(57)【要約】  一般式［Ｉ］2009537625.tif 000010（式中、Ｒ１は、飽和でも不飽和でもよく、直鎖でも分枝鎖でもよい、５〜１４個の炭素原子を含む脂肪族ヒドロカルビル基であり、Ｒ２は、水素原子または炭素数１〜４のアルキル基であり、Ｒ３は、水素原子またはフッ素原子である）で示される置換Ｎ−アシルホモセリンラクトンおよびその任意のエナンチオマー。これらの化合物は、免疫抑制活性を示すが、そのバイオセンサー（オートインデューサー）活性は既知のＮ−アシルホモセリンラクトンと比較して低減されている。
2009537625.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式［Ｉ］
【化１】
2009537625.tif 000008
（式中、Ｒ１は、飽和でも不飽和でもよく、直鎖でも分枝鎖でもよい、５〜１４個の炭素原子を含む脂肪族ヒドロカルビル基であり、Ｒ２は、水素原子または炭素数１〜４のアルキル基であり、Ｒ３は、水素原子またはフッ素原子である）で示される化合物およびその任意のエナンチオマー。
【請求項２】
Ｒ１が５〜１４個の炭素原子を含む直鎖アルキル基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ１がｎ−オクチル基である、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ２が水素原子またはメチル基である、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物。
【請求項５】
Ｎ−（４−アザ−３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンである、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｎ−（４−メチル−４−アザ−３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンである、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
Ｎ−（４−アザ−２−フルオロ−３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンである、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
有効成分として請求項１〜７のいずれかに記載の化合物を含み、かつ薬学的に許容される１以上の医薬担体、賦形剤または希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項９】
一般式［Ｉ］
【化２】
2009537625.tif 000009
（式中、Ｒ１は、飽和でも不飽和でもよく、直鎖でも分枝鎖でもよい、５〜１４個の炭素原子を含む脂肪族ヒドロカルビル基であり、Ｒ２は、水素原子または炭素数１〜４のアルキル基であり、Ｒ３は、水素原子またはフッ素原子である）で示される化合物およびその任意のエナンチオマーの製造方法であって、一般式Ｒ１Ｒ２ＮＣ（Ｏ）ＣＨＲ３Ｃ（Ｏ）ＯＨ（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は前記記載のとおりである）を有する置換カルボン酸とＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールとを反応させ、次いでＮ−アシルイミダゾール中間体とＬ−ホモセリンラクトンとを反応させることを含む製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は置換Ｎ−アシルホモセリンラクトンに関する。さらに詳しくは、免疫抑制活性を示しつつ、バイオセンサー（オートインデューサー）活性は低減されている、ある種の置換Ｎ−アシルホモセリンラクトンに関する。本発明はさらに、有効成分として置換Ｎ−アシルホモセリンラクトンを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫抑制化合物は、免疫応答系の抑制を引き起こす。免疫抑制活性を示すことが知られている化合物としては、菌代謝物質であるシクロスポリンＡ、およびＦＫ５０６と呼ばれるマクロライド系抗生物質（ストレプトミセスツクバエンシスからの代謝物質）が挙げられる。これらの薬剤はいずれも、移植および多くの疾患の治療において免疫系を抑制する目的で、臨床的、実験的に使用されている。
【０００３】
自己免疫疾患とは、「自己」と「非自己」とを識別する宿主の機能が破綻し、個体の免疫系（先天性要素、後天性要素いずれも）が自己の組織を攻撃する疾患である。これらの疾患は、関節リウマチ、自己免疫性甲状腺疾患、１型糖尿病のような一般的なものから、多発性硬化症のようなあまり一般的でないもの、さらには重症筋無力症のようなまれな疾患まで多岐にわたる。基礎的な生体医科学、とりわけ免疫学の進歩により、ほとんどの自己免疫疾患の誘導および持続に関与する主要かつ根本的な病変は、増殖する自己反応性Ｔリンパ球に存在することが示されている。実際、自己免疫疾患の大部分は、Ｔ細胞ホメオスタシスの喪失に関係している。健康な免疫系は、ヘルパーＴ１（Ｔｈ１）リンパ球サブセットおよびヘルパーＴ２（Ｔｈ２）リンパ球サブセットによってサイトカインの産生が互いに拮抗しあっており、それによってバランスのとれた平衡状態に保たれていると考えられる。自己免疫においては、Ｔｈ１サイトカインが優位であり、アレルギー症では、Ｔｈ２サイトカインが優位となる。Ｔｈ１偏位の反応、ひいては自己免疫疾患の進行と密接に係るサイトカインは、ＴＮＦ−αである。
【０００４】
シクロスポリンＡおよびＦＫ５０６はいずれも、自己免疫疾患治療において臨床的に使用され、有望な結果を示している。
【０００５】
現在利用可能な免疫抑制剤には、治療指数（すなわち毒性に対する臨床的有益性）が低いという欠点がある。これらの化合物は、腎毒性、神経毒性、および潜在的糖尿病誘発性を有することが知られている。このため、上述の分野におけるこれらの使用は限定的なものである。また、これらの化合物には、その投与、有効利用率、ならびに臨床的および研究室内でのレベルモニタリング上の問題が存在する。
【０００６】
Ｎ−アシルホモセリンラクトンは既知である。国際公開第９２／１８６１４号パンフレットには、次式を有する化合物が開示されている。
【化１】
2009537625.tif 000003
ここでｎは２または３；ＹはＯ、Ｓ、またはＮＨ；ＸはＯ、Ｓ、またはＮＨ；Ｒは置換されていてもよい炭素数１〜１２のアルキル基またはアシル基を示す。これらの化合物は、該文献において、オートインデューサーとして、また遺伝子発現を制御する薬剤として、開示されている。天然に生じるオートインデューサーは、微生物による代謝作用の過程において産生される化合物であり、該微生物の遺伝子の発現を増加させる働きをする。国際公開第９２／１８６１４号パンフレットで示されたものと同系列の化合物が、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌｕｍｅ  １７５，  ｎｕｍｂｅｒ  １２，  Ｊｕｎｅ  １９９３，  ３８５６−３８６２でも挙げられているが、ここでも微生物外での作用の可能性について何ら教示されていない。
【０００７】
Ｇ．  Ｐａｐａｃｃｉｏは、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐｒａｃｔ．  ｖｏｌ．  １３，  Ｎｏ．  １，  １９９１，  ９５−１０２において、化学的に誘導される糖尿病に対する防御を強化することを目的とした、スーパーオキシドジスムターゼのエンハンサーとしてのＮ−アセチルホモシステインチオラクトンの使用を開示している。
【０００８】
Ｎ−アセチルホモシステインチオラクトンをＩｇＥの修飾に使用することについては、Ｊ．Ｌｊａｌｊｅｖｉｃらが、  Ｏｄ．  Ｍｅｄ．  Ｎａｕｋａ，  ｖｏｌ．２４，  １９７１，  １３７−１４３およびＣｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ，  ｖｏｌ．７８，  Ｎｏ．  ７，  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １９７３，  ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．  ４１２１３ａにおいて示している。しかしながら、この論文は免疫抑制については何ら示唆していない。
【０００９】
米国特許第５，５９１，８７２号明細書には、緑膿菌のオートインデューサー分子として、化合物Ｎ−（３−オキソドデカノイル）ホモセリンラクトンが開示されている。
Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，  ｖｏｌ．  ６６，  Ｎｏ．  １，  Ｊａｎｕａｒｙ  １９９８において、著者らは、コンカナバリンＡマイトジェン刺激によるマウス脾臓細胞の増殖およびＬＰＳ刺激された接着性マウス腹腔マクロファージによるＴＮＦ−αの産生を抑制するＮ−（３−オキソドデカノイル）ホモセリンラクトン（ＯｄＤＨＬ）の作用について報告している。
【００１０】
国際公開第９５／０１１７５号パンフレットには、以前に国際公開第９２／１８６１４号パンフレットにおいて開示された化合物と関連する化合物クラスが抗アレルギー性活性を示すこと、およびヒスタミン放出を抑制することが記載されている。
【００１１】
国際公開第０１／７４８０１号パンフレットには、免疫抑制剤であるＮ−アシルホモセリンラクトンの新たなサブクラスが開示されている。これらの化合物またはその任意のエナンチオマーは、生きた動物の体内で免疫応答を調節できることが報告されており、次式で表すことができる。
【化２】
2009537625.tif 000004
式中、Ｒは次式のアシル基である。
【化３】
2009537625.tif 000005
式中、Ｒ１とＲ２は、いずれか一方が水素原子であり、他方はＯＲ４、ＳＲ４、およびＮＨＲ４（Ｒ４は水素原子または炭素数１〜６のアルキル基である）から選択されるか、または、Ｒ１とＲ２とがそれらが結合している炭素原子とともにケト基を形成している。Ｒ３は、直鎖でも分枝鎖でもよく、飽和でも不飽和でもよい、８〜１１個の炭素原子を含む脂肪族ヒドロカルビル基である。また、Ｒ３は、ハロゲン、炭素数１〜６のアルコキシ基、カルボキシ基、炭素数１〜６のアルコキシカルボニル基、カルバモイル基（窒素原子において、炭素数１〜６のアルキル基で、一置換または二置換されていてもよい）、ならびにＮＲ５Ｒ６（Ｒ５およびＲ６はそれぞれ、水素原子および炭素数１〜６のアルキル基から選択されるか、またはＲ５とＲ６とが該窒素原子とともにモルホリノ基またはピペラジノ基を形成している）から選択される１以上の置換基で置換されてもよい。これらの化合物は、特に、ヒトリンパ細胞増殖に対する抑制作用を有し、単球／マクロファージによるＴＮＦ−αの分泌をダウンレギュレートすることにより、ヒトＴｈ１リンパ球の活性化をダウンレギュレートする。先行技術に示されたＮ−アシルホモセリンラクトンはいずれも、増殖抑制活性をも有する化合物においては不利になるバイオセンサー活性を有している。同程度の免疫調節特性を有しつつバイオセンサー活性は低減されているという長所を有するＯｄＤＨＬ関連化合物を発見することは、この分野における研究者らの目標となっている。そのような化合物が今回発見されたことは、発明者らの功績である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
したがって、本発明はその第１の態様において、一般式Ｉの化合物およびその任意のエナンチオマーを提供する。
【化４】
2009537625.tif 000006
式中、Ｒ１は、飽和でも不飽和でもよく、直鎖でも分枝鎖でもよい、５〜１４個の炭素原子を含む脂肪族ヒドロカルビル基である。Ｒ２は、水素原子または炭素数１〜４のアルキル基である。Ｒ３は、水素原子またはフッ素原子である。
【００１３】
前記一般式Ｉ中のＲ１基は、飽和でも不飽和でもよく、直鎖でも分枝鎖でもよい、５〜１４個の炭素原子を含む脂肪族ヒドロカルビル基である。たとえば、Ｒ１は、直鎖もしくは分枝鎖の炭素数５〜１４のアルキル基、直鎖もしくは分枝鎖の炭素数５〜１４のアルケニル基、または直鎖もしくは分枝鎖の炭素数５〜１４のアルキニル基であってよい。Ｒ１は、好ましくは５〜１４個の炭素原子を含む直鎖アルキル基である。このようなアルキル基の具体例としては、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基およびデシル基が挙げられる。本発明の特に好ましい実施形態によれば、Ｒ１基はｎ−オクチル基である。
【００１４】
前記一般式Ｉ中のＲ２基は、水素原子および炭素数１〜４のアルキル基を含む群から選択される。前記一般式ＩにおいてＲ２で表される炭素数１〜４のアルキル基の例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基およびイソブチル基が挙げられる。本発明におけるＲ２は、好ましくは水素原子またはメチル基である。
【００１５】
前記一般式Ｉ中のＲ３基は、水素原子およびフルオロ基から選択される。一般式ＩにおけるＲ３がフルオロ基である場合、フルオロ基の付いた炭素原子にもう１つのキラル中心が存在することは明らかであろう。本発明は、該化合物の個々のエナンチオマーおよびそのラセミ混合物にも関する。
【００１６】
本発明による好ましい化合物は、Ｒ１基がｎ−オクチル基であり、Ｒ２基が水素原子またはメチル基であり、Ｒ３基が水素原子またはフルオロ基である前記一般式Ｉを有する。本発明による好ましい化合物の具体例としては、Ｎ−（４−アザ−３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（４−メチル−４−アザ−３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンおよびＮ−（４−アザ−２−フルオロ−３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンが挙げられる。
【００１７】
本発明の化合物は、一般に、一般式Ｒ１Ｒ２ＮＣ（Ｏ）ＣＨＲ３Ｃ（Ｏ）ＯＨ（Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は前記記載のとおりである）を有する置換カルボン酸とＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールとを反応させ、次いでＮ−アシルイミダゾール中間体とＬ−ホモセリンラクトン（一般的には塩酸塩として）とを反応させることによって、調製することができる。
【００１８】
前記の調製における出発原料としてのカルボン酸自体は、アミンＲ１Ｒ２ＮＨを置換されていてもよいマロン酸エチルエステルと反応させ、必要とされる置換カルボン酸のエチルエステルを形成した後にこれを加水分解することによって得てもよい。たとえば、発明者らは、単にアミンＲ１Ｒ２ＮＨとエチルマロニルクロリドとを反応させ、次いで、得られたエチルエステルを目的の酸へと加水分解することによって、前記の式で表される置換カルボン酸（Ｒ３は水素原子）を調製できることを見いだした。また、Ｒ３基がフルオロ基である場合、アミンＲ１Ｒ２ＮＨとジメチルフルオロマロネートとの反応によって、目的とする置換カルボン酸のエチルエステルが収率よく得られることを見いだした。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の化合物は、免疫抑制活性が奏功する疾患または障害を患う個体の治療において、薬学的有効成分としての用途を有する。本発明の化合物は、リンパ球の増殖およびＴＮＦ−αの産生を抑制する一方、そのオートインデューサー活性はＯｄＤＨＬと比較して低減されている。したがって、該化合物は、たとえば自己免疫疾患の治療において、個体の免疫系を調節するために使用されてもよい。本発明の化合物の有効量を投与することによって治療されてもよい自己免疫疾患の具体例としては、乾癬、多発性硬化症および関節リウマチが挙げられる。治療を要する個体への投与量は、当然のことながら、実際に使用する活性化合物、投与方法および望ましい治療の種類ならびに個体の体重に依存する。該活性化合物は、単独で、または、たとえば適切な医薬担体、賦形剤もしくは希釈剤を含む適切な医薬組成物の形態で投与されてもよい。このような医薬組成物においては、酸化防止剤および安定剤のような他の物質もまた使用することが可能であり、その使用は当業者には周知である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】４−アザ−ＯｄＤＨＬの増殖抑制活性を既知のＯｄＤＨＬと比較して示す図である。
【図２】４−メチル−４−アザ−ＯｄＤＨＬの増殖抑制活性を既知のＯｄＤＨＬと比較して示す図である。
【実施例１】
【００２１】
Ｎ−（４−アザ−３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン  （４−アザ−ＯｄＤＨＬ）の合成
ステップ１  エチル４−アザ−３−オキソドデカノエート
氷冷撹拌下、ｎ−オクチルアミン（１０１．５４ｍｍｏｌ，１３．１２ｇ）の無水ジクロロメタン（７５ｍｌ）溶液に、エチルマロニルクロリド（５０．７７ｍｍｏｌ，６．５ｍｌ）を１５分かけて滴下し、さらに１時間撹拌した。この溶液を、飽和重炭酸ナトリウム（３×２０ｍｌ）、２Ｍ  ＨＣｌ（３×２０ｍｌ）および飽和塩化ナトリウム溶液（１×２０ｍｌ）で順次洗浄した。ＭｇＳＯ４で乾燥させ、有機溶媒をロータリーエバポレーションすることにより、エチル−４−アザ−３−オキソドデカノエートを白色固体（８．５ｇ，６９％）として得た。
ＴＬＣ  Ｒｆ  ０．４３，  酢酸エチル−ヘキサン（１：１）
１Ｈ  ＮＭＲ  （２５０  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ  ０．９３  （３Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ６．０  Ｈｚ，  （ＣＨ３（ＣＨ２）７），  １．０７−１．７７  （１３Ｈ，  ｍ，  ＣＨ３（ＣＨ２）５  ａｎｄ  ＯＣＨ２ＣＨ３），  １．４８  （２Ｈ，  ｍ，  ＣＨ３（ＣＨ２）５ＣＨ２），  ３．２３  （２Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ７．５  Ｈｚ，  ＣＨ３（ＣＨ２）６ＣＨ２），  ３．３０  （２Ｈ，  ｓ，  ＣＯＣＨ２ＣＯＯ），  ４．２３  （２Ｈ，  ｑ，    Ｊ    ７．５  Ｈｚ，  ＯＣＨ２ＣＨ３），  ７．７１  （１Ｈ，  ｂｒ  ｓ，  ＮＨ）．
【００２２】
ステップ２  ４−アザ−３−オキソドデカン酸
撹拌下、エチル−４−アザ−３−オキソドデカノエート（７．５ｍｍｏｌ，１．８１ｇ）のエタノール（５０ｍｌ）溶液に、ＮａＯＨ（８．７５ｍｍｏｌ，３５０ｍｇ）の水（５０ｍｌ）溶液を加え、室温で１６時間撹拌を続けた。エタノールを除去するため、この混合液をロータリーエバポレータにかけた。残渣を再び水に溶解し、酢酸エチルで洗浄した。次いでこれを２Ｍ  ＨＣｌ（ｐＨ１）で酸性にした。生成した４−アザ−３−オキソドデカン酸をジクロロメタン（４×１５ｍｌ）で抽出した。ＭｇＳＯ４で乾燥させ、ジクロロメタンをロータリーエバポレータで留去することにより、４−アザ−３−オキソドデカン酸を白色固体（１．３５ｇ，８４．３％）として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （２５０  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ  ０．９  （３Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ６．１５  Ｈｚ，  ＣＨ３（ＣＨ２）７），  １．３  （１０Ｈ，  ｍ，  ＣＨ３（ＣＨ２）５），  １．５４  （２Ｈ，  ｍ，  ＣＨ３（ＣＨ２）５ＣＨ２−），  ３．３  （２Ｈ，  Ｊ  ６．４，  ＣＨ３（ＣＨ２）６ＣＨ２），  ３．３７  （２Ｈ，  ｓ，  ＣＯＣＨ２ＣＯ），  ７．１９  （１Ｈ，  ｓ，  ＮＨ），  １０．６４  （１Ｈ，  ｓ，  ＣＯＯＨ）．
【００２３】
ステップ３  Ｎ−（４−アザ−３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン  （４−アザ−ＯｄＤＨＬ）
撹拌下、４−アザ−３−オキソドデカン酸（５．７４ｍｍｏｌ，１．２３ｇ）の無水ジクロロメタン（４０ｍｌ）溶液に、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（５．０２ｍｍｏｌ，９４３ｍｇ）、トリエチルアミン（５．７４ｍｍｏｌ，０．８ｍｌ）およびＬ−ホモセリンラクトン塩酸塩（５．７４ｍｍｏｌ，７９０ｍｇ）を順次加えた。この混合液を室温で一晩撹拌し、次いでロータリーエバポレータで溶媒を蒸発させた。残渣を再び酢酸エチル（４０ｍｌ）に溶解し、この溶液を飽和重炭酸ナトリウム（２×２５ｍｌ）、２Ｍ  ＨＣｌ（３×２５ｍｌ）および食塩水（１×２５ｍｌ）で洗浄した。
ＭｇＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧留去した後、単離生成した４−アザ−ＯｄＤＨＬを、ヘキサン−酢酸エチル（１：４）溶媒系（６７６ｍｇ，３９．５％）を使用してＰＬＣにより精製した。
ＴＬＣ  Ｒｆ，酢酸エチル−ヘキサン（４：１）
ＩＲ  （ＫＢｒ）  ３２９３  （ＮＨ），  １７７１  （ｒｉｎｇ  Ｃ＝Ｏ），  １６８５  （３−ａｍｉｄｅ  Ｃ＝Ｏ），  １６４５  （１−ａｍｉｄｅ  Ｃ＝Ｏ）  ｃｍ−１
１Ｈ  ＮＭＲ  （２５０  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ  ０．９  （３Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ６．５  Ｈｚ，  ＣＨ３（ＣＨ２）７），  １．２７  （１０Ｈ，  ｍ，  ＣＨ３（ＣＨ２）５），  １．５  （２Ｈ，  ｂｒ，  ＣＨ３（ＣＨ２）５ＣＨ２）  ２．３４  （１Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ  ９．９  ａｎｄ  １．５  Ｈｚ，  ｒｉｎｇ，  ４α−Ｈ），  ２．６６  （１Ｈ，  ｄｄｄ，  Ｊ  ２．０，  ３．８  ａｎｄ  ６．８  Ｈｚ，    ｒｉｎｇ，  ４β−Ｈ），  ３．２２  （２Ｈ，  ｔ，  Ｊ    ６．６  Ｈｚ，  ＣＨ３（ＣＨ２）６ＣＨ２），  ３．２８  （２Ｈ，  ｓ，  ＣＯＣＨ２ＣＯ），  ４．２３  （１Ｈ，  ｄｄｄ，  Ｊ  ３．０，  ４．４  ａｎｄ  ６．３  Ｈｚ，  ｒｉｎｇ，  ３Ｈ），  ４．４９  （１Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ  ７．６５  ａｎｄ  １．３  Ｈｚ，  ｒｉｎｇ，  ５α−Ｈ），  ４．６  （１Ｈ，  ｄｄｄ，  Ｊ  ２．３，  ４．９  ａｎｄ  ８．７  Ｈｚ，  ｒｉｎｇ，  ５β−Ｈ），  ７．１４  （１Ｈ，  ｂｒ  ｔ，  ４−ＮＨ），    ８．２  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ６．８  Ｈｚ，  ＮＨ−ＨＳＬ）．
ＥＳ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ２９９．１３  （Ｍ＋Ｈ，  Ｃ１５Ｈ２６Ｎ２Ｏ４  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｍ／ｚ  ２９８），  ３２１．１１  （Ｍ＋Ｎａ）．
【実施例２】
【００２４】
Ｎ−（４−アザ−４−メチル−３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン（４−アザ−４−Ｍｅ−ＯｄＤＨＬ）の合成
ステップ１  エチル−４−アザ−４−メチル−３−オキソドデカノエート
実施例１ステップ１の手順を、ｎ−オクチルアミンの代わりにＮ−メチル−ｎ−オクチルアミンを使用すること以外は同様に繰り返した。標記の化合物を、ジエチルエーテル（９７％）から再結晶した半固体物質として得た。
ＴＬＣ  Ｒｆ  ０．５，酢酸エチル−ヘキサン（１：１）
１Ｈ  ＮＭＲ  （２５０  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ  ０．８７  （３Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ６．７  Ｈｚ，  （ＣＨ３（ＣＨ２）７），  １．２６−１．３２  （１３Ｈ，  ｍ，  ＣＨ３（ＣＨ２）５  ａｎｄ  ＯＣＨ２ＣＨ３），  １．５５  （２Ｈ，  ｓ  （ｂｒｏａｄ），  ＣＨ３（ＣＨ２）５ＣＨ２），  ２．９４，  ２．９８  （３Ｈ，  ２  ｘ  ｓ，    ＮＣＨ３），  ３．２４  （１Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ  １．９  ａｎｄ  ７．６  Ｈｚ，  ＣＨ３（ＣＨ２）６ＣＨ（Ｈ）），  ３．３９  （１Ｈ，  ｄｄｄ，  Ｊ  １．９，  ５．６  ａｎｄ  ７．６  Ｈｚ，  ＣＨ３（ＣＨ２）６ＣＨ（Ｈ）），  ３．４４  （２Ｈ，  ｓ，  ＣＯＣＨ２ＣＯＯ），  ４．２  （２Ｈ，  ｔｗｏ  ｑ  （ｏｖｅｒｌａｐ），  ＯＣＨ２ＣＨ３）．
【００２５】
ステップ２  ４−アザ−４−メチル−３−オキソドデカン酸
エチル４−アザ−４−メチル−３−オキソドデカノエート（４．８５ｍｍｏｌ，１．２４６ｇ）を、実施例１ステップ２でエチル４−アザ−３−オキソドデカノエートに対して実施した手順に従って、ＮａＯＨ溶液（５．７ｍｍｏｌ，  ２２６ｍｇ）を用いて鹸化した。生成物４−アザ−４−メチル−３−オキソドデカン酸を白色固体（１．０３ｇ、９３％）として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （２５０  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ  ０．８９  （３Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ６．０  Ｈｚ，  （ＣＨ３（ＣＨ２）７），  １．３  （１０Ｈ，  ｍ，  ＣＨ３（ＣＨ２）５），  １．５８  （２Ｈ，  ｂｒ  ｓ，  ＣＨ３（ＣＨ２）５ＣＨ２），  ３．０３  （３Ｈ，  ｓ，  ＮＣＨ３），  ３．２４  （２Ｈ，  Ｊ  ７．６  Ｈｚ，  ＣＨ３（ＣＨ２）６ＣＨ２），  ３．４２  （２Ｈ，  ｓ，  ＣＯＣＨ２ＣＯＯ），  １０．１５  （１Ｈ，  ｓ，  ＣＯＯＨ）．
【００２６】
ステップ３  Ｎ−（４−アザ−４−メチル−３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン  （４−アザ−４−Ｍｅ−ＯｄＤＨＬ）
４−アザ−４−メチル−３−オキソドデカン酸（３．９ｍｍｏｌ，８９６ｍｇ）を、実施例１ステップ３の手順に従って、Ｌ−ホモセリンラクトン塩酸塩（４．０ｍｍｏｌ，５５０ｍｇ）とカップリングさせた。標記の生成物、４−アザ−４−メチル−ＯｄＤＨＬは、ヘキサン−酢酸エチル（１：４）（２３７ｍｇ，１９．５％）を用いて、ＰＬＣにより精製した。
ＴＬＣ  Ｒｆ−０．１９，  酢酸エチルヘキサン（４：１）
ＩＲ  （ＫＢｒ）  ３２９９  （ＮＨ），  １７７６  （ｒｉｎｇ  Ｃ＝Ｏ），  １６８３  （３−ａｍｉｄｅ  Ｃ＝Ｏ），  １６５４  （１−ａｍｉｄｅ  Ｃ＝Ｏ）  ｃｍ−１
１Ｈ  ＮＭＲ  （２５０  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  ０．８８  （３Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ５．６  Ｈｚ，  （ＣＨ３（ＣＨ２）７），  １．２７  （１０Ｈ，  ｍ，  ＣＨ３（ＣＨ２）５），  １．５３  （２Ｈ，  ｂｒ  ｓ，  ＣＨ３（ＣＨ２）５ＣＨ２），  ２．２９  （１Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ  １０．１  ａｎｄ  １．４７  Ｈｚ，  ｒｉｎｇ，  ４α−Ｈ），  ２．６６  （１Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ  ２．０  ａｎｄ  ５．６  Ｈｚ，  ｒｉｎｇ，  ４β−Ｈ），  ３．０  （３Ｈ，  ２  ｘ  ｓ，  ＮＣＨ３），  ３．３  （２Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ７．７２  Ｈｚ，  ＣＨ３（ＣＨ２）６ＣＨ２），  ３．３８  （２Ｈ  ｓ，  ＣＯＣＨ２ＣＯ），  ４．２８  （１Ｈ，  ｄｄｄｄ，  １．４９，  ３．１９，  ４．０５  ａｎｄ  ６．１  Ｈｚ，  ｒｉｎｇ，  ３Ｈ），  ４．４８  （１Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ９．１  Ｈｚ，  ｒｉｎｇ，  ５α−Ｈ），  ４．６  （１Ｈ，  ｄｄｄｄ，  Ｊ  １．５，  ２．６，  ４．５  ａｎｄ  ７．２  Ｈｚ，  ｒｉｎｇ，  ５β−Ｈ），  ８．８４  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ７．４  Ｈｚ，  ＮＨ−ＨＳＬ）  ．
ＥＳ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ３１３．１４  （Ｍ＋Ｈ，  Ｃ１６Ｈ２８Ｎ２Ｏ４  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｍ／ｚ  ３１２），  ３３５．１２  （Ｍ＋Ｎａ）．
【実施例３】
【００２７】
４−アザ−２−フルオロ−３−オキソドデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン  （４−アザ−２−Ｆ−ＯｄＤＨＬ）の合成
ステップ１  メチル−４−アザ−２−フルオロ−３−オキソドデカノエート
撹拌下、ジメチルフルオロマロナート（１ｍｍｏｌ，１５０．１１ｍｇ）の無水メタノール（１０ｍｌ）溶液に、ｎ−オクチルアミン（１ｍｍｏｌ，１６６μｌ）のメタノール（５ｍｌ）溶液を室温で１時間かけて滴下した。これをその後さらに２時間室温で撹拌した。この溶液をロータリーエバポレータにかけ、残渣を酢酸エチルに再び溶解した。この酢酸エチル溶液を、２Ｍ  ＨＣｌ（２×１０ｍｌ）および飽和塩化ナトリウム溶液（１×１５ｍｌ）で順次洗浄した。ＭｇＳＯ４で乾燥させ、有機溶媒をロータリーエバポレータで留去することにより、ビスアミドとエチル４−アザ−２−フルオロ−３−オキソドデカノエートとの混合物を白色固体として得た。目的化合物を、４０−６０石油エーテル−ジエチルエーテル（３：２）（１１７ｍｇ，４７％）を用いて、ＰＬＣにより白色固体として精製した。
ＴＬＣ  Ｒｆ  ０．２３，  石油エーテル−ジエチルエーテル（３：２）
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ  ０．８８  （３Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ６．４  Ｈｚ，  （ＣＨ３（ＣＨ２）７），  １．２９  （１０Ｈ，  ｍ，  ＣＨ３（ＣＨ２）５），  １．５４  （２Ｈ，  ｂｒ  ｓ，  ＣＨ３（ＣＨ２）５ＣＨ２），  ３．３２  （２Ｈ，  ｍ，  Ｊ  ６．６  Ｈｚ，  ＣＨ３（ＣＨ２）６ＣＨ２），  ３．９  （３Ｈ，  ｓ，  ＯＣＨ３），  ５．２８  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ４９．２，  Ｃ（Ｈ）Ｆ），  ６．４２  （１Ｈ，  ｓ，  ＮＨ）．
【００２８】
ステップ２  ４−アザ−２−フルオロ−３−オキソドデカン酸
撹拌下、メチル４−アザ−２−フルオロ−３−オキソドデカノエート（０．２８ｍｍｏｌ，７０ｍｇ）のメタノール（１５ｍｌ）溶液に、ＮａＯＨ（０．２８ｍｍｏｌ，１１．２ｍｇ）の水（５ｍｌ）溶液を加え、室温でさらに２時間撹拌した。メタノールを除去するため、この混合液をロータリーエバポレータにかけた。残渣を再び水（２５ｍｌ）に溶解し、水溶液を酢酸エチルで洗浄した。次いでこれを２Ｍ  ＨＣｌ（ｐＨ１）で酸性にした。生成した４−アザ−２−フルオロ−３−オキソドデカン酸を酢酸エチル（３×１５ｍｌ）で抽出した。ＭｇＳＯ４で乾燥させ、酢酸エチルをロータリーエバポレータで留去することにより、４−アザ−２−フルオロ−３−オキソドデカン酸を白色固体（６４ｍｇ，９９％）として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ  ０．９  （３Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ６．６  Ｈｚ，  （ＣＨ３（ＣＨ２）７），  １．３１  （１０Ｈ，  ｍ，  ＣＨ３（ＣＨ２）５），  １．６０  （２Ｈ，  ｍ，  ＣＨ３（ＣＨ２）５ＣＨ２），  ３．４  （２Ｈ，  Ｊ  ６．８  Ｈｚ，  ＣＨ３（ＣＨ２）６ＣＨ２），  ５．３  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ４７．２  Ｈｚ，  Ｃ（Ｈ）Ｆ），  ６．７  （１Ｈ，  ｓ，  ＮＨ），  ７．３  （１Ｈ，  ｂｒ    ｓ，  ＣＯＯＨ）．
【００２９】
ステップ３  ４−アザ−２−フルオロ−３−オキソドデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン  （４−アザ−２−Ｆ−ＯｄＤＨＬ）
撹拌下、４−アザ−２−フルオロ−３−オキソドデカン酸（０．２８ｍｍｏｌ，６４ｍｇ）の無水ジクロロメタン（２０ｍｌ）溶液に、１，１’−カルボニルジイミダゾール（０．３ｍｍｏｌ，４９ｍｇ）、トリエチルアミン（０．３ｍｍｏｌ，４２μｌ）およびＬ−ホモセリンラクトン塩酸塩（０．３ｍｍｏｌ，４２ｍｇ）を順次加えた。この混合液を室温で一晩撹拌し、次いでロータリーエバポレータで溶媒を蒸発させた。残渣を再び酢酸エチル（３０ｍｌ）に溶解した。この酢酸エチル溶液を、飽和重炭酸ナトリウム（２×２０ｍｌ）、１Ｍ  ＫＨＳＯ４（２×２０ｍｌ）および食塩水（１×２０ｍｌ）で洗浄した。ＭｇＳＯ４で乾燥させ、ロータリーエバポレータで溶媒を蒸発させた。生成物、４−アザ−４−メチル−ＯｄＤＨＬを、酢酸エチル（８．２ｍｇ，１０．４％）を用いて、ＰＬＣにより精製した。
ＴＬＣ  Ｒｆ  ０．３２，  酢酸エチル
ＩＲ  （ＫＢｒ）  ３２９８  （ＮＨ），  １７７２  （ｒｉｎｇ  Ｃ＝Ｏ），  １６８３  （３−ａｍｉｄｅ  Ｃ＝Ｏ），  １６５３  （１−ａｍｉｄｅ  Ｃ＝Ｏ）  ｃｍ−１
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  ０．８９  （３Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ６．９  Ｈｚ，  （ＣＨ３（ＣＨ２）７），  １．３  （１０Ｈ，  ｍ，  ＣＨ３（ＣＨ２）５），  １．５６  （２Ｈ，  ｍ，  ＣＨ３（ＣＨ２）５ＣＨ２），  ２．２７  （１Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ  ８．９７  ａｎｄ  ２．３  Ｈｚ，  ｒｉｎｇ，  ４α−Ｈ），  ２．８０  （１Ｈ，  ｄｄｄ，  Ｊ１．４，  ２．５４  ａｎｄ  ５．３４  Ｈｚ，  ｒｉｎｇ，  ４β−Ｈ），  ３．３３  （２Ｈ，  ｍ，  ＣＨ３（ＣＨ２）６ＣＨ２），  ４．２８  （１Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ  １．４  ａｎｄ  ４．５  Ｈｚ，  ｒｉｎｇ，  ３Ｈ），  ４．５３  （１Ｈ，  ｍ，  ｒｉｎｇ，  ５α−Ｈ），  ４．６４  （１Ｈ，  ｄｄｄ，  Ｊ  ２．６４，  ２．９４  ａｎｄ  ４．１４  Ｈｚ，  ｒｉｎｇ，  ５β−Ｈ），  ５．３  （１Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ  １０．２  ａｎｄ  ３８．０  Ｈｚ，  ＣＦ（Ｈ）），  ６．６３  （１Ｈ，  ｓ，  ４−ＮＨ），  ７．５  （１Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ  １３．３，  ６．４  Ｈｚ，  ＮＨ−ＨＳＬ）．
ＥＳ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ３１７．１２  （Ｍ＋Ｈ，  Ｃ１５Ｈ２５ＦＮ２Ｏ４  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｍ／ｚ  ３１６），  ３３９．０９  （Ｍ＋Ｎａ）．
【００３０】
ホモセリンラクトン化合物の免疫調節活性
材料および方法
Ｉ．  ＣｏｎＡマイトジェン刺激によるマウス脾細胞の増殖
被検物ホモセリンラクトン（ＨＳＬ）化合物の、Ｔ細胞の活性化および増殖に対する作用を評価するために、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）細胞増殖アッセイを使用した。増殖の評価は、［３Ｈ］‐チミジンのＤＮＡへの取り込みによって行った。８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスをＨａｒｌａｎ（Ｂｉｃｅｓｔｅｒ，  Ｏｘｏｎ，  ＵＫ）から入手し、飼料および水を自由に摂取させた。脾細胞懸濁液は、脾臓を切除してＲＰＭＩ  １６４０培地に入れ、調製した。単個細胞浮遊液（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）とするため、脾臓は５ｍｌの注射器に入れ、プランジャーを使用して孔径７０μｍの細目金網を通過させた。細胞を遠心分離によりペレット状にし、赤血球を０．０１７Ｍトリス−０．１４４Ｍ塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解した。白血球は、２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ  １６４０培地で２度洗浄し、５％ＦＣＳ、２ｍＭＬ−グルタミンおよび５×１０−５Ｍ２−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ  １６４０培地から成る完全細胞培養培地（ＣＴＣＭ）に再懸濁した。試験に供したＨＳＬ化合物の濃度範囲は、１ｍＭ〜０．１μＭの２倍段階希釈系列で、１μｇ／ｍｌＣｏｎＡ（Ｓｉｇｍａ社，  Ｐｏｏｌｅ，  ＵＫ）および１００，０００個の脾細胞を含むＣＴＣＭの最終容量が２００μｌとなるよう調製した。５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で４８時間培養を行った後、ＲＰＭＩ  １６４０培地で調製した０．２５μＣｉ［３Ｈ］−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）１０μｌを加え、該細胞をさらに２４時間培養した。細胞は、Ｐａｃｋａｒｄ製セルハーベスターを用いてガラス繊維フィルタ上に回収した。各ウェルに２５μｌのＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ‐Ｏ（Ｐａｃｋａｒｄ）を加えた後、ＰａｃｋａｒｄのＴｏｐＣｏｕｎｔシンチレーション計数器でフィルタの計数を行った。
【００３１】
マイトジェン（コンカナバリンＡ）に誘導されるマウス脾細胞増殖は、マウス脾臓細胞ＤＮＡへのトリチウム標識チミジン取り込み（シンチレーション計数器の使用によりカウント毎分で示される）によって示された。試験対象であるＨＳＬ化合物の細胞増殖抑制作用は、カウント毎分の減少によって示された。
【００３２】
図１は、先行技術の化合物ＯｄＤＨＬおよび本発明の化合物Ｎ−（４−アザ−３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン（４−アザ−ＯｄＤＨＬ）の濃度（マイクロモル濃度）に対するカウント毎分（ＣＰＭ）のプロットを示す。図からわかるように、４−アザ−ＯｄＤＨＬは、ＯｄＤＨＬと同様に脾細胞増殖を抑制する。図２は、図１と同様のプロットを示しているが、ここでは、ＯｄＤＨＬで得られたプロットと本発明の化合物Ｎ−（４−メチル−４−アザ−３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン（４−メチル−４−アザ−ＯｄＤＨＬ）で得られたプロットとを比較している。図２に示されるように、化合物４−メチル−４−アザ−ＯｄＤＨＬは脾細胞の増殖を抑制する。図１および２はまた、ＨＳＬ濃度（マイクロモル濃度）に対するＨＳＬ化合物のオートインデューサー活性のプロットを示している。
【００３３】
ＩＣ５０値、すなわちマウス脾細胞の増殖を５０％抑制するために必要な化合物量（マイクロモル濃度）を、４−アザ−ＯｄＤＨＬ、４−メチル−４−アザ−ＯｄＤＨＬおよび本発明の化合物Ｎ−（２−フルオロ−４−アザ−３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン（２−フルオロ−４−アザ−ＯｄＤＨＬ）について求めた。
【００３４】
さらに、これらの化合物の各々について、特別に設計されたバクテリアバイオレポーターシステムにおいて該化合物の光生成誘導能を指標として、オートインデューサー活性を測定した。オートインデューサー（Ａ．Ｉ．）活性は、試験対象であるＮ−アシルホモセリンラクトン化合物（ＡＨＬ）がｌｕｘベースの生物発光レポータープラスミドを含む大腸菌中で生物発光を誘導する能力によって測定した。ＯｄＤＨＬのような長鎖ＡＨＬの検出には、レポータープラスミドｐＳＢ１０７５を含む大腸菌ＪＭ１０９を使用した。このレポーターは、Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ由来のｌｕｘＣＤＡＢＥに融合した緑膿菌由来ｌａｓＲ遺伝子およびｌａｓＩプロモーターを含み、炭素数１０〜１４のアシル鎖長を有するＡＨＬに優先的に応答する。
【００３５】
バイオアッセイは、９６ウェルｍｉｃｒｏｔｉｔｒｅプレートで行った。簡単に言えば、評価する化合物１０μｌをｍｉｃｒｏｔｉｔｒｅウェルプレートに入れ、１００μＭから１００ｆＭの濃度に調製するために、ＬＢ培地を使用して段階的に希釈した。合成ＯｄＤＨＬについても同様の希釈を行い、陽性対照として使用した。一晩培養したバイオセンサー株１００μｌを各ウェルに加え、３７℃４時間の培養後、発光を測定した。光の生成は、生物発光測定用に調整されたＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ製ＴｏｐＣｏｕｎｔ装置におけるカウント毎秒として評価した。各値は、バイオレポーターを３７℃で４時間ＯｄＤＨＬと接触させた後に測定した生物発光量をパーセント値で表したものである。合成ＯｄＤＨＬ希釈濃度範囲における対数回帰分析では、典型的に０．９６を上回る決定係数値が返された。
【００３６】
試験化合物およびＯｄＤＨＬについて得られたＩＣ５０（μＭ）およびＡ．Ｉ．活性（１０μＭ）の値を、以下の表に示す。
【００３７】
【表１】
2009537625.tif 000007
＊ＩＣ５０＝マウス脾細胞の増殖を５０％抑制するために必要な化合物量。増殖マーカーとして［３Ｈ］チミジンの取込み量を測定し、非線形回帰分析により求めた。決定係数値はすべて０．９８を上回っていた。
＊＊オートインデューサー活性は、特別に設計されたバクテリアバイオレポーターシステムにおける該化合物の光生成誘導能を指標とする。値は、該バクテリアを３７℃で４時間ＯｄＤＨＬと接触させた後に測定した生物発光をパーセンテージで表したものである。
【図１】
2009537625.tif 000011
【図２】
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【国際調査報告】
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2009537625.tif 000014
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