(57)【要約】  本発明は、ホスフェートの結合に関連して、例えば、水の精製及び腎臓透析システムにおいて有用な合成リセプター、生成物及び方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガンド結合メンバーであって、
i）リガンドへの結合のために配置される少なくとも２のオリゴアミン；及び
ii）オリゴアミンの動きが立体配座的に制限されるように、前記少なくとも２のオリゴアミンに共有結合される有機テンプレート
を含んでなり、前記オリゴアミンは同一であるか又は相違するものであり、独立して、直鎖状、環状又は分枝状である、リガンド結合メンバー。
【請求項２】
オリゴアミン２個を含む、請求項１記載のリガンド結合メンバー。
【請求項３】
オリゴアミンが同一のものである、請求項１又は２記載のリガンド結合メンバー。
【請求項４】
オリゴアミンが、シス又はトランス型で配置されている、請求項３記載のリガンド結合メンバー。
【請求項５】
少なくとも２のオリゴアミンが、独立して、非環式である、請求項１〜４のいずれかに記載のリガンド結合メンバー。
【請求項６】
テンプレートが、不飽和炭化水素、環状脂肪族炭化水素又は環状芳香族炭化水素である、請求項１〜５のいずれかに記載のリガンド結合メンバー。
【請求項７】
不飽和炭化水素がアルケンである、請求項６記載のリガンド結合メンバー。
【請求項８】
不飽和炭化水素がアルキンである、請求項６記載のリガンド結合メンバー。
【請求項９】
環状芳香族炭化水素が、単環式又は多環式芳香族炭化水素である、請求項６記載のリガンド結合メンバー。
【請求項１０】
多環式芳香族炭化水素が、２、３又は４個の炭化水素環を含有するものである、請求項９記載のリガンド結合メンバー。
【請求項１１】
多環式芳香族炭化水素が、ナフタレン、インデン、ペンタレン、アズレン、ヘプタレン、ビフェニレン、インダセン、フルオレン、フェナレン、フェナントレン、アントラセン、ピレン、クリセン、ナフタセン、アセファナントリレン、アセアントリレン、トリフェニレン又はフルオロアンテンからなる群から選ばれるものである、請求項９記載のリガンド結合メンバー。
【請求項１２】
環状脂肪族炭化水素が、単環式又は多環式脂肪族炭化水素である、請求項６記載のリガンド結合メンバー。
【請求項１３】
単環式脂肪族炭化水素が、炭素原子３〜１０個を含有するものである、請求項１２記載のリガンド結合メンバー。
【請求項１４】
多環式脂肪族炭化水素が、２、３又は４個の炭化水素環を含有するものである、請求項１２記載のリガンド結合メンバー。
【請求項１５】
多環式脂肪族炭化水素が二環系である、請求項１２記載のリガンド結合メンバー。
【請求項１６】
テンプレートが複素環炭化水素である、請求項６記載のリガンド結合メンバー。
【請求項１７】
テンプレートが糖又は配糖体である、請求項１記載のリガンド結合メンバー。
【請求項１８】
糖がペントース又はヘキソースである、請求項１７記載のリガンド結合メンバー。
【請求項１９】
さらに１以上のアミド基を含有するものである、請求項１〜１８のいずれかに記載のリガンド結合メンバー。
【請求項２０】
少なくとも２個のオリゴアミンがテンプレートに共有結合している、請求項１９記載のリガンド結合メンバー。
【請求項２１】
少なくとも２個のオリゴアミンが、１個以上のアミド結合を介して、テンプレートに共有結合している、請求項２０記載のリガンド結合メンバー。
【請求項２２】
少なくとも２個のオリゴアミンが、１級、２級又は３級アミン、４級アンモニウム塩又はその組み合せで形成されるものである、請求項１〜２１のいずれかに記載のリガンド結合メンバー。
【請求項２３】
少なくとも２個のオリゴアミンが、１級アミン基及び３級アミン基を含有するものである、請求項２２記載のリガンド結合メンバー。
【請求項２４】
少なくとも２個のオリゴアミンが、２〜４個のプロトン化可能なアミンを含有するものである、請求項１〜２３のいずれかに記載のリガンド結合メンバー。
【請求項２５】
オリゴアミンが、３〜４個のプロトン化可能なアミンを含有するものである、請求項２４記載のリガンド結合メンバー。
【請求項２６】
オリゴアミンのアミン基が、原子少なくとも２個によって分離されている、請求項１〜２５のいずれかに記載のリガンド結合メンバー。
【請求項２７】
オリゴアミンのアミン基が、原子３又は４個によって分離されている、請求項２６記載のリガンド結合メンバー。
【請求項２８】
原子が、炭素、酸素又はイオウである、請求項２６又は２７記載のリガンド結合メンバー。
【請求項２９】
リセプターである、請求項１〜２８のいずれかに記載のリガンド結合メンバー。
【請求項３０】
リセプターが非環式リセプターである、請求項２６記載のリガンド結合メンバー。
【請求項３１】
合成されたものである、請求項１〜３０のいずれかに記載のリガンド結合メンバー。
【請求項３２】
リガンドがホスフェート分子又はイオンである、請求項１〜３１のいずれかに記載のリガンド結合メンバー。
【請求項３３】
ホスフェート分子が、無機ホスフェート分子又は有機ホスフェート分子である、請求項２９記載のリガンド結合メンバー。
【請求項３４】
リガンドがホスフェート含有生体分子である、請求項１〜３３のいずれかに記載のリガンド結合メンバー。
【請求項３５】
生体分子が、タンパク質、脂質、炭水化物又は核酸である、請求項３４記載のリガンド結合メンバー。
【請求項３６】
ホスファターゼ阻害剤である、請求項１〜３５のいずれかに記載のリガンド結合メンバー。
【請求項３７】
医薬品として使用されるものである、請求項１〜３６のいずれかに記載のリガンド結合メンバー。
【請求項３８】
固体支持体上に不動化されている、請求項１〜３７のいずれかに記載のリガンド結合メンバー。
【請求項３９】
固体支持体が重合体である、請求項３８記載のリガンド結合メンバー。
【請求項４０】
重合体が、ビニル重合体、アクリル重合体、アリル重合体及びポリエチレンオキシドからなる群から選ばれるものである、請求項３９記載のリガンド結合メンバー。
【請求項４１】
重合体が、アガロース、セファロース、デキストラン、セルロース、キシラン、リグニン、ナイロン、DNA、RNA、ポリエステル、ポリアミド、ポリカーボネート、及びその誘導体からなる群から選ばれるものである、請求項３９記載のリガンド結合メンバー。
【請求項４２】
支持体が、重合体ビーズ、ガラスビーズ、又はシリカビーズの形である、請求項３８〜４１のいずれかに記載のリガンド結合メンバー。
【請求項４３】
支持体が、ミクロ滴定プレート、ガラススライド、ゲル、ファイバー、フィラメント、膜、デンドライト、樹脂、ミセル、ナノ粒子又は相境界面である、請求項３８〜４１のいずれかに記載のリガンド結合メンバー。
【請求項４４】
支持体が、カラム、瀘過装置、メッシュ又はゲルの一部である、請求項３８〜４１のいずれかに記載のリガンド結合メンバー。
【請求項４５】
探知可能なラベルを含むものである、請求項１〜４４のいずれかに記載のリガンド結合メンバー。
【請求項４６】
ラベルが、酵素、蛍光ラベル又は放射性同位体である、請求項４５記載のリガンド結合メンバー。
【請求項４７】
請求項１〜４６のいずれかに記載のリガンド結合メンバーを含んでなる、フィルター。
【請求項４８】
請求項４７記載のフィルターを含んでなる、水精製システム。
【請求項４９】
請求項４７記載のフィルターを含んでなる、腎臓透析システム。
【請求項５０】
請求項１〜４６のいずれかに記載のリガンド結合メンバーの、ホスフェート分子、ホスフェートイオン又はホスフェート含有分子の液体からの除去における使用。
【請求項５１】
液体が、水又は排水である、請求項５０記載の使用。
【請求項５２】
液体が血液である、請求項５０記載の使用。
【請求項５３】
請求項１〜４６のいずれかに記載のリガンド結合メンバーの、ホスフェート分子又はホスフェート含有分子の選択スクリーニングにおける使用。
【請求項５４】
ホスフェート分子が無機ホスフェートである、請求項５３記載の使用。
【請求項５５】
リガンド結合メンバーが環状である、請求項５３又は５４記載の使用。
【請求項５６】
液体からホスフェート分子又はイオン又はホスフェート含有分子を分離する方法であって、
ｉ）請求項１〜４６のいずれかに記載のリガンド結合メンバーを、pH約５〜９において、液体と接触させる工程、及び
ii）リガンド結合メンバーに結合した各種ホスフェート分子又はイオン又はホスフェート含有分子を任意に溶離する工程
を包含する、ホスフェート分子又はイオン又はホスフェート含有分子の分離法。
【請求項５７】
請求項１〜４６のいずれかに記載のリガンド結合メンバーの、ホスファターゼ活性の阻害における使用。
【請求項５８】
請求項１〜４６のいずれかに記載のリガンド結合メンバーの、腎不全の治療又は予防のための医薬品の製造における使用。
【請求項５９】
腎不全を治療又は予防する方法であって、対象者に、請求項１〜４６のいずれかに記載のリガンド結合メンバーを、治療上有効な量で投与する、腎不全の治療又は予防法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスフェートの結合に関連して、例えば、水の精製及び腎臓透析システムにおいて有用な合成リセプター、生成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホスフェートは、自然界の至る所に存在する。これらは、DNA及びRNAの主鎖を構成し、ATPの形の化学エネルギー源を提供する。ホスフェートアニオンは、表流水の富栄養化の発生において重要な役割を果たし、医学的には、末期腎不全患者における高ホスフェートレベルは、高疾病率及び死亡率に係わる。これらの理由のため、ホスフェートは合成リセプターの興味深いターゲットとなっている。
【０００３】
これに関連して研究されてきたリセプターの種類は、天然のホスフェートバインダーの１つ、スペルミンに似たポリアミンである。これらの合成リセプターは、静電的相互作用及びプロトン化アミンとH2PO4-及びHPO42-アニオン（中性pHにおける２つの主要な化学種である）との間の水素結合の組合せを使用して、ホスフェートを結合する。
【０００４】
ホスフェートアニオンの結合において遭遇する１つの固有の課題は、水中での結合を確立することである。高度に競合的な溶媒のため、水は、結合のための主駆動力、すなわち、静電的相互作用及び水素結合を劇的に弱める。
【０００５】
水中におけるポリアミンリセプターのホスフェートに対する弱い親和性を解消する公知の手段は、強固な大環状環を形成することである。環構造においてプロトン化可能なアミン及び水素結合ドナー及び／又はアクセプターの組織化は、リセプターの立体配座的フレキシビリティーを減じ、主としてエントロピーに関する理由のため、より高い親和性をもたらすプレ組織化作用を有する。この現象は、大環状効果として知られている。開放鎖リセプターと比べて、ホスフェートに関する結合強さが増大されるが、大環状化合物は、その合成には、通常、競合する重合反応以上に、究極の大環状化を促進するために、多段階反応及び希釈反応条件を必要とするため、合成上の課題である。
【０００６】
Kubikらは、相互作用サイトとしてアミド結合のみを有する環状ペプチドを使用することによる、８０％水／メタノール混合物中でのアニオン（ホスフェートを含む）の結合を検討している（Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40 No. 14: 2648-2651）。一般に、有機性媒体中では、アミドを基材とするリセプターのみが良好に作用し、アミドを基材とするリセプターは、ホスフェートのような部分的にプロトン化されたアニオンについては、あまり研究されていない。
【０００７】
D.A. Natioらは、静電的相互作用を介してのみ相互作用できる一連のポリアミン大環状化合物を検討している（Inorg. Chem. 35: 4597-4603 (1996)）。これらは、リセプターのプロトン化度に応じて、解離定数２.５〜３.９で、水中においてホスフェートを結合できる。結合は、pH６以下でのみ顕著であり、潜在的な適用を厳格に制限する。
【０００８】
Hossainらは、アミドを、４級化したアミンと組み合せることによって得られた大環状化合物を開示している（Inorg. Chem. 42: 1397-1399 (2003)）。これら大環状化合物のホスフェートへの結合が、ジメチルスルホキシドのような有機溶媒中でテストされているが、水中ではテストされていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
水中において高親和性をもってホスフェートを結合するために使用される、改良された構造、例えば、合成上より容易に利用できる構造についての要求がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第１の態様によれば、リガンド結合メンバーであって、
i）リガンドへの結合のために配置される少なくとも２のオリゴアミン；及び
ii）オリゴアミンの動きが立体配座的に制限されるように、前記少なくとも２のオリゴアミンに共有結合される有機テンプレート
を含んでなり、前記オリゴアミンは同一であるか又は相違するものであり、独立して、直鎖状、環状又は分枝状である、リガンド結合メンバーが提供される。
【００１１】
ここで使用するように、用語「リガンド結合メンバー」は、リガンドと錯体を形成できる各種のエンティティーを含む。代表的には、リガンド結合メンバーはリセプターであり、リガンドはリセプターの基材である。
【００１２】
ここで使用するように、用語「リガンド」は、リガンド結合メンバーに結合されうる分子又はイオンを含む。
【００１３】
リガンドは、ホスフェート分子、ホスフェート含有分子又はホスフェートイオンである。ホスフェート分子としては、ここに記載するような無機ホスフェート又は有機ホスフェートが含まれる。
【００１４】
用語「ホスフェート含有分子」及び「リン酸化ターゲット」は、１以上のホスフェート分子を含有する又は提供する各種の分子を意味するために、交換可能なものとして使用される。ホスフェートを含有する分子又はターゲットは、生体分子（例えば、タンパク質、脂質、炭水化物又は核酸（DNA又はRNA）又は各種の有機分子）である。
【００１５】
ここで使用しているように、「オリゴアミン」は、複数の結合アミン基を含む。直鎖オリゴアミンは、一般に、複数のアミン置換基を持つ直鎖状の炭素主鎖に関する。分枝状又は環状オリゴアミンは、一般に、それぞれ、複数のアミン置換基を持つ分枝状又は環状の炭素主鎖に関する。炭素主鎖は、炭素原子２０個以下、例えば、炭素原子１〜１０個、又は１〜５個、例えば、炭素原子１、２、３、４又は５個を含む。
【００１６】
ここで使用するように、「有機テンプレート」は、オリゴアミン用のスカフォードとして機能する各種の有機分子を含む。
【００１７】
ここで使用するように、用語「立体配座的に制限される」は、シングル化学結合の周りにおけるオリゴアミンの動き、例えば、回転についての制限に関する。オリゴアミンの立体配座についての制限により、１つのオリゴアミンの他のオリゴアミンに対する限定された関係（これら内の各一方のリガンドへの結合が増大される）が生じ、例えば、立体配座的制限により、リガンド結合ポケットがオリゴアミンによって提供されるようになる。
【００１８】
リガンド結合メンバーは、２つのオリゴアミンによって構成され、これらオリゴアミンは同一又は相違するものである。好ましくは、オリゴアミンは同一である。
【００１９】
リガンド結合メンバーにおける少なくとも２つのオリゴアミンの相対位置は、シス（又はＺ）又はトランス（又はＥ）である。
【００２０】
リガンド結合メンバーの少なくとも２つのオリゴアミンは、独立して、非環式オリゴアミンである。オリゴアミンは、独立して、任意に置換された末端アミン基、例えば、末端NH2基を含有できる。
【００２１】
好ましくは、本発明によるリガンド結合メンバーは、不飽和炭化水素、環状脂肪族炭化水素又は環状芳香族炭化水素である。このようなテンプレートは、テンプレートに取付けられたオリゴアミンの相対的立体配座を制限するように働く。不飽和炭化水素は、アルケニル又はアルキニルである。好ましくは、不飽和炭化水素はアルケニルである。環状芳香族炭化水素は、単環式又は多環式芳香族炭化水素である。単環式芳香族炭化水素はベンゼン又はピランを含む。多環式芳香族炭化水素は、２、３又は４つの炭化水素環を含有しうる。多環式芳香族炭化水素は、ナフタレン、インデン、ペンタレン、アズレン、ヘプタレン、ビフェニレン、インダセン、フルオレン、フェナレン、フェナントレン、アントラセン、ピレン、クリセン、ナフタセン、アセファナントリレン、アセアントリレン、トリフェニレン又はフルオロアンテンからなる群から選ばれる。本発明によるリガンド結合メンバーの環状脂肪族炭化水素は、単環式又は多環式脂肪族炭化水素である。単環式脂肪族炭化水素は炭素原子３〜１０個を含有できる。好ましくは、単環式脂肪族炭化水素はシクロヘキシルである。多環式脂肪族炭化水素は、２、３又は４つの炭化水素環を含有しうる。多環式脂肪族炭化水素は二環式系でもよい。
【００２２】
ここで使用するように、「アルキル」は、炭素原子２０個以下、例えば、１２個以下を含有でき、直鎖状又は１回以上枝分かれしていてもよい。好ましくは低級アルキルであり、
特に好ましくはＣ1〜Ｃ4アルキル、特に、メチル、エチル又はｉ-プロピル又はｔ-ブチルであり、アルキルは１以上の置換基で置換されていてもよい。
【００２３】
ここで使用するように、用語「アルケニル」は、炭素原子２〜６個を含有し、さらに、Ｅ又はＺ立体化学の少なくとも１つの二重結合を有する直鎖状又は分枝状のアルキルモイエティーを表す。この用語は、エテニル、２-プロペニル、１-ブテニル、２-ブテニル、３-ブテニル、１-ペンテニル、２-ペンテニル、３-ペンテニル、１-ヘキセニル、２-ヘキセニル及び３-ヘキセニル等を表す。
【００２４】
ここで使用するように、用語「アルキニル」は、炭素原子２〜６個を含有し、さらに、少なくとも１つの三重結合を有する直鎖状又は分枝状のアルキルモイエティーを表す。この用語は、エチニル、１-プロピニル、２-プロピニル、１-ブチニル、２-ブチニル、３-ブチニル、１-ペンチニル、２-ペンチニル、３-ペンチニル、１-ヘキシニル、２-ヘキシニル及び３-ヘキシニル等を表す。
【００２５】
用語「アミン」基は、通常、水素で占められた少なくとも２つの置換サイトを持つ含窒素モイエティーである。水素で占められた２つ未満の置換サイトを有するアミノ基は、モノ-又はジ-置換モイエティーである。
【００２６】
アルキル又はアミン基は、未置換又は炭化水素モイエティーによって置換されていてもよく、炭化水素モイエティーは、例えば、Ｃ1-4アルキル、特にＣ1、Ｃ2、Ｃ3又はＣ4アルキル、シクロアルキル、特にシクロヘキシル、アルキル-カルボキシ、カルボキシ、アルカノイル、特にアセチル、炭素環式基、例えば、シクロヘキシル又はフェニル、複素環基から選ばれる；ここで、炭化水素モイエティーは、未置換であるか、又は、例えば、アルキル（Ｃ1、Ｃ2、Ｃ3、Ｃ4、Ｃ5、Ｃ6又はＣ7）、ハロゲン、OH、エステル化カルボキシ、エステル化ヒドロキシ、Ｃ1-6アルコキシ、NH2、SH、S-アルキル、SO-アルキル、SO2-アルキル、NH-アルキル、N-ジアルキル、カルボキシル、CF3（ここで、アルキルは、未置換又は置換の分枝状、非分枝状又は環状Ｃ1-6であり、０〜３回、Ｏ、Ｓ、Ｎが割り込んでいる）によって置換されている。
【００２７】
本発明のリガンド結合メンバーでは、テンプレートは、複素環炭化水素、例えば、単環式複素環又は多環式複素環である。
【００２８】
環状脂肪族又は芳香族炭化水素基（これらの複素環基を含む）の例としては、シクロヘキシル、フェニル、アクリジン、ベンズイミダゾール、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、ベンゾオキサゾール、ベンゾチアゾール、カルバゾール、シンノリン、ジオキシン、ジオキサン、ジオキソラン、ジチアン、ジチアジン、ジチアゾール、ジチオラン、フラン、イミダゾール、イミダゾリン、イミダゾリジン、インドール、インドリン、インドリジン、インダゾール、イソインドール、イソキノリン、イソオキサゾール、イソチアゾール、モルホリン、ナフチリジン、ノルボルネン、オキサゾール、オキサジアゾール、オキサチアゾール、オキサチアゾリジン、オキサジン、オキサジアジン、フェナジン、フェノチアジン、フェノキサジン、フタラジン、ピペラジン、ピペリジン、プテリジン、プリン、プトレシン、ピラン、ピラジン、ピラゾール、ピラゾリン、ピラゾリジン、ピリダジン、ピリジン、ピリミジン、ピロリジン、ピロール、ピロリン、キノリン、キノキサリン、キナゾリン、キノリジン、テトラヒドロフラン、テトラジン、テトラゾール、チオフェン、チアジアジン、チアジアゾール、チアトリアゾール、チアジン、チアゾール、チオモルホリン、チアナフタレン、チオピラン、トリアジン、トリアゾール、トリチアン、トロピンがあるが、これらに限定されない。好ましくは、芳香族炭化水素はフェニルである。
【００２９】
リガンド結合メンバーは、糖、例えば、ペントース又はヘキソース等、又は配糖体であるテンプレートを含有しうる。
【００３０】
リガンド結合メンバーにおいて、少なくとも２つのオリゴアミンは、１級、２級又は３級アミン、４級アンモニウム塩又はその組み合わせで構成される。好ましくは、少なくとも２つのオリゴアミンは、１級アミノ基及び２級アミノ基を含有する。
【００３１】
本発明の好適な１態様では、オリゴアミンは、プロトン化可能なアミン２〜４個、例えば、プロトン化可能なアミン３又は４個を含有する。オリゴアミンの１以上は、１以上のアミド基を含有しうる。
【００３２】
特許請求の範囲に記載するリガンド結合メンバーでは、オリゴマーのアミン基は、少なくとも２個の原子、例えば、３又は４個の原子（このような原子は、炭素、酸素又はイオウである）によって分離される。プロトン化可能なアミン基を分離することによって、プロトン化が充分な程度で生じ、これによって、結合したリガンドとの、増大された静電的相互作用が生ずる。
【００３３】
アミン基を分離する少なくとも２個の原子は、Ｃ1-6アルキル、例えば、メチル又はエチルのような炭化水素基であってもよい。
【００３４】
このように、本発明の好適な１具体例では、オリゴアミンは、式（Ｉ）
【化１】
2009504718.tif 000002
（ここで、Ｒ1は、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｃ1-4アルキル（例えば、メチレン）又はその組み合わせから選ばれるものであり；、Ｒ2は、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｃ1-4アルキル（例えば、メチレン）又はその組み合わせから選ばれるものであり；Ｒ3及びＲ3'は、独立して、Ｈ又はＣ1-4アルキル（例えば、メチル）から選ばれるものであり；、Ｒ4、Ｒ4'、Ｒ4''は、独立して、Ｈ又はＣ1-4アルキル（例えば、メチル）から選ばれるものであり；、Ｒ5及びＲ5'は、独立して、Ｈ又はＣ1-4アルキル（例えば、メチル）から選ばれるものであり、Ｒ4''は存在しなくてもよく；及びｎは１〜５の整数（例えば、１、２又は３）である）で表される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
本発明の１具体例では、リガンド結合メンバーの少なくとも２つのオリゴアミンのＲ4、Ｒ4'及びＲ4''（代表的には、Ｃ1-4アルキル）の１以上は互いに結合して、環状炭化水素を形成することができる。別法では、リガンド結合メンバーの少なくとも２つのオリゴアミンのＲ4、Ｒ4'及びＲ4''（代表的には、メチル又はエチル）の１以上は、環状炭化水素、例えば、フェニル基を介して結合することができる。このようにして、本発明は、環状のリガンド結合メンバーを提供する。
【００３６】
少なくとも２つのオリゴアミンの各々の立体配座的に制限されたスカフォードへの共有結合（間接又は直接の結合）は、アミド結合を介するものでもよい。発明者らは、驚くべきことには、リガンド結合メンバーにおけるアミド基の存在が、水溶液中において、その構造についての著しい影響を有するとの知見を得た。アミド基は、リガンド結合メンバーに対して、付加的な立体配座的制限を提供する。
【００３７】
このように、本発明の好適な１具体例では、リガンド結合メンバーは、式（II）
【化２】
2009504718.tif 000003
（ここで、Ｒ6は、既に定義したような有機テンプレートであり；及びＲ7及びＲ8の各々は、独立して、既に定義したようなオリゴアミンである）で表される。
【００３８】
本発明の好適な１態様では、リガンド結合メンバーはリセプターである。リセプターは、非環式又は環状リセプターである。
【００３９】
好ましくは、リセプターは非環式リセプターである。ここで使用するように、用語「非環式」は、開放鎖又は直鎖にて交換可能なものとして使用している。
【００４０】
本発明の好適な１具体例では、リガンド結合メンバーは、構造１
【化３】
2009504718.tif 000004
又は構造２
【化４】
2009504718.tif 000005
に示すような非環式化合物である。
【００４１】
本発明の他の具体例では、リガンド結合メンバーは、構造３
【化５】
2009504718.tif 000006
の環状化合物である。
【００４２】
本発明の好適な具体例としては、下記のいくつかのリガンド結合メンバーが含まれる。
【化６】
2009504718.tif 000007
【化７】
2009504718.tif 000008
【化８】
2009504718.tif 000009
【００４３】
本発明の好適な他の態様では、リセプターは合成されたものである。
【００４４】
本発明の好適な態様では、リガンドは、ホスフェート分子又はホスフェート基少なくとも１つを含有する分子である。ホスフェート分子としては、無機ホスフェート、すなわち、オルト-ホスフェート（PO43-）及びピロ-ホスフェート（P2O74-）のような炭素を含有しないホスフェートが含まれる。有機ホスフェート分子としては、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート又はポリホスフェートが含まれる。ホスフェート含有有機分子の例としては、アデノシン二リン酸及びアデノシン三リン酸が含まれる。リガンドは、生物学的分子に結合され、例えば、リガンドは、タンパク質、脂質、炭水化物又は核酸に結合される。
【００４５】
本発明のリガンド結合メンバーは、ホスフェート含有分子と結合するため、ホスフェート阻害剤である。
【００４６】
本発明の好適な態様では、リガンド結合メンバーは、医薬品としての用途を有する。このように、リガンド結合メンバーは、薬学上許容されるキャリヤー又は希釈剤と組合された医薬組成物として提供される。
【００４７】
本発明は、例えば、異性体、プロドラッグ及び薬学上許容される塩を含む全ての形の上記リガンド結合メンバーを含む。
【００４８】
リガンド結合メンバーは、例えば、錠剤又はカプセルの形で経口投与に適用される。
【００４９】
本発明のリガンド結合メンバーは支持体上において不動化される。好ましくは、支持体は固体支持体である。好ましくは、リガンド結合メンバーは、共有結合的に、固体支持体に結合される。固体支持体は、例えば、ビニル重合体、アクリル重合体、アリル重合体（例えば、ポリアリルアミン及びポリアリルアルコール）又はポリエチレンオキシドを含む重合体からなる（これらに限定されない）。重合体としては、アガロース、セファロース、デキストラン、セルロース、キシラン、リグニン、ナイロン、DNA、RNA、ポリエステル、ポリアミド、ポリカーボネート、及びその誘導体も含まれる。重合体は、ホモポリマー又は上述ものの各種組み合わせ又は共重合体でもよい。特殊な重合体としては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート、ポリテトラフルオロエチレン及び前記のいずれかのもののハロゲン化誘導体、ポリビニルアルコール、ポリ塩化ビニル、ポリホスフェート、ポリエチレングリコール、ポリブタジエン、ポリペプチド、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリ(Ｎ-アルキル)アクリルアミド、ポリメタクリル酸ヒドロキシエチル（polyhema）、又は上述のものの組み合わせ又は共重合体も含まれる。
【００５０】
支持体は、ビーズ状、例えば、重合体ビーズ、ガラスビーズ又はシリカビーズである。あるいは、固体支持体は、ミクロ滴定プレート又はガラススライドを含み、又はゲル、ファイバー、フィラメント、膜、デンドライト、樹脂、ミセル、ナノ粒子又は相境界面からなるものである。支持体は、カラム、瀘過装置、メッシュ又はゲルの一部を形成していてもよい。
【００５１】
本発明の第２の態様では、本発明の第１の態様によるリガンド結合メンバーを含んでなるフィルターが提供される。
【００５２】
本発明の更なる態様では、本発明の第２の態様によるフィルターを包含する水精製システムが提供される。
【００５３】
本発明のさらに他の態様では、本発明の第２の態様によるフィルターを包含する腎臓透析システムが提供される。
【００５４】
本発明の更なる態様は、本発明の第１の態様によるリガンド結合メンバーの、上記のように定義されるホスフェート分子、ホスフェートイオン又はホスフェート含有分子の液体からの除去における使用を提供する。液体は、例えば、水、排水、尿又は血液である。
【００５５】
本発明の更なる態様では、本発明の第１の態様によるリガンド結合メンバーの、ホスフェート分子又はホスフェート含有分子の選択的スクリーニングにおける使用が提供される。
【００５６】
好ましくは、リガンド結合メンバーは、環状（又は大環状）構造、例えば、環状リセプターである。
【００５７】
本発明による非環状及び環状（例えば、大環状）リセプターは、ホスフェート含有有機分子よりも、より効果的に、無機ホスフェート分子を結合することが示されている。このように、本発明は、本発明による非環状又は環状のリガンド結合メンバーの、無機ホスフェート分子（例えば、溶液中の遊離ホスフェート）の選択的スクリーニング又は除去（例えば、液体から）における使用を提供する。本発明によるリガンド結合メンバーは、無機ホスフェートの、ホスフェート含有有機分子のような他のホスフェートからの分離を容易なものとする。
【００５８】
本発明は、さらに、本発明による非環状リガンド結合メンバーの、例えば、液体からのホスフェート含有分子（例えば、ホスフェート含有有機分子）の選択的スクリーニング又は除去における使用を提供する。このようにして、本発明によるリガンド結合メンバーは、無機ホスフェートのような他のホスフェートからのホスフェート含有分子の分離を容易なものとする。
【００５９】
本発明のさらに他の態様は、液体からホスフェート分子又はイオン又はホスフェート含有分子を分離する方法であって、
ｉ）本発明によるリガンド結合メンバーを、pH約５〜９において、液体と接触させる工程、及び
ii）リガンド結合メンバーに結合した各種ホスフェート分子、イオン又はホスフェート含有分子を任意に除去する工程
を包含する分離法を提供する。
【００６０】
本発明の好適な方法では、工程ｉ）は、pH６〜８、さらに好ましくはpH６.５〜７.５において行われる。
【００６１】
本発明の更なる態様は、本発明の第１の態様によるリガンド結合メンバーの、ホスファターゼの活性の阻害における使用を提供する。リガンド結合メンバーのリガンド（このケースでは、ホスフェート含有分子）への結合を介して、リガンド結合メンバーは、リガンド上のホスファターゼの活性をブロックするように作用する。
【００６２】
リガンド結合メンバーは、その検出及び／又は分析又は定量が可能となるようにラベル付けされる。このように、本発明は、探知可能なラベルを含んでなる本発明によるリガンド結合メンバーを提供するものである。ラベルとしては、例えば、酵素、蛍光ラベル又は容易に探知可能な放射性同位体がある。このようなラベル化リガンド結合メンバーは、例えば、細胞におけるリン酸化エピトープを標的とするために使用される。
【００６３】
本発明のさらに他の態様は、本発明の第１の態様によるリガンド結合メンバーの、腎不全の治療又は予防のための医薬品の製造における使用を提供する。
【００６４】
本発明の更なる態様は、腎不全を治療又は予防する方法であって、対象者に、本発明の第１の態様によるリガンド結合メンバーを、治療上有効な量で投与することを包含する腎不全の治療又は予防法を提供する。
【００６５】
この明細書及び請求の範囲における記載を通して、用語「含んでなる」及び「含有する」及び用語の変形は、「含んではいるが、これらに限定されない」の意味で使用したものであり、他のモイエティー、添加剤、成分、整数又は工程を排除することを意図するものではない。
【００６６】
この明細書及び請求の範囲における記載を通して、単数表現は、内容的に要求されない限り複数表現を含むものである。特に、不定冠詞を使用する部分では、明細書は、内容的に要求されない限り、単数表現と共に複数表現を含むものとして理解されなければならない。
【００６７】
本発明の特殊な態様、具体例又は実施例に関連して記載した特徴、整数、特性、化合物、化学モイエティー又は基は、適合しない場合を除き、ここに記載の他の態様、具体例又は実施例にも提供されるものとして理解されるべきである。
【実施例】
【００６８】
物質及び方法
電位差滴定
小サンプル容量（５ml）に適する、一体化ガラス電極及び２５℃で恒温としたインハウス用ジャケットセルを備えたMetrohm 792SM Titron自動化ビューレットを使用して、電位差滴定を行った。セルを不活性雰囲気下で密封した。Millipore Simplicity 185システムからの超純粋CO2フリー水を使用して、全ての溶液を調製した。サンプル溶液は、バックグラウンド電解質として、０.１M KClを含有する。異なるイオン強度に関する問題を回避するため、市販のKOHのCO2フリー濃縮物（Riedel-de Haen）を、0.080 M KCl溶液にて所望の濃度（0.020 M）まで希釈して、滴定液ベースを調製した。ガラス電極を、既知量のHCl（Piedel-de Haen濃縮物から調製）を塩基にて滴定し、Gran法（G. Gran, Analyst, 1952, 77, 661-671）を使用して当量点を測定することによって校正した（水のイオン積（pKW＝13.78）が得られ、続く分析における定数として使用した）。
【００６９】
サンプル濃度は、代表的には、１.０〜５.０×１０-3 Mである。リセプターの充分なプロトン化を行うため、既知の過剰量のHClを添加した。本発明のリセプターのプロトン化度を滴定曲線のオンセットから算定した。ホスフェート結合の検討のため。KH2PO4及びリセプターの等モル混合物を使用した。各滴定において、平衡を確保するために各添加の間隔を少なくとも３０秒として、pH範囲２.５〜11.0において最小250ポイントで測定した。プロトン化定数及び安定定数を測定するために、コンピュータープログラムHYPERQUAD1を使用した。各システムについて、各セットについて、最少3回の滴定を初めに行い、ついで、最終の定数を与えるように、同時に融合及び適合させた。
【００７０】
蛍光滴定
励起波長324 nmを使用し、pH７.０の０.１M TRIS緩衝液中、２５℃において、Spex Fluoromax-II装置で滴定を行った。フルオロフォアである４-メチルウンエリフェリルホスフェートをSigmaから入手し、その濃度を５０×１０-6 Mで一定に維持した。データを、非線形最小２乗アルゴリズムにより、１：１結合モデルに適合させた。
【００７１】
リセプターの合成及び結合実験
リセプターの２つの例をスキーム１に示す（化合物(1)及び(2)）。構造中に存在する立体配座的に制限されたスカフォードを、グレー部分で示す。オリゴアミンをスカフォードに共有結合させるために、アミドを使用する。アミド結合も、アミド結合の周りでの回転が障害されるため、追加の立体配座的制限を提供する。
リセプター(1)及び(2)の合成（スキーム１）は、モノ-BOC-保護化N-メチル-N,N-ジ(３-アミノプロピル)アミン(6)２当量と、フマル酸（化合物(1)について）又はマレイン酸（化合物(2)について）の二酸塩化物との反応によって開始される。モノ-BOC-保護化化学種の合成は直接的であり、過剰量のアミン原料物質を、乾燥及び蒸留によって水性排水から回収した。続いて、ガス状HClを使用して、得られた中間体(9),(10)を脱保護化し、分取ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（Sephadex G-10；溶離剤：水）による精製後、塩酸塩として単離した。プロトン化度を電位差滴定によって定めた。
【化９】
2009504718.tif 000010
【００７２】
２つの開放鎖リセプターの間の差異は、二重結合の周りの立体配置にある。この差異は、この種の分子の1H NMRスペクトルにおける重大な差異につながる。[D6]DMSO中のBoc-保護化トランス化合物(9)は、Ｃ2対称化合物について、予測されたスペクトルを発揮するが、同じ溶媒中のシス化合物(10)については像が異なる。スペクトルにおいて（図１）、化合物(9)については、二重結合のプロトンについて、唯１つの一重線が観察され、化合物(10)については、二重線が現われる。同様に、13C NMRスペクトルにおいて、二重結合の炭素に関して２つのシグナルが観察され、２つの離れたカルボニルのシグナルも存在する。見たところでは、化合物(10)は、分子の対称性を排除する立体配置を有している。
【００７３】
温度が室温から８０℃に上がると、二重線は相互に近接するように移動し、徐々に、予測された一重線に変化し、合体が７５℃で生ずる（図１）。アミドプロトンの１つに属する6.92 ppmのピークも、比較的良好に分れた三重線から、高磁場にシフトした幅広い一重線に変化した。合体温度から、回転バリヤーが４９±３kj mol-1であることが決定される。
【００７４】
NHシグナルのシフト及び広がりは、水素結合が、この立体配座平衡に関与すること（室温では、回転をスローダウンさせる）を示している。１つのアミドのカルボニルと他のアミドのNHとの間には、おそらく水素結合が存在している。これは、エネルギー的には必ずしも非常に有利とはいえないような７員環の形成に関与するが、同様の構造が、マレイン酸に結合した２つのアミノ酸を有する関連する化合物について既に提起されている（S. Valenzaら, J. Org. Chem. 2000, 65, 4003-4008）。
【００７５】
非対称の同じ現象は、D2Oにおける最終リセプター(2)に関しても観察されているが、この場合、室温では、両立体配座（Ｃ2対称及び非対称配座異性体）が存在し、ゆっくりとした交換である（図２）。温度が上昇すると、これらはゆっくりとした交換を維持しているが、これらの比は、対称立体配座に有利な方向に変化する。このような観察は、立体配座的に制限されるスカフォードにおけるアミド基の存在が、水性条件下のリセプターに対して構造的影響を及ぼしたことを明確に示す。
【００７６】
これらリセプターのホスフェートに関する親和性を迅速に評価するために、蛍光性のホスフェート誘導体(13)
【化１０】
2009504718.tif 000011
の結合を検討した。緩衝化水（０.１ M Tris、pH７.０）におけるこのプローブの溶液に対する本発明のリセプターの滴定において、化合物(13)の発光が消失しているが、これは結合を示している（図３）
【００７７】
続いて、これらのデータを１：１結合モデルに当てはめたところ、化合物(2)についての結合定数（log K）5.15が得られた。化合物(1)〜(13)の添加は発光の明確な消失を生ぜず、従って、その結合定数は得られないが、これは、有意な結合が生じていないことを示している。これは、オリゴアミンが協同することを阻止する、化合物(1)における立体配座的に制限されるスカフォードの周りのオリゴアミンのトランス配座に関連する。生理学的条件下、水中のホスフェート誘導体を結合するこの種のリセプターについて、これまでのところ、化合物(2)に関するlog K値が最高であること報告されており、この種の化合物が非常に将来有望なアニオンリセプターであることを示している。
【００７８】
結合をより詳しく検討するため、電位差滴定法を使用した。これを可能にするため、初めに、リセプターのプロトン化定数を調査した。得られたデータを表１に示す。発明者らのシステムをスペルミン（化合物(4)）にて校正し、この化合物に関するデータ（文献値に基づく（Bazzicalupiら, J. Am. Chem. Soc. 121: 6807-6815 (1999); De Stefanoら, J. Chem. Soc. Farady Trans, 94: 1091-1095 (1998); Bergeronら, J. Med. Chem. 38: 2278-2285 (1995)））についても、この表に示した。
【００７９】
【表１】
2009504718.tif 000012
【００８０】
オリゴアミンにおける２つの隣接するアミンの間の原子の数は、それらのpKa値における差異を決定する。アミンを分離する原子２個が存在する場合には、第２のアミンのプロトン化が、第１のアミンのプロトン化によって課される正の電荷によって強く影響され、アミンがプロトンを受け容れることを、より困難なものとし、すなわち、そのpKa値を低下させる。この影響は、アミンを分離する原子の数が増えるにつれて、徐々に低減される。例えば、１,２-ジアミノエタンについては、第１のプロトン化はpKa＝10.1で生じ、第２のプロトン化はpKa＝７.０で生じ、すなわち、その差は３.１であり、１,３-ジアミノプロパンいついては、第１pKa＝10.6、第２pKa＝８.６、差＝２であり、及び１,４-ジアミノブタンについては、値は10.8及び９.４であり、差は１.４である（Bertschら, J. Phys. Chem. 62: 444-446 (1958)）。従って、中性pHにおいて高プロトン化度を持つリセプターを得るためには、アミン間の原子の数を考慮することが重要である。
【００８１】
トランス-リセプター(1)は、異なるアミン間に２以上の原子を持つ代表的な解放鎖ポリアミン（例えば、スペルミン）のように挙動し、これによって、連続するプロトン化工程は、近くのプロトン化したアミンの存在によって、わずかながら穏和な影響を受ける。これに対して、シス-リセプター(2)は、開放鎖リセプターではあるが、より大環状物質に似た挙動を示す。化合物(2)についての第３及び特に第４のプロトン化工程は、化合物(1)と比べて、明らかに困難になる。これは、立体配座的に制限されたスカフォードの周りのシス配座（大環状物質と酷似して、より小さいエリアに正に帯電したアミンを濃縮させる、すなわち、立体配座的に制限されたスカフォードは、この化合物を、擬似−大環状化合物に変化させる）によるものである。
【００８２】
ついで、再度、電位差滴定法を使用して、無機ホスフェートの結合を検討した（表２）。電位差滴定法は、全pH範囲にわたるホスフェート結合定数を提供し、このようにして、蛍光滴定法よりも、かなり詳細な結合状況を表示する。化合物(1)は、ホスフェートに対して穏和な親和性を発揮し、代表的な開放鎖リセプター（log K＝２.９〜３.４）である。リセプター(2)（分子の同じサイドを向く両アームを持つ）は、立体配座的に制限されたスカフォードの周りのシス配置から生ずる良好に組織化された結合サイトのため、より強い結合（log K＝４.４〜８.６）を発揮する。予測されるように、データは、より大きいプロトン化度を持つリセプターが最高の結合定数を発揮することを示しており、これは、静電的相互作用の重要性を示している。
【００８３】
【表２】
2009504718.tif 000013
【００８４】
本発明のリセプターの一般的なデザイン上の原則をさらに例示するため、強固なノルボルネンスカフォードに基いて化合物(14)
【化１１】
2009504718.tif 000014
を合成した。合成は、化合物(1)及び(2)に関して述べたものと同じ一般的ルートによって行い、化合物(8)２当量を、５-ノルボルネン-２-エンド-３-エキソジカルボン酸のジ酸塩化物誘導体と反応させることによって開始させた。ガス状HClを使用してBoc基の脱保護を行い、最終リセプターを塩酸塩として得た。
【００８５】
化合物(14)のプロトン化定数（電位差滴定法（表１）によって測定）は、化合物(2)と同様であり、このリセプターも、大環状化合物様の挙動、すなわち、第３及び第４のプロトン化工程が、この種の直鎖ポリアミドに関して予測されるよりも明らかに困難になることを示す。リセプター(14)の場合、オリゴアミンのアームは、アミド結合を介して、実質的に全く立体配座的な自由を許容しない、立体配座的に非常に制限されたノルボルネン骨格に結合している。その結果、化合物(14)における第4のプロトン化定数は、化合物(2)のものと比べて明らかに低い。リセプター(14)は、(2)と同様の高ホスフェート結合親和性を発揮し、その充分にプロトン化された形では、わずかに高い親和性を示す（表２）。これは、オリゴアミンのアームが結合するスカフォードが立体配座的に制限されればされるほど、ホスフェート結合親和性がより大きくなることの証明である。
【００８６】
電位差滴定法のデータから、各リセプターについて、溶液中の遊離ホスフェートのフラクションと対比して、異なるpH値で存在する表２に示す各種のホスフェート結合化学種のフラクションを示す種分化ダイアグラムが作成される。ホスフェート結合化学種の全てのフラクション及び未結合ホスフェートの全てのフラクションを合計することによって、全てのpH範囲にわたる溶液においてホスフェートを結合する化合物(1)、(2)及び(14)の総合効率を表す図４のグラフが作成された。これは、これら化合物の親和性における相違を表している。例えば、pH７.０では、化合物(1)は溶液中のホスフェートのわずか３１％を結合するが、化合物(2)及び(14)は９５％程度を結合できる。
【００８７】
これらリセプターは、ホスフェート(13)に対するよりも無機ホスフェートに対してより大きい親和性を示す。これは、無機ホスフェートが更なるイオン化可能な基を有し、これにより、より大きい電荷密度を有するとの事実を反映するものである。明らかに小さいサイズを有しており、立体反発を低減する。
【００８８】
化合物(2)及び(14)の無機ホスフェートに対する親和性は著しく大きい。確かに、文献において報告されている大環状物質よりも大きい。高親和性は、構造内に導入された立体配座的制限の結果としての該リセプターの強化された組織化によるものである。従って、これらの非環状リセプターは、容易に合成される高親和性ホスフェートリセプターの新規な種類を構成する。
【００８９】
発明者らは、比較のために、重合化よりもむしろ大環状化を促進するため、希釈条件下で、化合物(2)をイソフタルデヒドと反応させることによって、大環状化合物(3)を合成した（スキーム２）。シッフ塩基中間体(12)を単離せず、直ちに、ナトリウムシアノボロヒドリッドを使用して対応するアミン(3)に還元した。より反応性のナトリウムボロヒドリッドでの還元は二重結合の汚染還元反応を生ずるため、使用を回避した。生成物を分取ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによって精製し、遊離塩基の形で単離した。
【化１２】
2009504718.tif 000015
【００９０】
化合物(3)のホスフェートとの結合を検討し、得られた結合曲線を図３に示す。結合に関する分析の結果、化合物(2)の結合に関して観察された値5.15と同様のlog K値5.30が得られ、これは、大環状化合物もホスフェートに対して大きい親和性を示すことを示している。
【００９１】
さらに詳しくは調査するため、電位差滴定法を使用して、オルト-ホスフェートの結合を検討した。大環状化合物(3)のpKa値を表１に示す。物質(2)及び(3)に関するデータの比較から、大環状化合物(3)についての第２、第３及び第４のpKa値は、化合物(２)における第１級アミンが、化合物(3)におけるより塩基性の第２級アミンに転化されたとしても、いずれも、非環状化合物(2)についての対応する値よりも小さいことが明らかである。これは、大環状効果、すなわち、閉環時、アミンが正の電荷を分離する可能性が制限され、このようにして、連続するpKa値が低下されることによるものである。
【００９２】
続いて、化合物(3)の無機ホスフェートとの結合を検討し、得られた結合定数を表２に示している。大環状化合物は、大環状構造の形成によってリセプターの立体配座的制限が、より増大したため、その開放鎖カウンターパート(2)（logK＝４.４〜８.６）よりもさらに大きいホスフェートに対する親和性（logK＝７.５〜14.2）を有する。化合物(3)についてのデータは、電荷が多いリセプターは、より大きい結合性を有するとの、化合物２についてと同じ傾向を示している。表２に示す値は、ポリアミンリセプターによる水中でのオルト-ホスフェートの結合に関して、現在までに報告されている最高の値である。
【００９３】
化合物(2)及び(3)のホスフェート及びホスフェート分子(13)に対する結合結果を比較すると、ホスフェートに対する親和性に関して明らかな相違があること、すなわち、大環状化合物(3)のホスフェート結合性は最大であり、両リセプターの化合物(13)に対する結合親和性は実質的に同じであることが認められる。これは、化合物(13)のようなより複雑及び電位的に立体障害された分子を結合する場合、開放鎖リセプターを使用することが明らかに有利であることを意味している。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】各種の温度における、[D6]DMSO中の化合物(10)の270 MHz 1Ｈスペクトルの一部を示すチャートである。
【図２】各種の温度における、D2O中の化合物(2)の270 MHz 1Ｈスペクトルの一部を示すチャートである（非対称及び対称配置を示す）。
【図３】２０℃における、０.１M TRIS緩衝液中の化合物(13)（５.０×１０-6 M）の化合物(2)（■）及び(3)（●）への結合に関する蛍光滴定曲線を示すグラフである。
【図４】化合物(1)（A）、(2)（B）、(3)（C）及び(14)（D）による溶液においてリセプターに結合した（実線）及び遊離の（点線）ホスフェートのフラクションのグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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2009504718.tif 000021
2009504718.tif 000022
2009504718.tif 000023
2009504718.tif 000024
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