(57)【要約】  本発明は、インスリン分泌細胞からのインスリン分泌を調節する候補薬剤を同定するのに有用な方法に関し、ここで、該分子は、インスリン分泌細胞でTRPM4活性および発現を調節する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリン分泌のモジュレーターをスクリーニングする方法であって、
a) インスリン分泌細胞を候補薬剤と接触させ;そして、
b) TRPM4チャネル活性の調節を検出すること(ここで、該TRPM4チャネル活性の調節は、該候補薬剤がインスリン分泌のモジュレーターであることの指標である)
を含む、方法。
【請求項２】
該調節が、該TRPM4チャネルのカチオン透過性の変化を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
該調節が、該TRPM4チャネルを介した電流の動態の変化を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
該調節が、該TRPM4チャネルの発現の変化を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
該方法が、さらに、該候補薬剤による該細胞のインスリン分泌の調節を検出することを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
インスリン分泌のモジュレーターをスクリーニングする方法であって:
a) TRPM4チャネルを発現する細胞を提供し;
b) 該TRPM4チャネルを調節する候補薬剤を同定し;
c) 該TRPM4チャネルを調節する候補薬剤をインスリン分泌細胞と接触させ;そして、
d) 該候補薬剤の存在および非存在下で、該インスリン分泌細胞のインスリン分泌を測定すること
を含む、方法。
【請求項７】
該細胞が組換え細胞である、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
インスリン分泌のモジュレーターをスクリーニングする方法であって:
a) TRPM4チャネルに結合可能な候補薬剤を同定し;
b) 該TRPM4チャネル結合可能な候補薬剤をインスリン分泌細胞と接触させ;
c) 該候補薬剤の存在および非存在下で、該インスリン分泌細胞によるインスリン分泌を測定すること
を含む、方法。
【請求項９】
インスリン分泌のモジュレーターをスクリーニングする方法であって、
a) インスリン分泌細胞を候補薬剤と接触させ;
b) TRPM4チャネル活性の調節を検出し;そして、
c) インスリン分泌の調節を検出すること
を含む、方法。
【請求項１０】
該候補薬剤が、スルホニルウレア、ビグアニド、アルファ-グルコシダーゼ阻害剤、チアゾリジンジオン、メグリチナイド、アミノ酸D-フェニルアラニン誘導体、アミリン模倣剤(amylinomimetic)、インクレチン模倣剤、DPP-4阻害剤、インスリン類似体、およびその組合せからなる群から選択されるメンバーを含む、請求項1、6、8または9に記載の方法。
【請求項１１】
TRPM4チャネル活性の該調節が、該TRPM4チャネルの一価カチオン透過性の調節、該TRPM4チャネルのトランスロケーションの調節、該TRPM4チャネルの発現の調節、およびそれらの組合せからなる群から選択されるメンバーを含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１２】
インスリン分泌のモジュレーターを同定する方法であって:
a) 第1プールの候補薬剤を提供し;
b) TRPM4チャネルを発現する第1細胞を提供し;
c) 該第1細胞を該第1プールの候補薬剤の1個またはそれ以上のメンバーと接触させ;
d) TRPM4チャネル活性を調節する該第1プールの候補薬剤のメンバーを同定し(ここで、TRPM4チャネル活性を調節する該第1プールの候補薬剤のメンバーは、第2プールの候補薬剤を形成する);
e) インスリン分泌細胞である第2細胞を提供し;
f) 該第2細胞を該第2プールの候補薬剤の1個またはそれ以上のメンバーと接触させ;そして、
g) 該第2細胞のインスリン分泌を調節する該第2プールの候補薬剤のメンバーを同定すること
を含む、方法。
【請求項１３】
TRPM4のモジュレーターをスクリーニングする方法であって、
a) TRP4を発現する細胞を候補薬剤と接触させ;そして、
b) TRPM4チャネル活性の調節を検出すること
を含む、方法。
【請求項１４】
該細胞がインスリン分泌細胞である、請求項13に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2006年5月25日に出願したU.S.S.N. 60/808,767に対して、合衆国法典第35巻§119(e)のもとでの利益を主張し、それは、その全体を引用により本明細書の一部とする。
【０００２】
発明の分野
本発明は、本明細書で“TRPM4”と呼ぶ、カルシウム活性化非選択的(“CAN”)膜貫通チャネルポリペプチドの新規ファミリーのインスリンに影響を与えるTRPM4モジュレーターをスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
Transient Receptor Potential (TRP)タンパク質は、イオンチャネルのファミリーであり、3個の主なサブファミリーに分類される: TRPC “Canonical”、TRPV “Vanilloid”、およびTRPM “Melastatin”(Clapham DE. Nature, 426, 517-24 (2003) Harteneck C et al. Trends Neurosci, 23, 159-66.(2000), Montell C, et al. Mol Cell, 9, 229-31(2002)を参照のこと)。TRPMサブファミリーは、8個のメンバーからなり、それらの生理学的な機能に関する情報は、現れ始めたばかりである。TRPM4は、Ca2+に対する感知され得る透過なしに、主に、Na+およびK+を伝導する広く発現したカルシウム活性化非選択的カチオン(CAN)チャネルである。それは、〜25 pSの単一チャネル伝導性を有し、[Ca2+]iにより直接活性化される。下記の2つのスプライシングバリアントが記載されている; N末端で174アミノ酸残基を欠いた短型(Xu XZ, et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 98, 10692-7 (2001))および長(完全長)型(Launay P, et al. Cell, 109, 397-407 (2002))。Tリンパ球のような非興奮性細胞では、TRPM4仲介脱分極は、Ca2+放出活性化Ca2+チャネル(CRAC)を介したCa2+エントリーのための駆動力を減らし、Ca2+振動およびサイトカイン産生にかなりの影響を与える(Launay P, et al. Science, 306, 1374-7 (2004))。TRPM4は、筋原性収縮および心臓機能に関与し(Earley S, et al. Circ Res, 95, 922-9 (2004); Guinamard R, et al. J Physiol, 558, 75-83 (2004))、それがまた、電気的興奮細胞でCa2+エントリー機構をかなり制御し得ることを示す。
【０００４】
グルコース刺激の間の膜電位の変化は、各々の脱分極が、[Ca2+]iの付随する上昇を誘導し、インスリン分泌を誘導するので、β細胞でのCa2+振動の形態および頻度を決定するのに重要である(Bergsten P. Diabetes, 51 Suppl 1, S171-6 (2002); Gilon P, et al. Diabetes, 51 Suppl 1, S144-51 (2002))。正常な機能が損なわれたCa2+振動は、ヒトおよび齧歯類の2型糖尿病の形態で、インスリン分泌の欠損を生じる(Henquin JC. Diabetes, 49, 1751-60 (2000); Lin JM, et al. Diabetes, 51, 988-93 (2002); O'Rahilly S, et al. N Engl J Med, 318, 1225-30 (1988)。β細胞の膜脱分極に関与する細胞および分子構成要素は、完全には同定されていない。グルコースは、2つの経路を活性化することにより、インスリン分泌を刺激する(Henquin JC. (2000)。誘導経路は、グルコース吸収で始まり、その代謝およびATP-ADP比の増加、その後のATP-感受性K+(KATP)チャネルの閉鎖の一連の出来事を含む。KATPチャネルの閉鎖は、膜脱分極を誘導し、電位依存性カルシウムチャネル(VDCC)の開口およびCa2+流入を伴うが(Ashcroft FM, et al.  Nature, 312, 446-8 (1984))、これは、今までのところまだ同定されていない脱分極電流のさらなる存在を必要とする。VDCCの開口は、細胞膜電位に依存し、それは、約-70 mVで静止している。脱分極は、VDCCを活性化させ、ピークのCa2+電流は、約0 mVである(Barg S, et al. Diabetes, 51 Suppl 1, S74-82 (2002); Berggren PO, et al. Cell, 119, 273-84 (2004); Gopel S, et al.  J Physiol, 521 Pt 3, 717-28 (1999)。TRPM4電流は、およそ0 mVに反転させ、高められたチャネル活性は、負の静止膜電位から細胞を脱分極させる(Launay P, et al. Cell, 109, 397-407 (2002))。またKATP独立経路と呼ばれる増幅経路は、すでに高められた[Ca2+]Iに依存する。それは、分泌におけるCa2+の効率を増加させることにより作用する。
【０００５】
世界的な糖尿病の増大は、この病気の症状を処置し得る薬剤の必要性を生じている。糖尿病を制御するのに決定的に重要なのは、血中のインスリンレベルを制御し、調節する能力である。したがって、本発明は、インスリン分泌細胞からのインスリン分泌を調節できる候補薬剤をスクリーニングする方法を提供する。
【発明の概要】
【０００６】
要約
1つの局面では、インスリン分泌細胞を候補薬剤と接触させ、TRPM4チャネル活性の調節を検出する工程を含む、インスリン分泌のモジュレーターをスクリーニングする方法を提供する。好ましい局面では、TRPM4チャネル活性の調節は、候補薬剤がインスリン分泌のモジュレーターであることの指標である。
【０００７】
他の局面では、TRPM4チャネルを発現する細胞を提供し、TRPM4チャネルを調節する候補薬剤を同定する方法は、インスリン分泌のモジュレーターをスクリーニングする。そのような方法は、さらに、1個またはそれ以上の候補薬剤をインスリン分泌細胞と接触させ、候補薬剤に応答したインスリン分泌細胞のインスリン分泌を測定する工程を含む。
【０００８】
また他の局面では、インスリン分泌細胞を候補薬剤と接触させ、TRPM4チャネル活性の調節を検出し、インスリン分泌の調節を検出する工程を含む方法は、インスリン分泌のモジュレーターをスクリーニングする。
【０００９】
また他の局面では、インスリン分泌のモジュレーターを同定する方法は、第1プールの候補薬剤を使用し、TRPM4チャネルを発現する第1細胞を提供する。第1細胞を、1個またはそれ以上の候補薬剤の第1プールのメンバーと接触させ、TRPM4チャネル活性を調節する候補薬剤の第1プールは、候補薬剤の第2プールを形成する。インスリン分泌細胞である第2細胞を、次いで、候補薬剤の第2プールと接触させ、第2細胞のインスリン分泌を調節する候補薬剤の第2プールのメンバーを同定する。
【００１０】
該方法はまた、TRPM4のモジュレーターをスクリーニングするために使用し得る。該方法は、TRPM4を発現する細胞を候補薬剤と接触させ、TRPM4チャネル活性の調節を検出することを含む。細胞は、インスリン分泌細胞であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図1A-Bは、TRPM4の分子特徴付けを示す。図1Aは、アミノ末端固有領域1-4(ATU)、膜貫通ドメイン領域(TM)、コイルドコイル領域(CC)を有するTRPM4の図表および一次構造を示す。下線部分のアミノ酸は、TRPM4のN末端伸長を示し;配列の残りは、短いスプライシングバリアントのTRPM4と同一である。アミノ酸1から1214(配列番号2)のTRPM4タンパク質のアミノ酸配列を、また、示す。図1Bは、特異的TRPM4アンチセンスRNAプローブを用いたさまざまな組織およびヒト細胞株からのRNAのノザンブロット解析を示す。細胞株は、単球(U937)、Bリンパ球(Ramos)、Tリンパ球(Jurkat)、好塩基球(Ku812)、黒色腫細胞(G361)および胚性腎細胞(HEK 293)を表す。
【図２】図2は、1から約4061の核酸配列からなるTRPM4 cDNAの組換え核酸分子を示す(配列番号1)。
【図３】図3は、1から約1214の配列からなる組換えTRPM4タンパク質のアミノ酸配列を示す(配列番号2)。
【図４】図4A-Gは、膵臓β細胞で、TRPM4電流の特徴付けを示す。
【図５】図5A-Cは、TRPM4抑制がインスリン分泌に影響を与えることを示す。
【図６】図6A-Fは、HEK293細胞で、カルシウム誘導エキソサイトーシスおよびTRPM4活性化を示す。
【図７】図7A-Eは、エキソサイトーシスの刺激がFM1-43染色欠損および第2相の開発を生じることを示す。
【図８】図8A-Cは、TRPM4トランスロケーションおよび細胞膜との融合を示す。
【図９】図9A-Dは、TRPM4電流のアゴニスト誘導第2相を示す。
【図１０】図10A-Eは、INS細胞で、KATPおよびTRPM4電流に対するグリベンクラミドの効果を示す。
【図１１】図11A-Eは、HEK293細胞で、KATPおよびTRPM4電流に対するグリベンクラミドの効果を示す。
【００１２】
詳細な説明
TRPM4は、β細胞で豊富に発現しているだけでなく、グルコース誘導インスリン分泌をかなり制御しており、TRPM4のドミナントネガティブ構築体によるTRPM4の抑制は、インスリン分泌の正常なパルス様式を抑制する(Cheng et al., Cell Calcium 41(1):51-61 (2007))。Ca2+依存性エキソサイトーシスによるTRPM4包含小胞のトランスロケーションは、また、β細胞が、細胞膜でTRPM4チャネルプールを制御するメカニズムを示す。
【００１３】
本明細書で使用するとき、“TRPM4”なる用語は、以前はLTRPCファミリーとして既知であった、Ca2+制御膜貫通チャネルポリペプチドファミリーのメンバーを意味する。配列番号2(図3)として本明細書に記載した特定の配列は、ヒト腎臓細胞に由来した。TRPM4は、広くヒト組織で発現しており、心臓、胎盤、および膵臓、ならびにヒト造血系の細胞株において、主要な発現を有する。
【００１４】
本明細書に記載したとおり、“TRPM4活性”は、TRPM4チャネルの機能的活性のことを言い、下記を含む: ナノモル範囲の細胞質Ca2+の上昇による活性化、Ca2+による開閉、かなりのCa2+の透過なしの一価カチオン、例えば、Na+、K+、およびCs+の伝導、受容体仲介Ca2+動員の後の活性化、膜電位の調節によるCa2+流入の制御、および、この方法で、他のCa2+透過経路を介したCa2+エントリーのための駆動力、電圧もしくはCa2+依存性不活性化による制御の不存在、ならびにタンパク質の発現およびその細胞内トランスロケーション。
【００１５】
TRPM4チャネルは、“Characterization of a Calcium Family”(WO 00/40614)で開示された“SOC”(ストア作動性チャネル)および“CRAC”(カルシウム放出活性化チャネル)ポリペプチドおよびチャネルとは異なる活性を示し、その開示は、引用により本明細書の一部とする。SOCおよびCRACタンパク質は、“細胞内カルシウムストアからのCa2+の欠損で活性化され得て”(WO 00/40614の2頁を参照のこと)、さらに、“高レベルの細胞内カルシウムにより阻害される”(WO 00/40614の10頁を参照のこと)。逆に、本発明のTRPM4チャネルは、高レベルの細胞内カルシウムの存在下で高められた活性を示し、ナノモル範囲の細胞質Ca2+濃度により直接開閉し得て、非興奮性細胞のストア作動性Ca2+チャネルを介したCa2+流入のための駆動力を減少させ、細胞内カルシウムストアの欠損または減少により影響されず、Ca2+に依存した方法で細胞膜を脱分極させる。SOCおよびCRACは、この方法で制御されない。
【００１６】
TRPM4は、天然起源から、またはTRPM4変異型を製造するために組み換え的に修飾されたものに由来する。“TRPM4配列”なる用語は、特に、自然に生じる切断もしくは分泌型(例えば、細胞外ドメイン配列)、自然に生じる変異型(例えば、オルタナティブスプライシング型)および自然に生じるアレル変異型を包含する。ヒト腎細胞由来のTRPM4ポリペプチドの天然配列は、完全長もしくは配列番号2の1から約1214のアミノ酸を含む成熟天然配列TRPM4ポリペプチドである(図3)。
【００１７】
本発明のTRPM4、またはその断片は、また、配列番号2のアミノ酸配列と、少なくとも約80%アミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも約85%アミノ酸配列同一性、さらに、より好ましくは、少なくとも約90%アミノ酸配列同一性、最も好ましくは、約95%配列同一性を有するポリペプチドを含む。該TRPM4ポリペプチドは、例えば、1個またはそれ以上のアミノ酸残基が、配列番号2の配列のNもしくはC末端で、および1個またはそれ以上の内部ドメイン内で、置換および/または欠失しているTRPM4ポリペプチドを含む。アミノ酸変化が、TRPM4ポリペプチド変異型の翻訳後過程を変え得る、例えば、グリコシル化サイトの数もしくは位置を変えるか、または膜アンカー特性を変えることを、当業者は、十分に理解している。あらゆるTRPM4ポリペプチドは、しかしながら、本明細書に記載した1個またはそれ以上のTRPM4ポリペプチドの新規特性を示す。
【００１８】
本明細書で同定したTRPM4ポリペプチド配列に関する“割合(%)アミノ酸配列同一性”は、所望により、最大の配列割合同一性を達成するために、配列を並べ、ギャップを導入した後、配列番号2(図3)のアミノ酸残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基の割合として定義し、あらゆる保存的置換は、配列同一の一部として考えない。本明細書で使用する%同一性値は、Altschul et al., Methods in Enzymology, 266:460 480 (1996);  http://blast.wustl/edu/blast/README.html.から取得可能なWU BLAST 2により作成する。WU BLAST 2は、いくつかの探索パラメーターを使用し、その多くは、デフォルト値に設定されている。調節可能なパラメーターは、下記の値に設定する: 重複範囲 =1、重複率(fraction) = 0.125、ワード(word)閾値 (T) = 11。HSP SおよびHSP S2パラメーターは、動的値(dynamic values)であり、特定の配列の構成および興味がある配列を探索している特定のデータベースの構成に依存して、プログラム自身により確立されている;しかしながら、該値は、感度を高めるために調節し得る。A %アミノ酸配列同一性値は、並べた領域の“より長い”配列の全残基数で割った一致する同一残基の数により決定する。“より長い”配列は、並べた領域の最も現実的な残基を有する配列である(アライメントスコアを最大にするために、WU Blast 2により導入されたギャップは、無視する)。
【００１９】
さらなる態様では、本明細書で使用する%同一性値は、PILEUPアルゴリズムを用いて作成する。PILEUPは、逐次的ペアアライメントを用いて、関連する配列の群からの多配列アライメントを作成する。それはまた、アライメントを作成するために使用する、クラスタリング関係を示すツリーをプロットし得る。PILEUPは、Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987)の簡素化進歩的アライメント法を使用し;該方法は、Higgins & Sharp CABIOS 5:151-153 (1989)に記載されたものに類似する。有用なPILEUPパラメーターは、3.00のデフォルトギャップ重量、0.10のデフォルトギャップ長重量、および重量末端ギャップを含む。
【００２０】
また、他の態様では、ヒトもしくは他の生物からのTRPM4ポリペプチドを、適当なゲノムもしくはcDNAライブラリーを用いて、オリゴヌクレオチドプローブまたは縮重ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)プライマー配列を使用することにより、同定および単離し得る。当業者により理解されているとおり、配列番号2(図3)のアミノ酸1-174をコードする配列番号2(図2)のヌクレオチド配列を含む固有のTRPM4核酸、またはその部分は、特に、プローブおよび/またはPCRプライマー配列として有用である。一般に、当業者に既知のとおり、好ましいPCRプライマーは、約15から約35ヌクレオチド長、好ましくは、約20から約30であり、所望により、イノシンを含み得る。PCR反応のための条件は、当業者に既知である。
【００２１】
好ましい態様では、TRPM4は、組換え技術を用いて、すなわち、HEK293細胞のような細胞株で組換えTRPM4核酸の発現を介して製造される、“組換えタンパク質”である。組換えタンパク質は、少なくとも1個またはそれ以上の特性により、自然に生じたタンパク質から区別される。例えば、該タンパク質は、通常、その野生型宿主に関連するいくつかのまたはすべてのタンパク質および化合物から、単離または精製され得て、したがって、実質的に、純粋であり得る。例えば、単離したタンパク質は、通常、その自然状態で関連する少なくともいくつかの物質を伴わず、好ましくは、特定のサンプル中、全タンパク質重量で、少なくとも約0.5%、より好ましくは、少なくとも約5%を構成する。実質的に純粋なタンパク質は、全タンパク質重量で、少なくとも約75%、好ましくは、少なくとも80%、特に好ましくは、少なくとも約90%を含む。定義は、異なる生物または宿主において、ある生物由来のタンパク質の産生を含む。あるいは、タンパク質は、誘導可能プロモーターまたは高発現プロモーターの使用を介して、通常見られるよりも、十分に高濃度で製造され得て、その結果、タンパク質は、増加した濃度レベルで製造される。あるいは、タンパク質は、通常は、事実上見出されない形態であり得て、例えば、下記したとおり、エピトープタグの添加またはアミノ酸置換、付加および欠失の添加された形態である。
【００２２】
さらなる態様では、TRPM4変異型は、1個のアミノ酸を類似の構造および/または化学的特性を有する他のアミノ酸と置き換えることにより、例えば、ロイシンのセリンとの置き換え、すなわち、保存されたアミノ酸置換により、組換え的に改変し得る。
【００２３】
さらなる態様状況では、欠失、付加またはそのあらゆる組合せを、TRPM4変異型を製造するために使用し得る。一般には、これらの変化は、分子の変化を最小限にするために、小数のアミノ酸でなされるが、大きな変化もしばしば許容され得る。TRPM4ポリペプチドの特性における小さな変化が望まれるとき、置換は、一般に、下記の表1にしたがってなされる:
表1
【表１】
2009538149.tif 000002
【００２４】
さらなる態様では、機能または免疫学的同一性における重大な変化は、表1で示したものより保存されていない置換基を選択することによりなし得る。例えば、変更領域でのポリペプチド骨格の構造、例えば、アルファへリックスまたはベータシート構造; 標的部位での分子の荷電もしくは疎水性; または側鎖の容量(bulk)に、より重要な影響を与える置換をなし得る。一般に、ポリペプチドの特性に最も大きな変化を与えることが予期される置換は、下記の置換である; (a) 親水性残基、例えば、セリルまたはスレオニルを、疎水性残基、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニルで(または、それらにより)置換する; (b) システインまたはプロリンを、任意の他の残基で(または、それらにより)置換する; (c) 陽性側鎖を有する残基、例えば、リジル、アルギニル、またはヒスチジルを、陰性残基、例えば、グルタミルまたはアスパルチルで(または、それらにより)置換する;または(d) 巨大側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンを、側鎖を有さない残基、例えば、グリシンで(または、それにより)置換する。本発明のTRPM4変異型は、本明細書に記載したとおり、1個またはそれ以上のTRPM4ポリペプチド特性を示す。
【００２５】
さらなる態様では、変異型は、変異型がまたTRPM4ポリペプチドの特性を修飾するために選択し得るが、典型的には、質的に同じ生物学的活性を示し、自然に生じる類似体と同じ免疫応答を誘導する。あるいは、変異型は、TRPM4の生物学的活性を変えるように設計し得る。例えば、グリコシル化サイトを変更または除去し得る。
【００２６】
本明細書で使用するとき、“TRPM4核酸”またはそれらの文法的同等物は、上記した1個またはそれ以上の新規TRPM4ポリペプチド特性を示すTRPM4ポリペプチドをコードする核酸のことを言う。TRPM4核酸は、配列番号1(図2)と配列相同性を示し、そこでは、相同性は、配列を比較することによるか、またはハイブリダイゼーションアッセイにより決定する。
【００２７】
TRPM4ポリペプチドをコードするTRPM4核酸は、図2(配列番号1)で示したcDNAと相同である。そのようなTRPM4核酸は、好ましくは、約75%以上相同、より好ましくは、約80%以上、より好ましくは約85%以上、および最も好ましくは、90%以上相同である。ある態様では、相同性は、約93から95%または98%の高さである。本明細書での相同性は、類似性または同一性を意味し、好ましくは、同一性を意味する。相同性目的のための好ましい比較は、シークエンシング差異(sequencing differences)を含む配列を、既知のCRACM配列と比較することである。この相同性は、非限定的に、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局地的相同性アルゴリズム、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アライメントアルゴリズム、Pearson & Lipman, PNAS USA 85:2444 (1988)の相同性探索法、これらのアルゴリズムのコンピューター実施(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WIのGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA)、Devereux et al., Nucl. Acid Res. 12:387-395 (1984)に記載されたBest Fit配列プログラムを含む、当業者に既知の標準的な技術を用いて、好ましくは、デフォルト設定を用いるか、または検討により決定する。
【００２８】
好ましい態様では、“パーセント(%)核酸配列同一性”は、配列番号1(図2)のヌクレオチド残基配列と同一である候補配列におけるヌクレオチド残基の割合として定義する。好ましい方法は、デフォルトパラメーターに設定された(重複範囲および重複画分が、それぞれ、1および0.125に設定されている)WU-BLAST-2のBLASTNモジュールを利用する。
【００２９】
上記したとおり、TRPM4核酸はまた、ハイブリダイゼーション研究をとおして決定したとおり、相同性により定義し得る。ハイブリダイゼーションは、低ストリンジェンシー条件下、より好ましくは、中ストリンジェンシー条件下、最も好ましくは、高ストリンジェンシー条件下で測定される。そのような相同な核酸によりコードされたタンパク質は、本明細書に記載した少なくとも1個の新規TRPM4ポリペプチド特性を示す。したがって、例えば、配列番号1(図2)およびそれらの相補体として説明した配列を有する核酸と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸は、それらがTRPM4特性を有するタンパク質をコードする場合、TRPM4核酸配列であると考えられる。
【００３０】
ハイブリダイゼーション反応の“ストリンジェンシー”反応は、当業者により容易に決定し得て、一般に、プローブ長、洗浄温度、および塩濃度に依存した経験的計算である。一般に、より長いプローブは、適当なアニーリングのためにより高い温度を必要とし、より短いプローブは、より低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは、一般に、相補鎖がそれらの融点以下の環境で存在するとき、変性したDNAが再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列間の望む相同性が高い程、相対的に高い温度を使用し得る。結果として、当然に、相対的により高い温度は、反応条件をよりストリンジェントにし、より低い温度は、低いストリンジェントにする。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる例に関しては、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
【００３１】
本明細書に記載した“ストリンジェント条件”または“高ストリンジェント条件”は、下記により同定し得る: (1) 洗浄のために、低イオン強度および高温を、例えば、50℃で、0.015 M塩化ナトリウム/0.0015 Mクエン酸ナトリウム/0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを使用する;(2) ハイブリダイゼーションの間、変性剤、例えば、ホルムアミド、例えば、42℃で、0.1%ウシ血清アルブミンを含む50% (v/v)ホルムアミド/0.1%フィコール/0.1%ポリビニルピロリドン/750 mM塩化ナトリウム、75 mMクエン酸ナトリウムを含むpH 6.5の50mMリン酸ナトリウム緩衝液を使用する; または(3)42℃で、50%ホルムアミド、5 x SSC (0.75 M NaCl、0.075 Mクエン酸ナトリウム)、50 mMリン酸ナトリウム(pH 6.8)、0.1%ピロリン酸ナトリウム、5 x デンハルト溶液、超音波破砕サケ精子DNA(50 μg/ml)、0.1% SDS、および10%硫酸デキストランを使用し、42℃で0.2 x SSC (塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム)および55℃で50%ホルムアミドで洗浄し、その後、55℃で、EDTAを含む0.1 x SSCからなる高ストリンジェンシー洗浄を行う。
【００３２】
“中ストリンジェント条件”は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989に記載されたとおり同定し得て、上記したもの程ストリンジェントでない洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件(例えば、温度、イオン強度および%SDS)の使用を含む。中ストリンジェント条件の例は、20%ホルムアミド、5 x SSC (150 mM NaCl、15 mMクエン酸三ナトリウム)、50 mMリン酸ナトリウム(pH 7.6)、5 x デンハルト溶液、10%硫酸デキストラン、および20 mg/mL変性剪断サケ精子DNAを含む溶液で、37℃で一晩インキュベーションし、その後、約37-50℃で、フィルターを、1 x SSCで洗浄する。当業者は、温度、イオン強度などを調節し、必要に応じて、プローブ長などのような因子を適合させる方法を認識している。一般に、ストリンジェント条件は、定義したイオン強度pHで、特異的な配列のための熱融点(Tm)よりも約5-10℃低いように選択される。Tmは、標的に相補的なプローブの50%が、平衡で、標的配列にハイブリダイズする(Tmで、標的配列が過度に存在するとき、プローブの50%が、平衡で占有する)温度である(定義したイオン強度、pHおよび核酸濃度下)。ストリンジェント条件は、塩濃度が、pH 7.0から8.3で、約1.0 Mナトリウムイオン未満、典型的には、約0.01から1.0 Mナトリウムイオン濃度(または他の塩)未満であり、温度が、短プローブ(例えば、10から50ヌクレオチド)のために少なくとも約30℃、長プローブ(例えば、50ヌクレオチド以上)のために少なくとも約60℃である条件である。ストリンジェント条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加で達成し得る。
【００３３】
他の態様では、よりストリンジェントではないハイブリダイゼーション条件を使用し;例えば、当業者に既知のとおり、中程度のもしくは低いストリンジェンシー条件を使用し得る。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーに関するさらなる詳細のために、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
【００３４】
本明細書に記載したTRPM4核酸は、記載したとおり一本鎖または二本鎖であるか、または二本鎖または一本鎖配列の部分を含み得る。当業者により理解されるとおり、一本鎖(“ワトソン”)なる描写は、また、他方の鎖の配列(“クリック”)を定義し;したがって、本明細書に記載された配列は、また、該配列の相補体を含む。核酸は、DNA、ゲノムおよびcDNAの両方、RNAまたはハイブリッドであり得て、ここで、核酸は、デオキシリボおよびリボヌクレオチドのあらゆる組合せ、ならびに、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニンなどを含む塩基の組合せを含む。本明細書で使用する本明細書で使用するとき“ヌクレオシド”なる用語は、ヌクレオチドおよびヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体、ならびに修飾したヌクレオシド、例えば、アミノ修飾ヌクレオシドを含む。さらに、“ヌクレオシド”は、非自然に生じる類似構造を含む。したがって、例えば、各塩基を含むペプチド核酸の個々の単位は、本明細書でヌクレオシドと呼ぶ。
【００３５】
本明細書の“組換え核酸”なる用語は、一般に、通常は自然に見出されない形態で、ポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼによる核酸の操作により、もともとインビトロで形成された核酸を意味する。したがって、直線型の単離した核酸、または通常は加わらないDNA分子を結合させることにより、インビトロで形成した発現ベクターは、本発明の目的のための組換え体であると考えられる。組換え核酸が作製され、宿主細胞もしくは生物に再導入されると、それは、非組換え的に、すなわち、インビトロ操作よりもむしろ宿主細胞のインビボ細胞機構を用いて複製する;しかしながら、そのような核酸は、いったん組換え的に産生されると、その後、非組換え的に複製されたとしても、まだ本発明の目的のための組換え体であると考えられると理解されるべきである。TRPM4核酸分子のホモログおよびアレルは、定義に含まれる。
【００３６】
そのようなライブラリースクリーニング法で同定したTRMP4配列は、公的なデータベース、例えば、GenBankまたは他の私的な配列データベースに置かれて利用可能な他の既知の配列と比較し、そして並べ得る。分子の限定した領域内の、または完全長配列の配列同一性(アミノ酸またはヌクレオチドレベルで)は、コンピューターソフトウェアプログラム、例えば、相同性を測定するのにさまざまなアルゴリズムを使用するALIGN、DNAstar、BLAST、BLAST2およびINHERITを用いて、配列アライメントを介して決定し得る(上記したとおりである)。
【００３７】
本明細書で使用するとき、TRPM4ポリペプチドをコードする核酸は、配列番号1(図2)のヌクレオチド配列のすべてまたは一部を用いて、選択したcDNAまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより取得し得る。上記のSambrook et al.に記載された慣用的なプライマー伸長手順を、cDNAに逆転写され得ないmRNAの前駆体および加工中間体を検出するために使用する。
【００３８】
他の態様では、上記した配列番号1(図2)のTRPM4核酸配列は、より大きな遺伝子のcDNA断片であり、すなわち、それは、核酸断片である。本明細書中の“遺伝子”は、コード領域、非コード領域、およびコード領域と非コード領域の混合を含む。したがって、本明細書に記載した配列を用いて当業者に理解されるとおり、TRPM4遺伝子のさらなる配列を、より長い配列または十分な長さの配列をクローニングするために当業者に既知の技術を用いて取得し得る; 上記のManiatis et al.およびAusubel, et al.を参照のこと(引用により本明細書の一部とする)。
【００３９】
TRPM4核酸が同定されると、それは、クローン化され、所望により、その構成部分を、全体のTRPM4遺伝子を形成するように再結合し得る。天然源から単離したとき、例えば、プラスミドもしくは他のベクターに含まれるか、または直線核酸断片としてそこから切り出したとき、組換えTRPM4核酸は、さらに、他の多細胞真核生物由来の他のTRPM4(例えば、さらなるコード領域)を同定するか、または単離するためのプローブとして使用し得る。組換えTRPM4核酸はまた、“前駆体”核酸として使用し、修飾もしくは変異型TRPM4核酸を産生し得る。
【００４０】
ほかの態様では、上記したとおり、TRPM4ペプチドをコードするTRPM4核酸(例えば、cDNAまたはゲノムDNA)を、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning (2000)に開示された当業者に既知の技術を用いて、クローニングのための(DNAの増幅)または発現のための複製可能ベクターに挿入し得て、それは、その全体を引用により本明細書の一部とする。さまざまなベクターが、公然に利用可能であり、多くの形態、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、またはファージの形態であり得る。適当な核酸配列は、当業者に既知の技術を用いて、さまざまな手順によりベクターに挿入し得る。一般に、DNAを、当業者に既知の技術を用いて、適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。ベクター構成要素は、一般に、非限定的に、1個またはそれ以上のシグナル配列、複製開始点、1個またはそれ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列を含む。1個またはそれ以上のこれらの構成要素を含む適当なベクターの構築は、当業者に既知の標準的なライゲーション技術を用いる。
【００４１】
そのようなベクターを含む宿主細胞をまた、提供する。一例として、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)、COS細胞、ヒト骨髄から単離した細胞、ヒト脾臓もしくは腎臓細胞、ヒト心臓組織から単離した細胞、ヒト膵臓細胞、ヒト白血球、単球細胞、非限定的に、膵臓β細胞、INS-1、およびβTC-3細胞を含むインスリン分泌細胞を含むほ乳類宿主細胞株であり得る。宿主細胞のより特定の例は、SV40により形質転換したサル腎臓CV1株(COS-7、ATCC CRL 1651); ヒト胚腎臓株(293 or 293 cells subcloned for growth in suspension culture, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); チャイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFR (CHO、Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); ヒト膵臓β細胞; マウスセルトリ細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); ヒト肺細胞(W138、ATCC CCL 75); ヒト肝細胞(Hep G2、HB 8065); およびマウス乳癌細胞(MMT 060562、ATCC CCL51)を含む。適当な宿主細胞の選択は、当業者の範囲内であると考えられる。好ましい態様では、HEK-293細胞を、宿主細胞として使用する。TRPM4ポリペプチドを製造する方法をさらに提供し、TRPM4ポリペプチドの発現のために適当な条件下で宿主細胞を培養し、細胞培養からTRPM4ポリペプチドを回収することを含む。
【００４２】
他の態様では、通常、構成的であるか、または誘導性であり、mRNA合成に向けられるように、TRPM4コード核酸配列に操作可能に結合したプロモーターを含む発現およびクローニングベクターを使用する。さまざまな潜在的宿主細胞により認識されるプロモーターは、既知である。ほ乳類宿主細胞で、TRPM4 DNAをコードするベクターの転写は、好ましくは、誘導性プロモーターにより、例えば、異種ほ乳類プロモーターから取得可能なプロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター、および熱ショックプロモーターにより制御される。本発明で実施し得る誘導性プロモーターの例は、単一またはバイナリーシステムで使用され、熱ショックにより誘導されるhsp 70プロモーター; 銅またはカドミウムにより誘導されるメタロチオネインプロモーター(Bonneton et al., FEBS Lett. 1996 380(1-2): 33-38); ショウジョウバエレチノイドにより誘導されるショウジョウバエオプシンプロモーター(Picking, et al., Experimental Eye Research. 1997 65(5): 717-27); およびテトラサイクリン誘導性完全長CMVプロモーターを含む。同定したすべてのプロモーターの中で、テトラサイクリン誘導性完全長CMVプロモーターが最も好ましい。構成的プロモーターの例は、発現が、特異的プロモーターによるか、または局所位置効果により制御される、GAL4エンハンサートラップ株(http://www.fruitfly.org; http://www.astorg.u-strasbg.fr:7081);および操作可能に結合したプロモーターの型に依存して、構成的であり得るか、または誘導的であり得る、E. coliに由来する転写活性化因子応答性プロモーターを含む。
【００４３】
高等動物でTRPM4をコードするDNAの存在の転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増加し得る。エンハンサーは、通常、約10から300 bpのDNAのシス作用エレメントであり、その転写を増加させるようにプロモーター上で作用する。多くのエンハンサー配列が、現在、ほ乳類遺伝子(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、αフェトプロテイン、およびインスリン)から既知である。典型的には、しかしながら、当業者は、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。例えば、複製開始点の後ろ側のSV40エンハンサー(bp 100-270)、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後ろ側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを含む。エンハンサーは、TRPM4コード配列の5'または3'位でベクターに挿入し得るが、好ましくは、プロモーターの5'位に位置する。
【００４４】
候補薬剤
本明細書で使用する“候補薬剤”なる用語は、TRPM4に結合し、TRPM4イオンチャネルの活性を調節し、細胞内のTRPM4の発現を変え、および/または細胞でのインスリン分泌を調節することが可能な多くの分子を記載する。上記したとおり、TRPM4イオンチャネルの活性は、その一価カチオン透過性、そのトランスロケーション、およびその電気伝導度の動態を含む。
【００４５】
本明細書に記載したとおり、候補薬剤分子は、オリゴペプチド、有機小分子、ポリサッカライド、ポリヌクレオチド、または多価カチオンなどであり得る。一般に、複数のアッセイ混合物を異なる薬剤濃度で平行して行い、さまざまな濃度での異なる応答を得る。典型的には、これらの濃度の1つは、ネガティブコントロールとして、すなわち、ゼロ濃度で、または検出レベル以下で用いる。
【００４６】
候補薬剤は、多くの化学クラスを包含するが、典型的には、それらは、多価カチオンまたは有機分子、または100以上約2,500ダルトン(D)以下の分子量を有する有機小分子化合物である。好ましい小分子は、2000 D未満、または1500 D未満、または1000 D未満、または500 D未満である。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、とりわけ、水素結合のために必要な官能基を含に、典型的には、少なくとも、アミン、カルボニル、ヒドロキシルもしくはカルボキシル基、好ましくは、少なくとも2個の官能化学基を含む。候補薬剤は、しばしば、上記官能基の1個またはそれ以上で置換された環炭素もしくはヘテロ環構造および/または芳香族もしくは多環芳香族構造を含む。候補薬剤はまた、ペプチド、サッカライド、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体、構造類似体または組合せを含む生物分子中に見出される。特に好ましいのは、ペプチドである。
【００４７】
好ましい態様では、候補薬剤は、潜在的なもしくは実際の血糖降下剤、インスリン類似体、または“抗糖尿病”剤であり得る他の型の分子である。抗糖尿病剤は、糖尿病の症状を緩和する分子および組成物を含む。抗糖尿病剤は、スルホニルウレア、ビグアニド、アルファグルコシダーゼ阻害剤、チアゾリジンジオン、メグリチナイド、アミノ酸Dフェニルアラニン誘導体、アミリン模倣剤、インクレチン模倣剤、DPP-4阻害剤、インスリン類似体、およびその組合せを含み得る。
【００４８】
ある態様では、候補薬剤は、下記の一般構造を有するスルホニルウレア化合物である:
【化１】
2009538149.tif 000003
【００４９】
スルホニルウレア化合物の一部は、R1が、置換されたアリールであり、R2が、アルキル、シクロアルキルまたは置換されたシクロアルキルである、上記の構造を含む。
【００５０】
適当な非限定的スルホニルウレア化合物の例は、非限定的に、グリピザイド、グリクラジド、グリベンクラミド、グリメピリド、グリブリド、クロルプロパミド、トルブタミド、アセトヘキサミド、トラザミド、およびその類似体、誘導体、プロドラッグを含む。
【００５１】
候補薬剤は、合成もしくは天然化合物のライブラリーを含むさまざまな起源から取得し得る。例えば、多くの手段が、無秩序なオリゴヌクレオチドの発現を含む、さまざまな有機化合物および生物分子の無秩序なおよび方向性のある合成のために利用可能である。あるいは、植物および動物抽出物の形態での天然化合物のライブラリーが利用可能であるか、または容易に作製される。さらに、天然もしくは合成的に作製されたライブラリーおよび化合物は、慣用的な化学的、物理的および生化学的手段により、容易に修飾し得る。既知の薬剤を、構造類似体を作製するために、方向性のある、もしくは無秩序な化学的修飾、例えば、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化を行い得る。
【００５２】
好ましい態様では、候補薬剤は、タンパク質である。本明細書で使用する“タンパク質”は、少なくとも2個の共有的に結合したアミノ酸を意味し、それは、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドを含む。タンパク質は、自然に生じるアミノ酸およびペプチド結合、または合成ペプチド模倣構造からなり得る。したがって、本明細書で使用する“アミノ酸”、または“ペプチド残基”は、自然に生じる、および合成アミノ酸の両方を意味する。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリンおよびノルロイシンは、本発明の目的のためのアミノ酸であると考えられる。“アミノ酸”はまた、イミノ酸残基、例えば、プロリンおよびヒドロキシプロリンを含む。側鎖は、(R)または(S)構造であり得る。好ましい態様では、アミノ酸は、(S)またはL構造である。非自然に生じる側鎖を使用するとき、非アミノ酸置換を、例えば、インビボ分解を妨害するか、または遅延させるために使用し得る。
【００５３】
好ましい態様では、候補薬剤は、自然に生じるタンパク質または自然に生じるタンパク質の断片である。したがって、例えば、タンパク質を含む細胞抽出物、またはランダム化もしくは方向性のあるタンパク様細胞抽出物の消化物を使用し得る。このようにして、多細胞真核生物タンパク質のライブラリーを、本発明の方法でのスクリーニングのために製造し得る。本態様で特に好ましいのは、多細胞真核生物タンパク質、およびほ乳類タンパク質のライブラリーであり、後者が好ましく、ヒトタンパク質が特に好ましい。
【００５４】
好ましい態様では、約5から30個のアミノ酸、好ましくは、約5から20個のアミノ酸、特に好ましくは、約7から約15個のアミノ酸からなるペプチドである。ペプチドは、上記したとおり、自然に生じるタンパク質の消化物、ランダムペプチド、または“偏った”ランダムペプチドであり得る。本明細書で使用する“ランダム化”または文法的に同等物は、各核酸およびペプチドが、それぞれ、本質的に、ランダムなヌクレオチドおよびアミノ酸からなることを意味する。一般に、これらのランダムなペプチド(または、下記の核酸)は、化学的に合成されるので、それらは、あらゆるヌクレオチドまたはアミノ酸を任意の位置に組み込み得る。合成工程は、ランダムなタンパク質または核酸を製造するために設計し得て、配列の長さにわたって、あらゆるまたは大部分の考え得る組合せの形成を可能にし、したがって、ランダムな候補タンパク性薬剤のライブラリーを形成し得る。
【００５５】
1つの態様では、ライブラリーは、任意の位置で配列優先または不変性を有さず、完全にランダムである。好ましい態様では、ライブラリーは偏っている。すなわち、配列内のいくつかの位置は、不変であるか、または制限された数の可能性から選択される。例えば、好ましい態様では、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基は、限られたクラスの中で、例えば、疎水性アミノ酸、親水性残基、立体的に偏った(小さいか、または大きい)残基の中で、架橋のための核酸結合ドメインの創出、システインの創出のために、SH-3ドメインのためのプロリン、リン酸化サイトのためのセリン、トレオニン、チロシンまたはヒスチジン、またはプリン類などの中で、ランダムである。
【００５６】
好ましい態様では、候補薬剤は、核酸である。
【００５７】
タンパク質に関して一般に上記したとおり、核酸候補薬剤は、自然に生じる核酸、ランダム化核酸、または“偏った”ランダム化核酸であり得る。例えば、原核もしくは真核生物ゲノムの消化物を、タンパク質に関して上記したとおり、使用し得る。
【００５８】
好ましい態様では、候補薬剤は、有機化学部分であり、さまざまなものが文献で利用可能である。
【００５９】
TRPM4チャネル活性のアッセイ
上記したとおり、TRPM4活性は、非限定的に、カチオン透過性、伝導性の動態、開閉、およびチャネルタンパク質自身のトランスロケーションを含む。好ましい態様では、本発明は、TRPM4チャネル活性を測定し、検出する方法を利用するアッセイを提供する。
【００６０】
1つの態様では、カチオン透過性およびチャネル開閉をモニターし、一価カチオン指標を用いて定量する。本明細書で使用するとき、一価カチオン指標は、容易に細胞膜を透過可能か、あるいは、例えば、リポソームなどにより細胞への輸送を受けやすい分子であり、細胞に入り、一価カチオンとの接触で高められるか、またはクエンチされる蛍光シグナルを示す分子である。本発明で有用な一価カチオン指標の例は、Haugland, R.P. Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals., 6th ed. Molcular Probes, Inc Eugene, OR, pp. 504-550 (1996)に詳述されており、それは、その全体を引用により本明細の一部とする。
【００６１】
他の態様では、結合アッセイを、TRPM4およびインスリン分泌を調節する候補薬剤をスクリーニングするために使用する。
【００６２】
結合アッセイの好ましい態様では、TRPM4または候補薬剤のどちらかを、例えば、蛍光、化学発光、化学もしくは放射活性シグナルで標識し、候補薬剤とTRPM4の結合を検出する手段を提供する。標識はまた、酵素、例えば、アルカリホスファターゼまたはセイヨウワサビホスファターゼであり得て、適当な基質と共に提供すると、検出可能な産物を産生する。あるいは、標識は、標識した化合物もしくは小分子、例えば、結合するが、酵素により触媒されたり変えられたりしない酵素阻害剤であり得る。標識はまた、部分または化合物、例えば、エピトープタグまたはストレプトアビジンに特異的に結合するビオチンであり得る。ビオチンの例に関して、ストレプトアビジンを上記したとおり標識し、それにより、結合したTRPM4のための検出可能シグナルを提供する。当業者に既知のとおり、非結合標識ストレプトアビジンは、解析前に除去される。あるいは、候補薬剤のライブラリーを、表面に固定化もしくは結合させ、標識した候補薬剤と接触させ得る。あるいは、候補薬剤のライブラリーを、バイオチップに固定化もしくは結合させ、標識したTRPM4と接触させ得る。バイオチップを使用する手順は、当業者に既知である。
【００６３】
好ましい態様では、TRPM4のイオン透過性は、インタクト細胞、好ましくは、TRPM4をコードする核酸およびそれに操作可能に結合した誘導性プロモーターを含むベクターで形質転換したHEK-293細胞で測定する。細胞内イオンの内在性レベルは、誘導前に測定し、次いで、誘導後に測定した細胞内イオンのレベルと比較する。fura-2のような蛍光分子は、細胞内イオンレベルを検出するために使用し得る。Na+、K+、Cs+および他の一価カチオンに対するTRPM4透過性を、そのようなアッセイで測定する。インスリン分泌を調節する候補薬剤は、本明細書に記載の方法を用いて測定したとおり、TRPM4透過性を調節するそれらの能力により同定し得る。
【００６４】
好ましい態様では、細胞内のTRPM4の発現レベルを調節する候補薬剤を同定する。ある態様では、これらの候補薬剤は、完全に、細胞内のTRPM4の発現を抑制し、それにより、細胞表現型を変える。他の態様では、候補薬剤は、細胞内のTRPM4の発現を高め、それにより、細胞表現型を変える。細胞でTRPM4の発現レベルに影響を与え得る候補薬剤の例は、アンチセンスcDNAおよびDNA、制御性結合タンパク質および/もしくは核酸、ならびに、TRPM4をコードする核酸の転写もしくは翻訳を調節する本明細書に記載したあらゆる他の候補薬剤を含む。
【００６５】
さらなる態様では、候補薬剤をスクリーニングするためのアッセイは、さまざまな細胞で、例えば、脊椎動物の神経、免疫、筋系細胞、および、非限定的に、膵臓β細胞、INS-1、およびβTC-3細胞を含むインスリン分泌細胞で、TRPM4チャネルを開口することにより、TRPM4活性に影響を与え、ここで、TRPM4チャネルの開口は、脊椎動物で、減少したまたは低減した免疫応答を生じる。本明細書に記載したような候補薬剤は、疾患、疾患に付随する状態、または、自己免疫疾患または移植片対宿主拒絶反応、または他の関連する自己免疫疾患のような障害の処置に有用であり、ここで、減少するか、もしくは軽減した免疫応答は、脊椎動物の改善した状態を生じる(すなわち、疾患、疾患に付随する状態、または障害が、予防されるか、除去されるか、または軽減される)。
【００６６】
またさらなる態様では、候補薬剤は、さまざまな細胞で、例えば、神経、免疫、脊椎動物の筋肉系の細胞、および非限定的に、膵臓β細胞、INS-1、およびβTC-3細胞を含むインスリン分泌細胞で、TRPM4チャネルを閉じることにより、TRPM4活性に影響を与える。本明細書に記載したような薬剤は、疾患、疾患に付随する状態、または、乳癌および大腸癌、または他の型の癌のような障害の処置に有用であり、ここで、高められるか、または増加した免疫応答は、脊椎動物の改善した状態を生じる(すなわち、疾患、疾患に付随する状態、または障害が、予防されるか、除去されるか、または軽減される)。
【００６７】
本発明はさらに、細胞でTRPM4のトランスロケーションを調節する候補薬剤を同定するための方法に関する。ある態様では、該方法は、TRPM4タンパク質を含むことが可能な細胞を提供し、該細胞を候補薬剤と接触させ;そして、TRPM4タンパク質のトランスロケーションにおける該候補薬剤の効果を決定することを含む。ある態様では、候補薬剤は、TRPM4タンパク質のトランスロケーションを増加させる。他の態様では、候補薬剤は、TRPM4タンパク質のトランスロケーションを減少させる。ある態様では、方法はさらに、候補薬剤の存在下でのTRPM4タンパク質のレベルを決定し、候補薬剤の非存在下でのTRPM4タンパク質のレベルと比較することを含む。
【００６８】
ある態様では、TRPM4は、1個またはそれ以上のマーカー分子と結合し、TRPM4発現の検出および定量ならびにトランスロケーションを可能にし得る。適当なマーカー分子は、非限定的に、分光器、光化学、放射能、生化学、免疫化学、熱量測定、電気、および非限定的に、生物発光、リン光、および蛍光を含む光学手段により検出可能な分子を含む。マーカー分子は、放射性同位体、エピトープタグ、親和性標識、酵素、蛍光基、化学発光基などを含む。マーカー分子は、他の分子とそれらの相互作用の機能として、直接または間接的に検出される分子およびそれらの位置またはトランスロケーションの機能として検出される分子を含む。ある態様では、マーカー分子は、光学的に検出可能なタンパク質を含む光学的に検出可能なマーカー分子であり、その結果、それらは、化学的、機械的、電気的、または放射活性的に励起し、蛍光、リン光、または生物発光を放出し得る。光学的に検出可能なマーカー分子は、例えば、ベータガラクトシダーゼ、ホタルルシフェラーゼ、バクテリアルシフェラーゼ、フルオレセイン、テキサスレッド、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびローダミン結合抗体を含む。他の態様では、光学的に検出可能なマーカー分子は、例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)を含む蛍光タンパク質のような本質的な蛍光分子である。
【００６９】
細胞内の位置、濃度、またはTRPM4のトランスロケーションを検出する方法は、使用するマーカー分子に依存して変わる。例えば、細胞膜、エンドサイトーシス小胞またはエンドソームでのTRPM4の濃度、およびクラスリン被覆ピットでのTRPM4の濃度などを含む、例えば、TRPM4の細胞内の位置、濃度、もしくはトランスロケーションおよびマーカー分子を検出する方法は、使用するマーカー分子に依存して変わる。当業者は、容易に、使用するマーカー分子のために適当な方法を考案することができる。光学的マーカー分子に関して、あらゆる光学的な方法を使用し得て、そこでは、蛍光、生物発光、またはリン光の変化を、放射光の再分布もしくは再配向により測定し得る。そのような方法は、例えば、偏光顕微鏡法、生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)、エバネセント波励起顕微鏡、および標準的もしくは共焦点顕微鏡を含む。
【００７０】
本明細書に記載した各々の項目/事象の検出は、比較のために、時間の一点で、時間にわたって、時間の二点またはそれ以上の点(例えば、候補薬剤の暴露前後)などで行い得る。TRPM4の細胞内位置、濃度、もしくはトランスロケーションの指標は、候補薬剤に曝した細胞で、本明細書に記載した1個またはそれ以上の項目/事象を検出し、コントロール細胞で、同じ項目/事象を検出することにより取得したものの結果と比較し、該結果を、前決定値と、または前決定レベルもしくはコントロール細胞を参照することなく比較することにより決定し得る。
【００７１】
インスリン分泌を調節する候補薬剤のアッセイ
上記に記載したとおり、TRPM4は、インスリン分泌細胞の膜電位を制御するのに重要な役割を果たす。結果として、TRPM4活性および発現を調節する候補薬剤を同定するアッセイは、また、インスリン分泌を調節する候補薬剤を同定する。インスリン分泌の調節はまた、当業者に既知の方法を用いて、直接検出し、測定し得る。
【００７２】
好ましい態様では、本発明は、候補薬剤をスクリーニングする2つのレベルを含む方法を提供する。第1に、TRPM4活性および発現を調節する候補薬剤を、潜在的薬剤のプールから同定する。TRPM4活性および発現を調節する薬剤は、次いで、第2プールを形成し、この第2プールからの候補薬剤を、次いで、インスリン分泌細胞と接触させ、この候補薬剤のだい2プールのメンバーがインスリン分泌を調節できるか否かを決定する。ある状況では、TRPM4発現細胞は、インスリン分泌細胞よりも、容易に取得し、取り扱い得る。したがって、最初に、スクリーニングとして、TRPM4活性および発現を用いて潜在的候補薬剤の幅を狭めることは、インスリン分泌を調節する候補薬剤を同定する工程を、能率的にし得る。
【００７３】
また本明細書は、インスリン分泌を調節することが可能な候補薬剤をスクリーニングする方法を提供する。ある態様では、該方法は、TRPM4タンパク質を含むインスリン分泌細胞を提供し、インスリン分泌細胞を候補薬剤と接触させ、該薬剤が、細胞でインスリン分泌を調節するか否かを検出することを含む。
【００７４】
インスリンを検出する方法は、当業者に既知であり、そのようなアッセイは、典型的には、ELISAまたはラジオイムノアッセイを使用し、例えば、Bergsten and Hellman, 1993, Diabetes 42:670-4; U.S.P.Ns. 6,642,003および6,849,708を参照のこと(その各々は、その全体を引用により本明細書の一部とする)。
【００７５】
インスリン分泌の検出は、比較のために、時間の一点で、時間にわたって、時間の二点またはそれ以上の点(例えば、候補薬剤への暴露前後)などで行い得る。インスリン分泌を調節することの指標は、候補薬剤に曝した細胞で、本明細書に記載した1個またはそれ以上の項目/事象を検出し、コントロール細胞で、同じ項目/事象を検出することにより取得したものの結果と比較し、該結果を、前決定値と、または前決定レベルもしくはコントロール細胞を参照することなく比較することにより決定し得る。特定の態様では、検出は、該候補薬剤の存在下で、該細胞により分泌されるインスリンの量を決定し、該候補薬剤の非存在下で、該細胞により分泌されるインスリンの量と比較することを含む。
【００７６】
また本明細書は、TRPM4タンパク質を含むインスリン分泌細胞を提供し、インスリン分泌細胞を候補薬剤と接触させ; インスリン分泌を誘導するために、インスリン分泌細胞を化合物と接触させ、該薬剤が、細胞でインスリン分泌を調節するか否かを検出することを含む、インスリン分泌を調節可能な候補薬剤をスクリーニングする方法を提供する。本明細書で使用するとき、“インスリン分泌を誘導する”なる句は、細胞に投与するとインスリン分泌を誘導し得る、あらゆる化合物を意味する。インスリン分泌を誘導する化合物の例は、非限定的に、グルコース、アルギニンバソプレシン(AVP)、ATP、およびその類似体、ならびに、今日存在しているか、または未来に開発される、インスリン分泌を誘導することが見出される化合物を含む。
【実施例】
【００７７】
実施例
実施例で言及した市販で購入可能な試薬は、他に記載がなければ、製造者の指示にしたがって使用した。
【００７８】
実施例1: 膵臓β細胞でのTRPM4電流の特徴付け
RT-PCRおよび免疫沈降: 全RNAを、製造者のプロトコール(ISO-TEX Diagnostics, Friendswood, Texas)にしたがい、RNAzolを用いて抽出した。DNAse I処理したRNAを、RETROscript Kit (Ambion, Austin, Texas)を用いた逆転写のために使用した。PCRを、Advantage Polymerase PCR Kit (Clonetch, Palo Alto, California)を用いて、標準的な方法により行った。免疫沈降のために、細胞を、1% Triton X-100 (Bio-Rad, Hercules, California)およびプロテアーゼ阻害剤を含むTrisバッファーpH 7.5で、4℃で30分間、溶解させた。免疫沈降が、6% SDS-PAGEで分離し、ヒトTRPM4のC末端領域に対するウサギポリクローナル抗血清でブロットし、Enhanced Chemiluminescence (Amersham Pharmacia Biotech)により視覚化した。
【００７９】
図4Aは、単離し、cDNAに転写した異なる細胞株からの全RNAを示す。RT-PCRは、TRPM4に対する特異的プライマーで行った。TRPM4転写産物は、HIT-T15 (ハムスター由来)、INS-1およびRINm5F (ラット由来)細胞で検出した。Jurkat T細胞のcDNAを、ポジティブコントロールとして使用した(Launay P, et al. (2004) Science, 306, 1374-7。
【００８０】
図4Bは、TRPM4タンパク質の検出を示す。細胞を、免疫沈降/イムノブロッテイング後、TRPM4 (M4)に対するポリクローナル抗体を用いて、TRPM4タンパク質の発現のために解析した。細胞質でのタンパク質発現を確認するために、TRPM4に対するウサギポリクローナル抗ペプチド抗体を使用した。チャネルは、INS-1およびRINm5F細胞株ならびにJurkat T細胞で、予想された分子サイズを有する単一バンドとして検出された(図4B)。無関係なコントロール抗体を用いた免疫沈降後、タンパク質は、検出されなかった(C)。
【００８１】
INS-1細胞を、それらがβ細胞代謝およびインスリン生合成の広く受け入れられたモデルを示すので、機能的特徴付けのために選択した(Frodin M, et al. (1995) J Biol Chem, 270, 7882-9; Kennedy ED, et al. (1996) J Clin Invest, 98, 2524-38l Merglen A, et al. (2004) Endocrinology, 145, 667-78)。図4C下部パネルは、0.5−3μM間でバッファーした[Ca2+]iを用いて、−80 mVおよび+80 mVで抽出した、INS-1細胞からのTRPM4により生じた平均内部電流(平均 ± s.e.m.)を示す。0.5-3 μM [Ca2+]iでの細胞のかん流は、濃度依存的な方法でTRPM4電流を誘導し(図4C)、それは、典型的には、2相様式を示した。図4C上部パネルは、ホールセルコンフィギュレーションの確立後、開始の80 sの間の第1相を示す平均内部電流を示す(n = 4-7 細胞/濃度)。第1相は、ホールセルコンフィギュレーションの確立後、数秒以内に観察され(図4C上部パネル)、その後、第2相は、実験の過程で徐々に開発されていった(図4C下部パネル)。第1相のピークで、および第2相のために600 sで、代表的な細胞から得た電流電圧関係は、TRPM4のそれらに似ている(図4Fおよび4G)。図4Dは、TRPM4活性化の第1および第2相のための用量応答曲線を示し、電流増幅は、実験中、80 s (第1相)または600 s (第2相)の+80 mVで抽出された。第1相および第2相の用量応答フィットは、各々、1.7 μMおよび1.2 μMのKD値を与えた(図4D)。図4Eは、図4Cの代表的な細胞からの標準化したキャパシタンス変化を示す。キャパシタンスは、侵入(break-in)後、即座に測定した静止インプットキャパシタンスまで標準化した。興味深いことに、第2相の出現は、細胞キャパシタンスの増加と相関していた(図4E)。図4Fは、上記した実験条件下、第1相のピークで代表的な細胞から得た電流電圧関係を示す。図4Gは、600 sで得られた代表的な細胞からの電流電圧関係を示す。
【００８２】
上記の実験を、HIT-T15β細胞モデルで繰り返し、TRPM4はまた、TRPM4に対するウサギポリクローナル抗ペプチド抗体を用いて、免疫沈降によりそこで検出し得る(データは示していない)。これらの細胞で、我々はまた、細胞サイズの増加と平行して開発される第1相および第2相ならびに比較可能用量応答曲線を観察した(データは、示していない)。
【００８３】
実施例2: TRPM4抑制は、インスリン分泌に影響を与える
インスリン分泌の測定: TRPM4 cDNAの切断型を、N末端V5エピトープタグと共に、pCDNA4/TOベクターの修飾版にクローン化した。V5−ΔN-TRPM4発現構築体の正しい配列を、DNAシークエンシングにより確認した。細胞をプレートした24時間後、構築体を、Lipofectamine 2000(商標)およびPlus Reagent(商標)(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いてINS-1細胞にトランスフェトし、実験は、トランスフェクション後、48-72 hrsで行った。コントロール細胞は、ΔN-TRPM4 DNAなしの試薬でトランスフェクトした。p47-p55のI NS-1細胞を、これらの実験で使用した。
【００８４】
静的インキュベーション実験: INS-1細胞を、24ウェルプレートに、〜5x105細胞/ウェルでプレートし、3−4日間、増殖させた。インスリン分泌の測定は、培養培地をNaCl 136、KCl 4.8、CaCl2 2.5、KH2PO4, 1.2、MgSO4 1.2、NaHCO3 5、HEPES 10、グルコース 4および0.1% BSA、pH 7.4(mMで)を含む修飾KRBで置き換えることにより行った。37℃で15分の平衡期間後、細胞を、異なる処理に曝し、15分間、インキュベートした。各実験の最後に、KRBを、以前記載されたとおり(Cheng H et al. (2002) Biochem J, 364, 33-9.)、インスリンRIAのために収集し、細胞の数を定量した。各実験を、4つ一組で行い、3回繰り返した。
【００８５】
かん流実験: かん流系は、以前記載されたものに(Cheng H et al. (2002))いくつかの修飾を加えて使用した。INS-1細胞を、マルチウェルプレート内部の22 mm丸形ガラスカバースリップ上で、コンフルエンス(〜106 細胞)まで3-4日間、増殖させた。各カバースリップを、次いで、各ウェルから取り出し、細胞をチャンバーの内側に面するように25 mmかん流チャンバー(Millipore Swinnex Filter Holders, Waters, Milford, MA, U.S.A.)に載せた。最初、細胞を修飾KRBと共に、37℃で20分の平衡期間、かん流した。流速は、実験前に0.5 ml/分に調節し、サンプルを30秒間隔で収集した。最後に、ガラスカバースリップを、チャンバーから取り出し、細胞の数を定量した。流出サンプルからのインスリン濃度を、RIAにより測定した。実験は、異なる継代細胞を用いて3回複製した。インスリン分泌実験からの結果を、SAS PROC MIXED手順および乱塊法を用いて解析した。処理およびブロックの2個の因子が存在した。個々の平均比較は、F検定を用いて行った。有意なレベルは、P < 0.05に設定した。
【００８６】
N末端の最初の177アミノ酸を欠いたTRPM4の切断型を、ドミナントネガティブ効果(ΔN-TRPM4)を得るために使用し、インスリン分泌におけるTRPM4の役割を調べた。この変異型が内在性TRPM4チャネルと結合し、活性を抑制する能力は、報告されている(Launay P, et al. (2004) Science, 306, 1374-7)。図5Aは、静的インキュベーション条件下、インスリン分泌におけるTRPM4タンパク質分泌の効果を示す。コントロール偽トランスフェクトINS-1細胞の4、10および25 mM グルコースへの暴露は、濃度依存的な方法でのインスリン分泌を刺激し、そこで、25 mMのグルコースは、基底4 mMと比較して、~2.2倍増加した分泌を生じた。ΔN-TRPM4構築体による内在性TRPM4の抑制は、コントロール細胞と比較して、25 mMグルコース(P<0.05)への応答をかなり減らし(図5A)、25 mMのグルコースは、ΔN-TRPM4細胞で、基底4 mMと比較して、かなり減少した〜1.3倍の分泌増加を生じた。
【００８７】
1 μM アルギニンバソプレシン(AVP)への応答は、コントロールと比較して、ΔN-TRPM4でかなり減少した(P<0.05)(図5B)。この実験で、KClまたはL-アルギニンへの応答は、変わらなかった。コントロール細胞は、ΔN-TRPM4 DNAを含まない試薬でトランスフェクトした。値は、平均 ± s.e.m.である(3個の異なる細胞継代からのn=4 ウェル/処理集団; 同じ濃度で比較した*P<0.05)。
【００８８】
β細胞で、膜電位の振動は、各脱分極がVDCCを開き、Ca2+流入を生じるので、Ca2+シグナルの振動を生じる。結果として、インスリンは、パルス的な方法で分泌される。パルス分泌様式におけるTRPM4の影響を調べるために、かん流系を、ΔNTRPM4細胞で、グルコース刺激に対する応答での分泌を測定するために使用した。TRPM4抑制は、コントロール偽トランスフェクトINS-1細胞と比較して、25 mMグルコースに対するインスリン分泌をかなり減少させた(図5C)。INS-1細胞を、基底レベルを得るために、4 mMグルコースを含むKRBで10分間かん流し、25 mM グルコースで20分間刺激し、インスリン分泌を誘導した。グルコース刺激で観察された典型的な振動は、ΔN-TRPM4細胞では存在しなかった。最後に、細胞を、それらの生存率を試験するために、20 mM KClで脱分極した。コントロール細胞は、ΔN-TRPM4 DNAを含まない試薬でトランスフェクトした。実験は、平均 ± s.e.m.を示す(3個の異なる細胞継代からのn=3/集団)。
【００８９】
実施例3: HEK293細胞でのカルシウム誘導エキソサイトーシスおよびTRPM4活性化
電気生理学: ガラスカバースリップ上で増殖させたHEK293細胞を、記録チャンバーに移し、下記の組成の標準修飾リンガー溶液(mM)で維持した: NaCl 140、KCl 2.8、CaCl2 1、MgCl2 2、グルコース10、Hepes・NaOH 10、pH 7.2(浸透圧は、約300 mOsmに調節する)。INS-1細胞での実験のために、外部溶液を、さらに、300 nM TTX、100 μM 4,4'-ジイソチオシアノ-2,2'-スチルベンジスルホン酸(DIDS)および10 mM テトラエチルアンモニウム(TEA)で補充した。HEK293細胞の細胞内ピペット充填(pipette-filling)用溶液は、K-グルタミン酸140、NaCl 8、MgCl2 1、K-BAPTA 10、HEPES・KOHを含んだ(mM)(KOHでpH 7.2に調節した)。INS-1細胞のための内部溶液は、Cs-グルタミン酸140、NaCl 8、MgCl2 1、Cs-BAPTA 10、HEPES・CsOHを含んだ(mM)(CsOHでpH 7.2に調節した)。[Ca2+]iを高められたレベルまで緩衝化した実験では、CaCl2を、所望により、加えた(WebMaxChttp://www.stanford.edu/~cpatton/webmaxcS.htmで計算した)。溶液変換は、カルシウム画像化実験のために、バスパーフュージョン（bath perfusion）により行った。
【００９０】
パッチクランプ実験を、21-25℃で、密着シールホールセル形態で行った。高分解能電流記録を、コンピューターに基づくパッチクランプ増幅系(EPC-9、HEKA, Lambrecht, Germany)を用いて獲得した。パッチピペットは、標準内部溶液で満たした後、3-6 MΩの間、抵抗を有していた。ホールセルコンフィギュレーションの確立後すぐに、−100から+100 mVの電圧範囲にわたる50 ms持続のランプ電圧を、600から1000秒の間、0.5 Hzの速度で、0 mVの保持電位から送達した。すべての電圧は、細胞内アニオンとしてグルタミン酸を用いるとき、外部および内部溶液間の10 mVの液界電位のために訂正した。電流は、2.9 kHzでフィルターし、100 μs間隔でデジタル化した。容量性電流および直列抵抗を、EPC-9の自動キャパシタンス補償を用いたランプ電圧前に決定および訂正した。両膜電流の低分解能時間的推移を、個々のランプ電流記録から−80 mVまたは＋80 mVで電流増幅を抽出することにより評価した。パッチクランプ実験のデータ解析、統計学的解析およびグラフ表示は、Igor Pro 5 ソフトウェアプログラム(Wavemetrics)を用いて行った。
【００９１】
β細胞でのTRPM4電流の電気生理学的記録は、高められたCa2+と共に、かん流の間、二層様式を示した。第1相は、ホールセルコンフィギュレーションの確立後、数秒以内に活性化した(Launay P. et al. (2002) Cell, 109, 397-407)。その迅速な動態に基づいて、第1相が、すでに細胞膜に存在しているTRPM4チャネルの活性化によるものであるか、および第2相が、エキソサイトーシスの間、TRPM4含有小胞の細胞膜へのトランスロケーションおよび組み込みから生じるか否かを調べた。細胞キャパシタンスの増加は、第2相の開発と相関があることが観察された。第2相を特徴付けるために、TRPM4を過剰発現するTrexHEK-293細胞を、異なる[Ca 2+]i濃度下で、電流/キャパシタンス変化の視覚化を促進するために使用した。
【００９２】
β細胞での観察と一致して、0.1−10 μM [Ca2+]iでのかん流は、濃度依存的な方法で2相電流を誘導した(図6Aおよび6B)。第1相は、ホールセルコンフィギュレーションの確立後、数秒以内に観察され、その後、第2相は、実験の過程で徐々に開発されていった。図6A下部パネルは、−80 mVで、TRPM4を過剰発現するTrexHEK-293細胞(flag-TRPM4-TrexHEK293)で発現した平均内部電流を示し、ここで、[Ca2+]iは、0.1-10μMでバッファーした(平均 ± s.e.m.、n = 5-7 細胞/濃度)。図6A上部パネルは、ホールセルコンフィギュレーションの確立後、最初の80秒の間の第1相を示す平均内部電流を示す。実験の最初の80秒の間の第1相、およびその後の増加した細胞キャパシタンスと関連する第2相の開発に留意して下さい(図6Dのパネルを参照のこと)。図6B下部パネルは、図6Aと同じ細胞からTRPM4により生じた+80 mVでの平均外部電流を示す。図6B上部パネルは、ホールセルコンフィギュレーションの確立後、最初の80秒の間の平均外部電流を示す。
【００９３】
異なるCa2+濃度のために第1相および第2相のピークで代表的な細胞から得た電流電圧関係は、TRPM4に特有である(図6Eおよび6F)。図6Eは、最初の80 sの実験の間、第1相のピークで、代表的な細胞から得た上記した実験条件下での電流電圧関係を示す。図6Fは、実験時間の600 sで抽出した場合と同様に(図6E)、同じ細胞からの電流電圧関係を示す。
【００９４】
図6Cは、TRPM4活性化の第1および第2相の用量応答曲線を示し、電流振幅は、第1相のピークで、または実験の600 s(第2相)で、+80 mVで抽出した。第1相および第2相の用量応答フィットは、各々、1.2 μMおよび1.3 μMのKD値を与えた(図6C)。図6Dは、代表的な細胞からの標準化したキャパシタンス変化を示す。β細胞と同様に、第2相の出現はまた、細胞キャパシタンスの増加と相関した(図6D)。
【００９５】
実施例4: エキソサイトーシスの刺激は、FM1-43染色欠失および第2相の開発を生じる
第2相がエキソサイトーシスによるものであるか否かを試験するために、細胞内小胞に膜マーカースチリル色素FM1-43を載せ、膜トラフィッキングのための蛍光プローブとして使用した(Cochilla AJ. et al. (1999) Annu Rev Neurosci, 22, 1-10; Smith CB. et al. (1996) Nature, 380, 531-4.)。細胞に、培養培地中、10 μM FM1-43を、24時間入れ、実験前に洗浄し、標準バッファー溶液で15分間、平衡化した。FM1-43の蛍光は、480 nmで励起し、535 nmで収集した。Ca2+測定実験からのデータ獲得は、二重励起蛍光分析イメージングシステム(TILL-Photonics, Graefelfingen, Germany)で取得し、TILLvisIONソフトウェアにより制御した。Fura-2 AM搭載細胞(5 μM/30分/37℃)を、340および380 nmの波長で励起させた。いくつかの細胞の蛍光放射を、1 Hzでサンプリングし、異なる波長の蛍光強度の相対比率ユニットに計算した。データ解析、統計学的解析およびイメージデータの図示を、Igor Pro 5ソフトウェアプログラム(Wavemetrics)を用いて行った。
【００９６】
図7は、エキソサイトーシスの刺激が、FM1-43染色欠失および第2相の開発を生じることを示す。図7Aは、600 sの間、FM 1-43を載せ、100 nM Ca2+でかん流したflag-TRPM4-TrexHEK293細胞(灰色矢印)またはコントロールインタクト細胞(白色矢印)の代表的な蛍光像である。図7Bは、600 sの間、エキソサイトーシスを誘導するために1 μM Ca2+でかん流した細胞(灰色矢印)またははコントロールインタクト細胞(白色矢印)を示す。図7Cは、100 nM (n = 3)もしくは1 μM Ca2+ (n = 6)でかん流した細胞およびインタクトコントロール(n=9)からの平均蛍光消失(平均 ± s.e.m.)である。1 μM Ca2+でかん流した細胞は、100 nMもしくはインタクトコントロール細胞と比較して、より強い蛍光消失を生じた(図7Aおよび7B; 図7Cでの平均蛍光変化)。
【００９７】
FM1-43染料を載せた細胞からの電気生理学的記録を、蛍光消失の間のキャパシタンスの増加が存在するか否かを決定するために得た。図7Dは、蛍光測定と同時にパッチした細胞からの平均キャパシタンス変化(平均 ± s.e.m.)である(n = 3/集団)。1μM [Ca2+]iでのかん流は、膜キャパシタンスを増加させ(図7D)、それは、第2相の開発と相関した。これは、100 nM [Ca2+]iでかん流した細胞では観察されなかった(図7E)。図7Eは、図7Dの同じ細胞からの−80 mVで、TRPM4により起こる平均内部電流である。これらの結果は、蛍光消失および増加したキャパシタンスおよび第2相の出現のすべてが、一時的に、相関するので、TRPM4チャネルを含む小胞が、細胞膜にリクルートされたことを示す。
【００９８】
実施例5. TRPM4トランスロケーションおよび細胞膜との融合
TRPM4トランスロケーションを視覚化するために、TRPM4のFlagタグ化型を有するHEK-293細胞を、1 μMイオノマイシンで刺激する前に、cytotracker緑色染料を載せた。
【００９９】
共焦点顕微鏡実験のために、指数関数的に増殖するFlag-TRPM4トランスフェクトHEK-293細胞を、12 mmのガラスカバースリップ上に置き、一晩インキュベートした。24時間後、細胞を、1 μM Cell Tracker Green (Molecular Probe, Eugene, OR)を用いて、37℃で30分間、インキュベートした。細胞を次いで、エキソサイトーシスを誘導するために、1 μMイオノマイシンで活性化した。活性化反応を停止し、細胞を、100%メタノールで、−20℃で10分間、カバースリップをインキュベートすることにより固定した。細胞をPBSで洗浄し、非特異的な抗体の結合を減らすために、室温で45分間、ブロッキング溶液(PBS-0.5% FSG)でインキュベートした。あらゆる次の工程は、室温で行い、カバースリップを、PBS-0.02% FGSで3回洗浄した。一次抗体および二次抗体を、続けて、30分間、加えた。Flag抗体は、1/5000で使用し、二次抗体GAMAlexa 568は、1/6500で使用した。カバースリップを、次いで、antifade剤(Biomeda Corp., Foster City, CA)を含む10 mlの封入剤中で反転させた。共焦点像は、Krypton/Argonレーザーを装備したBio-Rad MRC 1024ES レーザー走査顕微鏡(Bio-Rad, Hercules, California)を用いて得た。
【０１００】
図8Aは、休止flag-TRPM4-TrexHEK293 (左パネル)、および1μMイオノマイシン処理細胞(右パネル)で、flag-TRPM4細胞内局在を示し、2.5mg/ml マウス抗Flag一次抗体(Sigma)を用いてflag-TRPM4発現を染色し(赤色)、Alexa-568結合抗マウス二次抗体(Invitrogen)を用いて視覚化した。細胞体を、固定前に、1 mM Cell Tracker (緑色)を用いて描いた。上部パネルは、細胞を介して0.65mm インクリメントで撮影した投影Z-スタック(stacked)像であり、下部パネルは、x軸部分を補間したz軸である(サイズバー=10 mm)。最初のTRPM4の点状局在およびイオノマイシン処理後の細胞膜局在への蛍光の遷移に留意して下さい。共焦点顕微鏡下で、投影スタック(projected stacks)は、エキソサイトーシス後、TRPM4の膜トランスロケーションを示した(赤色)(図8A)。
【０１０１】
図8Bは、[Ca2+]iを1 μMで緩衝化し、−80 mVで、ΔN-TRPM4発現細胞(n = 14)および非テトラサイクリン誘導コントロール細胞(n = 7)からの平均内部電流である(平均 ± s.e.m.)。ΔN-TRPM4構築体を発現するHEK-293細胞は、確かに、1 μM Ca2+でかん流したとき、コントロールと比較してかなり小さなTRPM4電流増幅を有したが(図8B)、キャパシタンス測定により示したとおり、エキソサイトーシスの明白な効果は存在しなかった(図8C)。図8Cは、ΔN-TRPM4発現細胞およびコントロール細胞からの標準化したキャパシタンス変化を示す。これらの実験は、ドミナントネガティブによるTRPM4電流の阻害を示し、エキソサイトーシスを変えない。
【０１０２】
実施例6. TRPM4電流でのアゴニスト誘導第2相
TRPM4が、グルコースおよびAVP刺激に対する応答でインスリン分泌をかなり減らしたという事実により、アゴニスト刺激を用いた電流動員(current recruitment)の第2相を調べた。図9Aは、TRPM4を過剰発現するTrexHEK293からのカルシウム測定を示す。細胞を、カルシウム測定実験で使用したプロトコールにしたがって、カルバコールで2回処理した(n = 5)。最初、TRPM4含有小胞のエキソサイトーシスを誘導し、第2に、細胞膜に存在するTRPM4の新規プールを活性化した。Ca2+イメージング技術を用いて、fura-2-AM搭載細胞を、200 s の間、1 mM カルバコールで刺激し、その後、洗浄し、第2の刺激を行った(図9A)。第1カルバコール適用は、[Ca2+]iの鋭いピークを誘導し、その後、エキソサイトーシスのために必要とされるCa2+流入による持続した第2相があり、TRPM4電流は、増幅が1 nA未満であった。洗浄期間後、第2カルバコール適用は、より小さいCa2+シグナルを生じたが、現在、TRPM4により生じる電流は、増幅が、約10 nAであった。図9Bは、非バッファーCa2+条件下、−80 mVで、TRPM4により生じる平均内部電流(平均 ± s.e.m.)である。カルバコールに対するCa2+応答は、第2適用の間、より小さいが、細胞膜で、増加したTRPM4により生じた電流は、ずっと大きい。コントロール細胞を、70 s (n = 3)または750 s (n = 3)で、カルバコールを用いて処理した。単一カルバコール刺激を受けたコントロール細胞は、第2相を開発できなかった(図9B)。
【０１０３】
図9Cは、二重カルバコール適用(70秒および750秒)を受けた代表的な細胞から得たTRPM4の典型的な電流電圧関係である。両時間に関する、カルバコール刺激前後の代表的な細胞からの電流電圧関係は、TRPM4のそれに似ている(図9)。図9Dは、図9Bの細胞からのキャパシタンスの平均的な変化である。これらの実験で、エキソサイトーシスは、カルバコール刺激後、細胞キャパシタンスの増加により確認された。
【０１０４】
実施例10. グリベンクラミドは、INSおよびHEK293細胞でTRPM4チャネルを活性化する
スルホニル尿素グリベンクラミドを、本明細書に記載した方法を用いて、TRPM4チャネルの活性に関して試験した。グリベンクラミドを、DMSO中、100mMストック溶液から外部生理食塩水に加え、圧力を、INS(図10)およびHEK293(図11)細胞に適用した。グリベンクラミドは、インスリン分泌ラットベータ細胞株INS-1でATP依存性Kチャネルを妨害し(図10A)、TRPM4チャネルを活性化する(図10B)。INS細胞は、膵臓β細胞のモデルである。同様の結果は、HEK293細胞で発現させたTRPM4チャネルで見られた(図11)。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年1月22日(2009.1.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2009538149000001.app
【国際調査報告】
2009538149.tif 000047
2009538149.tif 000048