(57)【要約】【課題】  本発明は、オリゴヌクレオチドを使って核酸分子を同定する方法を提供することを目的とする。【課題を解決するための手段】  本発明は、核酸分子の同定に関する。特に、本発明は、核酸分子を同定するために核酸分子の可変領域用に設計されたオリゴヌクレオチドを使用する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子を同定するのに使用されるオリゴヌクレオチドを設計する方法であって、
ａ）少なくとも二つの核酸分子のそれぞれにおいて第一および第二可変領域を同定する工程であって、それぞれの核酸分子における前記第一および／または第二可変領域は、その核酸分子に特徴的である工程と、
ｂ）一つの核酸分子の前記第一可変領域と結合し、その核酸分子の前記第二可変領域の情報を作成するオリゴヌクレオチドを設計する工程と、を有する方法。
【請求項２】
前記ａ）工程の前に、少なくとも二つの核酸分子の配列を並べる工程を有する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
核酸分子を同定し、さらに２以上の配列可変領域の配列間のシス／トランス関係を判断する方法であって、
ａ）対立遺伝子の第一可変領域に結合し、前記核酸分子の第二可変領域の情報を作成するオリゴヌクレオチドを合わせる工程であって、前記第一および／または第二可変領域は前記核酸分子に特徴的である工程と、
ｂ）前記核酸分子の情報を作成する工程と、
ｃ）前記核酸分子を同定するために、作成された情報を解析する工程と、を有する方法。
【請求項４】
核酸分子を同定し、さらに２以上の配列可変領域の配列間のシス／トランス関係を判断する方法であって、
ａ）オリゴヌクレオチドの情報は含まずに２以上のシークエンスされた配列からの情報を合わせる工程と、
ｂ）前記核酸分子の情報を作成する工程と、
ｃ）前記核酸分子を同定するために情報を解析する工程と、を有する方法。
【請求項５】
個体のＨＬＡタイピングの方法であって、
ａ）前記個体からのサンプルと前記個体のＨＬＡ対立遺伝子の第一可変領域に結合するオリゴヌクレオチドとを合わせ、前記対立遺伝子の第二可変領域の情報を作成する工程であって、前記第一および／または第二可変領域は、前記対立遺伝子に特徴的である工程と、
ｂ）前記対立遺伝子の情報を作成する工程と、
ｃ）前記対立遺伝子を同定するために作成された情報を解析する工程であって、前記対立遺伝子の同定は、個体のＨＬＡタイプを提供する工程と、を有する方法。
【請求項６】
個体の障害もしくは病気を改善する方法であって、
ａ）前記個体からのサンプルと核酸分子の第一可変領域に結合するオリゴヌクレオチドとを混ぜ、前記核酸分子の第二可変領域の情報を作成する工程であって、前記第一および／または第二可変領域は、前記核酸分子に特徴的である工程と、
ｂ）前記核酸分子の情報を作成する工程と、
ｃ）前記核酸分子を同定するために作成された情報を解析する工程であって、前記核酸分子の同定は、前記病気または障害をどのように改善するかを示す工程と、を有する方法。
【請求項７】
個体の病気または障害を判断する方法であって、
ａ）前記個体からのサンプルと核酸分子の第一可変領域に結合するオリゴヌクレオチドとを合わせ、前記核酸分子の第二可変領域の情報を作成する工程であって、前記第一および／または第二可変領域は、前記核酸分子に特徴的である工程と、
ｂ）前記核酸分子の情報を作成する工程と、
ｃ）前記核酸分子を同定するために作成された情報を解析する工程であって、前記核酸分子の同定は、前記病気または障害の判断を提供する工程と、を有する方法。
【請求項８】
前記第一および第二可変領域のどちらともが前記核酸分子に特徴的ではないが、前記第一および第二核酸分子の組み合わせが前記核酸分子に特徴的である請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記核酸分子が遺伝子の対立遺伝子である請求項１、３または５から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記解析がコンピュータープログラムにより行われる請求項２から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記コンピュータープログラムがＡｓｓｉｇｎ−ＳＢＴＴＭである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第一および第二可変領域が１から１５００ヌクレオチド離れている請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記第一および第二可変領域が３０から１０００ヌクレオチド離れている請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記第一および第二可変領域が１００から５００ヌクレオチド離れている請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記核酸分子もしくは対立遺伝子が前記ａ）工程の前に増幅されている請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記核酸分子がＨＬＡ遺伝子である請求項４または８に記載の方法。
【請求項１７】
前記核酸分子がＨＬＡ−ＤＲＢ１である請求項４、８または１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
一つのオリゴヌクレオチドが使用される請求項３から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも四つのオリゴヌクレオチドが使用される請求項３から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記核酸分子が実質的にＣＴＣＡＣＡＣＣＡＴＣＣＡＧＡＴＡ配列から成る請求項１から１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記ａ）およびｂ）工程が同じ容器内で起こる請求項３から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
請求項３から２１のいずれかの方法に使用されるＣＴＣＡＣＡＣＣＡＴＣＣＡＧＡＴＡ配列を有するオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸分子の同定に関する。特に、本発明は、核酸分子を同定するために核酸分子の可変領域に対応する用に作成されたオリゴヌクレオチドを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ある核酸分子をその他の核酸分子から区別する必要のある状況は、いくつも例がある。例えば、多くの遺伝子は、二つ以上の対立遺伝子を有しており、個体の対立遺伝子を同定する必要があるような状況が多くある。さらには、多くの生物は、近縁する遺伝子もしくは似た配列を有する遺伝子を有しているが、これらの配列を基に生物を特定することが望ましいこともある。さらに、ＰＣＲ反応産物などのサンプル中の特定の核酸分子を同定するのが望ましいこともある。
【０００３】
対立遺伝子の同定を例にとると、現在１２００のＨＬＡ対立遺伝子が知られている。ＨＬＡ機構内の遺伝子多型の割合は、人類全体としては有利であっても、個体としてはいくつか不利になることもある。例えば、多くの病気にとって、臓器移植や幹細胞移植だけが既知の治療である場合である。しかしながら、ＨＬＡ対立遺伝子の数は結果として、同じＨＬＡ型をもった個体を見つけることが困難になるということである。ＨＬＡ型の異なるドナーの組織が、レシピエントに移植された場合、レシピエントの免疫反応は、移植された組織中の異なるＨＬＡ型を認識し、続く免疫反応は、移植された組織を拒絶する場合がある。
【０００４】
免疫機構を抑制する薬によって拒絶反応を防ぐもしくは緩和出来るため、ドナーとレシピエントとの間にＨＬＡの一致が少ししかない、もしくは全くなかったとしても、固形の臓器を移植することは多くある。しかしながら、ドナーとレシピエントのＨＬＡ型の一致が増加するほど、臓器とレシピエントの生存確率が増加することが示されている。
【０００５】
幹細胞移植の場合は、状況が異なっており、特に骨髄移植の場合は異なっている。これは、ドナーとレシピエントのＨＬＡ型が完全に一致しなければならないからである。この場合、ＨＬＡ型が完全に一致していないと、移植された幹細胞がレシピエントを異物とみなし、深刻な病気を引き起こす、または死に至らしめることもある。
【０００６】
近年の研究により、ＨＬＡ型が他の分野でも重要であることが示されている。例えば、ＨＩＶに感染している患者で治療薬アバカビル（Ａｂａｃａｖｉｒ）を使用する人は、患者のＨＬＡ型がＨＬＡ−Ｂ＊５７０１であると、ほぼ確実に潜在的に深刻な反応を引き起こす。同様に、アロプリノール（Ａｌｌｏｐｕｒｉｎｏｌ）を服用している患者が、ＨＬＡ―Ｂ＊５８０１であると、深刻な反応を引き起こす。
【０００７】
ワクチン試験においてもＨＬＡ型は重要である。ワクチンが上手く効果を出すためには、ワクチンの重要なペプチドがＨＬＡにより免疫機構に提示されなければならない。これには、個人が免疫機構にペプチドを提示できるＨＬＡ分子を持っていることが必要である。これは、ＨＬＡ分子のアミノ酸配列により決定されており、さらにＨＬＡ型はアミノ酸の配列により決定される。個体のＨＬＡ分子が認識できないタンパク部位の配列をワクチンが持っているために、個人のＨＬＡ型がワクチンを提示しない場合、ワクチンはこの個人には効果がない。
【０００８】
さらには、多くの病気が特定のＨＬＡ型と関連しており、ＨＬＡ遺伝子と関連するＨＬＡ対立遺伝子および／または遺伝子が、病気の罹患率に寄与することを示している。結果的に、患者のＨＬＡタイピングと、病気の罹患率に関する対立遺伝子を特定するための制御と、特定の対立遺伝子に関連する病気の診断に使用できるマーカーの同定とを含む多くの研究がされている。例えば、強直性脊椎炎（ＡＳ）を有している殆ど全ての患者は、ＨＬＡ―Ｂ＊２７の特定のサブタイプを持っている。従って、これらのサブタイプを除くということは、すなわちＡＳであるという診断を除外するということである。
【０００９】
多くの場合、正確なＨＬＡタイピングが必要である。しかしながら、ある個人のＨＬＡ対立遺伝子が同時にシークエンスされると、得られた配列は、二つ以上の対立遺伝子の組み合わせと同じである可能性もある。新しい対立遺伝子は、常に報告されており、結果的に可能な対立遺伝子の数が増加している。新しい研究方法では、ＨＬＡ対立遺伝子などの核酸分子の同定が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、オリゴヌクレオチドを使って核酸分子を同定する方法を提供する。核酸分子の同定は、沢山のそして種々の使用法がある。例えば、ＨＬＡ対立遺伝子の同定、病原性微生物の同定、またはＰＣＲ産物中の各構成物の同定である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
従って、本発明の第一の観点は、核酸分子の同定に使われるオリゴヌクレオチドの設計に関する方法を提供し、
ａ）少なくとも二つの核酸分子のそれぞれにおいて第一および第二可変領域を同定する工程であって、それぞれの核酸分子における前記第一および／または第二可変領域は、その核酸分子に特徴的である工程と、
ｂ）一核酸分子の第一可変領域と結合し、その核酸分子の第二可変領域の情報を作成するオリゴヌクレオチドを設計する工程と、を有する。
【００１２】
いくつかの実施形態において、ａ）の工程の前に、少なくとも二つの核酸配列を並べる最初の工程を有する方法がある。
【００１３】
本発明の第二の観点では、核酸分子を同定する方法を提供し、
ａ）核酸分子の第一可変領域に結合し、前記核酸分子の第二可変領域の情報を作成するオリゴヌクレオチドを合わせる工程であって、前記第一および／または第二可変領域は前記核酸分子に特徴的である工程と、
ｂ）前記核酸分子の情報を作成する工程と、
ｃ）前記核酸分子を同定するために、作成された情報を解析する工程と、を有する。
【００１４】
本発明の第三の観点では、個体のＨＬＡタイピングの方法を提供し、
ａ）前記個体からのサンプルと前記個体のＨＬＡ対立遺伝子の第一可変領域に結合するオリゴヌクレオチドとを合わせ、前記対立遺伝子の第二可変領域の情報を作成する工程であって、前記第一および／または第二可変領域は、前記対立遺伝子に特徴的である工程と、
ｂ）前記対立遺伝子の情報を作成する工程と、
ｃ）前記対立遺伝子と同定するために作成された情報を解析する工程であって、前記対立遺伝子の同定は、個体のＨＬＡタイプを提供する工程と、を有する。
【００１５】
本発明の第四の観点では、個体の病気または障害を改善する方法を提供し、
ａ）前記個体からのサンプルと核酸分子の第一可変領域に結合するオリゴヌクレオチドとを合わせ、前記核酸分子の第二可変領域の情報を作成する工程であって、前記第一および／または第二可変領域は、核酸分子に特徴的である工程と、
ｂ）前記核酸分子の情報を作成する工程と、
ｃ）前記核酸分子を同定するために作成された情報を解析する工程であって、前記核酸分子を同定することは、前記病気または障害をどのように改善するかを示す工程と、を有する。
【００１６】
本発明の第五の観点では、個体の病気または障害を判断する方法を提供し、
ａ）前記個体からのサンプルと核酸分子の第一可変領域に結合するオリゴヌクレオチドとを合わせ、前記核酸分子の第二可変領域の情報を作成する工程であって、前記第一および／または第二可変領域は、前記核酸分子に特徴的である工程と、
ｂ）前記核酸分子の情報を作成する工程と、
ｃ）前記核酸分子を同定するために作成された情報を解析する工程であって、前記核酸分子を同定することは、前記病気または障害の判断を提供する工程と、を有する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、対立遺伝子である。
【００１８】
いくつかの実施形態では、二つ以上の可変領域に関する情報は、作成されたものである。
【００１９】
第二から第五の観点のいくつかの実施形態において、解析は、コンピュータープログラムにより行われる。前記コンピュータープログラムは、Ａｓｓｉｇｎ−ＳＢＴＴＭであってもよい。
【００２０】
第二から第五の観点のうちのいくつかの実施形態は、一つのオリゴヌクレオチドが使用される。他の実施形態では、４つのオリゴヌクレオチドが使用される。
【００２１】
第二から第五の観点のうちのいくつかの実施形態では、ａ）およびｂ）工程は同じ容器内で行われてもよい。
【００２２】
いくつかの実施形態では、第一および第二可変領域は、１から１５００ヌクレオチド離れている。他の実施形態では、第一および第二可変領域は、３０１０００ヌクレオチド離れている。さらに別の実施形態では、第一および第二可変領域は、１００から５００ヌクレオチド離れている。
【００２３】
いくつかの実施形態において、対立遺伝子は、ａ）工程の前に増幅されている。
【００２４】
遺伝子は、ＨＬＡ遺伝子であってもよい。いくつかの実施形態では、遺伝子は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、核酸分子の可変領域を示す図であり、各可変領域は、文字Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥで表される異なる配列を有する。
【図２】図２は、核酸分子の可変領域を示す図であり、各可変領域は、文字Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤで表される異なる配列を有する。
【図３】図３は、対立遺伝子Ａ＊０１０１０１０１の配列と比較した、位置２７０から６２０におけるＨＬＡ−Ａ対立遺伝子、Ａ＊０３０１０１０１、Ａ＊０３２２、Ａ＊２９０２０１、およびＡ＊２９０９の配列を示す図である。Ａ＊０１０１０１０１と同じ配列のヌクレオチドは、ダッシュ（−）で表されており、異なっているものは示されている。一般的な表記に従って、文字Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔはヌクレオチド、アデニン、グアニン、シトシンおよびチアミンを表す。文字Ｗは、Ａ＋Ｔを、ＹはＣ＋Ｔを、ＲはＡ＋Ｇを、ＫはＧ＋Ｔを、ＭはＡ＋Ｃを示す。
【図４】図４は、ＨＬＡ対立遺伝子、Ａ＊２９０２０１、およびＡ＊２９０９の配列を同定するのに使われるオリゴヌクレオチド（ＨＡＲＰ１で記されている）の結合サイトを示す。位置５０２の小さな箱は、Ａ＊２９０２０１とＡ＊２９０９の配列とで異なるヌクレオチドである。ＨＡＲＰが、Ａ＊２９０２０１とＡ＊２９０９だけをシークエンスするという情報と位置５０２の配列を使って、正確な対立遺伝子（Ａ＊２９０２０１もしくはＡ＊２９０９）を同定できる。
【図５】図５は、混合配列がＨＬＡタイプでＡ＊０３０１０１＋２９０２０１もしくはＡ＊０３２２＋２９０２であった実験結果からの配列における重要領域（塩基５０２）を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明を詳しく説明する前に、本発明は例示された特定の方法に限定されることはなく、当然ながら変化できる点は、言うまでもない。この中で使われている用語は、本発明の特定の実施形態を説明する目的だけであって、これに限定するものではなく、本発明は後述の特許請求の範囲にのみ限定されるものである。
【００２７】
ここに、記載する刊行物、特許、特許出願は、全て、後述でも前述でも、引用文献としてのみ取り入れている。しかしながら、ここに記載する刊行物は、該刊行物において記載されたプロトコルと試薬を記載および開示する目的で引用されており、また本発明においても使用されてもよい。ここに記載するものは、先の発明によって、本発明がこのような開示以前のものではないことについて、許可を得るものではない。
【００２８】
さらに、本発明の作業は、特に示さない限りは、従来の分子生物学および薬理学をその技術的範囲内で用いている。そのような技術は、この技術の知識を有した者にはよく知られた技術であり、さらに文献でも詳しく説明されている。例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」の第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編集）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」、（Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｈｉｇｇｉｎｓ編集  １９８４）；  「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｇａｉｔ編集、１９８４）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｓｙｌｖａｎｉａ、ＵＳＡ．；  「Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ」、第１２版（１９９６）、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｃａｔｅｇｏｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ；および「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＆  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」、（Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｈｉｇｇｉｎｓ編集、１９８４）を参照。
【００２９】
尚、明細書および後述の特許請求の範囲では、特に明確に記されていない限り複数として言及する。したがって、例えば、「オリゴヌクレオチド」に言及しているときは、複数のオリゴヌクレオチドを含んでおり、さらに「対立遺伝子」に言及しているときは、一つ以上の対立遺伝子を含んでいる。特に定義されない限りは、ここで使われる全技術および科学用語は、この発明が属するこの分野の通常の知識を有する者に一般的に理解されるのと同じ意味で使われている。ここに記載する材料と方法に似たもしくは同等のものは、本発明を行うもしくは試すのに使われてもよいが、好ましい材料と方法は以下に記載する。
【００３０】
明細書中の「有する」さらにその変化形の言葉、例えば「有している」は、「含んでいるがそれに限定されない」という意味であり、その他の添加物、成分、整数、または工程を除外するものではない。「から成る」というのは、「から成る」という表現の前の部分を含んでいて、さらにそれに限定されるという意味である。従って、「から成る」というのは、記載された要素が必要もしくは必須であるという意味で、その他の要素は存在しないかもしれないという意味である。「から主に成る」というのは、その表現の前に記載されたいずれも含んでいて、さらに明細書で言及された要素の活動もしくは反応を妨げずまたは寄与するその他の要素に限定されると言う意味である。したがって、「から主に成る」という表現は、記載された要素は必要もしくは必須であるが、それ以外の要素は任意でなく、記載された要素の活動もしくは反応に影響するかしないかによって存在するかしないかが決まる。
【００３１】
一観点では、本発明は、核酸分子の同定に使用するのに適したオリゴヌクレオチドを設計する方法を提供する。発明者らは、核酸分子の可変領域と結合し、さらに核酸分子の他の可変領域の情報を作成できるオリゴヌクレオチドが核酸分子の同定に使用できることを驚いたことに発見した。
【００３２】
特定の理論や仮説に拘束されることなく、本発明者らは、一つのオリゴヌクレオチドを使って核酸分子の２つ以上の可変領域の情報を作成すると、オリゴヌクレオチドを使って一つだけの可変領域の情報を作成したときと比較して、実質的により多くの核酸分子を同定できることを見出した。
【００３３】
核酸分子の「可変領域」は、核酸分子をその他の核酸分子と区別する配列から成る。例えば、追加、削除、もしくは複製の結果として配列が違っていることもある。もしくは、またはそれに加えて、核酸分子内でのモチーフの再編成の結果、一ヌクレオチド以上配列が違っていることもある。再編成は、逆位（順番が反転）もしくは転位（ヌクレオチド配列が新たな位置に移動）である場合がある。好ましくは、可変領域は、一つのＨＬＡ群の対立遺伝子と他の一群の対立遺伝子を単に区別するだけではない。対立遺伝子の一群は、一般的にモチーフとしても知られている、歴史的に特定の配列の組み合わせを有した対立遺伝子である。このモチーフに結合するオリゴヌクレオチドは、その一群の全てではなくても、ほとんどの構成部と結合する。
【００３４】
核酸分子の可変領域は、少なくとも二つの既知の核酸分子の配列を並べて、さらに並べられた一以上の他の核酸分子に存在している配列と異なる配列を有した一以上の部位を同定することで判断できる。いくつかの実施形態では、二以上の既知の核酸分子が並べられた。
【００３５】
一実施形態においては、核酸分子は、遺伝子の対立遺伝子である。他の実施形態では、遺伝子中の知られた全ての対立遺伝子が並べられる。
【００３６】
ここで使われている「並べる」という単語は、核酸分子の配列を典型的には上下に並べ、必要であればギャップも挿入して並べることを意味する。このようにすることで、可変領域が強調される。本発明の目的のためのアラインメントは、この技術範囲内における種々の方法で可能であり、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＢＬＡＳＴ，ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２またはＭｅｇａｌｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）などの一般的に使用可能なコンピューターソフトウェアを使用する。この技術の知識を有した者であれば、比較される配列の全長に対する最大のアラインメントを達成するために必要なアルゴリズムを含むアラインメントを測定するための適切なパラメーターを判断できる。
【００３７】
核酸分子の可変領域の同定に続いて、該核酸分子に特徴的なものを選択する。ここで言う「特徴的」とは、可変領域の配列が一核酸分子を他の核酸分子と区別出来るようなものを言う。すなわち、いずれか一つの可変領域の配列が、特定の核酸分子に特徴的でなければならず、または可変領域の配列の組み合わせが特定の核酸分子に特徴的でなければならない。このようにすることで、核酸分子を特定できるようにする。これらのシナリオの実施例はそれぞれ図１および２に示している。
【００３８】
図１に示すように、核酸分子１は、可変領域１（ＶＲ１）に特徴的な配列「Ａ」があるため、核酸分子２と３と区別することが出来る。同様に、核酸分子３は、可変領域２（ＶＲ２）に特徴的な配列「Ｅ」があるため、核酸分子１および２と区別することが出来る。核酸分子２は、可変領域１もしくは２に「Ａ」もしくは「Ｅ」がないので、核酸分子１および３と区別することが出来る。
【００３９】
図２に示すように、核酸分子１は、可変領域３（ＶＲ３）に配列「Ｃ」があるため核酸分子２と区別することができ、可変領域２（ＶＲ２）に配列「Ｂ」があるため、核酸分子３と区別することができる。核酸分子２は、可変領域２に配列「Ｂ」があり、さらに可変領域３に配列「Ｄ」があるため核酸分子１および３と区別することができる。核酸分子３は、可変領域２に配列「Ａ」があり、さらに可変領域３に配列「Ｃ」があるため核酸分子１および２と区別することができる。
【００４０】
核酸分子の保存領域が同定されて選択され、必要であれば核酸分子の可変領域と組み合わせられる状況と対照的である。保存領域とは、並べられた核酸分子の全てではなくても、ほとんどに共通な配列から成る。この場合、ある特定の核酸分子は、オリゴヌクレオチドが該核酸分子に特徴的な可変領域の情報を作成したときだけ、同定できる。
【００４１】
いくつかの実施形態では、核酸分子の第一および第二可変領域は、１から１５００ヌクレオチド離れている。これは、一つのシークエンスプライマーから典型的に作成できる配列情報の量だからである。他の実施形態では、第一および第二可変領域は、３０から１０００ヌクレオチド離れている。他の実施形態では、第一および第二可変領域は、１００から５００ヌクレオチド離れている。
【００４２】
可変領域の配列は、該可変領域を有している核酸分子を同定できるオリゴヌクレオチドを設計するのに使われる。ここで使われているように、「オリゴヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチドプライマー」または「オリゴヌクレオチドプローブ」は、短い（典型的には、２から１００ヌクレオチド）、公知の方法で化学的に生成された（トリエステル、ホスホルアミダイト、ホスホネート化学を含む）単鎖もしくは二重鎖のポリデオキシヌクレオチドで、Ｅａｇｌｅｓ，  ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｎｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．  ２８：７１６−７３４（１９８９）などに記載されている。典型的には、その後、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりこれらは精製される。
【００４３】
本発明の方法により同定されたオリゴヌクレオチドは、核酸分子を同定するのに使えるように設計してある。いくつかの実施形態においては、オリゴヌクレオチドは、シークエンス用プライマーおよび／または増幅用プライマーとして使用される。いくつかの実施形態においては、オリゴヌクレオチドは、増幅用プライマーおよびシークセンス用プライマーの両方である。
【００４４】
増幅用プライマーとは、あるＤＮＡ配列に対して相補的な配列を持ち、さらにＤＮＡポリメラーゼによる複製を開始するのに使われるオリゴヌクレオチドである。シークエンス用プライマーとは、オリゴヌクレオチドが結合したＤＮＡフラグメントに相補的なＤＮＡフラグメントを生成する酵素反応おいて伸長できるオリゴヌクレオチドである。
【００４５】
いくつかの実施形態では、増幅および／またはシークエンス反応は、同じ容器内で起きる。ここで使われる「設計される」とは、好適な配列が決定されるという意味である。従って、本発明で使うオリゴヌクレオチドを設計するというのは、オリゴヌクレオチドの配列を決定することを意味する。該配列は、核酸分子の第一可変領域に結合し、そしてその核酸分子の第二可変領域の情報を作成するように決定される。オリゴヌクレオチドは、縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）配列を有していても良い。
【００４６】
オリゴヌクレオチドの設計方法は、この技術の知識を有する者には、周知であり、オリゴヌクレオチドの用途に一部よる。例えば、シークエンス用プライマーとして使用するオリゴヌクレオチドの長さは、典型的には１６から１５０ヌクレオチドで、１６から２５ヌクレオチドが最適であり、４０から６０％のＧ−Ｃ含有量を有し、融点は５５から７５℃であり、セルフハイブリッド形成を起こさないものである。いくつかの実施形態においては、オリゴヌクレオチドは１２ヌクレオチドである。
【００４７】
または、もしくはさらに、オリゴヌクレオチドは、増幅用プライマーとして設計される。この分野の技術を有するものは、ＤＮＡ増幅用のオリゴヌクレオチドの設計に同様な条件が適用されるべきであることを理解するであろう。例えば、重要な条件として、プライマーの長さ、融点の温度、特異性、鋳型プライマーの配列、Ｇ−Ｃ含有量、ポリピリミジン（Ｔ、Ｃ）もしくはポリプリン（Ａ、Ｇ）ストレッチおよび３’配列である。
【００４８】
特定の用途のためのオリゴヌクレオチドを設計する好適な数多くのコンピュータープログラムが利用できる。例えば、「Ｏｌｉｇｏ」（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ、プリマス、ミネソタ州、アメリカ合衆国）、「ＭａｃＶｅｃｔｏｒ」（Ｋｏｄａｋ／ＩＢＩ）、および配列分析プログラムのＧＣＧ  ｓｕｉｔｅを使用してもよい。
【００４９】
設計されたオリゴヌクレオチドは、核酸分子を同定するのに使われる。いくつかの実施形態では、１以上の核酸分子が実質的に同時に、核酸分子および必要なプライマーを一つの容器にいれることで同定できる。
【００５０】
「核酸分子」という言葉は、ＤＮＡとＲＮＡの両方、およびＤＮＡ／ＲＮＡのハイブリッド分子も含む。ここで使われているように「ＤＮＡ」分子は、例えば、ゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡなどの全タイプのＤＮＡを含む。同様に、「ＲＮＡ」はどのクラスのＲＮＡでもよく、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、もしくはリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を含む。
【００５１】
「二重鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子」とは、二重鎖螺旋のポリマー状のデオキシリボ核酸（アデニン、グアニン、チアミン、シトシンもしくはウリジン）を言う。この言葉は、分子の一次元および二次元構造についてのみ言い、いかなる特定の三次元構造にも限定されない。したがって、この言葉は、特に、直線上ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子（例えば、制限部分）、ウイルス、プラスミド、および染色体に存在する二重鎖ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。特定の二重鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子の構造に関し、ここでは通常の方法に従って、例えばｍＲＮＡと同じ配列を有する、ＤＮＡもしくはＲＮＡの非転写鎖に沿って５’から３’方向のみの配列を示すことも出来る。
【００５２】
ＤＮＡもしくはＲＮＡは、個体からのサンプル中に存在してもよい。ここで使われる「サンプル」という言葉は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ分子を有するいかなるサンプルも含む。例えば、生物学的なサンプルは全て、遺伝子および核酸分子を有するため、サンプルは、生物学的サンプルでもよい。好ましくは、生物学的サンプルは、細胞、組織、骨髄から分離した液体、血漿、血清、髄液、リンパ液、皮膚の外側部分、呼吸器、腸管、および泌尿生殖器、涙、唾液、乳、全血、血液細胞、腫瘍、臓器などである。また、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞培養構成物、細胞培養液中の細胞の成長からの調製された培養液もこれに限定されないが含まれ、ウイルスに感染したと推測される細胞、組み換えられた細胞、および細胞の構成物もサンプルは含む。いくつかの実施形態では、生物学的サンプルは、血液である。ＤＮＡもしくはＲＮＡは、微生物を含有するサンプルに存在してもよい。
【００５３】
該言葉は、サンプルの少なくとも１以上の他の構成物から分離もしくは精製された遺伝子および核酸分子も含み、さらに増幅されたＤＮＡを含んでもよい。
【００５４】
「対立遺伝子」とは、染色体の同じ遺伝子座にある、２以上の別の形状の遺伝子の全てを言う。各個体は、一つの遺伝子に付き、二つの対立遺伝子を有する。これらは互いに、同じもしくは異なっていてもよい。
【００５５】
ここで使われているように、「遺伝子」とは、特定のタンパク質もしくはＲＮＡ分子をコードするＤＮＡの長さである。「核酸分子」という言葉は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子を意味する。ＲＮＡ配列は、ＤＮＡ配列に対応するため、ＤＮＡもしくはＲＮＡのどちらかを対立遺伝子を同定するのに使用できる。ここで開示する核酸分子および遺伝子の配列は、遺伝子の５’および３’の非転写領域を含んでも含まなくてもよい。
【００５６】
いくつかの実施形態において、サンプル中のＤＮＡの量が少ない場合は、核酸分子は、該分子と本発明の方法で同定されるオリゴヌクレオチドを混ぜる前に、例えばＰＣＲで、増幅されてもよい。ここで使われている「ポリメラーゼ連鎖反応」もしくは「ＰＣＲ」とは、一般的にｉｎ  ｖｉｔｒｏで、所望のヌクレオチド配列を増幅させる方法を言う。一般的に、ＰＣＲ法は、ＰＣＲ試薬存在下で、鋳型ＤＮＡに好適にハイブリダイズできる二つのＰＣＲプライマーを使って、プライマー伸長合成の繰り返しサイクルを含む。典型的には、ＰＣＲ法で使われるＰＣＲプライマーは、鋳型鎖の両端部のヌクレオチド配列に相補的で、もしくは増幅されるヌクレオチドの側面に置かれるが、増幅されるＤＮＡ配列に対して相補的なＰＣＲプライマーを使用してもよい。Ｗａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、ｐｐ．７０−７５（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９０）；Ｏｃｈｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、ｐｐ．２１９−２２７；Ｔｒｉｇｌｉａ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：８１８６（１９８８）参照。  
【００５７】
本発明で使用するのに好適な一つの核酸分子は、ＨＬＡ機構の遺伝子である。ＨＬＡ（ヒト白血球型抗原）遺伝子は、ＨＬＡ機構の一部で、異物、もしくは自己免疫疾患の場合は宿主のタンパク質の一部が免疫機構に提示されることにより個体の免疫反応を誘導するタンパク質をコードする。例えば、細胞がウイルスに感染した後、ウイルスのタンパク質の一部分は、細胞中のＨＬＡ分子の結合溝に積まれ、ＨＬＡ分子は細胞表面まで移動し、そこで、ＨＬＡ分子は異物のタンパク質を提示していることを免疫細胞が認識するまで待つ。その後免疫機構は、それ以上の細胞の感染とそれに続く個人の死を防ぐために、ウイルスに感染した細胞を破壊する。ＨＬＡ：タンパク質の一部分の相互作用は、特異的なため、特定のアミノ酸配列のタンパク質もしくはペプチドだけが特定のＨＬＡ分子に積まれるようになっている。異物としてのタンパク質もしくはペプチドの配列はほぼ無限にあるため、ＨＬＡ分子は、いかなる免疫的な攻撃にも対応できるようにかなりのレベルまで多様化するように進化している。この多様性は、個体レベルでも、種レベルでも存在している。個体レベルでは、異なるいくつかのＨＬＡ遺伝子がある。種レベルでは、これらの遺伝子は、異なる個人によって異なるタイプを有している。典型的なＨＬＡ遺伝子としては、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃである。これらは、クラスＩ遺伝子として知られている。ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１およびＨＬＡ−ＤＰＢ１は、典型的なＨＬＡクラスＩＩ遺伝子である。他のクラスＩＩ遺伝子としては、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＲＡ１およびＨＬＡ−ＤＰＡ１が含まれる。ＨＬＡ−Ｂは、もっとも多様性のあるＨＬＡ対立遺伝子であり、現在８０９のＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子がある。本発明は、全てのＨＬＡ遺伝子が可変領域を有する対立遺伝子を持つので、どのＨＬＡ遺伝子の対立遺伝子を同定するのにも使用できる。
【００５８】
いくつかの実施形態では、個体のＨＬＡ−ＤＲＢ１の対立遺伝子を同定する。ＨＬＡ−ＤＲタンパク質（主要組織適合性複合体、クラスＩＩ）は、ＨＬＡクラスＩＩベーター鎖パラロガスに属する。アルファー鎖（ＤＲＡ）とベーター鎖からなるヘテロダイマーであり、両方とも細胞膜に固着している。これは、細胞外タンパク質からきたペプチドを提示することで免疫機構の中心的な役割を担っている。これは、抗原提示細胞（ＡＰＣ：Ｂリンパ球、ダンドリ細胞、マクロファージ）において発現する。ベーター鎖は、約２６から２８ｋＤａである。これは、６個のエクソンからコードされ、エクソン１は、リーダーペプチドをコードし、エクソン２および３は、二つの細胞外ドメインを、エクソン４は、膜貫通型ドメインを、そしてエクソン５は細胞質尾部をコードする。ＤＲ分子内で、ベーター鎖は、ペプチド結合の特異性を特定する全ポリモーフィズムを持っている。数百のＤＲＢ１対立遺伝子が記載され、これらのポリモーフィズムのタイピングは骨髄および腎臓移植のために日常的に行われている。ＤＲＢ１は、そのパラロゴスであるＤＲＢ３、ＤＲＢ４、およびＤＲＢ５の５倍も高く発現している。ＤＲＢ１は、全ての人に存在している。ＤＲＢ１の対立遺伝子のバリアントは、ＤＲＢ３、ＤＲＢ４、およびＤＲＢ５の一つと関連しているかいないかである。これらには、ＤＲＢ２、ＤＲＢ６、ＤＲＢ８およびＤＲＢ９の５つの偽遺伝子がある。
【００５９】
多くのその他の核酸分子も本発明を使って同定するのに好適である。例えば、ヒト免疫不全ウイルスもしくはＣ型肝炎の核酸分子も同定できる。その他のヒトの遺伝子としては、ＡＢＯ赤血球群、嚢胞性繊維症およびガンなどの病気を引き起こす遺伝子、さらに抗体やＴ細胞受容体遺伝子などの非常に遺伝子多型の多い一群などがある。
【００６０】
核酸分子の可変領域に従ってオリゴヌクレオチドが設計されると、その設計された核酸分子の可変領域に結合する。いくつかの実施形態において、この結合は、ストリンジェントハイブリット形成条件を使用した特異的な結合である。しかしながら、いくつかの実施形態においては、他のハブリッド形成条件を使ってもよく、例えば同定される核酸分子がサンプル中のその他の核酸分子と近縁でない時である。
【００６１】
適切なハイブリッド形成条件の定義は、この技術分野における範囲内である。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ｖｏｌ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎを参照されたい。しかしながら、簡単に、核酸分子のハイブリッド形成またはアニールのための「ストリンジェント条件」とは、（１）弱いイオン強度および高い洗浄温度、例えば、０．０１５ＭのＮａＣｌ／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を５０℃で用いる、もしくは（２）ハイブリッド形成において、ホルムアミドを用いる、例えば、０．１％ウシ血清アルブミンを含む５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ホルムアミド／０．１％フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ６．５の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを４２℃で用いる。他の例としては、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハルト液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、超音波破砕したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍＬ）、０．１％ＳＤＳおよび１０％デキストラン硫酸を４２℃で使い、０．２ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで４２℃において洗浄する。
【００６２】
オリゴヌクレオチドが、核酸分子の第一および第二可変領域の情報を作成するしないに関わらず、オリゴヌクレオチドは核酸分子に結合するため、核酸分子の情報は作成される。すなわち、オリゴヌクレオチドが設計された配列が核酸分子に存在するかしないかが判断できる。この配列は核酸分子を識別する情報を作成する配列である。
【００６３】
いくつかの実施形態では、ハイブリッド形成と、それに続く情報の作成は、同じ容器内で起きる。すなわち、サンプルと核酸分子を同定するのに必要な全てのオリゴヌクレオチドがハイブリッド形成が起きる容器内にある。
【００６４】
ここで言う「情報を作成する」という言葉は、第一可変領域に結合するオリゴヌクレオチドが第二可変領域を同定できることを言う。したがって、第一可変領域に結合するオリゴヌクレオチドは、第二可変領域の情報を作成するのに使用できる。いくつかの実施形態では、作成された情報は配列情報であり、第一可変領域に結合するオリゴヌクレオチドは、第二可変領域の配列情報を作成するためのプライマーとして使用できる。
【００６５】
オリゴヌクレオチドにより作成された情報をシークエンスするのに、どのシークエンシング反応を使ってもよい。シークエンシング反応の例として、Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７などの古典的な方法によるものも含む。マススペクトル分析（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｇｒｉｆｆｉｎ  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，１９９３；Ｋｏｓｔｅｒ，ＷＯ９４／１６１０１，１９９４）によるシークエンシングを含む、すべての種類の自動化されたシークエンシング手段（Ｎａｅｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）も使用できる。
【００６６】
作成された情報は、核酸分子を同定するために解析されてもよい。ここで言う、「解析する」とは、作成された情報が、対応する可変領域と相関しているという意味である。
【００６７】
解析は、手動による解析でもよく、もしくは特に区別する核酸分子の数が多い場合は、コンピュータープログラムで行ってもよい。いくつかの実施形態では、コンピュータープログラムは、Ａｓｓｉｇｎ−ＳＢＴＴＭ（Ｃｏｎｅｘｉｏ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）である。
【００６８】
作成された情報は、核酸分子を同定するのに使われる。これは、例えば、組織適合および予後、病気の判断、予防、および／または病気の改善、または疫学、進化および人口移動の研究もしくは法医学などのその他の理由による遺伝物質の同定などの結果的に他の使用方法があってもよい。
【００６９】
ここで使われる「個体」とは、どの個体であってもよく、核酸分子は多くの個体において病気と関連することが知られている。さらには、ＨＬＡおよびその他のほとんどのヒトの遺伝子は、多くの個体と相同体であることが知られており、例えば、ゼブラフィッシュ、猿、チンパンジー、ゴリラ、および犬である。
【００７０】
個体は、人もしくは人にとって経済的にも社会的にも重要な哺乳類、例えば、人以外の肉食動物（猫および犬など）、豚（豚、去勢豚、およびイノシシ）、反すう動物（蓄牛、雄牛、羊、キリン、鹿、山羊、バイソン、およびラクダなど）、馬、および鳥である。鳥は、動物園にいる鳥や、鶏、さらに詳しくは家畜化された鶏、例えば七面鳥、ニワトリ、アヒル、カモ、ホロホロ鳥、およびそれらの仲間も含む。これは、これらが人にとって経済的にも重要であるからである。これらは、年齢については記さない。従って、大人、新生児および胎内の個体も含むものである。
【００７１】
個体の対立遺伝子の同定は、ＨＬＡタイピングに使用してもよい。「ＨＬＡタイピング」とは、２個体の、典型的にはドナーとレシピエント、組織の適合性を判断する試験である。例えば、ドナーおよびレシピエントのＨＬＡタイプは典型的には組織移植の前に判断される。
【００７２】
多くの病気や障害が特定の核酸分子と関連しているため、核酸分子の同定は、病気の判断、改善、予後、および／または予防に使われてもよい。例えば、ベータグロブリンのＨｂＳ対立遺伝子は、鎌状赤血球症を引き起こすことが分かっており、ＨＤ対立遺伝子は、ハンチントン病を引き起こし、多重ＣＦＴＲ対立遺伝子は、嚢胞性繊維症を引き起こすことが知られている。さらには、病原性微生物から核酸分子を同定するのは、微生物により引き起こされた病気の判断、改善、予後、および／または予防に使用できる。
【００７３】
ここで使われている「病気」とは、個体が苦しむいかなる健康からの離脱を言う一般的な言葉である。「障害」とは、個体の体の機能もしくは一部が異常に機能していることを言う。
【００７４】
病気は、エイズ、肝炎、強直性脊椎炎（ＡＳ）、鎌状赤血球症、ハンチントン病、および嚢胞性繊維症を含む病気に関連するいかなる病気も含む。医療もしくは獣医療従事者は、核酸分子が同定されると、彼もしくは彼女の技術に従って、適切な改善を指示する。
【００７５】
「判断」という言葉は、検査室での試験（遺伝子型試験も含む）もしくは物理的所見を通して、その症状によって病気や障害を特定するプロセスを言う。核酸分子の同定は、核酸分子に関わる病気の判断に使用することができる。
【００７６】
ここで使われる「改善」もしくは「改善する」とは、核酸分子の同定に続いて個体に薬剤を投与して障害もしくは病気のいかなる改善も意味し、これには薬理ゲノミクスの使用も含まれる。「改善」もしくは「改善する」とは、（ａ）障害もしくは病気を阻害する、すなわちその進行を止める、または（ｂ）障害もしくは病気の症状を緩和もしくは軽減する、すなわち、障害もしくは病気の症状を回復させる、ということを含む。この効果は、障害もしくは病気の部分的もしくは完全な治癒という点に関して、治療的であってもよい。
【００７７】
「予後」という言葉は、個体で診断された障害もしくは病気の進行の可能性、または個体が障害もしくは病気を発症する可能性を意味する。例えば、本発明により同定された核酸分子によっては、個体には、特定の障害もしくは病気を発症する可能性があると同定されることもある。
【００７８】
本発明は、以下の非限定的実施例により、参照としてのみさらに説明される。
しかしながら、以下の実施例は、例示なだけであって、上述の本発明の普遍性を制限するものではないということを理解されたい。
【実施例】
【００７９】
ＨＬＡ対立遺伝子の可変領域は、図３に示すように対立遺伝子を並べて同定された。各対立遺伝子は、特徴的な配列を持つ。しかしながら、Ａ＊０３０１０１０１＋２９０２０１の混合配列は、Ａ＊０３２２＋２９０９の混合配列と同じである。従って、個人からＨＬＡタイプをシークエンスした時に、この混合配列が得られた場合、Ａ＊０３０１０１０１＋２９０２０１もしくはＡ＊０３２２＋２９０９どちらかが存在している。この結果は、ＨＬＡタイピングのいくつかの用途によっては、不十分な感度もしくは非常に曖昧な場合もある。
【００８０】
正確なＨＬＡタイプを得るために、位置５０２において配列に違いのある二つの対立遺伝子に結合するプライマー（ＨＡＲＰ１）を使用した。図４に示すように、ＨＡＲＰ１が結合する対立遺伝子の情報と、配列および位置５０２における配列の情報と、を使って正確なＨＬＡタイプが決定できる。
【００８１】
個体の染色体の双方からの高分子量ＤＮＡが、製造者の説明書（キアゲン（ＱＩＡｇｅｎ））に従って血液サンプルから抽出された。希釈無しのＤＮＡ２マイクロリットルが、染色体の双方からのＤＮＡを同時に増幅できるプライマー、ＡａｍｐＦおよびＡａｍｐＲ（図１参照）、と共にポリメラーゼ連鎖反応に使われた。上流のオリゴヌクレオチドプライマーは、翻訳されていない５’に位置しており、下流のプライマーは、エクソン４に位置している。
【００８２】
【表１】
2009539355.tif 000002
【００８３】
１マイクロリットルのＡａｍｐＦおよびＡａｍｐＲのそれぞれを、１ピコモル／マイクロリットルの濃度でＰＣＲに使用し、ＰＣＲには０．４マイクロリットルのポリメラーゼ酵素（Ｔａｑ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；  Ｇｅｎｅｗｏｒｋｓ）と、１７．６マイクロリットルのＰＣＲ緩衝液も含んだ。ＰＣＲ緩衝液の構成物の最終濃度は、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２％のＤＭＳＯ、６７ｍＭのトリス塩基、１６．６ｍＭのリン酸アンモニウム、および２５ｍＭの各ｄＮＴＰだった。
【００８４】
ＰＣＲは、以下の条件においてサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ９７００、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により行った。ＤＮＡ変性を９６度において６分間、続いて、変性を９６℃で３０秒、オリゴヌクレオチドプライマーのアニーリングを７０℃で３０秒、およびＤＮＡの伸長を７２℃で２分、を３５サイクル行った。これに続いて、７２度で１０分間の伸長工程が行われた。
【００８５】
ＰＣＲが終わると、２マイクロリットルのサンプルがＰＣＲチューブからとられ、予想される大きさの増幅されたＤＮＡの存在が確認できるようにエチジウムブロマイドの存在下でアガロースゲル内で電気泳動される。
【００８６】
残りのＰＣＲ産物は、シークエンシングを阻害するかもしれない使用されなかったＰＣＲ増幅オリゴヌクレオチドプライマーと、小さな非特異的産物と、を取り除くために製造者の説明に従ってＥｘｏＳａｐＩＴを使って精製された。
【００８７】
その後、ＰＣＲ産物は、標準的なサイクルシークエンス染色標識ジデオキシヌクレオチドシークエンシング反応と、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ（ＢＤＴ）  ｖ．３．１試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使ってシークエンスした。シークエンス反応において、２マイクロリットルの各シークエンス用プライマー、Ｘ２Ｆ、Ｘ２Ｒ、Ｘ３Ｆ、および／またはＸ３Ｒ（図１を参照）を１ピコモル／マイクロリットルを使って、２マイクロリットルのＰＣＲ産物がシークエンスされ、このシークエンス反応は、８マイクロリットルの水、１マイクロリットルのＢＤＴ反応ミックス、および７マイクロリットルのシークエンス緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）も含んだ。
【００８８】
ＰＣＲ産物は、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子のエクソン２および３の双方が同時に同じ容器内でシークエンスされるようにシークエンスされた。もしくは、一方の染色体だけからのＨＬＡ−Ａ対立遺伝子をシークエンスできるように単独のプライマーＨＡＲＰ１が使われてもよい。
【００８９】
シークエンス反応は、上述のと同じサーマルサイクラーにおいて、以下の条件下で行われた。変性を９６℃で１０秒、オリゴヌクレオチドシークエンス用プライマーのアニールを５０℃で５秒、フラグメントの伸長／停止を６０℃で４分、を２５サイクル行った。
【００９０】
シークエンスに続いて、ＤＮＡのフラグメントは、使用されなかったプライマーおよび余った染色標識されたジデオキシヌクレオチドを取り除くためにＣｌｅａｎＳｅｑを使って、精製された。その後、ＤＮＡフラグメントは、自動化されたキャピラリーシークエンサーＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７３０  ＸＬで細かくされた。
【００９１】
細かくされたフラグメントは、Ａｓｓｉｇｎ−ＳＢＴＴＭｖ３．５（Ｃｏｎｅｘｉｏ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使って解析された。このソフトウェアは、各染色体の対立遺伝子から得られた配列を同時に解析することができる。
【００９２】
図５に示すように、対立遺伝子ＨＬＡ−Ａ＊０３０１０１０１＋２９０２０１およびＡ＊０３２２＋２９０９と同じ配列がサンプル中には含まれていた。ＨＡＲＰ１プライマーは、Ａ＊２９０２０１およびＡ＊２９０９に相補的であって、Ａ＊２９０２０１もしくはＡ＊２９０９のいずれかを含む染色体からのＤＮＡもしくはＲＮＡしかシークエンスしない。位置５０２で「Ａ」ヌクレオチドを同定することは、一染色体がＡ＊２９０２０１を有することを意味する。従って、正しいＨＬＡタイプはＡ＊０３０１０１０１＋２９０２０１である。もしシークエンシングで、位置５０２において「Ｃ」を同定していれば、シークエンスされた対立遺伝子は、Ａ＊２９０９になるため、正しいタイプはＡ＊０３２２＋２９０９である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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