(57)【要約】Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、血液ガスＮＯの送達について、改善されたまたは最適な力学的および熱力学的特性を示すように変異する。操作されたＨ−ＮＯＸタンパク質には、対応する野生型Ｈ−ＮＯＸドメインと比較して変化したＮＯまたはＯ２リガンド結合を付与する変異が含まれ、これは、生理学的に適合する哺乳動物の血液ＮＯガス担体として作用する。本発明によってはまた、そのためにはＮＯの送達が有効である任意の症状の治療のための、野生型または変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質を使用する薬学的組成物、キット、および方法も提供される。
2009538133.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）薬学的に許容される量のＨ−ＮＯＸタンパク質であって、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ解離定数がヘモグロビンのＮＯ解離定数の大きさの２桁以内であり、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性がヘモグロビンのＮＯ反応性の少なくとも１０分の１未満である薬学的に許容される量のＨ−ＮＯＸタンパク質と、（ｉｉ）薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項２】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ解離定数が、ヘモグロビンのＮＯ解離定数の０．１倍〜１０倍の間である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ解離定数が、ヘモグロビンのＮＯ解離定数の０．５倍〜２倍の間である、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、ヘモグロビンのＮＯ反応性の少なくとも１００分の１未満である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、ヘモグロビンのＮＯ反応性の少なくとも１，０００分の１未満である、請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、約７００ｓ−１未満である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約０．０１２ｓ−１の間である、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約１×１０−３ｓ−１の間である、請求項８に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約１μＭである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約１０μＭである、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約５０μＭである、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間であり、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約１μＭである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間であり、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、約７００ｓ−１未満である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約１μＭであり、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、約７００ｓ−１未満である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化速度が、３７℃で約１ｈ−１未満である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間であり、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化速度が、３７℃で約１ｈ−１未満である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約１μＭであり、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化速度が、３７℃で約１ｈ−１未満である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化速度が、３７℃で約１ｈ−１未満であり、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、約７００ｓ−１未満である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
ヘムがＨ−ＮＯＸタンパク質に結合している、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が変異タンパク質である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、少なくとも１つの遠位ポケット変異を含む、請求項２１に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、前記遠位ポケット中にない少なくとも１つの変異を含む、請求項２０および２１のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、対応する野生型タンパク質と比較して、ＮＯ解離定数、ＮＯに対するｋｏｆｆ、ＮＯに対するｋ１、ＮＯに対するｋ２、Ｏ２解離定数、ＮＯ安定性、ヘム自動酸化速度、または上記の２つ以上の任意の組み合わせを変化させる、少なくとも１つの変異を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、対応する野生型タンパク質と比較して、ＮＯ反応性を変化させる少なくとも１つの変異を含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸのＴｙｒ１４０に対応する残基が任意の他のアミノ酸によって置き換えられる少なくとも１つの変異を含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ  ８  Ｈ−ＮＯＸのＰｈｅ１４８に対応する残基が任意の他のアミノ酸によって置き換えられる少なくとも１つの変異を含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質中の少なくとも１つのＣ末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質中の少なくとも約５０個の連続するＣ末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、請求項２８に記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質中の約２５個〜約２００個の連続するＣ末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、請求項２８および２９のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が以下：
【数１】
2009538133.tif 000035
【数２】
2009538133.tif 000036
からなる群より選択される、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の記載の薬学的組成物。
【請求項３２】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が以下からなる群より選択される、請求項３１に記載の薬学的組成物：野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ、野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−３８５）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−２１７）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−１９４）、野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０Ｆ、野生型Ｌ．ｐｎｅｕｏｐｈｉｌｉａ  １  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｈ−ＮＯＸ、およびＬ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｈ−ＮＯＸ  Ｆ１４２Ｙ。
【請求項３３】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が哺乳動物タンパク質であるか、または哺乳動物タンパク質由来である、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項３４】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質がヒトタンパク質であるか、またはヒトタンパク質由来である、請求項３３に記載の薬学的組成物。
【請求項３５】
前記ヒトタンパク質がβ１であるか、またはβ１由来である、請求項３４に記載の薬学的組成物。
【請求項３６】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が細菌タンパク質であるか、または細菌タンパク質由来である、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項３７】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質がＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓタンパク質であるか、またはＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓタンパク質由来である、請求項３６に記載の薬学的組成物。
【請求項３８】
ＮＯがＨ−ＮＯＸタンパク質に結合している、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項３９】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含む１つ以上のリポソームまたはナノ粒子を含む、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項４０】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が別の分子または部分に共有結合している、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項４１】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質がポリエチレングリコールに共有結合している、請求項４０に記載の薬学的組成物。
【請求項４２】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、請求項２４５〜３１４のいずれか１項に記載の変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質である、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項４３】
（ｉ）薬学的に許容される量のＨ−ＮＯＸタンパク質であって、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間であり、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約１μＭである、薬学的に許容される量のＨ−ＮＯＸタンパク質と、（ｉｉ）薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項４４】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約０．０１２ｓ−１の間である、請求項４３に記載の薬学的組成物。
【請求項４５】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約１×１０−３ｓ−１の間である、請求項４４に記載の薬学的組成物。
【請求項４６】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約１０μＭである、請求項４３〜４５のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項４７】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約５０μＭである、請求項４６に記載の薬学的組成物。
【請求項４８】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、約７００ｓ−１未満である、請求項４３〜４７のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項４９】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間であり、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約１μＭである、請求項４３〜４８のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項５０】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間であり、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、約７００ｓ−１未満である、請求項４３〜４９のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項５１】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約１μＭであり、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、約７００ｓ−１未満である、請求項４３〜５０のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項５２】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化速度が、３７℃で約１ｈ−１未満である、請求項４３〜５１のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項５３】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間であり、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化速度が、３７℃で約１ｈ−１未満である、請求項４３〜５２のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項５４】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約１μＭであり、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化速度が、３７℃で約１ｈ−１未満である、請求項４３〜５３のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項５５】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化速度が、３７℃で約１ｈ−１未満であり、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、約７００ｓ−１未満である、請求項４３〜５４のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項５６】
ヘムがＨ−ＮＯＸタンパク質に結合している、請求項４３〜５５のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項５７】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が変異タンパク質である、請求項４３〜５６のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項５８】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が少なくとも１つの遠位ポケット変異を含む、請求項５７に記載の薬学的組成物。
【請求項５９】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、遠位ポケット中にない少なくとも１つの変異を含む、請求項５７および５８のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項６０】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、対応する野生型タンパク質と比較して、ＮＯ解離定数、ＮＯに対するｋｏｆｆ、ＮＯに対するｋ１、ＮＯに対するｋ２、Ｏ２解離定数、ＮＯ安定性、ヘム自動酸化速度、または上記の２つ以上の任意の組み合わせを変化させる、少なくとも１つの変異を含む、請求項４３〜５９のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項６１】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、対応する野生型タンパク質と比較して、ＮＯ反応性を変化させる少なくとも１つの変異を含む、請求項４３〜６０のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項６２】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸのＴｙｒ１４０に対応する残基が任意の他のアミノ酸によって置き換えらる少なくとも１つの変異を含む、請求項４３〜６１のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項６３】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ  ８  Ｈ−ＮＯＸのＰｈｅ１４８に対応する残基が任意の他のアミノ酸によって置き換えられる少なくとも１つの変異を含む、請求項４３〜６２のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項６４】
変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質中の少なくとも１つのＣ末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、請求項４３〜６３のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項６５】
変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質中の少なくとも約５０個の連続するＣ末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、請求項６４に記載の薬学的組成物。
【請求項６６】
変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質中の約２５個〜約２００個の連続するＣ末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、請求項６４および６５のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項６７】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が以下：
【数３】
2009538133.tif 000037
【数４】
2009538133.tif 000038
からなる群より選択される、請求項４３〜６６のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項６８】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が以下からなる群より選択される、請求項６７に記載の薬学的組成物：野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ、野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−３８５）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−２１７）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−１９４）、野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０Ｆ、野生型Ｌ．ｐｎｅｕｏｐｈｉｌｉａ  １  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｈ−ＮＯＸ、およびＬ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｈ−ＮＯＸ  Ｆ１４２Ｙ。
【請求項６９】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が哺乳動物タンパク質であるか、または哺乳動物タンパク質由来である、請求項４３〜６８のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項７０】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質がヒトタンパク質であるか、またはヒトタンパク質由来である、請求項６９に記載の薬学的組成物。
【請求項７１】
前記ヒトタンパク質がβ１であるか、またはβ１由来である、請求項７０に記載の薬学的組成物。
【請求項７２】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が細菌タンパク質であるか、または細菌タンパク質由来である、請求項４３〜６８のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項７３】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質がＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓタンパク質であるか、またはＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓタンパク質由来である、請求項７２に記載の薬学的組成物。
【請求項７４】
ＮＯがＨ−ＮＯＸタンパク質に結合している、請求項４３〜７３のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項７５】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含む１つ以上のリポソームまたはナノ粒子を含む、請求項４３〜７４のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項７６】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が別の分子または部分に共有結合している、請求項４３〜７５のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項７７】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質がポリエチレングリコールに共有結合している、請求項７６に記載の薬学的組成物。
【請求項７８】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、請求項２４５〜３１４のいずれか１項に記載の変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質である、請求項４３〜７７のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項７９】
個体へＮＯを送達する方法であって、前記方法は、前記送達を必要とする個体へ有効量のＮＯを送達するために十分な量のＨ−ＮＯＸタンパク質を前記個体へ投与する工程を含み、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ解離定数はヘモグロビンのＮＯ解離定数の大きさの２桁以内であり、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性はヘモグロビンのＮＯ反応性の少なくとも１０分の１未満である、方法。
【請求項８０】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ解離定数が、ヘモグロビンのＮＯ解離定数の０．１倍〜１０倍の間である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ解離定数が、ヘモグロビンのＮＯ解離定数の０．５倍〜２倍の間である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、ヘモグロビンのＮＯ反応性の少なくとも１００分の１未満である、請求項７９〜８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、ヘモグロビンのＮＯ反応性の少なくとも１，０００分の１未満である、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、約７００ｓ−１未満である、請求項７９〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間である、請求項７９〜８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約０．０１２ｓ−１の間である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約１×１０−３ｓ−１の間である、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約１μＭである、請求項７９〜８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約１０μＭである、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約５０μＭである、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間であり、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約１μＭである、請求項７９〜９０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９２】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間であり、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、約７００ｓ−１未満である、請求項７９〜９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９３】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約１μＭであり、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、約７００ｓ−１未満である、請求項７９〜９２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９４】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化速度が、３７℃で約１ｈ−１未満である、請求項７９〜９３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９５】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間であり、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化速度が、３７℃で約１ｈ−１未満である、請求項７９〜９４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９６】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約１μＭであり、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化速度が、３７℃で約１ｈ−１未満である、請求項７９〜９５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９７】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化速度が、３７℃で約１ｈ−１未満であり、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、約７００ｓ−１未満である、請求項７９〜９６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９８】
ヘムがＨ−ＮＯＸタンパク質に結合している、請求項７９〜９７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９９】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が変異タンパク質である、請求項７９〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１００】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が少なくとも１つの遠位ポケット変異を含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、遠位ポケット中にない少なくとも１つの変異を含む、請求項９９および１００のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、対応する野生型タンパク質と比較して、ＮＯ解離定数、ＮＯに対するｋｏｆｆ、ＮＯに対するｋ１、ＮＯに対するｋ２、Ｏ２解離定数、ＮＯ安定性、ヘム自動酸化速度、または上記の２つ以上の任意の組み合わせを変化させる、少なくとも１つの変異を含む、請求項７９〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、対応する野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質と比較して、ＮＯ反応性を変化させる少なくとも１つの変異を含む、請求項７９〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸのＴｙｒ１４０に対応する残基が任意の他のアミノ酸によって置き換えられる少なくとも１つの変異が含む、請求項７９〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ  １０  Ｈ−ＮＯＸのＰｈｅ１４１０に対応する残基が任意の他のアミノ酸によって置き換えられる少なくとも１つの変異を含む、請求項７９〜１０４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０６】
変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質中の少なくとも１つのＣ末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、請求項７９〜１０５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０７】
変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質中の少なくとも約５０個の連続するＣ末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質中の約２５個〜約２００個のＣ末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、請求項１０６および１０７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が以下
【数５】
2009538133.tif 000039
【数６】
2009538133.tif 000040
からなる群より選択される、請求項７９〜１０８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が以下からなる群より選択される、請求項１０９に記載の方法：野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ、野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−３１０５）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−２１７）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−１１０４）、野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０Ｆ、野生型Ｌ．ｐｎｅｕｏｐｈｉｌｉａ  １  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｈ−ＮＯＸ、およびＬ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｈ−ＮＯＸ  Ｆ１４２Ｙ。
【請求項１１１】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が哺乳動物タンパク質であるか、または哺乳動物タンパク質由来である、請求項７９〜１１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質がヒトタンパク質であるか、またはヒトタンパク質由来である、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記ヒトタンパク質がβ１であるか、またはβ１由来である、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が細菌タンパク質であるか、または細菌タンパク質由来である、請求項７９〜１１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質がＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓタンパク質であるか、またはＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓタンパク質由来である、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含む１つ以上のリポソームまたはナノ粒子を含む、請求項７９〜１１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が別の分子または部分に共有結合している、請求項７９〜１１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質がポリエチレングリコールに共有結合している、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
ＮＯが、前記個体へのＨ−ＮＯＸタンパク質の投与の前に、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質に結合する、請求項７９〜１１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２０】
ＮＯが、前記個体へのＨ−ＮＯＸタンパク質の投与の前に、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質に結合せず、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、個体中の１つの位置から個体中の別の位置にＮＯを輸送する、請求項７９〜１１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２１】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、経口投与、直腸投与、または個体の血液に投与される、請求項７９〜１２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記個体がヒトである、請求項７９〜１２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２３】
前記個体が、心臓血管の症状、高血圧、高血圧によって悪化した症状、またはＮＯ機能不全に罹患しているか、あるいはそれらの危険性がある、請求項７９〜１２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２４】
前記高血圧によって悪化した症状が、心不全、腎不全、または脳卒中である、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が少なくとも２回個体に投与される、請求項７９〜１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２６】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、請求項２４５〜３１４のいずれか１項に記載の変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質である、請求項７９〜１２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２７】
個体へＮＯを送達する方法であって、前記方法は、前記送達を必要とする個体へ有効量のＮＯを送達するために十分な量のＨ−ＮＯＸタンパク質を前記個体へ投与する工程を含み、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間であり、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約１μＭである、方法。
【請求項１２８】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約０．０１２ｓ−１の間である、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約１×１０−３ｓ−１の間である、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約１０μＭである、請求項１２７〜１２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３１】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約５０μＭである、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、約７００ｓ−１未満である、請求項１２７〜１３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３３】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間であり、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約１μＭである、請求項１２７〜１３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３４】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間であり、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、約７００ｓ−１未満である、請求項１２７〜１３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３５】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約１μＭであり、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、約７００ｓ−１未満である、請求項１２７〜１３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３６】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化速度が、３７℃で約１ｈ−１未満である、請求項１２７〜１３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３７】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間であり、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化速度が、３７℃で約１ｈ−１未満である、請求項１２７〜１３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３８】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約１μＭであり、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化速度が、３７℃で約１ｈ−１未満である、請求項１２７〜１３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３９】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化速度が、３７℃で約１ｈ−１未満であり、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、約７００ｓ−１未満である、請求項１２７〜１３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４０】
ヘムがＨ−ＮＯＸタンパク質に結合している、請求項１２７〜１３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４１】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が変異タンパク質である、請求項１２７〜１４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４２】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が少なくとも１つの遠位ポケット変異を含む、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、遠位ポケット中にない少なくとも１つの変異を含む、請求項１４１および１４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４４】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、対応する野生型タンパク質と比較して、ＮＯ解離定数、ＮＯに対するｋｏｆｆ、ＮＯに対するｋ１、ＮＯに対するｋ２、Ｏ２解離定数、ＮＯ安定性、ヘム自動酸化速度、または上記の２つ以上の任意の組み合わせを変化させる、少なくとも１つの変異を含む、請求項１２７〜１４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４５】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、対応する野生型タンパク質と比較してＮＯ反応性を変化させる少なくとも１つの変異を含む、請求項１２７〜１４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４６】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸのＴｙｒ１４０に対応する残基が任意の他のアミノ酸によって置き換えられる少なくとも１つの変異を含む、請求項１２７〜１４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４７】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ  １０  Ｈ−ＮＯＸのＰｈｅ１４１０に対応する残基が任意の他のアミノ酸によって置き換えられる少なくとも１つの変異を含む、請求項１２７〜１４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４８】
変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質中の少なくとも１つのＣ末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、請求項１２７〜１４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４９】
変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質中の少なくとも約５０個の連続するＣ末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質中の約２５個〜約２００個の連続するＣ末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、請求項１４８および１４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５１】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が以下：
【数７】
2009538133.tif 000041
【数８】
2009538133.tif 000042
からなる群より選択される、請求項１２７〜１５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５２】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が以下からなる群より選択される、請求項１５１に記載の方法：野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ、野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−３１０５）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−２１７）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−１１０４）、野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０Ｆ、野生型Ｌ．ｐｎｅｕｏｐｈｉｌｉａ  １  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｈ−ＮＯＸ、およびＬ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｈ−ＮＯＸ  Ｆ１４２Ｙ。
【請求項１５３】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が哺乳動物タンパク質であるか、または哺乳動物タンパク質由来である、請求項１２７〜１５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５４】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質がヒトタンパク質であるか、またはヒトタンパク質由来である、請求項１５３に記載の方法。
【請求項１５５】
前記ヒトタンパク質がβ１であるか、またはβ１由来である、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が細菌タンパク質であるか、または細菌タンパク質由来である、請求項１２７〜１５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５７】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質がＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓタンパク質であるか、またはＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓタンパク質由来である、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５８】
１つ以上のリポソームまたはナノ粒子が前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含む、請求項１２７〜１５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５９】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が別の分子または部分に共有結合している、請求項１２７〜１５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６０】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質がポリエチレングリコールに共有結合している、請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６１】
ＮＯが、前記個体へのＨ−ＮＯＸタンパク質の投与の前に、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質に結合する、請求項１２７〜１６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６２】
ＮＯが、前記個体へのＨ−ＮＯＸタンパク質の投与の前に、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質に結合せず、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、個体中の１つの位置から個体中の別の位置にＮＯを輸送する、請求項１２７〜１６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６３】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、経口投与、直腸投与、または個体の血液に投与される、請求項１２７〜１６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６４】
前記個体がヒトである、請求項１２７〜１６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６５】
前記個体が、心臓血管の症状、高血圧、高血圧によって悪化した症状、血管収縮の症状、脳卒中、またはＮＯ機能不全に罹患しているか、あるいはそれらの危険性がある、請求項１２７〜１６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６６】
前記高血圧によって悪化した症状が、心不全、腎不全、または脳卒中である、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１６７】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が少なくとも２回個体に投与される、請求項１２７〜１６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６８】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、請求項２４５〜３１４のいずれか１項に記載の変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質である、請求項１２７〜１６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６９】
（ｉ）薬学的に許容される量のＨ−ＮＯＸタンパク質であって、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ解離定数がヘモグロビンのＮＯ解離定数の大きさの２桁以内であり、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性がヘモグロビンのＮＯ反応性の少なくとも１０分の１未満である薬学的に許容される量のＨ−ＮＯＸタンパク質と、（ｉｉ）薬学的に許容される担体を含む、キット。
【請求項１７０】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ解離定数が、ヘモグロビンのＮＯ解離定数の０．１倍〜１０倍の間である、請求項１６９に記載のキット。
【請求項１７１】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ解離定数が、ヘモグロビンのＮＯ解離定数の０．５倍〜２倍の間である、請求項１７０に記載のキット。
【請求項１７２】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、ヘモグロビンのＮＯ反応性の少なくとも１００分の１未満である、請求項１６９〜１７１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１７３】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、ヘモグロビンのＮＯ反応性の少なくとも１，０００分の１未満である、請求項１７２に記載のキット。
【請求項１７４】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、約７００ｓ−１未満である、請求項１６９〜１７３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１７５】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間である、請求項１６９〜１７４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１７６】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約０．０１２ｓ−１の間である、請求項１７５に記載のキット。
【請求項１７７】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約１×１０−３ｓ−１の間である、請求項１７６に記載のキット。
【請求項１７８】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約１μＭである、請求項１６９〜１７７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１７９】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約１０μＭである、請求項１７８に記載のキット。
【請求項１８０】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約５０μＭである、請求項１７９に記載のキット。
【請求項１８１】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間であり、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約１μＭである、請求項１６９〜１８０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１８２】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間であり、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、約７００ｓ−１未満である、請求項１６９〜１８１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１８３】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約１μＭであり、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、約７００ｓ−１未満である、請求項１６９〜１８２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１８４】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化速度が、３７℃で約１ｈ−１未満である、請求項１６９〜１８３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１８５】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間であり、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化速度が、３７℃で約１ｈ−１未満である、請求項１６９〜１８４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１８６】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約１μＭであり、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化速度が、３７℃で約１ｈ−１未満である、請求項１６９〜１８５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１８７】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化速度が、３７℃で約１ｈ−１未満であり、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、約７００ｓ−１未満である、請求項１６９〜１８６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１８８】
ヘムがＨ−ＮＯＸタンパク質に結合している、請求項１６９〜１８７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１８９】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が変異タンパク質である、請求項１６９〜１８８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１９０】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が少なくとも１つの遠位ポケット変異を含む、請求項１８９に記載のキット。
【請求項１９１】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、遠位ポケット中にない少なくとも１つの変異を含む、請求項１８９および１９０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１９２】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、対応する野生型タンパク質と比較して、ＮＯ解離定数、ＮＯに対するｋｏｆｆ、ＮＯに対するｋ１、ＮＯに対するｋ２、Ｏ２解離定数、ＮＯ安定性、ヘム自動酸化速度、または上記の２つ以上の任意の組み合わせを変化させる、少なくとも１つの変異を含む、請求項１６９〜１９１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１９３】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、対応する野生型タンパク質と比較して、ＮＯ反応性を変化させる少なくとも１つの変異を含む、請求項１６９〜１９２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１９４】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸのＴｙｒ１４０に対応する残基が任意の他のアミノ酸によって置き換えられる少なくとも１つの変異を含む、請求項１６９〜１９３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１９５】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ  ９  Ｈ−ＮＯＸのＰｈｅ１４９に対応する残基が任意の他のアミノ酸によって置き換えられる少なくとも１つの変異を含む、請求項１６９〜１９４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１９６】
変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質中の少なくとも１つのＣ末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、請求項１６９〜１９５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１９７】
変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質中の少なくとも約５０個の連続するＣ末端アミノ酸、または約２５個〜約２００個のＣ末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、請求項１９６に記載のキット。
【請求項１９８】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が以下：
【数９】
2009538133.tif 000043
【数１０】
2009538133.tif 000044
からなる群より選択される、請求項１６９〜１９７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１９９】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が以下からなる群より選択される、請求項１９８に記載のキット：野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ、野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−３９５）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−２１７）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−１９４）、野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０Ｆ、野生型Ｌ．ｐｎｅｕｏｐｈｉｌｉａ  １  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｈ−ＮＯＸ、およびＬ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｈ−ＮＯＸ  Ｆ１４２Ｙ。
【請求項２００】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が哺乳動物タンパク質であるか、または哺乳動物タンパク質由来である、請求項１６９〜１９９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２０１】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質がヒトタンパク質であるか、ヒトタンパク質由来であるか、ヒトβ１であるか、またはβ１由来である、請求項２００に記載のキット。
【請求項２０２】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が細菌タンパク質であるか、または細菌タンパク質由来である、請求項１６９〜１９９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２０３】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質がＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓタンパク質であるか、またはＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓタンパク質由来である、請求項２０２に記載のキット。
【請求項２０４】
ＮＯがＨ−ＮＯＸタンパク質に結合している、請求項１６９〜２０３のいずれか１項に記載のキット
【請求項２０５】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含む１つ以上のリポソームまたはナノ粒子を含む、請求項１６９〜２０４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２０６】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が別の分子または部分に共有結合している、請求項１６９〜２０５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２０７】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質がポリエチレングリコールに共有結合している、請求項２０６に記載のキット。
【請求項２０８】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、請求項２４５〜３１４のいずれか１項に記載の変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質である、請求項１６９〜２０７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２０９】
（ｉ）Ｈ−ＮＯＸタンパク質であって、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約１×１０ｓ−１の間であり、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約１μＭであるＨ−ＮＯＸタンパク質と、（ｉｉ）個体にＮＯを送達するためのキットの使用についての説明書を含む、キット。
【請求項２１０】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約０．０１２ｓ−１の間である、請求項２０９に記載のキット。
【請求項２１１】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約１×１０−３ｓ−１の間である、請求項２１０に記載のキット。
【請求項２１２】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約１０μＭである、請求項２０９〜２１１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２１３】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約５０μＭである、請求項２１２に記載のキット。
【請求項２１４】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、約７００ｓ−１未満である、請求項２０９〜２１３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２１５】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間であり、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約１μＭである、請求項２０９〜２１４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２１６】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間であり、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、約７００ｓ−１未満である、請求項２０９〜２１５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２１７】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約１μＭであり、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、約７００ｓ−１未満である、請求項２０９〜２１６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２１８】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化速度が、３７℃で約１ｈ−１未満である、請求項２０９〜２１７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２１９】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間であり、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化速度が、３７℃で約１ｈ−１未満である、請求項２０９〜２１８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２２０】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約１μＭであり、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化速度が、３７℃で約１ｈ−１未満である、請求項２０９〜２１９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２２１】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化速度が、３７℃で約１ｈ−１未満であり、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、約７００ｓ−１未満である、請求項２０９〜２２０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２２２】
ヘムがＨ−ＮＯＸタンパク質に結合している、請求項２０９〜２２１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２２３】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が変異タンパク質である、請求項２０９〜２２２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２２４】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が少なくとも１つの遠位ポケット変異を含む、請求項２２３に記載のキット。
【請求項２２５】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、遠位ポケット中にない少なくとも１つの変異を含む、請求項２２３および２２４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２２６】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、対応する野生型タンパク質と比較して、ＮＯ解離定数、ＮＯに対するｋｏｆｆ、ＮＯに対するｋ１、ＮＯに対するｋ２、Ｏ２解離定数、ＮＯ安定性、ヘム自動酸化速度、または上記の２つ以上の任意の組み合わせを変化させる、少なくとも１つの変異を含む、請求項２０９〜２２５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２２７】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、対応する野生型タンパク質と比較してＮＯ反応性を変化させる少なくとも１つの変異を含む、請求項２０９〜２２６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２２８】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸのＴｙｒ１４０に対応する１つの残基が任意の他のアミノ酸によって置き換えられる少なくとも１つの変異を含む、請求項２０９〜２２７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２２９】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ  ９  Ｈ−ＮＯＸのＰｈｅ１４９に対応する１つの残基が任意の他のアミノ酸によって置き換えられる少なくとも１つの変異を含む、請求項２０９〜２２８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２３０】
変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質中の少なくとも１つのＣ末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、請求項２０９〜２２９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２３１】
変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質中の少なくとも約５０個の連続するＣ末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、請求項２３０に記載のキット。
【請求項２３２】
変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質中の約２５個〜約２００個の連続するＣ末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、請求項２３０および２３１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２３３】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が以下：
【数１１】
2009538133.tif 000045
【数１２】
2009538133.tif 000046
からなる群より選択される、請求項２０９〜２３２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２３４】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が以下からなる群より選択される、請求項２３３に記載のキット：野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ、野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−３９５）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−２１７）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−１９４）、野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０Ｆ、野生型Ｌ．ｐｎｅｕｏｐｈｉｌｉａ  １  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｈ−ＮＯＸ、およびＬ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｈ−ＮＯＸ  Ｆ１４２Ｙ。
【請求項２３５】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が哺乳動物タンパク質であるか、または哺乳動物タンパク質由来である、請求項２０９〜２３４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２３６】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質がヒトタンパク質であるか、またはヒトタンパク質由来である、請求項２３５に記載のキット。
【請求項２３７】
前記ヒトタンパク質がβ１であるか、またはβ１由来である、請求項２３６に記載のキット。
【請求項２３８】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が細菌タンパク質であるか、または細菌タンパク質由来である、請求項２０９〜２３４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２３９】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質がＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓタンパク質であるか、またはＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓタンパク質由来である、請求項２３８に記載のキット。
【請求項２４０】
ＮＯがＨ−ＮＯＸタンパク質に結合している、請求項２０９〜２３９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２４１】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含む１つ以上のリポソームまたはナノ粒子を含む、請求項２０９〜２４０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２４２】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が別の分子または部分に共有結合している、請求項２０９〜２４１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２４３】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質がポリエチレングリコールに共有結合している、請求項２４２に記載のキット。
【請求項２４４】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、請求項２４５〜３１４のいずれか１項に記載の変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質である、請求項２０９〜２４３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２４５】
対応する野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質と比較して、ＮＯ解離定数またはＮＯ反応性を変化させる少なくとも１つの変異を含む、単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質であって、前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ解離定数は、ヘモグロビンのＮＯ解離定数の大きさの２桁以内であり、前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、ヘモグロビンのＮＯ反応性の少なくとも１０分の１未満であり、前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ４０Ｌ、野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ、またはＬ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｈ−ＮＯＸ  Ｆ１４２Ｙではない、単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２４６】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｆ７８Ｙ／Ｙ１４０Ｌではない、請求項２４５に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２４７】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質が以下ではない、請求項２４５および２４６のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質：野生型Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ（１−３８５）、野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ  β１  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ  ＣＧ１４８８５−ＰＡ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＧＣＹ−３５  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｓ．ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ、または野生型Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  Ｈ−ＮＯＸ。
【請求項２４８】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質が以下ではない、請求項２４５〜２４７のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質：Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｗ９Ｆ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０Ｆ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−３８５）Ｉ１４５Ｙ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｈ１０５Ｇ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｈ１０５Ｆ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｉ１４５Ｙ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｃ７８Ｓ、またはＲ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｃ７８Ｅ。
【請求項２４９】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０ＨまたはＨ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１  Ｉ１４０Ｙではない、請求項２４５〜２４８のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２５０】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ解離定数が、ヘモグロビンのＮＯ解離定数の０．１倍〜１０倍の間である、請求項２４５〜２４９のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２５１】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ解離定数が、ヘモグロビンのＮＯ解離定数の０．５倍〜２倍の間である、請求項２５０に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２５２】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、ヘモグロビンのＮＯ反応性の少なくとも１００分の１未満である、請求項２４５〜２５１のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２５３】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、ヘモグロビンのＮＯ反応性の少なくとも１，０００分の１未満である、請求項２５２に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２５４】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、約７００ｓ−１未満である、請求項２４５〜２５３のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２５５】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間である、請求項２４５〜２５４のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２５６】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約０．０１２ｓ−１の間である、請求項２４５〜２５５のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２５７】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約１×１０−３ｓ−１の間である、請求項２４５〜２５６のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２５８】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約１μＭである、請求項２４５〜２５７のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２５９】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約１０μＭである、請求項２４５〜２５８のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２６０】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約５０μＭである、請求項２５９に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２６１】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間であり、前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約１μＭである、請求項２４５〜２６０のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２６２】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間であり、前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、約７００ｓ−１未満である、請求項２４５〜２６１のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２６３】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約１μＭであり、前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、約７００ｓ−１未満である、請求項２４５〜２６２のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２６４】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化速度が、３７℃で約１ｈ−１未満である、請求項２４５〜２６３のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２６５】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間であり、前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化速度が、３７℃で約１ｈ−１未満である、請求項２４５〜２６４のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２６６】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約１μＭであり、前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化速度が、３７℃で約１ｈ−１未満である、請求項２４５〜２６５のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２６７】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化速度が、３７℃で約１ｈ−１未満であり、前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、約７００ｓ−１未満である、請求項２４５〜２６６のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２６８】
少なくとも１つの遠位ポケット変異を含む、請求項２４５〜２６７のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２６９】
遠位ポケット中にない少なくとも１つの変異を含む、請求項２４５〜２６８のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２７０】
Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸのＴｙｒ１４０に対応する残基が任意の他のアミノ酸によって置き換えられる少なくとも１つの変異を含む、請求項２４５〜２６９のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２７１】
Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ  ２  Ｈ−ＮＯＸのＰｈｅ１４２に対応する残基が任意の他のアミノ酸によって置き換えられる少なくとも１つの変異を含む、請求項２４５〜２７０のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２７２】
少なくとも１つのＣ末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、請求項２４５〜２７１のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２７３】
少なくとも約５０個の連続するＣ末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、請求項２７２に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２７４】
約２５個〜約２００個の連続するＣ末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、請求項２７２および２７３のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２７５】
前記対応する野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が哺乳動物タンパク質である、請求項２４５〜２７４のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２７６】
前記対応する野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質がヒトタンパク質である、請求項２７５に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２７７】
前記対応する野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質がβ１である、請求項２７６に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２７８】
前記対応する野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が細菌タンパク質である、請求項２４５〜２７４のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２７９】
前記対応する野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質がＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓタンパク質である、請求項２７８に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２８０】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質が別の分子または部分に共有結合している、請求項２４５〜２７９のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２８１】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質がポリエチレングリコールに共有結合している、請求項２８０に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２８２】
対応する野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質と比較して、ＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２を変化させるか、あるいはＯ２解離定数を変化させる少なくとも１つの変異を含む、単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質であって、前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２は、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間であり、前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約１μＭであり、前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ４０Ｌ、野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ、またはＬ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｈ−ＮＯＸ  Ｆ１４２Ｙではない、単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２８３】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｆ７８Ｙ／Ｙ１４０Ｌではない、請求項２８２に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２８４】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質が以下ではない、請求項２８２および２８３のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質：野生型Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ（１−３８５）、野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ  β１  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ  ＣＧ１４８８５−ＰＡ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＧＣＹ−３５  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｓ．ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ、または野生型Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  Ｈ−ＮＯＸ。
【請求項２８５】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質が以下ではない、請求項２８２〜２８４のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質：Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｗ９Ｆ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０Ｆ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−３８５）Ｉ１４５Ｙ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｈ１０５Ｇ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｈ１０５Ｆ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｉ１４５Ｙ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｃ７８Ｓ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｃ７８Ｅ、またはＨ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸ（１−３８５）Ｉ１４５Ｙ。
【請求項２８６】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０ＨまたはＨ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１  Ｉ１４０Ｙではない、請求項２８２〜２８５のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２８７】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約０．０１２ｓ−１の間である、請求項２８２〜２８６のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２８８】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約１×１０−３ｓ−１の間である、請求項２８７に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２８９】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約１０μＭである、請求項２８２〜２８８のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２９０】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約５０μＭである、請求項２８９に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２９１】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、約７００ｓ−１未満である、請求項２８２〜２９０のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２９２】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間であり、前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約１μＭである、請求項２８２〜２９１のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２９３】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間であり、前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、約７００ｓ−１未満である、請求項２８２〜２９２のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２９４】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約１μＭであり、前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、約７００ｓ−１未満である、請求項２８２〜２９３のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２９５】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化速度が、３７℃で約１ｈ−１未満である、請求項２８２〜２９４のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２９６】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２が、３７℃で約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間であり、前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化速度が、３７℃で約１ｈ−１未満である、請求項２８２〜２９５のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２９７】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、３７℃で少なくとも約１μＭであり、前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化速度が、３７℃で約１ｈ−１未満である、請求項２８２〜２９６のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２９８】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化速度が、３７℃で約１ｈ−１未満であり、前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、約７００ｓ−１未満である、請求項２８２〜２９７のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項２９９】
少なくとも１つの遠位ポケット変異を含む、請求項２８２〜２９８のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項３００】
遠位ポケット中にない少なくとも１つの変異を含む、請求項２８２〜２９９のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項３０１】
Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸのＴｙｒ１４０に対応する残基が任意の他のアミノ酸によって置き換えられる少なくとも１つの変異を含む、請求項２８２〜３００のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項３０２】
Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ  ２  Ｈ−ＮＯＸのＰｈｅ１４２に対応する残基が任意の他のアミノ酸によって置き換えられる少なくとも１つの変異を含む、請求項２８２〜３０１のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項３０３】
少なくとも１つのＣ末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、請求項２８２〜３０２のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項３０４】
少なくとも約５０個の連続するＣ末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、請求項３０３に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項３０５】
約２５個〜約２００個の連続するＣ末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、請求項３０３および３０４のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項３０６】
前記対応する野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が哺乳動物タンパク質である、請求項２８２〜３０５のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項３０７】
前記対応する野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質がヒトタンパク質である、請求項３０６に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項３０８】
前記対応する野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質がβ１である、請求項３０７に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項３０９】
前記対応する野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が細菌タンパク質である、請求項２８２〜３０５のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項３１０】
前記対応する野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質がＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓタンパク質である、請求項３０９に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項３１１】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質が別の分子または部分に共有結合している、請求項２８２〜３１０のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項３１２】
前記変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質がポリエチレングリコールに共有結合している、請求項３１１に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項３１３】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ解離定数が、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓヘモグロビンαのＮＯ解離定数の大きさの２桁以内である、請求項２７９〜３９５のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項３１４】
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓヘモグロビンαのＮＯ反応性の少なくとも１０分の１未満である、請求項２７９〜３９６のいずれか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質。
【請求項３１５】
請求項２４５〜３１４のいずれか１項に記載のＨ−ＮＯＸタンパク質をコードする組換え型核酸。
【請求項３１６】
請求項３１５に記載の核酸を含むベクター。
【請求項３１７】
請求項３１５に記載の核酸を含む細胞。
【請求項３１８】
請求項３１６に記載のベクターを含む細胞。
【請求項３１９】
タンパク質の生産に適している条件下で、請求項２４５〜３１４のいずれか１項に記載のＨ−ＮＯＸタンパク質をコードする核酸を含む細胞を培養する工程を含む、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の生産方法。
【請求項３２０】
Ｈ−ＮＯＸタンパク質を精製する工程をさらに含む、請求項３１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  ａｎｄ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」（ＵＣ  Ｃａｓｅ  Ｎｏ．Ｂ０６−０８４）という表題の、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ａ．Ｍａｒｌｅｔｔａ，Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｐ．Ｌ．Ｃａｒｙ，Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ  Ｍ．Ｂｏｏｎによる、２００６年５月２２日に出願された米国仮特許出願第＿＿号の利益を請求する。この仮特許は、２００６年５月２２日に出願された米国特許出願第１１／４４０，５８８号から、２００７年５月１日における仮特許出願に変更され、その開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（政府支援の研究または開発に関する陳述）
本研究は、助成金番号ＤＥ−ＡＣ０３−７６ＳＦに支援された。米国政府は、本出願にかかる任意の特許に権利を有し得る。
【０００３】
（技術分野）
本出願は、Ｈ−ＮＯＸタンパク質、および一酸化窒素（ＮＯ）を送達するためにそれらを使用する方法に関する。Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、ヒトにＮＯを送達するため、および動物についての獣医学的目的のための新規の治療用ツールを提供する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
ＮＯは、インビボでは、多くの重要なプロセスの制御において化学的メッセンジャーとしての役割を担っており、これには、血管拡張、神経伝達、炎症、血小板の凝集、ならびに消化管と血管の平滑筋の緊張の調節を含む。１８６７年のＤｒｓ．Ｌａｕｄｅｒ  ＢｒｕｎｔｏｎおよびＷｉｌｌｉａｍｓ  Ｍｕｒｒｅｌｌによる、ニトログリセリン（ＧＴＮ）が狭心症のような心疾患の症状を治療できることの発見から、有機硝酸塩は、血管収縮の急性の症例を治療するために広く使用されている。最近の数十年の間に、血管拡張の機構が明らかになってきた。内皮細胞の中で合成されるＮＯは平滑筋細胞に拡散し、可溶性のグアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）を活性化させてサイクリックＧＭＰを生じさせ、それにより拡張を誘導する。その結果、有機硝酸塩の臨床的な作用機構には、ＮＯへのそれらの生体内変換と、それに続くｓＧＣの活性化が必要されると推定される。しかし、有機硝酸塩は、耐性と呼ばれる表現形が原因で、２４〜４８時間後に、患者において効果がなくなる。したがって、高血圧の慢性的な症例の治療については、β−ブロッカー、およびＡＣＥ阻害剤のような化合物が使用される。しかし、これらには多くの制限と副作用がある。したがって、ニトロ系血管拡張剤が、狭心症および心筋梗塞のような、症状を緩和するために迅速な血管拡張が必要な急性の症状の治療には最も有用である。有機硝酸塩の長期にわたる投与によっては、効力の低下が生じ、血管系は無反応になる。この耐性は、慢性および急性のいずれの症例においても、それらをさらに使用することを妨げる。したがって、急性治療については、非継続的なニトロ系血管拡張剤の使用が使用され、これによっては、限られた効果がもたらされる。血管収縮の慢性的な症例については、他の治療方法が使用され、通常は、有機硝酸塩とＮＯ依存性血圧薬物治療の混合レジュメが使用され、これにより成果の混合がもたらされる。
【０００５】
耐性についての機構には２つの主要な矛盾する理論が、ＮＯの放出を導く硝酸塩の生体内変化の機構についての研究と平行して存在する。ＮＯは有機硝酸塩の血管拡張作用の媒介因子であると考えられているので、有機硝酸塩からのＮＯの放出の機構が阻害され得、耐性が生じ得る。しかし、有機硝酸塩が組織内で代謝によりＮＯを放出する方法は理解されていない。さらに、耐性についての機構に基づく理論は、耐性はまた血管拡張を媒介することにおける内因性ＮＯガスおよび外因性ＮＯガスの効力をも低下させるので、問題が多い。したがって、有機硝酸塩の生態内変化の機構は、耐性の理由とは区別されるようである。矛盾する理論は、有機硝酸塩由来のＮＯに対する応答が、おそらくは、ＮＯの生成、およびＮＯに対する応答を最終的に阻害する反応の副産物が原因で、あるいは、ＮＯ経路の急激な活性化が、それを刺激に対してさらに鈍感にさせるフィードバック機構を有していることが原因で、標的組織の中で抑制されるようになる。この理論は、末端臓器の耐性（ｅｎｄ−ｏｒｇａｎ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）として知られている。最近、統一された理論が提案された。これには、有機硝酸塩の生体内変換の態様、さらには、ＮＯに対する末端臓器の脱感作の態様を含む。原則として、有機硝酸塩の生体内変換は、組織内でより高いレベルのスーパーオキシド（Ｏ２）を生じる。スーパーオキシドはＮＯと拡散速度で反応して、ペルオキシ亜硝酸（ＯＯＮＯ）を生じる。この反応は、原則として基底ＮＯを捕捉し、崩壊させ、これがｓＧＣを活性化させることを防ぐ。低いＮＯレベルは血管収縮を導き、ＯＯＮＯ−は、組織を損傷させる強力な酸化剤である。有機硝酸塩（例えば、ＧＴＮ）での長期にわたる治療によっては、患者において高血圧および組織の損傷が生じる可能性があり、これは、アスコルビン酸塩のような抗酸化剤の同時投与を用いて抑えることができる。したがって、血管収縮を緩和するために臓器および組織へＮＯを送達するための改良された治療薬が、主要な治療の目的である。
【０００６】
ＮＯを送達するためのヘモグロビンをベースとする担体の使用については、いくつかの研究が行われている。しかし、ヘモグロビンをベースとする担体は、Ｏ２の存在下でのそれらのＮＯとの反応性（これは、ヘモグロビンをベースとする担体の不活化を導く）が原因で限られる。ＮＯはＯ２と直接反応し、これは、ヘモグロビンに結合して、メトヘモグロビンおよび硝酸塩が形成される。ヘム鉄とＮＯはいずれも、結合した酸素原子によって酸化され、反応は、ＮＯによるＯ２の置換が観察されないほど迅速に起こる（例えば、特許文献１を参照のこと）。
【０００７】
ＮＯは継続的に生産され、消費されるので、インビボではＮＯの自然な代謝回転がある。細胞を含まないヘモグロビンが投与されると、ＮＯの生産と消費との間での平衡は、細胞を含まないヘモグロビンとの反応によって変化する。ＮＯとヘモグロビンに結合したＯ２の間での酸化反応は不可逆的であり、それにより、ＮＯ、Ｏ２、およびヘモグロビンの崩壊が生じる。Ｏ２が結合していないヘモグロビンに対するＮＯの結合は、生理学的な時間のスケールでは事実上不可逆的である。なぜなら、ニトロシルヘモグロビンの解離についての半減期は５〜６時間であり、それにより、細胞を含まないＮＯ担体としてヘモグロビンが事実上不活化されるからである。一旦、ＮＯ分子がヘモグロビンと反応すると、これはシグナル分子のプールから排除され、それにより、特定の有害な症状が引き起こされる。例えば、（Ｏ２が結合した、またはＯ２が結合していない）ヘモグロビンに対するＮＯの結合は、血管の弛緩を妨げ得、高血圧を導く可能性がある。これは、特定の細胞外ヘモグロビン溶液の投与後に、しばしば観察される。
【０００８】
ＮＯはまた、特定の炎症応答を媒介するためにも必要である。例えば、内皮によって生産されたＮＯは血小板の凝集を阻害する。結果として、ＮＯは（Ｏ２が結合した、またはＯ２が結合していない）細胞を含まないヘモグロビンに結合されるので、血小板の凝集が増加し得る。血小板が凝集すると、これらは、トロンボキサンＡ２およびセロトニンのような、強力な血管収縮剤化合物を放出する。これらの化合物は、ヘモグロビンの除去によって引き起こされた低いＮＯレベルと共働して作用し得、有意な血管収縮を生じる。血小板の凝集を阻害することに加えて、ＮＯはまた、細胞壁に対する好中球の結合（これは次いで、細胞壁の損傷を導き得る）も阻害する。内皮細胞壁の損傷は、特定のヘモグロビン溶液の注入を用いて観察されている。ヘモグロビンをベースとするＮＯ担体はまた、血漿由来の細胞を含まないヘモグロビンを除去するヘモグロビン受容体の存在の理由により、血漿からの細胞を含まないヘモグロビンの迅速なクリアランスによっても妨げられる。細胞を含まないヘモグロビンはまた、おそらくは、糸球体の中でのＮＯの枯渇が原因で、腎臓毒性を引き起こす可能性もあり、これにより、収縮、それに続いて機能不全が起こり得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第６，４５５，６７６号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
現在のニトロ系血管拡張剤での治療の限界の理由により、ＮＯを送達するためのさらなる、または別の治療に依然として非常に関心が集まっており、それが必要とされている。具体的には、耐性を生じにくいＮＯ担体が必要とされている。加えて、Ｏ２の存在下ではＮＯによる不活化速度が遅いＮＯ担体（例えば、低いＮＯ反応性、および／またはＯ２に対して低い親和性を有しているＮＯ担体）が所望される。特定の臨床的または産業的用途に適しているＮＯ解離定数またはＮＯ解離速度を有しているＮＯ担体もまた、必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、野生型および変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質がヘモグロビンよりもはるかに低いＮＯ反応性を有しており、したがって、ＮＯ担体として所望されることの驚くべき発見に一部基づく。所望される場合には、ＮＯ担体としてのＨ−ＮＯＸタンパク質の使用をさらに最適化させるために、ＮＯおよびＯ２リガンドへのそれらの結合を変化させるための変異がＨ−ＮＯＸタンパク質に導入され得る。いくつかの実施形態においては、ＮＯ担体としてのＨ−ＮＯＸタンパク質の使用によっては、有機硝酸塩のような現在の血管拡張剤の使用によって生じる耐性よりも少ない耐性が生じる。
【００１２】
１つの態様においては、本発明は、変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質を特徴とする。したがって、いくつかの実施形態においては、本発明により、対応する野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のものと比較して、ＮＯ解離定数またはＮＯ反応性を変化させる少なくとも１つの変異を含む、単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質が提供される。いくつかの実施形態においては、変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ解離定数は、ヘモグロビンのＮＯ解離定数の大きさの２桁以内であり、変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、ヘモグロビンのＮＯ反応性の少なくとも１０分の１未満である。いくつかの実施形態においては、変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、ヘモグロビンのＮＯ反応性の少なくとも１００分の１未満であり、例えば、ヘモグロビンのＮＯ反応性の少なくとも１，０００分の１未満である。いくつかの実施形態においては、変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２は、３７℃では約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間であり、例えば、３７℃で、約１×１０−４ｓ−１〜約０．０１２ｓ−１、または約１×１０−４ｓ−１〜約１×１０−３ｓ−１である。いくつかの実施形態においては、変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、３７℃では少なくとも約１μＭであり、例えば、３７℃で、少なくとも約１０μＭ、または少なくとも約５０μＭである。
【００１３】
いくつかの実施形態においては、本発明により、対応する野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のものと比較して、ＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２を変化させる、あるいは、Ｏ２解離定数を変化させる、少なくとも１つの変異が含まれている単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質が提供される。いくつかの実施形態においては、変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２は、３７℃では約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間であり、そして、変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、３７℃では少なくとも約１μＭである。いくつかの実施形態においては、変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯについてのｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２は、３７℃で、約１×１０−４ｓ−１〜約０．０１２ｓ−１、または約１×１０−４ｓ−１〜約１×１０−３ｓ−１である。いくつかの実施形態においては、変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、３７℃では少なくとも約１０μＭであり、例えば、３７℃で、少なくとも約５０μＭである。いくつかの実施形態においては、変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、ヘモグロビンのＮＯ反応性の少なくとも１０分の１未満であり、例えば、ヘモグロビンのＮＯ反応性の少なくとも１００分の１未満、またはヘモグロビンのＮＯ反応性の少なくとも１，０００分の１未満である。
【００１４】
いくつかの実施形態においては、本発明により、以下からなる群より選択される単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質が提供される：Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｉ５Ａ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｉ５Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｉ５Ｌ−Ｐ１１５Ａ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｗ９Ｆ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｗ９Ｆ−Ｙ１４０Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｗ９Ｆ−Ｙ１４０Ｈ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｗ９Ｆ−Ｎ７４Ａ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｗ９Ｙ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｗ９Ｎ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｗ９Ｈ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｎ７４Ｅ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｎ７４Ａ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｎ７４Ｈ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｎ７４Ａ−Ｙ１４０Ｈ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｆ７８Ｙ−Ｙ１４０Ｆ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｐ１１５Ａ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｒ１３５Ｑ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０Ｆ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０Ｈ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０Ａ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｉ７５Ｆ−Ｈｉｓ６、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｉ７５Ｆ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｌ１４４Ｆ−Ｈｉｓ６、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｌ１４４Ｆ、Ｌ２  Ｆ９Ｗ−Ｆ１４２Ｙ、Ｄ．ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ  Ｈ−ＮＯＸ（７２８−８９９）、Ｄ．ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１３９Ｌ、β１（１−３８５）、β１（１−３８５）Ｉ１４５Ｙ、β１（１−３８５）Ｉ１４５Ｈ、β１（１−１９４）、β１（１−１９４）Ｉ１４５Ｙ、β１（１−１９４）Ｌ９Ｗ−Ｉ１４５Ｙ、β２（１−２１７）、β２（１−２１７）Ｉ１４２Ｙ、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｈ−ＮＯＸ（１−１７５）、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｈ−ＮＯＸ（１−１８６）、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  Ｈ−ＮＯＸ（１−１９７）、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  Ｈ−ＮＯＸ（１−１８３）、およびＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｈ−ＮＯＸ  ＧＣＹ−３５（１−２５２）。いくつかの実施形態においては、β１またはβ２タンパク質は、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓまたはＨ．ｓａｐｉｅｎｓのβ１あるいはβ２タンパク質に由来する。
【００１５】
いくつかの実施形態においては、本発明により、以下からなる群より選択される単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質が提供される：Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｉ５Ａ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｉ５Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｉ５Ｌ−Ｐ１１５Ａ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｗ９Ｆ−Ｙ１４０Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｗ９Ｆ−Ｙ１４０Ｈ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｗ９Ｆ−Ｎ７４Ａ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｗ９Ｙ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｗ９Ｎ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｗ９Ｈ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｎ７４Ｅ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｎ７４Ａ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｎ７４Ｈ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｎ７４Ａ−Ｙ１４０Ｈ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｆ７８Ｙ−Ｙ１４０Ｆ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｐ１１５Ａ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｒ１３５Ｑ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０Ｈ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０Ａ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｉ７５Ｆ−Ｈｉｓ６、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｉ７５Ｆ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｌ１４４Ｆ−Ｈｉｓ６、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｌ１４４Ｆ、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｆ９Ｗ−Ｆ１４２Ｙ、Ｄ．ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ  Ｈ−ＮＯＸ（７２８−８９９）、Ｄ．ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１３９Ｌ、β１（１−３８５）Ｉ１４５Ｈ、β１（１−１９４）、β１（１−１９４）Ｉ１４５Ｙ、β１（１−１９４）Ｌ９Ｗ−Ｉ１４５Ｙ、β２（１−２１７）、β２（１−２１７）Ｉ１４２Ｙ、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｈ−ＮＯＸ（１−１７５）、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｈ−ＮＯＸ（１−１８６）、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  Ｈ−ＮＯＸ（１−１９７）、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  Ｈ−ＮＯＸ（１−１８３）、およびＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｈ−ＮＯＸ  ＧＣＹ−３５（１−２５２）。いくつかの実施形態においては、β１またはβ２タンパク質は、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓまたはＨ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１もしくはβ２タンパク質に由来する。
【００１６】
単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ解離定数は、ヘモグロビンのＮＯ解離定数の０．１倍〜１０倍の間であり、例えば、ヘモグロビンの解離定数の０．５倍〜２倍の間である。単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ解離定数は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓヘモグロビンαのＮＯ解離定数の大きさの２桁以内であり、例えば、解離定数は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓヘモグロビンαの解離定数の０．１倍〜１０倍の間、または０．５倍〜２倍の間である。単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓヘモグロビンαのＮＯ反応性の少なくとも１０分の１未満であり、例えば、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓヘモグロビンαのＮＯ反応性の少なくとも１００分の１未満、または１，０００分の１未満である。単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、２０℃で約７００ｓ−１未満、例えば、２０℃で、約６００ｓ−１、５００ｓ−１、４００ｓ−１、３００ｓ−１、２００ｓ−１、１００ｓ−１、７５ｓ−１、５０ｓ−１、２５ｓ−１、２０ｓ−１、１０ｓ−１、５０ｓ−１、３ｓ−１、２ｓ−１、１．８ｓ−１、１．５ｓ−１、１．２ｓ−１、１．０ｓ−１、０．８ｓ−１、０．７ｓ−１、または０．６ｓ−１未満である。単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、３７℃では、少なくとも約１μＭであり、例えば、３７℃で、少なくとも約１０μＭ、または少なくとも５０μＭである。単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２は、３７℃では約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間であり、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、３７℃では、少なくとも約１μＭである。単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２は、３７℃では約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間であり、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、２０℃で約７００ｓ−１未満（例えば、２０℃で、約６００ｓ−１、５００ｓ−１、１００ｓ−１、２０ｓ−１、または１．８ｓ−１未満）である。単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、３７℃で、少なくとも約１μＭであり、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、２０℃で約７００ｓ−１未満（例えば、２０℃で、約６００ｓ−１、５００ｓ−１、１００ｓ−１、２０ｓ−１、または１．８ｓ−１未満）である。単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化速度は、３７℃で約１ｈ−１未満である。単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２は、３７℃では約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間であり、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化速度は、���７℃で約１ｈ−１未満である。単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、３７℃で少なくとも約１μＭであり、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化速度は、３７℃で約１ｈ−１未満である。単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化速度は、３７℃で約１ｈ−１未満であり、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、２０℃で約７００ｓ−１未満（例えば、２０℃で、約６００ｓ−１、５００ｓ−１、１００ｓ−１、２０ｓ−１、または１．８ｓ−１未満）である。
【００１７】
単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、それが由来するＨ−ＮＯＸタンパク質と比較して１つ以上の変異（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または１０個の変異）を含む。様々な実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、それが由来するＨ−ＮＯＸタンパク質と比較して、２０、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２個未満の変異を含む。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、少なくとも１つの遠位ポケット変異を有する。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、遠位ポケット中には存在しない少なくも１つの変異を有する。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸのＴｙｒ１４０、またはＬ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ  ２のＰｈｅ１４２に対応する残基が任意の他のアミノ酸によって置き換えられる少なくとも１つの変異を有する。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は少なくとも２つの変異を有し、ここでは、少なくとも１つの変異は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸのＴｙｒ１４０、またはＬ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ  ２のＰｈｅ１４２に相当する残基の任意の他のアミノ酸による置換である。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質中の変異は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのＹ１４０Ｆ変異またはＹ１４０Ｌ変異、あるいは、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ  ２のＦ１４２Ｙ変異に相当する。単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質中の少なくとも１つのＣ末端アミノ酸（例えば、少なくとも約５０個の連続するＣ末端アミノ酸、または約２５〜約２００の連続するＣ末端アミノ酸）が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓまたはＨ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１もしくはβ２タンパク質のような、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の最初の１９４個、２１７個、あるいは３８５個のアミノ酸を含む欠失である。
【００１８】
単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は哺乳動物タンパク質（例えば、β１のようなヒトタンパク質）に由来する。単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質の様々な実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は細菌タンパク質（例えば、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓタンパク質）に由来する。単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、別の分子または部分（例えば、ポリエチレングリコール）に共有結合される。ヘムは、Ｈ−ＮＯＸタンパク質に結合される場合も、また結合されない場合もある。単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質のいくつかの実施形態においては、ＮＯはＨ−ＮＯＣタンパク質に結合される。単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｈ−ＮＯＸドメインと、別のタンパク質（例えば、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン））の一部または全体を含む融合タンパク質である。
【００１９】
単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ４０Ｌ、野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ、またはＬ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｈ−ＮＯＸ  Ｆ１４２Ｙではない。単離されたＨ−ＮＯＣタンパク質のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｆ７８Ｙ／Ｙ１４０Ｌではない。単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、以下ではない：野生型Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ（１−３８５）、野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ  β１  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ  ＣＧ１４８８５−ＰＡ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＧＣＹ−３５  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｓ．ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ、または野生型Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  Ｈ−ＮＯＸ。単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は以下ではない：Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｗ９Ｆ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０Ｆ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｈ１０５Ｇ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｈ１０５Ｆ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｉ１４５Ｙ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｃ７８Ｓ、またはＲ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｃ７８Ｅ。単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β２（１−２１７）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−１９４）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−３８５）、またはＲ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−３８５）Ｉ１４５Ｙではない。単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｗ９Ｆ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０Ｆ、またはＨ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸ（１−３８５）Ｉ１４５Ｙではない。単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０Ｈ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１  Ｉ１４０Ｙ、またはＨ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１  Ｉ１４５Ｙではない。単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ４０Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｆ７８Ｙ／Ｙ１４０Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｗ９Ｆ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０Ｆ、野生型Ｔ．ｔｅ��ｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｈ−ＮＯＸ  Ｆ１４２Ｙ、野生型Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｈ−ＮＯＸ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｉ１４０Ｙ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  Ｂ１  Ｉ１４５Ｙ、野生型Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ（１−３８５）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ（１−３８５）Ｉ１４５Ｙ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｈ１０５Ｇ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｈ１０５Ｆ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｉ１４５Ｙ、野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ  β１  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ  ＣＧ１４８８５−ＰＡ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＧＣＹ−３５  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｓ．ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ、または野生型Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  Ｈ−ＮＯＸではない。単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、それらの種の省略形とＧｅｎｂａｎｋ識別番号にしたがってそれらの遺伝子名によって列挙される以下のＨ−ＮＯＸタンパク質のいずれでもない（例えば、２００６年５月２１日、２００６年５月２２日、２００７年５月２１日、または２００７年５月２２日に入手した以下のタンパク質配列）：Ｎｐｕｎ５９０５＿Ｎｐｕ＿２３１２９６０６、ａｌｒ２２７８＿Ａｎａ＿１７２２９７７０、ＳＯ２１４４＿Ｓｏｎｅ＿２４３７３７０２、Ｍｄｅｇ１３４３＿Ｍｄｅ＿２３０２７５２１、ＶＣＡ０７２０＿Ｖｃｈ＿１５６０１４７６、ＣＣ２９９２＿Ｃｃｒ＿１６１２７２２２、Ｒｓｐｈ２０４３＿Ｒｈｓｐ＿２２９５８４６３（ｇｉ：４６１９２７５７）、Ｍｍｃ１０７３９＿Ｍｃｓｐ＿２２９９９０２０、Ｔａｒ４＿Ｔｔｅ＿２０８０７１６９、Ｄｄｅｓ２８２２＿Ｄｄｅ＿２３４７５９１９、ＣＡＣ３２４３＿Ｃａｃ＿１５８９６４８８、ｇｃｙ−３１＿Ｃｅ＿１７５６８３８９、ＣＧ１４８８５＿Ｄｍ＿２４６４７４５５、ＧＵＣＹ１Ｂ３＿Ｈｓ＿４５０４２１５、ＨｐＧＣＳ−ｂｅｔａ１＿Ｈｐｕｌ＿１４２４５７３８、Ｇｙｃｂｅｔａ１００Ｂ＿Ｄｍ＿２４６５１５７７、ＣＧ４１５４＿Ｄｍ＿２４６４６９９３（ｇｉ：ＮＰ＿６５０４２４．２、ｇｉ：６２４８４２９８）、ｇｃｙ−３２＿Ｃｅ＿１３５３９１６０、ｇｃｙ−３６＿Ｃｅ＿１７５６８３９１（ｇｉ：３２５６６３５２、ｇｉ：８６５６４７１３）、ｇｃｙ−３５＿Ｃｅ−１７５０７８６１（ｇｉ：７１９９０１４６）、ｇｃｙ−３７＿Ｃｅ＿１７５４０９０４（ｇｉ：７１９８５５０５）、ＧＣＹ１α３＿Ｈｓ＿２０５３５６０３、ＧＣＹ１α２−Ｈｓ＿８９９４７７、またはＧＹＣα−９９Ｂ＿Ｄｍ＿７２９２７０（ｇｉ：６８０６７７３８）（Ｌａｋｓｈｍｉｎａｒａｙａｎら、（２００３）、「Ａｎｃｉｅｎｔ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｓｈａｒｅｄ  ｂｙ  ａｎｉｍａｌ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｇｕａｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅｓ  ａｎｄ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、ＢＭＧ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５−１３）。これらの名称の中で使用される種の省略形には以下を含む：Ａｎａ−Ａｎａｂａｅｎａ  Ｓｐ；Ｃｃｒ−Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ；Ｃａｃ−Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ；Ｄｄｅ−Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ；Ｍｃｓｐ−Ｍａｇｎｅｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．；Ｍｄｅ−Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ  ｄｅｇｒａｄａｎｓ；Ｎｐｕ−Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ；Ｒｈｓｐ−Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ；Ｓｏｎｅ−Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ；Ｔｔｅ−Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ；Ｖｃｈ−Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ；Ｃｅ−Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ；Ｄｍ−Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ；Ｈｐｕｌ−Ｈｅｍｉｃｅｎｔｒｏｔｕｓ  ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍｕｓ；Ｈｓ−Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ。単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、それらの生物名とＰｆａｍデータベース登録番号によって列挙される以下のＨ−ＮＯＸタンパク質のいずれでもない（例えば、２００６年５月２１日、２００６年５月２２日、２００７年５月１７日、２００７年５月２１日、または２００７年５月２２日に入手した以下のタンパク質配列）：
【００２０】
【化１】
2009538133.tif 000003
【００２１】
【化２】
2009538133.tif 000004
。単離されたＨ−ＮＯＸタンパク質のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、ヒトＨ−ＮＯＸのＴｙｒ１３５、Ｓｅｒ１３７、およびＡｒｇ１３９を含むＹ−Ｓ−Ｒモチーフの中には変異を有さない。
【００２２】
１つの態様においては、本発明は、本明細書中に記載される変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のうちの任意の１つ以上をコードする組み換え体核酸を特徴とする。特定の実施形態においては、核酸は、図２−４Ｄ、または８Ａ−８ＤＤに示される核酸のうちの任意のものの核酸配列のセグメント、またはその全体を含む。いくつかの実施形態においては、核酸は、Ｈ−ＮＯＸドメインと、別のタンパク質（例えば、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン））の一部または全体を含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態においては、核酸には、Ｈ−ＮＯＸ核酸に由来する少なくとも約５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００のいずれか以上の連続しているヌクレオチドを含み、および、それが由来するＨ−ＮＯＸ核酸と比較して、１つ以上の変異（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の変異）を含む。様々な実施形態においては、変異Ｈ−ＮＯＸ核酸には、それが由来するＨ−ＮＯＸ核酸と比較して、約２０、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２個未満の変異を含む。本発明はまた、変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードする任意の核酸の縮重変異体をも特徴とする。
【００２３】
なお別の態様においては、本発明により、本明細書中に記載される変異Ｈ−ＮＯＸ核酸の任意の１つ以上が含まれているベクターが提供される。別の態様においては、本発明は、本明細書中に記載される変異Ｈ−ＮＯＸ核酸の任意の１つ以上が含まれている細胞を特徴とする。１つの態様においては、本発明は、本明細書中に記載される任意のベクターが含まれている細胞を特徴とする。
【００２４】
１つの態様においては、本発明は、Ｈ−ＮＯＸタンパク質を生産する方法を特徴とする。この方法は、本明細書中に記載される変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のうちの任意の１つ以上をコードする核酸を有している細胞を、変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質の生産に適している条件下で培養する工程を含む。いくつかの実施形態においては、本発明は、変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質を精製する工程をさらに含む。
【００２５】
１つの態様においては、本発明は、本明細書中に記載される野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質または変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のうちの任意のもののような、１つ以上のＨ−ＮＯＸタンパク質を含む薬学的組成物を特徴とする。いくつかの実施形態においては、薬学的組成物は、薬学的に許容される量の本明細書中に記載されるＨ−ＮＯＸタンパク質と、薬学的に許容される担体を含む。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２は、３７℃では約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間であり、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、３７℃では少なくとも約１μＭである。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ解離定数は、ヘモグロビンのＮＯ解離定数の大きさの２桁以内であり、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、ヘモグロビンのＮＯ反応性の少なくとも１０分の１未満である。
【００２６】
薬学的組成物のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ解離定数は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓヘモグロビンαのＮＯ解離定数の大きさの２桁以内であり、例えば、ＮＯ解離定数は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓヘモグロビンαの解離定数の０．１倍〜１０倍の間、または０．５倍〜２倍の間である。薬学的組成物のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓヘモグロビンαのＮＯ反応性の少なくとも１０分の１未満であり、例えば、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓヘモグロビンαのＮＯ反応性の少なくとも１００分の１未満、または１，０００分の１未満である。薬学的組成物のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は野生型タンパク質である。薬学的組成物のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、本明細書中に記載されるような変異タンパク質である。薬学的組成物の様々な実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、対応する野生型タンパク質のものと比較して、ＮＯ解離定数、ＮＯに対するｋｏｆｆ、ＮＯに対するｋ１、ＮＯに対するｋ２、Ｏ２解離定数、ＮＯ安定性、ＮＯ反応性、ヘム自動酸化速度、または上記の２つ以上の任意の組み合わせを変化させる少なくとも１つの変異を有する。薬学的組成物のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、以下からなる群より選択される：野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｉ５Ａ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｉ５Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｉ５Ｌ−Ｐ１１５Ａ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｗ９Ｆ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｗ９Ｆ−Ｙ１４０Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｗ９Ｆ−Ｙ１４０Ｈ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｗ９Ｆ−Ｎ７４Ａ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｗ９Ｙ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｗ９Ｎ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｗ９Ｈ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｎ７４Ｅ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｎ７４Ａ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｎ７４Ｈ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｎ７４Ａ−Ｙ１４０Ｈ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｆ７８Ｙ−Ｙ１４０Ｆ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｆ７８Ｙ／Ｙ１４０Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｐ１１５Ａ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｒ１３５Ｑ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０Ｆ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ４０Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０Ｈ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０Ａ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｉ７５Ｆ−Ｈｉｓ６、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｉ７５Ｆ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｌ１４４Ｆ−Ｈｉｓ６、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｌ１４４Ｆ、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｈ−ＮＯＸ  Ｆ１４２Ｙ、野生型Ｌ．ｐｎｅｕｏｐｈｉｌｉａ  １  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｌ．ｐｎｅｕｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｈ−ＮＯＸ、Ｌ．ｐｎｅｕｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｆ９Ｗ−Ｆ１４２Ｙ、野生型Ｄ．ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ  Ｈ−ＮＯＸ、Ｄ．ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ  Ｈ−ＮＯＸ（７２８−８９９）、Ｄ．ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１３９Ｌ、野生型Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１  Ｉ１４０Ｙ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１  Ｉ１４５Ｙ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１（１−３８５）、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１（１−３８５）Ｉ１４５Ｙ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１（１−３８５）Ｉ１４５Ｈ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１（１−１９４）、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１（１−１９４）Ｉ１４５Ｙ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１（１−１９４）Ｌ９Ｗ−Ｉ１４５Ｙ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β２（１−２１７）、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β２（１−２１７）Ｉ１４２Ｙ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｈ１０５Ｇ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｈ１０５Ｆ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｃ７８Ｓ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｃ７８Ｅ、野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−３８５）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−３８５）Ｉ１４５Ｙ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−３８５）Ｉ１４５Ｈ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−１９４）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−１９４）Ｉ１４５Ｙ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−１９４）Ｌ９Ｗ−Ｉ１４５Ｙ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β２（１−２１７）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β２（１−２１７）Ｉ１４２Ｙ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｈ１０５Ｇ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｈ１０５Ｆ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｃ７８Ｓ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｃ７８Ｅ、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｈ−ＮＯＸ（１−１７５）、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｈ−ＮＯＸ（１−１８６）、野生型Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  Ｈ−ＮＯＸ、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  Ｈ−ＮＯＸ（１−１９７）、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  Ｈ−ＮＯＸ（１−１８３）、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＧＣＹ−３５  Ｈ−ＮＯＸ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｈ−ＮＯＸ  ＧＣＹ−３５（１−２５２）、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ  β１  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ  ＣＧ１４８８５−ＰＡ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ  ＣＧ１４８８６、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ  ＣＧ４１５４；野生型Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｓ．ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｂ．ｔａｕｒｕｓ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ；野生型Ｘ．ｌａｅｖｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｏ．ｌａｔｉｐｅｓ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｏ．ｃｕｒｉｖａｔｕｓ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｆ．ｒｕｂｒｉｐｅｓ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ａ．ｇａｍｂｉａｅ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｍ．ｓｅｘｔａ  Ｈ−���ＯＸ；野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｇｃｙ−３１、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｇｃｙ−３２、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｇｃｙ−３３、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｇｃｙ−３４、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｇｃｙ−３５、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｇｃｙ−３６、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｇｃｙ−３７、野生型Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｖ．ｆｉｓｃｈｅｒｉｉ  Ｈ−ＮＯＸ、および野生型Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  Ｈ−ＮＯＸ。薬学的組成物の特定の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、以下からなる群より選択される：野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ、野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−３８５）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−２１７）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−１９４）、野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０Ｆ、野生型Ｌ．ｐｎｅｕｏｐｈｉｌｉａ  １  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｈ−ＮＯＸ、およびＬ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｈ−ＮＯＸ  Ｆ１４２Ｙ。薬学的組成物のいくつかの実施形態においては、薬学的組成物は、Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含むかもしくはＨ−ＮＯＸタンパク質をカプセル化する、１つ以上のリポソームまたはナノ粒子を含む。
【００２７】
薬学的組成物のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ４０Ｌ、野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ，野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ、またはＬ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｈ−ＮＯＸ  Ｆ１４２Ｙではない。薬学的組成物のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｆ７８Ｙ／Ｙ１４０Ｌではない。薬学的組成物のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、野生型Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ（１−３８５）、野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ  β１  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ  ＣＧ１４８８５−ＰＡ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＧＣＹ−３５  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｓ．ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ、または野生型Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  Ｈ−ＮＯＸではない。薬学的組成物のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｗ９Ｆ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０Ｆ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｈ１０５Ｇ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｈ１０５Ｆ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｉ１４５Ｙ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｃ７８Ｓ、またはＲ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｃ７８Ｅではない。薬学的組成物のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β２（１−２１７）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−１９４）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−３８５）、またはＲ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−３８５）Ｉ１４５Ｙではない。薬学的組成物のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｗ９Ｆ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０Ｆ、またはＨ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸ（１−３８５）Ｉ１４５Ｙではない。薬学的組成物のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０Ｈ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１  Ｉ１４０Ｙ、またはＨ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１  Ｉ１４５Ｙではない。薬学的組成物のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ４０Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｆ７８Ｙ／Ｙ１４０Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｗ９Ｆ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０Ｆ、野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｈ−ＮＯＸ  Ｆ１４２Ｙ、野生型Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｈ−ＮＯＸ、Ｈ．ｓａｐｉｅ��ｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｉ１４０Ｙ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  Ｂ１  Ｉ１４５Ｙ、野生型Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ（１−３８５）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ（１−３８５）Ｉ１４５Ｙ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｈ１０５Ｇ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｈ１０５Ｆ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｉ１４５Ｙ、野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ  β１  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ  ＣＧ１４８８５−ＰＡ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＧＣＹ−３５  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｓ．ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ、または野生型Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  Ｈ−ＮＯＸではない。薬学的組成物のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、それらの種の省略形とＧｅｎｂａｎｋ識別番号にしたがってそれらの遺伝子名によって列挙される以下のＨ−ＮＯＸタンパク質のいずれでもない（例えば、２００６年５月２１日、２００６年５月２２日、２００７年５月２１日、または２００７年５月２２日に入手した以下のタンパク質配列）：Ｎｐｕｎ５９０５＿Ｎｐｕ＿２３１２９６０６、ａｌｒ２２７８＿Ａｎａ＿１７２２９７７０、ＳＯ２１４４＿Ｓｏｎｅ＿２４３７３７０２、Ｍｄｅｇ１３４３＿Ｍｄｅ＿２３０２７５２１、ＶＣＡ０７２０＿Ｖｃｈ＿１５６０１４７６、ＣＣ２９９２＿Ｃｃｒ＿１６１２７２２２、Ｒｓｐｈ２０４３＿Ｒｈｓｐ＿２２９５８４６３（ｇｉ：４６１９２７５７）、Ｍｍｃ１０７３９＿Ｍｃｓｐ＿２２９９９０２０、Ｔａｒ４＿Ｔｔｅ＿２０８０７１６９、Ｄｄｅｓ２８２２＿Ｄｄｅ＿２３４７５９１９、ＣＡＣ３２４３＿Ｃａｃ＿１５８９６４８８、ｇｃｙ−３１＿Ｃｅ＿１７５６８３８９、ＣＧ１４８８５＿Ｄｍ＿２４６４７４５５、ＧＵＣＹ１Ｂ３＿Ｈｓ＿４５０４２１５、ＨｐＧＣＳ−ｂｅｔａ１＿Ｈｐｕｌ＿１４２４５７３８、Ｇｙｃｂｅｔａ１００Ｂ＿Ｄｍ＿２４６５１５７７、ＣＧ４１５４＿Ｄｍ＿２４６４６９９３（ｇｉ：ＮＰ＿６５０４２４．２、ｇｉ：６２４８４２９８）、ｇｃｙ−３２＿Ｃｅ＿１３５３９１６０、ｇｃｙ−３６＿Ｃｅ＿１７５６８３９１（ｇｉ：３２５６６３５２、ｇｉ：８６５６４７１３）、ｇｃｙ−３５＿Ｃｅ−１７５０７８６１（ｇｉ：７１９９０１４６）、ｇｃｙ−３７＿Ｃｅ＿１７５４０９０４（ｇｉ：７１９８５５０５）、ＧＣＹ１α３＿Ｈｓ＿２０５３５６０３、ＧＣＹ１α２−Ｈｓ＿８９９４７７、またはＧＹＣα−９９Ｂ＿Ｄｍ＿７２９２７０（ｇｉ：６８０６７７３８）（Ｌａｋｓｈｍｉｎａｒａｙａｎら、（２００３）、「Ａｎｃｉｅｎｔ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｓｈａｒｅｄ  ｂｙ  ａｎｉｍａｌ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｇｕａｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅｓ  ａｎｄ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、ＢＭＧ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５−１３）。これらの名称の中で使用される種の省略形には以下を含む：Ａｎａ−Ａｎａ��ａｅｎａ  Ｓｐ；Ｃｃｒ−Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ；Ｃａｃ−Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ；Ｄｄｅ−Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ；Ｍｃｓｐ−Ｍａｇｎｅｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．；Ｍｄｅ−Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ  ｄｅｇｒａｄａｎｓ；Ｎｐｕ−Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ；Ｒｈｓｐ−Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ；Ｓｏｎｅ−Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ；Ｔｔｅ−Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ；Ｖｃｈ−Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ；Ｃｅ−Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ；Ｄｍ−Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ；Ｈｐｕｌ−Ｈｅｍｉｃｅｎｔｒｏｔｕｓ  ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍｕｓ；Ｈｓ−Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ。薬学的組成物のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、それらの生物名とＰｆａｍデータベース登録番号によって列挙される以下のＨ−ＮＯＸタンパク質のいずれでもない（例えば、２００６年５月２１日、２００６年５月２２日、２００７年５月１７日、２００７年５月２１日、または２００７年５月２２日に入手した以下のタンパク質配列）：
【００２８】
【化３】
2009538133.tif 000005
【００２９】
【化４】
2009538133.tif 000006
【００３０】
【化５】
2009538133.tif 000007
。薬学的組成物のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、ヒトＨ−ＮＯＸのＴｙｒ１３５、Ｓｅｒ１３７、およびＡｒｇ１３９を含むＹ−Ｓ−Ｒモチーフの中には変異を有さない。
【００３１】
他で明記されないか、または状況によって示されない限りは、本明細書中に記載される全ての野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質および変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、本明細書中に記載される薬学的組成物のうちの任意のものにおいて使用され得る。Ｈ−ＮＯＸタンパク質には、ヘムおよび／またはＮＯが結合している場合も、また、結合していない場合もあり、そしてこれらは、別の分子または部分（例えば、ポリエチレングリコール）に共有結合される場合も、また結合されていない場合もある。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｈ−ＮＯＸドメインと、別のタンパク質（例えば、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン））の一部または全体が含まれている融合タンパク質である。
【００３２】
１つの態様においては、本発明により、Ｈ−ＮＯＸタンパク質を使用して、個体（例えば、哺乳動物（例えば、霊長類（例えば、ヒト、サル、ゴリラ、類人猿、キツネザルなど）、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、またはネコ））に対してＮＯを送達する方法が提供される。いくつかの実施形態においては、個体は、心臓血管の症状、高血圧、高血圧によって悪化した症状、血管収縮の症状、脳卒中、ＮＯ機能不全に罹患しているか、あるいはそれらの危険性がある。特定の実施形態においては、高血圧によって悪化した症状は、心不全、腎不全、または脳卒中である。
【００３３】
したがって、いくつかの実施形態においては、本発明により、個体（例えば、ヒト）にＮＯを送達する方法が提供される。この方法は、個体に対して有効量のＮＯを送達するために十分な量のＨ−ＮＯＸタンパク質をそれが必要な個体に投与することによる。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２は、３７℃では約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間であり、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、３７℃では少なくとも約１μＭである。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ解離定数は、ヘモグロビンのＮＯ解離定数の大きさの２桁以内であり、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、ヘモグロビンのＮＯ反応性の少なくとも１０分の１未満である。
【００３４】
この方法のいくつかの実施形態においては、ＮＯは、個体へのＨ−ＮＯＸタンパク質の投与の前にＨ−ＮＯＸタンパク質に結合される。この方法のいくつかの実施形態においては、ＮＯは、個体へのＨ−ＮＯＸタンパク質の投与の前にはＨ−ＮＯＸタンパク質に結合されず、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、個体中の１つの位置から個体中の別の位置にＮＯを輸送する。この方法のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、経口で、直腸に、または個体の血液に投与される。この方法の特定の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、個体の血液に投与される。この方法のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、少なくとも２回、個体に投与される。
【００３５】
この方法のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ解離定数は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓヘモグロビンαのＮＯ解離定数の大きさの２桁以内であり、例えば、ＮＯ解離定数は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓヘモグロビンαの解離定数の０．１倍〜１０倍の間、または０．５倍〜２倍の間である。この方法のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓヘモグロビンαのＮＯ反応性の少なくとも１０分の１未満であり、例えば、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓヘモグロビンαのＮＯ反応性の少なくとも１００分の１未満、または１，０００分の１未満である。この方法のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は野生型タンパク質である。この方法のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、本明細書中に記載されるような変異タンパク質である。この方法の様々な実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、対応する野生型タンパク質のものと比較して、ＮＯ解離定数、ＮＯに対するｋｏｆｆ、ＮＯに対するｋ１、ＮＯに対するｋ２、Ｏ２解離定数、ＮＯ安定性、ＮＯ反応性、ヘム自動酸化速度、または上記の２つ以上の任意の組み合わせを変化させる少なくとも１つの変異を有する。この方法のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、以下からなる群より選択される：野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｉ５Ａ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｉ５Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｉ５Ｌ−Ｐ１１５Ａ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｗ９Ｆ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｗ９Ｆ−Ｙ１４０Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｗ９Ｆ−Ｙ１４０Ｈ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｗ９Ｆ−Ｎ７４Ａ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｗ９Ｙ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｗ９Ｎ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｗ９Ｈ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｎ７４Ｅ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｎ７４Ａ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｎ７４Ｈ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｎ７４Ａ−Ｙ１４０Ｈ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｆ７８Ｙ−Ｙ１４０Ｆ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｆ７８Ｙ／Ｙ１４０Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｐ１１５Ａ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｒ１３５Ｑ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０Ｆ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ４０Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０Ｈ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０Ａ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｉ７５Ｆ−Ｈｉｓ６、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｉ７５Ｆ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｌ１４４Ｆ−Ｈｉｓ６、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｌ１４４Ｆ、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｈ−ＮＯＸ  Ｆ１４２Ｙ、野生型Ｌ．ｐｎｅｕｏｐｈｉｌｉａ  １  Ｈ��ＮＯＸ、野生型Ｌ．ｐｎｅｕｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｈ−ＮＯＸ、Ｌ．ｐｎｅｕｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｆ９Ｗ−Ｆ１４２Ｙ、野生型Ｄ．ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ  Ｈ−ＮＯＸ、Ｄ．ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ  Ｈ−ＮＯＸ（７２８−８９９）、Ｄ．ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１３９Ｌ、野生型Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１  Ｉ１４０Ｙ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１  Ｉ１４５Ｙ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１（１−３８５）、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１（１−３８５）Ｉ１４５Ｙ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１（１−３８５）Ｉ１４５Ｈ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１（１−１９４）、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１（１−１９４）Ｉ１４５Ｙ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１（１−１９４）Ｌ９Ｗ−Ｉ１４５Ｙ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β２（１−２１７）、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β２（１−２１７）Ｉ１４２Ｙ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｈ１０５Ｇ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｈ１０５Ｆ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｃ７８Ｓ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｃ７８Ｅ、野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−３８５）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−３８５）Ｉ１４５Ｙ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−３８５）Ｉ１４５Ｈ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−１９４）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−１９４）Ｉ１４５Ｙ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−１９４）Ｌ９Ｗ−Ｉ１４５Ｙ，Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β２（１−２１７）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β２（１−２１７）Ｉ１４２Ｙ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｈ１０５Ｇ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｈ１０５Ｆ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｃ７８Ｓ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｃ７８Ｅ、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｈ−ＮＯＸ（１−１７５）、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｈ−ＮＯＸ（１−１８６）、野生型Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  Ｈ−ＮＯＸ、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  Ｈ−ＮＯＸ（１−１９７）、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  Ｈ−ＮＯＸ（１−１８３）、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＧＣＹ−３５  Ｈ−ＮＯＸ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｈ−ＮＯＸ  ＧＣＹ−３５（１−２５２）、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  β１  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ＣＧ１４８８５−ＰＡ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ＣＧ１４８８６、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ＣＧ４１５４；野生型Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｓ．ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｂ．ｔａｕｒｕｓ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ；野生型Ｘ．ｌａｅｖｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｏ．ｌａｔｉｐｅｓ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｏ．ｃｕｒｉｖａｔｕｓ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｆ．ｒｕｂｒｉｐｅｓ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ａ．ｇａｍｂｉａｅ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｍ．ｓｅｘｔａ  Ｈ−ＮＯＸ；野生型Ｃ���ｅｌｅｇａｎｓ  ｇｃｙ−３１、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｇｃｙ−３２、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｇｃｙ−３３、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｇｃｙ−３４、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｇｃｙ−３５、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｇｃｙ−３６、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｇｃｙ−３７、野生型Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｖ．ｆｉｓｃｈｅｒｉｉ  Ｈ−ＮＯＸ、および野生型Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  Ｈ−ＮＯＸ。この方法の特定の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、以下からなる群より選択される：野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ、野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−３８５）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−２１７）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−１９４）、野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０Ｆ、野生型Ｌ．ｐｎｅｕｏｐｈｉｌｉａ  １  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｈ−ＮＯＸ、およびＬ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｈ−ＮＯＸ  Ｆ１４２Ｙ。この方法のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含むかまたはＨ−ＮＯＸタンパク質をカプセル化する、１つ以上のリポソームまたはナノ粒子を含む。
【００３６】
この方法のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ４０Ｌ、野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ、またはＬ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｈ−ＮＯＸ  Ｆ１４２Ｙではない。この方法のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｆ７８Ｙ／Ｙ１４０Ｌではない。この方法のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、野生型Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ（１−３８５）、野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ  β１  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ  ＣＧ１４８８５−ＰＡ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＧＣＹ−３５  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｓ．ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ、または野生型Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  Ｈ−ＮＯＸではない。この方法のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｗ９Ｆ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０Ｆ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｈ１０５Ｇ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｈ１０５Ｆ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｉ１４５Ｙ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｃ７８Ｓ、またはＲ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｃ７８Ｅではない。この方法のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β２（１−２１７）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−１９４）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−３８５）、またはＲ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１（１−３８５）Ｉ１４５Ｙではない。この方法のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｗ９Ｆ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０Ｆ、またはＨ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸ（１−３８５）Ｉ１４５Ｙではない。この方法のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０Ｈ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１  Ｉ１４０Ｙ、またはＨ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１  Ｉ１４５Ｙではない。この方法のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ４０Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｆ７８Ｙ／Ｙ１４０Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｗ９Ｆ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０Ｆ、野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｈ−ＮＯＸ  Ｆ１４２Ｙ、野生型Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｈ−ＮＯＸ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｉ１４０Ｙ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  Ｂ１  Ｉ１４５Ｙ、野生型Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ（１−３８５）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ（１−３８５）Ｉ１４５Ｙ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｈ１０５Ｇ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｈ１０５Ｆ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｓＧＣ  β１  Ｈ−ＮＯＸ  Ｉ１４５Ｙ、野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ  β１  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ  ＣＧ１４８８５−ＰＡ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＧＣＹ−３５  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ  Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｓ．ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ、または野生型Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  Ｈ−ＮＯＸではない。この方法のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、それらの種の省略形とＧｅｎｂａｎｋ識別番号にしたがってそれらの遺伝子名によって列挙される以下のＨ−ＮＯＸタンパク質のいずれでもない（例えば、２００６年５月２１日、２００６年５月２２日、２００７年５月２１日、または２００７年５月２２日に入手した以下のタンパク質配列）：Ｎｐｕｎ５９０５＿Ｎｐｕ＿２３１２９６０６、ａｌｒ２２７８＿Ａｎａ＿１７２２９７７０、ＳＯ２１４４＿Ｓｏｎｅ＿２４３７３７０２、Ｍｄｅｇ１３４３＿Ｍｄｅ＿２３０２７５２１、ＶＣＡ０７２０＿Ｖｃｈ＿１５６０１４７６、ＣＣ２９９２＿Ｃｃｒ＿１６１２７２２２、Ｒｓｐｈ２０４３＿Ｒｈｓｐ＿２２９５８４６３（ｇｉ：４６１９２７５７）、Ｍｍｃ１０７３９＿Ｍｃｓｐ＿２２９９９０２０、Ｔａｒ４＿Ｔｔｅ＿２０８０７１６９、Ｄｄｅｓ２８２２＿Ｄｄｅ＿２３４７５９１９、ＣＡＣ３２４３＿Ｃａｃ＿１５８９６４８８、ｇｃｙ−３１＿Ｃｅ＿１７５６８３８９、ＣＧ１４８８５＿Ｄｍ＿２４６４７４５５、ＧＵＣＹ１Ｂ３＿Ｈｓ＿４５０４２１５、ＨｐＧＣＳ−ｂｅｔａ１＿Ｈｐｕｌ＿１４２４５７３８、Ｇｙｃｂｅｔａ１００Ｂ＿Ｄｍ＿２４６５１５７７、ＣＧ４１５４＿Ｄｍ＿２４６４６９９３（ｇｉ：ＮＰ＿６５０４２４．２、ｇｉ：６２４８４２９８）、ｇｃｙ−３２＿Ｃｅ＿１３５３９１６０、ｇｃｙ−３６＿Ｃｅ＿１７５６８３９１（ｇｉ：３２５６６３５２、ｇｉ：８６５６４７１３）、ｇｃｙ−３５＿Ｃｅ−１７５０７８６１（ｇｉ：７１９９０１４６）、ｇｃｙ−３７＿Ｃｅ＿１７５４０９０４（ｇｉ：７１９８５５０５）、ＧＣＹ１α３＿Ｈｓ＿２０５３５６０３、ＧＣＹ１α２−Ｈｓ＿８９９４７７、またはＧＹＣα−９９Ｂ＿Ｄｍ＿７２９２７０（ｇｉ：６８０６７７３８）（Ｌａｋｓｈｍｉｎａｒａｙａｎら、（２００３）、「Ａｎｃｉｅｎｔ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｓｈａｒｅｄ  ｂｙ  ａｎｉｍａｌ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｇｕａｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅｓ  ａｎｄ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、ＢＭＧ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５−１３）。これらの名称の中で使用される種の省略形には以下を含む：Ａｎａ−Ａｎａｂａｅｎａ  Ｓｐ；Ｃｃｒ−Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ；Ｃａｃ−Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ；Ｄｄｅ−Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ；Ｍｃｓｐ−Ｍａｇｎｅｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．；Ｍｄｅ−Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ  ｄｅｇｒａｄａｎｓ；Ｎｐｕ−Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ；Ｒｈｓｐ−Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ；Ｓｏｎｅ−Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ；Ｔｔｅ−Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ；Ｖｃｈ−Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ；Ｃｅ−Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ；Ｄｍ−Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ；Ｈｐｕｌ−Ｈｅｍｉｃｅｎｔｒｏｔｕｓ  ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍｕｓ；Ｈｓ−Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ。この方法のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、それらの生物名とＰｆａｍデータベース登録番号によって列挙される以下のＨ−ＮＯＸタンパク質のいずれでもない（例えば、２００６年５月２１日、２００６年５月２２日、２００７年５月１７日、２００７年５月２１日、または２００７年５月２２日に入手した以下のタンパク質配列）：
【００３７】
【化６】
2009538133.tif 000008
【００３８】
【化７】
2009538133.tif 000009
【００３９】
【化８】
2009538133.tif 000010
。この方法のいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、ヒトＨ−ＮＯＸのＴｙｒ１３５、Ｓｅｒ１３７、およびＡｒｇ１３９を含むＹ−Ｓ−Ｒモチーフの中には変異を有さない。
【００４０】
他で明記されないか、または状況によって示されない限りは、本明細書中に記載される全ての野生型タンパク質および変異タンパク質、ならびに全ての薬学的組成物は、本明細書中に記載されるＮＯの送達方法のうちの任意のものにおいて使用され得る。Ｈ−ＮＯＸタンパク質には、ヘムおよび／またはＮＯが結合している場合も、また、結合していない場合もあり、そしてこれらは、別の分子または部分（例えば、ポリエチレングリコール）に共有結合される場合も、また結合されていない場合もある。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｈ−ＮＯＸドメインと、別のタンパク質（例えば、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン））の一部または全体が含まれている融合タンパク質である。
【００４１】
１つの態様においては、本発明は、１つ以上のＨ−ＮＯＸタンパク質が含まれているキットを特徴とする。いくつかの実施形態においては、本発明により、Ｈ−ＮＯＸタンパク質と、個体にＮＯを送達するためにこのキットを使用するための説明書が含まれているキットが提供される。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２は、３７℃では約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間であり、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、３７℃では少なくとも約１μＭである。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ解離定数は、ヘモグロビンのＮＯ解離定数の大きさの２桁以内であり、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、ヘモグロビンのＮＯ反応性の少なくとも１０分の１未満である。他で明記されないか、または状況によって示されない限りは、本明細書中に記載される全ての野生型タンパク質および変異タンパク質、ならびに全ての薬学的組成物は、本明細書中に記載されるキットのうちの任意のものにおいて使用され得る。Ｈ−ＮＯＸタンパク質には、ヘムおよび／またはＮＯが結合している場合も、また、結合していない場合もあり、そしてこれらは、別の分子または部分（例えば、ポリエチレングリコール）に共有結合される場合も、また結合されていない場合もある。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｈ−ＮＯＸドメインと、別のタンパク質（例えば、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン））の一部または全体が含まれている融合タンパク質である。
【００４２】
１つの態様においては、本発明は、医薬品として使用されるＨ−ＮＯＸタンパク質（例えば、本明細書中に記載される野生型タンパク質または変異タンパク質のうちのいずれか）を特徴とする。いくつかの実施形態においては、本発明は、個体へのＮＯの送達方法に使用されるＨ−ＮＯＸタンパク質を特徴とする。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、ＮＯの送達が有効である任意の症状（例えば、心臓血管の症状、高血圧、高血圧によって悪化した症状（例えば、心不全、腎不全、または脳卒中）、血管収縮の症状、脳卒中、あるいはＮＯ機能不全）を治療するために使用される。
【００４３】
いくつかの実施形態においては、本発明は、医薬品（例えば、個体にＮＯを送達するための医薬品）の製造のためのＨ−ＮＯＸタンパク質（例えば、本明細書中に記載される野生型タンパク質または変異タンパク質のうちのいずれか）の使用を特徴とする。いくつかの実施形態においては、本発明は、個体へのＮＯの送達のためのＨ−ＮＯＸタンパク質の使用を特徴とする。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、ＮＯの送達が有効である任意の症状（例えば、心臓血管の症状、高血圧、高血圧によって悪化した症状（例えば、心不全、腎不全、または脳卒中）、血管収縮の症状、脳卒中、あるいはＮＯ機能不全）を治療するために使用される。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１Ａ】図１Ａは、ＮＯ結合およびＯ２結合Ｈ−ＮＯＸタンパク質の遠位ポケット残基の三次元構造（ヘムの上）の図である。ＮＯ結合Ｈ−ＮＯＸタンパク質とＯ２結合Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム配位残基もまた示される（ヘムの下）。図１Ａは、Ｐｅｌｌｉｃｅｎａ，Ｐ．ら、（２００４年８月３１日）によって報告されたＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸの三次元構造に基づく。「Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎ  Ｏｘｙｇｅｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｈｅｍｅ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅｓ」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１（３５）：１２８５４−１２８５９。
【図１Ｂ】図１Ｂは、Ｈ−ＮＯＸドメインの構造的特徴を示しているＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸの三次元構造の立体的な側面図である。タンパク質の折り畳みは、リボン図によって示される。ヘム、２酸素リガンド、および近位ヒスチジンが、ｂａｌｌ−ａｎｄ−ｓｔｉｃｋモデルとして示されている。α−ヘリックスは、図５Ｂに示される命名法にしたがってＡ−Ｇと表される。β−鎖は、１−４と表される。図１Ｂは、Ｐｅｌｌｉｃｅｎａ，Ｐ．ら、（２００４年８月３１日）、「Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎ  Ｏｘｙｇｅｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｈｅｍｅ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅｓ」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１（３５）：１２８５４−１２８５９による。
【図１Ｃ】図１Ｃ〜１Ｈは、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸの中の例示的な遠位ポケット残基を説明している、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸの三次元構造の図である。図１Ｃ〜１Ｈの中に示される以下の残基が、Ｈ−ＮＯＸの遠位ポケットに含まれている主な残基である：Ｔｈｒ４、Ｉｌｅ５、Ｔｈｒ８、Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ６７、Ａｓｎ７４、Ｉｌｅ７５、Ｐｈｅ７８、Ｐｈｅ８２、Ｔｙｒ１４０、およびＬｅｕ１４４。これらは、ヘリックスＡ、Ｄ、Ｅ、およびＧの中に含まれる。図１Ｃ〜１Ｈは、ＰＹＭＯＬ（ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＬＬＰ）を使用して作成した。
【図１Ｄ】図１Ｃ〜１Ｈは、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ中の例示的な遠位ポケット残基を説明している、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸの三次元構造の図である。図１Ｃ〜１Ｈの中に示される以下の残基が、Ｈ−ＮＯＸの遠位ポケットに含まれている主な残基である：Ｔｈｒ４、Ｉｌｅ５、Ｔｈｒ８、Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ６７、Ａｓｎ７４、Ｉｌｅ７５、Ｐｈｅ７８、Ｐｈｅ８２、Ｔｙｒ１４０、およびＬｅｕ１４４。これらは、ヘリックスＡ、Ｄ、Ｅ、およびＧの中に含まれる。図１Ｃ〜１Ｈは、ＰＹＭＯＬ（ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＬＬＰ）を使用して作成した。
【図１Ｅ】図１Ｃ〜１Ｈは、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ中の例示的な遠位ポケット残基を説明している、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸの三次元構造の図である。図１Ｃ〜１Ｈの中に示される以下の残基が、Ｈ−ＮＯＸの遠位ポケットに含まれている主な残基である：Ｔｈｒ４、Ｉｌｅ５、Ｔｈｒ８、Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ６７、Ａｓｎ７４、Ｉｌｅ７５、Ｐｈｅ７８、Ｐｈｅ８２、Ｔｙｒ１４０、およびＬｅｕ１４４。これらは、ヘリックスＡ、Ｄ、Ｅ、およびＧの中に含まれる。図１Ｃ〜１Ｈは、ＰＹＭＯＬ（ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＬＬＰ）を使用して作成した。
【図１Ｆ】図１Ｃ〜１Ｈは、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ中の例示的な遠位ポケット残基を説明している、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸの三次元構造の図である。図１Ｃ〜１Ｈの中に示される以下の残基が、Ｈ−ＮＯＸの遠位ポケットに含まれている主な残基である：Ｔｈｒ４、Ｉｌｅ５、Ｔｈｒ８、Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ６７、Ａｓｎ７４、Ｉｌｅ７５、Ｐｈｅ７８、Ｐｈｅ８２、Ｔｙｒ１４０、およびＬｅｕ１４４。これらは、ヘリックスＡ、Ｄ、Ｅ、およびＧの中に含まれる。図１Ｃ〜１Ｈは、ＰＹＭＯＬ（ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＬＬＰ）を使用して作成した。
【図１Ｇ】図１Ｃ〜１Ｈは、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ中の例示的な遠位ポケット残基を説明している、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸの三次元構造の図である。図１Ｃ〜１Ｈの中に示される以下の残基が、Ｈ−ＮＯＸの遠位ポケットに含まれている主な残基である：Ｔｈｒ４、Ｉｌｅ５、Ｔｈｒ８、Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ６７、Ａｓｎ７４、Ｉｌｅ７５、Ｐｈｅ７８、Ｐｈｅ８２、Ｔｙｒ１４０、およびＬｅｕ１４４。これらは、ヘリックスＡ、Ｄ、Ｅ、およびＧの中に含まれる。図１Ｃ〜１Ｈは、ＰＹＭＯＬ（ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＬＬＰ）を使用して作成した。
【図１Ｈ】図１Ｃ〜１Ｈは、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ中の例示的な遠位ポケット残基を説明している、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸの三次元構造の図である。図１Ｃ〜１Ｈの中に示される以下の残基が、Ｈ−ＮＯＸの遠位ポケットに含まれている主な残基である：Ｔｈｒ４、Ｉｌｅ５、Ｔｈｒ８、Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ６７、Ａｓｎ７４、Ｉｌｅ７５、Ｐｈｅ７８、Ｐｈｅ８２、Ｔｙｒ１４０、およびＬｅｕ１４４。これらは、ヘリックスＡ、Ｄ、Ｅ、およびＧの中に含まれる。図１Ｃ〜１Ｈは、ＰＹＭＯＬ（ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＬＬＰ）を使用して作成した。
【図２】図２は、Ｏ２およびＮＯに結合するか、または結合すると予想される、以下のＨ−ＮＯＸタンパク質の配列アラインメントである：多数派（Ｍａｊｏｒｉｔｙ）（配列番号１）；Ｃｅ．ｇｃｙ−３１（配列番号２）；Ｃｅ．ｇｃｙ−３３（配列番号３）；Ｃｅ．ｇｃｙ−３５（配列番号４）；Ｄｍ．ＣＧ１４８８５  ＨＮＯＸ（配列番号５）；Ｄｍ．ＣＧ４１５４  ＨＮＯＸ（配列番号６）；Ｍｓ．Ｂｅｔａ３  ＨＮＯＸ（配列番号７）；Ｔｔ  ＨＮＯＸ（配列番号８）；およびＣａ  ＨＮＯＸ（配列番号９）。これらのＨ−ＮＯＸタンパク質は、これらがＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸのＹ１４０に相当する位置にチロシンを有しているとの理由から、Ｏ２ならびにＮＯに結合すると予想される。図２で使用したアミノ酸のナンバリングは、Ｈ−ＮＯＸドメインまたは全長のタンパク質の最初のアミノ酸を、残基番号１として開始した。アラインメントは、プログラムＭｅｇＡｌｉｇｎにおいてデフォルトパラメータを使用して作成した。図２において使用した省略形は、図４Ａ〜４Ｄに関して以下に記載される。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｄは、ＮＯに結合するが、Ｏ２には結合しないか、あるいはそのように予想される以下のＨ−ＮＯＸタンパク質の配列アラインメントである：多数派（配列番号１０）；Ｄｍ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１１）；ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１２）；ｈｓ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１３）；ｈｓ．ｂｅｔａ２タンパク質（配列番号１４）；Ｍｓ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１５）；Ｍｍ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１６）；Ｎｐ．ｂｅｔａ１  ＨＤ−様（配列番号１７）；Ｔｒ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１８）；Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ＿ｇａｍｂｉａｅ｜ＸＰ＿３１０９１９（配列番号１９）；Ａｐｉｓ＿ｍｅｌｌｉｆｅｒａｌ｜ＭＰ＿００１０１１６３２（配列番号２０）；Ｂｔ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号２１）；Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ＿ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ｜ＡＡＲ０２（配列番号２２）；Ｏｒｙｚｉａｓ＿ｃｕｒｖｉｎｏｔｕｓ｜ＢＡＣ９８３９６（配列番号２３）；Ｏｒｙｚｉａｓ＿Ｌａｔｉｐｅｓ｜ＢＡＡ７６６９１（配列番号２４）；Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ＿ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ｜Ｘ（配列番号２５）；およびＳｕｓ  ｓｃｒｏｆａ  ｂｅｔａ１｜ＮＰ＿００１０１８０４２＋（配列番号２６）。アラインメントは、プログラムＭｅｇＡｌｉｇｎにおいてデフォルトパラメータを使用して作成した。図３Ａ〜３Ｄにおいて使用した省略形は、図４に関して以下に記載される。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｄは、ＮＯに結合するが、Ｏ２には結合しないか、あるいはそのように予想される以下のＨ−ＮＯＸタンパク質の配列アラインメントである：多数派（配列番号１０）；Ｄｍ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１１）；ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１２）；ｈｓ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１３）；ｈｓ．ｂｅｔａ２タンパク質（配列番号１４）；Ｍｓ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１５）；Ｍｍ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１６）；Ｎｐ．ｂｅｔａ１  ＨＤ−様（配列番号１７）；Ｔｒ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１８）；Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ＿ｇａｍｂｉａｅ｜ＸＰ＿３１０９１９（配列番号１９）；Ａｐｉｓ＿ｍｅｌｌｉｆｅｒａｌ｜ＭＰ＿００１０１１６３２（配列番号２０）；Ｂｔ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号２１）；Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ＿ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ｜ＡＡＲ０２（配列番号２２）；Ｏｒｙｚｉａｓ＿ｃｕｒｖｉｎｏｔｕｓ｜ＢＡＣ９８３９６（配列番号２３）；Ｏｒｙｚｉａｓ＿Ｌａｔｉｐｅｓ｜ＢＡＡ７６６９１（配列番号２４）；Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ＿ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ｜Ｘ（配列番号２５）；およびＳｕｓ  ｓｃｒｏｆａ  ｂｅｔａ１｜ＮＰ＿００１０１８０４２＋（配列番号２６）。アラインメントは、プログラムＭｅｇＡｌｉｇｎにおいてデフォルトパラメータを使用して作成した。図３Ａ〜３Ｄにおいて使用した省略形は、図４に関して以下に記載される。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｄは、ＮＯに結合するが、Ｏ２には結合しないか、あるいはそのように予想される以下のＨ−ＮＯＸタンパク質の配列アラインメントである：多数派（配列番号１０）；Ｄｍ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１１）；ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１２）；ｈｓ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１３）；ｈｓ．ｂｅｔａ２タンパク質（配列番号１４）；Ｍｓ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１５）；Ｍｍ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１６）；Ｎｐ．ｂｅｔａ１  ＨＤ−様（配列番号１７）；Ｔｒ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１８）；Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ＿ｇａｍｂｉａｅ｜ＸＰ＿３１０９１９（配列番号１９）；Ａｐｉｓ＿ｍｅｌｌｉｆｅｒａｌ｜ＭＰ＿００１０１１６３２（配列番号２０）；Ｂｔ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号２１）；Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ＿ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ｜ＡＡＲ０２（配列番号２２）；Ｏｒｙｚｉａｓ＿ｃｕｒｖｉｎｏｔｕｓ｜ＢＡＣ９８３９６（配列番号２３）；Ｏｒｙｚｉａｓ＿Ｌａｔｉｐｅｓ｜ＢＡＡ７６６９１（配列番号２４）；Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ＿ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ｜Ｘ（配列番号２５）；およびＳｕｓ  ｓｃｒｏｆａ  ｂｅｔａ１｜ＮＰ＿００１０１８０４２＋（配列番号２６）。アラインメントは、プログラムＭｅｇＡｌｉｇｎにおいてデフォルトパラメータを使用して作成した。図３Ａ〜３Ｄにおいて使用した省略形は、図４に関して以下に記載される。
【図３Ｄ】図３Ａ〜３Ｄは、ＮＯに結合するが、Ｏ２には結合しないか、あるいはそのように予想される以下のＨ−ＮＯＸタンパク質の配列アラインメントである：多数派（配列番号１０）；Ｄｍ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１１）；ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１２）；ｈｓ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１３）；ｈｓ．ｂｅｔａ２タンパク質（配列番号１４）；Ｍｓ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１５）；Ｍｍ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１６）；Ｎｐ．ｂｅｔａ１  ＨＤ−様（配列番号１７）；Ｔｒ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１８）；Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ＿ｇａｍｂｉａｅ｜ＸＰ＿３１０９１９（配列番号１９）；Ａｐｉｓ＿ｍｅｌｌｉｆｅｒａｌ｜ＭＰ＿００１０１１６３２（配列番号２０）；Ｂｔ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号２１）；Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ＿ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ｜ＡＡＲ０２（配列番号２２）；Ｏｒｙｚｉａｓ＿ｃｕｒｖｉｎｏｔｕｓ｜ＢＡＣ９８３９６（配列番号２３）；Ｏｒｙｚｉａｓ＿Ｌａｔｉｐｅｓ｜ＢＡＡ７６６９１（配列番号２４）；Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ＿ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ｜Ｘ（配列番号２５）；およびＳｕｓ  ｓｃｒｏｆａ  ｂｅｔａ１｜ＮＰ＿００１０１８０４２＋（配列番号２６）。アラインメントは、プログラムＭｅｇＡｌｉｇｎにおいてデフォルトパラメータを使用して作成した。図３Ａ〜３Ｄにおいて使用した省略形は、図４に関して以下に記載される。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｄは、図２および３Ａ〜３ＤのＨ−ＮＯＸタンパク質の配列アラインメントである：多数派（配列番号２７）；Ｄｍ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１１）；ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１２）；ｈｓ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１３）；ｈｓ．ｂｅｔａ２タンパク質（配列番号１４）；Ｍｍ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１６）；Ｎｐ．ｂｅｔａ１  ＨＤ−様（配列番号１７）；Ｔｒ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１８）；Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ＿ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ｜ＡＡＲ０２（配列番号２２）；Ｏｒｙｚｉａｓ＿ｃｕｒｖｉｎｏｔｕｓ｜ＢＡＣ９８３９６（配列番号２３）；Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ＿ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ｜Ｘ（配列番号２５）；Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ  ｂｅｔａ１｜ＮＰ＿００１０１８０４２＋（配列番号２６）；ｇｃｙ−３１ａ（配列番号２）；ｇｃｙ−３３（配列番号３）；Ｃａ  ＨＮＯＸ（配列番号９）；Ｔ．ｂｅｔａ１  ＨＤ−様（配列番号８）  ＨＮＯＸ（配列番号８）；Ｍｓ．ｓＧｃ  ｂｅｔａ３タンパク質（配列番号７）；ＣＧ１４８８５（配列番号５）；およびＤｍ．ｓＣＧ短縮変異体（配列番号６）。アラインメントは、プログラムＭｅｇＡｌｉｇｎにおいてデフォルトパラメータを使用して作成した。図２〜４Ｄについては、「Ｄｍ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質」は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質」は、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「ｈｓ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質」は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「ｈｓ．ｂｅｔａ２タンパク質」は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  β２  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｍｍ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質」は、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｎｐ．ｂｅｔａ１  ＨＤ−様」は、Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｔｒ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質」は、Ｔａｋｉｆｕｇｕ  ｒｕｂｒｉｐｅｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ＿ｇａｍｂｉａｅ｜ＸＰ＿３１０９１９」は、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇａｍｂｉａｅ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ａｐｉｓ＿ｍｅｌｌｉｆｅｒａ｜ＮＰ＿００１０１１６３２」は、Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｂｔ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質」は、Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ＿ｒｅｉｎｆａｒｄｔｉｉ｜ＡＡＲ０２」は、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｏｒｙｚｉａｓ＿ｃｕｒｖｉｎｏｔｕｓ｜ＢＡＣ９８３９６」は、Ｏｒｙｚｉａｓ  ｃｕｒｖｉｎｏｔｕｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｏｒｙｚｉａｓ＿ｌａｔｉｐｅｓ｜ＢＡＡ７６６９１」は、Ｏｒｙｚｉａｓ  ｌａｔｉｐｅｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ＿ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ｜Ｘ」は、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ＿ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ  ｂｅｔａ１｜ＮＰ＿００１０１８４２＋」は、Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「ｇｃｙ−３１ａ」は、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  Ｇｃｙ−３１ａ  Ｈ−ＮＯＸを示し；「ｇｃｙ−３３」は、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  Ｇｃｙ−３３  Ｈ−ＮＯＸを示し；「ｇｃｙ−３５」は、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  Ｇｃｙ−３５  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｃａ．ＨＮＯＸ」は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｉｙｌｉｃｕｍ  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｔ．ｂｅｔａ１  ＨＤ−様」は、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｍｓ．ｓＧｃ  ｂｅｔａ３タンパク質」は、Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａ  β３  Ｈ−ＮＯＸを示し；「ＣＧ１４８８５」は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ＣＧ１４８８５  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｄｍ．ｓＧＣ短縮変異体」は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  Ｇｃｙ−８８−Ｅ−Ｓ  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｄｍ．ＣＧ４１５４  ＨＮＯＸ」は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ＣＧ４１５４  Ｈ−ＮＯＸを示す。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｄは、図２および３Ａ〜３ＤのＨ−ＮＯＸタンパク質の配列アラインメントである：多数派（配列番号２７）；Ｄｍ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１１）；ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１２）；ｈｓ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１３）；ｈｓ．ｂｅｔａ２タンパク質（配列番号１４）；Ｍｍ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１６）；Ｎｐ．ｂｅｔａ１  ＨＤ−様（配列番号１７）；Ｔｒ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１８）；Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ＿ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ｜ＡＡＲ０２（配列番号２２）；Ｏｒｙｚｉａｓ＿ｃｕｒｖｉｎｏｔｕｓ｜ＢＡＣ９８３９６（配列番号２３）；Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ＿ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ｜Ｘ（配列番号２５）；Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ  ｂｅｔａ１｜ＮＰ＿００１０１８０４２＋（配列番号２６）；ｇｃｙ−３１ａ（配列番号２）；ｇｃｙ−３３（配列番号３）；Ｃａ  ＨＮＯＸ（配列番号９）；Ｔ．ｂｅｔａ１  ＨＤ−様（配列番号８）  ＨＮＯＸ（配列番号８）；Ｍｓ．ｓＧｃ  ｂｅｔａ３タンパク質（配列番号７）；ＣＧ１４８８５（配列番号５）；およびＤｍ．ｓＣＧ短縮変異体（配列番号６）。アラインメントは、プログラムＭｅｇＡｌｉｇｎにおいてデフォルトパラメータを使用して作成した。図２〜４Ｄについては、「Ｄｍ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質」は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質」は、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「ｈｓ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質」は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「ｈｓ．ｂｅｔａ２タンパク質」は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  β２  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｍｍ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質」は、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｎｐ．ｂｅｔａ１  ＨＤ−様」は、Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｔｒ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質」は、Ｔａｋｉｆｕｇｕ  ｒｕｂｒｉｐｅｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ＿ｇａｍｂｉａｅ｜ＸＰ＿３１０９１９」は、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇａｍｂｉａｅ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ａｐｉｓ＿ｍｅｌｌｉｆｅｒａ｜ＮＰ＿００１０１１６３２」は、Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｂｔ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質」は、Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ＿ｒｅｉｎｆａｒｄｔｉｉ｜ＡＡＲ０２」は、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｏｒｙｚｉａｓ＿ｃｕｒｖｉｎｏｔｕｓ｜ＢＡＣ９８３９６」は、Ｏｒｙｚｉａｓ  ｃｕｒｖｉｎｏｔｕｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｏｒｙｚｉａｓ＿ｌａｔｉｐｅｓ｜ＢＡＡ７６６９１」は、Ｏｒｙｚｉａｓ  ｌａｔｉｐｅｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ＿ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ｜Ｘ」は、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ＿ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ  ｂｅｔａ１｜ＮＰ＿００１０１８４２＋」は、Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「ｇｃｙ−３１ａ」は、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  Ｇｃｙ−３１ａ  Ｈ−ＮＯＸを示し；「ｇｃｙ−３３」は、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  Ｇｃｙ−３３  Ｈ−ＮＯＸを示し；「ｇｃｙ−３５」は、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  Ｇｃｙ−３５  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｃａ．ＨＮＯＸ」は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｉｙｌｉｃｕｍ  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｔ．ｂｅｔａ１  ＨＤ−様」は、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｍｓ．ｓＧｃ  ｂｅｔａ３タンパク質」は、Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａ  β３  Ｈ−ＮＯＸを示し；「ＣＧ１４８８５」は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ＣＧ１４８８５  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｄｍ．ｓＧＣ短縮変異体」は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  Ｇｃｙ−８８−Ｅ−Ｓ  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｄｍ．ＣＧ４１５４  ＨＮＯＸ」は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ＣＧ４１５４  Ｈ−ＮＯＸを示す。
【図４Ｃ】図４Ａ〜４Ｄは、図２および３Ａ〜３ＤのＨ−ＮＯＸタンパク質の配列アラインメントである：多数派（配列番号２７）；Ｄｍ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１１）；ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１２）；ｈｓ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１３）；ｈｓ．ｂｅｔａ２タンパク質（配列番号１４）；Ｍｍ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１６）；Ｎｐ．ｂｅｔａ１  ＨＤ−様（配列番号１７）；Ｔｒ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１８）；Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ＿ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ｜ＡＡＲ０２（配列番号２２）；Ｏｒｙｚｉａｓ＿ｃｕｒｖｉｎｏｔｕｓ｜ＢＡＣ９８３９６（配列番号２３）；Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ＿ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ｜Ｘ（配列番号２５）；Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ  ｂｅｔａ１｜ＮＰ＿００１０１８０４２＋（配列番号２６）；ｇｃｙ−３１ａ（配列番号２）；ｇｃｙ−３３（配列番号３）；Ｃａ  ＨＮＯＸ（配列番号９）；Ｔ．ｂｅｔａ１  ＨＤ−様（配列番号８）  ＨＮＯＸ（配列番号８）；Ｍｓ．ｓＧｃ  ｂｅｔａ３タンパク質（配列番号７）；ＣＧ１４８８５（配列番号５）；およびＤｍ．ｓＣＧ短縮変異体（配列番号６）。アラインメントは、プログラムＭｅｇＡｌｉｇｎにおいてデフォルトパラメータを使用して作成した。図２〜４Ｄについては、「Ｄｍ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質」は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質」は、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「ｈｓ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質」は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「ｈｓ．ｂｅｔａ２タンパク質」は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  β２  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｍｍ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質」は、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｎｐ．ｂｅｔａ１  ＨＤ−様」は、Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｔｒ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質」は、Ｔａｋｉｆｕｇｕ  ｒｕｂｒｉｐｅｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ＿ｇａｍｂｉａｅ｜ＸＰ＿３１０９１９」は、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇａｍｂｉａｅ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ａｐｉｓ＿ｍｅｌｌｉｆｅｒａ｜ＮＰ＿００１０１１６３２」は、Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｂｔ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質」は、Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ＿ｒｅｉｎｆａｒｄｔｉｉ｜ＡＡＲ０２」は、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｏｒｙｚｉａｓ＿ｃｕｒｖｉｎｏｔｕｓ｜ＢＡＣ９８３９６」は、Ｏｒｙｚｉａｓ  ｃｕｒｖｉｎｏｔｕｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｏｒｙｚｉａｓ＿ｌａｔｉｐｅｓ｜ＢＡＡ７６６９１」は、Ｏｒｙｚｉａｓ  ｌａｔｉｐｅｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ＿ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ｜Ｘ」は、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ＿ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ  ｂｅｔａ１｜ＮＰ＿００１０１８４２＋」は、Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「ｇｃｙ−３１ａ」は、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  Ｇｃｙ−３１ａ  Ｈ−ＮＯＸを示し；「ｇｃｙ−３３」は、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  Ｇｃｙ−３３  Ｈ−ＮＯＸを示し；「ｇｃｙ−３５」は、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  Ｇｃｙ−３５  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｃａ．ＨＮＯＸ」は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｉｙｌｉｃｕｍ  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｔ．ｂｅｔａ１  ＨＤ−様」は、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｍｓ．ｓＧｃ  ｂｅｔａ３タンパク質」は、Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａ  β３  Ｈ−ＮＯＸを示し；「ＣＧ１４８８５」は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ＣＧ１４８８５  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｄｍ．ｓＧＣ短縮変異体」は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  Ｇｃｙ−８８−Ｅ−Ｓ  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｄｍ．ＣＧ４１５４  ＨＮＯＸ」は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ＣＧ４１５４  Ｈ−ＮＯＸを示す。
【図４Ｄ】図４Ａ〜４Ｄは、図２および３Ａ〜３ＤのＨ−ＮＯＸタンパク質の配列アラインメントである：多数派（配列番号２７）；Ｄｍ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１１）；ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１２）；ｈｓ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１３）；ｈｓ．ｂｅｔａ２タンパク質（配列番号１４）；Ｍｍ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１６）；Ｎｐ．ｂｅｔａ１  ＨＤ−様（配列番号１７）；Ｔｒ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質（配列番号１８）；Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ＿ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ｜ＡＡＲ０２（配列番号２２）；Ｏｒｙｚｉａｓ＿ｃｕｒｖｉｎｏｔｕｓ｜ＢＡＣ９８３９６（配列番号２３）；Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ＿ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ｜Ｘ（配列番号２５）；Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ  ｂｅｔａ１｜ＮＰ＿００１０１８０４２＋（配列番号２６）；ｇｃｙ−３１ａ（配列番号２）；ｇｃｙ−３３（配列番号３）；Ｃａ  ＨＮＯＸ（配列番号９）；Ｔ．ｂｅｔａ１  ＨＤ−様（配列番号８）  ＨＮＯＸ（配列番号８）；Ｍｓ．ｓＧｃ  ｂｅｔａ３タンパク質（配列番号７）；ＣＧ１４８８５（配列番号５）；およびＤｍ．ｓＣＧ短縮変異体（配列番号６）。アラインメントは、プログラムＭｅｇＡｌｉｇｎにおいてデフォルトパラメータを使用して作成した。図２〜４Ｄについては、「Ｄｍ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質」は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質」は、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「ｈｓ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質」は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「ｈｓ．ｂｅｔａ２タンパク質」は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  β２  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｍｍ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質」は、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｎｐ．ｂｅｔａ１  ＨＤ−様」は、Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｔｒ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質」は、Ｔａｋｉｆｕｇｕ  ｒｕｂｒｉｐｅｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ＿ｇａｍｂｉａｅ｜ＸＰ＿３１０９１９」は、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇａｍｂｉａｅ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ａｐｉｓ＿ｍｅｌｌｉｆｅｒａ｜ＮＰ＿００１０１１６３２」は、Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｂｔ．ｓＧＣ  ｂｅｔａ１タンパク質」は、Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ＿ｒｅｉｎｆａｒｄｔｉｉ｜ＡＡＲ０２」は、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｏｒｙｚｉａｓ＿ｃｕｒｖｉｎｏｔｕｓ｜ＢＡＣ９８３９６」は、Ｏｒｙｚｉａｓ  ｃｕｒｖｉｎｏｔｕｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｏｒｙｚｉａｓ＿ｌａｔｉｐｅｓ｜ＢＡＡ７６６９１」は、Ｏｒｙｚｉａｓ  ｌａｔｉｐｅｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ＿ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ｜Ｘ」は、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ＿ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ  ｂｅｔａ１｜ＮＰ＿００１０１８４２＋」は、Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ  β１  Ｈ−ＮＯＸを示し；「ｇｃｙ−３１ａ」は、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  Ｇｃｙ−３１ａ  Ｈ−ＮＯＸを示し；「ｇｃｙ−３３」は、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  Ｇｃｙ−３３  Ｈ−ＮＯＸを示し；「ｇｃｙ−３５」は、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  Ｇｃｙ−３５  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｃａ．ＨＮＯＸ」は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｉｙｌｉｃｕｍ  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｔ．ｂｅｔａ１  ＨＤ−様」は、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｍｓ．ｓＧｃ  ｂｅｔａ３タンパク質」は、Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａ  β３  Ｈ−ＮＯＸを示し；「ＣＧ１４８８５」は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ＣＧ１４８８５  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｄｍ．ｓＧＣ短縮変異体」は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  Ｇｃｙ−８８−Ｅ−Ｓ  Ｈ−ＮＯＸを示し；「Ｄｍ．ＣＧ４１５４  ＨＮＯＸ」は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ＣＧ４１５４  Ｈ−ＮＯＸを示す。
【図５】図５Ａは、Ｈ−ＮＯＸファミリーのメンバーの配列アラインメントである。配列のナンバリングは、Ｔ−ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸのナンバリングである。不変の残基は「Ｖ」で示し、極めて高度に保存されている残基を「ｓ」で示す。Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸのＹ１４０を「Ｈ」で示す。他のＨ−ＮＯＸタンパク質中のＦｅＩＩ−Ｏ２複合体を安定化させ得る予想される遠位ポケットチロシン残基は以下である。Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  ＧＣＹ−３５の７０位；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ＣＧ１４８８５−ＰＡの１４０位、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  ＧＣＹ−３５の１３８位；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍの１４０位。ナンバリングは、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓに従った。登録番号は以下である：Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  β１［ｇｉ：２７４６０８３］（配列番号２８）、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１［ｇｉ：２７１２７３１８］（配列番号２９）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ  β１［ｇｉ：８６１２０３］（配列番号３０）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ  ＣＧ１４８８５−ＰＡ［ｇｉ：２３１７１４７６］（配列番号３１）、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  ＧＣＹ−３５［ｇｉ：５２７８２８０６］（配列番号３２）、Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ［ｇｉ：２３１２９６０６］（配列番号３３）、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ［ｇｉ：１６１２７２２２］（配列番号３４）、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ［ｇｉ：２４３７３７０２］（配列番号３５）、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ（ＯＲＦ２）［ＣＵＣＧＣ＿２７２６２４］（配列番号３６）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ［ｇｉ：１５８９６４８８］（配列番号３７）、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ［ｇｉ：２０８０７１６９］（配列番号３８）。アラインメントは、プログラムＭｅｇＡｌｉｇｎ、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ，ＤＮＡ  Ｓｔａｒを使用して作成した（「ｄｎａｓｔａｒ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｍｅｇａｌｉｇｎ．ｐｈｐ」にてｗｏｒｌｄ−ｗｉｄｅ  ｗｅｂを参照のこと）。Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｗデフォルトパラメータを使用した。  図５Ｂは、例示的なＨ−ＮＯＸドメインの配列アラインメントである。二次構造の注釈、およびアラインメントの上部のナンバリングは、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ由来のＨ−ＮＯＸドメインに対応する。α−ヘリックスを螺旋で、βシートを矢印で示した。遠位ポケットは、α−ヘリックスαＡ、αＤ、αＥ、およびαＧによって定義した。Ｐｕｂｍｅｄ／ＮＣＢＩ登録番号は以下である：Ｔｈｅｒ＿ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  ｇｉ｜２０８０７１６９｜（配列番号３９）、Ｃｌｏｓ＿ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ｇｉ｜１５８９６４８８｜（配列番号４０）、Ｃｌｏｓ＿ｔｅｔａｎｉ  ＧＩ：７５５４３２６６（配列番号４１）、Ｄｅｓｕ＿ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ  ｇｉ｜２３４７５９１９｜（配列番���４２）、Ｖｉｂｒ＿ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ  ｇｉ｜２７３６１７３４｜（配列番号４３）、Ｃａｕｌ＿ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ  ｇｉ｜１６１２７２２２｜（配列番号４４）、Ｍｉｃｒ＿ｄｅｇｒａｄａｎｓ  ｇｉ｜２３０２７５２１｜（配列番号４５）、Ｖｉｂｒ＿ｃｈｏｌｅｒａｅ  ｇｉ｜１５６０１４７６｜（配列番号４６）、Ｓｈｅｗ＿ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ  ｇｉ｜２４３７３７０２｜（配列番号４７）、Ｒａｔ＿ｂｅｔａ１＿ｓＧＣ  ｇｉ｜２７１２７３１８｜（配列番号４８）、Ｒａｔ＿ｂｅｔａ２＿ｓＧＣ  ｇｉ｜２１９５６６３５｜（配列番号４９）、Ｎｏｓｔ｜ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  ｇｉ｜２３１２９６０６｜（配列番号５０）、およびＮｏｓｔ＿ｓｐ．ｇｉ｜１７２２９７７０｜（配列番号５１）。コンセンサス配列を図５Ｂの一番下に示す（配列番号５２）。アラインメントは、プログラムＭＵＬＴＡＬＩＮ（Ｃｏｒｐｅｔ，Ｆ．（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０８８１−１０８９０）を使用して作成し、図５Ｂは、プログラムＥＳＰＲＩＰＴ（Ｇｏｕｅｔ，Ｐ．ら、（１９９９）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １５：３０５−３０８）を使用して調製した。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸドメインのヘム環境の三次元構造の図である。図６Ａおよび６Ｂは、Ｐｅｌｌｉｃｅｎａ，Ｐ．ら、（２００４年８月３１日）による。「Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎ  Ｏｘｙｇｅｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｈｅｍｅ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅｓ」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１（３５）：１２８５４−１２８５９。
【図７】図７Ａ〜７Ｆは、Ｔｔ  Ｈ−ＮＯＸ（図７Ａ）、Ｔｔ  Ｙ１４０Ｌ（図７Ｂ）、Ｔｔ  Ｗ９Ｆ−Ｙ１４０Ｌ（図７Ｃ）、Ｔｔ  Ｆ７８Ｙ−Ｙ１４０Ｌ（図７Ｄ）、Ｌ２  Ｈ−ＮＯＸおよびＬ２  Ｆ１４２Ｙ（図７Ｅ）、ならびにβ１（１−３８５）およびβ１（１−３８５）Ｉ１４５Ｙ（図７Ｆ）についての、嫌気的還元の後（ＦｅＩＩ非連結複合体；それぞれのグラフの一番上のライン）、空気への暴露前および後（ＦｅＩＩ−Ｏ２複合体；それぞれのグラフの一番下のライン）のＨ−ＮＯＸタンパク質のＵＶ可視スペクトル分析のグラフである。Ｌ２  Ｆ１４２Ｙおよびβ１（１−３８５）Ｉ１４５ＹのＦｅＩＩおよびＦｅＩＩ−Ｏ２複合体に加えて、還元および空気への暴露後の野生型Ｌ２  Ｈ−ＮＯＸおよびβ１−（１−３８５）Ｈ−ＮＯＸのスペクトルを、それぞれ、図７Ｅおよび７Ｆの真ん中のラインに示し、これらのタンパク質が、遠位ポケットチロシンの付加前にはＯ２には結合しないことを明らかにした。それぞれのパネルの上左隅に記載した２つまたは３つの数字は、グラフの中のラインのピークについての波長を示す。数字は、対応するラインがグラフの中に垂直に現れるように、垂直に記載した。例えば、図７Ａの４３０ｎｍの値は、グラフの一番上のラインについての波長のピークを示し（これは、ＦｅＩＩ非連結複合体を示す）、図７Ａの４１６ｎｍの値は、グラフの一番下のラインについての波長のピークを示す（これは、ＦｅＩＩ−Ｏ２複合体を示す）。空気の存在下での波長のシフトは、このタンパク質がＯ２に結合することを示す。空気の存在下では、５００ｎｍと６００ｎｍの間に二重のピークが形成されることもまた、Ｏ２結合の指標である。図７Ａ〜７Ｆは、Ｂｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．ら、（２００５）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  Ｆｏｒ  ＮＯ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：５３−５９による。
【図８Ａ】図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸタンパク質のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。
【図８Ｂ】図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸタンパク質のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。
【図８Ｃ】図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸタンパク質のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。
【図８Ｄ】図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸタンパク質のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。
【図８Ｅ】図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸタンパク質のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。
【図８Ｆ】図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸタンパク質のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。
【図８Ｇ】図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸタンパク質のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。
【図８Ｈ】図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸタンパク質のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。
【図８Ｉ】図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸタンパク質のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。
【図８Ｊ】図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸタンパク質のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。
【図８Ｋ】図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸタンパク質のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。
【図８Ｌ】図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸタンパク質のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。
【図８Ｍ】図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸタンパク質のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。
【図８Ｎ】図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸタンパク質のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。
【図８Ｏ】図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸタンパク質のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。
【図８Ｐ】図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸタンパク質のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。
【図８Ｑ】図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸタンパク質のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。
【図８Ｒ】図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸタンパク質のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。
【図８Ｓ】図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸタンパク質のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。
【図８Ｔ】図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸタンパク質のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。
【図８Ｕ】図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸタンパク質のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。
【図８Ｖ】図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸタンパク質のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。
【図８Ｗ】図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸタンパク質のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。
【図８Ｘ】図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸタンパク質のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。
【図８Ｙ】図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸタンパク質のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。
【図８Ｚ】図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸタンパク質のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。
【図８ＡＡ】図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸタンパク質のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。
【図８ＢＢ】図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸタンパク質のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。
【図８ＣＣ】図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸタンパク質のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。
【図８ＤＤ】図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸタンパク質のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、Ｈ−ＮＯＸタンパク質がヘモグロビンよりもはるかに低いＮＯ反応性を有していることの驚くべき発見に一部基づく。この固有の低いＮＯ反応性（および高いＮＯ安定性）は、野生型および変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質を望ましいＮＯ担体とする。なぜなら、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｏ２の存在下でＮＯによって不活化される可能性が低いからである。重要なことは、いくつかのＨ−ＮＯＸタンパク質中に遠位ポケットチロシンが存在することである（Ｐｅｌｌｉｃｅｎａ，Ｐ．ら、（２００４年８月３１日））。「Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎ  Ｏｘｙｇｅｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｈｅｍｅ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅｓ」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１（３５）：１２８５４−１２８５９は、望ましくない高いＮＯ反応性を示唆しており、これによりＮＯ担体としての使用が禁止されている。例えば、構造的に類似する遠位ポケットチロシンから類推すると、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓヘモグロビンタンパク質はＮＯと極めて迅速に反応し、感染した宿主によって生産されるＮＯを効率よく除去し、防御性のＮＯを回避するために、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｕによって使用される（Ｏｕｅｌｌｅｔ，Ｈ．ら、（２００２年４月３０日）。「Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ＨｂＮ  Ｐｒｏｔｅｃｔｓ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｂｏｖｉｓ  Ｆｒｏｍ  Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９（９）：５９０２−５９０７）。しかし、本発明者らは、驚くべきことに、Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、実際には、ヘモグロビンよりもはるかに低いＮＯ反応性を有しており、それによってＮＯ担体としてそれらを使用することが可能となることを発見した。
【００４６】
加えて、ＮＯ担体としてのＨ−ＮＯＸタンパク質の有用性を、Ｈ−ＮＯＸタンパク質に結合するＮＯの量を最大にし、そしてＨ−ＮＯＸタンパク質に結合したＯ２とのＮＯの反応によって酸化されるＨ−ＮＯＸタンパク質の量を減少させるように、ＮＯまたはＯ２に対するそれらの親和性を変更することによって改善することができることが発見されている。具体的には、ＮＯまたはＯ２に対するＨ−ＮＯＸタンパク質の親和性、およびＮＯリガンドとＯ２リガンドの間を区別するＨ−ＮＯＸタンパク質の能力は、１つ以上のアミノ酸変異の導入によって変化させることができ、Ｈ−ＮＯＸタンパク質を、所望される親和性でＮＯまたはＯ２に結合するように、状況に応じて仕立て上げることができる。例えば、Ｈ−ＮＯＸタンパク質によるＮＯまたはＯ２結合についての解離定数または解離速度は、１つのアミノ酸変異の導入によって変化させることができる。ＮＯおよび／またはＯ２に対する親和性をさらに変化させるためのさらなる変異を導入することができる。したがって、Ｈ−ＮＯＸタンパク質ファミリーは、ＮＯの送達について、改善されたか、または最適な力学的特性および熱力学的特性を示すように操作することができる。例えば、様々な臨床的用途および産業的用途についてＨ−ＮＯＸタンパク質の有用性を改善する、ＮＯ結合についての変化した解離定数および／または解離速度を有する変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質が作成されている。いくつかの実施形態においては、Ｏ２について低い親和性（例えば、３７℃で少なくとも約１μＭのＯ２解離定数）を有しているＨ−ＮＯＸタンパク質が、Ｈ−ＮＯＸタンパク質に結合するＯ２の量を最少にするために使用され、それにより、ＮＯのＨ−ＮＯＸタンパク質に対する結合が促進され、そしてＨ−ＮＯＸタンパク質のヘムに結合したＯ２とのＮＯの反応が原因で酸化されるＨ−ＮＯＸタンパク質の量が減少される。このＨ−ＮＯＸタンパク質の酸化の減少は治療される個体の臓器、組織、および細胞によって使用され得るＮＯおよびＯ２のより少ない崩壊を生じる。ＮＯに結合し、これを送達するようにＨ−ＮＯＸタンパク質を調整する能力は、現在の血管拡張剤の重要な欠点に取り組み、そしてこれを克服する治療的手段である。したがって、本発明により、ＮＯの送達のためのタンパク質、組成物、キット、および方法が提供される。
【００４７】
ＮＯの送達においてＨ−ＮＯＸタンパク質を使用することについては多くの利点がある。有機硝酸塩は、耐性が原因で限られた時間の間について有効である。Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、硝酸塩のＮＯへの生体内変換の必要なく個体に直接ＮＯを送達するので、ＮＯ担体としてのＨ−ＮＯＸタンパク質の有効性は、この生体内変換経路の阻害によっては制限されない。ヘモグロビンをベースとするＮＯ担体についての主要な限界は、Ｏ２に対するそれらの高い親和性と、ＮＯによって不活化されるそれらの傾向である。上記のように、ヘモグロビンをベースとする担体によるＮＯのなおさらに低いレベルの分解は、血管と臓器の緊張性の（ｔｏｎｉｃ）休止状態に対して深刻な影響を有し得、高血圧と胃腸障害を導く可能性がある。分子内および分子間架橋が、酸素担体として使用される場合の、ヘモグロビンをベースとする媒体の毒性を最小にするために使用されている（「Ｂｌｏｏｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ」，Ｒ．Ｗｉｎｓｌｏｗ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，２００６）。これらの修飾によっては、ヘモグロビンの管外遊出に関係する深刻な毒性の問題のうちのいくつかが克服されるが、高いＮＯ反応性は残る。対照的に、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、ヘモグロビンよりもはるかに低いＮＯ反応性を有する。この低い反応性によって導かれるＮＯ、Ｏ２、およびＨ−ＮＯＸタンパク質の分解は少ない。なぜなら、ＮＯは、Ｈ−ＮＯＸタンパク質に結合したＯ２とはほとんど反応しないからである。ＮＯに対して所望される解離定数と解離速度を有しているＨ−ＮＯＸタンパク質を選択する能力もまた、多すぎるＮＯが放出されること（高血圧を引き起こす）を防ぐことによって副作用を最小にすることができ、そして望ましくない部位（例えば、血管収縮していない部位）でＮＯが放出されることを防ぐことができる。最も小さいＮＯ反応性でＮＯに結合し、これを送達するようにＨ−ＮＯＸタンパク質を操作することにより、新しい血液ガスＮＯ担体が提供される。ここでは、Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、ＮＯによって不活化されることなくＮＯを送達する。これらのＨ−ＮＯＸタンパク質、組成物、キット、および方法は本明細書中以下にさらに記載される。
【００４８】
ＮＯの送達のためには、操作されたＨ−ＮＯＸタンパク質は、現在のニトロ系血管拡張剤に伴う耐性についてのなかなか解決できない問題を克服する重要な代換えを提示する。ＮＯの送達媒体としてのＨ−ＮＯＸタンパク質の使用により、慢性高血圧によって悪化した疾患を治療するための新しい治療的手段が提供される。
【００４９】
Ｈ−ＮＯＸタンパク質
Ｈ−ＮＯＸタンパク質ファミリーの概要
他で明記されない限りは、全ての野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質または変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質を、本明細書中に記載される組成物、キット、および方法において使用することができる。本明細書中で使用される場合は、「Ｈ−ＮＯＸタンパク質」は、Ｈ−ＮＯＸドメイン（ヘム−酸化窒素および酸素結合ドメイン（Ｈｅｍｅ−Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ａｎｄ  ＯＸｙｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）について命名された）を有しているタンパク質を意味する。Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｈ−ＮＯＸドメインに加えて、１つ以上の他のドメインを含む場合も、また含まない場合もある。Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、高度に保存されており、十分に特性決定されているヘムタンパク質のファミリーのメンバーである（Ｉｙｅｒ，Ｌ．Ｍ．ら、（２００３年２月３日）「Ａｎｃｉｅｎｔ  Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｄｏｍａｉｎｓ  Ｓｈａｒｅｄ  ｂｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｇｕａｎｙｌｙｌ  Ｃｙｃｌａｓｅｓ  Ａｎｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４（１）：５；Ｋａｒｏｗ，Ｄ．Ｓ．ら、（２００４年８月１０日）「Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ−Ｌｉｋｅ  Ｈｅｍｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ  Ｆｒｏｍ  Ｖｉｂｒｉｏ  Ｃｈｏｌｅｒａｅ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  Ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ」，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３（３１）：１０２０３−１０２１１；Ｂｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．ら、（２００５）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  Ｆｏｒ  ＮＯ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：５３−５９；Ｂｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．ら、（２００５年１０月）「Ｌｉｇａｎｄ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  Ｈｅｍｅ  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９（５）：４４１−４４６；Ｂｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．ら、（２００５）「Ｌｉｇａｎｄ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｄｏｍａｉｎｓ：Ｆｒｏｍ  ｓＧＣ  ｔｏ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＮＯ  Ｓｅｎｓｏｒｓ」，Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９９（４）：８９２−９０２）。Ｈ−ＮＯＸタンパク質はまた、Ｐｆａｍ  ０７７００タンパク質またはＨＮＯＢタンパク質とも呼ばれる（Ｐｆａｍ−タンパク質ドメインファミリーのアラインメントのＡデータベース、およびＨｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  Ｍｏｄｅｌｓ，Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ（Ｃ）１９９６−２００６  Ｔｈｅ  Ｐｆａｍ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ；ＧＮＵ  ＬＧＰＬ  Ｆｒｅｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，５９  Ｔｅｍｐｌｅ  Ｐｌａｃｅ−Ｓｕｉｔｅ  ３３０，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ  ０２１１１−１３０７，ＵＳＡ）。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、６個のαヘリックス、それに続く２つのβ鎖、続く１つのαヘリックス、続く２つのβ鎖が含まれている二次構造を有するか、あるいはそれらを有すると予想される。��−ＮＯＸタンパク質は、ヘムに結合することができるアポタンパク質であっても、また、ヘムが結合したホロタンパク質であってもよい。Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、ヘム基に共有結合することができ、また共有結合以外で結合することもできる。いくつかのＨ−ＮＯＸタンパク質はＮＯに結合するがＯ２には結合せず、他のＨ−ＮＯＸタンパク質はＮＯとＯ２の両方に結合する。単離されている通性好気性菌に由来するＨ−ＮＯＸドメインはＮＯに結合するが、Ｏ２には結合しない。偏性好気性原核生物、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、およびＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒに由来するＨ−ＮＯＸタンパク質はＮＯにも、Ｏ２にも結合する。哺乳動物は２つのＨ−ＮＯＸタンパク質：β１とβ２を有している。マウス、ラット、ウシ、およびヒトのＨ−ＮＯＸ配列のアラインメントは、これらの種が＞９９％の同一性を共有していることを示している。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＨ−ＮＯＸドメイン、または完全なＨ−ＮＯＸタンパク質は、自然界に存在しているＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸタンパク質または自然界に存在しているｓＧＣタンパク質（例えば、自然界に存在しているｓＧＣ  β１タンパク質）の対応する領域に対して、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９７、９８、９９、または９９．５％同一である。本明細書中にさらに議論されるように、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、状況に応じて、対応する自然界に存在しているＨ−ＮＯＸタンパク質と比較して１つ以上の変異を含む場合がある。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｈ−ＮＯＸドメインに加えて、１つ以上のドメインを含む。特定の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、別のタンパク質に由来する１つ以上のドメイン、または別のタンパク質の完全な配列を含む。例えば、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｈ−ＮＯＸドメインと、別のタンパク質（例えば、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン））の一部または全体が含まれている融合タンパク質であり得る。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸドメインだけが存在する。
【００５０】
Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓに由来する原核生物のＯ２結合Ｈ−ＮＯＸの結晶構造（Ｎｉｏｃｈｅ，Ｐ．ら、（２００４年１１月２６日）「Ｆｅｍｔｏｍｏｌａｒ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ＮＯ  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｆｒｏｍ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０６（５７０１）：１５５０−１５５３；Ｐｅｌｌｉｃｅｎａ，Ｐ．ら、（２００４年８月３１日）「Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎ  Ｏｘｙｇｅｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｈｅｍｅ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１（３５）：１２８５４−１２８５９）は、チロシン側鎖のヒドロキシル基が、ＦｅＩＩ−Ｏ２部分に対して重要な意味を持つＨ−結合を形成することを示している。この遠位ポケットの水素結合ネットワーク（主にＹ１４０が関与している）は、ＦｅＩＩ−Ｏ２複合体を安定化させる（図６Ｂ）。このチロシンは、Ｏ２を識別し、ＮＯにしか結合しないＨ−ＮＯＸタンパク質中には存在しない。例えば、この水素結合ネットワークは、ｓＧＣおよび好気性原核生物に由来するＨ−ＮＯＸタンパク質中には存在しないと予想され、このことは、これが、これらのヘムタンパク質によって提示されるＯ２に対する顕著なリガンド選択性における極めて重要な分子因子であることを示唆している。図７Ａ〜７Ｇは、ＮＯに結合するが、Ｏ２には結合しない野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の遠位ポケット中へのチロシンの付加により、変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質をＯ２に結合させることができることを明らかに示している。したがって、折り畳まれたＨ−ＮＯＸヘムの遠位ヘムポケットの中のチロシンは、Ｏ２結合をオンまたはオフに切り替えるためのスイッチのような役割を担う。
【００５１】
図６Ａおよび６Ｂに示されるように、ポルフィリンの構造はかなり湾曲している。図６Ａに示されるように、保存されているＹ−Ｓ−Ｒモチーフは、ヘム基のプロピオン酸側鎖と水素結合相互作用を形成する。図６Ｂに示されるように、保存されているＨ１０２はヘムに対する近位リガンドである（図６Ｂ）。
【００５２】
本明細書中で使用される場合は、「タンパク質」は、自然界の供給源から単離されたかどうか、組み換え技術によって生産されたかどうか、または化学合成されたかどうかにはかかわらず、タンパク質とタンパク質の断片を含む。タンパク質は、１つ以上の修飾（例えば、翻訳後修飾（例えば、グリコシル化など）、または任意の他の修飾（例えば、ＰＥＧ化など））を有する場合がある。タンパク質は、１つ以上の自然界には存在しないアミノ酸（例えば、側鎖の修飾を有しているアミノ酸）を含む場合がある。様々な実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、少なくとも約５０、１００、１５０、１８１、２００、２５０、３００、３５０、４００以上のアミノ酸を有する。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、約５０〜約６００のアミノ酸、例えば、約１００〜約５００のアミノ酸、約１５０〜約４００のアミノ酸、約１５０〜約３００のアミノ酸、または約１７５〜約２００のアミノ酸が含まれ得る。
【００５３】
Ｈ−ＮＯＸタンパク質の供給源
任意の属または種に由来するＨ−ＮＯＸタンパク質を、本明細書中に記載される組成物、キット、および方法において使用することができる。様々な実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、哺乳動物（例えば、霊長類（例えば、ヒト、サル、ゴリラ、類人猿、キツネザルなど）、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、もしくはネコ）、昆虫、酵母、または細菌に由来するタンパク質であるか、あるいは、そのようなタンパク質から誘導される。例示的な哺乳動物のＨ−ＮＯＸタンパク質としては、野生型のヒトおよびラットの可溶性グアニル酸シクラーゼ（例えば、β１サブユニット）が挙げられる。Ｈ−ＮＯＸタンパク質の例としては、野生型の哺乳動物Ｈ−ＮＯＸタンパク質（例えば、Ｈ，ｓａｐｉｅｎｓ、Ｍ．ｎｕｓｃｕｌｕｓ、Ｃ．ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ、Ｂ．ｔａｕｒｕｓ、およびＲ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）；および野生型の哺乳動物以外の脊椎動物のＨ−ＮＯＸタンパク質（例えば、Ｘ．ｌａｅｖｉｓ、Ｏ．ｌａｔｉｐｅｓ、Ｏ．ｃｕｒｉｖａｔｕｓ、およびＦ．ｒｕｂｒｉｐｅｓ）が挙げられる。哺乳動物以外の野生型のＮＯ結合Ｈ−ＮＯＸタンパク質の例としては、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ａ，ｇａｍｂｉａｅ、およびＭ．ｓｅｘｔａの野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が挙げられる。哺乳動物以外の野生型のＯ２結合Ｈ−ＮＯＸタンパク質の例としては、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｇｃｙ−３１、ｇｃｙ−３２、ｇｃｙ−３３、ｇｃｙ−３４、ｇｃｙ−３５、ｇｃｙ−３６、およびｇｃｙ−３７；Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ＣＧ１４８８５、ＣＧ１４８８６、およびＣＧ４１５４；ならびにＭ．ｓｅｘｔａ  ｂｅｔａ−３の野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が挙げられる：原核生物の野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の例としては、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａ、Ｖ．ｆｉｓｃｈｅｒｉｉ、Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ、Ｄ．ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ  １、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ  ２、およびＣ．ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍが挙げられる。
【００５４】
例示的なＨ−ＮＯＸタンパク質についてのＮＣＢＩ登録番号としては以下が挙げられる：Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  β１［ｇｉ：２７４６０８３］、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１［ｇｉ：２７１２７３１８］、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ  β１［ｇｉ：８６１２０３］、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ  ＣＧ１４８８５−ＰＡ［ｇｉ：２３１７１４７６］、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  ＧＣＹ−３５［ｇｉ：５２７８２８０６］、Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ［ｇｉ：２３１２９６０６］、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ［ｇｉ：１６１２７２２２］、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ［ｇｉ：２４３７３７０２］、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ（ＯＲＦ２）［ＣＵＣＧＣ＿２７２６２４］、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ［ｇｉ：１５８９６４８８］、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ［ｇｉ：２０８０７１６９］。
【００５５】
例示的なＨ−ＮＯＸタンパク質にはまた、それらの種の省略形とＧｅｎｂａｎｋ識別番号にしたがってそれらの遺伝子名によって列挙される以下のＨ−ＮＯＸタンパク質も含む（例えば、２００６年５月２１日、２００６年５月２２日、２００７年５月２１日、または２００７年５月２２日に入手した以下のタンパク質配列、これらはその全体が参照としてそれぞれ本明細書中に組み込まれる）：Ｎｐｕｎ５９０５＿Ｎｐｕ＿２３１２９６０６、ａｌｒ２２７８＿Ａｎａ＿１７２２９７７０、ＳＯ２１４４＿Ｓｏｎｅ＿２４３７３７０２、Ｍｄｅｇ１３４３＿Ｍｄｅ＿２３０２７５２１、ＶＣＡ０７２０＿Ｖｃｈ＿１５６０１４７６、ＣＣ２９９２＿Ｃｃｒ＿１６１２７２２２、Ｒｓｐｈ２０４３＿Ｒｈｓｐ＿２２９５８４６３（ｇｉ：４６１９２７５７）、Ｍｍｃ１０７３９＿Ｍｃｓｐ＿２２９９９０２０、Ｔａｒ４＿Ｔｔｅ＿２０８０７１６９、Ｄｄｅｓ２８２２＿Ｄｄｅ＿２３４７５９１９、ＣＡＣ３２４３＿Ｃａｃ＿１５８９６４８８、ｇｃｙ−３１＿Ｃｅ＿１７５６８３８９、ＣＧ１４８８５＿Ｄｍ＿２４６４７４５５、ＧＵＣＹ１Ｂ３＿Ｈｓ＿４５０４２１５、ＨｐＧＣＳ−ｂｅｔａ１＿Ｈｐｕｌ＿１４２４５７３８、Ｇｙｃｂｅｔａ１００Ｂ＿Ｄｍ＿２４６５１５７７、ＣＧ４１５４＿Ｄｍ＿２４６４６９９３（ｇｉ：ＮＰ＿６５０４２４．２、ｇｉ：６２４８４２９８）、ｇｃｙ−３２＿Ｃｅ＿１３５３９１６０，ｇｃｙ−３６＿Ｃｅ＿１７５６８３９１（ｇｉ：３２５６６３５２、ｇｉ：８６５６４７１３）、ｇｃｙ−３５＿Ｃｅ−１７５０７８６１（ｇｉ：７１９９０１４６）、ｇｃｙ−３７＿Ｃｅ＿１７５４０９０４（ｇｉ：７１９８５５０５）、ＧＣＹ１ａ３＿Ｈｓ＿２０５３５６０３、ＧＣＹ１ａ２−Ｈｓ＿８９９４７７、またはＧＹＣａ−９９Ｂ＿Ｄｍ＿７２９２７０（ｇｉ：６８０６７７３８）（Ｌａｋｓｈｍｉｎａｒａｙａｎら、（２００３）、「Ａｎｃｉｅｎｔ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｓｈａｒｅｄ  ｂｙ  ａｎｉｍａｌ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｇｕａｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅｓ  ａｎｄ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、ＢＭＧ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５−１３）。これらの名称の中で使用される種の省略形には以下を含む：Ａｎａ−Ａｎａｂａｅｎａ  Ｓｐ；Ｃｃｒ−Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ；Ｃａｃ−Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ；Ｄｄｅ−Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ；Ｍｃｓｐ−Ｍａｇｎｅｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．；Ｍｄｅ−Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ  ｄｅｇｒａｄａｎｓ；Ｎｐｕ−Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ；Ｒｈｓｐ−Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ；Ｓｏｎｅ−Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ；Ｔｔｅ−Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ；Ｖｃｈ−Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ；Ｃｅ−Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ；Ｄｍ−Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ；Ｈｐｕｌ−Ｈｅｍｉｃｅｎｔｒｏｔｕｓ  ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍｕｓ；Ｈｓ−Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ。
【００５６】
他の例示的なＨ−ＮＯＸタンパク質には、それらの生物名とＰｆａｍデータベース登録番号によって列挙される以下のＨ−ＮＯＸタンパク質を含む（例えば、２００６年５月２１日、２００６年５月２２日、２００７年５月１７日、２００７年５月２１日、または２００７年５月２２日に入手した以下のタンパク質配列、これらは、それらの全体がそれぞれ参照として本明細書中に組み込まれる）：
【００５７】
【化９】
2009538133.tif 000011
【００５８】
【化１０】
2009538133.tif 000012
【００５９】
【化１１】
2009538133.tif 000013
これらの配列は、本明細書中に記載されるＰｆａｍデータベースを使用したＨ−ＮＯＸタンパク質ファミリーに属するとのこれらのタンパク質の同定に基いて、Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードすると予想した。
【００６０】
さらに別のＨ−ＮＯＸタンパク質および核酸（これらは、本明細書中に記載される薬学的組成物および方法での使用に適している可能性がある）は、標準的な方法を使用して同定することができる。例えば、標準的な配列アラインメントおよび／または構造予測プログラムを使用して、既知のＨ−ＮＯＸタンパク質および核酸のものとのそれらの一次タンパク質構造および／または予想されるタンパク質二次構造の類似性に基づいて、さらに別のＨ−ＮＯＸタンパク質および核酸を同定することができる。例えば、Ｐｆａｍデータベースでは、定義されたアラインメントアルゴリズムと、Ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｌｏｖ  Ｍｏｄｅｌｓ（例えば、Ｐｆａｍ  ２１．０）が使用されて、タンパク質がファミリー（例えば、Ｈ−ＮＯＸタンパク質ファミリー）に分類される（タンパク質ドメインファミリーのアラインメントのＰｆａｍ−Ａデータベース、およびＨｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  Ｍｏｄｅｌｓ，Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ（Ｃ）１９９６−２００６  Ｔｈｅ  Ｐｆａｍ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ；ＧＮＵ  ＬＧＰＬ  Ｆｒｅｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，５９  Ｔｅｍｐｌｅ  Ｐｌａｃｅ−Ｓｕｉｔｅ  ３３０，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ  ０２１１１−１３０７，ＵＳＡ）。標準的なデータベース（例えば、ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ−ｔｒｅｍｂｌデータベース（「ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ」にてｗｏｒｌｄ−ｗｉｄｅ  ｗｅｂ、Ｓｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ｇｒｏｕｐ  ＣＭＵ−１  ｒｕｅ  Ｍｉｃｈｅｌ  Ｓｅｒｖｅｔ  ＣＨ−１２１１  Ｇｅｎｅｖａ  ４，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）もまた、Ｈ−ＮＯＸタンパク質ファミリーのメンバーを同定するために使用することができる。Ｈ−ＮＯＸタンパク質の二次構造および／または三次構造は、標準的な構造予測プログラム（例えば、ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎ（６３０  Ｗｅｓｔ，１６８  Ｓｔｒｅｅｔ，ＢＢ２１７，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１００３２，ＵＳＡ）のデフォルト設定を使用して予測することができる。あるいは、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の実際の二次構造および／または三次構造は、標準的な方法を使用して決定することができる。
【００６１】
いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸの中の以下の遠位ポケット残基のうちの任意のものに対応する位置に同じアミノ酸を有する：Ｔｈｒ４、Ｉｌｅ５、Ｔｈｒ８、Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ６７、Ａｓｎ７４、Ｉｌｅ７５、Ｐｈｅ７８、Ｐｈｅ８２、Ｔｙｒ１４０、Ｌｅｕ１４４、または上記の２つ以上の任意の組み合わせ。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、それらのアミノ酸配列の配列アラインメントに基づいて、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸのＰｒｏ１１５またはＡｒｇ１３５に対応する位置に、それぞれ、プロリンまたはアルギニンを有する。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸのＨｉｓ５に対応するヒスチジンを有する。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、６個のαヘリックス、それに続く２つのβ鎖、続く１つのαヘリックス、続く２つのβ鎖が含まれている二次構造を有するか、あるいはそれらを有すると予想される。この二次構造は、Ｈ−ＮＯＸタンパク質について報告されている。
【００６２】
所望される場合には、新しく同定されたＨ−ＮＯＸタンパク質を、それがヘムに結合するかどうかを決定するために、標準的な方法を使用して試験することができる。ＮＯ担体として機能するＨ−ＮＯＸタンパク質の能力は、Ｈ−ＮＯＸタンパク質がＮＯに結合するかどうかを、標準的な方法（例えば、本明細書中に記載される方法）を使用して決定することによって試験することができる。所望される場合には、本明細書中に記載される変異のうちの１つ以上を、ＮＯ担体としてのその特性を最適化させるために、Ｈ−ＮＯＸタンパク質に導入することができる。例えば、そのＮＯ解離定数、ＮＯに対するｋｏｆｆ、ＮＯに対するｋ１、ＮＯに対するｋ２、Ｏ２解離定数、ＮＯ安定性、ＮＯ反応性、ヘム自動酸化速度、または上記の２つ以上の任意の組み合わせを変化させるための少なくとも１つの変異を、導入することができる。標準的な技術（例えば、本明細書中に記載される技術）を使用して、これらのパラメータを測定することができる。
【００６３】
本明細書中で議論される場合には、変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質（例えば、以下に議論されるクラスＩおよびクラスＩＩ変異体）を、これらの、または他の自然界での野生型の供給源配列（例えば、配列番号２〜４Ｄもしくは８Ａ〜８ＤＤに列挙される配列、または本明細書中に記載される任意の他の配列）から突然変異誘発によって導くことができる。本明細書中で使用される場合は、「由来する」は、その中に１つ以上の変異が導入されるタンパク質の供給源をいう。例えば、「哺乳動物タンパク質に由来する」タンパク質は、野生型（すなわち、自然界に存在している配列）の哺乳動物タンパク質の配列に１つ以上の変異を導入することによって生じる目的のタンパク質を意味する。
【００６４】
変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質
本明細書中でさらに議論されるように、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は１つ以上の変異（例えば、対応する野生型タンパク質のものと比較して、ＮＯ解離定数、ＮＯに対するｋｏｆｆ、Ｏ２解離定数、Ｏ２に対するｋｏｆｆ、ヘム自動酸化速度、ＮＯ反応性、ＮＯ安定性、または上記の２つ以上の任意の組み合わせを変化させる変異）を含む場合がある。操作されたＨ−ＮＯＸタンパク質のパネルは、本明細書中に記載され、加えて、当業者に公知の技術を使用して本明細書中に提供される教示を参照して、ランダムな突然変異誘発、それに続く必要な、もしくは所望される解離定数、解離速度、ＮＯ反応性、安定性、生理適合性、または上記の２つ以上の任意の組み合わせについての経験的スクリーニングによって作成することができる。あるいは、突然変異誘発は、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の実験によって決定された三次元構造または予測された三次元構造から明らかである遠位ポケット残基（本明細書中の図１Ａ；および例えば、Ｂｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．ら、（２００５）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  Ｆｏｒ  ＮＯ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １：５３−５９（これは、特に野生型および変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質の配列に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる）を参照のこと）、あるいは、配列アラインメントから同定された進化的に保存されている残基（本明細書中の図２〜４Ｄ；および例えば、Ｂｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．ら、（２００５）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  Ｆｏｒ  ＮＯ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １：５３−５９（これは、特に野生型および変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質の配列に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる）を参照のこと）のような、特定の領域または残基に対して選択的に標的化させることができる。
【００６５】
本明細書中で使用される場合は、「変異タンパク質」は、自然界に存在しているタンパク質と比較して１つ以上の変異を有しているタンパク質を意味する。１つの実施形態においては、変異タンパク質は、自然界に存在している全てのタンパク質の配列とは異なる配列を有する。様々な実施形態においては、変異タンパク質のアミノ酸配列は、自然界に存在しているタンパク質の対応する領域に対して、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９７、９８、９９、または９９．５％同一である。いくつかの実施形態においては、変異タンパク質は、全長のタンパク質に由来する少なくとも約２５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、または４００個のいずれかの連続するアミノ酸が含まれているタンパク質断片である。配列同一性は、例えば、配列分析ソフトウェアをその中に特定されているデフォルトパラメータとともに使用して測定することができる（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ５３７０５）。このソフトウェアプログラムは、様々なアミノ酸の置換、欠失、および他の修飾に対して、相同性の程度を割り当てることにより類似する配列を一致させる。
【００６６】
本明細書中で使用される場合は、「変異」は、自然界に存在している参照核酸またはアミノ酸配列の中の変化を意味する。例示的な核酸変異は、挿入、欠失、フレームシフト変異、サイレント変異、ナンセンス変異、またはミッセンス変異を含む。いくつかの実施形態においては、核酸変異はサイレント変異ではない。例示的なタンパク質変異としては、１つ以上のアミノ酸の挿入（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸の挿入）、１つ以上のアミノ酸の欠失（例えば、Ｎ末端、Ｃ末端および／もしくは内部残基の欠失、例えば、少なくとも約５、１０、１５、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００個以上のアミノ酸の欠失、または約５、１０、１５、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、もしくは４００個のアミノ酸の欠失）、１つ以上のアミノ酸の置換（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸の置換）、あるいは上記の２つ以上の組み合わせが挙げられる。Ｈ−ＮＯＸタンパク質の例示的な機能的短縮はβ１配列の残基１〜３８５を含む。いくつかの実施形態においては、変異タンパク質は、自然界に存在しているタンパク質と比較して少なくとも１つのアミノ酸変化を有する。いくつかの実施形態においては、変異体核酸配列は、自然界に存在しているタンパク質と比較して少なくとも１つのアミノ酸変化を有しているタンパク質をコードする。いくつかの実施形態においては、核酸は、自然界に存在しているタンパク質と同じアミノ酸配列を有しているタンパク質をコードする自然界に存在している核酸の縮重バージョンではない。特定のアミノ酸変異に関して使用される命名法は、最初に野生型アミノ酸を特定し、続いて、残基番号、最後に置換残基を識別する。例えば、Ｙ１４０Ｌは、残基番号１４０のチロシンがロイシンで置き換えられることを意味する。
【００６７】
「進化的に保存されている変異」は、同じタンパク質ファミリーの中の別のタンパク質の対応する位置における、１つのアミノ酸による１つのタンパク質中の１つのアミノ酸の置換である。例示的な進化的に保存されている変異（クラスＩ変異とも記載される）が、表ＩＡに列挙される。表ＩＡにおいては、変異は、ヒトβ１  Ｈ−ＮＯＸの配列にしたがってナンバリングされている／注釈が付けられているが、全てのＨ−ＮＯＸ配列について同様である。したがって、任意の他のＨ−ＮＯＸタンパク質中の対応する位置を、示された残基になるように変異させることができる。例えば、ヒトβ１  Ｈ−ＮＯＸのＰｈｅ４を、他のＨ−ＮＯＸタンパク質がこの位置にチロシンを有しているので、チロシンに変異させることができる。対応しているフェニルアラニン残基を、任意の他のＨ−ＮＯＸタンパク質中でチロシンに変異させることができる。特定の実施形態においては、１つ以上の変異を進化的に保存されている残基に限定される。いくつかの実施形態においては、１つ以上の変異には、少なくとも１つの進化的に保存されている変異、および少なくとも１つの進化的には保存されていない変異が含まれ得る。所望される場合には、これらの変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、本明細書中に提供される教示を参照して、ＮＯ／Ｏ２解離定数、ＮＯ反応性、安定性、および生理適合性についての経験的なスクリーニングが行われる。
【００６８】
表１Ａ．進化的に保存されている残基を標的化する例示的なクラスＩ  Ｈ−ＮＯＸ変異
【００６９】
【表１Ａ】
2009538133.tif 000014
いくつかの実施形態においては、変異は遠位ポケットの変異であり、例えば、α−ヘリックスＡ、Ｄ、Ｅ、またはＧの中の残基の変異である（Ｐｅｌｌｉｃｅｎａ，Ｐ．ら、（２００４年８月３１日）「Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎ  Ｏｘｙｇｅｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｈｅｍｅ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅｓ」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１（３５）：１２８５４−１２８５９）。例示的な遠位ポケット変異（クラスＩＩ変異とも記載される）は、表ＩＢに列挙される。表ＩＢにおいては、変異は、ヒトβ１  Ｈ−ＮＯＸの配列にしたがって番号付けされる／注釈が付けられるが、全てのＨ−ＮＯＸ配列について同様である。いくつかの置換によっては、それぞれ記載される残基で可変性の変異が提供されるので、個々の示された位置の残基を、任意の他の自然界に存在しているアミノ酸または自然界には存在しないアミノ酸（「Ｘ」で示される）に変化させることができる。そのような変異によっては、様々な所望される親和性、安定性、および反応性の特性を有しているＨ−ＮＯＸタンパク質を得ることができる。
【００７０】
表１Ｂ．遠位ポケット残基を標的化する例示的なクラスＩＩ  Ｈ−ＮＯＸ変異
【００７１】
【表１Ｂ】
2009538133.tif 000015
特定の実施形態においては、変異はヘム遠位ポケット変異である。本明細書中に記載されるように、Ｈ−ＮＯＸファミリーのＮＯ結合メンバーにおいてＯ２結合を妨げる重要な分子的決定要因は、ヘムの遠位ポケット中にＨ結合ドナーがないことである。したがって、いくつかの実施形態においては、変異は、Ｈ−ＮＯＸドメインと遠位ポケット中のリガンドとの間でのＨ結合を変化させる。いくつかの実施形態においては、変異体は、遠位ポケットのＨ結合ドナーを崩壊させ、対応する野生型Ｈ−ＮＯＸドメインと比較して、Ｏ２リガンド結合の減少をもたらす。例示的な遠位ポケット残基としては、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸのＴｈｒ４、Ｉｌｅ５、Ｔｈｒ８、Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ６７、Ａｓｎ７４、Ｉｌｅ７５、Ｐｈｅ７８、Ｐｈｅ８２、Ｔｙｒ１４０、およびＬｅｕ１４４、ならびに任意の他のＨ−ＮＯＸタンパク質中の対応する残基が挙げられる。
【００７２】
遠位ポケット中には存在しない残基もまた、ヘム基の三次元構造に影響を与え得る。この構造は、次に、ヘム基の中の鉄に対するＯ２およびＮＯの結合に影響を与える。したがって、いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、遠位ポケットの外側に１つ以上の変異を有する。変異させることができるが、遠位ポケット中にはない残基の例としては、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸのＰｒｏ１１５およびＡｒｇ１３５が挙げられる。いくつかの実施形態においては、変異は、ヘム鉄に結合する残基としてＨｉｓ１０５を含む近位ポケットの中にある。
【００７３】
２つ以上の変異が存在するいくつかの実施形態においては、少なくとも１つの変異が遠位ポケット中にあり、そして少なくとも１つの変異は遠位ポケットの外側にある（例えば、遠位ポケット中の変異）。いくつかの実施形態においては、全ての変異が遠位ポケット中にある。
【００７４】
いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のアミノ酸配列は、自然界に存在している生物によって生産されるタンパク質の配列と同じではない。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のアミノ酸配列は、２００６年５月２１日、または２００６年５月２２に任意のデータベースにおいて見られた配列（例えば、Ｈ−ＮＯＸ核酸またはアミノ酸配列であると予想されるか、またはそうであることがわかっている全ての公知の配列）と同じではない。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のアミノ酸配列は、２００７年５月２１日、または２００７年５月２２に任意のデータベースにおいて見られた配列（例えば、Ｈ−ＮＯＸ核酸またはアミノ酸配列であると予想されるか、またはそうであることがわかっている全ての公知の配列）と同じではない。
【００７５】
ヒト以外の供給源に由来するＨ−ＮＯＸタンパク質の免疫原性を低下させるためには、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のアミノ酸を、ヒトＨ−ＮＯＸの中の対応するアミノ酸に変異させることができる。例えば、ヒト以外のＨ−ＮＯＸタンパク質の三次構造の表面上にある１つ以上のアミノ酸を、ヒトＨ−ＮＯＸタンパク質中の対応するアミノ酸に変異させることができる。いくつかのバリエーションにおいては、１つ以上の表面アミノ酸の変異を、２つ以上の遠位ポケット残基の変異、遠位ポケットの外側の１つ以上の残基の変異（例えば、近位ポケットの中の変異）、あるいは上記の２つ以上の組み合わせと組み合わせることができる。
【００７６】
例示的な変異は表２に示される。加えて、表２に列挙される任意の残基は、任意の他のアミノ酸に変異させることができる。本発明はまた、本明細書中に記載される変異の任意の組み合わせ（例えば、二重変異、三重変異以上の多重変異）にも関する。例えば、本明細書中に記載される変異の任意の組み合わせは、同じＨ−ＮＯＸタンパク質中に作成することができる。他の哺乳動物Ｈ−ＮＯＸタンパク質または哺乳動物以外のＨ−ＮＯＸタンパク質中の同等の位置の変異もまた、本発明に含まれることに留意されたい。所望される場合には、表２に記載された残基以外の残基も変異させることができる。例示的な変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質には、対応する野生型Ｈ−ＮＯＸドメインと比較してＮＯまたはＯ２リガンド結合の変化をもたらす１つ以上の変異が含まれ、これは、生理学的に適合する哺乳動物ＮＯ血液ガス担体として作動する。
【００７７】
表２および全ての後の表においては、変異についての残基の番号は、記載される特定のＨ−ＮＯＸタンパク質の配列の中の位置を示す。例えば、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｉ５Ａは、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸの５番目の位置でのイソロイシンのアラニンによる置換をいう。同じイソロイシンのアラニンへの変異は、任意の他のＨ−ＮＯＸタンパク質中の対応する残基において作成することができる（この残基は、他のＨ−ＮＯＸタンパク質の配列の中では５番目の残基である場合も、また、５番目の残基ではない場合もある）。哺乳動物β１  Ｈ−ＮＯＸドメインのアミノ酸配列が最大２個のアミノ酸によって異なるので、野生型ラットβ１  Ｈ−ＮＯＸタンパク質に導入されると所望される変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質を生じる変異はまた、他の哺乳動物（例えば、ヒト）に由来する野生型β１  Ｈ−ＮＯＸタンパク質に導入されると所望される変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質を生じると予想される。
【００７８】
いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸのＩｌｅ５、Ｔｒｐ９、Ａｓｎ７４、Ｐｒｏ１１５、Ａｒｇ１３５、または、Ｔｙｒ１４０、β１（１−３８５）のＩ１４５、あるいは、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ  ２のＰｈｅ１４２に対応する残基が、任意の他のアミノ酸によって置き換えられる少なくとも１つの変異を有する。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は少なくとも２つの変異を有し、この場合、少なくとも１つの変異は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのＩｌｅ５、Ｔｒｐ９、Ａｓｎ７４、Ｐｒｏ１１５、Ａｒｇ１３５、または、Ｔｙｒ１４０、β１（１−３８５）のＩ１４５、あるいは、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ  ２のＰｈｅ１４２に対応する残基の任意の他のアミノ酸による置換である。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質中の変異は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのＩ５Ａ変異、Ｉ５Ｌ変異、Ｗ９Ｆ変異、Ｙ１４０Ｆ変異、Ｙ１４０Ｌ変異、Ｙ１４０Ｈ変異、Ｗ９Ｆ  Ｙ１４０Ｈ二重変異、またはＦ７８Ｙ  Ｙ１４０Ｆ二重変異、あるいは、β１のＩ１４５Ｙ変異に対応する。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質中の変異は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸのＷ９Ｙ変異、Ｗ９Ｈ変異、Ｗ９Ｎ変異、Ｎ７４Ｈ変異、Ｎ７４Ｅ変異、Ｎ７４Ａ変異、Ｐ１１５Ａ変異、Ｒ１３５Ｑ変異、Ｉ５Ｌ  Ｐ１１５Ａ二重変異、Ｎ７４Ａ  Ｙ１４０Ｈ二重変異、またはＷ９Ｆ  Ｎ７４Ａ二重変異に対応する。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質中の少なくとも１つのＣ末端アミノ酸（例えば、少なくとも約５０個の連続するＣ末端アミノ酸、または約２５〜約２００個の間の連続するＣ末端アミノ酸）が、対応する野生型タンパク質（例えば、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓまたはＨ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１）と比較して除去されている。
【００７９】
【表２−１】
2009538133.tif 000016
【００８０】
【表２−２】
2009538133.tif 000017
Ｈ−ＮＯＸタンパク質に対する修飾
野生型Ｈ−ＮＯＸまたは変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のうちの任意のものを、治療への応用または産業への応用を促進するために、標準的な方法を使用して修飾するおよび／または処方することができる。例えば、そして特に、非相同に操作されたＨ−ＮＯＸタンパク質に応用される場合には、免疫学的監視によるそのような薬剤の隔離（架橋、ＰＥＧ化、糖質の装飾などを含む）のための様々な方法（例えば、Ｒｏｈｌｆｓ，Ｒ．Ｊ．ら、（１９９８年５月１５日）「Ａｒｔｅｒｉａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ａｎｄ  Ｔｈｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（２０）：１２１２８−１２１３４；Ｍｉｇｉｔａ，Ｒ．ら、（１９９７年７月）「Ｂｌｏｏｄ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ａｎｄ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｉｎｄｅｘ  ｉｎ  Ｒａｔｓ  Ａｆｔｅｒ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ−Ｂａｓｅｄ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ」，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．８２（６）：１９９５−２００２；Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ，Ｋ．Ｄ．ら、（２００４年８月１５日）「Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ＮＯ  ａｎｄ  Ｏ２  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ａ  Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ  Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）−Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ」，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３８２（Ｐｔ  １）：１８３−１８９（これらはそれぞれが、特にタンパク質の修飾に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる））、ならびに当業者に公知の他の技術は当該分野で公知である。Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヒトタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）との融合により、血清半減期、粘性、およびコロイド浸透圧を増大させることができる。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、その免疫原性を低下させるため、および／またはその血漿保持時間を増大させるために、その合成の間あるいは後に修飾される。Ｈ−ＮＯＸタンパク質はまた、カプセル化させることもできる（例えば、リポソームまたはナノ粒子の中へのカプセル化）。
【００８１】
野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質および変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質の特徴
本明細書中に記載されるように、様々なＮＯ解離定数、Ｏ２解離定数、ＮＯ  ｋｏｆｆ、Ｏ２  ｋｏｆｆ、ＮＯ反応性、および安定性を提供する多くの多様なＨ−ＮＯＸ変異タンパク質が作成されている。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、ＮＯを送達するために現在使用されている任意の化合物（例えば、ＮＯへの生体内変換のための任意の有機硝酸塩）と比較して、類似するか、あるいは改善されたＮＯ解離定数、Ｏ２解離定数、ＮＯ  ｋｏｆｆ、Ｏ２  ｋｏｆｆ、ＮＯ反応性、自動酸化速度、血漿保持時間、または上記の２つ以上の任意の組み合わせを有する。
【００８２】
上記で議論されるように、内因性の低いＮＯ反応性（および高いＮＯ安定性）により、野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質および変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質は所望されるＮＯ担体となる。なぜなら、Ｏ２の存在下でのＮＯによるＨ−ＮＯＸタンパク質の不活化の可能性は低いからである。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｏ２に対して低い親和性（例えば、３７℃で少なくとも約１μＭのＯ２解離定数）を有するか、またはＯ２に対しては検出できるほどの親和性は有さない。存在する場合にも、Ｏ２はＨ−ＮＯＸタンパク質にはほとんど結合しないので、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘムに結合したＯ２は、ＮＯによっては最小限にしか酸化されない。したがって、最小限のＮＯ、Ｏ２、およびＨ−ＮＯＸタンパク質だけが、このＮＯ酸化によって不活化される。したがって、さらに多量のＮＯを個体の所望される部位に送達することができ、そして個体の組織によって使用され得るＯ２はほとんど破壊されない。
【００８３】
本明細書中で使用される場合は、「ヘモグロビン」は、赤血球の中の鉄を含むＯ２輸送メタロプロテインである、十分に特性決定されているヘモグロビンのファミリーに由来するタンパク質またはその変異体を意味する。精製された、間質を含まないヒトヘモグロビンは、約２００〜５００ｎＭのＯ２に対する動力学的ＫＤを有する。この値はサブユニットに依存する。
【００８４】
「６−配位ＦｅＩＩ−ＮＯ複合体」によっては、Ｂｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．ら、（２００６年８月）「Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｈｏｍｏｌｏｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｌｕｂｅ  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ  β１  Ｈ０ＮＯＸ  Ｄｏｍａｉｎ」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（３１）：２１８９２−２１９０２（これは、特に、６−配位ＦｅＩＩＮＯ複合体を含むＨ−ＮＯＸタンパク質試料の割合と５−配位ＦｅＩＩＮＯ複合体を含むＨ−ＮＯＸタンパク質試料の割合の決定に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる）に記載されているように、およそ４１６〜４２２ｎｍでＵＶ−Ｖｉｓ  Ｓｏｒｅｔピークを生じる６−配位第一鉄ニトロシルを意味する。
【００８５】
「５−配位ＦｅＩＩ−ＮＯ複合体」によっては、Ｂｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．ら、（２００６年８月）「Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｈｏｍｏｌｏｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｌｕｂｅ  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ  β１  Ｈ０ＮＯＸ  Ｄｏｍａｉｎ」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（３１）：２１８９２−２１９０２（これは、特に、６−配位ＦｅＩＩＮＯ複合体を含むＨ−ＮＯＸタンパク質試料の割合と５−配位ＦｅＩＩＮＯ複合体を含むＨ−ＮＯＸタンパク質試料の割合の決定に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる）に記載されているように、およそ３９７〜４００ｎｍでＵＶ−Ｖｉｓ  Ｓｏｒｅｔピークを生じる５−配位第一鉄ニトロシルを意味する。
【００８６】
本明細書中で使用される場合は、「ｋｏｆｆ」は、タンパク質からのＮＯまたはＯ２の放出速度のような解離速度を意味する。数字ｋｏｆｆが小さければ小さいほど、遅い解離速度を示す。６−配位ＦｅＩＩ−ＮＯ複合体を有しているＨ−ＮＯＸタンパク質について、ＮＯに対するｋｏｆｆは、Ｂｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．ら、（２００６年８月）「Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｈｏｍｏｌｏｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｌｕｂｅ  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ  β１  Ｈ０ＮＯＸ  Ｄｏｍａｉｎ」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（３１）：２１８９２−２１９０２、およびＢｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．ら、（２００５）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  Ｆｏｒ  ＮＯ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １：５３−５９（これらはそれぞれ、特に、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ  ｋｏｆｆの計算に関してその全体が参照として本明細書中に組み込まれる）に記載されているように計算される。５−配位ＦｅＩＩ−ＮＯ複合体を有しているＨ−ＮＯＸタンパク質について、ＮＯに対するｋｏｆｆは、Ｗｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ａ．ら、（２００７年１月）「Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  ｆｒｏｍ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ  ａｎｄ  Ｈｅｍｅ−Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ／Ｏｘｙｇｅｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２（２）：８９７−９０７（これは、特に、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ  ｋｏｆｆ、ＮＯ  ｋ１、およびＮＯ  ｋ２の計算に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる）に記載されているように、ＮＯに対するｋ１およびＮＯに対するｋ２によって記載される。５−配位ＦｅＩＩ−ＮＯ複合体と６−配位ＦｅＩＩ−ＮＯ複合体の混合物が含まれているＨ−ＮＯＸタンパク質については、ＮＯに対するｋｏｆｆは、Ｗｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ａ．ら、（２００７年１月）「Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  ｆｒｏｍ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ  ａｎｄ  Ｈｅｍｅ−Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ／Ｏｘｙｇｅｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２（２）：８９７−９０７（これは、特に、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ  ｋｏｆｆ、ＮＯ  ｋ１、およびＮＯ  ｋ２の計算に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる）に記載されているように、ＮＯに対するｋ１およびＮＯに対するｋ２によって記載される。
【００８７】
いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２は、３７℃では約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間であり、例えば、３７℃で、約１×１０−４ｓ−１〜約０．０１２ｓ−１、約１×１０−４ｓ−１〜約０．００７ｓ−１、約０．００５ｓ−１〜約０．０１１ｓ−１、または１×１０−４ｓ−１〜約１×１０−３ｓ−１
である。様々な実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２に対するｋｏｆｆは、３７℃では約１〜約１，０００ｓ−１の間であり、例えば、３７℃で、約１〜約５０ｓ−１、約５０〜約１００ｓ−１、約１００〜約２５０ｓ−１、約２５０〜約５００ｓ−１、約５００〜約７５０ｓ−１、または約７５０〜約１，０００ｓ−１である。
【００８８】
「ｋｏｎ」によっては、タンパク質に対するＮＯまたはＯ２の結合の速度のような会合速度を意味する。ｋｏｎの数字が小さければ小さいほど、遅い会合速度を示す。様々な実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２に対するｋｏｎは、２０℃では約０．１４〜約６０μＭ−１ｓ−１の間であり、例えば、約６〜約６０μＭ−１ｓ−１、約６〜１２μＭ−１ｓ−１、約１５〜約６０μＭ−１ｓ−１、約５〜約１８μＭ−１ｓ−１、または約６〜約１５μＭ−１ｓ−１である。
【００８９】
「解離定数」によっては、「動力学的解離定数」または「計算された解離定数」を意味する。「動力学的解離定数」または「ＫＤ」は、当業者に公知であり、そして／または本明細書中に記載される方法を含む標準的な方法（例えば、標準的な分光測定法、ストップトフロー測定法、または閃光光分解法）を使用して絶対値として決定されたＫＤ値のような、動力学的解離速度（ｋｏｆｆ）の動力学的結合速度（ｋｏｎ）に対する比を意味する。「計算された解離定数」または「計算されたＫＤ」は、計算されたｋｏｆｆに基づく動力学的解離定数の近似をいう。計算されたＮＯに対するＫＤについては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質についてのＮＯに対するｋｏｎの値は７１０μＭ−１ｓ−１と推測され、これは、４℃で測定された報告されたβ１（１−３８５）に対するｋｏｎであり、３７℃でも有意には増大しない（Ｚｈａｏ，ら、（１９９９）「Ａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  Ｓｅｎｓｉｎｇ  ｂｙ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ」，ＰＮＡＳ．９６：１４７５３−１４７５８（これは、特に、Ｈ−ＮＯＸタンパク質についてのＮＯ  ｋｏｎの計算に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる）。計算されたＯ２に対するＫＤについては、ｋｏｎの値は、本明細書中に記載される動力学的ＫＤとｋｏｆｆとの間での相関関係から導かれる。
【００９０】
様々な実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質によるＮＯ結合についての動力学的ＫＤまたは計算されたＫＤは、同じ条件下（例えば、２０℃）でのヘモグロビンのＫＤの約０．１〜約１００倍の間であり、例えば、同じ条件下（例えば、２０℃）でのヘモグロビンのＫＤの約０．１〜約１０倍の間、約０．５〜約２倍の間である。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ解離定数は、３７℃では約０．１〜約２０ｐＭの間であり、例えば、３７℃で、約０．５〜約１５、約０．５〜約１２、約０．７〜約４、または約０．７〜約３である。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ解離定数は、３７℃では少なくとも約０．１ｐＭであり、例えば、３７℃で、少なくとも約０．５、１、３、５、１０、１２、５０、１００、４００、５００、１０００、２０００、３０００、または４０００ｐＭのいずれかである。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ解離定数は、３７℃では約５０００ｐＭ未満であり、例えば、３７℃で、約４０００ｐＭ、３０００ｐＭ、２０００ｐＭ、１０００ｐＭ、５００ｐＭ、４００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、１２ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭ、３ｐＭ、または１ｐＭ未満のいずれかである。
【００９１】
様々な実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質によるＯ２結合についての動力学的ＫＤまたは計算されたＫＤは、同じ条件下（例えば、２０℃）でのヘモグロビンのＫＤの約０．０１〜約１００倍の間であり、例えば、同じ条件下（例えば、２０℃）でのヘモグロビンのＫＤの約０．１〜約１０倍の間、または約０．５〜約２倍の間である。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、３７℃では少なくとも約１μＭであり、例えば、３７℃で、少なくとも約５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、または１００μＭのいずれかである。いくつかの実施形態においては、３７℃ではＯ２に対する結合は検出できない、例えば、本明細書中に記載されるＵＶ可視分光測定法を使用した場合には、検出できるＯ２結合が存在しない（例えば、Ｏ２の存在下では約４１８ｎｍには検出できるピークがない、例えば、ＳｏｒｅｔピークがＯ２が存在しない場合に見られるものと同じ約４３１ｎｍのままである場合、あるいは、酸化されたタンパク質が原因でＳｏｒｅｔピークが約４１０ｎｍにシフトする場合）。
【００９２】
本明細書中で使用される場合は、「ＮＯ親和性」は、タンパク質に対するＮＯの結合（例えば、へム基に対する結合、またはタンパク質と会合したヘム基に結合した酸素に対する結合）の強度をいう定量的用語である。この親和性は、ＮＯに対するｋｏｆｆとｋｏｎの両方の影響を受ける。ＮＯ  ＫＤ値が数的に小さければ小さいほど、高い親和性を意味する。「酸素親和性」は、タンパク質のヘム部分に対する酸素の結合の強度を意味する定量的用語である。この親和性は、酸素に対するｋｏｆｆとｋｏｎの両方の影響を受ける。酸素ＫＤが数的に小さければ小さいほど、高い親和性を意味する。
【００９３】
本明細書中で使用される場合は、「ＮＯ安定性」は、酸素の存在下でのＮＯによる酸化に対するタンパク質の安定性または抵抗性をいう。例えば、酸素の存在下でＮＯに結合していると酸化されないタンパク質の能力は、タンパク質のＮＯ安定性の指標である。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の約５０％未満、４０％未満、３０％未満、１０％未満、または５％未満のうちのいずれかが、２０℃で約１、２、４、６、８、１０、１５、または２０時間のいずれかのインキュベーションの後に酸化される。
【００９４】
本明細書中で使用される場合は、「ＮＯ反応性」は、ヘム結合タンパク質のヘムのなかの鉄が２μＭのタンパク質濃度で、酸素の存在下でＮＯによって酸化される速度をいう。ｓ−１の単位でのＮＯ反応性の数的値が小さければ小さいほど、低いＮＯ反応性を示す。様々な実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、２０℃では約７００ｓ−１未満であり、例えば、２０℃で、約６００ｓ−１、５００ｓ−１、４００ｓ−１、３００ｓ−１、２００ｓ−１、１００ｓ−１、７５ｓ−１、５０ｓ−１、２５ｓ−１、２０ｓ−１、１０ｓ−１、５０ｓ−１、３ｓ−１、２ｓ−１、１．８ｓ−１、１．５ｓ−１、１．２ｓ−１、１．０ｓ−１、０．８ｓ−１、０．７ｓ−１、または０．６ｓ−１未満である。様々な実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、２０℃では、約０．１〜約６００ｓ−１の間であり、例えば、２０℃で、約０．５〜約４００ｓ−１の間、約０．５〜約１００ｓ−１の間、約０．５〜約５０ｓ−１の間、約０．５〜約１０ｓ−１の間、約１〜約５ｓ−１の間、または約０．５〜約２．１ｓ−１の間である。様々な実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の反応性は、同じ条件下（例えば、２０℃）でのヘモグロビンの反応性の、少なくとも約１０分の１、１００分の１、１，０００分の１、または１０，０００分の１である。
【００９５】
本明細書中で使用される場合は、「自己酸化速度」は、ヘム結合タンパク質のヘムの中の鉄が自己酸化される速度をいう。ｓ−１の単位での自己酸化速度の数的値が小さければ小さいほど、おそい自動酸化速度を示す。様々な実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自己酸化速度は、３７℃では約１．０ｈ−１未満であり、例えば、３７℃で、約０．９ｈ−１未満、０．８ｈ−１未満、０．７ｈ−１未満、０．６ｈ−１未満、０．５ｈ−１未満、０．４ｈ−１未満、０．３ｈ−１未満、０．２ｈ−１未満、０．１ｈ−１未満、または０．０５ｈ−１未満のいずれかである。様々な実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化速度は、３７℃では約０．００６〜約５．０ｈ−１の間であり、例えば、３７℃で、約０．００６〜約１．０ｈ−１、０．００６〜約０．９ｈ−１、または約０．０６〜約０．５ｈ−１である。
【００９６】
様々な実施形態においては、変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、（ａ）ヘモグロビンのものの大きさの２桁以内の、ＮＯもしくはＯ２解離定数、会合速度（ＮＯもしくはＯ２に対するｋｏｎ）、または解離速度（ＮＯもしくはＯ２に対するｋｏｆｆ）を有する、（ｂ）ｓＧＣ  β１のものよりも弱いＮＯ親和性（例えば、少なくとも約１０倍、１００倍、または１０００倍弱い）を有する、（ｃ）ヘモグロビンの少なくとも１，０００分の１未満である結合したＯ２とのＮＯ反応性を有する、（ｄ）ヘモグロビンのものよりも少なくとも２倍、１０倍、１００倍、または１０００倍高いインビボでの血漿保持時間を有するか、あるいは（ｅ）上記の２つ以上の任意の組み合わせを有する。
【００９７】
例示的な適切なＮＯ担体により、ヘモグロビンのものの大きさの２桁以内である、例えば、ヘモグロビンのものの約０．０１〜約１００倍の間、例えば、約０．１〜約１０倍の間、または約０．５〜約２倍の間の解離定数が提供される。様々な確立されている技術（例えば、本明細書中に記載される技術）（Ｂｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．ら、（２００５）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  Ｆｏｒ  ＮＯ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：５３−５９；Ｂｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．ら、（２００５年１０月）「Ｌｉｇａｎｄ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  Ｈｅｍｅ  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９（５）：４４１−４４６；Ｂｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．ら、（２００５）「Ｌｉｇａｎｄ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｄｏｍａｉｎｓ：Ｆｒｏｍ  ｓＧＣ  ｔｏ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＮＯ  Ｓｅｎｓｏｒｓ」，Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９９（４）：８９２−９０２）、Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ，Ｋ．Ｄ．ら、（２００４年８月１５日）「Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ＮＯ  ａｎｄ  Ｏ２  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ａ  Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ  Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）−Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ」，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３８２（Ｐｔ  １）：１８３−１８９（これらはそれぞれが、特に解離定数の測定に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる））、ならびに当業者に公知の他の技術を、解離定数を定量するために使用することができる。例示的なＮＯ担体により、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の結合したＯ２との低い、または最小のＮＯ反応性（例えば、ヘモグロビンのものよりも低いＮＯ反応性）が提供される。いくつかの実施形態においては、ＮＯ反応性は、ヘモグロビンのものよりもはるかに低く、例えば、少なくとも約１０分の１、１００分の１、１，０００分の１、または１０，０００分の１である。様々な確立されている技術を（Ｂｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．ら、（２００５）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  Ｆｏｒ  ＮＯ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：５３−５９；Ｂｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．ら、（２００５年１０月）「Ｌｉｇａｎｄ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  Ｈｅｍｅ  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９（５）：４４１−４４６；Ｂｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．ら、（２００５）「Ｌｉｇａｎｄ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｄｏｍａｉｎｓ：Ｆｒｏｍ  ｓＧＣ  ｔｏ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＮＯ  Ｓｅｎｓｏｒｓ），Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９９（４）：８９２−９０２）、Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ，Ｋ．Ｄ．ら、（２００４年８月１５日）「Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ＮＯ  ａｎｄ  Ｏ２  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ａ  Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ  Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）−Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ」，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３８２（Ｐｔ  １）：１８３−１８９（これらはそれぞれが、特にＮＯ反応性の測定に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる））ならびに当業者に公知の技術を、ＮＯ反応性を定量化するために使用することができる。野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸはそのような低いＮＯ反応性を有しているので、他の野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質および変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質は同様の低いＮＯ反応性を有し得る。例えば、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０Ｈは、野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸのＮＯ反応性と同様のＮＯ反応性を有する。
【００９８】
ＮＯ送達のための例示的な変異体は、ｓＧＣ  β１のＮＯ親和性よりも弱い、好ましくは、少なくとも１０分の１、１００分の１、または１０００分の１の弱いＮＯ親和性を有する。治療的なＮＯの送達（例えば、心臓発作、心臓切開手術、または脳卒中の間／後）のためには、様々な親和性を有している多様な操作されたＨ−ＮＯＸタンパク質が、特定の疾患状態における効力について０．１〜１０００ｎＭのＮＯ親和性のいくつかの実施形態の範囲を用いて、経験的に試験される。
【００９９】
加えて、適切なＮＯ担体により、高いか、または最大の安定性（特に、インビボでの安定性）が提供される。様々な安定性の数的指標（例えば、酸化的安定性（例えば、自己酸化またはＮＯによる酸化に対する安定性）、温度安定性、およびインビボ安定性が使用され得る。本明細書中に記載されている技術（Ｂｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．ら、（２００５）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  Ｆｏｒ  ＮＯ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：５３−５９；Ｂｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．ら、（２００５年１０月）「Ｌｉｇａｎｄ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  Ｈｅｍｅ  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９（５）：４４１−４４６；Ｂｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．ら、（２００５）「Ｌｉｇａｎｄ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｄｏｍａｉｎｓ：Ｆｒｏｍ  ｓＧＣ  ｔｏ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＮＯ  Ｓｅｎｓｏｒｓ」，Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９９（４）：８９２−９０２）、ならびに、当業者に公知の技術のような様々な確立されている技術を、安定性を定量化するために使用することができる。血漿、血液、または組織中でのインビボ安定性についての、例示的な安定性の数的指標としては、保持時間、クリアランス速度、および半減期が挙げられる。好熱性生物に由来するＨ−ＮＯＸタンパク質は、高温で安定であると予想される。様々な実施形態においては、血漿保持時間は、ヘモグロビンの血漿保持時間よりも少なくとも約２倍、１０倍、１００倍、または１０００倍大きい（例えば、Ｂｏｂｏｆｃｈａｋ，Ｋ．Ｍ．ら、（２００３年８月）「Ａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  Ｗｉｔｈ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ，Ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｏ２  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ」，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８５（２）：Ｈ５４９−Ｈ５６１）。当業者に明らかなように、ヘモグロビンをベースとする担体は、血漿に由来する細胞を含まないヘモグロビンを除去するヘモグロビン受容体の存在が原因で、血漿からの細胞を含まないヘモグロビンの迅速なクリアランスによって制限される。血漿中にはＨ−ＮＯＸタンパク質に対する受容体が存在しないので、野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質および変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、ヘモグロビンよりも長い血漿保持時間を有すると予想される。所望される場合には、血漿保持時間は、標準的な方法（例えば、本明細書中に記載される方法、および当業者に公知の方法）を使用して、ＰＥＧ化、またはＨ−ＮＯＸタンパク質の架橋、または別のタンパク質とＨ−ＮＯＸタンパク質との融合によって増大させることができる。
【０１００】
様々な実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ解離定数は、ヘモグロビンのＮＯ解離定数の大きさの２桁以内であり、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、ヘモグロビンのＮＯ反応性の少なくとも１０分の１未満である。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２は、３７℃では約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間であり、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、３７℃では少なくとも約１μＭである。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２は、３７℃では約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間であり、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、３７℃では少なくとも約１μＭである。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２は、３７℃では約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間であり、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、２０℃で約７００ｓ−１未満（例えば、２０℃で、約６００ｓ−１未満、５００ｓ−１未満、１００ｓ−１未満、２０ｓ−１未満、または１．８ｓ−１未満）である。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は３７℃では少なくとも約１μＭであり、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、２０℃で約７００ｓ−１未満（例えば、２０℃で、約６００ｓ−１未満、５００ｓ−１未満、１００ｓ−１未満、２０ｓ−１未満、または１．８ｓ−１未満）である。いくつかの実施形態においては、ＨＮＯＸタンパク質のＮＯに対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２は、３７℃では約１×１０−４ｓ−１〜約１０ｓ−１の間であり、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化速度は、３７℃で約１ｈ−１未満である。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は３７℃では少なくとも約１μＭであり、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化速度は、３７℃で約１ｈ−１未満である。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化速度は、３７℃で約１ｈ−１未満であり、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、２０℃で約７００ｓ−１未満（例えば、２０℃で、約６００ｓ−１未満、５００ｓ−１未満、１００ｓ−１未満、２０ｓ−１未満、または１．８ｓ−１未満）である。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質溶液の粘性は、１〜４センチポアズ（ｃＰ）の間である。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質溶液のコロイド浸透圧は、２０〜５０ｍｍＨｇの間である。
【０１０１】
表３には、野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質および変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質についての例示的な大きさ、酸素親和性、自動酸化安定性、ＮＯ反応速度、および修飾が列挙される。表３においては、媒体の大きさは、修飾された（例えば、ＰＥＧ化された）Ｈ−ＮＯＸタンパク質または未修飾のＨ−ＮＯＸタンパク質の分子量をいう。
【０１０２】
表３．Ｈ−ＮＯＸタンパク質についての例示的な実施形態
【０１０３】
【表３】
2009538133.tif 000018
特定の変異体についての例示的なデータが表４〜１４に報告される。表４〜１４においては、β１およびＢ２は、ラットＨ−ＮＯＸタンパク質に由来するタンパク質をいう。哺乳動物β１  Ｈ−ＮＯＸドメインのアミノ酸配列が最大２個のアミノ酸によって異なるので、同様の結果が、他の哺乳動物β１  Ｈ−ＮＯＸタンパク質（例えば、ヒトβ１）の中の対応している変異について予想される。
【０１０４】
表４は、ＮＯ結合についての解離定数を、Ｈ−ＮＯＸタンパク質中の１つ以上の残基を変異させることによって有意に変化させることができることを明らかに示している。加えて、ｓＧＣに対するＮＯの解離定数および解離速度に劇的に影響を与えるアロステリック調節因子の能力は、ＮＯの解離定数と解離速度を変化させるようにｓＧＣまたは他のＨ−ＮＯＸタンパク質の構造を変化させる変異の能力をサポートする。所望される場合には、ＮＯ結合に対する解離定数は、本明細書中に記載されるように、表４に列挙される任意の変異を組み合わせることによって、またはＨ−ＮＯＸタンパク質中に１つ以上のさらに別の変異を導入することによって、さらに変化させることができる。
【０１０５】
表４．Ｈ−ＮＯＸおよび他のヘムタンパク質に対するＮＯ結合についてのＫＤ値
【０１０６】
【表４】
2009538133.tif 000019
ａｋｏｆｆ：ｋｏｎの比から計算した；ｂＺｈａｏ，ら、（１９９９）「Ａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  Ｓｅｎｓｉｎｇ  ｂｙ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ」，ＰＮＡＳ．９６：１４７５３−１４７５８、４℃で測定した、速度は拡散速度に近づき、３７℃でも有意には増大しない；ｃＷｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ａ．ら、（２００７年１月）「Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  ｆｒｏｍ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ  ａｎｄ  Ｈｅｍｅ−Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ／Ｏｘｙｇｅｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２（２）：８９７−９０７；ｄｋ値、５配位および６配位からのＮＯ解離から最も適合した範囲を括弧でくくった、それぞれ、飽和ＮＯ、およびＮＯトラップとしての３０ｍＭのＮａ２Ｓ２Ｏ４を使用し、０．８８〜２．２μＭのタンパク質を含む、２〜４回の解離実験から平均した。データは、二重指数関数方程式による最良の適合であった：ΔＡｔ＝ΔＡ１（１−ｅ−ｋ１ｔ）＋ΔＡ２（１−ｅ−ｋ２ｔ）；ｅ２０℃で測定した；ｆＭｏｒｒｉｓ、ら、１９８０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：８０５０−８０５３；ｇＫＤ計算、３７℃に調整した、速度は１０℃ごとに倍にした、括弧内には２０℃での値を示す；ｈＭｏｏｒｅ，ら、（１９７６）「Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  ｆｒｏｍ  Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１：２７８８−２７９４；ｉβ１（１−３８５）と同じｋｏｎと仮定した（７１０μＭ−１ｓ−１）；ｊＢｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．ら、（２００６年８月）「Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｈｏｍｏｌｏｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｌｕｂｅ  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ  β１  Ｈ０ＮＯＸ  Ｄｏｍａｉｎ」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（３１）：２１８９２−２１９０２。
【０１０７】
表５は、ＮＯ結合についての解離速度（ｋｏｆｆ）を、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の１つ以上の残基を変異させることによって有意に変化させることができることを明らかに示している。これらの例示的な変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のｋｏｆｆは、３７℃では０．０００１３〜０．０１１ｓ−１の範囲である。表５については、ヘムタンパク質からのＮＯ解離定数は、それぞれ引用されている参考文献に示されているように化学トラップを使用して導かれた。比較のために、有機硝酸塩とＮＯＮＯａｔｅからのＮＯ解離速度をＮＯ電極を使用して測定し、オキシヘモグロビントラップを使用して確認した。必要な場合には、１０℃ごとに速度がほぼ倍増するという事実を使用して、３７℃に調整した。所望される場合には、ＮＯ結合についてのｋｏｆｆを、本明細書中に記載されるように、表５に列挙される１つの変異または二重変異のいずれかを組み合わせることによって、あるいは、Ｈ−ＮＯＸタンパク質に１つ以上のさらに別の変異を導入することによって、さらに変化させることができる。
【０１０８】
表５．３７℃でのヘムタンパク質とニトロ系血管拡張剤ＮＯの解離速度の比較
【０１０９】
【表５】
2009538133.tif 000020
ａＷｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ａ．ら、（２００７年１月）「Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  ｆｒｏｍ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ  ａｎｄ  Ｈｅｍｅ−Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ／Ｏｘｙｇｅｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２（２）：８９７−９０７；ｂＢｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．ら、（２００６年８月）「Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｈｏｍｏｌｏｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｌｕｂｅ  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ  β１  Ｈ０ＮＯＸ  Ｄｏｍａｉｎ」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（３１）：２１８９２−２１９０２；ｃＭｏｒｒｉｓ、ら、（１９８０）「Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｉｎ  ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒａｔｅ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：８０５０−８０５３；ｄＭｏｏｒｅ，ら、（１９７６）「Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｆｒｏｍ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１：２７８８−２７９４；ｅＭａｅｓ，ら、（２００４）「Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  Ｌｏｏｐｓ  ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  Ｎｉｔｒｉｘ  Ｏｘｉｄｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  Ｎｉｔｒｏｐｈｏｒｉｎ  ４」，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３（２１）：６６７９−９０；ｆＡｒｔｚ，Ｊ．Ｄ．ら、（１９９８）「ＮＯ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｎｏ  Ｄｏｎｅｒｓ  ａｎｄ  Ｎｉｔｔｏｖａｓｏｄｉｌａｔｏｒｓ：Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｏｘｙｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ａｎｄ  Ｐｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙｓ」，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１１（１２）：１３９３−１３９７；ｇＢｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．ら、（２００６）「Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  Ｕｓｉｎｇ  ａｎ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｄｏｍａｉｎ」，ＪＡＣＳ  １２８：１００２２−１００２３。
【０１１０】
表６に示されるように、野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質に１つ以上の変異を導入することにより、自動酸化速度およびＯ２解離速度を変化させることが可能となる。所望される場合には、自動酸化速度またはＯ２解離速度を、本明細書中に記載されるように、表６に列挙される１つの変異または二重変異のいずれかを組み合わせることによって、あるいは、Ｈ−ＮＯＸタンパク質に１つ以上のさらに別の変異を導入することによって、さらに変化させることができる。
【０１１１】
表６．野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質およびクラスＩＩ変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質について、自動酸化に対する安定性、Ｏ２結合特性（例えば、Ｏ２解離速度）、および遠位ポケットＨ結合残基が列挙される
【０１１２】
【表６−１】
2009538133.tif 000021
【０１１３】
【表６−２】
2009538133.tif 000022
ａこの構築物は、酸化（３７℃での自動酸化速度ｋｏｘ［ｈ−１］によって評価した）および／またはヘムの喪失に対して安定である。ｂＯ２結合活性は、２０℃でのヘムからのＯ２の解離速度によって評価した（ｓ−１）。ｃ３７℃で２４時間の後でもなお、自動酸化の指標は存在しなかった。ｄタンパク質のうちの小さい割合だけがＯ２と複合体を形成しており、報告される速度は、この集団についての反応速度論を示す。ｅタンパク質はＯ２に結合するが、ｋｏｆｆは決定しなかった。ｆ比較的安定であったが、このタンパク質は、これが酸化されるとタンパク質が沈殿し、これによってｋｏｆｆを測定することが難しくなる。ｇ不安定性または迅速な酸化が原因で適用できなかった。
１６  ｈ「安定ではない構築物」は、タンパク質が試験した条件下ですぐに酸化されることを意味する。ｉ「やや高く安定」は、タンパク質が、試験した条件下では数分間から数時間かけて酸化されるが、２４時間を越えては安定なままであることはないことを意味する。
【０１１４】
表７は、１つ以上の変異に導入によるＨ−ＮＯＸタンパク質のＯ２会合速度（ｋｏｎ）、Ｏ２解離速度（ｋｏｆｆ）、Ｏ２解離定数（ＫＤ）、および酸化速度（ｋｏｘ）の変化を示す。いくつかの実施形態においては、表７に列挙した１つの変異または二重変異のうちの任意のものが別の変異（例えば、表７の別の変異または本明細書中に記載される任意の他の変異）と組み合わせられて、Ｏ２会合速度、Ｏ２解離速度、Ｏ２解離定数、自動酸化速度、または上記の２つ以上の組み合わせがさらに変化する。
【０１１５】
表７．ヒスチジル−リガンドＦｅＩＩヘムタンパク質についてのＯ２結合の動力学的定数
【０１１６】
【表７】
2009538133.tif 000023
ａ２０℃での解離定数（ｎＭ）；ｂ２０℃でのヘムに対するＯ２会合速度（μＭ−１ｓ−１）；ｃ２０℃でのヘムからのＯ２の解離速度（ｓ−１）；ｄ３７℃でのヘムの自動酸化速度（ｈ−１）；ｅ３７℃で２４時間の後でもなお、自動酸化の指標は存在しなかった。ｆタンパク質のうちの小さい割合だけがＯ２と複合体を形成したが、この集団についての反応速度論は測定できなかった；Ｂｏｏｎｅ，Ｅ．Ｍ．ら、（２００５年６月）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  Ｆｏｒ  ＮＯ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １（１）：５３−５９による、ｊ未公開データ；ｋＳｐｒｉｎｇｅｒ，Ｂ．Ａ．ら、（１９９４）「Ｆａｍｉｌｙ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｋｅｙ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ  ｉｎ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ  Ｓｕｉｃｉｄｅ  Ａｍｏｎｇ  Ｙｏｕｔｈ」，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９４：６９９−７１４；ｌＧｉｌｌｅｓ−Ｇｏｎｚａｌｅｚら、（１９９４）「Ｈｅｍｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｓｅｎｓｏｒｓ，Ｅｘｅｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｋｉｎａｓｅ  ＦｉｘＬ，ａｒｅ  ａ  Ｎｅｗ  Ｃｌａｓｓ  ｏｆ  Ｈｅｍｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  Ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｕｔｏｘｉｄａｔｉｏｎ」，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：８０６７−８０７３。ｍＡｏｎｏ，Ｓ．ら、（２００２）「Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｒａｍａｎ  ａｎｄ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｏｘｙｇｅｎ−Ｓｅｎｓｉｎｇ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＨｅｍＡＴ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｓｕｂｔｉｌｉｓ」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１３５２８−１３５３８。ｎＡｎｔｏｎｉｎｉ，Ｅ．ら、（１９７１）「Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ａｎｄ  Ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ  ｉｎ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｌｉｇａｎｄｓ」，Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｐｕｂｌ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ。
【０１１７】
表８は、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２会合速度、Ｏ２解離速度、Ｏ２自動酸化速度、ＮＯ反応性、およびＦｅＩＩ−Ｏ２複合体の安定性を、１つ以上の変異の導入によって変化させることができることを示す。いくつかの実施形態においては、表８に列挙されている１つの変異または二重変異のうちの任意のものが別の変異（例えば、表８の別の変異または本明細書中に記載される任意の他の変異）と組み合わせられて、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２会合速度、Ｏ２解離速度、Ｏ２自動酸化速度、ＮＯ反応性、またはＦｅＩＩ−Ｏ２複合体の安定性がさらに変化する。当業者に明らかであるように、１つ以上のさらに別の変異（例えば、本明細書中に記載される変異）の導入を、これらの値をさらに変化させるために使用することができる。
【０１１８】
表８．Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２会合速度、Ｏ２解離速度、Ｏ２自動酸化速度、ＮＯ反応性、およびＦｅＩＩ−Ｏ２複合体の安定性
【０１１９】
【表８】
2009538133.tif 000024
ａ２０℃でのヘムに対するＯ２の会合速度（μＭ−１ｓ−１）；ｂ２０℃でのヘムからのＯ２解離速度（ｈ−１）；ｃ３７℃でのヘムの自動酸化速度（ｈ−１）；ｄＮＯ反応性の決定のために、精製したタンパク質（Ｔｔ  ＷＴ  ＨＮＯＸ、Ｔｔ  Ｙ１４０Ｈ  ＨＮＯＸ、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓヘモグロビン（Ｈｓ  Ｈｂ））を２μＭの緩衝液の中に調製し、一酸化窒素（ＮＯ）を２０℃の緩衝液Ａの中に２００μＭで調製した（緩衝液Ａ：５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌ）。ストップトフロー分光光度計を使用して、０．００１２５秒の積分時間で、タンパク質をＮＯと１：１で迅速に混合した。最大変化の波長を、単一指数関数にフィットさせて、原則として、ＮＯによる酸化の律速工程を測定した。反応の最終産物は、ＨＮＯＸタンパク質についてはｆｅｒｒｉｃ−ＮＯであり、Ｈｓ  Ｈｂについてはｆｅｒｒｉｃ−ａｑｕｏであった。ｅＨｓ  Ｈｂについて、ＮＯとのタンパク質の反応は、反応が実験の不感時間（０．００１秒）以内に完了したほどに早かった。ヘモグロビンのＮＯ反応性は、Ｅｉｃｈ，Ｒ．Ｆ．ら、（１９９６）「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ＮＯ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ  ａｎｄ  Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ」，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：６９７６−６９８３に基づくと、２０℃ではおよそ７，０００ｓ−１である。
【０１２０】
表９は、Ｏ２結合についての解離定数を、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の１つ以上の残基を変異させることによって有意に変化させることができることを明らかに示している。これらの例示的なＨ−ＮＯＸタンパク質についての動力学的ＫＤ値は、２０℃では２１．２０ｎＭ〜１００００００．００ｎＭまでの範囲である。所望される場合には、Ｏ２結合についての解離定数を、本明細書中に記載されるように、表９に列挙される１つの変異または二重変異のいずれかを組み合わせることによって、あるいは、Ｈ−ＮＯＸタンパク質に１つ以上のさらに別の変異を導入することによって、さらに変化させることができる。
【０１２１】
表９．Ｏ２結合についての解離定数の値によって並べられた、野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質および変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質ならびに参照タンパク質
【０１２２】
【表９】
2009538133.tif 000025
表１０は、Ｏ２結合についての解離速度を、Ｈ−ＮＯＸタンパク質中の１つ以上の残基を変異させることによって有意に変化させることができることを明らかに示している。これらの例示的なＨ−ＮＯＸタンパク質についての解離速度は、２０℃では０．２１ｓ−１〜２３．４ｓ−１までの範囲である。所望される場合には、Ｏ２結合についての解離速度を、本明細書中に記載されるように、表１０に列挙される１つの変異または二重変異のいずれかを組み合わせることによって、あるいは、Ｈ−ＮＯＸタンパク質に１つ以上のさらに別の変異を導入することによって、さらに変化させることができる。
【０１２３】
表１０．Ｏ２結合についての解離速度の値によって並べられた、野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質および変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質ならびに参照タンパク質
【０１２４】
【表１０】
2009538133.tif 000026
表１１は、Ｏ２結合についての会合速度を、Ｈ−ＮＯＸタンパク質中の１つ以上の残基を変異させることによって有意に変化させることができることを明らかに示している。これらの例示的なＨ−ＮＯＸタンパク質についての会合速度は、２０℃では６０μＭ−１ｓ−１〜０．１４μＭ−１ｓ−１までの範囲である。所望される場合には、Ｏ２結合についての会合速度を、本明細書中に記載されるように、表１１に列挙される１つの変異または二重変異のいずれかを組み合わせることによって、あるいは、Ｈ−ＮＯＸタンパク質に１つ以上のさらに別の変異を導入することによって、さらに変化させることができる。
【０１２５】
表１１．Ｏ２結合についての会合速度の値によって並べられた、野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質および変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質ならびに参照タンパク質
【０１２６】
【表１１】
2009538133.tif 000027
表１２は、ＮＯ結合およびＯ２結合に対する例示的なＨ−ＮＯＸ変異の影響を示している。Ｆｅが連結していない形態について表１２に列挙されるそれぞれの数字は、１つのピークについての数字である（これは、β列およびα列の間に列挙される）。ＮＯまたはＯ２が結合している場合には、この１つのピークが２つのピークβとαに分かれる（これらはそれぞれ、β列およびα列の下に列挙される。所望される場合には、ＮＯまたはＯ２結合を、本明細書中に記載されるように、表１２に列挙される１つの変異または二重変異のいずれかを組み合わせることによって、あるいは、Ｈ−ＮＯＸタンパク質に１つ以上のさらに別の変異を導入することによって、さらに変化させることができる。
【０１２７】
表１２：いくつかのヒスチジル−リガンドＦｅＩＩヘムタンパク質複合体についてのＵＶ可視ピークの位置ａ
【０１２８】
【表１２−１】
2009538133.tif 000028
【０１２９】
【表１２−２】
2009538133.tif 000029
表１３には、いくつかのＦｅ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）−ＮＯ、およびＦｅ（ＩＩ）−Ｏ２複合体についてのＵＶ可視ピークの位置が含まれる。ヘモグロビンまたはＨ−ＮＯＸタンパク質が嫌気性である場合には、これは約４３１ｎｍにＳｏｒｅｔピークを有し、そしてこれは連結されていない状態である。Ｈ−ＮＯＸタンパク質がＮＯに結合しない場合には、Ｓｏｒｅｔピークは、ＮＯが添加されても変化しないであろう。Ｈ−ＮＯＸタンパク質がＮＯに結合し、６−配位第二鉄−ニトロシル複合体を形成する場合には、そのＳｏｒｅｔピークは、ＮＯが添加されると、４２０ｎｍ〜４２４ｎｍの間にシフトするであろう。Ｈ−ＮＯＸタンパク質がＮＯに結合し、５−配位第二鉄−ニトロシル複合体を形成する場合には、Ｓｏｒｅｔピークは約３９９ｎｍにシフトするであろう。Ｈ−ＮＯＸタンパク質がＯ２に結合しない場合には、Ｓｏｒｅｔピークは、Ｏ２が添加されても変化しないであろう。Ｈ−ＮＯＸタンパク質がＯ２に結合する場合には、そのＳｏｒｅｔピークは、Ｏ２が添加されると、４１４ｎｍ〜４１８ｎｍの間にシフトするであろう。これは、ヘモグロビンにおいて起こるシフトと同じであり、ヘムに結合したＯ２の指標である。酸化されたＨ−ＮＯＸ（Ｆｅ（ＩＩＩ））についてのＳｏｒｅｔピークは、保存または使用後のＨ−ＮＯＸタンパク質の状態と関係し得る。所望される場合には、ＮＯまたはＯ２結合を、本明細書中に記載されるように、表１３に列挙される１つの変異または二重変異のいずれかを組み合わせることによって、あるいは、Ｈ−ＮＯＸタンパク質に１つ以上のさらに別の変異を導入することによって、さらに変化させることができる。
【０１３０】
表１３．いくつかのＦｅ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）−ＮＯ、およびＦｅ（ＩＩ）−Ｏ２複合体についてのＵＶ可視ピークの位置
【０１３１】
【表１３−１】
2009538133.tif 000030
【０１３２】
【表１３−２】
2009538133.tif 000031
表１４には、例示的なＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸタンパク質についての自動酸化速度が含まれる。所望される場合には、自動酸化速度を、本明細書中に記載されるように、表１４に列挙される変異の任意の組み合わせによって、あるいは、Ｈ−ＮＯＸタンパク質に１つ以上のさらに別の変異を導入することによって、さらに変化させることができる。表１４の中の２ｎｍおよび３ｎｍの値の平均は、観察期間全体にわたる、２〜３ｎｍのＵＶ−Ｖｉｓ  Ｓｏｒｅｔピークのシフトをいう；この例示的な小さな変化は、自己酸化が原因であり得る。
【０１３３】
表１４．Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ（Ｔｔ）Ｈ−ＮＯＸタンパク質についての自動酸化速度
【０１３４】
【表１４】
2009538133.tif 000032
ａ「安定」は、少なくとも２４時間の後にはヘムの酸化がないことを示す。
「ＲＴ」は室温を示す。
【０１３５】
Ｈ−ＮＯＸ核酸
本発明はまた、本明細書中に記載される変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のうちの任意のものをコードする核酸を特徴とする。本明細書中で使用される場合は、「核酸」は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態の、２つ以上のデオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドを意味し、これは、他の場所に明記されない限りは、自然界に存在しているヌクレオチドと同様の様式で核酸にハイブリダイズする、自然界に存在しているヌクレオチドの公知のアナログを含む。いくつかの実施形態においては、核酸は組み換え体核酸である。「組み換え体核酸」によっては、目的の核酸が由来する生物体の自然界に存在しているゲノムの中で目的の核酸に隣接している１つ以上の核酸（例えば、遺伝子）が含まれていない目的の核酸を意味する。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ核酸は、組み換え体核酸がＨ−ＮＯＸタンパク質（例えば、Ｈ−ＮＯＸタンパク質に由来する別のドメインを含むかまたはそれを含まないＨ−ＮＯＸドメイン）と、別のタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）の全体または一部が含まれている融合タンパク質をコードするように、別のタンパク質の全体または一部をコードする別の核酸に対して動作可能であるように連結される。したがって、この用語は、例えば、ベクターの中に、自律複製するプラスミドもしくはウイルスの中に、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡの中に組み込まれたか、あるいは、別の分子（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ断片、またはＰＣＲもしくは制限エンドヌクレアーゼ消化によって生産されたｃＤＮＡ断片）として存在する、組み換え体ＤＮＡを含む。
【０１３６】
本発明はまた、本明細書中に記載される任意の変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードする１つ以上の核酸を含むベクターを特徴とする。本明細書中で使用される場合は、「ベクター」は、宿主細胞の中で目的の１つ以上の核酸を送達し、そして状況に応じてこれを発現することができる構築物を意味する。ベクターの例としては、プラスミド、ウイルスベクター、ＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、コスミド、およびファージベクターが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態においては、ベクターは、発現制御配列の制御下に核酸を含む。「発現制御配列」は、目的の核酸の転写を指示する核酸配列を意味する。発現制御配列はプロモーター（例えば、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター）あるいはエンハンサーであり得る。発現制御配列は、転写される核酸セグメントに動作可能であるように連結される。
【０１３７】
特定の実施形態においては、核酸は、図２〜４Ｄまたは８Ａ〜８ＤＤに示される任意の核酸の核酸配列のセグメントまたは全体が含む。いくつかの実施形態においては、核酸は、Ｈ−ＮＯＸ核酸に由来する少なくとも約５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００個以上の連続しているヌクレオチドが含まれ、そしてこれには、それが由来するＨ−ＮＯＸ核酸と比較して、１つ以上の変異（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の変異）を含む。様々な実施形態においては、変異Ｈ−ＮＯＸ核酸は、それが由来するＨ−ＮＯＸ核酸と比較して、約２０、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２個未満の変異を含む。本発明はまた、変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードする任意の核酸の縮重変異体をも特徴とする。
【０１３８】
本発明はまた、本明細書中に記載される変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸が含まれている細胞、または細胞の集団を含む。例示的な細胞としては、昆虫、植物、酵母、細菌、および哺乳動物の細胞が挙げられる。これらの細胞は、本明細書中に記載される方法のような標準的な方法を使用する変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質の生産に有用である。
【０１３９】
Ｈ−ＮＯＸタンパク質の処方
本明細書中に記載される任意の野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質または変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、薬学的組成物または非薬学的組成物の処方に使用することができる。以下でさらに議論されるように、これらの処方物は、様々な治療への応用および産業的応用に有用である。
【０１４０】
いくつかの実施形態においては、薬学的組成物は、１つ以上の野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質または変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質（例えば、本明細書中に記載される野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質または変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質のいずれか）と薬学的に許容される担体を含む。様々な実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、単離されたタンパク質または精製されたタンパク質である。「薬学的に許容される担体」によっては、有効成分と組み合わせられた場合に、その性分が生物学的活性を保つことができ、そして当業者の知識に基づいて許容されない免疫応答（例えば、重篤なアレルギーまたはアナフィラキシーショック）を誘発することのない、任意の物質を意味する。例としては、リン酸緩衝化生理食塩溶液、水、エマルジョン（例えば、油／水エマルジョン）、および様々なタイプの湿潤剤のような、任意の標準的な薬学的担体が挙げられるが、これらに限定されない。エアゾール投与または非経口投与のための例示的な希釈剤は、リン酸緩衝化生理食塩水または生理食塩水（０．９％）である。そのような担体が含まれている組成物は、周知の従来法によって処方される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，編，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ，，１９９０；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  第２０版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０００（これらはそれぞれが、特に処方物に関してその全体が参照として本明細書中に組み込まれる）を参照のこと）。
【０１４１】
当業者に公知の任意の適切な担体を本発明の薬学的組成物において使用することができるが、担体のタイプは投与の態様に応じて変化するであろう。組成物は、任意の適切な投与様式（例えば、静脈内、動脈内、膀胱内、吸入、腹腔内、肺内、筋肉内、皮下、気管内、経粘膜、眼内、クモ膜下、または経皮投与を含む）のために処方することができる。皮下注射のような非経口投与については、担体には、例えば、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックス、または緩衝液が含まれ得る。経口投与については、任意の上記の担体または固体担体（例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、または炭酸マグネシウム）を使用することができる。生体分解性マイクロスフェア（例えば、ポリアセテートポリグリコレート）もまた、担体として使用される場合がある。
【０１４２】
いくつかの実施形態においては、薬学的組成物または非薬学的組成物は、緩衝液（例えば、中性の緩衝化生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水など）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロース、デキストランなど）、抗酸化剤、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ、グルタチオンなど）、保存剤、ＮＯの結合および／または輸送に有用な別の化合物、不活性な成分（例えば、安定化剤、増量剤など）、あるいは上記の２つ以上の組み合わせを含む。いくつかの実施形態においては、組成物は、凍結乾燥物として処方される。Ｈ−ＮＯＸタンパク質はまた、周知の技術を使用してリポソームまたはナノ粒子の中にカプセル化される場合もある。Ｈ−ＮＯＸタンパク質に使用することができる別の例示的な処方物は、例えば、米国特許第６，９７４，７９５号および同第６，４３２，９１８号（これらはそれぞれ、特に、タンパク質の処方に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる）に記載されている。
【０１４３】
本明細書中に記載される組成物は、徐放性処方物（例えば、投与後に化合物の緩やかな放出を生じるカプセルまたはスポンジのような処方物）の一部として投与される場合がある。そのような処方物は、通常、周知の技術を使用して調製することができ、そして例えば、経口、直腸、または皮下への埋め込み、あるいは所望される標的部位への移植によって投与することができる。徐放性処方物は、担体マトリックスの中に分散された、および／または速度制御膜によって囲まれているレザーバーの中に含まれるＨ−ＮＯＸタンパク質を含む場合がある。そのような処方物に使用される担体は生体適合性であり、これは生体分解性でもあり得る。いくつかの実施形態においては、この処方物によって、比較的一定のレベルのＨ−ＮＯＸタンパク質の放出が提供される。徐放性処方物の中に含まれているＨ−ＮＯＸタンパク質の量は、移植部位、放出速度および期待される期間、および治療もしくは予防される症状の性質に応じて様々である。
【０１４４】
いくつかの実施形態においては、薬学的組成物は、有効量の野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質または変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含む。用語「有効量」は、効力と毒性についてのそのパラメータの組み合わせにおいて、実施する専門家の知識に基づいて所定の治療的形態において有効であるはずである、本明細書中に記載される１つ以上のタンパク質のそのような量を意図する。当該分野で理解されているように、有効量は、単回用量であっても、また、それ以上の用量であってもよい。臨床的状況で理解されるように、薬学的組成物の有効量は、別の薬物、化合物、または薬学的組成物との組み合わせにおいて得られる場合も、またそうではない場合もある。したがって、有効量は、１つ以上の他の薬剤との組み合わせにおいて、所望されるかもしくは有用な結果を得ることができるか、または所望されるかもしくは有用な結果が得られる場合には、１つ以上の治療薬を投与する状況において考慮することができ、そして、単一の薬剤が、有効量で投与されるように考慮することもできる。
【０１４５】
血液代用物としてのヘモグロビンの例示的な用量は、患者の体重１キログラムあたり、約１０ｍｇ〜約５グラムまたはそれ以上の細胞外ヘモグロビンである。同様の用量のＨ−ＮＯＸタンパク質をＮＯの送達に使用することができる。したがって、いくつかの実施形態においては、ヒトに投与されるＨ−ＮＯＸタンパク質の有効量は、数グラム〜約３５０グラムを超えるまでの間である。他の例示的なＨ−ＮＯＸタンパク質の用量としては、適切な注入速度（例えば、約０．５ｍｌ／分）での、約４．４、５、１０、または１３Ｇ／ＤＬ（この場合、Ｇ／ＤＬは、循環への注入の前のＨ−ＮＯＸタンパク質溶液の濃度である）のいずれかが挙げられる（例えば、Ｗｉｎｓｌｏｗ，Ｒ．第１２章、Ｂｌｏｏｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓを参照のこと）。いくつかの実施形態においては、１０ｍｇ未満のＨ−ＮＯＸタンパク質の用量が、一時的な血管拡張のために使用される。それぞれの投与形態の個々の用量の中に含まれる有効成分の単位含有量が、それ自体が有効量を構成する必要はないことが理解されるであろう。なぜなら、必要な有効量は、複数回の投与による作用の合計によってもたらされ得るからである。薬学的組成物の中に含められるＨ−ＮＯＸタンパク質の量の選択は、利用される投与形態、治療される症状、その分野の当業者の決定にしたがって達成される特定の目的に応じて様々である。
【０１４６】
例示的な組成物としては、遺伝子操作された、組み換え体Ｈ−ＮＯＸタンパク質が挙げられる。これは、単離されている場合も、また精製されている場合もあり、これは、対応する野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質と比較してＮＯもしくはＯ２リガンド結合がまとめて変化されており、生理学的に適合する哺乳動物の血液ガスＮＯ担体として作動することができる１つ以上の変異体を含む。例えば、本明細書中に記載されている変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質である。
【０１４７】
本発明によってはまた、１つ以上の野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質または変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質が含まれているか、あるいは原則としてそれらから構成されているＮＯ担体が提供される。タンパク質（例えば、血液または消化器系に送達されるタンパク質）の処方のための適切な緩衝液および他の成分は当該分野で公知である。
【０１４８】
薬学的組成物が投与されるヒト被験体において免疫応答を軽減または予防するためには、ヒトＨ−ＮＯＸタンパク質（野生型ヒトタンパク質、または１つ以上の変異が導入されているヒトタンパク質のいずれか）、あるいは他の非抗原性Ｈ−ＮＯＸタンパク質（例えば、哺乳動物Ｈ−ＮＯＸタンパク質）を使用することができる。ヒト以外の供給源に由来するＨ−ＮＯＸタンパク質の免疫原性を低下させるまたは排除するためには、Ｈ−ＮＯＸタンパク質中のアミノ酸を、ヒトＨ−ＮＯＸタンパク質中の対応するアミノ酸に変異させることができる。例えば、ヒト以外のＨ−ＮＯＸタンパク質の三次構造の表面上にある１つ以上のアミノ酸を、ヒトＨ−ＮＯＸタンパク質中の対応するアミノ酸に変異させることができる。
【０１４９】
Ｈ−ＮＯＸタンパク質の治療的応用
本明細書中に記載される任意の野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質または変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質（例えば、単離または精製されたＨ−ＮＯＸタンパク質）あるいは薬学的組成物は、治療的応用において使用することができる。
【０１５０】
特定のＨ−ＮＯＸタンパク質を、治療される特定の適応症についての所望されるＮＯ解離定数、Ｏ２解離定数、ＮＯ  ｋｏｆｆ、Ｏ２  ｋｏｆｆ、ＮＯ反応性、ＮＯ安定性、自動酸化速度、血漿保持時間、半減期、または上記の２つ以上の任意の組み合わせに基づいて、そのような応用のために選択することができる。Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、ＮＯの送達が有効である任意の症状を治療するために使用することができる。例示的な標的の適応症としては、機能性ＮＯ欠乏症の疾患（例えば、血管拡張剤またはＮＯ担体が適用される場合）が挙げられ、これには、慢性高血圧によって悪化した症状（例えば、心不全、腎不全、および脳卒中を含む）。様々な実施形態においては、治療される症状は心臓血管の症状（例えば、心筋梗塞、または心臓の外科手術）、高血圧、血管収縮の症状（例えば、脳卒中）、勃起障害、便秘、または腸閉塞である。便秘または腸閉塞の治療については、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、括約筋調節能力の障害を治療するためにＮＯを送達するために使用することができ、それにより、平滑筋が弛緩する。例えば、消化器系において機能するＨ−ＮＯＸタンパク質は、Ｈ−ＮＯＸタンパク質が消化器系を通過するのに伴い、回腸の平滑筋を弛緩させることができる。これらの方法および組成物を、急性の状況（組織または特異的な部位にＮＯが迅速に提供される、例えば、急性心筋梗塞または脳卒中）、ならびに、慢性の状況（例えば、慢性高血圧、または急性心筋梗塞もしくは脳卒中からの急性期後の回復）の両方に応用することができる。
【０１５１】
様々な実施形態においては、本発明は、個体にＮＯを送達するために十分な量の野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質もしくは変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質を、それが必要な個体に投与することによる、個体（例えば、哺乳動物、例えば、霊長類（例えば、ヒト、サル、ゴリラ、類人猿、キツネザルなど）、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、またはネコ））に対してＮＯを送達する方法を特徴とする。いくつかの実施形態においては、本発明は、血液ガスを個体（例えば、哺乳動物）に運搬または送達する方法が提供される。この方法は、１つ以上のＨ−ＮＯＸ組成物を個体（例えば、哺乳動物）の血液に送達する工程を含む。血液、消化器系、または組織（例えば、哺乳動物の血液または組織）にタンパク質を送達するための方法は当該分野で公知である。様々な実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、ヘムに結合することができるアポタンパク質であっても、また、ヘムが結合したホロタンパク質であってもよい。Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、個体へのＨ−ＮＯＸタンパク質の投与の前に結合されたヘムを有している場合も、またそれを有していない場合もある。他の実施形態においては、ＮＯは、個体への投与の前にはＨ−ＮＯＸタンパク質に結合されず、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、個体中の１つの位置から個体中の別の位置にＮＯを輸送する。例えば、特定の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、血流の中のＮＯに結合し、ＮＯ濃度が非常に低い場所（例えば、血管収縮の部位）でのみこれを放出する。この標的化されたＮＯの送達によっては、局所的なＮＯ濃度とは無関係にＮＯを放出し、したがって、全身的に作用を及ぼし、頭痛および周囲のヒリヒリ感のような副作用を伴う従来の血管拡張剤によって生じる副作用よりも副作用は少なくなり得る。
【０１５２】
本発明の方法は、任意の個体を治療するために使用することができる。本明細書中での使用のためには、他の場所に明記されない限りは、「個体」は、本明細書中で使用される場合は、哺乳動物（霊長類（例えば、ヒト、サル、ゴリラ、類人猿、キツネザルなど）、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、またはネコを含むがこれらに限定されない）が意図される。したがって、本発明により、ヒト用の医薬品と、獣医学的状況（農業用動物および家畜ペットにおける使用を含む）の両方における用途が見出される。個体は、心臓血管の症状（例えば、心筋梗塞または心臓の外科手術）、高血圧、高血圧によって悪化した症状（例えば、心不全、腎不全、または脳卒中）、血管収縮の症状（例えば、脳卒中）、ＮＯ機能不全、勃起障害、便秘、または腸閉塞のような適応症と診断されている場合も、それらを有している疑いがある場合も、あるいは、それらを発症する危険性がある場合もある。個体は、これらの適応症に関係している１つ以上の症状を示す場合がある。個体は、そのような症状を発症する遺伝的素因があり得るか、または別の理由でそのような素因があり得る。
【０１５３】
本明細書中で使用される場合は、「その必要がある」には、症状または疾患（例えば、心臓血管の症状（例えば、心筋梗塞または心臓の外科手術）、高血圧、高血圧によって悪化した症状（例えば、心不全、腎不全、または脳卒中）、血管収縮の症状（例えば、脳卒中）、ＮＯ機能不全、勃起障害、便秘、または腸閉塞）を有しているか、あるいは、そのような症状または疾患の「危険性がある」個体を含む。本明細書中で使用される場合は、「危険性がある」個体は、症状（例えば、心臓血管の症状（例えば、心筋梗塞または心臓の外科手術）、高血圧、高血圧によって悪化した症状（例えば、心不全、腎不全、または脳卒中）、血管収縮の症状（例えば、脳卒中）、ＮＯ機能不全、勃起障害、便秘、または腸閉塞）を発症する危険性がある個体である。「危険性がある」個体は、検出することができる疾患もしくは症状を有している場合も、また有していない場合もあり、そして本明細書中に記載される治療方法の前に検出することができる疾患が明らかになっている場合も、また明らかになっていない場合もある。「危険性がある」は、個体が１つ以上のいわゆる危険因子を有していることを示す。危険因子は、疾患または症状の発症と相関関係がある測定可能なパラメータであり、当該分野で公知である。１つ以上のこれらの危険因子を有している個体は、これらの危険因子（単数または複数）を有していない個体よりも、疾患または症状を発症する可能性が高い。これらの危険因子には、年齢、性別、人種、食事療法、これまでの病歴、病気の前兆の存在、遺伝的（すなわち、遺伝性）な検討材料、および環境暴露を含むが、これらに限定されない。
【０１５４】
これらの方法は、そのためにはＮＯの送達が有効である任意の症状を治療するか、または遅らせるために使用することができる。「治療」または「治療する」によっては、有効な結果または所望される結果（臨床的結果を含む）を得るためのアプローチを意味する。本発明の目的のためには、有用な結果または所望される結果には、症状（例えば、心臓血管の症状（例えば、心筋梗塞または心臓の外科手術）、高血圧、高血圧によって悪化した症状（例えば、心不全、腎不全、または脳卒中）、血管収縮の症状（例えば、脳卒中）、ＮＯ機能不全、勃起障害、便秘、または腸閉塞であるが、これらに限定されない）に伴う兆候の緩和、症状に伴う兆候の程度の縮小、または症状に伴う兆候の悪化を防ぐことを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態においては、本明細書中に開示される１つ以上のタンパク質での治療には、副作用は付随しないか、または現在利用することができる治療に付随する副作用よりも少ない副作用が付随する。
【０１５５】
本明細書中で使用される場合は、疾患または症状の発症を「遅らせること」は、疾患または症状（例えば、心臓血管の症状（例えば、心筋梗塞または心臓の外科手術）、高血圧、高血圧によって悪化した症状（例えば、心不全、腎不全、または脳卒中）、血管収縮の症状（例えば、脳卒中）、ＮＯ機能不全、勃起障害、便秘、または腸閉塞）の発症を引き伸ばす、妨げる、遅くする、妨害する、安定化させる、および／またはあとに延ばすことを意味する。この遅延は、治療される疾患および／または個体の病歴に応じて、様々な時間の長さであり得る。当業者に明らかであるように、十分な、または有意な遅延には、事実上、予防が含まれ得、この場合、個体は、疾患または症状を発症しない。例えば、この方法により、この方法を使用しなかった場合と比較して、所定の時間枠の中での疾患の発症の可能性が低下する場合があり、そして／また、所定の時間枠の中での疾患の程度が軽減する場合もある。いくつかの実施形態においては、そのような比較は、統計学的に有意な数の被験体を使用する臨床試験に基づく。疾患の発症は、標準的な臨床的技術を使用して検出することができる。発症はまた、最初は検出不可能であり得る疾患の進行をもまた意味する場合があり、これは、発生、再発、および発症を含む。
【０１５６】
体内の特定の部位（例えば、組織または臓器）へのＮＯが結合したＨ−ＮＯＸタンパク質の直接の送達のためのいくつかの実施形態においては、ＮＯについてのｋｏｆｆは、ＫＤよりも重要である。なぜなら、ＮＯはタンパク質にすでに結合しており（ｋｏｎを重要ではなくしてしまう）、ＮＯが体内の特定の部位またはその付近で放出される（ｋｏｆｆによる影響を受ける速度で）必要があるからである。急性の症状の治療のためのいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、ＮＯに対して比較的高いｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２（例えば、少なくとも約０．０５ｓ−１、０．１ｓ−１、または１．０ｓ−１のいずれか）を有しており、その結果、血管拡張が迅速に起こる。全身的投与についてのいくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、ＮＯに対して比較的低いｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２（例えば、約０．０５ｓ−１未満、０．０１ｓ−１未満、または０．００１ｓ−１未満のいずれか）を有しており、その結果、ＮＯは、Ｈ−ＮＯＸタンパク質が低いＮＯ濃度の部位（例えば、血管収縮している部位）に達するまでは放出されない。
【０１５７】
Ｈ−ＮＯＸタンパク質はまた、画像化のためにも使用することができる。具体的には、光イメージング（ｌｉｇｈｔ  ｉｍａｇｉｎｇ）（例えば、光コヒーレンス・トモグラフィー；例えば、Ｖｉｌｌａｒｄ，Ｊ．Ｗ．（２００２）「Ｕｓｅ  ｏｆ  ａ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ  ｔｏ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  Ｉｎｓｔａｎｔａｎｅｏｕｓ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｒｉｇｈｔ  Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  Ｔｈｉｃｋｅｎｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ」，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０５：１８４３−１８４９（これが、特に光コヒーレンス・トモグラフィーに関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる）を参照のこと）が、赤血球によって曖昧にされる。Ｈ−ＮＯＸ溶液での潅流により、循環および血管壁の鮮明な画像が可能となる。なぜなら、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は赤血球よりもはるかに小さいからである。
【０１５８】
本発明のＨ−ＮＯＸタンパク質および薬学的組成物は、任意の従来の手段（例えば、経口、局所、眼内、クモ膜下、肺内、気管内、またはエアゾール投与）によって；経皮または粘膜吸収によって；あるいは注射（例えば、皮下、静脈内、動脈内、膀胱内、または筋肉内注射）によって、個体に投与することができる。Ｈ−ＮＯＸタンパク質はまた、血液への投与のための多量の非経口用の溶液の中に含まれる場合もある。例示的な実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、個体の血液に投与される（例えば、血管（例えば、静脈、動脈、または毛細血管）への投与）。
【０１５９】
いくつかの実施形態においては、組成物の持続性の徐放性処方物が使用される。Ｈ−ＮＯＸタンパク質の投与は、例えば、投与の目的に応じて数秒間〜数時間の期間にわたって行われ得る。急性の症状については、例示的な投与期間は、可能な限り迅速である。他の例示的な期間としては、約１０、２０、３０、４０、６０、９０、または１２０分が挙げられる。Ｈ−ＮＯＸ溶液についての例示的な注入速度は、約３０ｍＬ／時間〜約１３，２６０ｍＬ／時間、例えば、約１００ｍＬ／時間〜約３，０００ｍＬ／時間である。例示的なＨ−ＮＯＸタンパク質の全用量は、１３，２６０ｍＬ／時間で２０分間かけて投与される約９００ｍｇ／ｋｇである。ブタについてのＨ−ＮＯＸタンパク質の例示的な全用量は、約１８．９グラムである。
【０１６０】
例示的な投与頻度としては、１週間に少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、６回、または７回（すなわち、毎日）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、１日に少なくとも２回、３回、４回、または６回投与される。Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、例えば、数日間〜数週間の期間にわたって投与することができる。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、さらに長い期間（例えば、数ヶ月間または数年間）にわたって投与される。組成物の投与頻度は、投与を行う医師の判断に基づいて、治療期間全体を通じて調整される場合がある。
【０１６１】
上記のように、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の投与量の選択は、利用される投与形態、投与頻度および回数、治療される症状、ならびに当業者の決定にしたがって達成される特定の目的に応じて様々である。いくつかの実施形態においては、ヒトに投与されるＨ−ＮＯＸタンパク質の有効量は、数グラム〜３５０グラムを超えるまでの間である。
【０１６２】
いくつかの実施形態においては、２つ以上の異なるＨ−ＮＯＸタンパク質が、同時に、連続して、または一斉に投与される。いくつかの実施形態においては、ＮＯの送達に有用な別の化合物または治療が、１つ以上のＨ−ＮＯＸタンパク質の投与と同時に、連続して、または一斉に投与される。
【０１６３】
Ｈ−ＮＯＸタンパク質の産業的応用
本明細書中に記載されるＨ−ＮＯＸタンパク質および組成物はまた、多くのインビトロでの応用または産業的応用にも使用することができる（例えば、米国特許第６，４５５，６７６号（これは、特に、インビトロでの応用または産業的応用に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる）を参照のこと）。特定のＨ−ＮＯＸタンパク質は、特定の応用についての所望されるＮＯ解離定数、Ｏ２解離定数、ＮＯ  ｋｏｆｆ、Ｏ２  ｋｏｆｆ、ＮＯ反応性、ＮＯ安定性、自動酸化速度、血漿保持時間、半減期、または上記の２つ以上の任意の組み合わせに基づいて、そのような応用のために選択することができる。産業的応用の様々な実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、ヘムに結合することができるアポタンパク質であっても、また、ヘムが結合したホロタンパク質であってもよい。
【０１６４】
Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、それについてＮＯが所望される溶液にＮＯを加えるために使用することができる。嫌気性醗酵が必要なバイオリアクターを使用する実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、細胞にＮＯを送達するために使用される。例えば、ミトコンドリアへのＮＯの送達は、酸化的リン酸化を制限する場合があり、乳酸経路を介する代謝を促進する場合がある。（バイオ燃料発生器としての嫌気性醗酵下で培養された）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍのＨ−ＮＯＸタンパク質は、自然な状態でその機能を果たし得る。さらに、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、ＮＯの除去が必要な溶液からＮＯを除去するために使用することができる。例えば、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、ＮＯが細胞増殖および／またはミトコンドリア機能の阻害因子である場合には、バイオリアクターの中のＮＯを吸着する、または除去するために使用することができる。ＮＯの除去によりミトコンドリア機能は改善され得るか、アポトーシスが制限され得るか、細胞あたりの生産性が向上し得るか、または、上記の２つ以上の任意の組み合わせが生じ得る。
【０１６５】
Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含むキット
本明細書中に記載される任意のＨ−ＮＯＸタンパク質と適切なパッケージングが含まれている製品およびキットもまた提供される。いくつかの実施形態においては、本発明は、（ｉ）Ｈ−ＮＯＸタンパク質（例えば、本明細書中に記載される野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質もしくは変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質、または本明細書中に記載されているようなその処方物）と、（ｉｉ）個体にＮＯを送達するためのキットの使用についての説明書が含まれているキットを含む。様々な実施形態においては、本発明は、（ｉ）Ｈ−ＮＯＸタンパク質（例えば、本明細書中に記載されている野生型Ｈ−ＮＯＸもしくは変異Ｈ−ＮＯＸ、または本明細書中に記載されているようなその処方物）と、（ｉｉ）本明細書中に記載される任意の産業的な用途（例えば、溶液へのＮＯの添加、または溶液からのＮＯの除去）についてのキットの使用のための説明書が含まれているキットを特徴とする。
【０１６６】
本明細書中に記載される組成物についての適切なパッケージングは当該分野で公知であり、これは例えば、ウイルス（例えば、密封されたウイルス）、容器、アンプル、瓶、広口瓶、柔軟性のあるパッケージング（例えば、密封されたマイラー、またはプラスチックバッグ）などを含む。これらの製品は、さらに滅菌および／または密封される場合もある。本明細書中に記載される組成物が含まれている単位投与量形態もまた提供される。これらの単位投与量形態は、１単位の投与量、もしくは複数の単位の投与量で適切なパッケージングの中で保存することができ、これもまた、さらに滅菌し、密封することができる。本発明のキットの中に供給される説明書は、通常は、ラベルまたはパッケージの挿入物に印刷された文書（例えば、キットの中に含められる紙シート）であるが、機械で読み取ることができる説明書（例えば、磁気ディスクまたは光学保存ディスク上にある説明書）もまた許容される。Ｈ−ＮＯＸタンパク質の使用に関する説明書は、一般的には、投与量、投与スケジュール、および意図される治療または産業的な用途のための投与経路に関する情報を含む。キットはさらに、個々の適切な治療の選択についての記載を含む場合がある。
【０１６７】
容器は、単位用量、大量包装（例えば、多用量パッケージ）、または副次的単位用量であり得る。例えば、長期間（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約３ヶ月間、約４ヶ月間、約５ヶ月間、約６ヶ月間、約７ヶ月間、約８ヶ月間、約９ヶ月間のいずれそれ以上）にわたり個体の効果的な治療を提供するために十分な投与量の本明細書中に開示されるＨ−ＮＯＸタンパク質が含まれているキットもまた提供され得る。キットにはまた、複数の単位用量のＨ−ＮＯＸタンパク質と使用のための説明書が含まれ得、薬局（例えば、病院薬剤部および調剤薬局）での保存および使用に十分な量でパッケージされ得る。いくつかの実施形態においては、キットは、再構成、再懸濁、または再水和して、一般的にＨ−ＮＯＸタンパク質の安定な水性懸濁液を形成させることができる乾燥（例えば、凍結乾燥された）組成物を含む。
【０１６８】
Ｈ−ＮＯＸタンパク質の生産のための例示的な方法
本発明によってはまた、本明細書中に記載される任意の変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質の生産のための方法も提供される。いくつかの実施形態においては、この方法は、変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質の生産に適している条件下で、変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードする核酸を有している細胞を培養する工程を含む。様々な実施形態においては、変異Ｈ−ＮＯＸはまた、精製（例えば、細胞または培養培地からのＨ−ＮＯＸタンパク質の精製）される。
【０１６９】
上記のように、いくつかの野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質および核酸の配列は公知であり、本発明の変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質および核酸を作成するために使用することができる。組み換え体Ｈ−ＮＯＸタンパク質の変異、発現、および精製のための技術は、例えば、Ｂｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．ら、（２００５）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  Ｆｏｒ  ＮＯ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １：５３−５９、およびＫａｒｏｗ，Ｄ．Ｓ．ら、（２００４年８月１０日）「Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ−Ｌｉｋｅ  Ｈｅｍｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ  Ｆｒｏｍ  Ｖｉｂｒｉｏ  Ｃｈｏｌｅｒａｅ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  Ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ」，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３（３１）：１０２０３−１０２１１（これは、特に、組み換え体Ｈ−ＮＯＸタンパク質の変異、発現、および精製に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる）に記載されている。これらの技術または他の標準的な技術を使用して、任意の変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質を作成することができる。
【０１７０】
具体的には、本明細書中に記載される変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、当該分野で公知の多くの方法によって作成することができる。変異は、アミノ酸の化学的修飾によってアミノ酸レベルで、または所定のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列の変更によってコドンレベルでのいずれかで、行うことができる。タンパク質中の任意の所定の位置でのアミノ酸の置換は、そのアミノ酸をコードするコドンを変化させることによって行うことができる。これは、例えば以下を使用する部位特異的突然変異誘発によって行うことができる：（ｉ）Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｗ．ら、（１９８５年１２月２０日）の方法に基づくＡｍｅｒｓｈａｍ技術（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット、Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｉｎｃ．，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）「Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ  ｉｎ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｅｐａｒｅ  Ｎｉｃｋｅｄ  ＤＮＡ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３（２４）：８７４９−８７６４；Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｗ．ら、（１９８５年１２月２０日）「Ｔｈｅ  Ｒａｐｉｄ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｔ  Ｈｉｇｈ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３（２４）：８７６５−８７８５；Ｎａｋａｍａｙｅ，Ｋ．Ｌ．ら、（１９８６年１２月２２日）「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｎｃｉ  Ｉ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｂｙ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４（２４）：９６７９−９６９８；およびＤｅｎｔｅら、（１９８５）ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｇｌｏｖｅｒ，編，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，７９１−８０２頁、（ｉｉ）Ｐｒｏｍｅｇａキット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、または（ｉｉｉ）Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．（１９８５年１月）の方法に基づくＢｉｏｒａｄキット（Ｂｉｏｒａｄ  Ｉｎｃ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ  Ｃａｌｉｆ．）「Ｒａｐｉｄ  Ａｎｄ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２（２）：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．（１９８７）「Ｒａｐｉｄ  Ａｎｄ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２；Ｋｕｎｋｅｌ，米国特許第４，８７３，１９２号（これらはそれぞれ、特に、タンパク質の突然変異誘発に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる）。突然変異誘発はまた、変異体オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的突然変異誘発を利用する手段のような、他の��販されている手段によって、または市販されていない手段によって行うこともできる。
【０１７１】
部位特異的突然変異誘発はまた、以下に記載されているようなＰＣＲに基づく突然変異誘発を使用して行うこともできる：Ｚｈｅｎｇｂｉｎら、（１９９２）、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋの２０５〜２０７頁、；Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．Ｈ．ら、（１９９０年２月）「Ａ  Ｒａｐｉｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ａｎｄ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  Ｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇ  ｂｙ  Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｇｅｎｅｒａｔｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｃｉｒｃｌｅｓ」，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ８（２）：１７８−１８３；Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．Ｈ．ら、（１９９１年１月）「Ａ  Ｒａｐｉｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｆｏｒ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  Ｐｌａｃｉｎｇ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  Ｅｎｄｓ  ｏｎ  ＤＮＡ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ」，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １０（１）：６２−６６（これらはそれぞれ、特に、タンパク質の突然変異誘発に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる）。部位特異的突然変異誘発はまた、当業者に公知の技術を用いるカセット突然変異誘発を使用して行うこともできる。
【０１７２】
変異Ｈ−ＮＯＸ核酸は、標準的な技術を使用して、発現ベクターのようなベクターに取り込ませることができる。例えば、制限酵素を使用して、変異Ｈ−ＮＯＸ核酸とベクターを切断することができる。その後、切断された変異Ｈ−ＮＯＸ核酸と切断されたベクターの適合する末端を連結させることができる。得られるベクターは、コードされるＨ−ＮＯＸの発現のために、標準的な技術（例えば、エレクトロポレーション）を使用して、細胞（例えば、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞、または細菌細胞）の中に挿入することができる。
【０１７３】
具体的には、異種タンパク質が、多くの生物学的発現システム（例えば、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞、および細菌細胞）の中で発現されている。したがって、任意の適切な生物学的タンパク質発現システムを利用して、多量の組み換え体Ｈ−ＮＯＸタンパク質を生産することができる。いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質（例えば、変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質または野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質）は単離されたタンパク質である。本明細書中で使用される場合は、「単離されたタンパク質」は、タンパク質が自然界においてそれと会合している１つ以上の成分（例えば、核酸、脂質、および他のタンパク質を含む）から分離されたタンパク質を意味する。単離されたタンパク質はまた、２、５、１０、２０、５０種類以上の様々なタンパク質ライブラリーのような、タンパク質のライブラリーの中には存在しない。単離されたタンパク質は、例えば、タンパク質をコードする組換え型核酸の発現によって、またはタンパク質の化学合成によって得ることができる。
【０１７４】
所望される場合には、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、標準的な技術を使用して精製することができる。本明細書中で使用される場合は、「精製されたタンパク質」は、タンパク質が生産される場合に存在する１つ以上の成分から分離されたタンパク質（例えば、変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質または野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質）を意味する。いくつかの実施形態においては、タンパク質は、そのうちの少なくとも約６０重量％には、タンパク質が生産される場合に存在する他の成分は含まれない。様々な実施形態においては、タンパク質は、少なくとも約７５重量％、９０重量％、または９９重量％純粋である。精製されたタンパク質は、例えば、自然界の供給源、組み換え発現システム、または化学合成のための反応混合物からの精製（例えば、抽出）によって得ることができる。例示的な精製方法としては、免疫沈降、カラムクロマトグラフィー（例えば、免疫アフィニティークロマトグラフィー）、磁気ビーズ免疫親和性精製、およびプレートに結合させた抗体を用いるｐａｎニング、ならびに当業者に公知の他の技術）が挙げられる。純度は、任意の適切な方法によって（例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析によって）アッセイすることができる。いくつかの実施形態においては、精製されたタンパク質は、本発明の薬学的組成物の中に取り込ませられるか、または、本発明の方法において使用される。本発明の薬学的組成物は、精製されたタンパク質に加えて、添加剤、担体、または他の成分を含む場合がある。
【実施例】
【０１７５】
純粋に本発明の例と意図され、したがって、いかなる方法においても本発明を限定するようには解釈されるべきではない実施例でもまた、上記で議論された本発明の詳細な態様と実施形態が記載される。実施例は、以下の実験が行われる全てのまたは限られた実験であることを示すようには意図されない。他の場所に明記されない限りは、温度はセ氏温度であり、圧力は大気圧であるかまたはほぼ大気圧である。
【０１７６】
（実施例１）
野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質および変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質の生産
野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質および変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質を、原則として、Ｂｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．ら、（２００５）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  Ｆｏｒ  ＮＯ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １：５３−５９、およびＫａｒｏｗ，Ｄ．Ｓ．ら、（２００４年８月１０日）「Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ−Ｌｉｋｅ  Ｈｅｍｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ  Ｆｒｏｍ  Ｖｉｂｒｉｏ  Ｃｈｏｌｅｒａｅ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  Ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ」，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３（３１）：１０２０３−１０２１１（これらはいずれも、特に、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の突然変異誘発、発現、および精製に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる）に記載されているとおりに、標準的な方法を使用して生産させ、発現させ、そして精製した。突然変異誘発は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）によるＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）プロトコルを使用して行った。細胞培養物中でのタンパク質の発現、およびその後のタンパク質の精製は、Ｋａｒｏｗ，Ｄ．Ｓ．ら、（２００４年８月１０日）「Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ−Ｌｉｋｅ  Ｈｅｍｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ  Ｆｒｏｍ  Ｖｉｂｒｉｏ  Ｃｈｏｌｅｒａｅ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  Ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ」，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３（３１）：１０２０３−１０２１１に記載されているとおりに行った。
【０１７７】
（実施例２）
変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質の特性決定
計算したＮＯに対するＫＤ：ｋｏｎに対するｋｏｆｆの比
計算したＮＯに対するＫＤを決定するために、Ｈ−ＮＯＸタンパク質についてのＮＯに対するｋｏｎの値を７１０μＭ−１ｓ−１と仮定し、ＮＯに対する解離速度（６−配位ＦｅＩＩ−ＮＯ複合体を有しているＨ−ＮＯＸタンパク質についてのｋｏｆｆ、または５−配位ＦｅＩＩ−ＮＯ複合体を有しているＨ−ＮＯＸタンパク質についてのｋ１もしくはｋ２）を、以下に記載するように決定した。
【０１７８】
ｋｏｆｆ、ｋ１、およびｋ２（ＮＯ解離速度）
６−配位ＦｅＩＩ−ＮＯ複合体を有しているＨ−ＮＯＸタンパク質についてのｋｏｆｆ値
６−配位ＦｅＩＩ−ＮＯ複合体を有しているＨ−ＮＯＸタンパク質について、ＮＯに対するｋｏｆｆを、Ｂｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．ら、（２００６年８月）「Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｈｏｍｏｌｏｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｌｕｂｅ  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ  β１  Ｈ０ＮＯＸ  Ｄｏｍａｉｎ」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（３１）：２１８９２−２１９０２、およびＢｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．ら、（２００５）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  Ｆｏｒ  ＮＯ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １：５３−５９（これらはそれぞれ、特に、Ｈ−ＮＯＸタンパク質についてのＮｏ  ｋｏｆｆの計算に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる）に記載されているとおりに計算した。簡単に説明すると、嫌気性の５０ｍＭのトリエタノールアミン、５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液の中に稀釈したＨ−ＮＯＸタンパク質のＦｅＩＩ−ＮＯ複合体（５μＭのヘム最終濃度）を、飽和させた一酸化炭素、および同じ緩衝液（嫌気性）の３０ｍＭ（最終濃度）の亜ジチオン酸塩トラップ（Ｎａ２Ｓ２Ｏ４）と迅速に混合した（Ｋｈａｒｉｔｏｎｏｖ，Ｖ．Ｇ．ら、（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：６８１４−６８１８、およびＭｏｏｒｅ，Ｅ．Ｇ．ら、（１９７６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１：２７８８−２７９４（これらはそれぞれ、特に、ＮＯ解離速度の計算に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる）。ＣＯ結合がこれらの実験の律速段階ではないことは、以前に明らかにされている（Ｋｈａｒｉｔｏｎｏｖ，Ｖ．Ｇ．ら、（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：６８１４−６８１８）。これを、トラップとしてのＣＯを用いないで、３０ｍＭのＮａ２Ｓ２Ｏ４だけを使用した実験において確認した。データを、１００μＬ〜１ｍＬの大きさで、１ｃｍの路長の石英キュベットを使用して、様々な温度（０〜７０℃）に設定したＮｅｓｌａｂ  ＲＴＥ−１００定温浴が備えられているＣａｒｙ  ３Ｅ分光光度計（Ｃａｒｙ  ３Ｅ，Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）上で、定期的にスキャンすることによって獲得した。ヘムからのＮＯの解離を、ＦｅＩＩ−ＣＯ複合体の形成として、４２３ｎｍでモニターした。スペクトルの差を、それぞれのその後のスキャンから最初のスキャンを減算することによって計算した。ＮＯ解離速度は、時間に対する４２３ｎｍでの吸光度の増大と、Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ  ３．×（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｒｅａｄｉｎｇ，ＰＡ）を使用したｆ（ｘ）＝Ａ×（１−ｅ−ｋｘ）の形の単一指数関数との適合によって決定した。具体的には、ヘム−ＣＯの濃度の単一指数関数的増大（ＮＯトラップによるＣＯの結合が原因である）は、以下の方程式１によって記載することができる：
ΔＡｔ＝ΔＡＴ（１−ｅ−ｋ１ｔ）      （方程式１）
式中、ΔＡｔは、時間ｔでの単一の振幅の変化であり；ΔＡＴは、単一振幅の変化の合計であり、そしてｋ１は、観察された反応速度定数である。それぞれの実験は、最大６回行い、得られた速度を平均した。測定した解離速度はＣＯおよび亜ジチオン酸塩濃度（３ｍＭ、３０ｍＭ、および３００ｍＭの亜ジチオン酸塩を試験した）とは無関係であった。
【０１７９】
５−配位ＦｅＩＩ−ＮＯ複合体を有しているＨ−ＮＯＸタンパク質についてのｋ１およびｋ２値
５−配位ＦｅＩＩ−ＮＯ複合体を有しているＨ−ＮＯＸタンパク質について、ＮＯに対するｋｏｆｆは、Ｗｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ａ．ら、（２００７年１月）「Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  ｆｒｏｍ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ  ａｎｄ  Ｈｅｍｅ−Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ／Ｏｘｙｇｅｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２（２）：８９７−９０７（これは、特に、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ  ｋｏｆｆ、ＮＯ  ｋ１、およびＮＯ  ｋ２の計算に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる）に記載されているように、ＮＯに対するｋ１およびＮＯに対するｋ２によって記載される。簡単に説明すると、５−配位ＦｅＩＩ−ＮＯ複合体を有しているＨ−ＮＯＸタンパク質のヘムからのＮＯの解離を、以前に記載されているＣＯ／亜ジチオン酸塩トラップ方法（Ｃｒａｙ，Ｓ．Ｐ．Ｌ．ら、（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０２：１３０６４−１３０６９、およびＫｈａｒｉｔｏｎｏｖ，Ｖ．Ｇ．ら、（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：６８１４−６８１８（これらはそれぞれ、特に、ＮＯ解離速度の計算に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる））を使用して、３７℃および１０℃で測定した。トラップ溶液は以下のように調製した：５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、５０ｍＭのＮａＣｌ中の亜ジチオン酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ４）の溶液を、嫌気性チャンバー（Ｃｏｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を使用して、Ｔｅｆｌｏｎ−ｓｅａｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉ−Ｖｉａｌ（Ｐｉｅｒｃｅ）の中で調製した。溶液を嫌気性バイオチャンバーから取り出し、溶液全体に１０分間気体を泡立たせることによって、ＣＯで飽和させた。Ｈ−ＮＯＸタンパク質−ＮＯ複合体を、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、５０ｍＭのＮａＣｌ中で２５℃で１０分間、過剰のＤＥＡ／ＮＯ（１０ｍＭのＮａＯＨ中）とともにインキュベーションすることによって形成させた。ニトロシル種への完全な変換を、Ｓｏｒｅｔ最大の４３１ｎｍ〜３９９ｎｍへのシフトを追うことによって確認した。Ｈ−ＮＯＸタンパク質を、隔壁で密閉された嫌気性キュベット（１００μＬ〜１ｍＬの大きさの、１ｃｍの路長を有している石英キュベット）に入れ、酸素を除去したガスプラント（ｏｘｙｇｅｎ−ｓｃａｖｅｎｇｅｄ  ｇａｓ  ｔｒａｉｎ）を使用して酸素除去した。少量のＤＥＡ／ＮＯ（３等量まで）を、ニトロシル種を維持するために酸素除去の直前に添加した（残りは全て、その後、トラップ溶液中の大過剰量のＮａ２Ｓ２Ｏ４によって崩壊された）。嫌気性キュベットの頭部の空間をＣＯで置き換え、キュベットとトラップ溶液をアッセイ温度で１分間平衡化させた。反応は、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｇａｓ−ｔｉｇｈｔ注射器での嫌気性キュベットへのＣＯ／亜ジチオン酸塩溶液の添加と、混合によって開始させた。反応混合物中のＮａ２-Ｓ２Ｏ４の最終濃度は３０ｍＭであった。最終的なタンパク質濃度は、β１（１−１９４）、β１（１−３８５）、およびβ２（１−２１７）については１．９〜２．５μＭ、ｓＧＣについては０．８８〜２．５μＭであった。データの収集は、トラップの添加の１０秒後に開始した。反応を、Ｎｅｓｌａｂ  ＲＴＥ−１００温度制御装置が取り付けられているＣａｒｙ  ３Ｅ分光光度計（Ｃａｒｙ  ３Ｅ，Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して、電気的吸収分光によってモニターした。データは、１．５ｎｍのデータ点の間隔を用いて、３８０〜４５０ｎｍの範囲全体について収集した。スペクトルは、全部で３時間の間あるいは反応が完了するまで、５分間は１８秒おきに、１０分間は１分おきに、そしてその後は２分おきに記録した。緩衝液のベースラインを、それぞれのスペクトルから減算し、スペクトルを、４１０ｎｍでの等吸収点に対する正規化によって、ベースラインのそれについて補正した。スペクトルの差は、全てのその後のスペクトルからの０時スペクトルの減算によって得た。４２３ｎｍ（ΔＡ４２３；β１（１−１９４）およびβ１（１−３８５））または４２４ｎｍ（ΔＡ４２４；ｓＧＣおよびβ２（１−２１７））での吸光度の変化についての値をスペクトルの差から抽出し、それぞれの実験についての解離の経時変化を得るために時間に対してプロットした。解離の経時変化は、２連または３連で得、それぞれの実験を、数日間かけて２〜５回繰り返した。一般的には、多量の精製したｓＧＣを得ることは比較的困難であるので、全長のｓＧＣについてのΔＡ４２４の値（これらは、実験のタンパク質濃度と比例する）は、ヘムドメイン構築物よりも小さかった。
【０１８０】
曲線のフィッティング、データ分析、および図面の作成は、Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ  ３．Ｘ（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｒｅａｄｉｎｇ，ＰＡ）を使用して行った。個々の解離実験によるデータを、観察した速度定数を得るために、以下の方程式２に示すような二重指数関数にフィットさせた。具体的には、方程式２は、ヘム−ＣＯの濃度の二重指数関数的増大（ＮＯトラップによるＣＯの結合が原因である）を記載する：
ΔＡｔ＝ΔＡ１（１−ｅ−ｋ１ｔ）＋ΔＡ２（１−ｅ−ｋ２ｔ）      （方程式２）
式中、ΔＡｔは、時間ｔでの単一の振幅の変化であり；ΔＡ１およびΔＡ２は、単一振幅の変化の合計に対するそれぞれの指数プロセスの寄与であり、そしてｋ１およびｋ２は、それぞれのプロセスについて観察された反応速度定数である。
【０１８１】
観察したデータは、反応図式１に概説するように、２つの５−配位ヘム−ＮＯ複合体の最初の平衡混合物から解離が進行するモデルと一致する。したがって、ｋ１は、ヘム−ＮＯ５Ｃ立体構造からのＮＯの解離に相当し、一方、ｋ２は、観察した反応の速度を示し、ヘム−ＮＯ  ＮＯ＊５Ｃからヘム−ＮＯ５Ｃへのより遅い変換によって制限されるｋＯ−ｋＣに相当する。
【０１８２】
【化１２】
2009538133.tif 000033
５−配位ＦｅＩＩ−ＮＯ複合体と６−配位ＦｅＩＩ−ＮＯ複合体の混合物を含むＨ−ＮＯＸタンパク質についてのｋ１およびｋ２の値
５−配位ＦｅＩＩ−ＮＯ複合体と６−配位ＦｅＩＩ−ＮＯ複合体の混合物が含まれているＨ−ＮＯＸタンパク質については、ＮＯに対するｋｏｆｆは、ＮＯに対するｋ１とＮＯに対するｋ２によって記載される。ＮＯに対するｋ１とｋ２は、Ｗｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ａ．ら、（２００７年１月）「Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  ｆｒｏｍ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ  ａｎｄ  Ｈｅｍｅ−Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ／Ｏｘｙｇｅｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２（２）：８９７−９０７（これは、特に、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ  ｋｏｆｆ、ＮＯ  ｋ１、およびＮＯ  ｋ２の計算に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる）に記載されているように、５−配位ＦｅＩＩ−ＮＯ複合体を有しているＨ−ＮＯＸタンパク質について上記に記載したように測定した。
【０１８３】
計算したＮＯに対するＫＤ
計算したＮＯに対するＫＤのために、Ｈ−ＮＯＸタンパク質についてのＮＯに対するｋｏｎの値を７１０μＭ−１ｓ−１と仮定した。これは、４℃で測定されたβ１（１−３８５）についての報告されたｋｏｎであり、３７℃でも有意には増大しない（Ｚｈａｏ，ら、（１９９９）「Ａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  Ｓｅｎｓｉｎｇ  ｂｙ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ」，ＰＮＡＳ．９６：１４７５３−１４７５８（これは、特に、Ｈ−ＮＯＸタンパク質についてのＮＯ  ｋｏｎの計算に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる）。したがって、計算されたＯ２に対するＫＤを、ｋｏｎ（７１０μＭ−１ｓ−１と仮定した）に対するｋｏｆｆ、ｋ１、またはｋ２のいずれかの比（上記のように測定した）を計算することによって決定した。
【０１８４】
Ｏ２に対する動力学的ＫＤ：ｋｏｎに対するｋｏｆｆの比
Ｏ２についての動力学的ＫＤ値を、原則として、Ｂｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．ら、（２００５）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  Ｆｏｒ  ＮＯ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １：５３−５９（これは、特に、Ｏ２会合速度、Ｏ２解離速度、Ｏ２結合についての解離定数、自動酸化速度、およびＮＯ解離速度の測定に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる）に記載されているとおりに、野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質および変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質について決定した。
【０１８５】
ｋｏｎ（Ｏ２会合速度）
ヘムに対するＯ２-の会合を、２０℃での閃光光分解を使用して測定した。非常に速い対再結合速度論の結果として、ＦｅＩＩ−Ｏ２複合体をフラッシュオフ（ｆｌａｓｈ  ｏｆｆ）させることは不可能であった；したがって、ＦｅＩＩ−ＣＯ複合体について、５６０ｎｍのレーザー光線での閃光光分解を行い（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）、５−配位ＦｅＩＩ中間体を生じさせ、続いて、それに対する分子Ｏ２の結合を様々な波長で行った。タンパク質試料を、１０ｍＭの亜ジチオン酸塩での嫌気性還元、その後のＰＤ−１０カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）上での脱塩によって作成した。その後、試料を、１００μＬ〜１ｍＬの大きさの、１ｃｍの路長を有している人工空気石英キュベットの中の５０ｍＭのＴＥＡ、５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液中に２０μＭのヘムとなるように希釈した。ＣＯガスをこのキュベットの頭部の空間全体に流して、ＦｅＩＩ−ＣＯ複合体を形成させ、この形成を、ＵＶ−可視スペクトル分析（Ｓｏｒｅｔ最大４２３ｎｍ）によって確認した。この試料を、その後、なお１気圧のＣＯガス下での閃光光分解後のＣＯ−再結合速度論を測定するために使用したか、またはこれを開き、Ｏ２−再結合事象を観察するために閃光光分解前に緩衝液を完全に酸化させるために３０分間、空気中で攪拌するかのいずれかを行った。ヘムに対するＯ２の会合を、時間に対して複数の波長でモニターした。これらの記録を、Ｉｇｏｒ  Ｐｒｏソフトウェア（Ｗａｖｅｍｅｔｒｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｏｓｗｅｇｏ，ＯＲ；最新の２００５年バージョン）を使用して単一指数とフィットさせた。この速度は、観察波長とは無関係であったが、Ｏ２濃度に依存していた。ＵＶ可視スペクトルを全体を通じて使用して、複合体と中間体の全てを確認した（Ｃａｒｙ  ３Ｋ，Ｖａｒｉａｎ，Ｉｎｃ．Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）。一時的な吸光度のデータは、Ｄｍｏｃｈｏｗｓｋｉ，Ｉ．Ｊ．ら、（２０００年８月３１日）「Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｔｒｉｃ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｕ−Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｂｙ  Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０ｃａｍ」，Ｊ  Ｉｎｏｒｇ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１（３）：２２１−２２８（これは、特に、機器に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる）に記載されている機器を使用して収集した。機器は、２０ｎｓの反応時間を有しており、データを２００メガ試料（ｍｅｇａｓａｍｐｌｅ）ｓ−１でデジタル化した。
【０１８６】
ｋｏｆｆ（Ｏ２解離速度）
ｋｏｆｆを測定するために、嫌気性５０ｍＭのＴＥＡ、５０ｍＭのＮＡＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液中に希釈したタンパク質（５μＭのヘム）のＦｅＩＩ−Ｏ２複合体を、様々な濃度の亜ジチオン酸塩を含む、および／またはＣＯガスで飽和されている等量の同じ緩衝液（嫌気性）と迅速に混合した。データを、２０℃に設定したＮｅｓｌａｂ  ＲＴＥ−１００定温浴が取り付けられているＨＩ−ＴＥＣＨ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＳＦ−６１  ストップトフロー分光光度計（ＴＧＫ  Ｓｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＬＴＤ．，Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｏｎ  Ａｖｏｎ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）上で獲得した。ヘムからのＯ２の解離は、４３７ｎｍ（ＦｅＩＩ−ＦｅＩＩ−Ｏ２差スペクトルの最大）での吸光度、または４２５ｎｍ（ＦｅＩＩ−ＦｅＩＩ−ＣＯ差スペクトルの最大）の増大としてモニターした。最終的な記録を、機器の一部であるソフトウェアを使用して、単一指数関数にフィットさせた。それぞれの実験は、少なくとも６回行い、得られた速度を平均した。測定した解離定数は亜ジチオン酸塩濃度（１００、５０、２５、１０、５、および２．５ｍＭの亜ジチオン酸塩を試験した）とは無関係であり、還元された種についてのトラップとしての飽和ＣＯ（１０ｍＭの亜ジチオン酸塩が存在する場合、およびそれが存在しない場合の両方）とも無関係であった。
【０１８７】
Ｏ２についての動力学的ＫＤ
Ｏ２についての動力学的ＫＤを、上記のｋｏｆｆおよびｋｏｎの測定を使用して、ｋｏｎに対するｋｏｆｆの比を計算することによって決定した。
【０１８８】
計算したＫＤ
計算したＫＤを測定するために、上記のようにして得たｋｏｆｆと動力学的ＫＤの値をグラフにした。ｋｏｆｆと動力学的ＫＤの間での直線的関係は、方程式（ｙ＝ｍｘ＋ｂ）によって定義した。その後、ｋｏｆｆ値を線に沿って外挿し、Ｅｘｃｅｌ：ＭＡＣ  ２００４（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）を使用して計算したＫＤを導いた。測定したｋｏｎがない場合には、この外挿により、ＫＤに対してｋｏｆｆを関係付ける方法が提供される。
【０１８９】
自動酸化速度
自動酸化速度を測定するために、タンパク質試料を嫌気的に還元させ、その後、嫌気性の５０ｍＭのＴＥＡ、５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液中に５μＭのヘムとなるように希釈した。これらの試料を、その後、３７℃に設定したＮｅｓｌａｂ  ＲＴＥ−１００定温浴が取り付けられているＣａｒｙ  ３Ｅ分光光度計の中でインキュベートし、これを定期的にスキャンした（Ｃａｒｙ  ３Ｅ，Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）。自動酸化速度は、時間に対してプロットしたＦｅＩＩＩ−ＦｅＩＩ差スペクトルの最大と最小の間の差と、Ｅｘｃｅｌ：ＭＡＣ  ２００４（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）を使用した単一指数関数とのフィットから決定した。
【０１９０】
ＮＯとの反応の速度
ＮＯ反応性を、緩衝液Ａの中に２μＭで調製した精製したタンパク質（Ｔｔ  ＷＴ  ＨＮＯＸ、Ｔｔ  Ｙ１４０Ｈ  ＨＮＯＸ、およびＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓヘモグロビン（Ｈｓ  Ｈｂ））、ならびに緩衝液Ａ中に２００μＭで調製したＮＯを使用して測定した（緩衝液Ａ：５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭのＮａＣｌ）。データは、２０℃に設定したＮｅｓｌａｂ  ＲＴＥ−１００定温浴が取り付けられているＨＩ−ＴＥＣＨ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＳＦ−６１  ストップトフロー分光光度計（ＴＧＫ  Ｓｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＬＴＤ．，Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｏｎ  Ａｖｏｎ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）上で獲得した。タンパク質を、０．００１２５秒の積分時間で、１：１の割合でＮＯと迅速に混合した。最大変化の波長を、原則として、ＮＯによる酸化の律速工程を測定することにより、分光光度計の一部であるソフトウェアを使用して単一指数関数にフィットさせた。反応の最終産物は、ＨＮＯＸタンパク質についてはｆｅｒｒｉｃ−ＮＯであり、Ｈｓ  Ｈｂについてはｆｅｒｒｉｃ−ａｑｕｏであった。
【０１９１】
ｐ５０の測定
所望される場合には、変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質または野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質についてのｐ５０値を、Ｇｕａｒｎｏｎｅ，Ｒ．ら、（１９９５年９月／１０月）「Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｈｅｍｏｘ−Ａｎａｌｙｚｅｒ  Ｆｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｃｕｒｖｅ」，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ８０（５）：４２６−４３０（これは、特に、ｐ５０値の測定に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる）に記載されているように測定することができる。ｐ５０値は、ＨｅｍＯｘ分析計を私用して決定した。測定チャンバーは０％の酸素で開始し、１００％の酸素に向かって緩やかに徐々に上昇させた。チャンバーの中の酸素プローブにより、酸素飽和％を測定した。第２のプローブ（ＵＶ−Ｖｉｓスペクトル）により、２つの波長での吸光度を測定し、ヘムタンパク質（例えば、ヘムと錯体形成したＨ−ＮＯＸのようなタンパク質）のＵＶ−Ｖｉｓスペクトルのαピークとβピークに波長を合わせた。これらの吸光度のピークは、ヘムタンパク質が酸素に結合するのに伴い、直線的に増大した。その後、非結合から１００％の結合までの変化の割合を酸素率の値（％）に対してプロットした、曲線を作成した。ｐ５０は、ヘムタンパク質の５０％が酸素に結合した、曲線上の点である。
【０１９２】
詳細には、Ｈｅｍｏｘ−Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＴＣＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｅｗ  Ｈｏｐｅ，ＰＡ）によって、５０μＬの血液またはヘムタンパク質を漸増酸素分圧の上昇に曝すこと、そしてそれを窒素ガスで酸素除去することにより、オキシヘムタンパク質解離曲線（ＯＤＣ）を決定した。クラーク酸素電極によって酸素圧の変化を検出し、これを、ｘ−ｙレコーダーのｘ軸上に記録した。得られたオキシヘムタンパク質画分の増大を、５６０ｎｍと５７６ｎｍの二重波長分光光度計によって同時にモニターし、ｙ軸上に表示した。血液試料を前中央部の（ａｎｔｅｒｏｍｅｄｉａｌ）静脈から採取し、ヘパリンで抗凝固処理し、そしてアッセイまで氷水（ｗｅｔ  ｉｃｅ）の上で４℃に保った。５０μＬの全血を５μＬのＨｅｍｏｘ溶液（７．４±０．０１の値に溶液のｐＨを保つ製造業者によって提供された緩衝液）の中に希釈した。試料−緩衝液を、Ｈｅｍｏｘ−Ａｎａｌｙｚｅｒの一部であるキュベットの中に入れ、混合物の温度を平衡化させて、３７℃にした。その後、試料を空気で１００％に酸素処理した。ｐＯ２値の調整の後、試料を窒素で酸素除去し、酸素除去プロセスの間に、曲線をグラフ用紙上に記録した。Ｐ５０値を、Ｈｅｍｏｘ−Ａｎａｌｙｚｅｒの一部であるソフトウェアを使用して、Ｏ２飽和度が５０％である点として、ｘ軸上に外挿した。完全な記録に必要な時間はおよそ３０分であった。
【０１９３】
任意のＨ−ＮＯＸタンパク質についてのｐ５０値は、ヘモグロビンの親和性と比較したＯ２に対するＨ−ＮＯＸタンパク質の相対的な親和性の指標として、ヘモグロビンのｐ５０値と比較することができる。表１５には、ヘモグロビンについての以前に報告されたｐ５０値を列挙する。
【０１９４】
表１５．ヘモグロビン変異体とそれらの報告されている酸素親和性
【０１９５】
【表１５】
2009538133.tif 000034
粘性の測定
所望される場合には、Ｈ−ＮＯＸ溶液の粘性を、２００／ｓの剪断速度で、ＣＰＥ−４０垂形支軸を有しているコーン／プレート血流計（モデルＤＶ−ＩＩＩ、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｋｄ；Ｍｉｄｄｌｅｂｏｒｏ，ＭＡ）を使用して測定することができる。血液稀釈酸素送達実験において投与した１〜４センチポアズ（ｃＰ）の間の粘性を有している溶液が、安全であると報告されている（Ｗｉｎｓｌｏｗ，Ｒ．Ｍ．ら、（２００４年１０月）「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ＰＥＧ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ａｌｂｕｍｉｎ  Ａｎｄ  Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ｉｎ  Ｅｘｔｒｅｍｅ  Ｈｅｍｏｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｒａｔ」，Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９７（４）：１５２７−１５３４、米国特許第６，９７４，７９５号および同第６，４３２，９１８号（これらはそれぞれ、特に、粘性の測定に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる））。したがって、いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質溶液の粘性は、１〜４ｃＰの間である。
【０１９６】
コロイド浸透圧の測定
所望される場合には、コロイド浸透圧を、製造業者の説明書（モデル４４２０、Ｗｅｓｃｏｒ；Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）にしたがってコロイド浸透圧計を使用して測定することができる。コロイド浸透圧を測定するための例示的な方法は、Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ，Ｆ．Ｄ．ら、（１９９７年１１月）「Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｏｓｍｏｔｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｓ：Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｖｅｒｓｕｓ  Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ−Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ」，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．６９（１）：２３−３０、「ａｎａｅｓｔｈｅｓｉａｍｃｑ．ｃｏｍ／ＦｌｕｉｄＢｏｏｋ／ｆｌ２＿４．ｐｈｐ；」にてｗｏｒｌｄ−ｗｉｄｅ  ｗｅｂの中、米国特許第６，９７４，７９５号および同第６，４３２，９１８号（これらはそれぞれ、特に、コロイド浸透圧の測定に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる）に記載されている。血液稀釈酸素送達実験において投与した２０〜５０ｍｍＨｇの間のコロイド浸透圧を有している溶液が、安全であると報告されている（Ｗｉｎｓｌｏｗ，Ｒ．Ｍ．ら、（２００４年１０月）「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ＰＥＧ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ａｌｂｕｍｉｎ  Ａｎｄ  Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ｉｎ  Ｅｘｔｒｅｍｅ  Ｈｅｍｏｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｒａｔ」，Ｊ  Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．９７（４）：１５２７−１５３４）。したがって、いくつかの実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸタンパク質溶液のコロイド浸透圧は、２０〜５０ｍｍＨｇの間である。
【０１９７】
（実施例３）
ＮＯ担体Ｈ−ＮＯＸ変異体についての心疾患モデル
２つの動物モデルを使用して、標準的な硝酸塩での治療に対して、ＮＯ担体としてのＨ−ＮＯＸタンパク質の効力を比較することができる。慢性心臓血管疾患のラットモデルにおいて、硝酸イソソルビド（ＩＳＤＮ）を用いた信頼できるＮＯの送達とＨ−ＮＯＸタンパク質の効果と比較するために、確立されているプロトコル（Ｓｈｉｍａｍｕｒａ，Ｓ．ら、（２００６）、Ｊ  Ｖｅｔ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ｖｏｌ．６８（３）：２１３−７（これは、特に、心臓血管疾患のモデルに関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる）の適応は、雄のＷｉｓｔａｒラットを使用して行うことができる。心臓血管の肥大を刺激するために、腹部大動脈開腹術と、挿入した２１ゲージ針の上での収縮点の適用（これはその後、均一な血管の収縮を可能にするために除去した）によって、腹部大動脈を収縮させた（腹部大動脈の収縮または「ＡＣ」モデル）。擬似手術を行ったラットには同様の外科手術を受けさせたが、ＡＣは作成しなかった。外科手術後、ラットを１つのグループあたり１４匹の動物（薬物について７匹、プラセボについて７匹）の処置グループに無作為に分け、７日間回復させた。グループについての処置（対照のグループを、プラセボとしてそれぞれの試験例において対にした）は以下である：（１）経口でｓｒ−ＩＳＤＮまたはプラセボを投与したＡＣラット；（２）本明細書中に記載した１つ以上の野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質もしくは変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質、またはプラセボ（例えば、不活化したＨ−ＮＯＸタンパク質）をＩＶ投与したＡＣラット；（３）および（４）それぞれ、（１）または（２）と同様に処置した擬似処置を行ったラット。処置は、１２週間、１日に１回行い、その後、動物を屠殺し、心臓を、心筋細胞の形態、線維症、コラーゲンの沈着、心室径、大動脈の形態の決定のための標準的な組織病理学的分析のために、および疾患の進行もしくは予防を評価するための他の標準的な分析のために、取り出した。
【０１９８】
急性心筋梗塞後の長期間の左心室リモデリングの媒介におけるＩＳＤＮの効力に対してＨ−ＮＯＸの効力を比較するために、イヌモデル（ここでは、ＩＳＤＮは長期にわたる投与によるいくらかの効力が示されている）を、標準的なプロトコル（Ｂｏｄｈ  Ｉ．Ｊｕｇｄｕｔｔ，ＭＢＣｈＢ，ＭＳｃ：Ｍｏｈａｍｍａｄ  Ｉ．Ｋｈａｎ，ＭＢＢＳ（１９９４）．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８９（Ｓ））を使用して行った。それぞれの実験について、いずれかの性別の４０匹の健康な雑種犬（体重１６〜２９ｋｇ）に、一般的な麻酔（ペントバルビタールナトリウム、３０ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）下で左側開胸術を行った。ポリエチレンカテーテルを、外頸静脈、内頸動脈、および左心房に挿入し、ヘパリン化生理食塩水を満たし、それらの末端を頸の後ろから外に出した。絹の結紮糸を、最初の斜め方向の分岐と２番目の斜め方向の分岐の間に、左中前方の下降冠状動脈を取り囲むように配置し、結んだ。金属ビーズを、連続的なトポグラフィーのために一貫する心エコー図の方向になるように、左中心室レベルで、短軸平面の中の前方、側方、および後方の心外膜面上に縫いつけた。その後、心膜と胸郭を閉じた。ペニシリン（１００万単位）およびストレプトマイシン（１ｇ）を筋肉内に投与し、犬をそれらのケージに戻した。
【０１９９】
冠動脈の結紮の２日後、７０匹の健康な生存している犬を硝酸塩での治療（ｎ＝１０）、Ｈ−ＮＯＸタンパク質での治療（例えば、状況に応じて本明細書中に記載される任意のアッセイを使用してインビトロで特性決定し、状況に応じて毒性および／または薬物動態についての最適化を行った１つ以上の野生型または変異Ｈ−ＮＯＸタンパク質）（１０）、およびマッチング対照のサブグループ（処置しない、ｎ＝２０）；サブグループ１（１０匹の対照、１０匹の硝酸塩）、およびサブグループ２（１０匹の対照、１０匹のＨ−ＮＯＸタンパク質）に無作為に分けた。犬は、水分には自由に近づけるようにし、水分の制限または薬物療法による心不全を治療する試みは行わなかった。６週間で、生存している犬を麻酔し、心臓を、静脈内への塩化カリウムの過量投与を用いて心臓拡張期で停止させ、取り出し、通常の生理食塩溶液で洗浄し、重さを測定した。血液試料を血液ガス、ヘモグラム、および電解質をモニターするために採取した。標準的な手順を使用して、回復の間に測定（例えば、ＥＣＧ、血行動態など）を行い、死後分析には、慢性的な心不全（例えば、コラーゲンの蓄積、心筋細胞の形態など）について上記に記載した測定値を含めた。心筋梗塞および／または慢性的なＡＣモデル実験において有効であるか、またはＩＳＤＮ（急性および慢性の心不全についての硝酸塩をベースとする治療法について重要な標準）よりも有効であるＨ−ＮＯＸタンパク質が、心筋梗塞および／または慢性のＡＣの治療に特に有用である。そのようなＨ−ＮＯＸタンパク質は、ＮＯの送達が有効である他の適応症を治療するためにもまた有用であると予想した。
【０２００】
上記の実施例と詳細な記載は、説明のために与えられ、限定のために与えられるものではない。本明細書中で引用された全ての刊行物、特許出願、および特許はそれぞれの個々の刊行物、特許出願、または特許が、具体的に、かつ個別に参照として組み込まれることが示されているかのように、参照として本明細書中に組み込まれる。上記発明は、理解の明確化の目的のための説明および例によって、いくらか詳細に記載されているが、本発明の教示を参照して、特定の変更および修飾を、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなくそれに対して行うことができることは、当業者には容易に明らかであろう。
【０２０１】
他の場所に明記されない限りは、本明細書中で使用される全ての技術的および科学用語の意味は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されている意味である。本明細書中に記載された方法および材料と同様あるいは同等の任意の方法および材料もまた、本発明を実施または試験するために使用できることもまた、当業者に明らかであろう。
【０２０２】
本明細書中での使用については、他の場所に明記されない限りは、用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの使用は１つ以上を意味する。
【０２０３】
本明細書中の「約」の値またはパラメータの言及には、その値またはパラメータ自体に関する実施形態を含む（そして、それらが記載される）。例えば、「約Ｘ」との記載には「Ｘ」の記載を含む。
【０２０４】
本明細書中に記載される本発明の態様と実施形態には、複数の態様と複数の実施形態「が含まれている」、それら「からなる」、および「原則としてからなる」を含むことが理解される。
【図１Ａ】
2009538133.tif 000047
【図１Ｂ】
2009538133.tif 000048
【図１Ｃ−１Ｈ】
2009538133.tif 000049
【図２】
2009538133.tif 000050
【図３Ａ】
2009538133.tif 000051
【図３Ｂ】
2009538133.tif 000052
【図３Ｃ】
2009538133.tif 000053
【図３Ｄ】
2009538133.tif 000054
【図４Ａ】
2009538133.tif 000055
【図４Ｂ】
2009538133.tif 000056
【図４Ｃ】
2009538133.tif 000057
【図４Ｄ】
2009538133.tif 000058
【図５Ａ】
2009538133.tif 000059
【図５Ｂ】
2009538133.tif 000060
【図６】
2009538133.tif 000061
【図７】
2009538133.tif 000062
【図８Ａ】
2009538133.tif 000063
【図８Ｂ】
2009538133.tif 000064
【図８Ｃ】
2009538133.tif 000065
【図８Ｄ】
2009538133.tif 000066
【図８Ｅ】
2009538133.tif 000067
【図８Ｆ】
2009538133.tif 000068
【図８Ｇ】
2009538133.tif 000069
【図８Ｈ】
2009538133.tif 000070
【図８Ｉ】
2009538133.tif 000071
【図８Ｊ】
2009538133.tif 000072
【図８Ｋ】
2009538133.tif 000073
【図８Ｌ】
2009538133.tif 000074
【図８Ｍ】
2009538133.tif 000075
【図８Ｎ】
2009538133.tif 000076
【図８Ｏ】
2009538133.tif 000077
【図８Ｐ】
2009538133.tif 000078
【図８Ｑ】
2009538133.tif 000079
【図８Ｒ】
2009538133.tif 000080
【図８Ｓ】
2009538133.tif 000081
【図８Ｔ】
2009538133.tif 000082
【図８Ｕ】
2009538133.tif 000083
【図８Ｖ】
2009538133.tif 000084
【図８Ｗ】
2009538133.tif 000085
【図８Ｘ】
2009538133.tif 000086
【図８Ｙ】
2009538133.tif 000087
【図８Ｚ】
2009538133.tif 000088
【図８ＡＡ】
2009538133.tif 000089
【図８ＢＢ】
2009538133.tif 000090
【図８ＣＣ】
2009538133.tif 000091
【図８ＤＤ】
2009538133.tif 000092
【手続補正書】
【提出日】平成21年3月3日(2009.3.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009538133000001.app
【国際調査報告】
2009538133.tif 000093
2009538133.tif 000094