(57)【要約】本発明は、蛋白質フォールディング疾患に関連するもののごとき、蛋白質のミスフォールディングの事象を防止することに指向される。熱ショック蛋白質ＡＴＰアーゼＡｈａ１および／または同様の機能を持つ関連分子のレベルを減少させる作用物質を投与することを含む処置方法が提供される。かかる方法は、部分最適化フォールディング動力学を持つ蛋白質のフォールディング、輸送、ならびに機能のレスキューを生じることができる。また、蛋白質ミスフォールディング疾患の処置のための作用物質を同定するスクリーニング方法が提供される。
2009537179.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
センス鎖およびアンチセンス鎖を含む、細胞における機能的Ａｈａ蛋白質発現を阻害するｄｓＲＮＡであって、
該アンチセンス鎖は、Ａｈａ標的配列に実質的に相補的な配列を有する相補性領域を含み、該標的配列は、３０ヌクレオチド未満の長さであり、
該センス鎖は該アンチセンス鎖に実質的に相補的であり、
該ｄｓＲＮＡは、機能的Ａｈａ蛋白質を発現する細胞との接触に際して、機能的Ａｈａ蛋白質発現を少なくとも２０％阻害することを特徴とする該ｄｓＲＮＡ。
【請求項２】
該Ａｈａ標的配列が配列番号：１２〜５６よりなる群から選択される配列を含む請求項１記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項３】
該ｄｓＲＮＡが、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：６１、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６７、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７３、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３、配列番号：１０５、配列番号：１０７、配列番号：１０９、配列番号：１１１、配列番号：１１３、配列番号：１１５、配列番号：１１７、配列番号：１１９、配列番号：１２１、配列番号：１２３、配列番号：１２５、配列番号：１２７、配列番号：１２９、配列番号：１３１、配列番号：１３３、配列番号：１３５、配列番号：１３７、配列番号：１３９、配列番号：１４１、配列番号：１４３および配列番号：１４５よりなる群から選択される配列を有するセンス鎖；ならびに
配列番号：５８、配列番号：６０、配列番号：６２、配列番号：６４、配列番号：６６、配列番号：６８、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７４、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００、配列番号：１０２、配列番号：１０４、配列番号：１０６、配列番号：１０８、配列番号：１１０、配列番号：１１２、配列番号：１１４、配列番号：１１６、配列番号：１１８、配列番号：１２０、配列番号：１２２、配列番号：１２４、配列番号：１２６、配列番号：１２８、配列番号：１３０、配列番号：１３２、配列番号：１３４、配列番号：１３６、配列番号：１３８、配列番号：１４０、配列番号：１４２、配列番号：１４４および配列番号：１４６よりなる群から選択される配列を有するそのセンス鎖に相補的なアンチセンス鎖
を含む請求項１記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４】
配列番号：５７の配列を有するセンス鎖、および配列番号：５８の配列を有するそのセンス鎖に相補的なアンチセンス鎖を含む請求項１記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項５】
配列番号：６９の配列を有するセンス鎖、および配列番号：７０の配列を有するそのセンス鎖に相補的なアンチセンス鎖を含む、請求項１記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項６】
配列番号：８１の配列を有するセンス鎖、および配列番号：８２の配列を有するそのセンス鎖に相補的なアンチセンス鎖を含む、請求項１記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項７】
センス鎖、ヘアピンリンカーおよびアンチセンス鎖を含む、細胞における機能的Ａｈａ１発現を阻害するｓｈＲＮＡを発現するためのベクターであって、
該センス鎖は、Ａｈａ標的配列に実質的に相補的な配列を有する相補性領域を含み、該標的配列は、３０ヌクレオチド未満の長さであり、
該アンチセンス鎖は、該センス鎖に実質的に相補的であり、
該ｄｓＲＮＡは、機能的Ａｈａ蛋白質を発現する細胞との接触に際して、機能的Ａｈａ蛋白質発現を少なくとも２０％阻害することを特徴とする該ベクター。
【請求項８】
該Ａｈａ標的配列が、配列番号：１２〜５６よりなる群から選択される配列を含む請求項７記載のベクター。
【請求項９】
該ベクターが、配列番号：１４７、配列番号：１４９および配列番号：１５１よりなる群から選択される配列を有するセンス鎖；ならびに配列番号：１４８、配列番号：１５０および配列番号：１５２よりなる群から選択される配列を有するアンチセンス鎖を含む請求項７記載のベクター。
【請求項１０】
Ａｈａ標的配列に実質的に相補的な配列を有する相補性領域を含み、該標的配列が３０ヌクレオチド未満の長さである、細胞における機能的Ａｈａ１蛋白質発現を阻害するためのｓｈＲＮＡであって、
該ｓｈＲＮＡは、機能的Ａｈａ蛋白質を発現する細胞との接触に際して、機能的Ａｈａ蛋白質発現を少なくとも２０％阻害することを特徴とする該ｓｈＲＮＡ。
【請求項１１】
Ａｈａ標的配列が、配列番号：１２〜５６よりなる群から選択される配列を含む請求項１０記載のｓｈＲＮＡ。
【請求項１２】
該ｓｈＲＮＡが、配列番号：１５３、配列番号：１５４および配列番号：１５５よりなる群から選択される配列を含む請求項１０記載のｓｈＲＮＡ。
【請求項１３】
請求項１に記載のｄｓＲＮＡを含む細胞または細胞集団。
【請求項１４】
請求項７に記載のベクターを含む細胞または細胞集団。
【請求項１５】
請求項１０に記載のｓｈＲＮＡを含む細胞または細胞集団。
【請求項１６】
機能的Ａｈａ１、機能的Ａｈａ１に対するＨｓｐ９０ ＡＴＰアーゼ結合部位、および／または機能的Ａｈａ１−Ｈｓｐ９０ ＡＴＰアーゼ複合体に特異的に結合する単離された抗体。
【請求項１７】
小分子、抗体、アンチセンス核酸、アプタマー、ｄｓＲＮＡ、リボザイムおよびそのいずれかの組合せよりなる群から選択される、機能的Ａｈａ１蛋白質の細胞内レベルを減少させる作用物質。
【請求項１８】
機能的Ａｈａ１蛋白質の細胞内レベルを減少させる治療上有効な量の少なくとも１つの作用物質をそれを必要とする対象に投与することを特徴とする蛋白質のミスフォールディングに関連した疾患を処置する方法であって、
該作用物質は、小分子、抗体、アンチセンス核酸、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、リボザイムおよびその組合せよりなる群から選択される該方法。
【請求項１９】
疾患が、嚢胞性線維症（ＣＦ）、マルファン症候群、ファブリー病、ゴーシェ病、網膜色素変性症３、アルツハイマー病、ＩＩ型糖尿病、パーキンソン病およびクロイツフェルト−ヤコブ病よりなる群から選択されることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
疾患がＣＦであることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
ミスフォールドされた蛋白質が、ミスフォールドされたＣＦＴＲであることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
ミスフォールドされた蛋白質がΔＦ５０８蛋白質であることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２３】
治療上有効な量の機能的Ａｈａ１発現の少なくとも１つのｄｓＲＮＡインヒビターをそれを必要とする対象に投与することを含み、該ｄｓＲＮＡがセンス鎖およびアンチセンス鎖を含むことを特徴とする蛋白質のミスフォールディングに関連した疾患を処置する方法であって、
該アンチセンス鎖は、Ａｈａ標的配列に実質的に相補的な配列を有する相補性領域を含み、該標的配列は３０ヌクレオチド未満の長さであり、
該センス鎖は、該アンチセンス鎖に実質的に相補的であり、
該ｄｓＲＮＡは、機能的Ａｈａ蛋白質を発現する細胞との接触に際して、機能的Ａｈａ蛋白質発現を少なくとも２０％阻害する該方法。
【請求項２４】
疾患が、嚢胞性線維症（ＣＦ）、マルファン症候群、ファブリー病、ゴーシェ病、網膜色素変性症３、アルツハイマー病、ＩＩ型糖尿病、パーキンソン病およびクロイツフェルト−ヤコブ病よりなる群から選択される請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
疾患がＣＦであることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
ミスフォールドされた蛋白質が、ミスフォールドされたＣＦＴＲであることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
ミスフォールドされた蛋白質が、ΔＦ５０８蛋白質であることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２８】
治療上有効な量の機能的Ａｈａ１発現の少なくとも１つのｄｓＲＮＡインヒビターをそれを必要とする対象に投与することを特徴とする蛋白質のミスフォールディングに関連した疾患を処置する方法であって、ｄｓＲＮＡインヒビターは、
ａ）約１９ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドのセンス鎖配列および約１９ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドのアンチセンス鎖配列を含むｄｓＲＮＡ；および
ｂ）センス鎖配列またはアンチセンス鎖配列が、機能的Ａｈａ１以外のいずれかの遺伝子もしくはｍＲＮＡの５'非翻訳領域、３'非翻訳領域、イントロンまたはエキソンを含むコンティグ配列に同一の１５個以下のコンティグヌクレオチドを含むこと
に基づいて選択された配列を含む該方法。
【請求項２９】
疾患が、嚢胞性線維症（ＣＦ）、マルファン症候群、ファブリー病、ゴーシェ病、網膜色素変性症３、アルツハイマー病、ＩＩ型糖尿病、パーキンソン病およびクロイツフェルト−ヤコブ病よりなる群から選択されることを特徴とする請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
疾患がＣＦであることを特徴とする請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
ミスフォールドされた蛋白質がミスフォールドされたＣＦＴＲである請求項２８記載の方法。
【請求項３２】
ミスフォールドされた蛋白質がΔＦ５０８蛋白質であることを特徴とする請求項２８記載の方法。
【請求項３３】
蛋白質のミスフォールディングに関連した疾患を処置するための作用物質をスクリーニングする方法であって、
機能的Ａｈａ１を発現する細胞または細胞集団を供し；
候補作用物質をその細胞または細胞集団に投与し；
細胞または細胞集団における機能的Ａｈａ１活性を定量し；次いで
候補作用物質が細胞または細胞集団における機能的Ａｈａ１活性を減少させるかを決定し、それにより、機能的Ａｈａ１活性における減少が、蛋白質のミスフォールディングの低減を示すことを特徴とする該方法。
【請求項３４】
候補作用物質が、機能的Ａｈａ１発現を阻害するｄｓＲＮＡであることを特徴とする請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
ｄｓＲＮＡが、ａ）約１９ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドの配列、およびｂ）Ａｈａ遺伝子もしくはｍＲＮＡ以外のいずれかの遺伝子もしくはｍＲＮＡの５'非翻訳領域、３'非翻訳領域、イントロンまたはエキソンを含むコンティグ配列と同一の１５個以下のコンティグヌクレオチドを含む配列を含むことを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
Ａｈａ遺伝子もしくはｍＲＮＡがヒトＡｈａ遺伝子もしくはｍＲＮＡであることを特徴とする請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
疾患が、嚢胞性線維症（ＣＦ）、マルファン症候群、ファブリー病、ゴーシェ病、網膜色素変性症３、アルツハイマー病、ＩＩ型糖尿病、パーキンソン病およびクロイツフェルト−ヤコブ病よりなる群から選択されることを特徴とする請求項３３記載の方法。
【請求項３８】
疾患がＣＦであることを特徴とする請求項３３記載の方法。
【請求項３９】
ミスフォールドされた蛋白質が、ミスフォールドされたＣＦＴＲ、ミスフォールドされたフィブリリン、ミスフォールドされたアルファ・ガラクトシダーゼ、ミスフォールドされたベータ・グルコセレブロシダーゼ、ミスフォールドされたロドプシン、凝集アミロイド・ベータおよびタウ、凝集アミリン、凝集アルファ・シヌクレインならびに凝集プリオンよりなる群から選択される請求項３３記載の方法。
【請求項４０】
ミスフォールドされた蛋白質が、ミスフォールドされたＣＦＴＲであることを特徴とする請求項３３記載の方法。
【請求項４１】
ミスフォールドされた蛋白質がΔＦ５０８蛋白質であることを特徴とする請求項３３記載の方法。
【請求項４２】
蛋白質のミスフォールディングに関連した疾患を処置するための作用物質をスクリーニングする方法であって、
機能的Ａｈａ１を発現する細胞または細胞集団を供し；
候補作用物質を細胞または細胞集団に投与し；
細胞または細胞集団におけるＨｓｐ９０／ＡＤＰ複合体、Ｈｓｐ９０／ＡＴＰ複合体またはその組合せを定量し；次いで
候補作用物質が細胞または細胞集団におけるＨｓｐ９０／ＡＤＰ複合体、Ｈｓｐ９０／ＡＴＰ複合体またはその組合せを減少させるかを決定し、それにより、Ｈｓｐ９０／ＡＤＰ複合体またはＨｓｐ９０／ＡＴＰ複合体の量における減少が、蛋白質のミスフォールディングの低減を示すことを特徴とする該方法。
【請求項４３】
候補作用物質が、機能的Ａｈａ１発現を阻害するｄｓＲＮＡであることを特徴とする請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
ｄｓＲＮＡが、ａ）約１９ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドの配列、およびｂ）Ａｈａ１遺伝子もしくはｍＲＮＡ以外のいずれかの遺伝子もしくはｍＲＮＡの５'非翻訳領域、３'非翻訳領域、イントロンまたはエキソンを含むコンティグ配列と同一の１５個以下のコンティグヌクレオチドを含む配列を含むことを特徴とする請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
Ａｈａ遺伝子もしくはｍＲＮＡが、ヒトＡｈａ遺伝子もしくはｍＲＮＡであることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
疾患が、嚢胞性線維症（ＣＦ）、マルファン症候群、ファブリー病、ゴーシェ病、網膜色素変性症３、アルツハイマー病、ＩＩ型糖尿病、パーキンソン病およびクロイツフェルト−ヤコブ病よりなる群から選択されることを特徴とする請求項４２記載の方法。
【請求項４７】
疾患がＣＦであることを特徴とする請求項４２記載の方法。
【請求項４８】
ミスフォールドされた蛋白質が、ミスフォールドされたＣＦＴＲ、ミスフォールドされたフィブリリン、ミスフォールドされたアルファ・ガラクトシダーゼ、ミスフォールドされたベータ・グルコセレブロシダーゼ、ミスフォールドされたロドプシン、凝集アミロイド・ベータおよびタウ、凝集アミリン、凝集アルファ・シヌクレインならびに凝集プリオンよりなる群から選択されることを特徴とする請求項４２記載の方法。
【請求項４９】
ミスフォールドされた蛋白質が、ミスフォールドされたＣＦＴＲであることを特徴とする請求項４２記載の方法。
【請求項５０】
ミスフォールドされた蛋白質が、ΔＦ５０８蛋白質であることを特徴とする請求項４２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に蛋白質のミスフォールディング疾患の処置方法に関する。特に、本発明は、熱ショック蛋白質９０ＡＴＰアーゼ（Ａｈａ）の遺伝子アクチベーターのモジュレーターを用いる処置方法に関係する。例えば、本発明は、Ａｈａの発現をダウンレギュレートする二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を投与することによって所望ではないＡｈａ活性と関連した障害を処置するための組成物および方法を提供する。
【０００２】
（関連出願の相互参照）
本願は、２００６年５月１９日に出願された米国仮出願シリアル番号６０／８０１,８４０、２００６年６月２１日に出願された米国仮出願シリアル番号６０／８１５,４９４、および２００６年１１月１７日に出願された米国仮出願シリアル番号６０／８５９,８９０からの優先権を主張し、その各々をここに出典明示してそのすべてを本明細書の一部とみなす。
【０００３】
（連邦政府により委託された研究または開発に関する記述）
本発明は、国立衛生研究所助成金ＧＭ４２３３６およびＧＭ４５６７８／ＮＩＨ  ＲＲ１１８２３下の政府支援で一部分なされた。政府は本発明においてある種の権利を有している。
【０００４】
（コンパクトディスクで提出された資料の参照による取り込み）
本開示の一部である配列表は、本発明のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列を含む米国特許商標庁のＰａｔｅｎｔＩｎバージョン３.４ソフトウェアによって作製されたコンピュータファイル「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５.ＴＸＴ」を含む。配列表の内容をここに出典明示してそのすべてを本明細書の一部とみなす。
【背景技術】
【０００５】
（緒言）
小胞体（ＥＲ）は、特殊化したフォールディング環境であり、その中には、真核生物のゲノムによってコード化された蛋白質のほぼ３分の１が移動し、内腔分泌蛋白質または膜貫通型タンパク質のいずれかとして折り畳まれている。蛋白質は、カーゴのゴルジへの送達のための輸送小胞を生成するコンカテマー複合体ＩＩ（ＣＯＰＩＩ）機構によってＥＲから輸出される(Leeら, Annu. Rev Cell Dev. Biol. 20, 87 (2004))。また、ＥＲ関連フォールディング（ＥＲＡＦ）経路は、ＥＲ関連分解（ＥＲＡＤ）経路で調整され、それにより、ミスフォールドされた蛋白質は、細胞質ゾルのプロテアソーム系への移行のための標的とされる(Wegeleら, Rev Physiol Biochem Pharmacol 151, 1 (2004); Youngら, Trends Biochem. Sci. 28, 541 (2003))。
【０００６】
内腔または膜貫通のカーゴのいずれかの変異体が、適切に折り畳まれず、ＣＯＰＩＩ輸出機構に関与せず、ＥＲにおいて分解する結果、機能表現型を喪失する多数のミスフォールディング疾患を生じる。嚢胞性線維症（ＣＦ）は、ＥＲからのＣＦ膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ；多数の組織で裏打ちされた極性化上皮の頂端膜で見出された複数ドメインのｃＡＭＰ調節クロライドチャネル）の不完全なフォールディングおよび輸出が主として引き金となって起きた遺伝性小児疾患である(Riordan, Annu. Rev. Physiol. 67, 701 (2005))。ＣＦＴＲは、細胞質ゾル指向性ＮおよびＣ末端ドメインにより生合成的に分離した２つの膜貫通ドメイン（ＴＭＤ１および２）、ならびにチャネル・コンダクタンスを調節するＮＢＤ１、ＲおよびＮＢＤ２のドメインからなる。ＣＦＴＲの輸送は、フォールディングおよびＥＲからの輸出を指令するシャペロン(Amaral, J. Mol. Neurosci. 23, 41 (2004); Wangら, J. Struct. Biol. 146, 44 (2004))、ならびにトランスゴルジ(Chengら, J. Biol. Chem. 280, 3731 (2005))からの輸送および内細胞経路を介して再循環して、細胞表面での適切なレベルのクロライドチャネル活性を維持することを指令するアダプター蛋白質を含む(Gentzschら, Mol. Biol. Cell 15, 2684 (2004); Swiatecka-Urbanら, J. Biol. Chem. 280, 36762 (2005))。
【０００７】
９０％を超えるＣＦ患者は、重篤な形態の疾患に導くＣＦＴＲの細胞質ゾルＮＢＤ１ ＡＴＰ結合ドメインにおけるＰｈｅ ５０８欠失（ΔＦ５０８）の少なくとも１つの対立遺伝子を保有する。ΔＦ５０８は、ＥＲにおけるＣＦＴＲのフォールディングを崩壊させる(Quら, J. Bioenerg. Biomembr. 29, 483 (1997); Riordan, 前記)。ΔＦ５０８ ＮＢＤ１のフォールディングは、動力学的に障害されることが報告されている(Quら, 前記; Quら, J. Biol. Chem. 272, 15739 (1997); QuおよびThomas, J. Biol. Chem. 271, 7261 (1996))。フォールディングにおけるこのエネルギー的欠損の結果として、ΔＦ５０８がＥＲにおける野生型フォールディングを達成せず、ＣＯＰＩＩ  ＥＲ輸出機構に関与せず(Wangら, 前記)、ＥＲ関連分解（ＥＲＡＤ）のための標的とされる) (Nishikawaら, J Biochem (Tokyo) 137, 551 (2005))。かくして、ＣＦの処置におけるΔＦ５０８ ＣＦＴＲのミスフォールディングの結果を防止するためのいくらかの手段を提供することが望ましいであろう。
【０００８】
熱ショック蛋白質９０ ＡＴＰアーゼ１（Ａｈａ１）のアクチベーターは、Ｈｓｐ９０のＡＴＰアーゼ活性のアクチベーターであり、酵母Ｈｓｐ９０の遺伝性活性を１２倍、ヒトＨｓｐ９０を５０倍刺激できる(Panaretou, B.,ら, Mol. Cell 2002, 10:1307-1318)。生化学的試験は、Ａｈａ１がＨｓｐ９０の中央領域に結合することを示し(Panaretouら, 2002, 前記, Lotz, G. P.,ら, J. Biol. Chem. 2003, 278:17228-17235)、Ａｈａ１−Ｈｓｐ９０コア複合体に関する最近の構造的研究は、共同シャペロンが、触媒Ａｒｇ３８０を遊離し、Ｎ末端ヌクレオチド結合ドメインにおけるＡＴＰとのその相互作用を促進するＨｓｐ９０の中央セグメント触媒ループ(370-390)における立体構造スイッチを促進することを示唆する(Meyer, P.,ら, EMBO J. 2004, 23:511-519)。
【０００９】
分子シャペロン熱ショック蛋白質９０（Ｈｓｐ９０）は、特定のクライアント蛋白質のｉｎ ｖｉｖｏでの活性化または成熟を担う(Picard, D., Cell Mol. Life Sci. 2002, 59:1640-1648; Pearl, L. H.,およびProdromou, C., Adv. Protein Chem. 2002, 59:157-185; Pratt, W. B., および Toft, D. O., Exp. Biol. Med. 2003, 228:111-133; Prodromou, C., およびPearl, L. H., Curr. Cancer Drug Targets 2003, 3:301-323)。かかる活性化に重大であるのはＨｓｐ９０の本質的なＡＴＰアーゼ活性であり(Panaretou, B.,ら, EMBO J. 1998, 17:4829-4836)、それはＨｓｐ９０二量体内のＮ末端ヌクレオチド結合ドメインの一過性の会合に関与する立体配置サイクルを駆動する(Prodromou, C.,ら, EMBO J. 2000, 19:4383-4392)。
【００１０】
分子シャペロンとして、ＨＳＰ９０は成熟を促進し、多数の立体配置的に不安定なクライアント蛋白質の安定性を維持し、その大部分は、情報伝達、細胞周期進行およびアポトーシスのごとき腫瘍細胞内でしばしば崩壊する生物学的プロセスに関与する。結果的に、および他の分子標的治療学とは対照的に、ＨＳＰ９０のインヒビターは癌細胞内の多数の腫瘍形成性物質の同時の崩壊を通して有望な抗癌活性を達成する(Whitesell L,およびDai C., Future Oncol. 2005; 1:529-540; WO 03/067262)。さらに、ＨＳＰ９０は、嚢胞性線維症の膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）の分解に関係している。ＣＦＴＲ遺伝子における変異は、ＨＳＰ９０ ＡＴＰアーゼ活性の結果としての蛋白質の不完全なフォールディングおよびユビキチン化に導く。ユビキチン化に続いて、ＣＦＴＲがその活性部位に達することができる前に、分解される。次いで、活性ＣＦＴＲの欠乏は、かかる変異を有するヒト対象における嚢胞性線維症の発生に導く。従って、ＨＳＰ９０活性の阻害は癌または嚢胞性線維症に苦しむ対象に有益であり得る。
【００１１】
Ｈｓｐ９０は、合計の細胞蛋白質の約１〜２％を構成し(Pratt, W. B., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1997, 37:297-326)、アンタゴニストまたはインヒビターによるかかる多量の蛋白質の阻害は、潜在的に細胞への過剰量のインヒビターまたはアンタゴニストの導入を必要とするであろう。別法のアプローチは、より少量で存在するＡｈａ１のごときＨＳＰ９０のＡＴＰアーゼ活性のアクチベーターの阻害である。細胞に存在するＡｈａ１の量のダウンレギュレートにより、ＨＳＰ９０の活性は実質的に低下し得る。
【００１２】
かなりの配列相同性は、ヒト（ＮＭ＿０１２１１１.１）、ハツカネズミ（ＮＭ＿１４６０３６.１）およびチンパンジー（ＸＭ＿５１００９４.１）Ａｈａ１の間に存在する。Ａｈａ１の明確なラットホモログは同定されていない；しかしながら、酵母Ａｈｓａ ２に対するその配列相同性に基づいて、熱ショック蛋白質ＡＴＰアーゼ同族体２（Ａｈｓａ ２）のアクチベーターと名付けられたラット（ＸＭ＿２２３６８０.３）遺伝子がある。その配列はｍｕｓ筋ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ  １１１００６４Ｐ０４遺伝子（ＮＭ＿１７２３９１.３）に相同性であり、それは今度はＮ末端切断を除いたＡｕｓ筋Ａｈａ１に対して配列において類似する。また、ヒトのＡｈｓａ ２（ＮＭ＿１５２３９２.１）は予測されたが、配列相同性は限られている。これらの後者の３つの遺伝子の機能は十分には解明されていない。しかしながら、上記の配列のすべてが同一であり、ＲＮＡｉ作用物質についての標的として用い得る１つの領域が存在する。１以上のＡｈａ遺伝子の活性を抑制することは有利であり得る。
【００１３】
最近、ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られた、高度に保存された調節機構における遺伝子発現をブロックすることが示された。ＷＯ９９／３２６１９（Fireら）は、Ｃ.ｅｌｅｇａｎｓにおける遺伝子の発現を阻害する少なくとも２５ヌクレオチド長のｄｓＲＮＡの使用を開示する。また、ｄｓＲＮＡは、植物(例えば、WO 99/53050, Waterhouseら;および WO 99/61631, Heifetzら参照)、ショウジョウバエ (例えば、Yang, D.,ら, Curr. Biol.  (2000) 10:1191-1200参照)ならびに哺乳動物(WO 00/44895, Limmer;およびDE 101 00 586.5, Kreutzerら参照)を含めた他の生物における標的ＲＮＡを分解することが示された。この自然の機構は、今や、遺伝子の異常または望ましくない調節によって引き起こされた障害を処置する新しいクラスの医薬作用物質の開発についての焦点になっている。
【００１４】
ＲＮＡｉの分野における著しい進歩、およびＨＳＰ９０により媒介された病理学的過程の処置における進歩にもかかわらず、例えば、細胞自身のＲＮＡｉ機構を用いることにより、選択的でかつ効率的にＨＳＰ９０ ＡＴＰアーゼ活性を減弱できる作用物質の必要性が残っている。かかる作用物質は、Ａｈａ発現、例えば、Ａｈａ１発現により直接的または間接的に媒介された病理学的過程の処置における使用のために、高い生物活性およびｉｎ ｖｉｖｏでの安定性の双方を所有でき、Ａｈａ１のごとき標的Ａｈａ遺伝子の発現を有効に阻害し得る。また、かかる作用物質は、機能的Ａｈａ１蛋白質の活性、例えば、熱ショック蛋白質ＡＴＰアーゼアクチベーター活性を有効に阻害し得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、一般的に蛋白質のミスフォールディング疾患の処置方法に関する。特に、本発明は、熱ショック蛋白質９０ＡＴＰアーゼ（Ａｈａ）の遺伝子アクチベーターのモジュレーターを用いる処置方法に関係する。例えば、本発明は、Ａｈａの発現をダウンレギュレートする二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を投与することによって所望ではないＡｈａ活性と関連した障害を処置するための組成物および方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
従って、本発明者は、機能的Ａｈａ１、熱ショック蛋白質（Ｈｓｐ）共同シャペロンおよびＡＴＰアーゼアクチベーターのレベルの減少の結果、ＣＦに関連するＣＦＴＲのΔＦ５０８変異体をエネルギー的に安定化できるという発見において成功した。これは、ΔＦ５０８のフォールディング、輸送および機能のレスキューを生じる。
【００１７】
かくして、本発明は、蛋白質ミスフォールディングに起因する疾患を処置するための組成物および方法を含む。この組成物は、一般的に、細胞における機能的Ａｈａ蛋白質発現を阻害するｄｓＲＮＡ、ベクター、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、小分子、抗体、アンチセンス核酸、アプタマー、リボザイムおよびそのいずれかの組合せを含むことができる。
【００１８】
例えば、ｄｓＲＮＡはセンス鎖およびアンチセンス鎖を含むことができ、該アンセンス鎖は、Ａｈａ標的配列に実質的に相補的な配列を有する相補性領域を含み、該標的配列は３０ヌクレオチド未満の長さであり、該センス鎖は、該アンチセンス鎖に実質的に相補的であり、該ｄｓＲＮＡは、機能的Ａｈａ蛋白質を発現する細胞との接触に際して、蛋白質発現を少なくとも２０％阻害する。
【００１９】
様々な態様において、Ａｈａ標的配列は、配列番号：１２〜５６よりなる群から選択される配列を含むことができる。もう一つの態様において、ｄｓＲＮＡは、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：６１、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６７、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７３、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３、配列番号：１０５、配列番号：１０７、配列番号：１０９、配列番号：１１１、配列番号：１１３、配列番号：１１５、配列番号：１１７、配列番号：１１９、配列番号：１２１、配列番号：１２３、配列番号：１２５、配列番号：１２７、配列番号：１２９、配列番号：１３１、配列番号：１３３、配列番号：１３５、配列番号：１３７、配列番号：１３９、配列番号：１４１、配列番号：１４３および配列番号：１４５よりなる群から選択される配列を有するセンス鎖；ならびに
配列番号：５８、配列番号：６０、配列番号：６２、配列番号：６４、配列番号：６６、配列番号：６８、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７４、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００、配列番号：１０２、配列番号：１０４、配列番号：１０６、配列番号：１０８、配列番号：１１０、配列番号：１１２、配列番号：１１４、配列番号：１１６、配列番号：１１８、配列番号：１２０、配列番号：１２２、配列番号：１２４、配列番号：１２６、配列番号：１２８、配列番号：１３０、配列番号：１３２、配列番号：１３４、配列番号：１３６、配列番号：１３８、配列番号：１４０、配列番号：１４２、配列番号：１４４および配列番号：１４６よりなる群から選択される配列を有するそのセンス鎖に相補的なアンチセンス鎖を含むことができる。
【００２０】
もう一つの例において、細胞における機能的Ａｈａ１発現を阻害するｓｈＲＮＡを発現するためのベクターは、センス鎖、ヘアピンリンカーおよびアンチセンス鎖を含むことができる。様々な態様において、センス鎖は、Ａｈａ標的配列に実質的に相補的な配列を有する相補性領域を含むことができ、該標的配列は３０ヌクレオチド未満の長さであり、アンチセンス鎖は、該センス鎖に実質的に相補的であることができ、ｄｓＲＮＡは、機能的Ａｈａ蛋白質を発現する細胞との接触に際して、機能的Ａｈａ蛋白質発現を少なくとも２０％阻害できる。様々な態様において、Ａｈａ標的配列は、配列番号：１２〜５６よりなる群から選択される配列を含むことができる。もう一つの態様において、ベクターは、配列番号：１４７、配列番号：１４９および配列番号：１５１よりなる群から選択される配列を有するセンス鎖；配列番号：１４８、配列番号：１５０および配列番号：１５２からなる群から選択される配列を有するアンチセンス鎖を含むことができる。
【００２１】
もう一つの例において、細胞における機能的Ａｈａ１蛋白質発現を阻害するｓｈＲＮＡは、Ａｈａ標的配列に実質的に相補的な配列を有する相補性領域を含むことができ、該標的配列は３０ヌクレオチド未満の長さであり、該ｓｈＲＮＡは、機能的Ａｈａ蛋白質を発現する細胞との接触に際して、機能的Ａｈａ蛋白質発現を少なくとも２０％阻害する。様々な態様において、Ａｈａ標的配列は、配列番号：１２〜５６よりなる群から選択される配列を含むことができる。もう一つの態様において、ｓｈＲＮＡは、配列番号：１５３、配列番号：１５４および配列番号：１５５よりなる群から選択される配列を含むことができる；
【００２２】
また、本発明は、ｄｓＲＮＡ、ベクターおよび／またはｓｈＲＮＡを含む細胞または細胞集団を提供する。
【００２３】
もう一つの例において、抗体は、機能的Ａｈａ１、機能的Ａｈａ１のためのＨｓｐ９０ ＡＴＰアーゼ結合部位および／または機能的Ａｈａ１−Ｈｓｐ９０ ＡＴＰアーゼ複合体に特異的に結合できる。
【００２４】
さらにもう一つの例において、作用物質は、小分子、抗体、アンチセンス核酸、アプタマー、ｄｓＲＮＡおよびリボザイムのいずれかの組合せを含むことができる。
【００２５】
また、本発明は、蛋白質のミスフォールディングに関連した疾患を処置する方法を提供する。その方法は、機能的Ａｈａ１蛋白質の細胞内レベルを減少させる治療上有効な量の少なくとも１つの作用物質をそれを必要とする対象に投与することを含むことができる。様々な態様において、作用物質は、小分子、抗体、アンチセンス核酸、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、リボザイムおよびその組合せよりなる群から選択できる。様々な態様において、その疾患は嚢胞性線維症（ＣＦ）およびマルファン症候群、ファブリー病、ゴーシェ病、網膜色素変性症３、アルツハイマー病、ＩＩ型糖尿病、パーキンソン病およびクロイツフェルト−ヤコブ病を含むことができる。もう一つの態様において、ミスフォールドされた蛋白質は、ミスフォールドされたＣＦＴＲであり得る。さらにもう一つの態様において、ミスフォールドされた蛋白質はΔＦ５０８蛋白質であり得る。
【００２６】
また、その方法は、治療上有効な量の機能的Ａｈａ１発現の少なくとも１つのｄｓＲＮＡインヒビターをそれを必要とする対象に投与することを含むことができ、該ｄｓＲＮＡはセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。様々な態様において、アンチセンス鎖は、Ａｈａ標的配列に実質的に相補的な配列を有する相補性領域を含むことができ、該標的配列は３０ヌクレオチド未満の長さであり、センス鎖は、該アンチセンス鎖に実質的に相補的であり、ｄｓＲＮＡは、機能的Ａｈａ蛋白質を発現する細胞との接触に際して、機能的Ａｈａ蛋白質発現を少なくとも２０％阻害する。様々な態様において、その疾患は、嚢胞性線維症（ＣＦ）、マルファン症候群、ファブリー病、ゴーシェ病、網膜色素変性症３、アルツハイマー病、ＩＩ型糖尿病、パーキンソン病およびクロイツフェルト−ヤコブ病を含むことができる。もう一つの態様において、ミスフォールドされた蛋白質はミスフォールドされたＣＦＴＲであり得る。さらにもう一つの態様において、ミスフォールドされた蛋白質はΔＦ５０８蛋白質であり得る。
【００２７】
また、方法は、治療上有効な量の機能的Ａｈａ１発現の少なくとも１つのｄｓＲＮＡインヒビターをそれを必要とする対象に投与することを含むことができる。様々な態様において、ｄｓＲＮＡインヒビターは、ａ）約１９ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドのセンス鎖配列および約１９ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドのアンチセンス鎖配列を含むｄｓＲＮＡ；およびｂ）機能的Ａｈａ１以外のいずれかの遺伝子もしくはｍＲＮＡの５'非翻訳領域、３'非翻訳領域、イントロンまたはエキソンを含むコンティグ配列に同一の１５個以下のコンティグヌクレオチドを含むセンス鎖配列またはアンチセンス鎖配列に基づいて選択された配列を含む。様々な態様において、その疾患は、嚢胞性線維症（ＣＦ）、マルファン症候群、ファブリー病、ゴーシェ病、網膜色素変性症３、アルツハイマー病、ＩＩ型糖尿病、パーキンソン病およびクロイツフェルト−ヤコブ病を含むことができる。もう一つの態様において、ミスフォールドされた蛋白質はミスフォールドされたＣＦＴＲであり得る。さらにもう一つの態様において、ミスフォールドされた蛋白質はΔＦ５０８蛋白質であり得る。
【００２８】
また、本発明方法は、蛋白質のミスフォールディングに関連した疾患を処置する作用物質をスクリーニングすることを含むことができる。様々な態様において、その方法は、機能的Ａｈａ１を発現する細胞または細胞集団を供し；候補作用物質をその細胞または細胞集団に投与し；細胞または細胞集団における機能的Ａｈａ１活性を定量し；次いで、候補作用物質が細胞または細胞集団における機能的Ａｈａ１活性を減少させるかを決定し、それにより、機能的Ａｈａ１活性の減少が、蛋白質のミスフォールディングの低減を示すことを含むことができる。様々な態様において、候補作用物質は機能的Ａｈａ１発現を阻害するｄｓＲＮＡであり得る。もう一つの態様において、ｄｓＲＮＡは、ａ）約１９ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドの配列、およびｂ）Ａｈａ遺伝子もしくはｍＲＮＡ以外のいずれかの遺伝子もしくはｍＲＮＡの５'非翻訳領域、３'非翻訳領域、イントロンまたはエキソンを含むコンティグ配列と同一の１５個以下のコンティグヌクレオチドを含む配列を含むことができる。様々な態様において、Ａｈａ遺伝子もしくはｍＲＮＡは、ヒトＡｈａ遺伝子もしくはｍＲＮＡである。もう一つの態様において、その疾患は、嚢胞性線維症（ＣＦ）、マルファン症候群、ファブリー病、ゴーシェ病、網膜色素変性症３、アルツハイマー病、ＩＩ型糖尿病、パーキンソン病およびクロイツフェルト−ヤコブ病よりなる群から選択できる。もう一つの態様において、ミスフォールドされた蛋白質は、ミスフォールドされたＣＦＴＲ、ミスフォールドされたフィブリリン、ミスフォールドされたアルファ・ガラクトシダーゼ、ミスフォールドされたベータ・グルコセレブロシダーゼ、ミスフォールドされたロドプシン、凝集アミロイド・ベータおよびタウ、凝集アミリン、凝集アルファ・シヌクレインならびに凝集プリオンよりなる群から選択される。さらにもう一つの態様において、ミスフォールドされた蛋白質はミスフォールドされたＣＦＴＲであり得る。そして、もう一つの態様において、ミスフォールドされた蛋白質はΔＦ５０８蛋白質であり得る。
【００２９】
また、スクリーニング方法は、機能的Ａｈａ１を発現する細胞または細胞集団を供し；候補作用物質をその細胞または細胞集団に投与し；細胞または細胞集団におけるＨｓｐ９０／ＡＤＰ複合体、Ｈｓｐ９０／ＡＴＰ複合体またはその組合せを定量し；次いで、候補作用物質が細胞または細胞集団におけるＨｓｐ９０／ＡＤＰ複合体、Ｈｓｐ９０／ＡＴＰ複合体またはその組合せを減少させるかを決定し、それにより、Ｈｓｐ９０／ＡＤＰ複合体またはＨｓｐ９０／ＡＴＰ複合体の量における減少が、蛋白質のミスフォールディングの低減を示すことを含むことができる。様々な態様において、候補作用物質は機能的Ａｈａ１発現を阻害するｄｓＲＮＡであり得る。もう一つの態様において、ｄｓＲＮＡは、ａ）約１９ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドの配列；ｂ）その配列は、Ａｈａ遺伝子もしくはｍＲＮＡ以外のいずれかの遺伝子もしくはｍＲＮＡの５'非翻訳領域、３'非翻訳領域、イントロンまたはエキソンを含むコンティグ配列に同一の１５個以下のコンティグヌクレオチドを含むことを含むことができる。さらにもう一つの態様において、Ａｈａ遺伝子もしくはｍＲＮＡはヒトＡｈａ遺伝子もしくはｍＲＮＡであり得る。様々な態様において、その疾患は、嚢胞性線維症（ＣＦ）、マルファン症候群、ファブリー病、ゴーシェ病、網膜色素変性症３、アルツハイマー病、ＩＩ型糖尿病、パーキンソン病およびクロイツフェルト−ヤコブ病よりなる群から選択できる。もう一つの態様において、ミスフォールドされた蛋白質は、ミスフォールドされたＣＦＴＲ、ミスフォールドされたフィブリリン、ミスフォールドされたアルファ・ガラクトシダーゼ、ミスフォールドされたベータ・グルコセレブロシダーゼ、ミスフォールドされたロドプシン、凝集アミロイド・ベータおよびタウ、凝集アミリン、凝集アルファ・シヌクレインならびに凝集プリオンよりなる群から選択できる。さらにもう一つの態様において、ミスフォールドされた蛋白質はミスフォールドされたＣＦＴＲであり得る。もう一つの態様において、ミスフォールドされた蛋白質はΔＦ５０８蛋白質であり得る。
【００３０】
本教示のこれらおよび他の特徴、態様および利点は、以下の記載、実施例および添付された特許請求の範囲を参照して一層よく理解されるであろう。
【００３１】
（図面）
当業者ならば、以下に記載された図面が例示的な目的だけのものであることを理解するであろう。図面は、何ら本教示の範囲を制限するようには意図されない。
【００３２】
図１．ＣＦＴＲ インタラクトームの描写。
図２．（Ａ）ＥＲフォールディングネットワークの描写、および（Ｂ）ＷＴおよびΔＦ５０８を発現する細胞における蛋白質発現レベルを示す免疫ブロット。
図３．ΔＦ５０８のフォールディングおよびＥＲからの輸出に対するＨｓｐ９０共同シャペロンｐ２３の効果を示す一連の棒グラフ。
図４．ΔＦ５０８のフォールディングおよびＥＲからの輸出に対するＨｓｐ９０共同シャペロンＦＫＢＰ８の効果を示す一連の棒グラフ。
図５．ΔＦ５０８のフォールディングおよびＥＲからの輸出に対するＨｓｐ９０共同シャペロンＨＯＰの効果を示す一連の棒グラフ。
図６．細胞表面へのΔＦ５０８輸出が、機能的Ａｈａ１のダウンレギュレーションによってレスキューできることを示す一連の棒グラフ。
図７．ＣＦＢＥ４１ｏ−細胞系によるヨウ化物流出に対するｄｓＲＮＡ Ａｈａ１の効果を示す線および散布図ならびに棒グラフ。
図８．ＣＦＴＲフォールディングを指令するＨｓｐ９０シャペロン／共同シャペロン相互作用の一連の描写。
図９．Ｈｓｐ９０に対するｄｓＲＮＡ Ａｈａ１の効果の（免疫ブロットを用いた）例図。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
（略語および定義）
本発明についての理解を促進するために、本明細書に用いられた多数の用語および略語は、以下のように定義される：
【００３４】
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、「Ｔ」および「Ｕ」（大文字または小文字で書かれたかに関係なく）は、各々、一般的に、塩基としてグアニン、シトシン、アデニン、チミンおよびウラシルを含むヌクレオチドを表わす。しかしながら、「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」なる用語も、以下にさらに詳述される改変されたヌクレオチド、あるいは代替用置換部分をいうことができることが理解されるであろう。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、チミンおよびウラシルが、かかる置換部分を担うヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対合特性を実質的に改変することなく、他の部分と置換し得ることをよく知っている。例えば、限定なくして、その塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシンまたはウラシルを含むヌクレオチドと塩基対合し得る。従って、ウラシル、グアニンまたはアデニンを含むヌクレオチドは、本発明のヌクレオチド配列において、例えば、イノシンを含むヌクレオチドにより置換し得る。
【００３５】
本明細書に用いた「機能的Ａｈａ１蛋白質」または「機能的Ａｈａ１」は、熱ショック蛋白質ＡＴＰアーゼアクチベーター活性を有するヒトＡｈａ１ポリペプチド（配列番号：４）、ならびに熱ショック蛋白質ＡＴＰアーゼアクチベーター活性を有するＡｈａ１に関係する分子を含むことを意図する。ヒトＡｈａ１に関係するかかる分子は、熱ショック蛋白質ＡＴＰアーゼアクチベーター活性ならびに機能的Ａｈａ１に対して少なくとも８０％の相同性を有するポリペプチドを含む。例えば、関連分子は、ヒトＡｈａ１に対して８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有することができ、かつ熱ショック蛋白質ＡＴＰアーゼアクチベーター活性を有することができる。かかる分子は、例えば、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７および配列番号：８を含むことができる。加えて、ヒトＡｈａ１に関係するかかる分子は、より長いかまたはより短いアミノ酸配列を有し、かつ熱ショック蛋白質ＡＴＰアーゼアクチベーター活性を有するポリペプチドを含む。
【００３６】
熱ショック蛋白質ＡＴＰアーゼ・アクチベーター活性は、標準アッセイを用いて、例えば、Ｈｓｐ９０による無機リン酸（Ｐｉ）の生成を測定することにより決定し得る。Ｐｉ生成は、例えば、リポーター分子の生成または消耗を測定または判定することにより決定し得る。かかる１つの方法はピルビン酸キナーゼ／乳酸脱水素酵素結合アッセイを用いて、再生ＡＴＰアーゼアッセイを利用し、ここに、Ｐｉの生成は、分光光度的に測定できる(Aliら, Biochemistry (1993) 32:2717-2724)。他の分光光度法は、Lanzettaら (1979) Anal. Biochem. 100, 95-97; Lillら, (1990) Cell 60, 271-280;および Coganら, Anal. Biochem. (1999) 271:29-35によって記載されたものを含む。当業者は、熱ショック蛋白質ＡＴＰアーゼアクチベーター活性を測定する他の方法を認識しているであろう。
【００３７】
本明細書に用いた「Ａｈａ遺伝子」とは、機能的Ａｈａ１蛋白質を発現できる熱ショック蛋白質９０ ＡＴＰアーゼ遺伝子のアクチベーターをいう。「Ａｈａ１」とは、熱ショック蛋白質９０ ＡＴＰアーゼ遺伝子のアクチベーターをいい、その非網羅的な例は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿０１２１１１.１（ヒト）、ＮＭ＿１４６０３６.１（ハツカネズミ）およびＸＭ＿５１００９４.１（チンパンジー）下に見出される。
【００３８】
本明細書に用いた「標的配列」とは、第１次転写産物のＲＮＡプロセシングの生成物であるｍＲＮＡを含めた、Ａｈａ遺伝子の転写の間に形成されたｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の近接部分をいう。本発明のいずれの所与のＲＮＡｉ作用物質の標的配列も、かかる配列に対するＲＮＡｉ作用物質のアンチセンス鎖の相補性によりＲＮＡｉ作用物質によって標的とされ、それに対してアンチセンス鎖が、そのｍＲＮＡと接触させた場合にハイブリダイズし得るＸヌクレオチドのｍＲＮＡ配列を意味し、ここに、Ｘは、アンチセンス鎖におけるヌクレオチド数＋、もしあれば、センス鎖の単鎖の突出におけるヌクレオチド数である。
【００３９】
本明細書に用いた「配列を含む鎖」なる用語は、標準ヌクレオチド命名法を用いて参照された配列によって記載されたヌクレオチドの鎖を含むオリゴヌクレオチドをいう。
【００４０】
特記されない限りは、本明細書に用いた「相補的」なる用語は、当業者によって理解されるように、第２のヌクレオチド配列に関して第１のヌクレオチド配列を記載するために用いた場合、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと、ある条件下にて、ハイブリダイズし、二重鎖構造を形成するための第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの能力をいう。例えば、ストリンジェントな条件が、４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ  ｐＨ  ６.４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２〜１６時間に続いての洗浄を含み得る場合に、かかる条件はストリンジェントな条件であり得る。生物内部で遭遇し得る生理学上適切な条件のごとき他の条件を適用できる。当業者は、ハイブリダイズされたヌクレオチドの最終的適用により２つの配列の相補性のテストに最も適当な条件のセットを決定できるであろう。
【００４１】
これは、第１および第２のヌクレオチド配列の全長にわたる第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに対する第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの塩基対合を含む。かかる配列は、本明細書において相互に関して「十分に相補的」ということができる。しかしながら、第１の配列が本明細書で第２の配列に関して「実質的に相補的」という場合、その２つの配列は十分に相補的であり得るか、またはそれらは、それらの最終的な適用に最も関連する条件下でハイブリダイズする能力を保持しつつ、ハイブリダイゼーションに際して、１個以上、しかし一般的には４、３または２個以下のミスマッチした塩基対を形成し得る。しかしながら、２つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーションに際して、１以上の単鎖の突出を形成するように設計された場合、かかる突出は、相補性の決定に関してミスマッチと見なされないであろう。例えば、１つの２１ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドおよび２３ヌクレオチド長のもう一つのオリゴヌクレオチドを含み、ここに、より長いオリゴヌクレオチドは、より短いオリゴヌクレオチドに十分に相補的である２１ヌクレオチドの配列を含むｄｓＲＮＡは、本発明の目的のために「十分に相補的」とさらにいうことができる。
【００４２】
また、本明細書に用いた「相補的」配列は、ハイブリダイズするそれらの能力に関しての上記の必要条件が満たされる限りは、非ワトソンクリック塩基対および／または非天然および改変されたヌクレオチドから形成された塩基対を含み得るか、またはそれらから完全に形成され得る。
【００４３】
本明細書中の「相補的」、「十分に相補的」および「実質的に相補的」なる用語は、それらの使用の文脈から理解されるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖間、またはｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖および標的配列間の塩基対合に関して用い得る。
【００４４】
本明細書に用いた、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の「少なくとも一部分に実質的に相補的」であるポリヌクレオチドとは、注目するｍＲＮＡ（例えば、コード化Ａｈａ１）の近接部分に実質的に相補的であるポリヌクレオチドをいう。例えば、ポリヌクレオチドは、配列がｍＲＮＡコード化Ａｈａ１の中断されていない部分に実質的に相補的であるならば、Ａｈａ１  ｍＲＮＡの少なくとも一部分に相補的である。
【００４５】
本明細書に用いた「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」なる用語は、前記に定義されるように、２つの逆平行および実質的に相補的な核酸鎖を含む二重鎖構造を有するリボ核酸分子の複合体をいう。二重鎖構造を形成する２つの鎖は、１つのより大きなＲＮＡ分子の異なる部分であり得るか、またはそれらは別々のＲＮＡ分子であり得る。その２つの鎖が１つのより大きな分子の一部分であり、従って、二重鎖構造を形成する一方の鎖の３'終端および他方の鎖の５'終端間のヌクレオチドの中断されない鎖によって連結される場合、その連結しているＲＮＡ鎖を「ヘアピンループ」といい、その全体構造を「ショートヘアピンＲＮＡ」または「ｓｈＲＮＡ」という。その２つの鎖が、二重鎖構造を形成する一方の鎖の３'末端およびそれぞれの他方の鎖の５'末端間でヌクレオチドの中断されない鎖以外の手段によって共有結合で連結される場合、連結している構造を「リンカー」という。様々な態様において、リンカーは、配列ＡＵＧ、ＣＣＣ、ＵＵＣＧ、ＣＣＡＣＣ、ＣＴＣＧＡＧ、ＡＡＧＣＵＵ、ＣＣＡＣＡＣＣおよびＵＵＣＡＡＧＡＧＡを含むことができる。ＲＮＡ鎖は、同一または異なる数のヌクレオチドを有し得る。塩基対の最大数は、二重鎖で存在するいずれかの突出を引いたｄｓＲＮＡの最短の鎖におけるヌクレオチド数である。二本鎖構造に加えて、ｄｓＲＮＡは１以上のヌクレオチド突出を含み得る。
【００４６】
本明細書に用いた「ヌクレオチド突出」とは、ｄｓＲＮＡの一方の鎖の３'末端が他方の鎖の５'末端を超えて伸びる、または逆である場合のｄｓＲＮＡの二重鎖構造から突き出る、不対合のヌクレオチドまたはヌクレオチド群をいう。「平滑末端化（blunt）」または「平滑末端」は、ｄｓＲＮＡのその終端にて不対合のヌクレオチドが存在しない（すなわち、ヌクレオチド突出がない）ことを意味する。１つの「平滑末端化」ｄｓＲＮＡは、その分子のいずれの終端にもヌクレオチド突出を有していないｄｓＲＮＡである。
【００４７】
「アンチセンス鎖」なる用語は、標的配列に実質的に相補的である領域を含むｄｓＲＮＡの鎖をいう。本明細書に用いた「相補性領域」なる用語は、本明細書に規定されるように、配列、例えば、標的配列に実質的に相補的であるアンチセンス鎖上の領域をいう。相補性領域が標的配列に十分に相補性でない場合に、ミスマッチは、末端領域で最も許容され、存在するならば、例えば、５'および／または３'末端の６、５、４、３または２個のヌクレオチド内の末端領域または領域群内に一般的にある。本発明のある態様において、ミスマッチは、アンチセンス鎖の５'末端および／またはセンス鎖の３'末端の６、５、４、３または２個のヌクレオチド内で位置できる。。
【００４８】
本明細書に用いた「センス鎖」なる用語は、アンチセンス鎖の領域に実質的に相補的である領域を含むｄｓＲＮＡの鎖をいう。
【００４９】
「細胞へ導入する」ことは、ｄｓＲＮＡを参照する場合、当業者によって理解されるように、細胞への取り込みまたは吸収を促進することを意味する。ｄｓＲＮＡの吸収または取り込みは、援助のない拡散性または能動的な細胞プロセスを介して、または補助剤またはデバイスによって生じることができる。この用語の意味は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞に限定されず；また、ｄｓＲＮＡは、「細胞に導入」でき、ここに、その細胞は生体系の一部である。かかる例において、細胞への導入は、生物への送達を含むであろう。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでの送達について、ｄｓＲＮＡを組織部位に注入するか、または全身投与できる。細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏでの導入は、エレクトロポレーションおよびリポフェクションのごとき当該技術分野に知られた方法を含む。
【００５０】
本明細書に用いた「レベルを減少させる、減少したレベル、またはレベルの減少」なる用語は、Ａｈａ１熱ショック蛋白質ＡＴＰアーゼ・アクチベーター活性を阻害し、細胞における機能的Ａｈａ１蛋白質の量を低減させることを含むことが意図される。例えば、抗体またはｄｓＲＮＡは、細胞からＡｈａ１蛋白質を取り出すことなく、熱ショック蛋白質ＡＴＰアーゼアクチベーター活性に干渉するか、その活性を沈黙させることによって機能的Ａｈａ１蛋白質のレベルを減少できる。もう一つの例において、リボザイムは、機能的Ａｈａ１蛋白質を切断して、細胞中の全体のＡｈａ１蛋白質の量を低下できる。もう一つの例において、ｄｓＲＮＡは、Ａｈａ遺伝子、例えば、Ａｈａ１遺伝子の発現を沈黙させて、そのＡｈａ遺伝子から転写したｍＲＮＡの量を低下できる。
【００５１】
本明細書において、Ａｈａ遺伝子、例えば、Ａｈａ１遺伝子を参照する限りは、「沈黙」および「の発現を阻害する」なる用語は、第１の細胞または細胞群に実質的に同一であるが、そのように処置されなかった第２の細胞または細胞群（対照細胞）に比較した、Ａｈａ遺伝子が転写され、Ａｈａ遺伝子の発現が阻害されるように処置された第１の細胞または細胞群から単離し得るＡｈａ遺伝子から転写されたｍＲＮＡ量の低減により明示されるような、Ａｈａ遺伝子、例えば、Ａｈａ１遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制をいう。本発明の様々な態様において、細胞はＨｅＬａまたはＭＬＥ１２細胞であり得る。阻害の程度は、通常、
【００５２】
【数１】
2009537179.tif 000003
【００５３】
によって表現される。
【００５４】
別法として、阻害の程度は、Ａｈａ遺伝子転写に機能的に連結されるパラメーター、例えば、細胞により分泌されたかまたはかかる細胞の溶解後の溶液中で判明したＡｈａ遺伝子によりコードされた蛋白質の量の低減、あるいはある種の表現型、例えば、アポトーシスまたは細胞表面ＣＦＴＲを示す細胞数により与えることもできる。原理的には、Ａｈａ遺伝子サイレンシングは、構成的にまたはゲノムエンジニアリングによるのいずれか、およびいずれかの適当なアッセイ方法により、その標的を発現するいずれの細胞においても決定し得る。しかしながら、所与のｄｓＲＮＡがＡｈａ遺伝子の発現をある程度阻害するかどうかを判断するために参照が必要であり、従って、参照が本発明により包含される場合には、以下の実施例に供されたアッセイ方法は、かかる参照として機能するであろう。
【００５５】
例えば、ある例において、Ａｈａ遺伝子、例えば、Ａｈａ１遺伝子の発現は、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与により、少なくとも約２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％または５０％抑制される。様々な態様において、Ａｈａ遺伝子、例えば、Ａｈａ１遺伝子は、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与により、少なくとも約５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％または８０％抑制される。様々な態様において、Ａｈａ遺伝子、例えば、Ａｈａ１遺伝子は、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与により、少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％抑制される。
【００５６】
Ａｈａ発現、例えば、Ａｈａ１発現の文脈において本明細書に用いた「処置する」、「処置」等の用語は、Ａｈａ発現により媒介された病理学的過程を除去することまたはその病理学的過程の軽減をいう。（Ａｈａ発現により媒介された病理学的過程以外の）以下の本明細書において引用されたいずれかの他の条件に関連する範囲での本発明の文脈において、「処置する」、「処置」等の用語は、かかる疾患に関連した少なくとも１つの症状を軽減または緩和すること、あるいはかかる疾患の進行を遅延または逆転させることを意味する。
【００５７】
本明細書に用いた「治療上有効な量」および「予防上有効な量」なる語句は、Ａｈａ発現により媒介された病理学的過程、またはＡｈａ発現により媒介された病理学的過程の明白な症状の治療、予防または管理における治療上の利益を提供する量をいう。治療上有効である特定の量は通常の医師により容易に決定でき、例えば、Ａｈａ発現により媒介された病理学的過程のタイプ、患者の病歴および年齢、Ａｈａ発現により媒介された病理学的過程のステージ、およびＡｈａ発現により媒介された他の抗病理学的過程の管理のごとき当該技術分野において知られた因子に依存して変更し得る。
【００５８】
本明細書に用いた「医薬組成物」は、薬理学的に有効な量のｄｓＲＮＡおよび医薬上許容される担体を含む。本明細書に用いた「薬理学的に有効な量」、「治療上有効な量」または単に「有効量」とは、意図した薬理学的、治療上または予防上の結果を生成するのに有効なＲＮＡの量をいう。例えば、疾患または障害に関係した測定可能なパラメーターにおいて少なくとも２５％の低減がある場合に、所与の臨床的処置が有効と考えるならば、その疾患または障害の処置のための薬物の治療上有効な量は、少なくともそのパラメーターにおいて２５％の低下を達成するのに必要な量である。
【００５９】
「医薬上許容される担体」なる用語とは、治療剤の投与のための担体をいう。かかる担体は、限定されるものではないが、セーライン、緩衝セーライン、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびその組合せ含む。その用語は特に細胞培養培地を除外する。経口投与される薬物について、医薬上許容される担体は、限定されるものではないが、不活性の希釈剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、甘味剤、矯味剤、着色剤および保存剤のごとき医薬上許容される賦形剤を含む。適当な不活性希釈剤は、炭酸ナトリウムおよび炭酸カルシウム、リン酸ナトリウムおよびリン酸カルシウムならびにラクトースを含み、一方、トウモロコシデンプンおよびアルギン酸は適当な崩壊剤である。結合剤はデンプンおよびゼラチンを含むこともでき、一方、滑沢剤は、存在するならば、一般的にはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクであろう。所望ならば、錠剤は胃腸管における吸収を遅延させるために、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルのごとき物質で被覆し得る。
【００６０】
本明細書に用いた「形質転換細胞」は、その中にベクターが導入され、ｄｓＲＮＡ分子を発現し得る細胞である。
【００６１】
蛋白質ミスフォールディングの処置
本発明は、機能的Ａｈａ１蛋白質（例えば、配列番号：４）および／または同様の機能を持った他の関連分子のレベルを減少させることによる、ミスフォールディング疾患の処置のための方法、ならびに蛋白質ミスフォールディング疾患の処置に有用な作用物質のスクリーニングのための方法を提供する。
【００６２】
本明細書に記載された技術は、部分的に、機能的Ａｈａ１、Ｈｓｐ９０ ＡＴＰアーゼアクチベーターのレベルの減少が、細胞表面への輸送のためのＣＯＰＩＩ輸出機構にアクセス可能な折り畳み状態における５０８でのフェニルアラニン欠失により特徴付けられる、ＣＦＴＲ（配列番号：１のＣＦＴＲ ｍＲＮＡ；配列番号：２のＣＦＴＲポリペプチド）の変異体のΔＦ５０８（配列番号：３のΔＦ５０８ポリペプチド）を著しく安定化できるという観察に基づいている。本明細書に記載された種々の処置の戦略は、対象における機能的Ａｈａ１、同様の機能を持つ他の関連分子のダウンレギュレーション、変異体ＣＦＴＲミスフォールディングのサルベージ、細胞表面に対するＨｓｐ９０を媒介とした輸送のレスキュー、ならびにチャンネル機能の少なくとも部分的な修復に指向される。
【００６３】
機能的Ａｈａ１を減少させる作用物質
機能的Ａｈａ１および／または同様の機能を持った他の関連分子のレベルを減少させる作用物質は、作用物質による１つの成分または双方の成分への結合が、熱ショック蛋白質ＡＴＰアーゼアクチベーター活性、Ｈｓｐ９０ ＡＴＰアーゼの活性化状態、および／または活性化されたＨｓｐ９０ ＡＴＰアーゼの活性レベルにおける減少を達成するように、機能的Ａｈａ１および／またはＨｓｐ９０ ＡＴＰアーゼを標的とでき、結果的にミスフォールドされた蛋白質の安定化を生じさせる。Ｈｓｐ９０およびＡｈａ１間の複合体の結晶構造が報告されている(Meyerら (2004) EMBO J. 23, 511-519)。Ａｈａ１、Ｈｓｐ９０ ＡＴＰアーゼ、および２つの間で形成された結合複合体についての構造的および機構的な理解が与えられると、例えば、１つまたは双方の成分にイオン的または共有結合的に結合する作用物質を設計し、それにより、機能的Ａｈａ１によるＨｓｐ９０ ＡＴＰアーゼの活性化を低減することは当該技術分野における技量内にある。
【００６４】
機能的Ａｈａ１および／または同様の機能を持つ関連分子のレベルを減少させる作用物質として本明細書に用いた種々のクラスの作用物質は、一般的に、限定されるものではないが、ＲＮＡ干渉分子、抗体、無機小分子、アンチセンス・オリゴヌクレオチドおよびアプタマーを含む。
【００６５】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、機能的Ａｈａ１（および／または同様の機能を持つ他の関連分子）のレベルを減少させるために用いることができる。（例えば、実施例８〜１０参照）。ＲＮＡｉ方法は、二本鎖ＲＮＡ、例えば、小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）およびミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を利用できる。以下の言及は、ｄｓＲＮＡに一般的に集中するが、当業者ならば、多数のアプローチがｍｉＲＮＡのごとき他のＲＮＡｉ分子に利用可能であることを認識するであろう。また、機能的Ａｈａ１および／または同様の機能の他の関連分子に特異的なＲＮＡｉ分子は、様々な源から商業的に入手可能である(例えば、SilencerＲ In Vivo Ready dsRNAs, Aha1 dsRNA ID#s 1136422, 136423, 36424, 19683, 19588, 19773, Ambion, TX; Sigma Aldrich, MO; Invitrogen, CA)。
【００６６】
様々なアルゴリズムを用いるいくつかのｄｓＲＮＡ分子設計プログラムが、当該技術分野に知られている(例えば、Cenix algorithm, Ambion; BLOCK-iTTM RNAi Designer, Invitrogen; dsRNA Whitehead Institute Design Tools, Bioinofrmatics & Research Computing参照)。最適なｄｓＲＮＡ配列の規定において影響力のある形質は、ｄｓＲＮＡの末端でのＧ／Ｃ含量、ｄｓＲＮＡの特定の内部ドメインのＴｍ、ｄｓＲＮＡの長さ、ＣＤＳ（コード領域）内の標的配列の位置、および３’突出のヌクレオチド含量を含む。
【００６７】
機能的Ａｈａ１に特異的なｄｓＲＮＡ分子および／または同様の機能を持つ他の関連分子の投与は、標的（例えば、Ａｈａ１）ｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介分解を達成できる。例えば、治療上有効な量のＡｈａ１に特異的なｄｓＲＮＡをそれを必要とする患者に投与して、蛋白質ミスフォールディング疾患を処置できる。１つの態様において、機能的Ａｈａ１のレベルの減少を達成するｄｓＲＮＡは、配列番号：５７〜１４６を含むヌクレオチド配列を有する（以下の表２参照）。
【００６８】
一般的には、有効な量のｄｓＲＮＡ分子は、ミスフォールディング部位でまたはその付近で、約１ナノモーラー（ｎＭ）〜約１００ｎＭ、様々な態様において、約２ｎＭ〜約５０ｎＭ、および他の態様において、約２.５ｎＭ〜約１０ｎＭの細胞間濃度を含むことができる。より多いまたはより少ない量のｄｓＲＮＡを投与できると考えられる。
【００６９】
ｄｓＲＮＡは、注目する細胞にＲＮＡｉ分子を送達するのに適当なずれかの手段によって対象に投与できる。例えば、ｄｓＲＮＡ分子は、遺伝子銃、エレクトロポレーションによって、または硝子体内注射のごとき他の適当な非経口または経腸投与経路によって投与できる。また、ＲＮＡｉ分子は、肺送達を介して局所的（肺組織）または全身的（循環系）に投与できる。様々な肺送達デバイスが、対象への機能的Ａｈａ１に特異的なＲＮＡｉ分子の送達において有効であることができる（以下参照）。さらに詳細に以下に記載されるように、ＲＮＡｉ分子は、様々な送達およびターゲティングシステムと組み合わせて用いることができる。例えば、ｄｓＲＮＡはペイロード・インターナリゼーションを促進するように設計された標的ポリマー送達システムに被包できる。
【００７０】
ｄｓＲＮＡは、機能的Ａｈａ１（または同様の機能を持つ他の関連分子）のｍＲＮＡ標的配列、例えば、配列番号：１２〜５６における３０個未満の近接ヌクレオチド、一般的には１９〜２５の近接ヌクレオチドのいずれかの伸張に対する標的とすることができる（下記の表１参照）。ヒトゲノム・データベース（ＢＬＡＳＴ）の検索を行って、選択されたｄｓＲＮＡ配列が他の遺伝子転写物を標的としないであろうということを保証できる。ｄｓＲＮＡにつき標的配列を選択する技術は、当該技術分野において知られている(例えば、 Reynoldsら (2004) Nature Biotechnology 22(3), 326 - 330参照)。かくして、当該ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、機能的Ａｈａ１（または同様の機能を持つ関連分子）の標的ｍＲＮＡにおける約１９〜約２５ヌクレオチドのいずれかの近接する伸張と同一のヌクレオチド配列を含むことができる。一般的には、標的ｍＲＮＡ上の標的配列は、例えば、開始コドンから下流（すなわち、３'方向）に５０〜１００ｎｔで始まる標的ｍＲＮＡに対応する所与のｃＤＮＡ配列から選択される。しかしながら、標的配列は、５'もしくは３'の非翻訳領域に、または開始コドン付近の領域に位置することができる。
【００７１】
本発明のｄｓＲＮＡは、３０ヌクレオチド未満の長さ、一般的には１９〜２５ヌクレオチド長であって、Ａｈａ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部分に実質的に相補的である領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を一般的に含むことができる。これらのｄｓＲＮＡの使用は、哺乳動物における癌細胞の複製および／または維持ならびに／あるいはミスフォールドされた嚢胞性線維症の膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）の分解に関係する遺伝子のｍＲＮＡの標的分解を可能にする。細胞ベースおよび動物のアッセイ方法を用いて、非常に低用量のこれらのｄｓＲＮＡは、ＲＮＡｉを特異的でかつ効率的に媒介できる結果、Ａｈａ遺伝子の発現をかなり阻害する。かくして、これらのｄｓＲＮＡを含む本発明の方法および組成物は、蛋白質分解に関与する遺伝子を標的とすることにより、癌および／または嚢胞性線維症を含めた、Ａｈａ発現により媒介された病理学的過程、例えば、蛋白質ミスフォールディングを処置するのに有用である。
【００７２】
以下の詳細な記載は、Ａｈａ遺伝子の発現を阻害するためのｄｓＲＮＡおよびｄｓＲＮＡを含有する組成物を調製および使用する方法、ならびに癌および／または嚢胞性線維症のごときＡｈａ遺伝子の発現により引き起こされた疾患および障害を処置する組成物および方法を開示する。本発明の医薬組成物は、医薬上許容される担体と一緒に、一般的に３０ヌクレオチド未満の長さ、一般的には、１９〜２５ヌクレオチド長であり、Ａｈａ遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部分に実質的に相補的である相補性領域を含むアンチセンス鎖を有するｄｓＲＮＡを含む。
【００７３】
結果的に、本発明のある態様は、医薬上許容される担体と一緒に本発明のｄｓＲＮＡを含む医薬組成物、Ａｈａ遺伝子の発現を阻害する組成物を用いる方法、ならびにＡｈａ遺伝子の発現によって引き起こされた疾患を処置する医薬組成物を用いる方法を提供する。
【００７４】
本発明の１つの態様は、細胞または哺乳動物におけるＡｈａ遺伝子、例えば、Ａｈａ１遺伝子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子を提供し、ここに、そのｄｓＲＮＡは、Ａｈａ遺伝子、例えば、Ａｈａ１遺伝子の発現において形成されたｍＲＮＡの少なくとも一部分に相補的である相補性領域を含むアンチセンス鎖を含み、その相補性領域は、３０ヌクレオチド未満の長さ、一般的に１９〜２５ヌクレオチド長である。そのｄｓＲＮＡは表２に示されたｄｓＲＮＡの１つと同一であり得るか、または表２に示されたｄｓＲＮＡの１つの標的配列内のＡｈａ遺伝子をコードするｍＲＮＡの切断を達成し得る。
【００７５】
表１．ヒトＡｈａ１  ｍＲＮＡ標的配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０１２１１１.１（配列番号：１１；Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子報告番号ＥＮＳＧ０００００１００５９１）のコード配列に基づいた配列位置）
1 Ａｈａ遺伝子配列  AAATTGGTCCACGGATAAGCT:
AAAUUGGUCCACGGAUAAGCU (配列番号：12)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 99
2 Ａｈａ遺伝子配列  AAGCTGAAAACACTGTTCCTG:
AAGCUGAAAACACUGUUCCUG (配列番号：13)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 115
3 Ａｈａ遺伝子配列  AAAACACTGTTCCTGGCAGTG:
AAAACACUGUUCCUGGCAGUG (配列番号：14)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 121
4 Ａｈａ遺伝子配列  AAAATGAAGAAGGCAAGTGTG:
AAAAUGAAGAAGGCAAGUGUG (配列番号：15)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 149
5 Ａｈａ遺伝子配列  AATGAAGAAGGCAAGTGTGAG:
AAUGAAGAAGGCAAGUGUGAG (配列番号：16)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 151
6 Ａｈａ遺伝子配列  AAGAAGGCAAGTGTGAGGTGA:
AAGAAGGCAAGUGUGAGGUGA (配列番号：17)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 155
7 Ａｈａ遺伝子配列  AAGTGAGTAAGCTTGATGGAG:
AAGUGAGUAAGCUUGAUGGAG (配列番号：18)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 179
8 Ａｈａ遺伝子配列  AACAATCGCAAAGGGAAACTT:
AACAAUCGCAAAGGGAAACUU (配列番号：19)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 211
9 Ａｈａ遺伝子配列  AATCGCAAAGGGAAACTTATC:
AAUCGCAAAGGGAAACUUAUC (配列番号：20)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 214
10 Ａｈａ遺伝子配列  AAAGGGAAACTTATCTTCTTT:
AAAGGGAAACUUAUCUUCUUU (配列番号：21)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 220
【００７６】
11 Ａｈａ遺伝子配列  AAACTTATCTTCTTTTATGAA:
AAACUUAUCUUCUUUUAUGAA (配列番号：22)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 226
12 Ａｈａ遺伝子配列  AATGGAGCGTCAAACTAAACT:
AAUGGAGCGUCAAACUAAACU (配列番号：23)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 245
13 Ａｈａ遺伝子配列  AAACTAAACTGGACAGGTACT:
AAACUAAACUGGACAGGUACU (配列番号：24)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 256
14 Ａｈａ遺伝子配列  AAACTGGACAGGTACTTCTAA:
AAACUGGACAGGUACUUCUAA (配列番号：25)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 261
15 Ａｈａ遺伝子配列  AAGTCAGGAGTACAATACAAA:
AAGUCAGGAGUACAAUACAAA (配列番号：26)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 280
16 Ａｈａ遺伝子配列  AATACAAAGGACATGTGGAGA:
AAUACAAAGGACAUGUGGAGA (配列番号：27)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 293
17 Ａｈａ遺伝子配列  に基づいたｍＲＮＡ標的配列   AATTTGTCTGATGAAAACAGC:
AAUUUGUCUGAUGAAAACAGC (配列番号：28)
遺伝子配列における位置: 319
18 Ａｈａ遺伝子配列  AAAACAGCGTGGATGAAGTGG:
AAAACAGCGUGGAUGAAGUGG (配列番号：29)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 332
19 Ａｈａ遺伝子配列  AAGTGGAGATTAGTGTGAGCC:
AAGUGGAGAUUAGUGUGAGCC (配列番号：30)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 347
20 Ａｈａ遺伝子配列  AAAGATGAGCCTGACACAAAT:
AAAGAUGAGCCUGACACAAAU (配列番号：31)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 373
21 Ａｈａ遺伝子配列  AAATCTCGTGGCCTTAATGAA:
AAAUCUCGUGGCCUUAAUGAA (配列番号：32)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 390
22 Ａｈａ遺伝子配列  AATGAAGGAAGAAGGGGTGAA:
AAUGAAGGAAGAAGGGGUGAA (配列番号：33)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 405
23 Ａｈａ遺伝子配列  AAGGAAGAAGGGGTGAAACTT:
AAGGAAGAAGGGGUGAAACUU (配列番号：34)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 409
24 Ａｈａ遺伝子配列  AAGAAGGGGTGAAACTTCTAA:
AAGAAGGGGUGAAACUUCUAA (配列番号：35)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 413
25 Ａｈａ遺伝子配列  AAGGGGTGAAACTTCTAAGAG:
AAGGGGUGAAACUUCUAAGAG (配列番号：36)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 416
26 Ａｈａ遺伝子配列  AAACTTCTAAGAGAAGCAATG:
AAACUUCUAAGAGAAGCAAUG (配列番号：37)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 424
27 Ａｈａ遺伝子配列  AAGAGAAGCAATGGGAATTTA:
AAGAGAAGCAAUGGGAAUUUA (配列番号：38)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 432
28 Ａｈａ遺伝子配列  AAGCAATGGGAATTTACATCA:
AAGCAAUGGGAAUUUACAUCA (配列番号：39)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 437
29 Ａｈａ遺伝子配列  AATGGGAATTTACATCAGCAC:
AAUGGGAAUUUACAUCAGCAC (配列番号：40)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 441
【００７７】
30 Ａｈａ遺伝子配列  AATTTACATCAGCACCCTCAA:
AAUUUACAUCAGCACCCUCAA (配列番号：41)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 447
31 Ａｈａ遺伝子配列  AATGAATGGAGAGTCAGTAGA:
AAUGAAUGGAGAGUCAGUAGA (配列番号：42)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 501
32 Ａｈａ遺伝子配列  AATGGAGAGTCAGTAGACCCA:
AAUGGAGAGUCAGUAGACCCA (配列番号：43)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 505
33 Ａｈａ遺伝子配列  AAGCCTGCTCCTTCAAAAACC:
AAGCCUGCUCCUUCAAAAACC (配列番号：44)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 565
34 Ａｈａ遺伝子配列  AAAATCCCCACTTGTAAGATC:
AAAAUCCCCACUUGUAAGAUC (配列番号：45)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 607
35 Ａｈａ遺伝子配列  AATCCCCACTTGTAAGATCAC:
AAUCCCCACUUGUAAGAUCAC (配列番号：46)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 609
36 Ａｈａ遺伝子配列  AAGATCACTCTTAAGGAAACC:
AAGAUCACUCUUAAGGAAACC (配列番号：47)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 622
37 Ａｈａ遺伝子配列  AAGGAAACCTTCCTGACGTCA:
AAGGAAACCUUCCUGACGUCA (配列番号：48)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 634
38 Ａｈａ遺伝子配列  AACATTAGAAGCAGACAGAGG:
AACAUUAGAAGCAGACAGAGG (配列番号：49)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 720
39 Ａｈａ遺伝子配列  AAGCAGACAGAGGTGGAAAGT:
AAGCAGACAGAGGUGGAAAGU (配列番号：50)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 728
40 Ａｈａ遺伝子配列  AAAGTTCCACATGGTAGATGG:
AAAGUUCCACAUGGUAGAUGG (配列番号：51)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 744
【００７８】
41 Ａｈａ遺伝子配列  AACGTCTCTGGGGAATTTACT:
AACGUCUCUGGGGAAUUUACU (配列番号：52)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 766
42 Ａｈａ遺伝子配列  AATTTACTGATCTGGTCCCTG:
AAUUUACUGAUCUGGUCCCUG (配列番号：53)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 779
43 Ａｈａ遺伝子配列  AAACATATTGTGATGAAGTGG:
AAACAUAUUGUGAUGAAGUGG (配列番号：54)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 802
44 Ａｈａ遺伝子配列  AAGTGGAGGTTTAAATCTTGG:
AAGUGGAGGUUUAAAUCUUGG (配列番号：55)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 817
45 Ａｈａ遺伝子配列  AAACAGACCTTTGGCTATGGC:
AAACAGACCUUUGGCUAUGGC (配列番号：56)に基づいたｍＲＮＡ標的配列  
遺伝子配列における位置: 982
【００７９】
表２．ヒト機能的Ａｈａ蛋白質発現のダウンレギュレーションのためのｄｓＲＮＡ作用物質
1. Ａｈａ遺伝子標的配列１に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: AUUGGUCCACGGAUAAGCU (配列番号：57)
アンチセンス鎖 dsRNA: AGCUUAUCCGUGGACCAAU (配列番号：58)
2. Ａｈａ遺伝子標的配列２に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: GCUGAAAACACUGUUCCUG (配列番号：59)
アンチセンス鎖 dsRNA: CAGGAACAGUGUUUUCAGC (配列番号：60)
3. Ａｈａ遺伝子標的配列３に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: AACACUGUUCCUGGCAGUG (配列番号：61)
アンチセンス鎖 dsRNA: CACUGCCAGGAACAGUGUU (配列番号：62)
4. Ａｈａ遺伝子標的配列４に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: AAUGAAGAAGGCAAGUGUG (配列番号：63)
アンチセンス鎖 dsRNA: CACACUUGCCUUCUUCAUU (配列番号：64)
5. Ａｈａ遺伝子標的配列５に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: UGAAGAAGGCAAGUGUGAG (配列番号：65)
アンチセンス鎖 dsRNA: CUCACACUUGCCUUCUUCA (配列番号：66)
6. Ａｈａ遺伝子標的配列６に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: GAAGGCAAGUGUGAGGUGA (配列番号：67)
アンチセンス鎖 dsRNA: UCACCUCACACUUGCCUUC (配列番号：68)
7. Ａｈａ遺伝子標的配列７に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: GUGAGUAAGCUUGAUGGAG (配列番号：69)
アンチセンス鎖 dsRNA: CUCCAUCAAGCUUACUCAC (配列番号：70)
8. Ａｈａ遺伝子標的配列８に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: CAAUCGCAAAGGGAAACUU (配列番号：71)
アンチセンス鎖 dsRNA: AAGUUUCCCUUUGCGAUUG (配列番号：72)
9. Ａｈａ遺伝子標的配列９に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: UCGCAAAGGGAAACUUAUC (配列番号：73)
アンチセンス鎖 dsRNA: GAUAAGUUUCCCUUUGCGA (配列番号：74)
10. Ａｈａ遺伝子標的配列１０に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: AGGGAAACUUAUCUUCUUU (配列番号：75)
アンチセンス鎖 dsRNA: AAAGAAGAUAAGUUUCCCU (配列番号：76)
【００８０】
11. Ａｈａ遺伝子標的配列１１に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: ACUUAUCUUCUUUUAUGAA (配列番号：77)
アンチセンス鎖 dsRNA: UUCAUAAAAGAAGAUAAGU (配列番号：78)
12. Ａｈａ遺伝子標的配列１２に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: UGGAGCGUCAAACUAAACU (配列番号：79)
アンチセンス鎖 dsRNA: AGUUUAGUUUGACGCUCCA (配列番号：80)
13. Ａｈａ遺伝子標的配列１３に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: ACUAAACUGGACAGGUACU (配列番号：81)
アンチセンス鎖 dsRNA: AGUACCUGUCCAGUUUAGU (配列番号：82)
14. Ａｈａ遺伝子標的配列１４に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: ACUGGACAGGUACUUCUAA (配列番号：83)
アンチセンス鎖 dsRNA: UUAGAAGUACCUGUCCAGU (配列番号：84)
15. Ａｈａ遺伝子標的配列１５に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: GUCAGGAGUACAAUACAAA (配列番号：85)
アンチセンス鎖 dsRNA: UUUGUAUUGUACUCCUGAC (配列番号：86)
16. Ａｈａ遺伝子標的配列１６に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: UACAAAGGACAUGUGGAGA (配列番号：87)
アンチセンス鎖 dsRNA: UCUCCACAUGUCCUUUGUA (配列番号：88)
17. Ａｈａ遺伝子標的配列１７に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: UUUGUCUGAUGAAAACAGC (配列番号：89)
アンチセンス鎖 dsRNA: GCUGUUUUCAUCAGACAAA (配列番号：90)
18. Ａｈａ遺伝子標的配列１８に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: AACAGCGUGGAUGAAGUGG (配列番号：91)
アンチセンス鎖 dsRNA: CCACUUCAUCCACGCUGUU (配列番号：92)
19. Ａｈａ遺伝子標的配列１９に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: GUGGAGAUUAGUGUGAGCC (配列番号：93)
アンチセンス鎖 dsRNA: GGCUCACACUAAUCUCCAC (配列番号：94)
20. Ａｈａ遺伝子標的配列２０に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: AGAUGAGCCUGACACAAAU (配列番号：95)
アンチセンス鎖 dsRNA: AUUUGUGUCAGGCUCAUCU (配列番号：96)
【００８１】
21. Ａｈａ遺伝子標的配列２１に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: AUCUCGUGGCCUUAAUGAA (配列番号：97)
アンチセンス鎖 dsRNA: UUCAUUAAGGCCACGAGAU (配列番号：98)
22. Ａｈａ遺伝子標的配列２２に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: UGAAGGAAGAAGGGGUGAA (配列番号：99)
アンチセンス鎖 dsRNA: UUCACCCCUUCUUCCUUCA (配列番号：100)
23. Ａｈａ遺伝子標的配列２３に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: GGAAGAAGGGGUGAAACUU (配列番号：101)
アンチセンス鎖 dsRNA: AAGUUUCACCCCUUCUUCC (配列番号：102)
24. Ａｈａ遺伝子標的配列２４に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: GAAGGGGUGAAACUUCUAA (配列番号：103)
アンチセンス鎖 dsRNA: UUAGAAGUUUCACCCCUUC (配列番号：104)
25. Ａｈａ遺伝子標的配列２５に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: GGGGUGAAACUUCUAAGAG (配列番号：105)
アンチセンス鎖 dsRNA: CUCUUAGAAGUUUCACCCC (配列番号：106)
26. Ａｈａ遺伝子標的配列２６に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: ACUUCUAAGAGAAGCAAUG (配列番号：107)
アンチセンス鎖 dsRNA: CAUUGCUUCUCUUAGAAGU (配列番号：108)
27. Ａｈａ遺伝子標的配列２７に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: GAGAAGCAAUGGGAAUUUA (配列番号：109)
アンチセンス鎖 dsRNA: UAAAUUCCCAUUGCUUCUC (配列番号：110)
28. Ａｈａ遺伝子標的配列２８に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: GCAAUGGGAAUUUACAUCA (配列番号：111)
アンチセンス鎖 dsRNA: UGAUGUAAAUUCCCAUUGC (配列番号：112)
29. Ａｈａ遺伝子標的配列２９に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: UGGGAAUUUACAUCAGCAC (配列番号：113)
アンチセンス鎖 dsRNA: GUGCUGAUGUAAAUUCCCA (配列番号：114)
30. Ａｈａ遺伝子標的配列３０に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: UUUACAUCAGCACCCUCAA (配列番号：115)
アンチセンス鎖 dsRNA: UUGAGGGUGCUGAUGUAAA (配列番号：116)
【００８２】
31. Ａｈａ遺伝子標的配列３１に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: UGAAUGGAGAGUCAGUAGA (配列番号：117)
アンチセンス鎖 dsRNA: UCUACUGACUCUCCAUUCA (配列番号：118)
32. Ａｈａ遺伝子標的配列３２に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: UGGAGAGUCAGUAGACCCA (配列番号：119)
アンチセンス鎖 dsRNA: UGGGUCUACUGACUCUCCA (配列番号：120)
33. Ａｈａ遺伝子標的配列３３に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: GCCUGCUCCUUCAAAAACC (配列番号：121)
アンチセンス鎖 dsRNA: GGUUUUUGAAGGAGCAGGC (配列番号：122)
34. Ａｈａ遺伝子標的配列３４に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: AAUCCCCACUUGUAAGAUC (配列番号：123)
アンチセンス鎖 dsRNA: GAUCUUACAAGUGGGGAUU (配列番号：124)
35. Ａｈａ遺伝子標的配列３５に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: UCCCCACUUGUAAGAUCAC (配列番号：125)
アンチセンス鎖 dsRNA: GUGAUCUUACAAGUGGGGA (配列番号：126)
36. Ａｈａ遺伝子標的配列３６に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: GAUCACUCUUAAGGAAACC (配列番号：127)
アンチセンス鎖 dsRNA: GGUUUCCUUAAGAGUGAUC (配列番号：128)
37. Ａｈａ遺伝子標的配列３７に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: GGAAACCUUCCUGACGUCA (配列番号：129)
アンチセンス鎖 dsRNA: UGACGUCAGGAAGGUUUCC (配列番号：130)
38. Ａｈａ遺伝子標的配列３８に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: CAUUAGAAGCAGACAGAGG (配列番号：131)
アンチセンス鎖 dsRNA: CCUCUGUCUGCUUCUAAUG (配列番号：132)
39. Ａｈａ遺伝子標的配列３９に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: GCAGACAGAGGUGGAAAGU (配列番号：133)
アンチセンス鎖 dsRNA: ACUUUCCACCUCUGUCUGC (配列番号：134)
40. Ａｈａ遺伝子標的配列４０に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: AGUUCCACAUGGUAGAUGG (配列番号：135)
アンチセンス鎖 dsRNA: CCAUCUACCAUGUGGAACU (配列番号：136)
【００８３】
41. Ａｈａ遺伝子標的配列４１に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: CGUCUCUGGGGAAUUUACU (配列番号：137)
アンチセンス鎖 dsRNA: AGUAAAUUCCCCAGAGACG (配列番号：138)
42. Ａｈａ遺伝子標的配列４２に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: UUUACUGAUCUGGUCCCUG (配列番号：139)
アンチセンス鎖 dsRNA: CAGGGACCAGAUCAGUAAA (配列番号：140)
43. Ａｈａ遺伝子標的配列４３に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: ACAUAUUGUGAUGAAGUGG (配列番号：141)
アンチセンス鎖 dsRNA: CCACUUCAUCACAAUAUGU (配列番号：142)
44. Ａｈａ遺伝子標的配列４４に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: GUGGAGGUUUAAAUCUUGG (配列番号：143)
アンチセンス鎖 dsRNA: CCAAGAUUUAAACCUCCAC (配列番号：144)
45. Ａｈａ遺伝子標的配列４５に基づいたｄｓＲＮＡ
センス鎖 dsRNA: ACAGACCUUUGGCUAUGGC (配列番号：145)
アンチセンス鎖 dsRNA: GCCAUAGCCAAAGGUCUGU (配列番号：146)
【００８４】
表３．ヒトの機能的Ａｈａ蛋白質発現のダウンレギュレーションのためのｓｈＲＮＡを転写するベクター用プライマー
1. Ａｈａ遺伝子標的配列１(配列番号：12)に基づいたプライマー
センス鎖: 
GATCCATTGGTCCACGGATAAGCTTTCAAGAGAAGCTTATCCGTGGACCAATTTTTTTGGAAA (配列番号：147)
アンチセンス鎖: 
AGCTTTTCCAAAAAAATTGGTCCACGGATAAGCTTCTCTTGAAAGCTTATCCGTGGACCAATG (配列番号：148)
2. Ａｈａ遺伝子標的配列７(配列番号：18)に基づいたプライマー
センス鎖: 
GATCCGTGAGTAAGCTTGATGGAGTTCAAGAGACTCCATCAAGCTTACTCACTTTTTTGGAAA (配列番号：149)
アンチセンス鎖: 
AGCTTTTCCAAAAAAGTGAGTAAGCTTGATGGAGTCTCTTGAACTCCATCAAGCTTACTCACG (配列番号：150)
3. Ａｈａ遺伝子標的配列１３(配列番号：24)に基づいたプライマー
センス鎖: 
GATCCACTAAACTGGACAGGTACTTTCAAGAGAAGTACCTGTCCAGTTTAGTTTTTTTGGAAA (配列番号：151)
アンチセンス鎖: 
AGCTTTTCCAAAAAAACTAAACTGGACAGGTACTTCTCTTGAAAGTACCTGTCCAGTTTAGTG (配列番号：152)
【００８５】
表４．ベクターをコード化することにより転写されたｓｈＲＮＡ配列
1.  GAUCCAUUGGUCCACGGAUAAGCUUUCAAGAGAAGCUUAUCCGUGGACCAAUUUUUUUGGAAA (配列番号：153)
2.  GAUCCGUGAGUAAGCUUGAUGGAGUUCAAGAGACUCCAUCAAGCUUACUCACUUUUUUGGAAA (配列番号：154)
3.  GAUCCACUAAACUGGACAGGUACUUUCAAGAGAAGUACCUGUCCAGUUUAGUUUUUUUGGAAA (配列番号：155)
【００８６】
本発明の様々な態様において、ｄｓＲＮＡは、表２に示されるｄｓＲＮＡの１つの鎖の少なくとも１つの鎖と同様に、および種々の態様において双方の鎖において鎖当たり少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも１８、少なくとも２０個の近接ヌクレオチドを有することができる。表２に供されるｄｓＲＮＡの１つの標的配列における他の場所を標的とする別法のｄｓＲＮＡを標的配列およびフランキングＡｈａ１配列を用いて容易に決定できる
【００８７】
ｄｓＲＮＡは、二重鎖構造を形成するようにハイブリダイズするための相補的である２つのＲＮＡ鎖を含む。そのｄｓＲＮＡ（アンチセンス鎖）の一方の鎖は、Ａｈａ遺伝子の発現の間に形成されたｍＲＮＡの配列に由来した標的配列に、実質的に相補的で、一般的に、十分に相補的である相補性領域を含み、他方の鎖は、適当な条件下で組み合わせた場合に、その２つの鎖がハイブリダイズし、二重鎖構造を形成するように、アンチセンス鎖に相補的である領域を含む。一般的に、二重鎖構造は、１５および３０個の間、より一般的には１８および２５個の間、さらにより一般的には１９および２４個の間、最も一般的には１９および２１個の間の塩基対の長さである。同様に、標的配列に相補性領域は、１５および３０個の間、より一般的には１８および２５個の間、さらにより一般的には１９および２４個の間、最も一般的には１９および２１個の間のヌクレオチド長である。本発明のｄｓＲＮＡは、さらに１以上の単鎖のヌクレオチド突出を含み得る。例えば、デオキシリボヌクレオチド配列「ｔｔ」またはリボヌクレオチド配列「ＵＵ」は、センスおよびアンチセンス鎖の双方の３'末端に接続して、突出を形成できる。ｄｓＲＮＡは、例えば、Biosearch, Applied Biosystems, Inc.から商業的に入手可能であるような自動ＤＮＡ合成装置の使用により、さらに以下に言及された当該技術分野に知られた標準的な方法により合成できる。本発明の１つの態様において、Ａｈａ遺伝子はヒトＡｈａ１遺伝子であり得る。
【００８８】
様々な態様において、ｄｓＲＮＡは、この群から選択された少なくとも２つの配列を含み、ここに、少なくとも２つの配列の一方は、少なくとも２つの配列のもう一つのものに相補的であり、少なくとも２つの配列の一方は、Ａｈａ遺伝子、例えば、Ａｈａ１遺伝子の発現において生成されたｍＲＮＡの配列に実質的に相補的である。
【００８９】
当業者は、２０および２３の間、特に、２１塩基対の二重鎖構造を含むｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉の誘導に特に有効であると認められることをよく知っている(Elbashirら, EMBO 2001, 20:6877-6888)。しかしながら、他のものは、より短いかまたはより長いｄｓＲＮＡが同様に有効であり得ることを見出した。
【００９０】
本発明のｄｓＲＮＡは、標的配列に対する１〜３のミスマッチを含むことができる。ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列に対するミスマッチを含むならば、ミスマッチの領域が相補性領域の中心に位置しないことが好ましい。ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列に対するミスマッチを含むならば、そのミスマッチが、いずれかの終端から５ヌクレオチドまで、例えば、相補性領域の５'または３'終端のいずれか、好ましくは、５'終端から５、４、３、２または１のヌクレオチドに限定されることが好ましい。例えば、Ａｈａ遺伝子の領域に相補的である２３ヌクレオチドのｄｓＲＮＡ鎖について、ｄｓＲＮＡは、一般的に中央の１３ヌクレオチド内のいずれのミスマッチを含まない。もう一つの態様において、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖（５'〜３'をカウントする）の１もしくは２位から９もしくは１０位の領域においていずれのミスマッチも含まない。本発明内に記載された方法を用いて、標的配列に対するミスマッチを含むｄｓＲＮＡがＡｈａ遺伝子の発現を阻害するのに有効かどうかを決定できる。Ａｈａ遺伝子の発現の阻害におけるミスマッチを持つｄｓＲＮＡの効力の考察は、特に、Ａｈａ遺伝子における相補性の特定の領域が、集団内の多形性の配列変形を有することが知られているならば、重要である。
【００９１】
１つの態様において、ｄｓＲＮＡの少なくとも１つの終端は、１〜４ヌクレオチド、一般的には１または２ヌクレオチドの単鎖のヌクレオチド突出を有する。少なくとも１つのヌクレオチド突出を有するｄｓＲＮＡは、それらの平滑末端化対応物よりも予期されない優れた阻害特性を有する。さらに、本発明者は、ただ１つのヌクレオチド突出の存在が、その全体的な安定性に影響せずに、ｄｓＲＮＡの干渉活性を強化することを見出した。ただ１つの突出を有するｄｓＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏにて、ならびに種々の細胞、細胞培養培地、血液および血清において特に安定し、有効であると分かった。一般的に、単鎖の突出は、アンチセンス鎖の３'末端終端または、代わりにセンス鎖の３'末端終端に位置する。また、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５'終端に一般的に位置した平滑末端を有し得る。かかるｄｓＲＮＡは、安定性および阻害活性を改善し、かくして、低用量、すなわち、１日当たり５未満のｍｇ／受容者の体重ｋｇでの投与を可能にする。一般的に、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３'終端でヌクレオチド突出を有し、５'終端は平滑末端化されている。もう一つの態様において、突出における１以上のヌクレオチドは、ヌクレオシド・チオホスフェイトで置換される。
【００９２】
ベクターでコード化したＲＮＡｉ
また、本発明のｄｓＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞内で組換えウイルスベクターから発現できる。本発明の組換えウイルスベクターは、本発明のｄｓＲＮＡをコード化する配列、およびｄｓＲＮＡ配列を発現するいずれかの適当なプロモーターを含む。適当なプロモーターは、例えば、Ｕ６またはＨ１ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター配列、およびサイトメガロウィルス・プロモーターを含む。他の適当なプロモーターの選択は、当該技術分野における技量内にある。また、本発明の組換えウイルスベクターは、特定の組織または特定の細胞内の環境においてｄｓＲＮＡの発現用の誘導可能または調節可能なプロモーターを含むことができる。ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞に本発明のｄｓＲＮＡを送達する組換えウイルスベクターの使用は、より詳細に以下に言及される。
【００９３】
本発明のｄｓＲＮＡは、２つの別々の相補的ＲＮＡ分子、または２つの相補性領域を持つ単一のＲＮＡ分子のいずれかとして組換えウイルスベクターから発現できる。
【００９４】
当業者は、発現されるべきｄｓＲＮＡ分子についてコード配列を受け入できるいずれのウイルスベクター、例えば、アデノウイルス（ＡＶ）に由来したベクター；アデノ関連性ウイルス（ＡＡＶ）；レトロウイルス（例えば、レンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウィルス、マウス白血病ウイルス）；ヘルペスウィルス等も用いることができることを認識するであろう。ウイルスベクターのトロピズムは、他のウイルスからの外膜蛋白質または他の表面抗原を持つベクターをシュードタイプすることにより、または必要に応じて、異なるウイルスのキャプシド蛋白質を置換することによって改変できる。
【００９５】
例えば、本発明のレンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、モコラ等から表面蛋白でシュードタイプできる。本発明のＡＡＶベクターは、異なるキャプシド蛋白質血清型を発現するベクターを設計することにより、異なる細胞を標的とするように調製できる。例えば、血清型２ゲノム上の血清型２キャプシドを発現するＡＡＶベクターは、ＡＡＶ  ２／２と呼ばれる。ＡＡＶ  ２／２ベクターにおけるこの血清型２キャプシド遺伝子は、血清型５キャプシド遺伝子と置換して、ＡＡＶ  ２／５ベクターを生成できる。異なるキャプシド蛋白質血清型を発現するＡＡＶベクターを構築する技術は、当該技術分野における技量内にあり、例えば、ここに出典明示してそのすべての開示を本明細書の一部とみなすRabinowitz J Eら (2002), J Virol 76:791-801を参照されたし。
【００９６】
本発明における使用に適する組換えウイルスベクターの選択、ｄｓＲＮＡを発現する核酸配列をベクターに挿入する方法、およびウイルスベクターを注目する細胞に送達する方法は、当該技術分野における技量内にある。例えば、ここに出典明示してそのすべての開示を本明細書の一部とみなすDornburg R (1995), Gene Therap. 2: 301-310; Eglitis M A (1988), Biotechniques 6: 608-614; Miller A D (1990), Hum Gene Therap. 1: 5-14; Anderson W F (1998), Nature 392: 25-30;およびRubinson D Aら, Nat. Genet. 33: 401-406を参照。例えば、本発明のｄｓＲＮＡは、例えば、Ｕ６またはＨ１  ＲＮＡプロモーター、またはサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーターのいずれかを含む組換えＡＡＶベクターからの２つの別々の相補的単鎖ＲＮＡ分子として発現される。本発明のｄｓＲＮＡの発現に適当なＡＶベクター、その組換えＡＶベクターを構築する方法およびベクターを標的細胞に送達する方法は、Xia Hら (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010に記載されている。本発明のｄｓＲＮＡの発現に適当なＡＡＶベクター、および組換えＡＶベクターを構築する方法は、ここに出典明示してそのすべての開示を本明細書の一部とみなすSamulski Rら (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher K Jら (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski Rら (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; 米国特許第５,２５２,４７９号；米国特許第５,１３９,９４１号；国際特許出願番号 WO 94/13788;および国際特許出願番号 WO 93/24641に記載されている。
【００９７】
非ｄｓＲＮＡ作用物質
抗体を用いて、機能的Ａｈａ１および／または同様の機能を持つ他の関連分子のレベルを減少できる。例えば、抗体は、機能的Ａｈａ１、機能的Ａｈａ１のためのＨｓｐ９０ ＡＴＰアーゼ結合部位および／または機能的Ａｈａ１−Ｈｓｐ９０ ＡＴＰアーゼ複合体に特異的に結合することにより機能的Ａｈａ１のレベルを減少できる。本発明の範囲内の抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体フラグメントおよび抗体ベースの融合分子を含む。抗体のエンジニアリング、生産、検査、精製、切断および治療的使用は、当該技術分野においてよく知られている（一般的には、Carter (2006) Nat Rev Immunol. 6(5), 343-357; Coligan (2005) Short Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, ISBN 0471715786); Teillaud (2005) Expert Opin Biol Ther. 5(Supp. 1) S15-27; Subramanian, ed. (2004) Antibodies : Volume 1: ProductionおよびPurification, Springer, ISBN 0306482452; Brentら, ed. (2003) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc, ISBN 047150338X; Lo, ed. (2003) Antibody Engineering MethodsおよびProtocols, Humana Press, ISBN 1588290921; Ausubelら, ed. (2002) Short Protocols in Molecular Biology 5th Ed., Current Protocols, ISBN 0471250929参照）。また、機能的Ａｈａ１に特異的な種々のタイプの抗体を様々な商業源から得ることができる。血漿中の抗体の終末半減期は、広範囲、例えば、数分から数週間にわたり調整して、蛋白質ミスフォールディング疾患を処置するための臨床目的に合わせることができる（例えば、Carterら (2006) Nat Rev Immunol. 6(5), 343-357, 353参照）。キメラの、ヒト型の、および完全なヒトＭＡｂは、非ヒトの源に由来した抗体の使用に対する潜在的な制限を有効に克服して、蛋白質ミスフォールディング疾患を処置でき、かくして、最適化されたエフェクター機能を持つ減少した免疫原性を供することができる(例えば、Teillaud (2005) Expert Opin. Biol. Ther. 5(1), S15-S27; Tomizukaら (2000) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 97, 722-727; Carterら (2006) Nat Rev Immunol. 6(5), 343-357, 346-347参照)。抗体は、効率的な抗体内在化を達成するように改変または選択できる。そのため、抗体は、機能的Ａｈａ１および／または同様の機能を持つ関連分子、またはかかるものを含む複合体のごとき標的細胞内分子と有効に相互作用できる。さらに、抗体医薬コンジュゲートは、抗体内在化の効率を増加できる。効率的な抗体内在化は、部分最適化フォールディングエネルギー学により特徴付けられた蛋白質の不完全なフォールディングおよび形質をサルベージするように、機能的Ａｈａ１特異抗体を細胞内の環境に送達するのに望ましくできる。抗体の細胞の内在化を促進できる様々な作用物質に対する抗体のコンジュゲーションは、当該技術分野において知られている(一般的には、Wuら (2005) Nat Biotechnol. 23(9), 1137-1146; McCarronら (2005) Mol Interv 5(6), 368-380; Niemeyer (2004) Bioconjugation Protocols, Strategies and Methods, Humana Press, ISBN 1588290980; Hermanson (1996) Bioconjugate Techniques, Academic Press, ISBN 0123423368参照)。
【００９８】
Ｈｓｐ９０共同シャペロンＡｈａ１のごとき熱ショック蛋白質共同シャペロンと特異的に相互作用する小さな有機分子を用いて、機能的Ａｈａ１および／または同様の機能を持つ他の関連分子のレベルを減少できる。機能的Ａｈａ１の医薬的または小さな分子インヒビターの同定は、標準的高処理スクリーニング方法を介して容易に達成できる。さらに、標準的な医化学的アプローチを、さらなる作用物質を得るためにそれらの活性を増強または改変するようにこれらの作用物質に適用できる。
【００９９】
機能的Ａｈａ１（または同様の機能を持つ他の関連分子）のヌクレオチドまたは蛋白質を特異的に認識しそれに結合する精製アプタマーを用いて、機能的Ａｈａ１（および／または同様の機能を持つ他の関連分子）のレベルを減少できる。アプタマーは、特定の標的分子に結合する大きなランダムシーケンス・プールから選択された核酸またはペプチド分子である。小規模のアプタマーは、容易に、それらを合成し化学的に改変させ、そうでなければブロックまたは隠され得るエピトープにアクセスすることを可能にする。そして、アプタマーは、内因性分子に対するそれらの密接な類似点のために一般的に非毒性でかつ弱い抗原である。アプタマーの生成、選択および送達は、当該技術分野の技量内にある(例えば、 Leeら (2006) Curr Opin Chem Biol. 10, 1-8; Yanら (2005) Front Biosci 10, 1802-1827; Hoppe-SeylerおよびButz (2000) J Mol Med. 78(8), 426-430参照)。ネガティブ選択手順は、分子変異体を細かく区別できるアプタマーを与えることができる。例えば、ネガティブ選択手順は、Ｈｓｐ９０／ＡＤＰおよびＨｓｐ９０／ＡＴＰを区別できるアプタマーを与えることできるか；または、機能的Ａｈａ１、Ｈｓｐ９０ ＡＴＰアーゼおよび機能的Ａｈａ１−Ｈｓｐ９０ ＡＴＰアーゼ結合複合体を区別できる。また、アプタマーを用いて、細胞および生物において蛋白質機能（例えば、機能的Ａｈａ１機能）を一時的および空間的に調節できる。例えば、リガンド調節ペプチド（ＬｉＲＰ）系は、細胞内ペプチドの結合活性がペプチド・アプタマーによって制御され、今度は細胞浸透性小分子によって調節される場合の一般的方法を提供する(例えば、Binkowski (2005) Chem & Biol. 12(7), 847-55参照)。ＬｉＲＰまたは同様の送達システムを用いると、機能的Ａｈａ１の結合活性は、導入された細胞内の機能的Ａｈａ１に特異的な蛋白質アプタマーと相互作用する細胞浸透性小分子によって制御できた。かくして、アプタマーは、例えば、機能的Ａｈａ１  ｍＲＮＡ、機能的Ａｈａ１を発現した蛋白質、機能的Ａｈａ１についてのＨｓｐ９０ ＡＴＰアーゼ結合部位および／または機能的Ａｈａ１−Ｈｓｐ９０ ＡＴＰアーゼ複合体に直接的に結合することにより、機能的Ａｈａ１レベルを減少させる有効な手段を提供できる。
【０１００】
機能的Ａｈａ１（および／または同様の機能を持つ他の関連分子）をコードするリボヌクレオチドを特異的に認識し結合する精製アンチセンス核酸を用いて、機能的Ａｈａ１（および／または同様の機能を持つ他の関連分子）のレベルを減少できる。本発明内のアンチセンス核酸分子は、その蛋白質の発現を阻害するように、例えば、転写および／または翻訳を阻害することによって、細胞の条件下で、細胞のｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡコード、例えば、機能的Ａｈａ１蛋白質に特異的にハイブリダイズ（例えば、結合）するものである。機能的Ａｈａ１レベルを減少させるのに有効なアンチセンス分子は、当該技術分野に一般的に知られている方法によって設計、生成および投与できる(例えば、Chanら (2006) ClinicalおよびExperimental PharmacologyおよびPhysiology 33(5-6), 533-540参照)。
【０１０１】
また、標的ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断するように設計されたリボザイム分子を用いて、機能的Ａｈａ１および／または同様の活性を持つ関連分子のレベルを減少できる。機能的Ａｈａ１に特異的なリボザイム分子は、当該技術分野に一般的に知られた方法によって設計、生成および投与できる(例えば、ハンマーヘッド型リボザイムおよび小さなヘアピンＲＮＡの治療用途を概説するFanningおよびSymonds (2006) Handbook Experimental Pharmacology 173, 289-303G参照)。また、三重形成オリゴヌクレオチドを用いて、機能的Ａｈａ１および／または同様の活性を持つ関連分子のレベルを減少できる(一般的にRogersら (2005) Current Medicinal Chemistry 5(4), 319-326参照)。
【０１０２】
投与
本明細書に記載された方法に用いる作用物質は、当該技術分野に知られた様々な手段で送達できる。作用物質は、外来性または内因性の物質のいずれかとして治療上用いることができる。外因性作用物質は、体外で生成または製造され、身体に投与されるものである。内因性作用物質は、体内または体内の他の器官への送達のために、いくらかのタイプのデバイス（生物学的または他の）によって体内で生成または製造されるものである。
【０１０３】
本明細書に記載された作用物質は、１以上の医薬上許容される担体および／または賦形剤を用いて、例えば、ここに出典明示してそのすべてを本明細書の一部とみなすRemington's Pharmaceutical Sciences (A.R. Gennaro, Ed.), 21st edition, ISBN: 0781746736 (2005)に記載されたいずれかの通常の方法によって処方できる。かかる処方は、対象への適当な投与のための形態を提供するために、適当な量の担体と一緒に、好ましくは精製された形態において、治療上有効な量の作用物質を含むであろう。その処方は、投与様式に適するであろう。本発明での使用の作用物質は、限定されるものではないが、非経口、肺、経口、局所的、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、眼内、バッカルおよび直腸を含めたいくつかの経路を用いて、対象への投与のための公知の方法によって処方できる。また、個々の作用物質は、本発明の１以上のさらなる作用物質と組み合わせて、または他の生物学的に活性もしくは生物学的に不活性な作用物質と一緒に投与し得る。かかる生物学的に活性もしくは不活性な作用物質は、その作用物質と流体または機械的連絡し得るか、あるいはイオン、共有結合、ファン・デル・ワールス、疎水性、親水性または他の物理的な力により作用物質に結合し得る。
【０１０４】
本発明の方法に用いた場合に、本明細書に記載された治療上有効な量の一つの作用物質は、純粋な形態、または、かかる形態が存在する場合には、医薬上許容される塩形態で、および医薬上許容される賦形剤とまたはその賦形剤なくして使用できる。例えば、本発明の作用物質は、部分最適化フォールディングエネルギー学および／または対象における少なくとも部分的なリストアチャンネル機序により特徴付けされた蛋白質の細胞内および／または細胞外の輸送をレスキューするのに十分な量で、いずれかの医学的処置に適用可能な合理的な利益／リスク比で投与できる。
【０１０５】
かかる作用物質の毒性および治療の効力は、ＬＤ５０（集団の５０％までの致死用量）、およびＥＤ５０（集団の５０％に治療上有効な用量）を決定するための細胞培養および／または実験動物における標準的な医薬手順により決定できる。毒性および治療効果間の用量比は、大きな治療指数が好ましいＬＤ５０／ＥＤ５０比として表現できる治療指数である。
【０１０６】
単回投与を生成するために医薬上許容される担体と組み合せ得る作用物質の量は、処理される宿主および特定の投与様式に依存して変化するであろう。各投与形態の個々の用量に含有される作用物質の単位含量は、必要な治療上有効な量が、多数の個々の用量により達成できるので、治療上有効量をそれ自体で形成する必要がないことは当業者によって認められるであろう。作用物質の投与は、単一の事象として、または治療の時間的経過で生じることができる。例えば、作用物質は、毎日、毎週、隔週、毎月で投与できる。いくつかの条件では、治療は、数週間から数か月、さらに１年以上まで延長できる。
【０１０７】
いずれかの特定の対象についての特定の治療上の有効量レベルは、処置される障害および障害の重症度；使用された特定の作用物質の活性；使用された特定の組成物；患者の年齢、体重、一般的健康、性別および食事；投与時間；投与経路；使用した特定の作用物質の排泄速度；治療期間；使用した特定の作用物質と組み合わせてまたは同時に用いた薬物ならびに医学の技術分野においてよく知られた様々な因子を含めた様々な因子に依存するであろう。本発明で用いた作用物質の合計の毎日の使用法は、正常な医学的判断の範囲内で主治医により決定されるであろうことは、熟練した実践家により理解されるであろう。
【０１０８】
また、機能的Ａｈａ１または同様の機能を持つ他の関連分子のレベルを減少させる作用物質は、他の治療手段と組み合わせて用いることができる。かくして、本明細書に記載された療法に加えて、特定の蛋白質ミスフォールディング疾患に効果的であることが知られた対象の他の療法にも提供し得る。
【０１０９】
放出制御（または徐放性）調製物を処方して、作用物質の活性を拡大および投与頻度を低減し得る。また、放出制御調製物を用いて、作用物質の血中濃度のごとき作用または他の特性の開始時間に影響させ、結果的に副作用の発生に影響できる。
【０１１０】
放出制御調製物は、最初に、所望の治療効果を生む作用物質の量を放出し、長期間にわたり治療効果のレベルを維持するように連続的に他の量の作用物質を放出するように設計し得る。体内にほぼ一定のレベルの作用物質を維持するために、作用物質は、代謝または身体から排泄される作用物質の量を置き換える割合で投与形態から放出できる。作用物質の放出制御は、種々の誘導因子、例えば、ｐＨの変化、温度における変化、酵素、水または他の生理学的条件もしくは分子によって刺激し得る。
【０１１１】
放出制御システムは、例えば、特定の器官または腫瘍にインスリンまたは化学療法を送達するのに用いるものに同様の方法で作用物質を投与するために用い得る輸液ポンプを含み得る。典型的には、かかるシステムを用いて、作用物質は、選択された部位で制御された期間にわたり作用物質を放出する生物分解性の生物学的適合性ポリマー埋込剤（以下を参照）と組み合わせて投与される。高分子材料の例は、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリエチレン酢酸ビニルならびにその共重合体および組合せを含む。加えて、放出制御システムは、治療標的に接近して配置でき、かくして、全身性の用量の一部分だけを必要とできる。
【０１１２】
本発明の作用物質は、当該技術分野における当業者によく知られている他の放出制御手段または送達デバイスによって投与し得る。これらは、例えば、割合を変更して所望の放出プロフィールを供するヒドロプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリクス、ゲル、透過膜、浸透システム、多層コーティング、微粒子、リポソーム、またはミクロスフェア等、あるいは前記のいずれかの組合せを含む（以下を参照）。作用物質の放出制御送達の他の方法は当業者に知られ、それは本発明の範囲内にある。
【０１１３】
機能的Ａｈａ１および／または同様の機能を持つ他の関連分子のレベルを減少させる作用物質は、当該技術分野においてよく知られている様々な経路を介して投与できる。例は、直接注入（例えば、全身性または定位的）、注目する因子を分泌するように設計された細胞の埋込み、薬物を放出する生体材料、埋込型マトリックスデバイス、埋込型ポンプ、注射可能なゲルおよびヒドロゲル、リポソーム、ミセル（例えば、３０μｍまで）、ナノスフェア（例えば、１  ｍ未満）、マイクロスフェア（例えば、１〜１００μｍ）、貯蔵デバイス等に関する方法を含む。
【０１１４】
本明細書に記載した作用物質のごとき高分子および／または薬物の肺送達は、肺の局所組織または全身循環のための循環系に比較的容易な非侵入性の投与を提供する(例えば、肺性送達技術の概説を供する Cryan (2004) AAPS J. 7(1) article 4, E20-41参照)。肺送達の利点は、非侵襲性、吸収のための大きな表面積（約７５ｍ２）、急速な吸収を可能とする薄い（約０．１〜０.５μｍ）肺胞上皮、初回通過代謝の不存在、蛋白質分解活性の減少、急速な作用の開始、および高バイオアべイラビリティを含む。賦形剤および／または分散可能な液体の有無での肺送達のための薬物処方は、当該技術分野に知られている。ポリマー送達システム、リポソームおよび微粉化炭水化物のごとき生体分子送達についての担体ベースのシステムは、肺送達と共に用いることができる。浸透増強剤（例えば、界面活性剤、胆汁酸塩、シクロデキストリン、酵素インヒビター（例えば、キモスタチン、ロイペプチン、バシトラシン）および担体（例えば、ミクロスフェアおよびリポソーム）を用いて、全身分布のための肺胞上皮細胞を横切って取り込みを増強できる。本明細書に記載された生体分子を送達するのに用いることができる計量式吸入器、噴霧器および乾燥粉末吸入器のごとき種々の吸入送達デバイスは、当該技術分野に知られている(例えば、AErx (Aradigm, CA); Respimat (Boehringer, Germany); AeroDose (Aerogen Inc., CA))。当該技術分野において知られるように、デバイス選択は、用いられる生体分子の状態（例えば、溶液または乾燥粉末）、貯蔵の方法および状態、賦形剤の選定ならびに処方およびデバイス間の相互作用に依存できる。乾燥粉末吸入デバイスは、蛋白質ベースの作用物質の肺送達のために特に好ましい(例えば、Spinhaler (Fisons Pharmaceuticals, NY); Rotohaler (GSK, NC); Diskhaler (GSK, NC); Spiros (Dura Pharmaceuticals, CA); Nektar (Nektar Pharmaceuticals, CA))。良好な流れ、分散性および安定性を供する活性の生物学的成分の乾燥粉末処方は、当業者に知られている。
【０１１５】
機能的Ａｈａ１のレベルにおける減少に影響する作用物質は、様々な担体送達システムにおいて被包および投与できる。担体送達システムの例は、ミクロスフェア、ヒドロゲル、ポリマー埋込剤、スマートポリマー担体およびリポソームを含む。生体分子の作用物質送達用の担体ベースのシステムは：細胞内送達を提供でき；生体分子／作用物質遊離速度を目的に合わせることができ；その作用部位に達する生体分子の割合を増加でき；その作用部位への薬物の輸送を改善でき；他の作用物質または賦形剤と共存する沈着を可能にでき；ｉｎ ｖｉｖｏでの作用物質の安定性を改善でき；クリアランスの低減によるその作用部位での作用物質の滞留時間を延長でき；非標的組織への作用物質の非特異性の送達を減少でき；作用物質によって惹起された刺激を減少でき；高い初回用量の作用物質により毒性を減少でき；作用物質の免疫原性を改変でき；投与頻度を減少でき、生成物の味を改善でき；および生成物の有効期間を改善できる。
【０１１６】
高分子ミクロスフェアは、自然発生または合成高分子を用いて生成でき、０.１〜５００μｍのサイズ範囲における微粒子のシステムである。高分子ミセルおよびポリメローム（polymerome）はミクロスフェアと同様の特性を持つポリマー伝達手段であり、本明細書に記載された生体分子の被包および送達を促進できる。様々な生体分子ペイロードのためのミクロスフェアの製作、被包および安定化は、当該技術分野の技量内にある(例えば、Varde & Pack (2004) Expert Opin.  Biol. 4(1) 35-51参照)。ミクロスフェアの放出速度は、ポリマーのタイプ、ポリマー分子量、共重合体組成、ミクロスフェア処方に添加した賦形剤およびミクロスフェアのサイズによって仕上げることができる。ミクロスフェアを形成するのに有用なポリマー材料は、ＰＬＡ、ＰＬＧＡ、ＤＰＰＣでコーティングされたＰＬＧＡ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＥＶＡｃ、ゼラチン、アルブミン、キトサン、デキストラン、ＤＬ−ＰＬＧ、ＳＤＬＭ、ＰＥＧ（例えば、ＰｒｏＭａｘｘ）、ヒアルロン酸ナトリウム、ジケトピペラジン誘導体（例えば、テクノスフェア）、リン酸カルシウム−ＰＥＧ粒子およびオリゴ糖誘導体ＤＰＰＧ（例えば、Ｓｏｌｉｄｏｓｅ）を含む。被包は、例えば、水／油の単一エマルジョン法、水油水二重エマルジョン法または凍結乾燥を用いて達成できる。いくつかの商業用被包技術が利用可能である（例えば、ＰｒｏＬｅａｓｅＲ、Ａｌｋｅｒｍｅ）。本明細書に記載された作用物質を被包するミクロスフェアは、非経口、経口、肺、埋込みおよびポンプデバイスを含めた様々な手段において投与できる。
【０１１７】
また、コラーゲン、フィブリンおよびアルギン酸塩のごとき親水性のポリマーを含むポリマーヒドロゲルは、機能的Ａｈａ１および／または同様の機能を持つ他の関連分子のレベルを減少させる作用物質の徐放性に用いることができる（一般的に、Sakiyamaら (2001) FASEB J. 15, 1300-1302参照）。
【０１１８】
ミリメートル〜センチメートルのスケールでの三次元のポリマー埋込剤は、機能的Ａｈａ１および／または同様の機能を持つ他の関連分子のレベルを減少させる作用物質を負荷できる(一般的には、Tengら (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 3024-3029参照)。ポリマー埋込剤は、典型的には生理活性因子のより大きな貯蔵を提供する。また、埋込剤は、適用に幾何学（例えば、形、サイズ、多孔度）を仕上げて、構造支持体に作り上げることができる。また、埋込可能なマトリックスベースの送達システムは、様々なサイズおよび送達プロフィールにおいて商業的に入手可能である（例えば、Innovative Research of America, Sarasota, FL）。
【０１１９】
「スマート」ポリマー担体を用いて、機能的Ａｈａ１および／または同様の機能を持つ他の関連分子のレベルを減少させる作用物質を投与できる(一般的には、Staytonら (2005) Orthod Craniofacial Res 8, 219-225; Wuら (2005) Nature Biotech (2005) 23(9), 1137-1146参照)。このタイプの担体は、生理的ｐＨで親水性でステルス様であるポリマーを利用するが、それらは、細胞質へのカーゴ分子の放出を増強するエンドソーム区画への取り込み（すなわち、エンドソームのｐＨ勾配からの酸性刺激）後に疎水性および膜−不安定化となる。スマートポリマー担体の設計は、ｐＨ感知官能性、疎水性膜不安定化群、多用途コンジュゲーションおよび／または薬物の取り込みを可能とする複合体形成要素、および所望の細胞標的成分を組み込むことができる。潜在的な治療高分子カーゴは、機能的Ａｈａ１および／または同様の機能を持つ関連分子のレベルにおける減少を達成するペプチド、蛋白質、抗体、ポリヌクレオチド、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）、アプタマー、アンチセンスのオリゴデオキシヌクレオチド、サイセンシングＲＮＡおよび／またはリボザイムを含む。一例として、受容体依存性エンドサイトーシスを介して内部移行したスマートポリマー担体は、機能的Ａｈａ１を標的とするｄｓＲＮＡおよび／または本明細書に記載した他の作用物質の細胞質の送達を増強できる。ポリマー担体は、例えば、ポリ（アルキルアクリル酸）ポリマーのファミリー、アルキル基が連続的に１つのメチレン基だけ増加したポリ（メチルアクリル酸）、ポリ（エチルアクリル酸）（ＰＥＡＡ）、ポリ（プロピルアクリル酸）（ＰＰＡＡ）およびポリ（ブチルアクリル酸）（ＰＢＡＡ）を含めた特定の例を含む。強力なｐＨ応答性の膜不安定化活性を持つスマートポリマー担体は、腎排泄サイズ限界未満であるように設計できる。例えば、ポリ（ＥＡＡ−ｃｏ−ＢＡ−ｃｏ−ＰＤＳＡ）およびポリ（ＰＡＡ−ｃｏ−ＢＡ−ｃｏ−ＰＤＳＡ）ポリマーは，各々、９および１２ｋＤａの低分子量での高溶血／膜不安定化活性を示す。種々のリンカー化学は、蛋白質、核酸および／または標的部分についての分解性のコンジュゲーションを供するために利用可能である。例えば、ピリジルジスルフィド・アクリレート（ＰＤＳＡ）モノマーは、治療剤のエンドソームの移行後に細胞質中で低減できるジスルフィド結合を介する効率的なコンジュゲーション反応を可能にする。
【０１２０】
リポソームは、機能的Ａｈａ１および／または同様の機能を持つ他の関連分子のレベルを減少させる作用物質を投与するために用いることができる。リポソームの薬物運搬能および放出速度は、脂質組成、サイズ、電荷、薬物／脂質比および送達の方法に依存できる。通常のリポソームは、中性または陰イオンの脂質（天然または合成）を含む。一般的に用いた脂質は、（ホスファチジルコリン）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、スフィンゴミエリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）のごときレシチンである。リポソーム被包法は、当該技術分野において一般的に知られている(Galovicら (2002) Eur. J. Pharm. Sci. 15, 441-448; Wagnerら (2002) J. Liposome Res. 12, 259-270)。また、標的とされたリポソームおよび反応性リポソームを用いて、本発明の生体分子を送達できる。標的とされたリポソームは、特定の受容体および／または細胞タイプとの相互作用を可能にするそれらの表面に付着したモノクローナル抗体またはレクチンのごとき標的とするリガンドを有する。反応性および多形性のリポソームは広範囲のリポソームを含み、その共通の特性は、特定の相互作用（例えば、ｐＨ感受性リポソーム）に際して、それらの相および構造を変更するようなそれらの傾向である(例えば、Lasic (1997) Liposomes in Gene Delivery, CRC Press, FL参照)。
【０１２１】
種々の他の送達システムが、当該技術分野において知られており、本発明の作用物質を投与するために用いることができる。さらに、これらおよび他の送達システムを、本発明の作用物質の投与を最適化するために組み合わせおよび／または改変し得る。
【０１２２】
ｄｓＲＮＡを含む医薬組成物
様々な態様において、本発明は、本明細書に記載されたｄｓＲＮＡおよび医薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。ｄｓＲＮＡを含む医薬組成物は、Ａｈａ１発現により媒介された病理学的過程のごときＡｈａ遺伝子の発現または活性と関連する疾患または障害を処置するのに有用である。かかる医薬組成物は、送達の様式に基づいて処方される。一例は、非経口送達による全身投与のために処方される組成物である。
【０１２３】
本発明の医薬組成物は、Ａｈａ遺伝子の発現を阻害するのに十分な量で投与される。本発明者らは、それらの効率の改善のために、驚くべき低用量で本発明のｄｓＲＮＡを含む組成物を投与できることを見出した。１日当たり受容者のキログラム体重当たり５ｍｇのｄｓＲＮＡの最大用量は、Ａｈａ遺伝子の発現を阻害または完全に抑制するのに十分である。
【０１２４】
一般的に、ｄｓＲＮＡの適当な用量は、１日当たりの受容者のキログラム体重当たり０.０１マイクログラム〜５.０ミリグラムの範囲内、通常、１日当たりのキログラム体重当たり１マイクログラム〜１ｍｇの範囲内にあるであろう。医薬組成物は毎日１回投与し得るか、またはｄｓＲＮＡは、その日を通して適当な間隔で２、３またはそれを超えるサブ用量として、または放出制御処方を通して連続的な注入または送達を用いてさえ投与し得る。その場合には、各サブ用量に含まれたｄｓＲＮＡは、合計の毎日用量を達成するために相応してより小さいにちがいない。また、投薬単位は、例えば、いくつかの日の期間にわたりｄｓＲＮＡの徐放性を提供する従来の徐放性処方を用いていくつかの日の間の送達のために調合できる。徐放性処方は当該技術分野においてよく知られ、本発明の作用物質と用いることができる作用物質の膣送達に特に有用である。様々な態様において、投薬単位は、対応する複数の毎日用量を含む。
【０１２５】
当業者は、限定されるものではないが、対象の疾患または障害の重篤度、前処置、身体全体の健康および／または年齢ならびに存在する他の疾患を含めたある種の因子が、対象を有効に処置するのに必要とされる用量および時期に影響することを認めるであろう。さらに、治療上有効な量の組成物での対象の処置は、単回の処置または一連の処置を含むことができる。本発明により包含された個々のｄｓＲＮＡについての有効用量およびｉｎ ｖｉｖｏの半減期の見積りは、本明細書に別記された従来の方法を用いて、または適当な動物モデルを用いるｉｎ ｖｉｖｏ試験に基づいて作成できる。
【０１２６】
マウス遺伝学における進歩は、Ａｈａ発現により媒介された病理学的過程のごとき種々のヒト疾患の試験についての多数のマウス・モデルを生成した。かかるモデルは、ｄｓＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ試験ならびに治療上有効な用量の決定に用いられる。
【０１２７】
また、本発明は、本発明のｄｓＲＮＡ化合物を含む医薬組成物および処方を含む。本発明の医薬組成物は、局所的または全身的な処置が所望されるか、および処置される領域に依存して多数の方法で投与し得る。投与は、例えば、噴霧器によることを含めた粉末またはエアロゾルの吸入または吹送による局所的肺性；気管内、鼻腔内、上皮性および経皮性、経口または非経口であり得る。非経口投与は静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内の注射もしくは注入、または頭蓋内、例えば、くも膜下腔内もしくは脳室内投与を含む。
【０１２８】
局所投与のための医薬組成物および処方は、経皮的な貼付剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル、滴剤、坐剤、スプレー剤、液剤および散剤を含み得る。通常の従来の医薬担体、水性、粉末または油性の基剤、増粘剤等は必要であり得るかまたは所望され得る。また、コーティングされたコンドーム、グローブ等も有用であり得る。例えば、局所的処方は、本発明のｄｓＲＮＡが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤および界面活性剤のごとき局所送達の剤と混合されるものを含む。様々な態様において、脂質およびリポソームは、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン＝ＤＯＰＥ、ジミリストイルホスファチジルコリン＝ＤＭＰＣ、ジステアロリホスファチジルコリン  ネガティブ（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロール＝ＤＭＰＧ）およびカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピル＝ＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン＝ＤＯＴＭＡ）を含むことができる。本発明のｄｓＲＮＡは、リポソーム内に被包し得るか、それに、特にカチオン性リポソームに対する複合体を形成し得る。あるいは、ｄｓＲＮＡは、脂質、特にカチオン性脂質に対して複合体化し得る。様々な態様において、脂肪酸およびエステルは、限定されるものではないが、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはＣ１−１０アルキルエステル（例えば、イソプロピルミリステートＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリドまたはその医薬上許容される塩を含むことができる。
【０１２９】
当業者は、経口投与のための組成物および処方が、散剤または顆粒剤、ミクロ粒剤、ナノ微粒子物、水もしくは非水性の媒体中の懸濁剤または溶液、カプセル剤、ゲルカプセル剤、カシェ剤、錠剤またはミニ錠剤を含むことができることを認識するであろう。増粘剤、矯味剤、希釈剤、乳化剤、分散化補助剤または結合剤が望ましいかもしれない。経口処方は、本発明のｄｓＲＮＡが１以上の浸透増強剤、界面活性剤およびキレート化剤と共に投与されるものであり得る。界面活性剤は、脂肪酸および／もしくはエステルまたはその塩、胆汁酸および／またはその塩を含むことができる。好ましい胆汁酸／塩は、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、ウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリルコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール、ナトリウムタウロ−２４,２５−ジヒドロ−フシデートおよびナトリウムグリコジヒドロフシデートを含む。脂肪酸は、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはモノグリセリド、ジグリセリドまたはその医薬上許容される塩（例えば、ナトリウム）を含むことができる。浸透増強剤の組合せ、例えば、胆汁酸／塩と組み合わせた脂肪酸／塩が有用であり得る。例えば、組合せは、ラウリン酸、カプリン酸およびＵＤＣＡのナトリウム塩であり得る。さらなる浸透増強剤はポリオキシエチレン−９−アウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルを含むことができる。
【０１３０】
また、当業者は、本発明のｄｓＲＮＡが、スプレーされた乾燥粒子を含めた顆粒形態で経口的に送達でき、またはマイクロまたはナノ粒子を形成するように複合体化し得ることを認識するであろう。ｄｓＲＮＡ複合体化剤は、ポリアミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；ポリアルキルアクリレート、ポリオキシエタン、ポリアルキルシアノアクリレート；カチオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリル酸塩、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびデンプン；ポリアルキルシアノアクリレート；ＤＥＡＥ誘導ポリイミン、ポルランス、セルロースおよびデンプンを含む。複合体化剤は、キトサン、Ｎ−トリメチルキトサン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ−アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）、ＤＥＡＥ−メタクリレート、ＤＥＡＥ−ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミンおよびＤＥＡＥ−デキストラン、ポリアクリル酸メチル、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ,Ｌ−乳酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギン酸塩およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むことができる。
【０１３１】
非経口投与、くも膜下腔内または脳室内投与のための組成物および処方は、緩衝剤、希釈剤、および限定されるものではないが、浸透増強剤、担体化合物のごとき他の適当な添加剤、ならびに他の医薬上許容される担体または賦形剤を含み得る無菌水溶液を含み得る。
【０１３２】
本発明の医薬組成物は、限定されるものではないが、溶液、乳剤およびリポソーム含有処方を含む。これらの組成物は、限定されるものではないが、事前形成された液剤、自己乳化固体および自己乳化半固体を含めた様々な成分から生成され得る。
【０１３３】
単位投薬形態で都合よく示され得る本発明の医薬処方は、医薬産業においてよく知られた従来技術により調製し得る。かかる技術は、医薬担体（群）または希釈剤（群）と有効成分を関連させる工程を含む。一般的に、処方は有効成分を液体担体もしくは最後に分割される固体または双方と均一および親密に関連させることにより調製され、必要ならば、生成物を形づくる。
【０１３４】
本発明の組成物は、限定されるものではないが、錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液体シロップ剤、ソフトゲル剤、坐剤および浣腸剤のごとき多数の可能な投薬形態のいずれかに処方され得る。また、本発明の組成物は、水性、非水性または混合媒体中の懸濁剤として処方され得る。水性懸濁液は、例えば、ナリウム・カルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストランを含めた懸濁液の粘性を増加させる物質をさらに含み得る。また、その懸濁剤は安定剤を含み得る。
【０１３５】
本発明の様々な態様において、医薬組成物は処方され、フォーム剤として用いられ得る。医薬フォーム剤は、限定されるものではないが、乳剤、マイクロエマルジョン、クリーム剤、ゼリー剤およびリポソームのごとき処方を含む。現実には基本的に類似しているが、これらの処方は、最終生成物の成分および一貫性において変化する。かかる組成物および処方の調製は、医薬および処方の技術分野の当業者に一般的に知られ、本発明の組成物の処方に適用し得る。
【０１３６】
スクリーニング
本発明のもう一つの態様は、機能的Ａｈａ１および／または同様の機能を持つ他の関連分子に対する作用について候補作用物質をスクリーニングするためのシステムに指向され、それは、蛋白質のフォールディング疾患の治療上または予防上の処置のための組成物の開発に有用であることができる。アッセイ方法は、体内の薬物の特定の血清レベルの効果に、より緊密に接近する哺乳動物生細胞で行なうことができる。エネルギー的に有利ではないフォールディング特性を持つ蛋白質を発現する細胞系は、機能的Ａｈａ１および／または同様の機能を持つ他の関連分子、または培養細胞系から調製された抽出物に対する潜在的な生物活性作用物質の活性を評価するのに有用であろう。抽出物を用いる試験は、直接的な作用物質／酵素の相互作用のより正確な決定の可能性を提供する。
【０１３７】
かくして、本発明は、機能的Ａｈａ１および／または同様の機能を持つ他の関連分子のレベルを減少させ、かくして、哺乳動物宿主、例えば、ヒト宿主におけるエネルギー的に有利でないフォールディング特性を持つ蛋白質のフォールディングを安定化させる作用物質を評価する方法を提供し得る。このアッセイ方法は、適当な培地または緩衝液における事前に選択された量の作用物質とミスフォールドされた蛋白質を表現する遺伝子組換え細胞系またはその抽出物を接触させ、次いで、前記の作用物質の不在下の対照細胞系または抽出物の一部分、および／または注目する蛋白質の非ミスフォールドされた変異体を発現する対照細胞系に比較して、機能的Ａｈａ１および／または同様の機能を持つ他の関連分子のレベルを比較することを含み得る。例えば、スクリーニング方法は、機能的Ａｈａ１のレベルを減少させる、Ｈｓｐ９０への細胞内のＡｈａ１結合を減少させる、Ｈｓｐ９０ ＡＴＰアーゼの活性化を減少させる、Ｈｓｐ９０／ＡＴＰの細胞内レベルを減少させる、および／またはＨｓｐ９０／ＡＤＰの細胞内レベルを増加させる作用物質を同定できる、
【０１３８】
より詳細には、蛋白質ミスフォールディング疾患の処置のための候補作用物質は、適当な培地または緩衝液に注目するミスフォールドされた蛋白質を安定的に発現する細胞を供し、候補作用物質を細胞に投与し、細胞における機能的Ａｈａ１のレベルを測定し、次いで、候補作用物質が細胞内の機能的Ａｈａ１レベルを減少させるかどうかを決定することによりスクリーニングできる。あるいは、蛋白質ミスフォールディング疾患の処置のための候補作用物質は、適当な培地または緩衝液中にミスフォールドされた蛋白質を安定的に発現する細胞を供し、候補作用物質を細胞に投与し、Ｈｓｐ９０に対する細胞内のＡｈａ１結合および／またはＨｓｐ９０ ＡＴＰアーゼの活性化のレベルを測定し、次いで、候補作用物質がかかる結合および／または活性化を減少させるかどうかを決定することによりスクリーニングできる。望ましい候補は、一般的に、細胞における機能的Ａｈａ１のレベルを減少させる能力を所有するであろう。ミスフォールドされた蛋白質を安定的に発現する細胞の提供は、当該技術分野の技量内にある（例えば、実施例１〜１１参照）。
【０１３９】
機能的Ａｈａ１および／または同様の機能を持った関連する分子、またはそれに形成された複合体のレベルを検出する適当ないずれかの方法を、候補作用物質の投与から得られるレベルについて使用し得る（例えば、実施例５〜９参照）。伝統的方法のうち、共免疫沈降、架橋、勾配またはクロマトカラムを介する同時精製およびＡｈａ１機能に関連した活性アッセイを使用し得る。これらのごとき手順の利用は、注目する蛋白質および／または複合体の同定を可能とする。
【０１４０】
スクリーニングにおいて同定された作用物質は、一般的に、増加した蛋白質通過を生じるように部分最適化フォールディング動力学で蛋白質の安定化を達成するような方法で機能的Ａｈａ１または同様の機能を持つ関連分子と相互作用する能力を示すであろう。例えば、同定された作用物質は、機能的Ａｈａ１のレベルを減少させ、Ｈｓｐ９０への細胞内Ａｈａ１結合を減少させ、Ｈｓｐ９０ ＡＴＰアーゼの活性化を減少させ、Ｈｓｐ９０／ＡＴＰの細胞内レベルを減少させ、および／またはＨｓｐ９０／ＡＤＰの細胞内レベルを増加させ得る。これらの作用物質は、限定されるものではないが、核酸、ポリペプチド、ｄｓＲＮＡ、アンチセンス分子、アプタマー、リボザイム、三重らせん、抗体および無機小分子を含むことができる。
【０１４１】
さらに、前記のスクリーニング方法は、非ミスフォールドされた蛋白質変異体を安定的に発現するもう一つの細胞を使用できる。他の細胞に関する実質的に同様の方法（部分最適化フォールディング動力学を持つ蛋白質を発現する）で、候補作用物質を投与し、非ミスフォールドされた蛋白質の通過レベルを測定することにより、候補作用物質が非ミスフォールドされた蛋白質の通過レベルを実質的に減少させるかどうかを決定できる。好ましくは、同定された作用物質は、非ミスフォールドされた蛋白質のフォールディングおよび／または通過に実質的に干渉しない。また、他の蛋白質を安定的に発現する細胞を同様に用いて、作用物質が他の関連する蛋白質または無関係な蛋白質のフォールディングおよび／または通過に影響するかどうかを決定できる。例えば、機能的Ａｈａ１のレベルを減少させる同定された作用物質は、よりエネルギー的に安定な折り畳み（fold）を持つ他の蛋白質の通過を好ましくは実質的に障害しない。
【０１４２】
また、本発明は、機能的Ａｈａ１および／または同様の機能を持つ他の関連分子に特異的に結合する作用物質を同定する方法を包含する。かかる１つの方法は、固定化され精製された機能的Ａｈａ１蛋白質および少なくとも１つのテスト作用物質を供し；固定化された蛋白質とテスト作用物質とを接触させ；固定化された蛋白質に結合していない作用物質を洗い流し；次いで、テスト作用物質が固定化された蛋白質に結合しているか否かを検出する工程を含む。固定化された蛋白質に結合したままであるそれらの作用物質は、機能的Ａｈａ１蛋白質と特異的に相互作用するものである。
【０１４３】
また、本発明は、機能的Ａｈａ１（または同様の機能を持つ他の分子）と、疾患状態、表現型または蛋白質ミスフォールディング疾患のごとき条件との間に存在する関係を解明する創薬の努力における機能的Ａｈａ１（および／または同様の機能を持つ他の分子）の使用を含む。これらの方法は、試料、組織、細胞または生物と本発明の作用物質とを接触させ、処置後のいくらかの時点で機能的Ａｈａ１の核酸またはタンパク質、および／または関連する表現型または化学的エンドポイントのレベルを測定し、次いで、所望により、本発明のさらなる作用物質で処置されていない試料または処置された試料と測定された値を比較することを含む、Ａｈａ１ポリヌクレオチドのレベルを検出または減少させることを含む。また、これらの方法は、標的バリデーションのプロセスについての知られていない遺伝子の機能を決定するため、または特定の疾患、状態または表現型の治療または予防の標的として特定の遺伝子産物の妥当性を決定するために他の実験と並行して、または組み合わせて行なうことができる。
【０１４４】
治療的処置
本発明の１つの態様は、蛋白質フォールディング疾患についての処置方法を提供する。特定の理論によって拘束されることなく、機能的Ａｈａ１レベルの減少、かくして、Ｈｓｐ９０ ＡＴＰアーゼ活性の減少は、速度論的にチャレンジされたΔＦ５０８変異体がレスキューシャペローム（chaperome）を利用して、より多くの輸出コンピテント折り畳みを創製するさらなる時間を可能とし得ることは可能である。従って、蛋白質フォールディングは、機能的Ａｈａ１および／または同様の機能を有する他の関連分子のレベルを減少させる作用物質の投与によりそれを必要とする対象において処置できる。
【０１４５】
さらに再び、特定の理論によって拘束されることなく、Ｈｓｐ９０−ＡＤＰ状態がカーゴおよびＥＲＡＤの経路の連結を支持するが、Ｈｓｐ９０−ＡＴＰ状態がそれらの知られた生化学的特性を与える機能的Ａｈａ１（例えば、図８Ｂ、Ｘ参照）またはｐ２３（例えば、図８Ｂ、Ｙ参照）に対する応答に基づいてＣＯＰＩＩに対する結合を与えることは可能である。かくして、蛋白質ミスフォールディング疾患の予防上または治療上の処置のためのもう一つのアプローチは、Ｈｓｐ９０ ＡＴＰアーゼに対する機能的Ａｈａ１の結合を減少させる、および／またはＨｓｐ９０ ＡＴＰアーゼに対する機能的Ａｈａ１の結合から生じる、得られた活性化レベルを減少させる作用物質をそれを必要とする対象に投与することを含むことができる。
【０１４６】
好ましくは、作用物質の投与は、他の細胞内の蛋白質のフォールディングおよび／または通過に実質的に干渉をしない。例えば、機能的Ａｈａ１のレベルを減少する、Ｈｓｐ９０ ＡＴＰアーゼへの機能的Ａｈａ１の結合を減少させる、および／または蛋白質ミスフォールディング疾患を処置するためにＨｓｐ９０ ＡＴＰアーゼへの機能的Ａｈａ１の結合から生じる得られた活性化レベルを減少させる作用物質の投与は、他の蛋白質、例えば、よりエネルギー的に安定な折り畳みを持つ他の蛋白質の通過を好ましくはかなりには障害しない。
【０１４７】
本発明の文脈における処置についての必要性を示す、および／または本明細書に記載した処置方法に従う疾患の状況または状態は、ＣＦ、マルファン症候群、ファブリー病、ゴーシェ病、網膜色素変性症３、アルツハイマー病、ＩＩ型糖尿病、パーキンソン病、クロイツフェルト−ヤコブ病のごとき海綿状脳症、原発性全身性アミロイドーシス、続発性全身性アミロイド症、老人性の全身性アミロイドージス、家族性アミロイドポリニューロパシーＩ、遺伝的脳アミロイド血管症、血液透析関連アミロイドーシス、家族性アミロイドポリニューロパシーＩＩＩ、フィンランド遺伝性の全身性アミロイドーシス、甲状腺の髄様癌、心房性アミロイドーシス、遺伝性非ニューロパシーの全身性アミロイドーシス、注射限局性アミロイド症および遺伝性腎アミロイドーシスのごとき蛋白質ミスフォールディング疾患を含む。例えば、本明細書に記載された方法によって治療可能な蛋白質ミスフォールディング疾患は、ミスフォールドされた蛋白質の結果、ＣＦ、マルファン症候群、ファブリー病、ゴーシェ病および網膜色素変性症３のごとき、ＥＲからの蛋白質通過の減少および蛋白質分解の減少を生じるそれらの疾患を含む。もう一つの例として、本明細書に記載された方法により処置できる蛋白質ミスフォールディング疾患は、アルツハイマー病、ＩＩ型糖尿病、パーキンソン病およびスポンジ様脳障害（例えば、クロイツフェルト−ヤコブ病）のごとき、ミスフォールドされた蛋白質の結果、不溶性凝集の沈着を生じるそれらの疾患を含む。前記にリストされた蛋白質ミスフォールディング疾患は、少なくとも部分的に、ＣＦＴＲ、フィブリリン、アルファ・ガラクトシダーゼ、ベータ・グルコセレブロシダーゼ、ロドプシン、アミロイド・ベータおよびタウ（島アミロイド・ポリペプチド）、アミリン、アルファ・シヌクレイン、プリオン、免疫グロブリン軽鎖、血清アミロイドＡ、トランスサイレチン、シスタチンＣ、β２−ミクログロブリン、アポリポ蛋白Ａ−１、ゲルゾリン、カルシトニン、心房性ナトリウム利尿因子、リゾチーム、インスリンおよびフィブリノゲンのミスフォールディングにより引き起こされ得る。
【０１４８】
処置の必要性の決定は、その疾患と合致する病歴および健康診断によって典型的に評価されるであろう。例えば、ＣＦの診断書は、臨床的基準および汗中Ｃｌ−値の分析の組合せを含むことができる。加えて、ΔＦ５０８についてのＤＮＡ分析を行なうことができる。かかるＣＦ診断は、当該技術分野の技量内にある(例えば、Cutting (2005) Annu Rev Genomics Hum Genet 6, 237-260, reviewing CF参照)。療法の同定された必要性を持つ対象は、本明細書に記載された治療処置に従う蛋白質ミスフォールディング疾患の診断された蛋白質ミスフォールディング疾患または徴候を持つもの、ならびに蛋白質ミスフォールディング疾患につき処置された、処置されるべきまたは処置されるであろう対象を含む。対象は、より好ましくは、限定されるものではないが、哺乳動物、爬虫類およびトリ、好ましくは、ウマ、ウシ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタおよびニワトリ、最も好ましくはヒトを含めた動物である。
【０１４９】
本発明のもう一つの態様は、蛋白質ミスフォールディングの効果から細胞をレスキューすることに指向される。かかるアプローチは、細胞の機能に指向され、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで行うことができる。例として、蛋白質ミスフォールディングの効果からの細胞のレスキューが、培養細胞系からの細胞において生じることができる。もう一つの例として、蛋白質ミスフォールディングの効果からの細胞のレスキューが、対象から取り出し、次いで引き続いて対象に再導入された細胞において生じることができる。さらなる例として、蛋白質ミスフォールディングの効果からの細胞のレスキューは、インサイツでの対象の細胞中で生じることができる。蛋白質ミスフォールディングが生じる細胞への、機能的Ａｈａ１および／または同様の機能を持つ関連分子のレベルを減少させる作用物質の投与は、エネルギー的に不安定な折り畳みの安定化を促進できる結果、蛋白質の障害された細胞内および／または細胞外の通過のレスキューを生じさせる。例えば、Ｈｓｐ９０共同シャペロンおよび機能的Ａｈａ１のレベルを低下させる作用物質のミスフォールドされたΔＦ５０８ ＣＦＴＲを発現する細胞への投与は、ΔＦ５０８ ＥＲ安定性を増強でき、細胞表面へのΔＦ５０８輸送をレスキューでき、細胞表面ΔＦ５０８有効性を増加でき、および／またはチャネル機能を部分的に回復できる（例えば、実施例１０参照）。好ましくは、蛋白質ミスフォールディングの効果から細胞をレスキューする機能的Ａｈａ１のレベルを減少させる作用物質の投与は、好ましくは、他の細胞内の蛋白質のフォールディングおよび／または通過と実質的に干渉をしない。
【０１５０】
ｄｓＲＮＡを用いる治療的処置
本発明は、特に、嚢胞性線維症の治療のためのｄｓＲＮＡまたはそれから調製された医薬組成物の使用に関する。Ａｈａ１発現に対する阻害効果のために、本発明によるｄｓＲＮＡまたはそれから調製された医薬組成物は、嚢胞性線維症患者の生活の質を増強できる。
【０１５１】
さらに、本発明は、例えば、腫瘍成長および腫瘍転移を阻害するための癌の処置を目的とした本発明のｄｓＲＮＡまたは医薬組成物の使用に関する。例えば、ｄｓＲＮＡまたはそれから調製された医薬組成物は、乳癌、肺癌、頭頸部癌、脳癌、腹部癌、結腸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃腸癌、神経膠腫、肝臓癌、舌癌、神経芽細胞腫、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、ウィルム腫瘍、多発性骨髄腫のような固形腫瘍の処置、ならびに黒色腫のごとき皮膚癌の処置、リンパ腫および血液癌の処置に用い得る。さらに、本発明は、Ａｈａ１発現を阻害するおよび／または異なるタイプの癌、例えば、乳癌、肺癌、頭部癌、頚部癌、脳癌、腹部癌、結腸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃腸癌、神経膠腫、肝臓癌、舌癌、神経芽細胞腫、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、ウィルム腫瘍、多発性骨髄腫、皮膚癌、黒色腫、リンパ腫および血液癌における腹水および胸水の蓄積を阻害するために本発明によるｄｓＲＮＡまたはそれから調製された医薬組成物の使用に関する。Ａｈａ１発現に対する阻害効果のために、本発明によるｄｓＲＮＡまたはそれから調製された医薬組成物は、癌患者の生活の質を増強できる。
【０１５２】
本発明は、さらに、例えば、他の医薬および／または他の処置方法、例えば、嚢胞性線維症または癌を処置する、または腫瘍転移を予防するために現在使用されているもののごとき、例えば、公知の医薬および／または公知の処置方法と組み合わせて、嚢胞性線維症もしくは癌を処置する、または腫瘍転移を予防するためのｄｓＲＮＡまたはその医薬組成物の使用に関する。医薬組成物が嚢胞性線維症の処置を目的とする場合、その組成物は、例えば、日常の胸部理学療法、経口適用された膵酵素、肺感染症に対抗する日常の経口的または吸入される抗生物質、吸入された抗喘息療法、コルチコステロイド錠剤、食事性ビタミンサプリメント、特にＡおよびＤ、ＰｕｌｍｏｚｙｍｅＴＭの吸入、便秘を軽減するまたは酵素サプリメント活性を改善する医薬、ＣＦ関連糖尿病用インスリン、ＣＦ関連肝臓病用薬物治療、および呼吸を助ける酸素と組み合せて与えることができる。
【０１５３】
医薬組成物が癌の処置および／または腫瘍転移の予防を目的とする場合、その組成物は、放射線治療および、例えば、シスプラチン、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシンまたはタモキシフェンのごとき化学療法剤と組み合せて与えることができる。
【０１５４】
また、本発明は、特定のＲＮＡｉ作用物質と、いずれかの従来の化学療法剤のごときもう一つの癌治療化学療法剤を含めることにより実施できる。他のかかる作用物質との特異的結合剤の組合せは、化学療法プロトコールを増強できる。多数の化学療法プロトコールは、本発明の方法に組み込むことができるとして熟練した実践者の脳にそれ自体が現われるであろう。いずれの化学療法剤も、アルキル化薬、代謝拮抗物質、ホルモンおよびアンタゴニスト、放射性同位元素、ならびに天然物を含めて用いることができる。例えば、本発明の化合物は、ドキソルビシンおよび他のアントラサイクリン・アナログのごとき抗生物質、シクロホスファミドのごときナイトロジェンマスタード、５−フルオロウラシル、シスプラチン、ヒドロキシ尿素、タキソールおよびその天然および合成の誘導体のごときピリミジン・アナログ等と共に投与できる。もう一つの実施例として、胸部の腺癌のごとき混合腫瘍の場合において、腫瘍が性腺刺激ホルモン依存性および性腺刺激ホルモン非依存性の細胞を含む場合、化合物はリュープロリドまたはゴセレリン （ＬＨ−ＲＨの合成ペプチドアナログ）と共に投与できる。他の抗腫瘍性プロトコールは、もう一つの処置様式、例えば、手術、放射線等（これらを本明細書では「補助抗腫瘍性物理療法」という）を持つテトラサイクリン化合物の使用を含む。かくして、本発明の方法は、副作用を低減し、効力を増強する利益を持つかかる通常の措置と共に使用できる。
【０１５５】
実施例
本教示の態様は、以下の実施例に徴してさらに理解でき、これは、何ら本教示の範囲の制限として解釈されるべきものではない。
【０１５６】
実施例１：ＣＦＴＲインタラクトーム
細胞外および細胞内経路におけるＣＦＴＲ輸送および機能に関与する全体的な蛋白質相互作用を規定するために、ＣＦＴＲ含有蛋白質複合体を、野生型ＣＦＴＲを発現する細胞系から免疫単離し（例えば、図１参照）、プロテアーゼ消化し、次いで、そのペプチド混合物の組成を多次元タンパク質同定技術（ＭｕｄＰＩＴ）を用いて決定した(Linら, Biochim Biophys Acta 1646, 1 (2003))。
【０１５７】
ＣＦＴＲは、野生型もしくはΔＦ５０８ ＣＦＴＲのいずれかを過剰発現する安定なＢＨＫ細胞系、または野生型ＣＦＴＲを発現するＣａｌｕ−３、ＨＴ２９およびＴ８４細胞系から免疫沈殿させた。ｗｔまたはΔＦ５０８ ＣＦＴＲを安定的に発現するベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞を、Ｆ１２、５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、各１００単位／ｍｌのペニシリンおよびストレプトマイシン(Pen/Strep)、および５００μＭメトトレキセート(Xanodyne Pharmacal, Inc., Florence, KY)を補足したＤＭＥＭ中に維持した。ＣＦＴＲを発現しない親ＢＨＫ細胞は、メトトレキセートを含まない以外は同一培地中で培養した。すべてが内因性ｗｔ ＣＦＴＲを発現するヒト肺細胞系Ｃａｌｕ−３およびヒト腸細胞系ＨＴ２９およびＴ８４をＡＴＣＣから購入し、製造者の指示によって維持した。
【０１５８】
全体細胞の洗浄剤溶解物におけるＣＦＴＲおよび共免疫沈殿している蛋白質を、抗ＣＦＴＲモノクローナル抗体Ｍ３Ａ７と結合したセファロース・ビーズに結合させた。ＣＦＴＲが異なる細胞内区画を通って通過すると生じる一時的または弱い相互作用を捕捉するために、細胞溶解に先立ち無傷の細胞に加えた切断可能な化学的架橋剤ジチオビススクシンイミジルプロピオネート（ＤＳＰ）の不存在または存在下で免疫沈降を行なった。ビーズへの蛋白質の非特異性の結合を制御するために、いくつかの条件を用いて、ビーズ単独、または水疱性口内炎ウイルスに感染した細胞中（Ｃａｌｕ−３、Ｔ８４およびＨ８９データセット）で見出されただけの蛋白質のＶＳＶ−Ｇに指向されたモノクローナル抗体に結合したビーズの存在下での細胞溶解物のインキュベーションを含めたバックグラウンド回収を示した。ＢＨＫ細胞の場合には、野生型およびΔＦ５０８を発現する安定な細胞系からの免疫沈殿をＣＦＴＲを発現しない親細胞系と直接的に比較した。エクセルファイル中で提供されたデータセットにおいて、クロスリンクしていないおよびクロスリンクした方法から回収した蛋白質をプールする。
【０１５９】
免疫沈降に続いて、蛋白質複合体は、新たに調製した８ＭグアニジンＨＣｌに続いて２Ｍまで希釈したもので蛋白質を変性させることにより消化した。エンドプロテアーゼ ＬｙｓＣを用いて、蛋白質を８時間消化し、続いて、１ＭグアニジンＨＣｌまで希釈し、PorozymeTMトリプシンビーズを用いてトリプシン消化した。消化はすべて３７℃で行っている。
【０１６０】
プロテアーゼで消化した免疫複合体を、ＭｕｄＰＩＴを用いて、ＬＣ／ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析に付した。このアプローチは、いくらかの著者によって詳細に記載された(Linkら, 1999 Nat Biotechnol 17, 676-682; MacCossら, 2002, Proc Natl Acad Sci U S A 99, 7900-7905; MacCossら, 2002, Anal Chem 74, 5593-5599; McDonaldら, 2002 Int J Mass Spect 219, 245-251; Washburnら, 2001 Nat Biotechnol 19, 242-247)。略言すると、変性、還元およびアルキル化した蛋白質を３つの画分に分け、３つの異なるプロテアーゼ（トリプシン、サブチリシンおよびエラスターゼ）で３７℃で一晩消化した。得られたペプチド混合物を、ギ酸（５％）で酸性化した。引き続いて、３相マイクロキャピラリーカラムを、Sutter Instrumentsレーザープラー(Sutter Manufacturing, Novato, CA)を用いて約５μｍの先端直径に従前に注いだ１００μＭ融合石英毛細管に約７ｃｍの５−μｍ Aqua C18材料（Aqua, Phenomimex）をスラリーパッキングして構築した。次に、３ｃｍの５−μｍ  Ｐａｒｔｉｓｐｈｅｒｅ強陽イオン交換樹脂(Partisphere, Whatman)に続いて、もう一つの３ｃｍの５−μｍ Aqua C18クロマトグラフィー材料をそのカラムに充填した。次いで、ペプチド混合物が高圧力セルを用いて三相性クロマトグラフィーカラムのバックエンドに負荷される前に、カラムを５％アセトニトリル／０.１％ギ酸で約３０分間平衡化させた。
【０１６１】
ペプチド消化物を負荷した後に、カラムをAgilent 1100 ４次HPLCで直列配置し、改変した６工程分離を用いて分析した。緩衝液は、５％アセトニトリル／０.１％ギ酸（緩衝液Ａ）、８０％アセトニトリル／０.１％ギ酸（緩衝液Ｂ）および５００ｍＭ酢酸アンモニウム／５％アセトニトリル／０.１％ギ酸（緩衝液Ｃ）であった。工程ｌは、０〜１００％緩衝液Ｂの１００分間の勾配よりなった。工程２〜５は以下のプロフィールを有した：３分間の１００％緩衝液Ａ、２分間のＸ％緩衝液Ｃ、０〜１５％の緩衝液Ｂの１０分間の勾配および１５〜４５％の緩衝液Ｂの９７分間の勾配。その２分間の緩衝液Ｃパーセンテージ（Ｘ）は、、６工程の分析につき、各々、１０、２０、３０、４０％であった。最終工程において、勾配は、３分間の１００％緩衝液Ａ、２０分間の１００％緩衝液Ｃ、０〜１５％の緩衝液Ｂの１０分間の勾配および１５〜７０％の緩衝液Ｂの１０７分間の勾配を含んだ。
【０１６２】
マイクロキャピラリーカラムから溶出したペプチドとして、それらを遠位２.４ｋＶのスプレー電圧の印加でＬＣＱ−Ｄｅｃａデカ質量分析計に直接的にエレクトロスプレイした。１つのフルスキャンの質量スペクトル（４００〜１４００ｍ／ｚ）のサイクルに続いて、３５％の標準化した衝突エネルギーでの３つのデータ依存性ＭＳ／ＭＳのスペクトルを多次元分離の各工程を通して連続的に繰り返した。質量分析計走査機能およびＨＰＬＣ溶媒勾配の適用は、Ｘｃａｌｉｂｕｒデータ・システムによって制御している。
【０１６３】
タンデム型質量スペクトルを以下のプロトコールを用いて順次分析した。第１に、ソフトウェア・アルゴリズム（２ｔｏ３）を用いて、複数の荷電したペプチド質量スペクトルから適当な荷電状態（＋２または＋３のいずれか）を決定し、次いで、貧弱な質のスペクトルを削除した(Sadygovら, 2002, J Proteome Res 1, 211-215)。２ｔｏ３後のＭＳ／ＭＳのスペクトルを、Ｒｅｆｓｅｑからの組み合わせたヒト、マウスおよびラット・データベース（ＨＭＲ）から構築した蛋白質データベースに対してBeowolf コンピューター・クラスター（約７５cpu's）で試行したＳＥＱＵＥＳＴＴＭの並列バーチャルマシン（ＰＶＭ）バージョン(Yatesら, 1995, Anal Chem 67, 3202-3210; Yatesら, 1995, Anal Chem 67, 1426-1436)を用いて調べた。データベース検索結果をＤＴＡＳｅｌｅｃｔプログラム(Tabbら, 2002, J Proteome Res 1, 21-26)を用いて、フィルターし、ソートし、表示した。不履行ＤＴＡＳｅｌｅｃｔ基準を使用した（すなわち、＋１ １.８、＋２ ２.５、＋３ ３.５、ΔＣＮ ０.０８および１つの遺伝子座当たり少なくとも２つのペプチド）。
【０１６４】
反復した免疫沈降から同定した蛋白質成分を合わせ、次いで、得られたデータセットをＮＩＨによって提供されたＥＡＳＥ分析プログラムを用いるＧＯ＿Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎで注釈した(Hosackら, 2003, Genome Biol 4, R70)。対象を引いたプロテオームからの、全体細胞プロテオミクス実験からの共通の汚染物質である核酸結合または構造のカテゴリーに属するとしてＧＯ＿Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＿Ｆｕｎｃｔｉｏｎによって注釈した蛋白質を消失させた。蛋白質の得られたリストは、主として、細胞質シャペロン、小胞体（ＥＲ）内腔蛋白質、後期分泌経路成分、細胞表面相互作用子およびプロテオソーム／ユビキチン化成分を含んだ。
【０１６５】
図１は、ＣＦＴＲインタラクトーム（薄い楕円形、以前に確立している相互作用；暗い楕円形、この試験で回収された新しい相互作用）をネットワークにおけるノードとして含む成分を示す画像であり、ＥＲ（Ｉ）、ＥＲＡＤ（ＩＩ）、膜輸送（ＩＩＩ）、およびポストＥＲ制御因子およびエフェクター（ＩＶ）における蛋白質のフォールディングを潜在的に促進するサブネットワークに分割される。暗線は、ＣＦＴＲ、およびＭｕｄＰＩＴによって同定し示された成分間の直接的または間接的な蛋白質相互作用を示すネットワークにおける端である。薄い灰色線は、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅプラットフォームを用いてアクセスしたＴｍｍ共発現データベースに基づいた相互作用を規定する端を示している。表７は、質量分析法によって部分配列カバー度の順序で整列した野生型ＣＦＴＲを発現する示した細胞タイプにおける多次元タンパク質同定技術（ＭｕｄＰＩＴ）を用いて回収した蛋白質上で導かれた配列の結果を示す。
【０１６６】
結果は、同定した蛋白質が、ＣＦＴＲプロテオームまたはインタラクトームを規定する蛋白質相互作用のネットワークを生成することを示した（例えば、図１参照）。ＣＦＴＲインタラクトームを含む蛋白質は、フォールディングおよびＥＲからの輸出に必要な成分を含む（例えば、図１−Ｉ参照）、ＥＲＡＤを媒介する（例えば、図１−ＩＩ参照）、細胞外および細胞内区画間（例えば、図１−ＩＩＩ参照）および細胞表面でＣＦＴＲ機能および調節に関与する潜在的な結合パートナーである成分（例えば、図１Ｂ−ＩＶ参照）間の輸送を指令する機能群を集合的に規定するサブネットワークに分割できる。
【０１６７】
細胞表面で判明した成熟した野生型ＣＦＴＲに見出された多数の蛋白質相互作用は、データベースを確証する（例えば、表８参照）。例えば、ＣＦＴＲは、ゲート制御したクロライドチャネルであり、その活性は、ｃＡＭＰ依存性プロテイン・キナーゼおよびタンパク質脱リン酸化酵素によって調節される(GugginoおよびBanks-Schlegel, 2004)。タンパク質脱リン酸化酵素２Ａ（ＰＰ２Ａ）またはＰＰ２Ｃは、様々な細胞タイプにおけるＣＦＴＲ脱リン酸化およびＣＦＴＲ活性のダウンレギュレーションにおける役割を有する。キナーゼは、おそらくそれらの非常に一時的な相互作用のために、検討したいずれの細胞系においても安定な相互作用パートナーとして検出されないが、ほぼすべての細胞系における野生型ＣＦＴＲは、ＰＰ２Ａ−調節および触媒サブユニットの双方との強力な相互作用を示した(Thelinら, 2005; Vastiauら, 2005)。ＰＰ２Ａに加えて、炭酸水素ナトリウム交換器（ＮＨＥ）アイソフォーム３制御因子１および３（ＮＨＥＲＦ−１／３）(Mohlerら, 1999; Yunら, 1997)を、ＣＦＴＲプロテオーム中で回収した。ＮＨＥＲＦは肺細胞の頂端表面に局在化し、Ｃ末端ＰＤＺドメインを通ってＣＦＴＲと相互作用することが十分に立証されている(GugginoおよびBanks-Schlegel, 2004, Am J Respir Crit Care Med 170, 815-820)。従前の知られていない相互作用子は、ＥＦ−ハンド−含有細胞質ゾルＣａ”結合蛋白質の分岐するＳ１００ファミリーのメンバーのカルグラニュリンＢ（Ｓ  １００−Ａ８）を含む(Donato, 2003, Microsc Res Tech 60, 540-551; Heizmann, 2002, Methods Mol Biol 172, 69-80)。カルグラニュリンＢは、ＣＦの炎症性経路(Fanjulら, 1995, Am J Physiol 268, C1241-1251; Renaudら, 1994, Biochem Biophys Res Commun 201, 1518-1525; Xuら, 2003, J Biol Chem 278, 7674-7682)に関係し、ＣＦＴＲ肺病態生理学に関係した可能な調節役割を示唆した。
【０１６８】
また、結果は、多数の細胞内輸送成分の同定が、正常機能におけるＣＦＴＲ内在化および再利用の重要性を示すことを一般的に示した。第２の群の成分は、膜輸送機構との野生型ＣＦＴＲの直接的または間接的な相互作用を強調する（例えば、表７参照）。これらは、ソルチリン関連受容体Ｌ（ＳＯＲＬ１）、無能化ホモログ２、ＲａｌＢＰ１関連ＥＰｓドメイン含有蛋白質（Ｒｅｐｓ １）、ＡＲＦ４、クラスリン軽鎖，空胞ソートティング蛋白質４（Ｖｐｓ４ｐ）、エンソプトチンおよびソーティングネキシン（ＳＮＸ）４および９を含む。ＳＯＲＬ１は、単一膜貫通ドメインを有し、再利用化核内体に局在化され、複数のリガンドの内在化に関与する(Jacobsenら, 2001, J Biol Chem 276, 22788-22796)。Ｄａｂ２は、カーゴ選択的な細胞内クラスリン・アダプターとして機能する(BonifacinoおよびTraub, 2003, Annu Rev Biochem 72, 395-447; Mishraら, 2002, Embo J 21, 4915-4926)が、Ｒｅｐｓｌは、ＣＦＴＲで見出されたＮＰＦ内在化モチーフを含む蛋白質に結合でき(Yamaguchiら, 1997, J Biol Chem 272, 31230-31234)、ＡＰ２、Ｄａｂ２を含むカーゴ選択機構によって、細胞内ＧＴＰアーゼ制御因子のＲａｂ１１−ＦＩＰ２ファミリーに結合できる(Bilanら, 2004, J Cell Sci 117, 1923-1935; Cullisら, 2002, J Biol Chem 277, 49158-49166; Gentzschら, 2004, Mol Biol Cell 15, 2684-2696; Swiatecka-Urbanら, 2005, J Biol Chem 280, 36762-36772)。ＡＲＦ４は、細胞内／再利用区画に関係した小さなＧＴＰアーゼであり(DonaldsonおよびHonda, 2005, Biochem Soc Trans 33, 639-642; Langhorstら, 2005, Cell Mol Life Sci 62, 2228-2240; MorrowおよびParton, 2005, Traffic 6, 725-740)、一方、ＶＰＳ４は、恐らく後期エンドソーム区画からリソソームへの蛋白質の輸送において機能する(Bowersら, 2004, Traffic 5, 194-210; Hislopら, 2004, J Biol Chem 279, 22522-22531; Scheuringら, 2001, J Mol Biol 312, 469-480; Scottら, 2005, Embo J 24, 3658-3669)。エントプロチンは、クラスリン・アダプターＡＰＩと、ゴルジ局所性γイヤを含むＡＲＦ結合蛋白質２と (McPhersonおよびRitter, 2005, Mol Neurobiol 32, 73-87; Wasiakら, 2003, FEBS Lett 555, 437-442; Wasiakら, 2002, J Cell Biol 158, 855-862)、そのカルボキシル末端ドメインを通って、クラスリン重鎖の末端ドメインに相互作用して、クラスリン被覆小胞の形成を刺激し(Kalthoffら, 2002, Mol Biol Cell 13, 4060-4073; Wasiakら, 2003, 前記; Wasiakら, 2002, 前記)、そのクラスリン軽鎖の回収(Ybeら, 2003, Traffic 4, 850-856)、ＣＦＴＲ再利用におけるクラスリンについての確立した役割と一致している(Chengら, 2004, J Biol Chem 279, 1892-1898; Huら, 2001, Biochem J 354, 561-572; Lukacsら, 1997, Biochem J 328 ( Pt 2), 353-361; Peterら, 2002, J Biol Chem 277, 49952-49957; Piccianoら, 2003, Am J Physiol Cell Physiol 285, C1009-1018; WeixelおよびBradbury, 2000, J Biol Chem 275, 3655-3660; WeixelおよびBradbury, 2001, Pflugers Arch 443 Suppl 1, S70-74; WeixelおよびBradbury, 2001, J Biol Chem 276, 46251-46259)。インタラクトームにおいて同定されたさらなるアダプターはＳｎｘ４およびＳｎｘ９を含む(Carltonら, 2005, Traffic 6, 75-82; LundmarkおよびCarlsson, 2003, J Biol Chem 278, 46772-46781; Wasiakら, 2003, J Cell Biol 158, 855-862)。Ｓｎｘ９は、ＡＰ２のβ−付属ドメインを結合し、クラスリンおよびダイナミン媒介内在化における細胞膜でのその機能においてＡＰ２を補助する(Linら, 2002, 前記; LundmarkおよびCarlsson, 2003, 前記; LundmarkおよびCarlsson, 2004, J Biol Chem 279, 42694-42702; LundmarkおよびCarlsson, 2005, Methods Enzymol 404, 545-556; Souletら, 2005, Mol Biol Cell 16, 2058-2067; Teasdaleら, 2001, Biochem J 358, 7-16)。Ｓｎｘ４は、アンフィファイシンと相互作用して、トランスフェリンおよび他の再利用成分の細胞内輸送を促進することが報告されている(Hettemaら, 2003, Embo J 22, 548-557; Leprinceら, 2003, J Cell Sci 116, 1937-1948)。
【０１６９】
上記の結果がエフェクターおよび輸送成分に注目しているが、野生型およびΔＦ５０８ＣＦＴＲの双方は、ユビキチンおよびプロテアソーム成分の双方を含むＥＲＡＤ経路により分解される(Amaral, 2004, J Mol Neurosci 23, 41-48)（例えば、表８参照）。野生型、およびΔＦ５０８ ＣＦＴＲの双方を発現する細胞からのプロテオームは、ＥＲＡＤに含まれる成分を含む。これらは、転座／転位Ｓｅｃ６１チャネル、およびプロテアソームに送達を指令するシャペロンのＶＣＰ／ｐ９７／Ｃｄｃ４８を含む。プロテアソームの役割は、インタラクトーム中のユビキチン化経路の２６Ｓプロテアソーム・サブユニットおよび成分における富化によって示される（例えば、表８参照）。注目されることには、プロテオームにおいて回収した、ユビキチン化コンジュゲーティング蛋白質Ｅ３Ａは、ＣＦＴＲを含めたＥＲＡＤにつき頻繁に起動した（invoked）あるクラスのＥ２ユビキチンコンジュゲーティング酵素のＵｂｃ６との相互作用を示す(Lenkら, 2002, J Cell Sci 115, 3007-3014)。
【０１７０】
これらのリガーゼがＥＲのレベルでＥＲＡＤに関係するだけか、さらに細胞内／リソソーム標的経路を介する細胞表面にてＣＦＴＲのダウンレギュレーションに参加するかどうかはまだ決定されていない(Gentzschら, 2004, Mol Biol Cell; Sharmaら, 2004, J Cell Biol 164, 923-933; Swiatecka-Urbanら, 2005, 前記)。前記に議論した例に加えて、さらなる成分はＣＦＴＲとの直接的または間接的な相互作用を有することが予測される（例えば、表１および２参照）。
【０１７１】
前記のものは、ＣＦＴＲフォールティングおよび輸送経路、ＣＦＴＲ インタラクトームに寄与する一時的な相互作用を同定するように取られたＭｕｄＰＩＴプロテオミクス技術の感度によって援助されるシステム生物学アプローチである。ポストＥＲ区画中でＣＦＴＲと相互作用することが示されたいくつかの蛋白質が同定されなかったが、これは、質量分析技術、この試験内で一貫性のために最適化した免疫沈降条件、およびインタラクトームが、捕捉するのが困難であり、高度に細胞型および増殖条件に依存する非常に動的な、従って、一時的な相互作用からなるようであるという事実の制限を反映できた。公知の相互作用（例えば、図１参照）のすべてを包含するインタラクトームは、新しいベースラインを提供して、ＣＦＴＲが頂端細胞表面にて機能的に達成および維持するのに必要な多数の異なる蛋白質複合体を評価し始めることができる。
【０１７２】
【表１】
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【０１７３】
【表２】
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【０１７４】
【表３】
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【０１７５】
【表４】
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【０１７６】
【表５】
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【０１７７】
【表６】
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【０１７８】
【表７】
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【０１７９】
【表８】
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【０１８０】
【表９】
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【０１８１】
【表１０】
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【０１８２】
【表１１】
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【０１８３】
【表１２】
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【０１８４】
【表１３】
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【０１８５】
【表１４】
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【０１８６】
【表１５】
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【０１８７】
実施例２：ＣＦＴＲスペクトル・リンケージ
インタラクトームにおいて観察した相互作用の富（実施例１参照）から、ＥＲからのΔＦ５０８の輸出の損失についての根拠を、最も一般的な形態のＣＦを理解する手段として検討した。Ｐｈｅ５０８の欠失に応じた蛋白質のフォールディングエネルギー学(Sekijimaら, 2005, Cell 121, 73-85; StricklandおよびThomas, 1997, J Biol Chem 272, 25421-25424)における変化の結果、ＣＯＰＩＩ出芽機構に連関することにΔＦ５０８ ＣＦＴＲが失敗し(Wangら, 1998, FEBS Lett 427, 103)、その結果、ＥＲ関連分解（ＥＲＡＤ）が生じる(Nishikawa 2005, J Biochem (Tokyo) 137, 551)。ＥＲＡＤ(Sekijimaら, 2005, 前記)経路を介するＣＦＴＲフォールディングにかなり影響すると現在考えられるシャペロン成分は、ＥＲの内腔で見出されたカルネキシン(FarinhaおよびAmaral, 2005, Mol Cell Biol 25, 5242; Okiyonedaら, 2004, Mol Biol Cell 15, 563; Pindら, 1994, J Biol Chem 269, 12784)、ならびに細胞質ゾルのシャペロン複合体Ｈｓｃ−Ｈｓｐ７０／４０およびＨｓｐ９０(Albertら, 2004, Mol Biol Cell 15, 4003; Amaral, 2004, 前記; Looら, 1998, Embo J 17, 6879; Meachamら, 1999, Embo J 18, 1492; Meachamら, 2001, Nat Cell Biol 3, 100; Stricklandら, 1997, J Biol Chem 272, 25421; Youngerら, 2004, 前記)を含む。
【０１８８】
これらの結果と一致して、野生型ＣＦＴＲを発現する細胞を発現するのプロテオーム（例えば、図１参照）は、カルネキシン、Ｈｓｃ−Ｈｓｐ７０／４０およびＨｓｐ９０の細胞質ゾルのシャペロンに回収した合計のスペクトル（例えば、表７参照）に基づいた強健な連関を示した。これらのシャペロン成分は、他の蛋白質について観察された(McClellanら, 2005, Nat Cell Biol 7, 736-741)ように、野生型ＣＦＴＲのフォールディングを促進するコア機構（図２）を規定するようである。
【０１８９】
結果は、野生型ＣＦＴＲを発現する細胞のプロテオーム（図１）が、カルネキシン、Ｈｓｃ−Ｈｓｐ７０／４０およびＨｓｐ９０の細胞質ゾルのシャペロンに回収した合計スペクトル（例えば、表７参照）に基づいた強健な連関を示すことを示した。これらの結果は、ＥＲＡＦ(Sekijimaら, 2005, 前記)経路を介してＣＦＴＲフォールディングにかなり影響すると現在考えられているシャペロン成分が、ＥＲの内腔内に見出されたカルネキシン(FarinhaおよびAmaral, 2005, 前記; Okiyonedaら, 2004, 前記; Pindら, 1994, J Biol Chem 269, 12784-12788)ならびに細胞質ゾルのシャペロン複合体Ｈｓｃ−Ｈｓｐ７０／４０およびＨｓｐ９０(Albertら, 2004, 前記; Amaral, 2004, 前記; Looら, 1998, 前記; Meachamら, 1999, 前記; Meachamら, 2001, 前記; Stricklandら, 1997, 前記; Youngerら, 2004, 前記)を含むという報告と一致している。
【０１９０】
これらのシャペロン成分は、他の蛋白質につき観察された(McClellanら, 2005, 前記)ように、野生型ＣＦＴＲのフォールディングを促進するコア機構（例えば、図２Ａ参照）を規定するようである。
【０１９１】
【表１６】
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【０１９２】
実施例３：ＣＦＴＲおよびΔＦ５０８局在ならびに相互作用
ＥＲ輸出機構に連結するΔＦ５０８の失敗に関与し得るインタラクトーム中の成分を同定するために、ＢＨＫ細胞から免疫沈殿した野生型およびΔＦ５０８ ＣＦＴＲのプロテオームを比較した。ＣＦＴＲを発現しない親ＢＨＫ細胞系を非特異的相互作用のための陰性対照として用いた（例えば、図２参照）。
【０１９３】
図２はＥＲフォールディングネットワークの一連の描写である。表８は、質量分析法によって部分配列カバー度の順序で整列したＣＦＴＲを発現しないＢＨＫ細胞（対照）、またはΔＦ５０８または野生型ＣＦＴＲのいずれかを発現するものにおけるＭｕｄＰＩＴを用いて回収した多数の蛋白質の結果を示す。
【０１９４】
図２Ａは、ＣＦＴＲ ＥＲフォールディングおよび分解プロテオームを含むネットワークについての合成図を示す図である。薄い灰色の端は、ＣＦＴＲとの潜在的な直接的または間接的な相互作用を示し；暗い端は、ＨＰＲＤ、ＢＩＮＤおよびＩｎｔＡｃｔ蛋白質相互作用データベースからのデータに基づいた成分間の公知の物理的相互作用を示す。薄緑色の円は、コアフォールディングシャペロンを示し；ライトピンクの円は、調節性共同シャペロンおよびＥＲＡＤ成分を示す。図２Ｂは、野生型およびΔＦ５０８ ＣＦＴＲを発現する細胞において観察したバンドＢおよびＣの典型的な定常レベルを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ免疫ブロット法の画像である。さらなる方法の情報については、実施例１を参照されたし。
【０１９５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット法について、細胞は、５００μｌの氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、２ｍｇ／ｍｌの溶解緩衝液で１％トリトンＸ−１００およびプロテアーゼインヒビターカクテル（Pierce）を補足した新たに調製したＴＢＳ（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７.０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）の４５μｌの添加により溶解し、時々撹拌しつつ３０分間の氷上でインキュベートした。溶解物を集め、４℃で１６,０００×ｇで２０分間回転させ、上澄みを集め、タンパク濃度につき分析した。溶解物（１レーン当たり２５μｇの合計蛋白質）をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ウエスタンブロット解析用ニトロセルロースに移した。アクチン(Chemicon, Temecula, CA)用の免疫ブロット法を試料負荷の整合性のためのさらなる内部対照として用いた（示さず）。ＣＦＴＲは、第２のヌクレオチド結合ドメインのＣ終端でのエピトープに対するモノクローナル抗体（Ｍ３Ａ７腹水）で検出した(Kartnerら, 1992)。ｐ２３をｐ２３腹水(JJ3, Abcam, Cambridge, MA)で、ＨＯＰをウサギポリクローナル血清で、ＦＫＢＰ８をウサギポリクローナル血清で、およびＡｈａ１をウサギＡｈａ１ポリクローナル血清で検出した。また、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）のＣ末端の細胞質テールに対するモノクローナル抗体（Ｐ５Ｄ４）を用いた。注目する各蛋白質の量は、AlphaInnotech Fluorochem SP (AlphaInnotech, San Leandro, CA)を用いてデンシトメトリーによって定量した。実験は３連で行い、平均および平均の標準誤差は、独立した両側検定のｔ検定を用いて決定した。
【０１９６】
結果は、生理的温度（３７℃）にて、野生型ＣＦＴＲが、細胞表面で見出されたバンドＣゴルジ処理グリコフォーム中に主に（＞８０〜９０％）存在し、残りのＣＦＴＲは、バンドＢ  ＥＲ関連コアグリコシル化グリコフォーム中で検出されることを示した（例えば、図２Ｂ参照）。対照的に、３７℃でのΔＦ５０８を発現する細胞において、蛋白質の一般的に５〜２０％だけ（細胞タイプおよび増殖条件を反映する）を、かなり低下した輸出のための安定性およびフォールディングによりバンドＣ中で検出できる。この場合に、蛋白質は、それがＥＲＡＤのための標的とされる未成熟コアグリコシル化バンドＢ  ＥＲグリコフォーム（例えば、図２Ｂ参照）に大部分は制限される(Jensenら, 1995, Cell 83, 129-135; Ward および Kopito, 1994, J Biol Chem 269, 25710-25718; Wardら, 1995, Cell 83, 121-127)。ＥＲＡＤ（表６）に含まれるような成分に加えて、ＥＲフォールディングインタラクトーム（例えば、図２Ａ参照）は、野生型ＣＦＴＲのように、ΔＦ５０８が内腔カルネキシン、ならびに細胞質ゾルＨｓｃ−Ｈｓｐ７０／４０およびＨｓｐ９０の細胞質ゾル成分との強力な相互作用を示すことを明らかにした（例えば、表７参照）。これらの結果は、ΔＦ５０８が野生型ＣＦＴＲのフォールディングを指令するコア機構と相互作用することを示す（例えば、図２Ａ参照）。
【０１９７】
実施例４：ΔＦ５０８ ＥＲインタラクトーム中のＨｓｐ９０共同シャペロン成分
ΔＦ５０８ ＥＲインタラクトームをＨｓｐ９０共同シャペロン成分の存在につき分析した。様々なクライアント蛋白質のＨｓｐ９０依存性フォールディングを共同シャペロンによって一過性に調節する(Picard, 2002, Cell Mol Life Sci 59, 1640-1648; Youngら, 2003, 前記; Youngら, 2001, 前記)。従前の試験は、ΔＦ５０８のフォールディングが速度論的に障害されることを示唆した((Quら, 1997, J Bioenerg Biomembr 29, 483-490; Quら, 1997, J Biol Chem 272, 15739-15744; Qu および Thomas, 1996, J Biol Chem 271, 7261-7264)。従って、ΔＦ５０８インタラクトーム中で見出された蛋白質が、フォールディング経路における速度論的欠損に応じて蓄積し得るＰｈｅ ５０８欠失に感受性のフォールディング中間体（群）に関連したものを含むことが期待されるであろう。
【０１９８】
結果は、ΔＦ５０８ ＥＲインタラクトーム中の多数のＨｓｐ９０共同シャペロン成分が野生型プロテオームにおいて一般的に検出されないことを示した（例えば、図２Ａ参照）。この発見は、ΔＦ５０８中のＰｈｅ ５０８欠失に感受性の蓄積したフォールディング中間体（群）の予測と一致している。野生型プロテオーム中に一般的に検出されないΔＦ５０８ ＥＲインタラクトーム中のＨｓｐ９０共同シャペロン成分は、Ｈｓｃ−Ｈｓｐ７０／Ｈｓｐ９０形成蛋白質（ＨＯＰ）、ｐ２３、Ｃｄｃ３７、イムノフィリンＦＫＢＰ８およびＡｈａ１を含んだ。Ｈｓｐ９０共同シャペロンを、ステロイドホルモン受容体（ＳＨＲ）およびシグナルキナーゼを含む準安定性クライアント蛋白質のフォールディングを調整するためにＨｓｐ９０クライアント相互作用の制御因子としてそれらの役割につき研究した(Wegele,ら, 2004, 前記)。検出した他のシャペロン制御因子は、ＣＦＴＲ(Arndtら, 2005, Mol Biol Cell; Daiら, 2005, J Biol Chem 280, 37634)、Ｈｓｐ１０５およびフォールディングシャペロニンＴＣＰ１の分解におけるＨｓｃ−Ｈｓｐ７０機能の調節におけるそれらの役割につき研究されたＢＡＧ−２／３を含んだ。
【０１９９】
Ｈｓｃ−Ｈｓｐ７０／４０、Ｈｓｐ９０およびそれらの調節に潜在的に関与する蛋白質間の公知の相互作用のネットワークは、ＥＲ輸出についてΔＦ５０８および野生型ＣＦＴＲフォールディング経路の潜在的な複雑さを示す（例えば、図２Ａ参照）。
【０２００】
実施例５：ＨＥＫ２９３細胞中のΔＦ５０８フォールディングに対する共同シャペロンｐ２３の効果
安定的にΔＦ５０８を発現するＨＥＫ２９３細胞における鍵となる共同シャペロン制御因子ｐ２３(Pratt および Toft, 2003, Exp Biol Med (Maywood) 228, 111-133; Prodromou および Pearl, 2003, Curr Cancer Drug Targets 3, 301-323; Wegeleら, 2004, 前記)の役割をいくつかの温度で検討した。ＨＯＰおよびＦＫＢＰ８と共に、Ｐ２３は、環状Ｈｓｐ９０クライアント相互作用経路におけるＡＴＰ依存性フォールディング工程に影響する。
【０２０１】
ΔＦ５０８ ＣＦＴＲのフォールディングおよび輸出におけるＨｓｐ９０の役割を規定し始めるために、ｄｓＲＮＡおよび一過性形質転換を用いて、環状Ｈｓｐ９０クライアント相互作用経路におけるＡＴＰ依存性フォールディング工程に影響する、ｐ２３（実施例５参照）、ＨＯＰ（実施例６参照）およびＦＫＢＰ８（実施例７参照）を含めた選択されたＨｓｐ９０共同シャペロンの蛋白質発現レベルを制御した。Ｈｓｃ−Ｈｓｐ７０／４０複合体によるＣＦＴＲのごときクライアント分子の認識に続いて、遍在する共同シャペロンＨＯＰは、Ｈｓｐ９０に対する新生Ｈｓｃ−Ｈｓｐ７０／４０クライアント複合体を連結する(Johnsonら, 1998, J Biol Chem 273, 3679-3686)。引き続いて、共同シャペロン制御因子ｐ２３は、ＡＴＰ存在下で、Ｈｓｃ−Ｈｓｐ７０／４０およびＨＯＰを置き換えて、ＡＴＰ結合状態における成熟したＨｓｐ９０−ｐ２３−クライアント複合体を形成する(Wegeleら, 2004, 前記)。ｐ２３を含むＨｓｐ９０クライアント複合体のサイクリングは、イムノフィリンによって制御される(Johnson および Toft, 1994, J Biol Chem 269, 24989-24993; Wuら, 2004, Proc Natl Acad Sci U S A 101, 8348-8353)。ステロイドホルモン受容体（ＳＨＲ）、原型Ｈｓｐ９０クライアント(Pratt および Toft, 2003, Exp Biol Med (Maywood) 228, 111-133; ProdromouおよびPearl, 2003, 前記)の場合におけるイムノフィリンＦＫＢＰ５２の損失は、中間体Ｈｓ ９０クライアントシャペロン複合体を不安定にし、ホルモン負荷を防止する(Cheung-Flynnら, 2005, Mol Endocrinol 19, 1654-1666)。
【０２０２】
ＨＥＫ２９３細胞は、前記のように１０％ＦＢＳおよびPen/Strepを補足したＤＭＥＭ中に維持した。ΔＦ５０８ ＣＦＴＲを安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞を前記の同一培地＋１５０μｇ／ｍｌヒグロマイシンＢ中に維持した。
【０２０３】
ｄｓＲＮＡおよび一過性形質転換を用いて、ｐ２３の蛋白質発現のレベルを制御した。ｐ２３についてのｃＤＮＡクローンは、ＡＴＣＣ(Manassas, VA)から購入し、ｐｃＤＮＡ発現ベクターにサブクローニングし、次いで、コード領域の配列をＤＮＡ配列決定分析によって確認した。ｄｓＲＮＡ溶液を、１２ウェル皿のウェル当たり０.６μＭの作用濃度での示されたｄｓＲＮＡ（ヒトｐ２３、Ambion (Austin, TX)カタログ番号 16704 ID 18391）および６μｌのＨｉＰｅｒＦｅｃｔ(Qiagen, Valencia, CA)と血清および抗生物質を含まないＤＭＥＭまたはＭＥＭ−αを混合することにより調製した。対照ｄｓＲＮＡ(Dharmaconカタログ番号 CONJB-000015)を等しい濃度でテストされるべきｄｓＲＮＡに添加した。そのｄｓＲＮＡ混合物（１００μｌ）を５０ｎＭの最終濃度での１.１ｍｌの適当な培地を含む細胞に添加し、３７℃／５％ＣＯ２で４８時間培養した。この培養の完了に際して、培地を除去し、１.１ｍｌの新鮮な完全培地および新たに調製したｄｓＲＮＡ溶液の１００μｌに置き換え、３７℃／５％ＣＯ２でさらに３３時間培養した。示された場合に、１５時間培養するために、細胞を３０℃／５％ＣＯ２インキュベーターに引き続いて移すか、または３７℃／５％ＣＯ２に維持した。
【０２０４】
ヒトｐ２３の過剰発現は、従前に記載されたワクシニアウイルス感染(Wangら, 2004, 前記)による、ＣＦＴＲΔＦ５０８およびｐ２３を発現するプラスミドでＨＥＫ２９３を共トランスフェクトすることによって行なった。許容温度細胞で分析した試料について、細胞を採取に先立ち３０℃に１５時間移した。
【０２０５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット法は実施例３に記載された通りである。
【０２０６】
図３は、ΔＦ５０８のフォールディングおよびＥＲからの輸出に対するＨｓｐ９０共同シャペロンｐ２３の影響を示す一連の棒グラフである。図３Ａは、ＥＲグリコフォームΔＦ５０８（Ｂ）、細胞表面グリコフォームΔＦ５０８（Ｃ）およびｐ２３発現の定常状態プールについてのパーセント最大レベルを示す１対の棒グラフである。ｐ２３に対するヒトｄｓＲＮＡ（左パネル）を用いて、３７℃で示した蛋白質の発現を低下させた。スクランブルｄｓＲＮＡを対照として用いた。ｐ２３に対するヒトｃＤＮＡ（右パネル）を用いて、３７℃で示した蛋白質を過剰発現させた。挿入図は、ＥＲグリコフォーム（バンドＢ）および細胞表面グリコフォーム（バンドＣ）の定常状態プールについてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ免疫ブロット法の画像である。バンドＢおよびＣの定常状態プールは免疫ブロット法を用いて決定した。図３Ｂは、細胞を許容温度（３０°）にて培養してフォールディングおよびＥＲからの輸出を促進することを除いて、図３Ａに記載した通りである。星印は（＊）は、統計的有意差（ｐ≦０.０５）を示す。実験は独立して３連にて少なくとも３回繰り返し、代表的な結果を示した。さらに詳しい方法の情報について、実施例５を参照されたし。
【０２０７】
結果は、約７０％のｐ２３レベルのｄｓＲＮＡ低下の結果、スクランブルモック対照（例えば、図３Ａ、左パネル参照）に比較した場合、バンドＢ  ＥＲグリコフォームの定常状態プールおよびバンドＣ細胞表面グリコフォームの小さなプールの双方において比較可能な（６０〜７０％）低下を生じることを示した。反対に、過剰発現（３〜５倍）は、部分的にバンドＢを安定化したが、バンドＣにおける有意な増加を生じなかった（例えば、図３Ａ、右パネル参照）。注目すべきことには、ｐ２３のｄｓＲＮＡ低下は、ＨＥＫ２９３においてバンドＢおよびＣの野生型ＣＦＴＲの双方の安定性に対して同様の効果を有し（示さず）、ｐ２３が正常なフォールディングの動力学に影響することを示唆した。
【０２０８】
ΔＦ５０８ ＣＦＴＲが温度感受性フォールディング変異体(Denningら, 1992, Nature 358, 761-764)であるために、３７℃に代えた許容温度（３０°）での細胞の培養は、よりエネルギー的に好ましいフォールディング環境を供し、細胞表面局在化ΔＦ５０８の有意なレベルに導く。
【０２０９】
結果は、定常状態（３７℃から３０℃までの１５時間のポスト温度シフト）にて、ＨＥＫ２９３細胞における合計のＦ５０８プールの４０〜５０％が、バンドＣに典型的に見出されることを示した（Denningら, 1992, 前記)（例えば、図３Ｂ、左パネル参照）。顕著には、許容的なフォールディング温度（３０℃）でさえ、ｐ２３のｄｓＲＮＡ低下の結果、バンドＢの安定性およびバンドＣへのプロセシングにおける有意な減少を生じさせた（例えば、図３Ｂ、左パネル参照）。３０℃にて、過剰発現はバンドＢに効果を有しなかったが、バンドＣへのプロセシングを防止した（例えば、図３Ｂ、右パネル参照）。ｐ２３過剰発現の同様の優位なネガティブな効果を他のＨｓｐ９０依存性シグナル経路について観察し、成熟クライアント複合体の過剰な安定化を反映した(Pratt および Toft, 2003, 前記)。
【０２１０】
かくして、野生型ＣＦＴＲに対する効果と一致して、ｐ２３は、限定的および許容的なフォールディング条件の双方でのＥＲΔＦ５０８の安定性に影響するフォールディングのモジュラー成分である。これらの結果は、動力学的に障害されたΔＦ５０８折り畳みに対する局所的シャペロン環境の潜在的な差異の役割を強調する。
【０２１１】
実施例６：ＨＥＫ２９３細胞におけるΔＦ５０８フォールディングに対する共同シャペロンＦＫＢＰ８の効果
ΔＦ５０８を安定的に発現しているＨＥＫ２９３細胞における共同シャペロン制御因子ＦＫＢＰ８の役割を検討した。ΔＦ５０８ ＣＦＴＲプロテオーム中のＳＨＲフォールディングに関与するＦＫＢＰ５２(Cheung-Flynnら, 2005, 前記)を同定することができないが、イムノフィリンファミリーＦＫＢＰ８(Nielsenら, 2001, Genomics 83, 181-192; Pedersenら, 1999, Electrophoresis 20, 249-255)を検出した。ＦＫＢＰ８は、ミトコンドリアおよびＥＲの双方に局在化されることが報告された膜関連イムノフィリンである(Kangら, 2005, FEBS Lett 579, 1469-1476; ShiraneおよびNakayama, 2003, Nat Cell Biol 5, 28-37; Weiwadら, 2005, FEBS Lett 579, 1591-1596)。
【０２１２】
ｄｓＲＮＡおよび一過性形質転換を用いて、ＦＫＢＰ８の蛋白質発現のレベルを制御した。ＦＫＢＰ８についてのｃＤＮＡクローンは、ＡＴＣＣ(Manassas, VA)から購入し、ｐｃＤＮＡ発現ベクターにサブクローニングし、次いで、コード領域の配列をＤＮＡ配列決定分析によって確認した。ｄｓＲＮＡ溶液を、ヒトＦＫＢＰ８、Ａｍｂｉｏｎカタログ番号１６７０４ ＩＤ ４５１８２を用いる以外は実施例５のように調製した。ヒトＦＫＢＰ８の過剰発現は、従前に記載(Wangら, 2004, 前記)のごときワクシニアウイルス感染による、ＣＦＴＲΔＦ５０８およびＦＫＢＰ８を発現するプラスミドでＨＥＫ２９３を共同トランスフェクトすることによって行った。許容温度にて分析した試料について、細胞を採取するのに先立って３０℃に１５時間シフトさせた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット法は実施例３に記載とされたものに同じであった。
【０２１３】
図４は、ΔＦ５０８のフォールディングおよびＥＲからの輸出に対するＨｓｐ９０共同シャペロンＦＫＢＰ８の効果を示す一連の棒グラフである。図４Ａは、ＥＲグリコフォームΔＦ５０８（Ｂ）の定常状態プール、細胞表面グリコフォームΔＦ５０８（Ｃ）およびＦＫＢＰ８発現についてのパーセント最大レベルを示す１対の棒グラフである。ＦＫＢＰ８（左パネル）へのヒトｄｓＲＮＡを用いて、３７℃で示された蛋白質の発現を低減した。スクランブルｄｓＲＮＡを対照として用いた。ＦＫＢＰ８に対するヒトｃＤＮＡ（右パネル）を用いて、３７℃で示された蛋白質を過剰発現させた。挿入図は、ＥＲグリコフォーム（バンドＢ）の定常状態プールおよび細胞表面グリコフォーム（バンドＣ）についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ免疫ブロット法の画像である。図４Ｂ（Ｂ）は、細胞を許容温度（３０°）にて培養して、フォールディングおよびＥＲからの輸出を促進ししたという点を除いて、図４Ａについて記載した通りである。星印（＊）は統計的有意差（ｐ≦０.０５）を示す。実験は３連にて少なくとも３回独立して繰り返し、代表的な結果を示した。さらに詳しい方法論情報については、実施例６を参照されたし。
【０２１４】
結果は、従前の報告書と一致する、ＦＫＢＰ８がＥＲマーカー蛋白質カルネキシンと実質的なオーバーラップを有する（示さず）ことを示した。ｐ２３  ｄｓＲＮＡの効果と同様に、３７℃でのＦＫＢＰ８の応答ｄｓＲＮＡ低下におけるΔＦ５０８のかなりの不安定化を観察した（例えば、図４Ａ、左パネル参照）。また、注目すべきことには、３７℃の過剰発現は、ＣＦＴＲを不安定化し、ＦＫＢＰ８機能がＨｓｐ９Ｏの定常的な濃度に連結されるという可能性を高めた（例えば、図４Ａ、右パネル参照）。対照的に、ＦＫＢＰ８発現のｄｓＲＮＡ低下は、３０℃でのΔＦ５０８ ＣＦＴＲの安定性を低下させ（３０〜４０％）、バンドＣ（−５０％）のレベルにおいて対応して低下した（例えば、図４Ｂ、左パネル参照）が、３０℃での過剰発現は安定性に対する適度の効果だけを有し、それはバンドＣへのプロセシングと干渉した（例えば、図４Ｂ、右パネル参照）。
【０２１５】
これらの結果は、ｐ２３のように、Ｈｓｐ９０共同シャペロンＦＫＢＰ８が、ＥＲにおけるΔＦ５０８安定性を制御するために、フォールディングモジュレーターとして作用することを示唆する。これらの結果は、動力学的に障害されたΔＦ５０８折り畳みに対する局所的なシャペロン環境の潜在的な差異の役割を強調する。
【０２１６】
実施例７：ＨＥＫ２９３細胞におけるΔＦ５０８フォールディングに対する共同シャペロンＨＯＰの効果
ΔＦ５０８を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞の共同シャペロン制御因子ＨＯＰの役割を検討した。ｄｓＲＮＡおよび一過性形質転換を用いて、ＨＯＰの蛋白質発現レベルを制御した。ＨＯＰについてのｃＤＮＡクローンはＡＴＣＣ(Manassas, VA)から購入し、ｐｃＤＮＡ発現ベクターにサブクローニングし、次いで、コード領域の配列をＤＮＡ配列決定分析によって確認した。ｄｓＲＮＡ溶液を、ヒトＨＯＰ、Ambion タログ番号１６７０４ ＩＤ  １８７１９を用いる以外は、実施例５のごとく調製した。ヒトＨＯＰの過剰発現は、従前に記載されたワクシニアウイルス感染(Wangら, 2004, 前記)による、ＣＦＴＲ ΔＦ５０８およびＨＯＰを発現するプラスミドでＨＥＫ２９３を共トランスフェクトするによって行なった。許容温度で分析した試料について、細胞を採取に先立ち１５時間３０℃に移した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット法は実施例３に記載された通りである。
【０２１７】
図５は、ΔＦ５０８のフォールディングおよびＥＲからの輸出に対するＨｓｐ９０共同シャペロンＨＯＰの効果を示す一連の棒グラフである。図５Ａは、ＥＲグリコフォームΔＦ５０８（Ｂ）、細胞表面グリコフォームΔＦ５０８（Ｃ）およびＨＯＰ発現の定常状態プールについてのパーセント最大レベルを示す１対の棒グラフである。ＨＯＰに対するヒトｄｓＲＮＡ（左パネル）を用いて、３７℃での示した蛋白質の発現を低下させた。スクランブルｄｓＲＮＡを対照として用いた。ＨＯＰに対するヒトｃＤＮＡ（右パネル）を用いて、３７℃で示した蛋白質を過剰発現させた。挿入図は、ＥＲグリコフォーム（バンドＢ）および細胞表面グリコフォーム（バンドＣ）の定常状態プールについてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ免疫ブロット法の画像である。図５Ｂは、細胞を許容温度（３０°）にて培養してフォールディングおよびＥＲからの輸出を促進することを除いて、図５Ａに記載した通りである。星印は（＊）は、統計的有意差（ｐ≦０.０５）を示す。実験は独立して３連にて少なくとも３回繰り返し、代表的な結果を示した。さらに詳しい方法の情報について、実施例７を参照されたし。
【０２１８】
結果は、ｐ２３およびＦＫＢＰ８の双方のｄｓＲＮＡ低下の効果とは対照的に、ＨＥＫ２９３細胞において観察したｄｓＲＮＡに応じたＨＯＰの最大の低減（４０〜６０％）が、バンドＢ安定性またはバンドＣのレベルの変化をほとんど与えなかったが（例えば、図５Ａ、左パネル参照）、過剰発現（約４倍）は、ＢおよびＣの双方を部分的に不安定化した（例えば、図５Ａ、右パネル参照）ことを示した。再度、ＨＯＰのｄｓＲＮＡは、３０℃でのΔＦ５０８のフォールディングまたは輸出に影響しなかった（例えば、図５Ｂ、左パネル参照）。しかしながら、過剰発現は、蛋白質をかなり不安定化し、許容的なフォールディング条件下のＨｓｃ−Ｈｓｐ  ７０／４０まで延長した連結が、分解の標的とすることを支持することを示す（例えば、図５Ｂ、右パネル参照）。
【０２１９】
これらの結果は、そのＨＯＰが分解におけるΔＦ５０８ ＣＦＴＲおよびＨｓｃ−Ｈｓｐ７０／４０機能の間のリンクを促進することを示唆する(Arndtら, 2005, 前記; Meachamら, 1999, 前記; Meachamら, 2001, 前記; Youngerら, 2004, 前記)。これらの結果は、動力学的に障害されたΔＦ５０８折り畳みに対する局所的シャペロン環境の潜在的な差異の役割を強調する。
【０２２０】
実施例８：ＨＥＫ２９３細胞のおけるΔＦ５０８フォールディングに対する共同シャペロンＡｈａ１の効果
ΔＦ５０８を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞にける共同シャペロン制御因子Ａｈａ１の役割を検討した。Ｈｓｐ９０共同シャペロンファミリーの最も最近認識されたメンバーはＡｈａ１である。Ａｈａ１は、Ｈｓｐ９０の中央ドメインに結合し、Ｈｓｐ９０のＡＴＰサイクルを調節するＡＴＰアーゼ活性化蛋白質として機能することが提唱されている(Harstら, 2005, Biochem J 387, 789-796; Mayerら, 2002, Mol Cell 10, 1255-1256; Meyer, 2004, Embo J 23, 1402-1410; Meyerら, 2003, Mol Cell 11, 647-658; Panaretouら, 2002, Mol Cell 10, 1307-1318; Siligardiら, 2004, J Biol Chem 279, 51989-51998)。
【０２２１】
ｄｓＲＮＡおよび一過性形質転換を用いて、Ａｈａ１の蛋白質発現レベルを制御した。Ａｈａ１のためのｃＤＮＡクローンはＣ末端ｍｙｃ−タグでＰＣＲにより増幅し、ｐＣＤＮＡ３.１＋にクローニングし、次いでその配列を配列決定によって確認した。ｄｓＲＮＡ溶液を、１２ウェル皿のウェル当たり、ヒトＡｈａ１配列attggtccacggataagct (配列番号：9; mRNA転写物 配列番号：12)およびgtgagtaagcttgatggag (配列番号：10; mRNA転写物 配列番号：18)に指向される各１μＭの２つのｄｓＲＮＡ(Dharmacon, Lafyette, CO)を用いる２μＭヒトＡｈａ１および 6 μlのHiPerFect (Qiagen, Valencia, CA)を用いる以外は実施例５のごとく調製した。対照ｄｓＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎカタログ番号ＣＯＮＪＢ−００００１５）をＡｈａ１ ｄｓＲＮＡに等しい濃度で添加した。ヒトＡｈａ１の過剰発現は、以前に記載(Wangら, 2004, 前記)されたワクシニアウイルス感染により、ＣＦＴＲΔＦ５０８およびＡｈａ１を発現するプラスミドで共同トランスフェクトするＨＥＫ２９３によって行なった。許容温度で分析した試料について、細胞を採取に先立って３０℃に１５時間シフトした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット法は実施例３に記載の通りであった。
【０２２２】
図６は、機能的Ａｈａ１のダウンレギュレーションによって細胞表面へのΔＦ５０８輸出をレスキューできることを示す一連の棒グラフである。図６Ａは、ＥＲグリコフォームΔＦ５０８（Ｂ）、細胞表面グリコフォームΔＦ５０８（Ｃ）およびＡｈａ１発現の定常的プールについてのパーセント最大レベルを示す１組の棒グラフである。ヒトＡｈａ１ ｄｓＲＮＡ（左パネル）またはヒトＡｈａ１ ｃＤＮＡ（右パネル）を用いて、各々、３７℃（上部パネル）または３０℃（下部パネル）でのΔＦ５０８を発現するＨＥＫ２９３細胞におけるＡｈａ１を低下または過剰発現した。挿入図は、ＥＲグリコフォーム（バンドＢ）および細胞表面グリコフォーム（バンドＣ）の定常状態プールについてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ免疫ブロット法の画像である。図６Ｂは、ヒトＡｈａ１ ｄｓＲＮＡを用いて、３７℃（左パネル）または３０℃（右パネル）でのΔＦ５０８を発現するＣＦＢＥ４１ｏ−細胞においてＡｈａ１発現を低下させる以外は、５Ａについて記載した通りである。星印は（＊）は、独立両側検定のｔ検定（三連試料）を用いる統計的有意差（ｐ≦０.０５）を示す。４つの独立した実験からの三連で示された代表的な結果。さらに詳しい方法の情報については、実施例８〜９を参照されたし。
【０２２３】
結果は、５０〜７０％だけＨＥＫ２９３細胞におけるＡｈａ１の内因性レベルのｄｓＲＮＡ低下が、ΔＦ５０８バンドＢの著しい３〜４倍の安定化を達成したことを示した（例えば、図６Ａ、上部の左パネル参照）。さらに明白な安定化（４〜５倍）を３０℃で観察した（例えば、図６Ａ、下部の左パネル参照）。顕著には、３７℃および３０℃の双方にて、安定化はバンドＣにおける対応する増加と関係し、他の共同シャペロン（参照、例えば、図３〜５）で観察されない結果（図３〜５参照）のかなりの細胞表面送達を反映した（例えば、図６Ａ、左パネル参照）。Ｈｓｐ９０共同シャペロンの発現のレベルが許容される（３０℃）および限定的な（３７℃）フォールディング温度の双方にてΔＦ５０８のフォールディングおよび輸出に影響できるために、ΔＦ５０８ ＣＦＴＲは、野生型ＣＦＴＲのフォールディングを通常促進するＨｓｐ９０共同シャペロンの内因性細胞質ゾルのプールに応じて、準安定のフォールディング状態のオン−経路に動力学的に捕捉し得る。そのレスキューされたバンドＣは、ゴルジ複合体を介する輸送の特徴のエンドグリコシダーゼＨによるプロセシングに抵抗性であった（示さず）。ｄｓＲＮＡの効果とは対照的に、ΔＦ５０８を発現するＨＥＫ２９３細胞におけるＡｈａ１の過剰発現（４倍）は、バンドＣへのプロセンシングの対応する損失で３７℃（−６０％）および３０℃（＞９０％）の双方にてバンドＢをかなり不安定化した（例えば、図６Ａ、右パネル参照）。これらの条件下で、Ｈｓｃ−Ｈｓｐ７０またはＢＩＰの合計プールにおける変化は検出されなく、一般的なＥＲストレス応答(SchroderおよびKaufman, 2005, Annu Rev Biochem 74, 739-789)が、Ａｈａ１の適度の低減により誘導されるようでもないことを示す（結果を示さず）。
【０２２４】
公知のフォールディング経路(Wegeleら, 2004, 前記; PrattおよびToft, 2003, Exp Biol Med (Maywood) 228, 111-133; ProdromouおよびPearl, 2003, 前記)におけるＨｓｐ９０の動的な役割との類似性によって、上記の結果は、共同シャペロンとの連続する相互作用を介するＨｓｐ９０とのＣＦＴＲクライアント相互作用の調節が、野生型立体配座を達成するプロセスにおけるＥＲＡＤを回避するために、ドメイン内フォールディングにおける工程を一時的に調整でき、および／またはドメイン間フォールディングを一時的に調整し得ることを示唆する。ドメイン内およびドメイン間のフォールディングを調整する必要性は、ΔＦ５０８が、安定な折り畳みを生成するためのＴＭＤ１とのＮＢＤ１の適当なドメイン内相互作用を達成できないという証拠と一致している(Riordan, 2005, 前記; Duら, 2005, Nat Struct Mol Biol 12, 17-25)。さらに、ＴＭＤ２(Riordan, 2005, 前記)の合成によって再度一時的に分離されたＮＢＤ２ドメインは、ΔＦ５０８ ＣＦＴＲを発現する細胞においてミスフォールドされ、ＮＢＤ１領域で二量化して、チャネル機能についてのヌクレオチド結合ポケットのうちの１つを活性化するにちがいない(Lewis, 2004, Embo J 23, 282-293)。ΔＦ５０８のフォールディング経路における止められた中間体は、ＥＲＡＤにＣＦＴＲのＨｓｃ−Ｈｓｐ７０／４０複合体および標的を結合させるＣＨＩＰおよびそれらの調節性因子ＨｓＢＰ１およびＢａｇ−１／２のごとき成分の補充ための標的であるようである(Albertiら, 2004, Mol Biol Cell 15, 4003-4010, ; Meachamら, 2001, 前記)。それは今や相対存在量であるようであり、恐らく、Ｈｓｃ−Ｈｓｐ７０／４０およびＨｓｐ９０の双方についての特異的な調節因子および共同シャペロン成分のバランスは、ＥＲからの輸出について折り畳むための野性型およびΔＦ５０８ ＣＦＴＲの能力にかなり影響する。この結論は、ΔＦ５０８のＥＲ安定性および細胞表面有効性が、異なる細胞タイプにおいて高度に可変的である一般的な観察と一致している。
【０２２５】
実施例９：ＣＦＢＥ４１ｏ−細胞におけるΔＦ５０８フォールディングに対する共同シャペロンＡｈａ１の効果
ＨＥＫ２９３細胞が通常ΔＦ５０８を発現せず、従って、Ａｈａ１活性レベルにユニークに感受性である特定の条件（実施例８参照）を示し得るために、３７℃でのＡｈａ１ ｄｓＲＮＡの効果を内因性レベルのΔＦ５０８を発現する１つの肺細胞系（ＣＦＢＥ４１ｏ−）において検討した。
【０２２６】
ΔＦ５０８ ＣＦＴＲに同型接合的なＣＦ患者に由来するヒト気管支の細胞系ＣＦＢＥ４１ｏおよびその修正されたＨＢＥ細胞系を、１０％ＦＢＳ、Pen/Strep、２ｍＭ付加的グルタミンおよび２μｇ／ｍｌピューロマイシンで補足したＭＥＭ中に維持した。ｄｓＲＮＡ調製物およびトランスフェクション、ｄｓＲＮＡ溶液およびＡｈａ１の過剰発現は、実施例８に記載の通りであった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット法は実施例３に記載された通りであった。
【０２２７】
ＨＥＫ２９３細胞において観察した結果と同様に、Ａｈａ１の低減の結果、スクランブル対照に比較して、バンドＢ（−４−モルド（mold））の安定化を生じさせ、３７℃（例えば、図６Ｂ、左パネル参照）または３０℃（例えば、図６Ｂ、右パネル参照）のいずれかでバンドＣの対応する４〜５倍の増加であり、野生型ＣＦＴＲを発現する修正されたＣＦＢＥ４１ｏ−細胞系（ＨＢＥ）において観察したものより大きなレベルであった(Brusciaら, 2002, Gene Ther 9, 683-685) (以下参照)。ΔＦ５０８を発現するＣＦＢＥ４１ｏ−中のパルス−チェイス分析は、細胞表面に対するＥＲ先行の輸出におけるバンドＢの２−３倍の安定化を明らかにした（示さず）。対照的に、Ａｈａ１ ｄｓＲＮＡの効果は、ＨＢＥ細胞系を用いるパルス−チェイス分析（示さず）またはバンドＣの定常的細胞表面レベルを用いる野生型ＣＦＴＲの安定化に観察されず、それが、より効率的な輸出を促進するための内因性Ａｈａ１プールへの調節を必要とするΔＦ５０８変異体であることを示唆する。
【０２２８】
Ａｈａ１の改変したレベルに応じたバンドＢの安定化およびΔＦ５０８バンドＣの回収は、低下したＡｈａ１活性が、ＣＯＰＩＩ  ＥＲ輸出機構へのΔＦ５０８のカップリングを促進するためにＨｓｐ９０シャペロン動力学を調節し得ることを示唆する。
【０２２９】
実施例１０：Ａｈａ１を沈黙するｓｉＲＮＡ設計
Ａｈａ１遺伝子を標的とするための候補ｓｈＲＮＡ配列はＡｍｂｉｏｎ(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)からの検索ツールから得た。ｈＡｈａ１のｃＤＮＡ配列（Ｅｎｓｅｍｂｌ受入番号ＥＮＳＧ０００００１００５９１）を用いて、例示的なリストを生成した。配列は５０％未満のＧＣ含有量を供し、連続的な４個以上のＧまたはＣを回避する。完全なリストを表１に提供する。
【０２３０】
各ｓｈＲＮＡは、ヒトゲノムに対してＢＬＡＳＴして、他の遺伝子における可能なオフ標的部位を同定した。他の遺伝子中の約４０％のＧＣ含量およびわずかのオフ標的部位を有する選定した３つのｄｓＲＮＡを選択した：９９（配列番号：１２）、１７９（配列番号：１８）および２５６（配列番号：２４）。これらの３つの１９塩基対配列の各々は、いずれかの他の遺伝子のいずれかの５'または３'の非翻訳領域、イントロンまたはエキソンと１５以下の連続的な同一性を有する。３つの配列をｐＳｉｌｅｎｃｅｒベクター（Ａｍｂｉｏｎ）にクローニングして、低下したｈＡｈａ１発現を持つ安定なＨｅｌａ系を調製した。前記の９９および１７９の配列に対応するｄｓＲＮＡを本明細書に提供される実験につき創製した(Dharmacon および Qiagen)。
【０２３１】
実施例１１：ΔＦ５０８を発現するＣＦＢＥ４１ｏ−細胞中のハロゲン化物コンダクタンスに対するＡｈａ１ ｄｓＲＮＡ効果
エンドＨ抵抗性バンドＣグリコフォームへのプロセンシングが、ＥＲからシス／中間のゴルジ区画への輸送の証明である（例えば、実施例８〜９参照）が、レスキューされた蛋白質を後期トランスゴルジまたは細胞内区画中に捕捉し、ポストＥＲ経路（例えば、図１参照）における異常なソーティングに対するＰｈｅ ５０８欠失の先行されていない寄与を反映する(Gentzschら, 2004a; Sharmaら, 2004; Swiatecka-Urbanら, 2005)。この可能性をテストするために、ΔＦ５０８を発現しているＣＦＢＥ４１ｏ−細胞をＡｈａ１ ｄｓＲＮＡで処理し、表面ハロゲン化物コンダクタンスをヨウ化物流出アッセイを用いて測定した(Looら, 2005, 前記)。
【０２３２】
陽性対照として、野生型ＣＦＴＲを発現する修正されたＨＢＥ細胞系のハロゲン化物コンダクタンスを検討した。ヨウ化物流出アッセイでは、野性型およびΔＦ５０８ ＣＦＢＥ４１ｏ−細胞を６０ｍｍ皿当たり５.０×１０５細胞の密度で蒔き、２日毎に培地を代えて５日間前記にリストされた条件下で成長させた。ｄｓＲＮＡ処理は、６０ｍｍ皿当たり２０μｌのＨｉＰｅｒＦｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で前記に示したように行なった。ＣＦＢＥ４１ｏ−細胞はヨウ化物流出分析(Hughesら, 2004)に先立って１５時間３０℃の許容温度へ移した。細胞をローディングバッファー（１３６ｍＭ ＮａＩ；３ｍＭ ＫＮＯ３；２ｍＭ Ｃａ（ＮＯ３）２；２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓおよび１１ｍＭグルコース）で５Ｘ洗浄し、２.５ｍｌのローディングバッファーで室温にて１時間インキュベートした。引き続いて、細胞を流出緩衝液（１３６ｍＭ ＮａＮＯ３；３ｍＭ ＫＮＯ３；２ｍＭ Ｃａ（ＮＯ３）２；２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓおよび１１ｍＭグルコース）で１５Ｘ洗浄し、２.５ｍｌの流出緩衝液で室温にて１分間インキュベートし、培地を分析のために集めた。このインキュベーションを合計４分間繰り返した。引き続いて、細胞を２.５ｍｌの刺激緩衝液（１０μＭホルスコリン(Sigma)および５０μＭゲニステイン(Sigma)を含有する流出緩衝液）で室温にて１分間インキュベートし、培地を分析のために集めた。このインキュベーションを合計４分間繰り返した。次いで、細胞を室温にて、２.５ｍｌの流出緩衝液で１分間インキュベートし、培地を分析のために集めた。このインキュベーションを合計１２分間繰り返した。試料をヨウ化物選択電極(Analytical Sensors & Instruments)およびＢｅｃｋｍａｎモデル３６０  ｐＨメーター(VWR)を用いて、ヨウ化物含量につき分析した。集めた培地におけるヨウ化物の量を公知のＮａＩ濃度の標準曲線から推定することにより決定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット法は実施例３に記載されていた通りであった。
【０２３３】
図７は、ＣＦＢＥ４１ｏ−細胞系によるヨウ化物流出に対するｄｓＲＮＡ Ａｈａ１の効果を示す系および散布図、ならびに棒グラフである。図７Ａはヨウ化物流出を経時的に示す系および散布図である。ヨウ化物流出は、野生型ＣＦＴＲを発現するＨＢＥ細胞（黒四角）、または３７℃で培養した、あるいは示した場合には、３０℃の許容温度（最終１５時間）（黒丸）にてΔＦ５０８を発現するＣＦＢＥ４１ｏ−細胞、Ａｈａ１でのトランスフェクト（白丸）またはスクランブルｄｓＲＮＡ（対照）（白四角）においてモニターした。ＣＦＴＲチャネルは、１０μＭホルスコリンおよび５０μＭゲニステインの添加によって１分からスタートして４分間活性化し、引き続いて、流出緩衝液で洗浄した。ＣＦＴＲ成熟（バンドＢからバンドＣグリコフォーム）およびＡｈａ１安定性に対する温度シフトおよびｄｓＲＮＡの効果を挿入図に示す。図７Ｂは、ホルスコリン／ゲニステイン（０分間）の添加に先立って、およびハロゲン化物流れのピーク期間の２分間にて、ハロゲン化物コンダクタンスの比を示す棒グラフである。星印（＊）は、スクランブルｄｓＲＮＡ処置対照（レーンｂ）と比較した、温度修正さた（レーンａ）およびｄｓＲＮＡ処置した（レーンｃ）ＣＦＢＥ４１ｏ−細胞間の独立した両側検定のｔ検定（三連試料）を用いる統計的有意差（ｐ≦０.０５）を示す。温度修正された（レーンａ）およびｄｓＲＮＡ修正したＣＦＢＥ４１Ｏ−細胞（レーンｃ）についてのハロゲン化物コンダクタンス間に統計的有意差はなかった（ｐ＝０.２）。実験を独立して少なくとも３回繰り返し、代表的な結果を示した。さらに詳しい方法の情報については、実施例１０を参照されたし。
【０２３４】
結果は、Ａｈａ１ ｄｓＲＮＡでのＣＦＢＥ４１ｏ−細胞系の処置の結果、内因性Ａｈａ１の約７０〜８０％ノック−ダウンを生じ、温度修正された対照に対して３０℃で約１.５倍のレベルにてΔＦ５０８バンドＢおよびＣの安定化、ならびにスクランブルｄｓＲＮＡ処置細胞に関してバンドＢの４倍の安定化に導いた（例えば、図７Ａ、挿入図参照）。ＨＢＥ細胞は強力なハロゲン化物コンダクタンスを示したが、スクランブルｄｓＲＮＡで処理した対照ＣＦＢＥ４１ｏ−細胞中でコンダクタンスは検出されなかった（例えば、図７Ａ参照）。３０℃へのＣＦＢＥ４１ｏ−のシフトの結果、ＨＢＥ細胞において観察したコンダクタンスの８０〜９０％の回復を生じた（例えば、図７Ａ参照）。顕著には、ｄｓＲＮＡで処理したがスクランブルしないＣＦＢＥ４１ｏ−細胞は、温度を修正した細胞において観察したものと比較して、ハロゲン化物コンダクタンスの５０〜８０％の回復を示した（例えば、図７Ｂ参照）。これらの結果は、Ａｈａ１ ｄｓＲＮＡがΔＦ５０８を発現するＣＦＢＥ４１ｏ−細胞にハロゲン化物コンダクタンスを回復させ、それにより、ＣＦＴＲの機能的レスキューを達成することを示す。
【０２３５】
図８は、ＣＦＴＲフォールディングを指令するＨｓｐ９０シャペロン／共同シャペロン相互作用を示す一連の図である。図８Ａは、野生型およびΔＦ５０８ ＣＦＴＲフォールディングに関与する成分を強調した図である。それらは、内腔シャペロン（１）、およびコア成分Ｈｓｃ−Ｈｓｐ７０／４０（２）およびＨｓｐ９０（３）ならびにＨｓｃ−Ｈｓｐ７０（２）およびＨｓｐ９０（３）共同シャペロン制御因子数を含む２状態細胞質ゾル系よりなる。また、ＴＣＰ１(Spiessら, 2004, 前記)およびＨｓｐ１０５／Ｓ１００（３ａ）のごときさらなるシャペロンは、フォールディングに寄与し得る。これらの１以上の蛋白質相互作用はＰｈｅ ５０８欠失によって動力学的に崩壊され、Ｈｓｐ９０ ＡＴＰアーゼサイクルおよびＣＦ病態生理学の崩壊に導く。図８Ｂは、ΔＦ５０８ ＣＦＴＲのフォールディングおよびレスキューにおけるＨｓｐ９０および共同シャペロンの潜在的な役割の例である。ＥＲＡＦを介する輸出のためのフォールディングを調節するか、またはＥＲＡＤを標的とするＡＴＰ／ＡＤＰサイクルを共同シャペロン制御因子（ＸおよびＹ）により動力学的に制御して、フォールディング経路の動力学およびエネルギー学にシャペロンサイクルの動力学を適合できる。例えば、ｄｓＲＮＡ（Ｘ）によるＡｈａ１ ＡＴＰアーゼ活性のダウンレギュレーションは、Ｈｓｐ９０ ＡＴＰアーゼ活性の低減により輸出についてのΔＦ５０８の安定化を支持するが、ｐ２３（Ｙ）のダウンレギュレーションはＥＲＡＤに導く不安定化を支持するであろう。図８Ｃは、全体的な蛋白質エネルギー学(Sekijimaら, 2005, Cell 121, 73-85) (Ｚ軸)によって規定した仮説の「フォールディング安定性スコア」の細胞質ゾル（Ｘ軸）における（共）シャペロン濃度、および細胞表面（Ｙ軸）への輸送のレベルを反映する「輸出効率」間の関係を示したプロットである。よりエネルギー的に安定な野生型ＣＦＴＲ（破線曲線）はＡｈａ１（グリッドを有するボックス、『正常シャペローム』）の通常濃度に対するＣＦＴＲシャペローム応答のフォールディング活性に応答するが、ΔＦ５０８（左の実線曲線）の低減したフォールディングエネルギー学は、このフォールディング環境において不安定であり、輸出されない。Ａｈａ１（灰色ボックス『レスキューシャペローム』）のダウンレギュレーションによって与えられたＨｓｐ９０ ＡＴＰ／ＡＤＰサイクルの設定ポイントにおける変化は、野生型ＣＦＴＲ折り畳み（右の実線曲線、グリッドボックス）の機能性を維持しつつ、ΔＦ５０８（左曲線）のフォールディングにシャペロームフォールディングキャパシティー（グリッドボックス）を調節することによりより生産的な解決を提供する。Ｈｓｐ９０インヒビターのゲルダナマイシン（ＧＡ）は、Ｈｓｐ９０に直接的に結合し、フォールディングサイクル（下部左コーナー）を抑止することにより、野生型およびΔＦ５０８ ＣＦＴＲフォールディングおよび輸出をブロックする(Looら, 1998, 前記)。
【０２３６】
要約すると、上記の結果は、変異体ＣＦＴＲにおける内因性フォールディング欠損が、Ａｈａ１感受性Ｈｓｐ９０ ＡＴＰアーゼサイクルの活性に動力学的に連結されることを示唆する。本明細書の結果から開発した作用モデルは、正常細胞のフォールディング経路からの環境感受性脱共役を強調する。この見地から、Ｈｓｐ９０クライアント複合体相互作用を制御するＨｓｐ９０ ＡＴＰ／ＡＤＰサイクルの固有の割合は、共同シャペロン活性を介する野生型ＣＦＴＲのフォールディングエネルギー学と調和される。野性型ＣＦＴＲの輸出を駆動するフォールディングエネルギー学は、正常細胞のシャペロンプール（図８）に対し最適化されるが、Ａｈａ１の活性の変化および潜在的に他の共同シャペロンは、これら（図８）およびシャペロンフォールディング／輸出経路のキャパシティーを改変できる。Ａｈａ１の場合には、Ｈｓｐ９０ ＡＴＰアーゼ活性の低減は、動力学的に曝露したΔＦ５０８変異体（図８）のためのさらなる時間が、『レスキュー』シャペロンプール（図８）を保証し、輸出のための安定性およびフォールディングを支持し得る。Ａｈａ１プールの部分的低下がよりエネルギー的に安定な野生型フォールディング（図８）をかなりには障害しなかったため、これらの結果は、Ｐｈｅ ５０８欠失のフォールディングエネルギー学を正常な付き添いフォールディング境界外に位置し得ることを強調する。フォールディングを調整するためのシャペロンのユニークな局所的集団の能力は、蛋白質凝集のインヒビター(Wicknerら, 1999, Science 286, 1888-1893)としての単なる機能よりも、フォールディングシャペロンが今や特定の細胞の蛋白質のフォールディング経路(Albaneseら, 2006, Cell 124, 75-88)を調節することが判明した最近の観察と一致している。進化的観点から、遺伝子変更遺伝子(QuおよびThomas, 1996, 前記)は、変異体の機能の低減のための好ましい遺伝子的またはエピジェネティックな(CowenおよびLindquist, 2005, Science 309, 2185; Queitschら, 2002, Nature 417, 618)環境、さらに、低減したクロライドチャネル機能が、野生型集団に比較した場合に脱水および死の可能性を減少させるであろうコレラ毒素のごときアゴニストで誘発する場合の生存価値(Gabrielら, 1994, Science 266, 107; ThiagarajahおよびVerkman, 2005, Trends Pharmacol Sci 26, 172)さえも供するフォールディングシャペロンを今や含むようである。かくして、シャペロンプールの活性は、ＣＦおよび他の蛋白質ミスフォールディング疾患における許容された多形性および有害変異間の差を規定し得る。
【０２３７】
実施例１２：ＣＦＴＲに対するＨｓｐ９０結合はＡｈａ１活性に応答する
Ｈｓｐ９０とのΔＦ５０８の相互作用に対するＡｈａ１ノック−ダウンの効果を決定するために、本発明者らは、Ａｈａ１ ｄｓＲＮＡでの細胞の処置後のＣＦＴＲに結合したＨｓｐ９０の回収を分析した。３７℃でΔＦ５０８を発現する細胞をスクランブルまたはＡｈａ１ ｄｓＲＮＡの存在下でインキュベートした。細胞を採取し、ＣＦＴＲ免疫沈殿し、ΔＦ５０８と会合したＨｓｐ９０の量を免疫ブロット法によって定量した。これらの実験のために、本発明者らは、免疫沈殿において回収したＣＦＴＲに対するＨｓｐ９０の比を分析して、対照またはノック−ダウン条件下でＣＦＴＲに結合したＨｓｐ９０の相対量を決定した。
【０２３８】
図９は、Ｈｓｐ９０に対するｄｓＲＮＡ Ａｈａ１の効果を示す。３７℃でΔＦ５０８を発現するＨＥＫ２９３細胞は、Ａｈａ１ ｄｓＲＮＡの不存在または存在下でインキュベートした。細胞を採取し、ＣＦＴＲ免疫沈殿させ、ΔＦ５０８で回収したＨｓｐ９０の量を免疫ブロット法によって定量した。左パネル：免疫沈殿において回収したＣＦＴＲに対するＨｓｐ９０の比。右パネル：スクランブル対照に比較したＡｈａ１ ｄｓＲＮＡ処置後に細胞内に残ったＡｈａ１の画分。
【０２３９】
本発明者らがＡｈａ１の約６０％ノック−ダウンを観察した（図９、右パネル）条件下、本発明者らは、Ａｈａ１（図９、左パネル）の低減したレベルで結合したＨｓｐ９０の５０〜６０％の減少を観察した。対照的に、これらの条件下では、本発明者らは、スクランブル対照と比較したカルネキシン、ＢｉＰ、Ｈｓｐ４０、Ｈｓｃ−Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、ＨＯＰ  ＦＫＢＰ８／３８およびｐ２３の細胞レベルにおける変化を検出せず、これはＡｈａ１の低減がＥＲにおいてＨｓｐ９０と会合したΔＦ５０８の定常状態プールを改変できることを示した。この結果は、ＣＦＴＲ野生型インタラクトームにおけるＨｓｐ９０およびＨｓｐ９０の共同シャペロン回収が、バンドＢの比較可能なレベルにも拘わらずΔＦ５０８インタラクトームに対し、低下するという観察と一致する。その結果は、Ａｈａ１共同シャペロン制御因子のレベルの低減がＨｓｐ９０とのΔＦ５０８の動力学的相互作用を改変して、フォールディング経路を介してより効率的な進行を促し、それにより、輸出を支持するということを示す。
【０２４０】
他の態様
前記の詳細な記載は、本発明の実施において当業者を援助するために提供される。しかしながら、本明細書に記載および特許請求された本発明は、これらの態様が本発明のいくつかの態様の例として意図されるために、本明細書に開示した特定の態様によって範囲において限定されるものではない。いずれの等価な態様も、本発明の範囲内であることが意図される。事実、本明細書に示し記載されたものに加えた本発明の種々の変形は、当該創造性のある発見の精神または範囲から逸脱しない前記の記載から当業者に明らかになるであろう。また、かかる変形は、添付した特許請求の範囲内にあることが意図される。
【０２４１】
引用文献
本明細書中の引用文献の引用は、かかるものが本発明に対する先行技術であるという承認として解釈されるべきではない。特に本発明の範囲内にあることを意図し、すべての目的のためにここに出典明示してそのすべてを本明細書の一部とみなすのは、以下の刊行物：Wang, X.ら, Hsp90 cochaperone Aha1 downregulation rescues misfolding of ＣＦＴＲ in cystic fibrosis, Cell (2006 Nov 17) 127(4):673-5である。
【図面の簡単な説明】
【０２４２】
【図１】図１．ＣＦＴＲ インタラクトームの描写。
【図２】図２．（Ａ）ＥＲフォールディングネットワークの描写、および（Ｂ）ＷＴおよびΔＦ５０８を発現する細胞における蛋白質発現レベルを示す免疫ブロット。
【図３】図３．ΔＦ５０８のフォールディングおよびＥＲからの輸出に対するＨｓｐ９０共同シャペロンｐ２３の効果を示す一連の棒グラフ。
【図４】図４．ΔＦ５０８のフォールディングおよびＥＲからの輸出に対するＨｓｐ９０共同シャペロンＦＫＢＰ８の効果を示す一連の棒グラフ。
【図５】図５．ΔＦ５０８のフォールディングおよびＥＲからの輸出に対するＨｓｐ９０共同シャペロンＨＯＰの効果を示す一連の棒グラフ。
【図６】図６．細胞表面へのΔＦ５０８輸出が、機能的Ａｈａ１のダウンレギュレーションによってレスキューできることを示す一連の棒グラフ。
【図７】図７．ＣＦＢＥ４１ｏ−細胞系によるヨウ化物流出に対するｄｓＲＮＡ Ａｈａ１の効果を示す線および散布図ならびに棒グラフ。
【図８】図８．ＣＦＴＲフォールディングを指令するＨｓｐ９０シャペロン／共同シャペロン相互作用の一連の描写。
【図９】図９．Ｈｓｐ９０に対するｄｓＲＮＡ Ａｈａ１の効果の（免疫ブロットを用いた）例図。
【図１】
2009537179.tif 000020
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
2009537179.tif 000026
【図６Ｂ】
2009537179.tif 000027
【図７】
2009537179.tif 000028
【図８Ａ】
2009537179.tif 000029
【図８Ｂ】
2009537179.tif 000030
【図８Ｃ】
2009537179.tif 000031
【図９】
2009537179.tif 000032
【手続補正書】
【提出日】平成21年1月19日(2009.1.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2009537179000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年2月17日(2009.2.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６５】
図１は、ＣＦＴＲインタラクトーム（薄い楕円形、以前に確立している相互作用；暗い楕円形、この試験で回収された新しい相互作用）をネットワークにおけるノードとして含む成分を示す画像であり、ＥＲ（Ｉ）、ＥＲＡＤ（ＩＩ）、膜輸送（ＩＩＩ）、およびポストＥＲ制御因子およびエフェクター（ＩＶ）における蛋白質のフォールディングを潜在的に促進するサブネットワークに分割される。暗線は、ＣＦＴＲ、およびＭｕｄＰＩＴによって同定し示された成分間の直接的または間接的な蛋白質相互作用を示すネットワークにおける端である。破線は、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅプラットフォームを用いてアクセスしたＴｍｍ共発現データベースに基づいた相互作用を規定する端を示している。表７は、質量分析法によって部分配列カバー度の順序で整列した野生型ＣＦＴＲを発現する示した細胞タイプにおける多次元タンパク質同定技術（ＭｕｄＰＩＴ）を用いて回収した蛋白質上で導かれた配列の結果を示す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９４】
図２Ａは、ＣＦＴＲ ＥＲフォールディングおよび分解プロテオームを含むネットワークについての合成図を示す図である。薄い灰色の端は、ＣＦＴＲとの潜在的な直接的または間接的な相互作用を示し；暗い端は、ＨＰＲＤ、ＢＩＮＤおよびＩｎｔＡｃｔ蛋白質相互作用データベースからのデータに基づいた成分間の公知の物理的相互作用を示す。内側の三角形（ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０およびＨＰＳ４０よりなる）は、コアフォールディングシャペロンを示し；外側の円は、調節性共同シャペロンおよびＥＲＡＤ成分を示す。図２Ｂは、野生型およびΔＦ５０８ ＣＦＴＲを発現する細胞において観察したバンドＢおよびＣの典型的な定常レベルを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ免疫ブロット法の画像である。さらなる方法の情報については、実施例１を参照されたし。
【国際調査報告】
2009537179.tif 000033
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2009537179.tif 000036
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