(57)【要約】  本発明は、一般的に試料中で微生物を同定する方法に関し、かつ特には原核微生物の同定に関する。幾つかの実施態様において、本発明は、試験試料中での少なくとも１種の微生物の検出及び／若しくは同定、又は数種の微生物の同時検出及び／若しくは同定方法であって、試験試料が、ｔｕｆ遺伝子可変領域に由来する１種以上のプローブと接触する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験試料中での少なくとも１種の微生物の検出及び／若しくは同定、又は数種の微生物の同時検出及び／若しくは同定方法であって、
（ａ）１種以上の標的微生物を含む疑いのある試験試料を提供することと、
（ｂ）試験試料中に存在するならば、前記試験試料からの前記少なくとも１種の微生物から、ポリ核酸を任意に放出、単離及び／又は濃縮し、各前記ポリ核酸が、ｔｕｆ遺伝子可変領域の少なくとも１部を含むことと、
（ｃ）前記試験試料、又は前記試験試料からの前記ポリ核酸を、前記ｔｕｆ遺伝子可変領域に由来する１種以上のプローブと、ハイブリダイゼーションが生じるために十分な時間及び条件で接触させることと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で生じたいかなるハイブリダイゼーションも検出し、ハイブリダイゼーションの有無が、前記試験試料中の前記１種以上の前記微生物の有無を示すこととを含む方法。
【請求項２】
前記試験試料中のポリ核酸が、増幅される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試験試料中での少なくとも１種の微生物の検出及び／若しくは同定、又は数種の微生物の同時検出及び／若しくは同定方法であって、
（ａ）検出すべき前記少なくとも１種の微生物から、ポリ核酸を任意に放出、単離及び／又は濃縮することと、
（ｂ）少なくとも１種のプライマー対によって前記微生物からのｔｕｆ遺伝子可変領域の少なくとも１部を任意に増幅することと、
（ｃ）前記試験試料、又は前記試験試料からの前記ポリ核酸を、前記ｔｕｆ遺伝子可変領域に由来する１種以上のプローブと、ハイブリダイゼーションが生じるために十分な時間及び条件で接触させることと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で生じたいかなるハイブリダイゼーションも検出し、ハイブリダイゼーションの有無が、前記試験試料中の前記１種以上の前記微生物の有無を示すこととを含む方法。
【請求項４】
ポリ核酸が、配列番号１から１１に示すｔｕｆ遺伝子可変領域に由来する請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ポリ核酸が、配列番号１から１１のヌクレオチド１０８−２２０、３９３−５９１、７０８−７７４、７９２−８１６、及び／又は８８５−９４５から実質的になる請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ポリ核酸が、配列番号１から１１に示すｔｕｆ遺伝子可変領域のアンチセンスである配列を有する請求項３に記載の方法。
【請求項７】
試験試料を接触させるステップが、配列番号１２から８４、２０８から２５１、２５４−３１５及び３３０から３９３からなる群から選択される少なくとも１種のプローブを含む１組のプローブによるｔｕｆ遺伝子可変領域の少なくとも１部とのハイブリダイゼーションを含む請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
試験試料中での少なくとも１種の微生物の検出及び／若しくは同定、又は数種の微生物の同時検出及び／若しくは同定方法であって、
（ａ）検出すべき前記少なくとも１種の微生物から、ポリ核酸を任意に放出、単離及び／又は濃縮することと、
（ｂ）少なくとも１種のプライマー対によって前記微生物からのｔｕｆ遺伝子可変領域の少なくとも１部を任意に増幅することと、
（ｃ）配列番号１２から８４、２０８から２５１、２５４−３１５及び３３０から３９３からなる群から選択される少なくとも１種のプローブを含む１組のプローブによる前記微生物からのｔｕｆ遺伝子可変領域の少なくとも１部をハイブリダイズすることと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で形成されたハイブリッドを検出することと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の前記検出から前記少なくとも１種の微生物を同定することとを含む方法。
【請求項９】
少なくとも１種のプローブが、配列番号１２から８４、２０８から３１５及び３３０から３９３からなる群から選択される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１種のプローブが、配列番号１２から３９２及び３９３からなる群から選択される請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
検出及び／又は同定される微生物が、ボルデテラ種、クラミドフィラ種、ヘモフィルス種、レジオネラ種、マイコプラズマ種、マイコバクテリウム種、ブドウ球菌種、連鎖球菌種、シュードモナス種、モラクセラ種及びフゾバクテリウム種、ステノトロフォモナス種、バークホルデリ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉ）種、腸球菌種、コリネバクテリウム種及びナイセリア種からなる群から選択される請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
標的微生物と関連した疾患の診断及び／予後診断方法であって、
（ａ）検出すべき前記少なくとも１種の微生物から、ポリ核酸を任意に放出、単離及び／又は濃縮することと、
（ｂ）少なくとも１種のプライマー対によって前記微生物からのｔｕｆ遺伝子可変領域の少なくとも１部を任意に増幅することと、
（ｃ）前記試験試料、又は前記試験試料からの前記ポリ核酸を、前記ｔｕｆ遺伝子可変領域に由来する１種以上のプローブと、ハイブリダイゼーションが生じるために十分な時間及び条件で接触させることと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で生じたいかなるハイブリダイゼーションも検出し、ハイブリダイゼーションの有無が、前記試験試料中の標的微生物の有無を示すことと、
（ｅ）前記１種以上の前記標的微生物の存在を疾患と関連付けることと、
（ｆ）前記疾患の診断及び／又は予後診断を決定することとを含む方法。
【請求項１３】
検出及び／又は同定される微生物が、ボルデテラ種、クラミドフィラ種、ヘモフィルス種、レジオネラ種、マイコプラズマ種、マイコバクテリウム種、ブドウ球菌種、連鎖球菌種、シュードモナス種、モラクセラ種及びフゾバクテリウム種、ステノトロフォモナス種、バークホルデリ種、腸球菌種、コリネバクテリウム種及びナイセリア種からなる群から選択される請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
標的微生物と関連した疾患の予防又は治療方法であって、
（ａ）検出すべき前記少なくとも１種の微生物から、ポリ核酸を任意に放出、単離及び／又は濃縮することと、
（ｂ）少なくとも１種のプライマー対によって前記微生物からのｔｕｆ遺伝子可変領域の少なくとも１部を任意に増幅することと、
（ｃ）前記試験試料、又は前記試験試料からの前記ポリ核酸を、前記ｔｕｆ遺伝子可変領域に由来する１種以上のプローブと、ハイブリダイゼーションが生じるために十分な時間及び条件で接触させることと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で生じたいかなるハイブリダイゼーションも検出し、ハイブリダイゼーションの有無が、前記試験試料中の標的微生物の有無を示すことと、
（ｅ）前記１種以上の前記標的微生物の存在を疾患と関連付けることと、
（ｆ）前記疾患の予防又は治療を処方することとを含む方法。
【請求項１５】
微生物からのｔｕｆ遺伝子可変領域の少なくとも１部を増幅するステップは、少なくとも１種のプライマー対を利用し、ここでプライマーの少なくとも１種は、配列番号３９４−３９６、又はその同等物が、同時に異なる種の微生物のｔｕｆ可変領域又はその１部を特異的に増幅するならば、前記同等物からなる群から選択される請求項３から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
１種以上の標的微生物の存在を疾患と関連付けるステップ、又は治療を処方するステップが、コンピュータプログラムを使用するステップを含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
疾患が、細菌感染症、呼吸器感染症、胃腸管感染症、皮膚感染症、血流感染症、髄膜炎又は中枢神経系感染症、尿路感染症、生殖路感染症、創傷感染症又は院内感染症である請求項１２から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
検出及び／又は同定される微生物が、ボルデテラ種、クラミドフィラ種、ヘモフィルス種、レジオネラ種、マイコプラズマ種、マイコバクテリウム種、ブドウ球菌種、連鎖球菌種、シュードモナス種、モラクセラ種及びフゾバクテリウム種、ステノトロフォモナス種、バークホルデリ種、腸球菌種、コリネバクテリウム種及びナイセリア種からなる群から選択される請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
配列番号１２−２９３、又はその同等物が、検出すべき微生物のｔｕｆ遺伝子可変領域に特異的に結合するならば、前記同等物からなる群から選択される少なくとも１種のプローブを含む組成物。
【請求項２０】
配列番号１２−３９３、又はその同等物が、検出すべき微生物のｔｕｆ遺伝子可変領域に特異的に結合するならば、前記同等物から実質的になる群から選択される少なくとも１種のプローブを含む組成物。
【請求項２１】
配列番号３９４−３９６、又はその同等物が、検出すべき微生物のｔｕｆ遺伝子可変領域又はその１部を特異的に増幅するならば、前記同等物から実質的になる群から選択される少なくとも１種のプライマーを含む組成物。
【請求項２２】
ボルデテラ種、クラミドフィラ種、ヘモフィルス種、レジオネラ種、マイコプラズマ種、マイコバクテリウム種、ブドウ球菌種、連鎖球菌種、シュードモナス種、モラクセラ種及びフゾバクテリウム種、ステノトロフォモナス種、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）種、腸球菌種、コリネバクテリウム種及びナイセリア種からなる群から選択される試験試料中で見出される少なくとも１種の微生物の検出及び／又は同定のためのオリゴヌクレオチドプローブであって、前記プローブが、
インフルエンザ菌に関して、
ＴＡＴＴＡＴＣＣＧＴＡＣＡＧＧＴＧＡＴＧＡＡＧＴＡＧＡＡＡ（配列番号１２）；
ＡＡＡＧＡＴＡＣＡＧＣＧＡＡＡＡＣＴＡＣＴＧＴＡＡＣＧ（配列番号１３）；
ＣＡＴＣＧＧＴＧＣＡＴＴＡＴＴＡＣＧＴＧＧＴＡＣ（配列番号１４）；
ＣＡＴＡＣＴＣＣＡＴＴＣＴＴＣＡＡＡＧＧＴＴＡＣＣＧ（配列番号１５）；
ＴＧＡＣＴＧＧＴＡＣＡＡＴＣＧＡＡＴＴＡＣＣＡＧＡＡ（配列番号１６）；
ＣＣＧＴＡＡＡＴＴＡＣＴＴＧＡＣＧＡＡＧＧＴＣＧ（配列番号１７）；
ＡＣＴＴＣＧＡＡＴＣ  ＡＧＡＡＧＴＧＴＡＣ（配列番号６４）；
ＣＡＡＡＣＧＴＧＡＡ  ＧＡＡＡＴＣＧＡＡＣ（配列番号６５）；
ＣＧＡＴＡＡＣＡＴＣ  ＡＡＧＡＴＧＡＣＡＧ  Ｔ（配列番号６６）；
モラクセラ・カタラーリスに関して、
ＴＧＡＧＣＧＴＧＡＣＡＴＣＧＡＴＡＡＧＴＣＡ（配列番号１８）；
ＣＡＧＧＣＡＴＴＡＴＴＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＴＧＡＡＡＴＴ（配列番号１９）；
ＡＡＡＣＣＡＡＣＴＡＣＴＡＡＡＡＣＣＡＣＴＴＧＴＡＣＴＧ（配列番号２０）；
ＣＧＴＡＡＧＣＴＧＣＴＡＧＡＣＧＡＡＧＧＴ（配列番号２１）；
ＴＡＣＣＣＣＡＴＴＣＣＴＡＡＡＴＧＧＣＴＡＴＣＧ（配列番号２２）；
ＴＡＡＣＴＧＧＴＧＣＣＡＴＣＡＣＣＣＴＡＣ（配列番号２３）；
ＡＧＴＴＴＧＡＴＧＣＡＧＡＡＧＴＡＴＡＣＧ（配列番号２０８）
ＴＡＴＣＣＴＡＣＴＡＣＧＴＧＧＴＡＣＴＡＡ（配列番号２０９）
ＡＴＡＡＣＧＴＴＧＡＧＡＴＧＡＧＣＧ（配列番号２１０）
大便連鎖球菌に関して、
ＡＡＧＧＣＧＡＣＧＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＡＧＡ（配列番号２４）；
ＡＡＴＴＡＡＴＧＧＣＴＧＣＡＧＴＴＧＡＣＧＡＡＴ（配列番号２５）；
ＧＡＡＧＴＴＣＧＣＧＴＴＧＧＴＧＡＣＧ（配列番号２６）；
ＧＡＣＧＡＡＡＣＡＴＣＴＡＡＡＡＣＡＡＣＴＧＴＴＡＣＡＧ（配列番号２７）；
ＴＧＧＴＧＴＴＧＴＡＧＡＡＴＴＧＣＣＡＧＡＡＧ（配列番号２８）；
ＴＡＡＡＣＣＡＧＣＴＡＣＡＡＴＣＡＣＴＣＣＡＣＡ（配列番号２９）；
黄色ブドウ球菌に関して、
ＧＴＴＧＡＣＡＴＧＧＴＴＧＡＣＧＡＴＧＡＡＧＡＡＴＴＡ（配列番号３０）；
ＣＴＴＡＧＡＡＴＴＡＡＴＧＧＡＡＧＣＴＧＴＡＧＡＴＡＣＴＴＡＣＡ（配列番号３１）；
ＡＴＣＡＴＣＧＧＴＴＴＡＣＡＴＧＡＣＡＣＡＴＣＴＡＡＡＡ（配列番号３２）；
ＣＡＣＣＡＣＡＴＡＣＴＧＡＡＴＴＴＡＡＡＧＣＡＧＡＡＧＴＡ（配列番号３３）；
ＣＡＴＴＣＴＴＣＴＣＡＡＡＣＴＡＴＣＧＴＣＣＡＣＡＡ（配列番号３４）；
ＣＴＧＧＴＧＴＴＧＴＴＣＡＣＴＴＡＣＣＡＧＡＡＧ（配列番号３５）；
ＴＡＣＴＧＡＡＡＴＧＧＴＡＡＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＴＡ（配列番号３６）；
ＣＣＡＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＡＡＧＡＣＧＧ（配列番号３７）；
ＣＴＧＧＴＴＣＡＧＣＡＴＴＡＡＡＡＧＣＴＴＴＡＧＡＡＧ（配列番号３８）；
ＴＧＡＣＡＡＣＡＴＴＧＧＴＧＣＡＴＴＡＴＴＡＣＧＴ（配列番号３９）；
ＴＧＴＴＡＣＡＧＧＴＧＴＴＧＡＡＡＴＧＴＴＣＣＧ（配列番号４０）；
ＧＴＡＴＴＡＴＣＡＡＡＡＧＡＣＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＧ（配列番号４１）；
ＧＣＧＡＴＧＣＴＣＡＡＴＡＣＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＴＣ（配列番号４２）；
ＴＧＡＡＴＴＣＡＡＡ  ＧＣＡＧＡＡＧＴＡＴ  ＡＣ （配列番号７６）；
ＡＴＴＡＴＴＡＣＧＴ  ＧＧＴＧＴＴＧＣＴＣ（配列番号７７）；
ＧＴＧＡＴＡＡＣＧＴ  ＴＧＡＡＡＴＧＡＣＡ  Ｇ（配列番号７８）；
表皮ブドウ球菌に関して、
ＴＡＧＡＣＴＴＡＡＴＧＣＡＡＧＣＡＧＴＴＧＡＴＧＡＴＴＡＣ（配列番号４３）；
ＣＣＡＣＡＣＡＣＡＡＡＡＴＴＣＡＡＡＧＣＴＧＡＡＧ（配列番号４４）；
ＣＴＧＧＴＧＴＴＧＴＡＡＡＣＴＴＡＣＣＡＧＡＡＧＧ（配列番号４５）；
ＧＡＡＡＴＧＧＴＴＡＴＧＣＣＴＧＧＣＧＡＣ（配列番号４６）；
ＣＴＧＧＴＴＣＴＧＣＡＴＴＡＡＡＡＧＣＡＴＴＡＧＡＡＧ（配列番号４７）；
ＴＧＡＣＡＡＣＡＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＡＴＴＡＣＧ（配列番号４８）；
ＣＴＧＴＴＡＣＴＧＧＴＧＴＡＧＡＡＡＴＧＴＴＣＣＧ（配列番号４９）；
ＣＧＴＡＴＴＡＴＣＴＡＡＡＧＡＴＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＧ（配列番号５０）；
緑膿菌に関して、
ＡＡＧＴＴＣＧＡＧＴＧＣＧＡＡＧＴ（配列番号５１）；
ＡＡＧＧＣＧＴＡＧＡＧＡＴＧＧＴＡＡＴ（配列番号５２）；
ＴＴＣＴＴＣＡＡＧＧＧＣＴＡＣＣＧ（配列番号５３）；
ＡＴＣＡＴＣＡＡＧＧＴＣＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧＴ（配列番号５４）；
ＡＣＣＡＡＧＡＣＴＡＣＣＴＧＣＡＣＣＧ（配列番号５５）；
ＴＧＴＡＣＧＴＧＣＴＧＴＣＣＡＡＧＧＡＡ（配列番号５６）；
ＣＣＧＧＴＡＡＣＴＧＣＧＡＡＣＴＧＣ（配列番号５７）；
ＣＡＣＧＴＴＧＡＣＴＧＣＣＣＣＧＧＴＣＡＣＧＣ（配列番号８５）；
ＡＣＧＣＣＴＴＣＣＧＧＣＡＧＴＴＣＧＣＡＧＴＴＡＣ（配列番号８６）；
ＡＴＣＧＧＴＣＡＣＧＴＴＧＡＣＣＡＴＧＧＣＡ（配列番号８７）；
ＧＣＣＧＣＣＴＴＣＧＣＧＧＡＴＣＧＣＧＡＡ（配列番号８８）；
百日咳菌に関して、
ＧＴＡＣＡＴＴＣＴＧ  ＴＣＣＡＡＧＧＡＡＧ（配列番号５８）；
ＧＡＣＡＡＣＧＴＧＧ  ＧＴＡＴＣＴＴＧ（配列番号５９）；
ＧＡＣＡＡＧＧＡＡＡ  ＴＧＧＴＧＣＴ（配列番号６０）；
肺炎クラミジアに関して、
ＡＡＴＴＴＡＡＧＴＣ  ＡＧＣＴＧＴＴＴＡＣ  Ｇ（配列番号６１）；
ＧＡＧＧＴＡＴＴＧＧ  ＡＡＡＧＡＡＣＧＡＴ（配列番号６２）；
ＡＴＡＡＣＧＴＴＧＡ  ＧＣＴＴＧＡＴＧＴＴ（配列番号６３）；
レジオネラ・ニューモフィラに関して、
ＡＧＴＴＴＧＡＡＧＣ  ＡＧＡＡＧＴＧＴＡＴ（配列番号６７）；
ＴＧＴＴＡＴＴＡＣＧ  ＡＧＧＴＡＣＧＡＡＧ（配列番号６８）；
ＡＧＡＴＡＡＴＧＴＧ  ＣＡＡＴＴＡＧＴＴＧ  ＴＴＡ（配列番号６９）；
肺炎マイコプラズマに関して、
ＧＡＡＡＴＴＴＡＡＡ  ＧＣＧＧＡＡＡＴＣＴ  ＡＴＧ（配列番号７０）；
ＧＡＡＣＧＴＧＧＴＣ  ＡＡＧＴＧＴＴＡＧ（配列番号７１）；
ＧＡＣＡＡＴＡＣＣＴ  ＣＧＡＴＴＡＣＡＧＴ（配列番号７２）；
結核菌に関して、
ＡＡＣＡＴＣＴＣＧＧ  ＴＧＡＡＧＴＴＧＡＴ（配列番号７３）；
ＴＧＡＣＡＡＣＡＣＣ  ＡＡＣＡＴＣＴＣ（配列番号７４）；
ＡＣＧＡＡＧＧＴＣＴ  ＧＣＧＴＴＴ（配列番号７５）；
肺炎連鎖球菌に関して、
ＡＡＴＴＣＡＡＡＧＧ  ＴＧＡＡＧＴＣＴＡＣ  Ａ（配列番号７９）；
ＣＡＡＣＧＴＧＡＴＧ  ＡＡＡＴＣＧＡＡＣ（配列番号８０）；
ＧＡＣＡＡＴＣＧＡＣ  ＧＴＴＧＡＧＴＴ（配列番号８１）；
化膿連鎖球菌に関して、
ＣＡＡＡＧＧＴＧＡＡ  ＧＴＡＴＡＴＡＴＣＣ  ＴＴＴＣ（配列番号８２）；
ＣＡＡＣＧＴＧＡＣＧ  ＡＡＡＴＣＧＡＡ（配列番号８３）；
ＣＧＴＧＡＣＡＡＴＣ  ＡＡＣＧＴＴＧＡ（配列番号８４）；
及びその組み合わせからなる群から選択されるオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項２３】
ポリ核酸を含む疑いのある試験試料を、配列番号１２−３９２及び３９３からなる群から選択される１種以上のプローブをその上に固定した固体担体と接触させることを含むハイブリダイゼーション方法。
【請求項２４】
試験試料中での少なくとも１種の微生物の検出及び／若しくは同定、又は同時に数種の微生物の検出及び／若しくは同定のためのキットであって、
（ａ）任意に、ｔｕｆ遺伝子可変領域の少なくとも１部の増幅を可能にする少なくとも１種のプライマー対と、
（ｂ）請求項２１に記載の組成物と、
（ｃ）前記組成物中に含まれるプローブと、前記試料中に存在するポリ核酸、又はその増幅された生成物との間でのハイブリダイゼーション反応を可能にする、緩衝液、又は緩衝液を生成するために必要な成分と、
（ｄ）適切な洗浄条件で形成されたハイブリッドの洗浄を可能にする、溶液、又は溶液を生成するために必要な成分と、
（ｅ）任意に、先行するハイブリダイゼーションから生じるハイブリッドを検出する手段とを含むキット。
【請求項２５】
痰試料中での少なくとも１種の微生物の検出及び／若しくは同定、又は数種の微生物の同時検出及び／若しくは同定方法であって、
（ａ）検出すべき前記少なくとも１種の微生物から、ポリ核酸を任意に放出、単離及び／又は濃縮するステップと、
（ｂ）少なくとも１種のプライマー対によって前記微生物からのｔｕｆ遺伝子可変領域の少なくとも１部を任意に増幅するステップと、
（ｃ）配列番号１２から８４、２０８から２５１、２５４−３１５及び３３０から３９３からなる群から選択される少なくとも１種のプローブを含む１組のプローブによる前記微生物からのｔｕｆ遺伝子可変領域の少なくとも１部をハイブリダイズするステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で形成されたハイブリッドを検出するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の前記検出から前記少なくとも１種の微生物を同定するステップとを含む方法。
【請求項２６】
配列番号１２−３９３、又はその同等物が、微生物のｔｕｆ遺伝子可変領域に特異的に結合するならば、前記同等物からなる群から選択される少なくとも１種のプローブを含むマイクロアレイ。
【請求項２７】
試験試料中での少なくとも１種のインフルエンザ菌微生物の検出及び／若しくは同定、又は数種のインフルエンザ菌微生物の同時検出及び／若しくは同定方法であって、
（ａ）検出すべき前記少なくとも１種の微生物から、ポリ核酸を任意に放出、単離及び／又は濃縮するステップと、
（ｂ）少なくとも１種のプライマー対によって前記微生物からのｔｕｆ遺伝子可変領域の少なくとも１部を任意に増幅するステップと、
（ｃ）配列番号１２−１７及び６４−６６からなる群から選択される少なくとも１種のプローブを含む１組のプローブによる前記微生物からのｔｕｆ遺伝子可変領域の少なくとも１部をハイブリダイズするステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で形成されたハイブリッドを検出するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の前記検出から前記少なくとも１種の微生物を同定するステップとを含む方法。
【請求項２８】
試験試料中での少なくとも１種のモラクセラ・カタラーリス微生物の検出及び／若しくは同定、又は数種のモラクセラ・カタラーリス微生物の同時検出及び／若しくは同定方法であって、
（ａ）検出すべき前記少なくとも１種の微生物から、ポリ核酸を任意に放出、単離及び／又は濃縮するステップと、
（ｂ）少なくとも１種のプライマー対によって前記微生物からのｔｕｆ遺伝子可変領域の少なくとも１部を任意に増幅するステップと、
（ｃ）配列番号１８−２３及び２０８から２１０からなる群から選択される少なくとも１種のプローブを含む１組のプローブによる前記微生物からのｔｕｆ遺伝子可変領域の少なくとも１部をハイブリダイズするステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で形成されたハイブリッドを検出するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の前記検出から前記少なくとも１種の微生物を同定するステップとを含む方法。
【請求項２９】
試験試料中での少なくとも１種のシュードモナス微生物の検出及び／若しくは同定、又は数種のシュードモナス微生物の同時検出及び／若しくは同定方法であって、
（ａ）検出すべき前記少なくとも１種の微生物から、ポリ核酸を任意に放出、単離及び／又は濃縮するステップと、
（ｂ）少なくとも１種のプライマー対によって前記微生物からのｔｕｆ遺伝子可変領域の少なくとも１部を任意に増幅するステップと、
（ｃ）配列番号５１−５７及び８５−８８からなる群から選択される少なくとも１種のプローブを含む１組のプローブによる前記微生物からのｔｕｆ遺伝子可変領域の少なくとも１部をハイブリダイズするステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で形成されたハイブリッドを検出するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の前記検出から前記少なくとも１種の微生物を同定するステップとを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に試料中で微生物を同定する方法に関し、かつ特には原核微生物の同定に関する。本発明の方法は、とりわけ病原体（ヒト病原体を含む）と関連した疾患の予後診断、診断、予防及び治療のために有用であり、かつ特には呼吸器感染症、胃腸管感染症、皮膚感染症、生殖路感染症及び院内感染症のような疾患に有用である。本発明は、微生物、特に原核微生物を同定するために使用されるキットにも関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、細菌感染症の診断に使用される標準的方法は、患者から得られる臨床試料の培養である。培養技術は、臨床診断に長年、使用されてきた。遅く、時間がかかり、かつ労働力を要することを別として、培養技術によって得られる結果の信頼性は、非常に低い。従って、このことは細菌感染症を治療するための効果的な薬剤の処方を妨げ、結果としてより多くの患者の苦しみ及び／又は死を招いた。
【０００３】
現在の微生物同定法の他の欠点には、特別な成長培地が必要なこと、密接に関連した種及び菌株を区別できないこと、及び大量の試料が必要なことを含む。重要なことに、以前の微生物検出法は、試料中で１種を超える微生物を同時に検出することは困難であった。従って、迅速で、感度が高く、かつ正確である、試料中で微生物を同定する方法を開発する必要がある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
従って、第１の態様において、本発明は、試験試料中での少なくとも１種の微生物の検出及び／若しくは同定、又は数種の微生物の同時検出及び／若しくは同定方法であって、
（ａ）１種以上の標的微生物を含む疑いのある試験試料を提供することと、
（ｂ）試験試料中に存在するならば、前記試験試料からの前記少なくとも１種の微生物から、ポリ核酸を任意に放出、単離及び／又は濃縮し、各前記ポリ核酸が、ｔｕｆ遺伝子可変領域の少なくとも１部を含むことと、
（ｃ）前記試験試料、又は前記試験試料からの前記ポリ核酸を、前記ｔｕｆ遺伝子可変領域に由来する１種以上のプローブと、ハイブリダイゼーションが生じるために十分な時間及び条件で接触させることと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で生じたいかなるハイブリダイゼーションも検出し、ハイブリダイゼーションの有無が、前記試験試料中の前記１種以上の前記微生物の有無を示すこととを含む方法を提供する。
【０００５】
前記試験試料中のポリ核酸は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅技術を使用して、増幅されることが好ましい。
【０００６】
従って、第２の態様において、本発明は、試験試料中での少なくとも１種の微生物の検出及び／若しくは同定、又は数種の微生物の同時検出及び／若しくは同定方法であって、
（ａ）検出すべき前記少なくとも１種の微生物から、ポリ核酸を任意に放出、単離及び／又は濃縮することと、
（ｂ）少なくとも１種のプライマー対によって前記微生物からのｔｕｆ遺伝子可変領域の少なくとも１部を任意に増幅することと、
（ｃ）前記試験試料、又は前記試験試料からの前記ポリ核酸を、前記ｔｕｆ遺伝子可変領域に由来する１種以上のプローブと、ハイブリダイゼーションが生じるために十分な時間及び条件で接触させることと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で生じたいかなるハイブリダイゼーションも検出し、ハイブリダイゼーションの有無が、前記試験試料中の前記１種以上の前記微生物の有無を示すこととを含む方法を提供する。
【０００７】
幾つかの実施態様において、ポリ核酸は、配列番号１から１１に示すｔｕｆ遺伝子可変領域に由来する。好ましくは、ポリ核酸は、配列番号１から１１のヌクレオチド１０８−２２０、３９３−５９１、７０８−７７４、７９２−８１６、及び／又は８８５−９４５から実質的になる。
【０００８】
他の実施態様において、ポリ核酸は、配列番号１から１１に示すｔｕｆ遺伝子可変領域のアンチセンスである配列を有する。好ましくは、ポリ核酸は、配列番号１から１１のヌクレオチド１０８−２２０、３９３−５９１、７０８−７７４、７９２−８１６、及び／又は８８５−９４５のアンチセンスであるヌクレオチドから実質的になる。
【０００９】
幾つかの実施態様において、試験試料を接触させるステップは、配列番号１２から８４、２０８から２５１、２５４−３１５及び３３０から３９３からなる群から選択される少なくとも１種のプローブを含む１組のプローブによるｔｕｆ遺伝子可変領域の少なくとも１部とのハイブリダイゼーションを含む。
【００１０】
従って、第３の態様において、本発明は、試験試料中での少なくとも１種の微生物の検出及び／若しくは同定、又は数種の微生物の同時検出及び／若しくは同定方法であって、
（ａ）検出すべき前記少なくとも１種の微生物から、ポリ核酸を任意に放出、単離及び／又は濃縮することと、
（ｂ）少なくとも１種のプライマー対によって前記微生物からのｔｕｆ遺伝子可変領域の少なくとも１部を任意に増幅することと、
（ｃ）配列番号１２から８４、２０８から２５１、２５４−３１５及び３３０から３９３からなる群から選択される少なくとも１種のプローブを含む１組のプローブによる前記微生物からのｔｕｆ遺伝子可変領域の少なくとも１部をハイブリダイズすることと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で形成されたハイブリッドを検出することと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の前記検出から前記少なくとも１種の微生物を同定することとを含む方法を提供する。
【００１１】
他の実施態様において、少なくとも１種のプローブは、配列番号１２から８４、２０８から３１５及び３３０から３９３からなる群から選択される。他の実施態様において、少なくとも１種のプローブは、配列番号１２から３９２及び３９３からなる群から選択される。
【００１２】
第４の態様において、本発明は、標的微生物と関連した疾患の診断及び／予後診断方法であって、
（ａ）検出すべき前記少なくとも１種の微生物から、ポリ核酸を任意に放出、単離及び／又は濃縮することと、
（ｂ）少なくとも１種のプライマー対によって前記微生物からのｔｕｆ遺伝子可変領域の少なくとも１部を任意に増幅することと、
（ｃ）前記試験試料、又は前記試験試料からの前記ポリ核酸を、前記ｔｕｆ遺伝子可変領域に由来する１種以上のプローブと、ハイブリダイゼーションが生じるために十分な時間及び条件で接触させることと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で生じたいかなるハイブリダイゼーションも検出し、ハイブリダイゼーションの有無が、前記試験試料中の標的微生物の有無を示すことと、
（ｅ）前記１種以上の前記標的微生物の存在を疾患と関連付けることと、
（ｆ）前記疾患の診断及び／又は予後診断を決定することとを含む方法を提供する。
【００１３】
第５の態様において、本発明は、標的微生物と関連した疾患の予防又は治療方法であって、
（ａ）検出すべき前記少なくとも１種の微生物から、ポリ核酸を任意に放出、単離及び／又は濃縮することと、
（ｂ）少なくとも１種のプライマー対によって前記微生物からのｔｕｆ遺伝子可変領域の少なくとも１部を任意に増幅することと、
（ｃ）前記試験試料、又は前記試験試料からの前記ポリ核酸を、前記ｔｕｆ遺伝子可変領域に由来する１種以上のプローブと、ハイブリダイゼーションが生じるために十分な時間及び条件で接触させることと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で生じたいかなるハイブリダイゼーションも検出し、ハイブリダイゼーションの有無が、前記試験試料中の標的微生物の有無を示すことと、
（ｅ）前記１種以上の前記標的微生物の存在を疾患と関連付けることと、
（ｆ）前記疾患の予防又は治療を処方することとを含む方法を提供する。
【００１４】
幾つかの実施態様において、１種以上の標的微生物の存在を疾患と関連付けるステップ、又は治療を処方するステップは、コンピュータプログラムを使用するステップを含む。
【００１５】
幾つかの実施態様において、疾患は、細菌感染症、呼吸器感染症、胃腸管感染症、皮膚感染症、血流感染症、髄膜炎又は中枢神経系感染症、尿路感染症、生殖路感染症、創傷感染症又は院内感染症であっても良い。
【００１６】
幾つかの実施態様において、検出及び／又は同定される微生物は、ボルデテラ種、クラミドフィラ種、ヘモフィルス種、レジオネラ種、マイコプラズマ種、マイコバクテリウム種、ブドウ球菌種、連鎖球菌種、シュードモナス種、モラクセラ種及びフゾバクテリウム種、ステノトロフォモナス種、バークホルデリ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉ）種、腸球菌種、コリネバクテリウム種及びナイセリア種からなる群から選択される。
【００１７】
幾つかの実施態様において、微生物からのｔｕｆ遺伝子可変領域の少なくとも１部を増幅するステップは、少なくとも１種のプライマー対を利用し、ここでプライマーの少なくとも１種は、配列番号３９４−３９６、又はその同等物が、同時に異なる種の微生物のｔｕｆ可変領域又はその１部を特異的に増幅するならば、前記同等物からなる群から選択される。
【００１８】
第６の態様において、本発明は、配列番号１２−３９３、又はその同等物が、検出すべき微生物のｔｕｆ遺伝子可変領域に特異的に結合するならば、前記同等物からなる群から選択される少なくとも１種のプローブを含む組成物を提供する。
【００１９】
第７の態様において、本発明は、配列番号３９４−３９６、又はその同等物が、検出すべき微生物のｔｕｆ遺伝子可変領域又はその１部を特異的に増幅するならば、前記同等物からなる群から選択される少なくとも１種のプライマーを含む組成物を提供する。
【００２０】
第８の態様において、本発明は、ボルデテラ種、クラミドフィラ種、ヘモフィルス種、レジオネラ種、マイコプラズマ種、マイコバクテリウム種、ブドウ球菌種、連鎖球菌種、シュードモナス種、モラクセラ種及びフゾバクテリウム種、ステノトロフォモナス種、バークホルデリ種、腸球菌種、コリネバクテリウム種及びナイセリア種からなる群から選択される試験試料中で見出される少なくとも１種の微生物の検出及び／又は同定のためのオリゴヌクレオチドプローブであって、前記プローブが、
インフルエンザ菌に関して、
ＴＡＴＴＡＴＣＣＧＴＡＣＡＧＧＴＧＡＴＧＡＡＧＴＡＧＡＡＡ（配列番号１２）；
ＡＡＡＧＡＴＡＣＡＧＣＧＡＡＡＡＣＴＡＣＴＧＴＡＡＣＧ（配列番号１３）；
ＣＡＴＣＧＧＴＧＣＡＴＴＡＴＴＡＣＧＴＧＧＴＡＣ（配列番号１４）；
ＣＡＴＡＣＴＣＣＡＴＴＣＴＴＣＡＡＡＧＧＴＴＡＣＣＧ（配列番号１５）；
ＴＧＡＣＴＧＧＴＡＣＡＡＴＣＧＡＡＴＴＡＣＣＡＧＡＡ（配列番号１６）；
ＣＣＧＴＡＡＡＴＴＡＣＴＴＧＡＣＧＡＡＧＧＴＣＧ（配列番号１７）；
ＡＣＴＴＣＧＡＡＴＣ  ＡＧＡＡＧＴＧＴＡＣ（配列番号６４）；
ＣＡＡＡＣＧＴＧＡＡ  ＧＡＡＡＴＣＧＡＡＣ（配列番号６５）；
ＣＧＡＴＡＡＣＡＴＣ  ＡＡＧＡＴＧＡＣＡＧ  Ｔ（配列番号６６）；
モラクセラ・カタラーリスに関して、
ＴＧＡＧＣＧＴＧＡＣＡＴＣＧＡＴＡＡＧＴＣＡ（配列番号１８）；
ＣＡＧＧＣＡＴＴＡＴＴＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＴＧＡＡＡＴＴ（配列番号１９）；
ＡＡＡＣＣＡＡＣＴＡＣＴＡＡＡＡＣＣＡＣＴＴＧＴＡＣＴＧ（配列番号２０）；
ＣＧＴＡＡＧＣＴＧＣＴＡＧＡＣＧＡＡＧＧＴ（配列番号２１）；
ＴＡＣＣＣＣＡＴＴＣＣＴＡＡＡＴＧＧＣＴＡＴＣＧ（配列番号２２）；
ＴＡＡＣＴＧＧＴＧＣＣＡＴＣＡＣＣＣＴＡＣ（配列番号２３）；
ＡＧＴＴＴＧＡＴＧＣＡＧＡＡＧＴＡＴＡＣＧ（配列番号２０８）
ＴＡＴＣＣＴＡＣＴＡＣＧＴＧＧＴＡＣＴＡＡ（配列番号２０９）
ＡＴＡＡＣＧＴＴＧＡＧＡＴＧＡＧＣＧ（配列番号２１０）
大便連鎖球菌に関して、
ＡＡＧＧＣＧＡＣＧＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＡＧＡ（配列番号２４）；
ＡＡＴＴＡＡＴＧＧＣＴＧＣＡＧＴＴＧＡＣＧＡＡＴ（配列番号２５）；
ＧＡＡＧＴＴＣＧＣＧＴＴＧＧＴＧＡＣＧ（配列番号２６）；
ＧＡＣＧＡＡＡＣＡＴＣＴＡＡＡＡＣＡＡＣＴＧＴＴＡＣＡＧ（配列番号２７）；
ＴＧＧＴＧＴＴＧＴＡＧＡＡＴＴＧＣＣＡＧＡＡＧ（配列番号２８）；
ＴＡＡＡＣＣＡＧＣＴＡＣＡＡＴＣＡＣＴＣＣＡＣＡ（配列番号２９）；
黄色ブドウ球菌に関して、
ＧＴＴＧＡＣＡＴＧＧＴＴＧＡＣＧＡＴＧＡＡＧＡＡＴＴＡ（配列番号３０）；
ＣＴＴＡＧＡＡＴＴＡＡＴＧＧＡＡＧＣＴＧＴＡＧＡＴＡＣＴＴＡＣＡ（配列番号３１）；
ＡＴＣＡＴＣＧＧＴＴＴＡＣＡＴＧＡＣＡＣＡＴＣＴＡＡＡＡ（配列番号３２）；
ＣＡＣＣＡＣＡＴＡＣＴＧＡＡＴＴＴＡＡＡＧＣＡＧＡＡＧＴＡ（配列番号３３）；
ＣＡＴＴＣＴＴＣＴＣＡＡＡＣＴＡＴＣＧＴＣＣＡＣＡＡ（配列番号３４）；
ＣＴＧＧＴＧＴＴＧＴＴＣＡＣＴＴＡＣＣＡＧＡＡＧ（配列番号３５）；
ＴＡＣＴＧＡＡＡＴＧＧＴＡＡＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＴＡ（配列番号３６）；
ＣＣＡＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＡＡＧＡＣＧＧ（配列番号３７）；
ＣＴＧＧＴＴＣＡＧＣＡＴＴＡＡＡＡＧＣＴＴＴＡＧＡＡＧ（配列番号３８）；
ＴＧＡＣＡＡＣＡＴＴＧＧＴＧＣＡＴＴＡＴＴＡＣＧＴ（配列番号３９）；
ＴＧＴＴＡＣＡＧＧＴＧＴＴＧＡＡＡＴＧＴＴＣＣＧ（配列番号４０）；
ＧＴＡＴＴＡＴＣＡＡＡＡＧＡＣＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＧ（配列番号４１）；
ＧＣＧＡＴＧＣＴＣＡＡＴＡＣＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＴＣ（配列番号４２）；
ＴＧＡＡＴＴＣＡＡＡ  ＧＣＡＧＡＡＧＴＡＴ  ＡＣ （配列番号７６）；
ＡＴＴＡＴＴＡＣＧＴ  ＧＧＴＧＴＴＧＣＴＣ（配列番号７７）；
ＧＴＧＡＴＡＡＣＧＴ  ＴＧＡＡＡＴＧＡＣＡ  Ｇ（配列番号７８）；
表皮ブドウ球菌に関して、
ＴＡＧＡＣＴＴＡＡＴＧＣＡＡＧＣＡＧＴＴＧＡＴＧＡＴＴＡＣ（配列番号４３）；
ＣＣＡＣＡＣＡＣＡＡＡＡＴＴＣＡＡＡＧＣＴＧＡＡＧ（配列番号４４）；
ＣＴＧＧＴＧＴＴＧＴＡＡＡＣＴＴＡＣＣＡＧＡＡＧＧ（配列番号４５）；
ＧＡＡＡＴＧＧＴＴＡＴＧＣＣＴＧＧＣＧＡＣ（配列番号４６）；
ＣＴＧＧＴＴＣＴＧＣＡＴＴＡＡＡＡＧＣＡＴＴＡＧＡＡＧ（配列番号４７）；
ＴＧＡＣＡＡＣＡＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＡＴＴＡＣＧ（配列番号４８）；
ＣＴＧＴＴＡＣＴＧＧＴＧＴＡＧＡＡＡＴＧＴＴＣＣＧ（配列番号４９）；
ＣＧＴＡＴＴＡＴＣＴＡＡＡＧＡＴＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＧ（配列番号５０）；
緑膿菌に関して、
ＡＡＧＴＴＣＧＡＧＴＧＣＧＡＡＧＴ（配列番号５１）；
ＡＡＧＧＣＧＴＡＧＡＧＡＴＧＧＴＡＡＴ（配列番号５２）；
ＴＴＣＴＴＣＡＡＧＧＧＣＴＡＣＣＧ（配列番号５３）；
ＡＴＣＡＴＣＡＡＧＧＴＣＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧＴ（配列番号５４）；
ＡＣＣＡＡＧＡＣＴＡＣＣＴＧＣＡＣＣＧ（配列番号５５）；
ＴＧＴＡＣＧＴＧＣＴＧＴＣＣＡＡＧＧＡＡ（配列番号５６）；
ＣＣＧＧＴＡＡＣＴＧＣＧＡＡＣＴＧＣ（配列番号５７）；
ＣＡＣＧＴＴＧＡＣＴＧＣＣＣＣＧＧＴＣＡＣＧＣ（配列番号８５）；
ＡＣＧＣＣＴＴＣＣＧＧＣＡＧＴＴＣＧＣＡＧＴＴＡＣ（配列番号８６）；
ＡＴＣＧＧＴＣＡＣＧＴＴＧＡＣＣＡＴＧＧＣＡ（配列番号８７）；
ＧＣＣＧＣＣＴＴＣＧＣＧＧＡＴＣＧＣＧＡＡ（配列番号８８）；
百日咳菌に関して、
ＧＴＡＣＡＴＴＣＴＧ  ＴＣＣＡＡＧＧＡＡＧ（配列番号５８）；
ＧＡＣＡＡＣＧＴＧＧ  ＧＴＡＴＣＴＴＧ（配列番号５９）；
ＧＡＣＡＡＧＧＡＡＡ  ＴＧＧＴＧＣＴ（配列番号６０）；
肺炎クラミジアに関して、
ＡＡＴＴＴＡＡＧＴＣ  ＡＧＣＴＧＴＴＴＡＣ  Ｇ（配列番号６１）；
ＧＡＧＧＴＡＴＴＧＧ  ＡＡＡＧＡＡＣＧＡＴ（配列番号６２）；
ＡＴＡＡＣＧＴＴＧＡ  ＧＣＴＴＧＡＴＧＴＴ（配列番号６３）；
レジオネラ・ニューモフィラに関して、
ＡＧＴＴＴＧＡＡＧＣ  ＡＧＡＡＧＴＧＴＡＴ（配列番号６７）；
ＴＧＴＴＡＴＴＡＣＧ  ＡＧＧＴＡＣＧＡＡＧ（配列番号６８）；
ＡＧＡＴＡＡＴＧＴＧ  ＣＡＡＴＴＡＧＴＴＧ  ＴＴＡ（配列番号６９）；
肺炎マイコプラズマに関して、
ＧＡＡＡＴＴＴＡＡＡ  ＧＣＧＧＡＡＡＴＣＴ  ＡＴＧ（配列番号７０）；
ＧＡＡＣＧＴＧＧＴＣ  ＡＡＧＴＧＴＴＡＧ（配列番号７１）；
ＧＡＣＡＡＴＡＣＣＴ  ＣＧＡＴＴＡＣＡＧＴ（配列番号７２）；
結核菌に関して、
ＡＡＣＡＴＣＴＣＧＧ  ＴＧＡＡＧＴＴＧＡＴ（配列番号７３）；
ＴＧＡＣＡＡＣＡＣＣ  ＡＡＣＡＴＣＴＣ（配列番号７４）；
ＡＣＧＡＡＧＧＴＣＴ  ＧＣＧＴＴＴ（配列番号７５）；
肺炎連鎖球菌に関して、
ＡＡＴＴＣＡＡＡＧＧ  ＴＧＡＡＧＴＣＴＡＣ  Ａ（配列番号７９）；
ＣＡＡＣＧＴＧＡＴＧ  ＡＡＡＴＣＧＡＡＣ（配列番号８０）；
ＧＡＣＡＡＴＣＧＡＣ  ＧＴＴＧＡＧＴＴ（配列番号８１）；
化膿連鎖球菌に関して、
ＣＡＡＡＧＧＴＧＡＡ  ＧＴＡＴＡＴＡＴＣＣ  ＴＴＴＣ（配列番号８２）；
ＣＡＡＣＧＴＧＡＣＧ  ＡＡＡＴＣＧＡＡ（配列番号８３）；
ＣＧＴＧＡＣＡＡＴＣ  ＡＡＣＧＴＴＧＡ（配列番号８４）；
及びその組み合わせからなる群から選択されるオリゴヌクレオチドプローブを提供する。
【００２１】
第９の態様において、本発明は、ポリ核酸を含む疑いのある試験試料を、配列番号１２−３９２及び３９３からなる群から選択される１種以上のプローブをその上に固定した固体担体と接触させることを含むハイブリダイゼーション方法を提供する。
【００２２】
幾つかの実施態様において、本発明のある態様は、キットとして提供される。
【００２３】
従って、第１０の態様において、本発明は、試験試料中での少なくとも１種の微生物の検出及び／若しくは同定、又は同時に数種の微生物の検出及び／若しくは同定のためのキットであって、
（ａ）任意に、ｔｕｆ遺伝子可変領域の少なくとも１部の増幅を可能にする少なくとも１種のプライマー対と、
（ｂ）第６の態様による組成物と、
（ｃ）前記組成物中に含まれるプローブと、前記試料中に存在するポリ核酸、又はその増幅された生成物との間でのハイブリダイゼーション反応を可能にする、緩衝液、又は緩衝液を生成するために必要な成分と、
（ｄ）適切な洗浄条件で形成されたハイブリッドの洗浄を可能にする、溶液、又は溶液を生成するために必要な成分と、
（ｅ）任意に、先行するハイブリダイゼーションから生じるハイブリッドを検出する手段とを含むキットを提供する。
【００２４】
第１１の態様において、本発明は、痰試料中での少なくとも１種の微生物の検出及び／若しくは同定、又は数種の微生物の同時検出及び／若しくは同定方法であって、
（ａ）検出すべき前記少なくとも１種の微生物から、ポリ核酸を任意に放出、単離及び／又は濃縮するステップと、
（ｂ）少なくとも１種のプライマー対によって前記微生物からのｔｕｆ遺伝子可変領域の少なくとも１部を任意に増幅するステップと、
（ｃ）配列番号１２から８４、２０８から２５１、２５４−３１５及び３３０から３９３からなる群から選択される少なくとも１種のプローブを含む１組のプローブによる前記微生物からのｔｕｆ遺伝子可変領域の少なくとも１部をハイブリダイズするステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で形成されたハイブリッドを検出するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の前記検出から前記少なくとも１種の微生物を同定するステップとを含む方法を提供する。
【００２５】
第１２の態様において、本発明は、配列番号１２−３９３、又はその同等物が、微生物のｔｕｆ遺伝子可変領域に特異的に結合するならば、前記同等物からなる群から選択される少なくとも１種のプローブを含むマイクロアレイを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
好ましい実施態様を詳細に記載する前に、本明細書において使用される用語は、本発明の特定の実施態様を記載する目的のためであり、かつ限定することを意図しない。
【００２７】
本明細書に引用される全ての公報、特許及び特許出願は、前掲であれ、後掲であれ、全体が参考として組み込まれる。しかしながら、本明細書に言及される公報は、公報に報告され、かつ本発明に関連して使用され得る手順及び試薬を記載及び開示する目的で引用される。本明細書中の何ものも、本発明が、先行発明のためにかかる開示に先行する権利がないという承認と解釈されるべきでない。
【００２８】
本発明の実践は、特に明記しない限り、当該技術分野における技能の範囲内である、微生物学及び分子生物学の従来の技術を用いる。かかる技術は、文献中に記載されている。例えば、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，２ｎｄ  Ｅｄ．，（ｅｄ．ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」，（Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｇａｉｔ  ｅｄ．，１９８４）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡ．；「Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ」，１２ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９６），Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｃａｔｅｇｏｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ；及び「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＆  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」，（Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）を参照。
【００２９】
本明細書及び添付の請求項で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別段の指図をしない限り、複数の参照を含む。それ故、例えば「微生物」は、複数の微生物を含み、かつ「核酸分子」は、複数の核酸分子を指す、等である。
【００３０】
別段の定めがない限り、本明細書において用いられる全ての技術及び科学用語は、本発明が属する当該技術分野において通常の技能を有する者によって一般に理解されるものと、同じ意味を有する。
【００３１】
以下に続く記載において、指示のない場合、細胞培養技術は、この分野において周知であり、かついかなるこのような技術も、採用できることが認識される。
【００３２】
本明細書に記載された材料及び方法と類似又は同等のいかなるものも、本発明を実践又は試験するために使用でき、好ましい材料及び方法を、ここで記載する。
【００３３】
「含む」とは、単語「含む」に何が続こうとも、含むが限定されないことを意味する。それ故に、用語「含む」の使用は、一覧にした要素が必要又は必須であるが、他の要素が任意であり、かつ存在することも、しないこともあることを示す。「からなる」とは、語句「からなる」に何が続こうとも、含みかつ限定されることを意味する。それ故に、語句「からなる」は、一覧にした要素が必要又は必須であり、かつ他の要素が存在できないことを示す。「から実質的になる」とは、この語句の後に一覧にした、いかなる要素も含み、かつ一覧にした要素の開示で特定された活動又は作用に干渉しない、又は寄与する他の要素に限定されることを意味する。それ故に、語句「から実質的になる」は、一覧にした要素が、必要又は必須であるが、他の要素が任意であり、かつそれらが一覧にした要素の活動又は作用に影響を及ぼすか否かに応じて存在することも、しないこともあることを示す。
【００３４】
本発明に繋がる研究において、発明者らは、ｔｕｆ遺伝子が、異なる微生物間で異なる可変領域を含み、かつそれ故に異なる微生物を同定するために使用できることを発見した。試験試料中の異なる微生物は、可変領域及び可変領域に特異的なプローブ間のハイブリダイゼーションを検出することによって同定できる。
【００３５】
従って、本発明は、ｔｕｆ遺伝子可変領域に由来するポリ核酸に関する。本明細書で使用されるように「遺伝子」は、特異的タンパク質をコードする配列のような、特異的な機能の情報を含むポリ核酸分子である。遺伝子は、シグナル配列、複製開始点、エンハンサー要素、プロモーター及び／又は転写終結配列の１つ以上のような、非コード情報を含むこともできる。本明細書で使用されるような用語「ポリ核酸」は、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はＤＮＡを指す。
【００３６】
ｔｕｆ遺伝子は、全ての細菌に普遍的に存在し、かつ一般的に均一の配列、すなわち全ての種の間で共通な配列を含む。他の普遍的細菌遺伝子の例には、１６ｓリボソームＲＮＡ、２３ｓリボソームＲＮＡ及びｒｐｏＢを含む。異なる微生物のｔｕｆ配列の例は、配列番号１から１１に示される。
【００３７】
本明細書に開示された配列が、本発明から逸脱することなく、配列番号１から１１のいずれかに与えられる配列と異なり得ることが、当業者によって認識されるであろう。特に、ｔｕｆ遺伝子配列は、変異体の生物活性が保持されるならば、３０％まで異なることがある。具体的には、変異体は、標的微生物を同定するために使用できる可変領域を有さねばならない。
【００３８】
「ｔｕｆ遺伝子可変領域」は、微生物の種、亜種及び亜系間でｔｕｆ遺伝子が異なるヌクレオチド配列である。幾つかの実施態様において、ｔｕｆ遺伝子可変領域は、配列番号１から１１のヌクレオチド１０８−２２０、３９３−５９１、７０８−７７４、７９２−８１６及び／又は８８５−９４５から実質的になる。
【００３９】
幾つかの実施態様において、ｔｕｆ遺伝子可変領域は、バークホルデリア・セパシア（Ｂｅｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）に由来し、それは、嚢胞性線維症患者の痰試料中でこの種を特異的に同定するために使用できる。幾つかの実施態様において、バークホルデリア・セパシアのｔｕｆ遺伝子可変領域に対応する配列番号２６９から２７５の１つ以上が使用できる。
【００４０】
他の実施態様において、ｔｕｆ遺伝子可変領域は、ステノトロフォモナス・マルトフィリアのｔｕｆ遺伝子に由来し、それは、緑膿菌感染症に続く肺炎の患者の痰試料中でこの種を特異的に同定するために使用できる。幾つかの実施態様において、ステノトロフォモナス・マルトフィリアのｔｕｆ遺伝子可変領域に対応する配列番号２６４から２６８の１つ以上が使用できる。
【００４１】
本明細書で使用されるように、ポリ核酸は、ｔｕｆ遺伝子可変領域を含むｔｕｆ遺伝子の少なくともいずれかの部分を含むか、又はｔｕｆ遺伝子に由来する。ポリ核酸配列は、少なくとも１種のｔｕｆ遺伝子可変領域又はその１部を含む限りにおいて、それ自体が全ｔｕｆ遺伝子又はその１部のヌクレオチド配列を有することができる。ポリ核酸は、ｔｕｆ遺伝子のアンチセンスであっても良い。本発明において、用語「アンチセンス」は、遺伝子のｔｕｆ遺伝子可変領域の相補的配列を有するＤＮＡ又はＲＮＡである核酸分子を表すために使用される。
【００４２】
本発明によれば、ｔｕｆ遺伝子可変領域は、試験試料中で標的微生物を同定するために使用される。試験試料は、標的微生物を含む疑いのあるいかなるタイプの試料であっても良い。従って、本発明の方法による分析のための試験試料は、多数の供給源から得ることができる。かかる供給源は、ヒトのような動物被検者、花、種子、野菜、食品に由来する試料、及び環境に由来する試料を含むが、それらに限定されない。幾つかの実施態様において、試験試料は、「生体試料」である。「生体試料」としては、血液、唾液、尿、涙、汗、脳脊髄液、リンパ液、血清、血漿、粘液、痰、糞便及び生検材料のような、但しそれらに限定されない動物に由来する生体物質の何らか試料が挙げられる。
【００４３】
本発明の方法により試験を受ける生体試料は、直接試験を受けられるか、又は試験に先立ち、何らか形状の処理を必要とし得る。例えば、生検材料は、試験の前に均質化を必要とし得る。更に、生体試料が液体形状でない（例えば、それは固体、半固体又は脱水液体試料であり得る）限りにおいて、試料を可動化するための緩衝液のような、試薬の添加を必要とし得る。
【００４４】
試験試料は、試験の前に何らかのポリ核酸を放出するために加工も必要とし得る。例えば、ポリ核酸は、市販の溶菌液のような溶菌緩衝液を使用して放出できる。細菌用の適切な市販の溶菌液は、Ｌｙｓｅ−Ｎ−Ｇｏ（商標）（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ、米国ＩＬ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）ＰＣＲ試薬である。一旦放出されると、ポリ核酸は、本発明の方法による試験に利用できる。
【００４５】
あるいは、又はその上、試験試料は、試験試料中のポリ核酸が単離、濃縮又は分離されるように、精製ステップを受けても良い。
【００４６】
「単離された」ポリ核酸は、その自然環境の成分から放出及び／又は分離及び／又は回復されたものである。その自然環境の汚染物質成分は、標的微生物の同定に概して干渉する物質であり、かつ酵素、ホルモン、及び他のタンパク質又は非タンパク質溶質を含み得る。幾つかの実施態様において、ポリ核酸は、（１）少なくとも３０から４５の塩基のヌクレオチド配列情報を得るために十分な程度まで、及び／又は（２）ゲル電気泳動による均質性まで精製及び／又は濃縮される。
【００４７】
ポリ核酸を単離する際に、試験試料は、組織均質化、細胞単離及び細胞質抽出、核酸抽出等のような多数の異なる加工ステップを受けることができる。細胞、組織、器官又は生物全体から核酸を単離する方法は、当業者に知られており、かつ例えば、各々の内容が、本明細書に参考として組み込まれる、Ｍａｎｉａｔｉｓら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ  １９９８）に記載されている。
【００４８】
本発明の幾つかの実施態様において、試験試料からの細胞は、分析用のポリ核酸源として使用でき、それにより純培養の要件を不要にする。ポリ核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は両方の組み合せであっても良い。幾つかの実施態様において、ポリ核酸は、ＤＮＡである。好ましくは、分析に利用できる少なくとも１００マイクログラムのＤＮＡである。しかしながら、著しくより少量のＤＮＡが、本発明の方法において使用できる。ＰＣＲのような核酸増幅技術は、低レベルのポリ核酸のみが分析に利用できる時に補償するために使用できる。
【００４９】
標的ポリ核酸の配列分析に基づき、多重ＰＣＲ反応は、数種のプライマーを使用して用いることができる。多重ＰＣＲは、１対以上のプライマーがポリメラーゼ連鎖反応で使用される時に使用される用語である。多重ＰＣＲの目的は、同時に標的ポリ核酸の幾つもの断片を増幅し、かつそれにより鋳型ポリ核酸、時間及び出費を節約することである。多重ＰＣＲの詳細な手順は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ｖｏｌｕｍｅ  ２，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓに見出すことができる。多くの場合、臨床試料がＰＣＲに干渉する物質を含むので、最適な増幅を得るために、独特の前加工方法を、開発できる。反応条件は、目的とする全てのポリ核酸領域の同時増幅のために最適化される。
【００５０】
他のポリ核酸増幅技術としては、自己持続配列複製、Ｑベータレプリカーゼ、ライゲーションに基づくサーモサイクリング（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｉｎｇ）アプローチ、リアルタイムＰＣＲ、リアルタイム鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）及び多置換増幅（ＭＤＡ）が挙げられる。
【００５１】
ポリ核酸増幅の詳細な手順は、とりわけＡｕｓｕｂｅｌら（Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９５）ｖｏｌｕｍｅ  ２，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｃｈａｐｔｅｒ  １５）及びＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｖｏｌｕｍｅ  ２，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に見出すことができる。これらの刊行物はまた、核酸増幅プライマーを設計する方法に関して詳細な指針を提供する。
【００５２】
本発明の幾つかの実施態様において、ポリ核酸は単離され、かつ次にＰＣＲを使用して増幅される。プライマーがｔｕｆ遺伝子可変領域又はその１部を特異的に増幅する限りにおいて、いかなる増幅プライマーも、標的微生物からのｔｕｆ遺伝子を増幅するために使用できる。微生物の異なる種から多数のｔｕｆ遺伝子を増幅できるプライマーを設計することは、十分に当該技術分野における技能の範囲内である。例えば、細菌種のためのｔｕｆ遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（商標）のような公共データベースから自由に入手できる。得られたｔｕｆ遺伝子配列を使用する複数の配列アラインメントが可能な多数のデータベースがある。一旦整列されると、当業者は、複数の配列アラインメントデータを分析することによって、種々の微生物内の保存領域を決定できる。表１は、種々の微生物からの多数のｔｕｆ遺伝子の複数の配列アラインメントを示す。
【００５３】
【表１】
2009502142.tif 000002
2009502142.tif 000003
2009502142.tif 000004
2009502142.tif 000005
2009502142.tif 000006
2009502142.tif 000007
2009502142.tif 000008
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2009502142.tif 000010
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2009502142.tif 000013
2009502142.tif 000014
2009502142.tif 000015
【００５４】
幾つかの実施態様において、多数の微生物からのｔｕｆ遺伝子を増幅するために使用されるプライマーは、配列番号３９４−３９６、又はその同等物が、同時に、微生物の異なる種のｔｕｆ可変領域又はその１部を特異的に増幅するならば、前記同等物からなる群から選択される。
【００５５】
配列番号３９４−３９５の同等物を設計する能力は、十分に当該技術分野における技能の範囲内ある。例えば、何らかの増幅プライマーの３’末端は、例えばプライマー伸長が生じるために、ＤＮＡ鋳型に適切にアニールする必要があるので、何らかのプライマーの最も重要な末端であることが、十分に認められる。従って、配列番号３９４−３９５の３’末端は、維持される必要がある。しかしながら、大部分のプライマーの５’末端が、生成物を増幅するプライマーの能力に悪影響を与えずに、変更、伸長及び／又は短縮できることが更に認められる。当業者は、ルーチン実験によってプライマー内でなされ得る変化を決定することが可能である。
【００５６】
上述のように、ｔｕｆ遺伝子可変領域のｔｕｆ遺伝子を含むポリ核酸は、試験試料中の標的微生物を同定するために使用できる。「微生物」としては、顕微鏡を用いてしか観察できない、いかなる生物も包含し、かつ細菌、腸管内菌叢、モネラン（ｍｏｎｅｒａｎｓ）、モネロン（ｍｏｎｅｒｏｎｓ）、微生物（ｍｉｃｒｏｂｅｓ）、病原体、線毛、原生生物（ｐｒｏｔｉｓｔｓ）、原生生物（ｐｒｏｔｉｓｔａｎｓ）、原生生物（ｐｒｏｔｏｃｔｉｓｔｓ）、ウイルス、リケッチア、原虫、アルガエ・スピリルム（ａｌｇａｅ  ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）及び真菌が挙げられる。
【００５７】
幾つかの実施態様において、標的微生物は、原核微生物である。原核微生物の例として、百日咳菌、インフルエンザ菌、レジオネラ・ニューモフィラ、肺炎マイコプラズマ、黄色ブドウ球菌、結核菌、大腸菌、化膿連鎖球菌、バークホルデリア・セパシア、コリネバクテリウム、肺炎クラミジア、大便連鎖球菌、有核紡錘菌、肺炎桿菌、レジオネラ・ロングビーチアエ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｌｏｎｇｂｅａｃｈｉａｅ）、モラクセラ・カタラーリス、髄膜炎菌、緑膿菌、表皮ブドウ球菌、ステノトロフォモナス・マルトフィリア、肺炎連鎖球菌、ミュータンス連鎖球菌、サングイス連鎖球菌及び霊菌が挙げられる。
【００５８】
表２に示すように、以上に参照した細菌は、一連の特性を示す。
【００５９】
【表２】
2009502142.tif 000016
【００６０】
微生物を同定するための本発明の方法は、ヒト医学、疫学、薬物開発、獣医学、農業、環境、食品科学及び工業微生物学を含むが、それらに限定されない種々の分野で使用できる。例えば、微生物同定は、感染症を患う患者において発見された微生物の同定を決定するために使用できる。微生物同定は、病原体を試験することにより、食品安全性を監視するためにも使用できる。同様に、植物は、それらが植物病原性細菌のすみかとなっているかを決定するために、確認できる。更に、本発明の方法は、細菌の抗生物質耐性菌を含む薬剤抵抗性細菌を同定するために使用できる。
【００６１】
試験試料中で標的微生物を同定するための本発明の一方法は、試験試料、又は上記の増幅プロセスの生成物を、ｔｕｆ遺伝子可変領域に由来するプローブと、ハイブリダイゼーションが生じるために十分な時間及び条件で接触させることを含む。
【００６２】
本明細書で使用されるような用語「プローブ」は、用語「オリゴヌクレオチドプローブ」又は「ハイブリダイゼーションプローブ」の代わりに使用され、かつ標的微生物からの、本明細書で定義されたようなポリ核酸に特異的に結合できるように、標的微生物からのｔｕｆ遺伝子可変領域の少なくとも１部に相補的である短いスパンの隣接ヌクレオチド、好ましくは１０から５０個の間のヌクレオチドを指す。プローブの設計、使用及び標識化は、Ｋｅｌｌｅｒら、ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅｓ，ｐｐ．１４９−２１３（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されている。
【００６３】
用語「特異的結合」又は「特異的に結合する」は、本発明のプローブと、標的微生物からの対応するポリ核酸との間の相互作用を指す。
【００６４】
本明細書で使用されるように、用語「接触させること」とは、他の条件が適切であれば、ハイブリダイゼーションが生じ得るように、試験試料又は増幅生成物を、ｔｕｆ遺伝子可変領域に由来するプローブの物理的近傍に持ってくることを意味する。接触させることは、直接的又は間接的であっても良い。例えば、試験試料は、ハイブリダイゼーションが生じ得るように、プローブに直接接触させられる。あるいは、試料は、ｔｕｆ遺伝子可変領域に由来するプローブと次にハイブリダイズする他の分子（例えば他の核酸分子）とハイブリダイズできる。
【００６５】
「ハイブリダイズ」は、本明細書において、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを生成するために、相補的ヌクレオチド配列の対合を示すために使用される。相補的塩基配列は、塩基対合法則によって関係する配列である。ＤＮＡにおいて、Ａは、Ｔと対になり、かつＣは、Ｇと対になる。ＲＮＡにおいて、Ｕは、Ａと対になり、かつＣは、Ｇと対になる。この点に関して、本明細書で使用されるような用語「マッチ」及び「ミスマッチ」は、相補的核酸鎖中の対ヌクレオチドのハイブリダイゼーション可能性を指す。マッチしたヌクレオチドは、上述の古典的なＡ−Ｔ及びＧ−Ｃ対のように、効果的にハイブリダイズする。ミスマッチは、効果的にハイブリダイズしないヌクレオチドの組み合せである。
【００６６】
適切なハイブリダイゼーション条件を定義することは、当該技術分野における技能の範囲内である。例えば、前掲のＳａｍｂｒｏｏｋらを参照。しかしながら、通常、プローブのハイブリダイゼーション又はアニーリングのための「厳格な条件」は、
（１）洗浄に低いイオン強度及び高温、例えば０．０１５ＭのＮａＣｌ／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を５０℃で用いるか、又は
（２）ホルムアミドのような変性剤、例えば０．１％のウシ血清アルブミン／０．１％のフィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液を有する５０％（体積／体積）のホルムアミドを、ｐＨ６．５で、７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムと、４２℃にてハイブリダイゼーション中に用いる条件である。
【００６７】
ハイブリダイゼーションの中程度厳格（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）条件の例は、４２℃での５０％のホルムアミド、５ＸＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５Ｘデンハート液、超音波で分解されたサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍＬ）、０．１％のＳＤＳ及び１０％の硫酸デキストランの使用であり、４２℃での０．２ＸＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳ中での洗浄を伴う。
【００６８】
適切なハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、具体的な用途によって決まる。区別する必要がある２種の微生物の間の類似程度が高いほど、ハイブリダイゼーション及び洗浄条件の厳格さ（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）が、高くなるべきである。例えば、用途が、属レベルで微生物を区別することを必要とする時、比較的低い厳格さのハイブリダイゼーション及び洗浄条件で十分なことがある。しかしながら、微生物が高度な類似性を共有する、種レベルで微生物を区別する時、高い厳格さのハイブリダイゼーション及び洗浄条件が必要である。更に、微生物が一層高度な類似性を共有する、菌株レベルで微生物を区別する時、一層高い厳格さのハイブリダイゼーション及び洗浄条件が必要である。
【００６９】
幾つかの実施態様において、試験試料を接触させるステップは、配列番号１２から５７、２０８から２０９及び２１０からなる群から選択される少なくとも１種のプローブを含む１組のプローブによるｔｕｆ遺伝子可変領域の少なくとも１部とのハイブリダイゼーションを含む。
【００７０】
他の実施態様において、少なくとも１種のプローブは、配列番号１２から７９、２０８から２０９及び２１０からなる群から選択される。他の実施態様において、少なくとも１種のプローブは、配列番号１２から３９２及び３９３からなる群から選択される。
【００７１】
幾つかの実施態様において、標的微生物は、ボルデテラ種、クラミドフィラ種、ヘモフィルス種、レジオネラ種、マイコプラズマ種、マイコバクテリウム種、ブドウ球菌種、連鎖球菌種、シュードモナス種、モラクセラ種及びフゾバクテリウム種、ステノトロフォモナス種、バークホルデリ種、腸球菌種、コリネバクテリウム種及びナイセリア種からなる群から選択され、プローブは、
インフルエンザ菌に関して、
ＴＡＴＴＡＴＣＣＧＴＡＣＡＧＧＴＧＡＴＧＡＡＧＴＡＧＡＡＡ（配列番号１２）；
ＡＡＡＧＡＴＡＣＡＧＣＧＡＡＡＡＣＴＡＣＴＧＴＡＡＣＧ（配列番号１３）；
ＣＡＴＣＧＧＴＧＣＡＴＴＡＴＴＡＣＧＴＧＧＴＡＣ（配列番号１４）；
ＣＡＴＡＣＴＣＣＡＴＴＣＴＴＣＡＡＡＧＧＴＴＡＣＣＧ（配列番号１５）；
ＴＧＡＣＴＧＧＴＡＣＡＡＴＣＧＡＡＴＴＡＣＣＡＧＡＡ（配列番号１６）；
ＣＣＧＴＡＡＡＴＴＡＣＴＴＧＡＣＧＡＡＧＧＴＣＧ（配列番号１７）；
ＡＣＴＴＣＧＡＡＴＣ  ＡＧＡＡＧＴＧＴＡＣ（配列番号６４）；
ＣＡＡＡＣＧＴＧＡＡ  ＧＡＡＡＴＣＧＡＡＣ（配列番号６５）；
ＣＧＡＴＡＡＣＡＴＣ  ＡＡＧＡＴＧＡＣＡＧ  Ｔ（配列番号６６）；
モラクセラ・カタラーリスに関して、
ＴＧＡＧＣＧＴＧＡＣＡＴＣＧＡＴＡＡＧＴＣＡ（配列番号１８）；
ＣＡＧＧＣＡＴＴＡＴＴＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＴＧＡＡＡＴＴ（配列番号１９）；
ＡＡＡＣＣＡＡＣＴＡＣＴＡＡＡＡＣＣＡＣＴＴＧＴＡＣＴＧ（配列番号２０）；
ＣＧＴＡＡＧＣＴＧＣＴＡＧＡＣＧＡＡＧＧＴ（配列番号２１）；
ＴＡＣＣＣＣＡＴＴＣＣＴＡＡＡＴＧＧＣＴＡＴＣＧ（配列番号２２）；
ＴＡＡＣＴＧＧＴＧＣＣＡＴＣＡＣＣＣＴＡＣ（配列番号２３）；
ＡＧＴＴＴＧＡＴＧＣＡＧＡＡＧＴＡＴＡＣＧ（配列番号２０８）
ＴＡＴＣＣＴＡＣＴＡＣＧＴＧＧＴＡＣＴＡＡ（配列番号２０９）
ＡＴＡＡＣＧＴＴＧＡＧＡＴＧＡＧＣＧ（配列番号２１０）
大便連鎖球菌に関して、
ＡＡＧＧＣＧＡＣＧＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＡＧＡ（配列番号２４）；
ＡＡＴＴＡＡＴＧＧＣＴＧＣＡＧＴＴＧＡＣＧＡＡＴ（配列番号２５）；
ＧＡＡＧＴＴＣＧＣＧＴＴＧＧＴＧＡＣＧ（配列番号２６）；
ＧＡＣＧＡＡＡＣＡＴＣＴＡＡＡＡＣＡＡＣＴＧＴＴＡＣＡＧ（配列番号２７）；
ＴＧＧＴＧＴＴＧＴＡＧＡＡＴＴＧＣＣＡＧＡＡＧ（配列番号２８）；
ＴＡＡＡＣＣＡＧＣＴＡＣＡＡＴＣＡＣＴＣＣＡＣＡ（配列番号２９）；
黄色ブドウ球菌に関して、
ＧＴＴＧＡＣＡＴＧＧＴＴＧＡＣＧＡＴＧＡＡＧＡＡＴＴＡ（配列番号３０）；
ＣＴＴＡＧＡＡＴＴＡＡＴＧＧＡＡＧＣＴＧＴＡＧＡＴＡＣＴＴＡＣＡ（配列番号３１）；
ＡＴＣＡＴＣＧＧＴＴＴＡＣＡＴＧＡＣＡＣＡＴＣＴＡＡＡＡ（配列番号３２）；
ＣＡＣＣＡＣＡＴＡＣＴＧＡＡＴＴＴＡＡＡＧＣＡＧＡＡＧＴＡ（配列番号３３）；
ＣＡＴＴＣＴＴＣＴＣＡＡＡＣＴＡＴＣＧＴＣＣＡＣＡＡ（配列番号３４）；
ＣＴＧＧＴＧＴＴＧＴＴＣＡＣＴＴＡＣＣＡＧＡＡＧ（配列番号３５）；
ＴＡＣＴＧＡＡＡＴＧＧＴＡＡＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＴＡ（配列番号３６）；
ＣＣＡＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＡＡＧＡＣＧＧ（配列番号３７）；
ＣＴＧＧＴＴＣＡＧＣＡＴＴＡＡＡＡＧＣＴＴＴＡＧＡＡＧ（配列番号３８）；
ＴＧＡＣＡＡＣＡＴＴＧＧＴＧＣＡＴＴＡＴＴＡＣＧＴ（配列番号３９）；
ＴＧＴＴＡＣＡＧＧＴＧＴＴＧＡＡＡＴＧＴＴＣＣＧ（配列番号４０）；
ＧＴＡＴＴＡＴＣＡＡＡＡＧＡＣＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＧ（配列番号４１）；
ＧＣＧＡＴＧＣＴＣＡＡＴＡＣＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＴＣ（配列番号４２）；
ＴＧＡＡＴＴＣＡＡＡ  ＧＣＡＧＡＡＧＴＡＴ  ＡＣ （配列番号７６）；
ＡＴＴＡＴＴＡＣＧＴ  ＧＧＴＧＴＴＧＣＴＣ（配列番号７７）；
ＧＴＧＡＴＡＡＣＧＴ  ＴＧＡＡＡＴＧＡＣＡ  Ｇ（配列番号７８）；
表皮ブドウ球菌に関して、
ＴＡＧＡＣＴＴＡＡＴＧＣＡＡＧＣＡＧＴＴＧＡＴＧＡＴＴＡＣ（配列番号４３）；
ＣＣＡＣＡＣＡＣＡＡＡＡＴＴＣＡＡＡＧＣＴＧＡＡＧ（配列番号４４）；
ＣＴＧＧＴＧＴＴＧＴＡＡＡＣＴＴＡＣＣＡＧＡＡＧＧ（配列番号４５）；
ＧＡＡＡＴＧＧＴＴＡＴＧＣＣＴＧＧＣＧＡＣ（配列番号４６）；
ＣＴＧＧＴＴＣＴＧＣＡＴＴＡＡＡＡＧＣＡＴＴＡＧＡＡＧ（配列番号４７）；
ＴＧＡＣＡＡＣＡＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＡＴＴＡＣＧ（配列番号４８）；
ＣＴＧＴＴＡＣＴＧＧＴＧＴＡＧＡＡＡＴＧＴＴＣＣＧ（配列番号４９）；
ＣＧＴＡＴＴＡＴＣＴＡＡＡＧＡＴＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＧ（配列番号５０）；
緑膿菌に関して、
ＡＡＧＴＴＣＧＡＧＴＧＣＧＡＡＧＴ（配列番号５１）；
ＡＡＧＧＣＧＴＡＧＡＧＡＴＧＧＴＡＡＴ（配列番号５２）；
ＴＴＣＴＴＣＡＡＧＧＧＣＴＡＣＣＧ（配列番号５３）；
ＡＴＣＡＴＣＡＡＧＧＴＣＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧＴ（配列番号５４）；
ＡＣＣＡＡＧＡＣＴＡＣＣＴＧＣＡＣＣＧ（配列番号５５）；
ＴＧＴＡＣＧＴＧＣＴＧＴＣＣＡＡＧＧＡＡ（配列番号５６）；
ＣＣＧＧＴＡＡＣＴＧＣＧＡＡＣＴＧＣ（配列番号５７）；
ＣＡＣＧＴＴＧＡＣＴＧＣＣＣＣＧＧＴＣＡＣＧＣ（配列番号８５）；
ＡＣＧＣＣＴＴＣＣＧＧＣＡＧＴＴＣＧＣＡＧＴＴＡＣ（配列番号８６）；
ＡＴＣＧＧＴＣＡＣＧＴＴＧＡＣＣＡＴＧＧＣＡ（配列番号８７）；
ＧＣＣＧＣＣＴＴＣＧＣＧＧＡＴＣＧＣＧＡＡ（配列番号８８）；
百日咳菌に関して、
ＧＴＡＣＡＴＴＣＴＧ  ＴＣＣＡＡＧＧＡＡＧ（配列番号５８）；
ＧＡＣＡＡＣＧＴＧＧ  ＧＴＡＴＣＴＴＧ（配列番号５９）；
ＧＡＣＡＡＧＧＡＡＡ  ＴＧＧＴＧＣＴ（配列番号６０）；
肺炎クラミジアに関して、
ＡＡＴＴＴＡＡＧＴＣ  ＡＧＣＴＧＴＴＴＡＣ  Ｇ（配列番号６１）；
ＧＡＧＧＴＡＴＴＧＧ  ＡＡＡＧＡＡＣＧＡＴ（配列番号６２）；
ＡＴＡＡＣＧＴＴＧＡ  ＧＣＴＴＧＡＴＧＴＴ（配列番号６３）；
レジオネラ・ニューモフィラに関して、
ＡＧＴＴＴＧＡＡＧＣ  ＡＧＡＡＧＴＧＴＡＴ（配列番号６７）；
ＴＧＴＴＡＴＴＡＣＧ  ＡＧＧＴＡＣＧＡＡＧ（配列番号６８）；
ＡＧＡＴＡＡＴＧＴＧ  ＣＡＡＴＴＡＧＴＴＧ  ＴＴＡ（配列番号６９）；
肺炎マイコプラズマに関して、
ＧＡＡＡＴＴＴＡＡＡ  ＧＣＧＧＡＡＡＴＣＴ  ＡＴＧ（配列番号７０）；
ＧＡＡＣＧＴＧＧＴＣ  ＡＡＧＴＧＴＴＡＧ（配列番号７１）；
ＧＡＣＡＡＴＡＣＣＴ  ＣＧＡＴＴＡＣＡＧＴ（配列番号７２）；
結核菌に関して、
ＡＡＣＡＴＣＴＣＧＧ  ＴＧＡＡＧＴＴＧＡＴ（配列番号７３）；
ＴＧＡＣＡＡＣＡＣＣ  ＡＡＣＡＴＣＴＣ（配列番号７４）；
ＡＣＧＡＡＧＧＴＣＴ  ＧＣＧＴＴＴ（配列番号７５）；
肺炎連鎖球菌に関して、
ＡＡＴＴＣＡＡＡＧＧ  ＴＧＡＡＧＴＣＴＡＣ  Ａ（配列番号７９）；
ＣＡＡＣＧＴＧＡＴＧ  ＡＡＡＴＣＧＡＡＣ（配列番号８０）；
ＧＡＣＡＡＴＣＧＡＣ  ＧＴＴＧＡＧＴＴ（配列番号８１）；
化膿連鎖球菌に関して、
ＣＡＡＡＧＧＴＧＡＡ  ＧＴＡＴＡＴＡＴＣＣ  ＴＴＴＣ（配列番号８２）；
ＣＡＡＣＧＴＧＡＣＧ  ＡＡＡＴＣＧＡＡ（配列番号８３）；
ＣＧＴＧＡＣＡＡＴＣ  ＡＡＣＧＴＴＧＡ（配列番号８４）；
及びその組み合わせからなる群から選択される。
【００７２】
一旦、ハイブリダイゼーションが、生じたと考えられると、次に形成されたいかなるハイブリッドも検出される。当業者は、本発明のプローブと、本発明のポリ核酸との間のハイブリダイゼーションを検出することが容易にできるであろう。例えば、ポリ核酸も、プローブも、標識化されない場合、ハイブリダイゼーションは、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｃｏｒｅｓｂｙ  ＶＩＣ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）又はＳＹＴＯＸ  Ｏｒａｎｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｍｏｕｎｔ  Ｗａｖｅｒｌｅｙ  ＶＩＣ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）のようなＤＮＡ挿入染料を使用して検出できる。これらの染料は、二本鎖ＤＮＡに効果的に結合する。従って、標的ポリ核酸と、プローブヌクレオチド配列との間のハイブリッドが形成される時、上記のような染料による染色は、結果として生じるハイブリッドの検出を容易にする。
【００７３】
本発明の幾つかの好ましい実施態様において、プローブ又は試験試料に由来するポリ核酸は、ハイブリダイゼーション検出を容易にするために、標識化される。ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を標識化するために使用できる方法及び材料は、当該技術分野において公知である。以下の実施例において、Ｃｙ３又はＣｙ５によりＤＮＡを標識化する方法が、記載される。しかしながら他の公知の標識化材料及び方法も、使用できる。例えば、Ｃｙ３．５及びＣｙ５．５のような他のＣｙ染料、Ａｌｅｘａ蛍光染料、並びに３２Ｐ及び３５Ｓのような放射性同位体等も、ハイブリダイゼーションの検出を容易にするために全ゲノムＤＮＡを標識化するために使用できる。更にまた、２色蛍光標識化ストラテジーが、本発明において使用できる。ストラテジーは、両者とも全体が参考として組み込まれる、Ｒａｍｓａｙ，１９９８，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１６：４０−４４）及びＳｈａｌｏｎら、１９９６，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，６：６３９−６４５に記載されている。かかる多色ハイブリダイゼーション検出ストラテジーは、一貫しない実験条件から生じる変動を最小にし、かつ異なる試料中の標的発生量の直接かつ定量的比較を可能にする（前掲のＲａｍｓａｙ，１９９８及び前掲のＳｈａｌｏｎら、１９９６を参照）。標識は、好ましくは可変シグナルを提供しないが、その代わりに所与の期間にわたって、一定かつ再現可能なシグナルを提供するものである。
【００７４】
幾つかの実施態様において、プローブと、試験試料とを接触させ、かつ微生物を検出する好ましい方法は、マイクロアレイを使用することによる。「マイクロアレイ」は概して、本発明の２種以上のプローブが堆積された２次元アレイである。幾つかの実施態様において、各々が本発明の異なる配列を有する、プローブを含むマイクロアレイ上の少なくとも３つの位置がある。このことは、偽陽性を最小にするという利点を有する。
【００７５】
標的微生物からポリ核酸の存在を検出するもう１つの方法は、特異的な核酸マイクロアレイ及びマイクロチップ技術である。マイクロアレイは、遺伝子又は核酸配列の存在を検出するための道具であり、かつ概して多くのプローブの試料が規則的パターンで配置された小膜又はスライドグラスからなる。
【００７６】
例えば、本明細書に開示された微生物ポリ核酸のオリゴヌクレオチドプローブは、スライドグラス上の所定の位置に堆積できる。試験試料又はそこから単離されたポリ核酸は、試験試料中に存在するならば、プローブと、ポリ核酸との間のハイブリダイゼーション又は結合を可能にする条件で、プローブに添加できる。あるいは、試験試料からのポリ核酸は、本明細書に開示されたポリ核酸のプローブを添加する前にスライドに適用できる。プローブと、ポリ核酸との間の結合は、当該技術分野において公知のいかなる手段によっても検出でき、かつポリ核酸と、プローブとの間の特異的結合は、ポリ核酸が、試験試料中に存在することを示す。
【００７７】
ポリ核酸のハイブリダイゼーション及びマイクロアレイ技術の手順は、当該技術分野において周知である。例えば、ハイブリダイゼーションのためのポリ核酸の特異的調製、並びにプローブ、スライド、及びハイブリダイゼーション条件は、本明細書に参考として組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ０１／１０４８２に提供されている。
【００７８】
マイクロアレイ技術は、同時に何千もの遺伝子又はポリ核酸の測定を可能にし、それにより微生物の存在を同定する強力な道具を与える。２つのマイクロアレイ技術が、現在広く使用されている。第１は、ｃＤＮＡアレイであり、かつ第２は、オリゴヌクレオチドアレイである。これらのチップの構造に差が存在するが、実質的に全ての下流データ分析及び出力は、同じである。これらの分析の成果は概して、マイクロアレイ上の公知の位置でポリ核酸にハイブリダイズする試験試料からポリ核酸を検出するために使用される標識プローブから受けたシグナルの強度の測定である。概して、シグナル強度は、ポリ核酸量に比例する。多数のかかる技術が、利用でき、かつ有用である。好ましい方法は、各々の開示が、本明細書に参考として組み込まれる、Ｌｉｎｓｌｅｙらの米国特許第６２７１００２号、Ｆｒｉｅｎｄらの米国特許第６２１８１２２号、Ｐｅｃｋらの米国特許第６２１８１１４号、及びＷａｎｇらの米国特許第６００４７５５号に見出すことができる。
【００７９】
好ましい方法において、ビオチン化プローブが、Ｈｏｆｆｍａｎｎら，２００５，ＭｏＩ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２９：３１−８に記載されたような方法によって、調製され、かつＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａオリゴヌクレオチドマイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）のようなマイクロアレイにハイブリダイズされる。アレイ画像は、次に例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＭＡＳ  ５．０ソフトウェアを使用して、各プローブに関する強度値（ＣＥＬファイル）にされる。発現手段は、例えばＩｒｉｚａｒｒｙら，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３１：ｅｌ５及びＤａｌｌａｓら，２００５，ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．，６：５９に記載されたようなロバスト複数アレイ分析（ＲＭＡ）を使用して抽出される。
【００８０】
一旦微生物が、本明細書に記載された発明を使用して検出されると、適切な診断、予後診断、又は治療が、行われ得る。従って、本発明は、試験試料中のポリ核酸と、ｔｕｆ遺伝子可変領域に由来するプローブとの間のハイブリダイゼーション検出を含む、疾患の被検者における予後診断、診断、予防又は治療方法を更に提供する。試料中の核酸分子と、遺伝子の可変領域との間のハイブリダイゼーションを検出することは、試料中の微生物の同定を可能にする。この情報は、疾患が、病原微生物によって引き起こされたか、及びそれ故に疾患の予後診断、診断、予防又は治療を決定するために使用できる。
【００８１】
本明細書において、「予後診断」とは、疾患の進行及び結果、又は疾患を発現した被検者の見込みの予測を意味する。
【００８２】
本明細書において、「診断」とは、例えばその症状、実験室試験（遺伝子型試験を含む）及び理学的所見によって疾患を同定するプロセスを意味する。
【００８３】
本明細書において、「予防」は、被検者におけるいかなる疾患予防も意味し、かつ疾患にかかりやすいことがあるが、まだ疾患を有すると診断されなかった被検者において疾患が起こることを予防することを含む。効果は、疾患、又はその徴候若しくは症状を完全に又は部分的に予防する点で、予防的であっても良い。
【００８４】
本明細書において、「治療」又は「治療すること」は、特定の微生物検出に続き、被検者に薬物を投与することによる、被検者におけるいかなる疾患治療も意味する。「治療」及び「治療すること」は、
（ａ）疾患を阻害すること、すなわちその発達を止めること、又は
（ｂ）疾患の症状を軽減又は改善すること、すなわち疾患の症状の後退を引き起こすことを含む。効果は、疾患の部分的又は完全な治癒の点で治療的であっても良い。
【００８５】
本発明の方法は、全ての動物及び植物が、微生物に感染し、かつ微生物によって引き起こされる疾患及び障害を受けるので、動物及び植物のような、いかなる被検者の予後診断、診断、予防又は治療にも使用できる。
【００８６】
本明細書において、「動物」は、ヒト、又はヒトに対する経済的な重要性及び／又は社会的重要性を有する哺乳動物、例えば（ネコ及びイヌのような）ヒト以外の肉食動物、イノシシ・ブタ（小ブタ（ｐｉｇｓ）、ブタ（ｈｏｇｓ）及びイノシシ）、（ウシ属（ｃａｔｔｌｅ）、雄ウシ（ｏｘｅｎ）、ヒツジ、キリン、シカ、ヤギ、バイソン及びラクダのような）反すう動物及びウマのようないかなる動物も意味する。同様に、ヒトに対する経済的な重要性を同様に有するので、絶滅寸前の、動物園で飼われる種類の鳥、並びに家禽（ｆｏｗｌ）及び特には、家畜化された家禽、例えばシチメンチョウ、ニワトリ、カモ、ガチョウ、ホロホロチョウ等のような家禽（ｐｏｕｌｔｒｙ）の治療を含む、鳥の治療が、提供される。それ故に、家畜化されたイノシシ・ブタ（小ブタ及びブタ）、反すう動物、ウマ、家禽（ｐｏｕｌｔｒｙ）等を含むが、それらに限定されない家畜の治療が提供される。この用語は、特定の年齢を示さない。それ故に、成体及び新生児の被検者をカバーすることが、意図される。
【００８７】
本明細書において、「植物」は、そのいかなる部分（例えば花粉、種子、細胞、塊茎、茎）及びそのいかなる細胞成分（例えばプラスミド、リボソーム等）も含む、真核藻、コケ、ヒカゲノカズラ、シダ、被子植物、裸子植物及び（藻を含む）地衣を含むが、それらに限定されない植物界のいかなる構成要素も含む。
【００８８】
本明細書において「疾患」は、被検者が苦しむ健康からのいかなる逸脱も指すために使用される一般的な用語である。
【００８９】
幾つかの実施態様において、疾患は、（動物性病原体を含む）病原体、及び特には感染症、（院外感染性肺炎を含む）肺炎、百日咳、髄膜炎、発疹チフス、結核、ジフテリア、腸チフス及び細菌性下痢を含む呼吸器感染症；胃腸炎を含む胃腸管感染症；皮膚感染症；生殖路感染症；尿路感染症；院内感染症；腸チフス；ボツリヌス中毒；連鎖球菌性咽頭炎；リウマチ熱；梅毒、膀胱炎；腎臓感染症；毛包炎；フルンケル症（腫脹）；膿痂疹（とびひ）；メチシリン耐性黄色ブドウ球菌；ブドウ球菌性熱傷様皮膚症候群；毒素ショック症候群；蜂巣炎、丹毒；壊疽性筋膜炎；猩紅熱；創傷感染症、すなわち皮膚炎及び疥癬と関連付けられるものである
【００９０】
開業医又は獣医は、上記の方法の結果を提供された後に、その知識及び技能に従って適当な治療を処方できる。しかしながら、代替的実施態様において、一旦微生物の同定が生じると、コンピューターソフトウェアプログラムが、患者の適切な治療について助言するために提供できる。
【００９１】
本発明の実施態様は、同様にキットにおいて便利に提供できる。本発明のキットは、プローブ又はプライマーのような試薬、基準ポリ核酸、緩衝液、酵素等を含むことができる。本発明のキットは、本発明の方法を行うための指示書も含むことができる。当該指示書は、添付文書、又はラベル、又は本、定期刊行物、ウェブサイト及びコンパクトディスクのような他の情報源への照会という形状を取ることができる。
【実施例】
【００９２】
本発明は、専ら以下の非限定的実施例の参照として、更に記載される。しかしながら、以下の実施例は、専ら例証となることが理解されるべきであり、かつ決して以上に記載した発明の一般性の制限として取られるべきではない。
【００９３】
実施例１  痰試料からの微生物の同定
【００９４】
痰試料は、病理学研究所から得て、かつ水で希釈した。２マイクロリットルのこれらの試料を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって真正細菌種で発見される特異的保存配列を増幅するために使用した。次に、ＰＣＲ生成物を、Ｄｏｒｅｌｌら、２００１（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１１，１７０６−１５）のランダムに感作された重合反応、又はポストＰＣＲ標識化によって蛍光類似体Ｃｙ５を直接組み込むための鋳型として、使用した。
【００９５】
オリゴヌクレオチドプローブは、真正細菌種中で保存配列から選択され、かつマイクロアレイスライドに印刷される単一の特徴的配列を含んで設計した。
【００９６】
標識化したＰＣＲ生成物を、次にマイクロアレイスライドにハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、３０分間、５３℃の水浴に浸漬される加湿チャンバー中でガラスカバースリップの下で行った。スライドは、洗浄、乾燥及びレーザー作動の共焦点スキャナを使用することによって、蛍光を走査させた。
【００９７】
バックグラウンドは、走査させたアレイ上の各点に関して差し引き、かつ臨床試料中に存在する種を生じさせ、かつ患者の適当な治療について助言するためにソフトウェアによって分析した。
【００９８】
材料及び方法
【００９９】
スライド：ＣｏｄｅＬｉｎｋ（商標）作動スライド（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
【０１００】
オリゴヌクレオチドプローブ：５’アミノ修飾及び１０Ｔ付着を５’末端に有する１７から２４個の範囲のオリゴヌクレオチドを、設計した。オリゴヌクレオチドは、真正細菌種のｔｕｆ遺伝子中で単一の特徴的配列を含むように設計した。
【０１０１】
標定溶液：１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液。１００μＭの濃度で、逆浸透水中に溶解したオリゴヌクレオチド。標定溶液中のオリゴヌクレオチドの最終濃度は、２５μＭであり、かつリン酸ナトリウム緩衝液のそれは２５０ｍＭであった。
【０１０２】
印刷：エポキシスライドの印刷は、ＭｉｃｒｏＧｒｉｄ  ＩＩ  Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｅｒ（ＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓ）を使用して実行された。
【０１０３】
標的ＤＮＡ：ｔｕｆ遺伝子の断片は、プライマー対ＭＡｔｕｆ−Ｆ４（フォワードプライマー、５’  ＫＹＡＣＩＧＧＨＧＴＢＧＡＲＡＴＧＴＴＣ  ３’、配列番号３９６）及びＭＡｔｕｆ−Ｒ５（リバースプライマー、５’  ＧＴＤＣＧＤＣＣＲＣＣＹＴＣＷＣＧＲＡＴ  ３’、配列番号３９５）を使用して増幅した。ｔｕｆ遺伝子の第２の断片は、プライマーＭＡｔｕｆ−Ｆ１（配列番号３９４）及びＭＡｔｕｆ−Ｒ５（配列番号３９５）を使用して増幅した。プライマーは、ｔｕｆ遺伝子中に見出される保存領域を使用して設計した。ＰＣＲ条件は、１Ｘ  ９４℃、１分の初期変性、３５Ｘ  ９４℃、３０秒／５０℃、３０秒／７２℃、３０秒、１Ｘ  ７２℃、７分の最終伸長であった。ＰＣＲ生成物は、標識化前に、Ｗｉｚａｒｄ  ＰＣＲ  Ｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して精製した。
【０１０４】
標識化：標識化は、標識化混合物、２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、１．５ｍＭのｄＴＴＰ及び０．５ｍＭのビオチン−ｄＵＴＰを使用して行った。標識化は、プライマーＭＡｔｕｆ−Ｆ４及びＭＡｔｕｆ−Ｒ５を使用して得られた生成物に関して、一晩中、３７℃で行った。Ｃｙ５−ｄＵＴＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するＰＣＲ反応中の直接標識化は、ＭＡｔｕｆ−Ｆ１及びＭＡｔｕｆ−Ｒ５プライマーを使用して増幅したｔｕｆ断片に関して行った。
【０１０５】
ハイブリダイゼーション：ハイブリダイゼーションは、５３℃で３０分、ハイブリダイゼーションチャンバーで行った。この後に、次のような各々５分の４回の洗浄ステップが続いた：洗浄１、２ＸＳＳＣ／０．１％のＳＤＳ；洗浄２、０．５ＸＳＳＣ／０．１％のＳＤＳ；洗浄３、２ＸＳＳＣ；洗浄４、４ＸＳＳＣ／０．２％のツイーン２０。ハイブリダイゼーション後、アレイは、ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂスキャナー（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して走査した。
【０１０６】
結果
【０１０７】
ｔｕｆ遺伝子断片のＰＣＲ増幅。プライマーＭＡｔｕｆ−Ｆ４及びＭＡｔｕｆ−Ｒ５を使用する増幅ＰＣＲ生成物の大きさは、約３８１塩基対であった（図１）。プライマーＭＡｔｕｆ−Ｆ１及びＭＡｔｕｆ−Ｒ５プライマーは、約１．１ｋｂのＰＣＲ増幅生成物を生成した。
【０１０８】
スキャナー出力。マイクロアレイは、この研究において試験した生物：すなわち（ａ）肺炎連鎖球菌；（ｂ）モラクセラ・カタラーリス；（ｃ）レジオネラ・ニューモフィラ；（ｄ）黄色ブドウ球菌；（ｅ）インフルエンザ菌の検出及び区別に成功した（図２、３、４、５及び６）。
【０１０９】
考察
【０１１０】
ＤＮＡマイクロアレイは、ＤＮＡ断片の高スループットスクリーニングを得るために、高精度な技術を高度な分子生物学と組み合わせる。この研究において、５種の病原菌からのＰＣＲ由来単位複製配列を同定及び区別するＤＮＡマイクロアレイ技術の可能性が、調査された；すなわち、肺炎連鎖球菌、モラクセラ・カタラーリス、レジオネラ・ニューモフィラ、黄色ブドウ球菌及びインフルエンザ菌である。
【０１１１】
ｔｕｆ遺伝子からの断片が、増幅のために選択された。この遺伝子は、全ての細菌種に普遍的に存在する。この遺伝子の部分は、高度に保存され（保存領域）、他方で残りの部分は、高い変動を示す（可変領域）。保存及び可変領域は、幾つもの異なる細菌種から得られるｔｕｆＤＮＡ配列を使用する遺伝子の複数の配列アライメントを介して決定した。保存領域は、可変領域を含む単位複製配列を得るために、プライマーを設計するように使用した。これらの単位複製配列は、前述の細菌種を検出及び区別するためにＤＮＡマイクロアレイ上で使用した。
【０１１２】
このことは、マイクロアレイ技術が、細菌種を同定及び選別する方法として使用できることを示す。方法は、高感度であり、かつ特異的であることが証明された。この調査は、ＰＣＲ技術を介して増幅された細菌ｔｕｆ遺伝子配列が、臨床診断の設定において上記目的にかなうためにＤＮＡマイクロアレイとの結合に成功したことを立証する。現在の要求を満たせるならば、核酸マイクロアレイ技術は、他の分子ベースの同定方法に対して競合的な利点を与える。この領域での急速な発展は、同時に技術を改善し、かつコストを減少させ、マイクロアレイ手順を魅力的、かつ競争的にする。
【０１１３】
配列
【０１１４】
種々の微生物からのｔｕｆ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号１から１１である。配列番号１２から３９３は、種々の微生物からの特徴的（プローブ）配列であり：
ＡＢＡＵ−アシネトバクター・バウマニー
ＢＣＥＰ−バークホルデリア・セパシア
ＢＰＥＲ−百日咳菌
ＣＡＢＯ−クラミドフィラ・アボルツス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）
ＣＤＩＰ−ジフテリア菌
ＣＪＥＪ−カンピロバクター・ジェジュニ
ＣＰＥＲ−ウェルチ菌
ＣＰＮＥ−肺炎クラミジア
ＣＴＥＴ−破傷風菌
ＥＦＡＥ−大便連鎖球菌
ＦＮＵＣ−有核紡錘菌
ＨＰＹＬ−ピロリ菌
ＨＨＥＰ−ヘリコバクター・ヘパティカス
ＨＩＮＦ−インフルエンザ菌
ＫＰＮＥ−肺炎桿菌
ＬＬＯＮ−レジオネラ・ロングビーチアエ
ＬＭＯＮ−リステリア菌
ＬＰＮＥ−レジオネラ・ニューモフィラ
ＭＣＡＴ−モラクセラ・カタラーリス
ＭＴＵＢ−結核菌
ＭＰＮＥ−肺炎マイコプラズマ
ＮＧＯＮ−淋菌
ＮＭＥＮ−髄膜炎菌
ＰＡＥＲ−緑膿菌
ＳＡＵＲ−黄色ブドウ球菌
ＳＥＰＩ−表皮ブドウ球菌
ＳＳＡＰ−腐生ブドウ球菌
ＳＭＡＬ−ステノトロフォモナス・マルトフィリア
ＳＰＮＥ−肺炎連鎖球菌
ＳＰＹＯ−化膿連鎖球菌
ＳＭＵＴ−ミュータンス連鎖球菌
ＳＳＡＮ−サングイス連鎖球菌
ＳＭＡＲ−霊菌
ＶＶＵＬ−ビブリオ・バルニフィカス
ＶＰＡＲ−腸炎ビブリオ
ＶＣＨＯ−コレラ菌
ＹＰＥＳ−ペスト菌
ＹＰＳＥ−偽結核エルシニア菌である。
【０１１５】
配列番号３９４及び３９５は、種々の微生物のｔｕｆ遺伝子の保存領域に対して設計されたオリゴヌクレオチドプライマーである。
【０１１６】
配列は、代替的塩基を含むこともできる。それらを以下に示す：
Ｒ−Ａ又はＧ
Ｙ−Ｃ又はＴ
Ｍ−Ａ又はＣ
Ｋ−Ｇ又はＴ
Ｓ−Ｇ又はＣ
Ｗ−Ａ又はＴ
Ｈ−Ａ又はＣ又はＴ
Ｂ−Ｇ又はＣ又はＴ
Ｖ−Ａ又はＧ又はＣ
Ｄ−Ａ又はＧ又はＴ
Ｉ−Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴに結合するＡ塩基
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】ｔｕｆ遺伝子断片のＰＣＲ増幅である。レーン１、ＤＮＡ標準マーカー；レーン２、肺炎連鎖球菌；レーン３、モラクセラ・カタラーリス；レーン４、レジオネラ・ニューモフィラ；レーン５、黄色ブドウ球菌；レーン６、インフルエンザ菌。
【図２】肺炎連鎖球菌の検出を示す。試験１、２及び３−細菌性肺炎の原因物質の１種の肺炎連鎖球菌の存在を示す複製での陽性試験結果。試験１−配列番号７９試験２−配列番号８０試験３−配列番号８１
【図３】モラクセラ・カタラーリスの検出を示す。試験１、２及び３−慢性閉塞性肺疾患の原因物質の１種のモラクセラ・カタラーリスの存在を示す複製での陽性試験結果。試験１−配列番号２０８試験２−配列番号２０９試験３−配列番号２１０
【図４】レジオネラ・ニューモフィラの検出を示す。試験１、２及び３−在郷軍人病の主要原因物質のレジオネラ・ニューモフィラの存在を示す複製での陽性試験結果。試験１−配列番号６７試験２−配列番号６８試験３−配列番号６９
【図５】黄色ブドウ球菌の検出を示す。試験１、２及び３−高齢者における軟組織感染症及び肺炎の原因物質の１種の黄色ブドウ球菌の存在を示す複製での陽性試験結果。試験１−配列番号７６試験２−配列番号７７試験３−配列番号７８
【図６】インフルエンザ菌の検出を示す。試験１、２及び３、細菌性肺炎の原因物質の１種のインフルエンザ菌の存在を示す複製での陽性試験結果。試験１−配列番号６４試験２−配列番号６５試験３−配列番号６６
【図１】
2009502142.tif 000017
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2009502142.tif 000022
【配列表】
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【国際調査報告】
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2009502142.tif 000024
2009502142.tif 000025
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