(57)【要約】  本発明は、皮膚の酸化還元状態を測定する電気化学的装置であって、好ましくは微小電極である少なくとも１つの作用電極と、対極と、参照電極とを備え、前記電極全てが、各電極を検査される皮膚の表面に同時に接触させられるように、単一の支持体中に固定されており、前記電極が、一方では、ポテンシオスタットのような、所定の電圧を作用電極と参照電極の間に印加する手段に接続され、他方では、酸化還元種の検出によって作用電極で発生する電流の強度を測定する装置に接続されている電気化学的装置に関する。本発明はまた、皮膚の酸化還元状態を測定する方法にも関する。
2009521295.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚の酸化還元状態を測定する電気化学的装置であって、
少なくとも１つの作用電極と、
対極と、
参照電極と
を備え、
前記電極全てが、各電極を検査される皮膚の表面に同時に接触させられるように、単一の支持体中に固定されており、
前記電極が、一方では、ポテンシオスタットのような、所定の電圧を作用電極と参照電極の間に印加する手段に接続され、他方では、酸化還元種の検出によって作用電極で発生する電流の強度を測定する装置に接続されていることを特徴とする、電気化学的装置。
【請求項２】
前記作用電極が、微小電極であることを特徴とする、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記作用電極の活性表面積または複数の前記作用電極の表面積の総和が、１００〜１００００μｍ２、好ましくは２００〜３０００μｍ２であることを特徴とする、請求項１または２に記載の装置。
【請求項４】
前記作用電極の活性表面積または複数の前記作用電極の活性表面積の総和と、検査される皮膚の表面積との間の比が、１０−３〜１０−５のオーダー、好ましくは１０−４〜１０−５のオーダーであることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項５】
前記作用電極が、環状、帯状、円盤状または楕円状であるか、あるいは円錐形であることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６】
前記作用電極の活性表面が、炭素または金属で作製されており、
前記構成金属が、金、白金、イリジウム、タングステンおよびパラジウム、好ましくは白金、またはこれらの金属の合金、またはこれらの金属とこれらの金属の酸化物もしくは金属酸化物、好ましくは酸化スズなどの遷移金属酸化物との合金を含む群から選ばれることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項７】
前記作用電極の活性表面が、白金黒付き白金で作製されていることを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項８】
前記参照電極が、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極、カロメル電極、または白金ワイヤ参照擬似電極であることを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項９】
前記対極が、白金またはステンレス鋼製の金属ワイヤである、あるいは非酸化性導電性セラミック製であることを特徴とする、請求項１から８のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１０】
前記電極が、電気化学的および化学的に不活性な絶縁樹脂によって、前記支持体中に固定されていることを特徴とする、請求項１から９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１１】
使用位置で皮膚および前記支持体と接触するイオン導電性液体の所定の量を入れられる手段をさらに備えることを特徴とする、請求項１から１０のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１２】
前記支持体が、皮膚接触液体を入れられる前記手段を内蔵することを特徴とする、請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
前記皮膚接触液体が、水性媒体、アルコール媒体、水性−アルコール媒体または油性媒体、あるいは、例えば水、エタノール、水／エタノール溶液、流動パラフィン、シリコーン油または植物油のエマルジョンであり、
前記媒体が、必要に応じて、例えばＮａＣｌを用いた塩化によって導電性にしたものであることを特徴とする、請求項１１または１２に記載の装置。
【請求項１４】
前記接触液体が、緩衝化されており、ｐＨが４〜８、好ましくは５〜７．５であることを特徴とする、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１５】
検査される皮膚の表面積に対しての接触液体の量が、１０−５〜１０−３Ｌ／ｃｍ２のオーダー、好ましくは１０−４〜５×１０−４Ｌ／ｃｍ２のオーダーであることを特徴とする、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１６】
皮膚の表面の酸化還元状態を測定する方法であって、
請求項１から１５のいずれか一項に記載の装置を皮膚上に配置するステップと、
作用電極と参照電極の間に電圧を印加するステップと、
酸化還元種に起因する作用電極での電流の強度を測定するステップと
を有することを特徴とする、方法。
【請求項１７】
印加される電圧が、−１〜２Ｖ、好ましくは０〜１．５Ｖ、さらに好ましくは０〜１．０Ｖであることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
別々の測定を別々の時間ｔで行い、ｔは数秒から数ヶ月の間で変動することができることを特徴とする、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
電圧を、所定の範囲内で、最小値から最大値の間を、その後、最大値から最小値まで、時間と共に直線的に変化させることを特徴とする、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
得られた強度曲線を基準曲線または対照曲線と比較する追加のステップをさらに含むことを特徴とする、請求項１６から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
母集団を代表するサンプルの酸化還元状態を測定するための請求項１から１５のいずれか一項に記載の装置の使用であって、
サンプルを構成する個体それぞれについて皮膚の酸化還元状態を測定することを特徴とする使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚の表面の酸化還元状態の非侵襲性リアルタイム測定用の電気化学的装置および電気化学的方法に関する。本発明はまた、皮膚の酸化還元状態、言い換えれば酸化ストレスおよび皮膚の老化を抑制する効果に対する化粧品の効力の決定への本発明の方法の応用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
身体の他の部分と同じように、皮膚は老化する。この皮膚の老化は、より特には、しわ、褐色斑点などの出現で顕在化され、これらは細胞代謝および細胞外基質の組織化の障害の目に見える結果である。
【０００３】
この老化の原因は、生物学的なものと、環境的なものの両方である。
【０００４】
外部からの攻撃に対する障壁としての役割において、皮膚は、より大きな環境ストレス、より特には酸化ストレスにさらされる。
【０００５】
この酸化ストレスを抑制するために、本質的に酵素（スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ）であるか、でなければ、例えばビタミンＥ、ビタミンＣおよびグルタチオンである低分子量の抗酸化物質などの本質的に非酵素である、調節および保護の自然のシステムが存在する。これらの抗酸化性化学種は、皮膚の表層中に見られる。
【０００６】
皮膚の表面で、その抗酸化性化学種、すなわち還元性化学種は、皮膚を攻撃する酸化性化学種と反応する。皮膚の表面上に存在する、これらの酸化性化学種および還元性化学種の量および種類により、皮膚の酸化還元状態が決まる。
【０００７】
したがって、酸化ストレスを抑制するメカニズムの知識を得るために、および皮膚の老化の状態の評価を行うために、これらの化学種を定性分析できること、および、これらの化学種を定量化できることは有利である。
【０００８】
皮膚の表面での還元性化学種の測定は、電気化学的方法によって、既に研究されている。
−  間接的な測定によるもの。すなわち、抽出溶液を、所定の時間、皮膚と接触させ、次いで酸化還元性化学種をサイクリックボルタンメトリーによって分析する（Ｋｏｈｅｎら、１９９９年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第３００巻、４２８〜４３７頁）。
−  または、皮膚と接触させる幾つかの電極のセットを用いるもの（Ｋｏｈｅｎらによる米国特許第６１０８５７０号、または仏国特許第２８４５２６４号。これらは、同じキャピラリの中に、または２つの同軸のキャピラリの中に共に集められる作用電極および補助電極を用い、さらに、参照電極を独立に、別個に用いて「ｐＨおよび酸化状態を直接測定する装置および方法」を開示している。）。
【０００９】
これらの従来技術の装置は、直接測定を可能にしないか、でなければ、皮膚に様々な電極を当てることを必要とすることから、使用が簡単ではない。さらに、それらは、非常に小さな皮膚の表面の領域に適用される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、使用が簡単であり、全操作条件にわたって有効な制御、よって良好な再現性を可能にし、さらに、皮膚の典型的な部分の全部にわたって均一な測定を可能にする装置が真に必要とされている。さらに、この装置は、皮膚の酸化還元状態の連続的かつ非侵襲性の測定を可能にするものでなければならない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
長期かつ徹底的な研究の後、本発明者らは、これらの様々な要求を、
−  少なくとも１つの作用電極と、
−  対極と、
−  参照電極と
を備え、前記電極全てが、各電極を検査される皮膚の表面に同時に接触させられるように、単一の支持体中に固定されており、前記電極が、一方では、ポテンシオスタットのような、所定の電圧を作用電極と参照電極の間に印加する手段に接続され、他方では、酸化還元種の検出によって作用電極で発生する電流の強度を測定する装置に接続されている電気化学的装置を用いて満たすことができることを見出した。
【００１２】
したがって、本発明の装置は、３つの電極を皮膚の表面に同時に接触させることを可能にしていることから、使用がとても簡単である。
【００１３】
本発明では、用語「電気化学的装置」と用語「センサー」は、同じ意味で使用する。
【００１４】
本発明では、「皮膚接触」または「皮膚との接触」は、電極と皮膚の表面の間の直接または間接の接触を意味する。電極は、電極の活性表面領域の少なくとも一部が皮膚の表面に触れるときに、皮膚と直接接触する。電極は、電極の活性表面領域の少なくとも一部が皮膚の表面上にそのものが置かれた流体と接触するときに、皮膚と間接接触する。
【００１５】
「低分子量の抗酸化物質」は、グルタチオン、アスコルビン酸、トコフェロール、カルノシン、尿酸、ビタミンＥ、フェノール類、およびサイズが小さい他の分子などの還元剤である。
【００１６】
以下の本発明の装置の様々な実施形態の説明は、添付図面と関連して解釈されるべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の主題は、３つの電極、すなわち作用電極、参照電極および対極を組み合わせた電気化学的センサーである。このセンサーは、全表面積が数ｍｍ２から数ｃｍ２であり、皮膚と接触し、皮膚の表面の酸化還元状態、また、この酸化還元状態に対する医薬品または化粧品による処置の効果を非侵襲的に、リアルタイムで測定することを可能にする。
【００１８】
図１および図２は、皮膚と直接的に接触する、または間接的に、言い換えれば（図１中のみに示される）皮膚の上に配置されるカップの中に存在する導電性接触液体を介して接触する、本発明の装置１の一部の実施形態を示す。
【００１９】
装置１は、平面白金電極２と、対極３を構成する白金ワイヤと、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極４とを備える。
【００２０】
これら３つの電極２、３および４は、端部が皮膚またはカップ７を満たす液体６と接触している円筒体５の中に配置されている。図１および図２に示される好ましい一実施形態によれば、カップ７の内径は、カップ７が円筒体５と接触するように、円筒体５の外径に合わされている。３つの電極は、例えばエポキシ樹脂などの樹脂８によって円筒体５の内側に保持固定される。
【００２１】
３つの電極は、各電極の活性表面が単一面内で同じ高さにあり、好ましくは縦軸（Ｘ、Ｘ’）に対して垂直であるように配置される。
【００２２】
各電極２、３および４は、それぞれ、導線９、１０および１１によってポテンシオスタット１２に接続されている（図２中のみに示される）。カップ７は、検査される皮膚の表面１３上に配置される。
【００２３】
特定の一実施形態によれば、支持体の表面積は、１００ｍｍ２〜１０ｃｍ２、好ましくは１５０ｍｍ２〜５ｃｍ２、より好ましくは２００ｍｍ２〜２ｃｍ２である。
【００２４】
「支持体表面」は、電極が皮膚の表面または接触液体と接触するようにセンサーが作動中に配置されるときに支持体が占める表面を意味する。この支持体表面は、検査される皮膚の領域に対応する。
【００２５】
作用電極は、微小電極、言い換えれば、活性部分が少なくとも約１μｍ〜約５０μｍの範囲のサイズを有する電極である。
【００２６】
作用電極の形状は、その製造に用いられる技術に依存する。したがって、作用電極は、例えば、環状、帯状、円盤状または楕円状、あるいは円錐形であってよい。
【００２７】
作用電極の活性表面、言い換えれば、作用電極の活性部分は、平面であっても、平面でなくてもよい。この表面は、測定のために所望される分解能に応じて改変される。表面積が大きくなるほど、信号対雑音比（Ｓ／Ｎ比）の分解能の特性が低下するが、その結果が皮膚の平均的な酸化還元状態を表す範囲はより大きくなる。
【００２８】
有利な一実施形態によれば、支持体中に複数の作用電極を配置することができる。その場合、これらの作用電極は、分解能を最適化するように、支持体中で、言い換えれば、皮膚の表面上に当てる際に規則的に配置される。
【００２９】
作用電極の活性表面積または複数の作用電極の表面積の総和は、１００〜１００００μｍ２、好ましくは２００〜３０００μｍ２である。
【００３０】
作用電極の活性表面積または複数の作用電極の活性表面積の総和と、検査される皮膚の表面積との間の比は、１０−３〜１０−５のオーダー、好ましくは１０−４〜１０−５のオーダーであることができる。
【００３１】
作用電極の活性表面は、炭素または金属で作製されており、構成金属は、金、白金、イリジウム、タングステンおよびパラジウム、好ましくは白金、またはこれらの金属の合金、またはこれらの金属とこれらの金属の酸化物もしくは金属酸化物、好ましくは酸化スズなどの遷移金属酸化物との合金からなる群から選ばれる。使用できる合金の例は、白金／イリジウム合金、イリジウム／酸化スズ合金、および白金／タングステン合金である。装置が２つ以上の作用電極を備えるときには、電極は全て、同じ材料で作製されていることが好ましい。
【００３２】
電極の活性表面の性質だけが重要であることが理解されよう。したがって、電極は、例えば金属で被覆されている炭素製の非金属コアを有していてもよい。
【００３３】
結果を最適化し、作用電極の表面の不動態化を制限し、作用電極の感度を上げるために、作用電極は、白金黒の被覆物によって修飾されていることが好ましく、その場合、電極が白金黒めっきされていると言われる。この被覆物は、作用電極の表面上で、白金塩の溶液の電解によって、高活性表面積および高電気触媒活性の固体多結晶金属の層１層以上を形成して生成される。同様に、作用電極の活性表面は、金の被覆物またはクロムの被覆物で被覆されていてもよい。
【００３４】
参照電極は、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極、カロメル電極、または白金ワイヤなどの参照擬似電極である。
【００３５】
対極は、白金の金属ワイヤであるか、あるいはステンレス鋼などのステンレス金属合金製であるか、あるいは非酸化性導電性セラミック製である。好ましくは、対極は、白金製またはステンレス鋼製である。
【００３６】
電極は、当然、電極間の電気絶縁を確保する任意の手段によって、単一の支持体中に固定される。非常に有利な固定手段の１つは、エポキシ樹脂などの電気化学的および化学的に不活性な絶縁樹脂である。
【００３７】
有利な一実施形態によれば、例えば、皮膚にかかる過剰な圧力による、あるいは、皮膚とセンサーの間の不均一または不十分な接触による測定誤差を全て防ぐように、皮膚と間接接触するように電極を配置することができる。このために、本発明による装置は、一方が使用位置で皮膚と接触し、他方が支持体と接触する液体の所定の量を入れられる手段を備えていてもよい。
【００３８】
好ましい一実施形態では、センサーは、皮膚に付着させる開口カップの中に挿入される。少量の接触液体が、皮膚と電極の間の接触を実現するために、皮膚に付着させたカップの中に入れられる。
【００３９】
第２の実施形態によれば、図３に示したように、皮膚接触液体を入れられる上記手段は支持体の一部になっている。
【００４０】
液体貯蔵槽の使用に伴う利点は複数あり、測定中に皮膚に電極の圧力がかからないこと、標準化された物理化学的動作条件の下での分析であること、および測定される皮膚の表面積を制御できることである。測定の再現性は高められる。動態は、数十分にわたって行うことができ、したがって、この技術の感度を高めることができる。
【００４１】
接触液体は、０．８ｍＰａ・ｓ〜１０Ｐａ・ｓの間で、非常に様々な粘度を有する導電体、特にイオン導電体である。この液体は、例えば水性媒体、アルコール媒体、水性−アルコール媒体または油性媒体、あるいは、例えば水、エタノール、水／エタノール溶液、流動パラフィン、シリコーン油または植物油のエマルジョンであり、媒体は、必要に応じて、例えばＮａＣｌを用いた塩化によって導電性にしたものであってよい。
【００４２】
液体の粘度は、液体の導電性には影響を及ぼさないが、粘度調整剤として働く少なくとも１種のゲル化剤を加えることによって変化させることができる。この種のゲル化剤は、より詳細には、ｃａｒｂｏｐｏｌ、天然ガム、アルギン酸塩類、セルロース誘導体およびヒアルロン酸などの皮膚の使用に適合するゲル化剤を含む群から選ぶことができる。
【００４３】
液体は、緩衝化されていてもよく、ｐＨが４〜８、好ましくは５〜７．５であることが好ましい。
【００４４】
センサーは、使用される液体の化学的性質に応じて、皮膚の表面上に存在する数種類の酸化還元性化学種の放出動態の測定を可能にする。例えば、エタノールをベースとした液体は、ビタミンＥの定量に完全に適している。
【００４５】
当然、液体の量は、支持体のサイズによって決まる。
【００４６】
接触液体の量は、非常に少なくてよい。したがって、検査される皮膚の表面積、言い換えれば支持体によって画定される皮膚の表面積の１０−５〜１０−３Ｌ／ｃｍ２のオーダーの量で十分であることが分かることがある。好ましくは、また実際的には、この量は、１０−４〜５×１０−４Ｌ／ｃｍ２のオーダーであってよい。
【００４７】
図３は、本発明の第２の実施形態の装置１４を示す。この装置１４は、平面白金作用電極１５と、白金対極１６と、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極１７とを備える。
【００４８】
これら３つの電極１５、１６および１７は、空洞を形成し、接触液体１９で満たされているケーシング２０の内面１８上に配置される。
【００４９】
ケーシング２０は、形状が球形または角形であり、空洞を有する。使用位置で、ケーシングは、ケーシングと皮膚２１の間に閉鎖空間を形成するように、皮膚上に配置される。この空間（または空洞）は、測定を達成する目的で、液体１９で満たされている。
【００５０】
３つの電極１５、１６および１７は、それぞれ、接続点２２、２３および２４で支持体の外面に接続されている。これらの接続点によって、図示していない検出装置へ情報が伝達される。
【００５１】
同様に、本発明は、皮膚の酸化還元状態の測定方法に関する。
【００５２】
皮膚の「酸化還元状態」は、皮膚の表面上に存在する還元性化学種の定量的および／または定性的な測定を意味する。
【００５３】
この測定は、人工皮膚、すなわち細胞培養によって再形成された皮膚または表皮を用いて、あるいは、生物の表皮または皮膚のサンプルを用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかで行うことができる。
【００５４】
測定される還元性化学種は、例えば、先に述べた低分子量の抗酸化物質である。
【００５５】
この測定方法は、
−  装置を皮膚上に配置し、好ましくは装置を固定するステップと、
−  作用電極と参照電極の間に電圧を印加するステップと、
−  酸化還元種に起因する作用電極での電流の強度を測定するステップと
を含む。
【００５６】
定電圧または可変電圧のいずれでも印加することができる。印加される電圧は、−１〜２Ｖ、好ましくは０〜１．５Ｖ、さらに好ましくは０〜１．０Ｖであることができる。電圧の経時的な変動は、所望の印加に応じるものであり、例えば、２つの値または複数の連続する値の間で、時間と共に直線的に変化させてもよいし、でなければ、不連続に変化させてもよい。
【００５７】
有利な一方法では、サイクリックスイープボルタンメトリーの技術が使用され、この技術は、所定の範囲内で、最小値から最大値の間を、その後、最大値から最小値まで、時間と共に直線的に電圧を変化させるものである。
【００５８】
有利な一実施形態によれば、この方法は、接触液体を皮膚と電極の間に入れる手段を所定の位置に固定することを目的とするステップをさらに含む。
【００５９】
本発明の方法は、所定の瞬間に１回の測定を行うことを可能にすることができ、また、累積値を得るように、あるいは所定の期間にわたる変化をよりよく定量化するために、ある期間にわたって数回の測定を行うことを可能にすることもでき、その値は、より容易に解釈することができる。
【００６０】
したがって、別々の測定を別々の時間ｔで行ってもよく、ｔは数秒から数ヶ月の間で変動することができる。
【００６１】
本発明の方法は、得られた強度曲線を基準曲線または対照曲線と比較する追加のステップをさらに含んでいてもよい。
【００６２】
別の態様では、本発明は、酸化ストレスの影響を抑制するように意図された、皮膚への局所塗布に関しての化粧品の効力を決定する方法に関する。この方法は、本発明の方法によって時間ｔ０で皮膚の酸化還元状態を測定するステップと、化粧品を１回または複数回皮膚の所定の領域に塗布する（この塗布は規則的であることが好ましい）ステップと、次いで、本発明の方法によって化粧品の最後の塗布の後に所定の時間Ｔで皮膚の酸化還元状態を測定するステップと、時間ｔ０で得られた結果と時間Ｔで得られた結果を比較するステップとを含む。
【００６３】
同様に、本発明は、酸化ストレスの影響を抑制するための製品の効力を決定する方法に関する。この方法は、本発明の方法によって時間ｔ０で皮膚の酸化還元状態を測定するステップと、この製品を１回または複数回、局所的に皮膚に塗布する、または投与するステップと、次いで、本発明の方法によって製品の最後の塗布の後に所定の時間Ｔで皮膚の酸化還元状態を測定するステップと、時間ｔ０で得られた結果と時間Ｔで得られた結果を比較するステップとを含む。
【００６４】
このようにして試験される製品は、皮膚用の医薬品または化粧品であり、より特には、局所塗布または経口投与用の医薬品または化粧品である。
【００６５】
当然、時間Ｔは、用いられる製品の性質に依存する。例えば、問題になっている製品が即効性の製品である場合、時間Ｔは、数分から数時間であることができる。一方、問題になっている製品が長期有効性の製品である場合、この時間Ｔは、数日から数ヶ月であることができる。
【００６６】
問題になっている製品が局所用の製品である場合、その効力は、例えば、製品をボランティアの皮膚の領域に規則的に塗布し、時間ｔ０で、次いで時間Ｔで、皮膚のこの領域と、規則的な塗布を受けなかった皮膚の同等の領域で測定を行うことによって測定できる。このようにして、これら２つの領域で得られた結果は、容易に比較できる。例えば、製品を左前腕の正面に塗布し、前腕それぞれについて測定を行うことを選択することが可能である。統計的に信頼できる結果を得るために、十分な人数のボランティアが用いられ、ボランティアの半数は左前腕に、ボランティアの残りの半数は右前腕に、塗布が行われる。
【００６７】
別の実施形態によれば、本発明は、ストレス後の皮膚の酸化還元状態を決定する方法に関する。この方法は、本発明の方法によって時間ｔ０で皮膚の酸化還元状態を測定するステップと、このストレスを１回または複数回加えるステップと、次いで、本発明の方法によってストレスを最後に加えた後に所定の時間Ｔで皮膚の酸化還元状態を測定するステップと、時間ｔ０で得られた結果と時間Ｔで得られた結果を比較するステップとを含む。
【００６８】
加えることができ、その影響が直接測定できるストレスの例としては、ＵＶ、より特にはＵＶＡ、ＩＲなどの放射線、例えば過酸化水素または過酸化ベンゾイルによる化学的ストレス、例えば厳しい温度による熱的ストレス、例えば摩擦による機械的ストレスが挙げられる。
【００６９】
本発明はまた、
−  第１のステップにおいて、本発明の方法によって時間ｔ０で皮膚の酸化還元状態を測定することと、
−  第２のステップにおいて、処置がある状態または処置がない状態で、ストレスを１回または複数回加えることと、
−  第３のステップにおいて、本発明の方法を用いた測定によって、皮膚の酸化還元状態に対するストレスの最大の影響の出現に対応する時間ｔ１を決定することと、
−  第４のステップにおいて、本発明の方法を用いて、幾つかの時間ｔｉ（ｉは、１より大きい）で皮膚の酸化還元状態を測定することと、
−  最後に、第５のステップにおいて、皮膚の基礎的な酸化還元状態に対応する時間ｔ０で得られた結果と、時間ｔ１および時間ｔｉで得られた結果から、皮膚の酸化還元状態がその基礎的な酸化還元状態に戻る動態を決定することと
を含む方法によって、皮膚のストレス後の保護能力を回復する能力を決定することも可能にすることができる。
【００７０】
当然、値ｉは、ストレスの性質およびストレスの強度、用いられる処置の性質に応じて変化する。異なる値ｔｉと値ｔｉ間の間隔は、同じであっても、異なっていてもよい。これは、ストレスを加えることの影響の経時的な変化を、例えば、時間ｔ１での上記の測定の後、時間ｔ１近くで、非常に短い間隔（数分から数十分）をおいて、時間ｔ２、ｔ３およびｔ４で測定し、次いで、間隔をあけて、例えば、非常に長くあってよい間隔（一時間から数時間のオーダー、さらには一日から数日）をおいて、時間ｔ５およびｔ６で、次の測定を行うことが有利である場合があるからである。
【００７１】
本発明の装置は、母集団を代表するサンプルの酸化還元状態を決定する方法においても使用することができる。
【００７２】
この場合、ある母集団、例えば皮膚がフォトタイプＶＩに属する人々などの非常に皮膚の色が黒い、４５歳から６０歳までの人々、または、例えばフォトタイプＩＩＩに属する皮膚の色がより白い、２０歳から２５歳までの人々を代表するサンプルが選択され、各母集団からの各ボランティアの皮膚の酸化還元状態が、統計データを収集するために、測定される。
【００７３】
本発明はまた、疫学的研究において、偶発的に受けたストレスの影響、あるいは、特定の生活様式（ＵＶ、核放射線、環境汚染など）または病状などに関連するストレスの影響を決定することを可能にすることができる。
【００７４】
以下の実施例において本発明をさらに詳細に説明するが、これらの実施例は単に本発明の実例として示すものであって、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００７５】
各実施例では、図１または図２で示される本発明のセンサーが使用される。
寸法は、以下の通りである。
−  支持体の断面の長さは、１０ｃｍである。
−  作用電極：平面、帯状の形状で、長さ１００μｍ、幅５μｍである。
−  対極：平面白金円盤電極で、直径５００μｍである。
−  参照電極：Ａｇ／ＡｇＣｌタイプの平面円盤電極で、直径５００μｍである。
−  カップは、直径１．５ｃｍであり、直径１ｃｍの開口を有している。
Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌブランドのカップは、非永続的に皮膚に接着固定するための環を含む。
【００７６】
ポテンシオスタットは、Ｅｎｓｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社（米国、インディアナ州、ブルーミントン、型番ＥＩ４００）によって販売されている器械である。強度は、ＡＤ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社（米国、コロラド州、コロラドスプリングズ）によって販売されている、Ｐｏｗｅｒｌａｂ  ４ＳＰ  デジタル／アナログ  インターフェースおよびＰＣ用ソフトウェアＣｈａｒｔ  ５．０を用いて記録される。
【００７７】
実施例１〜３はｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われ、実施例４および実施例５はｉｎ  ｖｉｖｏで行われる。
【００７８】
＜実施例１＞
作用電極として白金の帯状電極を用いる本発明の装置を用いて、電位（１０ｍｖ．ｓ−１）のリニアスイープボルタンメトリーによって、以下の分析を行った。
試験１：ＰＢＳ中の２ｍＭのアスコルビン酸に関する。
試験２：ＰＢＳ中の２ｍＭの尿酸に関する。
試験３：ＰＢＳ中の２ｍＭの尿酸と２ｍＭのアスコルビン酸の５０対５０の混合物に関する。
試験１は、電極の濯ぎまたは洗浄をすることなく、連続して３回行った。
試験２および試験３は、それぞれ、電極の濯ぎまたは洗浄をすることなく、連続して２回行った。
【００７９】
得られた結果を、それぞれ、図４ａ、図４ｂおよび図４ｃに示す。
【００８０】
これらの図から、アスコルビン酸の酸化生成物が白金電極の表面を不動態化することは明らかである。
【００８１】
したがって、アスコルビン酸と尿酸の混合物は、白金作用電極を用いて、信頼性のある測定をすることは困難である。
【００８２】
＜実施例２＞
作用電極として白金黒付き白金帯状電極を用いて、実施例１の試験１および試験２が繰り返される。
【００８３】
得られた結果を図５ａおよび図５ｂに示す。
【００８４】
これらの図において、白金黒付き白金電極は、アスコルビン酸の酸化生成物による不動態化を防止し、アスコルビン酸および尿酸を安定に、かつ再現性よく検出することを可能にすることは明らかである。
【００８５】
＜実施例３＞
ＰＢＳにおける電位（１０ｍｖ．ｓ−１）のリニアスイープボルタンメトリーによる分析は、（図１による）カップを有する、白金黒付き白金帯状作用電極を備える本発明の装置を用いて（試験３−１）、および対極および作用電極がカップ中に配置され、参照電極がカップの外側のＰＢＳ中に配置されている従来技術の装置を用いて（試験３−２）行われる。
【００８６】
試験３−１および試験３−２のカップは、それぞれ、ＰＢＳ２００μｌで満たされている。
【００８７】
各試験について、ボルタンメトリーによる４回の分析が、２分、１０分、２０分および３０分に行われる。
【００８８】
これらの結果を、それぞれ、図６ａおよび図６ｂに示す。
【００８９】
これらの図において、本発明の装置を用いて、安定化が最適化されることは明らかである。
【００９０】
＜実施例４＞
用いられる装置は、作用電極として白金黒付き白金帯状電極を備える。それは、ボランティアの前腕に付着されるカップの中に配置される。このカップは、生理食塩水２００μｌ（試験４−１）およびＰＢＳ２００μｌ（試験４−２）で満たされている。
【００９１】
測定は、時間ｔ＝１０分、２０分および３０分に行われる。印加される電圧の関数としての強度曲線を、それぞれ、図７ａおよび図７ｂに示す。
【００９２】
＜実施例５＞
化粧用保護ケアクリームの効力の決定
以下の試験の目的は、より詳細には酸化ストレスからの保護を与える保護ケアクリームの効力を実証するものである。
【００９３】
試験するケアクリームは、オロバンケラプムエキス（０．５重量％）およびコンブレタムミクランサム葉エキス（０．１重量％）を含有する従来の水中油型エマルジョンである。オロバンケエキスは、よく知られた抗酸化活性を有する（欧州特許第０５７６４２０号）。コンブレタムエキスまたはキンベリバエキス（ｋｉｎｂｅｌｉｂａ  ｅｘｔｒａｃｔ）も抗酸化特性を有する。
【００９４】
このクリームは、ボランティアの左前腕に、表面積２５ｃｍ２、１ｃｍ２当たりクリーム２ｍｇの割合で、Ｄ０に、２時間おきに４回塗布される。測定は、最初の塗布の２４時間後、すなわち最後の塗布の１８時間後に行われる。ボランティアの右前腕は処置されておらず、対照となる。
【００９５】
この実施例では、白金黒付き白金帯状作用電極を備える本発明の装置が用いられ、それは、ボランティアの前腕に付着されるカップの中に配置される。このカップは、ＰＢＳ２００μｌで満たされている。
【００９６】
測定は、時間１０分、２０分および３０分に、処置を受けていた左前腕の部分および右前腕で行われた。結果は図８に示されており、ここで、図８ａは、（未処置の）右前腕で行われた測定で得られた結果であり、図８ｂは、（対照の）左前腕で行われた測定で得られた結果である。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】本発明の第１の実施形態の装置の、図２中の軸Ｉ−Ｉに沿った断面を示す図である。
【図２】カップを取り除いた第１の実施形態の装置の、図１の軸ＩＩ−ＩＩに沿った断面を示す図である。
【図３】本発明の第２の実施形態の装置の断面を示す図である。
【図４】ｉｎ  ｖｉｔｒｏで得られる、電位差の関数としての電流の強度を示す図である。
【図５】ｉｎ  ｖｉｔｒｏで得られる、電位差の関数としての電流の強度を示す図である。
【図６】ｉｎ  ｖｉｔｒｏで得られる、電位差の関数としての電流の強度を示す図である。
【図７】様々な時間でボランティアの前腕上で行った測定について得られる、電位差の関数としての電流の強度を示す図である。
【図８】様々な時間でボランティアの前腕上で行った測定について得られる、電位差の関数としての電流の強度を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【国際調査報告】
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