(57)【要約】パーフォリン−２（Ｐ２）分子は孔形成タンパク質である。前記パーフォリン−２の５’非翻訳領域は翻訳活性を制御する。組成物は前記パーフォリン２タンパク質及び前記５’非翻訳領域を含む。使用方法は疾患の治療での治療用化合物の同定するためのハイスループットスクリーニングアッセイを含む。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
パーフォリン２の５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）の配列番号１、２、５−１４と、これらの断片、バリアント、突然変異体及び類似体と、及び／又は、これらと実質的に類似する配列とを含む核酸分子を含むことを特徴とする、組成物。
【請求項２】
前記核酸分子は恒常型又は誘導型のプロモーターに操作可能に連結されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記核酸分子は、少なくとも１個の内部リボソーム進入部位、パーフォリン２の翻訳領域及び／又はリポーター核酸配列をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記パーフォリン２は配列番号３又は４であることを特徴とする、請求項３の組成物。
【請求項５】
パーフォリン２の５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）の配列番号１、２、５−１４と、これらの断片、バリアント、突然変異体及び類似体と、及び／又は、これらと実質的に類似する配列とを含むことを特徴とする、核酸分子。
【請求項６】
パーフォリン２の翻訳領域及び／又はリポーターの核酸配列をさらに含むことを特徴とする、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
前記パーフォリン２は配列番号３又は４であることを特徴とする、請求項６に記載の核酸分子。
【請求項８】
パーフォリン２の５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）の配列番号１、２、５−１４と、これらの断片、バリアント、突然変異体及び類似体と、及び／又は、これらと実質的に類似する配列とを含むことを特徴とする、発現ベクター。
【請求項９】
配列番号１、２、５−１４の分子は、恒常型又は誘導型のプロモーターに操作可能に連結されることを特徴とする、請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
前記核酸分子は、内部リボソーム進入部位、パーフォリン２の翻訳領域及び／又はリポーター核酸配列をさらに含むことを特徴とする、請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
前記パーフォリン２は配列番号３又は４であることを特徴とする、請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
パーフォリン２の５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）の配列番号１、２、５−１４と、これらの断片、バリアント、突然変異体及び類似体と、及び／又は、これらと実質的に類似する配列と、及び／又は、パーフォリン−２分子の配列番号３又は４とに特異的に結合することを特徴とする、抗体。
【請求項１３】
第１のリポーター分子、パーフォリン２の５’−非翻訳領域及び第２のリポーター分子に操作可能に連結されたプロモーターを含むベクターであって、該パーフォリン２の５’−非翻訳領域は、少なくとも１個の内部リボソーム進入部位と、これらのトランス活性化因子とを含むことを特徴とする、ベクター。
【請求項１４】
それぞれのリポーター分子の３’末端に終止コドンをさらに含むことを特徴とする、請求項１３に記載の発現ベクター。
【請求項１５】
単シストロン性又は２シストロン性であることを特徴とする、請求項１３に記載の発現ベクター。
【請求項１６】
それぞれのリポーター分子の５’末端に開始コドンをさらに含むことを特徴とする、請求項１３に記載の発現ベクター。
【請求項１７】
前記リポーター分子は、アルカリホスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ又は蛍光タンパク質を含むことを特徴とする、請求項１３に記載の発現ベクター。
【請求項１８】
前記パーフォリン２の５’−非翻訳領域は突然変異を含むことを特徴とする、請求項１３に記載の発現ベクター。
【請求項１９】
前記パーフォリン２の５’−非翻訳領域は、配列番号１、２、５−１４と、これらの断片、バリアント、突然変異体及び類似体と、及び／又は、これらと実質的に類似する配列とを含むことを特徴とする、請求項１３に記載の発現ベクター。
【請求項２０】
パーフォリン２の配列番号３又は４をエンコードしている核酸分子を含むことを特徴とする、請求項１３に記載の発現ベクター。
【請求項２１】
発現ベクターを含む細胞であって、該ベクターは、配列番号１、２、５−１４と、これらの断片、バリアント、突然変異体及び類似体と、及び／又は、これらと実質的に類似する配列とを含む少なくとも１個のパーフォリン２の５’−非翻訳領域を含むことを特徴とする、細胞。
【請求項２２】
配列番号１、２、５−１４の分子は恒常型又は誘導型のプロモーターと操作可能に連結されることを特徴とする、請求項２１に記載の細胞。
【請求項２３】
前記ベクターは、内部リボソーム進入部位、パーフォリン２の翻訳領域及び／又はリポーター核酸配列をさらに含むことを特徴とする、請求項２１に記載の細胞。
【請求項２４】
原核細胞又は真核細胞であることを特徴とする、請求項２１に記載の細胞。
【請求項２５】
請求項１３に記載の前記ベクターを含むことを特徴とする、細胞。
【請求項２６】
２シストロン性ｃＤＮＡベクターを発現する細胞を提供すること、治療用化合物候補とともに前記細胞及び対照細胞を培養すること、内部リボソーム進入活性を定量するためにリポーター分子の発現量を測定すること、及び、治療用化合物を同定することを含み、前記ベクターは、内部リボソーム進入部位及びそのトランス活性化因子を含むパーフォリン２の５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）の配列番号１、２、５−１４の核酸配列と操作可能に連結された第１のリポーター分子と、第２のリポーター分子とを含むことを特徴とする、治療用化合物を同定する方法。
【請求項２７】
前記第１のリポーター及び前記第２のリポーターが異なる分子であることを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記内部リボソーム進入部位の活性は、それぞれのリポーター分子の発現量を測定することにより、及び／又は、前記第１リポーター分子の発現量に対する前記第２リポーター分子の発現量の比率として測定されることを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記リポーター分子は、アルカリホスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ又は蛍光タンパク質を含むことを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１及び第２のリポーターが２つの異なるルシフェラーゼ分子であることを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１のリポーター分子がウミシイタケ・ルシフェラーゼであり、かつ、前記第２のリポーターがホタル・ルシフェラーゼであることを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記内部リボソーム進入部位の活性での増大が前記第２のリポーター分子の発現量を増大させることを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞は原核細胞又は真核細胞であることを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
前記プロモーターは恒常型又は誘導型のプロモーターであることを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】
前記ベクターは、パーフォリン２の配列番号３又は４をエンコードする核酸分子を含むことを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項３６】
ハイスループットスクリーニングアッセイであることを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項３７】
パーフォリン２の５’−非翻訳領域（ＵＴＲ）をエンコードしている発現ベクターを含む細胞を提供すること、治療用化合物候補とともに細胞を培養すること、候補分子の存在下及び非存在下でリポーター分子及び／又は遺伝子の発現量を測定すること、前記リポーター分子の発現量を比較すること、及び、治療用化合物を同定することを含み、前記発現ベクターは、前記リポーター分子に操作可能に連結された内部リボソーム進入部位を含むことを特徴とする、治療用化合物を同定するスクリーニングアッセイ。
【請求項３８】
前記リポーター分子はルシフェラーゼ又は蛍光分子であることを特徴とする、請求項３７に記載のスクリーニングアッセイ。
【請求項３９】
内部リボソーム進入部位の活性は治療用化合物候補に応答して増大することを特徴とする、請求項３７に記載のスクリーニングアッセイ。
【請求項４０】
前記内部リボソーム進入部位の活性はリポーター分子の発現量及び／又は遺伝子発現により測定されることを特徴とする、請求項３７に記載のスクリーニングアッセイ。
【請求項４１】
活性の増大はリポーター分子の発現量及び／又は遺伝子発現を増大させることを特徴とする、請求項３７に記載のスクリーニングアッセイ。
【請求項４２】
パーフォリン２ｍＲＮＡを産生する細胞を提供すること、該細胞を試験化合物と接触させること、試験化合物と接触させた前記細胞におけるパーフォリン２タンパク質の産生量を測定すること、該パーフォリン２の産生量を、前記化合物の非存在下で成長した細胞によるパーフォリン２の産生量と比較すること、及び、細胞内でパーフォリン２の翻訳を増大させる化合物を同定することを含むことを特徴とする、細胞内でパーフォリン２の翻訳を増大させる化合物を同定する方法。
【請求項４３】
前記細胞は哺乳類の細胞であることを特徴とする、請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞は、繊維芽細胞、樹状細胞、マクロファージ、単球又はリンパ球であることを特徴とする、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
対照細胞と、パーフォリン２発現ベクターを含む試験細胞とを提供すること、前記細胞を試験化合物に接触すること、前記試験化合物と接触した前記試験細胞が前記試験化合物の非存在下で成長した前記対照細胞よりもより多くのリポータータンパク質を産生する場合に、前記試験化合物を抗生物質として同定することを含み、前記ベクターは、前記リポータータンパク質をエンコードするリポーター配列と操作可能に連結された５’非翻訳領域配列を含む、発現配列と操作可能に連結されたプロモーターを含むことを特徴とする、抗生物質を同定する方法。
【請求項４６】
前記ベクターは配列番号３又は４をさらに含むことを特徴とする、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記５’−非翻訳領域配列（５’−ＵＴＲ）は、配列番号１、２、５−１４のうち少なくとも１個の配列を含むことを特徴とする、請求項４５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗生物質、抗癌剤及び創薬の分野に関する。より具体的には、細菌感染及び腫瘍に対する人体の自然防御を増強するのに有用な方法及び化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
パーフォリンは、ＣＤ８  Ｔ−細胞及びＮＫ細胞の顆粒で発見された細胞傷害性タンパク質である。脱顆粒の際、パーフォリンは標的細胞の細胞膜に挿入されて孔を形成する。発明者の研究室（非特許文献１及び２）及びＳｉｎｋａｉら（非特許文献３）によるパーフォリンのクローニングは、補体成分Ｃ９とパーフォリンとに相同性があり、両者は親水性で水溶性の前駆体として合成される孔形成体であるとの仮説（非特許文献４）を立証した。両者は、水で満たされた大きな膜貫通孔を形成するために、脂質二重層に挿入され、脂質二重層内で重合される場合がある。前記水で満たされた孔は、円柱状のタンパク質−多量体でできている。
【０００３】
円柱の外部は脂質コア内に固定されるために疎水性となる必要があるが、該円柱の内部は水で満たされた孔を形成するために表面が親水性でなければならない。この孔構造は両親媒性のへリックス（ヘリックス  ターン  へリックス）によって形成されると考えられる。パーフォリンと、Ｃ９その他の補体膜侵襲複合体（ＭＡＣ）形成する補体タンパク質との間で最も保存されるのは、タンパク質のドメインのこの部分、すなわち、いわゆるＭＡＣ−Ｐｆ（膜侵襲複合体／パーフォリン）ドメインである。
【０００４】
ＭＡＣ−Ｐｆドメインを有するタンパク質を予測させるヒト及びマウスのマクロファージで発現するｍＲＮＡ（Ｍｐｇ１又はＭｐｅｇ１−マクロファージ発現遺伝子と命名）は、Ｓｐｉｌｓｂｕｒｙによって初めて記載された（非特許文献５）。その後、同一のｍＲＮＡ（ＭＰＳ−１と命名）が実験的プリオン病で上向き調節されることが発見された。Ｄｅｓｊａｒｄｉｎらのグループは、ラテックスビーズを貪食させたマクロファージから単離された食胞膜のタンパク質組成を二次元ゲル電気泳動及び質量分析によって解析した（非特許文献６）。前記文献の著者はＭＳＰ−１タンパク質に対応するタンパク質スポットを見出した。Ｍａｈらは軟体動物アワビを解析し、血液中にＭｐｅｇｌ遺伝子ファミリーに相同なｍＲＮＡを発見し（非特許文献７）、予測されたタンパク質は、ＣＴＬパーフォリンと類似の機能を有するが、軟体動物の自然免疫系の一部であると示唆した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｌｉｃｈｔｅｎｈｅｌｄ，  Ｍ．Ｇ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３５：４４８−４５１（１９８８）．
【非特許文献２】Ｌｏｗｒｅｙ，  Ｄ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：２４７−２５１（１９８９）．
【非特許文献３】Ｓｈｉｎｋａｉ，  Ｙ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５２５−５２７（１９８８）．
【非特許文献４】ＤｉＳｃｉｐｉｏ，  Ｒ．Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１：７２９８−７３０２（１９８４）．
【非特許文献５】Ｐｏｄａｃｋ，  Ｅ．Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３  ０２：４４２−４４５（１９８３）．
【非特許文献６】Ｐｏｄａｃｋ，  Ｅ．Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７９：５７４−５７８（１９８２）．
【非特許文献７】Ｐｅｉｔｓｃｈ，  Ｍ．Ｃ．ら、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２７：５８９−６０２（１９９０）．
【非特許文献８】Ｓｐｉｌｓｂｕｒｙ，  Ｋ．ら、Ｂｌｏｏｄ  ８５：１６２０−１６２９（１９９５）．
【非特許文献９】Ｋｏｐａｃｅｋ，  Ｊ．ら、  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７４：４１１−４１７（２０００）．
【非特許文献１０】Ｇａｒｉｎ，  Ｊ．ら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５２：  １６５−１８０（２００１）．
【非特許文献１１】Ｍａｈ，  Ｓ．Ａ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３  １６：４６８−４７５（２００４）．
【非特許文献１２】Ｗｉｅｎｓ，  Ｍ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８０：２７９４９−２７９５９（２００５）．
【非特許文献１３】Ｄｅｎｎｅｒｔ，  Ｇ．ら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １５７：１４８３−１４９５（１９８３）．
【非特許文献１４】Ｄｕｎｃａｎ，  Ｒ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６２：３８０−３８８（１９８７）．
【非特許文献１５】Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，  Ｎ．ら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １０：２６８−２７５（１９９８）．
【非特許文献１６】Ｓｔｏｎｅｌｅｙ，  Ｍ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３：３２００−３２０７（２００４）．
【非特許文献１７】Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，  Ｊ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：  １２２８５−１２２９１（２００１）．
【非特許文献１８】Ｈｅｎｉｓ−Ｋｏｒｅｎｂｌｉｔ，  Ｓ．ら、ＭｏＩ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２０：４９６−５０６（２０００）．
【非特許文献１９】Ｈｏｌｃｉｋ，  Ｍ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９：４１７４−４１７７（２０００）．
【非特許文献２０】Ｍｏｒｒｉｓｈ，  Ｂ．Ｃ．ら、ＭｏＩ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２２：６０８９−６０９９（２００２）．
【非特許文献２１】Ｓｔｏｎｅｌｅｙ，  Ｍ．ら、ＭｏＩ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２０：１１６２−１１６９（２０００）．
【非特許文献２２】Ｌａｎｇ，  ＫＪ．ら、ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  １３：１７９２−１８０１（２００２）．
【非特許文献２３】Ｓｔｅｉｎ，  Ｉ．ら、ＭｏＩ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １８：３１１２−３１１９（１９９８）．
【非特許文献２４】Ｃｏｌｄｗｅｌｌ，  ＭＪ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０：４０９５−４１００（２００１）．
【非特許文献２５】Ｂｒａｓｅｙ，  Ａ．ら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７：３９３９−３  ９４９（２００３）．
【非特許文献２６】Ｃｏｒｎｅｌｉｓ，  Ｓ．ら、ＭｏＩ  Ｃｅｌｌ  ５：５９７−６０５（２０００）．
【非特許文献２７】Ｍａｉｅｒ，  Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：  １５４８０−１５４８５（２００２）．
【非特許文献２８】Ｑｉｎ，  Ｘ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９：  １３７２  １−１３７２８（２００４）．
【非特許文献２９】Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，  Ｓ．Ａ．ら、ＭｏＩ  Ｃｅｌｌ  １１：７５７−７７１（２００３）．
【非特許文献３０】Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，  Ｓ．Ａ．ら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １９：１５５６−１５７１（２００５）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
多剤耐性とは、病的な細胞の根絶を補助するために設計される化合物に該細胞が抵抗できることをいう。病的な細胞は、真菌細胞、細菌細胞及びウイルスに感染された細胞と、新生物（腫瘍）の細胞とを含むが、これらに限られない。現在多剤耐性を有する多くの異なる細菌は、ブドウ状球菌、腸球菌、淋菌、レンサ球菌、サルモネラ菌等を含む。さらに、いくつかの耐性細菌は耐性機構をコードするＤＮＡのコピーを他の細菌に伝達可能であり、これによって周囲の菌に耐性を与え、該周囲の菌も前記耐性遺伝子を伝達できる。
【０００７】
細菌は、例えば、もはや糖タンパク質細胞壁に依存しなくなるか、抗生物質を酵素で不活性化するか、抗生物質に対する細胞壁の浸透性を低下させるか、あるいは、抗生物質を除去するために抗生物質の排出機構の標的部位を変化させるかすることによって抗生物質に適応することができる。癌細胞も複数の異なる薬剤に耐性となる能力を有する。癌細胞が多剤耐性になる機構の多くは、細菌によって用いられる機構と類似である。したがって、新たなやり方で病的な細胞を攻撃する新規薬剤によって多剤耐性を克服する必要性が増大している。
【０００８】
ここで引用される全ての科学論文及び特許文献は、全ての目的のために引用によりその全体が本明細書に取り込まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
要約
抗体、抗癌剤及び薬剤創薬を同定する組成物及び方法
好ましい実施態様では、組成物は、パーフォリン２の５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）の配列番号１、２、５−１４と、これらの断片、バリアント（ｖａｒｉａｎｔｓ）、突然変異体及び類似体と、及び／又は、これらと実質的に類似する配列とを含む核酸分子を含む。前記核酸分子は、恒常型又は誘導型プロモーターと操作可能に連結される。
【００１０】
別の好ましい実施態様では、前記核酸分子は、少なくとも１個の内部リボソーム進入部位、パーフォリン２の翻訳領域及び／又はリポーター核酸配列をさらに含む。
【００１１】
別の好ましい実施態様では、前記核酸分子は、少なくとも１個の内部リボソーム進入部位、パーフォリン２の翻訳領域及び／又はリポーター核酸配列をさらに含む。
【００１２】
別の実施態様では、パーフォリン−２は配列番号３又は４である。
【００１３】
別の好ましい実施態様では、核酸分子は、パーフォリン２の５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）の配列番号１、２、５−１４と、これらの断片、バリアント、突然変異体及び類似体と、及び／又は、これらと実質的に類似する配列とを含む。
【００１４】
別の好ましい実施態様では、核酸分子は、パーフォリン２の翻訳領域及び／又はリポーターの核酸配列をさらに含む。前記パーフォリン−２は配列番号３又は４であることが好ましい。
【００１５】
別の好ましい実施態様では、発現ベクターは、パーフォリン２の５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）の配列番号１、２、５−１４と、これらの断片、バリアント、突然変異体及び類似体と、及び／又は、これらと実質的に類似する配列とを含む。
【００１６】
別の好ましい実施態様では、前記配列番号１、２、５−１４の分子は、恒常型又は誘導型のプロモーターと操作可能に連結される。
【００１７】
別の好ましい実施態様では、核酸分子は、内部リボソーム進入部位、パーフォリン２の翻訳領域及び／又はリポーター核酸配列を含む。前記パーフォリン−２は配列番号３又は４か、あるいはこれらの突然変異型であることが好ましい。
【００１８】
別の好ましい実施態様では、パーフォリン２の５’−非翻訳領域の配列番号１、２、５−１４と、これらの断片、バリアント、突然変異体及び類似体と、及び／又は、これらと実質的に類似する配列と、及び／又は、配列番号３又は４のパーフォリン−２の分子とに、抗体は特異的に結合する。
【００１９】
別の好ましい実施態様ではベクターは、第１のリポーター分子と、少なくとも１個の内部リボソーム進入部位及びこれらのトランス活性化因子を含むパーフォリン２の５’−非翻訳領域と、第２のリポーター分子とを操作可能に連結されたプロモーターを含む。
【００２０】
別の好ましい実施態様では前記ベクターは、それぞれのリポーター分子の３’末端に終止コドンをさらに含む。
【００２１】
別の好ましい実施態様では前記ベクターは、単シストロン性又は２シストロン性である。
【００２２】
別の好ましい実施態様では前記ベクターは、それぞれのリポーター分子の５’末端に開始コドンをさらに含む。
【００２３】
別の好ましい実施態様では前記リポーター分子は、アルカリホスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）、β−ガラクトシダーゼ又は蛍光タンパク質を含む。
【００２４】
他の好ましい実施態様では、パーフォリン２の５’−非翻訳領域は、例えば、欠失、置換、挿入等のような突然変異を含む。
【００２５】
別の好ましい実施態様では、パーフォリン２の５’−非翻訳領域は、配列番号１、２、５−１４と、これらの断片、バリアント、突然変異体及び類似体と、及び／又は、これらと実質的に類似する配列とを含む。
【００２６】
他の好ましい実施態様では前記ベクターは、パーフォリン２の配列番号３又は４をエンコードする核酸分子を含む。
【００２７】
別の好ましい実施態様では、細胞は発現ベクターを含み、該ベクターは少なくとも１個のあるパーフォリン２の５’−非翻訳領域を含み、該非翻訳領域は、配列番号１、２、５−１４と、これらの断片、バリアント、突然変異体及び類似体と、及び／又は、これらと実質的に類似する配列とを含む。
【００２８】
別の実施態様では、配列番号１、２、５−１４の分子は、恒常型又は誘導型のプロモーターと操作可能に連結される。
【００２９】
さらなる別の実施態様ではベクターは、内部リボソーム進入部位、パーフォリン−２の翻訳領域の配列番号３又は４、及び／又は、リポーターの核酸配列をさらに含む。
【００３０】
別の好ましい実施態様では前記細胞は、原核細胞又は真核細胞である。
【００３１】
別の好ましい実施態様では、治療用化合物を同定する方法であって、該方法は２シストロン性ｃＤＮＡベクターを発現する細胞を提供すること、治療用化合物候補とともに前記細胞及び対照細胞を培養すること、内部リボソーム進入活性を定量するためにリポーター分子の発現量を測定すること、及び、治療用化合物を同定することを含み、前記ベクターは、内部リボソーム進入部位及びそのトランス活性化因子を含むパーフォリン２の５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）の配列番号１、２、５−１４の核酸配列と操作可能に連結された第１のリポーター分子と、第２のリポーター分子とを含む。第１及び第２のリポーター分子は異なる分子であることが好ましい。１つの実施態様では、前記リポーター分子はアルカリホスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ又は蛍光タンパク質を含む。第１及び第２のリポーター分子は、例えば、第１のリポーターがウミシイタケ・ルシフェラーゼで、第２のリポーター分子がホタル・ルシフェラーゼのような異なる２種類のルシフェラーゼ分子の場合がある。前記ベクターは、パーフォリン２の配列番号３又は４をエンコードする核酸分子を含むことが好ましい。
【００３２】
別の好ましい実施態様では、アッセイはハイスループットスクリーニングアッセイである。
【００３３】
１つの局面では、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の活性は、それぞれのリポーター分子の発現量を測定することによって、及び／又は、第１リポーター分子の発現量に対する第２リポーター分子の発現量の比率として測定される。内部リボソーム進入部位の活性の増加は、第２のリポーター分子の発現量を増加させる。
【００３４】
別の好ましい実施態様では前記細胞は、原核細胞又は真核細胞である。
【００３５】
別の好ましい実施態様では、前記プロモーターは恒常型又は誘導型のプロモーターである。
【００３６】
別の好ましい実施態様では、治療用化合物を同定するためのスクリーニングアッセイは、発現ベクターを含む細胞を提供すること、該細胞を治療用化合物候補とともに培養すること、候補分子の存在下及び非存在下でリポーター分子及び／又は遺伝子の発現量を測定すること、前記リポーター分子の発現量を比較すること、及び、治療用化合物を同定することを含み、前記発現ベクターは、リポーター分子と操作可能に連結された内部リボソーム進入部位を含むパーフォリン２の５’−非翻訳領域（ＵＴＲ）をエンコードする。好ましくは、前記リポーター分子はルシフェラーゼ又は蛍光分子であり、前記内部リボソーム進入部位の活性は治療用化合物候補に対する応答を増加し、前記活性は前記リポーター分子の発現量及び遺伝子発現の測定値である。前記活性の増加は、リポーター分子の発現量及び／又は遺伝子発現を増加させることが好ましい。
【００３７】
別の好ましい実施態様では、細胞内でパーフォリン２の翻訳を増大させる化合物を同定する方法は、パーフォリン２ｍＲＮＡを産生する細胞を提供すること、該細胞を試験化合物と接触させること、試験化合物と接触させた前記細胞におけるパーフォリン２タンパク質の産生量を測定すること、該パーフォリン２の産生量を、前記化合物の非存在下で成長した細胞によるパーフォリン２の産生量と比較すること、及び、細胞内でパーフォリン２の翻訳を増大する化合物を同定することを含む。前記細胞は、例えば、繊維芽細胞、樹状細胞、マクロファージ、単球又はリンパ球のような哺乳類の細胞が好ましい。
【００３８】
本発明の１つの局面は、パーフォリン２の５’−ＵＴＲ（配列番号１、２又は５）、これらの断片及び／又はこれらと実質的に類似する配列を含み、恒常型活性のプロモーター、パーフォリン２の翻訳領域及び／又は受容体の核酸配列の両方と操作可能に連結された組み換え核酸分子に関する。
【００３９】
本発明の別の局面は、細胞内のパーフォリン２の翻訳を増大する化合物の同定する方法に関し、該方法は、パーフォリン２ｍＲＮＡを産生する細胞を提供すること、前記細胞を試験化合物に接触させること、該試験化合物に接触した前記細胞でのパーフォリン２タンパク質産生量を測定すること、及び、前記Ｐ２の産生量を、前記化合物の非存在下で成長した細胞により産生されたパーフォリン２の産生量と比較することを含む。
【００４０】
本発明の別の局面は、抗生物質を同定する方法に関し、該方法は、対照細胞と、パーフォリン２発現ベクターを含む試験細胞とを提供すること、前記細胞を試験化合物に接触すること、前記試験化合物と接触した前記試験細胞が前記試験化合物の非存在下で成長した対照細胞よりもより多くのリポータータンパク質を産生する場合に、前記試験化合物を抗生物質として同定することを含み、前記ベクターは、リポータータンパク質をエンコードするリポーター配列と操作可能に連結された５’-ＵＴＲ配列を含む、発現配列と操作可能に連結されたプロモーターを含む。
【００４１】
本発明のこの局面の１つの実施態様では、前記対照細胞及び試験細胞はＨＥＫ２９３細胞である。別の実施態様では、前記対照細胞及び試験細胞はＲＡＷ細胞である。さらに別の実施態様では、前記プロモーターはＣＭＶプロモーターである。さらに別の実施態様では、５’ＵＴＲ配列は、配列番号１、２又は５を含む。なおさらなる別の実施態様では、前記５’ＵＴＲ配列は、高度にストリンジェントな条件下で配列番号１、２又は５とハイブリダイズし、かつ、５’ＵＴＲ配列と操作可能に連結されたリポーター配列の翻訳を十分に抑制できる、配列を含む。別の実施態様では、前記リポータータンパク質は、アルカリホスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ及び蛍光タンパク質からなるグループから選択される。なおさらなる実施態様では、リポータータンパク質の産生は蛍光を測定することによって検出される。
【００４２】
本発明の別の局面は抗生物質を同定する方法に関し、該方法は、対照細胞と、パーフォリン２発現ベクターを含む試験細胞とを提供すること、微生物の存在下で前記対照細胞及び試験細胞を培養すること、前記試験細胞を試験化合物に接触させること、該試験化合物と接触させた前記試験細胞が前記対照細胞よりも効率的に微生物を殺すことができる場合に、抗生物質としての前記試験化合物を同定することを含み、前記発現ベクターはパーフォリン２ｃＤＮＡと操作可能に連結されたプロモーターを含む。
【００４３】
１つの実施態様では、前記対照細胞及び試験細胞はＨＥＫ２９３細胞である。別の実施態様では、前記対照細胞及び試験細胞はＲＡＷ細胞である。さらなる別の実施態様では、前記プロモーターはＣＭＶプロモーターである。さらなる別の実施態様では、Ｐ２ｃＤＮＡ配列は、配列番号３又は４を含む。さらなる別の実施態様では、前記Ｐ２ｃＤＮＡ配列は、高度にストリンジェントな条件下で配列番号３又は４とハイブリダイズし、かつ、Ｐ２タンパク質をエンコードできる、配列を含む。
【００４４】
別の実施態様では、前記微生物は、ウイルス、感染性の細菌、感染性の真菌及び感染性の単細胞原生生物であって、前記ウイルスは、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２のようなヒト免疫不全ウイルス、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス、デングウイルス、脳炎ウイルス、横熱ウイルス、コロナウイルス、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器多核体ウイルス、インフルエンザウイルス、ハンタウイルス、ブンガウイルス、出血熱ウイルス、レオウイルス、オルビウイルス、ロタウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、パルボウイルス、パピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１及び２、水痘・帯状ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、アフリカ豚コレラウイルス、Ｄ型肝炎の未分類病原体、非Ａ型、非Ｂ型肝炎の病原体のようなウイルスであり、前記感染性の細菌は、ヘリコバクター・ピロリ、ボレリア・バーグドルフェリー、レジオネラ・ニューモフィラ、ヒト型結核菌、ウシ型結核菌（ＢＣＧ）、トリ型結核菌、イントラセルラーレ結核菌、黄色ブドウ球菌、淋菌、髄膜炎菌、リステリア・モノサイトジェネス、化膿レンサ球菌、肺炎球菌、インフルエンザ菌、モラクセラ・カタラーリス、肺炎桿菌、炭疽菌、ジフテリア菌、ウェルシュ菌、破傷風菌、エンテロバクター・アエロゲネス、クレブシエラ・ニューモニエ、パスツレラ・マルトシダ及び梅毒トレポネ−マのような細菌であり、感染性の真菌は、クリプトコックス・ネオフォルマンス、カプスラーツム型ヒストプラスマ、コクシジオイデス・イミチス、ブラストミセス・デルマティティジス、カンジダ・アルビカンスのような真菌であり、前記感染性の単細胞原生生物は、例えば、熱帯熱マラリア原虫、トリパノソーマ・クルズ、リーシュマニア・ドノバニ及びトキソプラズマ・ゴンディと、前記カンジダ属菌（例えば、Ｃ．アルビカンス、Ｃ．パラプシローシス、Ｃ．クルセイ、Ｃ．グラブラータ、Ｃ．トロピカリス又はＣ．ルシタニエ）と、トルロピシス属（例えば、Ｔ．グラブラータ）と、アスペルギルス属（例えば、Ａ．フミガルス）と、ヒストプラズマ属（例えば、Ｈ．カプスラーツム）と、クリプトコッカス属（例えば、Ｃ．ネオフォルマンス）と、ブラストミセス属（例えば、B.デルマティティジス）と、フザリウム属と、トリコフィトン属と、シュ−ドアレシェリア・ボイディイと、コクシジオイデス・イミチスと、スポロトリクックス・シエンキと、ヒト腫瘍細胞とであり、前記感染性の真菌は、例えば、ヒストプラズマ症、カンジダ症、クリプトコッカス症、ブラストミセス症及びコクシジオイデス症を引き起こすこのような真菌である。別の実施態様では、Ｐ２ｃＤＮＡは操作可能にＧＦＰ配列と連結される。
【００４５】
本発明の別の局面は抗癌剤を同定する方法に関し、該方法は、対照細胞と、パーフォリン２発現ベクターを含む試験細胞とを提供すること、前記細胞を試験化合物に接触すること、前記試験化合物に接触した前記試験細胞が前記試験化合物の非存在下で成長した対照細胞よりもより多くのリポータータンパク質を産生する場合に、抗癌剤として前記試験化合物を同定することを含み、前記ベクターは発現配列と操作可能に連結されたプロモーターを含み、前記発現配列はリポータータンパク質をエンコードしているリポーター配列と操作可能に連結された５’-ＵＴＲ配列を含む。
【００４６】
本発明のこの局面の１つの実施態様では、前記対照及び試験細胞はＨＥＫ２９３細胞である。別の実施態様では、前記対照及び試験細胞はＲＡＷ細胞である。さらなる実施態様では、前記プロモーターはＣＭＶプロモーターである。なお別の実施態様では、前記５’-ＵＴＲ配列は配列番号１、２又は５を含む。さらなる別の実施態様では、前記５’-ＵＴＲ配列は高度にストリンジェントな条件下で配列番号１、２又は５にハイブリダイズし、かつ、５’-ＵＴＲ配列と操作可能に連結されたリポーター配列の翻訳を実質的に抑制できる、配列を含む。なお別の実施態様では、前記リポータータンパク質は、アルカリホスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ及び蛍光タンパク質を含むグループから選択される。なおさらなる実施態様では、リポータータンパク質の産生は蛍光を測定することによって検出される。
【００４７】
本発明の別の局面は抗癌剤を同定する方法に関し、該方法は、対照細胞と、パーフォリン２発現ベクターを含む試験細胞とを提供すること、癌細胞の存在下で前記対照細胞及び試験細胞を培養すること、前記試験細胞を前記試験化合物に接触させること、前記試験化合物に接触した前記試験細胞が前記対照細胞よりもより効率的に癌細胞を殺すことができる場合に、抗癌剤としての前記試験化合物を同定することを含み、前記ベクターはＰ２ｃＤＮＡと操作可能に連結されたプロモーターを含む。
【００４８】
本発明のこの局面の１つの実施態様では、前記対照及び試験細胞はＨＥＫ２９３細胞である。別の実施態様では、前記対照及び試験細胞はＲＡＷ細胞である。さらなる別の実施態様では、前記プロモーターはＣＭＶプロモーターである。さらなる別の実施態様では、前記Ｐ２ｃＤＮＡ配列は、配列番号３又は４を含む。さらなる別の実施態様では、前記Ｐ２ｃＤＮＡ配列は高度にストリンジェントな条件下で配列番号３又は４にハイブリダイズし、かつ、パーフォリン２タンパク質をエンコードできる、配列を含む。なおさらなる実施態様では、前記癌細胞は腫瘍細胞株のＮＣＩ−６０パネルに由来する。別の実施態様では、前記パーフォリン２ｃＤＮＡは操作可能にＧＦＰ配列と連結される。
【００４９】
本発明のさらなる利点は以下の詳細な説明から当業者に自明であるが、該詳細な説明では、本発明の好ましい実施態様のみが本発明を実施するための最良の形態を単に例示することによって示説される。了解されるであろうが、本発明は、本発明から全く逸脱することなしに、他の異なる実施態様となる場合があり、その多くの詳細はさまざまな自明な点で修正される場合がある。本発明はこれらの具体的な詳細の一部又は全部を伴わずに実施されてもかまわない。他の場合では、本発明を不必要に不明瞭にしないために周知の工程操作は詳細に説明されなかった。したがって、図面及び説明は、限定的なものとみなされるべきではなく、本質的に例示的なものとみなされるべきである。
【００５０】
本発明の他の局面は以下に説明される。
【００５１】
本発明は添付される請求の範囲で詳細に示される。本発明の上記及びさらなる利益は附属の図に関連してもたらされた以下の説明に言及することによって、より理解される場合がある。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１Ａ】９種にわたるパーフォリン−２アミノ酸配列の保存を示す表。
【図１Ｂ】９種にわたるパーフォリン−２アミノ酸配列の保存を示す表。
【図１Ｃ】９種にわたるパーフォリン−２アミノ酸配列の保存を示す表。
【図１Ｄ】９種にわたるパーフォリン−２アミノ酸配列の系統樹とを示す図。
【図２】真核細胞での発現用のパーフォリン−２／ＧＦＰ融合タンパク質の１次構造を示す図。
【図３】パーフォリン２の陰性染色電子顕微鏡写真。２９３細胞はｇｆｐで標識されたパーフォリン−２でトランスフェクションされ、Ｇ４１８で選択された。蛍光細胞は増殖され、Ｎ２−キャビテーションによって溶解された。膜分画は差次遠心分離によって生成された。最終的な膜標品は、１００μｇ／ｍＬのトリプシンで３７°Ｃ、１時間処理された。洗浄後に、膜はグリッドの上にマウントされ、０．５％  リンタングステン酸で陰性染色された。写真は５８，０００倍の初期倍率で撮影された。膜に結合したパーフォリン−２の上面及び側面が示される。不完全な多量体も可視化される。
【図４】さまざまな種由来のパーフォリン−２の５’−ＵＴＲの配列アライメントを示す表。Ｐ２はヒトパーフォリン−２の５’−ＵＴＲ（配列番号１）であり、ＭＰ２はマウスパーフォリン−２の５’−ＵＴＲ（配列番号２）を表す。
【図５Ａ】ＣＭＶプロモーターの下でＥＧＦＰをレポーターとして用いるＰ２完全長（ＦＬ）及び欠損５’−ＵＴＲコンストラクトによる翻訳制御の解析を示す図。〜７５％のトランスフェクション効率。
【図５Ｂ】Ｐ２の５’−ＵＴＲ  ＩＲＥＳ活性を調べるための２シストロン性発現コンストラクトを示す模式図。第１シストロンは、ＣＭＶプロモーターの制御下にある部分切断ＴＮＦＲ  ＳＦ２５（「ＤＮ−ＴＲ２５」と略す。）膜タンパク質で、Ａｌｅｘａ  ６４７で標識された抗ＴＲ２５抗体で検出される。第２のシストロン（ＥＧＦＰ）は上流配列がＩＲＥＳ活性を有する場合に発現される。細胞はトランスフェクションされ、フローサイトメーターによって４８時間後に解析された。図５Ｂの上のグラフでは、ＴＲ２５及びＥＧＦＰの発現は対照のＥＧＦＰベクターの相対値で表される。図５Ｂの下のグラフでは、ＴＮＲ２５陽性細胞にゲートを設定し、該ゲート内のＥＧＦＰ陽性細胞の百分率を測定した。
【図６】パーフォリン２の５’非翻訳配列が翻訳を制御することを示す図。パーフォリンの５’ＵＴＲ配列の欠失コンストラクトがＥＧＦＰのオープン・リーディング・フレーム（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）の前方に連結され、２９３細胞にトランスフェクションされた。４８時間後に、蛍光細胞の頻度がＦＡＣＳ解析によって測定された。対照ＥＧＦＰベクターは３７％のトランスフェクション効率を生み出した。パーフォリン−２の５’ＵＴＲの長さを増加することによって、トランスフェクションされた細胞の頻度が５％未満に減少した。
【図７】ＩＲＥＳ活性を制御するＰ２の５’−ＵＴＲセグメントを示す図。前記セグメントは１−６の番号が付される。マウスとヒトとの間で保存された配列（２つの配列のＢＬＡＳＴ）は、イントロン及びセグメント６に示される。矢印は上流の短いオープン・リーディング・フレームを示す。
【図８】Ｐ−２の殺菌活性を示す図。大腸菌ＪＭ１０９株は２４ウェルプレート中で０．５ｍＬあたり１×１０５個となるように組織培養培地中で１対１の割合で前記細胞とともに（抗生物質なしで、熱不活性化ＦＣＳを用いて）播種された。前記プレートは遠心分離され、その際に細菌が接着できるように３７°Ｃで１時間培養された。非接着性の細菌はＰＢＳで洗浄された。培地が添加され、培養は３０時間インキュベーションされ、コロニーを算出するためにプレーティングされ、撮影された。図８Ａは、２９３細胞と大腸菌との割合が１対１である。図８ＢはＰ２−ｇｆｐがトランスフェクションされた２９３細胞と大腸菌との割合が１対１の位相差顕微鏡写真である。図８Ｃは図８Ｂと同じで、蛍光顕微鏡写真である。図８ＤはサイトカラシンＤが添加されたＲＡＷ細胞（ＲＡＷ＋Ｃｙ）と、大腸菌との割合が１対１である。図８ＥはＲＡＷ細胞と、大腸菌との割合が１対１である。矢印は大腸菌を示す。グラフは３０時間後のコロニー数を示す（対数目盛であることに留意）。
【図９】Ｐ２−ｓｉＲＮＡがトランスフェクションされ（ｓｉＲＮＡ  １−３）、選択されたＲＡＷ細胞と、トランスフェクションされていないＲＡＷ細胞とが、表示のとおり、２０、２５及び３０サイクルのＰＣＲによってＰ２−ｍＲＮＡ及びｕ−アクチン（対照）について解析された（上の電気泳動結果）。下はアクチンで標準化されたＰ２のｍＲＮＡの定量結果を示すグラフである。
【図１０】Ｐ２がＲＡＷ細胞の抗菌作用に寄与することを示すグラフ。トランスフェクションされていないＲＡＷ細胞と、ｓｉＲＮＡがトランスフェクションされたＲＡＷ細胞とは、１（図１０Ａ）及び９（図１０Ｂ）の感染多重度で大腸菌に感染された。培養細胞は、０、１及び２時間後に溶解され、生存能力のある大腸菌の数はＬＢ寒天培地上にプレーティングすることによって得られ、コロニー数は次の日に測定された。ｙ軸はｌｏｇ２目盛りで、大腸菌の分裂回数を示すことに留意せよ。
【図１１Ａ】ヒトパーフォリン−２のｃＤＮＡ配列を示す表（配列番号３）。
【図１１Ｂ】ヒトパーフォリン−２のｃＤＮＡ配列を示す表（配列番号３）。
【図１１Ｃ】ヒトパーフォリン−２のｃＤＮＡ配列を示す表（配列番号３）。
【図１１Ｄ】ヒトパーフォリン−２のｃＤＮＡ配列を示す表（配列番号３）。
【図１２Ａ】マウスパーフォリン−２のｃＤＮＡ配列を示す表（配列番号４）。
【図１２Ｂ】マウスパーフォリン−２のｃＤＮＡ配列を示す表（配列番号４）。
【図１２Ｃ】マウスパーフォリン−２のｃＤＮＡ配列を示す表（配列番号４）。
【図１３Ａ】ＵＴＲ配列がＩＲＥＳトランス作用因子の結合のための複数の機能的ＤＮＡセグメントを含むことを示す表。
【図１３Ｂ】ＵＴＲ配列がＩＲＥＳトランス作用因子の結合のための複数の機能的ＤＮＡセグメントを含むことを示す表。
【図１３Ｃ】ＵＴＲ配列がＩＲＥＳトランス作用因子の結合のための複数の機能的ＤＮＡセグメントを含むことを示す表。
【図１４Ａ】複数の動物種でのパーフォリン２の配列相同性を示す表。海綿動物から哺乳動物までの動物界を通じて高度の相同性があることを図１４は示す。
【図１４Ｂ】複数の動物種でのパーフォリン２の配列相同性を示す表。海綿動物から哺乳動物までの動物界を通じて高度の相同性があることを図１４は示す。
【図１４Ｃ】複数の動物種でのパーフォリン２の配列相同性を示す表。海綿動物から哺乳動物までの動物界を通じて高度の相同性があることを図１４は示す。
【図１５】図１５Ａ及び１５Ｂはマウスタンパク質の予想ドメイン構造を示す模式図。図１５Ｂはパーフォリン２の電子顕微鏡写真。
【図１６】ＩＲＥＳ活性を制御するＰ２の５’ＵＴＲセグメントを示す模式図。前記セグメントは１−６の番号が付された。マウスとヒトとの間で保存された配列（２つの配列のＢＬＡＳＴ）は、イントロン及びセグメント６中に示される。矢印は上流の短いオープン・リーディング・フレームを示す。
【図１７】マウスＰ２の完全な遺伝子構造を示す模式図（図１７Ａ）。５’ＵＴＲの欠失コンストラクトを示す模式図（図１７Ｂ）。５’ＵＴＲの欠失ＩＲＥＳコンストラクトを示す模式図（図１７Ｃ）。ＩＲＥＳアッセイの結果を示すグラフ（図１７Ｄ−１７Ｆ）。
【図１８】図１８Ａは、細胞内ＲＮＡでスプライシングされていないＰ２  ｍＲＮＡと、選択的スプライシングされたｍＲＮＡと、完全にスプライシングされたＰ２ｍＲＮＡとが、約１対１０対１００の割合で存在することを示すブロッティング結果図。図１８Ｂないし１８Ｄは、パーフォリン２ｍＲＮＡが成熟樹状細胞とインターフェロン処理された繊維芽細胞とで発現されることを示すグラフ。図１８Ｅは、該ウエスタンブロットはＰ２タンパク質が未刺激のＪ７７４細胞で７０ｋＤのタンパク質として検出できることを示すウエスタンブロット結果図。Ｐ２−ＥＧＦＰでトランスフェクションされた２９３細胞は、対応してより高い分子量に移動する融合タンパク質を発現する。
【図１９Ａ】Ｐ２の翻訳開始点から上流に６００ｂｐにわたる哺乳類ゲノム由来のアライメントの表であって、非翻訳エキソン２配列（−１ないし−５０）とイントロン配列とが高度に保存されることを示す、表。
【図１９Ｂ】Ｐ２の翻訳開始点から上流に６００ｂｐにわたる哺乳類ゲノム由来のアライメントの表であって、非翻訳エキソン２配列（−１ないし−５０）とイントロン配列とが高度に保存されることを示す、表。
【図２０】ＩＲＥＳが活性状態のとき定量的に測定可能なホタル・ルシフェラーゼの発現を促進する、２シストロン性ｃＤＮＡベクターの模式図。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
詳細な説明
ゲノムデータベースの検索は、膜侵襲複合体／パーフォリン（ＭＡＣＰＦ）ドメインとして知られているドメインを含む予測タンパク質のｃＤＮＡがマクロファージで存在することを示す。対応するｍＲＮＡは、マウス及びヒトのマクロファージで発現されることが知られていた。この出願は、翻訳されたタンパク質の１次構造、その超微細構造、翻訳制御及びその細胞−殺傷特性を開示する。この出願では、新規のマクロファージタンパク質は、パーフォリン−２（又はＰ２）及びパーフォリン−１（又はＰ１）のような原型のＣＬＴパーフォリンとして明示されるであろう。
【００５４】
発明者は、細菌がマクロファージの原形質膜に結合するか、あるいはこれらのファゴサイトーシス後に、マクロファージのパーフォリン２の翻訳の増大と、孔形成によって細菌を殺傷する伝達シグナルを発見した。同様のシグナルは、腫瘍細胞によっても適切に伝達される。したがって、パーフォリン−２の翻訳を増大するシグナル及び化合物は、感染及び腫瘍免疫を制御するのに有用な成分となる。
【００５５】
より詳細に本発明を説明する前に、以下の定義は図に列挙され、本明細書を説明するのに用いられる用語の意味及び範囲を定義する。
【００５６】
原文で用いられるところの「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という冠詞を伴う単数形は、内容が明らかに他の内容を指図しない限り、複数の指示対象を含む。
【００５７】
本明細書で用いられるところの「下流」という用語は、ヌクレオチド配列に沿った方向に関して用いられるときに、５’末端ないし３’末端への方向を意味する。同様に、「上流」という用語は、３’末端ないし５’末端への方向を意味する。
【００５８】
本明細書で用いられるところの「遺伝子」という用語は、遺伝子と、現在知られているこれらのバリアントと、さらに解明される場合があるいずれかのバリアントとを意味する。
【００５９】
本明細書で用いられるところのポリペプチドの「バリアント」という用語は、１種類又は２種類以上のアミノ酸残基により変えられるアミノ酸配列をいう。前記突然変異型は「保存的な」変化となる場合があり、置換されたアミノ酸は、同様の構造的又は化学的特性を有する（例えば、イソロイシンでのロイシンの置換）。より稀に、バリアントは「非保存的な」変化となってもかまわない（例えば、トリプトファンでのグリシンの置換）。類似の重要ではない突然変異は、アミノ酸の欠失又は挿入か、あるいは両方を含んでもかわわない。生物学的活性を失うことなく、置換、挿入又は欠失する場合があるアミノ酸残基を測定する指図は、例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）のような当業者に周知のコンピュータープログラムを用いて理解される場合がある。
【００６０】
「バリアント」という前記用語は、ポリヌクレオチド配列の内容で用いられる場合には、野生型の遺伝子に関するポリヌクレオチド配列を含む場合がある。この定義は、例えば「対立遺伝子」、「スプライス」、「種」又は「多型」バリアントを含む。スプライスバリアントは、参考文献の分子に対して重要な特性を有する場合があるが、一般的に、ｍＲＮＡのプロセッシングの間にエキソンのスプライシングを交替するための多少のポリヌクレオチドを有するであろう。相当するポリヌクレオチドは追加の機能的なドメイン有するか、あるいはドメインの欠失する場合がある。スプライス突然変異体は、１つの種から他の種まで変化するポリヌクレオチド配列である。本発明の特定の有用性は、野生型の遺伝子産物のバリアントである。バリアントは核酸配列での少なくとも１つの突然変異により生じ、変化したｍＲＮＡか、構造又は機能が変化するか、あるいは変化しないポリペプチドかを生じる。既知の天然又は組み換え遺伝子のいずれかは、対立形質を全く有しないか、１つか、多く有する場合がある。バリアントを生じる一般的な突然変異は、一般的に、ヌクレオチドの自然欠失、付加又は置換にもとづいていると考えられる。これらの型の突然変異のそれぞれは、単独か、あるいは他の突然変異との組み合わせで、既知の配列内で１回又は２回以上起こる。
【００６１】
生じたポリペプチドは、一般的に、お互いに関して重要なアミノ酸特性を有するであろう。多型バリアントは、既知の種の個体間で特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列内での変化による。多型バリアントは、「１塩基多型」（ＳＮＰｓ）又は１塩基が変化するポリヌクレオチド配列内の１塩基突然変異を含む。ＳＮＰの存在は、例えば、疾患状態へと向かう傾向を有するある集団が抵抗性に対して影響を受けやすいという徴候を示す場合がある。
【００６２】
本明細書で用いられるところの「ｍＲＮＡ」という用語は、現在知られている遺伝子のｍＲＮＡの転写産物と、さらに解明される場合があるいずれかの転写産物とを意味する。
【００６３】
「発現ベクター」は、例えば、プラスミド、染色体、ウイルスのようないずれかの遺伝的構成であって、該遺伝的構成は、細胞内でのポリヌクレオチドの複製の自律的な構成単位（例えば、自らの制御下で複製可能）か、宿主細胞の染色体に挿入することによって複製を可能にするかのいずれかに振る舞い、連結された断片の複製及び／又は発現をするために別のポリヌクレオチド断片に連結されている。適切なベクターは、プラスミド、バクテリオファージ及びコスミドを含むが、これらに限られない。ベクターは、所望の宿主細胞にベクターの連結又は挿入を達成し、連結した断片の発現を達成するために必要であるポリヌクレオチド配列を含む場合がある。前記配列は宿主生物への依存性が異なり、前記配列は、転写を達成するためのプロモーター配列と、転写を増大するためのエンハンサー配列と、リボソーム結合部位配列と、転写及び翻訳の終結配列とを含む。代替的には、発現ベクターは宿主細胞のＤＮＡ配列にベクターの連結又は融合することなしに、核酸配列をエンコードするこれらの産物を直接的に発現可能となる場合がある。
【００６４】
「プロモーター領域」という用語はＤＮＡ配列をいい、１種類又は２種類以上の核酸配列の転写を制御する役割を果たし、遺伝子の転写開始部位の転写の方向に関して上流に位置し、ＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼに対する結合領域、転写開始部位及び他のいずれかのＤＮＡ配列の存在によって構造的に同定され、該ＤＮＡ配列は、転写因子結合部位と、抑制化因子及び活性化因子のタンパク質結合部位と、カルシウム及びｃＡＭＰ応答部位と、プロモーターから転写を直接的又は間接的に制御を行なうことが知られた他のいずれかのヌクレオチド配列とを含むが、これらに限られない。この発明の内容では、プロモーターはＣＭＶプロモーターのような恒常的に活性的なプロモーターであることが好ましい。恒常的に活性的なプロモーターは、操作可能に連結された核酸配列の転写の安定した基礎速度を提供することが好ましい。
【００６５】
「操作可能に連結した」という用語は、これらの意図するやり方で機能する断片を得るようにして１つのＤＮＡ断片に別のＤＮＡ断片を連結することをいう。直接的又は間接的にＤＮＡ配列の転写を変調するやり方で、例えば、プロモーター、エンハンサー及び／又はサイレンサーのような制御領域に連結される場合に、遺伝子産物をエンコードしているＤＮＡ配列は操作可能に制御配列に連結される。例えば、転写開始部位に関する正しい読み枠でプロモーターの転写開始部位に関するプロモーターの下流に連結される場合に、ＤＮＡ配列はプロモーターと操作可能に連結され、前記ＤＮＡ配列を通じて転写の伸長を続ける。ＤＮＡ配列の転写を、それぞれ、増加又は減少するやり方でＤＮＡ配列に連結される場合に、エンハンサー又はサイレンサーは遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列と操作可能に連結される。エンハンサー及びサイレンサーは、上流、下流に位置するか、あるいはＤＮＡ配列のコード領域内に包埋される場合がある。前記ポリペプチドの分泌に関与するタンパク質前駆体としてシグナル配列が発現される場合に、シグナル配列のＤＮＡはポリペプチドをコードするＤＮＡに連結される。制御配列へのＤＮＡ配列の連結は、当業者に知られた制限酵素を用いて配列内に挿入された適切な制限部位か、あるいはアダプター又はリンカーを介する連結によって達成されることが典型的である。
【００６６】
「リポーター核酸配列」は、検出可能な遺伝子産物を発現するＤＮＡ分子であり、該遺伝子産物はＲＮＡ又はタンパク質となる場合がある。検出は当業者に知られたいずれかの方法によって達成される。例えば、ｍＲＮＡの発現の検出はノーザンブロット解析及びＲＴ−ＰＣＲを用いて達成される場合があり、タンパク質産物の検出は、例えば、ウェスタンブロット解析のようなタンパク質に特異的な抗体を用いる染色か、あるいはその触媒活性を測定することによって達成される場合がある。リポーター核酸配列は容易に検出可能なものが好ましい。リポーター核酸配列は制御ＤＮＡ配列とともにＤＮＡコンストラクトと操作可能に連結される場合があり、リポーター核酸配列の産生物を検出することで制御配列の転写活性の測定できる。リポーター核酸配列の例は、アルカリホスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びアルカリホスファターゼをコードする配列を含むが、これらに限られない。リポーター核酸はルシフェラーゼをエンコードすることが好ましい。
【００６７】
リポータータンパク質の翻訳は、定性的に又は定量的に検出できる。例えば、比色検出はリポーターとして（ペルオキシダーゼのような）酵素が用いられる場合がある。可溶性の色素基質は、異なる色素の非可溶性の形状に変更され、該色素は酵素に隣接して沈殿し、それによって検出可能な染色を創造する。タンパク質レベルは、濃度測定（如何に濃く染色されたか）又は分光測定を通じて評価される場合がある。代替的には、化学発光検出法は基質を用いるリポータータンパク質のインキュベーションに依存し、前記基質は触媒された場合に蛍光を発する。光は写真フィルムで検出される場合があり、ＣＣＤカメラによる検出がより好ましい。画像は濃度測定によって解析され、該濃度測定はタンパク質染色の相対的な量を評価し、光学濃度の面からその結果を定量化する。蛍光検出はリポータータンパク質として生物発光タンパク質が用いられる場合がある。リポータータンパク質は緑色蛍光タンパク質であることが好ましい。リポータータンパク質は光によって励起され、励起の放出は適切な放出フィルターを備えたＣＣＤカメラのような光感知装置によって検出され、該光感知装置はさらなるデータ解析ができるデジタル画像を入手する。最も感受性の検出方法の中で好ましいものを考慮すると、蛍光は好ましい検出方法である。
【００６８】
リポーター核酸は、例えば、エクオリン又は緑色蛍光タンパク質のような特定の光波長によって励起される蛍光タンパク質をエンコードすることが好ましい。
【００６９】
本明細書で用いられるところの「アプタマー」又は「結合性機能核酸」という用語は、非修飾又は化学修飾されたＲＮＡ又はＤＮＡを含んでもかまわない。選択方法はアフィニティークロマトグラフィーとなり、増幅方法は逆転写（ＲＴ）又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）となる場合があるが、これらに限られない。
【００７０】
本明細書で用いられるところの「シグナルアプタマー」という用語は、例えば、発光、ルシフェラーゼ、蛍光色素のようなリポーター分子を有するアプタマーを含み、該リポーター分子はリガンドとのアプタマーの相互作用を生じる高次構造上の変化が起こるようにヌクレオチドに付け加えられ、異なるシグナルを産生し、蛍光強度が変化することが好ましい。
【００７１】
「発現ベクター」は、例えば、プラスミド、染色体、ウイルスのようないずれかの遺伝的構成であって、該遺伝的構成は、細胞内でのポリヌクレオチドの複製の自律的な構成単位（例えば、自らの制御下で複製可能）か、宿主細胞の染色体に挿入することによって複製を可能にするかのいずれかに振る舞い、連結されたセグメントの複製及び／又は発現をするために別のポリヌクレオチドセグメントに連結されている。適切なベクターは、プラスミド、バクテリオファージ及びコスミドを含むが、これらに限られない。ベクターは、所望の宿主細胞にベクターの連結又は挿入を達成し、連結したセグメントの発現を達成するために必要であるポリヌクレオチド配列を含む場合がある。前記配列は宿主生物への依存性が異なり、前記配列は、転写を達成するためのプロモーター配列と、転写を増強するためのエンハンサー配列と、リボソーム結合部位配列と、転写及び翻訳の終結配列とを含む。代替的には、発現ベクターは宿主細胞のＤＮＡ配列にベクターの連結又は融合することなしに、核酸配列をエンコードするこれらの産物を直接的に発現可能となる場合がある。
【００７２】
発現ベクターの構造は、例えば、ＣＭＶプロモーターのような恒常的に活性的なプロモーターを有し、該プロモーターはパーフォリン２のゲノム配列セグメントか、パーフォリン２ｃＤＮＡ（配列番号３又は４）又はこれらの一部分か、リポーター核酸配列と操作可能に連結されたパーフォリン２ｃＤＮＡの非翻訳領域（配列番号１、２、５−１４）のセグメントかのいずれかの非相同的なＤＮＡ配列と操作可能に連結され、前記発現ベクターは当業者によって容易に構築される場合がある。クローン化された発現ベクターは標的の宿主細胞を永遠に又は一過性にトランスフェクションし、トランスフェクション細胞は上手に以上に説明した核酸配列の適切なマーカーの存在にもとづいて選択される場合がある。本発明は、発現ベクター、宿主細胞及びトランスフェクション技術の他の態様を含むことが意図され、前記他の態様は同等の機能を提供し、当業者の知るところとなると理解される。
【００７３】
「トランスフォーメーションされた」又は「トランスフェクションされた」という用語は交換可能に用いられ、外来のＤＮＡ又はＲＮＡが適切な宿主細胞に移転又は導入される過程をいう。トランスフェクションした宿主細胞は安定なトランスフェクションされた細胞を含み、挿入されたＤＮＡは宿主細胞で複製可能となる。典型的に、安定したトランスフェクションは核酸配列の選択可能なマーカーとともにトランスフェクションされる外来のＤＮＡが必要であり、該ＤＮＡは、例えば、抗生物質耐性を提供する核酸配列であり、安定なトランスフェクタントの選択を可能にする。このマーカーの核酸配列は外来のＤＮＡに連結され、外来のＤＮＡを用いる同時トランスフェクションによって独立して提供される場合がある。トランスフェクションされた細胞は一過性に発現する細胞を含み、前記一過性に発現する細胞はＲＮＡ又はＤＮＡを限られた時間発現することができる。宿主細胞は、原核又は真核細胞となる場合がある。トランスフェクションの手順はトランスフェクションされる細胞に依存する。トランスフェクションの手順はウイルスでのポリヌクレオチドのパッケージングと、ポリヌクレオチドの直接取込とを含む。形質転換は宿主細胞のゲノム内に挿入されたＤＮＡの組み込みか、プラスミドの形状で宿主細胞内で挿入されたＤＮＡの維持かを生じる。形質転換／トランスフェクションの方法は当業者に周知であり、該方法は、微量注入のような直接注入、ウイルス感染、特別の複製−欠損アデノウイルス感染、電気穿孔法、リポフェクション、リン酸カルシウムに仲介された直接的な取り込み及び同様の方法を含むが、これらに限られない。
【００７４】
「宿主細胞」という用語は、一般的に、原核又は真核細胞をいい、前記宿主細胞は、いずれかの形質転換可能な細胞を含み、該形質転換可能な細胞はタンパク質を発現することが可能で、発現ベクター又は他の転移ＤＮＡの受け入れるために用いられる又は用いられた。
【００７５】
「組み換え細胞」という用語は非相同的なＤＮＡ又はＲＮＡの導入によって修飾された細胞をいう。例は、免疫細胞、繊維芽細胞、幹細胞、ＨＥＫ２９３及びＷＡＳ細胞を含むが、これらに限られない。しかしながら、いずれかの哺乳類の細胞株が用いられることができる。
【００７６】
本明細書で用いられるところの「免疫細胞」という用語は、解析される場合がある免疫系のいずれかの細胞を含むことを意味し、該細胞は、Ｂ細胞と呼ばれるＢリンパ球と、Ｔ細胞と呼ばれるＴリンパ球と、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞と、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞と、単球と、マクロファージと、好中球と、顆粒球と、マスト細胞と、血小板と、ランゲルハンス細胞と、幹細胞と、樹状細胞と、末梢血単核細胞と、腫瘍−浸潤（ＴＩＬ）細胞と、ハイブリドーマを含む遺伝子組み換え免疫細胞と、薬剤で調節された免疫細胞と、上記細胞型の誘導体、前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ）又は前駆体（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）とを含み、これらに限られない。
【００７７】
本発明の内容での翻訳の「実質上の」抑制とは、ｍＲＮＡの翻訳での翻訳機構の阻害をいう。本発明では、パーフォリン−２ｍＲＮＡの５’-ＵＴＲの構造がその翻訳を実質上抑制することが発見された。前記Ｐ２の５’-ＵＴＲはリポーター核酸配列の下流の翻訳を実質上抑制できる。定量的に、パーフォリン−２の５’-ＵＴＲに由来する実質上の抑制は、前記Ｐ２の５’-ＵＴＲを欠く転写産物からの同一タンパク質産生量と比較して、約５０％未満のタンパク質産生量となる。前記Ｐ２の５’-ＵＴＲを欠く転写産物からの同一タンパク質産生量と比較して、タンパク質の実質上の抑制は約４０％未満となることがより好ましく、さらには３０％未満となることがより好ましく、約２０％未満となることが最も好ましい。
【００７８】
配列番号１−１４と実質上等しい核酸配列は、それぞれの、ヌクレオチド塩基の少なくとも１つの特性に関して、配列番号１−１４と異なる場合があると当業者は認識するであろう。しかし、配列番号１−１４と実質上等しいプロモーター配列の全ては、（本明細書で定義したような）ストリンジェントな条件下で、それぞれの、配列番号１−１４（例えば、標的配列）の相補鎖の全て又は一部にハイブリダイズするであろう。
【００７９】
「特異的にハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ（ｓ）  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」又は「特異的にハイブリダイズする（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ（ｓ））」という用語は、オリゴヌクレオチド（例えば、プライマー又は標識されたプローブ）ないし標的配列間の相補的なハイブリダイゼーションをいう。前記用語は重要ではないミスマッチを特に含み、該ミスマッチはハイブリダイゼーション試薬のストリンジェンシーを低減することによって適応することができる。
【００８０】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下では、高い相補性、例えば、実質上同一の核酸配列のみがハイブリダイズする。前記条件は核酸のハイブリダイゼーションを妨げ、前記核酸は２０個の隣接するスクレオチドの中から３個又は４個以上のミスマッチを有することが好ましく、２０個の隣接するヌクレオチドの中から２個又は３個以上のミスマッチを有することがより好ましく、２０個の隣接するスクレオチドの中から１個又は２個以上のミスマッチを有することが最も好ましい。ハイブリダイゼーション核酸のハイブリダイゼーション部分は標的配列又はその相補鎖の配列に等しく、少なくとも約９０％であり、少なくとも約９５であることが好ましく、少なくとも約９８％であることが最も好ましい。
【００８１】
ストリンジェントな条件下での核酸ないし核酸試料のハイブリダイゼーションは以下に定義される。２本鎖又はハイブリッドな核酸の安定性は融解温度（Ｔｍ）として表現され、該温度はプローブの５０％が標的ＤＮＡから解離する温度である。この融解温度は所望のストリンジェンシー条件を定義するのに用いられる。配列がプローブに同一というよりもむしろ実質上等しいと同定される場合には、相同なハイブリダイゼーションが特定の塩（例えば、ＳＳＣ又はＳＳＣＰ）濃度でのみ起こる、最も低い温度を最初に確立するために用いられる。１％のミスマッチはＴｍの１°Ｃの低下で生じると予測され、したがってハイブリダイゼーション反応での最後の洗浄温度は低下される（例えば、プローブとの９５％より高い同一性を有する配列が要求される場合には、最終の洗浄温度は５°Ｃ低下される）。実際に、Ｔｍの変化は１％のミスマッチあたり０．５°Ｃないし１．５°Ｃの間となる。
【００８２】
ストリンジェントな条件は、６８°Ｃの５ｘＳＳＣ／５ｘデンハンス溶液／１．０％  ＳＤＳ中でハイブリダイズすることと、室温で０．２ｘＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳで洗浄することとを含む。適度にストリンジェントな条件は、４２°Ｃの３ｘＳＳＣで洗浄することを含む。塩濃度及び温度のパラメーターはプライマーないし標的核酸間での同一性の最適レベルを達成ために変化される。前記条件に関する追加の手引きは当業者が容易に利用でき、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、（第２版）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版、ニューヨーク、（１９８９）及びＦ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌらにより編集された、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ及びＳｏｎｓ（１９９４）である。
【００８３】
パーフォリン２の１次構造
パーフォリン２は、ヒトから系統的に最古の後生動物である海綿動物までの動物界を通じて非常に高度に保存される。ＭＡＣ／Ｐｆドメインは、右の縦線と、アミノ酸−配列を箱で囲むこととによって示される。図１を参照せよ。パーフォリンファミリーの特徴の両親和性のヘリックスＩ、ターン、へリックスＩＩの予測膜挿入ドメインは下線で示される。海綿動物のＰ２は、ＭＡＣ／ＰｆドメインのへリックスＩに相当する不完全なドメインのみ有する。さらにＭＡＣ／Ｐｆドメイン以外にＮ−末端の方向に高い保存性の別のドメインがあり、特に、ＶＬＰＧＧＧＷＤＮＬＲＮで設計されたＰ２ドメインは重要な機能的な意義を示唆している。Ｎ−末端の配列の全てはリーダーペプチドを含む組成物を有し、該ペプチドは、リボソームに結合している膜ないしＥＲと、Ｐ２の同時翻訳の膜貫通輸送とを示唆している。Ｃ−末端の方向には、配列の保存性は哺乳類間では非常に高く保持され、魚、軟体動物及び海綿動物に向かって保存性は低下する。Ｐ２の典型的な膜貫通配列は海綿動物を除き全ての種で予測される。膜貫通ドメイン以外に、細胞内ドメインは約３５個のアミノ酸から形成される。特に、チロシン及びセリン残基は保存され、リン酸化によるＰ２の翻訳後制御を可能にする。
【００８４】
マウスのＰ２の予測されるドメイン構造は図２に示される。リーダーペプチドは、Ｐ２−ドメイン（アミノ酸４３個ないし１５０個）で設計された保存されたドメインのあとに続けられる。ＭＡＣ／ＰＦドメイン（１５０個ないし３５０個のアミノ酸）は、Ｐ２の一部であり、該一部はパーフォリンＩと、膜侵襲複合体の補体タンパク質である、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８及びＣ９と共有される。細胞内ドメイン内の６９１番目のチロシンと、６９９番目のセリンとがリン酸化／脱リン酸化による翻訳後制御を許容する場合には、典型的な膜貫通ドメイン（６６３個ないし６８３個のアミノ酸）はＰ２の膜集合を示唆する。Ｐ２−タンパク質を同定するために、図中での緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐ）のようなＣ−末端（７２０個のアミノ酸）タグ及び（抗−Ｖ５による同定及びＮｉ−カラムでの精製のための）Ｖ５−ｈｉｓ６タグを用いて多くのコンストラクトが作製された。
【００８５】
Ｐ２の予測された構造は新規の孔形成タンパク質の構造であり、パーフォリン１又はポリＣ９の重合複合体におそらく類似する（非特許文献５、６）。（Ｐ１には存在しない）Ｐ２の膜貫通ドメインは、膜につながれた複合体を予測する。パーフォリン−２の推定機能は、Ｐ２が結合した細胞の近傍の膜に孔を形成する（穴をあける）ことである。マクロファージに接着しているか、あるいはファゴソーム中に取り込まれた細菌又は細胞は、Ｐ２の標的となりやすい。
【００８６】
超微細構造解析のためのパーフォリン２の発現
発明者はＰ２ｃＤＮＡをクローニングし、細胞内でパーフォリン２ｃＤＮＡを発現させ、エンコードされたタンパク質を特徴付けた。パーフォリン−２の空間的な発現を特徴付けるために、パーフォリン２はＨＥＫ２９３細胞で発現させられ、パーフォリン−２に関する膜画分が単離され、陰性に染色され、電子顕微鏡を用いて可視化された。
【００８７】
予測された孔形成タンパク質のための最も直接的な試験は、電子顕微鏡による孔複合体を可視化することである。Ｐ２が超微細構造を有する複合体を生み出し、該構造が重合によって組み立てられた孔形成複合体と一致すると図３の電子顕微鏡写真のパネルは立証する。これらの電子顕微鏡写真を得るためには、Ｐ２−緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐ）の十分に高いレベルで発現する細胞を生み出し、膜断片を単離することが必要である。発明者はｇｆｐの読み枠に合うように融合されたＰ２のコーディング配列のｃＤＮＡを用いて、ＲＡＷ細胞（マクロファージ腫瘍細胞株）、３Ｔ３−繊維芽細胞及びＮＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした。細胞にトランスフェクションされたＰ２−ｇｆｐは初めはｇｆｐ−陽性であったが、次の２日間でｇｆｐの蛍光は消失し、これは細胞が死んだためか、おそらくＰ２の孔形成特性のためか、あるいはプロモーターの抑制制御のいずれかのためである。
【００８８】
しかし多くのトランスフェクションの後に、発明者はＧ４１８の存在下で２９３−細胞を選択することができ、該細胞はＰ２−ｇｆｐを発現しつづけ、図３に示された膜調製物を作製するために用いられた。２９３細胞はアデノウイルスの発現のためにアポトーシス及び細胞死に対して非常に耐性であり、該２９３細胞はＰ２−ｇｆｐで膜を濃縮することによるＰ２による死に抵抗性を示し、該Ｐ２−ｇｆｐは細胞内器官で内部の高い蛍光を示す。この組み立てられた実験での別の観察は、上記図で電子顕微鏡でしか見えない孔構造はトリプシン処理後のみで可視化され、同時に膜画分はこれらのｇｆｐの蛍光を消失することを発見した。ｇｆｐは細胞質内ドメインを構成するＰ２のＣ−末端に結合される（図２）。多量のｇｆｐタグのタンパク質分解による開裂は、Ｐ２の重合及び孔構造の形成を電子顕微鏡によって可視化できるようにする場合がある。したがって、Ｐ２の細胞内ドメインはＰ２の重合を制御することができると前記可視化は示す。前記図で示されたようなＰ２中で保存された６９１Ｙ又は６９９Ｓのリン酸化／脱リン酸化することによって、潜在的な機構は達成される。
【００８９】
パーフォリン２が約１０個ないし約１４個のプロトマーの重合複合体を形成し、約１６ｎｍの内部を水で満たされたチャンネルを有する孔複合体に関する膜を生み出すと電子顕微鏡解析は示す。超微細構造はドメイン構造からの予測と一致し、すなわち、パーフォリン２はＣＴＬ及びＮＫ細胞によって発現されたパーフォリン−Ｉにいくつか類似する孔形成タンパク質である。
【００９０】
パーフォリン−Ｉないしパーフォリン−２間のある重要な相違点は、ＰＩ（又はＣ９）では存在しないが、Ｐ２では存在する典型的な膜貫通ドメインの内容である。Ｐ２が重合前ではなく翻訳後に細胞質膜上か、あるいはファゴソーム膜内で結合した膜であると膜貫通ドメインは示す。Ｐ２の細胞内ドメインからか、あるいは（フォゴソームドメイン内の）細胞外ドメインから伝達されたあるシグナルは、Ｐ２の重合と、同時に近傍の標的膜への挿入とを誘発しやすい。最も好ましい標的膜は、マクロファージが接着している細菌又はファゴサイトーシスされた細菌であり、該細菌はＰ２に重合によって穴が形成される。このモデルは、翻訳及び重合の慎重な制御を必要とするＰ２の細胞毒性及び殺菌活性を示す。
【００９１】
パーフォリン２の発現の翻訳制御
超微細構造の検討のためのＰ２−ｇｆｐ−タンパク質発現細胞の生産を試みる前述した一連の実験で、パーフォリン−２タンパク質の発現は翻訳制御下におかれ、感染及び過剰発現による未成熟のパーフォリン−２発現が宿主細胞を殺すと発明者は発見した。トランスフェクション用のコンストラクトにＰ２の５’-ＵＴＲ配列を含めることは、（ｍＲＮＡではなく）Ｐ２−ｇｆｐ−タンパク質の発現を低下又は消滅させると発明者は気付いた。Ｐ２の５’-ＵＴＲが翻訳活性を制御できたとこの観察は示した。非コード５’-ＵＴＲ配列の機能的な活性は、しばしば異なる種での配列保存性を伴う。図４のアライメントで示したように、６種類の哺乳類で高い配列保存性があり、６００ｂｐの５’-ＵＴＲが利用できる。ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）及びカタツムリの５’配列は、これらの種で変化した機能に分岐することを示唆している。
【００９２】
典型的な哺乳類の遺伝子の前記５’-ＵＴＲは、比較的に短く（〜１５０ヌクレオチドが平均の長さである）、ＡＴＧを欠き、安定した２次構造を含まず、キャップ−依存性翻訳開始及びリボソームスキャニングとして知られる機構によって、一般的に、翻訳される。この過程の限定ステップは、キャップ構造に結合しているリボソームであって、該リボソームは真核細胞の翻訳開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）に依存し、該開始因子は非常に少量で細胞内に存在する（非特許文献１４）。翻訳可能なｍＲＮＡの集合からの特定のｍＲＮＡの選択は、ｅＩＦ４Ｅがそのキャップ構造へ結合することに関連した効率と、リボソームスキャニングによる翻訳開始の効率とによって測定され、前記選択はｍＲＮＡの５’-ＵＴＲ配列によって主として制御される（非特許文献１５）。上流のＡＴＧコドン及び安定した２次構造の存在は、リボソームスキャニングを妨げ、真のＡＴＧ開始部位での翻訳開始を阻害することが知られている。
【００９３】
内部リボソーム進入は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）又は真のＡＴＧの近傍−上流への４０Ｓリボソームサブユニットの結合を含む。内部での翻訳を開始すると報告されたｍＲＮＡの数は多くなっており、全てのｍＲＮＡの１０％に匹敵するｍＲＮＡがこの機構によって翻訳を開始できる（非特許文献１６）。キャップ依存性機構の効率性を低下させる条件下、例えば、アミノ酸の枯渇（非特許文献１７）、細胞死（非特許文献１８−２１）、低酸素（非特許文献２２、２３）、ヒートショック（非特許文献２４）の条件下及び細胞周期のＧ２／Ｍ期の間（非特許文献２０、２５−２８）に内部開始は特定の細胞のｍＲＮＡの翻訳を促進するように思われる。細胞内のＩＲＥＳの作用機構は、現在、理解されていないが、これらの要素のいくつかはＩＲＥＳ−トランス−作用因子（ＩＴＡＦｓ）と呼ばれる補因子を機能するために必要とすることが明らかになった。ＩＴＡＦｓの主要な役割は正確な３次元のＩＲＥＳ構造を維持するか、獲得するかのいずれかのためのＲＮＡシャペロンとして作用することであり、該構造は４８Ｓ複合体の効率的な集合のために必要とされると提案された。
【００９４】
Ｐ２の５’-ＵＴＲと、多様な短いオープン・リーディング・フレームとの複雑性が与えられたとき、リボソームスキャニングが非常に非効率となるであろうということは事実上確かである。５’-ＵＴＲはＩＲＥＳ活性を有し、付加的なＩＴＡＦｓは効率的なＰ２の翻訳を獲得するために必要とされる場合がある。
【００９５】
５’ＲＡＣＥ及びＰＣＲによって、発明者はパーフォリン２の翻訳開始点の上流−１９３０ｂｓに転写開始部位を同定し、該転写開始部位は図５に示したように短いイントロンを含む。マウスパーフォリン２の５’-ＵＴＲの機能活性を調べるために、発明者はリポーターアッセイを実施した。欠失コンストラクトはパーフォリン２の５’-ＵＴＲ配列の上流−１．４ｋｂまでからなり、該配列はＣＭＶプロモーターの下流に（リポーターとして）ＥＧＦＰのコーディング配列に連結され（ＡＴＧ開始コドンを＋１とする）、調製され、２９３細胞にトランスフェクションされた。同様のコンストラクトは、イントロンを有するものと、有しないものとを作製された。トランスフェクション後４８時間に、ｇｆｐ−蛍光を示す細胞の頻度はフローサイトメトリーによって測定され、パーフォリン２−５’-ＵＴＲ配列を含まないＥＧＦＰを用いてトランスフェクションされた細胞と比較された。図５及び６で示したように、リポーターアッセイでのパーフォリン２の５’-ＵＴＲ配列の長さが長くなるにつれてｇｆｐ陽性細胞の頻度が低下する。さらにｇｆｐを発現している細胞での平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、５’-ＵＴＲ配列の長さが長くなるにつれて低下する。ＥＧＦＰ−プラスミドのみを用いて同様のトランスフェクション効率と推定すると、これらのデータはパーフォリン２の５’-ＵＴＲはｇｆｐ発現細胞の頻度を低下すると示唆する。ＭＦＩの低下はこれらの細胞を示唆し、該細胞は、パーフォリン２の配列を有しないＥＧＦＰと比較されたとき、パーフォリン２の長い５’-ＵＴＲの存在下でｇｆｐを発現し、非常に少ない発現量を産出する。前記データはパーフォリン２の５’-ＵＴＲ配列が翻訳制御をするという考えと一致し、該制御はパーフォリン２を発現している細胞の頻度及び該細胞が発現するパーフォリン２の発現量に影響された。より短いＵＴＲ２コンストラクトと比較されたとき、５’-ＵＴＲの最も長い配列を含むコンストラクトＵＴＲＩはｇｆｐ蛍光の頻度及びＭＦＩの増加を示し、付加的な制御機構が働いていることを示唆している。
【００９６】
好ましい実施態様では、リポーター遺伝子はその生産物に関する内在性の活性によって検出できるポリペプチド生産物をエンコードし、該産物は宿主細胞によって生産されない。例えば、リポーター遺伝子は遺伝子産物をエンコードする場合があり、該産物は酵素活性による色素、蛍光又は発光にもとづいたシグナルの同定のもとになる。リポーター分子の例は色素シグナルによって検出可能な酵素であり、該分子は、例えば、緑色蛍光タンパク質又は青色蛍光タンパク質のような蛍光タンパク質か、ルシフェラーゼか、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）か、β−ガラクトシダーゼか、β−ラクタマ―ゼか、分泌型胎盤性アルカリホスファターゼかを含む。他のリポーター分子及び他の酵素は機能を適切な色素生産性又は蛍光生産性の基質によって同定でき、当業者に知られている。
【００９７】
ある実施態様ではリポーターは同定可能に標識され、特に好ましい実施態様では蛍光エネルギーシグナルの発生を利用できる。阻害剤の存在下で活性は増加され、活性化剤の存在下で活性は減少するであろう。当業者に知られたように、リポーターは適当な分子又は原子団に共有又は非共有結合によって検出可能に標識され、例えば、特定の蛍光エネルギー技術に従って選択されたさまざまな蛍光物質（例えば、フルオロフォア）のいずれかが供される。本明細書で提供される蛍光の原子団及び方法は、例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄで理解される（１９９６  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  第６版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ．、１９９９  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  第７版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ、（ｐｒｏｂｅｓ．ｃｏｍ／ｌｉｔ／）及び本明細書で引用された参考文献）。好ましい実施態様でのフルオロフォアのような使用は、フルオレセイン、、ローダミン、テキサスレッド、アレクサフルオロ−５９４、アレクサフルオロ−４８８、オレゴングリーン、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ及びＣｙ−５が特に好ましい。しかしながら、いずれかの適切なフルオロフォアが用いられてもかまわず、ある実施態様では、これらの列挙されたフルオロフォアよりは他のものが好ましい場合がある。
【００９８】
本明細書で提供されるところの蛍光エネルギーシグナルとは、蛍光放出か、励起か、エネルギー伝達か、消光か、あるいは脱消光の事象又はそのようなもののいずれかを含む。蛍光エネルギーシグナルは、適切な波長の光に対する応答で蛍光検出可能な程度に標識された薬剤によって典型的に仲介される場合がある。要するに、原理によって結合されることを望むことなく、蛍光エネルギーシグナルの発生は、一般的に、適切な光源（例えば、選択された蛍光原子団又はフルオロフォアのための適切な波長の光）によるフルオロフォアの励起を含み、該光源は基底状態から放出状態までフルオロフォアのエネルギー状態を一過的に上昇させる。実際に励起されたフルオロフォアは、好ましい励起により典型的に異なる波長（例えば、しばしばより長い波長）を有する検出可能な光の形態でエネルギーを放出し、それによって、その基底状態のエネルギーに戻す。好ましい実施態様の方法は、蛍光エネルギーシグナルのいずれかの使用を期待し、該使用は特別なフルオロフォア、基質標識方法及び検出機器に依存し、当業者に知られた基準に従って過度の実験を要せずに容易に選択される場合がある。
【００９９】
ある実施態様では、前記蛍光エネルギーシグナルは蛍光偏光（ＦＰ）シグナルである。ある他の実施態様では、前記蛍光エネルギーシグナルは、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）シグナルの場合がある。ある他の好ましい実施態様では、前記蛍光エネルギーシグナルは、蛍光消滅（ＦＱ）シグナル又は蛍光共鳴分光（ＦＲＳ）シグナルとなる場合がある。（ＦＰ、ＦＲＥＴ、ＦＱ及びＦＲＳに関する詳細のために、例えば、国際公開第ＷＯ９７／３９３２６号公報明細書、国際公開第ＷＯ９９／２９８９４号公報明細書、Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ−第６版、１９９６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社，オレゴン州ユージーン，４５６頁及び本明細書で引用した参考文献を参照せよ。）
ＦＰ、フルオロフォアの（分子回転拡散のための）平均角変位の測定は、光源からの光子のその吸収と光子の連続したその放出間で起こり、フルオロフォアの励起される状態となる間の回転拡散の内容及び割合、分子サイズ及び形状、溶液の粘性及び溶液の温度に依存する（Ｐｅｒｒｉｎ，  １９２６  Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｒａｄ．  １：３９０）。粘性及び温度が一定に固定されたとき、ＦＰは直接的に見かけの分子の体積又はフルオロフォアのサイズに関連する。偏光値は独特な平面（例えば、垂直及び水平）で測定された蛍光強度率であって、したがって、フルオロフォアの強度によって影響されない無次元の数量である。
【０１００】
リポーターは、例えば、さまざまな酵素、蛍光物質、発光物質及び放射性物質のいずれかの適切な分子又は原子団に共有又は非共有結合によって標識される場合がある。適切な酵素の例は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ及びアセチルコリンエステラーゼを含むが、これらに限られない。適切な蛍光物質は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、フィコエリトリン、テキサスレッド、アレクサフルオロ−５９４、アレクサフルオロ−４８８、オレゴングリーン、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ及びＣｙ−５を含むが、これらに限られない。適切な発光物質はルミノールを含むが、これらに限られず、適切な放射性物質は、リン［３２Ｐ］、ヨウ素［１２５Ｉ又は１３１Ｉ］又はトリチウム［３Ｈ］を含むが、これらに限られない。
【０１０１】
好ましい実施態様では、蛍光エネルギーシグナルは蛍光偏光シグナルであって、該蛍光偏光シグナルは偏光フィルターを備えた蛍光分光光度計を用いて検出される場合がある。特に好ましい実施態様では、蛍光偏光アッセイは、複数の反応室のそれぞれで同時に実施され、例えば、さまざまな反応室中でさまざまな反応構成又は状態を有するハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）を提供するためにＬＪＬ  ＣＲＩＴＥＲＩＯＮ（ＴＭ）  Ａｎａｌｙｓｔ  （ＬＪＬ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カリホルニア州サニーベール）プレートリーダーを用いて読まれる場合がある。蛍光偏光の読み取り用の他の適切な機器の例は、ＰＯＬＡＲＳＴＡＲ（ＴＭ）（ＢＭＧ  Ｌａｂ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、オッフェンブルク、ドイツ）、ＢＥＡＣＯＮ（ＴＭ）（Ｐａｎｖｅｒａ社、ウィスコンシン州マディソン）及びＰＯＬＡＲＩＯＮ（ＴＭ）（Ｔｅｃａｎ社、ノースカロライナ州リサーチトライアングルパーク）装置を含む。
【０１０２】
エネルギー移転（ＥＴ）は、２つの分子、エネルギー分配「供与体」分子及びエネルギー受容「受容体」分子の共鳴相互作用から発生する。（１）供与体の放出スペクトルが受容体の吸収スペクトルと重複し、（２）供与体及び受容体がお互いにある距離の範囲内であるときに、エネルギー移転は起こる。エネルギー伝達の効率は供与体及び受容体の近接によって大いに指図され、弱い６つの力として減弱される。したがって、ＥＴの測定は供与体及び受容体化合物の近接に強く影響され、ＥＴでの変化は、例えば、供与体及び受容体の会合及び解離のような化合物の近接での変化に感度よく影響される。好ましい実施態様では、１種類又は２種類以上のＥＴ供与体及びＥＴ受容体分子は提供される。
【０１０３】
ある好ましい実施態様では、ＥＴ供与体及び受容体分子間でのエネルギー移転によって発生される検出可能なシグナルは、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）から生じる。励起された供与体フルオロフォアからのエネルギーが、受容体フルオロフォアに直接的に移転されるとき、ＦＲＥＴは分子内か、２つの異なる種類の分子間で起こる（復習のために、Ｗｕら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２１８：１  １３、１９９４を参照せよ。）。
【０１０４】
ＣＭＶプロモーター下でＥＧＦＰタンパク質の前に挿入された完全長（ＦＬ）５’-ＵＴＲは、２９３細胞で５’-ＵＴＲＩ−７の欠失コンストラクトよりもより効率的にＥＧＦＰの翻訳を抑制する。Ｐ２の５’ＵＴＲの欠失コンストラクトは、進行的により翻訳活性を増大する。５’-ＵＴＲ７及び４のコンストラクトは最も強い翻訳活性を許容する。この翻訳の活性化はＩＲＥＳ活性のためである。この仮説は、２シストロン性発現コンストラクトでＰ２の５’ＵＴＲのＩＲＥＳ活性の解析によって、現在、立証された（図５）。第１のシストロンは、ＣＭＶプロモーターによって駆動されたＴＮＦＲ−ＳＦ２５（ＤＲ３又はＴＲＡＭＰとして知られた短いＴＲ２５）の細胞外及び膜貫通ドメイン（細胞質内ドメインはシグナリングを回避するために欠失される）をエンコードする。第２のシストロンはＥＧＦＰをエンコードし、該ＥＧＦＰは指示されたようにＰ２の５’ＵＴＲのコンストラクトの下流で融合される（ＦＬ  ５’ＵＴＲまでは含まない）。２９３細胞は２シストロン性のコンストラクトを用いてトランスフェクションされ、２日後にＴＲ２５及びＥＧＦＰの発現を分析し、ＥＧＦＰの対照ベクターを用いた２９３細胞のトランスフェクション効率は、しばしば７５％である。図１Ｂの上部パネルでは、データはＥＧＦＰ対照ベクター（１００％に設定）に関してプロットされ、該ベクターはＣＭＶプロモーター制御下の市販のＥＧＦＰベクターである。前記データは、５’ＵＴＲ７、４、３のコンストラクトの有する多くの細胞は、ＴＲ−２５陽性よりもＥＧＦＰ陽性であることを示す。これは、ＥＧＦＰが非常に強いＩＲＥＳ活性を示しているＤＮ−ＴＲ２５よりもより効率的に翻訳されることを示す。５’ＵＴＲ３でのイントロンの包含は、イントロンが５’ＵＴＲ６（−７７４ないし−４５０塩基）で見られるＩＲＥＳの阻害活性を抑制できることを示す。ＩＲＥＳの抑制的な活性は、ＵＴＲ５、６、２及び１で明白である。これらのデータは、Ｐ２のＦＬ  ５’ＵＴＲが最も強くＩＲＥＳの活性を抑制すると予測される。
【０１０５】
異なるＰ２  ５’−ＵＴＲコンストラクトでの修飾されたＩＲＥＳの活性の発見は、ＩＲＥＳトランス作用因子（ＩＴＡＦｓ）が、例えば、ストレスの多い、ある条件下でＰ２のＩＲＥＳ活性及びＰ２タンパク質の発現の調節に責任があるとの発見と一致する。
【０１０６】
要約では、図１６中の断片１及び２は前記Ｐ２ＩＲＥＳを明らかに構成する。セグメント５は抑制を弱く打ち消す一方で、セグメント３、４及び６はＩＲＥＳ活性を抑制する。スプライシングされていないイントロンはＩＲＥＳ活性を抑制し、断片３による抑制を打ち消す。
【０１０７】
パーフォリン−２は殺菌活性を有する。
【０１０８】
Ｐ２の細胞毒性及び抗菌活性を試験するための実験では、発明者は、２９３細胞にトランスフェクションされたＰ２−ｇｆｐがＲＡＷ細胞の能力と類似のやり方で細菌を殺す能力を有するかどうかを観察した。ｇｆｐの蛍光よって証明されたとき図８Ｂ、Ｃ）、Ｐ２を発現しているＰ２−ｇｆｐ−２９３細胞は、抗生物質の非存在下でＥ．Ｃｏｌｉに対するこれらの殺菌活性においてトランスフェクションされていない２９３細胞（図８Ａ）と比較された。ＲＡＷ細胞は抗菌活性を仲介した細胞用の陽性対照として用いられた（図８Ｅ）。さらにＲＡＷ細胞のファゴサイトーシスの能力は、殺菌活性を阻害することが知られているサイトカラシンで阻害される（図８Ｄ）。図８Ｂで示されたように、トランスフェクションされていない２９３細胞は細菌を除去できないが、２９３細胞にトランスフェクションされたＰ２は、事実上、大腸菌の汚染を除去した。むしろ殺菌性の拡散は、最終的に、２４時間以内に２９３細胞の死を引き起こす（図８Ａ）。健全なＲＡＷ細胞はＥ．ｃｏｌｉを除去でき（図８Ｄ）、この能力はサイトカラシンによる阻害が期待された。
【０１０９】
Ｐ２の発現を専門としない（２９３）細胞によって発現されたときでさえ、これらの実験はＰ２の抗菌活性を示す。実験はＰ２がＲＡＷ細胞及び正常なマクロファージでの主な抗菌タンパク質であり、該細胞は細胞内の細菌殺傷に責任がある場合があると示す。
【０１１０】
ＲＡＷマクロファージ細胞株で発現されたＰ２ｍＲＮＡは細菌の殺傷に関与することを示すために、発明者は３つのＰ２ｓｉＲＮＡベクター（ｓｉＲＮＡ１−３）を作製し、ＲＡＷ細胞にトランスフェクションした。ハイグロマイシン選択後、Ｐ２ｍＲＮＡレベルはＲＴ−ＰＣＲによって測定され、トランスフェクションされていないＲＡＷ細胞でのレベルと比較された。３つのコンストラクトは、それぞれ、トランスフェクションされていないＲＡＷ細胞でのＰ２ｍＲＮＡレベルの４３％、５８％及び１２％にＰ２ｍＲＮＡを抑制した（図９）。
【０１１１】
約９０％のＰ２−ｍＲＮＡの減少がＲＡＷ細胞の殺菌活性に対していかなる効果を及ぼしたかどうかを決定するためにＲＡＷ−ｓｉＲＮＡベクター細胞株は用いられた。図１０で示されたように、Ｐ２−ｍＲＮＡの減少は確かに細菌活性を減少させ、大腸菌をほぼ２倍にする（１００％  Ｐ２の存在下でコロニーのほぼ５０％の減少と一致している）。この発見はＰ２が抗菌活性の主要な貢献者であることを示す。
【０１１２】
上記したように、本発明は組み換え核酸分子に関し、該分子はパーフォリン２の５’−ＵＴＲ、これらの断片及び／又はこれらと実質的に類似する配列を含む。かかる配列は、恒常型の活性プロモーターと、パーフォリン２又は受容体核酸配列の翻訳領域いずれかとの両方と操作可能に連結されることが好ましい。
【０１１３】
発明の別の局面は、細胞にパーフォリン２タンパク質の発現を誘導する化合物のスクリーニングの方法に関する。発明者は、パーフォリン２タンパク質が抗菌及び抗癌活性の両方を有することを発見した。前記発明者は、Ｐ２タンパク質の翻訳のレベルがＰ２ｍＲＮＡそのものの５’−ＵＴＲの長さ及び配列によって制御されることを発見した。特に、より長い５’−ＵＴＲは低レベルのＰ２ｍＲＮＡの翻訳を生じる。前記発明者は、マクロファージのような免疫細胞でのＰ２発現の増加が抗菌及び抗癌の有効性を増大させるであろうと主張する。
【０１１４】
かかるように前記発明者は、細胞でのＰ２ｍＲＮＡｓの翻訳の増加で効果的である化合物のスクリーニングの方法を考察する。かかる化合物は、翻訳を促進するＩＴＡＦｓと相互作用することによってＩＲＥＳの活性を増大することが好ましい。その最も基本的な形態では、かかる方法は曝露されている細胞を含み、該細胞がそれぞれ内因性又は外因性のパーフォリン２遺伝子又はｃＤＮＡを転写し、試験化合物でパーフォリン２タンパク質の生産物が増加するかどうかを決定する。
【０１１５】
別の方法は、パーフォリン２発現ベクターを有する対照細胞及び試験細胞の提供を必要とする。Ｐ２の発現ベクターは発現配列と操作可能に連結されたプロモーターを有する。発現配列は、リポータータンパク質をエンコードするリポーター配列と操作可能に連結されたＰ２の５’−ＵＴＲ配列を有する。この方法では、前記試験細胞は試験化合物に接触させられるが、対照細胞は接触させられない。前記試験細胞が前記試験化合物の非存在下で成長した対照細胞よりもより多くのリポータータンパク質を生産する場合に、そのとき、技術者は潜在的な治療用化合物としての試験化合物を同定できる。かかる試験化合物は効果的な抗生物質又は抗癌剤であると推測され、該抗生物質又は抗癌剤が、病原菌及び腫瘍細胞に対するその戦いで身体の自己免疫系の有効性を高める。
【０１１６】
別の方法では、細胞は機能的な細胞生産物を通じてＰ２の翻訳を増大させる化合物を直接的にスクリーニングする。これらの方法では、抗癌又は抗生物質はお互いにパーフォリン２発現ベクターを有する対照細胞及び試験細胞を提供することによって同定される。これらの実施態様では、前記Ｐ２発現ベクターはＰ２ｃＤＮＡと操作可能に連結されたプロモーターを有する。内因性の環境下では、Ｐ２ｍＲＮＡの翻訳はその５’ＵＴＲによって実質的に抑制される。Ｐ２発現ベクターを含んでいる試験細胞は所望のように試験化合物に曝露され、化合物が前記５’ＵＴＲに仲介された翻訳の抑制の原因となる細胞内機構を妨げ、そのためにＰ２ｍＲＮＡの翻訳が増大された。機能的なレベルでかかる測定を実施するために、細胞は細菌のような病原菌又は腫瘍細胞のいずれかを共存培養で殺傷する細胞の能力を試験される。
【０１１７】
試験のための好ましい微生物は、ウイルス、感染性の細菌、感染性の真菌及び感染性の単細胞原生生物であって、前記ウイルスは、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２のようなヒト免疫不全ウイルス、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス、デングウイルス、脳炎ウイルス、横熱ウイルス、コロナウイルス、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器多核体ウイルス、インフルエンザウイルス、ハンタウイルス、ブンガウイルス、出血熱ウイルス、レオウイルス、オルビウイルス、ロタウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、パルボウイルス、パピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（Ｉ−ＩＳＶ）１及び２、水痘・帯状ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、アフリカ豚コレラウイルス、Ｄ型肝炎の未分類病原体、非Ａ型、非Ｂ型肝炎の病原体のようなウイルスであり、前記感染性の細菌は、ヘリコバクター・ピロリ、ボレリア・バーグドルフェリー、レジオネラ・ニューモフィラ、ヒト型結核菌、ウシ型結核菌（ＢＣＧ）、トリ型結核菌、イントラセルラーレ結核菌、黄色ブドウ球菌、淋菌、髄膜炎菌、リステリア・モノサイトジェネス、化膿レンサ球菌、肺炎球菌、インフルエンザ菌、モラクセラ・カタラーリス、肺炎桿菌、炭疽菌、ジフテリア菌、ウェルシュ菌、破傷風菌、エンテロバクター・アエロゲネス、クレブシエラ・ニューモニエ、パスツレラ・マルトシダ及び梅毒トレポネ−マのような細菌であり、感染性の真菌は、クリプトコックス・ネオフォルマンス、カプスラーツム型ヒストプラスマ、コクシジオイデス・イミチス、ブラストミセス・デルマティティジス、カンジダ・アルビカンスのような真菌であり、前記感染性の単細胞原生生物は、例えば、熱帯熱マラリア原虫、トリパノソーマ・クルズ、リーシュマニア・ドノバニ及びトキソプラズマ・ゴンディと、前記カンジダ属菌（例えば、Ｃ．アルビカンス、Ｃ．パラプシローシス、Ｃ．クルセイ、Ｃ．グラブラータ、Ｃ．トロピカリス又はＣ．ルシタニエ）と、トルロピシス属（例えば、Ｔ．グラブラータ）と、アスペルギルス属（例えば、Ａ．フミガルス）と、ヒストプラズマ属（例えば、Ｈ．カプスラーツム）と、クリプトコッカス属（例えば、Ｃ．ネオフォルマンス）と、ブラストミセス属（例えば、Ｂ．デルマティティジス）と、フザリウム属と、トリコフィトン属と、シュ−ドアレシェリア・ボイディイと、コクシジオイデス・イミチスと、スポロトリクックス・シエンキと、ヒト腫瘍細胞とであり、前記感染性の真菌は、例えば、ヒストプラズマ症、カンジダ症、クリプトコッカス症、ブラストミセス症及びコクシジオイデス症を引き起こすこのような真菌である。
【０１１８】
共存培養のための好ましい腫瘍細胞株は、ＮＣＩ−６０細胞パネルから選択されるのが好ましい。ＮＣＩ−６０細胞株は以下の細胞株を含む。
【０１１９】
肺：ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ５２２、Ａ５４９−ＡＴＣＣ、ＥＫＶＸ、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ３３２Ｍ。
【０１２０】
結腸：ＨＴ２９、ＨＣＣ−２９９８、ＨＣＴｌ１６、ＳＷ６２０、ＣＯＬＯ２０５、ＨＣＴ１５、ＫＭ１２。
【０１２１】
胸部：ＭＣＦ７、ＭＣＦ７ＡＤＲｒ、ＭＤＡＭＢ２３１、ＨＳ５７８Ｔ、ＭＤＡＭＢ４３５、ＭＤＮ、ＢＴ５４９、Ｔ４７Ｄ。
【０１２２】
卵巣：ＯＶＣＡＲ３、ＯＶＣＡＲ４、ＯＶＣＡＲ５、ＯＶＣＡＲ８、ＩＧＲＯＶＩ、ＳＫＯＶ３。
【０１２３】
白血病：ＣＣＲＦＣＥＭ、Ｋ５６２、Ｍ０ＬＴ４、ＨＬ６０、ＲＰＭＩ８２６６、ＳＲ。
【０１２４】
腎臓：Ｕ０３１、ＳＮ１２Ｃ、Ａ４９８、ＣＡＫＩｌ、ＲＸＦ３９３、７８６０、ＡＣＨＮ、ＴＫｌＯ。
【０１２５】
黒色素細胞腫：ＬＯＸＩＭＶＩ、ＭＡＬＭＥ３Ｍ、ＳＫＭＥＬ２、ＳＫＭＥＬ５、ＳＫＭＥＬ２８、Ｍ１４、ＵＡＣＣ６２、ＵＡＣＣ２５７。
【０１２６】
前立腺：ＰＣ３、ＤＵ１４５。
【０１２７】
中枢神経系：ＳＮＢ１９、ＳＮＢ７５、Ｕ２５１、ＳＦ２６８、ＳＦ２９５、ＳＭ５３９。
【０１２８】
別の実施態様では、発現ベクターは２シストロン性のベクターである。１つの局面では、ベクターはＳＶ４０プロモーターを含む、しかしながら、異なる細胞系で機能的であるいずれかの型のプロモーターが用いられ、組織特異的プロモーターを含む。本発明を実施するのに有用なプロモーターの例は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳ガンウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶ長端末反復プロモーターのようなヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、モロニーウイルス、ＡＬＶ、ＣＭＶ即時型初期プロモーターのようなサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン及びヒトメタロチオネインのようなヒト遺伝子由来のプロモーターを含むが、これらに限られない。
【０１２９】
別の好ましい実施態様では、前記ベクターはポリアデニル化シグナルを含む。本発明を実施するのに有用なポリアデニル化シグナルの例は、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル及びＬＴＲポリアデニル化シグナルを含むが、これらに含まれない。特に、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルと称され、ｐＣＥＰ４プラスミド（インビトロジェン、サンディエゴ、カリフォルニア）中に存在する前記ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルが用いられる。
【０１３０】
パーフォリン２組成物
別の好ましい実施態様では、組成物はパーフォリン２分子及び標的化薬剤を含む。標的された細胞系は、宿主の正常な組織の一部分となるか、宿主の組織を減少させるか、あるいは感染の一部分として宿主に存在する場合がある。
【０１３１】
本発明での有用な標的化薬剤は、細胞表面タンパク質に対する抗体、細胞表面タンパク質に対するリガンド、レクチン、アプタマー及びこのようなもの（例えば、米国特許第４，６６１，３４７号公報明細書、米国特許第４，６７１，９５８号公報明細書及び米国特許第５，３３４，７６１号公報明細書を参照せよ）を含むが、これらに限られない。標識の目的のために、抗体を使用するとき、パーフォリン２に特異的な結合を供与するいずれかの断片は本発明で有用であり、該断片は全てのモノクローナル及びポリクローナル抗体と、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆｖのような有効なこれらの断片と、これらの断片に結合する他のエピトープとを含む。単鎖抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、２価性抗体、キメラ抗体及び他のそのような物は本発明に従って用いられる場合がある。同様に、特異的な結合を有する合成ペプチドは本発明に従って用いられる場合がある。細胞表面分子を認識するクローン化された受容体が用いられる場合がある。同様に、細胞表面分子のリガンドはパーフォリン２を標識するために有用である。リガンドは、ＩＬ−ＩないしＩＬ−１２、ＴＧＦ−α、腫瘍壊死因子、上皮成長因子、血小板由来成長因子、トランスフェリン及びトランスコバラミンのような成長因子及びサイトカインを含む。標識原子団は病原体によって認識される哺乳類細胞の表面上のこれらの分子を含む。反対に、病原体の表面分子は標識原子団として供される場合があり、該表面分子はＨＩＶのｇｐ１２０のような哺乳類細胞の表面タンパク質と相互作用する。他の類似の標識原子団は当業者に明らかとなるであろう。
【０１３２】
他の実施態様では、標的化原子団は１つの分子よりもより多くなる場合があり、特に、被包粒子となる場合があり、該粒子は所望の場所に粒子の内容物の送達を目的とし、同時に、標的に送達するためにパーフォリン２を被包する能力を有する。かかる「粒子」は、ウイルス、細菌、リポソーム、赤血球のゴースト及びそのようなものを含む。前記粒子への化合物の被包方法は当業者に周知である。同様に、リポソームは溶液の成分を取り囲むように自然に形成し、前記成分は脂質前駆体が組み合わされて用いられる。
【０１３３】
上記本発明のある実施態様のために、パーフォリン２は標的化原子団に「連結」される。特別な細胞又は他の脂質２重膜で囲まれた粒子に対するパーフォリン２の選択的な標的化のために、かかる「連結」は１種類又は２種類以上の標的薬剤ないし１種類又は２種類以上のパーフォリン２分子に結合するのに有用である。本明細書で用いられるところの「連結された」又は「連結」とは、２つの物がいずれかの物理化学的な手法によってお互いに結合されることを意味する。連結がパーフォリン２の有効性又は標的分子の特異的な結合能を実質的に減少させないかかる性質となるは重要である。これらのパラメーターが心に留められるとき、当業者に知られたいずれかの連結は、共有又は非共有結合にかかわらず、供される場合がある。
【０１３４】
本発明に従った連結は直接的な連結にならない必要がある。パーフォリン２及び別個の標的原子団はこれらの連結及び／又はリンカーの一群を安定にするために機能化された一群とともに提供される場合があり、前記連結及び／又はリンカーの一群はこれらの連結を安定にするためにパーフォリン２と標的原子団との間に置かれる場合がある。さらに、前記パーフォリン２及び標的原子団は単独の工程で合成される場合があり、前記パーフォリン２及び標的原子団は１つ及び同一の物とみなされる。例えば、従来の標準方法に従って単一の融合ポリペプチドが調製されたように、例えば、細胞外受容体に対する特異的な標的分子はパーフォリン２とともに合成される。
【０１３５】
連結はパーフォリン２と標的原子団との間に共有又は非共有結合を提供する、特異的な分子によって供与される場合がある。共有結合の具体的な例は、２価性のクロスリンカー分子が用いられる、これらの物を含む。前記クロスリンカー分子は、同一の２価性又は異なる２価性となる場合があり、連結される分子の特性に依存している。同一の２価性クロスリンカーは２つの同一の反応原子団を有する。異なる２価性クロスリンカーは２つの異なる反応原子団を有し、該原子団は連続して起こるコンジュゲート化反応をともなう。さまざまな形式の商業上入手可能なクロスリンカーは以下の原子団の１種類又は２種類以上と反応し、該原子団は、１級アミン、２級アミン、メルカプト基、カルボキシル基、カルボニル基及び炭水化物である。アミン−特異的クロスリンカーの例は、ビス（スルホスクシンイミジル）スベリン酸塩、ビス［２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン、ジスクシンイミジルスベリン酸塩、ジスクシンイミジル酒石酸塩、ジメチルアジピン酸塩．マルチドット．２ＨＣｌ、ジメチルスベリイミデート．マルチドット．２ＨＣｌ及びエチレングリコールビス−［スクシンイミジル］−［コハク酸塩］である。メルカプト基と反応するクロスリンカーは、ビスマレイミドヘキサン、ｌ，４−ジ−［３’−（２’−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド）］ブタン、ｌ−［ｐ−アジドサリシルアミド］−４−［ヨードアセトアミド］ブタン及びＮ−［４−（ｐ−アジドサリシルアミド）ブチル］−３’−［２’−ピリジルジチオ］プロピオンアミドを含む。炭水化物と優先的に反応するクロスリンカーはアジドベンゾイルヒドラジドを含む。カルボキシル基と優先的に反応するクロスリンカーは４−［ｐ−アジドサリシルアミド］ブチルアミンを含む。アミン及びメルカプト基と反応する異なる２価性クロスリンカーは、Ｎ−スクシンイミジル−３−［２−ピリジルジチオ］プロピオン酸塩、スクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノ安息香酸塩、スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボン酸塩、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシイミドエステル、スルホスクシンイミジル６−［３−［２−ピリジルジチオ］プロピオンアミド］ヘキサン酸塩及びスルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボン酸塩を含む。カルボキシル基及びアミン基と反応する異なる２価性クロスリンカーは１−エチル３−［３−ジメチルアミノプロピル］−カルボジイミド塩酸塩を含む。炭水化物及びメルカプト基と反応する異なる２価性クロスリンカーは、４−［Ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサネル−カルボキシルヒドラジド．マルチドット．ＨＣｌ、４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）−ブチル酸ヒドラジド．マルチドット．ＨＣｌ及び３−［２−ピリジルジチオ］プロピオニルヒドラジドを含む。前記クロスリンカーは非選択的となる場合がある。非選択的なクロスリンカーの例は、ビス−［β−（４−アジドサリシルアミド）エチル］ジスルフィド及びグルタルアルデヒドである。
【０１３６】
非共有結合は、パーフォリン２と標的原子団とを連結するために用いられる場合がある。非共有結合は直接的又は間接的な手法によって達成される場合があり、該手法は、疎水性相互作用、陽性及び陰性に荷電された分子のイオン性相互作用及び他の親和性相互作用を含む。非共有結合は特別なパーフォリン２と標的原子団とを連結し、パーフォリン２を特別な細胞に向けるために有用であると、当業者は容易に決定する場合がある。
【０１３７】
抗体：別の好ましい実施態様では、パーフォリン２及び５’−ＵＴＲ、突然変異体、融合タンパク質、ペプチド、核酸及びこれらの断片に対する抗体はモノクローナル抗体であることが好ましい。本発明の前記抗体は、当業者に知られたいずれかの適切な方法によって製造される場合がある。
【０１３８】
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎによって記載されたＮａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）及び米国特許第４，３７６，１１０号公報明細書か、Ｈａｒｌｏｗらによって記載されたＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第２版、（１９８８）か、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇらによって記載されたＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−ＣｅＩｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  Ｎ．Ｙ．，（１９８１））か、あるいは当業者に知られた他の方法のようなハイブリドーマ法を用いて調製される場合がある。モノクローナル抗体を産生するために供される場合がある方法の他の例は、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２、Ｃｏｌｅら、１９８３、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０：２０２６−２０３０）と、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９８５、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、７７−９６頁）とを含むが、これらに限られない。かかる抗体はいずれかの免疫グロブリンクラスとなる場合があり、該クラスは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びこれらのサブクラスを含む。本発明のｍＡｂを産生しているハイブリドーマは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで培養される場合がある。ｍＡｂｓのｉｎ  ｖｉｖｏの高い力価の生産は、これを現在の生産の好ましい方法とする。
【０１３９】
本発明の前記抗体はポリクローナル抗体を含む場合がある。ポリクローナル抗体を調製する方法は、当業者に知られている（Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第２版、（１９８８）は、引用により全体として本明細書に取り込まれる）。例えば、本発明のポリペプチドは、抗原に対して特異的なポリクローナル抗体を含む血清生産物を誘導するために、さまざまな宿主動物に投与される場合があり、該動物はウサギ、マウス、ラット等を含むが、これらに限られない。本発明の前記ポリペプチドの投与は、免疫化製剤と、所望のアジュバンドの１回又は２回以上の注射を課する。さまざまなアジュバンドは免疫学的な応答を増大させるために用いられる場合があり、該応答は宿主の種に依存し、前記アジュバンドは、フロイント（完全及び不完全）と、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲルと、リゾレシチンのような表面活性物質と、プルロニックポリオールと、ポリアニオンと、ペプチドと、乳濁油と、スカシ貝ヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎｅ）と、ジニトロフェノールと、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）及びコリネバクテリリウムパルバムのような潜在的に有用なヒトアジュバンドとを含むが、これらに限られない。かかるアジュバンドは当業者に周知である。本発明の目的のために「免疫化製剤」は、本発明のポリペプチド又は核酸として定義される場合があり、該ポリペプチド又は核酸は、断片、バリアント及び／又はこれらの誘導体、それに加えて本明細書で説明されたような非相同的なポリペプチドと、ポリペプチド及び核酸の他の形態とを用いた融合物を含む。
【０１４０】
別の好ましい実施態様では、レトロウイルスベクターは核酸分子を含み、該核酸分子はパーフォリン２の５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）（配列番号１、２又は５）と、これらの断片、バリアント、突然変異体及び類似体と、及び／又は、これらと実質的に類似する配列とを含む。
【０１４１】
１つの好ましい実施態様では、レトロウイルスは複製欠損レトロウイルス性ベクターである。
【０１４２】
別の好ましい実施態様では、前記レトロウイルス性ベクターは感染性であり、核酸分子はＩＲＥＳの翻訳制御下にある。
【０１４３】
前記レトロウイルスは全てのタンパク質をコードすることが好ましく、該タンパク質は、レトロウイルスに宿主細胞膜に接着すること、及び／又は宿主細胞の侵入することを許容する。前記タンパク質はウイルスの表面タンパク質となる場合があり、Ｅｎｖタンパク質又は機能的なこれらの誘導体となることが好ましい。前記ｅｎｖ遺伝子はレトロウイルス性ベクターにもとづいて同じレトロウイルスから生じる場合がある。しかしながら、前記ｅｎｖ遺伝子はレトロウイルス性ベクターに対して非相同的となる場合があり、異なるウイルス種、亜種、サブタイプ又はクレードに由来することが最も好ましい。さらに感染を始める前記タンパク質は、天然のタンパク質の一部となる場合があり、天然タンパク質のアミノ酸配列との相同性が、ただ６０ないし６９％である場合があり、７０ないし８９％となることが好ましく、９０ないし９９％となることが最も好ましい。
【０１４４】
前記レトロウイルス性ベクターは、少なくとも１個又は２個以上のＩＲＥＳを含む。別の好ましい実施態様では、前記ベクターはＩＲＥＳ−ｅｎｖ−カセットに加えて、さらに１種類又は２種類以上の非相同的な遺伝子を含み、ＩＲＥＳ−ｅｎｖ−カセットの５’への挿入が最も好ましい。かかるレトロウイルス性ベクターは、米国特許第７，０５６，７３０号公報明細書で説明される。
【０１４５】
別の好ましい実施態様では、本発明のベクターは、例えば、幹細胞のような細胞に導入される。本発明の方法に従って、胚性幹細胞は本発明に従ってレトロウイルス性の粒子を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで感染される。感染後、前記レトロウイルス性ベクターは前記胚性細胞のゲノムと融合する。一旦、前記レトロウイルス性ベクターが前記胚性幹細胞のゲノムと融合されると、該ベクターは系統を引き継いでいる細胞に規則的な細胞分裂によって伝達されるであろう。任意に用いられた前記レトロウイルス性ベクターは複製−構成要素であるために、前記ベクターは感染した胚性細胞中でさらに感染性のレトロウイルス粒子を産生する。これらの粒子はさらに胚性細胞に感染し、生殖系列のトランスダクションを獲得するための可能性を潜在的に増加する。したがって、本発明に従う方法は生殖系列のトランスダクションを獲得するのに非常に効率が有効である。生殖系列のトランスダクションの効率はトランスジェニック動物を最終的に獲得するための成果と一致するため、本発明に従う前記方法はトランスジェニック動物を生産するための迅速かつ効率的な技術を提供する。この方法は哺乳類に適用可能であるが、トリ又はサカナのような他の属にも適用可能である。
【０１４６】
スクリーニングアッセイ
パーフォリン２（Ｐ２）ＩＲＥＳ翻訳のための薬剤スクリーニングのアッセイは、Ｐ２の翻訳が殺菌及び抗腫瘍活性のために必要であるとの発見にもとづいている。Ｐ２ｍＲＮＡは〜１９００塩基対の非常に長い５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を有し、該領域は代替的なスプライス部位を有する２９０ｂｐを含むことを発明者は発見した。５’ＵＴＲは内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）活性をｍＲＮＡに供与している配列を含むことを発明者は見つけた。ＩＲＥＳの一部分はイントロン中に含まれる。Ｐ２ｍＲＮＡを翻訳するために、前記ＩＲＥＳはＩＲＥＳ−トランス作用因子（ＩＴＡＦｓ）に結合することによる翻訳を許容するために活性化される必要がある。翻訳者はＰ２のＩＲＥＳ活性を測定を許容するリポーターアッセイを開発した。（図２０）で示された２シストロン性ｃＤＮＡベクターは、活性化するとき、ＩＲＥＳがホタル・ルシフェラーゼの発現を操作し、該発現は定量的に測定されることができる。
【０１４７】
薬剤スクリーニングのために、Ｐ２の５’ＵＴＲ又は欠失配列はホタル・ルシフェラーゼの前方に挿入され、２９３細胞のような細胞株にトランスフェクションされ、選択された。トランスフェクションされた細胞は９６ウェル又は３８２ウェルのプレートに分注され、化合物ライブラリー由来の薬剤が添加され、さまざまな期間組織培養条件下で培養された。前記ウェルはウミシイタケ及びホタル・ルシフェラーゼ活性を用いて評価された。増加したホタル活性は増加したＩＲＥＳ活性を示し、該活性はｍＲＮＡのＰ２の翻訳を操作し、該翻訳は細胞を含む。
【０１４８】
Ｐ２ｍＲＮＡが繊維芽細胞、樹状細胞及びＢ細胞で誘導できることを発明者は発見した。異なる細胞型はＩＴＡＦｓの異なる組成物を有する。薬剤スクリーニングによって、異なる細胞株は２シストロン性のベクターを用いて形質転換され、細胞特異的な方法でＩＲＥＳ活性を促進する薬剤を単離できるであろう。これは異なる部位での感染の治療に非常に重要になるであろう。
【０１４９】
１つの実施態様では、スクリーニングはそれぞれの培養細胞に接触することを含み、該培養細胞はさまざまなライブラリーの構成化合物を用いて２シストロン性のベクターを発現している。前記化合物又は「治療用化合物候補」は有機物、無機物、低分子、タンパク質、抗体、アプタマー、核酸分子又は合成化合物のいずれかとなってもかまわない。
【０１５０】
製剤候補はさまざまな化学種を含み、これらは有機化合物となることが典型であるが、前記有機化合物は低分子有機化合物、核酸を含み、該化合物、核酸はオリゴヌクレオチド及びペプチドを含む。低分子有機化合物は、例えば、約４０又は５０より大きいが約２，５００より小さな分子量を適切に有する場合がある。製剤候補は機能的な化学原子団を含み、該原子団はタンパク質及び／又はＤＮＡと相互作用する。
【０１５１】
製剤候補は広範な種類の資源から得られる場合があり、該資源は合成又は天然化合物のライブラリーを含む。例えば、多くの手法は、広範な種類の有機化合物及び２分子の不規則及び直接合成に利用でき、該手法は任意抽出されたオリゴヌクレオチドの発現を含む。代替的には、例えば、細菌、真菌及び動物の抽出物の形態での天然化合物のライブラリーは利用できるか、あるいは容易に生産される。
【０１５２】
化学物質ライブラリー：コンビナントリアル化学における発展は数百ないし数千の別個の化合物の迅速かつ経済的な合成を許容する。これらの化合物は、効率的なスクリーニングのために設計された低分子の適度なサイズのライブラリー中に配列されるのが典型である。コンビナントリアル手法は不作為なライブラリーを製造するのに用いられ、新規化合物の同定に適する。さらに、製造される、より小さく、多様ではないライブラリーは、前もって測定された生物学的な活性を有する単一の親の化合物に由来する。いずれかの場合には、重要な酵素の阻害剤のようなコンビナントリアル化学によって生産された治療学上の適切な生物学的な分子を特異的に標的するための効率性なスクリーニング機構の欠如は、これらの供給源の最適な使用を阻害する。
【０１５３】
コンビナントリアル化学ライブラリーはさまざまな化学的な化合物の収集物であって、該収集物は化学的な合成又は生物学的な合成のいずれかか、試薬のような多くの化学的な「素材」と組み合わせることによって生み出された。例えば、ポリペプチドライブラリーのような一次元のコンビナントリアル化学ライブラリーは、非常に多くの組み合わせ中の化学的な素材（アミノ酸）の一群と、一定の化合物の長さ（例えば、ポリペプチド化合物でのアミノ酸の総数）のための潜在的に全て可能な方法とを組み合わせることによって形成される。かかる化学的な素材のコンビナントリアル的な混合を通じて数百万の化学的な化合物は合成される。
【０１５４】
「ライブラリー」は２から５０，０００，０００までのさまざまな構成の化合物を含む場合がある。ライブラリーは少なくとも４８種類のさまざまな化合物を含むことが好ましく、９６種類又はそれより多くのさまざまな化合物が好ましく、３８４種類又はそれより多くの種類のさまざまな化合物がより好ましく、１０，０００種類又は又はそれより多くの種類のさまざまな化合物がより好ましく、１０，０００種類のさまざまな化合物よりもより多いことがより好ましく、かつ、１，０００，０００のさまざまな構成の化合物よりもより多いことが最も好ましい。「さまざまな」に関して、ライブラリー中の化合物の５０％よりもより多い化合物がライブラリーの他の構成のいずれかにも一致しない化学構造を有することを意味する。ライブラリー中の化合物の７５％よりもより多い化合物が前記収集物の他の構成のいずれかにも一致しない化学構造を有することが好ましく、９０％よりもより多いことがより好ましく、約９９％よりもより多いことが最も好ましい。
【０１５５】
コンビナントリアル化学ライブラリーの調製は当業者に周知である。復習のために、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ  ９６：５５５−６００、１９９６と、Ｋｅｎａｎら、Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｗｉｔｈ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｓｈａｐｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  １９：５７−６４、１９９４と、Ｊａｎｄａ、Ｔａｇｇｅｄ  ｖｅｒｓｕｓ  ｕｎｔａｇｇｅｄ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  ９１：１０７７９−８５、１９９４と、Ｌｅｂｌら、Ｏｎｅ−ｂｅａｄ−ｏｎｅ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ３７：１７７−９８、１９９５と、Ｅｉｃｈｌｅｒら、Ｐｅｐｔｉｄｅ，  ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ，  ａｎｄ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、Ｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ．  １５：４８１−９６、１９９５と、Ｃｈａｂａｌａ、Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｎｏｖｅｌ  ｔａｇｇｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｌｅａｄｓ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ６：６３２−９、１９９５と、Ｄｏｌｌｅ、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ＭｏＩ  Ｄｉｖｅｒｓ．  ２：２２３−３６、１９９７と、Ｆａｕｃｈｅｒｅら、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｎｏｎｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｅａｄ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｕｓｉｎｇ  ｒｏｂｏｔｉｃａｌｌｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、Ｃａｎ  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ７５：６８３−９、１９９７と、Ｅｉｃｈｌｅｒら、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、ＭｏＩ  Ｍｅｄ  Ｔｏｄａｙ  １：  １７４−８０、１９９５と、Ｋａｙら、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、Ｃｏｍｂ  Ｃｈｅｍ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ  ４：５３５−４３、２００１とを参照せよ。
【０１５６】
化学的に多様なライブラリーを製造するための他の化学が用いられる。前記化学は、ペプチド（ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９１／１９７３５号公報明細書）と、エンコードされたペプチド（ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９３／２０２４２公報明細書）と、不規則バイオ−オリゴマー（ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９２／０００９１公報明細書）と、ベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号公報明細書）と、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン及びジペプチドのようなダイバーソマー（Ｈｏｂｂｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９０：６９０９−６９１３（１９９３））と、ビニローグポリペプチド（ｖｉｎｙｌｏｇｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）（Ｈａｇｉｈａｒａら、Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．１１４：６５６８（１９９２））と、β−Ｄ−ブドウ糖材料を用いる非ペプチド性ペプチド模倣分子（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎら、Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ、１１４：９２１７−９２１８（１９９２））と、低分子化合物ライブラリーの類似の有機合成（Ｃｈｅｎら、Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ、１１６：２６６１（１９９４））と、オリゴカルバミン酸塩（Ｃｈｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６１：１３０３（１９９３））と、及び／又は、ペプチジルリン酸塩（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  ５９：６５８（１９９４））と、核酸ライブラリー（Ａｕｓｕｂｅｌら、上記の全てを参照せよ）と、ペプチド核酸ライブラリー（例えば、米国特許第５，５３９，０８３号公報明細書を参照せよ）と、抗体ライブラリー（Ｖａｕｇｈｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４（３）：３０９−３１４（１９９６）及びＰＣＴ米国国際公開第ＵＳ９６／１０２８７国際公開を参照せよ）と、炭水化物ライブラリー（Ｌｉａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４：１５２０−１５２２（１９９６）及び米国特許５，５９３，８５３号公報明細書を参照せよ）と、有機低分子ライブラリー（例えば、ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ、Ｂａｕｍ  Ｃ＆Ｅ  Ｎｅｗｓ、１月１８日、３３頁（１９９３））と、イソプレノイド（米国特許第５，５６９，５８８号公報明細書）と、チアゾリジノン及びメタチアザノン（米国特許第５，５４９，９７４号公報明細書）と、ピロリジン（米国特許第５，５２５，７３５号公報明細書及び第５，５１９，１３４号公報明細書）と、モルホリン化合物（米国特許第５，５０６，３３７号公報明細書）と、ベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号公報明細書）と、そののようなものとを含むが、これらに限られない。
【０１５７】
コンビナントリアルライブラリーの調製をするための装置は商業的に入手できる（例えば、３５７  ＭＰＳ、３９０  ＭＰＳ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ．  Ｔｅｃｈ，  ケンタッキー州ルイビル、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ，  Ｒａｉｎｉｎ，  Ｗｏｂｕｒｎ，  Ｍａｓｓ．、４３３Ａ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスター、９０５０  Ｐｌｕｓ，  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｂｅｄｆｏｒｄ，  Ｍａｓｓ．を参照せよ）。さらに多くのコンビナントリアルライブラリーは、そのものを商業的に入手できる（例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ、ニュージャージー州プリンストン、Ａｓｉｎｅｘ，  ロシアモスクワ、  Ｔｒｉｐｏｓ社、，モンタナ州セントスイス、ＣｈｅｍＳｔａｒ、Ｌｔｄ．、ロシアモスクワ、３Ｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ペンシルバニア州エクストン、Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ、メーリランド州コロンビア等を参照せよ）。
【０１５８】
低分子：低分子試験化合物は初めに有機又は無機化学ライブラリーの構成となる。本明細書の用いるところの「低分子」とは、約３，０００ダルトンより小さな分子量の有機又は無機の低分子をいう。前記低分子は天然の生産物又はコンビナントリアル化学ライブラリーの構成となる。多様な分子の一群は電荷、芳香性、水素結合、柔軟性、サイズ、側鎖の長さ、疎水性、厳格性のようなさまざまな機能を扱うために用いられるべきである。低分子を合成するのに適しているコンビナントリアル技術は当業者に知られており、該技術は、例えば、Ｏｂｒｅｃｈｔ及びＶｉｌｌａｌｇｏｒｄｏによって実証されたような  Ｓｏｌｉｄ−Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｍａｌｌ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ−Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ  （１９９８）であり、「ｓｐｌｉｔ  ａｎｄ  ｐｏｏｌ法」又は「並列法」合成技術、固層及び液層技術及びエンコードする技術（例えば、Ｃｚａｒｎｉｋ、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏ．、１：６０（１９９７）を参照せよ）  のような技術を含む。さらに、多くの低分子ライブラリーは商業的に入手できる。
【０１５９】
好ましい実施態様では、ハイプットスクリーニングスクリーニングの際に、前記化合物は２シストロン性ベクターを含む細胞に対して評価される。リポーター分子は同一又は異なる分子となる場合があるが、前記リポーター分子は異なることが好ましい。
【０１６０】
別の局面では、本発明は細胞の分析方法を提供し、該方法は、多種多様の細胞の位置の配列を提供することと、おのおのの位置で多種多様の細胞を走査することと、シグナルをデジタルデータに変換することと、デジタルデータを利用することとを含み、前記位置の配列を提供する際には、前記細胞は１種類又は２種類以上の蛍光又はルシフェラーゼリポーター分子を含み、前記細胞は前記細胞で前記リポーター分子からのシグナルを獲得するための細胞を含み、前記データは、前記細胞内で前記リポーター分子の分配、環境又は活性を測定するためのデータである。
【０１６１】
新規薬剤創薬の実例の主要な構成要素は、蛍光及び発光試薬の一群は断続的に成長しており、前記試薬は細胞内のイオン、代謝物、高分子及び細胞器官の時間的及び空間的な分配、容量又は活性を測定するために用いられる。これらの試薬の一群は、標識化試薬、環境指標薬及び蛍光タンパク質バイオセンサーを含み、前記標識化試薬は生細胞及び固定細胞で分子の分配及び量を測定し、前記環境指標薬は時間及び空間でのシグナル伝達事象を伝えるためためのものであり、前記蛍光タンパク質バイオセンサーは生細胞内で標的分子活性を測定するためのものである。単一の細胞で別々の試薬を化合する多数のパラメーター研究法は、薬剤創薬のための強力な新規手段である。
【０１６２】
本方法は特異的な細胞構成要素に対する蛍光又は発光分子の高い親和性にたよる。特異的な構成要素に対する前記親和性は物理的な力によって調節され、該物理的な力は、イオン相互作用と、共有結合（該共有結合は、タンパク質を基にした発色団、フルオロフォア及びルミフォアとのキメラ融合を含む）と、疎水的相互作用と、電位と、いくつかの場合では細胞構成要素内での単純なエントラップメントとのようなものである。発光プローブは、低分子、標識された高分子又は遺伝子的に加工されたタンパク質となる場合があり、該タンパク質は緑色蛍光タンパク質キメラを含むが、これらに限られない。
【０１６３】
本発明で用いられる広範なさまざまな蛍光リポーター分子は、蛍光標識された、タンパク質、リン脂質、ＲＮＡ及びＤＮＡのような生体分子を含むが、これらに限られず、該ＲＮＡ及びＤＮＡはハイブリダイズするプローブであると当業者は認識するであろう。同様に、結合又は連結の特別な化学特性を用いて特別に合成された蛍光試薬は、蛍光リポーター分子として用いられた（Ｂａｒａｋら（１９９７）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２：２７４９７−２７５００、Ｓｏｕｔｈｗｉｃｋら（１９９０）、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  １１：４１８−４３０、Ｔｓｉｅｎ（１９８９）  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第ｌ巻２９、Ｔａｙｌｏｒ及びＷａｎｇ（編）、１２７−１５６頁）。蛍光標識された抗体は、細胞又は組織と同じくらい複雑な分子の混合物中で単一の分子標的に結合するための抗体の高い特異性のために特に有用なリポーター分子である。
【０１６４】
発光プローブは、生細胞内で合成される場合があるか、あるいは多くの非機械的なやり方を介して前記生細胞に送達され、前記やり方は、拡散と、促進性の又は活発な送達と、シグナル配列に仲介された送達と、エンドサイトーシス又はピノサイトーシスによる取込とを含む。当業者に周知である機械的な積荷の充填方法は、生細胞に発光プローブを充填するために用いられる場合がある（Ｂａｒｂｅｒら（１９９６）、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０７：１７−２０、Ｂｒｉｇｈｔら（１９９６）、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ２４：２２６−２３３、ＭｃＮｅｉｌ（１９８９）  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２９巻、Ｔａｙｌｏｒ及びＷａｎｇ（編）、１５３−１７３頁）。これらの方法は電気穿孔法と、スクラップ−充填法、ビーズ−充填法、衝撃−充填法、注射器−充填法、高張及び低張充填法のような他の機械的な方法とを含む。さらに細胞は、ＧＦＰのようなリポーター分子を発現するために遺伝子的に加工され、前述されたように関心のあるタンパク質に連結される場合がある（Ｃｈａｌｆｉｅ及びＰｒａｓｈｅｒ、米国特許第５，４９１，０８４号公報明細書、Ｃｕｂｉｔｔら（１９９５）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０：４４８−４５５）。
【０１６５】
前記標的領域との特異的及び高い親和性相互作用か、あるいはシグナル配列に仲介された送達のような分子標的の他のやり方を生じるように、一旦細胞で発光プローブは標的領域で蓄積する。蛍光標識されたリポーター分子は、前記リポーターの局在、容量及び化学的な環境を測定するのに有用である。例えば、前記リポーターは親油性の膜環境内か、あるいはより親水性の環境内かにある場合には、測定されることができる（Ｇｉｕｌｉａｎｏら（１９９５）、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２４：４０５−４３４、Ｇｉｕｌｉａｎｏ及びＴａｙｌｏｒ（１９９５）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２７．１−１６）。前記リポーターのｐＨ環境は測定されることができる（Ｂｒｉｇｈｔら（１９８９）、Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０４：１０１９−１０３３、Ｇｉｕｌｉａｎｏら（１９８７）、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １６７：３６２−３７１、Ｔｈｏｍａｓら（１９７９）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８：２２１０−２２１８）。キレート化原子団を有するリポーターはＣａ２＋のようなイオンに結合されるか否かを測定されることができる（Ｂｒｉｇｈｔら（１９８９）、Ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３０巻、Ｔａｙｌｏｒ及びＷａｎｇ（編）、１５７−１９２頁、Ｓｈｉｍｏｕｒａら、（１９８８）、Ｊ．  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（東京）  ２５１：４０５−４１０、Ｔｓｉｅｎ（１９８９）  Ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３０巻、Ｔａｙｌｏｒ及びＷａｎｇ（編）、１２７−１５６頁）。
【０１６６】
さらに、生物の内部に存在するある細胞系はある構成要素を含む場合があり、該構成要素は特異的に標識され、他の細胞系では標識されない場合がある。したがって、リポーター分子は特別な細胞内の特別な構成要素だけでなく、混合された細胞系の集団内の特別な細胞を標識するために設計されることができる。
【０１６７】
当業者は蛍光を測定するための広範なさまざまな方法を認識するであろう。例えば、いくつかの蛍光リポーター分子は励起又は放出スペクトルの変化を示し、前記いくつかの蛍光リポーター分子は共鳴エネルギー転移を示し、１つの蛍光リポーターは蛍光を消失する一方で、第２の蛍光リポーターは蛍光を獲得し、いくつかの蛍光リポーター分子は蛍光の消失（消光）又は出現を示す一方で、該分子は回転運動を伝える（Ｇｉｕｌｉａｎｏら（１９９５）、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２４：４０５−４３４、Ｇｉｕｌｉａｎｏら（１９９５）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ［Ｅｔａ］  ｅｕｒｏ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７：１−１６）。
【０１６８】
前手順は完全に自動化されることができる。例えば、試料物質の試料採取は複数のステップを用いて達成される場合があり、該ステップは試料容器から試料を回収することと、試験培養細胞（例えば、遺伝子発現が制御される培養細胞）に試料が回収した場所に少なくとも送達することとを含む。試料採取はさらなるステップを含む場合があり、該ステップは試料調製ステップであることが特に好ましい。別の研究法では、１つの試料のみが自動分注装置に一度に入れられ、１つの試料のみが装置中に同時に存在する。他の実施態様では、多種多様な試料は自動分注装置に入れられ、溶媒によって分離される場合がある。さらなる別の実施態様では、多種多様の装置は自動の試料採取と並行で用いられる場合がある。
【０１６９】
一般的な場合には、試料採取は、手作業、半自動のやり方又は自動のやり方で行なわれる。
【０１７０】
試料は、例えば、ピペット又は注射器型の手動装置を用いて試料容器から手作業で回収され、その際に、特性分析装置の充填口又は挿入口に手作業で運ばれる。半自動プロトコルでは、前記プロトコルのいくつかの局面は自動的に行なわれるが（例えば、送達）、他の局面のいくつかは手作業の介在が必要である（例えば、工程制御経路からの試料の回収）。しかしながら、試料は全自動のやり方（例えば、自動分注装置）で試料容器から回収され、特性分析装置に運ばれることが好ましい。
【０１７１】
１つの実施態様では、自動−試料採取はマイクロプロセッサーで制御している自動化された装置（例えば、ロボットアーム）が用いられる場合がある。マイクロプロセッサーは試料のライブラリーを適応するために使用者がプログラムすることができ、該試料は変化する配列の試料を有している（例えば、縦「ｎ−行」横「ｎ−列」の正方形配列、縦「ｎ−行」横「ｍ−列」の多次元配列、円形配列、「ｒ−」と「ｒ−」と「ｒ−」との三辺が等しい三角形配列、「ｒ−底辺」と「ｓ−」と「ｓ−」との二辺が等しい三角形配列などで、ｎ、ｍ、ｒ及びｓは整数である）。
【０１７２】
試料物質の自動化された試料採取は任意に自動分注装置を用いて行なわれ、該自動分注装置は過熱された注入装置（ｔｉｐ）を有する。前記自動分注装置の１つの例は、米国特許第６，１７５，４０９号Ｂｌ公報明細書（引用により取り込まれる）で開示される。
【０１７３】
本発明に従って、１種類又は２種類以上の装置、方法又は両方は多数の試料物質を同定するために用いられる。手作業の又は半自動化された装置及び方法は供することができるが、自動化された装置又は方法が供されることが好ましい。さまざまな機械的な又は自動的な装置は自動的に、プログラム可能に、前もって定められた動作を提供するために利用でき、該動作は、前もって定められたプロトコルに従って、固体、液体又は気体形状の物質の取扱い、接触、分配又はその他の取扱いのための動作である。前記装置はさまざまなハードウェア、ソフトウェア又は両方を含み、物質の機械的な特性を決定することで前記装置を助けるために適応又は改良される場合がある。機械装置を改良するためのハードウェア及びソフトウェアは、感知器と、変換器と、データ取得及びハードウェア処理と、データ取得及びハードウェア処理と、そのようなものとを含むが、これらに限られない。模範的な機械装置は、ＣＡＶＲＯ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（例えば、モデル番号ＲＳＰ９６５２）又はＢｉｏＤｏｔ（Ｍｉｃｒｏｄｒｏｐ  Ｍｏｄｅｌ  ３０００）から商業的に入手できる。
【０１７４】
一般的に、前記自動化された装置は適切なプロトコル企画及び実行ソフトウェアを含み、該ソフトウェアは、合成法、組成物、局在情報又は他の情報のような情報を用いてプログラムされ、該情報は基質に関して位置が定められた物質のライブラリーに関する。前記プロトコル及び実行ソフトウェアはロボットか、あるいは他の自動化された機器又は装置を制御するためにロボット制御ソフトウェアと通信していることが典型である。前記プロトコル企画は及び実行ソフトウェアは、応答を測定しているハードウェアからデータを収集するためにデータ取得ハードウェア／ソフトウェアと通信している。一旦前記データはデータベース、解析ソフトウェアに収集され、前記ータベース、分析ソフトウェアは前記データを解析するために用いられ、より具体的に薬剤候補の特性を測定するために用いられる場合があり、あるいは前記データは手作業で解析される場合がある。
【０１７５】
本開示では、本発明の好ましい実施態様のみが説明されるが、その用途の幅広い実施例はほとんど説明されない。本発明はさまざまな他の組み合わせ及び環境で使用でき、本明細書で述べられたような本発明の概念の範囲内で変化又は修飾できると理解されるためである。したがって、例えば、本明細書で説明した日常的な実験、特別な物質に対する多くの等価物及び手順をわずかに用いて当業者は認識するか、あるいは突き止めることができる。前記等価物は本発明の範囲内となると考えられる。
【０１７６】
以下の実施例は、実例を通して提供されるが、これらに限定されない。特別な実施例が提供されるとき、以上の説明は実例であり、以上の説明に限定されない。以前に説明された実施態様の１つ又は２つ以上の特徴のいずれかは、本明細書でのいずれかの他の実施態様の１つ又は２つ以上の特徴をいずれかのやり方で組み合わされることができる。さらに、本発明の多くのバリエーションは、明細書の論評に接することで当業者に明らかとなるであろう。
【０１７７】
本明細書に引用された全ての文献及び特許文献は、あたかもそれぞれ個々の文献又は特許文献が個々に示されるように、全ての目的ないし同程度に適切な一部分において引用により取り込まれる。本文献でのさまざまな文献の引用まで、出願は全く特別な文献を認めず、該文献は本発明に対する「従来技術」である。
【０１７８】
実施例
材料及び方法
パーフォリン２による孔形成を証明するためのアッセイ
１．利用可能なＥＳＴ断片からのパーフォリン２のオープン・リーディング・フレームの集合：合成又はＰＣＲで製造したＤＮＡを用いて隙間を満たす。２．緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐ）をエンコードしているｃＤＮＡを用いて終止シグナルを除去後にＰ２のＯＲＦの３’−末端へ標識する。３．Ｐ２−ｇｆｐを用いて腫瘍細胞系にトランスフェクションし、蛍光細胞を選択する。４．生き残り、高いレベルのＰ２を発現する細胞を選択するためにヒト２９３−細胞にトランスフェクションする。５．細胞を培養によって約１０９細胞に広げる。６．回収し、窒素キャビテーション装置によって溶解する。７．異なる遠心分離によって膜を単離する。８．等張性の緩衝液で膜を洗浄する。９．１００μｇ／ｍＬ  トリプシンを用いて膜を処理する（他のプロテアーゼも効果的である）。１０．試料の一定分量は電子顕微鏡観察用のグリッド上に置く。１２．０．５％  リンタングステン酸を用いて陰性染色する。１３．電子顕微鏡は初めの倍率の５０，０００倍で観察し、孔構造に関した膜の特徴を立証するために研究する。
【実施例１】
【０１７９】
新規孔形成タンパク質、パーフォリン２はマクロファージのｍＲＮＡによってエンコードされる。
【０１８０】
マウスタンパク質の予測ドメイン構造は図１４、１５Ａ−１５Ｂで示される。リーダー配列は全ての種で見つけられた保存されたドメインによって理解され、本明細書のＰ２ａとして明示された。次にＭＡＣ−Ｐｆドメインが現れ、該ドメインは全ての種で見つけられた２番目に高く保存されたドメインによってなりなっており、Ｐ２ｂとして明示された。Ｐ２ａ及びＰ２ｂのドメインは新規ドメインであり、該ドメインはＭＡＣ／Ｐｆファミリー内の他のタンパク質又は他のタンパク質のいずれかによって共有されない。Ｐ２ｂの次に、海綿動物を除く、軟体動物までの全ての種で発明者は典型的な予測膜貫通ドメインを発見する。マウスでの細胞内（細胞質内）ドメインは、３７個のアミノ酸の長さで、海綿動物を除く全ての種で保存されたチロシン及びセリンを含む。
【０１８１】
予測されたＭｐｇ−１タンパク質の特性はタンパク質はマクロファージのファゴソーム膜及び／又はマクロファージの原形質膜上で発現された膜に固定された孔形成体となる場合があるとの仮説と一致する。
【０１８２】
パーフォリン、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）及びＮＫ細胞の孔形成体（Ｐｏｄａｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ  ３０２、４４２−４４５（１９８３））は電子顕微鏡で検出できる。ポリＣ９及びポリＣ１の両方の膜に挿入された重合複合体は、トリプシン及びキモトリプシン消化に対して耐性であり、したがって、該複合体は膜から覆い隠されているタンパク質のタンパク質分解性の除去によって電子顕微鏡観察による検出を促進している（Ｂｏｒｓｏｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ２０２、２５１−２５２（１９６４）、Ｔｒａｎｕｍ−  Ｊｅｎｓｅｎら、Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７、４５−４６（１９７８））。発明者は、Ｍｐｇ−１が孔形成タンパク質をエンコードしているかどうかを決定するために類似の手順を用いた。
【０１８３】
発明者は、多くのＥＳＴ−クローンからＭｐｇ−１のｃＤＮＡの完全なコード領域を集め、ｇｆｐを用いてＣ−末端で該領域を標識した。３Ｔ３繊維芽細胞及びＲＡＷ−マクロファージへのこのｃＤＮＡのトランスフェクションは、ｇｆｐの短期間の発現の次に、４８時間ないし７２時間以内に細胞死を生じ、該細胞死はＭｐｇ−１タンパク質が細胞で発現しているｃＤＮＡによる毒性であることを含む。しかしながら発明者は、トランスフェクション及びＭｐｇ−１のｃＤＮＡを有する２９３細胞の選択に成功し、高いレベルのｇｆｐ発現を達成した。これらの細胞からの膜を単離すること、膜のトリプシン処理及びタングステン酸ナトリウムを用いる陰性染色は、電子顕微鏡で典型的な孔−複合体を示した。上面図では、管状の複合体は１２個ないし１４個のプロトマーからなり、〜９．２ｎｍの孔（８．４ないし１０の範囲）を満たした主要な染色法を用いて染色される（図１５Ｃ）。孔構造の重合状態は図の微細な構造及び複合体からの両方で明白であり、該複合体は不完全に集められ、特別な孔構造を形成する。側景では、孔複合体はおのおのの狭い膜ドメインを通じて取り付けられ、該ドメインが複合体が取り付けられた膜で孔を形成するようではない。前記孔複合体は膜の上に約２５ｎｍ突き出でて、膜に取り付けられるが、他の画像では前記距離はさらにより短い。いくつかの場合には、前記孔は取り込まれた図１５Ｃのように見える。孔形成タンパク質は膜及び多量体に固定され、固定されている膜を無傷まま残しつつ、近傍の細胞膜で孔複合体を形成する場合があるとの仮説を前記画像は示唆する。しかしながら、電子顕微鏡の検討は、Ｍｐｇ−１のｍＲＮＡがマクロファージによって発現された膜形成タンパク質をエンコードすると明らかにする。細菌（ポリＣ９）又はウイルス感染細胞（パーフォリン１）を殺傷するための細胞分解性のタンパク質としての説明された機能と同じ免疫系の孔形成タンパク質ために、発明者はＭｐｇ１によってエンコードされたタンパク質をパーフォリン２と名づけた。
【０１８４】
５’ＲＡＣＥ及びＰＣＲによって、発明者はＰ２の翻訳開始点の１９３０ｂｐ上流で転写開始部位を同定し、該上流は図５Ａ−５Ｂで示されたような短いイントロンを含む。ＣＭＶプロモーターのもとＥＧＦＰタンパク質の前方に挿入された、完全長（ＦＬ）５’ＲＡＣＥは２９３細胞で欠失コンストラクトの５’ＵＴＲ１−７よりもより効率的にＥＧＦＰの翻訳を抑制する。Ｐ２の５’ＵＴＲの欠失コンストラクトは連続的により多くの翻訳活性を許容する。５’ＵＴＲ７及び４のコンストラクトは、最も強い翻訳活性を許容する。発明者は２シストロン性発現ベクターでＰ２の５’ＵＴＲのＩＲＥＳ活性を解析することによって翻訳の活性化がＩＲＥＳ活性の原因となる場合があるかどうかを試験した（図５Ｂ）。第１のシストロンは、ＣＭＶプロモーターにより操作されたＴＮＦＲ−ＳＦ２５（ＤＲ３又はＴＲＡＭＰとして知られた；短いＴＲ２５）の細胞外及び膜貫通ドメイン（細胞内ドメインはシグナルリングを回避するために欠失される）をエンコードする。第２のシストロンはＥＧＦＰをエンコードし、該ＥＧＦＰは示されたような（ＦＬ  ５’ＵＴＲまでは含まない）Ｐ２の５’ＵＴＲのコンストラクトの下流で融合される。２９３細胞は２シストロン性コンストラクトを用いてトランスフェクションされ、ＴＲ２５及びＥＧＦＰの発現のために２日後に解析され；ＥＧＦＰの対照ベクターを用いる２９３細胞のトランスフェクション効率はしばしば〜７５％である。図１Ｂの上部パネルでは、データはＥＧＦＰの対照ベクター（１００％に設定）に関してプロットされ、該ベクターはＣＭＶプロモーター下の市販のＥＧＦＰベクターである。５’ＵＴＲ７、４、３のコンストラクを有する多くの細胞はＴＲ２５−陽性よりもむしろＥＧＦＰ陽性であると前記データは示す。ＥＧＦＰは常に強いＩＲＥＳ活性を示しているＤＮ−ＴＲ２５よりもより効率的に翻訳されるとこれは示す。前記イントロンが５’ＵＴＲ６（−７７４ないし−４５０ｂｐ）で見られたＩＲＥＳの阻害活性を抑制できると５’ＵＴＲ３でのイントロンの包含は示す。ＩＲＥＳの抑制的な活性はＵＴＲ５、６、２及び１で明白である。完全長のスプライシングされた及びスプライシングされていない５’ＵＴＲのＩＲＥＳコンストラクトを発明者はまだ有していないけれども、Ｐ２のＦＬ  ５’ＵＴＲが最も強くＩＲＥＳ活性を抑制するであろうと図５Ａからのデータは予測する。
【０１８５】
異なるＰ２の５’ＵＴＲコンストラクトで変調されたＩＲＥＳ活性の発見は発明者の仮説と一致し、該仮説はＩＲＥＳトランス作用因子（ＩＴＡＦｓ）はある条件、例えば、ストレス下でＰ２のＩＲＥＳ活性及びＰ２タンパク質の発現を制御することに責任を負うというものである。他の資源、例えば、ｃ−ｍｙｃ、ＡＰＡＦｌ及びＥＣＭ−ウイルスからＩＲＥＳを用いる定量的な比較は試験されるであろう。
【０１８６】
要約では、図１６でのセグメント１及び２は明らかにＰ２のＩＲＥＳを構成する。セグメント３、４及び６はＩＲＥＳ活性を抑制する一方で、セグメント５は抑制の影響を若干弱める。スプライシングされていないイントロンはＩＲＥＳ活性を支持し、セグメント３による抑制の影響を弱める。
【０１８７】
Ｐ２のＩＲＥＳの最小限のサイズを定義するために、発明者はさらに短くなっているセグメント２（及びセグメント１、所望の場合には、たとえ成功しそうになくとも）を欠失コンストラクトにするであろう。典型的なＩＲＥＳは〜１００−１５０ｂｐの長さであり、ステム−ループ構造を形成できる。発明者はさまざまな陰性セグメント（３、４、６）及び陽性セグメント（５）を単離し、前記セグメントをＰ２ＩＲＥＳ及び他のＩＲＥＳ（例えば、ｃ−ｍｙｃＩＲＥＳ）に直接的な連結後にこれらのおのおのの活性を解析するであろう。
【０１８８】
パーフォリン２の５’非翻訳配列（ＵＴＲ）は内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をエンコードしている保存されたイントロンを含み、マウス及びヒトＰ２の５’ＵＴＲ中に、短い、２９０ｂｐの長さのイントロンが存在する。Ｐ２の翻訳開始部位から６００ｂｐ上流までに拡張している利用可能な哺乳類ゲノム由来の配列を一列に並べるとき、発明者は翻訳されないエキソン２配列（−１ないし−５０）及びイントロン配列（図１９）の高い程度の保存性を理解でき、該イントロンはイントロンの機能的な重要性を示している。マウスＰ２ｍＲＮＡの５’ＵＴＲは多様な短い読み枠を有し、該読み枠は、その長さとともに、正統な５’キャップ依存性リボソーム機構による翻訳を始める。エキソン２の前記イントロン及び非翻訳部分を含む５’ＵＴＲの保存は、機能的な重要性を示した。翻訳における５’ＵＴＲ配列の存在の影響を決定するために、完全長の５’ＵＴＲ及び欠失コンストラクトは２シストロン性のＩＲＥＳアッセイで試験され、該コンストラクトはイントロンを含んでいるか、あるいは除去されている。ウミシイタケ・ルシフェラーゼはＣＭＶプロモーターの下で発現され、ホタル・ルシフェラーゼに５’ＵＴＲのＰ２配列のコンストラクトを介して連結される。この装置でホタル・ルシフェラーゼの発現は５’ＵＴＲのＩＲＥＳ活性又は謎のプロモーターの存在に依存する。欠失は図１７Ｂで、これらのＩＲＥＳコンストラクトは図１７Ｃで示される。ＩＲＥＳ活性は２９３細胞で測定され、該細胞はＰ２  ｍＲＮＡを発現せず（図１７Ｄ）、ＲＡＷマクロファージで恒常的にＰ２を発現する（図１７Ｅ）。
【０１８９】
短いコンストラクトのＵＴＲ１−３は全く活性を有さず、該コンストラクは陰性対照としてのホタル−ルシフェラーゼ活性の一定の低いバックグラウンドを示し、ｐＲＦベクターで２つのルシフェラーゼ遺伝子生産物は非−ＩＲＥＳＤＮＡの短い伸長を介して連結される。ＩＲＥＳの陽性対照として、発明者はＡｐａｆ  １  ＩＲＥＳ（Ｃｏｌｄｗｅｌｌら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９、８９９−９０５  （２０００））を用い、該Ａｐａｆ  １  ＩＲＥＳは２９３細胞及びＲＡＷ細胞で、それぞれに、上記バックグランドの約２０倍及び７倍までＩＲＥＳ依存性ホタル・ルシフェラーゼ活性を増大する。２９３細胞でＡｐａｆ−ＩＲＥＳに類似するＰ２−ＩＲＥＳ活性は全てのイントロンを用いて達成され、該イントロンはＵＴＲ３ｉよりもより長いＰ２−コンストラクトを含む（図１７Ｄ）。スプライシングでイントロンを放出することは約２倍ＩＲＥＳ活性を減少する。ＲＡＷマクロファージでは、Ｐ２ＩＲＥＳ活性はＡｐａｆＩＲＥＳよりも２０倍より活性化し、２９３細胞よりも非常に高く、上記バックグラウンドよりも１５０倍よりもより高い（図１７Ｅ）。イントロンを含むコンストラクトとイントロンを含まないコンストラクトとの間の差異は、２９３細胞よりもより明白である。スプライシングされていないｍＲＮＡでＰ２の５’ＵＴＲは最も大きなＩＲＥＳ活性を有するとこれらのデータは示す。したがってイントロンの保存は、ＩＲＥＳの機能に関連される場合がある。２９３細胞での活性よりもＲＡＷ細胞での増大されたＰ２−ＩＲＥＳ活性は、最適な翻訳活性のためのＩＲＥＳトランス作用因子（ＩＴＡＦｓ）の必要性を示唆する。
【０１９０】
第２のシストロンによって発現されたホタル・ルシフェラーゼ活性はＩＲＥＳ機能によって観察され、シストロン間のＤＮＡが謎のプロモーターを含む場合がある。この可能性を調べるために、両方のルシフェラーゼカセットの転写発現を操作しているＳＶ４０プロモーターは欠失され、第２のシストロンによって発現されたホタル・ルシフェラーゼ活性が一過的なトランスフェクション後に測定された。謎のプロモーターを含まないＡｐａｆ−１ＩＲＥＳは非特異的な陰性対照バックグランドとしての役目をした。ホタル・ルシフェラーゼの発現は３個のイントロンを用いて観察され、該イントロンは試験されたコンストラクト（図１７Ｆ）を含んでおり、該コンストラクトはイントロンの上流の謎のプロモーターの存在を示唆している（配列Ｄ、図１７Ｂ）。しかしながら、ＳＶ４０での完全長５’ＵＴＲのホタル・ルシフェラーゼ活性とプロモーターのないコンストラクトのホタル・ルシフェラーゼ活性を用いて比較するとき、謎のプロモーター活性は弱いことが明白となる。ＵＴＲ４ｉコンストラクトを用いて観察されたより高い謎のプロモーター活性は、完全長のコンストラクトで明らかに弱められる。このセグメントのプロモーター活性はリポーターとしてルシフェラーゼを用いる典型的なプロモーターアッセイで確かめられた。
【０１９１】
保存されたイントロンはスプライシングされていないＰ２ｍＲＮＡでＩＲＥＳ活性を与えるとデータは示す。５’ＵＴＲ中のイントロンに及んでいるＰ２特異的プライマーを用いて、ＲＡＷ細胞、Ｊ７７４細胞及び腹膜のマクロファージが恒常的にＰ２ｍＲＮＡの３つの型を発現すると発明者は理解した。シークエンスは、細胞内ＲＮＡで約１対１０対１００の比率で、スプライシングされていないＰ２ｍＲＮＡ、交替的にスプライシングされたｍＲＮＡ及び完全にスプライシングされたＰ２ｍＲＮＡの存在を示した（図１８Ａ）。交替的なスプライシングはｍＲＮＡでＰ２イントロンの保存された部分を保持し、該イントロンはＩＲＥＳ活性の原因となると考えられる。したがって交替的なスプライシングは、ＩＲＥＳ活性を変えることによってＰ２ｍＲＮＡの翻訳効率を制御する。この仮説及び交替的なスプライシングの制御は調査中である。
【０１９２】
パーフォリン２ｍＲＮＡは成熟樹状細胞及びインターフェロン処理された繊維芽細胞で発現される。
【０１９３】
ＧＭＣＳＦによって骨髄前駆体から誘導された樹状細胞は、前駆細胞で本質的に検出できないレベルからＰ２ｍＲＮＡを強く発現上昇する。成熟化の最後の２日間のＬＰＳ刺激は、追加の６倍までＰ２ｍＲＮＡレベルを増加し、該増加はＴＬＲシグナルの助力がＰ２の発現を制御することを示唆している（図１８Ｂ）。ＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞はＰ２ｍＲＮＡを発現しない。しかしながら、ポリＩ／Ｃ（図１８Ｃ）又はＩＦＮα、β又はγを用いる処理後に、ｍＲＮＡは強く発現上昇される。Ｉ型及びＩＩ型のインターフェロンのはともに相乗的にＰ２−ｍＲＮＡの発現を誘導する（図１８Ｄ）。繊維芽細胞でＰ２ｍＲＮＡ誘導によって誘導されたポリＩ／Ｃは、Ｉ型のインターフェロン生産物を伴う。
【０１９４】
ポリクローナル抗体を用いて、Ｐ２タンパク質は刺激されていないＪ７７４細胞で７０ｋＤのタンパク質としてウエスタンブロット法によって検出できる。Ｐ２−ＥＧＦＰを用いてトランスフェクションされた２９３細胞は、対応してより高い分子量に移動している融合タンパク質を発現する。マクロファージが孔形成タンパク質、パーフォリン２を発現できると発明者のデータは示す。パーフォリン２ｍＲＮＡの発現はマクロファージ及び樹状細胞で恒常的であり、繊維芽細胞で誘導できる。パーフォリン２ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳は内部リボソーム進入部位の制御下である。
【０１９５】
Ｐ２の抗菌活性
ＲＡＷマクロファージ細胞株で発現されるＰ２ｍＲＮＡが細菌の殺傷に加わるとの仮説を調べるために、発明者は３個のＰ２ｓｉＲＮＡベクター（ｓｉＲＮＡ１−３）を製造し、ＲＡＷ細胞にこれらをトランスフェクションした。ハイグロマイシン選択後に、Ｐ２ｍＲＮＡレベルはＰＣＲによって測定され、トランスフェクションされていないＲＡＷ細胞での前記レベルと比較された。３個のコンストラクトは、それぞれにトランスフェクションされていないＲＡＷ細胞の発現レベルの４３％、５８％及び１２％にＰ２ｍＲＮＡを抑制した（図９）。ＲＡＷ−ｓｉＲＮＡ３細胞株は、約９０％までのＰ２−ｍＲＮＡの減少がＲＡＷ細胞の殺菌活性においていかなる効果を有したかどうかを測定するために用いられた。図９で示されたように、Ｐ２−ｍＲＮＡの減少は確かに殺菌活性を減少させ、大腸菌をほとんど２倍にすることを許容した（１００％Ｐ２の存在下でコロニーのほとんど５０％の減少に一致している）。Ｐ２ｍＲＮＡの１０％で、パーフォリンの高い殺傷の効率にもとづく、Ｐ２抗菌活性の大部分はまだ存在すると発明者は仮説を立てる。
【０１９６】
発明者は９８％よりもより多くＰ２ｍＲＮＡを抑制する目的でＲＡＷ細胞に２種類又は３種類全てのｓｉＲＮＡベクターを用いて同時にトランスフェクションし、Ｐ２の真の抗菌作用を測定するために図４でのアッセイを繰り返すであろう。この点でＰ２はマクロファージの抗菌活性の以前に認められていなかった主要な構成要素を表す場合があるようである。
【０１９７】
他の実施態様
発明は本明細書の詳細な説明とともに関連して説明されたが、前述の説明は例示することを意図するものであって、本発明の範囲を限定するものではないことが理解されるべきである。他の局面、利点及び変更は以下の請求項の範囲に記載の範囲内である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
2009539352.tif 000017
【図１１Ｂ】
2009539352.tif 000018
【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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