(57)【要約】  本発明は、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）と黄体形成ホルモン（ＬＨ）の混合物の医薬製剤の分野、及び当該製剤の製剤方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）又はその変異体並びに黄体形成ホルモン（ＬＨ）又はその変異体、並びにＴｗｅｅｎ  ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、Ｔｗｅｅｎ  ４０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート）、Ｔｗｅｅｎ  ８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）を含むポリソルベートから選択される界面活性剤、を含んで成る凍結乾燥製剤。
【請求項２】
界面活性剤がＴｗｅｅｎ  ２０である、請求項１に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項３】
卵胞刺激ホルモンがヒト卵胞刺激ホルモンであり、そして／あるいは黄体形成ホルモン（ＬＨ）がヒト黄体形成ホルモン（ＬＨ）である、請求項１又は２に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項４】
卵胞刺激ホルモンが尿のヒト卵胞刺激ホルモンであり、そして／あるいは黄体形成ホルモン（ＬＨ）が尿のヒト黄体形成ホルモン（ＬＨ）である、請求項３に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項５】
卵胞刺激ホルモンが組換えヒト卵胞刺激ホルモンであり、そして／あるいは黄体形成ホルモン（ＬＨ）が組換えヒト黄体形成ホルモン（ＬＨ）である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項６】
卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）が全製剤１ｍｇ当たり約０．１〜１０μｇの濃度（ｗ／ｗ）で存在する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項７】
卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）が全製剤１ｍｇ当たり約０．３〜５μｇの濃度で存在する、請求項６に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項８】
卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）が全製剤１ｍｇ当たり約０．３７〜２μｇの濃度で存在する、請求項７に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項９】
黄体形成ホルモン（ＬＨ）が全製剤１ｍｇ当たり約０．１〜３μｇの濃度で存在する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項１０】
黄体形成ホルモン（ＬＨ）が全製剤１ｍｇ当たり約０．１〜１μｇの濃度で存在する、請求項９に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項１１】
黄体形成ホルモン（ＬＨ）が全製剤１ｍｇ当たり約０．１〜０．６μｇの濃度で存在する、請求項１０に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項１２】
ＦＳＨ対ＬＨの比率が約６：１〜約１：６の範囲内にある、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項１３】
ＦＳＨ対ＬＨの比率が約４：１〜約１：２の範囲内にある、請求項１２に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項１４】
ＦＳＨ対ＬＨの比率が約３：１〜約１：１の範囲内にある、請求項１３に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項１５】
ＦＳＨ対ＬＨの比率が約２：１〜約１：１の範囲内にある、請求項１４に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項１６】
更にスクロースを含んで成る、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項１７】
更にメチオニンを含んで成る、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項１８】
更にリン酸緩衝液を含んで成る、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項１９】
以下の成分：ｒＦＳＨ、ｒＬＨ、Ｔｗｅｅｎ  ２０、スクロース、メチオニン、リン酸緩衝液を含んで成る、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項２０】
１２．０μｇの組換えＦＳＨ、３．７μｇの組換えＬＨ、３０．０ｍｇのスクロース、０．４５ｍｇのＮａＨ2ＰＯ4  Ｈ2０、１．１１ｍｇのＮａ2ＨＰＯ4  ２Ｈ2０、０．０５ｍｇのＴｗｅｅｎ  ２０及び０．１ｍｇのＬ−メチオニンを含んで成る、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の凍結乾燥製剤を充填した第一容器及び再構成用の溶媒を含んで成る第二容器を含んで成る製品。
【請求項２２】
第二容器が再構成用の水を含む、請求項２１に記載の製品。
【請求項２３】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の凍結乾燥製剤の製造方法であって、ＦＳＨとＬＴ、そしてＴｗｅｅｎ  ２０との混合物を形成する工程、及び当該混合物を凍結乾燥にかける工程を含んで成る方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、及びＦＳＨと黄体形成ホルモン（ＬＨ）の混合物の凍結乾燥製剤の分野、並びに当該製剤の製造方法に関する。
【０００２】
卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）及び絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）は、ゴナドトロピンのクラスに分類される注射可能なタンパク質である。ＦＳＨ、ＬＨ及びｈＣＧは、単独で、そして組み合わせて、女性及び男性両方の患者の不妊症及び繁殖障害の治療に使用される。
【０００３】
本来、ＦＳＨ及びＬＨは下垂体によって産生される。医薬用途の場合、ＦＳＨ及びＬＨ並びにそれらの変異体は組換え技術で産生されることがあり（ｒＦＳＨ及びｒＬＨ）、あるいはそれらは閉経後の女性の尿から産生されることがある（ｕＦＳＨ及びｕＬＨ）。
【０００４】
ＦＳＨは、排卵誘発（ＯＩ）及び過排卵誘起（ＣＯＨ）の女性の患者において、生殖補助医療（ＡＲＴ）に使用される。排卵誘発の典型的な治療計画において、患者は、ＦＳＨ又は変異体（約７５〜３００ＩＵ  ＦＳＨ／日）を約６〜約１２日間毎日注射で投与される。過排卵誘起の典型的な治療計画において、患者は、ＦＳＨ又は変異体（約１５０〜６００ＩＵ  ＦＳＨ／日）を約６〜約１２日間毎日注射で投与される。
【０００５】
ＦＳＨはまた、精子減少症に罹患している男性の精子形成を誘導するのにも使用される。１５０ＩＵのＦＳＨを週３回、２５００ＩＵのｈＣＧを週２回、併用する計画は、低ゴナドトロピン性性機能低下症に罹患している男性の精子数の向上をもたらすのに成功している1。
【０００６】
ＬＨは、ＯＩ及びＣＯＨにおいて、女性患者、特に非常に低い内因性のＬＨレベルを有するか、又はＬＨに対して抵抗性のある患者、例えば低ゴナドトロピン性性機能低下症（ＨＨ、ＷＨＯグループＩ）に罹患している女性又は年配の患者（すなわち、３５歳以上）、及び胚着床又は早期流産が問題となっている患者においてＦＳＨと組み合わせて使用される。ＬＨとＦＳＨとの組み合わせは、閉経後の女性の尿から抽出されたヒト閉経期ゴナドトロピン（ｈＭＧ）と称される製剤において伝統的に利用されている。ｈＭＧは１：１のＦＳＨ：ＬＨ活性比を有する。
【０００７】
ＣＧはＬＨと同一の受容体に作用し、そして同一の反応を誘発する。ＣＧはＬＨよりも長い循環(circulation)半減期を有しており、そのため、長時間作用型のＬＨ活性原として一般的に使用されている。ＣＧは、自然のＬＨピークに似せて排卵を引き起こすためにＯＩ及びＣＯＨにおいて使用されている。ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の注射は、ＦＳＨ又はＦＳＨとＬＨの混合物による刺激の終了時に排卵を引き起こすために使用される。ＣＧはまた、ＬＨ活性が所望とされる患者、例えば上文で言及した者の刺激の間、ＬＨ活性を提供するために、ＯＩ及びＣＯＨ用の刺激の間ＦＳＨと一緒に使用されることもある。
【０００８】
ＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧは、ヘテロ二量体の糖タンパク質ホルモンファミリーのメンバーであり、これには甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）も含まれる。このファミリーのメンバーは、α−サブユニット及びβ−サブユニットを含んで成るヘテロ二量体である。当該サブユニットは、非共有結合性の相互作用によって一緒に保持されている。ヒトＦＳＨ（ｈＦＳＨ）ヘテロ二量体は、（ｉ）他のヒトファミリーメンバー（すなわち、絨毛性ゴナドトロピン（「ＣＧ」）、黄体形成ホルモン（「ＬＨ」）及び甲状腺刺激ホルモン（「ＴＳＨ」）にとっても共通の、成熟９２アミノ酸糖タンパク質アルファサブユニット；及び（ｉｉ）ＦＳＨに特有の成熟１１１アミノ酸ベータサブユニット、から成る2。ヒトＬＨへテロ二量体は、（ｉ）成熟９２アミノ酸糖タンパク質アルファサブユニット；及び（ｉｉ）ＬＨに特有の成熟１１２ベータサブユニット、から成る3。前記糖タンパク質のアルファ及びベータサブユニットは、防腐剤、界面活性剤及び他の賦形剤との相互作用により、製剤中で解離しやすいことがある。前記サブユニットの解離は生物学的効力の損失をもたらす4。
【０００９】
ＦＳＨは、筋肉内（ＩＭ）又は皮下（ＳＣ）注射用に製剤化される。ＦＳＨは、２〜２５℃で保存した場合に１年半から２年の貯蔵寿命を有する７５ＩＵ／バイアル及び１５０ＩＵ／バイアルのバイアル又はアンプルにおいて凍結乾燥（固体）型で供給される。注射溶液は、凍結乾燥型の製品を注射用水（ＷＦＩ）で再構成することで形成する。排卵誘発又は過排卵誘起の場合、７５ＩＵ〜６００ＩＵの開始用量での最大約１０日間の連日注射が推奨される。患者の反応に応じて、漸増用量のＦＳＨを用いる最大３サイクルの治療が使用されうる。凍結乾燥製剤を用いる場合、患者は新規バイアル中の凍結乾燥材料を希釈剤で再構成し、そして毎日それを再構成直後に投与する必要がある［Serono Laboratories, Inc., Randolph, MAにより皮下注射用のFertinex（登録商標）（精製型注射用尿性卵胞性刺激ホルモン）について１９９６年２月に発行された添付文書Ｎ１７００１０１Ａ］。
【００１０】
ＦＳＨはまた、単回投与又は多数回投与用の液体フォーマットのいずれにおいてもバイアル又はアンプルにおいて調製されてきた。単回投与フォーマットは、使用前の保存の際安定で且つ強力なままでなければならない。多数回投与フォーマットは、使用前の保存の際安定で且つ強力なままでなければならないだけでなく、アンプルの密封が損なわれた後、多数回投与に使用するための治療計画の投与期間を通じて安定で、強力で、且つ比較的細菌を含まない状態で維持されなければならない。このため、多数回投与フォーマットは静菌剤を含んでいる。
【００１１】
ＬＨは筋肉内（ＩＭ）又は皮下（ＳＣ）注射用に調製される。ＬＨは、２〜２５℃で保存した場合に１年半から２年の貯蔵寿命を有する７５ＩＵ／バイアルのバイアル又はアンプルにおいて凍結乾燥（固体）型で供給される。注射溶液は、凍結乾燥型の製品を注射用水（ＷＦＩ）で再構成することで形成する。排卵誘発又は過排卵誘起の場合、ＦＳＨと併用して、７５ＩＵ〜６００ＩＵのＬＨの開始用量での最大約１０日間の連日注射が推奨される。
【００１２】
ＥＰ０  ６１８  ８０８(Applied Research Systems ARS Holding N.V.)は、ゴナドトロピンと、安定量のスクロース単独又はスクロースとグリシンの固形均質混合物を含んで成る安定な液体医薬組成物を開示している。
【００１３】
ＥＰ０  ８１４  ８４１(Applied Research Systems ARS Holding N.V.)は、組換えヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）と安定量のマンニトールを含んで成る液体医薬組成物を開示している。
【００１４】
ＥＰ０  ４４８  １４６(AKZO N. V.)は、１重量部のゴナドトロピン；及び当該ゴナドトロピンと会合した２００〜１０，０００重量部のジカルボン酸塩の安定化剤を含んで成る安定化したゴナドトロピン含有凍結乾燥物を開示している。
【００１５】
ＥＰ０  ８５３  ９４５(Akzo Nobel N. V.)は、ゴナドトロピンと、安定化量のポリカルボン酸又はその塩及びチオエーテル化合物を含んで成ることを特徴とする液体ゴナドトロピン含有製剤を開示している。
【００１６】
ＷＯ００／０４９１３(Eli Lilly and Co.)は、アルファサブユニット及びベータサブユニットを含むＦＳＨ又はＦＳＨ変異体、及びフェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチル等）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム及びチメロサール、又はそれらの混合物から成る群から選択される防腐剤、を水性希釈剤中に含んで成る製剤を開示している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の目的は、ＦＳＨとＬＨの混合物の新規凍結乾燥製剤を提供すること、それらの調製方法、及び繁殖障害の治療におけるそれらの医薬用途又は獣医学的用途のための方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
第一の観点において、本発明は、ＦＳＨ又はその変異体並びにＬＨ又はその変異体、及びＴｗｅｅｎ  ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、Ｔｗｅｅｎ  ４０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート）、Ｔｗｅｅｎ  ８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）から選択される界面活性剤、を含んで成る凍結乾燥製剤を提供する。
【００１９】
第二の観点において、本発明は、凍結乾燥製剤の製造方法であって、ＦＳＨ又はその変異体並びにＬＨ又はその変異体と、Ｔｗｅｅｎ  ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、Ｔｗｅｅｎ  ４０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート）、Ｔｗｅｅｎ  ８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）から選択される界面活性剤との混合物を形成し、そして当該混合物を凍結乾燥にかけること、を含んで成る方法を提供する。
【００２０】
第三の観点において、本発明は、ヒト用医薬用途のための製品であって、凍結乾燥したＦＳＨ及びＬＨあるいはＦＳＨ又はＬＨの変異体、及びＴｗｅｅｎ  ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、Ｔｗｅｅｎ  ４０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート）、Ｔｗｅｅｎ  ８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）から選択される界面活性剤を含んで成る第一容器及び再構成用溶媒を含んで成る第二容器、を含んで成る製品、を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の混合ＦＳＨ／ＬＨ製剤は、向上した又はより適当な特性又は安定性を有しており、そして女性及び／又は男性における不妊治療にとって有用である。これらの製剤及び製品は、注射及び別の送達系、例えば、限定しないが、経鼻、経肺、経粘膜、経皮、経口、皮下、筋肉内又は非経口からの徐放における使用に更に適している。特に好ましい態様において、本発明の製剤は皮下及び／又は筋肉内注射用である。提供するＦＳＨ、ＬＨ又はＦＳＨ若しくはＬＨ変異体製剤は、また、活性又は安定性の損失を防ぎ又は軽減することで、あるいは投与の有効性又は望ましさのあらゆる観点、例えば形態、頻度、用量、快適性、使いやすさ、in vitro又はin vivoでの生物学的活性等のうちの少なくとも１つを改善することで、既知の商品と比較して長期間in vivoでの効力を増大させることができる。
【００２２】
卵胞刺激ホルモン、又はＦＳＨは、本明細書で使用する場合、完全長の成熟タンパク質として産生されるＦＳＨを意味し、これには、限定しないがヒトＦＳＨ又は「ｈＦＳＨ」が含まれており、組換え技術で産生されているか、ヒト起源のもの、例えば閉経後の女性の尿から単離されているかを問わない。ヒト糖タンパク質アルファサブユニットのタンパク質配列を配列番号１に示し、そしてヒトＦＳＨベータサブユニットのタンパク質配列を配列番号２に示す。
【００２３】
「ＦＳＨ変異体」の表現は、ヒトＦＳＨとアミノ酸配列、グリコシル化パターン又はサブユニット間の連結が異なるが、ＦＳＨ活性を示す分子を包含することを意味する。例としては長期作用性修飾型組換えＦＳＨであるＣＴＰ−ＦＳＨがあり、これは野生型α−サブユニット及び、ｈＣＧのカルボキシ末端ペプチドがＦＳＨのβ−サブユニットのＣ末端と融合しているハイブリッドβ−サブユニットから成る［LaPolt et al. ; Endocrinology; 1992, 131, 2514- 2520; or Klein et al. ; Development and characterization of a long-acting recombinant hFSH agonist; Human Reprod. 2003,18, 50-56に記載のとおり］。また、一本鎖分子である一本鎖ＣＴＰ−ＦＳＨも含まれ、これは以下の配列（Ｎ末端からＣ末端へ）から成り：
【化１】
2009514777.tif 000002
（ここで、βＦＳＨはＦＳＨのβ−サブユニットを表しており、βｈＣＧ  ＣＴＰ（１１３−１４５）はｈＣＧのカルボキシ末端ペプチドを表し、そしてαＦＳＨはＦＳＨのα−サブユニットを表している）、これはKleinらにより説明されたとおりである5。ＦＳＨ変異体の他の例には、ＷＯ０１／５８４９３(Maxygen)、特にＷＯ０１／５８４９３の請求項１０及び１１に開示されているような、α−サブユニット及び／又はβ−サブユニットに組み込まれた追加のグリコシル化部位を有するＦＳＨ分子、そしてＷＯ９８／５８９５７に開示されているようなサブユニット間Ｓ−Ｓ結合を有するＦＳＨ分子が含まれる。
【００２４】
本明細書で言及されるＦＳＨ変異体には、配列番号２の完全長成熟タンパク質よりも短いベータサブユニットのカルボキシ末端を欠失したものも含まれる。ヒトベータサブユニットのカルボキシ末端の欠失は、配列番号３，４及び５に示す。ベータ鎖のカルボキシ末端変異体は、既知のアルファサブユニットと二量体を形成してＦＳＨ変異体ヘテロ二量体を形成すると解される。
【００２５】
ＦＳＨヘテロ二量体又はＦＳＨ変異体ヘテロ二量体は、任意の適当な方法、組み換え技術により、場合によっては天然起源からの単離又は精製により、化学合成により、あるいはそれらの任意な組み合わせにより、産生することができる。
【００２６】
用語「組換え体」の使用は、ＦＳＨ、ＬＨ又は組み替えＤＮＡ技術（ＷＯ８５／０１９５８を参照のこと）の使用を通じて産生されるＦＳＨ及びＬＦ変異体の調製物を意味する。ＦＳＨのゲノムクローン及びｃＤＮＡクローンの配列は、複数の種のアルファサブユニット及びベータサブユニットについて知られている6。組換え技術を用いてＦＳＨ又はＬＨを発現させる方法の一例は、真核細胞にＦＳＨ又はＬＨのアルファサブユニット及びベータサブユニットをコードするＤＮＡ配列をトランスフェクションすることによるものであり、これは、欧州特許ＥＰ０２１１８９４及びＥＰ０４８７５１２に記載のように、それぞれ別個のプロモーターを有するサブユニットを持つ１つのベクター又は２つのベクターのいずれかで提供される。ＦＳＨ又はＬＨを産生するための組換え技術の使用の別の例は、欧州特許ＥＰ０５０５５００(Applied Research Systems ARS Holding NV)に記載のように、ＦＳＨ又はＬＨのサブユニットをコードする内因性配列に、作用可能に連結するよう異種の制御セグメントを挿入するための相同組換えの使用によるものである。
【００２７】
本発明に従い使用されるＦＳＨ又はＦＳＨ変異体は、組換え手段により、例えば哺乳類細胞から産生されるだけでなく、他の生物学的起源、例えば尿起源から精製されることもある。許容される方法には、Hakola, K. Molecular and Cellular Endocrinology, 127: 59-69,1997 ; Keene, et al., J. Biol. Chem. , 264: 4769- 4775,1989 ; Cerpa-Poijak, et al., Endocrinology, 132: 351-356,1993 ; Dias, et al., J. Biol. Chem. , 269: 25289-25294,1994 ; Flack, et al., J. Biol. Chem. , 269: 14015-14020, 1994; 及びValove, et al., Endocrinology, 135: 2657-2661, 1994, 米国特許第３，１１９，７４０号及び米国特許第５，７６７，０６７号に記載のものが含まれる。
【００２８】
黄体形成ホルモン、又はＬＨは、本明細書で使用する場合、完全長の成熟タンパク質として産生されるＬＨを意味し、これには、限定しないがヒトＬＨ又は「ｈＬＨ」が含まれており、組換え技術で産生されているか、ヒト起源のもの、例えば閉経後の女性の尿から単離されているかを問わない。ヒト糖タンパク質アルファサブユニットのタンパク質配列を配列番号１に示し、そしてヒトＬＨベータサブユニットのタンパク質配列を配列番号６に示す。好ましい態様において、ＬＨは組換え体である。
【００２９】
「ＬＨ変異体」の表現は、ヒトＬＨとアミノ酸配列、グリコシル化パターン又はサブユニット間の連結が異なるが、ＬＨ活性を示す分子を包含することを意味する。
【００３０】
ＬＨヘテロ二量体又はＬＨ変異体ヘテロ二量体は、任意の適当な方法、組み換え技術により、場合によっては天然起源からの単離又は精製により、化学合成により、あるいはそれらの任意な組み合わせにより、産生することができる。
【００３１】
用語「投与する」又は「投与」とは、本発明の製剤を、疾患又は症状を治療することが必要な患者の体内に導入することを意味する。
【００３２】
用語「患者」は、疾患又は症状が治療される哺乳類を意味する。患者は、限定しないが、以下の出身のもの、ヒト、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、ウサギ等である。
【００３３】
用語「効力」は、ＦＳＨ活性との関連においては、ＦＳＨ製剤又は混合製剤がＦＳＨに関連する生物学的反応、例えばSteelman-Pohleyアッセイ8における卵巣の増量、又は雌性患者の卵胞発育を誘発する能力を意味する。雌性患者の卵胞発育は、超音波によって、例えば刺激８日目の約１６ｍｍの平均直径を有する卵胞の数の観点で評価されうる。生物学的活性は、ＦＳＨについて許容されている基準に関して評価される。
【００３４】
用語「効力」は、ＬＨ活性との関連においては、ＬＨ製剤又は混合製剤がＬＨに関連する生物学的反応を誘発する能力を意味し、例えば精嚢増量法9による。ＬＨの生物学的活性は、ＬＨについて許容されている基準に関して評価される。
【００３５】
用語「水性希釈剤」とは、水を含む液体溶媒を意味する。液体溶媒系は水のみから成ることもあり、あるいは水と１又は複数の混和性溶媒から成ることもあり、そして溶解した溶質、例えば糖、緩衝剤、塩又は他の賦形剤を含むこともある。更に一般的に使用される非水性溶媒は、短鎖有機性アルコール、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、短鎖ケトン、例えばアセトン、及びポリアルコール、例えばグリセロールである。
【００３６】
「等張性物質」は、生理学的に許容され、且つ適当な等張性を製剤に賦与して、細胞と接触している細胞膜の水の正味の流れ(net flow)を防ぐ化合物である。化合物、例えばグリセリンは、このような目的のために既知の濃度で一般的に使用されている。他の適当な等張性物質には、限定しないが、アミノ酸又はタンパク質（例えば、グリシン又はアルブミン）、塩（例えば、塩化ナトリウム）、及び糖（例えば、デキストロース、スクロース及びラクトース）が含まれる。
【００３７】
用語「緩衝液」又は「生理学的に許容される緩衝液」とは、医薬用途又は獣医学的用途について製剤中で安全であることが知られており、且つ当該製剤について所望とされるｐＨ範囲内に製剤のｐＨを維持又は調節する作用を有する化合物の溶液を意味する。適度に酸性のｐＨを適度に塩基性のｐＨに調節するのに許容される緩衝液は、限定しないが、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、アルギニン、ＴＲＩＳ、及びヒスチジンの様な化合物を含む。「ＴＲＩＳ」は、２−アミノ−−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、及びそれらの医薬として許容される塩を意味する。好ましい緩衝液は、食塩水又は許容される塩を含む塩酸塩の緩衝液である。
【００３８】
用語「リン酸緩衝液」とは、リン酸又はその塩を含み、所望のｐＨに調節された溶液を意味する。通常、リン酸緩衝液は、リン酸、又はリン酸塩、例えば、限定しないが、ナトリウム塩及びカリウム塩、から調製される。複数のリン酸塩が当業界で知られており、例えば、当該酸の一塩基性、二塩基性、そして三塩基性のナトリウム及びカリウム塩である。リン酸塩はまた、発生している塩の水和物として発生することも知られている。リン酸緩衝液は、あるｐＨ範囲、例えば約ｐＨ４〜約ｐＨ１０のｐＨ範囲、好ましくは約ｐＨ５〜約ｐＨ９の範囲、そして最も好ましくは約６．０〜約８．０の範囲をカバーすることができ、好ましくは約ｐＨ７．０である。
【００３９】
用語「バイアル」又は「容器」は、封じ込められた無菌状態で固体又は液体のＦＳＨを保持するのに適した貯蔵のためのものを広く意味する。本明細書で使用する場合のバイアルの例には、アンプル、カートリッジ、ブリスター・パッケージ、又は、シリンジ、ポンプ（例えば浸透圧ポンプ）、カテーテル、経皮パッチ、経肺若しくは経粘膜的スプレーを患者へのＦＳＨの送達に適した他の前記のような貯蔵するためのものが含まれる。非経口、経肺、経粘膜、又は経皮投与用の製品を梱包するのに適したバイアルは周知であり、当業界で認識されている。
【００４０】
用語「安定性」は、本発明の製剤におけるＦＳＨ及びＬＨの物理的、化学的、且つ高次構造的な安定性を意味する（例えば、生物学的効力の維持）。タンパク質製剤の不安定性は、当該タンパク質分子が化学的に分解又は凝集して高次ポリマーを形成することにより、ヘテロ二量体がモノマーに解離することにより、本発明に含まれるＦＳＨポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を低下させる脱グリコシル化、グリコシル化の修飾、酸化（特にαサブユニットの酸化）又はそれ以外の構造的修飾により引き起こされることがある。
【００４１】
「安定な」溶液又は製剤は、その中に含まれるタンパク質の分解、修飾、凝集、生物学的活性の損失等の程度が受け入れられるほど調節されており、且つ時間とともに受け入れられないほど増大しないものである。好ましくは、当該製剤は、少なくとも約８０％の標識ＦＳＨ活性及び少なくとも約８０％の標識ＬＨ活性を６ヶ月の期間にわたり約２〜８℃、更に好ましくは約２〜８℃、更に好ましくは約４〜５℃で保持する。ＦＳＨ活性は、Steelman-Pohley卵巣増量アッセイ5を用いて測定されうる。ＬＨ活性は精嚢増量バイオアッセイ10を用いて測定されうる。
【００４２】
用語「治療」は、ＦＳＨ及び／又はＬＨの投与が卵胞又は精巣の刺激あるいはＦＳＨ及び／又はＬＨによって制御されるあらゆる他の生理学的応答の目的にとって望ましい、患者への投与、患者のフォローアップ、管理及び／又はケアを意味する。従って、治療には、限定しないが雄性における精子の品質の誘導又は向上、テストステロン放出の刺激、あるいは雌性における卵胞発達、又は排卵誘発のためのＦＳＨ及び／又はＬＨの投与が含まれることがある。
【００４３】
タンパク質の「塩」は、酸又は塩基の付加塩である。そのような塩は、好ましくは当該タンパク質中の荷電基のうちのいずれか１又は複数と、生理学的に許容される非毒性の陽イオン又は陰イオンのうちのいずれか１つ又は複数との間で形成される。有機塩及び無機塩には、例えば、酸、例えば塩酸、硫酸、スルホン酸、酒石酸、フマル酸、臭化水素酸、グリコール酸、クエン酸、マレイン酸、リン酸、コハク酸、酢酸、硝酸、安息香酸、アスコルビン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、プロピオン酸、カルボン酸等から調製されるもの、あるいは、例えば、アンモニウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、又はマグネシウムから調製されるものが含まれる。
【００４４】
本発明者は、ポリソルベート、特にＴｗｅｅｎ  ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、Ｔｗｅｅｎ  ４０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート）、Ｔｗｅｅｎ  ８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）の群から選択される界面活性剤が、ＬＨとＦＳＨの混合物を含んで成る安定製剤を調製するのに適した賦形剤であることを発見した。好ましい界面活性剤はＴｗｅｅｎ  ２０である。ポリソルベートは市販の界面活性剤である（例えばＭｅｒｃｋから市販されている）。
【００４５】
界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ  ２０は、好ましくは凍結乾燥製剤中に、全製剤の１ｍｇ当たり約０．００１〜約０．１ｍｇの濃度で、更に好ましくは約０．０１〜約０．０７５／ｍｇで存在する。
【００４６】
好ましくは、Ｔｗｅｅｎ、特にＴｗｅｅｎ  ２０の濃度は、再構成した製剤中、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ、更に好ましくは約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約０．５ｍｇ／ｍｌ、更に特に好ましくは約０．２ｍｇ／ｍｌ〜約０．４ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０．１ｍｇ／ｍｌである。
【００４７】
卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）は、凍結乾燥製剤中、好ましくは全製剤１ｍｇ当たり約０．１〜１０μｇの濃度（ｗ／ｗ）で存在する。１つの態様において、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）は、全製剤１ｍｇ当たり約０．３〜５μｇの濃度で存在する。更なる態様において、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）は全製剤１ｍｇ当たり約０．３７〜２μｇの濃度で存在する。
【００４８】
黄体形成ホルモン（ＬＨ）は、凍結乾燥製剤中、好ましくは全製剤１ｍｇ当たり約０．１〜３μｇの濃度（ｗ／ｗ）で存在する。１つの態様において、黄体形成ホルモン（ＬＨ）は、全製剤１ｍｇ当たり約０．１〜１μｇの濃度で存在する。更なる態様において、黄体形成ホルモン（ＬＨ）は全製剤１ｍｇ当たり約０．１〜０．６μｇの濃度で存在する。
【００４９】
再構成した製剤において、当該製剤中のＦＳＨの濃度は好ましくは約１５０ＩＵ／ｍｌ〜約２，０００ＩＵ／ｍｌであり、更に好ましくは約３００ＩＵ／ｍｌ〜約１，５００ＩＵ／ｍｌ、更に特に好ましくは約４５０〜約７５０、最も好ましくは約６００ＩＵ／ｍｌである。
【００５０】
再構成した製剤において、当該製剤中のＬＨの濃度は好ましくは約５０ＩＵ／ｍｌ〜約２，０００ＩＵ／ｍｌであり、更に好ましくは約１５０ＩＵ／ｍｌ〜約１，５００ＩＵ／ｍｌ、更に特に好ましくは約３００〜約７５０、最も好ましくは約６２５ＩＵ／ｍｌである。
【００５１】
ＦＳＨとＬＨの比率（ＦＳＨ：ＬＨ、ＩＵ：ＩＵ。ＦＳＨはラットの卵巣増量アッセイを用いて測定し、そしてＬＨはラットの精嚢増量アッセイを用いて測定した）は、好ましくは約６：１〜約１：６の範囲内であり、更に好ましくは約４：１〜約１：２、更に特に好ましくは約３：１〜約１：１である。特に好ましい比率は１：１及び２：１である。
【００５２】
好ましくは、ＦＳＨ及びＬＨは組換え技術で産生され、特に好ましくは、それらはＦＳＨ又はＬＨのヒト糖タンパク質アルファサブユニット及びベータサブユニットをコードするＤＮＡを含んで成る１又は複数のベクターでトランスフェクションされたチャイニーズハムスター卵巣細胞において産生される。当該アルファサブユニット及びベータサブユニットをコードするＤＮＡは、同一の又は異なるベクター上に存在してもよい。
【００５３】
組換えＦＳＨ及びＬＨは、それらの尿の対応物よりも複数の利点を有する。組換え細胞を用いた培養及び単離技術は、バッチ間での一貫性を可能にする。対照的に、尿ＦＳＨ及びＬＨは、前記サブユニットの純度、グリコシル化パターン、シアリル化及び酸化のような特性においてバッチ間で大きく変化する。組換えＦＳＨ及びＬＨのバッチ間での一貫性及び純度がより高ければ、前記ホルモンは、等電点電気泳動（ＩＥＦ）のような技術を用いて容易に同定し、そして定量することができる。組換えＦＳＨ及びＬＨを同定し、そして定量することが容易であることで、バイオアッセイで充填するよりむしろ、バイアルをホルモンの質量当たり充填することが可能となる(fill-by-mass)。
【００５４】
好ましくは、本発明の凍結乾燥製剤は緩衝液、好ましくはリン酸緩衝液を含み、但し、対イオンはナトリウム又はカリウムイオンである。リン酸緩衝食塩水は当業界で周知であり、例えばダルベッコリン酸緩衝液である。全溶液中の緩衝液の濃度は約５ｍＭ、９．５ｍＭ、１０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、そして５００ｍＭの間を変化することがある。好ましくは、緩衝液の濃度は約１０ｍＭである。特に好ましいのは、ｐＨ７．０のリン酸イオンの１０ｍＭ緩衝液である。
【００５５】
好ましくは、緩衝液は、本発明の凍結乾燥製剤の再構成した製剤が、約６．０〜約８．０、更に好ましくは約６．８〜約７．８の間のｐＨを有するように調節され、例えば約ｐＨ７．０、ｐＨ７．２、及び７．４である。
【００５６】
好ましくは、緩衝液は、本発明のＦＳＨとＬＨの混合物の再構成した製剤が、約６．０〜約９．０、更に好ましくは約６．８〜約８．５の間のｐＨを有するように調節され、例えば約ｐＨ７．０、ｐＨ８．０、及び８．２、最も好ましくは約ｐＨ８．０である。
【００５７】
本発明の注射可能な凍結乾燥製剤を提供するために、再構成には適当な溶媒が用いられる。好ましい溶媒は注射用水である。
【００５８】
更に具体的な態様において、本発明は、ＦＳＨ及びＬＨ、Ｔｗｅｅｎ  ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、Ｔｗｅｅｎ  ４０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート）、Ｔｗｅｅｎ  ８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）から選択される界面活性剤、を含んで成る凍結乾燥製剤を提供する。好ましくは、ＦＳＨ及びＬＨは約２：１〜約１：１の比率（ＦＳＨ：ＬＨ）で存在する。
【００５９】
更に具体的な態様において、本発明は、凍結乾燥製剤の製造方法であって、ＦＳＨとＬＨ、そしてＴｗｅｅｎ  ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、Ｔｗｅｅｎ  ４０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート）、Ｔｗｅｅｎ  ８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）から選択される界面活性剤との混合物を形成し、そして当該混合物を凍結乾燥にかけることを含んで成る方法を提供する。
【００６０】
更に別の好ましい態様において、本発明は、梱包された医薬組成物の製造方法であって、ＦＳＨとＬＨ、そしてＴｗｅｅｎ  ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、Ｔｗｅｅｎ  ４０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート）、Ｔｗｅｅｎ  ８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）から選択される界面活性剤とを含んで成る凍結乾燥混合物を容器に分注することを含んで成る方法を提供する。
【００６１】
更に別の好ましい態様において、本発明は、ヒト用医薬用途のための製品であって、凍結乾燥したＦＳＨ又はＦＳＨ変異体並びにＬＨ又はＬＨ変異体、並びにＴｗｅｅｎ  ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、Ｔｗｅｅｎ  ４０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート）、Ｔｗｅｅｎ  ８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）から選択される界面活性剤を含んで成る第一容器又はバイアルを含んで成る製品、を提供する。第二容器又はバイアルは再構成のための希釈剤、好ましくは水を含む。
【００６２】
本発明の凍結乾燥製剤は、少なくとも約６ヶ月、１２ヶ月又は２４ヶ月の間保管することができる。好ましい保存条件下では、最初の使用前に、当該製剤は明るい光から遠ざけられ（好ましくは暗い場所に保管される）、約２５℃、好ましくは約２〜８℃、更に好ましくは約４〜５℃の温度で保管される。
【００６３】
好ましくは、本発明の凍結乾燥製剤は、抗酸化剤、例えばメチオニン、亜硫酸水素ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）塩、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、及びブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）を含む。最も好ましいのはメチオニンである。抗酸化剤はＦＳＨ及びＬＨの酸化を防ぐ（特にαサブユニット）。
【００６４】
抗酸化剤、例えばメチオニンは、好ましくは、全製剤１ｍｇ当たり約０．０００１〜約０．１ｍｇの濃度で存在し、更に好ましくは約０．０１〜約０．０７５ｍｇ／ｍｇである。
【００６５】
再構成した製剤において、メチオニンは好ましくは約０．０１〜約１．０ｍｇ／ｍｌの濃度、更に好ましくは約０．０５〜約０．５ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。
【００６６】
好ましくは、本発明の凍結乾燥製剤は、安定化剤及び等張性調節物質として単糖又は二糖又は糖アルコール、例えばスクロース、デキストロース、ラクトース、マンニトール及び／又はグリセロールを含む。最も好ましいのはスクロースである。再構成した製剤において、スクロースは約６０ｍｇ／ｍｌで存在する。
【００６７】
上述のとおり、本発明は、凍結乾燥製剤、特に使い捨てのものを提供する。本発明の製剤は医薬用途又は獣医学的用途に適したものである。
【００６８】
上述のとおり、好ましい態様において、本発明は、凍結乾燥ＦＳＨ及びＬＨ並びにＴｗｅｅｎ  ２０を含んで成る梱包材料及びバイアルを含んで成る製品を提供する。第二の容器は希釈剤としての注射用水を含む。
【００６９】
本発明の製剤中のタンパク質ホルモンの範囲には、再構成時に約１．０μｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌの濃度をもたらす量が含まれ、但し、それ以下、そしてそれ以上の濃度でも実施可能であり、そして意図する送達担体に依存し、例えば、溶液製剤は、経皮パッチ、経肺、経粘膜的な方法、又は浸透圧ポンプ若しくはマイクロポンプ法とは異なる。タンパク質ホルモンの濃度は好ましくは約５．０μｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、更に好ましくは約１０μｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約５０μｇ／ｍｌ〜約２００μｇ／ｍｌである。
【００７０】
好ましくは、本発明の製剤は、梱包時のＦＳＨ活性及び／又はＬＨ活性の少なくとも約８０％を（最初の使用前）２４ヶ月の期間にわたり保持する。ＦＳＨ活性はSteelman-Pohley卵巣増量バイオアッセイ5を用いて測定されうる。ＬＨ活性はラットの精嚢増量バイオアッセイを用いて測定されうる。
【００７１】
本発明の製剤は、ＦＳＨとＬＨ、そしてＴｗｅｅｎ２０、並びに追加の賦形剤、例えば抗酸化剤及び／又は緩衝液とを混合し、そして当該混合物を凍結乾燥にかけることを含んで成る方法により調製することができる。前記の成分を混合し、そしてそれらを凍結乾燥することは、常用の手順を用いて実施される。適当な製剤を調製するために、例えば、測定量のＦＳＨ又はＦＳＨ変異体、ＬＨ又はＬＨ変異体は、Ｔｗｅｅｎ２０と混合され、そして生じた混合物は凍結乾燥された後、バイアル、アンプル又はカートリッジに分注される。この方法の変更は当業者により認識されている。例えば、前記成分を添加する順番、追加の添加物を使用するか否か、製剤を調製する温度及びｐＨは、全て、前記濃度及び使用する投与手段のために最適化されうる因子である。
【００７２】
本発明の凍結乾燥製剤から得られる再構成製剤は、認識されている器具を用いて投与されうる。これらの単一のバイアル系を含んで成る例には、溶液の送達のためのペン型注射器、例えば、Easy-Ject（登録商標）、Gonal-F（登録商標）、Humaject（登録商標）、NovoPen（登録商標）、B-D（登録商標）ペン、AutoPen（登録商標）及びOptiPen（登録商標）が含まれる。
【００７３】
本願の特許請求の範囲に記載の製品には、梱包材料が含まれる。梱包材料は、監督官庁が要求する情報に加えて、当該製品が使用されうる条件を提供する。本発明の梱包材料は、患者が本発明の凍結乾燥製剤を再構成して溶液を形成させ、そして当該溶液を２つのバイアルの湿潤／乾燥製品について２４時間以上の期間にわたり当該溶液を使用するための指示を提供する。１つのバイアルの溶液製品の場合、ラベルは、当該溶液が最初の使用後２４時間以上の期間、好ましくは最大１２又は１４日の期間保存されうることを示している。本願の特許請求の範囲に記載の製品は、ヒトの医薬製品の使用にとって有用である。
【００７４】
以下の実施例は単に本発明の製剤及び組成物の調製を例示するために提供される。本発明の範囲は、以下の実施例のみから成るとみなされるべきではない。
【実施例】
【００７５】
本発明の組換えゴナドトロピン（ＦＳＨ／ＬＨ）は、欧州特許ＥＰ１６０６９９及びＥＰ２１１８９４に記載の技術に従い相当の組換えＤＮＡで形質転換されたＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞における発現により調製した。
【００７６】
本実施例で使用するその他の物質は以下のとおりである：
−スクロースエキストラピュアＭｅｒｃｋコード番号１．０７６５３
−リン酸二水素ナトリウム一水和物（以下、ＮａＨ2ＰＯ4  Ｈ2０として示す）Ｍｅｒｃｋコード番号１．０６３４６
−リン酸水素二ナトリウム二水和物（以下、Ｎａ2ＨＰＯ4  ２Ｈ2０として示す）Ｍｅｒｃｋコード番号１．０６５８０
−Ｔｗｅｅｎ  ２０Ｍｅｒｃｋコード番号１８２２１８４
−Ｌ−メチオニン  Ｒｅｘｉｍ
−注射用水
−オルトリン酸８５％エキストラピュアＭｅｒｃｋコード番号１．００５６３
−オルトリン酸（約１７％ｗ／ｗ）溶液
−水酸化ナトリウムペレットエキストラピュアＭｅｒｃｋコード番号１．０６４９８
【００７７】
ＦＳＨ及びＬＨの凍結乾燥製剤
以下の組成を有する凍結乾燥製剤Ａを調製した：
製剤Ａ
ＦＳＨ                            μｇ  １２．０（１５６Ｉ．Ｕ．）
ＬＨ                              μｇ  ３．７（９２Ｉ．Ｕ．）
スクロース                        ｍｇ  ３０．０
ＮａＨ2ＰＯ4  Ｈ2０               ｍｇ  ０．４５
Ｎａ2ＨＰＯ4  ２Ｈ2０             ｍｇ  １．１１
Ｔｗｅｅｎ  ２０                  ｍｇ  ０．０５
Ｌ−メチオニン                    ｍｇ  ０．１
【００７８】
この製法は、薬物原料を直接前記成分と混合し、得られた溶液を濾過し、そして濾過物を凍結乾燥することによる。
【００７９】
当該方法の各工程の説明は以下に記すとおりである：
−風袋を計った容器にＷＦＩ、リン酸水素二ナトリウム二水和物、リン酸二水素ナトリウム一水和物、スクロース、５％のＴｗｅｅｎ２０及びＬ−メチオニンを添加し、そして完全に溶解するまで１０分間攪拌する。
−ｐＨを調べ、そして最終的にそれを１０％ＮａＯＨ又は希釈したＨ3ＰＯ4でｐＨ７．００±０．２に修正する。
−ＦＳＨ及びＬＨを上記の調製した混合物に添加し、そして得られた溶液を１０分間穏やかに攪拌する。
−再びｐＨを調べ、そして最終的にそれを１０％ＮａＯＨ又は希釈したＨ3ＰＯ4でｐＨ７．０±０．１に修正する。
−１５ｇ／ｃｍ2以上の濾過率を有する０．２２μｍのＤｕｒａｐｏｒｅ膜を用い、１．５ａｔｍ（１５１９８７．５Ｐａ）の窒素ガス流のもと溶液を濾過する。
−前記溶液を予め滅菌したフラスコに回収する。
−濾過した溶液をガラス容器に充填し、ストッパーで封をし、そして充填したバイアルをステンレス鋼のトレイに置く。
−前記トレイを凍結乾燥機に載せ、そして以下の凍結乾燥サイクルを用いて生成物を凍結乾燥する：
・＋４℃で約２０分間平衡化する。
・棚の温度を−２５℃にし、そして２時間維持する。
・棚の温度を−１５℃にし、そして１時間維持する。
・棚の温度を−４５℃にし、そして３時間維持する。
・濃縮機の温度を−６５℃にする。
・チャンバーを真空状態にする。
・真空が７ｘ１０-2ｍＢａｒの値に達したら、棚の温度を−１０℃にまで上昇させ、そして１４時間維持する。
・棚の温度を８時間で＋３５℃にまで上昇させ、そしてこのサイクルの最後まで維持する（１４時間）。
・真空状態を中断して乾燥窒素をチャンバー内に封入する。
・凍結乾燥機の自動システムにより蓋をする。
・蓋をしたバイアルを適切なフリップオフキャップで密封する。
【００８０】
製剤Ａ及びＢを２５±２℃で保存し、そして後述するように安定性及び生物学的活性について試験した。組成を解析する前に、それらを注射用水を用いて再構成する。
【００８１】
安定性及び生物学的活性は以下のとおりに決定した：
・ＦＳＨのin vivoアッセイ：製剤は、ＦＳＨ活性についてSteelman-Pohley卵巣増量バイオアッセイを用いて試験した。
・ＬＨのin vivoアッセイ：製剤は、ＬＨ活性についてラット精嚢増量バイオアッセイを用いて試験した。
・酸化型アルファサブユニットのアッセイ：酸化型アルファサブユニットのパーセンテージは、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）法で測定した。
・遊離サブユニット（ｒＦＳＨ＋ｒＬＨ）の評価：遊離サブユニットのパーセンテージをＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価した。
・凝集物の評価：凝集物のパーセンテージは、遊離サブユニットの評価について上述したようにＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した。
【００８２】
生物学的試験は、欧州薬局方の規則に従い実施した。特に、当該試験は、「メノトロピン」のモノグラフにおいて報告されている。
【００８３】
表１は製剤Ａの安定性及び生物学的活性に関する解析試験の結果を要約する。値は４つのチェックポイント：ゼロ時、保存から１ヶ月後、３ヵ月後及び６ヵ月後に、２５±２℃の保存温度でのものを決定した。
【００８４】
【表１】
2009514777.tif 000003
【００８５】
表２中、４０±２℃で保存した製剤Ａについての安定性及び生物学的活性に関連する解析試験の結果を、４つのチェックポイント：ゼロ時、保存から３ヶ月後、６ヵ月後及び９ヵ月後について要約する。
【００８６】
【表２】
2009514777.tif 000004
【００８７】
表１及び２から、製剤Ａの生物学的活性は保存から９ヶ月後でもよく保全されていることを結論付けることができる。
【００８８】
配列：
配列番号１：ヒト糖タンパク質α−サブユニット
配列番号２：ｈＦＳＨβ−サブユニット
配列番号３：ｈＦＳＨβ−サブユニット変異体１
配列番号４：ｈＦＳＨβ−サブユニット変異体２
配列番号５：ｈＦＳＨβ−サブユニット変異体３
配列番号６：ｈＬＨβ−サブユニット
【００８９】
【表３】
2009514777.tif 000005
【配列表】
2009514777000001.xml
【国際調査報告】
2009514777.tif 000011
2009514777.tif 000012
2009514777.tif 000013