(57)【要約】  本発明は、対照植物体または植物体の部分と比較して、その中の個々の個体群が変色の減少を示す植物体または植物体の部分の個体群のスクリーニング方法に関し、この方法は個体群からの植物体または植物体の部分の個体群を含み、随意に植物体または植物体の部分上に創面を作成し、植物体または植物体の部分またはそこに作成した創面をインキュベートしてその中またはそれ上に変色が起こるようにし、植物体または植物体の部分中または上の該変色を観察し、観察した変色を対照植物体または植物体の部分において観察される変色と比較することで、変色が見られないかまたは対照植物体または植物体の部分として減少した変色が見られる植物体または植物体の部分を同定する。適切には、該変色は傷害誘導性変色である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対照植物体または植物体の部分と比較して、その中の個々の個体群が変色の減少を示す植物個体群または植物体の部分のスクリーニング方法であって、
ａ）植物個体群または該個体群からの該植物体の部分を提供し、
ｂ）該植物体または植物体の部分上に随意に創面を生成し、
ｃ）該植物体または植物体の部分またはそこに形成された創面中または創面上に変色が起こるようインキュベートし、
ｄ）該植物体または植物体の部分中または上に該変色を観察し、
ｅ）観察された変色を該対照植物体または植物体の部分上に観察された変色と比較することで、変色が起こっていないまたは、該対照植物体または植物体の部分と比較して変色が減少した、植物体または植物体の部分を同定することを含む、方法。
【請求項２】
該変色が、傷害誘導性変色である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該植物体が、野菜植物類、結果植物類または顕花植物類である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
該植物体が、レタス、エンダイブ、チコリー、ポテト、サツマイモ、根セロリー、キノコ、アーティチョークおよびナスから選択された野菜植物類である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
該植物体が、リンゴ、バナナ、アボガド、モモ、西洋梨、アンズおよびマンゴーから選択された結果植物類である、請求項３記載の方法。
【請求項６】
該植物体が、ガーベラおよびキクから選択された顕花植物類である、請求項３記載の方法。
【請求項７】
該植物類が、キク科、特にアキノノゲシ属、さらに特にはレタス種に属する、請求項１ないし４のいずれか１記載の方法。
【請求項８】
該植物類が、チコリ属および、特にキクニガナおよびチコリ種に属する、請求項１ないし４のいずれか１記載の方法。
【請求項９】
該植物体の部分が、葉、頭状花序、シュート、根、塊茎、茎、花、果実、種子、発芽種子、またはそれらの断片および細胞から選択された、請求項１、２または３記載の方法。
【請求項１０】
該植物体の部分が、葉片である、請求項７または８記載の方法。
【請求項１１】
該植物体の部分が、中肋組織由来の断片である、請求項７または８記載の方法。
【請求項１２】
該植物個体群が、突然変異体植物体の個体群、生殖質収集物またはトランスジェニック植物の個体群である、請求項１ないし１１のいずれか１記載の方法。
【請求項１３】
該突然変異体植物体の個体群が、化学薬品および／または照射法を用いた変異誘発処理により得られた、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
該インキュベーションが、水性環境下で行われる、請求項１ないし１３のいずれか１記載の方法。
【請求項１５】
該水性環境が、湿らせた濾紙を含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
該水性環境が、水または水溶液を含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
該水性環境が、Ｌ-３,４-ジヒドロキシフェニルアラニン、クロロゲン酸、イソクロロゲン酸、Ｌ-チロシンおよびカテコールから選択された化合物を含む、請求項１５または１６記載の方法。
【請求項１８】
該水性環境が、表１に挙げられた化合物より選択された化合物を含む、請求項１５または１６記載の方法。
【請求項１９】
該対照植物体が、７日間５℃において２枚の湿らせた濾紙の間でインキュベートした場合、縁の辺りがピンク色に変色をする葉片の植物体である、請求項１ないし１８のいずれか１記載の方法。
【請求項２０】
対照植物体または植物体の部分と比較して、その中の個々の個体群が変色の減少を示す植物体または植物体の部分の群をスクリーニングする方法であって、
ａ）植物個体群または該個体群からの該植物体の部分を提供し、
ｂ）その中または上で変色が起こるよう、色素体に変化し得る基質と共に該植物体または植物体の部分をインキュベートし、
ｃ）該植物体または植物体の部分中または上に該変色を観察し、
ｄ）観察された変色を該対照植物体または植物体の部分上に観察された変色と比較することで、変色が起こっていないまたは、該対照植物体または植物体の部分と比較して変色が減少した、植物体または植物体の部分を同定することを含む、方法。
【請求項２１】
該基質が、表１に挙げられた化合物より選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
該化合物が、Ｌ-ＤＯＰＡである、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
該植物体または植物体の部分が、基質と共にインキュベートする前に創傷を受け、および該創面およびその近くに変色が観察される、請求項２０、２１または２２記載の方法。
【請求項２４】
該植物体の部分が、種子、発芽種子または葉片である、請求項２０ないし２３のいずれか１記載の方法。
【請求項２５】
該変色が、Ｌ-システインによって抑制または逆戻りし得る、請求項１ないし２４のいずれか１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、その中の個々の個体群が傷害誘導性表面変色の減少を示す植物体または植物体の部分の群をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
要求の増加により、レタス、赤チコリ、エンダイブ、および他の野菜等の生鮮食品の加工は、ここ数年大きく拡大している。葉菜の収穫および加工は、強い傷害反応を誘発する葉の大規模な切断を含む。この傷害反応は加工製品における変色の広がりを誘引する。この変色は、創面およびその周辺における酵素学的な茶色またはピンク色による変色、呼吸および蒸散による乾燥の徴候として現れる。特に酵素学的な茶色またはピンク色への変色は、直接または間接的にレタスおよび赤チコリ等の、摘み立ての包装された葉菜全体の品質を決定する、重要性のあるものと見なされている。
【０００３】
さらに、変色の結果として、微生物の数が有意に増加し得、これは食品安全性を損ない得る。加工レタスの非常に傷みやすい性質は、消費者において、非常に色のよくない、香りのよくないおよび感触もよくない認識をもたらし、これは、いわゆるコンビニエンス市場の現状よりも速い成長を妨害している。
【０００４】
他の野菜、例えばジャガイモ、キノコ、根セロリー、アーティチョークおよびナス等、またさらには果実および花類も望ましくない変色の対象となり得る。例として、バナナ、リンゴ、西洋梨、アボガド、マンゴー、モモおよびアンズ、等の果実は、スライスまたは皮を剥いた時に、素早く褐変する。これらの果実が加工された形として提供される時、例えばスライスされ、さいの目に刻まれ、皮をむかれまたはフルーツサラダとして提供される時は、対処法を取らなければならない。
【０００５】
カットした花茎、例としてガーベラまたはキク由来のものも、変色しがちであり、変色は消費者によって魅力的ではないと考えられ、よって製品の市場性が減少するので、これは商業的な視点からして望ましくない。
【０００６】
レタス等の野菜類の加工における変色を抑制するため、該加工レタスの変色を減速させるために適用され得る多くの化学的または物理的収穫後処理が開発されてきた。
【０００７】
酵素学的褐変を抑制する、摘み立ての葉菜の調整気相下における包装、可食性コーティングの適用、熱ショック処理および化学薬品の添加等、である。
【０００８】
摘み立てのレタスを低温下低酸素気相下において包装する場合、酵素学的褐変は大幅に減少し得る。しかしながらこの改変、低酸素濃度環境は嫌気呼吸を誘引し、これは非常に非魅力的と受け取られる生産物の異臭および香りの悪さをもたらす。
【０００９】
可食性コーティングは薄層物質であり、これは物理的絶縁壁として振る舞い、および蒸発および褐変等の、異なる形の変色から製品を効率的に保護する。これらのコーティングは例として、樹脂、多糖類またはタンパク質から生成され得る。
【００１０】
さらに摘み立てのレタスの褐変は、加工後直ちに９０秒間４５℃の短時間における熱ショックを適用することで防ぎ得ることが明らかとなっている。おそらく、熱ショックはタンパク質生合成を、変色に含まれる酵素から熱ショックタンパク質に転換し、よって該酵素学的褐変能が減少する。あるいは、褐変における熱ショック処理による効果は、該変色経路に含まれる酵素の温度感受性によっても説明し得る。
【００１１】
化学薬品で、適用できるものとしては、例としてビタミンＣ等の還元剤、ＥＤＴＡ等のキレート剤、シクロデキストリン等の錯化剤およびＬ-システイン等の酵素阻害剤があり得る。生鮮食品における化学薬品の適用は明らかに、食品安全性の問題を含みおよび規制当局の許可を必要とする。上記の収穫後技術との組み合わせが考えられ、および最終的に該適用は技術的効率、費用および食品安全性間の取引となる。
【００１２】
適用される技術に関係なく、加工野菜類、果実類、および花類の収穫後の品質の向上は、コストが高くつき、よって、物理的または科学的収穫後技術の必要性を取り除くまたは減少させる代替案の提供という、当分野における明らかな必要性が存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、傷害誘導性変色反応の減少が見られる植物体を選択するためのスクリーニング方法、および酵素学的褐変またはピンク色への変色等の、収穫後加工時の障害に耐性のある植物体およびそれら植物体由来の子孫を提供することにある。損傷上の変色はまた、茎、種子、果実、葉、花、塊茎、シュート等の植物体の部分中に見受けられる。本発明のさらなる目的は、植物体の部分中における傷害誘導性変色反応の減少が見られる植物体を選択するためのスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
すなわち、本発明は、対照植物体と比較してその中の個々の個体群が変色の減少を示す植物個体群または植物体の部分のスクリーニング方法であって、
ａ）該個体群からの植物体または該植物体の部分群を提供し、
ｂ）植物体または植物体の部分上に随意に創面を形成し、
ｃ）該植物体または植物体の部分またはその上に形成された該創面中またはそれらの上に変色が起こるようインキュベートし、
ｄ）植物体または植物体の部分中または上に変色を観察し、
ｅ）観察された変色を該対照植物体または植物体の部分中に観察された変色と比較することで、植物体または植物体の部分変色が起こっていないまたは、該対照植物体または植物体の部分と比較して変色が減少した、植物体または植物体の部分を同定することを含む、方法を提供する。
【００１５】
本発明の方法は２つの主要な実施形態を有する。第一の実施形態においては、該変色は内在性基質の転換の結果によるものである。このような変色は、ある一定の時間のもとある一定の環境下における植物体または植物体の部分のインキュベーションにおいて、自然に起こる。この場合における該変色は傷害誘導性である。本発明は特に、自然に起こる酵素学的ピンク色への変色および褐変反応に関する。本発明のスクリーニング方法は、この反応が見られないまたは対照と比較して反応の減少が見られる植物体の同定を目的とする。
【００１６】
第二の実施形態においては、該変色は、植物体内で反応が起こった場合に見受けられる有色の基質に転換され得る外因的に添加された基質の転換によって引き起こされる。このような呈色反応は傷害誘導性であり得るか、またはそうではない。これはまた、例として無傷の種子の種皮内においても起こる。本発明のスクリーニング方法はこの反応がない、または対照に比べて反応の減少が見られる植物体の同定を目的とする。
【００１７】
後者の実施形態は、さらに詳しくは、対照植物体または植物体の部分と比較して、その中の個々の個体群が変色の減少を示す植物個体群または植物体の部分のスクリーニング方法であって、
ａ）植物個体群または該個体群からの植物体の部分を提供し、
ｂ）該植物体または植物体の部分をその中または上で変色が起こるよう、色素体に転換され得る基質と共にインキュベートし、
ｃ）該植物体または植物体の部分中または上に該変色を観察し、
ｄ）該対照植物体または植物体の部分上に観察された変色と比較することで、変色が起こっていないまたは、該対照植物体または植物体の部分と比較して変色が減少した、植物体または植物体の部分を同定することを含む方法に関する。
【００１８】
本発明における方法は変色にさらされ得るどの植物体にも使用し得るが、特に生産物、特に野菜類または果実類、または花類に有用である。該方法はとりわけレタス、赤チコリまたはエンダイブ等の葉菜、ポテトまたはサツマイモ等の塊茎、根セロリーなどの根、チコリー等のシュート、またはキノコに適切である。該方法はさらに、リンゴ、バナナ、アボガド、モモ、西洋梨、アンズ、マンゴー、ナス等の果実類およびガーベラの茎、キクの花、アーティチョークの下部等の花または花茎に用いることができる。
【００１９】
本発明のスクリーニング方法は、１以上の植物体の部分または組織中の傷害誘導性表面変色の減少を有する植物体を同定することを目的とする。スクリーニングにおいて、よって変色が起こりやすい部分または組織において非常に実用的である。レタスにおいては、これは葉または葉の一部、例えば葉の穿孔部分にあたり、バナナにおいては皮を剥いた果実の切片が用いられ、および花類においては茎の切片が非常に実用的なテスト用賦形剤となる。
【００２０】
しかしながら、変色はまた傷ついていない組織上においても調べられることが分かっている。実施例においては、また無傷の種皮および根端が、傷害なしに色素体に転換される外因的に添加された基質の存在下において呈色反応を誘引できることが明らかとなっている。この呈色反応が減少するまたは存在しないことは、変色の減少を有する植物体のスクリーニングに用いることができる。
【００２１】
特定の実施形態において、該方法はキク科に属する植物体の選択、アキノノゲシ属の植物体およびより特にはレタス種またはチコリ属に属する植物体および、傷害誘導性表面変色がないまたは減少を示すキクニガナおよびチコリ種に属する種において有用である。
【００２２】
本発明の方法によってスクリーニングされる植物個体群はどの植物個体群でもよいが、好ましくは傷害誘導性変色の減少を示す植物体を発見する機会を増やすために、多くの異なるメンバーを持つ様々な植物個体群であるのがよい。そのような様々な個体群は、例として化学薬品および／または照射を用いた変異処理によって形成され、よってここでは突然変異体植物個体群と呼ぶ。一方の個体群は生殖質生殖質収集物であり、これは自然変動を示す植物体群である。また、トランスジェニック植物個体群も用いられ得る。
【００２３】
本発明の方法は創面を有する植物体の部分を用いて適切に行われる。非常に有用な実験サンプルは、葉からくり抜かれた切片、いわゆる葉片である。あるいは、葉脈のある葉菜の中肋組織が用いられ得る。適切には、葉片はこれらの中肋部分から切り取られる。果実類においては、半分に割った果実の切断面が評価され、または別にスライスしたものまたはさいの目に刻んだものが評価される。花類においては、茎をスライスしたものが非常に有用な実験サンプルとなる。
【００２４】
インキュベーションは水性環境下において適切に行われる。本発明における方法は、湿らせた濾紙上またはその間においてインキュベートした葉片を用いることで非常によく行われる。呈色反応はそれから濾紙上の創面の縁辺りで非常によく見られる。
【００２５】
また、水性環境は水または水溶液を含む。特定の実施形態において、それはさらにＬ-３,４-ジヒドロキシフェニルアラニン等の基質を含む水溶液下で例証されている。これらの化合物は酵素ポリフェノール・オキシダーゼによって、黒色メラニン色素の生成に転換される。この点におけるレタス植物体のスクリーニングに用いられる他の化合物としては、クロロゲン酸、イソクロロゲン酸、Ｌ-チロシンおよびカテコールを含むがこれに限定されるものではない。
【００２６】
本発明はさらに、傷害誘導性の葉の変色がないまたは減少が見られる親植物体の子孫についても、該子孫がさらに親植物体と同じく傷害誘導性の葉の変色がないまたは減少を有するか実証するために、行われる。
【００２７】
本発明はまた植物体の部分においても行われ得る。レタスまたはエンダイブの頭部または葉等の植物体の部分は通常、変色にさらされる割面を有する部分である。他の部分は果実類、シュート、根、種子、塊茎、花、茎、等である。
【００２８】
本発明のさらなる実施形態において、種子または発芽種子は外因的に添加された基質の存在下においてスクリーニング方法が行われる賦形剤として用いられる。発芽種子においては若い根端が呈色反応に含まれる。
【００２９】
本発明は加工野菜市場において用いることのできる突然変異植物体を同定するという意味で、商業的に非常に興味深いものである。上記で説明したように、加工における変色、特に生鮮果実類および野菜類においてのそれは、変色した製品は消費者によって拒否されるので、望ましくないものと考えられている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
レタスが収穫されおよび切断により加工される時に、創面部分またはそこに隣接する褐変またはピンク色への変色の徴候が現れる、植物体または植物体の部分における著しい反応を誘引する多くの葉の創面が生成される。ピンク色への変色はまた該創面から離れた部位、葉の端同様中肋部分においても観察することができる。しばしばピンク色への変色は収穫の前段階で観察され、これは非生物的ストレスまたは作物が過度に成熟したことによるものと考えられる。
【００３１】
他の植物体、特に他の野菜類、果実類および花類においても変色が起こりやすい。本発明の方法はよって、また他の植物体、特に傷害誘導性変色反応が見られる、野菜類、または果実類または花を同定するのに非常に便利なスクリーニング方法である。
【００３２】
異なる形の変色は酵素活性によって効果が及ぼされ、これは傷害の結果によって強力に高められ、およびいくつかの形のポリフェノールおよびこれらから派生した反応産物を生成する。
【００３３】
褐変反応に含まれる重要な酵素活性はＰＰＯである。酵素学的褐変に関するＰＰＯ活性はレタスに制限されず、リンゴ、バナナおよびポテト等の収穫後の品質劣化を含む多くの他の植物種についても記載されている。実際に、ＰＰＯは多くの加工生鮮果実類および野菜類での収穫後品質劣化に含まれる、最も重要な酵素の一つとして広く認められている。
【００３４】
この理由によりＰＰＯは、収穫後の食品の品質を高めるためにその活性を減少するまたは阻害するための多くの技術の標的となってきた。ＰＰＯは植物体組織内におけるポリフェノールが酸化され、ｏ-キノン形成を増加する反応を触媒する。その後、酵素学的および非-酵素学的反応が褐色または黒色色素形成を誘引する。
【００３５】
多くの植物種において、ＰＰＯは個々のメンバーが機能的相違を示す異なる時空間的発現パターンを有し得る小遺伝子ファミリーによってコードされている。例として、レタスは異なるＰＰＯアイソフォームを光合成および葉の維管束組織内に含んでいることが明らかとなっている。
【００３６】
ＰＰＯの天然基質は異なる種の間においては異なり得る。表１は傷害における変色にさらされる様々な野菜類及び果実類のＰＰＯ基質を挙げている。これらのおよび他の基質は、外因的基質を基とした本発明のスクリーニング方法に用いることができる。
【００３７】
【表１】
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【００３８】
多くの植物体において、ＰＰＯ酵素レベルは傷ついた植物体組織上に特異的に誘発されるのではなく、非活性的葉緑体中に存在する。創面上においては、ＰＰＯが、小胞内に存在するフェノール性基質が組織の崩壊によってＰＰＯと接触するようになるという事実によって、活性化されることが明らかとなる。
【００３９】
レタスにおいて、ＰＰＯの基質であるポリフェノールの生成は、創面上で誘導される。よって、レタス組織の褐変可能性は、葉組織のＰＰＯ量に限定されず、創面上のポリフェノール生合成率によって限定されると思われる。
【００４０】
この点において状況は作物間によって異なってくる。例として、リンゴにおいては、傷害後一時間以内の果実の褐変応答を起こすのにポリフェノール量が十分なのに対して、レタスにおいては、該褐変反応は、レタスにおいてはポリフェノールプールの大部分が創面上に新規に合成される必要があるという事実により、数日を必要とする。
【００４１】
ポリフェノール合成は、フェニルプロパノイド経路と呼ばれる非常に特徴的な生化学的経路を通して起こる。第一に、この経路の関与段階は、酵素フェニルアラニン・アンモニア・リアーゼ（PAL, Hahlbrock, KおよびScheel, D（1989）Annu. Rev. Plant Physiol. Plant MoI. Biol. 40, 347-369）によって触媒される。ＰＡＬはシキミ酸経路を通して合成されたアミノ酸、フェニルアラニンをケイ皮酸に転換する。
【００４２】
レタスにおいては、傷ついた葉は強いＰＡＬ遺伝子発現およびＰＡＬ活性誘導を引き起こす。ポリフェノールの形成はこの酵素活性に関連しており、これは、レタスの傷害により誘導されるＰＡＬ活性は褐変に対する重要な因子であることを示唆する（Campos, R. et al .（2004）Physiologica Plantarum 121, 429-438および本明細書中における引用文献）。しかしながら、他のどの因子が該傷害誘導性変色反応の最終的な結果を決定しているかは、現在のところ明確ではない。例として、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）活性もまた、変色の最終的なレベルを確立するにあたり重要であると考えられている（Fukumoto, L. R. et al .（2002）J. Agric.Food Chem. 540, 4503-4511、Martin-Diana A. et al（2005）Biosci. Biotechnol. Biochem. 69, 1677-1685）。
【００４３】
酵素活性が内在の過酸化水素の利用能に依存していることで、ＰＯＤの変色への寄与は限定され得る。
【００４４】
さらに、傷害は植物体によって何らかの形で知覚され、引き続いて信号がカスケードを通して生成され、これは現在のところレタスにおいてはほとんど定義されていないということが明確である。これらの活動は第一には創傷治癒にターゲットが絞られ、および病原体に対する防御反応となることは明らかであると考えられる。よって、多くの遺伝要因は損傷したレタス組織の変色反応の開始に含まれることとなり、およびこれらの各々は、傷害誘導性変色を減少または除去するための遺伝子組み換えの潜在的標的となり得る。
【００４５】
これらの遺伝要因のほとんどは現在知られておらず、および含まれていることが知られているものについては、どの程度までこれらの機能が変色反応において特異的な役割を持つのか、または、植物体の創傷の生理的機能と関係するより一般的な作用をおそらく有するのか、ということが明らかとなっていない。
【００４６】
例として、傷害誘導性ＰＡＬ活性はレタスの褐変レベルを決定すると考えられているが、フェニルプロパノイド経路生成はとりわけ細胞壁生合成または、同様に防御応答に含まれることが知られている。よって褐変能を減少させるために傷害誘導性ＰＡＬ活性を減少させることは、レタス栽培の他の様態に関してより望ましくない傷害誘導性褐変以外の他の機能を損なうこととなり得る。
【００４７】
同様に、ＰＰＯ活性は防御応答に含まれることも意味するので、よってＰＰＯレベルを減少させることでの褐変能の減少は、病原体への罹患率（Thipyapong, P. et al（2004）Planta 220, 105-117）を増加させる。よって、この点においてはより不偏的なアプローチがより成功につながることが、発明者たちによって推論されている。これらのアプローチは以下の段階を含む：
１.様々な植物個体群世代、特に突然変異体個体群。これらの突然変異体個体群はメタンスルホン酸エチル（ｅｍｓ）またはX線等の突然変異誘発物質で種子または植物体組織を処理することで作成することができる。
２.選別は植物体の変色、特にＰＡＬおよび／またはＰＰＯを通して導かれる植物体の傷害反応-誘導性変色に基づく、効率的な表現型スクリーニングのセットアップ。
３.成長および一般的な方法による植物体の加工を損なう、収穫後変色能に関する傷害性-応答および変異における多面発現効果がないように改変された突然変異体の特徴。
【００４８】
本発明はよって、傷害誘導性変色および収穫後の酵素学的褐変またはピンク色への変色等の加工時の変色の減少が見られる植物体の同定、選別および獲得ためのスクリーニング方法に関する。スクリーニング方法において、変色は創面に観察されるが、無傷組織もまた基質添加による呈色反応を示すことが明らかとなった。
【００４９】
本発明の方法に使用する突然変異体植物個体群は、例として以下のように用意することができる：
ａ）植物種のＭ０種子を、Ｍ１種子を得るため突然変異誘発物質によって改変するよう処理し、
ｂ）Ｍ１植物体を得るためにそのようにして得られたＭ１種子から植物体を栽培し、
ｃ）Ｍ１＋ｎ種子を得るために随意に段階ｂ）およびｃ）をn回繰り返し、
ｄ）そのようにして得られたＭ１＋ｎ種子を発芽させ、およびこれらの種子からの植物体を栽培する。
【００５０】
本発明によれば、これらの植物体は引き続いて傷害誘導性変色反応の分析にかけられる。傷害に対して変色反応が見られないまたは変色反応の減少が見られる植物体が選択される。それから、選択された植物体の子孫が栽培され、および該傷害誘導性変色反応が測定される。
【００５１】
遺伝的変異性を作り出すために、変異誘発を用いることができる。幾つかの化学的または物理的処理が、植物種における遺伝変種を誘発するために用いられるものとして当業者の間で知られている。例として、異なる濃度のｅｍｓ等の変異誘発物質を含む基質中で種子を処理することができる。Ｅｍｓは主にＤＮＡ鎖のＧ残基をアルキル化し、これはＤＮＡ複製中にＣ残基の代わりにＴ残基との対形成を引き起こす。よって、ＧＣ塩基対がＡＴ塩基対に頻繁に変化し、これはｅｍｓの有効量および植物体のミスマッチ修復システムの活動により決定される。
【００５２】
ｅｍｓの有効量は使用される濃度、種子の大きさおよび他の物理学的特性、およびｅｍｓ溶液中での種子のインキュベーション回数に依存する。突然変異誘発物質で処理した種子は、特にＭ１種子と呼ばれる。処理の結果として、Ｍ１種子の組織は細胞上の遺伝子内におよび細胞亜種内の遺伝子内においてランダムポイント突然変異を含み、これはM２と呼ばれる、次世代に引き継がれる生殖系列組織（胚芽細胞）を形成する。それ自身が生殖不能を引き起こすハプロ不全であるか、または胎児死亡を誘引する突然変異またはそれの組み合わせは、該M２世代には引き継がれない。
【００５３】
ｅｍｓを用いる上記と類似の手順は、他の突然変異誘発物質にも適用される。適切な突然変異誘発物質は当技術分野で周知である。特に有用なものはジエチル硫酸（des）、エチレンイミン（ei）、プロパンスルトン、N-メチル-N-ニトロソウレタン（mnu）、N-ニトロソ-N-メチル尿素（NMU）、N-エチル-N-ニトロソ尿素（enu）、アジ化ナトリウム等の、アルキル化突然変異誘発物質である。
【００５４】
また、突然変異は例として、X線、高速中性子、UV照射より選択される、照射を用いて誘引される。
【００５５】
本発明の他の実施形態において、突然変異はキメラオリゴヌクレオチド、相同組換え、標的遺伝子組換え、体内産物と競合する修飾標的遺伝子導入、RNA干渉を通した下方制御、等の遺伝子工学によって誘引される。
【００５６】
変異誘発処理のM２個体群が、ＰＡＬおよびＰＰＯを通して導かれる、傷害反応を目的とした手順のスクリーニングに用いられる。遺伝的変異をもたらすどの植物個体群も、自然変動を示す植物体収集物またはトランスジェニック植物個体群である生殖質収集物等の、表現型スクリーニング等の出発物質として用いることができることは、当業者にとって自明のことである。
【００５７】
Ｍ１およびＭ１＋ｎ種子の生成は自家受粉によって適切に行われる。
【００５８】
本発明の表現型スクリーニングを遂行するために、酵素学的変色反応が創傷上に誘引されるよう、創面が生成されなければならない。このような創傷は切断、押し抜き、スライス、磨耗、押しつぶし、破壊、剥皮、粉砕、圧搾、切り込み、研磨、流体流入、浸透圧ショック、剥離、刈り取り、引掻きによって達成される。
【００５９】
外因的に添加される基質が用いられる本発明の方法は、無傷組織および植物体の部分、例えば種子などにおいて、ＰＰＯが、基質が達する範囲内に存在する状態、例としてＰＰＯが分泌されるまたは細胞外にある場合といった状況下において、適用できることが明らかとなっている。呈色反応を誘引する酵素はよって、先立つ創傷がない場合も利用することができる。
【００６０】
創傷後または創傷が必要でない場合、組織変色を導く経路の診断軸となり、および突然変異体個体群のスクリーニングに非常に有効に利用できるといった表現型の特徴が必ず明らかとなる。
【００６１】
驚くべきことに、このような表現型の特徴は、植物体の部分を採取し、および異なる変色の形態、特に創面変色が起こることを好む非常に特殊な条件下でインキュベートすることで得ることができることが、明らかとなっている。次いで、このような分析は多数の植物体または植物体の部分、例えば突然変異植物体で、傷害誘導性変色反応の減少を示すこれらの植物体を選択するために、適用することができる。
【００６２】
本発明の一実施形態は、葉由来の切片、例えばレタスの葉またはエンダイブまたはチコリーの葉を、採取しおよび湿らせた濾紙の間で５℃でインキュベートした場合、およそ４日後にピンク色に染まった構造が葉片の縁において明らかになるという意外な発見に基づいている。適切な濾紙は、Schleier&Schuell, Microscience GmbH, Dassel,ドイツ由来の1450CV、Ref.no.10313281型の濾紙である。更なるインキュベーション下において、シグナルは増強し、およびおよそ一週間後、最大の強度に達する。ピンク色に染まる構造は特異的に創面において起こる。
【００６３】
変色は目視における尺度、０、これは褐変またはピンク色への変色がないことを意味する、から１０まで、これはスクリーニングされる植物体の標準品種（例としてレタスのスクリーニングにおけるL. sativa）におけるような褐変およびピンク色への変色を意味する、によって記録することで測定することができる。レタスに関する実施例においては、L. sativaの変種'Troubadour'が、１０の標準値として用いられる。
【００６４】
必要に応じて、０および１０の間の中間の階級の記録を比較するために、写真を用いることができる。加えて、強いピンク色または褐色のピクセル数を葉片部位毎に数えることで、デジタル画像がピンク色または茶色色素の濾紙によって作成することができる。これらの測定の一つを使うことで、ｔ-検定等の簡易な統計分析、そしてそれは当業者に周知である、が植物体または植物個体群が、標準値よりも有意にピンク色への変色または褐変が減少したかどうか証明するために行われ得る。適用される片側測定の有意水準は０.００１である。
【００６５】
変異体としては、統計比較が本来の品種のピンク色の記録、それは一番利用可能な水準である、および個々の突然変異体および／またはその子孫のピンク色の記録の間で行われ得る。
【００６６】
現在の植物体における本発明の特性を見つけるために、品種の代表試料、育種系統および／または遺伝子バンク目録が利用され得る。統計比較は調査上のここの目録におけるピンク色の記録、および個体群の残りの物の間で作成することができる。有意にピンク色の少ない個々の個体群を統計学的にテストする場合、適切な全体の有意水準を保つために複数の比較テストが必要となり、例として、一の標体とのダンネット多重比較試験（Dunnett's multiple comparison test with one standard）（Dunnett CW、J. Mer. Statist. Assoc. 50: 1096-1121（1955））がある。
【００６７】
さらに、この応答は多くの異なる発生段階における異なる葉の組織型を用いることで、得られることが明らかとなっている。例として、レタスの中肋部位においては、組織は、創傷上においてもこの応答が誘引され得る。異なる型のレタスに適用した場合、バターヘッド型、アイスバーグ型、コス型、バタビア型またはオークリーフ型等においては、残りの調査された個体群よりも有意にピンク色への変色の減少が見られるという、個々の目録は一つも発見されなかった。従って栽培レタスの型においては、傷害誘導性のピンク色への変色に関しては遺伝的変異がないか、非常に限られたものしかないと結論づけられる。
【００６８】
本発明によると、さらにＰＰＯの特異的阻害剤である、Ｌ-システインは、反応中に適用すると、強くピンク色色素の形成を抑制することが明らかとなっている。加えて、ピンク色色素の形成は、ＰＡＬ活性阻害剤および摘み立てのレタスの褐変の阻害剤である（Fujita, N. et al（2006）Biosci. Biotechnol. Biochem.70, 672-676）、桂皮アルデヒドによって阻害されることが明らかとなっている。これらの発見はレタスのピンク色への変色反応はＰＡＬおよびＰＰＯ依存であることを示している。
【００６９】
摘み立てのレタスにおける酵素学的褐変は、短時間の熱ショックをかけることによって非常に効果的に阻止されることが知られている。観測結果はそれにより代謝フラックスがポリフェノール形成となるのを減少させる、フェニルプロパノイド経路から熱ショックタンパク質への再ルーティングタンパク質生合成を仮定することによって、説明することができる。
【００７０】
また、該効果はＰＰＯおよびＰＯＤ等の、多価フェノール酸化に含まれる酵素が、熱ショック処理によって不活性化することを仮定することによって説明することができる。熱ショックが、引き続きピンク色への変色応答に分析されるレタスに適用されると、この応答は、酵素学的褐変のように、効果的に阻害されることが明らかとなっている。これは本発明の一部である、レタスのピンク色への変色応答が周知の酵素学的褐変応答と生理学的に非常に類似していることを示している。
【００７１】
この発見はＬ-システインを還元剤として適用することによってもさらに実証された。Ｌ-システインは、ＰＰＯ阻害剤である他にも、有色ｏ-キノンと反応し、およびそれらを化学的還元反応において無色のジフェノールに転換することで知られている。レタス葉片によって形成されたピンク色色素がＬ-システインによって処理されると、ピンク色の化合物が無色の化合物へと転換されることが実証されている。ゆえにピンク色素はＰＰＯによって形成されたｏ-キノンであると思われる。
【００７２】
これは、アスコルビン酸またはグルタチオン等の還元剤もまた、ピンク色素を無色化合物へ転換するという発見によっても実証されている。
【００７３】
加えて、野外から採取した、ピンク色である植物をＬ-システインで処理すると、ピンク色への変色が除かれる。これは、時々野外条件下で成長している植物体で見られる、葉片のピンク色への変色応答は自然なピンク色の現象が起こっていることを表すことが明らかとなっている。
【００７４】
本発明のさらなる実施形態は以下に続く実験に基づく。頭頂部のレタスの葉の部分を切断および空中で１６℃においてインキュベートすることで作成する。応答として創面がおよそ４日後に褐変する。特に大葉脈の創面において、褐変がはっきりと観察することができる。さらに、該褐変反応は切断または磨耗による傷を受けた葉において、全植物体レベルにおいても観察することができる。
【００７５】
これらの褐変反応の全てはＰＰＯの阻害剤であるＬ-システインによって完全に阻害され、これはこれらの表現型はＰＰＯ活性を通して徴候が現れることを示し、およびレタスの加工および包装の間に観察される収穫後褐変の診断軸として考えることができる。
【００７６】
これらの傷害誘導性褐変反応は効果的に作成することができ、傷害誘導性褐変能が減少する突然変異植物体を同定するための表現型スクリーニング手順として開発され得る。
【００７７】
本発明のさらなる実施形態はレタス組織の創面上での変色またはフェノール酸化剤酵素を有色化合物に転換し得る基質を適用することで誘引される、レタス種皮等の無傷レタス組織上またはその付近で観察される呈色反応に基づいている。
【００７８】
例として、レタスの葉片をＰＰＯ基質であるＬ-３,４-ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ-ＤＯＰＡ）と共にインキュベートすると、ＰＰＯを通したメラニン形成の徴候である、創面上での褐色から黒色への変色が観察される。Ｌ-システインが同時に適用されると、黒色への変色は完全に阻害され、これはこの変色がＰＰＯ仲介のものであるという仮説を確証する。
【００７９】
Ｌ-ＤＯＰＡはレタスＰＰＯの天然基質ではないと考えられているが、傷害誘導性変色の減少を示す、突然変異体の同定を目的とした分析に有用となり得る。
【００８０】
Ｌ-ＤＯＰＡとして記載したのと同様に、他の基質も変色応答を生じさせるために適用され得る。これらにはクロロゲン酸、イソクロロゲン酸、Ｌ-チロシン、およびカテコールが含まれるがこれに限定されない。
【００８１】
まとめると、植物体内で生じる創面上の異なる色素形成は、創傷シグナルの誘引によって始まり、ＰＡＬおよびＰＰＯを通して導かれ、変色へとつながる経路における変化をモニターする。上記のように、これらの傷害誘導性変色反応は非常に効率的な突然変異体スクリーニング手順を可能とする目視検査によって、容易に評価することができる。本発明に記載される方法の根底にある理論的根拠を図１に説明する。
【００８２】
本発明によると、インビトロでの葉片における傷害誘導性変色経路は、工業規模で加工されるレタスでの傷害誘導性変色と大きく重複し、ゆえにこの方法における指標として考えられることが明らかとなっている。これはＰＡＬまたはＰＰＯの阻害剤が、実用的、工業的条件下で加工および包装されたレタスの酵素学的褐変を阻害するという考えによって実証される。重要なことに、手順が誘引段階、すなわち創傷およびＰＰＯによって仲介される最終的な代謝的変換の一つを含むことで、該手順がこの生理学的方法に直接的または間接的に含まれる全遺伝要因を、捕らえる事を可能とする。さらに、この応答は全領域の異なる発生段階の葉の組織を用いて生じさせることができるので、変異体スクリーニングも、関連性が考慮された場合、これらの異なる段階または組織をターゲットとすることができる。
【００８３】
上記の１以上の表現型分析に基づく創傷からＰＡＬ-およびＰＰＯ-依存変色へと導かれる生理学的方法に関連して改変されたと同定される、変異体植物体がさらに特徴づけられる。このような特徴づけは、異なるレベル、例えば分子的、生化学的、生理学的および表現型レベルとして行われ得る。
【００８４】
元の個体群における変色形質に影響する同一の部位での、異なる変異部位または異なる対立形質の存在を示し得る、様々なレベルの変色が観察され得ることは当業者にとって明らかである。
【００８５】
劣勢突然変異の場合においては、これら２つの可能性を２つの突然変異体植物体の交雑を含む、対立性検定の実行、およびハイブリッド表現型を決定することで容易に区別することができる。突然変異の対立性の場合、減少した変色形質がFlにおいて明らかである一方で、異なる劣勢部位によって決定される突然変異体の表現型の場合、これはあてはまらない。
【００８６】
本発明の一実施形態におけるように、ランダム変異導入法が出発点の個体群を生成するのに適用され、遺伝的背景における突然変異はまた、実験条件下における表現型の多様性にも貢献する。異なる強さでの単一突然変異および遺伝的背景における突然変異体の混合した影響を区別するために、戻し交配を行い異なる変色が減少する事象での均一の遺伝的背景を作成しなければいけない。
【００８７】
このような手順はさらに、傷害誘導性変色に含まれる特異的な部位での突然変異が多面発現効果を示すか否かを決定することに関連している。
【００８８】
よって変色反応の減少に基づいて選択されたM２植物体は、M３種子を成長させるために用いられる。
【００８９】
引き続いて、変色が減少する事象に由来する同系交配系が、創傷に対する減少した応答について再評価される。加えて、褐変またはピンク色への変色の減少が、異なる遺伝的背景および異なる作物栽培および加工条件下において評価され得る。本発明のスクリーニング方法はこれら全ての評価に用いられ得る。
【００９０】
生化学的研究は、遺伝子組み換えによって影響される経路と関連する問題に対処するために行われ得る。分子学的研究は、酵素学的褐変またはピンク色への変色応答に推定的に含まれる、ＰＡＬ、ＰＰＯまたはペルオキシダーゼをコードする遺伝子等の候補遺伝子が改変されているか否かを決定するために行われ得る。遺伝学的解析はさらに、候補遺伝子で明らかとなった改変が、変化した表現型と関連した原因となるか否かを実証するために行われ得る。
【００９１】
誘引された変異誘発は、本発明のスクリーニング方法で用いるのには、植物個体群を提供する好ましい方法であるが、当業者においては、植物体のゲノム中に存在する標的遺伝子を特異的な方法で改変する方法が存在することが知られている。例として、キメラオリゴヌクレオチドは特定の作用方式において効果的な変異誘発物質であることが証明されている。
【００９２】
他のアプローチとしては、標的遺伝子を相同的組み換えまたは標的遺伝子組換えを通して改変するものがある。これらのアプローチを用いて、遺伝子断片が望ましい改変を含む導入されたＤＮＡ断片と交換される。トランスジェニック的アプローチはまた、内在性産物と競合する改変された標的遺伝子を導入するということも可能である。これは優性阻害効果をもたらし得る。更なる特異的な遺伝子発現の下方制御は、RNA干渉を通して可能となる。
【００９３】
変異原性オリゴヌクレオチドの場合、標的遺伝子組換えまたはトランスジェニックアプローチが、傷害誘導性変色反応を含む遺伝要因を改変するために用いられ、明らかに、関与遺伝子の一次構造は知られていなければいけない。
【００９４】
自家受精を通して得られた種子から成長した特定の突然変異体の子孫である植物体が、ピンク色への変色、観察された元の同定された変異体で発見されたのと同様の減少となる、ピンク色への変色について分析される。これは減少したピンク色への変色反応は遺伝的なものであり、およびゲノムの改変によって起こされるものであり得ることを実証する。
【００９５】
更に驚くべき発見は、減少した傷害誘導性変色が見られる同定された突然変異体の子孫である植物体が成熟し、および損傷した中肋組織の酵素学的褐変について検査されると、この応答もまた強く阻害されるという事実である。これは葉片のピンク色への変色分析は必然的にレタスにおける酵素学的褐変と関連し、およびピンク色への変色分析は成熟したレタス植物体の酵素学的褐変レベルを予測するのに用いられ得ることを示している。
【００９６】
従って、葉片のピンク色への変色分析は酵素学的褐変能の減少を示すレタス植物体を同定するための選択手段として用いられ得る。このようなツールは酵素学的褐変能の減少を示すレタス植物体を、このような個体群に存在する遺伝的変動という要因に関係なく、同定するのに用いられ得る。例として、ｅｍｓ個体群に加えて、自然目録または育種個体群を用いることもできる
【００９７】
該スクリーニング方法はまた、傷害誘導性変色を示す他の植物体のスクリーニングにも用いることができる。
【００９８】
本発明によって提供される１以上のスクリーニング方法は、例として、収穫後加工品質に改善が必要とされるどの植物体種にも適用することができる。栽培レタスに加えて、本発明は他の植物種、例としてアキノノゲシ属の野生種等のキク科、またはエンダイブ（チコリ）、チコリー（chicory）およびチコリー（witloof chicory）（キクニガナ）等の種である植物属、チコリに属している植物種に属する、他の植物種に適用することができる。更に、リンゴ、赤チコリ、ポテト、サツマイモ、根セロリー、キノコ、バナナ、アボガド、モモ、西洋梨、アンズ、マンゴー、ナス等の他の作物植物体、およびガーベラの茎、キクの花、アーティチョークの下部等の花または花茎が本発明における方法によってスクリーニングされ得る。
【００９９】
本発明は本明細書中に開示しているスクリーニング方法のひとつを行うことで、植物体中の表現型特長を検出する方法に関連する。特徴の存在は１以上の３つの変色テストによって決定され、すなわちピンク色への変色または褐変の発生またはＬ-ＤＯＰＡからメラニン等の、基質の有色色素への転換能力などである
【０１００】
ここで用いられる"対照"とはピンク色への変色、褐変およびＬ-ＤＯＰＡからメラニンへの転換の１以上の変色反応を示すことが知られているどれかの植物体であり、これらの反応はＬ-システインまたは桂皮アルデヒドによって阻害され得る。湿らせた濾紙の間で５℃で７日間インキュベートした場合、ピンク色の変色が葉片または植物体の部分の周辺部分にピンク色が見られる葉片または他の植物体の部分が、植物体として適切に用いられる。
【０１０１】
本発明は、以下に続きおよび本発明をいかなる方法においても限定することのない実施例において更に説明される。該実施例はレタス葉片および種子、チコリおよびナスに関するが、レタスの代わりに他の植物体またはその部分、特に新鮮な果実類および野菜類を用いることができる。実施例中、参照部分は以下に続く図で示される。
【実施例】
【０１０２】
実施例１
ｅｍｓを用いたレタスの遺伝子組み換え
レタスの変種、トゥルバドゥール（Troubadour）、アパケ（Apache）、ヨールビック（Yorvik）およびロデリック（Roderick）のおよそ２０００種子を、含気溶液の０.０５％（ｗ／ｖ）または０.０７％（ｗ／ｖ）濃度のｅｍｓ中で、２４時間室温においてインキュベートした。ｅｍｓ処理後、Ｍ１種子を水で洗浄し、および温室内に２０℃で１６時間を光条件、８時間暗条件下で植え、成熟した植物体に成長させおよびM２種子を作成するために、種をつけおよび花を咲かせるよう誘引した。成熟後、M２種子は使用するまで収穫し、積みおよび貯蔵した。突然変異はしばしばクロロフィル生合成を妨害する退色表現型を有する個々の植物体の相対数を基準として評価した。
【０１０３】
実施例２
ピンク色色素形成を基準としたレタスの傷害誘導性変色における表現型スクリーニング診断の開発
創傷によって誘引されるレタスの葉の変色を容易に評価できる表現型分析を開発した。このアプローチは変色における若い植物体のスクリーニングを可能とする。直径５mmの葉片を若いまたは成熟した植物体より採取し、およびトレー上の湿らせた濾紙の間に配置した。システムを５℃で７日間インキュベートした。インキュベートの間に、ピンク色色素が葉片の創傷部分で発達し、これは濾紙上のピンク色の円としてはっきり可視化できた（図２）。
【０１０４】
ピンク色色素の生成がフェニルプロパノイド経路活性を必要とするか明らかにするために、ＰＡＬ（桂皮アルデヒド、図３）およびＰＰＯ（Ｌ-システイン、図４）阻害剤の効果を本分析においてテストした。分析中に桂皮アルデヒドを適用した場合、ピンク色への変色が０.０１％またはそれより高い濃度において完全に阻害された。
【０１０５】
同様の結果が０.００１％およびそれ以上の濃度のＬ-システインを用いたときに得られ、一方でＬ-ロイシンまたはＬ-アラニン等の他のアミノ酸は何の効果も見せなかった。これはＬ-システインはレタス葉片のピンク色への変色応答を阻害でき、およびＬ-システインの阻害性効果が特異的であることを示す。
【０１０６】
Ｌ-システインがこのシステムにおいて本当にＰＰＯ活性の阻害剤として作用するかを実証するために、レタス葉片をＰＰＯ基質であるＬ-３,４-ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ-ＤＯＰＡ）と共にインキュベートした。Ｌ-ＤＯＰＡはレタスＰＰＯの天然基質とは考えられていないが、ＰＰＯを通したメラニン形成の徴候である、暗褐色から黒色への変色が創面において観察された。１ｍＭまたはそれ以上の濃度のＬ-システインを同時に適用した場合、該変色は図５で見られるように完全に阻害された。
【０１０７】
レタスの葉片のピンク色への変色応答を、傷害反応を誘引する前に熱ショックを適用することで更に特徴づけた。分離した葉を９０秒間、２１、４０、５０および６０℃でインキュベートした。この処理後、葉片を採取し、およびピンク色の変色について分析した。ピンク色への変色応答は５０℃またはそれ以上の温度下で熱ショックが行われた時に、完全に阻害された。この結果を図６に示す。
【０１０８】
Ｌ-システインはこれらを後退させ無色ジフェノールに転換することによって、ＰＰＯ生成物である、ｏ-キノンと反応することが知られているので、レタス葉片由来のピンク色色素上のＬ-システインの効果を測定した。平行してＬ-システインの効果を、Ｌ-ＤＯＰＡとのインキュベートにおけるメラニン形成について測定した。
【０１０９】
葉片を採取しおよび上記の手順に従ってインキュベートした。傷害反応が完了後、Ｌ-システインの濃度系列を葉片に添加しおよび色の変化をモニターした。結果を図７に示す。実験は明らかに、Ｌ-システインがピンク色色素を後退させ無色化合物に転換していることを示したが、一方でＬ-ＤＯＰＡ分析における黒色メラニン形成はＬ-システインによって影響されなかった。これは、ピンク色色素はレタスの多価フェノール酸化システムによって形成されるｏ-キノンである可能性が非常に高いことを示す。
【０１１０】
観察されたインビトロ応答が生理学的に関連のある応答を反映しているのか明らかにするために、変色をベースとしたＬ-システインを屋外栽培の植物体素材に適用した。これは葉脈に沿って激しいピンク色の徴候を見せた屋外栽培のレタス植物体由来の葉を収穫することで行った。これは、例として激しい湛水条件下等の、ストレスに植物体をさらした時に典型的に観察される。葉は１ｍＭ  Ｌ-システインで直ちにインキュベートした葉片を用意するために用いた。およそ３０分間の室温でのインキュベーション後、ピンク色への変色が  図８で見られるように、消滅した。
【０１１１】
まとめると、これらの実験データはレタスの葉片は創傷によって誘引され、ＰＡＬおよびＰＰＯ依存ピンク色への変色を生成することを示している。この表現型は、ＰＡＬ、ＰＰＯまたは両者を通して変色を誘引した改変された傷害反応を有するレタス突然変異体の効率的および効果的なスクリーニング手順を可能とする。
【０１１２】
実施例３
傷害誘導性変色の減少を示す突然変異体のスクリーニング
低い傷害誘導性酵素学的褐変またはピンク色への変色能を有するレタス突然変異体を同定するために、実施例２において記載した葉片分析をレタス突然変異体個体群の植物体に適用した。
【０１１３】
１２０００植物体を温室内で育て（場所:De Lier、３月２８日に種をまき、４月１８日に植え付けた;定型のレタス成長条件下で育てた）、および各個々の植物体から葉片を採取し（５月１５日以後からサンプルを収集）および湿らせた濾紙間で５℃で７日間、（平均）２５サンプルのプールとしてインキュベートした。ピンク色への変色の強さによって、各葉片に目に見える刻みをつけた。本評価に基づいて、創面における変色が見られないか、相対的に低レベルである葉片の植物体を選択した。変色の痕跡がほとんど見られない植物体を、０６Ｄ.２１０２０２と番号をつけた。
【０１１４】
１２０００植物体のうち、ほとんど可視化できない変色の痕跡のみ見られた１植物体を最終的に選択し、および相対的に低レベルの変色が見られた１１個体を選択した。これらの分析の結果を図９に示す。
【０１１５】
該変色分析を最初に選択した１２個体について繰り返し、ほとんどの個々のケースにおいて最初に出た結果が確定した。確定した個体のみを更なる分析および種子生成のために選択した。
【０１１６】
実施例４
傷害誘導性変色の減少が見られる突然変異体のスクリーニング
低障害誘導性酵素学的褐変能を持つレタス突然変異体を同定するために、実施例２で述べた葉片分析をレタス突然変異体個体群の植物体に適用した。８５００植物体が温室内で３週齢（６-８枚の葉の段階）まで育てられ、および各個々の植物体から葉片を採取し、湿らせた濾紙間で５℃で７日間インキュベートした。
【０１１７】
目に見える刻みをピンク色への変色の強さによって各葉片につけた。この評価に基づいて、創面における変色を見せないか、相対的に低レベルの変色を見せる葉片の植物体を選択した。８５００植物体のうち、可視化できる変色が何も見られない８植物体を選択し、および相対的に低レベルの変色を示す１０個体を選択した。該変色分析は最初に選択された該１８個体について繰り返し、およびほとんどの個々のケースにおいて、最初に出た結果が確定した。１２個体を図１０に示す。確定した個体のみを更なる分析および種子生成のために選択した。多面発現性副作用（例えば退色、矮化）のない一突然変異体植物体に０５Ｄ.２０２５３９と番号をつけた。この植物体の自家受粉により生成した種子を０５Ｄ.８１０５９６と番号をつけた。０５Ｄ.８１０５９６種子から成長した植物体の自家受粉により生成した種子を０７Ｇ.９９７９と番号をつけおよびＮＣＩＭＢに預けた。ＮＣＩＭＢ-番号は４１４４１（２００６年１０月１０日に預けた）である。
【０１１８】
実施例５
選択された傷害誘導性変色の減少が見られる突然変異体の表現型分析
実施例３、６におけるスクリーニングより選択された突然変異体の１２個体が強い、減少した成長表現型および退色を示した。他の突然変異体は通常通り発達し、例えば突然変異誘発実験の出発個体群の型による。
【０１１９】
矮化および退色した突然変異体はおそらく葉緑体機能を妨害する。ＰＰＯがこれらの細胞器官に存在し、これは葉片分析における相対的な低応答を説明し得る。このような多面発現突然変異は望ましくないので、これらの突然変異体はより関連性がないものと考えられた。
【０１２０】
葉片変色の最も強い減少が見られた突然変異体植物体０６Ｄ.２１０２０２が通常の表現型を示したので、該突然変異体はゆえに強い多面発現効果無しでの変色において特異的なものと考えられる。
【０１２１】
実施例６
子孫における変色表現型がほぼ不存在であることの確証
実施例３および５における植物体０６Ｄ.２１０２０２等のレタス突然変異体での減少した変色が、本明細書中に開示した変異誘発処理によって生じた遺伝的影響によるものであるか明らかにするために、種子を自家受粉によって生成した。植物体０６Ｄ.２１０２０２の自家受粉によって生成された種子は０６Ｄ.８１９７８４と番号をつけた。種子は土壌中で発芽しおよび植物体を葉片のピンク色への変色分析を用いて、変色についてテストをした。
【０１２２】
全ての子孫植物体が、種子を生成するのに用いた突然変異体のような、同様の表現型、例えばピンク色への変色における強い減少が起こるもの等を示したので、この実験は、変化した表現型が遺伝的根拠を持つことを明らかに示した。この結果は図１１において説明している。
【０１２３】
０６Ｄ.８１９７８４の種子から成長したこれらの植物体の自家受粉によって生成された種子に０６Ｄ.８６３B２と番号をつけ、およびＮＣＩＭＢに預けた。ＮＣＩＭＢ-番号は４１４５４（２００７年１月３日に預けた）である。
【０１２４】
実施例７
褐色色素形成に基づくレタスの傷害誘導性変色を診断するための表現型スクリーニングの開発
レタス植物体を成熟するまで栽培し、および外葉部分を葉脈組織から切片を切り取ることで採取した。切片を湿らせた濾紙上で１６℃でインキュベートした。
およそ７２時間後、創面が褐色に変化した。１０ｍＭ  Ｌ-システインの存在下で、褐変応答が阻害され、これは観察された変色はＰＰＯが仲介したものであることを示している。このような実験の典型的な結果を図１２に示す。
【０１２５】
図１２に示すような応答はＰＰＯ仲介の褐変応答であるので、この実施例で記載したスクリーニング手順は、レタスの加工時に起こる褐変の減少を示す突然変異体をスクリーニングするのに、効果的および不偏性のあるものであると考えられる。
【０１２６】
実施例８
Ｌ-３,４-ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ-ＤＯＰＡ）のメラニンと呼ばれる黒色色素への転換に基づくレタスの傷害誘導性変色を診断するための表現型スクリーニングの開発
広い意味で傷害誘導性変色に対応する分析に加えて、本発明による方法はまた、より特異的な減少したＰＰＯ活性を有する突然変異体のスクリーニングを可能とする。ＰＰＯ活性を示す表現型分析は、１.５ｍＭ  Ｌ-ＤＯＰＡの存在下でインキュベートした葉片を用いて開発した。黒色の変色が明らかであったので、Ｌ-ＤＯＰＡはレタスの葉の創面におけるポリフェノール酸化システムによって容易に、メラニンと呼ばれる黒色色素に転換され得ると結論づけられる。Ｌ-ＤＯＰＡはＰＰＯによって非-酵素的にドパクロムを介して転換される、関連するＬ-ＤＯＰＡ-キノンに転換され、およびインドールキノンは黒色メラニンに転換される。
【０１２７】
さらに、該反応は１ｍＭ  Ｌ-システインを反応中に添加することで、阻害し得ることが明らかとなった（図５）。よって、この分析は葉の創面におけるＰＰＯ活性を開始できるように改変された突然変異体の同定を可能とする。Ｌ-ＤＯＰＡの存在に対するレタス葉片の応答は図１３中に示すように湿らせた濾紙間同様、溶液中においても観察され得る。
【０１２８】
実施例９
葉脈切片の褐変分析を用いた減少した褐変応答における、変色がほぼ不存在であることを示す突然変異体の子孫の評価
葉片の創面のピンク色への変色が有意に減少する、実施例３、５および６由来の番号０６Ｄ.２１０２０２である植物体のようなレタス突然変異体の減少した変色もまた、傷害誘導性褐変応答において効果的に減少するかどうかを明らかにするために、多くの子孫植物体を成熟するまで栽培した。
【０１２９】
開発のこの段階において、３つの中肋組織切片を、多くの子孫植物体の外葉から採取する。これらの葉脈切片を実施例７に記載した手順によってインキュベートした。傷害誘導性ピンク色への変色の強い減少がより早く見られた突然変異体の子孫植物体は、傷害誘導性の中肋組織における褐変においても強く減少することが分かる。この実施例の結果を図１４に示す。
【０１３０】
実施例１０
プラスチックの袋に包装された摘み立てのレタス頭部を用いた褐変応答の減少における、変色がほぼ不存在であることを示す突然変異体の子孫の評価
実施例６由来の番号０６Ｄ.８１９７８４である種子から成長したレタス植物体の成熟した頭部、これは有意に葉片の創面のピンク色への変色が減少しているものを、ナイフを用いて細かく刻み、および雰囲気を含んだプラスチックの袋に包装した。通常の葉片のピンク色への変色反応を示す対照植物体を同様に処理した。袋は葉素材がその褐変応答について評価された後、４℃で６日間貯蔵した。
【０１３１】
この実験によって、加工および雰囲気を用いた袋中に貯蔵したときに、強い傷害誘導性ピンク色への変色の減少がより早く見られた突然変異体の子孫植物体はまた、傷害誘導性中肋組織における褐変も強く減少することは明らかである。この実施例の結果は図１５に示す。
【０１３２】
実施例１１
チコリにおけるピンク色への変色
低傷害誘導性酵素学的ピンク色への変色能力に応じて突然変異体を分類するために、実施例２で記載した葉片分析を、突然変異体チコリ個体群に適用した。結果を図１６に示す。当然チコリにおいても、ピンク色への変色反応が存在するという結果になる。本発明のスクリーニング方法はゆえに、減少した傷害誘導性変色を示すチコリ植物体の選択において強力なツールとなる。今までエンダイブおよびチコリーにおける褐変応答の評価は、突然変異体植物体を観察することでのみ行われていた。若い植物素材にも適用し得る本発明の方法は、非常に効率的および速いものである。
【０１３３】
実施例１２
ナスにおける変色
ナスを半分に切断し、室温で一晩インキュベートした。図１８からは、変色反応は主に種子によって引き起こされるという結果になる。よって、種子は例としてＬ-ＤＯＰＡ等の、基質-ベースの変色分析における適した候補である。
【０１３４】
実施例１３
クロロゲン酸の転換に基づくレタスの傷害誘導性変色を診断するための表現型スクリーニング
レタスの葉片は濾紙上で１０ｍＭクロロゲン酸と共にインキュベートした。図１７は葉片の褐変を示す。Ｌ-システインを添加した状態では、色が再び消滅し、これは変色がＰＰＯに依存していることを示す。
【０１３５】
この実施例は、クロロゲン酸が基質-ベースのスクリーニング分析における適した基質であることを実証している。
【０１３６】
実施例１４
種子における傷害誘導性変色を診断するための基質-ベースの表現型分析
レタスおよびナスの種子を０、２.５および５ｍＭ  Ｌ-ＤＯＰＡと共にインキュベートした。図１９種子において観察された呈色反応が濃度依存であることを示す。応答はＰＰＯ-依存であり、なぜならそれがＬ-システインによって阻害され得るからである。
【０１３７】
レタスの発芽種子をＬ-ＤＯＰＡと共にインキュベートした。図２０は種皮および根端のすぐ後ろの根域が呈色反応を示すことを表す。この呈色反応は減少した変色を示す種子のスクリーニングに用いることができる。
【０１３８】
レタスの種子を０、１００、２５０、５００、７５０および１０００ｍｇ／Ｌカテコールと共にインキュベートした。図２１は種子が濃度依存着色応答を示すことを表す。該応答はＰＰＯ-依存であり、なぜならそれはＬ-システインによって阻害されることが明らかとなったからである。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】図１は減少した収穫後酵素学的変色におけるレタス個体群の突然変異体スクリーニング手順の案における論理的根拠の概略図である。スクリーニングの入力信号は葉組織の創傷であり、これは植物体によって検知され、および老化、呼吸および組織の変色を含む多くの生理学的工程を導く、分岐する信号応答を生成する。この入力信号はＰＰＯ基質等のフェノール化合物の適用と併用し得る。  スクリーニングの出力信号は収穫後褐変およびピンク色への変色の診断のための、適用された条件に依存する、創面での褐変またはピンク色への変色である。これは、出力信号は完全に各々特異的なＰＡＬおよびＰＰＯ阻害剤である、桂皮アルデヒドおよびＬ-システインによって阻害されるという事実より推論される。
【図２】図２は葉片のピンク色への変色に基づくスクリーニングのアウトプットとしての表現型の代表的な画像である。レタス植物体の葉片（植物体につき１切片）は湿らせた濾紙の間に並べ、および５℃で７日間インキュベートした。ピンク色への変色は明らかに創面における各葉片周辺に観察することができた。
【図３】図３はＰＡＬ阻害剤、桂皮アルデヒドの異なる濃度存在下で行った葉片のピンク色への変色分析（デイッシュにつき４切片）である。各デイッシュの上部の数字は使用した桂皮アルデヒドの％を示す。
【図４】図４は湿らせた濾紙間でインキュベートしたレタスの葉の葉片のピンク色への変色（デイッシュにつき４切片）におけるＰＰＯ阻害剤Ｌ-システインの阻害作用である。各デイッシュの上部の数字は使用したＬ-システインの％を示す。
【図５】図５は１.５ｍＭ  Ｌ-ＤＯＰＡの存在下での湿らせた濾紙間でインキュベートしたレタス葉片（デイッシュにつき４切片）の黒色への変色におけるＰＰＯ阻害剤Ｌ-システインの阻害作用である。各デイッシュの上部の数字は使用したＬ-システインのｍＭ濃度を示す。
【図６】図６はレタス葉片のピンク色への変色における熱ショック前-処理の効果である。熱ショックは９０秒間各デイッシュ上に示した温度で無傷の葉に対して適用した。
【図７】図７はレタスの傷害反応によって形成されたピンク色色素の、Ｌ-システインによる無色化合物への転換である。上列のデイッシュはＬ-ＤＯＰＡ分析を示し、一方下列のデイッシュはピンク色への変色分析を示す。各デイッシュの下側の２つの切片は傷害反応が完了後、Ｌ-システインで処理をした。使用したＬ-システイン濃度は０、０.００１、０.０１、０.１、１および１０ｍＭであり、これは上部に示している。
【図８】図８は提示された栽培されたレタスでの、Ｌ-システインによるピンク色への変色の減少である。上側のパネルは植物体から採取されたレタスの葉の典型的なピンク色の徴候を示し、これは湛水によって著しくストレスにさらされたものである。大葉脈はピンク色色素の存在を示している。下側、右側のパネルは、１ｍＭ  Ｌ-システインで３０分間室温において処理した後ピンク色の徴候を示す葉から採取した切片を示す。下側、左側のパネルは、水で３０分間室温において処理した後の同様の葉片を示す。
【図９】図９のパネルA:本発明によって記載された方法における、各レタスM２植物体（プール上にグループ化されている）の葉片変色における表現型分析である。１２０００のうちの合計１３８サンプルがこのパネル上に示され、矢印で示されたそのうちの１つはピンク色への変色の強い減少を示した。パネルB:明らかな変色反応を示す対照サンプルと比較して、ピンク色への変色形成がほぼ不存在（中間に位置するサンプル）であることが確かめられた、パネルA中で示された選択された個体の再テストである。
【図１０】図１０はM２レタス植物体の表現型である。１、２、４、５、７、１０および１２とラベルされた植物体は、本発明における分析を用いて減少したピンク色への葉片変色を示す。植物体３、６、８、９、および１１は、ピンク色への葉片変色のレベルが、野生型対照体に相当する個体である。植物体１はピンク色への変色の強い現象および通常の発育体型を見せる唯一の突然変異体の例である。植物体２、４、５、７、１０および１２は減少したピンク色への変色および矮化、退色した表現型を示す。
【図１１】図１１は減少した変色を示すレタスの突然変異体の子孫のテストである。左側は、通常の傷害誘導性変色反応を示す２５の対照体サンプルが示されている。右側は、傷害誘導性変色反応が激しく減少する、１突然変異体から派生した一連の３５子孫植物体からさ異種されたサンプル集団が示されている。
【図１２】図１２は成熟したレタス植物体から採取した葉の中肋部分の褐変に基づいたスクリーニングのアウトプットの表現型の代表的な画像である。画像は３日間１６℃でインキュベーション後のレタスの外葉の中肋組織切片を示す。典型的な褐変が明らかに創面上に観察できる。各デイッシュは中肋組織（緑、明るい緑および白）の異なる部位において採取した３切片を含む。デイッシュの上部の番号は、濾紙に添加されたＬ-システインのｍＭ濃度を示す。
【図１３】図１３はレタスの葉表面におけるＬ-ＤＯＰＡのメラニンへの転換である。パネルAは１.５ｍＭのＬ-ＤＯＰＡ溶液における分析を示す。上部のチューブはネガティブコントロールであり、他の３チューブは全く同一である。パネルBは１.５ｍＭのＬ-ＤＯＰＡを含む湿らせた濾紙間で葉片をインキュベーションした結果を示す。
【図１４】図１４は中肋組織の褐変部位において減少した傷害誘導性ピンク色への変色を見せるレタスの突然変異体の子孫のテストである。パネルAは８子孫植物体の中肋組織切片を示し、減少したピンク色への変色突然変異体として１から８（植物体につき３切片）まで番号をつけた。パネルBは通常の褐変応答を示す９から１６（植物体につき３切片）まで番号をつけた、中肋組織切片の８対照植物体を示す。
【図１５】図１５は雰囲気下で切断および包装後に、減少した傷害誘導性のピンク色の変色または褐変応答を示すレタスの突然変異体の評価である。対照植物体の頭部の葉片は左側に見られ、および減少した変色突然変異体の葉片は右側に見られる。摘み立ての葉素材を６日間４℃で貯蔵した。褐変は明らかに対照体サンプルで観察される一方で、突然変異体サンプルは変化がない。
【図１６】チコリ（左側のパネル）およびキクニガナ（右側のパネル）におけるピンク色への変色分析である。
【図１７】レタス葉片上でのクロロゲン酸分析である。
【図１８】切断したナスにおける褐変応答である。
【図１９】レタス（上列）およびナス（下列）の種子上でのＬ-ＤＯＰＡ分析である。
【図２０】レタスの発芽種子上でのＬ-ＤＯＰＡ分析である。
【図２１】レタスの発芽種子上でのカテコール分析である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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