(57)【要約】  本発明は、疎水性及び親水性の両医薬活性物質が封入され得る、カチオン性表面電位を有するポリマーナノ粒子を記載する。荷電されたポリマーとのイオン複合体化により、親水性及び従って、水溶性物質が同時沈殿物により粒子コアーに封入される。治療剤及び診断剤の両者が、封入のための医薬活性物質として使用され得る。カチオン性粒子表面は、受動的及び活性標的化を改良するために標的−特異的リガンドを含むことができる、部分的に反対に荷電された化合物による安定した静電表面変性を可能にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カチオン性ポリマー及び控えめな水溶性であるポリマーを含む、カチオン性表面電位を有するポリマーナノ粒子であって、診断及び/又は治療剤を含むことを特徴とするポリマーナノ粒子。
【請求項２】
沈殿された凝集体を含んで成ることを特徴とする請求項１記載のポリマーナノ粒子。
【請求項３】
前記控えめな水溶性ポリマーが、ポリシアノアクリレート、ポリアルキルシアノアクリレート（PACA）、ポリエステル、アルギン酸、ヒアルロン酸、ポリシアル酸、酸性セルロース誘導体、酸性澱粉誘導体、多糖、ポリマータンパク質、ポリアミド、ポリ水和物、ポリオルトエステル、ポリカプロラクトン、ポリリン酸、ポリ（アミドエナミン）、アゾポリマー、ポリウレタン、ポリオルソエステル、デンドリマー、擬似ポリアミノ酸、又は前記化合物のすべての混合物及びコポリマーであることを特徴とする請求項１又は２記載のポリマーナノ粒子。
【請求項４】
前記控えめな水溶性ポリマーが、ポリブチルシアノアクリレート（PBCA）であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載のポリマーナノ粒子。
【請求項５】
カチオン的に変性されたポリアクリレートP（DMAEMA）、ジエチルアミノエチル−変性されたデキストラン、ヒドロキシメチルセルローストリメチルアミン、ポリリシン、プロタミンスルフェート、ヒドロキシエチルセルローストリメチルアミン、ポリアリルアミン、塩化プロタミン、ポリアリルアミン水和化された塩、ポリアミン、ポリビニルベンジルトリメチルアンモニウム塩、ポリジアリルジメチルアンモニウム塩、ポリイミダゾリン、ポリビニルアミン及びポリビニルピリジン、ポリエチレンイミン（PEI）、プトレッシン（ブタン−１，４−ジアミン）、スペルミジン（N（３−アミノブロピル）ブタン−１，４−ジアミン）、スペルミン（N, N’−ビス（３−アミノプロピル）ブタン−１，４−ジアミン）、ジメチルアミノエチルアクリレート、ポリ−N、N,−ジメチルアミノエチルメタクリレート、ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド、ジメチルアミノスチレン、ビニルピリジン及びメチルジアリルアミン、ポリ−DADMAC、グアール、又は脱アセチル化されたキチン、及び適切な無機又は低分子量有機酸と共に形成することができるそれらの対応する塩を含む請求項１又は２記載のポリマーナノ粒子。
【請求項６】
カチオン的に変性されたポリアクリレートP（DMAEMA）を含む請求項５記載のポリマーナノ粒子。
【請求項７】
ポリエチレンイミンを含むことを特徴とする請求項５記載のポリマーナノ粒子。
【請求項８】
前記表面が、静電的に変性されることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項記載のポリマーナノ粒子。
【請求項９】
前記表面が、Glu(10)-b-PEG(110)により変性されることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項記載のポリマーナノ粒子。
【請求項１０】
前記診断及び/又は治療剤が、負に荷電され、そして粒子におけるカチオン性ポリマーによりイオン対として封入されることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項記載のポリマーナノ粒子。
【請求項１１】
前記診断剤が蛍光色素を含んで成ることを特徴とする請求項１〜10のいずれか１項記載のポリマーナノ粒子。
【請求項１２】
前記診断剤が蛍光NIR色素を含んで成ることを特徴とする請求項１〜10のいずれか１項記載のポリマーナノ粒子。
【請求項１３】
前記診断剤がカルボシアニン色素を含んで成ることを特徴とする請求項１〜12のいずれか１項記載のポリマーナノ粒子。
【請求項１４】
前記診断剤TSC(テトラスルホシアニン)を含んで成ることを特徴とする請求項１〜13のいずれか１項記載のポリマーナノ粒子。
【請求項１５】
前記診断剤がIDCC(インドジカルボシアニン)を含んで成ることを特徴とする請求項１〜13のいずれか１項記載のポリマーナノ粒子。
【請求項１６】
前記診断剤がICG(インドシアニンGreen)を含んで成ることを特徴とする請求項１〜13のいずれか１項記載のポリマーナノ粒子。
【請求項１７】
前記治療剤が、新形成性疾病又は炎症反応を有する疾病の処理のための物質を含んで成ることを特徴とする請求項１〜10のいずれか１項記載のポリマーナノ粒子。
【請求項１８】
標的構造体を供給することを特徴とする請求項１〜10及び17のいずれか１項記載のポリマーナノ粒子。
【請求項１９】
前記標的構造体が負に荷電された成分を有し、そして静電相互作用によりカチオン性粒子表面に適用されることを特徴とする請求項18記載のポリマーナノ粒子。
【請求項２０】
前記標的構造体が、抗体、タンパク質、ポリペプチド、多糖、DNA分子、RNA分子、化学単位、核酸、脂質、炭水化物、又は前記のものの組合せを含んで成ることを特徴とする請求項18又は19記載のポリマーナノ粒子。
【請求項２１】
前記粒子のサイズが、１〜800nmの範囲であることを特徴とする請求項１〜10のいずれか１項記載のポリマーナノ粒子。
【請求項２２】
前記粒子のサイズが、５〜800nmの範囲であることを特徴とする請求項１〜10のいずれか１項記載のポリマーナノ粒子。
【請求項２３】
前記粒子のサイズが、１〜500nmの範囲であることを特徴とする請求項１〜10のいずれか１項記載のポリマーナノ粒子。
【請求項２４】
前記粒子のサイズが、５〜500nmの範囲であることを特徴とする請求項１〜10のいずれか１項記載のポリマーナノ粒子。
【請求項２５】
前記粒子のサイズが、１〜300nmの範囲であることを特徴とする請求項１〜10のいずれか１項記載のポリマーナノ粒子。
【請求項２６】
前記粒子のサイズが、５〜300nmの範囲であることを特徴とする請求項１〜10のいずれか１項記載のポリマーナノ粒子。
【請求項２７】
前記粒子のサイズが、10〜300nmの範囲であることを特徴とする請求項１〜10のいずれか１項記載のポリマーナノ粒子。
【請求項２８】
疾病、新形成性疾病又は炎症反応を有する疾病の診断又は治療のためへの、請求項１〜26のいずれか１項記載のポリマーナノ粒子の使用。
【請求項２９】
請求項１〜27のいずれか１項記載のポリマーナノ粒子の生成方法であって、次の工程段階：
・有機溶媒又は溶媒/水混合物へのカチオン性ポリマーの溶解、
・有機溶媒への前記水不溶性ポリマーの溶解、
・前記有機溶媒又は溶媒/水混合物への活性物質（診断又は治療剤）の溶解、
・カチオン性ポリマー、水不溶性ポリマー及び活性物質の完全に溶解された混合物の調製、
・界面活性剤含有溶液への前記混合物の添加、それに伴う沈殿された凝集体の自発的形成、
・   溶媒の除去、
・前記ナノ粒子分散体及び変性剤を一緒に、適切な量で添加することによる粒子の静電表面変性（任意）が実施されることを特徴とする方法。
【請求項３０】
医薬的に許容できる賦形剤を用いての医薬製剤/医薬形の製造のためへの請求項１〜27のいずれか１項記載のポリマーナノ粒子の使用。
【請求項３１】
医薬製剤が、適切な適用システムを通して、ヒト又は動物に、投与の適切な経路を通して投与することを特徴とする請求項１〜27 のいずれか１項記載のポリマーナノ粒子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の記載：
本発明は、疎水性及び親水性の両医薬活性物質が封入され得る、カチオン性表面電位を有するポリマーナノ粒子を記載する。荷電されたポリマーとのイオン複合体化により、親水性及び従って、水溶性物質が同時沈殿物により粒子コアーに封入される。治療剤及び診断剤の両者が、封入のための医薬活性物質として使用され得る。カチオン性粒子表面は、受動的及び活性標的化を改良するために標的−特異的リガンドを含むことができる、部分的に反対に荷電された化合物による安定した静電表面変性を可能にする。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景：
ナノ粒子薬剤供給システムの特定の性質は主にそれらの小さなサイズに基づかれ、その結果、種々の生理学的バリヤーが克服され得る（Fahmy T.M., Fong P.M. など., Mater. Today, 2005; 8(8): 18-26）。生物における連合する変更された分布が、例えば種々の新形成性疾病の診断及び治療の両者に役立つよう使用され得る。
【０００３】
疾病を検出し、そして処理するために使用され得るナノ粒子システムは、治療検出剤（teranostics）(＝治療剤（therapeutic agent）＋診断剤（diagnostic agent）)と呼ばれる。関連する治療モニターリングは、今後、治療に対する耐性のより早い認識を可能にし、そして他の治療の初期使用を通して患者の回復性を高く改良するであろう（Emerich D.F., Thanos CG., Curr. Nanosci., 2005; 1 : 177-188）。
【０００４】
細胞増殖抑制剤は、腫瘍治療に非常に都合よく使用される物質の種類を表す。身体の急速に分裂する細胞、例えば腫瘍細胞のすべては、それらの物質により損傷される。しかしながら、これは、腫瘍細胞の死を導くのみならず、また他の生存器官及び組織、例えば骨髄、粘膜又は心血管にも影響を及ぼす。関連する所望しない毒性はしばしば、治療において用量−制限因子である（Silacci D., Neri M., Modern Biopharmaceuticals: Design, development and optimization, Volume 3, Part V, Wiley-VCH, Weinheim, 2005; 1271-1299）。
【０００５】
ナノ粒子システムにおけるそのような物質の封入により、健康な組織への損傷が低くなり、そして腫瘍組織における活性物質の局部的に高い濃度が達成され得ることが示されている（Silacci D., Neri M., Modern Biopharmaceuticals: Design, development and optimization, Volume 3, Part V, Wiley-VCH, Weinheim, 2005; 1271 -1299）。市販の製品Doxil（商標）の成功した紹介は、このナノ配合物の臨床学的利点の証明である。
【０００６】
増強された透過及び保持効果（EPR-効果）が主に、これを担当できると思われて来た。このEPR−効果はすでに、固形腫瘍における標的化された薬物蓄積のための手段として、1986年Matsumura及びMaedaにより記載されている（Matsumura Y., Maeda H., Cancer Res., 1986; 46: 6387-6392][Maeda H., Adv. Enzyme Regul., 2001 ; 41 : 189-207）。これは、腫瘍組織又は炎症組織の構造特性を利用する受動的蓄積機構を包含する（Ulbrich K., Subr V., Adv. Drug Deliv. Rev., 2004; 56(7): 1023-1050）。
【０００７】
特に、その急速な増殖及び種々のメッセンジャー物質のために、腫瘍組織は一般的に、有窓の“穴のある”組織構造、及びリンパドレナージの不在により特徴づけられる。腫瘍のタイプに依存して、有窓のサイズは一般的に380nm〜780nmであり、その結果、この範囲はまた、ナノサイズ窓とも呼ばれる（Hobbs S. K., Monsky W. L. など., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1998; 95: 4607- 4612；Brigger I., Dubernet C. など., Adv. Drug Deliv. Rev., 2002; 54(5): 631 -651）。対照的に、正常組織、例えば心臓、脳又は肺は、10nm以下（一般的に2nm〜4nm）の直径を有する場合、コロイド状薬物ビークルに対して不透過性である、いわゆる堅い連結部を有する（Hughes G.A., Nanomedicine, 2005; 1 (1 ): 22-30）。従って、血流において循環するナノ粒子は、血流からの拡散により腫瘍組織において受動的に蓄積することができる。リンパドレナージの不在が、腫瘍において長期続く蓄積を促進するか、又はナノ粒子の急速な流出を妨げる（EPR−効果）。
【０００８】
可能性あるこの蓄積機構のために、ナノ粒子は、十分な時間、血流において循環すべきである。これは、約10nm〜380nmの粒子サイズ及び適切な粒子表面を必要とする。例えば、ペギレート化された粒子表面は、網内皮細胞システム（RES）の器官を通して急速な排除により、外来物としての粒子を同定する身体自体のタンパク質を妨げることができる（Otsuka H. など., Adv. Drug DeNv. Rev., 2003; 55(3): 403- 419）。粒子表面上の活性リガンド（例えば、抗体）を用いることにより、組織−特異的蓄積がさらに最適化され得る（Nobs L. など., . Pharm. Sei., 2004; 93: 1980-1992；Yokoyama M., J. Artif. Organs, 2005; 8: 77-84）。
【０００９】
細胞中に吸収されるべき活性物質のためには、さらにもう１つの生理学的バリヤー、すなわち細胞膜が克服されるべきである。多くの医学物質のための１つの困難性は、細胞が外来性又は毒性物質を排出するための非常に効果的な輸送機構（例えば、P−糖タンパク質）を有することである。しかしながら、ナノ粒子の助けにより、活性物質がエンドサイトーシスにより細胞中に運ばれる場合、輸送体の排出が回避され、そしていわゆる多薬物耐性（MDR）が妨げられ得る（Bharadwaj V., J. Biomed. Nanotechnol., 2005; 1 : 235-258；Huwyler J. など., J. Drug Target., 2002; 10(1 ): 73-79）。
【００１０】
ナノ粒子は一般的に、エンドサイトーシスにより細胞中に組込まれる。この理由のために、吸収工程の後、粒子はエンドソーム又はエンドリソソームに含まれる（Koo O.M.など., Nanomedicine, 2005; 1 (3):193-212）。エンドリソソームからの粒子の開放が発生する場合、小胞内の活性物質及びコロイド状ビークルシステムの酵素分解が存在する。粒子及び従って、活性物質のエンドリソソーム性解放は、細胞内治療効果のために必須である。
【００１１】
ナノ粒子からの活性物質の開放性質はさらに、ポリマーの適切な選択により調節され得る。従って、ナノ粒子配合物は、適用の頻度を最少にすることができ、そして治療的に必要な用量の低下を導くことができる。さらに、所望しないピーク血漿レベルがナノ粒子における封入により回避され得、そして遅延された開放性が達成され得る。
【００１２】
要約すると、次の利点が、ポリマーナノ粒子の開発のために決定的になる：（i）（ａ）受動的にEPR−効果による、（ｂ）活性的に組織−又は細胞−特異的リガンド、例えば抗体による、活性物質の標的化された蓄積、（ii）ポリマーの適切な選択による調節できる活性物質開放、（iii）血漿レベルでの大きな変動の回避、（iv）用量の低減又は等用量での有効性の上昇化、（v）より少ない副作用及び改良された安定性プロフィール、（vi）改良されたコンプライアンスを伴っての適用の低められた頻度、及び（vii）耐性機構の回避（Rosen H., Abribat T., Nature Reviews Drug Discovery, 2005 May; 4(5): 381 -5、McLennan D.N., Porter C. J. H.など., Drug Discovery Today: Technologies, 2005 Spring; 2(1): 89-96）。
【００１３】
記載されるすべての利点をすでに満たしているナノ粒子システムはまだ、技術状態において開発されていない。さらに、現在考えられ得るすべての問題についての最適なナノ配合物は存在しないことは、文献に記載される多くの種類のナノ粒子ビークルシステムから明白である。サイズの他に、粒子の全体の構造、マトリックス形成物質及び特にそれらの表面は、インビボ挙動性のための決定的に重要性のものである（Choi S.W., Kim W. S., Kim J. H., Journal of Dispersion Science and Technology, 2003; 24(3&4): 475-487）。さらに、異なった活性物質の生理学的性質は相当に変化する。従って、改良された性質を有するコロイド状薬剤ビークルシステムの開発のための必要性がまだ存在する。
【００１４】
未来の治療アプローチのために、蓄積が主に、疾病組織（例えば、腫瘍）において存在する、生物における粒子の分布の診断検出により改良することが必要であろう。イメージング技法、例えばソノグラフィー、X−線診断、断面−イメージング技法（CT、MRT）及び核医学（PET、SPECT）が、インビボ検出のために利用できる。もう１つの比較的新しい方法は、光学的イメージング（この検出原理は、近赤外蛍光の使用に基づかれる）である。それは、電離線なしに作動し、そしてMRTのような方法に比較して、非常に費用効率が良く、そして時間浪費ではない非侵襲性方法である。そのような用途のために開発されたNIR色素、例えばインドシアニングリーンは、水において非常に良好な溶解性を有し、その結果、それらが疎水性ポリマーマトリックスに効果的に封入されることは困難である。このための理由は、例えばナノ粒子の生成の間、水性相への親水性物質の急速な変化である。
【００１５】
ナノ粒子における親水性物質の封入のためには、わずかに少数の技法が利用でき、そしてそれらは種々の欠点を有する。
リポソーム又はポリメソソームの両親媒性特性は、粒子の水性内部への親水性物質の封入を可能にし、そして疎水性化合物は膜に取り込まれ得る。粒子のコアー又はシェルへの局在化のために、充填は非常に制限され、そして従って、一般的に不適切である。もう１つの欠点は、特に水性環境下での親水性物質がそのようなシステムからすばやく流出することである。
【００１６】
高分子電解質複合体における水溶性物質のもう１つの封入は、色素、例えばインドシアニングリーン（ICG）はほとんど荷電された基を有さない小さな分子であり、その結果、不十分な電荷が静電複合体化のために利用できるので、制限された程度まで可能である。さらに、水溶液における高分子電解質複合体は非常に動的なシステムであり、その結果、それらは一般的に血漿において適切なコロイド安定性を有する（Thuenemann A.F. など., Adv. Polym. Sei., 2004; 166: 113-171）。
【００１７】
すでに記載されたように、未来において、粒子の蓄積が主に標的位置、例えば腫瘍で生じることを、診断ナノ粒子により示すことが必要であろう。この証明が提供される場合、治療的活性物質が全く同一のシステムに封入され、そして作用の部位で最大の治療効果を達成することができる。なぜならば、ナノ粒子の所望する分布が診断システムを用いてすでに示されているからである。粒子の分布性質の変更を回避するために、診断検出及び続く処理のために全く同一のナノ粒子システムを使用できることが重要である。
【００１８】
すでに記載されたように、親水性又は疎水性物質の封入のために適切であるいくつかの異なったナノ粒子システムが存在する。ナノ粒子の性質、例えば粒子サイズ、表面材料、マトリックスポリマーのタイプ又は異なった界面活性剤の使用のわずかな変化が、身体における粒子の分布に対して莫大な影響を有することが文献から知られている。従って、診断、治療及びたぶん、さらに全く同一のシステムによる処理のモニターリングを実施できることは重要である。
【００１９】
従って、理想的には、診断及び治療物質の疎水性質のために、一般的に水における低い溶解性を有する診断及び治療物質のための水溶性色素を、全く同一のナノ粒子システムに、効果的且つ洗浄に対して十分な安定性をもって封入することが可能であるべきである。
【００２０】
追加の技術的挑戦は、一方では、十分な粒子安定性及び他方では、標的組織における特異的蓄積を、適切な表面の使用により確保することである。それが蓄積の部位（標的組織）で残存するかどうかは、中でも、粒子が組織及び細胞中にいかに十分に吸収されるかに依存する。
【００２１】
カチオン性粒子表面が細胞中への摂取を促進することは文献から知られている（Mounkes L.C. など., J. Biol. Chem., 1998; 273(40): 26164-26170；Mislick K.A., Baldeschwieler J. D., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1996; 93: 12349-12354）。これは、負に荷電された細胞膜（スルフェート化されたプロテオグリカン）と、カチオン性粒子表面（一般的に陽子化されたアミン機能）との間の静電相互作用のためである。さらに、アミノ基を担持するポリマー又は物質は、エンドオズモライティク活性を有することが知られており、すなわちそれらはエンドリソソーム膜に損傷を与えることにより、エンドリソソームからの粒子の細胞内開放を促進する（DeDuve C. など., Biochem. Pharmacol., 1974; 23:2495-2531）。
【００２２】
粒子がエンドリソソームにおける細胞内に存在する場合、粒子マトリックス及びそして組込まれる物質は、細胞自身の酵素により分解される。従って、封入された活性物質のエンドリソソーム開放は、治療効果のために必須である。しかしながら、時々、重度の毒素学的効果が、強くカチオン荷電された界面活性剤を伴ってのポリプレックス及び脂質のインビボ研究の間、記載されている問題が存在する（Kircheis S. など., J. Gene Med., 1999; 1 : 1 1 1-120；Ogris M. など., Gene Ther., 1999;6: 595-605）。その理由は、カチオン性粒子が負に電荷された赤血球と凝集し、そしてこれが血管の遮断を導くことである。
【００２３】
さらに、これは一般的に、肺において相当の蓄積を導き、これを通して、粒子は、適用の後、第１の毛管層として通過する（Kircheis R. など., Drug Deliv. Rev., 2001 ; 53(3): 341 -58）。この場合、粒子及び赤血球又は他の血液成分の凝集体により促進される肺塞栓症の危険性が存在する（Kircheis S. など., J. Gene Med., 1999; 1 : 1 1 1-120；Ogris M. など., Gene Ther., 1999;6: 595-605）。
【００２４】
従って、理想的には、インビボ使用を妨げる、可能性ある毒素学的に問題のある性質を伴わないで、カチオン性表面性質を有するナノ粒子システムが生成されるべきである。さらに、粒子表面は、標的組織における血流からの粒子の対応する蓄積のための必要条件である、十分に長い循環時間を初めて可能にする、身体自身の防御機構（オプソニン、RES）に対して目立つべきでない。ナノ粒子システムはまた、標的細胞中への摂取及びエンドリソソーム開放を促進すべきである。
【００２５】
ナノ粒子システムの生成におけるさらなる困難性は、粒子表面上への適切な物質又は標的構造体を適用することである。
【００２６】
しばしば、粒子の表面は、共有カップリング反応により変性される。このための必要条件は、化学カップリング反応により標的分子に不可逆的に結合され得る、ポリマー主鎖又は粒子表面上での官能基の存在である（Nobs L. など., J. Pharm. Sei., 2004; 93: 1980-1992）。コロイド状分散体の安定性はしばしば、試薬により、又は反応条件下で高く還元されるので、化学工程は一般的に高価で且つ問題がある（Koo O.M. など., Nanomedicine, 2005; 1 (3):193-212；Choi S.W. など., J. Dispersion Sei. Technol., 2003; 24(3&4): 475-487）。分子及び粒子表面の共有カップリングはさらに、可能性ある所望しない化学反応を回避するために表面に適用されるべき個々の新しい分子のために特に適合されるべきである。しばしば共有カップリング反応のために使用される有機溶媒の回避はまた、環境汚染を低めるために、及び反応の実施を単純化するために所望される。
【００２７】
従って、理想的には、表面変性は、非共有性であり、実施するのに単純であり、そして従って柔軟であるが、しかし安定性であるべきである。
【００２８】
文献から知られているコロイド状システムは一般的に、疎水性物質又は他方では、親水性物質の封入のために適切である。時折使用される粒子の共有表面変性の場合、全く同一の粒子上への非常に変更された構造の使用に関して、ほとんど柔軟性はない。さらに、特異的蓄積のためのリガンドはしばしば、実際の腫瘍組織における摂取及び特に細胞摂取に悪影響を及ぼす。粒子は適切な循環を確保し、そして標的組織において受動的に又は活動的に十分に蓄積されるけれども、一般的にインターナリゼーション及びエンドリソソーム開放は最適ではない（van Osdol W., Cancer Res., 1991 ; 51 : 4776-4784；Weinstein J. N. など., Cancer Res., 1992; 52(9): 2747-2751）。
【００２９】
従って、（i）水溶性及び控えめな水溶性医薬活性物質を、効果的に及び流出に対する十分な安定性を伴って、封入し、（ii）非共有性であり、実施するのに単純であり（柔軟性であり）、そしてそれにもかかわらず、安定性である表面変性を可能にし、（iii）十分な循環時間を可能にし、（iv）標的組織中に効果的に吸収され、そして（v）エンドリソソームから細胞内に開放される、医薬ナノ粒子配合物についての必要性がまだ存在する。
【００３０】
従って、本発明の１つの目的は、一方では、親水性及び疎水性活性物質が封入され得る改良された医薬配合物を入手することであった。他方では、柔軟且つ十分に安定した表面変性が疾病組織における最適な蓄積を可能にすべきである。最大の診断又は治療効果を達成できるためには、そのようなコロイド状システムはまた、エンドリソソーム開放が起こる、標的組織及び個々の細胞中に効果的に摂取されるべきである。さらに、生成を適切な時間で及び許可できる費用で可能にするための生成方法が実施できるべきである。
【発明の開示】
【００３１】
発明の記載：
本発明は、カチオン性ポリマー及び控えめな水溶性であるポリマーを含む、カチオン性表面電位を有する、診断及び/又は治療剤を含むことを特徴とするポリマーナノ粒子に関する。
【００３２】
水溶性カチオン性ポリマーと、控えめな水溶性ポリマーとの同時沈殿により、カチオン的に官能価された表面を有する安定したポリマーナノ粒子が生成され得る。さらに、疎水性で容易な水溶性の物質及び疎水性で控えめな水溶性である物質の両者が上記ナノ粒子のポリマーマトリックスに封入され得ることは、本発明において驚くべきことであった。思いがけなく、低分子量の水溶性物質と、荷電されたカチオン性ポリマーとのイオン複合体化は、ナノ沈殿による粒子のポリマーマトリックスにおける好結果を生む封入を導く。本発明においては、種々の疾病の診断及び/又は治療のために適切である物質は、ポリマー粒子に封入され得る。
【００３３】
さらに、カチオン的に官能価された粒子表面は部分的に反対に電荷された化合物により安定して及び柔軟に静電的に表面変性され得ることが見出された。記載される発明は、疾病の認識（診断）、疾病の処理（治療）、及び処理のモニターリングのために適切である。さらに、本発明は、特定の医薬形のために必要とされる医薬的に許容できる賦形剤を用いての適切な医薬形を含んで成る。本発明において開発される医薬形は、種々の投与経路を通して、ヒト又は動物に使用され得る。必要な適用システムはまた、本明細書に記載される発明の一部を形成する。
【００３４】
ナノ粒子の組成物は、好ましくは生物分解ポリマー又は種々の生物分解ポリマーの混合物である、控えめな水溶性のポリマーを含んで成る。生物分解ポリマーは、重合又は他の工程により前記ポリマーを形成する個々のモノマー単位に関して記載され得る。
【００３５】
１つの態様においては、控えめな水溶性のポリマーは、天然及び/又は合成ポリマー、又は対応するモノマーのホモ−及びコポリマーから誘導される。特に、ポリマーは、アルキルシアノアクリレート群、例えばブチルシアノアクリレート及びイソブチルシアノアクリレート、アクリレート、例えばメタクリレート、ラクチド、例えばL−ラクチド又はDL-ラクチド、グリコリド、カプロラクトン、例えばε−カプロラクトン及び他のものから誘導される。
【００３６】
もう１つの態様においては、前記ポリマー又はそのポリマーの一部は、ポリシアノアクリレート及びポリアルキルシアノアクリレート（PACA）、例えばポリブチルシアノアクリレート（PBCA）、ポリエステル、例えばポリ（DL−ラクチド）、ポリ（L−ラクチド）、ポリグリコリド、ポリジオキサノン、ポリオキサゾリン、ポリ（グリコリド−コ−トリメチレン−カーボネート）、ポリラクチド−コ−グリコリド（PLGA）、例えばポリ（L−ラクチド−コ−グリコリド）又はポリ（DL−ラクチド−コ−グリコリド）、ポリ（L−ラクチド−コ−DL−ラクチド）、ポリ（グリコリド−コ−トリメチレン）、ポリ（カーボネート−コ−ジオキサノン）、アルギン酸、ヒアルロン酸、ポリシアル酸、酸性セルロース誘導体、酸性澱粉誘導体、多糖、例えばデキストラン、アルギネート、シクロデキストリン、ヒアルロン酸、キトサン、酸性ポリアミノ酸、ポリマータンパク質、例えばコラーゲン、ゼラチン又はアルブミン、ポリアミド、例えばポリ（アスパラギン酸）、ポリ（グルタミン酸）、ポリリシン、ポリ（イミノカーボネート）、チロシン由来のポリ(カーボネート)、ポリ（β−ヒドロキシブチレート）、ポリ無水物、例えばポリセバシン酸（ポリ（SA））、ポリ（アジピン酸）、ポリ（CPP−SA）、ポリ（CPH）、ポリ（CPM）、芳香族ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリカプロラクトン、例えばポリ−ε−又はγ−カプロラクトン、ポリスルホン酸、例えばポリホスフェート、ポリホスホネート、ポリホスファゼン、ポリ（アミド−エナミン）、アゾポリマー、ポリウレタン、ポリオルトエステル、デンドリマー、擬似ポリアミノ酸、及び前記化合物のすべての混合物及びコポリマーから成る群から選択される。
【００３７】
好ましい態様においては、控えめな水溶性のポリマーは、ポリアルキルシアノアクリレート（PACA）の群からである。
それらのポリアルキルシアノアクリレートの構成は、下記に与えられる構造（式１）により示され、ここで言及される残基Rは好ましくは、１〜16個の炭素原子を有する線状及び枝分かれ鎖のアルキル基、シクロへキシル、ベンジル又はフェニル基を示す：
【００３８】
【化１】
2009539793.tif 000002
【００３９】
もう１つの好ましい態様においては、控えめな水溶性のポリマーは、ポリブチルシアノアクリレート（PBCA）（式２）である：
【００４０】
【化２】
2009539793.tif 000003
【００４１】
本発明においては、控えめな水溶性のポリマーは、粒子のポリマーマトリックスの大きな部分を形成する。
【００４２】
驚くべきことには、アミノ基を有する化合物、特に控えめな水溶性の固体ポリマーマトリックスにカチオン性ポリマーを組込むことにより、カチオン的に荷電された表面電位（ゼータ電位）を有するナノ粒子が生成されることが見出された。
１つの態様においては、カチオン性ポリマーは、天然及び/又は合成ポリマー群、又は対応するモノマーのホモ−及びコポリマーから誘導される。
【００４３】
水性有機溶媒に溶解性である、いずれかの低分子量酸により塩を形成できる、遊離第一、第２又は第三アミノ基を有するポリマーは、本発明におけるカチオン性ポリマーとして適切である。第四アンモニウムを有するポリマーは、本発明におけるカチオン性ポリマーとして適切である。第四アンモニウム基を担持し、そして有機溶媒性であるポリマー又はその塩がまた適切である。
【００４４】
好ましい態様においては、カチオン性ポリマー、ポリカチオン及びポリアミン化合物、又は対応するモノマーのホモ−及びコポリマーからのポリマーの次の群が特に適切である：変性された天然カチオン性ポリマー、カチオン性タンパク質、合成カチオン性ポリマー、種々の鎖長のアミノアルカン、変性されたカチオン性デキストラン、カチオン性多糖、カチオン性澱粉又はセルロース誘導体、キトサン、グアール誘導体、カチオン性シアノアクリレート、メタクリレート及びメタクリルアミド、及び適切な無機又は低分子量有機酸により形成され得る、対応する適切な化合物及び対応する塩を形成するために使用され得るモノマー及びコモノマー。
【００４５】
これは特に次のものを包含する：ジエチルアミノエチル−変性されたデキストラン、ヒドロキシメチルセルローストリメチルアミン、ポリリシン、プロタミンスルフェート、ヒドロキシエチルセルローストリメチルアミン、ポリアリルアミン、塩化プロタミン、ポリアクリルアミン水和化された塩、ポリアミン、ポリビニルベンジルトリメチルアンモニウム塩、ポリジアリルアンモニウム塩、ポリイミダゾリン、ポリビニルアミン及びポリビニルピリジン、ポリエチレンイミン（PCI）、プトレッシン（ブタン−１，４−ジアミン）、スペルミジン（N（３−アミノブロピル）ブタン−１，４−ジアミン）、スペルミン（N, N’−ビス（３−アミノプロピル）ブタン−１，４−ジアミン）、ジメチルアミノエチルアクリレート、ポリ−N、N,−ジメチルアミノエチルメタクリレート、ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド、ジメチルアミノスチレン、ビニルピリジン及びメチルアリルアミン、ポリ−DADMAC、グアール、脱アセチル化されたキチン、及び適切な無機又は低分子量有機酸と共に形成することができるそれらの対応する塩。塩形成のための適切な酸は次のものである：塩酸、硫酸、特にまた、酢酸、グリコール酸又は乳酸。
【００４６】
１つの態様においては、アミノ基を担持する化合物、特にカチオン性ポリマーは、水、好ましくはアセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、ジメチルスルホキシド（DMSO）と混和性である有機溶媒、又はそれらの溶媒と水との混合液に溶解され得る。
特に好ましい態様においては、ポリマーナノ粒子は、アミノ基を担持する化合物として、カチオン的に変性されたポリアクリレート（ポリ−N, N−ジメチルアミノエチルメタクリレート、P（DMAEMA））（式３）を含む：
【００４７】
【化３】
2009539793.tif 000004
【００４８】
生物学的に分解できる、カチオン的に変化されたポリアクリレートP（DMAEMA）は、ポリマーマトリックス、特にPBCA−ポリマー−マトリックスに、ナノ沈殿により封入される。得られるナノ粒子の表面は、カチオン性ポリマーのアミノ基のために、正（カチオン）の表面電位（ゼータ電位）を有する。カチオン性粒子表面は、良好な細胞摂取を確保し、そして部分的にアニオン荷電された化合物による柔軟な静電表面変性を可能にする。
【００４９】
もう１つの好ましい態様においては、ポリマーナノ粒子は、カチオン性ポリマーとして、変性されたポリアクリレートポリ（ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド）を含む。
もう１つの好ましい態様においては、ポリマーナノ粒子は、カチオン性ポリマーとして、種々の分子量、特に1.8kDa、70kDa及び750kDaのポリエチレンイミン（PEI）（式４）を含む。
【００５０】
PEIは、DNA−ポリプレックス（PEK）について、非ウィルス遺伝子療法の分野において時折使用され、そして従って、ずいぶん研究されて来たポリカチオンである（Remy J.-S.など., Adv. Drug DeNv. Rev., 1998; 30(1 -3): 85-95）。
【００５１】
【化４】
2009539793.tif 000005
【００５２】
PBCA-ポリマーマトリックスへのカチオン性高分子電解質PEIの封入のために、粒子シェルは、カチオン性表面電位を生成するPEIポリマー鎖を含んで成る。
【００５３】
さらに、アミノ基を有する上記カチオン性ポリマー又は化合物と共に、本発明によれば、診断又は治療物質がナノ沈殿によりポリマーマトリックスに封入されることが可能である。
【００５４】
封入のための診断物質として、次の種類の物質が、種々の分子イメージング方法のために使用され得、そして特に、本発明者は、分子イメージングについての次の方法のために対比剤又はトレーサーを言及している：光学イメージング、例えばDOT（拡散光学イメージング）、US（超音波イメージング）、OPT（光学投影断層撮影法）、近赤外蛍光イメージング、蛍光タンパク質のイメージング及びBLI（生物発光イメージング）、及び磁気共鳴断層撮影法（MRT, MRI）又はX−線。しかしながら、他の方法もまた考えられ得る。言及される物質群からの適切な診断物質の封入は、粒子のインビトロ及び/又はインビボでの検出を可能にする。
【００５５】
好ましい態様においては、診断剤は、特に次の群から選択された色素を含んで成る：フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、カルボキシフルオレセイン又はカルセイン、テトラブロモフルオレセイン又はエオシン、エトラヨードフルオレセイン又はエリトロシン、ジフルオロフルオレセイン、例えばOregon GreenTM 488, Oregon GreenTM 500 又はOregon GreenTM 514, カルボキシローダミン色素(Rhodol GreenTM)- Farbstoffe (アメリカ特許第 5,227,487号; US 5,442,045), Carboxyrodamin-Farbstoffe (Rhodamine GreenTMDyes) (アメリカ特許第5,366,860号), 4,4-ジフルオロ-4-ボーラ-3a,4a-ジアザ-インダセン, 例えばDodipy FL、Bodipy 493/503 又はBodipy 530/550 及び その誘導体 (アメリカ特許第4,774,339号; アメリカ特許第4,5,187,288号; アメリカ特許第5,248,782号; アメリカ特許第5,433,896号; アメリカ特許第5,451 ,663号)、ポリメチレン色素、クマリン色素、例えばクマリン６，７−アミノ−４−メチルクマリン、DTPAの金属錯体、又はテルビウム又はユーロピウムを有するテトラアザマクロサイクレン（Cyclene Pyvlene)、又はテトラピロール色素、ポリヒリン。
【００５６】
特に好ましい態様においては、診断物質は、蛍光−活性色素を含んで成る。
さらに特に好ましい態様においては、診断剤は蛍光近赤外（NIR）色素を含んで成る。好ましくは、光学イメージングのために使用されるそれらのNIR色素は、650nm〜1000nmのNIR領域で光を吸収し、そして放す。好ましい色素は、ポリメチン色素の種類に属し、そして次の群から選択される：カルボシアニン、例えばジエチルオキサカルボシアニン（DOC）、ジエチルオキサジカルボシアニン（DODC）、ジエチルオキサトリカルボシアニン（DOTC）、インド−ジ−又はインドトリカルボシアニン、トリカルボシアニン、メロシアニン、オキソノール色素（WO96/17628号）、ローダミン色素、フェノキサジン又はフェノチアジン色素、テトラピロール色素、特にベンゾポルヒドリン、コリン及びフタロシアニン。
【００５７】
本発明において好ましい、言及される色素は、酸として又は塩として使用され得る。それらの色素のための適切な無機カチオン又はカウンターイオンは例えば、リチウムイオン、カリウムイオン、水素イオン及び特にナトリウムイオンである。有機塩基の適切なカチオンは中でも、第一、第二又は第三アミン、例えばエタノールアミン、ジエタノールアミン、モルホリン、グルカミン、N, N-ジメチルグルカミン及び特にN-メチルグルカミン及びポリエチレンイミンのそれらである。アミノ酸の適切なカチオンは例えば、リシン、アルギニン及びオルニチンのそれら、及び酸性又は中性アミノ酸アミドである。
【００５８】
また、好ましい色素は、それらの塩基又は塩としても使用され得る。
さらに特に好ましい態様においては、診断物質は、カルボシアニン色素を含んで成る。カルボシアニンの一般構造は、下記式８：
【００５９】
【化５】
2009539793.tif 000006
[式中、Qは、下記フラグメントであり：
【００６０】
【化６】
2009539793.tif 000007
【００６１】
ここでR30は、水素原子、ヒドロキシル基、カルボキシル基、１〜４個の炭素原子を有するアルコキシ残基、又は塩素原子を表し、R31は水素原子、又は１〜４個の炭素原子を有するアルキル残基を表し、X及びYはお互い独立して、フラグメント-O-、-S-、-CH＝CH-又は-C(CH2R32)(CH2R33)-を表し、R20〜R29, R32及びR33はお互い独立して、水素原子、ヒドロキシル基、カルボキシル残基、スルホン酸残基、又は10個までの炭素原子を有するカルボキシアルキル、アルコキシカルボニル又はアルコキシオキソアルキル残基、又は４個までの炭素原子を有するスルホアルキル残基、又は非特異的に結合する高分子、又は下記一般式VI：
【００６２】
-(O)-v-(CH2)0-CO-NR34-(CH2)s-(NH-CO)q-R35  (VI)
で表される残基を表し、但しX及びYの両者は、O, S, -CH=CH-又は-C(CH3)2-を表し、残基R20〜R29の少なくとも１つは非特異的に結合する分子、又は一般式VIに対応し、ここでO及びSはOに等しいか、又はお互い独立して、１〜６の整数を表し、ｑ及びｖはお互い独立して、O又は１を表し、R34は水素原子又はメチル残基を表し、R35は２〜n-１個のヒドロキシ基を有する、３〜６個の炭素原子を有するアルキル基（ｎは炭素原子の数である）、又は１〜３個のカルボキシル基により置換された、１〜６個の炭素原子のアルキル残基、６〜９個の炭素原子を有するアリール基、又は７〜15個の炭素原子を有するアラルキル残基、又は下記一般式III d又はIII e：
【００６３】
【化７】
2009539793.tif 000008
【００６４】
で表される残基であり、但しｑは１を表し、又は非特異的に結合する高分子をを表し、R20及びR21, R21及びR22, R22及びR23, R24及びR25, R25及びR26, R26及びR27は、それらの間に位置する炭素原子と一緒に、５又は６員の芳香族又は飽和融合環を形成する]、及び生理学的に適用できるその塩として記載される。
【００６５】
式：カルボシアニンの一般構造。
カルボシアニンの場合、出願DE4445065号及びDE6991034号に記載され、それらの内容物は、本出願に組込まれる。
意外には、容易な水溶性のアニオン性物質、例えば一定のカルボシアニンは、記載されるナノ粒子の疎水性ポリマーマトリックスに安定して封入され得る。
【００６６】
本発明においては、アニオン性水溶性物質は、定義されたサイズの粒子の形成を伴って、イオン複合体化によるナノ沈殿により、及びカチオン性ポリマーとの同時沈殿により、控えめな水溶性ポリマーマトリックスに封入される。
粒子のポリマーマトリックスへのNIR−活性蛍光色素の組込みにより、粒子は、組織における非侵襲性光学的イメージングにより蛍光から検出され得る。従って、蛍光−ラベルされたナノ粒子のインビボ分布又は蓄積を検出することが可能になる。
特に好ましい態様においては、カルボシアニン色素は、容易に水に溶解できるアニオン性テトラスルホンシアニン（TSC）（式９）を含んで成る。
【００６７】
【化８】
2009539793.tif 000009
【００６８】
もう１つの特に好ましい態様においては、カルボシアニン色素は、IDCC（インドジカルボシアニン）（式10）を含んで成る。
【００６９】
【化９】
2009539793.tif 000010
【００７０】
さらにもう１つの特に好ましい態様においては、カルボシアニン色素は、ICG（インドシアニングリーン）（式11）を含んで成る。
【００７１】
【化１０】
2009539793.tif 000011
【００７２】
1つの態様においては、封入される医薬的活性物質は、治療剤を含んで成る。
【００７３】
好ましい態様においては、治療剤は、新形成性疾病、特に血管形成された腫瘍及び転移、又は炎症反応を有する疾病の処理のための物質を含んで成る。後者の疾病は、例えばリウマチ形態種類の疾病、例えばリウマチ様関節炎、乾癬性関節炎、膠原病、脈管炎及び感染性関節炎を包含する。炎症工程及び可能性ある組織変化を有する他の疾病は、慢性的炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）、多発性硬化症、アトピー性皮膚炎、及び一定の紅斑病である。特に次のグループは、治療物質として言及され得る：免疫原性ペプチド又はタンパク質、化学療法剤、トキシン、放射線治療剤、放射線感作物質、脈管形成インヒビター及び抗炎症性物質、例えばNSAID、又はそれらの組合せ。
【００７４】
新形成性疾病の処理のための治療剤は、アルキル化剤、特にベンダムスチン、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イフォスファミド、ロムスチン、メルファレン、ニムスチン、チオテパ、トレオスルファン及びトロホスファミドを含んで成る群、抗代謝物、特にシタラビン、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲンシタビン、メルカプトプリン、メトトレキセート及びチオグアニンを含んで成る群、アルカロイド及びジテルペン、特にビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ピノレルビン、エトポシド及びドセタキセルを含んで成る群、パクリタキセル、タキサン群、抗生物質、特にアクラルビシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシン、ミトザントロンの群、白金化合物、特にカルボプラチン及びシスプラチンの群、ホルモン及びホルモンアゴニスト、特にテストラクトン、フォスフェストロール、タモキシフェン、クリプロテロンフルタミド、ブセレリン、ゴナドレリン、ゴセレリン、ロイプロレリン、ナファレリン、トリプトレリン及びオクトレオチドの群、及びVEGFインヒビターの群から選択され得る。
【００７５】
もう１つの好ましい態様においては、治療剤は、炎症の処理のために適切である物質を含んで成る。それらは特に、非ステロイド抗リウマチ剤（NSAR）、特にサリチレート（アセチルサリチル酸を包含する）、アリール酢酸誘導体（アセメタシン、ジクロフェナックを包含する）、プロピオン酸誘導体（イブプロフェン、ケトプロフェン、ナプロキセン、チアプロフェン）、インドール誘導体（インドメタシン、アセメタシン、ロナゾラック、プログルメタシンを包含する）、オキシカム（ピロキシカム、テノキシカムを包含する）、アルカロン（ナブメトンを包含する）、ピラゾロン（アザプロパゾン、ピラジノブタゾン、フェニルブタゾン、オキシフェンブタゾンを包含する）、アントラニル酸誘導体（メフェナム酸を包含する）、COX2インヒビター（メロキシカム、セレコキシブ、ロフェコキシブを包含する）及びHSAR及び他の医薬製品の組合せ（ジクロフェナック及びミソプロストールの組合せを包含する）の群、
【００７６】
グルココルチコイド群、特にベタメタゾン、ブデソニド、クロプレドノール、コルチゾン、デフラザコルト、デキサメタゾン、フルオコルトロン、ヒドロコルチゾン、メチルプレジニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニリデン、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、フルニゾリド、フルチカゾン、アルクロメタゾン、アムシノニド、クロベタゾール、クロベタゾン、クロコルトロン、デソニド、デソキシメタゾン、ジフロラゾン、ジフルコルトロン、フルドロキシコルチド、フルメタゾン、フルオシノロン、フルオシノニド、フルオコルチン、フルプレドニデン、ハルシノニド、ハロメタゾン、モメタゾン、プレジニカルベート、フルオロメトロン、メドリゾン、コルチゾール（ヒドロコルチゾン）、アムシノニド、リメキソロンの群、長期作用性抗リュウマチ剤、特にクロロキン、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン（サラゾスルファピリジン）、アダリムマブ、アナキンラ、エタネルセプト、インフリキシマブ、D−ペニシラミンの群、
【００７７】
免疫抑制剤、特にアザチオプリン、メトトレキセート、マイコフェノラート、モフェチル、シクロスポリンA、シクロホスファミド、クロラムブシル、及びレフルノミドの群、及び抗生物質、特にペニシリン（アンピシリン、ピペラシリン、アモキシリンクラブラン酸、タゾバクタム、アパルシリン、ペニシリンG、オキナシリン、フルクロキサシリン、メズロシリン、フェノキシメチルペニシリンを包含する）、セファロスポリン（セファタキシム、セファキシチン、セフォチアム、セフェピム、セフタジジン、セフトリアキソン、セフロキシム、セファマンドール、セファゾリンを包含する）、カルバペネム（イミペネム、カルバペネム、シラスチン、メロペネムを包含する）、キノロン（モキシフロキサシン、レボフロキサシン、シプロフロキサシンを包含する）、アミノグリコシド（ゲンタマイシン、アミカシン、メチルマイシンスルフェート、トブラマイシン、ゲンタマイシンを包含する）、マクロリド（アジトロマイシン、クラリトロマイシン、エリトロマイシン、ロキシトロマイシンを包含する）、モノバクタム（アズトレオナムを包含する）、グリコペプチド（バンコマイシン、テイコプラニンを包含する）、及び他の抗生物質（ドキシサイクリン、クリンダマイシン、オフロキサシン、クロラムフェニコール、アンフォテリシンB、フルシトシン、メトロニダゾール、フシジン酸、ホスホマイシンを包含する）の群から選択される。
【００７８】
好ましい態様においては、ポリマーナノ粒子は、ナノ沈殿により生成される、沈殿した凝集体を含んで成る。このためには、次の生成方法が特に利用できる：
・界面活性剤を含む水溶液へのポリマー物質の溶解された混合物の添加、及び磁気撹拌機を用いての続く十分な混合による、試験管における直接的な沈殿、
・マイクロ−ミキサーシステムを用いての、前記２種の溶液を組合すことによる、界面活性剤含有水溶液におけるポリマー物質の混合物の沈殿、
・界面活性剤含有水溶液におけるポリマー物質の混合物の均等な分布のためへの超音波の使用。
【００７９】
ナノ沈殿によるナノ粒子の生成においては、有機溶媒がマトリックスポリマーから突然、除去され、そしてポリマー含有有機溶液が多量の水溶液に添加される場合、物質がそれと共に溶解される。驚くべきことには、ポリマー相に溶解される、アミノ基を有する化合物（水溶性及び水不溶性の両者）が、沈殿の間、控えめに溶解できるポリマーに同時封入される。必要な条件は、水との有機溶媒（例えば、アセトン、エタノール）の完全な混和性、及び水性相におけるマトリックスポリマーの不溶性である。
好ましい態様においては、すべての前述のポリマーナノ粒子に関しては、ポリマーナノ粒子の表面が静電的に変性される。
【００８０】
カチオン性ナノ粒子表面の静電変性は、本発明の顕著な利点である。イオン相互作用に基づいて、粒子表面は、化学カップリング反応を伴わないで、適切な物質により変性され得る。このための必要条件は、変性剤が粒子表面電荷に対して反対である電荷を一部有することである。この方法（電荷滴定による静電表面変性）は、粒子表面の単純で、柔軟で且つ融通の利く変性を可能にする。さらに、粒子表面上に不安定な活性物質を吸着することが可能であり、そして従って、それらは酵素による分解に対して保護され、そして従って、高い治療効果を生むことができる。
【００８１】
標的組織における血流からのナノ粒子の蓄積（活性及び受動的標的化）についての前提条件は、粒子が十分な時間、血流において循環することである。本発明によれば、上記表面変性により、身体における循環時間は、特にポリエチレンオキシド又はポリエチレングリコールを用いることにより、個々に適合され得る（例５を参照のこと）。
【００８２】
追加の顕著な利点は、本明細書に記載される静電表面変性は、使用の直前、すばやく、且ついずれかの問題を伴わないで実施され得ることである。これは、変性剤と共に、適切な量のナノ粒子分散体の単純な混合により、達成される。
従って、さらに、表面変性剤から粒子を別々に生成し、そして貯蔵されることが変性である。他方では、これは長期コロイド状安定性のために特に利点である。他方では、非常に不安定な表面変性物質、例えばペプチド又は抗体は、それらが使用されるまで、適切な条件下で貯蔵され得る。
【００８３】
コアー粒子及び変性剤の分離はまた、患者の個々の必要性に従って、表面変性を可能にする。次に、モジュラー原理に基づいての表面変性は、診断、治療及びモニターリングのための最大の柔軟性を提供し、そして変性は使用者により容易に、直接的に実施される。
【００８４】
カチオン的に官能価されたポリマーナノ粒子、特に記載されるPBCAナノ粒子のための表面−変性剤の好ましい構造は式５で表される。部分的にアニオン荷電された成分は、静電相互作用を通して、正に荷電された粒子表面のための機能を実施する。周囲の水性媒体に対して向けられる中性成分は、種々の長さのポリエチレングリコール及び/又はポリエチレンオキシド単位（PEG単位）を含んで成る。160〜30000ドルトンの分子量を有するPEG鎖が好ましくて、そして3000〜5000ドルトンを有するそれらが特に好ましい。他方では、この成分はまた、他の適切な構造体、例えばヒドロキシエチル澱粉（HES）及びすべての可能性あるそのポリマー化合物を含んで成る。残基Rは好ましくは、水素又はメチル単位である。
【００８５】
【化１１】
2009539793.tif 000012
【００８６】
特に好ましい態様においては、ポリマーナノ粒子の表面は、Glu（10）−ｂ−PEG（110）（式６）により変性される。ブロックコポリマーのグルタミン酸サブユニットのカルボキシレート基は、負の成分（結合部位）として作用する。
【００８７】
【化１２】
2009539793.tif 000013
【００８８】
特に好ましい態様においては、標的構造体が存在する。
この標的構造体は、静電相互作用によりカチオン性粒子表面に適用される少なくとも１つの負に荷電された成分を有する。
【００８９】
カチオン的に官能価されたポリマーナノ粒子、特に記載されるPBCAナノ粒子のための表面変性剤のもう１つの特に好ましい構造体が、式７で示されている。
【００９０】
【化１３】
2009539793.tif 000014
【００９１】
部分的にアニオン荷電された成分は、静電相互作用により、正に荷電された粒子表面上の固定部位の機能を実施する。中央の中性成分は、種々の長さのポリエチレングリコール単位及び/又はポリエチレンオキシド単位（PEG単位）を含んで成る。100〜30000ドルトンの分子量を有するPEG鎖がここで好ましく、そして3000〜5000ドルトンを有するそれらが特に好ましい。他方では、この成分はまた、他の適切な構造体、例えばヒドロキシエチル澱粉（HES）、及びすべての可能性あるそのポリマー化合物を含んで成る。
【００９２】
この後、標的構造体とも呼ばれる表面−変性剤のリガンドXは、ポリマーナノ粒子の受動性及び活性蓄積機能を改良するためである。
【００９３】
標的構造体としての適切なリガンドは、抗体、ペプチド、リガンド擬似体の受容体リガンド、又はアプタマーであり得る。次のものが構造体としてみなされ得る：アミノ酸、ペプチド、CDR（相補的決定領域）、抗原、ヘプテン、酵素物質、酵素補因子、ビオチン、カロチノイド、ホルモン、ビタミン、成長因子、リンホカイン、炭水化物、オリゴ糖、レシチン、デキストラン、脂質、ヌクレオシド、例えば、DNA又はRNA分子を含む生来の、修飾された又は人工のヌクレオシド、核酸、オリゴヌクレオチド、多糖、B-, A-, Z-へリックス又はヘアーピン構造体、化学単位、修飾された多糖、及び受容体結合物質、又はそれらのフラグメント。標的構造体はまた、トランスフェリン又は葉酸、又はそれらの一部、又は前記のすべての可能性ある組合せでもあり得る。
【００９４】
本発明によれば、それらのリガンドは、静電相互作用によりナノ粒子に結合されるが、しかしリガンドが共有結合を通して粒子表面に結合することも可能である。さらに、リガンドとナノ粒子との間にリンカーを組込むことも可能である。
【００９５】
標的構造体の静電結合は、カチオン性粒子表面上の少なくとも１つの負に荷電された成分との電荷相互作用により生じる。特に、化合物、特に例えばアセテート、カーボネート、シトレート、スクシネート、ニトレート、カルボキシレート、ホスフェート、スルホネート又はスルフェート群及びそれらの群の遊離酸が、負に荷電された成分（結合部位）として適切である。
【００９６】
１つの態様においては、ナノ粒子サイズは、１nm〜800nmである。
好ましい態様においては、ナノ粒子サイズは、5nm〜800nmである。
好ましい態様においては、ナノ粒子サイズは、１nm〜500nmである。
好ましい態様においては、ナノ粒子サイズは、１nm〜300nmである。
特に好ましい態様においては、ナノ粒子サイズは、5nm〜500nmである。
【００９７】
さらにもう１つの特に好ましい態様においては、ナノ粒子サイズは、5nm〜300nmである。
さらにもう１つの特に好ましい態様においては、ナノ粒子サイズは、10nm〜300nmである。
得られるポリマーナノ粒子のサイズは、光子相関分光分析法（PCS）により決定される。
【００９８】
特に好ましい態様においては、ポリマーナノ粒子は、次の工程段階の遂行により特徴づけられる：
・水不溶性ポリマーが、水と完全に混和性である適切な有機溶媒、好ましくはアセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、ジメチルスルホキシド（DMSO）、又はそれらの溶媒と水との混合液に溶解される。
・カチオン性ポリマーが、水と完全に混和性である適切な溶媒、好ましくはアセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、ジメチルスルホキシド（DMSO）、又はそれらの溶媒と水との混合液に溶解される。
【００９９】
・活性物質（診断剤又は治療剤）が、水と完全に混和性である適切な溶媒、好ましくはアセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、ジメチルスルホキシド（DMSO）、又はそれらの溶媒と水との混合液に溶解される。
・完全に均質の溶液が、カチオン性ポリマー、水不溶性ポリマー、及び活性物質から生成される。
【０１００】
・ポリマー物質の溶解された混合物を、界面活性剤としてのPluronic F68、 Triton X-100及びSynperonic T707と共に、界面活性剤含有溶液に添加し、コロイド状の沈殿された凝集体の自発的形成をもたらす。
・次に、有機溶媒が、凍結乾燥又は加熱により、又は他の適切な方法により、大気圧又は減圧下で完全に除去される。
【０１０１】
・粒子表面の変性のために、安定した水性ナノ粒子分散体が、適切な割合で、水に溶解された変性剤と共に混合される。適切な割合が、変性剤による分散体の段階的滴定により決定される。静電表面変性（電荷滴定）の程度が、ゼータ電位を決定することによりモニターされる。
【０１０２】
記載されるナノ粒子はさらに、適切な医薬賦形剤を用いて、ヒト又は動物への投与のために適切である種々の医薬から加工され得る。それらは特に、水性分散体、凍結乾燥物、固体医薬形、例えば急速溶解性錠剤、カプセル及び他のものを包含する。適切な医薬賦形剤は次のものであり得る：凍結乾燥のための糖アルコール（例えば、ソルビトール、マンニトール）、錠剤化助剤、ポリエチレングリコール、等。
【０１０３】
水性ナノ粒子分散体又はさらに開発された医薬形は、経口、非経口（静脈内）、皮下、筋肉内、眼内、肺内、鼻腔内、腹膜内又は皮膚経路により、及びヒト又は動物のためのすべての他の可能性ある投与経路により適用され得る。
【０１０４】
本発明は、次の工程段階：
・有機溶媒又は溶媒/水混合物へのカチオン性ポリマーの溶解、
・有機溶媒への前記水不溶性ポリマーの溶解、
・前記有機溶媒又は溶媒/水混合物への活性物質（診断又は治療剤）の溶解、
・カチオン性ポリマー、水不溶性ポリマー及び活性物質の完全に溶解された混合物の調製、
・界面活性剤含有溶液への前記混合物の添加、それに伴う沈殿された凝集体の自発的形成、
・   溶媒の除去、
・前記ナノ粒子分散体及び変性剤を一緒に、適切な量で添加することによる粒子の静電表面変性（任意）が実施されることを特徴とする、ポリマーナノ粒子の生成方法に関する。
【０１０５】
定義：
用語“活性物質”とは、本明細書において使用される場合、治療的に及び診断的に活性化合物を包含する。それはまた、ヒト以外の動物及び植物において活性的である化合物も包含する。
用語“マトリックスポリマー”とは、本明細書において使用される場合、粒子塊状物の定量的に高い部分を形成するポリマーを記載し、他の封入される物質（いずれかの必要とされる添加剤及び医薬的活性物質）が均等に及び/又は不均等に封入されることが可能である。
【０１０６】
用語“（ナノ）−沈殿”とは、本明細書において使用される場合、溶媒の十分な混合を伴って、水性相中に導入される控えめな水溶性ポリマーの沈殿により、コロイド状沈殿物の形成を記載する。同時沈殿の場合、本発明において、水溶性及び控えめな水溶性であり得るいくつかの物質の同時沈殿が存在する。
【０１０７】
“沈殿された凝集体”とは、本明細書において使用される場合、ナノ沈殿の間の発生する。この沈殿された凝集体は、本発明によれば、他のポリマー物質及び医薬的活性物質が部分的に又は完全に封入され得る、マトリックスポリマーを包含する。マトリックスポリマーにおける同時封入される物質の均等な又は不均等な分布が存在する。
【０１０８】
“結合部位”とは、本明細書において使用される場合、固定化を可能にし、そして従って、反対に荷電された化合物間のイオン相互作用による、荷電された粒子表面上の変性剤の局在化を可能にする、変性剤のイオン成分を記載する。
“電荷滴定”とは、ゼータ電位の測定を用いて達成される、粒子表面上の結合部位の静電カップリングの工程を記載する。次に、電荷された結合部位は、結合部位の電荷に粒子のゼータ電子を変更する。
【０１０９】
本発明における“界面活性剤”とは、一方では、２種の不混和性相間の界面張力を低め、その結果、コロイド状分散体の安定化が可能になる、界面活性物質である。さらに、本発明の界面活性剤は、コロイド状分散体を立体的に及び/又は静電的に安定化できるいずれかの種類の物質であり得る。
用語“活性標的化”とは、組織−特異的又は細胞−特異的リガンドが標的化された蓄積のために使用される場合に使用される。活性リガンドは、活性物質に直接的に（リガンド/活性物質接合体）、及びコロイド状ビークルシステムの表面にカップリングされ得る。
【０１１０】
用語“受動的標的化”とは、活性物質が（非特異的）物理、生化学又は免疫学工程の結果として分布される場合に使用される。増強された透過及び保持効果（EPR効果）が、これを主に担当すると思われる。それは、腫瘍又は炎症組織の構造特性を使用する受動的蓄積の機構である（Ulbrich K., Subr V., Adv. Drug Deliv. Rev., 2004; 56(7): 1023- 1050）。
【０１１１】
表面電荷とも呼ばれる、用語“表面電位”とは、用語“ゼータ電位”と同等である。ゼータ電位は、レーザーDoppler速度計（LDA）により決定される。
ゼータ電位とも呼ばれる表面電位は、すなわち粒子の移動の結果として、分散層のほとんどが剪断された場合、剪断面上の移動粒子の電位を現す。表面電位は、“Zetasiger 3000”Malvem Instruments)を用いて、レーザーDoppler速度計により決定される。
【０１１２】
電場における粒子の移動速度は、レーザーDoppler速度計により決定される。荷電された表面を有する粒子は、電場において、反対に電荷された電極の方に移動し、粒子の移動速度は表面電荷の量及び適用される場の強度の関数である。移動速度決定に関しては、電場における移動する粒子がレーザーにより照射され、そして散乱されたレーザー光が検出される。粒子の移動のために、振動数のシフトは、入射光に比較して、反射された光で測定される。振動数のシフトの大きさは、移動速度に依存し、そしてドプラー振動数（ドプラー効果）と呼ばれる。粒子の移動速度は、ドプラー振動数、散乱角度及び波長から見出され得る。電気泳動移動度は、移動速度及び電場強度の比から見出される。13の因子により掛算される電気泳動移動度は、ゼータ電位（ユニットmV）に対応する。
【０１１３】
測定（ｎ＝５）は、低電解質内容物（MilliQ水：抵抗値18.2mΩ.cm、 25℃及びTOC内容物（合計の有機炭素）＜10ppb）を有する分散媒体による希釈の後、及び定義されたpH値（pH6.8〜7.0）で、Malvern Instruments Ltd. (Worcestershire, England)からのZetasizer Advanced 3000及びZetamasterにより実施された。使用されるソフトウェアは、PCS V1.41/PCS V1.51 Revであった。ゼータ電位の制御測定が、Malvern Instruments Ltd. (約50mV±5mV)からのラテックス標準粒子により行われた。測定は、Malvern Instruments Ltd.の標準設定により行われた。
【０１１４】
ナノ粒子のサイズは、“Zetasizer 3000”（Malvern Instruments）を用いて、動的光散乱（DLS）により決定された。さらに、顕微鏡写真が、走査電子顕微鏡（SEM）により得られ、そして例は図12に示されている。図12はまた、ナノ粒子の球形状を確かにする。
【０１１５】
DLSによる粒子サイズの決定は、光子相関分光分析法（PCS）の原理に基づかれる。この方法は、3nm〜3μmの範囲のサイズを有する粒子の測定のために適切である。溶液において、粒子はランダム運動しやすく、この運動は分散媒体の液体分子との衝突により引起され、この駆動力が分子のブラウン運動である。粒子の得られる運動が早いほど、粒子の直径は小さい。キュベットにおけるサンプルがレーザー光により照射される場合、光の散乱がランダムに移動する粒子で生じる。粒子のこの運動のために、散乱は一定ではないが、しかし時間に対して変動する。
【０１１６】
90°の角度で検出される、散乱されたレーザー光の強さの変動は、早い移動及び従って、より小さな粒子ほど大きい。強さのそれらの変動に基づいて、粒子サイズは自動補正機能により結論づけられ得る。平均粒子直径は、相関機能の低下から計算される。平均粒子直径の正しい計算のためには、粒子は、SEM顕微鏡写真により確証され得る球形状のものであり（上記を参照のこと）、そしてそれらは沈殿も、表面への浮遊もすべきではない。測定は、適切な希釈度で、25℃の一定温度で、及び溶液の特定された粘度で、サンプルにより実施された。測定計測器は、MalvernInstruments Ltd．からの種々のサイズの標準ラテックス粒子により検量された。
【０１１７】
粒子サイズを決定するための走査電子顕微鏡写真（SEM顕微鏡写真）が、FEI（Kassel, Germany）からのXL-30-SFEGの現場放射走査電子顕微鏡により得られた。サンプルは、Cressington (Watford, England)からの高真空Sputter 208 HRにおける5nmの金−パラジウムフィルムにより、事前にスパッターされた。
【０１１８】
物質の溶解水は、純粋な物質が溶媒に溶解され得るかどうか、及びその程度を決定する。従って、それは、均質分布（原子、分子又はイオンとして）を伴って溶媒と共に混合する物質の性質を特徴づける。化合物の溶解性は、温度（室温）の関数として、溶解されていない沈殿物と平衡状態にある飽和溶液の濃度として定義される。控えめに溶解する化合物は0.1モル/l以下の溶解性を有し、適度に溶解する化合物は0.1〜1m/lの溶解を有し、そして容易に溶解する化合物は1モル/l以上の溶解性を有する。
本発明は例によりさらに説明されるが、それらは本発明を制限するものではない。
【実施例】
【０１１９】
例１：アニオン性重合によるPBCAの生成：
Sicomet 6000を、ブチルシアノアクリレート（BCA）のアニオン性重合によるPBCA生成のために使用する。重合工程を、pH2.2で、１％（w/v）Triton X-100溶液への2.5％（w/v）BCAのすべてのゆっくりした永久的な滴下により実施する。pH値を、0.1NのHCl溶液により事前に調節する。得られる分散体を、氷浴（約4℃）上で冷却しながら、４時間、一定の450回転/分で撹拌する。次に、より大きな凝集体を、ひだ付の紙フィルターを通しての濾過により除去する。エタノールの添加により、PBCAに重合されたBCAを沈殿し、そしてそれから得られるフィルター残留物を、精製水（MilliQシステム）により数度、洗浄する。乾燥キャビネットにおいて40℃で24時間、PBCAフィルター残留物を乾燥した後、平均分子量を、GPC（Mn 約2000Da）により決定する。ポリステロール標準を使用する。
【０１２０】
例２：官能価されたPBCAナノ粒子のナノ沈殿による生成：
ｉ）PBCA-P(DMAEMA)ナノ粒子：
500μlの2％アセトンPBCA溶液（w/v）を、標準の実験用振盪機を用いて、密閉された条件下で（アセトンの蒸発を避けるために）、100μlの２％アセトンP（DMAEMA）溶液と共に十分に混合する。このために使用されるPBCAは、例１に従って調製される。下記に記載される個々の色素溶液100μlを、このポリマー混合物に添加する。
【０１２１】
色素溶液a：3mgのインドシアニングリーンをまず、超音波槽において300μlの精製水に溶解し、そして次に700μlのアセトンを添加する。
色素溶液b, c, d：色素DODC、IDCC及びクマリン６を、0.02％（w/v）アセトン溶液において使用する。
【０１２２】
十分に混合された色素−ポリマー混合物を、2.5mlのEppendorfピペットに取り、そして10mlの激しく撹拌された1％（w/v）Synperonic T707溶液に添加する。ナノ粒子分散体を600回転/分（標準の磁気撹拌機）で２時間、及び100回転/分で、さらに16時間、溶媒の完全な蒸発のために撹拌する。それを、Eppendorf-Capsにおいて遠心分離により加工する。個々の場合、1mlの粒子分散体及び0.5mlの1％（w/v）CETAC溶液（塩化セチルトリメチルアンモニウム溶液）を十分に混合し、そして14000回転/分で10分間、遠心分離する（Sigma 2K15実験用遠心分離機）。上清液を除去し、粒子を１％CETAC溶液に再分散し、そして再び遠心分離する。この洗浄工程を３度、反復し、次に最終的に、粒子を、Synperonic T707の１％溶液に取る。
【０１２３】
ii) PBCA-[PEI-IDCC]ナノ粒子：
500μlの2％のアセトンPBCA溶液（w/v）を、イソプロパノール（2％、w/v）中、1.8kDaのPEIと共に使用する。i)において言及される個々の色素溶液（a〜d）100μlを使用する。
【０１２４】
十分に混合された色素−ポリマー混合物を、2.5mlのEppendorfピペットに取り、そして10mlの激しく撹拌された1％（w/v）Triton X-100溶液に添加する。ナノ粒子分散体を600回転/分（標準の磁気撹拌機）で２時間、及び100回転/分で、さらに16時間、溶媒の完全な蒸発のために撹拌する。それを、Eppendorf-Capsにおいて遠心分離により加工する。個々の場合、1mlの粒子分散体及び0.5mlの1％（w/v）CETAC溶液（塩化セチルトリメチルアンモニウム溶液）を十分に混合し、そして14000回転/分で10分間、遠心分離する（Sigma 2K15実験用遠心分離機）。上清液を除去し、粒子を１％CETAC溶液に再分散し、そして再び遠心分離する。この洗浄工程を３度、反復し、次に最終的に、粒子を、Triton X-100の１％溶液に取る。
【０１２５】
iii)PLGA-P(DMAEMA)ナノ粒子：
500μlの2％のアセトンPLGA溶液（w/v）を、アセトン（2％、w/v）中、100μlのP(DMAEMA)と共に使用する。i)において言及される個々の色素溶液（a〜d）100μlを使用する。十分に混合された色素−ポリマー混合物を、2.5mlのEppendorfピペットに取り、そして10mlの激しく撹拌された1％（w/v）Synperonic T707溶液に添加する。ナノ粒子分散体を600回転/分（標準の磁気撹拌機）で２時間、及び100回転/分で、さらに16時間、溶媒の完全な蒸発のために撹拌する。それを、Eppendorf-Capsにおいて遠心分離により加工する。個々の場合、1mlの粒子分散体及び0.5mlの1％（w/v）CETAC溶液（塩化セチルトリメチルアンモニウム溶液）を十分に混合し、そして14000回転/分で10分間、遠心分離する（Sigma 2K15実験用遠心分離機）。上清液を除去し、粒子を１％CETAC溶液に再分散し、そして再び遠心分離する。この洗浄工程を３度、反復し、次に最終的に、粒子を、Synperonic T707の１％溶液に取る。
【０１２６】
例３：界面活性剤相におけるポリマー内容物を変えることによるナノ沈殿への影響：
PBCA-P(DMAEMA)ナノ粒子の粒子サイズがポリマー濃度を変えることにより、生成の間、調節され得ることが、図１に示される。例２に従って生成されるPBCA-P(DMAEMA)ナノ粒子を、界面活性剤Synperonic T707により安定化する。粒子生成（ナノ沈殿）の間、界面活性剤相中に注入される有機ポリマー溶液の体積を一定に維持し、そしてポリマー濃度のみを相応じて変更する。すべての他の生成条件（界面活性剤濃度、ポリマーPBCA：P(DMAEMA)の比＝10：１、色素濃度、温度、撹拌速度/磁気撹拌棒、容器、注入のタイプ）は一定に維持する。
【０１２７】
沈殿の間、界面活性剤相における低ポリマー濃度の使用は、より小さな粒子直径を導く。試験期間にわたって、粒子サイズの変化は、等ポリマー内容物で見出されなかった。
【０１２８】
例４：カチオン的に官能価された粒子：
カチオン的に官能価された粒子を、例２に従って調製する。図２は、界面活性剤Triton X-100又はPluronic F68により安定化される、PBCA-[PEI-IDCC]ナノ粒子の粒子直径及びゼータ電位を示す。PBCA−マトリックスへのポリカチオンポリエチレンイミンの封入のために、粒子は、30mV〜40mVの正のゼータ電位を有する。粒子サイズ及びゼータ電位の両者は、粒子の処理（洗浄工程）の前及び後、一定である−粒子の良好な安定性の証明。
【０１２９】
例５：Glu(10)−ｂ−PEG（110）によるPBCA-[PEI-IDCC]ナノ粒子の静電表面変性：
本明細書において使用されるPBCA−[PEI-IDCC]ナノ粒子は、例２に従って調製される。
粒子表面を変性するために、安定した水性ナノ粒子分散体を、水に溶解された変性例と共に、適切な割合で混合する。その適切な割合は、変性剤による粒子分散体の段階的滴定により決定される。静電表面変性の程度（電荷滴定）を、ゼータ電位を決定することによりモニターする。図３は、粒子分散体（電荷滴定）への変性剤（Glu(10)-b-PEG(110)）の段階的添加による、＋25mV〜約-30mVへのゼータで電位の変動を示す。
【０１３０】
例６：種々の蛍光色素により負荷されたPBCA-P(DMAEMA)のSEM顕微鏡写真：
色素ジエチルオキサジカルボシアニン（DODC）及びクマリン６により負荷されたPBCA-P(DMAEMA)を、例２に従って調製する。
図４は、DODC−負荷されたPBCA-P(DMAEMA)のナノ粒子のSEM顕微鏡写真を示す。
図５は、クマリン６−負荷されたPBCA-P(DMAEMA)のナノ粒子のSEM顕微鏡写真を示す。
【０１３１】
例７：細胞培養物試験：
HeLa細胞系を、10％のウシ胎児血清（FCS）及び2mMのL−グルタミンの添加を伴って、ダルベッコ変性イーグル培地（DMEM）を含む225cm2の培養フラスコにおいて37℃及び5％CO2下で培養する。細胞工程への影響をできるだけ少なくするために、抗生物質（ペニシリン/ストレプタマイシン）の添加は行われなかった。細胞を規則的に継代培養し、そして試験目的のための接種を、調査の開始の24時間前、実施する。調査のための、細胞を、Falcon/Becton Dickinsonからの96ウェルプレートにおいて接種する。
【０１３２】
細胞の生存性又は典型的形態学に対する可視調査を、試験の開始の前、実施する。次に、FCS−含有培地を排水し、そして50μlの血清フリー培地により交換する。
【０１３３】
例２に従って調製されたナノ粒子分散体を最大60分間インキュベートした後、上清液粒子分散体を排水し、そして細胞をPBSにより２〜３度、洗浄する。培地において事前に希釈された、Molecular Probes Europe BV, Leiden (NL)からの色素MitoTracker Red CMXRos（0.25μl/ml）を、ミトコンドリアを染色するために使用する。50μlの色素溶液とのインキュベーションを、インキュベーターにおいて15分間、実施する（37℃、5％CO2）。次に、色素溶液を排水し、そして細胞をPBSにより２〜３度、洗浄する。細胞を、室温で10分間、1.37％ホルムアルデヒド100μlにより固定する。固定溶液を排水した後、細胞をPBSにより２〜３度、洗浄する。細胞核を、Hoechst 33342によりすでに固定された細胞において染色する。このためには、PBSに希釈された色素溶液（2μg/ml）100μlを、室温で10分間インキュベートする。色素溶液の除去の後、細胞を100μlのPBSにより２〜３度、洗浄する。固定されたプレートを、蛍光顕微鏡を用いての調査まで、8℃での冷蔵庫に、光から保護された、200μlのPBS/ウェルを用いて貯蔵する。
【０１３４】
例８：細胞摂取に対する官能価された粒子表面の影響：
【表１】
2009539793.tif 000015
【０１３５】
例８に使用されるナノ粒子は、例２に従って調製される。変性されていないか、又は葉酸又はGlu(10)-b-PEG(110)による静電表面変性の後、粒子は、表１に示される性質を有する。
【０１３６】
試験のために使用される96−ウェルプレートにおいて、すべてのウェルは同じ細胞密度（試験の24時間前での接種：１×104個の細胞）を有する。表（表１）に示される一定の粒子濃度の粒子を、インキュベーターにおいて60分間インキュベートする。次に、細胞を洗浄し、固定し、そして次の日、測定する。蛍光を発する細胞を、20倍の倍率及び一定の露出時間で、自動蛍光顕微鏡により写真を取る（図６を参照のこと）。図６は、細胞接種挙動性が全く同じナノ粒子電荷の異なった表面性質によりいかに影響されるかを示す。カチオン性表面電位を有する変性されていない粒子（例１）は、細胞上の又は細胞における高い蛍光対比から見出され得るように、細胞表面に対して高い親和性を示す。また効果的である、Glu(10)-b-PEG（110）による滴定の後、負の表面電位を有する粒子のインターナリゼーションが、例３からの細胞の拡大された断片から見出され得る。
【０１３７】
例９：Glu(10)-b-PEG(110)により変性されたPBCA-P(DMAEMA)ナノ粒子の細胞接種挙動性：
例９で使用されるナノ粒子は、例２に従って調製される。Glu(10)-b-PEG(110)による静電表面変性の後、粒子（dhyd＝171nm；ZP＝-33mV）の細胞接種挙動性を調査する。  エンドソーム又はエンドリソソームである、明るく蛍光を発する点は、エンドサイトーシスによる細胞中へのナノ粒子の効果的接種の証明である（図７）。倍率規模は、この写真において、個々の粒子が200nm以下のそれらのサイズのために見えることができないことを証明する。それらの小胞（エンドソーム/エンドリソソーム）内の多数の粒子が細胞質における強い点状の蛍光対比を引起す。Glu(10)-b-PEG(110)により変性されたPBCA-P(DMAEMA)ナノ粒子表面の細胞摂取が、図８に図示されている。
【０１３８】
例10：Glu(10)-b-PEG(110)により変性されたPBCA-P(DMAEMA)ナノ粒子の細胞核における蓄積：
共焦レーザー走査顕微鏡による細胞の中央面の写真（図９）は、細胞核における粒子の部分的蓄積が存在することを示す。
【０１３９】
例11：高粒子濃縮物のインキュベーションによる高められた粒子摂取：
クマリン６により負荷された、Glu(10)-b-PEG(110)表面変性されたPBCA-P(DMAEMA)粒子を、例２に従って調製する。0.21mg/mlの低粒子濃縮物（図10）及び0.85mg/mlの高粒子濃縮物（図11）を、例７に従って、同じ時間、細胞上でインキュベートする。図11は、図10に対して、高粒子濃縮物のインキュベーションに基づく高められた粒子摂取を示す。
【０１４０】
例12：PBCA-[P(DMAEMA)-ICG]ナノ粒子の特徴化：
動物実験のための生成の後、７日間にわたって、動物実験のために使用される、表面変性されたPBCA-[P(DMAEMA)-ICG]の粒子サイズが示される（図13）。非常に狭い粒子サイズ分布の特徴としての一定の粒子サイズ及び一定の低多分散性指数（PI<0.1）は、表面変性された粒子の良好な安定性の証拠である。
【０１４１】
SEM顕微鏡写真（図12）に基づいて、それらが約200nmのサイズを有する球状ナノ粒子であることがさらに断言され得る。
【０１４２】
電荷滴定により、PBCA-P(DMAEMA)ナノ粒子のカチオン性表面を、ブロックコポリマーGlu(10)-b-PEG(110)により変性する（図14を参照のこと）。ゼータ電位として測定される表面電荷を、解離平衡が約−30mVで達するまで、中性点を越えて約＋30mVから相応じて滴定する。表面変性されたPBCA-[P(DMAEMA)-ICG]粒子は、滴定の後、７日間の調査にわたって、ゼータ電位にいずれの変化も示さない。従って、末変化の粒子サイズ及び一定の低いPIは、良好な粒子安定性の証拠を提供する。
【０１４３】
図15は、ICG水溶液及びICGナノ粒子分散体（洗浄された、及び洗浄されていない）のUV-Vis吸収スペクトルを示す。インドシアニングリーンは、650〜900nmの波長範囲で吸収及び発酵スペクトルを有する近赤外蛍光色素である。カチオン性ポリアクリレートP(DMACMA)によるICGの複合体化及び封入は、２種の波長最大値の最小深色団シフトを導く。
【０１４４】
例13：動物実験：
使用される動物は、Taconic M&Bにより供給された。それらは、タイプNMRIヌードの雌の白子ヌードマウスである。十分に成長した動物は、約８週間後、22〜24gの体重を有する。５匹の雌ヌードマウスの右の後脚腿にF9−奇形腫の２×106個の細胞により接種する。細胞は、ATCC/LGC Promochem GmbHから入手された。それらは、マウスにおける癌調査目的のための腫瘍モデルとして使用される精巣奇形癌のマウス由来の胚細胞である。18日後、５匹のマウスのうち４匹において、約0.5〜1cmの直径の平均サイズを有する腫瘍が増殖した。動物を、実験の最初の時間、100μl/10g動物の用量で、Rompun-Ketavet注射により永久的に麻酔をかける。注射溶液は、生理食塩水によるRompunの１：10希釈溶液又はKetavetの1:5希釈溶液の１：１混合物を含んで成る。次に、200μlのナノ分散体を、尾の静脈にi.v.注射する。続く麻酔を、動物の循環の最少負荷のために、吸入される麻酔薬として肺を通してRompun-Ketavetによりもたらす。物質の注射の後、24及び48時間で、動物を、蛍光により視覚的に試験した。
【０１４５】
Glu(10)-b-PEG(110)-変性されたPBCA-[P(DMAEMA)-ICG]ナノ粒子が、静脈内適用（尾の静脈）の後、受動的蓄積機構により腫瘍組織に蓄積することができることは、図17から見出され得る（EPR効果）。エクスビボでの腫瘍の試験は、未処理の腫瘍組織に比較して、処理された腫瘍組織に関して、蛍光対比の明確な強化を示す（図18bとaとを、又はcとaとを比較する）。全く同一の動物における蛍光の複数の遅延された検出が、24及び48時間後、可能である（図17）。従って粒子はインビボで十分な長さの時間、循環し、そして従って、腫瘍において蓄積する。従って、静電的にペギレート化された（pegylated）表面は、粒子表面に安定して結合される。肝臓からの非腫瘍結合粒子の急速な胆汁排除が存在する。これは、24又は48時間後、肝臓におけるNIR蛍光コントラストの不在により示される。生物（例えば、肝臓）からの腫瘍に蓄積しない粒子の急速な蓄積は、他の器官の最少の負荷で良好な腫瘍対比を可能にし、これは、ほとんど副作用を有さないコントラスト剤システムのための必要条件である。
【０１４６】
動物実験のために使用される装置は、LMTB（Berlin, Germany）により構成された。それは次の別々の成分を有する：
レーザー：二極管レーザー (742 nm)、モデルCeralas PDT 742/1.5W; CeramOptec (Bonn, Germany)により製造された。
励起フィルター：1xLCLS-750 nm-F; 1x740 nm 干渉フィルター(Bandpass)。
発酵フィルター：1 x bk-802.5-22-c1 ; 1xbk-801-15-c1。
カメラ：Peltier空気冷却されたCCD カメラ, Model C4742-95  12ER, Hamamatsu (Herrsching, Germany)により製造された。
ソフトウェアー：Compix / Hamamatsu からのSimple PCI 5.0。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】図１は、ポリマー濃度を変えることによる粒子直径の調節を示し、すなわちPBCA-P(DMAEMA)ナノ粒子の粒子サイズが、ポリマー濃度を変えることにより、生成の間、調節され得ることを示す。
【図２】図２は、２種の異なった界面活性剤（TX-100＝Triton X-100, F68=Pluronic F-68）中、洗浄された及び洗浄されていない粒子におけるPBCA-[PEI-IDCC]-NPの粒子直径dhyd及びゼータ電位を示す。略図は、界面活性剤Triton X-100又はPluronic F68のいずれかにより安定化された、PBCA-[PEI-IDCC]ナノ粒子の粒子直径及びゼータ電位を示す。
【０１４８】
【図３】図３は、Glu(10)-b-PEG(110)により変性されたPBCA-[PEI-IDCC]ナノ粒子のゼータ電位を示す。この図は、粒子分散体（電荷滴定）への変性剤（Glu(10)-b-PEG(110)）の段階的添加による、＋25mV〜約-30mVのゼータ電位の変化を示す。
【図４】図４は、DOCD−負荷されたPBCA-P(DMAEMA)ナノ粒子のSEM(走査電子顕微鏡)写真を示す。この図は、DOCD−負荷されたPBCA-P(DMAEMA)ナノ粒子のSEM顕微鏡写真を示す。
【０１４９】
【図５】図５は、クマリン６−負荷されたPBCA-P(DMAEMA)ナノ粒子のSEM(走査電子顕微鏡)写真を示す。この図は、クマリン６−負荷されたPBCA-P(DMAEMA)ナノ粒子のSEM顕微鏡写真を示す。
【図６】図６は、細胞摂取に対する官能価された粒子表面の効果を示す：ａ）表面変性後の細胞摂取挙動性の比較；列１：変性されていない粒子；列２：葉酸により変性されたNP；列３：Glu(10)-b-PEG(110)により変性されたNP；b)詳細：列３/ウェル１/部位15；矢印は細胞核における蛍光の明確な増強を示す。
【図７】図７は、HeLa細胞におけるナノ粒子摂取；グレースケールイメージとしてのナノ粒子の蛍光を示す。この図は、HeLa細胞における、Glu(10)-b-PEG(110)により変性されたPBCA-P(DMAEMA)ナノ粒子の細胞摂取挙動性を示す。
【０１５０】
【図８】図８は、Glu(10)-b-PEG(110)により変性されたPBCA-P(DMAEMA)ナノ粒子表面の細胞摂取の図示である。使用される略語：PEG-NP：ペギレート化されたクマリン含有PBCA−P（DMAEMA）ナノ粒子；NP：クマリン−負荷されたPBCA-P(DMAEMA)ナノ粒子；CP：クラスリン被覆されたピット；ES：エンドソーム；LS：リソソーム；ELS：エンドリソソーム；ZK：細胞核；H+：H＋ATPアーゼ；PEG-Glu：遊離Glu(10)-b-PEG(110)ブロックコポリマー；サイズ関連は、実体には対応しない。
【図９】図９は、ａ）細胞中央面における蛍光の表示（CLSM、共焦走査レーザー顕微鏡）、ｂ）蛍光のコンピューターに基づく3D表示を示す。この図は、細胞核におけるGlu(10)-b-PEG(110)変性されたPBCA-P(DMAEMA)ナノ粒子の蓄積を示す。これは、蛍光−活性色素クマリン６による負荷を通して可能である。
【０１５１】
【図１０】図10は、低粒子濃縮物（0.21mg/ml）のインキュベーションにおける低められた粒子摂取；グレースケールイメージとしてのNPの蛍光を示す。この図は、0.21mg/mlの粒子濃度物のインキュベーションの後の蛍光を発するHeLa細胞を示す。Glu(10)-b-PEG(110)表面変性されたPBCA-P(DMAEMA)粒子が使用された。
【図１１】図11は、高粒子濃縮物（0.85mg/ml）のインキュベーションにおける高められた粒子摂取；グレースケールイメージとしてのNPの蛍光を示す。この図は、0.85mg/mlの高粒子濃度物のインキュベーションの後のより強い蛍光を発するHeLa細胞を示す。Glu(10)-b-PEG(110)表面変性されたPBCA-P(DMAEMA)粒子が使用された。
【０１５２】
【図１２】図12は、PBCA-[P(DMAEMA)-ICG]ナノ粒子のSEM顕微鏡写真を示す。
【図１３】図13は、Glu(10)-b-PEG(110)により表面変性された、PBCA-[P(DMAEMA)-ICG]ナノ粒子の粒子直径dhydを示す。これは、動物実験のための生成の後、７日間にわたって動物実験のために使用される、表面変性されたPBCA-[P(DMAEMA)-ICG]ナノ粒子の粒子サイズを示す。
【図１４】図14は、滴定されていない（洗浄された/洗浄されていない）及び滴定されたPBCA-[P(DMAEMA)-ICG]ナノ粒子のゼータ電位を示す。この図は、ブロックコポリマーGlu(10)-b-PEG(110)により変性されたPBCA-P(DMAEMA)ナノ粒子の、ゼータ電位として測定された表面電荷を示す。これは、約−30mVで解離平衡の達成まで、中性点を通して及びそれ以上に、約＋30mVから相応じて滴定される。
【０１５３】
【図１５】図15は、ａ）水性ICG溶液；ｂ）洗浄されていないPBCA-[P(DMAEMA)-ICG]ナノ粒子；ｃ）洗浄されたPBCA-[P(DMAEMA)-ICG]ナノ粒子のUV-Vis吸収スペクトルを示す。この図は、ICG水溶液及びICG−ナノ粒子分散体（洗浄された、及び洗浄されていない）のUV-Vis吸収スペクトルを示す。
【図１６】図16は、PBCA-[P(DMAEMA)-ICG]ナノ粒子及びICG水溶液の発光スペクトルを示す。この図は、ナノ粒子分散体に比較してのICG水溶液の対応する発光スペクトルを示す。
【０１５４】
【図１７】図17は、インビボでのNIR蛍光の検出を示す。この略図は、物質の注射後、24及び48時間で(  a）24時間、腹側、ｂ）24時間、側方、ｃ）48時間、側方、ｄ）ブランク値、腹側）のNIR蛍光を示す。
【図１８】図18は、処理の48時間後、エクスビボでの腫瘍組織のNIR蛍光対比を示す。この図は、ａ）NIR蛍光コントラストを伴わないでの、未処理の腫瘍の、ｂ）大きな処理された腫瘍の及びｃ）処理の48時間後、中位のサイズのエクスビボで処理された腫瘍のNIR蛍光コントラストを示す。
【手続補正書】
【提出日】平成21年2月12日(2009.2.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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