CD4アプタマーを含むキメラpRNAの結合アッセイ
CD4は、あるTリンパ球の表面に提示される受容体である。CD4-過剰発現T細胞株（CD4Hiと称される）は、検出不可能なレベルな内因性CD4を通常発現する、ネズミIL-7依存的プロT細胞株D1（CD4Lowと称される）から樹立した (Kim他, (2003), J Immunol Methods, 274, 177-184)。CD4発現のないFL5.12A細胞（図37-I-c）又はアプタマー（CD4）無しのFITC-ダイマー（データ非表示）で結合が検出されなかったので、pRNA (A-b')/アプタマー (CD4) 及びpRN A(B-a') /FITCからなるRNAダイマーによるCD4Hiのインキュベーションは、強力かつ特異的結合を示した（図37I）。
【０２６５】
b. アプタマー（CD4）及びsiRNA（サバイビン）を担持するダイマーによるインキュベーション
RNAダイマー-介在遺伝子送達の方法は、受容体-結合部分が細胞認識及び次の内在化を介在し、siRNAが次いで特定の遺伝子をダウンレギュレートするために放出されることである。pRNA/siRNA（サバイビン）及びpRNA/aptamer（CD4）を含むダイマーは、異なったCD4発現レベルを有する細胞でインキュベートした。CD4Hi細胞は、pRNAキメラ複合体に最も強力に反応した、このことは、IL-7の存在下で細胞生存率が30%超減少したことを示した。IL-7除去の際に、D1 CD4Low及びCDHiは、CD4-陰性FL5.12A細胞と比べて顕著な細胞死を示した。細胞死のレベルは、CD4の発現レベルと相関した。これらの結果は、サバイビンsiRNAのCD4-介在侵入が細胞生存の抑制をもたらし、細胞表面上のCD4分子のレベルに依拠した、ことを示唆する。
【０２６６】
c. 葉酸と複合化されたキメラpRNAの結合アッセイ
フローサイトメトリーによってpRNA/葉酸モノマーの特異的な細胞結合を証明した（図38A）。内因性過剰発現葉酸受容体を有するヒト鼻咽喉表皮癌Kb細胞がFITC-pRNA/葉酸でインキュベートしたときに、細胞の97.3%がFITC-陽性であった。インキュベーション緩衝剤への、ブロッキング剤としての遊離の葉酸の添加は、FITC-陽性細胞を0.7%だけ減少させた（図38A）。このことは、pRNAの細胞への結合が特異的であり、葉酸受容体に依拠することを示唆する。葉酸複合体を有さないFITC-標識pRNAは、結合を示さなかった。
【０２６７】
ダイマー型siRNAキメラを運ぶための葉酸の使用可能性もまた、放射標識RNAの使用によって証明した。第1に、Mg2+の存在下でRNA(A-b') 及び[H3]-pRNA(B-a') の等量を混合することによってRNAダイマーを生成した。葉酸-ダイマーは、葉酸標識のない対照ダイマーと比べて非常に強い結合を示した (図38B)。遊離の葉酸がブロッキング試薬として含まれる場合には、葉酸-標識ヘテロダイマーRNAの細胞への結合は減少した。
【０２６８】
d. インキュベーションによる細胞への送達の後のpRNA/siRNA（ホタル又はウミシイタケ）の機能性アッセイ
ルシフェラーゼ（結果3-b）に対するキメラsiRNAの特異的ノックダウン及び葉酸-標識ダイマーの特異的結合（結果5-c）を証明した後に、インキュベーションによる遺伝子サイレンシング効果を更に研究した。葉酸受容体-過剰発現細胞へのキメラsiRNAの葉酸-介在ターゲッティングがRNA複合体の侵入及び特定の遺伝子のノックダウンをもたらし得るか否かを決定するために、pRNA/siRNA（ホタル）及びpRNA/葉酸からなるダイマーを葉酸-受容体陽性KB細胞でインキュベートし、葉酸によって介在されたRNAの結合及び侵入を可能にした。二重アッセイは、インキュベーションの後のホタル・ルシフェラーゼ発現の劇的な減少を明らかにした (図38C)。対照的に、葉酸標識を有さない対照RNAは、標的タンパク質発現を顕著に妨害しなかった。ウミシイタケ・ルシフェラーゼを内部対照として使用したときに、ダイマーにおけるpRNA/siRNA（ホタル）の特異性を証明した。
【０２６９】
6. サバイビンに対するキメラsiRNAのex vivo送達による癌細胞の腫瘍原性の特異的抑制を証明するための動物試験
pRNA(A-b')/葉酸及びpRNA(B-a')/siRNA（サバイビン）を含むダイマーを用いるex vivo送達による特異性を試験するために動物試験を行った。腫瘍形成を抑制するこのRNAダイマーの可能性は、胸腺欠損ヌードマウスで試験した。脇の下注射によってヌードマウスに導入する前に、葉酸無しのブロッキング試薬を含む又は含まないダイマーRNAで鼻咽喉表皮癌（KB）細胞をインキュベートした。細胞のみを与えたマウスは、3週間以内に腫瘍を発生したが、pRNA(A-b')/葉酸及びpRNA(B-a')/siRNA（サバイビン）を有するダイマーで予備処理した細胞を与えたマウスは腫瘍を発生しなかった（表3）。対照マウス群で使用された葉酸複合体無しのダイマー対照RNAが腫瘍発生に影響を与えなかったので、腫瘍形成の阻害は特異的である。
【０２７０】
【表８】
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【０２７１】
a葉酸-無しの培地RPMI 1640中でKB細胞を維持した。動物注射のために使用する3時間前に、pRNA複合体で細胞を予めインキュベートした。10 mM MgCl2を含むPBSで2回濯いだ後、細胞を遠心管に回収した。各マウスを2.5 x 103細胞を含む0.1 mLの培地で接種した。キメラpRNA複合体と共に腫瘍異種移植片を与えたマウスのin vivo試験の結果を示す。群2の内の1匹のマウスは、いずれかの群の他のいずれかのマウスよりも非常に早く、1週間以内にプラークを生じ、そのため、これらの特定の環境を考慮すると、このマウスは異常値として扱い、8匹の代わりに群2では7匹のマウスを記録した。
【０２７２】
考察
Phi29 pRNAは、各pRNAの連結ループの相互作用の結果として、ヘキサマーの構築単位であるダイマーを形成する傾向を有する (図39)。本明細書は、特定の細胞に治療的RNAを送達するためのダイマーの産生を証明した。今後、キメラヘキサマーも、ハンド・イン・ハンド相互作用を介して集合され得る。従って、ヘキサマーに6つのキメラpRNAが存在するので、細胞認識、治療及び検出のための分子を運ぶために利用できる6つの位置が存在するだろう。受容体-結合アプタマー、siRNA、リボザイム及び本明細書の葉酸受容体、他の物質、例えば蛍光色素、重金属、量子点、蛍光ビーズ及び放射性同位体もまた、異なった開発ステージで癌痕跡の検出のために複合化され得る。葉酸及びFITCを複合化するための報告された方法は、化学物質の複合化のために使用でき、エンドソーム-破壊化学物質は、治療効率を改善するための送達の後に、エンドソームからのsiRNAの放出を促進するために加えることができた (図39)。ヌクレオチド誘導体、例えば、2'-F-2'デオキシCTP、2'-F-2'デオキシUTP又はスピーゲルマーは、RNase消化に抵抗性の安定なin vitro RNA転写物を産生するためにRNAに組み込まれるだろう (Soutschek他, (2004), Nature, 432, 173-178)。
【０２７３】
この多価性RNA複合体もまた、感染された細胞表面上に組み込まれた特定のウイルス-糖タンパク質にターゲッティングすることにより、慢性ウイルス感染症、例えば、HIV及びB型肝炎ウイルスによって起こるもの、を治療するために使用され得る。RNAは、タンパク質と複合化されるときに、検出可能な免疫反応を誘発しないことは、科学界ではよく知られている (Madaio他, (1984), J Immunol, 132, 872-876; Goldsby他, (2002), Antigens. Immunology, W. H. Freeman and Company, New York, 57-61頁)。送達ビヒクルとしてのRNAの使用は、繰り返された長期間の薬物投与の後の、免疫反応の問題及びタンパク質ベクターの拒絶を回避できた。このような30〜40 nmRNA複合体の使用は、他の小分子が与えるよりも体内で長いターンオーバーを与えただろう。
【０２７４】
実施例 13 鼻咽腔表皮癌に対するキメラsiRNAの送達のための葉酸-複合ファージPhi29モーターpRNAの構築
鼻咽喉癌は、hFR（ヒト葉酸受容体）を高度に発現する、十分に識別されてない上気道癌である。hFRへの葉酸の結合は、エンドサイトーシスを誘発する。葉酸は、1,6-へキサンジアミン結合によってAMPに複合化した。93%の純度に達した逆相HPLVの後、転写開始のために使用できるに過ぎず、鎖伸張のために使用できない葉酸-AMPは、phi29モーターpRNAの5'-末端に組み込まれた。転写における葉酸-AMP対ATPの16:1の比は、pRNA含有葉酸の60%超をもたらした。5'-オーバーハングを有するpRNAは、特定の受容体結合のために5'葉酸の近接性を増加するために必要とされる。設計された左/右連結ループを利用して、葉酸、検出マーカー及び抗-アポトーシス因子をターゲットとするsiRNAを運ぶRNAナノテクノロジーを用いて、多価性ダイマーpRNAナノ粒子を構築した。ダイサーによってds-siRNAにキメラpRNAをプロセスした。ダイマーによる鼻咽喉表皮癌（KB）細胞のインキュベーションは、癌細胞へのその侵入及び続く標的遺伝子のサイレンシングをもたらした。低い抗原性を有するこのようなタンパク質無しのRNAナノ-粒子は、有効性及び特異性が、動物試験のex vivo送達によって確認されたので、鼻咽喉癌の繰り返される長期間投与に可能性を有する。
【０２７５】
導入
117-ntバクテリオファージphi29-コードRNA (pRNA) は、DNAパッケージングにおいて新規かつ本質的な役割を果たすことが見出されている (Guo他, Science 1987; 236: 690-694)。pRNAは、右及び左連結ループのハンド・イン・ハンド相互作用によって、ダイマー、トリマー及び究極的にはヘキサマーを形成する (Guo, Prog Nucl Acid Res Moe Biol 2002; 72:415-472; Shu他, Nano Letters 2004; 4: 1717-1724)。pRNAの構造的特徴は、広範に研究されているが、簡便な操作を可能にし、及び遺伝子ターゲティング及び送達ビヒクルへのpRNAの変換を許容する。pRNA分子は、異なった機能を有する2つの独立したフォールディング度得インを含む (Guo, Prog Nucl Acid Res Mol Biol 2002; 72:415-472; Zhang他, Virology 1994; 201: 77-85)。残基23番の前の塩基又は残基97番の後の塩基の置換又は挿入は、鎖が対を形成する限り、ダイマー形成を妨害しない (Chen他, RNA 1999;5:805-818)。従って、pRNAの5'/3'近接二重鎖ヘリックス部位 (Zhang他，RNA 1995; 1: 1041-1050) は、その二次構造又は分子間相互作用を変えることなく、更なる配列を運ぶように再設計され得る (Hoeprich他, Gene Therapy 2003; 10(15): 1258-1267; Shu他, J Nanosci andNanotech (JNN) 2003; 3: 295-302)。
【０２７６】
ヒト上気癌は十分に識別されていないが、鼻咽喉癌は、KB細胞中で高度に発現されるヒト葉酸受容体（hFR）を有する。hFRへの葉酸の結合によって介在されるリガンド/受容体のエンドサイトーシスは、十分に研究されており、葉酸に複合化される高分子は、葉酸受容体によって成功的に認識され、細胞に内在化されている (Lee他, J Biol Chem 1994; 269: 3198-3204; Mathias他, J Nucl Med 1996; 37: 1003-1008; Benns他, J Drug Target 2001; 9: 123-139)。近年、我々は、治療的RNA、例えばsiRNAs及び/又はリボザイムの特定の癌細胞への送達のためのRNAナノ粒子の構築用担体として使用され得ることを見出した (Shu他, Nano Letters 2004; 4: 1717-1724; Guo他, Human Gene Therapy 2005; 16: 1097-1109 [実施例12]; Khaled他, Nano Letters 2005 ;5: 1797-1808 [実施例11])。本明細書では、我々は、葉酸-AMPの合成及び精製の方法、すなわち葉酸-pRNAの構築法、及び葉酸-含有産物の純度及び機能の試験法を記載した。葉酸によって介在される遺伝子療法におけるsiRNAの可能性も、動物試験で研究した。
【０２７７】
材料及び方法
RNAの調製
RNA調製及びダイマーの特徴付けは、我々の先の刊行物において記載した (Zhang他, Virology 1994; 201: 77-85; Guo他, Mol Cell 1998; 2: 149-155)。すなわち、Ambion社製のT7-MegaShortscriptキットを用いて、in vitro転写によってRNAを調製した。DNA鋳型は、T7ポリメラーゼと共に、7.5 mM ATP、7.5 mM GTP、7.5 mM UTP及び7.5 mM CTPの存在下で使用した。1 μl [α-32P] ATP又は[3H]UTPは、RNAの放射活性標識のために含めた。転写物は、8% PAGE/尿素によって精製し、0.5 M酢酸ナトリウム、0.1 mM EDTA及び0.1% SDSで希釈した。RNAは、エタノール沈殿させ、DEPC処理済の水に再懸濁した。5RNAの'-末端を葉酸で標識するために、1 mM UTP、CTP及びGTPと共に、4 mM葉酸-AMP及び0.25 mM ATPを転写反応に加えた。
【０２７８】
葉酸-AMPの合成及び精製
葉酸とアデノシン5'-モノリン酸塩（AMP）との複合体は、公表されている類似の複合化学 (Huang 他, RNA 2003; 9: 1562-1570) に基いて、連結分子1,6-ヘキサジアミン（HDA）によってAMPへの葉酸部分の導入によって達成した。次いで、準-プレパラティブ逆相HPLCによって、5'-葉酸-AMPを93%まで精製した。凍結乾燥した後、化合物を水に溶解した。その濃度は、350 nmでの吸収によって決定し、ε350 = 8,000 M-1・cm-1のモル減衰係数であった。次いで、葉酸-AMPは、公表された条件下で、T7Φ2.5プロモーター下での葉酸-複合RNAの調製のために直接、使用した。
【０２７９】
細胞培養
KB細胞は、10% FBS及びペニシリン/ストレプトマシンで補充した葉酸-無しのRPMI1640培地（Gibco）で、5% CO2インキュベーター中で維持した。血清は、細胞死のために内生的葉酸の通常の補足を提供した。
【０２８０】
フローサイトメトリー分析
4 x 105 KB細胞は、6-ウェルプレートに播き、24時間増殖した。PBSで2回濯いだ後、細胞を、室温で20分間、ブロッキング試薬の存在下又は非存在下にて、100 nM葉酸-FITCでインキュベートした。166 μMの遊離葉酸又は葉酸-AMPをブロッキング試薬としてインキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、PBSで採取し、フローサイトメトリーで分析した。
【０２８１】
KB細胞への葉酸RNAの結合
1μMのRNAを、10 mM Mg2+の存在下、107細胞の0.5 mlの培地の懸濁液に加え、37℃で30分間インキュベートした。次いで、細胞をRPMI1640培地で洗浄し、細胞の放射活性を液体シンチレーション・カウンタで測定した。
【０２８２】
二重-ルシフェラーゼアッセイ
ホタル・ルシフェラーゼをコードするpGL3プラスミド及びウミシイタケ・ルシフェラーゼをコードするpRL-TKプラスミドを有するマウス繊維芽細胞P A317-PARに、様々なキメラsiRNAをコトランスフェクトすることによって、トランスフェクションによる遺伝子サイレンシングアッセイを行った。2つのルシフェラーゼ活性は、Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) で測定した。
【０２８３】
インキュベーションアッセイのために、葉酸e-pRNA (7-106) B-a'及びpRNA/siRNA (ホタル・ルシフェラーゼ) A-b'と、10 mM Mg2+とを混合することによって、葉酸-ダイマーを調製した。KB細胞を葉酸-無しの培地で6-ウェルプレートに播いた。MgCl2で補充したPBSによって洗浄した後、予め混合したダイマーRNA (1.75 μM) を細胞に加え、37℃で3時間インキュベートした。RNase阻害剤であるSUPERRNaseIN (1単位/μl) (Ambion) を結合緩衝剤に加えた。インキュベーションの後、遊離のRNAを洗浄し、リポフェクタミン2000 (Promega) を用いて、pGL3及びpRL-TKプラスミドを細胞に導入した。翌日、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【０２８４】
キメラpRNA/siRNAプロセシング
本研究では、二重鎖RNAのsiRNAへのプロセシングを証明するためにNatureに記載の方法 (Bernstein他, Nature 2001; 409: 363-366) に正確に従った。精製した組換えダイサーは、Gene Therapy Systemsから購入した。
【０２８５】
In vivo動物試験
5週齢の雄性胸腺欠損ヌードマウス (Harlan Sprague Dawley) を病原体無しの環境で飼育した。動物を無作為に実験群に帰属した（n=8）。細胞を注射の1週間前に、抗生物質無しの培地で維持した。注射の第1日目に、細胞をPBSで2回濯ぎ、トリプシン消化によって回収する前の3時間、ダイマー型pRNA複合体と共に37℃でインキュベートした。各マウスの注射のために、2.5x105細胞の0.1 ml培地を使用した。前肢の右脇毛に細胞を皮下的に接種した。異種移植片が見えたら、そのサイズを、二次元的に外から腫瘍を測定することによって週に2回測定した。体積は以下の式によって計算した：V=(LxW2) x 0.5（ここで、Lは長さであり、Wは異種移植片の幅である）。
【０２８６】
結果
1. 葉酸-AMPの特徴
確立された化学 (Huang他, Biochemistry 2000; 39: 15548-15555)によって、連結分子1,6-ヘキサンジアミン (HDA) によってアデノシン5'-モノリン酸塩で葉酸を複合化することにより、葉酸-AMP複合体（図40）を合成した。複合体は、準-プレパラティブ逆相HPLCによって精製した（図40C）。葉酸-AMP複合体の純度は、逆相HPLC及び薄層クロマトグラフィーによって決定した。93%の純度を示す化合物（図40C）は、以下で考察するように、葉酸-pRNAの合成に使用した。
【０２８７】
葉酸-AMPが細胞表面上の葉酸受容体に結合することができるか否かを決定するために、ヒト鼻咽喉癌KB細胞への結合のための葉酸-FITCと競合する葉酸-AMPの可能性をフローサイトメトリーで評価した。KB細胞の97%は、葉酸-受容体陽性であり、葉酸-FITCによって強い結合を示した（図40A）。しかしながら、KB細胞を、葉酸受容体結合のための葉酸-FITC (100 nM) との競争相手として働く葉酸-AMPと予めインキュベートした時に、細胞の0.1%のみが葉酸-FITCを含むことが検出された (図40A)。遊離の葉酸を使用したときに同様の妨害が観察された。これらの結果は、AMPに取り込まれた葉酸部分が葉酸受容体の高い結合能を保持する、ことを示している。10O nM FITCもまた、FITCとICB細胞との間の非-特異的結合を排除するために陰性対照として含んだ。
【０２８８】
2. 葉酸pRNAの合成
従来、pRNAの特異的5'-末端修飾は、転写開始のためのGMPSを用いるT7 RNAポリメラーゼの使用によって達成している (Garver他, RNA 1997;3: 1068-1079)。かかる適用における主な限界は、「G」によるRNAの開始のみが適用され得ることである (Seelig他, Bioconjiig Chem 1999; 10: 371-378)。現在のところ、T7クラスIIプロモーターの使用によって (Huang, Nucleic Acids Res 2003; 31: e8; Pan他, Science 1991; 54: 361-1364)、アデノシンはまた、転写開始のために働き、そのため、我々は、1ステップ標識においてpRNA又は環状に並べ替えられたpRNA（cpRNA）の5'-末端にAMP誘導体を導入することができた。AMP誘導体、例えば葉酸-AMPは、開始のために使用されるだけでなく、鎖伸張のために使用され得る。よって、標識は5'-末端のみで起こることを確実にする。
【０２８９】
pRNAのin vitro転写は、葉酸-AMP及びATP、並びにCTP、UTP及びGTPの存在下で実行した。異なったモル比のAMP:ATPは、転写反応で試験した。我々の結果は、16:1が、RNA産生の総収率及び葉酸標識を担持するpRNAのパーセンテージを考慮して、葉酸-AMP対ATPの最も良い比であることを我々の結果は示す。葉酸で標識したRNAは、変性尿素/PAGE上で、非-標識RNAと比べて、より遅い移動率を有した (図41A)。結果は、最適な転写条件下で、ゲルから推定されるように、RNAの60%超が葉酸部分を含む、ことを示している（図41A）。
【０２９０】
3. 鼻咽喉癌細胞への葉酸-pRNAの結合
モーターpRNAモノマーのサイズは、11 nmであると決定した (Hoeprich他, J Biol Chem 2002; 277(23): 20794-20803)。このナノメートル-スケール粒子の葉酸標識との結合を試験した。5'-オーバーハングを有するpRNA（7-106）は、受容体結合のための5'葉酸の近接性を増加させるために構築した (図41B)。[3H]UTPは、RNAを一様に標識するために、転写反応において含めた。[3H]-葉酸-RNAは、葉酸無しのRNAと比べてKB細胞と強い結合を示した (図41B)。結合は遊離の葉酸によって妨害されるので、葉酸受容体によって介在される結合の特異性を証明した。3'末端の劣性平滑末端化又はオーバーハングは、葉酸-pRNAの受容体への結合効率を顕著に減少させた。
【０２９１】
4. 葉酸-pRNA及びsiRNAキメラを含むナノ粒子と鼻咽喉癌細胞との結合
Phi29 pRNAは、サイズが約20nmの所望の安定ダイマーを産生するために設計され得る2つの連結ループを含む (Hoeprich他, J Biol Chem 2002; 277(23): 20794-20803; Chen他, J Biol Chem 2000; 275(23): 17510-17516)。例えば、pRNA (A-b')は、それぞれ、pRNA (B-a')の左手ループa'（3'C85C84U83G82）及び右手ループB（5' A45C46G47C48）と対を形成し得る、右手ループA (5'G45G46A47C48) 及び左手ループb' (3'U85G84C83G82) を含む（図42）。キメラpRNA/siRNAモノマーは、遺伝子サイレンシング機能及びpRNA二次構造に影響を与えることなく、pRNAの二重鎖ヘリックス部位をsiRNA配列と置換することにより構築した (Guo他, Human Gene Therapy 2OO5; 16: 1097-1109 [実施例12]; Khaled他, Nano Letters 2005; 5: 1797-1808 [実施例11])。ナノ粒子を含む送達可能な葉酸は、連結ループの相互作用を介して、葉酸-pRNA (B-a')をキメラpRNA/siRNA (A-b')の等モル量と混合することによって複合化した（図42）。ダイマーの形成は、天然-PAGE、cryo-AFM (図42) 及び超遠心によって証明した。葉酸受容体へのこのようなpRNAダイマーの結合能を評価するために、[3H]-(A-b') pRNA及び非標識葉酸-(B-a') pRNAからなるRNA複合体をKB細胞でインキュベートした。葉酸-標識RNAダイマーは、葉酸標識を有さない対照RNAダイマーと比較して非常に強い結合を示した（図42）。結合特異性は、遊離の葉酸による封鎖で証明した。
【０２９２】
5. 鼻咽喉癌細胞への葉酸-pRNA及びsiRNAキメラを含むナノ粒子の侵入
キメラpRNAダイマー上の葉酸部分がKB細胞への複合体の侵入を介在できたか否かを決定するために、siRNAを、特定の遺伝子サイレンシングのための複合体に複合化した。葉酸及びホタル・ルシフェラーゼに対するsiRNAを含む1.75 μM RNAダイマーをKB細胞にトランスフェクトするよりもむしろ、KB細胞でインキュベートした。葉酸-RNAダイマーによって処理された細胞中のホタル・ルシフェラーゼの発現レベルは、RNA処理無しの細胞の30%まで減少した。対照的に、対照の葉酸無しRNAダイマーで処理した細胞は、ルシフェラーゼ遺伝子発現の85%を維持した。ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子の特異的ノックダウンは、トランスフェクション試薬の非存在下で、キメラpRNAダイマーの葉酸受容体-介在内在化によって達成された。
【０２９３】
6. ダイサーによるsiRNAへの、pRNAキメラ及びダイマーpRNAキメラの複合体のプロセシング
我々の先の仕事は、pRNAの5'/3'末端に付加された外来配列、例えばsiRNA又はハンマーヘッド型リボザイムが、細胞において生物的機能を保持したことを明らかにした (Hoeprich他, Gene Therapy 2003; 10(15): 1258-1267; Guo他, Human Gene Therapy 2005; 16: 1097-1109 [実施例12]; Khaled他, Nano Letters 2005; 5: 1797-1808 [実施例11])。本研究において、ホタル・ルシフェラーゼ又はウミシイタケ・ルシフェラーゼをターゲッティングするキメラpRNA/siRNAを構築し、一時的トランスフェクションによってサイレンシング効率を試験した。キメラsiRNA構築物は、二重レポーターアッセイによって証明されるように、その標的遺伝子を特異的かつ効率的に抑制した。そこでは、2つの異なったルシフェラーゼの発現レベルを、当該ルシフェラーゼの1つをターゲッティングするsiRNAを担持するキメラpRNAの存在下で測定した。非-標的ルシフェラーゼは内部対照として働いた。変異がpRNA複合体のsiRNAに導入したときに、ルシフェラーゼ遺伝子のサイレンシングは起こらなかった (図43)。
【０２９４】
上で示したノックダウン効果がsiRNA-特異的であるか否かを決定するために、キメラpRNA/siRNAモノマー又はダイマーは、細胞溶解物、又は長い二重鎖RNAを22-bp siRNAにプロセシングする独自の機能が知られている (Carmell他, Nat Struct Mol Biol 2004; 11: 214-218) 組換え精製ダイサーで処理した（図44）。
【０２９５】
5'-[γ32P]-pRNA/siRNA複合体の細胞溶解物によるインキュベーションは、キメラRNA複合体の、29-塩基二重鎖siRNAへのプロセシングをもたらした（非表示）。単一鎖ループへの連結部位のフォールディングの自由エネルギーを増加させるために、3方向連結部での2つのウリジンを意図的に導入したので、かかるプロセシングが予想される。29-塩基二重鎖siRNAを担持するpRNA/siRNA複合体の精製ダイサーによるインキュベーションは、変性尿素PAGEによって明らかにされるように、キメラRNA複合体の、22-塩基二重鎖siRNAへのプロセシングをもたらした（図44）。これらの結果は、キメラpRNA/siRNA複合体が、特異的に開裂して、5'/3'末端で機能性二重鎖siRNAを放出し、そしてRNA複合体が細胞に送達された後に、遺伝子サイレンシングの機能は、siRNAから生じた、ことを示唆する。キメラpRNA/siRNAのダイマー形成は、機能性siRNAのプロセシング及び放出を妨害しなかった。
【０２９６】
7. 動物試験は、サバイビンに対するキメラsiRNAのex vivo送達による癌細胞の腫瘍原性の特異的抑制を証明する
動物試験は、pRNA(A-b')/葉酸及びpRNA(B-a')/siRNA (サバイビン）を含むダイマーを用いてex vivo送達によって特異性を試験するために行った。胸腺欠損ヌードマウスで、腫瘍形成を抑制するこのRNAダイマーの可能性を試験した。脇毛注射によってヌードマウスに導入する前に、KB細胞を様々なRNA試料でインキュベートした。細胞のみを与えた8匹のマウスの内の4匹は、３週間以内に腫瘍を発生した；葉酸標識無しのダイマー [pRNA (B-a') + pRNA/siRNA (サバイビン) (A-V)] を与えた8匹のマウスの内の6匹は、腫瘍を発生し、ダイマー[pRNA (B-a') + pRNA/変異体siRNA (A-V)] を与えた8匹のマウスの内の8匹は、腫瘍を発生した。これらのマウスの各群は、注射から41日内に100 mm3を超える平均腫瘍サイズを示した。これに対して、pRNA(A-b')/葉酸及びpRNA (B-a')/siRNA (サバイビン) を有するダイマーで予め処理した細胞を与えた8匹のマウスの内の1匹のみが、腫瘍を発生した。この1匹のマウスは、1週間以内にプラークを形成し、これは、他の群のいずれのマウスよりも非常に早かった。従って、これらの特定の環境を考慮すると、このマウスは異常値として扱った。腫瘍形成の阻害は、対照のマウス群で使用された葉酸複合体無しの対照のダイマーRNAが腫瘍発生に影響を与えなかったので、特異的である。
【０２９７】
考察
この仕事の目標は、葉酸受容体を介する鼻咽喉癌細胞へのキメラsiRNAの送達のための葉酸-複合化phi29 pRNAを構築することである。葉酸-標識は、T7IIプロモーターによるRNA転写の開始剤として葉酸-AMPを利用することによって達成された；しかし、高濃度で使用した場合に、葉酸-AMPは、転写収量に対して阻害効果を有することがある。siRNA配列を運ぶためのベクターとしてファージphi29 pRNAを使用した。加えて、乳癌細胞及び卵巣癌細胞は、特異的に葉酸-FITCにより染色された。このことは、この送達法もまた、癌細胞の少なくとも2つの更なる種類に適用できることを示唆している。
【０２９８】
pRNA/siRNAがダイサーによりプロセスされ、遺伝子発現の特異的抑制をもたらした二重鎖siRNAの二重鎖を放出した。安定なpRNAダイマーは、2つのpRNを混合することにより生成した。そのうちの1つは、葉酸標識を運び、他方のpRNAはsiRNA配列を運んだ。トランスフェクション反応の非存在下で、このRNA複合体をKB細胞と混合するとき、葉酸部分は、(1) ダイマー複合体の結合を介在し、(2) 標的化されたルシフェラーゼ遺伝子発現のノックダウンを介在することが明らかとなった。更に、腫瘍成長の抑制は、腫瘍発生において重要な役割を果たす、サバイビン遺伝子に対する葉酸-siRNA複合体をインキュベートすることによってマウス試験において達成された。
【０２９９】
Phi29 pRNAは、各pRNAの連結ループの相互作用の結果としてダイマーを形成する。将来、キメラトリマー又はヘキサマーでさえも、連結ループの配列を設計することによって結集するだろう。pRNAの多価性は、細胞認識、検出、エンドソーム脱出及び遺伝子抑制を含む様々な機能を有する多数の成分の運搬を容易にするだろう。ヌクレオチド誘導体は、安定なRNase-抵抗性RNAを作製するために利用して、サイレンシング効率を改善するだろう (Soutschek他, 修飾siRNAの全身性投与による内因性遺伝子の治療的サイレンシング, Nature 2004; 432: 173-178)。この多価性RNA複合体は、感染細胞表面上に存在する特定のウイルス-糖タンパク質をターゲッティングすることによってHIV又はHBVによって起こる慢性ウイルス感染症を治療するために潜在的に有用であり得た。
【０３００】
この方法の1つの利点は、遺伝子サイレンシングが、単に、カチオン性脂質又はCaCl2から得られるトランスフェクション試薬の助けを借りずに、RNA複合体と癌細胞とを混合することによって達成され得ることである。より重要なことには、癌細胞は、発症の様々なステージで様々な痕跡受容体を発現するので、エンドサイトーシスし得る受容体の中には、受容体リガンドで標識した治療的試薬の侵入を介在するための担体として使用され得るものもある。送達ビヒクルとしてRNAを使用する別の利点は、免疫応答及び繰り返される長期間の薬物投与の後のタンパク質ベクターの拒絶という問題を避ける能力である。
【０３０１】
実施例 14 様々な癌細胞におけるアポトーシスの挿入のための、バクテリオファージPhi29 pRNA/リボザイムキメラ標的サバイビン
本明細書に記載したように、バクテリオファージphi29モーターpRNAは、リガンド、アプタマー又はsiRNAを運ぶキメラpRNAの連結ループを介する治療的RNAの特異的細胞送達のための多価性RNAナノ粒子を構築するために設計されてきた。本実施例では、我々は、送達可能なRNAナノ粒子の集合体のための追加のサブユニットとしてキメラリボザイムの構築を報告する。このキメラの遺伝子サイレンシング効果は、mRNA及びタンパク質レベルに証明された。キメラは、顕著なレベルの非-特異的細胞毒性を引き起こすことなく、乳癌、前立腺癌、子宮頸癌、鼻咽喉癌及び肺癌を含む様々なヒト癌細胞株の細胞死を引き起こした。キメラは、送達可能な複数のサブユニット複合体を形成するその能力を維持した。
【０３０２】
担体への融合及び異常細胞輸送後の分解、ミスフォールディングによって起こる低in vivo効率に関する治療的リボザイム適用における障害を解消するために、リボザイムを、環状に並べ替えられたpRNAの堅く折り畳まれた5'/3'原始的末端に連結し、好適なフォールディングを確実にし、安定性を増加させた。
【０３０３】
導入
pRNA又はパッケージングRNAは、バクテリオファージphi29によってコードされた117nt小RNAである。我々は、この小RNAが、ウイルスゲノムRNAパッケージングにおいて新規かつ必須であることを証明した (Guo他, Science 1987; 236: 690-694). Six copies of wild type pRNA form a hexameric ring (Guo他, Mol. Cell. 1998; 2: 149-155; Trottier他, J. Virol. 1997; 77: 487-494)。これは、協力して、ATP-依存的方法でDNA-パッケージングモーターを駆動する (Guo, Prog in Nucl Acid Res & Mole Biol. 2002; 72: 415-472, 及びGrimes他, Adv. Virus Res. 2002; 58: 255-294参照)。各pRNA分子は、2つの機能性ドメインを含む。分子間相互作用ドメイン（中央部位のヌクレオチド23〜97番）は、右手ループ及び左手ループを含む (Reid他, J Biol Chem 1994; 269: 5157-5162; Chen他, J Biol Chem 2000; 275(23): 17510-17516; Garver他, RNA. 1997; 3: 1068-1079; Chen他, RNA 1999; 5: 805-818)。これらの2つの連結ループ間の配列特異的相互作用は、pRNAのマルチマー形成のために必須である。加えて、これらの2つのループの配列は、Mg2+の存在下、安定なダイマー、トリマー又はヘキサマーを形成するために、任意に設計し得る。第2ドメインは、5'/3'対末端に位置する二重鎖ヘリックス構造であり、これは、phi29モーターによるDNAパッケージングにおいてpRNAの機能に必須である (Zhang他, Virology 1994; 201: 77-85)。これらの2つのドメインは、互いに独立に折り畳む。我々は、DNA-パッケージングドメインの除去がpRNAの分子間相互作用の性質を変更しないことを見出した。例えば、ヌクレオチド23番の前のヌクレオチド又はヌクレオチド97番の後のヌクレオチドの置換又は挿入は、ダイマー、トリマー及びヘキサマーの形成を妨害しない (Hoeprich他, Gene Therapy 2003; 70(15): 1258-1267; Chen他, RNA 1999; 5: 805-818; Shu他, J Nanoscicind Nanotech (JNN) 2003; 3: 295-302)。従って、pRNAの5'/3'二重鎖ヘリックスドメインは、外来配列を運ぶために利用され得る (Zhang他, RNA 1995; 7: 1041-1050)。
【０３０４】
pRNAモノマー、ダイマー、トリマー及びヘキサマーの3次元コンピュータモデルは、我々の研究室で構築された (Hoeprich他, J Biol. Chem. 2002; 277(23): 20794-20803)。これらの3Dモデルの構築は、化学修飾 (Zhang他, Virology 2001; 257: 281-293; Trottier他, RNA 2000; 65:1257-1266)、光アフィニティ架橋 (Garver他, RNA 1997; 3: 1068-1079)、相補的修飾 (Zhang他, Virology 1994; 201: 77-85; Zhang他, RNA 1995; 1: 1041-1050; Zhang他, RNA 1997; 3: 315-322; Wichitwechkarn他, J Mol. Biol 1992; 223: 991-998; Reid他, J Biol Chem 1994; 269: 18656-18661)、化学修飾干渉 (Mat-Arip他, J Biol Chem 2001; 276: 32575-32584)、ヌクレアーゼプロービング (Reid他, J Biol Chem 199 A; 269: 5151-5162; Chen他, J. Virol. 1997; 77: 495-500), competition assays (Trottier他, J. Virol. 1997; 71: 481-494)、オリゴターゲッティング (Zhang他, Virology 1995; 277: 568-576)、及びcryo-原子間力顕微鏡 (Chen他, J Biol Chem 2000; 275(23): 17510-17516; Trottier他, RNA 2000; 6: 1257-1266)(Mat-Arip他, J Biol Chem 2001; 276: 32575-32584) を含む様々な実験データに基いた。phi29 pRNAの独特な構造的特徴についての我々の理解は、pRNA分子の更なる設計を可能にする。すなわち、pRNA分子を、遺伝子ターゲッティングRNA複合体の骨格としても役立つ追加のRNA配列を運ぶためのビヒクルに変える。
【０３０５】
我々は、最近、pRNAと、受容体-結合RNAアプタマー、葉酸 (Guo他, Gene Then 2006. May; 13 (10): 814-20) [実施例13])、小干渉RNA (siRNA) (Guo他, Human Gene Therapy 2005; 16:1097-1109 [実施例12])(Khaled他, Nano Letters 2005; 5: 1797-1808 [実施例H]) 及びリボザイム (Hoeprich他, Gene Therapy 2003; 70(15): 1258-1267) との融合が、ダイマー形成を邪魔せず又は挿入された部分の機能を妨害しない、ことを見出した。HBV ポリAシグナルをターゲッティングするpRNAリボザイムキメラは、通常のリボザイムに比較して、高いHBV複製の阻害効果を示した (Hoeprich他, Gene Therapy 2003;  10(15): 1258-1267)。キメラpRNAサブユニットの優位性に加えて、我々はまた、pRNAが、ナノテクノロジーにおいてボトムアップ型集合体の構築単位として使用され得ることを記載した (Shu他, Nano Letters 2004; 4: 1717-1724)。受容体-結合モチーフを含む三価のナノスケール粒子のインキュベーションは、細胞への治療的分子の結合及び同時-侵入をもたらし、次いで標的細胞のアポトーシスを調節した。pRNAから結集されたかかるタンパク質無しのナノ粒子の利用は、抗原性を大幅に減少させ、繰り返される長期間投与を可能にするだろう。pRNA型ナノ構造のサイズは、小分子の短い維持時間、及び100 nm超の粒子を送達する際の困難性という問題を解消するだろう。本明細書では、我々は、標遺伝子の特異的ダウンレギュレーションを明らかにし、非-特異的毒性を起こすことなく、プログラムされた細胞死を誘発する、siRNAか、サバイビンをターゲッティングするハンマーヘッド型リボザイムへの治療的RNAの選択を拡げた。
【０３０６】
材料及び方法
RNAのin vitro合成
RNAの合成は、先に記載されている (Zhang他, Virology 1994; 201: 77-85)。すなわち、IDT製のDNAオリゴ（表4；図54A）は、PCRによるdsRNA鋳型を作製するために使用した。T7プロモーターを含むDNA産物は、直接的なin vitroRNA転写のための鋳型として使用した。全てのRNAはゲル精製し、H2Oで処理したDEPCに再懸濁した。10 mMのマグネシウムは、pRNAの分子間相互作用及びフォールディングを維持するために全ての緩衝剤に加えた (Chen他, J Biol Chem 2000; 275(23): 17510-17516; Mat-Arip他, J Biol Chem 2001; 276: 32575-32584)。pRNAの名称及び送達可能なRNAナノ粒子の構築のための得られたキメラpRNAサブユニットは報告されている (Chen他, RNA 1999; 5: 805-818; Khaled他, Nano Letters 2005; 5: 1797-1808 [実施例H])。pRNA/RZ(Sur) は、pRNA/リボザイム（HBV）の構築と同一の方法に従って、サバイビンをターゲッティングするハンマーヘッド型リボザイムを担持するpRNAキメラ、B型肝炎 (HBV) ポリAシグナルの成功的な開裂のためのハンマーヘッド型リボザイムを運ぶためのpRNA-型ベクターを有するキメラRNAを表す (Hoeprich他, Gene Therapy 2003; 10(15): 1258-1267)。pRNA/リボザイム(HBV) (Hoeprich他, Gene Therapy 2003; 10(15): 1258-1267) も本研究で使用され、pRNA/RZ(mut3)と称される。
【０３０７】
トランスフェクションによるpRNA/RZ(Sur)の遺伝子サイレンシング効率のアッセイ
pRNAキメラで細胞をトランスフェクションする方法は、既に報告されている (Klialed他, Nano Letters 2005; 5: 1797-1808 [実施例11])。ヒト子宮頸癌細胞Hela T4を24-ウェル培養ディッシュに播き、37℃/5% CO2で終夜インキュベートした。翌日、培地を抗生物質無しの培地と交換し、細胞を、リポフェクタミン2000 (Invitrogen) を用いて、0.5 μg、0.1 μg又は0.02 μgのpRNA構築物で、別々に1処理当たり3点でトランスフェクトした。6時間後、トランスフェクション溶液を10% FBS及び抗生物質で補充した標準培地と交換した。細胞生存性を決定するために、テトラゾリウム-系MTTアッセイを行った。KB、LNCaP及びMDA-MB-231細胞について、類似のアッセイを行った。
【０３０８】
ウェスタンブロットアッセイ
T47Dヒト乳癌細胞60 mmディッシュに播き、10% FBS及びペニシリン/ストレプトマイシンで補充したDMEM中で、70%コンフルエンスになるまで増殖させた。トランスフェクションの前に、細胞を抗生物質無しの培地と交換し、次いで陰性対照として、サバイビンをターゲッティングするpRNAキメラ又は変異体キメラリボザイムでトランスフェクトした。製造者の教示に従ってリポフェクタミン2000を使用した。トランスフェクションの12、16、20及び24時間後に、溶解緩衝剤で細胞を濯ぎ、採取した。タンパク質濃度を決定し、タンパク質の同量を12% ポリアクリルアミドゲルに装填した。タンパク質を溶解し、半-乾燥トランスファー（BioRad）を用いてニトロセルロース膜に転写した。膜をブロックし、一次抗体ペルオキシダーゼでインキュベートし、製造者の教示に従って二次抗体に複合化した (Amersham ECLキット)。化学発光プローブの活性化した後、膜をフィルムに露光させた。
【０３０９】
フローサイトメトリーでPI/アネキシンV二重染色法を用いるMCF-7のアポトーシスのアッセイ
当該方法は報告されている (Guo他, Human Gene Therapy 2005; 16: 097-1109 [実施例12])。すなわち、ヒト乳癌細胞MCF-7は、10% FBS及びペニシリン/ストレプトマイシンで補充したDMEM培地で増殖させ、0.5 x 105細胞/ウェルの濃度で24-ウェルプレートに播いた。トランスフェクションは、0.5 μgリボザイム/ウェル、3点/処理で行った。トランスフェクションの48時間後、アネキシンV-ヨウ化プロピジウム（PI）二重染色法により、乳癌細胞MCF-7のアポトーシスを評価した。
【０３１０】
リアルタイムPCRアッセイ
MCF-7細胞を0.5 x 105細胞/ウェルの濃度で24-ウェルプレートに播いた。トランスフェクションは、0.5 μg RNA/ウェル、3点/処理で行った。トランスフェクションの48時間後に細胞を採取し、総RNAをQIAamp RNAキット (Qiagen) で抽出した。逆転写は、RevertAidTM First Strand Synthesis Kit (Fermentas) を用い、1 μgのRNAで行った。
【０３１１】
SYBR緑色色素の存在下にQuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit (QIAGEN) 及びABI PRISM 6700リアルタイムPCR検出器 (Fengling Biotechnology Inc.) を用いて、同量のcDNAをPCRに供した。サバイビンのプライマーは、5'-AAA GAG CCA AGA ACA AAA TTG C-3' 及び5'-GAG AGAGAA GCA GCC ACT GTT AC-3'であり、これらは先に公表されている (Weikert他, Fertil. Steril. 2005 Apr 1983; 1100-1105)。PCRは、95℃で0.5秒、60℃で10秒及び72℃で10秒を40サイクル行った。鋳型無しのPCRを陰性対照として使用した。β-アクチン内因性ハウスキーピング遺伝子を内部対照として使用した。β-アクチン及び陰性対照は、対象の実験遺伝子と同一のプレートで増幅した。各試料を、サバイビンとβ-アクチンとの間の臨界閾値（CT）の差を用いて正規化した。以下の式：
ΔΔCTサバイビン=ΔCTサバイビン−ΔCTβ-アクチン
（ここで、ΔCTサバイビンは、サバイビンと陰性対照との最大のCTの差であり、ΔCTβ-アクチンは、β-アクチンと陰性対照との差である）
は、その結果を記載するために使用した。次いで、各試料のmRNAレベルを、発現2ΔΔCTサバイビンを用いて比較した。各群の結果を平均した。非-トランスフェクト試料の発現レベルを任意に値1に帰属し、最終的な結果を、非-トランスフェクト試料に比べた倍数として表した。
【０３１２】
ハンマーヘッド型リボザイムによるin vitro開裂
サバイビンmRNAターゲッティングリボザイムpRNA/RZ(Sur) 及び対照リボザイムpRNA/RZ(Mut2) の開裂反応を、20 mM Tris pH 7.5、20 mM MgCl2及び150 mM NaClの存在下で、37℃で60分間行った。サバイビンmRNA (200 ng) の部分配列を開裂するために、リボザイムRNA (5 μg) を使用した。127nt [32P]標識RNA基質は、77 nt及び50 ntフラグメントに開裂されると予想される。開裂産物は、8% PAGE/ 8 M 尿素-変性ゲルによって分離した。
【０３１３】
結果
1. リボザイムを担持するpRNAキメラの構築
癌の治療における治療的RNA分子の有効性を評価するために、腫瘍発生及び進行に関連する遺伝子を抑制することが必要である。サバイビンはアポトーシスを阻害し、癌細胞でのみ検出され、健常な成人細胞では検出されないので、サバイビンを標的として選択した。サバイビンの抑制が癌細胞のアポトーシスを誘発することは先に報告されている (Grossman他, Proc Natl Acad Sci 2001; 98: 635-640; Frey他, J Struct Biol 1999; 727: 94-100)。
【０３１４】
pRNAベクター配列に基づくpRNA/RZ(Sur) RNAキメラは、サバイビンmRNAを標的するために構築した（図45）。サバイビンをターゲッティングするリボザイムは、pRNAの5'/3'末端に連結し、pRNAは環状に並べ替えられた形態として再構成した (Pennati他, J Clin. Invest 2002; 109: 285-286)。先に記載したように、phi29 pRNAは、分子間相互作用ドメイン及び二重鎖ヘリックスドメインを含む。これらの2つのドメインは、互いに独立に折り畳み、塩基23番の前の5'末端の塩基及び塩基97番の後の3'末端の塩基の付加又は欠損は、pRNAの正確なフォールディング及びpRNAの全体的構造に影響を与えない (Zhang他, SNA 1995; 1: 1041-1050)。環状に並べ替えられたpRNAは、そのフォールディングに影響を与えることなく構築された (Zhang他, Virology 1995; 207: 442-451)。2つのリンカー配列は、リボザイムとpRNAベクターとを連結するために使用した。環状的並べ替えの方法は、リボザイム及びpRNAベクターの独立かつ正確なフォールディングを確実にし、pRNAキメラの原始的5'/3'末端を堅く折り畳まれた部位に再配置し、エキソヌクレアーゼ消化pRNAを保護することである。本研究では、変異のキメラリボザイムを使用した（図45）。
【０３１５】
2. pRNA/RZ(Sur)キメラは、試験された全ての癌細胞で特異的にアポトーシス及び細胞死を誘発した
a. ヒト乳癌細胞におけるキメラpRNA/RZ(Sur) の効果
4つの乳癌細部株、MCF-7、T47D、MDA-MD-231及びMDA-MB-453で、pRNA/RZ(Sur)を試験した。トランスフェクション後に、細胞のほとんどは縮み、細胞培養プレートから剥がれたが、対照pRNA/RZ(mut3) は、細胞変化を起こさなかった (図46、表5及び図54B)。様々なキメラリボザイムの効果をMDA-MD-231及びMDA-MB-453細胞でMTTアッセイにより測定したときに、pRNA/RZ(Sur) は強くかつ用量-依存的な細胞生存阻害を示したが、pRNA/RZ(mut3) は何の効果も示さなかった (図47)。
【０３１６】
この結果は、キメラpRNAが非-特異的細胞毒性を示さなかったことを示している。しかしながら、一時的なトランスフェクションによって乳癌細胞に導入したときに、pRNA/RZ(Sur) は、用量-依存的に特異的に細胞死を誘発できた。
【０３１７】
b. ヒト子宮頸癌細胞におけるキメラpRNA/RZ (Sur) の効果
ヒト子宮頸癌細胞のアポトーシスを誘発するその機能を評価するためにどうにかして、pRNA/RZ(Sur) をトランスフェクションによるヒト子宮頸癌Hela T4細胞に導入した。トランスフェクション後に様々な時点で細胞生存を測定した。図48に示すように、pRNA/RZ(Sur) による処理は、RNAを含まない対照に比べて、細胞生存の用量-依存的減少をもたらした。pRNA/RZ(mut3) 処理細胞については、異なったRNA用量を使用したときに生存率に顕著な相違は観察されなかった。このことは、非-特異的毒性を引き起こすことなく、Hela T4細胞に対してpRNA/RZ(Sur)が働くことを示している。
【０３１８】
c. 鼻咽喉癌細胞におけるキメラpRNA/RZ(Sur) の効果
ヒト鼻咽喉癌KB細胞をpRNA/RZ(Sur) 及び陰性対照としてのpRNA/RZ(mut3) に曝露した。図49に示すように、KB細胞は、トランスフェクション後にpRNA/RZ(Sur) に顕著に反応した。変異体リボザイムによって誘発された非-特異的毒性は、用量を増やした場合でも顕著ではなかった。このことは、他の癌細胞で見られるように、キメラサバイビンリボザイムによって起こった細胞死が特異的であることを示している。
【０３１９】
d. 前立腺癌細胞におけるキメラpRNA/RZ(Sur) の効果
ヒト前立腺癌細胞株LNCaPは、pRNA/RZ(Sur) 又はpRNA/RZ(mut3)（後者は陰性対照として働く）の異なった用量でトランスフェクトした。トランスフェクションの12又は24時間後に、前立腺癌細胞は、pRNA/RZ(Sur) の処理のみに対して強く反応したが、対照RNAは細胞生存率にほとんど影響を与えなかった（図50）。細胞生存性の減少は、非-特異的RNA毒性によって起こる代わりに、サバイビンリボザイムに対応する配列に依拠したことを示唆している。
【０３２０】
e. ヒト肺癌細胞に対するキメラpRNA/RZ(Sur) の効果
ヒト肺癌細胞株A-549は、pRNA/RZ(Sur) 又はpRNA/RZ(mut3) の異なった用量でトランスフェクトした。トランスフェクション後に、A-549細胞は、pRNA/RZ(Sur) の処理に対して強く反応し、培養プレートのウェルから直ちに減少したが、対照pRNA/RZ(mut3) は細胞生存率にほとんど影響を与えなかった（表2）。細胞生存性の減少は、非-特異的RNA毒性によって起こる代わりに、サバイビンリボザイムに対応する配列に依拠したことを示唆している。
【０３２１】
3. mRNA及びタンパク質レベルにおけるpRNA/RZ(Sur) によるサバイビン発現の特異的阻害
サバイビンの発現を抑制するその予測された機能を試験するために、pRNA/RZ(Sur) をサバイビンが大量に発現されたMCF-7及びT47Dヒト乳癌細胞に導入した。リアルタイムPCR及び免疫-ブロッティング分析は、サバイビンのmRNA及びタンパク質発現が顕著に減少し、一時的トランスフェクションの16時間後にほとんど全てなくなった、ことを明らかにした（図51及び52）。反対に、非-特異的な変異体対照処理細胞も、非処理細胞も、サバイビン発現をほとんど減少しないことが明らかになった。このことは、pRNA/RZ(Sur) が作用した特異性を証明する。図52から明らかなように、pRNA/RZ(Sur) により処理は、対照群と比べて、サバイビンタンパク質の時間依存的減少をもたらした。pRNA/RZ(Sur) によるサバイビンmRNAの特異的開裂は、図5Bに示した。触媒コアに2つの塩基の変異を含む変異体pRNA/RZ (mut2) がRNA開裂産物を産生しなかったので、特異性は証明された。
【０３２２】
4. キメラはネクローシスの代わりにアポトーシス起こす
pRNA/RZ(Sur) が抗-アポトーシス因子サバイビンの発現停止によって起こるアポトーシスを誘発し、ネクトーシスを非-特異的に促進するか否かを決定するために、アネキシンV-ヨウ化プロピジウム（PI）二重染色、次いでpRNA/RZ(Sur) でトランスフェクトした乳癌細胞に対するフローサイトメトリー分析を行った。図46Bに示すように、MCF-7細胞の25%±8.6は、アポトーシス細胞を表す右下四分画の細胞集団に示すように、RNA処理後にアポトーシスを受けた。反対に、変異体3で処理した細胞は、pRNAベクターのみで処理した細胞 (2.1%±0.3) に比べて、アポトーシス細胞が僅かに増加したに過ぎなかった（3.6%±0.2）。右上四分画に示すように、ネクローシス細胞は、RNA処理後にほとんど増加を示さなかったが、RNA処理の最初の段階の癌細胞におけるネクローシスの代わりに、RNA/リボザイムがアポトーシスを起こしたことを示している。
【０３２３】
5. pRNAキメラの安全性の試験
pRNAキメラの安全性は、インキュベーション及びトランスフェクション実験において高用量のpRNAキメラを用いて試験した。様々なpRNAキメラの濃度による細胞のインキュベーションは、細胞に対する顕著な毒性を起こさなかった（図37；実施例12参照）。pRNA/siRNA(サバイビン) 又はpRNA/RZ(Sur) による癌細胞のインキュベーションは、トランスフェクション試薬の非存在下で、最高72時間、細胞死を起こさなかった (Guo他, Human Gene Therapy 2005; 16: 097-1109 [実施例12]。このことは、キメラpRNAが、インキュベーションに対して非-特異的細胞毒性を示さなかったことを示している。しかしながら、トランスフェクションによって細胞に導入したときに、pRNAキメラは、乳癌、前立腺癌及び肺癌由来の細胞の死を引き起こした。しかし、サバイビンリボザイム配列を含むキメラpRNAのみは、細胞生存性の顕著な阻害を起こした。図48、49、50及び51に示すように、対照pRNA/RZ(mut3) は、B型肝炎の複製を阻害し、リボザイム配列を除いてpRNA/RZ(Sur) と同一のベクター配列を含むが、高RNA濃度でさえ、細胞死に顕著な阻害効果を示さなかった。
【０３２４】
6. ダイマー及びトリマーナノ粒子の集合におけるpRNA/RZ(Sur) の能力
効率的なRNA-型標的療法には、特異的細胞認識及び特定の遺伝子サイレンシングが必要とされる。しかしながら、機能性RNA分子の融合又は複合化は、ミスフォールディング及び機能の喪失をまねくことがある。pRNAダイマー構築は、これらの2つの局面を達成するための代替的な方法である。理想的には、追加のRNAモチーフ又は化学物質は、他の仕事、例えば、エンドソーム破壊、処理後の細胞運命の検出、及び複数のターゲッティングによる治療効果の亢進、を行うために送達複合体に組み込まれ得る。近年、多価性RNA複合体は、phi29 pRNAキメラを用いて構築されている。ダイマー又はトリマーは、受容体-結合RNAアプタマー又はsiRNAを担持する設計されたキメラpRNAの連結ループ/ループ相互作用によって結集された (Guo他, Human Gene Therapy 2005; 16: 097-1109 [実施例12]; Khaled他, Nano Letters 2005; 5: 1797-1808 実施例H))。pRNA/RZ(Sur) を構築する主な目的は、送達ナノ粒子としてのpRNAキメラのダイマー又はトリマーの1つのサブユニット構築単位を設計することである。pRNA/RZ(Sur) は、天然ゲル電気泳動、及び他の物理的方法（データ非表示）、例えば超遠心及び単一分子計数によって証明されるように、ダイマー及びトリマー形成に能力を有することが見出され（図53）、ダイマーの形成は、pRNA/RZ(Sur)(A-b') とpRNA(B-a') とを混合することによって達成した。トリマーの形成は、pRNA/RZ(Sur)(A-b') とpRNA(B-e') 及び (E-a') とを混合することによって達成した (Guo他, Mol Cell. 1998; 2: 149-155; Chen他, RNA 1999; 5: 805-818; Zhang他, Mol. Cell 1998; 2: 141-147)。これは、安定なRNAダイマー又はトリマーが、サバイビンリボザイムのpRNAベクター配列への付加にもかかわらず、キメラRNAモノマー型構築単位から生成することを示している。そのため、pRNA/RZ(Sur) は、ダイマー/トリマーRNAナノ粒子を結集するために使用でき、多価性RNA送達系の更なるメンバーであろう。
【０３２５】
考察
RNA治療薬は、現代の医薬において最も有望な方法の1つであると考えられている。他の治療薬において問題であるように、毒性及び特異性は、開発における2つの主な問題である。我々は、低毒性の治療的RNA複合体の探索に我々の努力を注いできた。先に、我々は、phi29 pRNAが、B型肝炎ウイルス複製の阻害のためにリボザイムをエスコートするベクターであり得る、ことを見出した (Hoeprich他, Gene TJierapy 2003; 10(15): 1258-1267)。pRNA/RZ(Sur) は、特定の細胞死を誘発するために有効であることが見出された。各々の治療的RNAは独自の配列を含むので、安全性の問題は細胞種に依拠し、ケースバイケースの問題である。例えば乳癌細胞株MCF-7は、他の乳癌細胞株に比べて、非常に脆く、かつRNAトランスフェクションにより感受性である。そのため、我々は、乳癌、前立腺癌、子宮頸癌、鼻咽喉癌及び肺癌を含む様々な癌細胞株を試験した。pRNA/RZ(Sur) は、癌細胞アポトーシスを誘発する点で非常に効率的であることを見出した。しかしながら、我々は、このRNAキメラが全ての細胞種について安全であるとは言えない。我々はまた、サバイビン遺伝子の転写物に対する発現停止効率を評価するために、リアルタイムPCRによって、最も脆くかつ感受性であるMCF7細胞で、このRNAキメラを試験した。我々は、たとえ当該分子がサバイビン遺伝子の発現を特異的に停止することができるとしても、サバイビンmRNAの発現はまた、変異体によって若干減少する、ことを見出した (図51)。明らかに、かかる減少は、非-特異的RNA効果によって起こる。従って、安全性の問題は再度解決されなければならない。分子的治療は、細胞への治療剤の送達を含むので、癌治療における目標は癌細胞をなくすことであるため、特異性は毒性よりも重要である。pRNAが癌細胞に特異的に侵入でき、そして非-侵入pRNAが細胞に毒性でない限り、癌細胞の非-特異的阻害は、場合によっては、望ましい。我々の先の報告から、我々は、高濃度のpRNAキメラによる細胞のインキュベーションが顕著な細胞死を起こさなかったことを見出した。従って、pRNAキメラは、マルチマーに設計することによって、特異的に細胞にpRNAキメラが侵入できる点で、有望である。我々の努力は、細胞侵入の特異性に焦点を当てるだろう。phi29 pRNAキメラの使用の利点は、標的細胞へのRNAキメラの特異的送達の強力な方法を開発することである；従って、細胞殺傷の効果と細胞侵入の効率の効果とのバランスが評価されるだろう。
【０３２６】
我々が知っているように、phi29 pRNAは、連結ループの相互作用の結果として、ダイマー（2 pRNAの連結）、トリマー（3 pRNAの連結）及びヘキサマー（6 pRNAの連結）を形成する傾向を有する。従って、2〜6個のpRNAキメラは、ターゲッティング、治療又は検出用のRNA分子を運ぶために利用できる複数の位置を有する、RNAナノ複合体に取り込まれ得る。例えば、複合体の1つのサブユニットは、細胞表面受容体又は葉酸のようなリガンドと結合するRNAアプタマーを運ぶために変更され得た (Guo他, Gene Ther. 2006. May; 13 (10): 814-20) 実施例13)。それによって、細胞内侵のためのRNA複合体を運ぶために役立つ。残りのサブユニットは、癌細胞の消去又は検出のための、特定の治療的siRNAリボザイム、アンチセンスRNA、化学療法薬物、蛍光色素、重金属、量子点、又は放射性同位体を運ぶために修飾され得た。エンドソーム-破壊化学物質もまた、エンドソームからのRNAの放出を促進するためにRNA複合体に組み込まれることがある。加えて、これらのRNAナノ粒子（30〜40 nmのサイズ）の使用は、短維持時間に起因する小分子によるin vivoで出くわした短半減期の問題を解決し、大分子（100 nm超）によっ出くわした低送達効率の問題を解決する。RNAの免疫原性は、タンパク質と複合化したときを除いて、非常に低レベルであることがはよく知られている (Goldsby他, Immunology, 57-61頁 (W. H. Freeman and Company, New York, 2002)。タンパク質/ペプチド無しのナノ粒子の構築は、免疫反応を解決でき、長期間投与を可能にした。
【０３２７】
実施例 15. 安定性を増加させるための、キメラpRNAへのヌクレオチド誘導体の取り込み
ヌクレオチド誘導体、例えば、2'-NH2-、2'-CH3-、又は2'-F-2'-デオキシCTP；2'-F-2'デオキシUTP、又はスピーゲルマー (L-塩基アプタマー) は、血清中でRNase消化に抵抗性である安定な転写物を産生するために、キメラpRNAに取り込まれ得る。安定化修飾は、2'位置又は他の位置でなされる。pRNAの安定化は、in vivoでの治療的適用のために有利である。そこでは、pRNAナノ粒子が様々な生物的条件下で安定であり、血清中でRNaseによる消化に抵抗性であることは重要である。天然ファージphi29 pRNAは、生物試料との接触の際に、様々なヌクレアーゼによる分解を受ける。pRNAアナログは、高い生物-安定性を生じると予想される修飾ヌクレオチドによって構築され得る。より一般的には、2'-F-NTP、2'-NH2-NTP又は2'-CH3F-NTPを有する機能性pRNAは、構築され得る修飾pRNAの例を表す。
【０３２８】
T7プロモーター及び117-nt最小野生型pRNA配列を含むdsDNA鋳型から、pRNAアナログは、例えば、2'-F-NTP又は2'-NH2-NTP (Trilink Biotechnologies) を用いて調製され得る。特に、ヌクレオチド誘導体、例えば、2'-NH2-、2'-CH3、又は2'-F-2'-デオキシCTP；2'-F-2'デオキシUTP；又はスピーゲルマーは、RNase消化に抵抗性である安定なin vitroRNA転写物を産生するためにRNAに取り込まれ得る。このような安定化されたpRNAの1例は、非修飾（天然）ヌクレオチドの1又は2種、及び2'-F-; 2'-NH2-; 又は2'-CH3-スピーゲルマーヌクレオチドの1種を含む。安定化されたキメラpRNAは、細胞受容体結合リガンドを運ぶpRNAダイマー、トリマー又はヘキサマーの成分として存在するときに、癌細胞に侵入することが予想される。
【０３２９】
好ましい受容体結合アフィニティを示す安定化されたpRNAキメラは、in vitro機能性試験、例えば、ダイマー、トリマー又はヘキサマー形成能、細胞侵入の特異性、及び特定の遺伝子サイレンシングの活性、によって更に分析できる。キメラpRNAは、多数の乳癌細胞株におけるサバイビン又はBcl-2発現を抑制する点での有効性について試験できる。
【０３３０】
合成2'-NH2-、2'-CH3もしくは2'-F-2'-デオキシCTP、2'-F-2'デオキシUTP、又はスピーゲルマー修飾RNA種もまた、機能性pRNAを再-構築するために使用できる。2'-F-2'-デオキシヌクレオチドはEpicentreから入手できる。
【０３３１】
実施例 16 毒性が減少したpRNAキメラ
毒性及び特異性は、RNAの使用に基づく技術を含めて、全ての治療的方法について解決されるき2つの主な関心事である。
【０３３２】
1. 環状的並べ替え
我々は、環状に並べ替えられたpRNAキメラのために最適な環状的並べ替えを特定することによって、特異性が増大し及び/又は毒性が減少し得ることを提案する。
【０３３３】
pRNAの毒性は、その一次配列、二次構造及び三次元構造、並びに5'及び37末端の位置の開口部の位置によって影響されることがある。環状的並べ替えを用いて、様々な5'及び3'末端を有する様々なpRNA、但し、同一の配列及び三次元構造を有するものが製造できる。従って、キメラpRNAは、スペーサ部分における生物活性部分（例えば、リボザイム、アンチセンス又はアプタマー）を運ぶキメラpRNAは、様々な環状的並べ替えRNAに形造られる。pRNA部位に120ヌクレオチドを有するキメラpRNAについて、同一の配列、機能及び三次元構造を有する120種の環状に並べ替えられたRNAが製造されるだろう。これらの種類は、完全な遺伝子サイレンシング機能及びナノ粒子構築におけるダイマー又はトリマーを形成する能力を示すよりより低い毒性を有する種を特定するために選別され得る。
【０３３４】
2. 3'末端にアニールされたDNAを有するpRNA
毒性を減少させる別の方法は、その対応物よりも毒性が少ないキメラpRNAを特定することを含む。pRNAキメラsph1-pRNAは、apRNAの3'末端に26ヌクレオチド単一鎖RNAフラグメント（5' AAUCCCGCGGCCAUGGCGGCCGGGAG 3'）を付着させることによって形成した。次いで、pRNAキメラは、DNAオリゴヌクレオチドのRNAフラグメントへのアニールを許容する条件下で、RNAフラグメントに相補的であるDNAオリゴヌクレオチドと接触させた。アニールされたオリゴヌクレオチドを含む得られたpRNA構築物（図55）は、低い毒性を有することが見出された。
【０３３５】
同様に、sph1-pRNA/siRNAは、その3'末端に余分な26塩基RNA単一鎖フラグメントを有する、キメラpRNA/siRNAである。余分なRNAフラグメントは、26塩基相補DNAオリゴヌクレオチドでアニールした。得られたsph1-pRNA/siRNA (26ヌクレオチド相補DNAオリゴヌクレオチドを含む) は、(1) 低い毒性、及び (2) 保持された遺伝子サイレンシング機能を有することが見出された。低い毒性は、MTTアッセイによって証明し、遺伝子サイレンシング機能は、GFP及び二重-ルシフェラーゼアッセイを用いて証明した。
【０３３６】
安定性試験
毒性試験に使用したpRNAは、3'RNAフラグメント伸張及びアニールされた相補的DNAオリゴヌクレオチドを含んだ（図55）。これらのpRNAは、ゲル電気泳動 (8% PAGE/尿素) を用いて、安定性及びアニーリング効率を最初に分析した。
【０３３７】
図56Aに示すゲルの凡例
1. Sph1-pRNA
2. 117〜143オリゴヌクレオチドにアニールされたSph1-pRNA
3. Sph1-pRNA/siRNA（ルシフェラーゼ）
4. 117〜143オリゴヌクレオチドにアニールされたSph1-pRNA/siRNA（ルシフェラーゼ）
5. Sph1-pRNA/siRNA (GFP)
6. 117〜143オリゴヌクレオチドにアニールされたSph1-pRNA/siRNA (GFP)
7. Sph1-pRNA/siRNA (サバイビン)
8. 117〜143オリゴヌクレオチドにアニールされたSph1-pRNA/siRNA (サバイビン)
9. ラダー
10. 117〜143ビオチン化オリゴヌクレオチドにアニールされたSph1-pRNA
【０３３８】
図56Aから明らかなように、RNAの顕著な分解は見られなかった。それはまた、RNA毒性アッセイのローディング対照として役立ち得る。
【０３３９】
図56Bに示すゲルの凡例
1. 117〜143ビオチン化オリゴヌクレオチドにアニールされたSph1-pRNA
2. 117〜143ビオチン化オリゴヌクレオチドにアニールされたSph1-pRNA/siRNA（ルシフェラーセ）
3. 117〜143ビオチン化オリゴヌクレオチドにアニールされたSph1-pRNA/siRNA（GFP）
4. 117〜143ビオチン化オリゴヌクレオチドにアニールされたSph1-pRNA/siRNA（サバイビン）
5. ラダー
6. （無し）
7. 1番+ストレプトアビジン
8. 2番+ストレプトアビジン
9. 3番+ストレプトアビジンラダー
10. 4番+ストレプトアビジン
【０３４０】
アニーリング効率は、4つのビオチンRNAをストレプトアビジンでインキュベートし、転移率変化を観察することによって決定した。図56Bは、PAGEで精製したRNAの大部分が3'末端DNAオリゴヌクレオチドを運んだことを示す。
【０３４１】
毒性試験
pRNAの3'末端でのDNAオリゴヌクレオチドのアニーリングがRNA毒性を減少させるか否かを決定するために、40 nM、13.3 nM、4.44 nM及び1.48 nMのRNA濃度を用いて、PC3細胞株で毒性試験を行った。MTTアッセイ（Promegaから入手可能）は、様々な構築物の細胞毒性を決定するために使用した。すなわち、様々なpRNA構築物は、細胞にトランスフェクトした。細胞の生存性は、pRNA構築物の様々な濃度を用いて測定した。所与の濃度において、最も高い毒性を有するRNA構築物は細胞のほとんどを死滅させるだろう。全く又はほとんど細胞毒性のないRNA構築物は、細胞生存性に全く影響を与えないか又はほとんど影響を与えないだろう、細胞生存値（reading）は、非処理対照群と同程度である。
【０３４２】
結果
図57Aは、Sph1-pRNA (三角形); 117〜143 DNAオリゴヌクレオチドにアニールされたSph1-pRNA、PAGE精製済み (菱形); 117〜143 ビオチン化DNAにアニールされたSph1-pRNA、PAGE精製済み (四角形); 117〜143 DNAオリゴヌクレオチドのみ (X); 及び117〜143 DNAオリゴヌクレオチドと混合されたSph1-pRNA、非精製 (星印/点線) についての毒性アッセイの結果を示す。
【０３４３】
117〜143 DNA又は117〜143ビオチン化DNAオリゴヌクレオチドのアニーリングは、sph1-pRNAの毒性を減少させることが分かった。減少した毒性は、オリゴヌクレオチド及びsph1-pRNA (非-PAGE精製) の混合物を用いるよりも、DNAオリゴヌクレオチドをsph1-RNAとアニールすることによって達成した。DNAオリゴヌクレオチド単独は、細胞生存性に対してほとんど効果を奏しなかった。RNAの完全性は、上で示したように、PAGEゲルによって保証される。結果を、図57Aに示す。RNA毒性実験の他の3つの群 (図57B、C及びD) も、Sph-pRNA/siRNAの毒性が、DNAオリゴヌクレオチドとアニールすることによって減少され得ることを示す。
【０３４４】
遺伝子サイレンシング
遺伝子発現を停止させるsph1-pRNA/siRNAキメラの能力を評価した。Sph1-pRNA/siRN A(GFP) 及びsph1-pRNA/siRNA（ルシフェラーゼ）は、緑色蛍光タンパク質（GFP）及びルシフェラーゼ（Luci）それぞれを発現停止させるダイマー型pRNAの能力を試験するために使用した。pRNA/siRNA(GFP) 及びpRNA/siRNA（ルシフェラーゼ）は対照として使用した。sph1-pRNA/siRNA(GFP) 及びsph1-pRNA/siRNA (Luci) pRNA キメラは、pRNAキメラが3'末端で異種オリゴヌクレオチドを含むか否かに関係なく、用量依存的に、その各々の標的遺伝子を発現停止させる、ことが見出された。
【０３４５】
材料及び方法
ショウジョウバエS2細胞を0.6x106/ウェルで24ウェルプレートに播種した。翌日、プラスミドpMT-GFPを、図58に示す濃度で様々なキメラpRNA複合体とコトランスフェクトした。GFP発現をGuSO4で誘導した。画像は、蛍光顕微鏡を用いて撮影した。
【０３４６】
結果
DNAオリゴにアニールされたsph1-pRNA/siRNA及びsph1-pRNA/siRNAは、用量依存的にGFP遺伝子発現を停止させるために効果的であった（図58; 各々、群2及び3の左パネル; 図59)。ノックダウン効果は、ルシフェラーゼsiRNA配列を含む3つのRNAは全て、GFP発現に対する阻害効果を示さなかった（図58；右パネル）。
【０３４７】
全ての特許、仮出願を含む特許出願、及び刊行物、並びに電子的に入手可能な資料（例えば、GenBankアミノ酸及びヌクレオチド配列の提供) の完全な開示は、文献として本明細書に援用される。先の詳細な説明及び実施例は、理解を明確にするためだけに提供されたものである。そこから、不要な限定とは理解するべきでない。本発明は、記載及び示された詳細な説明そのものに限定されるべきでない；当業者にとって多くの変更は明らかであり、そのような変更も、クレームにより定義される発明内に含まれる意図である。
【図面の簡単な説明】
【０３４８】
【図１】図１は、代表的なリボザイムによる標的RNA開裂の図である。
【図２ａ】図２ａは、ループ及びバルジの位置及び名称を示す (Zhang他, RNA 3: 315-323 (1997)) 野生型Φ29（phi29) pRNA (配列番号27) のヌクレオチド配列 (配列番号1) 及び二次構造を示す。
【図２ｂ】図２ｂは、プロカプシド結合ドメイン及びDNAパッケージングドメインを示す。右及び左-手ループ、ヘッドループ、U72U73U74バルジ及びC18C19A20バルジを四角で囲む; DNA-パッケージングドメイン (5'/3'末端) 及びプロカプシド結合ドメイン (大きな領域) は影で示す; 曲線は、2つの連結ループを示す；(a)で示される3つの塩基UAA3'オーバーハングはこの図には存在しない。
【図３ａ】図３ａは、環状的な並べ替えの前の数個のpRNAのヌクレオチド配列：バクテリオファージ SF5' (配列番号11及び28) を示す。
【図３ｂ】図３ｂは、環状的な並べ替えの前の数個のpRNAのヌクレオチド配列：バクテリオファージ B103 (配列番号12及び29) を示す。
【図３ｃ】図３ｃは、環状的な並べ替えの前の数個のpRNAのヌクレオチド配列：バクテリオファージ Φ29及びPZA (配列番号13及び30) を示す。
【図３ｄ】図３ｄは、環状的な並べ替えの前の数個のpRNAのヌクレオチド配列：バクテリオファージ M2及びNF (配列番号14及び31) を示す。
【図３ｅ】図３ｅは、環状的な並べ替えの前の数個のpRNAのヌクレオチド配列：バクテリオファージ GA1 (配列番号15及び32) (Chen 他, RNA 5: 805-818 (1999) を示す。
【図３ｆ】図３ｆは、環状的な並べ替えの前の数個のpRNAのヌクレオチド配列：aptRNA (配列番号16及び33) を示す。
【図４ａ】図４ａは、本発明のpRNAキメラの様々な構造的特徴：全体的なpRNAキメラを示す。
【図４ｂ】図４ｂは、本発明のpRNAキメラの様々な構造的特徴：スペーサ部位成分を示す。
【図４ｃ】図４ｃは、本発明のpRNAキメラの様々な構造的特徴：pRNA部位成分を示す。
【図５ａ】図５ａは、本発明のpRNAキメラの1実施態様のデザインを示す。
【図５ｂ】図５ｂは、本発明のpRNAキメラの1実施態様のデザインを示す。環状開口部の様々な位置を示す、模範的な環状に並べ替えられたpRNA（cpRNA）分子を示す。
【図６ａ】図６ａは、pRNA-リボザイム開裂活性の可能なメカニズムを示す。
【図６ｂ】図６ｂは、キメラpRNA/リボザイムの構造的配置を示す。
【図７ａ】図７ａは、野生型pRNA (配列番号1) の配列及び予測された二次構造を示す。
【図７ｂ】図７ｂは、pRNA dimer (配列番号26) (Trottier他, RNA 6: 1257-66 (2000)) のpRNAダイマーの二次構造を示す。（ｂ）のダイマーのモノマーサブユニットの残基間の線は、ハンド・イン・ハンド相互作用を介する左及び右手ループの分子間的な相互作用の塩基を示す (Guo他, Mol Cell 2: 149-55 (1998); Zhang他, Mol Cell 2: 141-47 (1998))。
【図７ｃ】図７ｃは、pRNAダイマーの３次元コンピュータモデルを示す(Hoeprich and Guo, J Biol Chem 277:20794-803 (2002))。
【図７ｄ】図７ｄは、上及び下のループ配列相互作用によるpRNAヘキサマー環の形成を示す。
【図７ｅ】図７ｅは、上及び下のループ配列相互作用によるpRNAヘキサマー環の形成を示す。
【図８】図８は、多価遺伝子送達ベクターとしての、pRNAダイマー、トリマー及びヘキサマーの様々な実施態様を示す。
【図９】図９は、予め同定された基質に結合するRNAアプタマーを同定するためのSELEX法における環状に並べ替えられたpRNAの使用を示す。NNN・・・N(25-100)・・・NNN、鋳型のランダム配列；鋳型 (配列番号36)、鋳型プライマー；プライマー1 (配列番号35)、3'末端プライマー2 (配列番号4)、5'末端プライマー。
【図１０】図10は、プレーク形成単位によって測定されたウイルス活性に対する、pRNAの3'末端の様々な伸張 (配列番号19〜22) の影響を示す。
【図１１ａ】図１１ａは、環状に並べ替えられたpRNAのデザイン及び産生を示す。配列番号2のDNA鋳型は、天然5'/3'末端と結合する短い（AAA）配列を使用する。
【図１１ｂ】図１１ｂは、環状に並べ替えられたpRNAのデザイン及び産生を示す。配列番号38の鋳型は、天然5'/3'末端と結合する長い配列 (配列番号8) を使用する。cpRNAの新しい開口部は、転写配列 (配列番号37及び39) 内の場所を示すウェッジによって示される (Zhang他, RNA 3: 315-323 (1997)参照)。
【図１２】図１２は、U7snRNA基質 (配列番号4)の部分に結合されたRNAキメラ（配列番号3の残基1〜167）を示す。
【図１３ａ】図１３ａは、pRNAによって運ばれるキメラリボザイムによる基質のin vitro開裂を示す。図は、RzU7の二次構造、リボザイムをターゲッティングするU7 snRNA (配列番号10)、その基質との塩基対形成 (配列番号4) を示す。
【図１３ｂ】図１３ｂは、リボザイムRzU7及びキメラリボザイムPRNA-RzU7による、基質U7snRNAのその予想される69マー及び25マー開裂産物への開裂を示す、変性尿素ゲルを示す。
【図１４】図１４は、基質HBV-ポリAの予想される70マー及び67マー開裂産物への成功的開裂を証明する変性尿素ゲルを示す。
【図１５ａ】図１５ａは、HBV ポリAシグナルをターゲッティングする自己-プロセスリボザイムをコードするプラスミドのデザイン及び構築を示す。リボザイムpRNA-RzAをコードするプラスミドのデザインを示す。
【図１５ｂ】図１５ｂは、HBV ポリAシグナルをターゲッティングする自己-プロセスリボザイムをコードするプラスミドのデザイン及び構築を示す。転写及びシス-開裂のプロセスされたキメラリボザイムを示す。
【図１５ｃ】図１５ｃは、HBV ポリAシグナルをターゲッティングする自己-プロセスリボザイムをコードするプラスミドのデザイン及び構築を示す。HBV ポリA標的配列（配列番号24）に塩基対形成されたハンマーヘッド型リボザイム（RzA）（配列番号23）の二次構造を示す。「G」から「A」に示した変化は、陰性対照としての不活性酵素を生じた。
【図１５ｄ】図１５ｄは、HBV ポリAシグナルをターゲッティングする自己-プロセスリボザイムをコードするプラスミドのデザイン及び構築を示す。HBV ポリA基質（配列番号4）に塩基対形成されたリボザイムpRNA-RzA (配列番号25) の二次構造を示す。
【図１６】図１６は、HepG2細胞のHBV RNAレベルに対するリボザイムの効果を示す。
【図１７】図１７は、基質（配列番号6）に結合された抗-12-LOXリボザイム（配列番号5）を示す。
【図１８】図１８は、右（大文字）手ループ及び左（小文字）手ループの相互作用を介するpRNAダイマー、トリマー及びヘキサマーの形成を示す。大文字及び小文字における同一の文字、例えばA及びa'は、相補的配列を示すが、異なった文字、例えばA及びb'は、非-相補的ループを示す。
【図１９ａ】図１９ａは、phi29ウイルス粒子：pRNA A-b' (配列番号40)の二次構造、ドメイン及び位置を示す。分子間結合ドメイン（影部分）及び反応性DNA転座ドメインは、太字線で示した。右及び左ループ内の4つの塩基は、分子間RNA相互作用の原因となるが、四角で示した。
【図１９ｂ】図１９ｂのパワーレンジャーは、ハンド・イン・ハンド相互作用によるpRNAヘキサマーを示す。
【図１９ｃ】図１９ｃは、pRNA A-b'及びB-a'によって形成されたpRNAヘキサマーを有するphi29 DNA-パッケージングモーターを示す。周囲の五角形は、側面にビリオンを有し先端をこちら向きに示した、5倍の対称的なカプシド頂点を示す。pRNAの中央部位は、コネクタに結合し、5'/3'対部位は外側に伸びる (Chen他, RNA, 5: 805-818 (1999))。
【図２０】図２０は、(a) 2個; (b) 3個及び (c) 6個の連結pRNAを示す。
【図２１】図２１は、代表的なキメラpRNAデザインを示す。I. 標的にハイブリダイズされたリボザイムを担持するキメラpRNA。II. pRNAモノマーの二次構造 (配列番号1)。III. HIV tat/rev基質をターゲッティングするリボザイム（配列番号44）を担持するキメラpRNA（配列番号41）の二次構造。IV. アデノウイルスknob-結合アプタマー (配列番号43）を担持するキメラpRNAの二次構造。V. CD4-結合RNAアプタマー（配列番号42）を担持するキメラpRNAの二次構造。3つのpRNAは、結合してトリマーを形成する。
【図２２】図２２は、RNAナノ粒子の設計及び構造の図解を示す。(I) phi29 pRNAベクターのサイズ及び3次元コンピュータモデル。(II) 構築されたトリマー。
【図２３】図２３は、アプタマー、siRNA、リガンド及び蛍光を含むトリマーデザインの6種の構造を示す。
【図２４】図２４は、CD4-過剰発現細胞への3つの成分の特異的かつ同時送達を示す共焦点顕微鏡を示す。I. CD4hi T細胞 (左カラムのA〜D、及び右カラムのI〜L) 及びCD4neg T細胞 (中央カラムのE〜H）への、pRNA(A-b')/アプタマー(CD4)、pRNA(B-e')-FITC及びpRNA(E-a')-ローダミンを含むpRNAトリマーの結合のアッセイ。A、E及びIは、FITCフィルターで画像化し；B、F及びJは、ローダミンフィルターで視覚化し；C、G及びKは、オーバーレイであり、及びD、H及びLはDIC画像である。右カラムは、CD4hi細胞のクローズアップ画像を示す。II. 結合（M）と細胞侵入（N及びOの矢印）とを識別するための共焦点顕微鏡画像の断片、及び陰性対照（P）、CD4-結合アプタマーを含むFITC-標識pRNAトリマーのリンパ球への結合は、丸で示し、侵入は、細胞内の緑色点で示した（Oでは矢印）。Nにおける赤色は、テキサスレッドで標識されたトランスフェリンの陽性侵入対照である。
【図２５】図２５は、構築されたpRNAトリマーの形成を検出するための、天然ポリアクリルアミドゲル（A）、AFM画像（B）及びショ糖グラディエント沈降（C）を示す。(A) 異なった移動率を示すpRNAキメラのpRNAモノマー及びトリマーを示す天然PAGEゲル。(B) pRNAモノマーは、チェックマーク状に折り畳まれ、トリマーは三角形を示した。各画像内の色は、分子の厚さ及び高さを反映している。明るい（又は白）色は、より厚い又は高い分子を示し；暗い色は、薄い分子を示す。(C) 5〜20%ショ糖グラディエント沈降によるpRNAモノマー及びトリマーの分離。全ての粒子は、グラディエントの一番上に充填され、超遠心によって分離された。右から左に沈降する。
【図２６】図２６は、異なったキメラsiRNA構築物のGFPノックダウンアッセイを示す。細胞が様々なキメラpRNA/siRNA構築物でトランスフェクトされた2日後に、GFP発現を蛍光顕微鏡により観察した。
【図２７】図２７は、アプタマー(CD4)、siRNA(CD4)及びpRNA/FITCを担持する構築されたpRNAトリマーを介して同時送達されたsiRNA(CD4)の機能性アッセイを示す。(I) pRNA(A-b')/アプタマー(CD4)、pRNA(B-e')-FITC及びトリマー中のpRNA(E-a')-ローダミンの同時送達を示す陽性対照 (図23A)。CD4hi T細胞のトリマーによる、トランスフェクションではなくインキュベーションは、フローサイトメトリーによって評価される、アプタマー(CD4)によって介在されるFITC及びローダミン蛍光RNAを取り込む95%の細胞をもたらした。(II) pRNA(A-b')/アプタマー(CD4)、pRNA(B-e')-FITC及びpRNA(E-a')-siRNA(CD4) を含むpRNAトリマーによる、トランスフェクションではなくインキュベーション(図1-III-C) は、FITCを取り込む85%の細胞をもたらした。pRNAトリマーを取り込むCD4hi T細胞は、FITC-陽性及びFITC-陰性細胞に分け、CD4レベルをPE-標識抗体を用いる表面染色で決定した。FITC-陽性細胞では、CD4レベルは、17.8%に減少したのに対し、FITC-陰性細胞では42.56%であった。このことは、トリマーにおけるsiRNA(CD4)の送達及び機能を証明する。(Ill) siRNA(CD4)ではなくアプタマー(CD4)を担持するpRNAダイマー又はトリマーによるCD4hi T細胞のインキュベーションが、CD4レベル（全て約90%）及び細胞生存性（全て約70%）では相違しないことを示す陰性対照。対照ダイマー又はトリマーは、pRNA/siRNA(CD4)の代わりにpRNA/siRNA(BIM)を含んだ。
【図２８】図２８は、細胞溶解物（C）又は精製ダイサー（D）によるsiRNAへのキメラpRNA/siRNA複合体のプロセシングを示す。pRNA/siRNAモノマー (レーンb〜e)、phi29 pRNAベクター (レーンf〜l、及びm〜o)又はトリマー型キメラ (j〜l) は、5'-末端を32Pで標識し、細胞溶解物（C）又はダイサー（D）によりインキュベートし、変性ゲルによって分析した。(E) 及び (F) は、特異的pRNA/siRNAによるプロ-アポトーシス因子BIMの阻害がサイトカイン削除からリンパ球を保護し、アポトーシスを誘発した、ことを示す。D1（T細胞）は、BIMを発現するサイトカイン-依存的リンパ球細胞株であり、サイトカインの非存在下でアポトーシスを示す。pRNA/siRNA(BIM) のD1細胞への導入（E）は、IL-3削除-誘発細胞死からの保護をもたらした。BIMのタンパク質レベル（F）は、ウェスタンブロットによりアッセイした。
【図２９】図２９は、構築されたRNAナノ粒子を用いる癌治療の動物試験を示す。(A) pRNA/siRNAキメラ無しの注射（RNA無し）；(B) 葉酸-pRNA及びsiRNA (サバイビン) を含むRNAキメラによる処置; (C) siRNA配列中に変異を有する、葉酸-pRNA及びsiRNA (サバイビン) を含むRNAキメラによる処置; (D) 葉酸をその5'末端に含まないpRNA-siRNAキメラによる処置。
【図３０】図３０は、pRNAキメラの配列及び構造のスケッチを示す。Ａ：phi29 pRNA配列及び二次構造。5'/3'末端上の二重鎖ヘリックスドメインはフレームで囲み、ダイマー形成のためのドメインは影を付けた。曲線は、2つの相互作用ループを示す。Ｂ：pRNAダイマーの3次元構造。Ｃ：異なった移動率を示すpRNAキメラのモノマー及びダイマーを示す天然ポリアクリルアミドゲル。以下のゲルは、phi29 pRNAモノマー及びダイマーのcryo-AFM画像である。色は、分子の厚さ及び高さを反映する；色が明るくなればなるほど、分子は厚く又は高くなる。Ｄ：外来部分を担持するキメラpRNAダイマーのデザイン（結果のところの、RNAサブユニットの名称を参照）。
【図３１】図３１は、ダイサーによるキメラpRNA/siRNA複合体のプロセシングを示す。pRNA/siRNA 及びpRNAベクターの構造をＡ及びＢに示す。組換えダイサーによる22-bp siRNAへのpRNA/siRNAのプロセシング。5'-末端32P標識を有するキメラpRNA/siRNAは、精製した組換えダイサーによってそれぞれ30分間、2時間インキュベートし、次いでPAGE/尿素ゲル上で分離した。分子量マーカーとして放射性標識22-塩基RNAを使用した。
【図３２】図３２は、トランスフェクションによるキメラpRNA/siRNA (GFP) の機能性アッセイを示す。Ａ〜Ｃ：トランスフェクションによるGFP遺伝子のサイレンシングを示す蛍光顕微鏡画像。キメラpRNA/siRNA (GFP)（左カラム）によるGFP遺伝子の用量-依存的サイレンシング。変異体pRNA/siRNA (右カラム）は陰性対照として使用した。Ｂ：様々なRNAでトランスフェクトした細胞のGFP発現：(a) RNA無し; (b) 合成二重鎖siRNA (GFP); (c) 二重鎖siRNA (LacZ) 対照; (d) pRNA/siRNA (GFP); (e) pRNA/siRNA (変異体); (f) pRNAベクターのみ。Ｃ：(a) キメラpRNA/siRNA (GFP) 及び (b) 同一のモル濃度での慣用的な二重鎖siRNA (GFP)；(c) siRNA処置なしの対照、の能力の比較。Ｄ：トランスフェクション後のGFP mRNAレベルに対するキメラpRNA/siRNA (GFP) の効果を試験するためのノーザンブロット。レーン1及び2は、pRNA/siRNA (GFP) の2つの異なった構築物の効果を示し；レーン3は、二重鎖siRNAを示し；レーン4は、RNA処置なしの細胞を示す。rRNAはローディング対照として使用した。
【図３３】図３３は、トランスフェクションによるルシフェラーゼをターゲッティングするキメラpRNA/siRNAの機能性アッセイを示す。Ａ：用量依存的に、それぞれpRNA/siRNA（ホタル）又はpRNA/siRNA（ウミシイタケ）によるホタル・ルシフェラーゼ又はウミシイタケ・ルシフェラーゼ発現の特異的ノックダウンを示す二重レポータールシフェラーゼアッセイ。Ｂ：慣用的なヘアピンsiRNA（ルシフェラーゼ）の活性とpRNA/siRNA（ルシフェラーゼ）の活性との比較。siRNA配列における変異を有するpRNA/siRNA（変異体）は、非-特異的対照として含めた。
【図３４】図３４は、サバイビンをターゲッティングするsiRNAを担持するキメラpRNAのトランスフェクションによって誘発されるアポトーシス及び細胞死を示す。Ｉ：乳癌MCF-7細胞は、pRNA/siRNA（サバイビン）によってトランスフェクトし、アポトーシスは、PI-アネキシンV二重標識によって監視し、フローサイトメトリーによって分析した。右下の四分画中の細胞は、アポトーシス細胞を示す。ＩＩ：乳癌細胞 (MDA-231) 及び前立腺細胞 (PC-3) は、24-ウェルプレートに20 pmolのpRNA/siRNA（サバイビン）でトランスフェクトし、トランスフェクションの24時間後に画像を撮った。変異体pRNA/siRNAは、陰性対照として並行してトランスフェクトした。
【図３５】図３５は、プロアポトーシス因子BADをターゲッィングするpRNA/siRNAキメラの機能性アッセイを示す。Ａ：pRNA/siRNA(BAD) 及び対照siRNAs (10 nM) は、エレクトロポレーションによってプロ-B細胞に導入され、1日目にトランスフェクション試薬と混合した。細胞を洗浄し、2日目にIL-3を除き、3日目に生存性についアッセイした。Ｂ：BADタンパク質レベルを、キメラsiRNA（BAD）又はsiRNA配列内の異なった変異を含む2つの変異体対照でトランスフェクトした細胞中で比較した。対照細胞は、pRNAのみで処理した。3日目に細胞溶解物を調製 (Khaled他, 2001)、タンパク質を12% SDS-PAGEで分離し、ウェスタンブロットによりBAD抗体 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) で分離した。パネル下の番号は、残りのBADレベルを示し、対照細胞と比べたパーセンテージで示す。Ｃ：pRNA/siRNA（サバイビン）又は変異体でトランスフェクトしたプロ-B-細胞をIL-3又はIL-3誘導体を含む完全培地で成長させた。RNAの細胞形態に対する影響は、顕微鏡で観察した。
【図３６】図３６は、CD4受容体によるキメラpRNA/siRNAの特異的送達を示す。Ｉ：CD4-結合アプタマーを含むFITC標識pRNAダイマーのリンパ球に対する結合に対応する緑色円は、共焦点顕微鏡 (a) によって明らかになり、RNAの侵入は細胞内の緑色点として示した (d)。テキサスレッド-標識トランスフェリンは、内在化の陽性対照として使用した (b)。CD4発現しない対照細胞株では結合は観察されなかった(c)。染色のために使用された挿入図：細胞の微分干渉コントラスト（DIC）像。ＩＩ：RNAダイマーのインキュベーションは、トリパンブルー排除アッセイによって測定された、細胞生存性の特異的抑制をもたらした。CD4発現レベルのない、低い又は高い3つの異なった細胞株は、IL-7の存在又は非存在下に、pRNA/siRNA (サバイビン)-pRNA/アプタマー (CD4) 複合体でインキュベートした。
【図３７】図３７は、サバイビンをターゲッティングするキメラpRNAの毒性アッセイを示す。インキュベーション時に30〜50%のコンフルエントになるように、HeLaT4細胞を24-ウェルプレートに播いた。播種の24時間後に、所定のRNA量を各ウェルに加えた。細胞を24、48及び72時間、更にインキュベートし、生存細胞数を血球計によりカウントした。示された相対的生存率は、各処理における生存細胞数の数を、RNAによる処理無しの生存細胞数で割って得た。
【図３８】図３８は、葉酸-pRNAによるキメラpRNA/siRNAの特異的送達を示す。Ａ：FITC-標識葉酸-pRNAのKB細胞への結合のフローサイトメトリー分析。左：FITCで標識された葉酸-pRNAで細胞をインキュベートした。中：受容体への結合のための葉酸-pRNAと競合するブロッキング剤として働く遊離の葉酸で、細胞を予めインキュベートした。右：陰性対照としてのFITCで標識した葉酸-無しのpRNAを用いて結合を試験した。FITC-陽性細胞のパーセンテージは、右上四分画に示す。Ｂ：葉酸-pRNAダイマーのKB細胞への特異的結合。遊離の葉酸の存在下（中カラム）又は非存在下（左カラム）で、[3H]葉酸-pRNAダイマーによる細胞のインキュベーション後に、細胞を単離し、シンチレーション・カウンタに供した。右手カラムは、陰性対照としての葉酸標識無しの3H-標識ダイマーを示す。Ｃ：インキュベーションによるノックダウンアッセイにおいて、pRNA(B-a')/葉酸及びpRNA(A-b')/siRNA（ホタル）を含む葉酸-キメラダイマー複合体は、3時間、ICB細胞でインキュベートし、RNAの結合及び侵入を可能にした。ルシフェラーゼレベルは、翌日、二重レポーター系で測定した。対照ダイマーは、葉酸標識の欠如を除いて、葉酸ダイマーと同一であった。
【図３９】図３９は、多価性遺伝子送達ベクターとしてのpRNAヘキサマーの潜在的使用を示す。pRNAの6つのコピーは、細菌性ウイルスphi29のDNA-パッケージングモーターを駆動するためにヘキサマー環を形成する。従って、ターゲッティング、治療及び検出のための外来部分を運ぶために利用できる6つの位置が存在するだろう。
【図４０】図４０は、葉酸-AMPの構造、精製及び特徴付けを示す。Ａ：競合アッセイによって示される葉酸受容体への葉酸-AMPの結合。KB細胞は処理 (a) をしないか、又は葉酸-FITC (c) でインキュベートした。また、葉酸標識無しのFITCの結合(b)を示す。右上四分画に示される数値は、蛍光-陽性細胞のパーセンテージを示す。葉酸-FITCのKB細胞への結合は、遊離の葉酸(d)又は葉酸-AMP(e)でブロックされた。Ｂ：葉酸-AMPの構造。Ｃ：以下の条件：カラム: 20 mMリン酸塩、pH 7.0で予め平衡化した、Delta Pak C18 7.8 x 300 mm; 流速 6 mL/分下での逆相HPLCによる葉酸-AMPの精製。試料ローディングの後、溶出溶媒を以下の順：100% 20 mMリン酸塩から8分で100%水、19分で10% MeOH/90%水、最後に20分で15% MeOH/90%水、に従って手動で変更した。22〜31分の葉酸-AMP分画を集め、凍結した。
【図４１】図４１は、葉酸によるpRNAの5'標識、及び葉酸-pRNAのKB細胞への結合を示す。ａ：葉酸-AMPは、非-修飾NTPと共にin vitro転写に含めた。[α32P] ATPの痕跡量は、RNAの位置を示すために含めた。葉酸-AMPを省略した時に、PAGE/尿素ゲル上で1つの主なバンドのみが検出された。2 mM及び4 mM 葉酸-AMPをそれぞれ利用した時に、RNAの約50〜60%が上の位置にシフトした。ｂ：[3H]-標識葉酸-RNAのKB細胞への結合。
【図４２】図４２は、pRNAキメラの配列及び構造のスケッチを示す。Ａ：Phi29 pRNA配列及び二次構造。右手及び左手ループを丸で囲み、二重ヘリックスドメインを四角で囲み、分子間相互作用ドメインを影で示す。曲線は、2つの相互作用ループを示す。Ｂ：pRNAモノマーの3D構造。Ｃ：切断された配列を有する葉酸-標識pRNA (7-106) の構築の説明である。Ｄ：サバイビンに対するsiRNAを担持する葉酸標識キメラpRNAダイマー。Ｅ：pRNAダイマーの高効率形成は、天然-PAGEによって証明された。Ｆ：葉酸-pRNAダイマーのKB細胞への特異的結合。細胞は、遊離の葉酸の存在下（中カラム）又は非存在下（左カラム）で、葉酸-pRNA (A-b') 及び[3H]-pRNA (B-a') からなるRNAダイマーでインキュベートした。右カラムは、陰性対照としての葉酸標識無しの[3H]-ダイマーである。
【図４３】図４３は、pRNA/siRNAのトランスフェクションによる遺伝子発現の特異的ノックダウンを示す。二重ルシフェラーゼアッセイは、一時的トランスフェクションによる、それぞれ、pRNA/siRNA（ホタル）及びRNA/siRNA（ウミシイタケ）による、ホタル・ルシフェラーゼ（左）及びウミシイタケ・ルシフェラーゼ（右）の遺伝子の特異的サイレンシングを示す。
【図４４】図４４は、組換えダイサーによるキメラpRNA/siRNA複合体の22-bp siRNAへのプロセシングを示す。5'-末端を[γ32P] 標識したキメラpRNA/siRNA (レーンa〜c) 又はpRNAベクター (レーンe〜f) は、それぞれ、30分間、2時間、精製した組換えダイサーによりインキュベートし、次いで変性PAGE/尿素ゲルで分離した。マーカーとして22nt RNAを用いた。ダイマーRNAのプロセシング（レーンa及びd）も試験した。
【図４５】図４５は、pRNAキメラの配列及び構造のスケッチを示す。(A) pRNAバクターに担持されたキメラリボザイムのスケッチ。(B) pRNA/RZ(Sur) 配列及び二次構造。強調したG75は、pRNA/RZ(mut1) では欠けている。pRNA/RZ(mut2) では、G75は欠け、「A」と置換される。(C) pRNA/RZ(mut3) の配列。
【図４６】図４６のＡは、pRNA/RZ(Sur)キメラの処理後、MCF-7の細胞形態を示す。MCF-7は、高及び低用量のpRNA/RZ(Sur)、pRNA/RZ(mut3)でトランスフェクトした。トランスフェクションの1日後、逆顕微鏡を用いて画像を撮った。Ｂは、ネクローシスとアポトーシスとを識別するためのPI/アネキシンV二重染色を示す。乳癌MCF-7細胞は、pRNA/RZ(sur)でトランスフェクトし、アポトーシスは、PI/アネキシンV二重染色によりモニターした後、フローサイトメトリーで分析した。3つの並行実験を行い、アポトーシス細胞のパーセンテージは標準偏差で示した。
【図４７】図４７は、（ａ）乳癌細胞に対するキメラサバイビンリボザイムの効果を示し、及び（ｂ）MDA-MB-453細胞はmRNAの所定の量でトランスフェクトし、細胞生存性は、翌日にMTTアッセイによって測定した。
【図４８】図４８は、子宮頸癌細胞に対するキメラサバイビンリボザイムの効果を示す。ヒト子宮頸癌Hela T4細胞は、所定の量のpRNA/RZ(sur)でトランスフェクトし、細胞生存性は、翌日にMTTアッセイによって測定した。
【図４９】図４９は、鼻咽喉癌細胞に対するキメラサバイビンリボザイムの効果を示す。ヒト鼻咽喉癌KB細胞は、所定の量のpRNA/RZ(sur)でトランスフェクトし、細胞生存性は翌日にMTTアッセイによって測定した。
【図５０】図５０は、前立腺癌細胞に対するキメラサバイビンリボザイムの効果を示す。ヒト前立腺癌LNCaP細胞は、pRNA/RZ(sur)でトランスフェクトし、細胞生存性は、翌日にMTTアッセイによって測定した。
【図５１】図５１は、リアルタイムPCRによって明らかにされた異なったpRNAキメラ処理試料のmRNAレベルの比較を示す。遺伝子発現レベルは、任意に値1と帰属した非-トランスフェクト試料に見られる遺伝子発現レベルに匹敵した。棒は、非-トランスフェクト試料中の発現レベルを超える遺伝子発現の倍数を示す。pRNA/RZ(sur)でトランスフェクトされた試料について、非-トランスフェクト細胞のmRNAレベルの16%に減少し、pRNA/RRZ(mut3)処理細胞の24%に減少した。
【図５２】図５２は、T47D細胞がキメラpRNA/RZ(sur)又は変異体キメラリボザイムによってトランスフェクトされた後の、ウェスタンブロットによるサバイビンタンパク質の比較を示す。
【図５３】図５３のＡは、8%天然PAGEデ示されるpRNA/RZ(sur)のダイマー及びトリマーの形成を示す。Ｂは、pRNA/RZ(sur)によるサバイビンmRNAの部分配列の開裂を示す。基質RNAは、[32P]によって標識されたヒトサバイビンのmRNAの部分配列である。Ｃは、送達可能なダイマー及びトリマーの複合体を示す。
【図５４ａ】図５４ａは、表4。pRNAキメラの産生のために使用されたDNAオリゴヌクレオチドを示す。
【図５４ｂ】図５４ｂは、表5。サバイビンをターゲッティングするキメラpRNA/リボザイムの機能性アッセイを示す。
【図５５】図５５は、3'RNA伸張（すなわち、オーバーハングの不対3'末端）を有するsph1-pRNAキメラ、及びそれにアニールされた相補的DNAオリゴヌクレオチドタグを示す。
【図５６Ａ−Ｂ】図５６Ａ−Ｂは、様々なsph1-pRNA構築物のpRNA毒性試験の結果のゲル電気泳動を示す。
【図５７Ａ】図５７Ａは、3'末端にアニールされた異なったDNAティルを有するsph1-pRNAのpRNA毒性試験の結果を示す。
【図５７Ｂ】図５７Ｂは、sph1-pRNA/siRNA（ルシフェラーゼ）のpRNA毒性試験の結果を示す。
【図５７Ｃ】図５７Ｃは、sph1-pRNA/siRNA（サバイビン）のpRNA毒性試験の結果を示す。
【図５７Ｄ】図５Ｄは、3'末端にアニールされた異なったDNAティルを有するsph1-pRNA/siRNA（GFP）のpRNA毒性試験の結果を示す。
【図５８】図５８は、様々なキメラpRNA/siRNAによるショウジョウバエS2細胞におけるGFP発現の阻害を示す。sph1pRNAは、3'末端に付加された配列にアニールされた相補的オリゴヌクレオチド（DNAタグ）を含む。
【図５９】図５９は、2つのルシフェラーゼアッセイを用いる様々なキメラpRNA/siRNAによるルシフェラーゼ発現の阻害を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０３４９】
1 生物名: バクテリオファージphi29/PZA
2 バクテリオファージphi29由来の環状に並べ替えられたpRNA（短いループ）
3 phi29 pRNA及びハンマーヘッド型リボザイムを含むRNAキメラ
4 U7snRNA基質
5 抗-12-Loxリボザイム
6 Lox基質RNA
7 pRNAキメラ
8 連結ループ
9 U7基質
10 RzU7ハンマーヘッド型リボザイム
11 生物名: バクテリオファージSF5'
12 生物名: バクテリオファージ B103 
13 バクテリオファージphi29由来の環状に並べ替えられたpRNA (長いループ)
14 生物名: バクテリオファージ M2/NF
15 生物名: バクテリオファージ GAl
16 aptRNA
17 phi29 pRNA及びハンマーヘッド型リボザイムを含むRNAキメラ
18 RzAハンマーヘッド型リボザイム
19-22 3' pRNA伸張
23 ハンマーヘッド型リボザイム
24 B型肝炎ウイルスポリA基質
25 phi29 pRNA及びハンマーヘッド型リボザイムを含むRNAキメラ
26 ステム構造の塩基に塩基対変化を有する野生型pRNA 
27 野生型pRNA
28 合成的な、並べ替えられたSF5 pRNAキメラ
29 合成的な、並べ替えられたB103 pRNAキメラ
30 合成的な、並べ替えられたSF5 pRNAキメラ 
31 合成的な、並べ替えられたM2/NF pRNAキメラ
32 合成的な、並べ替えられたGA1 pRNAキメラ
33 合成的な、並べ替えられたアプタマーpRNAキメラ
34 合成的な、環状に並べ替えられたpRNA 
35 合成的な、並べ替えられたpRNA
36 合成的な、並べ替えられたpRNA
37 合成cpRNA転写物
38 合成DNA鋳型
39 合成cpRNA転写物
40 合成phi29ウイルス粒子
41 合成キメラpRNA
42 合成キメラpRNA
43 合成キメラpRNA 
44 合成キメラpRNA
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図３ｆ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図７ｅ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１４】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１５ｃ】
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【図１５ｄ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９ａ】
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【図１９ｂ】
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【図１９ｃ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４ａ】
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【図５４ｂ】
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【図５５】
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【図５６Ａ】
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【図５６Ｂ】
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【図５７Ａ】
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【図５７Ｂ】
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【図５７Ｃ】
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【図５７Ｄ】
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【図５８】
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【図５９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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