(57)【要約】  本発明は、フェニルアラニン、システイン、該アミノ酸の誘導体、それらを含むペプチド、ならびに病状がＣＸＣＲ４活性および／または細胞の運動性によって引き起こされるかまたは関連する疾患、障害または症状におけるそれらの使用に関する。
2009521917.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＸＣＲ４活性の阻害および／または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造における
フェニルアラニンまたはその誘導体のアミノ酸；
システインまたはその誘導体のアミノ酸；
フェニルアラニンまたはその誘導体およびシステインまたはその誘導体を含むアミノ酸の組み合わせ；
少なくとも１つのフェニルアラニンもしくはその誘導体、少なくとも１つのシステインもしくはその誘導体、または少なくとも１つのフェニルアラニンもしくはその誘導体および少なくとも１つのシステインもしくはその誘導体を含む２２個までのアミノ酸残基を含むペプチドの使用。
【請求項２】
ＣＸＣＲ４活性の阻害および／または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造における、フェニルアラニンまたはその誘導体のアミノ酸の請求項１記載の使用。
【請求項３】
フェニルアラニン誘導体が、溶解性が改良されたフェニルアラニン誘導体である請求項２記載の使用。
【請求項４】
フェニルアラニン誘導体が、フェニルアラニノール（Ｐｈｅ−ｏｌ）またはサクシニルフェニルアラニン（Ｓｕｃ−Ｐｈｅ）である請求項３記載の使用。
【請求項５】
フェニルアラニン誘導体が、β−フェニルエチルアミンである請求項２記載の使用。
【請求項６】
ＣＸＣＲ４活性の阻害および／または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造における、システインまたはその誘導体のアミノ酸の請求項１記載の使用。
【請求項７】
システイン誘導体が、溶解性が改良されたシステイン誘導体である請求項６記載の使用。
【請求項８】
システイン誘導体が、システインエチルエステル、システインスルフィン酸およびシステインアミンから選択される請求項６記載の使用。
【請求項９】
ＣＸＣＲ４活性の阻害および／または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造における、フェニルアラニンまたはその誘導体およびシステインまたはその誘導体を含むアミノ酸の組み合わせの請求項１記載の使用。
【請求項１０】
ＣＸＣＲ４活性の阻害および／または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造における、少なくとも１つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む２２個までのアミノ酸残基のペプチドの請求項１記載の使用。
【請求項１１】
ペプチドが、少なくとも１つのフェニルアラニンを含む２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１個のアミノ酸残基からなる請求項１０記載の使用。
【請求項１２】
ペプチドが、少なくとも１つのフェニルアラニンおよび少なくとも１つの荷電性アミノ酸であってフェニルアラニンでないアミノ酸残基を含む、約２、３、４、５または６個の連続したアミノ酸残基を含む請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
少なくとも１つのフェニルアラニンでない残基が、正電荷をもつアミノ酸である請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
正電荷をもつアミノ酸が、リジンまたはアルギニンである請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
ペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３またはアミノカプロイック酸に結合したその誘導体、配列番号４、配列番号５および配列番号８から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１０〜１４のいずれかに記載の使用。
【請求項１６】
少なくとも１つのフェニルアラニンでない残基が、負電荷をもつアミノ酸残基である請求項１２記載の使用。
【請求項１７】
負電荷をもつアミノ酸残基が、グルタミン酸である請求項１６記載の使用。
【請求項１８】
ペプチドが、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列を含む請求項１０〜１２、１６および１７のいずれかに記載の使用。
【請求項１９】
ＣＸＣＲ４活性の阻害および／または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造における、少なくとも１つのシステインまたはその誘導体を含む２２個までのアミノ酸残基のペプチドの請求項１記載の使用。
【請求項２０】
ペプチドが、少なくとも１つのシステインを含む２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１個のアミノ酸残基からなる請求項１９記載の使用。
【請求項２１】
ペプチドが、少なくとも１つのシステイン、ならびにプロリン、アルギニンおよびグルタミン酸から選択される少なくとも１つのシステインでない残基を含む、約２、３、４、５、または６個の連続したアミノ酸残基を含む請求項２０記載の使用。
【請求項２２】
ペプチドがグルタチオンからなる請求項２０記載の使用。
【請求項２３】
ＣＸＣＲ４活性の阻害および／または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造における、ＬＳＹモチーフ（配列番号１９）を含むＳＤＦ−１のアミノ末端由来のペプチドを除く、少なくとも１つのフェニルアラニンまたはその誘導体および少なくとも１つのシステインまたはその誘導体を含む２２個までのアミノ酸残基のペプチドの請求項１記載の使用。
【請求項２４】
ペプチドが、少なくとも１つのフェニルアラニンまたはその誘導体および少なくとも１つのシステインまたはその誘導体を含む２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１個のアミノ酸残基からなる請求項２３記載の使用。
【請求項２５】
ペプチドが、少なくとも１つのシステインまたはその誘導体および少なくとも１つのフェニルアラニン残基またはその誘導体を含む、約２、３、４、５、６または７個の連続したアミノ酸残基を含む請求項２４記載の使用。
【請求項２６】
ペプチドが、少なくとも１つのシステインではないアミノ酸残基またはフェニルアラニンではないアミノ酸残基で隔てられた、１つのシステインまたはその誘導体および１つのフェニルアラニン残基またはその誘導体を含む、約３、４、５、６または７個の連続したアミノ酸残基からなる請求項２５記載の使用。
【請求項２７】
ペプチドが、配列番号１２の３個の連続したアミノ酸残基を含む請求項２６記載の使用。
【請求項２８】
ペプチドが、少なくとも１つのシステインではないアミノ酸残基またはフェニルアラニンではないアミノ酸残基で隔てられた、１つのシステインまたはその誘導体および１つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む４個の連続したアミノ酸残基を含む請求項２６記載の使用。
【請求項２９】
連続したアミノ酸残基の配列が配列番号１１からなる請求項２８記載の使用。
【請求項３０】
連続したアミノ酸残基の初めの残基がプロリンである請求項２８記載の使用。
【請求項３１】
連続したアミノ酸残基の配列が配列番号１３からなる請求項３０記載の使用。
【請求項３２】
ペプチドが、少なくとも１つのシステインではないアミノ酸残基またはフェニルアラニンではないアミノ酸残基で隔てられた、１つのシステインまたはその誘導体および１つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む５個の連続したアミノ酸残基を含む請求項２６記載の使用。
【請求項３３】
連続したアミノ酸残基の初めの残基が、プロリンである請求項３２記載の使用。
【請求項３４】
連続したアミノ酸残基の配列が、配列番号１６、またはシステインの代わりにｄＣｙｓ（Ｔｒｔ）残基を有する配列番号１６の誘導体からなる請求項３３記載の使用。
【請求項３５】
連続したアミノ酸残基の５番目の残基がグルタミン酸である請求項３２記載の使用。
【請求項３６】
連続したアミノ酸残基の配列が配列番号１０からなる請求項３５記載の使用。
【請求項３７】
ペプチドが、少なくとも１つのシステインではないアミノ酸残基またはフェニルアラニンではないアミノ酸残基で隔てられた、１つのシステインまたはその誘導体および１つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む６個の連続したアミノ酸残基を含む請求項２６記載の使用。
【請求項３８】
連続したアミノ酸残基の６番目の残基がグルタミン酸である請求項３７記載の使用。
【請求項３９】
連続したアミノ酸残基の初めの残基がプロリンである請求項３７記載の使用。
【請求項４０】
連続したアミノ酸残基の配列が配列番号９からなる請求項３８または３９記載の使用。
【請求項４１】
ＣＸＣＲ４活性および／または細胞の運動性が病状または経過に関与する疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造における、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、システインの代わりにｄＣｙｓ（Ｔｒｔ）残基を含む配列番号１６の誘導体、または配列番号１７の配列を含む２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１個のアミノ酸残基のペプチドの使用。
【請求項４２】
ＣＸＣＲ４活性および／または細胞の運動性が病状または経過に関与する疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造における、Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｆ（配列番号１８）のアミノ酸配列であって、Ｘがアルギニンまたはアラニンであるアミノ酸配列を含む４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１個のアミノ酸残基のペプチドの使用。
【請求項４３】
アミノ酸配列が、配列番号１４または配列番号１５からなる請求項４２記載の使用。
【請求項４４】
ペプチドが、融合ペプチドおよび／またはその塩である請求項１０〜４３のいずれかに記載の使用。
【請求項４５】
疾患、障害または症状が、ＣＸＣＲ４を発現している癌、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）および炎症から選択される請求項１〜４４のいずれかに記載の使用。
【請求項４６】
疾患が、ＣＸＣＲ４を発現している癌である請求項４５記載の使用。
【請求項４７】
ＣＸＣＲ４を発現している癌が、白血病、眼内悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、多発性骨髄腫、膵臓癌、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、甲状腺癌、直腸癌、口腔扁平上皮癌、子宮頸癌、神経芽腫、神経膠腫、星状細胞腫、横紋筋肉腫、小細胞肺癌および黒色腫から選択される請求項４６記載の使用。
【請求項４８】
癌が、白血病である請求項４７記載の使用。
【請求項４９】
白血病が、Ｂ細胞型急性リンパ芽球性白血病である請求項４８記載の使用。
【請求項５０】
転移を治療または予防するための請求項１〜４４のいずれかに記載の使用。
【請求項５１】
疾患が、ＡＩＤＳである請求項４５記載の使用。
【請求項５２】
炎症性疾患、障害または症状を治療または予防するための請求項４５記載の使用。
【請求項５３】
炎症性疾患、障害または症状が、慢性関節リウマチ、化膿性関節炎、変形性関節症、歯周炎、歯肉炎、喘息、自己免疫疾患、乾癬、乾癬性関節炎、アトピー性皮膚炎、間質性腎炎、眼内炎症、肝硬変、神経炎症性障害、移植片対宿主病および炎症性胃腸症状から選択される請求項５２記載の使用。
【請求項５４】
Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｆ（配列番号１８）のアミノ酸配列であって、Ｘがアルギニンまたはアラニンであるアミノ酸配列を含む４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２個のアミノ酸残基のペプチド。
【請求項５５】
アミノ酸配列が、配列番号１４または配列番号１５を含む請求項５４記載のペプチド。
【請求項５６】
少なくとも１つのアラニンで隔てられた、１つのシステインまたはその誘導体および１つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む３、４、５、６、７または８個の連続したアミノ酸残基を含む３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２個のアミノ酸残基のペプチド。
【請求項５７】
システインまたはその誘導体およびフェニルアラニンまたはその誘導体が、１つまたは２つのアラニン残基で隔てられている請求項５６記載のペプチド。
【請求項５８】
ペプチドが、少なくとも１つのアラニンで隔てられた、１つのシステインまたはその誘導体および１つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む４個の連続したアミノ酸残基を含む請求項５６または５７記載のペプチド。
【請求項５９】
連続したアミノ酸残基の初めのおよび／または最後のアミノ酸残基が、それぞれ、システインまたはその誘導体およびフェニルアラニンまたはその誘導体である請求項５８記載のペプチド。
【請求項６０】
ＬＳＹモチーフ（配列番号１９）を含むＳＤＦ−１のアミノ末端由来のペプチドを除く、１つのアルギニンで隔てられたシステインまたはその誘導体およびフェニルアラニンまたはその誘導体を含む３、４、５、６または７個の連続したアミノ酸残基を含む２２個までのアミノ酸残基のペプチド。
【請求項６１】
２２個までのアミノ酸残基のペプチドが、配列番号１２からなる３個の連続したアミノ酸残基を含む請求項６０記載のペプチド。
【請求項６２】
２２個までのアミノ酸残基のペプチドが、１つのアルギニンで隔てられた、１つのシステインまたはその誘導体および１つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む４個の連続したアミノ酸残基を含む請求項６０記載のペプチド。
【請求項６３】
連続したアミノ酸残基の初めのおよび最後のアミノ酸残基が、それぞれ、システインまたはその誘導体およびフェニルアラニンまたはその誘導体である請求項６２記載のペプチド。
【請求項６４】
連続したアミノ酸残基の配列が、配列番号１１からなる請求項６３記載のペプチド。
【請求項６５】
連続したアミノ酸残基の初めの残基が、プロリンである請求項６２記載のペプチド。
【請求項６６】
連続したアミノ酸残基の配列が、配列番号１３からなる請求項６５記載のペプチド。
【請求項６７】
２２個までのアミノ酸残基のペプチドが、１つのアルギニンで隔てられた、１つのシステインまたはその誘導体および１つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む５個の連続したアミノ酸残基を含む請求項６０記載のペプチド。
【請求項６８】
連続したアミノ酸残基の初めの残基が、プロリンである請求項６７記載のペプチド。
【請求項６９】
連続したアミノ酸残基の配列が、配列番号１６、またはシステインの代わりにｄＣｙｓ（Ｔｒｔ）残基を有する配列番号１６の誘導体からなる請求項６８記載のペプチド。
【請求項７０】
連続したアミノ酸残基の５番目の残基が、グルタミン酸である請求項６７記載のペプチド。
【請求項７１】
連続したアミノ酸残基の配列が、配列番号１０からなる請求項７０記載のペプチド。
【請求項７２】
２２個までのアミノ酸残基のペプチドが、１つのアルギニンで隔てられた、１つのシステインまたはその誘導体および１つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む６個の連続したアミノ酸残基を含む請求項６０記載のペプチド。
【請求項７３】
連続したアミノ酸残基の６番目の残基が、グルタミン酸である請求項７２記載のペプチド。
【請求項７４】
連続したアミノ酸残基の初めの残基が、プロリンである請求項７２記載のペプチド。
【請求項７５】
連続したアミノ酸残基の配列が、配列番号９からなる請求項７３または７４記載のペプチド。
【請求項７６】
２つのアルギニンで隔てられた１つのシステインまたはその誘導体および１つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む４、５、６、７または８個の連続したアミノ酸残基を含む２２個までのアミノ酸残基のペプチド。
【請求項７７】
連続したアミノ酸残基の配列が、配列番号１５からなる請求項７６記載のペプチド。
【請求項７８】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、または配列番号７からなる２個の連続したアミノ酸残基を含む２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２個のアミノ酸残基のペプチド。
【請求項７９】
アミノカプロイック酸に結合した配列番号１または配列番号８からなる３個の連続したアミノ酸残基を含む３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２個のアミノ酸残基のペプチド。
【請求項８０】
配列番号５からなる４個の連続したアミノ酸残基を含む４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２個のアミノ酸残基のペプチド。
【請求項８１】
配列番号１、アミノカプロイック酸に結合した配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、システインの代わりにｄＣｙｓ（Ｔｒｔ）残基を有する配列番号１６の誘導体または配列番号１７のアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項８２】
ＬＳＹモチーフを含むＳＤＦ−１のアミノ末端由来のペプチドを除く、Ｃ−Ｒ−Ｆアミノ酸配列を含む約３、４、５、６、７、８または９個のアミノ酸残基であるまたは最後のアミノ酸残基がセリンであるＬＳＹモチーフを欠失している６から９個のアミノ酸残基からなるペプチド。
【請求項８３】
環状に置換されている、請求項５４〜８２のいずれかに記載のペプチド。
【請求項８４】
請求項５４〜８３のいずれかに記載のペプチドを含む融合ペプチド。
【請求項８５】
融合ペプチドが、タンパク質に融合されている請求項８４記載の融合ペプチド。
【請求項８６】
タンパク質が、免疫グロブリンである請求項８５記載の融合ペプチド。
【請求項８７】
ペプチドが、高分子ポリマーに融合されている請求項８４記載の融合ペプチド。
【請求項８８】
ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である請求項８７記載の融合ペプチド。
【請求項８９】
請求項５４〜８８のいずれかに記載のペプチドの塩。
【請求項９０】
請求項５４〜８６のいずれかに記載のペプチドをコードする単離されたＤＮＡ。
【請求項９１】
請求項９０記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項９２】
請求項９０記載のＤＮＡを含有する宿主細胞。
【請求項９３】
請求項９１記載の発現ベクターを含有する宿主細胞。
【請求項９４】
細胞が、真核細胞である請求項９３記載の宿主細胞。
【請求項９５】
真核細胞が、哺乳類細胞、昆虫細胞、イースト菌である請求項９４記載の宿主細胞。
【請求項９６】
哺乳類細胞が、ＨｅＬａ、２９３Ｔ  ＨＥＫおよびＣＨＯ細胞である請求項９５記載の宿主細胞。
【請求項９７】
細胞が、原核細胞である請求項９３記載の宿主細胞。
【請求項９８】
請求項９２〜９７のいずれかに記載の宿主細胞を培養することおよび産生されたタンパク質を単離することを含む、請求項５４〜８６のいずれかに記載のペプチドを産生するための方法。
【請求項９９】
ＣＸＣＲ４を発現している癌、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）炎症および転移から選択される疾患、障害もしくは症状の治療または予防のための医薬の製造における、請求項５４〜８８のいずれかに記載のペプチドまたはその塩の使用。
【請求項１００】
薬学的に許容され得る担体および請求項５４〜８８のいずれかに記載のペプチドまたはその塩を含む医薬組成物。
【請求項１０１】
薬学的に許容され得る担体ならびにＬＳＹモチーフを含むＳＤＦ−１のアミノ末端由来のペプチドを除く、１つのアルギニンで隔てられた、１つのシステインまたはその誘導体および１つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む約３、４、５、６または７個の連続したアミノ酸残基を含む３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２個のアミノ酸残基のペプチドを含む医薬組成物。
【請求項１０２】
請求項９０記載のＤＮＡおよび薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物。
【請求項１０３】
請求項９１記載のベクターおよび薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物。
【請求項１０４】
薬学的に許容され得る担体ならびにフェニルアラニンまたはその誘導体およびシステインまたはその誘導体からなるアミノ酸の混合物を含む医薬組成物。
【請求項１０５】
必要とする個体における、ＣＸＣＲ４活性の阻害および／または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状の治療または予防の方法であって、該方法が、個体に、治療上効果的な量の、ＬＳＹモチーフを含むＳＤＦ−１のアミノ末端由来のペプチドを除く、フェニルアラニンまたはその誘導体であるアミノ酸；システインまたはその誘導体であるアミノ酸；フェニルアラニンまたはその誘導体およびシステインまたはその誘導体を含むアミノ酸の組み合わせ；少なくとも１つのフェニルアラニンもしくはその誘導体、少なくとも１つのシステインもしくはその誘導体、または少なくとも１つのフェニルアラニンもしくはその誘導体および少なくとも１つのシステインもしくはその誘導体を含む２２個までのアミノ酸残基を含むペプチドを投与することを含む方法。
【請求項１０６】
ＣＸＣＲ４活性が疾患、障害もしくは症状の病状または経過に関与している疾患、障害もしくは症状の治療または予防の方法であって、該方法が、必要とする個体に、治療上効果的な量の、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、システインの代わりにｄＣｙｓ（Ｔｒｔ）残基を含む配列番号１６の誘導体、配列番号１７またはそれらの組み合わせで示される配列を含むペプチドを投与することを含む方法。
【請求項１０７】
ＣＸＣＲ４活性が疾患、障害もしくは症状の病状または経過に関与している疾患、障害もしくは症状の治療または予防の方法であって、該方法が、必要とする個体に、治療上効果的な量の、配列番号１、アミノカプロイック酸に結合した配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８またはそれらの組み合わせで示される配列を含むペプチドを投与することを含む方法。
【請求項１０８】
ＣＸＣＲ４を発現している癌、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）炎症、および転移から選択される疾患、障害もしくは症状の治療または予防の方法であって、該方法が、必要とする個体に、治療上効果的な量の、請求項５４〜８８のいずれかに記載のペプチドまたはその塩を投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フェニルアラニン、システイン、該アミノ酸の誘導体およびそれらを含むペプチド、ならびに病状がＣＸＣＲ４活性および／または細胞運動によって引き起こされるかまたは関連する疾患、障害もしくは症状におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
造血幹細胞は、骨髄の微環境内の稀な細胞群である。造血幹細胞は、個体の一生にわたって、ＴおよびＢリンパ球といった免疫システムの主な構成成分を含むすべての成熟血液細胞系統の連続的な産生を活発に維持しており、その間、未分化の幹細胞および前駆細胞の小さなプールを保持している（Mayani, 2003）。
【０００３】
成長中、または実験的および臨床的移植術において、幹細胞は、順番に循環系の中に遊離される未熟なおよび成熟骨髄性およびリンパの血液細胞とともに自己を再増殖しながら、血液循環を通じて遊走し、骨髄（ＢＭ）に生着する。幹細胞の機能および免疫システムの発達に極めて重要である造血幹細胞のホーミングおよび再増殖の過程はあまりよく解明されていない。ケモカインストローマ細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）は、多くのタイプの細胞によってならびにまた骨髄性のストローマ細胞および内皮細胞によって産生されるが、未成熟および成熟造血細胞に対する強力な化学誘引物質であり、定常状態における白血球輸送の恒常性を制御している。
【０００４】
ＳＤＦ−１は進化を通じて高度に保全されている。ヒトおよびマウスのＳＤＦ−１は交差反応性であり、１つのアミノ酸のみ異なる。ＳＤＦ−１（ＣＸＣＬ１２とも呼ばれる）は幹細胞および前駆細胞のための生存因子としてはたらき、未成熟Ｂ細胞および巨核球の成長に関与している（McGrath et al., 1999; Nagasawa et al., 1996）。
【０００５】
免疫不全の移植マウスにおけるヒト幹細胞のホーミングならびにそれらのその後の増殖および分化は、宿主の骨髄によって発現されているＳＤＦ−１とドナーの生着細胞上で発現されているそのレセプターＣＸＣＲ４との間の相互作用に依存していることが見出された。未成熟ヒトＣＤ３４＋細胞を抗ＣＸＣＲ４中和抗体で前処理することによるＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４相互作用の阻害は、ＣＤ３４＋細胞のインビボでのホーミングおよび再増殖を遮断した。一方、未処理の細胞は数時間以内にレシピエントマウスのＢＭ中に生着することができた[Peled et al., 1999(a)]。
【０００６】
サイトカイン刺激によるＣＸＣＲ４発現の増加は、ホーミングおよび移植の向上を伴いながら、ＳＤＦ−１への応答を増強することが見出された。細胞表面にＣＸＣＲ４を発現していない未成熟ヒトＣＤ３４＋細胞は、内在ＣＸＣＲ４を含んでおり、移植に続いてインビボでオシレート（oscillate）し得る。このＣＸＣＲ４の上方調節の阻止は、低いレベルのヒトＣＤ３４+ＣＸＣＲ４-細胞移植を遮断する。これゆえ、再増殖能のあるヒト幹細胞の表現型はＣＤ３４＋ＣＤ３８-/lowＣＸＣＲ４＋細胞として定義される（Kollet et al., 2002）。
【０００７】
骨髄から循環系への幹細胞の遊離および移動は臨床的移植のために誘導される。Ｇ−ＣＳＦなどのサイトカインを用いた多重刺激が循環系からヒト幹細胞を補充（recruit）するために用いられる。Ｇ−ＣＳＦ投与後、ＢＭ内でのＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４相互作用が移動過程に関与していることが判明した（Petit et al., 2002）。
【０００８】
好中球エラスターゼなどのタンパク質分解酵素は、Ｇ−ＣＳＦ投与の間、骨髄中でＳＤＦ−１を分解することが判明した。同時に、骨髄内の造血細胞におけるＣＸＣＲ４の発現レベルは、それらの移動以前に増加していることが見出された。ＣＸＣＲ４またはＳＤＦ−１に対する中和抗体は、ヒトおよびマウスの幹細胞の移動を減少させた。これは細胞放出におけるＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４シグナル伝達を示している。
【０００９】
したがって、幹細胞のホーミングおよび遊離／移動は類似の機序を利用しており、かつ両方のプロセスにおいて、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４相互作用が主要な役割を担っている。
【００１０】
ＳＤＦ−１はまた、白血病性細胞の遊走においても重要な役割を果たしている。正常細胞および白血病性の細胞は遊走において類似の機序を共有しているが、ＳＤＦ−１シグナル経路と同様にホーミングパターンにおいても異なることが、悪性腫瘍のヒトＰｒｅ−Ｂ  ＡＬＬ細胞（前駆Ｂ細胞型急性リンパ芽球性白血病）を正常な未成熟ＣＤ３４＋細胞と比較した場合に判明した（Siegel et al., 2004）。別の悪性疾患である急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）においては、高レベルの細胞内ＣＸＣＲ４およびＳＤＦ−１が、表面上のＣＸＣＲ４を発現していない細胞を含めたすべての白血病性細胞において見つかっている。ＣＸＣＲ４は、免疫不全マウスのＢＭへのこれらの細胞のホーミングに不可欠であり、これは、これらの細胞におけるＣＸＣＲ４の動的調節を証明している（Tavor et al., 2005）。
【００１１】
血管内内皮細胞の細胞表面におけるＳＤＦ−１の発現は、循環系からの骨髄への成功的な経内皮移動のために不可欠な段階である、せん断流下のおける細胞停止を誘導するために大変重要であることが見出された。加えて、ＳＤＦ−１は、遊走性のヒト幹細胞および前駆細胞上のＣＤ４４、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−４およびＶＬＡ−５などの主要な接着性分子を、ホーミングおよび経内皮移動の多段階過程の一環として、活性化した（Peled et al., 2000）。
【００１２】
ＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４への結合によって誘発される、ＳＤＦ−１刺激およびシグナル伝達経路後の細胞運動および遊走を誘導する機序は知られていない。ＭＡＰＫでなく、ＰＩ３Ｋの活性化が、濃縮された未成熟ＣＤ３４＋細胞の運動性に必要であることが判明している。異型のＰＫＣゼータアイソフォームは遊走の過程に不可欠であることが判明した。さらに、ＳＤＦ−１によるＰＫＣゼータの活性化はＰＩ３Ｋ依存性であることが判明した（Petit et al., 2005）。
【００１３】
ＳＤＦ−１は、細胞骨格を変化させ、かつ表面上のＣＤ４４発現を再配置させることによって、ＢＭニッチの細胞外マトリックスへの幹細胞の接着および固定（anchorage）を媒介していると考えられている（Avigdor et al., 2004）。
【００１４】
遊走および接着における役割とは別に、ＳＤＦ−１はまた、正常なヒトＣＤ３４＋細胞および白血病性細胞を含む様々な細胞の増殖および生存に関与している（Lee et al., 2002; Nishii et al., 1999, および Tavor et al., 2005）。
【発明の開示】
【００１５】
ある局面において、本発明は、ＣＸＣＲ４活性の阻害および／または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造における、フェニルアラニンまたはその誘導体のアミノ酸；システインまたはその誘導体のアミノ酸；フェニルアラニンまたはその誘導体およびシステインまたはその誘導体を含むアミノ酸の組み合わせ；少なくとも１つのフェニルアラニンもしくはその誘導体、少なくとも１つのシステインもしくはその誘導体、または少なくとも１つのフェニルアラニンもしくはその誘導体および少なくとも１つのシステインもしくはその誘導体を含む２２個までのアミノ酸残基を含むペプチドの使用に関する。
【００１６】
本発明のある実施態様では、ＣＸＣＲ４活性の阻害および／または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造において、フェニルアラニンまたはその誘導体のアミノ酸が使用される。
【００１７】
本発明のさらなる実施態様では、フェニルアラニン誘導体は、溶解性が改良されたフェニルアラニン誘導体である。
【００１８】
本発明のさらなる別の実施態様では、フェニルアラニン誘導体は、フェニルアラニノール（Ｐｈｅ−ｏｌ）またはサクシニルフェニルアラニン（Ｓｕｃ−Ｐｈｅ）である。
【００１９】
本発明のさらなる別の実施態様では、フェニルアラニン誘導体は、β−フェニルエチルアミンである。
【００２０】
本発明の他の実施態様では、ＣＸＣＲ４活性の阻害および／または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造において、システインまたはその誘導体のアミノ酸が使用される。
【００２１】
本発明のさらなる実施態様では、システイン誘導体は、溶解性が改良されたシステイン誘導体である。
【００２２】
本発明のさらなる別の実施態様では、システイン誘導体は、システインエチルエステル、システインスルフィン酸およびシステインアミンから選択される。
【００２３】
本発明の別の実施態様では、ＣＸＣＲ４活性の阻害および／または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造において、フェニルアラニンまたはその誘導体およびシステインまたはその誘導体を含むアミノ酸の組み合わせが使用される。
【００２４】
本発明の別の実施態様では、ＣＸＣＲ４活性の阻害および／または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造において、少なくとも１つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む２２個までのアミノ酸残基のペプチドが使用される。
【００２５】
本発明のさらなる実施態様では、ペプチドは、少なくとも１つのフェニルアラニンを含む２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１個のアミノ酸残基からなる。
【００２６】
本発明のさらなる別の実施態様では、ペプチドは少なくとも１つのフェニルアラニンおよび少なくとも１つの、荷電したフェニルアラニンでない残基を含む約２、３、４、５または６個の連続したアミノ酸残基からなる。
【００２７】
本発明のさらなる別の実施態様では、少なくとも１つのフェニルアラニンでない残基は、リジンまたはアルギニンなどの正電荷をもつアミノ酸または負電荷をもつアミノ酸残基である。
【００２８】
本発明のさらなる別の実施態様では、ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３またはアミノカプロイック酸に結合したその誘導体、配列番号４、配列番号５および配列番号８から選択されるアミノ酸を含む。
【００２９】
本発明のさらなる別の実施態様では、負電荷をもつアミノ酸残基は、グルタミン酸である。
【００３０】
本発明のさらなる別の実施態様では、ペプチドは、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列を含む。
【００３１】
本発明の別の実施態様では、ＣＸＣＲ４活性の阻害および／または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造において、少なくとも１つのシステインもしくはその誘導体を含む２２個までのアミノ酸残基を含むペプチドが使用される。
【００３２】
本発明のさらなる実施態様では、ペプチドは、少なくとも１つのシステインを含む２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１個のアミノ酸残基からなる。
【００３３】
本発明のさらなる別の実施態様では、ペプチドは、少なくとも１つのシステインならびにプロリン、アルギニンおよびグルタミン酸から選択される少なくとも１つのシステインでない残基を含む、約２、３、４、５または６個の連続したアミノ酸残基を含む。
【００３４】
本発明のさらなる別の実施態様では、ペプチドはグルタチオンからなる。
【００３５】
本発明の別の実施態様では、ＣＸＣＲ４活性の阻害および／または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造において、ＬＳＹモチーフ（配列番号１９）を含むＳＤＦ−１のアミノ末端由来のペプチドを除く、少なくとも１つのフェニルアラニンまたはその誘導体および少なくとも１つのシステインまたはその誘導体を含む２２個までのアミノ酸残基のペプチドが使用される。
【００３６】
本発明のさらなる実施態様では、ペプチドは、少なくとも１つのフェニルアラニンまたはその誘導体および少なくとも１つのシステインまたはその誘導体を含む２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１個のアミノ酸残基からなる。
【００３７】
本発明のさらなる別の実施態様では、ペプチドは、少なくとも１つのシステインまたはその誘導体および少なくとも１つのフェニルアラニン残基またはその誘導体を含む、約２、３、４、５、６または７個の連続したアミノ酸残基を含む。
【００３８】
本発明のさらなる別の実施態様では、ペプチドは、少なくとも１つのシステインではないアミノ酸残基またはフェニルアラニンではないアミノ酸残基で隔てられた、１つのシステインまたはその誘導体および１つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む、約３、４、５、６または７個の連続したアミノ酸残基を含む。
【００３９】
本発明のさらなる別の実施態様では、ペプチドは配列番号１２の３個の連続したアミノ酸残基を含む。
【００４０】
本発明のさらなる別の実施態様では、ペプチドは、少なくとも１つのシステインではないアミノ酸残基またはフェニルアラニンではないアミノ酸残基で隔てられた、１つのシステインまたはその誘導体および１つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む４個の連続したアミノ酸残基を含む。
【００４１】
本発明のさらなる別の実施態様では、４個の連続したアミノ酸残基の配列が配列番号１１からなる。
【００４２】
本発明のさらなる別の実施態様では、４個の連続したアミノ酸残基の初めの残基が、配列番号１３からなる連続したアミノ酸残基の配列にあるようにプロリンである。
【００４３】
本発明のさらなる別の実施態様では、ペプチドは、少なくとも１つのシステインではないアミノ酸残基またはフェニルアラニンではないアミノ酸残基で隔てられた、１つのシステインまたはその誘導体および１つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む５個の連続したアミノ酸残基を含む。
【００４４】
本発明のさらなる別の実施態様では、５個の連続したアミノ酸残基の初めの残基が、配列番号１６、またはシステインの代わりにｄＣｙｓ（Ｔｒｔ）残基を有する配列番号１６の誘導体の配列にあるようにプロリンである。
【００４５】
本発明のさらなる別の実施態様では、５個の連続したアミノ酸残基の５番目の残基が、配列番号１０の配列にあるようにグルタミン酸である。
【００４６】
本発明のさらなる別の実施態様では、ペプチドは、少なくとも１つのシステインではないアミノ酸残基またはフェニルアラニンではないアミノ酸残基で隔てられた、１つのシステインまたはその誘導体および１つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む、６個の連続したアミノ酸残基を含む。
【００４７】
本発明のさらなる別の実施態様では、配列番号９の配列にあるように、６個の連続したアミノ酸残基の６番目の残基がグルタミン酸であって、および／または、連続したアミノ酸残基の初めの残基がプロリンである。
【００４８】
本発明は、ＣＸＣＲ４活性の阻害および／または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造における、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、システインの代わりにｄＣｙｓ（Ｔｒｔ）残基を含む配列番号１６の誘導体、配列番号１７の配列を含む２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１個のアミノ酸残基のペプチドの使用を提供する。
【００４９】
本発明はまた、ＣＸＣＲ４活性の阻害および／または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造における、Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｆ（配列番号１８）のアミノ酸配列であって、Ｘがアルギニンまたはアラニンであるアミノ酸配列を含む４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１個のアミノ酸残基のペプチドの使用を提供する。
【００５０】
本発明のある実施態様では、アミノ酸配列は配列番号１４または配列番号１５からなる。
【００５１】
本発明のさらなる実施態様では、ペプチドは融合ペプチドおよび／またはその塩である。
【００５２】
本発明のある実施態様では、該アミノ酸および／またはペプチドの使用は、ＣＸＣＲ４を発現している癌、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）および／または炎症などの疾患、障害または症状の治療のための医薬の製造のためである。
【００５３】
本発明のさらなる実施態様では、前記疾患は、白血病、眼内悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、多発性骨髄腫、膵臓癌、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、甲状腺癌、直腸癌、口腔扁平上皮癌、子宮頸癌、神経芽腫、神経膠腫、星状細胞腫、横紋筋肉腫、小細胞肺癌および黒色腫などの、ＣＸＣＲ４を発現している癌である。
【００５４】
本発明のさらなる実施態様では、前記癌は、急性リンパ芽球性白血病などの白血病である。
【００５５】
本発明のさらなる実施態様では、前記使用は、転移を治療または予防するための医薬の製造のためである。
【００５６】
本発明のさらなる実施態様では、前記使用は、ＡＩＤＳを治療するための医薬の製造のためである。
【００５７】
本発明のさらなる実施態様では、前記使用が、慢性関節リウマチ、化膿性関節炎、変形性関節症、歯周炎、歯肉炎、喘息、自己免疫疾患、乾癬、乾癬性関節炎、アトピー性皮膚炎、間質性腎炎、眼内炎症、肝硬変、神経炎症性障害、移植片対宿主病および炎症性胃腸症状などの炎症性疾患、障害もしくは症状を治療または予防するためのものである。
【００５８】
ある局面において、本発明は、Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｆ（配列番号１８）のアミノ酸配列であって、Ｘがアルギニンまたはアラニンであるアミノ酸配列を含む４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２個のアミノ酸残基のペプチドを提供する。
【００５９】
本発明のある実施態様では、ペプチドは、配列番号１４または配列番号１５のアミノ酸配列を含む。
【００６０】
本発明はまた、少なくとも１つのアラニンで隔てられた、１つのシステインまたはその誘導体および１つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む３、４、５、６、７または８個の連続したアミノ酸残基を含む３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２個のアミノ酸残基のペプチドを提供する。
【００６１】
本発明のある実施態様では、システインまたはその誘導体およびフェニルアラニンまたはその誘導体は、１つまたは２つのアラニン残基で隔てられている。
【００６２】
本発明のさらなる実施態様では、ペプチドは、少なくとも１つのアラニンで隔てられた、１つのシステインまたはその誘導体および１つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む４個の連続したアミノ酸残基を含む。
【００６３】
本発明のさらなる別の実施態様では、４個の連続したアミノ酸残基の初めのおよび／または最後のアミノ酸残基は、それぞれ、システインまたはその誘導体およびフェニルアラニンまたはその誘導体である。
【００６４】
本発明はまた、ＬＳＹモチーフ（配列番号１９）を含むＳＤＦ−１のアミノ末端由来のペプチドを除く、１つのアルギニンで隔てられた１つのシステインまたはその誘導体および１つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む３、４、５、６または７個の連続したアミノ酸残基を含む２２個までのアミノ酸残基のペプチドを提供する。
【００６５】
本発明のある実施態様では、２２個までのアミノ酸残基のペプチドは、配列番号１２からなる３個の連続したアミノ酸残基を含む。
【００６６】
本発明の別の実施態様では、２２個までのアミノ酸残基のペプチドは、１つのアルギニンで隔てられた、１つのシステインまたはその誘導体および１つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む４個の連続したアミノ酸残基を含む。
【００６７】
本発明のさらなる実施態様では、連続したアミノ酸残基の初めおよび最後のアミノ酸残基は、配列番号１１からなる４個の連続したアミノ酸残基の配列にあるようにそれぞれ、システインまたはその誘導体およびフェニルアラニンまたはその誘導体である。
【００６８】
本発明のさらなる実施態様では、４個の連続したアミノ酸残基の初めの残基は、配列番号１３の配列にあるようにプロリンである。
【００６９】
本発明の別の実施態様では、２２個までのアミノ酸残基のペプチドは、１つのアルギニンで隔てられた、１つのシステインまたはその誘導体および１つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む５個の連続したアミノ酸残基を含む。
【００７０】
本発明のさらなる実施態様では、５個の連続したアミノ酸残基の初めの残基は、配列番号１６、またはシステインの代わりにｄＣｙｓ（Ｔｒｔ）残基を有する配列番号１６の誘導体の配列にあるようにプロリンである。
【００７１】
本発明のさらなる実施態様では、５個の連続したアミノ酸残基の５番目の残基は、配列番号１０の配列にあるようにグルタミン酸である。
【００７２】
本発明のほかの実施態様では、２２個までのアミノ酸残基のペプチドは、１つのアルギニンで隔てられた、１つのシステインまたはその誘導体および１つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む６個の連続したアミノ酸残基を含む。
【００７３】
本発明のさらなる実施態様では、６個の連続したアミノ酸残基の６番目の残基は、グルタミン酸である。
【００７４】
本発明のさらなる実施態様では、６個の連続したアミノ酸残基の初めの残基は、配列番号９の配列にあるようにプロリンである。
【００７５】
本発明はまた、配列番号１５の配列にあるように、２つのアルギニンで隔てられた１つのシステインまたはその誘導体および１つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む４、５、６、７または８個の連続したアミノ酸残基を含む２２個までのアミノ酸残基のペプチドを提供する。
【００７６】
加えて、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、または配列番号７からなる２個の連続したアミノ酸を含む２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２個のアミノ酸残基のペプチドを提供する。
【００７７】
また、本発明は、アミノカプロイック酸に結合した配列番号１、または配列番号８からなる３個の連続したアミノ酸残基を含む３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２個のアミノ酸残基のペプチドを提供する。
【００７８】
本発明は、配列番号５からなる４個の連続したアミノ酸残基を含む４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２個のアミノ酸残基のペプチドを提供する。
【００７９】
本発明は、配列番号１、アミノカプロイック酸に結合した配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、システインの代わりにｄＣｙｓ（Ｔｒｔ）残基を有する配列番号１６の誘導体または配列番号１７のアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。
【００８０】
また、本発明は、ＬＳＹモチーフを含むＳＤＦ−１のアミノ末端由来のペプチドを除く、アミノ酸配列Ｃ−Ｒ−Ｆを含む約３、４、５、６、７、８または９個のアミノ酸残基であるペプチドまたは最後のアミノ酸残基がセリンであるＬＳＹモチーフを欠失している６から９個のアミノ酸残基からなるペプチドを提供する。
【００８１】
本発明によって提供されるペプチドは、環状に置換されたペプチドおよび／または融合ペプチドを含む。
【００８２】
本発明のある実施態様では、融合ペプチドは免疫グロブリンなどのタンパク質に融合されたペプチドである。
【００８３】
本発明のある実施態様では、融合ペプチドはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの高分子ポリマーに融合されたペプチドである。
【００８４】
加えて、本発明は、本発明によって提供されるペプチドの塩も包含する。
【００８５】
さらなる局面では、本発明は、本発明によって提供されるペプチドをコードする単離されたＤＮＡ、該ＤＮＡを含む発現ベクター、該ＤＮＡおよび／または発現ベクターを含有する宿主細胞、および宿主細胞を培養することおよび産生されたタンパク質を単離することを含む該ペプチドの製造方法に関する。
【００８６】
本発明のある実施態様では、宿主細胞は、ＨｅＬａ、２９３Ｔ  ＨＥＫおよびＣＨＯなどの哺乳類細胞、昆虫細胞、またはイースト菌といった真核細胞である。
【００８７】
本発明のある実施態様では、宿主細胞は、原核細胞である。
【００８８】
さらなる局面では、本発明は、ＣＸＣＲ４を発現している癌、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、炎症および転移から選択される疾患、障害もしくは症状の治療または予防のための医薬の製造における、本発明によって提供されるペプチドまたはその塩の使用に関する。
【００８９】
さらなる別の局面では、本発明は、薬学的に許容され得る担体および本発明によって提供されるペプチドまたはその塩を含む医薬組成物に関する。
【００９０】
さらなる別の局面では、本発明は、薬学的に許容され得る担体ならびにＬＳＹモチーフを含むＳＤＦ−１のアミノ末端由来のペプチドを除く、１つのアルギニンで隔てられた、１つのシステインまたはその誘導体および１つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む約３、４、５、６または７個の連続したアミノ酸残基を含む３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２個のアミノ酸残基のペプチドに関する。
【００９１】
さらなる別の局面では、本発明は、本発明のＤＮＡおよび薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物に関する。
【００９２】
さらなる別の局面では、本発明は、本発明のベクターおよび薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物に関する。
【００９３】
さらなる別の局面では、本発明は、薬学的に許容され得る担体ならびにフェニルアラニンまたはその誘導体およびシステインまたはその誘導体からなるアミノ酸の混合物を含む医薬組成物に関する。
【００９４】
さらなる別の局面では、本発明は、必要とする対象における、ＣＸＣＲ４活性の阻害および／または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状の治療または予防方法であって、該方法が、対象に、治療上有効量の、フェニルアラニンまたはその誘導体であるアミノ酸；システインまたはその誘導体であるアミノ酸；フェニルアラニンまたはその誘導体およびシステインまたはその誘導体を含むアミノ酸の組み合わせ；少なくとも１つのフェニルアラニンもしくはその誘導体、少なくとも１つのシステインもしくはその誘導体、または少なくとも１つのフェニルアラニンもしくはその誘導体および少なくとも１つのシステインもしくはその誘導体を含む２２個までのアミノ酸残基を含むペプチド（ＬＳＹモチーフを含むＳＤＦ−１のアミノ末端由来のペプチドを除く）を投与することを含む方法に関する。
【００９５】
さらなる別の局面では、本発明は、ＣＸＣＲ４活性が病状または経過に関与している疾患、障害もしくは症状の治療または予防方法であって、該方法を必要とする対象に、治療上有効量の、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、システインの代わりにｄＣｙｓ（Ｔｒｔ）残基を含む配列番号１６の誘導体、配列番号１７またはそれらの組み合わせで示される配列を含むペプチドを投与することを含む方法に関する。
【００９６】
さらなる別の局面では、本発明は、ＣＸＣＲ４活性が病状または経過に関与している疾患、障害もしくは症状の治療または予防方法であって、該方法を必要とする対象に、治療上有効量の、配列番号１、アミノカプロイック酸に結合した配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８またはそれらの組み合わせで示される配列を含むペプチドを投与することを含む方法に関する。
【００９７】
さらなる別の局面では、本発明は、ＣＸＣＲ４を発現している癌、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、炎症および転移から選択される疾患、障害もしくは症状の治療または予防方法であって、該方法を必要とする対象に、治療上有効量の、本発明によって提供されるペプチドを投与することを含む方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９８】
本発明は、ＣＸＣＲ４活性の阻害および／または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造における、フェニルアラニンまたはその誘導体のアミノ酸；システインまたはその誘導体のアミノ酸；フェニルアラニンまたはその誘導体およびシステインまたはその誘導体を含むアミノ酸の組み合わせ；少なくとも１つのフェニルアラニンもしくはその誘導体、少なくとも１つのシステインもしくはその誘導体、または少なくとも１つのフェニルアラニンもしくはその誘導体および少なくとも１つのシステインもしくはその誘導体を含む２２個までのアミノ酸残基を含むペプチドの使用に関する。
【００９９】
システインまたはその誘導体のアミノ酸、フェニルアラニンまたはその誘導体のアミノ酸、例えば、自然界ではフェニルアラニンアミノ酸から酵素的脱炭酸反応によって合成されるβ−フェニルエチルアミン、溶解性が改良されたフェニルアラニン誘導体、例えばフェニルアラニノール（Ｐｈｅ−ｏｌ）、サクシニルフェニルアラニン（Ｓｕｃ−Ｐｈｅ）、システインエチルエステル、システインスルフィン酸、システインアミン；およびシステイン、フェニルアラニンまたは両方のアミノ酸の組み合わせを含む短鎖ペプチドといった薬剤が、細胞遊走および／または細胞でのＣＸＣＲ４発現またはその両方を阻害することができるという、本発明による発見は、病状が、細胞の運動性の阻害および／または細胞中でのＣＸＣＲ４発現のレベルおよび／または活性の阻害によって改善、緩和もしくは予防され得るようなＣＸＣＲ４活性の阻害および／または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害または症状のための新しい治療法への道を開くものである。
【０１００】
実際、本発明によって得られた結果は、上記の薬剤（本明細書において「本発明の薬剤」または「本発明による薬剤」という）が、ＣＸＣＲ４活性または応答性をその機序にとらわれることなく、例えば細胞中のＣＸＣＲ４の発現レベルを減少させることによって減少させるために用いられ得ること、および／または細胞の運動性を阻害するために用いられ得ることを明らかにしている。したがって、これらの薬剤は、病状が細胞中のＣＸＣＲ４を介する活性またはシグナル伝達および／または細胞の運動性によって引き起こされるかまたは関連する疾患、障害もしくは症状を治療または予防するために用いられ得る。病状が細胞中のＣＸＣＲ４のレベルおよび／または細胞の運動性によって引き起こされるかまたは関連する疾患、障害もしくは症状は、ＣＸＣＲ４活性の阻害および／または細胞の運動性の阻害に反応し、かつＣＸＣＲ４活性および／または運動性の阻害によって予防または改善され得る疾患、障害もしくは症状である。ＣＸＣＲ４活性の阻害という用語は、例えば、活性の阻害またはＣＸＣＲ４の発現のレベルの阻害を示している。
【０１０１】
本発明によって、システインまたはその誘導体；フェニルアラニンまたはβ−フェニルエチルアミンなどのその誘導体；およびフェニルアラニンを含むペプチドといった本発明の薬剤が、トランスウェルアッセイ（transwell assay）によってインビトロで測定した場合、前駆−Ｂ  ＡＬＬ（Ｐｒｅ−ＢＬＬ）細胞の自発運動性、ならびにＳＤＦ−１依存性の運動性を阻害することが発見された。Ｐｒｅ−ＢＬＬは、最も発症率の高い小児悪性腫瘍であり、二番目に発生率の高い成人の急性白血病である。実際、ＤおよびＬフェニルアラニンの遊走阻害の効果は類似しており、それゆえ、遊走阻害の効果はアミノ酸の立体異性構造には依存しないことが判明している。特に、本発明による発見は、Ｐｈｅ−ｏｌがインビボにおいてＰｒｅ−ＢＬＬ細胞の循環系から骨髄、脾臓、肺および肝臓への遊走（またはホーミング）を阻害することを示している。
【０１０２】
本発明による薬剤の阻害効果はまた、正常な非新生細胞においても検知された。例えば、本発明によって、造血細胞、ＣＤ３４＋細胞などの正常細胞の運動性は、Ｐｈｅ−ｏｌによって阻害され、正常な初代Ｔ細胞の運動性は、フェニルアラニンを含む短鎖ペプチドまたはフェニルアラニンおよびシステインを含む短鎖ペプチドによって阻害されることが示された。
【０１０３】
本発明による発見は、本発明の薬剤が、ＳＤＦ−１およびそのレセプターであるＣＸＣＲ４によって媒介される活性を阻害できることを示している。例えば、本発明によって、システインまたはフェニルアラニンのアミノ酸；およびフェニルアラニノール（Ｐｈｅ−ｏｌ）、サクシニルフェニルアラニン（Ｓｕｃ−Ｐｈｅ）、システインエチルエステル、システインスルフィン酸、システインアミン、β−フェニルエチルアミンなどの該アミノ酸の誘導体；およびシステインおよび／またはフェニルアラニンのアミノ酸を含む短鎖ペプチドが、細胞のＳＤＦ−１依存性の運動性を阻害できることが見出された。また、本発明によって、Ｐｈｅ−ｏｌが、ＳＤＦ−１活性に依存性であることが知られている過程である、Ｐｒｅ−ＢＬＬ細胞の骨髄へのホーミングの阻害；ＳＤＦ−１依存性のＣａ＋インフラックスの阻害；およびＳＤＦ−１産生細胞へのＣＤ３４＋細胞の接着の阻害を媒介し得ることが示された。Ｐｈｅ−ｏｌで処理された細胞中でのＣＸＣＲ４の発現のレベルは、本発明によって試験され、その結果Ｐｈｅ−ｏｌが、Ｐｒｅ  ＢＬＬ細胞などの新生細胞中ならびに初代Ｔ細胞およびＣＤ３４＋細胞などの正常細胞中でのＣＸＣＲ４発現を阻害することが発見された。
【０１０４】
本発明は、ＣＸＣＲ４活性の阻害および／または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造における、フェニルアラニンまたは、例えば、フェニルアラニノール（Ｐｈｅ−ｏｌ）もしくはサクシニルフェニルアラニン（Ｓｕｃ−Ｐｈｅ）などの溶解性が改良された誘導体のようなその誘導体のアミノ酸、またはフェニルエチルアミドのようなフェニルアラニンアミノ酸から合成される誘導体；システインエチルエステル、システインスルフィン酸およびシステインアミンのようなシステインまたはその誘導体のアミノ酸；またはフェニルアラニンもしくはその誘導体およびシステインもしくはその誘導体を含むアミノ酸の混合物の使用を提供する。
【０１０５】
ここで使用される「アミノ酸」という用語は、他で特定されない限り、１つのアミノ酸もしくはその誘導体、または２つもしくはそれ以上のアミノ酸の混合物を意味し、タンパク質中で見出される全ての自然に存在するアミノ酸および非天然アミノ酸を含む。非天然アミノ酸の例として、４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリジン、およびＮ−メチルリジン、γ―カルボキシグルタメート、デスモシン、セレノシステイン、シトルリンおよびオルニチンなどのＮ−メチルアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【０１０６】
アミノ酸の誘導体は、通常はアミノ酸の一部にはない付加的な化学部位を含むアミノ酸残基であってもよく、ＣＸＣＲ４発現もしくは活性の阻害剤としてならびに／または自発的なおよび／もしくはＳＤＦ−１によって介される細胞遊走の阻害剤として、その使用が認められるアミノ酸の機能の少なくとも一部を保持している限りにおいて、本発明に包含される。この用語は、アミノ酸のＯＨ、ＳＨ（システイン中に存在する）またはカルボキシ基のエステル；ＯＨおよびＳＨのエーテル；アミド；アミノ基における置換などを含むが、これらに限定はされない。β−フェニルエチルアミンはフェニルアミンの誘導体である。自然界では、フェニルアラニンアミノ酸から酵素的脱炭酸反応によって合成される。
【０１０７】
アミノ酸は、１または複数の立体異性体として存在していてもよく、非対称的な原子または回転の制限の存在のために、それぞれのキラル中心でＲもしくはＳの立体化学を有する多数の立体異性体として、またはそれぞれのキラル軸においてＲもしくはＳの立体化学を有するアトロプ異性体として存在し得る。本発明は、全てのこれらの鏡像異性体およびジアステレオマーならびにそれらの混合物の使用を包含する。
【０１０８】
フェニルアラニンおよび／またはシステインアミノ酸および／または、フェニルアラニノール、サクシニルフェニルアラニン、β−フェニルエチルアミン、システインエチルエステル、システインスルフィン酸、およびシステインアミンなどのそれらの誘導体は、本発明によって、メチオニン、プロリン、バリン、グルタミン酸および／またはそれらの組み合わせなどの追加のアミノ酸と共に、投与または使用され得る。
【０１０９】
本発明のある実施態様では、アミノ酸は、フェニルアラニン、フェニルアラニノール、サクシニルフェニルアラニンもしくはフェニルアラニンおよびシステイン、システインエチルエステル、システインスルフィン酸、もしくはシステインアミンの組み合わせまたは混合物を含む。
【０１１０】
本発明によって、フェニルアラニンおよび／またはシステインを含む２、３、４、５、または６個のアミノ酸残基である短鎖の合成ペプチドが、細胞遊走を阻害することが見出された。このようなペプチドの、自発的および／またはＳＤＦ−１依存性の遊走に対する阻害効果は、正常な成熟Ｔ細胞を用いた場合と同様に白血病細胞（Ｇ２）を用いて行われたインビトロでのアッセイでも検知された。
【０１１１】
本発明によって、Ｆ−Ｋ（配列番号１）のようなペプチドを含むフェニルアラニン、配列番号１であるが、Ｆ−Ｋ−ε―アミノカプロイック酸のようにアミノカプロイック酸に結合しているようなペプチド、Ｋ−Ｆ（配列番号２）、Ｆ−Ｒ（配列番号３）、Ｒ−Ｆ（配列番号４）、Ｋ−Ｆ−Ｋ−Ｆ（配列番号５）、Ｆ−Ｅ（配列番号６）、Ｅ−Ｆ（配列番号７）、およびＦ−Ｌ−Ｋ（配列番号８）；またはグルタチオンのようなペプチドを含むシステインが、Ｐｒｅ−ＢＬＬ細胞の自発的な遊走を阻害することが見出された。Ｆ−Ｋ、Ｋ−Ｆ、Ｆ−Ｒ、Ｒ−ＦおよびＦ−Ｅが約５０％の細胞遊走を阻害することができ、Ｆ−Ｌ−ＫおよびＦ−Ｋ−ε―アミノカプロイック酸が約３０％の細胞遊走を阻害できることが判明した。
【０１１２】
本発明は、少なくとも１つのフェニルアラニンもしくはその誘導体を含む、または少なくとも１つのフェニルアラニンもしくはその誘導体を含む２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１個のアミノ酸残基である短鎖ペプチドを含む約２２個のアミノ酸である短鎖ペプチドの使用を提供する。短鎖ペプチドは、少なくとも１つのフェニルアラニンおよび少なくとも１つの荷電性アミノ酸であってフェニルアラニンでない残基を含む２、３、４、５または６個の連続したアミノ酸残基を含んでもよい。荷電性アミノ酸は、リジンもしくはアルギニンといった正電荷をもつアミノ酸であってもよく、またはグルタミン酸のような負電荷をもつアミノ酸であってもよい。これらペプチドの非限定的な例としては、Ｆ−Ｋ、Ｋ−Ｆ、Ｆ−Ｒ、Ｒ−Ｆ、Ｋ−Ｆ−Ｋ−Ｆ、Ｆ−Ｌ−Ｋ、Ｆ−Ｋ−ε―アミノカプロイック酸、Ｆ−Ｅ、およびＥ−Ｆまたはそれらの塩で表されるアミノ酸配列の１つを含む２２個までのアミノ酸残基の短鎖ペプチドである。これらの配列のＮ−末端またはＣ−末端の片方または両方に付加的なアミノ酸が含まれることは可能であり、もちろん、これらの付加的なアミノ酸残基はペプチドの機能活性を顕著に妨げるものであってはならない。
【０１１３】
本発明はまた、少なくとも１つのシステインもしくはその誘導体を含む２２個までのアミノ酸である短鎖ペプチド、例えば、少なくとも１つのシステインを含む２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１個のアミノ酸残基のペプチド、例えば、少なくとも１つのシステインならびにプロリン、アルギニンおよびグルタミン酸から選択される少なくとも１つのシステインでない残基を含む２、３、４、５または６個の連続したアミノ酸であるペプチドの使用に関する。本発明のある実施態様では、このようなペプチドはグルタチオンである。
【０１１４】
本発明によれば、例えば、Ｐ−Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆ−Ｅ（配列番号９）；Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆ−Ｅ（配列番号１０）；Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆ（配列番号１１）；Ｃ−Ｒ−Ｆ（配列番号１２）；Ｐ−Ｃ−Ｒ−Ｆ（配列番号１３）；Ｃ−Ａ−Ａ−Ｆ（配列番号１４）；Ｃ−Ｒ−Ｒ−Ｆ（配列番号１５）およびＰ−Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆ（配列番号１６）の誘導体、Ｐ−ｄＣｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｒ−Ｆ−Ｆなどのフェニルアラニンおよびシステインを含む短鎖ペプチドは、インビトロでのトランスウェルアッセイによって測定されるように、ＳＤＦ−１によって介されるＴ細胞遊走の非常に有力な阻害剤であることが見出された。
【０１１５】
これらは、Ｃ−Ｐ−Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆ−Ｅ（配列番号１７）であるシステインおよびフェニルアラニン残基を有する（ＳＤＦ−１のアミノ酸９〜１５）ＳＤＦ−１分子のＮ−末端配列に基づいた、合成の小さなペプチドである。配列番号９のペプチド、Ｐ−Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆ−Ｅは、１つのプロリン残基を位置１に、１つのシステイン残基を位置２に、２つのフェニルアラニンを位置４および５に含み、システインおよびフェニルアラニンがアルギニンで隔てられ、かつ最後の残基がグルタミン酸であるＳＤＦ−１のＮ−末端配列からの６個のペプチドである。配列番号１０のペプチド、Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆ−Ｅは、プロリンが欠失している以外は配列番号９のペプチドと同様であり、その結果、システインが位置１にある５個のペプチドである。配列番号１１のペプチド、Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆは、グルタミン酸が欠失している以外は配列番号１０のペプチドと同様であり、その結果、同じようにシステインが位置１にあり、最後の残基がフェニルアラニンであり、かつ全部で２つのフェニルアラニンを有する４個のペプチドである。配列番号１２のペプチド、Ｃ−Ｒ−Ｆは、最後のアミノ酸のフェニルアラニンが欠失している以外は配列番号１１のペプチドと同様であり、その結果、システインが位置１にあり、ただ１つのフェニルアラニン残基を位置３に有し、かつシステインおよびフェニルアラニンが１つのアルギニンで隔てられている４個のペプチドである。配列番号１３のペプチド、Ｐ−Ｃ−Ｒ−Ｆは、１つのフェニルアラニン残基および１つのグルタミン酸残基がそれぞれ位置５および６にて欠失している以外は配列番号９のペプチドと同様であり、その結果、プロリンが位置１にあり、かつシステインが位置２にあり、かつただ１つのフェニルアラニンを有する４個のペプチドである。配列番号１４のペプチド、Ｃ−Ａ−Ａ−Ｆは、配列番号１１のペプチドのような４個のペプチドであり、位置２のアルギニンおよび位置３のフェニルアラニンがアラニンによって置換されており、その結果、システインが位置１にあり、かつただ１つのフェニルアラニンを位置４に有するペプチドである。配列番号１５のペプチド、Ｃ−Ｒ−Ｒ−Ｆは、配列番号１１のペプチドのような４個のペプチドであり、位置３のフェニルアラニンがアルギニンによって置換されており、その結果、システインが位置１にあり、かつただ１つのフェニルアラニンを位置４に有するペプチドである。ペプチド、Ｐ−ｄＣｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｒ−Ｆ−ＦはペプチドＰ−Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆ（配列番号１６）の誘導体であり、システイン残基がシステイン誘導体ｄＣｙｓ（Ｔｒｔ）に置換されている。配列番号１６のペプチドは、システイン残基がｄＣｙｓ（Ｔｒｔ）に置換されており、かつグルタミン酸が欠失している以外は配列番号９のペプチドと同様である。Ｔｒｔはトリチルであって、システインのＳＨ官能部位のための保護基である。Ｆｍｏｃ−ＣＹＳ（Ｔｒｔ）が、ペプチド鎖の組み立てのためのビルディングブロックとして使用された。本発明によって、細胞にとって有毒ではないような濃度で使用されるこれらのペプチドが、ＳＤＦ−１によって介されるＴ細胞遊走に対する非常に有用な阻害剤（５０〜９０％の阻害の幅で）あることが見出された。これらのペプチドは、自発的な遊走も同様に阻害することができたが、より少ない程度であった。
【０１１６】
１０個のアミノ酸であるＳＤＦ−１のアミノ末端からのペプチドまたはより大きいＬＳＹモチーフを含むペプチドは、Ｈｅｖｅｋｅｒら(1998, 2001)、Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒら(1998)およびＬｕｏら(1999)によって、開示されている。留意すべきは、全ての開示された活性なペプチドはＬＳＹモチーフを含むことである。Ｈｅｖｅｋｅｒら(2001)によって開示されたように、ペプチドは多形核白血球（ＰＭＮ）に対して化学走性の効果を表すが、それらのどれ１つとして、これらの細胞内でＳＤＦ−１によって誘導される化学走性を阻害できるものはなかった。同じ発明者らは、それ以前の論文で、ＬＳＹモチーフ（配列番号１９）はＨＩＶ阻害にとって不可欠であることを示している(Heveker 1998)。
【０１１７】
報告されたペプチドとは異なり、ＳＤＦ−１のアミノ末端由来のシステインおよびフェニルアラニンを含む本発明によるペプチドは、ＬＳＹモチーフを欠失しており、かつＳＤＦ−１によって誘導される化学走性を阻害することができる。ＨＩＶの複製には、ＳＤＦ−１の化学走性の活性と同様に、ＣＸＣＲ４が関連しているので、本発明のこれらのペプチドは、ＨＩＶウイルスをもまた阻害することが可能であると思われる。
【０１１８】
これゆえ、別の局面では、本発明は、ＣＸＣＲ４活性の阻害および／または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造における、ＬＳＹモチーフを含むＳＤＦ−１のアミノ末端由来のペプチドを除く、少なくとも１つのフェニルアラニンまたはその誘導体および少なくとも１つのシステインまたはその誘導体を含む２２個までのアミノ酸残基のペプチドの使用に関する。
【０１１９】
ペプチドは、少なくとも１つのシステインまたはその誘導体および少なくとも１つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む２、３、４、５、６または７個の連続したアミノ酸残基を含む２２個までのアミノ酸残基のペプチドのような、少なくとも１つのフェニルアラニンまたはその誘導体および少なくとも１つのシステインまたはその誘導体を含む２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０および２１個のアミノ酸残基からなることができる。本発明のある実施態様では、ペプチドは、Ｐ−Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆ−Ｅ（配列番号９）、Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆ−Ｅ（配列番号１０）、Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆ（配列番号１１）、Ｃ−Ｒ−Ｆ（配列番号１２）、Ｐ−Ｃ−Ｒ−Ｆ（配列番号１３）、Ｃ−Ｒ−Ｒ−Ｆ（配列番号１５）、Ｐ−ｄＣｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｒ−Ｆ−Ｆ（配列番号１６）のような、１または複数のアルギニンで隔てられた、１つのシステインまたはその誘導体および１つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む３、４、５、６または７個の連続したアミノ酸残基からなる。本発明の別の実施態様では、ペプチドは、ペプチドＣ−Ａ−Ａ−Ｆのように、１または複数のアラニンで隔てられた、１つのシステインまたはその誘導体および１つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む３、４、５、６または７個の連続したアミノ酸残基を含む。本発明の別の実施態様では、ペプチドは、ペプチドＣ−Ａ−Ａ−Ｆ（配列番号１４）、Ｃ−Ｒ−Ｒ−Ｆ（配列番号１５）およびＣ−Ｒ−Ｆ−Ｆ（配列番号１１）のように、４個の連続したアミノ酸残基であって、連続したアミノ酸残基の初めの残基がシステインまたはその誘導体でありかつ４番目の残基がフェニルアラニンまたはその誘導体であるアミノ酸残基を含む。
【０１２０】
本発明のある実施態様では、ペプチドは、少なくとも１つのシステインまたはその誘導体および少なくとも１つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む４または５個の連続したアミノ酸残基であって、例えば、それぞれＰ−Ｃ−Ｒ−Ｆ（配列番号１３）およびＰ−ｄＣｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｒ−Ｆ−Ｆ（配列番号１６）のように、連続したアミノ酸残基の初めの残基がプロリンであるアミノ酸残基を含む。
【０１２１】
本発明の別の実施態様では、ペプチドは、少なくとも１つのシステインまたはその誘導体および少なくとも１つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む５、６または７個の連続したアミノ酸残基であって、それぞれＣ−Ｒ−Ｆ−Ｆ−Ｅ（配列番号１０）、Ｐ−Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆ−Ｅ（配列番号９）およびＣ−Ｐ−Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆ−Ｅ（配列番号１７）のように、連続したアミノ酸残基の最後の残基がグルタミン酸であるアミノ酸残基を含む。
【０１２２】
本発明の更なる実施態様は、初めのアミノ酸がプロリンであり、および／または最後のアミノ酸がグルタミン酸である場合、ならびに少なくとも１つのシステインまたはその誘導体および少なくとも１つのフェニルアラニンまたはその誘導体が、アルギニンまたはアラニン残基のような、システインまたはフェニルアラニンとは異なる、１または２個のアミノ酸残基で隔てられている場合の、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０および２１個の連続したアミノ酸残基を含む２２個までのアミノ酸残基のペプチドに関する。
【０１２３】
本発明によって使用可能である典型的なペプチドは、Ｆ−Ｋ、Ｋ−Ｆ、Ｆ−Ｒ、Ｒ−Ｆ、Ｋ−Ｆ−Ｋ−Ｆ、Ｆ−Ｅ、Ｅ−Ｆ、Ｆ−Ｌ−Ｋ、Ｆ−Ｌ−ε―アミノカプロイック酸およびグルタチオン、ならびに、Ｃ−Ｐ−Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆ−Ｅ；Ｐ−Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆ−Ｅ；Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆ−Ｅ；Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆ；Ｃ−Ｒ−Ｆ；Ｐ−Ｃ−Ｒ−Ｆ；Ｃ−Ａ−Ａ−Ｆ；Ｃ−Ｒ−Ｒ−ＦおよびＰ−ｄＣｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｒ−Ｆ−Ｆ、それらの塩、機能性誘導体、その活性な変異体、すなわち、フェニルアラニンおよびシステインを含むその他のペプチドであって、構造中の１または複数のアミノ酸が欠失しているかもしくは他のアミノ酸で置換されている、または１または複数のアミノ酸が、細胞の運動性および／またはＣＸＣＲ４活性を阻害するような同じ活性を有する２２個までのアミノ酸残基のペプチドを得るためにその配列に付加されている、フェニルアラニンおよびシステインの両方のタイプのアミノ酸を含むペプチドを含むが、これらに限定はされない。
【０１２４】
ペプチドは、体液中で、より長い半減期を有する「融合ペプチド」を結果として生じるような、タンパク質または高分子ポリマーなどの半減期を延長させるための部位を含んでもよい。例えば、本発明のペプチドは、例えば免疫グロブリンといったタンパク質に、また、例えばポリエチレングライコール（ＰＥＧ）といった高分子ポリマーなどに、融合され得る。
【０１２５】
本発明のペプチドが、Ｔ細胞遊走の非常に有用な阻害剤であることが見出されたので、それらは、病状がＴ細胞補充を含んでいる疾患、障害もしくは症状における医薬品として使用され得る。したがって、これらのペプチドによるＴ細胞補充の阻害は、該疾患、障害もしくは症状の病状の予防または改善に有益であり得る。病状がＴ細胞補充を含んでいる疾患、障害または症状の例としては、自己免疫疾患および炎症が挙げられる。
【０１２６】
別の局面として、本発明は、例えば、Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｆ（配列番号１８）のアミノ酸配列であって、Ｘがアルギニンもしくはアラニンであるアミノ酸配列を含む４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１個のアミノ酸残基のペプチドを提供する。本発明のある実施態様では、ペプチドは、配列番号１４または配列番号１５のアミノ酸配列を含む。
【０１２７】
また、本発明は、少なくとも１つのアラニンで隔てられた、１つのシステインもしくはその誘導体および１つのフェニルアラニンもしくはその誘導体を含む３、４、５、６、７または８個の連続したアミノ酸残基を含む３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２個のアミノ酸残基のペプチドを提供する。
【０１２８】
本発明のある実施態様では、ペプチドは、１つまたは２つのアラニン残基で隔てられた、１つのシステインまたはその誘導体および１つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む。
【０１２９】
本発明はまた、４個の連続したアミノ酸残基を含む３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２個のアミノ酸残基のペプチドであって、連続したアミノ酸残基の初めと最後のアミノ酸残基が、それぞれ、システインまたはその誘導体およびフェニルアラニンまたはその誘導体であるペプチドに関する。
【０１３０】
本発明はまた、ＬＳＹモチーフを含むＳＤＦ−１のアミノ末端由来のペプチド、および最後の残基としてセリンを有するＬＳＹモチーフを除外している６、７、８、９、１０または１１個のアミノ酸残基からなるペプチドを除く、１つのアルギニンで隔てられた１つのシステインまたはその誘導体および１つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む３、４、５、６または７個の連続したアミノ酸残基を含む２２個までのアミノ酸残基のペプチドを提供する。
【０１３１】
本発明のある実施態様では、ペプチドは、配列番号１２の３個の連続したアミノ酸を含む。
【０１３２】
本発明の別の実施態様では、２２個までのアミノ酸残基のペプチドは、連続したアミノ酸残基の最初と最後のアミノ酸残基が、配列番号１１のように、それぞれ、システインまたはその誘導体およびフェニルアラニンまたはその誘導体である４個の連続したアミノ酸残基を含む。
【０１３３】
本発明の別の実施態様では、２２個までのアミノ酸残基のペプチドは、連続したアミノ酸残基の最初のアミノ酸残基が、配列番号１３のように、プロリンである４個の連続したアミノ酸残基を含む。
【０１３４】
本発明の別の実施態様では、２２個までのアミノ酸残基のペプチドは、連続したアミノ酸残基の最初のアミノ酸残基が、配列番号１６、またはシステインの代わりにｄＣｙｓ（Ｔｒｔ）残基を有する配列番号１６の誘導体のように、プロリンである５個の連続したアミノ酸残基を含む。
【０１３５】
本発明の別の実施態様では、２２個までのアミノ酸残基のペプチドは、連続したアミノ酸残基の５番目の残基が、配列番号１０のように、グルタミン酸である５個の連続したアミノ酸残基を含む。
【０１３６】
本発明の別の実施態様では、２２個までのアミノ酸残基のペプチドは、配列番号９のように、連続したアミノ酸残基の６番目の残基がグルタミン酸であり、および／または連続したアミノ酸残基の初めの残基がプロリンである６個の連続したアミノ酸残基を含む。
【０１３７】
本発明の別の実施態様では、２２個までのアミノ酸残基のペプチドは、Ｃ−Ｐ−Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆ−Ｅ（配列番号１７）のように、連続したアミノ酸残基の７番目の残基がグルタミン酸であり、および／または連続したアミノ酸残基の初めの残基がシステインである７個の連続したアミノ酸残基を含む。
【０１３８】
加えて、本発明は、配列番号１５のように、２つのアラニンで隔てられた、１つのシステインまたはその誘導体および１つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む３、４、５、６、７または８個の連続したアミノ酸残基を含む２２個までのアミノ酸残基のペプチドを提供する。
【０１３９】
本発明によってまた、ＬＳＹモチーフ（配列番号１９）を含むＳＤＦ−１のアミノ末端由来のペプチドを除く、Ｃ−Ｒ−Ｆ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含む３、４、５、６、７、８または９個のアミノ酸残基のペプチドが提供される。
【０１４０】
本発明はまた、Ｆ−Ｋ、Ｋ−Ｆ、Ｆ−Ｒ、Ｒ−Ｆ、Ｆ−ＥもしくはＥ−Ｆからなる２個の連続したアミノ酸；Ｆ−Ｌ−ＫもしくはＦ−Ｋ−ε―アミノカプロイック酸からなる３個の連続したアミノ酸；またはＫ−Ｆ−Ｋ−Ｆからなる４個の連続したアミノ酸を含む約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２個のアミノ酸であるペプチドを提供する。
【０１４１】
加えて、本発明は、Ｆ−Ｋ、Ｋ−Ｆ、Ｆ−Ｒ、Ｒ−Ｆ、Ｋ−Ｆ−Ｋ−Ｆ、Ｆ−Ｌ−Ｋ、Ｆ−Ｋ−ε―アミノカプロイック酸、Ｆ−Ｅ、Ｅ−Ｆ、Ｐ−Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆ−Ｅ、Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆ−Ｅ、Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆ、Ｃ−Ｒ−Ｆ、Ｐ−Ｃ−Ｒ−Ｆ、Ｃ−Ａ−Ａ−Ｆ、Ｃ−Ｒ−Ｒ−ＦまたはＰ−ｄＣｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｒ−Ｆ−Ｆであるアミノ酸配列を含む１２個までのアミノ酸であるペプチドを提供する。
【０１４２】
本発明のある実施態様では、ペプチドは、Ｆ−Ｋ、Ｋ−Ｆ、Ｆ−Ｒ、Ｒ−Ｆ、Ｋ−Ｆ−Ｋ−Ｆ、Ｆ−Ｌ−Ｋ、Ｆ−Ｋ−ε―アミノカプロイック酸、Ｆ−Ｅ、Ｅ−Ｆ、Ｐ−Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆ−Ｅ、Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆ−Ｅ、Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆ、Ｃ−Ｒ−Ｆ、Ｐ−Ｃ−Ｒ−Ｆ、Ｃ−Ａ−Ａ−Ｆ、Ｃ−Ｒ−Ｒ−Ｆ、Ｐ−Ｃ−Ｒ−Ｆ−ＦまたはＰ−ｄＣｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｒ−Ｆ−Ｆからなる。付加的なアミノ酸が、これらの配列のＮ−もしくはＣ−末端の片方または両方に含まれ得るが、もちろん、これらの付加的なアミノ酸残基はペプチドの機能活性を顕著に妨げるものであってはならない。
【０１４３】
本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、アミノカプロイック酸に結合した配列番号１、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、システインの代わりにｄＣｙｓ（Ｔｒｔ）残基を有する配列番号１６の誘導体または配列番号１７（Ｃ−Ｐ−Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆ−Ｅ）、それらの誘導体、またはそれらの組み合わせであるアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。
【０１４４】
Ｋ−Ｆ−Ｋ−Ｆは、２つのＫ−Ｆペプチドを含むデュアルペプチドであって、Ｋ−Ｆペプチドもまた阻害活性を有しそれゆえ別の実施態様である；本発明は、多くの本発明と同じまたは異なるペプチドを含む複合的なペプチドを提供する。
【０１４５】
本発明のペプチドは、例えば、ペプチド合成で従来用いられているアミノ末端のための様々な保護基とカップリングさせることによって、末端のアミノ基において「保護される」ことが可能である。例えば、適切な基として、フォルミル、アセチル、およびベンゾイルなどのアシル保護基；例えば、ベンジロキシカルボニル基などの環状ウレタン保護基；ならびに例えば、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基などの脂肪族ウレタン保護基を含む。
【０１４６】
本発明のペプチドは、例えば、カルボキシル末端のための様々な保護基とカップリングさせることによって、末端のカルボキシル基において「保護される」ことが可能である。例えば、適切な保護基は、エステルまたはエーテル結合を介して末端のカルボキシル基と結合される、ｔｅｒｔ−ブチル基またはベンジル基を含む。
【０１４７】
ペプチドという用語は、アミノ酸および／またはアミノ酸誘導体の鎖に関する。本発明のペプチドの誘導体は、付加的な化学部位をペプチドの一部分として含んでもよい。このような化学部位の例は、ペプチドのＣ−末端におけるカルボキシル基のアミドおよびアスパラギン酸またはグルタミン酸残基の遊離型カルボキシル基のアミドである。もちろん、本発明によって包含されるこれらの誘導体は、本発明のペプチドと実質的に同様な活性をもたねばならない。
【０１４８】
ペプチドは、Ｄおよび／またはＬアミノ酸を含んでもよい。１または複数のＤアミノ酸残基を含むペプチドを用いることの利点は、これらのペプチドが、タンパク質分解に対し、より抵抗性があるかもしれないことであり、したがって、血漿などの生物学的液体中においてより長い半減期を有するかもしれないことである。
【０１４９】
本発明のある実施態様では、ペプチドは、短鎖ペプチドであり、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１もしくは２２個までのアミノ酸残基から、１０個までのアミノ酸残基から、または２、３、４、５、６、７、８もしくは９個のアミノ酸残基からなる。
【０１５０】
本発明はまた、円順列転換されたペプチドである本発明のペプチドを包含する。ここで使用されている「円順列転換された」という用語は、直鎖のペプチドを、直接的にまたはリンカーを介してのどちらかの方法で、環状ペプチドを作製するために末端が互いに接合し、その後、その環状ペプチドを、最初のペプチドにおける末端とは異なる末端を有する新規の直鎖のペプチドを作製するために別の位置で開環した、直鎖のペプチドを意味する。円順列転換は、環化されその後開環されたペプチドに、構造が等しいペプチドを含む。したがって、円順列転換されたペプチドは、直鎖のペプチドとしてデノボで合成されてもよく、かつ、環化および開環の段階を経ないかもしれない。ペプチドの特異的な円順列転換は、その間のペプチド結合が欠失されるアミノ酸残基を含んだひとくくりによって指定される。円順列転換されたペプチドは、単鎖のペプチドであり、通常の両末端は融合されており、しばしば融合にはリンカーが用いられ、そして、別の位置に新たな末端を含んでいる。ここに、参考文献として組み込まれる、ＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇらのJ. Mol. Biol., 165: 407-413 (1983)およびＰａｎらのGene 125: 111-114 (1993)を参照。円順列転換は、直鎖ペプチドを用いて、両端を融合して環状ペプチドを作製し、そして新規の異なる両末端を有する直鎖ペプチドを作製するために、環状ペプチドを異なる位置で切断することと、機能的には同一である。したがって、円順列転換は、異なる位置に新規の末端を作りながらも、基本的にペプチドの配列およびアミノ酸の同一性を保持する効果を有している。
【０１５１】
本発明によるペプチドは、直鎖状または環状であり得る。
【０１５２】
フェニルアラニンおよび／またはシステインを含み、運動性および／またはＣＸＣＲ４の阻害効果を示す、異なるアミノ酸の組み合わせを含む、本発明の付加的なペプチドは、例えば、化学的合成によって、または組換え技術によって、作製され得る。これらの方法は当該技術分野において公知である。化学的合成の１つの例は、マルチペプチド合成機(AMS 422. アビメド  アナライザー  テック社（Abimed Analyzer Tech）)を用いた固相合成法である。ある実施態様では、Ｆｍｏｃ（Ｎ−９フルオレンチルメトキシカルボニル）法が、会社の市販用プロトコールにしたがって用いられた。ペプチド合成に関するこの方法は、広く用いられている（Fridkin et al., 2006）。ペプチド合成の後、運動性および／またはＣＸＣＲ４の阻害効果を示すペプチドが、インビトロでのトランスウェルアッセイを用いることによって、実施例の部分に記載されているようにおよび／または以下に記載されているように、選択され得る。
【０１５３】
本発明のペプチドまたは融合ペプチドの哺乳類細胞での発現は、ペプチドまたは融合ペプチドをコードしているＤＮＡを、プロモーター配列、任意にはイントロン配列およびスプライシングドナー／アクセプターシグナル配列を含み、さらに任意には停止配列を含むベクターに挿入することによって、行われてもよい。これらの技術は一般的にAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology (Chapter 16),Greene Publications and Wiley Interscience, New York, NY, 1987-1995;Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載されている。
【０１５４】
上記のプロモーター、イントロン、および停止配列は、哺乳類細胞で動作可能である。プロモーターは、好ましくは、上記で記載したようなＲＳＶ、ＣＭＶまたはＭＰＳＶプロモーターなどの強力なプロモーターである。プロモーターはまた、ＳＶ４０アーリープロモーター（Everett, et al. 1983, およびその中の参考文献）、またはベータアクチンプロモーターもしくはＥＬＦ−１プロモーターなどのセルラープロモーター（Tokushige, et al., 1997）であってもよい。また、Ｅｄａｍａｔｕｓら、１９９７年によって記載されているｌａｃオペレーターおよびヒトＥＬＦ−１アルファプロモーターとの間のハイブリッド、Ａｋａｇｉら（１９９７）によって記載されているＣＭＶ−ベータアクチンハイブリッドプロモーター、またはオペレーター配列およびＣＭＶプロモーターの間のハイブリッド（Furth et al., 1994, およびその中の参考文献）などの、ハイブリッドプロモーターも使用可能であるかもしれない。
【０１５５】
完全な配列、すなわちスプライスドナーおよびアクセプターサイトを含む配列として挿入されるかもしれない、イントロン配列は、発現させようとしているポリペプチドをコードしている配列に挿入されるかもしれない。そのようなイントロン配列の挿入は、ＲＮＡの安定性を増大させ、したがって所望のポリペプチドの産生を増大させる。原則的には、適切なイントロン配列は、イントロンを含むいかなる遺伝子から選択されてもよく、イントロン配列の例としては、ベーターアクチンイントロン、ＳＶ４０イントロン、およびｐ５５ＴＮＦレセプターイントロンが挙げられる。
【０１５６】
イントロン配列は、上記に記載したプロモーターからの転写を増大させる、エンハンサー要素を含んでいてもよい。
【０１５７】
しばしば、イントロン配列はまた、細胞に特異的な発現ができるようにするための転写または翻訳制御配列を含む。これゆえ、本発明のペプチドまたは融合ペプチドを細胞特異的に発現させようとする際に、このようなイントロン配列が有利に使用されるかもしれない。細胞特異的なエンハンサー要素を含むイントロンの例は、ヒト５−アミノレブリネートシンターゼ２遺伝子（Surinya et al. 1998）のイントロン８に存在する赤血球特異的エンハンサーであり、イントロン配列を用いることによるタンパク質産生の増大に関する原理についての議論は、イントロン配列の例とともに、Ｈｕａｎｇら１９９０によってなされている。
【０１５８】
転写停止配列およびポリアデニレーションシグナル配列は、発現させようとしているポリペプチドをコードしているＤＮＡの３’末端に加えられるかもしれない。このような配列は多くの、またはまさに大部分の遺伝子の中に見出されるかもしれない。有利には、ＳＶ４０ポリアデニレーションシグナル配列が使用され得る（Schek et al., 1992, およびその中の参考文献）。
【０１５９】
本発明のペプチドまたは融合ペプチドの哺乳類細胞内での発現のためのベクターとしては、例えば、所望するポリペプチドをコードしている遺伝子を発現させるためのＣＭＶプロモーターを含むｐｃＤＮＡ３．１ベクター（インビトロジェン社（Invitrogen））およびＭＰＳＶプロモーターを有するｐＭＰＳＶＥＨベクターが使用され得る。
【０１６０】
組換えポリペプチドは、このようなポリペプチドをコードしているベクターで遺伝子導入されたバクテリアもしくは真核細胞（たとえば、ＣＨＯ）の培養宿主細胞中、またはトランスジェニック動物中のどちらででも産生されうる。トランスジェニック動物を使用する場合は、異種のポリペプチドをその母乳中で産生するために特に有利である。牛、羊およびヤギなどの乳用動物はしたがって、宿主の例である。例えば、国際公開第８８／００２３９号パンフレット、同第９０／０５１８８号パンフレット、同９１／０２３１８号パンフレットおよび同９２／１１７５７号パンフレット；および米国特許第４，８７３，１９１号；４，８７３，３１６号；および５，３０４，４８９号明細書を参照のこと。またこれらはここに引用文献として完全に組み入れられる。
【０１６１】
本発明はまた、本発明のペプチドまたは融合ペプチドをコードしているＤＮＡ配列を含む発現ベクター、および該ベクターを、昆虫細胞、イースト菌、またはＨｅＬａ、２９３Ｔ  ＨＥＫおよびＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞などの、原核または真核宿主細胞に遺伝子導入すること、それら細胞を培養することおよび産生されたタンパク質を単離することによってペプチドを産生するための方法を提供する。
【０１６２】
さらに、本発明は、ペプチドまたはその融合ペプチドをコードしているウイルスベクターを提供する。
【０１６３】
したがって、本発明による付加的なペプチドは、例えば、システインおよび／またはフェニルアラニンを含有する２２個までのアミノ酸残基のペプチドの化学的合成または組換え発現、それらペプチドの運動性阻害効果および／またはＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４阻害活性の評価、および配列番号１から配列番号１６のペプチドのように同様の運動性阻害効果および／またはＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４阻害活性を示すペプチドの選択によって単離され得る。これゆえ、付加的なシステインおよび／またはフェニルアラニンを含有するペプチドまたは融合ペプチドは合成されることができ、そして様々な濃度でＳＤＦ−１によっておよび／または自発的に誘導される遊走性についてインビトロまたはインビボでヒト初代Ｔ細胞、ＣＤ３４＋幹細胞またはＰｒｅ−ＢＬＬ細胞を用いて試験され得る。一般的に、インビトロでの遊走実験のためには、細胞（例えば、１×１０6／ｍＬ）が、例えば２時間３７℃、９５％の湿度でペプチドとインキュベートされ、それから、コースター製２４−ウェルの孔径５μmのフィルターを備えたトランスウェルプレート（コーニング社（Corning Inc.）、コーニング、ＮＹ）の上部のチャンバーに未洗浄で加えられ、２時間３７℃、９５％の湿度、５％のＣＯ2で自発的またはＳＤＦ−１（２０ｎｇ／ｍＬ）に対して遊走させられ得る。あるいは、ペプチドはトランスウェルアッセイの下部のチャンバーに加えられてもよい。移動した細胞は下部のチャンバーより集められ、そしてＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ベクトン  デッキンソン社（Becton Dickinson）、サンジョゼ、カリフォルニア）を用いてカウントされ得る。細胞は、常数ゲインで設定された前方散乱光および側方散乱光をパラメーターとしてゲーティングされ得る。データは、移動した未処理の細胞の割合を１００％とした場合に比べて、ペプチドで前処理された場合の移動した細胞の割合として示され得る。
【０１６４】
下部のウェル中および／または試験された細胞と接触しているペプチドの濃度は、５ｎＭ〜１００ｎＭまたは０．１ｍＭ〜１０ｍＭまたは５０ｍＭおよび１００ｍＭまで；５または１０ｍＭまで；および約０．１ｍＭ、１ｍＭ、５ｍＭまたは１０ｍＭの範囲であり得る。
【０１６５】
本発明は、上記で定義されたように本発明によるペプチド、それらの塩および／またはそれらの誘導体および／またはそれらの融合ペプチドに関連している。
【０１６６】
ここで「塩」という用語は、本発明のペプチドのカルボキシル基の塩およびアミノ基の酸添加塩の両方を意味する。カルボキシル基の塩は、当該技術分野において公知の方法によって作製されるかもしれず、かつ、例えばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、第２鉄または亜鉛の塩などの無機塩、ならびに、例えばトリエタノールアミン、アルギニンまたはリジン、ピペリジン、プロカインなどのアミンとから作られるような有機塩基との塩を含む。酸添加塩は、例えば、例えば塩酸または硫酸などの無機酸との塩、および、例えば酢酸またはシュウ酸などの有機酸との塩を含む。もちろん、このような塩は何であっても、本発明のペプチドと実質的に同様な活性を有していなければならない。
【０１６７】
本発明はまた、本発明によるペプチドまたは融合ペプチドをコードしているＤＮＡ配列に関する。その上、本発明はさらに、生物学的に活性なペプチド、断片または本発明によるペプチドの融合ペプチドをコードするＤＮＡ配列に関する。
【０１６８】
別の局面では、本発明は、フェニルアラニンまたはその誘導体、システインまたはその誘導体、フェニルアラニンもしくはその誘導体およびシステインもしくはその誘導体の混合物または組み合わせ、フェニルアラニンもしくはその誘導体および／またはシステインもしくはその誘導体を含む２２個までのアミノ酸残基のペプチド、該ペプチドをコードしているＤＮＡまたは該ＤＮＡを包含しているベクターならびに薬学的に許容され得る担体などの、本発明による薬剤を含む医薬組成物を提供する。
【０１６９】
本発明のある局面では、ＣＸＣＲ４によって引き起こされるかまたは関連する疾患もしくは症状、またはＣＸＣＲ４の阻害に反応性の疾患もしくは症状の治療のための医薬または動物薬組成物であって、薬学的または動物薬学的に許容され得る賦形剤または担体とともに本発明による薬剤を含む組成物が提供される。
【０１７０】
本発明は、ＣＸＣＲ４活性の阻害または運動性の阻害に反応性である疾患、障害もしくは症状、または疾患、障害もしくは症状の病状がケモカインレセプターＣＸＣＲ４のレベルまたは活性および／または細胞の運動性のレベルによって引き起こされているかまたは関連している疾患もしくは症状の管理（すなわち、治療または予防）における、人間の患者などの必要とする個体または獣医学における本発明による薬剤の使用を提供する。本発明による薬剤は、インビボまたはエックスビボにて投与され得る。
【０１７１】
明細書の記載で使用されている細胞の運動性および細胞遊走という用語は、交換可能である。
【０１７２】
疾患、障害もしくは症状を「治療／改善」する場合、本発明による薬剤または薬物は、疾患の兆候が見られたのちに与えられ、「予防」は、疾患のいかなる徴候をも患者が感知できる以前に本発明による薬物を投与することを意味している。
【０１７３】
ＣＸＣＲ４の阻害、細胞の運動性の阻害、またはＣＸＣＲ４または細胞の運動性の両方の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状は、該疾患、障害もしくは症状の病状または経過に反応性または関与する細胞内でのＣＸＣＲ４発現または活性の阻害、該疾患、障害もしくは症状の病状または経過に反応性または関与する細胞内での細胞運動性の阻害、または、該疾患、障害もしくは症状の病状または経過に反応性または関与する細胞内でのＣＸＣＲ４発現もしくは活性および運動性の両方の阻害によって、改善または予防され得る。
【０１７４】
ＣＸＣＲ４活性に関係するかもしくは引き起こされるかまたはＣＸＣＲ４活性の阻害に反応性である疾患、障害もしくは症状の例は、原発性腫瘍の増殖、二次転移による湿潤；リウマチ様動脈炎、化膿性関節炎、変形性関節症、歯周炎、歯肉炎、喘息、自己免疫疾患、乾癬、乾癬性関節炎、アトピー性皮膚炎などの炎症疾患；間質性腎炎、眼内炎症、肝硬変、神経系の炎症症状または神経炎症性障害、すなわち、多発性硬化症、移植拒否反応（すなわち、移植片対宿主疾患）、胃の炎症性症状、すなわち、クローン病、炎症性腸疾患、および潰瘍性大腸炎、および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を含むが、これらに限定されるわけではない。ＣＸＣＲ４はニューロン細胞遊走に関連していることが知られており、したがって、本発明は、パーキンソン病および精神分裂病などの神経学的疾患における、本発明による薬剤の使用を含む。
【０１７５】
ＣＸＣＲ４は癌細胞に通常発現されているようであり、遊走、湿潤、増殖、生存期間およびその他の悪化の過程において役割を果たしている。少なくとも２３の異なるタイプの癌からの悪性細胞はケモカインレセプターＣＸＣＲ４を発現しており、かつそのリガンドであるＳＤＦ−１に対して反応性である。
【０１７６】
ＣＸＣＲ４レセプターは、Ｂａｌｋｗｉｌｌ，２００４年によって、転移部位への癌細胞の直接の移動に関与しており、癌細胞の生存率および腫瘍が促進するサイトカイン／ケモカインネットワークの形成を増加させることが示唆された。したがって、ＣＸＣＲ４のアンタゴニストは癌治療において重要である。発明者らは、理論に縛られることを望んではいないが、ＣＸＣＲ４のアンタゴニストは、ＣＸＣＲ４を発現している癌に対して、増殖の速度を低下させることによってまたは増加の停止を引き起こすことによってまたは癌細胞の死を引き起こすことによって、効果的な治療を提供することを信じている。
【０１７７】
したがって、本発明のある実施態様は、ＣＸＣＲ４を発現している癌の治療における、本発明による薬剤の使用に関する。
【０１７８】
ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１は、血管形成および内皮細胞の遊走に重要である。したがって、ＣＸＣＲ４阻害は、血管形成を妨げることが望ましい、固形腫瘍のような疾患の治療に有利であると思われる。
【０１７９】
ＣＸＣＲ４を発現する癌の例としては、Ｂ−ＣＬＬ、ＡＭＬ、Ｂ系ＡＬＬ、眼内悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、ＣＭＬ、多発性骨髄腫、膵臓癌、前立腺癌（限局性および転移性癌）、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、甲状腺癌、直腸癌、口腔扁平上皮癌、子宮頸癌、神経芽腫、神経膠腫、星状細胞腫、横紋筋肉腫、小細胞肺癌および黒色腫を含むが、これらに限定はされない。ＣＸＣＲ４を過剰に発現している癌細胞の例としては、Ｂ−ＣＬＬ、Ｂ系ＡＬＬ、濾胞性リンパ腫、および星状細胞腫を含む（Balkwill, 2004）が、これらに限定はされない。
【０１８０】
前駆Ｂ−ＡＬＬは最も発症率の高い小児悪性腫瘍であり、二番目に発生率の高い成人の急性白血病である。白血病細胞は、肝臓、脾臓、リンパ節、および中枢神経系に浸透する能力を有している。白血球細胞におけるＣＸＣＲ４の高い発現率が、小児ＡＬＬの患者の中枢神経系への浸透を含む、器官侵襲性のためには強力に予測される。
【０１８１】
本発明によって、インビボでは、本発明による薬剤がＢ細胞型急性リンパ芽球性白血病細胞の骨髄、脾臓、肝臓および肺へのホーミングを妨げることが見出された。したがって、該薬剤は、白血病細胞の器官への侵襲を妨げることを対象にしてもよい。
【０１８２】
これゆえ、ある実施態様では、本発明は、Ｂ細胞型急性リンパ芽球性白血病のような白血病を治療または予防するための、本発明による薬剤の使用を提供する。
【０１８３】
細胞運動性および／またはＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１相互作用と転移の発生との間の関連性はよく知られている。ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１相互作用は、前立腺癌、腎臓癌、神経芽腫、卵巣癌、乳癌、リンパ節、骨髄、頭部および頚部癌、ならびに皮膚を含むＳＤＦ−１の豊富な供給源である器官に対する黒色腫を含むいくつかの癌のタイプにおける転移に関係している。
【０１８４】
したがって、別の実施態様では、本発明は、転移を治療または予防するための、本発明による薬剤の使用に関する。
【０１８５】
ＣＸＣＲ４のシグナル伝達および／または細胞の運動性は炎症において役割を果たしていることが知られている。例えば、ＳＤＦ−１レベルは炎症性の肝臓疾患において、リウマチ様関節の過形成被覆膜における滑膜細胞において、増加されている。慢性関節リウマチのマウスモデルにおいて、ペリアスリック（periathric）細胞に注射された外因性のＳＤＦ−１は、炎症性応答を引き出す（Balkwill 2004による総説を参照）。最初の徴候が現れる前に、ＣＸＣＲ４アンタゴニストであるＡＭＤ３１００でマウスを治療することが、効果的であることが発見された。ＳＤＦ−１は、変形性関節症および慢性関節リウマチにおける軟骨の破壊に関与している（Kanbe et al., 2004）。最近、ＣＸＣＲ４およびＳＤＦ−１が炎症／感染を誘発する神経毒性に関与していることの証拠が見出された。
【０１８６】
したがって、ＣＸＣＲ４アンタゴニストおよび／または細胞運動性の阻害剤は、炎症を予防または治療するために効果的である。
【０１８７】
したがって、ある実施態様では、本発明は、炎症を予防または治療するための、本発明による薬剤の使用を提供する。
【０１８８】
ＣＸＣＲ４が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のコーレセプターとしてはたらくことは、当該技術分野で公知である。ＣＸＣＲ４はＨＩＶとおよび細胞のＣＤ４レセプターと、細胞内へのウイルスの進入を可能にするために相互作用する。これらのレセプターに対するアンタゴニストを基にした治療方法が、開発されてきており、そのうちのいくつかが現在、臨床試験段階にある（Murakami および Yamamoto, 2000）。したがって、ＣＸＣＲ４アンタゴニストは、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の予防または治療に効果的である。
【０１８９】
したがって、ある実施態様では、本発明はＡＩＤＳを治療または予防するための、本発明による薬剤の使用を提供する。
【０１９０】
本発明による発見が、本発明によるペプチドの存在下、ＳＤＦ−１によって誘導されるＴ細胞の遊走をインビトロで減少させることを示しているので、このようなペプチドはＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４系が関与している様々な病状の状況で用いられるかもしれない。
【０１９１】
血液からのＴ細胞の補充は、病気の組織の損傷および炎症の開始および管理に不可欠であると考えられている。したがって、本発明による薬剤は、抗原により活性化されたＴ細胞の血液から炎症位置への移動を妨げるために使用されるかもしれない。Ｔ細胞遊走を阻止する本発明のこれらの薬剤、特に本発明のペプチドは、Ｔ細胞浸透性の自己免疫疾患の病状を減少または阻害するための治療薬として使用されるかもしれない。
【０１９２】
別の局面では、本発明は、病状が、ケモカインレセプターＣＸＣＲ４の活性によって引き起こされるかまたは関連する疾患、障害もしくは症状を治療および／または予防するための方法であって、該方法が、必要とする個体に、治療上効果的な量の本発明による薬剤またはその塩を、任意には薬学的に許容され得る担体とともに投与することを含む方法を提供する。したがって、本発明は、必要とする個体における、特に人間の患者における、ＣＸＣＲ４の阻害反応性である疾患もしくは症状の管理（すなわち、治療または予防）の方法であって、該方法が、治療上効果的な量の上記で定義された本発明による薬剤、または薬学的に許容され得るそれらの塩を、個体に投与することを含む方法に関する。適切な塩に関する概要については、Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use by Stahl and Wermuth (Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2002)を参照のこと。
【０１９３】
したがって、本発明のある局面では、フェニルアラニン、システイン、該アミノ酸の誘導体およびそれらを含むペプチドが、例えば、ＣＸＣＲ４を発現している癌、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、炎症および転移の治療または予防のために、ＣＸＣＲ４活性および／または細胞運動の阻害剤として、投与され得る。
【０１９４】
組成物の１回のまたは複数回の投与が、個体により必要とされかつ許容される服用量および頻度にしたがって行われるかもしれない。これらの薬剤の組成物の濃度は、治療効果を得るために充分な量の分子を体内に運ぶことができるようにデザインされるであろう。組成物は、ここに記載された疾患および症状の経過ならびに重症度に効果を示すのに充分であり、疾患を減退または寛解させる量の化合物および薬剤を運ぶことができるようにデザインされるであろう。効果的な量は、投与方法、治療される疾患および個体の症状に依存するであろう。
【０１９５】
癌患者が本発明の薬剤による治療によって恩恵を受けるかどうかは、もし望むのであれば、患者から腫瘍サンプルを得てＣＸＣＲ４がサンプル中に発現しているが否かを決定することによって（例えば、下記に例示したようにＣＸＣＲ４を測定することによっておよび／またはｍＲＮＡレベルによって、また当該技術分野でよく知られている他のいかなる方法によっても）または該サンプル中でのＳＤＦ−１の、増殖、接着、運動性、ホーミング、カルシウム放出およびＳＤＦ−１によって情報伝達される他の活性を調節する能力を決定することによって、決定され得る。
【０１９６】
予防的な投与は、罹患するリスクが非常に高い患者またはここで記載した疾患もしくは症状で苦しんでいる患者において特に有用である。
【０１９７】
本発明による薬剤はまた、抗ウイルス製剤（例えば、ＨＩＶ逆転写酵素阻害剤のヌクレオシドまたは非ヌクレオシド、ＨＩＶタンパク質分解酵素阻害剤、およびＨＩＶインテグラーゼ阻害剤）、化学療法などの抗腫瘍剤といったほかの治療用薬剤または他の抗炎症薬剤と併せて、組み合わせ療法において使用されてもよい。
【０１９８】
「薬学的に許容され得る」という定義は、活性成分の生物学的活性の効果を妨げず、かつそれが投与される宿主にとって有毒でないような、いかなる担体をも含むことを意図している。たとえば、非経口の投与では、本発明による薬物は、生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミンおよびリンガー溶液などの媒体中に、注射薬として単位投薬形態として製剤化されるかもしれない。
【０１９９】
いかなる特定の患者にとっても特異的な投薬量のレベルは、使用される特異的化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与の時間、投与方法、排出速度、薬物の組み合わせおよび治療を受けている特定の疾患の深刻さを含む、様々なファクターに依存していることは理解されるであろう。理想的な投与量のレベルおよび投薬の頻度は臨床試験によって決定されるであろう。
【０２００】
本発明と関係のある化合物は、それらの薬物動態学的特性と一致した経路による投与のために調製されるかもしれない。
【０２０１】
経口的に投与可能な組成物は、タブレット、カプセル、粉末、顆粒、舐剤、および経口、局所的、または滅菌の非経口溶液もしくは懸濁液などの液体またはゲルの形で調製されてもよい。経口投与のための錠剤およびカプセルは、単位用量を表す剤形であるかもしれず、かつ、例えば、シロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、またはポリビニル−ピロリドンなどの結合剤；例えば、ラクトース、砂糖、とうもろこしでんぷん、リン酸カルシウム、ソルビトールまたはグリシンなどの充填剤；例えばステアリン酸塩マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコールまたはシリカなどの錠剤潤滑剤；例えばジャガイモでんぷんなどの錠剤分解物質、または硫酸ラウリルナトリウムなどの許容可能な湿潤剤などの従来からの賦形剤を含んでいてもよい。錠剤は、通常の薬務でよく知られているような方法にしたがって、コートされてもよい。経口用液体調製は、例えば水性または油性の懸濁液、溶液、乳濁液、シロップまたはエリキシル剤などの形であるかもしれず、使用前に水またはその他の適切な媒体で再生されるような乾燥した製品として提供されるかもしれない。そのような液体調製は、たとえば、ソルビトール、シロップ、メチルセルロース、グルコースシロップ、食用のゼラチン硬化油脂のような懸濁化剤；例えばレシチン、オレイン酸塩ソルビタン、またはアカシアなどの乳化剤；例えば、アーモンドオイル、分画されたココナッツオイル、グリセリン、プロピレングリコール、またはエチルアルコールなどの油脂エステルなどの非水性媒体（食用の尾油脂を含んでいてもよい）；例えば、メチルまたはプロピル  パラヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸などの防腐剤、およびもし望ましいのであれば従来の香料または着色剤などの従来の添加剤を含んでいてもよい。
【０２０２】
皮膚への局所的塗布のためには、薬剤は、クリーム、ローションまたは軟膏に調合されるかもしれない。薬剤として使用されるかもしれないクリームまたは軟膏の製剤は、例えば薬剤学の標準的な教科書であるＢｒｉｔｉｓｈ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａに記載されているように、当該技術分野においてはよく知られている、従来の製剤である。
【０２０３】
目への局在的塗布のためには、薬剤は、適切な滅菌の水性または非水性媒体中の溶液または懸濁液に調合されるかもしれない。添加剤、例えばナトリウムメタ重亜硫酸塩またはエチレンジアミン４酢酸２ナトリウム塩などの緩衝剤；例えばフェニルマーキュリック酢酸塩または硝酸塩、ベンズアルコニウムクロライドまたはクロルヘキシジンなどの殺バクテリア剤および殺真菌剤を含む防腐剤、ならびにアッシュプロメローセル（ashypromellose）などの増粘剤もまた含まれるかもしれない。
【０２０４】
活性化成分はまた、滅菌の溶媒中で非経口で投与されるかもしれない。使用される媒体および濃度に依存して、薬剤は媒体に懸濁または溶解され得る。有利には、局所麻酔薬、防腐剤および緩衝剤などの補助剤が媒体に溶解され得る。
【０２０５】
本発明を完全に記載したので、当業者によって、本発明の本質および範囲から外れることなく、かつ過度の実験を行うことなく、様々な範囲の同様のパラメーター、濃度および条件内で、同様のことが行われ得ることは明らかである。
【０２０６】
本明細書で引用された、機関紙の論文または要約、刊行されたまたは未刊行である米国または外国の特許出願、発行された米国または外国の特許または他の全ての参考文献を含む全ての引用文献は、明細書中に参考文献として完全に組み入れられる。
【０２０７】
公知の方法段階、従来の方法段階、公知の方法または従来の方法への参考文献は、いかにしても、本発明のいかなる局面、記載または実施態様が、関連技術として開示され、教示されまたは示唆されているという是認ではない。
【０２０８】
本発明は、より詳細に以下の非限定的な実施例および付属の図に記載されるであろう。
【実施例】
【０２０９】
材料および方法
（ｉ）細胞培養：ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋細胞の集積が、以前に記載されたように（Kollet et al., 2001）磁性ビーズ分離を用いて行われた。
【０２１０】
ＭＳ−５およびＣＤ３４＋細胞は、１０％の熱により不活性化されたＦＣＳ、抗生物質およびグルタミンを追加したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養された。マウスのＭＳ−５ストローマル細胞株（ミレニウム  ファーマシューティカル（Millennium Pharmaceuticals）、ケンブリッジ、マサチューセッツ、ＵＳＡ）は以前に記載されている（Bleul et al., 1996）。
【０２１１】
前駆Ｂ  ＡＬＬ細胞株Ｇ２およびＢ１は、以前に記載されている（Freedman et al., 1993）。Ｂ１およびＧ２細胞は、１０％の熱により不活性化されたＦＣＳ、抗生物質およびグルタミンを追加したＩＭＤＭ中で培養された。
【０２１２】
（ii）トランスウェルアッセイ：トランスウェルアッセイはコースター製トランスウェル（６．５ｍｍ／直径、５μｍ／孔径）を用いて以前に記載されたように行われた（Aiuti et al., 1997）。
【０２１３】
典型的には、細胞（１００μｌ溶媒中に１−２×１０5個）がトランスウェル器具の上部チャンバーに加えられた。ＳＤＦ−１（１２５ｎｇ／ｍｌ）が添加もしくは無添加の標準の溶媒またはＢ１馴化培地（６００μｌ）が下部のチャンバーに加えられた。４時間以内にチャンバーの底に移動した細胞が、ＦＡＣＳｏｒｔ（ベクトン  デッキンソン社）を用いてカウントされた。組換えヒトＳＤＦ−１はぺプロテック社（PeproTech）より購入された。
【０２１４】
（iii）接着アッセイ：ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋細胞（１×１０5／ウェル）はＣＦＳＥ（モレキュラー  プローブ社（Molecular Probes））によってラベルされ、培地でまたはＰｈｅ−ｏｌを追加した（５ｍＭまたは１０ｍＭ）培地で２時間インキュベートされ、９６ウェル中３７℃で（１×１０5細胞／ウェル）４５分間、融合性ＭＳ−５細胞に接着させた。非接着性細胞は、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋１％ＦＣＳ＋０．０２％ＮａＮＯ3）で２回洗浄された。接着性細胞は、０．５ｍＭＥＤＴＡが加えられた１５０μｌのＦＡＣＳバッファー中に集められた。ＣＦＳＥ＋細胞の数は、ＦＡＣＳ分析によって決定された（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ; ＢＤ）。
【０２１５】
（iv）カルシウム流入アッセイ：ＳＤＦ−１（０．５μｇ／ｍｌ）刺激の後に、Ｇ２細胞を用いたカルシウム流入アッセイが以前に記載されているように行われた（Aiuti et al., 1997）。
【０２１６】
（ｖ）インビボ実験  インビボ実験は、Defined flora condition下、換気されている滅菌のマイクロアイソレーターケイジ中で交配され維持されているＮＯＤ／ＬｔＳｚ−Ｐｒｋｄｃscid（ＮＯＤ−ＳＣＩＤ）マウスを用いて行われた。インビボモデルは、正常細胞のおよび白血病性のヒトＣＤ３４＋ＣＤ３８−／ｌｏｗ幹細胞を、免疫不全移植マウスＮＯＤ／ＳＣＩＤおよびＮＯＤ／ＳＣＩＤ／Ｂ２ｍｎｕｌｌにおけるヒト造血を開始するためのそれらの機能的能力に基づいて同定するために育てられた（Lapidot et al., 1997）。
【０２１７】
溶媒を含むＰｈｅ−ｏｌ（５ｍＭ）またはＰｈｅ−ｏｌ（１０ｍＭ）との２時間のプレインキュベーションの後、ヒトＧ２細胞（１０7／マウス、ホーミングの試験用）が、８週齢のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの尾の静脈に注入された。注射から１６時間後に（ホーミングを評価するため）、マウスは犠牲にされた。ＢＭ細胞は、大腿骨、脛骨、および骨盤の骨から洗い流された。ヒト細胞の割合が、以下に述べられるようにフローサイトメトリーによって決定された。
【０２１８】
（vi）フローサイトメトリー：移植されたマウスのＢＭ中のヒト細胞のレベルが、以前に述べられたように抗ヒトＣＤ４５  ＦＩＴＣ（IQ Products）を用いて、検知された（Spiegel et al., 2004）。染色後、細胞はＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒによってＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエア（ＢＤ  バイオサイエンス社）を用いて解析された。
【０２１９】
ＣＸＣＲ４発現は、抗ＣＸＣＲ４  ＰＥ（ＢＤ バイオサイエンス社、ファーミンゲン（Pharmingen））によって検知された。
【０２２０】
（vii）ウェスタンブロット解析：未処理のＧ２細胞またはＢ１馴化培地で終夜前処理されたＧ２細胞が、２００ｎｇ／ｍｌのＳＤＦ−１で所定の時間の間、刺激され、そしてライシスバッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１％  Ｔｒｉｔｏｎ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＦ、ＮａＶＯ3、ＰＭＳＦ、１％  タンパク質分解酵素抑制剤カクテル[シグマ−アルドリッチ社（Sigma-Aldrich）]）とともに１時間インキュベートすることによって、細胞溶解物を得た。タンパク質は、１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離された。ニトロセルロース中にブロットされたリン酸化ＥＲＫを検知するために使用された抗体は、シグマ社から入手した抗リン酸化ＥＲＫおよび抗ＥＲＫである。
【０２２１】
（viii）ＰＫＣ−ζのためのＲＴ−ＰＣＲ：全体のＲＮＡがＢ１細胞またはＧ２細胞からＴＲＩ試薬（モレキュラー  リサーチ  センター社（Molecular Research Center Inc.））を用いて単離された。ＲＴ−ＰＣＲは以前に記載されたように（Petit et al., 2005）、ＰＫＣ−ζに特異的なプライマー、センス鎖５’‘ＴＡＴＣＴＡＣＣＧＣＣＧＧＧＧＡＧＣＣＡＧＡＡＧＡ’（配列番号２０）アンチセンス鎖５’‘ＴＡＧＣＴＣＣＣＧＣＧＣＣＣＧＡＴＧＡＣＴＣＴＧＡ’（配列番号２１）を用いて行われた。ＰＣＲプロダクトは４５１塩基対であった。βアクチンが、ＲＴ−ＰＣＲにおけるＲＮＡ量のノーマライゼーションのコントロールとして使用された。
【０２２２】
（ix）Ｂ１馴化培地の分画および遊走阻害ファクターの分離：Ｃ１８カラムが、疎水性によって分離を行うために用いられた。ＨＰＬＣは、Ｃ１８カラムで、水（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）からアセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）へのリニアグラディエントを用いて行われた。検知は、２２０ｎｍおよび２５４ｎｍに合わせたＵＶ分光光度計を用いて行われた。
【０２２３】
Ｂ１馴化培地およびＣ１８での活性画分のゲルろ過分離は、スーパーデックスペプチドＨＲ１０／３０カラムを用いて行われ、そしてサンプルは脱イオン化蒸留水（ＤＤＷ）によって溶出させられた。
【０２２４】
馴化培地または適切に制御されたイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）の低いＭＷ（＜３ｋＤａ）を有する画分がカラムによって分離され、そして異なる画分の遊走阻害能が、Ｇ２細胞を用いたトランスウェルアッセイによって評価された。
【０２２５】
（ｘ）ぺプチド合成：ペプチドは固相法により、マルチペプチド合成機（ＡＭＳ  ４２２、Abimed Analyzer Tech）を用いて合成された。Ｆｍｏｃ（Ｎ−９フルオレンチルメトキシカルボニル）法が、Ｆｒｉｄｋｉｎら、２００６によって述べられているように会社の市販用プロトコールにしたがって行われた。
【０２２６】
（xi）初代Ｔ細胞の調製：初代Ｔ細胞の調製は、Ｚａｎｉｎ−Ｚｈｏｒｏｖら、２００６によって述べられているように行われた。
【０２２７】
実施例１：リンパ芽球性白血病性前駆Ｂ細胞の馴化培地中に存在するファクターは、白血病性および正常な造血細胞の運動性を阻害する。
【０２２８】
高い細胞密度で培養された培養液から得られたＢ１細胞（急性リンパ芽球性白血病Ｂ細胞［Ｂ−ＡＬＬ］をもつ患者からのＢ細胞から調製された株）は、低い細胞密度で培養された培養液から得られたＢ細胞に比べて、ＳＤＦ−１勾配に対して明らかに少ししか移動しないことが見出された（インビトロのトランスウェル移動アッセイによって試験されることによって）（図１Ａ）。したがって、移動の阻害が、細胞―細胞の相互作用の阻害を誘導することができた細胞密度の結果によるものであるのか、または細胞によって培地中に分泌されたファクターによるものであるのかが、さらに調べられた。したがって、白血病性Ｂ１細胞、Ｂ１−２細胞（Ｂ１細胞由来のサブクローン）、白血病性Ｇ２細胞（異なる前駆Ｂ−ＡＬＬ患者から調製された、別の前駆Ｂ細胞株）または高い細胞密度での培養からのＢ１細胞の培地を用いて前処理された正常の臍帯血（ＣＢ）ＣＤ３４＋細胞が、トランスウェルアッセイにおけるＳＤＦ−１グラディエントに対して移動する能力についてアッセイされた。トランスウェルの上部ウェルには１〜２×１０5の細胞がロードされ、下部のウェルには高い細胞密度での培養からのＢ１馴化培地またはコントロールのＩＭＤＭがロードされた。図１にまとめられた結果は、Ｂ１馴化培地による、白血病性Ｂ１細胞、Ｇ２細胞および正常なＣＢ  ＣＤ３４＋細胞のＳＤＦ−１依存性遊走の阻害を示している（Ｇ２およびＣＤ３４＋細胞における、それぞれ３５％および２５％の阻害）。
【０２２９】
したがって、得られた結果は、細胞遊走阻害ファクターが、高い細胞密度で培養されたＢ１細胞馴化培地中に見出されたことを示している。
【０２３０】
続く実験は、細胞遊走阻害ファクターがＳＤＦ−１によって伝達されるシグナルの阻害を介してはたらいているのかどうかを評価するために行われた。
【０２３１】
ＳＤＦ−１刺激はＣＤ３４＋ヒト前駆細胞の遊走を必要とし、ＥＲＫリン酸化を含むシグナル経路を活性化する（Petit et al., 2005）ので、発明者らはＧ２細胞をＢ１馴化培地でインキュベートし（３７℃で終夜）、これらの細胞におけるＳＤＦ−１誘導性のＥＲＫリン酸化をモニターし、未処理の細胞におけるＳＤＦ−１誘導性のＥＲＫリン酸化と比較した。ＥＲＫリン酸化は、リン酸化されたＥＲＫに特異的な抗体の検知のために使用される細胞溶解物のウェスタンイムノブロッティング分析によって評価された。得られた結果は図１Ｃにまとめられており、Ｇ２細胞のＢ１馴化培地とのインキュベートが、ＳＤＦ−１誘導性のリン酸化シグナルを〜１．６倍減少させていることを示している。
【０２３２】
ＰＫＣ−ζは、ＳＤＦ−１シグナル伝達に関与するもう１つのカイナーゼである。ＰＫＣ−ζの発現が、高濃度条件で培養されたＢ１細胞において顕著にダウンレギュレートされることが見出された（図１Ｄ）。このようなＰＫＣ−ζの発現のダウンレギュレーションは、同様に高い細胞濃度で培養されたが細胞遊走阻害ファクターには欠けていた別の白血病性Ｇ２細胞においては、見られなかった。
【０２３３】
以上のことから、Ｂ１馴化培地中に存在する細胞遊走阻害ファクターが、ＳＤＦ−１シグナル伝達を阻害することが示された。
【０２３４】
実施例２：Ｂ１細胞馴化培地中に存在する細胞遊走阻害ファクターの単離。
【０２３５】
細胞遊走阻害ファクターの大きさを決定するために、ファクターを含むＢ１馴化培地が、様々な孔径を有するアミコンフィルターを用いてろ過され、そして細胞遊走を阻害する能力が、ろ液および残留画分の両方について試験された。Ｇ２遊走の阻害は、分子量が＜３ｋＤａであるろ液画分で見られたが、分子量が＞３ｋＤａである画分では見受けられなかった。
【０２３６】
アミコンろ過された低いＭＷ（＜３ｋＤａ）画分は、２４ｍｌスーパーデックスペプチドＨＲ  １０／３０カラム上でゲルろ過によって分離された。０．５ｍｌの画分が、カラムにロードされ、そして３回蒸留した水によって溶出された。異なる画分の遊走阻害能力が、トランスウェル運動性アッセイによってＧ２細胞を用いて測定された（０．５ｍｌのイスコフ改変ダルベッコ培地ＩＭＤＭが対照としてカラム中で分離された）。図２Ａにまとめられた結果は、ＭＷが〜１５０ダルトンに相当する、画分番号３３〜３４がＧ２細胞の遊走を４０％阻害したことを示している（図２Ａ、Ｂ）。
【０２３７】
低い分子量を有する細胞遊走阻害ファクターは沸騰および低ｐＨ条件（６Ｎ  ＨＣｌ）に抵抗性であることが判明した。
【０２３８】
アミコンろ過された低いＭＷ（＜３ｋＤａ）の疎水性Ｃ１８カラム上での分画、続くスーパーデックスゲルろ過カラムでの分画によって精製された細胞遊走阻害ファクターは、マススペクトル分析によって特徴付けられ、フェニルアラニンである１６５ダルトンのＭＷを有することが発見された。阻害のピークのマススペクトル分析は、それがフェニルアラニンに富んでいることを示した。
【０２３９】
次に、Ｃ１８からむおよびスーパーデックスカラムにおけるフェニルアラニンの溶出パターンを試験したところ、細胞遊走阻害ファクターの溶出パターンと類似していることが判明した。
【０２４０】
以上のことから、細胞遊走阻害ファクターの特性は、それがフェニルアラニンであることを示している。
【０２４１】
実施例３：フェニルアラニンおよびシステインのアミノ酸が有力な細胞遊走阻害ファクターである。
【０２４２】
前述の実施例で得られた発明者らの結果は、Ｂ１馴化培地中に存在する細胞遊走阻害ファクターがフェニルアラニンであることを示している。続く実施例は、フェニルアラニンまたは他のアミノ酸の自発的およびＳＤＦ−１誘導性のＧ２細胞の運動性を阻害する能力を試験する為に行われた。
【０２４３】
トランスウェルアッセイにおけるＳＤＦ−１誘導性のまたは自発的な運動性への、様々な濃度の以下のアミノ酸のそれぞれとＧ２細胞のインキュベーションの効果が試験された；フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、バリン（Ｖａｌ）、プロリン（Ｐｒｏ）、システイン（Ｃｙｓ）およびメチオニン（Ｍｅｔ）。
【０２４４】
図３Ａにまとめられた結果は、アミノ酸が細胞の運動性を阻害していること、ＰｈｅおよびＣｙｓが自発性（図３Ａ、左上）およびＳＤＦ−１誘導性（図３Ａ、右上）のどちらの遊走においても最も有力な阻害剤であることおよびそれらの阻害が用量依存性であることを示している。フェニルアラニンよりも良好な溶解性を有するフェニルアラニン誘導体の遊走阻害能力がまた試験された（図３Ａ、下部のパネル）。Ｌ−フェニルアラニノール（Ｐｈｅ−ｏｌ）およびサクシニルフェニルアラニン（Ｓｕｃ−Ｐｈｅ）など（Mati Fridkin教授から提供された）のフェニルアラニン誘導体の自発的またはＳＤＦ−１依存性の細胞遊走への阻害効果が評価された。トランスウェルの下部に加えられたＬ−またはＤ−フェニルアラニンのどちらかが、Ｇ２細胞の遊走を阻害することが見いだされた（図３Ｂ）。
【０２４５】
フェニルアラニン残基、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｐｈｅ、Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−Ｇｌｕ、Ｇｌｕ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ、およびＰｈｅ−Ｌｙｓ−ε−アミノカプロイック酸を含む短鎖ペプチドの、自発的なＧ２細胞遊走への効果が試験された（図３Ｃ）。全てのペプチドがＧ２細胞の遊走を阻害することができることが見いだされた。ペプチド、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−ＰｈｅおよびＰｈｅ−Ｇｌｕは、約５０％の細胞遊走を阻害することができ、そしてＰｈｅ−Ｌｅｕ−ＬｙｓおよびＰｈｅ−Ｌｙｓ−ε−アミノカプロイック酸は、約３０％の細胞遊走を阻害することができた。
【０２４６】
Ｐｈｅ−ｏｌ阻害の分子レベルの機序を調べるために、およびそれがＢ１細胞馴化培地におけるもの（図１Ｄ参照）と同じであるのかを確認するために、溶媒（ＩＭＤＭ）、Ｂ１細胞馴化培地（図３Ｅ、上部パネル）、またはＰｈｅ−ｏｌ（図３Ｅ、下部パネル）で前処理されたＧ２細胞中のＰＫＣ−ζ  ｍＲＮＡのレベルが観測された。ＰＫＣ−ζ発現は、Ｇ２細胞中で、Ｐｈｅ−ｏｌでのまたはＢ１細胞馴化培地での処理の後にダウンレギュレートされていることが発見された。したがって、Ｂ１馴化培地およびＰｈｅ−ｏｌは、ＰＫＣ−ζによって制御されている同じシグナル経路を介して遊走を阻害する。
【０２４７】
続く実施例は、フェニルアラニン誘導体であるＰｈｅ−ｏｌの自発的およびＳＤＦ−１依存性の正常な幹細胞および成熟Ｔ細胞の遊走への効果を確認するために行われた（図３Ｄ）。この目的のために、Ｇ２、ＣＤ３４＋前駆細胞（左）または以前述べられたように調製された（Zanin-Zhorov et at., 2005）初代Ｔ細胞（右）が上部のウェルにロードされ、Ｐｈｅ−ｏｌが下部のウェルに加えられ（ＳＤＦ−１含有培養液と共に、またはなしで）、そして下部のウェルへの遊走が測定された。Ｐｈｅ−ｏｌが、効果的なＧ２、ＣＤ３４＋の（図３Ａ、左側パネル）、およびＴ細胞のＳＤＦ−１依存性または自発的な遊走の阻害剤であることが見いだされた。
【０２４８】
異なる濃度のβ−フェニルアラニン（シグマ社  カタログ番号 p-6513）が、培地とともにまたはＳＤＦ−１を追加した培地とともに、トランスウェルアッセイの下部のウェルに加えられた。フェニルアラニンは、上部のウェルにロードされたＧ２細胞の自発的なおよびＳＤＦ−１依存性の遊走を阻害することが見いだされた（図３Ｆ）。
【０２４９】
実施例４：Ｐｈｅ−ｏｌは、Ｇ２細胞においてＣＸＣＲ４ダウンレギュレーション、接着の減少およびＳＤＦ−１シグナル伝達の変化を誘導する。
【０２５０】
前述の実施例において、フェニルアラニンおよびその誘導体が、細胞遊走に関するＳＤＦ−１活性への阻害効果を有していることを示した。以下の実施例はフェニルアラニン誘導体の阻害効果がＳＤＦ−１の他の活性に関与するか否かを評価するために行われた。そのような活性の１つは、幹細胞の接着の調節である（Peled et al., 1999; Peled et al., 2000）。ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋細胞（１×１０5／ウェル）がＣＦＳＥ（モレキュラー  プローブ社）でラベルされ、Ｐｈｅ−ｏｌ（５および１０ｍＭ）とインキュベートされ、そして融合性ＭＳ−５細胞へ、３７℃で４５分間（１×１０5細胞／ウェル）０．２％のＢＳＡが添加された９６−ウェルプレート中で接着させた。非接着細胞はＦＡＣＳバッファーで２度洗浄された。接着細胞は、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを添加された１５０μｌのＦＡＣＳバッファー中に回収された。ＣＦＳＥ＋細胞の数はＦＡＣＳ分析により決定された（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ; BD）。得られた結果は図４Ａにまとめられており、Ｐｈｅ−ｏｌがＣＤ３４＋前駆細胞のストローマル細胞への接着を阻害することおよびＰｈｅ−ｏｌの阻害活性は用量依存であることを示している。
【０２５１】
次に、Ｇ２細胞でのＳＤＦ−１によって誘導されるカルシウム流動におけるＰｈｅ−ｏｌの効果が調べられた。Ｐｈｅ−ｏｌはＳＤＦ−１刺激に応答してカルシウムフラックスを阻害することが発見された（図４Ｃ）。
【０２５２】
本明細書中で得られた結果は、Ｐｈｅ−ｏｌがＳＤＦ−１によってシグナル伝達される、細胞遊走、細胞接着およびカルシウム流動などの様々な活性を阻害することが可能であることを示している。
【０２５３】
次の実施例は、ＳＤＦ−１に関連した活性のＰｈｅ−ｏｌによる阻害が、ＳＤＦ−１レセプター、ＣＸＣＲ４のダウンレギュレーションと関連しているのか否かを評価するために行われた。このために、初代Ｔ細胞、Ｇ２細胞またはＣＤ３４＋細胞が、Ｐｈｅ−ｏｌとの２時間のインキュベーションによって前処理されるかまたは未処理のまま残され、そしてＣＸＣＲ４発現が観測されそして処理されたおよび未処理のままの細胞において比較がされた。図４Ｂにまとめられた結果は、Ｐｈｅ−ｏｌとの前処理が試験された全ての細胞においてＣＸＣＲ４発現をダウンレギュレートすることおよび阻害の程度が用量依存性であること（図４Ｂの下部パネル）を示している。
【０２５４】
以上より、得られた結果は、フェニルアラニンおよびその誘導体のアミノ酸Ｐｈｅ−ｏｌおよびｓｕｃ−Ｐｈｅは、異なる細胞中で細胞表面でのＣＸＣＲ４発現をダウンレギュレートすることによって、ＳＤＦ−１によるシグナル伝達を阻害することができることを示している。
【０２５５】
実施例５：急性リンパ芽球性白血病性Ｂ細胞（Ｐｒｅ−Ｂ  ＡＬＬ）の、ＮＯＤ−ＳＣＩＤ移植マウスの骨髄、脾臓、肝臓および肺へのホーミングは、Ｐｈｅ−ｏｌによって阻害される。
【０２５６】
Ｐｒｅ−Ｂ  ＡＬＬは、最も発症率の高い小児悪性腫瘍であり、二番目に発生率の高い成人の急性白血病である。白血病細胞は、肝臓、脾臓、リンパ節、および中枢神経系に浸透する能力を有している。白血球細胞におけるＣＸＣＲ４の高い発現率が、小児ＡＬＬの患者の中枢神経系への浸透を含む、器官侵襲性のためには強力に予測される。
【０２５７】
前述の実施例で、フェニルアラニンおよびその誘導体のアミノ酸がＳＤＦ−１のシグナル伝達を阻害することができることが示された。白血病性細胞の骨髄へのホーミングは、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４相互作用と関連しているので、フェニルアラニン誘導体であるＰｈｅ−ｏｌがＧ２細胞のＮＯＤ−ＳＣＩＤ移植マウスの骨髄、脾臓、肝臓および肺へのホーミングを阻害する可能性が試験された。このために、５または１０ｍＭのＰｈｅ−ｏｌまたは（対照として）培養液と１時間プレインキュベートされたＣ２細胞（１０7細胞／マウス）が、８週齢のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの尾の静脈に注入され、注射から１６時間後、マウスは犠牲にされ、骨髄（大腿骨、脛骨、および骨盤の骨から洗い出された）、脾臓、肝臓および肺が採取され、そしてヒトＢ２細胞の存在がアッセイされた（フローサイトメトリーによって決定された）。
【０２５８】
得られた結果は図５にまとめられており、注射以前にＰｈｅ−ｏｌで前処理されたＧ２細胞は、白血病性Ｇ２細胞の骨髄、脾臓、肝臓および肺へのホーミングを阻害することそして阻害が用量依存性であることを示している。
【０２５９】
本明細書中で得られた結果は、フェニルアラニン誘導体であるＰｈｅ−ｏｌの白血病性Ｇ２細胞の異なる器官へのホーミングへの阻害効果を示している。したがって、Ｐｈｅおよびその誘導体は、白血病性細胞の器官侵襲性を予防するために使用されることを目的とするかもしれない。
【０２６０】
実施例６：システインおよびその誘導体のアミノ酸による、正常なおよび白血病性ヒト細胞の遊走ならびに増殖の阻害。
【０２６１】
ケモカインは、それらにおけるアミノ酸のシステインの構成に基づき、ＣＸＣまたはＣＣメンバーに分類される。発明者らの予備的な結果は、システインが、白血病性ヒト前駆細胞（実施例３を参照）、正常な前駆細胞および成熟細胞（データは示されていない）の遊走を阻害できることを示している。Ｌ−システインおよびその誘導体（全て１０ｍＭ）ならびにグルタチオン（６）の、Ｇ２の自発的およびＳＤＦ−１誘導性（５０ｎｇ／ｍｌ）遊走への効果がトランスウェルアッセイによって試験された。培養溶媒のみまたはＬ−システイン、グルタチオンもしくはシステイン誘導体、Ｌ−システインエチルエステル塩酸塩（３）、Ｌ−システインスルフィン酸（４）、システインアミン塩酸塩（５）を含む溶媒が、トランスウェルチャンバーの下部にロードされた。Ｇ２細胞（１０6／ｍｌ）は上部のチャンバーにロードされ、下部のチャンバーに向かって３７℃で４時間移動させられた。この期間の後、細胞は下部のチャンバーから集められ、そして蛍光活性化細胞選別機（FACSCalibur）を用いてカウントされた。システインおよびシステイン誘導体が、自発的およびＳＤＦ−1誘導性の両方の遊走を阻害することが見出された。しかしながら、システインおよびその誘導体の阻害効果は、自発的遊走において、よりはっきり現れていた。この作用の機序は現時点では明らかではないが、フェニルアラニンによる阻害における機序とは異なっているかもしれず、かつシステインの電荷および還元電位に関連しているのかもしれない。
【０２６２】
実施例７：システインおよびフェニルアラニンを含むペプチドによるＴ細胞遊走の阻害。
【０２６３】
ＳＤＦ−１分子のＮ末端配列であって、システインおよびフェニルアラニン残基を有する（ＳＤＦ−１の９〜１５のアミノ酸）、Ｃ−Ｐ−Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆ−Ｅ（配列番号１７）配列を基本に、小さいペプチドが合成された。次のペプチドが、合成された：１）Ｐ−Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆ−Ｅ（配列番号９）；２）Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆ−Ｅ（配列番号１０）；３）Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆ（配列番号１１）；４）Ｃ−Ｒ−Ｆ（配列番号１２）；５）Ｃ−Ｒ−Ｆ（配列番号１２）、４番のペプチドの別のバッチ；６）Ｐ−Ｃ−Ｒ−Ｆ（配列番号１３）；７）Ｃ−Ａ−Ａ−Ｆ（配列番号１４）；８）Ｃ−Ｒ−Ｒ−Ｆ（配列番号１５）；１２）Ｐ−Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆ−Ｅ（配列番号１７）、１番のペプチドの別のバッチ；１３）Ｐ−ｄＣｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｒ−Ｆ−Ｆ、Ｐ−Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆ（配列番号１６）の誘導体。
【０２６４】
ペプチド１  Ｐ−Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆ−Ｅ（配列番号９）は、１つのシステイン残基を位置２に、および２つのフェニルアラニンを位置４および５に含むＳＤＦ−１のＮ−末端配列からの６個のペプチドである。ペプチド２  Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆ−Ｅ（配列番号１０）は、プロリンが欠失している以外はペプチド１と同様であり、その結果、システインが位置１にある５個のペプチドである。ペプチド３  Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆ（配列番号１１）は、グルタミン酸が欠失している以外はペプチド２と同様であり、その結果、同じようにシステインが位置１にあり、かつ２つのフェニルアラニン残基を有する４個のペプチドである。ペプチド４  Ｃ−Ｒ−Ｆ（配列番号１２）は、最後のアミノ酸のフェニルアラニンが欠失している以外はペプチド３と同様であり、その結果、システインが同様に位置１にあり、かつただ１つのフェニルアラニン残基を有する４個のペプチドである。ペプチド５  Ｃ−Ｒ−Ｆ（配列番号１２）は、ペプチド４と類似のペプチドの別のバッチである。ペプチド６  Ｐ−Ｃ−Ｒ−Ｆ（配列番号１３）は、フェニルアラニン残基およびグルタミン酸残基がそれぞれ位置５および６にて欠失している以外はペプチド１と同様であり、その結果、システインが位置２にあり、かつただ１つのフェニルアラニンを有する４個のペプチドである。ペプチド７  Ｃ−Ａ−Ａ−Ｆ（配列番号１４）は、ペプチド３のような４個のペプチドであり、位置２のアルギニンおよび位置３のフェニルアラニンがアラニンによって置換されており、その結果、システインを位置１に、かつただ１つのフェニルアラニンを位置４に有するペプチドである。ペプチド８  Ｃ−Ｒ−Ｒ−Ｆ（配列番号１５）は、ペプチド３のような４個のペプチドであり、位置３のフェニルアラニンがアルギニンによって置換されており、その結果、システインを位置１に、かつただ１つのフェニルアラニンを位置４に有するペプチドである。ペプチド１２  Ｐ−Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆ−Ｅ（配列番号９）は、１番のペプチドの別のバッチである。ペプチド１３  Ｐ−ｄＣｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｒ−Ｆ−Ｆ（配列番号１６のＰ−Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆの誘導体）は、システイン残基がｄＣｙｓ（Ｔｒｔ）に置換されており、かつグルタミン酸が欠失している以外はペプチド１と同様である。Ｔｒｔはトリチルであって、システインのＳＨ官能部位のための保護基である。Ｆｍｏｃ−ＣＹＳ（Ｔｒｔ）を、ペプチド鎖の組み立てのための成分として使用した。
【０２６５】
１ｍＭまたは１００μＭのこれらのシステイン−フェニルアラニン含有のペプチドの、インビトロにおける自発的なおよびＳＤＦ−１誘導性のヒト初代Ｔ細胞の遊走への影響が試験された。試験された濃度におけるこれらのペプチドは、細胞に有毒ではないことが見出された（データは示されていない）。遊走実験において、細胞（１×１０6／ｍＬ）はペプチドと３７℃で２時間、９５％の湿度でインキュベートされ、その後未洗浄のままコースター製２４−ウェルの５μｍ孔径のトランスウェルプレート（コーニング社、コーニング、ＮＹ）の上部のチャンバーに加えられ、３７℃、９５％湿度、５％ＣＯ2のもと、自発的にまたはＳＤＦ−１（２０ｎｇ／ｍＬ）へと移動させられた。遊走細胞は下部のチャンバーから集められ、そしてＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ベクトン  デッキンソン、サンジョゼ、カリフォルニア）を用いてカウントされた。細胞は、常数ゲインで設定された前方散乱光および側方散乱光をパラメーターとしてゲーティングされ得る。データは、未処理の遊走細胞の割合を１００％とした場合に比べて、ペプチドで前処理された場合の遊走細胞の割合として示されている。
【０２６６】
１ｍＭの濃度でシステインおよびフェニルアラニンを含んでいるペプチド（図７Ａ）は、ＳＤＦ−１によって介されるＴ細胞遊走の非常に有用な阻害剤であることが発見された（５０〜９０％の阻害の範囲）。活性についての同じ傾向が、これらのペプチドを１００μＭの濃度でテストした場合にも観察された（図７Ｂ）。これらのペプチドはＴ細胞の自発的遊走も同様に阻害したが、ＳＤＦ−１誘導の遊走の阻害に比べて有用性は低かった（データは示されていない）。
【０２６７】
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【図面の簡単な説明】
【０２６８】
【図１Ａ】白血病性Ｂ１細胞の馴化培地中に見出されたファクターを示す。高い細胞密度または低い細胞密度で１６時間、２４ウェルプレート中で培養されたＢ１細胞（急性リンパ芽球性白血病Ｂ細胞［Ｂ−ＡＬＬ］をもつ患者からのＢ細胞から調製された株）およびＢ１−２細胞（限界希釈法によるＢ１細胞由来のサブクローン）は、トランスウェル移動アッセイにおけるＳＤＦ−１（１２５ｎｇ／ｍｌ）に対して移動する能力について試験された。高い細胞密度で培養された培養液から得られた細胞は、低い細胞密度*ｐ＜０．０５で培養された培養液から得られたＢ細胞に比べて、ＳＤＦ−１に対して明らかに少ししか移動しないことが見出された。
【図１Ｂ】白血病性Ｂ１細胞の馴化培地中に見出されたファクターを示す。精製された臍帯血（ＣＢ）ＣＤ３４+細胞（前駆造血細胞を含む）または白血病性Ｇ２細胞（異なる前駆Ｂ−ＡＬＬ患者から調製された、別の前駆Ｂ細胞株）は、高い細胞密度でのＢ１培養液からの馴化培地を用いて１時間前処理されるか未処理のまま残され、そしてＳＤＦ−１誘導性遊走がトランスウェル移動アッセイによって試験された。トランスウェル移動アッセイでは、試験される細胞（ＣＢ  ＣＤ３４＋  またはＧ２）が、チャンバーの上部に入れられ、そしてＳＤＦ−１誘導性（１２５ｎｇ／ｍｌ）がチャンバーの下部に入れられた。Ｂ１馴化培地もまた、前処理された細胞がテストされる、トランスウェルアッセイの下部のチャンバーに入れられた。白血病性細胞および正常な臍帯血ＣＤ３４＋細胞の両方のＳＤＦ−１誘導性遊走は、細胞密度*ｐ＜０．０５のＢ１細胞馴化培地によって顕著に阻害されることが見いだされた。
【図１Ｃ】白血病性Ｂ１細胞の馴化培地中に見出されたファクターを示す。Ｂ１の馴化培地とプレインキュベートされたＧ２細胞中における、ＳＤＦ−１誘導性ＥＲＫリン酸化の阻害を示す。
【図１Ｄ】白血病性Ｂ１細胞の馴化培地中に見出されたファクターを示す。高い細胞密度での培養液（２×１０6細胞／ｍｌ）から得られたＢ１細胞中におけるＰＫＣ−ζのｍＲＮＡのレベル（ＰＣＲによって検知される）が、低い細胞密度での培養液（１×１０5細胞／ｍｌ）から得られたＢ１または高い細胞密度での培養液（２×１０6細胞／ｍｌ）から得られたＧ２細胞中におけるＰＫＣ−ζのｍＲＮＡのレベルと比較して減少していることが示されている。高い細胞密度での培養液からのＢ１細胞株は、ＰＫＣ−ζの減少した発現を表している。
【図２Ａ】Ｂ１馴化培地からの遊走阻害ファクターの分離を示す。ゲルろ過分離は、スーパーデックスペプチドカラムを用いて行われた。馴化培地の低いＭＷ（＜３ｋＤａ）を有する画分または適切な対照（イスコフ改変ダルベッコ培地、すなわち「ＩＭＤＭ」からなる）がロードされ、カラム上にて分画され、そして、異なる画分の遊走阻害能が、Ｇ２細胞を用いたトランスウェルアッセイで試験された。矢印は、ＩＭＤＭ中では見られなかった、阻害効果を示す画分を示している。
【図２Ｂ】Ｂ１馴化培地からの遊走阻害ファクターの分離を示す。画分３３〜３４が、Ｇ２細胞のＳＤＦ−１誘導性遊走を４０％阻害したことを示している。
【図３Ａ】異なるアミノ酸、ペプチドおよびβ−フェニルアラニンのＳＤＦ−１誘導性のまたは自発的な細胞の遊走への効果を示す。上部のパネル：示された濃度のそれぞれのアミノ酸Ｐｈｅ、Ｇｌｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、ＰｒｏおよびＣｙｓ（上部パネル）が、自発的な（左側）またはＳＤＦ−１誘導性の（右側）Ｇ２遊走への効果を調べる為に、それぞれ、培地とともにまたはＳＤＦ−１を追加した培地とともに、トランスウェルの下部のチャンバーに加えられた。このアッセイにおいては、ＰｈｅおよびＣｙｓが、ＳＤＦ−１誘導性のまたは自発的なＧ２遊走の両方の有用な阻害剤であることが見いだされた。下部のパネル：示された濃度のそれぞれのアミノ酸誘導体Ｌ−フェニルアラニノール（Ｐｈｅ−ｏｌ）またはＮ−サクシニル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｓｕｃ−Ｐｈｅ）が、自発的な（左側）またはＳＤＦ−１誘導性の（右側）Ｇ２遊走への効果を調べる為に、それぞれ、培地とともにまたはＳＤＦ−１を追加した培地とともに、トランスウェルの下部のチャンバーに加えられた。このアッセイにおいては、両方のフェニルアラニン誘導体が、ＳＤＦ−１誘導性のまたは自発的なＧ２遊走の両方の有用な阻害剤であることが見いだされた。
【図３Ｂ】異なるアミノ酸、ペプチドおよびβ−フェニルアラニンのＳＤＦ−１誘導性のまたは自発的な細胞の遊走への効果を示す。示された濃度でトランスウェルの下部に加えられたＬ−またはＤ−フェニルアラニンによるＧ２細胞の自発的な遊走の阻害を示している。
【図３Ｃ】異なるアミノ酸、ペプチドおよびβ−フェニルアラニンのＳＤＦ−１誘導性のまたは自発的な細胞の遊走への効果を示す。示された濃度でトランスウェルの下部に加えられたフェニルアラニン残基を含む短鎖ペプチドによる自発的なＧ２細胞遊走の阻害を示している。左から右へ、対象、Ｆ−Ｋ（配列番号１）、Ｋ−Ｆ（配列番号２）、Ｆ−Ｒ（配列番号３）、Ｒ−Ｆ（配列番号４）、Ｋ−Ｆ−Ｋ−Ｆ（配列番号５）、Ｆ−Ｅ（配列番号６）、Ｅ−Ｆ（配列番号７）、Ｆ−Ｌ−Ｋ（配列番号８）およびＦ−Ｋ−ε−アミノカプロイック酸である。
【図３Ｄ】異なるアミノ酸、ペプチドおよびβ−フェニルアラニンのＳＤＦ−１誘導性のまたは自発的な細胞の遊走への効果を示す。ＣＤ３４＋前駆細胞（左側）またはＴ細胞（右側）の遊走に対する効果を調べるために、トランスウェルアッセイの下部のウェルに加えられた（ＳＤＦ−１を含む溶媒とともにまたは溶媒なしに）異なる濃度のフェニルアラニン誘導体であるＰｈｅ−ｏｌを示している。Ｐｈｅ−ｏｌは、ＣＤ３４＋およびＴ細胞のＳＤＦ−１依存性のまたは自発的な遊走への効果的な阻害剤であることが見いだされた。
【図３Ｅ】異なるアミノ酸、ペプチドおよびβ−フェニルアラニンのＳＤＦ−１誘導性のまたは自発的な細胞の遊走への効果を示す。培地（ＩＭＤＭ）、Ｂ１細胞馴化培地（上部パネル）、またはＰｈｅ−ｏｌ（下部パネル）で前処理されたＧ２細胞中のＰＫＣ−ζ  ｍＲＮＡのレベルを示している。ＰＫＣ−ζ発現は、Ｇ２細胞中で、Ｐｈｅ−ｏｌでのまたはＢ１細胞馴化培地での処理の後にダウンレギュレートされている。
【図３Ｆ】異なるアミノ酸、ペプチドおよびβ−フェニルアラニンのＳＤＦ−１誘導性のまたは自発的な細胞の遊走への効果を示す。示された濃度のβ−フェニルアラニン（シグマ  カタログ番号 p-6513）が、培地とともにまたはＳＤＦ−１を追加した培地とともに、トランスウェルアッセイの下部のウェルに加えられ、そして、Ｇ２細胞の自発的なおよびＳＤＦ−１依存性の遊走を阻害することが見いだされた。
【図４Ａ】細胞接着、ＣＸＣＲ４発現およびＳＤＦ−１依存性のＧ２細胞の遊走へのＰｈｅ−ｏｌの阻害効果を示す。未処理のＣＢ  ＣＤ３４＋細胞またはＰｈｅ−ｏｌＰｈｅ−ｏｌ（示された濃度で）で前処理されたＣＢ  ＣＤ３４＋細胞の、ストローマルＭＳ−５細胞（ＳＤＦ−１を発現していることで知られている）への接着の評価を示している。ＣＤ３４＋細胞のＭＳ−５細胞への接着は、Ｐｈｅ−ｏｌによって用量依存的に阻害されることが見いだされた。
【図４Ｂ】細胞接着、ＣＸＣＲ４発現およびＳＤＦ−１依存性のＧ２細胞の遊走へのＰｈｅ−ｏｌの阻害効果を示す。未処理の初代Ｔ細胞、Ｇ２細胞およびＣＤ３４＋細胞（上部の左側パネル−初代Ｔ細胞、上部の右側パネル−Ｇ２細胞、下部パネル−ＣＤ３４＋細胞）におけるＣＸＣＲ４発現またはＰｈｅ−ｏｌとの２時間のインキュベーションによって処理された（示された濃度で）同じ細胞中におけるＣＸＣＲ４発現を示している。Ｐｈｅ−ｏｌは試験された全ての細胞においてＣＸＣＲ４発現を減少させた。ＣＤ３４＋細胞を用いて行われた実験においては、Ｐｈｅ−ｏｌは用量依存的にＣＸＣＲ４発現を減少させることが示された。
【図４Ｃ】細胞接着、ＣＸＣＲ４発現およびＳＤＦ−１依存性のＧ２細胞の遊走へのＰｈｅ−ｏｌの阻害効果を示す。Ｇ２細胞中（上のカーブ）またはＰｈｅ−ｏｌとともにプレインキュベートされたＧ２細胞中（下のカーブ）でのＳＤＦ−１によって誘導されるカルシウム流動を示している。Ｐｈｅ−ｏｌは、Ｇ２細胞中でＳＤＦ−１誘導性カルシウムインフラックスを阻害することが発見された。
【図５Ａ】ヒト白血病性Ｇ２細胞の、移植に先立つＰｈｅ−ｏｌと細胞とのプレインキュベーションによるＮＯＤ／ＳＣＩＤの骨髄（ＢＭ）、脾臓、肝臓および肺へのホーミングを示す。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスは、未処理のまたはＰｈｅ−ｏｌ（５または１０ｍＭ）とプレインキュベートされたＧ２細胞を移植された（１０7細胞／マウス）。１６時間後、骨髄が採取され、そして組織へのヒト細胞のホーミングのレベルがアッセイされた。データは、１０6の得られた全ての細胞に対するヒトＣＤ４５細胞の数を表している。Ｐｈｅ−ｏｌは、白血病性Ｇ２細胞のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの骨髄へのホーミングを用量依存的に阻害する。
【図５Ｂ】ヒト白血病性Ｇ２細胞の、移植に先立つＰｈｅ−ｏｌと細胞とのプレインキュベーションによるＮＯＤ／ＳＣＩＤの骨髄（ＢＭ）、脾臓、肝臓および肺へのホーミングを示す。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスは、未処理のまたはＰｈｅ−ｏｌ（５または１０ｍＭ）とプレインキュベートされたＧ２細胞を移植された（１０7細胞／マウス）。１６時間後、脾臓、肝臓および肺が採取され、そして組織へのヒト細胞のホーミングのレベルがアッセイされた。データは、１０6の得られた全ての細胞に対するヒトＣＤ４５細胞の数を表している。Ｐｈｅ−ｏｌは、白血病性Ｇ２細胞のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの脾臓、肝臓および肺へのホーミングを用量依存的に阻害する。
【図６】Ｌ−システイン、グルタチオンもしくはシステイン誘導体（全て１０ｍＭ）の存在下における、Ｇ２の自発的およびＳＤＦ−１誘導性（５０ｎｇ／ｍｌ）細胞遊走を示す。培養溶媒のみまたはＬ−システインもしくはその誘導体を含む培養液が、トランスウェルチャンバーの下部にロードされた。Ｇ２細胞（１０6／ｍｌ）は上部のチャンバーにロードされ、３７℃で４時間移動させられた。細胞は下部のチャンバーから集められ、そして蛍光活性化細胞選別機（FACSCalibur）を用いてカウントされた。遊走細胞の割合が、培地のみでの培養液（対照）（１）；Ｌ−システインを追加した培養液（２）；Ｌ−システインエチルエステル塩酸塩を追加した培養液（３）；Ｌ−システインスルフィン酸を追加した培養液（４）；システインアミン塩酸塩を追加した培養液（５）；またはグルタチオンを追加した培養液（６）において示されている。
【図７Ａ】システインおよびフェニルアラニンを含むペプチドの、インビトロにおける初代Ｔ細胞遊走への効果を示す。１ｍＭのシステインおよびフェニルアラニン含有のペプチド（１）Ｐ−Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆ−Ｅ（配列番号９）；（２）Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆ−Ｅ（配列番号１０）；（３）Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆ（配列番号１１）；（５）Ｃ−Ｒ−Ｆ（配列番号１２）；（６）Ｐ−Ｃ−Ｒ−Ｆ（配列番号１３）；（７）Ｃ−Ａ−Ａ−Ｆ（配列番号１４）；（８）Ｃ−Ｒ−Ｒ−Ｆ（配列番号１５）；および（１３）Ｐ−Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆ（配列番号１７）の誘導体、Ｐ−ｄＣｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｒ−Ｆ−ＦのＳＤＦ−１誘導性のヒト初代Ｔ細胞の遊走がインビトロで調べられた。これらの実験において、細胞（１×１０6／ｍＬ）はペプチドと３７℃で２時間、９５％の湿度でインキュベートされ、その後未洗浄のままコースター製２４−ウェルの５μｍ孔径のトランスウェルプレート（コーニング社、コーニング、ＮＹ）の上部のチャンバーに加えられ、３７℃、９５％湿度、５％ＣＯ2のもと、自発的にまたはＳＤＦ−１（２０ｎｇ／ｍＬ）へと移動させられた。遊走細胞は下部のチャンバーから集められ、そしてＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ベクトン  デッキンソン社、サンジョゼ、カリフォルニア）を用いてカウントされた。細胞は、常数ゲインで設定された前方散乱光および側方散乱光をパラメーターとしてゲーティングされた。データは、未処理の遊走細胞の割合を１００％とした場合に比べて、ペプチドで前処理された場合の遊走細胞の割合として示されている。
【図７Ｂ】システインおよびフェニルアラニンを含むペプチドの、インビトロにおける初代Ｔ細胞遊走への効果を示す。１００μＭのシステインおよびフェニルアラニン含有のペプチド（１）Ｐ−Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆ−Ｅ（配列番号９）；（２）Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆ−Ｅ（配列番号１０）；（３）Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆ（配列番号１１）；（５）Ｃ−Ｒ−Ｆ（配列番号１２）；（６）Ｐ−Ｃ−Ｒ−Ｆ（配列番号１３）；（７）Ｃ−Ａ−Ａ−Ｆ（配列番号１４）；（８）Ｃ−Ｒ−Ｒ−Ｆ（配列番号１５）；および（１３）Ｐ−Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｆ（配列番号１７）の誘導体、Ｐ−ｄＣｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｒ−Ｆ−ＦのＳＤＦ−１誘導性のヒト初代Ｔ細胞の遊走がインビトロで調べられた。これらの実験において、細胞（１×１０6／ｍＬ）はペプチドと３７℃で２時間、９５％の湿度でインキュベートされ、その後未洗浄のままコースター製２４−ウェルの５μｍ孔径のトランスウェルプレート（コーニング社、コーニング、ＮＹ）の上部のチャンバーに加えられ、３７℃、９５％湿度、５％ＣＯ2のもと、自発的にまたはＳＤＦ−１（２０ｎｇ／ｍＬ）へと移動させられた。遊走細胞は下部のチャンバーから集められ、そしてＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ベクトン  デッキンソン、サンジョゼ、カリフォルニア）を用いてカウントされた。細胞は、常数ゲインで設定された前方散乱光および側方散乱光をパラメーターとしてゲーティングされた。データは、未処理の遊走細胞の割合を１００％とした場合に比べて、ペプチドで前処理された場合の遊走細胞の割合として示されている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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