(57)【要約】  免疫アッセイ、好ましくは競合的免疫アッセイによる、生体試料中のＦＫ７７８の濃度の測定のための方法及びキット。ある態様において、本方法及びキットは、（ａ）標識に連結された（例えばアクリジニウム標識）ＦＫ７７８に対する抗体と、（ｂ）標識に連結されていないＦＫ７７８に対する抗体と、（ｃ）第一のハプテン例えばフルオレセインハプテンに対する抗体を含有する固相と、（ｄ）第一のハプテン及びＦＫ７７８又はＦＫ７７８の類似体を含むバイハプテン、例えばフルオレセインハプテン及びＦＫ７７８ハプテンを含むバイハプテンと、の使用を含む。別の態様において、本方法及びキットは、（ａ）ＦＫ７７８に対する抗体と、（ｂ）ＦＫ７７８又はＦＫ７７８の類似体及び第一のハプテンを含むバイハプテン、例えば、フルオレセインハプテン及びＦＫ７７８又はＦＫ７７８の類似体のハプテンを含むバイハプテンと、（ｃ）前処理試薬と、の使用を含む。
2009522581.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）混合物｛前記混合物は、ＦＫ７７８を含有する疑いのある試験試料と、第一のハプテンに特異的な抗体に結合された固相と、ＦＫ７７８又はＦＫ７７８の類似体及び第一のハプテンを含むバイハプテンと並びに試薬混合物［前記試薬混合物は、標識に連結されたＦＫ７７８に対する抗体と及び標識に連結されていないＦＫ７７８に対する抗体とを含んで、検出可能な複合体（前記検出可能な複合体は、（ｉ）前記標識に連結されたＦＫ７７８に対する前記抗体と、（ｉｉ）第一のハプテン及びＦＫ７７８又はＦＫ７７８の類似体を含むバイハプテンと並びに（ｉｉｉ）第一のハプテンに特異的な抗体に結合された固相とを含む。）を形成する。］とを含む。｝を温置する段階、
（ｂ）固相を混合物から分離する段階；
（ｃ）固相に結合されている標識量を測定する段階；及び
（ｄ）測定された標識量から試験試料中のＦＫ７７８の量を決定する段階
を含む、試験試料中のＦＫ７７８又はＦＫ７７８の代謝産物又はレフルノミドの代謝産物の量を決定する方法。
【請求項２】
前記標識が化学発光標識である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標識がアクリジニウム標識である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）標識に連結されたＦＫ７７８に対する抗体と及び標識に連結されていないＦＫ７７８に対する抗体との混合物と、（ｂ）第一のハプテン及びＦＫ７７８又はＦＫ７７８の類似体を含むバイハプテンと及び（ｃ）第一のハプテンに特異的な抗体に結合された固相とを含む、上述のアッセイを行うための試薬を含有するキット。
【請求項５】
前記標識が化学発光標識を含む、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
前記標識がアクリジニウム標識を含む、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
（ａ）混合物［前記混合物は、（１）ＦＫ７７８を含有する疑いのある試験試料と、（２）必要ならば試料に対する希釈剤と、（３）前処理試薬と、（４）ＦＫ７７８に対する又はＦＫ７７８の類似体に対する抗体と、（５）第一のハプテン及びＦＫ７７８（又はＦＫ７７８の類似体）とを含むバイハプテントレーサーを含み、混合物（前記混合物は、（ｉ）非結合トレーサーと、（ｉｉ）前記抗体に結合されたトレーサーと、（ｉｉｉ）前期抗体に結合されたＦＫ７７８と及び（ｉｖ）非結合ＦＫ７７８とを含む。）を形成する。］を温置する段階；
（ｂ）蛍光偏光により、存在する前記抗体に結合したトレーサー及び非結合トレーサーの比を測定する段階；
（ｃ）測定された蛍光偏光シグナルから試験試料中のＦＫ７７８又はＦＫ７７８類似体の量を決定する段階
を含む、試験試料中のＦＫ７７８又はレフルノミドの代謝産物の量を決定するための方法。
【請求項８】
前記バイハプテンが、ＦＫ７７８及びフルオレセイン誘導体を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
（ａ）ＦＫ７７８に対する抗体と、（ｂ）第一のハプテン及びＦＫ７７８又はＦＫ７７８の類似体を含むバイハプテントレーサーと及び（ｃ）前処理試薬とを含むキット。
【請求項１０】
前記バイハプテンがＦＫ７７８及びフルオレセイン誘導体を含む、請求項９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料中のＦＫ７７８又はＦＫ７７８の類似体の検出及び測定、及び、とりわけ、競合免疫アッセイによる生体試料中のＦＫ７７８又はＦＫ７７８の類似体の検出及び測定に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＦＫ７７８（ＨＭＲ  １７１５、Ｘ９２  ０７１５又はＭＮＡ７１５として以前は知られていた。）は、Ａ７７  １７２６、レフルノミドの活性代謝産物、に構造的に類似している。Ａ７７  １７２６のように、ＦＫ７７８はマロノニトリラマイドであり、これらの化合物は、自己免疫疾患及び同種又は異種移植実験モデルにおいて有効な免疫抑制剤である。レフルノミド（ＡｒａｖａＴＭ）が関節リウマチでの臨床用途に対して発売されている一方、ヒトにおいてＡ７７  １７２６の血漿半減期が長いために（１５−１８日）、この薬物は臨床移植での使用が好ましくないものとなっている。ＦＫ７７８はヒトでの血漿半減期がより短く、したがって、臨床移植において有用であろうことが期待される。ＦＫ７７８及びＡ７７  １７２６の構造を下記で示す。
【０００３】
【化１】
2009522581.tif 000003
2009522581.tif 000004
【０００４】
ＦＫ７７８は次の論文で詳細に記載されている（これらの全てを参照により本明細書中に組み込む。）：Ｂｉｌｏｌｏら、「ＳＹＮＥＲＧＩＳＴＩＣ  ＥＦＦＥＣＴＳ  ＯＦ  ＭＡＬＯＮＯＮＩＴＲＩＬＡＭＩＤＥＳ（ＦＫ７７８、ＦＫ７７９）  ＷＩＴＨ  ＴＡＣＲＯＬＩＭＵＳ（ＦＫ５０６）  ＩＮ  ＰＲＥＶＥＮＴＩＯＮ  ＯＦ  ＡＣＵＴＥ  ＨＥＡＲＴ  ＡＮＤ  ＫＩＤＮＥＹ  ＡＬＬＯＧＲＡＦＴ  ＲＥＪＥＣＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＲＥＶＥＲＳＡＬ  ＯＦ  ＯＮＧＯＩＮＧ  ＨＥＡＲＴ  ＡＬＬＯＧＲＡＦＴ  ＲＥＪＥＣＴＩＯＮ  ＩＮ  ＴＨＥ  ＲＡＴ」、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、第７５巻、１８８１−１８８７、第１１号、２００３年６月１５日。
【０００５】
Ｂｉｒｓａｎら、「Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｌｏｎｏｎｉｔｒｉｌａｍｉｄｅ  ＦＫ７７８  ｉｎ  ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ」、Ｔｒａｎｓｐｌ．Ｉｎｔ．（２００３）１６：３５４−３６０。
【０００６】
Ｂｉｒｓａｎら、「Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｌｏｎｏｎｉｔｒｉｌａｍｉｄｅ  ＦＫ７７８  ｏｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｎ  ｗｈｏｌｅ  ｂｌｏｏｄ  ｆｒｏｍ  ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ  ａｎｄ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｈｕｍａｎ  ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ」、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １１（２００３）１６３−１６７。
【０００７】
Ｆａｗｃｅｔｔら、「ＦＫ７７８：Ａ  Ｐｏｗｅｒｆｕｌ  Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ、Ｂｕｔ  Ｗｉｌｌ  Ｉｔ  Ｒｅａｌｌｙ  Ｂｅ  Ｇｏｏｄ  ｆｏｒ  Ｙｏｕ？」、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、第７８巻、第１号、２００４年７月１５日。
【０００８】
Ｅｖｅｒｓら、「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔ  ＦＫ７７８」、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｘｘｘ（２００４）ｘｘｘ−ｘｘｘ。
【０００９】
Ｆｉｒｓｔら、「ＮＥＷ  ＤＲＵＧＳ  ＴＯ  ＩＭＰＲＯＶＥ  ＴＲＡＮＳＰＬＡＮＴ  ＯＵＴＣＯＭＥＳ」、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、第７７巻、Ｓ８８−Ｓ９２、第９巻、２００４年５月１５日、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ。
【００１０】
Ｊｉｎら、「Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｌｅｆｌｕｎｏｍｉｄｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ、ＦＫ７７８、ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｏｇｓ」、Ｓｕｒｇｅｒｙ、第１３２巻、第１号、７２−７９、２００２年７月。
【００１１】
Ｓａｖｉｋｋｏら、「Ｌｅｆｌｕｎｏｍｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｕｅ  ＦＫ７７８  Ｉｓ  Ｖａｓｃｕｌｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ｉｔｓ  Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔ：Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ」、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２００３；７６：４５５、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、第７６巻、４７１−４７３、第３号、２００３年８月１５日。
【００１２】
Ｓａｖｉｋｋｏら、「ＬＥＦＬＵＮＯＭＩＤＥ  ＡＮＡＬＯＧＵＥ  ＦＫ７７８  ＩＳ  ＶＡＳＣＵＬＯＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＩＮＤＥＰＥＮＤＥＮＴ  ＯＦ  ＩＴＳ  ＩＭＭＵＮＯＳＵＰＰＲＥＳＳＩＶＥ：ＰＯＴＥＮＴＩＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ  ＦＯＲ  ＲＥＴＥＮＯＳＩＳ  ＡＮＤ  ＣＨＲＯＮＩＣ  ＲＥＪＥＣＴＩＯＮ」、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、第７６巻、４５５−４５８、第３号、２００３年８月１５日。
【００１３】
Ｓｌａｕｓｏｎら、「Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  ｏｆ  ｌｅｆｌｕｎｏｍｉｄｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｍａｌｏｎｏｎｉｔｒｉｌａｍｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｉｎ  ｎｏｖｅｌ  ｗｈｏｌｅ  ｂｌｏｏｄ  ａｓｓａｙ」、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ６７（１９９９）１７９−１８３。
【００１４】
Ｖａｎｒｅｎｔｅｒｇｈｅｍら、「Ｔｈｅ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＦＫ７７８  ｉｎ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ  ａｎｄ  Ｓｔｅｒｏｉｄｓ：Ａ  Ｐｈａｓｅ  ＩＩ  Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  Ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  Ｒｅｎａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ」、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、第７８巻、第１号、２００４年７月１５日。
【００１５】
薬物投与量の調整に役立つものとして、生体試料中のＦＫ７７８の検出及び測定は、治療薬剤を監視するために重要である。血漿中の薬物濃度は免疫抑制の程度に相関する。
【００１６】
ＦＫ７７８は、ＬＣ／タンデム質量分析により調べることができる。ＬＣ／タンデム質量分析のための方法は次の文献に記載されている（これを参照により本明細書中に組み込む。）：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔ  Ｄｒｕｇｓ  ｂｙ  Ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｔａｙｌｏｒ、Ｐａｕｌ  Ｊ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ２６（２）：２１５−２１９、２００４年４月。
【００１７】
生体試料中のＦＫ７７８又はＦＫ７７８の類似体の存在及び量の決定は、競合診断アッセイにより調べることができる。小分子、競合診断アッセイは通常、利用可能な抗体部位について検体と競合することができる標識された成分を必要とする。標識された成分は一般にトレーサーと呼ばれる。標識された成分の例には、放射活性トレーサー、蛍光トレーサー、化学発光トレーサー及び酵素トレーサーが含まれる。一般に、標識された成分は、標識に連結された、検体又は検体の類似体からなる。
【００１８】
ＦＫ７７８に対する抗体及び標識された成分を含む特定の試薬がＦＫ７７８に対する高感度アッセイで有用である可能性は、用量反応曲線を知ることにより評価することができる。ＦＫ７７８アッセイのための用量反応曲線は、ＦＫ７７８検体の濃度の関数としての、ＦＫ７７８検体非存在下での反応に対するＦＫ７７８検体存在下での反応の比のプロットである。あるＦＫ７７８アッセイのための用量反応曲線は、ＦＫ７７８に対する抗体及びトレーサーを含む各試薬に対して特有であり、検体に対する抗体の部位に対する、トレーサーと検体との間の競合により変化する。
【００１９】
自動化学発光分析装置での一般的なＦＫ７７８競合免疫アッセイに伴う問題は、ＦＫ７７８及びアクリジニウム標識を含むトレーサーが非常に強力なシグナルを有することである。その結果、分析装置により測定するためにはトレーサーを非常に低い濃度に希釈しなければならない。ＦＫ７７８検体は生体試料中で非常に高い濃度で存在する。したがって、トレーサーと効率的に競合させるためには１０００倍希釈より薄くこの試料を希釈しなければならない。この試料希釈度は一般に自動分析装置では不可能である。このような希釈が行えない結果、ＦＫ７７８濃度がトレーサーの濃度を超えるアッセイでは、信頼度の高いアッセイのためのダイナミックレンジにおいて用量反応曲線の勾配が非常に急になる。トレーサーと検体との間の効率的な競合が可能となるが、ＦＫ７７８及びアクリジニウム標識を含むトレーサーほど強力ではない標識成分を含有する競合アッセイを開発することが望ましい。臨床的に有用であるが測定が困難である、１０μｇ／ｍＬ以上２５０μｇ／ｍＬ以下の濃度のＦＫ７７８レベルの検出を可能にする競合免疫アッセイ方式を提供することが望ましいであろう。
【００２０】
臨床用途のためのＦＫ７７８薬剤を開発した会社（以前は藤沢薬品工業、現在はアステラス製薬）もまた、ＥＬＩＳＡ法を用いてＦＫ７７８に対する一連のモノクローナル抗体を開発し、評価した。免疫アッセイで使用するために、これらの抗体がＦＫ７７８に対して十分な親和性を有することが必要であった。さらに、ＦＫ７７８検体に対して適切な親和性を示す抗体を開発した場合でさえも、これらの抗体の多くは、代謝産物などの構造的に似ているＦＫ７７８類似体との高い交差反応性という望ましくない性質を示した。藤沢薬品工業によって、代謝産物に対する交差反応性の程度ついてこれらの抗体がさらにスクリーニングされ、交差反応性が低い抗体が選択された。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
発明の要旨
本発明は、免疫アッセイ、好ましくは競合免疫アッセイにより生体試料中のＦＫ７７８濃度の測定のための、方法及びキットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
ある態様において、本方法及びキットは、（ａ）標識に結合された（例えばアクリジニウム標識）ＦＫ７７８に対する抗体と、（ｂ）標識に結合されていないＦＫ７７８に対する抗体と、（ｃ）第一のハプテン例えばフルオレセインハプテンに対する抗体を含有する固相と、（ｄ）第一のハプテン及びＦＫ７７８又はＦＫ７７８の類似体を含むバイハプテン、例えばフルオレセインハプテン及びＦＫ７７８ハプテンを含むバイハプテンと、の使用を含む。このバイハプテン（ｄ）は、（ａ）標識に結合されたＦＫ７７８に対する抗体と（ｂ）第一のハプテンに対する抗体を含有する固相との間の架橋を与える。バイハプテン（ｄ）の濃度は、検体、ＦＫ７７８と効率的に競合させ、ＦＫ７７８試料を前もって過度に希釈することなく良好な用量反応曲線を与えるための濃度範囲内に最適化することができる。市販の化学発光リーダーの検出能力を超えないよう、非標識抗体を添加することにより複合体（ａ）の濃度を下方調整することができる。非標識抗体（ｂ）に対する標識抗体（ａ）の比は通常約１：１３５から約１：２２５の範囲であり、好ましくは約１：１７５である。
【００２３】
この態様において、本発明は、架橋（即ちバイハプテン）方式において、第一のハプテンに対する抗体及びＦＫ７７８又はその類似体に対する抗体の両方に対して適切な親和性を有するバイハプテンを同定することを含む。本発明の方法及びキットによる検出に適している化合物には、ＦＫ７７８、Ｍ３として知られる僅かに交差反応性があるＦＫ７７８代謝産物及びＡ７７  １７２６として知られるレフルノミドの活性代謝産物が含まれる。
【００２４】
この方法は、
（ａ）混合物｛前記混合物は、（１）ＦＫ７７８を含有する疑いのある試験試料と、（２）第一のハプテンに特異的な抗体に結合された固相と、（３）ＦＫ７７８又はＦＫ７７８の類似体及び第一のハプテンを含むバイハプテンと並びに（４）試薬混合物［前記試薬混合物は、標識に連結されたＦＫ７７８に対する抗体と及び標識に連結されていないＦＫ７７８に対する抗体とを含んで、検出可能な複合体（前記検出可能な複合体は、（ｉ）前記標識に連結されたＦＫ７７８に対する前記抗体と、（ｉｉ）第一のハプテン及びＦＫ７７８又はＦＫ７７８の類似体を含むバイハプテンと並びに及び（ｉｉｉ）第一のハプテンに特異的な抗体に結合された固相とを含む。）を形成する。］とを含む。｝を温置する段階、
（ｂ）固相を混合物から分離する段階；
（ｃ）固相に結合されている標識量を測定する段階；及び
（ｄ）測定された標識量から試験試料中のＦＫ７７８の量を決定する段階
を含む。
【００２５】
上述のアッセイを行うための試薬を含有するキットは、（ａ）標識に結合されたＦＫ７７８に対する抗体及び標識に結合されていないＦＫ７７８に対する抗体の混合物と、（ｃ）第一のハプテン及びＦＫ７７８又はＦＫ７７８の類似体を含むバイハプテンと、（ｂ）第一のハプテンに特異的な抗体に連結された固相と、を含む。
【００２６】
別の態様において、本方法及びキットは、（ａ）ＦＫ７７８に対する抗体と、（ｂ）ＦＫ７７８又はＦＫ７７８の類似体及び第一のハプテンを含むバイハプテン、例えばフルオレセインハプテン及びＦＫ７７８又はＦＫ７７８の類似体のハプテンつるを含むバイハプテンと並びに（ｃ）前処理試薬と、の使用を含む。
【００２７】
この態様の方法は、
（ａ）混合物［前記混合物は、（１）ＦＫ７７８を含有する疑いのある試験試料と、（２）必要ならば試料に対する希釈剤と、（３）前処理試薬と、（４）ＦＫ７７８に対する又はＦＫ７７８の類似体に対する抗体と、（５）第一のハプテン及びＦＫ７７８（又はＦＫ７７８の類似体）とを含むバイハプテントレーサーを含み、混合物（前記混合物は、（ｉ）非結合トレーサーと、（ｉｉ）前記抗体に結合されたトレーサーと、（ｉｉｉ）前期抗体に結合されたＦＫ７７８と及び（ｉｖ）非結合ＦＫ７７８とを含む。）を形成する。］を温置する段階；
（ｂ）蛍光偏光により、存在する前記抗体に結合したトレーサー及び非結合トレーサーの比を測定する段階；
（ｃ）測定された蛍光偏光シグナルから試験試料中のＦＫ７７８又はＦＫ７７８類似体の量を決定する段階
を含む。
【００２８】
本キットは、（ａ）ＦＫ７７８に対する抗体と、（ｂ）第一のハプテン及びＦＫ７７８又はＦＫ７７８の類似体を含むバイハプテントレーサーと、（ｃ）前処理試薬と、を含む。
【００２９】
本発明での使用に適切なＦＫ７７８のハプテン含有誘導体の代表例は、次の構造式を有し得る。
【００３０】
【化２】
2009522581.tif 000005
2009522581.tif 000006
2009522581.tif 000007
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【００３１】
構造１２、１４、４５及び４６は、アクリジニウム標識を有するＦＫ７７８の類似体を含有するトレーサーであり、従来の競合免疫アッセイ方式においてこれらは過剰に高いシグナルを生成するので、ＦＫ７７８アッセイに対して好ましくない。構造１０ｂ、１０ｃ、２１ａ、２１ｂ、２１ｃ、２５ａ、２５ｂ、３２ａ、３２ｂ及び３２ｃは、フルオレセイン分子がＦＫ７７８分子の芳香環の４位に連結されている、ＦＫ７７８のフルオレセイン誘導体の例である。これらのバイハプテントレーサーは、ＦＫ７７８に対する抗体及びフルオレセインに対する抗体の両方に強く結合し、ＦＫ７７８又はＦＫ７７８の類似体及び第一のハプテンを含むバイハプテンとして使用することができる。構造４４ａ、４４ｂ及び４４ｃは、ＦＫ７７８分子の芳香環の３位にフルオレセイン分子が連結され４位にＣＦ３基を保持している、ＦＫ７７８のフルオレセイン誘導体の例である。ＦＫ７７８に対する抗体がこのような誘導体に対して結合親和性を有する限り、ＦＫ７７８又はＦＫ７７８の類似体及び第一のハプテンを含むバイハプテンとしてこれらの構造を使用することができる。
【００３２】
ＦＫ７７８類似体の量の測定が所望される場合は、ＦＫ７７８部分がＦＫ７７８部分の類似体で置換され得ることにも注目されたい。
【００３３】
本発明の第一の利益は、ある一定のアッセイ方式の性能が、従来のアッセイ方式で使用される場合に、即ちＦＫ７７８又はＦＫ７７８類似体に対する抗体が固相に連結され、アクリジニウム含有トレーサーがシグナル源として使用される場合に得られ得るものよりも改善し得ることである。
【００３４】
このアッセイ方式により、自動分析装置での使用が可能となる。さらに、標識により生じるシグナルを市販の分析装置の範囲に制限することができる。
【００３５】
図面の簡単な説明
図１は、本発明の競合アッセイのある実施形態を示す概略図である。この実施形態において、化学発光標識を使用する。図１において、「ホット抗体」は標識を有する抗体であり、「コールド抗体」は非標識抗体である。
図２は、蛍光偏光免疫アッセイにおいて、ＦＫ７７８をＦＫ７７８のフルオレセイン誘導体及びＦＫ７７８に対する抗体と混合することにより作成した用量反応曲線を示すグラフである。
図３は、微小粒子を被覆するためのプロセスを示すフローチャートである。
図４は、本発明の連結物を調製するためのプロセスを示すフローチャートである。この連結物は化学発光標識を利用する。
図５は、ＦＫ７７８を含有する溶液をＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）装置上で保管した場合の、終夜測定したＦＫ７７８含有溶液の安定性を示すグラフである。
【００３６】
詳細な説明
本明細書中で使用する場合、「標識」という用語は、抗体と検体との間で検出可能な反応を起こさせるために抗体又は検体に連結された部分を意味する。標識は、視覚的又は機械的方法により検出可能なシグナルを生成することができる。本発明での使用に適切な様々な標識には、色原体、蛍光化合物、化学発光化合物などのシグナル生成基質が含まれる。本発明に適切な標識の代表例には、光を生じさせる部分、例えばアクリジニウム化合物、及び蛍光を生じさせる部分、例えばフルオレセイン、が含まれる。「トレーサー」という用語は、例えば、フルオレセイン部分に結合されたＦＫ７７８などの、標識に結合された検体を意味し、この、標識に結合された検体は、検体に特異的な抗体の部位に対して、検体（例えばＦＫ７７８）と効率的に競合できる。
【００３７】
「類似体」という用語は、検体と構造類似性を有する分子を意味する。「誘導体」という用語は、化学的又は生化学的に修飾されており、結果として、例えばＦＫ７７８トレーサー又は代謝産物などの化学部分が付加された又はこれで置換された検体を意味する。
【００３８】
「試料」、「試験試料」などの表現は、本明細書中で使用する場合、検体を含有する疑いのある物質を指す。試験試料は、その源から得られたように直接又は試料の性質を修飾するための前処理後に使用することができる。試験試料は、例えば血液、唾液、眼内液、脳脊髄液、汗、尿、乳、腹水（ａｓｃｉｔｅｓ  ｆｌｕｉｄ）、滑液、腹水（ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｆｌｕｉｄ）、羊水などの生理液といった何れかの生物学的源由来であり得る。血液から血漿を調製する、粘度の高い液を希釈するなど、使用前に試験試料を前処理することができる。
【００３９】
前処理の方法には、ろ過、蒸留、抽出、濃縮、干渉成分の不活性化、試薬の添加などが含まれ得る。
【００４０】
本明細書中で使用する場合、「抗ＦＫ７７８」という用語はＦＫ７７８に対する抗体を意味する。本明細書中で使用する場合、「ＣＰＳＰ」は９−｛Ｎ−トシル−Ｎ−（３−カルボキシプロピル）］−１０−（３−スルホプロピル）アクリジニウムカルボキサミドを意味し；「ＤＭＦ」という用語は、ジメチルホルムアミドを意味する。本明細書中で使用する場合、「アクリジニウム取り込み率」という表現は、標識抗体分子あたりのアクリジニウム分子の比率を意味する。本明細書中で使用する場合、「オーバーコート緩衝液」という表現は、微小粒子を抗体などの特異的タンパク質で被覆した後に微小粒子を処理するために使用する、緩衝液及び非特異的タンパク質、例えばウシ血清アルブミンを含有する溶液を意味する。
【００４１】
当業者にとって周知の手段により、抗体被覆微小粒子を調製することができる。連結物（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）は、好ましくは、標識の活性型、例えば活性エステルを抗体に連結する（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）ことにより調製する。簡略にするために、化学発光アッセイ及び蛍光偏光免疫アッセイを含む競合免疫アッセイ技術のみを詳述する。
【００４２】
化学発光標識を利用する本発明の態様において、本発明の方法は、
（ａ）混合物｛前記混合物は、（１）ＦＫ７７８を含有する疑いのある試験試料と、（２）第一のハプテンに特異的な抗体に結合された固相と、（３）ＦＫ７７８又はＦＫ７７８の類似体及び第一のハプテンを含むバイハプテンと並びに（４）試薬混合物［前記試薬混合物は、標識に連結されたＦＫ７７８に対する抗体と及び標識に連結されていないＦＫ７７８に対する抗体とを含んで、検出可能な複合体（前記検出可能な複合体は、（ｉ）前記標識に連結されたＦＫ７７８に対する前記抗体と、（ｉｉ）第一のハプテン及びＦＫ７７８又はＦＫ７７８の類似体を含むバイハプテンと並びに（ｉｉｉ）第一のハプテンに特異的な抗体に結合された固相とを含む。）を形成する。］とを含む。｝を温置する段階、
（ｂ）固相を混合物から分離する段階；
（ｃ）固相に結合されている標識量を測定する段階；及び
（ｄ）測定された標識量から試験試料中のＦＫ７７８の量を決定する段階
を含む。
【００４３】
上述のアッセイを行うための試薬を含有するキットは、（ａ）標識に連結されたＦＫ７７８に対する抗体及び標識に連結されていないＦＫ７７８に対する抗体の混合物と、（ｂ）第一のハプテン及びＦＫ７７８又はＦＫ７７８の類似体を含むバイハプテンと、（ｃ）第一のハプテンに特異的な抗体に結合された固相と、を含む。
【００４４】
図１は、上述のアッセイのある実施形態の概略を示す。図１によると、前もって希釈した試料（試料の１：２０希釈液の１０μＬ量）をライン希釈剤（５０μＬ）及び、適切な標識に連結されたＦＫ７７８に対する抗体及びＦＫ７７８に対する非標識抗体を含む試薬混合液（９０μＬ、標識に連結されていない抗体に対する標識に連結された抗体の比は１：１５０）と混合する。得られた混合物をおよそ６秒間、予温置する。得られた混合液（１５０μＬ）をバイハプテン試薬（５０μＬ）及び固相（５０μＬ）と混合する。得られた混合物をおよそ２５分間温置し、洗浄し、（ｉ）フルオレセインに対する抗体を含有する固相と、（ｉｉ）ＦＫ７７８及びフルオレセインを含むバイハプテンと、（ｉｉｉ）標識に結合されたＦＫ７７８に対する抗体と、を含むシグナル生成複合体を形成させる。
【００４５】
ＦＫ７７８に特異的な結合メンバーには、抗ＦＫ７７８特異的結合タンパク質、例えば、モノクローナル抗体及びＦＫ７７８に特異的に結合する他の特異的な合成又は組み換えタンパク質など、が含まれる。例えば、ＦＫ７７８に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生させることができることは当業者にとって周知である。ＦＫ７７８又は通常は共有結合により担体タンパク質（例えばアルブミン）に結合されたＦＫ７７８の誘導体を含む免疫原を動物に注射し、ＦＫ７７８に特異的に結合する抗体を動物の免疫系が産生する。マウス又はラットを用いて検体に対するモノクローナル抗体を調製するための一般的方法は当業者にとって周知である。検体に特異的な合成及び組み換えタンパク質を調製するための最新の方法が報告されており、同じ方法をＦＫ７７８に特異的な合成及び組み換えタンパク質の調製に容易に適用することができる。藤沢薬品工業は、本発明において有用なＦＫ７７８に対するモノクローナル抗体を開発した。この抗体は、クローン２０Ａ１と呼ばれる。ＦＫ７７８アッセイの開発で使用される抗体は、２０Ａ１  ｓｃ２４１と呼ばれるサブクローンである。
【００４６】
好ましくは、固相に結合されたハプテンに特異的な結合メンバーを有する固相を使用することによりシグナルを測定する。固相の例は微小粒子である。固相に結合された標識連結物の量又は溶液中に残存する標識連結物の量を調べることができるように、固相及び試験試料を分離する。化学発光により、固相に結合された標識連結物の量又は溶液中に残存する標識連結物の量を調べることができるが、この場合、化学発光部分を連結物中の標識として使用する。適切なトリガー試薬により化学発光部分が発光化合物に変換され得る。形成される化学発光化合物の量は、反応混合物中に存在するＦＫ７７８検体の量の指標である。したがって、試験試料中に存在するＦＫ７７８の量を調べるために、化学発光の測定を使用することができる。ＦＫ７７８の濃度の関数として化学発光活性を示すプロットによって、固相又は溶液中の標識連結物の量を試験試料中のＦＫ７７８の濃度と相関させ得る（一般に標準曲線と呼ばれる。）。
【００４７】
表ＸＶＩで述べるもの（後述）などの６個のキャリブレーターを用いてアッセイを行うことにより、標準曲線を作成することができる。標準曲線が有効であることを確認するために対照を測定する。ＦＫ７７８レベルが未知である試料をアッセイする場合、測定したアッセイシグナルを標準曲線と比較し、測定したシグナルに対応するＦＫ７７８レベルが試料のＦＫ７７８レベルとなる。
【００４８】
本発明による固相は、微小粒子に化学的又は物理的に結合された第一のハプテンに特異的な結合メンバーとの微小粒子の混合物であり得る。ポリマー性物質から本発明で使用することができる微小粒子を作製することができ、より好ましくは、スチレン単位を有するポリマー又はアクリレート単位を有するポリマー由来の微小粒子が含まれる。これらの粒子を試験試料から分離するための方法は、多孔性マトリクス（ガラス繊維など）上での微小粒子の捕捉を含む。
【００４９】
使用できる好ましい固相には、微小粒子に化学的又は物理的に結合された第一のハプテンに特異的な結合メンバーを有する磁化可能な微小粒子の混合物が含まれる。本発明で有用な磁化可能な微小粒子は、好ましくは、酸化鉄又は酸化クロムコア及びポリマー性コーティングを有する。このようなコーティングは、好ましくは、スチレン単位を有するホモポリマー及びコポリマー、カルボキシル化スチレン単位を有するホモポリマー及びコポリマー又はアクリレートもしくはメタクリレート単位を有するホモポリマー及びコポリマーから作製される。微小粒子は、好ましくは実質的に球状であり、好ましくは約１μｍから約１０μｍ、好ましくは約４μｍから約５μｍの範囲の半径を有する。
【００５０】
バイハプテンは、固相に固定されたハプテンに対する抗体とそのハプテンの相互作用により固相に固定された抗体に結合される。バイハプテンは、続く反応及び洗浄段階中にはずれる特異的な結合メンバーが実質的にないような方法で固相に結合されるべきである。選択した特異的カップリング法にかかわらず、バイハプテンは、第一のハプテンに対する抗体に結合し、固相に結合された後は標識に連結された抗体に結合できなければならない。
【００５１】
当業者にとって公知のその他の固相には、反応トレイのウェルの壁、チューブ、ポリマー性ビーズ、ニトロセルロース片、膜などが含まれる。合成により修飾される、自然の、合成の、及び天然に生じる材料を固相の材料として使用することができる。このような材料には、多糖類、例えばセルロース性材料（例えば、紙及び、酢酸セルロース及びニトロセルロースなどのセルロース性誘導体）；シリカ；無機材料、例えば不活性アルミナ、珪藻土、ＭｇＳＯ４又は多孔ポリマー性マトリクス中に均一に分散されたその他の無機粉砕物質（このマトリクスは、塩化ビニルのホモポリマー及びコポリマー、例えばポリ塩化ビニル、塩化ビニルプロピレンコポリマー及び塩化ビニル−酢酸ビニルコポリマーなどの１以上のポリマー、天然（例えば綿）及び合成（例えばナイロン）の両方を含み得る。）；シリカゲル、アガロース、デキストラン及びゼラチンなどの多孔性ゲル；ポリアクリルアミドなどのポリマー性フィルムなどが含まれる。何れの場合も、固相は、所望の物理的形状を維持するのに十分な強度を有するべきであり、検出可能なシグナルの生成に干渉すべきでない。支持体によって強度を与えることができる。
【００５２】
ある実施形態において、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）自動分析装置（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、Ｉｌｌ）を用いることによりシグナルを検出することができる。この分析装置は、光を測定するための光電子増倍管を含む光学アセンブリを含有する。この機器は、米国特許第５，７９５，７８４号及び同５，８５６，１９４号（これら両方を参照により本明細書中に組み込む。）に記載されている。別の実施形態において、ＩＭｘ（Ｒ）自動分析装置（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、Ｉｌｌ）を用いることによりシグナルを検出することができる。この分析装置は、光源としてキセノン球を使用する蛍光偏光分光光度計を含む光学アセンブリを含有する。この機器は、米国特許第５，２９４，４０４号（参照により本明細書中に組み込む。）に記載されている。
【００５３】
蛍光標識を利用する本発明の態様において、本方法及びキットは、（ａ）ＦＫ７７８に対する抗体と、（ｂ）ＦＫ７７８又はＦＫ７７８の類似体及び第一のハプテンを含むバイハプテン、例えばフルオレセインハプテン及びＦＫ７７８ハプテンを含むトレーサーと、（ｃ）前処理試薬と、の使用を含む。バイハプテンは、抗体に結合されていないトレーサーと抗体に結合されたトレーサーとを区別することができる蛍光偏光シグナルを与える。
【００５４】
この態様の方法は、
（ａ）混合物［前記混合物は、（１）ＦＫ７７８を含有する疑いのある試験試料と、（２）ＦＫ７７８に対する又はＦＫ７７８の類似体に対する抗体と、（３）前処理試薬と、（４）必要ならば試料に対する希釈剤と、（５）第一のハプテン及びＦＫ７７８（又はＦＫ７７８の類似体）とを含むバイハプテントレーサーを含み、混合物（前記混合物は、（ｉ）非結合トレーサーと、（ｉｉ）前記抗体に結合されたトレーサーと、（ｉｉｉ）前期抗体に結合されたＦＫ７７８と及び（ｉｖ）非結合ＦＫ７７８とを含む。）を形成する。］を温置する段階；
（ｂ）蛍光偏光により、存在する前記抗体に結合したトレーサー及び非結合トレーサーの比を測定する段階；
（ｃ）測定された蛍光偏光シグナルから試験試料中のＦＫ７７８又はＦＫ７７８類似体の量を決定する段階
を含む。
【００５５】
本キットは、（ａ）ＦＫ７７８に対する抗体と、（ｂ）第一のハプテン及びＦＫ７７８又はＦＫ７７８の類似体を含むバイハプテンと、（ｃ）前処理試薬と、を含む。
【００５６】
ＦＫ７７８濃度に対するアッセイシグナルに関連する標準曲線は一般にＦＫ７７８の既知の濃度を含有するキャリブレーター溶液から作成される。好ましくは、検量線を得るために６個のキャリブレーターを使用するが、所望の結果の精密度及び精度に応じてこれより多い又は少ないキャリブレーターを使用することができる。好ましくは、キャリブレーターはＦＫ７７８の漸増量を含有する。これらの試験で使用されるＦＫ７７８キャリブレーターは、ｐＨ７．４のＴｒｉｓ緩衝液中で４％ウシ血清アルブミン及び抗菌剤を含有する。対照は通常、検量線又はアッセイ試薬の正当性を確認するために、アッセイと組み合わせて使用される。対照の調合はキャリブレーターの調合とは異なり得、ある対照のＦＫ７７８濃度は、キャリブレーターの何れとも同一ではない可能性がある。例えば、２０、７５及び１５０μｇ／ｍＬのＦＫ７７８濃度を有する対照は、表ＸＶＩのキャリブレーターに対して適切な対照であろう。当業者は、その他のキャリブレーター及び対照調合を案出することができよう。
【００５７】
この手順を通じて無菌状態を維持するために、系に抗菌剤を少量添加することが望ましいものであり得、これには、溶媒、抗生物質及び毒物が含まれ得る。
【００５８】
次の反応スキームは、４−Ｏ−アルキルカルボキシフェニルＦＫ７７８ハプテンの合成及びこれらのハプテンからのフルオレセイン及び化学発光トレーサーの調製を示す。反応スキーム中の記号を下記で挙げる：
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
ＮａＨ：水素化ナトリウム
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＬｉＯＨ：水酸化リチウム
ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＥＤＡＣ：１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩
ＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＭｅＯＨ：メタノール
Ｅｔ３Ｎ：トリメチルアミン
Ｋ２ＣＯ３：炭酸カリウム
ＣＨ２Ｃｌ２：ジクロロメタン
ＮａＮＯ２：亜硝酸ナトリウム
ＫＩ：ヨウ化カリウム
ＣＦ３Ｉ：ヨウ化トリフルオロメチル
Ｃｕ：銅粉末
Ｐｔ／Ｃ：炭素担持白金
【００５９】
スキーム１：ＦＫ７７８の４−Ｏ−ペンチルカルボキシフェニルハプテンの合成（７）
【００６０】
【化３】
2009522581.tif 000012
【００６１】
スキーム２：４−Ｏ−ペンチルカルボキシフェニルハプテン（７）からのＦＫ７７８−含有蛍光トレーサー（１０ａ−１０ｃ）の合成
【００６２】
【化４】
2009522581.tif 000013
【００６３】
スキーム３：化合物８からのＦＫ７７８−含有化学発光トレーサー（１２及び１４）の合成
【００６４】
【化５】
2009522581.tif 000014
【００６５】
スキーム４：ＦＫ７７８の４−Ｏ−プロピルカルボキシフェニルハプテンの合成（１９）
【００６６】
【化６】
2009522581.tif 000015
【００６７】
スキーム５：４−Ｏ−プロピルカルボキシフェニルハプテン（１９）からのＦＫ７７８−含有蛍光トレーサー（２１ａ−２１ｃ）の合成
【００６８】
【化７】
2009522581.tif 000016
【００６９】
スキーム６：化合物２０からのＦＫ７７８−含有蛍光トレーサー（２５ａ及び２５ｂ）の合成
【００７０】
【化８】
2009522581.tif 000017
【００７１】
次の反応スキームは、３−プロピルカルボキシフェニルＦＫ７７８ハプテンの合成及びそのハプテンからのフルオレセイントレーサーの調製を示す。
【００７２】
スキーム７：ＦＫ７７８の４−プロピルカルボキシフェニルハプテン（３０）の合成
【００７３】
【化９】
2009522581.tif 000018
【００７４】
スキーム８：４−プロピルカルボキシフェニルハプテン（３０）からのＦＫ７７８−含有蛍光トレーサー（３２ａ−３２ｃ）の合成
【００７５】
【化１０】
2009522581.tif 000019
【００７６】
スキーム９：ＦＫ７７８の３−Ｏ−ペンチルカルボキシフェニルハプテン（４２）の合成
【００７７】
【化１１】
2009522581.tif 000020
【００７８】
スキーム１０：３−Ｏ−ペンチルカルボキシフェニルハプテン（４２）からのＦＫ７７８−含有蛍光トレーサー（４４ａ−４４ｃ）の合成
【００７９】
【化１２】
2009522581.tif 000021
【００８０】
スキーム１１：化合物４３からのＦＫ７７８化学発光トレーサー（４５及び４６）の合成
【００８１】
【化１３】
2009522581.tif 000022
【００８２】
次の実施例は、本発明を例証するものであり、特許請求の範囲で定義される本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきものではない。パーセンテージは全て、別段の指示がない限り、グラム（ｇ）重量／１００ミリリットル（ｍＬ）、体積（ｗ／ｖ）である。
【実施例１】
【００８３】
次の手順に従い、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬから市販されているＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）機器によりＦＫ７７８アッセイを行った。米国特許第５，７９５，７８４号及び同５，８５６，１９４号（この両方を参照により本明細書中に組み込む。）も参照のこと。２０部のライン希釈剤（Ｌｉｎｅ  Ｄｉｌｕｅｎｔ）に対して１部の試料の割合で血清試料（１０μＬ）をライン希釈剤で希釈した。希釈試料の一部（１０μＬ）を連結試薬（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ）９０μＬ及びライン希釈剤５０μＬと混合した。６秒後、磁性微小粒子試薬（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ）５０μＬ及びバイハプテントレーサー試薬（５０μＬ）を前述の混合液に添加した。得られた混合液（２５０μＬ）を２５分間温置した。微小粒子をライン希釈剤１ｍＬで３回洗浄した。磁性粒子を洗浄と同時に磁石に引き付けた。洗浄した微小粒子をプレトリガー試薬（Ｐｒｅｔｒｉｇｇｅｒ  Ｒｅａｇｅｎｔ）（１００μＬ  酸性過酸化水素）で処理した。最後に、トリガー試薬（Ｔｒｉｇｇｅｒ  Ｒｅａｇｅｎｔ）（アルカリ性界面活性剤溶液（３００μＬ））を添加することにより化学発光反応を誘発した。光電子増倍管によって、生じた光の測定を行った。
【００８４】
洗浄緩衝液、プレトリガー試薬、トリガー試薬及びＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）機器を含むアッセイに必要な材料はＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬから市販されている。表１は、本発明のアッセイに適切な成分の代表例の組成を示す。
【００８５】
【表１】
2009522581.tif 000023
【００８６】
消泡剤は、操作中の試薬の泡立ちを防ぎ、機器に置かれた試薬の安定性を向上させ得る。表２は、本発明での使用に適切な連結試薬に対する組成を示す。
【００８７】
【表２】
2009522581.tif 000024
【００８８】
表ＩＩＩは、本発明での使用に適切な磁性微小粒子試薬に対する組成を示す。
【００８９】
【表３】
2009522581.tif 000025
【００９０】
表ＩＶは、本発明での使用に適切なバイハプテントレーサー試薬に対する組成を示す。
【００９１】
【表４】
2009522581.tif 000026
【実施例２】
【００９２】
次の実施例は、蛍光偏光免疫アッセイ（ＦＰＩＡ）方式の本発明のアッセイのある実施形態を示す。
【００９３】
バイハプテントレーサー（フルオレセイン誘導体に連結されたＦＫ７７８）をＩＭｘ（Ｒ）ＦＰＩＡライン希釈剤（１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．５、０．０１％ウシガンマグロブリン、０．１％アジ化ナトリウム）中で２０００ｎＭの濃度に希釈し、トレーサー試薬を調製した。ＦＫ７７８に対するモノクローナル抗体をＩＭｘ（Ｒ）ＦＰＩＡライン希釈剤中で１００μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、抗体試薬を調製した。２％ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）を１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．５中で０．０５％ＬＤＳの最終濃度に希釈することによって、第三の試薬、ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）前処理試薬を調製した。ＬＤＳ前処理試薬を使用して、試料中で血清アルブミンに結合したＦＫ７７８又はバイハプテントレーサーを全て解離させた。合成マトリクス中でキャリブレーター及び対照を調製し、濃度を０から２５０μｇ／ｍＬ  ＦＫ７７８の範囲にした。
【００９４】
試料（２０μＬ）及びＩＭｘ（Ｒ）ＦＰＩＡライン希釈剤（７８０μＬ）を吸引し、試料カップの前希釈ウェルに添加することによってＩＭｘ（Ｒ）機器において試料に対する前希釈段階を行い、次いで３０秒間温置した。ＬＤＳ（７５μＬ）、ＩＭｘ（Ｒ）ＦＰＩＡライン希釈剤（９０５μＬ）及び試料（２０μＬ）（即ちキャリブレーター、対照又は検体）を吸引し、ＩＭｘ（Ｒ）キュベットに添加した。得られた溶液を５分間温置し、次いでブランクを読み取った。バイハプテントレーサー（７５μＬ、２０００ｎＭ）、ＦＫ７７８に対するモノクローナル抗体（７５μＬ）、試料（２０μＬ）及びＩＭｘ（Ｒ）ＦＰＩＡライン希釈剤（８３０μＬ）を吸引し、元のキュベットに添加した。得られた溶液を５分間温置し、その後、２回目の読み取りを行った。表Ｖは、検量線に対する値を示す。図２は、蛍光偏光免疫アッセイでの使用に適切なＦＫ７７８に対する用量反応の例である。
【００９５】
【表５】
2009522581.tif 000027
【実施例３】
【００９６】
この実施例の目的は、抗体被覆微小粒子の調製を示すことである。抗体で被覆された微小粒子を次のように調製した：
微小粒子をまとめて洗浄した。ピペットを用いてＭＥＳ緩衝液（３２ｍＬ）を遠沈管（５０ｍＬ）に移した。微小粒子（８ｍＬ、５％固体）を遠沈管中のＭＥＳ緩衝液に添加した。外側から磁力をかけることによって微小粒子を緩衝液から分離し、液体を除去した。ＭＥＳ緩衝液（４０ｍＬ）中で微小粒子を再懸濁した。微小粒子を磁性化し、液体を除去した。微小粒子をＭＥＳ緩衝液中で再懸濁した（３２ｍＬ、１．２５％固体）。
【００９７】
微小粒子に添加する前に抗体を低ｐＨで処理する。抗−ＦＩＴＣ抗体（５．５５ｍｇ／ｍＬ、１．４４１ｍＬ）をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４（２．５５９ｍＬ）で２ｍｇ／ｍＬ溶液に希釈した。抗−ＦＩＴＣ抗体（４．０ｍＬ）にＰＢＳ（４．０ｍＬ、ｐＨ１．７）を添加し、得られた溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を５分間温置し、次いで洗浄した微小粒子（３２．０ｍＬ）に添加した。室温で回転させながら、抗体とともに１０分間、微小粒子を温置した。微小粒子を磁性化し、液体を除去した。微小粒子をＭＥＳ緩衝液（４０．０ｍＬ）中で再懸濁した。
【００９８】
ＥＤＡＣ（３３．１ｍｇ）をＭＥＳ緩衝液（１．６５５ｍＬ）中で溶解し、２０ｍｇ／ｍＬの濃度の溶液を得た。抗体被覆微小粒子（４０ｍＬ）にＥＤＡＣ溶液（４００μＬ）を添加した。混合物を室温にて回転させながら３０分間温置した。磁性化によって微小粒子を分離し、液体を除去した。ウシ血清アルブミン／Ｔｗｅｅｎ（Ｒ）２０／Ｔｒｉｓ緩衝液（４０ｍＬ）の混合液で微小粒子を洗浄した。ウシ血清アルブミン／Ｔｗｅｅｎ（Ｒ）２０／Ｔｒｉｓ緩衝液（４０ｍＬ）の混合液中で微小粒子を再懸濁し、微小粒子が沈殿しないように、回転させながら室温にて１０分間温置した。微小粒子を磁力により分離し、液体を除去した。微小粒子を微小粒子希釈剤（４０ｍＬ）中で再懸濁した。微小粒子希釈剤は、表Ｉで示される磁性微小粒子試薬の成分（微小粒子は含まない。）を含む。微小粒子を磁性化し、液体を除去した。微小粒子希釈剤（４０ｍＬ）中で微小粒子を再懸濁し、冷蔵下で保存した（１％固体）。
【００９９】
使用前に、微小粒子希釈剤を用いて１％から０．１％固体に微小粒子を希釈した。図３は、微小粒子を被覆するためのプロセスを示すフローチャートである。
【実施例４】
【０１００】
この実施例は、アクリジニウム標識に連結された抗体を含む連結物の調製について述べる。図４は、本発明のアッセイでの使用に適切な連結物を調製するための手順を示す。
【０１０１】
必要に応じて７．２ｍｇ／ｍＬより高い濃度にＦＫ７７８に対する抗体を濃縮する。ＣＰＳＰ活性エステル（４ｍｇ／ｍＬ）をＤＭＦ中で調製した。連結緩衝液を調製した。ＦＫ７７８に対する抗体（２０ｍｇ）、連結緩衝液（２００μＬ）、ＣＰＳＰ活性エステル（２４μｇ；４ｍｇ／ｍＬエステル  ６μＬ）及びＰＢＳを含有する反応混合液（３ｍＬ）を調製した。この混合液を室温で２０分間反応させた。反応後、得られた産物を透析装置（Ｓｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒ）に移し、ここで、２５０ｍＬ透析緩衝液に対して少なくとも２４時間、４℃で透析した。透析済み反応混合液を０．２ミクロンフィルターに通してろ過した。１ｃｍキュベットでの吸収を３７０ｎｍで測定した。２８０ｎｍでも１ｃｍキュベットでの吸収を測定した。アクリジニウム取り込み率を計算した（目標は０．２５）。サイズ排除ＨＰＬＣを用い、凝集及び遊離ＣＰＳＰを測定した。連結物希釈剤中３００μｇ／ｍＬの濃度に連結物を希釈した（１０００Ｘ）。
【０１０２】
ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）機器は、相対的光単位（ＲＬＵ）でアッセイシグナルを測定する。ＦＫ７７８アッセイにおいて、キャリブレーターＦのＦＫ７７８濃度は２５０μｇ／ｍＬである。キャリブレーターＡは検体不含である。
【０１０３】
ＦＫ７７８の低濃度及び高濃度の両方を高い精度及び精密度で測定できるように、用量反応曲線の形を最適化した。ＦＫ７７８の極低濃度（＜１０μｇ／ｍＬ）は臨床的意義はないが、約５０から約１５０μｇ／ｍＬの範囲の濃度は治療的に有効である。ＦＫ７７８検体の濃度を変化させたところ、ＦＫ７７８−フルオレセインバイハプテントレーサー及び連結物は最適な曲線形態を与えた。
【実施例５】
【０１０４】
この実施例の目的は、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）機器に対して設計されたＦＫ７７８のためのアッセイに対する、機器に置かれた試薬の安定性を示すことである。
【０１０５】
消泡剤（Ａｎｔｉｆｏａｍ１０％活性、カタログ番号ＡＦ９０２０、ＧＥ  Ｓｉｌｉｃｏｎｅｓ、Ｗａｔｅｒｆｏｒｄ、ＮＹ  １２１８８）が最適でない場合、３０日間の機器上での試薬保管中、アッセイシグナルが時間依存的に少々上昇すること（ＦＫ７７８濃度の低下）が観察され得る。以前の実験から、微小粒子試薬中の消泡剤濃度を高めることによってドリフトを小さくすることができることが示された。下記のように、さらにドリフトを小さくするために、高濃度の消泡剤を有する試薬を試験した。輸送時のストレスを摸倣するように設計した室温での振盪試験（６０分間）に前もって供した試薬を用いて、機器上での安定性試験を行った。第３１−３３日からの平均対照値−第１−５日に対する平均対照値としてドリフトを計算した。表ＶＩは、消泡剤濃度の関数として％ドリフトを示す。
【０１０６】
【表６】
2009522581.tif 000028
【０１０７】
機器２において４００ｐｐｍの消泡剤濃度でさらなる３０日間の機器上での安定性試験を行い、この結果から、ドリフトが極めて小さくなることが示された。全体的精度（ドリフトを含む。）は、１０％の上限％ＣＶを十分に下回った。表ＶＩＩは、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）に置き保管した試薬を用いて行った３０日間精密試験の精度及びドリフトの結果を示す。
【０１０８】
【表７】
2009522581.tif 000029
【０１０９】
図５は、機器への搭載日数の関数として、ＦＫ７７８の濃度を示す。
【実施例６】
【０１１０】
この実施例は、精密試験の結果を示す。両方のアッセイ対照（合成マトリクス）に対して、及び薬物を添加した血清において、精度を評価するために、３８日間（２０個の試験ポイント）にわたり、３台のＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）機器において、ＦＫ７７８試薬の３種類のロットを試験した。下記でまとめた結果から、両対照及び２０−２００μｇ／ｍＬの範囲の血清の総％ＣＶが５％以下となることが示される。
【０１１１】
第０日及び第１５日に検定を行った。試薬の３種類のロットを機器ごとに使用した。３８日間にわたり、そのうち２０日間、各日２回の測定を行った。デュプリケート対照及び血清パネルを測定ごとに使用した。Ｎ＝７２０。表ＶＩＩＩ及びＩＸにおいて下記でまとめた結果から、両対照及び２０−２００μｇ／ｍＬの範囲の血清の総％ＣＶが５％以下となることが示される。
【０１１２】
【表８】
2009522581.tif 000030
【０１１３】
【表９】
2009522581.tif 000031
【実施例７】
【０１１４】
この実施例の目的は、液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析（本明細書中で以後、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により決定されたＦＫ７７８濃度に対するアッセイ結果とＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）機器により決定したＦＫ７７８濃度に対するアッセイ結果との相関を示すことである。外部ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法により既に試験した凍結肝臓移植検体のプールをＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）機器で再試験し、内測法により得られたＬＣ／ＭＳ／ＭＳの結果と比較し、外測法に合致するように最適化した。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法では、独立に調製したキャリブレーターを使用した。
【０１１５】
【表１０】
2009522581.tif 000032
【０１１６】
この結果から、独立に調製したキャリブレーターを用いる場合でも、参照方法と優れた相関を得ることができることが示される。
【実施例８】
【０１１７】
この実施例は、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）機器でのＦＫ７７８に対するアッセイにおいてリウマチ因子（ＲＦ）による干渉がないことを示す。ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）機器を利用したアッセイでの干渉について、ＲＦ（ＩｇＧのＦｃ部分に対する抗体）レベルが上昇している臨床検体を試験した。薬物有り又は無しで検体を試験した。表ＸＩで示す結果から、薬物無しで試料を試験した場合、干渉がないことが示される。これらの試料により、薬物回収において１０％を超えるある程度の変動があったが、平均回収は１０２％であり、ＲＦレベルに相関する強い偏向はなかった。
【０１１８】
【表１１】
2009522581.tif 000033
【実施例９】
【０１１９】
この実施例は、ヒト抗−マウス抗体（ＨＡＭＡ）干渉の影響を示す。アッセイにおいて試料として１ｍｇ／ｍＬの濃度の精製ヒト抗−マウス抗体（ＨＡＭＡ）を試験し、０．２６μｇ／ｍＬと読み取ったが、これは、およそ１．５μｇ／ｍＬの検出限界を十分に下回っていた。この結果から、試薬中に存在するマウスＩｇＧがＨＡＭＡの影響を阻止したことが確認された。
【実施例１０】
【０１２０】
この実施例は、処方薬による干渉を示す。ＮＣＣＬＳ文書ＥＰ−７Ｐで推奨されるレベルで４５種類の処方薬のうち４４種類に対して干渉について試験した。試料中のＦＫ７７８の存在下及びＦＫ７７８の非存在下で干渉を試験した。５μｇ／ｍＬを超えるもの（ＦＫ７７８なし）又は１０％を超えるもの（ＦＫ７７８あり）として干渉を定義した。フルオレセイン及びＡ７７，１７２６（レフルノミドの活性代謝産物）のみで干渉が観察された。両方の干渉が予想されたが、これは、フルオレセインの場合、ＦＫ７７８−フルオレセインバイハプテントレーサーとのフルオレセインの競合のためであり、Ａ７７，１７２６の場合、ＦＫ７７８に対するその構造類似性のためである。表ＸＩＩは、干渉試験の結果を示す。
【０１２１】
【表１２】
2009522581.tif 000034
2009522581.tif 000035
【０１２２】
眼において血流を測定するためにフルオレセインがインビボ診断手順で使用され、移植を受けている患者において存在しないと予想される。それにもかかわらず、４００μｇ／ｍＬ未満の濃度での干渉の程度を推定するためにさらに徹底してフルオレセインを試験した。表ＸＩＩＩで示す得られたデータから、干渉が３０から５０μｇ／ｍＬの範囲で１０％以下に低下することが示される。
【０１２３】
【表１３】
2009522581.tif 000036
【０１２４】
ＦＫ７７８の存在下及び非存在下でのこの分子の交差反応性を評価するために、Ａ７７，１７２６を用いてさらなる試験も行った。表ＸＩＶの結果から、競合する大量のＦＫ７７８存在下では、％交差反応性が上は４７％から下は１３％まで変動したことが示される。
【０１２５】
【表１４】
2009522581.tif 000037
【実施例１１】
【０１２６】
この実施例の目的は、ＦＫ７７８代謝産物Ｍ１及びＭ３を干渉について試験することである。表ＸＶで示されるように、ＦＫ７７８非存在下での干渉物質としてＦＫ７７８代謝産物を試験した。ＦＫ７７８に対する抗体の特異性から予想されるように、交差反応性はＭ１に対しては測定不可能であり、Ｍ３に対しては僅かおよそ１％である。Ｍ１及びＭ３の構造を下記で示す。
【０１２７】
【化１４】
2009522581.tif 000038
【０１２８】
【表１５】
2009522581.tif 000039
【実施例１２】
【０１２９】
この実施例は、ＦＫ７７８アッセイのための試薬における熱ストレス及び凍結融解の影響を示す。凍結下、４℃、２２℃、３０℃及び４５℃で試薬を５日間保存し、許容可能な検量線を維持する能力について試験した。データを表ＸＶＩで示す。４５℃でのみＲＬＵシグナルの顕著な変化が見られた（ＲＬＵがＣａｌＡからＣａｌＣで低下し、ＲＬＵがＣａｌＥ及びＣａｌＦで上昇した。）。それにもかかわらず、４５℃でストレスを与えた試薬は許容可能な曲線の形を維持した。測定データはＲＬＵである。
【０１３０】
【表１６】
2009522581.tif 000040
【実施例１３】
【０１３１】
この実施例は、微生物接種に対する、ＦＫ７７８のためのアッセイで使用される試薬の安定性を示す。ＦＫ７７８を含有する組成物に、組成物中での抗菌剤の有効性を調べるために及びアッセイ性能における微生物の影響を試験するために使用される標準的な微生物パネルを添加した。
【０１３２】
抗菌的な有効性を試験するために、試料を室温で保存し、１４及び２８日で微生物数について試験した。添加した組成物もまた、２から８℃の範囲の温度で３７日間温置し、次いでアッセイした（２１回の繰り返しでのキャリブレーター及び対照）。表ＸＶＩＩ、ＸＶＩＩＩ、ＸＩＸ、ＸＸは、これらの微生物が抗菌剤により殺菌され、何ら性能の低下を引き起こさないことを示唆する。表ＸＶＩＩ及びＸＶＩＩＩのデータは、微生物数を示す。表ＸＩＸ、ＸＸ及びＸＸＩのデータは、ＲＬＵでのシグナルを示す。
【０１３３】
【表１７】
2009522581.tif 000041
【０１３４】
【表１８】
2009522581.tif 000042
【０１３５】
【表１９】
2009522581.tif 000043
【０１３６】
【表２０】
2009522581.tif 000044
【実施例１４】
【０１３７】
この実施例の目的は、複数のロットの安定性を示すことである。最終調合物である試薬の３種類の独立したロットを低温で保存し、これらの長期間の安定性を調べた。さらに、キャップライナーとの長期接触の影響を調べるために逆さにして１つのロットを試験した。試験の最初の月には、１つのロットでの輸送ストレス試験も含まれた。結果を表ＸＸＩで示す。長期保存の主作用がＲＬＵシグナルが徐々に低下することであることが予想されるが、この測定を表ＸＸＩで報告する。Ｂ／Ａ比により曲線の形の安定性を評価し、これも報告する。輸送ストレスデータから、曲線のＣａｌＡ−Ｄ領域でＲＬＵ低下が加速するが、許容可能なＢ／Ａが維持されることが示される。測定データはＲＬＵである。
【０１３８】
【表２１】
2009522581.tif 000045
【０１３９】
本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の様々な修飾及び変更が当業者に対して明らかとなろうし、本発明が本明細書中で示される例証となる実施形態に過度に限定されないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】図１は、本発明の競合アッセイのある実施形態を示す概略図である。
【図２】図２は、蛍光偏光免疫アッセイにおいて、ＦＫ７７８をＦＫ７７８のフルオレセイン誘導体及びＦＫ７７８に対する抗体と混合することにより作成した用量反応曲線を示すグラフである。
【図３】図３は、微小粒子を被覆するためのプロセスを示すフローチャートである。
【図４】図４は、本発明の連結物を調製するためのプロセスを示すフローチャートである。この連結物は化学発光標識を利用する。
【図５】図５は、ＦＫ７７８を含有する溶液をＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）装置上で保管した場合の、終夜測定したＦＫ７７８含有溶液の安定性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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