(57)【要約】  本発明は概して、神経膠腫のモニタリング、診断、予後の予測及び治療の方法に関する。具体的には、本発明は、ａｋｔ及びｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の活性化の差異によって区別した神経膠腫の三（３）つの予後の分類を提供する。神経又は前神経ＰＮ系列のマーカー（ｎｏｔｃｈ経路のエレメントを含む）を示す腫瘍の患者の生存期間中央値が大きい一方で、残る二つの腫瘍マーカー、Ｐｒｏｌｉｆ及びＭｅｓは短い生存期間に関連付けられている。このようにして分類された腫瘍は、有糸分裂阻害薬、抗血管新生薬、Ａｋｔアンタゴニスト、及び神経分化薬と組み合わせた、細分類に対応する適切なＰＮ−、Ｐｒｏｌｉｆ−又はＭｅｓ療法によっても治療することができる。別の態様として、本発明は、ＰＴＥＮ及びＤＬＬ３の発現レベルに基づいた二つの遺伝子モデルを使用して、神経膠腫の予後の予測及び診断の方法も提供する。
2009523709.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）腫瘍の試料中において一組のＧＤＭの発現を測定すること、
（ｂ）腫瘍の細分類がＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ及びＭｅｓのいずれであるかを決定すること、及び
（ｃ）前記細分類に基づいた少なくとも有効量の治療薬に接触させること
を含む神経膠腫の治療法であって、
（Ｉ）Ｐｒｏｌｉｆ細分類を発現する腫瘍は、有効量の（ａ）Ａｋｔアンタゴニスト及び／又はＰｒｏｌｉｆアンタゴニスト及び／又は有糸分裂阻害薬と、（ｂ）神経分化薬とに接触させることからなる併用療法により治療し、（ＩＩ）Ｍｅｓ細分類を発現する腫瘍は、有効量の（ａ）Ａｋｔ及び／又はＭｅｓアンタゴニスト及び／又は抗血管新生薬と、（ｂ）神経分化薬とに接触させることからなる併用療法により治療し、（ＩＩＩ）ＰＮ細分類を発現する腫瘍は、有効量の（１）ＰＮアンタゴニスト、及び／又は（２）神経分化薬と、随意で、（３）Ａｋｔアンタゴニスト、（４）有糸分裂阻害薬及び（５）抗血管新生薬のうちの１つ以上の組み合わせに接触させることからなる併用療法により治療する、方法。
【請求項２】
細分類は、階層式クラスター形成を用いて腫瘍を一組の神経膠腫試料と比較することにより実行する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細分類は、ｋ平均法クラスター形成を用いて腫瘍を一組の神経膠腫試料と比較することにより実行する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
細分類は、投票方式を用いて腫瘍を一組の神経膠腫試料と比較することにより実行する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
細分類は、腫瘍と一組の分類の済んでいる神経膠腫試料との、一組のＧＤＭマーカーの発現の類似性を比較することにより実行する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＰＮアンタゴニストは、ＤＬＬ３、Ｎｏｇ、Ｏｌｉｇ１、Ｏｌｉｇ２、ＴＨＲ及びＡＳＣＬ１を除いて表Ａに示すＰＮマーカーからなる群より選択する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
Ｐｒｏｌｉｆアンタゴニストは、表Ａに示すいずれかのＰｒｏｌｉｆマーカーのアンタゴニストからなる群より選択する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
Ｍｅｓアンタゴニストは、表Ａに示すいずれかのＭｅｓマーカーのアンタゴニストからなる群より選択する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
Ａｋｔアンタゴニストは、ａｋｔ１、ａｋｔ２、ａｋｔ３のアンタゴニスト、ＰＩＫ３、ＰＤ１、ＦＲＡＰ、ＲＰＳ６ＫＢ１、ＳＧＫ、ＥＧＦＲ、及びＩＧＦＲの制御ドメイン又は触媒ドメインのアンタゴニスト、並びに、ＰＴＥＮ、ＩＮＰＰ５Ｄ又はＩＮＰＰＬ１の活性化因子、刺激装置又は回復薬からなる群より選択する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
有糸分裂阻害薬は、テモゾロミド、ＢＣＮＵ、ＣＣＮＵ、ロムスチン、グリアデル、エトポシド、カルムスチン、イリノテカン、トポテカン、プロカルバジン、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、メトトレキサート、シタラビン、パクリタキセル、アウリスタチン、メイタンシノイドからなる群より選択する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
抗血管新生薬は、ＶＥＧＦアンタゴニスト、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２アンタゴニストからなる群より選択する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
神経細胞分化薬は、ＭＡＰ２、βチューブリン、ＧＡＤ６５及びＧＡＰ４３からなる群より選択し、神経細胞分化薬には、限定されないが、レチノイン酸、バルプロ酸とその誘導体（例えばエステル、塩、レチノイド、retinate、バルプロ酸等）；甲状腺ホルモン又は甲状腺ホルモンレセプターのアゴニスト；ノギン；ＮＴＲＫ２レセプターのＢＤＮＦ、ＮＴ４／５又はその他アゴニスト；転写因子ＡＳＣＬ１、ＯＬＩＧ１の発現を増大させる薬剤；ｄｌｌ３アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ１、２、３又は４アンタゴニスト、ニカストリン、Ａｐｈ１Ａ、Ａｐｈ１Ｂ、Ｐｓｅｎ１、Ｐｓｅｎ２及びＰＳＥＮＥＮの小分子阻害剤を含むγ分泌阻害剤、デルタ様リガンド（Ｄｌｌ）−１アンタゴニスト、デルタ様リガンド（Ｄｌｌ）−４、ｊａｇｇｅｄ１アンタゴニスト、ｊａｇｇｅｄ２アンタゴニスト；ｎｕｍｂアゴニスト又はｎｕｍｂ様アゴニストが含まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）一組のＧＤＭの発現を測定すること、
（ｂ）腫瘍の細分類がＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ及びＭｅｓのいずれかを決定すること、及び
（ｃ）疾病の結果を予後予測及び／又は診断すること
を含む、神経膠腫の予後予測及び／又は診断方法であって、
Ｐｒｏｌｉｆ又はＭｅｓ細分類によって予後不良又は生存時間が短いことが示され、ＰＮ細分類によって良好な予後又は生存時間が長いことが示される、方法。
【請求項１４】
細分類は、階層式クラスター形成を用いて腫瘍を一組の試料と比較することにより実行する、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
細分類は、ｋ平均法クラスター形成を用いて腫瘍を一組の試料と比較することにより実行する、請求項７に記載の方法。
【請求項１６】
細分類は、投票方式を用いて腫瘍を一組の試料と比較することにより実行する、請求項７に記載の方法。
【請求項１７】
細分類は、腫瘍と一組の分類の済んでいる神経膠腫試料との、一組のＧＤＭマーカーの発現の類似性を比較することにより実行する、請求項７に記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）腫瘍試料におけるＰＴＥＮ及びＤＬＬ３腫瘍マーカーの発現を測定すること、及び
（ｂ）前記腫瘍マーカーの発現に基づいて予後の予測及び／又は診断を行うこと
を含む神経膠腫の予後予測及び／又は診断方法であって、
ＰＴＥＮ及びＤＬＬ３両方の発現が強いと、良好な予後又は生存時間が長いことが示され、ＤＬＬ３の発現レベルとは無関係に、ＰＴＥＮの発現が弱いと、予後不良又は生存時間が短いことが示される、方法。
【請求項１９】
患者から採取した少なくとも２つの試料において、一組の神経膠腫決定マーカー（「ＧＤＭ」）の発現シグネチャーを比較することからなる神経膠腫のモニタリング又は診断法であって、
（ａ）第１の時点において第１の腫瘍試料におけるＧＤＭの発現を測定するステップ、
（ｂ）第１の時点より後の第２の時点において、第２の腫瘍試料におけるＧＤＭの発現を測定するステップ、及び
（ｃ）第１及び第２の試料の細分類が、ＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ及びＭｅｓのうちのいずれであるかを決定するステップ
を含み、第１の腫瘍試料から第２の腫瘍試料の間に、ＰＮ又はＰｒｏｌｉｆからＭｅｓ細分類への移行があった場合、前記腫瘍の重症度の増大又は進行が示される、方法。
【請求項２０】
（ａ）腫瘍試料における一組のＧＤＭの発現を測定すること、
（ｂ）腫瘍の細分類が、ＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ及びＭｅｓのうちのいずれであるかを決定すること、及び
（ｃ）前記細分類に基づいた少なくとも有効量の治療薬に接触させること
を含む神経膠腫の大きさ又は増殖を抑制する方法であって、
（Ｉ）Ｐｒｏｌｉｆ細分類を発現する腫瘍は、有効量の（ａ）Ａｋｔアンタゴニスト及び／又はＰｒｏｌｉｆアンタゴニスト及び／又は有糸分裂阻害薬と、（ｂ）神経分化薬とに接触させることからなる併用療法により治療し、（ＩＩ）Ｍｅｓ細分類を発現する腫瘍は、有効量の（ａ）Ａｋｔ及び／又はＭｅｓアンタゴニスト及び／又は抗血管新生薬と、（ｂ）神経分化薬とに接触させることからなる併用療法により治療し、（ＩＩＩ）ＰＮ細分類を発現する腫瘍は、有効量の（１）ＰＮアンタゴニスト、及び／又は（２）神経分化薬と、随意で、（３）Ａｋｔアンタゴニスト、（４）有糸分裂阻害薬及び（５）抗血管新生薬のうちの１つ以上の組み合わせに接触させることからなる併用療法により治療し、よって腫瘍の大きさ又は増殖を低減する、方法。
【請求項２１】
細分類は、階層式クラスター形成を用いて腫瘍を一組の神経膠腫試料と比較することにより実行する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
細分類は、ｋ平均法クラスター形成を用いて腫瘍を一組の神経膠腫試料と比較することにより実行する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
細分類は、投票方式を用いて腫瘍を一組の神経膠腫試料と比較することにより実行する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
細分類は、腫瘍と一組の分類の済んでいる神経膠腫試料との、一組のＧＤＭマーカーの発現の類似性を比較することにより実行する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
ＰＮアンタゴニストは、ＤＬＬ３、Ｎｏｇ、Ｏｌｉｇ１、Ｏｌｉｇ２、ＴＨＲ及びＡＳＣＬ１を除いて表Ａに示すＰＮマーカーからなる群より選択する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
Ｐｒｏｌｉｆアンタゴニストは、表Ａに示すいずれかのＰｒｏｌｉｆマーカーのアンタゴニストからなる群より選択する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
Ｍｅｓアンタゴニストは、表Ａに示すいずれかのＭｅｓマーカーのアンタゴニストからなる群より選択する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
Ａｋｔアンタゴニストは、ａｋｔ１、ａｋｔ２、ａｋｔ３のアンタゴニスト、ＰＩＫ３、ＰＤ１、ＦＲＡＰ、ＲＰＳ６ＫＢ１、ＳＧＫ、ＥＧＦＲ、及びＩＧＦＲの制御ドメイン又は触媒ドメインのアンタゴニスト、並びに、ＰＴＥＮ、ＩＮＰＰ５Ｄ又はＩＮＰＰＬ１の活性化因子、刺激装置又は回復薬からなる群より選択する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
抗血管新生薬は、ＶＥＧＦアンタゴニスト、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２アンタゴニストからなる群より選択する、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
有糸分裂阻害薬は、テモゾロミド、ＢＣＮＵ、ＣＣＮＵ、ロムスチン、グリアデル、エトポシド、カルムスチン、イリノテカン、トポテカン、プロカルバジン、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、メトトレキサート、シタラビン、パクリタキセル、アウリスタチン、メイタンシノイドからなる群より選択する、請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
神経細胞分化薬は、ＭＡＰ２、βチューブリン、ＧＡＤ６５及びＧＡＰ４３からなる群より選択し、神経細胞分化薬には、限定されないが、レチノイン酸、バルプロ酸とその誘導体（例えばエステル、塩、レチノイド、retinate、バルプロ酸等）；甲状腺ホルモン又は甲状腺ホルモンレセプターのアゴニスト；ノギン；ＮＴＲＫ２レセプターのＢＤＮＦ、ＮＴ４／５又はその他アゴニスト；転写因子ＡＳＣＬ１、ＯＬＩＧ１の発現を増大させる薬剤；ｄｌｌ３アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ１、２、３又は４アンタゴニスト、ニカストリン、Ａｐｈ１Ａ、Ａｐｈ１Ｂ、Ｐｓｅｎ１、Ｐｓｅｎ２及びＰＳＥＮＥＮの小分子阻害剤を含むγ分泌阻害剤、デルタ様リガンド（Ｄｌｌ）−１アンタゴニスト、デルタ様リガンド（Ｄｌｌ）−４、ｊａｇｇｅｄ１アンタゴニスト、ｊａｇｇｅｄ２アンタゴニスト；ｎｕｍｂアゴニスト又はｎｕｍｂ様アゴニストが含まれる、請求項２０に記載の方法。
【請求項３２】
アンタゴニスト及び／又は薬剤との接触の結果、腫瘍細胞が死滅する、請求項２０に記載の方法。
【請求項３３】
ＰＮアンタゴニスト、Ｐｒｏｌｉｆアンタゴニスト又はＭｅｓアンタゴニストが、（１）抗ＰＮ抗体、抗Ｐｒｏｌｉｆ抗体又は抗Ｍｅｓ抗体、（２）抗ＰＮ抗原結合断片、抗Ｐｒｏｌｉｆ抗原結合断片又は抗Ｍｅｓ抗原結合断片、（３）ＰＮ結合オリゴペプチド、Ｐｒｏｌｉｆ結合オリゴペプチド又はＭｅｓ結合オリゴペプチド、（４）ＰＮ小分子アンタゴニスト、Ｐｒｏｌｉｆ小分子アンタゴニスト又はＭｅｓ小分子アンタゴニスト、或いは、（５）ＰＮアンチセンスオリゴヌクレオチド、Ｐｒｏｌｉｆアンチセンスオリゴヌクレオチド又はＭｅｓアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項２０に記載の方法。
【請求項３４】
ＰＮアンタゴニスト、Ｐｒｏｌｉｆアンタゴニスト又はＭｅｓアンタゴニストは、（１）抗ＰＮ抗体、抗Ｐｒｏｌｉｆ抗体又は抗Ｍｅｓ抗体、及び（２）抗ＰＮ抗原結合断片、抗Ｐｒｏｌｉｆ抗原結合断片又は抗Ｍｅｓ抗原結合断片からなる群より選択する、請求項２０に記載の方法。
【請求項３５】
アンタゴニスト抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及び一本鎖抗体からなる群より選択する、請求項２０に記載の方法。
【請求項３６】
抗体又は抗原結合断片は、増殖阻害剤又は細胞傷害性薬物にコンジュゲートさせる、請求項２０に記載の方法。
【請求項３７】
増殖阻害剤又は細胞傷害性薬物は、メイタンシノイド、カリケアマイシン、抗生物質、放射性同位体及び核酸分解酵素からなる群より選択する、請求項２０に記載の方法。
【請求項３８】
（ａ）腫瘍試料における一組のＧＤＭの発現を測定すること、
（ｂ）腫瘍の細分類が、ＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ及びＭｅｓのうちのいずれであるかを決定すること、及び
（ｃ）前記細分類に基づいた少なくとも有効量の治療薬に接触させること
を含む神経膠腫を有する哺乳動物の治療的処置方法であって、
（Ｉ）Ｐｒｏｌｉｆ細分類を発現する腫瘍は、有効量の（ａ）Ａｋｔアンタゴニスト及び／又はＰｒｏｌｉｆアンタゴニスト及び／又は有糸分裂阻害薬と、（ｂ）神経分化薬とに接触させることからなる併用療法により治療し、（ＩＩ）Ｍｅｓ細分類を発現する腫瘍は、有効量の（ａ）Ａｋｔ及び／又はＭｅｓアンタゴニスト及び／又は抗血管新生薬と、（ｂ）神経分化薬とに接触させることからなる併用療法により治療し、（ＩＩＩ）ＰＮ細分類を発現する腫瘍は、有効量の（１）ＰＮアンタゴニスト、及び／又は（２）神経分化薬と、随意で、（３）Ａｋｔアンタゴニスト、（４）有糸分裂阻害薬及び（５）抗血管新生薬のうちの１つ以上の組み合わせに接触させることからなる併用療法により治療し、よって腫瘍の大きさ又は増殖を低減する、方法。
【請求項３９】
アンタゴニスト又は薬剤を投与した結果、神経膠腫が死滅する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
アンタゴニスト又は薬剤が、抗体、抗抗原結合抗体断片、オリゴペプチド、小分子アンタゴニスト又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
アンタゴニスト抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及び一本鎖抗体からなる群より選択する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
抗体又は抗原結合断片は、増殖阻害剤又は細胞傷害性薬物にコンジュゲートさせる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
増殖阻害剤又は細胞傷害性薬物は、メイタンシノイド、カリケアマイシン、抗生物質、放射性同位体及び核酸分解酵素からなる群より選択する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
試料中における、ＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ又はＭｅｓ神経膠腫決定マーカー（「ＧＤＭ」）の発現レベルの測定方法であって、試料をＰＮ結合剤、Ｐｒｏｌｉｆ結合剤又はＭｅｓ結合剤に曝すこと、及び試料中におけるそれぞれの結合量を決定することを含み、前記結合量により、試料中におけるＰＮ−ＧＤＭ、Ｐｒｏｌｉｆ−ＧＤＭ又はＭｅｓ−ＧＤＭそれぞれの発現レベルが示される方法。
【請求項４５】
ＰＮ結合剤、Ｐｒｏｌｉｆ結合剤又はＭｅｓ結合剤は、抗ＰＮ抗体、抗Ｐｒｏｌｉｆ抗体又は抗Ｍｅｓ抗体、ＰＮ結合抗体断片、Ｐｒｏｌｉｆ結合抗体断片又はＭｅｓ結合抗体断片、ＰＮオリゴペプチド、Ｐｒｏｌｉｆオリゴペプチド又はＭｅｓオリゴペプチド、ＰＮ小分子アンタゴニスト、Ｐｒｏｌｉｆ小分子アンタゴニスト、又はＭｅｓ小分子アンタゴニスト、及びＰＮアンチセンスオリゴヌクレオチド、Ｐｒｏｌｉｆアンチセンスオリゴヌクレオチド又はＭｅｓアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群より選択する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
抗ＰＮ抗体、抗Ｐｒｏｌｉｆ抗体又は抗Ｍｅｓ抗体は、モノクローナル抗体、抗原結合抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体及び一本鎖抗体からなる群より選択する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
ＰＮ結合剤、Ｐｒｏｌｉｆ結合剤又はＭｅｓ結合剤を検出可能に標識する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
神経膠腫を有する哺乳動物の生存時間を予測する方法であって、
ａ）腫瘍の試験試料を除去すること、及び
ｂ）試験試料と、患者の生存時間が既知である三十（３０）以上の悪性度の高い神経膠腫からなる組とにおける、ＰＴＥＮ及びＤＬＬ３の発現レベルを測定すること
を含み、試験試料中のＰＴＥＮ及びＤＬＬ３両方の発現レベルが高い場合、標準試料の集団の中央値より生存時間が長い確率が統計的に高いことが示され、試験試料中のＰＴＥＮ又はＤＬＬ３の発現レベルが低い場合、標準試料の集団の中央値より生存時間が短い確率が統計的に高いことが示される、方法。
【請求項４９】
哺乳動物の神経膠腫の重症度を診断する方法であって、
（ａ）当該哺乳動物から採取された組織を含む試験試料を
（ｉ）ＰＴＥＮポリペプチドに結合する抗体、オリゴペプチド又は有機小分子である第１の試薬、及び
（ｉｉ）ＤＬＬ３ポリペプチドに結合する抗体、オリゴペプチド又は有機小分子である第１の試薬
に接触させること、並びに
（ｂ）試験試料中における、第１試薬のＰＴＥＮポリペプチドとの複合体形成量と、第２試薬のＤＬＬ３ポリペプチドとの複合体形成量をそれぞれ測定すること
を含み、ＰＴＥＮ複合体形成及びＤＬＬ３複合体形成両方の量が大きい場合に軽度の腫瘍が示され、ＰＴＥＮ複合体形成又はＤＬＬ３複合体形成の量が小さい場合に重度の腫瘍が示される、方法。
【請求項５０】
第１試薬及び／又は第２試薬を検出可能に標識する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
第１試薬及び／又は第２試薬を固体の支持体に付着させる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
神経膠腫の（ｉ）治療的処置又は（ｉｉ）診断的検出に有用な薬物の調製において、（ａ）ＰＮ−ＧＤＭポリペプチド、Ｐｒｏｌｉｆ−ＧＤＭポリペプチド又はＭｅｓ−ＧＤＭポリペプチド、又は（ｂ）（ａ）をコードする核酸配列を使用する方法。
【請求項５３】
ＧＤＭポリペプチドが、抗体、ＧＤＭ結合抗体断片、ＧＤＭ結合オリゴペプチド、ＧＤＭ小分子アンタゴニスト、又はＧＤＭアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項５２に記載の使用方法。
【請求項５４】
抗体が、モノクローナル抗体、抗原結合抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体又は一本鎖抗体である、請求項５２又は５３に記載の使用方法。
【請求項５５】
神経膠腫を有する哺乳動物を治療的に処置する方法であって、有効量の神経分化薬と、（１）Ａｋｔアンタゴニスト、（２）有糸分裂阻害薬及び（３）抗血管新生薬のうちの１つ以上との組合せに接触させることを含み、結果として腫瘍の大きさ又は増殖が低減される、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
関連出願
この出願は、米国特許法第１１９条(ｅ)に基づいて２００５年１２月１６日に出願された米国特許出願番号第６０/７５０９４４号の優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、癌、特に神経膠腫の診断、予後の予測及び治療の方法を目的とする。
【０００３】
発明の背景
悪性腫瘍（癌）は、米国において心臓疾患に続き第２の主要な死亡原因である（Boring等, CA Cancel J. Clin. 43:7(1993)）。癌は、正常な組織から誘導されて腫瘍塊を形成する異常な又は腫瘍形成性の細胞の数の増加、これらの腫瘍形成性腫瘍細胞による隣接組織の侵襲、及び最終的に血液やリンパ系を介して局所のリンパ節や遠くの部位に転移と呼ばれる過程を介して広がる悪性細胞の生成を特徴とする。癌性状態においては、正常細胞が増殖しない条件下で細胞が増殖する。癌自体は、異なる侵襲及び攻撃性の程度で特徴付けられる広範な種々の形態で顕現する。
【０００４】
神経膠腫は原発性脳腫瘍に最も多い種類であり、一般に重篤な予後に関連している。神経膠芽腫（ＧＢＭ）及び未分化星状細胞腫（ＡＡ）を含む悪性度の高い星細胞腫は、成人の内因性脳腫瘍に最も多い。高悪性度の星細胞腫の分子遺伝学的理解は進歩したが（Ketange等、Curr. Opin. Oncol. 15:197-203 (2003)）、起源となる細胞種類は依然として不明確であり、疾病の病原力の分子的決定要因はよく分かっていない。これらの腫瘍の細胞起源及び分子的病変形成がもっとよく理解されれば、ほぼ一様に致死性であるこれらの腫瘍の治療の新規標的を同定することができる。
腫瘍の類別は多くの場合正確な診断及び疾病の経過の予後予測にとって非常に重要であり、神経膠腫も例外ではない。数十年に亘る経験から、組織学に基づく神経膠腫の診断システムが導かれた。神経膠腫は、主にアストロサイトの形態を示すか、又はオリゴデンドログリアの形態を示すかに基づいて組織学的に決定され、細胞性、核の非定形性、壊死、有糸分裂形、及び微小血管性増殖といった全て生物学的攻撃行動に関連する特徴によって類別される。このような診断システムは、数十年に亘る神経膠腫の臨床経験の末に開発されたもので、現在の神経腫瘍学の基礎となっている。Kleihues, P.等による、世界保健機構（「ＷＨＯ」）の腫瘍の分類、Cancer 88:2887 (2000)参照。ＷＨＯによる星細胞種の分類の基本構想は、四（４）つのグレードに分けられる。悪性度の低い腫瘍はグレードＩ（毛様細胞性星細胞腫）及びグレードＩＩ（星状芽細胞腫）に分類され、一方それよりも悪性度の高い腫瘍はグレードＩＩＩ（未分化星状細胞腫）とグレードＩＶ（多形神経膠芽腫）と定義される。乏突起膠腫及び混合膠腫（オリゴデンドログリア成分及びアストロサイト成分の両方を有する）は、悪性度の低い変異体（ＷＨＯのグレードＩＩ）と、それよりも悪性度の高い（ＷＨＯのグレードＩＩＩ）変異体に生じる。
【０００５】
最近まで、星細胞腫とその他の神経膠腫は、脳の実質内に所在するグリア細胞から生じると思われていた。しかしながら、ヒト及び動物の研究における新しい証拠により、神経膠腫の別の細胞起源として神経幹細胞が示唆されている（(Caussinus及びGonzalez, Nat. Genet. 37: 1125 (2005); Singh等、Cancer Res. 63: 5821-5828 (2003); Zhu等、Cancer Cell 8: 119 (2005))。マウスモデルにより、アストロサイト又は神経幹／前駆細胞が、ヒト神経膠腫の病理組織学的特徴を示す腫瘍を生じさせ得ることが実証されている（Bachoo等、Cancer Cell 1: 269-277 (2002); Uhrbom等、Cancer Res. 62: 5551-5558 (2002)）。成体のヒトの前脳が神経幹細胞源を豊富に含むこと（(Sanai等Nature 427: 740-744 (2004))、及びヒトＧＢＭが腫瘍原性の神経幹細胞を含むこと（Galli等、Cancer Res. 64: 7011-7021 (2004); Ignatova等、GLIA 39: 193-206 (2002); Singh等、Nature 432: 396-401 (2004)）が実証されたことにより、神経幹及び／又は前駆細胞がヒト神経膠腫の有望な発生源であることが示唆され、また前記の実証により、ＧＢＭの幹細胞様成分を標的とすることを目指すアプローチにより、更に効果的な療法が得られると推論される（Berger等、Lancet Oncol. 5: 511-514 (2004); Fomchenko及びHolland, Exp. Cell Res. 306: 323-329 (2005); Ignatova等、上掲; Oliver and Wechsler-Reya, Neuron 42: 885-888 (2004)）。しかしながら、重要なことに、疾病の進行または治療的応答に対する幹様細胞の寄与は解明されておらず、腫瘍細胞のうち幹様特性を示す細胞の割合も明らかでない。
患者の予後及び治療上の決定は正確な病理学的類別に基づいて行われるため、一貫性は重要な属性である。大部分で再現性を示す一方で、現在の組織学に基づくシステムは、種類及び類別に関して神経病理学者の間で判断の実質的な相違を生じさせ得る。Louis, DN等、Am J. Pathol. 159: 779-86 (2001); Prayson RA等、J. Neurol. Sci. 175: 33-9 (2000); Coons等、Cancer 79:1381-93 (1997)。更に、類別の正確な方法は、時間の経過と共に変化する。最後に、このアプローチは、形態学（Burger, Brain Pathol. 12:257-9 (2002)）、即ち分子的最終状態より生物学的最終状態に基づくため、可能性のある新規化合物を同定する能力は限られている。
【０００６】
現在では、組織学に基づくびまん性神経膠腫の類別は、患者の余命の予測に最も効果がある。しかしながら、組織学は神経膠腫の病理学を説明するものではなく、新規の分子マーカーの同定及び新規治療法の開発にそれ程有用でもない。更に、分子マーカーの発現及び治療上の応答の両方に臨床的に関連するびまん性神経膠腫の未確認のサブクラスが存在することの証拠も多く得られている。Mischel PS等、Cancer Biol. Ther. 2:242-7 (2003)参照。更に、様々な治療計画において、組織学的に同一の腫瘍に対する臨床的応答が大きく異なる場合があることが報告されている。Mischelら、上掲; Cloughesy, TF等、Cancer 97: 2381-6 (2003)参照。これは、基礎となる生態学の解明に組織病理学的評価がどれだけ貢献しているかを強調するものである。腫瘍学者が分子を標的とした療法を志向するにつれ、分子によって定義される個別のサブグループが益々重要となっている。しかしながら、特定の腫瘍関連遺伝子が研究されている一方、個々の遺伝子／タンパク質アッセイのみか、場合によっては組織学的特性と組み合わせた同アッセイは、これまでのところ、生存時間を予測するものではなく、治療法の決定の指標として有用でない。Tortosa, A.等、Cancer 97: 1063-71 (2003); Reavey-Cantwell, JF等、J. Neurooncol. 55: 195-204 (2001); Bouvier-Labit, C.ら、Neuropathol. Appl. Neurobiol. 24:381-8 (1998); Stark, AM等、Zentralbl Neurochir. 64: 30-6 (2003); Li, J.等、Science 275: 1943-7 (1997)参照。
複数の研究は、ＡＡ及びＧＢＭ（それぞれグレードＩＩＩ及びＩＶの星状細胞腫としても知られる）の臨床的サブクラスと予後の分子的相関関係を調査している。腫瘍のグレードは、疾病の結果の最も確実で強い予後の予測手段である（Prados and Levin, Semin Oncol. 27: 1-10 (2000)）。染色体（ｃｈｒ）１０ｑの異型接合性の欠損は、ＡＡよりＧＢＭで多く発生するもので、ＧＢＭの生存期間が短いことと関連付けられている（Balesaria等、Br. J. Can. 81: 1371-1377 (1999); Schmidt等、J. Neuropathol. Exp. Neurol. 61: 321-328 (2002); Smith等、J. Nat. Can. Inst.  93: 1246-1256 (2001)）。診断時の年齢が高いことはＧＢＭのネガティブな予後因子であり（Curran等、J. Natl. Cancer Inst. 85; 704-710 (1993)）、結果の分子マーカーは患者の年齢によって異なる（Batchelor等、Clin. Cancer Res. 10: 228-233 (2004); Smith等、J. Natl. Cancer Inst. 93: 1246-1256 (2001)）。これらの事実は、年齢に関連する分子のサブクラスが存在することを示唆するものである。ｐ５３変異とＥＧＦＲの増幅は相互に排他的なＧＢＭサブグループを定義することが報告されている（von Deimling等、Glia 15, 328-338 (1995); Watanabe等、Brain Pathology 6, 217-223 (1996)）が、最近の研究により、この分類法の妥当性が問題となっており（Okada等、Cancer Research 63, 413-416 (2003)）、ｐ５３変異又はＥＧＦＲ座位の変更の、予後予測における価値は明らかでない（Heimberger等、Clinical Cancer Research 11: 1462-1466 (2005); Ushio等、Frontiers in Bioscience 8: e281-288 (2003)。これらの腫瘍の生物学的基礎の理解を深めることが、この疾病の治療の効果を上げるために必要であることは明らかである。
【０００７】
マイクロアレイ分析は、同時に数千個もの個別の遺伝子の発現を評価できるため、公平で、定量的な、再現性のある腫瘍評価を行うことができるツールとして認識されている。この手法は、これまでに神経膠腫を含む多数の異なる癌に適用されている。Mischel, P.S.等、Oncogene 22: 2361-73 (2003); Kim, S.等、Mol. Cancer Ther. 1:1229-36 (2002); Ljubimova等、Cancer Res. 61: 5601-10 (2001); Nutt, CL等、Cancer Res. 63: 1602-7 (2003); Rickman, D.S.等、Cancer Res. 61: 6885-91 (2001); Sallinen, S.L.等、Cancer Res. 60: 6617-22 (2000); Shai, R.等、Oncogene 22: 4918-23 (2003)参照。組織学的評価と異なり、マイクロアレイ分析は、腫瘍に潜む遺伝的変異を同定することができ、よって腫瘍の分類と患者の予後の予測を改善させる。神経膠腫のマイクロアレイ分析を行った結果、分類されるグループの均質性が高まった。Freije等、Cancer Res. 64: 6503-6510 (2004)。更に、マイクロアレイ分析は、生存期間の予後診断手段として組織学的分類より優れていることも分かっている。Freije等、上掲。
悪性の神経膠腫の発現のプロファイリングにより、腫瘍グレードの進行、及び患者の生存に関連する遺伝子だけでなく、分子のサブタイプが同定された（Godard等、Cancer Res. 63: 6613-6625 (2003); Rickman等、Can. Res. 61: 6885-6891 (2001); van den Boom等、Am. J. Pathol. 163: 1033-1043 (2003)）。ＧＢＭとＡＡが引き続き組織学的な外観に基づいて定義されている一方で、発現のプロファイリングによる結果予測が組織学的特性より優れているという発見（Freije等、上掲.; Nutt等、Clin. Can. Res. 11: 2258-2264 (2003)）は、形態学に基づいてＡＡ及びＧＢＭとして定義された腫瘍は分子的遺伝子的サブタイプの混合であるという仮説を支持するものである。分子的に異なる疾病の実態は、標的とされる抗癌剤に対して異なる臨床的応答を示し得ると仮定すると、分子的に決定された腫瘍のサブセットの挙動が更に明らかとなれば、更に効果的な治療法の開発の助けとなり得る。
【０００８】
悪性の神経膠腫は、遺伝的病変の段階的蓄積の結果として進行すると思われる。例えば、未分化星状細胞腫は通常、（１）通常はｐ５３の変異による、機能的ｐ５３経路の欠損、（２）通常はｐ１６／ＡＲＦ座の削除による、機能的ｐ１６／ｐＲｂ経路の欠損、（３）ｒａｓ変異以外の原因によるｒａｓ経路の活性化、及び（４）正常なヒトのアストロサイト（ＮＨＡ）又はグレードＩＩの神経膠腫に稀に見られるテロメラーゼの再活性化を示す。Cavenee等、“Diffuse infiltrating astrocytomas,” in Pathology and Genetics of Tumors of the Nervous System, W.K. Cavnee and P. Kleihues, Eds., pp. 9-51.  Lyon:IRAC Press (2000); Ichimura等、Cancer Res. 60: 417-424 (2000); Feldkamp等、Neurosurgery 45: 1442-1453 (1999)。多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）は、上述のようなｐ５３及びｐ１６／ｐＲｂ経路における変化に加え、Ａｋｔ経路の活性化に繋がるＰＴＥＮの破壊を含むことも多い。Hass-Kogan等、Curr. Biol. 8: 1195-1198 (2000), Holland等、Nat. Genet. 25: 55-57 (2000)。下流の標的に作用することにより、Ａｋｔは細胞周期阻害剤のレベルを下げることができ（Datta等、Cell 91: 231-241 (1997); Pap等、J. Biol. Chem. 273: 19929-19932 (1998); Brunet等、Cell 96: 857-868 (1999); Kops等、Nature, 398: 630-634 (1999); Medema等、Nature 404: 782-787 (2000)）、更には低酸素条件の下で血管性内皮増殖因子のレベルを増大させることができる。Mazure等、Blood 90: 3322-3331 (1997)。Ａｋｔはアポトーシスを抑制し、細胞周期の規制を解除し、且つ血管新生能を変化させることができる。更に、観察では、全てのＧＢＭ腫瘍の８０％が、高いレベルのＡｋｔの活性を示す。細胞生理学及びＧＢＭの高い発現に対するＡｋｔの既知の効果を考慮すると、Ａｋｔの活性化はＧＢＭの進行に強く関連している。Hass-Kogan、上掲; Holland、上掲。
癌抑制遺伝子のＰｔｅｎは、神経膠腫を含むヒトの種々の癌において変異、削除又は体細胞性に不活性化されることが多いホスファターゼをコードする。Li等、Science 275: 1943 (1997)。発癌に加え、Ｐｔｅｎは、胚におけるその中央神経系（ＣＮＳ）の発現パターンが偏在性であること（Gimm等、Hum. Mol. Genet. 9: 1633 (2000); Luukko等、Mech. Dev. 83: 187 (1999)）、並びに神経障害がヒトＰｔｅｎの生殖系列の変異に関連することによって示唆されるように、脳の発達にも重要な役割を果たすと思われる。従来のＰｔｅｎ−／−ノックアウトマウスの早期の胎生致死は、脳発達の初期におけるＰｔｅｎの機能に関する研究の障害となった（Di Cristofano等、Nature Genet. 19: 348 (1998) and Stambolic等、Cell 95: 29 (1998)）が、親動物にＣｒｅ及びｌｏｘｐ導入遺伝子を用いたもの等の、プロモーターによって誘導されたトランスジェニックノックアウト動物は、Ｐｔｅｎが神経幹細胞産生を負に調節することを示唆した。Groszer等、Science 294: 2186-2189 (2001)。
【０００９】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路は、ホジキン病、Ｔ細胞リンパ腫、並びに乳癌、子宮頸癌、膵臓癌及び大腸癌を含む多数の癌の発現に関与している。40-44  Jundt, F.等、Blood 99:3398-403 (2002); Pear, W.S.等、J. Exp. Med. 183: 2283-91 (1996); Weijzen S.,等、Nat. Med. 8: 979-86 (2002); Weijzen等、J. Cell Physiol. 194: 356-62 (2003); Miyamoto, Y.,等、Cancer Cell 3: 565-76 (2003); Nickoloff, B.J.等、Oncogene 22: 6598-608 (2003)。レセプターのｎｏｔｃｈファミリーは、細胞運命の決定に密接に関与するヘテロ二量体の膜貫通タンパク質からなっている。細胞種類によって、ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、増殖、分化及びアポトーシスに、陽性に又は陰性に影響し得る。Artavanis-Tsakonas, S.等、Science 284: 770-6 (1992); Miele, L.等、J. Cell Physiol. 181: 393-409 (1999)。今日まで、ヒトには４つのｎｏｔｃｈレセプター（つまりｎｏｔｃｈ１−４）と、５つの対応するリガンド、即ちｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ−３（ｄｌｌ−３）、ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ−４（ｄｌｌ−４）、ｊａｇｇｅｄ−１及びｊａｇｇｅｄ−２が同定されている。ｎｏｔｃｈ経路は、ハリネズミ等の他の重要な癌経路と相互作用及び重複する（Hallahan等、Cancer Res. 64: 7794-7800 (2004) and Ras.  Fitzgerald, K.等、Oncogene 19: 4191-8 (2000); Ruiz-Hidalgo, R.J.等、J. Oncol. 14: 777-83 (1999)）。しかしながら、癌におけるｎｏｔｃｈの役割は、組織種類等の要因に基づき、複雑であると考えられる。ｎｏｔｃｈ−１の活性が、ｒａｓで形質転換したヒト細胞における癌性の表現型を維持するのに必要である（Weijzen, S.等、Nat. Med. 8: 979-86 (2002)）一方、ｎｏｔｃｈ−１シグナル伝達は、マウスの皮膚腫瘍及び非小細胞肺癌に腫瘍抑制効果を有することが発見された。Wolfer等、Nat. Genet. 33: 416-21 (2003); Sriuranpong, V.等、Cancer Res. 61: 3200-5 (2001)。この結果は、癌においてｎｏｔｃｈシグナル伝達が様々な役割を有することを示唆するものである。
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、小脳において、分化を抑制し、且つ増殖を促進する。Solecki, DJ.等、Neuron 31: 557-68 (2001)。更に、ｎｉｔｃｈシグナル伝達は、特に神経膠腫に関連付けられている。具体的には、ｎｏｔｃｈリガンドのｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ−１とｊａｇｇｅｄ−１及びｎｏｔｃｈ−１レセプターの発現は、神経膠腫細胞株とヒト神経膠腫の両方において亢進され、それらの下方制御は、複数の神経膠腫細胞株においてアポトーシスを誘発し、増殖を阻害し、よって動物モデルの生存期間を延長させた。Purow等、Cancer Res. 65(6): 2353-2363 (2005)。
【００１０】
しかしながら、腫瘍形成におけるｎｏｔｃｈシグナル伝達の役割は変わり得る。例えば、Ｎｏｔｃｈ−１活性によって髄芽腫の増殖が阻害される一方、Ｎｏｔｃｈ−２活性によってその増殖が促進されることが観察された。Fan等、Cancer Res. 64: 7787-7793 (2004)。最近ｎｏｔｃｈリガンドＤｌｌ３がｎｏｔｃｈの不活性化と関連することが示唆されており、ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路に対する本発明者の理解を更に複雑にしている。Ladi等、J. Cell Biol. 170: 983-992 (2005)。このように、現在のところ、腫瘍形成におけるｎｏｔｃｈの役割に対する理解は、単に不完全である。
マイクロアレイ分析によって得られるもの等の遺伝子発現のプロファイリングにより、神経膠腫の予後の予測において遺伝子発現パネルを同定することができるが、これまでのところ、予後の有効な予測手段となる個別の遺伝子発現を同定した分析はない。例えば、７４人の患者から採取した第３期及び第４期の神経膠腫の腫瘍組織のマイクロアレイ分析において、予後に関連して異なって発現する遺伝子が５９５個同定された。Freije等、Cancer Res. 64: 6503-6510 (2004)。この群から、差別的発現が最も強く、一貫していた遺伝子４４個を同定した。この群を更に１６個の個別の遺伝子に絞り、逆転写−ＰＣＲによってさらに評価した。追加的なモデル化を行うことにより、生存期間の延長に関連する６つの遺伝子の１つであるｎｏｔｃｈリガンドＤＬＬ３の発現が増強していることが同定された。しかしながら、この研究により、マイクロアレイ分析により得られる遺伝子プロファイリングの予後予測及び診断上の価値が示された一方で、予後の予測を行う上で価値のある個別遺伝子は同定されなかった。
【００１１】
本発明者等は、ここで、神経膠腫の三（３）つの新規予後予測サブクラスを同定し、それらがａｋｔ及びＮｏｔｃｈシグナル伝達経路（Ｐｒｏｌｉｆ、Ｍｅｓ）の活性化に差別的に関連することを示す。神経又は前神経（ＰＮ）系列マーカー及びＮｏｔｃｈ経路の成分を示す１つの腫瘍分類では、生存期間中央値が増大することが示された。対照的に、増殖又は間葉のマーカーを特徴とする残る二（２）つの腫瘍分類は、短い生存期間に関連していた。
ここで本発明者等は更に、２つの遺伝子モデルを同定し、ＰＴＥＮ及びＤＬＬ３両方の強い発現が長い生存期間に関連することを明らかにすることにより、腫瘍の浸潤性に対するＡｋｔ及びＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の影響を実証する。更に、再発の際、原発時に前神経の表現型又は増殖性の表現型を示していた一部の腫瘍は間葉性のクラスへ移行し、よってこれらの分子的に定義される群が、別の分化状態又は腫瘍進行段階を表わし得ることが示唆された。このような予後の２つの遺伝子モデルのＤＤＬ３プラスＰＴＥＮの予後予測上の価値は２つの独立データセットにおいて統計的に有意であることが示されたので、Freije等によって開示された予後予測上の価値とは明確に異なるものである。ＢＭＰ２は、ＤＬＬ３と同じ腫瘍のサブクラスのマーカーである。２つの遺伝子モデルにおいてＢＭＰ２でＤＬＬ３を置換すると、ＤＬＬ３に見られる結果を再現することができない。
【００１２】
本発明者等は、更に、Ｎｏｔｃｈ又はＡｋｔ経路の活性化状態が腫瘍の浸潤性の決定因子であり、標的とした両方に対する応答を予測できることを発見した。
最後に、本発明者等は、予後不良の腫瘍が神経幹細胞のマーカー及びＡｋｔ経路のシグナル伝達及び血管新生又は増殖を特徴とすることを同定した。Ｎｏｔｃｈ経路のシグナル伝達、及び使用した神経前駆体のマーカーによって、予後予測上の腫瘍の特徴が更に明らかになる。正常な脳では増殖、血管新生、又はＮｏｔｃｈ及びＡｋｔシグナル伝達が殆ど行われないが、神経マーカーの強い発現が特徴的である。予後が良好なＰＮ腫瘍は予後不良のＭｅｓマーカーを有する細胞のパッチを示すことがあり、またＰＮ腫瘍はＭｅｓ表現型を伴って再発することがある。つまり、これらのことから、Ａｋｔシグナル伝達、血管新生又は増殖等の適切な生物学的過程を遮断することにより、予後不良の腫瘍が予後良好のＰＮ様腫瘍に変換する可能性が示唆される。これらの発見により、Ａｋｔシグナル経路、血管新生又は増殖と、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達又は神経分化を誘発するその他の処置とを組み合わせることにより、神経膠腫の増殖を遅らせる可能性が示唆される。
【００１３】
概要
本発明は概して、神経膠腫のモニタリング、診断、予後の予測及び治療の方法を提供する。一実施形態では、本発明は、神経膠腫の予後予測に関する三（３）つのサブクラスを提供する。これらのサブクラスの、ａｋｔ及びＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の活性化との関連性はそれぞれ異なっている。神経又は前神経（ＰＮ）系列マーカー及びＮｏｔｃｈ経路の成分を示す腫瘍の分類には、患者の生存期間中央値の増大が示された。対照的に、増殖（Ｐｒｏｌｉｆ）又は間葉（Ｍｅｓ）のマーカーは、短い生存期間に関連する。別の実施形態では、本発明は神経膠腫の２つの遺伝子モデルを提供し、これらのモデルでは、ＰＴＥＮ及びＤＬＬ３両方の比較的高い発現レベルは生存期間の延長の指標となり、ＰＴＥＮの低発現（ＤＬＬ３に関係なく）は生存期間の短縮の指標となる。
【００１４】
別の実施形態では本発明は神経膠腫の治療法を提供し、本方法は、（ｉ）当該組の発現シグネチャーの細分類、即ち前神経（ＰＮ）であるか、増殖性（Ｐｒｏｌｉｆ）であるか又は間葉性（Ｍｅｓ）であるかを決定し、（Ｉ）Ｐｒｏｌｉｆ細分類を示す腫瘍を、有効量の（ａ）Ａｋｔアンタゴニスト及び／又はＰｒｏｌｉｆアンタゴニスト及び／又は有糸分裂阻害薬、及び（ｂ）神経分化薬に接触させることを含む併用療法により処置し、（ＩＩ）Ｍｅｓ細分類を示す腫瘍を、有効量の（ａ）Ａｋｔ及び／又はＭｅｓアンタゴニスト及び／又は抗血管新生薬、及び（ｂ）神経分化薬に接触させることを含む併用療法により処置し、（ＩＩＩ）ＰＮ細分類を示す腫瘍を、有効量の（１）ＰＮアンタゴニスト及び／又は（２）神経分化薬と、随意で（３）Ａｋｔアンタゴニスト、（４）有糸分裂阻害薬、及び（５）Ｍｅｓアンタゴニスト及び／又は抗血管新生薬のうちの１つ以上とを組み合わせたものに接触させることを含む併用療法により処置することを含む。特定の態様では、Ａｋｔアンタゴニストはａｋｔ１、ａｋｔ２、ａｋｔ３のアンタゴニスト、ＰＩＫ３の制御又は触媒ドメインのアンタゴニスト、ＰＤ１、ＦＲＡＰ、ＲＰＳ６ＫＢ１、ＳＧＫ、ＥＧＦＲ、ＩＧＦＲ、及びＰＴＥＮ、ＩＮＰＰ５Ｄ又はＩＮＰＰＬ１の活性化因子、刺激装置又は回復薬からなる群より選択される。別の特定の態様では、Ｐｒｏｌｉｆアンタゴニストは表Ａに示されるあらゆるＰｒｏｉｆマーカーのアンタゴニストからなる群より選択される。更なる特定の態様では、有糸分裂阻害薬は、テモゾロミド、ＢＣＮＣ、ＣＣＮＵ、ロムスチン、グリアデル、エトポシド、カルムスチン、イリノテカン、トポテカン、プロカルバジン、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、メトトレキサート、シタラビン、パクリタキセル、アウリスタチン、メイタンシノイドからなる群より選択される。また別の特定の態様では、Ｍｅｓアンタゴニストは、表Ａに示されるあらゆるＭｅｓマーカーのアンタゴニストからなる群より選択される。また別の特定の態様では、抗血管新生薬は、ＶＥＧＦアンタゴニスト、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２アンタゴニストからなる群より選択される。また別の態様では、ＰＮアンタゴニストは、ＤＬＬ３、Ｎｏｇ、Ｏｌｉｇ１、Ｏｌｉｇ２、ＴＨＲ及びＡＳＣＬ１を除き、表Ａに示されるあらゆるＰＮマーカーのアンタゴニストからなる群より選択される。また別の特定の態様では、神経分化薬は、ＭＡＰ２、βチューブリン、ＧＡＤ６５及びＧＡＰ４３からなる群より選択される。神経分化薬の例は、これらに限定されるものではないが、レチノイン酸、バルプロ酸、及びそれらの誘導体（例えば、エステル、塩、レチノイド、retinates、バルプロ酸等）、甲状腺ホルモン又は甲状腺ホルモンレセプターの他のアゴニスト、ノギン、ＢＤＮＦ、ＮＴ４／５又はＮＴＲＫ２レセプターの他のアゴニスト、転写因子ＡＳＣＬ１、ＯＬＩＧ１の発現を増大させる薬剤、ｄｌｌ３アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ１、２、３又は４アンタゴニスト、γセクレターゼ阻害薬、例えばニカストリン、ＡｐｈｌＡ、ＡｐｈｌＢ、��ｓｅｎ１、Ｐｓｅｎ２及びＰＳＥＮＥＮの小分子阻害薬、デルタ様リガンド（Ｄｌｌ）−１アンタゴニスト、デルタ様リガンド（Ｄｌｌ）−４、ｊａｇｇｅｄ１アンタゴニスト、ｊａｇｇｅｄ２アンタゴニスト、ｎｕｍｂアゴニスト又はｎｕｍｂ様アゴニストを含む。
【００１５】
別の実施形態では、本発明は神経膠腫の治療方法を提供し、本方法は、有効量の（１）神経分化薬と、（３）Ａｋｔアンタゴニスト、（４）有糸分裂阻害薬、及び（５）Ｍｅｓアンタゴニスト及び／又は抗血管新生薬のうちの１つ以上とを組み合わせたものに接触させることを含む併用療法により処置することを含む、膠腫の治療法を提供する。特定の態様では、Ａｋｔアンタゴニストはａｋｔ１、ａｋｔ２、ａｋｔ３のアンタゴニスト、ＰＩＫ３の制御又は触媒ドメインのアンタゴニスト、ＰＤ１、ＦＲＡＰ、ＲＰＳ６ＫＢ１、ＳＧＫ、ＥＧＦＲ、ＩＧＦＲ、及びＰＴＥＮ、ＩＮＰＰ５Ｄ又はＩＮＰＰＬ１の活性化因子、刺激装置又は回復薬からなる群より選択される。別の特定の態様では、Ｐｒｏｌｉｆアンタゴニストは表Ａに示されるあらゆるＰｒｏｉｆマーカーのアンタゴニストからなる群より選択される。更なる特定の態様では、有糸分裂阻害薬は、テモゾロミド、ＢＣＮＣ、ＣＣＮＵ、ロムスチン、グリアデル、エトポシド、カルムスチン、イリノテカン、トポテカン、プロカルバジン、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、メトトレキサート、シタラビン、パクリタキセル、アウリスタチン、メイタンシノイドからなる群より選択される。また別の特定の態様では、Ｍｅｓアンタゴニストは、表Ａに示されるあらゆるＭｅｓマーカーのアンタゴニストからなる群より選択される。また別の特定の態様では、抗血管新生薬は、ＶＥＧＦアンタゴニスト、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２アンタゴニストからなる群より選択される。また別の態様では、ＰＮアンタゴニストは、ＤＬＬ３、Ｎｏｇ、Ｏｌｉｇ１、Ｏｌｉｇ２、ＴＨＲ及びＡＳＣＬ１を除き、表Ａに示されるあらゆるＰＮマーカーのアンタゴニストからなる群より選択される。また別の特定の態様では、神経分化薬は、ＭＡＰ２、βチューブリン、ＧＡＤ６５及びＧＡＰ４３からなる群より選択される。神経分化薬の例は、これらに限定されるものではないが、レチノイン酸、バルプロ酸、及びそれらの誘導体（例えば、エステル、塩、レチノイド、retinates、バルプロ酸等）、甲状腺ホルモン又は甲状腺ホルモンレセプターの他のアゴニスト、ノギン、ＢＤＮＦ、ＮＴ４／５又はＮＴＲＫ２レセプターの他のアゴニスト、転写因子ＡＳＣＬ１、ＯＬＩＧ１の発現を増大させる薬剤、ｄｌｌ３アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ１、２、３又は４アンタゴニスト、γセクレターゼ阻害薬、例えばニカストリン、ＡｐｈｌＡ、ＡｐｈｌＢ、Ｐｓｅｎ１、Ｐｓｅｎ２及びＰＳＥＮＥＮの小分子阻害薬、デルタ様リガンド（Ｄｌｌ）−１アンタゴニスト、デルタ様リガンド（Ｄｌｌ）−４、ｊａｇｇｅｄ１アンタゴニスト、ｊａｇｇｅｄ２アンタゴニスト、ｎｕｍｂアゴニスト又はｎｕｍｂ様アゴニストを含む。
【００１６】
別の実施形態では、本発明は神経膠腫の予後予測及び／又は診断方法を提供し、本方法は、（ｉ）腫瘍の試料中における神経膠腫の決定因子となる一組のマーカー（「ＧＤＭ」）の発現を測定すること、（ｉｉ）当該組の発現シグネチャーの細分類、即ち前神経（ＰＮ）であるか、増殖性（Ｐｒｏｌｉｆ）であるか又は間葉性（Ｍｅｓ）であるかを決定した後、（ｉｉｉ）疾病の結果の予後予測又は診断を行い、Ｐｒｏｌｉｆ又はＭｅｓの細分類によって予後不良又は基準試料からなる集団の中央値より短い生存期間を有する可能性が大きいこと統計的に示され、ＰＮの細分類によって、良好な予後又は基準試料からなる集団の中央値より長い生存期間を有する可能性が大きいことが統計的に示される。特定の態様では、細分類は、階層的クラスター形成を用いて行われる。別の特定の態様では、細分類はｋ平均法クラスター形成を用いて行われる。また別の特定の態様では、細分類は投票方式によって行われる。更なる特定の態様では、細分類は、腫瘍中のＧＤＭと腫瘍の基準セット中のＧＤＭの比較によって行われる。
【００１７】
また別の実施形態では、本発明は神経膠腫のモニタリング又は診断方法を提供し、本方法は、患者から採取した少なくとも２つの腫瘍試料における一組の神経膠腫決定マーカー（「ＧＤＭ」）の発現シグネチャーを比較すること、
（ｉ）第１の時点で第１腫瘍試料におけるＧＤＭの発現を測定すること、
（ｉｉ）第１の時点よりも後の第２の時点で第２の腫瘍試料におけるＧＤＭの発現を測定すること、及び
(ｉｉｉ)腫瘍試料におけるＧＤＭの発現シグネチャーを、前神経（ＰＮ）、増殖性（Ｐｒｏｌｉｆ）又は間葉性（Ｍｅｓ）に形態学的に再分類すること
を含み、第１腫瘍試料から第２腫瘍試料までの間に、細分類がＰＮからＰｒｏｌｉｆへ、Ｍｅｓへと移行することにより、前記腫瘍の重症度の上昇又は前記腫瘍の進行が示される。
【００１８】
別の実施形態では、本発明は神経膠腫の増殖の抑制方法を提供し、本方法は、（ｉ）一組の発現シグネチャーの細分類、即ち前神経（ＰＮ）であるか、増殖性（Ｐｒｏｌｉｆ）であるか又は間葉性（Ｍｅｓ）であるかを決定し、（Ｉ）Ｐｒｏｌｉｆ細分類を示す腫瘍を、有効量の（ａ）Ａｋｔアンタゴニスト及び／又はＰｒｏｌｉｆアンタゴニスト及び／又は有糸分裂阻害薬、及び（ｂ）神経分化薬に接触させることを含む併用療法により処置し、（ＩＩ）Ｍｅｓ細分類を示す腫瘍を、有効量の（ａ）Ａｋｔ及び／又はＭｅｓアンタゴニスト及び／又は抗血管新生薬、及び（ｂ）神経分化薬に接触させることを含む併用療法により処置し、（ＩＩＩ）ＰＮ細分類を示す腫瘍を、有効量の（１）ＰＮアンタゴニスト及び／又は（２）神経分化薬と、随意で（３）Ａｋｔアンタゴニスト、（４）有糸分裂阻害薬、及び（５）Ｍｅｓアンタゴニスト及び／又は抗血管新生薬のうちの１つ以上とを組み合わせたものに接触させることを含む併用療法により処置することを含み、その結果として腫瘍の大きさ又は増殖を低減する。特定の態様では、Ａｋｔアンタゴニストはａｋｔ１、ａｋｔ２、ａｋｔ３のアンタゴニスト、ＰＩＫ３の制御又は触媒ドメインのアンタゴニスト、ＰＤ１、ＦＲＡＰ、ＲＰＳ６ＫＢ１、ＳＧＫ、ＥＧＦＲ、ＩＧＦＲ、及びＰＴＥＮ、ＩＮＰＰ５Ｄ又はＩＮＰＰＬ１の活性化因子、刺激装置又は回復薬からなる群より選択される。別の特定の態様では、Ｐｒｏｌｉｆアンタゴニストは表Ａに示されるあらゆるＰｒｏｉｆマーカーのアンタゴニストからなる群より選択される。更なる特定の態様では、有糸分裂阻害薬は、テモゾロミド、ＢＣＮＣ、ＣＣＮＵ、ロムスチン、グリアデル、エトポシド、カルムスチン、イリノテカン、トポテカン、プロカルバジン、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、メトトレキサート、シタラビン、パクリタキセル、アウリスタチン、メイタンシノイドからなる群より選択される。また別の特定の態様では、Ｍｅｓアンタゴニストは、表Ａに示されるあらゆるＭｅｓマーカーのアンタゴニストからなる群より選択される。また別の特定の態様では、抗血管新生薬は、ＶＥＧＦアンタゴニスト、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２アンタゴニストからなる群より選択される。また別の態様では、ＰＮアンタゴニストは、ＤＬＬ３、Ｎｏｇ、Ｏｌｉｇ１、Ｏｌｉｇ２、ＴＨＲ及びＡＳＣＬ１を除き、表Ａに示されるあらゆるＰＮマーカーのアンタゴニストからなる群より選択される。また別の特定の態様では、神経分化薬は、ＭＡＰ２、βチューブリン、ＧＡＤ６５及びＧＡＰ４３からなる群より選択される。神経分化薬の例は、これらに限定されるものではないが、レチノイン酸、バルプロ酸、及びそれらの誘導体（例えば、エステル、塩、レチノイド、retinates、バルプロ酸等）、甲状腺ホルモン又は甲状腺ホルモンレセプターの他のアゴニスト、ノギン、ＢＤＮＦ、ＮＴ４／５又はＮＴＲＫ２レセプターの他のアゴニスト、転写因子ＡＳＣＬ１、ＯＬＩＧ１の発現を増大させる薬剤、ｄｌｌ３アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ１、２、３又は４アンタゴニスト、γセクレター��阻害薬、例えばニカストリン、ＡｐｈｌＡ、ＡｐｈｌＢ、Ｐｓｅｎ１、Ｐｓｅｎ２及びＰＳＥＮＥＮの小分子阻害薬、デルタ様リガンド（Ｄｌｌ）−１アンタゴニスト、デルタ様リガンド（Ｄｌｌ）−４、ｊａｇｇｅｄ１アンタゴニスト、ｊａｇｇｅｄ２アンタゴニスト、ｎｕｍｂアゴニスト又はｎｕｍｂ様アゴニストを含む。特定の態様では、このような接触の結果、腫瘍細胞の増殖が低減するか、又は腫瘍細胞が死滅する。別の態様では、アンタゴニストは抗体又は抗原に結合する抗体断片である。また別の特定の態様では、アンタゴニスト抗体はモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又は一本鎖抗体である。また別の特定の態様では、アンタゴニスト抗体又は抗原に結合する抗体断片は、増殖阻害剤又は例えばメイタンシノイド又はカリケアマイシンを含む毒素、アウリスタチン、抗生物質、放射性同位体、核酸分解酵素等の細胞傷害剤にコンジュゲートしている。
【００１９】
別の実施形態では、本発明は神経膠腫を有する哺乳動物の治療方法を提供し、本方法は、（ｉ）一組の発現シグネチャーの細分類、即ち前神経（ＰＮ）であるか、増殖性（Ｐｒｏｌｉｆ）であるか又は間葉性（Ｍｅｓ）であるかを決定し、（Ｉ）Ｐｒｏｌｉｆ細分類を示す腫瘍を、当該哺乳動物に対して治療的有効量の（ａ）Ａｋｔアンタゴニスト及び／又はＰｒｏｌｉｆアンタゴニスト及び／又は有糸分裂阻害薬、及び（ｂ）神経分化薬を投与することを含む併用療法により処置し、（ＩＩ）Ｍｅｓ細分類を示す腫瘍を、有効量の（ａ）Ａｋｔ及びＭｅｓアンタゴニスト及び／又は抗血管新生薬、及び（ｂ）神経分化薬に接触させることを含む併用療法により処置し、（ＩＩＩ）ＰＮ細分類を示す腫瘍を、有効量の（１）ＰＮアンタゴニスト及び／又は（２）神経分化薬と、随意で（３）Ａｋｔアンタゴニスト、（４）有糸分裂阻害薬、及び（５）Ｍｅｓアンタゴニスト及び／又は抗血管新生薬のうちの１つ以上とを組み合わせたものに接触させることを含む併用療法により処置することを含み、その結果として腫瘍を治療的に処置する。特定の態様では、アンタゴニストは抗体、抗原に結合する抗体断片、オリゴペプチド、小分子アンタゴニスト、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。別の特定の態様では、抗体はモノクローナル抗体、抗原に結合する抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は一本鎖抗体である。また別の態様では、アンタゴニスト又は本方法に使用するのに適した薬剤は、場合によっては、増殖阻害剤又は例えばメイタンシノイド又はカリケアマイシン等の毒素、抗生物質、放射性同位体、核酸分解酵素等の細胞傷害剤とすることができる。
【００２０】
また別の実施形態では、本発明は、試料中のＰＮ−ＧＤＭ、Ｐｒｏｌｉｆ−ＧＤＭ、又はＭｅｓ−ＧＤＭの発現レベルを測定する方法を目的とし、本方法では、当該試料をＰＮ結合剤、Ｐｒｏｌｉｆ結合剤又はＭｅｓ結合剤に接触させ、試料中における各結合剤の結合量を測定し、そのような結合量によって試料中におけるＰＮ−ＧＤＭ、Ｐｒｏｌｉｆ−ＧＤＭ又はＭｅｓ−ＧＤＭの発現レベルが示される。特定の態様では、ＰＮ結合剤、Ｐｒｏｌｉｆ結合剤又はＭｅｓ結合剤は、（１）抗ＰＮ抗体、抗Ｐｒｏｌｉｆ抗体、又は抗Ｍｅｓ抗体、（２）ＰＮ結合抗体断片、Ｐｒｏｌｉｆ結合抗体断片、Ｍｅｓ結合抗体断片、（３）ＰＮ結合オリゴペプチド、Ｐｒｏｌｉｆ結合オリゴペプチド、Ｍｅｓ結合オリゴペプチド、（４）ＰＮ小分子アンタゴニスト、Ｐｒｏｌｉｆ小分子アンタゴニスト、又はＭｅｓ小分子アンタゴニスト、或いは（５）ＰＮアンチセンスオリゴヌクレオチド、Ｐｒｏｌｉｆアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はＭｅｓアンチセンスオリゴヌクレオチドである。別の特定の態様では、前記抗体は、（ａ）モノクローナル抗体、（ｂ）抗原結合抗体断片、（ｃ）キメラ抗体、（ｄ）ヒト化抗体、又は（ｅ）一本鎖抗体である。また別の特定の態様では、このような抗体は、ＰＮ−ＧＤＭ、Ｐｒｏｌｉｆ−ＧＤＭ、又はＭｅｓ−ＧＤＭの結合位置又は結合量を定性的及び／又は定量的に測定するのに有用な化合物の分子を用いて検出可能に標識される。
【００２１】
また別の実施形態では、本発明は神経膠腫を有する哺乳動物の生存可能性を予後予測する方法を目的とし、本方法は、（ａ）腫瘍の試験試料を除去すること、（ｂ）試験試料及び患者の生存期間が既知である三十（３０）個以上の悪性度の高い神経膠腫からなる組におけるＰＴＥＮ及びＤＬＬ３遺伝子産物の発現レベルを測定することを含み、試験試料中のＰＴＥＮ及びＤＬＬ３両方の発現レベルが高い場合に基準試料の集団における中央値より生存期間が長い可能性が統計的に大きく、試験試料中におけるＰＴＥＮ又はＤＬＬ３の発現レベルが低い場合に基準試料の集団における中央値より生存期間が短い可能性が統計的に大きいことが示される。
【００２２】
また別の実施形態では、本発明は、哺乳動物の神経膠腫の重症度を診断する方法を目的とし、本方法は、（ａ）哺乳動物から採取された神経膠腫細胞或いはＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質又はその他遺伝子産物の抽出物からなる試験試料に対し、（ｉ）ＰＴＥＮ  ＧＤＭに結合する抗体、抗原結合抗体断片、オリゴペプチド又は有機小分子である第１の試薬、及び（ｉｉ）ＤＬＬ３  ＧＤＭに結合する抗体、抗原結合抗体断片、オリゴペプチド、又は有機小分子である第２の試薬を接触させることと、（ｂ）試験試料中におけるＰＴＥＮ  ＧＤＭ及びＤＬＬ３  ＧＤＭと第１の試薬及び第２の試薬とのそれぞれの複合体形成の量を測定することとを含み、高レベルのＰＴＥＮ  ＧＤＭ複合体形成及び高レベルのＤＬＬ３  ＧＤＭ複合体形成によって軽度の腫瘍が示され、低レベルのＰＴＥＮ  ＧＤＭ複合体又はＤＬＬ３  ＧＤＭ複合体によって重度の腫瘍が示される。特定の態様では、第１の試薬及び／又は第２の試薬は、検出可能に標識する、固体の支持体に付着させる等する。別の特定の態様では、第１の試薬は、抗ＰＴＥＮ抗体、ＰＴＥＮ結合抗体断片、又はＰＴＥＮ結合オリゴペプチド、小分子、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。また別の特定の態様では、第２の試薬は、抗ＤＬＬ３抗体、ＤＬＬ３結合抗体断片、又はＤＬＬ３結合オリゴペプチド、小分子又はアンチセンスヌクレオチドとすることができる。また別の特定の態様では、抗ＰＴＥＮ抗体又は抗ＤＬＬ３抗体は、モノクローナル抗体、抗原結合抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体又は一本鎖抗体とすることができる。また別の特定の態様では、このような抗体は、ＰＴＥＮ又はＤＬＬ３結合剤の細胞への結合の位置及び／又は量を定性的及び／又は定量的に測定するのに有用な分子又は化合物を用いて標識する。
【００２３】
また別の実施形態では、本発明は神経膠腫の診断的検出に有用な薬物の調製における、（ａ）ＰＴＥＮ、又はＤＬＬ３ポリペプチド、或いは（ｂ）（ａ）をコードする核酸の使用法を目的とする。特定の態様では、薬物はＰＴＥＮ結合剤又はＤＬＬ３結合剤とすることができる。別の特定の態様では、ＰＴＥＮ結合剤は、抗ＰＴＥＮ抗体、ＰＴＥＮ−結合抗体断片、又はＰＴＥＮ結合オリゴペプチド、小分子アンタゴニスト、アンチセンスオリゴヌクレオチドとすることができ、ＤＬＬ３結合剤は、抗ＤＬＬ３抗体、ＤＬＬ３結合抗体断片、又はＤＬＬ３結合オリゴペプチド、小分子、アンチセンスオリゴヌクレオチドとすることができる。また別の特定の態様では、抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は一本鎖抗体とすることができる。また別の特定の態様では、このようなＰＴＥＮ又はＤＬＬ３結合剤は、ＰＴＥＮ又はＤＬＬ３結合剤の、細胞への結合の位置及び／又は量を定性的及び／又は定量的に測定するのに有用な分子又は化合物を用いて標識される。
【００２４】
また別の実施形態では、本発明は、神経膠腫の診断的検出に有用な薬物の調製における（ａ）ＰＮ−ＧＤＭ、Ｐｒｏｌｉｆ−ＧＤＭ又はＭｅｓ−ＧＤＭ、或いは（ａ）をコードする核酸の使用法を目的とする。特定の態様では、この薬物はＰＮ結合剤、Ｐｒｏｌｉｆ結合剤、又はＭｅｓ結合剤である。別の特定の態様では、ＰＮ結合剤、Ｐｒｏｌｉｆ結合剤、又はＭｅｓ結合剤は、（１）抗ＰＮ抗体、抗Ｐｒｏｌｉｆ抗体、又は抗Ｍｅｓ抗体、（２）ＰＮ結合抗体断片、Ｐｒｏｌｉｆ結合抗体断片、又はＭｅｓ結合抗体断片、（３）ＰＮ結合オリゴペプチド、Ｐｒｏｌｉｆ結合オリゴペプチド、又はＭｅｓ結合オリゴペプチド、（４）ＰＮ結合小分子、Ｐｒｏｌｉｆ結合小分子、又はＭｅｓ結合小分子、或いは（５）ＰＮアンチセンスオリゴヌクレオチド、Ｐｒｏｌｉｆアンチセンスオリゴヌクレオチド、Ｍｅｓアンチセンスオリゴヌクレオチドとすることができる。また別の特定の態様では、抗ＰＮ抗体、抗Ｐｒｏｌｉｆ抗体、又はＭｅｓ抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又は一本鎖抗体とすることができる。また別の特定の態様では、このようなＰＮ結合剤、Ｐｒｏｌｉｆ結合剤、又はＭｅｓ結合剤は、ＰＮ結合剤、Ｐｒｏｌｉｆ結合剤、又はＭｅｓ結合剤の細胞への結合の位置及び／又は量を定性的及び／又は定量的に測定するのに有用な分子又は化合物を用いて標識される。
【００２５】
本発明の詳細な説明
１．定義
用語「神経膠腫」は、脳又は脊髄のグリア細胞又はそれらの前駆体から生じる腫瘍を指す。神経膠腫は、主に星状形態を示すか又は乏突起形態を示すかに基づいて組織学的に定義され、全て生物学的に侵襲性の挙動に関連する特性である細胞性、核非定型性、壊死、有糸分裂の形、及び微小血管の増殖によって類別される。星細胞腫には主に２つの種類、即ち、高悪性度と低悪性度がある。高悪性度の腫瘍は急速に増殖し、血管新生化が活発で、脳内に広がり易い。低悪性度の星細胞腫は、通常は局在性で、時間をかけてゆっくりと増殖する。低悪性度の腫瘍と比較して、高悪性度腫瘍の侵襲性は大きく、非常に集中的な治療を要し、これに関連する生存期間は短い。子供の星細胞腫の多くは低悪性度であり、成人の同腫瘍の多くは高悪性度である。これらの腫瘍は、脳及び脊髄のいずれにも発生し得る。より一般的な低悪性度の星細胞腫を幾つか挙げると、若年性毛細胞性星細胞腫（ＪＰＡ）、繊維性星細胞腫、多形性黄色星状細胞腫（ＰＸＡ）及びDesembryoplastic神経上皮腫瘍（ＤＮＥＴ）である。最も一般的な２つの高悪性度の星細胞腫は、未分化星状細胞腫（ＡＡ）と多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）である。
本明細書において使用される用語「神経膠腫決定マーカー」（「ＧＤＭ」）は、一般に神経膠腫に関連付けられている細胞マーカーを指す。この用語は、マーカーをコードする遺伝子（例えば、ＤＮＡ、遺伝子増殖）と、その転写の結果得られる遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡ、コード化ポリペプチド）の両方を包含する。ＧＤＭマーカーは、表Ａに示されるような、前神経（ＰＮ）細分類、増殖性（Ｐｒｏｌｉｆ）細分類又は間葉性（Ｍｅｓ）細分類に特有のものであり得る。
【００２６】
表Ａ：神経膠腫決定マーカー（ＧＤＭ）
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【００２７】
「天然配列ＧＤＭポリペプチド」には、天然由来のＧＤＭポリペプチドに対応する同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。このような天然配列ＧＤＭポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生成することもできる。「天然配列ＧＤＭポリペプチド」という用語には、特に、特定のＧＤＭポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌形態(例えば、細胞外ドメイン配列)、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びそのポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明のある実施態様では、ここに開示される天然配列ＧＤＭポリペプチドは、表Ａに示されるポリペプチドに対応する成熟又は完全長天然配列ポリペプチドである。
「ＧＤＭポリペプチド変異体」とはＧＤＭポリペプチド、好ましくは、ここに開示するような完全長天然配列ＧＤＭポリペプチド配列、及びシグナルペプチドを欠くその変異型、本明細書に示されるような完全長天然配列ＧＤＭポリペプチドの細胞外ドメイン又は任意の他の断片と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有するここで定義するような、ここに開示するようなその活性型でありを意味する。このような変異体ポリペプチドには、例えば、完全長天然アミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端において一又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたポリペプチドが含まれる。特定の態様では、このような変異体ポリペプチドは、ここに開示する完全長天然配列ＧＤＭポリペプチド配列ポリペプチド、及びシグナルペプチドを欠くその変異型、ここに開示するような完全長天然配列ＧＤＭポリペプチドの細胞外ドメイン、又は他の任意の断片に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有している。特定の態様では、このような変異体ポリペプチドは、対応する天然配列ポリペプチドとは、長さ上で少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、又はそれより大きいアミノ酸残基において異なる。別の態様では、このような変異体ポリペプチドは、対応する天然ポリペプチド配列と比較して一つ以下の保存的アミノ酸置換、あるいは天然ポリペプチド配列と比較して２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０以下の同類アミノ酸置換を有するにすぎない。
【００２８】
ここで同定したＧＤＭポリペプチド配列に関する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」とは、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした後の、特定のＧＤＭポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を測定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ-２プログラム用の完全なソースコードが下記の表１に提供されている配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を使用することによって得られる。ＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作成され、下記の表１に示したソースコードは米国著作権庁, ワシントンD.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ-２プログラムはジェネンテック社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから公的に入手可能であり、下記の表１に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標）Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され変動しない。
「ＧＤＭ変異体ポリヌクレオチド」又は「ＧＤＭ変異体核酸配列」とは、ここで定義されるように、ＧＤＭポリペプチド、好ましくはその活性型をコードし、ここに同定される完全長天然配列ＧＤＭポリペプチド配列、又はここに同定される各完全長ＧＤＭポリペプチド配列の他の任意の断片をコードする核酸配列（完全長ＧＤＭポリペプチドの完全なコード化配列の一部分のみを表す核酸によってコードされた）と、少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有する核酸分子を意味する。通常、このような変異体ポリヌクレオチドは、ここに開示する各完全長天然配列ＧＤＭポリペプチド配列、又はここに同定される各完全長ＧＤＭポリペプチド配列の任意の他の断片をコードする核酸配列と、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の核酸配列同一性を有している。このような変異体ポリヌクレオチドは、天然ヌクレオチド配列を含まない。
【００２９】
通常、このような変異体ポリヌクレオチドは、天然配列ポリペプチドとは、少なくとも約５０ヌクレオチド長が異なり、あるいはその変異は少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、又は１０００ヌクレオチド長に亘り、この文脈の「約」という用語は、表示ヌクレオチド配列長にその表示長の１０％を加えるか又は減じたものを意味する。
ここで同定されるＧＤＭポリペプチドコード化核酸配列に対する「パーセント(％)核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、対象のＧＤＭ核酸配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を測定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。ここでの目的のためには、％核酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ-２プログラム用の完全なソースコードが下記の表１に提供されている配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を使用することによって得られる。ＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作成され、下記の表１に示したソースコードは米国著作権庁,ワシントン D.C.，20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ-２プログラムはジェネンテック社、サウスサンフランシスコ, カリフォルニアから公的に入手可能であり、下記の表１に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標）Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され変動しない。
【００３０】
核酸配列比較にＡＬＩＧＮ-２が用いられる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与えられた核酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ-２のＣ及びＤのアラインメントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ＺはＤの全ヌクレオチド数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。％核酸配列同一性の計算の例として、「ＲＥＦ-ＤＮＡ」が対象となる仮説的ＧＤＭコード化核酸配列を表し、「比較ＤＮＡ」が対象となる「ＲＥＦ-ＤＮＡ」核酸分子が比較されている核酸配列を表し、そして「Ｎ」、「Ｌ」及び「Ｖ」の各々が異なった仮想ヌクレオチドを表していて、表４及び５が「比較ＤＮＡ」と称される核酸配列の「ＲＥＦ-ＤＮＡ」と称される核酸配列に対する％核酸配列同一性の計算方法を示す。特に断らない限りは、ここでの全ての％核酸配列同一性値は、直ぐ上のパラグラフに示したようにＡＬＩＧＮ-２コンピュータプログラムを用いて得られる。
【００３１】
他の実施態様では、ＧＤＭ変異体ポリヌクレオチドとは、ＧＤＭポリペプチドをコードする核酸分子であり、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で、ここに記載の完全長ＧＤＭポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とハイブリダイゼーションすることができる。このような変異体ポリペプチドは、このような変異体ポリヌクレオチドによってコードされているものであり得る。
ここに開示される種々のＧＤＭポリペプチドを記載するために使用される「単離」とは、自然環境の成分から同定され及び分離及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様では、このようなポリペプチドは、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でＳＤＳ-ＰＡＧＥにより均一になるまで精製される。このような単離されたポリペプチドには、ＧＤＭポリペプチドの自然環境由来の少なくとも一つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのポリペプチドが含まれる。しかしながら、通常は、このような単離されたポリペプチドは少なくとも一つの精製工程により調製される。
【００３２】
「単離された」ＧＤＭポリペプチドをコードする核酸は、同定され、ポリペプチドをコードする核酸の天然源に通常付随している少なくとも一つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。上述のような単離された核酸分子のいずれもが、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。故に、そのような核酸分子のいずれもが、天然の細胞中に存在する特異的なポリペプチドコード化核酸分子とは区別される。
「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列と、リボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００３３】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングに必要な温度が高くなり、プローブが短くなるとそれに必要な温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、相補鎖がその融点より低い環境に存在する場合に、変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーション配列の間で所望される相同性の程度が高くなればなるほど、用いることができる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をよりストリンジェントにすることになり、低い温度はストリンジェントを低下させることになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの更なる詳細及び説明については、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology（Wiley Interscience Publishers, 1995）を参照のこと。
【００３４】
ここで定義される「ストリンジェント条件」又は「高度のストリンジェンシー条件」は、（１）洗浄に低イオン強度及び高温度を用いる、例えば、５０℃で、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム；（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤を用いる、例えば、４２℃で、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム；又は（３）４２℃で、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％の硫酸デキストラン溶液中で終夜ハイブリダイゼーション、４２℃で、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中にて１０分間の洗浄、ついで５５℃で、ＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる１０分間の高ストリンジェンシー洗浄を用いるものによって同定される。
「中程度のストリンジェント条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Press, 1989)に記載されているように同定され、上記のストリンジェントより低い洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度のストリンジェント条件は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハード液、１０％硫酸デキストラン、及び２０ｍｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中にて３７℃での終夜インキュベーション、次いで１×ＳＳＣ中にて約３７−５０℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識する。
【００３５】
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」と融合したＧＤＭポリペプチド又はＧＤＭ結合剤を含んでなるキメラポリペプチドを意味する。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するのに十分な残基を有し、その長さは融合するポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくはそのような抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないように十分に独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜５０のアミノ酸残基(好ましくは、約１０〜２０の残基)を有する。
ここでの目的に対する「活性な」又は「活性」とは、天然又は天然に生じるＧＤＭポリペプチドの生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するＧＤＭポリペプチドの形態を意味し、その中で、「生物学的」活性とは、天然又は天然発生ＧＤＭポリペプチドが保持する抗原性エピトープに対する抗体の生成を誘発する能力以外の、天然又は天然発生ＧＤＭによって引き起こされる生物機能（阻害又は刺激）を意味し、「免疫学的」活性とは、天然又は天然発生ＧＤＭポリペプチドが保持する抗原性エピトープに対する抗体の生成を誘発する能力を意味する。本明細書において使用される、活性のＧＤＭポリペプチドとは、神経膠腫に罹患していない同様の組織上での発現と比較した場合、定性的又は定量的観点から神経膠腫に異なって発現する抗原のことである。
【００３６】
「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、そしてここに開示した天然ＧＤＭポリペプチドの生物学的活性を部分的又は完全にブロック、阻害、又は中和する任意の分子が含まれる。適切なアンタゴニスト分子には、特にアゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片、断片、又は天然ＧＤＭポリペプチドのアミノ酸配列変異体、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、小有機分子等が含まれる。ＧＤＭアンタゴニストを同定する方法は、それを発現する細胞を含むＧＤＭポリペプチドと候補アゴニスト又はアンタゴニスト分子を接触させ、そして通常はＧＤＭポリペプチドに関連している一又は複数の生物学的活性の検出可能な変化を測定することが含まれ得る。
「治療する」又は「治療」又は「緩和」とは、治療上の処置及び予防的療法又は防護的療法の双方を称し、その目的は、神経膠腫の進行を防ぐか又は衰え（小さく）させることである。「予後予測」とは、起こり得る神経膠腫の経過及び結果を決定すること又は予測することである。「診断する」とは、神経膠腫を区別するその特徴を同定すること又は決定する過程を指す。診断の過程は、重症度又は疾病の進行に基づく段階又は腫瘍分類として表現されることがある。
【００３７】
治療、予後の予測又は診断を必要とする患者には、神経膠腫に罹りやすい患者並びに神経膠腫に既に罹っているもの、又は神経膠腫の予防が必要な患者が含まれる。本発明の方法に従ってＧＤＭアンタゴニスト（例えば、ＰＮアンタゴニスト、Ｐｒｏｌｉｆアンタゴニスト又はＭｅｓアンタゴニスト）の治療量を投与された後に、患者が次の一又は複数のものについて観察可能な及び／又は測定可能な減少又は消失を示したならば、被検体又は哺乳動物は、ＧＤＭポリペプチドを発現する神経膠腫に関して成功裏に「治療された」ことになる：神経膠腫細胞の数の減少、又は神経膠腫細胞の消失；腫瘍の大きさの減少；軟部組織及び骨への癌の広がりを含む、末梢器官への神経膠腫細胞の浸潤の阻害（すなわち、ある程度の減速及び好ましくは停止）；腫瘍転移の阻害（すなわち、ある程度の減速及び好ましくは停止）；腫瘍増殖のある程度の阻害；及び／又は特定の癌に関連している一又は複数の症状のある程度の軽減；疾病率及び死亡率の減少、及び生命問題の質の改善。ある程度、このようなＧＤＭアンタゴニストは生存癌細胞の増殖を防ぐ及び／又は死滅させることができ、それは、細胞増殖抑制及び／又は細胞傷害性であり得る。これらの兆候又は症状の低減は、また、患者が感じることができる。
疾患における成功裏の治療及び改善を評価することに関する上記のパラメータは、医師にとってよく知られている日常的手法によって容易に測定が可能である。癌治療では、有効性は、例えば、病気の進行までの時間（ＴＴＰ）の算定及び／又は反応速度（ＲＲ）を確かめることによって測定できる。転移は、ステージング試験によって、転移の範囲を決定するためのカルシウムレベル及び他の酵素に関する試験によって確かめることができる。また、グリア外の領域への広がりを探索するためにＣＴスキャンを行うことができる。予後予測、診断及び／又は治療の過程に関して本明細書に開示される本発明は、ＧＤＭ（例えば、ＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ、Ｍｅｓ、Ｐｔｅｎ及びＤＬＬ３）の増殖及び発現の測定及び評価に関する。
【００３８】
癌の治療、症状の緩和又は診断のための「哺乳動物」とは、哺乳動物に分類される任意の動物を意味し、ヒト、家畜用及び農場用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、フェレットなどを含む。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
一又は複数の更なる治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時（同時期）及び任意の順序での連続した投与を含む。
【００３９】
ここで用いられる「担体」は、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる服用量及び濃度でそれらに曝露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン；グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標)、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ(登録商標)を含む。
「固相」又は「固体支持体」とは、本発明のＧＤＭアンタゴニスト、又はＧＤＭ結合剤が接着できる非水性マトリクスを意味する。ここに包含される固相の例は、部分的又は全体的にガラス（例えば、径の調整されたガラス）、ポリサッカリド（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンで形成されたものを含む。或る実施態様では、前後関係に応じて、固相はアッセイ用プレートのウェル；その他では精製用カラム（例えばアフィニティークロマトグラフィーカラム）を含むことができる。また、この用語は、米国特許第４２７５１４９号に記載されたような別々の粒子の不連続な固相も含む。
【００４０】
「リポソーム」は、哺乳動物への薬物（例えばＧＤＭアンタゴニスト）輸送に有用な、脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤を含む種々のタイプの小胞体である。リポソームの成分は、通常は細胞膜の脂質配向に類似した２層構造に配列される。
ここで定義されている「小」分子又は「小」有機分子とは、約５００ダルトン未満の分子量である。
【００４１】
ＧＤＭアンタゴニスト又はＧＤＭ結合剤の「有効量」とは、特に述べた目的を実施するために十分な量のことである。「有効量」は、述べられた目的に関連して、経験的及び常套的な形で決定することができる。
「治療的有効量」という用語は、患者又は哺乳動物の疾患又は疾病を「治療」するのに効果的なＧＤＭアンタゴニスト又は他の薬剤の量を指す。神経膠腫の場合、治療的に有効量の薬は癌細胞の数を減じ；腫瘍の大きさを減じ；末梢組織又は器官への神経膠腫細胞の浸潤を阻害（すなわち、ある程度まで減速、好ましくは停止）し；腫瘍転移を阻害（すなわち、ある程度まで減速及び好ましくは停止）し；腫瘍増殖をある程度まで阻害し；及び／又は神経膠腫に関連する一又は複数の症状をある程度まで緩和する。「治療する」のここでの定義を参照せよ。薬が存在する癌細胞の増殖を妨げ及び／又は死滅させる程度まで、それは、細胞分裂停止及び／又は細胞傷害性であり得る。
【００４２】
ＧＤＭアンタゴニストの「増殖阻害量」は、細胞、特に腫瘍、例えば癌細胞の増殖をインビトロ又はインビボで阻害できる量である。腫瘍性細胞増殖を阻害するために、そのような量は経験的及び常套的な形で決定することができる。
ＧＤＭアンタゴニストの「細胞傷害性量」は、細胞、特に神経膠腫細胞、例えば癌細胞をインビトロ又はインビボで破壊できる量である。腫瘍性細胞増殖の阻害の目的のための抗ＧＤＭ抗体、ＧＤＭポリペプチド、ＧＤＭ結合オリゴペプチド又はＧＤＭ結合有機分子の「細胞傷害性量」は、経験的及び常套的な形で決定することができる。
【００４３】
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、例えば、抗ＰＮ、抗Ｐｒｏｌｉｆ及び抗Ｍｅｓ  ＧＤＭモノクローナル抗体（アンタゴニスト及び中和抗体）、多エピトープ特異性を有する抗ＰＮ、抗Ｐｒｏｌｉｆ、及び抗Ｍｅｓ  ＧＤＭ抗体成分、一本鎖抗ＧＤＭ抗体、多特異性抗体（例えば、二重特異性）及び所望する生物学的又は免疫学的活性を示す限りは上に列挙した抗体の全ての抗原結合断片（下記参照）を含む。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、ここでの抗体と相互に置き換え可能に用いられる。
「単離された抗体」とは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものを意味する。その自然環境の汚染成分とは、抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様では、抗体は、(１)ローリー(Lowry)法によって定量して９５重量％以上の、最も好ましくは９９重量％以上の抗体まで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分な程度まで、あるいは(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた還元又は非還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離された抗体には、組換え体細胞内のインサイツの抗体が含まれるが、これは抗体の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないからである。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一つの精製工程により調製される。
【００４４】
基本的な４-鎖抗体ユニットは２つの同一の軽(Ｌ)鎖と２つの同一の重(Ｈ)鎖から構成されるヘテロ四量体の糖タンパクである(ＩｇＭ抗体は、基本的なヘテロ四量体ユニットとそれに付随するＪ鎖と称される付加的なポリペプチドの５つからなり、よって１０の抗原結合部位を有するが、分泌されたＩｇＡ抗体は重合して、基本的４-鎖ユニットとそれ付随するＪ鎖のうち２-５つを含む多価集合を形成可能である)。ＩｇＧの場合、４-鎖ユニットは一般的に約１５００００ダルトンである。それぞれのＬ鎖は１つの共有ジスルフィド結合によってＨ鎖に結合するが、２つのＨ鎖はＨ鎖のアイソタイプに応じて一又は複数のジスルフィド結合により互いに結合している。それぞれのＨ及びＬ鎖はまた規則的な間隔を持った鎖内ジスルフィド結合を持つ。それぞれのＨ鎖は、α及びγ鎖の各々に対しては３つの定常ドメイン(ＣＨ)が、μ及びεアイソタイプに対しては４つのＣＨドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)をＮ末端に有する。それぞれのＬ鎖は、その他端に定常ドメイン(ＣＬ)が続く可変ドメイン(ＶＬ)をＮ末端に有する。ＶＬはＶＨと整列し、ＣＬは重鎖の第一定常ドメイン(ＣＨ１)と整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。ＶＬとＶＨは共同して対になって、単一の抗原結合部位を形成する。異なるクラスの抗体の構造及び特性は、例えばBasic and Clinical Immunology, ８版, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow(編), Appleton ＆ Lange, Norwalk, CT, 1994, ７１頁及び６章を参照のこと。
任意の脊椎動物種からのＬ鎖には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる２つの明確に区別される型の一つを割り当てることができる。また、その重鎖の定常ドメイン(ＣＨ)のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンには異なったクラス又はアイソタイプを割り当てることができる。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭという免疫グロブリンの５つの主要なクラスがあり、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる重鎖を有する。さらにγ及びαのクラスは、ＣＨ配列及び機能等の比較的小さな差異に基づいてサブクラスに分割され、例えば、ヒトにおいては次のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２が発現する。
【００４５】
「可変」という用語は、可変ドメインのある部分が抗体の間で配列が広範囲に異なることを意味する。Ｖドメインは抗原結合性を媒介し、その特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を定める。しかし、可変性は可変ドメインの概ね１１０-アミノ酸スパンを通して均等には分布されていない。代わりに、Ｖ領域は、それぞれ９−１２アミノ酸長である「高頻度可変領域」と称される極度の可変性を有するより短い領域によって分離された１５−３０アミノ酸のフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる比較的不変の伸展からなる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメイン各々は、大きなβ-シート配置をとり、３つの高頻度可変領域により接続された４つのＦＲ領域を含み、それはループ状の接続を形成し、β-シート構造の一部を形成することもある。各鎖の高頻度可変領域はＦＲにより他の鎖からの高頻度可変領域とともに極近傍に保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ED. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)）。定常ドメインは抗体の抗原への結合に直接は関係ないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)における抗体の寄与を示す。
ここで使用されるところの「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合に寄与する抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は一般には「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメインのＫａｂａｔ残基２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７(Ｌ３)周辺、及び重鎖可変ドメインのＫａｂａｔ残基３１−３５Ｂ(Ｈ１)、５０−６５(Ｈ２)及び９５−１０２(Ｈ３)周辺；Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest,５版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)）及び／又は「高頻度可変ループ」からの残基(例えば、軽鎖可変ドメインのＣｈｏｔｈｉａ残基２６−３２(Ｌ１)、５０−５２(Ｌ２)及び９１−９６(Ｌ３)周辺及び重鎖可変ドメインの残基２６−３２(Ｈ１)、５２Ａ−５５(Ｈ２)及び９６−１０１(Ｈ３)；Chothia及びLesk J.Mol.Biol. 196:901-917 (1987)）を含む。
【００４６】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が、一般に少量で存在する突然変異等の、モノクローナル抗体の産生の間に生じる可能性のある突然変異を除いて、同一である及び／又は同じエピトープに結合する。このようなモノクローナル抗体は、一般に、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を包含しており、この場合の標的に結合するポリペプチドは、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列選択することを含むプロセスによって得られたものである。例えば、このような選択プロセスは、複数のクローン、例えばハイブリドーマクローン、ファージクローン又は組換えＤＮＡクローンのプールからの、独特のクローンの選択であり得る。選択された標的結合配列を更に変化させることにより、例えば標的に対する親和性を向上させる、標的結合配列をヒト化する、細胞培養液中でのその産生を向上させる、インビボでのその免疫原性を低減する、多特異性抗体を作製する等が可能であること、並びに、変化させた標的結合配列を含む抗体も本発明のモノクローナル抗体であることを理解されたい。一般に異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と比べて、モノクローナル抗体調製物の内の各モノクローナル抗体は、１の抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体長生物は、通常他の免疫グロブリンによって汚染されない点で有利である。「モノクローナル」との修飾詞は、ほぼ均一な抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示し、抗体を何か特定の方法で生成しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は様々な技術によって作ることができ、それらの技術には例えばハイブリドーマ法（例えば、Kohler等、Nature, 256:495 (1975); Harlow等、Antibodies: A loboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第２版 1988); Hammerling等: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981)）、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第4,816,567号参照）、ファージディスプレイ法（例えば、Clarkson等、Nature, 352:624-628 (1991); Marks等、J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Sidhu等、J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004); Lee等、J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004); 及びLee等、J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004)参照）、及びヒト免疫グロブリン座位又はヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部又は全部を有する動物においてヒト又はヒト様抗体を産生する技術（例えば、WO1998/24893; WO1996/34096; WO1996/33735; WO1991/10741; Jackobovits等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits等、Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann等、Year in Immuno., 7:33 (1993); 米国特許第5,545,806号；同第5,569,825号；同第5,591,669号（全てGenPharm）；同第5,545,807号；WO1997/17852; 米国特許第5,545,807号；同第5,545,806号；同第5,569,825号；同第5,625,126号；同第5,633,425号；及び同第5,661,016号；Marks等、Bio/Technology, 10:779-783 (1992); Longerg等、Nature, 368:856-859 (1994); Morrison, Nature, 368:812-813 (1994); Fishwild等、Nature Biotechnology, 14:845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14:826 (1996); 及びLongerg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995)）が含まれる。
【００４７】
「キメラ」抗体（免疫グロブリン）は、特定の種由来の抗体、あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか又は相同である重鎖及び／又は軽鎖の一部を有し、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体、あるいは他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか又は相同であり、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りこのような抗体の断片を特に含む(米国特許第４８１６５６７号;及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984))。ここで使用されるヒト化抗体は、キメラ抗体の１サブセットである。
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」形とは、非ヒト免疫グロブリンから得られた最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)の高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント又は受容器抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は、結合親和性等の抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、全て又はほとんど全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、全て又はほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のものであるが、ＦＲ領域が結合親和性を向上させる１以上のアミノ酸の置換を含み得る、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ＦＲにおけるアミノ酸の置換の数は、一般に重鎖において６以内であり、軽鎖において３以内である。ヒト化抗体は、状況に応じて免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。さらなる詳細は、Jones等, Nature 321, 522-525(1986)；Riechmann等, Nature 332, 323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596(1992)を参照のこと。
【００４８】
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ')２、及びＦｖ断片；ダイアボディ(diabodies)；直鎖状抗体（米国特許第５６４１８７０号、実施例２；Zapata等, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]）；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片と、容易に結晶化する能力を反映して命名された残留「Ｆｃ」断片を産生する。Ｆａｂ断片は全長Ｌ鎖とＨ鎖の可変領域ドメイン(ＶＨ)、及び一つの重鎖の第一定常ドメイン(ＣＨ１)からなる。各Ｆａｂ断片は抗原結合性に関して一価である、すなわち単一の抗原-結合部位を有する。抗体のペプシン処理により、単一の大きなＦ(ａｂ')２断片が生じ、これは２価の抗原結合部位を持つ２つのジスルフィド結合されたＦａｂ断片にほぼ対応し、抗原を交差結合させることができるものである。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に幾つかの残基が付加されていることによりＦａｂ断片と相違する。Ｆａｂ'-ＳＨは、ここでは定常ドメインのシステイン残基(類)が遊離のチオール基を持つＦａｂ'を表す。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、通常はＦａｂ'断片の対として生成され、それらの間にヒンジシステインを有する。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
【００４９】
Ｆｃ断片はジスルフィドにより一緒に保持されている双方のＨ鎖のカルボキシ末端部位を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域の配列により決定され、その領域は、所定の型の細胞に見出されるＦｃレセプター(ＦｃＲ)によって認識される部位である。
「Ｆｖ」は、完全な抗原-認識及び-結合部位を含む最小の抗体断片である。この断片は、密接に非共有結合した１本の重鎖と１本の軽鎖の可変領域の二量体からなる。これら２つのドメインの折り畳みから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に対する抗原結合特異性を付与する６つの高頻度可変ループ(Ｈ及びＬ鎖から、それぞれ３つのループ)が生じる。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含んでなるＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を持つ。
【００５０】
「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」とも略称される「単鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖内に結合したＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それはｓＦＶが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓＦｖの概説については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)；Borrebaeck 1995, 以下を参照のこと。
「ＧＤＭ結合剤」とは、ＧＤＭポリペプチド（例えば、ＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ、Ｍｅｓ、Ｐｔｅｎ及びＤＬＬ３）に結合する分子である。例示的な分子には、抗ＧＤＭ抗体、ＧＤＭ結合抗体断片、ＧＤＭ結合オリゴペプチド、ＧＤＭセンス及びアンチセンス核酸及びＧＤＭ小分子アンタゴニストが含まれる。
【００５１】
「ＧＤＭアンタゴニスト」は、例えば、天然リガンドの結合を遮断する、又はＧＤＭの天然リガンドから神経膠腫の下流成分への伝達を遮断する等して、ＧＤＭのシグナル伝達能を遮断することにより、ＧＤＭポリペプチドの活性又はシグナル伝達能を拮抗する（例えば、中和する、又は妨害する）分子である。例示的な分子には、抗ＧＤＭ抗体、ＧＤＭ結合抗体断片、ＧＤＭ結合オリゴペプチド、ＧＤＭセンス及びアンチセンス核酸及びＧＤＭ小分子アンタゴニストが含まれる。
「ＧＤＭ結合オリゴペプチド」は、本明細書に記載のように、それぞれレセプター、リガンド又はシグナル伝達成分を含め、ＧＤＭポリペプチドに、好ましくは特異的に結合するオリゴペプチドである。このようなオリゴペプチドは、既知のオリゴペプチド合成方法論を用いて化学的に合成することができるか、又は組換え技術を用いて調製及び精製することができる。このようなオリゴペプチドは、通常、少なくとも５アミノ酸長、或いは少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００アミノ酸長以上である。このようなオリゴペプチドは、周知の技術を用いた過度の実験を行うことなく同定できる。これに関し、ポリペプチドの標的に特異的に結合できるオリゴペプチドをオリゴペプチドライブラリからスクリーニングする技術が従来技術に既知である（例えば、米国特許第5,556,762号、同第5,750,373号、同第4,708,871号、同第4,833,092号、同第5,223,409号、同第5,403,484号、同第5,571,689号、同第5,663,143号、PCT公開番号WO 84/03506及びWO84/03564; Geysen等、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984); Geysen等、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985); Geysen等、in Synthetic Peptides as Antigens, 130■149 (1986); Geysen等、J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987); Schoofs等、J. Immunol., 14
0:611-616 (1988), Cwirla, S. E.等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378 (1990); Lowman, H.B.等、Biochemistry, 30:10832 (1991); Clackson, T.等、Nature, 352: 624 (1991); Marks, J. D.等、 J. Mol. Biol., 222:581 (1991); Kang, A.S.等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363 (1991),及びSmith, G. P., Current Opin. Biotechnol., 2:668 (1991)参照）。
【００５２】
「ＧＤＭ小分子アンタゴニスト」は、ここに開示されるＧＤＭポリペプチドのＧＤＭシグナル伝達経路を、好ましくは特異的に阻害する、こここに定義されるオリゴペプチド又は抗体以外の有機分子である。このようなＧＤＭシグナル伝達経路の阻害は、好ましくは、ＧＤＭポリペプチドを発現する神経膠腫細胞の増殖を抑制する。このような有機分子は、既知の方法論を用いて同定及び化学的に合成することができる（例えば、PCT公開公報WO2000/00823及びWO2000/39585参照）。このような有機分子は、通常、約２０００ダルトン未満、或いは約１５００、７５０、５００、２５０又は２００ダルトン未満の大きさを有し、ここに記載のＧＤＭポリペプチドに、好ましくは特異的に結合することができ、周知の技術を用いた過度の実験を行うことなく同定することができる。これに関し、ポリペプチドの標的に結合できる分子を有機分子ライブラリからスクリーニングする技術が従来技術に周知である（例えば、PCT公開公報WO00/00823及びWo00/39585参照）。
対象の標的抗原、例えばＧＤＭに「結合する」ＧＤＭアンタゴニスト又はＧＤＭ結合剤（例えば、抗体、ポリペプチド、オリゴペプチド又は小分子）は、当該抗原を発現する細胞又は組織を標的とするうえで、有用な診断薬、予後薬及び／又は治療薬となるのに十分な親和性を持って標的に結合するものであり、他のタンパク質に対し有意な交差反応をしない。望ましくないマーカーポリペプチドへの結合範囲は、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）分析又は放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）等の一般的な技術によって決定した場合、特定の所望の標的への結合の約１０％未満である。
【００５３】
更に、特定のＧＤＭポリペプチド又は特定のＧＤＭポリペプチド標的上のエピトープ「（に対する）特異的結合」、「に特異的に結合する」又は「に特異的である」という表現は、非特異的相互作用とは測定可能に異なる結合を意味する。特定の結合は、例えば、コントロール分子と比較したある分子の結合を決定することにより測定することができ、この場合コントロール分子は結合活性を有さない同じ構造の分子である。例えば、特異的結合は、標的と類似のコントロール分子との競合、例えば、標識しない標的の過多により定量することができる。この場合、標識した標的のプローブに対する結合が、標識していない標的の過多により競合的に阻害されると、特異的結合が示唆される。一実施形態では、このような表現は、１の分子が、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープに対し、他のポリペプチド又はポリペプチドのエピトープに殆ど結合することなく結合するような結合を意味する。或いは、このような表現は、少なくとも約１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ以上の標的に対してＫｄを有する分子によって表わすことができる。
「ＧＤＭポリペプチドを発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する」ＧＤＭアンタゴニスト（例えば、ＰＮアンタゴニスト、Ｐｒｏｌｉｆアンタゴニスト、又はＭｅｓアンタゴニスト）又はそのような分子の「増殖阻害」量とは、適切なＧＤＭポリペプチドを発現又は過剰発現する癌細胞の、測定可能な増殖抑制を導くものである。治療に使用するのに好ましい成分は、少なくとも一種類のＧＤＭアンタゴニスト（例えば、抗ＧＤＭ抗体、ＧＤＭ結合抗体断片、オリゴペプチド、又は小分子）の増殖阻害量を含み、よって、適切なコントロールと比較して、２０％、好ましくは約２０％〜約５０％、更に好ましくは５０％を超える（例えば約５０％〜約１００％）神経膠腫細胞の増殖を阻害する。一実施形態では、増殖の抑制は、細胞培養液中で約０．１〜３０μｇ／ｍｌ又は約０．５ｎＭ〜２００ｎＭの分子濃度において測定することができ、増殖阻害は、腫瘍細胞を抗体に曝してから１〜１０日後に測定する。インビボでの神経膠腫細胞の増殖阻害は、後述の実験的実施例に記載したような様々な方法で定量することができる。本パラグラフに既出の分子のいずれかを体重１ｋｇ当たり約１μg〜約１００ｍｇで投与した結果、当該抗体の初回投与から約５日〜３ヶ月、好ましくは約５〜３０日以内に腫瘍の大きさ又は腫瘍細胞の増殖が低減した場合、そのような分子の量はインビボにおいて増殖阻害性である。
【００５４】
「アポトーシスを誘発する」ＧＤＭアンタゴニストとは、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞の縮み、小胞体の拡張、細胞断片化、及び／又は膜小胞の形成（アポトーシス性本体と呼ばれる）により決定される、神経膠腫細胞のプログラムされた細胞死を誘発するものである。細胞は通常、ＧＤＭポリペプチドを過剰発現する細胞である。様々な方法を使用して、アポトーシスに関連する細胞イベントを評価することができる。例えば、ホスファチジルセリン（ＰＳ）の転位置をアネキシン結合により測定することができ、ＤＮＡ断片化をＤＮＡラダーリングにより評価することができ、核／染色質凝縮及びＤＮＡ断片化を、低二倍体性細胞の増加により評価することができる。好ましくは、アポトーシスを誘発する抗体、オリゴペプチド、又はその他の有機分子は、アネキシン結合アッセイにおいて、処理しない細胞に対し、約２〜５０倍、好ましくは約５〜５０倍、及び最も好ましくは約１０〜５０倍のアネキシン結合を誘発するものである。
「細胞死を誘発する」ＧＤＭアンタゴニストは、生存可能な神経膠腫細胞を生存不能にするものである。このような神経膠腫細胞は、非疾患細胞と比較して、ＧＤＭポリペプチドを発現、好ましくは過剰発現する細胞である。ＧＤＭポリペプチドは、このような癌細胞の表面上に発現される膜貫通ポリペプチドであるか、そのような細胞によって産生及び分泌されるポリペプチドであり得る。インビトロでの細胞死を補体及び免疫エフェクター細胞の不在下で決定し、よって抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）によって誘発された細胞死を区別することができる。つまり、細胞死のアッセイは、熱で不活性化した血清を用いて（即ち、補体の不在下において）、免疫エフェクター細胞の不在下で、実行することができる。細胞死を誘発する能力は、適切な技術により、処理しない細胞との比較において評価することができ、例えばヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルー（Moore等、Cytotechnology 17:1-11 (1995)参照）、又は７ＡＡＤの取り込み評価される膜完全性の欠損により評価することができる。好ましい細胞死誘発ＧＤＭアンタゴニストは、ＢＴ４７４細胞におけるＰＩ取り込みアッセイにおいてＰＩ取り込みを誘発するものである。
【００５５】
「Ｐｒｏｌｉｆアンタゴニスト」及び「Ｍｅｓアンタゴニスト」は、表Ａに示されるＰｒｏｌｉｆ又はＭｅｓ  ＧＤＭマーカーにそれぞれ特異的に結合するか、又はそうでない場合にそれらＰｒｏｌｉｆ又はＭｅｓ  ＧＤＭマーカーの活性をそれぞれ特異的に阻害するＧＤＭアンタゴニストである。「ＰＮアンタゴニスト」は、ＤＬＬ３、Ｎｏｇ、Ｏｌｉｇ１、Ｏｌｉｇ２、ＴＨＲ及びＡＳＣＬ１を除き、表Ａに示されるＰＮ  ＧＤＭマーカーに特異的に結合するか、又はそうでない場合にそれらＰＮ  ＧＤＭマーカーの活性を特異的に阻害するＧＤＭアンタゴニストである。
Ａｋｔアンタゴニストは、Ａｋｔシグナル伝達経路の生物学的活性を部分的に又は完全に、遮断、阻害又は中和するあらゆる分子である。適切なＡｋｔアンタゴニストには、Ａｋｔシグナル伝達経路の天然成分のアンタゴニスト抗体又は抗体断片、断片又はアミノ酸配列変異体（「Ａｋｔポリペプチド」）、ペプチドアンチセンスオリゴヌクレオチド、小有機分子等が含まれる。Ａｋｔアンタゴニストの同定方法は、Ａｋｔポリペプチドに候補分子を接触させること、及び通常Ａｋｔポリペプチドに関連付けられる１以上の生物学的活性の検出可能な変化を測定することを含むことができる。追加的な例示的Ａｋｔアンタゴニストは、ａｋｔ１、ａｋｔ２、又はａｋｔ３に対する特異的アンタゴニスト、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＰＩＫ３ＣＤ、ＰＩＫ３ＣＧ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＩＫ３Ｒ２、ＰＩＫ３Ｒ３、ＰＩＫ３Ｒ４；ＰＤＫ１；ＦＲＡＰ（例えばラパマイシン）；ＲＰＳ６ＫＢ１；ＳＧＫ；ＥＧＦＲ（例えば、エルロチニブ  ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））、ＩＧＦＲ等のＰＩＫ３キナーゼの触媒又は制御ドメイン（互いの相互作用を含む）に対するアンタゴニストを含む。或いは、Ａｋｔアンタゴニストは、ＰＴＥＮ、ＩＮＰＰ５Ｄ又はＩＮＰＰＬ１の活性をアゴナイズ、刺激又は回復する分子を含む。
【００５６】
「有糸分裂阻害薬」は、細胞分裂中に起こる有糸分裂を部分的に又は完全に遮断、阻害又はそうでない場合そのような有糸分裂に干渉する分子を含む。そのような阻害薬の例には、テモゾロミド、ＢＣＮＵ、ＣＣＮＵ、ロムスチン、グリアデル、エトポシド、カルムスチン、イリノテカン、トポテカン、プロカルバジン、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、メトトレキサート、シタラビン、パクリタキセル、アウリスタチン、メイタンシノイドが含まれる。
「抗血管新生薬」は、特に疾病又は疾患に関連付けられる、血管新生又は血管形成の過程を部分的に又は完全に遮断、阻害又はそうでない場合中和する分子である。Brem, Cancer Control 6(5): 436-458 (1999)によってリスト化されたものを含め、多くの血管新生アンタゴニストが同定されており、従来技術に既知である。通常、血管新生アンタゴニストには、特定の血管新生因子又は血管新生経路を標的とする分子が含まれる。特定の態様では、血管新生アンタゴニストは、血管新生因子を標的とする抗体のようなタンパク質成分である。例示的な１の血管新生因子は、Leung等、Science, 246:1306 (1989)、及びHouck等、Mol. Endocrin., 5:1806 (1991)によって記載されたような、ＶＥＧＦ（時に「ＶＥＧＦ−Ａ」としても知られる）、１６５アミノ酸血管内皮細胞増殖因子及び関連する１２１−、１８９−、及び２０６−アミノ酸血管内皮細胞増殖因子、並びにそれらの天然発生対立形質及び加工形態である。「ＶＥＧＦ」という用語は、１６５のアミノ酸ヒト血管内皮細胞成長因子のうちアミノ酸８〜１０９又は１〜１０９を含むポリペプチドの切断型を指す。このような天然ＶＥＧＦの切断された種類は、天然ＶＥＧＦと比較して、Ｆｌｔ−１（ＶＥＧＦ−Ｒ１）及びＫＤＲ（ＶＥＧＦ−Ｒ２）レセプターに対する結合親和性を有する。
【００５７】
例示的な抗血管新生因子は、抗ＶＥＧＦ抗体を中和する。「抗ＶＥＧＦ抗体」は、ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体である。好ましくは、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦ活性が関与する疾病又は状態の治療及びそのような疾病又は状態への干渉における治療薬として使用することができる。このような抗ＶＥＧＦ抗体は、通常、ＶＥＧＦ−Ｂ又はＶＥＧＦ−Ｃ等の他のＶＥＧＦ相同体に結合せず、ＰＩＧＦ、ＰＤＧＦ又はｂＦＧＦ等の他の増殖因子にも結合しない。好ましい抗ＶＥＧＦ抗体は、ハイブリドーマＡＴＣＣ  ＨＢ  １０７０９によって産生されたモノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体Ａ４．６．１と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体である。更に好ましくは、抗ＶＥＧＦ抗体は、マウスの抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体Ａ．４．６．１の変異したヒトＩｇＧ１フレームワーク領域及び抗原結合相補性決定領域を含み、Presta等、(1997) Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)に従って生成される組換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体であり、ベバシズマブ（ＢＶ；アバスチン（登録商標）を含むがこれに限定されない。
或いは、抗血管新生薬は、１以上のＶＥＧＦレセプター（例えば、ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２）への結合を含むＶＥＧＦ活性を中和、遮断、阻害、抑制、低減するか、又はそのような活性に干渉することができるあらゆる小分子で有り得る。
【００５８】
「神経分化薬」は、神経細胞の前駆体のニューロン（神経幹細胞、前駆細胞、神経芽細胞等）への分化を促進させるか、引き起こすか、刺激するか、又はそうでない場合誘発する分子である。神経細胞の前駆体は、胎生期の神経系、成人脳又は神経堤由来の細胞であり、細胞分裂及びニューロン形成の両方の能力を有する。ニューロンは、軸索投射、活動電位生成、及びシナプス伝達に関与するタンパク質を発現する有糸分裂後の（非分裂）細胞である。神経細胞分化薬は、神経細胞の前駆体の、増殖率の低下、並びに軸索伸長、活動電位生成、及びシナプス伝達に関与するタンパク質の発現の増大を誘発する分子である。神経細胞分化の例示的なマーカーには、これらに限定されないが、ＭＡＰ２、βチューブリン、ＧＡＤ６５及びＧＡＰ４３が含まれる。例示的な神経分化薬には、これらに限定されないが、レチノイン酸、バルプロ酸、及びそれらの誘導体（例えば、エステル、塩、レチノイド、レチネート、バルプロ酸等）；甲状腺ホルモン又は甲状腺ホルモンレセプターの他のアゴニスト；ノギン；ＢＤＮＦ、ＮＴ４／５又はＮＴＲＫ２レセプターのその他のアゴニスト；転写因子ＡＳＣＬ１、ＯＬＩＧ１の発現を増大させる薬剤；ｄｌｌ３アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ１、２、３又は４アンタゴニスト、γセクレターゼ阻害薬、例えばニカストリン、Ａｐｈ１Ａ、Ａｐｈ１Ｂ、Ｐｓｅｎ１、Ｐｓｅｎ２及びＰＳＥＮＥＮの小分子阻害剤、デルタ様リガンド（Ｄｌｌ）−１アンタゴニスト、デルタ様リガンド（Ｄｌｌ）−４、Ｊａｇｇｅｄ１アンタゴニスト、Ｊａｇｇｅｄ２アンタゴニスト；ｎｕｍｂアゴニスト又はｎｕｍｂ様アゴニストが含まれる。
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に帰する生物学的活性を意味し、抗体のアイソタイプにより変わる。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害；Ｆｃレセプター結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ＡＤＣＣ)；貪食作用；細胞表面レセプター（例えば、Ｂ細胞レセプター）のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が含まれる。
【００５９】
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」又は「ＡＤＣＣ」とは、ある種の細胞傷害細胞(例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球及びマクロファージ）上に存在するＦｃレセプター(ＦｃＲｓ)と結合した分泌Ｉｇにより、これらの細胞傷害エフェクター細胞が抗原-担持標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒により標的細胞を死滅させることを可能にする細胞傷害性の形態を意味する。抗体は細胞傷害細胞を「備えて」おり、これはこのような死滅には絶対に必要なものである。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞ＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991) の４６４頁の表３に要約されている。対象の分子のＡＤＣＣ活性をアッセイするために、米国特許第５５００３６２号又は同第５８２１３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを実施することができる。このようなアッセイにおいて有用なエフェクター細胞には、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）が含まれる。代わりとして、もしくは付加的に、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynes等, (USA) 95:652-656 (1998)において開示されているような動物モデルにおいて、インビボで評価することが可能である。
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記載するものである。好適なＦｃＲは天然配列ヒトＦｃＲである。さらに好適なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマレセプター）と結合するもので、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含み、これらのレセプターの対立遺伝子変異体、選択的にスプライシングされた形態のものも含まれる。ＦｃγＲＩＩレセプターには、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性型レセプター」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害型レセプター」）が含まれ、主としてその細胞質ドメインは異なるが、類似のアミノ酸配列を有するものである。活性型レセプターＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター活性化モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based activation motif ;ＩＴＡＭ）を含んでいる。阻害型レセプターＦｃγＲＩＩＢは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター阻害性モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif ;ＩＴＩＭ）を含んでいる（Daeron, Annu. Rev. immunol. 15:203-234 (1997)を参照）。ＦｃＲsに関しては、 Ravetch and Kinet, Annu.Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capel等, Immunomethods 4:25-34 (1994); 及びde Haas等, J.Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) に概説されている。将来的に同定されるものも含む他のＦｃＲsはここでの「ＦｃＲ」という言葉によって包含される。また、該用語には、母性ＩｇＧｓが胎児に受け継がれる要因となっている新生児性レセプターＦｃＲｎ（Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976) Kim等, J. Immunol.24:249 (1994))も含まれる。
【００６０】
「ヒトエフェクター細胞」とは、一又は複数のＦｃＲｓを発現し、エフェクター機能を実行する白血球のことである。その細胞が少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行することが望ましい。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例として、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞及び好中球が含まれるが、ＰＢＭＣとＮＫ細胞が好適である。エフェクター細胞は天然源、例えば血液から単離してもよい。
「補体依存性細胞傷害」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解することを意味する。典型的な補体経路の活性化は補体系(Ｃｌｑ)の第１補体が、同族抗原と結合した(適切なサブクラスの)抗体に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているように実施することができる。
【００６１】
「ＧＤＭ発現神経膠腫」は、場合によって十分なレベルのＧＤＭポリペプチドをその細胞表面上に産生するので、ＧＤＭポリペプチドアンタゴニストがそれに結合することができるか、又はそうでない場合、ＧＤＭ小分子アンタゴニストが、神経膠腫を標的とし、それに対する治療的効果を有し得る。
別の実施形態では、「ＧＤＭ発現神経膠腫」は、場合によって十分なレベルのＧＤＭポリペプチドを産生及び分泌するので、ＧＤＭポリペプチドアンタゴニストがそれに結合することができるか、又はそうでない場合、ＧＤＭ小分子アンタゴニストが癌を標的とし、それに対する治療的効果を有し得る。アンタゴニストに関し、そのような分子は、腫瘍細胞によって分泌されたＧＤＭポリペプチドの産生及び分泌を低減、阻害又は阻止するアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。
【００６２】
ＧＤＭポリペプチドを「過剰発現する」神経膠腫は、同じ組織型の非癌性細胞と比較して、細胞表面に有意に高いレベルのＧＤＭを有しているか、又は高いレベルのＧＤＭを産生及び分泌するものである。このような過剰発現は、遺伝子増幅により、又は転写又は翻訳を増加させることにより引き起こされてもよい。細胞表面におけるレベル又は分泌レベルを増大させるＧＤＭ発現の亢進は、抗ＧＤＭ抗体を用いた免疫組織化学アッセイ、ＦＡＣＳ分析等、様々な診断アッセイ又は予後予測アッセイによって測定され得る。あるいは、細胞におけるＧＤＭコード化核酸又はｍＲＮＡのレベルを、例えばＧＤＭコード化核酸又はその補体に対応する核酸に基づくプローブを用いた蛍光インシツハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ；1998年10月公開のWO98/45479参照)、サザンブロット法、ノーザンブロット法、又はポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)法、例えばリアルタイム定量ＰＣＲ(ＲＴ−ＰＣＲ)により測定してもよい。あるいは、ＧＤＭポリペプチドの過剰発現は、血清のような生体液中の脱落抗原を測定することにより測定される(例えば、1990年6月12日公開の米国特許第4,933,294号；1991年4月18日公開のWO91/05264；1995年3月28日公開の米国特許第5,401,638号；及びSiasら, J. Immunol. Methods 132: 73-80(1990)参照)。前記アッセイのみならず、技術熟練者であれば様々なインビボアッセイを利用できる。例えば、検知できるラベル、例えば放射性同位体で任意に標識された抗体に患者の体にある細胞を暴露してもよく、患者の細胞への抗体の結合は、例えば放射活性の外側スキャンニングにより、又は抗体に暴露された後で患者から得られたバイオプシーを分析することにより評価される。
【００６３】
ここで用いられているように、「イムノアドヘシン」という用語は、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能を持つ異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性を付与した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは抗体の抗原認識及び結合部位以外の所望の結合特異性を持つアミノ酸配列（即ち「異種」）と免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物である。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む近接アミノ酸配列を含む。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３、又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
「標識」という語は、ここで用いられる場合、「標識化」抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子を作製するために、抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子に直接的又は間接的に結合させる検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識はそれ自身によって検出可能でもよく（例えば、放射性同位体標識又は蛍光標識）、あるいは、酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物又は組成物の化学的変換を触媒してもよい。
【００６４】
ここで用いられる「細胞傷害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体）、化学治療薬、酵素及びその断片、例えば核溶解性酵素、抗生物質、及び毒素、例えばその断片及び／又は変異体を含む小分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素、そして下記に開示する種々の抗腫瘍又は抗癌剤を含むように意図されている。他の細胞傷害性薬が下記に記載されている。殺腫瘍性剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、ヒドロキシウレアタキサン（例えばパクリタキセル及びドセタキセル）及び／又はアントラサイクリン抗生物質；チオテパ及びシクロスホスファミド(CYTOXAN(登録商標))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethiylenethiophosphoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(acetogenins）(特にブラタシン(bullatacin)及びブラタシノン(bullatacinone)）；δ-９-テトラヒドロカンナビノール(ドロナビノール、MARINOL(登録商標))；β-ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトセシン(合成類似体トポテカン(topotecan)(HYCAMTIN(登録商標))、ＣＰＴ-１１(イリノテカン、CAMPTOSAR(登録商標))、アセチルカンプトテシン(acetylcamptothecin)、スコポレクチン(scopolectin)、及び９-アミノカンプトテシン(9-aminocamptothecin)を含む）；ブリオスタチン；カリスタチン(callysＧＤＭin）；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン(adozelesin)、カルゼレシン(carzelesin)及びバイゼレシン(bizelesin)合成類似体を含む)；ポドフィリン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン(cryptophycin)(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン(dolasＧＤＭin）；デュオカルマイシン(duocarmycin ）（合成類似体、KW-2189及びCB1-TM1を含む）；エレトロビン(eleutherobin）；パンクラチスタチン(pancratisＧＤＭin）；サルコディクチン(sarcodictyin）；スポンジスタチン(spongisＧＤＭin）；クロランブシル、クロルナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；ニトロスレアス(nitrosureas)、例えばカルムスチン(carmustine)、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン(lomustine)、ニムスチン、ラニムスチン；エネジイン(enediyne) 抗生物質等の抗生物質（例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンガンマ１Ｉ及びカリケアマイシンオメガＩ１、例えば、Agnew  Chem Intl. Ed. Engl., 33：183-186(1994)を参照のこと；ダイネミシンＡ(dynemicinＡ）を含むダイネミシン(dynemicin）；エスペラマイシン(esperamicin）；同様にネオカルチノスタチン発光団及び関連色素蛋白エネジイン(enediyne) 抗生物質発光団）、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン(bleomycins)、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin）、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin）、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ADRIAMYCIN(登録商標)ドキソルビシン (モルフォリノ−ドキソルビシ���、シアノモルフォリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin）、イダルビシン、マセロマイシン(marcellomycin）、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン(mitomycins）、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinosＧＤＭin)、ゾルビシン(zorubicin)；メトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ）などの抗-代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)のようなピリミジン類似体；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル(eniluracil)；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium aceＧＤＭe)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン(lonidainine)；メイタンシン(maytansine)及びアンサマイトシン(ansamitocin)のようなメイタンシノイド(maytansinoid)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダンモール(mopidanmol)；ニトラエリン(nitraerine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン(losoxantrone)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖類複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)(特に、Ｔ-２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリデンＡ(roridin A)及びアングイデン(anguidine)）；ウレタン；ビンデシン(ELDISINE(登録商標)、FILDESIN(登録商標))；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド（「Ara-C」）；チオテパ；タキソイド、例えばタキソール(登録商標)パクリタキセル、（Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）、ABRAXANETM クレモフォール(Cremophor)を含まない、アルブミン設計のナノ粒子形状のパクリタキセル(American  Pharmaceutical  Partners, Schaumberg, Illinois)及び��キソテア(登録商標）ドキセタキセル、（Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル；GEMZAR(登録商標)ゲンシタビン(gemcitabine)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン(VELBAN(登録商標))；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン(ONCOVIN(登録商標))；オキサリプラチン；ロイコボリン；NAVELBINE(登録商標)ビノレルビン；ノバントロン(novantrone)；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート(ibandronate)；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸などのレチノイド類；カペシタビン(capecitabine)(XELODA(登録商標))；上述したものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体；並びに、上記のうちの２以上の組合せ、例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン及びプレドニソロンの併用治療の略記号であるCHOP、及び５-ＦＵとロイコボリン(leucovovin)と組み合わされるオキサリプラチン(ELOXATINTM)による治療投薬計画の略記号であるFOLFOXが含まれる。
【００６５】
また、癌の増殖を促進しうるホルモンの影響を調節、低減、阻止(ブロック)又は阻害するように作用し、たびたび全身性、又は全身治療の形態にある抗ホルモン剤もこの定義に含まれる。これらはホルモン類自体でもよい。例として、抗卵胞ホルモン類及び、選択的なエストロゲンレセプターモジュレータ類(ＳＥＲＭ)、例えば、タモキシフェン(NOLVADEX(登録商標)タモキシフェン)、EVISTA(登録商標)ラロキシフェン、ドロロキシフェン(droloxifene)、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、LY117018、オナプリストン及びFARESTON(登録商標)トレミフェン、抗プロゲステロン類、エストロゲンレセプター下方制御因子(ＥＲＤ)、卵巣を抑制するか又は一時停止させるように機能する薬剤、例えば、黄体形成ホルモン放出ホルモン(ＬＨＲＨ)アゴニスト、例えば、LUPRON(登録商標)及びELIGARD(登録商標)酢酸ロイプロリド、ゴセレリンアセテート、ブセレリンアセテート及びトリプトレリン(tripterelin)、他の抗アンドロゲン類、例えばフルタミド、ニルタミド及びビカルタミド、及び、副腎のエストロゲン産生を制御する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害薬、例として、例えば４(５)-イミダゾール、アミノグルテチミド、MEGASE(登録商標)メゲストロールアセテート、AROMASIN(登録商標) エキセメスタン、ホルメスタン、ファドロゾール、RIVISOR(登録商標) ボロゾール、FEMARA(登録商標) レトロゾール及びARIMIDEX(登録商標) アナストロゾールなどがある。加えて、化学療法剤のこのような定義には、ビスホスホネート、例えばクロドロン酸(例えば、BONEFOS(登録商標)又はOSTAC(登録商標))、DIDROCAL(登録商標)エチドロン酸、NE-58095、ZOMETA(登録商標) ゾレドロン酸／ゾレドロネート、FOSAMAX(登録商標)アレンドロネート、AREDIA(登録商標)パミドロン酸、SKELID(登録商標) チルドロン酸又はACTONEL(登録商標)、リセドロン酸、並びにトロキサチタビン(troxacitabine)(1,3-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)、アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常な細胞増殖に関係するシグナル伝達経路の遺伝子の発現を阻害するもの、例として、例えばＰＫＣ-α、Ｒａｆ、Ｈ-Ｒａｓ及び上皮性増殖因子レセプター(ＥＧＦ-Ｒ)、ワクチン、例えばTHERATOPE(登録商標)ワクチン及び遺伝子治療ワクチン、例えばALLOVECTIN(登録商標)ワクチン、LEUVECTIN(登録商標)ワクチン及びVAXID(登録商標)ワクチン、LURTOTECAN(登録商標)トポイソメラーゼ１インヒビター、ABARELIX(登録商標) ｒｍＲＨ、ラパチニブジトシラート(ＥｒｂＢ-２及びＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ小分子インヒビター、GW572016とも称される)、及び、上記の何れかの薬学的に受容可能な塩類、酸又は誘導体が含まれる。
【００６６】
ここで用いられる際の「増殖阻害剤」は、細胞、特にＧＤＭ発現癌細胞の増殖をインビトロ又はインビボの何れかで阻害する化合物又は組成物を意味する。よって、増殖阻害剤は、Ｓ期でＧＤＭ発現細胞の割合を有意に減少させるものである。増殖阻害剤の例は、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の位置で）阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキサン類、及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。またＧ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びアラ-Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。タキサン類又はヒドロキシウレアタキサン類（パクリタキセル及びドセタキセル）は、共にイチイに由来する抗癌剤である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル（TAXOTERE（登録商標）、ローン・プーラン ローラー）は、パクリタキセル（TAXOL（登録商標）、ブリストル-マイヤー スクウィブ）の半合成類似体である。これらの分子は、チューブリン二量体から微小管の集合を促進し、細胞の有糸分裂を阻害する結果となる脱重合を防ぐことによって微小管を安定化にする。
「ドキソルビシン」はアントラサイクリン抗生物質である。ドキソルビシンの完全な化学名は、(８Ｓ-シス)-１０-[(３-アミノ-２，３，６-トリデオキシ-α-Ｌ-リキソ-ヘキサピラノシル)オキシ]-７，８，９，１０-テトラヒドロ-６，８，１１-トリヒドロキシ-８-(ヒドロキシアセチル)-１-メトキシ-５，１２-ナフタセンジオンである。
【００６７】
「サイトカイン」なる用語は、一つの細胞集団から放出され、他の細胞に細胞間メディエータとして作用するタンパク質の一般用語である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるのは、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インシュリン；プロインシュリン；レラキシン；プロレラキシン；糖タンパク質ホルモン、例えば濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体化ホルモン（ＬＨ）；肝臓成長因子；線維芽成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；ミューラー阻害因子；マウス生殖腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ-β等の神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ-α及びＴＧＦ-β等のトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦｓ）；インシュリン様成長因子-Ｉ及びＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘発因子；インターフェロン-α、-β、及び-γ等のインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）、例えばマクロファージ-ＣＳＦ（Ｍ-ＣＳＦ）；顆粒球-マクロファージ-ＣＳＦ（ＧＭ-ＣＳＦ）；及び顆粒球-ＣＳＦ（Ｇ-ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬｓ）、例えばＩＬ-１、ＩＬ-１ａ、ＩＬ-２、ＩＬ-３、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２；腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ-α及びＴＮＦ-β；及びＬＩＦ及びキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子である。ここで用いられる際、用語サイトカインには、天然供給源から、又は組換え細胞培養からのタンパク質、及び天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物が含まれる。
「パッケージ挿入物」という用語は、効能、用途、服用量、投与、配合禁忌及び／又はその治療薬の用途に関する警告についての情報を含む、治療薬の商業的包装を慣習的に含めた指示書を指す。
【００６８】
用語「階層的クラスター形成」は、遺伝子発現の類似性に基づいて試料を組分けする方法を意味する。使用される標準的アルゴリズムは、相関マトリクスを始点にして、全てのエレメントが１本のツリーに構築される系統樹を再帰的に計算する。Eisen, M.B.等、P.N.A.S. 95:14863-14868 (1998)。
「ｋ平均法によるクラスター形成」という用語は、遺伝子発煙の類似性に基づいて試料を組分けする方法を意味する。ｋ平均法法によるクラスター形成ではまず、全ての試料を多数のクラスターの１つにランダムに割り当てる。次いで各試料における遺伝子発現の代表的な値又は平均値を計算し、最も近い類似性を示すクラスターに各試料を再度割り当てる。安定な構造が得られるまでこの手順を繰り返す。Duda, R. O.及びHart, P. E., Pattern Classification and Scene Analysis, Wiley, New York (1973)参照。
用語「投票方式」とは、腫瘍のサブタイプ毎に特定の発現レベルで又は特定の発現レベルを超えて発現されるＧＤＭの数の比較に基づいて、腫瘍をグループに分ける方法を意味する。
【００６９】
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【００７０】
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【００７１】
ＩＩ．本発明の組成物及び方法
Ａ．方法及び目的
現在のところ、高悪性度の神経膠腫は病理組織学的基準により診断され、これら腫瘍の大部分の既知の頑強な予後因子は、腫瘍の悪性度及び患者の年齢に限定されている。ｃｈｒｓ  １ｐ及び１９ｑにおける損失が乏突起膠腫の予後の予測に有用である（Cairncross等、J. Natl Cancer Inst. 90: 1473-1479 (1998)）という認識は広く受け入れられており、これにより、神経膠腫の更に大きな集団に対する治療の結果及び応答を予測するための分子マーカーを開発しようとする興味が高まった。ＧＢＭには多数の遺伝子変異が報告されており、ＥＧＦＲ増幅及びｐ５３変異のようなその一部は、原発性ＧＢＭと続発性ＧＢＭを区別しているように思われ（(von Deimling等、Glia 15: 328-338 (1995); Watanabe等、Brain Pathol. 6: 217-223 (1996))、そのようなマーカーは結果を予測する、又は疾病の管理に関する決定を導くのに最低限の有用性を有する。重要なのは、最近の発現プロファイリングの研究により、神経膠腫の分子の分類が、予後の予測に有用となり得ることが判明していることである（Freije等、Cancer Res. 64: 6503-6510 (2004); Nutt等、Cancer Res. 63: 1602-1607 (2003)）。本研究において、本発明者等は、腫瘍の病原力、並びに疾病の進行に関連する分子の変質を同定し、標的の治療法に対する応答の予測に分子の分類を使用できるという証拠を提供する。
【００７２】
腫瘍の細分類による予後予測上の効果及び疾病の進行のパターン化
本明細書において、本発明者等は、規定された発現のシグネチャーとの類似性に基づいて腫瘍をサブタイプに割り当てる、高悪性度の星細胞腫の新規予後予測分類方式を開示する。神経膠腫の３つの分子サブタイプの各々は、個別の組織の組に対する類似性を有し、組織の成長の異なる側面のマーカーを豊富に含む。本分析では、３５のシグネチャー遺伝子の組を利用する。これらのマーカーは、各腫瘍のサブタイプを同定するために使用できるマーカーの更に長いリストの代表的なものである。ここで前神経性（ＰＮ）と呼ぶ１の腫瘍サブタイプは、顕著に良好な予後により区別され、健常な脳及び神経発生に関連する遺伝子を発現する。高度に増殖性の細胞株又は間葉性の起源を有する組織との類似性を特徴とする予後が不良な２つのサブタイプは、細胞増殖又は血管新生をそれぞれ示す遺伝子発現プログラムの活性化を示す。本発明者等は、Ｍｅｓ及びＰｒｏｌｉｆ腫瘍種類に関連する低い生存度は、細胞分裂の速度が大きいこと又は新血管新生による腫瘍細胞の生存の強化により起こる増殖の亢進に関連していると推測する。新血管新生又は有糸分裂形の単なる不在又は存在ではサブクラスは区別できなかったが、これらの特性がほぼ全ての多形神経膠芽腫の顕著な特徴であるため、このような区別は可能と思われる。以前の研究により、神経膠腫における増殖又は血管新生のマーカーの予後予測的価値が示唆されている（Ho等、Am. J. Clin. Pathol. 119: 715-722 (2003); Hsu等、Cancer Res. 56: 5684-5691 (1996); Osada等、Anticancer Res. 24: 547-552 (2004)）が、これらのプロセスに差次的に関連する明確な腫瘍のサブセットの存在は示されていない。当然のことながら、本発明のＰｒｏｌｉｆ及びＭｅｓ神経膠腫サブタイプは、複数の上皮性腫瘍の種類に見られる結果の不良に関連付けられている、創傷治癒シグネチャーのマーカーのサブセットの発現を特徴としている。表Ａを参照されたい（Chang等、P.N.A.S. (USA) 85: 704-710 (2005)）。
本研究において同定される腫瘍のサブタイプは、発現プロファイリングによって同定された既知の予後サブタイプに類似している。具体的には、公開済みの３つの研究により、ここに開示するＰＮ及びＭｅｓ腫瘍サブタイプによく似た表現型が報告されている（(Freije等、上掲、Liang等、P.N.A.S. (USA) 102: 5814-5819 (2005); Nigro等、Cancer Res. 65: 1678-1686 (2005))。加えて、以前の研究（Godard等、Cancer Res. 63: 6613-6625 (2003)）により、本発明のＭｅｓ腫瘍サブタイプに類似していると思われる腫瘍の１亜集団を規定する、血管新生遺伝子のクラスターが特に示されている。本発明者等による、ＰＮマーカー対Ｍｅｓマーカーの発現の相互排他的なパターンの観察により、これら２つの腫瘍サブタイプの存在に関するコンセンサスの説明を補う結果が得られた。ＰＮマーカーとＭｅｓマーカーの両方を発現する腫瘍検体内においても、発現が重複しない空間分布が見出された。ＬＯＨ１０と、ＭｅｓシグネチャーとＰＮシグネチャーの区別との強い関連性は、ＬＯＨ１０を予後予測的発現のシグネチャーにリンクさせる以前の研究による発見と一貫性を有し（Nigro等、Cancer Res. 65: 1678-1686 (2005)）、血管新生表現型とＬＯＨ１０の関連性は、ＧＢＭ細胞株へのｃｈｒ１０の導入による抗血管新生作用の示唆と一貫性を有する（(Hsu等、Cancer Res. 56: 5684-5691 (1996))。
【００７３】
増殖マーカーに富む個別の腫瘍サブタイプの存在は、１の以前の報告（Freije等、上掲）により記載されているが、他の研究には開示されていない。本発明者による発見により、Ｐｒｏｌｉｆシグネチャーの排他性が、ＰＮ又はＭｅｓシグネチャーより弱いこと、及びＰｒｏｌｉｆシグネチャーを有する神経膠腫の割合が異なる機関により採取された試料集団により異なることが示唆された。本発明者等が、腫瘍の個別の分子サブタイプとしてＰｒｏｌｉｆ腫瘍サブクラスを分類することを支援するものとして、Ｐｒｏｌｉｆ腫瘍における、この腫瘍サブタイプを区別するゲノム変化のパターンの存在が指摘される。Ｐｒｏｌｉｆシグネチャーを有する腫瘍に特有のゲノム変化の存在は、これら腫瘍を個別のサブクラスとしてまとめる根拠となるもので、調査した集団におけるこのサブクラスが疫学的因子の影響を受けた可能性を示唆している。
ＰＮ及びＭｅｓ腫瘍シグネチャーの著しい相互排他性は、これらの腫瘍サブタイプが、恐らくは異なる起源の細胞種類から発生した、個別の疾病を反映する可能性を示している。しかしながら、同じ患者由来の原発性腫瘍と再発性腫瘍からなる対の組み合わせを研究することにより、本発明者等は、元々ＰＮ又はＰｒｏｌｉｆ細部タイプとして生じた一部の腫瘍がＭｅｓシグネチャーを伴って再発することを観察した。Ｍｅｓ表現型のマーカーであるＣＨＩ３Ｌ１／ＹＫＬ４０の局所的発現は原発性の腫瘍に見られ、これには再発時にＭｅｓクラスに移行するものが含まれる。興味深いことに、最初に現れたときから再発するまでに感知できるＰＮ特性を得る腫瘍が見られる例は無い。神経幹細胞株の、ＰＮからＭｅｓシグネチャーに移行する能力と合わせて考えると、腫瘍のサブクラス変更能が、腫瘍サブタイプが疾病の異なる分化状態を表わしている可能性が示唆される。しかしながら、一部の外観上の変化が、過渡的な腫瘍特性の変化ではなく腫瘍の異種性を反映し得るという可能性を除外することはできない。加えて、本発明者等の実験設計は、治療効果により導かれるものに基づいて疾病の進行を反映する遺伝子発現の変化を区別できるものではない。それでも、本発明者等による一方向性の腫瘍サブクラスの移行の発見は、腫瘍細胞が、遺伝的又は後成的異常が蓄積した結果としてＭｅｓ表現型を獲得できるという可能性を示唆するものである。Ｍｅｓサブタイプの腫瘍を有する患者の年齢が高いことは、このような仮説と一致する。
【００７４】
腫瘍細胞シグネチャーの外観上の移行の基礎となる分子現象の直接的な証拠はないが、ｃｈｒ１０の欠損とＭｅｓシグネチャーとの強い相関性は、疾病の進行の生物学に重要な病識を提供していると思われる。基礎となるメカニズムに関わらず、Ｍｅｓ表現型への移行は疾病の進行の共通パターンであるように思われ、上皮腫瘍の悪性行動の増大に関連する上皮から間葉への移行を暗示するものである。ＥＭＴにおけるＡｋｔ活性の中心的役割（Larue及びBellacosa, Oncogene 24: 7443 (2005)）と一貫して、本発明者等のデータにより、神経膠腫における間葉への転移の誘発にＡｋｔが関与していることが示される。
【００７５】
Ｎｏｔｃｈ及びＡｋｔシグナル伝達のマーカーによる神経膠腫の侵襲性の予測
本発明者等の発見は、予後不良のサブタイプの腫瘍においてＡｋｔシグナル伝達の変化を活性化するゲノム、ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの証拠を実証するものである。以前の豊富なデータは、悪性度の高いグリアの形成及び増殖を促進するうえでのａｋｔシグナル伝達の役割を支持している（Knobbe等、Neuro-Oncology 4: 196-211 (2002); Sonoda等、Cancer Res. 61: 6674-6678 (2001)）。遺伝的改変マウスモジュールにおける一連の的確な研究により、悪性グリアの形成及び増殖を促進するａｋｔの役割が十分に示唆されている（Holland等、Nature Genetics 25: 55-57 (2000); Rajasekhar等、Mol. Cell 12: 889-901 (2003); Uhrbom等、Cancer Res. 62: 5551-5558 (2002); Xiao等、Cancer Res. 65: 5172-5180 (2005)）。ヒト腫瘍において、ＥＧＦＲの増殖及びＰＴＥＮ欠失の両方は、ａｋｔを活性化させる既知の変化であり、特にＧＢＭと低悪性度の病変との区別に関連付けられている（(Stiles等、Mol. Cell Biol. 22: 3842-3851 (2002))。更に最近になって、ＰＩＫ３ＣＡの変異と、ＰＩＫ３ＣＡ及びＰＩＫ３ＣＤにおけるコピー数の均衡が共に増大することが、ＡＡ及びＧＢＭについて開示された（(Broderick等、Cancer Res. 64: 5048-5050 (2004); Mizoguchi等、Brain Pathol. 14: 372-377 (2004); Samuels等、Science 304: 54 (2004))。ＥＧＦＲ増殖の予後予測的価値又はＰＩ３Ｋサブユニットにおける遺伝子的変化が不明である一方、複数の研究により、ｃｈｒ１０の損失、ＰＴＥＮ座位の損失、又はＰＩ３Ｋシグナル伝達の亢進が、全てＧＢＭの結果不良に関連していることが示されている（Chakravarti等、J. Clin. Oncol. 22: 1926-1933 (2004); Lin等、Clin. Cancer Res. 4: 2447-2454 (1998); Schmidt等、J. Neur. Exp. Neurol. 61: 321-328 (2002); Smith等、J. Nat. Cancer Inst. 93: 1246-1256 (2001); Tada等、J. Neurosurg. 95: 651-659 (2001)）。ＰＩ３Ｋ／ａｋｔシグナル伝達の活性化が、増殖、生存、及び血管新生を含む増殖上の利点を与える複数の生物学的プロセスにおいて示されている（(Abe等、Cancer Res. 63: 2300-2305 (2003); Pore等、Cancer Res. 63: 236-241 (2003); Su等、Cancer Res. 63: 3585-3592 (2003))。よって、本発明者等は、Ｐｒｏｌｉｆ及びＭｅｓサブタイプ腫瘍の結果の不良が、それぞれ高い率の増殖又は血管新生を特徴とする侵襲性の高い増殖パターンを促進するＰＩ３Ｋ／ａｋｔシグナル伝達の作用に起因していると推測する。本発明の発見は、２つの予後不良サブタイプにおけるａｋｔシグナル伝達の増殖性の徴候と血管新生の徴候の相違を説明する明瞭な仮定ではないが、Ｍｅｓ腫瘍においてｃｈｒ  １０ｐの座位における減少が頻繁に起こること又はｃｈｒ  ７における増加が頻繁に起こることが、このような差異を生じるという一つの可能性である。これに関し、ｃｈ１９上でコードされるマーカーが高頻度で観察されることは興味深い。
【００７６】
最近の研究により、Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達の活性化が複数の悪性腫瘍に関連付けられた（Fan等、Cancer Res. 64: 7787-7793 (2004); Purow等、Cancer Res. 65: 2353-2363 (2005); Radtke and Clevers, Science 307: 1904-1909 (2005); Weng等、Science 306: 269-271 (2004)）。本発明者等の観察は、高悪性度の神経膠腫におけるＮｏｔｃｈ経路のマーカーの予後予測的価値を示すものである。具体的には、本発明者等は、複数のＮｏｔｃｈ経路エレメントのＮｏｔｃｈ１核染色及びｍＲＮＡが、予後不良のサブタイプと比較した場合に、結果が良好なＰＮ腫瘍サブタイプにおいて有意に濃縮されていることを発見した。更に、２つの独立した試料集団において、特にＰＴＥＮ発現が大きい場合に、ＤＬＬ３のｍＲＮＡの発現が生存期間の延長と相関していることが見出された。複数の解釈が可能であるが、１つの可能性は、インタクトなＰＴＥＮの存在下において、ｎｏｔｃｈシグナル伝達に対するＤＬＬ３の抑制活性（Ladi等、J. Cell Biol. 170: 983-992 (2005)）が、高度に分化型の表現型を促進することにより、腫瘍の増殖を制限する可能性があるということである。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の正確な役割とは関係なく、本発明の２つの遺伝子ＰＴＥＮ及びＤＬＬ  Ｃｏｘモデルの予後予測的価値は、腫瘍増殖の大きな決定因子としてａｋｔ及びＮｏｔｃｈシグナル経路を明確に指し示している。
【００７７】
神経膠腫増殖と前脳神経発生の制御の平行
本発明の調査は、予後予測的腫瘍サブタイプを、神経芽細胞に対する神経幹細胞の相対的発現の差異と、Ａｋｔ及びＮｏｔｃｈシグナル伝達エレメントにおける差異に結びつける。ヒト神経膠腫の１モデルは、分子的に規定されたサブタイプの全てが、同様の起源を有する細胞種類に由来しているが、一部の腫瘍が未分化経幹細胞様（Ｍｅｓ）又は前駆様（Ｐｒｏｌｉｆ）表現型のいずれかに近い方に維持されており、それ以外（ＰＮ）が神経芽細胞又は未成熟のニューロンの表現型に近い表現型を有するものである。このモデルは、動物実験によって支持されており（Bachoo等、Cancer Cell 1: 269-277 (2002); Fomchenko及びHolland, Exp. Cell Res. 306: 323-329 (2005)）、神経幹細胞から、神経細胞又はグリアの系列への分化軸までのいずれの段階に悪性度の高い神経膠腫の細胞起源の種類が属しているかは特に予測せず、シグナル伝達経路における分子変化によって腫瘍の表現型が明らかになることを遅らせる。増殖する未分化状態において神経幹細胞又は前駆体を維持するためにＰＴＥＮとｎｏｔｃｈエキスパートが前脳の血管新生に果たす役割を考慮すると（Groszer等、Science 294: 2186-2189 (2001); Sakamoto等、J. Biol. Chem. 278: 44808-44815 (2003); Yoon及びGaiano, Nature Neurosci. 8: 709-715 (2005)）、本発明者らの発見により、血管新生の間の細胞運命の選択を制御するプロセスにより、腫瘍増殖の侵襲性をほぼ管理することができる。
新規に規定された腫瘍サブタイプの表現型は、成人脳における血管新生の複数の段階と平行している。コミットされた神経細胞の（又は神経オリゴデンドログリアの）前駆体と同様に、ＰＮサブタイプの腫瘍は増殖率が低く、神経芽細胞及び未成熟のニューロンに関連するマーカーと、他のニューロン系列マーカーに伴う転写因子ＯＬＩＧ２及びＡｓｃｌ１とを発現すると思われる。対照的に、Ｍｅｓ及びＰｒｏｌｉｆサブタイプの腫瘍はニューロン系列のマーカーを欠くが、神経幹細胞及び／又は前駆細胞の側面を再利用する。Ｐｒｏｌｉｆ腫瘍と前駆細胞の顕著に高速の増殖率の間には、容易に平行性を見い出すことができる。加えて、Ｐｒｏｌｉｆサブタイプの一部の腫瘍（但し他の分類は含まない）は、ＭＥＬＫ、即ちげっ歯類の前脳において急速に増殖する多分化能前駆細胞のマーカーの強い発現を特徴とする（Nakano等、J. Cell Biol. 170: 413 (2005)）。更に、Ｐｒｏｌｉｆ及びＭｅｓサブクラス両方の腫瘍におけるＥＧＦＲ増殖は、ＥＧＦに対する神経幹細胞及び前駆細胞の応答性と平行している（（Doetsch等、Neuron 36:1021-1034 (2002)）。Ｍｅｓ腫瘍による平滑筋、内皮細胞、及び軟骨マーカーの発現は、成人前脳由来の神経幹細胞に報告されている多分化能を暗示するものである。Bani-Yaghoub等、Development 131: 4287-4298 (2004); Rietze等、Nature 412: 736-739 (2001); Sieber-Blum, Developmental Neuroscience 25:273-278 (2003); Wurmser等、Nature 430: 350-356 (2004)参照。しかしながら、解釈においては、幹細胞様集団が腫瘍質量に含まれることにより、腫瘍の発現プロファイルが混乱している可能性に注意する必要がある。
【００７８】
興味深いことに、Ｍｅｓ腫瘍表現型と神経幹細胞の範囲との平行性には、神経幹細胞と内皮細胞の間に見られる密接な関連の反復が含まれる。他の腫瘍サブタイプとは対照的に、Ｍｅｓ腫瘍はＶＥＧＦ、そのレセプター、及び内非細胞のマーカーの強い発現を示す。最近の発見により、ＶＥＧＦが成人前脳の神経幹細胞の増殖及び生存を促進することが示唆されており、内皮細胞の分泌因子も神経幹細胞の増殖を促進することが実証されている（(Cao等、Nature Genetics 36: 827-835 (2004); Fabel等、Eur. J. Neurosci. 18: 2803-2812 (2003); Jin等、P.N.A.S. (USA) 99: 11946-11950 (2002); Maurer等、Neurosci. Lett. 344: 165-168 (2003); Schanzer等、Brain Pathol. 14: 237-248 (2004); Shen等、Science 304: 1338-1340 (2004); Yasuhara等、Reviews Neurosci. 15: 293-307 (2004); Zhu等、FASEB J. 17: 186-193 (2003))。Ｍｅｓ腫瘍の表現型を有する腫瘍細胞の増殖が、ＶＥＧＦ及び／又は内皮由来因子のレベルの上昇の作用により支持される可能性が推測されることは興味深い。これに関し、ＶＥＧＦ又はそのレセプターを標的とする治療法が、標的とする新脈管構造において有益であると証明されるだけでなく、神経幹細胞様生物学を明らかにする腫瘍細胞の増殖を直接抑制すると証明され得る。神経管において標的とされるＶＥＧＦの不活性化は、最近の研究により、マウスの前脳において血管欠損と重度の神経細胞アポトーシスの両方を生成することが示された（(Raab等、Thrombosis Haemostasis 91: 595-605 (2004))。
【００７９】
治療上の意味
本発明の発見により、神経膠腫の効果的な治療法の開発に複数の示唆が得られる。第１に、本発明の調査は、グリアの悪性腫瘍の最適な治療が、腫瘍の個別の分子分類を標的とした治療計画に依存するというコンセンサス（(Mischel等、Cancer Biol. Therapy 2: 242-247 (2003); Newton, Expert Rev. Antican. Ther. 4: 105-128 (2004); Rao等、Frontier Biosci. 8: e270-280 (2003))の高まりを支援するものである。本発明者等によるインビトロでの発見は、ここで規定する分子シグネチャーにより、特定のシグナル伝達経路を標的とする薬剤への応答を推測できることを示唆するものである。第二に、本発明者等の発見は、高悪性度の神経膠腫の新規治療計画を開発するうえで、Ａｋｔ経路とＮｏｔｃｈ経路の両方を標的とすることの意義を支持する。第三に、標準的な治療を行った後での腫瘍の再発には、間葉への表現型の移行、血管新生状態が伴うという示唆は、侵襲性の低い表現型を有する腫瘍においても、この侵襲性の表現型の状態を標的とすることが有益であることを強調するものである。最後に、幹細胞生物学と、もっと侵襲性の高い神経膠腫の表現型との相関関係により、前脳の神経発生に対する理解を深めるとグリア悪性腫瘍の治療的介入に新規の病識が得られる可能性があることが示唆される。
【００８０】
Ａ．抗ＧＤＭ抗体
一実施態様では、本発明は、ここで、神経膠腫の疾病の経過の重症度の決定及び／又は予後の予測において治療、診断及び／又は予後薬としての用途が見出され得る抗ＧＤＭ抗体の使用法を提供する。このような目的に使用できる例示的な抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロコンジュゲート抗体が含まれる。
１．ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原とアジュバントを複数回皮下(sc)又は腹腔内(ip)注射することにより、動物に産生される。それは、免疫化されるべき種において免疫原性であるタンパク質へ、関連する抗原（特に、合成ペプチドが用いられる場合）を結合させるために有用である。例えば、この抗原を、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターへ、二重官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介する抱合)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介する抱合)、グルタルアルデヒド、及び無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲ及びＲ１が異なるアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲを用いて結合させることができる。
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ（それぞれウサギ又はマウスの場合）を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。コンジュゲートはまた、タンパク融合として組換え細胞培養中で調製することができる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
【００８１】
２．モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第４８１６５６７号)によって作成することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記のように免疫し、免疫化に用いられたタンパク質と特異的に結合する抗体を産生する、又は産生することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。免疫化の後、リンパ球を単離し、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞（融合のパートナーとも呼ばれる）の増殖または生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ−欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
【００８２】
好ましい融合のパートナーである骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの発現を支援し、融合しない親細胞に対して選択する選択培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫株化細胞は、マウス骨髄腫ライン、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡより入手し得るＭＯＰＣ-２１およびＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及び、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、バージニア、ＵＳＡより入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されるものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている（Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,51-63頁、(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。
【００８３】
例えば、モノクローナル抗体の結合親和性は、Munson等, Anal. Biochem., 107:220(1980)のスキャッチャード分析によって測定することができる。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が確定された後、そのクローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地は、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地を包含する。また、このハイブリドーマ細胞は、動物の腹水症腫瘍として、例えばマウスへの細胞の腹腔内注射によって、インビボで増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばアフィニティークロマトグラフィー（例えばプロテインＡ又はプロテインＧ-セファロースを用いる）又はイオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析等のような常套的な抗体精製法によって、培地、腹水、又は血清から上手く分離される。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に分離されて、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび分離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、この状況以外では抗体タンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入し、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を獲得することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌での組み換え発現に関する概説論文には、Skerra等, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262(1993)及びPluckthun, Immunol. Revs. 130: 151-188(1992)が含まれる。
【００８４】
更なる実施態様では、抗体又は抗体断片は、McCafferty等, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリから分離することができる。Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marks等, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリを使用したマウス及びヒト抗体の分離を記述している。続く刊行物は、鎖シャフリングによる高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生成(Marks等, Bio/Technology, 10:779-783[1992])、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouse等, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266[1993])を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
抗体をコードするＤＮＡは、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメイン（ＣＨ及びＣＬ）の配列を、相同的マウス配列に代えて置換することによって(米国特許第４，８１６，５６７号；Morrison等, Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチド（異種ポリペプチド）のコード配列の全部又は一部を共有結合させることによって修飾してキメラ又は融合抗体ポリペプチドを生成することができる。非免疫グロブリンポリペプチド配列は、抗体の定常ドメインと置き代わることができるか、又は抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインが置換されて、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
【００８５】
３．ヒト及びヒト化抗体
本発明の実施に有用な抗-ＧＤＭ抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般的に、ヒト化抗体は、全て又はほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、全て又はほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的にウィンター(Winter)及び共同研究者［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４，８１６，５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【００８６】
抗体がヒトの治療用途を意図している場合、抗原性及びＨＡＭＡ反応(ヒト抗-マウス抗体)を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方のヒト可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒトＶドメイン配列を同定し、その中のヒトフレームワーク（ＦＲ）をヒト化抗体のために受け入れる(Sims等, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia等, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta等, J. Immunol., 151:2623(1993))。
更に、抗体を、抗原に対する高結合親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、高頻度可変領域残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
【００８７】
ヒト化抗ＧＤＭ抗体抗体の種々の形態が考えられる。例えばヒト化抗体は、免疫結合体を生成するために、状況に応じて一又は複数の細胞傷害剤(類)と結合していてもよい抗体断片、例えばＦａｂであってもよい。また、ヒト化抗体は無傷抗体、例えば無傷ＩｇＧ１抗体であってもよい。
ヒト化の別法として、ヒト抗体を生成することができる。例えば、現在では、免疫化することで、内因性免疫グロブリンの産生がなく、ヒト抗体の全レパートリーを産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子のホモ接合体欠失によって、結果として内因性抗体産生の完全な阻害が起こることが説明されてきた。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子配列の、このような生殖細胞系突然変異体マウスへの転移によって、結果として抗原投与時にヒト抗体の産生がおこる。Jakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993); Bruggeman等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第５５４５８０６号、同５５６９８２５号、同５５９１６６９号（全てジェンファーム(GenPharm)）；同５５４５８０７号；及び国際公開第９７／１７８５２号を参照されたい。
【００８８】
別法として、ファージディスプレイ技術(McCafferty等, Nature 348：552-553[1990])を使用して、非免疫化ドナーの免疫グロブリン可変(Ｖ)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を産出させることができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子を、フレーム単位で、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３又はｆｄの大きい又は小さいコートタンパク質遺伝子のどちらかでクローンし、ファージ粒子の表面で機能的抗体断片として表示させる。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づいた選択に基づいても、結果としてこれらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択が成される。よって、このファージはＢ細胞のいくつかの特性を模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる；例えばJohnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)を参照せよ。Ｖ-遺伝子セグメントのいくつかの供給源を、ファージディスプレイのために使用できる。Clackson等, Nature, 352：624-628(1991)は、免疫化したマウス脾臓由来のＶ遺伝子の小さいランダムなコンビナトリアルライブラリから、多様で多くの抗-オキサゾロン抗体を単離した。非免疫化ヒトドナーのＶ遺伝子のレパートリーが構成可能であり、多様で多くの抗原(自己抗原を含む)に対する抗体は、Marks等, J. Mol. Biol. 222：581-597(1991)、又はGriffith等, EMBO J. 12：725-734(1993)に記載の技術にそのまま従うことで単離することができる。また、米国特許第５５６５３３２号及び同５５７３９０５号を参照のこと。
上述したように、ヒト抗体はインビトロで活性化したＢ細胞により産生することができる(米国特許第５５６７６１０号及び同５２２９２７５号)。
【００８９】
４．抗体断片
ある状況下では、抗体全体よりも、抗体断片を用いることに利点がある。より小さな大きさの断片は、対応する完全長分子が有する抗原結合特異性に類似の特異性を維持しながら迅速なクリアランスを可能にし、固形腫瘍への接近の改良につながり得る。
抗体断片を産生するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化によって誘導された(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は、現在は組換え宿主細胞により直接産生することができる。Ｆａｂ、Ｆｖ及びＳｃＦｖ抗体断片は、すべて大腸菌で発現させ分泌させることができ、従って、大量のこれら断片の産生が容易となった。抗体断片は、上で論じた抗体ファージライブラリから単離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合させてＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。インビボ半減期が増した、サルベージレセプター結合性エピトープ残基を含むＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２が、米国特許第５８６９０４６号に記載されている。抗体断片を生成するのための他の方法は、当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択する抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦｖ)である。国際公開９３／１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号を参照のこと。Ｆｖ及びｓＦｖは、定常領域を欠く無傷の連結部位を有する唯一の種である；従って、インビボで使用している間の減少した非特異的結合に適している。ｓＦｖ融合タンパク質は、ｓＦｖのアミノ又はカルボキシ末端のどちらかで、エフェクタータンパク質の融合体が生成されるように構成されてもよい。上掲のAntibody Engineering, Borrebaeck編を参照のこと。また、抗体断片は、例えば米国特許第５６４１８７０号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。そのような直鎖状抗体断片は単一特異性又は二重特異性であってもよい。
【００９０】
５．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、ＧＤＭタンパク質の２つの異なるエピトープに結合しうる。他のこのような抗体では他のタンパク質に対する結合部位とＧＤＭ結合部位とが結合しうる。あるいは、抗ＧＤＭアームは、ＧＤＭ-発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させ局在させるように、ＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲＩＩ(ＣＤ３２)及びＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)等のＩｇＧ(ＦｃγＲ)に対するＦｃレセプター、又はＴ細胞レセプター分子(例えばＣＤ３)等の白血球上のトリガー分子に結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体はＧＤＭを発現する細胞に細胞傷害剤を局在化するためにも使用されうる。これらの抗体はＧＤＭ結合アーム及び細胞傷害剤(例えば、サポリン(saporin)、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテン)と結合するアームを有する。二重特異性抗体は完全長抗体又は抗体断片(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。
国際公開第９６／１６６７３号には、二重特異性抗-ＥｒｂＢ２／抗-ＦｃγＲＩＩＩ抗体が記載されており、米国特許第５８３７２３４号には、二重特異性抗-ＥｒｂＢ２／抗-ＦｃγＲＩ抗体が開示されている。二重特異性抗-ＥｒｂＢ２／Ｆｃα抗体は国際公開第９８／０２４６３号に示されている。米国特許第５８２１３３７号は、二重特異性抗-ＥｒｂＢ２／抗-ＣＤ３抗体を教示するものである。
二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において既知である。完全長二重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている(Millstein等, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開第９３／０８８２９号及びTraunecker等、EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
【００９１】
異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原-抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むＩｇ重鎖定常ドメインである。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時トランスフェクトする。これにより、組立に使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が所望の二重特異性抗体の最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が所望の鎖の結合にあまり影響がないときは、２または３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
この手法の好ましい実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公開第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology,１−７:210 (1986)を参照されたい。
【００９２】
米国特許第５７３１１６８号に記載された他の手法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面はＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
二重特異性抗体は、架橋した又は「ヘテロコンジュゲート」抗体もまた含む。例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体の一方はアビジンに結合され、他方はビオチンに結合され得る。そのような抗体は、例えば、不要の細胞に対する免疫系細胞をターゲティングするため(米国特許第４６７６９８０号）、及びＨＩＶ感染の治療のために提案された（国際公開第９１／００３６０号、同９２／２００３７３号、及び欧州特許第０３０８９号)。ヘテロコンジュゲート抗体は、あらゆる簡便な架橋法を用いて作製することができる。好適な架橋剤は当該分野において良く知られており、幾つかの架橋技術と共に米国特許第４６７６９８０号に開示されている。
【００９３】
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤、亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に変換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再変換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
最近の進歩により、大腸菌からのＦａｂ'-ＳＨ断片の直接の回収が容易になり、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby等,J.Exp.Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトＴ細胞、及びＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。
【００９４】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な技術もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生成されている。Kostelny等, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生成に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーによりＶＬにＶＨを結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、よって２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等 J.Immunol. 147:60(1991)。
【００９５】
６．ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロコンジュゲート抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため［米国特許第４６７６９８０号］及びＨＩＶ感染の治療のために［国際公開第９１／００３６０；国際公開第９２／２００３７３；欧州特許第０３０８９号］提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することによって、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチルイミダート、及び例えば米国特許第４６７６９８０号に開示されたものが含まれる。
【００９６】
７．多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早くインターナリゼーション(及び／又は異化)されうる。本発明の抗体は、３又はそれ以上の結合部位を有する多価抗体(ＩｇＭクラス以外のもの)であり得(例えば四価抗体)、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に生成することができる。多価抗体は二量化ドメインと３又はそれ以上の抗原結合部位を有する。好ましい二量化ドメインはＦｃ領域又はヒンジ領域を有する(又はそれらからなる)。このシナリオにおいて、抗体はＦｃ領域と、Ｆｃ領域のアミノ末端に３又はそれ以上の抗原結合部位を有しているであろう。ここで、好ましい多価抗体は３ないし８、好ましくは４の抗原結合部位を有する(又はそれらからなる)。多価抗体は少なくとも１つのポリペプチド鎖(好ましくは２つのポリペプチド鎖)を有し、ポリペプチド鎖(類)は２又はそれ以上の可変ドメインを有する。例えば、ポリペプチド鎖(類)はＶＤ１-(Ｘ１)ｎ-ＶＤ２-(Ｘ２)ｎ-Ｆｃを有し、ここでＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域のポリペプチド鎖の一つであり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは０又は１である。例えば、ポリペプチド鎖(類)は：ＶＨ-ＣＨ１-柔軟なリンカー-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖を有し得る。ここで多価抗体は、好ましくは少なくとも２つ(好ましくは４つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに有する。ここで多価抗体は、例えば約２〜約８の軽鎖可変ドメインポリペプチドを有する。ここで考察される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを有し、場合によってはＣＬドメインを更に有する。
【００９７】
８．エフェクター機能の加工
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば抗体の抗原-依存細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存細胞傷害性（ＣＤＣ）を向上させることは望ましい。これは、抗体のＦｃ領域で一又は複数のアミノ酸置換を誘導することによりなされうる。あるいは又はさらに、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成するようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上したインターナリゼーション能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体−依存細胞性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有する可能性がある。Caron等, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes,  B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。また、向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体は、Wolff等, Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されている異種二官能性架橋を用いて調製することができる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。抗体の血清半減期を増大させるために、例えば米国特許第５７３９２７７号に記載のように、抗体(特に抗体断片)へサルベージレセプター結合エピトープを導入してもよい。ここで使用される場合の「サルベージレセプター結合エピトープ」なる用語は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期を増加させる原因であるＩｇＧ分子(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４)のＦｃ領域のエピトープを意味する。
【００９８】
９．免疫複合体
また、本発明は、化学治療薬、成長阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片）などの細胞傷害性剤、あるいは放射性同位体（即ち、放射性コンジュゲート）と抱合している抗体を含む免疫複合体に関する。
ａ．化学療法薬
このような免疫複合体の生成に有用な化学治療薬を上に記載した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質（PAPI、PAPII、及びPAP-S）、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。放射性コンジュゲート抗体の生成には、様々な放射性ヌクレオチドが利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅが含まれる。抗体及び細胞傷害性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス-アジド化合物（ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等）、ビス-ジアゾニウム誘導体（ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２，６-ジイソシアネート等）、及びビス-活性フッ素化合物（１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等）を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されているように調製することができる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ-ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。国際公開９４／１１０２６参照。
抗体のコンジュゲートと一又は複数の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、トリコセン(trichothene)及びＣＣ１０６５、及び毒性活性を有するこれらの毒素の誘導体が、ここで考察される。
【００９９】
ｂ．メイタンシン及びメイタンシノイド
好ましい一実施態様では、本発明の抗ＧＤＭ抗体(完全長又は断片)は一又は複数のメイタンシノイド分子と結合している。
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第３８９６１１１号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ-３メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第４１５１０４２号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第４１３７２３０号；同４２４８８７０号；同４２５６７４６号；同４２６０６０８号；同４２６５８１４号；同４２９４７５７号；同４３０７０１６号；同４３０８２６８号；同４３０８２６９号；同４３０９４２８号；同４３１３９４６号；同４３１５９２９号；同４３１７８２１号；同４３２２３４８号；同４３３１５９８号；同４３６１６５０号；同４３６４８６６号；同４４２４２１９号；同４４５０２５４号；同４３６２６６３号；及び同４３７１５３３号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。
【０１００】
治療指標を改善する試みにおいて、メイタンシン及びメイタンシノイドは、腫瘍細胞抗原に特異的に結合する抗体と結合している。メイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲート及びそれらの治療用途は、例えば米国特許第５，２０８，０２０号、同５，４１６，０６４号、欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。Liu等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：8618-8623(1996)には、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合するＤＭ１と命名されたメイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲートが記載されている。前記コンジュゲートは培養された結腸癌細胞に対して高い細胞傷害性を有することが見出されており、インビボ腫瘍成長アッセイにおいて抗腫瘍活性を示す。Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)には、メイタンシノイドが、ジスルフィド結合を介して、ヒト結腸癌株化細胞の抗原に結合するマウス抗体Ａ７、又はＨＥＲ-２／ｎｅｕオンコジーンに結合する他のマウスモノクローナル抗体ＴＡ.１に結合している免疫コンジュゲートが記載されている。ＴＡ.１-メイタンシノイドコンジュゲートの細胞傷害性はヒト乳癌株化細胞ＳＫ-ＢＲ-３におけるインビトロで試験され、細胞当たり３×１０５ＨＥＲ-２表面抗原が発現した。薬剤コンジュゲートにより、遊離のメイタンシノイド剤に類似した細胞傷害度が達成され、該細胞傷害度は、抗体分子当たりのメイタンシノイド分子の数を増加させることにより増加する。Ａ７-メイタンシノイドコンジュゲートはマウスにおいては低い全身性細胞傷害性を示した。
【０１０１】
抗ＧＤＭ抗体-メイタンシノイド又はＧＤＭ結合抗体断片メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体又はメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性もほとんど低減することなく、メイタンシノイド分子に抗ＧＤＭ抗体又はＧＤＭ結合抗体断片を化学的に結合させることにより調製できる。１分子の毒素／抗体は、裸抗体の使用において細胞傷害性を高めることが予期されているが、抗体分子当たり、平均３-４のメイタンシノイド分子が結合したものは、抗体の機能又は溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞に対する細胞傷害性を向上させるといった効力を示す。メイタンシノイドは当該技術分野でよく知られており、公知の技術で合成することも、天然源から単離することもできる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第５２０８０２０号、及び他の特許、及び上述した特許ではない刊行物に開示されている。好ましいメイタンシノイドは、メイタンシノール、及び種々のメイタンシノールエステル等の、メイタンシノール分子の芳香環又は他の位置が修飾されたメイタンシノール類似体である。
例えば、米国特許第５２０８０２０号又は欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号、及びChari等, Cancer Research, 52：127-131(1992に開示されているもの等を含む、抗体-又は抗体断片−メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。リンカー成分ＳＭＣＣを含む抗体−メイタンシノイドコンジュゲートは、2004年10月8日出願の米国特許出願番号第１０／９６０６０２号に開示されているようにして調整することができる。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれるが、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。更なる結合基をここに開示及び例示する。
【０１０２】
抗体又は抗体断片とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。特に好ましいカップリング剤には、ジスルフィド結合により提供されるＮ-スクシンイミジル-４-(２-ピリジルチオ)ペンタノアート(ＳＰＰ)及びＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)(Carlsson等, Biochem. J. 173：723-737[1978])が含まれる。
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するＣ-３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ-１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ-１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ-２０位で生じる。好ましい実施態様において、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のＣ-３位で形成される。
【０１０３】
ｃ．カリケアマイシン
対象の他の免疫コンジュゲートには、一又は複数のカリケアマイシン分子と結合した抗ＧＤＭ抗体又はＧＤＭ結合抗体断片が含まれる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖ＤＮＡ破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５７１２３７４号、同５７１４５８６号、同５７３９１１６号、同５７６７２８５号、同５７７０７０１号、同５７７０７１０号、同５７７３００１号、同５８７７２９６号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ-アセチル-γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１(Hinman等, Cancer Research, 53：3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58：2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは双方共、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞傷害効果が大きく向上する。
【０１０４】
ｄ．他の細胞傷害剤
本発明の抗ＧＤＭ抗体と結合可能な他の抗腫瘍剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び５-フルオロウラシル、米国特許第５０５３３９４号、同５７７０７１０号に記載されており、集合的にＬＬ-Ｅ３３２８８複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン(esperamicine)(米国特許第５８７７２９６号)が含まれる。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日公開の国際公開第９３／２１２３２号を参照のこと。
本発明は、抗体と核酸分解活性を有する化合物(例えばリボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮアーゼ)との間に形成される免疫コンジュゲートをさらに考察する。
【０１０５】
腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性コンジュゲートした抗ＧＤＭ抗体を生成するために、種々の放射性同位体が利用される。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が含まれる。コンジュゲートが診断用に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴(ＮＭＲ)映像(磁気共鳴映像、mriとしても公知)用のスピン標識、例えばヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
放射-又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-９０はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80：49-57)は、ヨウ素-１２３の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
【０１０６】
抗体と細胞傷害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは細胞中の細胞傷害剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る(Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)；米国特許第５２０８０２０号)。
【０１０７】
別法として、抗ＧＤＭ抗体又はＧＤＭ結合抗体断片及び細胞傷害剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。ＤＮＡの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの２つの部分をコードする領域をそれぞれ含有する。
他の実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体-レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄剤を使用し、循環から未結合コンジュゲートを除去し、細胞傷害剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
【０１０８】
１０．免疫リポソーム
ここで開示されている抗ＧＤＭ抗体又はＧＤＭ結合抗体断片は、免疫リポソームとして処方することもできる。「リポソーム」は、哺乳動物への薬物輸送に有用な、脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤を含む種々のタイプの小胞体である。リポソームの成分は、通常は生物膜の脂質配向に類似した２層構造に配列される。抗体を含有するリポソームは、例えばEpstein等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688(1985)；Hwang等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030(1980)；及び米国特許第４４８５０４５号及び同４５４４５４５号；及び１９９７年１０月２３日に公開の国際公開９７／３８７３１に記載されているように、当該分野において既知の方法により調製される。循環時間が増したリポソームは米国特許第５０１３５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ-誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ-ＰＥ)を含有する脂質組成物を用いた逆相蒸発法により作製することができる。リポソームは孔径が定められたフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体のＦａｂ'断片は、ジスルフィド交換反応を介して、Martin等, J. Biol. Chem. 257:286-288(1982)に記載されているようにしてリポソームにコンジュゲートすることができる。場合によっては、化学療法剤はリポソーム内に包含される。Gabizon等, J. National Cancer Inst. 81(19)1484(1989)を参照されたい。
【０１０９】
Ｂ．ＧＤＭ結合オリゴペプチド
本発明のＧＤＭ結合オリゴペプチドはここで記載される様なＧＤＭポリペプチドに、好ましくは特異的に、結合するオリゴペプチドである。ＧＤＭ結合オリゴペプチドは、既知のオリゴペプチド合成法を用いて化学的に合成することができ、あるいは組換え技術を用いて調製及び生成することができる。ＧＤＭ結合オリゴペプチドは通常、少なくとも約５のアミノ酸長であり、或いは少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１−７３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００のアミノ酸長以上であり、このようなオリゴペプチドはここに記載される様なＧＤＭポリペプチドに対して好ましくは特異的に結合する能力がある。ＧＤＭ結合オリゴペプチドは、よく知られた技術を用いて過度の実験をすることなしに同定することができる。この点において、ポリペプチド標的に特異的に結合する能力のあるオリゴペプチドのオリゴペプチドライブラリを検索する技術は当分野でよく知られていることを注記する（例えば、米国特許第５５５６７６２号、同第５７５０３７３号、同第４７０８８７１号、同第４８３３０９２号、同第５２２３４０９号、同第５４０３４８４号、同第５５７１６８９号、同第５６６３１４３号；ＰＣＴ公開第ＷＯ８４／０３５０６号、及びＷＯ８４／０３５６４号；Geysen等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984)；Geysen等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985)；Geysen等, in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986)；Geysen等, J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987)；Schoofs等, J. Immunol., 140:611-616 (1988), Cwirla,S.E.等(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378；Lowman,H.B.等 (1991) Biochemistry, 30:10832；Clackson,T.等 (1991) Nature, 352:624；Marks,J.D.等 (1991) J. Mol. Biol., 222:581；Kang,A.S.等 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363、及びSmith, G.P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668参照）。
【０１１０】
この点において、バクテリオファージ（ファージ）ディスプレイは、大きなオリゴペプチドライブラリを検索して、ポリペプチド標的に特異的に結合する能力のあるこれらライブラリのメンバーを同定することを可能にするよく知られた技術の一つである。ファージディスプレイは、様々なポリペプチドがバクテリオファージ粒子の表面上のコートタンパク質に融合タンパク質として表示されることによる技術である（Scott,J.K.及びSmith G. P. (1990) Science 249:386)。ファージディスプレイの有用性は、選択的にランダム化されたタンパク質変異体（又はランダムクローンｃＤＮＡ）の大きなライブラリを標的分子に高い親和性で結合するこれらの配列について素早く効果的に分類することができる点にある。ファージでのペプチド（Cwirla,S.E.等 (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378）又はタンパク質（Lowman,H.B.ら (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson,T.ら (1991) Nature, 352: 624; Marks,J.D.等 (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang,A.S.等 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363）ライブラリのディスプレイは、特異的に結合する特性を有するものについて無数のポリペプチド又はオリゴペプチドをスクリーニングするために使用されている（Smith, G.P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668）。ランダム突然変異体のファージライブラリの分類は、多数の変異体を構築して増殖させる方法、標的レセプターを用いた親和性精製の方法、及び結合増強の結果を評価する手段を必要とする。米国特許第５２２３４０９号、同第５４０３４８４号、同第５５７１６８９号、及び同第５６６３１４３号。
【０１１１】
ほとんどのファージディスプレイ法は繊維状ファージを使用していたが、λファージディスプレイシステム（ＷＯ９５／３４６８３；米国特許第５６２７０２４号）、Ｔ４ファージディスプレイシステム（Ren等 Gene, 215:439 (1998); Zhu等Cancer Research, 58(15): 3209-3214 (1998); Jiang等, Infection & Immunity, 65(11): 4770-4777 (1997); Ren等, Gene, 195(2):303-311 (1997); Ren, Protein Sci., 5:1833 (1996); Efimov等, Virus Genes, 10:173 (1995)及びＴ７ファージディスプレイシステム（Smith及びScott, Methods in Enzymology, 217, 228-257 (1993); 米国特許第５７６６９０５号）も知られている。
【０１１２】
現在、基礎的なファージディスプレイ構想の多くの他の改良及び変形が開発されている。これらの改良は、選択された標的分子への結合についてペプチドライブラリをスクリーニングするための、及びこれらのタンパク質が所望の特性をスクリーニングする潜在能力で機能性タンパク質をディスプレイするためのディスプレイシステムの能力を増強する。ファージディスプレイ反応のための組み換え反応手段について記載があり（ＷＯ９８／１４２７７）及びファージディスプレイライブラリは二分子相互作用（ＷＯ９８／２０１６９；ＷＯ９８／２０１５９）及び拘束性へリックスペプチドの特性（ＷＯ９８／２００３６）を分析及び制御するために使用されている。ＷＯ９７／３５１９６は、リガンドが標的分子に結合しうる第一の溶液、及び親和性リガンドが標的分子に結合しない第二の溶液とファージディスプレイライブラリを接触させて結合リガンドを選択的に単離する、親和性リガンドの単離方法を記載する。ＷＯ９７／４６２５１は、親和性精製抗体でランダムファージディスプレイライブラリをバイオパニングし、次いで結合ファージを単離し、続いてマイクロプレートのウェルでマイクロパニングして高親和性結合ファージを単離する方法を記載する。黄色ブドウ球菌（Staphlylococcus aureus）タンパク質Ａの親和性タグとしての使用も報告されている（Li等, (1998) Mol Biotech., 9:187）。ＷＯ９７／４７３１４は、ファージディスプレイライブラリでもよいコンビナトリアルライブラリを用いて酵素特異性を識別するための基質サブトラクションライブラリの使用を記載している。ファージディスプレイに用いる洗浄剤における使用に適した酵素を選択する方法はＷＯ９７／０９４４６に記載される。特異的に結合するタンパク質を選択する更なる方法は、米国特許第５４９８５３８号、同第５４３２０１８号、及びＷＯ９８／１５８３３に記載されている。
ペプチドライブラリの作製及びこれらのライブラリのスクリーニングの方法は、米国特許第５７２３２８６号、同第５４３２０１８号、同第５５８０７１７号、同第５４２７９０８号、同第５４９８５３０号、同第５７７０４３４号、同第５７３４０１８号、同第５６９８４２６号、同第５７６３１９２号、及び同第５７２３３２３号に記載される。
【０１１３】
Ｃ．ＧＤＭ小分子アンタゴニスト
ＧＤＭ小分子アンタゴニストは、ここに記載されるようなＤＧＭポリペプチドのシグナル伝達エレメント（例えば、レセプター、リガンド、細胞内エレメント等）に、好ましくは特異的に結合する、ここに定義されるようなオリゴペプチド又は抗体（又はその断片）以外の小分子である。このような有機分子は既知の方法（例えばＰＣＴ公開第ＷＯ００／００８２３及びＷＯ００／３９５８５号参照）を用いて同定され、化学的に合成されうる。このような有機分子は通常、約２０００ダルトンの大きさ未満であり、あるいは約１５００、７５０、５００、２５０又は２００ダルトンの大きさであり、ここに記載される様なＧＤＭポリペプチドに、好ましくは特異的に結合する能力のあるこのような有機分子は、よく知られた技術を用いて過度の実験をすることなしに同定されうる。この点において、ポリペプチド標的に結合する能力のある分子の有機分子ライブラリを検索する技術は当分野でよく知られていることを注記する（例えばＰＣＴ公開第ＷＯ００／００８２３及びＷＯ００／３９５８５号参照）。ＧＤＭ分子アンタゴニストは、例えばアルデヒド、ケトン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、一級アミン、二級アミン、三級アミン、Ｎ置換ヒドラジン、ヒドラジド、アルコール、エーテル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド、尿素、カルバミン酸塩、炭酸塩、ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセタール、ハロゲン化アリール、アリールスルホン酸、ハロゲン化アルキル、アルキルスルホン酸、芳香族化合物、複素環化合物、アニリン、アルケン、アルキン、ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン、オキサゾリン、チアゾリジン、チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシアン酸塩、塩化スルホニル、ジアゾ化合物、酸塩化物等であり得る。
【０１１４】
Ｄ．ＧＤＭアンタゴニストのスクリーニング
本発明の抗体、ポリペプチド、オリゴペプチド及び有機分子を生成する技術を、上記に記載した。所望するような、所定の生物学的特性を有する抗体（及びその抗原結合断片）、オリゴペプチド又は有機分子をさらに選択することができる。
本発明に使用可能な様々なＧＤＭアンタゴニストの成長阻害効果を、例えば、内因的又はＧＤＭ遺伝子によるトランスフェクション後のいずれかでＧＤＭポリペプチドを発現する神経膠腫細胞を用いる当該分野で周知の方法によって評価することができる。例えば、適切な腫瘍細胞株及びＧＤＭコード化核を用いて形質移入した細胞は、数日間（例えば、２−７日）、種々の濃度の本発明のＧＤＭアンタゴニストで処理し、クリスタル・バイオレット又はＭＴＴで染色するか、又は他の何らかの比色アッセイによって分析することができる。増殖を測定するその他の方法は、このようなＧＤＭアンタゴニストの存在又は非存在下で処理した細胞の３Ｈ-チミジン取り込みを比較することによる。処理の後、細胞を収集し、ＤＮＡへ取り込まれた放射能をシンチレーションカウンターで定量化した。適切なポジティブコントロールには、細胞株の成長を阻害することが知られている成長阻害抗体でその選択した細胞株を処理することが含まれる。インビボでの成長阻害は、当該分野で知られている種々の方法で確かめることができる。好ましくは、腫瘍細胞は、ＧＤＭポリペプチドを過剰発現するものである。好ましくは、このようなＧＤＭアンタゴニストは、ある実施態様では約０．５から３０μｇ／ｍｌの抗体濃度で、未処理腫瘍細胞と比べて約２５−１００％、より好ましくは約３０−１００％、そしてさらにより好ましくは約５０−１００％又は７０−１００％のＧＤＭ発現腫瘍細胞の増殖をインビトロ又はインビボで阻害する。成長阻害は、細胞培養で、約０．５から３０μｇ／ｍｌ又は０．５ｎＭから２００ｎＭのＧＤＭアンタゴニスト濃度で測定することができ、その成長阻害は、抗体への腫瘍細胞の曝露後１-１０日で確かめられる。約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重でのアンタゴニスト及び／又はアゴニストの投与が、抗体の最初の投与から約５日から３ヶ月、好ましくは約５から３０日以内に腫瘍の大きさの減少又は腫瘍細胞増殖の減少を引き起こすならば、抗体はインビボで成長阻害作用がある。
【０１１５】
細胞死を誘発するＧＤＭアンタゴニストを選択するために、例えばヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルー又は７ＡＡＤの取込みにより示される膜インテグリティの損失度合いを対照と比較して求める。ＰＩ取込みアッセイは、補体及び免疫エフェクター細胞の不在下で行われる。ＧＤＭポリペプチド発現細胞腫瘍細胞を、培地のみ、又は適切なＧＤＭアンタゴニストを含有する培地でインキュベートする。細胞を３日間インキュベートする。各処理に続いて、細胞を洗浄し、細胞凝塊除去のために３５ｍｍのストレーナキャップ付き１２×７５チューブ(チューブ当たり１ｍｌ、処理グループ当り３チューブ)に等分する。次いで、チューブへＰＩ（１０μｇ／ｍｌ）を与える。サンプルをＦＡＣＳＣＡＮ(登録商標）フローサイトメータとＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴ(登録商標）セルクエスト(CellQuest)ソフトウエア(Becton Dickinson)を使用して分析してもよい。このようにして、ＰＩ取込みによって測定されるような、統計的に有意なレベルの細胞死を誘発するＧＤＭアンタゴニストを選択することができる。
関心のある抗体が結合したＧＤＭポリペプチド上のエピトープに結合するＧＤＭアンタゴニストをスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow及びDavid Lane編(1988)に記載されているような通常の交差ブロッキングアッセイを実施することができる。既知の抗ＧＤＭ抗体のように、試験抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子が同じ部位又はエピトープと結合するならば、このアッセイを確定するために用いることができる。あるいは、又は付加的に、エピトープマッピングを、当該分野で周知の方法によって行うことができる。例えば、接触残基を同定するために、例えばアラニンスキャンニングによって抗体配列を変異させることができる。この変異体抗体は、適切なフォールディングを確かめるために、最初にポリクローナル抗体との結合について試験される。異なる方法では、ＧＤＭポリペプチドの異なる領域と一致するペプチドを、試験抗体群又は試験抗体及び特徴付けられた又は既知のエピトープを有する抗体による競合アッセイで用いることができる。
【０１１６】
Ｅ．抗体依存性酵素媒介性プロドラッグ治療法(ＡＤＥＰＴ)
また、本発明のＧＤＭアンタゴニスト抗体は、プロドラッグ(例えばペプチジル化学療法剤、国際公開８１／０１１４５を参照)を活性な抗癌剤へ変換するプロドラッグ活性化酵素へ抗体をコンジュゲートすることによって、ＡＤＥＰＴにおいて使用することができる。例えば国際公開８８／０７３７８及び米国特許第４９７５２７８号を参照されたい。
ＡＤＥＰＴに有用な免疫コンジュゲートの酵素成分には、より活性な細胞毒形態に変換するようにプロドラッグへ作用し得る任意の酵素が含まれる。
限定するものではないが、この発明の方法に有用な酵素には、ホスファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ；スルファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５-フルオロシトシンを抗癌剤５-フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；プロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン(例えば、カテプシンＢ及びＬ)で、ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なもの；Ｄ-アミノ酸置換基を含有するプロドラッグの変換に有用なＤ-アラニルカルボキシペプチダーゼ；炭水化物切断酵素、例えばグリコシル化プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なノイラミニダーゼ及びβガラクトシダーゼ；βラクタムで誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に変換させるのに有用なβラクタマーゼ；及びペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれフェノキシアセチル又はフェニルアセチル基で、それらのアミン性窒素において誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に変換するのに有用なペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼが含まれる。あるいは、「アブザイム」としてもまた公知の酵素活性を有する抗体を、遊離の活性薬剤に本発明のプロドラッグを変換させるために使用することもできる(例えば、Massey, Nature 328:457-458(1987)を参照)。抗体-アブザイムコンジュゲートは、ここで記載されているようにして、腫瘍細胞個体群にアブザイムを送達するために調製することができる。
この発明の酵素は、当該分野においてよく知られている技術、例えば上で検討したヘテロ二官能性架橋試薬を使用することにより、抗ＧＤＭ抗体に共有的に結合させることができる。あるいは、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部位に結合せしめてなる融合タンパク質を、当該技術においてよく知られている組換えＤＮＡ技術を使用して作成することができる(Neuberger等, Nature 312:604-608[1984])。
【０１１７】
Ｆ．ＧＤＭポリペプチド変異体
ここに記載したＧＤＭポリペプチドに加えて、そのような分子の変異体を、ここに開示する本発明に使用するために調製できると考えられる。抗ＧＤＭ抗体及びＧＤＭポリペプチド変異体は、コード化ＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することによって、及び／又は所望の抗体又はポリペプチドを合成することによって調製できる。当業者は、アミノ酸変化がグリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などのこれら分子の翻訳後プロセスを変え得るのを理解するであろう。
アミノ酸配列の変異は、例えば、米国特許第５３６４９３４号に示す保存的及び非保存的変異に関する技術及び指針のいずれかを用いて作成することができる。変異は、結果として天然配列と比較してアミノ酸配列の変化を生じる、抗体又はポリペプチドをコードする一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってもよい。場合によっては、変異は、対象のアミノ酸配列の一つ又は複数のドメインにおける、少なくとも一つのアミノ酸の他の任意のアミノ酸との置換による。どのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失され得るかを確かめる指針は、抗ＧＤＭ抗体又はＧＤＭポリペプチドの配列を既知の相同タンパク質分子の配列と相同な対象のアミノ酸配列の配列と比較し、相同性の高い領域内で生じたアミノ酸配列変化の数を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、一のアミノ酸を類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸で置換すること、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果であるとすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲内であり得る。許容され得る変異は、配列にアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、生じた変異体を完全長又は成熟天然配列によって示される活性に関して試験することによって確かめられる。
【０１１８】
種々のＧＤＭポリペプチドの断片がここで提供されている。そのような断片は、例えば完全長天然抗体又はタンパク質と比較した時に、Ｎ末端又はＣ末端で切断しているか、又は内部残基を欠いている可能性がある。所望される生物学的活性にとって必須ではないアミノ酸残基を欠くそのような断片も、開示される方法に有用である。
上記ポリペプチド断片は、多くの従来技術のいずれかによって調製してもよい。所望のペプチド断片は化学合成してもよい。代替的方法には、酵素的消化、例えば特定のアミノ酸残基で確定した部位でタンパク質を切断することが知られた酵素によってタンパク質を処理することで、又は適当な制限酵素でＤＮＡを消化して所望の断片を単離することによってそのような断片を生成することが含まれる。さらにその他の好適な技術には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、所望断片断片をコードするＤＮＡ断片を単離し増幅することが含まれる。ＤＮＡ断片の所望の末端を確定するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲの５’及び３’プライマーで用いられる。好ましくは、そのような断片は、対応する完全長分子と少なくとも１つの生物学的及び／又は免疫学的活性を共有する。
【０１１９】
特定の実施態様では、対象とする保存的置換を、好ましい置換の項目で表６に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表６に例示的置換と名前を付けた又は以下にアミノ酸分類でさらに記載するように、より実質的な変化が導入され、所望の変異体を同定するために生成物がスクリーニングされる。
表６
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【０１２０】
ＧＤＭポリペプチドの機能又は免疫学的同一性の実質的修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の電荷又は分子疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において有意に異なる置換基を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
（２）中性の親水性：Cys, Ser, Thr; Asn; Gln
（３）酸性：Asp, Glu;
（４）塩基性：His, Lys, Arg;
（５）鎖配向に影響する残基：Gly, Pro; 及び
（６）芳香族：Trp, Tyr, Phe。
非保存的置換は、これらの分類の１つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、又はより好ましくは、残された（非保存）部位に導入されうる。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発等のこの分野で知られた方法を用いてなすことができる。部位特異的突然変異誘発［Carter等, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)］、カセット突然変異誘発［Wells等, Gene, 34: 315 (1985)］、制限的選択突然変異誘発［Wells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)］又は他の知られた技術をクローニングしたＤＮＡに実施して、抗ＧＤＭ分子を作成することもできる。
【０１２１】
また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である［Cunningham及びWells, Science, 244: 1081-1085 (1989)］。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman ＆ Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
ＧＤＭポリペプチドの適切なコンフォメーションを維持することに関与していない任意のシステイン残基も、分子の酸化的安定性を向上させ、異常な架橋を防ぐために、概してセリンと置換され得る。逆に、そのような分子の安定性（特に、抗体がＦｖ断片のような抗体断片）を向上させるために、それにシステイン結合（複数でも）を加えてもよい。
【０１２２】
特に好ましい型の置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の一又は複数の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的に、更なる開発のために得られた変異体は、それらが生成された親抗体と比較して向上した生物学的特性を有している。そのような置換変異体を生成する簡便な方法には、ファージディスプレイを使用する親和性成熟がふくまれる。簡潔に言えば、高頻度可変領域部位（例えば、６−７部位）を変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生成させる。このように生成された抗体変異体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物として一価形態で表示される。ファージ表示変異体は、ついで、ここに開示されるようなそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。改変の候補となる高頻度可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を実施し、抗原結合に有意に寄与する高頻度可変領域残基を同定することができる。あるいは、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して抗体と標的ポリペプチドとの接点を同定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、ここで詳しく記述した技術による置換の候補である。そのような変異体が生成されたら、変異体のパネルにここに記載するようなスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を更なる開発のために選択することができる。
ＧＤＭポリペプチドのアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当該分野で周知の種々の方法によって調製される。これらの方法には、限定されるものではないが、オリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、そして天然配列又は早期に調製した変異体のカセット突然変異誘発による、天然ソースからの単離（天然発生アミノ酸配列変異体の場合）又は調製が含まれる。
【０１２３】
Ｇ．ＧＤＭポリペプチドの修飾
共有結合的に修飾されたＧＤＭも、本発明の範囲に含まれる使用に適切であり得る。共有結合的修飾の一型には、標的とするそのような抗体及びポリペプチドのアミノ酸残基を、そのような抗体及びポリペプチドの選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることが含まれる。二官能性試薬による誘導体化は、例えば前述の分子を、精製に用いる水不溶性支持体マトリクス又は表面と架橋させるために有用であり、その逆も同じである。通常用いられる架橋剤には、例えば、１,１-ビス（ジアゾアセチル）-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４-アジドサリチル酸を有するエステル、３,３'-ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-１,８-オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-３-[(ｐ-アジドフェニル)-ジチオ］プロピオイミダート等の試薬が含まれる。
他の修飾には、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチル残基への脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman ＆ Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【０１２４】
本ＧＤＭポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、抗体又はポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。ここで意図される「天然グリコシル化パターンの変更」とは、天然配列に見られる一又は複数の炭水化物部分を欠失させること（内在するグリコシル化部位を取り除くことによって、又は化学及び／又は酵素的手法でグリコシル化を欠失させることのいずれか）、及び／又は対応する天然配列に存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。更には、この語句には、存在する種々の炭水化物部分の性質及び特性の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化における定性的な変化が含まれる。
抗体及び他のポリペプチドのグリコシル化とは、典型的にはＮ-結合又はＯ-結合のいずれかである。Ｎ-結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付与を指す。トリペプチドは、Ｘがプロリンを除く任意のアミノ酸である、アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニンの配列であり、アスパラギン側鎖への炭水化物部分が酵素的に付与される認識部位である。従って、ポリペプチドのこれらトリペプチド配列のいずれかの存在によって、潜在的なグリコシル化部位が作り出される。Ｏ-結合グリコシル化とは、５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンも用いられるが、殆どの場合にはセリン又はスレオニンへＮ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースのうちの一つの糖をヒドロキシアミノ酸へ付与することを指す。
グリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を改変して、それが上記に記載のトリペプチド配列（Ｎ-結合グリコシル化部位について）の一つ又は複数を含むようにすることによって簡便に完遂できる。この改変は、また、最初のそのような抗体又はポリペプチドの配列へ一つ又は複数のセリン又はスレオニン残基を付加、又は置換することによって生成される（Ｏ-結合グリコシル化部位について）。そのような抗体又はポリペプチド配列は、ＤＮＡレベルでの変化を通して、特に、コドンが所望するアミノ酸へ翻訳される、あらかじめ選択した塩基での前述のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを変異させることによって、場合によっては改変され得る。
【０１２５】
炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。そのような方法は、この技術分野において、例えば、１９８７年９月１１日に発行された国際公開８７／０５３３０、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。
炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Hakimuddin等, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)によって、そしてEdge等, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)によって記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura等, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
共有結合的修飾の他の型は、種々の非タンパク質様ポリマーの１つ、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンへ、米国特許第４６４０８３５号；第４４９６６８９号；第４３０１１４４号；第４６７０４１７号；第４７９１１９２号又は第４１７９３３７号に記載された方法で結合させることをを含む。また、ＧＤＭポリペプチドは、例えばコアセルベーション法によって又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセル）に、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルションで捕捉することができる。このような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences, １６版, A. Oslo編(1980)に開示されている。
ＧＤＭポリペプチドの、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列との融合に起因するキメラ分子を形成する修飾の、本発明への使用を考慮する。
【０１２６】
一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとＧＤＭポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的にはそのような抗体又はポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このような抗体又はポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってそのような抗体又はポリペプチドを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（ポリ-His）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（poly-his-gly）タグ；flu HAタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（gD）タグ及びその抗体［Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド［Hopp等, BioTechnology, 6:1204１−７0 (1988)］；ＫＴ３エピトープペプチド［Martin等, Science, 255:192-194 (1992)］；α-チューブリンエピトープペプチド［Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)］を含む。
それに換わる実施態様では、キメラ分子はＧＤＭポリペプチドの免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態（「イムノアドヘシン」とも呼ばれる）については、そのような融合体はＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。Ｉｇ融合体は、好ましくはＩｇ分子内の少なくとも１つの可変領域に換えて前述の抗体又はポリペプチドの可溶化（膜貫通ドメイン欠失又は不活性化）形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧ分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、１９９５年６月２７日発行の米国特許第５４２８１３０号を参照のこと。
【０１２７】
Ｈ．ＧＤＭポリペプチドの調製
以下の説明は、主として、このような抗体、ポリペプチド及びオリゴペプチドをコードする核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりＧＤＭポリペプチドを産生させる方法に関する。勿論、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてこのような抗体、ポリペプチド及びオリゴペプチドを調製することができると考えられている。例えば、適切なアミノ酸配列、又はその一部分を、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生成してもよい［例えば、Stewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., サン フランシスコ, カリフォルニア(1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照］。手動技術又は自動を使用することによってインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機（フォスター  シティー, カリフォルニア）を用いて、製造者の指示によって実施してもよい。このような抗体、ポリペプチド又はオリゴペプチドの種々の部分を別々に化学的に合成し、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて所望の生成物を生成してもよい。
【０１２８】
１．ＧＤＭポリペプチドをコードするＤＮＡの単離
ＧＤＭポリペプチドをコードするＤＮＡは、そのような抗体、ポリペプチド又はオリゴペプチドｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから得ることができる。従って、このようなポリペプチドをコードするＤＮＡは、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリ、ゲノムライブラリ又は公知の合成方法（例えば、自動核酸合成）から簡便に得ることができる。
ライブラリは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(少なくとも約２０-８０塩基のオリゴヌクレオチド等)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリのスクリーニングは、例えばSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。別法として、ＰＣＲ法を使用することができる［Sambrook等,上掲；Dieffenbach等, PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)］。
【０１２９】
ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするための技術は、当該分野で良く知られている。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、疑陽性が最小化されるよう十分な長さであり、十分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリ内のＤＮＡとのハイブリダイゼーション時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、３２Ｐ標識ＡＴＰのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用を含む。中程度のストリンジェンシー及び高度のストリンジェンシーを含むハイブリダイゼーション条件は、上掲のSambrookら，に示されている。
このようなライブラリスクリーニング法において同定された配列は、GenBankらの公共データベース又は他の個人の配列データベースに寄託され利用可能となっている他の周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決定された領域内の又は完全長配列に渡っての（アミノ酸又はヌクレオチドレベルのいずれかでの）配列同一性は、当該分野で知られた、及びここに記載した方法を用いて決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されていないｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrook等に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用して、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリをスクリーニングすることによって得られる。
【０１３０】
２．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したＧＤＭポリペプチド生成のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコル、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及び上掲のSambrook等に見出すことができる。
真核生物細胞形質移入及び原核生物細胞形質転換の方法、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shaw等, Gene, 23:315(1983)及び１９８９年６月２９日公開の国際公開８９／０５８５９に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が用いられる。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van Solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【０１３１】
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物には、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性微生物、例えば大腸菌のような腸内細菌科が含まれる。種々の大腸菌株が公に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）；大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）；大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）及びＫ５７７２（ＡＴＣＣ５３６３５）である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌属、例えば大腸菌（E. coli）、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えばネズミチフス菌(Salmonella Typhimurium）、セラチア、例えばセラチア・マルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバチルス・スブチルス(B. subtilis)及びバチルス・リチェニフォルミス(B. licheniformis)（例えば、１９８９年４月１２日発行のＤＤ２６６７１０に記載されたバチルス・リチェニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス、例えば緑膿菌及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生成物発酵のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０を、宿主にとって内因性のタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子変異をもたらすように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  （ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｋａｎrを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ  ５５，２４４）；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  (ａｒｇＦ-ｌａｃ)１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｒｂｓ７  ｉｌｖＧ  ｋａｎrを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び１９９０年８月７日発行の米国特許第４９４６７８３号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が好ましい。
【０１３２】
完全長抗体、抗体断片、及び抗体融合タンパク質は、治療用の抗体が細胞傷害剤（例えば、毒素）と結合し、その免疫コンジュゲートそのものが腫瘍細胞の破壊において有効性を示す場合など、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要ない場合に、細菌で産生させることができる。完全長抗体は、血液循環でより長い半減期を有する。大腸菌での産生が、より迅速でより費用効率的である。細菌での抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号（Carter等）、米国特許第５７８９１９９号（Joly等）、及び翻訳開始部位（ＴＩＲ）及び発現と分泌を最適化するシグナル配列を記載している米国特許第５８４０５２３号（Simmons等）を参照のこと。これら特許は、ここに参考文献として取り入れられている。発現の後、抗体は、大腸菌細胞ペーストから可溶性分画へ分離し、例えば、アイソタイプによってプロテインＡ又はＧカラムを介して精製することができる。最終精製は、例えば、適切な細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）で発現させた抗体を精製するための工程と同じようにして行うことができる。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＧＤＭポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)（Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981]; １９８５年５月２日公開の欧州特許第１３９３８３号）；クリュイベロミセス宿主(Kluyveromyces hosts)（米国特許第４９４３５２９号; Fleer等, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)）、例えばクリュイベロミセスラクチス(K. lactis)（MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt等, J. Bacteriol., 154(2): 737-742 [1983]）、クリュイベロミセス・フラギリス(K. fragilis)（ＡＴＣＣ１２４２４）、クリュイベロミセス・ブルガリクス(K. bulgaricus)（ＡＴＣＣ１６０４５）、クリュイベロミセス・ウィケラミイ(K. wickeramii)（ＡＴＣＣ２４１７８）、クリュイベロミセス・ワルチイ(K. waltii)（ＡＴＣＣ５６５００）、クリュイベロミセス・ドロソフィラルム(K. drosophilarum)（ＡＴＣＣ３６９０６； Van den Berg等, Bio/Technology, 8: 135 (1990)）、クリュイベロミセス・テモトレランス(K. thermotolerans)及びクリュイベロミセス・マルキシアナス(K. marxianus)；ヤロウィア(yarrowia)（欧州特許第４０２２２６号）；ピシア・パストリス(Pichia pastoris)（欧州特許第１８３０７０号； Sreekrishna等, J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988]）；カンジダ；トリコデルマ・レーシア(Trichoderma reesia)（欧州特許第２４４２３４号）；アカパンカビ（Case等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]）；シュワニオマイセス(Schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)（１９９０年１０月３１日公開の欧州特許第３９４５３８号）；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)（１９９１年１月１０日公開の国際公開９１／００３５７）；及びアスペルギルス宿主、例えばアスペルギルス・ニダランス（Ballance等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburn等, Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]）及びアスペルギルス・ニガー（Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985]）が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック(Ｃ１化合物資化性、Methylotropic)酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピシア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されたメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。
【０１３３】
グリコシル化ＧＤＭポリペプチドの発現に適した宿主細胞は、多細胞生物から由来のものである。非脊椎動物細胞の例には、植物細胞、例えば綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト及びタバコの細胞培養と同様に、ショウジョウバエＳ２及びヨトウ(spodoptera)Ｓｆ９等の昆虫細胞が含まれる。多くのバキュロウイルス株及び変異体、及びヨトウガ(Spodoptera frugiperda)(幼虫(caterpillar))、ネッタイシマカ(蚊)、ヒトスジシマカ(蚊)、キイロショウジョウバエ(ショウジョウバエ)、及びカイコ等の宿主に対応する許容性昆虫宿主細胞が同定されている。種々のトランスフェクション用のウイルス株、例えばオートグラファ・カルフォルニカ(Autographa californica)ＮＰＶのＬ−１変異株、カイコＮＰＶのＢｍ-５株が公に入手でき、このようなウイルスは、本発明に係るウイルスとして、特に、ヨトウガ細胞のトランスフェクションのために使用してもよい。
しかし、最大の関心は脊椎動物細胞に向けられ、培養(組織培養)した脊椎動物細胞の増殖がルーチン作業となった。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０(ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１)で形質転換させたサル腎ＣＶ１細胞株；ヒト胚芽腎細胞株(２９３又は懸濁培養で成長するようにサブクローン化された２９３細胞，Graham等,J.Gen Virol.,36:59 (1977))；ベビーハムスター腎細胞(ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ，Urlaub等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216 (1980));マウスセルトリ細胞(ＴＭ４，Mather,Biol.Reprod.,23：243-251 (1980))；サル腎細胞(ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０)；アフリカミドリザル腎細胞(ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト頚管腫瘍細胞(ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ２)；イヌ腎細胞(ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４)；バッファローラット肝細胞(ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２)；ヒト肺細胞(Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５)；ヒト肝細胞(Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５)；マウス乳房腫瘍細胞(ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68 (1982))；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝臓癌細胞（ＨｅｐＧ２）である。
宿主細胞は、ＧＤＭポリペプチド生成のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘発し、形質転換体を選出し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切に修正した通常の栄養培地で培養される。
【０１３４】
３．複製可能なベクターの選択及び使用
対応するＧＤＭポリペプチドをコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、クローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
ＧＤＭポリペプチドは直接的に組換え手法によって生成されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生成される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入される成熟配列をコードするＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクリュイベロミセス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第５，０１０，１８２号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、カンジダ・アルビカンス(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(１９９０年４月４日発行の欧州特許第３６２１７９号)、又は１９９０年１１月１５日に公開された国際公開９０／１３６４６に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【０１３５】
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスについてよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードしており、例えばバシリのＤ-アラニンラセマーゼをコードする遺伝子がある。
【０１３６】
哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、所望のタンパク質をコードする核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979)；Kingsman等, Gene, 7：141(1979)；Tschemper等, Gene, 10：157(1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファンで成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Jones, Genetics, 85:12 (1977)］。
発現及びクローニングベクターは、通常、所望のアミノ酸配列をコードする核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を方向付けるプロモーターを含む。種々の有能な宿主細胞により認識されるプロモーターが知られている。原核生物宿主との使用に適したプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Chang等, Nature, 275:615 (1978)； Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); 欧州特許第３６，７７６号］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［deBoer等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)］を含む。細菌系で使用するプロモーターもまた所望のタンパク質配列をコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
【０１３７】
酵母宿主との使用に適したプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ［Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他の糖分解酵素［Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17：4900(1978)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモーターは欧州特許第７３６５７号に更に記載されている。
【０１３８】
哺乳動物の宿主細胞におけるＤＮＡの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、伝染性上皮腫ウイルス(１９８９年７月５日公開の英国特許第２２１１５０４号)、アデノウイルス(例えばアデノウイルス２)、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びサルウイルス４０(SV40)のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
ＧＤＭポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製開始点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、前述のアミノ酸配列のコード化配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位に位置している。
【０１３９】
また真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウイルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、ここに記載する対応する抗体、ポリペプチド、又はオリゴペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養での抗体、ポリペプチド又はオリゴペプチドそれぞれの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (1981); Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979); 欧州特許第１１７０６０号；及び欧州特許第１１７０５８号に記載されている。
【０１４０】
４．宿主細胞の培養
本発明のＧＤＭポリペプチドを生成するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ham)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地((MEM),シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((DMEM),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国特許再発行第３０９８５号に記載された任意の培地も宿主細胞に対する培養培地として使用できる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオシド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシン（商品名）薬)、微量元素(マイクロモル範囲の最終濃度で通常は存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含まれてもよい。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【０１４１】
５．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリダイゼーションによって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。ついで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果、表面での二本鎖の形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量化する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、本方法に適した抗体は、天然配列ポリペプチド又はオリゴペプチドに対して、又はＤＮＡに融合し、そのようなポリペプチド又はオリゴペプチドの特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【０１４２】
６．タンパク質の精製
ＧＤＭポリペプチドは、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-Ｘ１００)を用いて又は酵素的切断により膜から引き離すことができる。前述したものの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
前述のものは、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。次の手順は、適切な精製手順の例である。すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過；ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及び所望の分子のエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生成方法及び請求の範囲に規定される方法のために特に生成される抗体、ポリペプチド又はオリゴペプチドの性質に依存する。
【０１４３】
組換え技術を使用する場合、ＧＤＭポリペプチドは細胞内、細胞膜周辺腔内に生成されるか、又は培地に直接分泌され得る。このような分子が細胞内に生成される場合、第１工程として、粒状屑、宿主細胞又は溶菌断片を、例えば遠心分離又は超遠心分離にかけて取り除く。Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992)は、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離するための手順について記載している。簡単に述べると、細胞ペーストを酢酸ナトリウム(ｐＨ３．５)、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフロリド(ＰＭＳＦ)の存在下で、３０分以上かけて解凍する。細胞屑は遠心分離により除去することができる。抗体が培地へ分泌されている場合、そのような発現系からの上清は、一般的には、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばAmicon又はMillipore Pelliconの限外濾過ユニットを用いて最初に濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めてタンパク質分解を阻害してもよく、抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
精製は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて行うことができ、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティリガンドとしてのプロテインＡの適合性は抗体に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる（Lindmark等, J. Immunol. Meth. 62: 1-13 [1983]）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている（Guss等, EMBO J. 5: 15671575 [1986]）。アフィニティリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Bakerbond ABX(商標)樹脂（J.T. Baker, Phillipsburg, NJ）が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラム）上でのヘパリンSEPHAROSE(商品名)クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿などの他のタンパク質精製技術も、回収される抗体に応じて利用可能である。
任意の予備精製工程に続いて、対象とする抗体と汚染物とを含む混合物に、約２．５−４．５のｐＨでの溶離バッファーを用いて、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーを施してもよく、好ましくは低い塩濃度（例えば、約０−０．２５Ｍ塩）で実施される。
【０１４４】
Ｉ．製薬製剤
本発明により使用されるＧＤＭアンタゴニスト（「治療薬」）の治療的製剤は、所望される程度の純度を持つ治療薬を、凍結乾燥製剤又は水性溶液の形態で、最適な製薬上許容される担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより調製され保存される（Remington's Pharmaceutical Science of Pharmacy, 20版, Gennaro, A.等、Ed., Philadelphia Coolege of Pharmacy and Science (2000)）。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、酢酸、Ｔｒｉｓ、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンズアルコニウムクロライド、ベンズエトニウムクロライド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；トレハロース及び塩化ナトリウムなどのトニシファイヤー；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ポリソルベート等の界面活性剤；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体）；及び／又はトゥイーン(TWEEN)（登録商標）、プルロニクス(PLURONICS)（登録商標）、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。抗体は、好ましくは５−２００ｍｇ／ｍｌの間、好ましくは１０−１００ｍｇ／ｍｌの間の濃度の抗体で構成される。
【０１４５】
ここでの製剤は、また、治療すべき特定の徴候の必要に応じて一以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。例えば、前述の治療薬に加えて、製剤に、例えば、そのような第二の薬剤、又は神経膠腫の成長に影響を与える成長因子のような何らかの他の標的に対する抗体を含めることは望ましい。あるいは、又はさらに、この組成物は、更に化学療法剤、細胞傷害性剤、サイトカイン、成長阻害剤、抗-ホルモン剤、及び／又は心臓保護剤を含んでもよい。このような分子は、意図する目的にとって有効な量の組み合わせで適切に存在する。
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Science of Pharmacy、上掲に開示されている。
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール））、ポリアクチド（米国特許第３７７３９１９号）、Ｌ-グルタミン酸及びγエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(登録商標)（乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球）などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、ポリ-(Ｄ)-（-）-３-ヒドロキシブチル酸が含まれる。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
【０１４６】
Ｊ．ＧＤＭアンタゴニストを用いる診断及び治療
神経膠腫におけるＧＤＭ発現を定量するために、種々の診断アッセイが利用可能である。一実施態様では、ＧＤＭポリペプチド過剰発現は、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって分析される。腫瘍生検からのパラフィン包埋組織切片をＩＨＣアッセイへ供してもよいし、次のようなＧＤＭタンパク質染色強度基準と合致させてもよい：
スコア０ - 染色が観察されないか、又は膜染色が腫瘍細胞の１０％未満で観察される。
スコア１＋ - わずかに／弱く認知できる程度の膜染色が腫瘍細胞の１０％を越えて検出される。細胞はそれらの膜の一部のみが染色される。
スコア２＋ - 弱いないしは中程度の完全な膜染色が腫瘍細胞の１０％を越えて観察される。
スコア３＋ - 中程度から強い完全な膜染色が腫瘍細胞の１０％を越えて観察される。
ＧＤＭポリペプチド発現に関して０又は１＋スコアの腫瘍は、ＧＤＭが過剰発現していないことを特徴としうるものであるのに対し、２＋又は３＋スコアの腫瘍はＧＤＭが過剰発現していることを特徴としうる。
【０１４７】
別に、又は付加的に、ＦＩＳＨアッセイ、例えばＩＮＦＯＲＭ（登録商標）(Ventana, Arizonaから販売)又はＰＡＴＨＶＩＳＩＯＮ（登録商標）(Vysis, Illinois)を、ホルマリン固定、パラフィン包埋された腫瘍組織で実施して、腫瘍におけるＧＤＭ過剰発現の程度(生じているならば)を測定してもよい。
ＧＤＭ過剰発現又は増幅は、インビボ診断アッセイを使用して評価することができ、例えば検出される分子に結合し、検出可能な標識(例えば、放射性同位体又は蛍光標識)が付けられた分子(例えば抗体、オリゴペプチド又は有機分子)を投与し、標識の局在化について患者を外部スキャニングする。
【０１４８】
現在、癌の段階に応じて、癌の治療には、次の治療：外科手術による癌組織の除去、放射線治療、及び化学治療の一つ、又はそれらを組合せたものが含まれる。ＧＤＭアンタゴニストの投与を含む治療は、特に、化学治療における副作用や毒素に対する耐性がない老年の患者、及び放射線治療の有用性に限界がある転移性疾患において所望されている。本発明の方法のＧＤＭアンタゴニストを標的とする腫瘍はまた、疾患の初期診断時及び再発中の、ＧＤＭ-発現癌の緩和に使用できる。治療用途に関しては、このようなＧＤＭアンタゴニストは、神経膠腫に用いられる他の従来の薬剤及び／又は方法の適用前又は後に、例えば、ホルモン、抗血管形成、又は放射標識された化合物と共に、又は外科手術、寒冷療法、放射線治療及び／又は化学療法と組み合わせて使用してもよい。化学療法剤、例えばタキソテレ(登録商標)(ドセタキセル)、タキソール(登録商標)(パリクタキセル)、エストラムスチン及びミトキサントロンは、癌、特に危険性の少ない患者の癌治療に使用される。
特に、パリクタキセル及び改変誘導体との組合せ治療が考えられる(例えば、欧州特許第０６００５１７号を参照のこと)。前述の抗体、ポリペプチド、オリゴペプチド又は有機分子は治療的有効量の化学療法剤と共に投与されるであろう。他の実施態様では、そのような抗体、ポリペプチド、オリゴペプチド又は有機分子は化学療法剤、例えばパクリタキセルの活性及び効力を高めるための化学治療と組合せて投与される。医師用卓上参考書(ＰＤＲ)には、種々の癌治療に使用されるこれらの薬剤の用量が開示されている。治療的に有効な上述の化学療法剤の投薬計画及び用量は、治療される特定の癌、疾患の程度、及び当該技術分野の医師によく知られている他の因子に依存し、医師が決定することができる。
【０１４９】
特定の一実施態様では、細胞傷害剤に結合したこのようなＧＤＭアンタゴニストを含有する免疫コンジュゲートを患者に投与する。好ましくは、このような免疫コンジュゲートは細胞によりインターナリゼーションし、結果として、それが結合した癌細胞の殺傷性における免疫コンジュゲートの治療的効果が向上する。好ましい実施態様では、細胞傷害剤は、癌細胞内の核酸を標的とするか、又はこれに干渉する。このような細胞傷害剤の例は、上述されており、メイタンシノイド、カリケアマイシン、リボヌクレアーゼ及びＤＮＡエンドヌクレアーゼを含む。
前述のＧＤＭアンタゴニスト又はその毒素抱合体は、公知の方法、例えばボーラス、もしくは一定時間にわたる連続注入による静脈内投与、頭蓋内、脳脊髄内、関節内、くも膜下腔内、静脈内、動脈内、皮下、経口、局所的、又は吸入経路により、ヒトの患者に投与される。
【０１５０】
他の治療計画を前述のＧＤＭアンタゴニストの投与と組合せてもよい。組合せ投与には、別々の製剤又は単一の医薬製剤を使用する同時投与、及び好ましくは両方(又は全ての)活性剤が同時にその生物学的活性を働かせる時間があるいずれかの順での連続投与が含まれる。このような組合せ治療により、結果として相乗的治療効果が生じることが好ましい。
他の実施態様では、本発明の治療方法は、異なる化学療法剤の混合物の同時投与を含む、上記ＧＤＭアンタゴニストと一又は複数の化学療法剤又は成長阻害剤との組合せ投与を含む。化学療法剤の例は前記した。このような化学療法剤の調製及び投与スケジュールは製造者の注意書きに従い使用されるか、又は熟練した実務者により経験的に決定される。このような化学療法の調製及び投与スケジュールは、Chemotherapy Service編 M.C.Perry, Williams ＆ Wilkins, Baltimore, MD(1992)にも記載されている。
【０１５１】
疾患の予防又は治療のための投与量及び方式は、公知の基準に従い、医師により選択されるであろう。ＧＤＭアンタゴニストの適切な用量は、治療される疾患の種類、疾患の重症度及び過程、投与の目的が予防なのか治療なのか、過去の治療、患者の臨床歴及び応答性（を含む）、手当てをする医師の裁量に依存するであろう。前述のＧＤＭアンタゴニストは、一度に又は一連の処置にわたって患者に適切に投与される。投与は、静脈注入又は皮下注射により行われる。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一又は複数の別個の投与又は連続注入のいずれであれ、体重１ｋｇ当たり約１μｇないし５０ｍｇ(例えば０．１−１５ｍｇ／ｋｇ／用量)のＧＤＭアンタゴニストを患者への最初の投与量の候補とすることができる。投薬計画は、約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷量、続いて１週間に約２ｍｇ／ｋｇの維持用量のＧＤＭアンタゴニストを投与することからなってよい。しかしながら、他の投薬計画も有効であろう。上述した因子に応じて、典型的な一日の投与量は約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇあるいはそれ以上の範囲である。数日間又はそれ以上の繰り返し投与の場合、状態によっては、疾患の徴候の望ましい抑制が生じるまで処置を維持する。この治療の進行状態は、医師又は他の当業者に公知の基準をベースにした通常の方法やアッセイで容易にモニターされる。
抗体タンパク質の患者への投与の他に、本出願は遺伝子治療による抗体の投与を考察する。ＧＤＭアンタゴニストをコードする核酸の投与は「抗体を治療的有効量で投与する」という表現に含まれる。例えば、遺伝子治療を用いた細胞内抗体の産生に関する、１９９６年３月１４日に公開された国際公開第９６／０７３２１号を参照のこと。
【０１５２】
核酸（場合によってはベクター内に含まれたもの）を患者の細胞に入れるために：インビボ及びエキソビボという２つの主要な方法がある。インビボ送達では、核酸は、通常は抗体が必要とされている部位に直接注入される。エキソビボ処理では、患者の細胞を取り出し、核酸をこれらの単離された細胞に導入し、修飾された細胞を患者に、直接、又は例えば患者に埋め込まれる多孔性膜にカプセル化して投与する（米国特許第４８９２５３８号及び第５２８３１８７号参照）。核酸を生細胞に導入するために利用可能な種々の技術がある。これらの技術は、核酸が培養された細胞にインビトロで移入されるか、又は対象とする宿主にインビボで移入されるかによって異なる。哺乳動物細胞にインビトロで核酸を移入するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などの使用を含む。遺伝子のエキソビボ送達に通常用いられるベクターはレトロウイルスベクターである。
現在好まれているインビボ核酸移入技術は、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ関連ウイルス）、及び脂質ベースの系（例えば、遺伝子の脂質媒介移入に有用な脂質は、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ-Ｃｈｏｌである）での形質移入を含む。現在知られている遺伝子マーキング及び遺伝子治療プロトコルの概説については、Anderson等, Science, 256:808-813 (1992)を参照のこと。また、国際公開第９３／２５６７３号及びそこに引用された参考文献も参照。
【０１５３】
Ｋ．製造品及びキット
治療に使用するために、本製造品は、容器と、神経膠腫の治療に使用できることを示す、容器に付与又は添付されるラベル又はパッケージ挿入物を含んでなる。好適な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等を含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどの多様な材料から形成されてよい。容器は、癌の状態の治療に有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも一つの活性剤はＧＤＭアンタゴニストである。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が癌の治療のために使用されることを示す。ラベル又はパッケージ挿入物は、癌患者に抗体、オリゴペプチド又は有機分子組成物を投与する際の注意書きをさらに含む。製造品はさらに、製薬的に許容可能なバッファー、例えば注射用の静菌水(ＢＷＦＩ)、リン酸緩衝塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第２の容器を具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
種々の他の目的、例えばＧＤＭ発現細胞殺傷アッセイ、細胞からのＧＤＭポリペプチドの精製又は免疫沈降に有用なキットも提供される。ＧＤＭポリペプチドの単離及び精製において、キットは、ビーズ(例えばセファロースビーズ)に結合した対応するＧＤＭ結合試薬を含むことが可能である。インビトロにおけるＧＤＭポリペプチドの検出及び定量化、例えばＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロットのためのそのような分子を含むキットを提供することもできる。製造品と同様、キットも容器と容器に付与又は添付されるラベル又は能書を含んでなる。容器には、本発明に使用できる少なくとも１つのそのようなＧＤＭ結合抗体、オリゴペプチド又は有機分子を含有する組成物が収容されている。希釈液及びバッファー、コントロール抗体等を収容する付加的な容器を具備していてもよい。ラベル又は能書は、組成物についての記載、並びに意図するインビトロ又は診断での使用に関する注意書きを提供するものである。
【０１５４】
Ｌ．センス及びアンチセンスＧＤＭ-コード核酸
ＧＤＭアンタゴニストは、アンチセンス又は及びオリゴヌクレオチド等のＧＤＭコード核酸の断片を含み、これには、標的ＧＤＭ ｍＲＮＡ（センス）又はＧＤＭ ＤＮＡ（アンチセンス）配列と結合できる一本鎖核酸配列（ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか）が含まれる。本発明によると、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、対応するＧＤＭ ＤＮＡのコード化領域の断片を含む。与えられたタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づいて、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを得る能力は、例えば、Stein及びCohen（Cancer Res. 48:2659, 1988）及び van der Krol等（BioTechniques 6:958, 1988）に記載されている。
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は二重鎖の形成をもたらし、それは、二重鎖の分解の促進、転写又は翻訳の未熟終止を含む幾つかの方法の一つ、又は他の方法により、標的配列の転写又は翻訳を阻止する。そのような方法は、本発明に含まれている。よって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＧＤＭタンパク質の発現を阻止するのに用いられ、それらＧＤＭタンパク質は、哺乳動物での癌の誘導を担い得る。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、修飾糖−ホスホジエステル骨格（又は他の糖結合、国際公開９１／０６６２９に記載のもの等）を有するオリゴヌクレオチドを更に含み、そのような糖結合は内因性ヌクレアーゼ耐性である。そのような耐性糖結合を持つオリゴヌクレオチドは、インビボで安定である（つまり、酵素分解に耐えうる）が、標的ヌクレオチド配列に結合できる配列特異性は保持している。
【０１５５】
本発明において使用されるアンチセンス化合物は固相合成のよく知られた技術によって簡便かつ常套的に製造することができる。そのような合成のための装置は、例えばApplied Biosystems (Foster City, Calif.)を含む幾つかのメーカーによって販売されている。当該分野で知られているそのような合成のための任意の他の手段を付加的に又は別に使用してもよい。オリゴヌクレオチド、例えばホスホロチオネート及びアルキル化誘導体を調製するために類似の技術を使用することはよく知られている。本発明の化合物は、また、取り込み、分散及び／又は吸収を補助するための他の分子、分子構造又は化合物混合物、例えばリポソーム、レセプター標的分子、経口、直腸、局所適用又は他の製剤と、混合、カプセル化、コンジュゲート又はその他、組み合わされてもよい。取り込み、分散及び／又は吸収を補助する製剤の調製を教示する代表的な米国特許には、限定されるものではないが、米国特許第５１０８９２１；５３５４８４４；５４１６０１６；５４５９１２７；５５２１２９１；５５４３１５８；５５４７９３２；５５８３０２０；５５９１７２１；４４２６３３０；４５３４８９９；５０１３５５６；５１０８９２１；５２１３８０４；５２２７１７０；５２６４２２１；５３５６６３３；５３９５６１９；５４１６０１６；５４１７９７８；５４６２８５４；５４６９８５４；５５１２２９５；５５２７５２８；５５３４２５９；５５４３１５２；５５５６９４８；５５８０５７５；及び５５９５７５６が含まれ、これらのそれぞれが出典明示によりここに取り込まれる。
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例は、国際公開９０／１００４８に記載されているもののような、有機部分、及びオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への親和性を向上させる他の部分、例えばポリ-(Ｌ-リジン)に共有結合したオリゴヌクレオチドを含む。さらにまた、エリプチシン等の挿入剤及びアルキル化剤又は金属錯体をセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させ、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列への結合特異性を改変してもよい。
【０１５６】
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＣａＰＯ４-媒介ＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーションを含む任意の遺伝子転換方法により、又はエプスタイン-バーウイルスなどの遺伝子転換ベクターを用いることにより、標的核酸配列を含む細胞に導入される。好ましい方法では、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、適切なレトロウイルスベクターに挿入される。標的核酸配列を含む細胞は、インビボ又はエキソビボで組換えレトロウイルスベクターに接触させる。好適なレトロウイルスベクターは、これらに限られないが、マウスレトロウイルスＭ-ＭｕＬＶから誘導されるもの、Ｎ２（Ｍ-ＭｕＬＶから誘導されたレトロウイルス）、又はＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５Ｂ及びＤＣＴ５Ｃと命名されたダブルコピーベクター（国際公開９０／１３６４１参照）を含む。
また、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、国際公開９１／０４７５３に記載されているように、リガンド結合分子との複合体の形成により標的ヌクレオチド配列を含む細胞に導入してもよい。適切なリガンド結合分子は、これらに限られないが、細胞表面レセプター、成長因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプターに結合する他のリガンドを含む。好ましくは、リガンド結合分子の複合体形成は、リガンド結合分子がその対応する分子又はレセプターに結合する、あるいはセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその複合体の細胞への侵入を阻止する能力を実質的に阻害しない。
【０１５７】
あるいは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、国際公開９０／１０４４８に記載されたように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成により標的核酸配列を含む細胞に導入してもよい。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは内因性リパーゼにより細胞内で分解される。
アンチセンス又はセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、通常は少なくとも約５ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、又は１０００ヌクレオチド長であり、この文脈の「約」という用語は、参照ヌクレオチド配列長にその参照長の１０％を加えるか又は減じたものを意味する。
【０１５８】
Ｍ．ＧＤＭアンタゴニストの同定に使用されるスクリーニングアッセイ
このアッセイは、タンパク質-タンパク質結合アッセイ、生化学スクリーニングアッセイ、免疫アッセイ、そして細胞ベースアッセイを含む、当該分野で良く特徴付けられている種々の形式で行うことができる。
アンタゴニストに関する全てのアッセイは、薬候補をここで同定された核酸によってコードされているＧＤＭポリペプチドと、これら両成分が相互作用するのに十分な条件下及び時間にわたって接触させることを必要とする点で共通である。
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出される。特別な実施態様では、ここに同定された遺伝子にコードされるＧＤＭポリペプチド又は薬候補が、共有又は非共有結合により固相、例えばマイクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に固体表面をＧＤＭポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化すべきＧＤＭポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体の使用によって検出できる。
【０１５９】
候補化合物が相互作用するがここに同定した遺伝子によってコードされる特定のＧＤＭポリペプチドと結合しない場合、そのポリペプチドとの相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために良く知られた方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィーのカラムを通す同時精製などの伝統的な手法を含む。さらに、タンパク質-タンパク質相互作用は、Chevray及びNathans Proc.Natl. Acad. Sci. USA,89:5789-5793 (1991)に開示されているようにして、Fields及び共同研究者等［Fiels及びSong, Nature(London),340,:245-246(1989); Chien等, Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991)］に記載された酵母菌ベースの遺伝子系を用いることにより監視することができる。酵母菌ＧＡＬ４などの多くの転写活性化剤は、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。以前の文献に記載された酵母菌発現系（一般に「２-ハイブリッド系」と呼ばれる）は、この特性の長所を利用して、２つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合し、他方では、候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。ＧＡＬ１-ｌａｃＺリポーター遺伝子のＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β-ガラクトシダーゼに対する色素生産性物質で検出される。２-ハイブリッド技術を用いた２つの特定なタンパク質間のタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための完全なキット（MATCHMAKER(商品名)）は、Clontechから商業的に入手可能である。この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこの相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張することができる。
【０１６０】
ここで同定されたＧＤＭポリペプチドをコードする遺伝子と他の細胞内又は細胞外成分との相互作用を阻害する化合物は、次のように試験できる：通常は反応混合物は、遺伝子産物と細胞内又は細胞外成分を、それら２つの生成物が相互作用及び結合する条件下及び時間で調製される。候補化合物の結合阻害能力を試験するために、反応は試験化合物の不存在及び存在下で実施される。さらに、プラシーボを第３の反応混合物に添加してポジティブコントロールを提供してもよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は細胞外成分との結合（複合体形成）は上記のように監視される。試験化合物を含有する反応混合物ではなくコントロール反応における複合体の形成は、試験化合物が試験化合物とその反応パートナーとの相互作用を阻害することを示す。
アンタゴニストを検定するために、ＧＤＭポリペプチドを、特定の活性についてスクリーニングされる化合物とともに細胞に添加してもよく、ＧＤＭポリペプチド存在下で対象とする活性を阻害する当該化合物の能力が、当該化合物がＧＤＭポリペプチドのアンタゴニストであることを示す。あるいは、アンタゴニストは、ＧＤＭポリペプチド及び潜在的アンタゴニストを、膜結合ＧＤＭポリペプチドレセプター又は組換えレセプターと、競合的阻害アッセイに適した条件下で結合させることにより検出してもよい。ＧＤＭポリペプチドは、放射活性等で標識でき、レセプターに結合したＧＤＭポリペプチド分子の数を潜在的アンタゴニストの有効性を決定するのに使用できる。レセプターをコードする遺伝子は、当業者に知られた多くの方法、例えばリガンドパニング及びＦＡＣＳソーティングにより同定できる。Coligan等, Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991)。好ましくは発現クローニングが用いられ、そこではポリアデニル化ＲＮＡがＧＤＭポリペプチドに反応性の細胞から調製され、このＲＮＡから生成されたｃＤＮＡライブラリがプールに分配され、ＣＯＳ細胞又は他のＧＤＭポリペプチドに反応性でない細胞の形質移入に使用される。スライドガラスで成長させた形質移入細胞を、標識したＧＤＭポリペプチドへ曝露する。ＧＤＭポリペプチドは、ヨウ素化又は部位特異的タンパク質キナーゼの認識部位の包含を含む種々の手段で標識できる。固定及びインキュベーションの後、スライドにオートラジオグラフ分析を施す。ポジティブプールを同定し、対話型サブプール化及び再スクリーニング法を用いてサブプールを調製して再形質移入し、最終的に推定レセプターをコードする単一のクローンを生成する。
【０１６１】
レセプター同定の代替的方法として、標識したＧＤＭポリペプチドをレセプター分子を発現する細胞膜又は抽出調製物に光親和性結合させることができる。架橋材料をＰＡＧＥで分離し、Ｘ線フィルムに曝す。レセプターを含む標識複合体を励起し、ペプチド断片に分離し、タンパク質マイクロシークエンシングを施してよい。マイクロシークエンシングから得たアミノ酸配列は、推定レセプターをコードする遺伝子を同定するｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするディジェネレートオリゴヌクレオチドプローブの組の設計に用いられる。
アンタゴニストの他の検定では、レセプターを発現する哺乳動物細胞又は膜調製物を、候補化合物の存在下で標識ＧＤＭポリペプチドとともにインキュベートする。次いで、この相互作用を促進又は阻止する化合物の能力を測定する。
潜在的なアンタゴニストのより特別な例は、免疫グロブリンとＧＤＭポリペプチドとの融合体に結合するオリゴヌクレオチド、特に、限られないが、ポリ-及びモノクローナル抗体及び抗体断片、一本鎖抗体、抗-イディオタイプ抗体、及びこれらの抗体又は断片のキメラ又はヒト化形態、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含んでいる。あるいは、潜在的アンタゴニストは、密接に関連したタンパク質、例えば、レセプターを認識するが効果を与えず、よってＧＤＭポリペプチドの作用を競合的に阻害するＧＤＭポリペプチドの変異形態であってもよい。
他の潜在的なＧＤＭポリペプチドアンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡコンストラクトであり、例えば、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡにハイブリダイゼーションしてタンパク質翻訳を妨害することによりｍＲＮＡの翻訳を直接阻止するように作用する。
【０１６２】
潜在的アンタゴニストは、ＧＤＭポリペプチドの活性部位、レセプター結合部位、又は成長因子又は他の関連結合部位に結合し、それによりＧＤＭポリペプチドの正常な生物学的活性を阻止する小分子を含む。小分子の例は、これらに限られないが、小型ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合成非ペプチド有機又は無機化合物を含む。
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリダイゼーション、次いでヌクレオチド鎖切断的開裂により作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、Rossi, Current Biology 4: 469-471 (1994)及びＰＣＴ公報、国際公開 ９７／３３５５１（１９９７年９月１８日公開）を参照。
転写阻害に用いられる三重螺旋形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスティン(Hoogsteen)塩基対則を介する三重螺旋形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンのかなり大きな伸張を必要とする。さらなる詳細は、例えば、上掲のＰＣＴ公報、国際公開９７／３３５５１を参照。
これらの小分子は、上記で議論したスクリーニングアッセイの一又は複数の任意のものにより及び／又は当業者に良く知られた他の任意のスクリーニング技術により同定できる。
【０１６３】
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
【実施例】
【０１６４】
実施例１：
実験手順
腫瘍試料と患者の特徴
全ての腫瘍を図８Ａにまとめた。生存分析のために、３つの発現プロファイリング用データセットを分析した。本発明者等が入手したのは、ＭＤＡにおける７６症例の凍結組織試料、ＵＣＳＦの３９症例のＲＮＡ（Nigro等、Cancer Res. 65:1678-1686 (2005)）、及びＵＣＬＡから出版されている研究のデータである。はじめの２つのデータセットのうち分析した症例は、以下の基準を満たすものであった。即ち、最初の外科的切除時に、放射線治療又は化学療法を受けた経歴を持たない患者（２２歳以上）から新鮮な凍結組織試料を採取した。手術後２年間又は生存中は臨床的追跡情報が入手可能であった。ＵＣＳＦ及びＭＤＡにおいてこれらのレトロスペクティブな実験室での研究のために、治験審査委員会／人体実験の承認を得た。症例は、ＷＨＯの基準に従ってＡＡ又はＧＢＭに類別し、全ての組織由来の切片を神経病理学者が検査することにより、試料の９０％以上が腫瘍を示すことを確認した。異常な組織学的変異は除外した。ＵＣＬＡのデータセットについては、公開されている研究から、患者年齢とマイクロアレイ品質管理パラメータについて本発明の基準を満たす全ての症例のデータを利用した。このデータセットには、オリゴデンドログリアの形態又は混合形態を有する症例と、検閲された生存期間が２年未満である症例が含まれていた。
健常な成人脳組織は、脳腫瘍又は神経障害の既往歴を持たないドナー由来の大脳皮質の剖検標本からなり、国立神経学的研究脳バンク（カリフォルニア州ロスアンゼルス）から取得したものであった。
腫瘍のグレードとシグネチャー分類を比較するため（図２Ａ）、臨床履歴が得られないものについて追加的試料標本を含めた。健常な成人脳組織は、脳腫瘍又は神経障害の既往歴を持たないドナー由来の大脳皮質の剖検標本からなり、国立神経学的研究脳バンク（カリフォルニア州ロスアンゼルス）から取得した。脳及び胎生期アストロサイトの標本を除き、図２Bにおいて分析した試料のデータは、ヒト試料のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘデータのＧｅｎｅ  Ｌｏｇｉｃ社（メリーランド州ゲーサーズバーグ）データベースの使用権により取得した。
【０１６５】
遺伝子発現プロファイリング、比較ゲノムハイブリダイゼーション、及び定量的ＰＣＲ
既知の出版物（Freije等、上掲; Nigro等、上掲）に含まれていない標本について、製造者のプロトコルに従ってＱｕｉｇｅｎのＲＮＡ単離キットを用いて腫瘍及び健常な脳標本の総細胞ＲＮＡを抽出した。オンカラムデオキシリボヌクレアーゼ消化ステップにより、ゲノムＤＮＡの汚染を取り除いた。文献に既知の技術（Tumor Analysis Best Practices Working, 2004）に従って、発現プロファイリングにＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ａ＆Ｂチップを用いた。品質管理パラメータはこの出版物に記載のものと同じであるが、例外として、ＧＡＰＤＨの３’／５’比が３未満であれば、試料はアクチンについて３を超える３’／５’比を示してもよいこととした。ＴａｑｍａｎのＰＣＲ  Ｃｏｒｅ試薬（Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティ）を用いて、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ７７００配列検出器（Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティ）上で、各試料について定量的ＰＣＲを２回ずつ行った。２５ｎｇの総ＲＮＡを各５０μｌの反応に使用した。多数の試料に亘って殆ど発現が変化しないので、Ｒａｂ１４を正規化に使用した。全てのプライマー対は、６７−７９ｂｐの単位複製配列を生成するように設計した。ＤＮＡ抽出及びアレイＣＧＨを上述のように実施した。Misra等、Clin. Cancer Res. 11(8): 2907-18 (2005)参照。ＣＧＨにより分析した９６の試料のうち、４３の標本のデータは公開されている既知の研究から取得した（Nigro等、上掲）。
【０１６６】
マイクロアレイデータの分析
マイクロアレイデータの全分析に、倍率５００でマイクロアレイ分析のＳｕｉｔｅバージョンにより得られたシグナル強度の値を使用した。類似性の基準としてピアソン相関を用いるＳｐｏｔｆｉｒｅ  Ｄｅｃｉｓｉｏｎ  Ｓｉｔｅソフトウエアのバージョン７．３を使用してＫ平均法によるクラスター形成及び塊状クラスター形成を実施した。各遺伝子について、クラスター形成の前にデータをＺスコアに正規化した。腫瘍の分類に使用した３５のシグネチャー遺伝子は、ＭＤＡの生存試料セットにおける３つの腫瘍サブセットの各々の、最も強いマーカーであった。各サブセットのマーカーは次のようにして同定した。即ち、生存と最も強い相関を示した１０８の遺伝子の発現のｋ平均法によるクラスター形成に基づいて、７６の試料の各々を３つのグループのうちの１つに割り当てた。１×１０−４のｐ値カットオフを使用し、ｔ検定を利用して、他のサブクラスの腫瘍と比較したとき、各サブクラスの試料間で異なって発現した全ての遺伝子を同定した（表Ａ、ＧＤＭ参照）。各比較回について、折り畳みの変化により最小ｐ値で５００のプローブセットに順位を付けた。各腫瘍サブタイプのシグネチャー遺伝子として使用したプローブセットは、最大の折り畳み変化を示し、且つ最小発現カットオフを満たした同定された完全長配列に対応するものであった（対象のグループ内で平均強度４００）。ｋ平均法によるクラスター形成を用いた実験の結果、クラスター形成の遺伝子リストにおいて３つの腫瘍サブタイプの１つのマーカーが他のサブタイプより少ない状態で均衡していれば、３０〜６０のプローブセットを使用してクラスター形成を実施すると、安定した試料クラスターが得られた。最終的な３５のシグネチャー遺伝子には、１５のＰＮ、１５のＭｅｓ、及び５のＰｒｏｌｉｆマーカーが含まれた。ＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ及びＭｅｓのセントロイドに対する類似性のスコアは、７６のＭＤＡ生存試料のｋ平均法によるクラスター形成において生成されるセントロイドの各々に対するＰｅａｒｓｏｎ相関係数を表わす。図４のＦ−Ｉ及び図７に示すデータの統計的な比較のため、複数のグループの比較を行うために修正されたｔ検定により、対数変換したデータを分析した。対数変換した発現データも、図５において実施された統計的分析に利用した。
【０１６７】
インサイツハイブリダイゼーション及び免疫組織化学
３３Ｐ−ＵＴＰで標識したアンチセンスリボプローブを、Ｐｒｏｍｅｇａ社のインビトロ転写システム（Promega、ウィスコンシン州マディソン）を用いて転写し、公開されている既知の方法を利用して（Phillips等、Science 250: 290-294 (1990)）多様な供給源から取得された、パラフィン包理ヒト神経膠腫組織マイクロアレイにハイブリダイズした。図１に示す画像はＰｅｔａｇｅｎ，Ｉｎｃ．から取得した組織マイクロアレイに含まれる組織のコアのものである。ＢＣＡＮに対するプローブは６６８ｂｐの断片（９３９〜１６０６）を示し、ＣＨＩ３Ｌ１／ＹＫＬ４０については１１５８ｂｐ断片（１２１〜１２７８）を示した。
上述のように、パラフィンに包理した切片に免疫組織化学を実施した（Simmons等、Cancer Res. 61: 1122-1128 (2001)）。一次抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（マサチューセッツ州ベバリー）の抗ｐ−ａｋｔ（ｓｅｒ４７３）及びＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（カリフォルニア州サンタクルーズ）の抗Ｎｏｔｃｈであった。評点は、分析した標本のシグネチャーグループに盲目の神経病理学者によって行われた。
【０１６８】
インビトロでの研究
上述のＧＢＭ細胞株を、インビトロでの研究に利用した（(Hartmann等、Internat. J. Oncol. 15: 975-982 (1999))。ニューロスフェア培養物とするために、一次ＧＢＭ標本について記載したように、ＣＤ１３３ビードによりポジティブに保存された細胞を培養液中に維持した（Singh等、Nature 432 396-401 (2004)）。全てのニューロスフェア培養物は、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｅｎ）及びＮＳＦ１（Ｃａｍｂｒｅｘ）を有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）中で維持した。存在すれば、ＥＧＦ及びＦＧＦを２０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した。ＥＧＦ＋ＦＧＦの不在下で、細胞株の分子シグネチャーに盲目な観察者により、ニューロスフェア増殖について各細胞株を評価した。評価のスケールは次の通りであった。即ち、０＝目視可能なニューロスフェアは無い、１＝ゆっくりと広がりつつあるニューロスフェア、２＝中程度の増殖速度、３＝中程度から速い増殖であるが、ＥＧＦ＋ＦＧＦに見られるものよりも遅い増殖、４＝ＥＧＦ＋ＦＥＦにより加速していない急速な増殖。
１０％のウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地において、標準細胞培養条件を使用して、増殖阻害アッセイを９６ウェルプレートにおいて実行した。ラパマイシン、ＬＹ２９４００２、又はγ分泌阻害剤ＧＳＩ−１又はＳ−２１８８を用いた処理のために、９６ウェルプレートに、１ウェル当たり１５００又は２０００の細胞密度で細胞を広げ、１日目は薬剤無しで処理し、４日目にアラマーブルー読み取りを使用して生存度を評価した。２回のアッセイで殆ど同一の結果を示したＳ−２１８８を除き、各処理条件は最低３回の実験を行って評価した。図６に代表的な実験結果を示す。
【０１６９】
結果
分子シグネチャーによる高悪性度星細胞腫の予後サブクラスの決定
新規に診断されたＧＢＭ（ｎ＝５５）及びＡＡ（ｎ＝２１）の７６症例を、ＭＤアンダーソン癌センター（ＭＤＡ）から取得し、ＤＮＡマイクロアレイによるプロファイリングにより、異なる予後を有するグループに腫瘍を分類する遺伝子発現パターンを同定した（図１Ａ−Ｃ）。本発明の研究において分析したこれら及び全ての腫瘍の症例の個体群統計を図８Ａに示す。まず、生存との相関性が最も強い発現を有するプローブセットが同定され（生存期間に対する対数変換された発現強度の値のスピアマンｒが、＞０．４５又は＜−０．４５）、続いて結果として得られた１０８のプローブセットと７６の試料の、双方向塊状クラスター形成を行った。この分析により、生存関連遺伝子の発現が著しく異なる試料セットから構成される３つの個別のグループが同定された（図１Ａ）。
３つの腫瘍サブクラスの各々について一組のマーカーを開発するために、本発明者等は、各サブグループについて、他の２つのサブクラスに含まれる腫瘍と比較して、当該グループ内で腫瘍によって最も強く過剰発現されるプローブセットを同定した（表Ａ参照。神経膠腫決定マーカー）。３つの腫瘍サブセットの各々に最も強いマーカーを使用して、腫瘍をサブクラスに振り分けるための、階層的クラスター形成（図１Ｂ）又はｋ平均法のクラスター形成に使用できる、シグネチャー遺伝子と呼ばれる３５の遺伝子からなる組を得た。ｋ平均法のクラスター形成により規定される腫瘍のサブクラスは、各サブクラスを特徴付けるマーカー遺伝子のリストの優性な特徴により、前神経性（ＰＮ）、増殖性（Ｐｒｏｌｉｆ）及び間葉性（Ｍｅｓ）と呼ぶ。各腫瘍サブクラスについて、３５のシグネチャー遺伝子の平均発現値に基づいてセントロイドを計算した（図１Ｂ）。セントロイドは腫瘍サブタイプの原型発現パターンと見ることができ、新規の試料を、それらのシグネチャー遺伝子の発現の、それらセントロイドとの類似性に基づいて分類することができる。ＭＤＡのデータセットに含まれる症例のカプラン−マイヤー図は、ＰＮサブクラスの生存期間中央値（１７４．５週）がＰｒｏｌｉｆ（６０．５週）又はＭｅｓ（６５．０週）より著しく長いことを示した（図１Ｃ）。
【０１７０】
新規腫瘍分類スキームの予後値を決定するため、本発明者等は新たに２つの独立したデータセットを調べた。１つのデータセットは、カリフォルニア大学サンフランシスコ校（ＵＣＳＦ）において治療を受けた症例から取得した一組のＡＡ及びＧＢＭ試料に基づいて生成され、一方、第２の検証用データセットは、ＵＣＬＡにおいて見られたグレードＩＩＩ及びＩＶのアストロサイト形態、オリゴデンドログリア形態、及び混合形態を有する症例に関する既知の研究文献（Freije等、2004）から得た。両方の検証セットに含まれる腫瘍は、それらのシグネチャー遺伝子の発現の、ＭＤＡデータセットにおいて規定されているセントロイドとの類似性に基づいて、ＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ、及びＭｅｓサブタイプに分類された。両検証セットの腫瘍サブタイプの生存時間のカプラン−マイヤー図は、最初のデータセットに観察されたものによく似たパターンを示した（図１Ｄ及びＥ）。ＧＢＭの症例だけを考慮すると、ＰＮと他の分類とを区別する予後値は、ＭＤＡ試料セットにおいても、３つの組み合わされたデータセットの全てにおいても、統計的に有意と思われた（ｐ＜０．０５、ＰＮ対他の分類の比較の両方に対するｔ検定）。
次に、マイクロアレイ及び定量的実時間ＰＣＲの両方により、選択したＰＮマーカーとＭｅｓマーカーの発現を比較した。本発明者等は、ＰＮマーカー及びＭｅｓマーカーとして、シグネチャー遺伝子リストからそれぞれＤＬＬ３（デルタ様リガンド３）及びＣＨＩ３Ｌ１／ＹＫＬ４０を選択し、これら同じ２つのサブクラスに、更に大きなマーカーのリスト（表Ａ）からそれぞれＢＣＡＮ及びＣＤ４４を選択した。図１Ｆ及びＧに示すように、神経膠腫試料の大部分が、ＰＮマーカーの対又はＭｅｓマーカーの対の集団平均を超える発現値を示したが、ＰＮマーカーとＭｅｓマーカーの組み合わせについてそのようなことは殆どなかった。
【０１７１】
一組の独立した腫瘍例に対するインサイツハイブリダイゼーションにより、ＢＣＡＮ及びＣＨＩ３Ｌ１／ＹＫＬ４０  ｍＲＮＡ発現に相互排他的なパターンが確認された（図１Ｈ）。大部分の標本が、ＢＣＡＮ又はＣＨＩ３Ｌ１／ＹＫＬ４０に強いシグナルを示したが、両マーカーに対して強いシグナルを示す標本は無かった。しかしながら、一部の標本は、重複していない細胞エレメント内のこれら２つのマーカーの各々に局所的な発現を示した。最も典型的には、これらは、広いＢＣＡＮ陽性領域を含む標本において、ＣＨＩ３Ｌ１／ＹＫＬ４０を発現する小さな座位を有する標本であった。このような場合、ＣＨＩ３Ｌ１／ＹＫＬ４０の発現は、血管に関連していることが多かった。
【０１７２】
ＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ、及びＭｅｓシグネチャーによる、腫瘍悪性度及び患者年齢の異なる腫瘍サブ集団の定義
分析の幅を広げ、２５６の悪性度の高い神経膠腫（表１）を含めたところ、大部分の腫瘍がＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ又はＭｅｓセントロイドに対する強い類似性を示し、他の２つのセントロイドには殆ど又は全く相関を示さなかった（図２Ａ）。一部の試料が２つのセントロイドに対する中程度の類似性を示したが、３つのセントロイド全てに弱い又は不明瞭な類似性を示す試料は殆ど無かった。従って、最も悪性度の高い神経膠腫は、通常、３つの異なる表現型の状態のうちの１つに属しており、２つの状態の中間の状態に属していることは殆ど無い。
新規に規定された腫瘍サブクラスは、組織学的な腫瘍のグレードとの強い関連を示した。試験した殆ど全てのグレードＩＩＩ腫瘍標本（８０％）は、オリゴデントログリア形態を示すかアストロサイト形態を示すかに関係なく、ＰＮに分類された。対照的に、グレードＩＶの病変（ＧＢＭ）の有意な割合が、３つの分子カテゴリーの１つに分類された。試験した１８４のＧＢＭ試料のうち、３２％がＰＮであり、２０％がＰｒｏｌｉｆであり、４８％がＭｅｓであった。
【０１７３】
ＭＤＡ試料に含まれるＧＢＭ症例由来のＨ＆Ｅで染色した切片の定性的検査では、腫瘍の分子細分類を一様に区別する組織学的特徴は見られなかった。その発生が統計的に分子サブクラスに関連している唯一の形態学的特徴は、腫瘍壊死であり、ＰＮ腫瘍での発生頻度は比較的小さかった。ＰＮと同定された９例のＧＢＭのうち、４例に壊死領域が無かった。対照的に、２２例のＭｅｓ  ＢＧＭのうち２例のみ（ｐ＜０．０５、ＰＮ対Ｍｅｓ、フィッシャーの正確な検定）及び２４例のＰｒｏｌｉｆ  ＧＢＭのうち０例（ｐ＝０．００５、ＰＮ対Ｐｒｏｌｉｆ）が壊死を示さなかった。
腫瘍のグレードと生存期間の両方と患者年齢との周知の相関関係と一致して、分子サブタイプへの腫瘍の配分は、年齢に基づいて患者を重層化することが判明した。本発明の生存分析において１８５の新規に診断された症例のうち、ＰＮサブクラスの腫瘍を有する患者は、Ｐｒｏｌｉｆ又はＭｅｓサブクラスの腫瘍を有する患者より有意に若かった（両方の比較についてＰ＜０．００５、ｔ検定）。ＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ及びＭＥＳサブクラスの腫瘍を有する患者の平均年齢＋／−ＳＥＭは、それぞれ４０．５＋／−１．４年、４９．０＋／−２．５年、及び５０．７＋／−１．３年であった。ＧＢＭの場合、Ｍｅｓの症例はＰＮ（ｐ＜−０．０５、ｔ検定）より有意に年齢が高く、一方Ｐｒｏｌｉｆ症例は他の２つの分類と年齢において差は無かった。
【０１７４】
ＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ、及びＭｅｓシグネチャーによる健常組織の異なる組の特徴付け
ＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ及びＭｅｓセントロイドにより示される分子シグネチャーの生物学的有意性の病識を得るため、複数のヒト組織及び細胞種類における３５のシグネチャー遺伝子の発現を試験した。この分析により、組織の異なる組が、神経膠腫のサブクラスを規定するセントロイドの１つに類似していることが判明した（図２Ｂ）。胎児及び成人の脳は共に、ＰＮ（前神経）セントロイドとの陽性の相関関係を有している。ヒト胎児脳から採取された２つの神経幹細胞株はまた、正常な培養条件の下でＰＮシグネチャーを示した（図２Ｂ）。Ｍｅｓ（間葉性）シグネチャーを示す組織には、骨、滑膜、平滑筋、内皮細胞、及び樹状細胞が含まれていた。加えて、培養されたヒト胎児アストロサイトの試料は、明らかに陽性のＭｅｓセントロイドとの相関関係を示した。抹消血から単離された造血幹細胞と増殖性の高い細胞株Ｊｕｒｋａｔは共に、Ｐｒｏｌｉｆセントロイドとの強い関連性を有していた。興味深いことに、２つの神経幹細胞株は、神経栄養因子ＢＤＮＦの処置及び退薬に応答してＰＮからＭｅｓクラスにシグネチャーサブクラスを変化させた（図２Ｂ）。
【０１７５】
腫瘍再発時のＭｅｓ表現型への移行
腫瘍サブクラスを規定する分子シグネチャーが各腫瘍例に固定の特徴であるか、又は治療又は病気の進行に応じて変化するのかを決定するため、同じ患者の原発性星細胞腫と続発性星細胞腫の一致する２６対の標本の発現シグネチャーを比較した。２６対の原発性試料と続発性試料のシグネチャーの全てに平均的な変化は、ＰＮセントロイドとの類似性の低下０．１８＋／−０．０６（ピアソンｒの平均的変化＋／−ＳＥＭ）、及びＭｅｓセントロイドとの類似性の増加０．２０＋／−０．９９に相当し、Ｐｒｏｌｉｆセントロイドとの類似性には殆ど変化が無かった（０．００２＋／−０．０８の増加）。２６の症例のうち、１８例に同じ分子サブクラスの原発及び再発が見られ、残りの８例では再発時にクラスが変化した（図２Ｃ）。表現型クラスが変化したこれら８例のうち、１例を除く全てがＭｅｓサブクラスへの移行を示し、うち３例はＰＮからＭｅｓサブタイプへの変化であり、残りの４例はＰｒｏｌｉｆからＭｅｓ表現型への移行であった。クラスが変化した最後の１例は、中程度のＭｅｓ類似性から中程度のＰｒｏｌｉｆ類似性への移行であった。
ペアワイズ分析を使用したマイクロアレイの有意性分析（ＳＡＭ）により、Ｍｅｓサブクラスへ移行した続発性腫瘍において有意に上方制御される遺伝子が同定された（図２Ｄ）。上方制御された遺伝子には、ＧＢＭ生物学によって以前に示された遺伝子であるＣＨＩ３Ｌ１／ＹＫＬ−４０、ＣＤ４４、及びＳＴＡＴ３、並びに間葉組織の常套的なマーカーであるビメンチン（ＶＩＭ）が含まれていた（Eibl等、J. Neuro-Oncol. 26: 165-170 (1995); Nigro等、上掲.; Nutt等、Cancer Res. 63: 1602-1607 (2005); Rahaman等、Oncogene 21: 8404-8413 (2002); Tanwar等、Cancer Res. 62: 4364-4368 (2002)）。ＣＨＩ３Ｌ１／ＹＫＬ−４０は、ヒト腫瘍の放射線抵抗性を予測し（Pelloski等、Clin. Cancer Res. 11: 3326-3334 (2005)）、且つインビトロでの放射の後、クローン原生の生存を促進する（Nigro等、上掲.）ことが報告されており、これらの発見は、治療後に腫瘍が再発する際に発現が相対的に増加するという事実と一致する。Ｍｅｓクラスに移行する症例において有意に下方制御される遺伝子は無かった。
再発時にＰＮから移行する症例の組織に対する免疫組織化学的検査により、ＣＨＩ３Ｌ１／ＹＫＬ−４０及び顕著な核ＯＬＩＧ２発現の減少が多いことが示唆された。図３に示す実施例では、優先的に悪性度の低い病変に関連付けられることが既知のＰＮマーカーである（Ligon等、J. Neuropathol. Exp. Neurol. 63: 499-509 (2004))、ＯＬＩＧ２の顕著な核発現を示すＰＮ腫瘍は、再発時にＯＬＩＧ２発現の相対的な低下を示した。健常な脳はオリゴデンドログリアに低レベルの染色しか示さず、このことは、アレイデータ中にＰＮ腫瘍によるこのマーカーの上方制御があっても、それは組織プロセシングの間の健常脳の汚染の徴候ではないことを示唆するものである。逆に、ＭｅｓマーカーであるＣＨＩ３Ｌ１／ＹＫＬ−４０は、原発試料中の腫瘍細胞中に殆ど発現しないが、再発性腫瘍細胞中には豊富に発現する。このような相対的発現の変化は、再発時にＭｅｓ移行した試験対象の腫瘍全てに見られた。
【０１７６】
増殖又は血管新生のマーカーによる予後不良の腫瘍サブタイプの区別
腫瘍の予後徴候のサブクラスを規定した後、本発明者等は、疾病の侵襲性の差異に寄与し得る生物学的側面の同定を試みた。腫瘍サブクラスの表現型を試験するため、分類に使用したセントロイドに対する強い類似性を示す本発明の生存分析から星細胞腫症例の複数の組を選択した（各サブタイプにつきｎ＝１２）。本発明の比較には、８の健常脳組織試料を含めた。増殖マーカーの試験において、増殖性核抗原（ＰＣＮＡ）及びトポイソメラーゼＩＩα（ＴＯＰ２Ａ）の両方が、ＰＮ又はＭｅｓ腫瘍と比べてＰｒｏｌｉｆ腫瘍に有意に過剰発現することが判明した（図３Ａ）。高速度の細胞分裂が無いときにＭｅｓ腫瘍が侵襲性の表現型を示すことを可能にする仕組みの１つの可能性は血管新生である。図３Ｂに示すように、Ｍｅｓ腫瘍は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ｈｕｌｔ１又はＶＥＧＦレセプター１（ＶＥＧＦＲ１）、ｋｄｒ又はＶＥＧＦレセプター２（ＶＥＧＦＲ２）、及び内皮マーカーＰＥＣＡＭ１の過剰発現を示した。
【０１７７】
予後不良腫瘍サブタイプによる神経幹細胞及び／又は前駆細胞の発現と、予後が比較的良好な腫瘍による神経芽細胞又はニューロンの発現
シグネチャー遺伝子セットに含まれるＰＮマーカーの一部、例えばＮＣＡＭ、ＧＡＢＢＲ１及びＳＮＡＰ９１は、ニューロンに関連している。ＧＢＭの腫瘍化細胞が神経幹細胞マーカーＣＤ１３３を発現するという最近の発見に基づき（(Singh等、Nature 432: 396-401 (2004))、本発明者等は、神経幹細胞のマーカーの発現と使用した神経細胞系列のマーカーの発現との比較を試みた（図３Ｃ−Ｅ）。本発明の分析には、成人前脳の神経発生に関連するマーカーを選択した（Abrous等、Physiol. Rev. 85: 523-569 (2005); Anton等、Nature Neurosci. 7: 1319-1328 (2004); Nakano等、J. Cell Biol. 170: 413 (2005); Shi等、Nature 427: 78-83 (2004)）。神経幹細胞又は多分化能前駆細胞の６のマーカーのうち５において、予後不良の腫瘍サブクラスの一方又は両方が、ＰＮ腫瘍と比べて高い発現を示すことが判明した（図３Ｃ）。このような差異は、ビメンチン（ＶＩＭ）、ネスチン（ＮＥＳ）、ＴＬＣ、ＣＤ１３３、及びＭＥＬＫに見られる。前駆細胞のマーカーであるＤＬＸ２は腫瘍グループ間で統計的に有意な差異を示さなかったが、幾つかのＰｒｏｌｉｆ腫瘍はこの遺伝子の強い発現を示した。幹細胞マーカーとは対照的に、、神経芽細胞又は発達中のニューロンのマーカーは、Ｐｒｏｌｉｆ及び／又はＭｅｓ腫瘍と比べてＰＮ腫瘍に過剰発現した（図３Ｄ）。これらのマーカーには、ＯＬＩＧ２、ＭＡＰ２、ＤＣＸ、ＥＮＣ１（ＮｅｕＮ）、ＥＲＢＢ４、及びＧＡＤ２が含まれた。ＰＮ腫瘍における神経細胞マーカーの発現は、健常脳の標本と比べて腫瘍中のＯＬＩＧ２、ＤＣＸ、ＮｅｕＮ、及びＧＡＤ２の発現レベルが上昇しなかったことから、健常な脳による腫瘍標本の汚染では説明されなかった（データは示さない。腫瘍と健常の比較の全てのｔ検定について、ｐ＜０．００５、多重比較については修正無し）。神経幹細胞とアストロサイトのマーカーであるＧＦＡＰは、Ｐｒｏｌｉｆ腫瘍と比べてＭＥＳとＰＮサブクラスに強く発現された（図３Ｅ）。
【０１７８】
Ｐｒｏｌｉｆ及びＭｅｓ腫瘍サブタイプに関連するＣｈｒ１０における減少とｃｈｒ７における増加
発現プロファイリングにより試験した症例のうち、ＡＡ及びＧＢＭの９６の標本由来のＤＮＡが、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーションによる分析（ＣＧＨ）に利用できた。ｃｈｒ１、７、１０及び１９におけるコピー数の変化について腫瘍をスコア化した。腫瘍はまたｃｈｒ１、７、１０及び１９におけるコピー数の相対的変化についてスコア化された。試料の大部分がｃｈｒ７における増加とｃｈｒ１０における減少を示した（図４Ａ）。ｃｈｒ１０における減少を試験する際に、本発明者等は、これらゲノム変化の頻度が腫瘍のサブクラス間で非常に異なることを発見した（図４Ａ）。Ｐｒｏｌｉｆ及びＭｅｓ腫瘍の大部分が１０ｑ２３．３に亘る（それぞれ７８％及び８４％）ｃｈｒ１０における減少を示す一方で、Ｐｎ腫瘍サブクラスの少数（２０％）がｃｈｒ１０における減少を示した。Ｍｅｓ腫瘍の場合、大部分の症例においてｃｈｒ１０におけるほぼ全ての座位が欠損し、２例だけが１０ｑに限定された欠損を示した。対照的に、Ｐｒｏｌｉｆ腫瘍の場合、Ｃｈｒ１０における減少は不均一であった。前神経性シグネチャーとＣｈｒ１０の状態との関連性は有意に高かった（ｐ＜０．０００１、フィッシャーの正確検定）。腫瘍シグネチャーとｃｈｒ７又は１９ｑにおける相対的コピー数の変化との間に、類似であるが、やや弱い相関が見られた（図４Ａ、ｃｈｒ７及び１９ｑの両方についてｐ＜０．０１、フィッシャーの正確検定）。ｃｈｒ１ｐ又は１ｑには類似の相関が見られなかった（ｐ＞０．０５）。
相対的ゲノムコピー数の変化と腫瘍サブタイプとが関連しているとして、各腫瘍サブタイプを決定する遺伝子が染色体の位置に対する偏向を有するかどうかの判定を試みた。腫瘍サブクラスマーカーの拡張版のリスト（表Ａ）に対するカイ二乗分析により、３つのリストのそれぞれについて、観察される染色体位置の頻度が、発現アレイの全プローブセットの位置頻度により予測されるものと有意に異なることが判明した（ＰＮの場合、Ｐ＜１×１０−１４、Ｐｒｏｌｉｆの場合、ｐ＜０．００１、Ｍｅｓの場合、ｐ＜０．０００５）。ＰＮ及びＭｅｓマーカーがｃｈｒ１０及び１９に示すマーカーはいずれも過剰であった（７２の比較についてボンフェローニ補正を行なった後での両比較についてＰ＜０．０５）。これらの発見は、ｃｈｒ１０及び１９ｑにおける相対的なＤＮＡコピー数の変化に見られる腫瘍サブタイプ間の差異を実証するものである。
【０１７９】
予後が良好な腫瘍サブクラスと予後不良の腫瘍サブクラスにおけるＮｏｔｃｈ及びａｋｔ経路の異なる活性化
ｃｈｒ１０の減少と腫瘍サブクラスとの関連性と一致して、ＰＴＥＮ座位を含むＢＡＣクローンのアレイＣＧＨデータの直接的な試験により、Ｐｒｏｌｉｆ及びＭｅｓ症例の大部分がＰＴＥＮ座位の欠損を示すことが確認された。ＰＴＥＮ座位の欠損とＰＮセントロイドへの類似の間には、関連性は見られなかった（図５Ａ）。この座位が増加又は増殖する症例の大部分は、Ｐｒｏｌｉｆ又はＭｅｓサブクラスいずれかの腫瘍であり、ＥＧＦＲコピー数の増加とＰＮセントロイドに対する類似性の間には関連性は見られなかった（図５Ｂ）。ａｋｔ１、ａｋｔ２、又はａｋｔ３に対応する座位には明らかな増殖又は欠失は見られず、ＰＩ３Ｋの触媒サブユニットの増殖又は欠失も見られなかった（図示しない）。小数の試料が、ＰＩ３Ｋの調節サブユニットであるＰＩＫ３Ｒ３についてコピー数の増加を示し、この座位のＣＧＨ比の、Ｐｒｏｌｉｆシグネチャーに対する類似性との関連性は陽性であった（図５Ｃ）。
このような結果により、ａｋｔ経路の活性化と腫瘍サブタイプとの強い関係が示唆されたことから、本発明者等は、腫瘍サブタイプにおけるＰＴＥＮ  ｍＲＮＡの発現とホスホ−ａｋｔ（ｐ−ａｋｔ）免疫組織学を比較した。本発明者等は、Ｐｒｏｌｉｆ及びＭｅｓ腫瘍におけるＰＴＥＮ  ｍＲＮＡの発現はＰＮ腫瘍の場合の概ね２分の一であり、ｐ−ａｋｔ（ｓｅｒ４７３）の発現はＰＮ腫瘍より強いことを発見した（図４Ｅ、図４Ｊ）。この結果は有意性の高いものであった（ＰＮ対その他のｔ検定で、ｐ−ａｋｔ免疫組織化学についてＰ＜５×１０−８；ＰＴＥＮ  ｍＲＮＡについてｐ＜５×１０−５）。ＰＴＥＮの結果は第二の独立試料セットにおいて確認された（データは示さない）。
【０１８０】
ＭＤＡの試料セット中のＰＮ腫瘍マーカーの完全なリストの試験において、本発明者等は、Ｎｏｔｃｈ経路エレメントＤＬＬ３、ＤＬＬ１、ＨＥＹ２及びＡＳＣＬ１に対応するプローブセットが、ＰＮ腫瘍のマーカーとして本発明の基準に見合うものであることを発見した（図５Ｅ−Ｈ）。これらの遺伝子は、両確認用データセットのＰＮ腫瘍に有意に過剰発現することが確認された。これら４つのＮｏｔｃｈ経路エレメントの各々は、前脳の神経発生に関係しているとみなされており（Campos等、J. Neurosci. Res. 64: 590-598 (2001); Casarosa等、Development 126: 525-534 (1999); Sakamoto等、J. Biol. Chem. 278: 44808-44815 (2003)）、ＡＳＣＬ１は最近、成人の前脳におけるニューロン及びオリゴデンドログリア両方の特定に関連付けられている（Parras等、EMBO Journal, 23(22): 4495-505 (2004)）。マイクロアレイのデータにＰＮ腫瘍の上方制御が示されなかったＮｏｔｃｈ経路の成分には、Ｎｏｔｃｈ１−４、Ｊａｇｇｅｄ１及び２、Ｈｅｓ１、２、４、６、７（図示しない）が含まれる。ＨＥＹ１は、ＭＤＡのＰＮ腫瘍に小さいが有意な上方制御を示した（１．４ＦＣ、ｐ＝５×１０−５）。
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の直接的な証拠を試験するために、利用可能なパラフィン埋設切片を用いてＭＤＡの全症例に対し、核Ｎｏｔｃｈ免疫反応性のブラインド評価を実施した。陽性の症例は、陰性の症例と比較した場合核に「紅潮」を示し、このことは核に染色が全く無いことを示すものであった。図４Ｋは、Ｎｏｔｃｈ核染色について０、１、又は２と評価された各腫瘍サブタイプの頻度を示す。陽性の症例は比較的弱いシグナルしか示さなかったが、それでもＰＮ試料は、Ｐｒｏｌｉｆ（ｐ＜０．００５、ｔ検定）又はＭｅｓ（ｐ＜０．００１、ｔ検定）サブクラスより有意に高いの評点を示した。
【０１８１】
ＤＬＬ３及びＰＴＥＮ発現の２遺伝子モデルによる高悪性度星細胞腫の生存時間の予想
本発明のデータにより腫瘍侵襲性におけるＮｏｔｃｈ及びａｋｔ経路の役割が示唆されたことから、本発明者等は、経路マーカーの発現と生存期間との直接的な関連の証拠を探求した。この分析のために、本発明者等は、使用可能なｍＲＮＡが十分な（ｎ＝６５）、ＭＤＡ生存セットに含まれる全ての試料のマイクロアレイデータを使用した定量的ＰＣＲ及びＤＬＬ３  ｍＲＮＡにより、ＰＴＥＮ  ｍＲＮＡを評価した。比例ハザードのコックスモデルにより、ＰＴＥＮ及びＤＬＬ３  ｍＲＮＡのレベル、及びそれらの統計的相関が全て高悪性度の星細胞腫の生存時間に関連しており、組み合わせることにより非常に重要な予測モデルが形成されることが判明した（自由度３のカイ二乗基準分布と比較した場合の尤度比試験２１．６、ｐ＜０．０００１）。図５Ａに示す予測される生存関数は、ＰＴＥＮ  ｍＲＮＡの値が低い試料が、ＤＬＬ３発現のレベルに関係なく不良な生存関数に関連していることを示す。ＰＴＥＮ発現の高い試料の場合、予測される生存時間はＤＬＬ３の関数として変化し、ＰＴＥＮとＤＬＬ３  ｍＲＮＡ両方のレベルが高い場合に最良の結果が示された。次いで、本発明者等は、同じモデルを、前例より少ないグレードＩＩＩ及びＩＶの星細胞腫の独立セット（ｎ＝３４）に適用した。予想される生存曲線は、ＭＤＡ試料のセットについて得られたものとよく似ており（図５Ｂ）、これによりこの２遺伝子モデルの堅実性が示された（図６Ｂ）。
【０１８２】
ＧＢＭ細胞株の発現シグネチャーによるＥＧＦ／ＦＧＦの独立したニューロスフェア増殖及びａｋｔ経路の阻害に対する感受性の予想
腫瘍の分子サブタイプの潜在的な治療的重要性を試験するため、本発明者等は、神経膠腫細胞株によるシグネチャー遺伝子の発現の関数として当該細胞株のインビトロでの応答を試験した。ｍＲＮＡ発現について１６のＧＢＭ細胞株をプロファイリングして、ＥＧＦ＋ＦＧＦの存在下又は不在下におけるそれらのニューロスフェアの生成能を調査し、Ｎｏｔｃｈ及びＡｋｔシグナル伝達に影響する薬剤へのそれらの応答性を評価した。１６株の全てが、ＰＮセントロイドとの相関を示さなかったが、Ｍｅｓセントロイドに対する幅広い類似性を示した。１６の細胞株のうち１５がＥＧＦ＋ＦＧＦ中で増殖できるニューロスフェアを生成する一方、それらのＥＧＦ＋ＦＧＦ不在下で増殖するニューロスフェアの生成能は同じでなく（図６Ａ）、親細胞株の発現シグネチャーに関連していると思われた（図６Ｂ）。最も顕著な発見は、Ｍｅｓセントロイドと相関していない２つの細胞株（Ｇ１１２及びＧ１２２）がＥＧＦ＋ＦＧＦの不在下で急速に増殖するニューロスフェアを生成する一方、Ｍｅｓセントロイドと強い相関関係を有する細胞株がＥＧＦ＋ＦＧＦの不在下で容易に増殖することができるニューロスフェアを生成しないことであった（図７Ｂ）。
腫瘍サブタイプと前脳の神経発達段階との平行性を含む主要な発見を図８Ａ及びＢにまとめた。
【０１８３】
実施例２：神経膠腫におけるＧＤＭポリペプチドの発現上方制御を検出するためのマイクロアレイ分析
多くの場合何千もの遺伝子配列を含む核酸マイクロアレイは、正常な相対物と比較して疾患組織に異なって発現する遺伝子の同定に有用である。核酸マイクロアレイを使用することによって、試験及びコントロール組織試料由来の試験及びコントロールｍＲＮＡ試料を、ｃＤＮＡプローブ生成のために逆転写し、標識する。次いでｃＤＮＡプローブを、固体支持体に固定化された核酸アレイにハイブリダイズさせる。アレイの各部位の配列と位置がわかるようにアレイを構築する。例えば、特定の疾患状態において発現されることが知られている選択された遺伝子を、固体支持体にアレイすることができる。標識されたプローブと特定のアレイ部位とのハイブリッド形成は、そのプローブが生成された試料がその遺伝子を発現することを示す。試験（疾患組織）試料由来のプローブのハイブリッド形成シグナルが、コントロール（正常組織）試料由来のハイブリッド形成シグナルよりも大きい場合に、疾患組織に過剰発現する遺伝子又は複数の遺伝子が同定される。この結果の意味するところは、疾患組織に過剰発現するタンパク質が疾患状態の診断マーカーとしてのみでなく、疾患状態の治療の治療標的としても有用だということである。
核酸ハイブリッド形成の方法論及びマイクロアレイ技術は当該技術者に周知である。本発明の例における、ハイブリッド形成及びプローブのための核酸の特異的調整、スライド、及びハイブリッド形成状態はすべて、2001年3月30日出願のPCT/US01/10482に詳述されており、出典明示によりこの明細書に包含する。
【０１８４】
実施例３：ＧＤＭｍＲＮＡ発現の定量分析
このアッセイでは、５'ヌクレアーゼアッセイ（例えば、TaqMan（登録商標））及びリアルタイム定量ＰＣＲ（例えば、ABI Prizm7700シーケンス検出システム（登録商標）（パーキンエルマー，Applied Biosystems Division ，フォスターシティー，カリフォルニア））を、他の癌性腫瘍又は正常な非癌性組織と比較し、癌性腫瘍又は腫瘍で顕著に過剰発現している遺伝子を見出すために使用した。５'ヌクレアーゼアッセイ反応は、Taq DNAポリメラーゼ酵素の５'エキソヌクレアーゼ活性を利用してリアルタイムでの遺伝子発現をモニターする蛍光ＰＣＲ-ベース技術である。２つのオリゴヌクレオチドプライマー（その配列は、対象である遺伝子又はＥＳＴ配列に基づく）を、ＰＣＲ反応で典型的な単位複製配列を生成するために使用する。三番目のオリゴヌクレオチド、又はプローブを、２つのＰＣＲプライマーの間に位置するヌクレオチド配列を検出するために設計する。このプローブは、Taq DNAポリメラーゼ酵素によって伸長可能ではなく、レポーター蛍光色素及びクエンチャー 蛍光色素で標識する。レポーター色素からのどんなレーザー誘導放射も、プローブ上で２つの色素が近接して位置する場合には、消光色素によって消光する。ＰＣＲ増幅反応の間、Taq DNAポリメラーゼ酵素は、鋳型依存的にプローブを切断する。この結果生じるプローブ断片は溶液中で分離し、放出レポーター色素からの信号は、二番目の蛍光物質の消火効果とは無関係である。レポーター色素の１つの分子は、各新規合成分子のために遊離され、非消光レポーター色素の検出によって、データの定量的及び定量的解釈に関する根拠が提供される。このアッセイはよく知られており、当技術分野において、２つの異なるヒト組織試料間の遺伝子発現の差異を定量的に同定するために常套的に使用される。例えば、Higuchi等、Biotechnology 10:413-417 (1992); Livak等、PCR Methods Appl., 4:357-362 (1995); Heid等、Genome Res. 6:986-994 (1996); Pennica等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (25):14717-14722 (1998); Pitti等、Nature 396 (6712):699-703 (1998)及びBieche等、Int. J. Cancer 78:661-666 (1998)を参照のこと。
５’ヌクレアーゼ手法は、ABI Prism7700TMシーケンス検出のようなリアルタイム定量ＰＣＲ装置で行われる。このシステムは、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合装置（ＣＣＤ）カメラ及びコンピューターで構成される。このシステムでは、サーモサイクラー上の９６-ウェルフォーマットで試料を増幅する。増幅の間、レーザー誘導蛍光信号が、すべての９６ウェルの光ファイバー計測ケーブルを介してリアルタイムで集められ、ＣＣＤで検出される。このシステムには、装置を作動するため、そしてデータを分析するためのソフトウエアが含まれる。
【０１８５】
スクリーニングのための出発材料は、種々の異なる癌性組織から単離したｍＲＮＡであった。このｍＲＮＡは、例えば蛍光定量的に、正確に定量化される。ネガティブコントロールとして、ＲＮＡを、試験される癌性組織と同じ組織型の種々の正常組織から単離した。多くの場合、腫瘍試料を、同じ組織種類の「対応する」正常試料と直接比較した。つまり、腫瘍試料と正常試料を同じ固体から取得した。
５’ヌクレアーゼアッセイデータは、最初にＣｔ、又は閾値サイクルとして表される。これは、レポーター信号が蛍光のバックグラウンドレベルを超えて蓄積するサイクルとして定義される。ΔＣｔ値は、癌のｍＲＮＡの結果を正常なヒトｍＲＮＡの結果と比較する場合に、核酸試料中の特定の標識配列の開始コピーの相対数の定量的測定として用いられる。１Ｃｔ単位は、１ＰＣＲサイクル、又は標準に対しておよそ２倍の相対増加に一致し、２単位は、４倍相対増加に一致し、３単位は８倍相対増加に一致する等々であり、２つ以上の異なる組織間のｍＲＮＡ発現の相対倍数増加を定量的且つ定量的に測定できる。これに関し、本技術分野では、ヒト腫瘍試料中のｍＲＮＡ発現の、正常なコントロールの２倍以上の増大を再現可能に検出するのに、このアッセイの技術的感度は十分であると認められている。
【０１８６】
実施例４：インサイツハイブリダイゼーション
インサイツハイブリダイゼーションは、細胞又は組織調製物内での核酸配列の検出及び局在化のための強力で多用途の技術である。それは、例えば、遺伝子発現部位の同定、転写物の組織分布の分析、ウイルス感染の同定と局在化、特定のｍＲＮＡ合成における変化の追跡及び染色体マッピングにおける補助に有用である。
インサイツハイブリダイゼーションは、Lu及びGillett, Cell Vision 1: 169-176 (1994)のプロトコルの最適化バージョンに従って、ＰＣＲ生成３３Ｐ-標識リボプローブを用いて実施される。簡単に述べると、ホルマリン固定、パラフィン包埋ヒト組織を切片化し、脱パラフィンし、プロテイナーゼＫ（20g/ml）で１５分間３７℃で脱タンパクし、さらに上掲のLu及びGillettに記載されたようにインサイツハイブリダイゼーションする。(３３-Ｐ)ＵＴＰ-標識アンチセンスリボプローブをＰＣＲ産物から生成し、５５℃で終夜ハイブリダイゼーションする。スライドをKodak NTB2核トラックエマルションに浸漬して４週間露出する。
【０１８７】
３３Ｐ-リボプローブ合成
６．０μｌ（１２５ｍＣｉ）の３３Ｐ-ＵＴＰ（Amersham BF 1002, SA＜2000 Ci/mmol）をスピード真空乾燥させた。乾燥３３Ｐ-ＵＴＰを含む各管に以下の成分を添加した：
２．０μｌの５ｘ転写バッファー
１．０μｌのＤＴＴ（１００ｍＭ）
２．０μｌのＮＴＰ混合物（２．５ｍＭ: 各１０μｌの１０ｍＭ ＧＴＰ，ＣＴＰ及びＡＴＰ＋１０μｌのＨ２Ｏ）
１．０μｌのＵＴＰ（５０μＭ）
１．０μｌのＲＮａｓｉｎ
１．０μｌのＤＮＡテンプレート（１μｇ）
１．０μｌのＨ２Ｏ
１．０μｌのＲＮＡポメラーゼ（ＰＣＲ産物についてＴ３＝ＡＳ，Ｔ７＝Ｓ，通常）
管を３７℃で１時間インキュベートし、１．０μｌのＲＱ１ ＤＮａｓｅを添加し、ついで３７℃で１５分間インキュベートした。９０μｌのＴＥ（１０ｍＭトリスｐＨ７．６／１ｍＭのＥＤＴＡｐＨ８．０）を添加し、混合物をＤＥ８１紙にピペットした。残りの溶液をＭｉｃｒｏｃｏｎ−５０限外濾過ユニットに充填し、プログラム１０を用いてスピンさせた（６分間）。濾過ユニットを第２の管に変換し、プログラム２を用いてスピンさせた（３分間）。最終回収スピンの後、１００μｌのＴＥを添加した。１μｌの最終生成物をＤＥ８１紙にピペットし６ｍｌのＢＩＯＦＬＵＯＲ ＩＩで数えた。
プローブをＴＢＥ／尿素ゲル上で走らせた。１−３μｌのプローブ又は５μｌのＲＮＡ  ＭｒｋＩＩＩを３μｌのローディングバッファーに添加した。加熱ブロック上で９５℃に３分間加熱した後、プローブを即座に氷上に置いた。ゲルのウェルを流し、試料を充填し、１８０−２５０ボルトで４５分間走らせた。ゲルをサランラップでラップし、−７０℃冷凍機内で補強スクリーンを持つＸＡＲフィルムに１時間から終夜露出した。
【０１８８】
３３Ｐ-ハイブリダイゼーション
Ａ．凍結切片の前処理
スライドを冷凍機から取り出し、アルミニウムトレイに配置して室温で５分間解凍した。トレイを５５℃のインキュベータに５分間配置して凝結を減らした。スライドを蒸気フード内において４％パラホルムアルデヒド中で１０分間固定し、０．５ｘＳＳＣで５分間室温で洗浄した（２５ｍｌ ２０ｘＳＳＣ＋９７５ｍｌ ＳＱ Ｈ２Ｏ）。０．５μｇ／ｍｌのプロテイナーゼ中、３７℃で１０分間の脱タンパクの後（２５０ｍｌの予備加熱ＲＮａｓｅ無しＲＮａｓｅバッファー中の１０ｍｇ／ｍｌストック１２．５μｌ）、切片を０．５ｘＳＳＣで１０分間室温で洗浄した。切片を、７０％、９５％、１００％エタノール中、各２分間脱水した。
Ｂ．パラフィン包埋切片の前処理：
スライドを脱パラフィンし、ＳＱ  Ｈ２Ｏ中に配置し、２ｘＳＳＣで室温において各々５分間２回リンスした。切片を２０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（２５０ｍｌのＲＮａｓｅ無しＲＮａｓｅバッファー中１０ｍｇ／ｍｌを５００μｌ；３７℃、１５分間）−ヒト胚又は８ｘプロテイナーゼＫ（２５０ｍｌのＲＮａｓｅバッファー中１００μｌ、３７℃、３０分間）−ホルマリン組織で脱タンパクした。続く０．５ｘＳＳＣでのリンス及び脱水は上記のように実施した。
Ｃ．プレハイブリッド：
スライドをＢｏｘバッファー（４ｘＳＳＣ、５０％ホルムアミド）−飽和濾紙で列を作ったプラスチックボックスに並べた。
Ｄ．ハイブリダイゼーション：
スライド当たり１．０ｘ１０６ｃｐｍのプローブ及び１．０μｌのｔＲＮＡ（５０ｍｇ／ｍｌストック）を９５℃で３分間加熱した。スライドを氷上で冷却し、スライド当たり４８μｌのハイブリダイゼーションバッファーを添加した。ボルテックスの後、５０μｌの３３Ｐ混合物をスライド上のプレハイブリダイゼーション５０μｌに添加した。スライドを５５℃で終夜インキュベートした。
Ｅ．洗浄：
洗浄は、２ｘ１０分間、２ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡで室温で実施し（４００ｍｌの２０ｘＳＳＣ＋１６ｍｌの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ、Ｖｆ＝４Ｌ）、次いでＲＮａｓｅＡ処理を３７℃で３０分間行った（２５０ｍｌＲＮａｓｅバッファー中１０ｍｇ／ｍｌを５００μｌ＝２０μｇ／ｍｌ）。スライドを２ｘ１０分間、２ｘＳＳＣＥＤＴＡで室温において洗浄した。ストリンジェントな洗浄条件は次の通りとすることができる：５５℃で２時間、０．１ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡ（２０ｍｌの２０ｘＳＳＣ＋１６ｍｌのＥＤＴＡ、Ｖｆ＝４Ｌ）。
Ｆ．オリゴヌクレオチド
ここに開示した様々なＤＮＡ配列についてインサイツ分析を実施した。これらの分析に対して用いたオリゴヌクレオチドは添付図に示した核酸（又はその相補鎖）に相補的であるように得られた。
【０１８９】
実施例５：ＧＤＭに結合する抗体の調整
モノクローナル抗体の生産のための技術は、この分野で知られており、例えば、上掲のGodingに記載されている。使用することができる免疫原には、精製ＧＤＭポリペプチド、ＧＤＭポリペプチドを含む融合タンパク質、及び細胞表面上に組換えＧＤＭポリペプチドを発現する細胞が含まれる。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなくなすことができる。
Ｂａｌｂ／ｃ等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は腹腔内に１−１００マイクログラムで注入した上記免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ribi Immunochemical Researh, Hamilton, MT）に乳化し、動物の後足蹠に注入してもよい。免疫化したマウスは、次いで１０から１２日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免疫する。抗ＧＤＭ抗体の検出のためのＥＬＩＳＡアッセイで試験するために、レトロオービタル出血からの血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。
適当な抗体力価が検出された後、抗体に「ポジティブ（陽性）」な動物に、ＧＤＭポリペプチドの静脈内注射の最後の注入をすることができる。３から４日後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を取り出した。次いで脾臓細胞を（３５％ポリエチレングリコールを用いて）、ＡＴＣＣから番号ＣＲＬ１５９７で入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１等の選択されたマウス骨髄腫株化細胞に融合させた。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、次いで、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害した。
ハイブリドーマ細胞は、ＧＤＭに対する反応性についてのＥＬＩＳＡでスクリーニングされる。ＧＤＭに対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「ポジティブ（陽性）」ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常識の範囲内である。
陽性ハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入し、抗ＧＤＭモノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで成長させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィ−を用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインＡ又はプロテインＧへの親和性に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。
【０１９０】
実施例６：ＧＤＭに結合する、毒素をコンジュゲートした抗体の調整
細胞傷害性又は細胞分裂停止性の薬剤、すなわち癌治療において腫瘍細胞を殺すか又は阻害するための薬剤の局部運搬に抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）、つまり免疫複合体を用いると(Payne (2003) Cancer Cell 3:207-212; Syrigos及びEpenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz及びSpringer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172；米国特許第4,975,278号)、腫瘍への薬剤成分の標的とする運搬とそこでの細胞内集積が可能となり、この非コンジュゲート薬物作用剤の全身性投与により正常細胞並びに除去しようとする腫瘍細胞への毒性が容認できないレベルとなりうる(Baldwinら、(1986) Lancet (Mar. 15, 1986):pp603-05; Thorpe, (1985) 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,」 in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pincheraら (ed.s), pp. 475-506)。これによって、最小限の毒性で最大限の効果が求められる。ＡＤＣを設定して精製するために、モノクローナル抗体(ｍＡｂ)の選択性並びに薬剤結合特性及び薬剤放出特性に注目した。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は共に、この方策に有用であるとして報告されている(Rowland等、(1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87)。この方法に用いる薬物には、ダウノマイシン、ドキソルビジン、メトトレキサート及びビンデジンが含まれる(Rowland等、(1986)、上掲)。抗体−毒素コンジュゲートに用いる毒素には、ジフテリア毒素などの細菌性毒素、リシンなどの植物毒素、ゲルダナマイシン(Mandlerら(2000) J. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581；Mandlerら(2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028；Mandlerら(2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791)、メイタンシノイド(EP 1391213；Liu等、(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623)、及びカリケアマイシン(Lodeら (1998) Cancer Res. 58:2928；Hinmanら (1993) Cancer Res. 53:3336-3342)などの小分子毒素が含まれる。
【０１９１】
生成された抗体に毒素をリンクさせることにより抗体薬剤コンジュゲートを生成する技術は周知であり、本技術分野で常套的に使用される。例えば、生成したモノクローナル抗体の毒素ＤＭ１への抱合は、次のように行うことができる。精製された抗体を、Ｎ−サクシニミジル−４−（２−ピリジルチオ）−ペンタン酸を用いて誘導体化し、ジチオピリジル基を誘導する。ＮａＣｌ（５０ｍＭ）及びＥＤＴＡ（１ｍＭ）を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液中の抗体（３７６．０ｍｇ，８ｍｇ／ｍＬ）４４．７ｍｌをＳＰＰ（２．３ｍｌのエタノール中５．３モル濃度当量）により処理した。外界温度及びアルゴン下で９０分に亘るインキュベーションを行った後、３５ｍＭのクエン酸ナトリウム、１５４ｍＭのＮａＣｌ及び２ｍＭのＥＤＴＡを用いて平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラムにより反応混合物をゲル濾過した。次いで、画分を含む抗体をプールし、アッセイした。抗体−ＳＰＰ−Ｐｙ（遊離可能な２−チオピリジン基を含め、３３７．０ｍｇ）を、上記３５ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５を用いて希釈し、最終濃度を２．５ｍｇ／ｍｌとした。次いで、３．０ｍＭのジメチルアセトアミド（ＤＭＡ、最終的な反応混合物中３％ｖ／ｖ）中のＤＭ１（１．７当量、１６．１モル）を抗体溶液に添加した。外界温度且つアルゴン下で反応を進行させた。反応物を、３５ｍＭのクエン酸ナトリウム、１５４ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ３００ゲル濾過カラム（５．０ｃｍ×９０．０ｃｍ、１．７７Ｌ）に充填した。流速は５．０ｍｌ／分であり、６５画分（各２０．０ｍｌ）が回収された。画分をプールしてアッセイし、抗体分子１つ当たりにリンクしたＤＭ１薬剤分子の数（ｐ’）を、２５２ｎｍ及び２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより決定した。
【０１９２】
また、例示として、毒素ＤＭ１への精製されたモノクローナル抗体のコンジュゲートは、以下の通りに達成されうる。精製された抗体は、(スクシンイミジル４(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシレート(ＳＭＣＣ、Pierce Biotechnology, Inc) で誘導体化して、ＳＭＣＣリンカーを導入する。５０ｍＭ リン酸カリウム／５０ｍＭ 塩化ナトリウム／２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５中で、７．５モル等量のＳＭＣＣ(ＤＭＳＯ中に２０ｍＭ、６．７ｍｇ／ｍＬ)にて２０ｍｇ／ｍＬの抗体を処理した。室温のアルゴン下で２時間撹拌した後に、反応混合物を、５０ｍＭ リン酸カリウム／５０ｍＭ 塩化ナトリウム／２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５にて平衡化したSephadex G25カラムにてろ過する。抗体を含有する分画をプールして、アッセイする。次いで、抗体-ＳＭＣＣを、５０ｍＭ リン酸カリウム／５０ｍＭ 塩化ナトリウム／２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５で希釈して、最終濃度およそ１０ｍｇ／ｍｌとし、１０ｍＭのＤＭ１を含むジメチルアセトアミド溶液(１．７等量、５ ＳＭＣＣ／抗体と推定)にて反応させる。反応は、１６．５時間、室温、アルゴン下にて撹拌して行う。コンジュゲート反応混合物は、ｐＨ６．５の１×ＰＢＳによるSephadex G25ゲル濾過カラム(１．５×４．９ｃｍ)に濾過する。次いで、ＤＭ１／抗体の比(ｐ)を２５２ｎｍと２８０ｎｍの吸光度にて測定する。
典型的に、細胞毒性剤は、抗体の多数になりうるリジン残基により抗体にコンジュゲートされている。対象の抗体に存在するか、又は対象の抗体中に操作したチオール基によるコンジュゲートもまた達成されている。例えば、システイン残基は遺伝子工学技術によってタンパク質内に導入されて、リガンドの共有結合的付着部位を形成している(Better等 (1994) J. Biol. Chem. 13:9644 9650；Bernhard等 (1994) Bioconjugate Chem. 5:126 132；Greenwood等 (1994) Therapeutic Immunology 1:247 255；Tu等 (1999) Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:4862 4867；Kanno等 (2000) J. of Biotechnology, 76:207 214；Chmura等 (2001) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98(15): 8480 8484；米国特許第６２４８５６４号)。一旦遊離システイン残基が対象の抗体の中に存在すると、毒素はその部位に連結されうる。例えば、薬剤リンカー試薬であるマレイミドカプロイル-モノメチルアウリスタチンＥ(ＭＭＡＥ)、すなわちＭＣ-ＭＭＡＥ、マレイミドカプロイル-モノメチルアウリスタチンＦ(ＭＭＡＦ)、すなわちＭＣ-ＭＭＡＦ、MC-val-cit-PAB-MMAE又はMC-val-cit-PAB-MMAFをＤＭＳＯに溶解して、濃度がわかっているアセトニトリルと水にて希釈して、冷やしたシステイン誘導体化抗体を含むリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)に添加する。およそ１時間後に、過剰量のマレイミドを添加して反応を止め、反応していない抗体チオール基を覆った。反応混合物を遠心限外濾過によって濃縮し、毒素コンジュゲート抗体を精製して、ＰＢＳ中のＧ２５樹脂による溶出によって脱塩して、無菌条件下で０．２ｍのフィルターにて濾過して、保存のために凍結した。
【０１９３】
さらに、選択した抗体の遊離システインを、ビスマレイミド試薬ＢＭ(ＰＥＯ)４(Pierce Chemical)にて修飾して、抗体の表面上の反応していないマレイミド基を除去する。これは、ＢＭ(ＰＥＯ)４を５０％のエタノール／水混合液に１０ｍＭの濃度になるまで溶解して、およそ１．６ｍｇ／ｍｌ(１０マイクロモル)の濃度でリン酸緩衝食塩水に抗体を含有する溶液に１０倍のモル過剰量を加え、１時間反応させることによって達成される。過剰なＢＭ(ＰＥＯ)４は、３０ｍＭ クエン酸塩、ｐＨ６と１５０ｍＭ ＮａＣｌバッファによるゲル濾過にて除去した。およそ１０倍のモル過剰ＤＭ１を、ジメチルアセトアミド(ＤＭＡ)に溶解して、抗体-ＢＭＰＥＯ中間生成物に加える。また、ジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)を用いて薬剤成分試薬を溶解してもよい。反応混合物を終夜反応させて、ＰＢＳでゲル濾過ないし透析を行って反応していない薬剤を取り除く。ＰＢＳ中のＳ２００カラムによるゲル濾過を用いて、高分子量凝集塊を取り除いて、精製された抗体-ＢＭＰＥＯ-ＤＭ１コンジュゲートに供給する。
【０１９４】
実施例７：インビトロでの細胞死滅アッセイ
対象のＧＤＭポリペプチドを発現する哺乳動物細胞を、標準的な発現ベクター及びクローニング法を使用して得る。あるいは、対象のＧＤＭポリペプチドを発現する多くの腫瘍細胞株は例えばＡＴＣＣから公的に入手可能であり、標準的なＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳ分析法を使用して常套的に同定することができる。ついで抗ＧＤＭポリペプチドモノクローナル抗体（及びその毒素コンジュゲート誘導体）をアッセイで用いて、ＧＤＭポリペプチド発現細胞を死滅させるインビトロでの抗体の能力を定量することができる。
特に本発明に関し、細胞表面上に安定してＧＤＭポリペプチドを発現するＰＣ３由来細胞株（ここではＰＣ３−ｇＤ−ＭＤＰと呼ぶ）を、標準的な技術を用いてエンジニアリングすることができ、ＰＣ３−ｇＤ−ＭＤＰ細胞によるＧＤＭポリペプチドの発現は、標準ＦＡＣＳ細胞選別、ＥＬＩＳＡ及び免疫組織化学分析を用いて確認することができる。ＭＭＡＥにコンジュゲートした抗ＧＤＭモノクローナル抗体の、対応するＧＤＭ発現細胞の死を引き起こす能力は、以下のプロトコルを採用するインビトロ細胞死滅アッセイを用いて決定することができる（Promega Corp. Technical Bulletin TB288; Mendoza et al (2002) Cancer Res. 62:5485-5488）。
１．増殖培地中の、約１０４個の細胞（ＰＣ３−ｇＤ−ＭＤＰ細胞又はＧＤＭを発現しない非形質導入細胞）を含む５０μｌの細胞培養液の一定分量を、９６ウェル式の壁が不透明なプレートに分配する。細胞を含まない５０μｌの増殖培地を収容する追加的コントロールウェルを設定する。
２．ＧＤＭ−ＭＭＡＥコンジュゲート抗体、又はＧＤＭに結合しないＭＭＡＥコンジュゲートコントロールモノクローナル抗体の容量５０μｌを、０．０００１〜１００μｇ／ｍｌに亘る様々な濃度で各ウェルに添加し、プレートを３７℃で５％のＣＯ２下で３〜５日間インキュベートする。
３．プレートを約３０分間室温に平衡化する。
４．各ウェル内の細胞培養培地の容量に等しい容量の、Ｐｒｏｍｅｇａ社製ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｏ  蛍光細胞生存度試薬を添加し、軌道シェーカーでプレートを２分間振盪し、細胞を溶解させる。
５．プレートを室温で１０分間インキュベートし、蛍光シグナルを安定化させる。
６．Ｔｒｏｐｉｘ  Ｗｉｎｇｌｏｗプログラムを用いるルミノメーターに蛍光度を記録し、ＲＬＵ＝相対的蛍光単位を報告する。
【０１９５】
上記アッセイから得られる結果により、ＧＤＭ−ＭＭＡＥ抗体が、抗体に依存する形で対応するＧＤＭポリペプチドを発現する細胞の死を誘発する能力を有することが実証された。つまり、ＧＤＭ−ＭＭＡＥ及びＭＭＡＥコンジュゲートコントロールはいずれも、１μｇ／ｍｌ以下の抗体濃度で非形質導入ＰＣ３細胞の有意な死滅を誘発することができなかった。１μｇ／ｍｌを超える抗体濃度では、非形質導入ＰＣ３細胞死の容量は、抗体に依存する形で抗体濃度に伴い線形に増加した。従って、１μｇ／ｍｌを超える抗体濃度での非形質導入ＰＣ３細胞の死滅は、反応混合物中に存在するＭＭＡＥ毒素のレベルが増加する結果に特異的な結果ではなく、使用する抗体の結合特異性の関数ではなかった。
しかしながら、安定してＧＤＭポリペプチドを発現するＰＣ３−ｇＤ−ＭＤＰ細胞に関し、ＭＭＡＥコンジュゲートコントロールが、抗体の、非形質導入ＰＣ３細胞を死滅させる能力と同じパターンで細胞死を誘発する一方、ＧＤＭ−ＭＭＡＥはこのレベルを有意に下回る抗体濃度で（例えば、０．００１μｍｇ／ｍｌ）有意な細胞死を誘発する。実際、１μｇ／ｍｌの抗体濃度で（非ＧＤＭ特異性ＭＭＡＥコンジュゲートコントロール抗体は有意な細胞死を示さない）、ほぼ全てのＰＣ３−ｇＤ−ＭＤＰ細胞はＧＤＭ−ＭＭＡＥによって死滅する。従って、このようなデータにより、ＧＤＭ特異性のモノクローナル抗体は、細胞の表面上に発現するときＧＤＭポリペプチドに結合し、結合するそれらの細胞の死を誘発する能力を有することが示された。
【０１９６】
実施例９：インビボでの腫瘍細胞死滅アッセイ
インビボでの腫瘍細胞の死を誘発する能力について、毒素コンジュゲート又は非コンジュゲート抗ＧＤＭポリペプチドモノクローナル抗体の有効性を試験するために、以下のプロトコルを採用した。
フラスコ内において、一組の胸腺欠損ヌードマウスの皮下に、ＧＤＭポリペプチドを発現する５×１０６個の腫瘍促進細胞を播種した。腫瘍が１００〜２００ｍｍ３の平均腫瘍容積に達したら、マウスを均等に５組に分け、以下のように処理した。
グループ１−ＰＢＳコントロール溶媒を週に１回の頻度で４週に亘って投与
グループ２−非特異的コントロール抗体を、週に１回１ｍｇ／ｋｇの容量で、４週に亘って投与
グループ３−非特異的コントロール抗体を、週に１回３ｍｇ／ｋｇの容量で、４週に亘って投与
グループ４−特異的抗ＧＤＭポリペプチド抗体を、週に１回１ｍｇ／ｋｇの容量で、４週に亘って投与
グループ５−特異的抗ＧＤＭポリペプチド抗体を、週に１回３ｍｇ／ｋｇの容量で、４週に亘って投与
次いで、各治療グループのマウスの平均腫瘍容量を周期的に測定し、抗体の有効性を決定した。
【０１９７】
実施例９：ＧＤＭのハイブリダイゼーションプローブとしての使用
以下の方法は、ＧＤＭポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションプローブとして、すなわち哺乳類における腫瘍の存在を診断するための使用を記載する。
ここに開示した完全長又は成熟ＧＤＭポリペプチドのコード化配列を含んでなるＤＮＡを、ヒト組織ｃＤＮＡライブラリー又はヒト組織ゲノムライブラリーにおける相同的なＤＮＡ（例えば、ＧＤＭの天然に生じる変異体をコードするもの）のスクリーニングのためのプローブとしてもまた用いられる。
いずれかのライブラリーＤＮＡを含むフィルターのハイブリダイゼーション及び洗浄は、以下の高ストリンジェント条件で実施した。放射標識ＧＤＭ誘導プローブのフィルターへのハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアルデヒド、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、２×デンハルト溶液、及び１０％硫酸デキストランの溶液中で、４２℃において２０時間行った。フィルターの洗浄は、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの水溶液中、４２℃で行った。
ついで、完全長天然配列ＧＤＭをコードするＤＮＡと所望の配列同一性を有するＤＮＡは、この分野で知られた標準的な方法を用いて同定できる。
【０１９８】
実施例１０：大腸菌中でのＧＤＭの発現
この実施例は、大腸菌中での組換え発現によるＧＤＭの非グリコシル化形態の調製を例証する。
前記ＧＤＭポリペプチド配列をコードするＤＮＡ配列は、選択されたＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅した。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位を持たなければならない。種々の発現ベクターが用いられる。好適なベクターの例は、ｐＢＲ３２２（大腸菌由来のもの；Bolivar等, Gene, 2:95 (1977)参照）であり、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性についての遺伝子を含む。ベクターは、制限酵素で消化され、脱リン酸化される。ＰＣＲ増幅した配列は、次いで、ベクターに結合させる。ベクターは、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ポリ-Ｈｉｓリーダー（最初の６つのＳＴIIコドン、ポリ-Ｈｉｓ配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む）、ＧＤＭコードする領域、ラムダ転写ターミネーター、及びａｒｇＵ遺伝子を含む。
ライゲーション混合物は、ついで、上掲のSambrook等に記載された方法を用いて選択した大腸菌の形質転換に使用される。形質転換体は、それらのＬＢプレートで成長する能力により同定され、次いで抗生物質耐性クローンが選択される。プラスミドＤＮＡが単離され、制限分析及びＤＮＡ配列で確認される。
選択されたクローンは、抗生物質を添加したＬＢブロスなどの液体培地で終夜成長させることができる。終夜培地は、続いて大規模培地の播種に用いられる。次に細胞を所望の光学密度まで成長させ、その間に発現プロモーターが作動する。
さらに数時間の細胞培養の後、遠心分離による集菌が可能である。遠心分離で得られた細胞ペレットは、この分野で知られた種々の試薬を用いて可溶化され、次いで可溶化ＧＤＭポリペプチドを、タンパク質が堅く結合する条件下で金属キレート化カラムを用いて精製した。
【０１９９】
以下の手法を用いて、ポリ-Ｈｉｓ（ポリ-ヒス）タグ形態で前記ＧＤＭポリペプチド配列を大腸菌で発現させてもよい。ＧＤＭをコードするＤＮＡを選択したＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅した。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位、及び効率的で信頼性のある翻訳開始、金属キレートカラムでの迅速な精製、及びエンテロキナーゼでのタンパク質分解的除去を与える他の有用な配列を含む。次いでＰＣＲ増幅された、ポリ-Ｈｉｓタグ配列を発現ベクターに結合させ、それを株５２（W3１１0 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) clpP(lacIq)）に基づく大腸菌宿主の形質転換に使用した。形質転換体は、最初に５０ｍｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有するＬＢ中、３０℃で振盪しながら３−５のＯ．Ｄ．６００に達するまで成長させた。ついで培地をＣＲＡＰ培地（３．５７ｇの(ＮＨ４)２ＳＯ４、０．７１gのクエン酸ナトリウム・２Ｈ２Ｏ、１．０７gのＫＣｌ、５．３６ｇのＤｉｆｃｏ酵母抽出物、５００ｍＬ水中の５．３６gのShefield hycase SF、並びに１１０ｍＭのＭＰＯＳ、ｐＨ７．３、０．５５%（w/v）のグルコース及び７ｍＭのＭｇＳＯ４の混合で調製）中に５０−１００倍希釈し、３０℃で振盪させながら約２０−３０時間成長させた。試料を取り出してＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析により発現を確認し、バルク培地を遠心分離して細胞のペレットとした。細胞ペレットを精製及びリフォールディングまで凍結させた。
０．５から１Ｌの発酵（６−１０gペレット）からの大腸菌ペーストを、７Ｍのグアニジン、２０ｍＭのトリス、ｐＨ８バッファー中で１０容量（w/v）で再懸濁させた。固体硫酸ナトリウム及びテトラチオン酸ナトリウムを添加して最終濃度を各々０．１Ｍ及び０．０２Ｍとし、溶液を4℃で終夜撹拌した。この工程により、すべてのシステイン残基が亜硫酸化によりブロックされた変性タンパク質がもたらされた。溶液をBeckman Ultracentrifuge中で４０，０００ｒｐｍで３０分間濃縮した。上清を金属キレートカラムバッファー（6Ｍのグアニジン、20ｍＭのトリス、ｐＨ7.4）の３−５容量で希釈し、０．２２ミクロンフィルターを通して濾過して透明化した。透明化抽出物を、金属キレートカラムバッファーで平衡化させた５ｍｌのQiagen Ni-NTA金属キレートカラムに充填した。カラムを５０ｍＭのイミダゾール（Calbiochem, Utrol grade）を含む添加バッファー、ｐＨ７．４で洗浄した。タンパク質を２５０ｍＭのイミダゾールを含有するバッファーで溶離した。所望のタンパク質を含有する画分をプールし、４℃で保存した。タンパク質濃度は、そのアミノ酸配列に基づいて計算した吸光係数を用いて２８０ｎｍにおけるその吸収により見積もった。
【０２００】
試料を、２０ｍＭのトリス、pH８．６、０．３ＭのＮａＣｌ、２．５Ｍの尿素、５ｍＭのシステイン、２０ｍＭのグリシン及び１ｍＭのＥＤＴＡからなる新たに調製した再生バッファー中に徐々に希釈することによりタンパク質を再生させた。リフォールディング容量は、最終的なタンパク質濃度が５０〜１００マイクログラム／ｍｌとなるように選択した。リフォールディング溶液を４℃で１２−３６時間ゆっくり撹拌した。リフォールディング反応はＴＦＡを最終濃度０．４％（約３のｐＨ）で添加することにより停止させた。タンパク質をさらに精製する前に、溶液を０．２２ミクロンフィルターを通して濾過し、アセトニトリルを最終濃度２−１０％で添加した。再生したタンパク質を、Poros R１/H逆相カラムで、０．１％ＴＦＡの移動バッファーと１０〜８０％のアセトニトリル勾配での溶離を用いてクロマトグラフにかけた。Ａ２８０吸収を持つ画分の一定分量をＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析し、相同な再生タンパク質を含有する画分をプールした。一般的に、殆どの正しく再生したタンパク質種は、これらの種が最も緻密であり、その疎水性内面が逆相樹脂との相互作用から遮蔽されているので、アセトニトリルの最低濃度で溶離される。凝集した種は通常、より高いアセトニトリル濃度で溶離される。誤って再生したタンパク質を所望の形態から除くのに加えて、逆相工程は試料からエンドトキシンも除去する。
所望の折り畳みタンパク質を含有する画分をプールし、弱い窒素流を溶液に向けながらアセトニトリルを除去した。透析又は調製バッファーで平衡化したＧ２５Superfine（Pharmacia）樹脂でのゲル濾過及び滅菌濾過により、０．１４Ｍの塩化ナトリウム及び４％のマンニトールを含む２０ｍＭのHepes、ｐＨ６．８にタンパク質を調製した。
【０２０１】
実施例１１：哺乳動物細胞中でのＧＤＭポリペプチドの発現
この実施例は、哺乳動物細胞における組み換え発現によるＧＤＭポリペプチドの潜在的なグリコシル化形態の調製を例示する。
発現ベクターとしてｐＲＫ５（１９８９年３月１５日発行のＥＰ３０７２４７を参照のこと）を用いた。場合によっては、本明細書のＧＤＭポリペプチドをコードするＤＮＡを、選択した制限酵素を持つｐＲＫ５に結合させ、上掲のSambrook等に記載されたようなライゲーション方法を用いてＧＤＭＤＮＡを挿入させる。得られたベクターは、ＧＤＭ−ＤＮＡと呼ばれる。
一実施態様では、選択された宿主細胞は２９３細胞とすることができる。ヒト２９３細胞（ATCC CCL １573）は、ウシ胎児血清及び場合によっては栄養成分及び／又は抗生物質を添加したＤＭＥＭなどの媒質中で組織培養プレートにおいて成長させて集密化した。約１０μｇのｐＲＫ５−ＧＤＭ ＤＮＡを、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子をコードする約１μｇのＤＮＡと混合し[Thimmappaya等, Cell, 31:543(1982)]、５００μｌの１ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．２２７ＭＣａＣｌ２に溶解させた。この混合物に、５００μｌの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＮａＰＯ４を滴下添加し、２５℃で１０分間沈殿物を形成させた。沈殿物を懸濁し、２９３細胞に加えて３７℃で約４時間定着させた。培養培地を吸引し、２ｍｌのＰＢＳ中２０％グリセロールを３０秒間添加した。２９３細胞は、次いで無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約５日間インキュベートした。
形質移入の約２４時間後、培養培地を除去し、培養培地（単独）又は２００μＣｉ／ml３５Ｓ−システイン及び２００μＣｉ／ml３５Ｓ−メチオニンを含む培養培地で置換した。１２時間のインキュベーションの後、条件培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、１５％ＳＤＳゲルに添加した。処理したゲルを乾燥させ、ＧＤＭポリペプチドの存在を現すとして選択された時間にわたってフィルムにさらした。形質転換した細胞を含む培地は、更なるインキュベーションを施し（無血清培地で）、培地を選択されたバイオアッセイで試験した。
【０２０２】
これに換わる技術において、ＧＤＭポリペプチドをコードするＤＮＡは、Somparyrac等、Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981)に記載された、硫酸デキストラン法を用いて２９３細胞に一過的に導入される。２９３細胞は、スピナーフラスコ内で最大密度まで成長させ、７００μｇのｐＲＫ５−ＧＤＭＤＮＡを添加する。細胞は、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、ＰＢＳで洗浄した。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で4時間インキュベートした。細胞を２０%グリセロールで９０秒間処理し、組織培養培地で洗浄し、組織培養培地、５μg/mlウシインシュリン及び０．１μｇ/mlウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入した。約４日後に、条件培地を遠心分離して濾過し、細胞及び細胞片を除去した。次いで発現されたＧＤＭを含む試料を濃縮し、透析及び／又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法によって精製した。
他の実施態様では、ＧＤＭポリペプチドをＣＨＯ細胞で発現させることができる。ｐＲＫ５−ＧＤＭは、ＣａＰＯ４又はＤＥＡＥ−デキストランなどの公知の試薬を用いてＣＨＯ細胞に形質移入することができる。上記したように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地（単独）又は３５Ｓ-メチオニン等の放射性標識を含む培地に置換することができる。ＧＤＭポリペプチドの存在を判定した後、培養培地を無血清培地に置換してもよい。好ましくは、培地を約６日間インキュベートし、ついで条件培地を収集する。ついで、発現されたＧＤＭポリペプチドを含む培地を濃縮して、任意の選択した方法によって精製することができる。
【０２０３】
また、エピトープタグＧＤＭは、宿主ＣＨＯ細胞において発現させてもよい。ＧＤＭタンパク質をコードする配列は、ｐＲＫ５ベクターからサブクローニングした。サブクローン挿入物は、ついで、ＰＣＲを施してバキュロウイルス発現ベクター中のポリ-Ｈｉｓタグ等の選択されたエピトープタグを持つ枠に融合できる。ポリ-ＨｉｓタグＧＤＭ挿入物は、ついで、安定なクローンの選択のためのＤＨＦＲ等の選択マーカーを含むＳＶ４０誘導ベクターにサブクローニングできる。最後に、ＣＨＯ細胞をＳＶ４０誘導ベクターで（上記のように）形質移入した。発現を確認するために、上記のように標識化を行ってもよい。発現されたポリ-ＨｉｓタグＧＤＭを含む培養培地は、次いで濃縮し、Ｎｉ２＋−キレートアフィニティークロマトグラフィー等の選択された方法により精製できる。
また、ＧＤＭポリペプチドは、一過性発現法によって、ＣＨＯ及び／又はＣＯＳ細胞中で、あるいは他の安定な発現法によってＣＨＯ細胞中で発現させることもできる。
ＣＨＯ細胞における安定な発現は，以下の方法を用いて実施することが可能である。タンパク質を、各タンパク質の可溶形態のコード化配列（例えば、細胞外ドメイン）がヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ２ドメインを含むＩｇＧ１定常領域配列に融合したＩｇＧコンストラクト（イムノアドヘシン）及び／又はポリ-Ｈｉｓタグ形態として発現する。
ＰＣＲ増幅に続いて、それぞれのＤＮＡを、Ausubel等, Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.１6, John Wiley and Sons (1997)に記載されたような標準的技術を用いてＣＨＯ発現ベクターにサブクローニングした。ＣＨＯ発現ベクターは、対象とするＤＮＡの５’及び３’に適合する制限部位を有し、ｃＤＮＡの便利なシャトル化(Shuttling)ができるように作製される。ベクターは、Lucas等, Nucl. Acids Res. 24: 9, 1774-1779 (1996)に記載されたようにＣＨＯ細胞での発現を用い、対象とするｃＤＮＡ及びジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）の発現の制御にＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサーを用いる。ＤＨＦＲ発現は、形質移入に続くプラスミドの安定な維持のための選択を可能にする。
所望のプラスミドＤＮＡの１２マイクログラムを、市販の形質移入試薬Superfect(登録商標)(Quiagen), Dosper(登録商標)及びFugene(登録商標)（Boehringer Mannheim）を用いいて約一千万のＣＨＯ細胞に導入した。細胞は、上掲のLucas等に記載されているように成長させた。約３×１０７細胞を、下記のような更なる成長及び生産のためにアンプル中で凍結させた。
【０２０４】
プラスミドＤＮＡを含むアンプルを水槽に配して解凍し、ボルテックスにより混合した。内容物を１０mLの媒質を含む遠心管にピペットして、１０００rpmで５分間遠心分離した。上清を吸引して細胞を１０mLの選択培地（０．２μm濾過ＰＳ２０、５％の０．２μm透析濾過ウシ胎児血清を添加）中に懸濁させた。次いで細胞を９０mLの選択培地を含む１００mlスピナーに分けた。１−２日後、細胞を１５０mLの選択成長培地を満たした２５０mLスピナーに移し、３７℃でインキュベートした。さらに２−３日後、２５０mL、５００mL及び２０００mLのスピナーを３×１０５細胞/mLで播種した。細胞培地を遠心分離により新鮮培地に交換し、生産培地に再懸濁させた。任意の適切なＣＨＯ培地を用いてもよいが、実際には１９９２年６月１６日に発行された米国特許第５１２２４６９号に記載された生産培地を使用した。３Ｌの生産スピナーを１．２×１０６細胞/mLで播種した。０日目に、細胞数とｐＨを測定した。１日目に、スピナーをサンプリングし、濾過空気での散布を実施した。２日目に、スピナーをサンプリングし、温度を３３℃に変え、５００g/Lのグルコース及び０．６mLの１０％消泡剤（例えば３５％ポリジメチルシロキサンエマルション、Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion）の３０mLとした。生産を通して、ｐＨは７．２近傍に調節し維持した。１０日後、又は生存率が７０%を下回るまで、細胞培地を遠心分離で回収して０．２２μmフィルターを通して濾過した。濾過物は、4℃で貯蔵するか、即座に精製用カラムに充填した。
ポリ-Ｈｉｓタグコンストラクトについて、タンパク質はＮｉ−ＮＴＡカラム（Qiagen）を用いて精製した。精製の前に、イミダゾールを条件培地に５ｍＭの濃度まで添加した。条件培地を、０．３ＭのＮａＣｌ及び５ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭのHepes、ｐＨ７．４バッファーで平衡化した６ｍｌのＮｉ−ＮＴＡカラムに４−５ｍｌ／分の流速で４℃においてポンプ供給した。充填後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を０．２５Ｍイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離した。高度に精製されたタンパク質は、続いて１０ｍＭのHepes、０．１４ＭのＮａＣｌ及び４％のマンニトール、ｐＨ６．８を含む貯蔵バッファー中で２５ｍｌのＧ２５Superfine（Pharmacia）カラムを用いて脱塩し、−８０℃で貯蔵した。
イムノアドヘシン（Ｆｃ含有）コンストラクトを以下のようにして条件培地から精製した。条件培地を、２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ６．８で平衡化した５ｍｌのプロテインＡカラム（Pharmacia）にポンプ供給した。充填後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、１００ｍＭのクエン酸、ｐＨ３．５で溶離した。溶離したタンパク質は、１ｍｌの画分を２７５μＬの１Ｍトリスバッファー、ｐＨ９を含む管に回収することにより即座に中性化した。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ-Ｈｉｓタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩した。均一性はＳＤＳポリアクリルアミドゲルで試験し、エドマン（Edman）分解によりＮ末端アミノ酸配列決定した。
【０２０５】
実施例１２：酵母中でのＧＤＭの発現
以下の方法は、酵母中でのＧＤＭポリペプチドの組換え発現を記述する。
第１に、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからの前記ＧＤＭ配列の細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作成する。このようなＧＤＭ配列をコードするＤＮＡ及びプロモーターを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してＧＤＭの細胞内発現を指示する。分泌のために、このようなＧＤＭ配列をコードするＤＮＡを選択したプラスミドに、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡ、天然ＧＤＭシグナルペプチド又は他の哺乳動物シグナルペプチド、又は、例えば酵母菌アルファ因子又は転化酵素分泌シグナル／リーダー配列、及び（必要ならば）ＧＤＭの発現のためのリンカー配列と共にクローニングすることができる。
酵母菌株ＡＢ１１０等の酵母菌は、ついで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、１０%トリクロロ酢酸での沈降及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離で分析し、次いでクーマシーブルー染色でゲルの染色をすることができる。
続いて組換えＧＤＭは、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、次いで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。ＧＤＭを含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよい。
【０２０６】
実施例１３：バキュロウイルス感染昆虫細胞中でのＧＤＭの発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中におけるＧＤＭポリペプチドの組換え発現を示す。
前記ＧＤＭ配列をコードする配列を、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させた。このようなエピトープタグは、ポリ-Ｈｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域など）を含む。ｐＶＬ１３９３（Navagen）などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単に述べると、前記ＧＤＭ配列をコードする配列、又はそのコード化配列の所望の部分、例えば膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列又はタンパク質が細胞外である場合の成熟タンパク質をコードする配列が、５’及び３’領域に相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅される。５’プライマーは、隣接する（選択された）制限酵素部位を包含していてもよい。生産物は、ついで、選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。
組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGoldＴＭウイルスＤＮＡ（Pharmingen）を、Spodoptera frugiperda（「Ｓｆ９」）細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １7１１）中にリポフェクチン（GIBCO-BRLから市販）を用いて同時形質移入することにより作成される。２８℃で４−５日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、更なる増幅に用いた。ウイルス感染及びタンパク質発現は、O'Reilley等, Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)に記載されているように実施した。
【０２０７】
次に、発現されたポリ-ＨｉｓタグＧＤＭポリペプチドは、例えばＮｉ２＋−キレートアフィニティークロマトグラフィーにより次のように精製される。抽出は、Rupert等, Nature, 362:１75-１79 (１993)に記載されているように、ウイルス感染した組み換えＳｆ９細胞から調製した。簡単には、Ｓｆ９細胞を洗浄し、超音波処理用バッファー（２５ｍＭのHepes、ｐＨ７．９；１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２；０．１ｍＭのＥＤＴＡ；１０％グリセロール；０．１％のＮＰ−４０；０．４ＭのＫＣｌ）中に再懸濁し、氷上で２回２０秒間超音波処理した。超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清をローディングバッファー（５０ｍＭリン酸塩、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ７．８）で５０倍希釈し、０．４５μmフィルターで濾過した。Ｎｉ２＋−ＮＴＡアガロースカラム（Qiagenから市販）を５ｍＬの総容積で調製し、２５ｍＬの水で洗浄し、２５ｍＬのローディングバッファーで平衡させた。濾過した細胞抽出物は、毎分０．５ｍＬでカラムに充填した。カラムを、分画回収が始まる点であるＡ２８０のベースラインまでローディングバッファーで洗浄した。次に、カラムを、結合タンパク質を非特異的に溶離する二次洗浄バッファー（５０ｍＭリン酸塩；３００ｍＭのＮａＣｌ、１０%グリセロール、ｐＨ６．０）で洗浄した。Ａ２８０のベースラインに再度到達した後、カラムを二次洗浄バッファー中で０から５００ｍＭイミダゾール勾配で展開した。１ｍＬの分画を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色又はアルカリホスファターゼ（Qiagen）に複合したＮｉ２＋−ＮＴＡでのウエスタンブロットで分析した。溶離したＨｉｓ１０−タグＧＤＭポリペプチドを含む画分をプールしてローディングバッファーで透析した。
あるいは、ＩｇＧタグ（又はＦｃタグ）ＧＤＭポリペプチドの精製は、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む公知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
【０２０８】
実施例１４：特異的抗体を用いたＧＤＭポリペプチドの精製
天然又は組換えＧＤＭポリペプチドは、この分野の種々の標準的なタンパク質精製方法によって精製できる。例えば、前記ＧＤＭ配列のプロ-ポリペプチド変異体、成熟ポリペプチド変異体、又はプレ-ポリペプチド変異体は、そのような配列に特異的な抗体を用いた免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。一般に、免疫親和性カラムは抗ＧＤＭ抗体を活性化クロマトグラフィー樹脂に共有結合させて作成される。
ポリクローナル免疫グロブリンは、硫酸アンモニウムでの沈殿又は固定化プロテインＡ(Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.)での精製のいずれかにより免疫血清から調製される。同様に、モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿又は固定化プロテインＡでのクロマトグラフィーによりマウス腹水液から調製される。部分的に精製された免疫グロブリンは、ＣｎＢｒ-活性化セファロースTM(Pharmacia LKB Biotechnology)等のクロマトグラフィー樹脂に共有結合される。抗体が樹脂に結合され、樹脂がブロックされ、誘導体樹脂は製造者の指示に従って洗浄される。
このような免疫親和性カラムは、可溶化形態の前記ＧＤＭ配列を含有する細胞からの画分を調製することによるそのような配列の精製において利用される。この調製物は、洗浄剤の添加又はこの分野で公知の方法により微分遠心分離を介して得られる全細胞又は細胞成分画分の可溶化により誘導される。あるいは、シグナル配列を含む可溶化ＧＤＭポリペプチドは、細胞が成長する培地中に有用な量で分泌される。
可溶化ＧＤＭポリペプチド含有調製物は、免疫親和性カラムを通され、カラムはこのような配列の好ましい吸着をさせる条件下(例えば、洗浄剤存在下の高イオン強度バッファー)で洗浄される。ついで、カラムは、抗体／基板の結合を分解する条件下(例えば、約２−３といった低ｐＨ、高濃度の尿素又はチオシアン酸イオン等のカオトロープ)で溶離され、ＧＤＭポリペプチドがそれぞれ回収される。
【図面の簡単な説明】
【０２０９】
【図１】高悪性度の神経膠腫の生存時間に関連する３つの主な遺伝子発現パターンを明らかにする発現プロファイリングを示す。Ａは、生存時間との相関関係が陽性又は陰性である１０８の遺伝子による、グレードＩＩＩ及びＩＶのＭＤＡ原発性星細胞腫７６例の、教師無しクラスター形成を示す（遺伝子クラスターには陽性又は陰性と標識する）。Ｂは、３５のシグネチャー遺伝子を用いて同定した場合、同じ７６の試料が、ＰＮ腫瘍サブセット、Ｐｒｏｌｉｆ腫瘍サブセット及びＭｅｓ腫瘍サブセットのいずれであるかを示す。ｋ平均法によるクラスター形成に基づくセントロイドを、ｚスコアにより正規化した遺伝子発現値（−１〜＋１）を用いて示す。Ｃ〜Ｅは、ＭＤＡ、ＵＣＳＦ、及びＵＣＬＡの試料集団に基づくデータのカプラン−マイヤー生存図を示す。ログランク検定のｐ値を示す。ライトグレイ、黒及びグレイの線は、それぞれＰＮサブクラス、Ｐｒｏｌｉｆサブクラス及びＭｅｓサブクラスに対応している。垂直の刻み目は、生存時間の観察の検閲を示す。Ｆ及びＧは、ＰＮマーカーとＭｅｓマーカーの強い発現が相互排他的であることを示す。各バーは、個々の試料中における４つのマーカー遺伝子の、マイクロアレイによるｍＲＮＡの測定値（Ｆ）又はＴａｑｍａｎ実時間ＰＣＲによるｍＲＮＡの測定値（Ｇ）を示す。図示の遺伝子は、ＢＣＡＮ、ＤＬＬ３、ＣＨＩ３ｌ１／ＹＫＬ４０（ＹＫＬ４０）、及びＣＤ４４を含む。これらの値は、完全な試料セットに対する個々の試料の遺伝子発現のＺスコアを表わす。Ｈは、５のグリオーマ症例の組織マイクロアレイコアにおけるＢＣＡＮ及びＣＨＩ３Ｌ１／ＹＫＬ４０（ＹＫＬ４０）のインサイツハイブリダイゼーションを示す。矢印は、ＢＣＡＮ陽性コアにおける局所的なＣＨＩ３Ｌ１／ＹＫＬ４０の発現を示す。
【図２】高悪性度の神経膠腫の多くは、シグネチャー遺伝子発現の３つのパターンのうちの１に強い類似性を有することと、疾病が進行するとサブクラスがＭｅｓ表現型に移行することを特徴とする。Ａ〜Ｃの三次元グラフでは、各点の位置が、基準（ＭＤＡ）試料セットのｋ平均法によるクラスター形成により決定された、個々の試料と３つのセントロイドの各々との類似性（スピアマンｒ）を表わす。Ａは、アストロサイト（黒い点）又はオリゴデンドログリア（ライトグレイの点）の形態両方の、殆ど全てのグレードＩＩＩの腫瘍がＰＮセントロイドに最も類似しており、一方グレードＩＶの腫瘍（グレイの点）の集団においてはセントロイドへの類似性という点で分散性が高かったことを示す。Ｂは、３つのセントロイドの各々に類似する、健常細胞又は組織からなる複数の異なるセットを示す。試料は、胎児脳、成人脳（脳）、胎児組織由来の２つの神経幹細胞株（ＮＳＣ１、ＮＳＣ２）、ジャーカット、造血性幹細胞（ＨＳＣ）、平滑筋（ＳｍｏＭｕｓｃ）、内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌ）、滑膜（ｓｙｎｏｖ）、及び骨であった。増殖因子ＢＤＮＦへの暴露による処置後、当該因子への暴露を中止した神経幹細胞株を、ＮＳＣ１＊及びＮＳＣ２＊と命名した。Ｃは、一致する原発性及び続発性星細胞腫の２６の対（グレイ＝グレードＩＶ、黒＝グレードＩＩＩ）を示す。シグネチャークラスに移行があった一致する標本の各対を、太矢印で繋いだ。Ｄは、再発の際にＭｅｓサブクラスに移行した場合に、遺伝子が有意に上方制御されたことを示す。ＦＣ＝折り畳みの変化。Ｅは、ＰＮからＭｅｓ表現型への移行が見られた症例の、一致する原発性及び続発性腫瘍におけるＣＨＩ３Ｌ１／ＹＫＬ４０及びＯＬＩＧ２のＩＨＣを示す。
【図３】腫瘍のサブクラスを、増殖、血管新生、及び神経発生のマーカーの発現により区別したものである。Ａ〜Ｅにおいて、白丸は脳を、グレイの丸又はバーはＰＮを、黒い三角又はバーはＰｒｏｌｉｆを、グレイの四角又はバーはＭｅｓを示している。Ａは、ＰＣＮＡ及びＴＯＰ２Ａの発現について、他の全てのグループよりＰｒｏｌｉｆ腫瘍が豊富であることを示す（ｐ＜１×１０−６）。Ｂは、Ｍｅｓ腫瘍が、他の全てのグループから、ＰＥＣＡＭ、ＶＥＧＦ、ＢＥＧＦＲ１、及びＶＥＧＦＲ２の発現の増加により区別されることを示す（ｐ＜０．０５）。Ｃ及びＤは、ＰＮ腫瘍と比較して、Ｐｒｏｌｉｆ及び／又はＭｅｓ腫瘍が神経幹及び前駆マーカーであるＶＩＭ、ＮＥＳ、ＴＬＸ、ＣＤ１３３、ＭＥＬＫ、及びＤＬＸ２を強く発現し（Ｄ）、神経芽細胞及び神経細胞のマーカーであるＯＬＩＧ２、ＭＡＰ２、ＤＣＸ、ＮｅｕＮ，ＥＲＢＢ４、及びＧＡＤ２を弱く発現する（Ｅ）ことを示す。星印は、ＰＮとの差異が大きいことを示す（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡの後ボンフェローニｐｏｓｔ−ｈｏｃ）。Ｅは、ＰＮ又はＭＥＳ腫瘍と比較して、Ｐｒｏｌｉｆ腫瘍においてＧＦＡＰ発現が有意に低下したことを示す。
【図４】腫瘍サブクラス間で、染色体７、１０、及び１９におけるコピー数の変化が異なること、及びそのような差異が発現シグネチャーに反映されることを示す。Ａは、腫瘍シグネチャーのサブクラスによる染色体１０、７及び１９ｑのコピー数の変化の頻度を示す。ｃｈｒ１０について、腫瘍は、減少を示さないか、ＰＴＥＮ座位を含む１０ｑに限定された減少を示すか、ほぼ全ての座位の減少を示すことが報告された。ｃｈｒ７について、症例を、増加なし、ｃｈｒ７のいずれかの部分の増加、又は全ての座位の増加にスコア化した。ｃｈｒ１９ｑについて、症例を、半分以上の座位がコピー数の変化を示すかどうかに応じて、増加又は減少にスコア化した。Ｂは、プロットした全てのＵ１３３  Ａ＆Ｂプローブセットと比較した場合の、染色体の位置によるＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ、又はＭｅｓ腫瘍マーカーのリスト（標識化）のプローブセットの数を示す。
【図５】Ｐｒｏｌｉｆ及びＭｅｓ腫瘍は、Ａｋｔ及びＮｏｔｃｈシグナル伝達カスケードの差次的な活性化を示す。ＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ、及びＭｅｓ腫瘍はそれぞれ、ライトグレイの丸、黒の三角及びグレイの四角で示す。（Ａ）ＰＴＥＮの減少及び（Ｂ）ＥＧＦＲの増幅は、ＰＮシグネチャーと関連していないが、一方、（Ｃ）ＰＩＫ３Ｒ３座位の増加はＰｒｏｌｉｆシグネチャーと関連している。Ａ〜Ｃでは、図示のように、各試料について、ｘ軸は、サンプリングされた座位における増加又は減少を示すＣＧＨ  ｌｏｇ２比を表わし、ｙ軸はＰＮ又はＰｒｏｌｉｆセントロイドとの相関関係を示す。ｒ値は、ＣＧＨ比と発現シグネチャーセントロイドの類似性のピアソン及びスピアマンの相関係数を示す。Ｄは、正規化されたＰＴＥＮ  ｍＲＮＡ値が、ＰＮ腫瘍サブクラスと比較した場合に予後不良の腫瘍サブタイプにおいて低いことを示す。水平な線は、グループ平均を示す。Ｅ〜Ｈは、ＰＮ腫瘍が、Ｎｏｔｃｈ経路エレメントであるＤＬＬ３、ＤＬＬ１、ＨＥＹ２、及びＡＳＣＬ１を強く過剰発現することを示す。腫瘍サブクラス間には、ｐ−Ａｋｔ及び核Ｎｏｔｃｈの染色において差異がある。各腫瘍サブタイプについて、ｐ−Ａｋｔ（Ｊ）又は核Ｎｏｔｃｈ（Ｋ）が０、１、又は２と評価された試料の画分を示す。ＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ、及びＭｅｓサブタイプを、３つの棒グラフによりそれぞれ示す。
【図６】２つの独立した試料セット（Ａ及びＢ）における、ＰＴＥＮ及びＤＬＬ３の発現により予想される高悪性度の星細胞腫の生存時間を示す。左右のパネルは、２０位及び８０位の百分位数（パーセンタイル）におけるＰＴＥＮ発現の場合についてそれぞれモデル化された各試料集団（Ａ：ｎ＝７６、Ｂ：ｎ＝３４）に予想される生存関数を示す。黒及びグレイの線は、それぞれ発現の２０位及び８０位のパーセンタイルにおけるＤＬＬ３の発現により試料に予想される生存時間を示す。
【図７】グリオーマ細胞株の発現シグネチャーによるＥＧＦ／ＦＧＦ依存性ニューロスフェアの増殖を示す。Ａは、５の細胞株から採取して、ＥＧＦ＋ＦＧＦの存在下又は不在下で維持したニューロスフェア培養液の実施例を示す。図示のように、ＥＧＦ＋ＦＧＦの不在下での増殖について、細胞株の実施例を０〜４に評価した。Ｂは、１６の細胞株のニューロスフェア増殖の評点を、Ｍｅｓ又はＰｒｏｌｉｆセントロイドに対する発現シグネチャーの相関の関数として示す。
【図８Ａ】腫瘍サブタイプをまとめたものであり、腫瘍サブタイプの主な特徴を示す。
【図８Ｂ】腫瘍サブタイプをまとめたものであり、腫瘍サブタイプと神経発生の段階との平行性を示すモデルである。
【図１】
2009523709.tif 000041
【図２】
2009523709.tif 000042
【図３】
2009523709.tif 000043
【図４】
2009523709.tif 000044
【図５】
2009523709.tif 000045
【図６】
2009523709.tif 000046
【図７】
2009523709.tif 000047
【図８Ａ】
2009523709.tif 000048
【図８Ｂ】
2009523709.tif 000049
【誤訳訂正書】
【提出日】平成20年9月17日(2008.9.17)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）腫瘍の試料中において一組のＧＤＭの発現を測定すること、
（ｂ）腫瘍の細分類がＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ及びＭｅｓのいずれであるかを決定すること、及び
（ｃ）前記細分類に基づいた少なくとも有効量の治療薬に接触させること
を含む神経膠腫の治療法であって、
（Ｉ）Ｐｒｏｌｉｆ細分類を示す腫瘍は、有効量の（ａ）Ａｋｔアンタゴニスト及び／又はＰｒｏｌｉｆアンタゴニスト及び／又は有糸分裂阻害薬と、（ｂ）神経分化薬とに接触させることを含む併用療法により治療し、（ＩＩ）Ｍｅｓ細分類を示す腫瘍は、有効量の（ａ）Ａｋｔ及び／又はＭｅｓアンタゴニスト及び／又は抗血管新生薬と、（ｂ）神経分化薬とに接触させることを含む併用療法により治療し、（ＩＩＩ）ＰＮ細分類を示す腫瘍は、有効量の（１）ＰＮアンタゴニスト、及び／又は（２）神経分化薬と、場合によって、（３）Ａｋｔアンタゴニスト、（４）有糸分裂阻害薬及び（５）抗血管新生薬のうちの１つ以上の組み合わせに接触させることを含む併用療法により治療する、方法。
【請求項２】
細分類は、階層式クラスター形成を用いて腫瘍を一組の神経膠腫試料と比較することにより実行する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細分類は、ｋ平均法クラスター形成を用いて腫瘍を一組の神経膠腫試料と比較することにより実行する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
細分類は、投票方式を用いて腫瘍を一組の神経膠腫試料と比較することにより実行する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
細分類は、腫瘍と一組の既に分類した神経膠腫試料との、一組のＧＤＭマーカーの発現の類似性を比較することにより実行する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＰＮアンタゴニストは、ＤＬＬ３、Ｎｏｇ、Ｏｌｉｇ１、Ｏｌｉｇ２、ＴＨＲ及びＡＳＣＬ１を除いて表Ａに示すＰＮマーカーからなる群より選択する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
Ｐｒｏｌｉｆアンタゴニストは、表Ａに示すいずれかのＰｒｏｌｉｆマーカーのアンタゴニストからなる群より選択する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
Ｍｅｓアンタゴニストは、表Ａに示すいずれかのＭｅｓマーカーのアンタゴニストからなる群より選択する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
Ａｋｔアンタゴニストは、ａｋｔ１、ａｋｔ２、ａｋｔ３のアンタゴニスト、ＰＩＫ３、ＰＤ１、ＦＲＡＰ、ＲＰＳ６ＫＢ１、ＳＧＫ、ＥＧＦＲ、及びＩＧＦＲの制御ドメイン又は触媒ドメインのアンタゴニスト、並びに、ＰＴＥＮ、ＩＮＰＰ５Ｄ又はＩＮＰＰＬ１の活性化因子、刺激因子又は回復因子からなる群より選択する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
有糸分裂阻害薬は、テモゾロミド、ＢＣＮＵ、ＣＣＮＵ、ロムスチン、グリアデル、エトポシド、カルムスチン、イリノテカン、トポテカン、プロカルバジン、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、メトトレキサート、シタラビン、パクリタキセル、アウリスタチン、メイタンシノイドからなる群より選択する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
抗血管新生薬は、ＶＥＧＦアンタゴニスト、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２アンタゴニストからなる群より選択する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
神経分化薬は、ＭＡＰ２、βチューブリン、ＧＡＤ６５及びＧＡＰ４３からなる群より選択し、神経分化薬には、限定されないが、レチノイン酸、バルプロ酸とその誘導体（例えばエステル、塩、レチノイド、レチネート、バルプロ酸等）；甲状腺ホルモン又は甲状腺ホルモンレセプターの他のアゴニスト；ノギン；ＮＴＲＫ２レセプターのＢＤＮＦ、ＮＴ４／５又はその他アゴニスト；転写因子ＡＳＣＬ１、ＯＬＩＧ１の発現を増大させる薬剤；ｄｌｌ３アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ１、２、３又は４アンタゴニスト、ニカストリン、Ａｐｈ１Ａ、Ａｐｈ１Ｂ、Ｐｓｅｎ１、Ｐｓｅｎ２及びＰＳＥＮＥＮの小分子阻害剤を含むγ分泌阻害剤、デルタ様リガンド（Ｄｌｌ）−１アンタゴニスト、デルタ様リガンド（Ｄｌｌ）−４、ｊａｇｇｅｄ１アンタゴニスト、ｊａｇｇｅｄ２アンタゴニスト；ｎｕｍｂアゴニスト又はｎｕｍｂ様アゴニストが含まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）一組のＧＤＭの発現を測定すること、
（ｂ）腫瘍の細分類がＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ及びＭｅｓのいずれかを決定すること、及び
（ｃ）疾病の結果を予後予測及び／又は診断すること
を含む、神経膠腫の予後予測及び／又は診断の方法であって、
Ｐｒｏｌｉｆ又はＭｅｓ細分類によって予後不良又は生存時間が短いことが示され、ＰＮ細分類によって良好な予後又は生存時間が長いことが示される、方法。
【請求項１４】
細分類は、階層式クラスター形成を用いて腫瘍を一組の試料と比較することにより実行する、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
細分類は、ｋ平均法クラスター形成を用いて腫瘍を一組の試料と比較することにより実行する、請求項７に記載の方法。
【請求項１６】
細分類は、投票方式を用いて腫瘍を一組の試料と比較することにより実行する、請求項７に記載の方法。
【請求項１７】
細分類は、腫瘍と一組の既に分類した神経膠腫試料との、一組のＧＤＭマーカーの発現の類似性を比較することにより実行する、請求項７に記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）腫瘍試料におけるＰＴＥＮ及びＤＬＬ３腫瘍マーカーの発現を測定すること、及び
（ｂ）前記腫瘍マーカーの発現に基づいて予後の予測及び／又は診断を行うこと
を含む神経膠腫の予後予測及び／又は診断の方法であって、
ＰＴＥＮ及びＤＬＬ３両方の発現が強いと、良好な予後又は生存時間が長いことが示され、ＤＬＬ３の発現レベルとは無関係に、ＰＴＥＮの発現が弱いと、予後不良又は生存時間が短いことが示される、方法。
【請求項１９】
患者から採取した少なくとも２つの試料において、一組の神経膠腫決定マーカー（「ＧＤＭ」）の発現シグネチャーを比較することを含む神経膠腫のモニタリング又は診断法であって、
（ａ）第１の時点において第１の腫瘍試料におけるＧＤＭの発現を測定する工程、
（ｂ）第１の時点より後の第２の時点において、第２の腫瘍試料におけるＧＤＭの発現を測定する工程、及び
（ｃ）第１及び第２の試料の細分類が、ＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ及びＭｅｓのうちのいずれであるかを決定する工程
を含み、第１の腫瘍試料から第２の腫瘍試料の間に、ＰＮ又はＰｒｏｌｉｆからＭｅｓ細分類への移行があった場合、前記腫瘍の重症度の増大又は進行が示される、方法。
【請求項２０】
（ａ）腫瘍試料における一組のＧＤＭの発現を測定すること、
（ｂ）腫瘍の細分類が、ＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ及びＭｅｓのうちのいずれであるかを決定すること、及び
（ｃ）前記細分類に基づいた少なくとも有効量の治療薬に接触させること
を含む神経膠腫の大きさ又は増殖を抑制する方法であって、
（Ｉ）Ｐｒｏｌｉｆ細分類を示す腫瘍は、有効量の（ａ）Ａｋｔアンタゴニスト及び／又はＰｒｏｌｉｆアンタゴニスト及び／又は有糸分裂阻害薬と、（ｂ）神経分化薬とに接触させることを含む併用療法により治療し、（ＩＩ）Ｍｅｓ細分類を示す腫瘍は、有効量の（ａ）Ａｋｔ及び／又はＭｅｓアンタゴニスト及び／又は抗血管新生薬と、（ｂ）神経分化薬とに接触させることを含む併用療法により治療し、（ＩＩＩ）ＰＮ細分類を示す腫瘍は、有効量の（１）ＰＮアンタゴニスト、及び／又は（２）神経分化薬と、場合によって、（３）Ａｋｔアンタゴニスト、（４）有糸分裂阻害薬及び（５）抗血管新生薬のうちの１つ以上の組み合わせに接触させることを含む併用療法により治療し、よって腫瘍の大きさ又は増殖を低減する、方法。
【請求項２１】
細分類は、階層式クラスター形成を用いて腫瘍を一組の神経膠腫試料と比較することにより実行する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
細分類は、ｋ平均法クラスター形成を用いて腫瘍を一組の神経膠腫試料と比較することにより実行する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
細分類は、投票方式を用いて腫瘍を一組の神経膠腫試料と比較することにより実行する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
細分類は、腫瘍と一組の既に分類した神経膠腫試料との、一組のＧＤＭマーカーの発現の類似性を比較することにより実行する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
ＰＮアンタゴニストは、ＤＬＬ３、Ｎｏｇ、Ｏｌｉｇ１、Ｏｌｉｇ２、ＴＨＲ及びＡＳＣＬ１を除いて表Ａに示すいずれかのＰＮマーカーアンタゴニストからなる群より選択する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
Ｐｒｏｌｉｆアンタゴニストは、表Ａに示すいずれかのＰｒｏｌｉｆマーカーのアンタゴニストからなる群より選択する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
Ｍｅｓアンタゴニストは、表Ａに示すいずれかのＭｅｓマーカーのアンタゴニストからなる群より選択する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
Ａｋｔアンタゴニストは、ａｋｔ１、ａｋｔ２、ａｋｔ３のアンタゴニスト、ＰＩＫ３、ＰＤ１、ＦＲＡＰ、ＲＰＳ６ＫＢ１、ＳＧＫ、ＥＧＦＲ、及びＩＧＦＲの制御ドメイン又は触媒ドメインのアンタゴニスト、並びに、ＰＴＥＮ、ＩＮＰＰ５Ｄ又はＩＮＰＰＬ１の活性化因子、刺激因子又は回復因子からなる群より選択する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
抗血管新生薬は、ＶＥＧＦアンタゴニスト、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２アンタゴニストからなる群より選択する、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
有糸分裂阻害薬は、テモゾロミド、ＢＣＮＵ、ＣＣＮＵ、ロムスチン、グリアデル、エトポシド、カルムスチン、イリノテカン、トポテカン、プロカルバジン、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、メトトレキサート、シタラビン、パクリタキセル、アウリスタチン、メイタンシノイドからなる群より選択する、請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
神経分化薬は、ＭＡＰ２、βチューブリン、ＧＡＤ６５及びＧＡＰ４３からなる群より選択し、神経分化薬には、限定されないが、レチノイン酸、バルプロ酸とその誘導体（例えばエステル、塩、レチノイド、レチネート、バルプロ酸等）；甲状腺ホルモン又は甲状腺ホルモンレセプターの他のアゴニスト；ノギン；ＮＴＲＫ２レセプターのＢＤＮＦ、ＮＴ４／５又はその他アゴニスト；転写因子ＡＳＣＬ１、ＯＬＩＧ１の発現を増大させる薬剤；ｄｌｌ３アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ１、２、３又は４アンタゴニスト、ニカストリン、Ａｐｈ１Ａ、Ａｐｈ１Ｂ、Ｐｓｅｎ１、Ｐｓｅｎ２及びＰＳＥＮＥＮの小分子阻害剤を含むγ分泌阻害剤、デルタ様リガンド（Ｄｌｌ）−１アンタゴニスト、デルタ様リガンド（Ｄｌｌ）−４、ｊａｇｇｅｄ１アンタゴニスト、ｊａｇｇｅｄ２アンタゴニスト；ｎｕｍｂアゴニスト又はｎｕｍｂ様アゴニストが含まれる、請求項２０に記載の方法。
【請求項３２】
アンタゴニスト及び／又は薬剤との接触の結果、腫瘍細胞が死滅する、請求項２０に記載の方法。
【請求項３３】
ＰＮアンタゴニスト、Ｐｒｏｌｉｆアンタゴニスト又はＭｅｓアンタゴニストが、（１）抗ＰＮ抗体、抗Ｐｒｏｌｉｆ抗体又は抗Ｍｅｓ抗体、（２）抗ＰＮ抗原結合断片、抗Ｐｒｏｌｉｆ抗原結合断片又は抗Ｍｅｓ抗原結合断片、（３）ＰＮ結合オリゴペプチド、Ｐｒｏｌｉｆ結合オリゴペプチド又はＭｅｓ結合オリゴペプチド、（４）ＰＮ小分子アンタゴニスト、Ｐｒｏｌｉｆ小分子アンタゴニスト又はＭｅｓ小分子アンタゴニスト、或いは、（５）ＰＮアンチセンスオリゴヌクレオチド、Ｐｒｏｌｉｆアンチセンスオリゴヌクレオチド又はＭｅｓアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項２０に記載の方法。
【請求項３４】
ＰＮアンタゴニスト、Ｐｒｏｌｉｆアンタゴニスト又はＭｅｓアンタゴニストは、（１）抗ＰＮ抗体、抗Ｐｒｏｌｉｆ抗体又は抗Ｍｅｓ抗体、及び（２）抗ＰＮ抗原結合断片、抗Ｐｒｏｌｉｆ抗原結合断片又は抗Ｍｅｓ抗原結合断片からなる群より選択する、請求項２０に記載の方法。
【請求項３５】
アンタゴニスト抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及び一本鎖抗体からなる群より選択する、請求項２０に記載の方法。
【請求項３６】
抗体又は抗原結合断片は、増殖阻害剤又は細胞障害性剤にコンジュゲートさせる、請求項２０に記載の方法。
【請求項３７】
増殖阻害剤又は細胞障害性剤は、メイタンシノイド、カリケアマイシン、抗生物質、放射性同位体及び核酸分解酵素からなる群より選択する、請求項２０に記載の方法。
【請求項３８】
（ａ）腫瘍試料における一組のＧＤＭの発現を測定すること、
（ｂ）腫瘍の細分類が、ＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ及びＭｅｓのうちのいずれであるかを決定すること、及び
（ｃ）前記細分類に基づいた少なくとも有効量の治療薬に接触させること
を含む神経膠腫を有する哺乳動物の治療的処置方法であって、
（Ｉ）Ｐｒｏｌｉｆ細分類を示す腫瘍は、有効量の（ａ）Ａｋｔアンタゴニスト及び／又はＰｒｏｌｉｆアンタゴニスト及び／又は有糸分裂阻害薬と、（ｂ）神経分化薬とに接触させることを含む併用療法により治療し、（ＩＩ）Ｍｅｓ細分類を示す腫瘍は、有効量の（ａ）Ａｋｔ及び／又はＭｅｓアンタゴニスト及び／又は抗血管新生薬と、（ｂ）神経分化薬とに接触させることを含む併用療法により治療し、（ＩＩＩ）ＰＮ細分類を示す腫瘍は、有効量の（１）ＰＮアンタゴニスト、及び／又は（２）神経分化薬と、場合によって、（３）Ａｋｔアンタゴニスト、（４）有糸分裂阻害薬及び（５）抗血管新生薬のうちの１つ以上の組み合わせに接触させることを含む併用療法により治療し、よって腫瘍の大きさ又は増殖を低減する、方法。
【請求項３９】
アンタゴニスト又は薬剤を投与した結果、神経膠腫が死滅する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
アンタゴニスト又は薬剤が、抗体、抗抗原結合抗体断片、オリゴペプチド、小分子アンタゴニスト又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
アンタゴニスト抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及び一本鎖抗体からなる群より選択する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
抗体又は抗原結合断片は、増殖阻害剤又は細胞障害性剤にコンジュゲートさせる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
増殖阻害剤又は細胞障害性剤は、メイタンシノイド、カリケアマイシン、抗生物質、放射性同位体及び核酸分解酵素からなる群より選択する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
試料中における、ＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ又はＭｅｓ神経膠腫決定マーカー（「ＧＤＭ」）の発現レベルの測定方法であって、試料をＰＮ結合剤、Ｐｒｏｌｉｆ結合剤又はＭｅｓ結合剤に曝すこと、及び試料中におけるそれぞれの結合量を決定することを含み、前記結合量により、試料中におけるＰＮ−ＧＤＭ、Ｐｒｏｌｉｆ−ＧＤＭ又はＭｅｓ−ＧＤＭそれぞれの発現レベルが示される方法。
【請求項４５】
ＰＮ結合剤、Ｐｒｏｌｉｆ結合剤又はＭｅｓ結合剤は、抗ＰＮ抗体、抗Ｐｒｏｌｉｆ抗体又は抗Ｍｅｓ抗体、ＰＮ結合抗体断片、Ｐｒｏｌｉｆ結合抗体断片又はＭｅｓ結合抗体断片、ＰＮオリゴペプチド、Ｐｒｏｌｉｆオリゴペプチド又はＭｅｓオリゴペプチド、ＰＮ小分子アンタゴニスト、Ｐｒｏｌｉｆ小分子アンタゴニスト、又はＭｅｓ小分子アンタゴニスト、及びＰＮアンチセンスオリゴヌクレオチド、Ｐｒｏｌｉｆアンチセンスオリゴヌクレオチド又はＭｅｓアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群より選択する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
抗ＰＮ抗体、抗Ｐｒｏｌｉｆ抗体又は抗Ｍｅｓ抗体は、モノクローナル抗体、抗原結合抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体及び一本鎖抗体からなる群より選択する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
ＰＮ結合剤、Ｐｒｏｌｉｆ結合剤又はＭｅｓ結合剤を検出可能に標識する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
神経膠腫を有する哺乳動物の生存時間を予測する方法であって、
ａ）腫瘍の試験試料を除去すること、及び
ｂ）試験試料と、患者の生存時間が既知である三十（３０）以上の悪性度の高い神経膠腫からなる組とにおける、ＰＴＥＮ及びＤＬＬ３の発現レベルを測定すること
を含み、試験試料中のＰＴＥＮ及びＤＬＬ３両方の発現レベルが高い場合、標準試料の集団の中央値より生存時間が長い確率が統計的に高いことが示され、試験試料中のＰＴＥＮ又はＤＬＬ３の発現レベルが低い場合、標準試料の集団の中央値より生存時間が短い確率が統計的に高いことが示される、方法。
【請求項４９】
哺乳動物の神経膠腫の重症度を診断する方法であって、
（ａ）当該哺乳動物から採取された組織を含む試験試料を
（ｉ）ＰＴＥＮポリペプチドに結合する抗体、オリゴペプチド又は有機小分子である第１の試薬、及び
（ｉｉ）ＤＬＬ３ポリペプチドに結合する抗体、オリゴペプチド又は有機小分子である第２の試薬
に接触させること、並びに
（ｂ）試験試料中における、第１試薬のＰＴＥＮポリペプチドとの複合体形成量と、第２試薬のＤＬＬ３ポリペプチドとの複合体形成量をそれぞれ測定すること
を含み、ＰＴＥＮ複合体形成及びＤＬＬ３複合体形成両方の量が大きい場合に軽度の腫瘍が示され、ＰＴＥＮ複合体形成又はＤＬＬ３複合体形成の量が小さい場合に重度の腫瘍が示される、方法。
【請求項５０】
第１試薬及び／又は第２試薬を検出可能に標識する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
第１試薬及び／又は第２試薬を固体の支持体に付着させる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
神経膠腫の（ｉ）治療的処置又は（ｉｉ）診断的検出に有用な薬物の調製における、（ａ）ＰＮ−ＧＤＭポリペプチド、Ｐｒｏｌｉｆ−ＧＤＭポリペプチド又はＭｅｓ−ＧＤＭポリペプチド、又は（ｂ）（ａ）をコードする核酸配列の使用。
【請求項５３】
ＧＤＭポリペプチドが、抗体、ＧＤＭ結合抗体断片、ＧＤＭ結合オリゴペプチド、ＧＤＭ小分子アンタゴニスト、又はＧＤＭアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項５２に記載の使用。
【請求項５４】
抗体が、モノクローナル抗体、抗原結合抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体又は一本鎖抗体である、請求項５２又は５３に記載の使用。
【請求項５５】
神経膠腫を有する哺乳動物を治療的に処置する方法であって、有効量の神経分化薬と、（１）Ａｋｔアンタゴニスト、（２）有糸分裂阻害薬及び（３）抗血管新生薬のうちの１つ以上との組合せに接触させることを含み、結果として腫瘍の大きさ又は増殖が低減される、方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
関連出願
この出願は、米国特許法第１１９条(ｅ)に基づいて２００５年１２月１６日に出願された米国特許出願番号第６０/７５０９４４号の優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、癌、特に神経膠腫の診断、予後の予測及び治療の方法を目的とする。
【０００３】
発明の背景
悪性腫瘍（癌）は、米国において心臓疾患に続き第２の主要な死亡原因である（Boring等, CA Cancel J. Clin. 43:7(1993)）。癌は、正常な組織から誘導されて腫瘍塊を形成する異常な又は腫瘍形成性の細胞の数の増加、これらの腫瘍形成性腫瘍細胞による隣接組織の侵襲、及び最終的に血液やリンパ系を介して局所のリンパ節や遠くの部位に転移と呼ばれる過程を介して広がる悪性細胞の生成を特徴とする。癌性状態においては、正常細胞が増殖しない条件下で細胞が増殖する。癌自体は、異なる侵襲及び攻撃性の程度で特徴付けられる広範な種々の形態で顕現する。
【０００４】
神経膠腫は原発性脳腫瘍に最も多い種類であり、一般に重篤な予後に関連している。神経膠芽腫（ＧＢＭ）及び未分化星状細胞腫（ＡＡ）を含む悪性度の高い星細胞腫は、成人の内因性脳腫瘍に最も多い。高悪性度の星細胞腫の分子遺伝学的理解は進歩したが（Ketange等, Curr. Opin. Oncol. 15:197-203 (2003)）、起源となる細胞種類は依然として不明確であり、疾病の病原力の分子的決定要因はよく分かっていない。これらの腫瘍の細胞起源及び分子的病変形成がもっとよく理解されれば、ほぼ一様に致死性であるこれらの腫瘍の治療の新規標的を同定することができる。
腫瘍の類別（グレード）は多くの場合正確な診断及び疾病の経過の予後予測にとって非常に重要であり、神経膠腫も例外ではない。数十年に亘る経験から、組織学に基づく神経膠腫の診断システムが導かれた。神経膠腫は、主にアストロサイトの形態を示すか、又はオリゴデンドログリアの形態を示すかに基づいて組織学的に決定され、細胞性、核の非定形性、壊死、有糸分裂形、及び微小血管性増殖といった全て生物学的攻撃行動に関連する特徴によって類別される。このような診断システムは、数十年に亘る神経膠腫の臨床経験の末に開発されたもので、現在の神経腫瘍学の基礎となっている。Kleihues, P.等による、世界保健機構（「ＷＨＯ」）の腫瘍の分類、Cancer 88:2887 (2000)参照。ＷＨＯによる星細胞種の分類の基本構想は、四（４）つのグレードに分けられる。悪性度の低い腫瘍はグレードＩ（毛様細胞性星細胞腫）及びグレードＩＩ（星状芽細胞腫）に分類され、一方それよりも悪性度の高い腫瘍はグレードＩＩＩ（未分化星状細胞腫）とグレードＩＶ（多形神経膠芽腫）と定義される。乏突起膠腫及び混合膠腫（オリゴデンドログリア成分及びアストロサイト成分の両方を有する）は、悪性度の低い変異体（ＷＨＯのグレードＩＩ）と、それよりも悪性度の高い（ＷＨＯのグレードＩＩＩ）変異体に生じる。
【０００５】
最近まで、星細胞腫とその他の神経膠腫は、脳の実質内に所在するグリア細胞から生じると思われていた。しかしながら、ヒト及び動物の研究における新しい証拠により、神経膠腫の別の細胞起源として神経幹細胞が示唆されている（(Caussinus及びGonzalez, Nat. Genet. 37: 1125 (2005); Singh等, Cancer Res. 63: 5821-5828 (2003); Zhu等, Cancer Cell 8: 119 (2005))。マウスモデルにより、アストロサイト又は神経幹／前駆細胞が、ヒト神経膠腫の病理組織学的特徴を示す腫瘍を生じさせ得ることが実証されている（Bachoo等, Cancer Cell 1: 269-277 (2002); Uhrbom等, Cancer Res. 62: 5551-5558 (2002)）。成体のヒトの前脳が神経幹細胞源を豊富に含むこと（(Sanai等Nature 427: 740-744 (2004))、及びヒトＧＢＭが腫瘍原性の神経幹様細胞を含むこと（Galli等, Cancer Res. 64: 7011-7021 (2004); Ignatova等, GLIA 39: 193-206 (2002); Singh等, Nature 432: 396-401 (2004)）が実証されたことにより、神経幹及び／又は前駆細胞がヒト神経膠腫の有望な発生源であることが示唆され、また前記の実証により、ＧＢＭの幹細胞様成分を標的とすることを目指すアプローチにより、更に効果的な療法が得られると推論される（Berger等, Lancet Oncol. 5: 511-514 (2004); Fomchenko及びHolland, Exp. Cell Res. 306: 323-329 (2005); Ignatova等, 上掲; Oliver and Wechsler-Reya, Neuron 42: 885-888 (2004)）。しかしながら、重要なことに、疾病の進行または治療的応答に対する幹様細胞の寄与は解明されておらず、腫瘍細胞のうち幹様特性を示す細胞の割合も明らかでない。
患者の予後及び治療上の決定は正確な病理学的類別に基づいて行われるため、一貫性は重要な属性である。大部分で再現性を示す一方で、現在の組織学に基づくシステムは、種類及び類別に関して神経病理学者の間で判断の実質的な相違を生じさせ得る。Louis, DN等, Am J. Pathol. 159: 779-86 (2001); Prayson RA等, J. Neurol. Sci. 175: 33-9 (2000); Coons等, Cancer 79:1381-93 (1997)。更に、類別の正確な方法は、時間の経過と共に変化する。最後に、このアプローチは、形態学（Burger, Brain Pathol. 12:257-9 (2002)）、即ち分子的最終状態より生物学的最終状態に基づくため、可能性のある新規化合物を同定する能力は限られている。
【０００６】
現在では、組織学に基づくびまん性神経膠腫の類別は、患者の余命の予測に最も効果がある。しかしながら、組織学は神経膠腫の病理学を説明するものではなく、新規の分子マーカーの同定及び新規治療法の開発にそれ程有用でもない。更に、分子マーカーの発現及び治療上の応答の両方に臨床的に関連するびまん性神経膠腫の未確認のサブクラスが存在することの証拠も多く得られている。Mischel PS等, Cancer Biol. Ther. 2:242-7 (2003)参照。更に、様々な治療計画において、組織学的に同一の腫瘍に対する臨床的応答が大きく異なる場合があることが報告されている。Mischel等, 上掲; Cloughesy, TF等, Cancer 97: 2381-6 (2003)参照。これは、基礎となる生態学の解明に組織病理学的評価がどれだけ貢献しているかを強調するものである。腫瘍学者が分子を標的とした療法を志向するにつれ、分子によって定義される個別のサブグループが益々重要となっている。しかしながら、特定の腫瘍関連遺伝子が研究されている一方、個々の遺伝子／タンパク質アッセイのみか、場合によっては組織学的特性と組み合わせた同アッセイは、これまでのところ、生存時間を予測するものではなく、治療法の決定の指標として有用でない。Tortosa, A.等, Cancer 97: 1063-71 (2003); Reavey-Cantwell, JF等, J. Neurooncol. 55: 195-204 (2001); Bouvier-Labit, C.等, Neuropathol. Appl. Neurobiol. 24:381-8 (1998); Stark, AM等, Zentralbl Neurochir. 64: 30-6 (2003); Li, J.等, Science 275: 1943-7 (1997)参照。
複数の研究は、ＡＡ及びＧＢＭ（それぞれグレードＩＩＩ及びＩＶの星状細胞腫としても知られる）の臨床的サブクラスと予後の分子的相関関係を調査している。腫瘍のグレードは、疾病の結果の最も確実で強い予後の予測手段である（Prados and Levin, Semin Oncol. 27: 1-10 (2000)）。染色体（ｃｈｒ）１０ｑの異型接合性の欠損は、ＡＡよりＧＢＭで多く発生するもので、ＧＢＭの生存期間が短いことと関連付けられている（Balesaria等, Br. J. Can. 81: 1371-1377 (1999); Schmidt等, J. Neuropathol. Exp. Neurol. 61: 321-328 (2002); Smith等, J. Nat. Can. Inst.  93: 1246-1256 (2001)）。診断時の年齢が高いことはＧＢＭのネガティブな予後因子であり（Curran等, J. Natl. Cancer Inst. 85; 704-710 (1993)）、結果の分子マーカーは患者の年齢によって異なる（Batchelor等, Clin. Cancer Res. 10: 228-233 (2004); Smith等, J. Natl. Cancer Inst. 93: 1246-1256 (2001)）。これらの事実は、年齢に関連する分子のサブクラスが存在することを示唆するものである。ｐ５３変異とＥＧＦＲの増幅は相互に排他的なＧＢＭサブグループを定義することが報告されている（von Deimling等, Glia 15, 328-338 (1995); Watanabe等, Brain Pathology 6, 217-223 (1996)）が、最近の研究により、この分類法の妥当性が問題となっており（Okada等, Cancer Research 63, 413-416 (2003)）、ｐ５３変異又はＥＧＦＲ座位の変更の、予後予測における価値は明らかでない（Heimberger等, Clinical Cancer Research 11: 1462-1466 (2005); Ushio等, Frontiers in Bioscience 8: e281-288 (2003)。これらの腫瘍の生物学的基礎の理解を深めることが、この疾病の治療の効果を上げるために必要であることは明らかである。
【０００７】
マイクロアレイ分析は、同時に数千個もの個別の遺伝子の発現を評価できるため、公平で、定量的な、再現性のある腫瘍評価を行うことができるツールとして認識されている。この手法は、これまでに神経膠腫を含む多数の異なる癌に適用されている。Mischel, P.S.等, Oncogene 22: 2361-73 (2003); Kim, S.等, Mol. Cancer Ther. 1:1229-36 (2002); Ljubimova等, Cancer Res. 61: 5601-10 (2001); Nutt, CL等, Cancer Res. 63: 1602-7 (2003); Rickman, D.S.等, Cancer Res. 61: 6885-91 (2001); Sallinen, S.L.等, Cancer Res. 60: 6617-22 (2000); Shai, R.等, Oncogene 22: 4918-23 (2003)参照。組織学的評価と異なり、マイクロアレイ分析は、腫瘍に潜む遺伝的変異を同定することができ、よって腫瘍の分類と患者の予後の予測を改善させる。神経膠腫のマイクロアレイ分析を行った結果、分類されるグループの均質性が高まった。Freije等, Cancer Res. 64: 6503-6510 (2004)。更に、マイクロアレイ分析は、生存期間の予後診断手段として組織学的分類より優れていることも分かっている。Freije等, 上掲。
悪性の神経膠腫の発現のプロファイリングにより、腫瘍グレードの進行、及び患者の生存に関連する遺伝子だけでなく、分子のサブタイプが同定された（Godard等, Cancer Res. 63: 6613-6625 (2003); Rickman等, Can. Res. 61: 6885-6891 (2001); van den Boom等, Am. J. Pathol. 163: 1033-1043 (2003)）。ＧＢＭとＡＡが引き続き組織学的な外観に基づいて定義されている一方で、発現のプロファイリングによる結果予測が組織学的特性より優れているという発見（Freije等, 上掲；Nutt等, Clin. Can. Res. 11: 2258-2264 (2003)）は、形態学に基づいてＡＡ及びＧＢＭとして定義された腫瘍は分子的遺伝子的サブタイプの混合であるという仮説を支持するものである。分子的に異なる疾病の実態は、標的とされる抗癌剤に対して異なる臨床的応答を示し得ると仮定すると、分子的に決定された腫瘍のサブセットの挙動が更に明らかとなれば、更に効果的な治療法の開発の助けとなり得る。
【０００８】
悪性の神経膠腫は、遺伝的病変の段階的蓄積の結果として進行すると思われる。例えば、未分化星状細胞腫は通常、（１）通常はｐ５３の変異による、機能的ｐ５３経路の欠損、（２）通常はｐ１６／ＡＲＦ座の削除による、機能的ｐ１６／ｐＲｂ経路の欠損、（３）ｒａｓ変異以外の原因によるｒａｓ経路の活性化、及び（４）正常なヒトのアストロサイト（ＮＨＡ）又はグレードＩＩの神経膠腫に稀に見られるテロメラーゼの再活性化を示す。Kleihues and Cavenee等, “Diffuse infiltrating astrocytomas,” Pathology and Genetics of Tumors of the Nervous System, W.K. Cavnee and P. Kleihues, Eds., pp. 9-21.  Lyon:IRAC Press (2000); Ichimura等, Cancer Res. 60: 417-424 (2000); Feldkamp等, Neurosurgery 45: 1442-1453 (1999)。多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）は、上述のようなｐ５３及びｐ１６／ｐＲｂ経路における変化に加え、Ａｋｔ経路の活性化に繋がるＰＴＥＮの破壊を含むことも多い。Hass-Kogan等, Curr. Biol. 8: 1195-1198 (2000), Holland等, Nat. Genet. 25: 55-57 (2000)。下流の標的に作用することにより、Ａｋｔは細胞周期阻害剤のレベルを下げることができ（Datta等, Cell 91: 231-241 (1997); Pap等, J. Biol. Chem. 273: 19929-19932 (1998); Brunet等, Cell 96: 857-868 (1999); Kops等, Nature, 398: 630-634 (1999); Medema等, Nature 404: 782-787 (2000)）、更には低酸素条件の下で血管性内皮増殖因子のレベルを増大させることができる。Mazure等, Blood 90: 3322-3331 (1997)。Ａｋｔはアポトーシスを抑制し、細胞周期の規制を解除し、且つ血管新生能を変化させることができる。更に、観察では、全てのＧＢＭ腫瘍の８０％が、高いレベルのＡｋｔの活性を示す。細胞生理学及びＧＢＭの高い発現に対するＡｋｔの既知の効果を考慮すると、Ａｋｔの活性化はＧＢＭの進行に強く関連している。Hass-Kogan、上掲; Holland、上掲。
癌抑制遺伝子のＰｔｅｎは、神経膠腫を含むヒトの種々の癌において変異、削除又は体細胞性に不活性化されることが多いホスファターゼをコードする。Li等, Science 275: 1943 (1997)。発癌に加え、Ｐｔｅｎは、胚におけるその中枢神経系（ＣＮＳ）の発現パターンが偏在性であること（Gimm等, Hum. Mol. Genet. 9: 1633 (2000); Luukko等, Mech. Dev. 83: 187 (1999)）、並びに神経障害がヒトＰｔｅｎの生殖系列の変異に関連することによって示唆されるように、脳の発達にも重要な役割を果たすと思われる。従来のＰｔｅｎ−／−ノックアウトマウスの早期の胎生致死は、脳発達の初期におけるＰｔｅｎの機能に関する研究の障害となった（Di Cristofano等, Nature Genet. 19: 348 (1998) and Stambolic等, Cell 95: 29 (1998)）が、親動物にＣｒｅ及びｌｏｘｐ導入遺伝子を用いたもの等の、プロモーターによって誘導されたトランスジェニックノックアウト動物は、Ｐｔｅｎが神経幹細胞産生を負に調節することを示唆した。Groszer等, Science 294: 2186-2189 (2001)。
【０００９】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路は、ホジキン病、Ｔ細胞リンパ腫、並びに乳癌、子宮頸癌、膵臓癌及び大腸癌を含む多数の癌の発現に関与している。40-44  Jundt, F.等, Blood 99:3398-403 (2002); Pear, W.S.等, J. Exp. Med. 183: 2283-91 (1996); Weijzen S.等, Nat. Med. 8: 979-86 (2002); Weijzen等, J. Cell Physiol. 194: 356-62 (2003); Miyamoto, Y.等, Cancer Cell 3: 565-76 (2003); Nickoloff, B.J.等, Oncogene 22: 6598-608 (2003)。レセプターのｎｏｔｃｈファミリーは、細胞運命の決定に密接に関与するヘテロ二量体の膜貫通タンパク質からなっている。細胞種類によって、ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、増殖、分化及びアポトーシスに、陽性に又は陰性に影響し得る。Artavanis-Tsakonas, S.等, Science 284: 770-6 (1999); Miele, L.等, J. Cell Physiol. 181: 393-409 (1999)。今日まで、ヒトには４つのｎｏｔｃｈレセプター（つまりｎｏｔｃｈ１−４）と、５つの対応するリガンド、即ちｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ−１（ｄｌｌ−１）、ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ−３（ｄｌｌ−３）、ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ−４（ｄｌｌ−４）、ｊａｇｇｅｄ−１及びｊａｇｇｅｄ−２が同定されている。ｎｏｔｃｈ経路は、ハリネズミ等の他の重要な癌経路と相互作用及び重複する（Hallahan等, Cancer Res. 64: 7794-7800 (2004) and Ras.  Fitzgerald, K.等, Oncogene 19: 4191-8 (2000); Ruiz-Hidalgo, R.J.等, J. Oncol. 14: 777-83 (1999)）。しかしながら、癌におけるｎｏｔｃｈの役割は、組織種類等の要因に基づき、複雑であると考えられる。ｎｏｔｃｈ−１の活性が、ｒａｓで形質転換したヒト細胞における癌性の表現型を維持するのに必要である（Weijzen, S.等, Nat. Med. 8: 979-86 (2002)）一方、ｎｏｔｃｈ−１シグナル伝達は、マウスの皮膚腫瘍及び非小細胞肺癌に腫瘍抑制効果を有することが発見された。Nicolas等, Nat. Genet. 33: 416-21 (2003); Sriuranpong, V.等, Cancer Res. 61: 3200-5 (2001)。この結果は、癌においてｎｏｔｃｈシグナル伝達が様々な役割を有することを示唆するものである。
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、小脳において、分化を抑制し、且つ増殖を促進する。Solecki, DJ.等, Neuron 31: 557-68 (2001)。更に、ｎｉｔｃｈシグナル伝達は、特に神経膠腫に関連付けられている。具体的には、ｎｏｔｃｈリガンドのｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ−１とｊａｇｇｅｄ−１及びｎｏｔｃｈ−１レセプターの発現は、神経膠腫細胞株とヒト神経膠腫の両方において亢進され、それらの下方制御は、複数の神経膠腫細胞株においてアポトーシスを誘発し、増殖を阻害し、よって動物モデルの生存期間を延長させた。Purow等, Cancer Res. 65(6): 2353-2363 (2005)。
【００１０】
しかしながら、腫瘍形成におけるｎｏｔｃｈシグナル伝達の役割は変わり得る。例えば、Ｎｏｔｃｈ−１活性によって髄芽腫の増殖が阻害される一方、Ｎｏｔｃｈ−２活性によってその増殖が促進されることが観察された。Fan等, Cancer Res. 64: 7787-7793 (2004)。最近ｎｏｔｃｈリガンドＤｌｌ３がｎｏｔｃｈの不活性化と関連することが示唆されており、ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路に対する本発明者の理解を更に複雑にしている。Ladi等, J. Cell Biol. 170: 983-992 (2005)。このように、現在のところ、腫瘍形成におけるｎｏｔｃｈの役割に対する理解は、単に不完全である。
マイクロアレイ分析によって得られるもの等の遺伝子発現のプロファイリングにより、神経膠腫の予後の予測において遺伝子発現パネルを同定することができるが、これまでのところ、予後の有効な予測手段となる個別の遺伝子発現を同定した分析はない。例えば、７４人の患者から採取した第３期及び第４期の神経膠腫の腫瘍組織のマイクロアレイ分析において、生存期間に関連して差次的に発現する遺伝子が５９５個同定された。Freije等, Cancer Res. 64: 6503-6510 (2004)。この群から、差次的発現が最も強く、一貫していた遺伝子４４個を同定した。この群を更に１６個の個別の遺伝子に絞り、逆転写−ＰＣＲによってさらに評価した。追加的なモデル化を行うことにより、生存期間の延長に関連する６つの遺伝子の１つであるｎｏｔｃｈリガンドＤＬＬ３の発現が増強していることが同定された。しかしながら、この研究により、マイクロアレイ分析により得られる遺伝子プロファイリングの予後予測及び診断上の価値が示された一方で、予後の予測を行う上で価値のある個別遺伝子は同定されなかった。
【００１１】
本発明者等は、ここで、神経膠腫の三（３）つの新規予後予測サブクラスを同定し、それらがａｋｔ及びＮｏｔｃｈシグナル伝達経路（Ｐｒｏｌｉｆ、Ｍｅｓ）の活性化に差次的に関連することを示す。神経又は前神経（ＰＮ）系列マーカー及びＮｏｔｃｈ経路の成分を示す１つの腫瘍分類では、生存期間中央値が増大することが示された。対照的に、増殖又は間葉のマーカーを特徴とする残る二（２）つの腫瘍分類は、短い生存期間に関連していた。
ここで本発明者等は更に、２つの遺伝子モデルを同定し、ＰＴＥＮ及びＤＬＬ３両方の強い発現が長い生存期間に関連することを明らかにすることにより、腫瘍の浸潤性に対するＡｋｔ及びＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の影響を実証する。更に、再発の際、原発時に前神経の表現型又は増殖性の表現型を示していた一部の腫瘍は間葉性のクラスへ移行し、よってこれらの分子的に定義される群が、別の分化状態又は腫瘍進行段階を表わし得ることが示唆された。このような予後の２つの遺伝子モデルのＤＤＬ３プラスＰＴＥＮの予後予測上の価値は２つの独立データセットにおいて統計的に有意であることが示されたので、Freije等によって開示された予後予測上の価値とは明確に異なるものである。ＢＭＰ２は、ＤＬＬ３と同じ腫瘍のサブクラスのマーカーである。２つの遺伝子モデルにおいてＢＭＰ２でＤＬＬ３を置換すると、ＤＬＬ３に見られる結果を再現することができない。
【００１２】
本発明者等は、更に、Ｎｏｔｃｈ又はＡｋｔ経路の活性化状態が腫瘍の浸潤性の主な決定因子であり、標的とした両方に対する応答を予測できることを発見した。
最後に、本発明者等は、予後不良の腫瘍が神経幹細胞のマーカー及びＡｋｔ経路のシグナル伝達及び血管新生又は増殖を特徴とすることを同定した。Ｎｏｔｃｈ経路のシグナル伝達、及び使用した神経前駆体のマーカーによって、予後予測上の腫瘍の特徴が更に明らかになる。正常な脳では増殖、血管新生、又はＮｏｔｃｈ及びＡｋｔシグナル伝達が殆ど行われないが、神経マーカーの強い発現が特徴的である。予後が良好なＰＮ腫瘍は予後不良のＭｅｓマーカーを有する細胞のパッチを示すことがあり、またＰＮ腫瘍はＭｅｓ表現型を伴って再発することがある。つまり、これらのことから、Ａｋｔシグナル伝達、血管新生又は増殖等の適切な生物学的過程を遮断することにより、予後不良の腫瘍が予後良好のＰＮ様腫瘍に変換する可能性が示唆される。これらの発見により、Ａｋｔシグナル経路、血管新生又は増殖と、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達又は神経分化を誘発するその他の処置とを組み合わせることにより、神経膠腫の増殖を遅らせる可能性が示唆される。
【００１３】
概要
本発明は概して、神経膠腫のモニタリング、診断、予後の予測及び治療の方法を提供する。一実施形態では、本発明は、神経膠腫の予後予測に関する三（３）つのサブクラスを提供する。これらのサブクラスの、ａｋｔ及びＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の活性化との関連性はそれぞれ異なっている。神経又は前神経（ＰＮ）系列マーカー及びＮｏｔｃｈ経路の成分を示す腫瘍の分類には、患者の生存期間中央値の増大が示された。対照的に、増殖（Ｐｒｏｌｉｆ）又は間葉（Ｍｅｓ）のマーカーは、短い生存期間に関連する。別の実施形態では、本発明は神経膠腫の２つの遺伝子モデルを提供し、これらのモデルでは、ＰＴＥＮ及びＤＬＬ３両方の比較的高い発現レベルは生存期間の延長の指標となり、ＰＴＥＮの低発現（ＤＬＬ３に関係なく）は生存期間の短縮の指標となる。
【００１４】
別の実施形態では本発明は、神経膠腫の治療法であって、（ｉ）腫瘍の試料中における一組の神経膠腫決定マーカー（「ＧＤＭ」）の発現を測定し、（ｉｉ）当該組の発現シグネチャーの細分類、即ち前神経（ＰＮ）であるか、増殖性（Ｐｒｏｌｉｆ）であるか又は間葉性（Ｍｅｓ）であるかを決定し、（Ｉ）Ｐｒｏｌｉｆ細分類を示す腫瘍を、有効量の（ａ）Ａｋｔアンタゴニスト及び／又はＰｒｏｌｉｆアンタゴニスト及び／又は有糸分裂阻害薬、及び（ｂ）神経分化薬に接触させることを含む併用療法により処置し、（ＩＩ）Ｍｅｓ細分類を示す腫瘍を、有効量の（ａ）Ａｋｔ及び／又はＭｅｓアンタゴニスト及び／又は抗血管新生薬、及び（ｂ）神経分化薬に接触させることを含む併用療法により処置し、（ＩＩＩ）ＰＮ細分類を示す腫瘍を、有効量の（１）ＰＮアンタゴニスト及び／又は（２）神経分化薬と、場合によって（３）Ａｋｔアンタゴニスト、（４）有糸分裂阻害薬、及び（５）Ｍｅｓアンタゴニスト及び／又は抗血管新生薬のうちの１つ以上とを組み合わせたものに接触させることを含む併用療法により処置することを含む方法を提供する。特定の態様では、Ａｋｔアンタゴニストはａｋｔ１、ａｋｔ２、ａｋｔ３のアンタゴニスト、ＰＩＫ３、ＰＤ１、ＦＲＡＰ、ＲＰＳ６ＫＢ１、ＳＧＫ、ＥＧＦＲ、ＩＧＦＲの制御又は触媒ドメインのアンタゴニスト、及びＰＴＥＮ、ＩＮＰＰ５Ｄ又はＩＮＰＰＬ１の活性化因子、刺激因子又は回復因子からなる群より選択される。別の特定の態様では、Ｐｒｏｌｉｆアンタゴニストは表Ａに示されるあらゆるＰｒｏｉｆマーカーのアンタゴニストからなる群より選択される。更なる特定の態様では、有糸分裂阻害薬は、テモゾロミド、ＢＣＮＣ、ＣＣＮＵ、ロムスチン、グリアデル、エトポシド、カルムスチン、イリノテカン、トポテカン、プロカルバジン、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、メトトレキサート、シタラビン、パクリタキセル、アウリスタチン、メイタンシノイドからなる群より選択される。また別の特定の態様では、Ｍｅｓアンタゴニストは、表Ａに示されるあらゆるＭｅｓマーカーのアンタゴニストからなる群より選択される。また別の特定の態様では、抗血管新生薬は、ＶＥＧＦアンタゴニスト、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２アンタゴニストからなる群より選択される。また別の態様では、ＰＮアンタゴニストは、ＤＬＬ３、Ｎｏｇ、Ｏｌｉｇ１、Ｏｌｉｇ２、ＴＨＲ及びＡＳＣＬ１を除き、表Ａに示されるあらゆるＰＮマーカーのアンタゴニストからなる群より選択される。また別の特定の態様では、神経分化薬は、ＭＡＰ２、βチューブリン、ＧＡＤ６５及びＧＡＰ４３からなる群より選択される。神経分化薬の例は、これらに限定されるものではないが、レチノイン酸、バルプロ酸、及びそれらの誘導体（例えば、エステル、塩、レチノイド、レチネート(retinates)、バルプロ酸等）、甲状腺ホルモン又は甲状腺ホルモンレセプターの他のアゴニスト、ノギン、ＢＤＮＦ、ＮＴ４／５又はＮＴＲＫ２レセプターの他のアゴニスト、転写因子ＡＳＣＬ１、ＯＬＩＧ１の発現を増大させる薬剤、ｄｌｌ３アゴニスト��Ｎｏｔｃｈ１、２、３又は４アンタゴニスト、γセクレターゼ阻害薬、例えばニカストリン、ＡｐｈｌＡ、ＡｐｈｌＢ、Ｐｓｅｎ１、Ｐｓｅｎ２及びＰＳＥＮＥＮの小分子阻害薬、デルタ様リガンド（Ｄｌｌ）−１アンタゴニスト、デルタ様リガンド（Ｄｌｌ）−４、ｊａｇｇｅｄ１アンタゴニスト、ｊａｇｇｅｄ２アンタゴニスト、ｎｕｍｂアゴニスト又はｎｕｍｂ様アゴニストを含む。
【００１５】
別の実施形態では、本発明は、本方法は、有効量の（１）神経分化薬と、（３）Ａｋｔアンタゴニスト、（４）有糸分裂阻害薬、及び（５）Ｍｅｓアンタゴニスト及び／又は抗血管新生薬のうちの１つ以上とを組み合わせたものに接触させることを含む、神経膠腫の治療法を提供する。特定の態様では、Ａｋｔアンタゴニストはａｋｔ１、ａｋｔ２、ａｋｔ３のアンタゴニスト、ＰＩＫ３、ＰＤ１、ＦＲＡＰ、ＲＰＳ６ＫＢ１、ＳＧＫ、ＥＧＦＲ、ＩＧＦＲの制御又は触媒ドメインのアンタゴニスト、及びＰＴＥＮ、ＩＮＰＰ５Ｄ又はＩＮＰＰＬ１の活性化因子、刺激因子又は回復因子からなる群より選択される。別の特定の態様では、Ｐｒｏｌｉｆアンタゴニストは表Ａに示されるあらゆるＰｒｏｉｆマーカーのアンタゴニストからなる群より選択される。更なる特定の態様では、有糸分裂阻害薬は、テモゾロミド、ＢＣＮＣ、ＣＣＮＵ、ロムスチン、グリアデル、エトポシド、カルムスチン、イリノテカン、トポテカン、プロカルバジン、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、メトトレキサート、シタラビン、パクリタキセル、アウリスタチン、メイタンシノイドからなる群より選択される。また別の特定の態様では、Ｍｅｓアンタゴニストは、表Ａに示されるあらゆるＭｅｓマーカーのアンタゴニストからなる群より選択される。また別の特定の態様では、抗血管新生薬は、ＶＥＧＦアンタゴニスト、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２アンタゴニストからなる群より選択される。また別の態様では、ＰＮアンタゴニストは、ＤＬＬ３、Ｎｏｇ、Ｏｌｉｇ１、Ｏｌｉｇ２、ＴＨＲ及びＡＳＣＬ１を除き、表Ａに示されるあらゆるＰＮマーカーのアンタゴニストからなる群より選択される。また別の特定の態様では、神経分化薬は、ＭＡＰ２、βチューブリン、ＧＡＤ６５及びＧＡＰ４３からなる群より選択される。神経分化薬の例は、これらに限定されるものではないが、レチノイン酸、バルプロ酸、及びそれらの誘導体（例えば、エステル、塩、レチノイド、レチネート、バルプロ酸等）、甲状腺ホルモン又は甲状腺ホルモンレセプターの他のアゴニスト、ノギン、ＢＤＮＦ、ＮＴ４／５又はＮＴＲＫ２レセプターの他のアゴニスト、転写因子ＡＳＣＬ１、ＯＬＩＧ１の発現を増大させる薬剤、ｄｌｌ３アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ１、２、３又は４アンタゴニスト、γセクレターゼ阻害薬、例えばニカストリン、ＡｐｈｌＡ、ＡｐｈｌＢ、Ｐｓｅｎ１、Ｐｓｅｎ２及びＰＳＥＮＥＮの小分子阻害薬、デルタ様リガンド（Ｄｌｌ）−１アンタゴニスト、デルタ様リガンド（Ｄｌｌ）−４、ｊａｇｇｅｄ１アンタゴニスト、ｊａｇｇｅｄ２アンタゴニスト、ｎｕｍｂアゴニスト又はｎｕｍｂ様アゴニストを含む。
【００１６】
別の実施形態では、本発明は神経膠腫の予後予測及び／又は診断方法を提供し、本方法は、（ｉ）腫瘍の試料中における神経膠腫の決定因子となる一組のマーカー（「ＧＤＭ」）の発現を測定すること、（ｉｉ）当該組の発現シグネチャーの細分類、即ち前神経（ＰＮ）であるか、増殖性（Ｐｒｏｌｉｆ）であるか又は間葉性（Ｍｅｓ）であるかを決定した後、（ｉｉｉ）疾病の結果の予後予測又は診断を行い、Ｐｒｏｌｉｆ又はＭｅｓの細分類によって予後不良又は基準試料からなる集団の中央値より短い生存期間を有する可能性が大きいことが統計的に示され、ＰＮの細分類によって、良好な予後又は基準試料からなる集団の中央値より長い生存期間を有する可能性が大きいことが統計的に示される。特定の態様では、細分類は、階層的クラスター形成を用いて行われる。別の特定の態様では、細分類はｋ平均法クラスター形成を用いて行われる。また別の特定の態様では、細分類は投票方式によって行われる。更なる特定の態様では、細分類は、腫瘍中のＧＤＭと腫瘍の基準セット中のＧＤＭの比較によって行われる。
【００１７】
また別の実施形態では、本発明は、神経膠腫のモニタリング又は診断方法であって、患者から採取した少なくとも２つの腫瘍試料における一組の神経膠腫決定マーカー（「ＧＤＭ」）の発現シグネチャーを比較すること、
（ｉ）第１の時点で第１腫瘍試料におけるＧＤＭの発現を測定すること、
（ｉｉ）第１の時点よりも後の第２の時点で第２の腫瘍試料におけるＧＤＭの発現を測定すること、及び
(ｉｉｉ)腫瘍試料におけるＧＤＭの発現シグネチャーを、前神経（ＰＮ）、増殖性（Ｐｒｏｌｉｆ）又は間葉性（Ｍｅｓ）に形態学的に再分類すること
を含み、第１腫瘍試料から第２腫瘍試料までの間に、細分類がＰＮからＰｒｏｌｉｆへ、Ｍｅｓへと移行することにより、前記腫瘍の重症度の上昇又は前記腫瘍の進行が示される方法を提供する。
【００１８】
別の実施形態では、本発明は、神経膠腫の増殖の抑制方法であって、（ｉ）腫瘍の試料中における一組の神経膠腫決定マーカー（「ＧＤＭ」）の発現を測定し、（ｉｉ）一組の発現シグネチャーの細分類、即ち前神経（ＰＮ）であるか、増殖性（Ｐｒｏｌｉｆ）であるか又は間葉性（Ｍｅｓ）であるかを決定し、（Ｉ）Ｐｒｏｌｉｆ細分類を示す腫瘍を、有効量の（ａ）Ａｋｔアンタゴニスト及び／又はＰｒｏｌｉｆアンタゴニスト及び／又は有糸分裂阻害薬、及び（ｂ）神経分化薬に接触させることを含む併用療法により処置し、（ＩＩ）Ｍｅｓ細分類を示す腫瘍を、有効量の（ａ）Ａｋｔ及び／又はＭｅｓアンタゴニスト及び／又は抗血管新生薬、及び（ｂ）神経分化薬に接触させることを含む併用療法により処置し、（ＩＩＩ）ＰＮ細分類を示す腫瘍を、有効量の（１）ＰＮアンタゴニスト及び／又は（２）神経分化薬と、場合によって（３）Ａｋｔアンタゴニスト、（４）有糸分裂阻害薬、及び（５）Ｍｅｓアンタゴニスト及び／又は抗血管新生薬のうちの１つ以上とを組み合わせたものに接触させることを含む併用療法により処置することを含み、その結果として腫瘍の大きさ又は増殖を低減する方法を提供する。特定の態様では、Ａｋｔアンタゴニストはａｋｔ１、ａｋｔ２、ａｋｔ３のアンタゴニスト、ＰＩＫ３、ＰＤ１、ＦＲＡＰ、ＲＰＳ６ＫＢ１、ＳＧＫ、ＥＧＦＲ、ＩＧＦＲの制御又は触媒ドメインのアンタゴニスト、及びＰＴＥＮ、ＩＮＰＰ５Ｄ又はＩＮＰＰＬ１の活性化因子、刺激因子又は回復因子からなる群より選択される。別の特定の態様では、Ｐｒｏｌｉｆアンタゴニストは表Ａに示されるあらゆるＰｒｏｉｆマーカーのアンタゴニストからなる群より選択される。更なる特定の態様では、有糸分裂阻害薬は、テモゾロミド、ＢＣＮＣ、ＣＣＮＵ、ロムスチン、グリアデル、エトポシド、カルムスチン、イリノテカン、トポテカン、プロカルバジン、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、メトトレキサート、シタラビン、パクリタキセル、アウリスタチン、メイタンシノイドからなる群より選択される。また別の特定の態様では、Ｍｅｓアンタゴニストは、表Ａに示されるあらゆるＭｅｓマーカーのアンタゴニストからなる群より選択される。また別の特定の態様では、抗血管新生薬は、ＶＥＧＦアンタゴニスト、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２アンタゴニストからなる群より選択される。また別の態様では、ＰＮアンタゴニストは、ＤＬＬ３、Ｎｏｇ、Ｏｌｉｇ１、Ｏｌｉｇ２、ＴＨＲ及びＡＳＣＬ１を除き、表Ａに示されるあらゆるＰＮマーカーのアンタゴニストからなる群より選択される。また別の特定の態様では、神経分化薬は、ＭＡＰ２、βチューブリン、ＧＡＤ６５及びＧＡＰ４３からなる群より選択される。神経分化薬の例は、これらに限定されるものではないが、レチノイン酸、バルプロ酸、及びそれらの誘導体（例えば、エステル、塩、レチノイド、レチネート、バルプロ酸等）、甲状腺ホルモン又は甲状腺ホルモンレセプターの他のアゴニスト、ノギン、ＢＤＮＦ、ＮＴ４／５又はＮＴＲＫ２レセプターの他のアゴニスト、転写因子ＡＳＣＬ１、ＯＬＩ���１の発現を増大させる薬剤、ｄｌｌ３アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ１、２、３又は４アンタゴニスト、γセクレターゼ阻害薬、例えばニカストリン、ＡｐｈｌＡ、ＡｐｈｌＢ、Ｐｓｅｎ１、Ｐｓｅｎ２及びＰＳＥＮＥＮの小分子阻害薬、デルタ様リガンド（Ｄｌｌ）−１アンタゴニスト、デルタ様リガンド（Ｄｌｌ）−４、ｊａｇｇｅｄ１アンタゴニスト、ｊａｇｇｅｄ２アンタゴニスト、ｎｕｍｂアゴニスト又はｎｕｍｂ様アゴニストを含む。特定の態様では、このような接触の結果、腫瘍細胞の増殖が低減するか、又は腫瘍細胞が死滅する。別の態様では、アンタゴニストは抗体又は抗原に結合する抗体断片である。また別の特定の態様では、アンタゴニスト抗体はモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又は一本鎖抗体である。また別の特定の態様では、アンタゴニスト抗体又は抗原に結合する抗体断片は、増殖阻害剤又は例えばメイタンシノイド又はカリケアマイシンを含む毒素、アウリスタチン、抗生物質、放射性同位体、核酸分解酵素等の細胞障害性剤にコンジュゲートしている。
【００１９】
別の実施形態では、本発明は、神経膠腫を有する哺乳動物の治療方法であって、（ｉ）腫瘍の試料中における一組の神経膠腫決定マーカー（「ＧＤＭ」）の発現を測定し、（ｉｉ）一組の発現シグネチャーの細分類、即ち前神経（ＰＮ）であるか、増殖性（Ｐｒｏｌｉｆ）であるか又は間葉性（Ｍｅｓ）であるかを決定し、（Ｉ）Ｐｒｏｌｉｆ細分類を示す腫瘍を、当該哺乳動物に対して治療的有効量の（ａ）Ａｋｔアンタゴニスト及び／又はＰｒｏｌｉｆアンタゴニスト及び／又は有糸分裂阻害薬、及び（ｂ）神経分化薬を投与することを含む併用療法により処置し、（ＩＩ）Ｍｅｓ細分類を示す腫瘍を、有効量の（ａ）Ａｋｔ及びＭｅｓアンタゴニスト及び／又は抗血管新生薬、及び（ｂ）神経分化薬に接触させることを含む併用療法により処置し、（ＩＩＩ）ＰＮ細分類を示す腫瘍を、有効量の（１）ＰＮアンタゴニスト及び／又は（２）神経分化薬と、場合によって（３）Ａｋｔアンタゴニスト、（４）有糸分裂阻害薬、及び（５）Ｍｅｓアンタゴニスト及び／又は抗血管新生薬のうちの１つ以上とを組み合わせたものに接触させることを含む併用療法により処置することを含み、その結果として腫瘍を治療的に処置する方法を提供する。特定の態様では、アンタゴニストは抗体、抗原に結合する抗体断片、オリゴペプチド、小分子アンタゴニスト、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。別の特定の態様では、抗体はモノクローナル抗体、抗原に結合する抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は一本鎖抗体である。また別の態様では、本方法に使用するのに適したアンタゴニスト又は薬剤は、場合によっては、増殖阻害剤又は例えばメイタンシノイド又はカリケアマイシン等の毒素、抗生物質、放射性同位体、核酸分解酵素等の細胞障害性剤にコンジュゲートしてもよい。
【００２０】
また別の実施形態では、本発明は、試料中のＰＮ−ＧＤＭ、Ｐｒｏｌｉｆ−ＧＤＭ、又はＭｅｓ−ＧＤＭの発現レベルを測定する方法を目的とし、本方法では、当該試料をＰＮ結合剤、Ｐｒｏｌｉｆ結合剤又はＭｅｓ結合剤に接触させ、試料中における各結合剤の結合量を測定することを含み、そのような結合量によって試料中におけるＰＮ−ＧＤＭ、Ｐｒｏｌｉｆ−ＧＤＭ又はＭｅｓ−ＧＤＭの発現レベルが示される。特定の態様では、ＰＮ結合剤、Ｐｒｏｌｉｆ結合剤又はＭｅｓ結合剤は、（１）抗ＰＮ抗体、抗Ｐｒｏｌｉｆ抗体、又は抗Ｍｅｓ抗体、（２）ＰＮ結合抗体断片、Ｐｒｏｌｉｆ結合抗体断片、又はＭｅｓ結合抗体断片、（３）ＰＮ結合オリゴペプチド、Ｐｒｏｌｉｆ結合オリゴペプチド、又はＭｅｓ結合オリゴペプチド、（４）ＰＮ小分子アンタゴニスト、Ｐｒｏｌｉｆ小分子アンタゴニスト、又はＭｅｓ小分子アンタゴニスト、或いは（５）ＰＮアンチセンスオリゴヌクレオチド、Ｐｒｏｌｉｆアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はＭｅｓアンチセンスオリゴヌクレオチドである。別の特定の態様では、前記抗体は、（ａ）モノクローナル抗体、（ｂ）抗原結合抗体断片、（ｃ）キメラ抗体、（ｄ）ヒト化抗体、又は（ｅ）一本鎖抗体である。また別の特定の態様では、このような抗体は、ＰＮ−ＧＤＭ、Ｐｒｏｌｉｆ−ＧＤＭ、又はＭｅｓ−ＧＤＭの結合位置及び／又は結合量を定性的及び／又は定量的に測定するのに有用な化合物の分子を用いて検出可能に標識される。
【００２１】
また別の実施形態では、本発明は神経膠腫を有する哺乳動物の生存可能性を予後予測する方法を目的とし、本方法は、（ａ）腫瘍の試験試料を除去すること、（ｂ）試験試料及び患者の生存期間が既知である三十（３０）個以上の悪性度の高い神経膠腫からなる組におけるＰＴＥＮ及びＤＬＬ３遺伝子産物の発現レベルを測定することを含み、試験試料中のＰＴＥＮ及びＤＬＬ３両方の発現レベルが高い場合に基準試料の集団における中央値より生存期間が長い可能性が統計的に高く、試験試料中におけるＰＴＥＮ又はＤＬＬ３の発現レベルが低い場合に基準試料の集団における中央値より生存期間が短い可能性が統計的に高いことが示される。
【００２２】
また別の実施形態では、本発明は、哺乳動物の神経膠腫の重症度を診断する方法を目的とし、本方法は、（ａ）哺乳動物から採取された神経膠腫細胞或いはＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質又はその他遺伝子産物の抽出物を含む試験試料に対し、（ｉ）ＰＴＥＮ  ＧＤＭに結合する抗体、抗原結合抗体断片、オリゴペプチド又は有機小分子である第１の試薬、及び（ｉｉ）ＤＬＬ３  ＧＤＭに結合する抗体、抗原結合抗体断片、オリゴペプチド、又は有機小分子である第２の試薬を接触させることと、（ｂ）試験試料中におけるＰＴＥＮ  ＧＤＭ及びＤＬＬ３  ＧＤＭと第１の試薬及び第２の試薬とのそれぞれの複合体形成の量を測定することとを含み、高レベルのＰＴＥＮ  ＧＤＭ複合体形成及び高レベルのＤＬＬ３  ＧＤＭ複合体形成によって軽度の腫瘍が示され、低レベルのＰＴＥＮ  ＧＤＭ複合体又はＤＬＬ３  ＧＤＭ複合体によって重度の腫瘍が示される。特定の態様では、第１の試薬及び／又は第２の試薬は、検出可能に標識する、固体の支持体に付着させる等する。別の特定の態様では、第１の試薬は、抗ＰＴＥＮ抗体、ＰＴＥＮ結合抗体断片、又はＰＴＥＮ結合オリゴペプチド、小分子、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。また別の特定の態様では、第２の試薬は、抗ＤＬＬ３抗体、ＤＬＬ３結合抗体断片、又はＤＬＬ３結合オリゴペプチド、小分子又はアンチセンスヌクレオチドとすることができる。また別の特定の態様では、抗ＰＴＥＮ抗体又は抗ＤＬＬ３抗体は、モノクローナル抗体、抗原結合抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体又は一本鎖抗体とすることができる。また別の特定の態様では、このような抗体は、ＰＴＥＮ又はＤＬＬ３結合剤の細胞への結合の位置及び／又は量を定性的及び／又は定量的に測定するのに有用な分子又は化合物を用いて標識する。
【００２３】
また別の実施形態では、本発明は神経膠腫の診断的検出に有用な医薬の調製における、（ａ）ＰＴＥＮ、又はＤＬＬ３ポリペプチド、或いは（ｂ）（ａ）をコードする核酸の使用を目的とする。特定の態様では、医薬はＰＴＥＮ結合剤又はＤＬＬ３結合剤とすることができる。別の特定の態様では、ＰＴＥＮ結合剤は、抗ＰＴＥＮ抗体、ＰＴＥＮ−結合抗体断片、又はＰＴＥＮ結合オリゴペプチド、小分子アンタゴニスト、アンチセンスオリゴヌクレオチドとすることができ、ＤＬＬ３結合剤は、抗ＤＬＬ３抗体、ＤＬＬ３結合抗体断片、又はＤＬＬ３結合オリゴペプチド、小分子、アンチセンスオリゴヌクレオチドとすることができる。また別の特定の態様では、抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は一本鎖抗体とすることができる。また別の特定の態様では、このようなＰＴＥＮ又はＤＬＬ３結合剤は、ＰＴＥＮ又はＤＬＬ３結合剤の、細胞への結合の位置及び／又は量を定性的及び／又は定量的に測定するのに有用な分子又は化合物を用いて標識される。
【００２４】
また別の実施形態では、本発明は、神経膠腫の診断的検出に有用な医薬の調製における（ａ）ＰＮ−ＧＤＭ、Ｐｒｏｌｉｆ−ＧＤＭ又はＭｅｓ−ＧＤＭ、或いは（ａ）をコードする核酸の使用を目的とする。特定の態様では、この医薬はＰＮ結合剤、Ｐｒｏｌｉｆ結合剤、又はＭｅｓ結合剤である。別の特定の態様では、ＰＮ結合剤、Ｐｒｏｌｉｆ結合剤、又はＭｅｓ結合剤は、（１）抗ＰＮ抗体、抗Ｐｒｏｌｉｆ抗体、又は抗Ｍｅｓ抗体、（２）ＰＮ結合抗体断片、Ｐｒｏｌｉｆ結合抗体断片、又はＭｅｓ結合抗体断片、（３）ＰＮ結合オリゴペプチド、Ｐｒｏｌｉｆ結合オリゴペプチド、又はＭｅｓ結合オリゴペプチド、（４）ＰＮ結合小分子、Ｐｒｏｌｉｆ結合小分子、又はＭｅｓ結合小分子、（５）ＰＮアンチセンスオリゴヌクレオチド、Ｐｒｏｌｉｆアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はＭｅｓアンチセンスオリゴヌクレオチドとすることができる。また別の特定の態様では、抗ＰＮ抗体、抗Ｐｒｏｌｉｆ抗体、又はＭｅｓ抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又は一本鎖抗体とすることができる。また別の特定の態様では、このようなＰＮ結合剤、Ｐｒｏｌｉｆ結合剤、又はＭｅｓ結合剤は、ＰＮ結合剤、Ｐｒｏｌｉｆ結合剤、又はＭｅｓ結合剤の細胞への結合の位置及び／又は量を定性的及び／又は定量的に測定するのに有用な分子又は化合物を用いて標識される。
【００２５】
本発明の詳細な説明
１．定義
用語「神経膠腫」は、脳又は脊髄のグリア細胞又はそれらの前駆体から生じる腫瘍を指す。神経膠腫は、主に星状（アストロサイト）形態を示すか又は乏突起（オリゴデンドログリア）形態を示すかに基づいて組織学的に定義され、全て生物学的に侵襲性の挙動に関連する特性である細胞性、核非定型性、壊死、有糸分裂の形、及び微小血管の増殖によって類別される。星細胞腫には主に２つの種類、即ち、高悪性度と低悪性度がある。高悪性度の腫瘍は急速に増殖し、血管新生化が活発で、脳内に広がり易い。低悪性度の星細胞腫は、通常は局在性で、時間をかけてゆっくりと増殖する。低悪性度の腫瘍と比較して、高悪性度腫瘍の侵襲性は大きく、非常に集中的な治療を要し、これに関連する生存期間は短い。子供の星細胞腫の多くは低悪性度であり、成人の同腫瘍の多くは高悪性度である。これらの腫瘍は、脳及び脊髄のいずれにも発生し得る。より一般的な低悪性度の星細胞腫を幾つか挙げると、若年性毛細胞性星細胞腫（ＪＰＡ）、繊維性星細胞腫、多形性黄色星状細胞腫（ＰＸＡ）及びDesembryoplastic神経上皮腫瘍（ＤＮＥＴ）である。最も一般的な２つの高悪性度の星細胞腫は、未分化星状細胞腫（ＡＡ）と多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）である。
本明細書において使用される用語「神経膠腫決定マーカー」（「ＧＤＭ」）は、一般に神経膠腫に関連付けられている細胞マーカーを指す。この用語は、マーカーをコードする遺伝子（例えば、ＤＮＡ、遺伝子増殖）と、その転写の結果得られる遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡ、コード化ポリペプチド）の両方を包含する。ＧＤＭマーカーは、表Ａに示されるような、前神経（ＰＮ）細分類、増殖性（Ｐｒｏｌｉｆ）細分類又は間葉性（Ｍｅｓ）細分類に特有のものであり得る。
【００２６】
表Ａ：神経膠腫決定マーカー（ＧＤＭ）
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【００２７】
「天然配列ＧＤＭポリペプチド」には、天然由来のＧＤＭポリペプチドに対応する同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。このような天然配列ＧＤＭポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生成することもできる。「天然配列ＧＤＭポリペプチド」という用語には、特に、特定のＧＤＭポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌形態(例えば、細胞外ドメイン配列)、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びそのポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明のある実施態様では、ここに開示される天然配列ＧＤＭポリペプチドは、表Ａに示されるポリペプチドに対応する成熟又は完全長天然配列ポリペプチドである。
「ＧＤＭポリペプチド変異体」とはＧＤＭポリペプチド、好ましくは、ここに開示するような完全長天然配列ＧＤＭポリペプチド配列、及びシグナルペプチドを欠くその変異型、本明細書に示されるような完全長天然配列ＧＤＭポリペプチドの細胞外ドメイン又は任意の他の断片と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有するここで定義するような、ここに開示するようなその活性型でありを意味する。このような変異体ポリペプチドには、例えば、完全長天然アミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端において一又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたポリペプチドが含まれる。特定の態様では、このような変異体ポリペプチドは、ここに開示する完全長天然配列ＧＤＭポリペプチド配列ポリペプチド、及びシグナルペプチドを欠くその変異型、ここに開示するような完全長天然配列ＧＤＭポリペプチドの細胞外ドメイン、又は他の任意の断片に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有している。特定の態様では、このような変異体ポリペプチドは、対応する天然配列ポリペプチドとは、長さ上で少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、又はそれより大きいアミノ酸残基において異なる。別の態様では、このような変異体ポリペプチドは、対応する天然ポリペプチド配列と比較して一つ以下の保存的アミノ酸置換、あるいは天然ポリペプチド配列と比較して２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０以下の保存的アミノ酸置換を有するにすぎない。
【００２８】
ここで同定したＧＤＭポリペプチド配列に関する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」とは、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした後の、特定のＧＤＭポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を測定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ-２プログラム用の完全なソースコードが下記の表１に提供されている配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を使用することによって得られる。ＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作成され、下記の表１に示したソースコードは米国著作権庁, ワシントンD.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ-２プログラムはジェネンテック社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから公的に入手可能であり、下記の表１に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標）Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され変動しない。
「ＧＤＭ変異体ポリヌクレオチド」又は「ＧＤＭ変異体核酸配列」とは、ここで定義されるように、ＧＤＭポリペプチド、好ましくはその活性型をコードし、ここに同定される完全長天然配列ＧＤＭポリペプチド配列、又はここに同定される各完全長ＧＤＭポリペプチド配列の他の任意の断片をコードする核酸配列（完全長ＧＤＭポリペプチドの完全なコード化配列の一部分のみを表す核酸によってコードされた）と、少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有する核酸分子を意味する。通常、このような変異体ポリヌクレオチドは、ここに開示する各完全長天然配列ＧＤＭポリペプチド配列、又はここに同定される各完全長ＧＤＭポリペプチド配列の任意の他の断片をコードする核酸配列と、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の核酸配列同一性を有している。このような変異体ポリヌクレオチドは、天然ヌクレオチド配列を含まない。
【００２９】
通常、このような変異体ポリヌクレオチドは、天然配列ポリペプチドとは、少なくとも約５０ヌクレオチド長が異なり、あるいはその変異は少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、又は１０００ヌクレオチド長に亘り、この文脈の「約」という用語は、表示ヌクレオチド配列長にその表示長の１０％を加えるか又は減じたものを意味する。
ここで同定されるＧＤＭポリペプチドコード化核酸配列に対する「パーセント(％)核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、対象のＧＤＭ核酸配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を測定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。ここでの目的のためには、％核酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ-２プログラム用の完全なソースコードが下記の表１に提供されている配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を使用することによって得られる。ＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作成され、下記の表１に示したソースコードは米国著作権庁,ワシントン D.C.，20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ-２プログラムはジェネンテック社、サウスサンフランシスコ, カリフォルニアから公的に入手可能であり、下記の表１に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標）Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され変動しない。
【００３０】
核酸配列比較にＡＬＩＧＮ-２が用いられる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与えられた核酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ-２のＣ及びＤのアラインメントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ＺはＤの全ヌクレオチド数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。％核酸配列同一性の計算の例として、表４及び５に「比較ＤＮＡ」と称される核酸配列の「ＲＥＦ-ＤＮＡ」と称される核酸配列に対する％核酸配列同一性の計算方法を示し、このとき「ＲＥＦ-ＤＮＡ」が対象となる仮説的ＧＤＭコード化核酸配列を表し、「比較ＤＮＡ」が対象となる「ＲＥＦ-ＤＮＡ」核酸分子が比較されている核酸分子のヌクレオチド配列を表し、そして「Ｎ」、「Ｌ」及び「Ｖ」の各々が異なった仮想ヌクレオチドを表す。特に断らない限りは、ここでの全ての％核酸配列同一性値は、直ぐ上のパラグラフに示したようにＡＬＩＧＮ-２コンピュータプログラムを用いて得られる。
【００３１】
他の実施態様では、ＧＤＭ変異体ポリヌクレオチドとは、ＧＤＭポリペプチドをコードする核酸分子であり、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で、ここに記載の完全長ＧＤＭポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とハイブリダイゼーションすることができる。このような変異体ポリペプチドは、このような変異体ポリヌクレオチドによってコードされているものであり得る。
ここに開示される種々のＧＤＭポリペプチドを記載するために使用される「単離」とは、自然環境の成分から同定され及び分離及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様では、このようなポリペプチドは、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でＳＤＳ-ＰＡＧＥにより均一になるまで精製される。このような単離されたポリペプチドには、ＧＤＭポリペプチドの自然環境由来の少なくとも一つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのポリペプチドが含まれる。しかしながら、通常は、このような単離されたポリペプチドは少なくとも一つの精製工程により調製される。
【００３２】
「単離された」ＧＤＭポリペプチドをコードする核酸は、同定され、ポリペプチドをコードする核酸の天然源に通常付随している少なくとも一つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。上述のような単離された核酸分子のいずれもが、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。故に、そのような核酸分子のいずれもが、天然の細胞中に存在する特異的なポリペプチドコード化核酸分子とは区別される。
「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列と、リボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００３３】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングに必要な温度が高くなり、プローブが短くなるとそれに必要な温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、相補鎖がその融点より低い環境に存在する場合に、変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーション配列の間で所望される相同性の程度が高くなればなるほど、用いることができる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をよりストリンジェントにすることになり、低い温度はストリンジェントを低下させることになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの更なる詳細及び説明については、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology（Wiley Interscience Publishers, 1995）を参照のこと。
【００３４】
ここで定義される「ストリンジェント条件」又は「高度のストリンジェンシー条件」は、（１）洗浄に低イオン強度及び高温度を用いる、例えば、５０℃で、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム；（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤を用いる、例えば、４２℃で、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム；又は（３）４２℃で、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％の硫酸デキストラン溶液中で終夜ハイブリダイゼーション、４２℃で、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中にて１０分間の洗浄、ついで５５℃で、ＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる１０分間の高ストリンジェンシー洗浄を用いるものによって同定される。
「中程度のストリンジェント条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Press, 1989)に記載されているように同定され、上記のストリンジェントより低い洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度のストリンジェント条件は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハード液、１０％硫酸デキストラン、及び２０ｍｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中にて３７℃での終夜インキュベーション、次いで１×ＳＳＣ中にて約３７−５０℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識する。
【００３５】
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」と融合したＧＤＭポリペプチド又はＧＤＭ結合剤を含んでなるキメラポリペプチドを意味する。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するのに十分な残基を有し、その長さは融合するポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくはそのような抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないように十分に独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜５０のアミノ酸残基(好ましくは、約１０〜２０の残基)を有する。
ここでの目的に対する「活性な」又は「活性」とは、天然又は天然に生じるＧＤＭポリペプチドの生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するＧＤＭポリペプチドの形態を意味し、その中で、「生物学的」活性とは、天然又は天然発生ＧＤＭポリペプチドが保持する抗原性エピトープに対する抗体の生成を誘発する能力以外の、天然又は天然発生ＧＤＭによって引き起こされる生物機能（阻害又は刺激）を意味し、「免疫学的」活性とは、天然又は天然発生ＧＤＭポリペプチドが保持する抗原性エピトープに対する抗体の生成を誘発する能力を意味する。本明細書において使用される、活性なＧＤＭポリペプチドとは、神経膠腫に罹患していない同様の組織上での発現と比較した場合、定性的又は定量的観点から神経膠腫に異なって発現する抗原のことである。
【００３６】
「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、そしてここに開示した天然ＧＤＭポリペプチドの生物学的活性を部分的又は完全にブロック、阻害、又は中和する任意の分子が含まれる。適切なアンタゴニスト分子には、特にアゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片、断片、又は天然ＧＤＭポリペプチドのアミノ酸配列変異体、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、小有機分子等が含まれる。ＧＤＭアンタゴニストを同定する方法は、それを発現する細胞を含むＧＤＭポリペプチドと候補アゴニスト又はアンタゴニスト分子を接触させ、そして通常はＧＤＭポリペプチドに関連している一又は複数の生物学的活性の検出可能な変化を測定することが含まれ得る。
「治療する」又は「治療」又は「緩和」とは、治療上の処置及び予防的療法又は防護的療法の双方を称し、その目的は、神経膠腫の進行を防ぐか又は衰え（小さく）させることである。「予後予測」とは、起こり得る神経膠腫の経過及び結果を決定すること又は予測することである。「診断する」とは、神経膠腫を区別するその特徴を同定すること又は決定する過程を指す。診断の過程は、重症度又は疾病の進行に基づく段階又は腫瘍分類として表現されることがある。
【００３７】
治療、予後の予測又は診断を必要とする患者には、神経膠腫に罹りやすい患者並びに神経膠腫に既に罹っている患者、又は神経膠腫の予防が必要な患者が含まれる。本発明の方法に従ってＧＤＭアンタゴニスト（例えば、ＰＮアンタゴニスト、Ｐｒｏｌｉｆアンタゴニスト又はＭｅｓアンタゴニスト）の治療量を投与された後に、患者が次の一又は複数のものについて観察可能な及び／又は測定可能な減少又は消失を示したならば、被検体又は哺乳動物は、ＧＤＭポリペプチドを発現する神経膠腫に関して成功裏に「治療された」ことになる：神経膠腫細胞の数の減少、又は神経膠腫細胞の消失；腫瘍の大きさの減少；軟部組織及び骨への癌の広がりを含む、末梢器官への神経膠腫細胞の浸潤の阻害（すなわち、ある程度の減速及び好ましくは停止）；腫瘍転移の阻害（すなわち、ある程度の減速及び好ましくは停止）；腫瘍増殖のある程度の阻害；及び／又は特定の癌に関連している一又は複数の症状のある程度の軽減；疾病率及び死亡率の減少、及び生命問題の質の改善。ある程度、このようなＧＤＭアンタゴニストは生存癌細胞の増殖を防ぐ及び／又は死滅させることができ、それは、細胞増殖抑制及び／又は細胞障害性であり得る。これらの兆候又は症状の低減は、また、患者が感じることができる。
疾患における成功裏の治療及び改善を評価することに関する上記のパラメータは、医師にとってよく知られている日常的手法によって容易に測定が可能である。癌治療では、有効性は、例えば、病気の進行までの時間（ＴＴＰ）の算定及び／又は反応速度（ＲＲ）を確かめることによって測定できる。転移は、ステージング試験によって、転移の範囲を決定するためのカルシウムレベル及び他の酵素に関する試験によって確かめることができる。また、グリア外の領域への広がりを探索するためにＣＴスキャンを行うことができる。予後予測、診断及び／又は治療の過程に関して本明細書に開示される本発明は、ＧＤＭ（例えば、ＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ、Ｍｅｓ、Ｐｔｅｎ及びＤＬＬ３）の増殖及び発現の測定及び評価に関する。
【００３８】
癌の治療、症状の緩和又は診断のための「哺乳動物」とは、哺乳動物に分類される任意の動物を意味し、ヒト、家畜用及び農場用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、フェレットなどを含む。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
一又は複数の更なる治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時（同時期）及び任意の順序での連続した投与を含む。
【００３９】
ここで用いられる「担体」は、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる服用量及び濃度でそれらに曝露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン；グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標)、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ(登録商標)を含む。
「固相」又は「固体支持体」とは、本発明のＧＤＭアンタゴニスト、又はＧＤＭ結合剤が接着できる非水性マトリクスを意味する。ここに包含される固相の例は、部分的又は全体的にガラス（例えば、径の調整されたガラス）、ポリサッカリド（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンで形成されたものを含む。或る実施態様では、前後関係に応じて、固相はアッセイ用プレートのウェル；その他では精製用カラム（例えばアフィニティークロマトグラフィーカラム）を含むことができる。また、この用語は、米国特許第４２７５１４９号に記載されたような別々の粒子の不連続な固相も含む。
【００４０】
「リポソーム」は、哺乳動物への薬物（例えばＧＤＭアンタゴニスト）輸送に有用な、脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤を含む種々のタイプの小胞体である。リポソームの成分は、通常は細胞膜の脂質配向に類似した２層構造に配列される。
ここで定義されている「小」分子又は「小」有機分子とは、約５００ダルトン未満の分子量である。
【００４１】
ＧＤＭアンタゴニスト又はＧＤＭ結合剤の「有効量」とは、特に述べた目的を実施するために十分な量のことである。「有効量」は、述べられた目的に関連して、経験的及び常套的な形で決定することができる。
「治療的有効量」という用語は、患者又は哺乳動物の疾患又は疾病を「治療」するのに効果的なＧＤＭアンタゴニスト又は他の薬剤の量を指す。神経膠腫の場合、治療的に有効量の薬は癌細胞の数を減じ；腫瘍の大きさを減じ；末梢組織又は器官への神経膠腫細胞の浸潤を阻害（すなわち、ある程度まで減速、好ましくは停止）し；腫瘍転移を阻害（すなわち、ある程度まで減速及び好ましくは停止）し；腫瘍増殖をある程度まで阻害し；及び／又は神経膠腫に関連する一又は複数の症状をある程度まで緩和する。「治療する」のここでの定義を参照せよ。薬が存在する癌細胞の増殖を妨げ及び／又は死滅させる程度まで、それは、細胞分裂停止及び／又は細胞障害性であり得る。
【００４２】
ＧＤＭアンタゴニストの「増殖阻害量」は、細胞、特に腫瘍、例えば癌細胞の増殖をインビトロ又はインビボで阻害できる量である。腫瘍性細胞増殖を阻害するために、そのような量は経験的及び常套的な形で決定することができる。
ＧＤＭアンタゴニストの「細胞障害性量」は、細胞、特に神経膠腫細胞、例えば癌細胞をインビトロ又はインビボで破壊できる量である。腫瘍性細胞増殖の阻害の目的のための抗ＧＤＭ抗体、ＧＤＭポリペプチド、ＧＤＭ結合オリゴペプチド又はＧＤＭ結合有機分子の「細胞障害性量」は、経験的及び常套的な形で決定することができる。
【００４３】
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、例えば、抗ＰＮ、抗Ｐｒｏｌｉｆ及び抗Ｍｅｓ  ＧＤＭモノクローナル抗体（アンタゴニスト及び中和抗体）、多エピトープ特異性を有する抗ＰＮ、抗Ｐｒｏｌｉｆ、及び抗Ｍｅｓ  ＧＤＭ抗体成分、ポリクローナル抗体、一本鎖抗ＧＤＭ抗体、多特異性抗体（例えば、二重特異性）及び所望する生物学的又は免疫学的活性を示す限りは上に列挙した抗体の全ての抗原結合断片（下記参照）を含む。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、ここでの抗体と相互に置き換え可能に用いられる。
「単離された抗体」とは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものを意味する。その自然環境の汚染成分とは、抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様では、抗体は、(１)ローリー(Lowry)法によって定量して９５重量％以上の、最も好ましくは９９重量％以上の抗体まで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分な程度まで、あるいは(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた還元又は非還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離された抗体には、組換え体細胞内のインサイツの抗体が含まれるが、これは抗体の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないからである。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一つの精製工程により調製される。
【００４４】
基本的な４-鎖抗体ユニットは２つの同一の軽(Ｌ)鎖と２つの同一の重(Ｈ)鎖から構成されるヘテロ四量体の糖タンパクである(ＩｇＭ抗体は、基本的なヘテロ四量体ユニットとそれに付随するＪ鎖と称される付加的なポリペプチドの５つからなり、よって１０の抗原結合部位を有するが、分泌されたＩｇＡ抗体は重合して、基本的４-鎖ユニットとそれ付随するＪ鎖のうち２-５つを含む多価集合を形成可能である)。ＩｇＧの場合、４-鎖ユニットは一般的に約１５００００ダルトンである。それぞれのＬ鎖は１つの共有ジスルフィド結合によってＨ鎖に結合するが、２つのＨ鎖はＨ鎖のアイソタイプに応じて一又は複数のジスルフィド結合により互いに結合している。それぞれのＨ及びＬ鎖はまた規則的な間隔を持った鎖内ジスルフィド結合を持つ。それぞれのＨ鎖は、α及びγ鎖の各々に対しては３つの定常ドメイン(ＣＨ)が、μ及びεアイソタイプに対しては４つのＣＨドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)をＮ末端に有する。それぞれのＬ鎖は、その他端に定常ドメイン(ＣＬ)が続く可変ドメイン(ＶＬ)をＮ末端に有する。ＶＬはＶＨと整列し、ＣＬは重鎖の第一定常ドメイン(ＣＨ１)と整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。ＶＬとＶＨは共同して対になって、単一の抗原結合部位を形成する。異なるクラスの抗体の構造及び特性は、例えばBasic and Clinical Immunology, ８版, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow(編), Appleton ＆ Lange, Norwalk, CT, 1994, ７１頁及び６章を参照のこと。
任意の脊椎動物種からのＬ鎖には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる２つの明確に区別される型の一つを割り当てることができる。また、その重鎖の定常ドメイン(ＣＨ)のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンには異なったクラス又はアイソタイプを割り当てることができる。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭという免疫グロブリンの５つの主要なクラスがあり、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる重鎖を有する。さらにγ及びαのクラスは、ＣＨ配列及び機能等の比較的小さな差異に基づいてサブクラスに分割され、例えば、ヒトにおいては次のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２が発現する。
【００４５】
「可変」という用語は、可変ドメインのある部分が抗体の間で配列が広範囲に異なることを意味する。Ｖドメインは抗原結合性を媒介し、その特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を定める。しかし、可変性は可変ドメインの概ね１１０-アミノ酸スパンを通して均等には分布されていない。代わりに、Ｖ領域は、それぞれ９−１２アミノ酸長である「高頻度可変領域」と称される極度の可変性を有するより短い領域によって分離された１５−３０アミノ酸のフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる比較的不変の伸展からなる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメイン各々は、大きなβ-シート配置をとり、３つの高頻度可変領域により接続された４つのＦＲ領域を含み、それはループ状の接続を形成し、β-シート構造の一部を形成することもある。各鎖の高頻度可変領域はＦＲにより他の鎖からの高頻度可変領域とともに極近傍に保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ED. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)）。定常ドメインは抗体の抗原への結合に直接は関係ないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞障害(ＡＤＣＣ)における抗体の寄与を示す。
ここで使用されるところの「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合に寄与する抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は一般には「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメインのＫａｂａｔ残基２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７(Ｌ３)周辺、及び重鎖可変ドメインのＫａｂａｔ残基３１−３５Ｂ(Ｈ１)、５０−６５(Ｈ２)及び９５−１０２(Ｈ３)周辺；Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest,５版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)）及び／又は「高頻度可変ループ」からの残基(例えば、軽鎖可変ドメインのＣｈｏｔｈｉａ残基２６−３２(Ｌ１)、５０−５２(Ｌ２)及び９１−９６(Ｌ３)周辺及び重鎖可変ドメインの残基２６−３２(Ｈ１)、５２Ａ−５５(Ｈ２)及び９６−１０１(Ｈ３)；Chothia及びLesk J.Mol.Biol. 196:901-917 (1987)）を含む。
【００４６】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が、一般に少量で存在する突然変異等の、モノクローナル抗体の産生の間に生じる可能性のある突然変異を除いて、同一である及び／又は同じエピトープ（一又は複数）に結合する。このようなモノクローナル抗体は、一般に、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を包含しており、この場合の標的に結合するポリペプチドは、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列を選択することを含むプロセスによって得られたものである。例えば、このような選択プロセスは、複数のクローン、例えばハイブリドーマクローン、ファージクローン又は組換えＤＮＡクローンのプールからの、独特のクローンの選択であり得る。選択された標的結合配列を更に変化させることにより、例えば標的に対する親和性を向上させる、標的結合配列をヒト化する、細胞培養液中でのその産生を向上させる、インビボでのその免疫原性を低減する、多特異性抗体を作製する等が可能であること、並びに、変化させた標的結合配列を含む抗体も本発明のモノクローナル抗体であることを理解されたい。一般に異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と比べて、モノクローナル抗体調製物の内の各モノクローナル抗体は、１の抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、通常他の免疫グロブリンによって汚染されない点で有利である。「モノクローナル」との修飾詞は、ほぼ均一な抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示し、抗体を何か特定の方法で生成しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は様々な技術によって作ることができ、それらの技術には例えばハイブリドーマ法（例えば、Kohler等, Nature, 256:495 (1975); Harlow等, Antibodies: A loboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第２版 1988); Hammerling等: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981)）、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第4,816,567号参照）、ファージディスプレイ法（例えば、Clarkson等, Nature, 352:624-628 (1991); Marks等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Sidhu等, J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004); Lee等, J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004); 及びLee等, J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004)参照）、及びヒト免疫グロブリン座位又はヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部又は全部を有する動物においてヒト又はヒト様抗体を産生する技術（例えば、WO1998/24893; WO1996/34096; WO1996/33735; WO1991/10741; Jackobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits等, Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann等, Year in Immuno., 7:33 (1993); 米国特許第5,545,806号；同第5,569,825号；同第5,591,669号（全てGenPharm）；同第5,545,807号；WO1997/17852; 米国特許第5,545,807号；同第5,545,806号；同第5,569,825号；同第5,625,126号；同第5,633,425号；及び同第5,661,016号；Marks等, Bio/Technology, 10:779-783 (1992); Longerg等, Nature, 368:856-859 (1994); Morrison, Nature, 368:812-813 (1994); Fishwild等, Nature Biotechnology, 14:845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14:826 (1996); 及びLongerg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995)）が���まれる。
【００４７】
「キメラ」抗体（免疫グロブリン）は、特定の種由来の抗体、あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか又は相同である重鎖及び／又は軽鎖の一部を有し、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体、あるいは他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか又は相同であり、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りこのような抗体の断片を特に含む(米国特許第４８１６５６７号;及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984))。ここで使用されるヒト化抗体は、キメラ抗体の１サブセットである。
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」形とは、非ヒト免疫グロブリンから得られた最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)の高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント又はアクセプター抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は、結合親和性等の抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、全て又はほとんど全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、全て又はほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のものであるが、ＦＲ領域が結合親和性を向上させる１以上のアミノ酸の置換を含み得る、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ＦＲにおけるアミノ酸の置換の数は、一般に重鎖において６以内であり、軽鎖において３以内である。ヒト化抗体は、状況に応じて免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。さらなる詳細は、Jones等, Nature 321, 522-525(1986)；Riechmann等, Nature 332, 323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596(1992)を参照のこと。
【００４８】
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ')２、及びＦｖ断片；ダイアボディ(diabodies)；直鎖状抗体（米国特許第５６４１８７０号、実施例２；Zapata等, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]）；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片と、容易に結晶化する能力を反映して命名された残留「Ｆｃ」断片を産生する。Ｆａｂ断片は全長Ｌ鎖とＨ鎖の可変領域ドメイン(ＶＨ)、及び一つの重鎖の第一定常ドメイン(ＣＨ１)からなる。各Ｆａｂ断片は抗原結合性に関して一価である、すなわち単一の抗原-結合部位を有する。抗体のペプシン処理により、単一の大きなＦ(ａｂ')２断片が生じ、これは２価の抗原結合部位を持つ２つのジスルフィド結合されたＦａｂ断片にほぼ対応し、抗原を交差結合させることができるものである。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に幾つかの残基が付加されていることによりＦａｂ断片と相違する。Ｆａｂ'-ＳＨは、ここでは定常ドメインのシステイン残基(類)が遊離のチオール基を持つＦａｂ'を表す。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、通常はＦａｂ'断片の対として生成され、それらの間にヒンジシステインを有する。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
【００４９】
Ｆｃ断片はジスルフィドにより一緒に保持されている双方のＨ鎖のカルボキシ末端部位を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域の配列により決定され、その領域は、所定の型の細胞に見出されるＦｃレセプター(ＦｃＲ)によって認識される部位である。
「Ｆｖ」は、完全な抗原-認識及び-結合部位を含む最小の抗体断片である。この断片は、密接に非共有結合した１本の重鎖と１本の軽鎖の可変領域の二量体からなる。これら２つのドメインの折り畳みから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に対する抗原結合特異性を付与する６つの高頻度可変ループ(Ｈ及びＬ鎖から、それぞれ３つのループ)が生じる。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含んでなるＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を持つ。
【００５０】
「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」とも略称される「単鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖内に結合したＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それはｓＦＶが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓＦｖの概説については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)；Borrebaeck 1995, 以下を参照のこと。
「ＧＤＭ結合剤」とは、ＧＤＭポリペプチド（例えば、ＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ、Ｍｅｓ、Ｐｔｅｎ及びＤＬＬ３）に結合する分子である。例示的な分子には、抗ＧＤＭ抗体、ＧＤＭ結合抗体断片、ＧＤＭ結合オリゴペプチド、ＧＤＭセンス及びアンチセンス核酸及びＧＤＭ小分子アンタゴニストが含まれる。
【００５１】
「ＧＤＭアンタゴニスト」は、例えば、天然リガンドの結合を遮断する、又は神経膠腫においてＧＤＭの天然リガンドから下流成分への伝達を遮断する等して、ＧＤＭのシグナル伝達能を遮断することにより、ＧＤＭポリペプチドの活性又はシグナル伝達能を拮抗する（例えば、中和する、又は妨害する）分子である。例示的な分子には、抗ＧＤＭ抗体、ＧＤＭ結合抗体断片、ＧＤＭ結合オリゴペプチド、ＧＤＭセンス及びアンチセンス核酸及びＧＤＭ小分子アンタゴニストが含まれる。
「ＧＤＭ結合オリゴペプチド」は、本明細書に記載のように、それぞれレセプター、リガンド又はシグナル伝達成分を含め、ＧＤＭポリペプチドに、好ましくは特異的に結合するオリゴペプチドである。このようなオリゴペプチドは、既知のオリゴペプチド合成方法論を用いて化学的に合成することができるか、又は組換え技術を用いて調製及び精製することができる。このようなオリゴペプチドは、通常、少なくともおよそ５アミノ酸長、或いは少なくともおよそ６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００アミノ酸長以上である。このようなオリゴペプチドは、周知の技術を用いた過度の実験を行うことなく同定できる。これに関し、ポリペプチドの標的に特異的に結合できるオリゴペプチドをオリゴペプチドライブラリからスクリーニングする技術が従来技術に既知である（例えば、米国特許第5,556,762号、同第5,750,373号、同第4,708,871号、同第4,833,092号、同第5,223,409号、同第5,403,484号、同第5,571,689号、同第5,663,143号、PCT公開番号WO 84/03506及びWO84/03564; Geysen等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984); Geysen等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985); Geysen等, in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen等, J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987); Schoofs等, J. Immunol., 140:611-616 (1988), Cwirla, S. E.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378 (1990); Lowman, H.B.等, Biochemistry, 30:10832 (1991); Clackson, T.等, Nature, 352: 624 (1991); Marks, J. D.等,  J. Mol. Biol., 222:581 (1991); Kang, A.S.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363 (1991)、及びSmith, G. P., Current Opin. Biotechnol., 2:668 (1991)参照）。
【００５２】
「ＧＤＭ小分子アンタゴニスト」は、ここに開示されるＧＤＭポリペプチドのＧＤＭシグナル伝達経路を、好ましくは特異的に阻害する、こここに定義されるオリゴペプチド又は抗体以外の有機分子である。このようなＧＤＭシグナル伝達経路の阻害は、好ましくは、ＧＤＭポリペプチドを発現する神経膠腫細胞の増殖を抑制する。このような有機分子は、既知の方法論を用いて同定及び化学的に合成することができる（例えば、PCT公開公報WO2000/00823及びWO2000/39585参照）。このような有機分子は、通常、約２０００ダルトン未満、或いは約１５００、７５０、５００、２５０又は２００ダルトン未満の大きさを有し、ここに記載のＧＤＭポリペプチドに、好ましくは特異的に結合することができ、周知の技術を用いた過度の実験を行うことなく同定することができる。これに関し、ポリペプチドの標的に結合できる分子を有機分子ライブラリからスクリーニングする技術が従来技術に周知である（例えば、PCT公開公報WO00/00823及びWO00/39585参照）。
対象の標的抗原、例えばＧＤＭに「結合する」ＧＤＭアンタゴニスト又はＧＤＭ結合剤（例えば、抗体、ポリペプチド、オリゴペプチド又は小分子）は、当該抗原を発現する細胞又は組織を標的とするうえで、有用な診断薬、予後薬及び／又は治療薬となるのに十分な親和性を持って標的に結合するものであり、他のタンパク質に対し有意な交差反応をしない。望ましくないマーカーポリペプチドへの結合範囲は、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）分析又は放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）等の一般的な技術によって決定した場合、特定の所望の標的への結合の約１０％未満である。
【００５３】
更に、特定のＧＤＭポリペプチド又は特定のＧＤＭポリペプチド標的上のエピトープ「（に対する）特異的結合」、「に特異的に結合する」又は「に特異的である」という表現は、非特異的相互作用とは測定可能に異なる結合を意味する。特定の結合は、例えば、コントロール分子と比較したある分子の結合を決定することにより測定することができ、この場合コントロール分子は結合活性を有さない同じ構造の分子である。例えば、特異的結合は、標的と類似のコントロール分子との競合、例えば、標識しない標的の過多により定量することができる。この場合、標識した標的のプローブに対する結合が、標識していない標的の過多により競合的に阻害されると、特異的結合が示唆される。一実施形態では、このような表現は、１の分子が、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープに対し、他のポリペプチド又はポリペプチドのエピトープに殆ど結合することなく結合するような結合を意味する。或いは、このような表現は、少なくとも約１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ以上の標的に対してＫｄを有する分子によって表わすことができる。
「ＧＤＭポリペプチドを発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する」ＧＤＭアンタゴニスト（例えば、ＰＮアンタゴニスト、Ｐｒｏｌｉｆアンタゴニスト、又はＭｅｓアンタゴニスト）又はそのような分子の「増殖阻害」量とは、適切なＧＤＭポリペプチドを発現又は過剰発現する癌細胞の、測定可能な増殖抑制を導くものである。治療に使用するのに好ましい成分は、少なくとも一種類のＧＤＭアンタゴニスト（例えば、抗ＧＤＭ抗体、ＧＤＭ結合抗体断片、オリゴペプチド、又は小分子）の増殖阻害量を含み、よって、適切なコントロールと比較して、２０％を超える、好ましくは約２０％〜約５０％、更に好ましくは５０％を超える（例えば約５０％〜約１００％）神経膠腫細胞の増殖を阻害する。一実施形態では、増殖の抑制は、細胞培養液中で約０．１〜３０μｇ／ｍｌ又は約０．５ｎＭ〜２００ｎＭの分子濃度において測定することができ、増殖阻害は、腫瘍細胞を抗体に曝してから１〜１０日後に測定する。インビボでの神経膠腫細胞の増殖阻害は、後述の実験的実施例に記載したような様々な方法で定量することができる。本パラグラフに既出の分子のいずれかを体重１ｋｇ当たり約１μg〜約１００ｍｇで投与した結果、当該抗体の初回投与から約５日〜３ヶ月、好ましくは約５〜３０日以内に腫瘍の大きさ又は腫瘍細胞の増殖が低減した場合、そのような分子の量はインビボにおいて増殖阻害性である。
【００５４】
「アポトーシスを誘発する」ＧＤＭアンタゴニストとは、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞の縮み、小胞体の拡張、細胞断片化、及び／又は膜小胞の形成（アポトーシス性本体と呼ばれる）により決定される、神経膠腫細胞のプログラムされた細胞死を誘発するものである。細胞は通常、ＧＤＭポリペプチドを過剰発現する細胞である。様々な方法を使用して、アポトーシスに関連する細胞イベントを評価することができる。例えば、ホスファチジルセリン（ＰＳ）の転位置をアネキシン結合により測定することができ、ＤＮＡ断片化をＤＮＡラダーリングにより評価することができ、核／染色質凝縮及びＤＮＡ断片化を、低二倍体性細胞の増加により評価することができる。好ましくは、アポトーシスを誘発する抗体、オリゴペプチド、又はその他の有機分子は、アネキシン結合アッセイにおいて、処理しない細胞に対し、約２〜５０倍、好ましくは約５〜５０倍、及び最も好ましくは約１０〜５０倍のアネキシン結合を誘発するものである。
「細胞死を誘発する」ＧＤＭアンタゴニストは、生存可能な神経膠腫細胞を生存不能にするものである。このような神経膠腫細胞は、非疾患細胞と比較して、ＧＤＭポリペプチドを発現、好ましくは過剰発現する細胞である。ＧＤＭポリペプチドは、このような癌細胞の表面上に発現される膜貫通ポリペプチドであるか、そのような細胞によって産生及び分泌されるポリペプチドであり得る。インビトロでの細胞死を補体及び免疫エフェクター細胞の不在下で決定し、よって抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）によって誘発された細胞死を区別することができる。つまり、細胞死のアッセイは、熱で不活性化した血清を用いて（即ち、補体の不在下において）、免疫エフェクター細胞の不在下で、実行することができる。細胞死を誘発する能力は、適切な技術により、処理しない細胞との比較において評価することができ、例えばヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルー（Moore等, Cytotechnology 17:1-11 (1995)参照）、又は７ＡＡＤの取り込みによって評価される膜完全性の欠損により評価することができる。好ましい細胞死誘発ＧＤＭアンタゴニストは、ＢＴ４７４細胞におけるＰＩ取り込みアッセイにおいてＰＩ取り込みを誘発するものである。
【００５５】
「Ｐｒｏｌｉｆアンタゴニスト」及び「Ｍｅｓアンタゴニスト」は、表Ａに示されるＰｒｏｌｉｆ又はＭｅｓ  ＧＤＭマーカーにそれぞれ特異的に結合するか、又はそうでない場合にそれらＰｒｏｌｉｆ又はＭｅｓ  ＧＤＭマーカーの活性をそれぞれ特異的に阻害するＧＤＭアンタゴニストである。「ＰＮアンタゴニスト」は、ＤＬＬ３、Ｎｏｇ、Ｏｌｉｇ１、Ｏｌｉｇ２、ＴＨＲ及びＡＳＣＬ１を除き、表Ａに示されるＰＮ  ＧＤＭマーカーに特異的に結合するか、又はそうでない場合にそれらＰＮ  ＧＤＭマーカーの活性を特異的に阻害するＧＤＭアンタゴニストである。
Ａｋｔアンタゴニストは、Ａｋｔシグナル伝達経路の生物学的活性を部分的に又は完全に、遮断、阻害又は中和するあらゆる分子である。適切なＡｋｔアンタゴニストには、Ａｋｔシグナル伝達経路の天然成分のアンタゴニスト抗体又は抗体断片、断片又はアミノ酸配列変異体（「Ａｋｔポリペプチド」）、ペプチドアンチセンスオリゴヌクレオチド、小有機分子等が含まれる。Ａｋｔアンタゴニストの同定方法は、Ａｋｔポリペプチドに候補分子を接触させること、及び通常Ａｋｔポリペプチドに関連付けられる１以上の生物学的活性の検出可能な変化を測定することを含むことができる。追加的な例示的Ａｋｔアンタゴニストは、ａｋｔ１、ａｋｔ２、又はａｋｔ３に対する特異的アンタゴニスト、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＰＩＫ３ＣＤ、ＰＩＫ３ＣＧ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＩＫ３Ｒ２、ＰＩＫ３Ｒ３、ＰＩＫ３Ｒ４；ＰＤＫ１；ＦＲＡＰ（例えばラパマイシン）；ＲＰＳ６ＫＢ１；ＳＧＫ；ＥＧＦＲ（例えば、エルロチニブ  ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））、ＩＧＦＲ等のＰＩＫ３キナーゼの触媒又は制御ドメイン（互いの相互作用を含む）に対するアンタゴニストを含む。或いは、Ａｋｔアンタゴニストは、ＰＴＥＮ、ＩＮＰＰ５Ｄ又はＩＮＰＰＬ１の活性をアゴナイズ、刺激又は回復する分子を含む。
【００５６】
「有糸分裂阻害薬」は、細胞分裂中に起こる有糸分裂を部分的に又は完全に遮断、阻害又はそうでない場合そのような有糸分裂に干渉する分子を含む。そのような阻害薬の例には、テモゾロミド、ＢＣＮＵ、ＣＣＮＵ、ロムスチン、グリアデル、エトポシド、カルムスチン、イリノテカン、トポテカン、プロカルバジン、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、メトトレキサート、シタラビン、パクリタキセル、アウリスタチン、メイタンシノイドが含まれる。
「抗血管新生薬」は、特に疾病又は疾患に関連付けられる、血管新生又は血管形成の過程を部分的に又は完全に遮断、阻害又はそうでない場合中和する分子である。Brem, Cancer Control 6(5): 436-458 (1999)によってリスト化されたものを含め、多くの血管新生アンタゴニストが同定されており、従来技術に既知である。通常、血管新生アンタゴニストには、特定の血管新生因子又は血管新生経路を標的とする分子が含まれる。特定の態様では、血管新生アンタゴニストは、血管新生因子を標的とする抗体のようなタンパク質成分である。例示的な１の血管新生因子は、Leung等, Science, 246:1306 (1989)、及びHouck等, Mol. Endocrin., 5:1806 (1991)によって記載されたような、ＶＥＧＦ（時に「ＶＥＧＦ−Ａ」としても知られる）、１６５アミノ酸血管内皮細胞増殖因子及び関連する１２１−、１８９−、及び２０６−アミノ酸血管内皮細胞増殖因子、並びにそれらの天然発生対立形質及びプロセシングされた形態である。「ＶＥＧＦ」という用語は、１６５のアミノ酸ヒト血管内皮細胞増殖因子のうちのアミノ酸８〜１０９又は１〜１０９を含むポリペプチドの切断型を指す。このような天然ＶＥＧＦの切断された種類は、天然ＶＥＧＦと比較して、Ｆｌｔ−１（ＶＥＧＦ−Ｒ１）及びＫＤＲ（ＶＥＧＦ−Ｒ２）レセプターに対する結合親和性を有する。
【００５７】
例示的な抗血管新生因子は、抗ＶＥＧＦ抗体を中和する。「抗ＶＥＧＦ抗体」は、ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体である。好ましくは、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦ活性が関与する疾病又は状態をターゲットとする際及びそのような疾病又は状態への干渉における治療薬として使用することができる。このような抗ＶＥＧＦ抗体は、通常、ＶＥＧＦ−Ｂ又はＶＥＧＦ−Ｃ等の他のＶＥＧＦ相同体に結合せず、ＰＩＧＦ、ＰＤＧＦ又はｂＦＧＦ等の他の増殖因子にも結合しない。好ましい抗ＶＥＧＦ抗体は、ハイブリドーマＡＴＣＣ  ＨＢ  １０７０９によって産生されたモノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体Ａ４．６．１と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体である。更に好ましくは、抗ＶＥＧＦ抗体は、マウスの抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体Ａ．４．６．１の変異したヒトＩｇＧ１フレームワーク領域及び抗原結合相補性決定領域を含み、Presta等, (1997) Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)に従って生成される組換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体であり、ベバシズマブ（ＢＶ；アバスチンＴＭ）を含むがこれに限定されない。
或いは、抗血管新生薬は、１以上のＶＥＧＦレセプター（例えば、ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２）への結合を含むＶＥＧＦ活性を中和、遮断、阻害、抑制、低減するか、又はそのような活性に干渉することができるあらゆる小分子で有り得る。
【００５８】
「神経分化薬」は、神経細胞の前駆体（神経幹細胞、前駆細胞(transit amplifying cells)、神経芽細胞等）のニューロンへの分化を促進させるか、引き起こすか、刺激するか、又はそうでない場合誘発する分子である。神経細胞の前駆体は、胎生期の神経系、成人脳又は神経堤由来の細胞であり、細胞分裂及びニューロン形成の両方の能力を有する。ニューロンは、軸索投射、活動電位生成、及びシナプス伝達に関与するタンパク質を発現する有糸分裂後の（非分裂）細胞である。神経分化薬は、神経細胞の前駆体の、増殖率の低下、並びに軸索伸長、活動電位生成、及びシナプス伝達に関与するタンパク質の発現の増大を誘発する分子である。神経細胞分化の例示的なマーカーには、これらに限定されないが、ＭＡＰ２、βチューブリン、ＧＡＤ６５及びＧＡＰ４３が含まれる。例示的な神経分化薬には、これらに限定されないが、レチノイン酸、バルプロ酸、及びそれらの誘導体（例えば、エステル、塩、レチノイド、レチネート(retinates)、バルプロ酸等）；甲状腺ホルモン又は甲状腺ホルモンレセプターの他のアゴニスト；ノギン；ＢＤＮＦ、ＮＴ４／５又はＮＴＲＫ２レセプターのその他のアゴニスト；転写因子ＡＳＣＬ１、ＯＬＩＧ１の発現を増大させる薬剤；ｄｌｌ３アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ１、２、３又は４アンタゴニスト、γセクレターゼ阻害薬、例えばニカストリン、Ａｐｈ１Ａ、Ａｐｈ１Ｂ、Ｐｓｅｎ１、Ｐｓｅｎ２及びＰＳＥＮＥＮの小分子阻害剤、デルタ様リガンド（Ｄｌｌ）−１アンタゴニスト、デルタ様リガンド（Ｄｌｌ）−４、Ｊａｇｇｅｄ１アンタゴニスト、Ｊａｇｇｅｄ２アンタゴニスト；ｎｕｍｂアゴニスト又はｎｕｍｂ様アゴニストが含まれる。
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に帰する生物学的活性を意味し、抗体のアイソタイプにより変わる。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害；Ｆｃレセプター結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)；貪食作用；細胞表面レセプター（例えば、Ｂ細胞レセプター）のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が含まれる。
【００５９】
「抗体依存性細胞媒介性細胞障害」又は「ＡＤＣＣ」とは、ある種の細胞障害細胞(例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球及びマクロファージ）上に存在するＦｃレセプター(ＦｃＲｓ)と結合した分泌Ｉｇにより、これらの細胞障害エフェクター細胞が抗原-担持標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒により標的細胞を死滅させることを可能にする細胞障害性の形態を意味する。抗体は細胞障害細胞を「備えて」おり、これはこのような死滅には絶対に必要なものである。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞ＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991) の４６４頁の表３に要約されている。対象の分子のＡＤＣＣ活性をアッセイするために、米国特許第５５００３６２号又は同第５８２１３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを実施することができる。このようなアッセイにおいて有用なエフェクター細胞には、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）が含まれる。代わりとして、もしくは付加的に、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynes等, (USA) 95:652-656 (1998)において開示されているような動物モデルにおいて、インビボで評価することが可能である。
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記載するものである。好適なＦｃＲは天然配列ヒトＦｃＲである。さらに好適なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマレセプター）と結合するもので、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含み、これらのレセプターの対立遺伝子変異体、選択的にスプライシングされた形態のものも含まれる。ＦｃγＲＩＩレセプターには、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性型レセプター」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害型レセプター」）が含まれ、主としてその細胞質ドメインは異なるが、類似のアミノ酸配列を有するものである。活性型レセプターＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター活性化モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based activation motif ;ＩＴＡＭ）を含んでいる。阻害型レセプターＦｃγＲＩＩＢは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター阻害性モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif ;ＩＴＩＭ）を含んでいる（Daeron, Annu. Rev. immunol. 15:203-234 (1997)を参照）。ＦｃＲsに関しては、 Ravetch and Kinet, Annu.Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capel等, Immunomethods 4:25-34 (1994); 及びde Haas等, J.Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) に概説されている。将来的に同定されるものも含む他のＦｃＲsはここでの「ＦｃＲ」という言葉によって包含される。また、該用語には、母性ＩｇＧｓが胎児に受け継がれる要因となっている新生児性レセプターＦｃＲｎ（Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976) Kim等, J. Immunol.24:249 (1994))も含まれる。
【００６０】
「ヒトエフェクター細胞」とは、一又は複数のＦｃＲｓを発現し、エフェクター機能を実行する白血球のことである。その細胞が少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行することが望ましい。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例として、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞障害性Ｔ細胞及び好中球が含まれるが、ＰＢＭＣとＮＫ細胞が好適である。エフェクター細胞は天然源、例えば血液から単離してもよい。
「補体依存性細胞障害」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解することを意味する。典型的な補体経路の活性化は補体系(Ｃｌｑ)の第１補体が、同族抗原と結合した(適切なサブクラスの)抗体に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているように実施することができる。
【００６１】
「ＧＤＭ発現神経膠腫」は、場合によって十分なレベルのＧＤＭポリペプチドをその細胞表面上に産生するので、ＧＤＭポリペプチドアンタゴニストがそれに結合することができるか、又はそうでない場合、ＧＤＭ小分子アンタゴニストが、神経膠腫を標的とし、それに対する治療的効果を有し得る。
別の実施形態では、「ＧＤＭ発現神経膠腫」は、場合によって十分なレベルのＧＤＭポリペプチドを産生及び分泌するので、ＧＤＭポリペプチドアンタゴニストがそれに結合することができるか、又はそうでない場合、ＧＤＭ小分子アンタゴニストが癌を標的とし、それに対する治療的効果を有し得る。アンタゴニストに関し、そのような分子は、腫瘍細胞によって分泌されたＧＤＭポリペプチドの産生及び分泌を低減、阻害又は阻止するアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。
【００６２】
ＧＤＭポリペプチドを「過剰発現する」神経膠腫は、同じ組織型の非癌性細胞と比較して、細胞表面に有意に高いレベルのＧＤＭを有しているか、又は高いレベルのＧＤＭを産生及び分泌するものである。このような過剰発現は、遺伝子増幅により、又は転写又は翻訳を増加させることにより引き起こされてもよい。細胞表面におけるレベル又は分泌レベルを増大させるＧＤＭ発現の亢進は、抗ＧＤＭ抗体を用いた免疫組織化学アッセイ、ＦＡＣＳ分析等、様々な診断アッセイ又は予後予測アッセイによって測定され得る。あるいは、細胞におけるＧＤＭポリペプチドコード化核酸又はｍＲＮＡのレベルを、例えばＧＤＭコード化核酸又はその補体に対応する核酸に基づくプローブを用いた蛍光インサイツハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ；1998年10月公開のWO98/45479参照)、サザンブロット法、ノーザンブロット法、又はポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)法、例えばリアルタイム定量ＰＣＲ(ＲＴ−ＰＣＲ)により測定してもよい。あるいは、ＧＤＭポリペプチドの過剰発現は、血清のような生体液中の脱落抗原を測定することにより測定される(例えば、1990年6月12日公開の米国特許第4,933,294号；1991年4月18日公開のWO91/05264；1995年3月28日公開の米国特許第5,401,638号；及びSias等, J. Immunol. Methods 132: 73-80(1990)参照)。前記アッセイのみならず、技術熟練者であれば様々なインビボアッセイを利用できる。例えば、検知できるラベル、例えば放射性同位体で任意に標識された抗体に患者の体内の細胞を曝露してもよく、患者の細胞への抗体の結合は、例えば放射活性の外側スキャンニングにより、又は抗体に曝露された後で患者から得られたバイオプシーを分析することにより評価される。
【００６３】
ここで用いられているように、「イムノアドヘシン」という用語は、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能を持つ異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性を付与した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは抗体の抗原認識及び結合部位以外の所望の結合特異性を持つアミノ酸配列（即ち「異種」）と免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物である。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む近接アミノ酸配列を含む。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３、又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
「標識」という語は、ここで用いられる場合、「標識化」抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子を作製するために、抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子に直接的又は間接的に結合させる検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識はそれ自身によって検出可能でもよく（例えば、放射性同位体標識又は蛍光標識）、あるいは、酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物又は組成物の化学的変換を触媒してもよい。
【００６４】
ここで用いられる「細胞障害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体）、化学治療薬、酵素及びその断片、例えば核溶解性酵素、抗生物質、及び毒素、例えばその断片及び／又は変異体を含む小分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素、そして下記に開示する種々の抗腫瘍又は抗癌剤を含むように意図されている。他の細胞障害性剤が下記に記載されている。殺腫瘍性剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、ヒドロキシウレアタキサン（例えばパクリタキセル及びドセタキセル）及び／又はアントラサイクリン抗生物質；チオテパ及びシクロスホスファミド(CYTOXAN(登録商標))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethiylenethiophosphoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(acetogenins）(特にブラタシン(bullatacin)及びブラタシノン(bullatacinone)）；δ-９-テトラヒドロカンナビノール(ドロナビノール、MARINOL(登録商標))；β-ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトセシン(合成類似体トポテカン(topotecan)(HYCAMTIN(登録商標))、ＣＰＴ-１１(イリノテカン、CAMPTOSAR(登録商標))、アセチルカンプトテシン(acetylcamptothecin)、スコポレクチン(scopolectin)、及び９-アミノカンプトテシン(9-aminocamptothecin)を含む）；ブリオスタチン；カリスタチン(callysＧＤＭin）；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン(adozelesin)、カルゼレシン(carzelesin)及びバイゼレシン(bizelesin)合成類似体を含む)；ポドフィリン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン(cryptophycin)(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン(dolasＧＤＭin）；デュオカルマイシン(duocarmycin ）（合成類似体、KW-2189及びCB1-TM1を含む）；エレトロビン(eleutherobin）；パンクラチスタチン(pancratisＧＤＭin）；サルコディクチン(sarcodictyin）；スポンジスタチン(spongisＧＤＭin）；クロランブシル、クロルナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；ニトロスレアス(nitrosureas)、例えばカルムスチン(carmustine)、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン(lomustine)、ニムスチン、ラニムスチン；エネジイン(enediyne) 抗生物質等の抗生物質（例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンガンマ１Ｉ及びカリケアマイシンオメガＩ１、例えば、Agnew  Chem Intl. Ed. Engl., 33：183-186(1994)を参照のこと；ダイネミシンＡ(dynemicinＡ）を含むダイネミシン(dynemicin）；エスペラマイシン(esperamicin）；同様にネオカルチノスタチン発光団及び関連色素蛋白エネジイン(enediyne) 抗生物質発光団）、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン(bleomycins)、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin）、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin）、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ADRIAMYCIN(登録商標)ドキソルビシン (モルフォリノ−ドキソルビシ���、シアノモルフォリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin）、イダルビシン、マセロマイシン(marcellomycin）、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン(mitomycins）、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinosＧＤＭin)、ゾルビシン(zorubicin)；メトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ）などの抗-代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)のようなピリミジン類似体；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル(eniluracil)；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium aceＧＤＭe)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン(lonidainine)；メイタンシン(maytansine)及びアンサマイトシン(ansamitocin)のようなメイタンシノイド(maytansinoid)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダンモール(mopidanmol)；ニトラエリン(nitraerine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン(losoxantrone)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖類複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)(特に、Ｔ-２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリデンＡ(roridin A)及びアングイデン(anguidine)）；ウレタン；ビンデシン(ELDISINE(登録商標)、FILDESIN(登録商標))；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド（「Ara-C」）；チオテパ；タキソイド、例えばタキソール(登録商標)パクリタキセル、（Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）、ABRAXANETM クレモフォール(Cremophor)を含まない、アルブミン設計のナノ粒子形状のパクリタキセル(American  Pharmaceutical  Partners, Schaumberg, Illinois)及び��キソテア(登録商標）ドキセタキセル、（Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル；GEMZAR(登録商標)ゲンシタビン(gemcitabine)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン(VELBAN(登録商標))；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン(ONCOVIN(登録商標))；オキサリプラチン；ロイコボリン；NAVELBINE(登録商標)ビノレルビン；ノバントロン(novantrone)；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート(ibandronate)；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸などのレチノイド類；カペシタビン(capecitabine)(XELODA(登録商標))；上述したものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体；並びに、上記のうちの２以上の組合せ、例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン及びプレドニソロンの併用治療の略記号であるCHOP、及び５-ＦＵとロイコボリン(leucovovin)と組み合わされるオキサリプラチン(ELOXATINTM)による治療投薬計画の略記号であるFOLFOXが含まれる。
【００６５】
また、癌の増殖を促進しうるホルモンの影響を調節、低減、阻止(ブロック)又は阻害するように作用し、たびたび全身性、又は全身治療の形態にある抗ホルモン剤もこの定義に含まれる。これらはホルモン類自体でもよい。例として、抗卵胞ホルモン類及び、選択的なエストロゲンレセプターモジュレータ類(ＳＥＲＭ)、例えば、タモキシフェン(NOLVADEX(登録商標)タモキシフェン)、EVISTA(登録商標)ラロキシフェン、ドロロキシフェン(droloxifene)、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、LY117018、オナプリストン及びFARESTON(登録商標)トレミフェン、抗プロゲステロン類、エストロゲンレセプター下方制御因子(ＥＲＤ)、卵巣を抑制するか又は一時停止させるように機能する薬剤、例えば、黄体形成ホルモン放出ホルモン(ＬＨＲＨ)アゴニスト、例えば、LUPRON(登録商標)及びELIGARD(登録商標)酢酸ロイプロリド、ゴセレリンアセテート、ブセレリンアセテート及びトリプトレリン(tripterelin)、他の抗アンドロゲン類、例えばフルタミド、ニルタミド及びビカルタミド、及び、副腎のエストロゲン産生を制御する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害薬、例として、例えば４(５)-イミダゾール、アミノグルテチミド、MEGASE(登録商標)メゲストロールアセテート、AROMASIN(登録商標) エキセメスタン、ホルメスタン、ファドロゾール、RIVISOR(登録商標) ボロゾール、FEMARA(登録商標) レトロゾール及びARIMIDEX(登録商標) アナストロゾールなどがある。加えて、化学療法剤のこのような定義には、ビスホスホネート、例えばクロドロン酸(例えば、BONEFOS(登録商標)又はOSTAC(登録商標))、DIDROCAL(登録商標)エチドロン酸、NE-58095、ZOMETA(登録商標) ゾレドロン酸／ゾレドロネート、FOSAMAX(登録商標)アレンドロネート、AREDIA(登録商標)パミドロン酸、SKELID(登録商標) チルドロン酸又はACTONEL(登録商標)、リセドロン酸、並びにトロキサチタビン(troxacitabine)(1,3-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)、アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常な細胞増殖に関係するシグナル伝達経路の遺伝子の発現を阻害するもの、例として、例えばＰＫＣ-α、Ｒａｆ、Ｈ-Ｒａｓ及び上皮性増殖因子レセプター(ＥＧＦ-Ｒ)、ワクチン、例えばTHERATOPE(登録商標)ワクチン及び遺伝子治療ワクチン、例えばALLOVECTIN(登録商標)ワクチン、LEUVECTIN(登録商標)ワクチン及びVAXID(登録商標)ワクチン、LURTOTECAN(登録商標)トポイソメラーゼ１インヒビター、ABARELIX(登録商標) ｒｍＲＨ、ラパチニブジトシラート(ＥｒｂＢ-２及びＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ小分子インヒビター、GW572016とも称される)、及び、上記の何れかの薬学的に受容可能な塩類、酸又は誘導体が含まれる。
【００６６】
ここで用いられる際の「増殖阻害剤」は、細胞、特にＧＤＭ発現癌細胞の増殖をインビトロ又はインビボの何れかで阻害する化合物又は組成物を意味する。よって、増殖阻害剤は、Ｓ期でＧＤＭ発現細胞の割合を有意に減少させるものである。増殖阻害剤の例は、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の位置で）阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキサン類、及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。またＧ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びアラ-Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。タキサン類又はヒドロキシウレアタキサン類（パクリタキセル及びドセタキセル）は、共にイチイに由来する抗癌剤である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル（TAXOTERE（登録商標）、ローン・プーラン ローラー）は、パクリタキセル（TAXOL（登録商標）、ブリストル-マイヤー スクウィブ）の半合成類似体である。これらの分子は、チューブリン二量体から微小管の集合を促進し、細胞の有糸分裂を阻害する結果となる脱重合を防ぐことによって微小管を安定化にする。
「ドキソルビシン」はアントラサイクリン抗生物質である。ドキソルビシンの完全な化学名は、(８Ｓ-シス)-１０-[(３-アミノ-２，３，６-トリデオキシ-α-Ｌ-リキソ-ヘキサピラノシル)オキシ]-７，８，９，１０-テトラヒドロ-６，８，１１-トリヒドロキシ-８-(ヒドロキシアセチル)-１-メトキシ-５，１２-ナフタセンジオンである。
【００６７】
「サイトカイン」なる用語は、一つの細胞集団から放出され、他の細胞に細胞間メディエータとして作用するタンパク質の一般用語である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるのは、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インシュリン；プロインシュリン；レラキシン；プロレラキシン；糖タンパク質ホルモン、例えば濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体化ホルモン（ＬＨ）；肝臓成長因子；線維芽成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；ミューラー阻害因子；マウス生殖腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ-β等の神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ-α及びＴＧＦ-β等のトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦｓ）；インシュリン様成長因子-Ｉ及びＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘発因子；インターフェロン-α、-β、及び-γ等のインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）、例えばマクロファージ-ＣＳＦ（Ｍ-ＣＳＦ）；顆粒球-マクロファージ-ＣＳＦ（ＧＭ-ＣＳＦ）；及び顆粒球-ＣＳＦ（Ｇ-ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬｓ）、例えばＩＬ-１、ＩＬ-１ａ、ＩＬ-２、ＩＬ-３、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２；腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ-α及びＴＮＦ-β；及びＬＩＦ及びキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子である。ここで用いられる際、用語サイトカインには、天然供給源から、又は組換え細胞培養からのタンパク質、及び天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物が含まれる。
「パッケージ挿入物」という用語は、効能、用途、服用量、投与、配合禁忌及び／又はその治療薬の用途に関する警告についての情報を含む、治療薬の商業的包装を慣習的に含めた指示書を指す。
【００６８】
用語「階層的クラスター形成」は、遺伝子発現の類似性に基づいて試料を組分けする方法を意味する。使用される標準的アルゴリズムは、相関マトリクスを始点にして、全てのエレメントが１本のツリーに構築される系統樹を再帰的に計算する。Eisen, M.B.等, P.N.A.S. 95:14863-14868 (1998)。
「ｋ平均法によるクラスター形成」という用語は、遺伝子発現の類似性に基づいて試料を組分けする方法を意味する。ｋ平均法によるクラスター形成ではまず、全ての試料を多数のクラスターの１つにランダムに割り当てる。次いで各試料における遺伝子発現の代表的な値又は平均値を計算し、最も近い類似性を示すクラスターに各試料を再度割り当てる。安定な構造が得られるまでこの手順を繰り返す。Duda, R. O.及びHart, P. E., Pattern Classification and Scene Analysis, Wiley, New York (1973)参照。
用語「投票方式」とは、腫瘍のサブタイプ毎に特定の発現レベルで又は特定の発現レベルを超えて発現されるＧＤＭの数の比較に基づいて、腫瘍をグループに分ける方法を意味する。
【００６９】
表１
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【００７０】
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【００７１】
ＩＩ．本発明の組成物及び方法
Ａ．方法及び目的
現在のところ、高悪性度の神経膠腫は病理組織学的基準により診断され、これら腫瘍の大部分の既知の頑強な予後因子は、腫瘍の悪性度及び患者の年齢に限定されている。ｃｈｒｓ  １ｐ及び１９ｑにおける損失が乏突起膠腫の予後の予測に有用である（Cairncross等, J. Natl Cancer Inst. 90: 1473-1479 (1998)）という認識は広く受け入れられており、これにより、神経膠腫の更に大きな集団に対する治療の結果及び応答を予測するための分子マーカーを開発しようとする興味が高まった。ＧＢＭには多数の遺伝子変異が報告されており、ＥＧＦＲ増幅及びｐ５３変異のようなその一部は、原発性ＧＢＭと続発性ＧＢＭを区別しているように思われ（(von Deimling等, Glia 15: 328-338 (1995); Watanabe等, Brain Pathol. 6: 217-223 (1996))、そのようなマーカーは結果を予測する、又は疾病の管理に関する決定を導くのに最低限の有用性を有する。重要なのは、最近の発現プロファイリングの研究により、神経膠腫の分子の分類が、予後の予測に有用となり得ることが判明していることである（Freije等, Cancer Res. 64: 6503-6510 (2004); Nutt等, Cancer Res. 63: 1602-1607 (2003)）。本研究において、本発明者等は、腫瘍の病原力、並びに疾病の進行に関連する分子の変質を同定し、標的の治療法に対する応答の予測に分子の分類を使用できるという証拠を提供する。
【００７２】
腫瘍の細分類による予後予測上の効果及び疾病の進行のパターン化
本明細書において、本発明者等は、規定された発現のシグネチャーとの類似性に基づいて腫瘍をサブタイプに割り当てる、高悪性度の星細胞腫の新規予後予測分類方式を開示する。神経膠腫の３つの分子サブタイプの各々は、個別の組織の組に対する類似性を有し、組織の成長の異なる側面のマーカーを豊富に含む。本分析では、３５のシグネチャー遺伝子の組を利用する。これらのマーカーは、各腫瘍のサブタイプを同定するために使用できるマーカーの更に長いリストの代表的なものである。ここで前神経性（ＰＮ）と呼ぶ１の腫瘍サブタイプは、顕著に良好な予後により区別され、健常な脳及び神経発生に関連する遺伝子を発現する。高度に増殖性の細胞株又は間葉性の起源を有する組織との類似性を特徴とする予後が不良な２つのサブタイプは、細胞増殖又は血管新生をそれぞれ示す遺伝子発現プログラムの活性化を示す。本発明者等は、Ｍｅｓ及びＰｒｏｌｉｆ腫瘍種類に関連する低い生存度は、細胞分裂の速度が大きいこと又は新血管新生による腫瘍細胞の生存の強化により起こる増殖の亢進に関連していると推測する。新血管新生又は有糸分裂形の単なる不在又は存在ではサブクラスは区別できなかったが、これらの特性がほぼ全ての多形神経膠芽腫の顕著な特徴であるため、このような区別は可能と思われる。以前の研究により、神経膠腫における増殖又は血管新生のマーカーの予後予測的価値が示唆されている（Ho等, Am. J. Clin. Pathol. 119: 715-722 (2003); Hsu等, Cancer Res. 56: 5684-5691 (1996); Osada等, Anticancer Res. 24: 547-552 (2004)）が、これらのプロセスに差次的に関連する明確な腫瘍のサブセットの存在は示されていない。当然のことながら、本発明のＰｒｏｌｉｆ及びＭｅｓ神経膠腫サブタイプは、複数の上皮性腫瘍の種類に見られる結果の不良に関連付けられている、創傷治癒シグネチャーのマーカーのサブセットの発現を特徴としている。表Ａを参照されたい。
本研究において同定される腫瘍のサブタイプは、発現プロファイリングによって同定された既知の予後サブタイプに類似している。具体的には、公開済みの３つの研究により、ここに開示するＰＮ及びＭｅｓ腫瘍サブタイプによく似た表現型が報告されている（(Freije等, 上掲、Liang等, P.N.A.S. (USA) 102: 5814-5819 (2005); Nigro等, Cancer Res. 65: 1678-1686 (2005))。加えて、以前の研究（Godard等, Cancer Res. 63: 6613-6625 (2003)）により、本発明のＭｅｓ腫瘍サブタイプに類似していると思われる腫瘍の１亜集団を規定する、血管新生遺伝子のクラスターが特に示されている。本発明者等による、ＰＮマーカー対Ｍｅｓマーカーの発現の相互排他的なパターンの観察により、これら２つの腫瘍サブタイプの存在に関するコンセンサスの説明を補う結果が得られた。ＰＮマーカーとＭｅｓマーカーの両方を発現する腫瘍検体内においても、発現が重複しない空間分布が見出された。ＬＯＨ１０と、ＭｅｓシグネチャーとＰＮシグネチャーの区別との強い関連性は、ＬＯＨ１０を予後予測的発現のシグネチャーにリンクさせる以前の研究による発見と一貫性を有し（Nigro等, Cancer Res. 65: 1678-1686 (2005)）、血管新生表現型とＬＯＨ１０の関連性は、ＧＢＭ細胞株へのｃｈｒ１０の導入による抗血管新生作用の示唆と一貫性を有する（(Hsu等, Cancer Res. 56: 5684-5691 (1996)）。
【００７３】
増殖マーカーに富む個別の腫瘍サブタイプの存在は、ある以前の報告（Freije等, 上掲）により記載されているが、他の研究には開示されていない。本発明者による発見により、Ｐｒｏｌｉｆシグネチャーの排他性が、ＰＮ又はＭｅｓシグネチャーより弱いこと、及びＰｒｏｌｉｆシグネチャーを有する神経膠腫の割合が異なる機関により採取された試料集団により異なることが示唆された。本発明者等が、腫瘍の個別の分子サブタイプとしてＰｒｏｌｉｆ腫瘍サブクラスを分類することを支援するものとして、Ｐｒｏｌｉｆ腫瘍における、この腫瘍サブタイプを区別するゲノム変化のパターンの存在が指摘される。とりわけ、ｃｈｒ１上のＰＩＫ３Ｒ３座位の増加はＰｒｏｌｉｆクラスの腫瘍特有の特徴であるようである。Ｐｒｏｌｉｆシグネチャーを有する腫瘍に特有のゲノム変化の存在は、これら腫瘍を個別のサブクラスとしてまとめる根拠となるもので、調査した集団におけるこのサブクラスが疫学的因子の影響を受けた可能性を示唆している。
ＰＮ及びＭｅｓ腫瘍シグネチャーの著しい相互排他性は、これらの腫瘍サブタイプが、恐らくは異なる起源の細胞種類から発生した、個別の疾病を反映する可能性を示している。しかしながら、同じ患者由来の原発性腫瘍と再発性腫瘍からなる対の組み合わせを研究することにより、本発明者等は、元々ＰＮ又はＰｒｏｌｉｆサブタイプとして生じた一部の腫瘍がＭｅｓシグネチャーを伴って再発することを観察した。Ｍｅｓ表現型のマーカーであるＣＨＩ３Ｌ１／ＹＫＬ４０の局所的発現は原発性の腫瘍に見られ、これには再発時にＭｅｓクラスに移行するものが含まれる。興味深いことに、最初に現れたときから再発するまでに感知できるＰＮ特性を得る腫瘍が見られる例は無い。神経幹細胞株の、ＰＮからＭｅｓシグネチャーに移行する能力と合わせて考えると、腫瘍のサブクラス変更能が、腫瘍サブタイプが疾病の異なる分化状態を表わしている可能性が示唆される。しかしながら、一部の外観上の変化が、過渡的な腫瘍特性の変化ではなく腫瘍の異種性を反映し得るという可能性を除外することはできない。加えて、本発明者等の実験設計は、治療効果により導かれるものに基づいて疾病の進行を反映する遺伝子発現の変化を区別できるものではない。それでも、本発明者等による一方向性の腫瘍サブクラスの移行の発見は、腫瘍細胞が、遺伝的又は後成的異常が蓄積した結果としてＭｅｓ表現型を獲得できるという可能性を示唆するものである。Ｍｅｓサブタイプの腫瘍を有する患者の年齢が高いことは、このような仮説と一致する。
【００７４】
腫瘍細胞シグネチャーの外観上の移行の基礎となる分子現象の直接的な証拠はないが、ｃｈｒ１０の欠損とＭｅｓシグネチャーとの強い相関性は、疾病の進行の生物学に重要な病識を提供していると思われる。基礎となるメカニズムに関わらず、Ｍｅｓ表現型への移行は疾病の進行の共通パターンであるように思われ、上皮腫瘍の悪性行動の増大に関連する上皮から間葉への移行（ＥＭＴ）を暗示するものである。ＥＭＴにおけるＡｋｔ活性の中心的役割（Larue及びBellacosa, Oncogene 24: 7443 (2005)）と一貫して、本発明者等のデータにより、神経膠腫における間葉への転移の誘発にＡｋｔが関与していることが示される。
【００７５】
Ｎｏｔｃｈ及びＡｋｔシグナル伝達のマーカーによる神経膠腫の侵襲性の予測
本発明者等の発見は、予後不良のサブタイプの腫瘍においてＡｋｔシグナル伝達の変化を活性化するゲノム、ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの証拠を実証するものである。以前の豊富なデータは、悪性度の高いグリアの形成及び増殖を促進するうえでのａｋｔシグナル伝達の役割を支持している（Knobbe等, Neuro-Oncology 4: 196-211 (2002); Sonoda等, Cancer Res. 61: 6674-6678 (2001)）。遺伝的改変マウスモジュールにおける一連の的確な研究により、悪性グリアの形成及び増殖を促進するａｋｔの役割が十分に示唆されている（Holland等, Nature Genetics 25: 55-57 (2000); Rajasekhar等, Mol. Cell 12: 889-901 (2003); Uhrbom等, Cancer Res. 62: 5551-5558 (2002); Xiao等, Cancer Res. 65: 5172-5180 (2005)）。ヒト腫瘍において、ＥＧＦＲの増殖及びＰＴＥＮ欠失の両方は、ａｋｔを活性化させる既知の変化であり、特にＧＢＭと低悪性度の病変との区別に関連付けられている（(Stiles等, Mol. Cell Biol. 22: 3842-3851 (2002))。更に最近になって、ＰＩＫ３ＣＡの変異と、ＰＩＫ３ＣＡ及びＰＩＫ３ＣＤにおけるコピー数の均衡が共に増大することが、ＡＡ及びＧＢＭについて開示された（(Broderick等, Cancer Res. 64: 5048-5050 (2004); Mizoguchi等, Brain Pathol. 14: 372-377 (2004); Samuels等, Science 304: 554 (2004))。ＥＧＦＲ増殖の予後予測的価値又はＰＩ３Ｋサブユニットにおける遺伝子的変化が不明である一方、複数の研究により、ｃｈｒ１０の損失、ＰＴＥＮ座位の損失、又はＰＩ３Ｋシグナル伝達の亢進が、全てＧＢＭの結果不良に関連していることが示されている（Chakravarti等, J. Clin. Oncol. 22: 1926-1933 (2004); Lin等, Clin. Cancer Res. 4: 2447-2454 (1998); Schmidt等, J. Neur. Exp. Neurol. 61: 321-328 (2002); Smith等, J. Nat. Cancer Inst. 93: 1246-1256 (2001); Tada等, J. Neurosurg. 95: 651-659 (2001)）。ＰＩ３Ｋ／ａｋｔシグナル伝達の活性化が、増殖、生存、及び血管新生を含む増殖上の利点を与える複数の生物学的プロセスにおいて示されている（(Abe等, Cancer Res. 63: 2300-2305 (2003); Pore等, Cancer Res. 63: 236-241 (2003); Su等, Cancer Res. 63: 3585-3592 (2003))。よって、本発明者等は、Ｐｒｏｌｉｆ及びＭｅｓサブタイプ腫瘍の結果の不良が、それぞれ高い率の増殖又は血管新生を特徴とする侵襲性の高い増殖パターンを促進するＰＩ３Ｋ／ａｋｔシグナル伝達の作用に起因していると推測する。本発明の発見は、２つの予後不良サブタイプにおけるａｋｔシグナル伝達の増殖性の徴候と血管新生の徴候の相違を説明する明瞭な仮定ではないが、Ｍｅｓ腫瘍においてｃｈｒ１０ｐの座位における減少が頻繁に起こること又はｃｈｒ７における増加が頻繁に起こることが、このような差異を生じるという一つの可能性である。これに関し、ｃｈ１９上でコードされるマーカーが高頻度で観察されることは興味深い。
【００７６】
最近の研究により、Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達の活性化が神経膠腫を含む複数の悪性腫瘍に関連付けられた（Fan等, Cancer Res. 64: 7787-7793 (2004); Purow等, Cancer Res. 65: 2353-2363 (2005); Radtke and Clevers, Science 307: 1904-1909 (2005); Weng等, Science 306: 269-271 (2004)）。本発明者等の観察は、高悪性度の神経膠腫におけるＮｏｔｃｈ経路のマーカーの予後予測的価値を示すものである。具体的には、本発明者等は、複数のＮｏｔｃｈ経路エレメントのＮｏｔｃｈ１核染色及びｍＲＮＡが、予後不良のサブタイプと比較した場合に、結果が良好なＰＮ腫瘍サブタイプにおいて有意に濃縮されていることを発見した。更に、２つの独立した試料集団において、特にＰＴＥＮ発現が大きい場合に、ＤＬＬ３のｍＲＮＡの発現が生存期間の延長と相関していることが見出された。複数の解釈が可能であるが、１つの可能性は、インタクトなＰＴＥＮの存在下において、ｎｏｔｃｈシグナル伝達に対するＤＬＬ３の抑制活性（Ladi等, J. Cell Biol. 170: 983-992 (2005)）が、高度に分化型の表現型を促進することにより、腫瘍の増殖を制限する可能性があるということである。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の正確な役割とは関係なく、本発明の２つの遺伝子ＰＴＥＮ及びＤＬＬ  Ｃｏｘモデルの予後予測的価値は、腫瘍増殖の大きな決定因子としてａｋｔ及びＮｏｔｃｈシグナル経路を明確に指し示している。
【００７７】
神経膠腫増殖と前脳神経発生の制御の平行
本発明の調査は、予後予測的腫瘍サブタイプを、神経芽細胞に対する神経幹細胞の相対的発現の差異と、Ａｋｔ及びＮｏｔｃｈシグナル伝達エレメントにおける差異に結びつける。ヒト神経膠腫の１モデルは、分子的に規定されたサブタイプの全てが、同様の起源を有する細胞種類に由来しているが、一部の腫瘍が未分化神経幹細胞様（Ｍｅｓ）又は前駆様（Ｐｒｏｌｉｆ）表現型のいずれかに近い方に維持されており、それ以外（ＰＮ）が神経芽細胞又は未成熟のニューロンの表現型に近い表現型を有するものである。このモデルは、動物実験によって支持されており（Bachoo等, Cancer Cell 1: 269-277 (2002); Fomchenko及びHolland, Exp. Cell Res. 306: 323-329 (2005)）、神経幹細胞から、神経細胞又はグリアの系列への分化軸までのいずれの段階に悪性度の高い神経膠腫の細胞起源の種類が属しているかは特に予測せず、シグナル伝達経路における分子変化によって腫瘍の表現型が明らかになることを遅らせる。増殖する未分化状態において神経幹細胞又は前駆体を維持するためにＰＴＥＮとｎｏｔｃｈエキスパートが前脳の血管新生に果たす役割を考慮すると（Groszer等, Science 294: 2186-2189 (2001); Sakamoto等, J. Biol. Chem. 278: 44808-44815 (2003); Yoon及びGaiano, Nature Neurosci. 8: 709-715 (2005)）、本発明者らの発見により、血管新生の間の細胞運命の選択を制御するプロセスにより、腫瘍増殖の侵襲性をほぼ管理することができる。
新規に規定された腫瘍サブタイプの表現型は、成人脳における血管新生の複数の段階と平行している。コミットされた神経細胞の（又は神経オリゴデンドログリアの）前駆体と同様に、ＰＮサブタイプの腫瘍は増殖率が低く、神経芽細胞及び未成熟のニューロンに関連するマーカーと、他のニューロン系列マーカーに伴う転写因子ＯＬＩＧ２及びＡｓｃｌ１とを発現すると思われる。対照的に、Ｍｅｓ及びＰｒｏｌｉｆサブタイプの腫瘍はニューロン系列のマーカーを欠くが、神経幹細胞及び／又は前駆細胞の側面を再利用する。Ｐｒｏｌｉｆ腫瘍と前駆細胞の顕著に高速の増殖率の間には、容易に平行性を見い出すことができる。加えて、Ｐｒｏｌｉｆサブタイプの一部の腫瘍（但し他の分類は含まない）は、ＭＥＬＫ、即ちげっ歯類の前脳において急速に増殖する多分化能前駆細胞のマーカーの強い発現を特徴とする（Nakano等, J. Cell Biol. 170: 413 (2005)）。更に、Ｐｒｏｌｉｆ及びＭｅｓサブクラス両方の腫瘍におけるＥＧＦＲ増殖は、ＥＧＦに対する神経幹細胞及び前駆細胞の応答性と平行している（（Doetsch等, Neuron 36:1021-1034 (2002)）。Ｍｅｓ腫瘍による平滑筋、内皮細胞、及び軟骨マーカーの発現は、成人前脳由来の神経幹細胞に報告されている多分化能を暗示するものである。Bani-Yaghoub等, Development 131: 4287-4298 (2004); Rietze等, Nature 412: 736-739 (2001); Sieber-Blum, Developmental Neuroscience 25:273-278 (2003); Wurmser等, Nature 430: 350-356 (2004)参照。しかしながら、解釈においては、幹細胞様集団が腫瘍質量に含まれることにより、腫瘍の発現プロファイルが混乱している可能性に注意する必要がある。
【００７８】
興味深いことに、Ｍｅｓ腫瘍表現型と神経幹細胞の範囲との平行性には、神経幹細胞と内皮細胞の間に見られる密接な関連の反復が含まれる。他の腫瘍サブタイプとは対照的に、Ｍｅｓ腫瘍はＶＥＧＦ、そのレセプター、及び内非細胞のマーカーの強い発現を示す。最近の発見により、ＶＥＧＦが成人前脳の神経幹細胞の増殖及び生存を促進することが示唆されており、内皮細胞の分泌因子も神経幹細胞の増殖を促進することが実証されている（(Cao等, Nature Genetics 36: 827-835 (2004); Fabel等, Eur. J. Neurosci. 18: 2803-2812 (2003); Jin等, P.N.A.S. (USA) 99: 11946-11950 (2002); Maurer等, Neurosci. Lett. 344: 165-168 (2003); Schanzer等, Brain Pathol. 14: 237-248 (2004); Shen等, Science 304: 1338-1340 (2004); Yasuhara等, Reviews Neurosci. 15: 293-307 (2004); Zhu等, FASEB J. 17: 186-193 (2003))。Ｍｅｓ腫瘍の表現型を有する腫瘍細胞の増殖が、ＶＥＧＦ及び／又は内皮由来因子のレベルの上昇の作用により支持される可能性が推測されることは興味深い。これに関し、ＶＥＧＦ又はそのレセプターを標的とする治療法が、標的とする新脈管構造において有益であると証明されるだけでなく、神経幹細胞様生物学を明らかにする腫瘍細胞の増殖を直接抑制すると証明され得る。神経管において標的とされるＶＥＧＦの不活性化は、最近の研究により、マウスの前脳において血管欠損と重度の神経細胞アポトーシスの両方を生成することが示された（(Raab等, Thrombosis Haemostasis 91: 595-605 (2004))。
【００７９】
治療上の意味
本発明の発見により、神経膠腫の効果的な治療法の開発に複数の示唆が得られる。第１に、本発明の調査は、グリアの悪性腫瘍の最適な治療が、腫瘍の個別の分子分類を標的とした治療計画に依存するというコンセンサスの高まりを支援するものである（(Mischel等, Cancer Biol. Therapy 2: 242-247 (2003); Newton, Expert Rev. Antican. Ther. 4: 105-128 (2004); Rao等, Frontier Biosci. 8: e270-280 (2003)）。本発明者等によるインビトロでの発見は、ここで規定する分子シグネチャーにより、特定のシグナル伝達経路を標的とする薬剤への応答を推測できることを示唆するものである。第二に、本発明者等の発見は、高悪性度の神経膠腫の新規治療計画を開発するうえで、Ａｋｔ経路とＮｏｔｃｈ経路の両方を標的とすることの意義を支持する。第三に、標準的な治療を行った後での腫瘍の再発には、間葉への表現型の移行、血管新生状態が伴うという示唆は、侵襲性の低い表現型を有する腫瘍においても、この侵襲性の表現型の状態を標的とすることが有益であることを強調するものである。最後に、幹細胞生物学と、もっと侵襲性の高い神経膠腫の表現型との相関関係により、前脳の神経発生に対する理解を深めるとグリア悪性腫瘍の治療的介入に新規の見識が得られる可能性があることが示唆される。
【００８０】
Ａ．抗ＧＤＭ抗体
一実施態様では、本発明は、ここで、神経膠腫の疾病の経過の重症度の決定及び／又は予後の予測において治療、診断及び／又は予後薬としての用途が見出され得る抗ＧＤＭ抗体の使用法を提供する。このような目的に使用できる例示的な抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロコンジュゲート抗体が含まれる。
１．ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原とアジュバントを複数回皮下(sc)又は腹腔内(ip)注射することにより、動物に産生される。それは、免疫化されるべき種において免疫原性であるタンパク質へ、関連する抗原（特に、合成ペプチドが用いられる場合）を結合させるために有用である。例えば、この抗原を、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターへ、二重官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介する抱合)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介する抱合)、グルタルアルデヒド、及び無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲ及びＲ１が異なるアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲを用いて結合させることができる。
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ（それぞれウサギ又はマウスの場合）を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。コンジュゲートはまた、タンパク融合として組換え細胞培養中で調製することができる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
【００８１】
２．モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第４８１６５６７号)によって作成することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記のように免疫し、免疫化に用いられたタンパク質と特異的に結合する抗体を産生する、又は産生することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。免疫化の後、リンパ球を単離し、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞（融合のパートナーとも呼ばれる）の増殖または生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ−欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
【００８２】
好ましい融合のパートナーである骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの発現を支援し、融合しない親細胞に対して選択する選択培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫株化細胞は、マウス骨髄腫ライン、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡより入手し得るＭＯＰＣ-２１およびＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及び、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、バージニア、ＵＳＡより入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されるものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている（Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63頁、(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。
【００８３】
例えば、モノクローナル抗体の結合親和性は、Munson等, Anal. Biochem., 107:220(1980)のスキャッチャード分析によって測定することができる。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が確定された後、そのクローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地は、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地を包含する。また、このハイブリドーマ細胞は、動物の腹水症腫瘍として、例えばマウスへの細胞の腹腔内注射によって、インビボで増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばアフィニティークロマトグラフィー（例えばプロテインＡ又はプロテインＧ-セファロースを用いる）又はイオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析等のような常套的な抗体精製法によって、培地、腹水、又は血清から上手く分離される。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に分離されて、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび分離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、この状況以外では抗体タンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入し、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を獲得することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌での組み換え発現に関する概説論文には、Skerra等, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262(1993)及びPluckthun, Immunol. Revs. 130: 151-188(1992)が含まれる。
【００８４】
更なる実施態様では、抗体又は抗体断片は、McCafferty等, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリから分離することができる。Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marks等, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリを使用したマウス及びヒト抗体の分離を記述している。続く刊行物は、鎖シャフリングによる高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生成(Marks等, Bio/Technology, 10:779-783[1992])、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouse等, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266[1993])を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
抗体をコードするＤＮＡは、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメイン（ＣＨ及びＣＬ）の配列を、相同的マウス配列に代えて置換することによって(米国特許第４８１６５６７号；Morrison等, Proc.Nat.Acad.Sci., USA, 81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチド（異種ポリペプチド）のコード配列の全部又は一部を共有結合させることによって修飾してキメラ又は融合抗体ポリペプチドを生成することができる。非免疫グロブリンポリペプチド配列は、抗体の定常ドメインと置き代わることができるか、又は抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインが置換されて、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
【００８５】
３．ヒト及びヒト化抗体
本発明の実施に有用な抗-ＧＤＭ抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般的に、ヒト化抗体は、全て又はほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、全て又はほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む（Jones等, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)）。
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的にウィンター(Winter)及び共同研究者［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４，８１６，５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【００８６】
抗体がヒトの治療用途を意図している場合、抗原性及びＨＡＭＡ反応(ヒト抗-マウス抗体)を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方のヒト可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒトＶドメイン配列を同定し、その中のヒトフレームワーク（ＦＲ）をヒト化抗体のために受け入れる(Sims等, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia等, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta等, J. Immunol., 151:2623(1993))。
更に、抗体を、抗原に対する高結合親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、高頻度可変領域残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
【００８７】
ヒト化抗ＧＤＭ抗体抗体の種々の形態が考えられる。例えばヒト化抗体は、免疫結合体を生成するために、状況に応じて一又は複数の細胞障害性剤(類)と結合していてもよい抗体断片、例えばＦａｂであってもよい。また、ヒト化抗体は無傷抗体、例えば無傷ＩｇＧ１抗体であってもよい。
ヒト化の別法として、ヒト抗体を生成することができる。例えば、現在では、免疫化することで、内因性免疫グロブリンの産生がなく、ヒト抗体の全レパートリーを産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子のホモ接合体欠失によって、結果として内因性抗体産生の完全な阻害が起こることが説明されてきた。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子配列の、このような生殖細胞系突然変異体マウスへの転移によって、結果として抗原投与時にヒト抗体の産生がおこる。Jakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993); Bruggeman等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第５５４５８０６号、同５５６９８２５号、同５５９１６６９号（全てジェンファーム(GenPharm)）；同５５４５８０７号；及び国際公開第９７／１７８５２号を参照されたい。
【００８８】
別法として、ファージディスプレイ技術(McCafferty等, Nature 348：552-553[1990])を使用して、非免疫化ドナーの免疫グロブリン可変(Ｖ)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を産出させることができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子を、フレーム単位で、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３又はｆｄの大きい又は小さいコートタンパク質遺伝子のどちらかでクローンし、ファージ粒子の表面で機能的抗体断片として表示させる。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づいた選択に基づいても、結果としてこれらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択が成される。よって、このファージはＢ細胞のいくつかの特性を模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる；例えばJohnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)を参照せよ。Ｖ-遺伝子セグメントのいくつかの供給源を、ファージディスプレイのために使用できる。Clackson等, Nature, 352：624-628(1991)は、免疫化したマウス脾臓由来のＶ遺伝子の小さいランダムなコンビナトリアルライブラリから、多様で多くの抗-オキサゾロン抗体を単離した。非免疫化ヒトドナーのＶ遺伝子のレパートリーが構成可能であり、多様で多くの抗原(自己抗原を含む)に対する抗体は、Marks等, J. Mol. Biol. 222：581-597(1991)、又はGriffith等, EMBO J. 12：725-734(1993)に記載の技術にそのまま従うことで単離することができる。また、米国特許第５５６５３３２号及び同５５７３９０５号を参照のこと。
上述したように、ヒト抗体はインビトロで活性化したＢ細胞により産生することができる(米国特許第５５６７６１０号及び同５２２９２７５号)。
【００８９】
４．抗体断片
ある状況下では、抗体全体よりも、抗体断片を用いることに利点がある。より小さな大きさの断片は、対応する完全長分子が有する抗原結合特異性に類似の特異性を維持しながら迅速なクリアランスを可能にし、固形腫瘍への接近の改良につながり得る。
抗体断片を産生するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化によって誘導された(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は、現在は組換え宿主細胞により直接産生することができる。Ｆａｂ、Ｆｖ及びＳｃＦｖ抗体断片は、すべて大腸菌で発現させ分泌させることができ、従って、大量のこれら断片の産生が容易となった。抗体断片は、上で論じた抗体ファージライブラリから単離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合させてＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。インビボ半減期が増した、サルベージレセプター結合性エピトープ残基を含むＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２が、米国特許第５８６９０４６号に記載されている。抗体断片を生成するのための他の方法は、当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択する抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦｖ)である。国際公開９３／１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号を参照のこと。Ｆｖ及びｓＦｖは、定常領域を欠く無傷の連結部位を有する唯一の種である；従って、インビボで使用している間の減少した非特異的結合に適している。ｓＦｖ融合タンパク質は、ｓＦｖのアミノ又はカルボキシ末端のどちらかで、エフェクタータンパク質の融合体が生成されるように構成されてもよい。上掲のAntibody Engineering, Borrebaeck編を参照のこと。また、抗体断片は、例えば米国特許第５６４１８７０号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。そのような直鎖状抗体断片は単一特異性又は二重特異性であってもよい。
【００９０】
５．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、ＧＤＭタンパク質の２つの異なるエピトープに結合しうる。他のこのような抗体では他のタンパク質に対する結合部位とＧＤＭ結合部位とが結合しうる。あるいは、抗ＧＤＭアームは、ＧＤＭ-発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させ局在させるように、ＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲＩＩ(ＣＤ３２)及びＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)等のＩｇＧ(ＦｃγＲ)に対するＦｃレセプター、又はＴ細胞レセプター分子(例えばＣＤ３)等の白血球上のトリガー分子に結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体はＧＤＭを発現する細胞に細胞障害性剤を局在化するためにも使用されうる。これらの抗体はＧＤＭ結合アーム及び細胞障害性剤(例えば、サポリン(saporin)、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテン)と結合するアームを有する。二重特異性抗体は完全長抗体又は抗体断片(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。
国際公開第９６／１６６７３号には、二重特異性抗-ＥｒｂＢ２／抗-ＦｃγＲＩＩＩ抗体が記載されており、米国特許第５８３７２３４号には、二重特異性抗-ＥｒｂＢ２／抗-ＦｃγＲＩ抗体が開示されている。二重特異性抗-ＥｒｂＢ２／Ｆｃα抗体は国際公開第９８／０２４６３号に示されている。米国特許第５８２１３３７号は、二重特異性抗-ＥｒｂＢ２／抗-ＣＤ３抗体を教示するものである。
二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において既知である。完全長二重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている(Millstein等, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開第９３／０８８２９号及びTraunecker等, EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
【００９１】
異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原-抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むＩｇ重鎖定常ドメインである。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時トランスフェクトする。これにより、組立に使用される３つのポリペプチド鎖の等しくない比率が所望の二重特異性抗体の最適な収率をもたらす態様において、３つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも２つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が所望の鎖の結合にあまり影響がないときは、２または３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
この手法の好ましい実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公開第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
【００９２】
米国特許第５７３１１６８号に記載された他の手法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面はＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
二重特異性抗体は、架橋した又は「ヘテロコンジュゲート」抗体もまた含む。例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体の一方はアビジンに結合され、他方はビオチンに結合され得る。そのような抗体は、例えば、不要の細胞に対する免疫系細胞をターゲティングするため(米国特許第４６７６９８０号）、及びＨＩＶ感染の治療のために提案された（国際公開第９１／００３６０号、同９２／２００３７３号、及び欧州特許第０３０８９号)。ヘテロコンジュゲート抗体は、あらゆる簡便な架橋法を用いて作製することができる。好適な架橋剤は当該分野において良く知られており、幾つかの架橋技術と共に米国特許第４６７６９８０号に開示されている。
【００９３】
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤、亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に変換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再変換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
最近の進歩により、大腸菌からのＦａｂ'-ＳＨ断片の直接の回収が容易になり、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby等,J.Exp.Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトＴ細胞、及びＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。
【００９４】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な技術もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生成されている。Kostelny等, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生成に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーによりＶＬにＶＨを結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、よって２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等 J.Immunol. 147:60(1991)。
【００９５】
６．ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロコンジュゲート抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため［米国特許第４６７６９８０号］及びＨＩＶ感染の治療のために［国際公開第９１／００３６０；国際公開第９２／２００３７３；欧州特許第０３０８９号］提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することによって、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチルイミダート、及び例えば米国特許第４６７６９８０号に開示されたものが含まれる。
【００９６】
７．多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早くインターナリゼーション(及び／又は異化)されうる。本発明の抗体は、３又はそれ以上の結合部位を有する多価抗体(ＩｇＭクラス以外のもの)であり得(例えば四価抗体)、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に生成することができる。多価抗体は二量化ドメインと３又はそれ以上の抗原結合部位を有する。好ましい二量化ドメインはＦｃ領域又はヒンジ領域を有する(又はそれらからなる)。このシナリオにおいて、抗体はＦｃ領域と、Ｆｃ領域のアミノ末端に３又はそれ以上の抗原結合部位を有しているであろう。ここで、好ましい多価抗体は３ないし８、好ましくは４の抗原結合部位を有する(又はそれらからなる)。多価抗体は少なくとも１つのポリペプチド鎖(好ましくは２つのポリペプチド鎖)を有し、ポリペプチド鎖(類)は２又はそれ以上の可変ドメインを有する。例えば、ポリペプチド鎖(類)はＶＤ１-(Ｘ１)ｎ-ＶＤ２-(Ｘ２)ｎ-Ｆｃを有し、ここでＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域のポリペプチド鎖の一つであり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは０又は１である。例えば、ポリペプチド鎖(類)は：ＶＨ-ＣＨ１-柔軟なリンカー-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖を有し得る。ここで多価抗体は、好ましくは少なくとも２つ(好ましくは４つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに有する。ここで多価抗体は、例えば約２〜約８の軽鎖可変ドメインポリペプチドを有する。ここで考察される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを有し、場合によってはＣＬドメインを更に有する。
【００９７】
８．エフェクター機能の加工
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば抗体の抗原-依存細胞媒介細胞障害性（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存細胞障害性（ＣＤＣ）を向上させることは望ましい。これは、抗体のＦｃ領域で一又は複数のアミノ酸置換を誘導することによりなされうる。あるいは又はさらに、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成するようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上したインターナリゼーション能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体−依存細胞性細胞障害性（ＡＤＣＣ）を有する可能性がある。Caron等, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes,  B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。また、向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体は、Wolff等, Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されている異種二官能性架橋を用いて調製することができる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。抗体の血清半減期を増大させるために、例えば米国特許第５７３９２７７号に記載のように、抗体(特に抗体断片)へサルベージレセプター結合エピトープを導入してもよい。ここで使用される場合の「サルベージレセプター結合エピトープ」なる用語は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期を増加させる原因であるＩｇＧ分子(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４)のＦｃ領域のエピトープを意味する。
【００９８】
９．免疫複合体
また、本発明は、化学治療薬、成長阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片）などの細胞障害性剤、あるいは放射性同位体（即ち、放射性コンジュゲート）と抱合している抗体を含む免疫複合体に関する。
ａ．化学療法薬
このような免疫複合体の生成に有用な化学治療薬を上に記載した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質（PAPI、PAPII、及びPAP-S）、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。放射性コンジュゲート抗体の生成には、様々な放射性ヌクレオチドが利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅが含まれる。抗体及び細胞障害性剤の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス-アジド化合物（ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等）、ビス-ジアゾニウム誘導体（ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２，６-ジイソシアネート等）、及びビス-活性フッ素化合物（１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等）を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されているように調製することができる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ-ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。国際公開９４／１１０２６参照。
抗体のコンジュゲートと一又は複数の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、トリコセン(trichothene)及びＣＣ１０６５、及び毒性活性を有するこれらの毒素の誘導体が、ここで考察される。
【００９９】
ｂ．メイタンシン及びメイタンシノイド
好ましい一実施態様では、本発明の抗ＧＤＭ抗体(完全長又は断片)は一又は複数のメイタンシノイド分子と結合している。
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第３８９６１１１号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ-３メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第４１５１０４２号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第４１３７２３０号；同４２４８８７０号；同４２５６７４６号；同４２６０６０８号；同４２６５８１４号；同４２９４７５７号；同４３０７０１６号；同４３０８２６８号；同４３０８２６９号；同４３０９４２８号；同４３１３９４６号；同４３１５９２９号；同４３１７８２１号；同４３２２３４８号；同４３３１５９８号；同４３６１６５０号；同４３６４８６６号；同４４２４２１９号；同４４５０２５４号；同４３６２６６３号；及び同４３７１５３３号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。
【０１００】
治療指標を改善する試みにおいて、メイタンシン及びメイタンシノイドは、腫瘍細胞抗原に特異的に結合する抗体と結合している。メイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲート及びそれらの治療用途は、例えば米国特許第５，２０８，０２０号、同５，４１６，０６４号、欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。Liu等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：8618-8623(1996)には、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合するＤＭ１と命名されたメイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲートが記載されている。前記コンジュゲートは培養された結腸癌細胞に対して高い細胞障害性を有することが見出されており、インビボ腫瘍成長アッセイにおいて抗腫瘍活性を示す。Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)には、メイタンシノイドが、ジスルフィド結合を介して、ヒト結腸癌株化細胞の抗原に結合するマウス抗体Ａ７、又はＨＥＲ-２／ｎｅｕオンコジーンに結合する他のマウスモノクローナル抗体ＴＡ.１に結合している免疫コンジュゲートが記載されている。ＴＡ.１-メイタンシノイドコンジュゲートの細胞障害性はヒト乳癌株化細胞ＳＫ-ＢＲ-３におけるインビトロで試験され、細胞当たり３×１０５ＨＥＲ-２表面抗原が発現した。薬剤コンジュゲートにより、遊離のメイタンシノイド剤に類似した細胞障害度が達成され、該細胞障害度は、抗体分子当たりのメイタンシノイド分子の数を増加させることにより増加する。Ａ７-メイタンシノイドコンジュゲートはマウスにおいては低い全身性細胞障害性を示した。
【０１０１】
抗ＧＤＭ抗体-メイタンシノイド又はＧＤＭ結合抗体断片メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体又はメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性もほとんど低減することなく、メイタンシノイド分子に抗ＧＤＭ抗体又はＧＤＭ結合抗体断片を化学的に結合させることにより調製できる。１分子の毒素／抗体は、裸抗体の使用において細胞障害性を高めることが予期されているが、抗体分子当たり、平均３-４のメイタンシノイド分子が結合したものは、抗体の機能又は溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞に対する細胞障害性を向上させるといった効力を示す。メイタンシノイドは当該技術分野でよく知られており、公知の技術で合成することも、天然源から単離することもできる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第５２０８０２０号、及び他の特許、及び上述した特許ではない刊行物に開示されている。好ましいメイタンシノイドは、メイタンシノール、及び種々のメイタンシノールエステル等の、メイタンシノール分子の芳香環又は他の位置が修飾されたメイタンシノール類似体である。
例えば、米国特許第５２０８０２０号又は欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号、及びChari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)に開示されているもの等を含む、抗体-又は抗体断片-メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれるが、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。
【０１０２】
抗体又は抗体断片とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。特に好ましいカップリング剤には、ジスルフィド結合を提供するためのＮ-スクシンイミジル-４-(２-ピリジルチオ)ペンタノアート(ＳＰＰ)及びＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)(Carlsson等, Biochem. J. 173：723-737[1978])が含まれる。
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するＣ-３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ-１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ-１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ-２０位で生じる。好ましい実施態様において、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のＣ-３位で形成される。
【０１０３】
ｃ．カリケアマイシン
対象の他の免疫コンジュゲートには、一又は複数のカリケアマイシン分子と結合した抗ＧＤＭ抗体又はＧＤＭ結合抗体断片が含まれる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖ＤＮＡ破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５７１２３７４号、同５７１４５８６号、同５７３９１１６号、同５７６７２８５号、同５７７０７０１号、同５７７０７１０号、同５７７３００１号、同５８７７２９６号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ-アセチル-γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１(Hinman等, Cancer Research, 53：3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58：2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは双方共、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
【０１０４】
ｄ．他の細胞障害性剤
本発明の抗ＧＤＭ抗体と結合可能な他の抗腫瘍剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び５-フルオロウラシル、米国特許第５０５３３９４号、同５７７０７１０号に記載されており、集合的にＬＬ-Ｅ３３２８８複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン(esperamicine)(米国特許第５８７７２９６号)が含まれる。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日公開の国際公開第９３／２１２３２号を参照のこと。
本発明は、抗体と核酸分解活性を有する化合物(例えばリボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮアーゼ)との間に形成される免疫コンジュゲートをさらに考察する。
【０１０５】
腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性コンジュゲートした抗ＧＤＭ抗体を生成するために、種々の放射性同位体が利用される。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が含まれる。コンジュゲートが診断用に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴(ＮＭＲ)映像(磁気共鳴映像、mriとしても公知)用のスピン標識、例えばヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
放射-又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-９０はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80：49-57)は、ヨウ素-１２３の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
【０１０６】
抗体と細胞障害性剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは細胞中の細胞障害性剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る(Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)；米国特許第５２０８０２０号)。
【０１０７】
別法として、抗ＧＤＭ抗体又はＧＤＭ結合抗体断片及び細胞障害性剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。ＤＮＡの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの２つの部分をコードする領域をそれぞれ含有する。
他の実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体-レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄剤を使用し、循環から未結合コンジュゲートを除去し、細胞障害性剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
【０１０８】
１０．免疫リポソーム
ここで開示されている抗ＧＤＭ抗体又はＧＤＭ結合抗体断片は、免疫リポソームとして処方することもできる。「リポソーム」は、哺乳動物への薬物輸送に有用な、脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤を含む種々のタイプの小胞体である。リポソームの成分は、通常は生物膜の脂質配向に類似した２層構造に配列される。抗体を含有するリポソームは、例えばEpstein等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688(1985)；Hwang等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030(1980)；及び米国特許第４４８５０４５号及び同４５４４５４５号；及び１９９７年１０月２３日に公開の国際公開９７／３８７３１に記載されているように、当該分野において既知の方法により調製される。循環時間が増したリポソームは米国特許第５０１３５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ-誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ-ＰＥ)を含有する脂質組成物を用いた逆相蒸発法により作製することができる。リポソームは孔径が定められたフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体のＦａｂ'断片は、ジスルフィド交換反応を介して、Martin等, J. Biol. Chem. 257:286-288(1982)に記載されているようにしてリポソームにコンジュゲートすることができる。場合によっては、化学療法剤はリポソーム内に包含される。Gabizon等, J. National Cancer Inst. 81(19)1484(1989)を参照されたい。
【０１０９】
Ｂ．ＧＤＭ結合オリゴペプチド
本発明のＧＤＭ結合オリゴペプチドはここで記載される様なＧＤＭポリペプチドに、好ましくは特異的に、結合するオリゴペプチドである。ＧＤＭ結合オリゴペプチドは、既知のオリゴペプチド合成法を用いて化学的に合成することができ、あるいは組換え技術を用いて調製及び生成することができる。ＧＤＭ結合オリゴペプチドは通常、少なくとも約５のアミノ酸長であり、或いは少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００のアミノ酸長以上であり、このようなオリゴペプチドはここに記載される様なＧＤＭポリペプチドに対して好ましくは特異的に結合する能力がある。ＧＤＭ結合オリゴペプチドは、よく知られた技術を用いて過度の実験をすることなしに同定することができる。この点において、ポリペプチド標的に特異的に結合する能力のあるオリゴペプチドのオリゴペプチドライブラリを検索する技術は当分野でよく知られていることを注記する（例えば、米国特許第５５５６７６２号、同第５７５０３７３号、同第４７０８８７１号、同第４８３３０９２号、同第５２２３４０９号、同第５４０３４８４号、同第５５７１６８９号、同第５６６３１４３号；ＰＣＴ公開第ＷＯ８４／０３５０６号、及びＷＯ８４／０３５６４号；Geysen等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984)；Geysen等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985)；Geysen等, in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986)；Geysen等, J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987)；Schoofs等, J. Immunol., 140:611-616 (1988), Cwirla,S.E.等(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378；Lowman,H.B.等 (1991) Biochemistry, 30:10832；Clackson,T.等 (1991) Nature, 352:624；Marks,J.D.等 (1991) J. Mol. Biol., 222:581；Kang,A.S.等 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363、及びSmith, G.P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668参照）。
【０１１０】
この点において、バクテリオファージ（ファージ）ディスプレイは、大きなオリゴペプチドライブラリを検索して、ポリペプチド標的に特異的に結合する能力のあるこれらライブラリのメンバーを同定することを可能にするよく知られた技術の一つである。ファージディスプレイは、様々なポリペプチドがバクテリオファージ粒子の表面上のコートタンパク質に融合タンパク質として表示されることによる技術である（Scott,J.K.及びSmith G. P. (1990) Science 249:386)。ファージディスプレイの有用性は、選択的にランダム化されたタンパク質変異体（又はランダムクローンｃＤＮＡ）の大きなライブラリを標的分子に高い親和性で結合するこれらの配列について素早く効果的に分類することができる点にある。ファージでのペプチド（Cwirla,S.E.等 (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378）又はタンパク質（Lowman,H.B.ら (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson,T.ら (1991) Nature, 352: 624; Marks,J.D.等 (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang,A.S.等 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363）ライブラリのディスプレイは、特異的に結合する特性を有するものについて無数のポリペプチド又はオリゴペプチドをスクリーニングするために使用されている（Smith, G.P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668）。ランダム突然変異体のファージライブラリの分類は、多数の変異体を構築して増殖させる方法、標的レセプターを用いた親和性精製の方法、及び結合増強の結果を評価する手段を必要とする。米国特許第５２２３４０９号、同第５４０３４８４号、同第５５７１６８９号、及び同第５６６３１４３号。
【０１１１】
ほとんどのファージディスプレイ法は繊維状ファージを使用していたが、λファージディスプレイシステム（ＷＯ９５／３４６８３；米国特許第５６２７０２４号）、Ｔ４ファージディスプレイシステム（Ren等 Gene, 215:439 (1998); Zhu等Cancer Research, 58(15): 3209-3214 (1998); Jiang等, Infection & Immunity, 65(11): 4770-4777 (1997); Ren等, Gene, 195(2):303-311 (1997); Ren, Protein Sci., 5:1833 (1996); Efimov等, Virus Genes, 10:173 (1995)及びＴ７ファージディスプレイシステム（Smith及びScott, Methods in Enzymology, 217, 228-257 (1993); 米国特許第５７６６９０５号）も知られている。
【０１１２】
現在、基礎的なファージディスプレイ構想の多くの他の改良及び変形が開発されている。これらの改良は、選択された標的分子への結合についてペプチドライブラリをスクリーニングするための、及びこれらのタンパク質が所望の特性をスクリーニングする潜在能力で機能性タンパク質をディスプレイするためのディスプレイシステムの能力を増強する。ファージディスプレイ反応のための組み換え反応手段について記載があり（ＷＯ９８／１４２７７）及びファージディスプレイライブラリは二分子相互作用（ＷＯ９８／２０１６９；ＷＯ９８／２０１５９）及び拘束性へリックスペプチドの特性（ＷＯ９８／２００３６）を分析及び制御するために使用されている。ＷＯ９７／３５１９６は、リガンドが標的分子に結合しうる第一の溶液、及び親和性リガンドが標的分子に結合しない第二の溶液とファージディスプレイライブラリを接触させて結合リガンドを選択的に単離する、親和性リガンドの単離方法を記載する。ＷＯ９７／４６２５１は、親和性精製抗体でランダムファージディスプレイライブラリをバイオパニングし、次いで結合ファージを単離し、続いてマイクロプレートのウェルでマイクロパニングして高親和性結合ファージを単離する方法を記載する。黄色ブドウ球菌（Staphlylococcus aureus）タンパク質Ａの親和性タグとしての使用も報告されている（Li等, (1998) Mol Biotech., 9:187）。ＷＯ９７／４７３１４は、ファージディスプレイライブラリでもよいコンビナトリアルライブラリを用いて酵素特異性を識別するための基質サブトラクションライブラリの使用を記載している。ファージディスプレイに用いる洗浄剤における使用に適した酵素を選択する方法はＷＯ９７／０９４４６に記載される。特異的に結合するタンパク質を選択する更なる方法は、米国特許第５４９８５３８号、同第５４３２０１８号、及びＷＯ９８／１５８３３に記載されている。
ペプチドライブラリの作製及びこれらのライブラリのスクリーニングの方法は、米国特許第５７２３２８６号、同第５４３２０１８号、同第５５８０７１７号、同第５４２７９０８号、同第５４９８５３０号、同第５７７０４３４号、同第５７３４０１８号、同第５６９８４２６号、同第５７６３１９２号、及び同第５７２３３２３号に記載される。
【０１１３】
Ｃ．ＧＤＭ小分子アンタゴニスト
ＧＤＭ小分子アンタゴニストは、ここに記載されるようなＤＧＭポリペプチドのシグナル伝達エレメント（例えば、レセプター、リガンド、細胞内構成成分等）に、好ましくは特異的に結合する、ここに定義されるようなオリゴペプチド又は抗体（又はその断片）以外の小分子である。このような有機分子は既知の方法（例えばＰＣＴ公開第ＷＯ００／００８２３及びＷＯ００／３９５８５号参照）を用いて同定され、化学的に合成されうる。このような有機分子は通常、約２０００ダルトンの大きさ未満であり、あるいは約１５００、７５０、５００、２５０又は２００ダルトンの大きさであり、ここに記載される様なＧＤＭポリペプチドに、好ましくは特異的に結合する能力のあるこのような有機分子は、よく知られた技術を用いて過度の実験をすることなしに同定されうる。この点において、ポリペプチド標的に結合する能力のある分子の有機分子ライブラリを検索する技術は当分野でよく知られていることを注記する（例えばＰＣＴ公開第ＷＯ００／００８２３及びＷＯ００／３９５８５号参照）。ＧＤＭ分子アンタゴニストは、例えばアルデヒド、ケトン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、一級アミン、二級アミン、三級アミン、Ｎ置換ヒドラジン、ヒドラジド、アルコール、エーテル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド、尿素、カルバミン酸塩、炭酸塩、ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセタール、ハロゲン化アリール、アリールスルホン酸、ハロゲン化アルキル、アルキルスルホン酸、芳香族化合物、複素環化合物、アニリン、アルケン、アルキン、ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン、オキサゾリン、チアゾリジン、チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシアン酸塩、塩化スルホニル、ジアゾ化合物、酸塩化物等であり得る。
【０１１４】
Ｄ．ＧＤＭアンタゴニストのスクリーニング
本発明の抗体、ポリペプチド、オリゴペプチド及び有機分子を生成する技術を、上記に記載した。所望するような、所定の生物学的特性を有する抗体（及びその抗原結合断片）、オリゴペプチド又は有機分子をさらに選択することができる。
本発明に使用可能な様々なＧＤＭアンタゴニストの成長阻害効果を、例えば、内因的又はＧＤＭ遺伝子によるトランスフェクション後のいずれかでＧＤＭポリペプチドを発現する神経膠腫細胞を用いる当該分野で周知の方法によって評価することができる。例えば、適切な腫瘍細胞株及びＧＤＭコード化核酸を用いて形質移入した細胞は、数日間（例えば、２−７日）、種々の濃度の本発明のＧＤＭアンタゴニストで処理し、クリスタル・バイオレット又はＭＴＴで染色するか、又は他の何らかの比色アッセイによって分析することができる。増殖を測定するその他の方法は、このようなＧＤＭアンタゴニストの存在又は非存在下で処理した細胞の３Ｈ-チミジン取り込みを比較することによる。処理の後、細胞を収集し、ＤＮＡへ取り込まれた放射能をシンチレーションカウンターで定量化した。適切なポジティブコントロールには、細胞株の成長を阻害することが知られている成長阻害抗体でその選択した細胞株を処理することが含まれる。インビボでの成長阻害は、当該分野で知られている種々の方法で確かめることができる。好ましくは、腫瘍細胞は、ＧＤＭポリペプチドを過剰発現するものである。好ましくは、このようなＧＤＭアンタゴニストは、ある実施態様では約０．５から３０μｇ／ｍｌの抗体濃度で、未処理腫瘍細胞と比べて約２５−１００％、より好ましくは約３０−１００％、そしてさらにより好ましくは約５０−１００％又は７０−１００％のＧＤＭ発現腫瘍細胞の増殖をインビトロ又はインビボで阻害する。成長阻害は、細胞培養で、約０．５から３０μｇ／ｍｌ又は０．５ｎＭから２００ｎＭのＧＤＭアンタゴニスト濃度で測定することができ、その成長阻害は、抗体への腫瘍細胞の曝露後１-１０日で確かめられる。約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重でのアンタゴニスト及び／又はアゴニストの投与が、抗体の最初の投与から約５日から３ヶ月、好ましくは約５から３０日以内に腫瘍の大きさの減少又は腫瘍細胞増殖の減少を引き起こすならば、抗体はインビボで成長阻害作用がある。
【０１１５】
細胞死を誘発するＧＤＭアンタゴニストを選択するために、例えばヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルー又は７ＡＡＤの取込みにより示される膜インテグリティの損失度合いを対照と比較して求める。ＰＩ取込みアッセイは、補体及び免疫エフェクター細胞の不在下で行われる。ＧＤＭポリペプチド発現細胞腫瘍細胞を、培地のみ、又は適切なＧＤＭアンタゴニストを含有する培地でインキュベートする。細胞を３日間インキュベートする。各処理に続いて、細胞を洗浄し、細胞凝塊除去のために３５ｍｍのストレーナキャップ付き１２×７５チューブ(チューブ当たり１ｍｌ、処理グループ当り３チューブ)に等分する。次いで、チューブへＰＩ（１０μｇ／ｍｌ）を与える。サンプルをＦＡＣＳＣＡＮ(登録商標）フローサイトメータとＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴ(登録商標）セルクエスト(CellQuest)ソフトウエア(Becton Dickinson)を使用して分析してもよい。このようにして、ＰＩ取込みによって測定されるような、統計的に有意なレベルの細胞死を誘発するＧＤＭアンタゴニストを選択することができる。
関心のある抗体が結合したＧＤＭポリペプチド上のエピトープに結合するＧＤＭアンタゴニストをスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow及びDavid Lane編(1988)に記載されているような通常の交差ブロッキングアッセイを実施することができる。既知の抗ＧＤＭ抗体のように、試験抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子が同じ部位又はエピトープと結合するならば、このアッセイを確定するために用いることができる。あるいは、又は付加的に、エピトープマッピングを、当該分野で周知の方法によって行うことができる。例えば、接触残基を同定するために、例えばアラニンスキャンニングによって抗体配列を変異させることができる。この変異体抗体は、適切なフォールディングを確かめるために、最初にポリクローナル抗体との結合について試験される。異なる方法では、ＧＤＭポリペプチドの異なる領域と一致するペプチドを、試験抗体群又は試験抗体及び特徴付けられた又は既知のエピトープを有する抗体による競合アッセイで用いることができる。
【０１１６】
Ｅ．抗体依存性酵素媒介性プロドラッグ治療法(ＡＤＥＰＴ)
また、本発明のＧＤＭアンタゴニスト抗体は、プロドラッグ(例えばペプチジル化学療法剤、国際公開８１／０１１４５を参照)を活性な抗癌剤へ変換するプロドラッグ活性化酵素へ抗体をコンジュゲートすることによって、ＡＤＥＰＴにおいて使用することができる。例えば国際公開８８／０７３７８及び米国特許第４９７５２７８号を参照されたい。
ＡＤＥＰＴに有用な免疫コンジュゲートの酵素成分には、より活性な細胞毒形態に変換するようにプロドラッグへ作用し得る任意の酵素が含まれる。
限定するものではないが、この発明の方法に有用な酵素には、ホスファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ；スルファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５-フルオロシトシンを抗癌剤５-フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；プロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン(例えば、カテプシンＢ及びＬ)で、ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なもの；Ｄ-アミノ酸置換基を含有するプロドラッグの変換に有用なＤ-アラニルカルボキシペプチダーゼ；炭水化物切断酵素、例えばグリコシル化プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なノイラミニダーゼ及びβガラクトシダーゼ；βラクタムで誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に変換させるのに有用なβラクタマーゼ；及びペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれフェノキシアセチル又はフェニルアセチル基で、それらのアミン性窒素において誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に変換するのに有用なペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼが含まれる。あるいは、「アブザイム」としてもまた公知の酵素活性を有する抗体を、遊離の活性薬剤に本発明のプロドラッグを変換させるために使用することもできる(例えば、Massey, Nature 328:457-458(1987)を参照)。抗体-アブザイムコンジュゲートは、ここで記載されているようにして、腫瘍細胞個体群にアブザイムを送達するために調製することができる。
この発明の酵素は、当該分野においてよく知られている技術、例えば上で検討したヘテロ二官能性架橋試薬を使用することにより、抗ＧＤＭ抗体に共有的に結合させることができる。あるいは、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部位に結合せしめてなる融合タンパク質を、当該技術においてよく知られている組換えＤＮＡ技術を使用して作成することができる(Neuberger等, Nature 312:604-608[1984])。
【０１１７】
Ｆ．ＧＤＭポリペプチド変異体
ここに記載したＧＤＭポリペプチドに加えて、そのような分子の変異体を、ここに開示する本発明に使用するために調製できると考えられる。このような変異体は、コード化ＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することによって、及び／又は所望の抗体又はポリペプチドを合成することによって調製できる。当業者は、アミノ酸変化がグリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などのこれら分子の翻訳後プロセスを変え得るのを理解するであろう。
アミノ酸配列の変異は、例えば、米国特許第５３６４９３４号に示す保存的及び非保存的変異に関する技術及び指針のいずれかを用いて作成することができる。変異は、結果として天然配列と比較してアミノ酸配列の変化を生じる、アミノ酸配列をコードする一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってもよい。場合によっては、変異は、対象のアミノ酸配列の一つ又は複数のドメインにおける、少なくとも一つのアミノ酸の他の任意のアミノ酸との置換による。どのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失され得るかを確かめる指針は、対象のアミノ酸配列を既知の相同なタンパク質分子の配列と相同な対象のアミノ酸配列の配列と比較し、相同性の高い領域内で生じたアミノ酸配列変化の数を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、一のアミノ酸を類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸で置換すること、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果であるとすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲内であり得る。許容され得る変異は、配列にアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、生じた変異体を完全長又は成熟天然配列によって示される活性に関して試験することによって確かめられる。
【０１１８】
種々のＧＤＭポリペプチドの断片がここで提供されている。そのような断片は、例えば完全長天然抗体又はタンパク質と比較した時に、Ｎ末端又はＣ末端で切断しているか、又は内部残基を欠いている可能性がある。所望される生物学的活性にとって必須ではないアミノ酸残基を欠くそのような断片も、開示される方法に有用である。
上記ポリペプチド断片は、多くの従来技術のいずれかによって調製してもよい。所望のペプチド断片は化学合成してもよい。代替的方法には、酵素的消化、例えば特定のアミノ酸残基で確定した部位でタンパク質を切断することが知られた酵素によってタンパク質を処理することで、又は適当な制限酵素でＤＮＡを消化して所望の断片を単離することによってそのような断片を生成することが含まれる。さらにその他の好適な技術には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、所望断片をコードするＤＮＡ断片を単離し増幅することが含まれる。ＤＮＡ断片の所望の末端を確定するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲの５’及び３’プライマーで用いられる。好ましくは、そのような断片は、対応する完全長分子と少なくとも１つの生物学的及び／又は免疫学的活性を共有する。
【０１１９】
特定の実施態様では、対象とする保存的置換を、好ましい置換の項目で表６に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表６に例示的置換と名前を付けた又は以下にアミノ酸分類でさらに記載するように、より実質的な変化が導入され、所望の変異体を同定するために生成物がスクリーニングされる。
表６
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【０１２０】
ＧＤＭポリペプチドの機能又は免疫学的同一性の実質的修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の電荷又は分子疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において有意に異なる置換基を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
（２）中性の親水性：Cys, Ser, Thr; Asn; Gln
（３）酸性：Asp, Glu;
（４）塩基性：His, Lys, Arg;
（５）鎖配向に影響する残基：Gly, Pro; 及び
（６）芳香族：Trp, Tyr, Phe。
非保存的置換は、これらの分類の１つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、又はより好ましくは、残された（非保存）部位に導入されうる。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発等のこの分野で知られた方法を用いてなすことができる。部位特異的突然変異誘発［Carter等, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)］、カセット突然変異誘発［Wells等, Gene, 34: 315 (1985)］、制限的選択突然変異誘発［Wells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)］又は他の知られた技術をクローニングしたＤＮＡに実施して、抗ＧＤＭ分子を生成することもできる。
【０１２１】
また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である［Cunningham及びWells, Science, 244: 1081-1085 (1989)］。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman ＆ Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
ＧＤＭポリペプチドの適切なコンフォメーションを維持することに関与していない任意のシステイン残基も、分子の酸化的安定性を向上させ、異常な架橋を防ぐために、概してセリンと置換され得る。逆に、そのような分子の安定性（特に、抗体がＦｖ断片のような抗体断片）を向上させるために、それにシステイン結合（複数でも）を加えてもよい。
【０１２２】
特に好ましい型の置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の一又は複数の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的に、更なる開発のために得られた変異体は、それらが生成された親抗体と比較して向上した生物学的特性を有している。そのような置換変異体を生成する簡便な方法には、ファージディスプレイを使用する親和性成熟がふくまれる。簡潔に言えば、高頻度可変領域部位（例えば、６−７部位）を変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生成させる。このように生成された抗体変異体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物として一価形態で表示される。ファージ表示変異体は、ついで、ここに開示されるようなそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。改変の候補となる高頻度可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を実施し、抗原結合に有意に寄与する高頻度可変領域残基を同定することができる。あるいは、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して抗体と標的ポリペプチドとの作用点を同定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、ここで詳しく記述した技術による置換の候補である。そのような変異体が生成されたら、変異体のパネルにここに記載するようなスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を更なる開発のために選択することができる。
ＧＤＭポリペプチドのアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当該分野で周知の種々の方法によって調製される。これらの方法には、限定されるものではないが、オリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、そして天然配列又は早期に調製した変異体のカセット突然変異誘発による、天然ソースからの単離（天然発生アミノ酸配列変異体の場合）又は調製が含まれる。
【０１２３】
Ｇ．ＧＤＭポリペプチドの修飾
共有結合的に修飾されたＧＤＭも、本発明の範囲に含まれる使用に適切であり得る。共有結合的修飾の一型には、標的とするそのような抗体及びポリペプチドのアミノ酸残基を、そのような抗体及びポリペプチドの選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることが含まれる。二官能性試薬による誘導体化は、例えば前述の分子を、精製に用いる水不溶性支持体マトリクス又は表面と架橋させるために有用であり、その逆も同じである。通常用いられる架橋剤には、例えば、１,１-ビス（ジアゾアセチル）-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４-アジドサリチル酸を有するエステル、３,３'-ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-１,８-オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-３-[(ｐ-アジドフェニル)-ジチオ］プロピオイミダート等の試薬が含まれる。
他の修飾には、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチル残基への脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman ＆ Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【０１２４】
本ＧＤＭポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、抗体又はポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。ここで意図される「天然グリコシル化パターンの変更」とは、天然配列に見られる一又は複数の炭水化物部分を欠失させること（内在するグリコシル化部位を取り除くことによって、又は化学及び／又は酵素的手法でグリコシル化を欠失させることのいずれか）、及び／又は対応する天然配列に存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。更には、この語句には、存在する種々の炭水化物部分の性質及び特性の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化における定性的な変化が含まれる。
抗体及び他のポリペプチドのグリコシル化とは、典型的にはＮ-結合又はＯ-結合のいずれかである。Ｎ-結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付与を指す。トリペプチドは、Ｘがプロリンを除く任意のアミノ酸である、アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニンの配列であり、アスパラギン側鎖への炭水化物部分が酵素的に付与される認識部位である。従って、ポリペプチドのこれらトリペプチド配列のいずれかの存在によって、潜在的なグリコシル化部位が作り出される。Ｏ-結合グリコシル化とは、５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンも用いられるが、殆どの場合にはセリン又はスレオニンへＮ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースのうちの一つの糖をヒドロキシアミノ酸へ付与することを指す。
グリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を改変して、それが上記に記載のトリペプチド配列（Ｎ-結合グリコシル化部位について）の一つ又は複数を含むようにすることによって簡便に完遂できる。この改変は、また、最初のそのような抗体又はポリペプチドの配列へ一つ又は複数のセリン又はスレオニン残基を付加、又は置換することによって生成される（Ｏ-結合グリコシル化部位について）。そのような抗体又はポリペプチド配列は、ＤＮＡレベルでの変化を通して、特に、コドンが所望するアミノ酸へ翻訳される、あらかじめ選択した塩基での前述のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを変異させることによって、場合によっては改変され得る。
【０１２５】
炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。そのような方法は、この技術分野において、例えば、１９８７年９月１１日に発行された国際公開８７／０５３３０、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。
炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Hakimuddin等, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)によって、そしてEdge等, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)によって記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura等, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
共有結合的修飾の他の型は、種々の非タンパク質様ポリマーの１つ、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンへ、米国特許第４６４０８３５号；第４４９６６８９号；第４３０１１４４号；第４６７０４１７号；第４７９１１９２号又は第４１７９３３７号に記載された方法で結合させることをを含む。また、ＧＤＭポリペプチドは、例えばコアセルベーション法によって又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセル）に、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルションで捕捉することができる。このような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences, １６版, A. Oslo編(1980)に開示されている。
ＧＤＭポリペプチドの、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列との融合に起因するキメラ分子を形成する修飾の、本発明への使用を考慮する。
【０１２６】
一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとＧＤＭポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的にはそのような抗体又はポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このような抗体又はポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってそのような抗体又はポリペプチドを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（ポリ-His）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（poly-his-gly）タグ；flu HAタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（gD）タグ及びその抗体［Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド［Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)］；ＫＴ３エピトープペプチド［Martin等, Science, 255:192-194 (1992)］；α-チューブリンエピトープペプチド［Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)］を含む。
それに換わる実施態様では、キメラ分子はＧＤＭポリペプチドの免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態（「イムノアドヘシン」とも呼ばれる）については、そのような融合体はＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。Ｉｇ融合体は、好ましくはＩｇ分子内の少なくとも１つの可変領域に換えて前述の抗体又はポリペプチドの可溶化（膜貫通ドメイン欠失又は不活性化）形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧ分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、１９９５年６月２７日発行の米国特許第５４２８１３０号を参照のこと。
【０１２７】
Ｈ．ＧＤＭポリペプチドの調製
以下の説明は、主として、このような抗体、ポリペプチド及びオリゴペプチドをコードする核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりＧＤＭポリペプチドを産生させる方法に関する。勿論、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてこのような抗体、ポリペプチド及びオリゴペプチドを調製することができると考えられている。例えば、適切なアミノ酸配列、又はその一部分を、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生成してもよい［例えば、Stewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., サン フランシスコ, カリフォルニア(1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照］。手動技術又は自動を使用することによってインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機（フォスター  シティー, カリフォルニア）を用いて、製造者の指示によって実施してもよい。このような抗体、ポリペプチド又はオリゴペプチドの種々の部分を別々に化学的に合成し、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて所望の生成物を生成してもよい。
【０１２８】
１．ＧＤＭポリペプチドをコードするＤＮＡの単離
ＧＤＭポリペプチドをコードするＤＮＡは、そのような抗体、ポリペプチド又はオリゴペプチドｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから得ることができる。従って、このようなポリペプチドをコードするＤＮＡは、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリ、ゲノムライブラリ又は公知の合成方法（例えば、自動核酸合成）から簡便に得ることができる。
ライブラリは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(少なくとも約２０-８０塩基のオリゴヌクレオチド等)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリのスクリーニングは、例えばSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。別法として、ＰＣＲ法を使用することができる［Sambrook等,上掲；Dieffenbach等, PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)］。
【０１２９】
ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするための技術は、当該分野で良く知られている。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、疑陽性が最小化されるよう十分な長さであり、十分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリ内のＤＮＡとのハイブリダイゼーション時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、３２Ｐ標識ＡＴＰのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用を含む。中程度のストリンジェンシー及び高度のストリンジェンシーを含むハイブリダイゼーション条件は、上掲のSambrookら，に示されている。
このようなライブラリスクリーニング法において同定された配列は、GenBankらの公共データベース又は他の個人の配列データベースに寄託され利用可能となっている他の周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決定された領域内の又は完全長配列に渡っての（アミノ酸又はヌクレオチドレベルのいずれかでの）配列同一性は、当該分野で知られた、及びここに記載した方法を用いて決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されていないｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrook等に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用して、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリをスクリーニングすることによって得られる。
【０１３０】
２．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したＧＤＭポリペプチド生成のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコル、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及び上掲のSambrook等に見出すことができる。
真核生物細胞形質移入及び原核生物細胞形質転換の方法、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shaw等, Gene, 23:315(1983)及び１９８９年６月２９日公開の国際公開８９／０５８５９に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が用いられる。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van Solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【０１３１】
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物には、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性微生物、例えば大腸菌のような腸内細菌科が含まれる。種々の大腸菌株が公に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）；大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）；大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）及びＫ５７７２（ＡＴＣＣ５３６３５）である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌属、例えば大腸菌（E. coli）、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えばネズミチフス菌(Salmonella Typhimurium）、セラチア、例えばセラチア・マルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバチルス・スブチルス(B. subtilis)及びバチルス・リチェニフォルミス(B. licheniformis)（例えば、１９８９年４月１２日発行のＤＤ２６６７１０に記載されたバチルス・リチェニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス、例えば緑膿菌及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生成物発酵のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０を、宿主にとって内因性のタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子変異をもたらすように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  （ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｋａｎrを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ  ５５，２４４）；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  (ａｒｇＦ-ｌａｃ)１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｒｂｓ７  ｉｌｖＧ  ｋａｎrを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び１９９０年８月７日発行の米国特許第４９４６７８３号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が好ましい。
【０１３２】
完全長抗体、抗体断片、及び抗体融合タンパク質は、治療用の抗体が細胞障害性剤（例えば、毒素）と結合し、その免疫コンジュゲートそのものが腫瘍細胞の破壊において有効性を示す場合など、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要ない場合に、細菌で産生させることができる。完全長抗体は、血液循環でより長い半減期を有する。大腸菌での産生が、より迅速でより費用効率的である。細菌での抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号（Carter等）、米国特許第５７８９１９９号（Joly等）、及び翻訳開始部位（ＴＩＲ）及び発現と分泌を最適化するシグナル配列を記載している米国特許第５８４０５２３号（Simmons等）を参照のこと。これら特許は、ここに参考文献として取り入れられている。発現の後、抗体は、大腸菌細胞ペーストから可溶性分画へ分離し、例えば、アイソタイプによってプロテインＡ又はＧカラムを介して精製することができる。最終精製は、例えば、適切な細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）で発現させた抗体を精製するための工程と同じようにして行うことができる。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＧＤＭポリペプチドをコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)（Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981]; １９８５年５月２日公開の欧州特許第１３９３８３号）；クリュイベロミセス宿主(Kluyveromyces hosts)（米国特許第４９４３５２９号; Fleer等, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)）、例えばクリュイベロミセスラクチス(K. lactis)（MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt等, J. Bacteriol., 154(2): 737-742 [1983]）、クリュイベロミセス・フラギリス(K. fragilis)（ＡＴＣＣ１２４２４）、クリュイベロミセス・ブルガリクス(K. bulgaricus)（ＡＴＣＣ１６０４５）、クリュイベロミセス・ウィケラミイ(K. wickeramii)（ＡＴＣＣ２４１７８）、クリュイベロミセス・ワルチイ(K. waltii)（ＡＴＣＣ５６５００）、クリュイベロミセス・ドロソフィラルム(K. drosophilarum)（ＡＴＣＣ３６９０６； Van den Berg等, Bio/Technology, 8: 135 (1990)）、クリュイベロミセス・テモトレランス(K. thermotolerans)及びクリュイベロミセス・マルキシアナス(K. marxianus)；ヤロウィア(yarrowia)（欧州特許第４０２２２６号）；ピシア・パストリス(Pichia pastoris)（欧州特許第１８３０７０号； Sreekrishna等, J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988]）；カンジダ；トリコデルマ・レーシア(Trichoderma reesia)（欧州特許第２４４２３４号）；アカパンカビ（Case等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]）；シュワニオマイセス(Schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)（１９９０年１０月３１日公開の欧州特許第３９４５３８号）；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)（１９９１年１月１０日公開の国際公開９１／００３５７）；及びアスペルギルス宿主、例えばアスペルギルス・ニダランス（Ballance等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburn等, Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]）及びアスペルギルス・ニガー（Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985]）が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック(Ｃ１化合物資化性、Methylotropic)酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピシア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されたメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。
【０１３３】
グリコシル化ＧＤＭポリペプチド生成物の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物から由来のものである。非脊椎動物細胞の例には、植物細胞、例えば綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト及びタバコの細胞培養と同様に、ショウジョウバエＳ２及びヨトウ(spodoptera)Ｓｆ９等の昆虫細胞が含まれる。多くのバキュロウイルス株及び変異体、及びヨトウガ(Spodoptera frugiperda)(幼虫(caterpillar))、ネッタイシマカ(蚊)、ヒトスジシマカ(蚊)、キイロショウジョウバエ(ショウジョウバエ)、及びカイコ等の宿主に対応する許容性昆虫宿主細胞が同定されている。種々のトランスフェクション用のウイルス株、例えばオートグラファ・カルフォルニカ(Autographa californica)ＮＰＶのＬ−１変異株、カイコＮＰＶのＢｍ-５株が公に入手でき、このようなウイルスは、本発明に係るウイルスとして、特に、ヨトウガ細胞のトランスフェクションのために使用してもよい。
しかし、最大の関心は脊椎動物細胞に向けられ、培養(組織培養)した脊椎動物細胞の増殖がルーチン作業となった。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０(ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１)で形質転換させたサル腎ＣＶ１細胞株；ヒト胚芽腎細胞株(２９３又は懸濁培養で成長するようにサブクローン化された２９３細胞，Graham等,J.Gen Virol.,36:59 (1977))；ベビーハムスター腎細胞(ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ，Urlaub等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216 (1980));マウスセルトリ細胞(ＴＭ４，Mather,Biol.Reprod.,23：243-251 (1980))；サル腎細胞(ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０)；アフリカミドリザル腎細胞(ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト頚管腫瘍細胞(ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ２)；イヌ腎細胞(ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４)；バッファローラット肝細胞(ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２)；ヒト肺細胞(Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５)；ヒト肝細胞(Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５)；マウス乳房腫瘍細胞(ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68 (1982))；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝臓癌細胞（ＨｅｐＧ２）である。
宿主細胞は、ＧＤＭポリペプチド生成のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘発し、形質転換体を選出し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切に修正した通常の栄養培地で培養される。
【０１３４】
３．複製可能なベクターの選択及び使用
対応するＧＤＭポリペプチドをコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、クローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
ＧＤＭポリペプチドは直接的に組換え手法によって生成されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生成される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入される成熟配列をコードするＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクリュイベロミセス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第５，０１０，１８２号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、カンジダ・アルビカンス(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(１９９０年４月４日発行の欧州特許第３６２１７９号)、又は１９９０年１１月１５日に公開された国際公開９０／１３６４６に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【０１３５】
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスについてよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードしており、例えばバシリのＤ-アラニンラセマーゼをコードする遺伝子がある。
【０１３６】
哺乳動物細胞に適切な選択マーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、所望のタンパク質をコードする核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979)；Kingsman等, Gene, 7：141(1979)；Tschemper等, Gene, 10：157(1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファンで成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Jones, Genetics, 85:12 (1977)］。
発現及びクローニングベクターは、通常、所望のアミノ酸配列をコードする核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を方向付けるプロモーターを含む。種々の有能な宿主細胞により認識されるプロモーターが知られている。原核生物宿主との使用に適したプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Chang等, Nature, 275:615 (1978)； Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); 欧州特許第３６，７７６号］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［deBoer等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)］を含む。細菌系で使用するプロモーターもまた所望のタンパク質配列をコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
【０１３７】
酵母宿主との使用に適したプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ［Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他の糖分解酵素［Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17：4900(1978)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモーターは欧州特許第７３６５７号に更に記載されている。
【０１３８】
哺乳動物の宿主細胞におけるＤＮＡの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、伝染性上皮腫ウイルス(１９８９年７月５日公開の英国特許第２２１１５０４号)、アデノウイルス(例えばアデノウイルス２)、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びサルウイルス４０(SV40)のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
ＧＤＭポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製開始点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、前述のアミノ酸配列のコード化配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位に位置している。
【０１３９】
また真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウイルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、ここに記載するそれぞれの抗体、ポリペプチド、又はオリゴペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養での抗体、ポリペプチド又はオリゴペプチドそれぞれの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (1981); Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979); 欧州特許第１１７０６０号；及び欧州特許第１１７０５８号に記載されている。
【０１４０】
４．宿主細胞の培養
本発明のＧＤＭポリペプチドを生成するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ham)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地((MEM),シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((DMEM),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国特許再発行第３０９８５号に記載された任意の培地も宿主細胞に対する培養培地として使用できる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオシド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシン（商品名）薬)、微量元素(マイクロモル範囲の最終濃度で通常は存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含まれてもよい。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【０１４１】
５．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリダイゼーションによって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。ついで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果、表面での二本鎖の形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量化する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、本方法に適した抗体は、天然配列ポリペプチド又はオリゴペプチドに対して、又はＤＮＡに融合し、そのようなポリペプチド又はオリゴペプチドの特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【０１４２】
６．タンパク質の精製
ＧＤＭポリペプチドは、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-Ｘ１００)を用いて又は酵素的切断により膜から引き離すことができる。前述したものの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
前述のものは、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。次の手順は、適切な精製手順の例である。すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過；ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及び所望の分子のエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選択する精製過程（一又は複数）は、例えば、用いられる生成方法及び請求の範囲に規定される方法のために特に生成される抗体、ポリペプチド又はオリゴペプチドの性質に依存する。
【０１４３】
組換え技術を使用する場合、ＧＤＭポリペプチドは細胞内、細胞膜周辺腔内に生成されるか、又は培地に直接分泌され得る。このような分子が細胞内に生成される場合、第１工程として、粒状屑、宿主細胞又は溶菌断片を、例えば遠心分離又は超遠心分離にかけて取り除く。Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992)は、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離するための手順について記載している。簡単に述べると、細胞ペーストを酢酸ナトリウム(ｐＨ３．５)、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフロリド(ＰＭＳＦ)の存在下で、３０分以上かけて解凍する。細胞屑は遠心分離により除去することができる。抗体が培地へ分泌されている場合、そのような発現系からの上清は、一般的には、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばAmicon又はMillipore Pelliconの限外濾過ユニットを用いて最初に濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めてタンパク質分解を阻害してもよく、抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
精製は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて行うことができ、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティリガンドとしてのプロテインＡの適合性は抗体に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる（Lindmark等, J. Immunol. Meth. 62: 1-13 [1983]）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている（Guss等, EMBO J. 5: 15671575 [1986]）。アフィニティリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Bakerbond ABX(商標)樹脂（J.T. Baker, Phillipsburg, NJ）が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラム）上でのヘパリンSEPHAROSE(商品名)クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿などの他のタンパク質精製技術も、回収される抗体に応じて利用可能である。
任意の予備精製工程に続いて、対象とする抗体と汚染物とを含む混合物に、約２．５−４．５のｐＨでの溶離バッファーを用いて、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーを施してもよく、好ましくは低い塩濃度（例えば、約０−０．２５Ｍ塩）で実施される。
【０１４４】
Ｉ．製薬製剤
本発明により使用されるＧＤＭアンタゴニスト（「治療薬」）の治療的製剤は、所望される程度の純度を持つ治療薬を、凍結乾燥製剤又は水性溶液の形態で、最適な製薬上許容される担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより調製され保存される（Remington: The Science of Practice of Pharmacy, 20版, Gennaro, A.等, Ed., Philadelphia Coolege of Pharmacy and Science (2000)）。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、酢酸、Ｔｒｉｓ、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンズアルコニウムクロライド、ベンズエトニウムクロライド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；トレハロース及び塩化ナトリウムなどのトニシファイヤー；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ポリソルベート等の界面活性剤；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体）；及び／又はトゥイーン(TWEEN)（登録商標）、プルロニクス(PLURONICS)（登録商標）、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。抗体は、好ましくは５−２００ｍｇ／ｍｌの間、好ましくは１０−１００ｍｇ／ｍｌの間の濃度の抗体で構成される。
【０１４５】
ここでの製剤は、また、治療すべき特定の徴候の必要に応じて一以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。例えば、前述の治療薬（一又は複数）に加えて、製剤に、例えば、そのような第二の薬剤、又は神経膠腫の成長に影響を与える成長因子のような何らかの他の標的に対する抗体を含めることは望ましい。あるいは、又はさらに、この組成物は、更に化学療法剤、細胞障害性剤、サイトカイン、成長阻害剤、抗-ホルモン剤、及び／又は心臓保護剤を含んでもよい。このような分子は、意図する目的にとって有効な量の組み合わせで適切に存在する。
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy、上掲に開示されている。
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール））、ポリアクチド（米国特許第３７７３９１９号）、Ｌ-グルタミン酸及びγエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(登録商標)（乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球）などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、ポリ-(Ｄ)-（-）-３-ヒドロキシブチル酸が含まれる。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
【０１４６】
Ｊ．ＧＤＭアンタゴニストを用いる診断及び治療
神経膠腫におけるＧＤＭ発現を定量するために、種々の診断アッセイが利用可能である。一実施態様では、ＧＤＭポリペプチド過剰発現は、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって分析される。腫瘍生検からのパラフィン包埋組織切片をＩＨＣアッセイへ供してもよいし、次のようなＧＤＭタンパク質染色強度基準と合致させてもよい：
スコア０ - 染色が観察されないか、又は膜染色が腫瘍細胞の１０％未満で観察される。
スコア１＋ - わずかに／弱く認知できる程度の膜染色が腫瘍細胞の１０％を越えて検出される。細胞はそれらの膜の一部のみが染色される。
スコア２＋ - 弱いないしは中程度の完全な膜染色が腫瘍細胞の１０％を越えて観察される。
スコア３＋ - 中程度から強い完全な膜染色が腫瘍細胞の１０％を越えて観察される。
ＧＤＭポリペプチド発現に関して０又は１＋スコアの腫瘍は、ＧＤＭが過剰発現していないことを特徴としうるものであるのに対し、２＋又は３＋スコアの腫瘍はＧＤＭが過剰発現していることを特徴としうる。
【０１４７】
別に、又は付加的に、ＦＩＳＨアッセイ、例えばＩＮＦＯＲＭ（登録商標）(Ventana, Arizonaから販売)又はＰＡＴＨＶＩＳＩＯＮ（登録商標）(Vysis, Illinois)を、ホルマリン固定、パラフィン包埋された腫瘍組織で実施して、腫瘍におけるＧＤＭ過剰発現の程度(生じているならば)を測定してもよい。
ＧＤＭ過剰発現又は増幅は、インビボ診断アッセイを使用して評価することができ、例えば検出される分子に結合し、検出可能な標識(例えば、放射性同位体又は蛍光標識)が付けられた分子(例えば抗体、オリゴペプチド又は有機分子)を投与し、標識の局在化について患者を外部スキャニングする。
【０１４８】
現在、癌の段階に応じて、癌の治療には、次の治療：外科手術による癌組織の除去、放射線治療、及び化学治療の一つ、又はそれらを組合せたものが含まれる。ＧＤＭアンタゴニストの投与を含む治療は、特に、化学治療における副作用や毒素に対する耐性がない老年の患者、及び放射線治療の有用性に限界がある転移性疾患において所望されている。本発明の方法のＧＤＭアンタゴニストを標的とする腫瘍はまた、疾患の初期診断時及び再発中の、ＧＤＭ-発現癌の緩和に使用できる。治療用途に関しては、このようなＧＤＭアンタゴニストは、神経膠腫の治療に用いられる他の従来の薬剤及び／又は方法の適用前又は後に、例えば、ホルモン、抗血管形成、又は放射標識された化合物と共に、又は外科手術、寒冷療法、放射線治療及び／又は化学療法と組み合わせて使用してもよい。化学療法剤、例えばタキソテレ(登録商標)(ドセタキセル)、タキソール(登録商標)(パリクタキセル)、エストラムスチン及びミトキサントロンは、癌、特に危険性の少ない患者の癌治療に使用される。
特に、パリクタキセル及び改変誘導体との組合せ治療が考えられる(例えば、欧州特許第０６００５１７号を参照のこと)。前述の抗体、ポリペプチド、オリゴペプチド又は有機分子は治療的有効量の化学療法剤と共に投与されるであろう。他の実施態様では、そのような抗体、ポリペプチド、オリゴペプチド又は有機分子は化学療法剤、例えばパクリタキセルの活性及び効力を高めるための化学治療と組合せて投与される。医師用卓上参考書(ＰＤＲ)には、種々の癌治療に使用されるこれらの薬剤の用量が開示されている。治療的に有効な上述の化学療法剤の投薬計画及び用量は、治療される特定の癌、疾患の程度、及び当該技術分野の医師によく知られている他の因子に依存し、医師が決定することができる。
【０１４９】
特定の一実施態様では、細胞障害性剤にコンジュゲートしたこのようなＧＤＭアンタゴニストを含有する免疫コンジュゲートを患者に投与する。好ましくは、このような免疫コンジュゲートは細胞によりインターナリゼーションし、結果として、それが結合した癌細胞の殺傷性における免疫コンジュゲートの治療的効果が向上する。好ましい実施態様では、細胞障害性剤は、癌細胞内の核酸を標的とするか、又はこれに干渉する。このような細胞障害性剤の例は、上述されており、メイタンシノイド、カリケアマイシン、リボヌクレアーゼ及びＤＮＡエンドヌクレアーゼを含む。
前述のＧＤＭアンタゴニスト又はその毒素コンジュゲートは、公知の方法、例えばボーラス、もしくは一定時間にわたる連続注入による静脈内投与、頭蓋内、脳脊髄内、関節内、くも膜下腔内、静脈内、動脈内、皮下、経口、局所的、又は吸入経路により、ヒトの患者に投与される。
【０１５０】
他の治療計画を前述のＧＤＭアンタゴニストの投与と組合せてもよい。組合せ投与には、別々の製剤又は単一の医薬製剤を使用する同時投与、及び好ましくは両方(又は全ての)活性剤が同時にその生物学的活性を働かせる時間があるいずれかの順での連続投与が含まれる。このような組合せ治療により、結果として相乗的治療効果が生じることが好ましい。
他の実施態様では、本発明の治療方法は、異なる化学療法剤の混合物の同時投与を含む、上記ＧＤＭアンタゴニストと一又は複数の化学療法剤又は成長阻害剤との組合せ投与を含む。化学療法剤の例は前記した。このような化学療法剤の調製及び投与スケジュールは製造者の注意書きに従い使用されるか、又は熟練した実務者により経験的に決定される。このような化学療法の調製及び投与スケジュールは、Chemotherapy Service編 M.C.Perry, Williams ＆ Wilkins, Baltimore, MD(1992)にも記載されている。
【０１５１】
疾患の予防又は治療のための投与量及び方式は、公知の基準に従い、医師により選択されるであろう。ＧＤＭアンタゴニストの適切な用量は、治療される疾患の種類、疾患の重症度及び過程、投与の目的が予防なのか治療なのか、過去の治療、患者の臨床歴及び応答性（を含む）、手当てをする医師の裁量に依存するであろう。前述のＧＤＭアンタゴニストは、一度に又は一連の処置にわたって患者に適切に投与される。投与は、静脈注入又は皮下注射により行われる。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一又は複数の別個の投与又は連続注入のいずれであれ、体重１ｋｇ当たり約１μｇないし５０ｍｇ(例えば０．１−１５ｍｇ／ｋｇ／用量)のＧＤＭアンタゴニストを患者への最初の投与量の候補とすることができる。投薬計画は、約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷量、続いて１週間に約２ｍｇ／ｋｇの維持用量のＧＤＭアンタゴニストを投与することからなってよい。しかしながら、他の投薬計画も有効であろう。上述した因子に応じて、典型的な一日の投与量は約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇあるいはそれ以上の範囲である。数日間又はそれ以上の繰り返し投与の場合、状態によっては、疾患の徴候の望ましい抑制が生じるまで処置を維持する。この治療の進行状態は、医師又は他の当業者に公知の基準をベースにした通常の方法やアッセイで容易にモニターされる。
抗体タンパク質の患者への投与の他に、本出願は遺伝子治療による抗体の投与を考察する。ＧＤＭポリペプチドアンタゴニストをコードする核酸の投与は「抗体を治療的有効量で投与する」という表現に含まれる。例えば、遺伝子治療を用いた細胞内抗体の産生に関する、１９９６年３月１４日に公開された国際公開第９６／０７３２１号を参照のこと。
【０１５２】
核酸（場合によってはベクター内に含まれたもの）を患者の細胞に入れるために：インビボ及びエキソビボという２つの主要な方法がある。インビボ送達では、核酸は、通常は抗体が必要とされている部位に直接注入される。エキソビボ処理では、患者の細胞を取り出し、核酸をこれらの単離された細胞に導入し、修飾された細胞を患者に、直接、又は例えば患者に埋め込まれる多孔性膜にカプセル化して投与する（米国特許第４８９２５３８号及び第５２８３１８７号参照）。核酸を生細胞に導入するために利用可能な種々の技術がある。これらの技術は、核酸が培養された細胞にインビトロで移入されるか、又は対象とする宿主にインビボで移入されるかによって異なる。哺乳動物細胞にインビトロで核酸を移入するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などの使用を含む。遺伝子のエキソビボ送達に通常用いられるベクターはレトロウイルスベクターである。
現在好まれているインビボ核酸移入技術は、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ関連ウイルス）、及び脂質ベースの系（例えば、遺伝子の脂質媒介移入に有用な脂質は、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ-Ｃｈｏｌである）での形質移入を含む。現在知られている遺伝子マーキング及び遺伝子治療プロトコルの概説については、Anderson等, Science, 256:808-813 (1992)を参照のこと。また、国際公開第９３／２５６７３号及びそこに引用された参考文献も参照。
【０１５３】
Ｋ．製造品及びキット
治療に使用するために、本製造品は、容器と、神経膠腫の治療に使用できることを示す、容器に付与又は添付されるラベル又はパッケージ挿入物を含んでなる。好適な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等を含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどの多様な材料から形成されてよい。容器は、癌の状態の治療に有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも一つの活性剤はＧＤＭアンタゴニストである。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が癌の治療のために使用されることを示す。ラベル又はパッケージ挿入物は、癌患者に抗体、オリゴペプチド又は有機分子組成物を投与する際の注意書きをさらに含む。製造品はさらに、製薬的に許容可能なバッファー、例えば注射用の静菌水(ＢＷＦＩ)、リン酸緩衝塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第２の容器を具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
種々の他の目的、例えばＧＤＭ発現細胞殺傷アッセイ、細胞からのＧＤＭポリペプチドの精製又は免疫沈降に有用なキットも提供される。ＧＤＭポリペプチドの単離及び精製において、キットは、ビーズ(例えばセファロースビーズ)に結合した対応するＧＤＭ結合試薬を含むことが可能である。インビトロにおけるＧＤＭポリペプチドの検出及び定量化、例えばＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロットのためのそのような分子を含むキットを提供することもできる。製造品と同様、キットも容器と容器に付与又は添付されるラベル又は能書を含んでなる。容器には、本発明に使用できる少なくとも１つのそのようなＧＤＭ結合抗体、オリゴペプチド又は有機分子を含有する組成物が収容されている。希釈液及びバッファー、コントロール抗体等を収容する付加的な容器を具備していてもよい。ラベル又は能書は、組成物についての記載、並びに意図するインビトロ又は診断での使用に関する注意書きを提供するものである。
【０１５４】
Ｌ．センス及びアンチセンスＧＤＭ-コード核酸
ＧＤＭアンタゴニストは、アンチセンス又は及びオリゴヌクレオチド等のＧＤＭコード核酸の断片を含み、これには、標的ＧＤＭ ｍＲＮＡ（センス）又はＧＤＭ ＤＮＡ（アンチセンス）配列と結合できる一本鎖核酸配列（ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか）が含まれる。本発明によると、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、対応するＧＤＭ ＤＮＡのコード化領域の断片を含む。与えられたタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づいて、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを得る能力は、例えば、Stein及びCohen（Cancer Res. 48:2659, 1988）及び van der Krol等（BioTechniques 6:958, 1988）に記載されている。
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は二重鎖の形成をもたらし、それは、二重鎖の分解の促進、転写又は翻訳の未熟終止を含む幾つかの方法の一つ、又は他の方法により、標的配列の転写又は翻訳を阻止する。そのような方法は、本発明に含まれている。よって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＧＤＭタンパク質の発現を阻止するのに用いられ、それらＧＤＭタンパク質は、哺乳動物での癌の誘導を担い得る。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、修飾糖−ホスホジエステル骨格（又は他の糖結合、国際公開９１／０６６２９に記載のもの等）を有するオリゴヌクレオチドを更に含み、そのような糖結合は内因性ヌクレアーゼ耐性である。そのような耐性糖結合を持つオリゴヌクレオチドは、インビボで安定である（つまり、酵素分解に耐えうる）が、標的ヌクレオチド配列に結合できる配列特異性は保持している。
【０１５５】
本発明において使用されるアンチセンス化合物は固相合成のよく知られた技術によって簡便かつ常套的に製造することができる。そのような合成のための装置は、例えばApplied Biosystems (Foster City, Calif.)を含む幾つかのメーカーによって販売されている。当該分野で知られているそのような合成のための任意の他の手段を付加的に又は別に使用してもよい。オリゴヌクレオチド、例えばホスホロチオネート及びアルキル化誘導体を調製するために類似の技術を使用することはよく知られている。本発明の化合物は、また、取り込み、分散及び／又は吸収を補助するための他の分子、分子構造又は化合物混合物、例えばリポソーム、レセプター標的分子、経口、直腸、局所適用又は他の製剤と、混合、カプセル化、コンジュゲート又はその他、組み合わされてもよい。取り込み、分散及び／又は吸収を補助する製剤の調製を教示する代表的な米国特許には、限定されるものではないが、米国特許第５１０８９２１；５３５４８４４；５４１６０１６；５４５９１２７；５５２１２９１；５５４３１５８；５５４７９３２；５５８３０２０；５５９１７２１；４４２６３３０；４５３４８９９；５０１３５５６；５１０８９２１；５２１３８０４；５２２７１７０；５２６４２２１；５３５６６３３；５３９５６１９；５４１６０１６；５４１７９７８；５４６２８５４；５４６９８５４；５５１２２９５；５５２７５２８；５５３４２５９；５５４３１５２；５５５６９４８；５５８０５７５；及び５５９５７５６が含まれ、これらのそれぞれが出典明示によりここに取り込まれる。
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例は、国際公開９０／１００４８に記載されているもののような、有機部分、及びオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への親和性を向上させる他の部分、例えばポリ-(Ｌ-リジン)に共有結合したオリゴヌクレオチドを含む。さらにまた、エリプチシン等の挿入剤及びアルキル化剤又は金属錯体をセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させ、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列への結合特異性を改変してもよい。
【０１５６】
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＣａＰＯ４-媒介ＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーションを含む任意の遺伝子転換方法により、又はエプスタイン-バーウイルスなどの遺伝子転換ベクターを用いることにより、標的核酸配列を含む細胞に導入される。好ましい方法では、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、適切なレトロウイルスベクターに挿入される。標的核酸配列を含む細胞は、インビボ又はエキソビボで組換えレトロウイルスベクターに接触させる。好適なレトロウイルスベクターは、これらに限られないが、マウスレトロウイルスＭ-ＭｕＬＶから誘導されるもの、Ｎ２（Ｍ-ＭｕＬＶから誘導されたレトロウイルス）、又はＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５Ｂ及びＤＣＴ５Ｃと命名されたダブルコピーベクター（国際公開９０／１３６４１参照）を含む。
また、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、国際公開９１／０４７５３に記載されているように、リガンド結合分子との複合体の形成により標的ヌクレオチド配列を含む細胞に導入してもよい。適切なリガンド結合分子は、これらに限られないが、細胞表面レセプター、成長因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプターに結合する他のリガンドを含む。好ましくは、リガンド結合分子の複合体形成は、リガンド結合分子がその対応する分子又はレセプターに結合する、あるいはセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその複合体の細胞への侵入を阻止する能力を実質的に阻害しない。
【０１５７】
あるいは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、国際公開９０／１０４４８に記載されたように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成により標的核酸配列を含む細胞に導入してもよい。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは内因性リパーゼにより細胞内で分解される。
アンチセンス又はセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、通常は少なくとも約５ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、又は１０００ヌクレオチド長であり、この文脈の「約」という用語は、参照ヌクレオチド配列長にその参照長の１０％を加えるか又は減じたものを意味する。
【０１５８】
Ｍ．ＧＤＭアンタゴニストの同定に使用されるスクリーニングアッセイ
このアッセイは、タンパク質-タンパク質結合アッセイ、生化学スクリーニングアッセイ、免疫アッセイ、そして細胞ベースアッセイを含む、当該分野で良く特徴付けられている種々の形式で行うことができる。
アンタゴニストに関する全てのアッセイは、薬候補をここで同定された核酸によってコードされているＧＤＭポリペプチドと、これら両成分が相互作用するのに十分な条件下及び時間にわたって接触させることを必要とする点で共通である。
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出される。特別な実施態様では、ここに同定された遺伝子にコードされるＧＤＭポリペプチド又は薬候補が、共有又は非共有結合により固相、例えばマイクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に固体表面をＧＤＭポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化すべきＧＤＭポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体の使用によって検出できる。
【０１５９】
候補化合物が相互作用するがここに同定した遺伝子によってコードされる特定のＧＤＭポリペプチドと結合しない場合、そのポリペプチドとの相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために良く知られた方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィーのカラムを通す同時精製などの伝統的な手法を含む。さらに、タンパク質-タンパク質相互作用は、Chevray及びNathans Proc.Natl. Acad. Sci. USA,89:5789-5793 (1991)に開示されているようにして、Fields及び共同研究者等［Fiels及びSong, Nature(London),340,:245-246(1989); Chien等, Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991)］に記載された酵母菌ベースの遺伝子系を用いることにより監視することができる。酵母菌ＧＡＬ４などの多くの転写活性化剤は、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。以前の文献に記載された酵母菌発現系（一般に「２-ハイブリッド系」と呼ばれる）は、この特性の長所を利用して、２つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合し、他方では、候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。ＧＡＬ１-ｌａｃＺリポーター遺伝子のＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β-ガラクトシダーゼに対する色素生産性物質で検出される。２-ハイブリッド技術を用いた２つの特定なタンパク質間のタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための完全なキット（MATCHMAKER(商品名)）は、Clontechから商業的に入手可能である。この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこの相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張することができる。
【０１６０】
ここで同定されたＧＤＭポリペプチドをコードする遺伝子と他の細胞内又は細胞外成分との相互作用を阻害する化合物は、次のように試験できる：通常は反応混合物は、遺伝子産物と細胞内又は細胞外成分を、それら２つの生成物が相互作用及び結合する条件下及び時間で調製される。候補化合物の結合阻害能力を試験するために、反応は試験化合物の不存在及び存在下で実施される。さらに、プラシーボを第３の反応混合物に添加してポジティブコントロールを提供してもよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は細胞外成分との結合（複合体形成）は上記のように監視される。試験化合物を含有する反応混合物ではなくコントロール反応における複合体の形成は、試験化合物が試験化合物とその反応パートナーとの相互作用を阻害することを示す。
アンタゴニストを検定するために、ＧＤＭポリペプチドを、特定の活性についてスクリーニングされる化合物とともに細胞に添加してもよく、ＧＤＭポリペプチド存在下で対象とする活性を阻害する当該化合物の能力が、当該化合物がＧＤＭポリペプチドのアンタゴニストであることを示す。あるいは、アンタゴニストは、ＧＤＭポリペプチド及び潜在的アンタゴニストを、膜結合ＧＤＭポリペプチドレセプター又は組換えレセプターと、競合的阻害アッセイに適した条件下で結合させることにより検出してもよい。ＧＤＭポリペプチドは、放射活性等で標識でき、レセプターに結合したＧＤＭポリペプチド分子の数を潜在的アンタゴニストの有効性を決定するのに使用できる。レセプターをコードする遺伝子は、当業者に知られた多くの方法、例えばリガンドパニング及びＦＡＣＳソーティングにより同定できる。Coligan等, Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991)。好ましくは発現クローニングが用いられ、そこではポリアデニル化ＲＮＡがＧＤＭポリペプチドに反応性の細胞から調製され、このＲＮＡから生成されたｃＤＮＡライブラリがプールに分配され、ＣＯＳ細胞又は他のＧＤＭポリペプチドに反応性でない細胞の形質移入に使用される。スライドガラスで成長させた形質移入細胞を、標識したＧＤＭポリペプチドへ曝露する。ＧＤＭポリペプチドは、ヨウ素化又は部位特異的タンパク質キナーゼの認識部位の包含を含む種々の手段で標識できる。固定及びインキュベーションの後、スライドにオートラジオグラフ分析を施す。ポジティブプールを同定し、相互作用的なサブプール化及び再スクリーニング法を用いてサブプールを調製して再形質移入し、最終的に推定レセプターをコードする単一のクローンを生成する。
【０１６１】
レセプター同定の代替的方法として、標識したＧＤＭポリペプチドをレセプター分子を発現する細胞膜又は抽出調製物に光親和性結合させることができる。架橋材料をＰＡＧＥで分離し、Ｘ線フィルムに曝す。レセプターを含む標識複合体を励起し、ペプチド断片に分離し、タンパク質マイクロシークエンシングを施してよい。マイクロシークエンシングから得たアミノ酸配列は、推定レセプターをコードする遺伝子を同定するｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするディジェネレートオリゴヌクレオチドプローブの組の設計に用いられる。
アンタゴニストの他の検定では、レセプターを発現する哺乳動物細胞又は膜調製物を、候補化合物の存在下で標識ＧＤＭポリペプチドとともにインキュベートする。次いで、この相互作用を促進又は阻止する化合物の能力を測定する。
潜在的なアンタゴニストのより特別な例は、免疫グロブリンとＧＤＭポリペプチドとの融合体に結合するオリゴヌクレオチド、特に、限られないが、ポリ-及びモノクローナル抗体及び抗体断片、一本鎖抗体、抗-イディオタイプ抗体、及びこれらの抗体又は断片のキメラ又はヒト化形態、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含んでいる。あるいは、潜在的アンタゴニストは、密接に関連したタンパク質、例えば、レセプターを認識するが効果を与えず、よってＧＤＭポリペプチドの作用を競合的に阻害するＧＤＭポリペプチドの変異形態であってもよい。
他の潜在的なＧＤＭポリペプチドアンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡコンストラクトであり、例えば、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡにハイブリダイゼーションしてタンパク質翻訳を妨害することによりｍＲＮＡの翻訳を直接阻止するように作用する。
【０１６２】
潜在的アンタゴニストは、ＧＤＭポリペプチドの活性部位、レセプター結合部位、又は成長因子又は他の関連結合部位に結合し、それによりＧＤＭポリペプチドの正常な生物学的活性を阻止する小分子を含む。小分子の例は、これらに限られないが、小型ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合成非ペプチド有機又は無機化合物を含む。
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリダイゼーション、次いでヌクレオチド鎖切断的開裂により作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、Rossi, Current Biology 4: 469-471 (1994)及びＰＣＴ公報、国際公開 ９７／３３５５１（１９９７年９月１８日公開）を参照。
転写阻害に用いられる三重螺旋形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスティン(Hoogsteen)塩基対則を介する三重螺旋形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンのかなり大きな伸張を必要とする。さらなる詳細は、例えば、上掲のＰＣＴ公報、国際公開９７／３３５５１を参照。
これらの小分子は、上記で議論したスクリーニングアッセイの一又は複数の任意のものにより及び／又は当業者に良く知られた他の任意のスクリーニング技術により同定できる。
【０１６３】
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
【実施例】
【０１６４】
実施例１：
実験手順
腫瘍試料と患者の特徴
調べた全ての腫瘍症例を図８Ａにまとめた。生存分析のために、３つの発現プロファイリング用データセットを分析した。本発明者等が入手したのは、ＭＤＡにおける７６症例の凍結組織試料、ＵＣＳＦの３９症例のＲＮＡ（Nigro等, Cancer Res. 65:1678-1686 (2005)）、及びＵＣＬＡから公開されている研究のデータ（Freije等, 上掲）である。はじめの２つのデータセットのうち分析した症例は、以下の基準を満たすものであった。即ち、最初の外科的切除時に、放射線治療又は化学療法を受けた経歴を持たない患者（２１歳を超える）から新鮮な凍結組織試料を採取した。手術後少なくとも２年間又は生存中は臨床的追跡情報が入手可能であった。ＵＣＳＦ及びＭＤＡにおいてこれらのレトロスペクティブな実験室での研究のために、治験審査委員会／人体実験の承認を得た。症例は、ＷＨＯの基準に従ってＡＡ又はＧＢＭに類別し、全ての組織由来の切片を神経病理学者（ＫＡ）が検査することにより、試料の９０％以上が腫瘍を示すことを確認した。異常な組織学的変異は除外した。ＵＣＬＡのデータセットについては、公開されている研究から、患者年齢とマイクロアレイ品質管理パラメータについて本発明の基準を満たす全ての症例のデータを利用した。このデータセットには、オリゴデンドログリアの形態又は混合形態を有する症例と、検閲された生存期間が２年未満である症例が含まれていた。
健常な成人脳組織は、脳腫瘍又は神経障害の既往歴を持たないドナー由来の大脳皮質の剖検標本からなり、国立神経学的研究脳バンク（カリフォルニア州ロスアンゼルス）から取得したものであった。
腫瘍のグレードとシグネチャー分類を比較するため（図２Ａ）、臨床履歴が得られないものについて追加的試料標本を含めた。健常な成人脳組織は、脳腫瘍又は神経障害の既往歴を持たないドナー由来の大脳皮質の剖検標本からなり、国立神経学的研究脳バンク（カリフォルニア州ロスアンゼルス）から取得した。脳及び胎生期アストロサイトの標本を除き、図２Ｂにおいて分析した試料のデータは、ヒト試料のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘデータのＧｅｎｅ  Ｌｏｇｉｃ社（メリーランド州ゲーサーズバーグ）データベースの使用権により取得した。
【０１６５】
遺伝子発現プロファイリング、比較ゲノムハイブリダイゼーション、及び定量的ＰＣＲ
既知の出版物（Freije等, 上掲; Nigro等, 上掲）に含まれていない標本について、製造者のプロトコールに従ってＱｉａｇｅｎのＲＮＡ単離キットを用いて腫瘍及び健常な脳標本の総細胞ＲＮＡを抽出した。オンカラムデオキシリボヌクレアーゼ消化ステップにより、ゲノムＤＮＡの汚染を取り除いた。文献に既知の技術（Tumor Analysis Best Practices Working, 2004）に従って、発現プロファイリングにＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ａ＆Ｂチップを用いた。品質管理パラメータはこの出版物に記載のものと同じであるが、例外として、ＧＡＰＤＨの３’／５’比が３未満であれば、試料はアクチンについて３を超える３’／５’比を示してもよいこととした。ＴａｑｍａｎのＰＣＲ  Ｃｏｒｅ試薬（Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティ）を用いて、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ７７００配列検出器（Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティ）上で、各試料について定量的ＰＣＲを２回ずつ行った。２５ｎｇの総ＲＮＡを各５０μｌの反応に使用した。多数の試料に亘って殆ど発現が変化しないので、Ｒａｂ１４を正規化に使用した。全てのプライマー対は、６７−７９ｂｐの単位複製配列を生成するように設計した。ＤＮＡ抽出及びアレイＣＧＨを上述のように実施した。Misra等, Clin. Cancer Res. 11(8): 2907-18 (2005)参照。ＣＧＨにより分析した９６の試料のうち、４３の標本のデータは公開されている既知の研究から取得した（Nigro等, 上掲）。
【０１６６】
マイクロアレイデータの分析
マイクロアレイデータの全分析に、倍率５００でマイクロアレイ分析のＳｕｉｔｅバージョンにより得られたシグナル強度の値を使用した。類似性の基準としてピアソン相関を用いるＳｐｏｔｆｉｒｅ  Ｄｅｃｉｓｉｏｎ  Ｓｉｔｅソフトウエアのバージョン７．３を使用してＫ平均法によるクラスター形成及び塊状クラスター形成を実施した。各遺伝子について、クラスター形成の前にデータをＺスコアに正規化した。腫瘍の分類に使用した３５のシグネチャー遺伝子は、ＭＤＡの生存試料セットにおける３つの腫瘍サブセットの各々の、最も強いマーカーであった。各サブセットのマーカーは次のようにして同定した。即ち、生存と最も強い相関を示した１０８の遺伝子の発現のｋ平均法によるクラスター形成に基づいて、７６の試料の各々を３つのグループのうちの１つに割り当てた。１×１０−４のｐ値カットオフを使用し、ｔ検定を利用して、他のサブクラスの腫瘍と比較したとき、各サブクラスの試料間で異なって発現した全ての遺伝子を同定した（表Ａ、ＧＤＭ参照）。各比較について、折り畳みの変化により最小ｐ値で５００のプローブセットに順位を付けた。各腫瘍サブタイプのシグネチャー遺伝子として使用したプローブセットは、最大の折り畳み変化を示し、且つ最小発現カットオフを満たした同定された完全長配列に対応するものであった（対象のグループ内で平均強度４００）。ｋ平均法によるクラスター形成を用いた実験の結果、クラスター形成の遺伝子リストにおいて３つの腫瘍サブタイプの１つのマーカーが他のサブタイプより少ない状態で均衡していれば、３０〜６０のプローブセットを使用してクラスター形成を実施すると、安定した試料クラスターが得られた。最終的な３５のシグネチャー遺伝子には、１５のＰＮ、１５のＭｅｓ、及び５のＰｒｏｌｉｆマーカーが含まれた。ＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ及びＭｅｓのセントロイドに対する類似性のスコアは、７６のＭＤＡ生存試料のｋ平均法によるクラスター形成において生成されるセントロイドの各々に対するＰｅａｒｓｏｎ相関係数を表わす。図４のＦ−Ｉ及び図７に示すデータの統計的な比較のため、複数のグループの比較を行うために修正されたｔ検定により、対数変換したデータを分析した。対数変換した発現データも、図５において実施された統計的分析に利用した。
【０１６７】
インサイツハイブリダイゼーション及び免疫組織化学
３３Ｐ−ＵＴＰで標識したアンチセンスリボプローブを、Ｐｒｏｍｅｇａ社のインビトロ転写システム（Promega、ウィスコンシン州マディソン）を用いて転写し、公開されている既知の方法を利用して（Phillips等, Science 250: 290-294 (1990)）多様な供給源から取得された、パラフィン包理ヒト神経膠腫組織マイクロアレイにハイブリダイズした。図１に示す画像はＰｅｔａｇｅｎ，Ｉｎｃ．から取得した組織マイクロアレイに含まれる組織のコアのものである。ＢＣＡＮに対するプローブは６６８ｂｐの断片（９３９〜１６０６）を示し、ＣＨＩ３Ｌ１／ＹＫＬ４０については１１５８ｂｐ断片（１２１〜１２７８）を示した。
上述のように、パラフィンに包理した切片に免疫組織化学を実施した（Simmons等, Cancer Res. 61: 1122-1128 (2001)）。一次抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（マサチューセッツ州ベバリー）の抗ｐ−ａｋｔ（ｓｅｒ４７３）及びＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（カリフォルニア州サンタクルーズ）の抗Ｎｏｔｃｈであった。評点は、分析した標本のシグネチャーグループを知らない神経病理学者によって行われた。
【０１６８】
インビトロでの研究
上述のＧＢＭ細胞株を、インビトロでの研究に利用した（(Hartmann等, Internat. J. Oncol. 15: 975-982 (1999))。ニューロスフェア培養物では、一次ＧＢＭ標本について記載したように、ＣＤ１３３ビーズによりポジティブに分類された細胞を培養液中に維持した（Singh等, Nature 432 396-401 (2004)）。全てのニューロスフェア培養物は、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｅｎ）及びＮＳＦ１（Ｃａｍｂｒｅｘ）を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）中で維持した。存在すれば、ＥＧＦ及びＦＧＦを２０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した。ＥＧＦ＋ＦＧＦの不在下で、細胞株の分子シグネチャーに盲目な観察者により、ニューロスフェア増殖について各細胞株を評価した。評価のスケールは次の通りであった。即ち、０＝目視可能なニューロスフェアは無い、１＝ゆっくりと広がりつつあるニューロスフェア、２＝中程度の増殖速度、３＝中程度から速い増殖であるが、ＥＧＦ＋ＦＧＦに見られるものよりも遅い増殖、４＝ＥＧＦ＋ＦＥＦにより加速していない急速な増殖。
１０％のウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地において、標準細胞培養条件を使用して、増殖阻害アッセイを９６ウェルプレートにおいて実行した。ラパマイシン、ＬＹ２９４００２、又はγ分泌阻害剤ＧＳＩ−１又はＳ−２１８８を用いた処理のために、９６ウェルプレートに、１ウェル当たり１５００又は２０００の細胞密度で細胞を広げ（０日目）、１日目に薬剤で処理し、４日目にアラマーブルー読み取りを使用して生存度を評価した。２回のアッセイで殆ど同一の結果を示したＳ−２１８８を除き、各処理条件は最低３回の実験を行って評価した。図６に代表的な実験結果を示す。
【０１６９】
結果
分子シグネチャーによる高悪性度星細胞腫の予後サブクラスの決定
新規に診断されたＧＢＭ（ｎ＝５５）及びＡＡ（ｎ＝２１）の７６症例を、ＭＤアンダーソン癌センター（ＭＤＡ）から取得し、ＤＮＡマイクロアレイによるプロファイリングにより、異なる予後を有するグループに腫瘍を分類する遺伝子発現パターンを同定した（図１Ａ−Ｃ）。本発明の研究において分析したこれら及び全ての腫瘍の症例の個体群統計を図８Ａに示す。まず、生存との相関性が最も強い発現を有するプローブセットが同定され（生存期間に対して対数変換した発現強度の値のスピアマンｒが、＞０．４５又は＜−０．４５）、続いて結果として得られた１０８のプローブセットと７６の試料の、双方向塊状クラスター形成を行った。この分析により、生存関連遺伝子の発現が著しく異なる試料セットから構成される３つの個別のグループが同定された（図１Ａ）。
３つの腫瘍サブクラスの各々について一組のマーカーを開発するために、本発明者等は、各サブグループについて、他の２つのサブクラスに含まれる腫瘍と比較して、当該グループ内で腫瘍によって最も強く過剰発現されるプローブセットを同定した（表Ａ参照。神経膠腫決定マーカー）。３つの腫瘍サブセットの各々に最も強いマーカーを使用して、腫瘍をサブクラスに振り分けるための、階層的クラスター形成（図１Ｂ）又はｋ平均法のクラスター形成に使用できる、シグネチャー遺伝子と呼ばれる３５の遺伝子からなる組を得た。ｋ平均法のクラスター形成により規定される腫瘍のサブクラスは、各サブクラスを特徴付けるマーカー遺伝子のリストの優性な特徴により、前神経性（ＰＮ）、増殖性（Ｐｒｏｌｉｆ）及び間葉性（Ｍｅｓ）と呼ぶ。各腫瘍サブクラスについて、３５のシグネチャー遺伝子の平均発現値に基づいてセントロイドを計算した（図１Ｂ）。セントロイドは腫瘍サブタイプの原型発現パターンと見ることができ、新規の試料を、それらのシグネチャー遺伝子の発現の、それらセントロイドとの類似性に基づいて分類することができる。ＭＤＡのデータセットに含まれる症例のカプラン−マイヤー図は、ＰＮサブクラスの生存期間中央値（１７４．５週）がＰｒｏｌｉｆサブタイプ（６０．５週）又はＭｅｓサブタイプ（６５．０週）より著しく長いことを示した（図１Ｃ）。
【０１７０】
新規腫瘍分類スキームの予後値を決定するため、本発明者等は新たに２つの独立したデータセットを調べた。１つのデータセットは、カリフォルニア大学サンフランシスコ校（ＵＣＳＦ）において治療を受けた症例から取得した一組のＡＡ及びＧＢＭ試料に基づいて生成され、一方、第２の検証用データセットは、ＵＣＬＡにおいて見られたグレードＩＩＩ及びＩＶのアストロサイト形態、オリゴデンドログリア形態、及び混合形態を有する症例に関する既知の研究文献（Freije等, 2004）から得た。両方の検証セットに含まれる腫瘍は、それらのシグネチャー遺伝子の発現の、ＭＤＡデータセットにおいて規定されているセントロイドとの類似性に基づいて、ＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ、及びＭｅｓサブタイプに分類された。両検証セットの腫瘍サブタイプの生存時間のカプラン−マイヤー図は、最初のデータセットに観察されたものによく似たパターンを示した（図１Ｄ及びＥ）。ＧＢＭの症例だけを考慮すると、ＰＮと他の分類とを区別する予後値は、ＭＤＡ試料セットにおいても、３つの組み合わされたデータセットの全てにおいても、統計的に有意と思われた（ｐ＜０．０５、ＰＮ対他の分類の比較の両方に対するｔ検定）。
次に、マイクロアレイ及び定量的リアルタイムＰＣＲの両方により、選択したＰＮマーカーとＭｅｓマーカーの発現を比較した。本発明者等は、ＰＮマーカー及びＭｅｓマーカーとして、シグネチャー遺伝子リストからそれぞれＤＬＬ３（デルタ様リガンド３）及びＣＨＩ３Ｌ１／ＹＫＬ４０を選択し、これら同じ２つのサブクラスに、更に大きなマーカーのリスト（表Ａ）からそれぞれＢＣＡＮ及びＣＤ４４を選択した。図１Ｆ及びＧに示すように、神経膠腫試料の大部分が、ＰＮマーカーの対又はＭｅｓマーカーの対の集団平均を超える発現値を示したが、ＰＮマーカーとＭｅｓマーカーの組み合わせについてそのようなことは殆どなかった。
【０１７１】
一組の独立した腫瘍例に対するインサイツハイブリダイゼーションにより、ＢＣＡＮ及びＣＨＩ３Ｌ１／ＹＫＬ４０  ｍＲＮＡ発現に相互排他的なパターンが確認された（図１Ｈ）。大部分の標本が、ＢＣＡＮ又はＣＨＩ３Ｌ１／ＹＫＬ４０に強いシグナルを示したが、両マーカーに対して強いシグナルを示す標本は無かった。しかしながら、一部の標本は、重複していない細胞エレメント内のこれら２つのマーカーの各々に局所的な発現を示した。最も典型的には、これらは、広いＢＣＡＮ陽性領域を含む標本において、ＣＨＩ３Ｌ１／ＹＫＬ４０を発現する小さな座位を有する標本であった。このような場合、ＣＨＩ３Ｌ１／ＹＫＬ４０の発現は、血管に関連していることが多かった。
【０１７２】
ＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ、及びＭｅｓシグネチャーによる、腫瘍悪性度及び患者年齢の異なる腫瘍サブ集団の定義
分析の幅を広げ、２５６の悪性度の高い神経膠腫（表１）を含めたところ、大部分の腫瘍がＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ又はＭｅｓセントロイドに対する強い類似性を示し、他の２つのセントロイドには殆ど又は全く相関を示さなかった（図２Ａ）。この所見は、試料が図２Ａに示した三次元プロットの三角形の一部でクラスターを形成する傾向にあることを示す。一部の試料が２つのセントロイドに対する中程度の類似性を示したが、３つのセントロイド全てに弱い又は不明瞭な類似性を示す試料は殆ど無かった。従って、最も悪性度の高い神経膠腫は、通常、３つの異なる表現型の状態のうちの１つに属しており、２つの状態の中間の状態に属していることは殆ど無い。
新規に規定された腫瘍サブクラスは、組織学的な腫瘍のグレードとの強い関連を示した。試験した殆ど全てのグレードＩＩＩ腫瘍標本（８０％）は、オリゴデントログリア形態を示すかアストロサイト形態を示すかに関係なく、ＰＮに分類された。対照的に、グレードＩＶの病変（ＧＢＭ）の有意な割合が、３つの分子カテゴリーの１つに分類された。試験した１８４のＧＢＭ試料のうち、３２％がＰＮであり、２０％がＰｒｏｌｉｆであり、４８％がＭｅｓであった。
【０１７３】
ＭＤＡ試料セットに含まれるＧＢＭ症例由来のＨ＆Ｅで染色した切片の定性的検査では、腫瘍の分子細分類を一様に区別する組織学的特徴は見られなかった。その発生が統計的に分子サブクラスに関連している唯一の形態学的特徴は、腫瘍壊死であり、ＰＮ腫瘍での発生頻度は比較的小さかった。ＰＮと同定された９例のＧＢＭのうち、４例に壊死領域が無かった。対照的に、２２例のＭｅｓ  ＢＧＭのうち２例のみ（ｐ＜０．０５、ＰＮ対Ｍｅｓ、フィッシャーの正確な検定）及び２４例のＰｒｏｌｉｆ  ＧＢＭのうち０例（ｐ＝０．００５、ＰＮ対Ｐｒｏｌｉｆ）が壊死を示さなかった。
腫瘍のグレードと生存期間の両方と患者年齢との周知の相関関係と一致して、分子サブタイプへの腫瘍の配分は、年齢に基づいて患者を重層化することが判明した。本発明の生存分析において１８５の新規に診断された症例のうち、ＰＮサブクラスの腫瘍を有する患者は、Ｐｒｏｌｉｆ又はＭｅｓサブクラスの腫瘍を有する患者より有意に若かった（両方の比較についてＰ＜０．００５、ｔ検定）。ＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ及びＭＥＳサブクラスの腫瘍を有する患者の平均年齢＋／−ＳＥＭは、それぞれ４０．５＋／−１．４年、４９．０＋／−２．５年、及び５０．７＋／−１．３年であった。ＧＢＭの場合、Ｍｅｓの症例はＰＮより有意に年齢が高く（ｐ＜−０．０５、ｔ検定）、一方Ｐｒｏｌｉｆ症例は他の２つの分類と年齢において差は無かった。
【０１７４】
ＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ、及びＭｅｓシグネチャーによる健常組織の異なる組の特徴付け
ＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ及びＭｅｓセントロイドにより示される分子シグネチャーの生物学的有意性の見識を得るため、複数のヒト組織及び細胞種類における３５のシグネチャー遺伝子の発現を試験した。この分析により、組織の異なる組が、神経膠腫のサブクラスを規定する各々のセントロイドに類似していることが判明した（図２Ｂ）。胎児及び成人の脳は共に、ＰＮ（前神経）セントロイドとの陽性の相関関係を有している。ヒト胎児脳から採取された２つの神経幹細胞株はまた、正常な培養条件の下でＰＮシグネチャーを示した（図２Ｂ）。Ｍｅｓ（間葉性）シグネチャーを示す組織には、骨、滑膜、平滑筋、内皮細胞、及び樹状細胞が含まれていた。加えて、培養されたヒト胎児アストロサイトの試料は、明らかに陽性のＭｅｓセントロイドとの相関関係を示した。末梢血から単離された造血幹細胞と増殖性の高い細胞株Ｊｕｒｋａｔは共に、Ｐｒｏｌｉｆセントロイドとの強い関連性を有していた。興味深いことに、２つの神経幹細胞株は、神経栄養因子ＢＤＮＦの処置及び退薬に応答してＰＮからＭｅｓクラスにシグネチャーサブクラスを変化させた（図２Ｂ）。
【０１７５】
腫瘍再発時のＭｅｓ表現型への移行
腫瘍サブクラスを規定する分子シグネチャーが各腫瘍例に固定の特徴であるか、又は治療又は病気の進行に応じて変化するのかを決定するため、同じ患者の原発性星細胞腫と続発性星細胞腫の一致する２６対の標本の発現シグネチャーを比較した。２６対の原発性試料と続発性試料のシグネチャーの全てに平均的な変化は、ＰＮセントロイドとの類似性の低下０．１８＋／−０．０６（ピアソンｒの平均的変化＋／−ＳＥＭ）、及びＭｅｓセントロイドとの類似性の増加０．２０＋／−０．９９に相当し、Ｐｒｏｌｉｆセントロイドとの類似性には殆ど変化が無かった（０．０２＋／−０．０８の増加）。２６の症例のうち、１８例に同じ分子サブクラスの原発及び再発が見られ、残りの８例では再発時にクラスが変化した（図２Ｃ）。表現型クラスが変化したこれら８例のうち、１例を除く全てがＭｅｓサブクラスへの移行を示し、うち３例はＰＮからＭｅｓサブタイプへの変化であり、残りの４例はＰｒｏｌｉｆからＭｅｓ表現型への移行であった。クラスが変化した最後の１例は、中程度のＭｅｓ類似性から中程度のＰｒｏｌｉｆ類似性への移行であった。
ペアワイズ分析を使用したマイクロアレイの有意性分析（ＳＡＭ）により、Ｍｅｓサブクラスへ移行した続発性腫瘍において有意に上方制御される遺伝子が同定された（図２Ｄ）。上方制御された遺伝子には、ＧＢＭ生物学によって以前に示された遺伝子であるＣＨＩ３Ｌ１／ＹＫＬ−４０、ＣＤ４４、及びＳＴＡＴ３、並びに間葉組織の常套的なマーカーであるビメンチン（ＶＩＭ）が含まれていた（Eibl等, J. Neuro-Oncol. 26: 165-170 (1995); Nigro等, 上掲.; Nutt等, Cancer Res. 63: 1602-1607 (2005); Rahaman等, Oncogene 21: 8404-8413 (2002); Tanwar等, Cancer Res. 62: 4364-4368 (2002)）。ＣＨＩ３Ｌ１／ＹＫＬ−４０は、ヒト腫瘍の放射線抵抗性を予測し（Pelloski等, Clin. Cancer Res. 11: 3326-3334 (2005)）、且つインビトロでの放射の後、クローン原生の生存を促進する（Nigro等, 上掲.）ことが報告されており、これらの発見は、治療後に腫瘍が再発する際に発現が相対的に増加するという事実と一致する。Ｍｅｓクラスに移行する症例において有意に下方制御される遺伝子は無かった。
再発時にＰＮから移行する症例の組織に対する免疫組織化学的検査により、ＣＨＩ３Ｌ１／ＹＫＬ−４０の上方制御及び顕著な核ＯＬＩＧ２発現の減少が多いことが示唆された。図３に示す実施例では、優先的に悪性度の低い病変に関連付けられることが既知のＰＮマーカーである（Ligon等, J. Neuropathol. Exp. Neurol. 63: 499-509 (2004))、ＯＬＩＧ２の顕著な核発現を示すＰＮ腫瘍は、再発時にＯＬＩＧ２発現の相対的な低下を示した。健常な脳はオリゴデンドログリアに低レベルの染色しか示さず、このことは、アレイデータ中にＰＮ腫瘍によるこのマーカーの上方制御があっても、それは組織プロセシングの間の健常脳の汚染の徴候ではないことを示唆するものである。逆に、ＭｅｓマーカーであるＣＨＩ３Ｌ１／ＹＫＬ−４０は、原発試料中の腫瘍細胞中に殆ど発現しないが、再発性腫瘍細胞中には豊富に発現する。このような相対的発現の変化は、再発時にＭｅｓ移行した試験対象の腫瘍全てに見られた。
【０１７６】
増殖又は血管新生のマーカーによる予後不良の腫瘍サブタイプの区別
腫瘍の予後徴候のサブクラスを規定した後、本発明者等は、疾病の悪性度の差異に寄与し得る生物学的側面の同定を試みた。腫瘍サブクラスの表現型を試験するため、分類に使用したセントロイドに対する強い類似性を示す本発明の生存分析から星細胞腫症例の複数の組を選択した（各サブタイプにつきｎ＝１２）。本発明の比較には、８の健常脳組織試料を含めた。増殖マーカーの試験において、増殖性核抗原（ＰＣＮＡ）及びトポイソメラーゼＩＩα（ＴＯＰ２Ａ）の両方が、ＰＮ又はＭｅｓ腫瘍と比べてＰｒｏｌｉｆ腫瘍に有意に過剰発現することが判明した（図３Ａ）。高速度の細胞分裂が無いときにＭｅｓ腫瘍が悪性度の表現型を示すメカニズムの１つの可能性は血管新生である。図３Ｂに示すように、Ｍｅｓ腫瘍は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ｆｌｔ１又はＶＥＧＦレセプター１（ＶＥＧＦＲ１）、ｋｄｒ又はＶＥＧＦレセプター２（ＶＥＧＦＲ２）、及び内皮マーカーＰＥＣＡＭ１の過剰発現を示した。
【０１７７】
予後不良腫瘍サブタイプによる神経幹細胞及び／又は前駆細胞のマーカーの発現と、予後が比較的良好な腫瘍による神経芽細胞又はニューロンのマーカーの発現
シグネチャー遺伝子セットに含まれるＰＮマーカーの一部、例えばＮＣＡＭ、ＧＡＢＢＲ１及びＳＮＡＰ９１は、ニューロンに関連している。ＧＢＭの腫瘍化細胞が神経幹細胞マーカーＣＤ１３３を発現するという最近の発見に基づき（(Singh等, Nature 432: 396-401 (2004))、本発明者等は、神経幹細胞のマーカーの発現と使用した神経細胞系列のマーカーの発現との比較を試みた（図３Ｃ−Ｅ）。本発明の分析には、成人前脳の神経発生に関連するマーカーを選択した（Abrous等, Physiol. Rev. 85: 523-569 (2005); Anton等, Nature Neurosci. 7: 1319-1328 (2004); Nakano等, J. Cell Biol. 170: 413 (2005); Shi等, Nature 427: 78-83 (2004)）。神経幹細胞又は多分化能前駆細胞の６のマーカーのうち５において、予後不良の腫瘍サブクラスの一方又は両方が、ＰＮ腫瘍と比べて高い発現を示すことが判明した（図３Ｃ）。このような差異は、ビメンチン（ＶＩＭ）、ネスチン（ＮＥＳ）、ＴＬＣ、ＣＤ１３３、及びＭＥＬＫに見られる。前駆細胞のマーカーであるＤＬＸ２は腫瘍グループ間で統計的に有意な差異を示さなかったが、幾つかのＰｒｏｌｉｆ腫瘍はこの遺伝子の強い発現を示した。幹細胞マーカーとは対照的に、、神経芽細胞又は発達中のニューロンのマーカーは、Ｐｒｏｌｉｆ及び／又はＭｅｓ腫瘍と比べてＰＮ腫瘍に過剰発現した（図３Ｄ）。これらのマーカーには、ＯＬＩＧ２、ＭＡＰ２、ＤＣＸ、ＥＮＣ１（ＮｅｕＮ）、ＥＲＢＢ４、及びＧＡＤ２が含まれた。ＰＮ腫瘍における神経細胞マーカーの発現は、健常脳の標本と比べて腫瘍中のＯＬＩＧ２、ＤＣＸ、ＮｅｕＮ、及びＧＡＤ２の発現レベルが上昇しなかったことから、健常な脳による腫瘍標本の汚染では説明されなかった（データは示さない。腫瘍と健常の比較の全てのｔ検定について、ｐ＜０．００５、多重比較については修正無し）。神経幹細胞とアストロサイトのマーカーであるＧＦＡＰは、Ｐｒｏｌｉｆ腫瘍と比べてＭＥＳとＰＮサブクラスに強く発現された（図３Ｅ）。
【０１７８】
Ｐｒｏｌｉｆ及びＭｅｓ腫瘍サブタイプに関連するＣｈｒ１０における減少とｃｈｒ７における増加
発現プロファイリングにより試験した症例のうち、ＡＡ及びＧＢＭの９６の標本由来のＤＮＡが、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーションによる分析（ＣＧＨ）に利用できた。ｃｈｒ１、７、１０及び１９におけるコピー数の変化について腫瘍をスコア化した。腫瘍はまたｃｈｒ１、７、１０及び１９におけるコピー数の相対的変化についてスコア化された。試料の大部分がｃｈｒ７における増加とｃｈｒ１０における減少を示した（図４Ａ）。ｃｈｒ１０における減少を試験する際に、本発明者等は、これらゲノム変化の頻度が腫瘍のサブクラス間で非常に異なることを発見した（図４Ａ）。Ｐｒｏｌｉｆ及びＭｅｓ腫瘍の大部分が１０ｑ２３．３に亘る（それぞれ７８％及び８４％）ｃｈｒ１０における減少を示す一方で、ＰＮ腫瘍サブクラスの少数（２０％）がｃｈｒ１０における減少を示した。Ｍｅｓ腫瘍の場合、大部分の症例においてｃｈｒ１０におけるほぼ全ての座位が欠損し、２例だけが１０ｑに限定された欠損を示した。対照的に、Ｐｒｏｌｉｆ腫瘍の場合、Ｃｈｒ１０における減少は不均一であった。前神経性シグネチャーとＣｈｒ１０の状態との関連性は有意に高かった（ｐ＜０．０００１、フィッシャーの正確検定）。腫瘍シグネチャーとｃｈｒ７又は１９ｑにおける相対的コピー数の変化との間に、類似であるが、やや弱い相関が見られた（図４Ａ、ｃｈｒ７及び１９ｑの両方についてｐ＜０．０１、フィッシャーの正確検定）が、ｃｈｒ１ｐ又は１ｑには類似の相関が見られなかった（ｐ＞０．０５）。
相対的ゲノムコピー数の変化と腫瘍サブタイプとが関連しているとして、各腫瘍サブタイプを決定する遺伝子が染色体の位置に対する偏向を有するかどうかの判定を試みた。腫瘍サブクラスマーカーの拡張版のリスト（表Ａ）に対するカイ二乗分析により、３つのリストのそれぞれについて、観察される染色体位置の頻度が、発現アレイの全プローブセットの位置頻度により予測されるものと有意に異なることが判明した（ＰＮの場合、Ｐ＜１×１０−１４、Ｐｒｏｌｉｆの場合、ｐ＜０．００１、Ｍｅｓの場合、ｐ＜０．０００５）。ＰＮ及びＭｅｓマーカーがｃｈｒ１０及び１９に示すマーカーはいずれも過剰であった（７２の比較についてボンフェローニ補正を行なった後での両比較についてＰ＜０．０５）。これらの発見は、ｃｈｒ１０及び１９ｑにおける相対的なＤＮＡコピー数の変化に見られる腫瘍サブタイプ間の差異を実証するものである。
【０１７９】
予後が良好な腫瘍サブクラスと予後不良の腫瘍サブクラスにおけるＮｏｔｃｈ及びａｋｔ経路の差次的活性化
ｃｈｒ１０の減少と腫瘍サブクラスとの関連性と一致して、ＰＴＥＮ座位を含むＢＡＣクローンのアレイＣＧＨデータの直接的な試験により、Ｐｒｏｌｉｆ及びＭｅｓ症例の大部分がＰＴＥＮ座位の欠損を示すことが確認された。ＰＴＥＮ座位の欠損とＰＮセントロイドへの類似の間には、関連性は見られなかった（図５Ａ）。この座位が増加又は増殖する症例の大部分は、Ｐｒｏｌｉｆ又はＭｅｓサブクラスいずれかの腫瘍であり、ＥＧＦＲコピー数の増加とＰＮセントロイドに対する類似性の間には関連性は見られなかった（図５Ｂ）。ａｋｔ１、ａｋｔ２、又はａｋｔ３に対応する座位には明らかな増殖又は欠失は見られず、ＰＩ３Ｋの触媒サブユニットの増殖又は欠失も見られなかった（図示しない）。小数の試料が、ＰＩ３Ｋの調節サブユニットであるＰＩＫ３Ｒ３についてコピー数の増加を示し、この座位のＣＧＨ比の、Ｐｒｏｌｉｆシグネチャーに対する類似性との関連性は陽性であった（図５Ｃ）。
このような結果により、ａｋｔ経路の活性化と腫瘍サブタイプとの強い関係が示唆されたことから、本発明者等は、腫瘍サブタイプにおけるＰＴＥＮ  ｍＲＮＡの発現とホスホ−ａｋｔ（ｐ−ａｋｔ）免疫組織学を比較した。本発明者等は、Ｐｒｏｌｉｆ及びＭｅｓ腫瘍におけるＰＴＥＮ  ｍＲＮＡの発現はＰＮ腫瘍の場合の概ね２分の一であり、ｐ−ａｋｔ（ｓｅｒ４７３）の発現はＰＮ腫瘍より強いことを発見した（図４Ｅ、図４Ｊ）。この結果は有意性の高いものであった（ＰＮ対その他のｔ検定で、ｐ−ａｋｔ免疫組織化学についてＰ＜５×１０−８；ＰＴＥＮ  ｍＲＮＡについてｐ＜５×１０−５）。ＰＴＥＮの結果は第二の独立試料セットにおいて確認された（データは示さない）。
【０１８０】
ＭＤＡの試料セット中のＰＮ腫瘍マーカーの完全なリストの試験において、本発明者等は、Ｎｏｔｃｈ経路エレメントＤＬＬ３、ＤＬＬ１、ＨＥＹ２及びＡＳＣＬ１に対応するプローブセットが、ＰＮ腫瘍のマーカーとして本発明の基準に見合うものであることを発見した（図５Ｅ−Ｈ）。これらの遺伝子は、両確認用データセットのＰＮ腫瘍に有意に過剰発現することが確認された。これら４つのＮｏｔｃｈ経路エレメントの各々は、前脳の神経発生に関係しているとみなされており（Campos等, J. Neurosci. Res. 64: 590-598 (2001); Casarosa等, Development 126: 525-534 (1999); Sakamoto等, J. Biol. Chem. 278: 44808-44815 (2003)）、ＡＳＣＬ１は最近、成人の前脳におけるニューロン及びオリゴデンドログリア両方の特定に関連付けられている（Parras等, EMBO Journal, 23(22): 4495-505 (2004)）。マイクロアレイのデータにＰＮ腫瘍の上方制御が示されなかったＮｏｔｃｈ経路の成分には、Ｎｏｔｃｈ１−４、Ｊａｇｇｅｄ１及び２、Ｈｅｓ１、２、４、６、７（図示しない）が含まれる。ＨＥＹ１は、ＭＤＡのＰＮ腫瘍に小さいが有意な上方制御を示した（１．４ＦＣ、ｐ＝５×１０−５）。
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の直接的な証拠を試験するために、利用可能なパラフィン埋設切片を用いてＭＤＡの全症例に対し、核Ｎｏｔｃｈ免疫反応性のブラインド評価を実施した。陽性の症例は、陰性の症例と比較した場合核に「紅潮」を示し、このことは核に染色が全く無いことを示すものであった。図４Ｋは、Ｎｏｔｃｈ核染色について０、１、又は２と評価された各腫瘍サブタイプの頻度を示す。陽性の症例は比較的弱いシグナルしか示さなかったが、それでもＰＮ試料は、Ｐｒｏｌｉｆ（ｐ＜０．００５、ｔ検定）又はＭｅｓ（ｐ＜０．００１、ｔ検定）サブクラスより有意に高い評点を示した。
【０１８１】
ＤＬＬ３及びＰＴＥＮ発現の２遺伝子モデルによる高悪性度星細胞腫の生存時間の予想
本発明のデータにより腫瘍悪性度におけるＮｏｔｃｈ及びａｋｔ経路の役割が示唆されたことから、本発明者等は、経路マーカーの発現と生存期間との直接的な関連の証拠を探求した。この分析のために、本発明者等は、使用可能なｍＲＮＡが十分な、ＭＤＡ生存セットに含まれる全ての試料（ｎ＝６５）のマイクロアレイデータを使用した定量的ＰＣＲ及びＤＬＬ３  ｍＲＮＡにより、ＰＴＥＮ  ｍＲＮＡを評価した。比例ハザードのコックスモデルにより、ＰＴＥＮ及びＤＬＬ３  ｍＲＮＡのレベル、及びそれらの統計的相関が全て高悪性度の星細胞腫の生存時間に関連しており、組み合わせることにより非常に重要な予測モデルが形成されることが判明した（自由度３のカイ二乗基準分布と比較した場合の尤度比試験２１．６、ｐ＜０．０００１）。図５Ａに示す予測される生存関数は、ＰＴＥＮ  ｍＲＮＡの値が低い試料が、ＤＬＬ３発現のレベルに関係なく不良な生存関数に関連していることを示す。ＰＴＥＮ発現の高い試料の場合、予測される生存時間はＤＬＬ３の関数として変化し、ＰＴＥＮとＤＬＬ３  ｍＲＮＡ両方のレベルが高い試料は最良の結果を示した。次いで、本発明者等は、同じモデルを、前例より少ないグレードＩＩＩ及びＩＶの星細胞腫の独立セット（ｎ＝３４）に適用した。予想される生存曲線は、ＭＤＡ試料のセットについて得られたものとよく似ており（図５Ｂ）、これによりこの２遺伝子モデルの堅実性が示された（図６Ｂ）。
【０１８２】
ＧＢＭ細胞株の発現シグネチャーによるＥＧＦ／ＦＧＦの独立したニューロスフェア増殖及びａｋｔ経路の阻害に対する感受性の予想
腫瘍の分子サブタイプの潜在的な治療的重要性を試験するため、本発明者等は、神経膠腫細胞株によるシグネチャー遺伝子の発現の関数として当該細胞株のインビトロでの応答を試験した。ｍＲＮＡ発現について１６のＧＢＭ細胞株をプロファイリングして、ＥＧＦ＋ＦＧＦの存在下又は不在下におけるそれらのニューロスフェアの生成能を調査し、Ｎｏｔｃｈ及びＡｋｔシグナル伝達に影響する薬剤へのそれらの応答性を評価した。１６株の全てが、ＰＮセントロイドとの相関を示さなかったが、Ｍｅｓセントロイドに対する幅広い類似性を示した。１６の細胞株のうち１５がＥＧＦ＋ＦＧＦ中で増殖できるニューロスフェアを生成する一方、それらのＥＧＦ＋ＦＧＦ不在下で増殖するニューロスフェアの生成能は同じでなく（図６Ａ）、親細胞株の発現シグネチャーに関連していると思われた（図６Ｂ）。最も顕著な発見は、Ｍｅｓセントロイドと相関していない２つの細胞株（Ｇ１１２及びＧ１２２）がＥＧＦ＋ＦＧＦの不在下で急速に増殖するニューロスフェアを生成する（図６Ｂ）のに対して、Ｍｅｓセントロイドと強い相関関係を有する細胞株がＥＧＦ＋ＦＧＦの不在下で容易に増殖することができるニューロスフェアを生成しないことであった（図７Ｂ）。
腫瘍サブタイプと前脳の神経発達段階との平行性を含む主要な発見を図８Ａ及びＢにまとめた。
【０１８３】
実施例２：神経膠腫におけるＧＤＭポリペプチドの発現上方制御を検出するためのマイクロアレイ分析
多くの場合何千もの遺伝子配列を含む核酸マイクロアレイは、正常な相対物と比較して疾患組織に異なって発現する遺伝子の同定に有用である。核酸マイクロアレイを使用することによって、試験及びコントロール組織試料由来の試験及びコントロールｍＲＮＡ試料を、ｃＤＮＡプローブ生成のために逆転写し、標識する。次いでｃＤＮＡプローブを、固体支持体に固定化された核酸アレイにハイブリダイズさせる。アレイの各部位の配列と位置がわかるようにアレイを構築する。例えば、特定の疾患状態において発現されることが知られている選択された遺伝子を、固体支持体にアレイすることができる。標識されたプローブと特定のアレイ部位とのハイブリッド形成は、そのプローブが生成された試料がその遺伝子を発現することを示す。試験（疾患組織）試料由来のプローブのハイブリッド形成シグナルが、コントロール（正常組織）試料由来のハイブリッド形成シグナルよりも大きい場合に、疾患組織に過剰発現する遺伝子又は複数の遺伝子が同定される。この結果の意味するところは、疾患組織に過剰発現するタンパク質が疾患状態の診断マーカーとしてのみでなく、疾患状態の治療の治療標的としても有用だということである。
核酸ハイブリッド形成の方法論及びマイクロアレイ技術は当該技術者に周知である。本発明の例における、ハイブリッド形成及びプローブのための核酸の特異的調整、スライド、及びハイブリッド形成状態はすべて、2001年3月30日出願のPCT/US01/10482に詳述されており、出典明示によりこの明細書に包含する。
【０１８４】
実施例３：ＧＤＭｍ ＲＮＡ発現の定量分析
このアッセイでは、５'ヌクレアーゼアッセイ（例えば、TaqMan（登録商標））及びリアルタイム定量ＰＣＲ（例えば、ABI Prizm7700シーケンス検出システム（登録商標）（パーキンエルマー，Applied Biosystems Division ，フォスターシティー，カリフォルニア））を、他の癌性腫瘍又は正常な非癌性組織と比較し、癌性腫瘍又は腫瘍で顕著に過剰発現している遺伝子を見出すために使用する。５'ヌクレアーゼアッセイ反応は、Taq DNAポリメラーゼ酵素の５'エキソヌクレアーゼ活性を利用してリアルタイムでの遺伝子発現をモニターする蛍光ＰＣＲ-ベース技術である。２つのオリゴヌクレオチドプライマー（その配列は、対象である遺伝子又はＥＳＴ配列に基づく）を、ＰＣＲ反応で典型的な単位複製配列を生成するために使用する。三番目のオリゴヌクレオチド、又はプローブを、２つのＰＣＲプライマーの間に位置するヌクレオチド配列を検出するために設計する。このプローブは、Taq DNAポリメラーゼ酵素によって伸長可能ではなく、レポーター蛍光色素及びクエンチャー 蛍光色素で標識する。レポーター色素からのどんなレーザー誘導放射も、プローブ上で２つの色素が近接して位置する場合には、消光色素によって消光する。ＰＣＲ増幅反応の間、Taq DNAポリメラーゼ酵素は、鋳型依存的にプローブを切断する。この結果生じるプローブ断片は溶液中で分離し、放出レポーター色素からの信号は、二番目の蛍光物質の消火効果とは無関係である。レポーター色素の１つの分子は、各新規合成分子のために遊離され、非消光レポーター色素の検出によって、データの定量的及び定量的解釈に関する根拠が提供される。このアッセイはよく知られており、当技術分野において、２つの異なるヒト組織試料間の遺伝子発現の差異を定量的に同定するために常套的に使用される。例えば、Higuchi等, Biotechnology 10:413-417 (1992); Livak等, PCR Methods Appl., 4:357-362 (1995); Heid等, Genome Res. 6:986-994 (1996); Pennica等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (25):14717-14722 (1998); Pitti等, Nature 396 (6712):699-703 (1998)及びBieche等, Int. J. Cancer 78:661-666 (1998)を参照のこと。
５’ヌクレアーゼ手法は、ABI Prism7700TMシーケンス検出のようなリアルタイム定量ＰＣＲ装置で行われる。このシステムは、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合装置（ＣＣＤ）カメラ及びコンピューターで構成される。このシステムでは、サーモサイクラー上の９６-ウェルフォーマットで試料を増幅する。増幅の間、レーザー誘導蛍光信号が、すべての９６ウェルの光ファイバー計測ケーブルを介してリアルタイムで集められ、ＣＣＤで検出される。このシステムには、装置を作動するため、そしてデータを分析するためのソフトウエアが含まれる。
【０１８５】
スクリーニングのための出発材料は、種々の異なる癌性組織から単離したｍＲＮＡである。このｍＲＮＡは、例えば蛍光定量的に、正確に定量化される。ネガティブコントロールとして、ＲＮＡを、試験される癌性組織と同じ組織型の種々の正常組織から単離する。多くの場合、腫瘍試料を、同じ組織種類の「対応する」正常試料と直接比較する。つまり、腫瘍試料と正常試料を同じ個体から取得する。
５’ヌクレアーゼアッセイデータは、最初にＣｔ、又は閾値サイクルとして表される。これは、レポーター信号が蛍光のバックグラウンドレベルを超えて蓄積するサイクルとして定義される。ΔＣｔ値は、癌のｍＲＮＡの結果を正常なヒトｍＲＮＡの結果と比較する場合に、核酸試料中の特定の標識配列の開始コピーの相対数の定量的測定として用いられる。１Ｃｔ単位は、１ＰＣＲサイクル、又は標準に対しておよそ２倍の相対増加に一致し、２単位は、４倍相対増加に一致し、３単位は８倍相対増加に一致する等々であり、２つ以上の異なる組織間のｍＲＮＡ発現の相対倍数増加を定量的且つ定量的に測定できる。これに関し、本技術分野では、ヒト腫瘍試料中のｍＲＮＡ発現の、正常なコントロールの２倍以上の増大を再現可能に検出するのに、このアッセイの技術的感度は十分であると認められている。
【０１８６】
実施例４：インサイツハイブリダイゼーション
インサイツハイブリダイゼーションは、細胞又は組織調製物内での核酸配列の検出及び局在化のための強力で多用途の技術である。それは、例えば、遺伝子発現部位の同定、転写物の組織分布の分析、ウイルス感染の同定と局在化、特定のｍＲＮＡ合成における変化の追跡及び染色体マッピングにおける補助に有用である。
インサイツハイブリダイゼーションは、Lu及びGillett, Cell Vision 1: 169-176 (1994)のプロトコルの最適化バージョンに従って、ＰＣＲ生成３３Ｐ-標識リボプローブを用いて実施される。簡単に述べると、ホルマリン固定、パラフィン包埋ヒト組織を切片化し、脱パラフィンし、プロテイナーゼＫ（20g/ml）で１５分間３７℃で脱タンパクし、さらに上掲のLu及びGillettに記載されたようにインサイツハイブリダイゼーションする。(３３-Ｐ)ＵＴＰ-標識アンチセンスリボプローブをＰＣＲ産物から生成し、５５℃で終夜ハイブリダイゼーションする。スライドをKodak NTB2核トラックエマルションに浸漬して４週間露光する。
【０１８７】
３３Ｐ-リボプローブ合成
６．０μｌ（１２５ｍＣｉ）の３３Ｐ-ＵＴＰ（Amersham BF 1002, SA＜2000 Ci/mmol）をスピード真空乾燥させた。乾燥３３Ｐ-ＵＴＰを含む各管に以下の成分を添加した：
２．０μｌの５×転写バッファー
１．０μｌのＤＴＴ（１００ｍＭ）
２．０μｌのＮＴＰ混合物（２．５ｍＭ: 各１０μｌの１０ｍＭ ＧＴＰ，ＣＴＰ及びＡＴＰ＋１０μｌのＨ２Ｏ）
１．０μｌのＵＴＰ（５０μＭ）
１．０μｌのＲＮａｓｉｎ
１．０μｌのＤＮＡテンプレート（１μｇ）
１．０μｌのＨ２Ｏ
１．０μｌのＲＮＡポメラーゼ（ＰＣＲ産物についてＴ３＝ＡＳ，Ｔ７＝Ｓ，通常）
チューブを３７℃で１時間インキュベートする。１．０μｌのＲＱ１ ＤＮａｓｅを添加し、ついで３７℃で１５分間インキュベートする。９０μｌのＴＥ（１０ｍＭトリスｐＨ７．６／１ｍＭのＥＤＴＡｐＨ８．０）を添加し、混合物をＤＥ８１紙にピペットする。残りの溶液をＭｉｃｒｏｃｏｎ−５０限外濾過ユニットに充填し、プログラム１０を用いてスピンさせる（６分間）。濾過ユニットを第２の管に変換し、プログラム２を用いてスピンさせる（３分間）。最終回収スピンの後、１００μｌのＴＥを添加する。１μｌの最終生成物をＤＥ８１紙にピペットし６ｍｌのＢＩＯＦＬＵＯＲ ＩＩで数える。
プローブをＴＢＥ／尿素ゲル上に流す。１−３μｌのプローブ又は５μｌのＲＮＡ  ＭｒｋＩＩＩを３μｌのローディングバッファーに添加する。加熱ブロック上で９５℃に３分間加熱した後、プローブを即座に氷上に置く。ゲルのウェルを流し、試料を充填し、１８０−２５０ボルトで４５分間流す。ゲルをサランラップでラップし、−７０℃冷凍機内で補強スクリーンを持つＸＡＲフィルムに１時間から終夜露光する。
【０１８８】
３３Ｐ-ハイブリダイゼーション
Ａ．凍結切片の前処理
スライドを冷凍機から取り出し、アルミニウムトレイに配置して室温で５分間解凍する。トレイを５５℃のインキュベータに５分間配置して凝結を減らす。スライドを蒸気フード内において４％パラホルムアルデヒド中で１０分間固定し、０．５×ＳＳＣで５分間室温で洗浄する（２５ｍｌ ２０×ＳＳＣ＋９７５ｍｌ ＳＱ Ｈ２Ｏ）。０．５μｇ／ｍｌのプロテイナーゼ中、３７℃で１０分間の脱タンパクの後（２５０ｍｌの予め温めたＲＮａｓｅ無しＲＮａｓｅバッファー中の１０ｍｇ／ｍｌ貯蔵液１２．５μｌ）、切片を０．５×ＳＳＣで１０分間室温で洗浄する。切片を、７０％、９５％、１００％エタノール中、各２分間脱水する。
Ｂ．パラフィン包埋切片の前処理：
スライドを脱パラフィンし、ＳＱ  Ｈ２Ｏ中に配置し、２×ＳＳＣで室温において各々５分間２回洗い流す。切片を２０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（２５０ｍｌのＲＮａｓｅ無しＲＮａｓｅバッファー中１０ｍｇ／ｍｌを５００μｌ；３７℃、１５分間）−ヒト胚又は８×プロテイナーゼＫ（２５０ｍｌのＲＮａｓｅバッファー中１００μｌ、３７℃、３０分間）−ホルマリン組織で脱タンパクする。続く０．５×ＳＳＣでの洗い流し及び脱水は上記のように実施する。
Ｃ．プレハイブリッド：
スライドをＢｏｘバッファー（４ｘＳＳＣ、５０％ホルムアミド）−飽和濾紙で列を作ったプラスチックボックスに並べる。
Ｄ．ハイブリダイゼーション：
スライド当たり１．０×１０６ｃｐｍのプローブ及び１．０μｌのｔＲＮＡ（５０ｍｇ／ｍｌストック）を９５℃で３分間加熱する。スライドを氷上で冷却し、スライド当たり４８μｌのハイブリダイゼーションバッファーを添加する。ボルテックスの後、５０μｌの３３Ｐ混合物をスライド上のプレハイブリダイゼーション５０μｌに添加する。スライドを５５℃で終夜インキュベートする。
Ｅ．洗浄：
洗浄は、２×１０分間、２×ＳＳＣ、ＥＤＴＡで室温で実施し（４００ｍｌの２０×ＳＳＣ＋１６ｍｌの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ、Ｖｆ＝４Ｌ）、次いでＲＮａｓｅＡ処理を３７℃で３０分間行う（２５０ｍｌＲＮａｓｅバッファー中１０ｍｇ／ｍｌを５００μｌ＝２０μｇ／ｍｌ）。スライドを２×１０分間、２×ＳＳＣ、ＥＤＴＡにて室温で洗浄する。ストリンジェントな洗浄条件は次の通りとすることができる：５５℃で２時間、０．１×ＳＳＣ、ＥＤＴＡ（２０ｍｌの２０×ＳＳＣ＋１６ｍｌのＥＤＴＡ、Ｖｆ＝４Ｌ）。
Ｆ．オリゴヌクレオチド
ここに開示した様々なＤＮＡ配列についてインサイツ分析を実施する。これらの分析に対して用いたオリゴヌクレオチドは添付図に示した核酸（又はその相補鎖）に相補的であるように得る。
【０１８９】
実施例５：ＧＤＭに結合する抗体の調整
モノクローナル抗体の生産のための技術は、この分野で知られており、例えば、上掲のGodingに記載されている。使用することができる免疫原には、精製ＧＤＭポリペプチド、ＧＤＭポリペプチドを含む融合タンパク質、及び細胞表面上に組換えＧＤＭポリペプチドを発現する細胞が含まれる。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなくなすことができる。
Ｂａｌｂ／ｃ等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は腹腔内に１−１００マイクログラムで注入した上記免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ribi Immunochemical Researh, Hamilton, MT）に乳化し、動物の後足蹠に注入してもよい。免疫化したマウスは、次いで１０から１２日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免疫する。抗ＧＤＭ抗体の検出のためのＥＬＩＳＡアッセイで試験するために、後眼窩血からの血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。
適当な抗体力価が検出された後、抗体に「ポジティブ（陽性）」な動物に、ＧＤＭポリペプチドの静脈内注射の最後の注入をすることができる。３から４日後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を取り出す。次いで脾臓細胞を（３５％ポリエチレングリコールを用いて）、ＡＴＣＣから番号ＣＲＬ１５９７で入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１等の選択されたマウス骨髄腫株化細胞に融合させる。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、次いで、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害する。
ハイブリドーマ細胞は、ＧＤＭに対する反応性についてのＥＬＩＳＡでスクリーニングされる。ＧＤＭに対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「ポジティブ（陽性）」ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常識の範囲内である。
陽性ハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入し、抗ＧＤＭモノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで成長させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィ−を用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインＡ又はプロテインＧへの親和性に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。
【０１９０】
実施例６：ＧＤＭを結合する、毒素をコンジュゲートした抗体の調整
細胞障害性又は細胞分裂停止性の薬剤、すなわち癌治療において腫瘍細胞を殺すか又は阻害するための薬剤の局部運搬に抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）、つまり免疫複合体を用いると(Payne (2003) Cancer Cell 3:207-212; Syrigos及びEpenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz及びSpringer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172；米国特許第4,975,278号)、腫瘍への薬剤成分の標的とする運搬とそこでの細胞内集積が可能となり、この非コンジュゲート薬物作用剤の全身性投与により正常細胞並びに除去しようとする腫瘍細胞への毒性が容認できないレベルとなりうる(Baldwin等, (1986) Lancet (Mar. 15, 1986):pp603-05; Thorpe, (1985) 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,」 in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera等 (ed.s), pp. 475-506)。これによって、最小限の毒性で最大限の効果が求められる。ＡＤＣを設定して精製するために、モノクローナル抗体(ｍＡｂ)の選択性並びに薬剤結合特性及び薬剤放出特性に注目した。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は共に、この方策に有用であるとして報告されている(Rowland等, (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87)。この方法に用いる薬物には、ダウノマイシン、ドキソルビジン、メトトレキサート及びビンデジンが含まれる(Rowland等, (1986)、上掲)。抗体−毒素コンジュゲートに用いる毒素には、ジフテリア毒素などの細菌性毒素、リシンなどの植物毒素、ゲルダナマイシン(Mandler等(2000) J. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581；Mandler等(2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028；Mandlerら(2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791)、メイタンシノイド(EP 1391213；Liu等, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623)、及びカリケアマイシン(Lode等 (1998) Cancer Res. 58:2928；Hinman等 (1993) Cancer Res. 53:3336-3342)などの小分子毒素が含まれる。
【０１９１】
精製された抗体に毒素をリンクさせることにより抗体-薬剤コンジュゲートを生成する技術は周知であり、本技術分野で常套的に使用される。例えば、精製したモノクローナル抗体の毒素ＤＭ１へのコンジュゲートは、次のように行うことができる。精製された抗体を、Ｎ−サクシニミジル−４−（２−ピリジルチオ）−ペンタン酸を用いて誘導体化し、ジチオピリジル基を誘導する。ＮａＣｌ（５０ｍＭ）及びＥＤＴＡ（１ｍＭ）を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液中の抗体（３７６．０ｍｇ，８ｍｇ／ｍＬ）４４．７ｍｌをＳＰＰ（２．３ｍｌのエタノール中５．３モル濃度当量）により処理する。外界温度及びアルゴン下で９０分に亘るインキュベーションを行った後、３５ｍＭのクエン酸ナトリウム、１５４ｍＭのＮａＣｌ及び２ｍＭのＥＤＴＡを用いて平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラムにより反応混合物をゲル濾過する。次いで、抗体を含む分画をプールし、アッセイする。抗体−ＳＰＰ−Ｐｙ（遊離可能な２−チオピリジン基を含め、３３７．０ｍｇ）を、上記３５ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５を用いて希釈し、最終濃度を２．５ｍｇ／ｍｌとする。次いで、３．０ｍＭのジメチルアセトアミド（ＤＭＡ、最終的な反応混合物中３％ｖ／ｖ）中のＤＭ１（１．７当量、１６．１モル）を抗体溶液に添加する。外界温度且つアルゴン下で反応を進行させる。反応物を、３５ｍＭのクエン酸ナトリウム、１５４ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ３００ゲル濾過カラム（５．０ｃｍ×９０．０ｃｍ、１．７７Ｌ）に充填する。流速は５．０ｍｌ／分であり、６５画分（各２０．０ｍｌ）が回収される。画分をプールしてアッセイし、抗体分子１つ当たりにリンクしたＤＭ１薬剤分子の数（ｐ’）を、２５２ｎｍ及び２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより決定する。
【０１９２】
また、例示として、毒素ＤＭ１への精製されたモノクローナル抗体のコンジュゲートは、以下の通りに達成されうる。精製された抗体は、(スクシンイミジル４(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシレート(ＳＭＣＣ、Pierce Biotechnology, Inc) で誘導体化して、ＳＭＣＣリンカーを導入する。５０ｍＭ リン酸カリウム／５０ｍＭ 塩化ナトリウム／２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５中で、７．５モル等量のＳＭＣＣ(ＤＭＳＯ中に２０ｍＭ、６．７ｍｇ／ｍＬ)にて２０ｍｇ／ｍＬの抗体を処理した。室温のアルゴン下で２時間撹拌した後に、反応混合物を、５０ｍＭ リン酸カリウム／５０ｍＭ 塩化ナトリウム／２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５にて平衡化したSephadex G25カラムにてろ過する。抗体を含有する分画をプールして、アッセイする。次いで、抗体-ＳＭＣＣを、５０ｍＭ リン酸カリウム／５０ｍＭ 塩化ナトリウム／２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５で希釈して、最終濃度およそ１０ｍｇ／ｍｌとし、１０ｍＭのＤＭ１を含むジメチルアセトアミド溶液(１．７等量、５ ＳＭＣＣ／抗体と推定)にて反応させる。反応は、１６．５時間、室温、アルゴン下にて撹拌して行う。コンジュゲート反応混合物は、ｐＨ６．５の１×ＰＢＳによるSephadex G25ゲル濾過カラム(１．５×４．９ｃｍ)に濾過する。次いで、ＤＭ１／抗体の比(ｐ)を２５２ｎｍと２８０ｎｍの吸光度にて測定する。
典型的に、細胞毒性剤は、抗体の多数になりうるリジン残基により抗体にコンジュゲートされている。対象の抗体に存在するか、又は対象の抗体中に操作したチオール基によるコンジュゲートもまた達成されている。例えば、システイン残基は遺伝子工学技術によってタンパク質内に導入されて、リガンドの共有結合的付着部位を形成している(Better等 (1994) J. Biol. Chem. 13:9644 9650；Bernhard等 (1994) Bioconjugate Chem. 5:126 132；Greenwood等 (1994) Therapeutic Immunology 1:247 255；Tu等 (1999) Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:4862 4867；Kanno等 (2000) J. of Biotechnology, 76:207 214；Chmura等 (2001) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98(15): 8480 8484；米国特許第６２４８５６４号)。一旦遊離システイン残基が対象の抗体の中に存在すると、毒素はその部位に連結されうる。例えば、薬剤リンカー試薬であるマレイミドカプロイル-モノメチルアウリスタチンＥ(ＭＭＡＥ)、すなわちＭＣ-ＭＭＡＥ、マレイミドカプロイル-モノメチルアウリスタチンＦ(ＭＭＡＦ)、すなわちＭＣ-ＭＭＡＦ、MC-val-cit-PAB-MMAE又はMC-val-cit-PAB-MMAFをＤＭＳＯに溶解して、濃度がわかっているアセトニトリルと水にて希釈して、冷やしたシステイン誘導体化抗体を含むリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)に添加する。およそ１時間後に、過剰量のマレイミドを添加して反応を止め、反応していない抗体チオール基を覆った。反応混合物を遠心限外濾過によって濃縮し、毒素コンジュゲート抗体を精製して、ＰＢＳ中のＧ２５樹脂による溶出によって脱塩して、無菌条件下で０．２ｍのフィルターにて濾過して、保存のために凍結した。
【０１９３】
さらに、選択した抗体の遊離システインを、ビスマレイミド試薬ＢＭ(ＰＥＯ)４(Pierce Chemical)にて修飾して、抗体の表面上の反応していないマレイミド基を除去する。これは、ＢＭ(ＰＥＯ)４を５０％のエタノール／水混合液に１０ｍＭの濃度になるまで溶解して、およそ１．６ｍｇ／ｍｌ(１０マイクロモル)の濃度でリン酸緩衝食塩水に抗体を含有する溶液に１０倍のモル過剰量を加え、１時間反応させることによって達成される。過剰なＢＭ(ＰＥＯ)４は、３０ｍＭ クエン酸塩、ｐＨ６と１５０ｍＭ ＮａＣｌバッファによるゲル濾過にて除去した。およそ１０倍のモル過剰ＤＭ１を、ジメチルアセトアミド(ＤＭＡ)に溶解して、抗体-ＢＭＰＥＯ中間生成物に加える。また、ジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)を用いて薬剤成分試薬を溶解してもよい。反応混合物を終夜反応させて、ＰＢＳでゲル濾過ないし透析を行って反応していない薬剤を取り除く。ＰＢＳ中のＳ２００カラムによるゲル濾過を用いて、高分子量凝集塊を取り除いて、精製された抗体-ＢＭＰＥＯ-ＤＭ１コンジュゲートに供給する。
【０１９４】
実施例７：インビトロでの細胞死滅アッセイ
対象のＧＤＭポリペプチドを発現する哺乳動物細胞を、標準的な発現ベクター及びクローニング法を使用して得る。あるいは、対象のＧＤＭポリペプチドを発現する多くの腫瘍細胞株は例えばＡＴＣＣから公的に入手可能であり、標準的なＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳ分析法を使用して常套的に同定することができる。ついで抗ＧＤＭポリペプチドモノクローナル抗体（及びその毒素コンジュゲート誘導体）をアッセイで用いて、ＧＤＭポリペプチド発現細胞を死滅させるインビトロでの抗体の能力を定量することができる。
特に本発明に関し、細胞表面上に安定してＧＤＭポリペプチドを発現するＰＣ３由来細胞株（ここではＰＣ３−ｇＤ−ＭＤＰと呼ぶ）を、標準的な技術を用いてエンジニアリングすることができ、ＰＣ３−ｇＤ−ＭＤＰ細胞によるＧＤＭポリペプチドの発現は、標準的なＦＡＣＳ細胞選別、ＥＬＩＳＡ及び免疫組織化学分析を用いて確認することができる。ＭＭＡＥにコンジュゲートした抗ＧＤＭモノクローナル抗体の、対応するＧＤＭ発現細胞の死を引き起こす能力は、以下のプロトコルを採用するインビトロ細胞死滅アッセイを用いて決定することができる（Promega Corp. Technical Bulletin TB288; Mendoza等 (2002) Cancer Res. 62:5485-5488）。
１．増殖培地中の、約１０４個の細胞（ＰＣ３−ｇＤ−ＭＤＰ細胞又はＧＤＭを発現しない非形質導入細胞）を含む５０μｌの細胞培養液の一定分量を、９６ウェル式の壁が不透明なプレートに分配する。細胞を含まない５０μｌの増殖培地を収容する追加的コントロールウェルを調整する。
２．ＧＤＭ−ＭＭＡＥコンジュゲート抗体、又はＧＤＭに結合しないＭＭＡＥコンジュゲートコントロールモノクローナル抗体の容量５０μｌを、０．０００１〜１００μｇ／ｍｌに亘る様々な濃度で各ウェルに添加し、プレートを３７℃で５％のＣＯ２下で３〜５日間インキュベートする。
３．プレートを約３０分間室温に平衡化する。
４．各ウェル内の細胞培養培地の容量に等しい容量の、Ｐｒｏｍｅｇａ社製ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｏ  蛍光細胞生存度試薬を各ウェルに添加し、軌道シェーカーでプレートを２分間振盪し、細胞を溶解させる。
５．プレートを室温で１０分間インキュベートし、蛍光シグナルを安定化させる。
６．Ｔｒｏｐｉｘ  Ｗｉｎｇｌｏｗプログラムを用いるルミノメーターに蛍光度を記録し、ＲＬＵ＝相対的蛍光単位を報告する。
【０１９５】
上記アッセイから得られる結果により、ＧＤＭ−ＭＭＡＥ抗体が、抗体に依存する形で対応するＧＤＭポリペプチドを発現する細胞の死を誘発する能力を有することが実証される。つまり、ＧＤＭ−ＭＭＡＥ及びＭＭＡＥコンジュゲートコントロールはいずれも、１μｇ／ｍｌ以下の抗体濃度で非形質導入ＰＣ３細胞の有意な死滅を誘発することができない。１μｇ／ｍｌを超える抗体濃度では、非形質導入ＰＣ３細胞死の容量は、抗体に依存する形で抗体濃度に伴い線形に増加しうる。従って、１μｇ／ｍｌを超える抗体濃度での非形質導入ＰＣ３細胞の死滅は、反応混合物中に存在するＭＭＡＥ毒素のレベルが増加する結果に特異的な結果ではなく、使用する抗体の結合特異性の関数でもない。
しかしながら、安定してＧＤＭポリペプチドを発現するＰＣ３−ｇＤ−ＭＤＰ細胞に関し、ＭＭＡＥコンジュゲートコントロールが、抗体の、非形質導入ＰＣ３細胞を死滅させる能力と同じパターンで細胞死を誘発するのに対して、ＧＤＭ−ＭＭＡＥはこのレベルを有意に下回る抗体濃度で（例えば、０．００１μｇ／ｍｌ）有意な細胞死を誘発する。実際、１μｇ／ｍｌの抗体濃度で（非ＧＤＭ特異性ＭＭＡＥコンジュゲートコントロール抗体は有意な細胞死を示さない）、ほぼ全てのＰＣ３−ｇＤ−ＭＤＰ細胞はＧＤＭ−ＭＭＡＥによって死滅する。従って、このようなデータにより、ＧＤＭ特異性のモノクローナル抗体は、細胞の表面上に発現するときＧＤＭポリペプチドに結合し、結合するそれらの細胞の死を誘発する能力を有することが示される。
【０１９６】
実施例８：インビボでの腫瘍細胞死滅アッセイ
インビボでの腫瘍細胞の死を誘発する能力について、毒素コンジュゲート又は非コンジュゲート抗ＧＤＭポリペプチドモノクローナル抗体の有効性を試験するために、以下のプロトコールを採用する。
フラスコ内において、一組の胸腺欠損ヌードマウスの皮下に、ＧＤＭポリペプチドを発現する５×１０６個の腫瘍促進細胞を播種する。腫瘍が１００〜２００ｍｍ３の平均腫瘍容積に達したら、マウスを均等に５組に分け、以下のように処理する。
グループ１−ＰＢＳコントロール溶媒を週に１回の頻度で４週に亘って投与
グループ２−非特異的コントロール抗体を、週に１回１ｍｇ／ｋｇの容量で、４週に亘って投与
グループ３−非特異的コントロール抗体を、週に１回３ｍｇ／ｋｇの容量で、４週に亘って投与
グループ４−特異的抗ＧＤＭポリペプチド抗体を、週に１回１ｍｇ／ｋｇの容量で、４週に亘って投与
グループ５−特異的抗ＧＤＭポリペプチド抗体を、週に１回３ｍｇ／ｋｇの容量で、４週に亘って投与
次いで、各治療グループのマウスの平均腫瘍容量を周期的に測定し、抗体の有効性を決定する。
【０１９７】
実施例９：ＧＤＭのハイブリダイゼーションプローブとしての使用
以下の方法は、ＧＤＭポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションプローブとして、すなわち哺乳類における腫瘍の存在を診断するための使用を記載する。
ここに開示した完全長又は成熟ＧＤＭポリペプチドのコード化配列を含んでなるＤＮＡを、ヒト組織ｃＤＮＡライブラリー又はヒト組織ゲノムライブラリーにおける相同的なＤＮＡ（例えば、ＧＤＭの天然に生じる変異体をコードするもの）のスクリーニングのためのプローブとしてもまた用いられる。
いずれかのライブラリーＤＮＡを含むフィルターのハイブリダイゼーション及び洗浄は、以下の高ストリンジェント条件で実施する。放射標識ＧＤＭ誘導プローブのフィルターへのハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアルデヒド、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、２×デンハルト溶液、及び１０％硫酸デキストランの溶液中で、４２℃において２０時間行う。フィルターの洗浄は、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの水溶液にて４２℃で行う。
ついで、完全長天然配列ＧＤＭをコードするＤＮＡと所望の配列同一性を有するＤＮＡは、この分野で知られた標準的な方法を用いて同定できる。
【０１９８】
実施例１０：大腸菌中でのＧＤＭの発現
この実施例は、大腸菌中での組換え発現によるＧＤＭの非グリコシル化形態の調製を例証する。
前記ＧＤＭポリペプチド配列をコードするＤＮＡ配列は、選択されたＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅する。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位を持たなければならない。種々の発現ベクターが用いられる。好適なベクターの例は、ｐＢＲ３２２（大腸菌由来のもの；Bolivar等, Gene, 2:95 (1977)参照）であり、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性についての遺伝子を含む。ベクターは、制限酵素で消化され、脱リン酸化される。ＰＣＲ増幅した配列は、次いで、ベクターに結合させる。ベクターは、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ポリ-Ｈｉｓリーダー（最初の６つのＳＴIIコドン、ポリ-Ｈｉｓ配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む）、ＧＤＭコードする領域、ラムダ転写ターミネーター、及びａｒｇＵ遺伝子を含む。
ライゲーション混合物は、ついで、上掲のSambrook等に記載された方法を用いて選択した大腸菌の形質転換に使用される。形質転換体は、それらのＬＢプレートで成長する能力により同定され、次いで抗生物質耐性クローンが選択される。プラスミドＤＮＡが単離され、制限分析及びＤＮＡ配列で確認される。
選択されたクローンは、抗生物質を添加したＬＢブロスなどの液体培地で終夜成長させることができる。終夜培地は、続いて大規模培地の播種に用いられる。次に細胞を所望の光学密度まで成長させ、その間に発現プロモーターが作動する。
さらに数時間の細胞培養の後、遠心分離による集菌が可能である。遠心分離で得られた細胞ペレットは、この分野で知られた種々の試薬を用いて可溶化され、次いで可溶化ＧＤＭポリペプチドを、タンパク質が堅く結合する条件下で金属キレート化カラムを用いて精製する。
【０１９９】
以下の手法を用いて、ポリ-Ｈｉｓ（ポリ-ヒス）タグ形態で前記ＧＤＭポリペプチド配列を大腸菌で発現させてもよい。ＧＤＭをコードするＤＮＡを選択したＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅した。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位、及び効率的で信頼性のある翻訳開始、金属キレートカラムでの迅速な精製、及びエンテロキナーゼでのタンパク質分解的除去を与える他の有用な配列を含む。次いでＰＣＲ増幅された、ポリ-Ｈｉｓタグ配列を発現ベクターに結合させ、それを株５２（W3１１0 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) clpP(lacIq)）に基づく大腸菌宿主の形質転換に使用した。形質転換体は、最初に５０ｍｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有するＬＢ中、３０℃で振盪しながら３−５のＯ．Ｄ．６００に達するまで成長させた。ついで培地をＣＲＡＰ培地（３．５７ｇの(ＮＨ４)２ＳＯ４、０．７１gのクエン酸ナトリウム・２Ｈ２Ｏ、１．０７gのＫＣｌ、５．３６ｇのＤｉｆｃｏ酵母抽出物、５００ｍＬ水中の５．３６gのShefield hycase SF、並びに１１０ｍＭのＭＰＯＳ、ｐＨ７．３、０．５５%（w/v）のグルコース及び７ｍＭのＭｇＳＯ４の混合で調製）中に５０−１００倍希釈し、３０℃で振盪させながら約２０−３０時間成長させる。試料を取り出してＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析により発現を確認し、バルク培地を遠心分離して細胞のペレットとする。細胞ペレットを精製及びリフォールディングまで凍結させる。
０．５から１Ｌの発酵（６−１０gペレット）からの大腸菌ペーストを、７Ｍのグアニジン、２０ｍＭのトリス、ｐＨ８バッファー中で１０容量（w/v）で再懸濁させる。固体硫酸ナトリウム及びテトラチオン酸ナトリウムを添加して最終濃度を各々０．１Ｍ及び０．０２Ｍとし、溶液を４℃で終夜撹拌する。この工程により、すべてのシステイン残基が亜硫酸化によりブロックされた変性タンパク質がもたらされる。溶液をBeckman Ultracentrifuge中で４０，０００ｒｐｍで３０分間遠心する。上清を金属キレートカラムバッファー（６Ｍのグアニジン、２０ｍＭのトリス、ｐＨ７.４）の３−５容量で希釈し、０．２２ミクロンフィルターを通して濾過して透明化する。透明化抽出物を、金属キレートカラムバッファーで平衡化させた５ｍｌのQiagen Ni-NTA金属キレートカラムに充填する。カラムを５０ｍＭのイミダゾール（Calbiochem, Utrol grade）を含む添加バッファー、ｐＨ７．４で洗浄する。タンパク質を２５０ｍＭのイミダゾールを含有するバッファーで溶離する。所望のタンパク質を含有する画分をプールし、４℃で保存する。タンパク質濃度は、そのアミノ酸配列に基づいて計算した吸光係数を用いて２８０ｎｍにおけるその吸光度により見積もる。
【０２００】
試料を、２０ｍＭのトリス、pH８．６、０．３ＭのＮａＣｌ、２．５Ｍの尿素、５ｍＭのシステイン、２０ｍＭのグリシン及び１ｍＭのＥＤＴＡからなる新たに調製した再生バッファー中に徐々に希釈することによりタンパク質を再生(refold)させる。リフォールディング容量は、最終的なタンパク質濃度が５０〜１００マイクログラム／ｍｌとなるように選択する。リフォールディング溶液を４℃で１２−３６時間ゆっくり撹拌する。リフォールディング反応はＴＦＡを最終濃度０．４％（約３のｐＨ）で添加することにより停止させる。タンパク質をさらに精製する前に、溶液を０．２２ミクロンフィルターを通して濾過し、アセトニトリルを最終濃度２−１０％で添加する。再生したタンパク質を、Poros R１/H逆相カラムで、０．１％ＴＦＡの移動バッファーと１０〜８０％のアセトニトリル勾配での溶離を用いてクロマトグラフにかける。Ａ２８０吸収を持つ画分の一定分量をＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析し、相同な再生タンパク質を含有する画分をプールする。一般的に、殆どの正しく再生したタンパク質種は、これらの種が最も緻密であり、その疎水性内面が逆相樹脂との相互作用から遮蔽されているので、アセトニトリルの最低濃度で溶離される。凝集した種は通常、より高いアセトニトリル濃度で溶離される。誤って再生したタンパク質を所望の形態から除くのに加えて、逆相工程は試料からエンドトキシンも除去する。
所望の折り畳み(folded)タンパク質を含有する画分をプールし、弱い窒素流を溶液に向けながらアセトニトリルを除去する。透析又は調製バッファーで平衡化したＧ２５Superfine（Pharmacia）樹脂でのゲル濾過及び滅菌濾過により、０．１４Ｍの塩化ナトリウム及び４％のマンニトールを含む２０ｍＭのHepes、ｐＨ６．８にタンパク質を調製する。
【０２０１】
実施例１１：哺乳動物細胞中でのＧＤＭポリペプチドの発現
この実施例は、哺乳動物細胞における組み換え発現によるＧＤＭポリペプチドの潜在的なグリコシル化形態の調製を例示する。
発現ベクターとしてｐＲＫ５（１９８９年３月１５日発行のＥＰ３０７２４７を参照のこと）を用いた。場合によっては、本明細書のＧＤＭポリペプチドをコードするＤＮＡを、選択した制限酵素を持つｐＲＫ５に結合させ、上掲のSambrook等に記載されたようなライゲーション方法を用いて該ＤＮＡを挿入させる。得られたベクターは、ＧＤＭ−ＤＮＡと呼ばれる。
一実施態様では、選択された宿主細胞は２９３細胞とすることができる。ヒト２９３細胞（ATCC CCL 1573）は、ウシ胎児血清及び場合によっては栄養成分及び／又は抗生物質を添加したＤＭＥＭなどの媒質中で組織培養プレートにおいて成長させて集密化する。約１０μｇのｐＲＫ５−ＧＤＭ ＤＮＡを、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子をコードする約１μｇのＤＮＡと混合し[Thimmappaya等, Cell, 31:543(1982)]、５００μｌの１ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．２２７ＭＣａＣｌ２に溶解させる。この混合物に、５００μｌの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＮａＰＯ４を滴下添加し、２５℃で１０分間沈殿物を形成させる。沈殿物を懸濁し、２９３細胞に加えて３７℃で約４時間定着させる。培養培地を吸引し、２ｍｌのＰＢＳ中２０％グリセロールを３０秒間添加する。２９３細胞は、次いで無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約５日間インキュベートする。
形質移入の約２４時間後、培養培地を除去し、培養培地（単独）又は２００μＣｉ／ml３５Ｓ−システイン及び２００μＣｉ／ｍｌ３５Ｓ−メチオニンを含む培養培地で置換する。１２時間のインキュベーションの後、条件培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、１５％ＳＤＳゲルに添加する。処理したゲルを乾燥させ、ＧＤＭポリペプチドの存在を現すとして選択された時間にわたってフィルムにさらす。形質転換した細胞を含む培地は、更なるインキュベーションを施し（無血清培地で）、培地を選択されたバイオアッセイで試験する。
【０２０２】
これに換わる技術において、ＧＤＭポリペプチドをコードするＤＮＡは、Somparyrac等, Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981)に記載された、硫酸デキストラン法を用いて２９３細胞に一過的に導入される。２９３細胞は、スピナーフラスコ内で最大密度まで成長させ、７００μｇのｐＲＫ５−ＧＤＭＤＮＡを添加する。細胞は、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、ＰＢＳで洗浄する。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で4時間インキュベートする。細胞を２０%グリセロールで９０秒間処理し、組織培養培地で洗浄し、組織培養培地、５μg/mlウシインシュリン及び０．１μｇ/mlウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入する。約４日後に、条件培地を遠心分離して濾過し、細胞及び細胞片を除去する。次いで発現されたＧＤＭを含む試料を濃縮し、透析及び／又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法によって精製する。
他の実施態様では、ＧＤＭポリペプチドをＣＨＯ細胞で発現させることができる。ｐＲＫ５−ＧＤＭは、ＣａＰＯ４又はＤＥＡＥ−デキストランなどの公知の試薬を用いてＣＨＯ細胞に形質移入することができる。上記したように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地（単独）又は３５Ｓ-メチオニン等の放射性標識を含む培地に置換することができる。ＧＤＭポリペプチドの存在を判定した後、培養培地を無血清培地に置換してもよい。好ましくは、培地を約６日間インキュベートし、ついで条件培地を収集する。ついで、発現されたＧＤＭポリペプチドを含む培地を濃縮して、任意の選択した方法によって精製することができる。
【０２０３】
また、エピトープタグＧＤＭは、宿主ＣＨＯ細胞において発現させてもよい。ＧＤＭ部分をコードする配列は、ｐＲＫ５ベクターからサブクローニングした。サブクローン挿入物は、ついで、ＰＣＲを施してバキュロウイルス発現ベクター中のポリ-Ｈｉｓタグ等の選択されたエピトープタグを持つ枠に融合できる。ポリ-ＨｉｓタグＧＤＭ挿入物は、ついで、安定なクローンの選択のためのＤＨＦＲ等の選択マーカーを含むＳＶ４０誘導ベクターにサブクローニングできる。最後に、ＣＨＯ細胞をＳＶ４０誘導ベクターで（上記のように）形質移入する。発現を確認するために、上記のように標識化を行ってもよい。発現されたポリ-ＨｉｓタグＧＤＭを含む培養培地は、次いで濃縮し、Ｎｉ２＋−キレートアフィニティークロマトグラフィー等の選択された方法により精製できる。
また、ＧＤＭポリペプチドは、一過性発現法によって、ＣＨＯ及び／又はＣＯＳ細胞中で、あるいは他の安定な発現法によってＣＨＯ細胞中で発現させることもできる。
ＣＨＯ細胞における安定な発現は，以下の方法を用いて実施することが可能である。タンパク質を、各タンパク質の可溶形態のコード化配列（例えば、細胞外ドメイン）がヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ２ドメインを含むＩｇＧ１定常領域配列に融合したＩｇＧコンストラクト（イムノアドヘシン）及び／又はポリ-Ｈｉｓタグ形態として発現する。
ＰＣＲ増幅に続いて、それぞれのＤＮＡを、Ausubel等, Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.１6, John Wiley and Sons (1997)に記載されたような標準的技術を用いてＣＨＯ発現ベクターにサブクローニングする。ＣＨＯ発現ベクターは、対象とするＤＮＡの５’及び３’に適合する制限部位を有し、ｃＤＮＡの便利なシャトル化(Shuttling)ができるように作製される。ベクターは、Lucas等, Nucl. Acids Res. 24: 9, 1774-1779 (1996)に記載されたようにＣＨＯ細胞での発現を用い、対象とするｃＤＮＡ及びジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）の発現の制御にＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサーを用いる。ＤＨＦＲ発現は、形質移入に続くプラスミドの安定な維持のための選択を可能にする。
所望のプラスミドＤＮＡの１２マイクログラムを、市販の形質移入試薬Superfect(登録商標)(Quiagen), Dosper(登録商標)及びFugene(登録商標)（Boehringer Mannheim）を用いいて約一千万のＣＨＯ細胞に導入した。細胞は、上掲のLucas等に記載されているように成長させる。約３×１０７細胞を、下記のような更なる成長及び生産のためにアンプル中で凍結させる。
【０２０４】
プラスミドＤＮＡを含むアンプルを水槽に配して解凍し、ボルテックスにより混合する。内容物を１０ｍＬの媒質を含む遠心管にピペットして、１０００rpmで５分間遠心分離した。上清を吸引して細胞を１０mLの選択培地（０．２μm濾過ＰＳ２０、５％の０．２μm透析濾過ウシ胎児血清を添加）中に懸濁させる。次いで細胞を９０ｍＬの選択培地を含む１００ｍｌスピナーに分ける。１−２日後、細胞を１５０ｍＬの選択成長培地を満たした２５０ｍＬスピナーに移し、３７℃でインキュベートする。さらに２−３日後、２５０ｍＬ、５００ｍＬ及び２０００ｍＬのスピナーを３×１０５細胞／ｍＬで播種する。細胞培地を遠心分離により新鮮培地に交換し、生産培地に再懸濁させる。任意の適切なＣＨＯ培地を用いてもよいが、実際には１９９２年６月１６日に発行された米国特許第５１２２４６９号に記載された生産培地を使用する。３Ｌの生産スピナーを１．２×１０６細胞／ｍＬで播種する。０日目に、細胞数とｐＨを測定する。１日目に、スピナーをサンプリングし、濾過空気での散布を実施する。２日目に、スピナーをサンプリングし、温度を３３℃に変え、５００ｇ／Ｌのグルコース及び０．６ｍＬの１０％消泡剤（例えば３５％ポリジメチルシロキサンエマルション、Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion）の３０ｍＬとする。生産を通して、ｐＨは７．２近傍に調節し維持する。１０日後、又は生存率が７０%を下回るまで、細胞培地を遠心分離と０．２２μmフィルターによる濾過によって回収する。濾過物は、4℃で貯蔵するか、即座に精製用カラムに充填した。
ポリ-Ｈｉｓタグコンストラクトについて、タンパク質はＮｉ−ＮＴＡカラム（Qiagen）を用いて精製する。精製の前に、イミダゾールを条件培地に５ｍＭの濃度まで添加する。条件培地を、０．３ＭのＮａＣｌ及び５ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４バッファーで平衡化した６ｍｌのＮｉ−ＮＴＡカラムに４−５ｍｌ／分の流速で４℃においてポンプ供給する。充填後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を０．２５Ｍイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離する。高度に精製されたタンパク質は、続いて１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、０．１４ＭのＮａＣｌ及び４％のマンニトール、ｐＨ６．８を含む貯蔵バッファー中で２５ｍｌのＧ２５Superfine（Pharmacia）カラムを用いて脱塩し、−８０℃で貯蔵する。
イムノアドヘシン（Ｆｃ含有）コンストラクトを以下のようにして条件培地から精製する。条件培地を、２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ６．８で平衡化した５ｍｌのプロテインＡカラム（Pharmacia）にポンプ供給する。充填後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、１００ｍＭのクエン酸、ｐＨ３．５で溶離する。溶離したタンパク質は、１ｍｌの画分を２７５μＬの１Ｍトリスバッファー、ｐＨ９を含む管に回収することにより即座に中和する。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ-Ｈｉｓタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩する。均一性はＳＤＳポリアクリルアミドゲルで試験し、エドマン（Edman）分解によりＮ末端アミノ酸配列決定する。
【０２０５】
実施例１２：酵母中でのＧＤＭの発現
以下の方法は、酵母中でのＧＤＭポリペプチドの組換え発現を記述する。
第１に、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからの前記ＧＤＭ配列の細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作製する。このようなＧＤＭ配列をコードするＤＮＡ及びプロモーターを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してＧＤＭの細胞内発現を指示する。分泌のために、このようなＧＤＭ配列をコードするＤＮＡを選択したプラスミドに、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡ、天然ＧＤＭシグナルペプチド又は他の哺乳動物シグナルペプチド、又は、例えば酵母菌アルファ因子又は転化酵素分泌シグナル／リーダー配列、及び（必要ならば）ＧＤＭの発現のためのリンカー配列と共にクローニングすることができる。
酵母菌株ＡＢ１１０等の酵母菌は、ついで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、１０%トリクロロ酢酸での沈降及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離で分析し、次いでクーマシーブルー染色でゲルの染色をすることができる。
続いて組換えＧＤＭは、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、次いで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。ＧＤＭを含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよい。
【０２０６】
実施例１３：バキュロウイルス感染昆虫細胞中でのＧＤＭの発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中におけるＧＤＭポリペプチドの組換え発現を示す。
前記ＧＤＭ配列をコードする配列を、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させる。このようなエピトープタグは、ポリ-Ｈｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域など）を含む。ｐＶＬ１３９３（Navagen）などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単に述べると、前記ＧＤＭ配列をコードする配列、又はそのコード化配列の所望の部分、例えば膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列又はタンパク質が細胞外である場合の成熟タンパク質をコードする配列が、５’及び３’領域に相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅される。５’プライマーは、隣接する（選択された）制限酵素部位を包含していてもよい。生産物は、ついで、選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。
組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGoldTMウイルスＤＮＡ（Pharmingen）を、Spodoptera frugiperda（「Ｓｆ９」）細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １7１１）中にリポフェクチン（GIBCO-BRLから市販）を用いて同時形質移入することにより作製される。２８℃で４−５日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、更なる増幅に用いる。ウイルス感染及びタンパク質発現は、O'Reilley等, Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)に記載されているように実施する。
【０２０７】
次に、発現されたポリ-ＨｉｓタグＧＤＭポリペプチドは、例えばＮｉ２＋−キレートアフィニティークロマトグラフィーにより次のように精製される。抽出は、Rupert等, Nature, 362:175-179 (1993)に記載されているように、ウイルス感染した組み換えＳｆ９細胞から調製する。簡単には、Ｓｆ９細胞を洗浄し、超音波処理用バッファー（２５ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．９；１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２；０．１ｍＭのＥＤＴＡ；１０％グリセロール；０．１％のＮＰ−４０；０．４ＭのＫＣｌ）中に再懸濁し、氷上で２回２０秒間超音波処理する。超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清をローディングバッファー（５０ｍＭリン酸塩、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ７．８）で５０倍希釈し、０．４５μmフィルターで濾過する。Ｎｉ２＋−ＮＴＡアガロースカラム（Qiagenから市販）を５ｍＬの総容積で調製し、２５ｍＬの水で洗浄し、２５ｍＬのローディングバッファーで平衡させる。濾過した細胞抽出物は、毎分０．５ｍＬでカラムに充填する。カラムを、分画回収が始まる点であるＡ２８０のベースラインまでローディングバッファーで洗浄する。次に、カラムを、結合タンパク質を非特異的に溶離する二次洗浄バッファー（５０ｍＭリン酸塩；３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ６．０）で洗浄する。Ａ２８０のベースラインに再度到達した後、カラムを二次洗浄バッファー中で０から５００ｍＭイミダゾール勾配で展開する。１ｍＬの分画を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色又はアルカリホスファターゼ（Qiagen）に複合したＮｉ２＋−ＮＴＡでのウエスタンブロットで分析する。溶離したＨｉｓ１０−タグＧＤＭポリペプチドを含む画分をプールしてローディングバッファーで透析する。
あるいは、ＩｇＧタグ（又はＦｃタグ）ＧＤＭポリペプチドの精製は、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む公知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
【０２０８】
実施例１４：特異的抗体を用いたＧＤＭポリペプチドの精製
天然又は組換えＧＤＭポリペプチドは、この分野の種々の標準的なタンパク質精製方法によって精製できる。例えば、前記ＧＤＭ配列のプロ-ポリペプチド変異体、成熟ポリペプチド変異体、又はプレ-ポリペプチド変異体は、そのような配列に特異的な抗体を用いた免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。一般に、免疫親和性カラムは抗ＧＤＭ抗体を活性化クロマトグラフィー樹脂に共有結合させて作製される。
ポリクローナル免疫グロブリンは、硫酸アンモニウムでの沈殿又は固定化プロテインＡ(Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.)での精製のいずれかにより免疫血清から調製される。同様に、モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿又は固定化プロテインＡでのクロマトグラフィーによりマウス腹水液から調製される。部分的に精製された免疫グロブリンは、ＣｎＢｒ-活性化セファロースTM(Pharmacia LKB Biotechnology)等のクロマトグラフィー樹脂に共有結合される。抗体が樹脂に結合され、樹脂がブロックされ、誘導体樹脂は製造者の指示に従って洗浄される。
このような免疫親和性カラムは、可溶化形態の前記ＧＤＭ配列を含有する細胞からの画分を調製することによるそのような配列の精製において利用される。この調製物は、洗浄剤の添加又はこの分野で公知の方法により微分遠心分離を介して得られる全細胞又は細胞成分画分の可溶化により誘導される。あるいは、シグナル配列を含む可溶化ＧＤＭポリペプチドは、細胞が成長する培地中に有用な量で分泌される。
可溶化ＧＤＭポリペプチド含有調製物は、免疫親和性カラムを通され、カラムはこのような配列の好ましい吸着をさせる条件下(例えば、洗浄剤存在下の高イオン強度バッファー)で洗浄される。ついで、カラムは、抗体／基質の結合を分解する条件下(例えば、約２−３といった低ｐＨ、高濃度の尿素又はチオシアン酸イオン等のカオトロープ)で溶離され、ＧＤＭポリペプチドがそれぞれ回収される。
【図面の簡単な説明】
【０２０９】
【図１】高悪性度の神経膠腫の生存時間に関連する３つの主な遺伝子発現パターンを明らかにする発現プロファイリングを示す。Ａは、生存時間との相関関係が陽性又は陰性である１０８の遺伝子による、グレードＩＩＩ及びＩＶのＭＤＡ原発性星細胞腫７６例の、教示無しクラスター形成により明らかとなった３つの試料クラスター（図の上に白抜き長方形で示す）を示す（遺伝子クラスターには陽性又は陰性と標識する）。Ｂは、３５のシグネチャー遺伝子を用いて同定した場合、同じ７６の試料が、ＰＮ腫瘍サブセット、Ｐｒｏｌｉｆ腫瘍サブセット及びＭｅｓ腫瘍サブセットのいずれであるかを示す。ｋ平均法によるクラスター形成に基づくセントロイドを、ｚスコアにより正規化した遺伝子発現値（−１〜＋１）を用いて示す。Ｃ〜Ｅは、ＭＤＡ、ＵＣＳＦ、及びＵＣＬＡの試料集団に基づくデータのカプラン−マイヤー生存図を示す。ログランク検定のｐ値を示す。黒い線、グレイの線及び点線は、それぞれＰＮサブクラス、Ｐｒｏｌｉｆサブクラス及びＭｅｓサブクラスに対応している。垂直の刻み目は、生存時間の観察の検閲を示す。Ｆ及びＧは、ＰＮマーカーとＭｅｓマーカーの強い発現が相互排他的であることを示す。各バーは、個々の試料中における４つのマーカー遺伝子の、マイクロアレイによるｍＲＮＡの測定値（Ｆ）又はＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲによるｍＲＮＡの測定値（Ｇ）を示す。図示の遺伝子は、ＢＣＡＮ、ＤＬＬ３、ＣＨＩ３ｌ１／ＹＫＬ４０（ＹＫＬ４０）、及びＣＤ４４を含む。これらの値は、完全な試料セットに対する個々の試料の遺伝子発現のＺスコアを表わす。Ｈは、５の神経膠腫症例の組織マイクロアレイコアにおけるＢＣＡＮ及びＣＨＩ３Ｌ１／ＹＫＬ４０（ＹＫＬ４０）のインサイツハイブリダイゼーションを示す。矢印は、ＢＣＡＮ陽性コアにおける局所的なＣＨＩ３Ｌ１／ＹＫＬ４０の発現を示す。
【図２】高悪性度の神経膠腫の多くは、シグネチャー遺伝子発現の３つのパターンのうちの１に強い類似性を有することと、疾病が進行するとサブクラスがＭｅｓ表現型に移行することを特徴とする。Ａ〜Ｃの三次元グラフでは、各点の位置が、基準（ＭＤＡ）試料セットのｋ平均法によるクラスター形成により決定された、個々の試料と３つのセントロイドの各々との類似性（スピアマンｒ）を表わす。Ａは、アストロサイト（黒い点）又はオリゴデンドログリア（白い点）の形態両方の、殆ど全てのグレードＩＩＩの腫瘍がＰＮセントロイドに最も類似しており、一方グレードＩＶの腫瘍（平行線模様の点）の集団においてはセントロイドへの類似性という点で分散性が高かったことを示す。Ｂは、３つのセントロイドの各々に類似する、健常細胞又は組織からなる複数の異なるセットを示す。試料は、胎児脳、成人脳（脳）、胎児組織由来の２つの神経幹細胞株（ＮＳＣ１、ＮＳＣ２）、ジャーカット、造血性幹細胞（ＨＳＣ）、平滑筋（ＳｍｏＭｕｓｃ）、内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌ）、滑膜（ｓｙｎｏｖ）、及び骨であった。増殖因子ＢＤＮＦへの曝露による処置後、当該因子への曝露を中止した神経幹細胞株を、ＮＳＣ１＊及びＮＳＣ２＊と命名した。Ｃは、一致する原発性及び続発性星細胞腫の２６の対（グレイ＝グレードＩＶ、黒＝グレードＩＩＩ）を示す。シグネチャークラスに移行があった一致する標本の各対を、太矢印で繋いだ。Ｄは、再発の際にＭｅｓサブクラスに移行した場合に、遺伝子が有意に上方制御されたことを示す。ＦＣ＝折り畳みの変化。Ｅは、ＰＮからＭｅｓ表現型への移行が見られた症例の、一致する原発性及び続発性腫瘍におけるＣＨＩ３Ｌ１／ＹＫＬ４０及びＯＬＩＧ２のＩＨＣを示す。
【図３】腫瘍のサブクラスを、増殖、血管新生、及び神経発生のマーカーの発現により区別したものである。Ａ〜Ｅにおいて、白丸は脳を、グレイの丸又は白いバーはＰＮを、黒い三角又は平行線模様のバーはＰｒｏｌｉｆを、白い四角又は黒いバーはＭｅｓを示している。Ａは、ＰＣＮＡ及びＴＯＰ２Ａの発現について、他の全てのグループよりＰｒｏｌｉｆ腫瘍が豊富であることを示す（ｐ＜１×１０−６）。Ｂは、Ｍｅｓ腫瘍が、他の全てのグループから、ＰＥＣＡＭ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、及びＶＥＧＦＲ２の発現の増加により区別されることを示す（ｐ＜０．０５）。Ｃ及びＤは、ＰＮ腫瘍と比較して、Ｐｒｏｌｉｆ及び／又はＭｅｓ腫瘍が神経幹及び前駆マーカーであるＶＩＭ、ＮＥＳ、ＴＬＸ、ＣＤ１３３、ＭＥＬＫ、及びＤＬＸ２を強く発現し（Ｃ）、神経芽細胞及び神経細胞のマーカーであるＯＬＩＧ２、ＭＡＰ２、ＤＣＸ、ＮｅｕＮ，ＥＲＢＢ４、及びＧＡＤ２を弱く発現する（Ｄ）ことを示す。星印は、ＰＮとの差異が大きいことを示す（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡの後ボンフェローニｐｏｓｔ−ｈｏｃ）。Ｅは、ＰＮ又はＭＥＳ腫瘍と比較して、Ｐｒｏｌｉｆ腫瘍においてＧＦＡＰ発現が有意に低下したことを示す。
【図４】腫瘍サブクラス間で、染色体７、１０、及び１９におけるコピー数の変化が異なること、及びそのような差異が発現シグネチャーに反映されることを示す。Ａは、腫瘍シグネチャーのサブクラスによる染色体１０、７及び１９ｑのコピー数の変化の頻度を示す。ｃｈｒ１０について、腫瘍は、減少を示さないか、ＰＴＥＮ座位を含む１０ｑに限定された減少を示すか、ほぼ全ての座位の減少を示すことが報告された。ｃｈｒ７について、症例を、増加なし、ｃｈｒ７のいずれかの部分の増加、又は全ての座位の増加にスコア化した。ｃｈｒ１９ｑについて、症例を、半分以上の座位がコピー数の変化を示すかどうかに応じて、増加又は減少にスコア化した。Ｂは、プロットした全てのＵ１３３  Ａ＆Ｂプローブセットと比較した場合の、染色体の位置によるＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ、又はＭｅｓ腫瘍マーカーのリスト（標識化）のプローブセットの数を示す。
【図５】Ｐｒｏｌｉｆ及びＭｅｓ腫瘍は、Ａｋｔ及びＮｏｔｃｈシグナル伝達カスケードの差次的な活性化を示す。ＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ、及びＭｅｓ腫瘍はそれぞれ、（ｉ）白の丸又は平行線模様のバー、（ｉｉ）黒の三角又は黒のバー、及び（ｉｉｉ）白の四角又は白のバーで示す。（Ａ）ＰＴＥＮの減少及び（Ｂ）ＥＧＦＲの増幅は、ＰＮシグネチャーと関連していないが、一方、（Ｃ）ＰＩＫ３Ｒ３座位の増加はＰｒｏｌｉｆシグネチャーと関連している。Ａ〜Ｃでは、図示のように、各試料について、ｘ軸は、サンプリングされた座位における増加又は減少を示すＣＧＨ  ｌｏｇ２比を表わし、ｙ軸はＰＮ又はＰｒｏｌｉｆセントロイドとの相関関係を示す。ｒ値は、ＣＧＨ比と発現シグネチャーセントロイドの類似性のピアソン及びスピアマンの相関係数を示す。Ｄは、正規化されたＰＴＥＮ  ｍＲＮＡ値が、ＰＮ腫瘍サブクラスと比較した場合に予後不良の腫瘍サブタイプにおいて低いことを示す。水平な線は、グループ平均を示す。Ｅ〜Ｈは、ＰＮ腫瘍が、Ｎｏｔｃｈ経路エレメントであるＤＬＬ３、ＤＬＬ１、ＨＥＹ２、及びＡＳＣＬ１を強く過剰発現することを示す。Ｉ及びＪは、ｐ−Ａｋｔと核Ｎｏｔｃｈについての染色が異なる腫瘍サブクラスを示す。各腫瘍サブタイプについて、ｐ−Ａｋｔ（Ｊ）又は核Ｎｏｔｃｈ（Ｋ）の免疫染色が０、１、又は２と評価された試料の画分を示す。ＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ、及びＭｅｓサブタイプを、３つの棒グラフによりそれぞれ示す。
【図６】２つの独立した試料セット（Ａ及びＢ）における、ＰＴＥＮ及びＤＬＬ３の発現により予想される高悪性度の星細胞腫の生存時間を示す。左右のパネルは、２０位及び８０位の百分位数（パーセンタイル）におけるＰＴＥＮ発現の場合についてそれぞれモデル化された各試料集団（Ａ：ｎ＝７６、Ｂ：ｎ＝３４）に予想される生存関数を示す。黒及び白の線は、それぞれ発現の２０位及び８０位のパーセンタイルにおけるＤＬＬ３の発現により試料に予想される生存時間を示す。
【図７】神経膠腫細胞株の発現シグネチャーによるＥＧＦ／ＦＧＦ依存性ニューロスフェアの増殖を示す。Ａは、５の細胞株から採取して、ＥＧＦ＋ＦＧＦの存在下又は不在下で維持したニューロスフェア培養液の実施例を示す。図示のように、ＥＧＦ＋ＦＧＦの不在下での増殖について、細胞株の実施例を０〜４に評価した。Ｂは、１６の細胞株のニューロスフェア増殖の評点を、Ｍｅｓ又はＰｒｏｌｉｆセントロイドに対する発現シグネチャーの相関の関数として示す。
【図８Ａ】腫瘍サブタイプをまとめたものであり、腫瘍サブタイプの主な特徴を示す。
【図８Ｂ】腫瘍サブタイプをまとめたものであり、腫瘍サブタイプと神経発生の段階との平行性を示すモデルである。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】全図
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１Ａ−１】
2009523709.tif 000088
【図１Ａ−２】
2009523709.tif 000089
【図１Ｂ−１】
2009523709.tif 000090
【図１Ｂ−２】
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【図１Ｃ】
2009523709.tif 000092
【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ−１】
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【図３Ｃ−２】
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【図３Ｃ−３】
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【図３Ｃ−４】
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【図３Ｃ−５】
2009523709.tif 000109
【図３Ｃ−６】
2009523709.tif 000110
【図３Ｄ−１】
2009523709.tif 000111
【図３Ｄ−２】
2009523709.tif 000112
【図３Ｄ−３】
2009523709.tif 000113
【図３Ｄ−４】
2009523709.tif 000114
【図３Ｄ−５】
2009523709.tif 000115
【図３Ｄ−６】
2009523709.tif 000116
【図３Ｅ】
2009523709.tif 000117
【図４】
2009523709.tif 000118
【図５Ａ】
2009523709.tif 000119
【図５Ｂ】
2009523709.tif 000120
【図５Ｃ】
2009523709.tif 000121
【図５Ｄ】
2009523709.tif 000122
【図５Ｅ】
2009523709.tif 000123
【図５Ｆ】
2009523709.tif 000124
【図５Ｇ】
2009523709.tif 000125
【図５Ｈ】
2009523709.tif 000126
【図５Ｉ】
2009523709.tif 000127
【図５Ｊ】
2009523709.tif 000128
【図６】
2009523709.tif 000129
【図７】
2009523709.tif 000130
【図８Ａ】
2009523709.tif 000131
【図８Ｂ】
2009523709.tif 000132
【手続補正書】
【提出日】平成20年10月24日(2008.10.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）腫瘍の試料中において一組のＧＤＭの発現を測定すること、
（ｂ）腫瘍の細分類がＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ及びＭｅｓのいずれであるかを決定すること、及び
（ｃ）前記細分類に基づいた少なくとも有効量の治療薬に接触させること
という手順によって用いられる、神経膠腫の治療のための医薬であって、
（Ｉ）Ｐｒｏｌｉｆ細分類を示す腫瘍は、有効量の（ａ）Ａｋｔアンタゴニスト及び／又はＰｒｏｌｉｆアンタゴニスト及び／又は有糸分裂阻害薬と、（ｂ）神経分化薬とを含む併用療法により治療し、（ＩＩ）Ｍｅｓ細分類を示す腫瘍は、有効量の（ａ）Ａｋｔ及び／又はＭｅｓアンタゴニスト及び／又は抗血管新生薬と、（ｂ）神経分化薬とを含む併用療法により治療し、（ＩＩＩ）ＰＮ細分類を示す腫瘍は、有効量の（１）ＰＮアンタゴニスト、及び／又は（２）神経分化薬と、場合によって、（３）Ａｋｔアンタゴニスト、（４）有糸分裂阻害薬及び（５）抗血管新生薬のうちの１つ以上の組み合わせを含む併用療法により治療される、医薬。
【請求項２】
細分類は、階層式クラスター形成を用いて腫瘍を一組の神経膠腫試料と比較することにより実行する、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
細分類は、ｋ平均法クラスター形成を用いて腫瘍を一組の神経膠腫試料と比較することにより実行する、請求項１に記載の医薬。
【請求項４】
細分類は、投票方式を用いて腫瘍を一組の神経膠腫試料と比較することにより実行する、請求項１に記載の医薬。
【請求項５】
細分類は、腫瘍と一組の既に分類した神経膠腫試料との、一組のＧＤＭマーカーの発現の類似性を比較することにより実行する、請求項１に記載の医薬。
【請求項６】
ＰＮアンタゴニストは、ＤＬＬ３、Ｎｏｇ、Ｏｌｉｇ１、Ｏｌｉｇ２、ＴＨＲ及びＡＳＣＬ１を除いて表Ａに示すＰＮマーカーからなる群より選択する、請求項１に記載の医薬。
【請求項７】
Ｐｒｏｌｉｆアンタゴニストは、表Ａに示すいずれかのＰｒｏｌｉｆマーカーのアンタゴニストからなる群より選択する、請求項１に記載の医薬。
【請求項８】
Ｍｅｓアンタゴニストは、表Ａに示すいずれかのＭｅｓマーカーのアンタゴニストからなる群より選択する、請求項１に記載の医薬。
【請求項９】
Ａｋｔアンタゴニストは、ａｋｔ１、ａｋｔ２、ａｋｔ３のアンタゴニスト、ＰＩＫ３、ＰＤ１、ＦＲＡＰ、ＲＰＳ６ＫＢ１、ＳＧＫ、ＥＧＦＲ、及びＩＧＦＲの制御ドメイン又は触媒ドメインのアンタゴニスト、並びに、ＰＴＥＮ、ＩＮＰＰ５Ｄ又はＩＮＰＰＬ１の活性化因子、刺激因子又は回復因子からなる群より選択する、請求項１に記載の医薬。
【請求項１０】
有糸分裂阻害薬は、テモゾロミド、ＢＣＮＵ、ＣＣＮＵ、ロムスチン、グリアデル、エトポシド、カルムスチン、イリノテカン、トポテカン、プロカルバジン、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、メトトレキサート、シタラビン、パクリタキセル、アウリスタチン、メイタンシノイドからなる群より選択する、請求項１に記載の医薬。
【請求項１１】
抗血管新生薬は、ＶＥＧＦアンタゴニスト、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２アンタゴニストからなる群より選択する、請求項１に記載の医薬。
【請求項１２】
神経分化薬は、ＭＡＰ２、βチューブリン、ＧＡＤ６５及びＧＡＰ４３からなる群より選択し、神経分化薬には、限定されないが、レチノイン酸、バルプロ酸とその誘導体（例えばエステル、塩、レチノイド、レチネート、バルプロ酸等）；甲状腺ホルモン又は甲状腺ホルモンレセプターの他のアゴニスト；ノギン；ＮＴＲＫ２レセプターのＢＤＮＦ、ＮＴ４／５又はその他アゴニスト；転写因子ＡＳＣＬ１、ＯＬＩＧ１の発現を増大させる薬剤；ｄｌｌ３アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ１、２、３又は４アンタゴニスト、ニカストリン、Ａｐｈ１Ａ、Ａｐｈ１Ｂ、Ｐｓｅｎ１、Ｐｓｅｎ２及びＰＳＥＮＥＮの小分子阻害剤を含むγ分泌阻害剤、デルタ様リガンド（Ｄｌｌ）−１アンタゴニスト、デルタ様リガンド（Ｄｌｌ）−４、ｊａｇｇｅｄ１アンタゴニスト、ｊａｇｇｅｄ２アンタゴニスト；ｎｕｍｂアゴニスト又はｎｕｍｂ様アゴニストが含まれる、請求項１に記載の医薬。
【請求項１３】
（ａ）一組のＧＤＭの発現を測定すること、
（ｂ）腫瘍の細分類がＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ及びＭｅｓのいずれかを決定すること、及び
（ｃ）疾病の結果を予後予測及び／又は診断すること
を含む、神経膠腫の予後予測及び／又は診断の方法であって、
Ｐｒｏｌｉｆ又はＭｅｓ細分類によって予後不良又は生存時間が短いことが示され、ＰＮ細分類によって良好な予後又は生存時間が長いことが示される、方法。
【請求項１４】
細分類は、階層式クラスター形成を用いて腫瘍を一組の試料と比較することにより実行する、請求項７に記載の医薬。
【請求項１５】
細分類は、ｋ平均法クラスター形成を用いて腫瘍を一組の試料と比較することにより実行する、請求項７に記載の医薬。
【請求項１６】
細分類は、投票方式を用いて腫瘍を一組の試料と比較することにより実行する、請求項７に記載の医薬。
【請求項１７】
細分類は、腫瘍と一組の既に分類した神経膠腫試料との、一組のＧＤＭマーカーの発現の類似性を比較することにより実行する、請求項７に記載の医薬。
【請求項１８】
（ａ）腫瘍試料におけるＰＴＥＮ及びＤＬＬ３腫瘍マーカーの発現を測定すること、及び
（ｂ）前記腫瘍マーカーの発現に基づいて予後の予測及び／又は診断を行うこと
を含む神経膠腫の予後予測及び／又は診断の方法であって、
ＰＴＥＮ及びＤＬＬ３両方の発現が強いと、良好な予後又は生存時間が長いことが示され、ＤＬＬ３の発現レベルとは無関係に、ＰＴＥＮの発現が弱いと、予後不良又は生存時間が短いことが示される、方法。
【請求項１９】
患者から採取した少なくとも２つの試料において、一組の神経膠腫決定マーカー（「ＧＤＭ」）の発現シグネチャーを比較することを含む神経膠腫のモニタリング又は診断法であって、
（ａ）第１の時点において第１の腫瘍試料におけるＧＤＭの発現を測定する工程、
（ｂ）第１の時点より後の第２の時点において、第２の腫瘍試料におけるＧＤＭの発現を測定する工程、及び
（ｃ）第１及び第２の試料の細分類が、ＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ及びＭｅｓのうちのいずれであるかを決定する工程
を含み、第１の腫瘍試料から第２の腫瘍試料の間に、ＰＮ又はＰｒｏｌｉｆからＭｅｓ細分類への移行があった場合、前記腫瘍の重症度の増大又は進行が示される、方法。
【請求項２０】
（ａ）腫瘍試料における一組のＧＤＭの発現を測定すること、
（ｂ）腫瘍の細分類が、ＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ及びＭｅｓのうちのいずれであるかを決定すること、及び
（ｃ）前記細分類に基づいた少なくとも有効量の治療薬に接触させること
を含む神経膠腫の大きさ又は増殖を抑制する方法であって、
（Ｉ）Ｐｒｏｌｉｆ細分類を示す腫瘍は、有効量の（ａ）Ａｋｔアンタゴニスト及び／又はＰｒｏｌｉｆアンタゴニスト及び／又は有糸分裂阻害薬と、（ｂ）神経分化薬とに接触させることを含む併用療法により治療し、（ＩＩ）Ｍｅｓ細分類を示す腫瘍は、有効量の（ａ）Ａｋｔ及び／又はＭｅｓアンタゴニスト及び／又は抗血管新生薬と、（ｂ）神経分化薬とに接触させることを含む併用療法により治療し、（ＩＩＩ）ＰＮ細分類を示す腫瘍は、有効量の（１）ＰＮアンタゴニスト、及び／又は（２）神経分化薬と、場合によって、（３）Ａｋｔアンタゴニスト、（４）有糸分裂阻害薬及び（５）抗血管新生薬のうちの１つ以上の組み合わせに接触させることを含む併用療法により治療し、よって腫瘍の大きさ又は増殖を低減する、方法。
【請求項２１】
細分類は、階層式クラスター形成を用いて腫瘍を一組の神経膠腫試料と比較することにより実行する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
細分類は、ｋ平均法クラスター形成を用いて腫瘍を一組の神経膠腫試料と比較することにより実行する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
細分類は、投票方式を用いて腫瘍を一組の神経膠腫試料と比較することにより実行する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
細分類は、腫瘍と一組の既に分類した神経膠腫試料との、一組のＧＤＭマーカーの発現の類似性を比較することにより実行する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
ＰＮアンタゴニストは、ＤＬＬ３、Ｎｏｇ、Ｏｌｉｇ１、Ｏｌｉｇ２、ＴＨＲ及びＡＳＣＬ１を除いて表Ａに示すいずれかのＰＮマーカーアンタゴニストからなる群より選択する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
Ｐｒｏｌｉｆアンタゴニストは、表Ａに示すいずれかのＰｒｏｌｉｆマーカーのアンタゴニストからなる群より選択する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
Ｍｅｓアンタゴニストは、表Ａに示すいずれかのＭｅｓマーカーのアンタゴニストからなる群より選択する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
Ａｋｔアンタゴニストは、ａｋｔ１、ａｋｔ２、ａｋｔ３のアンタゴニスト、ＰＩＫ３、ＰＤ１、ＦＲＡＰ、ＲＰＳ６ＫＢ１、ＳＧＫ、ＥＧＦＲ、及びＩＧＦＲの制御ドメイン又は触媒ドメインのアンタゴニスト、並びに、ＰＴＥＮ、ＩＮＰＰ５Ｄ又はＩＮＰＰＬ１の活性化因子、刺激因子又は回復因子からなる群より選択する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
抗血管新生薬は、ＶＥＧＦアンタゴニスト、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２アンタゴニストからなる群より選択する、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
有糸分裂阻害薬は、テモゾロミド、ＢＣＮＵ、ＣＣＮＵ、ロムスチン、グリアデル、エトポシド、カルムスチン、イリノテカン、トポテカン、プロカルバジン、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、メトトレキサート、シタラビン、パクリタキセル、アウリスタチン、メイタンシノイドからなる群より選択する、請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
神経分化薬は、ＭＡＰ２、βチューブリン、ＧＡＤ６５及びＧＡＰ４３からなる群より選択し、神経分化薬には、限定されないが、レチノイン酸、バルプロ酸とその誘導体（例えばエステル、塩、レチノイド、レチネート、バルプロ酸等）；甲状腺ホルモン又は甲状腺ホルモンレセプターの他のアゴニスト；ノギン；ＮＴＲＫ２レセプターのＢＤＮＦ、ＮＴ４／５又はその他アゴニスト；転写因子ＡＳＣＬ１、ＯＬＩＧ１の発現を増大させる薬剤；ｄｌｌ３アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ１、２、３又は４アンタゴニスト、ニカストリン、Ａｐｈ１Ａ、Ａｐｈ１Ｂ、Ｐｓｅｎ１、Ｐｓｅｎ２及びＰＳＥＮＥＮの小分子阻害剤を含むγ分泌阻害剤、デルタ様リガンド（Ｄｌｌ）−１アンタゴニスト、デルタ様リガンド（Ｄｌｌ）−４、ｊａｇｇｅｄ１アンタゴニスト、ｊａｇｇｅｄ２アンタゴニスト；ｎｕｍｂアゴニスト又はｎｕｍｂ様アゴニストが含まれる、請求項２０に記載の方法。
【請求項３２】
アンタゴニスト及び／又は薬剤との接触の結果、腫瘍細胞が死滅する、請求項２０に記載の方法。
【請求項３３】
ＰＮアンタゴニスト、Ｐｒｏｌｉｆアンタゴニスト又はＭｅｓアンタゴニストが、（１）抗ＰＮ抗体、抗Ｐｒｏｌｉｆ抗体又は抗Ｍｅｓ抗体、（２）抗ＰＮ抗原結合断片、抗Ｐｒｏｌｉｆ抗原結合断片又は抗Ｍｅｓ抗原結合断片、（３）ＰＮ結合オリゴペプチド、Ｐｒｏｌｉｆ結合オリゴペプチド又はＭｅｓ結合オリゴペプチド、（４）ＰＮ小分子アンタゴニスト、Ｐｒｏｌｉｆ小分子アンタゴニスト又はＭｅｓ小分子アンタゴニスト、或いは、（５）ＰＮアンチセンスオリゴヌクレオチド、Ｐｒｏｌｉｆアンチセンスオリゴヌクレオチド又はＭｅｓアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項２０に記載の方法。
【請求項３４】
ＰＮアンタゴニスト、Ｐｒｏｌｉｆアンタゴニスト又はＭｅｓアンタゴニストは、（１）抗ＰＮ抗体、抗Ｐｒｏｌｉｆ抗体又は抗Ｍｅｓ抗体、及び（２）抗ＰＮ抗原結合断片、抗Ｐｒｏｌｉｆ抗原結合断片又は抗Ｍｅｓ抗原結合断片からなる群より選択する、請求項２０に記載の方法。
【請求項３５】
アンタゴニスト抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及び一本鎖抗体からなる群より選択する、請求項２０に記載の方法。
【請求項３６】
抗体又は抗原結合断片は、増殖阻害剤又は細胞障害性剤にコンジュゲートさせる、請求項２０に記載の方法。
【請求項３７】
増殖阻害剤又は細胞障害性剤は、メイタンシノイド、カリケアマイシン、抗生物質、放射性同位体及び核酸分解酵素からなる群より選択する、請求項２０に記載の方法。
【請求項３８】
（ａ）腫瘍試料における一組のＧＤＭの発現を測定すること、
（ｂ）腫瘍の細分類が、ＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ及びＭｅｓのうちのいずれであるかを決定すること、及び
（ｃ）前記細分類に基づいた少なくとも有効量の治療薬に接触させること
を含む神経膠腫を有する哺乳動物の治療的処置方法であって、
（Ｉ）Ｐｒｏｌｉｆ細分類を示す腫瘍は、有効量の（ａ）Ａｋｔアンタゴニスト及び／又はＰｒｏｌｉｆアンタゴニスト及び／又は有糸分裂阻害薬と、（ｂ）神経分化薬とに接触させることを含む併用療法により治療し、（ＩＩ）Ｍｅｓ細分類を示す腫瘍は、有効量の（ａ）Ａｋｔ及び／又はＭｅｓアンタゴニスト及び／又は抗血管新生薬と、（ｂ）神経分化薬とに接触させることを含む併用療法により治療し、（ＩＩＩ）ＰＮ細分類を示す腫瘍は、有効量の（１）ＰＮアンタゴニスト、及び／又は（２）神経分化薬と、場合によって、（３）Ａｋｔアンタゴニスト、（４）有糸分裂阻害薬及び（５）抗血管新生薬のうちの１つ以上の組み合わせに接触させることを含む併用療法により治療し、よって腫瘍の大きさ又は増殖を低減する、方法。
【請求項３９】
アンタゴニスト又は薬剤を投与した結果、神経膠腫が死滅する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
アンタゴニスト又は薬剤が、抗体、抗抗原結合抗体断片、オリゴペプチド、小分子アンタゴニスト又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
アンタゴニスト抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及び一本鎖抗体からなる群より選択する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
抗体又は抗原結合断片は、増殖阻害剤又は細胞障害性剤にコンジュゲートさせる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
増殖阻害剤又は細胞障害性剤は、メイタンシノイド、カリケアマイシン、抗生物質、放射性同位体及び核酸分解酵素からなる群より選択する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
試料中における、ＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ又はＭｅｓ神経膠腫決定マーカー（「ＧＤＭ」）の発現レベルの測定方法であって、試料をＰＮ結合剤、Ｐｒｏｌｉｆ結合剤又はＭｅｓ結合剤に曝すこと、及び試料中におけるそれぞれの結合量を決定することを含み、前記結合量により、試料中におけるＰＮ−ＧＤＭ、Ｐｒｏｌｉｆ−ＧＤＭ又はＭｅｓ−ＧＤＭそれぞれの発現レベルが示される方法。
【請求項４５】
ＰＮ結合剤、Ｐｒｏｌｉｆ結合剤又はＭｅｓ結合剤は、抗ＰＮ抗体、抗Ｐｒｏｌｉｆ抗体又は抗Ｍｅｓ抗体、ＰＮ結合抗体断片、Ｐｒｏｌｉｆ結合抗体断片又はＭｅｓ結合抗体断片、ＰＮオリゴペプチド、Ｐｒｏｌｉｆオリゴペプチド又はＭｅｓオリゴペプチド、ＰＮ小分子アンタゴニスト、Ｐｒｏｌｉｆ小分子アンタゴニスト、又はＭｅｓ小分子アンタゴニスト、及びＰＮアンチセンスオリゴヌクレオチド、Ｐｒｏｌｉｆアンチセンスオリゴヌクレオチド又はＭｅｓアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群より選択する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
抗ＰＮ抗体、抗Ｐｒｏｌｉｆ抗体又は抗Ｍｅｓ抗体は、モノクローナル抗体、抗原結合抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体及び一本鎖抗体からなる群より選択する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
ＰＮ結合剤、Ｐｒｏｌｉｆ結合剤又はＭｅｓ結合剤を検出可能に標識する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
神経膠腫を有する哺乳動物の生存時間を予測する方法であって、
ａ）腫瘍の試験試料を除去すること、及び
ｂ）試験試料と、患者の生存時間が既知である三十（３０）以上の悪性度の高い神経膠腫からなる組とにおける、ＰＴＥＮ及びＤＬＬ３の発現レベルを測定すること
を含み、試験試料中のＰＴＥＮ及びＤＬＬ３両方の発現レベルが高い場合、標準試料の集団の中央値より生存時間が長い確率が統計的に高いことが示され、試験試料中のＰＴＥＮ又はＤＬＬ３の発現レベルが低い場合、標準試料の集団の中央値より生存時間が短い確率が統計的に高いことが示される、方法。
【請求項４９】
哺乳動物の神経膠腫の重症度を診断する方法であって、
（ａ）当該哺乳動物から採取された組織を含む試験試料を
（ｉ）ＰＴＥＮポリペプチドに結合する抗体、オリゴペプチド又は有機小分子である第１の試薬、及び
（ｉｉ）ＤＬＬ３ポリペプチドに結合する抗体、オリゴペプチド又は有機小分子である第２の試薬
に接触させること、並びに
（ｂ）試験試料中における、第１試薬のＰＴＥＮポリペプチドとの複合体形成量と、第２試薬のＤＬＬ３ポリペプチドとの複合体形成量をそれぞれ測定すること
を含み、ＰＴＥＮ複合体形成及びＤＬＬ３複合体形成両方の量が大きい場合に軽度の腫瘍が示され、ＰＴＥＮ複合体形成又はＤＬＬ３複合体形成の量が小さい場合に重度の腫瘍が示される、方法。
【請求項５０】
第１試薬及び／又は第２試薬を検出可能に標識する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
第１試薬及び／又は第２試薬を固体の支持体に付着させる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
神経膠腫の（ｉ）治療的処置又は（ｉｉ）診断的検出に有用な薬物の調製における、（ａ）ＰＮ−ＧＤＭポリペプチド、Ｐｒｏｌｉｆ−ＧＤＭポリペプチド又はＭｅｓ−ＧＤＭポリペプチド、又は（ｂ）（ａ）をコードする核酸配列の使用。
【請求項５３】
ＧＤＭポリペプチドが、抗体、ＧＤＭ結合抗体断片、ＧＤＭ結合オリゴペプチド、ＧＤＭ小分子アンタゴニスト、又はＧＤＭアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項５２に記載の使用。
【請求項５４】
抗体が、モノクローナル抗体、抗原結合抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体又は一本鎖抗体である、請求項５２又は５３に記載の使用。
【請求項５５】
神経膠腫を有する哺乳動物を治療的に処置するための医薬であって、有効量の神経分化薬と、（１）Ａｋｔアンタゴニスト、（２）有糸分裂阻害薬及び（３）抗血管新生薬のうちの１つ以上との組合せを含有してなり、結果として腫瘍の大きさ又は増殖が低減される、医薬。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７９】
予後が良好な腫瘍サブクラスと予後不良の腫瘍サブクラスにおけるＮｏｔｃｈ及びａｋｔ経路の差次的活性化
ｃｈｒ１０の減少と腫瘍サブクラスとの関連性と一致して、ＰＴＥＮ座位を含むＢＡＣクローンのアレイＣＧＨデータの直接的な試験により、Ｐｒｏｌｉｆ及びＭｅｓ症例の大部分がＰＴＥＮ座位の欠損を示すことが確認された。ＰＴＥＮ座位の欠損とＰＮセントロイドへの類似の間には、関連性は見られなかった（図５Ａ）。この座位が増加又は増殖する症例の大部分は、Ｐｒｏｌｉｆ又はＭｅｓサブクラスいずれかの腫瘍であり、ＥＧＦＲコピー数の増加とＰＮセントロイドに対する類似性の間には関連性は見られなかった（図５Ｂ）。ａｋｔ１、ａｋｔ２、又はａｋｔ３に対応する座位には明らかな増殖又は欠失は見られず、ＰＩ３Ｋの触媒サブユニットの増殖又は欠失も見られなかった（図示しない）。小数の試料が、ＰＩ３Ｋの調節サブユニットであるＰＩＫ３Ｒ３についてコピー数の増加を示し、この座位のＣＧＨ比の、Ｐｒｏｌｉｆシグネチャーに対する類似性との関連性は陽性であった（図５Ｃ）。
このような結果により、ａｋｔ経路の活性化と腫瘍サブタイプとの強い関係が示唆されたことから、本発明者等は、腫瘍サブタイプにおけるＰＴＥＮ  ｍＲＮＡの発現とホスホ−ａｋｔ（ｐ−ａｋｔ）免疫組織学を比較した。本発明者等は、Ｐｒｏｌｉｆ及びＭｅｓ腫瘍におけるＰＴＥＮ  ｍＲＮＡの発現はＰＮ腫瘍の場合の概ね２分の一であり、ｐ−ａｋｔ（ｓｅｒ４７３）の発現はＰＮ腫瘍より強いことを発見した（図５Ｅ、図５Ｉ）。この結果は有意性の高いものであった（ＰＮ対その他のｔ検定で、ｐ−ａｋｔ免疫組織化学についてＰ＜５×１０−８；ＰＴＥＮ  ｍＲＮＡについてｐ＜５×１０−５）。ＰＴＥＮの結果は第二の独立試料セットにおいて確認された（データは示さない）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８０】
ＭＤＡの試料セット中のＰＮ腫瘍マーカーの完全なリストの試験において、本発明者等は、Ｎｏｔｃｈ経路エレメントＤＬＬ３、ＤＬＬ１、ＨＥＹ２及びＡＳＣＬ１に対応するプローブセットが、ＰＮ腫瘍のマーカーとして本発明の基準に見合うものであることを発見した（図５Ｅ−Ｈ）。これらの遺伝子は、両確認用データセットのＰＮ腫瘍に有意に過剰発現することが確認された。これら４つのＮｏｔｃｈ経路エレメントの各々は、前脳の神経発生に関係しているとみなされており（Campos等, J. Neurosci. Res. 64: 590-598 (2001); Casarosa等, Development 126: 525-534 (1999); Sakamoto等, J. Biol. Chem. 278: 44808-44815 (2003)）、ＡＳＣＬ１は最近、成人の前脳におけるニューロン及びオリゴデンドログリア両方の特定に関連付けられている（Parras等, EMBO Journal, 23(22): 4495-505 (2004)）。マイクロアレイのデータにＰＮ腫瘍の上方制御が示されなかったＮｏｔｃｈ経路の成分には、Ｎｏｔｃｈ１−４、Ｊａｇｇｅｄ１及び２、Ｈｅｓ１、２、４、６、７（図示しない）が含まれる。ＨＥＹ１は、ＭＤＡのＰＮ腫瘍に小さいが有意な上方制御を示した（１．４ＦＣ、ｐ＝５×１０−５）。
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の直接的な証拠を試験するために、利用可能なパラフィン埋設切片を用いてＭＤＡの全症例に対し、核Ｎｏｔｃｈ免疫反応性のブラインド評価を実施した。陽性の症例は、陰性の症例と比較した場合核に「紅潮」を示し、このことは核に染色が全く無いことを示すものであった。図５Ｊは、Ｎｏｔｃｈ核染色について０、１、又は２と評価された各腫瘍サブタイプの頻度を示す。陽性の症例は比較的弱いシグナルしか示さなかったが、それでもＰＮ試料は、Ｐｒｏｌｉｆ（ｐ＜０．００５、ｔ検定）又はＭｅｓ（ｐ＜０．００１、ｔ検定）サブクラスより有意に高い評点を示した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【０２０９】
【図１】高悪性度の神経膠腫の生存時間に関連する３つの主な遺伝子発現パターンを明らかにする発現プロファイリングを示す。Ａは、生存時間との相関関係が陽性又は陰性である１０８の遺伝子による、グレードＩＩＩ及びＩＶのＭＤＡ原発性星細胞腫７６例の、教示無しクラスター形成により明らかとなった３つの試料クラスター（図の上に白抜き長方形で示す）を示す（遺伝子クラスターには陽性又は陰性と標識する）。Ｂは、３５のシグネチャー遺伝子を用いて同定した場合、同じ７６の試料が、ＰＮ腫瘍サブセット、Ｐｒｏｌｉｆ腫瘍サブセット及びＭｅｓ腫瘍サブセットのいずれであるかを示す。ｋ平均法によるクラスター形成に基づくセントロイドを、ｚスコアにより正規化した遺伝子発現値（−１〜＋１）を用いて示す。Ｃ〜Ｅは、ＭＤＡ、ＵＣＳＦ、及びＵＣＬＡの試料集団に基づくデータのカプラン−マイヤー生存図を示す。ログランク検定のｐ値を示す。黒い線、グレイの線及び点線は、それぞれＰＮサブクラス、Ｐｒｏｌｉｆサブクラス及びＭｅｓサブクラスに対応している。垂直の刻み目は、生存時間の観察の検閲を示す。Ｆ及びＧは、ＰＮマーカーとＭｅｓマーカーの強い発現が相互排他的であることを示す。各バーは、個々の試料中における４つのマーカー遺伝子の、マイクロアレイによるｍＲＮＡの測定値（Ｆ）又はＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲによるｍＲＮＡの測定値（Ｇ）を示す。図示の遺伝子は、ＢＣＡＮ、ＤＬＬ３、ＣＨＩ３ｌ１／ＹＫＬ４０（ＹＫＬ４０）、及びＣＤ４４を含む。これらの値は、完全な試料セットに対する個々の試料の遺伝子発現のＺスコアを表わす。Ｈは、５の神経膠腫症例の組織マイクロアレイコアにおけるＢＣＡＮ及びＣＨＩ３Ｌ１／ＹＫＬ４０（ＹＫＬ４０）のインサイツハイブリダイゼーションを示す。矢印は、ＢＣＡＮ陽性コアにおける局所的なＣＨＩ３Ｌ１／ＹＫＬ４０の発現を示す。
【図２】高悪性度の神経膠腫の多くは、シグネチャー遺伝子発現の３つのパターンのうちの１に強い類似性を有することと、疾病が進行するとサブクラスがＭｅｓ表現型に移行することを特徴とする。Ａ〜Ｃの三次元グラフでは、各点の位置が、基準（ＭＤＡ）試料セットのｋ平均法によるクラスター形成により決定された、個々の試料と３つのセントロイドの各々との類似性（スピアマンｒ）を表わす。Ａは、アストロサイト（黒い点）又はオリゴデンドログリア（白い点）の形態両方の、殆ど全てのグレードＩＩＩの腫瘍がＰＮセントロイドに最も類似しており、一方グレードＩＶの腫瘍（平行線模様の点）の集団においてはセントロイドへの類似性という点で分散性が高かったことを示す。Ｂは、３つのセントロイドの各々に類似する、健常細胞又は組織からなる複数の異なるセットを示す。試料は、胎児脳、成人脳（脳）、胎児組織由来の２つの神経幹細胞株（ＮＳＣ１、ＮＳＣ２）、ジャーカット、造血性幹細胞（ＨＳＣ）、平滑筋（ＳｍｏＭｕｓｃ）、内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌ）、滑膜（ｓｙｎｏｖ）、及び骨であった。増殖因子ＢＤＮＦへの曝露による処置後、当該因子への曝露を中止した神経幹細胞株を、ＮＳＣ１＊及びＮＳＣ２＊と命名した。Ｃは、一致する原発性及び続発性星細胞腫の２６の対（グレイ＝グレードＩＶ、黒＝グレードＩＩＩ）を示す。シグネチャークラスに移行があった一致する標本の各対を、太矢印で繋いだ。Ｄは、再発の際にＭｅｓサブクラスに移行した場合に、遺伝子が有意に上方制御されたことを示す。ＦＣ＝折り畳みの変化。Ｅは、ＰＮからＭｅｓ表現型への移行が見られた症例の、一致する原発性及び続発性腫瘍におけるＣＨＩ３Ｌ１／ＹＫＬ４０及びＯＬＩＧ２のＩＨＣを示す。
【図３】腫瘍のサブクラスを、増殖、血管新生、及び神経発生のマーカーの発現により区別したものである。Ａ〜Ｅにおいて、白丸は脳を、グレイの丸又は白いバーはＰＮを、黒い三角又は平行線模様のバーはＰｒｏｌｉｆを、白い四角又は黒いバーはＭｅｓを示している。Ａは、ＰＣＮＡ及びＴＯＰ２Ａの発現について、他の全てのグループよりＰｒｏｌｉｆ腫瘍が豊富であることを示す（ｐ＜１×１０−６）。Ｂは、Ｍｅｓ腫瘍が、他の全てのグループから、ＰＥＣＡＭ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、及びＶＥＧＦＲ２の発現の増加により区別されることを示す（ｐ＜０．０５）。Ｃ及びＤは、ＰＮ腫瘍と比較して、Ｐｒｏｌｉｆ及び／又はＭｅｓ腫瘍が神経幹及び前駆マーカーであるＶＩＭ、ＮＥＳ、ＴＬＸ、ＣＤ１３３、ＭＥＬＫ、及びＤＬＸ２を強く発現し（Ｃ）、神経芽細胞及び神経細胞のマーカーであるＯＬＩＧ２、ＭＡＰ２、ＤＣＸ、ＮｅｕＮ，ＥＲＢＢ４、及びＧＡＤ２を弱く発現する（Ｄ）ことを示す。星印は、ＰＮとの差異が大きいことを示す（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡの後ボンフェローニｐｏｓｔ−ｈｏｃ）。Ｅは、ＰＮ又はＭＥＳ腫瘍と比較して、Ｐｒｏｌｉｆ腫瘍においてＧＦＡＰ発現が有意に低下したことを示す。
【図４】腫瘍サブクラス間で、染色体７、１０、及び１９におけるコピー数の変化が異なること、及びそのような差異が発現シグネチャーに反映されることを示す。Ａは、腫瘍シグネチャーのサブクラスによる染色体１０、７及び１９ｑのコピー数の変化の頻度を示す。ｃｈｒ１０について、腫瘍は、減少を示さないか、ＰＴＥＮ座位を含む１０ｑに限定された減少を示すか、ほぼ全ての座位の減少を示すことが報告された。ｃｈｒ７について、症例を、増加なし、ｃｈｒ７のいずれかの部分の増加、又は全ての座位の増加にスコア化した。ｃｈｒ１９ｑについて、症例を、半分以上の座位がコピー数の変化を示すかどうかに応じて、増加又は減少にスコア化した。Ｂは、プロットした全てのＵ１３３  Ａ＆Ｂプローブセットと比較した場合の、染色体の位置によるＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ、又はＭｅｓ腫瘍マーカーのリスト（標識化）のプローブセットの数を示す。
【図５】Ｐｒｏｌｉｆ及びＭｅｓ腫瘍は、Ａｋｔ及びＮｏｔｃｈシグナル伝達カスケードの差次的な活性化を示す。ＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ、及びＭｅｓ腫瘍はそれぞれ、（ｉ）白の丸又は平行線模様のバー、（ｉｉ）黒の三角又は黒のバー、及び（ｉｉｉ）白の四角又は白のバーで示す。（Ａ）ＰＴＥＮの減少及び（Ｂ）ＥＧＦＲの増幅は、ＰＮシグネチャーと関連していないが、一方、（Ｃ）ＰＩＫ３Ｒ３座位の増加はＰｒｏｌｉｆシグネチャーと関連している。Ａ〜Ｃでは、図示のように、各試料について、ｘ軸は、サンプリングされた座位における増加又は減少を示すＣＧＨ  ｌｏｇ２比を表わし、ｙ軸はＰＮ又はＰｒｏｌｉｆセントロイドとの相関関係を示す。ｒ値は、ＣＧＨ比と発現シグネチャーセントロイドの類似性のピアソン及びスピアマンの相関係数を示す。Ｄは、正規化されたＰＴＥＮ  ｍＲＮＡ値が、ＰＮ腫瘍サブクラスと比較した場合に予後不良の腫瘍サブタイプにおいて低いことを示す。水平な線は、グループ平均を示す。Ｅ〜Ｈは、ＰＮ腫瘍が、Ｎｏｔｃｈ経路エレメントであるＤＬＬ３、ＤＬＬ１、ＨＥＹ２、及びＡＳＣＬ１を強く過剰発現することを示す。Ｉ及びＪは、ｐ−Ａｋｔと核Ｎｏｔｃｈについての染色が異なる腫瘍サブクラスを示す。各腫瘍サブタイプについて、ｐ−Ａｋｔ（Ｉ）又は核Ｎｏｔｃｈ（Ｊ）の免疫染色が０、１、又は２と評価された試料の画分を示す。ＰＮ、Ｐｒｏｌｉｆ、及びＭｅｓサブタイプを、３つの棒グラフによりそれぞれ示す。
【図６】２つの独立した試料セット（Ａ及びＢ）における、ＰＴＥＮ及びＤＬＬ３の発現により予想される高悪性度の星細胞腫の生存時間を示す。左右のパネルは、２０位及び８０位の百分位数（パーセンタイル）におけるＰＴＥＮ発現の場合についてそれぞれモデル化された各試料集団（Ａ：ｎ＝７６、Ｂ：ｎ＝３４）に予想される生存関数を示す。黒及び白の線は、それぞれ発現の２０位及び８０位のパーセンタイルにおけるＤＬＬ３の発現により試料に予想される生存時間を示す。
【図７】神経膠腫細胞株の発現シグネチャーによるＥＧＦ／ＦＧＦ依存性ニューロスフェアの増殖を示す。Ａは、５の細胞株から採取して、ＥＧＦ＋ＦＧＦの存在下又は不在下で維持したニューロスフェア培養液の実施例を示す。図示のように、ＥＧＦ＋ＦＧＦの不在下での増殖について、細胞株の実施例を０〜４に評価した。Ｂは、１６の細胞株のニューロスフェア増殖の評点を、Ｍｅｓ又はＰｒｏｌｉｆセントロイドに対する発現シグネチャーの相関の関数として示す。
【図８Ａ】腫瘍サブタイプをまとめたものであり、腫瘍サブタイプの主な特徴を示す。
【図８Ｂ】腫瘍サブタイプをまとめたものであり、腫瘍サブタイプと神経発生の段階との平行性を示すモデルである。
【国際調査報告】
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