(57)【要約】  Ｎ１，Ｎ４−ビス（ブタ−１，３−ジエニル）ブタン−１，４−ジアミン二塩酸塩（ＭＤＬ  ７２，５２７およびＮ，Ｎ’−ジ−２，３−ブタジエニル−１，４−ブタンジアミン二塩酸塩とも呼ばれる）またはその塩若しくは溶媒和物と、抗酸化剤としてのその使用と、ヒト男性における前立腺癌を予防および／または治療することにおけるその使用と、ヒトの前立腺組織または任意の他の体の組織における活性酸素種の濃度を減少させることにおけるその使用と、その化合物を製造するための方法。他の方法としては、治療量のＮ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミンまたはその塩若しくは溶媒和物のヒトへの投与を含む、ヒト前立腺組織または他の人体組織におけるアセチルポリアミン酸化酵素の阻害；並びに、酸化２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート蛍光：ＤＮＡ蛍光およびヒドロエチジン色素蛍光の比率を生体外または生体内で測定することを含む、ヒト前立腺組織または他のヒト若しくは動物の体の組織における酸化ストレスを判定するための方法；が含まれる。
2009538280.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療量のＮ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミンまたはその薬学上適した塩若しくは溶媒和物を投与することを含む、ヒト男性の前立腺における活性酸素種の濃度を低下させる方法。
【請求項２】
前記活性酸素種が、過酸化水素、スーパーオキシド、ヒドロキシラジカルおよび一酸化窒素からなる群より選択される１または複数のメンバーである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
治療量のＮ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミンまたはその薬学上適した塩若しくは溶媒和物を投与することを含む、男性のヒトにおける前立腺の癌を予防的に治療する方法。
【請求項４】
治療量のＮ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミンまたはその薬学上適した塩若しくは溶媒和物を投与することを含む、ヒト男性の前立腺における癌を治療する方法。
【請求項５】
前記塩が、二塩酸塩である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記治療量が、約１−１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内であり、前記治療量が、隔週ないし毎日の範囲内で投与される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記治療量が、約１０−４０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内であり、前記治療量が、毎週投与される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記治療量が、約２５ｍｇ／ｋｇ体重であり、前記治療量が隔週で投与される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
Ｎ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミンまたはその薬学上適した塩若しくは溶媒和物を含んでなる治療に有効な量の有効薬剤成分と、
担体、賦形剤、溶剤、添加剤、基剤、安定化剤、不活性希釈剤、結合剤、崩壊剤および結合剤からなる群から選択される１または複数の薬学上適したメンバーと、
を含んでなる経口医薬組成物。
【請求項１０】
素錠、コーティング錠、硬ゼラチンカプセル、軟ゼラチンカプセル、散剤、カプセル剤、顆粒剤、液剤、懸濁剤、エリキシル剤および乳剤からなる群から選択される形態である、請求項９記載の経口医薬組成物。
【請求項１１】
生体外で酸化２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート蛍光：ＤＮＡ蛍光の割合を測定することにより活性酸素種の濃度の低下を判定すること、をさらに含んでなる、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
生体外で酸化ヒドロエチジン蛍光：ＤＮＡ蛍光の割合を測定することにより活性酸素種の濃度の低下を判定すること、をさらに含んでなる、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
治療量のＮ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミンまたはその塩若しくは溶媒和物をヒトに投与することを含んでなる、ヒト男性の前立腺におけるアセチルポリアミン酸化酵素を阻害する方法。
【請求項１４】
前記アセチルポリアミン酸化酵素が、無処置ヒト男性と比較して、少なくとも５０％阻害される請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
生体外で酸化２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート蛍光：ＤＮＡ蛍光の割合を測定することを含んでなる、ヒト組織における酸化ストレスを判定する方法。
【請求項１６】
生体外で酸化ヒドロエチジン蛍光：ＤＮＡ蛍光の割合を測定することを含んでなる、ヒト組織における酸化ストレスを判定する方法。
【請求項１７】
前記ヒト組織が、腫瘍生検由来のヒト男性前立腺組織である、請求項１５または１６記載の方法。
【請求項１８】
前記ヒト組織が、前立腺以外の体の部分からの腫瘍生検から採取される、請求項１５または１６記載の方法。
【請求項１９】
オスのイヌの前立腺における癌を治療する方法であって、治療量のＮ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミンまたはその薬学上適した塩若しくは溶媒和物を前記イヌに投与することを含んでなる、方法。
【請求項２０】
ヒト組織における活性酸素種の濃度を低下させる方法であって、治療量のＮ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミンまたはその薬学上適した塩若しくは溶媒和物を前記ヒトに投与することを含んでなる、方法。
【請求項２１】
前記活性酸素種が、過酸化水素、スーパーオキシド、ヒドロキシラジカルおよび一酸化窒素からなる群から選択される１または複数のメンバーである、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
哺乳動物の細胞、器官または生検材料において活性酸素種の濃度を生体外または生体内で測定するための試薬キットであって、
ヒドロエチジン色素を含んでなる第１の成分、および
生細胞ＤＮＡ染色剤を含んでなる第２の成分
を含んでなる、試薬キット。
【請求項２３】
請求項２２記載の試薬キットを用いて、哺乳動物の細胞、器官または生検材料由来の組織において生体外で活性酸素種の濃度を測定する方法であって、
第１の組織を前記ヒドロエチジン色素で染色して第１の蛍光単位の値を出す工程、
第２の組織を前記生細胞ＤＮＡ染色剤で染色して第２の蛍光単位の値を出す工程、および
第１の蛍光単位の値を、第２の蛍光単位の値に対して標準化し、活性酸素種の濃度を定量する工程
を含んでなる、方法。
【請求項２４】
前記塩が、酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、酒石酸水素塩、臭化物、エデト酸カルシウム、カムシル酸塩、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、二塩酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストレート、エシレート、フマル酸塩、グルセプテート、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニレート、ヘキシルレゾルシン酸塩、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエート、ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メチルブロマイド、メチル硝酸塩、メチル硫酸塩、ムケート、ナプシレート、ミトレート、パモエート、パントテン酸塩、リン酸塩、二リン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、およびトリエチオジドからなる群より選択されるメンバーである、請求項１〜４、１１〜１４、または１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記塩が、酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、酒石酸水素塩、臭化物、エデト酸カルシウム、カムシル酸塩、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、二塩酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストレート、エシレート、フマル酸塩、グルセプテート、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニレート、ヘキシルレゾルシン酸塩、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエート、ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メチルブロマイド、メチル硝酸塩、メチル硫酸塩、ムケート、ナプシレート、ミトレート、パモエート、パントテン酸塩、リン酸塩、二リン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、およびトリエチオジドからなる群より選択されるメンバーである、請求項９または１０記載の経口医薬組成物。
【請求項２６】
前記治療量が、前立腺における１または複数の活性酸素種の濃度を、無処置対照ヒト男性における活性酸素種の濃度と比較して、少なくとも５０％低下させるのに十分な量である、請求項１記載の方法。
【請求項２７】
前記治療量が、以前に前立腺癌と診断されたまたは診断されていない無処置ヒト男性対照と比較して、前立腺癌の発生および／または再発を予防または抑制するのに十分な量である、請求項３記載の方法。
【請求項２８】
前記治療量が、前立腺癌の進行、罹患率および／または死亡率を停止または抑制するのに十分な量である、請求項４記載の方法。
【請求項２９】
前記治療量が、前立腺における１または複数の活性酸素種の濃度を、無処置ヒト組織における活性酸素種の濃度と比較して、少なくとも５０％低下させるのに十分な量である、請求項２０記載の方法。
【請求項３０】
生体外で酸化ヒドロエチジン蛍光：ＤＮＡ蛍光の割合を測定することにより活性酸素種の濃度低下を判定することをさらに含んでなる、請求項１記載の方法。
【請求項３１】
生体内で酸化２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート蛍光：ＤＮＡ蛍光の割合を測定することを含んでなる、ヒト男性前立腺組織における酸化ストレスを判定する方法。
【請求項３２】
前記生細胞ＤＮＡ染色剤が、
【化１】
2009538280.tif 000010
を含んでなる、請求項２２記載のキット。
【請求項３３】
前記生細胞ＤＮＡが、
【化２】
2009538280.tif 000011
を含んでなる、請求項２３記載の方法。
【請求項３４】
哺乳動物の細胞、器官または生検材料における活性酸素種の濃度を生体外または生体内で測定するための試薬キットであって、
２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート色素を含んでなる第１の成分、および
生細胞ＤＮＡ染色剤を含んでなる第２の成分
を含んでなる、試薬キット。
【請求項３５】
前記生細胞ＤＮＡが、
【化３】
2009538280.tif 000012
を含む請求項３４記載の試薬キット。
【請求項３６】
請求項３４記載のキットを用いて哺乳動物の細胞、器官または生検材料由来の組織において生体外で活性酸素種の濃度を測定するための方法であって：
第１の組織を２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート色素で染色して、第１の蛍光単位の値を出す工程、
第２の組織を前記生細胞ＤＮＡ染色剤で染色して、第２の蛍光単位の値を出す工程、および
第１の蛍光単位の値を第２の蛍光単位の値に対して標準化し、活性酸素種の濃度を定量する工程
を含んでなる、方法。
【請求項３７】
前記生細胞ＤＮＡが：
【化４】
2009538280.tif 000013
を含んでなる、請求項３６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権利に関する記載
本発明は次の機関により授与された米国政府補助金により行われた：ＡＲＭＹ／ＭＲＭＣ  ＤＡＭＤ１７−０２−１−０１６６およびＮＩＨ  ＤＫ０６５３０３。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本願は、２００６年５月３日に出願された米国特許出願第６０／７９７，１４２号の優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれたものとする。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
進行性ホルモン抵抗性転移性前立腺癌は米国に居住する男性の癌死亡の第２の主要な原因である。２００６年には２７，０００人以上の米国男性が転移性前立腺癌により死亡したとされる。現在、臨床で用いられるほとんどの化学療法薬は前記疾患の治療において限定的なものである。従って、転移性前立腺癌を治療するための新たな治療薬に対する大きな需要が存在する。
【０００４】
初期診断の時点において、ほとんどの前立腺癌患者は、手術、放射線およびアンドロゲン除去療法後に速やかに後退するアンドロゲン依存性腫瘍を有している。しかし、この癌はこのような患者のかなりの割合において数年後に再発する。再発は進行性ホルモン抵抗性転移性疾患の形態で現れる。現在のところ、この疾患、特に進行した状態のものを治療または予防するための効果的な療法は存在しない。従って、前立腺癌の再発および進行を抑制するための薬剤を開発することに対する実質的に差し迫った要求が存在する。
【０００５】
前立腺組織における酸化ストレスが前立腺癌の発生および進行の主要原因であることが理論上想定されている。従って、酸化ストレスを治療的に減少させるための薬剤を発見および開発することに対する差し迫った要求がさらに存在する。
【０００６】
公知の疫学的および生化学的証拠により、前立腺組織における酸化ストレスが前立腺癌の発生および進行の主要原因の１つであり、抗酸化剤によって前立腺発癌を抑制しうることが示唆されている。さらに、アンドロゲンが正常および悪性の前立腺細胞においてＲＯＳの主要な誘導物質の１つであることが知られている（Wilding, G., Endocrine Control of Prostate Cancer, Cancer Surveys, 23:43-62 (1995)を参照）。また、ポリアミン異化経路内において、アセチルポリアミン酸化酵素（「ＡＰＡＯ（acetyl polyamine oxidase）」）の再利用がＲＯＳ産生の主要な供給源となっていることも知られている（Cohen, S. S., A Guide to the Polyamines, Oxford Univ. Press, Oxford UK: 296-319 (1998); Schwartz, B et al, A New Model for Disruption of the Ornithine Decarboxylase Gene, SPE1, in Saccharomyces Cerevisiae Exhibits Growth Arrest and Genetic Instability at the MAT Locus, Biochem J., Nov 15:312 (Pt. 1):83-90 (1995); Schipper RG et al, Antitumor Activity of the Polyamine Analog N(1),N(11)-diethylnorspermine Against Human Prostate Carcinoma Cells, The Prostate, 44(4):313-21 (2000); Casero, RA et al, The Role of Polyamine Catabolism in Anti-tumour Drug Response, Biochem. Soc. Trans., Apr:31(2):361-5 (2003); Ha, HC et al, The Role of Polyamine Catabolism in Polyamine Analogue-Induced Programmed Cell Death, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94(21):11557-62 (1997);および、Bey, P et al, N- 2,3-Butadienyl-1,4-butanediamine Derivatives: Potent Irreversible Inactivators of Mammalian Polyamine Oxidase, J. Med. Chem, 28(1):1-2 (1985)を参照）。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の１つの局面は、治療量のＮ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミンまたはその薬学上適した塩若しくは溶媒和物を投与する工程または行為を含む、ヒト男性の前立腺における活性酸素種の濃度を減少させる方法である。
【０００８】
上記の方法の例示的態様においては、前記治療量は、前立腺中の１または複数の活性酸素種の濃度を、無治療対照ヒト男性における活性酸素種の濃度と比べ少なくとも５０％低下させるのに十分な量である。
【０００９】
上記の方法の例示的態様においては、前記方法はさらに、生体外で（ex vivo）酸化ヒドロエチジン蛍光：ＤＮＡ蛍光の比率を測定することにより活性酸素種の濃度低下を判定する工程または行為を含む。
【００１０】
上記の方法の他の例示的態様においては、前記方法はさらに、生体外で酸化２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート蛍光：ＤＮＡ蛍光の比率を測定することにより活性酸素種の濃度低下を判定する工程または行為を含む。
【００１１】
上記の方法の他の例示的態様においては、前記方法はさらに、生体外で酸化ヒドロエチジン蛍光：ＤＮＡ蛍光の比率を測定することにより活性酸素種の濃度低下を判定する工程または行為を含む。
【００１２】
任意の上記の方法の他の例示的態様において、前記活性酸素種は、過酸化水素、スーパーオキシド、ヒドロキシラジカルおよび一酸化窒素のうちの１または複数であり、ここで「スーパーオキシド」は１個の余分の電子を有する酸素分子である。例えば、スーパーオキシド分子は細胞のミトコンドリアで形成されたＲＯＳでありうる。
【００１３】
本発明の他の局面は、ヒト男性の前立腺におけるアセチルポリアミン酸化酵素を阻害する方法であって、該方法は治療量のＮ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミンまたはその塩若しくは溶媒和物を該ヒトに投与する工程または行為を含む。例示的態様においては、前記アセチルポリアミン酸化酵素は無処置のヒト男性と比較して少なくとも５０％阻害される。
【００１４】
本発明の他の局面は、男性のヒトにおける前立腺の癌を予防的に治療する方法であって、該方法は治療量のＮ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミンまたはその薬学上適した塩若しくは溶媒和物を投与する工程または行為を含む。
【００１５】
上記方法の例示的態様において、前記治療量は、以前に前立腺癌と診断されたまたは診断されていない無処置ヒト男性対照と比較して前立腺癌の発生および／または再発を予防または抑制するのに十分な量である。
【００１６】
本発明の他の局面は、ヒト男性の前立腺の癌を治療する方法であって、該方法は治療量のＮ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミンまたはその薬学上適した塩若しくは溶媒和物を投与する工程または行為を含む。
【００１７】
上記方法の例示的態様において、前記治療量は、前立腺癌の進行、罹患率および／または死亡率を停止または抑制するのに十分な量である。
【００１８】
任意の上記の方法の例示的態様において、前記塩は酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、酒石酸水素塩、臭化物、エデト酸カルシウム、カムシル酸塩（camsylate）、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、二塩酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストレート、エシレート、フマル酸塩、グルセプテート、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニレート（glycollylarsanilate）、ヘキシルレゾルシン酸塩（hexylresorcinate）、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエート（hydroxynaphthoate）、ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩（lactobionate）、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩（mesylate）、メチルブロマイド、メチル硝酸塩、メチル硫酸塩、ムケート（mucate）、ナプシレート（napsylate）、ミトレート（mitrate）、パモエート、パントテン酸塩、リン酸塩、二リン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩（teoclate）、またはトリエチオジド（triethiodide）である。
【００１９】
任意の上記方法の他の例示的態様において、前記塩は二塩酸塩である。
【００２０】
任意の上記方法の他の例示的態様において、前記治療量は約１−１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内であり、該治療量は隔週ないし毎日の範囲で投与される。
【００２１】
任意の上記方法の他の例示的態様において、前記治療量は約１０−４０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内であり、該治療量は毎週投与される。
【００２２】
任意の上記方法の他の例示的態様において、前記治療量は約２５ｍｇ／ｋｇ体重であり、該治療量は隔週で投与される。
【００２３】
本発明の他の局面は、Ｎ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミンまたは薬学上適したその塩若しくは溶媒和物を含んでなる治療上有効量の有効薬剤成分と、担体、賦形剤、溶剤、添加剤、基剤、安定化剤、不活性希釈剤、結合剤、崩壊剤および結合剤からなる群より選択される1または複数種の薬学上適したメンバーとを含んでなる経口医薬組成物である。
【００２４】
前記経口医薬組成物の例示的態様において、前記塩は酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、酒石酸水素塩、臭化物、エデト酸カルシウム、カムシル酸塩（camsylate）、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、二塩酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストレート、エシレート、フマル酸塩、グルセプテート、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニレート（glycollylarsanilate）、ヘキシルレゾルシン酸塩（hexylresorcinate）、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエート（hydroxynaphthoate）、ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩（lactobionate）、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩（mesylate）、メチルブロマイド、メチル硝酸塩、メチル硫酸塩、ムケート（mucate）、ナプシレート（napsylate）、ミトレート（mitrate）、パモエート、パントテン酸塩、リン酸塩、二リン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩（teoclate）、またはトリエチオジド（triethiodide）である。
【００２５】
前記経口医薬組成物の例示的態様において、該組成物は、素錠、コーティング錠、硬ゼラチンカプセル、軟ゼラチンカプセル、散剤、カプセル剤、顆粒剤（pellet）、液剤、懸濁剤、エリキシル剤、または乳剤の形態である。
【００２６】
本発明の他の局面は、酸化２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート蛍光：ＤＮＡ蛍光の比率を生体外で測定する工程または行為を含む、ヒト組織における酸化ストレスを判定する方法である。
【００２７】
本発明の他の局面は、酸化ヒドロエチジン蛍光：ＤＮＡ蛍光の比率を生体外で測定する工程または行為を含む、ヒト組織における酸化ストレスを判定する方法である。
【００２８】
本発明の他の局面は、酸化２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート蛍光：ＤＮＡ蛍光の比率を生体内で（in vivo）測定する工程または行為を含む、ヒト男性前立腺組織における酸化ストレスを判定する方法である。
【００２９】
上記方法の例示的態様において、前記ヒト組織は腫瘍生検から得られたヒト男性前立腺組織である。
【００３０】
上記方法の他の例示的態様において、前記ヒト組織は前立腺以外の体の部位から得られた腫瘍生検から採取される。
【００３１】
本発明の他の局面は、オスのイヌの前立腺の癌を治療する方法であって、治療量のＮ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミンまたはその薬学上適した塩若しくは溶媒和物を該イヌに投与する工程または行為を含む方法である。
【００３２】
本発明の他の局面は、ヒト組織における活性酸素種の濃度を低下させる方法であって、治療量のＮ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミンまたはその薬学上適した塩若しくは溶媒和物を該ヒトに投与する工程または行為を含む方法である。
【００３３】
上記方法の例示的態様において、前記の治療量は、無治療ヒト組織の活性酸素種の濃度と比較して、前立腺内の１または複数の活性酸素種の濃度を少なくとも５０％低下させるのに十分な量である。
【００３４】
上記方法の例示的態様において、前記活性酸素種は過酸化水素、スーパーオキシド、ヒドロキシラジカルおよび一酸化窒素のうちの１または複数である。
【００３５】
本発明の他の局面は、ヒドロエチジン色素を含んでなる第１の成分および生細胞ＤＮＡ染色剤を含んでなる第２の成分を含んでなる、哺乳動物の細胞、器官または生検材料において活性酸素種の濃度を生体外または生体内で測定するための試薬キットである。
【００３６】
上記試薬キットの例示的態様において、前記生細胞ＤＮＡ染色剤は：
【化１】
2009538280.tif 000003
を含む。
【００３７】
本発明の他の局面は、上記のキットを用いて哺乳動物の細胞、器官または生検材料由来の組織において生体外で活性酸素種の濃度を測定するための方法であって、該方法は第１の組織をヒドロエチジン色素で染色して第１の蛍光単位の値を出し、第２の組織を前記生細胞ＤＮＡ染色剤で染色して第２の蛍光単位の値を出し、次いで第１の蛍光単位の値を第２の蛍光単位の値に対して標準化し、活性酸素種の濃度を定量する工程または行為を含む。
【００３８】
上記方法の例示的態様において、前記生細胞ＤＮＡは：
【化２】
2009538280.tif 000004
を含む。
【００３９】
本発明の他の局面は、２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート色素を含んでなる第１の成分および生細胞ＤＮＡ染色剤を含んでなる第２の成分を含んでなる、哺乳動物の細胞、器官または生検における活性酸素種の濃度を生体外または生体内で測定するための試薬キットである。
【００４０】
上記試薬キットの例示的態様において、前記生細胞ＤＮＡは：
【化３】
2009538280.tif 000005
を含む。
【００４１】
本発明の他の局面は、前記の試薬キットを用いて哺乳動物の細胞、器官または生検由来の組織において生体外で活性酸素種の濃度を測定するための方法であって、該方法は第１の組織を２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート色素で染色して第１の蛍光単位の値を出し、第２の組織を前記生細胞ＤＮＡ染色剤で染色して第２の蛍光単位の値を出し、次いで第１の蛍光単位の値を第２の蛍光単位の値に対して標準化し、活性酸素種の濃度を定量する工程または行為を含む。
【００４２】
上記方法の例示的態様において、前記生細胞ＤＮＡは：
【化４】
2009538280.tif 000006
を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
好ましい態様の詳細な説明
本発明はＮ１，Ｎ４−ビス（ブタ−１，３−ジエニル）ブタン−１，４−ジアミン二塩酸塩（ＭＤＬ  ７２，５２７およびＮ，Ｎ’−ジ−２，３−ブタジエニル−１，４−ブタンジアミン二塩酸塩とも呼ばれる）またはその塩若しくは溶媒和物と、抗酸化剤としてのその使用と、ヒト男性における前立腺癌を予防および／または治療することにおけるその使用と、ヒトの前立腺組織または任意の他の体の組織における活性酸素種の濃度を減少させることにおけるその使用と、その化合物を製造するための方法に向けられる。他の方法としては、治療量のＮ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミンまたはその塩若しくは溶媒和物のヒトへの投与を含む、ヒト前立腺組織または他の人体組織におけるアセチルポリアミン酸化酵素の阻害；並びに、酸化２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート蛍光：ＤＮＡ蛍光およびヒドロエチジン色素蛍光の割合を生体外または生体内で測定することを含む、ヒト前立腺組織または他のヒト若しくは動物の体の組織における酸化ストレスを判定するための方法；等が挙げられる。本発明はヒトまたはイヌ等の任意の哺乳動物に生体外または生体内で用いても良い。
【００４４】
本発明は、前立腺組織中の酸化ストレスを特異的に減少させ、それにより前立腺癌の進行を、特にハイリスク患者において、予防および／または治療する化学療法薬を含む。活性酸素種（「ＲＯＳ」）は他の器官と比べ前立腺において相対的に高い水準で産生されていることが立証されている。ＲＯＳとしては過酸化水素、スーパーオキシド、ヒドロキシラジカルおよび一酸化窒素等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【００４５】
いずれの理論にも制限されることなく、本発明のＮ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミン化合物の投与は、アセチルポリアミン酸化酵素（「ＡＰＡＯ」）およびポリアミン酸化酵素（ＰＡＯ）プロセスを、アンドロゲン誘導性酸化ストレス（すなわち、ＲＯＳの産生）の生化学的経路の特異的な阻害により抑制し、それにより前立腺組織への抗酸化療法を標的にすると理論上想定される。さらに、本発明のＮ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミン化合物の投与は、有害な物質効果（material effect）をアンドロゲンシグナル伝達経路に対して及ぼさないことが理論上想定される。Ｎ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミンの構造を下記に示す。
【化５】
2009538280.tif 000007
好ましくは、Ｎ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミンの遊離型、塩または溶媒和物がヒトまたは非ヒト哺乳動物に投与される。該塩または溶媒和物の形態は、どのような薬学上適した塩または溶媒和物であってもよい。好ましくは、前記の薬学上適した塩の形態はＮ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミン・２ＨＣｌである。好ましくは、前記の薬学上適した溶媒和物の形態は、薬学上適した溶媒、例えば極性溶媒、好ましくは水、に溶解したＮ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミン・２ＨＣｌである。
【００４６】
従って、本発明のＮ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミン化合物の投与は首尾よく前立腺腫瘍の発生を遅らせ、広く受け入れられているマウス前立腺の症状発現前のトランスジェニック腺癌（transgenic adenocarcinoma of mouse prostate）（「ＴＲＡＭＰ」）モデルにおいて全生存率を上昇させた（例えば、Garcia, GE et al, 2-Methoxyestradiol Inhibits Prostate Tumor Development in Transgenic Adenocarcinoma of Mouse Prostate: Role of Tumor Necrosis Factor-α-Simulated Gene 6, Clin Cancer Res 12(3) (1Feb2006) を参照）。ＴＲＡＭＰモデルは自然に前立腺癌を発症し、該疾患により死亡する。本発明のＮ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミン化合物の投与により、培養されたアンドロゲン依存性のヒト腫瘍細胞株における、および前記ＴＲＡＭＰ動物の前癌病変部（生体内）における、酸化ストレスが顕著に低下した。本発明のＮ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミン化合物は、以前に原発性前立腺癌を治療した患者における再発を予防するための補助療法として投与してもよい。
【００４７】
ＲＯＳは他の器官よりも前立腺においてより高い水準で産生されていることが報告されている。ＲＯＳは増殖またはアポトーシスと関連した遺伝子を、ＤＮＡに対する直接的な変異効果または遺伝子発現の改変により変化させる。前立腺組織中の高いＲＯＳ濃度は、前立腺癌の発生および進行の両者において主要な役割を果たしている場合がある。ＲＯＳは脂質過酸化を引き起こし、チオール依存性酵素の活性を改変し、またはＤＮＡに損傷を与える場合がある。
【００４８】
低濃度のＲＯＳは腫瘍を誘発するマイトジェンとして働くか、またはＲＯＳ産生による酸化還元の改変は特定のシグナル伝達経路において主要な役割を演じている。高脂肪食は脂質過酸化を増進し（それによりＲＯＳを産生し）、このため発展途上国と比べ先進国では前立腺癌の発生率が相対的に高くなっている。既報のデータは、食事に細胞のＲＯＳ濃度を減少させるβカロチン、βリコピン、ビタミンＥおよびセレン等の食物抗酸化剤が含まれていると前立腺癌の発生率が減少することを支持している。
【００４９】
近年、実験的および臨床的証拠から、酸化ストレスの増加が前立腺癌の発症率の増加と直接関連していることが示唆されている。免疫組織化学を用い、外科的に切除された悪性および正常ヒト前立腺組織の記録パラフィンブロック（archival paraffin block）内において、酸化ストレスが誘導したＤＮＡ塩基への酸化的損傷が測定された。悪性および転移性ヒト前立腺腫瘍組織では、ＲＯＳにより誘発されたタンパク質およびＤＮＡ塩基の変異が正常な前立腺組織よりも多かった。免疫組織化学はさらに、ＤＮＡおよびタンパク質への酸化的損傷がＴＲＡＭＰ前立腺内の前癌病変部において、隣接の正常前立腺組織と比べて有意に大きいことも示した。
【００５０】
アンドロゲンは前立腺組織において酸化ストレスを誘発する天然の因子として同定されている。ヒドロエチジン色素はＲＯＳによる酸化の際に蛍光を発する。ＬＮＣａＰヒト腫瘍異種移植片における高い酸化ストレスの存在がオスヌードマウスにおいて生体内で観察されている。担癌マウスにおけるこの高水準の酸化ストレスは、アンドロゲンの自然発生源を除く去勢手術後７２時間以内に減少した。
【００５１】
前立腺組織内におけるＲＯＳのアンドロゲン誘導性の産生に関する正確な分子機構は不明である。ＣａＰ細胞において、ＲＯＳ産生の増加をもたらす他の経路が報告されている：例えば、核の転写因子（低酸素誘導転写因子（「ＨＩＦ−１α」）、ＮＦ−κＢ、ＡＰ−１等）の発現；および、還元剤であるグルタチオンの総濃度の減少を引き起こす、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ発現の抑制等。示唆された経路は相互排他的ではない可能性がある。
【００５２】
スペルミジンおよびスペルミンはポリアミン類であり、ここで前駆体ジアミンのプトレシンは全ての哺乳動物細胞中に存在する有機カチオンである。このようなポリアミン類は細胞の成長および増殖に不可欠である。健康な男性の精液は主に前立腺分泌中に産生される大量のスペルミン（〜３ｍＭ）を含む。
【００５３】
図１に示すように、ポリアミンの異化はＮ−アセチルポリアミン類を産生するスペルミジン／スペルミン  Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（「ＳＳＡＴ」）プロセスにより制御される。Ｎ−アセチルポリアミン類は構成酵素であるＡＰＡＯにより酸化される。ＡＰＡＯはこのアセチルポリアミン類の酸化中にＦＡＤＨ２へと還元されるＦＡＤを使用する。ＦＡＤＨ２はＨ２Ｏ２（すなわちＲＯＳ）の産生を経てＦＡＤに戻って再利用され、活性ＡＰＡＯ酵素を再生する。（特定の転写因子の誘導および総細胞グルタチオン量の低下による）ポリアミン異化酵素の発現量の増加は、ポリアミン異化による細胞の酸化ストレスを高めうる。
【００５４】
図１に示すように、ＳＳＡＴはポリアミン異化経路の律速酵素である。ＳＳＡＴにより産生されたアセチルポリアミン類はＡＰＡＯ酸化および付随するＲＯＳ産生のための基質として機能する。近年のＤＮＡマイクロアレイおよびｑＲＴ−ＰＣＲデータは、アンドロゲン依存性ＬＮＣａＰヒト前立腺癌細胞においてアンドロゲンがＳＳＡＴ遺伝子の３０−５０倍の過剰発現を誘導することを示唆している。
【００５５】
生理的濃度のアンドロゲンがアンドロゲン依存性前立腺癌細胞においてＲＯＳ産生を誘導することが当業者に広く受け入れられている。２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（ＤＣＦ）酸化アッセイを用いて、前立腺細胞株のＲＯＳ濃度の一般的な指標である酸化ＤＣＦ：ＤＮＡ蛍光の割合を測定した。そのデータおよび結果を表１に示す。
【表１】
2009538280.tif 000008
【００５６】
ＬＮＣａＰヒト前立腺癌細胞を１％ＦＢＳおよび４％活性炭処理済（charcoal stripped）ＦＢＳ（Ｆ１／Ｃ４）のアンドロゲン除去培地中で、１ｎＭの合成アンドロゲン類似体Ｒ１８８１の存在または不在下で、１５μＭの抗酸化剤α−トコフェロール（ビタミンＥ）前処理を行ってまたは行わずに、培養した。ＬＮＣａＰおよびＤＵ−１４５ヒト前立腺癌細胞のＲＯＳ濃度を、公知のＳＳＡＴ誘導物質であるＢＥ−３−３−３を用いて、ＭＤＬ  ７２，５２７の２５μＭ処理を伴ってまたは伴わずに、処理したものについて示す。
【００５７】
表１のデータは、全ての前立腺癌細胞株中のＲＯＳ濃度が正常な前立腺上皮細胞で観察されたその濃度よりも相対的に高いことを示唆している。表１のデータはまた、ＬＮＣａＰ細胞がＤＵ−１４５細胞よりも相対的に多くのＲＯＳを有していること；アンドロゲンの生理的濃度に相当する１ｎＭの濃度のアンドロゲン類似体Ｒ１８８１がＬＮＣａＰ細胞中のＲＯＳ濃度を上昇させること；致死未満量のＢＥ−３−３−３（１μＭ）が両細胞株中のＲＯＳ濃度を上昇させること；並びにＲＯＳ濃度の増加がビタミンＥおよび／またはＭＤＬ  ７２，５２７を用いた前処理によって逆転／緩和／予防されること；も示唆している。
【００５８】
図１に模式的に示すように、前立腺細胞における異常に高いポリアミン濃度およびＳＳＡＴの高度な誘導はＲＯＳ濃度の大幅な増加を誘発し得る。対照無処理ＬＮＣａＰ細胞、および１ｎＭアンドロゲン類似体Ｒ１８８１で９６時間処理した細胞中における遺伝子発現のＤＮＡマイクロアレイ分析を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｇｅｎｅｃｈｉｐ  Ａｒｒａｙｓを用いて２回行った。両実験において、ＳＳＡＴは明らかに無処理対照細胞と比べＲ１８８１処理したＬＮＣａＰ細胞において高度に過剰発現していると認められた。過剰発現（対照に対して１０倍超）している遺伝子のリスト中、ＳＳＡＴはＲＯＳ生成経路と関連した唯一の酵素であった。
【００５９】
ＤＮＡマイクロアレイおよびｑＲＴ−ＰＣＲを用いて生成したデータを図３に示す。各データ点は３重にして２回反復した、６つの同一処理したウェルからの測定値の平均である。ｑＲＴ−ＰＣＲのデータは、Ｒ１８８１処理したＬＮＣａＰ細胞のＳＳＡＴ遺伝子発現量が無処理対照細胞と比較して５０倍に上昇していることを示す。さらに注目すべきは、ＳＳＡＴは（酸化ストレスを誘発する）１ｎＭ  Ｒ１８８１で処理した細胞中でのみ過剰発現しており、酸化ストレスの増加が観察されなかった０．０５ｎＭ  Ｒ１８８１で処理した細胞においては過剰発現していなかったということである。従って、アンドロゲン誘導性ＳＳＡＴ遺伝子発現はアンドロゲン依存性前立腺癌細胞における細胞ＲＯＳ産生に対する重大な寄与因子であると想定される。
【００６０】
図４に、ビスエチルノルスペルミン（ＢＥ−３−３−３）を用いた細胞ＲＯＳ産生におけるＳＳＡＴの役割を示す。ＢＥ−３−３−３はアンドロゲン依存性ＬＮＣａＰおよびアンドロゲン非依存性ＤＵ−１４５前立腺癌細胞を含む各種細胞株においてＳＳＡＴ酵素活性を誘導することが知られている。ＤＵ−１４５細胞をＢＥ−３−３−３の濃度を増加させて７２時間処理した。９６ウェルプレートにおける２’−７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート色素（「ＤＣＦ」）酸化アッセイを用いて酸化ストレスを測定した。各データ点は３重にして２回反復した、６つの同一処理したウェルの測定値の平均である。このデータは、ＢＥ−３−３−３が（非細胞毒性量、＜１μＭにおいて）ポリアミン酸化を増加させ、細胞ＲＯＳ濃度を上昇させること、およびポリアミン酸化が前立腺細胞において酸化ストレスが生成する際の重大な因子であることを証明している。 
【００６１】
図５Ａ−５Ｅに、本発明のＮ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミン化合物で（Ｒ１８８１処理を伴ってまたは伴わずに）ＬＮＣａＰ細胞を前処理した際の、ポリアミンおよびアセチルポリアミン濃度に対する効果を示す。ＨＰＬＣ定量法を用いて、１ｎＭ  Ｒ１８８１±２５μＭ  ＭＤＬ  ７２，５２７で処理したＬＮＣａ細胞中のポリアミンおよびアセチルポリアミンの濃度を定量した。各データ点は３回の独立の実験から回収された細胞ペレットの２回の測定値の平均である。図５Ａ−５Ｅは、Ｒ１８８１処理が（１ｎＭの最終濃度、９６時間で）有意にプトレシンおよびスペルミジンの濃度を上昇させ、スペルミンの濃度を低下させ、またＮ−アセチルスペルミジンおよびＮ−アセチルスペルミンの濃度を上昇させることを示している。
【００６２】
図５Ａ−５Ｅは、Ｒ１８８１処理がＳＳＡＴ  ｍＲＮＡ濃度を増加させ、同時にＳＳＡＴ酵素活性を増進するという結論を支持していると言える。Ｒ１８８１細胞においては、本発明のＮ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミン化合物による前処理でほぼ完全に（１ｎＭ  Ｒ１８８１による）プトレシンおよびスペルミジン濃度の上昇の誘導が阻害され、また、スペルミン濃度を感知できるほど変化させることなくＮ−アセチルスペルミジンおよびＮ−アセチルスペルミン濃度の有意な上昇がもたらされた。本発明のＮ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミン化合物で処理された細胞において、Ｎ−Ａｃ−スペルミン濃度の有意でないわずかな上昇が観察された。また、２５μＭのＭＤＬ  ７２，５２７で処理された細胞は効率良くまた効果的にＡＰＡＯ活性を阻害することも観察された。観察されたアセチルポリアミン濃度の大きな上昇は、ＭＤＬ  ７２，５２７の投与がアンドロゲン処理細胞中のＳＳＡＴ遺伝子発現および／または酵素活性に対して物質効果を有しないことも示唆している。
【００６３】
図６に示すのは、２５μＭのＭＤＬ  ７２，５２７投与の前処理が効果的にアンドロゲン誘導性のＲＯＳ産生をＬＮＣａＰ細胞中で阻害することを証明するデータである。ＭＤＬ  ７２，５２７前処理を伴っておよび伴わずに、Ｒ１８８１の濃度を９６時間上昇させて、ＬＮＣａＰ細胞中のＲＯＳ濃度を誘導した。結果はＤＣＦ酸化アッセイ法を用いて測定した。各データ点は３重にして２回反復した、６つウェルからの測定値の平均である。前記Ｎ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミン化合物で前処理した細胞のＲＯＳ濃度に関するデータはＭＤＬ  ７２，５２７単独投与の効果に対して標準化した。図６のデータは、ＭＤＬ  ７２，５２７（１ｎＭ以上）を用いた前処理が効果的にＲ１８８１誘導性ＲＯＳ産生を阻害することを示唆している。このデータはさらに、ＭＤＬ  ７２，５２７を用いたポリアミン酸化酵素の阻害がアンドロゲン依存性前立腺癌細胞における細胞ＲＯＳ濃度を有意に低下させること、およびＭＤＬ  ７２，５２７がアンドロゲン依存性ヒト前立腺癌細胞中のアンドロゲン誘導性ＲＯＳ産生を特異的に阻害する効果的な抗酸化剤であることも示唆している。
【００６４】
図７Ａ−７Ｄは前記Ｎ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミン化合物が生体内でＴＲＡＭＰｘＦＶＢマウスの前立腺組織における酸化ストレスを減少させることを示す。ヒドロエチジン（ＨＥｔ）色素酸化を用いた方法を、前立腺腫瘍における酸化ストレスを生体内で観察するために標準化した。ＨＥｔは特異的にＲＯＳにより酸化されて２−ヒドロキシエチジウムとなる（４１）。２−ヒドロキシエチジウムは４８８ｎｍの励起および５９５ｎｍの発光周波数で蛍光を発する。ＨＥｔ色素は屠殺の少なくとも１時間前にマウスに安全に注射してもよい。２０週齢のＴＲＡＭＰｘＦＶＢマウスにＨＥｔ（８ｍｇ／ｋｇ体重）を屠殺１時間前に注射した。屠殺後、前立腺を回収し、ホルマリン固定し、パラフィン法埋した。パラフィンブロックをミクロトームで切片にし、組織を脱パラフィン処理し、蛍光顕微鏡を用いて観察し、デジタル画像解析を用いて分析した。この画像を図７Ａ−７Ｄに示す。
【００６５】
図７Ａに、溶媒のみで処理したマウスからの前立腺切片の位相差顕微鏡像を示す。図７Ｂに、図７Ａに示した前立腺切片の蛍光顕微鏡像を示す。図７Ｃに、２５ｍｇ／ｋｇ体重のＭＤＬ  ７２，５２７の６回投与で処理し、その２週間後に屠殺したマウスからの前立腺切片の位相差顕微鏡像を示す。図７Ｄに、図７Ｃに示した前立腺切片のＨＥｔ蛍光顕微鏡像を示す。図７Ａ−７Ｄに示した写真はＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＨ−２蛍光顕微鏡で４８０ｎｍ励起／６００ｎｍ発光フィルターを用い、Ｓｏｎｙ  ＤＳＣ−Ｖ３デジタルカメラセット（Ｆ２．８、３０秒間露出）との組み合わせで２０ｘの倍率において撮影した。
【００６６】
（ＨＥｔ酸化による）強い蛍光が前立腺管腔において全般的に、特に前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）を形成し始めた浸潤細胞の境界部において、観察された。一方、ＭＤＬ  ７２，５２７で処理したＴＲＡＭＰマウス前立腺組織において色素酸化は検出されず（図７Ｄ）、これは続いて行ったＨ＆Ｅ染色で確認された。図７Ａ−７Ｄに示すデータはＮ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミン化合物がＰＩＮの形成を開始したＴＲＡＭＰマウスの前立腺管腔内の酸化ストレスを生体内で有意に抑制することを示唆しており、このことはさらに、ポリアミン酸化が、培養ヒト前立腺細胞内における、およびＴＲＡＭＰマウスの前立腺管腔（生体内）における、酸化ストレスの重大な寄与因子であることを示唆している。
【００６７】
ＤＣＦＨ酸化アッセイ。９６ウェル培養物または新しく切除したマウスまたはヒト組織を、２’−７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート色素（ＤＣＦ）（Molecular Probes, Inc., Eugene, OR）を用いた無傷細胞におけるＲＯＳ濃度の推定のためにアッセイした。切除した組織または細胞培養物を、あらかじめ３７℃に加温した２００μＬのクレブズリンガー緩衝液（１１６ｍＭ  ＮａＣｌ、４．２ｍＭ  ＫＣｌ，２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．６ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２２ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、および１１ｍＭ  Ｄ−グルコース）で洗浄し、１０μｇ／ｍＬ（最終濃度）のＤＣＦ色素を含んだ１００μＬのクレブズリンガー緩衝液中で３７℃、４５分間インキュベートした。各９６ウェル培養プレートをＣｙｔｏＦｌｕｏｒ  ２３５０（登録商標）プレートスキャナー（Applied Biosystems, Foster City, CA）上で、４８５励起／５３０発光周波数を用いてスキャンした。各組織試料についてスキャンを行った。
【００６８】
ヒドロエチジンアッセイ。ヒドロエチジン色素をＤＭＳＯ（１００ｍｇ／ｍｌ）中に溶解し、注射前に等張食塩水中で１ｍｇ／ｍｌに希釈した。該色素を屠殺１時間前に尾静脈からマウスに静脈注射したか（生体内）、または新たに切除したヒトおよびマウス組織を等張ＰＢＳ中で洗浄し、処理前にあらかじめ３７℃に加温したクレブズリンガー緩衝液中の８ｍｇ／ｍｌ色素溶液中に６０分間３７℃で浸漬した（生体外）。生体内アッセイにおいては、腫瘍および他の組織を回収する前にマウスを安楽死させ、瀉血した。処理後の組織をパラフィンブロック中に包埋した。該ブロックのミクロトーム切片をスライド上にマウントし、４８８ｎｍ励起／５９５ｎｍ発光周波数で蛍光を定量した。
【００６９】
ＤＮＡアッセイ。
【化６】
2009538280.tif 000009
を含んだＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２色素を含む５０μＬのクレブズリンガー緩衝液（４０μｇ／ｍＬ）を、蛍光測定の４５分前に各ウェルに、および６０分前に全ての組織に、添加した。ＤＮＡ蛍光を３６０ｎｍ励起／４６０ｎｍ発光で測定した。全てのＤＣＦまたはヒドロエチジン蛍光は酸化ストレスの正確な定量のためにＤＮＡ蛍光に対して標準化した。
【００７０】
ＢＤ  Ｂｉｏｉｍａｇｅｒ。全ての蛍光測定値はＢＤ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｂｉｏｉｍａｇｅｒ自動化共焦点リアルタイム単一細胞動的終点画像システム（automated, confocal, real-time, single cell kinetic and endpoint imaging system）（BD Biosciences （Laguna Hills, CA））を用いて定量した。
【００７１】
図８に示すデータは、Ｎ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミン化合物の投与がＴＲＡＭＰマウスの全生存（ＯＳ）率を改善することを示唆している。２０−２２週齢で前立腺癌を自然に形成し、３０−３２週齢の全身腫瘍組織量でほとんど死亡する、ＴＲＡＭＰマウスを試験した。１２−１４週齢で前立腺腫瘍を形成し始め、２０−２２週齢の全身腫瘍組織量でほとんど死亡する、ＴＲＡＭＰｘＦＶＢマウスも試験した（図９−１１に示すデータ）。図９に示すように、２５ｍｇ／ｋｇ体重の投与量のＭＤＬ  ７２，５２７が用いられ、これは良好な耐容性を示した（すなわち、毒性の明白な兆候、異常行動または体重低下が認められなかった）。２０ｍｇ／ｋｇ体重を超える投与量がマウスアセチルポリアミン酸化酵素を完全に阻害するのに必要であった。
【００７２】
ＴＲＡＭＰマウスの分析においては、前記Ｎ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミン化合物を２２週で投与した。ここでは少数のマウスが触知可能な腫瘍を示し始めていた。マウス（各群で５個体）に２５ｍｇ／ｋｇ体重のＭＤＬ  ７２，５２７を隔週で（bi-weekly）計３回腹腔内投与した。ＯＳを図８に示す：ここでは溶媒処理マウスと比較して有意な改善が示唆される。
【００７３】
ＴＲＡＭＰｘＦＶＢマウスを用いた分析においては、ＭＤＬ  ７２，５２７処理群に８個体のマウス、溶媒処理群に８個体のマウスが含められた。これらマウスではＴＲＡＭＰマウスよりも早い齢で前立腺腫瘍の発生が始まるため、処理は８週齢で開始した。処理においては、２５ｍｇ／ｋｇＢＷのＭＤＬ  ７２，５２７を隔週の投与スケジュールで計６回腹腔内投与を行った。結果を図１１に示す：ここでは溶媒対照と比較してＭＤＬ  ７２，５２７処理マウスにおいてＯＳの有意な増加が示唆される。６０％超のＭＤＬ  ７２，５２７処理ＴＲＡＭＰｘＦＶＢマウスが治療終了後少なくとも８週間、また対照溶媒処理マウスの群全体が死亡した後少なくとも６週間生存した。図８および９のデータは、ＴＲＡＭＰマウスの別々の系統が、溶媒処理マウスと比較してＭＤＬ  ７２，５２７処理マウスにおいて６０％超の延命効果を再現性良く示すことを示している。
【００７４】
図１０に示すデータは、Ｎ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミン化合物の投与によりＴＲＡＭＰｘＦＶＢマウスにおける腫瘍発生までの時間が遅延することを示唆している。触知可能な前立腺腫瘍の発生の兆候を毎週２回観察した。ＭＤＬ  ７２，５２７処理（２５ｍｇ／ｋｇＢＷ、隔週で１回ずつ投与）中断の１１週間後（２９週齢マウス）、４０％超の処理マウスは前立腺または体の他の任意の部位における触知可能な腫瘍の兆候を示さなかった。
【００７５】
図１−１８に示すデータは、前記Ｎ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミン化合物が、ヒト前立腺癌細胞における、およびＴＲＡＭＰマウスの前立腺における、アンドロゲン誘導性酸化ストレスを効果的に阻害することを証明している。該データはまた、ＭＤＬ  ７２，５２７がＴＲＡＭＰマウスにおける腫瘍発生までの時間を遅延させ、統計的に有意なＯＳの上昇をもたらすことも示している。
【００７６】
本発明の他の局面は、Ｎ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミン製造における合成法の改良である。ＭＤＬ  ７２，５２７は哺乳動物ポリアミン酸化酵素の強力かつ不可逆性の阻害剤であり、ブタ肝臓ポリアミン酸化酵素に対し０．９ｍＭのＫｉを示す。ＭＤＬの公知の合成はＮ−Ｂｏｃ保護されたプロパルギルアミンを対応する（ビス）アレンに変換し、次いで２当量の該保護アレンを１，４−ジヨードブタンとカップリングさせることを伴う。得られたＮ−Ｂｏｃ−保護（ビス）アレンの脱保護によりＭＤＬ  ７２，５２７を産生した。この公知の合成は、二ヨウ化塩のアルキル化の過程でアレン部分の求電子性により多くの副生成物が生じたという点で問題がある。全収率は不都合なほどに低い。
【００７７】
Ｎ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミン製造のための本発明の方法は、好ましい高収率を示す。本発明の方法においては望ましくない副生成物の生成も回避される。本発明の方法を図１９に示す。
【００７８】
市販のプトレシン１を（ビス）−Ｎ−Ｂｏｃ保護し、化合物２を生成する（収率８５．２％）。化合物２を用いて、水素化ナトリウムの存在下、２当量の臭化プロパルギルをアルキル化し、化合物３を生成する（収率５９．５％）。この変換の収率はジメチルホルムアミド（「ＤＭＦ」）とテトラヒドロフラン（「ＴＨＦ」）との１：５の割合の混合物を用いることによりさらに上がる。化合物３のプロパルギル基を、ＣｕＢｒ、ホルムアルデヒド、およびジイソプロピルアミンの存在下で対応するアレン類に変換し、中間化合物４を生成する（収率３８．７％）。化合物４をＨＣｌの存在下で脱保護し、所望の目的分子ＭＤＬ  ７２，５２７を生成する（白色固体、収率６５．８％）。
【００７９】
細胞抽出物中並びにヒトおよび動物血清中のＭＤＬ、天然ポリアミン類およびそれらのアセチル誘導体のＨＰＬＣ定量法を標準化する。それにより、ＭＤＬ  ７２，５２７の薬物動態および薬力学を測定することが出来る。
【００８０】
本発明のＮ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミン化合物の塩類は、前記ＭＤＬ化合物の溶液を薬学上許容される酸の溶液と混合することにより生成される酸付加塩等を含むがそれらに限定されない、薬学上適した（すなわち薬学上許容される）塩であってよい。薬学上許容される酸は塩酸、メタンスルホン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酢酸、安息香酸、シュウ酸、クエン酸、酒石酸、炭酸またはリン酸であってもよい。様々な薬学上許容される塩が当業者に周知であり、Berge SM et al., "Pharmaceutical Salts." J. Pharm. Sci. 66:1-19 (1977) and Haynes DA et al., "Occurrence of pharmaceutically acceptable anions and cations in the Cambridge Structural Database," J. Pharm. Sci. 94:2111-2120 (2005)（これらは参照により本明細書に組み入れられたものとする）に開示されるもののように、Ｎ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミンと共に用いてもよい。例えば、ＦＤＡ承認済の市販の塩類のリストには、酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、酒石酸水素塩、臭化物、エデト酸カルシウム、カムシル酸塩、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、二塩酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストレート、エシレート、フマル酸塩、グルセプテート、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニレート、ヘキシルレゾルシン酸塩、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエート、ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メチルブロマイド、メチル硝酸塩、メチル硫酸塩、ムケート、ナプシレート、ミトレート、パモエート、パントテン酸塩、リン酸塩、二リン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、およびトリエチオジドが含まれる。
【００８１】
前記Ｎ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミン化合物（またはその塩若しくは溶媒和物）は、素錠、コーティング錠、硬若しくは軟ゼラチンカプセル、散剤、カプセル剤、顆粒剤（pellet）、液剤、懸濁剤、エリキシル剤、または乳剤等の経口投薬形態で投与されてもよい。これらの経口投薬形態は適した治療効果を達成するための投与計画に従って投与されても良い。これらの経口投薬形態は薬学上活性成分（ＡＰＩ）および各種の薬学上許容される／適した担体（水性、非水、液剤、懸濁剤、または乳剤）、賦形剤、溶剤、添加剤、基剤、安定化剤、不活性希釈剤、結合剤（アラビアゴム、コーンスターチ、ゼラチン等）、崩壊剤（コーンスターチ、バレイショデンプン、アルギン酸等）および滑沢剤（ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム等）等を含んだ医薬組成物によっても規定される。
【００８２】
例えば、薬学上許容される水性の担体としては、ゴム類、スターチ類、糖類、乳糖、ショ糖、セルロース系材料、水、アルコール／水混合物、リン酸緩衝液（０．０１−０．１Ｍ、またはより好ましくは０．０５Ｍ）および０．９％食塩水等が挙げられるがそれらに限定されない。非水溶媒としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物性油脂（オリーブオイル、オレイン酸エチル等）等が挙げられるがそれらに限定されない。薬学上許容されるＵＳＰ承認済の各種賦形剤を使用してもよく、例えばアルブミン、ゼラチン、界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８、胆汁酸塩等）、溶解補助剤（グリセロール、ポリエチレングリコール等）、酸化防止剤（アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム等）、保存剤（チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン等）、脂肪酸類、ワックス類、ポロキサマー類、ポロキサミン類、増量剤または張性調節剤（tonicity modifier）（乳糖、マンニトール等）、金属イオンとの共有結合または錯体形成のためのポリマー、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲル剤、リポソーム、マイクロエマルジョン剤、ミセル剤、１枚膜リポソーム剤、多重層リポソーム、赤血球ゴースト剤またはスフェロプラスト剤等が含まれるがこれらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】図１は、前立腺細胞内でアンドロゲンにより誘導されたＳＳＡＴ誘導がポリアミン酸化およびＲＯＳ産生を引き起こすということに関する、ポリアミン代謝の模式図である。
【図２】図２は、本発明のＮ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミン化合物が前立腺細胞中でアセチルポリアミン酸化酵素（ＡＰＡＯ）の阻害剤として作用し、アンドロゲンにより誘導されたＲＯＳ産生を阻害することを示す理論的な模式図である。
【図３】図３は、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素のｍＲＮＡ量に対して標準化した、無処理ＬＮＣａＰヒト前立腺癌細胞中の、および０．０５ｎＭまたは１．０ｎＭ  Ｒ１８８１で９６時間処理した細胞中の、ＳＳＡＴ  ｍＲＮＡ量のｑＲＴ−ＰＣＲ定量のプロットを示すグラフの図である。このＱＲＴ−ＰＣＲのデータは、１ｎＭ  Ｒ１８８１（合成アンドロゲン類似体）処理によりＳＳＡＴ  ｍＲＮＡ量がＬＮＣａＰ細胞において増加することを示す。
【図４】図４は、ＤＵ−１４５ヒト前立腺癌細胞において非アンドロゲン化合物ビスエチルノルスペルミン（bisethyl norspermine）（「ＢＥ−３−３−３」）の濃度を増加させて７２時間処理したＬＮＣａＰ細胞におけるＤＣＦ蛍光／ＤＮＡ蛍光のプロットを示したグラフの図である。このデータは対照無処理細胞のパーセントに対して標準化されたものである。ＢＥ−３−３−３（ＳＳＡＴの公知の誘導因子）はＤＵ−１４５細胞における酸化ストレスを増加させる。
【図５】図５Ａ−５Ｅは、２５μｇのＮ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミン化合物で１２０時間処理し、１ｎＭ  Ｒ１８８１で９６時間処理したまたは処理していないＬＮＣａＰヒト前立腺細胞における；および２５μＭ  Ｎ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミン化合物で２４時間前処理し、次いで１ｎＭ  Ｒ１８８１で９６時間処理した細胞における；プトレシン（Ｐｕ）、スペルミジン（Ｓｄ）、スペルミン（Ｓｍ）、Ｎ−アセチルスペルミジン（Ｎ−Ａｃ−Ｓｄ）、およびＮ−アセチルスペルミン（Ｎ−Ａｃ−Ｓｍ）の濃度のプロットを示したグラフの図である。ここでポリアミンの濃度は、ｎｍｏｌ／１０６細胞で表され、ＨＰＬＣ法（Kabra, PM et al, Solid-Phase Extraction and Determination of Dansyl Derivatives of Unconjugated and Acetylated Polyamines by Reverse-Phase Liquid Chromatography: Improved Separation Systems for Polyamines in Cerebrospinal Fluid, Urine and Tissue, J. Chromatogr., 1986;380(1):19-32 を参照）を市販の標準とともに用いて測定された。このデータは、１ｎＭ  Ｒ１８８１±２５μＭ  ＭＤＬ  ７２，５２７で処理したＬＮＣａＰ細胞中のポリアミンおよびアセチルポリアミンの濃度を示す。
【図６】図６は、Ｒ１８８１濃度を増加させて処理し、対照無処理細胞に対するパーセンテージとして表した、ＬＮＣａＰ細胞中のＤＣＦ蛍光/ＤＮＡ蛍光のプロットを示したグラフの図である。このデータは、ＭＤＬ  ７２，５２７による前処理が効果的にＬＮＣａＰ細胞中のアンドロゲン誘導性ＲＯＳ産生を阻害することを示す。
【図７】図７Ａ−７Ｄは、屠殺の１時間前に８ｍｇ／ｋｇＢＷのヒドロエチジン（ＨＥｔ）を静脈内に注射した２０週齢のＴＲＡＭＰｘＦＶＢ  Ｆ１マウスの前立腺の切片像（ハイブリッドマウス前立腺管腔）を含む（ＴＲＡＭＰはマウス前立腺モデルのトランスジェニック腺癌（the TRansgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate model）。ここで、図７Ａに、溶媒のみで処理したマウスからの前立腺切片の代表的な位相差顕微鏡像を示す。図７Ｂに、図７Ａに示した前立腺切片の蛍光顕微鏡像を示す。図７Ｃに、２５ｍｇ／ｋｇＢＷのＮ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミン化合物の６回投与で処理し、その２週間後に屠殺したマウスからの前立腺切片の代表的な位相差顕微鏡像を示す。図７Ｄに、図７Ｃに示した前立腺切片のＨＥｔ蛍光顕微鏡像を示す。全写真はＯｌｙｍｐｕｓ（登録商標）ＢＨ−２蛍光顕微鏡で４８０ｎｍ励起／６００ｎｍ発光フィルターを用い、Ｓｏｎｙ  ＤＳＣ−Ｖ３デジタルカメラセット（Ｆ２．８、３０秒間）との組み合わせで２０ｘの倍率において撮影した。写真は、前記薬剤の投与により酸化ストレスが減少したことを例証している。また、ＭＤＬ７２，５２７で処理したマウスにおいてＨＥｔ蛍光が低いことは酸化ストレスが低いことを表す。
【図８】図８は、オスＴＲＡＭＰマウスの齢に対するマウスの生存％のプロットを示したグラフの図である。マウスを２５ｍｇ／ｋｇＢＷのＮ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミン化合物または生理食塩水溶媒対照の腹腔内隔週投与（「ｔｘ」とマークされた週）で処理し、生存を追跡した。生存は、全身腫瘍組織量に基づく安楽死までの時間（time to euthanization due to tumor burden）により測定した。このデータは、ＴＲＡＭＰマウスにおいて、ＭＤＬ  ７２，５２７処理により全生存期間（overall survival）が向上することを示す。
【図９】図９は、２５ｍｇ／ｋｇＢＷのＭＤＬ  ７２，５２７または生理食塩水溶媒および対照の隔週投与（「ｔｘ」とマークされた週）で処理したＴＲＡＭＰｘＦＶＢマウスについて、マウスの（週）齢に対するマウスの体重（ｇ）のプロットを示したグラフの図である。このデータは、ＭＤＬ  ７２，５２７がＴＲＡＭＰｘＦＶＢマウスの体重の変化で測定されるような物質毒性効果を有しないことを証明している。
【図１０】図１０は、マウスの（週）齢に対して、明白な触知可能な腫瘤を有するマウスのパーセントをプロットしたグラフの図である。ＴＲＡＭＰｘＦＶＢマウスを２５ｍｇ／ｋｇＢＷのＮ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミン化合物で隔週（「ｔｘ」において）で処理した。このデータは、ＴＲＡＭＰｘＦＶＢマウスにおいて、ＭＤＬ  ７２，５２７処理により腫瘍発生までの時間が遅延することを示す。
【図１１】図１１は、オスＴＲＡＭＰｘＦＶＢマウスの（週）齢に対してマウス生存率％をプロットしたグラフの図である。マウスを２５ｍｇ／ｋｇＢＷのＮ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミン化合物または生理食塩水溶媒対照の腹腔内隔週投与（「ｔｘ」とマークされた週）で処理し、生存を追跡した。生存は全身腫瘍組織量に基づく安楽死までの時間により測定した。このデータは、ＴＲＡＭＰｘＦＶＢマウスにおいて、ＭＤＬ  ７２，５２７処理により全生存期間が向上することを示す。
【図１２】図１２は、ＴＲＡＭＰｘＦＶＢマウスにおいてＮ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミン化合物の投与により誘導されたアンドロゲン効果の阻害はアンドロゲン受容体（「ＡＲ」）のダウンレギュレーションによるものではないことを示す、ウェスタンブロット分析である。
【図１３】図１３に示すのは、ベクターのみで、またはＳＳＡＴに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉ２２）を発現するベクターで、トランスフェクトしたＬＮＣａＰ細胞クローンにおけるＲＯＳ濃度を表す、ＤＣＦ蛍光/ＤＮＡ蛍光のプロットである。細胞を無処理としたか、または１ｎＭ  Ｒ１８８１で９６時間処理した。全データをベクターのみをトランスフェクトした無処理細胞のものに対して標準化した。１ｎＭ  Ｒ１８８１で誘導されるＲＯＳ産生は、ＳＳＡＴを抑制したＬＮＣａＰクローン細胞（ｓｉ２２）において顕著に減少した。また、このデータはポリアミン酸化がＰＣａにおけるＲＯＳの原因であることを示す。
【図１４】図１４および１５に示すのは、図１４においてはＴＲＡＭＰの、図１５においてはＴＲＡＭＰｘＦＶＢのオスマウスの、齢に対する生存パーセントのカプラン−メイヤー生存プロットである。マウスを２５ｍｇ／ｋｇＢＷのＭＤＬ  ７２，５２７または生理食塩水溶媒対照のいずれかの腹腔内隔週投与（矢印でマークされた週）で処理し、生存を追跡した。生存は全身腫瘍組織量に基づく安楽死までの時間により測定した。（図１４に示すように）ＭＤＬ  ７２，５２７の２週間に１回の投与をｘ３処理するとＴＲＡＭＰマウスの全生存期間が向上した。また、（図１５に示すように）ＭＤＬ  ７２，５２７の２週間に１回の投与をｘ６処理するとＴＲＡＭＰｘＦＶＢマウスの全生存期間が向上した。
【図１５】図１４および１５に示すのは、図１４においてはＴＲＡＭＰの、図１５においてはＴＲＡＭＰｘＦＶＢのオスマウスの、齢に対する生存パーセントのカプラン−メイヤー生存プロットである。マウスを２５ｍｇ／ｋｇＢＷのＭＤＬ  ７２，５２７または生理食塩水溶媒対照のいずれかの腹腔内隔週投与（矢印でマークされた週）で処理し、生存を追跡した。生存は全身腫瘍組織量に基づく安楽死までの時間により測定した。（図１４に示すように）ＭＤＬ  ７２，５２７の２週間に１回の投与をｘ３処理するとＴＲＡＭＰマウスの全生存期間が向上した。また、（図１５に示すように）ＭＤＬ  ７２，５２７の２週間に１回の投与をｘ６処理するとＴＲＡＭＰｘＦＶＢマウスの全生存期間が向上した。
【図１６】図１６に示すのは、前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）または前立腺組織中の癌の存在を病理検査で顕微鏡測定するために８個体のマウスが屠殺される前の、触知可能な腫瘍を有していた２０週齢のマウスのプロットである。２５ｍｇ／ｋｇＢＷのＭＤＬ  ７２，５２７で２週間に１回ずつ処理したＴＲＡＭＰｘＦＶＢにおける腫瘍発生までの時間を示す。
【図１７】図１７に示すのは、無治療の男性から外科的に切除したヒト前立腺管腔組織を４−５ｍｍ厚にスライスし、ＨＥｔ（８ｍｇ／ｍｌ）溶液中で６０分間３７度にてインキュベートし、その後組織処理（蛍光顕微鏡検査のためのパラフィンブロック作成およびミクロトーム切片法）を行った写真である。ここに含まれる写真は処理後に２０ｘの倍率で、４８０ｎｍ励起／５９５ｎｍ発光波長で撮影した。
【図１８】図１８に示すのは、図１７において用いたヒト前立腺内腔と同一の切片の写真である。ここではＨＥｔ染色において上皮細胞と間質細胞との間に相違が認められる。また、このデータは、前立腺上皮細胞においてのみ高い酸化ストレスが存在することを裏付けるものである。
【図１９】図１９に示すのは、Ｎ，Ｎ’−ビス（２，３−ブタジエニル）−１，４−ブタンジアミンを製造するための本発明の方法である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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