(57)【要約】本発明は、補体タンパク質の機能的活性を血漿から除去し、それによって補体媒介性細胞溶解を低減するまたは消失させることによって補体カスケードを調節するための方法を提供する。本発明は、補体媒介性細胞溶解および炎症のペプチド調節因子の処置における、アストロウイルス科のウイルス由来のコートタンパク質およびその誘導体の治療的使用のための方法を提供する。本発明は、補体媒介性疾患の治療における、アストロウイルス科のウイルス由来のコートタンパク質およびその誘導体の治療的使用のための方法を提供する。アストロウイルスコートタンパク質または誘導体の投与後、血清中の一つまたは複数の補体成分の阻害または除去により、古典補体経路または代替補体経路のいずれかによって引き起こされる補体カスケードが細胞溶解および炎症をもたらすことを予防する方法を、本発明において述べる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アストロウイルス（Astroviridae）科コートタンパク質およびその誘導体を使用して補体カスケードタンパク質を調節するための方法。
【請求項２】
コートタンパク質または誘導体が古典補体経路を阻害する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
コートタンパク質または誘導体が代替補体経路を阻害する、請求項1記載の方法。
【請求項４】
コートタンパク質または誘導体がウイルス様粒子である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
アストロウイルスコートタンパク質または誘導体が野生型ウイルスから精製される、請求項1記載の方法。
【請求項６】
コートタンパク質または誘導体が組換え技術によって産生される、請求項1記載の方法。
【請求項７】
コートタンパク質または誘導体が、組換えタンパク質発現方法においてバキュロウイルス系、大腸菌（E. coli）、および酵母細胞からなる群より産生される、請求項6記載の方法。
【請求項８】
コートタンパク質または誘導体がキメラタンパク質である、請求項6記載の方法。
【請求項９】
誘導体がペプチドである、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
コートタンパク質または誘導体が融合タンパク質である、請求項6記載の方法。
【請求項１１】
アストロウイルスコートタンパク質またはその誘導体を投与する工程を含む、補体媒介性組織損傷を阻害するための方法。
【請求項１２】
組織損傷が関節リウマチに関連する、請求項13記載の方法。
【請求項１３】
組織損傷が全身性エリテマトーデスに関連する、請求項13記載の方法。
【請求項１４】
組織損傷が多発性硬化症に関連する、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
組織損傷が重症筋無力症に関連する、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
組織損傷が自己免疫性溶血性貧血に関連する、請求項13記載の方法。
【請求項１７】
組織損傷が膜性増殖性糸球体腎炎に関連する、請求項13記載の方法。
【請求項１８】
組織損傷が血清病に関連する、請求項13記載の方法。
【請求項１９】
組織損傷がシチメンチョウアストロウイルス感染症に関連する、請求項13記載の方法。
【請求項２０】
組織損傷が成人呼吸窮迫症候群に関連する、請求項13記載の方法。
【請求項２１】
組織損傷が虚血再灌流障害に関連する、請求項13記載の方法。
【請求項２２】
虚血再灌流障害が卒中に起因する、請求項23記載の方法。
【請求項２３】
虚血再灌流障害が心筋梗塞に起因する、請求項23記載の方法。
【請求項２４】
組織損傷が同種移植または異種移植に関連する、請求項13記載の方法。
【請求項２５】
組織障害がさらに超急性拒絶反応の結果である、請求項26記載の方法。
【請求項２６】
組織障害がさらに移植片対宿主病（GVHD）の結果である、請求項26記載の方法。
【請求項２７】
組織損傷がアルツハイマー病に関連する、請求項13記載の方法。
【請求項２８】
組織損傷が熱傷に関連する、請求項13記載の方法。
【請求項２９】
組織損傷が血液透析損傷に関連する、請求項13記載の方法。
【請求項３０】
組織損傷が心肺バイパス損傷に関連する、請求項13記載の方法。
【請求項３１】
組織損傷が発作性夜間血色素尿症に関連する、請求項13記載の方法。
【請求項３２】
コートタンパク質またはその誘導体を投与する工程を含む、アストロウイルス感染に対してワクチン接種するための方法。
【請求項３３】
ワクチンが精製アストロウイルスコートタンパク質である、請求項34記載の方法。
【請求項３４】
ワクチンが組換えアストロウイルスコートタンパク質である、請求項34記載の方法。
【請求項３５】
ワクチンがDNAワクチンである、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
アストロウイルスコートタンパク質またはその誘導体が、補体カスケードの終末経路の活性化を阻害する、請求項1記載の方法。
【請求項３７】
アストロウイルスコートタンパク質またはその誘導体が、補体ペプチドiC3bの形成を阻害する、請求項1記載の方法。
【請求項３８】
アストロウイルスコートタンパク質またはその誘導体が、補体ペプチド複合体C3コンバターゼの形成を阻害する、請求項1記載の方法。
【請求項３９】
アストロウイルスコートタンパク質またはその誘導体が、補体ペプチドC5aまたはC5bの形成を阻害する、請求項1記載の方法。
【請求項４０】
アストロウイルスコートタンパク質またはその誘導体が、標的細胞上での、膜侵襲複合体（MAC）として当技術分野において公知の補体ペプチドの形成を阻害する、請求項1記載の方法。
【請求項４１】
アストロウイルスコートタンパク質またはその誘導体が、正常ヒト血清を使用する標準RBC溶解アッセイにおいて赤血球の溶解を阻害する、請求項1記載の方法。
【請求項４２】
アストロウイルスコートタンパク質またはその誘導体が、B因子除去血清を使用する標準RBC溶解アッセイ法において赤血球の溶解を阻害する、請求項1記載の方法。
【請求項４３】
アストロウイルスコートタンパク質またはその誘導体が補体タンパク質C1に結合する、請求項1記載の方法。
【請求項４４】
アストロウイルスコートタンパク質またはその誘導体、および少なくとも1つの薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項４５】
請求項44記載の薬学的組成物をそれを必要とする患者に投与する工程を含む、補体媒介性組織損傷に関連する疾患を治療するための方法。
【請求項４６】
疾患の治療に有効な少なくとも1つの他の有効成分を投与する工程をさらに含む、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
少なくとも1つの他の有効成分が、非ステロイド系抗炎症薬、コルチコステロイド、または疾患修飾性抗リウマチ薬からなる群より選択される、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
少なくとも1つの他の有効成分がエクリズマブである、請求項46記載の方法。
【請求項４９】
アストロウイルス粒子、コートタンパク質、またはその誘導体を投与することによって遺伝性血管浮腫（HAE）を治療するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許法第119上の下で、 2006年6月15日出願の米国出願第60/813,685号の優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は概して、炎症性疾患および自己免疫疾患における治療的介入の分野に関する。より具体的には、本発明は、補体媒介性組織損傷の予防および治療、およびアストロウイルス感染に関連するウイルス性疾患に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
アストロウイルスは、一本鎖のメッセンジャーセンスRNAゲノムを有する小型のエンベロープを持たない正二十面体ウイルスであり、哺乳動物および鳥類の両方に感染することが公知である。それらは、世界中で小児の下痢性疾患の2〜17％を引き起こすと推定される。アストロウイルス感染は、栄養失調、腸内寄生虫またはその両方を有する小児にとって特に深刻であり得る。先進西欧諸国においてさえもヒトアストロウイルス（HAstV）は、親が病気の小児の世話をするために仕事を休むことによって重大な経済的損失を生じさせる。この経済的損失の傾向は、就労する母親の数の増加に伴って悪化する可能性が高い。小児におけるアストロウイルス感染の予防または治療は、医師および救急外来の受診ならびに労働時間の損失に重大な経済的影響を与えるであろう。養鶏業において、シチメンチョウアストロウイルスはシチメンチョウ飼育産業への大きな経済的影響力を有する。特に、シチメンチョウアストロウイルスはシチメンチョウの若鳥において急速な致死的ウイルス性敗血症を引き起こすが、これは、補体系を含む可能性が高くかつ補体系によって駆動されると考えられる絶大な免疫カスケードを示唆する。シチメンチョウアストロウイルスの損傷を予防するまたは緩和するように設計された獣医学的治療は、この産業のための重要な開発となるであろう。
【０００４】
補体阻害剤には大きな需要がある。現在のところ、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、および多発性硬化症などの自己免疫疾患を含む、多くの疾患過程における補体調節不全に関連した公知の罹患率および死亡率にもかかわらず、抗補体療法はヒトにおける使用に関して承認されていない。そのような多様な疾患における補体媒介性組織損傷の影響により、推定で毎年20〜40億ドルの市場を有する多くの補体阻害剤の開発が促された。2003年現在の補体治療に関する総説については、「Complement therapeutics; history and current progress」と題されたB. P. MorganおよびC.L. Harrisによる総説論文(B. P Morgan and C.L. Harris, 2003. Molec. Immunol. 40, 159-170（非特許文献1)）を参照されたい。アストロウイルスコートタンパク質は補体系に極めて強力な作用を及ぼすと思われ、該タンパク質の「活性」部分は、補体媒介性疾患由来の組織損傷を低減する際に臨床的有用性を有し得ると示唆される。現在のところ、抗補体特異的免疫調節剤は市販されていない。一部の自己免疫疾患におけるその有用性を説明し得る抗補体作用を高用量のIVIg（静脈内免疫グロブリン）が有するという、いくつかの証拠が存在する。IVIgは極めて高価であり、何百人ものドナー血液に由来するため、安全上の懸念がある。
【０００５】
抗補体治療のための現在の候補化合物は、あまりに広く作用し過ぎるという重大な不都合があるか、または一部の場合には毒性のために実現不能である。たとえばこれまでに公知の最も強力な抗補体物質であるコブラ毒因子（CVF）は、安定なC3コンバターゼ（C3bBb）として作用することによって血漿中のすべてのC3を実質的に除去することができる。しかしCVFは、一部の実験モデルにおける、長期間の補体除去を生じさせる制御不能な補体活性化と重篤な感染に対する脆弱性のゆえに、治療としては本質的に支持されない（Younger, J.G. et al., 2001. J. Appl. Physiol. 90, 2289-2295（非特許文献2)）。この化合物の治療的恩典はまた、CVFに対する抗体応答のために、慢性疾患の治療において最終的に有用となるためには短命すぎる可能性が高い。理想的な抗補体治療法とは、補体除去においてCVFと同程度に有効であるが、宿主に投与したときにより毒性が低く、より抗原性が少ないものである。アストロウイルスコートタンパク質およびその誘導体は、CVFに匹敵する程度に補体カスケードタンパク質を調節することができ、それにより補体媒介性組織損傷の治療または予防および補体関連疾患の緩和のために有用である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】B. P Morgan and C.L. Harris, 2003. Molec. Immunol. 40, 159-170
【非特許文献２】Younger, J.G. et al., 2001. J. Appl. Physiol. 90, 2289-2295
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、ウイルスコートサブユニット、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質、およびコートタンパク質のキメラ誘導体を含む、アストロウイルス科（Astroviridae）ウイルスコートタンパク質およびその誘導体を使用して補体カスケードタンパク質を調節するための方法に関する。本発明の1つの局面では、アストロウイルスコートタンパク質または誘導体は、古典経路タンパク質を調節することによって古典補体経路の溶解過程を阻害するために使用される。本発明のもう1つの局面では、コートタンパク質または誘導体は、代替補体経路タンパク質を調節することによって代替補体経路を引き起こす溶解過程を阻害するために使用される。本発明のこれらの局面では、コートタンパク質または誘導体は、補体カスケードがペプチド複合体形成の終末経路へと進行するのを妨げる。本発明のさらなる態様は、C3コンバターゼ、C3b、C5a、C5b、または膜侵襲複合体もしくはMACとして当技術分野において公知のペプチドの複合体のような補体経路成分の形成を阻害することを含む。当業者は、補体経路の阻害の試験が周知の標準アッセイを通して達成され得ることを認識するであろう。本発明の1つの態様では、アッセイは、感作させた赤血球の溶解を試験するために正常ヒト血清を使用することを含む。本発明のもう1つの態様では、アッセイは、アッセイの結果を古典経路の阻害に関する試験に限定するためにB因子除去血清を使用することを含む。本発明の好ましい態様では、アストロウイルスコートタンパク質またはその誘導体は補体ペプチドC1の成分に結合する。
【０００８】
本発明の他の態様では、該方法は、補体タンパク質の活性を調節するための非感染性ウイルス様粒子（VLP）を提供する。1つの態様では、アストロウイルスコートタンパク質またはその誘導体の多数のコピータンパク質が、典型的には他の非構造ウイルス遺伝子の不在下でのウイルスコートタンパク質の組換え発現を通して、粒子の外表面で発現される。もう1つの態様では、VLPは別のウイルス、たとえばその表面にアストロウイルスコートタンパク質の補体調節部分を提示するフロックハウスウイルスから産生される。本方法はさらに、補体の調節および補体関連疾患の治療のための、アストロウイルスコートタンパク質に由来するペプチドの使用を開示する。
【０００９】
本発明のもう1つの局面は、補体カスケードタンパク質を調節する際の野生型アストロウイルスビリオンまたはそのコートタンパク質の精製に関する。標準ウイルス精製手法を使用して、野生型アストロウイルス粒子を精製し、補体の調節、阻害、または除去能力に関するさらなる分析と試験のために使用し得る。
【００１０】
本発明のもう1つの局面は、アストロウイルスコートタンパク質または誘導体の組換え産生に関する。当業者は、組換えタンパク質の産生のために多くの選択肢が存在し、これらの方法が、過度の実験を必要とせずに多量のウイルスコートタンパク質を産生するために適合され得ることを認識するであろう。本発明の好ましい態様では、組換えアストロウイルスタンパク質はバキュロウイルス系で産生される。もう1つの態様では、組換えタンパク質は大腸菌（E.coli）で産生される。なおさらなる態様では、タンパク質は酵母細胞で産生される。これらの場合の各々において、そのようにして産生された組換えコートタンパク質は、産生細胞から採集され、標準タンパク質手法によって精製される。当業者は、哺乳動物細胞を含む広範囲の真核細胞発現系がタンパク質の組換え産生のために使用可能であることを認識するであろう。組換え分子手法についての推奨される参考文献は、参照により本明細書に組み入れられる、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rdEd., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)である。同様の参考文献は当業者に周知であり、慣例的組換え分子生物学プロトコールの説明のために容易に使用可能である。
【００１１】
本発明のさらなる態様は、アストロウイルスコートタンパク質または誘導体に融合した2番目のタンパク質の領域を含む組換えタンパク質の産生を含む。そのような融合タンパク質またはキメラタンパク質は、コートタンパク質を抗体または抗体フラグメントに連結することによって補体を調節し、レシピエントにおける特異的標的部位での補体関連組織損傷を低減するために使用され得る。
【００１２】
もう1つの態様では、本発明はさらに、補体媒介性組織損傷および疾患を治療するためのアストロウイルスコートタンパク質またはその誘導体の使用を対象とする。補体媒介性組織損傷は、しばしば自己免疫疾患および炎症性病変を伴う他の疾患に結びつく。アストロウイルスコートタンパク質または誘導体は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、溶血性貧血、膜性増殖性糸球体腎炎、血清病、成人呼吸窮迫症候群、虚血再灌流障害（たとえば卒中または心筋梗塞）、同種移植または異種移植（超急性拒絶反応および移植片対宿主病を含む）、アルツハイマー病、熱傷、血液透析損傷、心肺バイパス損傷、発作性夜間血色素尿症、および補体媒介性組織損傷に関連する他の疾患の治療において有用であり得る。さらなる用途は、シチメンチョウアストロウイルス感染のような動物疾患を治療するための獣医学適用を含む。
【００１３】
もう1つの態様では、本発明は、ヒトまたは動物におけるアストロウイルス感染に対するワクチンを作製するために、コートタンパク質またはその誘導体もしくはVLPを産生することによってアストロウイルスコートタンパク質を単離し、精製するための方法を対象とする。
【００１４】
本発明は、少なくとも1つのアストロウイルスコートタンパク質またはその誘導体、および一つまたは複数の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。1つの態様では、組成物は、治療的有効量のアストロウイルスコートタンパク質またはその誘導体を含む。もう1つの態様では、組成物は、補体媒介性組織損傷に関連する少なくとも1つの疾患の治療に有効な少なくとも1つの他の有効成分を含む。
【００１５】
本発明はまた、本発明の薬学的組成物をその必要のある動物に投与する工程を含む、補体媒介性組織損傷に関連する疾患を予防するまたは治療する方法を提供する。1つの態様では、本発明の薬学的組成物は、単独活性薬剤として投与される。もう1つの態様では、問題の疾患を予防するまたは治療するために有効な一つまたは複数の付加的な治療薬剤または予防薬剤と組み合わせて使用される。この局面では、本発明の方法は、補体媒介性組織損傷に関連する少なくとも1つの疾患の治療に有効な一つまたは複数の付加的な治療薬剤または予防薬剤の前に、それと同時に、および/またはその後に本発明の薬学的組成物を投与する工程を含む。
【００１６】
特記しない限り、本明細書において使用されるすべての技術および学術用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において述べるものと類似または等価の方法および材料が本発明の実施または試験において使用できるが、適切な方法および材料を以下で述べる。本明細書において言及されるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。加えて、材料、方法および実施例は単なる説明であり、限定を意図されない。
【００１７】
本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明、添付の図面、および添付の特許請求の範囲から明白である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
（表１）完全に配列決定されたコートタンパク質遺伝子を有するアストロウイルス科のメンバーのリストである。太字の試料は、本試験において同定されたコートタンパク質配列を示す；識別記号およびGenBankアクセッション番号は、どちらも各々の単離物について提示されている。略語：HAstV、ヒトアストロウイルス；FAstV、ネコアストロウイルス；MAstV、ミンクアストロウイルス；PAstV、ブタアストロウイルス；OAstV、ヒツジアストロウイルス；ANV、鶏腎炎ウイルス；TAstV、シチメンチョウアストロウイルス。
（表２）HAstV血清型1〜4に関するRBC溶解アッセイの結果を要約する。
【図１】補体活性化の3つの経路の概略である。主要タンパク質因子およびそれらのエフェクター機能が示されている。
【図２】HAstV-1コートタンパク質に関するRBCアッセイの結果を表すグラフである（n＝3）。
【図３】HAstV-1ビリオンに関するRBCアッセイの結果を表すグラフである（n＝5）。
【図４】非感染細胞培養培地に関するRBCアッセイの結果を表すグラフである（n＝3）。
【図５】RBC溶解へのHAstV-1ビリオンの抑制作用を表すグラフである。
【図６】CVFとHAstV-1のRBC溶解の比較時間経過を示すグラフである（n＝3〜5）。
【図７】HAstV-1ビリオンおよびCVFによる古典補体活性化経路の阻害を試験するために使用したRBCアッセイの結果を表すグラフである（n＝3）。
【図８】NHSと比較してHAstV-1コートタンパク質による古典補体活性化経路の阻害を試験するために使用したRBCアッセイの結果を表すグラフである（n＝3）。
【図９】HAstV-1ビリオン、非感染細胞培養培地およびCVFによる代替補体活性化経路の阻害を試験するために使用したRBCアッセイの結果を表すグラフである（n＝3〜5）。
【図１０】HAstV-1ビリオンによる代替補体活性化経路の阻害を試験するために使用したRBCアッセイの結果を表すグラフである（n＝3）。
【図１１】図11Aは、C1q、C1rおよびC1sを負荷し、クマシーブルー染色して非還元条件下で泳動させた7.5％SDS-PAGEゲルの画像である。図11Bは、C1q、C1rおよびC1sを負荷し、非還元条件下で泳動させて、野生型HAstV-1コートタンパク質でプローブした、7.5％SDS-PAGEゲルから移したニトロセルロースブロットの画像である。
【図１２】図12A〜Eは集合的に、HAstV-1コートタンパク質が補体タンパク質C1qに結合することを示す一連の例証パネルである。図12Aは、非還元7.5％SDS-PAGEゲルに負荷し（煮沸せず）、電気泳動させて、ニトロセルロース膜に移し、HAstV-1コートタンパク質でプローブして、HAstV-1ビリオンに対する一次抗体およびHRP結合二次抗体と共にインキュベーションした、部分精製補体C1因子および精製補体C2、C3およびC4因子を使用した免疫ブロットの画像である。図12Bは、HAstV-1コートタンパク質プローブを使用していない図12Aにおけるのと同じ免疫ブロット法の画像である。図12Cは、還元緩衝液に負荷し、煮沸して、12％ SDS-PAGEゲル上で電気泳動させ、その後HAstV-1コートタンパク質と共にインキュベーションして、図12Aにおけるように視覚化した、BSA、C1 、C1q、C1rおよび C1sを使用した免疫ブロットの画像である。図12Dは、ストリッピングし、C1q、C1rおよび C1sに対するポリクローナル抗体で再ブロットした後の、図12Cに示したのと同じブロットの画像である。図12Eは、HAstV-1コートタンパク質プローブを使用していない、図12Cにおける実験の二つ組のブロットの画像である。
【図１３】図13A〜Eは、HAstV-1コートタンパク質精製手順を分析し、コートタンパク質による自発的オリゴマー化を明らかにする実験からの、SDS-PAGEゲル（A、CおよびE）および免疫ブロット（BおよびD）の画像である。
【図１４】図14Aは、NHS単独、NHSプラスHAstV-1コートタンパク質、またはNHSプラスCVFにおけるiC3b産生の比較を示す免疫ブロットの画像である。図14Bは、NHS単独、NHSプラスHAstV-1コートタンパク質、またはNHSプラスCVFで産生されたiC3bの量（ng/mL）を定量したELISAの結果を示すグラフである。図14Cは、NHS単独、NHSプラスHAstV-1コートタンパク質、またはNHSプラスCVFで産生されたSC5b-9の量（ng/mL）を定量したELISAの結果を示すグラフである。
【図１５】図15Aは、RBC溶解アッセイにおける外因性C1タンパク質の添加によるHAstV-1コートタンパク質の補体溶解阻害の逆転を示すグラフである。図15Bは、NHS単独、NHSプラスHAstV-1コートタンパク質（外因性C1の添加を伴うまたは伴わない）、またはNHSプラスCVF（外因性C1の添加を伴うまたは伴わない）を有する試料においてザイモサンへのC3沈着（ng/mL）を定量するためのELISAの結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明は、アストロウイルス科のウイルス由来のコートタンパク質およびその誘導体の使用を通して補体カスケードタンパク質を調節するための方法を提供する。本発明は多数の用途と利点を有する。アストロウイルスコートタンパク質は、ヒトおよび動物の両方における様々な病変において補体媒介性疾患を治療するまたは補体媒介性組織損傷を軽減するために使用され得る。
【００２０】
アストロウイルスコートタンパク質
アストロウイルスキャプシド生物学に関する現在の知識の総説については、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、「Identification of structural domains involved in astrovirus capsid biology」(Viral Immunology 18(1): 17-26, 2005)と題された総説を参照されたい。簡単に説明すると、アストロウイルス科は、一本鎖のメッセンジャーセンスRNAゲノムを有するエンベロープを持たない正二十面体ウイルスのファミリーを構成する。これらのウイルスは哺乳動物および鳥類の両方に感染し、幼児における胃腸炎、ならびに、シチメンチョウにおける致死的ウイルス性敗血症を含む他の動物および鳥類における疾患の重要な原因となる。本発明は本明細書において、たとえば多量のコートタンパク質（およびコートタンパク質欠失突然変異体）を昆虫細胞における組換えバキュロウイルス発現系を使用して精製することができるインビトロ集合系のための方法を開示する。他の組換え手法も、コートタンパク質または誘導体の産生のために考慮される。哺乳動物組織培養において産生されるHAstV-1または他のビリオンのような感染性アストロウイルスも使用され得る。
【００２１】
補体系
補体系は、活性化されると極めて破壊的な免疫カスケードをもたらす、関連血漿タンパク質の群を含む。補体系は、孔形成（すなわち膜侵襲複合体または「MAC」の形成）による細菌および感染細胞の溶解、白血球による取り込みと破壊を導くオプソニン作用（免疫標識）、白血球の活性化、感染部位への白血球の誘導、Bリンパ球応答の刺激、および抗体産生を含む多種多様な方法によって感染に対抗する。補体系は、3つの公知の経路：古典経路、代替経路、およびマンナン結合レクチン経路によって活性化される（図1参照）。各々が、指数的に増幅するタンパク質-タンパク質反応カスケードを生じさせ、これは、極めて堅固な免疫応答へと至る。補体は、細菌および一部のエンベロープを持つウイルスのような病原生物に対する生体宿主防御機構であるが、その抑制されない活性化は深刻な宿主細胞損傷を引き起こし得る。補体によって媒介される宿主組織損傷は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、膜性増殖性糸球体腎炎、および血清病のような自己免疫疾病を含む多種多様な疾患に関係づけられてきた。また、以下の疾患：成人呼吸窮迫症候群（ARDS）、卒中（虚血再灌流障害）、心筋梗塞（虚血再灌流障害）、同種移植および異種移植（超急性拒絶反応および移植片対宿主病）、アルツハイマー病、熱傷、血液透析損傷、心肺バイパス損傷、および発作性夜間血色素尿症の病因に寄与すると同定された。
【００２２】
従って、本発明は、補体カスケードタンパク質に関連する組織損傷を緩和するためにアストロウイルス科のウイルス由来のコートタンパク質またはその誘導体を使用することに関する。いかなる特定の機構論によっても拘束されることを意図しないが、コートタンパク質は、典型的には抗原への抗体結合、次いでC1タンパク質およびそのフラグメントによって開始される古典補体経路、または典型的にはC3タンパク質およびそのフラグメントによって開始される代替経路のいずれかを除去または阻害し得る。
【００２３】
本明細書において、「アストロウイルス」という用語は、ウシ、ネコ、ヒト、ヒツジ、ブタおよびミンクアストロウイルスのような哺乳動物アストロウイルス種、またはニワトリ、シチメンチョウおよびアヒルアストロウイルスを含む、鳥類を含むがそれらに限定されるわけではないアストロウイルス科の任意のメンバーを指す（表1）。
【００２４】
（表１）
2009539980.tif 000002
【００２５】
「コートタンパク質」という用語は、無傷または集合アストロウイルスタンパク質コートあるいはそのサブユニット、前駆体タンパク質、エピトープ、単量体、二量体、三量体、オリゴマー、ポリペプチド、またはペプチドを含むがそれらに限定されるわけではない、アストロウイルスキャプシドの成分を指す。
【００２６】
「誘導体」という用語は、単離コートサブユニット、切断または欠失突然変異体、置換突然変異体、キメラタンパク質、融合タンパク質、またはアストロウイルスコートのエレメントの全部もしくは部分を含む他のタンパク質のようなアストロウイルスコートタンパク質の部分領域または修飾型であり、その誘導体が補体カスケードタンパク質活性を調節することができる、野生型ウイルスから精製されたかまたは組換え産生された、アストロウイルスコートの成分を指す。
【００２７】
「補体カスケード」および「補体タンパク質」という用語は、当業者に認識されるように、古典補体経路、代替補体経路またはマンナン結合レクチン補体経路におけるC1q、C1r、C1s、C4a、C4b、C2a、C2b、C3a、C3b、B因子、Ba、Bb、C3コンバターゼ、C5コンバターゼ、D、プロペルジン、C5a、C5b、C6、C7、C8、C9またはそれらの組合せを含むがそれらに限定されるわけではない、補体タンパク質C1-C9およびそのサブユニットを指す。
【００２８】
「阻害」という用語は、個別にまたは複合体中での、酵素、タンパク質、ペプチド、因子、副生成物もしくはその誘導体の生物学的機能の低下；インビボもしくはインビトロでの生体タンパク質、ペプチドもしくはその誘導体の量の減少；または、関連する一連の生物学的反応または化学反応を含むことが公知の事象、カスケードまたは経路の生物学的連鎖の遮断を指す。従って、阻害という用語は、たとえば対照試料と比較した補体カスケードの単一成分の量の減少、成分もしくは成分の複合体の形成の速度もしくは総量の低下、または細胞溶解、コンバターゼ酵素の形成、補体由来の膜侵襲複合体の形成、炎症もしくは炎症性疾患のような結果を導く生物学的反応の複合過程もしくはシリーズの全体的活性の低下を表すために使用され得る。インビトロアッセイでは、「阻害」の用語は、何らかの生物学的または化学的事象の測定可能な低下を表し得るが、当業者は、測定可能な低下がすべて「阻害性」である必要はないことを認識するであろう。
【００２９】
ウイルスコートタンパク質の産生
アストロウイルスコートタンパク質およびその誘導体の産生または単離のための数多くの供給源が当技術分野において広く理解されている。ウイルスコートタンパク質精製手法の例は、ショ糖勾配沈降ならびにサイズ排除に基づいてウイルス粒子を精製し得る分離カラム、親和性結合、イオン交換、疎水性相互作用（HIC）、または他の手段の使用を含む。一部の場合、修飾コートタンパク質または誘導体タンパク質は、カラムを用いて均一に精製することが困難であり得る。これらの状況において、当業者は、電気泳動とそれに続くゲルからの溶出および回収のような選択的精製方法が、精製ウイルスコートタンパク質の調製のための選択的手段であることを認識するであろう。
【００３０】
本発明のもう1つの局面では、アストロウイルスコートタンパク質を産生するために組換え技術を使用し得ることが考慮される。本発明のこの局面の好ましい態様では、組換えバキュロウイルスがインビトロでのウイルスコートタンパク質産生のために使用される。バキュロウイルス保存液を生成するために、Sf9、Sf21、またはTini/High5昆虫細胞がこの手法において一般的に使用され、バキュロウイルス保存液はその後産生細胞に感染させるために使用され、次に産生細胞が組換えコートタンパク質を生成する。そのような手法またはその変法を使用することは、組換え突然変異体、キメラタンパク質、融合タンパク質およびウイルス様粒子に加えて野生型アストロウイルスコートタンパク質の大規模産生を可能にする。HAstV-1（Newcastle）完全長コートタンパク質Ac_1-787、欠失突然変異体Ac_l-415および欠失突然変異体 Ac_416-787の産生と精製のための方法を本明細書において以下で例として提供する。他の変異型のコートタンパク質突然変異体も同様に産生し、同様の方式で精製し得る。
【００３１】
「ウイルス様粒子」（VLP）という用語は、組換え手段によって、またはアストロウイルスコートタンパク質エピトープもしくは領域を粒子表面に多価的に提示する他のウイルス由来のVLPと併せたキメラ技術の使用を通して産生され得る、非感染性ウイルス粒子またはキャプシドを指す。
【００３２】
本明細書において、「キメラ」または「融合」コートタンパク質という用語は、抗体または抗体フラグメントのような2番目のポリペプチドまたはタンパク質由来の少なくとも1つの領域に加えてアストロウイルスコートタンパク質の構成ポリペプチド、成分または領域を含む、補体カスケード因子を阻害するまたは除去することができる任意の組換えタンパク質を含むことが意図されている。
【００３３】
本発明のもう1つの態様では、組換えアストロウイルスコートタンパク質またはその誘導体の産生は、当業者に認識されるように標準組換え遺伝子手法を用いて大腸菌においておこる。そのようにして産生されたアストロウイルスコートペプチド、ポリペプチド、領域または全タンパク質は、その後、前記で論じたようにショ糖勾配、カラムまたは同様の装置で精製される。組換えタンパク質の産生は、同様に宿主細胞への組換えDNAの導入、次いで増殖、溶解、および関心対象のタンパク質の精製を含む、酵母細胞のような他の系に容易に適合可能であることが、当業者に認識されるであろう。
【００３４】
アストロウイルスコートタンパク質による補体媒介性溶解の阻害
本明細書において開示される本発明は、一例として、アストロウイルス科のメンバーであるHAstV-1のコートタンパク質が補体媒介性細胞溶解を阻害する際のCVFと同程度に有効であることを明らかにする。アストロウイルス科のメンバーの間での構造的類似性に鑑みて、ヒト株HAstV-2からHAstV-8、ウシ、ブタ、ヒツジ、ネコ、ミンクのような他の哺乳動物株のアストロウイルス、ならびにニワトリ、シチメンチョウおよびアヒルアストロウイルスのような家禽株由来のコートタンパク質またはその誘導体は、同じく抗補体活性を有するとして本明細書において考慮される。表1は、これまでに完全に配列決定されたアストロウイルス科のメンバーの非限定的なリストを提供する。
【００３５】
HAstV-1または他のアストロウイルスコートタンパク質の補体除去または阻害活性をCVFと比較するために、以下の実施例で述べるような一連の細胞溶解実験においてアストロウイルスコートタンパク質を試験することは有益である。赤血球は、赤血球溶解を測定することによって血清中の補体の活性化を調べるための感受性のある特異的方法である。従って、アッセイにおける溶解細胞のパーセンテージの測定は、実験試料、典型的にはヒト正常血清（NHS）における補体活性化の最も近い測定である。補体媒介性溶解を阻害するための本明細書において開示する方法は、効果において、本来は最も強力な補体除去物質であるCVFに匹敵する。RBCの補体媒介性溶解の阻害は、精製コートタンパク質だけでなく無傷HAstV-1ビリオンにも適用できる。従って、本発明のもう1つの態様では、無傷アストロウイルスビリオンまたはウイルス様粒子が、血漿から補体カスケードタンパク質を除去するために使用される。CVFと比較すると、HAstV-1ビリオンおよび精製コートタンパク質は同レベルの補体抑制を示すが、本明細書において提示するデータは、アストロウイルスビリオンおよびコートタンパク質が、CVFによって示される補体因子の活性化とその後の除去とは異なり、阻害機構を通して血清中の補体活性を抑制するように働くことを明らかにする。
【００３６】
野生型アストロウイルスコートタンパク質はコートタンパク質が保存される緩衝液中で三量体（およびおそらくその他のより高次のオリゴマー）にしばしばオリゴマー化することに留意することが重要である。そこで、本発明の1つの局面では、補体媒介性溶解に関する赤血球アッセイにおけるコートタンパク質は、二量体、三量体またはより高次のオリゴマーであることが意図される。コートタンパク質はカルシウムイオンに曝露されると沈殿することがあるが、これは、マグネシウムではより低い程度で起こり、EDTA/NaClでは全く起こらない作用である。多くの正二十面体キャプシドは構築のためにカルシウムイオンを必要とするので、これらの観察は初期ウイルス様粒子集合を示していると考えられる。本明細書において述べるRBC溶解アッセイはカルシウムイオン（150μM）を含み、従って、観察されたコートタンパク質サブユニットの自己集合と一致する。
【００３７】
タンパク質コートサブユニットと補体成分の間の相互作用
本明細書において開示される本発明の使用を最適化するための検討の重要な領域は、特異的補体成分とアストロウイルスコートタンパク質の間の相互作用を同定することである。これは、たとえば、一般に補体タンパク質の電気泳動ゲル分離とそれに続く膜への転移および精製コートタンパク質によるプロービングを含む、以下で例として述べる改変ウイルスオーバーレイブロット法の使用を通して達成され得る。このアプローチではいくつかの注意点を念頭に置かねばならない。第一に、補体タンパク質C2、C3およびC4は高度精製調製物として容易に入手可能であるが、C1タンパク質複合体は、非常に不安定な複合体でありたやすく壊れてしまうという事実のためにはるかに精製が困難であることを、当業者は認識するであろう。結果として、通常、他の血清タンパク質がC1調製物中に存在する。しかし、C2、C3、C4およびC5などの他の補体因子を含まず、抗補体抗体による常套的バッチ検査を必要としないC1調製物は、一般に、他の補体因子による大部分の交差汚染を予防するのに十分である。
【００３８】
複合体分子であるC1qは電気泳動の間にいくつかのフラグメントに分離するが、C1rおよびC1sは、非還元ゲルにおいてはホモ二量体として移動する。これらのアッセイにおけるアストロウイルスコートタンパク質の結合はホモ二量体に特異的であり得る；当業者は、還元条件下で泳動させた同じタンパク質調製物が、コートタンパク質が単量体に結合できないためまたは調製物中の単量体の濃度が検出可能レベルより低いために、全く結合を反映しないことがあり得ることを認識する。
【００３９】
製剤化および投与
本発明は、少なくとも1つのアストロウイルスコートタンパク質またはその誘導体、および一つまたは複数の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤は、使用される用量および濃度ではレシピエントに対して非毒性である。それらは、固体、半固体または液体であり得る。従って、本発明の薬学的組成物は、錠剤、丸剤、粉末、ロゼンジ、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル、懸濁液、乳剤、溶液またはシロップの形態であり得る。
【００４０】
薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤の一部の例は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、滅菌水、シロップおよびメチルセルロースを含む。本発明の薬学的組成物は、当技術分野で公知の手順を用いることにより、投与後に有効成分の即時、持続または遅延放出を提供するように製剤化され得る。
【００４１】
本発明の薬学的組成物は、適切な純度を有するアストロウイルスコートタンパク質または誘導体を薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と混合することによって調製される。そのような調製物を調製するための処方および方法の例は当技術分野において周知である。たとえば参照により本明細書に組み入れられる、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition (1995)参照。
【００４２】
本発明の薬学的組成物は、上記で述べたような様々な障害および疾患のための予防および治療薬剤として有用である。1つの態様では、組成物は、治療的有効量のアストロウイルスコートタンパク質またはその誘導体を含む。もう1つの態様では、組成物は、補体媒介性組織損傷に関連する少なくとも1つの疾患の治療に有効な少なくとも1つの他の有効成分を含む。「治療的有効量」という用語は、本明細書において、有意義な患者の利益を示すのに十分な各有効成分の総量を指す。
【００４３】
アストロウイルスコートタンパク質または誘導体の治療的有効量は、治療される状態、状態の重症度、投与の時間、投与経路、使用される化合物の排出率、治療期間、含まれる併用療法、ならびに患者の年齢、性別、体重および状態等のような因子に依存して異なる。治療的有効量を決定することは十分に開業医の技術範囲内である。従って、治療専門家は、最大治療効果を得るための必要に応じて用量を調節し、投与経路を変更することが必要であり得る。
【００４４】
そのような指針の下で、有効1日用量は、一般に約0.001〜約100 mg/kg体重、好ましくは約0.01〜50mg/kg、より好ましくは約0.1〜20mg/kgの範囲内である。これは、1日1〜6回の投与レジメンを通して達成され得る。あるいは、より少ない頻度の投与レジメンでの持続放出を通して最適治療が達成され得る。
【００４５】
薬学的製剤は、任意の適切な経路による投与、たとえば経口、経鼻、局所（口腔、舌下または経皮を含む）、または非経口（皮下、皮内、筋肉内、関節内、腹腔内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、病巣内、静脈内、または皮内注射もしくは注入）経路による投与に適合され得る。ヒト投与のためには、製剤は、好ましくはFDA Office and Biologics基準によって求められる滅菌性、発熱性、一般的安全性および純度に合致する。
【００４６】
併用療法
本発明はまた、本発明の薬学的組成物をその必要のある動物に投与する工程を含む補体媒介性組織損傷に関連する疾患を予防するまたは治療する方法を提供する。本発明の薬学的組成物は単独活性薬剤として投与することができるが、それらはまた、問題の疾患を予防するまたは治療するために有効な一つまたは複数の付加的な治療薬剤または予防薬剤と組み合わせて使用できる。この局面では、本発明の方法は、補体媒介性組織損傷に関連する少なくとも1つの疾患の治療に有効な一つまたは複数の付加的な治療薬剤または予防薬剤の前に、それと同時に、および/またはその後に本発明の薬学的組成物を投与する工程を含む。
【００４７】
たとえば本発明の薬学的組成物は、単独でまたは非ステロイド系抗炎症薬（NSAID）、コルチコステロイドまたは疾患修飾性抗リウマチ薬（DMARD）と組み合わせて、関節リウマチを治療するために使用できる。
【００４８】
NSAIDの例は、サリチル酸塩（アスピリン、アモキシプリン、ベノリラート、サリチル酸コリンマグネシウム、ジフルニサル、フェスラミン（Faislamine）、サリチル酸メチル、サリチル酸マグネシウムおよびサリチル酸サリチル（サルサラート）など）、アリールアルカン酸（ジクロフェナク、アセクロフェナク、アセメタシン、ブロムフェナク、エトドラク、インドメタシン、ケトロラク、ナブメトン、スリンダクおよびトルメチンなど）、2-アリールプロピオン酸（イブプロフェン、カルプロフェン、フェンブフェン、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、ケトプロフェン、ロキソプロフェン、ナプロキセン、チアプロフェン酸およびスプロフェンなど）、N-アリールアントラニル酸（メフェナミン酸およびメクロフェナミン酸など）、ピラゾリジン誘導体（フェニルブタゾン、アザプロパゾン、メタミゾール、オキシフェンブタゾンおよびスルフィンプラゾンなど）、オキシカム（ピロキシカム、ロルノキシカム、メロキシカムおよびテノキシカムなど）、COX-2阻害剤（エトリコキシブ、ルミラコキシブおよびパレコキシブ）、ニメスリドなどのスルホンアニリド、ならびにリコフェロンおよびω3脂肪酸などの他の薬剤を含む。
【００４９】
コルチコステロイドの例は、トリアムシノロン（Aristocort（登録商標））、コルチゾン（Cortone（登録商標）アセテート錠剤）、デキサメタゾン（Decadron（登録商標）エリキシル）、プレドニゾン（Deltasone（登録商標））、およびメチルプレドニゾロン（Medrol（登録商標））を含む。
【００５０】
DMARDの例は、メトトレキサート（Rheumatrex（登録商標））、レフルノミド（Arava（登録商標））、エタネルセプト（Enbrel（登録商標））、インフリキシマブ（Remicade（登録商標））、アダリムマブ（Humira（登録商標））、アナキンラ（Kineret（登録商標））、スルファサラジン（Azulfidine EN-Tabs（登録商標））、抗マラリア薬、金塩、d-ペニシラミン、シクロスポリンA、シクロホスファミドおよびアザチオプリンを含む。
【００５１】
Soliris（商標）（エクリズマブ）は、ヒト化抗C5モノクローナル抗体である。希少な型の溶血性貧血である発作性夜間血色素尿症の治療に関して、FDAによって承認された。1つの態様では、本発明の薬学的組成物は、発作性夜間血色素尿症、心臓病、肺疾患、自己免疫疾患、喘息を治療する際、ならびに移植の補助的ケアにおいて、Soliris（商標）と組み合わせて使用できる。
【００５２】
本発明の薬学的組成物は併用療法において、付加的な薬剤と一緒にまたは別々に、あるいは薬学的組成物と付加的な薬剤を1つの組成物中に組み合わせることによって、投与することができる。投薬および調節は、治療される状態の最大の管理を達成するように行われる。たとえば薬学的組成物と付加的な薬剤の両方が、通常単独療法レジメンにおいて投与される用量の約10〜約150％、より好ましくは約10〜約80％の用量レベルで通常存在する。
【００５３】
遺伝性血管浮腫（HAE）は、低レベルまたは非機能性のC1阻害剤によって引き起こされる非常にまれな遺伝性疾患である。C1阻害剤は生来C1の活性化を調節し、これらの患者における急性浮腫の治療は、C1阻害剤の実質的な注入または血漿輸血を必要とする。アストロウイルスコートタンパク質はC1活性化を機能的にブロックするので、これは潜在的な治療法であり、C1阻害剤は多数の被験者由来のヒト血清から精製されなければならず、従ってヒト血液媒介病原体で汚染されている潜在的可能性があるため、治療上の必要性に応えるものである。アストロウイルスコートタンパク質またはその誘導体の治療的投与は、C1阻害剤との補助治療においてまたは単独治療として、C1を阻害するために潜在的に使用され得る。
【００５４】
実施例
本発明を以下の実施例によってさらに説明する。実施例は説明のためにのみ提供される。それらはいかなる意味においても本発明の範囲または内容を限定すると解釈されるべきではない。
【００５５】
実施例1  細胞系およびウイルス
アストロウイルスコートタンパク質のバキュロウイルス産生のために、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera Frugiperda）細胞（IPLB-Sf21系統）（Vaughn, J.L. et al., 1977. In vitro. 13, 213-217）を、先に述べられているように（Scheneemann, A. et al., 1993. J. Virol. 67, 2756-2763）10％熱不活性化FBSを添加したTC1OO培地で増殖させた。野生型HAstV-1コートタンパク質遺伝子および欠失突然変異体をコードする組換えバキュロウイルスのウイルス保存液を、Sf21細胞を細胞増殖培地において感染多重度（MOI）＝1で感染させ、5〜7日間感染を進行させることによって調製した。感染期間後、細胞デブリを低速遠心機において除去し、培地に含まれるウイルスをプラークアッセイによって力価測定して、4℃で保存した。
【００５６】
感染性アストロウイルス粒子の増殖のために、CaCo-2細胞（J. Fogh and G. Trempe, 1975. New human tumor cell lines. In: Fogh J（ed）Human tumor cell lines in vitro. Plenum, New York, pp 115-159）を、指示に従って（ATCC）10-20％熱不活性化FBSを添加した最小必須培地において増殖させた。HAstV-1の細胞適合株（Oxford）（D. K. Mitchell博士, Eastern Virginia Medical School, Norfolk, Virginia, USAの好意により提供された）をCaCo-2細胞において増殖させた（Willcocks, MM. et al., 1990. Arch. Virol. 113:73-81）。簡単に説明すると、FBSを欠く最小必須培地中の細胞単層を、10μg/mlのトリプシンIX型（Sigma）を含むウイルス接種物で感染させ、ウイルスを37℃で1時間付着させた。接種物を除去し、2μg/mlのトリプシンを含む培地を添加した；細胞を、その後37℃で約48時間インキュベーションした。インキュベーション後、ウイルス懸濁液を、3サイクルの凍結/解凍によって細胞から放出させた。次に細胞デブリを低速遠心機において除去し、ウイルスを含む上清をアリコートに分けて、-80℃で保存した。先に上記のように増殖させた、HAstV-2〜7型の細胞適合株は、D. K. Mitchell博士より提供された。
【００５７】
実施例2  リアルタイム逆転写PCR
HAstV保存液を定量するため、リアルタイムPCR法を開発した。全RNAを単離するため、HAstV-1に感染させたCaCo-2細胞溶解産物40μLを1×細胞必須培地中で1：5に希釈した。次にトリゾール（Invitrogen）を製造者の指示に従って使用してRNAを抽出した。単離後、RNAをDNAse I(Promega)によって37℃で30分間処理し、その後酵素を65℃で10分間不活性化させた。RNAを-80℃で保存した。
【００５８】
iCycler IQ（商標）システム（Bio-Rad）を使用してワンステップリアルタイムRT-PCRを実施した。リアルタイムRT-PCR反応はSuperscript III Platinum Syber Green（登録商標）1-Step qRT-PCRキット(Invitrogen)を用いて構築した。簡単に説明すると、2×Syber（登録商標）Green RT-PCR Reaction Mix 12.5μL、10μMフォワードプライマーORF1a-F1およびリバースプライマーORF1a-R1（HAstVのセリンプロテアーゼ遺伝子の保存された部分を標的とする、最終濃度200nM）の各々0.5μL、ワンステップRT-PCR用のiScript Reverse Transcriptase 0.5μL、滅菌水6.0μLおよび全RNA 5.0μL（上述したように単離した）を含む反応混合物を作製した。反応物を50℃で10分間インキュベーションし、その後95℃で5分間 iScript RTを不活性化させることによってcDNA合成を実施した。PCRサイクリングおよび検出はそれぞれ、95℃で10秒間、55℃で30秒間、および72℃で30秒間のインキュベーション45サイクルを含んだ。融解曲線のために、試料を95℃で1分間、57℃で1分間インキュベーションし、その後、57℃から出発して各々の連続サイクルに関して0.5℃ずつ漸増する、10秒間のインキュベーション80サイクルを実施した。標準曲線を作成するために、HAstV-1についてのゲノム長のcDNAクローン（pAVIC）のT7媒介性インビトロ転写（Ambion）によってRNA標準品を調製した(U. Geigenmuller, et al. 1997. J. Virol. 71, 1713-1717.)。RNA標準品を1010から100まで連続希釈し、各々の希釈について対数表示した（log）初期コピー数に対する限界サイクル数をプロットすることによって標準曲線を確立した。CaCo-2細胞溶解産物に含まれるウイルスRNAの対数表示したコピー数を、次に、標準曲線の方程式、 Y＝ mX＋ b［式中、Y＝限界サイクル数 (CT)、m＝標準曲線の勾配、X＝対数表示した初期コピー数、b＝Y-切片または閾値蛍光値］から推定した。
【００５９】
実施例3  組換えバキュロウイルスの構築
完全長（Ac_l-787）および欠失突然変異体（Ac_l-415およびAc_416-787）のHAstV-1（Newcastle）コートタンパク質遺伝子を含む組換えバキュロウイルスをBacPAKバキュロウイルス発現系キット（Clontech）で作製した。このために、コートタンパク質のcDNAをコードするDNAフラグメント（M. J. Carter博士, University of Surrey, Englandの好意により提供された）（Willcocks, 1994）を、Pfuポリメラーゼ（Stratagene）ならびにPCR産物の5'および3'末端にそれぞれBamHIおよびXbaIを保持するプライマーを用いたPCRによって増幅した。プライマーは、キャプシド遺伝子コード領域全体(aa 1〜787)または aa 1〜415および aa 416〜787に対応する遺伝子セグメントを増幅するように設計した。次に各々のPCR産物をアガロースゲル電気泳動およびGene clean IIキット(Qbiogene)によって精製し、BamHIおよびXbaIで消化して、BamHI/XbaI消化した転移ベクター pBacPAK9に別々に連結した。JM109コンピテント細胞（Promega）の形質転換後、各々の構築物についていくつかのクローンからプラスミドDNAを単離し、診断的制限エンドヌクレアーゼマッピングによって挿入したDNAの存在を測定した。次に、様々なコートタンパク質遺伝子構築物を保持する陽性クローンを、自動塩基配列決定装置においてBig Dye Terminator Sequencing Kit v 3.1（Applied Biosystems）を使用して、挿入したDNA全体にわたって完全に配列決定した。
【００６０】
組換えバキュロウイルスの作製を製造者の指示（Clontech）に従って実施した。簡単に述べると、HAstV-1コートタンパク質構築物を含む転移ベクター pBacPAK9をBsu36I線形化 BacPAK6バキュロウイルスDNAと個別に混合し、Sf21細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの3日後、細胞上清を採集し、Sf21細胞単層上で上清を1回プラーク形成させることによって推定上の組換えウイルスを単離した。個々のプラーク単離物を増幅し、HAstV-1粒子に対するウサギポリクローナル抗体（D. M. Bass博士, Stanford University, USAの好意により提供された）(D. M. Bass and U. Upadhyayula. 1997. J. Virol. 71, 8666-8671)および西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgG二次抗体（Pierce）を使用した感染細胞溶解産物の免疫ブロット分析によって挿入遺伝子の存在と発現を確認した後、力価測定した（Dong XF et al., 1998. J. Virol. 72, 6024- 6033）。増感化学発光によるシグナル検出をVersadoc装置(Bio-Rad)で実施した。
【００６１】
実施例4  組換えタンパク質の合成と単離
50mlの円錐形バイアル中のSf21細胞（2×108）を細胞当たりMOI＝5で組換えバキュロウイルスに感染させた。振とうしながら室温で1時間置いた後、感染細胞を、細胞増殖培地と抗生物質を含むスピナーフラスコに移した。次にスピナーフラスコを27℃で攪拌した。感染の5日後、細胞を低速遠心機においてペレット化し、培地を廃棄した。その後細胞ペレットを必要時まで-20℃で凍結した。
【００６２】
Ac_1-787およびAc_l-415感染細胞から可溶性コートタンパク質を精製するために以下のプロトコールを開発した。異なる指示がない限り、以下の工程はすべて、あらかじめ冷却して置いた緩衝液とプロテアーゼ阻害剤（B. D. Pharmingen）を用いて4℃で実施した。6つの凍結ペレットを2容のTNE（50mMトリス[pH 7.0]、0.1M NaCl、10mM EDTA）緩衝液に各々再懸濁し、3サイクルの凍結/解凍によって溶解した。溶解産物を13,300×gで10分間遠心分離し、上清を廃棄した。コートタンパク質の凝集物を含むペレットを、2％NP-40を含むTNE緩衝液1mlに各々再懸濁し、氷上で30分間インキュベーションした。生じた懸濁液を13,300×gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。各々のペレットをTNM（50mMトリス[pH 7.0]、0.1M NaCl、20mM MgSO4）緩衝液1mlおよび10 mg/ml DNase 1(Sigma)2μlに再懸濁し、室温で30分間インキュベーションして、13,000×gで5分間遠心分離し、その後上清を廃棄した。ピペットチップを用いてペレットをTNE緩衝液1mlに各々再懸濁した。個々のアリコートをこの時点で2本の試験管にプールし、TNE緩衝液中の30％（w/v）ショ糖クッション1 mlを通して、SW50.1Tiローター(Beckman)において4℃で1時間、234,000 ×gでペレット化した。 上清を廃棄し、その後ペレットを注射器と針で解離緩衝液（100 mMトリス[pH 9.0]、0.5M NaCl、100mM尿素、10mM EDTA、5mM DTT）1mlに再懸濁し、-20℃で一晩凍結した。翌日、可溶化したタンパク質を13,300×gで10分間遠心分離し、上清500μlを、プロテアーゼを含まない解離緩衝液中で作製した2つの5〜25％（w/v）ショ糖勾配に負荷し、SW41Tiローター(Beckman)において4℃で16時間、274,000×gで遠心した。遠心分離後、コートタンパク質を、0.75ml/分および0.5分/画分で、ISCO勾配分画器での分画によって採集した。コートタンパク質を含む画分（典型的には画分6〜12）をプールし、100mMトリス [pH 7.0]、500mM NaCl、10mM EDTAに対して4℃で一晩透析した。その後試料を濃縮し（Amicon）、分注して、-80℃で保存した。
【００６３】
Ac_416-787感染細胞から可溶性コートタンパク質を精製するための異なる方法を開発した。Ac_1-787および Ac_1-415と異なり、Ac_416-787細胞由来の組換えタンパク質は可溶性であり、上記のように精製することができなかった。このために、Ac_416-787感染細胞の凍結ペレットを2容のTNE緩衝液に再懸濁し、3サイクルの凍結/解凍によって溶解した。溶解産物を13,300×gで10分間遠心分離し、上清を収集した。上清のアリコートを12％ SDS-PAGEゲル上で泳動させ、組換えタンパク質に対応するバンドを切り出して、ゲルからTNE緩衝液中に溶出した。その後タンパク質を4℃で保存した。
【００６４】
実施例5  強力な補体活性を示すHAstV-1コートタンパク質
コートタンパク質の補体への活性を明らかにした初期実験を図2に示す。このアッセイでは、赤血球（RBC）を抗体で感作し、補体活性化によって溶解を引き起こす正常ヒト血清（NHS）と共にインキュベーションする（図2、NHSカラム）。BSA（ウシ血清アルブミン）は、補体作用を含まない陰性対照タンパク質であり、NHS単独と比較して等しい量のRBC溶解を示す（図2、BSA＋NHSカラム）。コブラ毒因子（CVF）は、補体成分の除去を生じさせる強力な補体活性化因子であり、従ってRBCの溶解を阻害する；ここではCVFを陽性対照として使用する（図2、CVF＋NHSカラム）。漸増量のHAstV-1コートタンパク質をNHSに添加すると、RBC溶解における用量反応は補体活性の低下を示した。コートタンパク質1μgは無視し得る程度の作用であったが、8μgは、NHSによるRBC溶解の＞75％低下を示した（図2、グラフの右側の4つのカラム）。CVFは自然界において認められる最も強力な補体除去成分とみなされているので、コートタンパク質がCVFと同様の程度にRBC溶解を阻害するという事実は特筆すべきである。同様の結果を図10に示しており、これは、12.2μgから19.4μgまでの種々の量のHAstV-1コートタンパク質をNHSに添加した、独立した一組の実験（各々についての平均値を示す、n＝4）を例示する。BSAおよびCVF対照は、同様に、図2に示すものと実質的に同じ結果を生じた。
【００６５】
実施例6  同じく強力な補体活性を示すHAstV-1ビリオン
HAstV-1コートタンパク質は補体活性を有していたが、真正の感染性HAstV-1ビリオンも同様に補体活性に強力に作用するかどうかを調べるため、追加実験を実施した。このために、細胞培養培地中の様々な量のウイルスをNHSに添加した（図3）。予想されたように、NHS単独はRBCを完全に溶解したが、CVFは溶解を強力にブロックした。より多くのウイルスをNHSに添加するほど、用量反応が認められ、70μlのウイルスはCVFと同程度に溶解を阻害した。85μlおよび100μlのウイルスでは、RBC溶解の阻害はCVFを上回った。対照として、この活性がウイルス特異的であることを示すためにNHSを等量の非感染組織培養培地と共にインキュベーションした（図4）。このように、コートタンパク質およびウイルス全体の両方が補体系に強力な作用を示した。図3および図4のデータを、ウイルスゲノムコピー数（×108）を横軸に加えて、図5に並べて提示している。
【００６６】
実施例7  RBC溶解アッセイにおいて類似の動態を示す、HAstV-1ビリオンとCVF
RBC溶解アッセイにおけるアストロウイルスビリオンの活性の動態を特性決定するため、HAstV-1ビリオンとCVFを比較する経時変化を追跡した。HAstV-1粒子とCVFを2％NHSの存在下で0〜60分間インキュベーションした。0、5、15、30および60分後に、アリコートを取り、感作されたRBCに曝露した（平均値を示す、各試料についてn＝3〜5）。図6に示すように、CVFおよびウイルスの両方が、RBC溶解の阻害において類似の動態を示した。上述の図3および図5において示唆されたように、60分後の時点は、この濃度ではウイルスはCVFよりも強力な作用を及ぼし得ることを示唆した。このアッセイはコートタンパク質/ウイルスが相互作用し得る補体因子を同定しないが、データは、コートタンパク質/ウイルスがCVFと同様に補体成分を活性化し、おそらく除去し得ることを示唆する。あるいは、コートタンパク質またはウイルスは、標的細胞の溶解のために必要な下流の補体複合体の形成を阻害し得る。
【００６７】
実施例8  古典経路および代替経路に影響を及ぼすHAstV-1ビリオン
補体系には3つの経路、古典経路（主として抗原：抗体相互作用によって活性化される）、マンナン結合レクチン経路（病原体表面の特異的多糖に結合する）、および代替経路（抗体およびレクチン非依存性）経路が存在する（図1）。図7に示すように、アストロウイルスビリオンは古典経路と特異的に相互作用し、RBC溶解アッセイにおいてB因子除去血清を使用して測定される活性低下を導く。B因子は代替経路活性化に必須であり、古典経路活性の特異的試験を可能にする（図7、B因子除去血清カラム）。CVFと同様に、アストロウイルス粒子はB因子の不在下でRBC溶解を阻害し、このウイルスが古典経路を特異的にブロックするまたは除去することを示した（図7）。図8に例示するようにHAstV-1コートタンパク質に関して同様の結果が得られた（平均値を示す、n＝4）。合わせて考慮すると、これらの結果は、HAstV-1コートタンパク質がNHSに比べてB因子除去血清を使用してより有効に血清中の補体を抑制することを示し、HAstV-1コートタンパク質が代替経路よりも古典経路に対してより強力に作用することを示唆する。レクチン経路もこれらの条件下で活性し得る可能性がある。
【００６８】
HAstV-1コートタンパク質は古典経路に対して劇的な作用を及ぼすが、HAstV-1ビリオンはより低い程度で代替経路に作用する。図9に示すように、代替経路活性化を調べるアッセイにおいて、予想されたようにNHSはウサギRBCを溶解する（NHSカラム）。CVFをNHSに添加すると、溶解は有意に低下する（NHS＋CVFカラム）。ウイルスの存在下では、細胞の溶解は控えめに影響を受ける（NHS＋ウイルスカラム）。陰性対照として、予想されたように細胞培養培地の存在下でNHSは溶解に影響を及ぼさなかった（NHS＋培地カラム）。このアッセイは代替経路の活性化を検出するように設定されるが（すなわちRBCは抗体で感作されない）、NHS中のアストロウイルス抗体の存在は古典経路を潜在的に活性化し得る。これらの所見が代替経路に特異的であるかどうかを確認するため、NHSの代わりにC2除去血清（C2D）を使用した（図9）。このアッセイではNHSからC2を除去することにより、古典経路とレクチン経路がブロックされ、いかなるRBC溶解ももっぱら代替経路活性によるものである。予想されたように、細胞培養培地の不在下または存在下でC2DはRBCを溶解した（C2DおよびC2D＋培地カラム）。CVFとウイルスの両方が、このアッセイにおいて同様のレベルのRBC溶解の阻害を示した。HAstV-1ビリオンが代替経路を阻害する程度は古典経路よりも低いこと、および、ウイルスコートタンパク質が全く異なる機構によって両方の経路をブロックするように機能する可能性があることを、これらの結果は示した。代替経路の利用をさらに試験するため、C2D血清をMg-EGTA-GVBS緩衝液中でウサギRBC単独と共にまたは精製HAstV-1コートタンパク質89μgと共にインキュベーションした（各々についてn＝3）。HAstV-1コートタンパク質はウイルスと同様に代替補体経路を事実上阻害するが（図9）、その作用は、図7および図8において上述したように古典経路への阻害作用に比べてごくわずかであることを、図10に示す結果が実証している。また、多少の代替経路阻害が観察されるが、アストロウイルスビリオンおよびコートタンパク質の作用は代替経路よりも古典経路に対してより有意に阻害性であることを、データは明らかにしている。
【００６９】
実施例9  オーバーレイブロットアッセイ
HAstV-1コートタンパク質が特異的補体因子に結合するかどうかを確認するため、改変ウイルスオーバーレイタンパク質結合アッセイ（VOPBA）アプローチを利用した（Borrow and Oldstone, 1992)。このために、精製補体因子C1、C1q、C1r、C1s、C2、C3およびC4（Comptech）1μgまたは3μgを、1×PBSおよび還元剤を含まない等容量の2×SDS試料緩衝液と混合し、7.5％SDS-PAGEゲルに負荷した。150Vで1時間の電気泳動後、タンパク質をニトロセルロースに転写し、5％NFDM-PBS-0.001% Tween-20中、室温で1時間ブロックした。次に精製WTコートタンパク質をブロットに添加し（約10〜20μg）、1時間インキュベーションした後、ブロットをPBS-0.001％ Tween-20で十分に洗浄した。残りの手順は、上述したような標準免疫ブロット法に従って実施した。
【００７０】
C1調製物において約59kDaのバンドが検出された。補体タンパク質の他の調製物は、ここで例示するものとは異なる条件下で野生型アストロウイルスコートタンパク質または誘導体と相互作用し得ると考えられる。補体タンパク質C1へのHAstV-1コートタンパク質の結合をさらに検討するため、ブロット法のプロトコールを精製C1複合体成分、C1q、C1rおよびC1sに関して反復した。クマシーブルーによる全タンパク質染色を図11Aに示し、ブロット実験についての結果を図11Bに示す。結果は、HAstV-1野生型コートタンパク質が50〜60kDaの範囲内でC1qバンドと相互作用し、C1r成分は80kDaのすぐ上で結合することを示唆する。しかし、その後の実験は、80kDaのバンドが、コートタンパク質プローブの不在下でC1rホモ二量体と非特異的に相互作用するHAstV-1ビリオンに対する一次抗体によって生じた人為産物であることを明らかにした。図12Cのデータが示すように（下記参照）、コートタンパク質はC1qに特異的に結合する。
【００７１】
さらなる実験は、HAstV-1コートタンパク質がオーバーレイブロットアッセイにおいてC1qに結合するという初期所見を確認した。図12Aでは、精製補体因子C1、C2、C3およびC4（Comptech）を、1×PBSおよび還元剤を含まない等容量の2×SDS試料緩衝液と混合し、試料を煮沸せずに7.5％SDS-PAGEゲルに負荷した。150Vで1時間の電気泳動後、タンパク質をニトロセルロースに移し、5％NFDM-PBS-0.01% Tween-20中、室温で1時間ブロックした。次に精製コートタンパク質をブロットに添加し（〜10μg）、1時間インキュベーションした後、ブロットをPBS-0.001％ Tween-20で十分に洗浄した。残りの手順は、HAstV-1ビリオンに対する一次抗体および適切なHRP結合二次抗体を使用して標準免疫ブロット法に従って実施した。図12Bでは、コートタンパク質プローブを使用しなかったことを除き、上記図12Aと同じ実験を実施した。図12Cでは、BSA、C1、C1q、C1rおよびC1s 3μgを、1×PBSおよび還元剤を含まない等容量の2×SDS試料緩衝液と混合し、煮沸して、12％SDS-PAGEゲルに負荷した。次に図12Aにおけるようにオーバーレイブロット法を実施した。図12Dでは、図12Cにおけるオーバーレイブロットを製造者の指針に従ってRestoreウエスタンブロットストリッピング緩衝液（Pierce）でストリッピングし、C1q、C1rおよびC1sに対するポリクローナル抗体（Santa Cruz）、次いで適切なHRP結合二次抗体でプローブした。図12Eは、コートタンパク質プローブを使用しなかったことを除き、図12Cの二つ組のブロットである。
【００７２】
上記実験は、コートタンパク質が、約59kDaで泳動するC1内の何かに結合することを明らかにする。これらの試料は煮沸または還元しておらず、Comptechより購入したC1調製物には他の血清タンパク質が混入しているため、コートタンパク質がC1成分以外の何か、たとえばC1q、C1rまたはC1sに結合した可能性を排除するためにはさらなる実験が必要であった。煮沸し、還元した3つの高度精製C1成分をゲル上で泳動させ、実験を反復した。今回は、C1およびC1qレーンの両方で約34-kDaのバンドが検出された。34kDaバンドはC1qタンパク質のC鎖と一致する。C1qは、十分に酸化され、還元されると、3つの別々の鎖に分解する：A鎖は27.5kDaで泳動し、B鎖は31.6kDaで泳動し、C鎖は34kDaで泳動する（Cooper, N.R., 1985. Adv. Immunol. 37, 151-216）。オーバーレイブロットをストリッピングし、C1q、C1rおよびC1sに対する抗体でプローブした。先のブロットを再プローブしたブロットに対して整列させると、オーバーレイ内のバンドはC1qのC鎖に対応する。図12Aで見られる59kDaのバンドは、図12DのC1qレーン内で見られる二重線バンドの1つに相当する可能性がある。この二重線バンドは、それぞれ54kDaおよび69kDaで泳動する、先に報告された（Cooper, N.R., 1985. Adv. Immunol. 37, 151-216）C-C鎖およびA-B鎖二量体である可能性が最も高い。これらの実験の要旨は、アストロウイルスコートタンパク質がこのインビトロ結合アッセイにおいてC1q鎖と相互作用するということである。
【００７３】
実施例10  溶血性補体活性を抑制する、その他のHAstV血清型
1型以外のHAstV血清型が補体活性に対して同じ作用を示すかどうかを調べるため、血清型1〜4に感染させた等量の細胞溶解産物（各々2.92×108ゲノムコピー）をRBC溶解アッセイにおいて分析し、4つの血清型すべてが同等のレベルの溶血阻害を示した（表2）。これらの所見は、本明細書において報告した補体抑制作用がHAstVの保存された性質であることを示唆する。
【００７４】
（表２）HAstV血清型1〜4に関するRBC溶解アッセイ
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a 感染細胞溶解産物由来の2.92×108ゲノムコピーを、試験した各血清型について使用した。
b n＝3
【００７５】
実施例11  組換えコートタンパク質のオリゴマー化の分析
HAstV-1コートタンパク質精製手順のSDS-PAGEおよび免疫ブロット分析とコートタンパク質の自発的オリゴマー化の証明。図13Aに例示するように、精製手順のショ糖勾配超遠心分離工程からの最初の18画分のアリコートを7.5％SDS-PAGEゲルで分析した。次にゲルをクマシーブルーで染色した。画分の番号をゲルの上部に示し、矢印は勾配の上部から下部への沈降の方向を示す。87kDaコートタンパク質（CP）の泳動が示されている。図13Bでは、HAstV-1ビリオンに対する抗体を使用した同じ勾配画分の免疫ブロット分析。図13Cは、クマシーブルー染色によって分析した精製手順の各々の工程での画分を含むコートタンパク質の7.5％SDS-PAGE分析を示し、図13Dは、同じゲルの免疫ブロット分析である。図13Eでは、ショ糖精製したコートタンパク質のアリコートを、2-メルカプトエタノールの存在下で煮沸するかまたは煮沸せず、7.5％SDS-PAGEゲルで泳動させた。その後ゲルをクマシーブルーで染色した。煮沸されたタンパク質は、非切断コートタンパク質前駆体（単量体、M）の予想質量である約87kDaで泳動し、一方非煮沸試料は、261kDaで泳動すると推定される三量体（T）を表す可能性のある250kDa以上で泳動する。すべてのゲルおよびブロットに関して、分子量マーカー（kDa）を示している。
【００７６】
実施例12  iC3b形成および終末経路の活性化を阻害するHAstV-1コートタンパク質
抗体で感作したヒツジRBCをNHS単独、CVF 1μg、または精製HAstV-1コートタンパク質（CP）76μgと共に37℃で3時間インキュベーションした。図14Aに示すように、各々の反応物のアリコートを煮沸し、還元して、SDS-PAGEゲル上で泳動させ、ニトロセルロースに移して、C3に対するポリクローナル抗体でプローブした。C3α（114kDa）およびβ（75kDa）鎖についての陽性対照を2つのiC3b生成物（65kDaおよび42kDa）と共に示している。これらの結果は、HAstV-1コートタンパク質の存在下でのNHSが有意量のiC3bを生成しないことをさらに示す。iC3bの存在は、C3コンバターゼ形成、すなわち古典経路、代替経路、またはマンノース結合レクチン経路のいずれかの活性化の指標である。図14Bでは、iC3bに対するモノクローナル抗体を使用して、試料に関するiC3b ELISAを実施した。上清の吸光度を405nmで分光光度計において読み取った。標準曲線を利用してiC3bの値（ng/ml）を決定した。データは4つの独立した実験の平均値である。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。これらの結果は、コートタンパク質の存在下でのNHSが有意量のiC3bを生成しないことをさらに確認する。通常NHSはiC3bを自発的に産生する（「チックオーバー（tickover）」として知られる過程である）ので、NHS単独の添加よりもコートタンパク質の添加によってさらに一層少ないiC3bが生成されるという所見は注目に値する。同じ3つの試料のアリコートを、SC5b-9に対するモノクローナル抗体を使用したSC5b-9 ELISAに供した。上清の吸光度を405nmにおいて分光光度計で読み取った。図14Cに示すように、標準曲線を利用してSC5b-9の値（ng/ml）を決定した。データは4つの独立した実験の平均値である。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。図14CのELISAのデータは、終末補体複合体（あるいは膜侵襲複合体または「MAC」としても知られる）が、アストロウイルスコートタンパク質の存在下では形成を完全に阻害されることを明らかにする。全体として見るとこれらの所見は、アストロウイルスコートタンパク質が、CVFによって媒介される補体除去とは異なる機構で補体系を阻害することを示す。コートタンパク質がC3の上流で系を阻害し得るという事実は、C3aおよびC5aアナフィラトキシンの形成ならびにMAC形成を阻止するので、重要である。補体カスケードのそれらの生成物の阻止は、それらが、CVFと異なって、カスケードを活性化することができないため、コートタンパク質の治療的価値を大きく上昇させる。
【００７７】
実施例13  HAstV-1によるC3の溶血活性およびザイモサンへの沈着の阻害を逆転させる、外因性C1
HAstV-1による補体媒介性溶解の阻害におけるC1の役割をさらに定義するため、HAstV-1の溶血活性の阻害を外因性C1の添加による可逆性に関して試験した。NHSをコートタンパク質（CP）47μgまたはCVF 1μgと共に37℃で1時間インキュベーションした。CP 47μgは、約50％のRBC溶解を達成するために使用した。インキュベーション後、C1 10μl（〜1mg/ml）またはBSA 10μl（1mg/ml）を、図15Aに示すような指示試料に添加した。同時に、RBCをすべての試料に添加した。ヘム溶解をNHS単独について100％に標準化した。「HI-NHS」は、熱不活性化NHSの使用を示す。RBC溶解アッセイからのデータは、4つの独立した実験からの結果の平均値である。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。図15Bでは、NHS 20μlを、（i）GVBS--緩衝液  50μl、単独でインキュベーション、（ii）コートタンパク質67μg（50μl）、またはGVBS++緩衝液49μl中CVF 1μgのいずれかに添加した。GVBS++緩衝液を使用してすべての容量を1mlにし、37℃で1時間インキュベーションした。インキュベーション後、C1 15μl（〜1mg/ml）を指示試料に添加し、その後ザイモサン25μlをすべての試料に添加した。37℃で10分間のインキュベーション後、試料をGVBS++緩衝液中で2回洗浄し、37℃の水浴中で1時間、25mMメチルアミン30μlで処理した後、遠心沈降させ、上清を収集した。C3に対するポリクローナル抗体を使用して試料に関するC3 ELISAを実施した。上清の吸光度を405nmで分光光度計において読み取った。標準曲線を利用してC3の値（ng/ml）を決定した。データは4つの独立した実験の平均値として提示している。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。
【００７８】
図15Aでは、HAstV-1コートタンパク質の量を、50％RBC溶解を達成するために必要な量に滴定した（titered）。C1タンパク質を混合物に戻すと、溶血活性は完全に回復された。これに対し、BSA、CVF、又は熱不活性化NHSを戻すことによる溶血活性の回復は起こらない。図15Bでは、図15Aに提示したC1を戻したときのデータが、異なるアプローチを用いて確認された。この実験ではNHSをザイモサンに添加するが、これは、血清中の補体を活性化し、ザイモサンへのC3の沈着を導く。次にメチルアミンを使用してC3をザイモゲンから除去し、C3レベルをELISAによって検定する。コートタンパク質の存在下では、予想されたようにC3の沈着はごくわずかしか存在しない。C1を戻す場合にはより多くのC3が存在し、コートタンパク質の作用が打破されたことを示す。逆に、CVFへのC1の添加は有意な作用を及ぼさない。図15Aと15Bに示す実験を合わせると、HAstV-1コートタンパク質がC1複合体との相互作用を通して補体活性化の古典経路を阻害することが示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年3月5日(2009.3.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本明細書に記載された研究は、少なくとも部分的に、NIH助成金番号1R21 AI 608734の援助を受けたものである。米国政府は本発明において一定の権利を有しうる。
関連出願  本出願は、米国特許法第119上の下で、 2006年6月15日出願の米国出願第60/813,685号の優先権を主張する。
【国際調査報告】
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