(57)【要約】  本発明は結腸直腸癌の診断に関する。結腸直腸癌の診断におけるタンパク質S100A12の使用を開示する。本発明は、個体由来の便試料中のS100A12を測定することによる前記試料からの結腸直腸癌の診断のための方法に関する。S100A12の測定は、例えば、結腸直腸癌の早期検出または診断に使用され得る。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)  個体から得られた便試料を提供する工程、
b)  前記試料をS100A12に対する特異的結合剤と、前記結合剤とS100A12との複合体の形成に適切な条件下で接触させる工程、
c)  工程(b)で形成された複合体の量を測定する工程、および
d)  (c)で測定された複合体の量を結腸直腸癌の診断と相関させる工程
を含む、結腸直腸癌の診断方法。
【請求項２】
a)  個体から得られた便試料を提供する工程、
b)  前記試料をS100A12に対する特異的結合剤と、前記結合剤とS100A12との複合体の形成に適切な条件下で接触させる工程、
c)  前記試料を、ヘモグロビン/ハプトグロビン複合体、ヘモグロビン、メタロプロテーゼ組織インヒビター1(TIMP-1)、および腫瘍M2ピルビン酸キナーゼ(M2-PK)からなる群より選択される第２のマーカーに対する特異的結合剤と、前記結合剤と第２のマーカーとの複合体の形成に適切な条件下で接触させる工程、
d)  工程(b)および(c)で形成された複合体の量を検出する工程、ならびに
e)  工程(d)で測定された複合体の量を結腸直腸癌の診断と相関させる工程
を含む、結腸直腸癌の診断方法。
【請求項３】
前記第２のマーカーがヘモグロビンである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記第２のマーカーがヘモグロビン/ハプトグロビン複合体である、請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記第２のマーカーがTIMP-1である、請求項２記載の方法。
【請求項６】
前記第２のマーカーがM2-PKである、請求項２記載の方法。
【請求項７】
個体から得られた便試料からの結腸直腸癌の診断におけるマーカー分子としてのタンパク質S100A12の使用。
【請求項８】
個体から得られた便試料からの結腸直腸癌の早期診断におけるマーカー分子としてのタンパク質S100A12の使用。
【請求項９】
個体から得られた便試料からの結腸直腸癌の診断における、ヘモグロビン/ハプトグロビン複合体、ヘモグロビン、メタロプロテーゼ組織インヒビター1(TIMP-1)、および腫瘍M2ピルビン酸キナーゼ(M2-PK)からなる群より選択される結腸直腸癌の１種類以上の他のマーカー分子と組わ合せた、結腸直腸癌のマーカー分子としてのタンパク質S100A12の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結腸直腸癌の診断に関する。本発明は、結腸直腸癌の診断におけるマーカー分子としての、タンパク質S100A12（=Calgranulin C）の使用を開示する。さらに、本発明は特に、便試料中のS100A12を測定することによる、個体由来の便試料からの結腸直腸癌の診断方法に関する。S100A12の測定は、例えば結腸直腸癌の早期検出または診断に使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
検出や治療の進歩にかかわらず、癌は主要な公衆衛生課題であり続けている。種々の癌の中で、結腸直腸癌（=CRC）は、西洋諸国で最も頻度の高いものの1つである。
【０００３】
癌をより早期に検出/診断することができれば、全体の生存率はより良くなる。このことは、特にCRCについて真実である。進行した段階の腫瘍における予後は乏しい。診断から5年以内には、疾患の進行により1/3より多くの患者が死亡し、これは5年間で約40％の生存率に相当する。現在の治療は、患者の一部を処置することのみであり、疾患の初期段階で診断されたこれらの患者において明確に最も高い効果を有する。
【０００４】
公衆衛生課題としてのCRCに関して、結腸直腸癌について、より効果的なスクリーニングおよびより予防的な測定を開発することが必要不可欠である。
【０００５】
結腸直腸癌について、現在利用可能である最も早期の検出法には、便の血液についての試験または内視鏡診断法を使用することが含まれる。しかしながら、有意な腫瘍サイズは、通常、便の血液が検出される以前に存在しているはずである。便試料からのCRCの検出に関して、当該技術分野の現在の状態はグアヤクベース便潜血試験である。
【０００６】
近年、非常に多くの、いわゆる結腸特異的またはいわゆる結腸直腸癌特異的でもある遺伝子が報告されている。非常に多くの対応する研究論文または特許出願は、結腸（癌）組織対異なる組織もしくは隣接する正常組織のそれぞれのRNA発現パターンの解析により得られたデータに基づいている。このようなアプローチは、ディファレンシャルmRNAディスプレイ技術として要約され得る。
【０００７】
mRNAディスプレイ技術からの利用可能なデータの一例として、WO 01/96390が挙げられ、議論される。この出願には200より多くの単離ポリヌクレオチドおよびそれに対応するポリペプチド、ならびにCRCの検出におけるそれらの使用が記載され、権利が主張されている。しかしながら、mRNAのレベルの差が対応するタンパク質のレベルにより反映されないことは一般常識である。希少なmRNAにコードされるタンパク質が非常に多量に発見されたり、豊富なmRNAにコードされるタンパク質が、それにもかかわらず検出および発見することが非常に困難であったりし得る。このmRNAレベルとタンパク質レベルの間の相互関係の欠如は、mRNAの安定性、翻訳効率、タンパク質の安定性等の理由による。
【０００８】
最近では、CRCの診断に使用できると思われる候補マーカー分子を同定するために、異なる組織間または健常組織と疾患組織間でタンパク質パターンの差を調べるアプローチも存在する。Bruenagel, G. et al., Cancer Research 62 (2002) 2437-2442では、近接した正常組織と比較してCRC組織で豊富であると思われる7個の核マトリクスタンパク質が同定されている。個体から得られた液体試料および便試料由来のデータは報告されていない。
【０００９】
WO 02/078636には、表面強調レーザー吸収およびイオン化（SELDI）で発見された約9個の結腸直腸癌関連スポットが報告されている。これらのスポットは健常対照から得られた血清と比較してCRCの患者から得られた血清において高頻度で見られる。しかし、かかるスポットに含まれる（1つ以上の）分子、例えばその（それらの配列）の同一性は分かっていない。
【００１０】
CRCの分野において候補タンパク質マーカーのリストは大きく、依然増え続けているが、現在までにこれらの分子の臨床的/診断的有用性は分かっていない。臨床的に有用であるためには、単一マーカーとしての新規の診断マーカーは、当該技術分野で公知の最良の単一マーカーと同程度に良好であるはずである。または、新規マーカーは、単独で使用されるかまたは他の1つ以上のマーカーと組み合わされて使用される場合のいずれかで、診断感度および/または特異性のいずれかの進歩をもたらすはずである。診断感度および/または試験特異性は、しばしば以下に詳述されるその受信者動作特性によって評価される。
【００１１】
現在では、例えば癌胎児抗原（CEA）、腫瘍関連糖タンパク質の検出に基づく診断的血液試験がCRCの分野における診断を評価するために利用可能である。CEAは、結腸直腸癌、胃癌、および膵臓癌の患者から得られた組織試料の95％、ならびに乳癌、肺癌および頭部頚部癌の大部分で増加している（Goldenberg, D.M. et al., J. Natl. Cancer Inst. (Bethesda) 57 (1976) 11-22）。高いCEAレベルはまた、非悪性疾患の患者でも報告されており、多くの結腸直腸癌の患者は、特に疾患の初期段階では血清中の正常CEAレベルを有する（Carriquiry, L.A.およびPineyro, A., Dis. Colon Rectum 42 (1999) 921-929；Herrera, M.A. et al., Ann. Surg. 183 (1976) 5-9；Wanebo, H.J. et al., N. Engl. J. Med. 299 (1978) 448-451）。再発の検出において血清または血漿から測定される場合、CEAの有用性は議論されるところであり、依然として広く適用されている（Martell, R.E. et al., Int. J. Biol. Markers 13 (1998) 145-149；Moertel, C.G. et al., JAMA 270 (1993) 943-947）。
【００１２】
利用可能なデータを考慮すると、血清CEA測定は、無症候性の集団において結腸直腸癌についてのスクリーニング試験としての使用を可能にするための感度または特異性のいずれも有さない（Reynoso, G. et al., JAMA 220 (1972) 361-365；Sturgeon, C., Clin. Chem. 48 (2002) 1151-1159）。
【００１３】
便から得られる試料は、非侵襲性の手段によるサンプリングが容易に実行可能であるという利点を有する。
【００１４】
上述のように、便由来のCRCについてのスクリーニングアッセイの際にグアヤク試験は現在最も広く使用されている。しかしながら、グアヤク試験は乏しい感度および乏しい特異性の両方を有する。グアヤクベース便潜血試験の感度は約26％であり、これは悪性病変を有する患者の74％が検出されないままであることを意味する（Ahlquist, D.A., Gastroenterol. Clin. North Am. 26 (1997) 41-55）。
【００１５】
前癌性および癌性の病変の視覚化は早期検出について最高のアプローチを提示するが、結腸鏡検査法は侵襲性でありコストが高く、危険を伴い、かつ複雑である（Silvis, S.E. et al., JAMA 235 (1976) 928-930；Geenen, J.E. et al., Am. J. Dig. Dis. 20 (1975) 231-235；Anderson, W.F. et al., J. Natl. Cancer Institute 94 (2002) 1126-1133）。
【００１６】
グアヤク試験についての診断的代替法の感度および特異性は、現在Sieg, A. et al., Int. J. Colorectal Dis. 14 (1999) 267-271によって調査されている。特に便生検由来のヘモグロビンおよびヘモグロビン-ハプトグロビン複合体の測定が比較されている。ヘモグロビンアッセイは結腸直腸新生物の検出において満足のいく感度を有さなかったことに注意されたい。進行性の癌段階にある癌は約87％の感度で検出されるが、より早期の腫瘍段階は充分な感度では検出されない。ヘモグロビン-ハプトグロビン複合体アッセイは初期段階のCRCの検出においてより感受性であった。このより感受性の高い検出は、乏しい特異性を伴った。しかし、乏しい特異性は結腸鏡検査法のような多くの不必要な二次的調査につながるので乏しい特異性を有するアッセイも一般的に許容されるスクリーニングアッセイの要件を満たさない。
【００１７】
カルプロテクチンは、便試料からのCRCの検出のための代替的バイオマーカーであることがUS 5,455,160および対応するRoseth, A.G., et al.（Scand. J. Gastroenterol. 27 (1992) 793-798；Scand. J. Gastroenterol. 28 (1993) 1073-1076）の科学文献に記載されている。カルプロテクチンは炎症性疾患のマーカーであるが、便由来のCRCの検出のためのマーカーとしてのその能力がいくつかの文献に記載されている（Johne, B., et al., Scand. J. Gastroenterol. 36 (2001) 291-296；Limburg, P.J., et al., Am. J. Gastroenterol. 98 (2003) 2299-2305；Hoff, G., et al., Gut 53 (2004) 1329-1333）。カルプロテクチンの感度および特異性は免疫学的ヘモグロビンアッセイと同等であるが、カルプロテクチンはヘモグロビンと比較して、診断バイオマーカーについていくつかの好ましい特徴を有するように思われる。カルプロテクチンは便中に分布しており、試料の実験室への郵便送達が可能なように室温で安定であり、食物成分および医薬化合物による阻害を示さない（Ton, H., et al., Clin. Chim. Acta 292 (2000) 41-54）。しかし、高濃度のカルプロテクチン、S100A8およびS100A9のヘテロダイマーは、CRC、クローン病または炎症性腸疾患に苦しむ患者由来の便試料中に検出された。これらの結果は、炎症におけるカルプロテクチンのより一般的な役割と一致する（Ryckman, C., et al., J. Immunol. 170 (2003) 3233-3242）。そのため、胃腸病学におけるカルプロテクチンの使用はCRCの検出に限定されず、他の疾患、特にPoullis, A., et al.（J. Gastroenterol. Hepatol. 18 (2003) 756-762）によってまとめられた炎症性腸疾患にまで拡大される。
【００１８】
便中のCRCの検出のためのグアヤク試験に対するさらなる代替的方法が最近公表され、便中に分布した結腸細胞における免疫組織化学による結腸直腸癌特異的抗原、「ミニ染色体維持タンパク質2」（MCM2）の検出を含む。研究の規模が小さいために、結腸直腸癌の検出についての診断的価値における結論は仮のものである。しかしながら、この試験は右側直腸癌を検出するための限定的な特異性しか有していないと思われる（Davies, R.J. et al., Lancet 359 (2002) 1917-1919）。
【００１９】
近年、ピルビン酸キナーゼM2アイソエンザイム（M2-PK）の検出についてのアッセイが市場に導入された（Schebo Biotech, Giessen, Germany）。ヘモグロビンおよびM2-PKについてのイムノアッセイに対するグアヤクアッセイの比較が、例えばVogel, T. et. al., Dtsch. Med. Wochenschr. 130 (2005) 872-877により行なわれた。それらによると、免疫学的アッセイはグアヤク試験よりも優れていることおよびヘモグロビンアッセイと比較するとM2-PKアッセイは同等の特異性ではあるがCRC検出感度では劣っていることが示される。しかし、筆者らは、これらの便試料ベースアッセイの両方の有用性には依然として疑問があることを結論付けている。
【００２０】
便生検からの非侵襲性の手段により信頼性の高い癌の検出を可能にするか、または早期の予後的情報を提供する早期のCRC腫瘍マーカーの同定は、この疾患の診断および管理において大きな補助となる診断アッセイをもたらし得た。そのため、特に便由来のCRCの診断を改善するための緊急の臨床的な必要性が存在する。疾患の進行した段階で診断された患者と比較して早期に診断された患者は生存の可能性がより高いので、CRCの早期診断を改善することは特に重要である。
【００２１】
CRCの診断を補助し得る新規のマーカーを同定することができるかどうかを調べることが本発明の課題であった。好ましくは、このようなマーカーは便中に存在し、非侵襲性の診断を可能にするであろう。
【００２２】
驚くべきことに、CRCのためのマーカーとしてタンパク質S100A12の使用が、最先端の技術分野で知られている課題を少なくとも一部克服することができるということが見出された。
【００２３】
従って、本発明は、
a)  個体から得られた便試料を提供する工程、
b)  前記試料とS100A12に対する特異的結合剤を、前記結合剤とS100A12の複合体の形成に適した条件下で接触させる工程、
c)  工程(b)で形成された複合体の量を測定する工程、ならびに
d)  (c)で測定された複合体の量と結腸直腸癌の診断を相関させる工程
を含む結腸直腸癌の診断方法に関する。
【００２４】
当業者が理解するように、S100A12の任意のこのような測定はインビトロで行われる。患者試料はその後廃棄される。患者試料は本発明のインビトロでの方法のみに使用され、患者試料のどのような物質も患者の体に再び戻されることはない。S100A12の測定またはCRCの評価のいずれもヒトまたは動物体では行なわない。
【００２５】
本発明によるインビトロ診断法を使用して、便試料中のS100A12の非存在、存在または相対濃度が評価される。S100A12の測定値はCRCの評価、例えば医師の臨床的診断の確立および/または医師の適切な治療の決定において医師を補助する。
【００２６】
好ましい態様において、便試料は処理され、便生検よりも扱いに都合がよい処理済試料液が得られる。その後、かかる処理済試料をS100A12に対する特異的結合剤とインキュベートする。従って、本発明はまた、
a)  個体から得られた便試料を提供する工程、
b)  前記試料を処理して処理済液体試料を得る工程、
c)  前記処理済液体試料とS100A12に対する特異的結合剤を、前記結合剤とS100A12の複合体の形成に適した条件下で接触させる工程、ならびに
d)  (c)で形成された複合体の量と結腸直腸癌の診断を相関させる工程
を含む、結腸直腸癌の診断方法に関する。
【００２７】
本発明の別の好ましい態様は、
a)  個体から得られた便試料を処理して、処理済液体試料を得る工程、
b)  前記処理済液体試料とS100A12に対する特異的結合剤を、前記結合剤とS100A12の複合体の形成に適した条件下で接触させる工程、
c)  工程(b)で形成された複合体の量を測定する工程、ならびに
d)  (c)で測定された複合体の量と結腸直腸癌の診断を相関させる工程
を含む結腸直腸癌の診断方法である。
【００２８】
さらに好ましい態様において、本発明は、個体から得られた便試料を提供する工程、前記試料とS100A12に対する特異的結合剤を、前記結合剤とS100A12の複合体の形成に適した条件下で接触させる工程、前記試料をヘモグロビン/ハプトグロビン複合体、ヘモグロビン、メタロプロテアーゼ組織インヒビター1（TIMP-1）、および腫瘍M2ピルビン酸キナーゼ（M2-PK）からなる群より選択される第2のマーカーに対する特異的結合剤と、前記結合剤と第2のマーカーの複合体の形成に適した条件下で接触させる工程、S100A12および少なくとも1つの第2のマーカーについて形成された複合体の量を検出する（detection）工程、ならびに測定された複合体の量と結腸直腸癌の診断を相関させる工程を含む、結腸直腸癌の診断方法を開示する。さらに好ましい態様において、本発明の方法は、S100A12および第2のマーカーとしてのヘモグロビンの測定、S100A12および第2のマーカーとしてのヘモグロビン/ハプトグロビン複合体の測定、S100A12および第2のマーカーとしてのTIMP-1の測定、ならびにS100A12および第2のマーカーとしてのM2-PKの測定のそれぞれに基づく。当業者に明らかなように、S100A12の測定および少なくとも1つの第2のマーカーの測定は、便試料もしくは処理済便試料それぞれの同一のアリコートから、または患者の便試料の異なるアリコートもしくは患者の処理済便試料の異なるアリコートのそれぞれから行なうことができる。
【００２９】
別の好ましい態様において、便試料は、結腸細胞が回収されるように処理され、この細胞は、後に顕微鏡スライドガラス上でスメアにされる。その後、かかる処理済試料はS100A12に対する特異的結合剤とインキュベートされる。従って、本発明はまた、
a)  個体から得られた便試料を提供する工程、
b)  前記試料を回収結腸細胞に処理する工程、
c)  前記処理済試料とS100A12に対する特異的結合剤を、前記結合剤とS100A12の複合体の形成に適した条件下で接触させる工程、ならびに
d)  (c)で形成された複合体の量と結腸直腸癌の診断を相関させる工程
を含む結腸直腸癌の診断方法に関する。
【００３０】
タンパク質S100A12（=Calgranulin C）は、配列番号：1に示される配列を特徴とする。
【００３１】
S100A12はまた、CAAF1；CAGC；羊水中カルシウム結合タンパク質；calgranulin関連タンパク質；CGRP；羊水中カルシウム結合タンパク質1；Calgranulin C；ENRAGE（細胞外新規同定RAGE結合タンパク質）；好中球S100タンパク質；S100カルシウム結合タンパク質A12とも呼ばれる。この遺伝子にコードされるタンパク質は、2EF-ハンドカルシウム結合モチーフ含有タンパク質のS100ファミリーの一員である。S100タンパク質は、広範な細胞の細胞質および/または核に局在しており、細胞周期の進行および分化などの多くの細胞プロセスの制御に関連する。S100遺伝子は、染色体1q21上にクラスターとして位置する少なくとも13のメンバーを含む。このタンパク質は、特異的カルシウム依存的シグナル伝達経路に関連することが提唱されており、細胞骨格成分におけるその制御効果は種々の好中球活性を調節し得る。
【００３２】
S100A12の生理学的に関連のある構造は、Ca2+結合ホモダイマーである。また、S100A12が細胞から放出される場合の細胞外機能は、例えば炎症プロセスの進行の制御として説明されている（Foell, D. et al. Clin. Chim. Acta 344 (2004) 37-51）。S100A8（=calgranulin A）およびS100A9（calgranulin B）と共に、S100A12は顆粒球中で発現され、この場合、calgranulinタンパク質は可溶性サイトゾルタンパク質含量の50％までを構成する。S100A12は急性炎症の際に放出され、過敏性腸疾患、クローン病、川崎病または慢性関節リウマチ炎などの種々の疾患において見られている（Burmeister, G.およびGallacchi, G., Inflammopharmacology 3 (1995) 221-230；Foell, D. et al., Rheumatology 42 (2003) 1383-1389）。S100A12応答のシグナルカスケードが調べられた際に、S100A12は終末糖化産物受容体（=RAGE）を介した新規の炎症軸に関連していた。このレセプターは、例えば内皮細胞および免疫系の細胞などの種々の組織型に見ることができる（Hofmann, M.A. et al., Cell 97 (1999) 889-901；Schmidt, A. M. et al., J. Clin. Invest. 108 (2001) 949-955）。炎症性の応答に関連することに加えて、RAGE経路は、傷の治癒、腫瘍の伸長または全身性アミロイドーシスについても説明されている（Hofmann, M.A. et al., 上述；Schmidt, A.M. et al., 上述；Yan, S.S. et al., Nat. Med. 9 (2003) 287-293；Hofmann, M.A. et al., Genes Immun. 3 (2002) 123-135）。従って、S100A12は広範囲の効果を有している。しかしながら、腫瘍プロセスとの関係は今日まで説明されていない。
【００３３】
好ましい態様において、新規マーカーS100A12はCRCのスクリーニングに使用される。患者のモニタリングに使用される場合、本発明による診断方法は、患者の追跡調査における腫瘍負荷、治療効果および腫瘍再発の評価を補助し得る。高レベルのS100A12は腫瘍の負担に直接相関させる。化学療法後、短期間（数時間から14日間）のS100A12の増加は腫瘍細胞死の指標として機能し得る。手術および/または化学療法後の患者の長期間（3ヶ月から10年）の追跡調査において、S100A12の増加は結腸直腸における腫瘍再発の指標として使用することができる。
【００３４】
好ましい態様において、本発明による診断方法はスクリーニング目的で使用される。つまり、該方法は、CRCの前診断を伴うことなく、便試料中のS100A12のレベルを測定し、測定されたレベルとCRCの有無を相関させることにより被験体を評価することに使用される。
【００３５】
当業者が容易に理解するように、かかるスクリーニングにおいて、適当な量の便試料が使用されるように配慮がなされなければならない。好ましくは、本明細書に含まれるS100A12の測定には、一定量の便試料が使用される。好ましくは、S100A12の量は、便の量あたりのS100A12の量で表され、即ちS100A12の相対濃度が示される。
【００３６】
該診断法は、一般的な無症候集団のスクリーニングのみに使用されるのではなく、高いリスクの個体のサーベイランスについての代替的な好ましい態様に使用されてもよい。好ましくは、このような高いリスクの個体は、鉄欠乏性貧血の個体、CRCの第一グレードに相当する患者、CRCの家族性病歴を有する患者および新規に検出されたポリープまたは胃腸新生物の病歴を有する患者からなる群より選択される。
【００３７】
スクリーニングアッセイについてはAUC値だけが関連のあるものではない。スクリーニングの設定において非常に重要な要件は、充分高い良好な感度および臨床的に関連のあるレベルの特異性である。この要件が満たされなければ、スクリーニングアッセイにより、患者に不必要な追跡調査法および苦痛を伴わせる非常に多くの偽陽性結果が生じるため、高い特異性は重要である。他の好ましい態様において、臨床的に関連のあるスクリーニング集団のCRC陰性個体と比較して、特異性のレベルは96％、97％、98％または99％それぞれに設定される。
【００３８】
当業者が理解するように、S100A12についてのカットオフ値は、健常正常集団の個体由来の便試料において測定される場合のS100A12値に対して設定される。スクリーニング設定において臨床的に関連のある健常集団は、好ましくは、55〜65歳の臨床的に健常な個体からなる。設定されたカットオフ値より高い便試料のS100A12値はCRCを示すと見なされ得るか、または個々の個体のさらなる診断試験を少なくとも正当化し得る。
【００３９】
結腸直腸癌は、腺腫（ポリープ）から悪性腫瘍へと最も高い頻度で進行する。
【００４０】
癌の病期分類は、程度、進行、および重症度に関する疾患の分類である。病期分類は、予後および治療の選択に関して一般化され得るように癌患者を分類する。
【００４１】
CRCの種々の病期は、デュークス病期A〜Dに従って分類される（used to be）。今日、TNMシステムは、癌の解剖学的な程度の最も広く使用されている分類である。該システムは国際的に受け入れられた病期分類システムである。3種類の基本的な変数：T（原発腫瘍の程度）、N（局所リンパ節の状態）およびM（遠隔転移の有無）がある。TNM基準はUICC（国際対癌協会）、Sobin, L.H., Wittekind, Ch. (編)：TNM Classification of Malignant Tumours、第6版、2002）によって公表されている。一旦TNM状態が決定されると、患者は、IVが最も進行した病期であるI〜IVのローマ数字の範囲で示される病期に分類される。TNM病期分類およびUICC疾患状態は、Sobin L.H.およびWittekind (編)上述、から得られる以下の表1に示されるように互いに対応している。
【００４２】
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【００４３】
特に重要であるのは、CRCの早期診断は非常に良好な予後につながることである。結腸直腸の悪性腫瘍は良性腫瘍、つまり腺腫から生じる。従って、最良の予後は、これらの患者を腺腫の段階で診断する。ステージTis、N0、M0またはT1〜3；N0；M0という早い段階で診断された患者は、適切に治療された場合、遠隔転移が既に存在している場合に診断された患者についてわずか10％の5年生存率と比較して、診断後5年生存する可能性は90％より高い。
【００４４】
本発明の意味において、CRCの早期診断とは、転移が全く存在しない（近位=N0、または遠位=M0のいずれでもない）腫瘍段階、つまりTis、N0、M0またはT1〜4；N0；M0の段階での診断のことをいう。Tisとは、インサイチュ癌腫を表す。
【００４５】
CRCは、腸壁を貫通するほどにまだ完全には成長しきっておらず、そのために臓側腹膜が貫通されていないか、または他の器官もしくは構造が浸潤されていないときにCRCが診断されること、つまり診断がTis；N0；M0からT3；N0；M0（=Tis〜3；N0；M0）の任意の段階でなされることが好ましい。
【００４６】
本発明の診断方法は、個体由来の便試料に基づいている。便試料を抽出し、この処理済便試料から、特異的結合剤を使用してS100A12を特異的に測定する。
【００４７】
特異的結合剤は、例えばS100A12に対するレセプター、S100A12に結合するレクチン、S100A12に対するアプタマー、またはS100A12に対する抗体である。特異的結合剤は、その対応する標的分子に対して少なくとも107l/molの親和性を有する。好ましくは、特異的結合剤は、その標的分子に対して108l/mol、またはさらに好ましくは109l/molの親和性を有する。当業者が理解するように、用語、特異的は試料中に存在する他の生体分子が、S100A12に対する特異的結合剤に有意に結合しないことを示すために使用される。好ましくは、標的分子以外の生体分子に対する結合レベルは、標的分子の親和性のわずか10％、より好ましくはわずか5％以下の結合親和性で生じる。最も好ましい特異的結合剤は、親和性および特異性についての上記の最小基準を満たす。
【００４８】
好ましくは、特異的結合剤はS100A12に反応性のある抗体である。用語抗体とは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、かかる抗体の断片、および抗体の結合ドメインを含む遺伝的構築物のことをいう。特異的結合剤の上記の特徴を保持する任意の抗体断片を使用することができる。抗体は、例えばTijssen (Tijssen, P., Practice and theory of enzyme immunoassays 11 (1990) 本全体、特にp43〜78, Elsevier, Amsterdam)に記載される当該技術分野の手法の記述により作製される。また、当業者は、抗体の特異的な単離に使用することができるイムノソルベントに基づく方法を充分に認識している。これらの手段により、イムノアッセイにおけるポリクローナル抗体の質およびそれによる該抗体の性能を高めることができる（Tijssen, P., 上述, p108〜115）。
【００４９】
本発明に開示したような達成のため、ウサギで作製したポリクローナル抗体を使用した。しかしながら、明らかに、異なる種、例えばラットまたはモルモット由来のポリクローナル抗体、およびモノクローナル抗体も使用することができる。モノクローナル抗体は一定の性能に必要な任意の量で作製することができるので、臨床的常套手段についてのアッセイの開発において理想的なツールである。本発明の方法におけるS100A12に対するモノクローナル抗体の作製および使用はまた、別の好ましい態様である。
【００５０】
ここで、S100A12はCRCの診断に有用なマーカーであるとイムノアッセイにおける測定により同定されたと当業者には理解されようが、本発明の成果と同等の結果を達成するために代替的な方法を使用してもよい。マーカータンパク質S100A12は、適切な手段により検出され得、CRCのマーカーとして使用され得る。かかる好ましい適当な手段には、イムノアッセイ法、液体クロマトグラフィー、特に高速液体クロマトグラフィー、電気泳動、特にウェスタンブロットと組み合わせたSDS-PAGEおよび質量分光学によるS100A12ポリペプチドの検出が含まれる。
【００５１】
測定のために、便試料を個体から得る。便試料のアリコートを直接使用してもよい。好ましくは、便試料のアリコートを処理して液体試料を生成する。処理済便試料は、バッファーを用いた便試料の抽出の際に得られる液体試料である。
【００５２】
便試料の処理は、本発明の作業について最適化された抽出バッファーにより行われる。これは少なくとも3種類の基本的な要件を満たすはずである：これは便マトリクスから目的の検体を遊離するはずである。これは遊離検体を安定化するはずである。これはその後の検体の検出における便マトリクスの妨害を最小限にするはずである。マーカー組合せは付加的な診断可能性を維持し得るので、最適化されたバッファーは1種類の特異的バイオマーカーに適用可能であるだけでなく、目的の全検体に適用可能であるべきである。抽出バッファーは、便試料の均質化および抽出を向上するために尿素を含有してもよい。Ca2+結合タンパク質の安定化のためにCa2+を含んでもよい。S100タンパク質はCa2+結合タンパク質として公知であるので、好ましくは、抽出バッファーは、このようなタンパク質を安定化するためにCa2+イオンを含む。一方でCa2+結合タンパク質と便マトリクス間のイオン結合を切断することができるように、弱いキレート剤を使用するべきである。しかし、もう一方ではこれらのCa2+錯化剤で、S100A12からのCa2+イオンの剥脱を回避するために充分に弱いCa2+イオンを結合させる必要がある。好ましくは、トリ酢酸ニトリロまたはクエン酸を、便抽出バッファー中でキレート剤として使用する。最適かつ好ましい抽出バッファーは尿素、Ca2+イオンおよびキレート剤を含む。好ましくは、キレート剤は、トリ酢酸ニトリロまたはクエン酸からなる群より選択される。最適化された抽出バッファーは、例えば実施例4bに示される便試料の処理に使用される。
【００５３】
要求に合わせて作製した（tailor-made）便試料サンプリングデバイスと組み合わせて、最適化された抽出バッファーを使用することが最も都合がよい。最も都合がよい方法において、個体は規定量の便試料を回収し、安定化抽出バッファーを前もって充填された回収物に直接移す。サンプリングおよび抽出の都合のよい様式により、検体を分解することなく生検を診断研究室に輸送することが可能である。便試料の抽出はサンプリングデバイス中で直接行なうことができるので、必要な操作および移動手順が減る。
【００５４】
いくつかの最近の開発は、便試料のサンプリングおよび操作を行なうデバイスに焦点を当てている。EP 1 366 715には、便試料の回収のための特殊な回収チューブが開示されている。この抽出チューブは、本質的に、(a)内部が中空で、上部が開口し、バッファー溶液を受けることが可能なコンテナ体、(b)便試料の回収のための縫い付けられた小さなロッドを備えた上ブタであって、前記縫い付けられた小さなロッドは、コンテナ体の上端に上ブタが当たるとコンテナ体の内部の軸に沿って突き出る、ならびに(c)前記コンテナ体内部のトップチャンバーとボトムチャンバーを分離するように前記コンテナ体内部の中間部に備え付けられた仕切りであって、前記仕切りは、前記トップチャンバーの過剰な便を保持し、小さなロッドの縫い付けられた部分が前記ボトムチャンバー内に通過することが可能なように、前記縫い付けられた小さなロッドの通過を可能にするのに適した軸に沿った穴を有する、を備える。この抽出チューブは、さらに底が開口し、コンテナ体の底部に可動するように当たる底ブタが備え付けられたコンテナ体を有するので、前記抽出チューブは、自動解析装置のサンプルホルダープレートに挿入される一次サンプリングチューブとして直接使用することができ、その後前記底ブタを取り外して前記コンテナ体がひっくり返される。EP 1 366 715に開示されるデバイスは、規定量の便試料の都合のいい取り扱いが可能であり、適切な抽出後、チューブを自動分析装置の試料ホルダー中に直接設置してもよいという利点を有する。
【００５５】
便試料の都合のよいサンプリングおよび取り扱いに適切な、精巧に作製された便サンプリングデバイスの第2の例がWO 03/068398に開示される。
【００５６】
好ましくは、便試料は、サンプリング後または冷却保存、より都合よくは凍結保存後に直接使用または処理される。凍結便試料は、溶解し、その後適切なバッファーに希釈して、混合および遠心分離することで処理することができる。上清は、その後のマーカーS100A12の測定のために液体試料として使用される。
【００５７】
処理済便試料のアリコートとS100A12に対する特異的結合剤を、結合剤S100A12-複合体の形成に適した条件下でインキュベートする。何ら発明の努力を伴うことなく当業者はかかる適切なインキュベーション条件を容易に同定することができるので、かかる条件を特定する必要はない。
【００５８】
本発明に開示される方法による最終工程として、複合体の量を測定し、その量をCRCの診断に相関させる。当業者が理解するように、特異的結合剤-S100A12複合体の量を測定するためには非常に多くの方法があり、関連のある教本（例えばTijssen P., 上述、またはDiamandis et al. (編), Immunoassay, Academic Press, Boston (1996)参照）中にその全てが詳述される。
【００５９】
好ましくは、S100A12は、サンドイッチ型アッセイ形式で検出される。かかるアッセイにおいて、第1の特異的結合剤を使用して、S100A12を一枚のスライドガラス上に捕捉し、他のスライドガラス上で、直接または間接的に検出可能なように標識された第2の特異的結合剤を使用する。
【００６０】
また、例えばインサイチュでの結腸直腸癌細胞の検出のための他手段、生検、または免疫組織学的染色法において、CRCの評価のためにS100A12に対する抗体を使用することもできる。
【００６１】
好ましくは、S100A12に対する抗体は、定性的（S100A12の有無）または定量的（S100A12の量を測定）イムノアッセイに使用される。
【００６２】
驚くべきことに、上述のように、個体試料から得られた便試料からS100A12を測定することができることが見出された。CRCの診断において、マーカーS100A12を適用するために組織試料および生検試料は必要ない。
【００６３】
例えば健常組織と癌性組織を比較して、組織試料への常套的なプロテオミクス法の応用は、選択される組織/疾患について多くの潜在的マーカー候補の同定をもたらすが、これらのマーカー候補は循環中で偶然かつまれな場合に発見される。驚くべきことに、本発明の発明者らは、便試料中にタンパク質S100A12を検出することができた。発明者らは、個体から得られたかかる便試料中のS100A12の存在は結腸直腸癌の診断に相関可能であると示すことができた。
【００６４】
また、個体から得られたかかる便試料中のS100A12の有無は、患者における結腸直腸癌の有無と相関可能であることも見出された。本発明はまた、a) 個体から得られた便試料を提供する工程、b) 前記試料を処理して処理済液体試料を得る工程、c) 前記処理済液体試料とS100A12に対する特異的結合剤を、前記結合剤とS100A12の複合体の形成に適した条件下で接触させる工程、ならびにd) (c)の複合体の非存在を結腸直腸癌の非存在の指標として使用する工程を含む、結腸直腸癌を排除する方法にも関する。
【００６５】
当業者が理解するように、便試料中のS100A12についての陽性結果は、必ずしも患者がCRCを有するということを意味しない。しかし、便試料中のS100A12についての陽性の値は、明確な指標がさらなる診断および精密な診断を正当化するともなされるはずである。好ましい態様において、便試料から測定される際のS100A12についての陽性の値は、患者がさらなる調査、特に仮想のコンピューターによる断層結腸写真（VCTC）または結腸鏡検査を必要とすることの指標として使用される。好ましくは、便試料中の陽性の値は、患者の（診断）検査における次の工程として結腸鏡検査が保証されることの指標として使用される。
【００６６】
タンパク質S100A12のレベルを測定することは、CRCの分野において極めて有利であることが実証されている。従って、さらに好ましい態様において、本発明は、結腸直腸癌の診断における、個体から得られた便試料からのマーカー分子としてのタンパク質S100A12の使用に関する。
【００６７】
用語、マーカー分子は、個体から得られた処理済便試料から測定された際に、検体S100A12の存在または高レベルがCRCの存在を記すことを示すために使用される。明確には、マーカーS100A12は、CRCの存在またはCRCの評価に使用される測定値について、任意の適切な手段により測定され得る。
【００６８】
当業者に明らかなように、本発明は、配列番号：1の全長タンパク質S100A12の測定に限定されることを意図しない。また、本発明を実施しながら、S100A12の生理学的断片を測定することができ、CRCのマーカーとして使用することができる。好ましくは、免疫学的に検出可能な断片は、前記マーカーポリペプチドの少なくとも6、7、8、10、12、15または20個の連続したアミノ酸を含む。細胞により放出されるか、または細胞外マトリクス中に存在するタンパク質は、例えば炎症の際に損傷を受け得、かかる断片に分解または切断され得ることが当業者には理解されよう。当業者が理解するように、S100A12またはその断片は、複合体の一部としても存在し得る。このような複合体も、本発明の意味において、マーカーとして使用してもよい。また、あるいは代替的に、S100A12ポリペプチドは翻訳後修飾を受けても良く、かかる修飾されたS100A12をCRCのマーカーとして使用してもよい。
【００６９】
S100A12の人工断片を、例えばイムノアッセイの陽性対照として、または免疫原として使用してもよい。好ましくは、人工断片は、合成技術または組換え技術により産生された配列番号：1に開示される配列由来の、少なくとも6、7、8、9、10、12個または少なくとも15個の連続したアミノ酸からなるペプチドを包含する。好ましくは、このような人工断片は、少なくとも1つの診断目的のエピトープを含む。また、好適な人工断片は、少なくとも2つの目的のエピトープを含み、サンドイッチイムノアッセイにおける陽性対照としての使用に適している。
【００７０】
結腸直腸癌の早期診断において、新規マーカーS100A12を使用することが好ましい。しかしながら、当業者が理解するように、他のマーカーと同様にS100A12はまた、既に、より進行した腫瘍段階のCRCに苦しんでいる患者の診断および追跡調査において大きな利点を有する。
【００７１】
S100A12の濃度は、CRCの腫瘍負荷と密接に相関している。そのため、該マーカーは、治療後のCRC患者の追跡調査にも適している。好ましい態様において、新規マーカーS100A12は、CRCに苦しむ患者の追跡調査に使用される。CRCを定期的に、例えば3ヵ月間隔、6ヶ月間隔または1年間隔で測定することにより、腫瘍の進行および/または場合によっては腫瘍の再発を評価することができる。
【００７２】
正常カットオフ値よりも高いS100A12の増加または再現はCRC腫瘍の進行または腫瘍の再発のいずれかを示す。従って、さらに好ましい態様は、インビトロ測定による、腫瘍病変の除去のための手術後の結腸直腸癌に苦しむ患者の評価方法に関し、該方法はa) 前記患者から得られた便試料を提供する工程、b) 前記試料とS100A12に対する特異的結合剤を、前記結合剤とS100A12の複合体の形成に適した条件下で接触させる工程、c) 工程(b)で形成された複合体の量を測定する工程、ならびにd) (c)で測定された複合体の量と結腸直腸癌の再発または進行を相関させる工程を含む。便試料由来のS100A12の測定は特に有用であり、好ましい態様において、胃腸管内のCRC腫瘍の再発の早期検出に使用される。
【００７３】
結腸および直腸はともに胃腸管の一部である。ここで、S100A12が結腸直腸癌について患者のスクリーニングに有用である可能性が最も高いことが示されており、便試料中のS100A12の存在を他の種類の胃腸癌の評価における診断補助としても使用することができる可能性は極めて高い。さらに好ましい態様において、本発明は胃腸腫瘍の評価における便試料から測定されるS100A12の使用に関する。好ましくは、便試料から測定されるS100A12はまた、胃の腫瘍の評価にも使用される。便試料からのS100A12の測定は有用であり得、そのために、胃腸管内の胃腸腫瘍の早期検出において、本発明の好ましい態様が示される。
【００７４】
タンパク質S100A12それ自体の使用は、便からのCRC診断の困難な分野に対して大きな進歩を示す。S100A12とヘモグロビンもしくはヘモグロビン-ハプトグロビン複合体などの他の公知のマーカー、または今後発見されるであろうCRCの他のマーカーの測定を組み合わすことは、それぞれCRCの評価におけるさらなる向上を生じ、生じ得る。従って、さらに好ましい態様において、本発明は、個体から得られた便試料由来の結腸直腸癌の診断における、結腸直腸癌についての1つ以上の他のマーカー分子と組み合わせた結腸直腸癌についてのマーカー分子としてのS100A12の使用に関する。S100A12の測定と組み合わされる、選択される他の好ましいCRCマーカーは、TIMP-1、カルプロテクチン、腫瘍M2ピルビン酸キナーゼ（M2-PK）、ヘモグロビンおよび/またはヘモグロビン-ハプトグロビン複合体である。
【００７５】
さらに好ましい態様として、本発明は、ヘモグロビン/ハプトグロビン複合体、ヘモグロビン、メタロプロテアーゼ組織インヒビター1（TIMP-1）、カルプロテクチン、および腫瘍M2ピルビン酸キナーゼ（M2-PK）からなる群より選択された、結腸直腸癌についての1つ以上の他のマーカー分子と組み合わされた、結腸直腸癌についてのマーカー分子としてのタンパク質S100A12の使用を開示する。
【００７６】
好ましい態様において、本発明は、CRCの評価におけるマーカーS100A12およびTIMP-1を含むマーカー組合せの使用に関し、両マーカーは便試料から測定される。
【００７７】
好ましい態様において、本発明は、CRCの評価におけるマーカーS100A12およびヘモグロビンを含むマーカー組合せの使用に関し、両マーカーは便試料から測定される。
【００７８】
好ましい態様において、本発明は、CRCの評価におけるマーカーS100A12およびヘモグロビン/ハプトグロビン複合体を含むマーカー組合せの使用に関し、両マーカーは便試料から測定される。
【００７９】
好ましい態様において、本発明は、CRCの評価におけるマーカーS100A12および腫瘍M2ピルビン酸キナーゼ（M2-PK）を含むマーカー組合せの使用に関し、両マーカーは便試料から測定される。
【００８０】
また、さらに好ましい態様において、本発明は、CRCの評価におけるマーカーS100A12、TIMP-1およびヘモグロビンを含むマーカー組合せの使用に関し、3つ全てのマーカーは便試料から測定される。
【００８１】
また、さらに好ましい態様において、本発明は、CRCの評価におけるマーカーS100A12、TIMP-1およびヘモグロビン/ハプトグロビン複合体を含むマーカー組合せの使用に関し、3つ全てのマーカーは便試料から測定される。
【００８２】
TIMP-1（=組織プラスミノーゲンアクチベーター1）
マトリクスメタロプロテアーゼ（MMP）は腫瘍の成長および拡散に中心的な役割を果たし、細胞外マトリクスの酵素分解に寄与する。天然に存在するMMPのインヒビターは、MMP組織インヒビターまたはTIMPと称される。TIMPはMMPの活性化形態と密な1：1化学量論的複合体を形成し、これらの酵素の触媒活性を阻害する。
【００８３】
TIMP-1（Kodama, S., et al., Matrix 9 (1989) 1-6；Cooksley, S., et al., Matrix 10 (1990) 285-291；Clark, I.M., et al., Matrix 11 (1991) 76-85）およびTIMP-2（Fujimoto, N., et al., Clin. Chim. Acta 220 (1993) 31-45）の検出について多くの酵素結合イムノアッセイが記載されている。これらのアッセイは体液、例えば血清、血漿、羊水、脳脊髄液および尿に適用されている。当該技術分野において便試料中のTIMP-1の存在を示しているデータは見られない。当該技術分野において利用可能なデータはなく、便試料中のTIMP-1の存在は臨床的に有用であり得るという事実が示されている。
【００８４】
イムノアッセイなどの特異的結合アッセイの分野における診断試薬は、通常、キットの形態で最も良く提供されており、該キットは特異的結合剤およびアッセイの実行に必要な補助試薬を含む。そのため、本発明はまた、S100A12に特異的な少なくとも1つの特異的結合剤およびS100A12の測定のための補助試薬を含む免疫学的キットに関する。
【００８５】
診断試験の精度は、しばしばその受信者動作特性（ROC）により説明される（特に、Zweig, M.H.およびCampbell, G., Clin. Chem. 39 (1993) 561-577参照）。ROCグラフは観察されたデータの全範囲にわたり識別閾値を連続的に変動させることで得られる全ての感度/特異性ペアのプロットである。
【００８６】
実験室試験の臨床成績は、その診断精度、または被験体を臨床的に関連のあるサブグループに正確に分類する能力に依存する。診断精度は、調査された被験体の2つの異なる症状を正確に区別する試験の能力を測定する。かかる症状は、例えば、健常および疾患、または良性疾患対悪性疾患である。
【００８７】
それぞれの場合において、ROCプロットは、識別閾値の全範囲についての感度対1-特異性をプロットすることによる2分布間の重複を示す。y軸上は感度または真陽性画分［（真陽性試験結果数）/（真陽性数+偽陰性試験結果数）で規定される］である。これはまた、疾患または症状の存在下での陽性度ともいう。これは罹患したサブグループのみから計算される。x軸上は偽陽性画分または1-特異性［（偽陽性結果数）/（真陰性数+偽陽性結果数）で規定される］である。これは特異性の指標であり、罹患していないサブグループ全体から計算される。真陽性画分および偽陽性画分は、2つの異なるサブグループの試験結果を用いて全体的に別々に計算されるので、ROCプロットは試料における疾患の罹患率から独立している。ROCプロット上のそれぞれの点は、特定の識別閾値に対応する感度/1−特異性のペアを示す。完全な識別による試験（2つの結果の識別に重複がない）は、真陽性画分が1.0または100％（完全な感度）である、左上の角を通過するROCプロットを有し、偽陽性画分が0（完全な特異性）である。区別がない試験についての理論的なプロット（2つの群についての結果が同一の分布）は、左下の角から右上の角までの45°の対角線である。ほとんどのプロットはこれら2つの極値の間に該当する。（ROCプロットが45°の対角線よりも完全に下にある場合、これは「陽性度」についての基準値を「より大きい」から「未満」へと逆にすることで容易に矯正される。）定性的に、プロットが左上の角に近づくほどに試験の全体の精度は高くなる。
【００８８】
実験室試験の診断の精度を定量化するためのある都合のよい最終目標は、単独の数によりその成績を表すことである。最も一般的な世界的尺度はROCプロットの曲線下面積である。慣例により、この面積は常に≧0.5である（もしそうでなければ、そうなるように決定基準を入れ換え得る）。数値は1.0（２群の試験値の完全な分離）と0.5（２群間の試験値に明らかな分布の差が無い）の間の範囲である。該面積は、該斜め線に最も近い点または90％特異性における感度などのプロットの特定の部分だけでなく、全プロットにも依存する。これは、AUCが完全なもの（面積＝1.0）にどれだけ近いかということの定量的で説明的な表現である。
【００８９】
新規マーカーS100A12の臨床的有用性は、受信者動作特性分析(ROC；Zweig，M.H.およびCampbell，G.、Clin. Chem. 39 (1993)561-577)を用いて、確立されたマーカーヘモグロビンとの比較および組合せにおいて評価されている。この分析は、実施例のセクションに示すような充分に規定された患者のコホート由来の試料に基づいている。
【００９０】
確立されたマーカーヘモグロビン単独と比べて、S100A12単独の測定に基づく診断方法は、曲線下面積によって示されるものと少なくとも同等に良好な診断精度(感度/特異性プロフィール)を有することがわかった。
【００９１】
以下の実施例、図面、および配列表は、本発明の理解を補助するために提供され、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載する。本発明の精神から逸脱せずに、記載される手順において変更がなされ得ることを理解されたい。
【００９２】
略語
ABTS  2,2'-アジノ-ジ-[3-エチルベンズチアゾリンスルホネート(6)]ジアンモニウム塩
BSA  ウシ血清アルブミン
cDNA  相補DNA
DMSO  ジメチルスルホキシド
DTT  ジチオトレイトール
EDTA  エチレンジアミン四酢酸
ELISA  酵素免疫測定法
ESI  エレクトロスプレーイオン化
FCS  ウシ胎児血清
IAA  ヨードアセトアミド
IgG  免疫グロブリンG
LC  液体クロマトグラフィー
MS  質量分析
MES  メシチル-2,4,6-トリメチルフェニル
PAGE  ポリアクリルアミドゲル電気泳動
PBS  リン酸緩衝生理食塩水
PI  等電点
POD  ホースラディッシュペルオキシダーゼ
RTS  ラピッドトランスレーションシステム
SDS  ドデシル硫酸ナトリウム
【実施例】
【００９３】
実施例１
潜在的な結腸直腸癌のマーカーとしてのS100A12の同定
組織源
結腸直腸癌の潜在的な診断的マーカーとしての腫瘍特異的タンパク質を同定するために、プロテオミクス法を用いて3つの異なる種類の組織の分析を行う。
【００９４】
総計で結腸直腸癌を有する10人の患者からの組織試料を分析する。各患者から治療的切除に由来する3つの異なる組織の種類：腫瘍組織（>80%腫瘍）（T）、近隣の健常な組織（N）、および近隣の健常な粘膜からはぎ取った粘膜（M）を収集する。後者の2つの組織の種類は適合（matched）する健常対照試料とする。組織を切除の直後、即座に凍結させ、処理の前に-80℃で貯蔵する。腫瘍を組織病理学的基準によって診断する。
【００９５】
組織の調製
0.8〜1.2 gの凍結組織を乳鉢に入れ、液体窒素により完全に凍結させる。組織を乳鉢の中で微粉状にし、10倍容量（w/v）の溶解緩衝液（40mMクエン酸Na（Na-citrate）、5mM MgCl2、1%ゲナポール（Genapol)X-080、0.02%アジ化Na（Na-azide）、Complete（登録商標)EDTA非含有 [Roche Diagnostics GmbH、Mannheim、Germany、カタログ番号1 873 580] ）に溶解し、その後Wheaton（登録商標）ガラスホモジナイザー（20 x ゆるいフィッティング（loose fitting）、20 x きつい（tight）フィッティング）でホモジナイズする。3mlのホモジネートを1時間、4,500 x gで、ショ糖密度遠心分離（10〜60%のショ糖）に供する。この遠心分離工程の後、3つの画分を得る。勾配の頂部の画分は、可溶性タンパク質を含有し、さらなる分析に用いる。
【００９６】
LC-ESI-MSMS分析のための試料の調製
供給業者のマニュアルの指示に従い、可溶性タンパク質画分のタンパク質濃度をBio-Rad（登録商標）タンパク質アッセイ（カタログ番号500-0006、Bio-Rad Laboratories GmbH、Muenchen、Germany）を用いて測定する。200μgのタンパク質に相当する容積に、4mlの還元緩衝液（9 M 尿素、2mM DTT、100mM KH2PO4、pH8.2 NaOH）を加え、1時間インキュベートする。溶液をAmicon（登録商標)Ultra 10 kD デバイス（Millipore GmbH、Schwalbach、Germany）で250μlに濃縮する。アルキル化のために、該250μlを1mlのアルキル化緩衝液（9 M 尿素、4mM ヨードアセトアミド、100mM KH2PO4、pH8.2 NaOH）に移し、6時間インキュベートし、その後Amicon（登録商標)Ultra 10 kD デバイスで250μlに濃縮する。洗浄のために1mlの9 M 尿素を加え、再度Amicon（登録商標)Ultra 10 kD デバイスで250μlに濃縮する。洗浄を3回繰り返す。
【００９７】
プロテアーゼ消化のために、濃縮した溶液を希釈して2.5 M 尿素にし、4μgのトリプシン（プロテオミクスグレード、Roche Diagnostics GmbH、Mannheim、Germany）と共に一晩インキュベートする。1mlの1% ギ酸を加えることにより消化を止め、分析する。
【００９８】
LC-ESI-MSMS分析
トリプシン消化産物 (500μl)を、SCXおよびRP Pepmep C18カラム (LC Packings、Idstein、Germany)からなる2次元Nano-HPLC-System (Ultimate、Famos、Switchos；LC Packings、Idstein、Germany)で分離する。90分のグラジエント（5〜95%のアセトニトリル）を用い、RPカラムで、連続的にさらに分離し、ESI-MSイオントラップ (LCQ deca XP；Thermo Electron、Massachusetts、USA；パラメーターについては表2参照)で、データ依存的スキャンを用いてオンライン分析する、11個のSCX画分（0、5、10、25、50、100、200、300、400、500、1,500mM NH4Acを用いる段階溶離）を得る。各試料について、3回のランを行う。表2に記載されたパラメーターを用いて、生のデータをBioworks 3.1ソフトウェア（Thermo Electron、Massachusetts、USA）で処理する。反復ランから得られる同定されたペプチドおよびタンパク質の併せたリストを得る。
【００９９】
タンパク質S100A12は、表3に示す部分配列の補助によって同定される。
【０１００】
結腸直腸癌の潜在的マーカーとしてのS100A12の検出
各患者について、腫瘍試料から同定されたタンパク質、および対応するペプチドの数を、近隣の正常な組織、およびはぎ取った正常な粘膜組織に由来する対応する結果と比較する。この手段によって、タンパク質S100A12は、腫瘍組織において、特異的に発現されているか、または強く過剰発現されており、健常な対照組織においては、検出し得ない、もしくは少しは検出し得るか、または少し強く発現されていることがわかる。したがって、多くの他のタンパク質の中で、S100A12は、結腸直腸癌の診断における使用のための候補マーカーとして適する。
【０１０１】
タンパク質S100A12は、結腸直腸癌を有する患者に由来する腫瘍組織において強く過剰に提示された（over-represented）。タンパク質S100A12の以下のペプチド配列は、腫瘍組織についてBioworks 3.1形式LCQ-MS2-データを用いて同定した。
【０１０２】
2009537798.tif 000004
【０１０３】
2009537798.tif 000005
【０１０４】
上記の２つのペプチド配列は、S100A12の部分配列として同定された。それぞれ、配列(i)は、配列番号：1のアミノ酸2〜アミノ酸21のアミノ酸位置を表し、配列(ii)は、配列番号：1のアミノ酸23〜アミノ酸34のアミノ酸位置を表す。
【０１０５】
実施例２
結腸直腸癌のマーカータンパク質S100A12に対する抗体の産生
血清、血漿、血液および特に便試料中のS100A12の測定におけるさらなる使用のために、結腸直腸癌のマーカーのタンパク質S100A12に対するポリクローナル抗体を産生させる。例えば、S100A12のかかる測定は、免疫検出アッセイ、例えばウエスタンブロッティングおよびELISAによって行なわれる。
【０１０６】
大腸菌（E. coli）における組み換えタンパク質の発現
S100A12に対する抗体を産生させるために、免疫原を得るために、タンパク質の組み換え発現を行う。RTS 100発現系および大腸菌の組み合わせを適用することにより発現させる。最初の段階において、「ProteoExpert RTS E.coli HY」システムを用いて、該DNA配列を解析し、高収率のcDNAサイレント変異バリアント、およびそれぞれのPCRプライマー配列についての推奨を得る。これは商業的なウェブに基づくサービス（www.proteoexpert.com）である。推奨されるプライマー対を用い、cDNAから直鎖状PCR鋳型を産生させるための、ならびにS100A12タンパク質をコードするヌクレオチド配列のインビトロの転写および発現のための、「RTS 100 E. coli Linear Template Generation Set, His-tag（RTS 100 E. coli Linear Template Generation Set、His-tag）」（Roche Diagnostics GmbH、Mannheim、Germany、カタログ番号3186237）システムを用いる。ウエスタンブロット検出および後の精製のために、発現されるタンパク質はHisタグを含む。最もよく発現するバリアントを同定する。PCRから発現および検出までのすべての工程は、製造業者の使用説明書に従って行う。すべての必要なT7調節領域（プロモーター、リボソーム結合部位、およびT7ターミネーター）を含むそれぞれのPCR産物を、製造業者の使用説明書に従い、pBAD TOPO（登録商標）ベクター（Invitrogen、Karlsruhe、Germany、カタログ番号K 4300/01）の中にクローン化させる。T7調節配列を用いる発現のために、該構築物を大腸菌BL 21 (DE 3)に形質転換させ (Studier、F.W.,ら、Methods Enzymol. 185 (1990)60〜89)、形質転換された細菌をタンパク質発現のために1lのバッチで培養する。
【０１０７】
His-S100A12融合タンパク質の精製を、Niキレートカラムで、標準的な手順に従って行う。手短に言えば、His-S100A12融合タンパク質の発現ベクターを含有する1lの細菌培養物を遠心分離によりペレット状にする。pH8.0の50mMリン酸Na、300mM NaCl、1mg/mLリソチーム、2×完全(無EDTA)およびDNaseを含有する溶菌緩衝液に、細胞ペレットを再懸濁させ、その後に、フレンチプレス(型：IUL Basic Z)を用いて細胞破砕する。不溶性物質を高速遠心分離によりペレット状にし、上清をNiキレートクロマトグラフィーカラムに供する。数床容量の洗浄緩衝液(50mMリン酸Na、pH8.0、300mM NaCl、20mMイミダゾール)でカラムを洗浄する。最後に、20〜500mMイミダゾールの直線勾配で50mMリン酸Na、pH8.0、300mM NaClを含有する溶出緩衝液を用いて、結合抗原を単離する。
【０１０８】
S100A12に対するモノクローナル抗体の産生
a）マウスの免疫化
最初に100μgのS100A12で12週齢のA/Jマウスを腹腔内で免疫する。これに続いて6週間後に、1ヶ月間隔で2回さらに腹腔内で免疫する。この方法において、各マウスに、水酸化アルミニウムに吸着された100μgのS100A12、および細菌数109の百日咳菌（Bordetella pertussis）を投与する。その後、最後の2回の免疫化を、各々についてPBS緩衝液中の100μgのS100A12を用いる融合の3日前、および2日前に、静脈内で行う。
【０１０９】
b）融合およびクローニング
a）に従って免疫したマウスの脾臓細胞を、Galfre、G.およびMilstein、C.、Methods in Enzymology 73 (1981)3〜46に従って骨髄腫細胞と融合させる。この方法において、免疫したマウスの約1*108の脾臓細胞を2x107の骨髄腫細胞（P3X63-Ag8-653、ATCC CRL1580）と混合し、遠心分離する（300 x g 、4℃で10分）。次いで細胞をウシ胎児血清（FCS）なしのRPMI 1640培地で一度洗浄し、50mlの円錐管で、400 x gで再度遠心分離する。上清を捨て、細胞沈降物をタッピングにより穏やかにほぐし、1mlのPEG（分子量4,000、Merck、Darmstadt）を加え、ピペッティングにより混合する。1分間37℃の水浴の中に入れた後、FCSなしの5mlのRPMI 1640を室温で4〜5分かけて滴下する。その後、10%のFCSを含有する5mlのRPMI 1640を、約1分以内で滴下し、完全に混合し、培地（RPMI 1640+10% FCS）を満たして50 mlにし、続いて400 x g で10分間4℃で遠心分離する。沈降した細胞を10%のFCSを含有するRPMI 1640培地に回収し、ヒポキサンチン-アザセリン選択培地（RPMI 1640+10% FCS中の100 mmol/l ヒポキサンチン、1μg/ml アザセリン）中に播種する。成長因子として100 U/mlのインターロイキン 6を培地に加える。
【０１１０】
約10日後に初代培養物を特異的抗体について試験する。S100A12陽性初代培養物を、蛍光活性化セルソーターによって、96ウェル細胞培養プレートでクローン化させる。この方法において、再度成長添加物として100 U/mlのインターロイキン 6を培地に加える。
【０１１１】
c）細胞培養物上清からの免疫グロブリンの単離
得られたハイブリドーマ細胞を、10%のFCSを含有するRPMI 1640培地に、1 mlあたり1x105細胞の密度で播種し、発酵槽（Thermodux Co.、Wertheim/Main、Model MCS-104XL、注文番号144-050）の中で7日間増殖させる。培養物上清において、平均して1 mlあたり100μgのモノクローナル抗体の濃度が得られる。培養物上清からのこの抗体の精製を、タンパク質化学における従来の方法（例えばBruck、C.ら、Methods Enzymol. 121 (1986)587〜695による）により行う。
【０１１２】
ポリクローナル抗体の作製
a）免疫化
免疫化のために、タンパク質溶液の新鮮なエマルション（100μg/mlのタンパク質S100A12）および1:1の比のフロイント完全アジュバントを調製する。各ウサギを1日目、7日目、14日目、ならびに30日目、60日目、および90日目に1mlのエマルションで免疫する。血液を採り、得られた抗S100A12血清を、実施例3および実施例4に記載したように、さらなる実験に用いる。
【０１１３】
b）カプリル酸および硫酸アンモニウムを用いた連続的沈殿によるウサギ血清からのIgG（免疫グロブリン G）の精製
ウサギ血清1容を酢酸塩緩衝液（60mM、pH4.0）4容で希釈する。2 M Tris塩基でpHを4.5に調節する。カプリル酸（25μl/mlの希釈した試料）を激しく攪拌しながら滴下する。30分後、試料を遠心分離し（13,000 x g、30分、4℃）、ペレットを捨て、上清を収集する。2 M Tris塩基を加えることにより上清のpHを7.5に調節し、濾過する（0.2μm）。
【０１１４】
上清の中の免疫グロブリンを、激しく攪拌しながら、4 M硫酸アンモニウム溶液を滴下して沈殿させ最終濃度を2 Mにする。沈殿した免疫グロブリンを遠心分離（8,000 x g、15分、4℃）により収集する。
【０１１５】
上清を捨てる。ペレットを10mM NaH2PO4/NaOH、pH7.5、30mM NaClに溶解し、完全に透析する。透析物を遠心分離し（13,000 x g、15分、4℃）、濾過する（0.2μm）。
【０１１６】
ポリクローナルウサギIgGのビオチン化
ポリクローナルウサギIgGを10mM NaH2PO4/NaOH、pH7.5、30mM NaCl中で10 mg/mlにする。IgG溶液1 mlあたり50μlのビオチン-N-ヒドロキシスクシンイミド（DMSO中の3.6 mg/ml）を加える。室温で30分静置した後に、試料をSuperdex 200でクロマトグラフィーに供する（10mM NaH2PO4/NaOH、pH7.5、30mM NaCl）。ビオチン化IgGを含有する画分を収集する。モノクローナル抗体を、同じ手順によってビオチン化する。
【０１１７】
ポリクローナルウサギIgGのジゴキシゲニン化（Digoxygenylation）
ポリクローナルウサギIgGを10mM NaH2PO4/NaOH、30mM NaCl、pH7.5中で10 mg/mlにする。IgG溶液1 mlあたり50μlのジゴキシゲニン-3-O-メチルカルボニル-ε-アミノカプロン酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（Roche Diagnostics、Mannheim、Germany、カタログ番号1 333 054）（DMSO中3.8 mg/ml）を加える。室温で30分静置した後に、試料をSuperdex（登録商標)200でクロマトグラフィーに供する（10mM NaH2PO4/NaOH、pH7.5、30mM NaCl）。ジゴキシゲニン化IgGを含有する画分を収集する。モノクローナル抗体を、同じ手順によってジゴキシゲニンで標識する。
【０１１８】
実施例３
癌組織および健常組織それぞれにおけるS100A12のウエスタンブロッティング検出
腫瘍試料および健常対照試料からの組織溶解物を実施例１「組織の調製」に記載されるように調製する。
【０１１９】
SDS-PAGE、およびウエスタンブロッティングをInvitrogen、Karlsruhe、Germanyの試薬、および装置を用いて行う。試験した各組織試料について、10μgの組織溶解物を還元型NuPAGE（登録商標)(Invitrogen)SDS試料緩衝液で希釈し、10分間95℃で加熱する。試料をMES泳動（running）緩衝液系中で4〜12%のNuPAGE（登録商標）ゲル (Tris-グリシン)において泳動する。Invitrogen XCell IITM Blot Module (Invitrogen)およびNuPAGE（登録商標）転写緩衝液系を用いて、ゲルで分離したポリペプチドをニトロセルロース膜にブロットする。膜をPBS/0.05% Tween-20で3回洗浄し、Roti（登録商標）-Blockブロッキング緩衝液（A151.1；Carl Roth GmbH、Karlsruhe、Germany）で2時間ブロックする。一次抗体、ポリクローナルウサギ抗S100A12血清（実施例２で記載した産生）をRoti（登録商標）-Blockブロッキング緩衝液で1:10,000で希釈し、1時間膜とともにインキュベートする。膜をPBS/0.05% Tween-20で6回洗浄する。特異的に結合した一次ウサギ抗体をPOD結合ポリクローナルヒツジ抗ウサギIgG抗体で標識し、0.5 x Roti（登録商標）-Blockブロッキング緩衝液で希釈して10mU/mlにする。1時間のインキュベーションの後、膜をPBS/0.05% Tween-20で6回洗浄する。結合したPOD結合抗ウサギ抗体の検出のために、膜をLumi-LightPLUS ウエスタンブロッティング基質 (注文番号2015196、Roche Diagnostics GmbH、Mannheim、Germany)とともにインキュベートし、オートラジオグラフのフイルムに露光させる（exposed）。
【０１２０】
CRCと診断された４名の個体由来の腫瘍および正常組織を記載のようにしてブロットした場合、腫瘍組織においてS100A12タンパク質の高発現が検出されるが、正常組織ではそれぞれS100A12が全く見られないか、ずっと少ないS100A12が見られる(図1)。
【０１２１】
実施例4
便被検物質の処理
a)洗剤抽出
Sarstedt（ドイツ）製のオーダー番号80.623.022の特別な試料採取デバイスにおいて患者から試料あたり約1gの便を採取し、凍結し、-70℃で保存する。分析のため、便試料を解凍し、ほぼ100mgの便試料を、Roche、ドイツ製(オーダー番号：11 873 580)プロテーゼインヒビターカクテルMini Complete無EDTA:
2009537798.tif 000006
を加えたリン酸緩衝液、pH7.4で10倍希釈する。
【０１２２】
連続振とうしながら1時間室温で、およびさらに１時間4℃で振とうなしで試料をインキュベートする。3.000×gで15分間遠心分離後、上清をピペッティングにより除去し、5μmの細孔径を有する膜フィルターを用いて濾過する。試料を等分し、-70℃で保存する。この処理便試料のアリコートを、ELISAによるS100A12の定量に使用する。
【０１２３】
b)尿素抽出
便試料中のS100A12および他の目的のマーカーの測定を改善するため、「最適化抽出緩衝液」が使用される。該抽出緩衝液は、便試料の処理のために、プロテーゼインヒビターカクテル(Mini Complete 無EDTA、Roche、Germany)を以下の緩衝液:
2009537798.tif 000007
に添加することにより新たに調製する。
【０１２４】
便試料を解凍し、50〜100mgの各試料を便試料調製キット(カタログ番号：10745804 Roche、Germany)に移す。便試料の重量に応じて最適化抽出緩衝液を50倍希釈となるように添加する。回転式攪拌装置上で30分間、試料を激しく混合し、10mlチューブ(Sarstedt、Germany)に移し、1200gで10分間遠心分離する。5μm排除フィルター(Ultrafree(登録商標)-CL、Millipore、Germany)を用いて上清を濾過し、等分し、さらなる分析のために-70℃で保存する。これらの便抽出物は、この研究での目的のすべてのバイオマーカーに適している。
【０１２５】
実施例5
ヒト便被検物質中のS100A12の測定のためのELISA
便由来のS100A12測定のためのサンドイッチELISAを開発する。ポリクローナルウサギ抗体を大腸菌内で発現された組換え完全長S100A12での免疫によって生成させる。96ウェルストレプトアビジンプレート(Streptawell、HighBind、Roche、Germany)を使用するサンドイッチELISAを確立するために使用するため、抗血清の精製IgG画分をビオチン化またはジゴキシゲニン化する。便抽出物を試料希釈緩衝液(100mM Tris、pH8.0、2mM CaCl2、1.5% KCL、0.3% Triton X-100、0.2%カゼイン、2%スクロース)中で1:25に希釈し、50μlの試料または標準品を、各ウェルに移す。続いて、アッセイ緩衝液(PBS、pH7.4、0.1% ウシIgG、0.9% NaCl、0.5% Thesit、1% PEG 40,000、0.1% ウシIgG、0.025% ウシγグロブリンアセチル化)に0.5μg/ml ビオチン化ポリクローナル抗体PAB<S100A12>-Biおよび0.5μg/ml ジゴキシゲニン化ポリクローナル抗体PAB<S100A12>-Digを含有する抗体混合物50μlを添加することにより、抗原-抗体複合体の形成が開始される。プレートを60分間インキュベートし、350μlの洗浄緩衝液/ウェル(100mM PBS、pH7.4、0.05% TWEEN-20)で３回洗浄する。その後、100μlの25mU/ml MAB<Dig>-PODコンジュゲート(Roche Diagnostics、Germany)/ウェルを添加し、さらに60分間インキュベートする。350μlの洗浄緩衝液/ウェルで３回洗浄後、100μlのABTS溶液(Roche Diagnostics、Germany)/ウェルを添加し、プレートを60分間インキュベートする。ELISAリーダー(SLT.Spectra II)を使用し、405/620nmで吸光度を測定する。較正のため、組換え完全長S100A12が使用される。
【０１２６】
実施例6
尿素抽出物中の被検物質安定性
S100A12は、4bに記載の抽出方法を用いて調製された便抽出物中において、ヘモグロビンよりも安定なようである。便抽出物を1または3日間室温で保存した場合、S100A12の平均回収はヘモグロビンの平均回収よりも高く、より少ないばらつきを示すようである。安定性を評価するために使用した20個の試料のうち、２つがヘモグロビン陰性である。
【０１２７】
2009537798.tif 000008
【０１２８】
実施例7 
結腸直腸癌におけるS100A12の臨床的有用性
S100A12の臨床的有用性は、充分特徴付けされた患者コホートから得られた便試料を分析することにより評価される。各患者について、同じ腸運動からの２つの便試料を測定し、濃度を分析する。両濃度の相関をピアソン相関係数によって評価すると、密接な相関性が示される。アッセイの感度を改善するため、２つの対の試料の一方において測定された最大濃度を、さらなる分析に使用する。S100A12の診断値をZweig et al(上記)によるROC分析によって評価する。
【０１２９】
最初の２つの試験集団の便試料を、実施例4aに従って抽出する。希釈には、リン酸緩衝生理食塩水pH7.4、1.0mM CaCl2、1.2mM ニトリロ三酢酸、0.1% ウシ血清アルブミンを使用する。第３の試験集団の便試料は、実施例4bに従って抽出し、実施例5に示す試料希釈緩衝液で希釈する。抽出手順は異なるが、S100A12の測定に使用するELISA手順は、すべての患者集団で同一である(実施例5参照)。
【０１３０】
第１の試験集団:
18名の無CRC患者、結腸鏡検査法によって腺腫陽性と診断された10名の患者、ならびにUICC病期IIIおよびIVに分類される進行CRCを有すると診断された23名の患者由来の便試料を得る。S100A12は、各個体から得られた便試料において上記のようにして測定する。
【０１３１】
ROC分析は、上記のZweig，M. H.およびCampbellに従って行なう。曲線下面積によって測定される健常個体とCRC群の患者の識別力は、それぞれ、CRCでは健常対照に対して97% (図2)、CRC＋腺腫では健常対照に対して85% および腺腫では健常対照に対して57%であることがわかる。
【０１３２】
便由来のS100A12の測定に対するCa2+イオンの存在の正の効果を図3に示す。便抽出物を、CaCl2およびニトリロ三酢酸両方の非存在下でリン酸緩衝生理食塩水pH7.4、0.1% ウシ血清アルブミン中で希釈する場合、CaCl2およびニトリロ三酢酸の存在下で測定されるS100A12濃度(図3b)と比べて、低い濃度のS100A12が検出可能である(図3a)。また、Ca2+の非存在下でのELISAの小さいダイナミックレンジ(dynamic range)により、健常対照に対してCRCでは94%というROCプロットのAUCの低下がもたらされるが、改善された緩衝液系では、97%のAUCが観察される。健常対照に対するCRC＋腺腫を考慮すると、AUCは、それぞれ、Ca2+なしでは81%、CaCl2およびニトリロ三酢酸の存在下では85%である。
【０１３３】
第２の拡張試験集団:
結腸鏡検査法によって腺腫陽性と診断された10名の患者、CRCと診断された50名の患者(9名はUICC病期Iに分類；4名はUICC病期IIに分類；21名はUICC病期IIIに分類；13名はUICC病期IVに分類、2名はUICC病期I〜IIIに分類、すなわちIVでない；および1名は病期なしのCRC)ならびに50名の対照(他のGI-疾患を有する、すなわちCRCでない患者から7名；憩室症を有する患者から16名；GI健常に分類されたドナーから8名；および痔を有する患者から19名)から便試料を得る。これらの各個体から得た便試料において、上記のようにしてS100A12を測定する。
【０１３４】
ROC分析は、上記のZweig，M. HおよびCampbellに従って行なう。曲線下面積によって測定される健常個体とCRC群の患者の識別力は、それぞれ、CRCでは対照に対して90%、CRC＋腺腫では健常対照に対して86%、および腺腫では健常対照に対して66%であることがわかる。これは、S100A12が便試料から測定される場合、初期のUICC病期であっても検出されることを示す。
【０１３５】
第３の試験集団
S100A12を、より拡張された第３の試験集団(患者の特徴については表5参照)において測定する。多施設研究のフレームワークにおいて、多数の臨床的に充分特徴付けされた便試料を予見的(prospectively)に採取する。対照集団の患者(結腸鏡検査法を受けている)を、胃腸疾患部門(unit)において集め、平均リスクスクリーニング集団とする。炎症性腸疾患およびいずれかの種類の腺腫を有する患者は、対照集団から除外する。スクリーニング集団における結腸直腸癌患者の低有病率のため、癌患者由来の試料は、種々の外科部門で集める。医師は、結腸直腸癌の診断を確認し、また、各癌患者について病理学的病期分類を示す。グアヤク系FOBTプレスクリーニングによる患者の一般的な診断検査によって導入され得る任意の偏りを評価するため、事前にグアヤク系FOBTを行なっていない亜集団もまた集める。また、可視的であるため直腸出血が検出された患者はすべて、ヘモグロビンの利点に対する偏りが導入され得るため、この亜集団から除外する。
【０１３６】
便試料は252名の対照個体から得る。これらのうち、135名は結腸鏡検査法によってGI健常と確認されているが、残りの対照試料は、いくつかの関連GI疾患を含む。CRC集団は、UICC病期I〜IV由来の186のCRC試料を含む(表6)。38名のCRC患者について、正確な病期分類は不明である。したがって、表6において、規定されたUICC病期を有するCRC患者は合計で186名患者にならない。合計で101名のFOBTによるプレスクリーニングをしていないCRC患者を評価する。
【０１３７】
これらの各個体から得た便試料において、上記のようにしてS100A12を測定する。ROC分析は、上記のZweig，M. HおよびCampbellに従って行なう。曲線下面積(表6)によって測定される対照個体とCRC群の種々の患者の識別力は、すべての対照に対してCRCでは94%、同様に、対照に対してFOBTプレスクリーニングなしのCRCでも94%であることがわかる。疾患病期によるCRC患者の群分けにより、UICC病期Iでは90%およびUICC病期II〜IVでは96〜97%の曲線下面積が示される。FOBTプレスクリーニングによる偏りの証拠は、これらの患者曲線下面積が全CRC集団の曲線下面積と同一であるため、検出されない。
【０１３８】
2009537798.tif 000009
【０１３９】
2009537798.tif 000010
【０１４０】
実施例8
S100A12と他の便マーカーとの組合せ
S100A12と便抽出物由来の他のバイオマーカーの組合せを評価する。市販のELISAを用いて、マーカー、ヘモグロビン、ヘモグロビンとハプトグロビンとのヘテロ複合体、カルプロテクチン、TIMP-1、M2-PKおよびCEAを測定する。ヘモグロビン、ヘモグロビン/ハプトグロビンおよびカルプロテクチンの測定のためのアッセイは、R-Biopharm、Germanyから入手される。Calpro Calprotectin ELISAは、Calpro SA、Norwayで製造されており、ドイツ国外でPhiCalTM Testとして販売されている。CEAの測定のためのアッセイは、Roche Diagnostics、Germanyから入手される。M2-PK用のアッセイはSchebo Biotech、Germanyから、TIMP-1用のアッセイはR&D Systems、USAからそれぞれ供給されている。いくつかのアッセイは便抽出物における測定が意図されるが、２つのアッセイ、すなわちCEAおよびTIMP-1では、便は一般的に使用される試料材料ではない。したがって、アッセイは、抽出便被検物質を代理(represent)する試料中の対応する被検物質の測定に調整されなければならない。CEA測定のため、試料(便抽出物)を20倍に予備希釈するが、それ以外は製造業者の推奨に従ってアッセイを実施する。同様に、TIMP-1の測定のために、アッセイ手順自体は変更せずに試料を3倍に予備希釈する。
【０１４１】
マーカーの組合せによりCRCの診断が改善されるかどうかを試験するため、マーカーをベイズロジスティック回帰(BLR)によって組み合わせる。マーカーの組合せの評価のためのBLRアルゴリズムにおいて、事前ガウス(Gaussian prior)を使用し、Alexander Genkin、David D. LewisおよびDavid Madigan(Large-scale Bayesian logistic regression for text categorization. Technometrics)
のBBR-Softwareにおいて実行する。以下の設定：自動フィーチャー選択なし、事前に分散を0.05に固定、閾値調整なし、および正規化による入力標準化を使用する。数値処置のため、収束閾値0.0005、イテレーション1000および非精密モードでのデフォルト設定は、未変更のままとする。基本アルゴリズムでの結果を、Monte-Carloクロス確認設計において100回の実行によって評価する。各実行において、すべての場合の３分の２および対照を、それぞれ、デフォルト乱数発生器の開始値を19022007にしたMatlab(登録商標)R2006a内臓機能ランドサンプル(randsample)により、トレーニングセット(training set)として選択する。基本アルゴリズムをトレーニングセットに適用し、診断公式を得る。推定罹患事後確率(posterior case-probability)に対する閾値を、トレーニングセットの対照に関して決定し、それぞれ、95%または98%の特異性を得る。次いで、診断公式をデータのその他の３分の１に適用し、所定の閾値における感度および特異性を推定する。
【０１４２】
ヘモグロビンまたはヘモグロビン/ハプトグロビンいずれの偏りも回避するため、事前FOBTプレスクリーニングをしていない101名のCRC患者のみを評価に使用する。スクリーニングアッセイには、ROCプロットのAUCだけが重要なのではない。スクリーニング設定における非常に不可欠な要件は、高特異性において感度が充分良好なことである。低特異性は不必要な追跡手順および患者に対する苦痛を伴う多数の偽陽性結果を引き起こすため、高特異性は重要である。表7に、それぞれ、評価のAUC値ならびに予め設定した特異性95%および98%での感度をまとめる。測定した個々のマーカーのいくつかをBLRによって組み合わせると、CRCの診断のAUC値は+/1%の範囲内で非常に類似する。他方、CRCの検出における全体的な感度は、特に98%の特異性レベルで、S100A12と他のマーカーとの組合せによって有意に改善され得る。S100A12単独は67%の感度を有するが、２つのマーカーS100A12およびヘモグロビン-ハプトグロビン複合体を含むマーカーの組合せは79%の感度を示し、３つのマーカー、S100A12、ヘモグロビン-ハプトグロビン複合体およびTIMP-1を含む最良のマーカーの組合せは、同じ高い特異性レベルで、82%までの感度のさらなる増大を示す。これらのマーカーの組合せは、CRC、特に初期段階でのCRCを検出するために非常に重要であると考えられる。表7から明白なように、マーカーの組合せの使用によって、ずっと高い割合で特に病期Iの結腸直腸癌が検出される。マーカーS100A12の使用は、これらのマーカーの組合せで得られるROCの改善に重要である。
【０１４３】
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【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】図1はウエスタンブロット分析である。４名のCRC患者の腫瘍および正常組織を、ヒトS100A12に対するポリクローナル抗体を使用するウエスタンブロットによって分析した。大腸菌において6xHisタグ化タンパク質として発現された組換えタンパク質を陽性対照として使用した。組換えタンパク質の移動パターンの違いは、内部に含まれる6xHisタグによって引き起こされる。正常組織は、腫瘍を外科的に除去したときに患者から回収した。M：分子量マーカー；r.p.：組換えタンパク質；T：腫瘍組織；N：正常組織。
【図２】図2はROCプロットである。健常個体から得られた18個の試料と比較したときの、CRCを有する患者から得られた23個の試料の評価に関する受信者動作特性(ROC)のプロットを示す。
【図３】図3はCRC患者におけるS100A12濃度の散布図である。便抽出物中のS100A12の測定に対するCa2+イオンの効果。便抽出物を、Ca2+イオンの非存在下(図3a)または存在下(図3b)で希釈した。検出可能な濃度は、Ca2+イオンの存在下の方が高く、増大したダイナミックレンジを越えて分布している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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