(57)【要約】本発明はコロナウイルスの生産に関する。特に、本発明は、機能的なSARS-CoVの受容体を発現する細胞の用いることによるSARS-CoVを生産するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一次ヒト胚性網膜芽細胞から導かれるヒトの細胞であり、そのゲノムにおいてアデノウイルスのE1A及びE1Bを暗号化する配列を備えているものであって、細胞がヒトACE2タンパク質を発現するように設計されることを特徴とする、細胞。
【請求項２】
細胞がECACC第96022940号下に受託されるようなPER.C6又はその派生物であることを特徴とする、請求項1に従うヒト細胞。
【請求項３】
ヒトのACE2タンパク質を安定して発現することを特徴とする、請求項1又は2に従うヒト細胞。
【請求項４】
コロナウイルスを生産する方法であって、次の工程、
a) 一次ヒト胚性網膜芽細胞から導くヒトの細胞を提供する工程で、前記細胞がそのゲノムにおいてアデノウイルスのE1A及びE1Bを暗号化する配列を、ヒトのACE2タンパク質を暗号化する核酸分子と共に備える工程、
b) 細胞をヒトACE2タンパク質の発現のために適する条件下に培養する工程、
c) 細胞にコロナウイルスを感染させる工程、及び
d) 媒体又は細胞からコロナウイルスを収集する工程
を備える、方法。
【請求項５】
コロナウイルスが、SARS-CoV及びHcoV-NL63からなる群より選ばれることを特徴とする、請求項4に従う方法。
【請求項６】
ヒトの細胞が、ECACC第96022940号下に受託されるような PER.C6又はその派生物であることを特徴とする、請求項4又は5に従う方法。
【請求項７】
ヒトのACE2タンパク質を安定して発現することを特徴とする、請求項4-6の何れかに従う方法。
【請求項８】
ヒトのACE2タンパク質を暗号化する核酸分子をベクタによって提供することを特徴とする、請求項4-7の何れかに従う方法。
【請求項９】
ヒトの細胞が懸濁物において増殖するのを可能とすることを特徴とする、請求項4-8の何れかに従う方法。
【請求項１０】
ヒトの細胞を血清の不存在下において培養することができることを特徴とする、請求項4-9の何れかに従う方法。
【請求項１１】
さらに、収集されるコロナウイルスを不活性化又は弱毒化する工程を備える、請求項4-10の何れかに従う方法。
【請求項１２】
コロナウイルスの生産のための細胞の使用であって、請求項1から3までの何れかに従うヒトの細胞の使用。
【請求項１３】
コロナウイルスに対する抗ウイルス性薬剤の選別のための細胞の使用であって、請求項1から3までの何れかに従うヒトの細胞の使用。
【請求項１４】
コロナウイルスの感染及び/又は複製が抑制されるのを可能にする分子を識別するための方法であって、次の工程、
a) 請求項1から3までの何れかに従う細胞をコロナウイルスと共に候補分子の存在及び不存在において温置する工程、及び
b) 候補分子の存在がコロナウイルスの感染及び/又は複製を抑制するか定める工程
を備える、方法。
【請求項１５】
細胞のコロナウイルスによる感染が減らされるのを可能とする抗ウイルス性分子を選定するための方法であって、次の工程、
a) 請求項1から3までの何れかに従う細胞を、コロナウイルスの表面タンパク質と、候補抗ウイルス性分子の存在又は不存在の下において接触させる工程で、前記表面タンパク質が細胞によって発現されるヒトACE2タンパク質へのコロナウイルスの結合に関与している工程、
b) 細胞及び表面タンパク質間の結合性相互作用を測る工程、及び
c) 候補抗ウイルス性分子の不存在下においての結合性相互作用と比較されるときに結合性相互作用が減る候補抗ウイルス性分子を選ぶ工程
を備える、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(発明の分野)本発明は薬に関する。特に本発明はヒトのSARS-CoVのようなコロナウイルスの生産に関する。
【背景技術】
【０００２】
(発明の背景)重症急性呼吸窮迫症候群(Severe acute respiratory distress syndrome、SARS)はヒトにおける新しい呼吸器障害であり、それはSARSのコロナウイルス(SARS-CoV)によって引き起こされる。疾病は2003年の初めに中国及び東南アジアの様々な他の部分で現れ、及び次いで世界中に急速に広がった。疾病は2003年6月までに沈静したがその再出現は排除することができない。したがって、大いなる努力が現在もSARS-CoVについて治療上及び予防上の処置の開発に投入されている。
【０００３】
SARS-CoVが系統発生学的に、すべての以前に知られる人間(ヒト)及び動物のコロナウイルスと相違するが、著しい進展がSARS-CoVの分子及び細胞の生物学の理解においてなされた。SARS-CoVゲノムの完全な配列決定(Marra(マルラ)等(2003年); Rota(ロタ)等(2003年)を参照)の次に、Li(リ)等(2003年)は最近、亜鉛金属ペプチダーゼ、アンジオテンシン-変換酵素2(ACE2タンパク質)を、SARS-CoVについての機能的な受容体として識別している。SARS-CoVの分子及び細胞の生物学に関するこの、及び他の知識は、抗-ウイルス性並びにワクチン接種の戦略を開発するための手段(avenues)を与えた。
【０００４】
SARS-CoVに対してのワクチン防御の開発は、2種の戦略に集中しており、即ち、不活化した全体のSARS-CoVの使用(Tang(タン)等(2004年); Takasuka(タカスカ)等(2004年))及びSARS-CoVタンパク質の使用(Zhang(ツャン)等(2004年); Yang(ヤン)等(2004年); Kim(キム)等(2004年))である。不活化される全体のウイルスは通常、大量のウイルスを細胞組織培養において生産(生成)させること、及び次いでウイルスを、その免疫学的な特性を破壊しないで無害にすることによって調製される。細胞培養における最適なウイルス生産のために、それぞれのウイルスが細胞を感染させ、及び細胞において複製し得ることが極めて重要(pivotal)である。今までに限られた数の細胞しか、SARS-CoV感染の影響を受け易くなく、及びSARS-CoVの複製を培養において支持しないことが報告されている(Mossel(モーセル)等(2005年)参照)。その点に関して最も頻繁に用いられる細胞はベロ(Vero)又はVero E6の細胞のようなアフリカミドリザル(African Green Monkeys)から導かれる腎臓細胞である。これらの細胞に関連付けられる不利益はとりわけ、それらが増殖のために血清の存在及び/又は固形支持体への付着を必要とし、精製及び安全の問題、並びに大規模な生産にとって困難な系(システム)を招くことである。なお、細胞は人間のものではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
最近、SARS-CoV感染に抵抗性の細胞が機能的な受容体、即ちヒトACE2受容体を発現することによって、SARS-CoV複製を可能にさせ得ることが示された。WO(国際公開第)2005/032487(号パンフレット)には、ACE2タンパク質を形質移入するヒト293T細胞がSARS-CoV複製を支持し、及びSARS-CoVの生産のために適することが示された。
しかし、これらの細胞で得られる収率は低く、それらを用いる生産方法を経済的に魅力がないものにした。これらを元に、まだ、この技術においてSARS-CoVを現存する細胞培養系上、具体的に得られる収率の上で改良する宿主細胞系において生産する方法についての必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明はこの必要性に取り組むもので、ACE2タンパク質を発現する一次ヒト網膜細胞(HER細胞)を提供することによるものである。これらの細胞は予想外に高いSARS-CoV収率を与える。それらは更なる利益として、それらが広範囲に裏付けられ、及びこの技術での細胞と比較して、規模上昇化、懸濁物増殖及び成長因子非依存性の処理においてより一層良好に振舞うというものを持つ。ことさら、細胞が懸濁物において高度に再生可能なやり方でもたらされるという事実は、それらを大規模な生産のために非常に適切なようにするものである。さらに、本発明に従う細胞はヒト(人間)のSARS-CoVの種々の分離体(分離株)の複製のために有利に用いることができ、及び更にSARS-CoVの生産のためだけでなく、また機能的な受容体としてACE2タンパク質を利用する他の人間のコロナウイルス類の生産のために適切である。
【０００７】
(図の説明)図1はACE2タンパク質を発現するPER.C6(R)(商標)の細胞へのSARS-CoV Sタンパク質断片(フラグメント)(アミノ酸318から510まで)の結合を示す。変異体Fは変異(突然変異)N479Sを含み、及び変異体Hは変異K344R、F360S、L472P、D480G、T487Sを野生型(タイプ)S318-510断片と比較されて含む。
【０００８】
(発明の概要)本発明はコロナウイルスを生産するのに適切な細胞を提供する。好適例では、細胞はヒトACE2タンパク質を発現するHER細胞類である。本発明は更に、コロナウイルス、特にSARS-CoVを、その細胞を利用し、生産する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
(発明の詳細な記載)第1の局面では、本発明はヒトACE2タンパク質を発現する細胞を包含する。ACE2遺伝子の多形が重症急性呼吸器症候群の結末に影響を及ぼさないことが最近見出されたので(Chiu(チウ)等(2004年)参照)、ACE2タンパク質の変異体を発現する細胞はまた、本発明の部分である。前記変異体はもちろんまだ、SARS-CoVのための受容体として機能するのが可能なべきである。本発明に従う細胞はE1-不死化網膜細胞である。それらは、網膜細胞から、アデノウイルスE1配列、例はE1A及びE1Bの配列と共に不死化されることによって導かれた。E1A配列は、それらの内因性アデノウイルスのE1Aプロモータの影響下であり得るが、また例としてPGKプロモータのような異種プロモータによって調節され得る。E1Aタンパク質は形質転換活性を持つ一方、E1Bタンパク質は抗-アポトーシス活性を持つ。さらに、E1Aは細胞からの増加する発現レベルに役立ち得る。なるべくなら、本発明に従う細胞は一次細胞から導かれる。それらは任意の起源の細胞であり得、及びなるべくなら人間起源である。1種の好適な局面では、細胞は一次ヒト胚性網膜細胞から導かれ、言い換えれば、本発明の細胞は一次ヒト胚性網膜芽細胞(primary human embryonic retinoblast)(HER細胞)から導かれ、及びそれらのゲノムにおいてアデノウイルスのE1A及びE1Bを暗号(コード)化する配列を備える。一次HER細胞は胎児から分離することができる(Byrd(バード)等(1982年)、Byrd等(1988年)参照)。細胞のアデノウイルスE1配列での不死化は、例として米国特許第5,994,128号明細書に記述されている。したがって、アデノウイルスからのE1配列で不死化される胚性網膜細胞は、その方法によって得ることができる。アデノウイルスのE1A及びE1Bを発現する他の細胞をそれに応じて調製することができる。
【００１０】
本発明の方法及び使用のための最も好適なHER細胞は、1996年2月29日付けでECACC(ヨーロピアン・コレクション・オブ・セル・カルチャ)に第96022940号の下で受託(寄託)されるような細胞又はそれらの派生物である。本発明のための1種の有用なE1-不死化細胞系(細胞株)で、ECACCで第96022940号の下で受託された細胞の特徴を持つものは、商品名PER.C6(R)の下でCrucell Holland B. V. (クルセル・ホランド・ベー・ヴェー)によって市販される。本願の目的のためのPER.C6(R)細胞は、ECACC第96022940号の下で受託されるような細胞の上流又は下流の継代、又は上流又は下流の継代の子孫からの細胞を意味する。PER.C6(R)は、例として、またアデノウイルスからのE1領域によって不死化される形質転換されたヒト293細胞よりも取り扱いでより一層良好に振舞う。さらに、PER.C6(R)細胞は、十分に特徴付けられ、及び非常に広範囲に裏付けられる一方、それらは、規模上昇化、懸濁物増殖及び成長因子非依存性の処理において著しく良好に振舞う。ことさらPER.C6(R)細胞が懸濁物において高度の再生可能なやり方でもたらされ得るという事実は、それらを大規模な生産のために非常に適切にするものである。さらに、それらが、規定される無血清媒体において増殖し、任意の人間又は動物の血清タンパク質を欠くことができる事実、及びそれらの増殖がローラボトル(培養)、振盪フラスコ、回転フラスコ及び生物反応機(バイオリアクタ)と適合性があり、約35時間の倍加時間を伴い、それらをウイルスを増殖させるための宿主として適切なものにする。
【００１１】
E1A及びE1Bの配列は、アデノウイルスの血清型2、5、12及び35を含む任意のアデノウイルスの血清型から導くことができる(例として他の適切なアデノウイルスの血清型については欧州特許出願EP 1 054 064号の表1を参照)。
【００１２】
本発明に従う細胞は、ゲノム性物質中に安定して統合され(組込まれ)、又は自律的に複製するベクタの一部分としてヒトACE2タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを備え得、即ち、ヒトACE2タンパク質は一時的に発現されることがあるが、ヒトACE2タンパク質の安定な発現の長期間、高収率での発現が好ましい。言い換えると、本発明に従う細胞は、ヒトのACE2タンパク質を発現するように設計される。例えば、本発明の細胞は発現ベクタを用いて形質転換され得、それは、ウイルス性の複製起点及び/又は内因性発現要素及び同じ又は分かれたベクタ上の選定可能なマーカ遺伝子を含み得る。ベクタの導入に次いで、細胞を1-2日間、栄養強化媒体において、選定媒体(選択培地)に切替える前に増殖するのを許し得る。選定可能なマーカの目的は選定への抵抗性を授与することであり、及びその存在は、首尾よくACE2タンパク質を発現する細胞の増殖及び回収を許す。安定に形質転換する細胞の抵抗性クローンは、本発明の細胞に適切な組織培養技術を用いて繁殖され得る。本発明に従う多数の細胞を備える細胞培養物は、同様に本発明の部分であり、及び次の方法において用いられ得る。
【００１３】
別の局面において、本発明はコロナウイルス、例はヒトのSARS-CoVを生産する方法を提供し、本発明に従う細胞をコロナウイルスで感染させ、及びコロナウイルスを媒体又は細胞から収集することによる。具体例では、生産方法は、次の工程を備える。a) 上述のようなヒト細胞、例は一次ヒト胚性網膜芽細胞から導かれる細胞を提供し、前記細胞が、そのゲノムにおいてアデノウイルスのE1A及びE1Bを暗号化する配列を、ヒトACE2タンパク質を暗号化する核酸分子と共に備えること、b) 細胞をヒトACE2タンパク質の発現のために適切な条件下で培養すること、c) 細胞をコロナウイルスに感染させること、及びd) コロナウイルスを媒体又は細胞から収集することである。細胞はACE2タンパク質の最適発現のために培養される。これは細胞の慣習的な媒体で達成され得る。必要なら、媒体は、例は適した選定、増幅又は転写の誘導のために、修飾し得る。温度、pH、栄養素等のような細胞のための培養条件は、本技術における通常の技量の者によく知られている。設計された細胞はコロナウイルスの生産を促す条件の下で培養される。収集はCPEが観察されるとすぐに始めてよい。生産されるコロナウイルスは細胞を含まない抽出物から回収/収集することができるが、しかしまた培養媒体(培地)からも可能である。細胞を含まない抽出物又は培養媒体からウイルスを回収する方法は、本技術における熟練人によく知られており、及び遠心分離又はクロマトグラフの工程を含み得る。なるべくなら、本方法で用いるヒト細胞は、ECACC 第96022940号下で受託されるようなPER.C6(R)又はその派生物である。好適例では、ヒト細胞は懸濁物において増殖することが可能であり、及び/又は血清の不存在下に培養することができる。
【００１４】
好適例では、コロナウイルスは、感染性の侵入用の受容体としてACE2タンパク質を使用するコロナウイルス類からなる群から選ばれる。そのようなコロナウイルス類には、制限されないが、ヒトSARS-CoV分離体及びヒトCoV-NL63を含むヒトのコロナウイルス類が包含される(Hofmann(ホフマン)等(2005年)参照)。具体例において、設計される細胞がすべてのヒトSARS-CoV分離体を生産するのに適切であり得る(既知ヒトSARS-CoV分離体のリストについては表1参照)。
【００１５】
ヒトACE2タンパク質は一時的に発現させることができるが、好ましくは安定して発現させる。ヒトACE2タンパク質を暗号化する核酸分子は、適切な核酸構築物、例はベクタによって細胞に提供することができる。ベクタは、とりわけF、R1、RP1、Co1、pBR322、TOL、Ti、等のようなプラスミド; コスミド; ラムダ、ラムダ形、M13、Mu、P1、P22、Qβ、T-偶数系、T-奇数系、T2、T4、T7、等のようなファージ; 植物ウイルス; 又は動物ウイルスから導くことができる。ベクタの選抜は、組換え手法及び次いで用いる細胞に依存する。宿主細胞でのベクタの導入は、とりわけ、リン酸カルシウム形質移入(トランスフェクション)、ウイルス感染、DEAE-デキストラン媒介形質移入、リポフェクタミンの形質移入又は電気穿孔法(エレクトロポレーション)によって発効され得る。ベクタは自律的に複製し得、又はそれらが統合される染色体と一緒に複製され得る。なるべくなら、ベクタは1種以上の選択マーカを含む。マーカの選抜は好まれる宿主細胞に依存するが、これは本技術において熟練する人々によく知られるように本発明に絶対的でない。それらには、制限されないが次の、カナマイシン、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ゼオシン(zeocin)、単純ヘルペスウイルスからのチミジンキナーゼ遺伝子(HSV-TK)、マウスからのジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子(dhfr)が包含される。必要なら、ベクタは、分離目的に用いることができるタンパク質又はペプチドを暗号化する1種以上の核酸分子に操作可能に結び付くACE2タンパク質を暗号化する核酸分子を備え得る。これらのタンパク質又はペプチドには、制限されないが、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、マルトース結合性(binding)タンパク質、金属-結合性ポリヒスチジン、緑色蛍光タンパク質、発光酵素(ルシフェラーゼ)及びベータガラクトシダーゼが包含される。核酸構築物は発現調整性の核酸配列を備え得る。本明細書に用いるようにこの用語は、特定宿主有機体において操作可能に結び付くコード配列の発現に必要な及び/又は影響を与えるポリヌクレオチド配列に言及する。発現調整性の核酸、とりわけ、適した転写開始、終了、プロモータ、エンハンサの配列; リプレッサ又はアクチベータの配列; スプライシング及びポリアデニル化の信号のような効果的なRNAの処理性信号; 細胞質mRNAを安定化させる配列; 翻訳効率を高める配列(例はリボゾーム結合性部位); タンパク質の安定性を高める配列; 及び望まれるとき、タンパク質の分泌を高める配列は、好まれる宿主有機体において活性を示す任意の核酸配列であることができ、及び宿主有機体と同質(相同性)又は異質(異種)であるいずれかのタンパク質を暗号化する遺伝子からも導くことができる。発現調整性配列の識別及び採用は本技術において熟練する人に日常的なものである。頻繁に用いられる発現及び/又は形質移入のベクタはプラスミドベクタ及びレトロウイルス類が包含される。プラスミドベクタは本発明において好ましく、それはレトロウイルスが分裂性細胞(dividing cells)にだけ感染し、及び統合される不利益を持つからである。他の問題には、煩わしい調製、及び比較的低い力価、挿入される遺伝子上での寸法の制約、発現の調節又は確実化における困難性、及び宿主ゲノムにおける無作為な統合による遺伝的な損傷についての��在性が包含される。潜在的な毒性に関連する実験室でのレトロウイルス類の使用から起こる、特別に、ヒトの細胞に感染することができるウイルスからの安全性の問題は、レトロウイルスの使用の更なる不利益である。
【００１６】
別の局面において、本発明は更に、収集するコロナウイルスを不活化又は弱毒化する工程を備える方法を提供する。不活化又は弱毒化するコロナウイルスは、不活化又は弱毒化の工程前、その間又はその後に精製し得る。精製は、例としてグリセロールクッションを介する遠心分離及び本技術において熟練する人によく知られる他の方法のような、ウイルスにとって適切な精製方法を使って実行してよい。不活化は、ガンマ-又は紫外線(UV)の照射、熱処理、又はホルムアルデヒド、アセトン、アルコール及び酸化エチレン、エチレンイミン、アセチレンイミン及びB-プロピオラクトン様のアルキル化剤のような化学薬品での処置のような熟練職人によく知られる方法によって実行され得る。不活化の工程に次いで、ウイルスを細胞培養物における感染性の不存在について試験することができる。試験のための方法は、ウイルスがまだ感染性か、又は部分的に又は完全に不活化されるかであり、また本技術において熟練する人によく知られている。感染性の不存在が確立されれば、こうして得られる不活化されたウイルス調製物は更なる目的、例はワクチン調製物のために用いることができる。
【００１７】
弱毒化は、ウイルスの病原性を減らし、まだ生きているが、それがもはや病気を引き起こすことができないようにすることである。弱毒化の最も普通の方法は、有機体を増殖に対し通常でない条件において適合させ、それらの通常の宿主へのそれらの適応を失わせることを伴う。ウイルスの弱毒化の最も普通に用いられる方法は、延長される組織培養増殖である。延長された組織培養増殖は組織培養の皿(プレート)をウイルスで多くの世代のために感染させることを伴う。組織培養において有毒である必要のないウイルスのため、病原性についての選定がなく、及びウイルスは疾病を引き起こすその能力を失う。弱毒化されるワクチンの生産のために用いる組織培養はなるべくなら、弱毒化するワクチンで予防接種する(ワクチン投与する)同じ種からのものであり、組織に対する免疫反応の機会を減らす。その点で、ヒト細胞が組織培養系として好ましい。
【００１８】
不活化され、又は弱毒化されるコロナウイルス類は、ワクチンにおいて用い得る。ワクチンは本技術において既知の手法によって調剤され得る。通常これは補助剤(アジュバンド)及び/又は適切な担体の付加を伴い得る。
【００１９】
具体例において、収集されるコロナウイルスのウイルス力価は、少なくとも4.00、4.25、4.50、4.75、5.00、5.25、5.50、5.75、6.00、6.25、6.50、6.75、7.00、7.25、7.50、及び好ましくは少なくとも7.75のlog10 TCID50/ml感染後24時間後である。
【００２０】
さらに、本発明は、コロナウイルス、なるべくなら、ヒトSARS-CoV又はHCoV-NL63のようなヒトのコロナウイルスの生産のために、本発明に従うヒト細胞の使用を提供する。本発明に従うヒト細胞はまた、コロナウイルスに対する抗ウイルス性薬剤の選別(スクリーニング)に用いることができる。抗ウイルス性薬剤は、受容体へのウイルスの結合性に影響を及ぼし、又はACE2タンパク質の受容体機能に他の任意な様式において影響を与える分子又は化合物類(配合物)であることができる。それらは、例として、細胞又はACE2タンパク質を所有する細胞の膜への候補分子(candidate molecule)の結合性を測定することによって得ることができ、及びそれらには、化学的化合物類、ペプチド、ポリペプチド、抗体又はそれらの断片類が含まれてよい。
【００２１】
更に別の局面において、本発明はコロナウイルスの感染及び/又は複製を抑制することが可能な分子を識別するための方法を提供し、その方法は、次の工程を備え、a) 本発明に従う細胞を、コロナウイルスと共に候補分子の存在及び不存在において温置(インキュベーション)する工程、及びb) 候補分子の存在がコロナウイルスの感染及び/又は複製を抑制するかどうか定める工程である。本技術において熟練する人は、洗浄工程及び温置条件を含む本発明の方法にかかるいくつかの(5又は6種くらいの)工程が最適化される必要があることに気付く。ウイルス及び候補分子は、細胞と接触する前に一緒に混合されてよい。本発明はまた、コロナウイルスによる細胞の感染を減らすことが可能な抗ウイルス性分子を選定するための方法を提供し、そこでは、方法は次の工程を備え、a) 本発明に従う細胞を、コロナウイルスの表面タンパク質と、候補抗ウイルス性分子の存在又は不存在において接触させる工程で、前記表面タンパク質が、コロナウイルスSタンパク質のような、細胞によって発現されるヒトACE2タンパク質に対するコロナウイルスの結合性に関与する工程、b) 細胞及び表面タンパク質の間の結合性相互作用を測る工程、及びc) 候補抗ウイルス性分子を選定し、それにより結合性相互作用を、候補抗ウイルス性分子の存在において、候補抗ウイルス性分子の不存在における結合性相互作用に比べるとき、減少又は低下させる工程である。ACE2タンパク質を所有する膜はまた、上の選定方法に用い得る。細胞及び膜はまた、ACE2タンパク質に特異的に結合する化合物についての選別性化合物ライブラリにおいて用いられる選別アッセイにおいて使用し得る。ACE2タンパク質が一定のコロナウイルス類、そのようなヒトSARS-CoV及びHcoV-NL63の、細胞への入口における役割を演じるので、そのような化合物はコロナウイルス感染を処置又は防ぐことにおいて用いられ得る。それ故、本発明は化合物を選別するための方法を提供し、それはヒトACE2タンパク質のこの機能に影響を及ぼす。これらの化合物は、受容体の機能を抑制し得る。本発明に従う選別/識別/選定の方法を用いて識別され得る化合物及び分子は、化学的化合物ライブラリ又は(自然な)化合物類の混合物を含む様々な供給源から導かれ得る。方法は本発明の細胞に又はそのACE2タンパク質を所有する膜に対する候補分子又は化合物の結合性を測定することを伴い得る。結合性は直接的又は間接的に測定され得る。結合性は、直接的に、例えば、候補分子と関連付けられる標識(ラベル)を使って測定され得る。結合性はまた間接的に測定され得る。例えば、間接的に候補分子の結合性を測定することは、(標識される)競争物と共に競争を伴い得る。候補分子の結合性の測定はまた、例えば、細胞-基礎(ベース)のアッセイにおいて定め得、そこではコロナウイルスが細胞に入るのを阻止するのを候補分子が可能にするかどうかを定め得る。その場合、候補分子又は化合物の存在において、細胞がまだコロナウイルスに感染することができるかどうか定めることができる。代わりに、標識されるヒトSARS-CoV Sタンパク質又はACE2タンパク質への結合性の原因である断片は、本発明の細胞と、候補化合物の存在又は不存在において、接触することができる。次に、候補化合物が細胞に結合するSタンパ��質又は断片の量を低下させるかを定めることができる。候補分子又は化合物は、化学的化合物類であることができ、又は同じく他の分子、例は抗体又は抗体の断片類であることができる。候補分子又は化合物は、ACE2タンパク質に結合することを可能とし、又はSタンパク質のような感染及び/又は複製に関与するコロナウイルスのタンパク質に結合することを可能とし得る。代わりに、候補分子又は化合物は、任意の他の様式において、ウイルスの侵入及び/又は複製を低下させ、又は抑制/廃止し得る。コロナウイルスの感染及び/又は複製を抑制する候補分子又は化合物を、コロナウイルスの感染を処置又は防止する方法において用いることができる。
【実施例】
【００２２】
(例)本発明を例証するために、次の例を提供する。これらの例は何らも本発明の範囲を制限するように意図していない。
(例1)
【００２３】
(安定的に形質移入するヒトACE2 PER.C6(R)細胞系の世代)
SARS-CoV及び他のコロナウイルス類が増殖する能力を、組換え技術によって、アンジオテンシン-変換酵素2(ACE2)、自然な受容体、とりわけヒトSARS-CoV又はHCoV-NL63のためのものを発現するPER.C6(R)細胞上で評価するため、PER.C6(R)細胞を、ACE2タンパク質を暗号化するcDNA配列を運ぶプラスミドで形質移入した(Donoghue(ドノヒュ)等(2000年)及びTipnis(ティプニス)等(2000年)参照; また、GenBank(ジェンバンク)(ジェネティック・シクエンス・デタバンク)第AAF78220及びAAF99721号参照; 及びSEQ ID NO:l(配列番号1))。安定な形質移入体を、本技術において熟練する人に既知の標準的な技術を使用して選んだ(Coligan(コリガン) JE、Dunn(ダン) BM、Ploegh(プロエ) HL、Speicher(スパイカ) DW及びWingfield(ウィングフィールド) PT (eds.(編))(2001年)、 Current protocols in protein science(タンパク質科学における現在のプロトコル)、第I巻. John Wiley & Sons, Inc.(ジョン・ワイリ・アンド・サン社)、米国ニューヨーク参照)。ACE2タンパク質を暗号化するcDNAをHindIII-XbaI断片としてpcDNA2004neo(ネオ)(-)(SEQ ID NO:2)においてクローン化した。PER.C6(R)細胞におけるDNA形質移入は標準的な技術を使用して実行された。安定なクローンを0.5mg/ml G418(Gibco(ギブコ社))の存在において選んだ。ACE2の発現はフローサイトメトリを使用して監視した。形質移入した細胞はヤギ抗-ヒトACE2外部ドメイン(ectodomain)の多クローン抗体(R&D systems(R&Gシステム社)と1時間4℃で温置した。細胞を3回、0.5%BSA含有PBSで洗浄し、フィコエリトリン-共役(phycoerythrin-conjugated)F(ab')2ロバ抗-ヤギIgGと45分間温置し、及びCELLQuest Pro software(セルクエスト・プロ・ソフトウェア)(Becton Dickinson(ベクトン・ディッキンソン社))を使用してFACSCalibur(ファクスキャリバ)上で分析した。分析はアッセイしたクローンのおよそ40%がACE2タンパク質を発現したことを明らかにした。ACE2タンパク質を発現するすべてのクローンはSARS-CoV S318-510の断片を拘束した(以下例3参照)。
【００２４】
(24)(例2)
(ACE2タンパク質を発現するPER.C6(R)細胞でのヒトSARS-CoVの生産)
安定的にACE2-形質移入したPER.C6(R)細胞がヒトSARS-CoVのために許容状態であり、及びヒトSARS-CoVの増殖を支持するかどうか評価するために、ACE2タンパク質を発現するPER.C6(R)細胞培養物の3組を、ヒトSARS-CoV Frankfurt(フランクフルト)1株を用い、0.1の感染の多様性(MOI)で感染させた。SARS-CoV許容状態のVero(ベロ)細胞を、陽性対照(コントロール)細胞系として含ませた。感染した培養物の上清を収集し、及び感染後(pi)12、24、48及び72時間後に-80℃でスナップ-凍結した。すべての試料の収集後、上清を解かし、及び遠心分離によって清浄にした。力価を定めるために、連続的な10-倍の希釈を行って、及びVero細胞の集密(コンフルエント)培養物で滴定した。表2において指示する算出した力価は、ヒトACE2タンパク質を発現するPER.C6(R)細胞が、SARS-CoVを、Vero細胞について観察されるそれらと似たレベルにまで及び293T細胞のようなACE2タンパク質を発現するように設計される他の細胞について観察されるそれらよりも高く生産するのが可能であることを示す。
【００２５】
(例3)
(スパイクタンパク質断片のACE2タンパク質発現PER.C6(R)細胞への結合)
フローサイトメトリ分析を用い、Sタンパク質の組換え断片の、ACE2形質移入したPER.C6(R)細胞への結合性をアッセイした。ACE2発現するPER.C6(R)細胞を、1時間、4℃で、myc-札(タグ)付S318-510断片の飽和性濃度と共に温置した。組換えS断片の構築及び発現を、本質的にvan den Brink(ファン・デン・ブリンク)等(2005年)に記述されるように実行した。簡潔には、SARS-CoV株のフランクフルト1のスパイク糖タンパク質のSlサブユニットのアミノ酸318-510を、一時的にmyc/His-札付タンパク質として293T細胞において発現させ、及びNi-クロマトグラフィを用いて精製した(野生型フランクフルト1のS318-510断片のアミノ酸配列についてSEQ ID NO: 3参照; 信号配列を含むS318-510断片のアミノ酸配列、myc札及びhis札についてSEQ ID NO:4参照)。
【００２６】
次に、刊行されたヒトSARS-CoV Sタンパク質配列から導かれる選定された変異を、S318-510断片において導入した。変異は株BJ302 cl.2(変異体F; GenBank第AY429073号; 変異N479S)及びGD03T0013(変異H; GenBank第AY525636号; 変異K344R、F360S、L472P、D480G、T487S)で見出される変異に対応する。3回の洗浄後、結合した断片を、フローサイトメトリ分析によりビオチン化した抗-myc抗体(Santa Cruz Biotechnology Inc.(サンタ・クルス・バイオテクノロジ社))及びストレプトアビジン-共役フィコエリトリン(Caltag(カルタグ))を用いることによって検出した。温置及び洗浄のすべては0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)を補うPBSにおいて4℃で実行した。抗-ACE2 IgG及び組換えS断片の結合性は、ACE2発現での損失が18回の継代数後に観察されなかったことを明らかにした(データを示していない)。図1で示すように、すべての断片は、ACE2タンパク質を発現するPER.C6(R)細胞への結合性が、野生型S318-510断片及び断片変異体Fについて検出される最も強い結合性を伴って可能であった。いくつかのヒトSARS-CoV分離体のSタンパク質断片の、ACE2タンパク質を発現するPER.C6(R)細胞への結合性は、細胞が概してヒトSARS-CoV分離体を生産するのに使用することができることを示す。
【００２７】
(表1)(ACE2タンパク質を発現するPER.C6(R)細胞で増殖することができるヒトSARS-CoV分離体のリスト)
【００２８】
【表１−１】
2009502128.tif 000002
【００２９】
【表１−２】
2009502128.tif 000003
【００３０】
【表１−３】
2009502128.tif 000004
【００３１】
【表１−４】
2009502128.tif 000005
【００３２】
【表１−５】
2009502128.tif 000006
【００３３】
【表１−６】
2009502128.tif 000007
【００３４】
【表１−７】
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【００３５】
【表１−８】
2009502128.tif 000009
【００３６】
【表１−９】
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【００３７】
【表１−１０】
2009502128.tif 000011
【００３８】
(表2)(SARS-CoVの力価をPER.C6(R)及びVeroの培養物のMOI 0.1での感染後12、24、48及び72の時間(hr pi)の後に収集した培養上清において測定した。力価はlog10±log10の標準誤差において表現した。
【００３９】
【表２】
2009502128.tif 000012
【００４０】
(参照)
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【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】ACE2タンパク質を発現する細胞へのタンパク質断片の結合を示す。
【図１】
2009502128.tif 000013
【配列表】
2009502128000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年5月21日(2007.5.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一次ヒト胚性網膜芽細胞から導かれるヒトの細胞であり、そのゲノムにおいてアデノウイルスのE1A及びE1Bを暗号化する配列を備えているものであって、細胞がヒトACE2タンパク質を発現するように設計されることを特徴とする、細胞。
【請求項２】
ヒトACE2タンパク質を発現するように設計される細胞がECACC第96022940号下に受託されるようなPER.C6である、請求項1に従うヒト細胞。
【請求項３】
ヒトのACE2タンパク質を安定して発現する、請求項1又は2に従うヒト細胞。
【請求項４】
コロナウイルスを生産する方法であって、次の工程、
a) 一次ヒト胚性網膜芽細胞から導くヒトの細胞を提供する工程で、前記細胞がそのゲノムにおいてアデノウイルスのE1A及びE1Bを暗号化する配列を、ヒトのACE2タンパク質を暗号化する核酸分子と共に備える工程、
b) 細胞をヒトACE2タンパク質の発現のために適する条件下に培養する工程、
c) 細胞にコロナウイルスを感染させる工程、及び
d) 媒体又は細胞からコロナウイルスを収集する工程
を備える、方法。
【請求項５】
コロナウイルスが、SARS-CoV及びHcoV-NL63からなる群より選ばれることを特徴とする、請求項4に従う方法。
【請求項６】
ヒトの細胞が、ECACC第96022940号下に受託されるような PER.C6又はその派生物であることを特徴とする、請求項4又は5に従う方法。
【請求項７】
ヒトのACE2タンパク質を安定して発現することを特徴とする、請求項4-6の何れかに従う方法。
【請求項８】
ヒトのACE2タンパク質を暗号化する核酸分子をベクタによって提供することを特徴とする、請求項4-7の何れかに従う方法。
【請求項９】
ヒトの細胞が懸濁物において増殖するのを可能とすることを特徴とする、請求項4-8の何れかに従う方法。
【請求項１０】
ヒトの細胞を血清の不存在下において培養することができることを特徴とする、請求項4-9の何れかに従う方法。
【請求項１１】
さらに、収集されるコロナウイルスを不活性化又は弱毒化する工程を備える、請求項4-10の何れかに従う方法。
【請求項１２】
コロナウイルスの生産のための細胞の使用であって、請求項1から3までの何れかに従うヒトの細胞の使用。
【請求項１３】
コロナウイルスに対する抗ウイルス性薬剤の選別のための細胞の使用であって、請求項1から3までの何れかに従うヒトの細胞の使用。
【請求項１４】
コロナウイルスの感染及び/又は複製が抑制されるのを可能とする分子を識別するための方法であって、次の工程、
a) 請求項1から3までの何れかに従う細胞をコロナウイルスと共に候補分子の存在及び不存在において温置する工程、及び
b) 候補分子の存在がコロナウイルスの感染及び/又は複製を抑制するか定める工程
を備える、方法。
【請求項１５】
細胞のコロナウイルスによる感染が減らされるのを可能とする抗ウイルス性分子を選定するための方法であって、次の工程、
a) 請求項1から3までの何れかに従う細胞を、コロナウイルスの表面タンパク質と、候補抗ウイルス性分子の存在又は不存在の下において接触させる工程で、前記表面タンパク質が細胞によって発現されるヒトACE2タンパク質へのコロナウイルスの結合に関与している工程、
b) 細胞及び表面タンパク質間の結合性相互作用を測る工程、及び
c) 候補抗ウイルス性分子の不存在下においての結合性相互作用と比較されるときに結合性相互作用が減る候補抗ウイルス性分子を選ぶ工程
を備える、方法。
【国際調査報告】
2009502128.tif 000014
2009502128.tif 000015
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