(57)【要約】  本発明は、ｈＢＳ細胞に由来する新しい肝細胞様細胞集団、及び、薬剤スクリーニング及び毒性テストのような医療における前記肝細胞様細胞の潜在的応用に関連する。さらに、本発明は、肝細胞様細胞と同じ応用として使われることができて、さらに、例えば初期肝形成または肝再生障害などの試験管内の肝形成研究に使用されることも可能な適切な特性を有する肝芽細胞様細胞に関連する。本発明に記載の肝細胞様細胞及び肝芽細胞様細胞は、遺伝子またはタンパク質発現レベルにおいて、薬物輸送体特性および／または薬物代謝特性のどちらかを表す。
2009539358.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｈＢＳ細胞に由来する細胞集団であって、
細胞集団の細胞の少なくとも２０％が、
アルファ  １−アンチトリプシン、サイトケラチン１８、ＨＮＦ−３ベータ、アルブミンまたは尿中Ｌ型脂肪酸結合蛋白のうちの少なくとも１つ特性を示すとともに、
細胞集団が、下記六つの特性のうちの少なくとも三つの特性を有する前記細胞集団：
Ａ．薬物輸送体
ｉ）細胞の少なくとも１％が、ＢＳＥＰのタンパク質および／または遺伝子発現を示す特性、
ｉｉ）細胞の少なくとも１％が、ＭＲＰ２のタンパク質および／または遺伝子発現を示す特性、
ｉｉｉ）細胞の少なくとも１％が、タンパク質および／または遺伝子発現ＯＡＴＰ−２および／またはＯＡＴＰ−８を示す特性、
Ｂ．薬物代謝酵素
ｉｖ）細胞の少なくとも２０％が、ＧＳＴ  Ａ１−１のタンパク質および／または遺伝子発現を示す特性、
ｖ）細胞の少なくとも２０％が、ＣＹＰ４５０ｓ−１Ａ２、−２Ａ６、−２Ｂ６、−２Ｃ８、−２Ｃ９、−２Ｃ１９、−２Ｄ６、−２Ｅ１、−３Ａ４及び−３Ａ７の少なくとも２つのタンパク質および／またはＧＳＴ  Ａ１−１の遺伝子発現を示す特性、
ｖｉ）細胞の少なくとも２０％がＧＳＴ  Ｐ１−１のタンパク質および／または遺伝子発現を示さない特性。
【請求項２】
細胞集団は、少なくとも一つの前記薬物輸送体特徴及び少なくとも一つの前記薬物代謝特徴を有する請求項１に記載の細胞集団。
【請求項３】
細胞集団が、前記特性のうちの少なくとも四つ、例えば五つの特性を有する請求項１または２に記載の細胞集団。
【請求項４】
細胞集団が前記特徴のうちの全ての６つの特性を有する請求項１〜３のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の細胞集団であって、
細胞集団の細胞の少なくとも２０％が、アルファ  １−アンチトリプシン、サイトケラチン１８、ＨＮＦ−３ベータ、アルブミンまたは尿中Ｌ型脂肪酸結合蛋白特性の少なくとも一つの示し、以下の特性を有する：
Ａ．薬物輸送体
ｉｉｉ）細胞の少なくとも１％が、機能的に活性を有するＯＡＴＰ−２および／またはＯＡＴＰ−８を示す特性、
Ｂ．薬物代謝酵素
細胞の少なくとも２０％が、ＧＳＴＡ１−１の機能的な活性を示す特性、
細胞の少なくとも２０％が、薬物代謝物質を分析することによって測定され、機能的に活性を有するＣｙｐ１Ａ２、Ｃｙｐ３Ａ４および／またはＣｙｐ２Ｃ９を示す特性。
【請求項６】
請求項１又は２に記載の細胞集団であって、
細胞集団の細胞の少なくとも７５％が、アルファ  １−アンチトリプシン、サイトケラチン１８、ＨＮＦ−３ベータ、アルブミンまたは尿中Ｌ型脂肪酸結合蛋白特性を示し、細胞集団が少なくとも以下の特性を有する。
Ａ．薬物輸送体
ｉｉｉ）細胞の少なくとも１０％が、機能的に活性を有するＯＡＴＰ−２および／またはＯＡＴＰ−８を示す特性、
Ｂ．薬物代謝酵素
ｉｖ）細胞の少なくとも３０％が、ＧＳＴＡ１−１の機能的な活性を示す特性、
ｖ）細胞の少なくとも５０％が、薬代謝物質を分析することによって測定され、機能的に活性を有するＣｙｐ１Ａ２、Ｃｙｐ３Ａ４および／またはＣｙｐ２Ｃ９を示す特性。
【請求項７】
特性ｉ）が、細胞の少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％である請求項１〜６のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項８】
特性ｉｉ）が、細胞の少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％にあてはまる請求項１〜７のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項９】
特性ｉｉｉ）は、細胞の少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％または少なくとも８０％にあてはまる請求項１〜８のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項１０】
特性ｉｖ）が、細胞の少なくとも３０％、例えば、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％または少なくとも８０％にあてはまる請求項１〜９のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項１１】
特性ｖ）が、細胞の少なくとも３０％、例えば、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％または少なくとも８０％にあてはまる請求項１〜１０のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項１２】
特性ｖｉ）が、細胞の少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％または少なくとも８０％にあてはまる請求項１〜１１のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項１３】
細胞集団の細胞の少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％のような少なくとも約３０％が、アルファ  １−アンチトリプシン、サイトケラチン１８、ＨＮＦ−３ベータ、アルブミンまたは尿中Ｌ型脂肪酸結合蛋白のうちの少なくとも１つを示している請求項１〜１２のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項１４】
細胞の少なくとも約５％がサイトケラチン１８及びＣＹＰ１Ａ２を共発現する請求項１〜１３のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項１５】
細胞の少なくとも約５％がサイトケラチン１８及びＣＹＰ２Ａ６を共発現する請求項１〜１４のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項１６】
細胞の少なくとも約５％がサイトケラチン１８及びＣＹＰ２Ｂ６を共発現する請求項１〜１５のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項１７】
少なくとも、細胞の約５％が、サイトケラチン１８及びＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９および／またはＣＹＰ２Ｃ１９を共発現する請求項１〜１６のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項１８】
、細胞の少なくとも約５％が、サイトケラチン１８及びＣＹＰ２Ｄ６を共発現する請求項１〜１７のいずれかに記載の細胞集。
【請求項１９】
細胞の少なくとも約５％がサイトケラチン１８及びＣＹＰ２Ｅ１を共発現する請求項１〜１８のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項２０】
細胞の少なくとも約５％が、サイトケラチン１８及びＣＹＰ３Ａ４および／またはＣＹＰ３Ａ７を共発現する請求項１〜１９のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項２１】
細胞の少なくとも約５％が、以下の追加的な特性のうちの少なくとも１つを有する請求項１〜２０のいずれかに記載の細胞集団。
Ａ．受容体
ｖｉｉ）細胞の少なくとも約５％が、ｃ−Ｍｅｔのタンパク質および／または遺伝子発現を示す特性、
Ｂ．細胞間接着分子
ｖｉｉｉ）細胞の少なくとも約５％がＩＣＡＭ−１のタンパク質および／または遺伝子発現を示す特性、
Ｃ．薬物代謝酵素
ｉｘ）細胞の少なくとも１％がＵＧＴのタンパク質および／または遺伝子発現を示す特性、
Ｄ．転写因子
ｘ）細胞の少なくとも９０％が、１Ｏｃｔ−４のタンパク質および／または遺伝子発現を示さない特性。
【請求項２２】
細胞集団は、特性ｖｉｉ）、ｖｉｉｉ）、ｉｘ）またはｘ）の中で、少なくとも二つ、例えば少なくとも三つを有する請求項２１に記載の細胞集団。
【請求項２３】
細胞集団が、特性ｖｉｉ）、ｖｉｉｉ）、ｉｘ）またはｘ）のうちの４つすべてを有する請求項２１または２２に記載の細胞集団。
【請求項２４】
特性ｖｉｉ）が、細胞の少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％にあてはまる請求項２１〜２３のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項２５】
特性ｖｉｉｉ）が、例えば、細胞の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％のような少なくとも１０％にあてはまる請求項２１〜２４のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項２６】
特性ｉｘ）が、例えば、細胞の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％のような少なくとも５％にあてはまる請求項２１〜２５のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項２７】
特性ｘ）が、例えば、細胞の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９５％のような少なくとも１０％にあてはまる請求項２１〜２６のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項２８】
ＣＹＰ４５０タンパク質のうちの少なくとも１つの発現が、誘発因子の付加物に誘導できる請求項１〜２７のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項２９】
ＧＳＴ  Ａ１−１および／またはＧＳＴ  Ｍ１−１タンパク質の発現が、誘発因子の付加物に誘導できる請求項１〜２８のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項３０】
ＵＧＴタンパク質の発現は、誘発因子の付加物に誘導できる請求項２１〜２９のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項３１】
誘発因子が、デキサメタゾン、オメプラゾールから成るグループから単独でまたは共に選択される請求項２８〜３０のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項３２】
誘発因子が、リファムプシン、デキサメタゾン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、オメプラゾール及びイソニアジドを含む請求項２８−３１のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項３３】
細胞集団が、特性ｖ）のＣＹＰ４５０タンパク質のうちの少なくとも１つの酵素活性を示す請求項１〜３２のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項３４】
細胞集団がＧＳＴ酵素活性を示す請求項１〜３３のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項３５】
ＧＳＴ酵素活性が、細胞集団の溶解物内のタンパク質の例えば、少なくとも０．０３μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ、少なくとも０．０５μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ、少なくとも１．０μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ、少なくとも０．０７μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ、少なくとも０．０９μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ、少なくとも０．１１μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ、少なくとも０．１３μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇまたは少なくとも０．１５μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇのような少なくとも０．４μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇである請求項３３に記載の細胞集団。
【請求項３６】
細胞集団が、ＵＧＴ酵素活性を示す請求項２１〜３５のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項３７】
前記細胞集団が、特性を維持しながら試験管内で少なくとも一ヶ月間培養される請求項１〜３６のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項３８】
前記細胞集団が、特性を維持しながら試験管内で少なくとも一週月間培養される請求項１〜３７のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項３９】
前記細胞集団が、特性を維持しながら試験管内で少なくとも７２時間培養される請求項１〜３８のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項４０】
前記細胞集団が、更にアルファフェトタンパク質を示す請求項１〜３９のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項４１】
前記細胞集団が、ヒトまたはマウス・フィーダ細胞のようなフィーダ細胞の存在下で得られる請求項１〜４０のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項４２】
前記細胞集団が、フィーダ細胞がない場合に得られる請求項１〜４１のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項４３】
前記細胞集団が、細胞外マトリックスを使用して得られ、前記マトリックスは、定義済み又は未定義の組成物である請求項４２に記載の細胞集団。
【請求項４４】
前記細胞集団が、内側に一つ以上のタンパク質により単独でまたは共にコーティングされるプラスチック細胞培養容器を使用して得られる請求項４２または４３に記載の細胞集団。
【請求項４５】
一つ以上のタンパク質がコラーゲン、ラミニン及びそれらの組合せから構成されるグループから選択される請求項４４に記載の細胞集団。
【請求項４６】
前記細胞集団が、例えば多孔性フィルタのような三次元環境を使用して得られる請求項４４または４５に記載の細胞集団。
【請求項４７】
前記細胞集団が、異種動物由来成分を含まない請求項４１〜４６のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項４８】
細胞集団における細胞の少なくとも約１０％が、ＨＮＦ３ベータ及びＡＦＰの少なくとも一つのを示し、増殖能を有し、細胞集団は以下の５つの特性のうちの少なくとも２つを有するｈＢＳ細胞に由来する細胞集団：
Ａ．受容体
ｉ）細胞の少なくとも１％が、アルファ−６−インテグリンのタンパク質および／または遺伝子発現を示す特性、
ｉｉ）細胞の少なくとも１％が、ｃ−Ｍｅｔのタンパク質および／または遺伝子発現を示す特性、
Ｂ．細胞間接着分子
ｉｉｉ）細胞の少なくとも１％が、ＩＣＡＭ−１のタンパク質および／または発現を示す特性、
Ｃ．転写因子
ｉｖ）細胞の少なくとも１０％が、ＨＮＦ−４アルファのタンパク質および／または発現を示す特性。
【請求項４９】
細胞集団が、以下の特性のうちの少なくとも２つを有する請求項４８に記載の細胞集団：
Ａ．受容体
ｉ）細胞の少なくとも１％が、アルファ−６−インテグリンのタンパク質および／または遺伝子発現を示す特性、
ｉｉ）細胞の少なくとも１％が、ｃ−Ｍｅｔのタンパク質および／または遺伝子発現を示す特性、
Ｂ．細胞間接着分子
ｉｉｉ）細胞の少なくとも１％が、ＩＣＡＭ−１のタンパク質および／または発現を示す特性、
Ｃ．転写因子
ｉｖ）細胞の少なくとも１０％が、ＨＮＦ−４アルファのタンパク質および／または発現を示す特性、
Ｄ．サイトケラチン
ｖ）細胞の少なくとも１％が、ＣＫ１９のタンパク質および／または発現を示す特性、
ｖｉ）細胞の少なくとも１％が、ＣＫ７のタンパク質および／または発現を示す特性、
Ｅ．上皮細胞接着分子
ｖｉｉ）細胞の少なくとも１％が、ＥｐＣＡＭのタンパク質および／または発現を示す特性。
【請求項５０】
細胞集団が、前記特性のうちの少なくとも３つを有する請求項４８または４９に記載の細胞集団。
【請求項５１】
細胞集団が、前記特性のうちの例えば少なくとも５、少なくとも６または全７つのような少なくとも４つを有する請求項４８〜５０のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項５２】
特性ｉ）が、細胞の例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％のように少なくとも５％にあてはまる請求項４８〜５１のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項５３】
特性ｉｉ）が、細胞の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％のような少なくとも５％にあてはまる請求項４８〜５２のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項５４】
特性ｉｉｉ）が、細胞の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％のような少なくとも５％にあてはまる請求項４８〜５３のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項５５】
特性ｉｖ）が、細胞の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％のような少なくとも１５％にあてはまる請求項４８〜５４のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項５６】
個体群の細胞の少なくとも約１５％、たとえば、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％又は少なくとも約９５％が、ＨＮＦ３ベータ及びＡＦＰの少なくとも一つを示し、増殖能を有する請求項４８〜５５のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項５７】
前記細胞集団が、以下の特性のうちの少なくとも１つを有する請求項４８〜５６のいずれかに記載の細胞集団：
Ｆ．薬物輸送体
ｖｉｉｉ）細胞の少なくとも１％が、ＢＳＥＰのタンパク質および／または遺伝子発現を示す特性、
ｉｘ）細胞の少なくとも１％が、ＭＲＰ２のタンパク質および／または遺伝子発現を示す特性。
【請求項５８】
創薬プロセスのための、請求項１〜５７のいずれかに定義した細胞集団の使用。
【請求項５９】
試験管内モデルの薬物輸送体を研究するための、請求項１〜５７のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
【請求項６０】
試験管内モデルの薬物代謝酵素を研究するための請求項１〜５７のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
【請求項６１】
試験管内のモデルで早期肝形成のような肝形成を研究するための請求項１〜５７のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
【請求項６２】
試験管内のモデルで  ヒト肝再生障害を研究するための請求項１〜５７のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
【請求項６３】
試験管内の肝毒性テストのための、請求項１〜５７のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
【請求項６４】
薬剤としての請求項１〜５７のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
【請求項６５】
肝臓組織の退化のような組織退化によって生じる疾患および／または病状の治療および／または予防するのための医薬製品を製造するための請求項１〜５７のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
【請求項６６】
肝臓疾患治療用の医薬品を製造するための請求項１〜５７のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
【請求項６７】
原発性胆汁性肝硬変を含む自動免疫性障害、脂質異常症を含んでいる代謝障害、２型糖尿病、肥満、アルコール等の濫用によって生じる肝臓疾患、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎及びＡ型肝炎などのウイルスによって生じる疾患、調合薬に対する鋭い中毒反応によって生じる肝臓壊死及び肝細胞性癌を患っている患者の腫瘍除去からなる群から選択される肝臓疾患を治療および／または予防する医薬品の製造のための請求項１〜５７のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
【請求項６８】
代謝病状および／または疾患を治療および／または予防する医薬品を製造するための請求項１〜５７のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
【請求項６９】
代謝的に改善された肝細胞様細胞を得るための請求項４８〜５７のいずれかにおいて定義した細胞集団からの一つ以上の細胞の使用。
【請求項７０】
肝細胞様細胞の成熟を研究するための請求項４８〜５７のいずれかにおいて定義した細胞集団からの一つ以上の細胞の使用。
【請求項７１】
請求項１〜５７のいずれかにおいて定義した細胞集団から合成物への細胞をさらすことから成る工程、及び、合成物が細胞に有毒かをどうか測定する工程を含む肝細胞性毒性の合成物をスクリーニング方法。
【請求項７２】
請求項１〜５７のいずれかにおいて定義した細胞集団から合成物へ細胞をさらす工程、合成物との接触による細胞のいかなる表現型又は代謝変化を決定する工程、変化を肝細胞性機能を調整する能力に関連づける工程を含む肝細胞性機能を調整する能力のために合成物をスクリーニング方法。
【請求項７３】
請求項１〜５７のいずれかにおいて定義した細胞集団を得るために、
ｉ）少なくとも５日間、無血清培地内の支持マトリックス上のｈＢＳ細胞から由来するｈＢＳ細胞または原種を試験管での分化する工程、
ｉｉ）約５日乃至約２５日ごとに媒介物を変える工程、
ｉｉｉ）機械的隔離によって細胞を分離する工程、
ｉｖ）酵素処理によりステップｉｉｉ）で得られる細胞を任意に解離する工程、
ｖ）表面抗原発現に基づいて細胞を任意にソートする工程を含む方法。
【請求項７４】
ｈＢＳ細胞に由来する原種が、少なくとも一つのＨＮＦ３ベータ及びＡＦＰを示し、増殖能を有する請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
無血清培地が、ｂＦＧＦから成るＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）である請求項７３または７４に記載の方法。
【請求項７６】
ｂＦＧＦの濃度が、約４ｎｇ／ｍｌから約２００ｎｇ／ｍｌまでであり、例えば、約４ｎｇ／ｍｌから約１５０ｎｇ／ｍｌまで、約４ｎｇ／ｍｌから約１００のｎｇ／ｍｌ、約４ｎｇ／ｍｌから約５０のｎｇ／ｍｌまで、または約４ｎｇ／ｍｌから約１０のｎｇ／ｍｌまでである請求項７３〜７５のいずれかに記載の方法。
【請求項７７】
ｂＦＧＦの濃度が、少なくとも４ｎｇ／ｍｌである請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
ステップｉ）の試験管内分化が、少なくとも１０日間、例えば、少なくとも２０日間、少なくとも３０日間または少なくとも４０日間実行される請求項７３〜７７のいずれかに記載の方法。
【請求項７９】
支持マトリックスがヒトまたはマウス・フィーダ細胞のようなフィーダ細胞を含む請求項７３〜７８のいずれかに記載の方法。
【請求項８０】
支持マトリックスが、定義済みまたは未定義組成物の細胞外基質を含む請求項７３〜７８のいずれかに記載の方法。
【請求項８１】
支持マトリックスが、細胞培養のために使用されるプラスチック細胞培養容器の中の内側にコーティングされ、一つ以上のタンパク質の単独または組合せからなるコーティングを含む請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
支持マトリックスが、三次元環境、例えば多孔性フィルタを含む請求項７３〜８１のいずれかに記載の方法。
【請求項８３】
多孔性フィルタが、直径が約４μｍの孔サイズを有する請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
多孔性フィルタが、単独または組合せによる一つ以上のタンパク質にコーティングされる請求項８２〜８３のいずれかに記載の方法。
【請求項８５】
一つ以上タンパク質が、コラーゲン、ラミニン及びこれらの組合せからなる群から選択される請求項８１〜８４のいずれかに記載の方法。
【請求項８６】
ステップｉｉ）が、約１０日間乃至約２０日間ごとに実行される請求項７３〜８５のいずれかに記載の方法。
【請求項８７】
ステップｉｉ）が、１４日から１５日間ごとに実行される請求項７３〜８６のいずれかによる方法。
【請求項８８】
ｉ）請求項１〜５７のいずれかにおいて定義した細胞集団、
ｉｉ）一つ以上の成熟因子および／または成熟培養基、及び
ｉｉｉ）任意に、使用説明書、
を含むキット。
【請求項８９】
成熟培養基が、ＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）、ｂＦＧＦで補充されるＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）、あらかじめ自己調整されたＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）、及び肝細胞特異的な培養基からなる群から選択される請求項８８に記載のキット。
【請求項９０】
一つ以上の成熟因子が、ｂＦＧＦ、上皮増殖因子、肝細胞増殖因子及びオンコスタチンＭからなる群から選択される請求項８８または８９に記載のキット。
【請求項９１】
成熟をモニタする道具をさらに含む請求項８９に記載のキット。
【請求項９２】
成熟をモニタするための道具が、
ｉ）ＨＮＦ３ベータ、ＡＦＰ、アルブミン、ＢＳＥＰ、ＭＲＰ２、ＯＡＴＰ−２、ＯＡＴＰ−８、ＧＳＴ  Ａ１−１、ＣＹＰ４５０−１Ａ２、ＣＹＰ４５０−２Ａ６、ＣＹＰ４５０−２Ｂ６、ＣＹＰ４５０−２Ｃ８、ＣＹＰ４５０−２Ｃ９、ＣＹＰ４５０−２Ｃ１９  ＣＹＰ４５０−２Ｄ６、ＣＹＰ４５０−２Ｅ１、ＣＹＰ４５０−３Ａ４、ＣＹＰ４５０−３Ａ７、ＧＳＴ  Ｍ１−１及びＵＧＴからなる群から選択されるマーカー発現を記録する、少なくとも３つ、少なくとも４つまたは少なくとも５つの遺伝子に対抗するＰＣＲプライマー、及び
ｉｉ）ユーザーズ・マニュアル、
からなる請求項９１に記載のキット。
【請求項９３】
成熟をモニタする道具が、
ｉ）ＨＮＦ３ベータ、ＡＦＰ、アルブミン、ＢＳＥＰ、ＭＲＰ２、ＯＡＴＰ−２、ＯＡＴＰ−８、ＧＳＴ  Ａ１−１、ＣＹＰ４５０−１Ａ２、ＣＹＰ４５０−２Ａ６、ＣＹＰ４５０−２Ｂ６、ＣＹＰ４５０−２Ｃ８、ＣＹＰ４５０−２Ｃ９、ＣＹＰ４５０−２Ｃ１９  ＣＹＰ４５０−２Ｄ６、ＣＹＰ４５０−２Ｅ１、ＣＹＰ４５０−３Ａ４、ＣＹＰ４５０−３Ａ７、ＧＳＴ  Ｍ１−１及びＵＧＴからなる群から選択される、少なくとも３つ、たとえば少なくとも４つまたは少なくとも５つのマーカー発現抗原に対する抗体、及び
ｉｉ）ユーザーズ・マニュアル、
からなる請求項９０または９１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｈＢＳ細胞に由来する新しい肝細胞様細胞集団、及び、薬剤スクリーニング及び毒性テストのような医療における前記肝細胞様細胞の潜在的応用に関係する。さらに、本発明は、肝細胞様細胞と同じ応用として使われることができて、さらに、例えば初期肝形成または肝再生障害などの試験管内の肝形成研究に使用されることも可能な適切な特性を有する肝芽細胞様細胞にも関連する。本発明に記載の肝細胞様細胞及び肝芽細胞様細胞は、遺伝子またはタンパク質発現レベルにおいて、薬物輸送体特性および／または薬物代謝特性のどちらかを表す。
【背景技術】
【０００２】
多能性ヒト幹細胞には、様々なヒト細胞型への接近可能性に革命をもたらすことが期待される。多能性ヒト胚盤胞由来幹（ｈＢＳ）細胞を培養し、その後の所望の目標細胞型へそれらを分化させる可能性は、生体内応用及び試験管応用範囲に、細胞の安定的で実質的に無制限の供給を提供する。
【０００３】
肝不全及び末期肝疾患は、世界中で大量死亡の原因となるとともに医療制度上の主な負担でもある。肝臓移植は、最も成功した治療である。しかし、この手順の有効性は、制限されて、多くの合併症、例えば感染症または拒絶反応につながっていた。肝臓移植は、さらに利用可能なドナー臓器の不足が欠点であり、治療された患者は、頻繁に生涯にわたる免疫抑制に付託される。移植器官のニーズを低下させる細胞に基づく治療は、社会及びこれらの疾患を患っている個人の両方にも非常に重要である。
【０００４】
さらに、肝臓は代謝のセンター及び人体の解毒器官であり、したがって、インビトロ・テスト用の機能的細胞型の高信頼性の供給源を確保するために大きな努力が行われた。残念ながら、肝臓の複雑さ及び機能は、今日において利用可能ないかなる細胞型によっても反映されていない。主たるヒト肝細胞の入手可能性は制限され、インビトロ使用に使われる場合に、細胞がさらに急速にその通常の表現型及び機能的な特性を失うことは公知である（すなわち２４時間以内）。初代細胞のよく使用される変形例は、肝臓細胞株であり、それは順番に代謝酵素の非常に低いレベルを含み、生体内の天然の肝細胞とかなり異なる他の重要なタンパク質の配列を有する。肝臓代謝が種特異であり、他の種の肝臓毒性を予測するのに問題点をもたらすことが公知にも関わらず、更なる多くの試験が動物性物質を使用して実行された。
【０００５】
製薬開発において、逆肝臓反応は、最も顕著な毒性易罹病性である。したがって、ヒト肝臓毒性易罹病性の早期予測は、臨床試験用に合成物を選ぶ時に、最重要である。この分野の能力を向上させる努力は、モデルの有効性問題及び開発について言及しなければならず、ヒトの逆肝損傷を誘発するために一致する複合の生物学的過程により大きな範囲を提供する。両方の分野において、ｈＢＳ細胞に由来する分化した細胞の使用は、有望な機会を提供する。
【０００６】
したがって、新薬または化学製品の開発には、ヒト肝細胞に擬態し、候補分子の効果を予測することが可能であるモデル・システムのための緊急のニーズが存在する。有効性及び生理的関連に関して、ヒト多能性幹細胞は、機能的なヒト肝細胞の理想的な再生可能な供給源として役立つことがあり得る。ｈＢＳ細胞が適当な環境に配置されるときに、特定の肝臓特性が分化の２〜４週後に観察された。
【０００７】
２００３年のＲａｍｂｈａｔｌａ等による前の研究による国際公開ＷＯ０１／８１５４９及び国際公開ＷＯ２００５／０９７９８０は、いくつかの肝細胞様特性を有する細胞を確認した。これらの特性はすなわち、分化されたｈＢＳ細胞培養のＣＹＰ及びＧＳＴ活性である。しかし、それまで、生成の細胞は、薬物輸送体発現及び特定のＣＹＰ及びＧＳＴ発現パターンに関して、従来の循環系を潜在的に交換するために必要である代謝特性を示さなかった。本発明において、創薬及び再生医療ために、薬物輸送体と重要な代謝酵素の少なくとも７２時間の安定発現を有する、ｈＢＳ細胞由来の肝細胞様細胞集団が提示された。
【０００８】
Ｃｅｌｌａｒｔｉｓの特許出願国際公開ＷＯ２００６０３４８７３は、発生生物学の経路をたどるために定義済み方法における異なる要因の用途を可能にする方法に基づく。本発明において、それは主に、分化に影響を及ぼす細胞の分泌内因子である。加えて、培養基の変更の頻度は、異なる。現在の方法は、培養基の少ない頻繁な変更を可能にし、したがって、大きな労働力を要しない。さらに、本発明の細胞はより成熟し、創薬及び毒性テストに役立つ分析システムでの長期間の培養を可能にする。
【０００９】
国際公開ＷＯ２００５０９７９８０と米国特許出願公開ＵＳ２００３０００３５７３のどちらも、薬物輸送体または機能的な輸送体の存在について教示していない。国際公開ＷＯ２００５０９７９８０は、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ９及びＣＹＰ１Ａ２が薬剤スクリーニングのための望ましい酵素であることを述べるだけである（表３を参照）。しかし、出願はこれらの最も重要なＣＹＰｓ活性について、何も教示しない。特に、ＣＹＰ３Ａ４は創薬及び毒性テストに用いられる唯一重要な酵素である。大多数の全ての薬は、ＣＹＰ３Ａ４によって新陳代謝する。肝細胞が、ヒト成人肝細胞を反映する個人間の構成で、機能的なＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ９及びＣＹＰ１Ａ２酵素を示すｈＢＳ細胞に由来することは望ましい。
【００１０】
ｈＢＳ細胞に由来される肝細胞が以下の結合を有する場合、創薬及び毒性テストにそれはさらに望ましい：（ｉ）機能的なＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ９及びＣＹＰ１Ａ２酵素、（ｉｉ）機能的なＧＳＴ酵素及び（ｉｉ）機能的な薬物輸送体。最も重要なＣＹＰｓ及び薬物輸送体に関して、国際公開ＷＯ２００５０９７８０に記載されている細胞の詳細がなく、さらに、限られたＧＳＴｓ特性解析データしか示されていない。対照的に、本発明は第２相酵素の完全な説明を有する。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は肝細胞様細胞及び肝芽細胞様細胞及び各自の調製方法に関する。本発明の肝細胞様細胞は、薬物輸送体および／または代謝酵素を表すので、特に創薬及び毒性テストに、かなり適している。
【００１２】
ヒト胚盤胞由来幹細胞（ｈＢＳ細胞）は、多能性であり、内胚葉、外胚葉及び中胚葉の全ての３つの胎児胚葉細胞及び、全身及び細菌細胞を引き起こすことができる。それで、将来において、肝臓細胞の機能的な特性を有するｈＢＳ細胞に由来される分化した細胞は、肝不全患者の体外肝庇護のための移植又は生物反応器内で使われる可能性を有するだけではなく、さらに、薬目標、生体異物の肝臓代謝、及び肝毒性を検討する試験システムになり得る。ｈＢＳ細胞に由来された肝細胞は、同じ遺伝子の提供者から必要に応じて、機能的なヒト肝細胞の無制限の供給源を潜在的に提供することができ、それで、毒性試験のような試験管内テストの予測可能性を改良し、動物実験の必要性を低下させる。しかし、生体異物の毒性は、その毒性及び反応性の代謝物質への生体内変化によく依存し、したがって、生体内変化システムの存在及び配列が必要である。現在、主たるヒト肝細胞は、試験管内の薬物代謝及び毒性テストのモデルを構成する。それにもかかわらず、初代肝細胞が培養される場合に、薬物代謝酵素の活性及び多くのトランスポータ機能は、急速に消失および／または変化する。さらに、試験管内研究に使われる肝細胞癌細胞株（例えばＨｅｐＧ２）の多くは、幾つの重要な薬物代謝酵素の発現を欠く。
【００１３】
シトクロムＰ４５０ｓ（ＣＹＰｓ）は、混合機能モノオキシゲナーゼ及び主な第一位相異物代謝酵素である。この酸性代謝は、生体異物の自然体に依存し、不活化及び除去促進、プロドラッグまたは代謝活性化をもたらす。ＣＹＰ発現の主な部位は肝臓であり、ＣＹＰ３Ａ４はヒト成人肝臓で最も多量であるＣＹＰイソ酵素である。薬物代謝のための最も重要な酵素は、系統１−３に帰属し、臨床的に使用された薬の代謝に依存している全ての位相Ｉの７０−８０％を示す。ＣＹＰ発現及び活性は、多形性のために大きい個人間の変化を提示する。さらに、ＣＹＰｓが数倍、誘発されたり、または、特定の薬によって阻害され、追加的な、一時的な、代謝活性の変動性をもたらす。特に、肝細胞の３つの主要ＣＹＰ−系統（１−３）ベースＣＹＰ−活性の組成物は、薬物代謝のために非常に重要である。本願明の実施例には、ｈＢＳ細胞由来肝細胞様細胞が記載され、ＣＹＰ１Ａ２及びＣＹＰ３Ａ４／７を含む大部分のＣＹＰ酵素からのｍＲＮＡが検出された。主要ＣＹＰ−系統ベースＣＹＰ−活性、より正確はＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９及びＣＹＰ３Ａ４が検出され、さらに、前記３つのＣＹＰｓ活性間の配合は、ヒトの初代肝細胞に類似する。したがって、本発明は、機能的な薬物代謝酵素を表示する肝細胞様細胞の生成方法を提供する。
【００１４】
肝細胞の機能的な薬物輸送体（例えばＢＳＥＰ、ＭＲＰ２及びＯＡＴＰｓ）は、肝臓の薬物代謝及び毒性を分析する時に重要である。したがって、本発明は、機能的なトランスポータを表示する肝細胞様細胞の生成方法を提供する。
【００１５】
上に述べたように、本願発明はｈＢＳ細胞に由来される細胞集団に関連し、細胞集団細胞の少なくとも２０％は、アルファ−１−抗トリプシン、サイトケラチン１８、ＨＮＦ−３ベータ、アルブミンまたはＬ型脂肪酸結合蛋白の特性のうちの少なくとも１つを示し、細胞集団は、以下の６つの特性のうちの少なくとも３つを有する。
Ａ．薬物輸送体
ｉ）細胞の少なくとも１％が、ＢＳＥＰのタンパク質および／または遺伝子発現を示し、
ｉｉ）細胞の少なくとも１％が、ＭＲＰ２のタンパク質および／または遺伝子発現を示し、
ｉｉｉ）細胞の少なくとも１％が、ＯＡＴＰ２および／またはＯＡＴＰ−８のタンパク質および／または遺伝子発現を示し、
Ｂ．薬物代謝酵素
ｉｖ）細胞の少なくとも２０％が、ＧＳＴ  Ａ１−１のタンパク質および／または遺伝子発現を示し、
ｖ）細胞の少なくとも２０％が、ＣＹＰ４５０ｓ−１Ａ２、−２Ａ６、−２Ｂ６、−２Ｃ８、−２Ｃ９、−２Ｃ１９、−２Ｄ６、−２Ｅ１、−３Ａ４及び−３Ａ７のうちの少なくとも２つのタンパク質および／または遺伝子発現を示し、
ｖｉ）細胞の少なくとも２０％が、ＧＳＴ  Ｐ１−１のタンパク質および／または遺伝子発現を示していない。
【００１６】
さらに、本願発明はｈＢＳ細胞に由来される細胞集団に関連し、その中の少なくとも細胞集団の細胞の約１０％が、ＨＮＦ３ベータ及びＡＦＰの少なくとも一つを表示し、増殖能を有し、細胞集団は、以下の４つの特性のうちの少なくとも２つを有する。
Ａ．受容体
ｉ）細胞の少なくとも１％が、アルファ−６−インテグリンのタンパク質および／または遺伝子発現を示し、
ｉｉ）細胞の少なくとも１％が、ｃ−Ｍｅｔのタンパク質および／または遺伝子発現を示し、
Ｂ．細胞間接着分子
ｉｉｉ）細胞の少なくとも１％が、ＩＣＡＭ−１のタンパク質および／または発現を示し、
Ｃ．転写因子
ｉｖ）細胞の少なくとも１０％が、ＨＮＦ−４アルファのタンパク質および／または発現を示し、
Ｄ．サイトケラチン
ｖ）細胞の少なくとも１％が、ＣＫ１９のタンパク質および／または発現を示し、
ｖｉ）細胞の少なくとも１％が、ＣＫ７のタンパク質および／または発現を示し、
Ｅ．上皮細胞接着分子
ｖｉｉ）細胞の少なくとも１％が、ＥｐＣＡＭのタンパク質および／または発現を示す。
【００１７】
尿素は、タンパク質及びアミノ酸代謝の最終的な分解産物である。肝臓の肝細胞は、尿素へアンモニアを変える体内唯一の細胞型である。したがって、本発明は尿素を合成する肝細胞様細胞の調製方法を提供する。
【００１８】
本発明の一実施例において、ｈＢＳＣから由来した肝細胞様細胞は、初代肝細胞と同様のレベルに培養基へ尿素を生産及び分泌する。肝細胞様細胞は、初代肝細胞と比較して少なくとも１０％、２０％、５０％、７０％、８０％、９０％または少なくとも１００％の尿素を合成する能力を有する。肝細胞様細胞は、１０日から２０日間尿素のために分析され、尿素合成の高水準を維持する。詳細は、本願明細書の実施例１０を参照。
【００１９】
異なるフィーダフリ表面への肝細胞様細胞の隔離及び再接種は、異なる類型の精製された肝細胞様細胞集団を可能にし、それは、肝細胞に基づく薬毒性及び代謝テスト、及び他の試験分析の範囲で異なる応用によって要求される柔軟性のために必要である。したがって、本発明は、９６−ウェルプレートのようなあらゆる種類の精製及び濃縮される肝細胞様細胞のフィーダフリ培養、好ましくは、コラーゲンＩ培養を生成する方法を提供する。
【００２０】
本発明の一実施例において、肝細胞様細胞は、ウェルの異なる表層、例えば９６−ウェルプレート上にうまく再接種される。異なる表層は、コラーゲンＩ、マトリゲルまたはｍＥＦ細胞層であってもよい。初代肝細胞を再接種することは、非常にむずかしい。それで、肝細胞様細胞が再接種される能力を有することは、初代肝細胞と比較して本質的利点を有する。詳しくは、実施例１５を参照。
【００２１】
増殖可能な状況で培養される時に拡大する能力及び、分化適切な状況に保たれるときに、機能的な肝細胞へ分化する能力を備える肝芽を原種状態に保つ能力は、機能的な肝細胞の非無制限の供給源をキープするのに価値がある。したがって、本発明は、ｍＥＦ−細胞層に肝芽細胞様細胞を再接種することによって肝芽細胞様細胞を原種状態にキープするための方法を提供する。加えて、肝芽細胞様細胞は、マトリゲルまたはコラーゲンがコーティングされた表面に再接種されるときに肝細胞様細胞に分化している。
【発明の説明】
【００２２】
定義及び省略形
ここで使用しているフィーダ細胞は、単独でまたは組合せで使用する支持細胞型を意味することを目的とする。細胞型は、ヒト又は他の種に起源のものでも良い。フィーダ細胞が由来する組織は、胚、胎児、新生児、少年又は成人組織を含み、それは、更に包皮、臍の緒、筋肉、肺、上皮、胎盤、卵管、腺、ストロマまたは胸部の皮膚に由来される組織を含む。フィーダ細胞は、ヒト線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、ケラチン生成細胞、内皮細胞及び上皮細胞からなる群に関連する細胞型に由来してもよい。フィーダ細胞を誘導するのに使われてもよい特定の細胞型の実施例は、胚線維芽細胞、胚体外内胚葉細胞、胚体外中胚葉細胞、胎児線維芽細胞および／または線維細胞、胎児の筋細胞、胎児の皮膚細胞、胎児の肺細胞、胎児の内皮細胞、胎児の上皮の細胞、臍の緒間充織細胞、胎盤の線維芽細胞および／または線維細胞、胎盤の内皮細胞、出産後の包皮線維芽細胞および／または線維細胞、出産後の筋細胞、出産後の皮膚細胞、出産後の内皮細胞、成人皮膚線維芽細胞および／または線維細胞、成人筋細胞、成人卵管内皮細胞、成人腺子宮内膜細胞、成人間質子宮内膜細胞、成人乳ガン実質細胞、成人内皮細胞、成人上皮の細胞または成人ケラチン生成細胞を含む。フィーダ細胞がｈＢＳ細胞に由来されるときに、細胞は線維芽細胞であってもよい。
【００２３】
ここで使用しているように、用語「３Ｄ」は、三次元を意味することを目的とする。
【００２４】
ここで使用しているように、用語「胚盤胞由来幹細胞」は、ＢＳ細胞を意味し、ヒトの型は「ｈＢＳ細胞」と呼ばれる。
【００２５】
ここで使用しているように、用語「ＡＡＴ」は、肝臓マーカーのアルファ−アンチ−トリプシンを意味することを目的とする。
【００２６】
ここで使用しているように、用語「ＡＦＰ」は、肝臓マーカーのアルファ−フェト−タンパク質を意味することを目的とする。
【００２７】
ここで使用しているように、用語「ＢＳＥＰ」は、胆汁酸塩輸出ポンプを意味することを目的とする。
【００２８】
ここで使用しているように、用語「ＣＫ」は、異なる亜類型（例えばサイトケラチン１８、サイトケラチン１９及びサイトケラチン７）を有する肝臓マーカー・サイトケラチン（交互に用いられる）を意味することを目的とする。
【００２９】
ここで使用しているように、用語「ｃ−Ｍｅｔ」は、肝細胞成長因子および／または散乱因子受容体を意味することを目的とする。
【００３０】
ここで使用しているように、用語「ＩＣＡＭ−１」は、細胞内粘着力分子１を意味することを目的とする。
【００３１】
ここで使用しているように、用語「ＬＦＡＢＰ」は、肝臓脂肪酸結合蛋白（交互に用いられる）を意味する。
【００３２】
ここで使用しているように、用語「ＥｐＣＡＭ」は、上皮細胞接着分子（交互に用いられる）を意味する。
【００３３】
ここで使用しているように、用語「ＦＧＦ」は、線維芽細胞成長因子を意味し、好ましくはヒトおよび／または組み換え型オリジンであり、それに対して帰属している亜類型は、例えばｂＦＧＦ（時々ＦＧＦ２と称する）及びＦＧＦ４である。
【００３４】
ここで使用しているように、用語「ＤＭＳＯ」は、ジメチルスルホキシドを意味する。
【００３５】
ここで使用しているように、「ＣＹＰ」はシトクロムＰ、より詳しくはシトクロムＰ  ４５０、多数の異なるサブユニット肝臓構成（例えば１Ａ１、１Ａ２、３Ａ４その他）の主要位相１の代謝酵素を意味する。
【００３６】
ここで使用しているように、用語「ＧＳＴ」は、グルタチオン転移酵素を意味することを目的とし、それの亜類型の実施例は、ＧＳＴ  Ａ１−１、ＧＳＴ  Ｍ１−１及びＧＳＴ  Ｐ１−１である。
【００３７】
ここで使用しているように、交互に用いられる「ＨＮＦ３ベータ」および／または「ＨＮＦ３ｂ」は、肝細胞核要因３、例えば肝臓、膵島及び脂肪細胞のような組織に由来の転写因子調整遺伝子発現を意味することを目的とする。ＨＮＦ３ベータは、時々さらにＦｏｘａ２と称してもよく、フォークヘッドボックス転写因子系統のメンバーである転写因子から由来している名前である。
【００３８】
ここで使用しているように、用語「ＯＡＴＰ」は、有機アニオン・トランスポーター遺伝子を意味することを目的とし、それは、肝臓内のスルホブロモフタレイン（ＢＳＰ）及び抱合型胆汁酸（タウロコール酸）及び非抱合型胆汁酸（コール酸塩）のような有機アニオンのナトリウム（Ｎａ＋）−独立トランスポートの媒介となる。
【００３９】
ここで使用しているように、用語「ＵＧＴ」は、ウリジン二リン酸グルクロノシル転移酵素を意味することを目的とし、それは、グルクロン酸化活性を触媒している一群の肝臓酵素である。
【００４０】
ここで使用しているように、用語「異種動物由来成分不含」は、人間以外の動物成分への直接又は間接的な暴露の完全な回避を意図する。
【００４１】
上記において言及されたように、本願発明は改良型のｈＢＳ細胞由来肝芽細胞様細胞および肝細胞様細胞を提供する。改良型の肝細胞様細胞は、同じ薬物輸送体及び代謝酵素を使用して生体内肝細胞と類似した薬取り込み、分泌及び代謝を確実にする薬物輸送体および／または代謝酵素を表示する。それで、それらの薬物および化学薬品への反応が生体内の肝細胞に似ていることが期待されることにつれ、これらの全ての特徴の発現は創薬及び毒性テストに使用される細胞のための望ましい特徴である。
【００４２】
したがって、本願発明の開示する肝芽細胞様細胞または肝細胞様細胞は、創薬プロセス、薬物輸送体を研究するためのインビトロ・モデル、薬物代謝酵素を研究するためのインビトロ・モデル、肝形成を研究するためのインビトロ・モデル、初期の肝形成、ヒト肝再生障害を調査するためのインビトロ・モデル、インビトロ・肝毒性テストのような多数の研究目的に有利に使われる。
【００４３】
さらに、本発明の肝芽細胞様細胞及び肝細胞様細胞は有利に、いくつかの肝臓疾患及び障害の治療および／または予防のために使われることができる。したがって、本発明の肝芽細胞様細胞及び肝細胞様細胞が、薬剤に使われることができる。
【００４４】
肝芽細胞様細胞は、肝細胞様細胞の原種細胞であり、したがって、それらは、例えば、代謝的に有能な肝細胞様細胞を得るために、または、肝細胞様細胞への成熟を研究するために最適に使われる。
【００４５】
肝細胞様細胞
現在のコンテキストにおいて、用語「肝細胞様細胞」は、アルファ−１−アンチトリプシン、サイトケラチン１８、ＨＮＦ−３ベータ、アルブミンまたは肝臓脂肪酸結合蛋白質の特性のうちの少なくとも１つを示している細胞を意味することを目的とする。本発明の肝細胞様細胞は、さらに、薬品トランスポート及び薬物代謝に関する重要及び安定した特性を有する。
【００４６】
したがって、一実施例において、本発明はｈＢＳ細胞に由来される細胞集団に関連し、その細胞集団の細胞の少なくとも２０％が、アルファ−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）、サイトケラチン１８（ＣＫ１８）、ＨＮＦ−３ベータ、アルブミンまたは肝臓脂肪酸結合蛋白（ＬＦＡＢＰ）の特性のうちの少なくとも１つを示し、さらに細胞集団は、以下の６つの特性のうちの少なくとも３つを有する。
Ａ．薬物輸送体
ｉ）  細胞の少なくとも１％が、ＢＳＥＰのタンパク質および／または遺伝子発現を示し、
ｉｉ）  細胞の少なくとも１％が、ＭＲＰ２のタンパク質および／または遺伝子発現を示し、
ｉｉｉ）  細胞の少なくとも１％が、タンパク質および／または遺伝子発現ＯＡＴＰ２および／またはＯＡＴＰ−８を示し、
Ｂ．  薬物代謝酵素
ｉｖ）  細胞の少なくとも２０％が、ＧＳＴ  Ａ１−１のタンパク質および／または遺伝子発現を示し、
ｖ）  細胞の少なくとも２０％が、ＣＹＰ４５０ｓ−１Ａ２、−２Ａ６、−２Ｂ６、−２Ｃ８、−２Ｃ９、−２Ｃ１９  −２Ｄ６、−２Ｅ１、−３Ａ４及び−３Ａ７のうちの少なくとも２つのタンパク質および／または遺伝子発現を示し、
ｖｉ）  細胞の少なくとも２０％が、ＧＳＴ  Ｐ１−１のタンパク質および／または遺伝子発現を示していない。
【００４７】
付加物または必要条件の代替品として、ｖｉ）細胞の少なくとも約５％が、ＧＳＴ  Ｍ１−１のタンパク質および／または遺伝子発現を示す。
【００４８】
本発明の一実施例において、肝細胞様細胞は、フェーズＩシトクロムｐ４５０酵素によって薬品を新陳代謝させることができる。特に、ｃｙｐ１Ａ２、ｃｙｐ２Ｃ９及びｃｙｐ３Ａ４は、誘発因子がない場合も新陳代謝することができる。実施例において、肝細胞様細胞によって新陳代謝する物質は、フェナセチン、ジクロフェナク及びミダゾラムであり、代謝物質はＬＣ−ＭＳによって分析された。肝細胞様細胞が誘発因子の影響なしで薬品を新陳代謝させることができる点は、重要である（例えば、国際公開ＷＯ２００５０９７９８０に記載される通り）。
【００４９】
他の実施例で、肝細胞様細胞は、ヒト初代肝細胞培養のｃｙｐ活性配合と同様のｃｙｐ−活性の配合を有する。具体的には、肝細胞様細胞のＣｙｐ１Ａ２、Ｃｙｐ３Ａ４及びＣｙｐ２Ｃ９の配合はヒト初代肝細胞培養物の配合に匹敵する。Ｃｙｐ１Ａ２、Ｃｙｐ３Ａ４及びＣｙｐ２Ｃ９間のＣｙｐ−活性配合は、ヒト初代肝細胞培養組織の配合と比較して、３０％、５０％、７５％及び１００％と異なることができる。
【００５０】
本発明の一実施例において、肝細胞様細胞は、機能的な薬物輸送体を表示する。特に、ＯＡＴＰ−２は、ＩＣＧ染料の着色により能動的に測定され、それは、細胞の範囲内の機能的な薬物輸送体の存在の指示である（図４８）。
【００５１】
本発明の更なる実施例において、細胞集団はｈＢＳ細胞に由来し、細胞集団の細胞の少なくとも２０％は、アルファ  １−アンチトリプシン、サイトケラチン１８、ＨＮＦ−３ベータ、アルブミンまたは肝臓脂肪酸結合蛋白の特性のうちの少なくとも１つを示し、細胞集団は、以下の２つの特性を有する。
Ａ．薬物輸送体
ｉｉｉ）細胞の少なくとも１％が、機能的に活性を有するＯＡＴＰ−２および／またはＯＡＴＰ−８を示し、
Ｂ．薬物代謝酵素
ｉｖ）細胞の少なくとも２０％が、ＧＳＴＡ１−１の機能的な活性を示し、
ｖ）細胞の少なくとも２０％が、薬物代謝物質を分析することで測定される機能的に活性を有するＣｙｐ１Ａ２、Ｃｙｐ３Ａ４および／またはＣｙｐ２Ｃ９を示す。
【００５２】
本発明の更なる実施例において、細胞集団はｈＢＳ細胞に由来し、細胞集団の細胞の少なくとも７５％は、アルファ  １−アンチトリプシン、サイトケラチン１８、ＨＮＦ−３ベータ、アルブミンまたは肝臓脂肪酸結合蛋白の特性を示し、細胞集団は、少なくとも２つの以下の特性を有する。
Ａ．薬物輸送体
ｉｉｉ）細胞の少なくとも１０％が、機能的に活性を有するＯＡＴＰ−２および／またはＯＡＴＰ−８を示し、
Ｂ．薬物代謝酵素
ｉｖ）細胞の少なくとも３０％が、ＧＳＴＡ１−１の機能的な活性を示し、
ｖ）細胞の少なくとも５０％が、薬品代謝物質を分析することで測定される機能的に活性を有するＣｙｐ１Ａ２、Ｃｙｐ３Ａ４および／またはＣｙｐ２Ｃ９を示す。
【００５３】
グリコーゲン記憶は、肝細胞様細胞の顕著なもう一つの特徴である。
【００５４】
さらに、肝細胞様及び肝芽細胞様細胞の割合は、Ｎｏｔｃｈ−２陽性である。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路は、成人の胚発育及びホメオスタシスの保全に広く使われている。それは、幹細胞信号ネットワークを構成するさらにキー経路の１本である。哺乳類において、４つのＮｏｔｃｈ受容体（Ｎｏｔｃｈ１−Ｎｏｔｃｈ４）及び５つの構造的類似のＮｏｔｃｈリガンド（Ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ１  ［さらに、Ｄｅｌｔａ１と呼ばれる］、Ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ３、Ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ４、Ｊａｇｇｅｄ１及びＪａｇｇｅｄ２）がこれまで確認された。Ｎｏｔｃｈリガンドは、１回膜貫通タンパクである。隣接の細胞に表示されるリガンドと結合することによって、Ｎｏｔｃｈ受容体は起動し、それは、タンパク質分解解放及び、順番に分化を調整するＮｏｔｃｈの細胞内領域の核移動を導く。胚発育の間、Ｎｏｔｃｈ−２は広く表示され、Ｎｏｔｃｈ−２は、多器官に重要な役割を有する。肝臓において、Ｎｏｔｃｈ−２は、肝内胆管の形成及び分化に関与している（アーダー等、２００５、コダマ等、２００６）。肝臓様細胞が幹細胞によって生成されるので、それらの細胞型のノッチ・シグナリングの役割を理解することは、重要である。
【００５５】
肝細胞様細胞は、肝細胞のために典型的な形態学を表示し、すなわち、それらは多角形の細胞形状を有し、大きい細胞直径（およそ２５−５０μＭ）、よく二重核を有し、脂質微粒を蓄積する傾向を示す。
【００５６】
ＡＡＴ、ＣＫ１８、ＨＮＦ−３ベータ、アルブミン及びＬＦＡＢＰは全て肝臓の特定のマーカーであり、それらの発現は、肝細胞様細胞を表す。しかし、これらの肝臓特定マーカーの全てが、本発明の細胞集団の全ての細胞に、必ずしも表示されるというわけではない。これらのマーカーのうちの一つ、二つ、三つ、四つだけを表示する均等な細胞は肝細胞と同様に機能することができ、それによって、それらが使われるべきであることによって決まる上述の目的に役立つ。細胞のｌｙｓａｔｉｏｎによって代謝を研究するために、少なくとも、ＣＹＰｓ及びＧＳＴｓが、要求される。摂取を研究するために、ＯＡＴＰｓは重要であり、さらに、分泌物のために、例えばＢＳＥＰまたはＭＲＰ−２の研究が要求される。実施する研究がインビボの研究に近付くにつれて、前記の特徴のうちより多くのものが必要となる。もっとよいものは、細胞−細胞相互作用によって肝臓環境を提供するマクロファージ及びクッパー細胞のような他の肝臓細胞型の肝細胞様細胞を潜在的に有する。この種の培養系は、サンドイッチの形状であり、これに一つ以上細胞型が組み込まれ、この３Ｄ構造及びさらなる体内模倣状況は肝細胞様細胞が潜在的にさらに正反対を示させることができる。すなわち、血液の方へ１つの親水側、胆汁の方へ１つの疎水側が示される。毒性研究のために、それらの相互作用により、フェーズＩ及びＩＩの代謝酵素が両方とも好ましい。加えて、細胞集団が周知の薬品誘発因子に反応できることが望ましく、それによって、例えばフェーズＩおよび／またはフェーズＩＩの代謝酵素が誘導できる。
【００５７】
本発明の実施例において、上述の特性ｉ）−ｖｉ）のうちの少なくとも３つを有する細胞集団の少なくとも約３０％の細胞、例えば、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％が、アルファ  １−アンチトリプシン、ＣＫ１８、ＨＮＦ−３ベータ、アルブミンまたはＬＦＡＢＰの特性の中の少なくとも２つ、例えば少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つまたは全てを示す。特定の実施形態において、特性の少なくとも一つは薬物輸送体のグループ（すなわち特性ｉ−ｉｉｉ）に関連するものであり、特性のうちの少なくとも１は薬物代謝酵素（すなわち特性ｉｖ）−ｖｉ））のグループに関連するものである。したがって、一つ以上の肝臓特定マーカーに加えて、細胞集団は、更に少なくとも一つの前記薬物輸送体特性及び少なくとも一つの前記薬物代謝特性を有してもよい。より具体的には、本発明の細胞集団は、特性ｉ）−ｖｉ）のうちの少なくとも４つ、例えば少なくとも５つまたは全６つの特性を有する。
【００５８】
特性ｉ）は、肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の割合に関係し、本発明による細胞集団の薬物輸送体ＢＳＥＰのタンパク質および／または遺伝子発現を示す。ＢＳＥＰは、胆汁酸塩輸出ポンプ（ｂｉｌｅ  ｓａｌｔ  ｅｘｐｏｒｔ  ｐｕｍｐ）を表し、ＡＴＰ加水分解のエネルギーを使用して、細胞外及び細胞内膜にわたる分子のトランスポートを触媒するＡＴＰ−結合カセット（ＡＢＣ）トランスポータであり、したがって、胆汁に薬品を外へ輸出することができる（通常は生体内に位置され、肝細胞のアピカル側と称する）。本発明の実施例において、肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％が、ＢＳＥＰのタンパク質および／または遺伝子発現を示す。
【００５９】
特性ｉｉ）は、本発明による細胞集団の薬物輸送体ＭＲＰ２のタンパク質および／または遺伝子発現を示す肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の割合に関する。ＭＲＰ２は、複数薬品抵抗タンパク質２を表し、さらにＡＢＣトランスポータ系統のメンバーであり、胆汁に薬品代謝物質を輸出する。本発明の実施例において、肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の少なくとも５％、例えば少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％または少なくとも８０％が、ＭＲＰ２のタンパク質および／または遺伝子発現を示す。
【００６０】
特性ｉｉｉ）は、本発明による細胞集団の薬物輸送体ＯＡＴＰ２および／またはＯＡＴＰ８のタンパク質および／または遺伝子発現を示す肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の割合に関する。ＯＡＴＰ−２及びＯＡＴＰ−８は、有機アニオン・トランスポータ２及び８を表し、両方ともＯＡＴＰ系統のメンバーであり、血液から有毒な内在性代謝物質及び生体異物物質を巻き取ることが公知である。ＯＡＴＰｓは、体内の血液の方の肝細胞の基底外側に位置している。本発明の一実施例において、肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の少なくとも５％、例えば少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％または少なくとも８０％が、ＯＡＴＰ２および／またはＯＡＴＰ−８のタンパク質および／または遺伝子発現を示す。
【００６１】
特性ｉｖ）は、本発明による細胞集団における薬品代謝酵素ＧＳＴ  Ａ１−１のタンパク質および／または遺伝子発現を示す肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の割合に関連する。グルタチオン転移酵素（ＧＳＴｓ）は、グルタチオンを有する生体異物の活用を触媒し、第２相解毒システムの不可欠な部分である。さらに、指定された７つのクラスへ割れられる１７種の異なるヒト細胞質ＧＳＴサブユニットがあり、例えばＡ、Ｍ、Ｐ及びＳである。ＧＳＴ  Ａ１−１は、生体内成人ヒト肝臓における最も多量のサブユニットである。ＧＳＴ  Ｐ１−１が胎児の肝臓でより高い程度で表示される一方、ＧＳＴ  Ｍ１−１は同様に成人ヒト肝臓において表示される。本発明の一実施例において、肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％または少なくとも８０％は、ＧＳＴ  Ａ１−１のタンパク質および／または遺伝子発現を示す。
【００６２】
特性ｖ）は、発明の細胞集団のＣＹＰ４５０ｓ−１Ａ２、−２Ａ６、−２Ｂ６、−２Ｃ８、−２Ｃ９、−２Ｃ１９、−２Ｄ６、−２Ｅ１、−３Ａ４及び−３Ａ７からなるグループから選択される薬品代謝酵素のうちの少なくとも２つのタンパク質および／または遺伝子発現を示す肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の割合に関連する。ＣＹＰは、シトクロムＰ４５０を表し、肝臓の小胞体細網構造に位置する一群の酵素である。それらの役割は、内在性合成物及び生体異物の代謝及び解毒である。これらの酵素の高い濃度は肝臓及び小腸で見つかるが、多数のＣＹＰｓは同様に他の組織でも見つかる。ＣＹＰｓは、抑制及び誘導を含む多くの機構によって変えられることができて、人から人へ変化することができる。ＣＹＰシステムは、薬物代謝、薬品相互作用及び薬剤誘発性肝毒性を理解するのに重要である。
【００６３】
本発明の一実施例において、肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の少なくとも３０％、例えば、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％または少なくとも８０％が、ＣＹＰ４５０ｓ−１Ａ２、−２Ａ６、−２Ｂ６、−２Ｃ８、−２Ｃ９、−２Ｃ１９、  ２Ｄ６、−２Ｅ１、−３Ａ４及び−３Ａ７のうちの少なくとも２つのタンパク質および／または遺伝子発現を示す。さらに、一般的ＣＹＰ４５０酵素活性が、そのような細胞集団に示されることができ、細胞集団は、これらのＣＹＰ４５０タンパク質のうちの少なくとも１つ、例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは全１０の酵素活性を更に示してもよい。
【００６４】
特性ｖｉ）は、本発明による細胞集団の第２相酵素ＧＳＴ  Ｐ１−１のタンパク質および／または遺伝子発現を示す肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の割合に関連する。本発明の一実施例において、肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％または少なくとも８０％は、ＧＳＴ  Ｐ１−１のタンパク質および／または遺伝子発現を示していない。
【００６５】
さらに、細胞集団はＧＳＴ酵素活性を示すことを示してもよく、それは、細胞集団の溶解物のタンパク質の少なくとも０．０１μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ、例えば少なくとも０．０３μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ、少なくとも０．０５μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ、少なくとも１．０μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ、少なくとも０．０７μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ、少なくとも０．０９μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ、少なくとも０．１１μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ、少なくとも０．１３μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇまたは少なくとも０．１５μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇであってもよい。
【００６６】
本発明の特定の実施例において、細胞組成は、ＣＫ  １８共発現細胞を含み、例えばＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１；ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９及びＣＹＰ２Ｃ１９の組合せ、またはＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ３Ａ７の組合せのような一つ以上のＣＹＰ薬物代謝酵素を含む。
【００６７】
上述の特性に加えて、本発明の細胞集団の細胞の少なくとも約５％は、以下の追加的な特性のうちの少なくとも１つを有する。
Ａ．受容体
ｖｉｉ）細胞の少なくとも約５％が、ｃ−Ｍｅｔのタンパク質および／または遺伝子発現を示し、
Ｂ．  細胞間接着分子
ｖｉｉｉ）細胞の少なくとも約５％が、ＩＣＡＭ−１のタンパク質および／または遺伝子発現を示し、
Ｃ．薬物代謝酵素
ｉｘ）細胞の少なくとも１％が、ＵＧＴのタンパク質および／または遺伝子発現を示し、
Ｄ．転写因子
ｘ）細胞の少なくとも９０％が、非Ｏｃｔ−４のタンパク質および／または遺伝子発現を示す。
【００６８】
好ましくは、細胞集団は特性ｖｉｉ）、ｖｉｉｉ）、ｉｘ）またはｘ）のうちの少なくとも２つ、例えば少なくとも３つまたは全４つを有する。
【００６９】
特性ｖｉｉ）は、発明の細胞集団における受容体ｃ−Ｍｅｔのタンパク質レベルおよび／または遺伝子発現に関する。ｃ−Ｍｅｔは、肝細胞成長因子および／または散乱因子受容体であり、それによって、肝細胞様細胞が、生体内ヒト肝細胞と同じ細胞内調節及びメカニズム（メチル化）を反応及び有するのを期待される。本発明の一実施例において、肝細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の少なくとも１０％、例えば少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％が、ｃ−Ｍｅｔのタンパク質および／または遺伝子発現を示す。
【００７０】
特性ｖｉｉｉ）は、本発明による細胞集団の細胞間接着分子ＩＣＡＭ−１のタンパク質のレベルおよび／または遺伝子発現に関する。ＩＣＡＭ−１は、肝臓内の細胞−細胞相互作用に重要な細胞内部−粘着力分子である。本発明の一実施例において、肝細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％は、ＩＣＡＭ−１のタンパク質および／または遺伝子発現を示す。
【００７１】
特性ｉｘ）は、本発明による細胞集団の薬品代謝酵素ＵＧＴのタンパク質のレベルおよび／または遺伝子発現に関する。ウリジン・ジホスホグルクロノシルトランスフェラーゼは、ＧＳＴｓ第２相代謝酵素と同様にｆａｔ−ｓｏｌｕｂｌｅ化学製品、両方の内因性培養基、薬品及び他の生体異物に砂糖の酵素添加の役割を果たす。哺乳類において、グルクロン酸は体の潜在的中毒レベルの環境または薬品から、代謝及び脂溶性化学製品の廃棄物蓄積を予防するために用いるメイン砂糖である。特にＵＧＴ２Ｂ７は、成人ヒト肝臓の重要な第２相酵素であり、例えば、薬品ジクロフェナクを新陳代謝するために、Ｃｙｐ２Ｃ９及びＣｙｐ３Ａ４と協力する。本発明の一実施例において、肝細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％は、ＵＧＴのタンパク質および／または遺伝子発現を示す。さらに、細胞集団はＵＧＴ酵素活性を示してもよい。
【００７２】
特性ｘ）は本発明による肝細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の割合に関連し、それは転写因子Ｏｃｔ−４の非タンパク質および／または遺伝子発現を示す。Ｏｃｔ−４は転写因子であり、その発現は未分化のｈＢＳ細胞に特徴的であり、肝細胞様細胞を含んでいる細胞集団におけるその存在は、望ましくない。したがって、Ｏｃｔ−４の無しまたは低い発現は、それらが未分化のｈＢＳ細胞ではないことを示し、未分化の細胞集団が潜在的に奇形腫様組織を引き起こすことがあるので、たとえば、再生医療においてそれは利点である。本発明の一実施例において、肝細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の少なくとも１０％、例えば少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％は、Ｏｃｔ−４のタンパク質および／または遺伝子発現を示す。
【００７３】
上述の特性ｉ）−ｘ）の一部は、誘発因子の追加で誘導でき、それは、デキサメタゾン、オメプラゾールからなるグループから単独でまたは組合せで選択される。誘発因子は、同様にリファンピシン、デキサメタゾン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、オメプラゾール及びイソニアジドを含んでもよい。このような方法で、ＣＹＰ４５０タンパク質のうちの少なくとも１つの発現が、誘発因子の追加で誘導できる。さらに、ＧＳＴ  Ａ１−１および／またはＧＳＴ  Ｍ１−１タンパク質の発現は、誘発因子の追加で誘導できる。ＵＧＴタンパク質の発現は、同様に誘発因子の追加で誘導できる。
【００７４】
本発明の肝細胞様細胞は、それらが培養される間にこれらが示す特性ｉ）−ｘ）を維持することができる。この文脈において、用語「維持された特性」は、定義済みの培養組織及び分析期間にわたる安定的タンパク質発現を意味することを目的とし、それは、例えば免疫組織化学及び発現輝度の測定及び比較で更に示されることができる。したがって、本願発明による肝細胞様細胞を含んでいる細胞集団が、少なくとも一ヶ月間、例えば、維持された特性を有しながら少なくとも一週間または少なくとも７２時間、インビトロで培養されることが可能である。
【００７５】
本発明の一実施例で、肝細胞様細胞を含んでいる細胞集団またはその部分母集団は、更にＡＦＰを表示する。
【００７６】
さらに特定の臓器模倣応用のために、おそらく、他の肝臓細胞型、例えばクッパー細胞および／またはマクロファージが、必要である。
【００７７】
本発明の肝細胞様または肝芽細胞様細胞は、本願明細書に記載されているそれらのそれぞれの特性を確かめるために使用の前に選ばれ、より高い収穫を得る。細胞は、細胞表面に表示される肝臓マーカー及び次のＦＡＣソーティングのために抗原検出を用いて精製されてもよい。抗原ベースのソートのための他の代わりは培養皿を特定の抗体でコーティングし、培養基から皿に細胞を加え、右側の抗原と細胞を結びつけ、及び残りの細胞は廃棄され、まとめられた細胞は更なる用途のために収穫する。この方法は、時々免疫と称され、さらに陰性選択として実行されることができる。すなわち、不要な細胞型をコーティングされる抗原へ結合させ、懸濁液の肝細胞様細胞を有する培養基を確保する。このアプローチは、磁気ビーズ上で実行された方がよく、いわゆるＭＡＣソートまたはカラムクロマトグラフィを使用する。例えば特定の特性を有する肝細胞様細胞のような細胞を精製するさらなる方法は、細胞分離のための、遠心分離中での浮遊密度またはサイズに基づく密度勾配培養基の使用を含む。
【００７８】
肝細胞様または肝芽細胞様細胞の精製集団を得るためのさらなる代替方法は、ｈＢＳ細胞由来細胞の混合集団における陽性選択または陰性選択を実行することである。両方の選択方法は、細胞単片の切断又は、コラゲナーゼＩＶまたはトリプシン、または、例えばＥＤＴＡまたは適切な酵素及びキレート化剤の混成物のような酵素への追加及び暴露によって手動で実行されることができる。本発明の１つの特定の実施例において、培養皿は、カルシウム／マグネシウムフリーＰＢＳで二回洗われ、その後、カルシウム／マグネシウムフリーＰＢＳに希釈される０．５ｍＭのＥＤＴＡにおいて培養され、非肝細胞様又は非肝芽細胞様細胞を取り除き、マウス胚のフィーダ上で完全に成長する肝臓様細胞型を残す、陰性選択をもたらす。キレート化剤および／または酵素への更なる暴露の後、肝臓様細胞は、フィーダ細胞及び、実験に更にプールされ、使われる皿から分離される。
【００７９】
肝芽細胞様細胞
このコンテキストにおいて、用語「肝芽細胞様細胞」は、ＨＮＦ３ベータ及びＡＦＰの少なくとも一つのを表示し、増殖能を有する細胞を意味することを目的とする。したがって、本願発明の一実施例は、ｈＢＳ細胞に由来される細胞集団に関連し、細胞集団の細胞の少なくとも約１０％が、少なくとも一つのＨＮＦ３ベータ及びＡＦＰを表示し、増殖能を有し、細胞集団は以下の４つの特性のうちの少なくとも２つを有する。
Ａ．受容体
ｉ）細胞の少なくとも１％が、アルファ−６−インテグリンのタンパク質および／または遺伝子発現を示し、
ｉｉ）細胞の少なくとも１％が、ｃ−Ｍｅｔのタンパク質および／または遺伝子発現を示し、
Ｂ．細胞間接着分子
ｉｉｉ）細胞の少なくとも１％が、ＩＣＡＭ−１のタンパク質および／または発現を示し、
Ｃ．転写因子
ｉｖ）細胞の少なくとも１０％が、ＨＮＦ−４アルファのタンパク質および／または発現を示し、
Ｄ．サイトケラチン
ｖ）細胞の少なくとも１％が、ＣＫ１９のタンパク質および／または発現を示し、
ｖｉ）細胞の少なくとも１％が、ＣＫ７のタンパク質および／または発現を示し、
Ｅ．上皮細胞接着分子
ｖｉｉ）細胞の少なくとも１％が、ＥｐＣＡＭのタンパク質および／または発現を示す。
【００８０】
細胞質比に高い核を有し、立方形の形状であることは、肝芽細胞様細胞の顕著な特徴である。さらに、それらは細胞質に小さい核小体及び微粒を有してもよい。好ましくは、細胞の直径は１０−３０μｍの間であってもよい。
【００８１】
肝芽細胞様細胞は、更に肝細胞様細胞に分化する能力を有する内皮オリジンの細胞である。ＨＮＦ３ベータは内皮性マーカーであり、内胚葉は肝細胞の方へ発育経路に沿っている。ＨＮＦ３ベータは、同様に膵臓で表示されることは公知である。この文脈において、用語「増殖能」は、細胞集団の細胞が分裂することを意味することを目的とする。
【００８２】
ＨＮＦ３ベータ以外の肝芽細胞様及び肝細胞様細胞へ分化するｈＢＳ細胞によって表示される追加的な内皮性マーカーの実施例は、Ｇａｔａ４、Ｃｄｘ２（尾部関連ホメオボックス転写因子）、Ｓｏｘ１７（Ｓｒｙ−ｂｏｘ含有遺伝子１７の遺伝子製品）、Ｐｄｘ１（膵臓の十二指腸ホメオボックス因子−１）及びＡＦＰであり、後者は通常、胎児の肝臓マーカーとみなされる。
【００８３】
肝芽細胞様細胞は、さらに、増殖されてもよく、それは、前駆状態の１つの表示であり、すなわち、それらは未成熟で完全に肝細胞様細胞に分化されなかった。細胞の繁殖的状態は、多数の手段によって示されることができ、それらは例えばＢｒｄＵ取り込み及び染色または例えばＫＩ６７のような繁殖的細胞に特有なタンパク質マーカーを使するもう一つの染色であり、固定の時点に集団における繁殖細胞を染色する。
【００８４】
肝芽細胞様細胞の特性ｉ）−ｖｉｉ）は、肝発育にとって重要な体内関連マーカーである。
【００８５】
特性ｉ）は、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の割合に関連し、アルファ−６−インテグリン受容体のタンパク質および／または遺伝子発現を示す。アルファ−６−インテグリンは、ラミニン受容体である。ラミニン受容体は、例えば発育中の肝臓の細胞外基質の一部であり、多数の細胞型（例えば体内肝芽及び肝細胞）に表示される。本発明の一実施例において、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％が、アルファ−６−インテグリン受容体のタンパク質および／または遺伝子発現を示す。
【００８６】
特性ｉｉ）は、ｃ−Ｍｅｔ受容体のタンパク質および／または遺伝子発現を示す、肝芽細胞様細胞を含む細胞集団の細胞の割合に関する。本発明の一実施例において、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％は、ｃ−Ｍｅｔ受容体のタンパク質および／または遺伝子発現を示す。
【００８７】
特性ｉｉｉ）は、細胞集団において、細胞間の粘着力分子ＩＣＡＭ−１のタンパク質および／または遺伝子発現を示す肝芽細胞様細胞を含む細胞の割合に関する。本発明の一実施例において、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団における細胞の少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％が、細胞間の粘着力分子ＩＣＡＭ−１のタンパク質および／または遺伝子発現を示す。
【００８８】
特性ｉｖ）は、転写因子ＨＮＦ−４アルファのタンパク質および／または遺伝子発現を示す肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団における細胞の割合に関する。この転写因子は、特に内皮性細胞型において表示され、したがって、肝芽細胞様細胞を表す。本発明の一実施例において、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％が、ＨＮＦ−４アルファのタンパク質および／または遺伝子発現を示す。
【００８９】
特性ｖ）は、サイトケラチン１９のタンパク質および／または遺伝子発現を示す、肝芽細胞様細胞を含む細胞集団の細胞の割合に関する。このサイトケラチンは、肝細胞以外の特に肝臓幹細胞及び肝芽において表示され、したがって、肝芽細胞様細胞を表す。本発明の一実施例において、肝芽細胞様細胞を含む細胞集団の細胞の少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％が、サイトケラチン１９のタンパク質および／または遺伝子発現を示す。
【００９０】
特性ｖｉ）は、サイトケラチン７のタンパク質および／または遺伝子発現を示す、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団における細胞の割合に関する。このサイトケラチンは、肝細胞ではなく特に肝臓幹細胞及び肝芽において表示され、したがって、肝芽細胞様細胞を表す。本発明の一実施例において、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％が、サイトケラチン７のタンパク質および／または遺伝子発現を示す。
【００９１】
特性ｖｉｉ）は、上皮細胞接着分子のタンパク質および／または遺伝子発現を示す、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の割合に関する。この上皮細胞接着分子は、肝細胞でなく特に肝臓前駆において表示され、したがって、肝芽細胞様細胞を表す。本発明の一実施例において、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％が、上皮細胞接着分子のタンパク質および／または遺伝子発現を示す。
【００９２】
本発明の一実施例において、上述の特性ｉ）−ｖｉｉ）のうちの少なくとも２つを有する細胞集団の細胞の少なくとも約１５％、例えば、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％が、ＨＮＦ３ベータ及びＡＦＰのうちの少なくとも一つに表示され、増殖能を有する。さらに、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団は、特性ｉ）−ｖｉｉ）のうちの少なくとも３つまたは全４つを有する。
【００９３】
本発明の他の実施例において、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団は、更に以下の特性のうちの少なくとも１つを有する。
Ｆ．薬物輸送体：
ｖｉｉｉ）細胞の少なくとも１％が、ＢＳＥＰのタンパク質および／または遺伝子発現を示す。
ｉｘ）細胞の少なくとも１％が、ＭＲＰ２のタンパク質および／または遺伝子発現を示す。
【００９４】
ＢＳＥＰ及びＭＲＰ２は、肝細胞様細胞へ発育の間に、すでに薬品トランスポート・プロセスを実行することにとって重要であるが、それは、この発育的なフェーズで代謝、解毒及び分泌物が同様に必要とするからである。
【００９５】
更なる使用態様
薬品トランスポート及び薬物代謝酵素の発現のために、本発明の肝細胞様細胞及び肝芽細胞様細胞は、医薬品用途に非常に適している。したがって、本発明に記載されている細胞集団が、予防および／または病状治療、および／または例えば、肝臓組織退化、原発性胆汁性肝硬変を含む自己免疫障害からなる群から選択される肝臓障害、脂質異常症を含む代謝障害、例えばアルコール濫用によって生じる肝臓障害、ウイルスによって生じる疾患（例えばＢ型肝炎、Ｃ型肝炎及びＡ型肝炎）、例えば調合薬に対する急性毒性反応によって生じる肝臓壊死及び肝細胞性癌及び代謝病状および／または、疾患で苦しんでいる患者の腫瘍除去のような組織退化によって生じる疾患のための医薬品の製造に使われることができる。
【００９６】
さらに、本発明の肝細胞様細胞及び肝芽細胞様細胞は、スクリーニングの目的のために最適に使われる。例えば、細胞は本発明の細胞集団から合成物へ細胞を暴露することを含む、肝細胞毒性の合成物をスクリーニングする方法に使うことが可能であり、合成物が細胞に対して有毒かどうか決定する。細胞は、さらに肝細胞性機能を調整する能力のために合成物をスクリーニングする方法に使われてもよい。上記の方法は、本発明の細胞集団からの細胞を合成物へ暴露し、合成物との接触から起こる細胞のいかなる表現型または代謝変化を測定し、肝細胞性機能を調整する能力に変化を関連づける方法である。
【００９７】
再生医療の応用において、ｈＢＳ細胞は、異種動物由来成分不含ｈＢＳ細胞に由来されるべきであり（実施例１を参照）、さらに分化の間に、分離及び可能性二次培養は直接的にも間接的にも非人間動物由来構成要素に暴露されない。これは、ヒト由来構成要素（例えば組み換え型培養基及び添加物）だけを用いて達成されることができる。
【００９８】
製剤方法
本発明の細胞集団は、分化誘導薬を用いずに得られるが、それは、一般的に他に使われる。分化誘導薬は、細胞に有毒な欠点を有し、そのような方法によって得られる分化細胞の収穫は低く、さらに、これらの得られた細胞の品質にも影響を及ぼす可能性がある。本発明の発明者は、培養状況を確認することにより、分化誘導薬を使用しないで肝細胞様細胞および／または肝芽細胞様細胞へｈＢＳ細胞の分化を可能にする。本発明による肝細胞様細胞及び肝芽細胞様細胞の製剤方法は、細胞の改良された品質及び改良された収穫を提供する。さらに、得られた細胞は、ここに記載されている特性を有し、この特性が細胞をここに記載の用途以外にも適応させる。
【００９９】
本発明の一実施例において、９６−ウェルプレートの肝細胞様細胞へのｈＢＳ細胞の分化は、うまく実行される。９６−ウェルの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％が、肝細胞様細胞へｈＢＳ細胞を分化させることに成功した。ｈＢＳ細胞は、本発明の実施要項に従う期間で肝細胞様細胞へ分化するが、例えば２０日目、２５日目、３０日目または３５日目である。
【０１００】
本発明の方法は、さらに、周知の方法より労力が掛からない。ｂＦＧＦ以外の、高価な因子は、培養基への添加物として必要でなく、ｂＦＧＦは、低い量だけ必要で、以前報告されるほうより少ない量である。
【０１０１】
方法は、細胞から排出する内因子に依存し、中毒特性のいかなる潜在的添加物にも依存しない。すなわち、より穏やかな、より生理的に適切な環境を実現する。それゆえに、方法はまれな培養基置換及び部分的な培養基置換に依存する。有毒な物質は、特定の誘導酵素の誘導性のみを確認するために使われる。
【０１０２】
加えて、方法は肝細胞様細胞へ分化するために重要なｍＥＦ細胞に依存する。ｈＢＳ細胞が分化するｍＥＦ細胞の濃度は、２０．０００細胞／ｃｍ２から２００．０００細胞／ｃｍ２の範囲内で変動してもよく、例えば約３０．０００から１００．０００細胞／ｃｍ２、例えば４０．０００から７０．０００細胞／ｃｍ２、例えば５２．０００細胞／ｃｍ２である。
【０１０３】
肝細胞様細胞への分化方法にとって重要な他の１つの要因は、ｂＦＧＦの存在であり、それは、分化の前に培養基に加えられる。
【０１０４】
本発明のための出発原料は、未分化ｈＢＳ細胞株のような最適に多能性の未分化ｈＢＳ細胞である。そのような材料は、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ  ＡＢ社から得られることができ、さらにＮＩＨ幹細胞レジストリで入手できる（ｈｔｔｐ：／／ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｒｅｇｉｓｔｒｙ／）。Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ  ＡＢ社は、２つのｈＢＳ細胞株（ＳＡ００１及びＳＡ００２）を有し、ＳＡ００２（ＳＡ００２．５）の１つのサブクローンは、ＮＩＨを通して入手できる。それらのｈＢＳ細胞株は、本発明において多用された。
【０１０５】
出発物質として推薦されるｈＢＳ細胞の特性は、以下の通りである：陽性のアルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ−３−ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ  １−６０、ＴＲＡ  １−８１、Ｏｃｔ−４、陰性のＳＳＥＡ−１、テロメラーゼ活性、及びインビトロ及びインビボの多分化能（後者は、免疫不全マウスの奇形腫形成によって示される）（図１）。
【０１０６】
使用の前に、出発物質として使用されるｈＢＳ細胞株は、特徴プログラムに従うＬＯＴ製造に由来されてもよい。ｈＢＳ細胞株のＬＯＴ製剤は、標準化方法に従う培養及び１つの単一継代における１００ストロー以上の冷凍でのｈＢＳ細胞の拡張を構成する（出願中の特許国際公開ＷＯ２００４０９８２８５）。ｈＢＳ細胞株の形態は、冷凍の前後、更に、ＬＯＴからの細胞の解凍の後の次なる培養における連続的継代でモニタされる。ＬＯＴ冷凍の品質は、１０解凍の各ストローの１００パーセントの解凍速度を示す解凍回復率の検査によって確認される。細胞の汚染がないことを確認するために、微生物学的安全に関する安全試験が、それから細胞及び冷凍経過における培養基に実行される。実行される特性解析プログラムは、ｈＢＳ細胞株の分化状態を確認する方法の幅広い範囲を含む。未分化細胞（ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、Ｏｃｔ−４及びＡＬＰ）のための一般に認められたマーカーの最初のマーカー発現分析において、実行される。継代の細胞の遺伝子の安定性及び冷凍−解凍サイクルが、染色体分析及びＦＩＳＨで点検される。テロメラーゼ活性が、Ｔｅｌｏ  ＴＡＧＧＧ  Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ＰＣＲ  ＥＬＩＳＡＰＬＵＳキットを使用して測定される。ｈＢＳ細胞の多分化能が、胎様体ステップで試験管内の分化及び、免疫不全ＳＣＩＤマウスの腎臓カプセルでのｈＢＳ細胞の移植による体内分化によって調べられる。
【０１０７】
ここで用いられる出発物質は、さらに完全に異種動物由来成分不含に由来されてもよく、それによって、完全な異種動物由来成分不含肝細胞様細胞が、再生医療の潜在的使用のために得られてもよい。ｈＢＳ細胞の異種動物由来成分不含由来物のために、全ての培養基及びマトリックス構成要素、フィーダ細胞及び使用する他の材料は、いかなる人間以外の動物材料に由来又は接触しなくてもよい。ｈＢＳ細胞の異種動物由来成分不含由来物のための適切な構成要素及び、異種動物由来成分不含肝細胞様細胞、異種動物由来成分不含由来のヒト線維芽細胞であり、たとえば、ヒト包皮線維芽細胞、組み換え型成長因子を有する無血清またはヒト血清ベースの培養基、分化因子および／または潜在的な他の添加物、及び、ヒト組み換え酵素または細胞の分離及び培養のための殺菌したメカニカルツールの何れかである。
【０１０８】
他の出発物質は内皮性細胞であり、すなわちすでに内胚葉血統へ取組まれたｈＢＳ細胞由来の細胞である。そのような細胞は、以下の内胚葉マーカーのうちの１つ以上を表示してもよい：ＨＮＦ３ベータ（肝細胞核因子３）、Ｇａｔａ４、Ｃｄｘ２（尾部関連ホメオボックス転写因子）、Ｓｏｘ  １７（Ｓｒｙ−ｂｏｘ含有遺伝子１７の遺伝子製品）、及びＰｄｘ１（膵臓の十二指腸ホメオボックス因子−１）。
【０１０９】
本願発明の一実施例は本発明による肝芽細胞様細胞および／または肝細胞様細胞を含む集団の製剤のための方法に関し、次のステップを含んでいる：
ｉ）無血清培地の支持マトリックスでｈＢＳ細胞またはｈＢＳ細胞由来前駆を少なくとも５日間、試験管内分化を行う。
ｉｉ）培養基を約５日から２５日ごとに変える。
ｉｉｉ）機械的隔離によって細胞を分離する。
ｉｖ）酵素処理によってステップｉｉｉ）において得られる細胞を任意に解離する。
ｖ）表面抗原発現に基づいて細胞を任意にソートする。
【０１１０】
ｈＢＳ細胞に由来される前駆は、ＨＮＦ３ベータ及びＡＦＰを表示してもよく、増殖能を有する。
【０１１１】
ステップｉ）のインビトロの分化は、少なくとも１０日間（例えば少なくとも２０日間、少なくとも３０日間または少なくとも４０日間）実行される。このステップの分化のために与えられる時間は、得られた細胞が肝細胞様細胞または肝芽細胞様細胞の特性を有するかを決定している。したがって、肝細胞様細胞を得るために、ｈＢＳ細胞の試験管内分化または無血清培地での支持マトリックス上のｈＢＳ細胞由来前駆は、約１８日から約３０日まで実行され、好ましくは２０−２７日間、より好ましくは約２５日間実行され、反対に、約５日から約１０日間、好ましくは１５日間肝芽細胞様細胞を得るために必要である。
【０１１２】
血清培地は、ＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）、ｂＦＧＦで補充されるＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）及びあらかじめ自己調整されたＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）（すでに肝細胞様細胞に改良される）からなる群から選択されてもよい。無血清培地は、ｂＦＧＦを更に含み、その濃度は好ましくは約４ｎｇ／ｍｌから約２００ｎｇ／ｍｌまでの濃度、例えば、約４ｎｇ／ｍｌから約１５０ｎｇ／ｍｌまで、約４ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌまで、約４ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌまで、または約４ｎｇ／ｍｌから約１０ｎｇ／ｍｌまでである。
【０１１３】
本発明の一実施例において、無血清培地はｂＦＧＦを含んでいるＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）である。ｂＦＧＦの濃度は、約４ｎｇ／ｍｌから約２００ｎｇ／ｍｌまであってもよく、例えば、約４ｎｇ／ｍｌから約１５０ｎｇ／ｍｌまで、約４ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌまで、約４ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌまで、または約４ｎｇ／ｍｌから約１０ｎｇ／ｍｌまでである。ｂＦＧＦの濃度は、４ｎｇ／ｍｌであってもよい。
【０１１４】
ステップｉｉ）において、無血清培養基は、約１０日ごとから約２０日ごと、例えば、約１２−１８日ごと、例えば１４−１５日ごとに変わってもよい。
【０１１５】
支持マトリックスは、例えば、ヒトまたはマウス・フィーダ細胞のようなフィーダ細胞を含んでもよく、または、定義済みまたは未定義の配合の細胞外基質を含んでもよい。あるいは、支持マトリックスは以下を含んでもよい：細胞培養に使用されるプラスチック細胞培養容器の内側にコーティングする、単独または組合せの、一つ以上のタンパク質を含むコーティング、または、三次元環境（例えば多孔性フィルタ）を含んでもよい。支持マトリックスとして多孔性フィルタを使用する場合、この多孔性フィルタは、直径が約４μｍの孔サイズを有してもよく、単独でまたは組合せで、一つ以上のタンパク質でコーティングされてもよい。
【０１１６】
上記にて説明した容器またはフィルタコーティングするために使用する一つ以上タンパク質は、コラーゲン、ラミニン及びそれらの組合せからなる群から選択されてもよい。
【０１１７】
ステップｉｉｉ）において実行される細胞のメカニカル分析は、細胞形態の視覚の点検で判断されることで肝芽細胞様細胞および／または肝細胞様細胞を取り出すことによって実行されてもよい。肝細胞様細胞は、肝細胞の典型的な形態学を表示する。すなわち、それらは多角形の細胞形状を有し、大きい細胞直径（凡そ２５−５０μＭ）は、しばしば核を二つもち、脂肪顆粒を蓄積する傾向がある。経験及び完全な実験によって、形態学は、肝臓マーカー（例えばアルファ−１−抗トリプシン、ＣＫ１８、ＨＮＦ−３ベータ、アルブミンまたはＬＦＡＢＰ）の発現に関連づけられた。実行された選択は、免疫組織化学による識別によって肝芽細胞様細胞または肝細胞様細胞として更に検査されてもよい。メカニカル解剖の代わりに、それらが成長している表層及び、例えば酵素またはキレート化剤またはそれらの組合せから細胞を分離し、その後、例えばＦＡＣソート、磁気ビーズまたは免疫することによって細胞をソートする。細胞は、それから適切な培養および／または例えばインビトロの分析のために更に使われる数に相当するマルチウェルプレート分析容器に最後に接種されてもよい。
【０１１８】
本願明細書において記載されている方法によれば、本発明の細胞集団は、ヒトまたはマウス・フィーダ細胞のようなフィーダ細胞の存在下で得ることができ、さらにそれらはフィーダ細胞がない場合に得ることができる。フィーダ細胞がない場合、本発明の細胞集団は、定義済みまたは未定義の配合の細胞外基質、または単独または組合せで、一つ以上のタンパク質で内側がコーティングされたプラスチック細胞培養容器を使用して得ることができる。この目的の適切なタンパク質は、コラーゲン、ラミニン及びそれらの組合せからなる群から選択されてもよい。あるいは、本願発明の細胞集団は、三次元環境（例えば多孔性フィルタ）を使用することによって獲得してもよい。
【０１１９】
肝細胞様細胞を得る追加的な方法は、例えば異なる培養基配合によって刺激される３Ｄ培養における最終的に類似する内胚葉によって、肝細胞様細胞へｈＢＳ細胞を統制的に分化させることである。異なる因子または構成要素は、それからタイプ及び濃度（たとえば血清、培養基における成長因子及び他の刺激的な因子）に加えられるかまたは変化する。簡単に概説すると、未分化のｈＢＳ細胞部分は取り除かれて、たとえば２４−ウェルプレートのフィルタ挿入紙へ移動されてもよい。全ての培養は、それから異なる培養基配合において育てられて、肝細胞様細胞または肝芽細胞様細胞の収穫を最大にするための一番よい時間枠を見つけるために、例えば異なる時間位置上の免疫組織化学分析のような分析を受ける。
【０１２０】
肝細胞様細胞または肝芽細胞様細胞を得るためのさらなる追加的方法は、例えばヒト成人肝臓または器官断片または他の種（例えばマウス胚の肝臓を実施例２で述べたように肝細胞様細胞の方へ分化するように刺激させる）の細胞型の肝臓断片を有するｈＢＳ細胞に由来されるｈＢＳ細胞または内胚葉前駆細胞を相互培養することである。そのようなシステムの相互培養は、３Ｄ構造（例えば肝細胞及びダクトの一群）の形成のために有益である。
【０１２１】
さらに、肝細胞様及び肝芽細胞様細胞の繁殖的な状態への誘導は、培養基の培養によって誘導されることが可能であり、それは、例えば成長因子を含んでいる肝細胞のために調整される。
【０１２２】
本発明の具体例において、得られた細胞集団は、異種動物由来成分不含であってもよい。
【０１２３】
本願発明の一実施例は、本発明の肝細胞様細胞を含む集団を生産するための改良された方法に関連し、その方法は、以下のステップを含む。
ｉ）ｈＢＳ細胞を育てることに適している培養基、例えばＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）培養基の中で最大１０日から３０日間、好ましくは例えば、１５日目または２３日目までの１３日間から２７日間、ｈＢＳ細胞をインビトロで分化させ、例えば、培養基の１００％が、新規な肝細胞培養基に取り替えられることができ、５０％に変わる。
ｉｉ）１０−４０日目、好ましくは１３−３５日目、例えば１５日目または２３日目にＨＣＭ培養基のような肝細胞の培養のために最適化される新規な培養基に代わる。培養基は、以下の構成要素の一つ以上を含んでもよい：ウシ血清アルブミン、アスコルビン酸、上皮細胞増殖因子、トランスフェリン、インスリン、ヒドロコルチゾン及び抗生物質。
【０１２４】
交換する培養基の量は、３０％から最高１００％まで変動することができる。培養基は、一週間に三回、または一週間に一回交換され、好ましくは週に一度交換される。
【０１２５】
さらに、方法は次の工程を含んでもよい。
ｉｉｉ）高い濃度のデキサメタゾンを最大１０日、好ましくは８日間、任意に加える。
ｉｖ）ナトリウム酪酸塩（ＮａＢ）及びＨＧＦを最大１０日、好ましくは５日間、任意に加える。
ｖ）細胞を分離する。
ｖｉ）酵素処理によってステップｉｉ）において得られる細胞を任意に解離する。
ｖｉｉ）表面抗原発現に基づいて細胞を任意にソートする。
【０１２６】
全ての詳細及び以下の一般的方法で言及される詳細は、上述の特定の実施例に準用する。
【０１２７】
キット
本発明の別の態様は、以下を含んでいるキットに関する：ｉ）肝細胞様細胞および／または肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団、ｉｉ）一つ以上の成熟因子および／または成熟培養基、及びｉｉｉ）任意的に使用指示書。成熟培養基は、ＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）、ｂＦＧＦで補充されるＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）、及びあらかじめ調整されたＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）（肝細胞様細胞上ですでに調整された）からなる群から選択されてもよい。
【０１２８】
一つ以上の成熟因子は、ｂＦＧＦ、上皮増殖因子、肝細胞増殖因子及びオンコスタチンＭからなる群から選択される。
【０１２９】
さらに、キットは成熟をモニタするためのツールを含んでもよい。
【０１３０】
一実施例において、成熟をモニタするための道具は以下を含む：
ｉ）ＨＮＦ３ベータ、ＡＦＰ、アルブミン、ＢＳＥＰ、ＭＲＰ２、ＯＡＴＰ−２、ＯＡＴＰ−８、ＧＳＴ  Ａ１−１、ＣＹＰ４５０−１Ａ２、ＣＹＰ４５０−２Ａ６、ＣＹＰ４５０−２Ｂ６、ＣＹＰ４５０−２Ｃ８、ＣＹＰ４５０−２Ｃ９、ＣＹＰ４５０−２Ｃ１９  ＣＹＰ４５０−２Ｄ６、ＣＹＰ４５０−２Ｅ１、ＣＹＰ４５０−３Ａ４、ＣＹＰ４５０−３Ａ７、ＧＳＴ  Ｍ１−１及びＵＧＴからなる群から選択される発現マーカーを符号化する遺伝子の少なくとも３つ、例えば少なくとも４つまたは少なくとも５つに対するＰＣＲプライマー、及び
ｉｉ）ユーザーズ・マニュアル。
【０１３１】
他の一実施例において、成熟をモニタするためのツールは以下を含む：
ｉ）ＨＮＦ３ベータ、ＡＦＰ、アルブミン、ＢＳＥＰ、ＭＲＰ２、ＯＡＴＰ−２、ＯＡＴＰ−８、ＧＳＴ  Ａ１−１、ＣＹＰ４５０−１Ａ２、ＣＹＰ４５０−２Ａ６、ＣＹＰ４５０−２Ｂ６、ＣＹＰ４５０−２Ｃ８、ＣＹＰ４５０−２Ｃ９、ＣＹＰ４５０−２Ｃ１９  ＣＹＰ４５０−２Ｄ６、ＣＹＰ４５０−２Ｅ１、ＣＹＰ４５０−３Ａ４、ＣＹＰ４５０−３Ａ７、ＧＳＴ  Ｍ１−１及びＵＧＴからなるグループから選択される発現マーカー抗原の少なくとも３つ、例えば少なくとも４つまたは少なくとも５つに対抗する抗体、および
ｉｉ）ユーザーズ・マニュアル。
【０１３２】
細胞をモニタするための追加的な道具は、ＰＲＯＤ分析構成要素及び、培養基の尿素および／またはアルブミン検出のための構成要素である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０１３３】
【非特許文献１】シュヴァルツ、ロバート、Ｅ等、ヒト胚性幹細胞から機能的な肝臓細胞を発育するための限定条件、幹細胞及び発育  １４：６４３−６５５（２００５）。
【非特許文献２】Ｒａｍｂｈａｔｌａ、ヒト胚性幹細胞からの大量の肝細胞様細胞、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．  ２００３；  １２（１）：１−１１
【非特許文献３】ハインズ等、ヒト胚性幹細胞の分化、由来物、特徴；  ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ；  ２００４；  ２２（３）：  ３６７−７６．
【特許文献】
【０１３４】
【特許文献１】国際公開ＷＯ０３０５５９９２、多能性胚盤胞由来幹細胞株の樹立方法
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００５／０９７９８０
【特許文献３】国際公開ＷＯ０１／８１５４９
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】出発物質の特性、ｈＢＳ細胞、即ち、（Ａ）形態学、（Ｂ）ＳＳＥＡ−１（陰性）、（Ｃ）ＳＳＥＡ−３、（Ｄ）ＳＳＥＡ−４、（Ｅ）ＴＲＡ−１−６０、（Ｆ）ＴＲＡ−１−８１、（Ｇ）Ｏｃｔ−４、（Ｈ）ＡＬＰ（すべてがｈＢＳ細胞株ＳＡ００２、ＬＯＴ  ＡＬ００２に由来）及び、右上に外胚葉性組織、右下の内胚葉組織、及び左の中胚葉性組織（ｈＢＳ細胞株ＳＡ１２１に由来）印をつけられた外胚葉性組織を有する免疫不全マウスからのエオシン染色された奇形腫断片、ヘマトキシリンによって図解される（Ｉ）体内多分化能。
【図２】以下の肝臓マーカーに陽性染色した肝細胞様細胞を示す：（Ａ）アルブミン、及び、（Ｂ）ＣＫ−１８、（Ｃ）ＤＡＰＩ（核）、及び（Ｄ）フェーズ対照、すべてがＳＡ００２に、継代５６、ｍＥＦｓでの２３分化日の後
【図３】以下の肝臓マーカーに陽性染色した肝細胞様細胞を示す：（Ａ）ＡＡＴ、（Ｂ）ＨＮＦ３ベータ及び（Ｃ）ＤＡＰＩ、全てがＳＡ０３４で、継代１３７、ｍＥＦでの分化の３２日以後。
【図４】以下の肝臓マーカーに陽性染色した肝細胞様細胞を示す：（Ａ）ＳＡ０３４でのＬＦＡＢＰ、継代１３５、ｍＥＦでの２５分化日後、及び初期の肝臓マーカー（Ｂ）ＡＦＰの弱陽性、ＳＡ００２で、継代５６、ｍＥＦでの２３分化日の後。
【図５】ＳＡ００２で（Ａ）ＣＫ１８と（Ｂ）Ｃｙｐ１Ａ２の共発現を示す。継代６３、ｍＥＦでの２３分化日の後。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図６】ＳＡ００２での（Ａ）ＣＫ１８と（Ｂ）Ｃｙｐ２Ａ６の共発現を示す。継代６３、ｍＥＦでの２３分化日の後。Ｃｙｐタンパク質発現は、さらにリファンピシン、デキサメタゾン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、オメプラゾール及びイソニアジド（データは示されない）のＣＹＰ誘発因子混合を使用して、更に誘導されることができる。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図７】継代６３、ｍＥＦでの２３分化日後の、ＳＡ００２での（Ａ）ＣＫ１８と（Ｂ）Ｃｙｐ２Ｂ６の共発現を示す。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図８】継代６３、ｍＥＦでの２３分化日後の、ＳＡ００２での（Ａ）ＣＫ１８と（Ｂ）Ｃｙｐ２Ｃ８／９／１９の共発現を示す。Ｃｙｐタンパク質発現は、さらにリファンピシン、デキサメタゾン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、オメプラゾール及びイソニアジド（データは示されない）のＣＹＰ誘発因子混合を使用して、更に誘導されることができた。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図９】継代６３、ｍＥＦでの２３分化日後の、ＳＡ００２での（Ａ）ＣＫ１８と（Ｂ）Ｃｙｐ２Ｄ６の共発現を示す。Ｃｙｐタンパク質発現は、さらにリファンピシン、デキサメタゾン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、オメプラゾール及びイソニアジド（データは示されていない）のＣＹＰ誘発因子混合を使用して、更に誘導されることができた。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図１０】ｍＥＦでの２３分化日後の、継代６３での、ＳＡ００２での（Ａ）ＣＫ１８と（Ｂ）Ｃｙｐ２Ｅ１の共発現を示す。Ｃｙｐタンパク質発現は、さらにリファンピシン、デキサメタゾン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、オメプラゾール及びイソニアジド（データは示されない）のＣＹＰ誘発因子混合を使用して、更に誘導されることができた。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図１１】ｍＥＦでの２３分化日後の、継代６３での、ＳＡ００２での（Ａ）ＣＫ１８と（Ｂ）Ｃｙｐ３Ａ４／７の共発現を示す。Ｃｙｐタンパク質発現は、さらにリファンピシン、デキサメタゾン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、オメプラゾール及びイソニアジド（データは示されない）のＣＹＰ誘発因子混合を使用して、更に誘導されることができた。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図１２】誘導混合物処理後にウエスタンブロット法によって視覚化される肝細胞様細胞のＣｙｐ３Ａ４／７及びＣｙｐ１Ａ２の誘導性を示す。ｍＥＦで２３−２５日の分化後の継代５１、５３、５４及び５５のＳＡ００２（ＬＯＴ  ＡＬ００２）及び、２３−２５日の分化後の継代５１、５３、５４及び５５のＳＡ００２．５（ＬＯＴ  ＢＥ００２．５）での誘導されたｈＢＳ細胞（リファンピシンのＣｙｐ誘発因子混合、デキサメタゾン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、オメプラゾール及び９６時間イソニアジド）非処理のｈＢＳ細胞：ＳＡ００２（ＬＯＴ  ＡＬ００２）、継代４７、５２及び５６、１９−２３日の分化後、及びＳＡ００２．５（ＬＯＴ  ＢＥ００２．５）継代４８、５３及びｍＥＦで５５、１９−２６日の分化後。ＨｅｐＧ２（Ｃａｔ  Ｎｏ  ＨＢ−８０６５，  ＡＴＣＣ）：陰性対照としての継代２３。陰性対照としての継代２での主たるケラチン生成細胞（Ｃａｔ  Ｎｏ  Ｃ−１２００３、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ））。陽性対照として使われ、解凍及び最近準備したヒト初代肝細胞（男性の及び女性の）。ベータ−アクチンが、内部ローディング対照として使われた。
【図１３】ＰＲＯＤ分析を使用する一般のＣｙｐ活性を示す。画像明るさによって視覚化される、Ｃｙｐ誘発因子（上記の通り）処理において活性は増加する。位相コントラスト（Ａ）及びＰＲＯＤ蛍光（Ｂ）の非処理の細胞、位相コントラスト（Ｃ）及びＰＲＯＤ蛍光（Ｄ）の誘導された細胞。位相コントラスト（Ｅ）及びＰＲＯＤ蛍光（Ｆ）における技術的対照（細胞にＰＲＯＤを追加することなく）。全ては、ｍＥＦで２６日分化後に、継代５６のＳＡ００２の画像である。灰色のスケールのよりよく明るさを視覚化するためにＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用している、赤から黄に変わる画像。
【図１４】リファンピシン、デキサメタゾン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、オメプラゾール及びイソニアジドの混合を加えることによって、（Ａ）前で誘導（Ｂ）後のＧＳＴ  Ａ１−１、（Ｃ）前で誘導（Ｄ）後のＧＳＴ  Ｍ１−１、及び（Ｅ）前で誘導（Ｆ）後のＧＳＴ  Ｐ１−１の発現を示す。ＧＳＴ  Ｍ１−１及びＧＳＴ  Ｐ１−１のはっきりした誘導は、観察されることができないが、ＧＳＴ  Ａ１−１のわずかな誘導は発見された。よりよく灰色のスケールの明るさを視覚化するために、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用して、赤から黄色に変わる画像。
【図１５】誘導混合物処理の後のウエスタンブロット法による、肝細胞様細胞におけるＧＳＴ  Ａ１−１の誘導を示す。９６時間リファンピシン、デキサメタゾン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、オメプラゾール及びイソニアジドのＣＹＰ誘発因子混合による処理及び非処理での、ｍＥＦの分化の２０−２６日後の、ＳＡ００２．５（ＬＯＴ  ＢＥ００２．５）継代３５、３６、４３及び４６、及びＳＡ１６７（ＬＯＴ  ＣＥ１６７）継代１７、１８，２５及び２８。ＧＳＴタンパク質製剤及びヒト男性及び女性の最近備えた（解凍した）、初代肝細胞が、対照として使われた。
【図１６】３つの異なるｈＥＳＣ株及びヒト肝細胞及びＨｅｐＧ２細胞に由来する肝細胞様細胞のＣＤＮＢへのＧＳＴ酵素活性、全タンパク質（平均±ＳＤ（ｎ＝３））のμｍｏｌ培養基共役／分／ｍｇとして示される。
【図１７】フェーズＩＩ代謝酵素ＵＧＴ１Ａ１及びＵＧＴ１Ａ６の肝細胞様細胞の免疫反応性を示す。ＣＫ１８（Ｂ）と共発現されるＵＧＴ１Ａ１（Ａ）、及びＣＫ１８（Ｄ）と二重着色されるＵＧＴ１Ａ６（Ｃ）、全てが、ｍＥＦでの２４日分化後の、ＳＡ００２で継代５９にある。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図１８】薬物輸送体ＯＡＴＰ−２／８のための肝細胞様細胞の免疫反応性を示す。継代５６、ＳＡ００２の（Ａ）ＤＡＰＩ、（Ｂ）ＯＡＴＰ−２／８、（Ｃ）位相コントラスト、ｍＥＦでの２３日分化後。よりよく灰色のスケールの明るさを視覚化するためにＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用して赤から黄に変わる画像。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図１９】薬物輸送体ＢＳＥＰのための肝細胞様細胞の免疫反応性を示す。ｍＥＦで２３日分化後、ＳＡ００２の継代３２の（Ａ）ＤＡＰＩ、（Ｂ）ＢＳＥＰ、（Ｃ）位相コントラスト。よりよく灰色のスケールの明るさを視覚化するためにＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用して赤から黄に変わる画像。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図２０】薬物輸送体ＭＲＰ−２のための肝細胞様細胞の免疫反応性を示す。ｍＥＦで２２日分化後、ＳＡ００２の継代３３の（Ａ）ＤＡＰＩ、（Ｂ）ＭＲＰ−２、（Ｃ）位相コントラスト。よりよく灰色のスケールの明るさを視覚化するためにＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用して赤から黄に変わる画像。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図２１】細胞株ＳＡ００２、ＬＯＴ  ＡＬ００２からの肝細胞様細胞のグリコーゲンの保管を示す、２１日分化後の継代１５。グリコーゲンは、ＰＡＳ染色−システムによってピンクの染色として検出される。培養は、（ＢとＤ）のどちらで処理されるかまたは、グリコーゲン検出の前にヒト唾液（Ａ及びＣ）で処理されていない。
【図２２】マトリゲルに分化する肝細胞様細胞のＣＹＰ及びＧＳＴ免疫染色を示す。ＳＡ００２及びｐ５７での（Ｂ）Ｃｙｐ２Ｂ６と共発現される（Ａ）Ｃｙｐ１Ａ２および（Ｄ）ＧＳＴ  Ａ１−１と共発現される（Ｃ）ＣＫ１８、マトリゲルでの２４日間の分化後。よりよく灰色のスケールの明るさを視覚化するためにＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用して赤から黄に変わる画像。
【図２３】ｃＤＮＡの同じ総量からの未分化のｈＢＳ細胞の対照サンプル（ＢＥ００２．５継代２４、５日（対照サンプル１）及びＢＥ００２、継代６２、４日（対照サンプル２））に関連する２１分化日の継代２の、細胞株ＳＡ００２．５、ＬＯＴ  ＢＥ００２．５から肝細胞様細胞におけるＱＰＣＲを使用して高いＭＲＰ−２発現を示す。発現レベルは、３つの細胞サンプルのために得られるＣＴ値（閾値サイクル）から算出され、さらに対照サンプル２の発現に比較される。肝細胞様細胞のＭＲＰ２発現は、未分化細胞のものより１１から３２倍高い。
【図２４】肝細胞様細胞におけるＣｙｐ１Ａ２発現の誘導を示す。非処理の肝細胞様細胞（Ａ）及び、対応する位相コントラスト（Ｂ）及び、誘導された（Ｃ）及び、対応する位相コントラスト（Ｄ）。よりよく灰色のスケールの明るさを視覚化するためにＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用して赤から黄に変わる画像。
【図２５】肝細胞様細胞でのＣｙｐ２Ｂ６発現の誘導を示す。非処理の肝細胞様細胞（Ａ）及び、対応する位相コントラスト（Ｂ）及び、誘導された（Ｃ）及び、対応する位相コントラスト（Ｄ）。よりよく灰色のスケールの明るさを視覚化するためにＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用して赤から黄に変わる画像。
【図２６】胚マウス肝臓と共培養されるｈＢＳ細胞によって形成されるＡＦＰ陽性の肝芽細胞様細胞を示す。赤（特徴的に核を染色してある）のヒト特定の核抗原、ｈＢＳ細胞は緑の内胚葉由来されたＡＦＰ陽性の大きいクラスタを引き起こしていることを示す（実施例２を参照）。
【図２７】細胞株ＳＡ１６７（Ａ及びＢ）、ＳＡ００２（ＣおよびＤ）及びＳＡ００２．５（Ｅ及びＦ）に由来した非処理及び誘導された肝細胞様細胞のＣｙｐ１Ａ２、３Ａ４／７及び１Ａ１タンパク質発現のウエスタンブロット法分析を示す。Ａ、Ｃ、Ｅ：非処理の細胞、Ｂ、Ｄ、Ｆ：誘発因子カクテルで処理される細胞、Ｇ：ヒト肝細胞Ｌｏｔ  ＧＩＵ  ２２（ＣＹＰ１Ａ１  Ｌｏｔ  ＭＹＯ）、Ｈ：未分化のｈＥＳＣ株ＳＡ００２．５、Ｉ：ＭＥＦ、Ｊ：ＨｅｐＧ２細胞及びＫ：組み換え型ＣＹＰ１Ａ１。
【図２８】（Ａ）は、肝臓／内胚葉マーカーＨＮＦ４アルファの反応を示す。（Ｂ）は、集団における繁殖細胞の割合を示すために使用されるマーカーであるＫｉ６７の反応である。（Ｃ）は、多くの肝芽細胞様細胞に共存されるＨＮＦ４アルファ及びＫｉ６７を示す。（Ｄ）はＤＡＰＩ（染色核）示す。（Ｅ）は形態学を示す。
【図２９】培養基への反応として増殖能に関連する結果及びその誘導を示す。（実施例４を参照）。ＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）の培養された（Ａ）−（Ｃ）は  ＳＡ００２細胞の肝細胞様細胞を示す。（Ａ）は、形態学を示している。（Ｂ）ＫＩ６７マーカー反応なしをを示す（即ち、増殖なし）。（Ｃ）肝臓マーカー・アルファ−１−抗トリプシン反応を示している。（Ｄ）−（Ｆ）は、Ｗｉｌｌｉｍａｓ  Ｅ培養基で培養された肝細胞様ＳＡ００２細胞を示す。（Ｄ）は、形態学を示している。（Ｅ）ＫＩ６７マーカー（増殖）反応を示している。（Ｆ）は、肝臓マーカー・アルファ−１−抗トリプシン反応を示している。
【図３０】肝細胞様細胞及び初代肝細胞のＥＲＯＤ反応を示す。左の欄は、（上部から）未処理、オメプラゾール＋リファンピン誘導、及び６−構成要素カクテル誘導の肝細胞様細胞でのＥＲＯＤ活性を示し、右側の欄は、初代肝細胞の対応結果を示す。肝細胞様細胞は、したがって、特定のＣｙｐ１Ａ２反応性を有し、それは、非常に弱いながら、Ｃｙｐ誘発因子処理の前に検出された。（実施例１３を参照。）
【図３１】ＨｅｐＧ２と比較して肝細胞様細胞由来のｈＢＳ細胞におけるＣｙｐ活性を示す。（Ａ）及び（Ｄ）は、非処理の肝細胞様細胞を示し、（Ｂ）及び（Ｅ）は、誘導肝細胞様細胞を示し、（Ｃ）及び（Ｆ）は、ＨｅｐＧ２を示す。
【図３２】肝細胞様細胞及び初代肝細胞のＰＲＯＤ反応を示す。左の欄は、（上部から）非処理、プリミドン誘導、及び６−構成要素カクテル誘導の肝細胞様細胞でのＰＲＯＤ活性を示し、右側の欄は、初代肝細胞の対応する結果を示す。肝細胞様細胞は、したがって、Ｃｙｐ誘発因子処理の前に一般のＣｙｐ活性を有する。（実施例４を参照。）
【図３３】肝細胞小管区分（左）を有するラット肝細胞（ｌａｎ  Ｃｏｔｇｒｅａｖｅ教授からの画像）及び小管類似構造（右）を有する肝細胞様細胞を示す。
【図３４】ｈＢＳ細胞から肝芽細胞様細胞を経過して肝細胞様細胞の由来物のためのフローチャートを示す。
【図３５】１７日間後の培養下の膜表現型Ｎｏｔｃｈ２（膜組織で、緑の）及び細胞株ＳＡ４６１（継代２６）の核染色（青の）の発現を示す。矢印は、双核肝細胞様細胞を示す。拡大倍率２５０ｘ。
【図３６】Ｃｙｐ３Ａ４、３Ａ７、１Ａ１、１Ａ２及びＣｙｐ２Ａ６の相対的な遺伝子発現レベルが肝細胞様細胞、ＨｅｐＧ２及びヒト肝エキスの誘導及び非誘導培養のリアルタイムＰＣＲ技術によって測定及び比較されたことを示す。ヒト肝エキスの測定は、１にセットされ、他のサンプルは、各々のシトクロムｐ４５０のヒト肝臓基準に関連する。全ての遺伝子のための発現は、ＧＡＰＤＨ（ＣＹＰ１Ａ１／１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６またはＴＢＰ（ＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７）に対して標準化される。
【図３７】肝細胞様細胞を培養するための培養基の改良の研究デザインを示す。研究デザインＡ；培養基の１００％は、１５日後にＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）からＨＣＭに交換され、２３日に５０％のＨＣＭは、新規なＨＣＭ−培養基と取り替えられた。実験は、細胞株ＳＡ００２で行われた。研究デザインＢ；培養基の１００％は、２３日後にＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）からＨＣＭに交換された。実験は、細胞株ＳＡ３４８で行われた。
【図３８】研究デザインＡ及びＢ、図３７及び実施例１、２及び表５に基づいて、それぞれＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）（Ａ）及びＨＣＭ（Ｂ）で培養された肝細胞様細胞の形態を示す。
【図３９】研究デザインＡ及びＢ、図３７及び実施例１、２及び表５に基づくＨＣＭと比べて、ＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）でのＨＮＦ４−アルファ、アルブミン、ＣＹＰ３Ａ４及びＵＧＴ２Ｂ７の相対的なｍＲＮＡ発現レベルを示す。参照プロトコル（ＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標））からのデータは、１に設定され、ＨＣＭ−培養基による異なる遺伝子の発現レベルの倍増加は、グラフに示される。
【図４０】肝細胞様細胞を培養する培養基での増強剤及び誘導因子のための研究計画を示す。研究デザインＣ；５０μｍデキサメタゾンが、２２−２４日以後に加えられた。実験は、細胞株ＳＡ００２、ＳＡ１６７及びＳＡ３４８で行われた。研究デザインＤ；ＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）培養基が、別の５日間、ＨＧＦ及びナトリウム酪酸塩（ＮａＢ）で補充されるＨＣＭ−培養基に、２１日後に交換された。
【図４１】研究デザインＣ、図４０及び実施例１、２、３及び表６に基づいて、ＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）（Ａ）及び５０μｍデキサメタゾンで補充されるＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）（Ｂ）で培養された肝細胞様細胞の形態を示す。同じく、研究デザイン  Ｄ、図４０及び実施例１、２及び表７に基づいて、Ｃ）ＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）、ＨＧＦ及び酪酸ナトリウムで補充されるＤ）ＨＣＭで培養された肝細胞様細胞。
【図４２】Ａ）研究デザインＣ、図４０及び実施例１、２、３及び表６に基づいて、５０のμｍデキサメタゾン処理の後の肝細胞様細胞でのＨＮＦ４−アルファ、アルブミン、ＣＹＰ３Ａ４及びＵＧＴ２Ｂ７の相対的なｍＲＮＡ発現レベルを示す。Ｂ）研究デザインＤ、図４０及び実施例１、２及び表７に基づく、酪酸ナトリウム及びＨＧＦ処理後の相対的ｍＲＮＡ遺伝子発現レベルを示す。参照プロトコル（ＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標））からのデータは、１に設定され、異なる処理による異なる遺伝子の発現レベルの倍増加は、グラフに示される。
【図４３】培養基置換頻度、希薄及び頻繁な培養基置換のための研究計画を示す。ＨＣＭ及びＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）が使われた。
【図４４】研究デザインＥ、図４３及び実施例１、表８に基づく、希薄な（Ａ）対頻繁な（Ｂ）培養基置換後の肝細胞様細胞の形態を示す。
【図４５】研究デザインＥ、図４３及び実施例１、表８に基づく、頻繁な培養基置換と比較したまれな培養基置換後のＨＮＦ４−アルファ、アルブミン、ＣＹＰ３Ａ４及びＵＧＴ２Ｂ７の相対的なｍＲＮＡ遺伝子発現レベルを示す。頻繁な培養基置換からのデータは、１に設定され、まれな培養基置換後の異なる遺伝子の発現レベルの倍増加は、グラフに示される。
【図４６】９６−ウェルにコーティングされるコラーゲンＩに３８日旧肝細胞様細胞を再接種後の３日（Ａ）から６日（Ｂ−Ｃ）まで。肝細胞様細胞の外植体は、再接種する前に、Ｃａ及びＭｇ−フリーＰＢＳ（Ａ）またはコラゲナーゼ（Ｂ−Ｄ）に処理された。培養物は、肝細胞マーカーＣＫ１８（Ｂ，Ｄ）及びＨＮＦ３ベータ（Ｃ）のために、二倍染色される。図尺度：１００μｍ（Ａ）及び５０μｍ（Ｂ−Ｃ）。実験的な詳細のために、実施例１５を参照。
【図４７】（Ａ−Ｃ及びＧ−Ｉ）及びｍＥＦ−細胞層（Ｄ−Ｆ及びＪ−Ｌ）９６−ウェルにコーティングされるコラーゲンＩに再接種の５日後、肝芽細胞様細胞の免疫細胞学及び形態を示す。培養物は、肝芽マーカーＨＮＦ４アルファ（Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ）及びＣＫ１９（Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋ）のために染色された。核染色のためのＤａｐｉを有するマーカーのオーバレイ図は、Ｂ、Ｅ、Ｈ及びＫに示される。各々の染色のための対応の形態図は、Ｃ、Ｆ、Ｉ及びＬでそれぞれ見られる。図Ｃの矢印は、重核細胞を示す。図尺度：２５μｍ；４０ｘ対物レンズが使われた。実験的な詳細のために、実施例１８を参照。
【図４８】３０日の旧培養における肝細胞様細胞のＩＣＧ摂取を示す。
【図４９】１５日の旧培養での肝芽を示す。細胞は、ＣＫ１９（Ａ）、ＣＫ７（Ｂ）及びＥｐＣａｍ（Ｃ）に陽性である。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【０１３６】
出発物質
本発明のための出発物質は、例えば未分化のｈＢＳ細胞株のような最適に多能性未分化のｈＢＳ細胞である。前記材料は、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ社から得られることができ、さらにＮＩＨ幹細胞レジストリを通して入手できる。ｈｔｔｐ：／／ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｒｅｇｉｓｔｒｙ／。Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ  ＡＢは、２種のｈＢＳ細胞株（ＳＡ００１及びＳＡ００２）を有し、ＳＡ００２（ＳＡ００２．５）の１つのサブクローンがＮＩＨを通して入手できる。加えて、２０のＣｅｌｌａｒｔｉｓ細胞株は英幹細胞バンクにリストされる。それらのｈＢＳ細胞株及び加えて、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ社からのＳＡ１６７及びＳＡ３４８が、本願発明において多用された。出発物質として推薦されるｈＢＳ細胞の特性は、以下である：アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ  １−６０、ＴＲＡ  １−８１、Ｏｃｔ−４の陽性反応、ＳＳＥＡ−１の陰性反応、テロメラーゼ活性、及びインビトロ及び体内の多分化能（後者は免疫不全マウスの奇形腫形成によって示される）（図１を参照）（方法及びプロトコルはすでに開示された。ハインズその他、国際公開ＷＯ０３０５５９９２）。
【０１３７】
ＬＯＴ調製及び特性解析プログラム
ｈＢＳ細胞株のＬＯＴ調製は、標準化された方法に基づくｈＢＳ細胞の培養拡張及び、次の１つの単一通過での１００本以上のストローの冷凍を構成する（出願中の特許国際公開ＷＯ２００４０９８２８５）。ｈＢＳ細胞株の形態は、冷凍の前後、更に、ＬＯＴからの細胞の解凍後の次の培養における連続的な継代でモニタされる。ＬＯＴ冷凍の品質は、解凍回復率の検査によって確認され、それは、１０解凍の各ストローのための１００％の解凍速度を示す。すなわち、細胞材料は、解凍時に各々のガラス化ストローから二次培養されることができる。微生物学的に安全に関する安全試験は、細胞に汚染がないかを確認するために、それから細胞及び冷凍継代での培養基に実行される。実行される特性解析プログラムは、ｈＢＳ細胞株の分化状態を確認するために方法の幅広い範囲を含む。最初に、未分化の細胞（ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、Ｏｃｔ−４及びＡＬＰ）のための一般に認められたマーカーのマーカー発現分析が、実行される。継代全体における細胞の遺伝子安定性及び冷凍−解凍サイクルは、染色体分析及びＦＩＳＨで点検される。テロメラーゼ活性は、Ｔｅｌｏ  ＴＡＧＧＧ  テロメラーゼ  ＰＣＲ  ＥＬＩＳＡＰＬＵＳキットを使用して測定される。ｈＢＳ細胞の多分化能は、胚様体ステップによる試験管内分化及び、免疫不全ＳＣＩＤマウスの腎臓被膜でのｈＢＳ細胞の移植による体内分化によって調べられる。
【０１３８】
ここで用いられる出発物質は、さらに、完全に異種動物由来成分不含であってもよく、それによって、異種動物由来成分不含肝細胞様細胞は、再生医療の潜在的使用のために得られて、したがって、組織不適合性及び人間外の病原体の潜在的転送の危険度をかなり減少させる。ｈＢＳ細胞の異種動物由来成分不含由来のために、全ての培養基及びマトリックス構成要素、フィーダ細胞及び使用する他の材料は、いかなる人間以外の動物材料に由来、または接触してはならない。ｈＢＳ細胞の異種動物由来成分不含由来のための適切な構成要素及び、異種動物由来成分不含肝細胞様細胞は、異種動物由来成分不含のヒト線維芽細胞であり、それは、例えばヒト包皮線維芽細胞、ヒト組み換え型成長因子を有する培養基ベース無血清またはヒト血清、分化因子および／または潜在的他の添加物、及び細胞の培養及び分離のための殺菌メカニカル道具またはヒト組み換え酵素である。
【実施例２】
【０１３９】
肝細胞様細胞を得るためのプロトコル
内因子プロトコル（分化は、培養基に分泌される内因子への暴露によって誘導される）
ａ）ＩＶＦ培養皿（ファルカン）でのｍＥＦ細胞層で育てられるｈＢＳ細胞は、肝細胞様細胞を得るために、３７度、５％のＣＯ２及び９５％の湿度の下で最高４０日間分化させられる。使用する培養基（４ｎｇ／ｍｌの加えられるヒト組み換え型ｂＦＧＦ  ［インビトロゲン］を有するＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）［  Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ  ＡＢ  ］）は、おおよそ１から２ｍｌの旧培養基を放棄し、１から２ｍｌの新しい培養基に加えることによって、７日及び２１日ごと、通常１４日ごとに変えられる。１８日から３０日後に、肝細胞様細胞は、カット及び転送ツールとして鋭いミクロ毛細管またはＳｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｏｏｌ（商標）（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ  ＡＢ）を使用して培養から分離され、細胞はそれから長期保存（冷凍された）または即時利用のためにプールされるか、または培養皿に直接染色されるかまたは固定されるかまたは、例えばＣｙｐ活性分析の生体細胞として使用される。ｈＢＳ細胞の分化がｍＥＦＳ（例えばマトリゲル上のｈＢＳ細胞培養）の非存在下で徹底的に変更されるので、ｍＥＦＳは肝細胞様細胞の発育を支える基本的信号を提供するようであり、少ない肝細胞様細胞が、その培養（データは示されてない）から得られることができる。これは、そのような培養物のためのｍＥＦ−馴化培地を用いて、培養基へのｍＥＦｓによる因子の分泌物を指定して部分的に救われることができる。従って、我々は、培養期間で培養基を二度以上に変えることは、肝細胞様細胞を得るための不利な点であることを観察した。肝細胞様細胞を得るための重要なもう一つの要素は、ｂＦＧＦで培養基を補充することである。
【０１４０】
ｂ）４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦで補充されるｍＥＦ馴化培地Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ベクトン−ディッキンソン）で育てられるｈＢＳ細胞は、肝細胞様細胞を得るために、３７度、５％のＣＯ２及び９５％の湿度下で最大４０日間、分化される。使用する培養基は、７日及び２１日ごとの間で変えられる。１８日から３０日あとに、肝細胞様細胞は、カット及び転送ツールにとして鋭いミクロの毛細管またはＳｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｏｏｌ（商標）を使用して培養物から分離され、細胞は、それから長期保存（冷凍された）または即時利用のためにプールされるかまたは、固定及び例えば免疫組織化学の特性解析のために使用される。
【０１４１】
肝細胞様細胞及び分化細胞集団を有する培養皿内の肝芽細胞様細胞の選択が手動で実行され、大部分は形態学に依存する。形態学は、主に免疫組織化学を使用する以前の経験及び完全な実験によって肝臓マーカー発現に関連づけられ、それは例えば実施例３から７までにリストされる。その経験で、熟練した人は、形態学によって能動的に肝細胞様細胞を選ぶことができる。
【０１４２】
肝芽細胞様細胞を得るために、同じプロトコルが使われるが、潜伏期間は、１０日から２０日間、好適には１５日間短くなる。
【０１４３】
フィルタ培養
ＩＶＦ皿内のｍＥＦで５日から１０日間培養された未分化ｈＢＳ細胞（ＢＥ００２．５継代４２）は、小さい断片に切られ、ガラス毛細管を用いて、４００μｌ培養基を含んでいる２４−ウェルプレートのフィルタ挿入紙（孔サイズ：４μｍの直径、外植体培養のために特殊化される、ミリポア）に移動される。フィルタは、培養基に細胞がおぼれることを妨げながら、細胞の栄養摂取を可能にし、水分環境をつくる培養基面と接触し、それによって、体内状況は、模倣される。培養基は、５０％のＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）及び４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦで補充されるｍＥＦ内の未分化のｈＢＳ細胞からの５０％の馴化培地を構成する。半分の培養基は、一日おき又は３日ごとに変えられる。細胞は、分析の前にそれぞれ７、１４、２１及び３１日間分化する。３Ｄ−ｈＢＳ細胞培養は、免疫組織化学によって分析される。培養物は、３０％のサッカロースの低温保存の後に４％のＰＦＡに取り付けられ、Ｓａｋｕｒａ  Ｏ．Ｃ．Ｔ．  ｔｉｓｓｕｅ−ｔｅｋに組み込まれる。１０μｍのアールのクリオ切片は、異なる内胚葉の免疫反応性のマーカー及び肝細胞様マーカーために形態学的に分析される。
【０１４４】
共同培養プロトコル
マウス胚肝臓の器官形成は、三次元フィルタシステムの肝細胞様細胞へのｈＢＳ細胞分化を促進することができる。異なる発育的な段階におけるＥＧＦＰ（強化された緑の蛍光タンパク質）トランスジェニック・マウス胚の肝臓外植体は分離され、フィルタシステムで培養されるｈＢＳ細胞に移植される。対照培養物として、ｈＢＳ細胞のみ、または肝臓以外のマウス胚外植体（心臓及び卵黄嚢）は、ｈＢＳ細胞に移植され、フィルタ上で培養された。共同培養物は、４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦで補充されるＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）で培養され、培養基の５０％は、第２日又は第３日ごとに交換された。７日目及び１４日目に、共培養が免疫組織化学分析のために用意された。ＨＮＦ３ベータ、ＡＦＰ、ＨＮＦ４アルファ、ＣＫ１８、ＣＹＰ３Ａ４／７及びＣＹＰ１Ａ２／１のような内皮性及び肝臓マーカーが分析された。
【０１４５】
内胚葉由来構造の量または数は、４つのカテゴリ、即ち小さいクラスタ、大きいクラスタ、ダクト及びライニング、皮覆組織（下の定義を見る）に分けられた。皮覆組織を除いて、構造は内胚葉及び初期の肝臓マーカーＡＦＰ、ＨＮＦ３ベータ及びアルファ−１−抗トリプシンｅに陽性だった。異なる構造の数は、各々の断面及び培養物のために計数された。各々の構造の総数が、各々の共培養のために計数された断面の数に割られた。これは、構造が断面につきどれくらいよく起こっているかを測定する数値をもたらし、三次元ｈＢＳ細胞共培養での内胚葉構造の数量の表示を与える。平均値及び各グループ（ｎ＝３）の平均（ＳＥＭ）の標準エラーが算出された。研究は、二回繰り返された。
【０１４６】
小さいクラスタが、ＡＦＰに陽性である５つの細胞より少ないかまたは同じ数の集合として定義された。大きいクラスタは、ＡＦＰに陽性である６つの細胞より多いかまたは同じ数の集合として定義された。ダクト及びライニングは、単一またはマルチ層中空構造として定義される一般的なカテゴリを形成した。皮覆組織は、細胞のＡＦＰ陽性ライニングまたはクラスタと関連する堅い列の細長い核を有する有機物化される構造として定義された。皮覆組織は、ＡＦＰに決して陽性でない。１４日目において、ダクト及びライニングが単にマウス胚外植体移植片を含むグループに存在する場合、全てのグループは、小さいクラスタの類似した量を現し、それで、自発的に分化するｈＢＳ細胞は、ダクト及びライニングを形成する傾向ではなかった。しかし、大きいクラスタは、卵黄嚢及び心臓共培養と比較してよりよく肝臓共培養で発生し、自発的に、ｈＢＳ細胞を分化させた。組織、例えば大きいクラスタ及びダクトは、例えばＨＮＦ３ベータ、ＡＦＰ、アルファ−１−抗トリプシン、Ｈｎｆ４アルファ、ＣＹＰ３Ａ４／７及びＣＹＰ１Ａ２／１のような内胚葉及び肝臓マーカーに陽性であった。しかし、クラスタは未成熟肝細胞様細胞を潜在的に示しているＣＫ１８に陰性であった。
【０１４７】
全体的に、データは、ｈＢＳ細胞が単独より肝臓との直接の接触時に、Ｅ１０．５マウス胚から肝芽細胞様細胞または肝細胞様細胞により有効に分化させることができることを示す。
【０１４８】
表１は、Ｅ１０．５胚マウス肝臓のｈＢＳ細胞の共培養の１４日後に、免疫組織化学によって分析される肝臓マーカーの一覧を示している。
【０１４９】
【表１】
2009539358.tif 000003
【実施例３】
【０１５０】
肝臓マーカーによる特性解析（図２、３及び４を参照）
肝細胞様細胞は、肝細胞の典型的な形態学を表示する。すなわち、それらは多角形の細胞形状、大きい細胞直径（凡そ２５−５０μＭ）を有し、よく核を二つもち、脂肪顆粒を蓄積する傾向がある。さらに、それらは肝臓細胞型のために記載されるいくつかのマーカー、例えばアルブミン、アルファ１−抗トリプシン、ＬＦＡＢＰ、ＣＫ１８及びＨＮＦ３ベータを表示する。それらは未分化の細胞のために使われる幹細胞マーカーであるＯｃｔ−４をもはや表示しない。おそらくいくつかの未成熟肝細胞様細胞は依然として胎児の肝臓マーカーＡＦＰを表示する。これらの細胞は、優先して分化ｈＢＳ細胞のコロニーで見つかる。細胞核を視覚化する対照としてのＤＡＰＩ（４’，６’−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｈｙｄｒａｔｅ．  Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）。（マトリゲル（商標）で分化された肝細胞様細胞のＣＫ１８発現のために図２２を参照。）
【０１５１】
繁殖的な肝芽細胞様前駆細胞の識別のために、ＡＦＰ、ＨＮＦ４アルファ、ＣＫ１９、ＣＫ７及びＥｐＣａｍが、使われた。（図４９）
【０１５２】
使用された一次抗体：
アルブミン（ウサギ）１：５００、ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ａ０００１
ＡＡＴ（ウサギ）１：２００、ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ａ００１２
ＣＫ１８（マウス）１：２００、ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｍ７０１０
ＬＦＡＢＰ（ヤギ）１：５００、サンタクルーズ、ｓｃ−１６０６４
ＨＮＦ３ｂ（ヤギ）１：２５０、サンタクルーズ、ｓｃ−６５５４
Ｏｃｔ−４（マウス）１：５００、サンタクルーズ、ｓｃ−５２７９
ｃ−Ｍｅｔ（ＨＧＦ受容体（マウス））１：１００、ｕｐｓｔａｔｅ、０５−２３７
アルファ６−インテグリン（ＣＤ４９ｆ（ラット））１：２５０、ＢＤ  バイオサイエンス、５５５７３６
ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４（マウス））１：５００、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、５５９０４７
ＡＦＰ（マウス）１：２００、ＳＩＧＭＡ、Ａ８４５２
ＨＮＦ４アルファ（ウサギ）１：４００、サンタクルーズ、ｓｃ−８９８７
ＣＫ１９（マウス）１：２００、Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ、ＮＣＬ−ＣＫ１９
ＣＫ７（マウス）１：２００、Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ、ＮＣＬ−Ｌ−ＣＫ７−５６０
ＥｐＣＡＭ−ＦＩＴＣ（１：２００）ＧｅｎｅＴｅｘ社  ＧＴＸ２８６６６
【０１５３】
使用された第２の抗体：
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｇｏａｔ−Ａｌｅｘａ  ４８８、１：５００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、＃  Ａ−１１０５５
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ  ｍｏｕｓｅ−Ｃｙ３（１：１０００）Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＃７１５−１６５−１５１
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ−Ｃｙ２（１：１００）Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＃７１５−２２５−１５１
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ−Ａｌｅｘａ４８８（１：１０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  ＃Ａ−２１２０６
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ−Ａｌｅｘａ５９４（１：１０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  ＃Ａ−２１２０７
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｒａｔ−Ｃｙ３（１：５００）Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＃７１２−１６５−１５３
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｒａｔ−Ｃｙ２（１：１００）Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＃７１２−２２５−１５３
【０１５４】
免疫染色プロトコル：
アルブミン、ＡＡＴ、ＣＫ１８、ＨＮＦ３ｂ、Ｏｃｔ−４、ＣＫ１９、ＣＫ７、ＡＦＰ：
４％ＰＦＡに１５分凝固し、２回ＰＢＳ洗浄し、０，１％  ＰＢＴの５％ＦＢＳに３０分入れ、一次抗体を０．１％ＰＢＴの１％ＦＢＳ中で４℃で一晩培養させ、二次抗体を０．１％ＰＢＴの１％ＦＢＳ中で常温で３時間培養させ、全ては０．１％ＰＢＴ、０．０５ｍｇ／ｍｌのＤＡＰＩの中で常温で５分間洗浄され、ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ封入剤のなかで組み込まれる。
【０１５５】
ＬＦＡＢＰ、ｃ−Ｍｅｔ、アルファ６−インテグリン、ＩＣＡＭ−１、ＣＸＣＲ４：
４％ＰＦＡに１５分凝固し、２回ＰＢＳ洗浄し、ＰＢＳ内の５％ＦＢＳに３０分入れ、一次抗体をＰＢＴの１％ＦＢＳ中で４℃で一晩培養させ、二次抗体をＰＢＴの１％ＦＢＳ中で常温で３時間培養させ、全ては０．０５ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ、ＤＡＰＩの中で常温で５分間洗浄され、ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ封入剤の中で組み込まれる。
【０１５６】
ＥｐＣａｍ：
４％ＰＦＡに１５分凝固し、２回ＰＢＳ洗浄し、０，１％ＰＢＴの５％ＦＢＳに３０分入れ、０．１％ＰＢＴの１％ＦＢＳ中で４℃で一晩培養される一次抗体を直接活用するＦＩＴＣ、０．０５ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ、ＤＡＰＩの中で常温で５分間洗浄され、ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ封入剤の中で組み込まれる。
【実施例４】
【０１５７】
特徴描写
フェーズＩ代謝酵素：
肝細胞様細胞は、以下のＣｙｐｓの免疫反応性を表示する：１Ａ２、２Ａ６、２Ｂ６、２Ｃ８／９／１９（３つの亜類型間の潜在的抗体交差反応）、２Ｄ６、２Ｅ１、３Ａ４／７（２つの亜類型間の潜在的抗体交差反応）。（ｍＥＦに分化される肝細胞様細胞は図５−１１を参照、マトリゲル（商標）で分化された肝細胞様細胞でのＣｙｐ１Ａ２及びＣｙｐ２Ｂ６発現は、図２２を参照）。Ｃｙｐ発現誘導性は、２５μＭリファムピン、２０μＭデソキシフェノバルビタール（プリミドン）、１００μＭデキサメタゾン、８８ｍＭのエタノール、２５μＭオメプラゾール及び１００μＭイソニアジドを含むＣｙｐ誘導混合物に９６時間の暴露の後に見られた。（ｍＥＦでの肝細胞様細胞のＣｙｐ  １Ａ２及び２Ｂ６の誘導について、図２４及び２５を参照）ＣｙｐｓはさらにＨｅｐＧ２内で免疫組織化学的に分析された。それは、いかなる反応も引き起こさなかった（図３１を参照）。
【０１５８】
使用された一次抗体：
Ｃｙｐ１Ａ２（ウサギ）１：１００、ｂｉｏｍｏｌ、ＣＲ３１３０；
Ｃｙｐ２Ａ６（ウサギ）１：１００、ｂｉｏｍｏｌ、ＣＲ３２６０；
Ｃｙｐ２Ｂ６（ヒツジ）１：１００、ｂｉｏｍｏｌ、ＣＲ３２９５；
Ｃｙｐ２Ｃ８／９／１９（ウサギ）１：１００、ｂｉｏｍｏｌ、ＣＲ３２８０；
Ｃｙｐ２Ｄ６（ヒツジ）１：１００、ｂｉｏｍｏｌ、ＣＲ３２４５；
Ｃｙｐ２Ｅ１（ウサギ）１：１００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、ＡＢ１２５２；
Ｃｙｐ３Ａ４／７（ヒツジ）１：１００、ｂｉｏｍｏｌ、ＣＲ３３４５；
Ｃｙｐ２Ｅ１（ウサギ）１：１０００、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＰＡ２６；
Ｃｙｐ３Ａ４／７（ウサギ）１：１０００、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＰＡ３２。
【０１５９】
使用された第２の抗体：
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｇｏａｔ−Ａｌｅｘａ  ４８８，  １：５００，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  ＃  Ａ−１１０５５
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ  ｍｏｕｓｅ−Ｃｙ３，  １：１０００，  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ＃７１５−１６５−１５１
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ−Ｃｙ２，  １：１００，  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ＃７１５−２２５−１５１
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ−Ａｌｅｘａ４８８，  １：１０００，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  ＃Ａ−２１２０６
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ−Ａｌｅｘａ５９４，  １：１０００，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  ＃Ａ−２１２０７
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｒａｔ−Ｃｙ３，  １：５００，  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ＃７１２−１６５−１５３
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｒａｔ−Ｃｙ２，  １：１００，  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ＃７１２−２２５−１５３
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｓｈｅｅｐ−Ａｌｅｘａ４８８，  １：１０００，  ＃Ａ−１１０１５
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｓｈｅｅｐ−Ａｌｅｘａ５９４，  １：１０００，  ＃Ａ−１１０１６
【０１６０】
免疫染色プロトコル：
４％ＰＦＡに１５分凝固し、２回ＰＢＳ洗浄し、０，１％ＰＢＴ内の５％ＦＢＳに３０分入れ、
一次抗体を０．１％  ＰＢＴの１％ＦＢＳ中で４℃で一晩培養させ、二次抗体を０．１％ＰＢＴの１％ＦＢＳ中で常温で３時間培養させ、全ては０．１％  ＰＢＴ、０．０５ｍｇ／ｍｌのＤＡＰＩの中で常温で５分間洗浄され、ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ封入剤の中で組み込まれる。
【０１６１】
ウエスタンブロット法：
Ｃｙｐ１Ａ２及び３Ａ４／７発現は、ウエスタンブロット法（図１２を参照）において確認された。Ｃｙｐ誘導剤処理で、１Ａ２及び３Ａ４及びまたは３Ａ７のタンパク質量（潜在的交差反応）は、非処理及び誘導の細胞からのタンパク質バンドに比べて肝細胞様細胞の誘導性の視覚化を明らかに強化した。タンパク質は、Ｍ−ＰＥＲタンパク質摘出試薬（ピアス）を使用して細胞から抽出され、１：１００プロテアーゼ抑制剤カクテル（シグマ−アルドリッチ）で補充される。タンパク質は、電気泳動法によって１２％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離され、ニトロセルロース膜組織に変えられる（Ｂｉｏｒａｄ、ヘラクレス、ＣＡ）。免疫ブロット法のために、（Ｃｙｐ１Ａ２（ウサギ）及びＣｙｐ３Ａ４／７（ウサギ）、両方ともＢｉｏｍｏｌから）に対する一次抗体は、１％のＢＳＡブロッキングバッファーに希釈された。二次抗体は、対応ＨＲＰ−共役抗体であった（それぞれヤギ抗ウサギ、ヤギ抗マウス及びウサギ抗ヤギ（１：２０００；  ＤＡＫＯ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク））。強化化学ルミネセンス（ＥＣＬ）が、製造業者の指示（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）によって使われた。ＨｅｐＧ２細胞が、陰性対照として使われた。一次ヒト肝細胞（インビトロ  テクノロジーズ、ライプツィヒ、ドイツにおいて）が、陽性対照として使われた。
【０１６２】
追加的な実行において、Ｂｉｏｍｏｌ（ウサギｐＡｂ、ＣＲ１３０））からのＣｙｐ１Ａ２特定抗体が、使われた。誘導及び非処理のＳＡ００２、ＬＯＴ  ＡＬ００２及びＳＡ１６７、ＬＯＴ  ＡＬ００２、に進行された結果は、両方のｈＢＳ細胞由来肝細胞様細胞集団に特定のＣｙｐ１Ａ２反応を示す（弱いにもかかわらず）（図２７を参照）。
【０１６３】
Ｃｙｐ活性分析（図１３、３０及び３２を参照）：
ＰＲＯＤ分析は、９６時間のＣｙｐ誘導混合物との処理においてＰＲＯＤ活性の強い誘導、および非処理の肝細胞様細胞で構造性ＰＲＯＤ活性を示した。さらに、ＥＲＯＤ分析は、特定の構造性及び誘導可能性Ｃｙｐ  １Ａ２活性を示して実行された（図３０を参照）。両方の分析は、初代肝細胞と同程度の誘導活性を示し、さらに、ｈＢＳ細胞由来肝細胞様細胞におけるいかなる誘導の前に、基礎発現が、弱いけれども、実際にはあった。
【０１６４】
カクテルは、２５μＭリファンピシン、２０μＭデソキシフェノバルビタール（プリミドン）、１００μＭデキサメタゾン、８８ｍＭエタノール、２５μＭオメプラゾール及び１００μＭイソニアジドを含んでいる。ＰＲＯＤ（ペントキシレゾルフィン）は一般のＣｙｐ活性分析であり、ＥＲＯＤ（エトキシレゾルフィン）はＣｙｐ１  Ａ２に特有である。ＰＲＯＤまたはＥＲＯＤ貯蔵液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｔ．  Ｎｏ．７７１０５及び４６１２１それぞれからの製品）は、２ｍＭの濃度でＤＭＳＯにおいて準備される。細胞は、各種の誘発因子で９６時間誘導されるかまたは対照として処理しないまま放置する。分析を実行する前に、細胞はＰＢＳによって慎重に二回洗われ、誘発因子の残余量を洗い落とすために、新しいＰＢＳで１５−３０分間培養される。細胞は、３７℃の暗い環境で６０分間、ＰＢＳ内の２５μＭのＰＲＯＤまたはＰＢＳ内の５０μＭのＥＲＯＤによって培養された。それから、細胞はＰＢＳによって再び二回洗われ、顕微鏡の下で分析された。
【０１６５】
Ｃｙｐ３Ａ４、３Ａ７、１Ａ１、１Ａ２及びＣｙｐ２Ａ６の相対的な遺伝子発現レベルが測定され、肝細胞様細胞、ＨｅｐＧ２及びヒト肝エキスの誘導及び非誘導培養物でのリアルタイムＰＣＲ技術によって比較される。ヒト肝エキスの測定は、１にセットされ、他の全てのサンプルは、各シトクロムｐ４５０のためのヒト肝臓参照に関連した。全ての遺伝子の発現は、ＧＡＰＤＨ（ＣＹＰ１Ａ１／１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６）又はＴＢＰ（ＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７）に対して正常化される。図３６を参照。
【実施例５】
【０１６６】
特徴描写：
フェーズＩＩ代謝酵素：
肝細胞様細胞は、ＧＳＴ  Ａ１−１の強い免疫反応性及びＧＳＴ  Ｍ１−１の弱い免疫反応性を表示する。胎児のＧＳＴ  Ｐ１−１の免疫反応性は、ほとんど示されなかった（ｍＥＦで分化される肝細胞様細胞について図１４を参照）。さらに、肝細胞様細胞は、ＵＧＴ  １Ａ１及びＵＧＴ  １Ａ６のための免疫反応性を示す（図１７を参照）。誘導剤処理で、わずかな誘導が、ＧＳＴ  Ａ１−１のために観察されたが、ＧＳＴ  Ｍ１−１またはＧＳＴ  Ｐ１−１のためのはっきりした誘導はなかった。（マトリゲル（商標）に育てられた肝細胞様細胞でのＧＳＴ  Ａ１−１発現は、図２２を参照。）
【０１６７】
使用された一次抗体：
ＧＳＴＡ１−１（ウサギ）１：５００、オックスフォード生医学研究、ＧＳ６２；
ＧＳＴ  Ｍ１−１（ウサギ）１：５００、オックスフォード生医学研究、ＧＳ６７；
ＧＳＴ  Ｐ１−１（ウサギ）１：５００、オックスフォード生医学研究、ＧＳ７２；
ＵＧＴ  １Ａ１（ウサギ）１：５００、ＢＤ  バイオサイエンス、４５８４１１；
ＵＧＴ１Ａ６（ウサギ）１：５００、ＢＤ  バイオサイエンス、４５８４１６。
【０１６８】
使用された第２の抗体：
−ｄｏｎｋｅｙ  抗ウサギ−Ａｌｅｘａ４８８、１：１０００，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（＃Ａ−２１２０６）
−ｄｏｎｋｅｙ  抗ウサギ−Ａｌｅｘａ５９４（１：１０００），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  ＃Ａ−２１２０７
【０１６９】
免疫染色プロトコル：
４％ＰＦＡに１５分凝固し、２回ＰＢＳ洗浄し、０．１％ＰＢＳ内の５％ＦＢＳに３０分入れ、一次抗体をＰＢＴの１％ＦＢＴ中で４℃で一晩培養させ、二次抗体を０．１％ＰＢＴの１％ＦＢＳ中で常温で３時間培養させ、全てが０．０５ｍｇ／ｍｌのＤＡＰＩ  、０．１％ＰＢＴの中で常温で５分間洗浄され、ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ封入剤の中に組み込まれる。
【０１７０】
ウエスタンブロット法：
ウエスタンブロット法分析が、ＢＳ細胞株ＳＡ００２．５（ＬＯＴ  ＢＥ００２．５）、ＳＡ１６７（ＬＯＴ  ＣＥ１６７）（図１５を参照）及びＳＡ００２（ＬＯＴ  ＡＬ００２）（データが示されてない）からの肝細胞様細胞でＧＳＴ  Ａ１−１（２５ｋＤａ）発現を確認する。より胎児性ＧＳＴ亜類型ＧＳＴ  Ｐ１−１（２５ｋＤａ）のための発現は、ウエスタンブロット法によって検出されなかった。ヒトＧＳＴｓを共起表現するＶ７９細胞からの細胞溶解物が、陽性対照として使われた。Ｂ−アクチン（４２ｋＤａ）が、内部積載対照として使われた。ＧＳＴ  Ａ１−１またはＧＳＴ  Ｐ１−１の発現が、株ＳＡ００２またはＳＡ００２．５からの未分化ｈＢＳ細胞において検出されることができなかった。
【０１７１】
タンパク質は、１：１００のプロテアーゼ抑制剤カクテル（シグマ−オールドリッチ）で補充され、Ｍ−ＰＥＲタンパク質摘出試薬（ピアス）を使用して細胞から抽出された。タンパク質は、電気泳動法によって１２％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルに分離され、その後、ニトロセルロース膜（Ｂｉｏｒａｄ、ヘラクレス、ＣＡ）へ変えられた。免疫ブロット法のために、ＧＳＴ  Ａ１−１及びＧＳＴ  Ｐ１−１（１：１０００）に対する一次抗体が、１％のＢＳＡブロッキングバッファーにおいて希釈された。二次抗体は、対応ＨＲＰ−共役抗体であった（ヤギ抗ウサギ、ヤギ抗マウス及びウサギ抗ヤギそれぞれ、１：２０００（ＤＡＫＯ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク））。強化された化学ルミネセンス（ＥＣＬ）が、製造業者の指示（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）によって使われた。一次ヒト肝細胞（インビトロ  テクノロジーズ、ライプツィヒ、ドイツ）及びＧＳＴタンパク質調製が、陽性対照として使われた。
【０１７２】
ＧＳＴ活性分析（図１６を参照）：
１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＣＤＮＢ）へのＧＳＴ触媒活性が、Ｈａｂｉｇとその他、１９７４の分光測光法の分析を使用して決定された。ＣＤＮＢ（１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン）は、一般のＧＳＴ参照培養基（Ｍａｎｎｅｒｖｉｋ  １９８８）である。反応混合は、８５μｌの０．１Ｍのリン酸カリウム（ｐＨ  ６．５）、２．５μｌの０．２ＭのＧＳＨ、２．５μｌの２０ｍＭのＣＤＮＢ及びＭ−ＰＥＲ渙散バッファ内の１０μｌのタンパク質溶解物から構成されていた。タンパク質なしで、１０μｌのＭ−ＰＥＲ渙散バッファとの完全な分析混合が、対照として使われた。３４０ｎｍ及び３０℃の吸光度が、フィリップスＰＵ８７２０  ＵＶ／ＶＩＳ走査型分光光度計を使用して１分間モニタされた。ＣＤＮＢへのＧＳＴ触媒活性が、ｈＢＳ細胞株ＳＡ００２（ＬＯＴ  ＡＬ００２）ＳＡ００２．５（ＬＯＴ  ＢＥ００２．５）及びＳＡ１６７（ＬＯＴ  ＣＥ１６７）及びヒト初代肝細胞培養物に由来した肝細胞様細胞、およびＨｅｐＧ２培養物において検定された。ｈＢＳ由来肝細胞様細胞が、ヒト初代肝細胞に類似したＧＳＴ−活性及びＨｅｐＧ２培養より本質的に高いＧＳＴ活性レベルを示した。図１６を参照。
【実施例６】
【０１７３】
特徴描写：
薬物輸送体
免疫組織化学：
肝細胞様細胞は、トランスポータＭＲＰ２、ＢＳＥＰ、及びＯＡＴＰ−２および／またはＯＡＴＰ−８のための免疫反応性（潜在的抗体交差反応）を示す（図１８、１９、２０を参照）。ＢＳＥＰが肝芽細胞様細胞及び肝細胞様細胞より小さい集団だけにおいて表示される時、ＯＡＴＰ−２／８及びＭＲＰ２が、大多数の肝細胞様細胞において表示されるようである。
【０１７４】
使用された一次抗体：
ＭＲＰ２（ウサギ）１：５０、サンタクルーズ、ｓｃ−２０７６６；
ＢＳＥＰ（ヤギ）１：５０、サンタクルーズ、ｓｃ−１７２９２；
予め希釈されたＯＡＴＰ−２（マウス）、Ｐｒｏｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ社、クローンｍＭＤＱ
【０１７５】
使用された第２の抗体：
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｇｏａｔ−Ａｌｅｘａ  ４８８、１：５００、分子の調査、＃  Ａ−１１０５５
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ  ｍｏｕｓｅ−Ｃｙ３，、１：１０００、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＃７１５−１６５−１５１
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ−Ｃｙ２，  １：１００，  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ＃７１５−２２５−１５１
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ−Ａｌｅｘａ４８８，  １：１０００，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  ＃Ａ−２１２０６
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ−Ａｌｅｘａ５９４，  １：１０００，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  ＃Ａ−２１２０７
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｒａｔ−Ｃｙ３，  １：５００，  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ＃７１２−１６５−１５３
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｒａｔ−Ｃｙ２，  １：１００，  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ＃７１２−２２５−１５３
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｓｈｅｅｐ−Ａｌｅｘａ４８８，  １：１０００，  ＃Ａ−１１０１５
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｓｈｅｅｐ−Ａｌｅｘａ５９４，  １：１０００，  ＃Ａ−１１０１６
【０１７６】
免疫染色プロトコル：
ＭＲＰ２，ＯＡＴＰ−２：
４％ＰＦＡに１５分凝固し、２回ＰＢＳ洗浄し、０．１％ＰＢＴ内の５％ＦＢＳに３０分入れ、一次抗体を０．１％ＰＢＴの１％ＦＢＳ中で４℃で一晩培養させ、二次抗体を０．１％ＰＢＴの１％ＦＢＳ中で常温で３時間培養させ、全ては０．０５ｍｇ／ｍｌのＤＡＰＩ  、０．１％ＰＢＴの中で常温で５分間洗浄され、ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ封入剤の中で組み込まれる。
【０１７７】
ＢＳＥＰ：
４％ＰＦＡに１５分凝固し、２回ＰＢＳ洗浄し、０．１％ＰＢＳ内の５％ＦＢＳに３０分入れ、一次抗体をＰＢＳの１％ＦＢＳ中で４℃で一晩培養させ、二次抗体をＰＢＳの１％ＦＢＳ中で常温で３時間培養させ、全ては０．０５ｍｇ／ｍｌのＤＡＰＩ  、ＰＢＳの中で常温で５分間洗浄され、ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ封入剤の中で組み込まれる。
【０１７８】
ＭＲＰ２遺伝子発現の分析（図２３を参照）
肝細胞様細胞でＭＲＰ２発現は未分化細胞での発現と比較してそれぞれ１１から３２倍高い。
【０１７９】
完全ＲＮＡは、ＧｉｂｃｏからのＴｒｉｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔを使用して、肝細胞様細胞（ＳＡ００２．５、ＬＯＴ  ＢＥ００２．５継代２、ｍＥＦでの２１日分化後）及び、未分化ｈＢＳ細胞（ＳＡ００２．５、ＬＯＴ  ＢＥ００２．５継代２４、５日目（対照サンプル１）及びＳＡ００２、ＬＯＴ  ＢＥ００２、継代６２、４日目（対照サンプル２））から抽出された。５μｇの完全ＲＮＡが、Ｓｕｐｅｒｃｒｉｐｔ  ＩＩキット（インビトロゲン社）を使用して、デオキシリボヌクレアーゼ（インビトロゲン社、ペイズリー、英国）による処理の後に相補型ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写された。トランスポータのための遺伝子特有プライマー及び調査が、プライマー３ソフトウェア・プログラム及びＮｅｔｐｒｉｍｅｒを使用して考案された。２００ｎｇのｃＤＮＡが、ＳｅｎｓｉＭｉｘ  Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍｉｘ，  （  １．５ｍＭの最終的なＭｇＣｌ２）；（Ｃｅｌｔｉｃ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、０．７ユニットＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ）、３００ｎＭの遺伝子特有の前方及び後方のプライマーに適切な遺伝子のためのプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって詳しく説明される。使用するプライマー・シーケンスは、前方：ｔｇｃａｇｃｃｔｃｃａｔａａｃｃａｔｇａ及び、後部：ｇｇａｃｔｔｃａｇａｔｇｃｃｔｇｃｃａである。ＰＣＲは、５０度で２分間、９５度で１０分間、最初工程のＣｏｒｂｅｔｔ  Ｒｏｔｏｒｇｅｎｅで実行され、そのあと９５度で１５秒及び６２度で６０秒を４０回実行される。各々のサンプルのＰＣＲ拡大は、ピペット操作エラーを最小にするために重複に実行された。ノー・テンプレート対照が、陰性対照として各々の実行のために含まれた。各々のサンプルのためのＣｔ値は、記録され、各々のサンプルのための相対的な遺伝子発現が、２△（４０−Ｃｔ）を使用して、標準のＡＢＩプロトコルを使用して算出された。９０％効率の推測下の相対的な発現が最も低いサンプルをゼロにセットすることによって推定された。
【実施例７】
【０１８０】
ＰＡＳ陽性による細胞のグリコーゲン貯蔵発見（過ヨウ素酸染色シッフシステム、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ、Ｃａｔ−ｎｏ．３９５Ｂ）
肝細胞様細胞が、ＰＡＳ陽性方法によって検出されるグリコーゲンを保存する（図２１を参照）。技術的な陰性対照として、唾液処理された培養物は、培養物の９５−９９％でグリコーゲン発見の減少を証明した。ブドウ糖余剰がある限りグリコーゲン合成及び貯蔵は人体の多数の細胞型の一般的な機能ある。しかし、肝細胞及び骨格の筋肉は、グリコーゲンを保存する際に特に特殊化される。肝細胞様細胞を選ぶかまたは取り除く前の分化ｈＢＳ細胞培養において、グリコーゲンを保存する他の細胞集団が、観察され、同じく、グリコーゲンを保存することができない、いくつかの集団も観察される。重要なことに、グリコーゲンを保存しいない培養物の非肝細胞様細胞がある。細胞は、メタノールに希釈される４％のパラホルムアルデヒドに室温で、１５分間、取り付けられ、その後、３回をＰＢＳで洗われた。技術的陰性対照として、培養物は室温で、２０分間、ヒト唾液で処理され、その後、ＰＢＳで洗われた。ヒト唾液は、グリコーゲンを消化するα−アミラーゼを含む。アルデヒドにグリコールを酸化する過沃素酸が処理及び非処理の培養物に５分間室温で、加えられ、ＰＢＳにおける繰り返し洗浄が続いた。その後、培養物は室温で、１５分間、シッフ試薬で培養され、パラローズアニリン及び異性重亜硫酸ナトリウム間の反応を可能にし、グリコール含有する細胞コンパートメントを明るいピンクに染色するパラローズアニリン製品を作り出す。ＰＢＳで洗った後に、細胞は、室温で、９０秒間、ヘマトキシリンで対比染色され、マウンティング培養基に取り付ける前にＨ２Ｏにおいてすすがれた。ヘマトキシリンは、細胞（青っぽい）の核を染色する。
【実施例８】
【０１８１】
遺伝子の分析
重要な特定の遺伝子を分析するさらなる別の方法、例えば、下記の物質は量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）を用いている。そのような措置は以下の通りである：第１の適切な遺伝子が選ばれ、それらの遺伝子と相補的にマッチするプライマーが考案され、定量化がＰＣＲ分析によって行われ、重要な遺伝子の発現レベルがハウスキーピング遺伝子、分化の間に下方対照する遺伝子と比較される（分化の間に安定して表示されることが公知の場合）。いくつかのｈＢＳ細胞株の分化の間に、下方対照される適切な遺伝子の実施例は、Ｃｒｉｐｔｏ、Ｎａｎｏｇ及びＯｃｔ−４である。
【０１８２】
ｈＢＳ細胞由来肝細胞様細胞は、例えばマイクロアレイ、ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｔｙカードまたは遺伝子の適切な選択を有する遺伝子チップのような、従来の技術によって遺伝子レベル（ｍＲＮＡ発現レベル）で、更に特徴描写されてもよい。例えば下記の表（表１）にリストされる。サンプルの完全ＲＮＡに由来されるｃＤＮＡは、例えばｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｔｙカードと交雑され、実験は、ＰＣＲセットアップに入り、更に、適切なソフトウェアを使用して分析される。
【０１８３】
【表２】
2009539358.tif 000004
【０１８４】
誘発因子混合物で処理されるかまたは非処理である細胞株ＳＡ１６７、ＬＯＴ  ＣＡ１６７及びＳＡ００２、ＬＯＴ  ＡＬ００２の未分化ｈＢＳ細胞及び、２つの細胞株に由来する肝細胞様細胞は、インストラクタのマニュアル（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴ  Ｍｉｃｒｏ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｃａｒｄ  Ｇｅｔｔｉｎｇ  Ｓｔａｒｔｅｄ  Ｇｕｉｄｅ）及び以下の短縮プロトコルに従って、ＬＤＡチップ上で並行に繰り返し行われる。
【０１８５】
ｃＤＮＡが、完全ＲＮＡから調製され、適切な濃度を達成するためにＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー水に希釈される（下記参照）。以下の構成要素が混合された：
ｃＤＮＡ（１−１００  ｎｇ）、５μｌ
ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー水
ＴａｑＭａｎの汎用ＰＣＲ、４５のμｌ
マスター混合物（２Ｘ）（５０μｌ）
合計：１００μｌ
【０１８６】
サンプルは、その後、ＬＤＡカードに載せられ（各々のサンプル混合物は、１サンプルにつき１００ｕｌ及び１７０ｎｇ  ｃＤＮＡである）、遠心分離機で分離され、その後に、ＬＤＡカードは密閉された。最後に、マニュアルの説明に基づいて、カードはＡＢＩ  ７９００ＨＴリアルタイムＰＣＲシステムで実行され、結果はＳＤＳ  ２．２．１ソフトウェア及び相対的な定量化方法を用いて分析される。
【０１８７】
ｈＢＳ細胞−由来肝細胞様細胞から検出の肝臓タンパク質の概要（ＬＤＡ分析またはＱＰＣＲによって）は、下の表３及び４に示される。
【０１８８】
【表３】
2009539358.tif 000005
【０１８９】
【表４】
2009539358.tif 000006
【実施例９】
【０１９０】
肝細胞様細胞の生物反応器培養物
ｈＢＳ細胞及びそれの由来的細胞型、例えば肝芽細胞様細胞または肝細胞様細胞は、例えば人工中空ファイバー毛細血管膜によって区分される三次元スペースにおいて育てられてもよい。このシステムは、毛細管間のより大きい細胞集団へ細胞を成長させることを可能にし、培養基の潅流及び酸素類のガスによって最適化、天然環境を提供する。密閉生物反応器システムは、細胞（最高１０＾１１細胞）を大量に生産し、細胞の機能的特性の保全を支えるために開発される。酵素潅流による細胞隔離が、密閉したＧＭＰシステムで拡大された。細胞浄化が、例えば膜組織抗原発現に基づくＦＡＣソートまたは密度勾配培養基及び遠心分離を使用して、それから実行される。
【実施例１０】
【０１９１】
尿素合成
尿素合成は、肝臓特定の特性であり、したがって、異なる細胞株から肝細胞様細胞へ分化する培養基の尿素濃度が、２４時間潜伏の後、異なる時刻で測定された。培養基サンプルは、集められ、分析のために送られた。尿素分泌が、尿素／尿素窒素（ロシュ／日立）の運動ＵＶ検査法のためのキットを使用して分析された（Ｋｌｉｎｉｓｋ  Ｋｅｍｉ、Ｃ−研究室、Ｓａｈｌｇｒｅｎｓｋａ大学病院、イェーテボリで）。
【０１９２】
血清／プラスマの期待値は、１０−５０ｍｇ／ｄＬ（１．７−８．３ｍｍｏｌ／Ｌ）である。
【０１９３】
方法に従う尿素発見のための低いレベルは、０．８のｍｍｏｌ／Ｌであった。
【０１９４】
【表５】
2009539358.tif 000007
【０１９５】
ｈＢＳＣ−由来肝細胞様細胞は、初代肝細胞と同様の濃度の培養基へ尿素を生産及び分泌する。十分に面白いことに、肝細胞様細胞が培養物内で現れてからおよそ２０日後に、重要な尿素濃度のみが、測定されることができる。
【０１９６】
例えばアルブミン分泌に関する更なる機能的テストが、シュヴァルツとその他の２００２及び２００５にて説明したように、実行されることができる。肝細胞様細胞及び肝芽細胞様細胞の更なる機能的な特徴描写が、ＬＤＬ摂取及び糖新生を実行する能力のために分析されることができた。
【実施例１１】
【０１９７】
細胞極性及び機能性
サンドイッチ培養系が、更に細胞極性及び肝細胞様細胞の長期の機能性を改善することができる。そのような培養系において、肝細胞様細胞の埋め込みは、低いレベル酸性応力と別の肝臓体内を模倣する三次元環境提供する。それによって、肝細胞様細胞は有極性を示する。すなわち、アピカル側を有する上皮様組織（生体内胆汁側の方へ、疎水性）及び基底外側（生体内血液側の方へ、親水性）を形成する。サンドイッチ培養での肝細胞様細胞のもう一つの潜在的改良は、Ｃｙｐ発現のより強い誘導性である。
【実施例１２】
【０１９８】
免疫組織化学的ノッチ特徴描写：
ＩＶＦ皿で育てられる培養ｈＢＳ細胞は、室温で、１５分間、４％のパラホルムアルデヒドに取り付けられた。細胞は、それから一次抗体によって一晩４℃で培養された（Ｎｏｔｃｈ２、１：２００  サンタクル\ス、ｓｃ５５４５、ＵＳＡ）。その翌日、細胞は１０分間二回１Ｘ  ＰＢＳによって洗われ、１時間、室温の１Ｘ  ＰＢＳ内で第２抗体（抗ウサギ−ＦＩＴＣ、１：５００）によってその後に培養され、それぞれ５分間二度洗われ、５分間１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ溶液に暴露される。水でそれぞれ５分間二回細胞を洗った後に、それらは、アクアマウントに取り付けられ、蛍光性顕微鏡検査によって分析される。最近、未分化のｈＢＳ細胞がＮｏｔｃｈ２（Ｎｏｇｇｌｅとその他（２００６））を表示することが示された。Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ  ｈＢＳ細胞株ＳＡ００２において、大多数の細胞は、分化の第１日にＮｏｔｃｈ２に弱陽性である。２週後に、Ｎｏｔｃｈ２は、肝細胞様および／または肝芽細胞様細胞のほんの少数のサブセットだけで見つかる。すなわち、肝臓形態学に似ている二核小体の細胞である（図３５を参照）。
【実施例１３】
【０１９９】
肝芽細胞様及び肝細胞様細胞の繁殖的状態が、実施例２の内因子プロトコルに基づいて、ｈＢＳ細胞をそれぞれ１４及び２１日間培養することによって、試験された。分析の日、培養物は室温で１５−２０分間４％のＰＦＡに取り付けられ、数回ＰＢＳで洗われ、ＰＢＳに希釈される０．１−０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ１００において透過処理された。肝芽細胞様細胞のため、内胚葉／初期肝臓マーカーＨＮＦ４アルファ（ウサギｐＡｂ、サンタクルーズ、ＳＣ−８９８７、１：４００希薄）が使われ、肝細胞様細胞のために、内胚葉／肝臓マーカーＨＮＦ３ベータ  （Ｆｏｘａ−２）（ＩｇＧ、サンタクルーズ、ＳＣ−６５５４、１．２００希薄）が使用された。２つの肝臓様細胞集団の増殖を研究するために、抗体、Ｋｉ６７（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、＃５５６００３、１：５００希薄）が、一晩冷蔵庫での培養に加えられる。いくつかの洗浄の後、第２の抗体が利用され、室温で２時間培養された。培養物が洗われ、ＤＡＰＩは核を検出するために最後の洗濯に含まれた。ＨＮＦ４アルファに陽性の肝芽細胞様細胞は、Ｋｉ６７との共局所によって繁殖表示である（図２８を参照）。肝細胞様細胞はＫｉ６７に陽性でなく、非繁殖細胞を示した。
【０２００】
増殖能が肝細胞様細胞において誘導されることができたかどうか確認するために、培養基状況を変えるとともに、初代肝細胞の増殖を刺激する公知の成長因子を加えることによって、ｈＢＳ細胞由来肝細胞様細胞の増殖誘導が、追加的に試験された。ｈＢＳ細胞（細胞株ＳＡ００２）は、先に述べた状況の下で１７日間分化させられ、肝芽細胞及び肝細胞様細胞になる。培養基は、１０％のＦＢＳ（または血清代替物）で補充されるウィリアムズ培養基Ｅ（シグマ、Ｗ−４１２８）、１％のＰＥＳＴ、１％のグルタマックス、１ｘ  ＩＴＳ、０．２５ｎｇ／ｍｌデキサメタゾン、２％のＤＭＳＯ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＨＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌオンコスタチンＭ、１０ｍＭのニコチンアミド及び４ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦに変えられた。ｈＢＳ細胞は、おおよそ５日ごとに変えられる培養基で、さらに５−１５日間育てられた。細胞の増殖能は、その後で、上記通りの追加的な１１日以後に分析された。上記通りに補充されるウィリアムズＥ培養基で培養される時に、ｈＢＳ細胞由来肝細胞様細胞は繁殖するが、４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦで補充されるＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）で育てられる肝細胞様細胞において増殖は検出されなかった（図２９を参照）。したがって、もし適切な培養基で培養された場合、肝細胞様細胞は、増加する増殖能へ刺激されることができる。
【実施例１４】
【０２０１】
９６−ウェルプレートの肝細胞様細胞へのｈＢＳ細胞分化
４日間から５日間、前のｈＢＳ細胞は、小さい断片に手動で解剖され、マイトマイシンＣ−に処理され、９６−ウェルコーティングされたｍＥＦへ移動される。ｈＢＳ細胞の２つから３つの断片が各々のウェルに加えられた。培養物は、４ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦで補充されるＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）において、３７℃、５％のＣＯ２及び９５％の湿度で２０−３０日間培養された。１０日目に、培養基の５０％が、４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦで補充される新しいＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）と取り替えられ、２０日目に、培養基の１００％が取り替えられた。ｈＢＳ細胞は、ＭＥＦ−コーティング、ＩＶＦ−皿で培養されたｈＢＳ細胞コロニーに類似するコロニーに分化され、例えば肝芽細胞様細胞は、ＨＮＦ４アルファに免疫陽性反応であり、１４日目あたりにコロニーの周辺に現れ、２０日目の肝細胞様細胞に現れた。９６−ウェルの８０％が、このプロトコルを用いて２０日目に肝細胞様細胞へｈＢＳ細胞を分化させることに成功した。
【実施例１５】
【０２０２】
異なる表層への肝細胞様細胞の再接種
肝細胞様細胞の再接種の前に、９６ウェルプレートのウェルが、異なるコーティングによって予めコーティングされる：ラットの尾からのコラーゲンＩ  （ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃３５４２３６）、１０％から１００％の異なる濃度のマトリゲル（商標）（基底膜マトリックス、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃３５６２３７）、または、ｍｉｔｏｃｙｃｉｎ  Ｃ処理のｍＥＦ細胞層。コーティングは、次のように実行された：コラーゲンＩが９６ウェルに加えられ、５％のＣＯ２、３０ｍｉｎ−１ｈの９５％湿度で３７℃で培養される。コラーゲンＩの余剰が廃棄され、ウェルは、その後いかなる酸性の酸性トレースも取り除くために二回ＰＢＳによって洗われた。ウェルは、２０％のＦＣＳで補充され、予め暖められた５０−１００μｌのＨＣＭ−培養基で満たされた（ＨＢＭ（商標）、Ｃａｍｂｒｅｘからのｃｃ−４３１６ＢＢ、ｃｃ−４３６２ＢＢ、ｃｃ−４３３５ＢＢ、ｃｃ−４３１３ＢＢ、ｃｃ−４３２１ＢＢ、ｃｃ−４３１７ＢＢ、ｃｃ−４３８１ＢＢのＨＣＭ（商標）  ＳｉｎｇｌｅＱｏｕｔｓで補充されるｃｃ−３１９９）。マトリゲル（商標）コーティングのために、マトリゲル（商標）の冷凍分割量が、冷蔵庫において一晩解凍された。マトリゲル（商標）は、１０％から１００％のマトリゲル（商標）を達成するためにＨＣＭ−培養基で希釈された。マトリゲル（商標）の異なる濃度は、９６−ウェルに加えられ、３０分間３７℃で培養された。マトリゲル（商標）の余剰は、２０％のＦＣＳで補充されるＨＣＭ−培養基を加える前に廃棄された。２５から３８日までの古い培養範囲の肝細胞様細胞が、ＢＤからのマイクロ外科用メスを用いてマイクロ解剖され、ＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）培養基を含んでいる収集ディッシュへ幹細胞ナイフで移動される。領域を含んでいるミクロ解剖した肝細胞様細胞は、小さいクラスタを形成し、いくつかのプレートから集められた。クラスタは、３７℃で１０分間カルシウム及びマグネシウムなしのＰＢＳ、加熱プレートでのＴｒｙｐＬｅ  Ｓｅｌｅｃｔ（Ｇｉｂｃｏ、＃１２５６３）で４２℃で３−５分間、または３７℃で５−１５分間Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ＩＶによって、２０％のＦＣＳで補充されるＨＣＭ−培養基を含んでいる９６−ウェルプレートの異なるコーティング上に再接種する前に処理される。一日以後、肝細胞様細胞を有するクラスタは、表層に付属し、表層上にクラスタから移り始めた。これは、肝細胞様細胞の全ての異なる種類のコーティング及び分離処理にとって真実だった。２０％ＦＣＳで補充されるＨＣＭ−培養基は、無血清ＨＣＭ−培養基に交換された。培養に、一日おきに、新しいＨＣＭ−培養基が提供された。数日後に、肝細胞様細胞は、ウェルを再接種した。肝細胞様細胞は、保持された肝臓典型的形態学を培養物で４５日間キープした。大きい多角形及び複数核細胞（図４６を参照）は、肝細胞マーカーＨＮＦ３ベータ及びＣＫ１８（図４６）に陽性であった。
【実施例１６】
【０２０３】
新陳代謝の肝細胞様細胞
異なる分化プロトコルによって得られるｈＢＳ細胞由来肝細胞様細胞は、誘発因子の非存在下でフェーズＩシトクロムｐ４５０酵素、ｃｙｐ１Ａ２、ｃｙｐ２Ｃ９及びｃｙｐ３Ａ４にそれぞれによって、フェナセチン（アルドリッチ）、ジクロフェナック（ＳＩＧＭＡ）及びミダゾラム（ＳＩＧＭＡ）を新陳代謝させるその能力のために検査された。培養基へ放出されたそれぞれ物質の代謝物質が、ＬＣ−ＭＳで測定された。細胞株ＳＡ００２、ＳＡ００２．５及びＳＡ３４８からの肝細胞様細胞を含んでいる混合培養物が、２６日から３５日までに試験された。物質は、フェノールレッドなしの培養基、２６μＭフェナセチン、９μＭジクロフェナク及び３μＭミダゾラムの中でカクテルとして、６時間、１２時間及び２４時間、３７℃で５％のＣＯ２の条件下で培養された。各々の培養及び時刻からのサンプルはいかなる細胞残屑も取り除くために、集められ、高速で２０分間遠心分離機で分離された。１００μｌの取り除かれた培養基サンプルは、９６−ウェルプレートへ移動され、１５μｌのアセトニトリルは、各々のウェルに加えられた。ＬＣ−ＭＳによって代謝物質測定が実行され、分析されるまで、サンプルは冷凍だった。
【０２０４】
液体クロマトグラフィ・システムは、ＨＰ１１００シリーズＬＣポンプ及びＨＴＳ  ＰＡＬ注射器（ＣＴＣ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ、Ｚｗｉｎｇｅｎ、スイス）と組み合わせであるカラムオーブン（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ドイツ、Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ、ドイツ）から構成されていた。４−ヒドロキシジクロフェナック及び１−ヒドロキシミダゾラムのために、ＬＣ分離が、逆相ＨｙＰｕｒｉｔｙ  Ｃ１８（２．１ｘ５０ｍｍ、５μｍ、ＴｈｅｒｍｏＱｕｅｓｔ、ランコーン、英国）にＨｙＰｕｒｉｔｙ  Ｃ１８  ｐｒｅｃｏｌｕｍｎとともに４０℃で実行された。移動式フェーズは、以下から構成されていた：（Ａ）０．１％の（ｖ／ｖ）ギ酸及び（Ｂ）アセトニトリルにおける０．１％の（ｖ／ｖ）ギ酸。有機条件剤含有量は、３分間に５から８０％のＢに、線形に増やされ、そして、０．２分間５％のＢに戻る。
【０２０５】
パラセタモールのために、クロマトグラフィが、ＨｙＰｕｒｉｔｙ  Ｃ１８  ｐｒｅｃｏｌｕｍｎを有するＺｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ８（４．６ｘ１５０ｍｍ、５μｍ）上で、同じシステム及び移動式フェーズを使用して実行された。有機条件剤含有量は、５分間に２から３０％のＢに、線形に増やされ、そして２分間に３０から８０％まで増加し、その後０．１分間２％のＢに戻る。４−ヒドロキシジクロフェナック、１−ヒドロキシミダゾラム及びパラセタモールのための保持時間は、それぞれ、２．９、２．４及び６．４分であった。発見は、電気スプレイ・インタフェース（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ  Ｓｃｉｅｘ、コンコード、カナダ）を備えている３倍の四重極質量分析計ＡＰＩ４０００で実行された。４５０℃の４−ヒドロキシジクロフェナック及び５５０℃での１−ヒドロキシミダゾラム及びパラセタモール、ネビュライザー・ガスのための、ターボ・ヒーター温度で操作されるＭＳは、それぞれ、５０、３０、７０及び、５０であった（ＧＳ１）。ターボ・ガスはそれぞれ、５０、６０、７０及び、７０であり（ＧＳ２）、カーテン・ガスは、それぞれ２０、２０、１０及び２０であった。４−ヒドロキシジクロフェナックのための電気スプレイ電圧は、陰性モードの−３ｋＶであり、１−ヒドロキシミダゾラム及びパラセタモールのための電気スプレイ電圧はそれぞれ陽性モードの５、３．５ｋＶであった。
【０２０６】
衝突エネルギーは、それぞれ、−１５、３９及び２１Ｖにセットされ、衝突活性化解離ガスは、それぞれ、５、７及び、５である。選択されるＭＲＭ移行は、４−ヒドロキシジクロフェナックは３０９．９＞２６５．９であり、１−ヒドロキシミダゾラムは３４２．０＞２０２．７で、パラセタモールは１５２．３＞１１０．０である。２００ｍｓの滞留時間が使われた。計測器対照、データ収集及びデータ評価が、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ／ＭＤＳ  Ｓｃｉｅｘ  Ａｎａｌｙｓｔ  １．４ソフトウェアを使用して実行された。
【０２０７】
誘発因子の非存在下及び異なる世代の異なるｈＢＳ細胞由来肝細胞様細胞のＣｙｐ−活性
【０２０８】
【表６】
2009539358.tif 000008
【実施例１７】
【０２０９】
ｃｙｐ活性の配合
体内の薬物代謝を予測するために、薬物代謝を分析するときに、肝細胞の範囲内のｃｙｐ−活性配合は欠かせない。ｈＢＳＣ−由来肝細胞様細胞のｃｙｐ−活性配合がどれくらいよくヒト肝細胞を反映させるかについて分析するために、薬品フェナセチン（２６μＭ）ジクロフェナック（９μＭ）及びミダゾラム（３μＭ）、（それぞれｃｙｐ１Ａ２、ｃｙｐ２Ｃ９及びｃｙｐ３Ａ４によって新陳代謝される）の混合が、細胞株ＳＡ３４８及びヒト初代肝細胞に由来した肝細胞様細胞に加えられた。薬品カクテルの１２時間培養の後に、サンプルは、代謝物質のＬＣ−ＭＳ発見のために集められた。サンプルは、前の実施例１６に記載されている通りにＬＣ−ＭＳによって調製され、分析された。試験した３つの酵素システム間のｃｙｐ活性配合が、分析された。
【０２１０】
【表７】
2009539358.tif 000009
【０２１１】
肝細胞様細胞のｃｙｐ活性配合は、ヒト初代肝細胞培養でのｃｙｐ活性配合と類似していた。
【実施例１８】
【０２１２】
肝細胞様細胞の改良
ｈＢＳＣ−由来肝細胞様細胞を改善するために、リアルタイムＰＣＲ技術に基づく選別法が使われた。４つの遺伝子の相対的な発現レベル；ＨＮＦ４アルファ、Ｃｙｐ３ａ４、アルブミン及びＵＧＴ２Ｂ７が、肝細胞様細胞の改良を示した。Ｃｙｐ３ａ４は、成人肝臓内で重要なシトクロムｐ４５０酵素である。それは、成人肝臓でのフェーズＩ酵素活性の６０％を構成する。アルブミンは、成熟及び成人肝細胞に高く表示される。ＵＴＧ２Ｂ７は、成人肝臓の重要なフェーズＩＩ酵素（グルクロノシルトランスフェラーゼ）である。Ｃｙｐ３ａ４、アルブミン及びＵＴＧ２Ｂ７の上昇レベルが、改良され、成熟し、潜在的により機能的な肝細胞様細胞示す。ＨＮＦ４アルファは、肝芽細胞様細胞の初期のマーカーである。ＨＮＦ４アルファ遺伝子発現の上昇レベルは、肝芽細胞様細胞の増加数を示す。アルブミン、Ｃｙｐ３Ａ４及びＵＴＧ２Ｂ７の高水準及び、加えて、ＨＮＦ４アルファの減少されたレベルは、ＨＣＬＣの成熟した及びより機能的な集団を示す。
【０２１３】
異なるプロトコルからの細胞サンプルの完全ＲＮＡ（詳細な説明のために下記を参照）が、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｓ  Ｔｒｉｚｏｌ方法を使用して抽出された。ｃＤＮＡが、オリゴｄＴ（ｏｌｉｇｏ  ｄＴ）を使用して完全ＲＮＡサンプルから作られた。その後、使用準備済のＴａｑｍａｎプライマー、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからの標準プログラム及び装置を使用して、ｃＤＮＡがリアルタイムＰＣＲ反応において拡大された。
【０２１４】
分析のために、ＰＣＲ製品を検出するために必要なサイクル（ＣＴ−値）の数が、同じサンプルでのハウスキーピング遺伝子、ＧＡＰＤＨのＣＴ−値に正常化された。正常化されたＣＴ−値は、その後で、相対的な定量化（△△Ｃｔ方法）のために比較的Ｃｔ方法を用いて、各々の実験における対照サンプルの正常化されたＣＴ−値と比較された。結果は、それからサンプルと同じ実験の対照サンプルとのフォールド変化として提示された。
【０２１５】
異なるパラメータ及び培養プロトコルが、肝細胞様細胞を改善するために合成された。異なる培養基が試験され、肝細胞様細胞は、培養でより長い時間キープされ、培養基置換の頻度は分析され、異なる成熟及び誘導因子が試験されたなどである。
【０２１６】
肝細胞様細胞へｈＢＳ細胞を分化させる参照プロトコル（実施例２に記載されている内容と類似する）：
１日目
ｈＢＳ細胞は、手動で断片に切断され、４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦで補充されるＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）−培養基を含み、ｍＥＦ−コーティングされたＩＶＦ皿へ移動された。
１０日目
培養基の５０％は、４ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦで補充されるＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）と取り替えられた。
１４−１５日目
ＨＮＦ４−アルファ染色によって示される肝芽細胞様細胞は、コロニーの周辺に存在する。
２０日目
培養基の１００％が、４ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦで補充されるＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）と取り替えられた。肝細胞様細胞は、コロニーの周辺に現れている。
【０２１７】
プロトコルの重要な要素のうちの１つは、培養基を非常にまれに置換することである。内因子は、分化過程に重要である。
【０２１８】
改良されたプロトコル
Ｉ  異なる培養基
ＣａｍｂｒｅｘからのＨＣＭ−培養基        表５の実験１、２；  図３７−３９
【０２１９】
ＩＩ  成熟及び誘導因子を有するサプリメント
ａ．  デキサメタゾン                      表６の実験１、２、３；  図４０−４２
ｂ．  ＨＣＭ−培養基、ＨＧＦ、ナトリウム酪酸塩  表７の実験１、２；  図４０−４２
【０２２０】
ＩＩＩ  培養基置換頻度
ＨＣＭ−培養基及びＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）  表８の実験１；  図４３−４５
【０２２１】
【表８】
2009539358.tif 000010
【０２２２】
【表９】
2009539358.tif 000011
【０２２３】
【表１０】
2009539358.tif 000012
【０２２４】
【表１１】
2009539358.tif 000013
【０２２５】
Ｉ．  ＣａｍｂｒｅｘからのＨＣＭ培養基が、ウシ血清アルブミンの一等分で補充される無血清基礎培養基（ＢＳＡ−ＦＡＦ；  １０ｍｌ／５００ｍｌのＨＢＭ、ｃｃ−４３６２ＢＢ、Ｃａｍｂｒｅｘ）、アスコルビン酸（０．５ｍｌ／５００ｍｌのＨＢＭ、ｃｃ−４３１６ＢＢ、Ｃａｍｂｒｅｘ）、上皮細胞増殖因子（ｒｈ−ＥＧＦ；  ０，５ｍｌ／５００ｍｌのＨＢＭ、ｃｃ−４３１７ＢＢ、Ｃａｍｂｒｅｘ）、トランスフェリン（０．５ｍｌ／５００ｍｌのＨＢＭ；  ｃｃ−４３１３ＢＢ、Ｃａｍｂｒｅｘ）、インスリン（０．５ｍｌ／５００ｍｌのＨＢＭ；  ｃｃ−４３２１ＢＢ、Ｃａｍｂｒｅｘ）、ヒドロコルチゾン（０．５ｍｌ／５００ｍｌのＨＢＭ；  ｃｃ−４３３５ＢＢ、Ｃａｍｂｒｅｘ）及び抗生物質（ＧＡ−１０００；  ０．５ｍｌ／５００ｍｌのＨＢＭ；  ｃｃ−４３８１ＢＢ、Ｃａｍｂｒｅｘ）である。培養基は、初代肝細胞培養のために最適化される。
【０２２６】
ＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）が、ＨＣＭ−培養基により１５日目または２３日目の後に交換された。プロトコルは、改良された肝細胞様細胞をもたらした。細胞株ＳＡ００２及びＳＡ３４８に由来の改良肝細胞様細胞は、アルブミン、ＣＹＰ３Ａ４及びＵＧＴ２Ｂ７（図３９）の上昇する遺伝子発現レベルを示した。形態学によって判断されれば、肝細胞を有するコロニーの末梢は、改良された培養物においてより広く、細胞は脂肪質でない（図３８）。プロトコル詳細の研究設計のために、図３７、表５、実験１及び２を参照。
【０２２７】
ＩＩａ．  細胞株ＳＡ１６７、ＳＡ３４８、ＳＡ００２に由来されるＨＣＬＣは、参照プロトコルに基づき分化されたが、プロトコルの終わりでの８日間の高い濃度のデキサメタゾンによるサプルメントはＨＣＬＣの外観を改良した（図４１Ａ＋Ｂ）。加えて、ＨＮＦ４アルファ、アルブミン、ｃｙｐ３Ａ４及びＵＧＴ２Ｂ７の上昇する遺伝子発現レベルが、明白である傾向が示された（図４２Ａ）。研究設計のために、図４０を参照、研究デザインＣ及びプロトコルの詳細は、表６、実験１、２、３を参照。
【０２２８】
ＩＩｂ．  細胞株ＳＡ１６７及びＳＡ００２に由来される肝細胞様細胞が、２１日目まで参照プロトコルに基づき分化された。その時刻で、培養基はＨＧＦ及びナトリウム酪酸塩（ＮａＢ）で補充されるＨＣＭ−培養基に交換された。
【０２２９】
ＩＩＩ．  分化のためのまれな培養基置換及びｈＢＳ細胞に由来される肝細胞様細胞の成熟処理の重要性が、ＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）及びＨＣＭ（商標）−培養基の中の異なるいくつかの培養基のために試験され、分析された。参照プロトコルは、１５日目まで続かれた。１５日目の後、培養基は週３回または週１回交換された。研究デザインのために、図４３を参照、プロトコルの詳細について、表８の実験１を参照。はっきりした傾向が、試験される全ての培養基のために観察された。培養基のまれにされた置換が、形態学に基づいく肝細胞様細胞（図４４Ａ＋Ｂ）及び、Ｃｙｐ３Ａ４、アルブミン、ＵＴＧ２Ｂ７及びＨＮＦ４アルファのために上昇した遺伝子発現レベル（図４５）を改良した。データは、内因子が、ｈＢＳＣ−由来肝細胞様細胞の分化処理のために重要であることを示す。
【実施例１９】
【０２３０】
ｈＢＳ細胞由来肝芽前駆細胞
肝芽前駆細胞株を確立するために、１５日間古いｈＢＳ−細胞由来肝芽細胞が、分離され、異なるコーティングに再接種された。肝芽細胞様細胞の再接種の前に、９６−ウェルプレートのウェルが、以下の異なるコーティングによって予めコーティングされた；１７−２０ｘ１０３細胞／ｃｍ２の密度を有するマイトマイシンＣ−処理のｍＥＦ細胞、ラットの尾からのコラーゲンＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃３５４２３６）または、ＨＣＭ−培養基に１：３で希釈したマトリゲル（商標）（基底膜マトリックス、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃３５６２３７）。コラーゲンＩ及びマトリゲル（商標）のためのコーティング手順は前の実施例１５で記載されている。ウェルは、２０％のＦＣＳで補充される予め暖められた５０−１００μｌのＨＣＭ培養基で満たされた（ＨＢＭ（商標）、Ｃａｍｂｒｅｘからのｃｃ−４３１６ＢＢ、ｃｃ−４３６２ＢＢ、ｃｃ−４３３５ＢＢ、ｃｃ−４３１３ＢＢ、ｃｃ−４３２１ＢＢ、ｃｃ−４３１７ＢＢ、ｃｃ−４３８１ＢＢのＨＣＭ（商標）  ＳｉｎｇｌｅＱｏｕｔｓに補充されるｃｃ−３１９９）。１５日間古い培養からの肝芽細胞様細胞の範囲がＢＤからのマイクロ外科用メスを用いてマイクロ解剖され、ＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）培養基を含んでいる収集ディッシュに、幹細胞ナイフで移動される。範囲を含むマイクロ解剖された肝芽細胞様細胞は、小さいクラスタを形成し、いくつかのプレートから集められた。ところが、ｍＥＦ−細胞層に再接種される肝芽細胞様細胞は、肝細胞の典型的特性を示しておらず、小さい核を有する肝芽細胞様細はｍＥＦ−細胞層上で育てられた（図４７Ｄ−Ｆ及びＫ、Ｌ）。加えて、ｍＥＦに育てられる大多数の肝芽細胞様細胞クラスタは、肝芽マーカーＣＫ１９（図４７Ｊ、Ｋ）に強く陽性だったが、コラーゲンＩ及びマトリゲル（商標）上の肝芽細胞様細胞の一部だけが、ＣＫ１９に陽性であった（図４７Ｇ、Ｈ）。ｍＥＦ細胞層上の肝芽細胞様細胞及びコラーゲンＩ及びマトリゲル（商標）コーティング上の肝芽細胞様細胞は、ＨＮＦ４アルファ陽性核を示したが、ｍＥＦに育てられる肝芽細胞様細胞（図４７Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ）と比較して、後者は、より大きくて、強く染色されなかった核を有した。データは、肝細胞様細胞への肝芽細胞様細胞の分化がコラーゲンＩ及びマトリゲル（商標）コーティング上で可能にされる場合に、ｍＥＦ細胞層が、前駆状態に肝芽細胞様細胞をキープする能力を有することを示す。
【実施例２０】
【０２３１】
機能的な薬物輸送体
ｈＢＳＣ由来肝細胞様細胞におけるトランスポータに関する機能的なテストが、培養にインドシアニングリーン色素（ＩＣＧ）を利用することによって分析された。ＩＣＧは、５ｍｇ／ｍｌの濃度へ蒸留、殺菌された水に溶かされ、その後で、１ｍｇ／ｍｌの最終濃度へ培養基で薄められた。ＩＣＧ溶液は、細胞培養皿に加えられ、おおよそ６０分間３７℃で培養された。培養の後に、細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に洗い落され、ＩＣＧの細胞摂取は、ステレオ顕微鏡で検査された。肝細胞様細胞は、ＩＣＧ色素を表し、細胞の範囲に機能的な薬物輸送体の存在を示唆する（図４８）。
【図１６】
2009539358.tif 000014
【図２３】
2009539358.tif 000015
【図３６】
2009539358.tif 000016
【図３７】
2009539358.tif 000017
【図４０】
2009539358.tif 000018
【図４３】
2009539358.tif 000019
【図１】
2009539358.tif 000020
【図２】
2009539358.tif 000021
【図３】
2009539358.tif 000022
【図４】
2009539358.tif 000023
【図５】
2009539358.tif 000024
【図６】
2009539358.tif 000025
【図７】
2009539358.tif 000026
【図８】
2009539358.tif 000027
【図９】
2009539358.tif 000028
【図１０】
2009539358.tif 000029
【図１１】
2009539358.tif 000030
【図１２】
2009539358.tif 000031
【図１３】
2009539358.tif 000032
【図１４】
2009539358.tif 000033
【図１５】
2009539358.tif 000034
【図１７】
2009539358.tif 000035
【図１８】
2009539358.tif 000036
【図１９】
2009539358.tif 000037
【図２０】
2009539358.tif 000038
【図２１】
2009539358.tif 000039
【図２２】
2009539358.tif 000040
【図２４】
2009539358.tif 000041
【図２５】
2009539358.tif 000042
【図２６】
2009539358.tif 000043
【図２７】
2009539358.tif 000044
【図２８】
2009539358.tif 000045
【図２９】
2009539358.tif 000046
【図３０】
2009539358.tif 000047
【図３１】
2009539358.tif 000048
【図３２】
2009539358.tif 000049
【図３３】
2009539358.tif 000050
【図３４】
2009539358.tif 000051
【図３５】
2009539358.tif 000052
【図３８】
2009539358.tif 000053
【図３９】
2009539358.tif 000054
【図４１】
2009539358.tif 000055
【図４２】
2009539358.tif 000056
【図４４】
2009539358.tif 000057
【図４５】
2009539358.tif 000058
【図４６】
2009539358.tif 000059
【図４７】
2009539358.tif 000060
【図４８】
2009539358.tif 000061
【図４９】
2009539358.tif 000062
【手続補正書】
【提出日】平成21年2月12日(2009.2.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のステップを含む方法であって、分化が、細胞から培養基へ排出される内因子に依存する：
ｉ）ｈＢＳ細胞またはｈＢＳ細胞に由来した前駆体を、ｂＦＧＦを含む無血清培地内の支持マトリックス上で少なくとも１０日間、インビトロ分化させる工程、
ｉｉ）約５日乃至約２５日ごとに、培養基を変える工程、
ｉｉｉ）機械的分離によって細胞を分離する工程、
ｉｖ）酵素処理によってステップｉｉｉ）において得られる細胞を任意に解離する工程、
ｖ）表面抗原発現に基づいて細胞を任意に分類する工程。
【請求項２】
ｈＢＳ細胞に由来される前駆体が、少なくとも一つのＨＮＦ３ベータ及びＡＦＰを表示し、増殖能を有する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
無血清培地がｂＦＧＦを含んでいるＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ｂＦＧＦの濃度が、約４ｎｇ／ｍｌから約２００ｎｇ／ｍｌまで、例えば約４ｎｇ／ｍｌから約１５０ｎｇ／ｍｌまで、約４ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌまで、約４ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌまで、または約４ｎｇ／ｍｌから約１０ｎｇ／ｍｌまでである請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ｂＦＧＦの濃度が少なくとも４ｎｇ／ｍｌである請求項３に記載の方法。
【請求項６】
支持マトリックスが例えばヒトまたはマウス・フィーダ細胞のようなフィーダ細胞を含む請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
支持マトリックスが、定義済みまたは未定義の配合の細胞外マトリックスを含む請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
支持マトリックスが、単独でまたは組合せで、一つ以上のタンパク質を含んでいるコーティングを含み、細胞培養のために使用されるプラスチック細胞培養容器の内側をコーティングする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
支持マトリックスが三次元環境、例えば多孔性フィルタを含む請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
多孔性フィルタの直径が約４μｍの孔サイズを有する請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
多孔性フィルタが、一つ以上のタンパク質に、単独でまたは組合せで、コーティングされた請求項９〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
一つ以上のタンパク質が、コラーゲン、ラミニン及びそれらの組合せからなる群から選択される請求項８〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ステップｉｉ）が、約１０日間から約２０日間ごとに実行される請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
ステップｉｉ）が、１５から１５日ごとに実行される請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ｈＢＳ細胞に由来する細胞集団であって、細胞集団の細胞の少なくとも２０％が、アルファ  １−アンチトリプシン、サイトケラチン１８、ＨＮＦ−３ベータ、アルブミンまたは尿中Ｌ型脂肪酸結合蛋白のうちの少なくとも１つの特性を示すとともに、細胞集団が、下記六つの特性のうちの少なくとも三つの特性を有する前記細胞集団：
Ａ．薬物輸送体
ｉ）細胞の少なくとも１％が、ＢＳＥＰのタンパク質および／または遺伝子発現を示す特性、
ｉｉ）細胞の少なくとも１％が、ＭＲＰ２のタンパク質および／または遺伝子発現を示す特性、
ｉｉｉ）細胞の少なくとも１％が、タンパク質および／または遺伝子発現ＯＡＴＰ−２および／またはＯＡＴＰ−８を示す特性、
Ｂ．薬物代謝酵素
ｉｖ）細胞の少なくとも２０％が、ＧＳＴ  Ａ１−１のタンパク質および／または遺伝子発現を示す特性、
ｖ）細胞の少なくとも２０％が、ＣＹＰ４５０ｓ−１Ａ２、−２Ａ６、−２Ｂ６、−２Ｃ８、−２Ｃ９、−２Ｃ１９、−２Ｄ６、−２Ｅ１、−３Ａ４及び−３Ａ７の少なくとも２つのタンパク質および／または遺伝子発現を示す特性、
ｖｉ）細胞の少なくとも２０％がＧＳＴ  Ｐ１−１のタンパク質および／または遺伝子発現を示さない特性。
【請求項１６】
細胞集団が、少なくとも一つの前記薬物輸送体特徴及び少なくとも一つの前記薬物代謝特徴を有する請求項１５に記載の細胞集団。
【請求項１７】
細胞集団が、前記特性のうちの少なくとも四つ、例えば五つの特性を有する請求項１５または１６に記載の細胞集団。
【請求項１８】
細胞集団が前記特徴のうちの全ての六つの特性を有する請求項１５〜１７のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項１９】
細胞集団の細胞の少なくとも２０％が、アルファ  １−アンチトリプシン、サイトケラチン１８、ＨＮＦ−３ベータ、アルブミンまたは尿中Ｌ型脂肪酸結合蛋白特性の少なくとも一つを示し、以下の特性を有する請求項１５又は１６に記載の細胞集団：
Ａ．薬物輸送体
ｉｉｉ）細胞の少なくとも１％が、機能的に活性を有するＯＡＴＰ−２および／またはＯＡＴＰ−８を示す特性、
Ｂ．薬物代謝酵素
細胞の少なくとも２０％が、ＧＳＴＡ１−１の機能的な活性を示す特性、
細胞の少なくとも２０％が、薬物代謝物質を分析することによって測定され、機能的に活性を有するＣｙｐ１Ａ２、Ｃｙｐ３Ａ４および／またはＣｙｐ２Ｃ９を示す特性。
【請求項２０】
細胞集団の細胞の少なくとも７５％が、アルファ  １−アンチトリプシン、サイトケラチン１８、ＨＮＦ−３ベータ、アルブミンまたは尿中Ｌ型脂肪酸結合蛋白特性を示し、細胞集団が少なくとも以下の特性を有する請求項１５または１６に記載の細胞集団：
Ａ．薬物輸送体
ｉｉｉ）細胞の少なくとも１０％が、機能的に活性を有するＯＡＴＰ−２および／またはＯＡＴＰ−８を示す特性、
Ｂ．薬物代謝酵素
ｉｖ）細胞の少なくとも３０％が、ＧＳＴＡ１−１の機能的な活性を示す特性、
ｖ）細胞の少なくとも５０％が、薬物代謝物質を分析することによって測定され、機能的に活性を有するＣｙｐ１Ａ２、Ｃｙｐ３Ａ４および／またはＣｙｐ２Ｃ９を示す特性。
【請求項２１】
特性ｉ）が、細胞の少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％である請求項１５〜２０のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項２２】
特性ｉｉ）が、細胞の少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％に該当する請求項１５〜２１のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項２３】
特性ｉｉｉ）が、細胞の少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％または少なくとも８０％に該当する請求項１５〜２２のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項２４】
特性ｉｖ）が、細胞の少なくとも３０％、例えば、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％または少なくとも８０％に該当する請求項１５〜２３のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項２５】
特性ｖ）が、細胞の少なくとも３０％、例えば、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％または少なくとも８０％に該当する請求項１５〜２４のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項２６】
特性ｖｉ）が、細胞の少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％または少なくとも８０％に該当する請求項１５〜２５のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項２７】
細胞集団の細胞の少なくとも約３０％、例えば、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％が、アルファ  １−アンチトリプシン、サイトケラチン１８、ＨＮＦ−３ベータ、アルブミンまたは尿中Ｌ型脂肪酸結合蛋白のうちの少なくとも１つの特性を示している請求項１５〜２６のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項２８】
細胞の少なくとも約５％がサイトケラチン１８及びＣＹＰ１Ａ２を共発現する請求項１５〜２７のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項２９】
細胞の少なくとも約５％がサイトケラチン１８及びＣＹＰ２Ａ６を共発現する請求項１５〜２８のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項３０】
細胞の少なくとも約５％がサイトケラチン１８及びＣＹＰ２Ｂ６を共発現する請求項１５〜２９のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項３１】
少なくとも、細胞の約５％が、サイトケラチン１８及びＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９および／またはＣＹＰ２Ｃ１９を共発現する請求項１５〜３０のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項３２】
細胞の少なくとも約５％が、サイトケラチン１８及びＣＹＰ２Ｄ６を共発現する請求項１５〜３１のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項３３】
細胞の少なくとも約５％がサイトケラチン１８及びＣＹＰ２Ｅ１を共発現する請求項１５〜３２のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項３４】
細胞の少なくとも約５％が、サイトケラチン１８及びＣＹＰ３Ａ４および／またはＣＹＰ３Ａ７を共発現する請求項１５〜３３のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項３５】
細胞の少なくとも約５％が、以下の追加的な特性のうちの少なくとも１つを有する請求項１５〜３４のいずれかに記載の細胞集団：
Ａ．受容体
ｖｉｉ）細胞の少なくとも約５％が、ｃ−Ｍｅｔのタンパク質および／または遺伝子発現を示す特性、
Ｂ．細胞間接着分子
ｖｉｉｉ）細胞の少なくとも約５％がＩＣＡＭ−１のタンパク質および／または遺伝子発現を示す特性、
Ｃ．薬物代謝酵素
ｉｘ）細胞の少なくとも１％がＵＧＴのタンパク質および／または遺伝子発現を示す特性、
Ｄ．転写因子
ｘ）細胞の少なくとも９０％が、Ｏｃｔ−４のタンパク質および／または遺伝子発現を示さない特性。
【請求項３６】
細胞集団は、特性ｖｉｉ）、ｖｉｉｉ）、ｉｘ）またはｘ）の中で、少なくとも二つ、例えば少なくとも三つを有する請求項３５に記載の細胞集団。
【請求項３７】
細胞集団が、特性ｖｉｉ）、ｖｉｉｉ）、ｉｘ）またはｘ）のうちの４つすべてを有する請求項３５または３６に記載の細胞集団。
【請求項３８】
特性ｖｉｉ）が、細胞の少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％に該当する請求項３５〜３７のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項３９】
特性ｖｉｉｉ）が、少なくとも１０％、例えば、細胞の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％に該当する請求項３５〜３８のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項４０】
特性ｉｘ）が、少なくとも５％、例えば、細胞の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％に該当する請求項３５〜３９のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項４１】
特性ｘ）が、少なくとも１０％、例えば、細胞の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９５％に該当する請求項３５〜４０のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項４２】
ＣＹＰ４５０タンパク質のうちの少なくとも１つの発現が、誘発因子の付加物に誘導できる請求項１５〜４１のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項４３】
ＧＳＴ  Ａ１−１および／またはＧＳＴ  Ｍ１−１タンパク質の発現が、誘発因子の付加物に誘導できる請求項１５〜４２のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項４４】
ＵＧＴタンパク質の発現は、誘発因子の付加物に誘導できる請求項３５〜４３のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項４５】
誘発因子が、デキサメタゾン、オメプラゾールから成るグループから単独でまたは組合せで選択される請求項４２〜４４のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項４６】
誘発因子が、リファンピシン、デキサメタゾン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、オメプラゾール及びイソニアジドを含む請求項４２〜４５のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項４７】
細胞集団が、特性ｖ）のＣＹＰ４５０タンパク質のうちの少なくとも１つの酵素活性を示す請求項１５〜４６のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項４８】
細胞集団がＧＳＴ酵素活性を示す請求項１５〜４７のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項４９】
ＧＳＴ酵素活性が、細胞集団の溶解物内のタンパク質の少なくとも０．４μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ、例えば、少なくとも０．０３μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ、少なくとも０．０５μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ、少なくとも１．０μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ、少なくとも０．０７μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ、少なくとも０．０９μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ、少なくとも０．１１μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ、少なくとも０．１３μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇまたは少なくとも０．１５μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇである請求項４７に記載の細胞集団。
【請求項５０】
細胞集団が、ＵＧＴ酵素活性を示す請求項３５〜４９のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項５１】
前記細胞集団が、特性を維持しながらインビトロで少なくとも一ヶ月間培養される請求項１５〜５０のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項５２】
前記細胞集団が、特性を維持しながらインビトロで少なくとも一週月間培養される請求項１５〜５１のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項５３】
前記細胞集団が、特性を維持しながらインビトロで少なくとも７２時間培養される請求項１５〜５２のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項５４】
前記細胞集団が、更にアルファフェトタンパク質を示す請求項１５〜５３のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項５５】
前記細胞集団が、ヒトまたはマウス・フィーダ細胞のようなフィーダ細胞の存在下で得られる請求項１５〜５４のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項５６】
前記細胞集団が、フィーダ細胞がない場合に得られる請求項１５〜５５のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項５７】
前記細胞集団が、細胞外マトリックスを使用して得られ、前記マトリックスは、定義済み又は未定義の組成物である請求項５６に記載の細胞集団。
【請求項５８】
前記細胞集団が、内側に一つ以上のタンパク質により単独でまたは共にコーティングされるプラスチック細胞培養容器を使用して得られる請求項５６または５７に記載の細胞集団。
【請求項５９】
一つ以上のタンパク質がコラーゲン、ラミニン及びそれらの組合せから構成されるグループから選択される請求項５８に記載の細胞集団。
【請求項６０】
前記細胞集団が、例えば多孔性フィルタのような三次元環境を使用して得られる請求項５８または５９に記載の細胞集団。
【請求項６１】
前記細胞集団が、異種動物由来成分不含である請求項５５〜６０のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項６２】
細胞集団における細胞の少なくとも約１０％が、ＨＮＦ３ベータ及びＡＦＰの少なくとも一つを示し、増殖能を有し、細胞集団が以下の５つの特性のうちの少なくとも２つを有するｈＢＳ細胞に由来する細胞集団：
Ａ．受容体
ｉ）細胞の少なくとも１％が、アルファ−６−インテグリンのタンパク質および／または遺伝子発現を示す特性、
ｉｉ）細胞の少なくとも１％が、ｃ−Ｍｅｔのタンパク質および／または遺伝子発現を示す特性、
Ｂ．細胞間接着分子
ｉｉｉ）細胞の少なくとも１％が、ＩＣＡＭ−１のタンパク質および／または発現を示す特性、
Ｃ．転写因子
ｉｖ）細胞の少なくとも１０％が、ＨＮＦ−４アルファのタンパク質および／または発現を示す特性。
【請求項６３】
細胞集団が、以下の特性のうちの少なくとも２つを有する請求項６２に記載の細胞集団：
Ａ．受容体
ｉ）細胞の少なくとも１％が、アルファ−６−インテグリンのタンパク質および／または遺伝子発現を示す特性、
ｉｉ）細胞の少なくとも１％が、ｃ−Ｍｅｔのタンパク質および／または遺伝子発現を示す特性、
Ｂ．細胞間接着分子
ｉｉｉ）細胞の少なくとも１％が、ＩＣＡＭ−１のタンパク質および／または発現を示す特性、
Ｃ．転写因子
ｉｖ）細胞の少なくとも１０％が、ＨＮＦ−４アルファのタンパク質および／または発現を示す特性、
Ｄ．サイトケラチン
ｖ）細胞の少なくとも１％が、ＣＫ１９のタンパク質および／または発現を示す特性、
ｖｉ）細胞の少なくとも１％が、ＣＫ７のタンパク質および／または発現を示す特性、
Ｅ．上皮細胞接着分子
ｖｉｉ）細胞の少なくとも１％が、ＥｐＣＡＭのタンパク質および／または発現を示す特性。
【請求項６４】
細胞集団が、前記特性のうちの少なくとも３つを有する請求項６２または６３に記載の細胞集団。
【請求項６５】
細胞集団が、前記特性のうちの少なくとも４つ、例えば、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは全７つを有する請求項６２〜６４のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項６６】
特性ｉ）が、細胞の少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％に該当する請求項６２〜６５のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項６７】
特性ｉｉ）が、細胞の少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％に該当する請求項６２〜６６のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項６８】
特性ｉｉｉ）が、細胞の少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％に該当する請求項６２〜６７のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項６９】
特性ｉｖ）が、細胞の少なくとも１５％、例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％に該当する請求項６２〜６８のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項７０】
個体群の細胞の少なくとも約１５％、例えば、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％又は少なくとも約９５％が、ＨＮＦ３ベータ及びＡＦＰの少なくとも一つを示し、増殖能を有する請求項６２〜６９のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項７１】
前記細胞集団が、以下の特性のうちの少なくとも１つを有する請求項６２〜７０のいずれかに記載の細胞集団：
Ｆ．薬物輸送体
ｖｉｉｉ）細胞の少なくとも１％が、ＢＳＥＰのタンパク質および／または遺伝子発現を示す特性、
ｉｘ）細胞の少なくとも１％が、ＭＲＰ２のタンパク質および／または遺伝子発現を示す特性。
【請求項７２】
創薬プロセスのための請求項１５〜７１のいずれかに定義した細胞集団の使用。
【請求項７３】
インビトロ・モデルの薬物輸送体を研究するための請求項１５〜７１のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
【請求項７４】
インビトロ・モデルの薬物代謝酵素を研究するための請求項１５〜７１のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
【請求項７５】
インビトロ・モデルで早期肝形成のような肝形成を研究するための請求項１５〜７１のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
【請求項７６】
インビトロ・モデルでヒト肝再生障害を研究するための請求項１５〜７１のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
【請求項７７】
インビトロの肝毒性テストのための請求項１５〜７１のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
【請求項７８】
薬剤としての請求項１５〜７１のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
【請求項７９】
肝臓組織の退化のような組織退化によって生じる疾患および／または病状の治療および／または予防するための医薬製品を製造するための請求項１５〜７１のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
【請求項８０】
肝臓疾患治療用の医薬品を製造するための請求項１５〜７１のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
【請求項８１】
原発性胆汁性肝硬変を含む自動免疫性障害、脂質異常症を含んでいる代謝障害、２型糖尿病、肥満、アルコール等の濫用によって生じる肝臓疾患、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎及びＡ型肝炎などのウイルスによって生じる疾患、調合薬に対する急性の中毒反応によって生じる肝臓壊死及び肝細胞性癌を患っている患者の腫瘍除去からなる群から選択される肝臓疾患を治療および／または予防する医薬品の製造のための請求項１５〜７１のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
【請求項８２】
代謝病状および／または疾患を治療および／または予防する医薬品を製造するための請求項１５〜７１のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
【請求項８３】
代謝的に改善された肝細胞様細胞を得るための請求項６２〜７１のいずれかにおいて定義した細胞集団からの一つ以上の細胞の使用。
【請求項８４】
肝細胞様細胞への成熟を研究するために、請求項６２〜７１のいずれかにおいて定義した細胞集団からの一つ以上の細胞の使用。
【請求項８５】
請求項１５〜７１のいずれかにおいて定義した細胞集団から合成物への細胞をさらすことから成る工程、及び、合成物が細胞に有毒かをどうか測定する工程を含む肝細胞性毒性の合成物をスクリーニングする方法。
【請求項８６】
請求項１５〜７１のいずれかにおいて定義した細胞集団から合成物へ細胞をさらす工程、合成物との接触による細胞のいかなる表現型又は代謝変化を決定する工程、変化を肝細胞性機能を調整する能力に関連づける工程を含む肝細胞性機能を調整する能力のために合成物をスクリーニングする方法。
【請求項８７】
ｉ）請求項１５〜７１のいずれかにおいて定義した細胞集団、
ｉｉ）一つ以上の成熟因子および／または成熟培養基、及び
ｉｉｉ）任意に、使用説明書、
を含むキット。
【請求項８８】
成熟培養基が、ＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）、ｂＦＧＦで補充されるＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）、あらかじめ自己調整されたＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）、及び肝細胞特異的な培養基からなる群から選択される請求項８７に記載のキット。
【請求項８９】
一つ以上の成熟因子が、ｂＦＧＦ、上皮増殖因子、肝細胞増殖因子及びオンコスタチンＭからなる群から選択される請求項８７または８８に記載のキット。
【請求項９０】
成熟をモニタするツールをさらに含む請求項８８に記載のキット。
【請求項９１】
成熟をモニタするためのツールが、
ｉ）ＨＮＦ３ベータ、ＡＦＰ、アルブミン、ＢＳＥＰ、ＭＲＰ２、ＯＡＴＰ−２、ＯＡＴＰ−８、ＧＳＴ  Ａ１−１、ＣＹＰ４５０−１Ａ２、ＣＹＰ４５０−２Ａ６、ＣＹＰ４５０−２Ｂ６、ＣＹＰ４５０−２Ｃ８、ＣＹＰ４５０−２Ｃ９、ＣＹＰ４５０−２Ｃ１９  ＣＹＰ４５０−２Ｄ６、ＣＹＰ４５０−２Ｅ１、ＣＹＰ４５０−３Ａ４、ＣＹＰ４５０−３Ａ７、ＧＳＴ  Ｍ１−１及びＵＧＴからなる群から選択されるマーカー発現を記録する、少なくとも３つ、少なくとも４つまたは少なくとも５つの遺伝子に対抗するＰＣＲプライマー、及び
ｉｉ）ユーザーズ・マニュアル、
からなる請求項９０に記載のキット。
【請求項９２】
成熟をモニタするツールが、
ｉ）ＨＮＦ３ベータ、ＡＦＰ、アルブミン、ＢＳＥＰ、ＭＲＰ２、ＯＡＴＰ−２、ＯＡＴＰ−８、ＧＳＴ  Ａ１−１、ＣＹＰ４５０−１Ａ２、ＣＹＰ４５０−２Ａ６、ＣＹＰ４５０−２Ｂ６、ＣＹＰ４５０−２Ｃ８、ＣＹＰ４５０−２Ｃ９、ＣＹＰ４５０−２Ｃ１９  ＣＹＰ４５０−２Ｄ６、ＣＹＰ４５０−２Ｅ１、ＣＹＰ４５０−３Ａ４、ＣＹＰ４５０−３Ａ７、ＧＳＴ  Ｍ１−１及びＵＧＴからなる群から選択される、少なくとも３つ、たとえば少なくとも４つまたは少なくとも５つのマーカー発現抗原に対する抗体、及び
ｉｉ）ユーザーズ・マニュアル、
からなる請求項８９または９０に記載のキット。
【手続補正書】
【提出日】平成21年3月31日(2009.3.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｈＢＳ細胞に由来する新しい肝細胞様細胞集団、及び、薬剤スクリーニング及び毒性テストのような医療における前記肝細胞様細胞の潜在的応用に関係する。さらに、本発明は、肝細胞様細胞と同じ応用として使われることができて、さらに、例えば初期肝形成または肝再生障害などの試験管内の肝形成研究に使用されることも可能な適切な特性を有する肝芽細胞様細胞にも関連する。本発明に記載の肝細胞様細胞及び肝芽細胞様細胞は、遺伝子またはタンパク質発現レベルにおいて、薬物輸送体特性および／または薬物代謝特性のどちらかを表す。
【背景技術】
【０００２】
多能性ヒト幹細胞には、様々なヒト細胞型への接近可能性に革命をもたらすことが期待される。多能性ヒト胚盤胞由来幹（ｈＢＳ）細胞を培養し、その後の所望の目標細胞型へそれらを分化させる可能性は、生体内応用及び試験管応用範囲に、細胞の安定的で実質的に無制限の供給を提供する。
【０００３】
肝不全及び末期肝疾患は、世界中で大量死亡の原因となるとともに医療制度上の主な負担でもある。肝臓移植は、最も成功した治療である。しかし、この手順の有効性は、制限されて、多くの合併症、例えば感染症または拒絶反応につながっていた。肝臓移植は、さらに利用可能なドナー臓器の不足が欠点であり、治療された患者は、頻繁に生涯にわたる免疫抑制に付託される。移植器官のニーズを低下させる細胞に基づく治療は、社会及びこれらの疾患を患っている個人の両方にも非常に重要である。
【０００４】
さらに、肝臓は代謝のセンター及び人体の解毒器官であり、したがって、インビトロ・テスト用の機能的細胞型の高信頼性の供給源を確保するために大きな努力が行われた。残念ながら、肝臓の複雑さ及び機能は、今日において利用可能ないかなる細胞型によっても反映されていない。主たるヒト肝細胞の入手可能性は制限され、インビトロ使用に使われる場合に、細胞がさらに急速にその通常の表現型及び機能的な特性を失うことは公知である（すなわち２４時間以内）。初代細胞のよく使用される変形例は、肝臓細胞株であり、それは順番に代謝酵素の非常に低いレベルを含み、生体内の天然の肝細胞とかなり異なる他の重要なタンパク質の配列を有する。肝臓代謝が種特異であり、他の種の肝臓毒性を予測するのに問題点をもたらすことが公知にも関わらず、更なる多くの試験が動物性物質を使用して実行された。
【０００５】
製薬開発において、逆肝臓反応は、最も顕著な毒性易罹病性である。したがって、ヒト肝臓毒性易罹病性の早期予測は、臨床試験用に合成物を選ぶ時に、最重要である。この分野の能力を向上させる努力は、モデルの有効性問題及び開発について言及しなければならず、ヒトの逆肝損傷を誘発するために一致する複合の生物学的過程により大きな範囲を提供する。両方の分野において、ｈＢＳ細胞に由来する分化した細胞の使用は、有望な機会を提供する。
【０００６】
したがって、新薬または化学製品の開発には、ヒト肝細胞に擬態し、候補分子の効果を予測することが可能であるモデル・システムのための緊急のニーズが存在する。有効性及び生理的関連に関して、ヒト多能性幹細胞は、機能的なヒト肝細胞の理想的な再生可能な供給源として役立つことがあり得る。ｈＢＳ細胞が適当な環境に配置されるときに、特定の肝臓特性が分化の２〜４週後に観察された。
【０００７】
２００３年のＲａｍｂｈａｔｌａ等による前の研究による国際公開ＷＯ０１／８１５４９及び国際公開ＷＯ２００５／０９７９８０は、いくつかの肝細胞様特性を有する細胞を確認した。これらの特性はすなわち、分化されたｈＢＳ細胞培養のＣＹＰ及びＧＳＴ活性である。しかし、それまで、生成の細胞は、薬物輸送体発現及び特定のＣＹＰ及びＧＳＴ発現パターンに関して、従来の循環系を潜在的に交換するために必要である代謝特性を示さなかった。本発明において、創薬及び再生医療ために、薬物輸送体と重要な代謝酵素の少なくとも７２時間の安定発現を有する、ｈＢＳ細胞由来の肝細胞様細胞集団が提示された。
【０００８】
Ｃｅｌｌａｒｔｉｓの特許出願国際公開ＷＯ２００６０３４８７３は、発生生物学の経路をたどるために定義済み方法における異なる要因の用途を可能にする方法に基づく。本発明において、それは主に、分化に影響を及ぼす細胞の分泌内因子である。加えて、培養基の変更の頻度は、異なる。現在の方法は、培養基の少ない頻繁な変更を可能にし、したがって、大きな労働力を要しない。さらに、本発明の細胞はより成熟し、創薬及び毒性テストに役立つ分析システムでの長期間の培養を可能にする。
【０００９】
国際公開ＷＯ２００５０９７９８０と米国特許出願公開ＵＳ２００３０００３５７３のどちらも、薬物輸送体または機能的な輸送体の存在について教示していない。国際公開ＷＯ２００５０９７９８０は、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ９及びＣＹＰ１Ａ２が薬剤スクリーニングのための望ましい酵素であることを述べるだけである（表３を参照）。しかし、出願はこれらの最も重要なＣＹＰｓ活性について、何も教示しない。特に、ＣＹＰ３Ａ４は創薬及び毒性テストに用いられる唯一重要な酵素である。大多数の全ての薬は、ＣＹＰ３Ａ４によって新陳代謝する。肝細胞が、ヒト成人肝細胞を反映する個人間の構成で、機能的なＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ９及びＣＹＰ１Ａ２酵素を示すｈＢＳ細胞に由来することは望ましい。
【００１０】
ｈＢＳ細胞に由来される肝細胞が以下の結合を有する場合、創薬及び毒性テストにそれはさらに望ましい：（ｉ）機能的なＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ９及びＣＹＰ１Ａ２酵素、（ｉｉ）機能的なＧＳＴ酵素及び（ｉｉ）機能的な薬物輸送体。最も重要なＣＹＰｓ及び薬物輸送体に関して、国際公開ＷＯ２００５０９７８０に記載されている細胞の詳細がなく、さらに、限られたＧＳＴｓ特性解析データしか示されていない。対照的に、本発明は第２相酵素の完全な説明を有する。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は肝細胞様細胞及び肝芽細胞様細胞及び各自の調製方法に関する。本発明の肝細胞様細胞は、薬物輸送体および／または代謝酵素を表すので、特に創薬及び毒性テストに、かなり適している。
【００１２】
ヒト胚盤胞由来幹細胞（ｈＢＳ細胞）は、多能性であり、内胚葉、外胚葉及び中胚葉の全ての３つの胎児胚葉細胞及び、全身及び細菌細胞を引き起こすことができる。それで、将来において、肝臓細胞の機能的な特性を有するｈＢＳ細胞に由来される分化した細胞は、肝不全患者の体外肝庇護のための移植又は生物反応器内で使われる可能性を有するだけではなく、さらに、薬目標、生体異物の肝臓代謝、及び肝毒性を検討する試験システムになり得る。ｈＢＳ細胞に由来された肝細胞は、同じ遺伝子の提供者から必要に応じて、機能的なヒト肝細胞の無制限の供給源を潜在的に提供することができ、それで、毒性試験のような試験管内テストの予測可能性を改良し、動物実験の必要性を低下させる。しかし、生体異物の毒性は、その毒性及び反応性の代謝物質への生体内変化によく依存し、したがって、生体内変化システムの存在及び配列が必要である。現在、主たるヒト肝細胞は、試験管内の薬物代謝及び毒性テストのモデルを構成する。それにもかかわらず、初代肝細胞が培養される場合に、薬物代謝酵素の活性及び多くのトランスポータ機能は、急速に消失および／または変化する。さらに、試験管内研究に使われる肝細胞癌細胞株（例えばＨｅｐＧ２）の多くは、幾つの重要な薬物代謝酵素の発現を欠く。
【００１３】
シトクロムＰ４５０ｓ（ＣＹＰｓ）は、混合機能モノオキシゲナーゼ及び主な第一位相異物代謝酵素である。この酸性代謝は、生体異物の自然体に依存し、不活化及び除去促進、プロドラッグまたは代謝活性化をもたらす。ＣＹＰ発現の主な部位は肝臓であり、ＣＹＰ３Ａ４はヒト成人肝臓で最も多量であるＣＹＰイソ酵素である。薬物代謝のための最も重要な酵素は、系統１−３に帰属し、臨床的に使用された薬の代謝に依存している全ての位相Ｉの７０−８０％を示す。ＣＹＰ発現及び活性は、多形性のために大きい個人間の変化を提示する。さらに、ＣＹＰｓが数倍、誘発されたり、または、特定の薬によって阻害され、追加的な、一時的な、代謝活性の変動性をもたらす。特に、肝細胞の３つの主要ＣＹＰ−系統（１−３）ベースＣＹＰ−活性の組成物は、薬物代謝のために非常に重要である。本願明の実施例には、ｈＢＳ細胞由来肝細胞様細胞が記載され、ＣＹＰ１Ａ２及びＣＹＰ３Ａ４／７を含む大部分のＣＹＰ酵素からのｍＲＮＡが検出された。主要ＣＹＰ−系統ベースＣＹＰ−活性、より正確はＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９及びＣＹＰ３Ａ４が検出され、さらに、前記３つのＣＹＰｓ活性間の配合は、ヒトの初代肝細胞に類似する。したがって、本発明は、機能的な薬物代謝酵素を表示する肝細胞様細胞の生成方法を提供する。
【００１４】
肝細胞の機能的な薬物輸送体（例えばＢＳＥＰ、ＭＲＰ２及びＯＡＴＰｓ）は、肝臓の薬物代謝及び毒性を分析する時に重要である。したがって、本発明は、機能的なトランスポータを表示する肝細胞様細胞の生成方法を提供する。
【００１５】
上に述べたように、本願発明はｈＢＳ細胞に由来される細胞集団に関連し、細胞集団細胞の少なくとも２０％は、アルファ−１−抗トリプシン、サイトケラチン１８、ＨＮＦ−３ベータ、アルブミンまたはＬ型脂肪酸結合蛋白の特性のうちの少なくとも１つを示し、細胞集団は、以下の６つの特性のうちの少なくとも３つを有する。
Ａ．薬物輸送体
ｉ）細胞の少なくとも１％が、ＢＳＥＰのタンパク質および／または遺伝子発現を示し、
ｉｉ）細胞の少なくとも１％が、ＭＲＰ２のタンパク質および／または遺伝子発現を示し、
ｉｉｉ）細胞の少なくとも１％が、ＯＡＴＰ２および／またはＯＡＴＰ−８のタンパク質および／または遺伝子発現を示し、
Ｂ．薬物代謝酵素
ｉｖ）細胞の少なくとも２０％が、ＧＳＴ  Ａ１−１のタンパク質および／または遺伝子発現を示し、
ｖ）細胞の少なくとも２０％が、ＣＹＰ４５０ｓ−１Ａ２、−２Ａ６、−２Ｂ６、−２Ｃ８、−２Ｃ９、−２Ｃ１９、−２Ｄ６、−２Ｅ１、−３Ａ４及び−３Ａ７のうちの少なくとも２つのタンパク質および／または遺伝子発現を示し、
ｖｉ）細胞の少なくとも２０％が、ＧＳＴ  Ｐ１−１のタンパク質および／または遺伝子発現を示していない。
【００１６】
さらに、本願発明はｈＢＳ細胞に由来される細胞集団に関連し、その中の少なくとも細胞集団の細胞の約１０％が、ＨＮＦ３ベータ及びＡＦＰの少なくとも一つを表示し、増殖能を有し、細胞集団は、以下の４つの特性のうちの少なくとも２つを有する。
Ａ．受容体
ｉ）細胞の少なくとも１％が、アルファ−６−インテグリンのタンパク質および／または遺伝子発現を示し、
ｉｉ）細胞の少なくとも１％が、ｃ−Ｍｅｔのタンパク質および／または遺伝子発現を示し、
Ｂ．細胞間接着分子
ｉｉｉ）細胞の少なくとも１％が、ＩＣＡＭ−１のタンパク質および／または発現を示し、
Ｃ．転写因子
ｉｖ）細胞の少なくとも１０％が、ＨＮＦ−４アルファのタンパク質および／または発現を示し、
Ｄ．サイトケラチン
ｖ）細胞の少なくとも１％が、ＣＫ１９のタンパク質および／または発現を示し、
ｖｉ）細胞の少なくとも１％が、ＣＫ７のタンパク質および／または発現を示し、
Ｅ．上皮細胞接着分子
ｖｉｉ）細胞の少なくとも１％が、ＥｐＣＡＭのタンパク質および／または発現を示す。
【００１７】
尿素は、タンパク質及びアミノ酸代謝の最終的な分解産物である。肝臓の肝細胞は、尿素へアンモニアを変える体内唯一の細胞型である。したがって、本発明は尿素を合成する肝細胞様細胞の調製方法を提供する。
【００１８】
本発明の一実施例において、ｈＢＳＣから由来した肝細胞様細胞は、初代肝細胞と同様のレベルに培養基へ尿素を生産及び分泌する。肝細胞様細胞は、初代肝細胞と比較して少なくとも１０％、２０％、５０％、７０％、８０％、９０％または少なくとも１００％の尿素を合成する能力を有する。肝細胞様細胞は、１０日から２０日間尿素のために分析され、尿素合成の高水準を維持する。詳細は、本願明細書の実施例１０を参照。
【００１９】
異なるフィーダフリ表面への肝細胞様細胞の隔離及び再接種は、異なる類型の精製された肝細胞様細胞集団を可能にし、それは、肝細胞に基づく薬毒性及び代謝テスト、及び他の試験分析の範囲で異なる応用によって要求される柔軟性のために必要である。したがって、本発明は、９６−ウェルプレートのようなあらゆる種類の精製及び濃縮される肝細胞様細胞のフィーダフリ培養、好ましくは、コラーゲンＩ培養を生成する方法を提供する。
【００２０】
本発明の一実施例において、肝細胞様細胞は、ウェルの異なる表層、例えば９６−ウェルプレート上にうまく再接種される。異なる表層は、コラーゲンＩ、マトリゲルまたはｍＥＦ細胞層であってもよい。初代肝細胞を再接種することは、非常にむずかしい。それで、肝細胞様細胞が再接種される能力を有することは、初代肝細胞と比較して本質的利点を有する。詳しくは、実施例１５を参照。
【００２１】
増殖可能な状況で培養される時に拡大する能力及び、分化適切な状況に保たれるときに、機能的な肝細胞へ分化する能力を備える肝芽を原種状態に保つ能力は、機能的な肝細胞の非無制限の供給源をキープするのに価値がある。したがって、本発明は、ｍＥＦ−細胞層に肝芽細胞様細胞を再接種することによって肝芽細胞様細胞を原種状態にキープするための方法を提供する。加えて、肝芽細胞様細胞は、マトリゲルまたはコラーゲンがコーティングされた表面に再接種されるときに肝細胞様細胞に分化している。
【発明の説明】
【００２２】
定義及び省略形
ここで使用しているフィーダ細胞は、単独でまたは組合せで使用する支持細胞型を意味することを目的とする。細胞型は、ヒト又は他の種に起源のものでも良い。フィーダ細胞が由来する組織は、胚、胎児、新生児、少年又は成人組織を含み、それは、更に包皮、臍の緒、筋肉、肺、上皮、胎盤、卵管、腺、ストロマまたは胸部の皮膚に由来される組織を含む。フィーダ細胞は、ヒト線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、ケラチン生成細胞、内皮細胞及び上皮細胞からなる群に関連する細胞型に由来してもよい。フィーダ細胞を誘導するのに使われてもよい特定の細胞型の実施例は、胚線維芽細胞、胚体外内胚葉細胞、胚体外中胚葉細胞、胎児線維芽細胞および／または線維細胞、胎児の筋細胞、胎児の皮膚細胞、胎児の肺細胞、胎児の内皮細胞、胎児の上皮の細胞、臍の緒間充織細胞、胎盤の線維芽細胞および／または線維細胞、胎盤の内皮細胞、出産後の包皮線維芽細胞および／または線維細胞、出産後の筋細胞、出産後の皮膚細胞、出産後の内皮細胞、成人皮膚線維芽細胞および／または線維細胞、成人筋細胞、成人卵管内皮細胞、成人腺子宮内膜細胞、成人間質子宮内膜細胞、成人乳ガン実質細胞、成人内皮細胞、成人上皮の細胞または成人ケラチン生成細胞を含む。フィーダ細胞がｈＢＳ細胞に由来されるときに、細胞は線維芽細胞であってもよい。
【００２３】
ここで使用しているように、用語「３Ｄ」は、三次元を意味することを目的とする。
【００２４】
ここで使用しているように、用語「胚盤胞由来幹細胞」は、ＢＳ細胞を意味し、ヒトの型は「ｈＢＳ細胞」と呼ばれる。
【００２５】
ここで使用しているように、用語「ＡＡＴ」は、肝臓マーカーのアルファ−アンチ−トリプシンを意味することを目的とする。
【００２６】
ここで使用しているように、用語「ＡＦＰ」は、肝臓マーカーのアルファ−フェト−タンパク質を意味することを目的とする。
【００２７】
ここで使用しているように、用語「ＢＳＥＰ」は、胆汁酸塩輸出ポンプを意味することを目的とする。
【００２８】
ここで使用しているように、用語「ＣＫ」は、異なる亜類型（例えばサイトケラチン１８、サイトケラチン１９及びサイトケラチン７）を有する肝臓マーカー・サイトケラチン（交互に用いられる）を意味することを目的とする。
【００２９】
ここで使用しているように、用語「ｃ−Ｍｅｔ」は、肝細胞成長因子および／または散乱因子受容体を意味することを目的とする。
【００３０】
ここで使用しているように、用語「ＩＣＡＭ−１」は、細胞内粘着力分子１を意味することを目的とする。
【００３１】
ここで使用しているように、用語「ＬＦＡＢＰ」は、肝臓脂肪酸結合蛋白（交互に用いられる）を意味する。
【００３２】
ここで使用しているように、用語「ＥｐＣＡＭ」は、上皮細胞接着分子（交互に用いられる）を意味する。
【００３３】
ここで使用しているように、用語「ＦＧＦ」は、線維芽細胞成長因子を意味し、好ましくはヒトおよび／または組み換え型オリジンであり、それに対して帰属している亜類型は、例えばｂＦＧＦ（時々ＦＧＦ２と称する）及びＦＧＦ４である。
【００３４】
ここで使用しているように、用語「ＤＭＳＯ」は、ジメチルスルホキシドを意味する。
【００３５】
ここで使用しているように、「ＣＹＰ」はシトクロムＰ、より詳しくはシトクロムＰ  ４５０、多数の異なるサブユニット肝臓構成（例えば１Ａ１、１Ａ２、３Ａ４その他）の主要位相１の代謝酵素を意味する。
【００３６】
ここで使用しているように、用語「ＧＳＴ」は、グルタチオン転移酵素を意味することを目的とし、それの亜類型の実施例は、ＧＳＴ  Ａ１−１、ＧＳＴ  Ｍ１−１及びＧＳＴ  Ｐ１−１である。
【００３７】
ここで使用しているように、交互に用いられる「ＨＮＦ３ベータ」および／または「ＨＮＦ３ｂ」は、肝細胞核要因３、例えば肝臓、膵島及び脂肪細胞のような組織に由来の転写因子調整遺伝子発現を意味することを目的とする。ＨＮＦ３ベータは、時々さらにＦｏｘａ２と称してもよく、フォークヘッドボックス転写因子系統のメンバーである転写因子から由来している名前である。
【００３８】
ここで使用しているように、用語「ＯＡＴＰ」は、有機アニオン・トランスポーター遺伝子を意味することを目的とし、それは、肝臓内のスルホブロモフタレイン（ＢＳＰ）及び抱合型胆汁酸（タウロコール酸）及び非抱合型胆汁酸（コール酸塩）のような有機アニオンのナトリウム（Ｎａ＋）−独立トランスポートの媒介となる。
【００３９】
ここで使用しているように、用語「ＵＧＴ」は、ウリジン二リン酸グルクロノシル転移酵素を意味することを目的とし、それは、グルクロン酸化活性を触媒している一群の肝臓酵素である。
【００４０】
ここで使用しているように、用語「異種動物由来成分不含」は、人間以外の動物成分への直接又は間接的な暴露の完全な回避を意図する。
【００４１】
上記において言及されたように、本願発明は改良型のｈＢＳ細胞由来肝芽細胞様細胞および肝細胞様細胞を提供する。改良型の肝細胞様細胞は、同じ薬物輸送体及び代謝酵素を使用して生体内肝細胞と類似した薬取り込み、分泌及び代謝を確実にする薬物輸送体および／または代謝酵素を表示する。それで、それらの薬物および化学薬品への反応が生体内の肝細胞に似ていることが期待されることにつれ、これらの全ての特徴の発現は創薬及び毒性テストに使用される細胞のための望ましい特徴である。
【００４２】
したがって、本願発明の開示する肝芽細胞様細胞または肝細胞様細胞は、創薬プロセス、薬物輸送体を研究するためのインビトロ・モデル、薬物代謝酵素を研究するためのインビトロ・モデル、肝形成を研究するためのインビトロ・モデル、初期の肝形成、ヒト肝再生障害を調査するためのインビトロ・モデル、インビトロ・肝毒性テストのような多数の研究目的に有利に使われる。
【００４３】
さらに、本発明の肝芽細胞様細胞及び肝細胞様細胞は有利に、いくつかの肝臓疾患及び障害の治療および／または予防のために使われることができる。したがって、本発明の肝芽細胞様細胞及び肝細胞様細胞が、薬剤に使われることができる。
【００４４】
肝芽細胞様細胞は、肝細胞様細胞の原種細胞であり、したがって、それらは、例えば、代謝的に有能な肝細胞様細胞を得るために、または、肝細胞様細胞への成熟を研究するために最適に使われる。
【００４５】
肝細胞様細胞
現在のコンテキストにおいて、用語「肝細胞様細胞」は、アルファ−１−アンチトリプシン、サイトケラチン１８、ＨＮＦ−３ベータ、アルブミンまたは肝臓脂肪酸結合蛋白質の特性のうちの少なくとも１つを示している細胞を意味することを目的とする。本発明の肝細胞様細胞は、さらに、薬品トランスポート及び薬物代謝に関する重要及び安定した特性を有する。
【００４６】
したがって、一実施例において、本発明はｈＢＳ細胞に由来される細胞集団に関連し、その細胞集団の細胞の少なくとも２０％が、アルファ−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）、サイトケラチン１８（ＣＫ１８）、ＨＮＦ−３ベータ、アルブミンまたは肝臓脂肪酸結合蛋白（ＬＦＡＢＰ）の特性のうちの少なくとも１つを示し、さらに細胞集団は、以下の６つの特性のうちの少なくとも３つを有する。
Ａ．薬物輸送体
ｉ）  細胞の少なくとも１％が、ＢＳＥＰのタンパク質および／または遺伝子発現を示し、
ｉｉ）  細胞の少なくとも１％が、ＭＲＰ２のタンパク質および／または遺伝子発現を示し、
ｉｉｉ）  細胞の少なくとも１％が、タンパク質および／または遺伝子発現ＯＡＴＰ２および／またはＯＡＴＰ−８を示し、
Ｂ．  薬物代謝酵素
ｉｖ）  細胞の少なくとも２０％が、ＧＳＴ  Ａ１−１のタンパク質および／または遺伝子発現を示し、
ｖ）  細胞の少なくとも２０％が、ＣＹＰ４５０ｓ−１Ａ２、−２Ａ６、−２Ｂ６、−２Ｃ８、−２Ｃ９、−２Ｃ１９  −２Ｄ６、−２Ｅ１、−３Ａ４及び−３Ａ７のうちの少なくとも２つのタンパク質および／または遺伝子発現を示し、
ｖｉ）  細胞の少なくとも２０％が、ＧＳＴ  Ｐ１−１のタンパク質および／または遺伝子発現を示していない。
【００４７】
付加物または必要条件の代替品として、ｖｉ）細胞の少なくとも約５％が、ＧＳＴ  Ｍ１−１のタンパク質および／または遺伝子発現を示す。
【００４８】
本発明の一実施例において、肝細胞様細胞は、フェーズＩシトクロムｐ４５０酵素によって薬品を新陳代謝させることができる。特に、ｃｙｐ１Ａ２、ｃｙｐ２Ｃ９及びｃｙｐ３Ａ４は、誘発因子がない場合も新陳代謝することができる。実施例において、肝細胞様細胞によって新陳代謝する物質は、フェナセチン、ジクロフェナク及びミダゾラムであり、代謝物質はＬＣ−ＭＳによって分析された。肝細胞様細胞が誘発因子の影響なしで薬品を新陳代謝させることができる点は、重要である（例えば、国際公開ＷＯ２００５０９７９８０に記載される通り）。
【００４９】
他の実施例で、肝細胞様細胞は、ヒト初代肝細胞培養のｃｙｐ活性配合と同様のｃｙｐ−活性の配合を有する。具体的には、肝細胞様細胞のＣｙｐ１Ａ２、Ｃｙｐ３Ａ４及びＣｙｐ２Ｃ９の配合はヒト初代肝細胞培養物の配合に匹敵する。Ｃｙｐ１Ａ２、Ｃｙｐ３Ａ４及びＣｙｐ２Ｃ９間のＣｙｐ−活性配合は、ヒト初代肝細胞培養組織の配合と比較して、３０％、５０％、７５％及び１００％と異なることができる。
【００５０】
本発明の一実施例において、肝細胞様細胞は、機能的な薬物輸送体を表示する。特に、ＯＡＴＰ−２は、ＩＣＧ染料の着色により能動的に測定され、それは、細胞の範囲内の機能的な薬物輸送体の存在の指示である（図４８）。
【００５１】
本発明の更なる実施例において、細胞集団はｈＢＳ細胞に由来し、細胞集団の細胞の少なくとも２０％は、アルファ  １−アンチトリプシン、サイトケラチン１８、ＨＮＦ−３ベータ、アルブミンまたは肝臓脂肪酸結合蛋白の特性のうちの少なくとも１つを示し、細胞集団は、以下の２つの特性を有する。
Ａ．薬物輸送体
ｉｉｉ）細胞の少なくとも１％が、機能的に活性を有するＯＡＴＰ−２および／またはＯＡＴＰ−８を示し、
Ｂ．薬物代謝酵素
ｉｖ）細胞の少なくとも２０％が、ＧＳＴＡ１−１の機能的な活性を示し、
ｖ）細胞の少なくとも２０％が、薬物代謝物質を分析することで測定される機能的に活性を有するＣｙｐ１Ａ２、Ｃｙｐ３Ａ４および／またはＣｙｐ２Ｃ９を示す。
【００５２】
本発明の更なる実施例において、細胞集団はｈＢＳ細胞に由来し、細胞集団の細胞の少なくとも７５％は、アルファ  １−アンチトリプシン、サイトケラチン１８、ＨＮＦ−３ベータ、アルブミンまたは肝臓脂肪酸結合蛋白の特性を示し、細胞集団は、少なくとも２つの以下の特性を有する。
Ａ．薬物輸送体
ｉｉｉ）細胞の少なくとも１０％が、機能的に活性を有するＯＡＴＰ−２および／またはＯＡＴＰ−８を示し、
Ｂ．薬物代謝酵素
ｉｖ）細胞の少なくとも３０％が、ＧＳＴＡ１−１の機能的な活性を示し、
ｖ）細胞の少なくとも５０％が、薬品代謝物質を分析することで測定される機能的に活性を有するＣｙｐ１Ａ２、Ｃｙｐ３Ａ４および／またはＣｙｐ２Ｃ９を示す。
【００５３】
グリコーゲン記憶は、肝細胞様細胞の顕著なもう一つの特徴である。
【００５４】
さらに、肝細胞様及び肝芽細胞様細胞の割合は、Ｎｏｔｃｈ−２陽性である。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路は、成人の胚発育及びホメオスタシスの保全に広く使われている。それは、幹細胞信号ネットワークを構成するさらにキー経路の１本である。哺乳類において、４つのＮｏｔｃｈ受容体（Ｎｏｔｃｈ１−Ｎｏｔｃｈ４）及び５つの構造的類似のＮｏｔｃｈリガンド（Ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ１  ［さらに、Ｄｅｌｔａ１と呼ばれる］、Ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ３、Ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ４、Ｊａｇｇｅｄ１及びＪａｇｇｅｄ２）がこれまで確認された。Ｎｏｔｃｈリガンドは、１回膜貫通タンパクである。隣接の細胞に表示されるリガンドと結合することによって、Ｎｏｔｃｈ受容体は起動し、それは、タンパク質分解解放及び、順番に分化を調整するＮｏｔｃｈの細胞内領域の核移動を導く。胚発育の間、Ｎｏｔｃｈ−２は広く表示され、Ｎｏｔｃｈ−２は、多器官に重要な役割を有する。肝臓において、Ｎｏｔｃｈ−２は、肝内胆管の形成及び分化に関与している（アーダー等、２００５、コダマ等、２００６）。肝臓様細胞が幹細胞によって生成されるので、それらの細胞型のノッチ・シグナリングの役割を理解することは、重要である。
【００５５】
肝細胞様細胞は、肝細胞のために典型的な形態学を表示し、すなわち、それらは多角形の細胞形状を有し、大きい細胞直径（およそ２５−５０μＭ）、よく二重核を有し、脂質微粒を蓄積する傾向を示す。
【００５６】
ＡＡＴ、ＣＫ１８、ＨＮＦ−３ベータ、アルブミン及びＬＦＡＢＰは全て肝臓の特定のマーカーであり、それらの発現は、肝細胞様細胞を表す。しかし、これらの肝臓特定マーカーの全てが、本発明の細胞集団の全ての細胞に、必ずしも表示されるというわけではない。これらのマーカーのうちの一つ、二つ、三つ、四つだけを表示する均等な細胞は肝細胞と同様に機能することができ、それによって、それらが使われるべきであることによって決まる上述の目的に役立つ。細胞のｌｙｓａｔｉｏｎによって代謝を研究するために、少なくとも、ＣＹＰｓ及びＧＳＴｓが、要求される。摂取を研究するために、ＯＡＴＰｓは重要であり、さらに、分泌物のために、例えばＢＳＥＰまたはＭＲＰ−２の研究が要求される。実施する研究がインビボの研究に近付くにつれて、前記の特徴のうちより多くのものが必要となる。もっとよいものは、細胞−細胞相互作用によって肝臓環境を提供するマクロファージ及びクッパー細胞のような他の肝臓細胞型の肝細胞様細胞を潜在的に有する。この種の培養系は、サンドイッチの形状であり、これに一つ以上細胞型が組み込まれ、この３Ｄ構造及びさらなる体内模倣状況は肝細胞様細胞が潜在的にさらに正反対を示させることができる。すなわち、血液の方へ１つの親水側、胆汁の方へ１つの疎水側が示される。毒性研究のために、それらの相互作用により、フェーズＩ及びＩＩの代謝酵素が両方とも好ましい。加えて、細胞集団が周知の薬品誘発因子に反応できることが望ましく、それによって、例えばフェーズＩおよび／またはフェーズＩＩの代謝酵素が誘導できる。
【００５７】
本発明の実施例において、上述の特性ｉ）−ｖｉ）のうちの少なくとも３つを有する細胞集団の少なくとも約３０％の細胞、例えば、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％が、アルファ  １−アンチトリプシン、ＣＫ１８、ＨＮＦ−３ベータ、アルブミンまたはＬＦＡＢＰの特性の中の少なくとも２つ、例えば少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つまたは全てを示す。特定の実施形態において、特性の少なくとも一つは薬物輸送体のグループ（すなわち特性ｉ−ｉｉｉ）に関連するものであり、特性のうちの少なくとも１は薬物代謝酵素（すなわち特性ｉｖ）−ｖｉ））のグループに関連するものである。したがって、一つ以上の肝臓特定マーカーに加えて、細胞集団は、更に少なくとも一つの前記薬物輸送体特性及び少なくとも一つの前記薬物代謝特性を有してもよい。より具体的には、本発明の細胞集団は、特性ｉ）−ｖｉ）のうちの少なくとも４つ、例えば少なくとも５つまたは全６つの特性を有する。
【００５８】
特性ｉ）は、肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の割合に関係し、本発明による細胞集団の薬物輸送体ＢＳＥＰのタンパク質および／または遺伝子発現を示す。ＢＳＥＰは、胆汁酸塩輸出ポンプ（ｂｉｌｅ  ｓａｌｔ  ｅｘｐｏｒｔ  ｐｕｍｐ）を表し、ＡＴＰ加水分解のエネルギーを使用して、細胞外及び細胞内膜にわたる分子のトランスポートを触媒するＡＴＰ−結合カセット（ＡＢＣ）トランスポータであり、したがって、胆汁に薬品を外へ輸出することができる（通常は生体内に位置され、肝細胞のアピカル側と称する）。本発明の実施例において、肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％が、ＢＳＥＰのタンパク質および／または遺伝子発現を示す。
【００５９】
特性ｉｉ）は、本発明による細胞集団の薬物輸送体ＭＲＰ２のタンパク質および／または遺伝子発現を示す肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の割合に関する。ＭＲＰ２は、複数薬品抵抗タンパク質２を表し、さらにＡＢＣトランスポータ系統のメンバーであり、胆汁に薬品代謝物質を輸出する。本発明の実施例において、肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の少なくとも５％、例えば少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％または少なくとも８０％が、ＭＲＰ２のタンパク質および／または遺伝子発現を示す。
【００６０】
特性ｉｉｉ）は、本発明による細胞集団の薬物輸送体ＯＡＴＰ２および／またはＯＡＴＰ８のタンパク質および／または遺伝子発現を示す肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の割合に関する。ＯＡＴＰ−２及びＯＡＴＰ−８は、有機アニオン・トランスポータ２及び８を表し、両方ともＯＡＴＰ系統のメンバーであり、血液から有毒な内在性代謝物質及び生体異物物質を巻き取ることが公知である。ＯＡＴＰｓは、体内の血液の方の肝細胞の基底外側に位置している。本発明の一実施例において、肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の少なくとも５％、例えば少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％または少なくとも８０％が、ＯＡＴＰ２および／またはＯＡＴＰ−８のタンパク質および／または遺伝子発現を示す。
【００６１】
特性ｉｖ）は、本発明による細胞集団における薬品代謝酵素ＧＳＴ  Ａ１−１のタンパク質および／または遺伝子発現を示す肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の割合に関連する。グルタチオン転移酵素（ＧＳＴｓ）は、グルタチオンを有する生体異物の活用を触媒し、第２相解毒システムの不可欠な部分である。さらに、指定された７つのクラスへ割れられる１７種の異なるヒト細胞質ＧＳＴサブユニットがあり、例えばＡ、Ｍ、Ｐ及びＳである。ＧＳＴ  Ａ１−１は、生体内成人ヒト肝臓における最も多量のサブユニットである。ＧＳＴ  Ｐ１−１が胎児の肝臓でより高い程度で表示される一方、ＧＳＴ  Ｍ１−１は同様に成人ヒト肝臓において表示される。本発明の一実施例において、肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％または少なくとも８０％は、ＧＳＴ  Ａ１−１のタンパク質および／または遺伝子発現を示す。
【００６２】
特性ｖ）は、発明の細胞集団のＣＹＰ４５０ｓ−１Ａ２、−２Ａ６、−２Ｂ６、−２Ｃ８、−２Ｃ９、−２Ｃ１９、−２Ｄ６、−２Ｅ１、−３Ａ４及び−３Ａ７からなるグループから選択される薬品代謝酵素のうちの少なくとも２つのタンパク質および／または遺伝子発現を示す肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の割合に関連する。ＣＹＰは、シトクロムＰ４５０を表し、肝臓の小胞体細網構造に位置する一群の酵素である。それらの役割は、内在性合成物及び生体異物の代謝及び解毒である。これらの酵素の高い濃度は肝臓及び小腸で見つかるが、多数のＣＹＰｓは同様に他の組織でも見つかる。ＣＹＰｓは、抑制及び誘導を含む多くの機構によって変えられることができて、人から人へ変化することができる。ＣＹＰシステムは、薬物代謝、薬品相互作用及び薬剤誘発性肝毒性を理解するのに重要である。
【００６３】
本発明の一実施例において、肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の少なくとも３０％、例えば、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％または少なくとも８０％が、ＣＹＰ４５０ｓ−１Ａ２、−２Ａ６、−２Ｂ６、−２Ｃ８、−２Ｃ９、−２Ｃ１９、  ２Ｄ６、−２Ｅ１、−３Ａ４及び−３Ａ７のうちの少なくとも２つのタンパク質および／または遺伝子発現を示す。さらに、一般的ＣＹＰ４５０酵素活性が、そのような細胞集団に示されることができ、細胞集団は、これらのＣＹＰ４５０タンパク質のうちの少なくとも１つ、例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは全１０の酵素活性を更に示してもよい。
【００６４】
特性ｖｉ）は、本発明による細胞集団の第２相酵素ＧＳＴ  Ｐ１−１のタンパク質および／または遺伝子発現を示す肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の割合に関連する。本発明の一実施例において、肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％または少なくとも８０％は、ＧＳＴ  Ｐ１−１のタンパク質および／または遺伝子発現を示していない。
【００６５】
さらに、細胞集団はＧＳＴ酵素活性を示すことを示してもよく、それは、細胞集団の溶解物のタンパク質の少なくとも０．０１μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ、例えば少なくとも０．０３μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ、少なくとも０．０５μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ、少なくとも１．０μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ、少なくとも０．０７μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ、少なくとも０．０９μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ、少なくとも０．１１μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ、少なくとも０．１３μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇまたは少なくとも０．１５μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇであってもよい。
【００６６】
本発明の特定の実施例において、細胞組成は、ＣＫ  １８共発現細胞を含み、例えばＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１；ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９及びＣＹＰ２Ｃ１９の組合せ、またはＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ３Ａ７の組合せのような一つ以上のＣＹＰ薬物代謝酵素を含む。
【００６７】
上述の特性に加えて、本発明の細胞集団の細胞の少なくとも約５％は、以下の追加的な特性のうちの少なくとも１つを有する。
Ａ．受容体
ｖｉｉ）細胞の少なくとも約５％が、ｃ−Ｍｅｔのタンパク質および／または遺伝子発現を示し、
Ｂ．  細胞間接着分子
ｖｉｉｉ）細胞の少なくとも約５％が、ＩＣＡＭ−１のタンパク質および／または遺伝子発現を示し、
Ｃ．薬物代謝酵素
ｉｘ）細胞の少なくとも１％が、ＵＧＴのタンパク質および／または遺伝子発現を示し、
Ｄ．転写因子
ｘ）細胞の少なくとも９０％が、非Ｏｃｔ−４のタンパク質および／または遺伝子発現を示す。
【００６８】
好ましくは、細胞集団は特性ｖｉｉ）、ｖｉｉｉ）、ｉｘ）またはｘ）のうちの少なくとも２つ、例えば少なくとも３つまたは全４つを有する。
【００６９】
特性ｖｉｉ）は、発明の細胞集団における受容体ｃ−Ｍｅｔのタンパク質レベルおよび／または遺伝子発現に関する。ｃ−Ｍｅｔは、肝細胞成長因子および／または散乱因子受容体であり、それによって、肝細胞様細胞が、生体内ヒト肝細胞と同じ細胞内調節及びメカニズム（メチル化）を反応及び有するのを期待される。本発明の一実施例において、肝細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の少なくとも１０％、例えば少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％が、ｃ−Ｍｅｔのタンパク質および／または遺伝子発現を示す。
【００７０】
特性ｖｉｉｉ）は、本発明による細胞集団の細胞間接着分子ＩＣＡＭ−１のタンパク質のレベルおよび／または遺伝子発現に関する。ＩＣＡＭ−１は、肝臓内の細胞−細胞相互作用に重要な細胞内部−粘着力分子である。本発明の一実施例において、肝細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％は、ＩＣＡＭ−１のタンパク質および／または遺伝子発現を示す。
【００７１】
特性ｉｘ）は、本発明による細胞集団の薬品代謝酵素ＵＧＴのタンパク質のレベルおよび／または遺伝子発現に関する。ウリジン・ジホスホグルクロノシルトランスフェラーゼは、ＧＳＴｓ第２相代謝酵素と同様にｆａｔ−ｓｏｌｕｂｌｅ化学製品、両方の内因性培養基、薬品及び他の生体異物に砂糖の酵素添加の役割を果たす。哺乳類において、グルクロン酸は体の潜在的中毒レベルの環境または薬品から、代謝及び脂溶性化学製品の廃棄物蓄積を予防するために用いるメイン砂糖である。特にＵＧＴ２Ｂ７は、成人ヒト肝臓の重要な第２相酵素であり、例えば、薬品ジクロフェナクを新陳代謝するために、Ｃｙｐ２Ｃ９及びＣｙｐ３Ａ４と協力する。本発明の一実施例において、肝細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％は、ＵＧＴのタンパク質および／または遺伝子発現を示す。さらに、細胞集団はＵＧＴ酵素活性を示してもよい。
【００７２】
特性ｘ）は本発明による肝細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の割合に関連し、それは転写因子Ｏｃｔ−４の非タンパク質および／または遺伝子発現を示す。Ｏｃｔ−４は転写因子であり、その発現は未分化のｈＢＳ細胞に特徴的であり、肝細胞様細胞を含んでいる細胞集団におけるその存在は、望ましくない。したがって、Ｏｃｔ−４の無しまたは低い発現は、それらが未分化のｈＢＳ細胞ではないことを示し、未分化の細胞集団が潜在的に奇形腫様組織を引き起こすことがあるので、たとえば、再生医療においてそれは利点である。本発明の一実施例において、肝細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の少なくとも１０％、例えば少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％は、Ｏｃｔ−４のタンパク質および／または遺伝子発現を示す。
【００７３】
上述の特性ｉ）−ｘ）の一部は、誘発因子の追加で誘導でき、それは、デキサメタゾン、オメプラゾールからなるグループから単独でまたは組合せで選択される。誘発因子は、同様にリファンピシン、デキサメタゾン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、オメプラゾール及びイソニアジドを含んでもよい。このような方法で、ＣＹＰ４５０タンパク質のうちの少なくとも１つの発現が、誘発因子の追加で誘導できる。さらに、ＧＳＴ  Ａ１−１および／またはＧＳＴ  Ｍ１−１タンパク質の発現は、誘発因子の追加で誘導できる。ＵＧＴタンパク質の発現は、同様に誘発因子の追加で誘導できる。
【００７４】
本発明の肝細胞様細胞は、それらが培養される間にこれらが示す特性ｉ）−ｘ）を維持することができる。この文脈において、用語「維持された特性」は、定義済みの培養組織及び分析期間にわたる安定的タンパク質発現を意味することを目的とし、それは、例えば免疫組織化学及び発現輝度の測定及び比較で更に示されることができる。したがって、本願発明による肝細胞様細胞を含んでいる細胞集団が、少なくとも一ヶ月間、例えば、維持された特性を有しながら少なくとも一週間または少なくとも７２時間、インビトロで培養されることが可能である。
【００７５】
本発明の一実施例で、肝細胞様細胞を含んでいる細胞集団またはその部分母集団は、更にＡＦＰを表示する。
【００７６】
さらに特定の臓器模倣応用のために、おそらく、他の肝臓細胞型、例えばクッパー細胞および／またはマクロファージが、必要である。
【００７７】
本発明の肝細胞様または肝芽細胞様細胞は、本願明細書に記載されているそれらのそれぞれの特性を確かめるために使用の前に選ばれ、より高い収穫を得る。細胞は、細胞表面に表示される肝臓マーカー及び次のＦＡＣソーティングのために抗原検出を用いて精製されてもよい。抗原ベースのソートのための他の代わりは培養皿を特定の抗体でコーティングし、培養基から皿に細胞を加え、右側の抗原と細胞を結びつけ、及び残りの細胞は廃棄され、まとめられた細胞は更なる用途のために収穫する。この方法は、時々免疫と称され、さらに陰性選択として実行されることができる。すなわち、不要な細胞型をコーティングされる抗原へ結合させ、懸濁液の肝細胞様細胞を有する培養基を確保する。このアプローチは、磁気ビーズ上で実行された方がよく、いわゆるＭＡＣソートまたはカラムクロマトグラフィを使用する。例えば特定の特性を有する肝細胞様細胞のような細胞を精製するさらなる方法は、細胞分離のための、遠心分離中での浮遊密度またはサイズに基づく密度勾配培養基の使用を含む。
【００７８】
肝細胞様または肝芽細胞様細胞の精製集団を得るためのさらなる代替方法は、ｈＢＳ細胞由来細胞の混合集団における陽性選択または陰性選択を実行することである。両方の選択方法は、細胞単片の切断又は、コラゲナーゼＩＶまたはトリプシン、または、例えばＥＤＴＡまたは適切な酵素及びキレート化剤の混成物のような酵素への追加及び暴露によって手動で実行されることができる。本発明の１つの特定の実施例において、培養皿は、カルシウム／マグネシウムフリーＰＢＳで二回洗われ、その後、カルシウム／マグネシウムフリーＰＢＳに希釈される０．５ｍＭのＥＤＴＡにおいて培養され、非肝細胞様又は非肝芽細胞様細胞を取り除き、マウス胚のフィーダ上で完全に成長する肝臓様細胞型を残す、陰性選択をもたらす。キレート化剤および／または酵素への更なる暴露の後、肝臓様細胞は、フィーダ細胞及び、実験に更にプールされ、使われる皿から分離される。
【００７９】
肝芽細胞様細胞
このコンテキストにおいて、用語「肝芽細胞様細胞」は、ＨＮＦ３ベータ及びＡＦＰの少なくとも一つのを表示し、増殖能を有する細胞を意味することを目的とする。したがって、本願発明の一実施例は、ｈＢＳ細胞に由来される細胞集団に関連し、細胞集団の細胞の少なくとも約１０％が、少なくとも一つのＨＮＦ３ベータ及びＡＦＰを表示し、増殖能を有し、細胞集団は以下の４つの特性のうちの少なくとも２つを有する。
Ａ．受容体
ｉ）細胞の少なくとも１％が、アルファ−６−インテグリンのタンパク質および／または遺伝子発現を示し、
ｉｉ）細胞の少なくとも１％が、ｃ−Ｍｅｔのタンパク質および／または遺伝子発現を示し、
Ｂ．細胞間接着分子
ｉｉｉ）細胞の少なくとも１％が、ＩＣＡＭ−１のタンパク質および／または発現を示し、
Ｃ．転写因子
ｉｖ）細胞の少なくとも１０％が、ＨＮＦ−４アルファのタンパク質および／または発現を示し、
Ｄ．サイトケラチン
ｖ）細胞の少なくとも１％が、ＣＫ１９のタンパク質および／または発現を示し、
ｖｉ）細胞の少なくとも１％が、ＣＫ７のタンパク質および／または発現を示し、
Ｅ．上皮細胞接着分子
ｖｉｉ）細胞の少なくとも１％が、ＥｐＣＡＭのタンパク質および／または発現を示す。
【００８０】
細胞質比に高い核を有し、立方形の形状であることは、肝芽細胞様細胞の顕著な特徴である。さらに、それらは細胞質に小さい核小体及び微粒を有してもよい。好ましくは、細胞の直径は１０−３０μｍの間であってもよい。
【００８１】
肝芽細胞様細胞は、更に肝細胞様細胞に分化する能力を有する内皮オリジンの細胞である。ＨＮＦ３ベータは内皮性マーカーであり、内胚葉は肝細胞の方へ発育経路に沿っている。ＨＮＦ３ベータは、同様に膵臓で表示されることは公知である。この文脈において、用語「増殖能」は、細胞集団の細胞が分裂することを意味することを目的とする。
【００８２】
ＨＮＦ３ベータ以外の肝芽細胞様及び肝細胞様細胞へ分化するｈＢＳ細胞によって表示される追加的な内皮性マーカーの実施例は、Ｇａｔａ４、Ｃｄｘ２（尾部関連ホメオボックス転写因子）、Ｓｏｘ１７（Ｓｒｙ−ｂｏｘ含有遺伝子１７の遺伝子製品）、Ｐｄｘ１（膵臓の十二指腸ホメオボックス因子−１）及びＡＦＰであり、後者は通常、胎児の肝臓マーカーとみなされる。
【００８３】
肝芽細胞様細胞は、さらに、増殖されてもよく、それは、前駆状態の１つの表示であり、すなわち、それらは未成熟で完全に肝細胞様細胞に分化されなかった。細胞の繁殖的状態は、多数の手段によって示されることができ、それらは例えばＢｒｄＵ取り込み及び染色または例えばＫＩ６７のような繁殖的細胞に特有なタンパク質マーカーを使するもう一つの染色であり、固定の時点に集団における繁殖細胞を染色する。
【００８４】
肝芽細胞様細胞の特性ｉ）−ｖｉｉ）は、肝発育にとって重要な体内関連マーカーである。
【００８５】
特性ｉ）は、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の割合に関連し、アルファ−６−インテグリン受容体のタンパク質および／または遺伝子発現を示す。アルファ−６−インテグリンは、ラミニン受容体である。ラミニン受容体は、例えば発育中の肝臓の細胞外基質の一部であり、多数の細胞型（例えば体内肝芽及び肝細胞）に表示される。本発明の一実施例において、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％が、アルファ−６−インテグリン受容体のタンパク質および／または遺伝子発現を示す。
【００８６】
特性ｉｉ）は、ｃ−Ｍｅｔ受容体のタンパク質および／または遺伝子発現を示す、肝芽細胞様細胞を含む細胞集団の細胞の割合に関する。本発明の一実施例において、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％は、ｃ−Ｍｅｔ受容体のタンパク質および／または遺伝子発現を示す。
【００８７】
特性ｉｉｉ）は、細胞集団において、細胞間の粘着力分子ＩＣＡＭ−１のタンパク質および／または遺伝子発現を示す肝芽細胞様細胞を含む細胞の割合に関する。本発明の一実施例において、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団における細胞の少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％が、細胞間の粘着力分子ＩＣＡＭ−１のタンパク質および／または遺伝子発現を示す。
【００８８】
特性ｉｖ）は、転写因子ＨＮＦ−４アルファのタンパク質および／または遺伝子発現を示す肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団における細胞の割合に関する。この転写因子は、特に内皮性細胞型において表示され、したがって、肝芽細胞様細胞を表す。本発明の一実施例において、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％が、ＨＮＦ−４アルファのタンパク質および／または遺伝子発現を示す。
【００８９】
特性ｖ）は、サイトケラチン１９のタンパク質および／または遺伝子発現を示す、肝芽細胞様細胞を含む細胞集団の細胞の割合に関する。このサイトケラチンは、肝細胞以外の特に肝臓幹細胞及び肝芽において表示され、したがって、肝芽細胞様細胞を表す。本発明の一実施例において、肝芽細胞様細胞を含む細胞集団の細胞の少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％が、サイトケラチン１９のタンパク質および／または遺伝子発現を示す。
【００９０】
特性ｖｉ）は、サイトケラチン７のタンパク質および／または遺伝子発現を示す、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団における細胞の割合に関する。このサイトケラチンは、肝細胞ではなく特に肝臓幹細胞及び肝芽において表示され、したがって、肝芽細胞様細胞を表す。本発明の一実施例において、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％が、サイトケラチン７のタンパク質および／または遺伝子発現を示す。
【００９１】
特性ｖｉｉ）は、上皮細胞接着分子のタンパク質および／または遺伝子発現を示す、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の割合に関する。この上皮細胞接着分子は、肝細胞でなく特に肝臓前駆において表示され、したがって、肝芽細胞様細胞を表す。本発明の一実施例において、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％が、上皮細胞接着分子のタンパク質および／または遺伝子発現を示す。
【００９２】
本発明の一実施例において、上述の特性ｉ）−ｖｉｉ）のうちの少なくとも２つを有する細胞集団の細胞の少なくとも約１５％、例えば、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％が、ＨＮＦ３ベータ及びＡＦＰのうちの少なくとも一つに表示され、増殖能を有する。さらに、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団は、特性ｉ）−ｖｉｉ）のうちの少なくとも３つまたは全４つを有する。
【００９３】
本発明の他の実施例において、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団は、更に以下の特性のうちの少なくとも１つを有する。
Ｆ．薬物輸送体：
ｖｉｉｉ）細胞の少なくとも１％が、ＢＳＥＰのタンパク質および／または遺伝子発現を示す。
ｉｘ）細胞の少なくとも１％が、ＭＲＰ２のタンパク質および／または遺伝子発現を示す。
【００９４】
ＢＳＥＰ及びＭＲＰ２は、肝細胞様細胞へ発育の間に、すでに薬品トランスポート・プロセスを実行することにとって重要であるが、それは、この発育的なフェーズで代謝、解毒及び分泌物が同様に必要とするからである。
【００９５】
更なる使用態様
薬品トランスポート及び薬物代謝酵素の発現のために、本発明の肝細胞様細胞及び肝芽細胞様細胞は、医薬品用途に非常に適している。したがって、本発明に記載されている細胞集団が、予防および／または病状治療、および／または例えば、肝臓組織退化、原発性胆汁性肝硬変を含む自己免疫障害からなる群から選択される肝臓障害、脂質異常症を含む代謝障害、例えばアルコール濫用によって生じる肝臓障害、ウイルスによって生じる疾患（例えばＢ型肝炎、Ｃ型肝炎及びＡ型肝炎）、例えば調合薬に対する急性毒性反応によって生じる肝臓壊死及び肝細胞性癌及び代謝病状および／または、疾患で苦しんでいる患者の腫瘍除去のような組織退化によって生じる疾患のための医薬品の製造に使われることができる。
【００９６】
さらに、本発明の肝細胞様細胞及び肝芽細胞様細胞は、スクリーニングの目的のために最適に使われる。例えば、細胞は本発明の細胞集団から合成物へ細胞を暴露することを含む、肝細胞毒性の合成物をスクリーニングする方法に使うことが可能であり、合成物が細胞に対して有毒かどうか決定する。細胞は、さらに肝細胞性機能を調整する能力のために合成物をスクリーニングする方法に使われてもよい。上記の方法は、本発明の細胞集団からの細胞を合成物へ暴露し、合成物との接触から起こる細胞のいかなる表現型または代謝変化を測定し、肝細胞性機能を調整する能力に変化を関連づける方法である。
【００９７】
再生医療の応用において、ｈＢＳ細胞は、異種動物由来成分不含ｈＢＳ細胞に由来されるべきであり（実施例１を参照）、さらに分化の間に、分離及び可能性二次培養は直接的にも間接的にも非人間動物由来構成要素に暴露されない。これは、ヒト由来構成要素（例えば組み換え型培養基及び添加物）だけを用いて達成されることができる。
【００９８】
製剤方法
本発明の細胞集団は、分化誘導薬を用いずに得られるが、それは、一般的に他に使われる。分化誘導薬は、細胞に有毒な欠点を有し、そのような方法によって得られる分化細胞の収穫は低く、さらに、これらの得られた細胞の品質にも影響を及ぼす可能性がある。本発明の発明者は、培養状況を確認することにより、分化誘導薬を使用しないで肝細胞様細胞および／または肝芽細胞様細胞へｈＢＳ細胞の分化を可能にする。本発明による肝細胞様細胞及び肝芽細胞様細胞の製剤方法は、細胞の改良された品質及び改良された収穫を提供する。さらに、得られた細胞は、ここに記載されている特性を有し、この特性が細胞をここに記載の用途以外にも適応させる。
【００９９】
本発明の一実施例において、９６−ウェルプレートの肝細胞様細胞へのｈＢＳ細胞の分化は、うまく実行される。９６−ウェルの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％が、肝細胞様細胞へｈＢＳ細胞を分化させることに成功した。ｈＢＳ細胞は、本発明の実施要項に従う期間で肝細胞様細胞へ分化するが、例えば２０日目、２５日目、３０日目または３５日目である。
【０１００】
本発明の方法は、さらに、周知の方法より労力が掛からない。ｂＦＧＦ以外の、高価な因子は、培養基への添加物として必要でなく、ｂＦＧＦは、低い量だけ必要で、以前報告されるほうより少ない量である。
【０１０１】
方法は、細胞から排出する内因子に依存し、中毒特性のいかなる潜在的添加物にも依存しない。すなわち、より穏やかな、より生理的に適切な環境を実現する。それゆえに、方法はまれな培養基置換及び部分的な培養基置換に依存する。有毒な物質は、特定の誘導酵素の誘導性のみを確認するために使われる。
【０１０２】
加えて、方法は肝細胞様細胞へ分化するために重要なｍＥＦ細胞に依存する。ｈＢＳ細胞が分化するｍＥＦ細胞の濃度は、２０．０００細胞／ｃｍ２から２００．０００細胞／ｃｍ２の範囲内で変動してもよく、例えば約３０．０００から１００．０００細胞／ｃｍ２、例えば４０．０００から７０．０００細胞／ｃｍ２、例えば５２．０００細胞／ｃｍ２である。
【０１０３】
肝細胞様細胞への分化方法にとって重要な他の１つの要因は、ｂＦＧＦの存在であり、それは、分化の前に培養基に加えられる。
【０１０４】
本発明のための出発原料は、未分化ｈＢＳ細胞株のような最適に多能性の未分化ｈＢＳ細胞である。そのような材料は、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ  ＡＢ社から得られることができ、さらにＮＩＨ幹細胞レジストリで入手できる（ｈｔｔｐ：／／ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｒｅｇｉｓｔｒｙ／）。Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ  ＡＢ社は、２つのｈＢＳ細胞株（ＳＡ００１及びＳＡ００２）を有し、ＳＡ００２（ＳＡ００２．５）の１つのサブクローンは、ＮＩＨを通して入手できる。それらのｈＢＳ細胞株は、本発明において多用された。
【０１０５】
出発物質として推薦されるｈＢＳ細胞の特性は、以下の通りである：陽性のアルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ−３−ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ  １−６０、ＴＲＡ  １−８１、Ｏｃｔ−４、陰性のＳＳＥＡ−１、テロメラーゼ活性、及びインビトロ及びインビボの多分化能（後者は、免疫不全マウスの奇形腫形成によって示される）（図１）。
【０１０６】
使用の前に、出発物質として使用されるｈＢＳ細胞株は、特徴プログラムに従うＬＯＴ製造に由来されてもよい。ｈＢＳ細胞株のＬＯＴ製剤は、標準化方法に従う培養及び１つの単一継代における１００ストロー以上の冷凍でのｈＢＳ細胞の拡張を構成する（出願中の特許国際公開ＷＯ２００４０９８２８５）。ｈＢＳ細胞株の形態は、冷凍の前後、更に、ＬＯＴからの細胞の解凍の後の次なる培養における連続的継代でモニタされる。ＬＯＴ冷凍の品質は、１０解凍の各ストローの１００パーセントの解凍速度を示す解凍回復率の検査によって確認される。細胞の汚染がないことを確認するために、微生物学的安全に関する安全試験が、それから細胞及び冷凍経過における培養基に実行される。実行される特性解析プログラムは、ｈＢＳ細胞株の分化状態を確認する方法の幅広い範囲を含む。未分化細胞（ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、Ｏｃｔ−４及びＡＬＰ）のための一般に認められたマーカーの最初のマーカー発現分析において、実行される。継代の細胞の遺伝子の安定性及び冷凍−解凍サイクルが、染色体分析及びＦＩＳＨで点検される。テロメラーゼ活性が、Ｔｅｌｏ  ＴＡＧＧＧ  Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ＰＣＲ  ＥＬＩＳＡＰＬＵＳキットを使用して測定される。ｈＢＳ細胞の多分化能が、胎様体ステップで試験管内の分化及び、免疫不全ＳＣＩＤマウスの腎臓カプセルでのｈＢＳ細胞の移植による体内分化によって調べられる。
【０１０７】
ここで用いられる出発物質は、さらに完全に異種動物由来成分不含に由来されてもよく、それによって、完全な異種動物由来成分不含肝細胞様細胞が、再生医療の潜在的使用のために得られてもよい。ｈＢＳ細胞の異種動物由来成分不含由来物のために、全ての培養基及びマトリックス構成要素、フィーダ細胞及び使用する他の材料は、いかなる人間以外の動物材料に由来又は接触しなくてもよい。ｈＢＳ細胞の異種動物由来成分不含由来物のための適切な構成要素及び、異種動物由来成分不含肝細胞様細胞、異種動物由来成分不含由来のヒト線維芽細胞であり、たとえば、ヒト包皮線維芽細胞、組み換え型成長因子を有する無血清またはヒト血清ベースの培養基、分化因子および／または潜在的な他の添加物、及び、ヒト組み換え酵素または細胞の分離及び培養のための殺菌したメカニカルツールの何れかである。
【０１０８】
他の出発物質は内皮性細胞であり、すなわちすでに内胚葉血統へ取組まれたｈＢＳ細胞由来の細胞である。そのような細胞は、以下の内胚葉マーカーのうちの１つ以上を表示してもよい：ＨＮＦ３ベータ（肝細胞核因子３）、Ｇａｔａ４、Ｃｄｘ２（尾部関連ホメオボックス転写因子）、Ｓｏｘ  １７（Ｓｒｙ−ｂｏｘ含有遺伝子１７の遺伝子製品）、及びＰｄｘ１（膵臓の十二指腸ホメオボックス因子−１）。
【０１０９】
本願発明の一実施例は本発明による肝芽細胞様細胞および／または肝細胞様細胞を含む集団の製剤のための方法に関し、次のステップを含んでいる：
ｉ）無血清培地の支持マトリックスでｈＢＳ細胞またはｈＢＳ細胞由来前駆を少なくとも５日間、試験管内分化を行う。
ｉｉ）培養基を約５日から２５日ごとに変える。
ｉｉｉ）機械的隔離によって細胞を分離する。
ｉｖ）酵素処理によってステップｉｉｉ）において得られる細胞を任意に解離する。
ｖ）表面抗原発現に基づいて細胞を任意にソートする。
【０１１０】
ｈＢＳ細胞に由来される前駆は、ＨＮＦ３ベータ及びＡＦＰを表示してもよく、増殖能を有する。
【０１１１】
ステップｉ）のインビトロの分化は、少なくとも１０日間（例えば少なくとも２０日間、少なくとも３０日間または少なくとも４０日間）実行される。このステップの分化のために与えられる時間は、得られた細胞が肝細胞様細胞または肝芽細胞様細胞の特性を有するかを決定している。したがって、肝細胞様細胞を得るために、ｈＢＳ細胞の試験管内分化または無血清培地での支持マトリックス上のｈＢＳ細胞由来前駆は、約１８日から約３０日まで実行され、好ましくは２０−２７日間、より好ましくは約２５日間実行され、反対に、約５日から約１０日間、好ましくは１５日間肝芽細胞様細胞を得るために必要である。
【０１１２】
血清培地は、ＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）、ｂＦＧＦで補充されるＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）及びあらかじめ自己調整されたＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）（すでに肝細胞様細胞に改良される）からなる群から選択されてもよい。無血清培地は、ｂＦＧＦを更に含み、その濃度は好ましくは約４ｎｇ／ｍｌから約２００ｎｇ／ｍｌまでの濃度、例えば、約４ｎｇ／ｍｌから約１５０ｎｇ／ｍｌまで、約４ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌまで、約４ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌまで、または約４ｎｇ／ｍｌから約１０ｎｇ／ｍｌまでである。
【０１１３】
本発明の一実施例において、無血清培地はｂＦＧＦを含んでいるＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）である。ｂＦＧＦの濃度は、約４ｎｇ／ｍｌから約２００ｎｇ／ｍｌまであってもよく、例えば、約４ｎｇ／ｍｌから約１５０ｎｇ／ｍｌまで、約４ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌまで、約４ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌまで、または約４ｎｇ／ｍｌから約１０ｎｇ／ｍｌまでである。ｂＦＧＦの濃度は、４ｎｇ／ｍｌであってもよい。
【０１１４】
ステップｉｉ）において、無血清培養基は、約１０日ごとから約２０日ごと、例えば、約１２−１８日ごと、例えば１４−１５日ごとに変わってもよい。
【０１１５】
支持マトリックスは、例えば、ヒトまたはマウス・フィーダ細胞のようなフィーダ細胞を含んでもよく、または、定義済みまたは未定義の配合の細胞外基質を含んでもよい。あるいは、支持マトリックスは以下を含んでもよい：細胞培養に使用されるプラスチック細胞培養容器の内側にコーティングする、単独または組合せの、一つ以上のタンパク質を含むコーティング、または、三次元環境（例えば多孔性フィルタ）を含んでもよい。支持マトリックスとして多孔性フィルタを使用する場合、この多孔性フィルタは、直径が約４μｍの孔サイズを有してもよく、単独でまたは組合せで、一つ以上のタンパク質でコーティングされてもよい。
【０１１６】
上記にて説明した容器またはフィルタコーティングするために使用する一つ以上タンパク質は、コラーゲン、ラミニン及びそれらの組合せからなる群から選択されてもよい。
【０１１７】
ステップｉｉｉ）において実行される細胞のメカニカル分析は、細胞形態の視覚の点検で判断されることで肝芽細胞様細胞および／または肝細胞様細胞を取り出すことによって実行されてもよい。肝細胞様細胞は、肝細胞の典型的な形態学を表示する。すなわち、それらは多角形の細胞形状を有し、大きい細胞直径（凡そ２５−５０μＭ）は、しばしば核を二つもち、脂肪顆粒を蓄積する傾向がある。経験及び完全な実験によって、形態学は、肝臓マーカー（例えばアルファ−１−抗トリプシン、ＣＫ１８、ＨＮＦ−３ベータ、アルブミンまたはＬＦＡＢＰ）の発現に関連づけられた。実行された選択は、免疫組織化学による識別によって肝芽細胞様細胞または肝細胞様細胞として更に検査されてもよい。メカニカル解剖の代わりに、それらが成長している表層及び、例えば酵素またはキレート化剤またはそれらの組合せから細胞を分離し、その後、例えばＦＡＣソート、磁気ビーズまたは免疫することによって細胞をソートする。細胞は、それから適切な培養および／または例えばインビトロの分析のために更に使われる数に相当するマルチウェルプレート分析容器に最後に接種されてもよい。
【０１１８】
本願明細書において記載されている方法によれば、本発明の細胞集団は、ヒトまたはマウス・フィーダ細胞のようなフィーダ細胞の存在下で得ることができ、さらにそれらはフィーダ細胞がない場合に得ることができる。フィーダ細胞がない場合、本発明の細胞集団は、定義済みまたは未定義の配合の細胞外基質、または単独または組合せで、一つ以上のタンパク質で内側がコーティングされたプラスチック細胞培養容器を使用して得ることができる。この目的の適切なタンパク質は、コラーゲン、ラミニン及びそれらの組合せからなる群から選択されてもよい。あるいは、本願発明の細胞集団は、三次元環境（例えば多孔性フィルタ）を使用することによって獲得してもよい。
【０１１９】
肝細胞様細胞を得る追加的な方法は、例えば異なる培養基配合によって刺激される３Ｄ培養における最終的に類似する内胚葉によって、肝細胞様細胞へｈＢＳ細胞を統制的に分化させることである。異なる因子または構成要素は、それからタイプ及び濃度（たとえば血清、培養基における成長因子及び他の刺激的な因子）に加えられるかまたは変化する。簡単に概説すると、未分化のｈＢＳ細胞部分は取り除かれて、たとえば２４−ウェルプレートのフィルタ挿入紙へ移動されてもよい。全ての培養は、それから異なる培養基配合において育てられて、肝細胞様細胞または肝芽細胞様細胞の収穫を最大にするための一番よい時間枠を見つけるために、例えば異なる時間位置上の免疫組織化学分析のような分析を受ける。
【０１２０】
肝細胞様細胞または肝芽細胞様細胞を得るためのさらなる追加的方法は、例えばヒト成人肝臓または器官断片または他の種（例えばマウス胚の肝臓を実施例２で述べたように肝細胞様細胞の方へ分化するように刺激させる）の細胞型の肝臓断片を有するｈＢＳ細胞に由来されるｈＢＳ細胞または内胚葉前駆細胞を相互培養することである。そのようなシステムの相互培養は、３Ｄ構造（例えば肝細胞及びダクトの一群）の形成のために有益である。
【０１２１】
さらに、肝細胞様及び肝芽細胞様細胞の繁殖的な状態への誘導は、培養基の培養によって誘導されることが可能であり、それは、例えば成長因子を含んでいる肝細胞のために調整される。
【０１２２】
本発明の具体例において、得られた細胞集団は、異種動物由来成分不含であってもよい。
【０１２３】
本願発明の一実施例は、本発明の肝細胞様細胞を含む集団を生産するための改良された方法に関連し、その方法は、以下のステップを含む。
ｉ）ｈＢＳ細胞を育てることに適している培養基、例えばＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）培養基の中で最大１０日から３０日間、好ましくは例えば、１５日目または２３日目までの１３日間から２７日間、ｈＢＳ細胞をインビトロで分化させ、例えば、培養基の１００％が、新規な肝細胞培養基に取り替えられることができ、５０％に変わる。
ｉｉ）１０−４０日目、好ましくは１３−３５日目、例えば１５日目または２３日目にＨＣＭ培養基のような肝細胞の培養のために最適化される新規な培養基に代わる。培養基は、以下の構成要素の一つ以上を含んでもよい：ウシ血清アルブミン、アスコルビン酸、上皮細胞増殖因子、トランスフェリン、インスリン、ヒドロコルチゾン及び抗生物質。
【０１２４】
交換する培養基の量は、３０％から最高１００％まで変動することができる。培養基は、一週間に三回、または一週間に一回交換され、好ましくは週に一度交換される。
【０１２５】
さらに、方法は次の工程を含んでもよい。
ｉｉｉ）高い濃度のデキサメタゾンを最大１０日、好ましくは８日間、任意に加える。
ｉｖ）ナトリウム酪酸塩（ＮａＢ）及びＨＧＦを最大１０日、好ましくは５日間、任意に加える。
ｖ）細胞を分離する。
ｖｉ）酵素処理によってステップｉｉ）において得られる細胞を任意に解離する。
ｖｉｉ）表面抗原発現に基づいて細胞を任意にソートする。
【０１２６】
全ての詳細及び以下の一般的方法で言及される詳細は、上述の特定の実施例に準用する。
【０１２７】
キット
本発明の別の態様は、以下を含んでいるキットに関する：ｉ）肝細胞様細胞および／または肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団、ｉｉ）一つ以上の成熟因子および／または成熟培養基、及びｉｉｉ）任意的に使用指示書。成熟培養基は、ＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）、ｂＦＧＦで補充されるＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）、及びあらかじめ調整されたＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）（肝細胞様細胞上ですでに調整された）からなる群から選択されてもよい。
【０１２８】
一つ以上の成熟因子は、ｂＦＧＦ、上皮増殖因子、肝細胞増殖因子及びオンコスタチンＭからなる群から選択される。
【０１２９】
さらに、キットは成熟をモニタするためのツールを含んでもよい。
【０１３０】
一実施例において、成熟をモニタするための道具は以下を含む：
ｉ）ＨＮＦ３ベータ、ＡＦＰ、アルブミン、ＢＳＥＰ、ＭＲＰ２、ＯＡＴＰ−２、ＯＡＴＰ−８、ＧＳＴ  Ａ１−１、ＣＹＰ４５０−１Ａ２、ＣＹＰ４５０−２Ａ６、ＣＹＰ４５０−２Ｂ６、ＣＹＰ４５０−２Ｃ８、ＣＹＰ４５０−２Ｃ９、ＣＹＰ４５０−２Ｃ１９  ＣＹＰ４５０−２Ｄ６、ＣＹＰ４５０−２Ｅ１、ＣＹＰ４５０−３Ａ４、ＣＹＰ４５０−３Ａ７、ＧＳＴ  Ｍ１−１及びＵＧＴからなる群から選択される発現マーカーを符号化する遺伝子の少なくとも３つ、例えば少なくとも４つまたは少なくとも５つに対するＰＣＲプライマー、及び
ｉｉ）ユーザーズ・マニュアル。
【０１３１】
他の一実施例において、成熟をモニタするためのツールは以下を含む：
ｉ）ＨＮＦ３ベータ、ＡＦＰ、アルブミン、ＢＳＥＰ、ＭＲＰ２、ＯＡＴＰ−２、ＯＡＴＰ−８、ＧＳＴ  Ａ１−１、ＣＹＰ４５０−１Ａ２、ＣＹＰ４５０−２Ａ６、ＣＹＰ４５０−２Ｂ６、ＣＹＰ４５０−２Ｃ８、ＣＹＰ４５０−２Ｃ９、ＣＹＰ４５０−２Ｃ１９  ＣＹＰ４５０−２Ｄ６、ＣＹＰ４５０−２Ｅ１、ＣＹＰ４５０−３Ａ４、ＣＹＰ４５０−３Ａ７、ＧＳＴ  Ｍ１−１及びＵＧＴからなるグループから選択される発現マーカー抗原の少なくとも３つ、例えば少なくとも４つまたは少なくとも５つに対抗する抗体、および
ｉｉ）ユーザーズ・マニュアル。
【０１３２】
細胞をモニタするための追加的な道具は、ＰＲＯＤ分析構成要素及び、培養基の尿素および／またはアルブミン検出のための構成要素である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０１３３】
【非特許文献１】シュヴァルツ、ロバート、Ｅ等、ヒト胚性幹細胞から機能的な肝臓細胞を発育するための限定条件、幹細胞及び発育  １４：６４３−６５５（２００５）。
【非特許文献２】Ｒａｍｂｈａｔｌａ、ヒト胚性幹細胞からの大量の肝細胞様細胞、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．  ２００３；  １２（１）：１−１１
【非特許文献３】ハインズ等、ヒト胚性幹細胞の分化、由来物、特徴；  ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ；  ２００４；  ２２（３）：  ３６７−７６．
【特許文献】
【０１３４】
【特許文献１】国際公開ＷＯ０３０５５９９２、多能性胚盤胞由来幹細胞株の樹立方法
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００５／０９７９８０
【特許文献３】国際公開ＷＯ０１／８１５４９
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】出発物質の特性、ｈＢＳ細胞、即ち、（Ａ）形態学、（Ｂ）ＳＳＥＡ−１（陰性）、（Ｃ）ＳＳＥＡ−３、（Ｄ）ＳＳＥＡ−４、（Ｅ）ＴＲＡ−１−６０、（Ｆ）ＴＲＡ−１−８１、（Ｇ）Ｏｃｔ−４、（Ｈ）ＡＬＰ（すべてがｈＢＳ細胞株ＳＡ００２、ＬＯＴ  ＡＬ００２に由来）及び、右上に外胚葉性組織、右下の内胚葉組織、及び左の中胚葉性組織（ｈＢＳ細胞株ＳＡ１２１に由来）印をつけられた外胚葉性組織を有する免疫不全マウスからのエオシン染色された奇形腫断片、ヘマトキシリンによって図解される（Ｉ）体内多分化能。
【図２】以下の肝臓マーカーに陽性染色した肝細胞様細胞を示す：（Ａ）アルブミン、及び、（Ｂ）ＣＫ−１８、（Ｃ）ＤＡＰＩ（核）、及び（Ｄ）フェーズ対照、すべてがＳＡ００２に、継代５６、ｍＥＦｓでの２３分化日の後
【図３】以下の肝臓マーカーに陽性染色した肝細胞様細胞を示す：（Ａ）ＡＡＴ、（Ｂ）ＨＮＦ３ベータ及び（Ｃ）ＤＡＰＩ、全てがＳＡ０３４で、継代１３７、ｍＥＦでの分化の３２日以後。
【図４】以下の肝臓マーカーに陽性染色した肝細胞様細胞を示す：（Ａ）ＳＡ０３４でのＬＦＡＢＰ、継代１３５、ｍＥＦでの２５分化日後、及び初期の肝臓マーカー（Ｂ）ＡＦＰの弱陽性、ＳＡ００２で、継代５６、ｍＥＦでの２３分化日の後。
【図５】ＳＡ００２で（Ａ）ＣＫ１８と（Ｂ）Ｃｙｐ１Ａ２の共発現を示す。継代６３、ｍＥＦでの２３分化日の後。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図６】ＳＡ００２での（Ａ）ＣＫ１８と（Ｂ）Ｃｙｐ２Ａ６の共発現を示す。継代６３、ｍＥＦでの２３分化日の後。Ｃｙｐタンパク質発現は、さらにリファンピシン、デキサメタゾン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、オメプラゾール及びイソニアジド（データは示されない）のＣＹＰ誘発因子混合を使用して、更に誘導されることができる。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図７】継代６３、ｍＥＦでの２３分化日後の、ＳＡ００２での（Ａ）ＣＫ１８と（Ｂ）Ｃｙｐ２Ｂ６の共発現を示す。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図８】継代６３、ｍＥＦでの２３分化日後の、ＳＡ００２での（Ａ）ＣＫ１８と（Ｂ）Ｃｙｐ２Ｃ８／９／１９の共発現を示す。Ｃｙｐタンパク質発現は、さらにリファンピシン、デキサメタゾン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、オメプラゾール及びイソニアジド（データは示されない）のＣＹＰ誘発因子混合を使用して、更に誘導されることができた。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図９】継代６３、ｍＥＦでの２３分化日後の、ＳＡ００２での（Ａ）ＣＫ１８と（Ｂ）Ｃｙｐ２Ｄ６の共発現を示す。Ｃｙｐタンパク質発現は、さらにリファンピシン、デキサメタゾン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、オメプラゾール及びイソニアジド（データは示されていない）のＣＹＰ誘発因子混合を使用して、更に誘導されることができた。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図１０】ｍＥＦでの２３分化日後の、継代６３での、ＳＡ００２での（Ａ）ＣＫ１８と（Ｂ）Ｃｙｐ２Ｅ１の共発現を示す。Ｃｙｐタンパク質発現は、さらにリファンピシン、デキサメタゾン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、オメプラゾール及びイソニアジド（データは示されない）のＣＹＰ誘発因子混合を使用して、更に誘導されることができた。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図１１】ｍＥＦでの２３分化日後の、継代６３での、ＳＡ００２での（Ａ）ＣＫ１８と（Ｂ）Ｃｙｐ３Ａ４／７の共発現を示す。Ｃｙｐタンパク質発現は、さらにリファンピシン、デキサメタゾン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、オメプラゾール及びイソニアジド（データは示されない）のＣＹＰ誘発因子混合を使用して、更に誘導されることができた。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図１２】誘導混合物処理後にウエスタンブロット法によって視覚化される肝細胞様細胞のＣｙｐ３Ａ４／７及びＣｙｐ１Ａ２の誘導性を示す。ｍＥＦで２３−２５日の分化後の継代５１、５３、５４及び５５のＳＡ００２（ＬＯＴ  ＡＬ００２）及び、２３−２５日の分化後の継代５１、５３、５４及び５５のＳＡ００２．５（ＬＯＴ  ＢＥ００２．５）での誘導されたｈＢＳ細胞（リファンピシンのＣｙｐ誘発因子混合、デキサメタゾン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、オメプラゾール及び９６時間イソニアジド）非処理のｈＢＳ細胞：ＳＡ００２（ＬＯＴ  ＡＬ００２）、継代４７、５２及び５６、１９−２３日の分化後、及びＳＡ００２．５（ＬＯＴ  ＢＥ００２．５）継代４８、５３及びｍＥＦで５５、１９−２６日の分化後。ＨｅｐＧ２（Ｃａｔ  Ｎｏ  ＨＢ−８０６５，  ＡＴＣＣ）：陰性対照としての継代２３。陰性対照としての継代２での主たるケラチン生成細胞（Ｃａｔ  Ｎｏ  Ｃ−１２００３、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ））。陽性対照として使われ、解凍及び最近準備したヒト初代肝細胞（男性の及び女性の）。ベータ−アクチンが、内部ローディング対照として使われた。
【図１３】ＰＲＯＤ分析を使用する一般のＣｙｐ活性を示す。画像明るさによって視覚化される、Ｃｙｐ誘発因子（上記の通り）処理において活性は増加する。位相コントラスト（Ａ）及びＰＲＯＤ蛍光（Ｂ）の非処理の細胞、位相コントラスト（Ｃ）及びＰＲＯＤ蛍光（Ｄ）の誘導された細胞。位相コントラスト（Ｅ）及びＰＲＯＤ蛍光（Ｆ）における技術的対照（細胞にＰＲＯＤを追加することなく）。全ては、ｍＥＦで２６日分化後に、継代５６のＳＡ００２の画像である。灰色のスケールのよりよく明るさを視覚化するためにＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用している、赤から黄に変わる画像。
【図１４】リファンピシン、デキサメタゾン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、オメプラゾール及びイソニアジドの混合を加えることによって、（Ａ）前で誘導（Ｂ）後のＧＳＴ  Ａ１−１、（Ｃ）前で誘導（Ｄ）後のＧＳＴ  Ｍ１−１、及び（Ｅ）前で誘導（Ｆ）後のＧＳＴ  Ｐ１−１の発現を示す。ＧＳＴ  Ｍ１−１及びＧＳＴ  Ｐ１−１のはっきりした誘導は、観察されることができないが、ＧＳＴ  Ａ１−１のわずかな誘導は発見された。よりよく灰色のスケールの明るさを視覚化するために、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用して、赤から黄色に変わる画像。
【図１５】誘導混合物処理の後のウエスタンブロット法による、肝細胞様細胞におけるＧＳＴ  Ａ１−１の誘導を示す。９６時間リファンピシン、デキサメタゾン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、オメプラゾール及びイソニアジドのＣＹＰ誘発因子混合による処理及び非処理での、ｍＥＦの分化の２０−２６日後の、ＳＡ００２．５（ＬＯＴ  ＢＥ００２．５）継代３５、３６、４３及び４６、及びＳＡ１６７（ＬＯＴ  ＣＥ１６７）継代１７、１８，２５及び２８。ＧＳＴタンパク質製剤及びヒト男性及び女性の最近備えた（解凍した）、初代肝細胞が、対照として使われた。
【図１６】３つの異なるｈＥＳＣ株及びヒト肝細胞及びＨｅｐＧ２細胞に由来する肝細胞様細胞のＣＤＮＢへのＧＳＴ酵素活性、全タンパク質（平均±ＳＤ（ｎ＝３））のμｍｏｌ培養基共役／分／ｍｇとして示される。
【図１７】フェーズＩＩ代謝酵素ＵＧＴ１Ａ１及びＵＧＴ１Ａ６の肝細胞様細胞の免疫反応性を示す。ＣＫ１８（Ｂ）と共発現されるＵＧＴ１Ａ１（Ａ）、及びＣＫ１８（Ｄ）と二重着色されるＵＧＴ１Ａ６（Ｃ）、全てが、ｍＥＦでの２４日分化後の、ＳＡ００２で継代５９にある。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図１８】薬物輸送体ＯＡＴＰ−２／８のための肝細胞様細胞の免疫反応性を示す。継代５６、ＳＡ００２の（Ａ）ＤＡＰＩ、（Ｂ）ＯＡＴＰ−２／８、（Ｃ）位相コントラスト、ｍＥＦでの２３日分化後。よりよく灰色のスケールの明るさを視覚化するためにＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用して赤から黄に変わる画像。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図１９】薬物輸送体ＢＳＥＰのための肝細胞様細胞の免疫反応性を示す。ｍＥＦで２３日分化後、ＳＡ００２の継代３２の（Ａ）ＤＡＰＩ、（Ｂ）ＢＳＥＰ、（Ｃ）位相コントラスト。よりよく灰色のスケールの明るさを視覚化するためにＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用して赤から黄に変わる画像。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図２０】薬物輸送体ＭＲＰ−２のための肝細胞様細胞の免疫反応性を示す。ｍＥＦで２２日分化後、ＳＡ００２の継代３３の（Ａ）ＤＡＰＩ、（Ｂ）ＭＲＰ−２、（Ｃ）位相コントラスト。よりよく灰色のスケールの明るさを視覚化するためにＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用して赤から黄に変わる画像。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図２１】細胞株ＳＡ００２、ＬＯＴ  ＡＬ００２からの肝細胞様細胞のグリコーゲンの保管を示す、２１日分化後の継代１５。グリコーゲンは、ＰＡＳ染色−システムによってピンクの染色として検出される。培養は、（ＢとＤ）のどちらで処理されるかまたは、グリコーゲン検出の前にヒト唾液（Ａ及びＣ）で処理されていない。
【図２２】マトリゲルに分化する肝細胞様細胞のＣＹＰ及びＧＳＴ免疫染色を示す。ＳＡ００２及びｐ５７での（Ｂ）Ｃｙｐ２Ｂ６と共発現される（Ａ）Ｃｙｐ１Ａ２および（Ｄ）ＧＳＴ  Ａ１−１と共発現される（Ｃ）ＣＫ１８、マトリゲルでの２４日間の分化後。よりよく灰色のスケールの明るさを視覚化するためにＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用して赤から黄に変わる画像。
【図２３】ｃＤＮＡの同じ総量からの未分化のｈＢＳ細胞の対照サンプル（ＢＥ００２．５継代２４、５日（対照サンプル１）及びＢＥ００２、継代６２、４日（対照サンプル２））に関連する２１分化日の継代２の、細胞株ＳＡ００２．５、ＬＯＴ  ＢＥ００２．５から肝細胞様細胞におけるＱＰＣＲを使用して高いＭＲＰ−２発現を示す。発現レベルは、３つの細胞サンプルのために得られるＣＴ値（閾値サイクル）から算出され、さらに対照サンプル２の発現に比較される。肝細胞様細胞のＭＲＰ２発現は、未分化細胞のものより１１から３２倍高い。
【図２４】肝細胞様細胞におけるＣｙｐ１Ａ２発現の誘導を示す。非処理の肝細胞様細胞（Ａ）及び、対応する位相コントラスト（Ｂ）及び、誘導された（Ｃ）及び、対応する位相コントラスト（Ｄ）。よりよく灰色のスケールの明るさを視覚化するためにＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用して赤から黄に変わる画像。
【図２５】肝細胞様細胞でのＣｙｐ２Ｂ６発現の誘導を示す。非処理の肝細胞様細胞（Ａ）及び、対応する位相コントラスト（Ｂ）及び、誘導された（Ｃ）及び、対応する位相コントラスト（Ｄ）。よりよく灰色のスケールの明るさを視覚化するためにＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用して赤から黄に変わる画像。
【図２６】胚マウス肝臓と共培養されるｈＢＳ細胞によって形成されるＡＦＰ陽性の肝芽細胞様細胞を示す。赤（特徴的に核を染色してある）のヒト特定の核抗原、ｈＢＳ細胞は緑の内胚葉由来されたＡＦＰ陽性の大きいクラスタを引き起こしていることを示す（実施例２を参照）。
【図２７】細胞株ＳＡ１６７（Ａ及びＢ）、ＳＡ００２（ＣおよびＤ）及びＳＡ００２．５（Ｅ及びＦ）に由来した非処理及び誘導された肝細胞様細胞のＣｙｐ１Ａ２、３Ａ４／７及び１Ａ１タンパク質発現のウエスタンブロット法分析を示す。Ａ、Ｃ、Ｅ：非処理の細胞、Ｂ、Ｄ、Ｆ：誘発因子カクテルで処理される細胞、Ｇ：ヒト肝細胞Ｌｏｔ  ＧＩＵ  ２２（ＣＹＰ１Ａ１  Ｌｏｔ  ＭＹＯ）、Ｈ：未分化のｈＥＳＣ株ＳＡ００２．５、Ｉ：ＭＥＦ、Ｊ：ＨｅｐＧ２細胞及びＫ：組み換え型ＣＹＰ１Ａ１。
【図２８】（Ａ）は、肝臓／内胚葉マーカーＨＮＦ４アルファの反応を示す。（Ｂ）は、集団における繁殖細胞の割合を示すために使用されるマーカーであるＫｉ６７の反応である。（Ｃ）は、多くの肝芽細胞様細胞に共存されるＨＮＦ４アルファ及びＫｉ６７を示す。（Ｄ）はＤＡＰＩ（染色核）示す。（Ｅ）は形態学を示す。
【図２９】培養基への反応として増殖能に関連する結果及びその誘導を示す。（実施例４を参照）。ＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）の培養された（Ａ）−（Ｃ）は  ＳＡ００２細胞の肝細胞様細胞を示す。（Ａ）は、形態学を示している。（Ｂ）ＫＩ６７マーカー反応なしをを示す（即ち、増殖なし）。（Ｃ）肝臓マーカー・アルファ−１−抗トリプシン反応を示している。（Ｄ）−（Ｆ）は、Ｗｉｌｌｉｍａｓ  Ｅ培養基で培養された肝細胞様ＳＡ００２細胞を示す。（Ｄ）は、形態学を示している。（Ｅ）ＫＩ６７マーカー（増殖）反応を示している。（Ｆ）は、肝臓マーカー・アルファ−１−抗トリプシン反応を示している。
【図３０】肝細胞様細胞及び初代肝細胞のＥＲＯＤ反応を示す。左の欄は、（上部から）未処理、オメプラゾール＋リファンピン誘導、及び６−構成要素カクテル誘導の肝細胞様細胞でのＥＲＯＤ活性を示し、右側の欄は、初代肝細胞の対応結果を示す。肝細胞様細胞は、したがって、特定のＣｙｐ１Ａ２反応性を有し、それは、非常に弱いながら、Ｃｙｐ誘発因子処理の前に検出された。（実施例１３を参照。）
【図３１】ＨｅｐＧ２と比較して肝細胞様細胞由来のｈＢＳ細胞におけるＣｙｐ活性を示す。（Ａ）及び（Ｄ）は、非処理の肝細胞様細胞を示し、（Ｂ）及び（Ｅ）は、誘導肝細胞様細胞を示し、（Ｃ）及び（Ｆ）は、ＨｅｐＧ２を示す。
【図３２】肝細胞様細胞及び初代肝細胞のＰＲＯＤ反応を示す。左の欄は、（上部から）非処理、プリミドン誘導、及び６−構成要素カクテル誘導の肝細胞様細胞でのＰＲＯＤ活性を示し、右側の欄は、初代肝細胞の対応する結果を示す。肝細胞様細胞は、したがって、Ｃｙｐ誘発因子処理の前に一般のＣｙｐ活性を有する。（実施例４を参照。）
【図３３】肝細胞小管区分（左）を有するラット肝細胞（ｌａｎ  Ｃｏｔｇｒｅａｖｅ教授からの画像）及び小管類似構造（右）を有する肝細胞様細胞を示す。
【図３４】ｈＢＳ細胞から肝芽細胞様細胞を経過して肝細胞様細胞の由来物のためのフローチャートを示す。
【図３５】１７日間後の培養下の膜表現型Ｎｏｔｃｈ２（膜組織で、緑の）及び細胞株ＳＡ４６１（継代２６）の核染色（青の）の発現を示す。矢印は、双核肝細胞様細胞を示す。拡大倍率２５０ｘ。
【図３６】Ｃｙｐ３Ａ４、３Ａ７、１Ａ１、１Ａ２及びＣｙｐ２Ａ６の相対的な遺伝子発現レベルが肝細胞様細胞、ＨｅｐＧ２及びヒト肝エキスの誘導及び非誘導培養のリアルタイムＰＣＲ技術によって測定及び比較されたことを示す。ヒト肝エキスの測定は、１にセットされ、他のサンプルは、各々のシトクロムｐ４５０のヒト肝臓基準に関連する。全ての遺伝子のための発現は、ＧＡＰＤＨ（ＣＹＰ１Ａ１／１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６またはＴＢＰ（ＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７）に対して標準化される。
【図３７】肝細胞様細胞を培養するための培養基の改良の研究デザインを示す。研究デザインＡ；培養基の１００％は、１５日後にＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）からＨＣＭに交換され、２３日に５０％のＨＣＭは、新規なＨＣＭ−培養基と取り替えられた。実験は、細胞株ＳＡ００２で行われた。研究デザインＢ；培養基の１００％は、２３日後にＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）からＨＣＭに交換された。実験は、細胞株ＳＡ３４８で行われた。
【図３８】研究デザインＡ及びＢ、図３７及び実施例１、２及び表５に基づいて、それぞれＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）（Ａ）及びＨＣＭ（Ｂ）で培養された肝細胞様細胞の形態を示す。
【図３９】研究デザインＡ及びＢ、図３７及び実施例１、２及び表５に基づくＨＣＭと比べて、ＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）でのＨＮＦ４−アルファ、アルブミン、ＣＹＰ３Ａ４及びＵＧＴ２Ｂ７の相対的なｍＲＮＡ発現レベルを示す。参照プロトコル（ＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標））からのデータは、１に設定され、ＨＣＭ−培養基による異なる遺伝子の発現レベルの倍増加は、グラフに示される。
【図４０】肝細胞様細胞を培養する培養基での増強剤及び誘導因子のための研究計画を示す。研究デザインＣ；５０μｍデキサメタゾンが、２２−２４日以後に加えられた。実験は、細胞株ＳＡ００２、ＳＡ１６７及びＳＡ３４８で行われた。研究デザインＤ；ＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）培養基が、別の５日間、ＨＧＦ及びナトリウム酪酸塩（ＮａＢ）で補充されるＨＣＭ−培養基に、２１日後に交換された。
【図４１】研究デザインＣ、図４０及び実施例１、２、３及び表６に基づいて、ＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）（Ａ）及び５０μｍデキサメタゾンで補充されるＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）（Ｂ）で培養された肝細胞様細胞の形態を示す。同じく、研究デザイン  Ｄ、図４０及び実施例１、２及び表７に基づいて、Ｃ）ＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）、ＨＧＦ及び酪酸ナトリウムで補充されるＤ）ＨＣＭで培養された肝細胞様細胞。
【図４２】Ａ）研究デザインＣ、図４０及び実施例１、２、３及び表６に基づいて、５０のμｍデキサメタゾン処理の後の肝細胞様細胞でのＨＮＦ４−アルファ、アルブミン、ＣＹＰ３Ａ４及びＵＧＴ２Ｂ７の相対的なｍＲＮＡ発現レベルを示す。Ｂ）研究デザインＤ、図４０及び実施例１、２及び表７に基づく、酪酸ナトリウム及びＨＧＦ処理後の相対的ｍＲＮＡ遺伝子発現レベルを示す。参照プロトコル（ＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標））からのデータは、１に設定され、異なる処理による異なる遺伝子の発現レベルの倍増加は、グラフに示される。
【図４３】培養基置換頻度、希薄及び頻繁な培養基置換のための研究計画を示す。ＨＣＭ及びＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）が使われた。
【図４４】研究デザインＥ、図４３及び実施例１、表８に基づく、希薄な（Ａ）対頻繁な（Ｂ）培養基置換後の肝細胞様細胞の形態を示す。
【図４５】研究デザインＥ、図４３及び実施例１、表８に基づく、頻繁な培養基置換と比較したまれな培養基置換後のＨＮＦ４−アルファ、アルブミン、ＣＹＰ３Ａ４及びＵＧＴ２Ｂ７の相対的なｍＲＮＡ遺伝子発現レベルを示す。頻繁な培養基置換からのデータは、１に設定され、まれな培養基置換後の異なる遺伝子の発現レベルの倍増加は、グラフに示される。
【図４６】９６−ウェルにコーティングされるコラーゲンＩに３８日旧肝細胞様細胞を再接種後の３日（Ａ）から６日（Ｂ−Ｃ）まで。肝細胞様細胞の外植体は、再接種する前に、Ｃａ及びＭｇ−フリーＰＢＳ（Ａ）またはコラゲナーゼ（Ｂ−Ｄ）に処理された。培養物は、肝細胞マーカーＣＫ１８（Ｂ，Ｄ）及びＨＮＦ３ベータ（Ｃ）のために、二倍染色される。図尺度：１００μｍ（Ａ）及び５０μｍ（Ｂ−Ｃ）。実験的な詳細のために、実施例１５を参照。
【図４７】（Ａ−Ｃ及びＧ−Ｉ）及びｍＥＦ−細胞層（Ｄ−Ｆ及びＪ−Ｌ）９６−ウェルにコーティングされるコラーゲンＩに再接種の５日後、肝芽細胞様細胞の免疫細胞学及び形態を示す。培養物は、肝芽マーカーＨＮＦ４アルファ（Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ）及びＣＫ１９（Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋ）のために染色された。核染色のためのＤａｐｉを有するマーカーのオーバレイ図は、Ｂ、Ｅ、Ｈ及びＫに示される。各々の染色のための対応の形態図は、Ｃ、Ｆ、Ｉ及びＬでそれぞれ見られる。図Ｃの矢印は、重核細胞を示す。図尺度：２５μｍ；４０ｘ対物レンズが使われた。実験的な詳細のために、実施例１８を参照。
【図４８】３０日の旧培養における肝細胞様細胞のＩＣＧ摂取を示す。
【図４９】１５日の旧培養での肝芽を示す。細胞は、ＣＫ１９（Ａ）、ＣＫ７（Ｂ）及びＥｐＣａｍ（Ｃ）に陽性である。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【０１３６】
出発物質
本発明のための出発物質は、例えば未分化のｈＢＳ細胞株のような最適に多能性未分化のｈＢＳ細胞である。前記材料は、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ  ＡＢ社から得られることができ、さらにＮＩＨ幹細胞レジストリを通して入手できる。ｈｔｔｐ：／／ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｒｅｇｉｓｔｒｙ／。Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ  ＡＢ社は、２種のｈＢＳ細胞株（ＳＡ００１及びＳＡ００２）を有し、ＳＡ００２（ＳＡ００２．５）の１つのサブクローンがＮＩＨを通して入手できる。加えて、２０のＣｅｌｌａｒｔｉｓ細胞株は英幹細胞バンクにリストされる。それらのｈＢＳ細胞株及び加えて、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ  ＡＢ社からのＳＡ１６７及びＳＡ３４８が、本願発明において多用された。出発物質として推薦されるｈＢＳ細胞の特性は、以下である：アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ  １−６０、ＴＲＡ  １−８１、Ｏｃｔ−４の陽性反応、ＳＳＥＡ−１の陰性反応、テロメラーゼ活性、及びインビトロ及びインビボの多分化能（後者は免疫不全マウスの奇形腫形成によって示される）（図１を参照）（方法及びプロトコルはすでに開示された。ハインズその他、国際公開ＷＯ０３０５５９９２）。
【０１３７】
ＬＯＴ調製及び特性解析プログラム
ｈＢＳ細胞株のＬＯＴ調製は、標準化された方法に基づくｈＢＳ細胞の培養拡張及び、次の１つの単一通過での１００本以上のストローの冷凍を構成する（出願中の特許国際公開ＷＯ２００４０９８２８５）。ｈＢＳ細胞株の形態は、冷凍の前後、更に、ＬＯＴからの細胞の解凍後の次の培養における連続的な継代でモニタされる。ＬＯＴ冷凍の品質は、解凍回復率の検査によって確認され、それは、１０解凍の各ストローのための１００％の解凍速度を示す。すなわち、細胞材料は、解凍時に各々のガラス化ストローから二次培養されることができる。微生物学的に安全に関する安全試験は、細胞に汚染がないかを確認するために、それから細胞及び冷凍継代での培養基に実行される。実行される特性解析プログラムは、ｈＢＳ細胞株の分化状態を確認するために方法の幅広い範囲を含む。最初に、未分化の細胞（ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、Ｏｃｔ−４及びＡＬＰ）のための一般に認められたマーカーのマーカー発現分析が、実行される。継代全体における細胞の遺伝子安定性及び冷凍−解凍サイクルは、染色体分析及びＦＩＳＨで点検される。テロメラーゼ活性は、Ｔｅｌｏ  ＴＡＧＧＧ  テロメラーゼ  ＰＣＲ  ＥＬＩＳＡＰＬＵＳキットを使用して測定される。ｈＢＳ細胞の多分化能は、胚様体ステップによるインビトロ分化及び、免疫不全ＳＣＩＤマウスの腎臓被膜でのｈＢＳ細胞の移植によるインビボ分化によって調べられる。
【０１３８】
ここで用いられる出発物質は、さらに、完全に異種動物由来成分不含であってもよく、それによって、異種動物由来成分不含肝細胞様細胞は、再生医療の潜在的使用のために得られて、したがって、組織不適合性及び人間外の病原体の潜在的転送の危険度をかなり減少させる。ｈＢＳ細胞の異種動物由来成分不含由来のために、全ての培養基及びマトリックス構成要素、フィーダ細胞及び使用する他の材料は、いかなる人間以外の動物材料に由来、または接触してはならない。ｈＢＳ細胞の異種動物由来成分不含由来のための適切な構成要素及び、異種動物由来成分不含肝細胞様細胞は、異種動物由来成分不含のヒト線維芽細胞であり、それは、例えばヒト包皮線維芽細胞、ヒト組み換え型成長因子を有する培養基ベース無血清またはヒト血清、分化因子および／または潜在的他の添加物、及び細胞の培養及び分離のための殺菌メカニカル道具またはヒト組み換え酵素である。
【実施例２】
【０１３９】
肝細胞様細胞を得るためのプロトコル
内因子プロトコル（分化は、培養基に分泌される内因子への暴露によって誘導される）
ａ）ＩＶＦ培養皿（ファルカン）でのｍＥＦ細胞層で育てられるｈＢＳ細胞は、肝細胞様細胞を得るために、３７℃、５％のＣＯ２及び９５％の湿度の下で最高４０日間分化させられる。使用する培養基（４ｎｇ／ｍｌの加えられるヒト組み換え型ｂＦＧＦ［インビトロゲン］を有するＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）［Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ  ＡＢ社］）は、およそ１から２ｍｌの旧培養基を放棄し、１から２ｍｌの新しい培養基に加えることによって、７日及び２１日ごと、通常１４日ごとに変えられる。１８日から３０日後に、肝細胞様細胞は、カット及び転送ツールとして鋭いミクロ毛細管またはＳｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｏｏｌ（商標）（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ  ＡＢ社）を使用して培養から分離され、細胞はそれから長期保存（冷凍された）または即時利用のためにプールされるか、または培養皿に直接染色されるかまたは固定されるかまたは、例えばＣｙｐ活性分析の生体細胞として使用される。ｈＢＳ細胞の分化がｍＥＦＳ（例えばマトリゲル上のｈＢＳ細胞培養）の非存在下で徹底的に変更されるので、ｍＥＦＳは肝細胞様細胞の発育を支える基本的信号を提供するようであり、少ない肝細胞様細胞が、その培養（データは示されてない）から得られることができる。これは、そのような培養物のためのｍＥＦ−馴化培地を用いて、培養基へのｍＥＦｓによる因子の分泌物を指定して部分的に救われることができる。従って、我々は、培養期間で培養基を二度以上に変えることは、肝細胞様細胞を得るための不利な点であることを観察した。肝細胞様細胞を得るための重要なもう一つの要素は、ｂＦＧＦで培養基を補充することである。
【０１４０】
ｂ）４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦで補充されるｍＥＦ馴化培地Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ベクトン−ディッキンソン）で育てられるｈＢＳ細胞は、肝細胞様細胞を得るために、３７℃、５％のＣＯ２及び９５％の湿度下で最大４０日間、分化される。使用する培養基は、７日及び２１日ごとの間で変えられる。１８日から３０日後に、肝細胞様細胞は、カット及び転送ツールとして鋭いミクロの毛細管またはＳｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｏｏｌ（商標）を使用して培養物から分離され、細胞は、それから長期保存（冷凍された）または即時利用のためにプールされるかまたは、固定及び例えば免疫組織化学の特性解析のために使用される。
【０１４１】
肝細胞様細胞及び分化細胞集団を有する培養皿内の肝芽細胞様細胞の選択が手動で実行され、大部分は形態学に依存する。形態学は、主に免疫組織化学を使用する以前の経験及び完全な実験によって肝臓マーカー発現に関連づけられ、それは例えば実施例３から７までにリストされる。その経験で、熟練した人は、形態学によって能動的に肝細胞様細胞を選ぶことができる。
【０１４２】
肝芽細胞様細胞を得るために、同じプロトコルが使われるが、潜伏期間は、１０日から２０日間、好適には１５日間短くなる。
【０１４３】
フィルタ培養
ＩＶＦ皿内のｍＥＦで５日から１０日間培養された未分化ｈＢＳ細胞（ＢＥ００２．５継代４２）は、小さい断片に切られ、ガラス毛細管を用いて、４００μｌ培養基を含んでいる２４−ウェルプレートのフィルタ挿入紙（孔サイズ：４μｍの直径、外植体培養のために特殊化される、ミリポア）に移動される。フィルタは、培養基に細胞がおぼれることを妨げながら、細胞の栄養摂取を可能にし、水分環境をつくる培養基面と接触し、それによって、体内状況は、模倣される。培養基は、５０％のＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）及び４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦで補充されるｍＥＦ内の未分化のｈＢＳ細胞からの５０％の馴化培地を構成する。半分の培養基は、一日おき又は３日ごとに変えられる。細胞は、分析の前にそれぞれ７、１４、２１及び３１日間分化する。３Ｄ−ｈＢＳ細胞培養は、免疫組織化学によって分析される。培養物は、３０％のサッカロースの低温保存の後に４％のＰＦＡに取り付けられ、Ｓａｋｕｒａ  Ｏ．Ｃ．Ｔ．  ｔｉｓｓｕｅ−ｔｅｋに組み込まれる。１０μｍのクリオ切片は、異なる内胚葉の免疫反応性のマーカー及び肝細胞様マーカーために形態学的に分析される。
【０１４４】
共同培養プロトコル
マウス胚肝臓の器官形成は、三次元フィルタシステムの肝細胞様細胞へのｈＢＳ細胞分化を促進することができる。異なる発育的な段階におけるＥＧＦＰ（強化された緑の蛍光タンパク質）トランスジェニック・マウス胚の肝臓外植体は分離され、フィルタシステムで培養されるｈＢＳ細胞に移植される。対照培養物として、ｈＢＳ細胞のみ、または肝臓以外のマウス胚外植体（心臓及び卵黄嚢）は、ｈＢＳ細胞に移植され、フィルタ上で培養された。共同培養物は、４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦで補充されるＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）で培養され、培養基の５０％は、２日目又は３日目ごとに交換された。７日目及び１４日目に、共培養が免疫組織化学分析のために用意された。ＨＮＦ３ベータ、ＡＦＰ、ＨＮＦ４アルファ、ＣＫ１８、ＣＹＰ３Ａ４／７及びＣＹＰ１Ａ２／１のような内皮性及び肝臓マーカーが分析された。
【０１４５】
内胚葉由来構造の量または数は、４つのカテゴリ、即ち小さいクラスタ、大きいクラスタ、ダクト及びライニング、皮覆組織（下の定義を見る）に分けられた。皮覆組織を除いて、構造は内胚葉及び初期の肝臓マーカーＡＦＰ、ＨＮＦ３ベータ及びアルファ−１−抗トリプシンに陽性だった。異なる構造の数は、各々の断面及び培養物のために計数された。各々の構造の総数が、各々の共培養のために計数された断面の数に割られた。これは、構造が断面につきどれくらいよく起こっているかを測定する数値をもたらし、三次元ｈＢＳ細胞共培養での内胚葉構造の数量の表示を与える。平均値及び各グループ（ｎ＝３）の平均（ＳＥＭ）の標準エラーが算出された。研究は、二回繰り返された。
【０１４６】
小さいクラスタが、ＡＦＰに陽性である５つの細胞より少ないかまたは同じ数の集合として定義された。大きいクラスタは、ＡＦＰに陽性である６つの細胞より多いかまたは同じ数の集合として定義された。ダクト及びライニングは、単一またはマルチ層中空構造として定義される一般的なカテゴリを形成した。皮覆組織は、細胞のＡＦＰ陽性ライニングまたはクラスタと関連する堅い列の細長い核を有する有機物化される構造として定義された。皮覆組織は、ＡＦＰに決して陽性でない。１４日目において、ダクト及びライニングが単にマウス胚外植体移植片を含むグループに存在する場合、全てのグループは、小さいクラスタの類似した量を現し、それで、自発的に分化するｈＢＳ細胞は、ダクト及びライニングを形成する傾向ではなかった。しかし、大きいクラスタは、卵黄嚢及び心臓共培養と比較してよりよく肝臓共培養で発生し、自発的に、ｈＢＳ細胞を分化させた。組織、例えば大きいクラスタ及びダクトは、例えばＨＮＦ３ベータ、ＡＦＰ、アルファ−１−抗トリプシン、Ｈｎｆ４アルファ、ＣＹＰ３Ａ４／７及びＣＹＰ１Ａ２／１のような内胚葉及び肝臓マーカーに陽性であった。しかし、クラスタは未成熟肝細胞様細胞を潜在的に示しているＣＫ１８に陰性であった。
【０１４７】
全体的に、データは、ｈＢＳ細胞が単独より肝臓との直接の接触時に、Ｅ１０．５マウス胚から肝芽細胞様細胞または肝細胞様細胞により有効に分化させることができることを示す。
【０１４８】
表１は、Ｅ１０．５胚マウス肝臓のｈＢＳ細胞の共培養の１４日後に、免疫組織化学によって分析される肝臓マーカーの一覧を示している。
【０１４９】
【表１】
2009539358.tif 000063
【実施例３】
【０１５０】
肝臓マーカーによる特性解析（図２、３及び４を参照）
肝細胞様細胞は、肝細胞の典型的な形態学を表示する。すなわち、それらは多角形の細胞形状、大きい細胞直径（凡そ２５−５０μＭ）を有し、よく核を二つもち、脂肪顆粒を蓄積する傾向がある。さらに、それらは肝臓細胞型のために記載されるいくつかのマーカー、例えばアルブミン、アルファ１−抗トリプシン、ＬＦＡＢＰ、ＣＫ１８及びＨＮＦ３ベータを表示する。それらは未分化の細胞のために使われる幹細胞マーカーであるＯｃｔ−４をもはや表示しない。おそらくいくつかの未成熟肝細胞様細胞は依然として胎児の肝臓マーカーＡＦＰを表示する。これらの細胞は、優先して分化ｈＢＳ細胞のコロニーで見つかる。細胞核を視覚化する対照としてのＤＡＰＩ（４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール  二塩酸塩水和物、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）。（マトリゲル（商標）で分化された肝細胞様細胞のＣＫ１８発現のために図２２を参照。）
【０１５１】
繁殖的な肝芽細胞様前駆細胞の識別のために、ＡＦＰ、ＨＮＦ４アルファ、ＣＫ１９、ＣＫ７及びＥｐＣａｍが、使われた。（図４９）
【０１５２】
使用された一次抗体：
アルブミン（ウサギ）１：５００、ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ａ０００１
ＡＡＴ（ウサギ）１：２００、ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ａ００１２
ＣＫ１８（マウス）１：２００、ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｍ７０１０
ＬＦＡＢＰ（ヤギ）１：５００、サンタクルーズ、ｓｃ−１６０６４
ＨＮＦ３ｂ（ヤギ）１：２５０、サンタクルーズ、ｓｃ−６５５４
Ｏｃｔ−４（マウス）１：５００、サンタクルーズ、ｓｃ−５２７９
ｃ−Ｍｅｔ（ＨＧＦ受容体（マウス））１：１００、ｕｐｓｔａｔｅ、０５−２３７
アルファ６−インテグリン（ＣＤ４９ｆ（ラット））１：２５０、ＢＤ  バイオサイエンス、５５５７３６
ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４（マウス））１：５００、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、５５９０４７
ＡＦＰ（マウス）１：２００、ＳＩＧＭＡ、Ａ８４５２
ＨＮＦ４アルファ（ウサギ）１：４００、サンタクルーズ、ｓｃ−８９８７
ＣＫ１９（マウス）１：２００、Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ、ＮＣＬ−ＣＫ１９
ＣＫ７（マウス）１：２００、Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ、ＮＣＬ−Ｌ−ＣＫ７−５６０
ＥｐＣＡＭ−ＦＩＴＣ（１：２００）ＧｅｎｅＴｅｘ  Ｉｎｃ社  ＧＴＸ２８６６６
【０１５３】
使用された第２の抗体：
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｇｏａｔ−Ａｌｅｘａ  ４８８、１：５００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、＃  Ａ−１１０５５
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ  ｍｏｕｓｅ−Ｃｙ３（１：１０００）Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＃７１５−１６５−１５１
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ−Ｃｙ２（１：１００）Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＃７１５−２２５−１５１
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ−Ａｌｅｘａ４８８（１：１０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  ＃Ａ−２１２０６
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ−Ａｌｅｘａ５９４（１：１０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  ＃Ａ−２１２０７
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｒａｔ−Ｃｙ３（１：５００）Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＃７１２−１６５−１５３
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｒａｔ−Ｃｙ２（１：１００）Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＃７１２−２２５−１５３
【０１５４】
免疫染色プロトコル：
アルブミン、ＡＡＴ、ＣＫ１８、ＨＮＦ３ｂ、Ｏｃｔ−４、ＣＫ１９、ＣＫ７、ＡＦＰ：
４％ＰＦＡに１５分凝固し、２回ＰＢＳ洗浄し、０，１％  ＰＢＴの５％ＦＢＳに３０分入れ、一次抗体を０．１％ＰＢＴの１％ＦＢＳ中で４℃で一晩培養させ、二次抗体を０．１％ＰＢＴの１％ＦＢＳ中で常温で３時間培養させ、全ては０．１％ＰＢＴ、０．０５ｍｇ／ｍｌのＤＡＰＩの中で常温で５分間洗浄され、ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ封入剤のなかで組み込まれる。
【０１５５】
ＬＦＡＢＰ、ｃ−Ｍｅｔ、アルファ６−インテグリン、ＩＣＡＭ−１、ＣＸＣＲ４：
４％ＰＦＡに１５分凝固し、２回ＰＢＳ洗浄し、ＰＢＳ内の５％ＦＢＳに３０分入れ、一次抗体をＰＢＳの１％ＦＢＳ中で４℃で一晩培養させ、二次抗体をＰＢＳの１％ＦＢＳ中で常温で３時間培養させ、全ては０．０５ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ、ＤＡＰＩの中で常温で５分間洗浄され、ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ封入剤の中で組み込まれる。
【０１５６】
ＥｐＣａｍ：
４％ＰＦＡに１５分凝固し、２回ＰＢＳ洗浄し、０，１％ＰＢＴの５％ＦＢＳに３０分入れ、０．１％ＰＢＴの１％ＦＢＳ中で４℃で一晩培養される一次抗体を直接活用するＦＩＴＣ、０．０５ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ、ＤＡＰＩの中で常温で５分間洗浄され、ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ封入剤の中で組み込まれる。
【実施例４】
【０１５７】
特徴描写
フェーズＩ代謝酵素：
肝細胞様細胞は、以下のＣｙｐｓの免疫反応性を表示する：１Ａ２、２Ａ６、２Ｂ６、２Ｃ８／９／１９（３つの亜類型間の潜在的抗体交差反応）、２Ｄ６、２Ｅ１、３Ａ４／７（２つの亜類型間の潜在的抗体交差反応）。（ｍＥＦに分化される肝細胞様細胞は図５−１１を参照、マトリゲル（商標）で分化された肝細胞様細胞でのＣｙｐ１Ａ２及びＣｙｐ２Ｂ６発現は、図２２を参照）。Ｃｙｐ発現誘導性は、２５μＭリファムピン、２０μＭデソキシフェノバルビタール（プリミドン）、１００μＭデキサメタゾン、８８ｍＭのエタノール、２５μＭオメプラゾール及び１００μＭイソニアジドを含むＣｙｐ誘導混合物に９６時間の暴露の後に見られた。（ｍＥＦでの肝細胞様細胞のＣｙｐ  １Ａ２及び２Ｂ６の誘導について、図２４及び２５を参照）ＣｙｐｓはさらにＨｅｐＧ２内で免疫組織化学的に分析された。それは、いかなる反応も引き起こさなかった（図３１を参照）。
【０１５８】
使用された一次抗体：
Ｃｙｐ１Ａ２（ウサギ）１：１００、ｂｉｏｍｏｌ、ＣＲ３１３０；
Ｃｙｐ２Ａ６（ウサギ）１：１００、ｂｉｏｍｏｌ、ＣＲ３２６０；
Ｃｙｐ２Ｂ６（ヒツジ）１：１００、ｂｉｏｍｏｌ、ＣＲ３２９５；
Ｃｙｐ２Ｃ８／９／１９（ウサギ）１：１００、ｂｉｏｍｏｌ、ＣＲ３２８０；
Ｃｙｐ２Ｄ６（ヒツジ）１：１００、ｂｉｏｍｏｌ、ＣＲ３２４５；
Ｃｙｐ２Ｅ１（ウサギ）１：１００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、ＡＢ１２５２；
Ｃｙｐ３Ａ４／７（ヒツジ）１：１００、ｂｉｏｍｏｌ、ＣＲ３３４５；
Ｃｙｐ２Ｅ１（ウサギ）１：１０００、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＰＡ２６；
Ｃｙｐ３Ａ４／７（ウサギ）１：１０００、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＰＡ３２。
【０１５９】
使用された第２の抗体：
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｇｏａｔ−Ａｌｅｘａ  ４８８、１：５００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、＃Ａ−１１０５５
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ  ｍｏｕｓｅ−Ｃｙ３、１：１０００、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、＃７１５−１６５−１５１
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ−Ｃｙ２、１：１００、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、＃７１５−２２５−１５１
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ−Ａｌｅｘａ  ４８８、１：１０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、＃Ａ−２１２０６
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ−Ａｌｅｘａ  ５９４、１：１０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、＃Ａ−２１２０７
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｒａｔ−Ｃｙ３、１：５００、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、＃７１２−１６５−１５３
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｒａｔ−Ｃｙ２、１：１００、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、＃７１２−２２５−１５３
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｓｈｅｅｐ−Ａｌｅｘａ  ４８８、１：１０００、＃Ａ−１１０１５
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｓｈｅｅｐ−Ａｌｅｘａ  ５９４、１：１０００、＃Ａ−１１０１６
【０１６０】
免疫染色プロトコル：
４％ＰＦＡに１５分凝固し、２回ＰＢＳ洗浄し、０．１％ＰＢＴ内の５％ＦＢＳに３０分入れ、一次抗体を０．１％  ＰＢＴの１％ＦＢＳ中で４℃で一晩培養させ、二次抗体を０．１％ＰＢＴの１％ＦＢＳ中で常温で３時間培養させ、全ては０．１％  ＰＢＴ、０．０５ｍｇ／ｍｌのＤＡＰＩの中で常温で５分間洗浄され、ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ封入剤の中で組み込まれる。
【０１６１】
ウエスタンブロット法：
Ｃｙｐ１Ａ２及び３Ａ４／７発現は、ウエスタンブロット法（図１２を参照）において確認された。Ｃｙｐ誘導剤処理で、１Ａ２及び３Ａ４及びまたは３Ａ７のタンパク質量（潜在的交差反応）は、非処理及び誘導の細胞からのタンパク質バンドに比べて肝細胞様細胞の誘導性の視覚化を明らかに強化した。タンパク質は、Ｍ−ＰＥＲタンパク質摘出試薬（ピアス）を使用して細胞から抽出され、１：１００プロテアーゼ抑制剤カクテル（シグマ−アルドリッチ）で補充される。タンパク質は、電気泳動法によって１２％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離され、ニトロセルロース膜組織に変えられる（Ｂｉｏｒａｄ、ヘラクレス、ＣＡ）。免疫ブロット法のために、（Ｃｙｐ１Ａ２（ウサギ）及びＣｙｐ３Ａ４／７（ウサギ）、両方ともＢｉｏｍｏｌから）に対する一次抗体は、１％のＢＳＡブロッキングバッファーに希釈された。二次抗体は、対応ＨＲＰ−共役抗体であった（それぞれヤギ抗ウサギ、ヤギ抗マウス及びウサギ抗ヤギ（１：２０００；  ＤＡＫＯ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク））。強化化学ルミネセンス（ＥＣＬ）が、製造業者の指示（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）によって使われた。ＨｅｐＧ２細胞が、陰性対照として使われた。一次ヒト肝細胞（インビトロ  テクノロジーズ、ライプツィヒ、ドイツ）が、陽性対照として使われた。
【０１６２】
追加的な実行において、Ｂｉｏｍｏｌ（ウサギｐＡｂ、ＣＲ１３０））からのＣｙｐ１Ａ２特定抗体が、使われた。誘導及び非処理のＳＡ００２、ＬＯＴ  ＡＬ００２及びＳＡ１６７、ＬＯＴ  ＡＬ００２、に進行された結果は、両方のｈＢＳ細胞由来肝細胞様細胞集団に特定のＣｙｐ１Ａ２反応を示す（弱いにもかかわらず）（図２７を参照）。
【０１６３】
Ｃｙｐ活性分析（図１３、３０及び３２を参照）：
ＰＲＯＤ分析は、９６時間のＣｙｐ誘導混合物との処理においてＰＲＯＤ活性の強い誘導、および非処理の肝細胞様細胞で構造性ＰＲＯＤ活性を示した。さらに、ＥＲＯＤ分析は、特定の構造性及び誘導可能性Ｃｙｐ  １Ａ２活性を示して実行された（図３０を参照）。両方の分析は、初代肝細胞と同程度の誘導活性を示し、さらに、ｈＢＳ細胞由来肝細胞様細胞におけるいかなる誘導の前に、基礎発現が、弱いけれども、実際にはあった。
【０１６４】
カクテルは、２５μＭリファンピシン、２０μＭデソキシフェノバルビタール（プリミドン）、１００μＭデキサメタゾン、８８ｍＭエタノール、２５μＭオメプラゾール及び１００μＭイソニアジドを含んでいる。ＰＲＯＤ（ペントキシレゾルフィン）は一般のＣｙｐ活性分析であり、ＥＲＯＤ（エトキシレゾルフィン）はＣｙｐ  １Ａ２に特有である。ＰＲＯＤまたはＥＲＯＤ貯蔵液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｔ．Ｎｏ．７７１０５及び４６１２１それぞれからの製品）は、２ｍＭの濃度でＤＭＳＯにおいて準備される。細胞は、各種の誘発因子で９６時間誘導されるかまたは対照として処理しないまま放置する。分析を実行する前に、細胞はＰＢＳによって慎重に二回洗われ、誘発因子の残余量を洗い落とすために、新しいＰＢＳで１５−３０分間培養される。細胞は、３７℃の暗い環境で６０分間、ＰＢＳ内の２５μＭのＰＲＯＤまたはＰＢＳ内の５０μＭのＥＲＯＤによって培養された。それから、細胞はＰＢＳによって再び二回洗われ、顕微鏡の下で分析された。
【０１６５】
Ｃｙｐ３Ａ４、３Ａ７、１Ａ１、１Ａ２及びＣｙｐ２Ａ６の相対的な遺伝子発現レベルが測定され、肝細胞様細胞、ＨｅｐＧ２及びヒト肝エキスの誘導及び非誘導培養物でのリアルタイムＰＣＲ技術によって比較される。ヒト肝エキスの測定は、１にセットされ、他の全てのサンプルは、各シトクロムｐ４５０のためのヒト肝臓参照に関連した。全ての遺伝子の発現は、ＧＡＰＤＨ（ＣＹＰ１Ａ１／１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６）又はＴＢＰ（ＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７）に対して正常化される。図３６を参照。
【実施例５】
【０１６６】
特徴描写：
フェーズＩＩ代謝酵素：
肝細胞様細胞は、ＧＳＴ  Ａ１−１の強い免疫反応性及びＧＳＴ  Ｍ１−１の弱い免疫反応性を表示する。胎児のＧＳＴ  Ｐ１−１の免疫反応性は、ほとんど示されなかった（ｍＥＦで分化される肝細胞様細胞について図１４を参照）。さらに、肝細胞様細胞は、ＵＧＴ  １Ａ１及びＵＧＴ  １Ａ６のための免疫反応性を示す（図１７を参照）。誘導剤処理で、わずかな誘導が、ＧＳＴ  Ａ１−１のために観察されたが、ＧＳＴ  Ｍ１−１またはＧＳＴ  Ｐ１−１のためのはっきりした誘導はなかった。（マトリゲル（商標）に育てられた肝細胞様細胞でのＧＳＴ  Ａ１−１発現は、図２２を参照。）
【０１６７】
使用された一次抗体：
ＧＳＴＡ１−１（ウサギ）１：５００、オックスフォード生医学研究、ＧＳ６２；
ＧＳＴ  Ｍ１−１（ウサギ）１：５００、オックスフォード生医学研究、ＧＳ６７；
ＧＳＴ  Ｐ１−１（ウサギ）１：５００、オックスフォード生医学研究、ＧＳ７２；
ＵＧＴ  １Ａ１（ウサギ）１：５００、ＢＤ  バイオサイエンス、４５８４１１；
ＵＧＴ１Ａ６（ウサギ）１：５００、ＢＤ  バイオサイエンス、４５８４１６。
【０１６８】
使用された第２の抗体：
−ｄｏｎｋｅｙ  抗ウサギ−Ａｌｅｘａ  ４８８、１：１０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、＃Ａ−２１２０６
−ｄｏｎｋｅｙ  抗ウサギ−Ａｌｅｘａ  ５９４、１：１０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、＃Ａ−２１２０７
【０１６９】
免疫染色プロトコル：
４％ＰＦＡに１５分凝固し、２回ＰＢＳ洗浄し、０．１％ＰＢＴ内の５％ＦＢＳに３０分入れ、一次抗体を０．１％ＰＢＴの１％ＦＢＴ中で４℃で一晩培養させ、二次抗体を０．１％ＰＢＴの１％ＦＢＳ中で常温で３時間培養させ、全てが０．０５ｍｇ／ｍｌのＤＡＰＩ、０．１％ＰＢＴの中で常温で５分間洗浄され、ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ封入剤の中に組み込まれる。
【０１７０】
ウエスタンブロット法：
ウエスタンブロット法分析が、ＢＳ細胞株ＳＡ００２．５（ＬＯＴ  ＢＥ００２．５）、ＳＡ１６７（ＬＯＴ  ＣＥ１６７）（図１５を参照）及びＳＡ００２（ＬＯＴ  ＡＬ００２）（データが示されてない）からの肝細胞様細胞でＧＳＴ  Ａ１−１（２５ｋＤａ）発現を確認する。より胎児性ＧＳＴ亜類型ＧＳＴ  Ｐ１−１（２５ｋＤａ）のための発現は、ウエスタンブロット法によって検出されなかった。ヒトＧＳＴｓを共起表現するＶ７９細胞からの細胞溶解物が、陽性対照として使われた。Ｂ−アクチン（４２ｋＤａ）が、内部積載対照として使われた。ＧＳＴ  Ａ１−１またはＧＳＴ  Ｐ１−１の発現が、株ＳＡ００２またはＳＡ００２．５からの未分化ｈＢＳ細胞において検出されることができなかった。
【０１７１】
タンパク質は、１：１００のプロテアーゼ抑制剤カクテル（シグマ−アルドリッチ）で補充され、Ｍ−ＰＥＲタンパク質摘出試薬（ピアス）を使用して細胞から抽出された。タンパク質は、電気泳動法によって１２％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルに分離され、その後、ニトロセルロース膜（Ｂｉｏｒａｄ、ヘラクレス、ＣＡ）へ変えられた。免疫ブロット法のために、ＧＳＴ  Ａ１−１及びＧＳＴ  Ｐ１−１（１：１０００）に対する一次抗体が、１％のＢＳＡブロッキングバッファーにおいて希釈された。二次抗体は、対応ＨＲＰ−共役抗体であった（ヤギ抗ウサギ、ヤギ抗マウス及びウサギ抗ヤギそれぞれ、１：２０００（ＤＡＫＯ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク））。強化された化学ルミネセンス（ＥＣＬ）が、製造業者の指示（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）によって使われた。一次ヒト肝細胞（インビトロ  テクノロジーズ、ライプツィヒ、ドイツ）及びＧＳＴタンパク質調製が、陽性対照として使われた。
【０１７２】
ＧＳＴ活性分析（図１６を参照）：
１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＣＤＮＢ）へのＧＳＴ触媒活性が、Ｈａｂｉｇ他、１９７４年の分光測光法の分析を使用して決定された。ＣＤＮＢ（１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン）は、一般のＧＳＴ参照培養基（Ｍａｎｎｅｒｖｉｋ  １９８８）である。反応混合は、８５μｌの０．１Ｍのリン酸カリウム（ｐＨ  ６．５）、２．５μｌの０．２ＭのＧＳＨ、２．５μｌの２０ｍＭのＣＤＮＢ及びＭ−ＰＥＲ渙散バッファ内の１０μｌのタンパク質溶解物から構成されていた。タンパク質なしで、１０μｌのＭ−ＰＥＲ渙散バッファとの完全な分析混合が、対照として使われた。３４０ｎｍ及び３０℃の吸光度が、フィリップスＰＵ８７２０  ＵＶ／ＶＩＳ走査型分光光度計を使用して１分間モニタされた。ＣＤＮＢへのＧＳＴ触媒活性が、ｈＢＳ細胞株ＳＡ００２（ＬＯＴ  ＡＬ００２）ＳＡ００２．５（ＬＯＴ  ＢＥ００２．５）及びＳＡ１６７（ＬＯＴ  ＣＥ１６７）及びヒト初代肝細胞培養物に由来した肝細胞様細胞、およびＨｅｐＧ２培養物において検定された。ｈＢＳ由来肝細胞様細胞が、ヒト初代肝細胞に類似したＧＳＴ−活性及びＨｅｐＧ２培養より本質的に高いＧＳＴ活性レベルを示した。図１６を参照。
【実施例６】
【０１７３】
特徴描写：
薬物輸送体
免疫組織化学：
肝細胞様細胞は、トランスポータＭＲＰ２、ＢＳＥＰ、及びＯＡＴＰ−２および／またはＯＡＴＰ−８のための免疫反応性（潜在的抗体交差反応）を示す（図１８、１９、２０を参照）。ＢＳＥＰが肝芽細胞様細胞及び肝細胞様細胞より小さい集団だけにおいて表示される時、ＯＡＴＰ−２／８及びＭＲＰ２が、大多数の肝細胞様細胞において表示されるようである。
【０１７４】
使用された一次抗体：
ＭＲＰ２（ウサギ）１：５０、サンタクルーズ、ｓｃ−２０７６６；
ＢＳＥＰ（ヤギ）１：５０、サンタクルーズ、ｓｃ−１７２９２；
予め希釈されたＯＡＴＰ−２（マウス）、Ｐｒｏｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨ社、クローンｍＭＤＱ
【０１７５】
使用された第２の抗体：
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｇｏａｔ−Ａｌｅｘａ  ４８８、１：５００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、＃Ａ−１１０５５
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ  ｍｏｕｓｅ−Ｃｙ３、１：１０００、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、＃７１５−１６５−１５１
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ−Ｃｙ２、１：１００、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、＃７１５−２２５−１５１
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ−Ａｌｅｘａ  ４８８、１：１０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、＃Ａ−２１２０６
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ−Ａｌｅｘａ  ５９４、１：１０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、＃Ａ−２１２０７
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｒａｔ−Ｃｙ３、１：５００、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、＃７１２−１６５−１５３
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｒａｔ−Ｃｙ２、１：１００、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、＃７１２−２２５−１５３
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｓｈｅｅｐ−Ａｌｅｘａ  ４８８、１：１０００、＃Ａ−１１０１５
−ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｓｈｅｅｐ−Ａｌｅｘａ  ５９４、１：１０００、＃Ａ−１１０１６
【０１７６】
免疫染色プロトコル：
ＭＲＰ２，ＯＡＴＰ−２：
４％ＰＦＡに１５分凝固し、２回ＰＢＳ洗浄し、０．１％ＰＢＴ内の５％ＦＢＳに３０分入れ、一次抗体を０．１％ＰＢＴの１％ＦＢＳ中で４℃で一晩培養させ、二次抗体を０．１％ＰＢＴの１％ＦＢＳ中で常温で３時間培養させ、全ては０．０５ｍｇ／ｍｌのＤＡＰＩ、０．１％ＰＢＴの中で常温で５分間洗浄され、ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ封入剤の中で組み込まれる。
【０１７７】
ＢＳＥＰ：
４％ＰＦＡに１５分凝固し、２回ＰＢＳ洗浄し、ＰＢＳ内の５％ＦＢＳに３０分入れ、一次抗体をＰＢＳの１％ＦＢＳ中で４℃で一晩培養させ、二次抗体をＰＢＳの１％ＦＢＳ中で常温で３時間培養させ、全ては０．０５ｍｇ／ｍｌのＤＡＰＩ、ＰＢＳの中で常温で５分間洗浄され、ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ封入剤の中で組み込まれる。
【０１７８】
ＭＲＰ２遺伝子発現の分析（図２３を参照）
肝細胞様細胞でＭＲＰ２発現は未分化細胞での発現と比較してそれぞれ１１から３２倍高い。
【０１７９】
完全ＲＮＡは、ＧｉｂｃｏからのＴｒｉｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔを使用して、肝細胞様細胞（ＳＡ００２．５、ＬＯＴ  ＢＥ００２．５継代２、ｍＥＦでの２１日分化後）及び、未分化ｈＢＳ細胞（ＳＡ００２．５、ＬＯＴ  ＢＥ００２．５継代２４、５日目（対照サンプル１）及びＳＡ００２、ＬＯＴ  ＢＥ００２、継代６２、４日目（対照サンプル２））から抽出された。５μｇの完全ＲＮＡが、Ｓｕｐｅｒｃｒｉｐｔ  ＩＩキット（インビトロゲン  Ｌｔｄ社）を使用して、デオキシリボヌクレアーゼ  Ｉ（インビトロゲン  Ｌｔｄ社、ペイズリー、英国）による処理の後に相補型ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写された。トランスポータのための遺伝子特有プライマー及び調査が、プライマー３ソフトウェア・プログラム及びＮｅｔｐｒｉｍｅｒを使用して考案された。２００ｎｇのｃＤＮＡが、ＳｅｎｓｉＭｉｘ  Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍｉｘ（１．５ｍＭの最終的なＭｇＣｌ２）；（Ｃｅｌｔｉｃ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、０．７ユニットＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ）、３００ｎＭの遺伝子特有の前方及び後方のプライマーに適切な遺伝子のためのプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって詳しく説明される。使用するプライマー・シーケンスは、前方：ｔｇｃａｇｃｃｔｃｃａｔａａｃｃａｔｇａ及び、後部：ｇｇａｃｔｔｃａｇａｔｇｃｃｔｇｃｃａである。ＰＣＲは、５０℃で２分間、９５℃で１０分間、最初工程のＣｏｒｂｅｔｔ  Ｒｏｔｏｒｇｅｎｅで実行され、そのあと９５℃で１５秒及び６２℃で６０秒を４０回実行される。各々のサンプルのＰＣＲ拡大は、ピペット操作エラーを最小にするために重複して実行された。ノー・テンプレート対照が、陰性対照として各々の実行のために含まれた。各々のサンプルのためのＣｔ値は、記録され、各々のサンプルのための相対的な遺伝子発現が、２Δ（４０−Ｃｔ）を使用して、標準のＡＢＩプロトコルを使用して算出された。９０％効率の推測下の相対的な発現が最も低いサンプルをゼロにセットすることによって推定された。
【実施例７】
【０１８０】
ＰＡＳ陽性による細胞のグリコーゲン貯蔵発見（過ヨウ素酸染色シッフシステム、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ、Ｃａｔ−ｎｏ．３９５−Ｂ）
肝細胞様細胞が、ＰＡＳ陽性方法によって検出されるグリコーゲンを保存する（図２１を参照）。技術的な陰性対照として、唾液処理された培養物は、培養物の９５−９９％でグリコーゲン発見の減少を証明した。ブドウ糖余剰がある限りグリコーゲン合成及び貯蔵は人体の多数の細胞型の一般的な機能ある。しかし、肝細胞及び骨格の筋肉は、グリコーゲンを保存する際に特に特殊化される。肝細胞様細胞を選ぶかまたは取り除く前の分化ｈＢＳ細胞培養において、グリコーゲンを保存する他の細胞集団が、観察され、同じく、グリコーゲンを保存することができない、いくつかの集団も観察される。重要なことに、グリコーゲンを保存しない培養物の非肝細胞様細胞がある。細胞は、メタノールに希釈される４％のパラホルムアルデヒドに室温で、１５分間、取り付けられ、その後、３回ＰＢＳで洗われた。技術的陰性対照として、培養物は室温で、２０分間、ヒト唾液で処理され、その後、ＰＢＳで洗われた。ヒト唾液は、グリコーゲンを消化するα−アミラーゼを含む。アルデヒドにグリコールを酸化する過沃素酸が処理及び非処理の培養物に５分間室温で、加えられ、ＰＢＳにおける繰り返し洗浄が続いた。その後、培養物は室温で、１５分間、シッフ試薬で培養され、パラローズアニリン及び異性重亜硫酸ナトリウム間の反応を可能にし、グリコール含有する細胞コンパートメントを明るいピンクに染色するパラローズアニリン製品を作り出す。ＰＢＳで洗った後に、細胞は、室温で、９０秒間、ヘマトキシリンで対比染色され、マウンティング培養基に取り付ける前にＨ２Ｏにおいてリンスした。ヘマトキシリンは、細胞（青っぽい）の核を染色する。
【実施例８】
【０１８１】
遺伝子の分析
重要な特定の遺伝子を分析するさらなる別の方法、例えば、下記の物質は量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）を用いている。そのような措置は以下の通りである：第１の適切な遺伝子が選ばれ、それらの遺伝子と相補的にマッチするプライマーが考案され、定量化がＰＣＲ分析によって行われ、重要な遺伝子の発現レベルがハウスキーピング遺伝子、分化の間に下方対照する遺伝子と比較される（分化の間に安定して表示されることが公知の場合）。いくつかのｈＢＳ細胞株の分化の間に、下方対照される適切な遺伝子の実施例は、Ｃｒｉｐｔｏ、Ｎａｎｏｇ及びＯｃｔ−４である。
【０１８２】
ｈＢＳ細胞由来肝細胞様細胞は、例えばマイクロアレイ、ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｔｙカードまたは遺伝子の適切な選択を有する遺伝子チップのような、従来の技術によって遺伝子レベル（ｍＲＮＡ発現レベル）で、更に特徴描写されてもよい。例えば下記の表（表１）にリストされる。サンプルの完全ＲＮＡに由来されるｃＤＮＡは、例えばｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｔｙカードと交雑され、実験は、ＰＣＲセットアップに入り、更に、適切なソフトウェアを使用して分析される。
【０１８３】
【表２】
2009539358.tif 000064
【０１８４】
誘発因子混合物で処理されるかまたは非処理である細胞株ＳＡ１６７、ＬＯＴ  ＣＡ１６７及びＳＡ００２、ＬＯＴ  ＡＬ００２の未分化ｈＢＳ細胞及び、２つの細胞株に由来する肝細胞様細胞は、インストラクタのマニュアル（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴ  Ｍｉｃｒｏ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｃａｒｄ  Ｇｅｔｔｉｎｇ  Ｓｔａｒｔｅｄ  Ｇｕｉｄｅ）及び以下の短縮プロトコルに従って、ＬＤＡチップ上で並行に繰り返し行われる。
【０１８５】
ｃＤＮＡが、完全ＲＮＡから調製され、適切な濃度を達成するためにＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー水に希釈される（下記参照）。以下の構成要素が混合された：
ｃＤＮＡ（１−１００ｎｇ）、５μｌ
ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー水
ＴａｑＭａｎの汎用ＰＣＲ、４５μｌ
マスター混合物（２Ｘ）（５０μｌ）
合計：１００μｌ
【０１８６】
サンプルは、その後、ＬＤＡカードに載せられ（各々のサンプル混合物は、１サンプルにつき１００ｕｌ及び１７０ｎｇ  ｃＤＮＡである）、遠心分離機で分離され、その後に、ＬＤＡカードは密閉された。最後に、マニュアルの説明に基づいて、カードはＡＢＩ  ７９００ＨＴリアルタイムＰＣＲシステムで実行され、結果はＳＤＳ  ２．２．１ソフトウェア及び相対的な定量化方法を用いて分析される。
【０１８７】
ｈＢＳ細胞−由来肝細胞様細胞から検出の肝臓タンパク質の概要（ＬＤＡ分析またはＱＰＣＲによって）は、下の表３及び４に示される。
【０１８８】
【表３】
2009539358.tif 000065
【０１８９】
【表４】
2009539358.tif 000066
【実施例９】
【０１９０】
肝細胞様細胞の生物反応器培養物
ｈＢＳ細胞及びそれの由来的細胞型、例えば肝芽細胞様細胞または肝細胞様細胞は、例えば人工中空ファイバー毛細血管膜によって区分される三次元スペースにおいて育てられてもよい。このシステムは、毛細管間のより大きい細胞集団へ細胞を成長させることを可能にし、培養基の潅流及び酸素類のガスによって最適化、天然環境を提供する。密閉生物反応器システムは、細胞（最高１０＾１１細胞）を大量に生産し、細胞の機能的特性の保全を支えるために開発される。酵素潅流による細胞隔離が、密閉したＧＭＰシステムで拡大された。細胞浄化が、例えば膜組織抗原発現に基づくＦＡＣソートまたは密度勾配培養基及び遠心分離を使用して、それから実行される。
【実施例１０】
【０１９１】
尿素合成
尿素合成は、肝臓特定の特性であり、したがって、異なる細胞株から肝細胞様細胞へ分化する培養基の尿素濃度が、２４時間潜伏の後、異なる時刻で測定された。培養基サンプルは、集められ、分析のために送られた。尿素分泌が、尿素／尿素窒素（ロシュ／日立）の運動ＵＶ検査法のためのキットを使用して分析された（Ｋｌｉｎｉｓｋ  Ｋｅｍｉ、Ｃ−ｌａｂ、Ｓａｈｌｇｒｅｎｓｋａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、イェーテボリ）。
【０１９２】
血清／プラズマの期待値は、１０−５０ｍｇ／ｄＬ（１．７−８．３ｍｍｏｌ／Ｌ）である。
【０１９３】
方法に従う尿素発見のための低いレベルは、０．８ｍｍｏｌ／Ｌであった。
【０１９４】
【表５】
2009539358.tif 000067
【０１９５】
ｈＢＳＣ−由来肝細胞様細胞は、初代肝細胞と同様の濃度の培養基へ尿素を生産及び分泌する。十分に面白いことに、肝細胞様細胞が培養物内で現れてからおよそ２０日後に、重要な尿素濃度のみが、測定されることができる。
【０１９６】
例えばアルブミン分泌に関する更なる機能的テストが、シュヴァルツ他の２００２年及び２００５年にて説明したように、実行されることができる。肝細胞様細胞及び肝芽細胞様細胞の更なる機能的な特徴描写が、ＬＤＬ摂取及び糖新生を実行する能力のために分析されることができた。
【実施例１１】
【０１９７】
細胞極性及び機能性
サンドイッチ培養系が、更に細胞極性及び肝細胞様細胞の長期の機能性を改善することができる。そのような培養系において、肝細胞様細胞の埋め込みは、低いレベル酸性応力と別の肝臓インビボを模倣する三次元環境を提供する。それによって、肝細胞様細胞は有極性を示す。すなわち、アピカル側を有する上皮様組織（インビボ胆汁側の方へ、疎水性）及び基底外側（インビボ血液側の方へ、親水性）を形成する。サンドイッチ培養での肝細胞様細胞のもう一つの潜在的改良は、Ｃｙｐ発現のより強い誘導性である。
【実施例１２】
【０１９８】
免疫組織化学的ノッチ特徴描写：
ＩＶＦ皿で育てられる培養ｈＢＳ細胞は、室温で、１５分間、４％のパラホルムアルデヒドに取り付けられた。細胞は、それから一次抗体によって一晩４℃で培養された（Ｎｏｔｃｈ２、１：２００  サンタクルーズ、ｓｃ５５４５、ＵＳＡ）。その翌日、細胞は１０分間二回１Ｘ  ＰＢＳによって洗われ、１時間、室温の１Ｘ  ＰＢＳ内で第２抗体（抗ウサギ−ＦＩＴＣ、１：５００）によってその後に培養され、それぞれ５分間二度洗われ、５分間１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ溶液に暴露される。水でそれぞれ５分間二回細胞を洗った後に、それらは、アクアマウントに取り付けられ、蛍光性顕微鏡検査によって分析される。最近、未分化のｈＢＳ細胞がＮｏｔｃｈ２（Ｎｏｇｇｌｅ他、２００６年）を表示することが示された。Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ  ｈＢＳ細胞株ＳＡ００２において、大多数の細胞は、分化の第１日にＮｏｔｃｈ２に弱陽性である。２週後に、Ｎｏｔｃｈ２は、肝細胞様および／または肝芽細胞様細胞のほんの少数のサブセットだけで見つかる。すなわち、肝臓形態学に似ている二核小体の細胞である（図３５を参照）。
【実施例１３】
【０１９９】
肝芽細胞様及び肝細胞様細胞の繁殖的状態が、実施例２の内因子プロトコルに基づいて、ｈＢＳ細胞をそれぞれ１４及び２１日間培養することによって、試験された。分析の日、培養物は室温で１５−２０分間４％のＰＦＡに取り付けられ、数回ＰＢＳで洗われ、ＰＢＳに希釈される０．１−０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ１００において透過処理された。肝芽細胞様細胞のため、内胚葉／初期肝臓マーカーＨＮＦ４アルファ（ウサギｐＡｂ、サンタクルーズ、ＳＣ−８９８７、１：４００希薄）が使われ、肝細胞様細胞のために、内胚葉／肝臓マーカーＨＮＦ３ベータ  （Ｆｏｘａ−２）（ＩｇＧ、サンタクルーズ、ＳＣ−６５５４、１．２００希薄）が使用された。２つの肝臓様細胞集団の増殖を研究するために、抗体、Ｋｉ６７（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、＃５５６００３、１：５００希薄）が、一晩冷蔵庫での培養に加えられる。いくつかの洗浄の後、第２の抗体が利用され、室温で２時間培養された。培養物が洗われ、ＤＡＰＩは核を検出するために最後の洗濯に含まれた。ＨＮＦ４アルファに陽性の肝芽細胞様細胞は、Ｋｉ６７との共局所によって繁殖表示である（図２８を参照）。肝細胞様細胞はＫｉ６７に陽性でなく、非繁殖細胞を示した。
【０２００】
増殖能が肝細胞様細胞において誘導されることができたかどうか確認するために、培養基状況を変えるとともに、初代肝細胞の増殖を刺激する公知の成長因子を加えることによって、ｈＢＳ細胞由来肝細胞様細胞の増殖誘導が、追加的に試験された。ｈＢＳ細胞（細胞株ＳＡ００２）は、先に述べた状況の下で１７日間分化させられ、肝芽細胞及び肝細胞様細胞になる。培養基は、１０％のＦＢＳ（または血清代替物）で補充されるウィリアムズ培養基Ｅ（シグマ、Ｗ−４１２８）、１％のＰＥＳＴ、１％のグルタマックス、１ｘ  ＩＴＳ、０．２５ｎｇ／ｍｌデキサメタゾン、２％のＤＭＳＯ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＨＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌオンコスタチンＭ、１０ｍＭのニコチンアミド及び４ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦに変えられた。ｈＢＳ細胞は、おおよそ５日ごとに変えられる培養基で、さらに５−１５日間育てられた。細胞の増殖能は、その後、上記通りの追加的な１１日以後に分析された。上記通りに補充されるウィリアムズＥ培養基で培養される時に、ｈＢＳ細胞由来肝細胞様細胞は繁殖するが、４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦで補充されるＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）で育てられる肝細胞様細胞において増殖は検出されなかった（図２９を参照）。したがって、もし適切な培養基で培養された場合、肝細胞様細胞は、増加する増殖能へ刺激されることができる。
【実施例１４】
【０２０１】
９６−ウェルプレートの肝細胞様細胞へのｈＢＳ細胞分化
４日間から５日間、前のｈＢＳ細胞は、小さい断片に手動で解剖され、マイトマイシンＣ−に処理され、９６−ウェルコーティングされたｍＥＦへ移動される。ｈＢＳ細胞の２つから３つの断片が各々のウェルに加えられた。培養物は、４ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦで補充されるＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）において、３７℃、５％のＣＯ２及び９５％の湿度で２０−３０日間培養された。１０日目に、培養基の５０％が、４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦで補充される新しいＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）と取り替えられ、２０日目に、培養基の１００％が取り替えられた。ｈＢＳ細胞は、ＭＥＦ−コーティング、ＩＶＦ−皿で培養されたｈＢＳ細胞コロニーに類似するコロニーに分化され、例えば肝芽細胞様細胞は、ＨＮＦ４アルファに免疫陽性反応であり、１４日目あたりにコロニーの周辺に現れ、２０日目の肝細胞様細胞に現れた。９６−ウェルの８０％が、このプロトコルを用いて２０日目に肝細胞様細胞へｈＢＳ細胞を分化させることに成功した。
【実施例１５】
【０２０２】
異なる表層への肝細胞様細胞の再接種
肝細胞様細胞の再接種の前に、９６ウェルプレートのウェルが、異なるコーティングによって予めコーティングされる：ラットの尾からのコラーゲンＩ  （ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃３５４２３６）、１０％から１００％の異なる濃度のマトリゲル（商標）（基底膜マトリックス、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃３５６２３７）、または、ｍｉｔｏｃｙｃｉｎ  Ｃ処理のｍＥＦ細胞層。コーティングは、次のように実行された：コラーゲンＩが９６ウェルに加えられ、５％のＣＯ２、３０ｍｉｎ−１ｈの９５％湿度で３７℃で培養される。コラーゲンＩの余剰が廃棄され、ウェルは、その後いかなる酸性の酸性トレースも取り除くために二回ＰＢＳによって洗われた。ウェルは、２０％のＦＣＳで補充され、予め暖められた５０−１００μｌのＨＣＭ−培養基で満たされた（ＨＢＭ（商標）、Ｃａｍｂｒｅｘからのｃｃ−４３１６ＢＢ、ｃｃ−４３６２ＢＢ、ｃｃ−４３３５ＢＢ、ｃｃ−４３１３ＢＢ、ｃｃ−４３２１ＢＢ、ｃｃ−４３１７ＢＢ、ｃｃ−４３８１ＢＢのＨＣＭ（商標）  ＳｉｎｇｌｅＱｏｕｔｓで補充されるｃｃ−３１９９）。マトリゲル（商標）コーティングのために、マトリゲル（商標）の冷凍分割量が、冷蔵庫において一晩解凍された。マトリゲル（商標）は、１０％から１００％のマトリゲル（商標）を達成するためにＨＣＭ−培養基で希釈された。マトリゲル（商標）の異なる濃度は、９６−ウェルに加えられ、３０分間３７℃で培養された。マトリゲル（商標）の余剰は、２０％のＦＣＳで補充されるＨＣＭ−培養基を加える前に廃棄された。２５から３８日までの古い培養範囲の肝細胞様細胞が、ＢＤからのマイクロ外科用メスを用いてマイクロ解剖され、ＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）培養基を含んでいる収集ディッシュへ幹細胞ナイフで移動される。領域を含んでいるミクロ解剖した肝細胞様細胞は、小さいクラスタを形成し、いくつかのプレートから集められた。クラスタは、３７℃で１０分間カルシウム及びマグネシウムなしのＰＢＳ、加熱プレートでのＴｒｙｐＬｅ  Ｓｅｌｅｃｔ（Ｇｉｂｃｏ、＃１２５６３）で４２℃で３−５分間、または３７℃で５−１５分間Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ＩＶによって、２０％のＦＣＳで補充されるＨＣＭ−培養基を含んでいる９６−ウェルプレートの異なるコーティング上に再接種する前に処理される。一日以後、肝細胞様細胞を有するクラスタは、表層に付属し、表層上にクラスタから移り始めた。これは、肝細胞様細胞の全ての異なる種類のコーティング及び分離処理にとって真実だった。２０％ＦＣＳで補充されるＨＣＭ−培養基は、無血清ＨＣＭ−培養基に交換された。培養に、一日おきに、新しいＨＣＭ−培養基が提供された。数日後に、肝細胞様細胞は、ウェルを再接種した。肝細胞様細胞は、保持された肝臓典型的形態学を培養物で４５日間キープした。大きい多角形及び複数核細胞（図４６を参照）は、肝細胞マーカーＨＮＦ３ベータ及びＣＫ１８（図４６）に陽性であった。
【実施例１６】
【０２０３】
新陳代謝の肝細胞様細胞
異なる分化プロトコルによって得られるｈＢＳ細胞由来肝細胞様細胞は、誘発因子の非存在下でフェーズＩシトクロムｐ４５０酵素、ｃｙｐ１Ａ２、ｃｙｐ２Ｃ９及びｃｙｐ３Ａ４にそれぞれによって、フェナセチン（アルドリッチ）、ジクロフェナック（ＳＩＧＭＡ）及びミダゾラム（ＳＩＧＭＡ）を新陳代謝させるその能力のために検査された。培養基へ放出されたそれぞれ物質の代謝物質が、ＬＣ−ＭＳで測定された。細胞株ＳＡ００２、ＳＡ００２．５及びＳＡ３４８からの肝細胞様細胞を含んでいる混合培養物が、２６日から３５日までに試験された。物質は、フェノールレッドなしの培養基、２６μＭフェナセチン、９μＭジクロフェナク及び３μＭミダゾラムの中でカクテルとして、６時間、１２時間及び２４時間、３７℃で５％のＣＯ２の条件下で培養された。各々の培養及び時刻からのサンプルはいかなる細胞残屑も取り除くために、集められ、高速で２０分間遠心分離機で分離された。１００μｌの取り除かれた培養基サンプルは、９６−ウェルプレートへ移動され、１５μｌのアセトニトリルは、各々のウェルに加えられた。ＬＣ−ＭＳによって代謝物質測定が実行され、分析されるまで、サンプルは冷凍だった。
【０２０４】
液体クロマトグラフィ・システムは、ＨＰ１１００シリーズＬＣポンプ及びＨＴＳ  ＰＡＬ注射器（ＣＴＣ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ、Ｚｗｉｎｇｅｎ、スイス）と組み合わせであるカラムオーブン（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ドイツ、Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ、ドイツ）から構成されていた。４−ヒドロキシジクロフェナック及び１−ヒドロキシミダゾラムのために、ＬＣ分離が、逆相ＨｙＰｕｒｉｔｙ  Ｃ１８（２．１ｘ５０ｍｍ、５μｍ、ＴｈｅｒｍｏＱｕｅｓｔ、ランコーン、英国）にＨｙＰｕｒｉｔｙ  Ｃ１８  ｐｒｅｃｏｌｕｍｎとともに４０℃で実行された。移動式フェーズは、以下から構成されていた：（Ａ）０．１％の（ｖ／ｖ）ギ酸及び（Ｂ）アセトニトリルにおける０．１％の（ｖ／ｖ）ギ酸。有機条件剤含有量は、３分間に５から８０％のＢに、線形に増やされ、そして、０．２分間５％のＢに戻る。
【０２０５】
パラセタモールのために、クロマトグラフィが、ＨｙＰｕｒｉｔｙ  Ｃ１８  ｐｒｅｃｏｌｕｍｎを有するＺｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ８（４．６ｘ１５０ｍｍ、５μｍ）上で、同じシステム及び移動式フェーズを使用して実行された。有機条件剤含有量は、５分間に２から３０％のＢに、線形に増やされ、そして２分間に３０から８０％まで増加し、その後０．１分間２％のＢに戻る。４−ヒドロキシジクロフェナック、１−ヒドロキシミダゾラム及びパラセタモールのための保持時間は、それぞれ、２．９、２．４及び６．４分であった。発見は、電気スプレイ・インタフェース（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ  Ｓｃｉｅｘ、コンコード、カナダ）を備えている３倍の四重極質量分析計ＡＰＩ４０００で実行された。４５０℃の４−ヒドロキシジクロフェナック及び５５０℃での１−ヒドロキシミダゾラム及びパラセタモール、ネビュライザー・ガスのための、ターボ・ヒーター温度で操作されるＭＳは、それぞれ、５０、３０、７０及び、５０であった（ＧＳ１）。ターボ・ガスはそれぞれ、５０、６０、７０及び、７０であり（ＧＳ２）、カーテン・ガスは、それぞれ２０、２０、１０及び２０であった。４−ヒドロキシジクロフェナックのための電気スプレイ電圧は、陰性モードの−３ｋＶであり、１−ヒドロキシミダゾラム及びパラセタモールのための電気スプレイ電圧はそれぞれ陽性モードの５、３．５ｋＶであった。
【０２０６】
衝突エネルギーは、それぞれ、−１５、３９及び２１Ｖにセットされ、衝突活性化解離ガスは、それぞれ、５、７及び、５である。選択されるＭＲＭ移行は、４−ヒドロキシジクロフェナックは３０９．９＞２６５．９であり、１−ヒドロキシミダゾラムは３４２．０＞２０２．７で、パラセタモールは１５２．３＞１１０．０である。２００ｍｓの滞留時間が使われた。計測器対照、データ収集及びデータ評価が、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ／ＭＤＳ  Ｓｃｉｅｘ  Ａｎａｌｙｓｔ  １．４ソフトウェアを使用して実行された。
【０２０７】
誘発因子の非存在下及び異なる世代の異なるｈＢＳ細胞由来肝細胞様細胞のＣｙｐ−活性
【０２０８】
【表６】
2009539358.tif 000068
【実施例１７】
【０２０９】
ｃｙｐ活性の配合
体内の薬物代謝を予測するために、薬物代謝を分析するときに、肝細胞の範囲内のｃｙｐ−活性配合は欠かせない。ｈＢＳＣ−由来肝細胞様細胞のｃｙｐ−活性配合がどれくらいよくヒト肝細胞を反映させるかについて分析するために、薬品フェナセチン（２６μＭ）ジクロフェナック（９μＭ）及びミダゾラム（３μＭ）、（それぞれｃｙｐ１Ａ２、ｃｙｐ２Ｃ９及びｃｙｐ３Ａ４によって新陳代謝される）の混合が、細胞株ＳＡ３４８及びヒト初代肝細胞に由来した肝細胞様細胞に加えられた。薬品カクテルの１２時間培養の後に、サンプルは、代謝物質のＬＣ−ＭＳ発見のために集められた。サンプルは、前の実施例１６に記載されている通りにＬＣ−ＭＳによって調製され、分析された。試験した３つの酵素システム間のｃｙｐ活性配合が、分析された。
【０２１０】
【表７】
2009539358.tif 000069
【０２１１】
肝細胞様細胞のｃｙｐ活性配合は、ヒト初代肝細胞培養でのｃｙｐ活性配合と類似していた。
【実施例１８】
【０２１２】
肝細胞様細胞の改良
ｈＢＳＣ−由来肝細胞様細胞を改善するために、リアルタイムＰＣＲ技術に基づく選別法が使われた。４つの遺伝子の相対的な発現レベル；ＨＮＦ４アルファ、Ｃｙｐ３ａ４、アルブミン及びＵＧＴ２Ｂ７が、肝細胞様細胞の改良を示した。Ｃｙｐ３ａ４は、成人肝臓内で重要なシトクロムｐ４５０酵素である。それは、成人肝臓でのフェーズＩ酵素活性の６０％を構成する。アルブミンは、成熟及び成人肝細胞に高く表示される。ＵＴＧ２Ｂ７は、成人肝臓の重要なフェーズＩＩ酵素（グルクロノシルトランスフェラーゼ）である。Ｃｙｐ３ａ４、アルブミン及びＵＴＧ２Ｂ７の上昇レベルが、改良され、成熟し、潜在的により機能的な肝細胞様細胞示す。ＨＮＦ４アルファは、肝芽細胞様細胞の初期のマーカーである。ＨＮＦ４アルファ遺伝子発現の上昇レベルは、肝芽細胞様細胞の増加数を示す。アルブミン、Ｃｙｐ３Ａ４及びＵＴＧ２Ｂ７の高水準及び、加えて、ＨＮＦ４アルファの減少されたレベルは、ＨＣＬＣの成熟した及びより機能的な集団を示す。
【０２１３】
異なるプロトコルからの細胞サンプルの完全ＲＮＡ（詳細な説明のために下記を参照）が、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｓ  Ｔｒｉｚｏｌ方法を使用して抽出された。ｃＤＮＡが、オリゴｄＴ（ｏｌｉｇｏ  ｄＴ）を使用して完全ＲＮＡサンプルから作られた。その後、使用準備済のＴａｑｍａｎプライマー、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからの標準プログラム及び装置を使用して、ｃＤＮＡがリアルタイムＰＣＲ反応において拡大された。
【０２１４】
分析のために、ＰＣＲ製品を検出するために必要なサイクル（ＣＴ−値）の数が、同じサンプルでのハウスキーピング遺伝子、ＧＡＰＤＨのＣＴ−値に正常化された。正常化されたＣＴ−値は、その後で、相対的な定量化（△△Ｃｔ方法）のために比較的Ｃｔ方法を用いて、各々の実験における対照サンプルの正常化されたＣＴ−値と比較された。結果は、それからサンプルと同じ実験の対照サンプルとのフォールド変化として提示された。
【０２１５】
異なるパラメータ及び培養プロトコルが、肝細胞様細胞を改善するために合成された。異なる培養基が試験され、肝細胞様細胞は、培養でより長い時間キープされ、培養基置換の頻度は分析され、異なる成熟及び誘導因子が試験されたなどである。
【０２１６】
肝細胞様細胞へｈＢＳ細胞を分化させる参照プロトコル（実施例２に記載されている内容と類似する）：
１日目
ｈＢＳ細胞は、手動で断片に切断され、４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦで補充されるＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）−培養基を含み、ｍＥＦ−コーティングされたＩＶＦ皿へ移動された。
１０日目
培養基の５０％は、４ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦで補充されるＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）と取り替えられた。
１４−１５日目
ＨＮＦ４−アルファ染色によって示される肝芽細胞様細胞は、コロニーの周辺に存在する。
２０日目
培養基の１００％が、４ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦで補充されるＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）と取り替えられた。肝細胞様細胞は、コロニーの周辺に現れている。
【０２１７】
プロトコルの重要な要素のうちの１つは、培養基を非常にまれに置換することである。内因子は、分化過程に重要である。
【０２１８】
改良されたプロトコル
Ｉ  異なる培養基
ＣａｍｂｒｅｘからのＨＣＭ−培養基        表５の実験１、２；  図３７−３９
【０２１９】
ＩＩ  成熟及び誘導因子を有するサプリメント
ａ．  デキサメタゾン                      表６の実験１、２、３；  図４０−４２
ｂ．  ＨＣＭ−培養基、ＨＧＦ、ナトリウム酪酸塩  表７の実験１、２；  図４０−４２
【０２２０】
ＩＩＩ  培養基置換頻度
ＨＣＭ−培養基及びＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）  表８の実験１；  図４３−４５
【０２２１】
【表８】
2009539358.tif 000070
【０２２２】
【表９】
2009539358.tif 000071
【０２２３】
【表１０】
2009539358.tif 000072
【０２２４】
【表１１】
2009539358.tif 000073
【０２２５】
Ｉ．  ＣａｍｂｒｅｘからのＨＣＭ培養基が、ウシ血清アルブミンの一等分で補充される無血清基礎培養基（ＢＳＡ−ＦＡＦ；  １０ｍｌ／５００ｍｌのＨＢＭ、ｃｃ−４３６２ＢＢ、Ｃａｍｂｒｅｘ）、アスコルビン酸（０．５ｍｌ／５００ｍｌのＨＢＭ、ｃｃ−４３１６ＢＢ、Ｃａｍｂｒｅｘ）、上皮細胞増殖因子（ｒｈ−ＥＧＦ；  ０，５ｍｌ／５００ｍｌのＨＢＭ、ｃｃ−４３１７ＢＢ、Ｃａｍｂｒｅｘ）、トランスフェリン（０．５ｍｌ／５００ｍｌのＨＢＭ；  ｃｃ−４３１３ＢＢ、Ｃａｍｂｒｅｘ）、インスリン（０．５ｍｌ／５００ｍｌのＨＢＭ；  ｃｃ−４３２１ＢＢ、Ｃａｍｂｒｅｘ）、ヒドロコルチゾン（０．５ｍｌ／５００ｍｌのＨＢＭ；  ｃｃ−４３３５ＢＢ、Ｃａｍｂｒｅｘ）及び抗生物質（ＧＡ−１０００；  ０．５ｍｌ／５００ｍｌのＨＢＭ；  ｃｃ−４３８１ＢＢ、Ｃａｍｂｒｅｘ）である。培養基は、初代肝細胞培養のために最適化される。
【０２２６】
ＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）が、ＨＣＭ−培養基により１５日目または２３日目の後に交換された。プロトコルは、改良された肝細胞様細胞をもたらした。細胞株ＳＡ００２及びＳＡ３４８に由来の改良肝細胞様細胞は、アルブミン、ＣＹＰ３Ａ４及びＵＧＴ２Ｂ７（図３９）の上昇する遺伝子発現レベルを示した。形態学によって判断されれば、肝細胞を有するコロニーの末梢は、改良された培養物においてより広く、細胞は脂肪質でない（図３８）。プロトコル詳細の研究設計のために、図３７、表５、実験１及び２を参照。
【０２２７】
ＩＩａ．  細胞株ＳＡ１６７、ＳＡ３４８、ＳＡ００２に由来されるＨＣＬＣは、参照プロトコルに基づき分化されたが、プロトコルの終わりでの８日間の高い濃度のデキサメタゾンによるサプルメントはＨＣＬＣの外観を改良した（図４１Ａ＋Ｂ）。加えて、ＨＮＦ４アルファ、アルブミン、ｃｙｐ３Ａ４及びＵＧＴ２Ｂ７の上昇する遺伝子発現レベルが、明白である傾向が示された（図４２Ａ）。研究設計のために、図４０を参照、研究デザインＣ及びプロトコルの詳細は、表６、実験１、２、３を参照。
【０２２８】
ＩＩｂ．細胞株ＳＡ１６７及びＳＡ００２に由来される肝細胞様細胞が、２１日目まで参照プロトコルに基づき分化された。その時刻で、培養基はＨＧＦ及びナトリウム酪酸塩（ＮａＢ）で補充されるＨＣＭ−培養基に５日間交換された。詳細は、表７、実験１、２及び図４０、研究デザインＤを参照。肝細胞様細胞は、形態学及びリアルタイムＰＣＲ分析で判断される新規な処理によって改良されていた。より少ない細胞質肝細胞様細胞及びコロニーを囲む肝細胞様細胞のより広い末梢は、ＨＧＦ及びＮａＢで補充されるＨＣＭ−培養基で培養されたコロニーに現れた（図４１Ｃ＋Ｄ）。加えて、アルブミン、Ｃｙｐ３Ａ４、ＵＴＧ２Ｂ７及びＨＮＦ４アルファのｍＲＮＡレベルは、新しいプロトコルに基づいて培養される肝細胞様細胞において上昇した（図４２Ｂ）。
【０２２９】
ＩＩＩ．  分化のためのまれな培養基置換及びｈＢＳ細胞に由来される肝細胞様細胞の成熟処理の重要性が、ＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）及びＨＣＭ（商標）−培養基の中の異なるいくつかの培養基のために試験され、分析された。参照プロトコルは、１５日目まで続かれた。１５日目の後、培養基は週３回または週１回交換された。研究デザインのために、図４３を参照、プロトコルの詳細について、表８の実験１を参照。はっきりした傾向が、試験される全ての培養基のために観察された。培養基のまれにされた置換が、形態学に基づいく肝細胞様細胞（図４４Ａ＋Ｂ）及び、Ｃｙｐ３Ａ４、アルブミン、ＵＴＧ２Ｂ７及びＨＮＦ４アルファのために上昇した遺伝子発現レベル（図４５）を改良した。データは、内因子が、ｈＢＳＣ−由来肝細胞様細胞の分化処理のために重要であることを示す。
【実施例１９】
【０２３０】
ｈＢＳ細胞由来肝芽前駆細胞
肝芽前駆細胞株を確立するために、１５日間古いｈＢＳ−細胞由来肝芽細胞が、分離され、異なるコーティングに再接種された。肝芽細胞様細胞の再接種の前に、９６−ウェルプレートのウェルが、以下の異なるコーティングによって予めコーティングされた；１７−２０ｘ１０３細胞／ｃｍ２の密度を有するマイトマイシンＣ−処理のｍＥＦ細胞、ラットの尾からのコラーゲンＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃３５４２３６）または、ＨＣＭ−培養基に１：３で希釈したマトリゲル（商標）（基底膜マトリックス、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃３５６２３７）。コラーゲンＩ及びマトリゲル（商標）のためのコーティング手順は前の実施例１５で記載されている。ウェルは、２０％のＦＣＳで補充される予め暖められた５０−１００μｌのＨＣＭ培養基で満たされた（ＨＢＭ（商標）、Ｃａｍｂｒｅｘからのｃｃ−４３１６ＢＢ、ｃｃ−４３６２ＢＢ、ｃｃ−４３３５ＢＢ、ｃｃ−４３１３ＢＢ、ｃｃ−４３２１ＢＢ、ｃｃ−４３１７ＢＢ、ｃｃ−４３８１ＢＢのＨＣＭ（商標）ＳｉｎｇｌｅＱｏｕｔｓに補充されるｃｃ−３１９９）。１５日間古い培養からの肝芽細胞様細胞の範囲がＢＤからのマイクロ外科用メスを用いてマイクロ解剖され、ＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）培養基を含んでいる収集ディッシュに、幹細胞ナイフで移動される。範囲を含むマイクロ解剖された肝芽細胞様細胞は、小さいクラスタを形成し、いくつかのプレートから集められた。クラスタは、無カルシウム及び無マグネシウムＰＢＳによって洗浄され、２０％のＦＣＳに補充されるＨＣＭ−培養基を含んでいる９６−ウェルプレートの異なるコーティング上へ再接種する前に、３７℃で５−１５分間５％のコラゲナーゼＩＶで処理された。２日後に、２０％のＦＣＳで補充されるＨＣＭ−培養基は、無血清ＨＣＭ培養基に交換された。培養に一日おきに、新しいＨＣＭ−培養基が提供された。５日後に、培養物は４％のＰＦＡに取り付けられ、ＨＮＦ４アルファ及びＣＫ１９のための免疫細胞学が実行された。形態学によると、コラーゲンＩ及びマトリゲル（商標）コーティング上の肝芽細胞様細胞は、大きい多角形を有した肝細胞様細胞及び二核細胞になった（図４７Ｃ及びＩ）。ところが、ｍＥＦ−細胞層に再接種される肝芽細胞様細胞は、肝細胞の典型的特性を示しておらず、小さい核を有する肝芽細胞様細はｍＥＦ−細胞層上で育てられた（図４７Ｄ−Ｆ及びＫ、Ｌ）。加えて、ｍＥＦに育てられる大多数の肝芽細胞様細胞クラスタは、肝芽マーカーＣＫ１９（図４７Ｊ、Ｋ）に強く陽性だったが、コラーゲンＩ及びマトリゲル（商標）上の肝芽細胞様細胞の一部だけが、ＣＫ１９に陽性であった（図４７Ｇ、Ｈ）。ｍＥＦ細胞層上の肝芽細胞様細胞及びコラーゲンＩ及びマトリゲル（商標）コーティング上の肝芽細胞様細胞は、ＨＮＦ４アルファ陽性核を示したが、ｍＥＦに育てられる肝芽細胞様細胞（図４７Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ）と比較して、後者は、より大きくて、強く染色されなかった核を有した。データは、肝細胞様細胞への肝芽細胞様細胞の分化がコラーゲンＩ及びマトリゲル（商標）コーティング上で可能にされる場合に、ｍＥＦ細胞層が、前駆状態に肝芽細胞様細胞をキープする能力を有することを示す。
【実施例２０】
【０２３１】
機能的な薬物輸送体
ｈＢＳＣ由来肝細胞様細胞におけるトランスポータに関する機能的なテストが、培養にインドシアニングリーン色素（ＩＣＧ）を利用することによって分析された。ＩＣＧは、５ｍｇ／ｍｌの濃度へ蒸留、殺菌された水に溶かされ、その後で、１ｍｇ／ｍｌの最終濃度へ培養基で薄められた。ＩＣＧ溶液は、細胞培養皿に加えられ、おおよそ６０分間３７℃で培養された。培養の後に、細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に洗い落され、ＩＣＧの細胞摂取は、ステレオ顕微鏡で検査された。肝細胞様細胞は、ＩＣＧ色素を表し、細胞の範囲に機能的な薬物輸送体の存在を示唆する（図４８）。
【国際調査報告】
2009539358.tif 000074
2009539358.tif 000075
2009539358.tif 000076