(57)【要約】【課題】本発明はリン酸化インスリンのオリゴマーとその処方を提供する。【解決手段】本特許のオリゴマー誘導体は、天然のインスリンまたは中間の作用を持つインスリンまたは基礎のインスリン（例えばNPH、Lantus、デテミル）を著しく改良した薬理動態特性を示した。そしてそれは4倍の高い治療指標と４倍の低血糖症リスクの低下を示した。本発明は、長びく血糖の低下の利点を提供し、低血糖の危険を減ずる利点をそれにっくみあわせる。上記はいかなる現在知られているインスリン、あるいは基礎のインスリン、あるいは中間の作用のインスリンの特性ではない。さらなる本発明の実施例では、オリゴマーのリン酸化インスリンは、吸入、頬（口内）、皮下注射、点滴、あるいはインスリン投与で他に技術的に立証された経路を含む、すべての投与経路に対して適している。本発明は、加えて食間や就寝時に吸入のための長時間作用処方の利点を提供する。【選択図】図１Ａ
2009539778.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の配列の一つからなるインスリンオリゴマー：
Ｘ−Ｘ（ＩＤＮＯ．１）、
Ｘ−Ｘ−Ｘ（ＩＤ  ＮＯ．２）、
Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ（ＩＤ  ＮＯ．３）、
Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ（ＩＤ  ＮＯ．４）、
Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ（ＩＤ  ＮＯ．５）、そして、
［ｘ−］n（ＩＤ  ＮＯ．６）、Ｘはｎ回繰り返されている；
Ｘは、配列ＩＤ  ＮＯ．７で定義されたインスリンあるいはその製薬上受容できる塩のいずれか一つである。配列ＩＤ  ＮＯ．７を以下に示す。
【化１】
2009539778.tif 000008
Ｐは、Ｏ−リン酸化されたアミノ酸残基を示す。
Ｒは任意にＯ−リン酸化されたアミノ酸残基である。そして
小文字の「ｓ」は硫黄である；
あるいは、配列ＩＤ  ＮＯ．８によって定義されたインスリンあるいはその製薬上受容できる塩である。配列ＩＤ  ＮＯ．８を以下に示す。
【化２】
2009539778.tif 000009
ＰはＯ−リン酸化されたアミノ酸残基を示す。そして小文字の「ｓ」は硫黄である。
【請求項２】
前記Ｘがインスリン類似物である請求項１に記載のインスリンオリゴマー。
【請求項３】
ポジションＲ１、Ｒ２、Ｒ３あるいはＲ４の一つあるいはそれ以上の残基がリン酸化されていない、請求項１に記載のインスリンオリゴマー。
【請求項４】
請求項１に記載のインスリンオリゴマーあるいはその類似物の効果的な服用量の投与方法からなる、その必要がある患者に糖尿病の治療を行うための方法。
【請求項５】
請求項１に記載のインスリンオリゴマーあるいはその類似物の効果的な服用量を皮下点滴あるいは皮下注射によって投与することからなる請求項４に記載の糖尿病を治療するための方法。
【請求項６】
請求項１に記載のインスリンオリゴマーあるいはその類似物の効果的な服用量を吸入によって投与することからなる請求項４に記載の糖尿病を治療するための方法。
【請求項７】
請求項１に記載のインスリンオリゴマーあるいはその類似物の効果的な服用量を口内からの吸収によって投与することからなる請求項４に記載の糖尿病を治療するための方法。
【請求項８】
請求項１に記載のインスリンオリゴマーあるいはその類似物の効果的な服用量を経口で投与することからなる請求項４に記載の糖尿病を治療するための方法。
【請求項９】
請求項１に記載のインスリンオリゴマーあるいはその類似物の効果的な服用量を経口で投与することからなる、その必要がある患者に高血糖症の治療をするための方法。
【請求項１０】
次の配列の一つからなるインスリンオリゴマーを含む組成：
Ｘ−Ｘ（ＩＤＮＯ．１）、
Ｘ−Ｘ−Ｘ（ＩＤ  ＮＯ．２）、
Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ（ＩＤ  ＮＯ．３）、
Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ（ＩＤ  ＮＯ．４）、
Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ（ＩＤ  ＮＯ．５）、そして、
［Ｘ−］n（ＩＤ  ＮＯ．６）、Ｘはｎ回繰り返される；
Ｘは、配列ＩＤ  ＮＯ．７で定義されたインスリンあるいはその製薬上受容できる塩のいずれか一つである。配列ＩＤ  ＮＯ．７を以下に示す。
【化３】
2009539778.tif 000010
ＰはＯ−リン酸化されたアミノ酸残基を示す
Ｒは任意にＯ−リン酸化されたアミノ酸残基である。そして小文字の「ｓ」は硫黄である；あるいは、
配列ＩＤ  ＮＯ．８  によって定義されたインスリンあるいはその製薬上受容できる塩、そして製薬上受容できる希釈液、賦経済、担体。配列ＩＤ  ＮＯ．８を以下に示す。
【化４】
2009539778.tif 000011
ＰはＯリン酸化されたアミノ酸残基を示す。そして小文字の「ｓ」は硫黄である。
【請求項１１】
糖尿病の治療での請求項１０に記載のインスリンオリゴマーを含む組成の使用。
【請求項１２】
以下に定義されるインスリンの使用：
以下の配列の一つを含んで製造されるインスリンオリゴマー。：
Ｘ−Ｘ（ＩＤＮＯ．１）、
Ｘ−Ｘ−Ｘ（ＩＤ  ＮＯ．２）、
Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ（ＩＤ  ＮＯ．３）、
Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ（ＩＤ  ＮＯ．４）、
Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ（ＩＤ  ＮＯ．５）、そして、
［Ｘ−］n（ＩＤ  ＮＯ．６）、Ｘはｎ回繰り返される；
Ｘは配列ＩＤＮｏ．７と配列ＩＤＮｏ．８のインスリンのいずれか１つであること。
配列ＩＤ  ＮＯ．７あるいはその製薬上受容できる塩。配列ＩＤ  ＮＯ．７：
【化５】
2009539778.tif 000012
Ｐは、Ｏリン酸化されたアミノ酸残基を示す。
Ｒは任意にＯリン酸化されたアミノ酸残基である。そして
小文字「ｓ」は硫黄である。；
あるいは、配列ＩＤ  ＮＯ．８あるいはその製薬上受容できる塩。配列ＩＤ  ＮＯ．８を以下に示す。
【化６】
2009539778.tif 000013
Ｐは、Ｏ−リン酸化されたアミノ酸残基を示す。そして小文字の「ｓ」は硫黄である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医学と特に糖尿病及び高血糖症の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、世界の人口の５％以上に影響を与える身体を衰弱させる病気である。全米で、およそ１千５百万人が糖尿病を患っている。糖尿病の症状には高血糖症を含む。糖尿病の患者は、インスリンに関し、感受性、産生、及び／または放出の減少を示す。糖尿病は、１型あるいはインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）と、２型あるいは非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）として分類される。１型糖尿病は、膵臓がインスリンを産生するのを停止しており、すべての糖尿病患者のうちの１０％が冒されている。それはしばしば幼年時代に始まり、若年性糖尿病としても知られている。より一般的な２型糖尿病、あるいは成人型糖尿病において、インスリンの生産は維持されるが、食事に応えての分泌作用は遅れて、および／または減少している。そして糖尿病患者の組織はしばしばインスリンの効果に対して感受性が低下している。
【０００３】
両方の型において、インスリンの反応の減少あるいはインスリンの低レベルが血中ブドウ糖の慢性的な高レベルをもたらす。そしてそれは次第に正常な身体生理機能に変化をもたらし、腎臓、心臓、網膜、神経を含む微小血管およびマクロ血管の続発症および循環器の合併症のリスクを高める。このような合併症は、血中ブドウ糖の不十分なコントロールより主に生じ、重大な健康上の問題である。糖尿病コントロールと合併症に関する試験（ＤＣＣＴ）からの結果は、ブドウ糖コントロールの改善は糖尿病の合併症の発生率を低下させることを証明している［非特許文献１］。
【０００４】
しかしながら、このようなコントロールを達成するには、インスリンの療法が必要であり、それは正常な人にみられる内因性インスリン分泌作用の型を反映している。健康な人において、次のように毎日のインスリン分泌作用は必要に応じて変動する。（ａ）食事吸収段階において、インスリンは食事関連のブドウ糖、アミノ酸および他の食物を処理するために最高１０倍に増大する、そして（ｂ）吸収後の段階に、より低く、比較的一定で、持続する量のインスリン（基礎的供給）放出が肝臓（ｌｉｖｅｒ）ブドウ糖産出と末梢神経のブドウ糖取り込みとのバランスを保つために生じる。そしてそれによって標準的な血中ブドウ糖を維持する。したがって、有効な療法は、速効性食事時インスリンとより長期間作用、あるいは中間の作用の基本的なインスリンである外因性インスリンの２つのタイプを組み合わせての使用を必要とする。
【０００５】
ＨｂＡｌＣは普通に普及している血中ブドウ糖の指標である。２００６年のアメリカ糖尿病協会（ＡＤＡ）の治療目標と勧告では、著しい低血糖を起こすことなく可能な限り標準（＜６％）に近い糖化ヘモグロビン（ＨｂＡｌＣ）、そして１３０ｍｇ／ｄＬ以下の目標朝食前ブドウ糖が含まれる。このようなＡＤＡ勧告は、異常に高いブドウ糖が病気の合併症とつながりがあることを証明する所見に基づいている。多数の大規模なマルチセンターの第３相臨床試験において、今までに、インスリンなしあるいはその組合せでは、１３０ｍｇ／ｄＬ以下の平均空腹時血糖（ＦＢＧ）というＡＤＡ治療のガイドラインを達成しなかった。さらに、大規模な試験で観察した通常の最も良い平均研究母集団ＨｂＡｌＣｓは６％以下でなく、むしろ７から８％の範囲である。
【０００６】
第３相臨床実験において、改善された「基礎の」インスリンは、Ｌａｎｔｕｓ＆Ｄｅｔｅｍｉｒは、さらに十分にＡＤＡ臨床勧告をうわまわり、著しく正常（＜１００ｍｇ／ｄＬ）を上回る１４５ｍｇ％のＦＢＧを達成した。不幸にも、ＮＰＨのような既存のインスリンあるいはＬａｎｔｕｓのような基礎のインスリンあるいはＤｅｔｅｍｉｒ単独あるいはリスプロのような速効作用食事インスリンとの組み合わせでは、毎日の基準における空腹時ブドウ糖のための治療ガイドラインをコントロールできない。
【０００７】
明らかに、食間ブドウ糖を強靱にコントロールする基礎インスリン処方の改良の必要が多く臨床的に残されている。
【０００８】
当該の技術でよく熟練した人たちによって理解されるように、長期間作用するインスリン処方は、皮下注射の微晶質の懸濁液として標準的なインスリンを作り上げることによって得られる。市販の基礎的なインスリン調剤の例にＮＰＨ（Ｎｅｕｔｒａｌ  Ｐｒｏｔａｍｉｎｅ  Ｈａｇｅｄｏｒｎ）インスリン、プロタミン亜鉛インスリン（ＰＺＩ）とウルトラレンテ（ＵＬ）がある。
【０００９】
ＮＰＨインスリンは、最も広く使われていインスリン調剤であり、極最近まで世界中で使われたインスリンの５０〜７０パーセントをしめていた。それはインスリン、亜鉛、プロタミンと１種以上のフェノールの防腐剤の微晶質の複合体の懸濁液である。モノマーのインスリン類似物のＮＰＨ様調剤、ＬｙｓＢ２９８、ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン類似物が、当該技術［特許文献１：Ｄｅ  Ｆｅｌｉｐｐｉｓ，  Ｍ．  Ｒ．，発行日Ｍａｙ  ５，  １９９８］で知られている。
【００１０】
現在使用可能なＮＰＨインスリン調剤を使った療法では、食間の長時間において最適な空腹時血中ブドウ糖を維持するために必要な、理想的である「平らな」吸収分布を与えられない。従って、ＮＰＨインスリンの治療は、好ましくない高い血中インスリン濃度をもたらす可能性がある。そのために生命にかかわる低血糖を引き起こすかもしれない。
【００１１】
理想的である平らな吸収分布プロファイルを与えられないのに加えて、ＮＰＨインスリンの作用の持続時間もまた同じく劣っている。しばしば翌朝までもたない。特にＮＰＨ療法の主な問題は、「暁現象」、高血糖症である。それは、目を覚ます前に有効なブドウ糖コントロールを失うことに起因する。ウルトラレンテはＮＰＨより高濃度の亜鉛を含んだインスリンの結晶質の調剤であり、プロタミンあるいはフェノールの防腐剤のどちらも含まない。ヒトウルトラレンテ調剤はより長期間作用するが、その作用は実際において可変的で、一定ではない。
【００１２】
脂肪酸インスリンが記述されている［非特許文献２］。そしてインスリンデテミル（ノヴォ・ノルディスク）が最近発売された。脂肪酸−アシル化されたインスリンに用いられた脂肪酸鎖はおよそ１０炭素原子より概して長く、１４と１６の炭素原子の鎖長が、血清アルブミンへの結合と作用の延長に最適である。デテミルのような脂肪酸−アシル化インスリンは、通常の療法濃度のインスリンであれば溶解するが、それによって長期の作用を与える血液中のアルブミンに結合する。しかしながら、これらの調剤の時間作用は正常で根本的なコントロールを与えるには、十分に平らではない。
【００１３】
インスリンランタスは基礎的な特性を持つインスリン類似物である。（デテミルと同じように）それは、生理的なｐＨにおいて不溶解性であるが、それがつくられたｐＨにおい
て溶解性であることによって、インスリン懸濁液で観察された吸収可変性をいくらか防ぐ。  注射液において沈殿が起こり、長く続く吸収を生じる。適度にフラットな吸収がこのインスリンで得られるが、このインスリンを大規模な臨床実験で試験したとき、インスリンの急な服用量−反応カーブとをあわせ日毎の吸収の変動があることにより、受け入れ難い低血糖を生み出すことなくＡＤＡブドウ糖目標を達成するのに、十分に強固な療法とはならない。
【００１４】
種々のリン酸化インスリン（Ｐインスリン）が開示された。リン酸を用いた方法（非特許文献３）、あるいは結合剤を使い非水性有機溶媒中でリン酸／ＰＯＣＬ3を用いた方法（特許文献２及び３：Ｃｅｒａｍｉ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ）、あるいはホスホアミデートとともに用いた方法（非特許文献４）により、インスリンはリン酸化されている。Ｆｅｒｒｅｌら、およびＲａｔｈｌｅｖとＲｏｓｅｎｂｅｒｇによって作り出されたリン酸化インスリンは、リン酸化のプロセスをさらに理解するために計画された研究の一部であった。そして特にそれがどのように生物学のシステムに関連しているかの学識を増やすためであった。このリン酸化インスリンの臨床の効果は測定されも、観察もされなかった。上記の先行技術において、インスリンがリン酸化されていた特定のアミノ酸あるいはその部位を決定しなかった。それ故特定の分子の構造が明らかにされず、特許も取られなかった。さらに、どの上記先行技術も変えられた薬力学を用いてインスリンを発表していない。それと対照的に、本発明では平らになったブドウ糖インスリン服用量反応カーブを用いてインスリンを記述する。
【００１５】
Ｃｅｒａｍｉら（上記に引用）に与えられた特許は、インスリン運搬システムで長期保存される時、還元された重合の長所を持つスルホン酸化とリン酸化のインスリンを含む。      
【００１６】
これらのインスリンは、インスリンポンプの閉塞を起こさない効果を主張している。そして、したがって、それらのために患者は血中ブドウ糖をより良くコントロールしなければない。Ｃｅｒａｍｉらの特許では、非水性の溶媒中リン酸化を行うことにより工程における改良が達成されることを強調している。したがって、彼らはＰインスリンが低血糖症を産み出す高い可能性があることを教えている（マウスけいれん分析）。そのため、ここに記述された結果に反して、低血糖になる可能性が減少することを示していないという点で、上記のＣｅｒａｍｉらのインスリンは異なる。とりわけ、Ｃｅｒａｍｉらによって記述されたＰインスリンの化学的な同一性は、著しく本発明とは異なると、このために結論しなくてはならない。Ｃｅｒａｍｉらは、彼らの特許により製造されたリン酸化されたインスリンの異種の混合（等電部分の範囲を持つ）の科学的な同一性を決定できなかった。そして当該の技術に詳しい当事者による化学的比較は、そのようなことなしでは不可能である。
【００１７】
非特許文献５によって明らかにされるように、インスリンもまた過剰のピリジンと共に、ＰＯＣｌ3と共にリン酸化されている。この引用文献では、本質的にその低血糖症の効果の改変無く、インスリンが無水媒体中でリン酸化されるかもしれないことを明らかにしている。化学組成は明らかにされず、そして決定されなかった。また、ブドウ糖コントロールにおいて有益な効果が記述されることも、評価されることもなかった。
【００１８】
著者の特許（特許文献４及び５：Ｌｏｕｇｈｅｅｄ、ＷＤ）は、ここで引用された先行技術上、そしてＡｌｂｉｓｓｅｒ（特許文献６）に認められた。Ａｌｂｉｓｓｅｒによる特許文献６には、特にモノマーのＰインスリンが次のように記述される点で、本発明とは異なる［”ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃａｌｌｙ  ｔｈｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｗａｓ  ｉｎｔａｃｔ  ｍｏｎｏｍｅｌｉｃ  ｉｎｓｕｌｉｎ”（ｐ．４  、１．２３−２４）］。対照的に、本発明はインスリンオリゴマーについて論じている。優れた薬理作用がオリゴマーから得られている。Ａｌｂｉｓｓｅｒはアミノ酸配列結果を明らかにしているが、それは特異的ではなく、インスリンの３つの可能なセリン残基の１つまたはそれ以上がＯ−リン酸としてリン酸化されている。
【００１９】
リン酸化されたインスリン化学組成は、この配列データからは明確にはできない。
【００２０】
ロッキード（Ｌｏｕｇｈｅｅｄ）特許（特許文献４及び５）では、ユニークな特性を持っているモノマーのリン酸化インスリンが記述されている。それによると低血糖症を減じる好結果が判明され、インスリンの急激な投薬反応が３−４倍平らになっている。
【００２１】
低血糖症のリスクを減らすことにより、いっそう積極的にインスリンが与えられ、結果としてブドウ糖のコントロールが改善される。リン酸化インスリンのオリゴマーが著しくその血清半減期を長くするという驚くべき付加的な有用性を持つことを記述するという点で、ここにある本発明は発明者の前の研究とは異なっている。この特性により、基礎のインスリンが食間にブドウ糖をコントロールするために必要とされる延長作用を提供される。
【００２２】
インスリンの肺への投与は、水溶液あるいは散剤によって成し遂げられることができる。  このようなインスリンの乾燥した粉、エアロゾルあるいは液体吸入薬の処方が、広く盛んに分析されている。以下にその例を挙げる（特許文献８及び９、非特許文献７及び８）。
【００２３】
例えば、非特許文献９のように、多くが１型と２型インスリン依存型糖尿病患者にブドウ糖コントロールを提供することを示している。Ｐａｔｔｏｎらによって記述された無水散剤インスリン処方は、処方不安定性の問題を克服している。
【００２４】
Ｓａｙａｎｉらによって検討されるように増進剤の使用により（非特許文献１０）、あるいは亜鉛なしの処方を活用することにより（特許文献１０）、吸収は増やされる。
【００２５】
Ｐａｔｔｏｎらによって記述されるように（吸入療法システム，特許文献１１）、無水粉末のインスリンは、気体の流れの中に分散されて、取り込まれることにより、エアゾールに形成される。そして計量され、投薬される。Ｓｔｅｉｎｅｒ  ＳＳらの特許文献１２に、インスリン−ジケトピペララジン沈殿が記述されている。このような粒子は、亜鉛の除去と共に肺の吸収を高める大きい縦溝彫りの表面積を持っている。
【００２６】
Ｐｌａｔｚらの吸入療法システム特許文献１３に記述されるように、様々な緩衝液と合わせられたマンニトールが、吸入可能な処方の安定性を増大するために用いられるかもしれない。小さい粒子サイズ、０．２−５ｍｕ．ｍのオーダー、は、深い肺浸透のために最適である。
【００２７】
長期間効果がある肺へのインスリンが最近同じく最近次の米国特許で記述された（特許文献１４〜１７）。動物モデルで試験されたように、これらは食間のブドウ糖のコントロールの前臨床研究において長期の効果を示すという好結果が得られた。人間での有効性はまだ示されなかった。これらの肺への処方が基礎的な肺への配給を提供することについての見込みを示すのに対して、この出願で示されるようには、低血糖の影響を減じる結果と組み合わせた長期作用を示さない。
【００２８】
糖尿病についてのアメリカ糖尿病協会専門家諮問委員会は、低血糖になる可能性を減じると共に作用が延長されたインスリンの必要を定義した。［非特許文献１１］。
【００２９】
オリゴマーのＰインスリン化合物の長い血清半減期は、低血糖の発生率を減らす一方、糖尿病を治療するために長期間効果がある処方を提供する必要を満たしている。治療が、例えば針、ペン、吸入システム、口で吹くもの、針なしの注射システムあるいはインスリンポンプを使っての投与のような、確定した治療処方のいずれによってでもよい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３０】
【特許文献１】米国特許５７４７６４２
【特許文献２】米国特許４５３４８９４
【特許文献３】米国特許４７０５８４５
【特許文献４】米国特許５４５３４１７
【特許文献５】ＰＣＴ／ＣＡ９２／０００８２
【特許文献６】米国特許５２４２９００
【特許文献７】米国特許４６３９３３３（Ｏｂｅｒｍｅｉｅｒ  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  ｆｉｌｅｄ  Ｊａｎｕａｒｙ  ２７，１９８７．）
【特許文献８】米国特許５，９９７８４８，Ｐａｔｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，
【特許文献９】米国特許５５０６２０３、Ｐｌａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｈａｌｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＰＣＴ  ＷＯ  ９６／３２１４９．
【特許文献１０】Ｂｏｅｄｅｒｋｅ，Ｐ．：米国特許６９６０５６１
【特許文献１１】ＷＯ９５／２４１８３
【特許文献１２】米国特許６６５２８８５
【特許文献１３】ＷＯ９６／３２１４９
【特許文献１４】米国特許６４６５４２６，Ｂｒａｄｅｒ  ＭＬ，発行日Ｏｃｔｏｂｅｒ  １５，  ２００２
【特許文献１５】米国特許６８３８０７６，Ｐａｔｔｏｎ  ＪＳ  ｅｔ  ａｌ，発行日Ｊａｎｕａｒｙ  ４，  ２００５
【特許文献１６】米国特許６３１００３８，Ｈａｖｅｌｕｎｄ  Ｓ，発行日Ｏｃｔｏｂｅｒ  ３０，  ２００１
【特許文献１７】米国特許６３３５３１６，Ｈｕｇｈｓ  ＢＬ  ｅｔ  ａｌ，発行日Ｊａｎｕａｒｙ  １，  ２００２
【特許文献１８】Ｃｈａｎｃｅ，  ｅｔ  ａｌ．，米国特許５５１４６４６，発行日Ｍａｙ  ７，  １９９６
【特許文献１９】ＥＰＯ公開番号３８３４７２，Ｆｅｂ．  ７，  １９９６
【特許文献２０】Ｂｒａｎｇｅ，  Ｊ．  Ｊ．  Ｖ．，  ｅｔ  ａｌ．ＥＰＯ公開番号２１４８２６，Ｍａｒ．  １８，  １９８７
【特許文献２１】Ｐｌａｔｚ，  ｅｔ  ａｌ．，国際公開ＷＯ９６／３２１４９，公開日Ｏｃｔ．  １７，  １９９６
【特許文献２２】Ｐａｔｔｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，国際公開ＷＯ９５／２４１８３，公開日Ｓｅｐ．  １４，  １９９５
【特許文献２３】米国特許５６２２１６６，発行日Ａｐｒ．  ２２，  １９９７
【特許文献２４】Ｍｅｃｉｋａｌｓｋｉ，  ｅｔ  ａｌ．，米国特許５５７７４９７，Ｎｏｖ．  ２６，  １９９６
【特許文献２５】Ｍｅｃｉｋａｌｓｋｉ，  ｅｔ  ａｌ．，米国特許５４９２１１２，発行日Ｆｅｂ．  ２０，  １９９６
【特許文献２６】Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  ｅｔ  ａｌ．，米国特許５３２７８８３，発行日ＪｕＩ．  １２，  １９９４
【特許文献２７】Ｇｏｏｄｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，米国特許５４０４８７１，発行日Ａｐｒ．  １１，  １９９５
【特許文献２８】Ｒｕｂｓａｍｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，米国特許５６７２５８１，発行日Ｓｅｐ．  ３０，  １９９７
【特許文献２９】Ｇｏｎｄａ，  ｅｔ  ａｌ．，米国特許５７４３２５０，発行日Ａｐｒ．  ２８，  １９９８
【特許文献３０】Ｒｕｂｓａｍｅｎ，米国特許５４１９３１５，発行日Ｍａｙ  ３０，  １９９
【特許文献３１】Ｒｕｂｓａｍｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，米国特許５５５８０８５，発行日Ｓｅｐ．  ２４，  １９９６
【特許文献３２】Ｊｏｈｎｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，米国特許５６５４００７，発行日Ａｕｇ．  ５，  １９９７
【特許文献３３】Ｇｏｎｄａ，  ｅｔ  ａｌ．，国際公開ＷＯ９８／３３４８０，公開日Ａｕｇ．  ６，  １９９８
【特許文献３４】Ｒｕｂｓａｍｅｎ，米国特許５３６４８３３，発行日Ｎｏｖ．  １５，  １９９４
【特許文献３５】Ｌａｕｂｅ，  ｅｔ  ａｌ．，米国特許５３２００９４，発行日Ｊｕｎ．  １４，  １９９４
【特許文献３６】Ｅｌｊａｍａｌ，  ｅｔ  ａｌ．米国特許５７８００１４，発行日ＪｕＩ．  １４，  １９９８
【特許文献３７】Ｂａｃｋｓｔｒｏｍ，  ｅｔ  ａｌ．，米国特許５６５８８７８，発行日Ａｕｇ．  １９，  １９９７
【特許文献３８】Ｂａｃｋｓｔｒｏｍ，  ｅｔ  ａｌ．，米国特許５５１８９９８，発行日Ｍａｙ  ２１，  １９９６
【特許文献３９】Ｂａｃｋｓｔｒｏｍ，  ｅｔ  ａｌ．，米国特許５５０６２０３，発行日Ａｐｒ．  ９，  １９９６
【特許文献４０】Ｍｅｅｚａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，米国特許５６６１１３０，発行日Ａｕｇ．  ２６，  １９９７
【特許文献４１】Ｓｃｈｕｌｔｚ，  ｅｔ  ａｌ．，米国特許５６４５０５１，発行日ＪｕＩ．  ８，  １９９７
【特許文献４２】Ｒｕｂｓａｍｅｎ，米国特許５３６４８３８，発行日Ｎｏｖ．  １５，  １９９４
【特許文献４３】Ｒｕｂｓａｍｅｎ，米国特許５６７２５８１，発行日Ｓｅｐ．  ３０，  １９９７
【特許文献４４】Ｗｉｌｌｉａｍｓ，米国特許５２７７１９５，発行日Ｊａｎ．  １１，  １９９４．
【特許文献４５】Ｍａｒｋｕｓｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ，米国特許４９１６２１２  ｆｉｌｅｄ  Ｍａｙ  ２９，１９８５；発行日Ａｐｒｉｌ  １０，１９９０
【特許文献４６】米国特許４５５９３００（Ｋｏｖａｃｅｖｉｃ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．発行日Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １７，１９８５，Ｄｉ  Ｍａｒｃｈｉ  Ｒ．，ｆｉｌｅｄ  Ａｕｇｕｓｔ  １，１９８３
【特許文献４７】米国特許４６１６０７８，Ｄｉ  Ｍａｒｃｈｉ  Ｒ．，ｆｉｌｅｄ  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ７，１９８６
【非特許文献】
【００３１】
【非特許文献１】Ｔｈｅ  ＤＣＣＴ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｒｏｕｐ．  Ｎｅｗ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．、３２９、９７７−９８６（１９９３）
【非特許文献２】Ｗｈｉｔｔｉｎｇｈａｍ，  Ｊ．  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．  ［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：２８２６−２８３１（１９９７）
【非特許文献３】Ｆｅｒｒｅｌ  Ｒ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  ７０，  ２１０７−７，  １９４８
【非特許文献４】Ｒａｔｈｌｅｖ，  Ｖ．  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  Ｔ．，  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，  ６５，  ３１９−３３９，  １９５６
【非特許文献５】Ｒｏｕｂａｌ  Ｚら、ケミカルアブストラクト、Ｖｏｌ．６８、１９６８、（コロンバス、オハイオ、合衆国）
【非特許文献６】Ｒ．Ｅ．Ｃｈａｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ：Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ４，  １４７  （１９８２）
【非特許文献７】Ｉｎｈａｌｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ：  Ｎｉｖｅｎ，  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｔｈｅｒ．  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓ，  １２（２＆３）：  １５１−２３１  （１９９５）
【非特許文献８】Ｓａｙａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｔｈｅｒ．  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓ，  １３（１＆２）：  ８５−１８４  （１９９６）
【非特許文献９】Ｐａｔｔｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  １，  ３５  （２−３），  ２３５−２４７（１９９９）
【非特許文献１０】Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｔｈｅｒ．  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓ  ｙｓ，  １３（１＆２）：  ８５−１８４  （１９９６）
【非特許文献１１】”ｍｏｒｅ  ｅｆｆｏｒｔ  ｉｓ  ｎｅｅｄｅｄ  ｔｏ  ｄｅｖｅｌｏｐ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ  ｗｈｉｃｈ  ｒｅｄｕｃｅ  ｔｈｅ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉａ”、糖尿病における１９９７のＦＤＡの政策綱領
【非特許文献１２】”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”，  Ｓｌｏｔｉｎ  ＬＡ，  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  ７３７−７５２  （１９７７）
【発明の概要】
【００３２】
この出願は２００６年６月８日に提出されたアメリカ合衆国の先行特許出願書Ｎｏ．６０／８１１，７６６の優先権提出期日の利益を主張する。それは、ここにそのすべてが組み入れられる。
【００３３】
低血糖の影響を減じ、食間のブドウ糖コントロールのための延長作用療法を持つ改良されたインスリン組成物が提供される。  驚くべきことに、発明者は、下に定義され配列ＩＤ  Ｎｏ．７＆８のＰインスリンがオリゴマー形成を引き起こすことを発見した。該オリゴマー化は有益な以下の特質を持っている。
【００３４】
１．皮下組織からの吸収を長期化して、そしてさらにホルモンの血清半減期を伸ばすこと。これは、発明者の前の特許と比較して、それによってさらに低血糖の危険を減らすことについての効果を持つ。２．著しく作用の存続期間を伸ばすこと。このような薬力学の特性は食事の間の血糖コントロールを強める。
【００３５】
本発明は、それで大量の薬物とＰインスリンオリゴマーの処方に関連している。そのＰインスリンは、重要なことに、持続する作用の存続期間という長所を持ち、低血糖の影響を減じる。それらは、［Ｘ］ｎ式のオリゴマーの配列により、または、より具体的には次のように記述される。
【００３６】
Ｘ−Ｘ                  ＩＤ  ＮＯ．１、又は、
Ｘ−Ｘ−Ｘ              ＩＤ  Ｎｏ．２、又は、
Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ          ＩＤ  Ｎｏ．３、又は、
Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ      ＩＤ  Ｎｏ．４、又は、
Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ  ＩＤ  Ｎｏ．５、又は、
［Ｘ−］n               ＩＤ  Ｎｏ．６（「Ｘ」はｎ回繰り返される）
そして「Ｘ」は以下の配列ＩＤ  Ｎｏ．７あるいはＩＤ  Ｎｏ．８に限定される。
【００３７】
配列ＩＤ  ＮＯ．７
【００３８】
【化１】
2009539778.tif 000003
【００３９】
「−Ｐ」はＯ−リン酸化されたアミノ酸残基を示すと定義される。そして「Ｒ」はさらにＯ−リン酸化できるアミノ酸残基を意味する。小文字「ｓ」は硫黄を意味する。
【００４０】
あるいは、
「Ｘ」は以下の配列ＩＤ  ＮＯ．８を示す；
【００４１】
【化２】
2009539778.tif 000004
【００４２】
「−Ｐ」がＯ−リン酸化されたアミノ酸残基を示すと定義され。小文字の「ｓ」は硫黄を意味する。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
今から本発明の製造方法を、以下の添付の図面への参照と共に記述する。
【図１Ａ．Ｂ】９９／１の５０ｍＭのアンモニウムリン酸塩、ｐＨ９．０／アセトニトリル中でＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いたサイズ排除クロマトグラフィ。ａ．オリゴマー（テトラマー、ヘキサマーとオクタマ−）ｂ．分子量標準。
【図１Ｃ】特許文献４に従って生産されたリン酸化インスリンのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動。分子量６０００ｄａのリン酸化インスリンモノマーのみを示す。
【図２Ａ】Ｐインスリンオリゴマーの質量分光法。２ａ．ＰインスリンオリゴマーのＭＡＬＤＩ−ＭＳ。ＭＡＬＤＩ−ＭＳの間に、高級オリゴマーが切断されて、ｐインスリンモノマー（５８０８ｄａ）、ダイマー（１１，６１６）そして  トリマー（１７，４２４ｄａ）が発生する。
【図２Ｂ．Ｃ】Ｐインスリンは還元、アルキル化され  、ジスルフィド結合を壊し、Ａ鎖とＢ鎖とが切り離された。ＭＡＬＤＩ−ＭＳでＡ鎖とＢ鎖両方の質量が観察された。そして結果からＡ鎖中に２つのリン酸サイトが、そしてＢ鎖に４つのリン酸サイトがあることを明らかにした。ＭＳ／ＭＳによりＳｅｒ９とＴｙｒｌ６に対してリン酸化サイトをＡ鎖に位置づけした（図２Ｂ）。そして残存リン酸化サイトを位置づけするために、還元し、アルキル化されたＰインスリンをトリプシンで一晩消化させた。結果として断片をスライド＃１５−１７に示した。２つのリン酸化サイトがインスリンＢ鎖のＴｙｒ２６とＴｈｒ２７で決定された（図２Ｃ）。
【図３】膵切除された糖尿病のビーグル犬へのヒトインスリンとＰインスリンの静脈注射。Ａ．ヒトインスリンが示す血中濃度の急激な低下。１５分で低血糖、注射後短い血清半減期で急激な血糖症の回復を示している。Ｂ．種々の服用量においてのＰインスリンオリゴマー。作用の延長された存続期間（長い血清半減期）、すべての服用量においての高血糖症なく標準的なブドウ糖の維持を示す。基本の８倍の服用量あるいは「ブドウ糖を維持する服用量」に達成するまで低血糖は観察されなかった。
【図４】糖尿病のビーグル犬へのヒトインスリンとＰインスリンオリゴマーの皮下注射。修飾されていないインスリンと比較して、作用の存続期間が延長されたことを示す。
【図５】Ｌ６ネズミの筋細胞においてヒト＆ブタ＆Ｐインスリンオリゴマーの服用量反応カーブ。細胞は各実験でそれぞのインスリンのさまざまな濃度で６０分間培養された。２−デオキシグルコースの摂取がそれから測られた。Ｐインスリンオリゴマーが調査されたすべての濃度において服用量反応が平らになったことを示さなかった。驚くべきことにＰインスリンオリゴマーは、ブタあるいはヒトインスリンより著しく低い最大の反応を示した。
【図６】リン酸化インスリンヘキサマーの４０ｍｇのスプラグ−ドーリーネズミのブドウ糖反応。ネズミにはＯｈに注射され、ブドウ糖レベルが１２ｈ測定された。示されるように、ブドウ糖レベルは服用後２ｈまで下がり、そして服用後１１ｈまで抑えられ、その後にがベースラインあるいは服用前のレベルに戻った。
【００４４】
これは過量摂取濃度においてさえもＰインスリン  オリゴマーが低血糖を起こす可能性が減ぜられていることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
次の省略はアミノ酸を表すために使われる。
【００４６】
【表１】
2009539778.tif 000005
【００４７】
次の配列の１つからなるインスリン  オリゴマーが提供される  。
Ｘ−Ｘ（ＩＤ  Ｎｏ．１）、
Ｘ−Ｘ−Ｘ（ＩＤ  Ｎｏ．２）、
Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ（ＩＤ  Ｎｏ．３）、
Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ（ＩＤ  Ｎｏ．４）、
Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ（ＩＤ  Ｎｏ．５）、そして、
［Ｘ−］n（ＩＤ  Ｎｏ．６）、Ｘはｎ回繰り返されている。
Ｘは以下のいずれかである。
【００４８】
（ａ）配列ＩＤ  Ｎｏ．７によって定義されたインスリン、あるいはその製薬上受容できる塩。配列ＩＤ  Ｎｏ．７を以下に示す。
【００４９】
【化３】
2009539778.tif 000006
【００５０】
ＰはＯ−リン酸化されたアミノ酸残基を示す。
【００５１】
Ｒは任意にＯ−リン酸化されたアミノ酸残基であり、そして小文字の「ｓ」は硫黄である。あるいは、
（ｂ）配列ＩＤ  ＮＯ．８によって定義されたインスリンあるいはその製薬上受容できる塩。配列ＩＤ  ＮＯ．８を以下に示す。
【００５２】
【化４】
2009539778.tif 000007
【００５３】
ＰはＯ−リン酸化されたアミノ酸残基を示し、小文字の「ｓ」は硫黄である。
【００５４】
配列ＩＤ  Ｎｏ．７あるいは８により定義されたインスリンはインスリン類似物であることができる。
【００５５】
他の実施例として、ポジションＲ１、Ｒ２、Ｒ３あるいはＲ４の１あるいはそれ以上の残基はリン酸化される必要がない。
【００５６】
糖尿病を治療するための方法が、必要としている患者に提供される。その方法は、インスリンオリゴマーの、上で明確にされるように、あるいはその類似物の効果的な服用量を投与することを含む。
【００５７】
代わりに、インスリンオリゴマ−あるいはその類似物の効果的な服用量を、口内の吸収、経口、あるいは皮下注射により、吸入、皮下点滴の組み合わせ、あるいはいずれかにより、投与されることを含む。
【００５８】
高血糖症を治療するための方法が、その必要とする患者に同じく提供される。  その方法は、インスリンオリゴマーの、上で定義されるように、あるいはその類似物の効果的な服用量を経口で投与されることからなる。
【００５９】
上で定義されるように上記配列の一つからなるインスリンオリゴマーを含む組成物もまた提供される。組成物はさらに製薬上適切な希釈液、賦形剤、あるいはその担体からなる。  インスリンオリゴマーを含む組成物は、高血糖症の糖尿病の治療で使われる。
【００６０】
次の配列の１つからなるインスリンオリゴマーの製造において、配列ＩＤ  Ｎｏ．７、配列ＩＤ  Ｎｏ．８あるいはその製薬上受容できる塩により定義されたインスリンの使用。
Ｘ−Ｘ（ＩＤ  Ｎｏ．１）、
Ｘ−Ｘ−Ｘ（ＩＤ  Ｎｏ．２）、
Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ（ＩＤ  Ｎｏ．３）、
Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ（ＩＤ  Ｎｏ．４）、
Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ（ＩＤ  Ｎｏ．５）、そして、
［Ｘ−］n（ＩＤ  Ｎｏ．６）、Ｘはｎ回、繰り返されている。
配列ＩＤ  Ｎｏ．７と配列ＩＤ  Ｎｏ．８のインスリンのいずれかひとつであるＸもまた提供される。
【００６１】
リン酸化インスリンオリゴマーの投与は、医療従事者により効果的であると知られるいかなるルートでも経由できる。ここで非経口とは「胃腸を介する経路以外による施与」と定義づけられる。本発明の処方を実施するための非経口ルートは、皮下、肺、動脈、腹膜、筋肉、鼻、静脈、口内のルートを含む。
本発明の処方は、カテーテル、または点滴システム、またはカテーテルあるいは皮膚下に導入される注射針を利用することができる。あるいは逆に肺か頬口内の投与のための吸入器を活用できる。
【００６２】
さらに、本発明によって提供されたＰインスリンオリゴマーは、非経口の投与のために当該の技術で認められたどんな他の手段によってでも実施されることができる。本発明のＰインスリンオリゴマーは同様に肺、鼻腔、舌下スペースあるいは頬粘膜への吸収のためにドライパウダーとしてあるいはエアゾールとして処方されることができる。
【００６３】
ブドウ糖をコントロールするために実施されるのＰインスリンオリゴマーの量は、多くの因子に左右される。それには、制限なしに、実施ルート、処方の効力、体重と年齢、糖尿病の型、実施ルートとそのルートによる生物学的利用、実施されたＰインスリンの生体内半減期、そして処方が含まれる。インスリンの生物学的利用は、特に鼻の、頬口内の、そして肺の療法を含む種々のルートを経由して減ぜられるらことが知られている。そして服用量は、医者あるいはこれらのルートにおいて訓練されたほかの医療従事者により、もっと多く調整されて、個々に調節される必要がある。継続的な投与が、インスリン服用量の調節することに当該の技術で熟練したいかなる医者によっても達成される。断続的な投与が、同様に当該の技術で熟練している者により達成される。そして薬服用時の合間にコントロールすることが必要とされる服用量を考慮に入れることができる。
【００６４】
本発明のインスリンとＰインスリンは、様々な認識されたタンパク質／ペプチド合成技術のいずれによってでも作られることができる。これらには、組み換えＤＮＡ方法、半合成の方法、固相あるいは溶液の方法と、特にアミノ酸あるいはリン酸アミノ酸をペプチドに取り入れること、インスリン類似物を作り出すことで知られている方法が含まれる（特許文献１８〜２０、非特許文献１２及び７）。これらの特許は、当該の技術で熟練した人に本発明のＰインスリンを調製することができるようにするべき十分な詳細を、種々のペプチド、アミノ酸、リン酸アミノ酸酸、インスリンあるいはインスリン類似物の調製について公開している。適切なキナーゼが、本発明の製品を生産するために、インスリンのリン酸化チロシン、セリン、そしてトレオニン残基にまた用いられることができる。
【００６５】
本発明によれば、ｐインスリンオリゴマーが、いろいろな吸入装置のいずれででも使われ、そして、以下に例示されるように、肺のインスリンの処方の調製のために当該の技術で知られている方法によって調製されることができる（特許文献２１〜４４）。上にリストされた出版物のそれぞれの公開全体は、参照によって明白にここに含まれる。
【００６６】
本発明の水溶液の処方はＨ４．０−８．０でＰインスリンを溶かすことによって調製されることができる。ｐＨ９．０以上で溶解が可能であるけれども、さらされるのは短くなくてはならない。あるいは起こることを知られているインスリンのアミノ酸加水分解を制限するために温度がに引き下げられなくてはならない。上記の条件にあったｐＨの範囲内で、溶解と調製は、限定なく、クエン酸塩、リン酸塩、酢酸塩、塩化ナトリウム、塩酸、リン酸、硫酸、トリスヒドロキシアミノメタンとグリセリンを含むいかなる生理的に受容できる有毒でない塩、等張化剤と緩衝液を用いることができる。
【００６７】
そうすることについての方法が当該の技術で熟練した人にとって明らかであるように、処方がヒトに等張にされることはたいへん好ましい。
【００６８】
処方への添加物の性質と濃度、同様の付加のオーダー薬剤濃度、ｐＨ、調整中の温度は処方のために最適化され、投与のルートも意図される。
【００６９】
用語「Ｐインスリン」は配列ＩＤＮｏ．１から６のすべてのリン酸化インスリンオリゴマーを意味する。
【００７０】
用語「フェノールの防腐剤」はｍ−クレゾール、フェノール、メチルパラベンのいずれも意味する。バイアル、カートリッジ、注射器あるいは処方への多数の接触及び／または多数の使用が要請される他の装置でこれらが使用される時本発明のインスリン処方の滅菌を維持するために、フェノールの防腐剤が必要とされる。そのような防腐剤は、吸入やエアロゾール装置での使用された例としてはカートリッジ、エンベロープ、ドライパウダーパッケージの様なシングルユーズでは必要ない。
【００７１】
用語「インスリン類似物」は、それぞれヒトインスリンのＡ鎖とＢ鎖として実質的に同じアミノ酸配列を持つＡ鎖とＢ鎖をもつタンパク質を意味する。しかし、インスリン類似物のインスリン活性を壊さない、１つかそれ以上のアミノ酸付加及び／又は一つかそれ以上のアミノ酸置換、一つかそれ以上のアミノ酸末端を持つことにより、ヒトインスリンのＡ鎖とＢ鎖とは異なる。
【００７２】
ここにある用語「治療すること」は、糖尿病または高血糖症を持つ患者の医療を意味する。そしてそのインスリン投与は、ブドウ糖を低下させる、高血糖症とその様なものからくる代謝の続発症の徴候を軽減する目的を示す。「治療する」ことは、良好な血糖を維持するまたは回復する、高血糖症を防ぐ、高血糖症を減ずる、そしてさもなければ糖尿病の合併症を防ぐ、あるいは改善する、減ずることを目的として、糖尿病患者に、固相あるいは液体形態どちらかで、本発明の服用量を投与することを含み示す。
【００７３】
次の試験例はさらに本発明を図解し、記述するためにのみ提供される。発明の範囲は次の例に制限されない。
【実施例】
【００７４】
試験例１
特許文献４５に記述された方法により調製されたインスリンは、Ｐインスリンオリゴマーのために適切なモノマー前駆体の後反応の組成物をを最適化するために、すべての亜鉛を取り除くために透析された。６０分間５０ｍＭのカリウムリン酸塩の最小スタートの濃度と超過のＰＯＣｌ3（３６０μＬ）を用いて、−２から＋２℃でリン酸化を行うと、溶解度限界に達した濃度のリン酸塩が得られる。これによりオリゴマーのリン酸インスリンの高い収率を産み出した。Ｚｏｒｂａｘ２５０カラムまたはＱセファロースを用いた同様のカラムで、１％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを添加した５０ｍＭアンモニウムリン酸塩バッファ（ｐＨ９．０）を用いて、サイズ排他クロマトグラフィにより、オリゴマーは分離された。図１ａ，２ａに示されるようなこの方法で、リン酸化インスリンのダイマー、トリマー、ヘキサマーが調製できる。インスリンモノマーの保持時間を比較のために図１ｂに示す。サンプルは、モル重量を決定するために適切なモル重量標準のＨＰＬＣ分析により、ひとまとめに扱われた。図１ｃに、比較として、特許文献４（ロッキード、ＷＤ）により、産生されたＰインスリンモノマーを示す。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動は、ＭＷ８，０００ＤａのＰインスリンモノマーと、インスリンオリゴマーの不在を示した。
【００７５】
試験例２
ヒトインスリン前駆体は、特許文献４６及び特許文献４７により調製され、特許文献７に記載される方法により、ヒトインスリンに変えられた。
【００７６】
−２から０℃でリン酸化は、６０分間の反応で５０ｍＭのカリウムリン酸塩の最小スタートの濃度と過剰のＰＯＣｌ3（３６０μＬ）を用いた。反応は５倍量の非イオン化された氷で急冷された。高い収率のオリゴマーのリン酸化インスリンが得られた。
【００７７】
オリゴマーは、Ｚｏｒｂａｘ２５０カラムで、１％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを添加した５０ｍＭアンモニウムリン酸塩バッファ（ｐＨ９．０）を用いて、サイズ排他クロマトグラフィにより分離された。この方法で、リン酸化インスリンのダイマー、トリマー、ヘキサマーが調製できた。
【００７８】
試験例３
Ｐインスリンオリゴマーの処方は次のように調製された。サイズ排他クロマトグラフィにより、上のように分離されたＰインスリンテトラマー４０ｍｇを、５０ｍモル塩化ナトリウム、１５ｍモルナトリウムリン酸塩９ｍＬに添加した。グリセリンは最終量において溶液を等張にするために加えられた。ｐＨは１Ｎ  ＮａＯＨおよび／または１ＮＨＣｌで７．４に調整された。Ｍ−クレゾール／フェノールを０．１２５％（最終量１０ミリリットルに基づいて）の等モル濃度になるように加えられた。量が１０ｍＬになるように作られ、そして無菌濾過し４℃で保存した。
【００７９】
試験例４
質量分光器
ＭＡＬＤＩとタンデムの質量分光器により、反応温度を０℃に保ったままではあるが、例１で調製されたＰインスリンに対して行われた。結果は図２Ａ−２Ｄに示される。等電点収束を用いる等電点確定により実証されるように、Ｐインスリンモノマー、ダイマー、トリマー、テトラマーそしてヘキサマーがそれぞ５つのリン酸基を含んでいた。Ａ＆Ｂ鎖を得るためのスルホン酸分解、次いでＭＡＬＤＩとタンデム質量分光器により、これらのオリゴマーのＸが配列ＳＥＱＩＤ  Ｎｏ．７（図２Ｂ−２Ｄ）であると識別した。
【００８０】
試験例５
非修飾ヒトインスリンまたは配列ＩＤ  Ｎｏ．７のヒトインスリンのＰインスリンオリゴマーを膵切除された糖尿病の犬に静脈注射した（図３）。図３ａに示されるように、非修飾のインスリンは血糖値において急激な低下、顕著な低血糖と作用の非常に短い存続期間（IVを与えられるとき、２０分）を表した。
【００８１】
顕著なコントラストで、Ｐインスリンのオリゴマー（図３ｂ）は、血糖値の低下はなくあるいは最小を示し（非常に高い服用量以外）、すべての服用量時において低血糖を示さず、非修飾のインスリンより１０倍長い作用を示した。
【００８２】
試験例６
配列ＩＤ  ＮＯ．８のヒトインスリンのＰインスリンオリゴマーをフィッシャー３４４ネズミ（ｎ＝３０）に静脈注射した。予想されるヒトの服用量の２，０００倍に至るまでの注射により、極めて高い服用量（およそ０．１５ミリグラム／ｋｇ体重）だけが低血糖を誘発した。そして、死亡あるいはけいれんは誘発しなかった。
【００８３】
試験例７
修飾インスリンあるいは３：１  Ｍ：Ｍ  プロタミン／インスリンと共に、配列ＩＤ  ＮＯ．８のＰインスリンオリゴマーを含んでいる例３の処方を、糖尿病の犬に静脈注射した。Ｐインスリンオリゴマーの長期のブドウ糖抑制を図４に示す。
【００８４】
試験例８
配列ＩＤ  Ｎｏ．７のＰインスリンオリゴマーがグルコースの取り込みを引き起こす可能性についてＬ６ネズミ筋細胞培養で試験した。Ｐインスリンオリゴマーは、ヒトインスリンのその半分のデオキシブドウ糖取り込みの最大の刺激を引き起こした。そしてネズミ筋肉細胞で全部の服用量の範囲に関して、服用量反応はフラットになった（図５）。
【００８５】
試験例９
肺のルートを経由して、６匹のスプラグ−ドーリーネズミ（ＢＷ２５０−３６０グラム）に、リン酸化インスリンオリゴマー（ヘキサマーの形態で）４ｍｇを投与した。ＰｅｎｎＣｅｎｔｕｒｙ  ｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌ  Ａｅｒｏｓｏｌｉｚｅｒ（Ｍｉｃｒｏｓｐｒａｙｅｒ）を使い気管内投与によって、動物たちは薬を服用させられる。服用量は１００μＬ／動物とした。
【００８６】
研究のための服用濃度は、等張化されリン酸緩衝液の標準的な生理食塩水、ｐＨ７．４に３０ｍｇ／ｍＬのリン酸化インスリンヘキサマーを希釈することにより調製した。
【００８７】
アチバメゾ−ル塩酸塩（１ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｋｇ）からなるアンチセダンカクテルと生理食塩水を、１ｍＬ／ｋｇを一回の服用量で静脈注射をすることにより投与し、服用工程が達成した。一連の１３の血液サンプル（およそ０．１ｍＬ／サンプル）が、服用後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０，１１，１２時間後にそれぞれ動物から集められた。
【００８８】
この目的で、それぞれのネズミ（麻酔をかけられていない）は頚静脈／尾静脈穿刺（あるいは必要であるとされる他の場所）で血を採取された。そしてＡｃｃｕ  Ｓｏｆｔ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ（商標：ブドウ糖計）法を用いて全血中ブドウ糖レベルを測定するためにサンプルは使われた。血漿リン酸化インスリンレベルのためのサンプルが同じく採取された。
【００８９】
肺の投与（図６）の後に、血中ブドウ糖レベルが２時間後穏やかに抑制されてきた。そして服用してから１１時間ベースラインを下回ったままであった。１２時間後までにブドウ糖レベルは服用前のレベルに戻った。
【００９０】
本発明の範囲と権限は付加された請求項で定義されているので、本発明の他の実施例と例は、当業者にとって容易に明白であるであろうと理解されるだろう。
【図１Ａ】
2009539778.tif 000014
【図１Ｂ】
2009539778.tif 000015
【図１Ｃ】
2009539778.tif 000016
【図２Ａ】
2009539778.tif 000017
【図２Ｂ】
2009539778.tif 000018
【図２Ｃ】
2009539778.tif 000019
【図２Ｄ】
2009539778.tif 000020
【図３Ａ】
2009539778.tif 000021
【図３Ｂ】
2009539778.tif 000022
【図４】
2009539778.tif 000023
【図５】
2009539778.tif 000024
【図６】
2009539778.tif 000025
【手続補正書】
【提出日】平成21年3月11日(2009.3.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
今から本発明の製造方法を、以下の添付の図面への参照と共に記述する。
【図１Ａ】９９／１の５０ｍＭのアンモニウムリン酸塩、ｐＨ９．０／アセトニトリル中でＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いたサイズ排除クロマトグラフィ。オリゴマー（テトラマー、ヘキサマーとオクタマ−）についての測定結果。
【図１Ｂ】９９／１の５０ｍＭのアンモニウムリン酸塩、ｐＨ９．０／アセトニトリル中でＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いたサイズ排除クロマトグラフィ。分子量標準についての測定結果。
【図１Ｃ】特許文献４に従って生産されたリン酸化インスリンのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動。分子量６０００ｄａのリン酸化インスリンモノマーのみを示す。
【図２Ａ】Ｐインスリンオリゴマーの質量分光法。２ａ．ＰインスリンオリゴマーのＭＡＬＤＩ−ＭＳ。ＭＡＬＤＩ−ＭＳの間に、高級オリゴマーが切断されて、ｐインスリンモノマー（５８０８ｄａ）、ダイマー（１１，６１６）そして トリマー（１７，４２４ｄａ）が発生する。
【図２Ｂ】Ｐインスリンは還元、アルキル化され 、ジスルフィド結合を壊し、Ａ鎖とＢ鎖とが切り離された。ＭＡＬＤＩ−ＭＳでＡ鎖とＢ鎖両方の質量が観察された。そして結果からＡ鎖中に２つのリン酸サイトが、そしてＢ鎖に４つのリン酸サイトがあることを明らかにした。ＭＳ／ＭＳによりＳｅｒ９とＴｙｒｌ６に対してリン酸化サイトをＡ鎖に位置づけした。
【図２Ｃ】残存リン酸化サイトを位置づけするために、還元し、アルキル化されたＰインスリンをトリプシンで一晩消化させた。結果として断片をスライド＃１５−１７に示した。２つのリン酸化サイトがインスリンＢ鎖のＴｙｒ２６とＴｈｒ２７で決定された。
【図３】膵切除された糖尿病のビーグル犬へのヒトインスリンとＰインスリンの静脈注射。Ａ．ヒトインスリンが示す血中濃度の急激な低下。１５分で低血糖、注射後短い血清半減期で急激な血糖症の回復を示している。Ｂ．種々の服用量においてのＰインスリンオリゴマー。作用の延長された存続期間（長い血清半減期）、すべての服用量においての高血糖症なく標準的なブドウ糖の維持を示す。基本の８倍の服用量あるいは「ブドウ糖を維持する服用量」に達成するまで低血糖は観察されなかった。
【図４】糖尿病のビーグル犬へのヒトインスリンとＰインスリンオリゴマーの皮下注射。修飾されていないインスリンと比較して、作用の存続期間が延長されたことを示す。
【図５】Ｌ６ネズミの筋細胞においてヒト＆ブタ＆Ｐインスリンオリゴマーの服用量反応カーブ。細胞は各実験でそれぞのインスリンのさまざまな濃度で６０分間培養された。２−デオキシグルコースの摂取がそれから測られた。Ｐインスリンオリゴマーが調査されたすべての濃度において服用量反応が平らになったことを示さなかった。驚くべきことにＰインスリンオリゴマーは、ブタあるいはヒトインスリンより著しく低い最大の反応を示した。
【図６】リン酸化インスリンヘキサマーの４０ｍｇのスプラグ−ドーリーネズミのブドウ糖反応。ネズミにはＯｈに注射され、ブドウ糖レベルが１２ｈ測定された。示されるように、ブドウ糖レベルは服用後２ｈまで下がり、そして服用後１１ｈまで抑えられ、その後にがベースラインあるいは服用前のレベルに戻った。
【国際調査報告】
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