(57)【要約】  本発明は、貫通穴の高密度アレイを有するデバイス又は「プラテン」を作製する方法、更にそのようなプラテンの表面を清浄化及び一新する方法を特徴とする。本発明はさらに、従来のより低密度のアレイを上回る多くの利点を有する、化学的、生化学的及び生物学的化合物の高密度アレイを作製する方法を特徴とする。本発明には、多くの物理的、化学的又は生物学的転換をデバイスの各々のアドレス指定可能な貫通穴の内部において連続して、又は並行して実行することができる方法が含まれる。加えて、本発明には、サンプルの物理的特性をアッセイすることを含めて、アレイの内容物を分析する方法が含まれる。【選択図】なし
2009504161.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のプラテンの貫通穴が第２のプラテンの貫通穴と実質的に位置が合うように、当該プラテンが位置調整され、そして当該膜がこれら２つのプラテンの間に挟まれる、各々が複数の貫通穴を有する第１のプラテン及び第２のプラテン、並びに多孔性膜を含んでなる細胞チップ。
【請求項２】
前記膜が、貫通穴の直径の半分以下である細孔を含んでなる、請求項１に記載の細胞チップ。
【請求項３】
前記膜が、約０．２〜２５０μｍの細孔を含んでなる、請求項１に記載の細胞チップ。
【請求項４】
前記膜が、約０．２μｍ、０．５μｍ又は１．０μｍの細孔を含んでなる、請求項１に記載の細胞チップ。
【請求項５】
前記膜が、直径が０．２μｍである均一な構造の細孔を含んでなる、請求項１に記載の細胞チップ。
【請求項６】
前記膜が、酸化アルミニウムを含んでなる、請求項５に記載の細胞チップ。
【請求項７】
前記膜が、ポリカーボネートを含んでなる、請求項１に記載の細胞チップ。
【請求項８】
前記ポリカーボネートが、１μｍの細孔を含んでなる、請求項７に記載の細胞チップ。
【請求項９】
前記ポリカーボネートが、細胞接着を支えるフィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン又は別の基質で被覆される、請求項７に記載の細胞チップ。
【請求項１０】
前記プラテンが、金属を含んでなる、請求項１に記載の細胞チップ。
【請求項１１】
前記金属が、金、タングステン又はステンレススチールである、請求項１に記載の細胞チップ。
【請求項１２】
前記プラテンが、ポリスチレンを含んでなる、請求項１に記載の細胞チップ。
【請求項１３】
前記チップが、個々のウエルを密封するガスケットをさらに含んでなる、請求項１に記載の細胞チップ。
【請求項１４】
前記ガスケットが、取り外し可能である、請求項９に記載の細胞チップ。
【請求項１５】
前記チップが、横方向の拡散を防止する疎水性化合物をさらに含む、請求項１に記載の細胞チップ。
【請求項１６】
前記膜と前記プラテンとの間の水密シールをもたらす疎水性化合物をさらに含んでなる、請求項１に記載の細胞チップ。
【請求項１７】
一方のプラテンが柔軟な生体適合性物質を包含し、そして他方のプラテンが、前記柔軟なプラテンを支える堅いプラテンである、請求項１に記載の細胞チップ。
【請求項１８】
前記柔軟なプラテンが、シリコーン、ポリプロピレン又はゴムを含んでなる、請求項１３に記載の細胞チップ。
【請求項１９】
前記２つのプラテンが、一方のプラテン上の凹んだ表面に嵌合する他方のプラテン上の盛り上がった表面によって取り付けられる、請求項１に記載の細胞チップ。
【請求項２０】
細胞チップの全体の厚さが、約１０ｍｍ以下である、請求項１に記載の細胞チップ。
【請求項２１】
細胞チップの全体の厚さが、約５ｍｍ以下である、請求項１に記載の細胞チップ。
【請求項２２】
細胞チップの全体の厚さが、約１ｍｍ以下である、請求項１に記載の細胞チップ。
【請求項２３】
前記第１のプラテンと接触している固体支持体をさらに含んでなる、請求項１に記載の細胞チップ。
【請求項２４】
前記固体支持体が、顕微鏡用スライドガラスである、請求項２３に記載の細胞チップ。
【請求項２５】
前記第２のプラテンと接触しているカバースリップをさらに含んでなる、請求項２４に記載の細胞チップ。
【請求項２６】
前記カバースリップ、顕微鏡用スライドガラス及び細胞チップが、一緒に固定される、請求項２２に記載の細胞チップ。
【請求項２７】
上部から底部への順に、
（ａ）スペーサーと接触しているカバースリップ、
（ｂ）カバースリップを第１のプラテンから隔てるスペーサー、
（ｃ）複数の貫通穴を有する第１のプラテン、
（ｄ）第１のプラテンと膜との間のシールをもたらす、複数の貫通穴を含むガスケット、
（ｅ）ガスケットと第２のプラテンとの間に挟まれた、酸化アルミニウムを包含し、そして０．１μｍ〜１μｍの細孔を有する多孔性膜、
（ｆ）複数の貫通穴を有する第２のプラテン、
（ｇ）第２のプラテンと接触している固体支持体
を含んでなる、細胞チップ。
【請求項２８】
様々な構成要素を一緒に保持する留め具をさらに含んでなる、請求項２７に記載の細胞チップ。
【請求項２９】
前記膜が、直径が０．２μｍである均一な構造の細孔を含んでなる、請求項２７に記載の細胞チップ。
【請求項３０】
前記プラテンが、タングステン、金又はステンレススチールを含んでなる、請求項１に記載の細胞チップ。
【請求項３１】
（ａ）細胞培養培地を包含している請求項１〜３０のいずれか一項に記載の細胞チップを提供すること、
（ｂ）多孔性膜を細胞と接触させること、そして
（ｃ）細胞を、細胞生存のための好適な条件のもとでインキュベーションすること、
を含んでなる、細胞を細胞チップ上で培養する方法。
【請求項３２】
前記条件が、前記細胞チップをガス透過性液体と接触させることを含んでなる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ガス透過性液体が、ペルフルオロデカリンである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞チップが、前記細胞培養培地と接触している疎水性流体をさらに含んでなる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記疎水性流体が、ペルフルオロデカリン、シリコーンオイル又は鉱油である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
（ａ）複数の貫通穴を有する第１のプラテンに細胞培養培地を充填すること、
（ｂ）第１のプラテンを多孔性膜と接触させること、
（ｃ）膜を、貫通穴が実質的に位置が合うように、複数の貫通穴を有する第２のプラテンと接触させ、それにより、細胞チップを構築すること、
を含んでなる、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の細胞チップを構築する方法。
【請求項３７】
前記細胞チップが、前記第１のプラテンと接触している固体支持体をさらに含んでなる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞チップが、前記第２のプラテンと接触しているスペーサーをさらに包含し、前記スペーサーがカバースリップと接触している、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞チップが、前記第１のプラテンとの間に挟まれたガスケットをさらに含んでなる、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記ガスケットが、柔軟な物質を含んでなる、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記ガスケットが、生体適合性エラストマーを含んでなる、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
前記エラストマーが、テフロン（登録商標）、シリコーン又はゴムである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
前記充填することが、前記第１のプラテンを固体支持体の上に置き、プラテン及び固体支持体を遠心分離することによって達成される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４４】
前記第１のプラテンを、ガスケットに接触させ、次いで細胞培地で前記プラテンを覆う、請求項３６に記載の方法。
【請求項４５】
（ａ）細胞を包含する請求項１〜３０のいずれか一項に記載の細胞チップを、薬剤を包含するプラテンと接触させること、
（ｂ）細胞を薬剤と接触させること、そして
（ｃ）細胞における変化を検出し、それにより、所望の生物学的活性を有する薬剤を同定すること。
を含んでなる、所望の生物学的活性を有する薬剤を同定するための方法。
【請求項４６】
前記薬剤を細胞増殖培地に存在させるか、又は溝付きピン若しくはシリンジを使用して薬剤を細胞と接触させるか、又は細胞を薬剤を包含するウエルに加えることによって細胞と接触させる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記薬剤が、ポリペプチド、核酸分子又は小さい化合物である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記核酸分子が、ｓｉＲＮＡ、ミクロＲＮＡ又はアプタマーである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記変化が、遺伝子発現、ポリペプチド発現、細胞成長、細胞増殖又は細胞生存における変化、細胞成分の細胞内局在化における変化、形態学的変化、又は運動性における変化である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記変化が、免疫アッセイ、酵素アッセイ、ハイスループット遺伝子発現プロファイリング、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、メチル化、又は定量的蛍光顕微鏡観察及び自動化された画像収集を用いるハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）で検出される、請求項４４に記載の方法。
【請求項５１】
前記ハイコンテントスクリーニングにより、タンパク質移行の変化が検出される、請求項４４に記載の方法。
【請求項５２】
前記細胞を溶解して、タンパク質又は核酸分子を結合性表面に結合させる、請求項４４に記載の方法。
【請求項５３】
前記結合性表面が、弱カチオン交換媒体である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記結合したタンパク質又は核酸分子が、配列、分子量、結合特性及び発現レベルからなる群より選択される特性について分析される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
前記結合特性が、免疫アッセイで、又はポリペプチドの結合によって検出される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５６】
ａ）上部表面及び下部表面を有する複数のプレートを提供すること（ここにおける前記複数のプレートの少なくともいくつかの上部表面及び下部表面の一方又は両方が、前記表面の長さにわたる連続する実質的に平行な溝を有する）、
ｂ）前記複数のプレートの１つを除く全ての上部表面をそれ以外のプレートの下部表面に結合すること、そして
ｃ）所望の厚さを達成するために必要ならば、プラテンを貫通穴に対して実質的に直交して薄切りにし、それにより、複数の貫通穴を有する所望の厚さのプラテンを得ること、
を含んでなる、複数の貫通穴を有する所望の厚さのプラテンを作製する方法。
【請求項５７】
複数のプラテンを作製するために、工程ｃ）を繰り返すことをさらに含んでなる、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記プレートが、１つのプレートの溝がそれ以外のプレートの各々の溝に対して実質的に平行である形態で結合される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
複数の貫通穴（ここにおける貫通穴の少なくともいくつかが、プローブ、細胞又は溶媒の固定化のための多孔性物質を含有する）を有するプラテンを含んでなる、プローブ、細胞又は溶媒を固定化するためのデバイス。
【請求項６０】
（ａ）プレートを、両親媒性分子と反応する物質により被覆すること、
（ｂ）貫通穴を形成すること、そして
（ｃ）プレートを両親媒性分子の溶液又は蒸気で処理して、疎水性被覆を、貫通穴の壁ではなく、プラテンの表面に有するプラテンを提供すること、
を含んでなる、疎水性の対置する表面と、複数の親水性貫通穴を有するプラテンを作製する方法。
【請求項６１】
請求項６０に記載の方法によって、作製されるプラテン。
【請求項６２】
（ａ）存在するならば、残留する疎水性被覆を除くこと、そして
（ｂ）プラテンを両親媒性分子の溶液又は蒸気で処理して、疎水性被覆を再生すること、
を含んでなる、請求項６１に記載のプラテンの使用後に、疎水性被覆を再生する方法。
【請求項６３】
（ａ）プラテンの表面を、両親媒性分子と反応する物質で選択的に被覆すること、そして
（ｂ）プラテンを両親媒性分子の溶液又は蒸気で処理して、疎水性被覆を再生すること、
を含んでなる、複数の貫通穴を有するプラテンの表面における被覆を選択的に作製する方法。
【請求項６４】
プラテンは、２つの対置する表面及びこれらの表面間に伸びる複数の貫通穴を有しており、この貫通穴の壁及び前記表面がそれぞれ独立して機能するように、壁及び表面が異なる化学的特性を有するデバイス。
【請求項６５】
ａ）複数のキャピラリーを、貫通穴を有する少なくとも２つのプラテンを包含するプラテン積み重ね物の貫通穴に入れること、
ｂ）隣接するプラテンを、所望の厚さと等しい距離だけ隔てること、
ｃ）プラスチック形成物質を、隔てられているプラテンの間の空間に注入すること、
ｄ）プラスチック体を形成すること、そして
ｅ）プラテンとプラスチック体との境界で薄切りにして、チップを形成すること、
を含んでなる、貫通穴を有する所望の厚さのプラスチックプラテンを作製する方法。
【請求項６６】
ａ）複数の繊維又はワイヤを、貫通穴を有する少なくとも２つのプラテンを包含するプラテン積み重ね物の貫通穴に入れること、
ｂ）隣接するプラテンを、所望の厚さと等しい距離で隔てること、
ｃ）プラスチック形成物質を、隔てられているプラテンの間の空間に注入すること、
ｄ）プラスチック体を形成すること、
ｅ）繊維又はワイヤをプラスチック体から引き抜いて、貫通穴を形成すること、そして
ｆ）プラテンとプラスチック体との境界で薄切りにして、チップを形成すること、
を含んでなる、貫通穴を有する所望の厚さのプラスチックプラテンを作製する方法。
【請求項６７】
ａ）複数の貫通穴及び２つの対置する表面を有するプラテンを提供すること、
ｂ）マスクをプラテンの一方の表面又は両方の表面に適用して、貫通穴の少なくともいくつかを塞ぎ、その一方で、他の貫通穴を開いたままにすること、
ｃ）プラテンの表面を試薬に曝し、試薬が開いている貫通穴の少なくとも１つに入るようにすること、そして
ｄ）工程ｂ）及び工程ｃ）を、少なくとも１つの異なるマスク及び少なくとも１つの異なる試薬を用いて繰り返し、化学的アレイを作製すること、
を含んでなる、化学的アレイを作製する方法。
【請求項６８】
前記マスクが、ポリマー、エラストマー、紙、ガラス又は半導体物質から作製される、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記マスクが、機械的バルブ、ピンアレイ又はガスジェットを含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記適用する工程により、前記マスクと前記プラテンとの間に気密シールが形成される、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
前記試薬が、液体、気体、固体、粉末、ゲル、溶液、懸濁物、細胞培養物、ウイルス調製物又は電磁放射線である、請求項６７に記載の方法。
【請求項７２】
前記マスクを、異なる貫通穴を露出させるために平行移動させる、請求項６７に記載の方法。
【請求項７３】
前記マスクが、マスクのピン及び穴の位置合わせが、前記プラテンの貫通穴に見当をつけるように共通の位置合わせ用ピン及び穴を有する、請求項６７に記載の方法。
【請求項７４】
前記マスクが、柔軟な物質を含んでなる、請求項６７に記載の方法。
【請求項７５】
多数のマスクが、柔軟なテープの一部であり、前記多数のマスクが、テープを進めることによってプラテンの貫通穴と位置合わせされる、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
請求項６７に記載の方法によって作製されるアレイ。
【請求項７７】
ａ）複数の貫通穴と、２つの対置する表面を有するプラテンを提供すること、
ｂ）１つ又は複数の試薬をその表面に有するマスクを、プラテンの一方の表面又は両方の表面に適用して、試薬をマスクから貫通穴の少なくともいくつかに移すこと、そして
ｃ）工程ｂ）を、少なくとも１つの異なるマスク及び少なくとも１つの異なる試薬を用いて繰り返して、化学的アレイを作製すること、
を含んでなる、化学的アレイを作製する方法。
【請求項７８】
ａ）複数の貫通穴と、２つの対置する表面を有するプラテンを提供すること、
ｂ）プラテンを、試薬を含有する電気泳動装置の中に置き、貫通穴に対して平行する電場を加えることによって、荷電された試薬を貫通穴の少なくともいくつかに電気泳動により輸送すること、そして
ｃ）工程ｂ）を、少なくとも１つの異なる試薬を用いて繰り返して、化学的アレイを作製すること
を含んでなる、プラテンの化学的アレイの内部で、サンプルを分離するための方法。
【請求項７９】
ａ）空間的にアドレス指定可能な複数の別個の貫通穴（各々の貫通穴が内壁を有している）を有するプラテンであって、対置する疎水性表面を有するプラテンを提供すること、そして
ｂ）少なくとも１つの試薬又はプローブを、貫通穴の少なくともいくつかの内壁に、又は貫通穴の少なくとも１つの中に含有されるビーズに、共有結合的又は非共有結合的に固定化して、空間的にアドレス指定可能なアレイを形成すること、
を含んでなる、空間的にアドレス指定可能なアレイを作製する方法。
【請求項８０】
前記貫通穴が、通じていない貫通穴である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記貫通穴が、選択的に通じている貫通穴である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
ｃ）試薬を、貫通穴の所定のサブセットに入れるか、又は貫通穴の所定のサブセットを通過させること、
をさらに含んでなる、請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
ａ）複数の貫通穴を有するプラテンを提供すること、そして
ｂ）複数の試薬の各々を、ランダム様式又は準ランダム様式で貫通穴に適用して、確率論的アレイを作製すること、
を含んでなる、確率論的アレイを作製する方法。
【請求項８４】
前記適用する工程が、貫通穴の少なくともいくつかをアドレス指定する複数の分注デバイスを提供すること、試薬溶液の異なる組合せを各々の貫通穴に分注すること、そして貫通穴の異なるセットをアドレス指定するように分注デバイスを少なくも１回は再配置することを含んでなる、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記試薬溶液と混和しない流体を、少なくとも１つの貫通穴に分注することをさらに含んでなる、請求項２９に記載の方法。
【請求項８６】
ａ）確率論的アレイを、請求項８３に記載の方法を用いて作製すること、
ｂ）確率論的アレイを、目的の特性を有する組合せ物でアッセイすること、そして
ｃ）目的の特性を有する試薬を同定すること
を含んでなる、目的の生物学的、化学的又は物理的特性を有する試薬の組合せを同定するための方法。
【請求項８７】
ａ）プラテンを、貫通穴に負荷するサンプルを包含する液体サンプルの中に浸け、それにより貫通穴の少なくともいくつかにサンプルを負荷すること、そして
ｂ）プラテンを、プラテンの表面に対する親和性を有し、しかし、液体サンプルと混和しない液体に通し、それによりプラテンの表面から過剰なサンプル混合物を除くこと、
を含んでなる、対置する表面を有して、複数の貫通穴を有するプラテンに負荷する方法。
【請求項８８】
ａ）プラテンを、貫通穴に負荷するサンプルを包含する液体サンプルの中に浸け、それにより貫通穴の少なくともいくつかにサンプルを負荷すること、そして
ｂ）プラテンを、プラテンの表面に対する親和性を有し、しかし、液体サンプルと混和しない液体と接触させ、それによりプラテンの表面から過剰なサンプル混合物を除くこと、
を含んでなる、対置する表面を有して、複数の貫通穴を有するプラテンに負荷する方法。
【請求項８９】
ａ）好気性生物を、プラテンの貫通穴の少なくともいくつかに負荷すること、そして
ｂ）プラテンを、ガス透過性液体の中に沈めること、
を含んでなる、好気性生物の生存能を、複数の貫通穴を有するプラテンにおいて維持する方法。
【請求項９０】
前記生物が流体中に存在し、そして前記ガス透過性液体が前記流体と混和しない、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記好気性生物の１つ又はそれ以上の物理的特性を、アッセイすることをさらに含んでなる、請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
前記好気性生物が、細胞である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９３】
前記ガス透過性液体が、フルオロカーボン、シリコーンポリマー又は単分子層である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９４】
ａ）複数の貫通穴を有するプラテンを提供すること、
ｂ）貫通穴の一部又は全てに、１つ又はそれ以上の不揮発性サンプルを任意に負荷すること、
ｃ）プラテンの貫通穴の少なくともいくつかに、１つ又はそれ以上の揮発性サンプルを負荷して、各々の貫通穴におけるサンプルが同じ貫通穴において他のサンプルと混合することを可能にすること、そして
ｄ）プラテンを、揮発性サンプルと混和しない液体に沈めること、
を含んでなり、工程ｂ）、工程ｃ）及び工程ｄ）を任意の順序で行うことができる、
揮発性サンプルを他のサンプルと混合する方法。
【請求項９５】
前記混合されるサンプルが、２つの別個のプラテンにおいて最初に提供され、これらが、混合できるように前記非混和性液体に沈めて接触させられる、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
工程ｃ）及び工程ｄ）が逆の順序で行われる、請求項９４に記載の方法。
【請求項９７】
前記非混和性液体が、フルオロカーボン、シリコーンポリマー、鉱油又はアルカンである、請求項９４に記載の方法。
【請求項９８】
ａ）複数の貫通穴を有するプラテンを提供すること（ここにおける貫通穴の少なくともいくつかには、第１のサンプル又は第１のサンプルセットが負荷される）、
ｂ）第２のサンプル又は第２のサンプルセットのアレイを包含する実質的に平坦な表面を提供すること（ここにおいて、平坦な表面における第２のサンプル又は第２のサンプルセットは、プラテンにおけるサンプルと位置合わせすることができる）、
ｃ）プラテンを、平坦な表面における第２のサンプル又は第２のサンプルセットのアレイと位置合わせすること、そして
ｄ）プラテンを平坦な表面と接触させること（ここにおいて、プラテンのサンプルは平坦な表面におけるサンプルと位置調整される）、
を含んでなる、サンプルのアレイを混合する方法。
【請求項９９】
第１のサンプル又は第１のサンプルセットが、１つ又はそれ以上のプローブを含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
第２のサンプル又は第２のサンプルセットが、１つ又はそれ以上のプローブを含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０１】
プラテンに含有されるサンプルの物理的特性を分析することをさらに含んでなる、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０２】
前記平坦な表面が、プラテンのアレイのパターンと一致する疎水性パターンを含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０３】
ａ）プラテンを容器の上に置くこと、
ｂ）気体、液体又は固体の一吹き、又はピンを、前記特定の貫通穴に加えて、前記試薬又はプローブを容器の中に移すこと
を含んでなる、試薬又はプローブを、複数の貫通穴を有するプラテンの特定の貫通穴から容器に移すための方法。
【請求項１０４】
気体、液体又は固体の一吹きが、シリンジにより生じる、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
光力学的又は光熱的物質を貫通穴内又は貫通穴の上方に置き、その後、光力学的又は光熱的物質を、光力学的又は光熱的物質を活性化するのに好適な振動数及び強度のレーザービームに曝すことにより、前記の気体の一吹きが生じる、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０６】
ａ）プラテンを収容するのに適合したホルダー、
ｂ）サンプルを前記プラテンの単一の貫通穴に注入するための、好適なサイズの開口度を有するノズル、及び
ｃ）前記ノズルを通過するサンプルの流れを制御するバルブ
を含んでなり、
前記ホルダー及びノズルが互いに移動することができる、複数の貫通穴を有するプラテンの貫通穴に充填するか、又は貫通穴から排出するためのデバイス。
【請求項１０７】
前記ノズルが、前記プラテンと接触するように配置される、請求項１０６に記載のデバイス。
【請求項１０８】
サンプルを前記プラテンから受け取るために配置されたマイクロプレートをさらに含んでなる、請求項１０６に記載のデバイス。
【請求項１０９】
前記バルブを制御し、そして前記ホルダー及びノズルの位置を互いに制御するコンピューターをさらに含んでなる、請求項１０６に記載のデバイス。
【請求項１１０】
前記バルブを制御し、そして前記マイクロプレート及びホルダーの位置を互いに制御するコンピューターをさらに含んでなる、請求項１０８に記載のデバイス。
【請求項１１１】
前記マイクロプレート、ホルダー及びノズルを、少なくとも二次元において互いにそれぞれ独立して移動させることができる、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１２】
前記ノズルが、単一の位置で保持され、そして前記ホルダー及びノズルを少なくとも二次元において互いにそれぞれ独立して移動させることができる、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１３】
ａ）貫通穴に第１のサンプル又は第１のサンプルセットが負荷される、複数の貫通穴を有する第１のプラテンを提供すること、
ｂ）プラテンを検出デバイスに導入すること、
ｃ）貫通穴にサンプル又は試薬が負荷される、複数の貫通穴を有する第２のプラテンを検出デバイスに導入すること、
ｄ）前記第１のプラテンの貫通穴の内容物が、前記第２のプラテンの対応する貫通穴の内容物と混合し得るように、プラテンを位置合わせし、接触させること、そして
ｅ）貫通穴の少なくともいくつかの内容物の物理的特性における変化を、経時的に検出すること、
を含んでなる、プラテンの貫通穴の少なくとも１つにおいて生じる１つ又はそれ以上の反応速度を分析する方法。
【請求項１１４】
ａ）貫通穴がサンプルで負荷される、複数の貫通穴を有するプラテンを提供すること、
ｂ）プラテンを２つの半透明ミラーの間に置くこと、
ｃ）サンプルに、前記ミラーの１つを介して光を当てること、そして
ｄ）サンプルからの光学的出力を検出すること、
を含んでなる、アレイにおけるサンプルの物理的特性を分析する方法。
【請求項１１５】
当該画像化工程が、前記アレイから生じる光を測定することを含む、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記プラテンがレーザー空洞内にあり、そして光学的利得媒体が前記２つのミラーの間に配置される、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１７】
当該画像化工程が、照射光源の対面にあるミラーから放射された光を測定することを含んでなる、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１８】
ａ）貫通穴がサンプルで負荷される、複数の貫通穴を有するプラテンを提供すること、
ｂ）サンプルをキャピラリーのアレイの中に導入すること、
ｃ）サンプルを、不連続な流れを生じさせるパルス圧力を用いて、キャピラリーを通して溶出すること、
ｄ）溶出するサンプルを、キャピラリーに対して移動している表面にスポットすること（ただし、スポットは離れており、サンプル間の混合が生じない）、そして
ｅ）スポットの物理的特性を分析すること、
を含んでなる、アレイからのサンプル出力を測定する方法。
【請求項１１９】
ａ）複数の貫通穴を有するプラテンを提供すること、
ｂ）貫通穴に、２つの溶媒（第１の溶媒が低い蒸気圧を有し、第２の溶媒がそれよりも高い蒸気圧を有する）を包含する混合物に溶解された前記サンプルを負荷すること、そして
ｃ）第２の溶媒を蒸発させて、第１の溶媒における複数のサンプルを得ること、
を含んでなる、複数のサンプルを、アッセイが直ちに可能な、高密度形式で保存する方法。
【請求項１２０】
各々の溶液における前記第１の溶媒の体積が、約２５ｎｌ以下である、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
ａ）貫通穴の少なくともいくつかが低い蒸気圧を有する溶媒に溶解されたサンプルを含有する、複数の貫通穴を有するプラテンを提供すること、
ｂ）プラテンを、溶解されたサンプルを凍結させるために十分な温度に冷却すること、
ｃ）プラテンを、試薬を含む溶液の中に浸けること（この場合、溶液の温度はサンプルの凝固点よりも低く、しかし、試薬溶液の凝固点よりも高い）、
ｄ）プラテンを試薬溶液から取り出すこと、そして
ｅ）プラテンを、サンプルの凝固点よりも高い温度に加温すること、
を含んでなる、ハイスループットアッセイを形成する方法。
【請求項１２２】
ａ）複数の貫通穴を有するプラテンを、提供すること、
ｂ）貫通穴に、２つの溶媒（第１の溶媒が低い蒸気圧を有し、第２の溶媒がそれよりも高い蒸気圧を有する）を含む混合物に溶解されたサンプルを負荷すること、そして
ｃ）第１の溶媒を蒸発させること、
を含んでなる、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
前記試薬溶液が、水溶液である、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２４】
第１のプラテンの貫通穴が第２のプラテンの貫通穴と実質的に位置が合うように、これらのプラテンが位置調整され、そして膜がこれらの２つのプラテンの間に挟まれる、複数の貫通穴を各々有する第１のプラテン及び第２のプラテン、並びに半透過性膜を包含するろ過デバイス。
【請求項１２５】
前記半透過性膜が、ニトロセルロース膜である、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記半透過性膜が、細胞の層を含む、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２７】
前記プラテンが、疎水性表面を有する、請求項１２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
本出願は、米国仮特許出願第６０／７０７，５０１号（２００５年８月１１日出願）の優先権を主張し、米国特許出願第１０／３１５，８３２号（２００２年１２月１０日出願）の一部継続出願であり、この米国特許出願第１０／３１５，８３２号は、米国特許出願第０９／９７５，４９６号（２００１年１０月１０日出願；これは現在、米国特許第６，７１６，６２９号として発行される）の分割出願であり、米国仮特許出願第６０／２３９，５３８号（２０００年１０月１０日出願）、米国仮特許出願第６０／２６８，８９４号（２００１年２月１４日出願）及び米国仮特許出願第６０／２８４，７１０号（２００１年４月１８日出願）の恩恵を主張する。前記出願の各々が、その全体を参考として本明細書により組み込まれる。
【０００２】
本発明は、分子の合成、保管及びスクリーニング、並びに他の化学的、生化学的、生物学的及び物理学的実験のためのデバイス、また、その作製方法、使用方法及び操作方法に関連する。
【背景技術】
【０００３】
化学的及び生化学的な多様性を開発及び分析するためのハイスループット方法は、薬剤の発見及び開発を含めて、様々な技術において極めて重要な役割を果たしている。ハイスループット方法の具体的な適用には、薬剤発見、反応条件（例えば、タンパク質結晶化のために好適な条件）の最適化、ゲノミクス、プロテオミクス、遺伝子型決定、多型分析、細胞又は組織におけるＲＮＡ発現プロフィールの試験、ハイブリダイゼーションによる配列決定、及び組換え酵素の発見が含まれる。
【０００４】
非常に多数のこれらの化合物を（例えば、コンビナトリアル化学の方法を使用して）合成し、生物学的性質及び物理化学的特性についてスクリーニングするための迅速なハイスループット方法が、例えば、薬剤リード化合物の発見及び最適化のスピードを増大させるために所望される。
【０００５】
同様に、部分的には、ヒトゲノムプロジェクトから得られる配列データの量が多いために、多くの新たに発見された遺伝子のタンパク質産物についてのＸ線結晶学データを迅速に得るための、様々な努力が進行中である。このプロセスにおける律速段階の１つが、タンパク質の結晶化を生じさせるための適切な溶液条件（例えば、ｐＨ、塩濃度）についての探索である。新たに発見された遺伝子の各々の機能を明らかにすること（すなわち、「機能ゲノミクス」）、及びタンパク質−タンパク質の相互作用をマッピングすること（すなわち、「プロテオミクス」）もまた必要である。非常に多数のヒト遺伝子、タンパク質修飾及びタンパク質結合パートナーを考えた場合、より高度なハイスループット方法が所望される。
【０００６】
生物工学における別の進歩は、バイオポリマー（例えば、オリゴヌクレオチド又はペプチドなど）の高密度アレイを有する表面の作製である。様々な高密度オリゴヌクレオチドアレイが、例えば、米国特許第５，４９２，８０６号、同第５，５２５，４６４号及び同第５，６６７，９７２号（全て、Hyseq, Inc.）に記載されるように、例えば、遺伝子型決定、多型分析、細胞又は組織におけるＲＮＡ発現プロフィールの試験、及びハイブリダイゼーションに基づく配列決定法において使用される。現在提供されるよりも多い数のプローブを含有するアレイが望ましい。
【０００７】
組換え酵素を産業使用又は消費者の使用のために発見及び改良するプロセスが、近年では重要な経済的活動として出現している。非常に希な、活性を改善する変異を発見したいという願望が、より高度なハイスループットスクリーニング方法についての探索をさらに刺激している。そのような方法では多くの場合、遺伝子ライブラリーの１００，０００個〜１，０００，０００個のメンバーを並行してスクリーニングし、その後、有望なメンバーをさらなる分析及び最適化のために迅速に検出及び単離することが要求される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ハイスループット方法の開発における課題の１つが、従来の液体取り扱い技術、例えば、ピペット操作、圧電的な液滴分注、スプリットピン分注、及び液体の微量添加などは一般に、液体を高密度のプレート（例えば、約３８４個を越えるウエルを有するプレート）に、又はプレートから迅速に負荷又は移動するためには適していないことである。例えば、これらの技術はかなりのはね返りを引き起こすことがあり、これにより、例えば、隣接ウエルの汚染及びサンプル体積の喪失が生じ得る。また、ウエルの数が増大するにつれ、化合物を前世代のプレートからより高密度のプレートに再設定するために必要な時間が一般には増大し、従って、より高密度のプレートの有用性を制限する。蒸発もまた、数秒よりも長い時間に関しては問題となり得る。そのうえ、閉じ込められた気泡は、小さい流体体積（例えば、約１マイクロリットル以下）を負荷する際の不一致をもたらし得る。
【０００９】
ハイスループットスクリーニングの試みにおける大きな障害には、ライブラリーの保存、取り扱い及び輸送が含まれる。ライブラリーにおける化合物の数が増大するにつれ、９６ウエルプレート又は３８４ウエルプレートの数、並びにライブラリーを保存するために必要となる全体的な体積もまた増大する。凍結された溶媒（例えば、ＤＭＳＯ又は水など）に保存される化合物については、解凍、分注及び再凍結は、一部の化合物の結晶化、沈殿化又は分解の危険性を有しており、このことは、将来において正確な量を分注することを困難にしている。サンプルが低密度のプレートにおいて保存されると、高密度技術が利用され得る前にサンプルを高密度のプレートに再配置するという時間のかかる工程が必要となる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、貫通穴の高密度アレイを有するデバイス又は「プラテン」を作製する方法、更にそのようなプラテンの表面を清浄化及び再生する方法を特徴とする。本発明はさらに、従来の低密度のアレイを上回る多くの利点を有する、化学的、生化学的及び生物学的化合物の高密度アレイを作製する方法を特徴とする。本発明には、多くの物理的、化学的又は生物学的転換をデバイスの各々のアドレス指定可能な貫通穴の内部において連続して、又は並行して実行することができる方法が含まれる。加えて、本発明には、サンプルの物理的特性をアッセイすることを含めて、アレイの内容物を分析する方法が含まれる。
【００１１】
様々な態様において、試薬を毛細管作用によって貫通穴内に含有させることができるか、貫通穴の壁に付着させることができるか、又は貫通穴の内部において多孔性物質に付着又は含有させることができる。多孔性物質は、例えば、ゲル、ビーズ、焼結ガラス又は粒状物であってもよく、又は化学的にエッチングされている貫通穴の内壁であってもよい。特定の態様において、アレイは、個々の分子、分子の複合体、ウイルス、細胞、細胞群、組織片又は小さい粒子若しくはビーズを含むことができる。アレイの部材はまた、例えば、分析物の存在を（例えば、容易に検出されるシグナルをもたらすことによって）知らせるトランスジューサーとして機能することができ、又は目的の分析物を保持するための選択的な結合剤として機能することができる。これらの方法を用いて、非常に多数のヒト遺伝子に対応するアレイ（例えば、核酸プローブを使用するアレイ）もまた調製することができる。
【００１２】
本発明の１つの態様は、複数の貫通穴を有する所望の厚さのプラテンを作製する方法を特徴とする。この方法は、（ａ）上部及び下部表面を有する複数（例えば、２個、３個、５個、８個、１０個、１００個、１０００個又はそれ以上）のプレートを提供する工程（ただし、前記複数のプレートの少なくともいくつかの上部表面及び下部表面の一方又は両方が、前記表面の長さにわたる連続する実質的に平行な溝を有する）、（ｂ）前記複数のプレートの１つを除く全ての上部表面をそれ以外のプレートの下部表面に結合する工程（すなわち、第１のプレートの上部表面が第２のプレートの下部表面に結合され、第２のプレートの上部表面が第３プレートの下部表面に結合され、それ以降、同様であり、最後のプレートの上部表面は他の何れにも結合されない）、そして（ｃ）所望の厚さを達成するために必要ならば、プラテンを貫通穴に対して実質的に直交して薄切りにし、それにより、複数の貫通穴を有する所望の厚さのプラテンを得る工程を含む。工程ｃ）は場合により、複数のプラテンを作製するために繰り返すことができる。「複数の貫通穴」は、少なくとも２個（例えば、２、５、１０、２０、２５、５０、１００、２００、２５０、５００、２５，０００、５０，０００個又はそれ以上）を意味する。例えば、従来の顕微鏡用スライドガラスのサイズのプラテンは約３，０７２個の穴を有することができ、一方、マイクロタイタープレートのサイズのプラテンは約２４，５７６個の穴を有することができる。マイクロタイタープレート上の貫通穴の数は、５０，０００、１００，０００、２００，０００個又はそれ以上であってもよい。当然、貫通穴の数は、穴の直径及びプラテンのサイズに依存して変化する。例えば、貫通穴が約４００マイクロメートル以下の直径を有する場合、貫通穴の密度は１平方ミリメートルあたり少なくとも１．６個の貫通穴である。
【００１３】
プレートは、結合させることできる物質の何れか（例えば、プラスチック、金属、ガラス又はセラミックス）から作製することができ、各々が、例えば、約０．０１ｍｍ〜２．０ｍｍ（好ましくは、０．１ｍｍ〜１ｍｍ）の厚さを有することができる；溝は、例えば、０．００５ｍｍ〜２．０ｍｍの深さ（すなわち、プレートの厚さよりも小さい深さ）を有する；また、溝は、例えば、０．１ｍｍ〜１．０ｍｍの幅を有することができる。
【００１４】
プレートは、１つのプレートの溝がそれ以外のプレートの各々の溝に対して実質的に平行である形態で結合させることができ、又は特定のプレートの溝が、特定の他のプレートの溝に対して直交又は鋭角であるように結合させることができる。
【００１５】
別の態様において、本発明は、プローブ、細胞又は溶媒を固定化するためのデバイスを特徴とする。このデバイスは、（例えば、上部表面から下部表面に）複数の貫通穴を有するプラテン（場合により、疎水性の上部表面及び下部表面を有する）を含み、この場合、貫通穴の少なくともいくつかが、プローブ、細胞又は溶媒の固定化のための多孔性物質（例えば、ゲル（例えば、ポリアクリルアミド）、シリカ、焼結ガラス又はポリマーなど）を含有する。
【００１６】
さらに別の態様において、本発明は、対置する疎水性表面と、複数の親水性貫通穴とを有するプラテンを作製する方法を特徴とする。この方法は、（ａ）プレートを、両親媒性分子（例えば、アルカンチオール、アルカンホスフェート、アルカンカルボキシレート）と反応する物質（例えば、金、銀、銅、ヒ化ガリウム、金属酸化物又はアルミナ）により被覆する工程、（ｂ）貫通穴を（例えば、ドリル穴開け、放電加工（ＥＤＭ）、パンチング、スタンピング又はエッチングのような、微細加工法によって）プレートに形成する工程、及び（ｃ）プレートを両親媒性分子の溶液又は蒸気で処理（例えば、浸漬又は噴霧）して、貫通穴の壁においてではなく、プラテンの表面に疎水性被覆を有するプラテンを提供する工程を含む。本発明にはまた、本発明の方法によって作製されるプラテン、更にプラテンにおける疎水性表面を使用後に再生する方法が含まれる。この方法は、（ａ）存在するならば、残留する疎水性被覆を、（例えば、プラテンを、酸化剤、還元剤、酸、塩基又は界面活性剤により洗浄することによって、又は加熱、電解研磨、放射線照射又は燃焼によって）除く工程、及び（ｂ）プラテンを両親媒性分子の溶液又は蒸気で処理して、疎水性被覆を再生する工程を含む。
【００１７】
さらに別の態様において、本発明は、複数の貫通穴を有するプラテンの表面に、被覆を選択的に作製する方法を特徴とする。この方法は、（ａ）プラテンの表面を、両親媒性分子と反応する物質により選択的に被覆する工程、及び（ｂ）プラテンを両親媒性分子の溶液又は蒸気で処理して、疎水性被覆を再生する工程を含む。
【００１８】
本発明のさらに別の態様は、２つの対置する表面、及びそれらの表面間に伸びる複数の貫通穴を含むプラテンを特徴とする。表面は、壁及び表面がそれぞれ独立して官能基化されるように、貫通穴の壁に対して異なる化学的特性を有する。例えば、壁を、（例えば、プラテン全体（壁及び対置する表面の両方を含む）を金により被覆し、その後、表面を電解研磨して、金を表面から除くことによって）金により被覆することができ、これにより、アルカンチオールで処理したとき、壁を疎水性にすることができる。逆に、表面（壁ではない）を、アルカンホスフェートが結合できるように金属酸化物により被覆することができる。
【００１９】
別の態様において、本発明は、貫通穴を有する所望の厚さのプラスチックプラテンを作製する方法を特徴とする。この方法は、ａ）複数のキャピラリー（例えば、ガラス又はプラスチックのキャピラリー）を、貫通穴を有する少なくとも２つのプラテンを包含するプラテン積み重ね物の貫通穴に入れる工程、ｂ）隣接するプラテンを、所望の厚さと等しい距離だけ隔てる工程、ｃ）プラスチック形成物質を、隔てられているプラテンの間の空間に注入する工程、ｄ）プラスチック体を形成（例えば、熱硬化又は硬化）する工程、及びｅ）プラテンとプラスチック体との境界において薄切りにして、チップを形成する工程を特徴とする。プラスチック形成物質は、例えば、光硬化性、熱硬化性又は化学硬化性物質、例えば、ＵＶ硬化性物質（例えば、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリスチレン又はエポキシ）などであり、形成する工程は、そのような物質を紫外線に曝すことを伴うことができる。又は、プラスチック形成物質は、溶融した熱可塑性物質であり、形成する工程は、そのような物質を冷却することを伴うことができる。
【００２０】
さらに別の態様において、本発明は、貫通穴を有する所望の厚さのプラスチックチップを作製する方法を特徴とする。この方法は、ａ）複数の繊維又はワイヤを、貫通穴を有する少なくとも２つのプラテンを包含するプラテン積み重ね物の貫通穴に入れる工程、ｂ）隣接するプラテンを、所望の厚さと等しい距離だけ隔てる工程、ｃ）プラスチック形成物質を、隔てられているプラテンの間の空間に注入する工程、ｄ）プラスチック体を形成する工程、ｅ）繊維又はワイヤをプラスチック体から引き抜いて、貫通穴を形成する工程、及びｆ）プラテンとプラスチック体との境界において薄切りにして、チップを形成する工程を特徴とする。
【００２１】
本発明の更なる別の態様が、化学的アレイを作製する方法である。この方法は、ａ）複数の貫通穴、及び２つの対置する表面とを有するプラテンを提供する工程、ｂ）マスクをプラテンの一方の表面又は両方の表面に適用して、貫通穴の少なくともいくつかを塞ぎ、その一方で、他の貫通穴を開いたままにする工程、ｃ）プラテンの表面を、試薬（例えば、液体、気体、固体、粉末、ゲル、溶液、（スラリーのような）懸濁物、細胞培養物、ウイルス調製物又は電磁放射線）に、（例えば、試薬の溶液又は懸濁物をプラテンに噴霧することによって、あるいは、試薬をプラテン上に凝固、注入、堆積又は浸漬することによって）曝し、その結果、試薬が、開いている貫通穴の少なくとも１つの中に入るようにする工程、及びｄ）工程ｂ）及び工程ｃ）を、少なくとも１つの異なるマスク及び少なくとも１つの異なる試薬を用いて、（例えば、少なくとも１回、一般には少なくとも３回）繰り返して、化学的アレイを得る工程を含む（核酸アレイを作製するために、これらの工程は、所望される核酸鎖の長さの４倍繰り返すことができ、タンパク質アレイを作製するために、これらの工程は、所望されるペプチド鎖の長さの２０倍繰り返すことができる）。マスクは再使用又は使い捨てが可能であり、また、機械（例えば、ロボット）により、又は手作業により適用することができる。マスクは、一部の場合には、試薬を最初に含むことができる（例えば、マスク表面に吸収させる、又はマスク内に含有することができる）。マスクは、例えば、柔軟又は剛直であることが可能であり、ポリマー、エラストマー、紙、ガラス又は半導体物質から作製することができる。マスクは、例えば、機械的バルブ、ピンアレイ（例えば、ポスト、ピストン、チューブ、プラグ又はピン）又はガスジェットを含むことができる。一部の場合において、「適用する」工程により、マスクとプラテンとの間での気密シールが形成される。マスクはまた、異なる貫通穴を露出させるために平行移動させることができる（例えば、方法の繰り返しの間において移動させることができる）。一部の場合において、マスクは、マスクにおけるピン及び穴の位置合わせが、プラテンの貫通穴に見当をつけるように共通の位置決め用ピン及び穴を有する。これらの場合において、多数のマスクを柔軟なテープの一部とすることができ、そのような多数のマスクは、テープを進めることによってプラテンの貫通穴と位置合わせされる（例えば、マスクを、スプール、リボン又はロールに存在させることができ、また、カメラのフィルムを進めるのと同様な様式で進めることができる）。これらの方法のいずれかによって作製されるアレイもまた、本発明の態様であると見なされる。
【００２２】
さらに別の態様において、本発明は、化学的アレイを作製する方法を特徴とする。この方法は、ａ）複数の貫通穴、及び２つの対置する表面を有するプラテンを提供する工程、ｂ）１つ又はそれ以上の試薬をその表面に有するマスクを、プラテンの一方の表面又は両方の表面に適用して、試薬をマスクから貫通穴の少なくともいくつかに移す工程、及びｃ）工程ｂ）を、少なくとも１つの異なるマスク及び少なくとも１つの異なる試薬を用いて繰り返して、化学的アレイを得る工程を含む。
【００２３】
本発明はまた、サンプルをプラテンの化学的アレイ内で分離するための方法を特徴とする。この方法は、ａ）複数の貫通穴、及び２つの対置する表面を有するプラテンを提供する工程、ｂ）プラテンを、試薬を含有する電気泳動装置の中に置き、貫通穴に対して平行する電場を加えることによって、荷電を有する試薬を貫通穴の少なくともいくつかの中に電気泳動により輸送する工程、及びｃ）工程ｂ）を、少なくとも１つの異なる試薬を用いて繰り返して、化学的アレイを得る工程を含む。
【００２４】
さらに別の態様において、本発明は、空間的にアドレス指定可能なアレイを作製する方法を特徴とする。この方法は下記の工程を含む：ａ）空間的にアドレス指定可能な複数の別個の貫通穴（各々の貫通穴が内壁を有している）を有するプラテンであって、対置する疎水性表面を有するプラテンを提供する工程、及びｂ）少なくとも１つの試薬又はプローブを、貫通穴の少なくともいくつかの内壁に、又は貫通穴の少なくとも１つの中に含有されるビーズに共有結合的又は非共有結合的に固定化して、空間的にアドレス指定可能なアレイを形成する工程を含む。この方法において、貫通穴は、通じていない貫通穴（すなわち、隣接する貫通穴の内容物が互いに混合しない）、又は、選択的に通じている貫通穴（すなわち、貫通穴の少なくともいくつかの壁が半透過性膜として作用する）のいずれかであってもよい。一部の場合において、この方法はまた、ｃ）試薬（例えば、モノマー、洗浄液、触媒、停止剤、変性剤、活性化剤、ポリマー、細胞、緩衝液、発光性又は発色性基質溶液、ビーズ、加熱又は冷却された液体又は気体、標識された化合物、又は反応性有機分子）を貫通穴の所定のサブセットに流し入れるか、又は貫通穴の所定のサブセットを通過させる工程を含むことができる。
【００２５】
本発明のさらに別の態様は、確率論的アレイを作製する方法である。この方法は、ａ）複数の貫通穴を有するプラテンを提供すること、及びｂ）複数の試薬の各々を、ランダム様式又は準ランダム様式（例えば、空間的ランダム、又は試薬の分布に関してランダム）で貫通穴に適用して、確率論的アレイを得ることを含む。「適用する」工程は、例えば、貫通穴の少なくともいくつかをアドレス指定する複数の分注デバイスを提供すること、試薬溶液の異なる組合せで（例えば、溶液として、試薬のみで又は懸濁物で）各々の貫通穴に分注すること、そして貫通穴の異なるセットをアドレス指定するように分注デバイスを少なくも１回は再配置することを含むことができる。この場合において、この方法はまた、試薬溶液と混和しない流体を少なくとも１つの貫通穴に分注することを含むことができる。
【００２６】
別の態様において、本発明は、目的の生物学的、化学的又は物理的特性を有する試薬の組合せを同定する方法を特徴とする。この方法は、例えば、放射能標識されたプローブの使用、又は化学発光の測定を伴う。この方法は、ａ）確率論的アレイを、上記の方法を用いて作製する工程、ｂ）確率論的アレイを、目的の特性を有する組合せ物についてアッセイする工程、及びｃ）目的の特性を有する試薬を同定する工程を特徴とする。目的の特性の限定されない例には、触媒作用（例えば、「Weinberg et al., Current Opinion in Solid State & Materials Science, 3:104-110 (1998)」を参照されたい）、特定の分子についての結合親和性（例えば、「Brandts et al., American Laboratory, 22:3041 (1990)」、又は「Weber et al., J. Am. Chem. Soc. 16:2717-2724 (1994)」を参照されたい）、特定の化学的及び生化学的反応を阻害することができること、熱安定性（例えば、Ｐａｎｔａｌｉａｎｏらの米国特許第６，０３６，９２０号及び同第６，０２０，１４１号を参照されたい）、ルミネセンス（例えば、「Danielson et al., Nature, 389:944-948 (1997)」を参照されたい）、結晶構造（例えば、「Hindeleh et al., Journal of Materials Science, 26:5127-5133 (1991)」を参照されたい）、結晶成長速度、ジアステレオ選択性（例えば、「Burgess et al., Angew. Chem. 180:192-194 (1996)」を参照されたい）、結晶品質又は多形、表面張力（例えば、「Erbil, J. Phys. Chem. B., 102:9234-9238 (1998)」を参照されたい）、表面エネルギー（例えば、「Leslot et al., Phys. Rev. Lett. 65:599-602 (1990)」を参照されたい）、電磁的性質（例えば、「Briceno et al., Science 270:273-275 (1995)」、又は「Xiang et al., Science 268:1738-1740 (1995)」を参照されたい）、電気化学的特性（例えば、「Mallouk et al., Extended Abstracts; Fuel Cell seminar: Orlando, Florida, 686-689 (1996)」を参照されたい）、及び光学的性質（例えば、「Levy et al., Advanced Materials 7:120-129 (1995)」を参照されたい）、毒性、抗生物活性、結合、及び他の生物学的性質、蛍光及び他の光学的性質、並びにｐＨ、質量、結合親和性、他の化学的及び物理的特性が含まれる。
【００２７】
さらに別の態様において、本発明は、対置する表面を有し、複数の貫通穴を有するプラテン（例えば、表面が疎水性であり、貫通穴が親水性の壁を有する）に負荷する方法を特徴とする。この方法は、ａ）プラテンを、貫通穴に負荷するサンプルを包含する液体サンプル（例えば、そのままの液体、溶液、懸濁物又は細胞培養物）の中に浸け、それにより貫通穴の少なくともいくつかにサンプルを負荷する工程、及びｂ）プラテンを、プラテンの表面に対する親和性を有し、しかし、液体サンプルと混和しない液体の中に通し、それによりプラテンの表面から過剰なサンプル混合物を除く工程（例えば、サンプル混合物の上に、サンプル混合物よりも低い密度を有する非混和性液体（例えば、鉱油）を加えること、そしてプラテンを、液体の中を通過させてサンプル混合物から除くこと、サンプルと液体との間にバリアを包含するデバイスを含む）を含む。
【００２８】
本発明はまた、対置する表面を有し、複数の貫通穴を有するプラテンに負荷する別の方法を特徴とする。この方法は、ａ）プラテンを、貫通穴に負荷されるサンプルを含む液体サンプルの中に浸け、それにより貫通穴の少なくともいくつかにサンプルを負荷する工程、及びｂ）プラテンを、プラテンの表面に対する親和性を有し、しかし、液体サンプルと混和しない液体と接触させ、それによりプラテンの表面から過剰なサンプル混合物を除く工程を含む。
【００２９】
本発明はまた、好気性生物の生存能を、複数の貫通穴を有するプラテンにおいて維持する方法を特徴とする。この方法は、ａ）好気性生物（例えば、細胞又は胚）を、プラテンの貫通穴の少なくともいくつかに負荷する工程、及びｂ）プラテンを、ガス透過性液体の中に沈める工程を含む。生物は、例えば、増殖培地などの流体の中に存在させることができ、そのような場合、ガス透過性液体はそのような流体と非混和性でなければならない。この方法はまた、好気性生物の１つ又はそれ以上の物理的特性をアッセイすることを含むことができる。
【００３０】
ガス透過性液体は、例えば、ペルフルオロデカリン、シリコーンポリマー又は単分子層（例えば、脂質又は高分子量アルコールの単分子層）のようなフルオロカーボンである。
【００３１】
さらに別の態様において、本発明は、揮発性サンプルを他のサンプル（揮発性又は不揮発性のいずれであってもよい）と混合する方法を特徴とする。この方法は、ａ）複数の貫通穴を有するプラテンを提供する工程、ｂ）貫通穴の一部又は全てに、（存在するならば）１つ又はそれ以上の不揮発性サンプルを任意に負荷する工程、ｃ）プラテンの貫通穴の少なくともいくつかに、１つ又はそれ以上の揮発性サンプルを負荷して、各々の貫通穴におけるサンプルが同じ貫通穴において他のサンプルと混合することを可能にする工程、及びｄ）プラテンを、揮発性サンプルと混和しない液体に沈める工程を含み、この場合、工程ｂ）、工程ｃ）及び工程ｄ）は、任意の順序で行うことができる。好ましい態様において、工程ｄ）は、揮発性サンプルを導入する前に行われる。混合されるサンプルは、２つの別個のプラテンにおいて最初に提供され、これらが混合できるように前記非混和性液体に沈めて接触させることができる。非混和性液体は、例えば、フルオロカーボン、シリコーンポリマー、鉱油又はアルカンであってもよい。
【００３２】
本発明はまた、サンプルのアレイを混合する方法を特徴とする。この方法は、ａ）複数の貫通穴を有するプラテンを提供すること（ここにおける貫通穴の少なくともいくつかには、第１のサンプル又は第１のサンプルセットが負荷される）、ｂ）第２のサンプル又は第２のサンプルセットのアレイを含む実質的に平坦な表面を提供すること（ここにおいて、平坦な表面における第２のサンプル又は第２のサンプルセットは、プラテンにおけるサンプルと位置合わせすることができる（例えば、第２のサンプル又は第２のサンプルセットを、プラテンの貫通穴の少なくともいくつかと並ぶことができる空間的パターンで配置することができる））、ｃ）プラテンを、平坦な表面における第２のサンプル又は第２のサンプルセットのアレイと位置合わせすること、そしてｄ）プラテンを平坦な表面と接触させること（ここにおいて、プラテンにおけるサンプルは、平坦な表面におけるサンプルと位置調整される）を伴う。この方法は、例えば、相互汚染を避けるために使用することができる、また、位置合わせ及び接触させることも同時に行うことができる。一部の場合において、第１又は第２のいずれかのサンプル、又は第１又は第２のいずれかのサンプルセットは、１つ又はそれ以上のプローブを含むことができる。この方法はまた、プラテンに含有されるサンプルの物理的特性（例えば、蛍光又は他の光学的性質、ｐＨ、質量、結合親和性）を、（例えば、放射能標識されたプローブ及びフィルム、化学発光を用いて）分析する更なる工程を含むことができる。一部の場合において、平坦な表面はまた、（例えば、相互汚染を防止するために）プラテンのアレイのパターンと一致する疎水性パターンを含むことができる。
【００３３】
別の態様において、本発明は、試薬又はプローブを、複数の貫通穴を包含するプラテンの特定の貫通穴から容器に（例えば、ボトル、チューブ、別のプラテン、マイクロタイタープレート又はカンの中に）移すための方法を特徴とする。この方法は、ａ）プラテンを容器の上に置く工程、及びｂ）気体、液体、固体の一吹き、又はピン（例えば、ピストン、チューブ、ポスト、プラグ）を、特定の貫通穴に加えて、試薬又はプローブを容器の中に移す工程を含む。気体、液体又は固体の一吹きは、例えば、シリンジを用いて、又は光力学的又は光熱的物質（カーボンブラック、プラスチック爆薬、水滴）を貫通穴内又は貫通穴の上方に置き、その後光力学的又は光熱的物質を、光力学的又は光熱的物質を活性化するのに好適な振動数及び強度のレーザービームに曝すことによって生じさせることができる。
【００３４】
別の態様において、本発明は、複数の貫通穴を有するプラテンにおける貫通穴に充填するか、又は貫通穴から排出するためのデバイスを特徴とする。このデバイスは、ａ）プラテンを収容するのに適合したホルダー；ｂ）サンプルを前記プラテンの単一の貫通穴に注入するための、好適なサイズの開口度を有するノズル、及びｃ）前記ノズルを通過するサンプルの流れを制御するバルブを含み、この場合、ホルダー及びノズルは互いに移動させることができる。ノズルは、例えば、プラテンと接触するように、（又は、プラテンと接触しないように）配置することができる。このデバイスは、サンプルをプラテンから受け取るために配置されたマイクロプレート（例えば、マイクロタイタープレート）、更にバルブを制御し、かつホルダー及びノズル（及び場合により、マイクロプレート）の位置を相互に制御するコンピューターを場合により含むことができる。任意に用いられるマイクロプレート、ホルダー及びノズルは、ある場合には、少なくとも二次元において互いにそれぞれ独立して移動させることができる。あるいは、ノズルを単一の位置で保持することができ、そしてホルダー及びノズルを少なくとも二次元において互いにそれぞれ独立して移動させることができる。
【００３５】
別の態様において、本発明は、プラテンの貫通穴の少なくとも１つにおいて生じる１つ又はそれ以上の反応速度を分析する方法を特徴とする。この方法は、ａ）貫通穴に第１のサンプル又は第１のサンプルセットが負荷される、複数の貫通穴を有する第１のプラテンを提供すること、ｂ）プラテンを検出デバイスに導入すること、ｃ）貫通穴にサンプル又は試薬が負荷される、複数の貫通穴を有する第２のプラテンを検出デバイスに導入すること、ｄ）前記第１のプラテンの貫通穴の内容物が、前記第２のプラテンの対応する貫通穴の内容物と混合し得るように、プラテンを位置合わせし、接触させること、そしてｅ）貫通穴の少なくともいくつかの内容物の物理的特性における変化を、経時的に検出することを含む。
【００３６】
別の態様において、本発明は、アレイにおけるサンプルの物理的特性を分析する方法を特徴とする。この方法は、ａ）貫通穴がサンプルで負荷される、複数の貫通穴を有するプラテンを提供する工程、ｂ）プラテンを２つの半透明ミラーの間に置く工程、ｃ）サンプルに、（例えば、レーザー、原子ランプ又は他の光源（白色光源を含む）を用いて）ミラーの１つを介して光を当てる工程、及びｄ）サンプルからの光学的出力を検出する工程を含む。場合により、１つだけの波長に反射し、そして他の波長の全てを通すミラーを使用することができ、また、非線形光学作用もまた観察することができる。「画像化」工程は、例えば、アレイから生じる光を測定すること、又は照射光源の対面にあるミラーから放射された光を測定することを含むことができる。プラテンはまた、レーザー空洞内に置くことができ、そして光学的利得媒体を２つのミラーの間に配置することができる。
【００３７】
本発明はまた、アレイからのサンプル出力を測定する方法を特徴とする。この方法は、ａ）貫通穴がサンプルで負荷される、複数の貫通穴を有するプラテンを提供する工程、ｂ）サンプルをキャピラリーのアレイの中に導入する工程、ｃ）サンプルを、不連続な流れを生じさせるパルス圧力を用いて、キャピラリーを通して溶出する工程、ｄ）溶出するサンプルを、キャピラリーに対して移動している表面（例えば、ウエブ、テープ、ベルト又はフィルム）にスポットする工程（ただし、スポットは離れており、サンプルの混合が生じない）、及びｅ）スポットの物理的特性を分析する工程を含む。
【００３８】
本発明はまた、複数のサンプルを、アッセイが直ちに可能な、高密度形式で保存する方法を特徴とする。この方法は、ａ）複数の貫通穴を有するプラテンを提供する工程、ｂ）貫通穴に、２つの溶媒（第１の溶媒が低い蒸気圧を有し（例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、第２の溶媒が、第１の溶媒よりも高い蒸気圧を有する（例えば、エタノール）、好ましくは、両方の溶媒が不活性であり、サンプルを溶解することができる）を包含する混合物に溶解されたサンプル（例えば、小分子）を負荷する工程、及びｃ）第２の溶媒を蒸発させて、第１の溶媒における複数のサンプルを（好ましくは、貫通穴の壁におけるフィルムとして）得る工程を含む。各々の溶液における第１の溶媒の体積は、例えば、約２５ｎｌ以下であってもよい（例えば、１０ｎｌ未満、１ｎｌ未満、２５０ｐｌ未満、１００ｐｌ未満、又はさらに約２５ｐｌ以下、例えば、「マイクロ液滴」）。一部の態様において、第１の溶媒に溶解されたサンプルは、フィルムを貫通穴の壁において形成する。
【００３９】
本発明は、ハイスループットアッセイを形成する方法を特徴とする。この方法は、ａ）貫通穴の少なくともいくつかが低い蒸気圧を有する溶媒に溶解されたサンプル（例えば、上記方法に従って保管のために調製されたサンプルのアレイなど）を含有する、複数の貫通穴を有するプラテンを提供すること、ｂ）プラテンを、溶解されたサンプルを凍結させるために十分な温度に冷却すること、ｃ）プラテンを、試薬を含む溶液の中に浸けること（この場合、溶液の温度はサンプルの凝固点よりも低く、しかし、試薬溶液の凝固点よりも高い）、ｄ）プラテンを試薬溶液から取り出すこと、そしてｅ）プラテンを、サンプルの凝固点よりも高い温度に加温することを含む。試薬溶液は、例えば、水溶液であってもよい。
【００４０】
本発明のさらに別の態様は、複数の貫通穴を各々有する第１のプラテン及び第２のプラテン、並びに半透過性膜を含むろ過デバイスを特徴とする。第１のプラテンの貫通穴が第２のプラテンの貫通穴と実質的に位置が合うように、これらのプラテンが位置調整され、そして膜がこれらの２つのプラテンの間に挟まれる。場合により、プラテンは疎水性の表面を有することができる。半透過性膜は、例えば、ニトロセルロース膜であり、又は細胞の層を含むことができる。
【００４１】
さらに別の態様において、本発明は、複数の貫通穴を各々有する第１のプラテン及び第２のプラテン、並びに多孔性膜とを含む細胞チップを提供する。この場合、これらのプラテンは、第１のプラテンの貫通穴が第２のプラテンの貫通穴と実質的に位置が合うように位置調整され、そして膜がこれら２つのプラテンの間に挟まれる。「細胞チップ」は、複数の貫通穴を含有し、そして少なくとも１つの貫通穴に細胞及び培養培地を含有するプラテンを、少なくとも意味する。
【００４２】
別の態様において、本発明は、上部から底部への順に、（ａ）スペーサーと接触しているカバースリップ、（ｂ）カバースリップを第１のプラテンから隔てるスペーサー、（ｃ）複数の貫通穴を有する第１のプラテン、（ｄ）第１のプラテンと膜との間のシールをもたらす、複数の貫通穴を含有するガスケット、（ｅ）ガスケットと第２のプラテンとの間に挟まれた、酸化アルミニウムを含有し、そして０．１μｍ〜１μｍの間の細孔を有する多孔性膜、（ｆ）複数の貫通穴を有する第２のプラテン、及び（ｇ）第２のプラテンと接触している固体支持体、を含む細胞チップを提供する。
【００４３】
さらに別の態様において、本発明は、細胞を細胞チップ上で培養する方法を提供し、この場合、この方法は、細胞培養培地を含む前記態様の何れかの細胞チップを提供すること、多孔性膜を細胞と接触させること、及び細胞を細胞生存のための好適な条件のもとでインキュベーションすることを含む。一態様において、そのような条件には、細胞チップをガス透過性液体（例えば、ペルフルオロデカリン）と接触させることが含まれる。さらに別の態様において、細胞チップは、細胞培養培地と接触している疎水性流体（例えば、ペルフルオロデカリン、シリコーンオイル又は鉱油）をさらに含んでなる。
【００４４】
さらに別の態様において、本発明は、前記態様の何れかの細胞チップを構築する方法を提供し、この場合、この方法は、複数の貫通穴を有する第１のプラテンに細胞培養培地を充填すること、第１のプラテンを多孔性膜と接触させること、そして膜を、貫通穴が実質的に位置が合うように、複数の貫通穴を有する第２のプラテンと接触させ、それにより、細胞チップを構築することを含む。一態様において、細胞チップはさらに、第１のプラテンと接触している固体支持体を含有する。別の態様において、細胞チップはさらに、第２のプラテンと接触しているスペーサーを含み、この場合、スペーサーはカバースリップと接触している。さらに別の態様において、細胞チップはさらに、第１のプラテンとの間に挟まれたガスケットを含む。さらに別の態様において、ガスケットは柔軟な物質（例えば、生体適合性エラストマー、例えば、テフロン（登録商標）、シリコーン又はゴムなど）を包含する。
【００４５】
さらに別の態様において、本発明は、所望の生物学的活性を有する薬剤を同定するための方法を提供し、この場合、この方法は、細胞を含有する前記態様の何れかの細胞チップを、薬剤を含有するプラテンと接触させること、細胞を薬剤と接触させること、そして細胞における変化を検出し、それにより、所望の生物学的活性を有する薬剤を同定することを含む。一態様において、薬剤を細胞増殖培地に存在させるか、又は溝付きピン若しくはシリンジを使用して薬剤を細胞と接触させるか、又は細胞を薬剤を含有するウエルに加えることによって細胞と接触させる。別の態様において、薬剤は、ポリペプチド、核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ミクロＲＮＡ又はアプタマー）又は小さい化合物である。別の態様において、変化は、遺伝子発現、ポリペプチド発現、細胞成長、細胞増殖又は細胞生存における変化、細胞成分の細胞内局在化における変化、形態学的変化、又は運動性における変化である。さらに別の態様において、変化は、免疫アッセイ、酵素アッセイ、ハイスループット遺伝子発現プロファイリング、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、メチル化、又は定量的蛍光顕微鏡観察及び自動化された画像収集を用いるハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）で検出される。さらに別の態様において、ハイコンテントスクリーニングにより、タンパク質移行における変化が検出される。さらに別の態様において、細胞を溶解して、タンパク質又は核酸分子を結合性表面に結合させる。さらに別の態様において、結合性表面は、弱カチオン交換媒体である。さらに別の態様において、結合したタンパク質又は核酸分子が、配列、分子量、結合特性及び発現レベルからなる群より選択される特性について分析される。別の態様において、結合特性は、免疫アッセイで、又はポリペプチドの結合によって検出される。
【００４６】
上記態様の何れかの様々な態様において、膜は、貫通穴の直径の半分以下である細孔（例えば、約０．２μｍ〜２５０μｍの細孔）を含む。様々な態様において、細孔は、直径が約０．２μｍ、０．５μｍ又は１．０μｍである。上記態様の何れかの他の態様において、膜は、酸化アルミニウム又はポリカーボネートを包含する。さらに他の態様において、ポリカーボネートは、１μｍの細孔を包含する。上記態様の何れかのさらに他の態様において、膜は、細胞接着を支えるフィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン又は別の基質で被覆される。上記態様の何れかのさらに他の態様において、プラテンは、金属（例えば、金、タングステン又はステンレススチール）、ポリスチレン又は柔軟な物質（例えば、シリコーン、ゴム又はテフロン（登録商標））を包含する。上記態様の何れかのさらに他の態様において、チップは、個々のウエルを密封するガスケット（例えば、取り外し可能なガスケット）をさらに包含する。さらに他の態様において、ガスケットは、プラテンの貫通穴と一致する複数の貫通穴を含有する。上記態様の何れかのさらに他の態様において、チップは、横方向の拡散を防止する疎水性化合物（例えば、膜とプラテンとの間での水密シールをもたらす疎水性化合物など）をさらに包含する。上記態様の何れかのさらに他の態様において、プラテンは柔軟な生体適合性物質を包含し、他方のプラテンは、柔軟なプラテンを支える堅いプラテンである。様々な態様において、柔軟なプラテンは、シリコーン、ポリプロピレン又はゴムを包含する。上記態様の何れかのさらに他の態様において、２つのプラテンは、一方のプラテン上の凹んだ表面に嵌合する他方のプラテン上の盛り上がった表面によって取り付けられる。上記態様の何れかのさらに他の態様において、細胞チップの全体の厚さが、約１０ｍｍ、５ｍｍ又は１ｍｍ以下である。上記態様の何れかのさらに他の態様において、固体支持体（例えば、顕微鏡用スライドガラス）が、第１のプラテンと接触している。別の態様において、チップは、第２のプラテンと接触しているカバースリップをさらに含有する。さらに他の態様において、カバースリップ、顕微鏡用スライドガラス及び細胞チップが、一緒に固定される。上記態様の何れかのさらに他の態様において、チップに培地を充填することが、第１のプラテンを固体支持体の上に置き、プラテン及び固体支持体を遠心分離することによって達成される。一例において、第１のプラテンを、ガスケットと接触させ、次いで、細胞培地で前記プラテンの上を覆う。
【００４７】
「空間的にアドレス指定可能な貫通穴」は、（例えば、デバイス上の基準位置に対して）大きな確実度で知られる位置及び大きさを有する。そのような確実度は、一方のプラテンを他方の上に置く２つのプラテンの貫通穴が位置が合い、それにより試薬が並行様式で移行することが可能になれば、十分である。そのような確実度はまた、所定の何れかの貫通穴におけるサンプルが、穴がデバイス上の基準点に対して相対的に見い出される穴の位置だけを知るロボットデバイスによって回収されれば、十分である。「貫通穴の平面アレイ」という用語は、プラテンにおける貫通穴のアレイ（例えば、ＰＣＴ出願第ＷＯ９９／３４９２０号に記載されるような）を示す。
【００４８】
「試薬」は、化学的化合物、気体、液体、固体、粉末、溶液、ゲル、ビーズ又は電磁放射線である。
【００４９】
「プローブ」又は「化学的プローブ」という用語は、特定の分析物を特異的な結合又は触媒的事象によって検出する化学的、生物学的、機械的又は電子工学的構造体を示す。そのような結合又は触媒的事象は、操作者によって読み取り可能なシグナルに変換することができる。化学的プローブの１つのタイプが。親和性プローブ（例えば、別の核酸に結合する特異的な核酸）である。機械的プローブの例には、その表面に固体化されたリガンドを有するカンチレバー（cantilever）、及び化学的又は生物学的事象に応答して変化する性質（例えば、ひずみ、慣性、表面張力）をもつ物質が含まれる。
【００５０】
「化学的検出事象」という用語は、操作者によって観測できるシグナルをその結果として生成する、目的の分子とプローブ分子との間の化学反応を示す。例えば、フルオレセインであるジ−β−ガラクトシドの酵素β−ガラクトシダーゼによる加水分解は、蛍光性分子のフルオレセインを生成する、化学的検出事象の１つである。一部の場合において、化学的検出事象には、分析物及びプローブの最初の相互作用（例えば、リガンドが表面受容体に結合することによるプローブ細胞におけるシグナル伝達経路の活性化）によって誘発される一連の化学反応を伴うことができる。
【００５１】
「リンカー分子」という用語は、プラテン又はビーズの表面に対する高い親和性、又は表面に共有結合により結合する分子を意味する。リンカー分子は、スペーサーセグメント（例えば、炭素鎖など）を有することができ、また、共有結合又は高い親和性によるプローブ分子の結合を可能にする官能基もまたその末端に有することができる。
【００５２】
「固定化された」という用語は、分子レベルで（すなわち、共有結合性又は非共有結合性の結合又は相互作用を介して）実質的に結合されることを意味する。
【００５３】
「光切断可能な化合物」という用語は、光に曝されたとき、多数の独立した分子に解離する部分を含有する化合物を示す。
【００５４】
「小分子」という用語は、約３０００ダルトン以下の質量を有する分子を示す。
【００５５】
「ハイブリダイゼーション」という用語は、２つ又はそれ以上の分子（例えば、核酸）が互いに相補的かつ特異的に結合することを示す。
【００５６】
「固相合成」は、合成反応における出発物質の少なくとも１つが、固体物質（例えば、ポリマービーズ、ゲル状樹脂、多孔性固体又は平面表面など）に結合している化学合成プロセスを示す。
【００５７】
「ブロッター」という用語は、過剰な液体を吸収によって捕捉することができる物質を示す。
【００５８】
「ビーズ」という用語は、試薬をその表面に結合させることができるか、又はその内部に保管することができる小さい粒子（大きさが、一般には約１ｍｍ以下（例えば、約１００μｍ以下）である）を意味する。ビーズは、有機ポリマー、ガラス及び金属を含む様々な物質の１つ又はそれ以上から作製することができる。試薬は一般的には、その表面における反応性の官能基（例えば、カルボキシル基、シラノール基又はアミノ基など）との化学反応によってビーズに結合する。試薬は、例えば、共有化学結合によって、又はビーズ表面への物理的吸着によってビーズに閉じ込めることができる。ビーズ形状は、ほぼ球状、不規則な形状又は中間的な形状であり得る。
【００５９】
「ストリンジェンシー（stringency）」という用語は、非特異的な分子的相互作用が洗浄工程時に破壊される程度を示す。
【００６０】
「電気泳動的洗浄」という用語は、電場を加えることによりプローブから非特異的結合のイオン性分子を除去することを示す。
【００６１】
「特異的相互作用」は、関与する分子のうちの少なくとも１つの特異的な三次元構造から生じる２つの分子の間での相互作用である。例えば、酵素は、反応中間体を安定化することに対して、その展開により遷移状態アナログとの特異的な相互作用を有する。
【００６２】
「マイクロプレート」という用語は、アレイの貫通穴の内容物を移すために使用される回収プレートを示し、この場合、貫通穴の相互汚染が移動の際に全く生じない。
【００６３】
「マイクロ液滴」という用語は、５０ｎｌ以下の体積（例えば、約５０ｎｌ未満、２５ｎｌ未満、１０ｎｌ未満、５ｎｌ未満、１ｎｌ未満、５００ｐｌ未満、２５０ｐｌ未満、１００ｐｌ未満、５０ｐｌ未満、又は、それよりも小さい体積）を有する液体の滴を意味する。
【００６４】
「物理的特性」という用語は、電気的、磁気的、光学的、熱的、機械的、生物学的、核及び化学的特性を含めて、物体又はシステムの測定可能な何れかの特性を意味する。
【００６５】
本発明の新規な方法は、数多くの利点を有する。例えば、本発明の新規な方法は、並行様式でのプロセスの最適化を可能にする。例えば、特別な分子種の合成では多くの場合、生成収率を最適化する目的で、異なる合成方法の冗長な定量的調査が要求される。本発明の新規な方法を使用した場合、プロセスパラメーターをアレイにおいて貫通穴毎に変化させることができ、そして生成物を分析して、高収率の合成のために最適である手順を決定することができる。
【００６６】
平面基材上の化学的プローブの従来のアレイを上回る本発明の別の利点は、各々の化学的事象検出が、物理的に隔離された容器（すなわち、貫通穴）において生じ、これにより触媒作用（例えば、検出可能な分子を、各々の貫通穴に含有される溶液に放出すること）によりシグナルの増幅が可能になることである。そのような検出可能な分子には、例えば、蛍光発生の酵素基質の蛍光性生成物、及び発色性基質の発色性生成物が含まれる。アレイに保持されたサンプルが、貫通穴間の横方向の連絡をなくすことによって物理的隔離され、相互汚染が防止される。
【００６７】
本発明の別の利点は、各々の貫通穴が、正確な既知の空間的存在位置をアレイにおいて有することができることである。従って、各々の貫通穴は空間的アドレス指定可能であり、それにより各々の貫通穴からの液体の挿入及び除去、各々の貫通穴の内容物の分析、並びに試薬の高度に並行的な移行のための多数のアレイの位置合わせを容易にする。
【００６８】
本発明の別の利点は、２つのアレイのメンバーの相対的な体積が、一方のアレイに対してもう一方のアレイの深さを変化させることによって容易に調節できることである。
【００６９】
本発明のさらに別の利点は、貫通穴に含有される化学的プローブに結合する物質が、さらなる分析のために別個のサンプルとして容易に回収できることである。例えば、ウエルの結合した内容物を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析若しくは表面増強レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）質量分析又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法による分析のために平面基材上に溶出することができる。あるいは、貫通穴の内容物を、貫通穴から質量分析計内に直接にエレクトロスプレーすることができる。貫通穴の内容物はまた、（例えば、結晶構造を決定するために）結晶化させ、Ｘ線又は電子線回折技術により分析することができる。本発明のこの態様は、標識されていない分析物の高感度検出を可能にする。
【００７０】
本発明のさらに別の利点は、貫通穴は電場の伝導を可能にするので、サンプルを電気泳動によってプラテンに導入、又はプラテンから取り出すことができることである。
【００７１】
本発明の別の利点は、サンプルへのアクセスがプラテンの両側から可能なことである。このことは、例えば、圧力、空気若しくはガスの流れ、又は炸薬を目的の貫通穴に加え、その後、物質をプラテンの反対側の面から集めることによって、サンプルをプラテンから取り出すことができることを意味する。あるいは、サンプルを、真空を生じさせることなく、プラテンから吸引することができる。従って、サンプルの体積は、現在の最先端のマイクロ流体工学技術によって制限されず、また、最少限の量の流体しかサンプル回収時に失われない。圧力は、例えば、固体ピン（これは、例えば、ピストンとして作用する）の形態で、又は不活性ガスの一吹きの形態で加えることができる。この利点の別の意味合いが、エレクトロスプレーイオン化質量分析を、プラテンから直接に行うことが比較的容易なことである。マイクロ流路アレイに位置する２つの分光学的に異なった発光プローブからのルミネセンスの同時測定を、例えば、光源、光学フィルター及びＣＣＤカメラを含む、透過照明又は落射照明のいずれかの光学形態で行うことができる。光学的シグナルを、プラテンの両側から同時に集めることができる。
【００７２】
プラテンに含有される数多くのサンプルを、平坦な表面又は膜に迅速に移すことができ、このことは、ＳＥＬＤＩ質量分析法による分析などのプロセスを容易にし、また、個々のコロニーを保管及びさらなる分析のために形成させるための細菌細胞（例えば、貫通穴に含有される細胞）の増殖を容易にする。平面物質からアレイへの移動はまた、ポリアクリルアミド２Ｄタンパク質ゲルからアレイ内にエレクトロブロッティングする場合のように達成することができる。
【００７３】
好都合なことに、環境に曝された液体の表面積は、高いアスペクト比の幾何形状によって最小になり、従って、蒸発が制限される。
【００７４】
本発明の新規な方法のさらに別の利点では、所定の貫通穴に含有されるサンプルは、小さい熱質量を構成しており、従って、迅速かつ均一に熱平衡に達することができる。この事実は、例えば、加熱工程及び／又は冷却工程を伴う合成方法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する核酸の複製）に関連する。
【００７５】
別途定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法及び材料と類似又は同等である方法及び材料を、本発明の実施又はテストにおいて使用することができるが、好適な方法及び材料が下記に記載される。本明細書中で言及される全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、その全体において参考として組み込まれる。矛盾する場合には、本明細書（定義を含む）が優先する。加えて、材料、方法及び例は、例示的にすぎず、限定することは意図しているものではない。
【００７６】
本発明の他の特徴及び利点が、下記の詳細な説明から、また、特許の請求範囲から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７７】
本発明は、プラテンを突き抜ける貫通穴に各々が含有される多様な化学的及び生物学的組成物を作製し、保存し、そしてスクリーニングするための方法、更に様々なプラテン（特に、細胞を含有するプラテン）を作製し、そして使用するための方法を提供する。ある特定の態様において、本発明の方法は、試薬を貫通穴の高密度アレイにおける選択された穴の一群に送達することを含む。さらに追加の試薬送達が必要に応じて実施される。本発明ではまた、一連のマスクを貫通穴の平面アレイを覆って置き、試薬をマスクを介して流して、各々の貫通穴の内容物が既知であるようにプローブ又は試薬の規定されたパターンを組み立てることを提供する。代わりの態様において、本発明は、プローブを保持する粒子（例えば、ビーズ又は細胞など）を貫通穴のアレイに分布させることを提供する。そのようなプローブには、核酸、ペプチド、小分子、及び化学物質を検知する細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。このようなアレイの使用には、遺伝子ライブラリーのスクリーニング、医薬品リード化合物を発見するための化合物ライブラリーの作製及びスクリーニング、反応条件の最適化、遺伝子発現分析、臨床診断学、ゲノミクス、機能ゲノミクス、薬理ゲノミクス、構造的ゲノミクス、プロテオミクス、工業用触媒の作製及び最適化、化学遺伝学、反応のための好適な条件（例えば、タンパク質結晶化のために好適な条件）の同定、遺伝子型決定、多型分析、細胞又は組織におけるＲＮＡ発現プロフィールの検査、ハイブリダイゼーションによる配列決定、及び組換え酵素発見が含まれる。
【００７８】
本発明の一態様による貫通穴の高密度アレイを有するプラテンが、図１に（上面図）及び図２（断面側面図）に例示される。プラテンは、ケイ素又は他の硬質の物質（例えば、金属、ガラス又はプラスチックなど）から作製することができる。プラテンの材料は、化学的不活性であるか、又は適切な表面処理によってそのようにすることができる。
【００７９】
図１を参照すると、各々の貫通穴は、正方形の断面を有しているが、円形又は長方形の断面を代替として使用することができる。各々の貫通穴の直径は１ｍｍ未満（例えば、約６００μｍ以下、３００μｍ以下、１００μｍ以下、１０μｍ以下、１μｍ以下又は１００ｎｍ以下）であり、一般的には２００μｍ〜２５０μｍであり、また、プラテンの深さは１０μｍ〜２０００μｍ又はそれ以上であり、一般には約２５０μｍ〜１０００μｍである。
【００８０】
より大きい深さを、ガラスキャピラリーの束を使用して達成することができる。あるいは、より大きい深さを有するプラテンを、平行する溝を有する多数の表面を一緒に接着し、物体の長さ全域にわたる貫通穴を有する長い三次元の物体を作製することによって達成することができる。この物体は続いて水平方向で薄切りすることができ、このことは貫通穴の深さに柔軟に対応可能となる。その結果は、貫通穴の深さがアレイ毎に変化させることができ、貫通穴の適合する位置を有するアレイが使用できることである。
【００８１】
空間的なアドレス指定が可能であるため、貫通穴の中心間の間隔はかなり精密にしなければならない。穴間の間隔は、プラテン内における貫通穴の大きさに依存する。貫通穴は、規則的な縦横の列、六角形のアレイ、又は他の形態（例えば、貫通穴をより小さいサブアレイにグループ化する形態）で配置することができる。多数のプラテンを、パターンが再現可能であるように同じ配列の貫通穴を伴って製造することができ、そして各々の貫通穴がアレイ内のそれ自身のアドレスによって同定することができる。
【００８２】
貫通穴を有する３つのプラテンが積み重ねられるとき、単一の流路（すなわち、積み重ねられた３つの貫通穴）の全体的な体積は、一般的には約１００ｎｌである。この体積を一例として使用すると、流路全体が高密度の酵母細胞培養物（約１０７個／ｍｌ）から満たされるならば、各々の流路は、従って、約１０３個の酵母細胞を含有するであろう。酵母細胞の体積が７０μｍ３であることに基づけば、１００ｎｌの流路あたりの最大細胞数は、１０６個程度である。１つのマイクロ流路あたり少なくとも１００個の細胞が、バイオアッセイに対する酵母細胞の応答の細胞間変動を補償するために十分であり得る。しかしながら、この体積は、貫通穴の直径だけでなく、貫通穴の深さにも依存して変化し得る。サンプルの体積を変化させることができることは、より広範囲の様々な物質、濃度及び反応条件の使用を柔軟に可能とする。
【００８３】
識別のバイナリーコード、又は見出し及び位置合わせのための穴及び溝のような特徴もまた、任意に各々のプラテンに組み込むことができる。
【００８４】
Ｉ．貫通穴のアレイを有するデバイスを作製する方法
樹脂の一体成型による貫通穴のアレイの製造
高密度の貫通穴アレイを製造するための従来の技術には、微細加工、放電加工（ＥＤＭ）又は化学的エッチングが含まれる。あるいは、アレイは、ポリマー又は樹脂で一体成型することができる。一体成型用金型を、金型の内径がアレイデバイスの最終的な外径と等しいか、又はそれよりも大きくなるように設計することができる。一体成型用金型の深さは、１つのアレイについては０．５ｍｍほどに小さくすることができ、又は１メートル以上にすることができる。樹脂の長いブロックが一体成型される場合、樹脂は、横に切って、所望される厚さの薄切りにすることができ、また、表面を研磨又は平滑化することができる。貫通穴はいくつかの方法による一体成型で規定することができる。固体ワイヤ、繊維、又は所望される幾何形状及び直径のピンのアレイを、一体成型用金型の内部に配置することができる。必要ならば、ワイヤ、繊維又はピンは、１つ又はそれ以上の配置用ジグを一体成型用金型内で使用することにより、所定の位置に固定化することができる。ワイヤ、繊維又はピンの化学的特性は、樹脂又はポリマーが固化するとき、それらが樹脂又はポリマーとの永続的な結合を形成せず、その結果、それらを引き抜いて貫通穴を作製できるように選ばなければならない。例えば、繊維は、エチレンテレフタレートであってもよく、樹脂はポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）である。あるいは、ワイヤ、繊維又はピンの表面を、最終的なキュア処理、硬化又は重合が完了すると、一体成型された樹脂又はポリマーからのワイヤ、繊維又はピンの除去を容易にする離型剤（例えば、オイル、フルオロポリマー、水又は重合抑制剤など）により被覆することができる。
【００８５】
代わりのシステムにおいて、貫通穴は、中空チューブ又はキャピラリーのアレイを一体成型用金型内に配置することによって規定することができる。中空チューブは、配置用ジグで一体成型用金型内に固定化することができる。内径が異なるチューブの使用により、直径が異なる貫通穴を有するアレイがもたらされる。中空チューブ及びポリマーの化学的特性は、理想的には、永続的な結合が、中空チューブの外側と一体成型される樹脂又はポリマーとの間で形成されるように選ばれる。その後、中空チューブの内側表面が、アレイの貫通穴を構成する。中空チューブは、ガラス若しくは溶融シリカ、ポリマー、又は金属から作製することができる。
【００８６】
一体成型される樹脂又はポリマーの化学的特性は、アレイデバイスの表面が所望の疎水性又は親水性であるように選択することができる。一体成型用樹脂（例えば、アクリレート又はポリスチレンなど）の化学的特性は、所望される表面の化学的特性を有するアレイをもたらすように疎水性の基により修飾することができる。あるいは、アレイデバイスの表面の化学的特性は、薄切り及び研磨の後で標準的な技術により修飾することができる。加えて、ポリマーの化学的又は物理的特性は、他の物質を加えることによって修飾することができる。例えば、デバイスの電気伝導度を制御するために、導電性金属の粒子を、導電性をデバイスに与えるために、一体成型の前に樹脂又はポリマーに混合することができる。一般に、一体成型前に樹脂又はポリマーと混合される金属粒子が多くなるほど、デバイスの導電性が大きくなる。
【００８７】
樹脂又はポリマーに対する添加剤を、アレイの光学的画像化の感度を改善するために使用することができる。例えば、金属粒子を、貫通穴間の物質を作製するために加えることができる。金属粒子は光を散乱させることができ、これは、貫通穴内のプローブにより生じた蛍光シグナルを検出器の方向に反射させ、そしてシグナルのクロストーク（cross-talk）を防止する。あるいは、カーボンブラックを、クロストークが防止し、そしてアレイの表面から散乱される光からのシグナルを最小限に抑えるように、物質に加えることができる。より好ましくは、光散乱剤（例えば、二酸化チタンなど）及び光吸収剤（例えば、カーボンブラックなど）の組合せが、最大の光学的密度を穴間で達成するように樹脂又はポリマーに加えられる。
【００８８】
中空チューブを、貫通穴を形成するために一体成型用金型において使用することにより、チューブの化学的特性を適用の要求に従って変化させることが可能である。生物学的に不活性なポリマー（例えば、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）又はポリ（テトラフルオロエチレン）（ＰＴＦＥ）など）から製造されたチューブが、いくつかの適用のためには望ましい。あるいは、溶融シリカチューブを、貫通穴を形成するために使用することができる。溶融シリカの内側表面を一体成型前に誘導体化することができ、これにより、実質的に任意のレベルの所望される親水性又は疎水性が可能となる。金属又は合金のチューブもまた、アレイの貫通穴を形成するために使用することができる。金属チューブは、金属チューブを生体適合できるように被覆することができる。例えば、金属を、金の薄い層により被覆することができ、そして金の表面を、チオール成分を有する様々な試薬により容易に被覆することができる。
【００８９】
チューブ又はキャピラリーの内側表面は、例えば、得られる薄切り物をプローブアレイとして使用できるようにする物質により被覆することができる。例えば、各々のチューブ又はキャピラリーを、異なる核酸プローブにより被覆することができ、その結果、樹脂のブロックが薄切りされる場合、得られたプラテンが遺伝子センサーとして使用することができる。あるいは、プローブを、キャピラリーに含有される多孔性物質に固定化することができる。
【００９０】
ブロックが所望の樹脂又はポリマーから一体成型されると、ブロックは、貫通穴のアレイを有するプラテンを形成するために、適切な厚さに薄切りすることができる。ある特定の態様において、プラテンの厚さは、０．２ｍｍ〜２５．０ｍｍの範囲である。しかしながら、本技術を用いると、使用される一体成型用金型と同じ長さを有する貫通穴のアレイを製造することができる。所望されるならば、長さが数メートルである一体成型物を調製することができる。半導体産業においてケイ素インゴットを薄切りし、研磨することによってシリコンウエハーを製造するための標準的な技術を、貫通穴のアレイの製造にそのまま適用することができる。薄切りしている間、一体成型されたアレイにおける貫通穴に冷却剤を流すことにより、熱の蓄積を防止することができ、そうでない場合にはポリマーを融解させるか、又は穴の内部における被覆若しくはプローブを劣化させる。冷却剤の例には、冷水、冷却エチレングリコール水溶液、及び冷却したイソプロパノールが含まれる。
【００９１】
固体ワイヤが一体成型物に配置され、その後、得られたブロックが薄切りされるならば、そのワイヤは、電気化学セル中でプレートに電着することにより、又は化学的分解（例えば、薄切り物を、貫通穴のアレイを得るために濃硝酸に入れることによるなど）によって侵食することができる。薄切り物は、金属シート、侵食されたポリマー、及び薄切り物（シンク（sink）のＥＤＭによる貫通穴アレイを製造するための電極として使用される）に接着することができる。ポリマーは、化学的手段、融解又は焼却によって侵食することができる。
【００９２】
多数の溝付き表面を積み重ねて接着することによりアレイを作製する方法
貫通穴のアレイを製造する１つの方法は、上部及び下部表面を有する溝付きプレートを積み重ね、一緒に接着し、これにより三次元アレイを得ることである。任意の数の物質を、貫通穴のアレイを製造するために使用することができ、そのような物質には、ケイ素、ガラス、プラスチック、樹脂又は金属が含まれるが、これらに限定されるものではない。使用される物質に依存して、溝は、様々な技術（例えば、微細加工、化学的エッチング、エンボス加工又はスタンピング）を使用して個々の表面に加工することができる。各々の溝の深さ及び幅により、完成したプラテンにおける貫通穴の直径が決定され、そして各々の溝の深さ及び幅は、所望される仕様に従って加工することができる。
【００９３】
三次元アレイへの溝付きプレートの正確な層化又は積み重ねを、各々の表面が正確に置かれる外部又は内部ジグの使用により達成することができる。あるいは、位置決めデバイス（例えば、切欠き、ポスト、さねなど）により、正確な積み重ねが容易になり、各々の表面に正確に一体化することができる。個々の溝付き表面を積み重ねた後、それらは永続的な様式で一緒に接着される。プレートを一緒に接着するための従来の接着剤の使用は、過剰な接着剤が溝の中に入ることがあり、また、貫通穴のいくつかの閉塞をもたらすことがあるので、好ましくない方法である。この接着プロセスのための好ましい方法は、選ばれた物質の融着をもたらす高い温度及び圧力の組合せの使用である。一部の場合において、溝付きプラテンの片方又は両方の表面が、適量の温度及び圧力が加えられたとき、表面内に拡散し、永続的な結合をもたらす物質（例えば、金）により被覆される。溝付きプレートは、熱可塑性物質、セラミックス、ガラス又は金属（例えば、ケイ素など）を含む様々な物質から作製することができる。
【００９４】
好ましい態様において、溝付きプレートの各々の幅は、貫通穴の最終的なプラテンの幅と等しく、しかし、各々の溝付きプレートの長さは、貫通穴の最終的なプラテンの所望される厚さよりも大幅に長い。これにより、要求されるよりも大幅に厚い貫通穴の三次元アレイがもたらされる。その後、貫通穴の個々のプラテンを、所望される仕様に応じてこの厚いブロックから正確に切断することができる。プラテンは、光学的に平坦な表面を得るために、切断された後に研磨することがさらに要求されてもよい。その後、要求される表面の化学的特性を、プラテンに加えることができる。この製造方法の利点は、従来の微細加工技術を使用して作製されるプラテンよりもはるかに深いまっすぐな壁の貫通穴を有するプラテンが得られることである。
【００９５】
個々の溝付きプレートを積み重ねる場合にわずかでも一直線にならないと、最終的なプラテンにおける貫通穴の位置決めにわずかな不完全性をもたらし得る。これは、貫通穴のプラテンを使用する様々な操作（例えば、大規模な並列反応を開始させるために２つ又はそれ以上のプラテンを積み重ねること）を妨げ得る。しかしながら、位置の位置合わせにおけるわずかな誤差が存在する場合でさえ、貫通穴の各々の厚いアレイから切断された隣接する薄切り物は、ほぼ完全に一致したものであり、要求される積み重ね操作を達成することができる。
【００９６】
酸化ケイ素層の形成
１つの態様において、貫通穴の高密度アレイが、シリコンウエハーにおいて作製される。酸化ケイ素層が、シリコンアレイを炉において、酸化を引き起こすのに十分な高い温度に加熱することによってアレイの全表面に均一に作製される。炉内の酸素及び／又は湿度レベルは、酸化プロセスを早めるために周囲よりも高くすることができる（例えば、「Atalla et al., The Bell System Technical Journal. pp. 749-783, May 1959」を参照されたい）。酸化ケイ素層は、様々な化学的表面処理をアレイ表面に適用することを可能にするので好都合である。表面処理の様々な例が、「Immobilized Affinity Ligand Techniques (Hermanson et al, Academic Press, San Diego, 1992)」及び「Unitied Chemical Technologies, Inc., Bristol, PA.)」から入手可能な技術文献に見出される。酸化ケイ素の使用は、表面の光学的反射能が、酸化ケイ素薄膜の厚さを調節することによって制御されることを可能にする、さらなる利点を提供する（例えば、「Principles of Optics, M.Born & E. Wolf, Pergamon Press, 1980, 59-66」を参照されたい）。
【００９７】
ＩＩ．アレイデバイスの表面及び貫通穴の壁を修飾する方法
貫通穴アレイの表面を、（例えば、その物理的及び化学的特性を変化させるために）様々な方法で修飾することができる。表面修飾のタイプには、ポリマー被覆の適用、金属の堆積、化学的誘導体化及び機械的研磨が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００９８】
アレイ面の表面の化学的特性の選択的な修飾：
水溶液がアレイ表面に接着しないようにするために、また負荷時及び他の操作時における様々な貫通穴の間における相互汚染を防止するために、プラテンの表面を疎水性の被覆物により被覆することが望ましい。貫通穴の内側表面を親水性の被覆物により被覆し、その結果、貫通穴の内側表面が流体を保持するようにすることもまた望ましい。内側の被覆物をさらにブロッキング処理し、これにより非特異的な結合を防止する、又は親和性リガンドにより誘導体化することができる。疎水性表面及び親水性貫通穴のこの組合せにより、貫通穴への即座の負荷を可能にしながら、水溶液がアレイの表面に接着することが防止される。
【００９９】
一般には、貫通穴の高密度アレイを有するプラテンが、ケイ素で製造され、酸化によって酸化ケイ素に被覆される。その後、プラテンは、過酸化水素及び硫酸の混合物、又は他のアルカリ溶媒の清浄化溶液に浸けることによって清浄化され、有機物が除去される。この処理により、大きい表面エネルギーを有する清浄な酸化ケイ素がもたらされる。この方法を用いて作製された疎水性被覆は、高湿度下で安定であり、また繰り返し使用することもできる。
【０１００】
アレイの上部及び下部面は、揮発溶媒中に適切なシラン化剤（例えば、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．によって、Ｇｌａｓｓｃｌａｄ２１６として市販されるポリジメチルシロキサンなど）を含有する溶液からの蒸気に曝すことにより疎水性にされる。シラン化剤は、アレイ表面のヒドロキシル基及びシラノール基と反応して、疎水性のアルキル基への共有結合性の結合をもたらす。表面の化学的特性の選択的な修飾を、代わりのシラン化剤を選択することによって達成することができる。
【０１０１】
１つの表面修飾方法において、不活性ガスの加圧が、処理されている表面とは反対側のプラテンの表面に適用される。貫通穴内の加圧により、シラン化蒸気が内部の貫通穴に到達することが防止される。ガラス状表面を疎水性にするために好適なシラン化剤には、アルキルトリクロロシラン及びアルキルトリメトキシシランが含まれ、それらの多くが市販されている。
【０１０２】
別の方法において、第１のプラテンが、ケイ素から作製され、その後、酸化される。第２のケイ素のプラテンが、貫通穴を伴わないことを除いて、同一のサイズ及び位置合わせ穴を伴って作製される。貫通穴アレイのプラテンが、各々の貫通穴がウエルになるように、積み重ね用ジグにおいて中空でないプラテンの上に置かれる。その後、ジグ及びプレートは、表面修飾の化学試薬で処理される。ウエルの底部に閉じ込められた空気により、流体がウエルの中に入ることが防止される。反応が生じるための十分な時間の後で、プレートが溶液から取り出され、乾燥され、その後、適するならば、熱処理される。裏当てが除かれ、アレイがひっくり返され、プロセスが繰り返され、これにより、第２の表面が被覆される。
【０１０３】
疎水性の外側表面を作製するためのさらに別の方法は、アレイを、各々の単一のピンがその対応する貫通穴を狭く通過するように一致するピンのアレイに置くことである。このピンのアレイは、シンクＥＤＭを用いて貫通穴のアレイを作製するために使用される電極であり得る。次いで、疎水性ポリマー（例えば、ポリプロピレン又はＴｅｆｌｏｎなど）の被覆物が、気相蒸着法（例えば、蒸発蒸着など）を用いて露出表面に堆積するようにする。貫通穴のアレイが一致するピンアレイから取り出され、逆さにされ、その後、反対側の表面を覆うために被覆プロセスが繰り返される。
【０１０４】
疎水性の被覆物をプラテン表面に生じさせるための別の方法では、プラテン表面を金属（例えば、金など）により被覆し、その後、アレイを、その金属と選択的に反応するが、被覆されてない貫通穴表面とは反応しない化学物質に曝すことを含む。例えば、電子ビーム気相蒸着を、複数の貫通穴を含有するプラテンの外側表面を、金、他の金属又は半導体により被覆するために用いることができる。電子ビーム気相蒸着では、金が、ビーム方向に対して垂直な表面に優先的に堆積する。金被覆の表面は、その後、疎水性のアルキル基を結合させるためにアルカンチオールと反応させることができる（Z. Hou et al., Langumuir, 14:3287-3297, 1998）。金が被覆されていない貫通穴の内側表面は、親水性のままである。アルカンチオールはまた、銀、銅及びヒ化ガリウムを含む他の物質に対してもまた反応性を有する（Y Xia and G.M. Whitesides, Annu. Rev. Mater. Sci., 28:153-84, 1998）。アルカンチオールのほかに両親媒性物質が、他の無機固体物質と化学的に反応して、疎水性の被覆物を生成することができる。そのような被覆物の例には、金属酸化物上でのアルカンホスフェート（「D. Brovelli et al., Langmuir, 15:4324-4327, 1999」及び「R. Hofer et al., Langmuir, 17:4014-4020, 2001」）、及びアルミナ上でのアルカンカルボキシレート（P.E. Laibinis et al., Science, 245:845, 1989）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１０５】
貫通穴表面の選択的な表面化学修飾
１つの方法において、多数の同一の貫通穴アレイが調製され、位置合わせされ、積み重ねられる。化学試薬が、積み重ねられたアレイによって形成される連続した流路の中を通過させられる。試薬は、溶液、懸濁物、液体、蒸気又は微粉末であり得る。アレイの積み重ね物は、その後、洗浄され、乾燥され、そして特定の被覆に適切であるように加熱される。その後、チップの積み重ね物は、互いに物理的に分離され、積み重ね物の上部及び底部におけるアレイ（「犠牲アレイ」）が捨てられる。
【０１０６】
貫通穴表面を選択的に被覆するための別の方法では、細い針又は細い針のアレイを各々の貫通穴の入口の近くに配置するために、ロボットを使用することを含む。化学的な表面修飾のための試薬を、その後、この針／キャピラリーを介して個々の穴に直接に送達することができる。
【０１０７】
別の方法において、ケイ素の貫通穴アレイの表面の全てが化学的に修飾される。その後、アレイの面が、元の表面特性を回復するために機械的に研磨される。その後、アレイの面を再び被覆することができる。
【０１０８】
さらに別の方法において、アレイの面が、所望の表面修飾用の化学物質に対して不活性である物質により被覆され、その後、アレイ全体が表面修飾用の化学物質に曝される。例えば、金の被覆物を、電子ビーム蒸着によって酸化されたケイ素の貫通穴アレイの両方の面に適用することができる。その後、アレイを、化学試薬（例えば、ケイ素の貫通穴表面と選択的に反応するシラン化試薬など）の溶液に沈めることができる。
【０１０９】
別の方法において、貫通穴アレイの内側表面及び外側表面が、取り外し可能な非透過性物質を穴に充填することによって被覆される。例えば、アレイにおける貫通穴の内側表面を、後で除くことができる固体を貫通穴に充填することによって保護することができる。そのような固体の例には、ワックス、プラスチック、凍結オイル、氷、ドライアイス又はポリマー（例えば、ポリ（エチレングリコール）など）が含まれる。一例において、貫通穴が満たされ、過剰な物質がプラテンの表面から除かれ、そして表面が被覆され、これにより、内部が被覆されないままとなる。過剰な物質を除くための方法には、かき取ること、紙ヤスリ研磨、研磨、溶媒による溶解、融解又は燃焼が含まれる。貫通穴の内部における固体物質は、同様な条件のもとで除くことができる。その後、貫通穴の内部を、選択的に被覆又は修飾することができる。
【０１１０】
貫通穴表面の誘導体化
多くの場合において、プローブを貫通穴の全て、いくつか又は１つの内壁に固定化することが望ましい。プローブをガラス又はプラスチック表面に共有結合により結合するための多くの技術が存在する（例えば、「Immobilized Affinity Ligand Techniques, Hermanson et al., Academic Press, 1992」を参照されたい）。ガラスについて有用なそれらの方法はまた、ケイ素基材の酸化された表面に使用することができる。例えば、酸化されたケイ素の貫通穴アレイにおける穴の内壁を、酸の存在下でｇ−グリシドオキシプロピルトリメトキシシランと反応させ、そして加熱して、グリセロール被覆をもたらすことができる。その後、このグリセロール被覆は、ペプチド又は核酸プローブに共有結合することができる。
【０１１１】
内壁を多孔性にすること：
貫通穴の内壁は、Ｗｅｉ他（Nature, 399:243-246, 1999）により概略される手順に従った化学的エッチングによって多孔性にすることができる。多孔性の領域の面積が大きくなると、表面積が増大し、貫通穴の内壁に結合される化学試薬の量が増大する。合成の変換に使用される場合、多孔性の貫通穴の増大した試薬負荷は、収率を増大させる。検出に使用される場合、増大した試薬負荷は、感度を増大させる。更に、隣接する貫通穴の間の物質を多孔性にすることができ、これにより、液体又は気体による貫通穴間の連絡が可能になる。この方法は、隣接する貫通穴に保管された試薬の制御された送達に有用であり、これにより、試薬の混合を可能にし、反応を開始させることができる。貫通穴の全て又は一部（例えば、ちょうど中央部分）を多孔性にすることができる。
【０１１２】
プラテンにおけるタンパク質及び細胞の固定化のためのポリマー足場形成
プラテンの貫通穴の内壁は、タンパク質又は細胞の共有結合的又は非共有結合的な結合が可能になるように誘導体化することができる。その後、このようにして結合させたタンパク質又は細胞から生じる何らかのシグナルは、そのシグナルがＥＬＩＳＡアッセイでのように酵素的に増幅される場合を除いて、ウエルの周縁部に限定される。しかしながら、このように増幅された場合でさえ、シグナルは、例えば、低い分析物濃度によって弱められる。細胞付着の場合、ウエルには底がないので、細胞は内壁にだけ結合することができ、上に向かって二次元的に増殖することができる。アレイの貫通穴の壁に対する受動的なタンパク質吸着及び共有結合に対する代替法が、三次元の疎水性足場（例えば、タンパク質カップリングのために活性化されるか、又はウエル内でのタンパク質若しくは細胞の閉じ込めが可能である親水性の線状のゲル又はフォームポリマー充填物など）を導入することである。
【０１１３】
プラテンのポリマー充填貫通穴へのタンパク質の共有結合による結合
貫通穴の内側表面は親水性であるので、親水性又は水溶性のプレポリマーをプラテンのウエルに容易に負荷することができ、そして重合反応を、温度若しくはｐＨの変化によって、又は開始剤の添加によって開始させることができる。タンパク質のカップリングを、重合条件がタンパク質の構造及び機能に影響を及ぼさないならば、重合時に行うことができる。あるいは、タンパク質のカップリングを、重合後に行うことができる。タンパク質を、遊離アミン、遊離カルボン酸基及び遊離スルフィド基の反応を含め、様々な反応の何れかを用いてカップリングすることができる。イソウレア連結、ジアゾ連結又はペプチド結合を形成する反応は、タンパク質を表面にカップリングするために一般的に用いられる反応の１つであるが、容易に制御される水溶性のポリマー反応の何れかを使用することができる。ポリマー足場の例には、デキストラン及びポリアミドが含まれる。
【０１１４】
デキストランは、大きな親水性をもつ多糖ポリマーである。デキストランの糖残基は、共有結合の形成のために化学的に活性化することができるヒドロキシル基を含有する。ヒドロキシル基はまた、水分子と水素結合を形成し、これにより支持体内に水性環境を生じさせる。アルデヒドにより活性化された場合、デキストランは、（例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを使用して）アミン基を介してタンパク質と容易にカップリングすることができる。ヒドラジドにより活性化された場合、デキストランは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を使用して、アルデヒド基又はカルボキシル基を介してタンパク質とカップリングすることができる。しかしながら、ある特定の適用でのデキストランの使用は、微生物攻撃に対するその感受性によって制限される。
【０１１５】
タンパク質又は酵素を共有結合により固定化するための代わりの方法が、様々な誘導体化されたポリアミド（例えば、ナイロン（登録商標）など）によるものである。ポリアミドは、高分子量の基質を固定化するのに最もよく適する。化学的に多くのポリアミドは、並行する鎖のアミド基の間で確立される分子間水素結合相互作用によって引き起こされる、高い機械的強度、表面硬度、及び摩擦条件に対する抵抗性を有する熱可塑性ポリマーである。これらの特徴は、触媒活性及び酵素構造の両方を支えるための有利な親水性の微小環境を提供するので、ポリアミドを固定化酵素に有用なものとしている。ポリマー足場に共有結合的に結合されたタンパク質は、従来の生化学的アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、結合アッセイ及び活性アッセイなど）を受け入れることができる。
【０１１６】
タンパク質（又は細胞）のカプセル化
タンパク質及び細胞はともに、繊維、マトリックス、半透過性膜の細孔、ゲル又はフォームの内部におけるカプセル化によって固定化することができる。細胞のカプセル化では、下記の要因の特別な検討が必要とされる：支持体内及び支持体を介した物質の拡散；細胞に対する出発物質及びポリマーの非毒性；及び物理的特性（例えば、光学的透明度、温度安定性、柔軟性、並びに化学物質及び微生物の攻撃に対する抵抗性など）。支持体は、好ましくは、弾力的で、柔軟性であり、水素結合が可能であり、そしてタンパク質分解及び加水分解に対して抵抗性があるものである。
【０１１７】
適切な足場が与えられた場合、哺乳動物細胞をプラテンの貫通穴において三次元的に培養することができ、このことは、多くのタイプの細胞ベースのアッセイの実施及び共焦点技術を用いての貫通穴内の細胞の画像化の可能性をともにできるようにする。実施できるアッセイのタイプの例には、レポーター遺伝子アッセイ、細胞増殖アッセイ、アポトーシスアッセイ、及び細胞表面又は細胞質領域内で生じる事象を伴うアッセイ（例えば、小胞体からのカルシウム流失の測定）が含まれる。そのようなアッセイは、化学的及び生物学的ライブラリーの機能性の研究のために有用である。カプセル化が容易である物質の例には、ポリ−（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（ポリ−ＨＥＭＡ）ゲル、ポリ（カルバモイルスルホネート）（ＰＣＳ）ヒドロゲル、及びリン酸化されたポリビニルアルコール（ＰＶＡ）ゲルが含まれる。
【０１１８】
ポリ−（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）ゲルである「ポリ−ＨＥＭＡ」ゲルは、多くの天然ポリマー（例えば、ゼラチン、アガロース、カラギーナン、セルロース及びアルブミン）よりも優れた機械的性質、温度許容性、及び微生物攻撃に対する抵抗性を有する。ポリ−ＨＥＭＡゲルは、タンパク質及び細胞の両方を閉じ込めるために使用することができる。ポリ−ＨＥＭＡヒドロゲルにおける生物触媒固定化のプロセスは、一般に、固定化酵素の活性の大きな保持、十分に制御された多孔性（例えば、反応物及び生成物の十分な物質移動を確実にするために）、及び良好な化学的抵抗性を可能する。ポリ−ＨＥＭＡヒドロゲルはまた、ゲル支持体内への細菌の進入を阻止することによって、閉じ込められたタンパク質及び細胞を細菌による分解から保護する。加えて、ポリ−ＨＥＭＡヒドロゲルは多量の水を保持することができ、これにより、インビボ条件に近い微小環境を提供する。
【０１１９】
ポリ（カルバモイルスルホネート）である「（ＰＣＳ）ヒドロゲル」は、調節可能なゲル化時間、高い機械的安定性、及び微生物攻撃に対する抵抗性をもたらす。ＰＣＳヒドロゲルはまた、大きな度合いの柔軟性を有しており、このことは、サンプルをろ過又は排出するために利用することができる。
【０１２０】
リン酸化されたポリビニルアルコールゲルである「リン酸化ＰＶＡ」ゲルは、細菌又は酵母の細胞を固定化するために使用することができる。このゲルは経済的であり、非毒性であり、耐久性があり、かつ高い細胞生存能を支える。リン酸化ＰＶＡゲルを使用する様々な適用では、そのガス透過性が良くないことで制限を受ける。
【０１２１】
膜上での細胞の増殖
本発明は、多孔性膜が、プラテンの穴が膜の両側で一直線になるプラテンの間に挟まれる形式において、真核生物細胞を増殖させ、そして分析するための方法を特徴とする。細胞が、プラテンの穴の１つと膜とによって形成されるウエルにおいて増殖させられる。取り外し可能なガスケットを、細胞が加えられることができるデバイスの上部に設置することができる。テスト化合物を、マイクロスポット用のピンを用いて、又はテスト化合物がウエル上方に事前にスポットされた固体表面を位置合わせすることによって、膜のいずれかの側でウエルに導入することができる。デバイスは、蒸発を低く抑えるために、スペーサーによって隔てられるカバースリップにより両側を覆うことができる。固体基材（例えば、ガラス製顕微鏡スライドガラスなど）を、デバイスを支えるために使用することができる。画像分析を、従来の走査デバイスにより巨視的に行うことができ、又は光検出若しくは蛍光検出を用いて微視的に行うことができる。生化学的分析を、標準的な遠心分離又は真空ろ過のデバイスを使用して上清又は細胞溶解物に対して行うことができる。
【０１２２】
特定の態様において、マイクロウエルを作製するために使用されるプラテンは、膜において一様に接触させるために十分に堅い。そのような物質は、好ましくは生体適合性であり、金属、プラスチック又はセラミックスであり得る。プラテンによって形成される穴は、直径を０．５ｍｍ未満とすることができ、０．１ｍｍ未満の間隔で離すことができ、又は接着性の真核生物細胞の増殖を可能にする他の任意の形態及び大きさにすることができる。横方向の拡散を防止するために、水密シールを膜とプラテンとの間に形成することができる。これは、プラテンを、プラテンが膜と接触するところで、疎水性物質により被覆することによって、又は上部において硬質のプラテンによって支持される柔軟な生体適合性物質（例えば、シリコーン、ゴム、又は他の適切な物質など）から作製された二次的なプラテンを使用することによって達成することができる。これら２つのプラテンは、一方のプラテン上の盛り上がった表面が向き合うプラテン上の凹んだ表面に嵌合することによって結合させることができる。膜のいずれかの側における全体的なプラテンの厚さは、１つの硬質のプラテンでも、又は、柔軟なプラテン上の硬質のプラテンであろうとも、一般的には１ｍｍ未満である。
【０１２３】
関連した態様において、接着性細胞の増殖が、細胞付着を可能にする市販の膜又は生体適合性の何れかの多孔性膜において維持される。接着性細胞のための最適な細胞増殖が、栄養分を含有する培地にいずれかの側で曝された膜において維持される。
【０１２４】
培地及び細胞を伴うチップの構築は、第１のプラテンにおける貫通穴に培地を充填することによって始まる。これは、第１のプラテンを固体支持体の上に置くことによって行うことができる。ガスケットをプラテン上に置くことができ、その後、細胞培地がプラテンに重ねられる。遠心分離後、プラテンの穴における空気が培地により置き換えられる。次いで、事前に湿らされた多孔性膜が、第１のプラテンの上に置かれ、続いて、第２のプラテンが置かれる。これらのプラテンの全てにあるガイド穴により、視覚的に穴の位置を合わせることが可能になる。あるいは、プラテンにおけるガイド穴と同じ形態で間隔を開けて底部支持体に取り付けられたピンを、プラテンを位置調整するために使用することができる。プラテンを組み立てた後で、ガスケットをプラテンの上に設置することができ、その後、細胞を含有する培地が加えられる。細胞が貫通穴の中に入ることができるように遠心分離した後、過剰な培地を取り除くことができる。スペーサー（約０．５ｍｍ以下の厚さ）を上部プラテンの縁に設置し、続いて、カバースリップを設置することができる。その後、デバイスは、クランプにより一緒に固定され、細胞増殖に適合する加湿チャンバーに入れられる。
【０１２５】
事前にスポットされたテスト化合物（例えば、タンパク質、小分子量化合物、ＲＮＡｉ又は他の核酸など）を、化合物がプラテンの貫通穴と同じ形態で配置されている固体基材を使用して、細胞に加えることができる。そのような態様において、化合物は、蒸発を低く抑えるために揮発性が低い媒体（例えば、グリセロールなど）で固体基材にスポットされる。その後、化合物は、プラテンの貫通穴と空間的配向を有するように固体基材に適用される。化合物が適用される固体基材はまた、細胞チップに嵌合するガイドピンを有し、その結果、各々の穴が化合物と位置調整される。加えて、化合物の横方向の拡散及び相互汚染を防止するために、化合物との接触の前に、片方又は両方のプラテンに鉱油の層を適用することができる。化合物がプラテンの貫通穴の中に接触することは、その後、貫通穴内への拡散、及び膜に結合した細胞への分散を可能にする。その後、細胞を分析までインキュベーションすることができる。
【０１２６】
他の態様において、テスト化合物を加えた後の分析は、画像分析及び／又は生化学的分析を含むことができる。画像分析は、細胞における形態学的変化又は生化学的な変化を、可視又は蛍光色素によって検出する既存の技術（可視光、レーザースキャナー、可視顕微鏡観察又は蛍光顕微鏡観察など）を用いて行うことができる。細胞溶解物又は上清の生化学的成分（例えば、ＲＮＡ又はタンパク質など）は、ｑＰＣＲ又はＳＥＬＤＩ  ＭＳによる分析のために膜又はモジュール上に成分を分離するための既存の技術（例えば、遠心分離ろ過又は真空ろ過など）によって分析することができる。
【０１２７】
他の態様において、化合物及び他のテスト物質が、標準的なマイクロアレイスポット用のピンを用いて送達される。マイクロ形式は、アレイスポッターを使用するハイスループットスクリーニングを可能にする。細胞の生存能又は形態学的変化を膜上で直接に測定することができる。タンパク質又はｍＲＮＡの発現は、膜処理の後で測定することができる。この技術の適用には、薬剤発見のためのリード化合物の作製、スクリーニング、又はＲＮＡｉ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡを使用する遺伝子機能研究が含まれる。
【０１２８】
ガラス繊維チップ
繊維で満たされた穴を有する貫通穴アレイを、簡便かつ安価な様式で作製することができる。有用な繊維の例には、ガラス繊維フィルター、メッシュガラス繊維フィルター及びポリマーフィルター（例えば、ナイロン（登録商標）及びポリエーテルスルホンなど）が含まれる。これらの物質は、融着の前に、特異的な相互作用のための表面修飾をすることができる。
【０１２９】
１つの方法において、目の粗いガラス繊維メッシュのシートが、アレイの貫通穴の間に融着される。この融着は、ガラス繊維を融着するのに十分な温度に加熱されている、ケイ素又は他の好適な金属から作製された貫通穴アレイに対して、ガラス繊維を押し付け、その後アレイを取り除くことによって達成することができる。非反応性の潤滑剤（例えば、グラファイト又はモリブデングリースなど）を、加熱されたアレイ及びガラス繊維アレイの分離を助けるために使用することができる。あるいは、ガラス繊維シートを、位置合わせされた２つの加熱された貫通穴アレイの間で圧縮することができる。
【０１３０】
得られたガラス繊維アレイは、多孔性穴の間の領域を疎水性にするために処理することができる。そのような処理は、反対側の面をシラン化蒸気に曝しながら、アレイを通してガスを吹き付けることによって達成することができる。得られたガラス繊維アレイにおける多孔性領域を、結合のための非常に大きい表面積、アレイの中を流れる容易さ、及びガラスの光学的透明性の利点を用いて、プローブ（例えば、核酸又はペプチドなど）を固定化するのに使用することができる。
【０１３１】
ガラス繊維アレイを作製するための代わりの方法は、熱可塑性物質を所望の穴の間の空間に注入するか、又は所望の穴の空間での熱可塑性物質の重合を、例えば、ポリマー、エポキシ、モノマー若しくは重合開始剤を堆積させる印刷技術、又は１つ若しくはそれ以上のフォトマスクを用いて所望の領域における光誘導の重合又は硬化処理によって、生じさせることである。
【０１３２】
貫通穴における多孔性ガラスの増大
多孔性物質を含有する貫通穴のアレイを作製するための別の方法は、アレイを適切な方法（例えば、ＥＤＭなど）によって加工すること、そしてその後、物質をアレイにおいて増殖させることである。多孔性ガラスは、圧力をかけてホルムアミドと混合されたケイ酸カリウムの混合物をアレイの中に強制的に入れ、その後、数時間焼成することによってアレイに導入することができる。融着されるか、又は結合剤に埋め込まれるキャピラリーのアレイは、この方法によって多孔性ガラスを充填することができ、その後、多孔性ガラスが充填された貫通穴アレイの多数の薄いプラテンを得るために、冷却された切断用ノコにより切断することができる。粒子（例えば、多孔性シリカ又はポリマービーズなど）をケイ酸カリウム混合物に含めることによって、物質の親和性特性及び多孔性を所望の通りに調節することができる。
【０１３３】
ＩＩＩ．アレイデバイスにサンプルを負荷する方法
マスキングによるアレイの合成
ある特定の方法は、試薬がマスクに適用される場合、試薬がマスクによって選択された貫通穴だけに通じるようなプラテンの、１つのプラテン又は位置合わせして積み重ねたプラテンに少なくとも１つのマスクを適用することを特徴とする。特定の態様において、試薬は、水溶液、有機溶液、乾燥粉末、ゲル、気体又は電磁放射線（例えば、熱、光、Ｘ線、紫外線、磁場）から選択することができる。試薬を、マスクを介してアレイ内に導入するための方法には、機械的又は光学的圧力を試薬リザーバーに加えること、拡散及び電気泳動が含まれる。隣接するウエルの相互汚染を防止するための対策では、第２の同一のマスクを、試薬が適用される面とは反対側のプラテンの面に置くこと、そして貫通穴を通って流れる過剰な液体を吸収するためにブロッターを使用することが含まれる。マスク及びアレイは、静電気力、磁力若しくは重力によって、又は加えられた圧力（例えば、クランプを積み重ねたプラテンの周縁部に適用することによる）によって一緒に保持することができる。マスク及びアレイは、液体が貫通穴を満たす場合、静電気力、磁力又は重力により、又は積み重ねたプラテンを減圧することによって分離することができる。積み重ねたプラテンは場合により、分離を容易にするために乾燥することができる。
【０１３４】
貫通穴における液体サンプルは、空のアレイを充填されたアレイ又はアレイ積み重ね物の下に置き、その後、加圧又は減圧にして、強制的に液体の一部を空のアレイに入れることによって小分けすることができる。小さい（一般的には１００μｍ未満）空気のすき間が、流体の移送が完了した後でのこれら２つのアレイの物理的分離を容易にするために、充填されたアレイと、空のアレイの間で維持される。
【０１３５】
マスクを加えること、試薬を導入すること、及び場合によりアレイを洗浄することのサイクルを繰り返すことにより、化学物質の規定されたパターンを、液相化学を使用することによってプラテンの貫通穴において作製することができる。
【０１３６】
最初に、貫通穴の内側表面を、遊離の官能基を含有するリンカー分子により誘導体化することによって、各々の穴の内側表面を分子ライブラリーの１つの構成成分により被覆することができる。パターン化された貫通穴アレイは、その後、化学的情報を分析するために使用される。液相システムについて上記で記載されたように、マスクを加えること、試薬を導入すること、及びアレイを洗浄することを繰り返すことにより、貫通穴においてリンカー分子に結合した化学物質の規定されたパターンを得ることができる。図１は、このプロセスの例示である。誘導体化された内側表面を伴う貫通穴（４）を有するプラテン（１）が、プラテンの選択された貫通穴のみが、マスクされたプラテンが曝される試薬に通じるように構成されたマスク（２）と接触させられる。この態様において、２つの同一のマスク（２、３）が、プラテンの上部及び底部表面と接触して置かれ、その結果、流体が覆われた貫通穴の中に入るのを防止できる。好ましくは、マスク及びプラテンは平坦であり、かつ（例えば、光学的仕上げに）研磨され、その結果マスク及びプラテンは、接触した場合、気密シールをもたらす。あるいは、マスク、プラテン又は両者を、シール形成を容易にするために、軟質のポリマー又はガスケット形成物質により被覆することができ、あるいはマスク及びプラテンの表面を、一方が他方に嵌合して、大きな接触表面積を形成するように、傾斜した表面を伴って製造することができる。傾斜した表面はまた、マスク及びプラテンにおける貫通穴が一緒に位置合わせするのを助けることができるアライメントの特徴を提供することができる。インターロック式アレイ設計の一例が、図２に断面で示され、この場合、貫通穴アレイは、対置し、かつ一致する幾何学的特徴を有するように傾斜している。必要な幾何学的特徴を、例えば、パターン化された化学的エッチング又はマイクロミリング（micromilling）によって得ることができる。
【０１３７】
同様な方法を、プラテンが間に挟まれている２つのマスクを有するシステムの製造に適用することができる。マスク−プラテンのサンドイッチ体は、その後、開口の（すなわち、遮蔽されていない）貫通穴の中に試薬が入るように、試薬を負荷することができる。試薬が、貫通穴の内部に位置するリンカー分子と反応した後、過剰な試薬をサンドイッチ体から洗浄して除くことができ、このプロセスを、新しい試薬を用いて繰り返すことができる。その場合、マスクは取り除いて、新しいマスクを適用することができ、又は合成された物質を各々の貫通穴から取り出すことができる。
【０１３８】
別の態様では、１つのマスクだけが、貫通穴の一方の端を気密シールにより塞ぐために使用される。貫通穴に閉じ込められた空気は、液体が貫通穴の中に入ることを防止する。
【０１３９】
別の態様において、遊離の官能基を有するリンカー分子で誘導体化された多孔性物質が、各々の貫通穴に存在し、化学的プローブのライブラリーの構成成分が、リンカー分子に結合する。あるいは、貫通穴の内側表面が、（例えば、フッ化水素酸によるエッチングによって）多孔性となり、プローブのライブラリーが結合する。多孔性のポリマー又は表面におけるプローブの閉じ込めは、（すなわち、貫通穴の内側表面のライブラリー構成成分の固定化とは対照的に）、各々の貫通穴におけるライブラリー分子の密度を増大させる。
【０１４０】
化学合成のために、遊離の官能基を有するリンカー分子で誘導体化された多孔性ポリマーを貫通穴に挿入することができる。マスクを加えること、試薬を導入すること、そして場合によりアレイを洗浄することを繰り返すことにより、リンカー分子に結合した化学物質の規定されたパターンを、貫通穴において作製することができる。多孔性ポリマー内におけるリンカー分子の閉じ込めは、各々の貫通穴における合成された分子の密度を増大させる。
【０１４１】
同様な合成手順を、多孔性の貫通穴表面の内部に固定化された分子ライブラリーと共に使用することができる。
【０１４２】
マスク製造方法
本発明の態様では、合成又は分析のために使用されるアレイと、実質的に同一である貫通穴アレイの使用によってマスクを製造することが提供される。一態様において、マスクを、金属、誘電体（ガラス、ポリマー）又は半導体（例えば、ケイ素、ゲルマニウム、ヒ化ガリウム）から製造することができる。慣性ドリリング（drilling）が、ポリマー、ガラス又は金属でのマスクを製造するための好適な製造プロセスである。パターン化の化学的エッチングプロセス（例えば、深掘り反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）など）は、半導体及び誘電体（例えば、ガラスなど）でのマスクを製造するための別の好適な製造プロセスを提供する。放電加工（ＥＤＭ）は、導電性物質（例えば、導電性半導体及び金属）でのマスクを製造するための別の好適な製造プロセスである。
【０１４３】
本発明の別の態様が図４に示されており、この態様では、合成又は分析のために使用されるアレイと、実質的に同一である貫通穴アレイの使用によってマスクを製造することが提供される。溶液（１）が、照射時に重合する分子又は分子の混合物を含有するように貫通穴アレイ（２）の各々の穴に加えられる（工程１）。溶液は、例えば、紫外線（３）が照射されたときに重合のフリーラジカル開始剤を生成する光反応性分子及びポリマーの水溶液であり得る（工程２）。マスク製造のために好適なＵＶ硬化性ポリマーの一例が、ＵＶ硬化性ポリウレタンエポキシの種類に見い出すことができる。試薬を貫通穴アレイに加える所定の工程において、熟練者が塞ぎたい各々の穴に紫外線を照らすことによって、マスク（４）が組み立てられる（工程３）。得られたポリマーは、マスクが曝される流体に対して不透過性である。塞がれる貫通穴には、光学的に不透明なマスクを介して照射することができ、又は、収束する光で連続して照射することができる。
【０１４４】
別の態様が図５に示されており、ピン又はポストのアレイが、マスクを作製するために使用される。静的ピンアレイの外部寸法は、一致する貫通穴への正確な嵌合を有するように選択される。断面で見たとき、事前に製造されたピンアレイ（１）は、そのような貫通穴が合成シーケンスの一部として試薬に通じることを選択的に防止する。貫通穴アレイ（２）は、貫通穴の内部表面が、遊離の官能基を有するリンカー分子で誘導体化されることにより調製される（工程１）。ピンアレイが貫通穴アレイに挿入され（工程２）、そして試薬の導入及び任意のアレイの洗浄のプロセスによって、開口の貫通穴における化学物質の規定されたパターンが、リンカー分子に結合するように作製される（工程３）。ピンアレイマスクが除かれ、このプロセスが、異なるマスク及び試薬を用いて繰り返され、これにより、リンカー分子に結合した貫通穴アレイ（３）で生成された化学物質の規定されたパターンがもたらされる（工程４）。
【０１４５】
アレイにおけるピンは、各々の一致する貫通穴に正確に嵌合し、これにより、気密シールを形成するように製造される。ポリマー被覆物（例えば、Ｔｅｆｌｏｎ）を、シール形成を容易にするように各々のピンに適用することができる。この方法の利点は、ポストアレイが再使用可能であり、一回の作製が必要とされるだけである。ピンと貫通穴の内側表面との間の大きな接触面積により、実用的な気密シールが確保される。プレートマスクとは対照的に、ピンがアレイプレートと接触するだけであり、従って、このことは、合成サイクルが完了した後で、マスクをアレイプレートから外すことを容易にする。さらなる利点が、アレイにおける貫通穴をシールするために、１つだけのピンアレイを適用することによって得られる。これは、挿入されたピンにより、又は貫通穴に閉じ込められた空気の圧力により、穴を物理的に塞ぐことによって達成される。ピンアレイは、様々な製造技術によって製造することができる。一例が、貫通穴を気密シールするために必要とされる正確な断面を有するピンの規則的なアレイを、放電加工（ＥＤＭ）することである。形彫りＥＤＭを用いて、選択されたポストを、特定のマスク形態に一致するピンの空間的パターンを形成するための金型を用いて、加工することができる。第２の例が、マスク形態に一致する空間的パターンの穴を有するプレートを用いて開始することである。ピンは各々の貫通穴に嵌合され、同時に適切に接合される。
【０１４６】
別の態様では、アレイにおける選択された貫通穴を気密シールするための、マスクを形成する作動型ピンアレイが使用される。作動型ピンアレイは、各々のピンが、ピンアレイを再構成して異なるマスクを作製するように、飛び出し又は引っ込むことができることを除いて、静的ピンアレイと設計において類似している。これは、各々の異なるマスクが異なるピンアレイを要求するという点で、静的ピンアレイとは異なる。飛び出たピンは貫通穴に挿入され、一方、引っ込んだピンは貫通穴に挿入されない。アレイにおける個々のピンが、圧電的、電磁的（ソレノイド）、磁気ひずみ性、形状記憶合金又は導電性ポリマーを含むいくつかのタイプの方法の１つによって、作動するように電子的にアドレス指定可能である。この方法の１つの利点は、単一のピンアレイを再構成して、ｎ！／（ｎ−２）！個の異なるマスクを製造できることである（ｎは、アレイにおけるピンの数である）。別の利点は、異なるマスクが自動化された様式で作製されることである。このことは、貫通穴アレイを遮蔽することが必要なプロセスも自動化される場合に重要である。
【０１４７】
さらに別の態様において、マスクは、試薬が貫通穴プレートにおける選択された位置に流れることを可能にする穴を有する。他の位置において、マスクは、塞がれる穴に嵌合する盛り上がった特徴（例えば、ピン又は隆起）を含む。この方法は、マスク及びプラテンの位置調整を助け、単一のマスクが使用されることを可能にし、また、マスクとプラテンとの間における良好なシールを確実にする。
【０１４８】
貫通穴アレイはまた、貫通穴アレイの一方の側にバルブを有して製造することができる。従って、各々の貫通穴が、貫通穴の一方の端の閉塞又は開放のいずれかをもたらすバルブを有する。貫通穴に閉じ込められた空気の圧力により、液体が、塞がれた貫通穴の開口の末端の中に入ることが防止される。バルブは、形状記憶合金、電気ひずみ性、電気多孔性、圧電性、磁気ひずみ性又は導電性のポリマー物質によって作動する二層構造体として形成することができる。マイクロソレノイド作動バルブもまた、同様な機能を発揮するために使用することができる。
【０１４９】
フローマスクを製造するための別の方法は、プラテンを非透過性膜（例えば、接着テープなど）とともに少なくとも１つの面において積み重ねることである。マスクが、その後、積層物に選択的に穴を開けることによって作製される。積層物に穴を開けることができる方法には、作動型ピンアレイによる方法、レーザー加工による方法、熱を局在化された様式で加えることができ、従って、積層物における穴を融解又は焼成するプラテンと接触させることによる方法がある。連続希釈を負荷時に行うことができる。
【０１５０】
この操作は、一連の貫通穴に同じ溶質を異なる濃度で満たすために行うことができる。一般的な例において、マイクロシリンジ又は他の流体移送デバイスが、第１の貫通穴の上に配置され、第１及び第２の貫通穴に溶質の１６倍の溶液を満たすために使用される。シリンジチップの外側表面及びアレイの面は、分注されている溶液に対して非湿潤性でなければならない。各々の穴に十分な体積の溶液（下記では「Ｙｎｌ」として示される）が、正のメニスカスを生じさせるのに十分なように、穴からあふれるように分注する。その後、マイクロシリンジチップは３回すすぎ、溶媒で満たす。シリンジチップは、第２の貫通穴の上に配置され、Ｙｎｌの溶媒が、シリンジチップの端で液滴を形成するように排出される。シリンジチップが、溶媒の液滴が溶液表面と接触するまで下げられ、これにより、２つの液体が混合させられ、８倍の溶液が生じる。その後、シリンジのプランジャーが、８倍の溶液のＹｎｌを吸引するために引かれ、その溶液を次の貫通穴に分注する。その後、溶媒の別の液滴が形成され、このプロセスを繰り返して、４倍、２倍、１倍などを個々のアレイ貫通穴に分注することができる。
【０１５１】
柔軟なシートにおけるマスクの連続アレイ
貫通穴におけるプローブのアレイの合成では、多くのマスクの使用を伴うので、マスクを交換するための迅速な自動化方法が望ましい。１つの方法では、合成されるアレイの幅よりも広い幅を有する単一の柔軟なテープ（例えば、金属又はプラスチックのテープなど）において多数のマスクを作製することを含む。第１のマスクをアレイと位置合わせでき、試薬をそのアレイに移すことができる。その後、テープを、第２の試薬を加える前に、次のマスクを明らかにするように進めることができる。このプロセスを、固相合成が完了するまで繰り返すことができる。アレイ全体の洗浄を必要とする工程のために、単一の大きい穴、又はアレイにおける各々の位置に対応する穴を、テープ上に作製することができる。合成のさらなる処理及び特別仕様化のために、テープは、例えば、テープを進めるときに穴を作製する、パンチ穴のアレイ又はマイクロ配置レーザードリリングシステムを有することによって、合成と同時に作製することができる。第２のテープ又はブロッターを、（例えば、クロストークを防止するために）アレイの反対側で使用することができる。マスクをアレイと位置合わせするための様々な方法が使用でき、これらには、正確な位置合わせ用切り欠きをテープに設置すること、及びアレイに対するマスクの位置を決めるための光学的又は電流検出を使用することが含まれる。
【０１５２】
マスク及び膜を使用するアレイの合成
本明細書中に記載されるマスク合成方法はまた、硬質のプラテンの代わりに、アドレス指定できない多孔性膜（例えば、フィルター）と共に使用することができる。
【０１５３】
キャピラリーチューブアレイ
断面で見る場合、キャピラリーチューブアレイ（図６）が、第２のアレイの貫通穴に正確に嵌合する外径を有するキャピラリーチューブ（１）から構築される。チューブアレイ（３）が、一方の端におけるチューブが、貫通穴アレイにおける穴の間の間隔に等しい中心間の間隔を有し、反対側の端におけるチューブが、マイクロタイタープレート（２）におけるウエルの中心間の間隔に等しい中心間の間隔を有するように設計される。このような間隔の貫通穴を有するプレートは、チューブを通常のアレイで保持するためのジグ（４）として役立つ。これら２つの端の間に置かれたさらなる貫通穴プレートは、中心間の間隔がチューブの長さにわたって変化するとき、チューブアレイに追加の支えを提供するスペーサージグである。
【０１５４】
アレイにおける各々のチューブの内部体積は、アレイ積み重ね物における位置合わせした穴のカラムの総体積よりもわずかに大きい。例えば、アレイにおける貫通穴の大きさが、６２．５ｎｌに等しい貫通穴あたりの体積を与える２５０μｍ×２５０μｍ×１０００μｍであるならば、１００個のアレイの積み重ね物における１組の穴の体積は、６．２５μｌ（６２．５ｎｌ×１００）である。内径が２００μｍであり、外径が２４５μｍであるキャピラリーチューブを容易に得ることができ、従って、２００ｍｍの最小のチューブ長さにより、この１組の貫通穴を満たすために必要とされる流体の体積が保管される。
【０１５５】
チューブアレイの一方の端が、各々のチューブが一致するウエルに挿入されるようにマイクロタイタープレートのウエルに挿入される。チューブの長さにわたって減圧し、これにより液体が各々のウエルからその対応するチューブに引き込まれる。各々のチューブを個々に減圧するか、又は図６に示すように、チューブアレイの両端を、部分的に排出することができるチャンバーに入れることができる。アレイの各々のチューブを満たした後、マイクロタイタープレートが除かれる。液体は、凍結又は加湿環境のいずれかで、チューブアレイにおいて無期限に保管することができる。多数のチューブアレイを、（ウエルあたり十分な体積の液体が存在することを仮定して）同じマイクロタイタープレートから満たすか、又は異なるチューブアレイを異なるマイクロタイタープレートから満たすことができる。
【０１５６】
柔軟な膜のアレイを用いたマイクロタイタープレートからの移送
図７に例示されるように、流体を、柔軟な部材のアレイ（２）（例えば、形状記憶合金繊維）を用いてマイクロタイタープレート（３）の個々のウエルから移すことができる。繊維の直径は、流体が移されるアレイ（１）における貫通穴の内側寸法以下である。束における繊維の数は、例えば、マイクロタイタープレートにおけるウエルの数に等しくすることができる。束の一方の端における繊維の端は、貫通穴アレイにおける穴の間隔に等しい中心間の間隔を有することができ、一方、反対側の端における繊維の端は、マイクロタイタープレートにおけるウエルの間隔に等しい中心間の間隔を有することができる。繊維は、束の一方の端から別の端まで繊維間の間隔を増大させるように設計された一連の貫通穴ジグにより所定の位置で保持することができる。所定の位置に固定されると、形状記憶合金繊維を、その臨界転移温度よりも高く加熱して、強制された繊維の曲率を永続的にすることができる。室温に冷却された後、繊維を、繊維の中心間の間隔における変化を損なうことなく、保持用ジグから取り除くことができる。その後、繊維束の密集した端を、プレートにおける各々のウエルから流体が入ることになる貫通穴アレイに、挿入することができる。反対側の端は、各々の繊維がマイクロタイタープレートにおけるウエルの上に配置され、かつ繊維の端が各々のウエルに含有される流体に沈めることができるように配置することができる。引っ込められたとき、小さい体積の滴（４）を、各々の繊維の端に（例えば、表面張力によって）付着させたままにすることができる。貫通穴アレイの穴を通って束を引っ張るように、力を繊維束の反対側の端に加えることができ、その結果、流体が、対応する貫通穴と接触するようになる。繊維が穴を通って引っ張られるので、繊維が取り除かれるとき、表面張力が液体を貫通穴に保持するように作用することができる。
【０１５７】
圧力負荷
アレイはまた、圧力をプラテン全体に加えることによって負荷することができ、それにより、試薬及び／又はサンプルの希釈溶液を貫通穴のアレイを通って流れるようにできる。この方法は、貫通穴が試薬により既に負荷され、第２の組の試薬との反応が望まれる場合に好都合であり得る。
【０１５８】
ビーズ負荷
ビーズの負荷を、均一なサイズの微細なポリマー球体に固定化されたコンビナトリアルライブラリー全体を負荷するために使用することができる。この方法では、アレイにおける貫通穴は、１つの貫通穴あたり１個だけの微小球体を保持するように形状化することができる。貫通穴はさらに、微小球体がアレイ表面又はそれよりも下側のいずれかで穴に置かれるように、先細りの断面を有することができる（図８）。
【０１５９】
内容物の第２のアレイからの移送
貫通穴を含有するプラテンを複製することにより、各々の流路が特異な遺伝的プロフィールを有する細胞のコロニーを含有する、アレイが複製される。マスタープレートが、多様な遺伝的特性の細胞の懸濁物から調製される。懸濁物は、アレイが希釈溶液から負荷される場合、平均して１個の細胞が各々の流路に移されるように希釈することができる。その後、アレイは、細胞が中期対数期に達するまで、その細胞タイプのための適切な温度及び撹拌と共に、閉じられた湿度チャンバーにおいてインキュベーションされる。細胞数密度を、選択された流路を光学顕微鏡で観察し、光がアレイに入射するときの散乱の量を測定することによって、又は細胞が緑色蛍光タンパク質の産生のための遺伝子を含有するならば、各々の流路からの蛍光の強度を測定することによって推定することができる。様々な方法を、細胞の一部を各々の流路から第２のアレイの対応する流路に移すために使用することができる。
【０１６０】
１つの移送方法では、貫通穴の内容物を凍結乾燥することを伴う。マスター貫通穴アレイが、上記で記載されたように、多様な遺伝的特性の細胞の懸濁物から調製される。第２の同一の貫通穴アレイが、増殖培地で満たされる。これら２つの貫通穴アレイが、対応する貫通穴の内容物を混合するために位置合わせされ、積み重ねられる。積み重ねられた貫通穴アレイが、凍結乾燥され、分離される。コロニーが、アレイに培地を満たすことによって再構成される。丈夫な細胞（例えば、細菌細胞及び酵母細胞など）の場合、蒸発による脱水が、細胞の生存能を著しく損なうことなく、液体を十分除くことができる。この方法はまた、化合物のライブラリー（例えば、小分子のライブラリーなど）を乾燥状態で保存するのに有用である。例えば、結晶性化合物を、流路の壁に付着させることができる。その後、化合物を長期間にわたって保存することができ、溶媒の添加によって再構成することができる。化合物のライブラリーはまた、不活性なマトリックスで凍結されたまま、粉末又は結晶の形態で保存することができる。結晶性化合物の懸濁物を、低分子量のペルフルオロ炭化水素で作製し、凍結保存することができる。この目的のために使用することができるペルフッ素化炭化水素の一例が、−４℃の融点及び約５９℃の沸点を有するペルフルオロヘキサンである。サンプルを回収する場合、炭化水素は、大気圧又は適用される真空下で容易に蒸発することができる。その後、サンプルは、ＤＭＳＯ、水又は他の溶媒で再構成することができる。
【０１６１】
平坦な表面でのサンプルを有する貫通穴アレイのサンプルの移送／混合
貫通穴アレイに含有される液体サンプルは、親水性領域及び疎水性領域のパターンを有する平坦な表面に一部又は全てを移すことができる。親水性領域は、アレイが表面と接触する場合に、各々の貫通穴の内容物が多くても１つの親水性領域と接触するように、互いに空間的に隔離され、かつ貫通穴の間隔に一致しなければならない。表面における疎水性領域はまた、移された流体を互いに隔離するために役立つ。
【０１６２】
表面は、貫通穴アレイに含有されるプローブのアレイと位置決めすることができるサンプルのアレイを支持することができる。サンプルは、アレイがこの表面と接触させられる場合、各々の貫通穴の内容物が多くても１つのサンプルと接触するように、互いに空間的に隔離され、かつ貫通穴の間隔に一致しなければならない。表面はまた、表面及びアレイが接触した後での相互汚染を防止するために、貫通穴アレイのパターンと一致する疎水性のパターンを含有することができる。疎水性パターンが提供されない場合、プラテン及び表面は、気密シールを形成するように互いにきつく押し付けて、隣接するサンプル間の混合を防止することができる。
【０１６３】
あるいは、平坦な表面は、サンプルを含有する貫通穴アレイに一致するプローブ（例えば、蛍光標識オリゴヌクレオチド、化学物質又は細胞など）のアレイを支持することができる。プローブは様々な方法で表面に結合することができる：プローブを表面に化学的又は物理的に吸収させること、多孔性マトリックスに閉じ込めること、接着層を用いて付着させること、又は液体の滴に含有させることができる。プローブは、結合活性又は酵素活性のようなサンプルの化学的又は生物学的特性に応答して、サンプルの検出可能な物理的特性（例えば、蛍光、光学的吸収又は質量など）における変化を生じさせるために使用することができる。
【０１６４】
プランジャーの殺菌
プランジャーの殺菌は、連続サンプリングスキームの重要な態様であり得る。１つの方法は、少なくとも２つのプランジャーを有することである。この場合、一方のプランジャーがサンプリング中である間に、他方が殺菌される。２つのプランジャーは、共通の機械的ハウジングに設置することができ、例えば、プランジャー軸に平行する軸の周りで回転するように取り付けることができる。プランジャーの殺菌は、熱、又は殺菌剤（例えば、７０％エタノール）への曝露によって達成することができる。セラミック外装の内部のワイヤ（例えば、白金）ループは、好適なプランジャー設計の一例である。セラミック外装は機械的堅さを与え、電気的絶縁体であり、これに対して、ワイヤループは、電流による加熱を可能する。一例として、４Ｊ／ｋｇ・℃の比熱を有する白金のワイヤループが使用されることを仮定する。１０−４ｋｇのワイヤを、０．２ｓで１０００℃に電気的に加熱するためには、４．５Ａの最大電流が必要であるが、これは、中出力のサイリスターを用いて容易に達成される。急速冷却は、揮発性の殺菌剤（例えば、エタノール）のスプレーから達成することができ、その大きい蒸発潜熱が、加熱されたワイヤを冷却することを助けることができる。あるいは、ワイヤは、ガス又は液化ガス（例えば、液体窒素など）のスプレーによって急速冷却することができる。
【０１６５】
単一のサンプリングデバイスによる逐次的サンプリングは、例えば、機械的プランジャーの線状アレイのような、サンプリングデバイスの線状アレイに拡張することができる。１つの直交方向に沿った動きを回避することできるので、実質的な時間節約が可能である（例えば、貫通穴のＭ×Ｍのアレイに対して１／Ｍに）。同様な時間節約検討が、二次元のサンプリング技術に適用される。代わりの方法では、液体、固体又は気体の空間的に局在化されたジェットによって生じる圧力を、プランジャーの代わりに使用することができる。
【０１６６】
高タンパク質／界面活性剤培地での負荷
試薬又は培地がタンパク質又は界面活性剤が多く含み、表面張力が低い場合には、プラテンを目的の試薬に沈めることによってプラテンに負荷することが、１つの課題となり得る。低い表面張力の流体の液滴は、負荷される流体から除かれた後もプラテンの表面に留まることができる。タンパク質が多い培地の液滴又は表面被覆物が、表面に留まるな場合、アッセイの汚染又は貫通穴間のクロストークが生じる。この問題は、負荷される流体と混和しない疎水性流体の層に通してプラテンを引き上げることによって、大幅に軽減される。これにより、プラテンの表面に付着しているタンパク質又は界面活性剤を取り除くワイピング（wiping）又は「液体スキージー（squeegee）」効果がもたらされる。ワイピング液の設定は、少なくとも３つの方法のうちの１つで生成することができる。
【０１６７】
プラテンを負荷される流体に沈めることにより、貫通穴が満たされることを確実にする。プラテンが、負荷される流体から引き上げられ、その後、タンパク質又は界面活性剤に対する親和性が、タンパク質又は界面活性剤がプラテンの表面に対して有するよりも大きい疎水性流体に沈められる。そのような流体には、ペルフルオロデカリン、シリコーンオイル及び鉱油が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【０１６８】
あるいは、プラテンが最初に、負荷される流体に沈められる。その後、少量の密度が負荷液より小さい疎水性流体（例えば、鉱油及びシリコーンオイルなどであるが、これらに限定されない）を、負荷液の表面がこのワイピング液により完全に覆われるように表面に静かに層を作る。その後、プラテンが、ワイピング液の中を通って上方に、負荷液からゆっくり取り出される。
【０１６９】
更に、容器を、図２３のように使用することができる。容器は、容器の片側から別の面に広がるが、容器の底には広がらないバッフルを有している。容器には、負荷される流体がバッフルの中程のレベルに満たされる。これにより、流路の下側で通じている負荷液の２つの開口表面がもたらされる。ワイピング液が、表面の片方に静かに層を作り、バッフルによって他方の表面はそのまま保たれる。プラテンが、負荷される流体の中に沈められ、バッフルの下を通り、そしてワイピング液の中を通って取り出される。ワイピング液を用いるためのこの方法は、高処理能の自動化の方法によく適している。
【０１７０】
流体を貫通穴に選択的に負荷することによるアレイの合成
ピンのアレイ（１）を、貫通穴の第２の通常のアレイ（２）と一緒に位置決めし、そして位置合わせするように配置されたピンを用いて製造することができる（図３）。各々の貫通穴は、化学合成のために好適なリンカー分子が各々の貫通穴の内側表面に固定化されるように調製することができる。ピンの末端又は先端を、所定の表面積にわたって親水性にすることができ、一方で、アレイ表面積の残り部分は疎水性にされる。一態様において、ピンアレイにおけるピンの先端が、貫通穴アレイ（３）の貫通穴に負荷される流体と接触させられる。引っ込められたとき、小さい体積の液体の滴が（例えば、表面張力によって）各々のピンの親水性領域に付着する。ピンに付着している液体の体積は、液体と固体表面との間における相対的な表面エネルギー、及び疎水性表面積に対する液体内へのピンの浸漬深さによって決定される。付着性液体の滴を有するピンアレイを、液体が入れられる貫通穴が付着性液体の滴を有する各々のピンに対して相対的に位置合わせするように、貫通穴アレイに対して配置することができる。これら２つのアレイは、滴が（例えば、毛細管圧によって）対応する貫通穴の中に入るように接触させることができる。ピンアレイを除くことにより、アレイ（４）の貫通穴の中に置かれた流体が後に残る。従って、化学反応を、貫通穴の内側表面に固定化されたリンカー分子と、貫通穴に置かれた液体との間で開始させることができる。化学反応の速度は、温度を上げることによって、及び／又は貫通穴アレイの周りの雰囲気の気体の分圧及び／又は組成を変化させることによって増大させることができる。反応が完了した後、アレイは、未反応の成分を除くために洗浄し、そして過剰な溶媒を除くために乾燥することができる。同じ又は異なるピン構成のいずれかを有する第２のピンアレイは、流体で負荷することができ、合成プロセスを繰り返すことができる。アレイ負荷プロセスは、単純な機械的動きに依存できるので、アレイ負荷は極めて迅速であり得る。従って、律速段階は、合成工程そのものであると考えられる。
【０１７１】
別の態様は、通常のアレイの貫通穴に位置合わせされたピンがまばらに存在するピンアレイの使用を特徴とする。ピンは、その長さが貫通穴アレイプラテンの厚さの少なくとも２倍であるように製造することができる。各々の貫通穴は、化学合成のために好適なリンカー分子が各々の貫通穴の内側表面に固定化されるように調製することができる。各々のピンの末端を、例えば、親水性にすることができ、アレイの残り部分を疎水性にすることができる。ピンの横方向の大きさは、ピンが通常のアレイの貫通穴に一致して挿入されるように設定することができる。その後、ピンアレイを、ピンがプラテンの反対側に通り抜けるように、第２の貫通穴アレイに通して挿入することができる。このアセンブリーは、ピンが挿入されている貫通穴の中に入れられる流体の表面に対して配置することができる。ピンの先端を流体表面と接触させることができ、また、引っ込めた場合小さい体積の滴を各々のピンの末端に付着させることができる。ピンアレイが貫通穴アレイに対して引っ込められるとき、液体の滴が、ピンが挿入されている貫通穴と接触することができる。ピンが貫通穴から離れるとき、表面張力により、流体体積を貫通穴の内部に保つことができる。
【０１７２】
両方の態様の利点は、流体をアレイにおける貫通穴の中に負荷するのに、迅速で、簡便で、正確な方法を提供することである。例えば、界面活性剤を含有する流体を、隣接するピンの末端を隔てるアレイ表面に沿った長い経路のために、隣接する貫通穴の間における混入を最小限にしながら、アレイに容易に移すことができる。
【０１７３】
確率論的アレイの合成
確率論的アレイを、アレイにおける異なる貫通穴にランダムに動くノズルを使用して作製することができる。貫通穴に確率論的方法（この場合、サンプルの１つの変数がランダムな様式で変化する）で負荷することは、多くの用途を有する。例えば、確率論的負荷は、負荷されたサンプルにおける特定の試薬の濃度に関して変化し得る。試薬の濃度の違いは、多くの異なる反応条件の制御された様式でのサンプリングを同時にすることを可能にする。例えば、サンプルのこの種の適用は、化学合成における反応条件を最適化するために使用することができ、又は結晶化実験のパラメーターを最適化することができる。
【０１７４】
ＩＶ．プラテンにおける反応／実験
コンビナトリアルライブラリーの合成
本発明は、コンビナトリアルライブラリーをプラテンにおいて作製する新規な方法を提供する。この新規な方法を用いて作製することができるコンビナトリアルライブラリーのタイプには、核酸アレイ、ペプチドアレイ、タンパク質アレイ、ポリマーアレイ、及び小分子のアレイが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１７５】
新規な方法のいくつかでは、リンカー分子をプラテンの貫通穴の内壁に又は貫通穴の内部に位置する多孔性物質に固定化すること、及び試薬をマスクを介して順次流して、化学物質のパターンを組み立てることが含まれる。例えば、核酸アレイを作製するために、ホスホルアミダイトモノマーを規定されたパターンで貫通穴に順次置いていくが、このモノマーの各々の添加の間に、活性化、反応、洗浄及び脱保護の各工程を実施することができる。固相又は液相合成化学を用いて小分子のアレイを作製するために、例えば、保護されたアミド基を有するリンカー分子を、各々の合成試薬の添加工程の間の洗浄及び脱保護の各工程を伴う規定されたパターンで貫通穴に置くことができる。固相化学による化学合成を、貫通穴の内側表面に連結されたコア分子において、貫通穴に設置された多孔性物質の内部において、又は貫通穴に設置されたポリマービーズにおいて行うことができる。化学的に活性な側鎖基を有するコア分子もまた、液相化学を用いて貫通穴において調製することができる。
【０１７６】
化学的及び物理的プロセスの最適化
化学的プロセス又は物理的プロセスの最適化では、実験条件の多変数空間を、所望の結果をもたらすそのようなパラメーターのサブセットについて探索することが要求される。この探索の方法は、体系的又は確率論的のいずれでも可能であり、いずれか又は両方の方法を本発明の態様として実行することができる。体系的な最適化は、既知の通常の様式で貫通穴ごとの化学的条件又は物理的条件のアレイを作製することにより達成される。
【０１７７】
試薬濃度の貫通穴ごとの確率論的変化を、例えば、最初にアレイに第１の試薬を均一に負荷することによって達成することができる。その後、第２の試薬を保持する容器を、例えば、モーター駆動される二軸架台において、アレイの上に配置することができ、第２の試薬を、電子的に制御されたバルブによりノズルを介して分注することができる。ノズルは、ランダムに選択された異なるアレイ位置（又は、アルゴリズムによって決定される位置）に移動させることができ、そしてノズルを介して分注される液体の量は、事前に選択された最大値よりも小さいランダムに選択された（又は、アルゴリズムにより選択された）持続時間によって決定することができる。この様式では、第２の試薬の種々の量が、第１の試薬を含有する貫通穴に分注される。このプロセスは、必要に応じて、さらなる試薬を用いて繰り返すことができる。最適な結果を伴う反応を、貫通穴の内容物を分析することによって同定することができる。第２の試薬が、アルゴリズムに従うのではなく、ランダムに分布させられるならば、これらの反応についての出発条件に関する具体的な知識がない場合には、複製が困難になり得る。しかしながら、反応生成物だけが注目されるならば、確率論的手段は、所望の反応結果について大きい実験パラメーター空間を迅速に探索する容易な方法を提供することができる。そのうえ、反応条件はときには、例えば、反応がほとんど又は全く起こらなかったアレイ内の他の貫通穴の内容物を調べ、その後、その結果を多変数プロットで組み合わせることによって推測することができる。最適な反応条件を、データをほとんど又は全く含有しないドメインから推定することができる。初期反応条件を評価するための別の方法が、同じ分注プロトコルではあるが、第１の試薬のどれも有しない溶媒を均一に負荷したアレイへの分注プロトコルを用いて、複製プレートを作製することである。所望の化学的活性を示す貫通穴を、複製プレートの対応する貫通穴の内容物と比較することにより、観測された反応の最も確からしい出発条件に関する情報が提供される。
【０１７８】
非常に多数の条件を調べる必要がある場合、多数の試薬を、貫通穴の全てが満たされるまで、アレイにランダムに噴霧することができる。その後、表面を、過剰な流体を除くために、ゴムスパチュラによりふき取ることができる。反応を、このアレイを第２のアレイとともに積み重ねることによって開始させることができ、結果を光学的にプローブにより調べることができる。アレイにおける各々のアドレスの内容物は不明であるので、有望なアドレスを選び、その後、内容物を分析して何が穴に存在していたかを決めるか、又はプレートを、反応を開始する前に複製し、その後複製プレートを使用して、最適な条件を決定することができる。
【０１７９】
これらの例ではまた、物理的パラメーターを体系的又はランダム的のいずれかで貫通穴毎に変化させることが可能となる。例えば、温度勾配を、例えば、端を異なる温度で保持することによって、熱伝導性物質から製造されたアレイの一次元又は二次元にわたって課すことができる。加熱源／冷却源の温度が時間とともに変化するならば、アレイ全域での温度分布を変化させることができる。温度変化の割合は、一般には温度に比例しており、従って、温度及び温度変化の割合はともに貫通穴ごとに変化させることができる。あるいは、収束レーザービームを、各々の貫通穴をそれぞれ独立して加熱するようにすることができ、従って、例えば、米国特許第５，９９８，７６８号（これはその全体を参考として組み込む）に記載されるように、各々の貫通穴における経時的な液体の制御が可能になる。
【０１８０】
タンパク質の結晶化
結晶化されたタンパク質のＸ線回折は、タンパク質の構造及び機能を明らかにするための重要な分析ツールである。タンパク質は、一般に多数の疎水性分子群及び親水性分子群を含むので、結晶化させることが困難であり得る。結果として、タンパク質は多くの場合、溶媒、ｐＨ、塩濃度及び温度の各条件の特定のセットのもとでのみ結晶化する。タンパク質結晶化のためのハイスループット方法が、本発明によって可能になる。
【０１８１】
スクリーニング方法
生化学的に有効な化合物が、医薬品化合物としてのさらなる開発のために好適であるか否かを決めるパラメーターには、吸収、分布、代謝、排出及び毒性（「ＡＤＭＥＴ」）が含まれる。薬剤の可能性のあるリード化合物の数が、一次ハイスループットスクリーニングにおける進歩により増大するので、ＡＤＭＥＴテストがますます、薬剤開発プロセスにおける律速になり得る。
【０１８２】
吸着
経口投与が、小分子薬剤のための好ましい投与経路である。経口投与された薬剤が生物学的効力を有するためには、その薬剤が生体利用可能でなければならない（すなわち、その薬剤は腸を介して、血流の中に入ることができなければならない）。薬剤の候補物が腸の内壁を通過する能力を、インビトロアッセイで評価することができることが非常に望ましい。一般的には、そのような吸収アッセイでは、２つの液体充填チャンバーを分離する半透過性膜に増殖させた細胞の単層物が利用される。薬剤候補物が、チャンバーの一方に加えられ、拡散又は輸送のための十分な時間の後で、もう一方のチャンバーにおける分子の濃度が定量分析される。
【０１８３】
生物医薬品業界で一般に使用されるこのような吸収アッセイの１つが、ＣａＣｏ−２吸収アッセイである。ＣａＣｏ−２アッセイでは、ＣａＣｏ−２として知られている結腸細胞株の単層を通過する分子の能力が調べられる。一般的には、細胞層を横断する、先端から基部への拡散及び基部から先端への拡散の両方の速度が、測定される。ＣａＣｏ−２アッセイは通常、多孔性膜によって隔てられた２つの流体チャンバーを提供する装置で実施される。膜は、細胞増殖生成物に対して透過性であるが、細胞のための支持体及び非透過性バリアとして作用する。細胞の単層物が、膜の表面全体に増殖させられ、この細胞バリアを越える一方のチャンバーからもう一方のチャンバーへの分子の能動輸送又は受動輸送がアッセイされる。
【０１８４】
貫通穴のアレイを含有するプラテンは、（例えば、ＣａＣｏ−２細胞又は他の細胞を使用して）吸収アッセイのアレイを提供し、従って、処理能を増大させ、かつ試薬の体積を最小限に抑えるために、いくつかの様式で構成することができる。一態様において、等方性の多孔性膜（例えば、ＰＴＦＥフィルターなどであるが、これに限定されない）が、接着性細胞を増殖させるための生物学的に適合する表面を提供するために処理される。膜は少なくとも貫通穴のアレイの大きさを有しており、プラテンの貫通穴を覆うように１つのプラテンの上に置かれる。一致する貫通穴を有する第２のプラテンが、膜がこれら２つのプラテンの間に挟まれるように膜の上に置かれる。圧力がプラテンに加えられ、その結果、膜が、隣接する貫通穴の間で押しつぶされ、かつ、何らかの化学的クロストークが、対置していない貫通穴との間で生じる恐れがないようにするが、対置する貫通穴との間での化学的連絡をアッセイのために可能にする。
【０１８５】
第２の態様において、膜は異方的に多孔性であり、膜を貫通する並行した細孔からなる。このタイプの膜の例が、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって販売されるＩｓｏｐｏｒｅ及びＮｕｃｌｅｏｐｏｒｅのフィルターである。前述の態様のように、膜は２つのプラテンの間に挟まれ、圧力が加えられる。この態様では、膜を、隣接する貫通穴の間で押しつぶすような圧力が要求されないが、隣接する貫通穴の間をシールするために要求される。膜の並行する細孔は、隣接していない貫通穴又は対置していない貫通穴との間ではなく、対置する貫通穴との間での化学的連絡を可能にする。
【０１８６】
第３の態様において、膜が、プラテンにおける過通穴のパターンのような間隔及び及びサイズを有する多孔性の領域を伴ってパターン化される。膜は、多孔性の領域が貫通穴と一致するように２つのプラテンの間に挟まれ、これにより、隣接していない貫通穴又は対置していない貫通穴との間ではなく、対置する貫通穴との間での化学的連絡を可能にする。
【０１８７】
第４の態様において、膜が、貫通穴が多孔性物質（例えば、多孔性シリカなどであるが、これらに限定されない）を含有する貫通穴のプラテンから作製される。この態様では、膜プラテンが、貫通穴の２つのプラテンの間に挟まれ、これにより、隣接していない貫通穴又は対置していない貫通穴との間ではなく、対置する貫通穴との間での化学的連絡を可能にする。
【０１８８】
代謝
代謝検討のために、化合物は、様々なチトクロームＰ−４５０（ＣＹＰ−４５０）酵素又は肝臓ミクロソーム調製物によって分解される、その性向についてテストすることができる。薬剤−薬剤の相互作用を引き起こす性向を、各々の薬剤又は薬剤候補物による様々なＣＹＰ４５０酵素の阻害をアッセイすることによって評価することができる。
【０１８９】
本発明の態様では、ライブラリー由来の化合物の細胞代謝を測定することが提供される。吸着アッセイに関連した上記のように、化合物は、小さい有機分子、ペプチド、オリゴヌクレオチド又はオリゴ糖であり得る。細胞は、液体に懸濁するか、又は貫通穴の内部若しくは長さ方向の高い透過性及び横方向の低い透過性を有する膜において細胞の単層物として増殖させることができる。膜は、例えば、プレートの貫通穴における重合されるモノマー、又は貫通穴アレイのドメインに等しいドメインサイズ及び中心間の間隔を有する柔軟な膜における親水性／疎水性ドメインを含むことができる。既知濃度の様々な体積を、化合物ライブラリーから１つの貫通穴アレイに負荷することができる。細胞アレイ又は細胞層を、ライブラリーアレイと接触させて置き、インキュベーションすることができ、そしてアレイ組成物を分析して、細胞代謝による化合物の組成又は量の変化を測定することができる。
【０１９０】
毒性
本発明の態様では、ライブラリー由来の化合物の細胞毒性を測定することが提供される。吸着及び代謝アッセイに関連した上記のように、化合物は、小さい有機分子、ペプチド、オリゴヌクレオチド又はオリゴ糖であり得て、液体に懸濁するか、又は貫通穴の内部若しくは長さ方向の高い透過性及び横方向の低い透過性を有する膜において細胞の単層物として増殖させることができる。膜は、例えば、プレートの貫通穴における重合されるモノマー、又は貫通穴アレイのドメインに等しいドメインサイズ及び中心間の間隔を有する柔軟な膜における親水性／疎水性ドメインを含むことができる。既知濃度の様々な体積が、化合物ライブラリーから１つの貫通穴アレイに負荷される。細胞層をライブラリーアレイと接触させて置き、インキュベーションすることができ、各々の貫通穴における細胞を生存能について分析することができる。
【０１９１】
親和性によるリガンドスクリーニング
特定の標的高分子に対する化合物ライブラリーの様々な構成成分の親和性を測定又はランク付けすること、又はプローブアレイの様々な構成成分に対する分析物の親和性を測定することは望ましいことであり得る。そのようなスクリーニングを、本明細書中に記載の新規な方法を用いて行うことができる。例えば、親和性実験を、標的を貫通穴アレイの多くの穴に固定化すること、潜在的なリガンドのライブラリーでプローブすること、又はリガンドライブラリーをアレイに固定化し、標的でプローブすることによって実施することができる。
【０１９２】
熱変性ランキング
新しい薬剤標的が急速に発見されつつあるので、これらの標的に対する親和性を有する分子を機能的アッセイの非存在下で見出すための方法が必要である。この目標を満たすことは、標的生体分子をアレイの内側表面に固定化すること、アレイの穴を化合物のライブラリーと共にインキュベーションすること、そして化合物を保持するアレイのそのような構成成分を検出することによって達成することができる。結合した化合物はまた、標的分子を、熱変性に対して親和性の程度と相関する程度に安定化させる。タンパク質のアンフォールディングを温度又は変性溶媒条件の関数として検出することによって、親和性を、例えば、米国特許第６，０２０，１４１号（Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏら）に記載されるように、ランク付けすることができる。
【０１９３】
遺伝子プローブ
本発明の態様では、数多くの既知の核酸配列を含有する貫通穴アレイの製造が提供され、この場合、少なくともいくつかの未知の配列を有する核酸溶液をアレイの穴の各々に加えること、未知の核酸が貫通穴における相補的な核酸に特異的に結合するための十分な時間、温度及び溶液の条件を提供すること、そして各々の貫通穴における既知及び未知の配列の核酸との間でのハイブリダイゼーションの程度を分析することを伴う。結合後、アレイを所望の厳密性の溶液により洗浄することができる。多くの場合、未知の核酸には、蛍光性プローブが結合している。本発明の利点は、シグナルの増幅が、ハイブリダイゼーションした核酸に関連する酵素反応を使用することによって達成することである。例えば、未知の核酸を西洋ワサビペルオキシダーゼにより標識することができ、そして結合及び洗浄工程の後で酵素と反応した場合に、発光、蛍光又は発色シグナルを生成する基質とインキュベーションすることができる。そのような増幅技術は、平面状の表面での従来の核酸アレイとの適合性を有することができるが、これは、溶液における活性化された基質は一般に、拡散のためにアレイ上の特定の点に割り当てることができないことによる。ＰＣＲ又は他の熱サイクル反応を、アレイを水非混和性液体（例えば、オイル、アルカン又はペルフルオロ化溶媒など）に沈めることによってアレイにおいて行うことができる。アレイ及び水非混和性液体を、熱伝導性の容器（例えば、金属箱など）に含まれるようにでき、その後、そのような箱を収容するのに適合化したサーマルサイクラー（thermal cycler）に入れることができる。
【０１９４】
細胞の長期間培養又は高温培養
蒸発を最小限にするために、少量の低揮発性の非混和性液体で小さい体積の水性反応媒体の上に層を作ることが当分野では既知である。例えば、少量の鉱油で、加熱サイクル期間中の蒸発を最小限にするために、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）反応液を含有する反応バイアルに層を作ることができる。酸素溶解性が大きい内容物を伴う流体が、酸素を必要とする系への酸素輸送を可能にするために使用されることもまた知られている。本発明の新規な態様では、酸素溶解性が高い内容物を伴う非混和性流体を、細胞の生存能を維持するために酸素輸送を容易にしながら、サブマイクロリットルのサンプルのアレイからの蒸発をなくすために使用することができる。
【０１９５】
非接着性細胞をナノ体積形式で（例えば、１２時間を越える）長期間にわたって培養するためには、細胞を疎水性の低揮発性流体に含有することによって、蒸発を低下させることが望ましいことであり得る。好気的呼吸又は他のガス交換プロセスが起こることを可能にするように、ペルフルオロ化化合物の酸素化されたエマルションを使用することができる。このような化合物は、人工血液代替物として臨床テストの対象となっている。例には、ペルフルオロデカリン（これは、ミドリ十字（日本）によってＦｌｕｏｓｏｌ−ＤＡ（商標）として販売される）、Ｏｘｙｃｙｔｅ（商標）（これは、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｂｌｏｏｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌによって開発中である）、及びＯｘｙｇｅｎｔ（商標）の商品名のペルフルオロオクチルブロミド（これは、Ａｌｌｉａｎｃｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによってテスト中である）が含まれる。貫通穴アレイを使用するこれらの方法及び物質の一般的な適用において、細胞は、酸素又は空気が、細胞を乱さない様式で媒体に吹き込まれながら、ペルフルオロデカリンに沈められるプラテンにおいて増殖する。
【０１９６】
貫通穴の壁に、又は貫通穴に固定化された多孔性物質に接着する細胞の培養では、酸素化された水性媒体を、必要に応じてプラテンに通して又はプラテンの周りで灌流することができるので、比較的より簡便である。
【０１９７】
好熱性生物を小さい体積及び高い温度において好気的条件下で培養することは、９０℃のような温度では蒸発が急速に作用する傾向があるので、特に問題となり得る。貫通穴のアレイを適切なフッ素化溶媒に沈めることによって、これらの温度を、細胞への酸素の供給を維持しながら、著しい蒸発を伴うことなく使用することができる。
【０１９８】
多くの場合、アッセイ検出又はサンプル「選別」の行為では、プラテンが非加湿環境又は明るい光に一定期間に曝されることが要求されることがある。これらは、貫通穴からの蒸発が問題となる条件である。一般的な実験において、サンプルの蒸発は、操作を非混和性流体（例えば、ペルフルオロデカリンなどであるが、これらに限定されない）層の下で行うことによって最小限に抑えられ、また、サンプルを、そのような流体に沈められたまま、マイクロシリンジを用いて貫通穴に加える、又は貫通穴から取り出すことができる。他の操作、例えば、画像化及びプラテン操作（例えば、プラテンの積み重ね）なども、非混和性流体のもとで同様に行うことができる。
【０１９９】
Ｖ．アレイデバイスからの結果を分析及び操作する方法
サンプルを貫通穴から移す方法
さらに別の方法は、マイクロタイタープレートへの移送を特徴とする。テストに対して陽性の応答となるサンプルを回収するために、多くの場合、高密度アレイプレートにおける選択された貫通穴から、流体を低密度のウエルを有するマイクロタイタープレートに移す必要がある。多くの場合、この移送プロセスは、無菌技術を用いて実施しなければならない。このことは、選択された性質を有する貫通穴に保持された物質をサンプルのより大きいコレクションからサンプリングすることを可能にする。流体を高密度アレイプレートからマイクロタイタープレートのウエルに移すための、３つの一般的な方法が存在し、単一のサンプリングデバイスによる移送、サンプリングデバイスの線状アレイによる移送、及びサンプリングデバイスの二次元アレイによる移送である。禁止された（proscribed）貫通穴からのサンプルを、空間的に局在化された機械的動作によって取り出すことができる。１つの一般的な態様は、物質を機械的に反対側から移動させるために、穴の下に配置された容器に入れるように、部材を穴に通して挿入することである。第二の一般的な態様は、穴における物質を反対側の端から移動させるために、穴の下に配置された容器に入れさせるように、局在化されたガスジェット又は液体ジェットを適用することである。第三の、しかし、より遅い方法は、液体をピン又はシリンジに移し、ピン又はシリンジを容器に移動させ、液体を分注することによって、液体を穴から待ち受け容器に移すことである。
【０２００】
移送システムの処理能を最大にするためには、低密度のプレートを移動する回数を最小限にしなければならない。高密度アレイが画像化され、画像がコンピューターに保存される場合、所望される貫通穴の座標が、移送装置への入力のために利用可能である。高密度アレイを低密度プレートの上に位置合わせし、所望されるサンプルが低密度プレートの空のウエルの上に位置するかを計算することによって、最大数のサンプルを、低密度プレートを再配置することなく移すことができる。その後、低密度プレートを、可能な限り最大数のサンプルが次の工程で移されるように位置に移動させることができる。移送装置の費用を最小限に抑えるために、高密度の貫通穴アレイは、高精度の位置調整システムの使用を避るように静止したままでなければならない。この様式で使用することができるいくつかのハイスループットシステムが下記に記載される。
【０２０１】
別の方法は、単一のサンプリングデバイスによる移送を特徴とする。この方法は、例えば、機械的プランジャーを、サンプリングされる貫通穴の上に配置すること、そしてプランジャーを穴に通して押し出して、穴の内容物を、貫通穴アレイ（６）の下に短い距離で位置するマイクロタイタープレートのウエルに移すことを素早く連続的に実施することによって達成することができる（図９）。機械的プランジャー（１）は、例えば、リニア電磁モーター（２）によって作動させることができる。このプロセスは、マイクロタイタープレート（４）の各々のウエル（３）が異なる貫通穴の内容物を含有するまで繰り返される。完了すると、満たされたプレートは、空のプレートにより置き換えられ、このプロセスが繰り返される。サーボ制御の、リニアモーターにより作動される、磁気ベアリング又は空気ベアリングを有する二軸ステージ（５）は、その直径が貫通穴の直径よりもわずかに小さい（穴の直径の１／１００未満（約１μｍ）の範囲内に、また１ｍ／ｓまでの速度）機械的プランジャーを配置することができる。従って、１００，０００穴のアレイの１％がマイクロタイタープレートに移されることなり、各々の穴をサンプリングするための時間が平均して０．２ｓであるならば、アレイの１％を約２００ｓでサンプリングすることができる。この時間には、当然のことではあるが、マイクロタイタープレートを交換するために必要な時間、プランジャーをサンプル間で殺菌するために必要とされる時間、及び必要ならば、ウエルをサンプリングされた貫通穴に下に配置するための時間は含まれていない。
【０２０２】
空間的に局在化されたガス、液体又は固体ジェット
図１０に関連して、レーザー（１）からのビームは、シャッター（２）を通過し、貫通穴の高密度アレイ（５）における指定された貫通穴（４）に収束するようにビーム走査システム（３）によって導くことができる。レーザーの波長は、標的の貫通穴における流体の吸収バンドと一致するように選ぶことができる。対応する吸収係数は、入射したレーザー放射線の大きな割合が液体カラムの上部の薄い層において吸収されるようにすることができる。シャッターは、貫通穴の液体がレーザー放射線に曝される時間の長さを制御することができる。シャッターが開いているとき、レーザー光は液体を照射し、十分なエネルギーが曝露時間の間に吸収されて、薄い液体層を迅速に加熱して気化させ、これにより、圧力の迅速な増大を貫通穴の一方の端において引き起こす。膨張しつつある蒸気から得られた力により、液体が穴の反対側の端（６）から貫通穴アレイの下に位置するマイクロタイタープレート（７）のウエルの中へ噴出されるのを引き起す。加熱された表面の上方の体積が気密シールされるならば、液体に加えられる力を増大させ、さらなる力の増大が可能である。カラムからの液体の迅速な気化及び排出では、レーザーエネルギーを熱化時間よりも少ない時間で堆積させることが要求される。迅速な排出は、処理能を増大させるために、また液体に含有される細胞又は試薬の実質的な分解を防止するために必要となる。
【０２０３】
水で満たされた貫通穴のケースの例示的な例を、提供する。実際、多くのケースにおいて、分析物質は水に存在する。１０．６μｍにおける水の吸収係数は、約１０００ｃｍ−１であり、これは、水カラムの長さの短い一部が０．５ｍｍ以上の長さを仮定して、入射した放射線の９９％が表面の４６μｍの範囲で吸収されることを示す。熱化時間（τ）は、水カラムが熱平衡に達するために必要な時間であり、τ＝ｌ２／４αによって与えられ、式中、ｌは熱エネルギー源からの距離であり、αは温度拡散率（＝κ／ｃρ、式中、熱伝導率がκであり、ｃは比熱であり、そしてρは密度である）である。水についての適切な値を代入すると、長さ１ｍｍの水のカラムについての熱化時間は１．７５ｓであり、一方、長さ０．５ｍｍのカラムについては、τは０．４４ｓである。レーザーパルスの長さ（Δｔ）がτよりも小さいならば、収束レーザービームによる断熱加熱が生じる。
【０２０４】
厚さが４６μｍで、大きさが２００μｍの水の体積の瞬間的気化によって生じるピーク圧力は、水蒸気が理想気体であることを仮定して、推定することができる。この体積Ｖ（＝１．４×１０−１２ｍ３）における圧力Ｐは、液体が気化するとき、Ｐ＝ｎＲＴ／Ｖであり、式中、ｎは水のモル数（＝８８ナノモル）であり、Ｔは気体の温度（＝３７３Ｋ）であり、Ｒは理想気体定数（＝８．２ｍ３・Ｐａ／ｍｏｌｅ・°Ｋ）である。これらの値を代入すると、Ｐｍａｘ＝１８６×１０６Ｐａが得られ、これは、水カラムに対する５．８Ｎの力に等しく、液体を貫通穴から追い出すためには十分である。
【０２０５】
直径が２００μｍの貫通穴における、厚さが４６μｍの水の層を気化させるためのレーザー出力は、この体積の水を気化させるためのエネルギーＱをコンピューター計算することによって見出すことができる。熱エネルギーは、Ｑ＝ｍ（ｃΔＴ＋ΔＨｖａｐ）により与えられ、式中、ｍはこの体積における水の質量（１．６×１０−９ｋｇ）であり、ｃは水の比熱（＝４１８４Ｊ／ｋｇ／°Ｋ）であり、ΔＴは温度変化（３５３°Ｋ）であり、ΔＨｖａｐは水の蒸発潜熱（＝２．３ＭＪ／ｋｇ）である。これらの値を代入すると、６ｍＪに等しいＱが得られる。入射レーザーエネルギーの９９％吸収を仮定すると、１０Ｗのレーザーが液体表面を０．６ｍｓにわたって照射することによって、６ｍＪがサンプルに与えられる。ランダムアクセス走査のために、検流計制御のミラーについての一般的な設定時間は１０ｍｓであり、個々にアドレス指定されるアレイ内の１０００個の貫通穴については、約１０．６秒を要する。
【０２０６】
別の態様において、固体（例えば、粉末）又は液体を、特定の貫通穴の内容物又は一般には貫通穴の内容物を押し出すために、又は（例えば、加圧下で）強制的に出すために使用することができる（図２２を参照されたい）。使用することができる液体の例には、貫通穴の内容物と混和する液体（例えば、貫通穴の内容物が水性であるときには、水）、又は貫通穴の内容物と混和しない液体（例えば、貫通穴の内容物が水性であるときには、オイル又は有機溶液など）が含まれる。加圧された液体をアレイに適用することが、各々の穴の内容物を、例えば、共通の容器に洗い出すために使用することができる。
【０２０７】
炸薬
前述の態様の延長としては、貫通穴の一方の端の近くに位置する炸薬を発火させたときの急速に膨張するガスによって生じる圧力波によって液体を貫通穴から排出することである。図１０に関連して、ばらばらの緩燃性炸薬のアレイ（１）が、１つの炸薬が１つの貫通穴の上に位置するように、貫通穴アレイに関して一緒に位置決めされる。各々の炸薬が、共通壁としての薄い膜を貫通穴とともに有するチャンバーにおいて設置される。炸薬アレイが、貫通穴アレイに接着される（又は、強固に取り付けられる）。この適用のための爆発性物質の例には、プラスチック爆薬シート、例えば、「Ｃ４」、又はプラスチックに埋め込まれたトリニトロトルエン（ＴＮＴ）などが含まれる。炸薬アレイは、例えば、電気的又は光学的にアドレス指定可能である。個々の炸薬を、電流を、チャンバー内に位置する抵抗エレメント（２）に流すことによって、又は収束レーザービームによってチャンバー内に与えられる熱エネルギーによって発火させることができる。発火させられると、爆発からの膨張するガスが、分離用膜を破裂させ、液体（３）を、貫通穴（４）を通して、貫通穴アレイ（７）の下に位置するマイクロタイタープレート（６）のウエル（５）の中に押し出すのに十分な圧力を生じさせる。
【０２０８】
あるいは、図１１に示されるように、炸薬は、薄いプラスチックシート（１）に均一な確率論的分布として埋め込むことができる。逆に、爆発性の化学物質を、図１２に示されるように、貫通穴アレイと同じパターンでシート上に印刷することができる。シートに印刷されるのは、貫通穴アレイと同じパターンを有する、別個の空間的場所での抵抗エレメント（２）である。あるいは、シート上での空間的場所は、爆発性化学物質を発火させるためにに必要なエネルギーを提供する収束レーザービームによってアドレス指定可能である。シートは、貫通穴アレイ（３）に接着され、その内容物（４）が、貫通穴アレイの下に位置するマイクロタイタープレート（６）のウエル（５）の中に移される貫通穴の上で、炸薬が発火させられる。
【０２０９】
膨張するガス噴出物から液体カラムに与えられる慣性を増大させるために、金属又はセラミックの微小球体が炸薬と混合され、爆発によって加速される。あるいは、炸薬と、爆発によって加速された液体カラムとの間における物質の詰め物は、液体を貫通穴から放出するための機械的プランジャーとして作用する。
【０２１０】
炸薬を含有するチャンバーの出口をノズルの中に形成することは、空間的局在化、及び液体カラムに衝突する前の出て行くガスの慣性を増大させる。ノズル出口は、チャンバー表面で流動的であるか、又は対置する貫通穴に挿入するためにわずかに突き出るかのいずれかである。
【０２１１】
サンプル吸引
貫通穴又は貫通穴群の液体サンプルは、チューブ又は流路に吸引することによって貫通穴から移すことができる。柔軟なチューブ又は硬質のチューブ（一般には貫通穴の内径よりも小さい外径を有する）の１つの先端を、貫通穴内に位置が合うようにできる。その場合、チューブの遠位端を減圧にして、流体を貫通穴からチューブの中に吸引するように使用することができる。吸引される流体の量は、いくつかの変数を操作することによって正確に制御することができる。例えば、チューブの長さ及び内径により、１本のチューブの両端における圧力低下が決定される。この圧力低下は、結果として、減圧にする所定の量に対して、１本のチューブを通過する流速に影響する。一定量の流体を、貫通穴からバルブアセンブリーに吸引することができ、バルブアセンブリーから、流体を、所定の適用に必要とされる流体素子回路の何れかのタイプに加圧又は減圧によって移動させることができる。一態様において、流体が、貫通穴から流体素子バルブに吸引される。そのようなバルブの作動により、流体が、その流体を分析するために質量分析計に加圧により導入される。あるいは、さらなるサンプル調製又は特徴付け（例えば、クロマトグラフィー、分光法）を、貫通穴から吸引される流体に対して実施することができる。
【０２１２】
電気泳動及びエレクトブロッティング：
本発明はまた、イオン性サンプルを、化学的プローブを含有する貫通穴アレイに導入するための方法、サンプルにおけるある特定のイオンとプローブとの間での結合を厳密に調節するための方法、及びイオン性サンプルを貫通穴アレイから取り出すための方法を提供する。この方法では、穴に局在化された化学的プローブを含有する貫通穴アレイを、電気泳動装置中の緩衝液に入れることが含まれる。イオンを含有するサンプルが、平面状の貫通穴アレイの一方の側において電気泳動装置に導入され、その結果、電場が加えられると、適切な電荷のイオンが貫通穴アレイの方向で移動するようにされる。特定のイオンが、アレイに結合せず、また、電場が十分な時間にわたって加えられるならば、そのイオンは穴を通って貫通穴アレイの反対側に移動する。電場の方向を周期的に変化させることによって、貫通穴における荷電化学種と化学的プローブと間での結合の平衡状態に近づくことが加速される。分析されるサンプルの部分精製は場合により、貫通穴アレイへの移動の前にゲルによるサンプルの電気泳動によって達成することができる。サンプルにおける目的の分析物が化学的プローブと会合していると、非特異的に結合したイオンを化学的プローブから解離させるための十分な時間及び十分な強度で電場を加えることができる。その後、貫通穴アレイを電気泳動装置から取り出し、結合のパターンを分析することができる。結合した分析物はまた、さらなる分析のために取り出すことができるが、例えば、膜にエレクトロブロッティングし、その後、その膜をさらなる分析のために取り出す。
【０２１３】
貫通穴のアレイにおけるサンプルの色分析
多くの適用のために、サンプルは、クロマトグラフィー工程によって単離、精製又は濃縮される。多くの異なるタイプのクロマトグラフィーを、液体サンプルに対して行うことができる。公知のクロマトグラフィー法の例には、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、バイオアフィニティークロマトグラフィー及びゲルろ過クロマトグラフィーが含まれるが、これらに限定されるものではない。クロマトグラフィーマトリックスは、不溶性のビーズ、ゲル、樹脂、ポリマー又はスラリーの形態であり得る。あるいは、マトリックスは微細加工構造物であり得る。そのような微細加工構造物の１つの態様が、面の大きさが０．０１μｍ〜１０μｍの程度の正方形の貫通穴又は流路のグループ化である。これらの貫通穴の壁は、サンプルが貫通穴の群の中を流れるとき、分離が達成されるように、所望の親和性を有する表面により被覆することができる。その後、目的の分析物混合物がこのマトリックスに導入され、マトリックスに対する分析物混合物の成分の選択的な結合が生じる。その後、目的の分析物又は混入物を、マトリックスの物理的又は化学的環境を変化させることによってマトリックスから選択的に溶出させることができる。
【０２１４】
液体クロマトグラフィーが、クロマトグラフィーマトリックスが固定化され、分析物がカラムの中に流され、これによりサンプルとクロマトグラフィー媒体との間での化学的及び／又は物理的相互作用が生じることを可能にする、カラムにおいて一般的に実施される。キャピラリーのアレイの長さ及び内径は一般に、各々のカラムに負荷できるクロマトグラフィーマトリックスの量を決めるが、それにより各々のカラムの負荷容量が直接関連づけられる。
【０２１５】
クロマトグラフィーマトリックスを貫通穴のアレイの内部に固定化することにより、小型の液体クロマトグラフィーカラムのアレイを作製することができる。貫通穴のアレイの好適な長さ対直径比を選択することができる。一般的に、最低でも約１０の長さ対直径比が、効果的なクロマトグラフィーカラムを形成するために要求される。特定の態様において、貫通穴において形成されるカラムの内径はミリメートル未満であり、これにより、非常に少ない量のサンプルの精密かつ正確な操作が可能になる。クロマトグラフィーマトリックスは、多孔性のフリットをカラムの出口端に配置することによって、又は多孔性のポリマー、セラミック又はガラスの基材をカラムの内部に化学的に結合することによって、クロマトグラフィーカラム内に固定化することができる。多孔性のセラミック又はガラスの基材は、ビーズ又は樹脂のクロマトグラフィー媒体を固定化するためのフリットとして、又はカラム内における総表面積を増大させるための方法として作用することができる。表面効果によって働くクロマトグラフィー方法（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー又は逆相クロマトグラフィー）では、カラムの内側表面の化学的誘導体化により、必要な分離を提供することができる。
【０２１６】
一態様において、サンプルが、シリンジによりカラムのアレイに負荷される。サブミクロリットルの体積のサンプルを、シリンジ又はカラムアレイの間隔に対して一緒に位置決めされた間隔を有するシリンジ列の針に引き込み、その後、カラムアレイに移すことができる。シリンジの胴部は、キャピラリーの束における洗浄工程及び／又は溶出工程を行うために、より大きい量の液体を含有することができる。シリンジの針におけるサンプル及びシリンジの胴部における液体は、少量の空気をシリンジに引き込むことによって互いに隔離することができる。シリンジの針は、水密圧縮フィッティングによりキャピラリーのアレイにつなぐことができる。シリンジの内容物が、カラムのアレイの中に押し出されるとき、シリンジの針中のサンプルが最初に、カラム床の上に流出する。使用されるクロマトグラフィー媒体及びシリンジの胴部に引き込まれた緩衝液により、クロマトグラフィー分離が左右される。サンプルがカラムに負荷されると、シリンジはその接続口から外すことができ、類似又は異なる緩衝液の第２のアリコートをシリンジに引き込むことができる。必要に応じた多くの洗浄及び／又は溶出工程を、圧縮フィッティングを締めることによりシリンジをキャピラリーのアレイに再びつなぎ、そして液体をシリンジから押し出すことによって行うことができる。カラムの第１のアレイはまた、さらなる分離のためのカラムの第２のアレイと対にすることができる。
【０２１７】
多くの場合、クロマトグラフィーカラムからの溶出物を、様々な分光学的方法を使用してリアルタイムで分析することが望ましい。クロマトグラフィーカラムからの溶出物を調べるための様々な分光学的デバイスが広く知られている。特定の適用によって必要ならば、カラムの束の各々のカラムからの溶出物を、分光学的に（例えば、吸収、蛍光又はラマン分光法によって）、電気化学的に、又は他の方法で、リアルタイムでオンライン分析することができる。分光学的光源からの光を、光が光ファイバーケーブルでそのカラムの出口キャピラリーの中に加工された観測窓を通過するとき、カラムの束の各々のカラムの溶出物に送達することができ、また溶出物から回収することができる。
【０２１８】
貫通穴のアレイを液体クロマトグラフィー流路のアレイと対にすること
デバイスを、カラムのアレイの内部に固定化されたクロマトグラフィーマトリックスを有するクロマトグラフィーカラムのアレイを含むように製造することができ、例えば、カラムのアレイが、クロマトグラフィーマトリックスを含有しない貫通穴のアレイにおける貫通穴と一緒に位置決めできるような間隔を有している。貫通穴のアレイの物理的サイズにより、カラムのアレイのサイズが決定される。好ましくは、カラムのアレイにおける各々のカラムの内径は、貫通穴のアレイにおける対応する一緒に位置決めされる貫通穴の内径と類似である。
【０２１９】
カラムのアレイは、加圧又は減圧がデバイス全体にわたって適用でき、そして個々のサンプルの間でのクロストークを生じさせない様式で、貫通穴のアレイと対にしなければならない。カラムの数は、貫通穴と１対１の比である必要はない。適用される外部圧力に応答する貫通穴のアレイの積み重ね物の層の間でのサンプルの半径方向の拡散は、クロストークをもたらす恐れがあり、回避されなければならない。サンプル間のクロストークを、半径方向の拡散をなくする貫通穴間での液密シール又は気密シールを形成することによってなくすことができる。アレイにおける貫通穴と一緒に位置決めされる穴とエラストマーシートを、そのようなシールを形成するために積み重ね物の層の間で圧縮することができる。あるいは、薄い不活性な多孔性ポリマーシートを、２つのカラムが一緒に押し付けられる場合、液体がシートにおける細孔を通って流れることができるが、横方向には流れることができないように、２つのアレイの間に設置することができる。別の方法では、各々の貫通穴の周りの中間領域の１つの面がアレイの残り部分に対して盛り上がるように貫通穴のアレイを製造することを伴う。その場合、Ｏ−リングをこの盛り上がった部分の周りに設置することができる。２つ又はそれ以上の貫通穴アレイが一緒に押しつけられる場合、Ｏ−リングが気密シールを形成し、それにより、半径方向の拡散及びサンプルのクロストークがなくなる。一致するアレイの何れかの対の断面もまた、漏れのない流体シールを提供するために、一致する表面の間でのエラストマーガスケット又は被覆を互いにかみ合うように製造することができる。
【０２２０】
１つ又はそれ以上の貫通穴アレイを、同様な様式でカラムのアレイと対にすることができる。その後、上部プレートを、クロマトグラフィーでの必要な洗浄及び／又は溶出の緩衝液を各々の貫通穴に適用できるようにアセンブリーに取り付けることができる。液体を、サンプルが貫通穴のアレイを通って、クロマトグラフィーが行われるカラムのアレイに押し出すような様式で、デバイスに強制的に通すことができる。特定の適用によって必要ならば、クロマトグラフィーカラムからの洗浄及び／又は溶出の緩衝液を、別のクロマトグラフィーデバイス、クロマトグラフィーフラクションコレクター、又は貫通穴の別のアレイにキャピラリーを介して移すことができる。そのようなデバイスの１つの例示が、図１４に示される。デバイスの出入口につながる流体接続部を、標準的な流体成分（例えば、フェルール（ferules）及び圧縮管継手のような標準的な流体装置部材を使用する標準的な流体接続部への容易な結合のために加工することができる。
【０２２１】
分画物捕集用のデバイス
クロマトグラフィーでは一般に、化合物の混合物を、クロマトグラフィーマトリックスとその混合物の個々の成分の示差的な化学的及び／又は物理的相互作用に基づいて分離することを伴う。物理的及び／又は化学的環境における突然の変化又は漸進的変化は、混合物の成分とクロマトグラフィーマトリックスとの間における相互作用に影響を及ぼす。一般的には、物理的及び／又は化学的条件が変化するのに伴って、混合物の各々の成分が、クロマトグラフィーマトリックスから個々に溶出する。化合物の混合物の所定の成分を、さらなる分析又はクロマトグラフィーのために単離することは望ましいことであり得る。一部の場合において、目的の成分を、オンラインでの分光学的分析によって同定することができる。
【０２２２】
クロマトグラフィーカラムの溶出物を分画し、そして個々の分画物を保管するための様々なデバイスが広く知られている。本発明の１つの態様は、カラムのアレイからのクロマトグラフィー分画物を採取するためのシステムを特徴とする。カラムの溶出物を貫通穴の別のアレイに液滴をスポットすることができる。貫通穴のアレイがカラムのアレイに対して動く速度を制御することによって、各々の分画物の体積を制御することができる。流体の架橋を、貫通穴の内側表面が、溶出物と適切な親和性を有する物質で被覆されるならば、カラムのアレイからの出口キャピラリーと、貫通穴アレイにおける貫通穴との間で形成することができる。所定のカラムから採取することができる分画物の最大数は、各々の分画物のサイズ、貫通穴の捕集アレイが動かされる速度、及びカラムのアレイの密度に依存する。非常に多数の分画物を各々のカラムから集める場合は、カラムの線状アレイを使用することができ、この場合、その溶出液は貫通穴の二次元アレイにおいて集められる。その場合に、貫通穴の分画物捕集アレイが、カラムの線状アレイに対して直交して動かされるならば、採取できる分画物の数は、捕集アレイの物理的サイズによってのみ制限される。
【０２２３】
いくつかの適用については、単一のクロマトグラフィー分離は、完了するまでに数分以上要することがある。長い時間が必要な場合、分画物捕集デバイスにおける貫通穴のアレイからの液体の蒸発が生じる可能性がある。分画物捕集デバイスにおける貫通穴からの蒸発損失を避けるために、分画物を集めるために使用される貫通穴のアレイ全体を、環境制御された囲いの中に入れることができる。高湿度環境が囲いの中で維持されるならば、蒸発損失を最小限に抑えることができる。加えて、特定の温度（例えば、４℃）を囲いの中で維持して、化合物の安定性を維持することは望ましいことであり得る。カラムのアレイからの溶出キャピラリーを、カラムのアレイからの溶出物の導入を可能にしながら、囲いの一体性を維持するために、一連の精密加工された穴を介して囲いの中に入れることができる。エラストマーガスケットを、囲いの周りでの良好なシールを確保するために使用することができる。
【０２２４】
カラムのアレイから採取された分画物を含有する貫通穴のアレイは、化学反応を開始させるための第２の混合操作を開始するために、貫通穴の別のアレイと共に積み重ねることができる。第２のクロマトグラフィー適用を、分画物が採取された貫通穴のアレイをカラムの第２のアレイと共に積み重ねることによって開始することができる。あるいは、さらなる分光学的分析又は分光分析をこの時、採取された分画物に対して行うことができる。
【０２２５】
貫通穴のアレイにおける化合物の分光分析
大気圧イオン化質量分析（ＡＰＩ−ＭＳ）
貫通穴のアレイにおけるサンプルを、大気圧イオン化質量分析（ＡＰＩ−ＭＳ）のような分光分析技術によって分析することができる。分光分析は、一般的には連続的に行われる。従って、チップは、蒸発によるサンプルの損失を避けるために、制御された温度及び湿度の環境において環境的に隔離されなければならない。ＡＰＩ−ＭＳにおいて、サンプルを質量分析計に導入するための１つの簡便な方法は、選択されたサンプルを、（例えば、本明細書中に記載されるように）ある長さのキャピラリーチューブを使用して、特定の貫通穴からバルブの中に直接に吸引することを特徴とする。その場合、一定体積のサンプルを、標準的なＡＰＩ−ＭＳプロトコルを用いて質量分析計に導入することができる。
【０２２６】
マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ）
ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ分析において、目的のサンプルは一般に、１つ又はそれ以上のマトリックス形成化合物と混合される。一般的に、有機マトリックス物質（例えば、ヒドロキシケイ皮酸の誘導体）の飽和溶液が、等体積のサンプルと混合される。ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳのいくつかの適用では、有機マトリックス化合物が無機のナノ粒子（例えば、コロイド状金、量子ドット又は多孔性シリカ）によって置き換えられる。その後、混合物は、平坦なプレートでの通常のアドレス指定可能なアレイの形態でスポットされ、完全に蒸発させられる。その後、サンプルプレートが質量分析計に置かれ、サンプルがパルスレーザーからの照射によってイオン化される。
【０２２７】
貫通穴のアレイにおけるサンプルは、必要なサンプル調製工程を並行様式で容易に行うことができるので、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ及び関連する適用を用いて分析するために十分に適する。例えば、貫通穴の第２のアレイに、有機マトリックスの飽和溶液又は無機マトリックス化合物のスラリーを負荷することができる。貫通穴のアレイは、均一に浸漬負荷され得るか、又は所望されるならば、任意の数の異なるマトリックス化合物を、個々の貫通穴にアドレス指定可能な様式で負荷することができる。貫通穴のサンプル及びマトリックスアレイは、チップを（例えば、本明細書中に記載されるように）一緒にすることによって一緒に混合することができる。溶媒を完全に蒸発させた後、貫通穴のアレイを、市販のＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量分光計の殆どでわずかに修飾された容器に設置することができる。従来の平坦な金属ＭＡＬＤＩプレートを、貫通穴のアレイの厚さに補正するために加工することができる。貫通穴のアレイを、標準的なサンプルホルダーの凹んだ部分の内部に一時的な接着剤により取り付けることができる。
【０２２８】
ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量分光計におけるサンプルイオン化のために使用されるレーザーは、サンプルイオン化のための必要な放射照度を提供するために貫通穴内に収束させることができる。貫通穴内でのレーザービームの内部反射は、マトリックスによって吸収され、サンプルに移行するレーザーエネルギーの量をおそらく増大させることができ、従って、サンプルイオン化の量を増大させる。加えて、貫通穴のアレイは、非常に高密度のサンプルが、サンプル間の混合を伴うことなく、小さいフットプリントにおいて空間的に位置することを可能にすることができる。
【０２２９】
一般的なＭＡＬＤＩ−ＭＳサンプルプレートは、サンプルがスポットされる固体表面である。サンプルをイオン化するために使用されるレーザーは、サンプルプレートがレーザーエネルギーに対して不透明であるので、質量分析計の飛行チューブの入口と同じ側のプレートになければならない。貫通穴のアレイをサンプルプレートとして使用すると、レーザー照射源及びＴＯＦ質量分析計への入口を、サンプルプレートの反対面に位置させることができる。この線状ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量分析計のスキームが、図１５に示される。サンプルプレートの位置を飛行チューブの入口の前で変えることにより、選択されたサンプルのレーザーイオン化が可能になる。
【０２３０】
あるいは、貫通穴のアレイに嵌合するように精密加工されたポスト又はピンのアレイは、アレイをバルクマトリックス溶液に浸けることによってＭＡＬＤＩマトリックス物質で被覆することができる。溶媒が蒸発した後、ピンアレイを貫通穴アレイに挿入することができる。各々の貫通穴に含有される流体が、その対応するピン表面に移される。溶媒が蒸発した後、ピンアレイをＴＯＦ質量分析計への入力部に置き、そしてピンに収束レーザービームを逐次的に照射することができる。そのようなピンアレイにおいて、各々の貫通穴からのサンプルの一部を、各々のピンの間における空気のすき間によってその隣から隔離したままにすることができる。
【０２３１】
貫通穴アレイ／表面方法
電場の中に置かれるか又は圧力により動かされる場合、貫通穴アレイは、並列キャピラリー電気泳動、界面動電クロマトグラフィー又はクロマトグラフィーのデバイスとして使用することができる。１つの貫通穴アレイにおけるアレイのサンプルを、第２の、一般的にはより長い貫通穴アレイに導入することができる。第２の貫通穴アレイは、ゲル（例えば、シリカ）、ポリマー（例えば、ポリアクリルアミド）又は樹脂により満たすことができ、そして電気浸透又はタンパク質結合を防止若しくは強化するために、その壁を被覆することができる。しかしながら、電気泳動又はクロマトグラフィーがそのようなアレイで実施されるならば、各々のカラムの産出物を、分子がカラムから現れるときに分析することは困難である。この問題を軽減するための１つの方法は、分析物の分子に親和性を有する移動する表面（例えば、ニトロセルロースシート）に産出物を通し、その後その膜を画像化検出器に移動させることである。例えば、蛍光標識されたＤＮＡ又はタンパク質を、移動するニトロセルロース膜の上に溶出させ、そして分析するために蛍光画像化装置に通すことができる。連続して移動する表面は、テープの様式で移動する場合、サンプルのスミアリングを引き起すであろう。従って、表面が移動しているような期間に、電場の極性若しくは圧力を低下させるか、又は電場の極性又は圧力を反転させることが好都合である。検出システムの感度の増大は、検出器が画像を取得している間に、表面の運動を遅らせること及び電圧又は圧力によって達成することができる。あるいは、画像化装置は、ラインスキャナー（例えば、蛍光レーザーラインスキャナーなど）が可能である。表面は、所望されるならば、（例えば、テープ様の様式で）長いスプールから供給することができる。表面はさらに、第２のスプールで巻き取ることができる。
【０２３２】
読み取り方法
貫通穴の壁に対する化学的結合を検出するためにアレイの湿潤性を使用する方法
２つのタンパク質の間の結合（例えば、抗体と抗原との間における結合など）が、流路内部の表面エネルギーに対するその影響により検出される。
【０２３３】
１つの好ましい態様において、ライブラリー（例えば、抗体、受容体、高分子又は分子プローブのライブラリー）が、親水性の流路壁及び疎水性の面を有する貫通穴アレイの内壁に結合させられる。アレイは、流路壁における非特異的なタンパク質吸収部位に結合するが、壁表面の親水性を変化させない、ブロッキング剤ですすがれる。そのようなブロッキング剤には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、粉乳及びゼラチンが含まれる。その後、アレイは、抗原を含有する溶液に沈められ、抗原が相補的な抗体に結合することを可能にするために十分な時間インキュベーションされる。その後、アレイは、抗原溶液から取り出され、緩衝液で洗浄される。アレイは乾燥され、発色団又は蛍光団を含有する水溶液に浸けられる。表面における抗原の存在により、表面エネルギーが十分に低下し、液体が貫通穴の中に入ることが妨げられる。空の貫通穴は、アレイを画像化することによって同定することができる。その場合、空の貫通穴は、リガンドと効果的に結合するライブラリー内の抗体に対応する。
【０２３４】
別の態様において、１組の小さいアレイデバイス（各々が、約１個〜１００個の貫通穴を有する）の内壁が、各々のアレイが異なる抗体を有するように被覆される。アレイが抗原の溶液に一緒に入れられ、抗原が相補的な抗体に結合することができるように十分な時間インキュベーションされる。その後、アレイは、抗原溶液から取り出され、緩衝液で洗浄される。その後、全てのアレイが、タンパク質に対して非破壊的であり、かつ何らかの様式で（例えば、より高密度の液体を加えることによって、又は増粘剤を加えることによって）密度を調節することができる液体を含有する分離浴槽に一緒に入れられる。
【０２３５】
穴が空のままである場合、浴槽中のアレイの密度は低下し、そして適切な条件のもとで、結合した抗原を含有するアレイは、表面に浮くことができる。表面における抗原の存在により、表面エネルギーが十分に低下し、液体が貫通穴の中に入ることが妨げられる。このような浮遊するアレイが取り出され、各々のアレイに結合した抗体の同定が、質量分析によって、各々のアレイにおけるコードから、又は何らかの他の手段（例えば、アレイに組み込まれたバーコード又は無線トランスポンダーなど）によって決定される。この方法のために、アレイは、多孔性の構造体（例えば、エアロゲル又は多孔性ビーズなど）であることが可能である。
【０２３６】
貫通穴のアレイを質量分析によって分析するためのデバイス
サンプル又はサンプルのアリコートは、いくつかの異なる方法の１つによって、質量分析による分析のために貫通穴のアレイから取り出すことができる。そのような方法の一つは、サンプル又はそのアリコートを減圧の適用によりチューブに引き入れることを特徴とする。この方法の一例では、シリンジの先端が、アレイにおける選択された貫通穴に挿入され、一定量のサンプルがシリンジの中に引き込まれる。あるいは、真空を使用して、サンプルを、チューブの長さ部、バルブ又は保管用容器に吸引することができる。
【０２３７】
特定の適用に関して、貫通穴のアレイの各々のサンプルを、連続プロセス（例えば、質量分析など）によってアッセイすることは望ましいことである。連続プロセスを貫通穴のアレイの非常に多数のサンプルに適用することは、非常に迅速に行われたとしても、長い時間を依然として必要とする。湿度条件及び温度がこの期間中に厳密に調節されないならば、貫通穴からのサンプルの蒸発が生じる可能性があり、アッセイ結果を不自然に偏らせる。
【０２３８】
貫通穴のアレイからの個々のサンプルの蒸発を制御しかつ吸引を容易にするための１つの方法は、貫通穴の各々がアッセイにおけるサンプル貫通穴と一緒に位置決めされる貫通穴の追加のアレイを設計することである。貫通穴のこの追加のアレイは、上部プレートを作製するために、アッセイで使用される貫通穴のアレイの上部に設置することができる。この上部プレートにおける貫通穴は、各々の貫通穴の直径が、アッセイで使用される貫通穴のアレイと接触する表面における直径よりも、外側表面においてはるかに大きくすることができるように設計することができる。そのような貫通穴によって形成される円錐形状は、シリンジの針を選択された貫通穴に入れるためのガイドとして作用し、また、効率的なサンプリングを容易にする。この上部プレートの外側表面はまた、積層化で使用されるポリマーと同様なポリマーの薄いフィルムで被覆することができる。シールされた表面は、蒸発を遅らせるように作用する。サンプルを貫通穴から吸引するために使用されるシリンジの針は、この薄いフィルムに容易に穴を開けることができ、効率的なサンプリングを妨害しない。
【０２３９】
サンプルがシリンジの中に吸引されると、サンプルを、当業者に既知の多くの技術のいずれか１つによる分析のために質量分析計に送達することができる。これらには、大気圧イオン化技術（例えば、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）又は大気圧化学的イオン化（ＡＰＣＩ）など）が含まれる。
【０２４０】
本発明の別の態様において、金属プレートを貫通穴のアレイのための底部プレートとして使用することができる。アッセイで使用される溶媒を蒸発させることができ、そして固体サンプルを、貫通穴の内径に対応する底部プレートにフットプリントで形成させることができる。所望されるならば、マトリックスを、完全に蒸発しないうちにサンプルに加えることができる。あるいは、マトリックスを、金属底部プレートが、アッセイで使用される貫通穴のアレイと共に積み重ねられる前に、金属底部プレートの表面に加えることができる。サンプルが完全に蒸発すると、金属底部プレートを貫通穴のアレイから取り外すことができ、各々のサンプルを、当業者によって一般に実施されるマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析又は同様な表面型イオン化質量分析技術によって分析することができる。
【０２４１】
本発明の別の態様において、貫通穴のアレイと一緒に位置決めされたピンのアレイを、貫通穴のアレイの中に浸け、取り出すことができる。貫通穴のアレイにより残留物として取り出されるサンプルを、ピンのアレイの先端で蒸発させることができる。前述の態様のように、蒸発後のこのサンプルは、表面型質量分析法に使用することができる。
【０２４２】
貫通穴アレイの時間ゲート型蛍光画像化
多くの生物学的アッセイは、貫通穴のアレイから蛍光画像化によって取得することができる蛍光読み取り値を与えるように構成される。一般的に、励起ランプ又はレーザーからの光は、励起フィルターを通過し、アレイを通過し、放射フィルターを通過し、その後ＣＣＤカメラに至る。多くの場合において、シグナルの感度が、フィルターの不完全な性能に起因するバックグラウンド光によって、また、サンプル及び光学的要素による光の非弾性散乱及び弾性散乱によって制限される。目的の蛍光団が、約１ｎｓ〜１ｍｓの蛍光寿命を有することから見れば、散乱ははるかにより短い時間スケールで生じる。従って、バックグラウンド光の除去を、時間ゲート化の技術によって達成することができる。時間ゲート化は、カメラがデータを取得することを防止しながら、サンプルを照射し、迅速に励起光を除き、その後、蛍光放射画像を取得する前に一定の遅延時間を待つプロセスである。励起後の最初の１ｐｓ〜１００ｐｓの期間中に放射された光子を集めないことによって、バックグラウンドノイズが著しく減少し、シグナル対ノイズが改善される。同様な装置を、様々な遅延時間によるデータ取得を繰り返すために使用することができ、従って、アレイにおける貫通穴の各々についての蛍光寿命情報がもたらされる。
【０２４３】
様々な方策を、時間ゲート型蛍光画像化システムを構築するために用いることができる。パルス型励起源が必要とされ、閃光ランプ又はレーザーのいずれでも可能である（例えば、受動若しくは能動モードロックレーザー又はＱスイッチ型レーザーなど）。レーザーが使用されるならば、ビームエクスパンダー及びビームディヒューザープレートにより、プラテンの均一な照射が得られる。連続励起源もまた、光を迅速に遮断及び非遮断するための手段（例えば、電気光学的セル、音響光学的セル、又はスリットを有する高速回転ディスクなど）と共に使用することができる。パルス発生器を、照射光源及び検出器を所定の遅延で駆動させるために使用することができる。ＣＣＤカメラは、電子的にシャッター開閉が可能であるか、又は励起パルス発生と位相が一致しない、スリットを有する回転ディスクによる物理的なシャッター開閉が可能である。
【０２４４】
光学的な共鳴器又は干渉計への貫通穴アレイの挿入に基づいた光学的読み取り
貫通穴アレイは、各々の貫通穴に含有される物質と光場との同時かつ並行する相互作用のための光学的共鳴器又は光学的干渉計のいずれかに挿入することができる（図２１を参照されたい）。そのような方法は、貫通穴アレイ（２）が、吸収（５）を増大させるために、光路長を貫通穴アレイの長さよりも増大させるように、光学的共鳴器に設置される場合（照射（１）が照らし、ミラー（２）とミラー（３）との間で増幅される）には、好都合であり得る。光路長が、光学的吸収を増大させるために、素通り長さの倍数として増やされる。例えば、化学反応を同時に開始させるには、光学的共鳴器に特徴的な増強された光場によって実施する。それはまた、例えば、入射光場強度、位相、偏光若しくは振動数の変化を記録することによって、又は貫通穴に含有される物質と入射光場との間での相互作用の結果（例えば、蛍光、リン光）若しくは物質そのものにおける変化（例えば、ルミネセンス）として放射される光のこれらのパラメーターを記録することによって、貫通穴に含有される物質間の相互作用を同時に分析するための手段として好都合であり得る。
【０２４５】
チップを光学的共鳴器の一部として用いてこれらのパラメーターを測定することの１つの利点は、共鳴器構造体に含有される光場が、各々の貫通穴に含有される物質と相互作用した場合、共鳴器の共鳴条件が変化することである。これらの変化（例えば、位相、強度、偏光、振動数）は、貫通穴に含有される物質の組成及び物理的状態に密接に関連づけられる。光場パラメーターの変化は、空洞の共鳴条件を変化させ、このことは、結果として、共鳴器を通過した光、又は共鳴器から反射された光の強度を変化させる。
【０２４６】
光学的共鳴構造体に特徴的な増大した光場強度もまた、例えば、貫通穴に含有される物質の特性を測定するためのプローブとして、光化学反応又は非線形の光学的作用（多光子吸収、高調波変換など）を開始させるために活用することができる。共鳴器に入射する光場は、時間において連続的であるか、又は光パルスのように時間とともに変化してもよい。
【０２４７】
この態様において使用することができる光学的共鳴器構造体の例には、２つの平面ミラーを有するファブリー・ペロー型（Fabry-Perot-style）干渉計、及び２つの湾曲したミラーを有するか又は１つの平面ミラー及び１つの湾曲したミラーを有する共焦点ファブリー・ペロー型干渉計が含まれる。
【０２４８】
貫通穴アレイは、二ビーム干渉計の一部であってもよいか、又は二ビーム干渉計の中に挿入することができる。そのような干渉計の例は多く、これらには、マイケルソン（Michelson）型干渉計、トワイマン・グリーン（Twyman-Green）型干渉計、サニャック（Sagnac）型干渉計及びマッハ・ツェンダー型（Mach-Zhender-type）干渉計が含まれる。アレイが二ビーム干渉計の光路の一方に挿入される態様において、光の位相は、波長の関数として複素屈折率（屈折率及び吸収）に従って遅れる。干渉計は、貫通穴アレイもまた照射するのに十分な幅の白色光のビームで照射することができる。干渉計の２つのアームの間での各々の光路長差のために、干渉計の出口におけるカメラは、干渉計から出る、アレイにおける各々の穴を通過している光に対応する光のパターンを記録することができる。従って、一連の画像を各々の光路長差について取得することができ、画像の各々の画素のフーリエ変換を光路長の関数として取ることにより、アレイの各々の貫通穴における物質についての光学的な吸収又は放射スペクトルを作製することができる。
【０２４９】
別の態様では、貫通穴アレイを通過した光又は貫通穴アレイから放射された光を分析するために、二ビーム干渉計が使用される。カメラにより、干渉計を構成する２つの平面ミラーの間に課せられた各々の光路長差についての干渉計からの光パターンが記録される。各々の光路長差に対応する一連の画像を記録した後、個々のインターフェログラムを、画像列全体で一緒に位置決めされた画素の各々のセットから作製することができる。フーリエ変換を各々のインターフェログラムに適用することにより、画像内での各々の空間的位置における吸収又は放射スペクトルを作製することができる。このようにして、アレイの各々の貫通穴に含有される物質と相互作用する光の分光学的内容を測定することができる。
【０２５０】
全領域画像化に適合する米国特許第６，０８８，１００号（これは、その全体が参考として本明細書中に組み込まれる）に記載される方法の適用はまた、貫通穴アレイの積み重ね物における各々の貫通穴からの吸収の分光学的情報を捉えることを可能にする。
【０２５１】
熱的摂動の関数としてのアレイの画像中心
本発明は、化学的プローブのアレイの出力を検出するために、多くのシステムとの適合性を有している。市販の蛍光スキャナーを、所望されるならば、使用することができる。アレイにおける各々の位置は、２つの開口部（すなわち、プラテンの上部面及び底部面に）を有するので、アレイは、プラテンの一方の面で電磁放射線に曝すことができ、アレイのサンプルの光学的特性を、プラテンの反対側の面での検出によって測定することができる。アレイの位置を並行して、又は連続走査技術によって画像化することができる。反応の静的分析及び動的分析の両方を利用することができる。
【０２５２】
分析物と貫通穴の壁において固定化されたプローブとの間の結合を検出する１つの方法では、摂動の関数として各々の貫通穴の内部における分析物の分布を観察することが含まれる。例えば、目的のリガンドは、２平方ｃｍのプラテンにおいて１０，０００個の貫通穴の各々の内壁に共有結合により結合することができる。その後、チップは、例えば、ライブラリーの各々の構成成分がそれ自身の貫通穴を占め、かつ蛍光性タグを有するように、ペプチドライブラリーを含有する別のチップと共に積み重ねることができる。非共有結合性の結合反応が平衡に達するのに十分な時間を経過した後、チップを、結合していない物質を除くために緩衝液ですすぐことができる。各々の穴における蛍光分布を摂動（例えば、温度を上げること、又はホルムアミド濃度を上げることなど）の関数として観察することによって、ライブラリーの構成成分を結合エネルギーに関してランク付けすることができる。結合速度は、蛍光分布を迅速な摂動（例えば、温度上昇など）の後の時間の関数として追跡することによって測定することができる。アッセイの感度は、マスクを使用することによって改善することができるが、このマスクは、チップに対して相補的な、しかし、より小さい直径の貫通穴のアレイを含み、そして各々の貫通穴の内部のみが観察されるように光を空間的にフィルター処理する。シグナル対ノイズ比を増大させる別の方法には、周期的又は確率論的な摂動（例えば、温度など）を加え、その後、その摂動と相関するシグナルのみを観察することが含まれる。
【０２５３】
薬剤の発見において、一般的になりつつある技術が、細胞集団のミリ秒の時間スケールでの蛍光分析である。既存の市販デバイスでは、試薬を、薬剤候補物を含有する１つの３８４ウエルマイクロプレートから、カルシウムの蛍光指示剤（例えば、Ｆｕｒａ−２など）が負荷された細胞を含有する第２の３８４ウエルマイクロプレートに加える、シリンジの列が利用され、その後、第２のプレートの下側が、細胞の小胞体からのカルシウム放出のミリ秒での速度論的測定を得るためにレーザー走査される。そのような速度論的データを、より低コストで、また励起波長のより大きい選択で取得するために、白色光の励起源及びデジタルカメラを使用することが、好都合である。これは、シリンジ列がそのようなシステムにおいて光路を妨害したり、またミリ秒の時間スケールで動かさなければならないために、従来は困難であった。白色光源の使用が、貫通穴のアレイに保管されたサンプルに第２のアレイで増殖している細胞を混合するのを開始することによって可能である（この場合、両方のアレイがカメラシステムの中にある）。この方法のさらなる利点が、集められたサンプルの処理能が、２０，０００個又はそれ以上の多くのサンプルを含有する貫通穴アレイの使用によって、大幅に増大することである。一般的には、このシステムは、自動化され、混合時に開始してデータを集めるか、又はそうでない場合には、採取されたデータ点に関連する時間を積み重ねて指標化する。この方法により可能となるアッセイのタイプには、細胞又は蛍光アッセイがあるが、これらに限定されず、分未満の時間スケールで行われる光学的読み取りを伴うアッセイの何れも、本発明から恩恵を受けることができる。
【０２５４】
本発明の好ましい態様は、貫通穴アレイを含有する、少なくとも２つの積み重ねられ、そして一緒に位置調整されたプラテンを含み、（ｉ）検出デバイス、（ｉｉ）プラテンを検出デバイスの中に導入するための手段、（ｉｉｉ）流体が、一緒に位置決めされた貫通穴の少なくともいくつかとの間で通じるように、プラテンを位置決めするための手段、及び（ｉｖ）貫通穴の少なくともいくつかにおいて、同時に試薬の混合を開始させるために、プラテンを接触させる手段からなる。検出デバイス（図２４）は、照射のための光学的フィルター及び光源を有する画像化デバイス（例えば、ＣＣＤカメラなど）であることが可能である。光源（１）からの光は、柔軟な二叉に分かれた繊維束（２）を通った後、放物面のコリメート化ミラー（３）を照射する。その後、光は、アレイの貫通穴を通り抜けた光線がカメラレンズ（５）の中に入らないように、傾斜した角でアレイの積み重ね物を照射する。この光学的配置は、光学的感度を上げるために光学的バックグラウンドを低下させるための簡便な手段として望ましい。
【０２５５】
分離方法
液体で満たされた２つ又はそれ以上のアレイの積み重ね物を分離する方法
個々の貫通穴の内容物が積み重ねによって一緒にされると、アレイを分離することは望ましいことであり得る。例えば、２倍ずつの希釈を行うために、化学的ライブラリーで満たされたアレイが、溶媒緩衝液を含有するアレイに積み重ねられる。２つの液体の混合のための十分な時間（１００ｎｌについては約１５秒）が経過した後、プレートは、ライブラリー構成成分が初期濃度の半分である２つの同一のアレイを作製するために分離される。このプロセスを、希釈系列を作製するために繰り返すことができる。
【０２５６】
２つの貫通穴アレイが、それらの内容物が混合するように積み重ねられるとき、２つのプレートは、隣の貫通穴との相互混入を伴うことなく、容易には分離されない。一方のプレートを流体の多数の微視的カラムによって生じる付加的な表面張力に対抗して引くことにより、チップが分離されるとき、個々の貫通穴の内容物を一緒に混合する剪断力が一定して導入される。
【０２５７】
１つの方法では、各々の流体カラムを、小さい蒸気相により分離されるより短いカラムに分離することが提案される。２つの積み重ねられたアレイの間での境界における小さい電極は、小さい体積の気体を各々の貫通穴において生じさせる。泡が成長するにつれ、泡は液体の蒸気境界を２つのアレイの間で再形成する。各々のカラムが２つに割れた後、アレイは機械的に分離される。
【０２５８】
あるいは、不活性な湿った気体が、積み重ねられたアレイの上方及び／又は下方の雰囲気に導入され、２つの積み重ねられたアレイの間における境界で核化する。
【０２５９】
あるいは、気体を、非常に細かい中空チューブの一致するアレイを介して各々の中心に送り込むことができる。
【０２６０】
貫通穴のアレイを遠心分離する（アレイにおいて重力分離を行う）こと
多くの生物学的又は化学的アッセイでは、サンプルの遠心分離及び／又はろ過が必要とされる。多くの場合、貫通穴のアレイで行われる生物学的又は化学的アッセイにおいて、サンプルをろ過又は遠心分離することは望ましいことであり得る。下記の発明は、貫通穴のアレイの遠心分離及び／又はろ過のためのデバイスに関する。
【０２６１】
貫通穴のアレイよりも大きい２つの平坦な表面を有する金属ジグを組み立てることができる。貫通穴のアレイの１つ又は積み重ね物が、２つの平坦な表面の間に設置され、力を金属プレートに加えることにより一緒に一様に押しつけられる。金属ジグは、押しつけの量が、好ましくは、ジグを一緒に保持するいくつかのネジを単に締めることによって所望通りに調節され得るように加工される。
【０２６２】
いくつかの適用において、ろ液又はペレットを、遠心分離されたサンプルから回収する必要がある。他の場合には、遠心分離後に形成されたペレットを取り出す必要がある。このための簡便な解決策は、貫通穴のアレイに対して一緒に位置決めされる、一定体積のウエル又はくぼみのアレイを含有するプレートを加工することである。貫通穴のアレイを、一緒に位置決めされたウエルを有するこの底部プレートの上に積み重ねることができる。所望されるならば、フィルターを、底部プレートと、貫通穴のアレイとの間に設置することができる。遠心分離が完了した後、底部プレートを取り外すことができ、ろ液又は混入している沈殿物を取り出すことができる。あるいは、上清が所望の画分であるならば、上清を貫通穴のアレイから直接に吸引することができ、底部プレートを取り外す必要がない。
【０２６３】
特定の適用において、大きい遠心力が、貫通穴のアレイに加えるために必要とされ得る。底部プレート及び／又はフィルターでも、大きな遠心力を貫通穴のアレイの積み重ね物に適用すると、貫通穴のアレイの個々の層の間の空間に力がかかり、サンプルの横方向の移動が生じることになる。貫通穴のアレイの接触面を疎水性の物質により被覆することにより、比較的低い遠心力での層間の横方向の拡散が妨げられる。高いレベルの遠心力が必要される場合、貫通穴のアレイが金属ジグによって一緒に押しつけられると、漏れのないシールが２つの貫通穴アレイの間で形成されるように、貫通穴の各々の個々のアレイの内部において物質を積み重ねることができる。そのようなシールを形成するために使用される物質が多孔性であるならば、貫通穴の層の間での液体の流れは妨げられず、それにもかかわらず、横方向の流れに対する堅固なシールが形成される。
【０２６４】
ＶＩ．その他の使用
ナノリットル体積の流体取り扱いによって提供される試薬体積の節約及び増大した処理能の潜在的可能性を完全に実現するために、化学的及び生物学的サンプルを小さい体積に高密度で保管する手段及び方法が必要である。このような保管システムは、マイクロ流体のスクリーニング器具類によって容易に利用されなければならない。
【０２６５】
本発明の一態様は、化学的及び生物学的サンプルを高密度及び小さい体積で保管するための方法を提供する。加えて、本発明のデバイス及び方法を用いて保管されたサンプルは、最小限の液体取り扱い工程又は他の操作によりアッセイすることができる。この方法では、溶媒に溶解された小さい体積の化合物を貫通穴のアレイに入れ、第２の溶媒を、貫通穴から外への化合物の実質的な移動をさせることなく、貫通穴のアレイに加えることが含まれる。その結果、アレイの化合物は第２の溶媒から主に構成される液体に溶解されることになる。
【０２６６】
本発明はさらに、サンプルがアッセイを行うために水性媒体に容易に導入されることができる様式で、化合物を保管する方法を提供する。この工程では、溶媒が分注される容器の体積よりもはるかに小さい溶媒中の化合物の一定体積を分注すること、しばらくの間保管すること、及び水性媒体をアッセイのための調製で容器の残り体積を満たすように加えることが含まれる。
【０２６７】
好ましい態様において、小さい体積の化合物ライブラリーの保存及びスクリーニングの一体化では、下記の工程が含まれる：（１）スクリーニングのために使用される容器の総体積よりも小さい、非水性溶媒に溶解された化合物の一定体積を分注すること。通常、分注される体積は、容器の総容量の半分未満であり、容器の総容量の１／１０、１／４０又はそれ未満とすることができる。通常、容器は、容器のアレイの一部である。容器は、好ましくは、貫通穴アレイの流路のような疎水性部分によって囲まれた親水性部分であるか、又は疎水性部分のスポットが親水性のバックグラウンドに存在するスライドガラスにおけるスポットである。（２）化合物を、しばらくの間保管すること。保管条件は、低い温度（例えば、４℃、−２０℃、−８０℃、液体窒素に沈めること、又はより低い温度など）からなっていてもよい。乾燥が、通常の場合には望ましい。（３）化合物を保管状態から取り出し、化合物の凝固点以上でなく、容器に負荷される水性媒体の凝固点よりも高く昇温すること。（４）水性媒体を容器に加えること。好ましくは、水性媒体は、その凝固点よりも高く、かつ非水性媒体の凝固点よりも低く冷却される。添加を分注器によって行うことができるが、添加は、容器を水性媒体の浴槽に浸けることによってより迅速かつ安価に行われる。水性媒体中への化合物の損失を最小限に抑えるように、また隣接流路又は付近の流路における化合物の連絡を防止するように、非水性溶媒が固体形態であることが好都合である。（５）化合物と水性媒体との混合を可能にするために十分な時間を待つこと。そして（６）サンプルに対するアッセイ又は測定を行うこと。
【０２６８】
小さい体積を大きい穴に分注するための方法
試薬を節約し、そして処理能を増大させるために、薬剤候補物のようなサンプルを非常に小さい体積でスクリーニングすることは好都合である。一般的な貫通穴アレイ形式は、６０ｎｌの流体を保持する流路を有しており、一般的なアッセイが、合計で１２０ｎｌを保持する２つの積み重ねられたチップを用いて行われる。アッセイにおいて許容されるＤＭＳＯの最大濃度が２％であるならば、合計で２．４ｎｌが流路の１つに分注されなければならず、これは、従来の液体取り扱いシステムにより行うことが極めて困難である。この問題を解決するための１つの方法が、化合物を揮発性溶媒（エタノール、ＤＭＳＯ、水など）に溶解し、化合物を分注し、溶媒を蒸発させ、これにより、乾燥した化合物のスポットを容器に残すことである。これは、化合物が、容易に再溶解しない形態に結晶化することがあり、また十分に固定化されないという点で、いくつかの大きな欠点を有する。別の方法が、ＤＭＳＯのような揮発性溶媒の化合物を分注し、ＤＭＳＯを蒸発させて、所望の化合物をより少ない体積のＤＭＳＯにおいて残すことである。この場合、溶媒を一様に蒸発させることが困難であるかもしれず、このために、サンプルに対して行われるアッセイが妨げられるかもしれない。
【０２６９】
より確実な方法が、化合物を、第１の揮発性溶媒（例えば、ＤＭＳＯなど）及び第２のより揮発性の溶媒（例えば、エタノール又はメタノールなど）に溶解し、混合物を容器に分注し、第２の溶媒を蒸発させ、これにより、第１の溶媒に溶解された化合物を残すことである。他の溶媒を使用することもできるが、エタノール及びメタノールは、これらがほとんどの薬剤様化合物を溶解し、また疎水性バリアによって囲まれた親水性容器に含有されたままにするために十分に親水性であるので、好適な選択である。ＤＭＳＯは、これがほとんどの化合物を溶解し、その親水性のためにその場所に留まり、またあまり揮発性でなく、そのため水よりもゆっくり蒸発するので、第１の溶媒として使用される好適な溶媒である。
【０２７０】
本発明はまた、化合物を疎水性バリアによって隔てられたサブマイクロリットル容器のアレイにおいて乾燥状態で保存するための方法を特徴とする。化合物が揮発性溶媒又は混合溶媒に溶解され、容器のアレイに導入され、そして固体化合物の薄いフィルムが残るように溶媒が乾燥させられる。必要ならば、生体適合性の接着剤が、容器の壁に付着したフィルムを保つために加えられる。第１の揮発性溶媒及び第２のそれほど揮発性でない溶媒を含有する混合溶媒が、アレイにおける容器の実質的に全てに加えられる。好ましい態様では、混合溶媒は、エタノールのようなアルコール及びＤＭＳＯを含む。より揮発性の溶媒が蒸発させられ、これにより、アレイにおける化合物の少なくともほとんどを溶解するそれほど揮発性でない溶媒の残渣が残る。一般的には、それほど揮発性でない溶媒は、混合溶媒の小さい割合を構成し、通常では混合溶媒の２０％未満であり、多くの場合には混合溶媒の５％未満である。その後、アレイが、アッセイとの適合性を有する水性媒体（例えば、水又は緩衝液など）を導入することによって、アッセイのために調製される。水性媒体を、上記の方法によって分注することができる。
（実施例）
【０２７１】
本発明はさらに下記の実施例において記載されるが、下記の実施例は、特許請求の範囲において記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【０２７２】
［実施例１］
ＤＮＡプローブアレイ
５０，０００流路の貫通穴アレイを、ケイ素から製造する。遺伝子データベースを用いて、８０個の空間的フィルターの上部マスクのシリーズを、別の８０個の同一底部マスクと共に製造する。アレイを位置合わせして、遊離官能基の被覆を貫通穴の内側表面に施すために、３−グリシドオキシプロピルトリメトキシシランにより誘導体化する。
【０２７３】
１０個の被覆されたプラテンの積み重ね物を整列させる。アライメントを、様々な流路の光学的透過性を観測することによって確認する。マスク＃１を、積み重ね物の上と位置調整し、同一のマスクを同じ配向で、積み重ね物の底部と位置調整する。マスク＃１は、最初の位置にアデノシンを有するデータベース内の遺伝子に対応する、マスク内の位置が開くように、そしてそれらのアドレス指定可能な位置の貫通穴を通しての流れを可能にするように構築する。積み重ね物を、乾燥アセトニトリルですすぐ。ホスホルアミダイトモノマーを、アセトニトリル及びテトラゾール中の０．１Ｍの濃度で、マスクに対して加圧した流れによって加える。カップリング反応を３分間進行させる。ヨウ素／ルチジン／アセトニトリル／水の酸化液をチップの積み重ね物に導入し、２分間インキュベーション、その後、アセトニトリル及びジクロロメタンですすぐ。チップを真空によって乾燥する。
【０２７４】
マスクを取り外し、Ｔモノマーが付加される位置に対応する、上部及び底部マスク＃２と交換する。脱保護剤を加え、Ｔカップリング反応を開始する。
【０２７５】
このプロセスを、最初の位置のＧに対するマスク＃３、そして最初の位置のＣに対するマスク＃４を用いて繰り返す。２番目の位置のＡに対応するマスク＃５等も、同様である。合成が完了した後、チップを、３０％アンモニアに１２時間保管する。
【０２７６】
アレイをテストするために、アレイにおける意図されたプローブの１つに対応するフルオレセイン末端標識された２０ｍｅｒを標準的な方法によって合成し、６×ＳＳＣ／０．５％のＳＤＳのハイブリダイゼーション溶液に溶解し、アレイの全ての貫通穴に同時に導入する。アレイを０．５×ＳＳＣにより洗浄し、チップを蛍光により画像化する。テストのオリゴヌクレオチドに対して相補的なプローブに対応するアレイ内の位置のみが、アレイの残りの位置からのシグナルを平均化して決定されたバックグラウンドレベルを、上回る蛍光強度で著しい増大を示す。
【０２７７】
［実施例２］
触媒スクリーニング
組換え酵素ライブラリーを、蛍光発生基質に対して貫通穴の高密度アレイにおいてスクリーニングする。ポリヒスチジンタグを有するプロテアーゼ・ズブチリシンの遺伝子を含有する遺伝子的に多様な大腸菌を、変異誘発によって作製する。細菌の希釈溶液を、１つの貫通穴当たり平均して１〜２個の細菌が存在するようにニッケル被覆アレイに加える。細菌を対数期に増殖させ、複製を（上記のように）作製する。アレイにおける細菌を、加熱によって溶解し、タグ化ズブチリシンをアレイのニッケル被覆壁に結合させる。蛍光発生基質及び反応緩衝液（Boehringer）を各々のウエルに含有する別のアレイを、第１のアレイと共に積み重ねる。積み重ね物を、ＣＣＤカメラベースの蛍光画像化システムに直ちに入れ、蛍光強度の増大速度を各々の貫通穴について測定する。最も速い速度を有する酵素を選択し、複製プレートにおける対応する細菌を更なる研究のために増殖させる。
【０２７８】
［実施例３］
ビーズを用いたハイスループットスクリーニング
直径１０ミクロンのビーズに光切断可能なリンカーを介して固定化された１００，０００成分のコンビナトリアルライブラリーを、Ａｆｆｙｍａｘから購入する。プラテンを、１個だけのビーズが各々の穴に嵌るような直径の１００，０００個の貫通穴を伴って調製する。ビーズをＰＢＳで洗浄し、スクリーニングされる酵素についての蛍光発生基質を含有する溶液に懸濁し、ゴムスパチュラによりプラテン上に広げる。紫外線ランプを使用して、ライブラリーの成分をビーズから脱結合する。反応緩衝液における酵素の溶液が満たされた第２のプラテンを位置調整し、第１のチップの上に積み重ねる。積み重ね物を落射蛍光によって直ちに画像化して、蛍光強度における増大速度を流路位置の関数として測定する。低下した酵素速度を示すそのような穴を、薬剤リード化合物として更なる分析のために選択する。
【０２７９】
［実施例４］
吸収アッセイ
ＣａＣｏ−２細胞の単細胞層を、貫通穴のアレイよりもわずかに大きい、コラーゲンにより被覆された２つの同一の異方性膜において増殖させる。ＣａＣｏ−２細胞のインビトロでの増殖及び維持において使用される細胞培養条件、培地及び膜被覆物は、当業者によって広く知られている。細胞の均一な層が確立されると、各々の膜を、培養維持培地が浸漬負荷された貫通穴の２つの同一の貫通穴アレイの間に挟む。アレイ及び膜のアセンブリーを、ＣａＣｏ−２細胞が貫通穴において平衡化し、無傷の層を形成することを可能にするためにさらに１日培養する。ＣａＣｏ−２アレイと一緒に位置決めされた貫通穴を有する２つの追加のアレイに、小分子の化学的多様性ライブラリーを負荷する。ＣａＣｏ−２細胞を通過しないことが知られている化合物（例えば、マンニトール）が、ＣａＣｏ−２細胞単層の一体性を評価するための陰性対照として使用され、一方で、ＣａＣｏ−２細胞単層を容易に拡散して通過することが知られている化合物が、陽性対照として使用される。化学的ライブラリーを含有するアレイの１つを、先端から基部への吸収を評価するために、ＣｏＣａ−２細胞単層アレイの１つの先端側に積み重ね、一方で、第２の同一の化学的ライブラリーアレイを、基部から先端への吸収を評価するために、ＣｏＣａ−２細胞単層アレイの基部側に設置する。完成したアレイを、ライブラリー化合物の輸送又は浸透を可能にするように１時間インキュベーションする。化学的ライブラリーの経口による生物学的利用能が、ＣａＣｏ−２細胞単層を拡散して通過するライブラリー化合物の量を（例えば、質量分析によって）定量することによって評価される。
【０２８０】
［実施例５］
２−Ｄゲルからのブロッティングによるリガンドフィッシング
リガンドに対する親和性を示す細胞タンパク質を、２−Ｄゲルを使用して同定する。５００，０００個の貫通穴を有するプラテンを、ヒト上皮増殖因子受容体のセグメントを各々の貫通穴の内側に共有結合により連結するために誘導体化する。各々の穴に緩衝液を満たす。その後、ヒト細胞株の細胞抽出物を、プラテンのサイズと同様なサイズの２−Ｄゲルで分離し、その後、プラテンと位置調整する。その後、２−Ｄゲルにおけるタンパク質を、緩衝液をチップの上方に加え、チップを通過する液体を、チップをブロッターの上に置くことにより引き寄せることによってチップ上にブロットする。タンパク質をこのようしてチップから移し、上皮増殖因子受容体に対する親和性を有するタンパク質がチップに保持される。１００ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８）中の１Ｍのホルムアミドから構成される変性溶液を使用して、チップの内容物を質量分析法による分析のためにプラテンにブロットする。受容体に対して親和性を有するタンパク質を含有するそのような穴の場所、及びそのような穴に含有されるタンパク質の質量を使用して、結合性タンパク質の同定を決定する。これらのタンパク質は、ある特定のガン治療としてＥＧＦのシグナル伝達経路を遮断する薬剤の標的である可能性がある。
【０２８１】
［実施例６］
抗体についてのスクリーニング
５００，０００成分のコンビナトリアルペプチドライブラリーを、ペプチドが穴における無菌の細胞培養培地に溶解されるように、５００，０００個の貫通穴を含むプラテンに調製する。ライブラリーを、各々の貫通穴に存在するペプチドの同定が既知であるように調製する。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ細菌の薄い培養物を、各々の貫通穴が平均して１０個の細菌を細胞培養培地に受けるように調製する。細菌プラテンをペプチドライブラリープラテンと共に積み重ねて、混合され、その後、３０℃で５時間インキュベーションする。その後、積み重ねられたプラテンを光散乱測定によって画像化して、各々の貫通穴における細菌増殖の程度を測定する。
【０２８２】
増殖における９９％を越える低下を示す穴を同定し、対応するペプチドのより多い量を更なる分析のために合成する。
【０２８３】
［実施例７］
放射能標識によるキナーゼのペプチド標的を見出すこと
プロテインキナーゼであることが疑われるタンパク質を、単離する。このタンパク質を、１００，０００個の異なるタンパク質（全てが、貫通穴を有するプラテンにおいて特有の位置を占める）の存在下、放射能標識されたＡＴＰ基質とインキュベーションする。十分な時間（例えば、約２０分）のインキュベーションの後、貫通穴を含有するプラテンを水により洗浄し、放射能標識されたタンパク質の存在を、リン光体の画像化システムによって検出する。キナーゼについてのタンパク質標的を、このようにして同定する。
【０２８４】
［実施例８］
蛍光によるチトクロームＰ４５０阻害アッセイ
本実験の目的は、特定のＣＹＰ４５０酵素を阻害する化合物のライブラリーの可能性を調べることである。プロトコルは、Ｃｒｅｓｐｉらの「Anal. Biochem. 248:188-190, 1997」を適応する。蛍光分析用基質は、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９及びＣＹＰ２Ｄ６については３−シアノ−７−エトキシクマリンであり、ＣＹＰ３Ａ４についてはレゾルフィンベンジルエーテル（ＢｚＲｅｓ）である。これらの試薬を、Ｐｈａｒｍａｚｙｍｅから得る。化合物ライブラリーを、各酵素のＫｍに等しい濃度でテストされるＣＹＰ４５０酵素の各々の１つのプラテンアレイデバイスに負荷する。適切な基質含有反応混合物を、第２のプラテンアレイデバイスに加え、酵素を第３のプラテンアレイデバイスに加える。これらのチップを積み重ねて、反応を開始させ、蛍光シグナルにおける増大を蛍光画像化によって連続してモニターする。Ｐ４５０阻害の相対的な速度を用いて、薬剤リード化合物を候補化合物ライブラリーから選択する。
【０２８５】
［実施例９］
ハイスループットタンパク質結晶化
溶媒におけるタンパク質を、貫通穴アレイに均一に負荷する。アレイの貫通穴を、塩の濃度及び相対的な存在量をランダムに変化させて、種々の塩を含有する溶液でランダムに満たす。酸性溶液及び塩基性溶液を続いて、ｐＨを変化させて貫通穴に負荷する。温度勾配を、アレイデバイスに加え（又は、アレイを一定の温度で交互に保つことができ）、これにより、溶媒を所定の速度で蒸発させる。加えて、溶媒の分圧もまた、アレイが、蒸発速度を変化させるために置かれる容器において変化させることができる。タンパク質の結晶化が観測されるそのような貫通穴をＸ線又は電子のビームに曝し、回折パターンを分析のために記録する。１つの重要な利点が、結晶化をもたらす実験条件を迅速かつ効率的に見い出すことである。そのうえ、タンパク質の結晶を、貫通穴において直接に分析することができる。
【０２８６】
１６の異なる結晶化溶液及び１１の異なる緩衝液を、Ｅｍｅｒａｌｄ  Ｂｉｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ（Bainbridge Island, WA）から得て、リゾチームと一緒にプラテンの貫通穴にランダムに負荷する。温度勾配をプラテン全面に加え、そして過剰な液体をゴムスパチュラにより除く。システムを、２０ｍｌの沈殿化溶液を有する容器にシールする。ＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー−質量分析）を使用して結晶化のための最適な溶液条件を、決定する。
【０２８７】
［実施例１０］
貫通穴の高密度アレイにおけるウルトラハイスループット混合物の分離及びスクリーニング
多くの状況（例えば、薬理学的活性分子についての天然産物のスクリーニングなど）において、複雑な混合物を迅速かつ効率的に分離し、そしてタンパク質標的に対してスクリーニングする必要がある。本実験の目的は、蛍光発生基質に対して天然産物の複雑な混合物を貫通穴の高密度アレイにおいて分離し、そしてスクリーニングすることである。天然産物サンプルを、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のための通常の様式で最初に調製する。液体がクロマトグラフィーカラムから溶離するとき、等体積のサンプルを得て、アレイの貫通穴に順次保管する。複製プレートを同時に作製することができる。その後、蛍光発生基質を、第２の貫通穴アレイに均一に負荷する。クロマトグラフィー分離が完了した後、アレイにおける各々のサンプルを、サンプルプレートを基質プレートの上に積み重ねることによって基質に曝す。アッセイされた分画物からの蛍光シグナルを光学的にモニターすることにより、アッセイされたプレート又は複製プレートの何れかからサンプルを、更なる評価のために選択する。
【０２８８】
多数の混合物が貫通穴の高密度アレイにおいて保存される、この方法の適用の拡張もまた記載される（例えば、混合物における活性な成分の分離及び同定）。一態様において、プラテンの貫通穴と同じ中心間の間隔を有するキャピラリーチューブアレイが、サンプルアレイと接触させられる。各々のチューブが、アレイにおける１つの穴に空間的にアドレス指定するように位置する。チューブアレイの反対側の端が、各々のキャピラリーチューブにより、空間的に一緒に位置決めされたアレイにおける貫通穴の１つだけの列がアドレス指定されるアレイの積み重ね物に挿入される。積み重ねられたアレイの数は、捕獲及び分析される溶出サンプルの数に等しい。各々のチューブには、混合物のクロマトグラフィー分離のために好適な多孔性ゲルが事前に満たされる。緩衝液が満たされたアレイプレートがサンプルプレートの上に積み重ねられ、圧力を加えて、緩衝液を各々の貫通穴に通して、対応するキャピラリーチューブに入れる。液体が各々のチューブから出るとき、チューブが位置する貫通穴が満たされる。チューブアレイがゆっくりアレイ積み重ね物から抜かれるとき、液体サンプルが貫通穴に保持される。このスキームの１つの利点が、キャピラリーチューブのアレイから溶出される分画物が同時に集められることである。アレイが満たされると、アレイを積み重ね物から取り外すことができ、（例えば、蛍光発生基質を含有するプラテンアレイと接触させて）アッセイすることができる。その後、蛍光放射によって明らかにされる活性な化合物が、分析のためにプレートから取り出される。あるいは、チューブアレイからの液体の流速、及び抜き取り速度を、２つのプレートが、カラムから溶出される本質的に同じ分画物により満たされるように選ぶことができる。これら２つのプレートが取り出され、一方がアッセイされ、他方が複製プレートとして提供される。
【０２８９】
並列のＨＰＬＣ分離に、質量分析のような本来連続的な分析方法をつなぐための、この方法の更なる拡張が次に記載される。図１３は、キャピラリーチューブ（１）のアレイが、サンプルで満たされた貫通穴アレイ（２）とつながれることを示す。しかしながら、チューブアレイの反対側の端が、もう一方の端をそのままに保ちながら、アレイの連続した横列（又は縦列）の間の距離を増大させるような様式で広げられる。チューブが、アレイを形成するために挿入される一連のスペーサー（３）により、構造的一体性がもたらされる。サンプルアレイを、キャピラリーチューブアレイと接触させ、一緒に位置決めする。アレイにおける各々のキャピラリーチューブには、アレイの貫通穴に含有される混合物のクロマトグラフィー分離のために好適な多孔性ゲルが事前に満たされる。加圧されたキャリア溶媒が、アレイにおける穴を通過させられ、１つのサンプルを１つのキャピラリーチューブに運ぶ。アレイにおけるチューブの様々な長さが、分析された混合物における成分についての所望の分離効率を与えるように選ばれる。繊維又は薄いテープが、キャピラリーチューブアレイの横列又は縦列の直ぐ下側で並行する。繊維に対するチューブアレイの横方向の動きにより、チューブの端が、繊維（又はテープ）（４）と接触しているアレイにおける１つの縦列／横列に入れられる。各々のチューブからの流体が繊維に沿って離れた空間的場所に移される。流体が移された後、繊維が真空の接合部（５）を通って進められ、流体の液滴が分析のために質量分析計（６）に連続して提示される。１組の液滴が置かれると、表面（例えば、ニトロセルロース繊維）は、次の組の液滴が置かれるように十分な距離が進められる。表面は一方向に、アレイは直交方向へと、２つの置き換えのみが必要とされることに留意されたい。
【０２９０】
質量スペクトル測定を行い、そして約３００ｍｓの繊維を移動させるための組合せ時間により、１００滴からなる１つの横列が輸送され、３０秒で分析される。１０，０００本のチューブのアレイの全体が、３０００秒（５０分）で分析される。米国特許第６，００５，６６４号に示されるように、確率論的サンプリングは、等間隔でのサンプリングと比較して、シグナルを再構成するために必要とされるデータ点の数を（１０倍まで）実質的に減らすことができる。確率論的サンプリングプロトコルの実行は、一般に分析時間を減らすことができる。
【０２９１】
［実施例１１］
化学合成条件の最適化
１つ又はそれ以上のプロセスパラメーターを変化させ、そして１組の反応条件で合成された物質の量を記録することにより、化学合成を最適化する。変更されるプロセスパラメーターには、試薬のタイプ、試薬濃度、添加／混合の順序、温度及び時間が含まれる。
【０２９２】
一連のヒダントイン化合物（てんかんの治療のために有用な医薬用薬剤）を、固相合成での新しい方法を用いて調製する。合成プロセスにおける各々の工程は、溶媒和させた試薬との所定の１組の時間条件及び温度条件のもとでの反応、及びその後、過剰な試薬（未反応の試薬）を除くための洗浄からなる。種々の官能基（例えば、水素、フェニル、メチル、ベンジル及びｓ−ブチル）及び保護されたアミド基を有する樹脂から作製された微小球体を、購入又は合成する。アレイを、ビーズが表面全体に広げられ、１つだけの樹脂ビーズが各々の貫通穴に嵌合するように先細りの穴を伴って製造する。種々の樹脂から作製された微小球体を一緒に混合し、異なる樹脂から作製された微小球体を、全ての穴が異なる樹脂から作製された微小球体でそれぞれ満たされるように希釈溶液でアレイ全体に広げる。次に、マスクを貫通穴の通常のアレイに覆って置き、露出した樹脂ビーズのアミン基を強酸（例えば、トリフルオロ酢酸）又は塩基に曝すことにより脱保護する。酸又は塩基を除くための洗浄工程の後、同じ樹脂を、異なる化学的部分及び構造的部分からなるイソシアネート基ライブラリーからの１つの構成成分に曝す。イソシアネート基とアミド基との間の反応により、可変部分を有するウレアを形成する。そのような化学的ユニットには、水素、ブチル、アリル、２−トリフルオロトイル及び４−メトキシフェニルが含まれる。反応を高い温度で一定の時間にわたって進め、その後、露出した穴を洗浄して、未反応の試薬を除く。このプロセスを、最初の穴のいくつか、更に新しい穴を露出させて、これらの微小球体を新しいイソシアネートライブリラリーの基に露出させるように、新しいマスクを用いて繰り返す。完了したとき、ヒダントイン化合物を、標的に対してスクリーニングして、そのような強力な化合物を見出す。試薬類、それらの濃度、試薬類の順序、反応温度及び反応時間を変化させることにより、合成経路を最適化するための迅速かつ効率的な方法が、提供される。
【０２９３】
［実施例１２］
ファージ抗体ライブラリーの選抜（マルチチップ法）
貫通穴の高密度アレイにおける標的抗原に対するファージ抗体のライブラリーを、スクリーニングする。プロトコルは、「Winter, http://aximtl.imt.uni-marburg.de/〜rek/AEPStart.html」を適用する。
【０２９４】
組換えＤＮＡ技術の適用により、大きく（１０９個〜１０１０個）多様なモノクローナル抗体ライブラリーを、細菌（大腸菌）コロニーにおけるＤＮＡプラスミドとして作製し、保存する。１回だけの従来のアフィニティー選抜を、標的抗原により被覆されたイムノチューブにおいて行う。インキュベーション、ブロッキング処理及び洗浄の後、特異的に結合したファージを溶出し、更なる大腸菌に再感染させるために使用する。
【０２９５】
２つの１０，０００個の貫通穴ケイ素アレイを、製造する。両方のアレイデバイスに、精製された標的抗原の溶液を負荷する。その後、アレイデバイスを４℃で約１２時間インキュベーションし、洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の４％の乾燥粉乳からなるブロッキング処理溶液で満たす。１時間後、ブロッキング処理溶液を除き、アレイデバイスをすすぎ、ＩＰＴＧの緩衝溶液で再び満たして、細菌におけるファージ発現を誘導する。
【０２９６】
ファージ感染細菌の十分に希釈された溶液を、１つあたり平均して１個〜１０個の細菌が存在するように第３の１０，０００個の貫通穴アレイに加える。得られた貫通穴アレイ（以降、これはライブラリー発現チップと呼ばれる）を、細菌が対数期に達するまでインキュベーションする。ライブラリー発現チップを、２つの抗原被覆されたアレイの間で積み重ねる。その後、積み重ね物を高湿度チャンバーにおいて２時間インキュベーションして、ファージ抗体が抗原に結合することを可能にする。抗原の通穴アレイを、細菌及び結合していないファージを除くために洗浄し、ライブラリー発現チップから分離する。
【０２９７】
これら２つの抗原貫通穴アレイの１つ（以降、これはファージ接種チップと呼ばれる）に由来する結合ファージを、貫通穴に１００ｍＭのトリエチルアミンの溶液を満たすことによって溶出し、約１０分間インキュベーションし、その後、２×Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を含有する別の１０，０００個の貫通穴アレイに積み重ねることによって中和する。溶出されたファージを使用して、第４の１０，０００個の流路アレイに含有される非感染細菌に接種する。このアレイ（以降、これは陽性発現チップと呼ばれる）を対数期に増殖させ、保存する。
【０２９８】
その間に、第２の抗原−ファージチップ（抗体選抜チップ）を、結合したファージ抗体について間接的ＥＬＩＳＡアッセイにより分析する。プロトコルを、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Supplement 15, pages 11.2.2-11.2.5）を適応する。このプロトコルは、特異的な抗体を検出するための間接的ＥＬＩＳＡである。他の形態のＥＬＩＳＡアッセイ（例えば、直接的な競合ＥＬＩＳＡアッセイなど）を、本実施例に記載される手順に対して、わずかな修飾で貫通穴アレイに実行することができる。
【０２９９】
抗体選抜チップに、ブロッキング処理溶液中の発色試薬（西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲート化されたＭ１３）を満たす。室温で３０分インキュベーションした後、アレイを洗浄し、ブロッキング処理し、再び洗浄する。その後、アレイを蛍光基質の溶液で満たし、室温で３０分間インキュベーションする。その後、蛍光画像を１時間にわたって５分毎に集める。陽性の貫通穴の全てが、経時的な蛍光強度における増大によって同定される。その後、各々の対応する細菌培養物を、陽性発現チップから取り出し、別個の細胞培養ウエルにおいて寒天（アンピシリン含有）上に分散させる。これらの選択された細菌培養物は、その後の分析のための追加のファージ抗体の供給源となる。
【０３００】
別な方法では、チップではなく、ライブラリー発現プレートの複製が作製される。単一の抗原貫通穴アレイが、抗体ライブラリーにさらされるだけである。抗原選抜チップで陽性の相互作用を同定した後、複製されたライブラリー発現プレートの対応する貫通穴に由来する細菌を希釈し、別の１０，０００個の貫通穴アレイの全面に分散させる。アッセイを、全ての選択された細菌コロニーが、単一培養物になるまで繰り返す。
【０３０１】
［実施例１３］
ファージ抗体の選抜（単一プレート法）
ファージディスプレー抗体のライブラリーを、貫通穴の１枚の１０，０００個の流路アレイを使用して、標的抗原に対してスクリーニングする。１枚のアレイにおける選抜を行うことによって、スクリーニングプロセスが簡略化されるが、ＥＬＩＳＡアッセイでは、選択されたファージを、細菌に再感染させることができないので、ファージをそのＤＮＡから再構築しなければならない。
【０３０２】
標的抗原は、アレイを抗原溶液で満たし、環境チャンバーにおいてインキュベーションすることによって、貫通穴の壁に固定化される。非特異的な結合部位は、アレイをブロッキング処理溶液により洗浄することによってブロッキング処理される。
【０３０３】
ファージ感染細菌の溶液を、１つの貫通穴当たり平均して１個〜１０個の細菌が存在するように、アレイの貫通穴の全てに加える。その後、アッセイデバイスを、細菌が対数期に達するまで加湿チャンバーにおいてインキュベーションする。アッセイデバイスを、ＩＰＴＧが貫通穴の中に拡散するには十分であるが、細菌がアレイの中から外に拡散することができるには不十分である時間、ＩＰＴＧの溶液に沈める。アッセイデバイスを、インキュベーションして、ファージ抗体の発現及び抗体−抗原の結合を可能にする。標的抗体の存在下におけるファージ抗体の発現は、当該技術分野における現在の方法とは逆であり、スクリーニングにおいて選抜される抗体の数を減らすことができる。
【０３０４】
次に、アレイを洗浄して、細菌、上清及び非結合ファージを、貫通穴から除く。その後、結合したファージ抗体を、間接的ＥＬＩＳＡアッセイによって検出する。蛍光画像を集めた後、プレートを洗浄し、結合したファージ抗体を溶出するための溶出試薬で満たす。貫通穴における溶液を、９６ウエル又はより高密度のマイクロタイタープレートの個々のウエルに対する入念な選択によって全ての陽性貫通穴に対応して同定する。その後、ファージＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、配列決定する。そのＤＮＡ配列を用いて、選択された抗体の構造を同定し、そしてより多くのファージ抗体を、更なる実験のために再び作製する。
【０３０５】
［実施例１４］
タンパク質チップ
１０万個のタンパク質結合プローブを、各々のプローブが特定のヒトタンパク質と高い親和性及び特異性により選択的に結合するように、Ｓｈｅｅｔｓらの「Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:6157-6162, 1998」（これは、その全体が参考として組み込まれる）に記載される方法に従って、ファージディスプレー技術を用いて作製する。プローブを、異なるタンパク質結合プローブがその貫通穴の各々に存在するように、プラテンに移す。プラテンは、湿潤化及びタンパク質吸収を防止するためにテフロン（登録商標）表面を有する。
【０３０６】
組織サンプルをホモジネートし、タンパク質部分を抽出し、そしてプラテンと平衡化する。プラテンを洗浄して、非特異的に結合した分子を除く。各々の貫通穴の内容物を、貫通穴の壁から貫通穴の中心へのタンパク質の脱着を検出するために、ラマン画像化を使用しながらプラテンを２分間かけて周囲温度から１００℃に加熱することにより分析する。
【０３０７】
［実施例１５］
迅速な並行するサンプル分離及び精製のためのミクロＨＰＬＣカラムのアレイの構築
直線配置の１２個の貫通穴のアレイを、物質のブロック（例えば、金属、セラミック又はプラスチック）において加工する。貫通穴は、直径が２５０μｍであり、全長が２０ｍｍであり、中心間の間隔が９ミリメートルである。貫通穴のアレイの遠位端の内径は、標準的なナット・フェルール圧縮嵌合を使用して標準的な１／１６”外径のＨＰＬＣチューブを受けられるように広げられ、ねじ切りされる。内径が５０μｍで、外径が１／１６”のチューブの長さ２ｃｍのものを、加工された圧縮嵌合によりアレイの貫通穴の各々にかみ合わせる。外径が、１／１６”のステンレススチール製フリットを、貫通穴の内部に設置し、圧縮嵌合によりその位置に保持する。その後、クロマトグラフィー媒体をスラリーの形態でアレイの各々の貫通穴に詰める。クロマトグラフィー媒体が、ステンレススチール製フリットが遠位端に存在するために貫通穴内に固定化され、ミクロＨＰＬＣカラムが作製される。加圧された場合、サンプル、洗浄及び溶出緩衝液が、クロマトグラフィー媒体及びフリットを通って流れ、遠位端のかみ合った５０μｍの内径のチューブを通って貫通穴から溶出する。
【０３０８】
サンプルを、実施例２及び３で詳しく記載したように、シリンジの列をミクロＨＰＬＣアレイにと対にすることによって、ミクロＨＰＬＣカラムのアレイに負荷する。洗浄及び溶出緩衝液を、同じシリンジ列を使用してミクロカラムアレイの中に流す。１分当たり１〜２０μｌの液体の流速で、洗浄し、サンプルをミクロカラムから溶出する。狭い径のチューブをミクロＨＰＬＣカラムの遠位端において使用することにより、カラムから溶出する液体が小さい液滴を形成することになる。カラム溶出液は、ウエルのアレイ（例えば、マイクロタイタープレート）に集める。溶出液は、ミクロＨＰＬＣカラムから溶出するときの個々の液滴を、マイクロタイタープレートの異なるウエルに集めることによって分画化される。サンプルの化学的及び物理的分析（例えば、分光法又は分光測定）を、ウエル内のサンプルに対して行うことができる。
【０３０９】
［実施例１６］
マイクロキャピラリー流路での並列ＨＰＬＣのための流体シール
図１６に関連して、貫通穴のアレイを、物質のブロック（例えば、金属、セラミック又はプラスチック）において加工する。貫通穴は、直径が１ｍｍ未満であり、アスペクト比が１０を越える。貫通穴は、Ｏ−リングのガスケットを受け入れるために面取りされる。シリンジ列を、貫通穴アレイと同じ中心間の間隔を伴って製造する。シリンジの針が、空気圧により作動されるバネ押しピンによって、シリンジ列ホルダーに取り付けられる金属ブロックを通過する。Ｏ−リングのガスケットを、ブロックを通って突き出るシリンジの針に付ける。シリンジに、流体を負荷し、キャピラリーチューブに挿入する。ピンを空気圧により作動させて、金属ブロックをキャピラリーチューブブロックの上部表面と接触させ、Ｏ−リングのガスケットを穴の面取り部内に、シリンジの針の周りで押しつける。これにより、漏れのないシールが、針とキャピラリー流路との間に作製され、従って、キャピラリー流路がシリンジによって加圧されることが可能になる（図１７）。図１８及び図１９には、それらの図におけるシリンジ列が、容易な取り扱いのための堅牢な構造とするためにキャピラリーチューブアレイにボルト締めされることが示されることを除いて、同様な方法が例示される。
【０３１０】
［実施例１７］
生体分子標的に対するリガンドを同定すること
本実験の目的は、生体分子標的（この場合にはタンパク質）に結合する、化学的、生化学的又は生物学的混合物におけるリガンドを同定するために、貫通穴アレイを使用して少ない体積のクロマトグラフィーを使用することである。２つの線状貫通穴アレイを、各々の貫通穴が、満たされる場合に５０ｎｌの液体を保持するように構築する。アレイの外側表面を、疎水性にするために処理し、また、内部を親水性にするために処理する。各々の貫通穴の間は、９ｍｍの中心間の間隔であり、位置決め穴が、精密ジグにおけるピンを使用してアレイを積み重ねたときの貫通穴の位置調整及び同時位置決めを確実にするために含められる。シリンジの列が、５０ｎｌの標的タンパク質溶液を第１のアレイに分注し、そして５０ｎｌの異なる化合物ライブラリーを第２のアレイの各々の貫通穴に分注するために使用される。アレイを、精密ジグを使用して積み重ね、流体により、同時位置決めされた貫通穴位置の各々において混合することが可能となる。圧縮嵌合を有するシリンジの列は、１ｍｌの溶出液を満たし、続いて、小さい気泡を満たし、その後、１００ｎｌのタンパク質ライブラリー反応混合物を引き込むのに使用する。反応混合物を、シリンジの先端に保持し、空気のすき間によって溶出液リザーバーから分離されたままにする。シリンジの先端を、サイズ排除カラムのアレイの開口部の中に入れ、圧縮嵌合を締めて、シールを確実にする。サンプルをカラムに分注し、続いて、溶出液を分注する。少なくとも１つのカラムから出るサンプルのＵＶ吸光度をモニターすることによって、リガンドに結合するタンパク質が、何時カラムから出てくるかを、測定することができる。その場合、このタンパク質は、２つのカラムアレイをつなぐことによって逆相カラムのアレイに回収される。リガンドを逆相クロマトグラフィーによってタンパク質から除き、回収し、分析して、その同定を決定する。
【０３１１】
［実施例１８］
ワックスでの被覆による貫通穴の保護
５４℃の融点を有するパラフィンワックスを、その融点よりも高く加熱する。貫通穴アレイを、平均分子量が１５００である溶融したポリ（エチレングリコール）ワックスの薄い層に沈める。貫通穴アレイ及びワックスを冷却して、ワックスを固まらせる。過剰なワックスを、鋭利な刃によりかき取り、その後、研磨することによって表面から除く。その後、ワックスが満たされたアレイを、キシレン中の１：２０希釈された（トリデカフルオロ−１，１，２，２−テトラヒドロオクチル）−１−トリクロロシランの溶液からの蒸気に１０秒間曝す。その後、被覆を、プラテンを１１０℃で３０分間焼成（ワックスを融解させ、プラテンから滴下させながら）することによって硬化させる。ワックス残渣を、水で洗浄することによって流路内部から除くことができる。その後、プラテンを、硫酸／過酸化水素（２：１）で１０秒間すすぎ、次いで水ですすいで、残渣を除き、そして流路内部の酸化を確実なものにする。得られた貫通穴アレイは、疎水性の外部と、親水性の内部とを有する。
【０３１２】
［実施例１９］
ガラス繊維の貫通穴アレイ製造の光開始方法
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Bedford, MA）から入手可能であるようなガラス繊維フィルターの１シートを、重合可能な溶液（例えば、メチルメタクリレートモノマー及びベンゾインメチルエーテルのような光開始剤を含有する溶液）に浸し、２枚の石英プレート（各々が開放及び多孔性のままである部分を遮蔽するために使うドットのアレイを有している）の間に置く。モノマー溶液の重合を、フォトマスクを紫外線で照射することによって実施する。
【０３１３】
［実施例２０］
貫通穴のアレイへのアッセイの適用
薬剤発見への取り組みにおいて使用される一般的なアッセイの１つが、チトクロームＰ４５０阻害アッセイである。Ｐ４５０酵素の活性を阻害する化合物は一般に、医薬品として望ましくない。そのような化合物は、深刻な副作用を引き起こす可能性を有し、そして他の医薬品との併用で好ましくない反応の可能性を有するからである。医薬品にするために潜在的な候補物である化合物をスクリーニングするのに使用される一般的なアッセイは、Ｐ４５０酵素を発現する細胞、細胞外又は組換えシステムで化合物をインキュベーションし、酵素の活性を候補化合物の存在下でアッセイすることである。そのようなアッセイは、貫通穴のアレイにおける大規模な並列様式での分析のために修正することができる。
【０３１４】
４つの一緒に位置決めされた貫通穴アレイが、使用される。酵素又はＰ４５０酵素を発現する細胞成分（例えば、肝臓細胞のミクロソーム区画）を、各々の貫通穴が等しい体積及び濃度のＰ４５０を含有するように、貫通穴の１つのアレイに負荷することができる。選ばれたＰ４５０酵素についての既知の基質及び一緒にＮＡＤＰＨ源（エネルギー源）を、各々の貫通穴が等しい体積及び濃度の基質及びＮＡＤＰＨを含有するように、貫通穴の第２のアレイに負荷することができる。第３のプレートには、アッセイされる化合物の既知濃度（例えば、連続希釈物）及び一緒に陽性及び陰性対照を負荷することができる。貫通穴の多数のアレイに、迅速に負荷するための発明の一つが、本明細書に記載されている。アッセイが、貫通穴のこれら３つのアレイが互いに接触させられるときに開始される。本明細書に記載されているように、貫通穴のサイズ、密度及び表面化学更にアレイそのものを、制御することによって、３つのアレイの内容物を互いに迅速に混合させることができ、一方で、２つ又はそれ以上の隣接する貫通穴の間における貫通穴間の汚染を回避することができる。
【０３１５】
その後、貫通穴の積み重ねられたアレイを、制御された湿度環境において３７℃でインキュベーションして、反応を進行させることが可能である。高湿度環境をこのインキュベーション期間中に維持することによって、貫通穴からの蒸発損失を最小限に抑えることができる。３０分後、停止溶液（例えば、有機溶媒、尿素、高塩溶液など）で満たされた第４のアレイをアッセイアレイと一緒に積み重ねることによって、停止溶液を各々の貫通穴に加える。停止溶液は、Ｐ４５０酵素の変性及び／又は溶液からの沈殿によって、アッセイを停止させるように機能する。この沈殿物は、本明細書に記載される発明を用いて遠心分離によってペレット化することができる。その後、貫通穴の上部アレイをそれ以外のアレイから取り除き、分析のために使用することができる。多くの場合において、基質が、Ｐ４５０酵素によって代謝されるとき、基質は非蛍光性の化合物から蛍光性の化合物に転換される。蛍光の量はＰ４５０酵素の量に正比例する。アッセイされる化合物が、Ｐ４５０酵素を阻害するならば、より少ない代謝が生じ、より少ない蛍光性物質がもたらされる。多数の濃度の違う阻害剤が、アッセイに使用されるならば、Ｐ４５０酵素が５０％阻害される濃度（ＩＣ５０値）を測定することができる。サンプルの蛍光測定分析及び／又は質量分析を、本明細書に記載される発明を用いて実施することができる。
【０３１６】
［実施例２１］
タンパク質を貫通穴アレイの表面から洗浄すること
貫通穴アレイを、フルオロ−クロロ−アルカンの被覆をその表面に有するケイ素から調製し、そして穴の内部を親水性にする酸化液により処理する。アレイを水に浸けて−８０℃に凍結し、フルオロポリマーＦｌｕｏｒｏＰｅｌ（登録商標）（Cytonix Corp., Beltsville, MD）の溶液に素早く浸ける。アレイを、２００℃で２０分間焼成し、その後、１０％のウシ胎児血清を含有する細胞培地に浸ける。貫通穴アレイを培地に浸けることにより、アレイの穴が満たされ、表面が湿らされる。その後、貫通穴アレイをペルフルオロオクタンに浸け、ゆっくり引き上げることによって、表面から、全ての水性培地が除かれる。
【０３１７】
［実施例２２］
ＤＮＡ配列決定
蛍光標識されたＤＮＡフラグメントを、サンガー配列決定によって調製し、厚さが０．５ｍｍのプラテンの２５００個の貫通穴のアレイに配置する。その後、このプラテンを、ゲルを含有する、厚さが８０ｍｍである第２のプラテンの上に積み重ね、盛んに冷却されている電気泳動タンクの中に入れる。蛍光性オリゴが、カラムアレイから現れるとき、蛍光性オリゴは、スプールから巻きから解かれるニトロセルロース膜に結合する。コンピューターにより、（テープの形態で）ニトロセルロース膜が移動している間に、膜の動きが制御され、そして電場が止められる。その後、膜を移動させて、光源及びＣＣＤカメラに曝し、貫通穴の各々について画像が分析され、溶出プロフィールが作製される。これにより、ＤＮＡ配列の再構築が達成される。
【０３１８】
［実施例２３］
多数の溝付きプレートを使用してプラテンを製造する方法
貫通穴を有するプラテンは、並行する溝を有するケイ素のプレートから製造することができる。図２０を参照されたい。得られるアレイは、５０００個の貫通穴を有しており、この場合、貫通穴は、各々の辺が０．２５ｍｍの長さを有するほぼ正方形であり、プラテンは約１ｍｍの深さを有する。
【０３１９】
９インチのシリコンウエハー（０．５ミリメートルの厚さ）を使用する。円形ウエハーを正確に切断して、５５×１６０ミリメートルである長方形片（合計で６０個）を作製する（ウエハー当たり合計で３つの表面が、得られる）。その後、２５０ミクロンの幅及び２５０ミクロの深さを有する溝を各々のケイ素片に長さ方向にエッチングする。合計で１００の溝を５０個のケイ素片にエッチングし、各々の溝の間の距離を約２５０ミクロンに調節する。残る１０個のケイ素片はエッチングしない。ケイ素の化学的エッチングは、当業者には既知のプロセスであり、ケイ素の適切な領域を遮蔽し、酸で処理することを伴う。その後、遮蔽されなかった領域を、制御された様式でエッチングして除く。各々の辺から合計で２５ミリメートルがエッチングされず、これにより、連続する縁が、完成したプラテンにもたらされる。
【０３２０】
表面の化学的エッチングが完了すると、エッチングプロセスで使用されたマスクが取り除かれ、各々のケイ素片の溝形成されていない表面が金の薄い層でスパッタリング被覆される。その後、ケイ素片を、直角のブラケットとともに平坦な表面を有するジグに一緒に積み重ねる。溝を有しない５個のケイ素片を最初に積み重ね、続いて、５０個の溝付き表面、そして、溝を有しない別の５個を積み重ねる。これらのケイ素片を含有することができるジグ全体をプレス機に移動し、圧力を積み重ねたケイ素片に加える。アセンブリーを加熱し、高圧高温のもとで約１６時間にわたってそのままにする。この処理により、プラテンの永続的な結合で、（１００×５０のアレイの）５０００個の貫通穴と、貫通穴の周りでの２５ｍｍの連続するケイ素縁を有する、５５×３０×１６０ｍｍの大きさの１つの大きなケイ素片がもたらされる。ワイヤー式のこぎりを使用して、個々のプラテンを０．５ミリメートルの厚さに切断する。これらのプラテンは、貫通穴に対して直交する平面で薄切りによって切断される。図２０を参照されたい。のこぎりで使用されたワイヤーは、１５０ミクロの厚さを有しており、結果として、この量の物質が、のこぎりで切るプロセス時に失われる。両方の端部で作製された不均一なプラテンを含めて、要求される仕様に一致する合計で２３０個のプラテンが、この大きいケイ素片から切断される。
【０３２１】
プラテンの両表面を、平坦な表面を確保するためにラッピング機で研磨する。これにより、微々たる量のケイ素が除かれる。最後に、表面化学を、プラテンに適用して、所望の物理的特徴を有する完成した製造物を提供する。
【０３２２】
［実施例２４］
ナノリットル体積の化合物ライブラリーの保存及びスクリーニング
化合物を、９６ウエルプレートから貫通穴アレイに、下記にように再配置する。９６ウエルプレートにおける化合物を、化合物がアッセイされる濃度の１００倍に、例えば、アッセイで１ｕＭの最終濃度については、１００ｕＭでＤＭＳＯに溶解する。９６ウエルプレートの各々のウエルにおけるＤＭＳＯサンプル溶液の総体積は、１０ｕｌである。さらに９０ｕｌのエタノールを各々のウエルに混合し、サンプルを分注のために直ちにシリンジ列に引き込む。自動化されたシリンジ列では、６０ｎｌの体積が、９６ウエルプレートと同じフットプリントを有する貫通穴アレイの各々の積み重ね物に分注される。このプロセスを、貫通穴アレイが実質的に一杯になるまで、新しい９６ウエルプレートを用いて繰り返す。その後、アルコールを蒸発させ、これにより、約６００ｐｌのＤＭＳＯ溶解化合物の残渣を、各々の貫通穴アレイの各々の流路に残す。−８０℃での乾燥下に所望の期間、化合物を保存した後、配列された化合物を含有する貫通穴アレイを取り出し、ＤＭＳＯが凍結したままであるように１０℃にし、１０℃に冷却されているアッセイ水溶液を含有するビーカーの中に浸ける。貫通穴アレイを加湿環境のもとでビーカーから取り出すことにより、チップの貫通穴が水性媒体で満たされる。貫通穴アレイを周囲温度まで加温して、溶媒の混合を可能にする。第２の貫通穴アレイに、酵素及び蛍光発生基質を含有する新しく調製され、冷却されたアッセイ緩衝液を、均一に満たす（マトリックスメタロプロテアーゼアッセイの場合に）。２つのチップを積み重ね、周囲温度に加温し、３０分間にわたっていくつかの時点で蛍光画像化することにより、酵素阻害についての一次スクリーニングがもたらされる。
【０３２３】
［実施例２４］
細胞培養のための膜の選択
本発明は、これらに限定されないが、成体幹細胞、軟骨細胞、胚性幹細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、造血系細胞、筋肉細胞（心臓の心筋細胞を含む）、ニューロン、骨細胞を含む、真核細胞等の様々な細胞タイプの増殖のための方法を提供する。この方法の概略が、図２５に示される。これらの細胞の増殖を容易にするための多孔性膜を、例示的な細胞タイプ（ＰＫＣｂ−ＧＦＰ発現ベクターによりトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞）の付着、生存、成長又は増殖を支えるその能力についてアッセイした（図２６）。細胞を、アッセイされるインサートを含有する２４ウエルプレート（ＢＤ−Ｂｉｏｃｏａｔ２４ウエル）のウエルに置床した。被覆されていないか、又はフィブロネクチン、ラミニン及びコラーゲンにより被覆された３μｍの細孔のインサートを、０．２μｍの細孔サイズの均一なキャピラリー細孔構造を有する酸化アルミニウムから製造された膜（ＡＮＯＰＯＲＥ組織培養インサート）（Nunc Inc.）と同じようにテストした。膜を２００，０００個の細胞と一晩インキュベーションした。このインキュベーションの後、ＡＮＯＰＯＲＥ膜は完全な集密度になった（図２５）。ラミニンにより被覆された膜は約２０％の集密度であった。他の膜は１０％未満の集密度であった。７５，０００個／ウエルでＡｎｏｐｏｒｅインサートに播種された細胞は、６日目に十分な集密度になるまで増殖し続けた（図２７を参照されたい）。
【０３２４】
［実施例２５］
細胞チップの構築方法
細胞チップ構築のために、ａｎｏｄｉｓｃ膜（これは、ＡＮＯＰＯＲＥインサートにおける膜である）を使用した。最初に、膜を、スライドガラスの上に置き、そして直径が１５０μｍの細孔を有する、厚さが４００μｍのステンレススチール製プラテンを、膜の上に置いた。デバイスを、Ｃｙｔｏｓｐｉｎスライドガラス遠心分離器のチャンバーに入れ、細胞をプラテンの上部に加えた。２４時間のインキュベーションの後、プラテンを細胞培養培地で３回洗浄した。膜に接着している細胞が存在したが、細胞は丸くなり、ａｎｏｐｏｒｅインサートを使用する以前の実験で見られたようなしっかりした付着又は広がりは認められなかった。このインサートに関して、膜は、固体支持体の上に置かないで、プラテン内につり下げられた。これにより、膜が両方の表面で培地と接触するのを可能にした。
【０３２５】
二重プラテンを、図２８で示すようにプラテンの間にａｎｏｄｉｓｃ膜を用いて構築した。培地の液滴をプラテンの上に置き、そしてプラテンに直交するガラス製カバースリップを表面上で移動させて、液体を細孔の中に押し込むことによって、底部プラテンを事前に湿らせた。これを、１×１０６細胞／ｍＬの細胞懸濁物の１滴を使用して上部プラテンにおいて繰り返した。その後、事前に湿らせた膜をプラテンの間に置き、プラテンを、両方のプラテンの細孔が位置決め又はアライメントするように顕微鏡下で調節した。デバイスを締め、一晩インキュベーションした。洗浄後の膜を調べることにより、細胞が、インサートを用いて見られた形態と同じような特徴的な接着性形態を有していることが示された（図２８）。細胞を２４時間毎に調べ、十分な集密度になるまで増殖させた（図２８）。
【０３２６】
［実施例２６］
アレイスポッティング
化合物をテストするために、アレイスポッターと共に使用される細胞チップの潜在的可能性を評価するために、単一のピンによるスポッティングを特定化する（図２９）。図３０は、ヘキスト（Hoechst）色素を使用する金プラテンにおけるマイクロスポッティングを示す。図３６は、細胞生存能を測定するためのＣ１２レサズリンの、マイクロスポッティングを示す。Ｃ１２レサズリンは、細胞の代謝を検討するために使用される検出剤である。Ｃ１２レサズリンの還元生成物が、Ｃ１２−レゾルフィンであり、これは、レサズリンの還元生成物に関連した強化された細胞保持及び検出を示す。代謝的活性な細胞は、Ｃ１２レサズリンを、赤色の蛍光を発するＣ１２−レゾルフィンに還元する。ヘキスト染色を、対比染色として含めた。プラテンに軽くスポットした後、細胞チップを、３７℃、５％ＣＯ２で１５分間インキュベーションした。チップを、蛍光顕微鏡を使用して調べた。スポットの領域における数個のウエルがヘキスト染色を示し、代謝的に活性な細胞を含有していた。この領域は、直径が約３００ｕＭであり、ピンの直径の約１．５倍であった（図２９を参照されたい）。図３６は、開放アレイ型の細胞チップ及び浮動ピンを使用するアレイ上の単一のウエルへのＣ１２−レサズリンの送達を示す。
【０３２７】
マイクロアレイスポッティングのための技術は、ｃＤＮＡ及び／又はオリゴヌクレオチドを固体チップ表面にスポッティングすることによる高密度マイクロアレイの作製を可能にする。本報告では、チップ表面が修飾され、これにより、ウルトラハイスループット細胞型スクリーニングアッセイの改善された成績を提供する。この新規なチップ技術は、細胞の付着及び生存能を支えるその能力について選択されたＡＮＯＤＩＳＣ膜、及びマイクロウエルステンレススチールプラテンを含む。
【０３２８】
３ｕｍ又は０．２μｍのいずれかの細孔直径を有する膜を、ＰＫＣｂ−ＧＦＰ細胞の付着及び増殖を支えるそれらの能力についてテストした。ＡＮＯＤＩＳＣの０．２μｍの膜は、一晩のインキュベーションの後、細胞の集密の層で覆われた。対照的に、３μｍの細孔サイズを有するポリカーボネート膜は、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチンで処理されたか、又は処理されなかった場合、１０％未満の集密度で存在した。これらの実験は、より小さい細孔サイズを有する膜が、細胞付着を支える向上した能力を有することを示唆しているが、膜材料における違いは除外することができない。あるいは、製造の材料における違いを除外することができない。
【０３２９】
細胞が、ステンレススチール製プラテンで覆われたスライドガラス上の膜からなる細胞チップと共に培養される場合、細胞が、丸くなって現れ、ウエルに付着しなかった。対照的に、両側での培養培地との接触を提供される枠組みされたインサートでの膜（すなわち、２つのプラテンの間における膜）において培養された細胞は、この問題を解決した。この形態は、様々な分析システム又は培養システムでの使用に適合させることができる。一態様において、細胞を膜上に含むチップが、タンパク質又はＲＮＡを付着させるために設計された膜を有する別のチップを覆って設置される。細胞を溶解し、溶解された内容物が、ドットブロット分析のために真空ろ過によってこの第２の膜にスポットされる。
【０３３０】
本明細書中に記載されるこれらの実験ではさらに、化合物が、細胞チップに直接にスポットでき、そしてプラテン上での最小限の拡散で代謝活性な細胞によってプロセシングされ得ることが明らかにされた。拡散をさらに低下させるために、そして高密度のスポッティングを達成するために、プラテンの表面を、疎水性の薬剤により処理することができる。鉱油及びシリコーンの被覆は、５０μｍの細孔を有する膜を金のプラテンにおいて使用して実施された検討において、拡散を劇的に制限し、そして小さいスポットをもたらした（図３１）。
【０３３１】
小さいウエルサイズのために、この新規な技術は、珍しい細胞タイプの培養及び分析を可能にし、そしてウルトラハイスループット単一細胞スクリーニング（ｕＨＴＳ）をさらに提供する。単一細胞ｕＨＴＳは、活性化されたＢ細胞が融合（陽性細胞から増幅された可変領域）を伴うことなくテストされ得るので、抗体工学に対して転換させる作用を有するかもしれない。
【０３３２】
本発明は、先行技術に存在する様々な制限を克服する。特に、本明細書中に記載される細胞チップ形態を使用するとき、蛍光マーカーを細胞機能のために使用して、生細胞を分析することができる。そのうえ、培養された細胞を溶解し、内容物を更なる生化学的分析（例えば、タンパク質分析又は遺伝子発現）のために膜を介して移すことができる。
【０３３３】
［実施例２７］
細胞のヘキスト染色
細胞をステンレススチールの細胞チップにおいて一晩インキュベーションし、その後、培地により洗浄した。ヘキスト色素を、ブロッティングによって乾燥された第１のプラテンにスポットした。テストされたステンレススチール製プラテン（National Jet Company, LaVale, M.D.）は１インチ平方であり、厚さが４００μｍであり、細孔は直径が１５０μｍであった。第２のプラテンを、中心部を切り取った接着性のシール用フィルムを使用して第１のプラテンに取り付けた。チップを、プラテンとチャンバーの上部との間の小さいガスケットと共に、ｃｙｔｏｓｐｉｎサンプルチャンバーに入れた。漏斗を使用しなかった。本実験の結果が、図３２に示される。図３３は、２つのステンレススチール製プラテンの間に挟まれたａｎｏｐｏｒｅ膜を示す。ＰＫＣβ−ＧＦＰ細胞を加え、一晩インキュベーションした。
【０３３４】
タングステン製プラテン
［実施例２８］
細胞マイクロアレイのプロトタイプを、厚さが２００μｍのタングステン製プラテンにおいて構築した。プラテン（National Jet Company, LaVale, M.D.）は、直径が３００μｍの細孔を有し、４つのネジにより取り付けられた。このプロトタイプが、図３４に示される。酸化アルミニウムのＡｎｏｐｏｒｅ膜を２つのタングステン製プラテンの間に挟んだ（図３４に示されるように）。ＰＫＣβ−ＧＦＰ細胞を加え、４８時間インキュベーションした（図３５）。本実験では、ランダムな細胞分布が観察され、細胞はよりしっかりと基質に付着していた。生体適合性を有する金属プラテンは、このような方法で使用することができる。生体適合性でない金属は、生体適合性のポリマー（ＰＥＧ）又は金属で被覆することができる。
【０３３５】
［実施例２９］
培養細胞の共焦点画像
図３７は、５×１０５個／ｍＬで加えられ、そして３７℃にて５％ＣＯ２でインキュベーションされた、ＰＫＣβ−ＧＦＰトランスフェクション細胞を有する開放アレイ型細胞チップを示す。画像を共焦点顕微鏡によって取得した。図３８は、プラテンが示されていないことを除いて、実質的に図３７に示される図と同じである。
【０３３６】
［実施例３０］
多孔性膜に結合することができる硬質の物質
硬質の物質（例えば、直径が１０〜３００μｍの細孔を有する金属又はポリスチレンなど）のプラテンを、多孔性膜又は修飾されたガラス表面に取り付けて、多孔性の底部を有するマイクロウエルのアレイを形成する（図３９）。細胞を加え、膜に一晩接着させる。続いて、１つ又はそれ以上のテスト化合物を、マイクロスポット用のピンを使用して加える。インキュベーション後、ハイコンテント画像分析を実施する。膜を処理して、タンパク質、ｍＲＮＡ発現を分析するか、又は目的の生物学的機能における変化を検出する。図４０は、図３９に示される個々のウエルの断面を示す。本発明は、図４１に示されるように適合させることができる。図４１は、個々のウエルを密封するための部材及び／又はガスケットに対しての、圧力を増大させるための構造的強化を示す。
【０３３７】
細胞チップアッセイを、下記の方法及び材料を使用して行った。
【０３３８】
細胞培養培地
１０％のＦＳＣ及び０．２２ｕｇ／ｍＬのヒグロマイシンが補充されたＤＭＥＭを使用して、ＰＫＣｂ−ＧＦＰ細胞を維持した。いくつかの実験では、１０％のＦＣＳ及び１００ＩＵ／ｍＬのペニシリン、１００ｕｇ／ｍＬのストレプトマイシンが補充された、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭを使用した。
【０３３９】
細胞
ヒトＰＫＣβＩＩのｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ０７１０９）を、逆転写されたヒト脾臓ｍａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（Clontech）からＰＣＲによって単離し、そしてヒグロマイシン耐性遺伝子を含有するｐＣＤＮ３ベクター（Invitrogen）にサブクローンした。遺伝子を、緑色Ｘｕｏｒｅｓｃｅｎｔタンパク質（ＺｓＧＦＰ）（Clontech）をコードする配列の下流側に挿入した。ＧＦＰ−ＰＫＣβＩＩを発現する安定的な細胞株を、ｐｃＤＮＡ３／ＧＦＰ−ＰＫＣβＩＩベクターをヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞（QBI, Montreal, Quebec, Canada）にトランスフェクションし、その後６００μｇ／ｍｌのヒグロマイシンＢで選別することによって得た。薬剤耐性コロニーを選び、抗ＰＫＣβＩＩ抗体（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）を使用する免疫ブロティングによってＰＫＣβＩＩタンパク質発現についてスクリーニングした。ＧＦＰの発現を、Ｘｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ顕微鏡によって調べた。陽性クローンを、３００μｇ／ｍｌのヒグロマイシンＢを含有する増殖培地において維持した。ＧＦＰタグ化ＰＫＣ−βＩＩタンパク質でトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞を、１０％のＦＢＳ、グルタミン、抗生物質及びヒグロマイシンＢを含有するＤＭＥＭにおいて３７℃で維持した。Ｉｌｙｉｎらの「Methods, 37:280-288, 2005」を参照されたい（これは、本明細書により参考として組み込まれる）。
【０３４０】
膜上での細胞培養
ＢＤ−Ｂｉｏｃｏａｔ膜由来の細胞培養インサートを、３ｕＭの細孔サイズで得た（BD Biosciences, San Jose, CA）。インサートを、ラミニン、コラーゲン又はフィブロネクチンにより被覆した。０．２ｕＭの細孔サイズの（Ｎｕｎｃ）膜を有するＡｎｏｐｏｒｅインサートもまたテストした。インサートを２４ウエル培養プレートに設置した。細胞培養培地を、液面が膜に達するまで加えた。細胞を２００ｕＬの培地でインサートに加えた。プレートを、３７℃にて５％ＣＯ２で一晩インキュベーションした。枠組みされたインサートを有していない膜を使用するその後の実験では、０．２又は０．１μｍの細孔を有するａｎｏｄｉｃｓ膜（Whatman, Clifton, N.J.）を使用した。
【０３４１】
プラテン
厚さが４００μｍのステンレススチール製シム（shims）を得て、５０μｍの間隔で離れた１５０ｕＭの直径の穴の１０×１０プラテンを、ミクロ放電加工を使用して製造するためにＮａｔｉｏｎａｌ  Ｊｅｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（LaVale, M.D.）に送った。各々のシムを、中心部にプラテンを有する約１インチ平方に切断した。
【０３４２】
スポット用のピン
容量送達範囲が５〜１５ｎＬである、ＦＰ９の０．２２９ｍｍ直径の浮動チューブピン（V&P Scientific Inc., San Diego, CA）を全ての実験において使用した。スポット用溶液をエッペンドルフチューブ（eppendorf tube）で作製した。スポット用ピンを溶液に浸け、その後、プラテンに対して直交して軽く触れることによってプラテンにスポットした。
【０３４３】
細胞生存能アッセイ
Ｃ１２−レサズリン（分子プローブ）を、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ）で希釈した。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８（分子プローブ）を、スポット形成効率のための対照として含めた。溶液を、上記のように、細胞の上部においてプラテンにスポットした。細胞チャンバーを、３７℃にて５％ＣＯ２で１５分間インキュベーションした。インキュベーション後、チャンバーを、ヘキスト色素によるＤＮＡ染色について蛍光顕微鏡観察によって調べた。その後、この領域を、生細胞によるＣ１２−レサズリンの赤色蛍光性のレゾルフィンへの変換について共焦点顕微鏡を使用して分析した（Ａｂｓ／Ｅｍ  ５６３／５８７）。
【０３４４】
他の態様
前述の記載から、様々な変化及び修飾が、本明細書中に記載される発明を様々な使用法及び条件に適合させるように、実施できることは明らかであろう。そのような態様もまた、本発明の特許請求の範囲内である。
【０３４５】
本明細書中の変数の定義のいずれかにおける要素の列挙の説明には、列挙された要素の単一の要素の何れか又はそれらの組合せ（又は部分組合せ）として、変数の定義に含まれる。本明細書中における態様の説明には、単一の態様の何れかとして、又は他の態様の何れか若しくはその一部分と組合せた態様が含まれる。
【０３４６】
本明細書において言及される全ての特許及び刊行物は、各々の個々の特許及び刊行物が、具体的及び個々に参考として組み込まれることが示されている場合と同じく、参考として本明細書中に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０３４７】
【図１】図１は、上部マスク及び底部マスクを有するプラテンの分解した斜視図である。
【図２】図２は、インターロック式アレイシステムの断面図である。
【図３】図３は、小容量の液滴を、ピンアレイを有するアレイで特定の貫通穴に移すための方法を図解する。
【図４】図４は、マスクをＵＶ硬化性エポキシの使用により作製するための方法を図解する。
【図５】図５は、マスクを、貫通穴の一致するアレイに正確に嵌合するピンを有するアレイの使用により作製するための方法を図解する。
【図６】図６は、液体を、キャピラリーチューブの束でマイクロタイタープレート由来の個々のウエルから高密度の貫通穴アレイに移して保管するための方法を図解する。
【図７】図７は、液体を、マイクロタイタープレートにおけるウエルから、柔軟な部材を使用するアレイで貫通穴に移すための方法を図解する。
【図８】図８は、貫通穴の断面が１つの貫通穴あたり１個だけの微小球体を保持するように形状化され、かつ、長さ方向の断面が、微小球体がアレイ表面又はその下側のいずれかで穴の中に位置するように先細りであるアレイの図である。
【図９】図９は、機械的プランジャーを、サンプリングする貫通穴の上に位置させて、そのプランジャーを穴の中に押し出し、貫通穴アレイのすぐ下側に位置するマイクロタイタープレートのウエルに穴の内容物を移すのを連続して速く行う単一のサンプリングデバイスによる移送方法を図解する。
【図１０】図１０は、集束レーザービームによる空間的に局在化された加熱によって生じるガスジェットを用いて、物質を貫通穴アレイにおける貫通穴からマイクロタイタープレートのウエルに移すための方法を図解する。
【図１１】図１１は、貫通穴アレイの１つの表面に重ねられた薄いシートにランダムに分布する炸薬の局在化された発火によって引き起こされるガスジェットにより、物質をアレイの貫通穴からマイクロタイタープレートのウエルに移すための方法を図解する。
【図１２】図１２は、炸薬パターンが、アレイの貫通穴の位置に一致するシートを図解する。
【図１３】図１３は、大規模な並列のＨＰＬＣ分離を、質量分析のような本質的に連続した分析方法と接続するための方法を図解する。
【図１４】図１４は、クロマトグラフィーデバイスを図解する。
【図１５】図１５は、線状ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計を図解する。
【図１６】図１６は、物質のブロックに加工された面取りした貫通穴のアレイ、貫通穴アレイと同じ中心間の間隔を有するシリンジ列（この場合、シリンジの針は、空気圧により作動するバネ押しピンによってシリンジ列ホルダーに取り付けられる金属ブロックを貫通する）を図解する。
【図１７】図１７は、キャピラリー流路がシリンジによって加圧される図１６のアレイを図解する。
【図１８】図１８は、シリンジ列がキャピラリーチューブアレイにボルト締めされることを除いて、図１７と同様のアレイを図解する。
【図１９】図１９は、シリンジ列がキャピラリーチューブアレイにボルト締めされることを除いて、図１８と同様のアレイを図解する。
【図２０】図２０は、多数の溝付き表面を一緒に接着することによって、複数の貫通穴及び２つの対置する表面を有するプラテンを製造する方法を図解する。
【図２１】図２１は、照射光源及び２つの部分反射表面を特徴とする光学的共振器の内部に配置されたアレイを示す。
【図２２】図２２は、貫通穴アレイの内容物を取り出し、そしてそれらの内容物を移すためのデバイスを示す。このデバイスは、ノズル、貫通穴アレイを保持するためのステージ、及び捕獲チャンバーを保持するためのステージを有する。ノズル又は貫通穴アレイの二次元での動きを実現することができる。
【図２３】図２３は、プラテンの表面から過剰な液体をふき取るための方法を示す。このデバイスは、貫通穴アレイにサンプルを負荷し、そして効率的な方法で、過剰な液体をワイピング液体で除くことを可能にする。
【図２４】図２４は、複数の貫通穴を有するプラテンを検出デバイスの内部に整列させるためのデバイスを示し、この場合、プラテンは、平坦な基部に取り付けられた２つのピンを包含するデバイスにより所定の位置に保持される。
【図２５】図２５は、細胞チップマイクロアレイのフローチャートを示す。直径が５０μｍ〜２００μｍの細孔を有する硬質の物質（例えば、金属又はポリスチレンなど）のプラテンが、多孔性膜に取り付けられ、これにより、多孔性の底部を有するマイクロウエルのアレイが形成される。細胞が加えられ、膜に接着させられ、その後、テスト化合物がマイクロスポット用のピンにより加えられる。インキュベーション後、膜は、タンパク質又はｍＲＮＡ発現の分析、又は目的の何れかのアッセイ若しくはアッセイ成分のために処理することができる。
【図２６】図２６は、１００ｕｇ／ｍＬのフィブロネクチンに浸けられ、２時間にわたって風乾された、１．０μｍの細孔サイズを有するポリカーボネート膜を示す。膜を、１０％アガロースを縁に加えることによってペトリ皿の底に取り付けた。ＰＫＣβ−ＧＦＰによりトランスフェクションされた２９３細胞を、５×１０５個／ｍＬの濃度で加え、３７℃にて５％ＣＯ２でインキュベーションした。画像を共焦点顕微鏡によって得た。
【図２７】図２７は、１００ｕｇ／ｍＬのフィブロネクチンに浸けられ、２時間にわたって風乾された、１．０μｍの細孔サイズを有するポリカーボネート膜を示す。膜を、１０％アガロースを縁に加えることによってペトリ皿の底に取り付けた。ＰＫＣβ−ＧＦＰによりトランスフェクションされた２９３細胞を５×１０５個／ｍＬの濃度で加え、３７℃にて５％ＣＯ２でインキュベーションした。次いで、１ｕＭのホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）を加え、３７℃にて５％ＣＯ２で１時間後、画像を共焦点顕微鏡によって取得した。
【図２８】図２８は、図１で実証されたように組み立てられた、金プラテン及び多孔性膜からなる細胞チップデバイスにおける膜に対する細胞の付着を示す。
【図２９】図２９は、金プラテンにおけるマイクロスポットを示す。３００メッシュの金プラテン（５０ｕｍ２の穴）を培地により湿らせた。１０％のＤＭＳＯ／ＰＢＳにおけるフルオレセインを、ＦＰ９浮動ピン（ＶＰ−ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてプラテンにスポットした。スポットを５倍の倍率で共焦点顕微鏡で調べた。
【図３０】図３０は、ヘキスト染料の細胞取り込みを示す。ＰＫＣβ−ＧＦＰ細胞を３００メッシュの金プラテン（５０ｕｍ２の穴）において一晩インキュベーションし、培地により洗浄した。その後、ヘキスト染料を、ブロッティングによって乾燥させたプラテンにスポットした。
【図３１】図３１は、金プラテンにおけるマイクロスポットを示す。３００メッシュの金プラテン（５０ｕｍ２の穴）を培地により湿らせるか、又はブロッティングによって短時間乾燥させた。１滴の鉱油をプラテンに加え、その後、１０％のＤＭＳＯ／ＰＢＳにおけるフルオレセインを、ＦＰ９浮動ピンを使用して加えた。スポットを５倍の倍率で共焦点顕微鏡で調べた。
【図３２】図３２は、ステンレススチールの細胞チップにおいて一晩インキュベーションし、その後、培地により洗浄されたＰＫＣβ−ＧＦＰ細胞によるヘキスト染料の細胞取り込みを示す。ヘキスト染料を、ブロッティングによって乾燥させた第１のプラテンにスポットした。テストされたステンレススチールのプラテン（National Jet Company, LaVale, M.D.）は１インチ四方であり、厚さが４００μｍであり、細孔の直径が１５０μｍであった。第２のプラテンを、中心部が切り抜いた接着性のシール用フィルムを使用して取り付けた。チップを、漏斗がプラテンとチャンバーの上部との間における小さいガスケットとともに除かれるサイトスピンサンプルチャンバーの中に置いた。
【図３３】図３３は、（図８に示されるように）２つのステンレススチール製プラテンの間に挟まれたａｎｏｐｏｒｅ膜を示す。ＰＫＣβ−ＧＦＰ細胞を加え、一晩インキュベーションした。プラテンと膜との間における培地の漏れの可能性があるため、ウエルにおける細胞の同じでない分布に留意すること。
【図３４】図３４は、厚さが２００μｍのタングステンのプラテンに基づく細胞マイクロアレイのプロトタイプを示す。プラテン（National Jet Company, LaVale, M.D.）は、直径が３００μｍの細孔を有し、４つのネジで取り付けられた。
【図３５】図３５は、（図３４に示されるように）２つのタングステンのプラテンの間に挟まれたａｎｏｐｏｒｅ膜における細胞培養を示す。ＰＫＣβ−ＧＦＰ細胞を加え、４８時間インキュベーションした。さらにしっかりと付着した、よりランダムに分布した細胞に注目されたい、しかしながら、プラテンは、細胞付着について未だ最適化されていない。
【図３６】図３６は、開放アレイ型の細胞チップ、及び浮動ピンを用いるアレイ上の単一のウエルへのＣ１２−レサズリンの送達を示す。
【図３７】図３７は、ＰＫＣβ−ＧＦＰでトランスフェクションされた細胞が５×１０５個／ｍＬで加えられ、３７℃にて５％ＣＯ２でインキュベーションされた開放アレイ型の細胞チップを示す。画像を共焦点顕微鏡によって得た。
【図３８】図３８は、ここでプラテンが示されていないことを除いて、本質的には、図１２に示されるものを示す。
【図３９】図３９は、本発明の１つの特定の態様（具体的には、インビトロ分析及びエクスビボ分析のための装置）を示す。直径が１０μｍ〜３００μｍの細孔を有する硬質の物質（例えば、金属又はポリスチレン）のプラテンが、多孔性膜又は修飾ガラス表面に取り付けられ、これにより、多孔性の底部を有するマイクロウエルのアレイが形成される。細胞を加え、膜に一晩接着して、その後、テスト化合物をマイクロスポット用のピンにより加える。インキュベーション後、ハイコンテント画像分析が行われる。膜は、タンパク質又はｍＲＮＡ発現の分析、又は目的の他のアッセイ若しくはアッセイ成分のために処理される。
【図４０】図４０は、本質的には、図１５に示されるものであり、しかし、個々のウエルの断面が示される。
【図４１】図４１は、個々のウエルをシールするために膜及び／又はガスケットへの圧力を増大させるための構造的補強を示す。
【図１】
2009504161.tif 000003
【図２】
2009504161.tif 000004
【図３】
2009504161.tif 000005
【図４】
2009504161.tif 000006
【図５】
2009504161.tif 000007
【図６】
2009504161.tif 000008
【図７】
2009504161.tif 000009
【図８】
2009504161.tif 000010
【図９】
2009504161.tif 000011
【図１０】
2009504161.tif 000012
【図１１】
2009504161.tif 000013
【図１２】
2009504161.tif 000014
【図１３】
2009504161.tif 000015
【図１４】
2009504161.tif 000016
【図１５】
2009504161.tif 000017
【図１６】
2009504161.tif 000018
【図１７】
2009504161.tif 000019
【図１８】
2009504161.tif 000020
【図１９】
2009504161.tif 000021
【図２０】
2009504161.tif 000022
【図２１】
2009504161.tif 000023
【図２２】
2009504161.tif 000024
【図２３】
2009504161.tif 000025
【図２４】
2009504161.tif 000026
【図２５】
2009504161.tif 000027
【図２６】
2009504161.tif 000028
【図２７】
2009504161.tif 000029
【図２８】
2009504161.tif 000030
【図２９】
2009504161.tif 000031
【図３０】
2009504161.tif 000032
【図３１】
2009504161.tif 000033
【図３２】
2009504161.tif 000034
【図３３】
2009504161.tif 000035
【図３４】
2009504161.tif 000036
【図３５】
2009504161.tif 000037
【図３６】
2009504161.tif 000038
【図３７】
2009504161.tif 000039
【図３８】
2009504161.tif 000040
【図３９】
2009504161.tif 000041
【図４０】
2009504161.tif 000042
【図４１】
2009504161.tif 000043
【国際調査報告】
2009504161.tif 000044
2009504161.tif 000045
2009504161.tif 000046