(57)【要約】  本発明は、組換えポリペプチド、特にフィブロネクチンのED-Bイソフォームに結合し、そしてそれらの機能を阻止する、抗体又は抗体フラグメントに関する。さらに、本発明のポリペプチドの診断及び医薬適用が開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）フィブロネクチンのED−Bドメインに対して特異的に結合し、そして
（ii）ED-Bドメインとその受容体との間の相互作用を阻害することを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
抗体又は抗体フラグメントである請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
100ｎモル以下のKD値に対応するED-Bドメインに対する親和性を示す請求項１又は２記載のポリペプチド。
【請求項４】
10ｎモル以下のKD値に対応するED-Bドメインに対する親和性を示す請求項３記載のポリペプチド。
【請求項５】
１ｎモル以下のKD値に対応するED-Bドメインに対する親和性を示す請求項３記載のポリペプチド。
【請求項６】
フィブロネクチンドメイン６及び/又はフィブロネクチンドメイン７−８−９に対してよりも、フィブロネクチンED-Bドメインに対して、少なくとも５倍、高い特異性を示す請求項１〜５のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項７】
HDMVEc細胞、腫瘍細胞及び/又は支質細胞へのED-Bの付着の阻害をインビトロで示す請求項１〜６のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項８】
試験動物におけるF9−奇形癌細胞の移植により生成される腫瘍の増殖の阻害をインビボで示す請求項１〜６のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項９】
（ａ）（i）核酸配列  配列番号1 (MOR 02610)、 配列番号5 (MOR 02611)、 配列番号9 (MOR 02613)、 配列番号13 (MOR 02614)、 配列番号17 (MOR 02616)、 配列番号21 (MOR 02618)、 配列番号25 (MOR 02619)、 配列番号29 (MOR 02622)、 配列番号33 (MOR 02715)、 配列番号37 (MOR 02718)、配列番号41 (MOR 02721)、 配列番号45 (MOR 02722)によりコードされるVH領域、又は前記VH領域の１つの少なくとも１つのH-CDR1-、H-CDR-2- 及び/又は H-CDR3-領域、又は
（ii）少なくとも１つのH-CDR領域における変化により（i）のVH領域に由来するVH領域、及び/又は
（ｂ）（i）核酸配列  配列番号3 (MOR 02610)、 配列番号7 (MOR 02611)、 配列番号11 (MOR 02613)、 配列番号15 (MOR 02614)、 配列番号19 (MOR 02616)、 配列番号23 (MOR 02618)、 配列番号27 (MOR 02619)、 配列番号31 (MOR 02622)、 配列番号35 (MOR 02715)、 配列番号39 (MOR 02718)、 配列番号43 (MOR 02721)、 配列番号47 (MOR 02722)によりコードされるVL領域、又は前記VL領域の１つの少なくとも１つのL-CDR1-, L-CDR2- 及び/又は L-CDR3-領域、又は
（ii）少なくとも１つのL−CDR領域における変化により（i）のVL領域に由来するVL領域を含んで成る、抗体又は抗体フラグメントから選択される請求項１〜８のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項１０】
L−CDR3領域における変化により（ｂ）（i）のVL領域に由来するVL領域を示す請求項９記載のポリペプチド。
【請求項１１】
核酸配列  配列番号27 (MOR 02619) 又は配列番号35 (MOR 02715)によりコードされるVL領域に由来するVL領域を示す請求項10記載のポリペプチド。
【請求項１２】
（ａ）（i）核酸配列  配列番号25 (MOR 02619) 又は配列番号33 (MOR 02715)によりコードされるVH領域、又は前記VH領域の１つの少なくとも１つのH-CDR1-、H-CDR-2- 及び/又は H-CDR3-領域、又は
（ii）少なくとも１つのH-CDR領域における変化により（i）のVH領域に由来するVH領域、及び/又は
（ｂ）（i）核酸配列  配列番号49 (MOR 03055)、配列番号51 (MOR 03066)、配列番号53 (MOR 03075)、配列番号55 (MOR 03069)、配列番号57 (MOR 03071)、配列番号59 (MOR 03064)、配列番号61 (MOR 03062)によりコードされるVL領域、又は前記VL領域の１つの少なくともL-CDR3領域、又は
（ii）少なくとも１つのL-CDR領域における変化により（i）のVL領域に由来するVL領域を含んで成る請求項９〜11のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項１３】
H−CDR2領域における変化により（a）（i）のVH領域に由来するVH領域を示す請求項９〜12のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項１４】
核酸配列  配列番号25 (MOR 02619) 又は配列番号33 (MOR 02715)によりコードされるVH領域に由来するVH領域を示す請求項13記載のポリペプチド。
【請求項１５】
（ａ）（i）核酸配列  配列番号63 (MOR 03243)、配列番号67 (MOR 03245)、配列番号71 (MOR 03246)、配列番号75 (MOR 03251)、配列番号79 (MOR 03252)、配列番号81 (MOR 03253)、配列番号83 (MOR 03255)、配列番号85 (MOR 03257)、配列番号87 (MOR 03258)によりコードされるVH領域、又は少なくともそのH-CDR-2-領域、又は
（ii）少なくとも１つのH-CDR領域における変化により（i）のVH領域に由来するVH領域、及び/又は
（ｂ）（i）核酸配列  配列番号 65 (MOR 03243)、配列番号69 (MOR 03245)、配列番号73 (MOR 03246)、配列番号77 (MOR 03251)、配列番号89 (MOR 03258)によりコードされるVL領域、又は前記VL領域の１つの少なくともL-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域、又は
（ii）少なくとも１つのL-CDR領域における変化により（i）のVL領域に由来するVL領域を含んで成る請求項９〜14のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号１によりコードされるVH領域、及び配列番号３（MOR 02610）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成る請求項９〜14のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号５によりコードされるVH領域、及び配列番号７（MOR 02611）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成る請求項９〜14のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項１８】
配列番号９によりコードされるVH領域、及び配列番号11（MOR 02613）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成る請求項９〜14のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項１９】
配列番号13によりコードされるVH領域、及び配列番号15（MOR 02614）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成る請求項９〜14のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項２０】
配列番号17によりコードされるVH領域、及び配列番号19（MOR 02616）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成る請求項９〜14のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項２１】
配列番号21によりコードされるVH領域、及び配列番号23（MOR 02618）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成る請求項９〜14のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項２２】
配列番号25によりコードされるVH領域、及び配列番号27（MOR 02619）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成る請求項９〜14のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項２３】
配列番号29によりコードされるVH領域、及び配列番号31（MOR 02622）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成る請求項９〜14のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項２４】
配列番号33によりコードされるVH領域、及び配列番号35（MOR 02715）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成る請求項９〜14のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項２５】
配列番号37によりコードされるVH領域、及び配列番号39（MOR 02718）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成る請求項９〜14のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項２６】
配列番号41によりコードされるVH領域、及び配列番号43（MOR 02721）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成る請求項９〜14のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項２７】
配列番号45によりコードされるVH領域、及び配列番号47（MOR 02722）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成る請求項９〜14のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項２８】
配列番号25によりコードされるVH領域、及び配列番号49（MOR 03055）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成る請求項９〜14のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項２９】
配列番号25によりコードされるVH領域、及び配列番号51（MOR 03066）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成る請求項９〜14のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項３０】
配列番号25によりコードされるVH領域、及び配列番号53（MOR 03075）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成る請求項９〜14のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項３１】
配列番号25によりコードされるVH領域、及び配列番号55（MOR 03069）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成る請求項９〜14のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項３２】
配列番号25によりコードされるVH領域、及び配列番号57（MOR 03071）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成る請求項９〜14のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項３３】
配列番号33によりコードされるVH領域、及び配列番号59（MOR 03064）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成る請求項９〜14のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項３４】
配列番号33によりコードされるVH領域、及び配列番号61（MOR 03062）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成る請求項９〜14のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項３５】
配列番号63によりコードされるVH領域、及び配列番号65（MOR 03243）によりコードされるVR領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成る請求項９〜14のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項３６】
配列番号67によりコードされるVH領域、及び配列番号69（MOR 03245）によりコードされるVR領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成る請求項９〜14のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項３７】
配列番号71によりコードされるVH領域、及び配列番号73（MOR 03246）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成る請求項９〜14のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項３８】
配列番号75によりコードされるVH領域、及び配列番号77（MOR 03251）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成る請求項９〜14のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項３９】
配列番号79によりコードされるVH領域、及び配列番号77（MOR 03252）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成る請求項９〜14のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項４０】
配列番号81によりコードされるVH領域、及び配列番号77（MOR 03253）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成る請求項９〜14のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項４１】
配列番号83によりコードされるVH領域、及び配列番号77（MOR 03255）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成る請求項９〜14のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項４２】
配列番号85によりコードされるVH領域、及び配列番号77（MOR 03257）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成る請求項９〜14のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項４３】
配列番号87によりコードされるVH領域、及び配列番号89（MOR 03258）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成る請求項９〜14のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項４４】
治療的活性成分との接合体の形で存在する請求項１〜43のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項４５】
前記治療活性成分が、放射線療法剤及び化学療法剤から選択される請求項44記載のポリペプチド。
【請求項４６】
融合タンパク質の形で存在する請求項１〜43のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項４７】
サイトカインとの融合タンパク質として、又は二特異的抗体として存在する請求項46記載のポリペプチド。
【請求項４８】
診断的に検出できるラベリング基との接合体の形で存在する請求項１〜43のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項４９】
前記診断的に検出できるラベル基が、放射性−、NMR−、色素−、酵素及び蛍光ラベリング基から選択される請求項46記載のポリペプチド。
【請求項５０】
活性成分として、請求項１〜47のいずれか１項記載のポリペプチド、及び薬理学的に許容できるビークル、アジュバント及び/又は希釈剤を含んで成る医薬組成物。
【請求項５１】
過増殖患者の予防又は処理のための請求項50記載の組成物。
【請求項５２】
癌の予防又は処理のための請求項50又は51記載の組成物。
【請求項５３】
診断試薬として、請求項１〜43、48又は49のいずれか1項記載のポリペプチドを含んで成る診断組成物。
【請求項５４】
過増殖性疾患又はそれに対する素因の診断のための請求項53記載の組成物。
【請求項５５】
癌又はその素因の診断のための請求項53又は54記載の組成物。
【請求項５６】
ヒト医薬への使用のための請求項50〜55のいずれか１項記載の組成物。
【請求項５７】
請求項１〜43又は46〜47のいずれか1項記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項５８】
発現制御配列との操作的結合下にある請求項57記載の核酸。
【請求項５９】
請求項57又は58のいずれか１項記載の核酸を含むベクター。
【請求項６０】
請求項57又は58のいずれか１項記載の核酸、又は請求項59記載のベクターにより形質転換される細胞。
【請求項６１】
請求項57又は58のいずれか１項記載の核酸、又は請求項59記載のベクターにより形質転換される非ヒト細胞。
【請求項６２】
請求項１〜43のいずれか１項記載のポリペプチドの生成方法であって、請求項60記載の細胞又は請求項61記載の非ヒト生物を、前記ポリペプチドの発現が実施される条件下で培養し、そして発現されたポリペプチドを入手する方法。
【請求項６３】
ED-B-関連疾患の予防又は処理のための医薬剤の生成へのためへの請求項１〜47のいずれか１項記載のポリペプチドの使用。
【請求項６４】
癌の予防又は処理のための医薬剤の生成のためへの請求項62記載の使用。
【請求項６５】
ED-B-関連の患者又はその素因の診断のための検出試薬の生成のためへの請求項１〜43、48又は49のいずれか１項記載のポリペプチドの使用。
【請求項６６】
癌又はその素因の診断のための検出試験の生成のためへの請求項65記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えポリペプチド、特にフィブロネクチンのED-Bイソフォームに結合し、そしてそれらの機能を阻止する、抗体又は抗体フラグメントに関する。さらに、本発明のポリペプチドの診断及び医薬適用が開示されている。
【０００２】
腫瘍の増殖及び進行の間、腫瘍が増殖する細胞外マトリックス（ECM）は、すでに存在するECMのタンパク質分解により修飾される。この工程は、正常組成物において存在するECMのそれとは区別される、腫瘍−誘発されたマトリックスを生成する。腫瘍−誘発されたECMは、腫瘍増殖及び腫瘍脈管形成のための最適環境であるように見える（１−４）。
【０００３】
腫瘍脈管形成においては、新しい血管がすでに存在する血管から形成される。この工程は、ECMのタンパク質分解、さらなる腫瘍増殖のために必須である、新しい血管構造体における内皮細胞の標的化された増殖及び分化を必要とする（５）。
【０００４】
フィブロネクチンは、重要な種類のマトリックス−糖タンパク質である。それらの主要役割は、多くの異なった細胞外マトリックスへの細胞の付着の促進から成る。培養物における形質転換されていない細胞の表意面上でのフィブロネクチンの存在、及び形質転換された細胞の場合のそれらの不在は、重要な付着タンパク質としてのフィブロネクチンの同定をもたらした。それらは、多くの他の異なった分子、例えばコラーゲン、ヘパラン硫酸−プロテオグリカン及びフィブリンと相互作用し、そして従って、細胞形状及び細胞骨格の創造を調節する。さらに、それらは、胚形成の間、細胞移動及び細胞分化を担当する。さらに、それらは、創傷の治癒のために重要であり、ここでそれらは、問題の場所におけるマクロファージ及び他の免疫細胞の移動を可能にし、そして血液クロットの形成において、血管の損傷された部分への血小板の付着を可能にする。
【０００５】
フィブロネクチンは、２種の類似するペプチドのダイマーであり、それにより、個々の鎖は約60〜70mmの長さである。少なくとも20の異なったフィブロネクチン鎖が同定されており、それらのすべては、単一のフィブロネクチン遺伝子のRNA転写体の選択的スプライシングにより生成される。
【０００６】
フィブロネクチンは、血管系の成長において重要な役割を演じる、高分子量の付着介在性糖タンパク質である。さらに、フィブロネクチンは、内皮細胞に対して走化性的に作用し、成長因子の作用を調節し、そして脈管形成の間、内皮細胞の直線的増殖を支持する（６−９）。タンパク質分解性フィブロネクチン−切断性生物の分析は、ポリペプチドが６個の重度に折りたたまれたドメインから成り、個々のドメインは、それらのアミノ酸配列に対する類似性が３種のタイプ（タイプI、II及びIII ）の分類を可能にする、いわゆる反復配列（“反復体”）を含むことを示す。前記ダイマーの両鎖の中央領域は、平均90個のアミノ酸の長さである、いわゆるIII 型反復部分から成る（10）。構造研究は、個々のIII 型反復が２種の逆平行の折りたたまれたシートに折りたたまれる、７個のβ−鎖から成り、それにより、短いループ領域が可能性あるタンパク質−タンパク質−相互作用部位として露出される（11）。
【０００７】
それらのIII 型反復は、細胞表面分子と相互作用する付着分子、いわゆる“インテグリン”としてのフィブロネクチンの作用を可能にする。用語“インテグリン”は、細胞外マトリックスと細胞内細胞骨格との間のメディエーターとして作用し、そして従って、細胞付着及び移動を誘発するヘテロダイマー細胞表面分子の関連するグループを記載するために、最初に（12）において1987年、使用された。それらのヘテロダイマー受容体は、特定の細胞機能を伴って、細胞外環境からのシグナルを“取り込むか”又は介在する。現在まで、特に20の異なったファミリーとして形成するために、20以上のα−サブユニットと特異的に及び非共有的に相互作用できる17種のβ−サブユニットが知られている（13）。
【０００８】
III 型のフィブロネクチンの10番目の反復（III −10）に見出される配列RGDSは特に、少なくとも８種の異なったインテグリンとのフィブロネクチンの相互作用を介在する。さらに、少なくとも４種のインテグリンがRGDS非依存性手段でフィブロネクチンと特異的に相互作用することが示されている（13）。III ７−、III ８−、III ９−及びIII 10配列のほかに、III 型の反復配列のグループはまた、EIII B及びEIII A（ED−B及びED-A）反復を含んで成る。
【０００９】
ED-B-フィブロネクチンは、成人の正常組織においては検出されず(単一の例外：増殖する子宮内膜）、ところがそれは、ED−Bの支質局在発現のほかに、胎児組織及び腫瘍増殖において強く発現される。さらに、ED-B-フィブロネクチンは、脈管形成の間、新しく形成された血管の周囲に位置する。この理由のために、ED−B−フィブロネクチンは、（腫瘍）脈管形成の工程のための特定のマーカータンパク質である（14）。
【００１０】
ED-Bドメインは、91個のアミノ酸から成る、高く保存された完全なIII 型相同生成である。ヒトとラットとの間の相同性の程度は100％であり、ヒトとニワトリとの間の相同性の程度は96％である。文献においては、ED-B-ドメインの機能についてはほとんど知られていない。小数の出版物（15−17）は、種々の細胞のための一般的付着−介在性作用を推測する。内皮細胞に対する特定の作用はまだ、今日まで知られていない。
【００１１】
WO02/20563号においては、組換えED-Bがインビトロで特定の前−脈管形成作用を示すことが示されている：（i）bFGF−刺激されたヒト皮膚微小血管内皮細胞（HDMVEc）の増殖が組換えED-Bにより増強され、（ii）タンパク質がHDMVECの付着を仲介し、そして（iii）組換えED-BがコラーゲンゲルにおけるHDMVEcの侵入及び分化（管形成）を刺激する。
【００１２】
さらに、それらのED-B−介在された効果は、ED-Bドメインに由来する合成ペプチドにより特異的に阻止され得る。従って、ペプチド配列は、α2β1―インテグリンとして親和性クロマトグラフィーにより同定された、内皮細胞表面上のED-B−特異的受容体のための結合領域を表す。α2β1―インテグリンとED-Bドメインとの間の特異的相互作用は、これまで文献においては記載されていない。
【００１３】
α2β1−インテグリン、特定の付着キナーゼ、CD6リガンド（ALCAM）、ビトロネクチン受容体のα鎖、組込まれたα−８サブユニット、又はフォリスタチン−関連タンパク質の前駆体を含んで成る、ED-B−フィブロネクチンドメインにより特異的に調節されるタンパク質が、WO02/20563号に開示されている。
【００１４】
部分的にオーバーラップする性質を有する多くのインテグリン受容体が内皮細胞により発現されている（DG Stupack and DA Cheresh, SciSTKE, 2002 Feb 12; 2002）。それらの発現パターンは、異なったインテグリン（例えば、αVβ3及びα5β1）が類似する生物学的現象（付着、移動及び生存）を仲介し、そして従って、それらの挙動性及び生存性を保護する内皮細胞のための冗長システムを表すことを示す。α2β1がその天然のリガンド、すなわちコラーゲンと相互作用することは、これまで知られている。この相互作用の阻止は、抗−脈管形成作用をもたらすことができる（Y Funahashi など. Cancer Res. 62:6116-6123, 2002）。
【００１５】
従って、本発明の１つの目的は、機能−阻止結合分子、例えばED-B−ドメインの受容体結合部位を特異的に阻止する抗体の調製であった。それらの結合分子は、（腫瘍）内皮細胞に対する抗−脈管形成作用を有する。比較的広く発現されるα2β1−インテグリンに比較して、ED-Bドメインは、そのような結合分子のための理想的且つ特異的な標的分子を表す。
【００１６】
ED-Bの構造は、ED-Bがインビボで低い免疫原性を有することが予測され得るので、モノクローナル及びポリクローナル抗体の成長を困難にする。従って、抗体BC-1（J. Cell Biol. 108 (1989), 1139-1148）は、ED-Bの存在下においてのみ存在するフィブロネクチンの潜在エピトープと反応し、そして従ってED-Bとは直接的に反応しない。免疫原として組換えED-Bの使用により生成された抗体L19（Tarli など. Blood 94 (1999), 192-198 及び WO 01/62800号）は、生物学的に不活性であり、すなわち有意な程度までED-Bへの細胞付着を認識することはできない。
【００１７】
驚くべきことには、機能−阻止ED-B−結合分子、例えばED-Bへの細胞の付着を高く阻害し、そして腫瘍増強の有意な低下をインビボで引起す、ED-B−機能−阻止抗体MOR03255が生成され得る。本発明の結合分子により生成されるED-Bの阻止は、コラーゲン−インテグリンの補足機構により、明らかに補足され得ない。
【００１８】
HuCAL（商標）-GOLD抗体ライブラリー[すべての6種のCDR領域におけるヒト抗体の多様性に対応する多様化により、HaCAL−コンセンサス配列（WO 97/08320号; Knappik A, Ge L1 Honegger A, Pack P, Fischer M, Wellnhofer G, Hoess A: Wolle J, Plunckthun A, and Virnekas B (2000) J. Mol. Biol. 296:57-86）から出発して生成され、そしてファージ表示方法の変法のCysDisplay（WO01/05950号）により厳密に試験される、Fab-フラグメントフォーマットにおける1.6×10E10の異なった抗体を有するライブラリー]により、ED-Bドメインに選択的に結合する機能−阻止Fab−抗体フラグメントが、本細胞を導く試験において同定された。それらの抗体フラグメントの有効性は、組換えED-Bと単離されたHDMVEcとの間の特定の相互作用に影響を及ぼすインビトロ付着試験において示される。ED-B−ドメインへの結合親和性は、結合分子における特定の変化により相当に改良され得る。動物モデルにおける結合分子が腫瘍の増殖を阻害することをインビボで示すこともまた可能である。
【００１９】
従って、本発明の第１の観点は、
（i）フィブロネクチンのED-B−ドメインに対して特異的に結合し、そして
（ii）ED-Bドメインと、その受容体との間の相互作用を阻害するポリペプチドである。
本発明のポリペプチドは好ましくは、抗体又は抗体フラグメントである。用語“抗体”とは、本明細書においては、ポリクローナル、キメラ、ヒト適合された又はヒト抗体、及び組換え抗体、例えば一本鎖抗体、又は抗原−結合抗体フラグメント、例えば単価抗体フラグメント、例えばFabフラグメント又はscFvフラグメント、又は二価抗体フラグメント、例えばF(ab’)2フラグメントを包含する。
【００２０】
これに関しては、抗体が、上記必要条件、すなわちED-Bドメインへの特異的結合及びED-Bドメインとその受容体、特に内皮細胞上のその受容体との間の相互作用の阻害を満たす１又は複数の抗原結合部位を含むことが本発明において必須である。それらの抗原結合性質は好ましくは、VH及びVL領域の組合わせにより達成され、それにより、それらの領域は、上記に言及される骨格領域（FR1, FR2, FR3及びFR4）、及び抗原結合を仲介するCDR領域（VH領域のためのH-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, 及びVL領域のためのL-CDR1, L-CDR2, L-CDR3）から構築される。
【００２１】
本発明のポリペプチドは好ましくは、1μm以下、好ましくは100nM以下、特に好ましくは10nM以下、さらにより好ましくは１nM以下及び最も好ましくは0.1nM以下、特に好ましくは10nM以下、さらにより好ましくは1nM以下及び最も好ましくは0.1nM以下のKD値に対応する、ED-Bドメインに対する親和性を有し、それにより、前記親和性は、BIAcore（商標）システム上の試験により、実施例に示されるようにして決定され得る。
【００２２】
本発明のポリペプチドは、それがフィブロネクチンのED-Bドメインに対して特異的に結合し、例えばそれが他のフィブロネクチンドメイン、特にフィブロネクチンドメイン6(FN6)及び/又はフィブロネクチンドメイン７−８−９（７−８−９）に対して、有意に低い親和性を伴って結合することにおいて区別される。好ましい態様においては、本発明のポリペプチド及びフィブロネクチンED-Bドメインは、例えば実施例に示される結合試験により決定され得るように、FN6及び/又は７−８−９の親和性よりも少なくとも２倍（特に少なくとも５倍、及び特に好ましくは少なくとも10倍）、高い親和性を伴って結合する。
【００２３】
もう１つの好ましい態様においては、本発明のポリペプチドは、HDMVEc細胞への組換えED-Bの付着の阻害、好ましくは個々の場合、10μg/mlの濃度で少なくとも50％、及び特に好ましくは少なくとも75％の阻害をインビトロで示す。
さらに、好ましくは、本発明のポリペプチドは、試験動物、例えば無毛マウスへのF9−奇形癌細胞（ATCC CRL-1720）の移植により生成される腫瘍の増殖の阻害をインビボで示す。
【００２４】
本発明のポリペプチドは好ましくは、
（ａ）（i）核酸配列配列番号1 (MOR 02610)、 配列番号5 (MOR 02611)、 配列番号9 (MOR 02613)、 配列番号13 (MOR 02614)、 配列番号17 (MOR 02616)、 配列番号21 (MOR 02618)、 配列番号25 (MOR 02619)、 配列番号29 (MOR 02622)、 配列番号33 (MOR 02715)、 配列番号37 (MOR 02718)、配列番号41 (MOR 02721)、 配列番号45 (MOR 02722)によりコードされるVH領域、又は前記VH領域の１つの少なくとも１つのH-CDR1-、H-CDR-2- 及び/又は H-CDR3-領域、又は
（ii）少なくとも１つのH-CDR領域における変化により（i）のVH領域に由来するVH領域、及び/又は
（ｂ）（i）核酸配列  配列番号3 (MOR 02610)、 配列番号7 (MOR 02611)、 配列番号11 (MOR 02613)、 配列番号15 (MOR 02614)、 配列番号19 (MOR 02616)、 配列番号23 (MOR 02618)、 配列番号27 (MOR 02619)、 配列番号31 (MOR 02622)、 配列番号35 (MOR 02715)、 配列番号39 (MOR 02718)、 配列番号43 (MOR 02721 )、 配列番号47 (MOR 02722)によりコードされるVL領域、又は前記VL領域の１つの少なくとも１つのL-CDR1-, L-CDR2- 及び/又は L-CDR3-領域、又は
（ii）少なくとも１つのL−CDR領域における変化により（i）のVL領域に由来するVL領域を含んで成る、抗体又は抗体フラグメントから選択される。
VL領域におけるL−CDR3領域の変化及び/又はVH領域におけるH-CDR2領域の変化が好ましい。
【００２５】
例えば、本発明のポリペプチドは、核酸配列  配列番号27 (MOR 02619) 又は配列番号35 (MOR 02715)によりコードされるVL領域に由来するVL領域を示す。
（i）核酸配列  配列番号25 (MOR 02619) 又は配列番号33 (MOR 02715)によりコードされるVH領域、又は前記VH領域の１つの少なくとも１つのH-CDR1-、H-CDR-2- 及び/又は H-CDR3-領域、又は
（ii）少なくとも１つのH-CDR領域における変化により（i）のVH領域に由来するVH領域を含んで成るポリペプチドが特に好ましい。
【００２６】
ポリペプチドは好ましくは、H−CDR2領域の変化により誘導されるVH領域を示し、そして核酸配列  配列番号25 (MOR 02619) 又は配列番号33 (MOR 02715)からのVH領域によりコードされる。この場合、
（ａ）（i）核酸配列  配列番号63 (MOR 03243)、配列番号67 (MOR 03245)、配列番号71 (MOR 03246)、配列番号75 (MOR 03251)、配列番号79 (MOR 03252)、配列番号81 (MOR 03253)、配列番号83 (MOR 03255)、配列番号85 (MOR 03257)、配列番号87 (MOR 03258)によりコードされるVH領域、又は少なくともそのH-CDR-2-領域、又は
（ii）少なくとも１つのH-CDR領域における変化により（i）のVH領域に由来するVH領域、及び/又は
（ｂ）（i）核酸配列  配列番号 65 (MOR 03243)、配列番号69 (MOR 03245)、配列番号73 (MOR 03246)、配列番号77 (MOR 03251)、配列番号89 (MOR 03258)によりコードされるVL領域、又は前記VL領域の１つの少なくともL-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域、又は
（ii）少なくとも１つのL-CDR領域における変化により（i）のVL領域に由来するVL領域を含んで成るポリペプチドが特に好ましい。
【００２７】
本発明のポリペプチドの特定の例は、次の通りである：
配列番号１によりコードされるVH領域、及び配列番号３（MOR 02610）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成るポリペプチド。
配列番号５によりコードされるVH領域、及び配列番号７（MOR 02611）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成るポリペプチド。
【００２８】
配列番号９によりコードされるVH領域、及び配列番号11（MOR 02613）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成るポリペプチド。
配列番号13によりコードされるVH領域、及び配列番号15（MOR 02614）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成るポリペプチド。
【００２９】
配列番号17によりコードされるVH領域、及び配列番号19（MOR 02616）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成るポリペプチド。
配列番号21によりコードされるVH領域、及び配列番号23（MOR 02618）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成るポリペプチド。
【００３０】
配列番号25によりコードされるVH領域、及び配列番号27（MOR 02619）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成るポリペプチド。
配列番号29によりコードされるVH領域、及び配列番号31（MOR 02622）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成るポリペプチド。
【００３１】
配列番号33によりコードされるVH領域、及び配列番号35（MOR 02715）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成るポリペプチド。
配列番号37によりコードされるVH領域、及び配列番号39（MOR 02718）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成るポリペプチド。
【００３２】
配列番号41によりコードされるVH領域、及び配列番号43（MOR 02721）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成るポリペプチド。
配列番号45によりコードされるVH領域、及び配列番号47（MOR 02722）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成るポリペプチド。
【００３３】
配列番号25によりコードされるVH領域、及び配列番号49（MOR 03055）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成るポリペプチド。
配列番号25によりコードされるVH領域、及び配列番号51（MOR 03066）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成るポリペプチド。
【００３４】
配列番号25によりコードされるVH領域、及び配列番号53（MOR 03075）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成るポリペプチド。
配列番号25によりコードされるVH領域、及び配列番号55（MOR 03069）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成るポリペプチド。
【００３５】
配列番号25によりコードされるVH領域、及び配列番号57（MOR 03071）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成るポリペプチド。
配列番号33によりコードされるVH領域、及び配列番号59（MOR 03064）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成るポリペプチド。
【００３６】
配列番号33によりコードされるVH領域、及び配列番号61（MOR 03062）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成るポリペプチド。
配列番号63によりコードされるVH領域、及び配列番号65（MOR 03243）によりコードされるVR領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成るポリペプチド。
【００３７】
配列番号67によりコードされるVH領域、及び配列番号69（MOR 03245）によりコードされるVR領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成るポリペプチド。
配列番号71によりコードされるVH領域、及び配列番号73（MOR 03246）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成るポリペプチド。
【００３８】
配列番号75によりコードされるVH領域、及び配列番号77（MOR 03251）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成るポリペプチド。
配列番号79によりコードされるVH領域、及び配列番号77（MOR 03252）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成るポリペプチド。
【００３９】
配列番号81によりコードされるVH領域、及び配列番号77（MOR 03253）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成るポリペプチド。
配列番号83によりコードされるVH領域、及び配列番号77（MOR 03255）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成るポリペプチド。
【００４０】
配列番号85によりコードされるVH領域、及び配列番号77（MOR 03257）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成るポリペプチド。
配列番号87によりコードされるVH領域、及び配列番号89（MOR 03258）によりコードされるVL領域、又は少なくとも１つのそのH-CDR1-、H-CDR2-、H-CDR3-、L-CDR1-、L-CDR2- 又はL-CDR3-領域を含んで成るポリペプチド。
【００４１】
本発明のポリペプチドのVH及びVR鎖の創造は、次の通りである：
VH鎖：
１−領域骨格はnt1-78（すなわち、26aa）から延長し；FR1の最後のコドン（aa）は常にTCC(Cys)である。
“CDR1領域”は、２種の異なった長さのもの、すなわち30nt（10aa）（ファミリーVH1A, VH1B, ３，４及び５において可能である）、又は36nt(12aa)（ファミリーVH2, VH4及びVH6において可能である）であり得る。
【００４２】
２−領域骨格は常に33nt（すなわち、11aa）を示し；FR2の最後のコドン（aa）は常にTCG(Trp)であり；最後の２つのコドンは常にCTC. GAG(Leu Glu)である。
“CDR2領域”は、３種の異なった長さのもの、すなわち57nt（19aa）（ファミリーVH2及びVH4において可能である）、60nt(20aa)又は36nt(12aa) （ファミリーVH1A、VH1B、３及び５において可能である）、又は63nt(21aa)（ファミリーVH6において可能である）であり得る。
【００４３】
３−領域骨格は常に96nt（すなわち、32aa）を示し；FR3の３番目のコドン（aa）は常にACC(Thr)であり；最後の５個のコドンは常にTAT.TAT.TGC.GCG.CGT (Tyr Tyr Cys Ala Arg)である。
“CDR3領域”は、７種の異なった長さのもの、すなわち12-69nt（4-23aa）（すべてのファミリーVH2及びVH4において可能である）、60nt(20aa) （ファミリーVH1A、VH1B、３及び５において可能である）又は63nt(21aa)（ファミリーVH6において可能である）であり得る。
４−領域骨格は常に33nt（すなわち、11aa）を示し；そしてすべての７種のファミリーにおいて同一である：TGG.GGC.CAA.GGC.ACC.CTG.GTG.ACG.GTT.AGC.TCA。
【００４４】
VLκ鎖：
１−領域骨格はnt1-69 （すなわち、23 aa）から延長し；FR1の最後のコドン（aa）は常にTGC(Cys)である。
“CDR1領域”は、4種の異なった長さのもの、すなわち24 nt（8aa）（ファミリーVκ1及びVκ3 において可能である）、27nt(9aa) （ファミリーVκ3 において可能である）,39nt(13aa) （ファミリーVκ2  において可能である）又は42nt(14aa) （ファミリーVκ4 において可能である）;最初のコドン(aa)は常にAGA（Arg）であり；CDR1領域の最後から2番目のコドン(aa)は常にCTG（Leu）である。
【００４５】
２−領域骨格は常に33nt（すなわち、11aa）を示し；FR2の最初の２つのコドン（aa）は常にTGG.TAC (Trp Tyr)であり；最後から2番目のコドン(aa)は常にCCG (Pro)である。
“CDR2領域”は、常に33nt（すなわち、11aa）を示し、それにより最初の３種のコドン（aa）は常にCTA.TTA.ATT (Leu Leu Ile)である。
【００４６】
３−領域骨格は常に96nt（すなわち、32aa）を示し；FR3の最初の３種のコドン（aa）は常にGGG.GTC.CCG (GIy VaI Pro)であり；最後の３個のコドンは常にTAT.TAT.TGC (Tyr Tyr Cys)である。
“CDR3領域”は、常に24nt（すなわち、８aa）を示し、それに第２のコドン（aa）は常にCAG (Gln)である。
４−領域骨格は常に39nt（すなわち、13aa）を示し；そしてすべての４種のファミリーにおいて同一である：ACC.TTT.GGC.CAG.GGT.ACG.AAA.GTT.GAA. ATT.AAA.CGT.ACG。
【００４７】
VLλ鎖：
１−領域骨格はnt1-66 （すなわち、22 aa）から延長し；FR1の最後のコドン（aa）は常にTGT(Cys)である。
“CDR1領域”は、３種の異なった長さのもの、すなわち33 nt（11aa）（ファミリーV13において可能である）、39nt(13aa) （ファミリーV11 において可能である）又は42nt(14aa) （ファミリーV11及びV12 において可能である）である。
【００４８】
２−領域骨格は常に33nt（すなわち、11aa）を示し；FR2の最初の２つのコドン（aa）は常にTGG.TAC (Trp Tyr)であり；３番目の最後のコドン(aa)は常にGCG (Ala)である。
“CDR2領域”は、常に33nt（すなわち、11aa）を示し、それにより３番目のコドン(aa)は常にATT(Ile)であり、そして最後のの３種のコドン（aa）は常にCGT.CCC.TCA (Arg Pro Ser)である。
【００４９】
３−領域骨格は常に96nt（すなわち、32aa）を示し；FR3の最初のコドン（aa）は常にGGC(GIy)であり；そして最後の４個のコドンは常にGAT.TAT.TAT.TGC (Asp Tyr Tyr Cys)である。
“CDR3領域”は、３種の異なった長さのもの、すなわち24 nt（８aa）、27nt(９aa)又は30nt(10aa)である。
【００５０】
４−領域骨格は常に39nt（すなわち、13aa）を示し；そしてすべての３種のファミリーにおいて同一である：GTG.TTT.GGC.GGC.GGC.ACG.AAG.TTA.ACC.GTT.CTT.GGC.CAG。
治療又は診断目的のためには、例えばインビトロ又はインビボ診断のためには、本発明のポリペプチドが使用され得る。
【００５１】
治療適用のためには、本発明のポリペプチドは、例えば放射線剤又は化学療法剤から選択された治療活性成分、例えば生物学的細胞増殖抑制又は細胞毒性活性成分との接合体の形で存在することができる。ポリペプチドに対する治療活性成分の接合は、既知方法に従って、好ましくはタンパク質の反応性アミノ、カルボキシ、ヒドロキシ及び/又はチオール基への共有結合により、任意には既知方法に従って、ホモ−又はヘテロ−二官能価リンカーの使用により実施され得る。
【００５２】
さらに、ポリペプチドはまた、抗体の他に、例えばIgG分子又はそのフラグメントの形で、それに融合されるサイトカイン、例えばIL2, II12又はTNFα−ポリペプチドを含む融合タンパク質の形でも存在することができる。さらに、融合タンパク質は、二特異的抗体の形で存在し、それによりED-Bドメインへの結合の他に、もう１つの抗原への結合が好ましい。二特異的抗体の他の抗体特異性は、診断的に及び治療的に適切な放射性核種、例えばα−、β−又はγ−エミッター、例えば90Yのためのキレート化剤に対する結合ドメイン、診断用NIR（近赤外線）−色素、治療的に有効な色素、免疫学的エフェクター細胞（例えば、NK細胞、細胞毒性T細胞又はNKT細胞）上の表面分子、脈管形成適合インテグリン、特にそれらの機能を阻止する結合ドメイン（例えば、α1、β3、α1β3、α2β1、α2β2）、不活性化抗−VEGF−結合ドメイン、及びVEGF受容体１，２及び３に対する不活性化結合ドメインである。
【００５３】
診断適用に関しては、ポリペプチドは、診断的に検出できるラベリング基、例えばインビトロ又はインビボ診断のためのラベリング基の接合体の形で存在することができる。ラベリング基の例は、放射性ラベリング基、NMR−、色素−、酵素−、及び蛍光−（例えば、近赤外線範囲での蛍光）ラベリング基である。
【００５４】
治療適用に関しては、ポリペプチドは好ましくは、活性成分として、本発明のポリペプチド、任意には追加の活性成分、及び薬理学的に許容できるビークル、アジュバント及び/又は希釈剤を含む医薬組成物として配合される。医薬組成物は、適切な細胞培養物又は動物モデルにおいて、インビトロ試験により単純な手段で当業者により決定され得る治療的有効用量で活性成分を含む。組成物の投与は好ましくは、注射又は注入により行われるか、又は他のタイプの投与も与えられる。静脈内及び/又は皮下投与が好ましくは、実施される。
【００５５】
投与される活性成分の用量は、疾病の型及び重症度、並びに処理される患者の状態に依存する。治療組成物は好ましくは、少なくとも２〜４週間、延長された期間にわたって数度、投与される。これに関しては、例えば、Ferarra, N. など., Nature Reviews Drug Discovery, Volume 3, Mai 2004, 391-400 及び Salgaller, M. L., Current Opinion in Molecular Therapeutics 2003 5(6):657-667に記載されるように、抗体又は抗体接合体を投与するための既知方法、又は医薬抗体、例えばRituximab, CAMPATH, Remicade, 等のための存在する投与方法が言及されている。
【００５６】
本発明のもう１つの対象は、本発明のポリペプチドを、診断用試薬として含んで成る診断組成物である。さらに、診断組成物はさらに、次の診断的に許容できる試薬、ビークル、アジュバント及び/又は希釈剤を含むことができる。診断組成物は、それぞれのフォーマットで、例えばインビボ又はインビトロ診断フォーマットでの診断検出を可能にするのに十分な量でポリペプチドを含む。これに関しては、ラベルされた抗体の使用を伴ってインビボ及びインビトロ診断のための既知方法が言及される。
【００５７】
医薬及び診断組成物は、ED-B発現、例えば支質及び/又は血管周囲でのED-B発現により付随されるすべての疾病の治療及び診断のためである。そのような疾病の例は、過増殖性疾患、例えば脈管形成に関連する疾病、特に癌、眼底疾患、肥大性瘢痕、等、筋線維芽細胞機能不全に関連する疾病、例えば子宮内膜症、動脈硬化性プラーク、等、又は炎症性疾患、例え乾癬、クローン病、リウマチ様関節炎、又は多発性硬化症である。
【００５８】
本発明の医薬又は診断組成物は、ED−Bドメインの異なった領域に結合する、１又は複数の活性ポリペプチド、例えばポリペプチドの組合わせを含むことができる。組成物は、ヒト及び家畜用薬剤への使用のために適切である。
【００５９】
本発明のもう１つの対象は、本発明のペプチド又は融合ポリペプチドをコードする核酸である。この核酸は、一本鎖又は二本鎖DNA又はRNAであり得る。核酸は好ましくは、適切な宿主細胞又は適切な宿主生物における発現を可能にする、発現モニター配列と操作可能的結合下にある。核酸は、宿主細胞又は宿主生物中への導入のために適切であるベクター上に存在することができる。ベクターは例えば、原核細胞への導入のために適切な原核ベクター、例えばプラスミド又はバクテリオファージであり得る。対照的に、ベクターはまた、真核宿主細胞又は宿主生物中への挿入のために適切な真核ベクター、例えばプラスミド、人工染色体又はウィルスベクターであり得る。適切なベクターは例えば、Sambrook など. (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory Press, 及び Ausubel など. (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sonsから、当業者に知られている。
【００６０】
本発明のさらにもう１つの対象は、本発明の核酸又は本発明のベクターにより形質転換される、細胞、例えば原核細胞又は真核細胞、例えばヒト細胞である。本発明のもう１つの対象は、本発明の核酸又は本発明のベクターにより形質転換される、非ヒト生物、例えばトランスジェニック動物である。この場合、用語“形質転換”とは、本発明の範囲内で、細胞又は生物中への外来性核酸の導入のためのすべての可能性、例えばトランスフェクション又は感染を含む。
【００６１】
本発明のポリペプチドは、本発明の細胞又は本発明の非ヒト生物を、ポリペプチドの発現が達成される条件下で培養し、そして次に、発現されたポリペプチドを、例えば前記細胞、培養培地、生物、又は生物の排泄生成物から得ることにより製造され得る。
【実施例】
【００６２】
１．材料及び方法：
１．１．タンパク質及び抗体：
精製された組換えフィブロネクチンドメインED-B(His)6、フィブロネクチンドメイン６(6FN), フィブロネクチンドメイン７−８−９及びドメイン７−ED−B−８−９を、標準方法（例えば、Sambrook など, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Press）に従って生成した。
【００６３】
精製されたED-B受容体に対するマウス抗体をまた、完全フロイントアジュバント中、50μgの精製された受容体をマウスに投与し、３週間後、不完全フロイントアジュバント中、25μgの精製された受容体を投与し、そしてさらに３週間後、不完全アジュバント中、すべての適用物を投与することにより、標準の方法に従って生成した。次に、血液を、３度目の免疫化の14日後、眼窩後洞を通して採取した。
血漿フィブロネクチンは、Sigmaから入手した。
【００６４】
１．２．ED-B−特異的ファージの選択：
選択を、HuCAL（商標）Gold ファージ選択プロトコールに従って行った。HuCAL（商標）Goldライブラリーを、６の骨格−特異的プールに細分した。ED-B−特異的ファージを、96−ホールプレート（Maxisorb, Nunc, Rochester , NY, USA）に固定された組換えタンパク質の３回の連続的選択により濃縮した。パンニングAに関しては、プレートを、１μg/ホールのED-B（His6）（Ampuwma（商標）中、10μg/ml）により37℃で２時間、被覆した。パンニングBに関しては、プレートを、PBS（1mモルのMgCl2/1m モルのCaCl2によりpH7.2にされる）中、同じ濃度でのED-Bにより４℃で一晩、被覆した。プレートを、PBS、0.05％Tween20（Sigma, St. Louis, MO, USA）（ブロッキング緩衝液）中、５％脱脂粉乳によりブロックし、そして多量のブロッキング緩衝液と共にプレインキュベーションされた、１×1013個のHuCAL（商標）Goldファージと共にインキュベートした。
【００６５】
パンニングBに関しては、ファージを、フィブロネクチンのタイプIII ドメイン反復の保存された構造体に対して特異的である結合分子の選択性を低めるために、0.5μg/mlのフィブロネクチン−ドメイン６と共にプレインキュベーションした。室温での２時間、ファージと共にインキュベーションした後、ホールを、PBS、0.05％Tween20により５度、及びPBSにより５度、洗浄した。残るファージを、10mモルのトリス/HCl（pH8.0）中、20mモルのジチオトレイトール（DTT）により室温で10分間、溶出した。次に、E. コリTG−１（Stratagene, OD600＝0.5）とのインキュベーションを、感染のために実施した。次に、ホールを、E. コリTG-1と共に、追加の溶出段階としてインキュベーションした。
【００６６】
１．３．ファゲミド回収、ファージ増幅及び精製：
Die HuCAL（商標）Goldファージを、34μg/mlのクロラムフェニコール及び１％グルコース（２×TY-CG）を含む２×TY培地において増殖した。37℃及び約0.5のOD600でのヘルパーファージ（VCSM13）による感染、遠心分離及び２×TY-CG/50μg/mlのカナマイシンへの再懸濁の後、細胞を、0.25mモルのIPTGにより誘発し、そして22℃で一晩、培養した。ファージを、ポリエチレングリコールにより上清液から沈殿し（Ausubel など. (1998), Current Protocols of Microbiology）、PBSに再懸濁し、そして続く選択段階に使用した。
【００６７】
１．４．選択されたFabフラグメントのサブクローニング及び可溶性Fabフラグメントの発現：
選択されたHuCAL（商標）GoldファージのFab−コード挿入体を、発現ベクターpMORPHx9-FSにサブクローン化した。選択されたHuCAL（商標）Goldクローンのプラスミド−DNA調製物を、制限酵素Xbal I/EcoRIにより切断し、それにより、Fab−コード挿入体を切断した（ompA-VL及びphoA-Fd）。このベクターにおいて発現されるFab分子は、検出及び精製のために２種のC−末端ラベリング（FLAGTM及びStrep-tagII）を含む。
【００６８】
１．５．E.コリにおけるHuCAL（商標）Gold抗体の発現及び精製：
E. コリにおけるpMORPHx9-FS−コードされるFabフラグメントに基づくTG-1 F細胞の発現を、0.75Lの２×TY培地及び34μg/mlのクロラムフェニコールを含む振盪ボトル培養物において実施した。0.75mモルのIPTGによる誘発の後、細胞を30℃で16時間、培養した。他方では、第２成熟プールから得られたFabクローンを、0.1mモルのIPTGにより誘発し、そして次に、22℃で培養した。細胞ペレットからのペリプラズマチック抽出物を、浸透ショックにより生成し、そしてFabフラグメントを、Strep-Tactin（商標）クラマトグラフィー (IBA, Goettingen,Germany)により単離した。見掛け分子量を、検量標準を用いて、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）により決定した。濃度を、UV分光計により決定した。
【００６９】
１．６．ELISAによるED-B−結合Fab−フラグメントの同定：
96−ホール−Maxisorb ELISAプレートを、100μlのED-B溶液（被覆緩衝液（PBS, pH7.4、1mモルのCaCl2, 1mモルのMgCl2）中、10μg/ml）により、4℃で一晩、被覆した。粗溶解物又は精製されたFab分子を添加し；非結合Fab分子を、洗浄緩衝液（PBS, pH7.4、0.05％Tween 20）による５度の洗浄により除去した。Fabフラグメントを、抗ヒト−Fab−抗体−ペルオキシダーゼ接合体（Dianova）とのインキュベーション、続く可溶性ペルオキシダーゼ基質（Roche）による展開、及び370nmでの測定により検出した。ED-B-特異的Fab分子を発現するクローンを、6FNでのほとんどか又はまったく存在しないシグナルに対する、固定されたED-Bに対する陽性ELISAシグナルにより同定した。
【００７０】
１．７．生理学的温度条件下でELISAによる血漿安定性の決定：
ED-B（2.5μg/ml）による被覆を、上記のようにして実質的に行った。Fabフラグメントを、37℃及びヒト血漿（German Red Cross; Batch 9985550）中、50μg/mlの濃度で4時間インキュベートした。インキュベーションの後、Fab分子を、１％ウシ血清アルブミンを含むPBS中、5.0, 2.5, 1.25, 0.62, 0.31, 0.156, 0.078 及び 0.039μg/mlの濃度に、ELISA試験のために希釈し、シグナル強度の線状領域を決定した。機能的Fab分子を、抗−Flag M2抗体（Sigma F3165）及び二次抗−マウス−抗体−アルカリ相接合体により決定し、続いてAttophos (Roche)により展開し、そして535nmで測定した。
【００７１】
１．８．HDMVEc細胞培養物及び細胞付着試験：
若い人の包皮から単離されたヒト皮膚微小血管内皮細胞（HDMVEc）を、10％ウシ胎児血清、2mモルのグルタミン、20μg/mlのヘパリン及び3ng/mlのbFGFを含む、0.1％ゼラチン（Sigma）により被覆されたEGM-MV培地（Clonetics, Inc.）を含む容器において培養した。付着試験に関しては、継代８よりも長く培養されなかった細胞を使用した。ED-B（10μg/ml）又は血清フィブロネクチン（2.5μg/ml）を、96−ホールELISAプレートにおける、PBS, pH7.4、0.9mモルのCaCl2、0.5mモルのMgCl2において4℃で一晩、固定し、そしてPBS、pH7.4中、１％RSA、0.9mモルのCaCl2、0.5mモルのMgCl2により37℃で１時間、ブロックした。
【００７２】
細胞を、0.15μg/mlのカルセインにより37℃で30分間、ラベルし、そして付着媒体（MCDB131, 2mモルのグルタミン、0.1％RSA、20μg/mlのヘパリン）において1度、洗浄した。1×105個の細胞を、個々の場合、示される、付着媒体（最終体積100μl）に希釈された抗体濃縮物と共に37℃で20分間インキュベートした。その細胞懸濁液を、ED-B−被覆されたプレートに、37℃で２時間、添加した。細胞を、PBS（pH7.4）により２度、洗浄した後、0.9mモルのCaCl2、0.5mモルのMgCl2、付着細胞をプレート蛍光計量により検出した（励起485nm；発光530nm）。
【００７３】
対照として、（A）リガンド−被覆されたプレートに結合する細胞を、特定の抗体を添加しないで決定し、そして（B）ホールへの細胞付着を、リガンド被覆を伴わないで決定し、これにより、最後の言及された対照において得られる値を、試験における最小の細胞付着として定義した。
【００７４】
１．９．段階的CDRカセットの交換による選択されたFab分子の親和性成熟：
選択された抗体フラグメントの親和性及び生物学的活性を高めるために、CDR領域を、トリヌクレオチド−指図された突然変異誘発の使用によるカセット突然変異誘発により最適化した。
【００７５】
このために、ファゲミドベクターpMORPH-23における発現ベクターpMORPHx9からのFabフラグメントを、EcoRI/XbaI制限部位の使用によりクローン化した。選択されたFabフラグメントの親和性を最適化するために、個々の成熟プールについての２連続成熟段階を行った。第１の段階においては、出発クローンのL-CDR3領域が７×108（プール１）及び3.8×108（プール２）の個々のL鎖−CDR配列の範囲により変更された、抗体フラグメント−ファージライブラリーを生成した。次に、第１の成熟段階からの親和性−改良された誘導体を、多様化された要素のライブラリーにより置換されるH−CDR−2領域により、第２の成熟段階に暴露した。この手段においては、個々の場合、１×108の個々のクローンを有する２種のファージライブラリーを生成した。
【００７６】
親和性成熟ライブラリーを、E. コリTOP10Fの形質転換により生成した。ファージを、上記のようにして生成した。改良された親和性を有するFabフラグメントにおける選択を、第１の成熟段階において３度、及び第２段階において２度、緊縮条件下で実施した。
【００７７】
１．10．表面プラスモン共鳴（BIAcore（商標））による親和性の決定：
KD値を決定するために、Fabフラグメントのモノマー画分（少なくとも80％モノマー含有率、分析SECにより決定される；Superdex75, Amersham Pharmacia）を使用した。F 1 -Chips (Biacore, Sweden)を、約200RUのED-B（30μg/ml、10mモルの酢酸緩衝液、pH4.0）により被覆し、そして参照流動細胞を、標準EDC-NHS-アミン−カップリング化学の使用により、対応する量のヒト血清アルブミン（20μg/ml、10mモルの酢酸緩衝液、pH4.5）により被覆した。抗原密度を、第２成熟のFab特徴化のために約100RUに低めた。
【００７８】
再生を、10mモルのHClを用いて行った。すべての運動学的測定を、1.5〜500nモルのFab濃度範囲の使用により、20μl/分の流速で、PBS緩衝液（136mモルのNaCl、2.7mモルのKCl、10mモルのNa2HPO4、1.76mモルのKH2PO4、pH7.4）において実施した。注入期間は、個々の場合、１分であった。すべてのセンソグラム（sensograms）を、BIA評価ソフトウェア3.1の使用により評価した。
略語：EDC：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、NHS：N−ヒドロキシスクシンイミド、RU：共鳴単位。
【００７９】
２．結果：
２．１．ヒトED-Bに対する抗体の生成：
２種の異なったパンニングアッセイを実施した。第１のアッセイ（パンニングA）についてのED-Bによる被覆を、固定された抗原へのHDMVEc細胞の付着を可能にするコンホメーションでED-Bを提供するために生物学的試験から知られている条件に従って実施した。第２のパンニング（B）に関しては、ファージを、過剰の6FNの添加により阻止し、フィブロネクチン−ドメイン6と交差反応する結合分子の選択を回避した。
【００８０】
全体的に、1315の一次ヒットからの23種の異なったHuCAL-Fab分子が、ED-Bへの結合の基準に適合し、そして6FNへの結合基準には適合しないことが見出された。さらに、抗体を、それらの天然の配置での挿入されたED-Bドメインを伴って、及びそれらのドメインを伴わないで、ドメイン7、8及び９を含んで成る、組換え的に発現されたフィブロネクチンへの結合のためのそれらの能力について試験した（図３を参照のこと）。すべての試験された抗体は、７−ED−B−８−９に対する特定の認識を示したが、しかしED-Bドメインを有さないその対応する構造体とは反応しなかった。
【００８１】
２．２．ED-B特異的結合分子の機能的特徴化：
ELISAにおいて特異的に同定されるような材料を、精製、そしてED-B−被覆されたプレートへのHDMVEc細胞の付着を阻止するためにそれらの能力について試験した。２種の濃度でのED-B−特異的Fabフラグメントの存在下でのHDMVEc細胞の付着を、非特異的HuCAL−制御−Fab−分子及び陽性マウス制御血清に比較して、試験した。
【００８２】
セクション２．１に記載される23のFab分子中の12個は、固定されたED-Bにおける細胞付着の阻害を示した。６個の最も効果的なFab分子の代表的選択が図４に示されている。25μg/mlの濃度で、細胞付着は、50％〜ほとんど100％阻害された。0.4μg/mlの濃度で、わずか少数のFab分子、例えばMOR02610, MOR02616, MOR02715 及び MOR02718は、細胞付着の再現性阻害を示した。
【００８３】
機能−阻止Fab−抗体フラグメントを、F9−マウス−奇形癌細胞及びヒトIRM30神経芽腫−異種移植凍結断片上でのそれらの局在化に関する免疫組織化学により特徴づけられた。すべての試験された抗体は、２種の組織断片上での血管局在化を示したが、しかし正常組織（例えば、正常及び硬化性肝臓及び皮膚）上での血管の染色を示さなかった。図５B及び5Dにおいては、MOR02616による内皮及び腫瘍支質を増殖する血管の血管周囲アブルミナル染色が示される。指数的に増殖する腫瘍（但し、正常な血管においては増殖しない）の新生血管構造の付近のED-Bの採取物が検出され得る。同じ濃度でのリゾチームに対する負の対照抗体により、染色は見えなかった（図５A及び５C）。
【００８４】
12の選択された結合分子の性質を、BIAコアー分析により決定した（表１を参照のこと）。その親和性（Kon）は、15〜500nモルの範囲であった。二価のL19誘導体AP39（ED-Bに対する生物学的に不活性な比較抗体）の親和性を、2.4nモルにより決定した。表１はまた、CDR配列（L−CDR3及びH−CDR3のみ）及び骨格組合せを示す。異なったバッチからのFab分子による少なくとも２つの独立した測定を、タンパク質発現及びタンパク質精製について実施した。Fab分子の結合速度（Kon）及び解離−off速度（Koff）が別々の欄に示されている。
【００８５】
【表１】
2009514540.tif 000002
【００８６】
２．３．L−CDR3及びH−CDR2領域の最適化による機能−阻止ED-B−抗体の親和性成熟：
Fab分子の親和性成熟を２つのセクションにおいて実施した。最初に、L−CDR3配列を多様化し、そして次に、第１段階において得られた、改良されたFab分子のH-CDR2配列を交換した。
【００８７】
個々の段階のための２種の親和性成熟ライブラリーを生成した。最適化を、２つの別々のプールにおいて行った。７×108個の要素の多様性の程度を有するL−CDR3ライブラリー１は、４種の出発Fab分子MOR02610、MOR02616、MOR02619 及び MOR02622を含んだ。3.8×108個の要素の多様性の程度を有するL−CDR3ライブラリー２は、MOR02715及びMOR02718の誘導体のみを含んだ。ここで、Fab分子を、付着試験におけるそれらの親和性及び生物学的に従って、個々の場合、グループ中に組合せた。
【００８８】
２種のライブラリーを、選択工程の間、別々に保持した。この場合、２種のパンニング方法を実施した。パンニングIを、前に示されたように、３段階のためにマキシゾーブ（maxisorb）プレート上に固定されたED-Bにより実施した。パンニングIIに関しては、溶液におけるビオチニル化されたED-Bの選択を行った。この場合、ファージ−抗原複合体を、最初の段階においてストレプタビジン−被覆された粒子により、及び続く２つの段階において中性アビジンプレート上に回収した。緊縮条件は、選択工程の範囲内で使用された。
【００８９】
最適化されたFab分子に対するスクリーニングを、BIAcoreシステムにおけるKoff値を決定することにより、実施した。全体的に、ライブラリーIの11の誘導体が特徴づけられた。最高の親和性を有する５種の誘導体が表２に示されている。この場合、すべての改良されたクローンは、７倍までの親和性の上昇を有するMOR02619の誘導体である。クローンMOR03075においては、2.4nモルの親和性が見出された。
【００９０】
ライブラリー２から、MOR02715の２種の誘導体を詳細に分析した。クローンMOR03062に関しては、15倍の親和性上昇が見出され、その結果、2.4nmのモノマー親和性が得られた。L-CDR3領域のアミノ酸配列における変化が、表2a及び2bに示されている。
【００９１】
【表２ａ】
2009514540.tif 000003
【００９２】
【表２ｂ】
2009514540.tif 000004
【００９３】
最初の成熟段階からのすべての誘導体のED-Bについての特異性（ELISA, 免疫組織化学、及び細胞付着試験により決定された）は、未変化であった。
表2a及び2bに示されるFab分子を、２つのプールにおける続くH-CDR2成熟のために選択した。プール１においては、５種のFab分子を類似する活性にゆだねたが、但しH-CDR2における多様化の異なったL−CDR3領域（７×107個の要素のライブラリーサイズ）を有した。プール２（8.5×107個の要素のライブラリーサイズ）に関しては、２つのFab分子を選択した。ライブラリーは上記のようにして、別々に選択された。高められた親和性を有する結合分子を、緊縮条件下で溶液における２つのパンニング段階により濃縮した。
【００９４】
３種のFab分子を、プール１から選択した。誘導体MORO3243及びMOR03245に関しては、約0.7nモルの親和性が見出された。誘導体MOR03246に関しては、0.6nモルの親和性が見出された。
その対応するクローンのH-CDR2配列及び親和性データが表3aに示される。
【００９５】
【表３ａ】
2009514540.tif 000005
【００９６】
改良された性質を有する誘導体をまた、プール２から選択した。親クローンに比較して、誘導体の親和性は、26〜250倍、改良された。30pM又は40pMを有する、クローンMOR03255及びMOR03258の親和性を決定した。
表3bにおいては、プール２からの選択されたクローンのH-CDR2アミノ酸配列、及びその対応する親和性データが示される。
【００９７】
【表３ｂ】
2009514540.tif 000006
【００９８】
２．４．高アフィン機能−阻止ED-B−抗体の特徴化：
親和性成熟により得られる抗体がまだ常にED-Bに対して特異的であるかどうかを試験するために、ELISAフォーマットにおける特異性試験（図６）、免疫組織化学研究（図７）及び付着試験（図８）を行った。すべての３種の試験においては、ED-Bに対する親和性−成熟Fab分子の特異性が未変化のまま存続したことが見出された。さらに、親クローン、例えばMOR02715、及び親和性成熟により生成されるクローン、例えばMOR03062、 MOR03255、 MOR03064 及び MOR03259が、既知抗体L19よりも有意に高い生物学的活性（付着阻害）を有することが、図８から明白である。
【００９９】
さらに、ヒト血漿におけるFab分子の熱安定性を試験した。このために、Fab分子を、37℃で４時間、ヒト血漿と共にインキュベートし、そしてELISAにより決定される免疫反応性の有意な損失（図９）は見出されなかった。
すべての選択されたFab分子は、用量依存性手段で、ED-Bに対するヒト微小血管内皮細胞と受容体との相互作用を阻止することができ、ところが既知ED-B−抗体L19は阻止しない。細胞外マトリックスへのHDMVEcの付着は、新生脈管形成における初期段階の１つであるので、本発明の結合分子によるこの工程の阻止は、新規血管の形成を阻害し、そして腫瘍増殖を阻害するために治療剤を生成する。
【０１００】
２．５．インビボ作用：
F9−奇形癌細胞（100μgのFab MOR03255を有するか又は有さない、Matrigel中、マウス当たり106個の細胞）を、無毛マウスの側腹部にs.c.移植した。３日後、動物を、100μgのMOR03255/マウスにより７日連続して処理した。溶媒対照に比較して、両処理グループは、42〜64％の範囲の腫瘍増殖の阻害を示す。試験結果の要約は、図10に示される。
【０１０１】
さらなる労力を伴わないで、当業者は、前述の記載を用いて、本発明をその十分な程度まで利用できることと思われる。従って、前述の好ましい特定の態様は、単なる例示であり、本発明の範囲を制限するものではない。
前述及び実施例においては、すべての温度は、特にことわらない限り、℃であり、そしてすべての部及び％は重量によってである。
【０１０２】
本明細書に引用されるすべての出願、特許及び出版物、及び2005年10月14日に出願された対応するドイツ出願番号102004050101.7号及び2005年７月11日に出願されたアメリカ特許仮出願番号60/697,565号の全開示は、引用により本明細書に組込まれる。
前記例は、遺伝学的に又は特異的に記載される本発明の反応体及び/又は操作条件を、前記例に使用されるそれらにより置換することにより類似する好結果を伴って反復され得る。
前述の記載から、当業者は、本発明の必須特徴を容易に確かめることができ、そして本発明の範囲内で、本発明の種々の変更及び修飾を行うことができ、種々の使用法及び条件にそれを適合することができる。
【０１０３】
文献：
(1)Brown LF, Guidi AJ, Schnitt SJ, Van De Water L, Iruela-Arispe ML, Yeo T-K, Tognazzi K, Dvorak HF (1999) Clin. Cancer Res. 5: 1041-1056；
(2)Folkman J (1995) Nature (Med.) 1: 27-31；
(3)Risau W und Lemmon V (1988) Develop. Biol. 125: 441-450；
(4)Van Den Hoff A (1988) Adv. Cancer Res. 50: 159-196；
(5)Folkman J und Shing Y (1992) J. Biol. Chem. 267: 10931-10934；
(6)George EL, Baldwin HS, Hynes RO (1997) Blood 90: 3073-3081；
(7)Bowersox JC und Sorgente N (1982) Cancer Res. 42: 2547-2551；
【０１０４】
(8)Madri JA, Pratt BM, Tucker AM (1988) J. Cell Biol. 106: 1375- 1384；
(9)Nicosia RF, Bonnano E, Smith M (1993) J. Cell. Physiol. 154: 654-661；
(1O)Kornblihtt AR, Vibe-Pedersen K und Baralle FE, 1983. Isolation and characterization of cDNA clones for human and bovine fibronectins.Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80, 3218-22；
(11)Leahy DJ, Hendrickson WA, Aukhil I und Erickson HP. 1992. Structure of fibronectin type III domain from tenascin phased by MAS analysis of the selenomethionyl protein. Science, 258, 987-91；
【０１０５】
(12)Hynes R.O. , 1987, Cell 48, 549-550；
(13)Plow E.F. et al. 2000, J. Biol. Chem., 275, 21785-21788 ；
(14)Castellani P, Viale G, Dorcaratto A, Nicolo G, Kaczmarek J, Querze G, Zardi L (1994) Int. J. Cancer 59: 612-618；
(15)Hashimoto-Uoshima M, Yan YZ, Schneider G, Aukhil I (1997) J. Cell Science 110: 227-2280；
(16)Chen W and Culp LA (1996) Exp. Cell Res. 223: 9-19；
(17)Chen W and Culp LA (1998) Clin. Exp. Metastasis 16: 30-42。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】図１は、機能的活性の抗体を同定するための阻害試験の図示である。皮膚（ヒト皮膚微小血管内皮細胞、HDMVEc）の微小血管から得られたヒト内皮細胞を、ED-B−特異的Fab−抗体フラグメントと共にインキュベートした。結合された細胞の数を、クリスタルバイオレット染色により可視化し、そして光度計により測定した。高い色の強度は、多くの付着細胞を意味し、そして結合−阻止抗体を意味しない。低い色の強度は、少々の付着性及び結合−阻止抗体を意味する。
【０１０７】
【図２】図２は、Fab−フラグメント表示によりED-B−フィブロネクチン−阻止抗体を同定するためのスクリーニング図を示す。第１段階においては、組換えED-Bによるパンニング方法が行われる。この手段で得られる抗体フラグメントを、特異性試験（ELISA）、機能的付着試薬、及び免疫組織化研究にゆだねる。次に、それらの試薬を実施する抗体の親和性を決定する。次に、CDRドメインにおける変更を実施し、親和性を改良し、それにより、親和性熟成１は、L-CDR3度メインにおける変更を意味し、そして親和性熟成２はH-CDR2ドメインにおける変更を意味する。  親和性成熟により得られる抗体が上記試験をパスした後、インビボ有効性が試験される。
【０１０８】
【図３】図３は、組換えED-Bによるパンニングにより生成される抗体−FabフラグメントによるELISAフォーマットにおける特異性試験の結果を示す。  ED-Bは、組換えED-Bへの結合を意味し、６−FNは組換えフィブロネクチン−ドメイン６への結合を意味し、ドメイン７−８−９は組換えフィブロネクチンドメイン７−８−９への結合を意味し（ED-Bなしで）、そしてドメイン７−EDB−８−９は、ED-Bを伴っての組換えフィブロネクチンドメイン７−８−９への結合を意味する。ED-B：６−FN又は７−８−９の比は、研究下の抗体の特異的を生成する。AP-39は、生物学的不活性の抗−ED-B  scFv抗体L19の共有ダイマーを意味する。
【０１０９】
【図４】図４は、研究下の抗体による付着試験の結果を示す。  25μg/ml又は0.4μg/mlのFabの濃度で、示されるFabフラグメントによるED-B−被覆されたプレートへのHDMVEc細胞の付着の阻害を試験した。示される値は、３回の測定の結果である。
【０１１０】
【図５】図５は、MORO2616の例における機能−阻止抗−ED-B-Fabフラグメント免疫組織化学的反応パターンを示す。図５A及び5Cにおいては、負の対照（負のHuCAL-Fab）による結果、及び図5B及び5Dにおいては、ヒト神経芽腫細胞−IRM異種移植体（図5A及び5B）及びネズミF9−奇形癌細胞（図5C及び5D）に対する抗体MOR02616による結果が示されている。  細胞の凍結断片（厚さ：10μm）を空気乾燥し、そして次に氷冷却されたアセトンに10分間、配置した。次に、断片をPBSにより洗浄し、そして2μg/mlのMOR02616又は負の対照と共に室温で60分間インキュベートした。二次抗体として、ペルオキシダーゼ−ラベルされたポリクローナルヤギ抗−ヒトF(ab)2抗血清（PBSに1：100で希釈された、Dianova）を、クロモゲン基質としてのジアミノベンジン（Sigma Chemicals）と組合せて使用した。
【０１１１】
【図６】図６は、成熟により最適化される抗体FabフラグメントとのELISAフォーマットにおける特異性試験の結果を示す。  試験の実行は図３に記載される通りであった。
【図７】図７は、F9−奇形癌細胞の凍結断片（図7A）及び無毛マウスにおけるSKMEL-28ヒト−メラノーマ細胞異種移植片（図7B）に対する、成熟により最適化された抗体FabフラグメントMOR03255の免疫組織化学的反応パターンを示す。  試験の実行は図５に記載される通りであった。
【０１１２】
【図８】図８は、比較抗体L19及びLy6 0.3に対する本発明の抗体Fabフラグメントによる付着試験の結果を示す。  試験の実行は、図４に記載されるとおりであった。抗体濃度は、1μl/ml、10μl/ml又は20μl/mlであった。
【０１１３】
【図９】図９は、ヒト血漿又はPBSにおいて37℃で４時間のインキュベーションの後、本発明の抗体−Fabフラグメントの安定性を示す。  免疫反応性を、0.039〜5μg/mlの範囲の濃度を伴ってELISA試験により決定した。インキュベーションを伴わないヒト血漿における0.62μg/mlのシグナルを、100％値として定義した。
【図１０】図10は、MOR03255の例における抗−ED-B−機能―阻止Fab−抗体フラグメントの治療有効性を示す。
【図１１−１】図11-1は、本発明の抗体のVH及びVL領域をコードするヌクレオチド配列を示す。
【図１１−２】図11-2は、本発明の抗体のVH及びVL領域をコードするヌクレオチド配列を示す。
【図１１−３】図11-3は、本発明の抗体のVH及びVL領域をコードするヌクレオチド配列を示す。
【図１１−４】図11-4は、本発明の抗体のVH及びVL領域をコードするヌクレオチド配列を示す。
【図１１−５】図11-5は、本発明の抗体のVH及びVL領域をコードするヌクレオチド配列を示す。
【図１１−６】図11-6は、本発明の抗体のVH及びVL領域をコードするヌクレオチド配列を示す。
【図１１−７】図11-7は、本発明の抗体のVH及びVL領域をコードするヌクレオチド配列を示す。
【図１１−８】図11-8は、本発明の抗体のVH及びVL領域をコードするヌクレオチド配列を示す。
【図１】
2009514540.tif 000007
【図２】
2009514540.tif 000008
【図３】
2009514540.tif 000009
【図４】
2009514540.tif 000010
【図５Ａ】
2009514540.tif 000011
【図５Ｂ】
2009514540.tif 000012
【図５Ｃ】
2009514540.tif 000013
【図５Ｄ】
2009514540.tif 000014
【図６】
2009514540.tif 000015
【図７】
2009514540.tif 000016
【図８】
2009514540.tif 000017
【図９】
2009514540.tif 000018
【図１０】
2009514540.tif 000019
【図１１−１】
2009514540.tif 000020
【図１１−２】
2009514540.tif 000021
【図１１−３】
2009514540.tif 000022
【図１１−４】
2009514540.tif 000023
【図１１−５】
2009514540.tif 000024
【図１１−６】
2009514540.tif 000025
【図１１−７】
2009514540.tif 000026
【図１１−８】
2009514540.tif 000027
【配列表】
2009514540000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年8月20日(2007.8.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）核酸配列  配列番号1 (MOR 02610)、配列番号17 (MOR 02616)、配列番号25 (MOR 02619)、 配列番号29 (MOR 02622)、 配列番号33 (MOR 02715)、又は 配列番号37 (MOR 02718)によりコードされるVH領域、又は前記VH領域のいずれかからのH-CDR1、H-CDR-2 及びH-CDR3領域、及び
（ｂ）核酸配列  配列番号3 (MOR 02610)、配列番号19 (MOR 02616)、配列番号27 (MOR 02619)、 配列番号31 (MOR 02622)、 配列番号35 (MOR 02715)、 又は配列番号39 (MOR 02718)、によりコードされるVL領域、又は前記VL領域のいずれかからのL-CDR1, L-CDR2 及びL-CDR3領域を有することを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
核酸配列  配列番号27(MOR 02619)、又は 配列番号35(MOR 02715)によりコードされるVL領域、又は前記VL領域のいずれかからのL-CDR1、L-CDR-2 及びL-CDR3領域を有することを特徴とする請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
（ａ）核酸配列  配列番号25 (MOR 02619)、又は配列番号33 (MOR 02715)によりコードされるVH領域、又は前記VH領域のいずれかからのH-CDR1、H-CDR-2 及びH-CDR3領域を有することを特徴とする請求項１又は２記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号１(MOR 02610)によりコードされるVH領域、及び配列番号３（MOR 02610）によりコードされるVL領域、又はこのVH領域からのH-CDR1、H-CDR2及びH-CDR3領域、及びこのVL領域からのL-CDR1、L-CDR2 及びL-CDR3領域を有することを特徴とする請求項１記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号17(MOR 02616)によりコードされるVH領域、及び配列番号19（MOR 02616）によりコードされるVL領域、又はこのVH領域からのH-CDR1、H-CDR2及びH-CDR3領域、及びこのVL領域からのL-CDR1、L-CDR2 及びL-CDR3領域を有することを特徴とする請求項１記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号25(MOR 02619)によりコードされるVH領域、及び配列番号27（MOR 02619）によりコードされるVL領域、又はこのVH領域からのH-CDR1、H-CDR2及びH-CDR3領域、及びこのVL領域からのL-CDR1、L-CDR2 及びL-CDR3領域を有することを特徴とする請求項１記載のポリペプチド。
【請求項７】
配列番号29(MOR 02622)によりコードされるVH領域、及び配列番号31（MOR 02622）によりコードされるVL領域、又はこのVH領域からのH-CDR1、H-CDR2及びH-CDR3領域、及びこのVL領域からのL-CDR1、L-CDR2 及びL-CDR3領域を有することを特徴とする請求項１記載のポリペプチド。
【請求項８】
配列番号33(MOR 02715)によりコードされるVH領域、及び配列番号35（MOR 02715）によりコードされるVL領域、又はこのVH領域からのH-CDR1、H-CDR2及びH-CDR3領域、及びこのVL領域からのL-CDR1、L-CDR2 及びL-CDR3領域を有することを特徴とする請求項１記載のポリペプチド。
【請求項９】
配列番号37(MOR 02718)によりコードされるVH領域、及び配列番号39（MOR 02718）によりコードされるVL領域、又はこのVH領域からのH-CDR1、H-CDR2及びH-CDR3領域、及びこのVL領域からのL-CDR1、L-CDR2 及びL-CDR3領域を有することを特徴とする請求項１記載のポリペプチド。
【請求項１０】
（ａ）核酸配列  配列番号25(MOR 02619)、又は配列番号33 (MOR 02715)によりコードされるVH領域、又は前記VH領域のいずれかからのH-CDR1、H-CDR-2 及びH-CDR3領域、及び
（ｂ）核酸配列  配列番号49(MOR 03055)、配列番号51 (MOR 03066)、配列番号53 (MOR 03075)、 配列番号55(MOR 03069)、 配列番号57 (MOR 03071)、配列番号59 (MOR 03064)又は配列番号61 (MOR 03062)、によりコードされるVL領域、又は前記VL領域のいずれかからのL-CDR1, L-CDR2 及びL-CDR3領域を有することを特徴とするポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号25(MOR 03055)によりコードされるVH領域、及び配列番号49（MOR 03055）によりコードされるVL領域、又はこのVH領域からのH-CDR1、H-CDR2及びH-CDR3領域、及びこのVL領域からのL-CDR1、L-CDR2 及びL-CDR3領域を有することを特徴とする請求項10記載のポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号25(MOR 03066)によりコードされるVH領域、及び配列番号51（MOR 03066）によりコードされるVL領域、又はこのVH領域からのH-CDR1、H-CDR2及びH-CDR3領域、及びこのVL領域からのL-CDR1、L-CDR2 及びL-CDR3領域を有することを特徴とする請求項10記載のポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号25(MOR 03075)によりコードされるVH領域、及び配列番号53（MOR 03075）によりコードされるVL領域、又はこのVH領域からのH-CDR1、H-CDR2及びH-CDR3領域、及びこのVL領域からのL-CDR1、L-CDR2 及びL-CDR3領域を有することを特徴とする請求項10記載のポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号25(MOR 03069)によりコードされるVH領域、及び配列番号55（MOR 03069）によりコードされるVL領域、又はこのVH領域からのH-CDR1、H-CDR2及びH-CDR3領域、及びこのVL領域からのL-CDR1、L-CDR2 及びL-CDR3領域を有することを特徴とする請求項10記載のポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号25(MOR 03071)によりコードされるVH領域、及び配列番号57（MOR 03071）によりコードされるVL領域、又はこのVH領域からのH-CDR1、H-CDR2及びH-CDR3領域、及びこのVL領域からのL-CDR1、L-CDR2 及びL-CDR3領域を有することを特徴とする請求項10記載のポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号33(MOR 03064)によりコードされるVH領域、及び配列番号59（MOR 03064）によりコードされるVL領域、又はこのVH領域からのH-CDR1、H-CDR2及びH-CDR3領域、及びこのVL領域からのL-CDR1、L-CDR2 及びL-CDR3領域を有することを特徴とする請求項10記載のポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号33(MOR 03062)によりコードされるVH領域、及び配列番号61（MOR 03062）によりコードされるVL領域、又はこのVH領域からのH-CDR1、H-CDR2及びH-CDR3領域、及びこのVL領域からのL-CDR1、L-CDR2 及びL-CDR3領域を有することを特徴とする請求項10記載のポリペプチド。
【請求項１８】
（ａ）核酸配列  配列番号63 (MOR 03243)、配列番号67 (MOR 03245)、配列番号71 (MOR 03246)、 配列番号75 (MOR 03251)、 配列番号79(MOR 03252)、配列番号81 (MOR 03253)、配列番号83(MOR 03255)、配列番号85 (MOR 03257)、又は配列番号87(MOR 03258)によりコードされるVH領域、又は前記VH領域のいずれかからのH-CDR1、H-CDR-2 及びH-CDR3領域、及び
（ｂ）核酸配列  配列番号65(MOR 03243)、配列番号69 (MOR 03245)、配列番号73(MOR 03246)、 配列番号77(MOR 03251)、又は配列番号89 (MOR 03258)、によりコードされるVL領域、又は前記VL領域のいずれかからのL-CDR1, L-CDR2 及びL-CDR3領域を有することを特徴とするポリペプチド。
【請求項１９】
配列番号63(MOR 03243)によりコードされるVH領域、及び配列番号65（MOR 03243）によりコードされるVL領域、又はこのVH領域からのH-CDR1、H-CDR2及びH-CDR3領域、及びこのVL領域からのL-CDR1、L-CDR2 及びL-CDR3領域を有することを特徴とする請求項18記載のポリペプチド。
【請求項２０】
配列番号67(MOR 03245)によりコードされるVH領域、及び配列番号69（MOR 03245）によりコードされるVL領域、又はこのVH領域からのH-CDR1、H-CDR2及びH-CDR3領域、及びこのVL領域からのL-CDR1、L-CDR2 及びL-CDR3領域を有することを特徴とする請求項18記載のポリペプチド。
【請求項２１】
配列番号71(MOR 03246)によりコードされるVH領域、及び配列番号73（MOR 03246）によりコードされるVL領域、又はこのVH領域からのH-CDR1、H-CDR2及びH-CDR3領域、及びこのVL領域からのL-CDR1、L-CDR2 及びL-CDR3領域を有することを特徴とする請求項18記載のポリペプチド。
【請求項２２】
配列番号75(MOR 03251)によりコードされるVH領域、及び配列番号77（MOR 03251）によりコードされるVL領域、又はこのVH領域からのH-CDR1、H-CDR2及びH-CDR3領域、及びこのVL領域からのL-CDR1、L-CDR2 及びL-CDR3領域を有することを特徴とする請求項18記載のポリペプチド。
【請求項２３】
配列番号79(MOR 03252)によりコードされるVH領域、及び配列番号77（MOR 03252）によりコードされるVL領域、又はこのVH領域からのH-CDR1、H-CDR2及びH-CDR3領域、及びこのVL領域からのL-CDR1、L-CDR2 及びL-CDR3領域を有することを特徴とする請求項18記載のポリペプチド。
【請求項２４】
配列番号81(MOR 03253)によりコードされるVH領域、及び配列番号77（MOR 03253）によりコードされるVL領域、又はこのVH領域からのH-CDR1、H-CDR2及びH-CDR3領域、及びこのVL領域からのL-CDR1、L-CDR2 及びL-CDR3領域を有することを特徴とする請求項18記載のポリペプチド。
【請求項２５】
配列番号83(MOR 03255)によりコードされるVH領域、及び配列番号77（MOR 03255）によりコードされるVL領域、又はこのVH領域からのH-CDR1、H-CDR2及びH-CDR3領域、及びこのVL領域からのL-CDR1、L-CDR2 及びL-CDR3領域を有することを特徴とする請求項18記載のポリペプチド。
【請求項２６】
配列番号85(MOR 03257)によりコードされるVH領域、及び配列番号77（MOR 03257）によりコードされるVL領域、又はこのVH領域からのH-CDR1、H-CDR2及びH-CDR3領域、及びこのVL領域からのL-CDR1、L-CDR2 及びL-CDR3領域を有することを特徴とする請求項18記載のポリペプチド。
【請求項２７】
配列番号87(MOR 03258)によりコードされるVH領域、及び配列番号89（MOR 03258）によりコードされるVL領域、又はこのVH領域からのH-CDR1、H-CDR2及びH-CDR3領域、及びこのVL領域からのL-CDR1、L-CDR2 及びL-CDR3領域を有することを特徴とする請求項18記載のポリペプチド。
【請求項２８】
治療薬剤との接合体の形で存在する請求項１〜27のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項２９】
前記治療薬剤が、放射線療法剤及び化学療法剤から選択される請求項28記載のポリペプチド。
【請求項３０】
融合タンパク質の形で存在する請求項１〜27のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項３１】
サイトカインとの融合タンパク質として、又は二特異的抗体として存在する請求項30記載のポリペプチド。
【請求項３２】
診断的に検出できるラベリング基との接合体の形で存在する請求項１〜27のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項３３】
前記診断的に検出できるラベル基が、放射性−、NMR−、色素−、酵素及び蛍光ラベリング基から選択されることを特徴とする請求項32記載のポリペプチド。
【請求項３４】
活性化合物として、請求項１〜31のいずれか１項記載のポリペプチド、及び薬理学的に許容できるキャリヤー、賦形剤及び/又は希釈剤を含んで成ることを特徴とする医薬組成物。
【請求項３５】
過増殖患者の予防又は処理のための請求項34記載の組成物。
【請求項３６】
癌の予防又は処理のための請求項34又は35記載の組成物。
【請求項３７】
診断試薬として、請求項１〜27、32又は33のいずれか1項記載のポリペプチドを含んで成る診断組成物。
【請求項３８】
過増殖性疾患又はそれに対する素因の診断のための請求項37記載の組成物。
【請求項３９】
癌又はその素因の診断のための請求項37又は38記載の組成物。
【請求項４０】
ヒト医薬への適用のための請求項34〜39のいずれか１項記載の組成物。
【請求項４１】
請求項１〜27又は30及び31のいずれか1項記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項４２】
発現制御配列との操作的結合下にある請求項41記載の核酸。
【請求項４３】
請求項41又は42のいずれか１項記載の核酸を含んで成ることを特徴とするベクター。
【請求項４４】
請求項41又は42のいずれか１項記載の核酸、又は請求項43記載のベクターにより形質転換されることを特徴とする細胞。
【請求項４５】
請求項41又は42のいずれか１項記載の核酸、又は請求項43記載のベクターにより形質転換されることを特徴とする非ヒト細胞。
【請求項４６】
請求項１〜27のいずれか１項記載のポリペプチドの生成方法であって、請求項44記載の細胞又は請求項45記載の非ヒト生物を、前記ポリペプチドの発現が実施される条件下で培養し、そして発現されたポリペプチドを入手することを特徴とする方法。
【請求項４７】
ED-B-関連疾患の予防又は処理のための薬剤の生成へのためへの請求項１〜31のいずれか１項記載のポリペプチドの使用。
【請求項４８】
癌の予防又は処理のためへの請求項47記載の使用。
【請求項４９】
ED-B-関連の患者又はその素因の診断のための検出試薬の生成のためへの請求項１〜27、32又は33のいずれか１項記載のポリペプチドの使用。
【請求項５０】
癌又はその素因の診断のためへの請求項49記載の使用。
【国際調査報告】
2009514540.tif 000028
2009514540.tif 000029
2009514540.tif 000030
2009514540.tif 000031
2009514540.tif 000032
2009514540.tif 000033