(57)【要約】  改変開裂ハーフドメイン；それらの改変開裂ハーフドメインを含む融合ポリペプチド；該改変開裂ハーフドメイン及び融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び前記ポリヌクレオチド及び／又は融合タンパク質を含む細胞；が開示されている。また、これらのポリペプチド及びポリヌクレオチドを、例えば、ゲノム配列の標的開裂に利用する方法も記載される。
2009538138.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変ＦｏｋＩ開裂ハーフドメインを含むポリペプチドであって：
（ｉ）該改変開裂ハーフドメインが１又は複数の野生型アミノ酸残基４８３，４８６，４８７，４９０，４９９，５３８又はこれらの組み合わせに突然変異を含み、ここで該アミノ酸残基は全長の野生型ＦｏｋＩに対して番号付けされており；
（ｉｉ）該改変開裂ハーフドメインが野生型開裂ハーフドメイン又は第２改変開裂ハーフドメインとオブリゲートなヘテロ二量体を形成し；そして
（ｉｉｉ）該改変開裂ハーフドメインがアミノ酸残基４９０で突然変異を含む場合、さらに少なくとも１つの別のアミノ酸突然変異を含む、
ことを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
前記位置４９０及び５３８におけるアミノ酸残基が突然変異していることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記改変開裂ハーフドメインがＥ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋと称されるポリペプチドを含むことを特徴とする請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
位置４８６における野生型アミノ酸が突然変異していることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記改変開裂ハーフドメインがＱ４８６Ｅと称されるポリペプチドを含むことを特徴とする請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
位置４９９における野生型アミノ酸が突然変異していることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記改変開裂ハーフドメインがＩ４９９Ｌと称されるポリペプチドを含むことを特徴とする請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記改変開裂ハーフドメインがＱ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌと称されるポリペプチドを含むことを特徴とする請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の改変開裂ハーフドメインと野生型ＦｏｋＩ開裂ハーフドメインを含むヘテロ二量体。
【請求項１０】
前記改変開裂ハーフドメインがＥ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋと称されるポリペプチドを含むことを特徴とする請求項９に記載のヘテロ二量体。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の第１改変開裂ハーフドメインと第２改変開裂ハーフドメインを含むヘテロ二量体。
【請求項１２】
前記第１改変開裂ハーフドメインがアミノ酸残基４９０及び／又はアミノ酸残基５３８における突然変異を含むことを特徴とする請求項１１に記載のヘテロ二量体。
【請求項１３】
前記第２改変開裂ハーフドメインがアミノ酸残基４８６及び／又はアミノ酸残基４９９における突然変異を含むことを特徴とする請求項１１又は１２に記載のヘテロ二量体。
【請求項１４】
亜鉛フィンガー・タンパク質ＤＮＡ結合ドメインをさらに含む請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれか１項又は請求項１４に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１〜８のいずれか１項又は請求項１４に記載のポリペプチドを含む単離された細胞。
【請求項１７】
請求項１５に記載のポリヌクレオチドを含む単離された細胞。
【請求項１８】
注目の領域におけるゲノム細胞クロマチンを開裂する方法であって：
（ａ）注目の領域で第１ヌクレオチド配列を選択する段階；
（ｂ）第１配列に結合するように第１亜鉛フィンガー結合ドメインを改変する段階；
（ｃ）細胞内で第１融合タンパク質を発現させる段階であって、該第１融合タンパク質が改変亜鉛フィンガー結合ドメインと請求項１〜８のいずれか１項に記載の改変開裂ハーフドメインを含んで成る段階；
（ｄ）細胞内で第２融合タンパク質を発現させる段階であって、該第２融合タンパク質が第２亜鉛フィンガー結合ドメインと第２開裂ハーフドメインを含んで成る段階、
を含み、
ここで、第１融合タンパク質が第１ヌクレオチド配列と結合し、第２融合タンパク質が第１ヌクレオチド配列から２〜５０ヌクレオチド離れた位置にある第２ヌクレオチド配列と結合し、第１改変開裂ドメイン及び第２改変開裂ドメインが、注目の領域における細胞クロマチンを開裂するヘテロ二量体を形成することを特徴とする方法。
【請求項１９】
前記第２開裂ハーフドメインが改変開裂ハーフドメインであることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記開裂が、第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列の間で生じることを特徴とする請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記第２亜鉛フィンガー結合ドメインが第２ヌクレオチド配列と結合するように改変されることを特徴とする請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞クロマチンが染色体にあることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞を第３ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと接触させる段階をさらに含む請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の方法であって、ここで第３ヌクレオチド配列は該第１ヌクレオチド配列と相同的であるが同一ではなく；注目の領域における細胞クロマチンの開裂が第１ヌクレオチド配列と第３ヌクレオチド配列の間の相同組み換えを促進し、第１ヌクレオチド配列の変化をもたらすことを特徴とする、方法。
【請求項２４】
前記第３ヌクレオチド配列が、注目の領域に相同的な配列に隣接する注目の領域内に存在しない配列を含有することを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞が細胞周期のＧ２期で停止していることを特徴とする請求項１８〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチドとゲノム工学及び相同組み換えの分野に関する。
【０００２】
本出願は、開示の全体が参照によって本明細書に組み込まれる、2006年5月25日出願の米国特許仮出願No. 60/808,486の優先権を主張する。
【０００３】
連邦援助研究の下でなされた発明に対する権利の表明
該当せず。
【背景技術】
【０００４】
これまでに、ゲノムDNAの標的開裂のための亜鉛フィンガー・ヌクレアーゼ（亜鉛フィンガー・ドメインと開裂ドメインの融合）については記載されている。このような標的開裂事象は、例えば、標的突然変異の誘発、細胞DNA配列の標的欠失の誘発、及び所定の染色体遺伝子座における標的組み換えの促進のために利用できる。例えば、米国特許公報第20030232410号; 第20050208489号; 第20050026157号; 第20050064474号; 第20060188987号; 第20060063231号; 及び国際特許公報第WO 07/014275号を参照のこと。これらの開示は全体が参照によって本明細書に組み込まれている。
【０００５】
特異性を高めるために、それぞれ亜鉛フィンガー結合ドメインと開裂ハーフドメインから成る一対の融合タンパク質を用いて標的ゲノムDNAを開裂することができる。開裂は、開裂ハーフドメイン（複数）が連合して機能的二量体を形成しなければ起こらないので、この配置形態は特異性を増大する。
【０００６】
しかしながら、標的から外れた開裂事象をさらに減らすためには、ヘテロ二量体が形成されたときにのみDNAを開裂する遺伝子組み換えされた開裂ハーフドメインが必要とされる。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、互いに、又は野生型のハーフドメインとともに、ヘテロ二量体を形成する改変開裂ハーフドメインを提供する。これらの改変開裂ハーフドメインを含む複合体（例えば、ヘテロ二量体）及び融合タンパク質もまた記載される。本発明はまた、注目の領域における細胞クロマチンの標的開裂及び／又は細胞における所定の注目の領域での相同組み換えのためにこれらの組成物を用いる方法を提供する。
【０００８】
したがって、ある様態において、改変開裂ハーフドメイン、例えば、表１，図２又は図３に示されているようなFokI開裂ハーフドメインの変異体が本明細書に記載される。改変開裂ハーフドメインは、これらが由来する親野生型開裂ドメインと比較して、１又は複数の突然変異を含む。いくつかの実施形態では、改変開裂ハーフドメインは、FokIから誘導され、野生型のFokI開裂ハーフドメインに対して番号付けされた、483, 486, 487, 490, 499及び／又は538のアミノ酸残基の１つ以上における突然変異を含む。ある実施形態において、改変開裂ハーフドメインは、野生型FokI開裂ドメインから誘導され、野生型のFokIに対して番号付けされたアミノ酸残基490における突然変異を含む。別の実施形態においては、改変開裂ハーフドメインは野生型のFokIに対して番号付けされたアミノ酸残基486における突然変異を含む。
【０００９】
本明細書で記載される改変開裂ハーフドメインは、野生型の開裂ハーフドメインと共に、及び／又は他の改変開裂ハーフドメインと共に、ヘテロ二量体を形成することができる。いくつかの実施形態では、改変開裂ハーフドメインは、位置490（野生型のFokIに対して番号付けされた）における突然変異、例えば野生型Glu(E)残基をLys(K)で置換する突然変異、及び任意に位置538における突然変異、例えばIle(I)をLys(K)で置き換える突然変異を含み、野生型のFokIドメインとともにヘテロ二量体を形成する。他の実施形態において、一方はアミノ酸残基490における突然変異を含み、他方はアミノ酸残基486における突然変異を含む２つの改変開裂ハーフドメインが機能的なヘテロ二量体を形成できる。別の実施形態において、改変開裂ハーフドメインが野生型のFokIに対して番号付けされたアミノ酸残基538における突然変異を含み、アミノ酸残基499（全長の野生型のFokIに対して番号付けされた）における突然変異を含む改変開裂ハーフドメインと機能的なヘテロ二量体を形成できる。さらに別の実施形態において、野生型のFokIに対して番号付けされたアミノ酸残基490及び538における突然変異を含む改変開裂ハーフドメインが提供され、野生型のFokIに対して番号付けされたアミノ酸残基486及び499における突然変異を含む改変開裂ハーフドメインと機能的なヘテロ二量体を形成する。
【００１０】
別の様態において、亜鉛フィンガー結合ドメイン（例えば、改変亜鉛フィンガー結合ドメイン）と本明細書において記載されている改変開裂ハーフドメインを含む融合ポリペプチドが提供される。
【００１１】
別の様態において、本明細書において記載されている改変開裂ハーフドメイン又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００１２】
さらに別の様態において、本明細書において記載されているポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）及び／又はポリヌクレオチドを含む細胞もまた提供される。ある実施形態において、細胞は一対の融合ポリペプチドを含み、その一方は図２Aに示されている開裂ハーフドメインを含む融合ポリペプチドであり、他方は図２Bに示されている開裂ハーフドメインを含む融合ポリペプチドである。
【００１３】
さらに別の様態において、注目の領域における細胞クロマチンの標的開裂の方法；細胞に相同組み換えを発生させる方法；及び／又は疾病を治療する方法が提供される。それらの方法は、本明細書において記載されている一対の融合ポリペプチド（すなわち、一方の融合ポリペプチドは図２Aに示されている改変開裂ハーフドメインを含み、他方の融合ポリペプチドは図２Bに示されている改変開裂ハーフドメインを含む一対の融合ポリペプチドであり、それらの改変開裂ハーフドメインはオブリゲート（obligate）なヘテロ二量体を形成する）を発現させることによって細胞の所定の注目の領域で細胞クロマチンを開裂させる段階を含む。
【００１４】
本明細書において記載された改変開裂ハーフドメインは、所定の注目の領域における細胞クロマチンの標的開裂及び／又は細胞の所定の注目の領域における相同組み換えの方法に用いることができる。細胞は、培養細胞、生物内の細胞、及び治療後に生物に細胞及び／又はその子孫が戻される場合において治療のために生物から取り出された細胞を含む。細胞クロマチンにおける注目の領域は、例えば、ゲノムの配列又はその一部である。組成物は、改変亜鉛フィンガー結合ドメイン（例えば、新しい特異性を有する亜鉛フィンガー結合ドメイン）と上述のような開裂ハーフドメインから成る融合ポリペプチドを含む。
【００１５】
融合タンパク質は細胞内において、例えば、融合タンパク質を細胞に送達すること、又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞に送達することにより発現させることができ、ここでポリヌクレオチドは、DNAである場合、転写され、RNA分子が細胞に送達されるか、又は細胞に送達されたDNA分子の転写物が翻訳されて、融合タンパク質を生成する。細胞にポリヌクレオチド及びポリペプチドを送達する方法は本明細書の他のところで説明される。
【００１６】
したがって、別の様態において、注目の領域で細胞クロマチンを開裂するための方法は、（a）注目の領域における第１配列を選択する段階；（b）第１亜鉛フィンガー結合ドメインを第１配列と結合するように改変する段階；（c）細胞で第１融合タンパク質を発現する段階であって、該第１融合タンパク質は第１亜鉛フィンガー結合ドメインと本明細書において記載されている第１改変開裂ハーフドメインを含む段階；及び（d）細胞内で第２融合タンパク質を発現する段階であって、該第２融合タンパク質は第２亜鉛フィンガー結合ドメインと本明細書において記載されている第２改変開裂ハーフドメインを含む段階を含むことができ、ここで第１融合タンパク質は第１配列と結合し、そして第２融合タンパク質は第１配列から2〜50ヌクレオチドに位置する第２配列と結合し、これにより改変開裂ハーフドメインがヘテロ二量体を形成するように位置し、そのヘテロ二量体が細胞クロマチンを注目の領域で開裂させる。
【００１７】
他の実施形態では、記載されるいずれの方法も、（a）注目の領域で第１及び第２配列を選択する段階、ここで第１及び第２配列は2〜50ヌクレオチド離れている；（b）第１亜鉛フィンガーを第１配列と結合するように改変する段階；（c）第２亜鉛フィンガーを第２配列と結合するように改変する段階；（d）細胞で第１融合タンパク質を発現させる段階、第１融合タンパク質は第１改変亜鉛フィンガー結合ドメインと本明細書において記載されている第開裂ハーフドメインを含む；（e）細胞で第２融合タンパク質を発現させる段階、第２融合タンパク質は第１改変亜鉛フィンガー結合ドメインと本明細書において記載されている本明細書において記載されている第２開裂ハーフドメインを含む；を含み、ここで第１融合タンパク質は第１配列と結合し、そして第２融合タンパク質は第２配列と結合し、これにより第１及び第２改変開裂ハーフドメインがヘテロ二量体を形成し、そのヘテロ二量体が細胞クロマチンを注目の領域で開裂させるように位置させる。いくつかの実施形態では、細胞クロマチンが、融合タンパク質が結合する第１及び第２配列の間の１又は複数の部位で開裂される。
【００１８】
別の実施形態では、注目の領域で細胞クロマチンを開裂させる方法が、（a）注目の領域を選択する段階；（b）第１亜鉛フィンガー結合ドメインを注目の領域における第１配列と結合するように改変する段階；（c）注目の領域における第２配列と結合する第２亜鉛フィンガー結合ドメインを用意する段階、第２配列は第１配列から2〜50ヌクレオチドの位置にある；（d）細胞で第１融合タンパク質を発現させる段階、第１融合タンパク質は第１亜鉛フィンガー結合ドメインとここに記載されているような第１開裂ハーフドメインを含む；及び（e）細胞で第２融合タンパク質を発現させる段階、第２融合タンパク質は第２亜鉛フィンガー結合ドメインとここに記載されているような第２開裂ハーフドメインを含む、を含み、ここで第１融合タンパク質は第１配列と結合し、そして第２融合タンパク質は第２配列と結合し、これにより第１及び第２開裂ハーフドメインがヘテロ二量体を形成し、細胞クロマチンが注目の領域において開裂されるように位置する。
【００１９】
細胞クロマチンのある領域を改変し、例えば標的突然変異を導入するように改変する方法もまた提供される。いくつかの実施形態では、細胞クロマチンを改変する方法は、細胞に所定の部位で細胞クロマチンに二重鎖切断を生成する１又は複数の標的ヌクレアーゼ、及び切断の領域における細胞クロマチンのヌクレオチド配列と相同性を有するドナーのポリヌクレオチドを導入する段階を含む。細胞DNA修復プロセスは、二本鎖切断の存在によって活性化され、ポリヌクレオチドが切断の修復のためのテンプレートとして用いられ、ドナーのヌクレオチド配列の全部又は一部が細胞クロマチンに導入される。こうして細胞クロマチンのある配列が改変され、いくつかの実施形態ではドナーのポリヌクレオチドに存在する配列に変換される。
【００２０】
標的改変は、点突然変異（すなわち、単一塩基対を異なる塩基対に変換）、置換（すなわち、複数の塩基対を同じ長さの異なる配列に変換）、１又は複数の塩基対の挿入、１又は複数の塩基対の欠損、及び前記改変の組み合わせを含むが、これだけに限定されない。
【００２１】
ドナーのポリヌクレオチドは、DNA又はRNAであっても、線状又は円形であっても、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。細胞には、ネイキッド核酸として、１又は複数の送り込み物質（例えば、リポソーム、ポロキサマー）との複合体として、又はアデノウイルス又はアデノ関連ウイルス（AAV）などのウイルス状の送給ビヒクルに含有させて細胞に送達してもよい。ドナー配列は長さが10〜1,000ヌクレオチド（又はその中間の任意の整数値のヌクレオチド）又はそれ以上にわたることもある。
【００２２】
いくつかの実施形態では、相同組み換えの頻度を、細胞周期のG2期で停止させることによって及び／又は相同組み換えに関与する１又は複数の分子（タンパク質、RNA）の発現を活性化することによって及び／又は非相同断端結合に関与するタンパク質の発現又は活性を抑制することによって増加させることができる。
【００２３】
本明細書において記載されるいずれの方法においても、第２亜鉛フィンガー結合ドメインを改変して第２配列と結合するようにすることができる。
【００２４】
さらに、本明細書において記載されるいずれの方法においても、融合タンパク質は単一のポリヌクレオチドでコードすることができる。
【００２５】
前述のいずれの方法においても、細胞クロマチンは、染色体、エピソーム、又は器官ゲノムの中にあるものであってよい。細胞クロマチンは、原核細胞及び真核細胞、真菌細胞、植物細胞、動物細胞、哺乳類細胞、霊長類細胞、及びヒト細胞など、いかなる種類の細胞に存在してもよい。さらに、本明細書において記載されるいずれの方法においても、少なくとも１つの亜鉛フィンガー結合ドメインは、例えば、設計又は選択方法によって、改変される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】野生型FokI開裂ハーフドメインのアミノ酸配列を示す（SED ID NO:1）。配列を変化して改変開裂ハーフドメインを形成できる位置（483, 486, 490, 499及び538）は太字でアンダーラインが引かれている。
【図２Ａ】パネルA及びBは、本明細書において記載されている改変開裂ハーフドメインのアミノ酸配列の例を示す。図２A（SED ID NO:2）は、図２Bに示されている改変開裂ハーフドメインとヘテロ二量体を形成する突然変異した開裂ハーフドメインの配列を示す。野生型と比べて配列が改変された位置（アミノ酸残基486と499に対応する）にアンダーラインが引かれている。
【図２Ｂ】本明細書において記載されている亜鉛フィンガー・ヌクレアーゼ（ZFNs）で用いることができる改変開裂ハーフドメインの別のアミノ酸配列（SED ID NO:3）の例を示す。野生型と比較して配列が改変された位置（アミノ酸残基490と538に対応する）にアンダーラインが引かれている。
【図３】多様なFokI開裂ドメインのアミノ酸配列であって、野生型（SED ID NO:1）、E490K（SED ID NO:6）、Q486E（SED ID NO:7）、E490K:I538K（SED ID NO:3）、及びQ486E:I499L（SED ID NO:2）などを示す。各配列で、位置486, 490, 499, 及び538にアンダーラインが引かれている。野生型との違いは四角で示されている。
【図４】パネルAからCまでは、亜鉛フィンガー結合ドメインと開裂ハーフドメインから成るZFNsの例を示す。図４Aは、典型的な非パリンドロームDNA標的に結合したZFN二量体を示す。各ZFNは亜鉛フィンガー・タンパク質（ZFP）と融合したFokIの開裂ドメインから成り、5又は6 bpのスペーサーによって分離されている“左”又は“右”ハーフ部位を特異的に認識するようにカスタマイズされている。両方のZFNsの結合によってFokIヌクレアーゼ・ドメインの二量体化とDNA開裂が可能になる。例示的なZFN二量体は、それぞれ12塩基対の部位と結合する４つのフィンガーで示されている。  図４Bは、野生型開裂ハーフドメインとのZFNsの共発現がヘテロ二量体（上段）とホモ二量体（中段と下段）の両方を形成する様子を示す。“Lwt”は野生型FokI開裂ハーフドメインに融合した左ZFNを指し、“Rwt”は野生型FokI開裂ハーフドメインに融合した右ZFNを指す。ZFPドメインは４つの隣接する円によって示され、開裂ハーフドメインは、“wt”でラベルされた相補的な多角形で示されている。折れ曲がった矢印は各二量体分子がDNAを開裂する能力を有することを強調している。  図４Cは、本明細書において記載されている改変開裂ハーフドメインとZFNsの共発現がヘテロ二量体（上段）だけを形成し、ホモ二量体（中段と下段）による標的から外れた活動を排除する様子を示す。ラベルL+とR-は、それぞれ、変異体開裂ドメインと融合した“左”及び“右”ZFPsを表す。L+/L+とR-/R-のペアで折れ曲がった矢印がないのは、これらのホモ二量体がDNAを開裂できないことを表している。
【図５】パネルAからFまで、は、オブリゲート・ヘテロ二量体として機能する改変開裂ハーフドメインを含む亜鉛フィンガー・ヌクレアーゼの例を示す。図５Aは、遺伝子修正活性に関して開裂ドメイン変異体をスクリーニングするために用いられるレポーター・システムを示す概略図である。このシステムは、HEK293細胞株を用いており、よく分かっているZFN二量体の開裂標的を含む短いDNA断片で中断されたeGFP遺伝子の組み込まれたコピーを含んでいる（上段）。ZFN二量体はUrnov et al., (2005) Nature 435:646-651に記載されている。開裂と切除によって相同修復（HDR）のための基質が得られるが、これはeGFP配列の一部を担う外部ドナーDNA断片からテンプレートすることができる（中段と下段）。遺伝子修復効率は、緑色蛍光に変換する細胞の比率をカウントすることによってモニターされる。不活性eGDP遺伝子とドナーの間の破線はHDRプロセスを示す。  図５Bは、ドナーだけ又はドナーとZFNsを移入したレポーター細胞のフローサイトメトリー・データを示す。GFPポジティブ細胞の割合は示されているゲートを用いて定量化できる。  図５Cは、野生型FokIの二量体境界の中央領域を示す概略図である。突然変異した残基にはアミノ酸と位置が表示されている。  図５Dは、オブリゲート・ヘテロ二量体として機能するFokI開裂ドメイン変異体を同定するために用いられる反復スクリーニング・プロセスを示す。“Wt”は野生型FokI開裂ドメインを表す。FokI開裂ドメイン変異体は、野生型配列に対する突然変異によって一文字のアミノ酸コードを用いて表される（E=Glu; K=Lys; I=Ile; Q=Gln; L=Leu）。各進展段階でカーブした矢印は、親の開裂ドメインを最良のヘテロ二量体化性質を有する発見された変異体に結びつけている。矢印はまた、二量体界面の各表面を段階的に交互に変質させる戦略を強調している。相対的な遺伝子修正率は、示されている複合体で観測されたGFPポジティブ細胞の割合をwt/wt二量体で得られたGFPポジティブ細胞の割合で規格化して示している。wt/wt二量体で得られた遺伝子修正％は星印で強調されたデータを与えた実験で1.27±0.11であり、残りのデータを与えた実験で0.93±0.09であった。  図５Eは、“＋”及び“―”開裂ドメイン・ヘテロ二量体変異体の間の界面のモデルを示す概略図である。導入された突然変異はボックスで示されている。  図５Fは、GFPレポーター・システムにおける“＋”及び“―”開裂ドメイン変異体の遺伝子修正効率を示すグラフである。“Lwt”は“左”ZFPが野生型FokI開裂ドメインに融合されたものを表し（Urnov et al.,前出、のZEN-L*と同一）、L+とL-は“左”ZFPが“＋”と“―”開裂ドメイン変異体と融合したものを表す。“D.O.”はドナー・プラスミドのみで処理された細胞を表す。変異体はヘテロ二量体として効率的な遺伝子修正を刺激する（L+/R-とL-/R+ vs. Lwt/Rwtを比較せよ）が、自己連関（self-associate）を強制された場合は刺激しない。値は４つの独立な形質移入の平均を表す。エラー・バーは標準偏差を表す。
【図６】パネルAとBは、内在標的におけるFokI開裂ドメイン変異体の遺伝子修正活性を示す。図６Aは、内在遺伝子修正分析を示す概略図である。自生のIL2Rγ遺伝子の開裂と切除（上段と中段）はHDRのための基質を与え、BsrBIの制限部位を担うドナーDNA断片を用いてそれをテンプレートにすることができる（中段と下段）。すると、遺伝子修正効率は、ドナー配列の外側で結合するプライマーを用いて内在遺伝子座をPCR増幅した後にPCR産物をBsrBIで消化することによって定量化される。切除されたIL2Rγ遺伝子とドナーの間の破線はHDRプロセスを表す。図６Bは、記されている構築物を移入されたヒトK562細胞についての内在遺伝子修正分析の結果を示す。“GFP”はpmaxGFP (Amaxa)を表し、その他の構築物の内容は図５Fに記載されているようなものである。“未切断”は未消化PCR産物の位置を示し、“切断”はBsrBI消化によって生成された断片（これはドナー部位がドナーから遺伝子に移された場合にのみ現れる）の位置を示す。可視BsrBIバンドのレーンの下の数字は開裂されたPCR産物のパーセンテージを表す。
【図７】パネルAとBは、in vitroでのDNA開裂によって示されたFokI変異体の優先的ヘテロ二量体活性を示す。図７Aは、標的断片の両DNA鎖を示す（5’から3’への方向の上の鎖と3’から5’への方向の下の鎖）。左（L）及び右（R）ZFN対の12 bpの一次鎖はボックスで囲まれて影がつけられている。図７Bは、記されたZFNの組み合わせによるin vitro標的開裂を示す。開裂産物と未開裂産物の移動が示されている。各レーンの下の数字は開裂されたバンドにおけるDNAのパーセンテージを示す。Lwt/Rwt組み合わせのタンパク質濃度は、L+/R-及びL-/R+組み合わせと同様のレベルのLR標的開裂を与えるように調整された。Lwt/Rwt組み合わせによって３つの標的を開裂する野生型ヌクレアーゼ・ドメインでホモ二量体形成が起こるが（左パネル）、ヘテロ二量体開裂ドメイン変異体を担うZFNsによるLL及びRR標的の開裂はほとんど全く見られない（中央と右のパネル）。図７Cは、図７AとBの場合と同じ実験条件の下で、ただし、各左と右ヌクレアーゼの全濃度を用い、“LR”部位がすべてのサンプルで用いて行われた25のDNA開裂実験の結果を示す（実施例５）。“R”はRヌクレアーゼでの開裂ドメインのタイプを示し、“L”はLヌクレアーゼでの開裂ドメインのタイプを示す。W=野生型；K=E490K；E=Q486E；“+”=E490K;I538K；“-”= Q486EI499L。“未切断”は未切断標的DNAの位置を示し、“切断”は切断標的DNAの位置を示す。開裂DNAパーセントが各サンプルについて計算され、各レーンの下に示されている。
【図８】抗FLAGウエスタンブロットによってモニターされたZFN発現を示す。ZFNsは、Lwt及びL-ZFNsの20残基C-末端タグの存在によってダブレットとして（“FLAG”とラベルされたバンドで）移動する。サイズ標準の移動は左に記されている。TFIIBがローディング・コントロールとしてモニターされた。
【図９】記されている構築物が移入されたK562細胞におけるDNA損傷と遺伝子変質の割合を示す。移入から３日後、各サンプルのDNA損傷が実施例６に記載されているようにモニターされた。観測されたγH2AXポジティブ細胞のパーセンテージが下に記されている。同時に、IL2Rγ遺伝子座における遺伝子変質の割合も、ゲノムDNAの単離、IL2Rγエクソン５の32P-dNTPsを用いたPCR増幅、PCR産物の再アニーリング、SurveyorTMヌクレアーゼによる消化、及び消化産物のポリアクリルアミド・ゲル電気泳動による分析によりモニターされた。得られたゲルの露光結果（exposure）が、導出された遺伝子変質の割合と共に示されている。遺伝子変質の％は開裂された割合から、変質％＝(1-(1-(開裂された割合)1/2)x100という式で導出された。
【００２７】
詳細な説明
改変開裂ハーフドメイン、及び細胞クロマチンの標的開裂と細胞ヌクレオチドの標的改変に有用な、例えば標的開裂とそれに続く非相同断端結合による、又は標的開裂とそれに続く外来ポリヌクレオチド（細胞ヌクレオチド配列と１又は複数の相同領域を含む）とゲノム配列の間の相同組み換えによる改変に有用なそれらの改変開裂ハーフドメインを含む融合ポリペプチドがここに開示される。
【００２８】
改変開裂ハーフドメインの例は、表１並びに図２と３に示されている。図２の変異体は、互いにヘテロ二量体を形成するがホモ二量体を形成しないような２つの突然変異を含む。これによってDNA開裂の特異性が高められる及び／又は意図する複合体の濃度が（ホモ二量体との競合が減る又はなくなるために）高められる。亜鉛フィンガー・ヌクレアーゼ融合タンパク質に組み込まれた場合、これらの変異体は意図した標的で（外来遺伝子座で及び統合GFPレポーター分析によって調べたとき）遺伝子の変質を誘発すると同時に、野生型開裂ハーフドメインに比べてゲノム全体でのDNA開裂を顕著に減らす。
【００２９】
このように、本明細書において記載される改変開裂ハーフドメインは、ホモ二量体機能を顕著に低下させる。同じ変異体の２つのコピーを相互作用するように強制することは遺伝子の変質を減少又は排除するからである。ホモ二量体機能の低下は、in vivoでのZFN開裂の特異性を高めるが、ZFN発現も、所望の標的部位の変質を刺激する能力も低下させない。
【００３０】
概説
本明細書で開示される方法の実施、並びに組成物の調製及び利用は、特に断らない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造及び分析、計算化学、細胞培養、組み換えDNA及び当業者の範囲にある関連分野における通常の方法を用いる。これらの方法は文献に詳細に説明されている。例えば、Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 and 3rd edition, 2001; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 とその周期的更新；シリーズMETHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, 3rd edition, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, “Chromatin” (P.M. Wassarman and Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999;及びMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, “Chromatin Protocols” (P.B. Becker ed.) Humana Press, Totowa, 1999を参照のこと。
【００３１】
定義
“核酸”、“ポリヌクレオチド”、及び“オリゴヌクレオチド”という用語は互換的に用いられ、線状又は円形状の、一本鎖又は二本鎖の形態のデオキシリボ核酸又はリボ核酸を指す。本明細書では、これらの用語はポリマーの長さに関して制限的に解釈されない。これらの用語は、対応する天然ヌクレオチドの既知の類似体、並びに塩基、糖、及び／又はリン酸部分が修飾されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオアート・バックボーン）を包含できる。一般に特定のヌクレオチドの類似体は同じ塩基対形成特異性を有する；すなわち、Aの類似体はTと塩基対を形成する。
【００３２】
“ポリペプチド”、“ペプチド”、及び“タンパク質”という用語はアミノ酸残基のポリマーを示すものとして互換的に用いられる。この用語はまた、１又は複数のアミノ酸が、対応する天然アミノ酸の化学類似体又は修飾された誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
【００３３】
“結合”とは、巨大分子間の（例えば、タンパク質と核酸の間の）配列特異的な非共有結合相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的であれば、結合する相互作用のすべての成分が配列特異的である必要はない（例えば、DNAバックボーンにおけるリン酸残基との接触）。そのような相互作用は一般に10-6M-1以下の解離定数（Kd）によって特徴付けられる。“親和度”とは結合の強さを指す：より大きな結合親和度は小さなKdと相関する。
【００３４】
“結合タンパク質”とは、別の分子に非共有結合で結合できるタンパク質である。結合タンパク質は、例えばDNA分子と（DNA結合タンパク質）、RNA分子と（RNA結合タンパク質）、及び／又はタンパク質分子と（タンパク質結合タンパク質）結合できる。タンパク質結合タンパク質の場合、それ自体と結合する（ホモ二量体、ホモ三量体、等を形成する）ことができる、及び／又は異なるタンパク質（単数又は複数）の１又は複数の分子と結合することができる。結合タンパク質は、２種以上の結合活性を有することができる。例えば、亜鉛フィンガー・タンパク質はDNA結合、RNA結合及びタンパク質結合活性を有する。
【００３５】
“亜鉛フィンガーDNA結合タンパク質”（又は結合ドメイン）とは、亜鉛イオンの配位によって構造が安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１又は複数の亜鉛フィンガーによって配列特異的な仕方でDNAと結合するタンパク質又は大きなタンパク質内のドメインである。亜鉛フィンガーDNA結合タンパク質という用語は、しばしば亜鉛フィンガー・タンパク質又はZFPと略記される。
【００３６】
亜鉛フィンガー結合ドメインを、所定のヌクレオチド配列と結合するように“改変する”ことができる。亜鉛フィンガー・タンパク質を改変する方法の非限定的な例は、設計（design)と選択(selection)である。設計された亜鉛フィンガー・タンパク質は、その設計／構成が主として合理的規準から発生している、天然に見られないタンパク質である。設計の合理的規準としては、既存のZFP設計の情報と結合データを格納しているデータベースの中の情報を処理する置換規則とコンピュータ化されたアルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第6,140,081号; 第6,453,242号; 及び第6,534,261号;を参照のこと。また、WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536及びWO 03/016496も参照のこと。
【００３７】
“選択された”亜鉛フィンガー・タンパク質とは、その生成が主としてファージディスプレー、相互作用トラップ、又はハイブリッド選択などの実験方法から生じる天然に見られないタンパク質である。例えば、US 5,789,538; US 5,925,523; US 6,007,988; US 6,013,453; US 6,200,759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970; WO 01/88197; 及びWO 02/099084を参照のこと。
【００３８】
“配列”という用語は、任意の長さのヌクレオチドの配列を指し、それはDNAでもRNAでもよく；線状、円形、又は枝分かれしたものであってもよく、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。“ドナー配列”という用語は、ゲノムの挿入されたヌクレオチド配列を指す。ドナー配列はどんな長さであってもよく、例えば、長さは2から10,000ヌクレオチドの間（又はその間の又はその上の任意の整数値）、好ましくは長さは約100から1,000ヌクレオチドの間（又はその間の任意の整数値）、さらに好ましくは長さは約200から500ヌクレオチドの間である。
【００３９】
“相同的、非同一的配列”とは、第１配列が、第２配列に対してある程度の配列同一性を有するが、第２配列と同一ではないものを指す。例えば、ある突然変異種の野生型配列を含むポリヌクレオチドは突然変異種の配列と相同であり非同一である。いくつかの実施形態では、２つの配列の間の相同性の度合は、正常な細胞メカニズムを利用してそれらの間の相同組み換えを可能にするのに十分である。２つの相同的で非同一の配列は、どのような長さであってもよく、その非相同性の度合は単一ヌクレオチドというほど小さいことも（例えば、標的相同組み換えによってゲノムの点突然変異を修正する場合）、10キロベースというほど大きいことも（例えば、染色体の所定の異所性（ectopic）部位に遺伝子を挿入する場合）ある。相同的で非同一の配列を含む２つのポリヌクレオチドは同じ長さである必要はない。例えば、20から10,000ヌクレオチド又はヌクレオチド対までの外来ポリヌクレオチド（すなわち、ドナー・ポリヌクレオチド）を用いることができる。
【００４０】
核酸及びアミノ酸の配列同一性を決定する方法は当業者には既知である。通常、このような方法は、ある遺伝子のmRNAのヌクレオチド配列を決定する及び／又はこれによりコードされるアミノ酸配列を決定する段階、及びこれらの配列を第２ヌクレオチド又はアミノ酸配列と比較する段階を含む。ゲノムの配列もこのような様式で決定し、比較することができる。一般に、同一とは２つのポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列が、それぞれ、ヌクレオチド対ヌクレオチド又はアミノ酸対アミノ酸で正確に対応することを指す。２つ以上の配列（ポリヌクレオチド又はアミノ酸）は、パーセント同一性を決定して比較することができる。核酸配列であれアミノ酸配列であれ、２つの配列のパーセント同一性とは、アライメントされた２つの配列の間の正確に一致する数を短い方の配列の長さで割って100を乗じたものである。核酸配列の近似的なアライメントは、Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)の局所相同性アルゴリズムによって与えられる。このアルゴリズムは、Dayoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M.O. Dayoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USAによって開発されGribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986) によって規格化されたスコアリング・マトリクスを用いてアミノ酸配列に適用できる。このアルゴリズムを実施して配列のパーセント同一性を決定した例がGenetics Computer Group (Madison, WI)によって“BestFit”ユティリティ・アプリケーションに示されている。この方法のデフォルト・パラメータは、Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual, Version 8 (1995)に記載されている（Genetics Computer Group, Madison, WIから入手できる）。本発明の文脈においてパーセント同一性を確立するのに好ましい方法は、John F. Collins and Shane S. Sturrokによって開発されIntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA) によって頒布されているUniversity of Edinburghが版権を持つプログラムのMPSRCHパッケージを用いることである。このパッケージの組からSmith-Watermanアルゴリズムを用い、スコアリング表でデフォルト・パラメータ（例えば、ギャップオープン・ペナルティ12、ギャップ延長ペネルティ１，及びギャップ6）を用いることができる。発生されたデータから、“Match”値が配列同一性を反映している。配列の間のパーセント同一性又は相似性を計算するためのその他の適当なプログラムは一般に当業者には公知である、例えば、別のアライメントプログラムは、BLASTをデフォルト・パラメータで用いることである。例えば、BLASTNとBLASTPを次のデフォルト・パラメータで用いることができる：遺伝コード＝標準；フィルタ＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝60；expect=10；Matrix=BLOSUM62；Description=50配列；sort by=HIGH SCORE；データベース＝冗長性なし；GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translation +Swiss protein + Spupdate + PIR.  これらのプログラムについての詳細は以下のインターネット・アドレスにおいて見ることができる：http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST.  本明細書において記載される配列に関しては、配列同一性の望ましい度合の範囲は約80%から100%及びその間の任意の整数値である。通常、配列の間のパーセント同一性は、少なくとも70-75%、好ましくは80-82%、さらに好ましくは85-90%、もっと好ましくは92%、さらにもっと好ましくは95%、最も好ましくは98%の配列同���性である。
【００４１】
あるいはまた、このポリヌクレオチドの間の配列相似性の度合は、相同領域の間でデュプレックスを形成できる条件の下でポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行い、続いて一本鎖特異的ヌクレアーゼ（単数又は複数）による消化、消化された断片のサイズ決定を行うことにより決定できる。２つの核酸又は２つのポリペプチド配列は、それらの配列が、分子のある一定長さにわたって、上述の方法で決定して少なくとも約70-75%、好ましくは80-82%、さらに好ましくは85-90%、より好ましくは92%、さらにより好ましくは95%、最も好ましくは98%の配列同一性を示すとき、２つは互いに実質的に相同である。ここで用いられる場合、実質的に相同であるとは、所定のDNA又はポリペプチド配列との完全な同一性を示す配列も指す。実質的に相同なDNA配列は、例えば、この特定配列に関して定められたストリンジェントな条件の下でのSouthernハイブリダイゼーション実験で同定できる。適当なハイブリダイゼーション条件を定めることは当業者の能力の範囲内にある。例えば、Sambrook et al., 前出； Nucl. Acid Hybridization: A Practical Approach, B.D. Hames and S.I. Higgins ed. (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press を参照のこと。
【００４２】
２つの核酸断片の選択的ハイブリダイゼーションは次のように決定できる。２つの核酸分子の間の配列同一性の度合がそれらの分子の間のハイブリダイゼーション事象の効率と強さに影響する。部分的に同一な核酸配列は標的との完全に同一な配列のハイブリダイゼーションを少なくとも部分的に阻害する。完全に同一な配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当業者に公知のハイブリダイゼーション分析（例えば、サザン（DNA）ブロット、ノーザン（RNA）ブロット、溶液ハイブリダイゼーション、など。Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Ed. (1989) Cold Spring Harbor, N.Y., を参照のこと）を用いて評価できる。そのような分析は様々な度合の選択性を用いて、例えば低から高ストリンジェンシーまで変化する条件を用いて行うことができる。低ストリンジェンシーの条件を用いた場合、非特異的結合の存在は、部分的な度合の配列同一性さえもない二次プローブを用いて（例えば、標的分子との配列同一性が約30%より低いプローブを用いて）、非特異的結合が存在しない場合には二次プローブが標的とハイブリダイズしないということで評価することができる。
【００４３】
ハイブリダイゼーションに基づく検出システムを用いる場合、基準核酸配列と相補的な核酸プローブが選択され、適当な条件を選択してプローブと基準配列が選択的に互いにハイブリダイズし、すなわち、結合してデュプレックス分子を形成する。弱ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下で基準配列に選択的にハイブリダイズできる核酸分子は、通常、選ばれた核酸プローブの配列と約70%の配列同一性を有する長さが少なくとも約10-14ヌクレオチドの標的核酸配列の検出を可能にする条件の下でハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、通常、選ばれた核酸プローブの配列と約90-95%より大きな配列同一性を有する長さが少なくとも約10-14ヌクレオチドの標的核酸配列の検出を可能にする。プローブと基準配列が特定の度合の配列同一性を有する場合のプローブ／基準配列・ハイブリダイゼーションに用いることができるハイブリダイゼーション条件は、当業者に公知の仕方で決定できる（例えば、Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, B.D. Hames and S.J. Higgins ed., (1985) Oxford; Washingtton, DC; IRL Press を参照のこと）。
【００４４】
ハイブリダイゼーションのための条件は当業者には周知である。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーとは、ミスマッチのヌクレオチドを含むハイブリッドの形成に対してハイブリダイゼーション条件が不利になる度合を指し、ストリンジェンシーが高いほどミスマッチのハイブリッドが許容されにくくなる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する因子は当業者には周知であり、温度、pH、イオン強度、及び有機溶媒、例えばホルムアミドやジメチルスルフォキシドなどの濃度などである。当業者に既知のように、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度が高いほど、イオン強度が低いほど、溶媒濃度が低いほど高くなる。
【００４５】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件に関して、ある特定のストリンジェンシーを確立するために、例えば、以下のような因子：すなわち、配列の長さと性質、様々な配列の塩基組成、塩やその他のハイブリダイゼーション溶液成分の濃度、ハーン溶液におけるブロッキング物質の存在と非存在（例えば、硫酸デキストラン、及びポリエチレン・グリコール）、ハイブリダイゼーション反応の温度と時間パラメーターを変えることによって、並びに洗浄条件を変えることによって、多数の等価な条件を採用することができることは当業者には周知である。ハイブリダイゼーション条件の特定の組の選択は、当業者に取って標準的である方法に従って行われる（例えば、Sambrook et al., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989), Cold Spring Harbor, N.Y. を参照のこと）。
【００４６】
“組み換え”とは、２つのポリヌクレオチドの間の遺伝情報の交換のプロセスを指す。本明細書では“相同組み換え（HR）”は、例えば、細胞における二本鎖切断の修復の間に行われるこのような交換の特殊な形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列の相同性を必要とし、“ドナー”分子を用いて“標的”分子（すなわち、二本鎖切断が起こった分子）の修復のテンプレートとし、ドナーから標的への遺伝情報の伝達につながるために、“非クロスオーバー遺伝子変換”、又は“ショートトラクト（short tract）遺伝子変換”と様々な言い方で知られている。特定の理論に束縛されることは望まないが、このような伝達は、切断したDNAトドナーの間で形成されるヘテロ・デュプレックスDNAのミスマッチの修正、及び／又はドナーを用いて遺伝情報を再合成し、それが標的の一部になる“合成依存的な鎖のアニーリング”、及び／又は関連したプロセス、が関わっている可能性がある。そのような特殊なHRは、しばしば、ドナーのポリヌクレオチドの配列の一部又は全部が標的のポリヌクレオチドに組み込まれる形で標的分子の配列の改変を生ずる。
【００４７】
“開裂”とは、DNA分子の共有結合バックボーンの切断を指す。開裂は、ホスフォジエステル結合の酵素又は化学的加水分解など、それだけに限定されないが、様々な方法で開始させることができる。一本鎖の開裂も二本鎖の開裂も可能であり、二本鎖の開裂は２つの異なる一本鎖開裂事象の結果として起こり得る。DNAの開裂は、鈍端（blunt end）又は付着末端（staggered end）を生ずる。いくつかの実施形態では、標的二本鎖DNA開裂のために融合ポリペプチドが用いられる。
【００４８】
“開裂ハーフドメイン”とは、ポリペプチド配列であって、第２ポリペプチド（同一の又は異なる）と一緒に開裂活性（好ましくは二本鎖開裂活性）を有する複合体を形成するものである。“第１及び第２開裂ハーフドメイン”；“＋及び−開裂ハーフドメイン”及び“右及び左開裂ハーフドメイン”という用語は、二量体を作る開裂ハーフドメインの対を指すものとして互換的に用いられる。
【００４９】
“改変開裂ハーフドメイン”とは、別の開裂ハーフドメイン（例えば、別の改変開裂ハーフドメイン）と共にオブリゲートなヘテロ二量体を形成するように変改された開裂ハーフドメインである。
【００５０】
“クロマチン”とは、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主にDNA、及びタンパク質、ヒストン及び非ヒストン染色体タンパク質、を含む。真核細胞クロマチンの多くはヌクレオソ−ムの形で存在し、ヌクレオソームのコアは約150塩基対のDNAを、ヒストンH2A, H2B, H3及びH4のそれぞれ２つを含むオクタマーが結びついた形で含み；リンカーDNA（生物によって長さが異なる）がヌクレオソームのコアの間に延びている。ヒストンH1の分子が一般にリンカーDNAに結びついている。本明細書では、“クロマチン”という用語は、原核細胞と真核細胞を含むすべてのタイプの核タンパク質を包含するものとする。細胞クロマチンは染色体クロマチンとエピソーム・クロマチンの両方を含む。
【００５１】
“染色体”とは、細胞のゲノムの全部又は一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムはしばしばその核型によって特徴付けられる。これは細胞のゲノムを構成するすべての染色体の集まりである。細胞のゲノムは１又は複数の染色体を含むことができる。
【００５２】
“エピソーム”とは、複製される核酸、核タンパク質複合体、又はその他の核酸を含む構造であって、細胞の染色体核型の部分ではないものである。エピソームの例は、プラスミド及びいくつかのウイルス・ゲノムである。
【００５３】
“到達可能領域”とは、細胞クロマチンの部位であって、核酸に存在する標的部位がその標的を認識する外来分子によって結合できる部位である。特定の理論によって束縛されたくはないが、到達可能領域はヌクレオソーム構造にパッケージされていない領域であると考えられる。到達可能領域のはっきりとした構造は、しばしば、化学的及び酵素プローブに対する、例えば、ヌクレアーゼに対する感受性によって検出できる。
【００５４】
“標的部位”又は“標的配列”とは、結合分子が結合するための十分条件が存在する場合に結合する核酸の部分を画定する核酸配列である。例えば、配列5’-GAATTC-3’はEco RI制限エンドヌクレアーゼの標的部位である。
【００５５】
“外来”分子とは、通常は細胞に存在しないが、１又は複数の遺伝的、生化学的、又はその他の方法によって細胞に導入できる分子である。“細胞に通常存在”するかどうかは、細胞の特定の発生段階及び環境条件に応じて決定される。したがって、例えば、筋の胚発生のときにだけ存在する分子は、成熟した筋細胞に関しては外来分子である。同様に、ヒートショックによって誘発される分子は、非ヒートショック細胞に関しては外来分子である。外来分子は、例えば、機能不全の内生分子の機能するバージョン、又は通常は機能する内生分子の機能不全バージョンであってもよい。
【００５６】
外来分子は、とりわけ、コンビナトリアル化学プロセスで生成されるような小さな分子であることも、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、ポリサッカライド、上記分子の修飾された誘導体、などの巨大分子、又は上記分子の１つ以上を含む複合体、であることもある。核酸は、DNAとRNAを含み、一本鎖でも二本鎖でもよく；線状、枝分かれ、又は円形であってもよく；長さも任意である。核酸は、デュプレックスを形成できるもの、並びにトリプレックスを形成する核酸も含む。例えば、米国特許Nos. 5,176,996及び5,422,251を参照のこと。タンパク質は、DNA結合タンパク質、転写因子、クロマチン・リモデリング因子、メチル化DNA結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、フォスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイラーゼ、及びヘリカーゼ、などを含むがそれだけに限定されない。
【００５７】
外来分子は、内生分子と同じタイプの分子、例えば外来タンパク質又は核酸、であることもある。例えば、外来核酸は、感染するウイルス・ゲノム、プラスミド、又は細胞に導入されたエピソーム、又は通常細胞に存在しない染色体を含む。細胞に外来分子を導入する方法は当業者に公知であり、脂質媒介移入（すなわち、リポソーム、中性及びカチオン脂質を含む）、電気穿孔法、直接注入、細胞融合、粒子砲撃、リン酸カルシウム共沈法、DEAEデキストラン媒介移入、ウイルス・ベクター媒介移入法、などがあるが、それだけに限定されない。
【００５８】
対照的に、“内生”分子とは特定細胞に特定発生段階で特定環境の下で通常存在する分子である。例えば、内生的な核酸は、染色体、ミトコンドリアのゲノム、葉緑体又はその他の小器官、又は天然のエピソーム核酸などを含む。その他の内生的な分子は、タンパク質、例えば、転写因子及び酵素を含む。
【００５９】
“融合”分子とは、２つ以上のサブユニット分子が、好ましくは共有結合によって結合している分子である。サブユニット分子は同じ化学タイプの分子であっても異なる化学タイプの分子であってもよい。第１タイプの融合分子の例としては、融合タンパク質（例えば、ZFP DNA結合ドメインと開裂ドメインの融合）及び融合核酸（例えば、前記の融合タンパク質をコードする核酸）などがあるが、それだけに限定されない。第２タイプの融合分子の例としては、トリプレックスを形成する核酸とポリペプチドの融合、及び副溝結合剤と核酸の融合などがあるが、それだけに限定されない。
【００６０】
細胞における融合分子タンパク質の発現は、細胞に融合タンパク質を送り込むことによって、又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞に送り込むことによって生じ、ポリヌクレオチドが転写され、それが翻訳されることによって融合タンパク質が生成される。細胞におけるタンパク質の発現には、トランススプライシング、ポリペプチド開裂、及びポリペプチド結紮も関与する。細胞にポリヌクレオチド及びポリペプチドを送り込む方法は本明細書の他のところで説明される。
【００６１】
本明細書において、“遺伝子”とは、遺伝子産物をコードするDNA領域（以下を参照のこと）並びに遺伝子産物の産生を調節するDNA領域を含む、そのような調節配列がコーディング及び／又は転写された配列と隣接しているかどうかに関わらない。したがって、遺伝子は、プロモータ配列、ターミネータ、翻訳調節配列、例えば、リボソーム結合部位及び内部リボソーム・エントリー部位、エンハンサ、サイレンサ、インシュレータ、境界エレメント、複製始点、マトリクス付着部位、遺伝子座制御領域などを含むが、それだけに限定されない。
【００６２】
“遺伝子発現”とは、遺伝子に含まれる情報を遺伝子産物に変換することを指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接の転写産物（例えば、mRNA、tRNA、rRNA、アンチセンスRNA、リボザイム、構造RNA、及び他のタイプのRNA）、又はmRNAの翻訳によって生成されたタンパク質である。遺伝子産物は、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、及び編集なそのプロセスで修飾されたRNA、及びメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ADP-リボシル化、ミリスチル化、及びグリコシル化などによって修飾されたタンパク質を含む。
【００６３】
遺伝子発現の“調節”とは、遺伝子の活性の変化を指す。発現の調節は遺伝子の活性化及び遺伝子の抑圧を含むが、それだけに限定されない。
【００６４】
“真核”細胞は、真菌細胞（酵母など）、植物細胞、動物細胞、哺乳類細胞及びヒト細胞を含むが、それだけに限定されない。
【００６５】
“注目の領域”とは、細胞クロマチンの何らかの領域、例えば、遺伝子又は遺伝子内部の又は隣接する非コーディング配列であって、外来分子を結合することを望む領域である。結合は、標的DNA開裂及び／又は標的組み換えのためであるかも知れない。注目の領域は、例えば、染色体、エピソーム、小器官ゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）、又は感染ウイルスのゲノム、などである。注目の領域は、遺伝子のコーディング領域内、転写された非コーディング領域、例えば、リーダー配列、トレーラー配列、又はイントロン、内、又は非転写領域内、コーディング領域の上流又は下流、にある。注目の領域は、単一のヌクレオチド対という小さなものから、長さが2,000ヌクレオチド対というものまで、又はその間の任意の整数値のヌクレオチド対であってよい。
【００６６】
“作動的リンケージ”及び“作動的に結合された”（又は“作動可能に結合された”）は、２つ以上の成分（配列エレメントなど）の並置に関して互換的に用いられ、通常両成分が機能し、少なくとも１つの成分が他の成分の少なくとも１つに作用する機能を媒介する可能性を許すようにそれらの成分が配置されるものである。例をあげると、プロモータなどの転写調節配列は、その転写調節配列が１又は複数の転写調節因子の存在又は非存在に応じてコーディング配列の転写のレベルをコントロールする場合、そのコーディング配列と作動的に結合している。転写調節配列は、一般に、コーディング配列とcisで作動的に結合しているが、そのすぐ隣にある必要はない。例えば、エンハンサはコーディング配列と作動的に結合しているが、それらは隣接していない。
【００６７】
融合ポリペプチドに関して、“作動的に結合された”とは、成分の各々が、他方の成分に対して、結合していない場合と同じ機能をリンケージで遂行することを指す。例えば、ZFP DNA-結合ドメインが開裂ドメインと融合している融合ポリペプチドに関して、その融合ポリペプチドにおいて、ZFP DNA-結合ドメイン部分が標的部位及び／又は結合部位と結合することができ、開裂ドメインが標的部位の付近でDNAを開裂できる場合、ZFP DNA-結合ドメインと開裂ドメインは作動的に結合している。
【００６８】
タンパク質、ポリペプチド、又は核酸の“機能的断片”とは、配列が全長のタンパク質、ポリペプチド、又は核酸と同一ではないが、全長のタンパク質、ポリペプチド、又は核酸と同じ機能を保持しているタンパク質、ポリペプチド、又は核酸である。機能的断片は対応する原生分子より多い、少ない、又は同じ数の残基を有する、及び／又は１又は複数のアミノ酸又はヌクレオチド置換を含む。ある核酸の機能（例えば、コーディング機能、別の核酸とハイブリダイズする能力）を決定する方法は当業者には周知である。例えば、ポリペプチドのDNA結合機能は、例えば、フィルタ結合、電気泳動移動度シフト、又は免疫沈澱分析によって決定できる。DNA開裂はゲル電気泳動で分析できる。Ausubel et al., 前出、を参照のこと。タンパク質が別のタンパク質と相互作用する能力は、例えば、免疫共沈澱法、２ハイブリッド・アッセイ、又は遺伝的及び生化学的な相補性試験によって決定できる。例えば、Fields et al., (1989) Nature 340 :245-246; 米国特許第5,585,245号及びPCT WO 98/44350を参照のこと。
【００６９】
改変開裂ハーフドメイン
ホモ二量体化を最小にする又は阻止する改変開裂ハーフドメインは（二量体化ドメイン突然変異とも称される）、例えば、全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許公報第20050064474号及び第20060188987号に記載されている。FokIの位置446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 488, 500, 531, 534, 537, 及び538におけるアミノ酸残基はすべてFokI開裂ハーフドメインの二量体化に影響する標的である。FokIタンパク質のアミノ酸残基の番号付けは、Wah et al., (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95:10564-10569に従う。
【００７０】
本明細書では、オブリゲート・ヘテロ二量体を形成するFokIの改変開裂ハーフドメインが記載される。突然変異種の開裂ハーフドメインの例が表１に示されている。いくつかの実施形態では、開裂ハーフドメインはFokIの位置490と538におけるアミノ酸残基のひとつ又は両方で突然変異を含む。別の実施形態では、第２開裂ハーフドメインがアミノ酸残基486と499の１つ以上で突然変異を含む。図１−３；実施例を参照のこと。
【００７１】
ある実施形態では、図２と３に示されているように、490における突然変異がGlu(E)をLys(K)で置き換え；538における突然変異がIle(I)をLys(K)で置き換え；486における突然変異がGln(Q)をGlu(E)で置き換え；499における突然変異がIle(I)をLys(K)で置き換える。具体的に言うと、本明細書において記載される改変開裂ハーフドメインは、ひとつの開裂ハーフドメインで位置490(E→K)と538(I→K)を突然変異させて“E490K:I538K”と表される改変開裂ハーフドメインを生成し、別の開裂ハーフドメインで位置486(Q→E)と499(I→L)を突然変異させて“Q486E:I499L”と表される改変開裂ハーフドメインを生成することによって調製された。本明細書において記載される改変開裂ハーフドメインは、異常な開裂が最小又は排除されるオブリゲート・ヘテロ二量体突然変異種である。実施例を参照のこと。
【００７２】
本明細書において記載される改変開裂ハーフドメインは任意の適当な方法によって調製できる、例えば、米国特許公報No. 20050064474の実施例５及び国際特許公開WO 07/014275の実施例５と３８に記載されているような野生型開裂ハーフドメイン（FokI）の部位特異的変異処理によって調製できる。
【００７３】
融合タンパク質
本明細書において記載される改変開裂ハーフドメインは、ZFPsと共に任意の細胞における特定の部位を標的とした融合タンパク質で有利に利用される。
【００７４】
標的部位の選択；ZFPs及び融合タンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）を設計し構成する方法、は当業者に公知であり、本明細書に全体が参照によって組み込まれる米国特許公報第20050064474号に詳細に記載されている。
【００７５】
本明細書において記載されるZFNsは任意の適当な方法で標的細胞に送り込むことができる。亜鉛フィンガーを含むタンパク質を送り込む方法は、例えば、米国特許第6,453,242号; 第6,503,717号; 第6,534,261号; 第6,599,692号; 第6,607,882号; 第6,689,558号; 第6,824,978号; 第6,933,113号; 第6,979,539号; 第7,013,219号; 及び第7,163,824号に記載されており、すべての開示は参照によって全体が本明細書に組み込まれる。
【００７６】
本明細書において記載されるZFNsも、１又は複数のZFNsをコードする配列を含むベクターを用いて送り込むことができる。プラスミド・ベクター、レトロウイルス・ベクター、レンチウイルス・ベクター、アデノウイルス・ベクター、ポックス・ウイルス・ベクター、ヘルペスウイルス・ベクター及びアデノ随伴ウイルス・ベクター、など、それだけに限定されず、任意のベクター・システムを用いることができる。米国特許第6,534,261号; 第6,607,882号; 第6,824,978号; 第6,933,113号; 第6,979,539号; 第7,013,219号; 及び第7,163,824号を参照のこと、これらは参照によって全体がここに組み込まれる。
【００７７】
通常のウイルス及び非ウイルス・ベースの一般に移入方法を用いて、細胞（例えば、哺乳類細胞）及び標的組織に改変開裂ドメインを含むZFNsをコードした核酸を導入することができる。そのような方法は、また、核酸をin vitroで細胞に投与するのにも用いることができる。いくつかの実施形態では、ZFNsをコードした核酸が、in vivo又はex vivo遺伝子治療のために投与される。非ウイルス・ベクター移入システムとしては、DNAプラスミド、ネイキッド核酸、及びリポソームやポロキサマーなどの移入ビヒクルとの複合体にした核酸などがある。ウイルス・ベクター移入システムとしては、DNA及びRNAウイルスがあり、これらは細胞への移入後にエピソーム又は統合ゲノムを有する。遺伝子治療手順の概説としては、Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11;211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11;162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11;167-1175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bohm (eds.) (1995); 及びYu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994) を参照のこと。
【００７８】
ZFNsをコードした核酸の非ウイルス移入方法としては、電気穿孔法、リポフェクション、直接注入、バイオリティック（biolistics）、ビロソーム（virosomes）、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン又は脂質：核酸接合体、ネイキッドDNA、人工ビリオン、及びDNA摂取促進物質などがある。例えばSonitron 2000 システム（Rich-Mar）を用いる超音波遺伝子導入法も核酸の移入に使用できる。
【００７９】
その他の核酸移入システムの例としては、Amaxa Biosystems (Cologne, Germany), Maxcyte, Inc. (Rockville, Maryland), 及びBTX Molecular Delivery Systems (Holliston, MA) が提供しているものがある。
【００８０】
リポフェクション（lipofection）は、例えば、米国特許No. 5,049,386; 4,946,787; 4,897,355に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、TransfectamTM及びLipofectinTM）。効率的なポリヌクレオチドの受容体認識リポフェクションに適するカチオン及び中性脂質としては、Felgner, WO 91/17424, WO91/16024に記載されているものがある。移入は細胞へ（ex vivo投与）又は標的組織へ（in vivo投与）行うことができる。
【００８１】
免疫脂質複合体など標的リポソームを含む脂質：核酸複合体の調製は当業者に周知である（例えば、Crystal, Science 270:404-410 (1995): Blases et al., Cncer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); 米国特許第4,186,183号; 第4,217,344号; 第4,235,871号; 第4,261975号; 第4,485,054号; 第4,501,728号; 第4,774,085号; 第4,837,028号; 及び第4,946,787号 を参照のこと）。
【００８２】
本明細書において記載されている改変開裂ハーフドメインを含むZFNsをコードする核酸を移入するためのRNA又はDNAウイルスに基づくシステムの使用は、体の特定細胞を標的としてウイルスを注入しウイルスの積み荷を核に運ぶ高度に進んだプロセスを利用するものである。ウイルス・ベクターは、直接患者に投与する（in vivo）ことも、in vitroで細胞を処理して、変性した細胞を患者に投与する（ex vivo）こともできる。ZFNsの移入のための通常のウイルスに基づくシステムは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクチン及びヘルペス・シンプレックス・ウイルス・ベクターを遺伝子の移入のために用いるが、それだけに限定されない。ホスト・ゲノムへの組み込みはレトロウイルス、レンチウイルス、及びアデノ随伴ウイルス遺伝子移入方法で可能であり、しばしば、挿入された導入遺伝子の長期発現を生ずる。さらに、多くの異なる細胞タイプ及び標的組織で高い移入効率が観測されている。
【００８３】
レトロウイルスの向性（trpism）は、外被タンパク質を組み込み、標的細胞の可能な標的集団を拡げることによって変えることができる。レンチウイルス・ベクターは非分裂細胞に導入又は感染できるレトロウイルス・ベクターであり、通常、高いウイルス力価を与える。レトロウイルス遺伝子移入システムの選択は標的組織に依存する。レトロウイルス・ベクターは、6-10 kbまでの異物配列をパッケージする能力がありcis-作用する長い末端反復配列を含む。最小のcis-作用するLTRsがベクターの複製とパッケージングに十分であり、それを用いて治療遺伝子を標的細胞に組み込んで恒久的な導入遺伝子の発現が可能になる。広く用いられているレトロウイルス・ベクターは、マウス白血病ウイルス（MuLV）、テナガザル白血病ウイルス（GaLV）、サル免疫不全ウイルス（SIV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、及びこれらの組み合わせである（例えば、Buchscher et al., J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann et al., J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol. 63:2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); PCT/US 94/05700を参照のこと）。
【００８４】
ZFP融合タンパク質の一時的発現が好ましい用途では、アデノウイルスに基づくシステムを用いることができる。アデノウイルスに基づくベクターは、多くの細胞タイプで非常に高い導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。このようなベクターで、高い力価と高レベルの発現が得られている。このベクターは比較的簡単なシステムで大量に生産できる。アデノ随伴イルス（“AAV”）ベクターも細胞に標的核酸を導入するために、例えば、核酸とペプチドのin vitro生産、及びin vivo及びex vivo遺伝子治療手順で用いられる（例えば、West et al., Virology 160:38-47 (1987); U.S. Patent No. 4,797,368; WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994)を参照のこと）。組み換えAAVベクターの構成はいくつかの刊行物に記載されている、すなわち、U.S. Patent No. 5,173,414; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81: 6466-6470 (1984); 及びSamulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989) などである。
【００８５】
現在、臨床試験における遺伝子移入では少なくとも６つのウイルス・ベクター方法が利用できる。それらは、ヘルパー細胞株に挿入された遺伝子によって欠陥ベクターを補って形質移入物質を生成する方法を用いている。
【００８６】
pLASNとMFG-Sは、臨床試験で用いられたレトロウイルス・ベクターの例である（Dunbar et al., Blood 85:3048-305 (1995); Kohn et al., Nat. Med. 1:1017-102 (1995); Malech et al., PNAS 94:22 12133-12138 (1997)）。PA317/pLASNは遺伝子治療の試験で用いられた最初の治療用ベクターであった（Blaese et al., Science 270:475-480 (1995)）。MFG-Sパッケージされたベクターで50%以上の導入効率が観測されている（Ellem et al., Immunol. Immunother. 44(1):10-20 (1997); Dranoff et al., Hum. Gene Ther. 1:111-2 (1997)）。
【００８７】
組み換えアデノ随伴ウイルス・ベクター（rAAV）は、欠陥があり非病原性のパルボウイルス・アデノ随伴２型ウイルスに基づく期待される別の遺伝子移入システムである。すべてのベクターは、導入遺伝子発現カセットに横付けしているAAV 145 bpの逆向き反復配列のみを保持するプラスミドから得られる。効率的な遺伝子導入と導入された細胞のゲノムへの組み込みによる安定した導入遺伝子の移入がこのベクター・システムの重要な特徴である（Wagner et al., Lancet 351:9117 1702-3 (1998), Kearns et al., Gene Ther. 9:748-55 (1996)）。
【００８８】
複製欠陥組み換えアデノウイルス・ベクター（Ad）を高い力価で生産し、いくつかの異なる細胞タイプに容易に感染させることができる。ほとんどのアデノウイルスは、導入遺伝子がAd E1a, E1b, 及び／又はE3遺伝子に置き換わるように改変される；その後、複製に欠陥があるベクターはヒト293細胞で増殖され、それが欠損した遺伝子機能をtransで供給する。Adベクターは、肝臓、腎臓及び筋に見られる分裂しない、分化した多数のタイプのin vivoの組織に導入できる。通常のAdベクターは大きな積載容量を有する。臨床試験におけるAdベクターの使用の一例は、筋肉注射による抗腫瘍免疫化のためのポリヌクレオチド治療に関わっている（Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-9 (1998)）。臨床試験における遺伝子移入のためのアデノウイルス・ベクター使用の別の例は、Rosenecker et al., Infection 24:1 5-10 (1996); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 9:7 1083-1089 (1998); Welsh et al., Hum. Gene Ther. 2:205-18 (1995); Alvarez et al., Hum. Gene Ther. 5:597-613 (1997); Topf et al., Gene Ther. 5:507-513 (1998); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7: 1083-1089 (1998) などである。
【００８９】
いくつかの実施形態では、ベクターはアデノウイルス・ベクターである。したがって、ここでは細胞に非相同配列（例えば、亜鉛フィンガー・ヌクレアーゼ（ZFNs））を導入するためのアデノウイルス（Ad）ベクターについて説明する。
【００９０】
この用途で用いることができるAdベクターの非限定例は、組み換え（E1-欠損、など）、条件付き複製可能（腫瘍崩壊性、など）、及び／又は複製可能Adベクターであって、ヒト又は非ヒト血清型から得られるもの（例えば、Ad5, Ad11, Ad35,又はブタ・アデノウイルス-3）；及び／又はキメラAdベクター（Ad5/35など）、又は組み換えファイバー（例えば、ノブ又はシャフト）タンパク質（ノブ・タンパク質のHIループ内のペプチド挿入物など）によって向性を変えたAdベクター、などである。また、“ガットレス”Adベクター、例えば、すべてのアデノウイルス遺伝子が除去されて免疫原性を減らしDNAペイロードのサイズを増大したAdベクターも有用である。これは、例えば、ZFNsをコードする配列とドナー・配列の同時移入を可能にする。このようなガットレス・ベクターは、ドナー配列が標的組み込みによって組み込むべき大きな導入遺伝子を含む場合に特に有用である。
【００９１】
複製欠陥組み換えアデノウイルス・ベクター（Ads）は高い力価で生産でき、いくつかの個止まる細胞タイプに容易に感染する。たいていのアデノウイルス・ベクターは、導入遺伝子がAd E1a, E1b, 及び／又はE3遺伝子を置き換えるように改変される；その後、複製欠陥ベクターは、１又は複数の欠損遺伝子機能をtransで提供する細胞で増殖される。例えば、ヒト293細胞はE1機能を供給する。Adベクターは、肝臓、腎臓及び筋に見られる分裂しない、分化した多数のタイプのin vivoの組織に導入できる。通常のAdベクターは大きな積載容量を有する。臨床試験におけるAdベクターの使用の一例は、筋肉注射による抗腫瘍免疫化のためのポリヌクレオチド治療に関わっている（Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-9 (1998)）。
【００９２】
臨床試験における遺伝子移入のためのアデノウイルス・ベクター使用の別の例は、Rosenecker et al., Infection 24:1 5-10 (1996); Welsh et al., Hum. Gene Ther. 2:205-18 (1995); Alvarez et al., Hum. Gene Ther. 5:597-613 (1997); Topf et al., Gene Ther. 5:507-513 (1998);などである。
【００９３】
いくつかの実施形態では、Adベクターは２つ以上の異なるアデノウイルス・ゲノムからの配列を含むキメラ・アデノウイルス・ベクターである。例えば、AdベクターはAd5/35ベクターであってもよい。Ad5/35は、Ad5のファイバー・タンパク質遺伝子（ノブ、シャフト、テイル、ペントン）の１つ以上を、Bグループのアデノウイルス、例えば、Ad35からの対応するファイバー・タンパク質遺伝子で置き換えることによって生成される。Ad5/35ベクターとこのベクターの特性は、例えば、Ni et al. (2005) “ヒヒへの静脈注射後のグループBファイバーを含むアデノウイルス・ベクターの生体分布と安全性の評価”Hum Gene Ther. 16:664-677; Nilsson et al., (2004) “機能的に異なる臍帯血CD34+細胞のサブ集団にセロタイプ5又は35向性のアデノウイルス・ベクターを導入” Mol Ther 9:377-388; Nilsson et al., (2004) “アデノウイルス・セロタイプ35向性のアデノウイルス・ベクター・システムの開発；原発性悪性造血細胞への効率的な一時遺伝子移入”、J Gene Med 6:631-641; Schroers et al. (2004) “Ad5/F35キメラ・アデノウイルス・ベクターによるヒトTリンパ球及びナチュラルキラー細胞への遺伝子移入”、Exp Hematol 32へ:536-546; Seshidhar et al., (2003) “遺伝子移入ベクターとしてのアデノウイルス・セロタイプ35の開発”、Virology 311:384-393; Shayakhmetov et al. (2000) “再標的アデノウイルス・ベクターによるヒトCD34(+)細胞への効率的な遺伝子移入”、J Virol 74:2567-2583; 及びSova et al. (2004),“肝臓転移の治療のためのTRAILを発現する腫瘍を標的とする条件的に複製する腫瘍崩壊アデノウイルス・ベクター”、Mol Ther 9:496-509.
【００９４】
パッケージング細胞を用いてホスト細胞に感染できるウイルス粒子が形成される。そのような細胞としては、アデノウイルスをパッケージする293細胞、レトロウイルスをパッケージするΨ2又はPA317細胞がある。遺伝子治療に用いられるウイルス・ベクターは通常生産細胞株が核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージして生成される。通常、ベクターはパッケージしてホストに組み込むために必要な最小限のウイルス配列を含み、その他のウイルス配列は発現されるタンパク質をコードする発現カセットに置き換えられる。失われたウイルス機能はパッケージング細胞株からtransで供給される。例えば、遺伝子治療に用いられるAAVベクターは通常、パッケージングとホストへの組み込みに必要なAAVゲノムからの逆向き末端反復（ITR）配列のみを有する。ウイルスDNAは細胞株でパッケージされ、それは他のAAV遺伝子、すなわちrepとcapをコードするヘルパー・プラスミドを含むがITR配列を欠いている。細胞株にはヘルパーとしてアデノウイルスが感染する。ヘルパー・ウイルスはAAVベクターの複製及びヘルパー・プラスミドからのAAV遺伝子の発現を促進する。ヘルパー・プラスミドはITR配列を欠いているため、それほど多量にパッケージされない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、AAVよりもアデノウイルスの方が感受性が高い熱処理によって減らすことができる。
【００９５】
多くの遺伝子治療用途において、遺伝子治療ベクターは特定のタイプの組織に高度の特異性を持って移入されることが望ましい。したがって、ウイルス・ベクターを修飾して、ウイルスの外側表面にウイルス・コート・タンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現させることによって与えられた細胞タイプに対する特異性を持たせるようにすることができる。リガンドは、問題の細胞タイプに存在することが知られている受容体と親和性があるように選ばれる。例えば、Han et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751 (1995) は、Moloneyマウス白血病ウイルスをgp70に融合したヒトheregulinを発現するように修飾することができ、組み換えウイルスはヒト上皮成長因子受容体を発現するヒト乳癌細胞に感染すると報告した。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、ウイルスが細胞表面の受容体に対するリガンドを含む融合タンパク質を発現する他のウイルス−標的細胞のペアに拡張できる。例えば、繊維状ファージを組み換えて、ほとんど任意の選ばれた細胞受容体に特異的結合親和性を有する抗体断片（例えば、FAB又はFv）を発現するようにできる。上述の説明は主としてウイルス・ベクターにあてはまるが、同じ原理は非ウイルス・ベクターにもあてはまる。そのようなベクターを組み換えて特定標的細胞による取込に有利な特異的取込配列を含むようにすることができる。
【００９６】
遺伝子治療ベクターは、上述のように、個々の患者に、通常は全身的に（例えば、静脈注射、腹腔内注射、筋肉注射、皮下注射、又は頭蓋内輸液で）投与することによってin vivoで移入できる。あるいはまた、ベクターはex vivoで細胞に移入できる、例えば個々の患者から細胞を取り出し（例えば、リンパ球、骨髄吸引、組織生検）又は万能給血者の血液幹細胞を取り、通常ベクターを組み込んだ細胞を選んだ後に細胞を患者に再び移植する。
【００９７】
診断、研究、又は遺伝子治療のためのex vivo細胞移入（例えば、形質移入された細胞をホスト生物に再び注入することによる）は当業者に周知である。ある好ましい実施形態では、細胞は対象生物から取り出され、ZFN核酸（遺伝子又はcDNA）を移入され、再び対象生物（例えば、患者）に注入して戻される。ex vivoでの形質移入に適当な様々な細胞タイプは当業者に周知である（患者から細胞を取り出して培養する仕方についての議論は、例えば、Freshney et al., Culture of Animal Cells, A manual of Basic Technique (3rd ed. 1994)及びそこで引用されている文献を参照のこと）。
【００９８】
ある実施形態では、細胞への移入と遺伝子治療のためのex vivo手順に幹細胞が用いられる。幹細胞を用いる利点は、in vitroで他の細胞タイプに分化させることができる、又は哺乳類（細胞のドナーなど）に導入することができ、そこで骨髄に移植できるということである。GM-CSF、IFN-γ、及びTNF-αなどのサイトカインを用いてin vitroでCD34+細胞を臨床的に重要な免疫細胞タイプに分化させる方法が知られている（Inaba et al., J. Exp. Med. 176:1693-1702 (1992)）。
【００９９】
幹細胞は公知の方法によって形質導入と分化のために単離される。例えば、幹細胞は骨髄細胞から、不要な細胞と結合する抗体、例えば、CD4+及びCD8+（T細胞）、CD45+（panB細胞）、GR-１（顆粒球）、及びIad（分化した抗原提示細胞）によって骨髄細胞を選別することによって単離される（Inaba et al., J. Exp. Med. 176:1693-1702 (1992)）。
【０１００】
治療用ZFP核酸を含むベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソーム、など）は、また、in vivoでの細胞の形質移入のために生物に直接投与することもできる。あるいはまた、ネイキッドDNAを投与することもできる。投与は、注射、輸液、局所塗布、及び電気穿孔法など、それだけに限定されないが、分子を導入して最終的に血液又は組織細胞と接触させるために通常用いられるいずれかのルートによって行われる。そのような核酸を投与するための適当な方法は当業者に周知であり利用できるものである。特定の組成物を投与するために２つ以上のルートを利用することができても、多くの場合ある特定のルートが別のルートよりも直接的でより効果的な反応を与える。
【０１０１】
DNAを血液幹細胞に導入する方法は、例えば、米国特許No. 5,928,638に開示されている。導入遺伝子を血液幹細胞、例えばCD34+細胞、に導入するのに使用できるベクターはアデノウイルス35型などである。
【０１０２】
導入遺伝子を免疫細胞（例えば、T-細胞）に導入するのに適当なベクターは、非挿入レンチウイルス・ベクターなどである。例えば、Ory et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11382-11388; Dull et al. (1998) J. Virol. 72:8463-8471; Zuffery et al. (1998) J. Virol. 72:9873-9880; Follenzi et al. (2000) Nature Genetics 25:217-222を参照のこと。
【０１０３】
医薬的に許容されるキャリアは、部分的には投与される特定組成物によって、並びにその組成物を投与するために用いられる特定の方法によって決定される。したがって、以下で記述されるように利用できる医薬組成物の適当な調合には多様な種類がある（例えば、Remington’s Pharmaceutical Science, 17th ed., 1989 を参照のこと）。
【０１０４】
上述のように、上述の方法及び組成物は、原核細胞、真菌細胞、古細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳類細胞、及びヒト細胞など、任意のタイプの細胞で使用できる。タンパク質発現のために適当な細胞株は当業者には公知であり、COS, CHO (例えば、CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11), VERO, MDCK, W138, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NSO, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293 (例えば、HEK293-F,  HEK293-H, HEK293-T), perC6,昆虫細胞、例えばSpodoptera fugiperda (Sf), 及び真菌細胞、例えばSaccharomyces, Pischia 及びSchizosaccharomycesなどを含むが、それだけに限定されない。これらの細胞株の子孫、変異体及び誘導体も使用できる。
【０１０５】
応用
開示された開裂ドメインは亜鉛フィンガー・タンパク質と組み合わせてDNAを開裂し標的から外れた部位の開裂を最小にするのに（野生型又はホモ二量体化する開裂ドメインを含むZFNsと比べて）有利に用いられる。開裂は細胞クロマチンの注目の領域で（例えば、ゲノムにおける、例えば、遺伝子、突然変異した又は野生型、における所望の又は所定の部位で）行って；ゲノムの配列を（例えば、細胞クロマチンの注目の領域を）相同な、非同一配列（すなわち、標的組み換え）によって置き換える；DNAをゲノムの１又は複数の部位でDNAを開裂し、次に開裂部位を非相同断端結合（NHEJ）によって結合してあるゲノム配列を削除する；相同組み換えを容易にする細胞因子をスクリーニングする；及び／又は野生型配列を突然変異配列で置き換える、又はある対立遺伝子を異なる対立遺伝子に変換することができる。このような方法は、例えば、米国特許公報No. 20050064474; 国際特許公開WO 07/014275に詳細に記載されており、これらは参照によって全体が本明細書に組み込まれる。
【０１０６】
したがって、開示された改変開裂ハーフドメインは、特定の標的開裂が望ましい方法で、及び／又はゲノム配列を相同の、非同一配列で置き換えるために、どんなZFNでも用いることができる。例えば、突然変異のゲノム配列を野生型配列で置き換えて治療のための方法、例えば遺伝的な疾患、遺伝した疾病、癌、及び自己免疫疾患を治療する方法を提供できる。同様に、ある遺伝子のある対立遺伝子を、ここに開示された標的組み換えの方法を用いて異なる対立遺伝子に置き換えることができる。実際、特定のゲノム配列に何らかの仕方で依存する病気は、ここに開示された方法を用いて修正又は軽減することができる。
【０１０７】
遺伝的疾患の例としては、軟骨形成不全症、色盲、酸マルターゼ欠損症、アデノシン・デアミナーゼ欠損症（OMIM No. 102700）、副腎白質萎縮症、エカルディ症候群、アルファ-1 アンチトリプシン欠損症、α-サラセミア、アンドロジェン不応症候群、アペール症候群、不整脈源性右室異形性、毛細管拡張性運動失調、バース症候群、β-サラセミア、青色ゴムまり様母斑症候群、カナバン病、慢性肉芽腫症（CGD）、ネコ鳴き症候群、嚢胞性繊維炎、ダーカム病、外胚葉性形成異常、ファンコーニ貧血、進行性骨化性繊維形成異常、脆弱Ｘ症候群、ガラクトース血症、ゴーシェ病、全身性ガングリオシド蓄積症（例えば、GM1）、血色素症、ベータ−グロビンの第６コドンにおけるヘモグロビンC突然変異（HbC）、ヘモフィリア、ハンチントン病、ハーラー症候群、低フォスファターゼ症、クラインフェルター症候群、クラッベ病、ランガーギデオン症候群、白血球粘着不全症（LAD, OMIM No. 116920）、白質萎縮症、QT延長症候群、マルファン症候群、メビウス症候群、ムコ多糖対沈着症（MPS）、爪膝蓋骨症候群、腎性尿崩症、神経繊維腫症、ニーマン・ピック病、骨形成不全症、ポルフィリン症、プラーダービリ症候群、早老症、プロテウス症候群、網膜芽細胞腫、レット症候群、ルビンスタイン−テービ症候群、サンフィリポ症候群、重症複合型免疫不全症（SCID）、シュバッハマン症候群、鎌状赤血球症（鎌状赤血球貧血症）、スミス- マグニス症候群、スティックラー症候群、テイ−ザックス病、血小板減少橈骨欠損（TAR）症候群、トリーチャーコリンズ症候群、トリソミー、結節硬化症、ターナー症候群、尿素サイクル異常症、フォンヒッペル・ランダウ病、ワールデンブルグ症候群、ウイリアムズ症候群、ウィルソン病、ウイスコット・アルドリッチ症候群、X連鎖リンパ球増殖症候群（XLP, OMIM No. 308240）。
【０１０８】
標的DNA開裂及び／又は相同組み換えによって治療できる疾患のその他の例としては、後天性免疫不全症候群、リソソーム蓄積症（例えば、ゴーシェ病、GMI、ファブリー病、及びテイ・ザックス病）、ムコ多糖体沈着症（ハンター病、ハーラー病）、異常血色素症（例えば、鎌状赤血球症、HbC、αサラセミア、βサラセミア）、及び血友病がある。
【０１０９】
このような方法は、また、ホストにおける感染症（ウイルス又はバクテリア）の治療（例えば、ウイルス又はバクテリアの受容体の発現を阻止し、これによりホストにおける感染及び／又は拡がりを防ぐ）；遺伝病を治療することを可能にする。
【０１１０】
感染した又は組み込まれたウイルス・ゲノムの標的開裂を用いて、ホストにおけるウイルス感染を治療することができる。さらに、ウイルスの受容体をコードした遺伝子の標的開裂を用いてそのような受容体の発現をブロックし、これによりホスト生物におけるウイルスの感染及び／又はウイルスの拡がりを防止できる。ウイルスの受容体（例えば、HIVのCCR5及びCXCR4受容体）をコードする遺伝子の標的突然変異誘発を用いて受容体がウイルスと結合できなくなるようにし、これにより新たな感染を防止し、既存の感染の拡がりを防止することができる。これと同じ日付で出願された米国特許出願No. ＿＿＿を参照のこと。標的とすることができるウイルス又はウイルスの受容体の例としては、ヘルペス・シンプレックス・ウイルス（HSV）、及びサイトメガロウイルス（CMV）、HHV6、及びHHV7がある。肝炎ファミリーのウイルスとしては、A型肝炎ウイルス（HAV）、B型肝炎ウイルス（HBV）、C型肝炎ウイルス（HCV）、デルタ肝炎ウイルス（HDV）、E型肝炎ウイルス（HEV）、及びG型肝炎ウイルス（HGV）がある。その他のウイルス又はその受容体も標的にすることができる。例えば、Picomaviridae （例えば、ポリオウイルス、など）；カリシウイルス科（例えば、風疹ウイルス、デング熱ウイルス、など）；フラビウイルス科；コロナウイルス科；レオウイルス科；ビルナウイルス科；ラブドウイルス科（例えば、狂犬病ウイルス、など）；フィロウイルス科；パラミクソウイルス科（例えば、ムンプス(おたふくかぜ)ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器多核体ウイルス、など）；オルソミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス・タイプA, B及びC）；ブニヤウイルス科；アレナウイルス科；レトロウイルス科；レンチウイルス科（例えば、HTLV-I; HTLV-II; HIV-1(HTLV-III, LAV, ARV, hTLR,などとも呼ばれる)、HIV-II）；サル免疫不全ウイルス（SIV）、ヒトパピローマウイルス（HPV）、インフルエンザウイルス及びダニ媒介脳炎ウイルス、などであるが、それだけに限定されない。これらのウイルス及びその他のウイルスの記述は、例えば、Virology, 3rd Edition (W.K. Joklik ed. 1988); Fundamental Virology, 2nd Edition (B.N. Fields and D.M. Knipe, eds. 1991) を参照のこと。HIVの受容体は、例えば、CCR-5及びCXCR-4などを含む。
【０１１１】
このように、ここで記載されているヘテロ二量体開裂ドメインの様々な変異体は、遺伝子修飾用途でZFNの特異性を高めるために広い有用性を提供する。これらの変異体の開裂ドメインは、部位特異的な突然変異誘発又はサブクローニングによって既存のZFNに容易に組み込むことができ、これによりZFN二量体のin vivo特異性を高めることができる。
【０１１２】
上述のように、本明細書において記載される組成物と方法は、遺伝子修飾、遺伝子修正、及び遺伝子分断のために利用できる。遺伝子修飾の非限定例としては、相同指向的修復（HDR）をベースとする標的組み込み；HDRをベースとする遺伝子修正；HDRをベースとする遺伝子修飾；HDRをベースとする遺伝子分断；NHEJをベースとする遺伝子分断及び／又はHDR、NHEJの組み合わせ、及び／又は一本鎖アニーリング（SSA）などがある。一本鎖アニーリング（SSA）とは、5’-3’エクソヌクレアーゼによってDSBを切除して２つの相補領域を露出させることによって同じ向きで起こる２つの反復配列の間の二重鎖切断の修復を指す。２つの直接反復配列をコードする一本鎖を次に互いにアニールし、アニールされた中間部分を処理して、一本鎖のテール（配列にアニールされなかった一本鎖の部分）を消化して除き、ギャップをDNAポリメラーゼによって埋めてDNA断端を再結合することができる。その結果、直接反復配列の間にある配列が削除される。
【０１１３】
ここで記載されている開裂ドメインを含む組成物（例えば、ZFNs）及び方法は、また、様々な遺伝疾患及び／又は感染疾患の治療のために利用できる。
【０１１４】
これらの組成物及び方法は幹細胞をベースとする治療に応用できる、それは以下のようなものであるが、それだけに限定されない：
（a）ショートパッチ遺伝子変換による体細胞突然変異の修正とモノジェニック遺伝子治療のための標的組み込み
（b）優性阻害的対立遺伝子の分断
（c）細胞への病原体の進入又は増殖感染に必要な遺伝子の分断
（d）組織の改変の強化、例えば：
（i）機能的組織の分化又は形成を促進する遺伝子活性の修飾；及び／又は
（ii）機能的組織の分化又は形成を促進する遺伝子活性の破壊
（e）分化のブロッキング又は誘導、例えば：
（i）分化をブロックする遺伝子を破壊して幹細胞が特定の系列（lineage）経路に分化することを促進する
（ii）幹細胞の分化を刺激する遺伝子又はsiRNA発現カセットの標的挿入
（iii）幹細胞の分化をブロックし多分化能をより良く拡大し維持することを可能にする遺伝子又はsiRNA発現カセットの標的挿入
（iv）内生遺伝子のフレームで多分化能又は分化常置のマーカーであるレポーター遺伝子の標的挿入、これは幹細胞の分化状態を示し、メディア、サイトカイン、成長条件、遺伝子の発現、siRNA分子の発現、細胞表面マーカーに対する抗体への曝露又は薬、がこの状態を変化させる仕方の容易なマーカーを可能にする。
（f）体細胞核の移入、例えば、患者自身の体細胞を単離し、意図する標的遺伝子を適当に修飾し、細胞のクローンを生成し（ゲノムの安全を確保するように質をコントロールして）、これらの細胞から核を単離し、未受精卵子に移入して患者特異的なhES細胞を生成し、それを直接注入するか又は分化させた後で患者に移植して、組織の拒絶反応を減らす又はなくすことができる。
（g）MHC受容体をノックアウトすることによる万能幹細胞−このアプローチは免疫アイデンティティが低下又は完全になくなった細胞を生成するために用いられる。この手順のための細胞タイプとしては、T-細胞、B-細胞、血液幹細胞、及び胚芽幹細胞などがあるが、それだけに限定されない。したがって、これらの幹細胞又はその派生物（分化した細胞タイプ又は組織）は、その起源や組織適合性に関わりなくどんな人にも移植できる可能性がある。
【０１１５】
この組成物及び方法は体細胞治療（例えば、自己骨髄細胞投与療法及び／又はMHC受容体をノックアウトすることによる万能T細胞、上のセクション（g）を参照のこと）に用いて、生物学的性質を改良するように修飾されたT細胞のストックを生産することができる。このような細胞はT細胞のドナー起源やレシピエントに対する組織適合性に関わりなく改変患者に輸液できる。
【０１１６】
治療的な応用の他に、ここで記載されている変異体をZFNsで用いたときに得られる高い特異性は、作物の遺伝子組み換え、細胞株の改変、及び疾病モデルの構築のために利用できる。オブリゲートなヘテロ二量体開裂ハーフドメインは、ZFNの性質を、特にホモ二量体活性が効力を制限する場合に、ZFNの性質を改良するための単純明快な手段になる。
【０１１７】
ここで記載されている改変開裂ハーフドメインは、また、介在する領域を削除したり、一度に２つの特定の座を変化させたりするために、複数の標的で同時に開裂することが必要な遺伝子修飾手順で利用できる。２つの標的での開裂は、４つのZFNsの細胞発現を必要とし、それは１０の異なる活性ZFN組み合わせを生ずる。このような応用で、野生型ヌクレアーゼ・ドメインに我々の変異体を用いると、これらの組み合わせのうち６つの活性が消滅し、標的から外れた開裂の確率が減少する。
【０１１８】
ここで言及されたすべての特許、特許出願、及び刊行物は、参照によって全体が本明細書に組み込まれる。
【０１１９】
本明細書は分かりやすく理解できるように図と実施例によってある程度詳細に説明されているが、本発明の精神と範囲から逸脱することなく様々な変化や変更を加えることが可能であることは当業者には明らかであろう。したがって、これまでの説明と以下の実施例は制限的なものと解釈すべきでない。
【実施例】
【０１２０】
実施例１：改変FokI開裂ハーフドメインの設計
ヘテロ二量体的な蛋白質相互作用表面を構築するための様々な戦略が記載されている。O’Shea, E.K. et al. (1993) Curr Biol 3:658-667; Zhu et al. (1997) Protein Sci 6:781-788; Atwell et al.(1997) J Mol Biol 270:26-35; Nohail et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:3109-3114; Havranek & Harbury (2003) Nat Struct Biol 10:45-52; Bolon et al. (2005) Proc Natl Acad Sci USA 102:12724-12729 を参照のこと。しかしながら、FokIヘテロ二量体の開発は難題に直面し、異なるアプローチを必要とした。以前の戦略との決定的な違いのひとつは、再設計努力の目標、FokI開裂ドメインが酵素であるということである。したがって、単なる相互作用の選択ではなく、触媒機能に関して様々な設計変異体をスクリーニングすることが重要であった。活性部位の残基は界面から10オングストローム以内にあるので、これは難しい問題であった。Wah et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95:10564-10569を参照のこと。
【０１２１】
ヘテロ二量体化する開裂ハーフドメインの設計の第２の特徴はFokI二量体化の親和性が非常に低いことであった。開裂の特異性を確保するために重要なこの性質を保存したいという我々の関心は、ヘテロ二量体の開発のために親和性に基づく選択方法を用いることを妨げた。最後の問題は、FokI二量体の界面がきわめて親水性であることだった。この界面は多くの静電相互作用、並びに多くの秩序ある水を含む（Wah et al. 前出）。この特徴のため、純粋に計算的な戦略で所望の性質を有するモノマーが得られることは考えにくくなった。
【０１２２】
分子モデル構築は次のように行われた。2FOK.pdb結晶構造がすべての分子モデル構築の基礎として用いられた。二量体界面は、CrystalEyes3 3D可視化アイウエア（stereographics）を装備したSilicon Graphics Octane ワークステーションでVMD version 1.8.2を実行して可視化された。アミノ酸置換は、Silicon Graphics Octane ワークステーションでSwiss-Pdb version 3.7を実行し、次のような水素結合閾値：最小距離2.195 Å、最大距離3.300 Å、及びアクセプタ、ドナー、及びドナーに共有結合された原子の間の角度90°、を用いてモデル化された。様々なアミノ酸置換の水素結合の可能性は、“変異（mutate）”コマンドを用い、次に“ねじれ（torsion）”コマンドによって問題の側鎖のねじれ角を手動で操作することによって調べられた。手動のねじれ操作の間、水素結合と立体的クラッシュの実時間ディスプレーが可能であった。与えられたアミノ酸置換に対して水素結合の閾値内にあり同時に立体的クラッシュが避けられるねじれ角を見出すことができた場合、その置換は我々のヌクレアーゼで水素結合を作る可能性があると見なされた。複数のアミノ酸置換で界面をモデル化する場合、この手動のねじれ操作は、問題とする側鎖の間で交互に、新しい水素結合のための適当な幾何形状が見つかるか、又はそのような水素結合が不可能であると判明するまで繰り返された。市販で入手できる分子モデル化ソフトウエアによる分子モデル化の間の自動化されたエネルギー最小化又は結合エネルギー計算は、親水性のタンパク質界面を正確にモデル化しない傾向があるため採用しなかった。
【０１２３】
さらに、段階的な（反復）アプローチを用いて、二量体界面を変えることによって本明細書において記載されている変異体を作成した。特に、亜鉛フィンガー・ヌクレアーゼの文脈デ４サイクルの変異体設計と変異体の試験を行って（実施例２を参照のこと）、各サイクルで二量体界面においてひとつのアミノ酸を置換して、より多くのヘテロ二量体的なZFN複合体を生成した。各サイクルで、ひとつの開裂ドメイン内にひとつのアミノ酸置換による小さなパネルを生成し、その相手方は変更しなかった。置換の選択は、自生のFokI二量体の座標を指針とした（Wah et al. Proc Natl Acad Sci USA 95:10564-10569）。図５Cを参照のこと。突然変異は、変更されない相手方と接触する可能性がある位置で、電荷−電荷相互作用を導入する方向にバイアスをかけて行われた。次の、各変異体が、２つの代替形態、すなわち、（i）変更しない相手方ZFNとのヘテロ二量体として、及び（ii）ホモ二量体として、遺伝子修正を刺激する能力に関してスクリーニングされた。引き続くサイクルは、二量体界面の２つの側で交互になされた。
【０１２４】
開発の各サイクルで、我々は一定の相手方ZFNでヘテロ二量体として効率的に遺伝子修正を誘発するが、ホモ二量体としては低い活性を示す変異体を確認した。このプロセスの概観と、各サイクルで同定された最良の成績の変異体の性質を合わせて図５Dに示す。
【０１２５】
本明細書において記載した界面変異体の反復設計とスクリーニングによってますますヘテロ二量体的な挙動へ進んでゆく戦略は、また、どんなヌクレアーゼをオブリゲートなヘテロ二量体に変換する場合にも応用できる。
【０１２６】
実施例２：改変開裂ハーフドメインによるZFNsの構築と試験
開裂ハーフドメイン変異体が所望の活性を保持することを確認するために、変異体は亜鉛フィンガー・ヌクレアーゼ（ZFNs）に組み込まれ、亜鉛フィンガー・ヌクレアーゼに組み込まれたときに哺乳類細胞でDNAを開裂し遺伝子修正を誘発する能力について設計候補を直接テストする機能的スクリーンを用いる分析が行われた。
【０１２７】
亜鉛フィンガー・タンパク質と本明細書において記載されている修飾された開裂ハーフドメインを含む融合タンパク質が本質的に米国特許公報第20050064474号及び国際特許公開WO 2005/014791に記載されているように調製された。具体的には、Lwt及びRwt ZFNsのアミノ酸配列はUrnov (2005), 前出、でZFP-L*及びZFP-R*として記載されているものと同一である。図５Dに示されている突然変異は、QuikChange突然変異誘発キット（Invitrogen）を用いて各ZFNのFokI開裂ドメインをコードする領域に導入された。Lwt及びRwt構築物は、Wah et al., 前出、に記載されているFokIエンドヌクレアーゼの残基384と579を含んでいる。他のいくつかのグループは、位置501でプロリンでなくトレオニンを含むFokIの変異体を用いている；この対立遺伝子は我々の開裂ドメイン変異体における突然変異に適合しない可能性がある。
【０１２８】
Urnov et al. (2005) Nature 435:646-651に記載されているin vitro DNA開裂分析（実施例５）及びGFP遺伝子修正分析で、ZFNsがDNAの機能的開裂に関して分析された（実施例３も参照のこと）。GFP修正システムは、良く分かっているZFN二量体に対する標的の挿入によって変更され、組み込まれて構成的に発現されたeGFP遺伝子を含むHEK293細胞株を利用していた。Urnov, 前出、図５A；実施例３，を参照のこと。eGFP遺伝子は、標的開裂の後にeGFPドナー・テンプレートを用いる遺伝子修正によって回復される。ZFN変異体がこのプログラムを刺激する能力は、Porteus et al. (2003) Science 300:763に記載されているように、緑色蛍光に変換された細胞の割合をカウントすることによって定量化できる。図５Bを参照のこと。
【０１２９】
我々のGFPレポーター・システムにおけるZFN標的配列は、内生的なヒトIL2Rγ遺伝子座の遺伝子修正のために設計された二量体ZFN-L*/ ZFN-R*の結合部位である（Urnov et al. (2005), 前出、を参照のこと）。分かりやすくするため、これらのZFNsのDNA結合ドメインを“L”及び“R”ZFPsと呼ぶ。
【０１３０】
我々の反復最適化プログラムでテストされた様々な構築物の活性に関する反復設計の結果を表１に示す。初めの方のスクリーニング・段階はin vitro DNA開裂分析（実施例５）によって行われ、あとの方の段階は細胞に基づいたGFPレポーター遺伝子修正分析（実施例３）を用いて行われた。表１は、４つの別々のin vitro開裂実験と６つの別々の細胞に基づく遺伝子修正分析を集めたものである。“相対活性”欄のすべての値は、その特定実験の野生型ZFNsの活性によって規格化されている；規格化で用いた絶対活性は一番右の欄でパーセントDNA開裂（in vitro 開裂分析）又はGFPポジティブ（GFP遺伝子に関して）と判定された細胞のパーセンテージで示されている。a : bヘテロ二量体の値は、“a”及び“b”欄に示された開裂ドメイン変異体を含むZFNペアの相対活性である。“a”及び“b”ドメインが両方の可能な向きでテストされた実験で（すなわち、L-a+R-b及びR-a+L-b）報告された値はこれらの２つの実験の平均である。b : bホモ二量体の値は、各ZFNが“b”ドメインに記された開裂ドメイン変異体を含む場合のZFN対の相対活性である（空白はそのホモ二量体実験が行われなかったことを示す）。スクリーニングの全体的な意図は、ヘテロ二量体として高い相対活性を示しホモ二量体として著しく低い活性を示すドメインを見つけることである。上付き添字１は第１ラウンドの最適化で最良の成績を示し、その後第２ラウンドの最適化でコンスタントなパートナーとして用いられた２つの構築物を示す。上付き添字２と３は、それぞれ、第２ラウンド又は第３ラウンドの最適化で最良の成績を示し、ｎ＋１ラウンドの最適化でコンスタントなパートナーとして用いられた構築物を示す。上付き添字４の構築物は、第４ラウンドの最適化での最良の構築物であり、第３ラウンドの最良の構築物と合わせて、我々の開裂ドメイン変異体の最終的なペアと決定された。
【０１３１】
【表１】
2009538138.tif 000003
【０１３２】
特に、表１に示されているように、我々の最初の設計努力はZFNのD483とそのパートナーのR487の間のビデンデート（bidendate）水素結合の極性を逆にすることに向けられた。
【０１３３】
このアプローチのために、ひとつのZFN（“ZFNa”）の残基D483をアルギニン又はリジンに変換し、他方のZFN（“ZFNb”）の残基R487をアスパルテート又はグルタメートに変換した（表１，最初の８つのエントリー）。これらの変異体のin vitro開裂分析は、野生型FokIヌクレアーゼ・ドメインの２つのコピーを含むZFNペアに対してすべてのペアで開裂効率の顕著な（＞70%）減少を示した。したがって、この設計はそれ以上発展させなかった。
【０１３４】
この最初の試みの後、我々は開発戦略を図５に大略を示した順次修飾アプローチに変更した。このプロセスの最初の段階として、野生型ドメインのコピーとペアにしたときに（ヘテロ二量体として）活性を保持するが、自分自身の第２コピーとペアにしたときに（ホモ二量体として）活性の低下を示す開裂ドメイン変異体を探索した。
【０１３５】
５つの単一残基置換がテストされた（表１，開発サイクル１）。立体的には保守的なD483L変異体は、ホモ二量体界面におけるD483-R487相互作用の両方を排除するが野生型ドメインとペアにしたときにはこのような相互作用の一方だけしか排除しないので、ホモ二量体を優先的に不安定化する。Q486突然変異体がこの界面の各側に負荷電の残基を付加してホモ二量体を優先的に不安定化することを意図した。E490K変異体が野生型ドメインのE490と水素結合する可能性があってヘテロ二量体を安定化するが、２つの正荷電の残基を界面に付加する及び／又は立体的なクラッシュを生ずることによってホモ二量体を不安定化することを意図した。野生型ドメインとペアにしたとき、E490変異体は完全な活性を保持するが、他の２つの突然変異は何も検出可能な活性を示さず、それ以上追求されなかった（表１）。
【０１３６】
この結果を得て、E490RとE490Hも生成され、野生型ドメインとのヘテロ二量体としての機能、並びにホモ二量体としての活性の低下について、E490Kと比較された。すべての変異体はヘテロ二量体として高レベルの開裂を示したが、ホモ二量体としての活性が低下したのはE490KとE490Rだけであった（表１，開発サイクル１）。したがって、これら２つの変異体は次の開発サイクルへ進められた。E490K変異体は、野生型開裂ドメインとのヘテロ二量体としてテストされたときに親FokI活性の80%を示したが、ホモ二量体としては活性の低下を示した（親FokIの42%）。
【０１３７】
開発の第２ラウンドでは、我々はK490又はR490との水素結合によってE490K又はE490Rと有利に相互作用するように５つの構築物を設計した。負荷電の残基による位置486と490のすべての可能な置換が所望の相互作用の候補として検討され、個別に又は組み合わせで構築された。最初の定性的な研究では、Q486DがE490K又はE490Rとペアにしたときに活性の劇的な低下を示し、それ以上測定しなかった。残りの構築物（E490D, Q486E:E490D, Q486D:E490D, Q486E）のうち、Q486EがE490Kとペアにしたときに、ヘテロ二量体活性が最も高く、ホモ二量体に媒介される開裂が顕著に（> 50%）低下するという点で最も望ましい性質を示した（表１，“in vitro開裂”エントリー）。
【０１３８】
それ以後の研究では、我々は細胞GFP遺伝子修正分析に切り換えた。このシステムの使用は、考察しているヌクレアーゼ変異体の触媒効率を測るための手段を与えるだけでなく、真核細胞の核の機能との適合性を評価する手段も与える。このシステムでの我々の最初の研究として、すべての新たなQ486X変異体が生成され、E490Kとペアにしたときの活性の保持に関して定性的にスクリーニングされた。このスクリーニングに合格した構築物（Q486K, -M, -W, 及び-L, 並びにQ486E）は、次に定量的に調べられた。５つの構築物はすべて、E490K変異体とのヘテロ二量体として高レベルの遺伝子修正活性を示した（表１，“GFP遺伝子修正”エントリー）が、Q486Eだけがホモ二量体活性の顕著な低下を示したので、この変異体を第３ラウンドの開発でコンスタントなパートナーとして選んだ。特に、図５Dに示されているように、Q486E変異体はE490Kとのヘテロ二量体としてテストしたときに親FokI活性の65%を示したが、ホモ二量体としては活性の低下（親FokIの19%）を示した。
【０１３９】
第３ラウンドの開発では、E490Kの文脈で、Q486Eとのヘテロ二量体として活性を維持又は増加させながら、ホモ二量体機能を低下させるという目標でさらに置換を行った。突然変異は２つの位置：486と538に導入された。486位置では、すべての可能なアミノ酸置換が生成され、Q486EとペアにしたときのGFPレポーター・システムの活性に関して定性的にスクリーニングされた。顕著な活性（一般に、wt:wtペアの25%より大）を示したものは、さらにホモ二量体及びヘテロ二量体機能の両方に関して定量的にテストされた。これらのダブル突然変異のうち２つ（E490K:Q486I及びE490K:Q486L）は、高いヘテロ二量体活性を保ちながらホモ二量体機能との差で改善を示し、三番目のもの（E490K:Q486E）は高い活性と明らかなヘテロ二量体優先による低下を示した（表１）。
【０１４０】
538位置では、モデル化研究は、塩基性残基による置換が対向サブユニットでE490との水素結合形成を可能にすると示唆した。さらに、I538は他方のモノマーのI499と相互作用する嫌気性ポケットを形成するので、I538への突然変異はI538- I499相互作用の両方のコピーを壊すことによってホモ二量体を優先的に不安定化するが、ヘテロ二量体としてはこのコピーの一方だけしか壊さない。予備研究では、I538KとI538Rが両方共作られ、野生型ドメイントペアにしたときの活性が調べられ、I538Kの方がI538Rよりも活性を保つことが認められた（wt:wtコントロールに対して、それぞれ、0.87と0.43）。
【０１４１】
この結果に基づいて、I538K がE490Kに導入され、E490K:Q486I及びE490K:Q486E変異体、及びこれにより得られるダブル及びトリプル突然変異体が、Q486Eとペアにしたとき、又はホモ二量体としてペアにしたときの遺伝子修正活性が調べられた。これらの研究から、E490K:I538Kダブル変異体が、ヘテロ二量体として高い活性を有しホモ二量体としての活性が低い最良の組み合わせであることが明らかになり（表１，図５D）、したがってこの変異体が第４ラウンドの開発でのコンスタントなパートナーとして選ばれた。
【０１４２】
第４ラウンドの開発は、E490K:I538Kとペアにしたときに良く機能するが、ホモ二量体としては良く機能しない構築物を探索した。アミノ酸側鎖の様々な組み合わせが位置486, 490及び538で試みられたが、それらはすべてE490K:I538Kとペアにしたときに活性を顕著に低下させた。Q486EからQ486E:I499Lへの微妙な変更も、IleからLeuへの変化がホモ二量体としてペアにしたときにI538の両方のコピーとの嫌気性パッキングを壊すがE490K:I538KとペアにしたときのK538とのパッキングには影響しないであろうという期待で試みられた。このQ486E:I499Lダブル変異体は、この最終スクリーニングにおいて最良の性質を示し、E490K:I538Kと一緒に用いられた。これら２つの変異体は＋及び−変異体と名付けられて詳しく調べられた。図２，３，及び５Dを参照のこと。分かりやすいように、これらの変異体ドメインを“＋”及び“−”と呼ぶ。これらの記名法は新しい残基の電荷を反映している。これらの変異体がFokI二量体界面でどのように相互作用するかというモデルが図５Eに示されている。
【０１４３】
実施例３：HEK293細胞株におけるレポーター遺伝子修正
修飾された開裂ハーフドメインによるZFNsの機能をテストするために、ZFNsは、米国特許公報No. 20050064474及び国際特許公開WO 2005/014791に記載されているようなGFPレポーター分析で評価された。
【０１４４】
簡単に説明すると、フレームシフト変異とIL2Rγ遺伝子のZFN標的ストレッチの断片を含む欠陥eGFPレポーター遺伝子が、Porteus et al. 前出、に記載されているように生成され、pcDNA4/TOベクター（Invitrogen）でクローニングされ、HEK293 T-Rex細胞（Invitrogen）に安定的に導入された。この遺伝子の単一組み込みコピーを含むクローン系統を同定し、すべての実験で用いた。欠陥eGFP遺伝子を修正するためのドナー・プラスミドは、機能的eGFP遺伝子（BD Biosciences）をpcDNA4/TOでクローニングすることによって生成サレタ。ドナー構築物からのGFP発現を防ぐために、最初の12 bpと開始コドンを除去した。次に、1.5 kbの断片を以下のプライマー：GGCGAGGAGCTGTTCAC (SEQ ID NO:4)、TGCATACTTCTGCCTGC (SEQ ID NO:5)（リバース・プライマーはpcDNA4/TOベクター・バックボーンにアニールする）を用いてPCRによって生成し、pCR4Topo（Invitrogen）でクローニングした。
【０１４５】
HEK293 T-Rex細胞（Invitrogen）がメーカーの指示に従って生育され、２つのZFNプラスミドとドナー構築物がLipofectAMINETM2000（Invitrogen）を用いて移入された。遺伝子修正頻度は、移入の４日後にGuava RasycyteTM単一細胞分析システムによって測定された。525 nmと583 nmの両方で蛍光を独立に測定してGFP信号を自己蛍光から分離した（GFP信号は525 nmチャンネルの方が強いが、自己蛍光は両方のチャンネルで同様であった）。他の類似のレポーター・ラインと同様に、この実験で観測された絶対遺伝子修飾頻度も内生の遺伝子座で見られるより低かったが、これは、挿入された外来DNAストレッチによってドナーと標的の間の配列が拡がるためである。
【０１４６】
図５Fに示されているように、E490K/I538KとQ486E/I499Lは遺伝子修正レポーター・システムでヘテロ二量体化で強い優位を示した。遺伝子修正の能力に関してテストされると、“＋”開裂変異体の“L”ZFPとの融合及び“−”開裂変異体の“R”ZFPとの融合は1.98%の遺伝子修正効率を刺激する複合体を生じた（図５F）。さらに、ZFP-開裂ドメインの逆転（すなわち、L-/R+ヘテロ二量体の構築）も同じように高い修正率（1.71%）を与えた。それと対照的に、無理にホモ二量体にすると、両方の開裂変異体が強く損傷し、修正率はL+/R+及びL-/R-ホモ二量体で、それぞれ、わずか0.02%及び0.12%であった。比較のために言うと、野生型FokI開裂ドメインは遺伝子修正率が1.27%であった（図５F）。このように、“＋”及び“−”変異体は強いオブリゲートなヘテロ二量体ペアである。
【０１４７】
実施例４：K562細胞における内生遺伝子修飾
二量体化変異体の機能はまた、融合タンパク質の“L”及び“R”ZFPsによって認識される内生IL2Rγ遺伝子座（エクソン５）で確認された。特に、ZFNsを含む二量体化変異体が、新しいBrsBI制限部位を導入する遺伝子修正事象を誘発する能力が評価された。Urnov et al. (2005)、前出；図６A、を参照のこと。
【０１４８】
簡単に説明すると、BrsBI制限部位をIL2Rγ遺伝子のエクソン５に導入するために用いられるドナー・プラスミドは、以前にUrnov et al. (2005)、前出、で記載されたものである。遺伝子修正のために、K562細胞（ATCC）がRPMIメディア（Gibco）に10% FBSを補った培地でコンフルエンスまで生育され、移入の１日前に1:4に分割された。2x106個の細胞に各5μgのZFPプラスミドと25μgのドナー・プラスミドがCell Line NucleofecterTM Kit VとプログラムT16 (Amaxa Biosystems) をメーカーの手順に従って用いて核移入された。細胞は、移入の48時間後に採取された。DNA抽出は、DNeasyTM Tissue Kit (Qiagen) を供給業者の手順に従って用いて行われた。遺伝子修正のパーセンテージは、本質的に以前にUrnov et al. (2005)、前出、で記載されたようなPCRに基づく分析を用いて決定された、ただしPCR段階はもっと少ない量のゲノムDNA（8 ng）を用い、24サイクルにわたって行われ、各16 μCiのα-32P-dCTP及びα-32P-dATPを含んでいた。
【０１４９】
次に、遺伝子修正の効率が、PCR増幅とそれに続くBrsBI消化及びゲル電気泳動によって定量化された。結果は図６Bに示されている。L-/R+とL+/R-ZFN組み合わせはどちらも、きわめて効率的（>10%）であり、Lwt/RwtZFN組み合わせによって誘発されるものと区別できない遺伝子修正を誘発した。重要なことは、強制的なホモ二量体化（L+/R+及びL-/R-）はこの分析で検出できるほどの遺伝子修正を生じなかったことである（図６B、最も右側の２つのレーンを参照のこと）。このように、“＋”及び“−”変異体は内生の標的でオブリゲートなヘテロ二量体として振る舞う。
【０１５０】
実施例５：In vitro DNA 開裂分析
“＋”及び“−”変異体がZFN二量体機能を顕著に抑制することを立証した内生遺伝子修正研究及びGFPレポーター研究をさらに裏付けるために以下のin vitro開裂分析が行われた。
【０１５１】
２つの相補的な合成69-merオリゴヌクレオチドがアニールされ、top-bluntTMベクター（Invitrogen）でクローニングされ、図７Aに示された３つの配列の各々が生成された。各構築物のZFN部位はDNA配列決定法によって検証された。検証されたテンプレートは、top-bluntTMキットに含まれていたM13フォワード及びM13リバース・プライマーを用い、勧告されたPCRプロトコルを用いて増幅された、ただし反応には各5μCiのα-32P-dCTP及びα-32P-dATPが加えられた。
【０１５２】
取り込まれなかったヌクレオチドはG50スピンカラム（GE healthcare）で除去され、得られた混合物は、20 mM Tris-HCl pH 8.5、150 mM NaCl、2 mM MgCl2、5% (v/v)グリセリン、10 μM ZnCl2、0.5 mg/ml BSA及び1 mM DTTから成るFokIバッファーで100倍に希釈された。ZFNsはTnT-QuickTM転写／翻訳結合システム（Promega）をメーカーの勧告に従って用いて、ただしインキュベーション時間を2時間に増やして、発現された。適当なZFNsが混合され、１体積のFokIバッファーで希釈された。開始テンプレートを含まずに１体積のFokIバッファーで希釈された模擬溶液を用いて、Lwt/Rwt混合物を６倍に希釈し、LR結合部位での３つのZFN混合物のすべての活性をほぼ規格化した。等しい体積の希釈された標的部位と希釈されたタンパク質混合物を混合し、37℃で２時間インキュベートした。次に、放射性標識されたDNAがフェノール／クロロホルム混合物で抽出され、PAGEで分析された後、phosphoimager system (Molecular Dynamics)によって定量化された。
【０１５３】
３つの放射性標識されたデュプレックスがL/Rヘテロ二量体又は対応するL/L及びR/Rホモ二量体の標的配列を含んで生成された。図７Aを参照のこと。次に、各標的は、野生型FokI開裂ドメイン（Lwt/Rwt）又は可能な両方の形態（L-/R+及びL+/R-）で“＋”及び“−”変異体を含むL及びR ZFNsによって消化された。
【０１５４】
図７Bに示されているように（中央及び右パネル）、修飾されたヘテロ二量体化開裂ドメインを含むZFNsはヘテロ二量体標的を効率的に開裂し（~50%切断）、ホモ二量体標的に対しては顕著に低い活性を示した。対照的に、ヘテロ二量体標的に対して同程度の活性（61%切断）を示すLwt/Rwt非修飾二量体は、ホモ二量体形成によってLL及びRR標的も効率的に開裂した（図７B、左パネル）。
【０１５５】
ホモ二量体DNA開裂活性はまた、ヘテロ二量体部位と同じ開裂ドメイン変異体を用いてL及びRヌクレアーゼの両方でテストされた。図７Cと表２は、野生型及び／又は突然変異型開裂ハーフドメインの様々なペアを含むZFNsによる開裂を示す。表２では、数字は野生型／野生型ペア（それはこのような条件の下で100%開裂だった）に対する開裂活性を示す。a及びb欄は、各ペアの開裂ドメイン変異体の識別するものである。a/b欄の数字は、L-a + R-b及びL-b + R-aの規格化された活性の平均である；a/a欄の数字は、L-a + R-aの値；b/b欄の数字は、L-b + R-bの値である。
【０１５６】
【表２】
2009538138.tif 000004
【０１５７】
E490K:I538K+ Q486E:I499Lペアが対応する各ホモ二量体で最も低い活性を有するが、このペアは実際、野生型ヌクレアーゼよりも低い活性を有する。タンパク質発現が低いシステム又は低い親和度のヌクレアーゼを用いるシステムでは、他のペア、例えば、E490K + wt又はE490K + Q486E:I499Lなど、が好ましいかもしれない。
【０１５８】
これらの結果は、新しい変異体がZFNホモ二量体の機能を抑制し、標的部位特異的開裂を増加させることを裏付けている。
【０１５９】
実施例６：in vivoでの二本鎖切断の測定
ヘテロ二量体化する開裂ドメインの特異性を、遺伝子修飾手順の文脈で標的を外れた効果を測定することによってさらにテストするために、ゲノム全体にわたるDNA開裂のレベルがこれらのヘテロ二量体を含むZFNsを発現する哺乳類細胞で調べられた。
【０１６０】
特に、DNA損傷の部位に関連したタンパク質の抗体に媒介された検出を用いるDNA二本鎖切断を可視化する２つの十分に裏付けられている分析が行われた。これらの研究で、標的細胞にはZFN発現構築物だけが移入された（すなわち、ドナーDNAは移入されなかった）。二本鎖の切断はヒストンH2AXのリン酸化と53BP1などのDNA損傷応答タンパク質の漸増を誘発する。したがって、細胞に歪みがかかると（例えば、53BP1に対する抗体によって）、各切断のまわりに病巣（foci）が現れる。例えば、Gorgoulis et al. (2005) Nature 434:907-913を参照のこと。したがって、DNA損傷の部位に局在して病巣を形成する53BP1タンパク質の存在を検出する免疫蛍光分析が、本質的にはSchultz et al. (2000) J Cell Biol 151:1381-1390; Anderson et al. (2001) Mol Cell Biol 21:1719-1729 (2001); 及びRappold et al. (2001) J Cell Biol 153:613-620に記載されているように行われた。
【０１６１】
K562 (ATCC)細胞が上述のように生育され、NucleofectionTM (Amaxa Biosystems)によってメーカーの手順に従って形質移入された（Solution V, Program T16）。ZFNsが別のプラスミドで同時移入された。ただし、図８に示されている実験では、両方のZFNsが2Aペプチドのコーディング領域によって隔てられた単一の転写物から発現され、各ZFNは2Aペプチドの部分も含む別々のタンパク質として得られる（Szymczak et al. (2004) Nat Biotechnol 22:589-594）。その結果、余分な20残基のC-末端タグがL ZFNに融合し、L/R ZFN二量体が図８のウエスタンブロットでダブレットとして移動する。
【０１６２】
53BP1免疫細胞化学研究のために、細胞が核移入から1-3日後に集められ、cytospin (Thermo Scientific)によってスライドを調製するために用いられた。細胞は低温メタノールで固定され、0.5% Triton X-100バッファ(0.5% Triton X-100, 1%BSA, 0.02%NaN3, PBS)によって室温で5分間処理された。細胞は非特異的染色を防ぐために5%ヤギ血清と共にインキュベートされた。細胞は、その後、抗53BP1ウサギ・ポリクローナル抗体（Bethyl Laboratories, Montgomery, TX）と共にインキュベートされ、続いてAexa Fluor 594接合二次抗体（Invitrogen-Molecular-Probes）と共に2.5μg/mlのOAPI (Sigma)の存在下でインキュベートされ、細胞核を対比染色した。スライドを取り付け、免疫蛍光顕微鏡の下で調べ、顕微鏡に接続されたディジタル・カメラで画像を取得した。
【０１６３】
抗体による53BP1の検出で、野生型FokI開裂ドメインをヘテロ二量体変異体に置換することによって、K562細胞における53BP1染色病巣の数が視覚的にバックグラウンドと同程度のレベルまで劇的に低下した。この観測は、多重病巣（>3）を含む細胞の割合を定量化することによって確認された。Lwt/Rwt二量体によって誘発されるこのような細胞の割合はバックグラウンドの約2.69倍（43.5% vs. 16.2%）であったが、L-/R+二量体による処理ではもっとわずかな増加になった（21.7% vs. 16.2%、すなわち~1.34倍）。この結果はL-/R+二量体による発現が低いことによるものではなかった。何故なら、ウエスタンブロット分析は、Lwt/RwtとL-/R+の組み合わせで同程度のレベルの発現を確認していた（図８）。
【０１６４】
53BP1の結果を裏付けるために、我々は別の損傷マーカーに対する抗体、リン酸ヒストンH2AX (γH2AX)を用いてこの実験を繰り返した。これは、DNA損傷に応答して生成され、二本鎖切断箇所で病巣を形成する（Rogakon et al. (1998) J Biol Chem 273:5858-5868; Rogakon et al. (1999) J Cell Biol 146:905-916; 及び、Stiff et al. (2004) Cancer Res 64:2390-2396 (2004)、を参照のこと）。
【０１６５】
γH2AXフローサイトメトリー分析では、細胞は核移入の1-3日後に集められ、2%パラホルムアルデヒド-PBSで固定され、パーマ/洗浄バッファー（0.05% Saponin, 2.5% FBS, 0.02% NaN3, PBS）によって透過化処理された。次に、細胞は新しくラベルされた抗γH2AXモノクローナル抗体（Upstate, Lake Placid, NY）、又はネガティブ対照として新しくラベルされた対照マウスIgG1 (Invitrogen)、と共にインキュベートされる；どちらの抗体もゼノン R-フィコエリトリン(PE)ウサギIgGラベリング・キット（Invitrogen-Molecular-Probes, Eugene, OR）をメーカーの指示に従って用いてラベルされた。染色された細胞は、Guava EasycyteTM単一細胞分析システムを用いて分析された。525 nmと583 nmの両方で蛍光を独立に測定してフィコエリスリン信号を自己蛍光から分離した（補償を用いて583 nmチャンネルでフィコエリスリン信号を分離した）。
【０１６６】
定量化は、フローサイトメトリーによって、γH2AX信号を自己蛍光から分離するようにゲートを経験的に調整して抗体染色された細胞の割合をカウントすることによって行われた。野生型FokI開裂ドメインを＋／−ヘテロ二量体で置換すると、γH2AXポジティブ細胞の割合が18.9%から1.7%に低下し、変異体ドメインによって誘発される標的から外れた開裂事象の数が顕著に低下することを示した。さらに、個別に移入されるとLwtとRwtはどちらもかなりの数のγH2AXポジティブ細胞を生じ（それぞれ、4.8%と10.4%）、ホモ二量体化による標的から外れた開裂が、このシステムで両方のZFNsで起こることを示した（図９）。
【０１６７】
最後に、ゲノム全体にわたる特異性の改善が、意図した標的における効力を犠牲にして達成されたものでないことを確かめるために、我々は、また、IL2Rγ遺伝子座のZFN誘発修飾をモニターした。ドナーが存在しない場合、非相同断端結合による遺伝子修復はDBSの部位に小さな挿入と欠失を生じ（Jeggo (1998) Adv Genet 38:185-218を参照のこと）、それらの事象の頻度を測定することがin vivoでのZFN活性を測る好適な手段となる。これは、問題の領域のPCR増幅と、それに続くアニーリングで配列の変化をミスマッチと膨れ（bulge）に変換することで遂行された。次に、再アニールされたPCR産物はSurveyorTMヌクレアーゼ（Transgenomic）によって消化された。この消化はDNAをデュプレックス歪みの部位で優先的に切断する（Qiu et al. (2004) Biotechnique 36:702-707）。図９に示されているように、Lwt/Rwt、L+/R-、及びL-/R+で処理された細胞で同じようなレベルのアンプリコンが開裂され、これらのZFNsがIL2Rγ標的遺伝子座で同じような細胞活性を有することが示された。
【０１６８】
これらの研究は、設計されたZFNsが標的から外れた開裂についてin vivoでテストされた最初の研究であり、ヘテロ二量体変異体が標的遺伝子座のin vivo修飾に関する完全な活性を保持したが、標的から外れた開裂のレベルはかなり大きく低下することを示す。
【０１６９】
要約すると、以上の結果は、FokI突然変異体E490K:I538K及びQ486E:I499Lがオブリゲートなヘテロ二量体を形成することをはっきりと示している。さらに、これらの改変開裂ハーフドメインを含む融合ポリペプチドは、親Fok（ZFP融合体として）のレベルと同程度のレベルで遺伝子修正を刺激するが、細胞分析で測定される全開裂事象の数は少なくなる。
【図１】
2009538138.tif 000005
【図２Ａ】
2009538138.tif 000006
【図２Ｂ】
2009538138.tif 000007
【図３】
2009538138.tif 000008
【図４】
2009538138.tif 000009
【図５】
2009538138.tif 000010
【図６】
2009538138.tif 000011
【図７】
2009538138.tif 000012
【図８】
2009538138.tif 000013
【図９】
2009538138.tif 000014
【配列表】
2009538138000001.app
【国際調査報告】
2009538138.tif 000015
2009538138.tif 000016
2009538138.tif 000017