(57)【要約】本明細書は、黄体形成ホルモン/絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、および甲状腺刺激ホルモンの受容体の、アゴニストおよびアンタゴニストを含む、ホルモン受容体の小分子調節物質を開示する。開示される例示的な化合物としては、表記式のものが挙げられ、式中、Xは-S(O)nR5であり；nは0、1、または2であり；Yは-OR6または-NR7R8であり；R1およびR2は、置換されてもよい低級脂肪族、アルコキシ、アラルキル、ハロゲン、H、および-OR5から独立して選択され、ここで、R5は低級アルキル、H、アラルキル、アシル、アルコキシカルボニル、およびアミノカルボニルから選択され；R3およびR4はアシル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アラルキル、H、低級アルキル、およびシクロアルキルから独立して選択され；R5は低級アルキル、アラルキル、シクロアルキル、およびハロアルキルから選択され；R6はH、低級アルキル、およびアラルキルから選択され；R7およびR8はH、低級アルキル、アラルキル、およびシクロアルキルから独立して選択される。2009537551.tif 000038
2009537551.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式による化合物：
2009537551.tif 000030
式中、Xは-S(O)nR5であり；
nは0、1、または2であり；
Yは-OR6または-NR7R8であり；
R1およびR2は、置換されてもよい低級脂肪族、アルコキシ、アラルキル、ハロゲン、H、および-OR5から独立して選択され、ここでR5は低級アルキル、H、アラルキル、アシル、アルコキシカルボニル、およびアミノカルボニルから選択され；
R3およびR4はアシル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アラルキル、H、低級アルキル、およびシクロアルキルから独立して選択され；
R5は低級アルキル、アラルキル、シクロアルキル、およびハロアルキルから選択され；
R6はH、低級アルキル、およびアラルキルから選択され；
R7およびR8はH、低級アルキル、アラルキル、およびシクロアルキルから独立して選択され；
ただし、R1がメトキシである場合、R2はHではない。
【請求項２】
下記式による、請求項1記載の化合物：
2009537551.tif 000031
。
【請求項３】
下記式による、請求項1記載の化合物：
2009537551.tif 000032
。
【請求項４】
R7が立体的にかさ高いアルキル基である、請求項3記載の化合物。
【請求項５】
下記式による、請求項1記載の化合物：
2009537551.tif 000033
式中、R9はアシル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アラルキル、H、低級アルキル、およびシクロアルキルから選択される。
【請求項６】
R9が低級アルキルである、請求項5記載の化合物。
【請求項７】
下記式による、請求項5記載の化合物：
2009537551.tif 000034
。
【請求項８】
下記式による、請求項5記載の化合物：
2009537551.tif 000035
。
【請求項９】
以下を含む薬学的組成物：
薬学的に許容される担体、佐剤、または媒体；および
下記式を有するOrg 41841以外の化合物、または任意の薬学的に許容されるその塩
2009537551.tif 000036
式中、Xは-S(O)nR5であり、
nは0、1、または2であり、
Yは-OR6または-NR7R8であり、
R1およびR2は、置換されてもよい低級脂肪族、アルコキシ、アラルキル、ハロゲン、H、および-OR5から独立して選択され、ここでR5は低級アルキル、H、アラルキル、アシル、アルコキシカルボニル、およびアミノカルボニルから選択され、
R3およびR4はアシル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アラルキル、H、低級アルキル、およびシクロアルキルから独立して選択され、
R5は低級アルキル、アラルキル、シクロアルキル、およびハロアルキルから選択され、
R6はH、低級アルキル、およびアラルキルから選択され、かつ
R7およびR8はH、低級アルキル、アラルキル、およびシクロアルキルから独立して選択される。
【請求項１０】
化合物が甲状腺ホルモン受容体の選択的アンタゴニストである、請求項9記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
甲状腺障害を有する被験者を提供する段階および請求項1記載の化合物の有効量を該被験者に投与する段階を含む、甲状腺障害を処置する方法。
【請求項１２】
甲状腺障害が甲状腺機能亢進障害である、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
甲状腺機能亢進障害がバセドウ病である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
化合物が甲状腺刺激ホルモン受容体アンタゴニストである、請求項12記載の方法。
【請求項１５】
化合物が下記式を有する、請求項14記載の方法：
2009537551.tif 000037
。
【請求項１６】
甲状腺障害が甲状腺機能低下障害である、請求項11記載の方法。
【請求項１７】
化合物が卵胞刺激ホルモン受容体よりも甲状腺刺激ホルモン受容体を選択的に結合する、請求項11記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2006年5月17日付で出願された米国特許仮出願第60/801,370号の先の出願日の恩典を主張する。
【０００２】
分野
本開示はホルモン受容体調節化合物およびその使用の方法に関係する。
【背景技術】
【０００３】
背景
黄体形成ホルモン/絨毛性ゴナドトロピン(LH/CG)、卵胞刺激ホルモン(FSH)、および甲状腺刺激ホルモン(TSH)は、生殖および甲状腺の恒常性を調節するヘテロ二量体糖タンパク質ホルモンである。LHは女性では排卵誘発に関与しており、男性ではテストステロン産生を制御している。FSHは女性では卵胞成熟を引き起こし、男性では精子形成に関与している。TSHは、甲状腺卵胞細胞の増殖および機能に関与している。全三つの糖タンパク質ホルモンに対する細胞応答は、異なる7回膜貫通受容体、例えば、LHCG受容体、FSH受容体、およびTSH受容体を介して媒介される。各受容体は、大きな糖タンパク質ホルモンの認識および結合に関与するいくつかのロイシンリッチモチーフによって識別される伸長した細胞外ドメインにより特徴付けられる。各受容体の7回膜貫通ヘリックスは、その高度な相同性のゆえに注目に値する。
【０００４】
多様な病因性突然変異によるLHCG受容体、FSH受容体、およびTSH受容体の生理的調節の乱れがいくつかのヒト疾患に関与している。これらの多機能性受容体の特異的かつ強力な制御は、重要な治療上の進歩をもたらしうる。LHおよびFSHは、現在、不妊症の処置に臨床的に使用されている。組換えTSHは甲状腺癌の診断スクリーニングに使用されている。TSH受容体のアゴニストおよびアンタゴニストは、それぞれ、甲状腺癌の診断および処置において有用性がある可能性がある。LHCG受容体およびFSH受容体の小分子調節物質の開発も、さまざまな成功の度合いで進められている。
【発明の開示】
【０００５】
概要
本明細書において開示されるのは、黄体形成ホルモン受容体、卵胞刺激ホルモン受容体、および甲状腺刺激ホルモン受容体の、アゴニストおよびアンタゴニストを含む、ホルモン受容体の調節物質である。そのようなホルモン受容体調節物質の例としては、下記式のものが挙げられる：
2009537551.tif 000003
式中、Xは-S(O)nR5であり；
nは0、1、または2であり；
Yは-OR6または-NR7R8であり；
R1およびR2は、置換されてもよい低級脂肪族、アルコキシ、アラルキル、ハロゲン、H、および-OR5から独立して選択され、ここでR5は低級アルキル、H、アラルキル、アシル、アルコキシカルボニル、およびアミノカルボニルから選択され；
R3およびR4はアシル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アラルキル、H、低級アルキル、およびシクロアルキルから独立して選択され；
R5は低級アルキル、アラルキル、シクロアルキル、およびハロアルキルから選択され；
R6はH、低級アルキル、およびアラルキルから選択され；かつ
R7およびR8はH、低級アルキル、アラルキル、およびシクロアルキルから独立して選択される。
【０００６】
本発明の上述のおよび他の目的、特徴、および利点は、添付の図面を参照して進められる以下の詳細な説明からさらに明らかにされる。
【０００７】
詳細な説明
I. 序論
本明細書において開示されるのは、7回膜貫通受容体などのようなホルモン受容体を調節するのに使用できる小分子化合物である。そのような受容体の7回膜貫通ヘリックスは高度な相同性を示すので、任意の特定の理論に限定するものではないが、開示される化合物は多くのそのような化合物を調節するのに有用であると現在のところ考えられる。特に興味深いのは、生殖および甲状腺の恒常性を調節するヘテロ二量体糖タンパク質ホルモンである黄体形成ホルモン/絨毛性ゴナドトロピン(LH/CG)、卵胞刺激ホルモン(FSH)、および甲状腺刺激ホルモン(TSH)に対する7回膜貫通受容体の調節である。
【０００８】
TSH受容体は甲状腺の機能を調節し、いくつかの疾患において重要である。現在のところ、組換えヒトTSH (rhTSH, Thyrogen(商標))は、甲状腺癌を有する患者の処置において使用されるTSH受容体の活性化物質(アゴニスト)である。甲状腺機能亢進症(「過剰に活動する甲状腺」)を有する患者では、甲状腺がTSH受容体を介して腫瘍の内部(「中毒性腺腫」)でまたは抗体(自己免疫甲状腺機能亢進症もしくはバセドウ病)によって過度に刺激される。アンタゴニスト(逆アゴニスト)は過度に刺激を受けた甲状腺を阻害し、これらの形態の甲状腺機能亢進症を処置するのに使用することができる。本明細書において開示されるのは、TSH受容体に結合し、かつ、rhTSHのようにTSH受容体を活性化するか、またはTSH受容体を下方制御するかのいずれかの低分子量化合物である。例示的な化合物は、開示される化合物の活性によって、TSH受容体を活性化する方法または下方制御する方法において使用されてもよい。それゆえ、TSH受容体を活性化する化合物は受容体アゴニストとして使用することができ、TSH受容体の作用を阻害する化合物はアンタゴニストとして使用することができる。
【０００９】
用語および方法の以下の説明は、本発明の化合物、組成物、および方法をより良く記述するために、ならびに本発明の開示の実践において当業者を導くために供与される。本開示において使用される専門用語は、特定の態様および例のみを記述するためにあり、限定が意図されないこともまた理解されるべきである。
【００１０】
本明細書において用いられる場合、「一つの(a)」、「一つの(an)」、および「その(the)」という単数の用語は、文脈上明らかに他の指定のない限り、複数の指示対象を含む。同じように、「または(or)」という単語は、文脈上明らかに他の指定のない限り、「および(and)」を含むよう意図される。同様に、本明細書において用いられる場合、「含む(comprise)」という用語は「含む(include)」を意味する。それゆえ「AまたはBを含む(comprising A or B)」とは、A、B、またはAおよびBを含む(including A, B, or A and B)ことを意味する。
【００１１】
本開示の全体を通して使用されるR1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、n、X、およびYなどのような変数は、明記されていない限り、先に定義したのと同じ変数である。
【００１２】
「任意の」または「任意で」とは、その後に記述されている事象または状況が行われてもよいが行われる必要はないこと、ならびにこの記述が、該事象または状況が行われる場合およびそれが行われない場合を含むことを意味する。
【００１３】
「誘導体」とは、親化合物から誘導されるまたは理論上誘導できる、化合物または化合物の一部分をいう。
【００１４】
「被験者」という用語は、ヒト被験者も獣医学的被験体もともに含む。
【００１５】
「処置」とは、疾患または病的状態が発現し始めた後にその兆候または症候を改善する治療的介入をいう。本明細書において用いられる場合、疾患または病的状態に関連して「改善する」という用語は、処置による観測可能な任意の有益な効果をいう。有益な効果は、例えば、影響を受けやすい被験者における疾患の臨床症状の発症の遅延、疾患の一部もしくは全部の臨床症状の重症度の低減、疾患の緩徐な進行、被験者の全般的な健康もしくは快適性の改善により、または特定の疾患に特異的な、当技術分野において周知の他のパラメータにより、証明することができる。「疾患を処置する」という語句は、例えば、ホルモン受容体介在性の障害、具体的には甲状腺障害、例えば甲状腺機能亢進障害または甲状腺機能低下障害などのような疾患の危険性がある被験者において、疾患または状態の完全な発現を阻害することをいう。「予防的」処置は、病状を発現する危険性を減らす目的で、疾患の兆候を示していないまたは初期兆候しか示していない被験者に施される処置である。「同時投与する」という用語は、少なくとも二つの化合物のそれぞれを、生物学的活性の各期間が重複する時間枠の間に投与することを意味する。すなわち、この用語は二つまたはそれ以上の薬剤化合物の同一の広がりを持つ(coextensive)投与のみでなく連続の投与も含む。
【００１６】
「薬学的に許容される塩」または「薬理学的に許容される塩」という用語は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、リンゴ酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、コハク酸、マレイン酸、サリチル酸、安息香酸、フェニル酢酸、マンデル酸などを含むがこれらに限定されない無機酸および有機酸の塩基性塩を含む、従来の手段によって調製される塩をいう。本明細書において開示される化合物がカルボキシ基などのような酸性官能基を含む場合、カルボキシ基に適した薬学的に許容される陽イオン対は、当業者に周知であり、アルカリ、アルカリ土類、アンモニウム、第四級アンモニウム陽イオンなどを含む。そのような塩は当業者に公知である。「薬学的に許容される塩」のさらなる例については、Berge et al., J. Pharm. Sci. 66:1 (1977)を参照されたい。
【００１７】
「飽和または不飽和」とは、水素で飽和した置換基、水素で完全に飽和していない置換基、および水素で部分的に飽和した置換基を含む。
【００１８】
「アシル」という用語は、Rが有機基である式RC(O)-の基をいう。
【００１９】
「アルキル」という用語は、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、t-ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、デシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシルなどのような、1〜24個の炭素原子の分枝または非分枝飽和炭化水素基をいう。「低級アルキル」基は、1〜10個の炭素原子を有する飽和分枝または非分枝炭化水素である。
【００２０】
「アルケニル」という用語は、2〜24個の炭素原子および少なくとも一つの炭素-炭素二重結合を含む構造式の炭化水素基をいう。
【００２１】
「アルキニル」という用語は、2〜24個の炭素原子および少なくとも一つの炭素-炭素三重結合を含む構造式の炭化水素基をいう。
【００２２】
「ハロゲン化アルキル」または「ハロアルキル基」という用語は、これらの基に存在する一つまたは複数の水素原子がハロゲン(F、Cl、Br、I)で置換された、上記に定義のアルキル基をいう。
【００２３】
「シクロアルキル」という用語は、少なくとも三つの炭素原子から構成される非芳香族炭素系環をいう。シクロアルキル基の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。「ヘテロシクロアルキル基」という用語は、環の炭素原子の少なくとも一つが、限定されるものではないが、窒素、酸素、硫黄、またはリンなどのようなヘテロ原子で置換されている、上記に定義のシクロアルキル基である。
【００２４】
「脂肪族」という用語は、上記のアルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン化アルキル、およびシクロアルキル基を含むと定義される。「低級脂肪族」基は、1〜10個の炭素原子を有する分枝または非分枝脂肪族基である。
【００２５】
「アルコキシカルボニル」とは、Rが、置換されてもよいアルキル、アリール、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、または類似の部分を表す、アルコキシ置換カルボニル基である-C(O)ORをいう。
【００２６】
「アミノカルボニル」とは、単独でまたは組み合わせで、アミノ基が、例えばアルキル、アリール、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アラルコキシカルボニルなどで一置換または二置換されてもよい、アミノ置換カルボニル(カルバモイル)基を意味する。
【００２７】
「アリール」という用語は、ベンゼン、ナフタレンなどを含むが、これらに限定されない、任意の炭素系芳香族基をいう。「芳香族」という用語は同様に、芳香族基の環内に組み込まれた少なくとも一つのヘテロ原子を有する芳香族基と定義される「ヘテロアリール基」を含む。ヘテロ原子の例としては、窒素、酸素、硫黄、およびリンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。アリール基は、アルキル、アルキニル、アルケニル、アリール、ハロゲン化物、ニトロ、アミノ、エステル、ケトン、アルデヒド、ヒドロキシ、カルボン酸、もしくはアルコキシを含むがこれらに限定されない一つもしくは複数の基で置換されてもよく、またはアリール基は非置換であってもよい。「アルキルアミノ」という用語は、少なくとも一つの水素原子がアミノ基で置き換えられた、上記に定義のアルキル基をいう。
【００２８】
「カルボニル」とは、式-C(O)-の基をいう。カルボニル含有基は、アシル基、アミド、カルボキシ基、エステル、尿素、カルバメート、カルボネート、ならびにケトンおよびアルデヒド、例えばRが脂肪族、ヘテロ脂肪族、アルキル、ヘテロアルキル、ヒドロキシル、または第二級、第三級、もしくは第四級アミンである-CORまたは-RCHOに基づく置換基を含む、炭素-酸素二重結合(C=O)を含有する任意の置換基を含む。
【００２９】
「カルボキシル」とは、-COOH基をいう。置換カルボキシルとは、Rが脂肪族、ヘテロ脂肪族、アルキル、ヘテロアルキル、またはカルボン酸、もしくはエステルである-COORをいう。
【００３０】
「ヒドロキシル」という用語は、式-OHによって示される。「アルコキシ基」という用語は、Rが上記のアルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、シクロアルキル、ハロゲン化アルキル、またはヘテロシクロアルキル基で置換されてもよいアルキル基でありうる式-ORによって示される。
【００３１】
「ヒドロキシ脂肪酸」という用語は、ヒドロキシル基で置換された少なくとも一つの水素原子を有するアルキル基をいう「ヒドロキシアルキル」をいう。「アルコキシアルキル基」という用語は、上記のアルコキシ基で置換された少なくとも一つの水素原子を有するアルキル基と定義される。
【００３２】
「アミン」または「アミノ」という用語は、RおよびR'が独立して、水素または上記のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、シクロアルキル、ハロゲン化アルキル、もしくはヘテロシクロアルキル基でありうる式-NRR'の基をいう。
【００３３】
「アミド基」という用語は、RおよびR'が独立して、水素、上記のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、シクロアルキル、ハロゲン化アルキル、またはヘテロシクロアルキル基でありうる式-C(O)NRR'によって示される。
【００３４】
「アラルキル」という用語は、アリール基に付着された、上記に定義の、アルキル基を有するアリール基をいう。アラルキル基の一例はベンジル基である。
【００３５】
「置換されてもよいアルキル」のような、置換されてもよい基は、置換される場合、アルコキシ、置換されてもよいアルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、アミノアシル、アミノアシルオキシ、アリール、カルボキシアルキル、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいシクロアルケニル、ハロゲン、置換されてもよいヘテロアリール、置換されてもよいヘテロシクリル、ヒドロキシ、スルホニル、チオール、およびチオアルコキシから選択される、1〜5個の置換基、典型的には1、2、または3個の置換基を有するアルキル基などの基をいう。具体的には、置換されてもよいアルキル基は、例証として、非限定的にトリフルオロメチル基を含む、フルオロアルキル基などのようなハロアルキル基を含む。
【００３６】
開示されるホルモン調節化合物のプロドラッグも、本明細書において企図される。プロドラッグは、被験者へのプロドラッグの投与後、加水分解、代謝などのようなインビボの生理的作用を通じて活性な化合物に化学的に修飾される活性なまたは不活性な化合物である。プロドラッグの作出および使用に関わる適合性および技術は、当業者により周知である。エステルを含むプロドラッグの一般的考察については、Svensson and Tunek Drug Metabolism Reviews 165 (1988)およびBundgaard Design of Prodrugs, Elsevier (1985)を参照されたい。
【００３７】
薬学的に許容されるプロドラッグとは、被験者において代謝され、例えば、加水分解または酸化されて、本開示の抗ウイルス化合物を形成する化合物をいう。プロドラッグの典型例としては、活性な化合物の官能部分に一つまたは複数の生物学的に不安定な保護基を有しているまたはその部分を別のやり方で遮断している化合物が挙げられる。プロドラッグは、酸化され、還元され、アミノ化され、脱アミノ化され、ヒドロキシル化され、脱ヒドロキシル化され、加水分解され、脱加水分解され(dehydrolyzed)、アルキル化され、脱アルキル化され、アシル化され、脱アシル化され、リン酸化され、脱リン酸化されて、活性な化合物を生じうる化合物を含む。概して、本明細書において開示されるプロドラッグ化合物は、ホルモン受容体調節活性を保有し、および/またはインビボで代謝されるかもしくは別のやり方で処理されて、そのような活性を示す化合物を形成する。
【００３８】
「プロドラッグ」という用語は同様に、プロドラッグが被験者に投与されるとインビボにおいて本発明の活性な親薬物を放出する任意の共有結合した担体を含むよう意図される。プロドラッグは活性な医薬品に比べて、溶解性および生体利用性などの特性が増強していることが多いので、本明細書において開示される化合物はプロドラッグの形態で送達することができる。したがって、同様に企図されるのは、請求の範囲に記載されている化合物のプロドラッグ、プロドラッグを送達する方法、およびこのようなプロドラッグを含有する組成物である。開示される化合物のプロドラッグは典型的には、修飾が日常的な操作またはインビボのいずれかで切断されて親化合物を生じるなどの、化合物に存在する一つまたは複数の官能基を修飾することによって調製される。プロドラッグは、インビボで切断されて、対応するアミノ基および/またはホスホン酸基をそれぞれ生じる任意の基で官能化されたホスホン酸基および/またはアミノ基を有する化合物を含む。プロドラッグの例としては非限定的に、アシル化アミノ基および/またはホスホン酸エステル基もしくはホスホン酸アミド基を有する化合物が挙げられる。特定の例では、プロドラッグは、ホスホン酸イソプロピルエステルなどのようなホスホン酸低級アルキルエステルである。
【００３９】
開示される化合物の保護誘導体も企図される。開示される化合物において用いるのに適したさまざまな保護基は、Greene and Wuts Protective Groups in Organic Synthesis; 3rd Ed.; John Wiley & Sons, New York, 1999に開示されている。
【００４０】
一般に、保護基は、分子の残存部分に影響を与えない条件の下で除去される。これらの方法は当技術分野において周知であり、酸加水分解、水素化分解などを含む。一つの好ましい方法は、遊離ホスホン酸をもたらすTMS-Br媒介性のエステル切断でなどのようなルイス酸性条件を用いたホスホン酸エステルの切断などの、エステルの除去を含む。第二の好ましい方法は、アルコール、酢酸などまたはその混合物などの適当な溶媒系における炭素上のパラジウムを利用した水素化分解によるベンジル基の除去などの、保護基の除去を含む。t-ブトキシカルボニル保護基を含む、t-ブトキシに基づく基は、水、ジオキサン、および/または塩化メチレンなどの適当な溶媒系の中で、HClまたはトリフルオロ酢酸などの無機酸または有機酸を利用して除去することができる。アミノおよびヒドロキシ官能アミノ(hydroxy functions amino)を保護するのに適した、別の例示的な保護基はトリチルである。他の従来型の保護基は公知であり、当業者はGreene and Wuts Protective Groups in Organic Synthesis; 3rd Ed.; John Wiley & Sons, New York, 1999を参照して適当な保護基を選択することができる。アミンが脱保護される場合、得られる塩は容易に中和されて、遊離アミンを生じることができる。同様に、ホスホン酸部分などの酸部分が暴露される場合、化合物は酸化合物としてまたはその塩として単離することができる。
【００４１】
本開示のホルモン受容体調節化合物の特定の例では、一つまたは複数の不斉中心を含み；すなわちこれらの化合物は異なる立体異性体の形態で存在することができる。したがって、化合物および組成物は、個々の純粋な鏡像異性体としてまたはラセミ混合物を含む立体異性混合物として、供与されうる。ある種の態様において、本明細書において開示される化合物は、90%の鏡像体過剰率、95%の鏡像体過剰率、97%の鏡像体過剰率、または場合により99%よりも高い鏡像体過剰率で、例えば高光学純度の形態などの、実質的に高光学純度の形態で合成されるか、またはその形態であるよう精製される。
【００４２】
当業者は、本明細書において記述する化合物の置換基および置換パターンを選択して、化学的に安定な、かつ当技術分野において公知の技術およびさらに本開示に記載の方法により容易に合成できる化合物を供与できることが理解される。以下、本発明の好ましい化合物について詳細に言及する。
【００４３】
II. ホルモン受容体調節化合物
開示されるホルモン受容体調節化合物のある種の態様は、下記式によって示される：
2009537551.tif 000004
式中、Xは-S(O)nR5であり；
nは0、1、または2であり；
Yは-OR6または-NR7R8であり；
R1およびR2は、置換されてもよい低級脂肪族、アルコキシ、アラルキル、ハロゲン、水素、および-OR5から独立して選択され、ここでR5は低級アルキル、水素、アラルキル、アシル、アルコキシカルボニル、およびアミノカルボニルから選択され；
R3およびR4はアシル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アラルキル、水素、低級アルキル、およびシクロアルキルから独立して選択され；
R5は低級アルキル、アラルキル、シクロアルキル、およびハロアルキルから選択され；
R6は水素、低級アルキル、およびアラルキルから選択され；かつ
R7およびR8は水素、低級アルキル、アラルキル、およびシクロアルキルから独立して選択される。
【００４４】
一つの局面において、そのような化合物は下記式を有する：
2009537551.tif 000005
式中、Xは-S(O)nR5であり；
nは0、1、または2であり；
Yは-OR6または-NR7R8であり；
R1およびR2は、置換されてもよい低級脂肪族、アルコキシ、アラルキル、ハロゲン、H、および-OR5から独立して選択され、ここでR5は低級アルキル、H、アラルキル、アシル、アルコキシカルボニル、およびアミノカルボニルから選択され；
R3およびR4はアシル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アラルキル、H、低級アルキル、およびシクロアルキルから独立して選択され；
R5は低級アルキル、アラルキル、シクロアルキル、およびハロアルキルから選択され；
R6はH、低級アルキル、およびアラルキルから選択され；
R7およびR8はH、低級アルキル、アラルキル、およびシクロアルキルから独立して選択され；
ただし、R1がメトキシである場合、R2はHではない。
【００４５】
開示されるホルモン受容体調節化合物のある種の態様において、Yは、Yが結合するカルボニル部分と一緒に、アミド基を形成する。そのような化合物は下記式によって示すことができる。
2009537551.tif 000006
【００４６】
開示されるある種の化合物において、R7およびR8は水素、低級アルキル、アラルキル、およびシクロアルキルから独立して選択される。そのような化合物のある種の例において、R7およびR8の少なくとも一方が水素である。特定の態様において、R7およびR8の少なくとも一方が立体的にかさ高い置換基である。そのような立体的にかさ高い置換基は、有機化学の当業者に公知であり、非限定的に、tert-ブチル、イソ-ブチル、ネオペンチル、アダマンチルなどのようなアルキル基を含む。
【００４７】
ある種の態様において、開示される化合物は下記式によって示される：
2009537551.tif 000007
式中、R9はアシル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アラルキル、H、低級アルキル、およびシクロアルキルから選択される。上記の式に関して、そのような化合物は単一の異性体として、またあるいはE異性体およびZ異性体の混合物として供与されてもよい。TSH受容体の特に有効なアンタゴニストであると考えられるE化合物は、下記式によって示すことができる。
2009537551.tif 000008
【００４８】
表1を参照して、開示される例示的な化合物をLibert et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989, 165, 1250-1255)により；およびSchulz et al. (Mol. Endocrinol. 1999, 13, 181-190)により既報のように、HEK 293 EM細胞で安定的に発現されたヒトTSH受容体およびヒトLHCG受容体に対して評価した。TSH受容体およびLHCG受容体の細胞表面での発現をFACS分析によって測定した(Kleinau, G.; Jaschke, H.; Neumann, S.; Lattig, S.; Paschke, R.; Krause, G. J. Biol. Chem. 2004, 279, 51590-51600)。化合物3〜20の受容体活性化作用は、細胞内の環状AMP蓄積の測定によって判定した。開示されるホルモン受容体調節化合物のある種の態様は、有利な受容体選択性を示す。例えば、ある種の化合物は、本明細書において開示されるある種の化合物と、FSH受容体に何の影響も及ぼさずに、選択的に相互作用する。
【００４９】
(表1) HEK EM 293細胞において安定的に発現されたTSHRおよびLHCGRにおける選択されたホルモン受容体調節化合物の薬理学的特性
2009537551.tif 000009
化合物のアゴニスト活性を、細胞内の環状AMPの測定によって判定した。有効性(最大反応)をLHCGRまたはTSHRの、それぞれ、LH (1000 ng/ml)またはTSH (100 mU/ml)に対する最大反応の%として表す。GraphPad Prism 4.0ソフトウェアを用いて、EC50値および95%信頼区間(C.I.)を用量反応曲線(0〜100 μMの化合物)から得た。
信頼区間は、明らかなプラトーに達しなかった用量反応曲線では計算されなかった。
n.d. = 測定されていない
＊ 100 μMの化合物での推定最大反応
＊＊ 推定EC50 (用量反応曲線はプラトーを示さなかった)
【００５０】
明細書および特許請求の範囲には「...および...からなる群より選択される」ならびに「...または...からなる群より選択される」という言い回し(マーカッシュ群といわれることもある)を用いた種の列挙が含まれる。この言い回しが本出願において使用される場合、特に指定のない限り、その群を全体として、その任意の単一の成員、またはその任意の下位群を含むことが意図される。この言い回しの使用は単に簡便にする目的のためであり、個々の要素または下位群の除去を必要に応じて制限することは決して意図されない。
【００５１】
N-tert-ブチル-5-アミノ-4-(4-((E)-ブト-1-エニル)フェニル)-2-(メチルチオ)チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボキサミドを含む薬学的組成物は、例えば、TSH受容体活性化を阻害するのに特に有用である。例えば、この化合物はバセドウ病血清由来の抗体(IgG)によりTSH受容体の活性化を阻害することが実証されている。
【００５２】
III. 合成
スキーム1を参照して、開示されるホルモン受容体調節化合物の合成は、van Boeckelおよび共同研究者により報告されているものと同様の方法で達成した(van Straten, N. C. R. Schoonus-Gerritsma, G. G.; van Someren, R. G.; Draaijer, J.; Adang, A. E. P.; Timmers, C. M.; Hanseen, R. G. J. M.; van Boeckel, C. A. A. Chem. Bio. Chem. 2002, 10, 1023)。引き続きスキーム1を参照して、改変したビギネリ縮合(段階i)により、置換ピリミドン骨格を得た。
スキーム1
2009537551.tif 000010
a試薬および条件： (i) K2CO3、EtOH、60℃、5時間；(ii) POCl3、ジオキサン、還流、2時間；(iii) NaOEt、EtOH、50℃ 3時間；(iv) LiOH、ジオキサン/H2O；(v) PyBop、DIPEA、DMF、その後アミンの添加を行った(その後のベンジルの脱保護は類似体19の合成に必要とされた)。
【００５３】
高度に電子吸引性(すなわち、ポリフルオロおよびニトロ)ならびに電子リッチ(ポリメトキシおよびヒドロキシル)の芳香環系を含む、多数のアルデヒドがこの系の範囲内で許容された。POCl3による処理により4-クロロ-置換ピリミジンが定量的収率で得られ、エチル-2-メルカプトアセテートまたはtert-ブチル-2-メルカプトアセテートのいずれかとの置換により、生化学的に関連する化合物4および5を含む、いくつかのチエノピリミジンが得られた。ジオキサン/水混合物中の水酸化リチウムでのエチルエステルのけん化により、チエノピリミジン酸(thienopyrimidine acid)が得られ、いくつかのアミンとのPyBOP触媒アミドカップリングによりOrg 41841 (3)および化合物6〜19が得られた。
【００５４】
初期のドッキング実験から、TSH受容体およびLHCG受容体の両方の膜貫通ヘリックス3における3とE3.37のアミン官能基間の潜在的な水素結合が示唆された。これを精査するため、本発明者らは二つの異なる実験手段を介してこの潜在的な相互作用を取り除くことを選択した。操作上の要点として小分子を用い、芳香族アミンの除去またはジメチル化を介した芳香族アミンの保護によって、H-結合供与の可能性の排除を達成するものであった。残念ながら、Org 41841構造からアミノ基を取り去るという全ての試みは失敗した。しかしながら、塩基性アセトニトリル中でのヨウ化メチルを用いた直接的処理によって、モノメチル化類似体および付随するジメチルアミン-メチルアミド付加とともにジメチルアミン化合物(20)が得られた。20の生物学的評価の前にHPLCを介した精製を行った。
【００５５】
IV. 開示される化合物の組成物、投与、および使用
開示される別の局面は、被験者への投与のために調製され、かつ本開示の化合物の一つまたは複数の治療的にまたは診断的に有効な量を含んだ薬学的組成物を含む。開示される化合物の治療的に有効な量は、投与経路、被験者の種、および処置されるまたは評価される被験者の身体的特徴に依ると考えられる。考慮されうる特定の要因は、疾病の重症度および段階、体重、食事制限、ならびに併用薬物(concurrent medication)を含む。開示される化合物の治療的または分光的に有効な量の判定に対するこれらの要因の関係を、当業者は理解している。しかしながら、一般に、検討にふさわしい用量は、インビトロの試験で認められる効力の相違を考慮しながら、類似のホルモン受容体のアゴニストおよびアンタゴニストの範囲内に、一般的には1用量につき被験者の体重1キログラムあたり約0.1〜400 mg、例えば2.5 mg/kg/用量、3.0 mg/kg/用量、3.5 mg/kg/用量などのような0.5 mg/kg/用量きざみの約0.1 mg〜約250 mg/kg/用量の範囲内、典型的には1用量につき体重1キログラムあたり0.5〜50 mgの範囲内、および最も一般的には1用量につき体重1キログラムあたり1〜300 mgの範囲内にあると考えられる。本開示の化合物の投与に的確な投与量および投与計画は、求められる治療効果(例えば、甲状腺調節、不妊症処置、避妊)に依存し、特定の化合物および化合物が投与される個々の被験者によって変化しうる。所望の用量は、1回の用量として、または1日を通して適切な間隔で投与される複数回の部分用量として、あるいは、女性レシピエントの場合、月経周期を通して適切な日周の間隔で投与される用量として供与することができる。投与量および投与計画は女性レシピエントと男性レシピエントの間で異なることがある。インビトロ受精の用途などのような、インビトロまたはエクスビボの用途の場合、本発明の化合物はおよそ0.01〜5 μg/mLの濃度にてインキュベーション培地中で使用されるべきである。
【００５６】
被験者への投与のための薬学的組成物は、選択された分子に加えて、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤、界面活性剤などを含むことができる。薬学的組成物は抗菌剤、抗炎症剤、麻酔剤などのような一つまたは複数の活性成分を含むこともできる。薬学的処方物は、担体などのようなさらなる成分を含むことができる。これらの処方物に有用な薬学的に許容される担体は慣用されている。E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th Edition (1995)によるRemington's Pharmaceutical Sciencesには、開示される化合物の薬学的送達に適した組成物および処方物が記述されている。
【００５７】
一般に、担体の性質は、利用される特定の投与方法に依ると考えられる。例えば、非経口処方物は、通常、媒体として、水、生理食塩水、平衡塩溶液、水性デキストロース、グリセロールなどのような薬学的および生理学的に許容される流体を含む注射可能な流体を含有する。固体組成物(例えば、粉末、丸剤、錠剤、またはカプセル形態)の場合、慣用的な非毒性の固体担体は、例えば、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを含むことができる。生物学的に中性の担体に加えて、投与される薬学的組成物は湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびpH緩衝剤などのような非毒性の補助物質、例えば酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを少量含有することができる。経口投与に適した薬学的組成物は丸剤、錠剤、もしくはカプセルなどのような個別の投与量単位として、または粉末もしくは顆粒として、または溶液もしくは懸濁液として供与することができる。活性成分はボーラスまたはペーストとして供与することもできる。組成物は直腸投与のために坐薬または浣腸剤にさらに加工されてもよい。
【００５８】
非経口投与の場合、適当な組成物は水性および非水性の無菌注射液を含む。組成物は単位用量または複数用量の容器、例えば密閉バイアルおよびアンプル中で供与され、使用の前に、例えば水などのような無菌の液体担体の添加しか要しない凍結乾燥された状態で保存されうる。
【００５９】
鼻孔吸入による投与に適した組成物または処方物は、定量加圧式エアロゾルまたは噴霧器によって生成されうる微細な粉塵または霧を含む。
【００６０】
開示される化合物は同様に、活性材料のコアからなり、放出速度調節膜で包まれた移植可能な薬学的装置の形態で投与することもできる。そのようなインプラントは皮下または局所に適用されるべきであり、例えば数週間から数年間の比較的広い期間にわたりほぼ一定の速度で活性成分を放出する。移植可能な薬学的装置それ自体の調製の方法は、例えば欧州特許第0,303,306号(AKZO N.V.)に記述されているように、当技術分野において公知である。
【００６１】
開示されるホルモン受容体調節物質は、それを必要とする任意の被験者に投与することができる。被験者を処置するのに適した化合物は、一つには、処置される状態に基づき選択することができる。例えば、ある種の化合物はTSH受容体アンタゴニストである。そのようなアンタゴニスト化合物は、バセドウ病などのような甲状腺機能亢進障害を処置するために使用することができる。
【００６２】
卵胞刺激ホルモンは、現在、不妊症を処置するために臨床的に使用されている。開示されるFSH受容体アゴニストは、不妊症治療薬として卵胞刺激ホルモンに代えて使用することができる。同様に、黄体形成ホルモン(LH)受容体を活性化する活性を有する本明細書において開示される化合物を、不妊症調節療法において使用することができる。例えば、本明細書において開示されるある種のLH受容体活性化化合物は、天然の黄体形成ホルモンと同じ臨床目的のために使用することができ、開示される化合物は優れた安定性の特性を示し、したがって違った形で投与できるという利点を有する。このように、開示されるLHCG受容体およびFSH受容体の低分子量リガンドの例は、不妊症処置または経口避妊用の治療薬として使用することができる。LHCG受容体に対するOrganon社のリード化合物であるOrg41841 (N-tert-ブチル-5-アミノ-4-(3-メトキシフェニル)-2-(メチルチオ)チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボキサミド)のインビボでの有効性が排卵誘発モデルにおいて実証され、本明細書において開示される合成リガンドの薬理学的有用性が支持されたことは注目に値するものである(van Straten, N. C., Schoonus-Gerritsma, G. G., van Someren, R. G., Draaijer, J., Adang, A. E., Timmers, C. M., Hanssen, R. G., およびvan Boeckel, C. A. (2002) Chembiochem. 3, 1023-1026)。同様に、TSH受容体の低分子量アンタゴニストはTSH受容体介在性の甲状腺機能亢進の処置における治療用途を有し、アゴニストは甲状腺癌の診断スクリーニングにおいて注射される組換えヒトTSH (rhTSH, Thyrogen(商標))を代替する可能性がある。
【００６３】
実施例
以下の例は、限定するものではなく例証であることが意図される。
【００６４】
一般的な方法
1H NMRデータはVarian Gemini 300 MHzに記録した。スペクトルはd6-DMSO、d4-CD3OD、およびD2O中で記録し、それぞれ、2.50、3.31、および4.79 ppmの残留溶媒ピークを参照した。逆相(C18) HPLCはZorbax (商標) SP-C18半分取カラムとともにAgilent HPLCを用いて行った。高分解能質量分析測定はMicromass/Waters LCT Premier Electrospray TOF質量分析計にて行った。
【００６５】
一般的な合成手順
以下の一般的な手順は、異なるがしかし類似する構造を有する化合物を合成するために使用した。当業者は所望の変換を達成するのに必要なら、これらの一般的な手順をいかに修正するかを認識すると考えられる。
【００６６】
5-カルボニトリル-1,6-ジヒドロ-2-(メチルチオ)-6-オキソ-4-(置換フェニル)ピリミジン
5-メチルイソチオ尿素(1当量)、適切に置換したベンズアルデヒド(2当量)およびシアン酢酸エチル(2当量)のエタノール溶液にK2CO3 (2当量)を加えた。反応混合物を5時間60℃に加熱し、冷却後にろ過して生成物を得た。フラッシュクロマトグラフィー(1:1のEtOAc:ヘキサンを用いた)精製により、収率30〜50%でオフホワイト色の固形物として最終生成物を得た。
【００６７】
5-カルボニトリル-4-クロロ-2-(メチルチオ)-6-(3-置換フェニル)ピリミジン
オキソピリミジンのジオキサン混合物にジオキサン中のPOCl3 (過剰)を加えた。反応物を3時間加熱還流し、溶媒を減圧によって除去した。得られた褐色の固形物に飽和NaHCO3を加え、反応混合物をCH2Cl2 (3×100 mL)で抽出した。有機層を合わせ、Na2SO4で乾燥し、溶媒を減圧下で除去した。シリカプラグろ過(1:1のEtOAc:ヘキサンを用いた)精製により、収率80〜90%で白色の結晶性固形物として最終生成物を得た。
【００６８】
エチル-5-アミノ-2-(メチルチオ)-4-(置換フェニル)チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボキシレート
適切なピリミジン(1当量)およびエチル-2-メルカプトアセテート-または-tert-ブチル-2-メルカプトアセテート(1.1当量)のエタノール溶液にエタノール中のナトリウム(0.910当量)を加えた。黄色の反応混合物を3時間50℃に加熱し、冷却し、エタノールを減圧下で除去した。黄色の固形物をCH2Cl2 (50 mL)に溶解し、DI水(3×25 mL)で洗浄し、有機層をNa2SO4で乾燥し、溶媒を減圧下で除去した。フラッシュクロマトグラフィー(1:1のEtOAc:ヘキサンを用いた)精製により、収率70〜90%で黄色の固形物として最終生成物を得た。
【００６９】
N-tert-ブチル-5-アミノ-2-(メチルチオ)-4-(置換フェニル)チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボキサミド
ジオキサンおよび水混合液中の適切なエチルエステル(1当量)の溶液に水酸化リチウム(2当量)を加えた。反応混合物を3時間50℃に加熱し、冷却し、溶媒を減圧下で除去した。この粗酸をそれ以上精製せずに使用した。黄色の固形物を最少量のDMFに溶解し、引き続きそれぞれPyBOP (3当量)、DIPEA (5.5当量)、およびtert-ブチルアミン(3当量)の添加を行った。フラッシュクロマトグラフィー(2:1のEtOAc:ヘキサンを用いた)精製により、収率50〜90%で黄色の固形物として最終生成物を得た。
【００７０】
以下の例は、開示されるホルモン受容体調節化合物ならびにその中間体および類似体の精製および特徴付けについて記述する。
【００７１】
N-tert-ブチル-5-アミノ-4-(3-メトキシフェニル)-2-(メチルチオ)チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボキサミド(3)
漸増量のCH3CNを含むH2Oの直線勾配を用いたC8逆相LCMS分析(流速1 mL/分で0 → 17分、30%〜70% CH3CN、tR 13.5分)から、ピーク積分によって純度が99%よりも高いと分かった。
2009537551.tif 000011
【００７２】
エチル-5-アミノ-4-(3-メトキシフェニル)-2-(メチルチオ)チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボキシレート(4)
漸増量のCH3CNを含むH2Oの直線勾配を用いたC8逆相LCMS分析(流速1 mL/分で0 → 15分、30% → 90% CH3CN、tR 12.5分)から、ピーク積分によって純度が92%よりも高いと分かった。
2009537551.tif 000012
【００７３】
tert-ブチル-5-アミノ-4-(3-メトキシフェニル)-2-(メチルチオ)チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボキシレート(5)
漸増量のCH3CNを含むH2Oの直線勾配を用いたC8逆相LCMS分析(流速1 mL/分で0 → 15分、30% → 90% CH3CN、tR 13.2分)から、ピーク積分によって純度が98%よりも高いと分かった。
2009537551.tif 000013
【００７４】
5-アミノ-N-(エチル)-4-(3-メトキシフェニル)-2-(メチルチオ)チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボキサミド(6)
漸増量のCH3CNを含むH2Oの直線勾配を用いたC8逆相LCMS分析(流速1 mL/分で0 → 18分、40% → 80% CH3CN、tR 9.8分)から、ピーク積分によって純度が99%よりも高いと分かった。
2009537551.tif 000014
【００７５】
N-tert-ブチル-5-アミノ-4-(3-メトキシフェニル)-N-メチル-2-(メチルチオ)チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボキサミド(7)
漸増量のCH3CNを含むH2Oの直線勾配を用いたC8逆相LCMS分析(流速1 mL/分で0 → 18分、40% → 80% CH3CN、tR 14.6分)から、ピーク積分によって純度が95%よりも高いと分かった。
2009537551.tif 000015
【００７６】
5-アミノ-4-(3-メトキシフェニル)-2-(メチルチオ)チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボヒドラジド(8)
漸増量のCH3CNを含むH2Oの直線勾配を用いたC8逆相LCMS分析(流速1 mL/分で0 → 18分、40% → 80% CH3CN、tR 13.7分)から、ピーク積分によって純度が92%よりも高いと分かった。
2009537551.tif 000016
【００７７】
5-アミノ-4-(3-メトキシフェニル)-N',N'-ジメチル-2-(メチルチオ)チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボヒドラジド(9)
漸増量のCH3CNを含むH2O中0.1%のTFAの直線勾配を用いたC8逆相LCMS分析(流速1 mL/分で0 → 18分、30% → 80% CH3CN、tR 8.7分)から、ピーク積分によって純度が93%よりも高いと分かった。
2009537551.tif 000017
【００７８】
N'-tert-ブチル-5-アミノ-4-(3-メトキシフェニル)-2-(メチルチオ)チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボヒドラジド(10)
漸増量のCH3CNを含むH2Oの直線勾配を用いたC8逆相LCMS分析(流速1 mL/分で0 → 10分、25% → 90% CH3CN、10 → 15分、90% → 25% CH3CN、tR 12.0分)から、ピーク積分によって純度が95%よりも高いと分かった。
2009537551.tif 000018
【００７９】
N'-Boc-5-アミノ-4-(3-メトキシフェニル)-2-(メチルチオ)チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボヒドラジド(11)
漸増量のCH3CNを含むH2Oの直線勾配を用いたC8逆相LCMS分析(流速1 mL/分で0 → 10分、25% → 90% CH3CN、10 → 15分、90% → 25% CH3CN、tR 11.0分)から、ピーク積分によって純度が97%よりも高いと分かった。
2009537551.tif 000019
【００８０】
5-アミノ-4-(3-メトキシフェニル)-N-(2-ヒドロキシエチル)-2-(メチルチオ)チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボキサミド(12)
漸増量のCH3CNを含むH2Oの直線勾配を用いたC8逆相LCMS分析(流速1 mL/分で0 → 18分、30% → 60% CH3CN、tR 7.4分)から、ピーク積分によって純度が92%よりも高いと分かった。
2009537551.tif 000020
【００８１】
5-アミノ-N-(シアノメチル)-4-(3-メトキシフェニル)-2-(メチルチオ)チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボキサミド(13)
漸増量のCH3CNを含むH2Oの直線勾配を用いたC8逆相LCMS分析(流速1 mL/分で0 → 10分、25% → 90% CH3CN、10 → 15分、90% → 25% CH3CN、tR 10.5分)から、ピーク積分によって純度が91%よりも高いと分かった。
2009537551.tif 000021
【００８２】
5-アミノ-N-ベンジル-4-(3-メトキシフェニル)-2-(メチルチオ)チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボキサミド(14)
漸増量のCH3CNを含むH2Oの直線勾配を用いたC8逆相LCMS分析(流速1 mL/分で0 → 18分、40% → 80% CH3CN、tR 12.6分)から、ピーク積分によって純度が99%よりも高いと分かった。
2009537551.tif 000022
【００８３】
5-アミノ-4-(3-メトキシフェニル)-2-(メチルチオ)-N-フェネチルチエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボキサミド(15)
漸増量のCH3CNを含むH2Oの直線勾配を用いたC8逆相LCMS分析(流速1 mL/分で0 → 18分、40% → 80% CH3CN、tR 14.7分)から、ピーク積分によって純度が98%よりも高いと分かった。
2009537551.tif 000023
【００８４】
N-tert-ブチル-5-アミノ-4-(2,3-ジメトキシフェニル)-2-(メチルチオ)チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボキサミド(16)
漸増量のCH3CNを含むH2Oの直線勾配を用いたC8逆相LCMS分析(流速1 mL/分で0 → 16分、35% → 95% CH3CN、tR 14.3分)から、ピーク積分によって純度が93%よりも高いと分かった。
2009537551.tif 000024
【００８５】
N-tert-ブチル-5-アミノ-4-(2-フルオロ-3-メトキシフェニル)-2-(メチルチオ)チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボキサミド(17)
漸増量のCH3CNを含むH2Oの直線勾配を用いたC8逆相LCMS分析(流速1 mL/分で0 → 15分、35% → 90% CH3CN、tR 11.0分)から、ピーク積分によって純度が92%よりも高いと分かった。
2009537551.tif 000025
【００８６】
N-tert-ブチル-5-アミノ-4-(3-フルオロフェニル)-2-(メチルチオ)チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボキサミド(18)
漸増量のCH3CNを含むH2Oの直線勾配を用いたC8逆相LCMS分析(流速1 mL/分で0 → 15分、45% → 90% CH3CN、tR 11.4分)から、ピーク積分によって純度が92%よりも高いと分かった。
2009537551.tif 000026
【００８７】
N-tert-ブチル-5-アミノ-4-(3-ヒドロキシフェニル)-2-(メチルチオ)チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボキサミド(19)
漸増量のCH3CNを含むH2Oの直線勾配を用いたC8逆相LCMS分析(流速1 mL/分で0 → 10分、25% → 90% CH3CN、tR 10.1分)から、ピーク積分によって純度が92%よりも高いと分かった。
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【００８８】
N-tert-ブチル-5-(-ジメチルアミノ)-4-(3-メトキシフェニル)-2-(メチルチオ)チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボキサミド(20)
漸増量のCH3CNを含むH2Oの直線勾配を用いたC8逆相LCMS分析(流速1 mL/分で0 → 5分、50% → 90% CH3CN、5 → 15分、90% CH3CN、tR 7.4分)から、ピーク積分によって純度が93%よりも高いと分かった。
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【００８９】
構造および純度の確認
上記に掲載した化合物の構造的性質および純度を以下のように確認した。
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（a）漸増量のCH3CNを含有するH2Oの直線勾配(0〜5分、50%〜95% CH3CNの直線勾配；5〜14.9分、95% CH3CNで維持する勾配)。
（b）漸増量のCH3CNを含有するH2Oの直線勾配(0〜7分、30%〜80% CH3CNの直線勾配；7〜8分、80%〜90% CH3CN；8〜13分、90%で維持する勾配；13〜14分、直線勾配90%〜30% CH3CN；14〜15分、30% CH3CNで維持する勾配)。
【００９０】
組織培養およびcAMPアッセイ法
細胞を5% CO2加湿培養器内での1 mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX) (SIGMA)およびウシTSH (1.8 μM) (SIGMA)もしくはヒトLH (1000 ng/ml) (Dr. A. Parlow, NIDDK National Hormone and Pituitary Program)または化合物3〜19 (0〜100 μM)含有の無血清DMEM中1時間のインキュベーションの前に24ウェルプレート中で48時間培養した。化合物とのインキュベーション後の培地の吸引に続き、cAMP Biotrak Enzymeimmunoassay (EIA) System (Amersham Biosciences)の溶解用緩衝液1を用いて細胞を溶解した。製造元のプロトコルを用いて細胞溶解物のcAMP含有量を測定した。小分子調節物質による受容体活性化の有効性をLHCG受容体またはTSH受容体の、それぞれ、LHまたはTSHに対する最大反応の%として表す。Windows用のGraphPad Prism 4でのデータ分析により、効力(EC50)を用量反応曲線(0〜100 μMの化合物)から得た。図1を参照し、細胞内cAMP産生を100 μMの各化合物に応じて測定し、TSHR/LHCGRのTSH (100 mU/ml)/LH (1000 ng/ml)に対する最大反応の%として表す。それぞれを二つ組で行った、二回の独立した実験の平均±SEMとしてデータを示す。
【００９１】
細胞表面での発現を測定するため、トランスフェクション後48時間細胞を培養し、PBS中の1 mM EDTA/1 mM EGTAを用いて回収し、Falcon 2058試験管に移した。細胞を0.1% BSAおよび0.1% NaN3 (結合用緩衝液)含有のPBSで一回洗浄し、結合用緩衝液中200分の1希釈のマウス抗ヒトTSH受容体抗体(Serotec)とともに1時間インキュベートし、二回洗浄し、結合用緩衝液中200分の1希釈のAlexa Fluor 488-標識ヤギ抗マウスIgGのF(ab')2断片(Molecular Probes)とともに暗所中1時間インキュベートした。FACS分析(FACS Calibur, BD Biosciences)の前に、細胞を二回洗浄し、1%パラホルムアルデヒドで固定した。受容体発現を蛍光強度によって推定し、トランスフェクション効率を蛍光細胞の割合から推定した。
【００９２】
開示される発明の原理を適用できる多くの可能な態様を考慮すれば、例証する態様は本発明の単に好ましい例にすぎず、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではないと認識されたい。むしろ、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって定義される。本発明者らはそれゆえ、これらの特許請求の範囲および趣旨に入る全てのものを本発明者らの発明として主張する。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】TSH受容体およびLHCG受容体の両方における化合物3および20の分析を示し、化合物3および20による受容体およびLHCG受容体の活性化を、両受容体の基礎活性に対して比較している。
【図２】TSH受容体およびLHCG受容体における化合物3、5、および7の全濃度分析を示し、それぞれ二つ組で行った二回の独立した実験の平均±SEMとしてデータを表している。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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