(57)【要約】  【解決手段】  骨細胞または他の組織に対して特異的且つ選択的な電場の静電結合または誘導結合を介して、骨細胞および他の組織における形質転換成長因子（ＴＧＦ）−β１、β２、および/またはβ３タンパク質の遺伝子発現を制御する方法および装置について記載する。この方法および装置では、罹患または損傷した骨および他の組織の治療を促進するために、骨細胞または他の組織に対して配置された電極または１若しくはそれ以上のコイルまたは他の電場発生デバイスに対して特異的且つ選択的な電気信号および電磁信号の印加により、特異的且つ選択的な電場が発生する。遺伝子発現とは、ヒトゲノム（ＤＮＡ）の特定部位（遺伝子）がｍＲＮＡに転写され、次にタンパク質に翻訳される過程の上方制御若しくは下方制御を意味する。本願の方法および装置は、損傷または罹患した骨および他の組織の標的治療のために提供されており、この方法および装置には、ＴＧＦ−β１、β２、および／またはβ３タンパク質の遺伝子発現を上昇させるために最適化された標的組織において電場を発生させる特異的且つ選択的な電気信号および電磁信号を発生させる、工程と、その組織におけるＴＧＦ−β１、β２、および／またはβ３タンパク質の遺伝子発現を制御するように前記特異的且つ選択的な信号によって生成される電場に骨および他の組織を露出する工程とものである、露出する工程がを含むものである。結果として得られる前記方法および装置は、骨折、骨折の危険性のある骨、遷延治癒骨折、癒着不能の骨折、骨欠損症、脊椎固定、骨壊死または虚血壊死の標的治療のため、前記の疾患の１若しくは全ての治療における他の補助治療として、骨粗鬆症の治療において、およびＴＧＦ−β１、β２、および／またはβ３タンパク質が関わる他の病態において有益である。  【選択図】      図９
2009538694.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨折、骨折の危険性のある骨、遷延治癒骨折、骨折の癒着不能、骨欠損症、脊椎固定、骨壊死、骨粗鬆症、および／または形質転換成長因子（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ：ＴＧＦ）−β１、β２、および／またはβ３タンパク質が患者において関わる他の病態を治療するための装置であって、
少なくとも１つの特異的且つ選択的な電気信号を発生させる信号源と、
標的組織に対し動作可能であるように配置される電場発生デバイスと
を有し、
前記電場発生デバイスが、前記少なくとも１つの特異的且つ選択的な電気信号を受信して、所定の継続時間の間、所定の間隔で、前記少なくとも１つの特異的且つ選択的な電場を前記標的組織に印加することにより、ｍＲＮＡによって測定される前記標的組織におけるＴＧＦ−β１、β２、および／またはβ３タンパク質の遺伝子発現を実質的に上方制御する特異的且つ選択的な電場を前記標的組織に発生させる、装置。
【請求項２】
請求項１記載の装置において、この装置は、さらに、
第一モードおよび第二モードにおいて前記信号源を導き出す携帯用電源ユニットと、前記標的組織において選択される期間２０ｍＶ／ｃｍの電場を発生させる第一モードにおける出力信号と、前記標的組織においてさらに別の選択される期間４０ｍＶ／ｃｍの電場を発生させる第二モードにおける出力信号とを有するものである。
【請求項３】
請求項２記載の装置において、前記携帯用電源ユニットは、前記第一モードおよび第二モードの間に発生した電場が様々な期間および様々な順番で前記標的組織に連続して印加されるようにプログラム可能なものである。
【請求項４】
請求項１記載の装置において、この装置は、さらに、
前記電場発生デバイスを前記患者の身体の骨組織近傍に取り付ける手段を有するものである。
【請求項５】
請求項１記載の装置において、この装置は、さらに、
前記信号源を前記患者の身体に取り付ける手段を有するものである。
【請求項６】
請求項１記載の装置において、前記少なくとも１つの特異的且つ選択的な電気信号の電場発生デバイスへの印加によって発生する前記電場は、静電結合または誘導結合を介して前記標的組織に印加されるものである。
【請求項７】
請求項６記載の装置において、前記特異的且つ選択的な電気信号は、正弦波形、約５０％のデューティサイクル、および約６０ｋＨｚの周波数を有し、その結果前記標的組織において生じる前記特異的且つ選択的な電場は約２０〜４０ｍＶ／ｃｍの振幅を有するものである。
【請求項８】
請求項１記載の装置において、電場発生デバイスは、電極または１若しくはそれ以上のコイルを含むものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、２００２年１０月８日付け出願の米国特許出願第１０／２５７，１２６号の一部継続特許出願であり、前記米国特許出願は、２００１年２月２３日付け出願のＰＣＴ／ＵＳ０１／０５９９１号の米国国内移行特許出願である。さらに、前記米国国内移行特許出願は、２０００年２月２３日付け出願の米国仮特許出願第６０／１８４，４９１号に対して優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、損傷または罹患した組織を治療するために、特異的且つ選択的な電気信号および電磁信号によって生成される電場および電磁場を印加することによって生体細胞における形質転換成長因子−ベータ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ−ｂｅｔａ：ＴＧＦ−β）の遺伝子発現を上方制御する方法および前記信号を生成する装置に関する。
【背景技術】
【０００３】
様々な生体組織および生体細胞内に存在すると考えられている生体電気の相互作用および活動は、最も解明が遅れている生理的過程の１つである。しかしながら、特定の組織および細胞の増殖および修復に関わるこのような相互作用および活動に関する研究が近年多数行われてきた。特に、電場および電磁場による刺激、さらに骨、軟骨および様々な成長因子の増殖および修復におけるその効果について多数の研究がなされてきた。研究者等は、このような研究が様々な医学的問題に対する新治療法の発展に有用である可能性があると確信している。
【０００４】
形質転換成長因子−ベータ（ＴＧＦ−β）は多くの組織中に存在する多機能成長因子であり、細胞の増殖、遊走、分化、および生存に関与する。このため、ＴＧＦ−βは血管形成、自己免疫、骨修復（骨折、遷延治癒、癒着不能）および骨維持（骨粗鬆症）、軟骨維持（変性性関節炎）、癌抑制、および創傷治癒など多様な病態において臨床応用されている（Ｋｉｍら、Ｊ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｇｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、３８：１〜８、（２００５）；Ｊａｎｓｓｅｎｓら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、２６：７４３〜７７４、（２００５））。
【０００５】
急性骨折、骨折の遷延治癒および癒着不能、および様々な骨の異常において、新たに治癒した骨の形成は骨形成を誘導する骨形成タンパク質（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＢＭＰｓ）および軟骨形成を誘導するＴＧＦ−βｓの存在に依存する。２００５年１月１１日付に出願されたＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ/ＵＳ２００５/００７９３号（２００４年１月１２日付に出願された米国仮特許出願第６０/５３５，７５５号に対して優先権を主張）において、損傷または罹患した骨の治療に対し、ＢＭＰｓの遺伝子発現は特異的且つ選択的な電場および電磁場により上方制御可能であることが示された。ＴＧＦ−βｓの遺伝子発現も特異的且つ選択的な電場および電磁場により上方制御可能であることが本願明細書において示されている。ＢＭＰｓの遺伝子発現に対して最適な信号がＴＧＦ−βｓのものとはわずかに異なることも本願明細書中で示されており、この相違により、骨折治癒の骨相中にＢＭＰｓを最大限上方制御する一つの信号および骨折治癒の軟骨相中にＴＧＦ−βｓを主として上方制御するもう一つの信号を送達する装置の設計が可能になる。これは例えば骨折治癒機転において非常に有用と考えられ、例えば、骨折仮骨は初めは軟骨でできており、この軟骨が徐々に骨に置き換えられる。ＴＧＦ−βｓを最大限上方制御することによって治癒プロセスの早期に軟骨を形成し、ＢＭＰｓを最大限上方制御することによって治癒プロセスの後期に骨を形成し、急性骨折の治癒の最適化、骨折の遷延治癒における治癒の促進、および癒着不能骨折における治癒の再開が可能となる。
【０００６】
ＴＧＦ−βの上方制御は一般に、鉱物質が失われ骨が異常に希薄化する骨粗鬆症として周知の疾患の治療にも有用である可能性がある。骨は細胞と基質からなる有機成分および無機若しくは鉱物成分を含有する。前記細胞および基質は、骨に硬性を付与するリン酸カルシウム（８５％）および炭酸カルシウム（１０％）の鉱物成分が含浸した膠原線維の骨格で構成される。健康な骨では骨形成と骨吸収が平衡状態にある。骨粗鬆症では骨吸収が骨形成を上回ることによって骨が脆弱化し、椎体が骨折したり圧潰することがある。骨粗鬆症は高齢者の疾患と考えられているが、ある種の骨粗鬆症は骨が機能的ストレスを受けにくい全年齢層の人々を侵す可能性がある。そのような場合、長期の固定期間中に患者の皮質骨および海綿骨が著しく失われる可能性がある。高齢患者では骨折後の固定化時における廃用により骨量が減少することが知られており、そのような骨量の減少は、最終的にすでに骨粗鬆症状態にある骨格における二次骨折を引起す可能性がある。骨密度の減少は椎骨の圧潰を引起すのみならず、股関節、前腕、手関節、足関節の骨折および耐え難い痛みを引起す可能性がある。これらの疾患に対しては、代替的、非外科的治療が必要である。
【０００７】
パルス電磁場（Ｐｕｌｓｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃ  ｆｉｅｌｄｓ：ＰＥＭＦ）および静電結合（Ｃａｐａｃｉｔｉｖｅ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ：ＣＣ）は、１９７９年に食品医薬品局（Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）で承認されて以来、治癒不能の骨折（癒着不能）を治療および骨折治癒機転に関連する問題を処理するために広範囲に使用されてきた。この治療形式の治験の当初の基準は、骨に物理的な圧力をかけると機械的なひずみに伴って僅かな電流を引き起こし、その電流が、前記物理的圧力を骨形成を促進する信号に変換する発症機序であると考えられるという観察結果に基づいていた。癒着不能の治療において成功を収めた直接的電場刺激と同様に、ＰＥＭＦおよび静電結合を使用した非侵襲的な技術（治療域の皮膚上に電極を配置するもの）もまた効果的であることが認められた。ＰＥＭＦｓは、伝導率の高い細胞外液に小誘導電流（ファラデー電流）を誘導し、一方、静電結合は前記組織に直接電流を生じさせるものである。それにより、ＰＥＭＦｓおよびＣＣ双方とも内因性電流を擬態する。
【０００８】
内因性電流は、当初骨内の結晶表面に起こる現象に起因すると考えられていたが、主に、陰性の固定電荷を有する有機成分を含有し、いわゆる「流動電位」を生成する、骨管内の電解質を含む液体の運動によって生じることが明らかになった。骨内における電気現象に関する研究は、骨を機械的に圧迫することにより、前記骨基質中のプロテオグリカンおよびコラーゲンにおける陰性の固定電荷の表面上に液体運動および電解質が生じる際に起こる機械−電気変換メカニズムを実証した。このような流動電位は、骨内で一定の目的を果たし、機械的な緊張と同様に、石灰化可能な基質における骨細胞の合成を刺激することが可能なシグナル伝達をもたらし、これにより骨形成が促進される。
【０００９】
直流、静電結合およびＰＥＭＦｓは主に整形外科で癒着不能の骨折治癒に応用されてきた（Ｂｒｉｇｈｔｏｎら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．、６３：２〜１３、１９８１年、ＢｒｉｇｈｔｏｎおよびＰｏｌｌａｃｋ、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．、６７：５７７〜５８５、１９８５年、Ｂａｓｓｅｔｔら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．、１７：４５１〜５２９、１９８９年、Ｂａｓｓｅｔｔら、ＪＡＭＡ  ２４７：６２３〜６２８、１９８２年）。成人における股関節の虚血壊死、および小児におけるレッグパーセス病（Ｌｅｇｇ−Ｐｅｒｔｈｅｓ‘ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）での臨床効果が報告されてきた（Ｂａｓｓｅｔｔら、Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．２４６：１７２〜１７６、１９８９年、Ａａｒｏｎら、Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．２４９：２０９〜２１８、１９８９年、Ｈａｒｒｉｓｏｎら、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｏｒｔｈｏｐ．４：５７９〜５８４、１９８４年）。また、ＰＥＭＦｓ（Ｍｏｏｎｅｙ、Ｓｐｉｎｅ、１５：７０８〜７１２、１９９０年）および静電結合（Ｇｏｏｄｗｉｎ、Ｂｒｉｇｈｔｏｎら、Ｓｐｉｎｅ、２４：１３４９〜１３５６、１９９９年）が、腰椎部癒着の成功率を有意に高める可能性があることも示されている。さらに、末梢神経再生の増加およびその機能の増強、および血管形成の促進も報告されている（Ｂａｓｓｅｔｔ  Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  ６：３６〜４２、１９８７年）。ステロイド注射および他の通常の措置に反応しない、持続性回旋筋腱板腱炎患者は、プラセボで治療を受けた患者と比べて有意に有益性を示した（Ｂｉｎｄｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ  ６９５〜６９８、１９８４年）。最後に、Ｂｒｉｇｈｔｏｎらは、ラットにおいて、適切な静電結合の電場が、腰椎における椎骨骨粗鬆症を予防し、さらに好転させる能力があることを示した（Ｂｒｉｇｈｔｏｎら、Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．６：６７６〜６８４、１９８８年、Ｂｒｉｇｈｔｏｎら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．、７１：２２８〜２３６、１９８９年）。
【００１０】
より最近では、この分野の研究は刺激が組織および細胞に与える影響に着目してきた。例えば、直流は細胞膜を透過しないこと、および細胞外基質の分化を介して調整が行われることが推測されてきた（Ｇｒｏｄｚｉｎｓｋｙ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．９：１３３〜１９９，１９８３年）。また、直流とは対照的に、ＰＥＭＦｓは、細胞膜を透過することが可能で、且つ、同細胞膜を刺激するか、細胞内器官に直接影響を与えるかのいずれかが可能であることが報告された。ＰＥＭＦｓが細胞外基質および生体内軟骨内骨化に与える効果についての試験では、軟骨分子の合成の増加および骨梁の成熟が認められた（Ａａｒｏｎら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．４：２２７〜２３３、１９８９年）。さらに最近では、Ｌｏｒｉｃｈら（Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｒｅｓ．３５０：２４６〜２５６，１９８９年）、およびＢｒｉｇｈｔｏｎら（Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．、８３−Ａ、１５１４−１５２３、２００１年）は、静電結合型の電気信号のシグナル伝達は、電位依存性のカルシウムチャネルを介して行われるが、ＰＥＭＦｓまたは複合電磁場のシグナル伝達は、細胞内に貯蔵されているカルシウムの放出を介して行われる。３つのタイプの電気刺激全てにおいて、細胞質のカルシウムが増加し、さらに（細胞骨格の）カルモジュリンの活性化を促すことを報告した。
【００１１】
１９９６年に本発明者らは、環状二軸で０．１７％の機械的緊張によって、Ｃｏｏｐｅｒディッシュ中で培養したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１骨細胞中のＴＧＦ−β１  ｍＲＮＡが有意に増加することを報告した（Ｂｒｉｇｈｔｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２９：４４９〜４５３，１９９６年）。１９９７年には、重要な追研究がいくつか行われた。１研究においては、同一の環状二軸で０．１７％の機械的緊張によって、類似骨細胞中のＰＤＧＦ−Ａ  ｍＲＮＡがＣｏｏｐｅｒディッシュ中で有意に増加したことが報告された（Ｂｒｉｇｈｔｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．４３：３３９〜３４６，１９９７年）。また、６０ｋＨｚで２０ｍＶ／ｃｍの静電結合型電場によって、類似骨細胞中のＴＧＦ−β１が有意に増加したことも報告された（Ｂｒｉｇｈｔｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３７：２２５〜２２９、１９９７年）。但し、前記文献では、このような電場が体内の他の遺伝子に及ぼす影響については報告されていない。
【００１２】
「Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  Ｖｉａ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｓｉｇｎａｌｓ（特異的且つ選択的な電気信号および電磁信号の印加による遺伝子制御）」と題する上述の親特許出願では、罹患組織、または損傷組織の標的遺伝子を制御することを目的する電場を発生させるために使用される前記特異的且つ選択的な電気信号および電磁信号の決定方法を開示している。本発明は、新鮮骨折、骨折の危険性のある骨、遷延治癒骨折、骨折の癒着不能、骨欠損症、脊椎固定、骨壊死または虚血壊死の治療のため、前記疾患の１つ或いは全ての治療における他の治療法の補助療法として、及び骨粗鬆症の治療において、特異的且つ選択的な電気信号および電磁信号によって生成される電場の印加を介して標的遺伝子ファミリーの発現、すなわち、ＴＧＦ−β（複数可）遺伝子の発現を制御する方法を説明することにより、前記親出願で記載された技術をさらに発展させるものである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、電極に印加される特異的且つ選択的な電気信号および／または電磁信号によって生成される特異的且つ選択的な電場および／または電磁場を印加することにより、骨細胞における形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）（一例として）の遺伝子発現の制御に関する。電気信号の継続時間、振幅、周波数、およびデューティサイクルに関する連続的用量反応曲線を作成し、生じる電場の作用を測定することにより、骨細胞におけるＴＧＦ−βのｍＲＮＡを上方制御するための最適な信号を発見した。前記最適な信号により、２０〜４０ｍＶ／ｃｍの振幅、２４時間の継続時間、６０ｋＨｚの周波数、および５０％のデューティサイクルを伴う静電結合型電場が生成された。本発明は、より具体的には、このような信号によって生成される電場を印加することにより、骨細胞におけるＴＧＦ−β１、２、および３の遺伝子発現を上方制御する工程に関する。
【００１４】
本発明の典型的な実施形態において、静電結合型電場、電磁場、または複合場を用いて、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３の遺伝子発現（ｍＲＮＡによって測定）を特定的および選択的に上方制御する方法を提供する。ＴＧＦ−βｓ１、２、および３の遺伝子発現を上方制御する、約２４時間の電場継続時間、６０ｋＨｚの周波数、約５０％のデューティサイクル、および正弦波形を伴う約２０〜４０ｍＶ／ｃｍの静電結合型電場で新鮮骨折、骨折の危険性のある骨、遷延治癒骨折、癒着不能の骨折、骨欠損症、骨壊死、骨粗鬆症などを治療する。本発明の方法によると、「特異的且つ選択的な」信号は、振幅、継続時間、デューティサイクル、周波数、および波形に一定の特性を有し、ＴＧＦ−βの遺伝子発現を上方制御する信号である（特定性）。これにより、ＴＧＦ−βの遺伝子発現を上方制御するための異なる信号を選択し、ある特定の生物学的反応または治療効果を達成することが可能になる（選択性）。さらに、本発明は、本明細書で説明する方法を用いた装置に関し、この装置は、前記ＴＧＦ−βの遺伝子発現を上方制御する電場を発生させる特異的且つ選択的な信号を生成するものである。
【００１５】
関連態様において、本発明は、新鮮骨折、骨折の危険性のある骨、遷延治癒骨折、癒着不能の骨折、骨欠損症、脊椎固定、骨壊死を治療するための方法および装置に関し、前記方法および装置は、上記のうちの１若しくはそれ以上の治療および骨粗鬆症の治療における他の治療法の補助療法としての方法および装置である。また、本発明の前記方法は、ＴＧＦ−βの細胞産生を増加させるとして知られている、若しくは増加させると推測される開始信号の継続時間を体系的に変化させることにより、ＴＧＦ−βの遺伝子発現のための「特異的且つ選択的な」信号を決定する方法を含む。最適な継続時間を決定後、前記信号の振幅を、ＴＧＦ−βｓ１、２、および３の遺伝子発現に基づいて決定された最適な継続時間の間変化させる。上記と同様の用量反応法で前記デューティサイクル、周波数、および波形を体系的に変化させ、それと同時に他の信号特性を一定にする。前記ＴＧＦ−βｓの発現を最大限に上昇させる最適な信号が決定されるまで、この工程を繰り返す。
【００１６】
本発明について上述した点および他の点については、以下の発明の詳細な説明において明らかにする。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、骨細胞が２０ｍＶ／ｃｍの静電結合型電場に様々な継続時間の間露出された場合の、ＴＧＦ−βｓ１、２、および３のｍＲＮＡ発現をグラフで示したものである。図示したように、前記様々なＴＧＦ−βのｍＲＮＡの最大発現は、信号の継続時間が２４時間の場合に起った。
【図２】図２は、骨細胞が２４時間の継続時間の間様々な静電結合型電場振幅に露出された場合の、ＴＧＦ−βｓ１、２、および３のｍＲＮＡ発現をグラフで示したものである。図示したように、前記様々なＴＧＦ−βのｍＲＮＡの最大発現は、電場振幅が２０〜４０ｍＶ／ｃｍの場合に起った。
【図３】図３は、骨細胞が、電場振幅が２０〜４０ｍＶ／ｃｍで、信号継続時間が２４時間である、様々な静電結合型電場の周波数に露出された場合の、ＴＧＦ−βｓ１、２、および３のｍＲＮＡ発現をグラフで示したものである。図示したように、前記様々なＴＧＦ−βのｍＲＮＡの最大発現は、周波数が６０ｋＨｚの場合に起った。
【図４】図４は、骨細胞が、周波数が６０ｋＨｚ、電場振幅が２０ｍＶ／ｃｍ、信号継続時間が２４時間である、様々な静電結合型電場のデューティサイクルに露出された場合の、ＴＧＦ−βｓ１、２、および３のｍＲＮＡ発現をグラフで示したものである。図示したように、前記様々なＴＧＦ−βのｍＲＮＡの最大発現は、デューティサイクルが５０〜１００％で正弦波の場合に起った。
【図５】図５は、骨細胞が、電場振幅が２０〜４０ｍＶ／ｃｍ、周波数が６０ｋＨｚ、正弦波形状であり、５０％のデューティサイクルの静電結合型電場に露出された場合の、ＴＧＦ−β１タンパク質をグラフで示したものである。図示したように、ＴＧＦ−β１タンパク質の増加量は２０ｍＶ／ｃｍ若しくは４０ｍＶ／ｃｍのいずれによっても同じであった。
【図６】図６は、骨細胞が、静電結合型で５０％のデューティサイクルの電場（振幅が２０ｍＶ／ｃｍまたは４０ｍＶ／ｃｍ、周波数が６０ｋＨｚ、正弦波形状）に２４時間露出された場合の、ＢＭＰ−２タンパク質をグラフで示したものである。図示したように、図５に示されたＴＧＦ−β１反応と異なり、２０ｍＶ／ｃｍに比べ４０ｍＶ／ｃｍの電場においてＢＭＰ−２タンパク質の産生における有意な増加は認められなかった。
【図７】図７は、骨細胞が、５０％のデューティサイクルの静電結合型電場（２０ｍＶ／ｃｍ、６０ｋＨｚ、正弦波）に２４時間の間露出された場合の、ＢＭＰのｍＲＮＡ発現をグラフで示したものである。この図を図２と比較することにより、４０ｍＶ／ｃｍの電場における骨細胞によるＢＭＰタンパク質産生反応の欠如と４０ｍＶ／ｃｍの電場における骨細胞によるＴＧＦ−βタンパク質産生反応の有意な増加との相違が明らかである。
【図８】図８は、図２のＴＧＦ−β遺伝子発現と同じグラフ上に図７のＢＭＰ遺伝子発現を示している。
【図９】図９は、本発明の好適な実施形態に従った、変形性膝関節症の治療のための装置を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
図１〜９を参照しながら、以下に本発明を詳細に説明する。前記図面に関する本明細書の記載は、例示的な目的のみを意図しており、いかなる点においても、本発明の範囲を制限することを意図しないことは、当業者であれば理解するものである。本発明の範囲に関する質問はすべて、添付の特許請求の範囲を参照することにより解決されうる。
【００１９】
本発明は、特異的且つ選択的な電気信号および／または電磁信号を印加することにより、特定の遺伝子発現を制御することが可能であるという発見に基づいている。すなわち、本発明者らは、骨、軟骨および他の組織細胞における各遺伝子を制御するための電場を生成する特定の電気信号および／または電磁信号があり、このような特定の信号によって、前記細胞における遺伝子を特定的および選択的に制御することが可能になることを発見したものである。特に、組織または細胞の増殖、維持、修復、および変性または変質を支配する遺伝子発現は、本発明に従って、特異的且つ選択的な電気信号および／または電磁信号によって生成される電場を印加することにより制御することが可能であり、その結果、有益な臨床効果を得ることができる。このような発見は、新鮮骨折、骨折の危険性のある骨、遷延治癒骨折、癒着不能の骨折、骨欠損症、脊椎固定、骨壊死を含むある特定の病状を標的とする治療法の開発において、上記の病状のうちのいずれか１つ若しくはそれ以上の治療、および骨粗鬆症の治療における補助療法として有益である。
【００２０】
本明細書では、用語「信号」は、装置によって出力される、機械的信号、超音波信号、電磁信号および電気信号を含む様々な信号に言及するために使用される。本明細書での用語「電場」は、複合場、パルス電磁場、または直流、静電結合、または誘導結合によって生成された電場のいずれかに関わらず、標的組織内の電場に言及することが理解されるものである。
【００２１】
用語「遠隔」は、距離を置いた場所から作用する、作用を受ける、または制御されることを意味するために使用される。「遠隔的に」提供することは、距離を置いた場所から提供することを指す。例えば、遠隔電源から特異的且つ選択的な信号を提供することは、組織または細胞から距離を置いた電源から、若しくは身体の外部または身体外側の電源から信号を提供することを指す。
【００２２】
用語「特異的且つ選択的な」信号は、一定の特質の振幅、継続時間、デューティサイクル、周波数および波形を有し、標的遺伝子または補足遺伝子の標的機能を上方制御若しくは下方制御する電場を発生させる信号を意味する（特定性）。これにより、様々な遺伝子発現を上方制御若しくは下方制御するための異なる「特異的且つ選択的な」信号を選択し、ある特定の生物学的反応または治療効果を達成することが可能になる（選択性）。
【００２３】
用語「制御する」は、遺伝子発現を制御することを意味する。「制御する」には、上方制御および下方制御の両方が含まれる。上方制御は遺伝子発現の上昇を意味し、また下方制御は遺伝子発現を抑制、若しくは阻止することを意味する。
【００２４】
「機能的に相補的」は、ある特定の細胞または組織において、発現が相補的または相乗的である２若しくはそれ以上の遺伝子を指す。
【００２５】
「組織」は、患者の構造物質の１つを形成する細胞外物質を伴う細胞の集合体を指す。本明細書では、用語「組織」は、筋肉および臓器組織、腫瘍組織、さらに骨組織または軟骨組織など身体のすべての組織を含むことを意図する。また、本明細書では、用語「組織」は、個別細胞を指す場合もある。
【００２６】
「患者」は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。
【００２７】
本発明は、特定の組織、細胞または疾患を標的とする治療方法および装置を提供するものである。特に、損傷または罹患した組織または細胞における修復過程に関連する遺伝子発現は、特異的且つ選択的な電気信号によって生成される電場を該標的組織または細胞における被制御遺伝子に対して印加することにより、制御することが可能である。遺伝子発現は、各遺伝子または補足遺伝子の各集合のための特異的且つ選択的な信号を印加することによって、上方制御若しくは下方制御することが可能であり、その結果有益な臨床効果を得ることができる。例えば、ある固有の特定および選択的な信号は、特定の望ましい遺伝子発現を上方制御する電場を生成し、一方、同一の、または別の固有の特定および選択的な信号は特定の望ましくない遺伝子発現を下方制御する電場を生成する場合もある。ある特定の遺伝子は、ある固有の特定および選択的な信号によって生成される電場により上方制御され、また、別の特異的且つ選択的な信号によって生成さる電場により下方制御される可能性もある。当業者であれば、組織の増殖、維持、修復、および変性または変質を支配する遺伝子を制御することにより、ある特定の罹患または損傷した組織を治療標的とすることが可能であることを理解するものである。
【００２８】
本発明の方法および装置は、ある特定の標的罹患組織および損傷組織に関連する遺伝子発現のための特異的且つ選択的な電場を生成する信号を同定することに基づいている。例えば、様々な形態の電気（静電結合、誘導結合、複合場）は、各選択遺伝子に対して印加電場の周波数、振幅、波形またはデューティサイクルを変化させることにより、患者の身体の標的組織または細胞における遺伝子発現を特定的および選択的に制御することが可能である。また、電気に対する露出継続時間も、電気が患者の身体の標的組織または細胞における遺伝子発現を特定的および選択的に制御する能力に影響を及ぼす。遺伝子発現に対して望ましい効果を提供する周波数、振幅、波形、デューティサイクルおよび継続時間の組み合わせが検出されるまで、特異的且つ選択的な信号によって、各遺伝子に対して印加電場を生成する。
【００２９】
ある特定の遺伝子発現のための電場の特定性および選択性は、複数の要因から影響を受ける可能性があるため、様々な罹患組織または損傷組織、若しくは病状を治療標的とすることが可能であることが理解されるものである。特に、ある特定の遺伝子発現のための、適切な周波数、振幅、波形、および／またはデューティサイクルを有する電場は特定的および選択的であるため、標的治療を提供することが可能である。また、時間的要因（例えば、電場に対する露出継続時間）も、ある特定の遺伝子発現のための電場の特定性および選択性に影響を与える。遺伝子発現の制御は、一定の継続時間の間電場を印加することによってより効果的（若しくは可能）になる場合がある。従って、本発明は、様々な罹患または損傷した、組織若しくは疾患を標的とする治療を提供するために、印加電場の周波数、振幅、波形、デューティサイクルおよび／または継続時間を変化させて、ある電場がある特定の遺伝子発現に対して特定的および選択的であることを検出する工程を提供することを、当業者であれば理解するものである。
【００３０】
このように、本発明は、適切な継続時間の間、適切な周波数、振幅、波形、および／またはデューティサイクルを有する、特異的且つ選択的な信号によって生成される電場を印加することにより、特定の罹患組織または損傷組織に関連する特定の遺伝子発現を制御することが可能なため、標的治療を提供することができる。従って、電場を生成する信号の特定性および選択性を調整することにより、特定の遺伝子発現を制御して特定の罹患組織または損傷組織、若しくは病状を治療標的とすることが可能である。特に、本発明は、新鮮骨折、骨折の危険性のある骨、癒着不能の骨折、骨欠損症、脊椎固定、骨壊死の標的治療を提供し、前記標的治療は、上記のうちの１若しくは全ての治療、および骨粗鬆症の治療における他の治療法の補助療法としての治療である。
【００３１】
本発明の装置では、特異的且つ選択的な信号によって生成される電場を患者の罹患または損傷した組織および／または皮膚に直接印加することが可能である。また、本発明の装置では、特異的且つ選択的な電場を遠隔的に印加する場合もある（例えば、罹患組織または損傷組織から距離を置いた場所で電場を印加しても、標的細胞内には望ましい効果が及ぶ）。但し、静電結合型の装置では被験者の皮膚への接触が必要になることが理解されるものである。静電結合の場合、本発明の装置は、患者の身体の損傷組織または罹患組織の近傍に電極を取着する手段を含む場合もある。例えば、自動接着性の導電性電極を、患者の骨折骨の両側の皮膚上に取着する場合もある。図９で示すように、本発明の装置１０は、当該装置を患者の身体に取着するための自動接着性の電極１２を具備することもある。例えば、本発明の装置１０は、電源装置１４に取着された電極を具備し、この電源装置１４は、裏面にＶＥＬＣＲＯ（登録商標）パッチ１６を有するため、患者のギプスの周囲に適合するＶＥＬＣＲＯ（登録商標）ストラップ（図示せず）に当該電源装置１４を取着することが可能になる。誘導結合の場合、本発明の装置は、電極の代わりに電源装置に取着されたコイルを具備することもある。
【００３２】
本発明の装置１０は、様々な方法で用いることができる。前記装置１０は、携帯用であってもよいし、患者の身体に一時的または永久的に取り付けられていてもよい。本発明の装置１０は、非侵襲的であることが好ましい。例えば、予め定められた特異的且つ選択的な電気信号によって生成される電場を印加するために、患者の皮膚に接触するようなっている電極を取着することによって、本発明の装置１０が患者の皮膚に取り付けられることもある。また、このような信号は内部に時変電流が流れるコイルを介して印加することも可能であり、前記標的組織を透過して内部に特異的且つ選択的な電磁場を生成する。また、本発明の装置１０を患者に埋め込むことも可能であり、この埋め込みには、患者の骨との直接接触のための皮下埋め込みが含まれる。
【００３３】
当業者であれば、本発明の装置を、一対または複数の対の電極、あるいは電磁コイルまたはソレノイドに印加するためのプログラムされた、複数の、切替え可能な、特異的且つ選択的な信号を伴う静電結合型の電源装置を含む様々な形態で提供することが可能であることがさらに理解されるものであり、これらの電極、あるいは電磁コイルまたはソレノイドは、切替え可能な、複数の、特異的且つ選択的な信号を伴う電源装置および特異的且つ選択的な信号を生成するための電源を伴う超音波刺激装置に取着されている。通常、患者の承諾および適応性に基づいて装置の選択が行われる。現行技術において入手可能な最も小型の携帯用装置は静電結合型装置であるが、皮膚が非常に敏感な患者においては、誘導結合型装置を使用することが好ましい場合もある。一方、超音波装置は患者の協力を最も必要とするが、特定の患者によって使用されるのが望ましい場合もある。
【００３４】
実施例 
本発明は、以下の実施例において実証されるものであるが、この実施例は例示を目的とし、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００３５】
物質および方法 
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１骨細胞（５×１０５細胞／ｃｍ２）を、特別改良したＣｏｏｐｅｒディッシュ上で平板培養した。前記細胞を培地で７日間増殖させ、この培地を実験条件を開始する直前に交換した。これらの研究全般における実験用細胞培養は、６０ｋＨｚ、静電結合型の正弦波、４４．８１Ｖピーク−ピークの出力を伴う電場の条件下に置いた。前記条件により、前記ディッシュの培地に、電流密度が３００μＡ／ｃｍ２で２０ｍＶ／ｃｍの算出電場強度を発生させた。対照細胞培養ディッシュは、電極が関数発生器に接続されていない点を除いては、刺激を受けた細胞培養ディッシュと同一であった。
【００３６】
実験の終了時に、製造業者の取扱説明書に従い、ＴＲＩｚｏｌを使用して全ＲＮＡを分離し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素を使用して逆転写（ｒｅｖｅｒｓｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ：ＲＴ）を行った。リアルタイムのＲＴ−ＰＣＲ法において使用するオリゴヌクレオチドプライマーを、公開ｃＤＮＡ配列から選択するか、若しくは、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアプログラムを使用して設計した。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７０００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して、ＲＴ−ＰＣＲ産物のリアルタイム定量分析を行った。
【００３７】
特にＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３を含む、（ＴＧＦ）遺伝子の望ましい上方制御のための最適な信号を以下のように体系的に検出した。ある特定のタンパク質の細胞産生を増加させる電場を生成することが知られている（若しくは、増加させると推測される）電気信号を前記特定のタンパク質の遺伝子発現（ｍＲＮＡ）のための電場を生成する特定の信号を決定するための開始信号とする。始めに、前記信号の継続時間を変化させる一方で、その他全ての信号特性（振幅、デューティサイクル、周波数および波形）を一定に保つことにより、用量反応曲線を作成する（図１）。これにより、前記特定のタンパク質の遺伝子発現のための前記開始信号の最適な継続時間が決定される。次に、第２の用量反応曲線の作成を行い、今回は、前記電場の振幅（単位ｍＶ／ｃｍ）を変化させる一方で、前記最適な継続時間および他の信号特性を一定に保った（図２）。第３の用量反応曲線の作成を行い、今回は、前記信号の周波数を変化させる一方で、上記で検出された最適な継続時間および振幅を一定に保った（図３）。第４の用量反応曲線の作成を行い、デューティサイクルを１００％（連続稼動）〜１０％若しくはそれ未満に変化させる一方で、上記で検出された最適な継続時間、振幅、および周波数を一定に保った（図４）。前記方法により、前記様々なＢＭＰｓの遺伝子発現を最大限に上昇させるために最適な信号が決定される。
【００３８】
５０％のデューティサイクルの連続（信号）（静電結合、２０ｍＶ／ｃｍ、６０ｋＨｚ、正弦波）を用いて第５の実験を行い、ＴＧＦ−β１タンパク質の産生における２０ｍＶ／ｃｍの電場と４０ｍＶ／ｃｍの電場を比較した。示されるように、両方の電場においてＴＧＦ−β１タンパク質は有意に同等に増加した（図５）。図５で示したものと同じ二つの電場（２０ｍＶ／ｃｍと４０ｍＶ／ｃｍ）におけるＢＭＰ−２タンパク質の産生増加を証明するために、第６の実験を行った。５０％のデューティサイクル（静電結合、６０ｋＨｚ、正弦波）の電場で２４時間刺激したところ、２０ｍＶ／ｃｍの電場ではＢＭＰ−２タンパク質は有意に増加したが、４０ｍＶ／ｃｍの電場ではＢＭＰ−２タンパク質の有意な増加は認められなかった（図６）。このように、またこれは非常に重要であるが、前記遺伝子はすべて同じＴＧＦスーパーファミリーに属するにもかかわらず、細胞を４０ｍＶ／ｃｍの電場で刺激することによりＴＧＦ−β遺伝子発現をＢＭＰ遺伝子発現から切り離すことが可能となる。このことは図２を図７と比較すれば明らかである。図７において、ＢＭＰ遺伝子発現の上方制御における反応は２０ｍＶ／ｃｍの電場の方が他のいずれの電場よりもはるかに大きいことが明らかである。一方、図２において、２０ｍＶ／ｃｍの電場と４０ｍＶ／ｃｍの電場はＴＧＦ−β遺伝子発現の上方制御において同等に有効であることが示されている。図８では、図２のＴＧＦ−β遺伝子発現と同じグラフ上に図７のＢＭＰ遺伝子発現を示している。このように、骨折治癒において、骨折治癒の骨形成相中に骨および軟骨形成を一緒に刺激するか、または骨折治癒の軟骨形成相中に軟骨形成のみを刺激するかのいずれかを選択することが可能である。
【００３９】
前記実施例で説明した最適な電場により、ＴＧＦ−ベータ１、２、および３のｍＲＮＡを非常に有意に上方制御することが可能であり、骨折治癒、骨折治癒遅延、遷延治癒、癒着不能、骨欠損症、脊椎固定、および骨粗鬆症においてこの上方制御により骨形成が促進されることを、本発明は明瞭に示している。本明細書では静電結合を用いた適切な電場を説明したが、誘導結合を用いた場合、さらに、均等または略均等の電場特性を発生させる全電磁システムを用いた場合も同様の効果があることを、当業者であれば理解するものである。また、より多くのデータポイント（例えば、１００±３％のデューティサイクルを３０±３分間）に関する実験をさらに行うことによって、より固有の信号特性を発見することが可能であるが、各信号特性のこのような僅かな変化は、本明細書の教示を鑑みると、当業者のレベルの範囲内であると確信するものであることも、当業者は理解するであろう。
【００４０】
また、当業者であれば、本発明の要旨の範囲内で本発明に対し数多くの他の修正が可能であることも理解するものである。例えば、本明細書で説明した最適な電場は、対になったまたはストリップ状の、あるいは補強材、包帯またはギプスに組み込まれた、２若しくはそれ以上の適切な表面電極を介して任意の骨に印加可能であり、また前記電場は静電結合によって供給することができる。さらに、本明細書で説明した最適な電場は、補強材、包帯またはギプスに組み込まれたコイル（複数可）またはソレノイドを介して任意の骨に印加可能であり、誘導結合によって供給することができる。従って、本発明の範囲は、上述した好適な実施形態に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲よってのみ限定されることを意図するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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