(57)【要約】本明細書において多種多様な疾患および障害、例えば、加齢もしくはストレスに関連する疾患もしくは障害、糖尿病、肥満、神経変性疾患、心血管疾患、血液凝固障害、炎症、癌、眼の障害および／または紅潮ならびにミトコンドリア活性の増大から利益を受ける疾患または障害を処置および／または予防するためのＣｄｃ２様キナーゼ（Ｃｌｋ）モジュレータの使用方法を提供される。また、Ｃｌｋモジュレート化合物を別の治療用薬剤との組合せで含む組成物を提供する。
2009521408.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核生物細胞の生存を促進させるための方法であって、該細胞を、少なくとも１種類のＣＬＫ阻害化合物またはその薬学的に許容され得る塩もしくはプロドラッグと接触させることを含む、方法。
【請求項２】
前記ＣＬＫ阻害化合物が前記細胞の寿命を増大させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＣＬＫ阻害化合物がストレスに抵抗する前記細胞の能力を増大させる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ストレスが、熱ショック、浸透圧ストレス、ＤＮＡ損傷、不充分な塩レベル、不充分な窒素レベルまたは不充分な栄養レベルの１つ以上である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＣＬＫ阻害化合物が、前記細胞に対する栄養制限の効果を模倣する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記真核生物細胞が哺乳動物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
被験体において、細胞死または加齢と関連する疾患または障害を処置または予防するための方法であって、該方法は、治療有効量の少なくとも１種類のＣＬＫ阻害化合物またはその薬学的に許容され得る塩もしくはプロドラッグを、処置または予防を必要とする被験体に投与することを含む、方法。
【請求項８】
前記加齢関連疾患が、脳卒中、心血管疾患、関節炎、高血圧またはアルツハイマー病である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
被験体において、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、糖尿病もしくはその合併症を処置もしくは予防するため、またはインスリン感受性を増大させるための方法であって、該方法は、治療有効量の少なくとも１種類のＣＬＫ阻害化合物またはその薬学的に許容され得る塩もしくはプロドラッグを、それを必要とする被験体に投与することを含む、方法。
【請求項１０】
治療有効量の少なくとも１種類のＣＬＫ阻害化合物またはその薬学的に許容され得る塩もしくはプロドラッグを、それを必要とする被験体に投与することを含む、被験体の減量のため、または被験体において体重増加を予防するための方法。
【請求項１１】
前記被験体が、ＣＬＫ阻害化合物の非存在下で体重減少をもたらすのに充分な程度まで、カロリー消費も低下させず、活動性も高めず、それらの組合せも行わない、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前脂肪細胞の分化を防止するための方法であって、該前脂肪細胞を、少なくとも１種類のＣＬＫ阻害化合物またはその薬学的に許容され得る塩もしくはプロドラッグと接触させることを含む、方法。
【請求項１３】
被験体に、治療有効量の少なくとも１種類のＣＬＫ阻害化合物またはその薬学的に許容され得る塩もしくはプロドラッグを投与することを含む、被験体の寿命を延ばすための方法。
【請求項１４】
治療有効量の少なくとも１種類のＣＬＫ阻害化合物またはその薬学的に許容され得る塩もしくはプロドラッグを、それを必要とする被験体に投与することを含む、被験体において神経変性障害を処置または予防するための方法。
【請求項１５】
前記神経変性障害が、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；ルー・ゲーリグ病）、びまん性レヴィー小体病、舞踏病有棘赤血球増加症、原発性側索硬化症、多発性硬化症（ＭＳ）およびフリートライヒ運動失調からなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
治療有効量の少なくとも１種類のＣＬＫ阻害化合物またはその薬学的に許容され得る塩もしくはプロドラッグを、それを必要とする被験体に投与することを含む、被験体において血液凝固障害を処置または予防するための方法。
【請求項１７】
前記血液凝固障害が、血栓塞栓症、深部静脈血栓症、肺塞栓症、脳卒中、心筋梗塞、流産、アンチトロンビンＩＩＩの欠損と関連している栓友病、プロテインＣの欠損、プロテインＳの欠損、活性型プロテインＣに対する抵抗性、異常フィブリノゲン血症、フィブリン溶解性障害、ホモシスチン尿症、妊娠、炎症性障害、骨髄増殖性障害、動脈硬化、アンギナ、播種性血管内凝固症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、癌転移、鎌状赤血球症、糸球体腎炎、薬剤誘発性血小板減少症、および治療的血餅溶解または血管形成術もしくは手術などの手順中またはその後の再閉塞からなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
治療有効量の少なくとも１種類のＣＬＫ阻害化合物またはその薬学的に許容され得る塩もしくはプロドラッグを、それを必要とする被験体に投与することを含む、眼の疾患または障害を処置または予防するための方法。
【請求項１９】
前記眼の疾患または障害が、視力障害、緑内障、視神経炎、黄斑変性または前部虚血性視神経障害からなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記視力障害が、視神経または中枢神経系（ｓｙｔｅｍ）に対する損傷によって引き起こされる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記損傷が、高眼圧、前記視神経の腫脹または虚血によって引き起こされる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２２】
前記視力障害が網膜の損傷によって引き起こされる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記損傷が、網膜への血流の妨害または斑の破壊によって引き起こされる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
治療有効量の少なくとも１種類のＣＬＫ阻害化合物またはその薬学的に許容され得る塩もしくはプロドラッグを、それを必要とする被験体に投与することを含む、化学療法剤誘発型神経障害を処置または予防するための方法。
【請求項２５】
前記化学療法剤が、ビンカアルカロイドまたはシスプラチンを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
治療有効量の少なくとも１種類のＣＬＫ阻害化合物またはその薬学的に許容され得る塩もしくはプロドラッグを、それを必要とする被験体に投与することを含む、虚血性の事象または疾患に関連する神経障害を処置または予防するための方法。
【請求項２７】
前記虚血性の事象が、脳卒中、冠性心疾患（鬱血性心不全または心筋梗塞を含む）、脳卒中、気腫、出血性ショック、不整脈（例えば、心房性細動）、末梢血管疾患または移植関連損傷である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
治療有効量の少なくとも１種類のＣＬＫ阻害化合物またはその薬学的に許容され得る塩もしくはプロドラッグを、それを必要とする被験体に投与することを含む、ポリグルタミン病を処置または予防するための方法。
【請求項２９】
前記ポリグルタミン病が、脊髄延髄筋萎縮（ケネディ病）、ハンチントン病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ハウリバー症候群）、脊髄小脳性運動失調症１型、脊髄小脳性運動失調症２型、脊髄小脳性運失調３型（マチャド−ジョセフ病）、脊髄小脳性運動失調症６型、脊髄小脳性運動失調症７型、または脊髄小脳性運動失調症型１７である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
さらに、治療有効量のＨＤＡＣ  Ｉ／ＩＩ阻害剤を投与することを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
被験体において、治療有効量の少なくとも１種類のＣＬＫ阻害化合物またはその薬学的に許容され得る塩もしくはプロドラッグを、それを必要とする被験体に投与することを含む、ミトコンドリア活性の増大から利益を受ける疾患または障害の処置方法。
【請求項３２】
さらに、前記被験体に、ビタミン、補因子または抗酸化剤の１種類以上を投与することを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
さらに、前記被験体に、コエンザイムＱ１０、Ｌ−カルニチン、チアミン、リボフラビン、ナイアシンアミド、葉酸塩、ビタミンＥ、セレン、リポ酸またはプレドニゾンの１種類以上を投与することを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
さらに、前記被験体に、前記疾患または障害の症状を緩和する１種類以上の薬剤を投与することを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記薬剤が、発作、神経障害性疼痛または心機能不全を緩和する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記障害が、ミトコンドリア活性を低下させる医薬用薬剤の投与と関連している、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記医薬用薬剤が、逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、またはジヒドロオロト酸デヒトロゲナーゼの阻害剤（ＤＨＯＤ）である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
治療有効量の少なくとも１種類のＣＬＫ阻害化合物またはその薬学的に許容され得る塩もしくはプロドラッグを、それを必要とする被験体に投与することを含む、運動能力もしくは筋持久力の増強、疲労低減、または疲労からの回復の増進のための方法。
【請求項３９】
前記被験体が運動選手である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記疲労が化学療法剤の投与と関連している、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
治療有効量の少なくとも１種類のＣＬＫ阻害化合物またはその薬学的に許容され得る塩もしくはプロドラッグを、それを必要とする被験体に投与することを含む、運動能力または筋持久力が低下した状態を処置または予防するための方法。
【請求項４２】
前記状態が、筋ジストロフィー、神経筋障害、マッカードル病、重症筋無力症、筋肉損傷、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、または加齢性筋肉減弱症である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
治療有効量の少なくとも１種類のＣＬＫ阻害化合物またはその薬学的に許容され得る塩もしくはプロドラッグを、それを必要とする被験体に投与することを含む、低酸素症または虚血と関連している筋肉組織の損傷を処置または予防するための方法。
【請求項４４】
治療有効量の少なくとも１種類のＣＬＫ阻害化合物またはその薬学的に許容され得る塩もしくはプロドラッグを、それを必要とする被験体に投与することを含む、被験体において筋肉ＡＴＰレベルを増加させるための方法。
【請求項４５】
前記方法が、選択的、非正常、異常または望ましくないスプライシングと関連する疾患または障害を処置または予防することに関与するものではない、請求項１〜４４いずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記方法が、以下の疾患または障害：β−サラセミア、ＦＴＤＰ−１７、ＮＦ２、ＦＲＡＳＩＥＲ、ウィルムス腫、乳癌、卵巣癌、腎臓癌、肺癌、尿路上皮癌、胃癌、甲状腺乳頭癌、ＨＮＳＣＣ、浸潤性乳癌、骨巨細胞腫、前立腺癌、黒色腫、リンパ腫、口腔癌、咽頭癌、早老症、神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、脊髄小脳性運動失調症、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）ならびに癲癇、進行性核上性麻痺、およびピック病の１つ以上を処置または予防することに関与するものではない、請求項１〜４５いずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
さらに、前記被験体に少なくとも１種類のサーチュイン活性化化合物を投与することを含む、請求項１〜４４いずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記サーチュイン活性化化合物が、レスベラトロール、ブテイン、フィセチン、ピセアタンノール、ケルセチンおよびニコチンアミドリボシドからなる群より選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＣＬＫ阻害化合物がＴＧ０００３である、請求項１〜４８いずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＣＬＫ阻害化合物がサーチュインタンパク質および／またはＰＧＣ−１αのＣＬＫ関連リン酸化を低減させる、請求項１〜４９いずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＣＬＫ阻害化合物が、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマーまたは抗体である、請求項１〜４４いずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＣＬＫ阻害化合物が少なくとも１種類のヒトＣＬＫタンパク質の阻害剤である、請求項１〜４４いずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記ヒトＣＬＫタンパク質が、ｈＣＬＫ１、ｈＣＬＫ２、ｈＣＬＫ３および／またはｈＣＬＫ４の１種類以上である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ヒトＣＬＫタンパク質がｈＣＬＫ２である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
（ｉ）治療有効量の少なくとも１種類のＣＬＫ活性化化合物またはその薬学的に許容され得る塩もしくはプロドラッグ、あるいは（ｉｉ）ＣＬＫタンパク質の過剰発現を促進するポリヌクレオチドを、それを必要とする被験体に投与することを含む、被験体において癌を処置または予防するための方法。
【請求項５６】
さらに、前記被験体に化学療法剤を投与することを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
（ｉ）治療有効量の少なくとも１種類のＣＬＫ活性化化合物またはその薬学的に許容され得る塩もしくはプロドラッグ、あるいは（ｉｉ）ＣＬＫタンパク質の過剰発現を促進するポリヌクレオチドを、それを必要とする被験体に投与することを含む、被験体において体重増加を刺激するための方法。
【請求項５８】
細胞の放射線感受性または化学的感受性を増大させるための方法であって、該方法は、
（ｉ）該細胞を少なくとも１種類のＣＬＫ活性化化合物またはその薬学的に許容され得る塩もしくはプロドラッグと接触させる工程、あるいは
（ｉｉ）該細胞内に、ＣＬＫタンパク質の過剰発現を促進するポリヌクレオチドを導入する工程を含む、方法。
【請求項５９】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記化合物が、サーチュインタンパク質および／またはＰＧＣ−１αのＣＬＫ関連リン酸化を促進する、請求項５５〜５９いずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記ポリヌクレオチドが、ＣＬＫタンパク質またはその生物学的に活性な断片をコードする核酸配列を含む発現ベクターである、請求項５５〜５９いずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記発現ベクターが、哺乳動物のＣＬＫタンパク質またはその生物学的に活性な断片をコードする核酸配列を含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記発現ベクターが、ヒトＣＬＫタンパク質またはその生物学的に活性な断片をコードする核酸配列を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記発現ベクターが、ｈＣＬＫ１、ｈＣＬＫ２、ｈＣＬＫ３もしくはｈＣＬＫ４、または前述のもののいずれかの生物学的に活性な断片をコードする核酸配列を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記ＣＬＫ活性化化合物が、少なくとも１種類のヒトＣＬＫタンパク質のアクチベータである、請求項５５〜５９いずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記ヒトＣＬＫタンパク質が、ｈＣＬＫ１、ｈＣＬＫ２、ｈＣＬＫ３および／またはｈＣＬＫ４の１種類以上である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記ヒトＣＬＫタンパク質がｈＣＬＫ２である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
さらに、前記被験体に、少なくとも１種類のサーチュイン阻害化合物を投与することを含む、請求項５５〜６８いずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記サーチュイン阻害化合物が、ニコチンアミド、サーチノールおよびスプリトミシンからなる群より選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
少なくとも１種類のＣＬＫ阻害化合物および少なくとも１種類のサーチュイン活性化化合物を含む組成物。
【請求項７１】
前記ＣＬＫ阻害化合物がＴＧ００３である、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７２】
前記サーチュイン活性化化合物が、レスベラトロール、ブテイン、フィセチン、ピセアタンノール、ケルセチンおよびニコチンアミドリボシドからなる群より選択される、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７３】
少なくとも１種類のＣＬＫ活性化化合物および少なくとも１種類のサーチュイン阻害化合物を含む組成物。
【請求項７４】
前記サーチュイン阻害化合物が、ニコチンアミド、サーチノールおよびスプリトミシンからなる群より選択される、請求項７３に記載の組成物。
【請求項７５】
さらに、薬学的に許容され得る担体を含む請求項７０〜７４いずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、２００５年１２月２日に出願された、米国仮特許出願第６０／７４１，７８２号の利益を主張し、この出願はその全体が本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
（米国政府資金提供）
本発明は、米国立衛生研究所により与えられた助成金交付番号Ｒ０１−ＤＫ０６９９６６で、米国政府資金提供によりなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
細胞のシグナル伝達は、細胞外刺激が細胞内部に中継され、続いて、多様な細胞内プロセスが調節される基本的な機構である。シグナル伝達の重要な生化学的機構の一例は、タンパク質の可逆的リン酸化を伴うものである。ポリペプチドのリン酸化によって、その構造および機能が改変されることにより、成熟タンパク質の活性が調節される。リン酸基は、ほとんどの場合、タンパク質のセリン、トレオニンまたはチロシンアミノ酸のヒドロキシル部分（−ＯＨ）上に存在する。細胞内エフェクターのリン酸化を媒介する酵素は、２つの類型に分類される。プロテインホスファターゼは、ホスホリルタンパク質基質由来のリン酸基部分を加水分解し、一方、プロテインキナーゼは、リン酸基部分をアデノシン三リン酸からタンパク質基質に転移させる。プロテインキナーゼとプロテインホスファターゼの逆の機能は、均衡しており、シグナル伝達プロセスにおけるシグナルのフローを調節する。
【０００４】
プロテインキナーゼおよびプロテインホスファターゼは、典型的には、受容体型および非受容体型２つの群のタンパク質に分けられる。受容体プロテインキナーゼは、細胞外ドメイン、膜貫通（ｓｐａｎｎｉｎｇ）領域および触媒性ドメインで構成される。
【０００５】
非受容体プロテインキナーゼの一類型は、ＲＮＡスプライシングの調節に関与しているものである（非特許文献１；ＳｔａｋｎｉｓおよびＲｅｅｄ、１９９４，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：７６７０−７６８２）。このようなプロテインキナーゼは、セリンおよびアルギニン高含有ポリペプチド（ＳＲタンパク質）をリン酸化する。ＳＲタンパク質は、少なくとも１つのアミノ末端ＲＮＡ認識モチーフならびに塩基性のセリンおよびアルギニン残基（多くの場合、タンデム反復配列で配置）高含有カルボキシ末端ドメインを含むことで特徴付けられる（非特許文献２）。実験的証拠により、ＳＲドメインが、タンパク質−タンパク質相互作用（非特許文献３）ならびにタンパク質−ＲＮＡ相互作用（非特許文献４）に関与しており、タンパク質を核スペックル（ｓｐｅｃｋｌｅ）に指向する局在シグナルに寄与している可能性がある（非特許文献５）という見解が支持されている。
【０００６】
スプライス部位の選択は、数多くの細胞外刺激、例えば、増殖因子、サイトカイン、ホルモン、脱分極、浸透圧性ショックおよび合成中でのＵＶＣ照射、リン酸化、ならびにセリン／アルギニン高含有（ＳＲ）タンパク質局在の変化によって改変され得る（Ｓｔａｍｍ（２００２）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１１：２４０９）。
【０００７】
ＳＲタンパク質は、プレ−ｍＲＮＡの構成的スプライシングに必要とされる必須因子の一ファミリーであり（Ｋｒａｉｎｅｒら（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６６：３８３）、選択的スプライシングのモジュレーションに重要な役割を果たす（Ｂｌｅｎｃｏｗｅ（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２５：１０６）。該タンパク質は、真核生物において高度に保存されており、１つまたは２つのＲＮＡ認識モチーフをアミノ末端に、およびＲＳドメインをカルボキシル末端に有することを特徴とする（Ｚａｈｌｅｒら（１９９２）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．６：８３７；Ｃａｃｅｒｅｓら（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：４７１５）。ＲＳドメインは、多数の連続的なＲＳ／ＳＲジペプチド反復配列からなり、異なるＳＲタンパク質間で長さが異なる。ＲＳドメイン内のセリンの広範な（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ）リン酸化は、すべてのＳＲタンパク質において起こる（Ｋｏｈｔｚら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：１１９；Ｇｕｉら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６９：６７８）。その正確な生理学的役割は未だわかっていないが、ＳＲタンパク質のリン酸化は、そのタンパク質−タンパク質相互作用およびタンパク質−ＲＮＡ相互作用（Ｘｉａｏら（１９９７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１１：３３４）、細胞内局在および輸送（Ｃａｃｅｒｅｓら（１９９８）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１２：５５；Ｍｉｓｔｅｌｉら（１９９８）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４３：２９７）、ならびにプレ−ｍＲＮＡの選択的スプライシング（Ｄｕｎｃａｎら（１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７：５９９６）に影響を及ぼす。スプライセオソームの合成は、特異的タンパク質相互作用を助長するとともに、ＳＲタンパク質がＲＮＡにランダムに結合するのを妨げるＳＲタンパク質のリン酸化によって促進され得る（Ｘｉａｏら（１９９７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１１：３３４）。機能性のスプライセオソームが形成されると、エステル交換反応が起こるようにするため、ＳＲタンパク質の脱リン酸化が必要であると思われる（Ｃａｏら（１９９７）ＲＮＡ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）３：１４５６）。したがって、ＳＲタンパク質の逐次のリン酸化および脱リン酸化は、各回のスプライシング反応における各段階間の移行を示すものであり得る。これまでに、いくつかのキナーゼ、例えば、ＳＲＰＫファミリーキナーゼ（Ｇｕｉら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１０８２４；Ｋｕｒｏｙａｎａｇｉら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２４２：３５７−６４）、ｈＰＲＰ４（Ｋｏｊｉｍａら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３２２４７）、およびトポイソメラーゼ１（Ｒｏｓｓｉら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３８１：８０）、ならびにＣＬＫ（Ｃｄｃ２様キナーゼ）と称されるキナーゼのファミリー、または４つの構成員（ＣＬＫ１／ＳｔｙおよびＣＬＫ２、ＣＬＫ３およびＣＬＫ４）からなる、コンセンサスモチーフ由来のＬＡＭＭＥＲキナーゼ（Ｃｏｌｗｉｌｌら（１９９６）ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：２６５；Ｎａｙｌｅｒら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２６：６９３）が、ＳＲタンパク質をリン酸化することが報告されている。
【０００８】
哺乳動物のＣＬＫファミリーキナーゼは、ＳＲドメインを含み、ＳＲタンパク質をインビトロで、およびＳＦ２／ＡＳＦをインビボでリン酸化することが示されている（Ｎａｙｌｅｒら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２６：６９３）。Ｃｌｋは、過剰発現系のチロシン、セリンおよびトレオニン残基において、およびインビトロで自己リン酸化する二重特異性キナーゼであることが示されている（Ｎａｙｌｅｒら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２６：６９３；Ｂｅｎ−Ｄａｖｉｄら（１９９１）ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３１７；Ｈｏｗｅｌｌら（１９９１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：５６８）。過剰発現されると、触媒的に不活性な変異型キナーゼは、スプライシング因子が濃縮された核スペックルに局在するが、野生型の該酵素は核全体に分布し、スペックルの溶解を引き起こす（Ｃｏｌｗｉｌｌら（１９９６）ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：２６５）。また、ＣＬＫの過剰発現は、インビボで、自身の転写物をアデノウイルスＥ１Ａ転写物の両方のプレ−ｍＲＮＡのスプライシング部位の選択に影響を及ぼす（Ｄｕｎｃａｎら（１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７：５９９６）。
【０００９】
ＣＬＫは、多くの生物体において、よく保存されている。ｍＣＬＫ１は、最初にマウス発現ライブラリーにおいて単離された二重特異性プロテインキナーゼであり（Ｂｅｎ−Ｄａｖｉｄら、１９９１、ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３１７−３２５；Ｈｏｗｅｌｌら、１９９１、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：５６８−５７２）、その後、ヒト（ｈＣＬＫ１、ｈＣＬＫ２、ｈＣＬＫ３、ｈＣＬＫ４）、植物（ＡＦＣ１、ＡＦＣ２、ＡＦＣ３）およびハエ（ＤＯＡ）ＣＬＫプロテインキナーゼが同定された（ＪｏｈｎｓｏｎおよびＳｍｉｔｈ、１９９１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：３４０２−３４０７；Ｈａｎｅｓら、１９９４、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４４：６６５−６７２；ＢｅｎｄｅｒおよびＦｉｎｋ、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１２１０５−１２１０９；Ｙｕｎら、１９９４、Ｇｅｎｅｓ．Ｄｅｖ．８：１１６０−１１７３）。ヒトＣＬＫの遺伝子のうち３つ、具体的には、ｈＣＬＫ１−２ｑ３３、ｈＣＬＫ２−１ｑ２１およびｈＣＬＫ３−１５ｑ２４が、特有の染色体位置にマッピングされた（Ｔａｌｍａｄｇｅら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．１９９８  １０３（４）：５２３−４）。これらのタンパク質のアミノ末端ドメインは、セリンおよびアルギニン高含有であるが、該触媒性ドメインは、セリン／トレオニンプロテインキナーゼであるＣＤＣ２に最も類似したものであり得る（Ｂｅｎ−Ｄａｖｉｄら、１９９１、ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３１７−３２５）。ＣＬＫはまた、ＳＴＹまたはＬＡＭＭＥＲキナーゼ（後者は、ＣＬＫファミリー構成員間で保存されているシグネチャー（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）モチーフ「ＥＨＬＡＭＭＥＲＩＬＧ」に基づく）としても知られている。
【００１０】
特許文献１（「ＣＬＫ２プロテインキナーゼをコードする核酸」）には、ｍＣＬＫ２、ｍＣＬＫ３およびｍＣＬＫ４ポリペプチドをコードする核酸分子、そのアミノ酸配列の一部をコードする核酸分子、かかる核酸分子を保有する核酸ベクター、かかる核酸ベクターを含む細胞、かかる核酸分子にコードされる精製ポリペプチド、およびかかるポリペプチドに対する抗体が記載されている。また、少なくとも１種類のＣＬＫプロテインキナーゼ関連分子を含むアッセイも記載されている。ＣＬＫプロテインキナーゼ関連分子または化合物を使用することにより、生物体においてＲＮＡスプライシングまたは細胞増殖に関連する非正常状態を診断および処置することが開示されている。ＣＬＫプロテインキナーゼ関連分子または化合物を、雄生物体における生殖の避妊薬として使用する方法もまた開示されている。
【００１１】
ｍＣＬＫ１およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａホモログＤＯＡ（Ｄｅａｄ  Ｏｎ  Ａｒｒｉｖａｌ）は、ともに、ＲＮＡスプライシング事象を調節する。これらは各々、完全長の触媒的に活性なタンパク質または触媒性ドメインを欠く切断型のタンパク質のいずれかをコードする２つの選択的スプライシング産物を有する（Ｙｕｎら、１９９４、Ｇｅｎｅｓ．Ｄｅｖ．８：１１６０−１１７３；Ｄｕｎｃａｎら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２１５２４−２１５３１）。また、同一のスプライス形態がヒトＣＬＫプロテインキナーゼにおいて見出された（Ｈａｎｅｓら、１９９４、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４４：６６５−６７２）。このようなスプライス産物の比は、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）では発達に伴って（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ）調節され（Ｙｕｎら、１９９４、Ｇｅｎｅｓ．Ｄｅｖ．８：１１６０−１１７３）、哺乳動物では、組織および細胞型特異的様式で調節されるようである（Ｈａｎｅｓら、１９９４、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４４：６６５−６７２；Ｄｕｎｃａｎら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２１５２４−２１５３１）。また、いくつかの他のより大きな転写物の発現が、差示的に調節されることが観察されており、部分スプライス産物を提示することが示されている（Ｄｕｎｃａｎら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２１５２４−２１５３１）。
【００１２】
これまでに、ミススプライシングによって引き起こされるいくつかの疾患が報告されており、一部の場合では、スプライス部位周囲に見られる変異（１つまたは複数）が、非通常のエキソン含有もしくは排除および／または５’もしくは３’部位の改変により、転写物のスプライシングパターンを変化させる原因となっているようである（Ｓｔｏｓｓら（２０００）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５：９；Ｐｈｉｌｉｐｓら（２０００）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．５７：２３５；Ｆａｕｓｔｉｎｏら（２００３）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１７：４１９に概説）。典型例は、常染色体劣性疾患であるβ−サラセミアであり、これは、多くの場合、α−グロビン遺伝子のイントロン２における変異と関連している。異常５’スプライス部位の生成により、該変異の上流の一般的な３’潜在（ｃｒｙｐｔｉｃ）部位が活性化され、イントロン含有終止コドンの断片の内包が誘導される。その結果、機能的α−グロビンタンパク質の量が低下する。選択的スプライシングの治療的モジュレーションについて、アンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｓａｚａｎｉら（２００３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．１１２：４８１）、ペプチド核酸オリゴヌクレオチド、およびＲＮＡｉ（Ｅｐｓｔｅｉｎ（１９９８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  １４：２１；Ｃｅｌｏｔｔｏら（２００２）ＲＮＡ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）８：７１８）を用いたいくつかの試行が報告されている。これらのアプローチは、β−グロビンなどの既知の標的配列の特異的スプライス部位の選択の操作に有用であり得る（Ｓａｚａｎｉら（２００３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．１１２：４８１）。しかしながら、乳癌、ウィルムス腫および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の患者に見られる異常スプライシングは、常にスプライス部位周囲の変異を伴うとは限らない。散発性ＡＬＳ患者では、ＥＡＡＴ２（興奮性アミノ酸輸送体２）ＲＮＡのプロセッシングが、多くの場合、運動皮質および脊髄において異常であり、該領域が特に該疾患によって冒される。エキソン９は、遺伝子内になんら変異のない一部のＡＬＳ患者において異常にスキッピングが生じるため（Ｌｉｎら（１９９８）Ｎｅｕｒｏｎ  ２０：５８９）、該障害は、スプライシングの調節因子の異常が原因である可能性がある。実際、選択的スプライシング産物の均衡は、ヘテロ核リボ核タンパク質とＳＲタンパク質の比の変化（Ｍａｙｅｄａら（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６８：３６５；Ｃａｃｅｒｅｓら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：１７０６）ならびにＳＲタンパク質のリン酸化状態および局在（Ｄｕｎｃａｎら（１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７：５９９６）の変化に影響され得る。
【００１３】
特許文献２（「過剰キナーゼ誘導によって引き起こされる非正常スプライシングを処置する治療用組成物」）には、過剰キナーゼ誘導によって引き起こされる非正常スプライシングを処置または予防するための組成物が示されており、過剰キナーゼ誘導によって引き起こされる非正常スプライシングを処置または予防するために該化合物を使用するための化合物および方法が含まれている。そのように記載された組成物および方法は、原因として、非正常スプライシングをもたらす過剰キナーゼ活性を有する疾患、例えば、該出願に記載のような一部の形態の癌および神経変性の処置に有用であり得る。
【００１４】
驚いたことに、ＣＬＫがスプライシングにおいて果たす役割に加え、ＣＬＫは、とりわけ、遺伝子転写；特定のリシン残基のアセチル化によって翻訳後修飾されたタンパク質の脱アセチル化；ならびにミトコンドリアの機能、バイオジェネシスおよび／または活性に関与しているタンパク質タンパク質を直接リン酸化することが見出された。具体的には、ＣＬＫはサーチュインおよびＰＧＣ−１αをリン酸化し、それにより、遺伝子転写ならびにミトコンドリアの機能、バイオジェネシスおよび／または活性に関与する経路がモジュレートされることが示された。このようにして、ＣＬＫ活性のモジュレータは、これらの細胞内プロセスをモジュレートすることが示され、したがって、本出願に明記するような数多くの疾患および障害の処置に有用であり得る。
【特許文献１】米国特許第６，７９７，５１３号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００５／０１７１０２６号明細書
【非特許文献１】Ｆｕ、ＲＮＡ（１９９５）１：６６３−６８０
【非特許文献２】Ｚａｈｌｅｒら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ（１９９２）６：８３７−８４７
【非特許文献３】Ｋｏｈｔｚら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９４）３６８：１１９−１２４
【非特許文献４】Ｈａｒａｄａら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９６）３８０：１７５−１７９
【非特許文献５】Ｈｅｄｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２：１１５２４−１１５２８
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
（概要）
一態様において、本発明は、ＣＬＫモジュレート化合物またはＣＬＫモジュレート化合物を含む組成物の使用方法を提供する。
【００１６】
特定のある実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、さまざまな治療適用用途、例えば、細胞の寿命の増大、ならびに多種多様な疾患および障害、例えば、加齢もしくはストレスに関連する疾患もしくは障害、糖尿病、肥満、神経変性疾患、心血管疾患、血液凝固障害、炎症および／または紅潮などの処置および／または予防などに使用され得る。ＣＬＫ阻害化合物はまた、筋肉機能の増強、筋肉ＡＴＰレベルの増加、または低酸素症もしくは虚血と関連している筋肉組織の損傷の処置もしくは予防のために、被験体において、ミトコンドリア活性の増大から利益を受ける疾患または障害を処置するために使用され得る。例示的な実施形態において、該方法は、ＣＬＫ阻害化合物を、少なくとも１種類の他の治療用薬剤、例えばサーチュイン活性化化合物などとの組合せで投与することを含むものであり得る。
【００１７】
他の実施形態において、ＣＬＫ活性化化合物は、さまざまな治療適用用途、例えば、ストレスに対する細胞の感受性の増大、アポトーシスの増大、癌の処置、食欲の刺激および／または体重増加の刺激などに使用され得る。例示的な実施形態において、該方法は、ＣＬＫ活性化化合物を、少なくとも１種類の他の治療用薬剤、例えば、サーチュイン阻害化合物などとの組合せで投与することを含むものであり得る。
【００１８】
以下にさらに記載するように、該方法は、医薬有効量のＣＬＫモジュレート化合物を、それを必要とする被験体に投与することを含む。
【００１９】
一態様において、本発明は、真核生物細胞の生存を促進させるための方法であって、該細胞を、少なくとも１種類のＣＬＫ阻害化合物またはその薬学的に許容され得る塩もしくはプロドラッグと接触させることを含む方法を提供する。ＣＬＫ阻害化合物は、該細胞の寿命を増大させるものであり得る。ＣＬＫ阻害化合物は、ストレス、例えば、熱ショックによるストレス、浸透圧ストレス、ＤＮＡ損傷、不充分な塩レベル、不充分な窒素レベルまたは不充分な栄養レベルなどに抵抗する細胞の能力を増大させるものであり得る。ＣＬＫ阻害化合物は、細胞に対する栄養制限の効果を模倣するものであり得る。例示的な一実施形態において、真核生物細胞は哺乳動物細胞である。
【００２０】
別の態様において、本発明は、治療有効量の少なくとも１種類のＣＬＫ阻害化合物またはその薬学的に許容され得る塩もしくはプロドラッグを、それを必要とする被験体に投与することを含む、被験体において、細胞死または加齢と関連する疾患または障害を処置または予防するための方法を提供する。加齢関連疾患は、例えば、脳卒中、心血管疾患、関節炎、高血圧またはアルツハイマー病であり得る。
【００２１】
別の態様において、本発明は、治療有効量の少なくとも１種類のＣＬＫ阻害化合物またはその薬学的に許容され得る塩もしくはプロドラッグを、それを必要とする被験体に投与することを含む、被験体において、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、糖尿病もしくはその合併症を処置もしくは予防するため、またはインスリン感受性を増大させるための方法を提供する。
【００２２】
別の態様において、本発明は、治療有効量の少なくとも１種類のＣＬＫ阻害化合物またはその薬学的に許容され得る塩もしくはプロドラッグを、それを必要とする被験体に投与することを含む、被験体の減量のため、または被験体において体重増加を予防するための方法を提供する。例示的な一実施形態において、被験体は、ＣＬＫ阻害化合物の非存在下で体重減少をもたらすのに充分な程度まで、カロリー消費も低下させず、活動性も高めず、それらの組合せも行わない。
【００２３】
別の態様において、本発明は、前脂肪細胞を、少なくとも１種類のＣＬＫ阻害化合物またはその薬学的に許容され得る塩もしくはプロドラッグと接触させることを含む、前脂肪細胞の分化を防止するための方法を提供する。
【００２４】
別の態様において、本発明は、被験体に、治療有効量の少なくとも１種類のＣＬＫ阻害化合物またはその薬学的に許容され得る塩もしくはプロドラッグを投与することを含む、被験体の寿命を延ばすための方法を提供する。
【００２５】
別の態様において、本発明は、治療有効量の少なくとも１種類のＣＬＫ阻害化合物またはその薬学的に許容され得る塩もしくはプロドラッグを、それを必要とする被験体に投与することを含む、被験体において、神経変性障害を処置または予防するための方法を提供する。神経変性障害は、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；ルー・ゲーリグ病）、びまん性レヴィー小体病、舞踏病有棘赤血球増加症、原発性側索硬化症、多発性硬化症（ＭＳ）およびフリートライヒ運動失調であり得る。
【００２６】
別の態様において、本発明は、治療有効量の少なくとも１種類のＣＬＫ阻害化合物またはその薬学的に許容され得る塩もしくはプロドラッグを、それを必要とする被験体に投与することを含む、被験体において、血液凝固障害を処置または予防するための方法を提供する。血液凝固障害は、例えば、血栓塞栓症、深部静脈血栓症、肺塞栓症、脳卒中、心筋梗塞、流産、アンチトロンビンＩＩＩの欠損と関連している栓友病、プロテインＣの欠損、プロテインＳの欠損、活性型プロテインＣに対する抵抗性、異常フィブリノゲン血症、フィブリン溶解性障害、ホモシスチン尿症、妊娠、炎症性障害、骨髄増殖性障害、動脈硬化、アンギナ、播種性血管内凝固症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、癌転移、鎌状赤血球症、糸球体腎炎、薬剤誘発性血小板減少症、および治療的血餅溶解または血管形成術もしくは手術などの手順中またはその後の再閉塞であり得る。
【００２７】
別の態様において、本発明は、治療有効量の少なくとも１種類のＣＬＫ阻害化合物またはその薬学的に許容され得る塩もしくはプロドラッグを、それを必要とする被験体に投与することを含む、眼の疾患または障害を処置または予防するための方法を提供する。眼の疾患または障害は、例えば、視力障害、緑内障、視神経炎、黄斑変性または前部虚血性視神経障害であり得る。視力障害は、例えば、視神経もしくは中枢神経系（ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｔｅｍ）に対する損傷（例えば、高眼圧、視神経の腫脹もしくは虚血など）、または網膜の損傷（例えば、網膜への血流の妨害もしくは斑（ｍａｃｕｌａ）の途絶など）によって引き起こされ（ｂｅ  ｃａｕｓｅ）得る。
【００２８】
別の態様において、本発明は、治療有効量の少なくとも１種類のＣＬＫ阻害化合物またはその薬学的に許容され得る塩もしくはプロドラッグを、それを必要とする被験体に投与することを含む、化学療法剤誘発型神経障害を処置または予防するための方法を提供する。例示的な一実施形態において、化学療法剤は、ビンカアルカロイドまたはシスプラチンを含む。
【００２９】
別の態様において、本発明は、治療有効量の少なくとも１種類のＣＬＫ阻害化合物またはその薬学的に許容され得る塩もしくはプロドラッグを、それを必要とする被験体に投与することを含む、虚血性の事象または疾患に関連する神経障害を処置または予防するための方法を提供する。虚血性の事象は、例えば、脳卒中、冠性心疾患（鬱血性心不全または心筋梗塞を含む）、脳卒中、気腫、出血性ショック、不整脈（例えば、心房性細動）、末梢血管疾患または移植関連損傷であり得る。
【００３０】
別の態様において、本発明は、治療有効量の少なくとも１種類のＣＬＫ阻害化合物またはその薬学的に許容され得る塩もしくはプロドラッグを、それを必要とする被験体に投与することを含む、ポリグルタミン病を処置または予防するための方法を提供する。ポリグルタミン病は、例えば、脊髄延髄筋萎縮（ケネディ病）、ハンチントン病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ｄｅｎｔａｔｏｒｕｂｒａｌｐａｌｌｉｄｏｌｕｙｓｉａｎ  ａｔｒｏｐｈｙ）（ハウリバー症候群（Ｈａｗ  Ｒｉｖｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ））、脊髄小脳性運動失調症１型、脊髄小脳性運動失調症２型、脊髄小脳性運失調３型（マチャド−ジョセフ病）、脊髄小脳性運動失調症６型、脊髄小脳性運動失調症７型、または脊髄小脳性運動失調症型１７であり得る。特定のある実施形態において、ポリグルタミン病を処置または予防するための方法は、さらに、治療有効量のＨＤＡＣ  Ｉ／ＩＩ阻害剤を投与することを含む。
【００３１】
別の態様において、本発明は、治療有効量の少なくとも１種類のＣＬＫ阻害化合物またはその薬学的に許容され得る塩もしくはプロドラッグを、それを必要とする被験体に投与することを含む、被験体において、ミトコンドリア活性の増大から利益を受ける疾患または障害を処置するための方法を提供する。特定のある実施形態において、該方法は、さらに、被験体に以下：ビタミン、補因子または抗酸化剤、例えば、コエンザイムＱ１０、Ｌ−カルニチン、チアミン、リボフラビン、ナイアシンアミド、葉酸塩、ビタミンＥ、セレン、リポ酸またはプレドニゾンなどの１種類以上を投与することを含むものであり得る。特定のある実施形態において、該方法は、さらに、被験体に、該疾患または障害の症状を緩和する１種類以上の薬剤、例えば、発作、神経障害性疼痛または心機能不全を緩和する薬剤などを投与することを含むものであり得る。特定のある実施形態において、該障害は、ミトコンドリア活性を低下させる医薬用薬剤、例えば、逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、またはジヒドロオロト酸デヒトロゲナーゼの（ｏｒ）阻害剤（ＤＨＯＤ）などの投与と関連している。
【００３２】
別の態様において、本発明は、治療有効量の少なくとも１種類のＣＬＫ阻害化合物またはその薬学的に許容され得る塩もしくはプロドラッグを、それを必要とする被験体に投与することを含む、運動能力もしくは筋持久力の増強、疲労低減または疲労からの回復の増進のための方法を提供する。特定のある実施形態において、被験体は運動選手であり得る。疲労は、例えば、化学療法剤の投与と関連するものであり得る。
【００３３】
別の態様において、本発明は、治療有効量の少なくとも１種類のＣＬＫ阻害化合物またはその薬学的に許容され得る塩もしくはプロドラッグを、それを必要とする被験体に投与することを含む、運動能力または筋持久力が低下した状態を処置または予防するための方法を提供する。該状態は、例えば、筋ジストロフィー、神経筋障害、マッカードル病、重症筋無力症、筋肉損傷、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、または加齢性筋肉減弱症であり得る。
【００３４】
別の態様において、本発明は、治療有効量の少なくとも１種類のＣＬＫ阻害化合物またはその薬学的に許容され得る塩もしくはプロドラッグを、それを必要とする被験体に投与することを含む、低酸素症または虚血と関連している筋肉組織の損傷を処置または予防するための方法を提供する。
【００３５】
別の態様において、本発明は、治療有効量の少なくとも１種類のＣＬＫ阻害化合物またはその薬学的に許容され得る塩もしくはプロドラッグを、それを必要とする被験体に投与することを含む、被験体において筋肉ＡＴＰレベルを増加させるための方法を提供する。
【００３６】
特定のある実施形態において、本明細書に記載の方法は、選択的、非正常、異常または望ましくないスプライシングと関連する疾患または障害を処置または予防することに関与するものではない。
【００３７】
特定のある実施形態において、本明細書に記載の方法は、以下の疾患または障害：β−サラセミア、ＦＴＤＰ−１７、ＮＦ２、ＦＲＡＳＩＥＲ、ウィルムス腫、乳癌、卵巣癌、腎臓癌、肺癌、尿路上皮癌、胃癌、甲状腺乳頭（ｐａｐｉｌｌａｒｙ  ｔｈｙｒｏｉｄ）癌、ＨＮＳＣＣ、浸潤性乳癌、骨巨細胞腫、前立腺癌、黒色腫、リンパ腫、口腔癌、咽頭癌、早老症、神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、脊髄小脳性運動失調症、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）ならびに癲癇、進行性核上性麻痺、およびピック病の１つ以上を処置または予防することに関与するものではない。
【００３８】
特定のある実施形態において、本明細書に記載の方法は、被験体に、少なくとも１種類のＣＬＫ阻害化合物および少なくとも１種類のサーチュイン活性化化合物を投与することを含む。サーチュイン活性化化合物の例としては、例えば、レスベラトロール、ブテイン、フィセチン、ピセアタンノール、ケルセチンおよびニコチンアミドリボシドが挙げられる。例示的なＣＬＫ阻害化合物はＴＧ０００３である。ＣＬＫ阻害化合物他の例としては、例えば、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマーまたは抗体が挙げられる。
【００３９】
特定のある実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、サーチュインタンパク質および／またはＰＧＣ−１αのＣＬＫ関連リン酸化を低減させる。
【００４０】
特定のある実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、少なくとも１種類のヒトＣＬＫタンパク質の阻害剤、例えば、ｈＣＬＫ１、ｈＣＬＫ２、ｈＣＬＫ３および／またはｈＣＬＫ４の１種類以上などである。
【００４１】
別の態様において、本発明は、（ｉ）治療有効量の少なくとも１種類のＣＬＫ活性化化合物もしくはその薬学的に許容され得る塩もしくはプロドラッグ、または（ｉｉ）ＣＬＫタンパク質の過剰発現を促進するポリヌクレオチドを、それを必要とする被験体に投与することを含む、被験体において癌を処置または予防するための方法を提供する。該方法は、さらに、被験体に化学療法剤を投与することを含む。
【００４２】
別の態様において、本発明は、（ｉ）治療有効量の少なくとも１種類のＣＬＫ活性化化合物もしくはその薬学的に許容され得る塩もしくはプロドラッグ、または（ｉｉ）ＣＬＫタンパク質の過剰発現を促進するポリヌクレオチドを、それを必要とする被験体に投与することを含む、被験体において体重増加を刺激するための方法を提供する。
【００４３】
別の態様において、本発明は、（ｉ）細胞を、少なくとも１種類のＣＬＫ活性化化合物またはその薬学的に許容され得る塩もしくはプロドラッグと接触させること、または（ｉｉ）細胞内に、ＣＬＫタンパク質の過剰発現を促進するポリヌクレオチドを導入することを含む、細胞の放射線感受性または化学的感受性を増大させるための方法を提供する。細胞は（ｃａｌｌ）は、例えば、哺乳動物細胞であり得る。
【００４４】
特定のある実施形態において、本明細書に記載の方法では、ＣＬＫ活性化化合物は、サーチュインタンパク質および／またはＰＧＣ−１αのＣＬＫ関連リン酸化を促進する。
【００４５】
特定のある実施形態において、ＣＬＫ活性化化合物は、ポリヌクレオチド、例えば、ＣＬＫタンパク質（例えば、哺乳動物のＣＬＫもしくはヒトＣＬＫなど）またはその生物学的に活性な断片をコードする核酸配列を含む発現ベクターなどである。ヒトＣＬＫの例としては、ｈＣＬＫ１、ｈＣＬＫ２、ｈＣＬＫ３およびｈＣＬＫ４が挙げられる。
【００４６】
特定のある実施形態において、ＣＬＫ活性化化合物は、少なくとも１種類のヒトＣＬＫタンパク質、例えば、ｈＣＬＫ１、ｈＣＬＫ２、ｈＣＬＫ３および／またはｈＣＬＫ４などのアクチベータである。
【００４７】
特定のある実施形態において、本明細書に記載の方法は、被験体に、少なくとも１種類のＣＬＫ活性化化合物および少なくとも１種類のサーチュイン阻害化合物を投与することを含む。サーチュイン阻害化合物の例としては、例えば、ニコチンアミド、サーチノール（ｓｉｒｔｉｎｏｌ）、およびスプリトミシン（ｓｐｌｉｔｏｍｉｃｉｎ）が挙げられる。
【００４８】
別の態様において、本発明は、少なくとも１種類のＣＬＫ阻害化合物および少なくとも１種類のサーチュイン活性化化合物を含む組成物を提供する。例示的な一実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物はＴＧ００３である。サーチュイン活性化化合物の例としては、例えば、レスベラトロール、ブテイン、フィセチン、ピセアタンノール、ケルセチンおよびニコチンアミドリボシドが挙げられる。
【００４９】
別の態様において、本発明は、少なくとも１種類のＣＬＫ活性化化合物および少なくとも１種類のサーチュイン阻害化合物を含む組成物を提供する。サーチュイン阻害化合物の例としては、例えば、ニコチンアミド、サーチノールおよびスプリトミシンが挙げられる。
【００５０】
別の態様において、本発明は、細胞の寿命の増大、ならびに多種多様な疾患および障害、例えば、加齢もしくはストレスに関連する疾患もしくは障害、糖尿病、肥満、神経変性疾患、心血管疾患、血液凝固障害、炎症、紅潮などの処置および／または予防、被験体におけるミトコンドリア活性の増大から利益を受ける疾患または障害の処置、筋肉機能の増強、筋肉ＡＴＰレベルの増加、または低酸素症もしくは虚血と関連している筋肉組織の損傷の処置もしくは予防のための医薬の調製のためのＣＬＫ阻害化合物の使用を提供する。
【００５１】
別の態様において、本発明は、ストレスに対する細胞の感受性の増大、アポトーシスの増大、癌の処置、食欲の刺激および／または体重増加の刺激などのための医薬の調製のためのＣＬＫ活性化化合物の使用を提供する。
【００５２】
別の態様において、本発明は、細胞の寿命の増大、ならびに多種多様な疾患および障害、例えば、加齢もしくはストレスに関連する疾患もしくは障害、糖尿病、肥満、神経変性疾患、心血管疾患、血液凝固障害、炎症、紅潮などの処置および／または予防、被験体におけるミトコンドリア活性の増大から利益を受ける疾患または障害の処置における使用、筋肉機能の増強、筋肉ＡＴＰレベルの増加、または低酸素症もしくは虚血と関連している筋肉組織の損傷の処置もしくは予防のためのＣＬＫ阻害化合物を提供する。
【００５３】
別の態様において、本発明は、ストレスに対する細胞の感受性の増大、アポトーシスの増大、癌の処置、食欲の刺激および／または体重増加の刺激などにおける使用のためのＣＬＫ活性化化合物を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５４】
（詳細説明）
１．定義
本明細書で用いる場合、以下の用語および語句は、以下に示す意味を有するものとする。特に規定のない限り、本明細書で用いるすべての科学技術用語は、当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。単数形態「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、本文中で特に明白な記載のない限り、複数の指示対象物を含む。
【００５５】
用語「薬剤」は、本明細書で用いる場合、化合物、化合物の混合物、生物学的巨大分子（核酸、抗体、タンパク質もしくはその一部分（例えばペプチド）など）、または生物学的材料、例えば、細菌、植物、真菌もしくは動物（特に、哺乳動物の）などの細胞もしくは組織から作製された抽出物を表す。かかる薬剤の活性により、自身が「治療用薬剤」として適したものとなり得、治療用薬剤は、被験体において局所または全身に作用する生物学的、生理学的または薬理学的に活性な物質（１種類または複数種）である。
【００５６】
化合物に言及する場合の用語「生物学的に利用可能な」は、当該技術分野で明確に理解されており、化合物または投与された化合物の量の一部が、投与対象の被験体または患者に吸収される、組み込まれる、あるいは生理学的に利用可能となることが可能である化合物の形態をいう。
【００５７】
用語「ＣＬＫタンパク質」または「ＣＬＫ」は、Ｃｄｃ２様キナーゼタンパク質ファミリーの一構成員をいう。Ｃｄｃ２様キナーゼファミリーの例示的な構成員としては、例えば、ヒト由来ＣＬＫタンパク質（ｈＣＬＫ１、ｈＣＬＫ２、ｈＣＬＫ３およびｈＣＬＫ４）、マウス由来のもの（ｍＣＬＫ１、ｍＣＬＫ２、ｍＣＬＫ３およびｍＣＬＫ４）、植物由来のもの（ＡＦＣ１、ＡＦＣ２およびＡＦＣ３）およびハエ（ＤＯＡ）ＣＬＫプロテインキナーゼ、ならびにそのホモログ（例えば、オルソログおよびパラログ）、バリアントまたは断片が挙げられる。例示的な一実施形態において、ＣＬＫタンパク質は、ｈＣＬＫ１（配列番号：１）、ｈＣＬＫ２（配列番号：２）、ｈＣＬＫ３（配列番号：３）またはｈＣＬＫ４（配列番号：４）をいう。他の実施形態において、ＣＬＫタンパク質は、配列番号：１、２、３または４に示すアミノ酸配列からなるか、もしくは本質的に該配列からなる配列を含むポリペプチド；配列番号：１、２、３または４に示すアミノ酸配列；１〜約２、３、５、７、１０、１５、２０、３０、５０、７５またはそれ以上の同類アミノ酸置換を有する配列番号：１、２、３または４に示すアミノ酸配列；配列番号：１、２、３または４と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列の全部または一部を含むポリペプチド；および前述のもののいずれかの機能的断片をいう。ＣＬＫタンパク質好ましくは、プロテインキナーゼ活性を有するものである。キナーゼ活性を有する完全長ＣＬＫタンパク質の断片は、当該技術分野でよく知られた手法、例えば、配列比較およびアッセイ（本明細書に記載のものなど）を用いて同定され得る。
【００５８】
「ＣＬＫの生物学的に活性な部分」は、ＣＬＫタンパク質の少なくとも１つの生物学的活性、例えばキナーゼ活性などを有するＣＬＫタンパク質の一部分をいう。ＣＬＫの生物学的に活性な部分は、ＣＬＫ触媒性ドメイン  （例えば、図５Ａを参照）またはエキソン４（例えば、図１０を参照）を含むものであり得る。
【００５９】
用語「愛玩動物」は、ネコおよびイヌをいう。本明細書で用いる場合、「イヌ（１種類または複数種）」は、多数の異なる血統が存在するケイネス・ファミリアリス（Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）の種の任意の構成員を示す。用語「ネコ（１種類または複数種）」は、ネコ科の動物、例えば、飼いネコおよびネコ科、ネコ属の他の構成員をいう。
【００６０】
用語「を含む」および「を含んでいる」は、包括的で開放的な意味で用い、付加的な要素が含まれ得ることを意味する。
【００６１】
用語「保存された残基」は、ある特定の胸中の特性を有する一群のアミノ酸の一構成員であるアミノ酸をいう。用語「同類アミノ酸置換」は、かかる群の１つのアミノ酸の同じ群の異なるアミノ酸での置換（概念的またはその他の様式での）をいう。個々のアミノ酸間の共通の特性を規定するための機能的な方法は、同種の生物体の対応するタンパク質間のアミノ酸変化の標準化された頻度を解析することである（Ｓｃｈｕｌｚ，Ｇ．Ｅ．およびＲ．Ｈ．Ｓｃｈｉｒｍｅｒ．、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。かかる解析により、１つの群内のアミノ酸が互いに優先的に交換され、したがって、そのタンパク質構造全体に対する影響が互いに最も類似するアミノ酸の群が規定され得る（Ｓｃｈｕｌｚ，Ｇ．Ｅ．およびＲ．Ｈ．Ｓｃｈｉｒｍｅｒ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。この様式で規定される一組のアミノ酸の群の一例としては、（ｉ）ＧｌｕおよびＡｓｐ、Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓからなる電荷を有する群、（ｉｉ）Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓからなる正の電荷を有する群、（ｉｉｉ）ＧｌｕおよびＡｓｐからなる負の電荷を有する群、（ｉｖ）Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐからなる芳香族の群、（ｖ）ＨｉｓおよびＴｒｐからなる窒素環の群、（ｖｉ）Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅからなる大きな脂肪族無極性の群、（ｖｉｉ）ＭｅｔおよびＣｙｓからなるわずかに極性の群、（ｖｉｉｉ）Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、ＧｌｎおよびＰｒｏからなる小残基群、（ｉｘ）Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＭｅｔおよびＣｙｓからなる脂肪族の群、ならびに（ｘ）ＳｅｒおよびＴｈｒからなる小さいヒドロキシルの群が挙げられる。
【００６２】
「糖尿病」は、高血糖またはケトアシドーシス、ならびに長期高血糖状態または耐糖能の低下により生じる慢性の一般的な代謝異常をいう。「糖尿病」には、該疾患のＩ型およびＩＩ型（インスリン非依存性糖尿病またはＮＩＤＤＭ）の形態の両方が包含される。糖尿病の危険因子としては、以下の因子：胴回りが男性で４０インチ超もしくは女性で３５インチ超、血圧が１３０／８５ｍｍＨｇ以上、１５０ｍｇ／ｄｌより上のトリグリセリド、１００ｍｇ／ｄｌより高い空腹時血糖または高密度リポタンパク質が男性で４０ｍｇ／ｄｌ未満もしくは女性で５０ｍｇ／ｄｌ未満が挙げられる。
【００６３】
ポリペプチドの「直接的アクチベータ」は、該ポリペプチドに結合することによりそれを活性化する分子である。
【００６４】
ポリペプチドの「直接的阻害剤」は、該ポリペプチドに結合することによりそれを阻害する分子である。
【００６５】
用語「ＥＤ５０」は、当該技術分野で明確に理解されている。特定のある実施形態において、ＥＤ５０は、その最大応答または効果の５０％をもたらす薬物の用量、あるいはまた、試験被験体または調製物の５０％において所定の応答をもたらす用量を意味する。用語「ＬＤ５０」は、当該技術分野で明確に理解されている。特定のある実施形態において、ＬＤ５０は、試験被験体の５０％において致死性である薬物の用量を意味する。用語「治療指数」は、当該技術分野で明確に理解されている用語であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０で規定される薬物の治療指数をいう。
【００６６】
用語「高インスリン血症」は、血液中のインスリンのレベルが正常より高い個体の状態をいう。
【００６７】
用語「が挙げられる」は、「限定されないが、・・・が挙げられる」を意図するために用いる。「が挙げられる」および「限定されないが、・・・が挙げられる」は、互換的に用いる。
【００６８】
用語「インスリン抵抗性」は、インスリン抵抗性をもたない被験体における生物学的応答と比べて、正常な量のインスリンで正常以下の生物学的応答がもたらされる状態をいう。
【００６９】
「インスリン抵抗性障害」は、本明細書で論考する場合、インスリン抵抗性によって引き起こされるか、またはインスリン抵抗性が一因である任意の疾患または状態をいう。例としては、糖尿病、肥満、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性症候群、シンドロームＸ、インスリン抵抗性、高血圧、高血圧症、高血中コレステロール、脂質異常症、高脂血症、脂質異常症、アテローム硬化性疾患、例えば、脳卒中、冠動脈疾患または心筋梗塞、高血糖症、高インスリン血症および／または高プロインスリン血症、グルコース寛容減損、インスリン放出の遅延、糖尿病合併症、例えば、冠性心疾患、狭心症、鬱血性心不全、脳卒中、痴呆における認知機能、網膜症、末梢神経障害、腎症、糸球体腎炎、糸球体硬化症、ネフローゼ症候群、高血圧性腎硬化  一部の型の癌（例えば、子宮内膜、乳房、前立腺および結腸など）、妊娠の合併症、女性の生殖的健康不良（例えば、月経不順、不妊、排卵不順、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）など）、脂肪異栄養症、コレステロール関連障害、例えば、胆石、胆嚢炎（ｃｈｏｌｅｓｃｙｓｔｉｔｉｓ）および胆石症、痛風、閉塞性睡眠時無呼吸および呼吸器の問題、変形性関節症、ならびに骨量減少、例えば骨粗鬆症の予防および処置が挙げられる。
【００７０】
用語「家畜動物」は、飼養化四足獣をいい、食肉および種々の副製品のために飼育されているもの、例えば、ウシ系動物（例えば、畜牛およびウシ属の他の構成員）、ブタ系動物（例えば、飼養ブタおよびイノシシ属の他の構成員）、ヒツジ系動物（ヒツジおよびヒツジ属の他の構成員）、飼養ヤギおよびヤギ属の他の構成員、特定の仕事、例えば、役畜としての使用のために飼育されている飼養化四足獣、例えば、ウマ系動物（例えば、飼養ウマおよびウマ科、ウマ属の他の構成員）が挙げられる。
【００７１】
用語「哺乳動物」は、当該技術分野において知られており、例示的な哺乳動物としては、ヒト、霊長類、家畜動物（例えば、ウシ、ブタなど）、愛玩動物（例えば、イヌ、ネコなど）および齧歯類（例えば、マウスおよびラット）が挙げられる。
【００７２】
化合物に言及する場合の用語「天然に存在する形態」は、自然状態で見られ得る形態（例えば、組成物）である化合物を意味する。例えば、化合物が、自然界で該化合物とともに見られるその他の分子の少なくとも一部から精製および分離されている場合、該化合物は、天然に存在する形態ではない。
【００７３】
「天然に存在する化合物」は、自然界に見られ得る化合物、すなわち、人間によって設計されたものではない化合物をいう。天然に存在する化合物は、人間によって、または自然によって作製されたものであり得る。「天然に存在しない化合物」は、自然界に存在することが知られていないか、または自然界に存在しない化合物である。
【００７４】
「肥満」個体または肥満に苦しむ個体は、一般的に、少なくとも２５またはそれより大きいボディマス指数（ＢＭＩ）を有する個体である。肥満は、インスリン抵抗性と関連するもの、または関連しないものであり得る。
【００７５】
用語「非経口投与」および「非経口で投与される」は当該技術分野で明確に理解されており、経腸的および経表面的投与以外の、通常注射による投与様式をいい、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、気管経由、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊椎内、および胸骨内への注射および輸液が挙げられる。
【００７６】
「患者」、「被験体」、「個体」または「宿主」は、ヒトまたは非ヒト動物のいずれかをいう。
【００７７】
用語「同一性の割合」は、２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間の配列同一性をいう。同一性は、各々、比較の目的でアラインメントされ得る各配列の位置を比較することにより決定され得る。比較対象の配列の対応する位置が同じ塩基またはアミノ酸で占められている場合、該分子は該位置において同一であり、対応する部位が同じまたは類似のアミノ酸残基（例えば、立体構造的および／または電子的性質が類似する）で占められている場合、該分子は、該位置において相同（類似する）と称され得る。相同性、類似性または同一性のパーセントでの表示は、比較対象の配列が共有する位置における同一または類似のアミノ酸の数の関数を示す。相同性、類似性または同一性のパーセントでの表示は、比較対象の配列が共有する位置における同一または類似のアミノ酸の数の関数を示す。種々のアラインメントアルゴリズムおよび／またはプログラムが使用され得、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＥＮＴＲＥＺが挙げられる。ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴは、ＧＣＧ配列解析パッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）の一部として入手可能であり、例えば、デフォルト設定を伴って使用され得る。ＥＮＴＲＥＺは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤから入手可能である。一実施形態において、２つの配列の同一性割合は、ＧＣＧプログラムによって、ギャップウェイト１で、例えば、２つの配列間に単一のアミノ酸またはヌクレオチドミスマッチがあるものと仮定して各アミノ酸ギャップを加重（ｗｅｉｇｈｔ）して決定され得る。
【００７８】
アラインメントの他の手法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第２６６巻：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（１９９６），編集Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（Ｈａｒｃｏｕｒｔ  Ｂｒａｃｅ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡの一部門）に記載されている。好ましくは、配列内のギャップが許容されるアラインメントプログラムを用いて配列をアラインメントする。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列アラインメントにおけるギャップが許容されるアルゴリズムの一類型である（Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３−１８７（１９９７）を参照のこと）。また、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアラインメント法を用いるＧＡＰプログラムを、配列のアラインメントに用いてもよい。択一的な検索ストラテジーの１つは、ＭＰＳＲＣＨソフトウエアを使用するものであり、ＭＡＳＰＡＲコンピュータ上で実行する。ＭＰＳＲＣＨではＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用い、大規模並列処理コンピュータにおいて配列をスコアリングする。このアプローチにより、遠縁種間のマッチング（ｄｉｓｔａｎｔｌｙ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｔｃｈ）を見出せる能力が改善され、小ギャップおよびヌクレオチド配列エラーに特に許容性となる。核酸にコードされたアミノ酸配列を用い、タンパク質とＤＮＡの両方のデータベースを検索することができる。
【００７９】
用語「薬学的に許容され得る担体」は当該技術分野で明確に理解されており、任意の主題の組成物またはその成分を運搬または輸送することに関与する、薬学的に許容され得る材料、組成物または媒体、例えば、液状もしくは固形の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル封入材料をいう。各担体は、主題の組成物およびその成分と適合性であり、患者に対して有害でないという意味で「許容され得る」ものでなければならない。薬学的に許容され得る担体として供され得る材料の一部の例としては、（１）糖類、例えばラクトース、グルコースおよびスクロースなど；（２）デンプン、例えばコーンスターチおよびイモデンプンなど；（３）セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなど；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）賦形剤、例えばココアバターおよび坐剤用ワックスなど；（９）油類、例えばピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油および大豆油など；（１０）グリコール、例えばプロピレングリコールなど；（１１）ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなど；（１２）エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；など（１３）寒天；（１４）緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなど；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェンフリー水；（１７）等張生理食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）リン酸緩衝溶液；ならびに（２１）医薬製剤に用いられる他の無毒性の適合性の物質が挙げられる。
【００８０】
用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、互換的に用いる。これらは、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態であって、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはその類縁体のいずれかをいう。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有するものであり得、既知または未知の任意の機能を果たすものであり得る。以下：遺伝子または遺伝子断片のコード領域もまたは非コード領域、連鎖解析から規定される遺伝子座（１つまたは複数）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマーは、ポリヌクレオチドの非限定的な例である。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えば、メチル化されたヌクレオチドおよびヌクレオチド類縁体などを含むものであってもよい。ヌクレオチド構造に対する修飾は、存在させる場合は、該ポリマーの合成の前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって分断されていてもよい。ポリヌクレオチドは、例えば、標識成分とのコンジュゲーションなどによってさらに修飾されたものであってもよい。用語「組換え」ポリヌクレオチドは、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成、または自然界に存在しないか、もしくは天然にない構成で別のポリヌクレオチドに連結されているかのいずれかである合成起源のポリヌクレオチドを意味する。
【００８１】
用語「予防的」または「治療的」処置は当該技術分野で明確に理解されており、宿主への薬物の投与をいう。好ましくない状態（例えば、宿主動物の疾患または他の好ましくない状況）の臨床徴候の前に投与される場合、処置は予防的である、すなわち、宿主を好ましくない状態の発現から保護し、一方、好ましくない状態の徴候後に投与される場合、処置は治療的である（すなわち、既に存在する好ましくない状態またはこれによる副作用を減退、改善または維持することが意図される）。
【００８２】
用語「パイロジェンフリー」は、組成物に関して、該組成物が投与された被験体において、有害作用（例えば、刺激、発熱、炎症、下痢、呼吸困難、内毒素性ショックなど）をもたらし得る量のパイロジェンを含有しない組成物をいう。例えば、該用語は、内毒素（例えば、リポ多糖（ＬＰＳ）など）を含まないか、または実質的に含まない組成物を包含することが意図される。
【００８３】
細胞の「複製寿命」は、個々の「母細胞」から生じる娘細胞の数をいう。他方において、「年代的（ｃｈｒｏｎｏｌｏｇｉｃａｌ）加齢」または「年代的寿命」は、栄養を枯渇させた場合に非分裂細胞の集団が生存可能なままである時間の長さをいう。「細胞の寿命の増大」または「細胞の寿命」は、細胞または生物体に適用される場合、１つの細胞から生じる娘細胞の数の増加；細胞もしくは生物体がストレスに対処する能力、損傷（例えば、ＤＮＡ、タンパク質に対するもの）に対処する能力の増大；および／または細胞もしくは生物体が、特別な条件下、例えばストレス（例えば、熱ショック、浸透圧ストレス、高エネルギー放射線、化学的誘発型ストレス、ＤＮＡ損傷、不充分な塩レベル、不充分な窒素レベルもしくは不充分な栄養レベル）下で生存状態でより長期間生存および存在する能力の増大をいう。寿命は、本明細書に記載の方法を用いて、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％または２０％〜７０％、３０％〜６０％、４０％〜６０％またはそれ以上増大され得る。
【００８４】
「ＣＬＫ活性化化合物」は、ＣＬＫタンパク質のレベルを増加させる、および／またはＣＬＫタンパク質の少なくとも１つの活性を増大させる化合物をいう。例示的な一実施形態において、ＣＬＫ活性化化合物は、ＣＬＫタンパク質の少なくとも１つの生物学的活性を、少なくとも約１０％、２５％、５０％、７５％、１００％またはそれ以上増大させるものであり得る。ＣＬＫタンパク質の例示的な生物学的活性としては、例えば、キナーゼ活性、サーチュインタンパク質をリン酸化する能力、ＳＩＲＴ１タンパク質をリン酸化する能力、ＰＧＣ−１αをリン酸化する能力、ＳＲタンパク質をリン酸化する能力、自己リン酸化する能力、スプライシング因子をリン酸化する能力、スプライシングを調節する能力、サーチュインタンパク質に結合する能力、ＳＩＲＴ１タンパク質に結合する能力、またはＰＧＣ−１αに結合する能力が挙げられる。
【００８５】
「ＣＬＫ阻害化合物」は、ＣＬＫタンパク質のレベルを低下させる、および／またはＣＬＫタンパク質の少なくとも１つの活性を低下させる化合物をいう。ＣＬＫ阻害化合物の例は、米国特許出願公開公報第２００５／０１７１０２６号（「過剰キナーゼ誘導によって引き起こされる異常スプライシングを処置する治療用組成物」）に例示されているもの、または図１４に例示したものである。例示的な一実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物はＴＧ００３である。例示的な一実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、ＣＬＫタンパク質の少なくとも１つの生物学的活性を、少なくとも約１０％、２５％、５０％、７５％、１００％またはそれ以上低下させるものであり得る。ＣＬＫタンパク質の例示的な生物学的活性としては、例えば、キナーゼ活性、サーチュインタンパク質をリン酸化する能力、ＳＩＲＴ１タンパク質をリン酸化する能力、ＰＧＣ−１αをリン酸化する能力、ＳＲタンパク質をリン酸化する能力、自己リン酸化する能力、スプライシング因子をリン酸化する能力、スプライシングを調節する能力、サーチュインタンパク質に結合する能力、ＳＩＲＴ１タンパク質に結合する能力、またはＰＧＣ−１αに結合する能力が挙げられる。
【００８６】
「ＣＬＫモジュレート化合物」は、ＣＬＫタンパク質の活性および／またはレベルをモジュレートする化合物をいう。例示的な実施形態において、ＣＬＫモジュレート化合物は、ＣＬＫタンパク質の機能的特性または生物学的活性を上方調節する（例えば、活性化または刺激する）もの、下方調節する（例えば、阻害または抑制する）もの、あるいは変化させるもののいずれかであり得る。ＣＬＫモジュレート化合物は、直接または間接的にのいずれかでＣＬＫタンパク質をモジュレートする作用を行なうものであり得る。特定のある実施形態において、ＣＬＫモジュレート化合物は、ＣＬＫ活性化化合物またはＣＬＫ阻害化合物であり得る。
【００８７】
「サーチュインタンパク質」は、サーチュイン脱アセチル化酵素タンパク質ファミリーの一構成員、または好ましくは、ｓｉｒ２ファミリーをいい、酵母Ｓｉｒ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ５３６８５）、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｓｉｒ−２．１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿５０１９１２）、ならびにヒトＳＩＲＴ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１２２３８およびＮＰ＿０３６３７０（またはＡＦ０８３１０６））およびＳＩＲＴ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１２２３７、ＮＭ＿０３０５９３、ＮＰ＿０３６３６９、ＮＰ＿０８５０９６およびＡＦ０８３１０７）タンパク質が挙げられる。他のファミリー構成員としては、「ＨＳＴ遺伝子」と呼ばれる４種類のさらなる酵母Ｓｉｒ２様遺伝子（Ｓｉｒ２のホモログ）ＨＳＴｌ、ＨＳＴ２、ＨＳＴ３およびＨＳＴ４、ならびに５種類の他のヒトホモログｈＳＩＲＴ３、ｈＳＩＲＴ４、ｈＳＩＲＴ５、ｈＳＩＲＴ６およびｈＳＩＲＴ７（Ｂｒａｃｈｍａｎｎら（１９９５）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．９：２８８８およびＦｒｙｅら（１９９９）ＢＢＲＣ  ２６０：２７３）が挙げられる。好ましいサーチュインは、ＳＩＲＴ２よりもＳＩＲＴ１、すなわちｈＳＩＲＴ１および／またはＳｉｒ２と、より多く類似性を共有するもの、例えば、ＳＩＲＴ１に存在するがＳＩＲＴ２に存在しないＮ末端配列の少なくとも一部分（例えば、ＳＩＲＴ３が有するもの）を有する構成員などである。
【００８８】
「ＳＩＲＴ１タンパク質」は、サーチュイン脱アセチル化酵素のｓｉｒ２ファミリーの一構成員をいう。一実施形態において、ＳＩＲＴ１タンパク質としては、酵母Ｓｉｒ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ５３６８５）、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｓｉｒ−２．１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿５０１９１２）、ヒトＳＩＲＴ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１２２３８またはＮＰ＿０３６３７０（またはＡＦ０８３１０６））、およびヒトＳＩＲＴ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１２２３７、ＮＭ＿０３０５９３、ＮＰ＿０３６３６９、ＮＰ＿０８５０９６、またはＡＦ０８３１０７）タンパク質、ならびにその同等物および断片が挙げられる。別の実施形態において、ＳＩＲＴ１タンパク質としては、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０３６３７０、ＮＰ＿５０１９１２、ＮＰ＿０８５０９６、ＮＰ＿０３６３６９またはＰ５３６８５に示すアミノ酸配列からなるか、または本質的に該配列からなる配列を含むポリペプチドが挙げられる。ＳＩＲＴ１タンパク質としては、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０３６３７０、ＮＰ＿５０１９１２、ＮＰ＿０８５０９６、ＮＰ＿０３６３６９またはＰ５３６８５に示すアミノ酸配列；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０３６３７０、ＮＰ＿５０１９１２、ＮＰ＿０８５０９６、ＮＰ＿０３６３６９またはＰ５３６８５に示すアミノ酸配列であって、１〜約２、３、５、７、１０、１５、２０、３０、５０、７５またはそれより多くの同類アミノ酸置換を有する配列；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０３６３７０、ＮＰ＿５０１９１２、ＮＰ＿０８５０９６、ＮＰ＿０３６３６９またはＰ５３６８５と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列の全部または一部を含むポリペプチド、ならびにその機能性断片が挙げられる。また、本発明のポリペプチドには、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０３６３７０、ＮＰ＿５０１９１２、ＮＰ＿０８５０９６、ＮＰ＿０３６３６９またはＰ５３６８５のホモログ（例えば、オルソログおよびパラログ）、バリアントまたは断片も含まれる。
【００８９】
「ＳＩＲＴ３タンパク質」は、サーチュイン脱アセチル化酵素タンパク質ファミリーの一構成員および／またはＳＩＲＴ１タンパク質のホモログをいう。一実施形態において、ＳＩＲＴ３タンパク質としては、ヒトＳＩＲＴ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＨ０１０４２、ＮＰ＿０３６３７１またはＮＰ＿００１０１７５２４）タンパク質およびマウスＳＩＲＴ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０７１８７８）タンパク質、ならびにその同等物および断片が挙げられる。別の実施形態において、ＳＩＲＴ３タンパク質としては、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＨ０１０４２、ＮＰ＿０３６３７１、ＮＰ＿００１０１７５２４またはＮＰ＿０７１８７８に示すアミノ酸配列からなるか、または本質的に該配列からなる配列を含むポリペプチドが挙げられる。ＳＩＲＴ３タンパク質としては、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＡＨ０１０４２、ＮＰ＿０３６３７１、ＮＰ＿００１０１７５２４またはＮＰ＿０７１８７８に示すアミノ酸配列；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＨ０１０４２、ＮＰ＿０３６３７１、ＮＰ＿００１０１７５２４またはＮＰ＿０７１８７８に示すアミノ酸配列であって、１〜約２、３、５、７、１０、１５、２０、３０、５０、７５またはそれより多くの同類アミノ酸置換を有する配列；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＨ０１０４２、ＮＰ＿０３６３７１、ＮＰ＿００１０１７５２４またはＮＰ＿０７１８７８と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％と同一であるアミノ酸配列の全部または一部を含むポリペプチド、ならびにその機能的断片が挙げられる。また、本発明のポリペプチドとしては、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＨ０１０４２、ＮＰ＿０３６３７１、ＮＰ＿００１０１７５２４またはＮＰ＿０７１８７８のホモログ（例えば、オルソログおよびパラログ）、バリアントまたは断片が挙げられる。一実施形態において、ＳＩＲＴ３タンパク質としては、糸粒体基質プロセッシングペプチダーゼ（ＭＰＰ）および／またはミトコンドリア中間体ペプチダーゼ（ＭＩＰ）での切断によって生成されるＳＩＲＴ３タンパク質の断片が挙げられる。
【００９０】
用語「実質的に相同な」は、アミノ酸配列に関して用いる場合、配列が互いに実質的に同一であるかまたは類似しており、コンホメーションの相同性をもたらし、したがって、有用な程度に１つ以上の生物学的（例えば、免疫学的）活性の保持をもたらす配列をいう。該用語は、配列の共通の進化を暗に意味することは意図されない。
【００９１】
「サーチュイン活性化化合物」は、サーチュインタンパク質のレベルを増加させる、および／またはサーチュインタンパク質の少なくとも１つの活性を増大させる化合物をいう。例示的な一実施形態において、サーチュイン活性化化合物は、サーチュインタンパク質の少なくとも１つの生物学的活性を、少なくとも約１０％、２５％、５０％、７５％、１００％またはそれ以上増大させるものであり得る。サーチュインタンパク質の例示的な生物学的活性としては、脱アセチル化（例えば、ヒストンおよびｐ５３の）；寿命の延長；ゲノムの安定性の増大；転写のサイレンシング；ならびに母細胞と娘細胞間の酸化タンパク質の分離の制御が挙げられる。サーチュイン活性化化合物の例としては、例えば、レスベラトロール、ブテイン、フィセチン、ピセアタンノール、ケルセチン、ニコチンアミドリボシドおよび前述のものの誘導体、ならびに米国特許出願公開公報第２００５／０１３６５３７号に記載されたサーチュイン活性化化合物が挙げられる。例示的な一実施形態において、サーチュイン活性化化合物は、ＣＬＫタンパク質に対して実質的なモジュレート活性をもたないものである。
【００９２】
「サーチュイン阻害化合物」は、サーチュインタンパク質のレベルを低下させる、および／またはサーチュインタンパク質の少なくとも１つの活性を低下させる化合物をいう。例示的な一実施形態において、サーチュイン阻害化合物は、サーチュインタンパク質の少なくとも１つの生物学的活性を、少なくとも約１０％、２５％、５０％、７５％、１００％またはそれ以上低下させるものであり得る。サーチュインタンパク質の例示的な生物学的活性としては、脱アセチル化（例えば、ヒストンおよびｐ５３の）；寿命の延長；ゲノムの安定性の増大；転写のサイレンシング；ならびに母細胞と娘細胞間の酸化タンパク質の分離の制御が挙げられる。サーチュイン阻害化合物の例としては、例えば、サーチノールやスプリトミシンおよびその誘導体、ならびにに記載されたサーチュイン阻害化合物米国特許出願公開公報第２００５／０１３６５３７号が挙げられる。例示的な一実施形態において、サーチュイン阻害化合物は、ＣＬＫタンパク質に対して実質的なモジュレート活性をもたないものであり得る。
【００９３】
用語「ＰＧＣ−１αタンパク質」または「ＰＧＣ−１αタンパク質」または「ＰＧＣ１ａタンパク質」は、タンパク質のＰＰＡＲγコアクチベータ１（「ＰＧＣ−１」）ファミリーの一構成員をいう。ＰＧＣ−１αタンパク質の例としては、マウスＰＧＣ−１αおよびヒトＰＧＣ−１αタンパク質（これらは米国特許第６，９０８，９８７号に記載されている）ならびにそのホモログ（例えば、オルソログおよびパラログ）、バリアントまたは断片が挙げられる。ＰＧＣ−１αの例示的な断片としては、ＰＧＣ−１αタンパク質の少なくとも１つの生物学的活性、例えば、ＰＰＡＲγと相互用する（例えば、結合する）能力；ＰＰＡＲγ活性をモジュレートする能力；ＵＣＰ発現をモジュレートする能力；筋肉または脂肪細胞内での熱の産生（例えば、褐色脂肪細胞内での熱の産生）をモジュレートする能力；脂肪細胞または筋肉内での酸素消費をモジュレートする能力；脂質生成（例えば、褐色脂肪細胞への白色脂肪細胞の分化）をモジュレートする能力；細胞のインスリン感受性（例えば、筋肉細胞、肝臓細胞、脂肪細胞のインスリン感受性）をモジュレートする能力；核ホルモン受容体（例えば、甲状腺ホルモン受容体、エストロゲン受容体、レチノイン酸受容体）と相互用する（例えば、結合する）能力；核ホルモン受容体の活性をモジュレートする能力；または転写因子Ｃ／ＥＢＰαと相互用する（例えば、結合する）能力などと保持している断片が挙げられる。マウスＰＧＣ−１αのＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＡＡＨ６６８６８またはＯ７０３４であり、ヒトＰＧＣ−１αのＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＮＰ＿０３７３９３またはＱ９ＵＢＫ２である。
【００９４】
用語「合成の」は当該技術分野で明確に理解されており、インビトロでの化学的または酵素的合成による作製をいう。
【００９５】
用語「全身投与」、「全身に投与される」、「末梢投与」および「末梢に投与される」は当該技術分野で明確に理解されており、患者の系に侵入し、したがって代謝および他の同様のプロセスに供されるように、主題の組成物、治療用物質または他の物質を直接中枢神経系内に行なう以外で投与することをいう。
【００９６】
用語「治療用薬剤」は当該技術分野で明確に理解されており、被験体において局所または全身に作用する生物学的、生理学的または薬理学的に活性な物質である任意の化学的部分をいう。該用語はまた、疾患の診断、治癒、軽減、処置または予防における使用、あるいは動物またはヒトにおける望ましい身体的または精神的発達および／または状態の増強における使用が意図される任意の物質を意味する。
【００９７】
用語「治療効果」は当該技術分野で明確に理解されており、薬理学的に活性な物質によってもたらされる動物、特に哺乳動物、より特別にはヒトにおける局所性または全身性効果をいう。語句「治療有効量」は、任意の処置に適用可能な妥当な便益／リスク比で、いくらかの所望の局所または全身性効果がもたらされる、かかる物質の量を意味する。かかる物質の治療有効量は、処置対象の被験体および疾患状態、被験体の体重および年齢、疾患状態の重篤度、投与様式などに応じて異なり、当業者によって容易に決定され得る。例えば、本明細書に記載のある特定の組成物は、かかる処置に適用可能な妥当な便益／リスク比で所望の効果がもたらされるのに充分な量で投与され得る。
【００９８】
「転写調節配列」は、本明細書全体を通して、開始シグナル、エンハンサーおよびプロモーターなどの、これらが作動可能に連結されるタンパク質コード配列の転写を誘導または制御するＤＮＡ配列をいうために用いる総称である。好ましい実施形態において、タンパク質コード配列の転写は、発現が意図される細胞型において該タンパク質コード配列の発現を制御するプロモーター配列（または他の転写調節配列）の制御下にある。また、タンパク質コード配列は、該（ｔｈｒ）タンパク質コード配列の天然に存在する形態の遺伝子の転写を制御する配列と同じか、または異なる転写調節配列の制御下にあり得ることは理解されよう。
【００９９】
ある状態または疾患を「処置すること」とは、該状態または疾患の少なくとも１つの症状を治癒することならびに改善することをいう。
【０１００】
「ベクター」は、挿入された核酸分子を宿主細胞内に、および／または宿主細胞間で移送する自己複製性核酸分子である。該用語には、主に細胞内への核酸分子の挿入のための機能を果たすベクター、主に核酸の複製のための機能を果たす複製ベクター、ならびにＤＮＡまたはＲＮＡの転写および／または翻訳のための機能を果たす発現ベクターが含まれる。また、上記の１つより多くの機能を提供するベクターも含まれる。本明細書で用いる場合、「発現ベクター」は、適切な宿主細胞に導入されると、ポリペプチド（１つまたは複数）に転写および翻訳され得るポリヌクレオチドと規定する。例示的な実施形態において、発現ベクターは、タンパク質コード配列に作動可能に連結された１つ以上の転写調節配列を含む。「発現系」は、通常、所望の発現産物をもたらす機能を果たし得る発現ベクターを含む適当な宿主細胞を暗示する。
【０１０１】
用語「視力障害」は、処置（例えば、手術）すると、多くの場合、一部のみ可逆性または不可逆性である視力の低下をいう。特に重症な視力障害は、「盲目」または「失明」と称され、これは、完全な視力の喪失、矯正レンズで改善され得ない２０／２００より悪い視力、または２０度直径（１０度半径）未満の視野をいう。
【０１０２】
「ミトコンドリア機能のインジケータ（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）」は、当業者によって測定され得るミトコンドリア機能を示す任意のパラメータである。特定のある実施形態において、ミトコンドリア機能のインジケータは、ミトコンドリア電子伝達系酵素、クレブスサイクル酵素、糸粒体基質成分、ミトコンドリア膜成分またはＡＴＰ生合成因子である。他の実施形態において、ミトコンドリア機能のインジケータは、細胞あたりのミトコンドリアの数または細胞あたりのミトコンドリアの質量である。他の実施形態において、ミトコンドリア機能のインジケータは、ＡＴＰ生合成因子である。他の実施形態において、ミトコンドリア機能のインジケータは、ミトコンドリアあたりのＡＴＰの量、単位ミトコンドリアの質量あたりのＡＴＰの量、単位タンパク質あたりのＡＴＰの量、または単位ミトコンドリアタンパク質あたりのＡＴＰの量である。他の実施形態において、ミトコンドリア機能のインジケータは、フリーラジカル生成を含む。他の実施形態において、ミトコンドリア機能のインジケータは、細胞内カルシウムの上昇に対する細胞応答を含む。他の実施形態において、ミトコンドリア機能のインジケータは、ミトコンドリア酵素、例えば、非限定的な一例として、シトレートシンターゼ、ヘキソキナーゼＩＩ、シトクロムｃオキシダーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ、グリコーゲンホスホリラーゼ、クレアチンキナーゼ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸デヒドロゲナーゼまたはリンゴ酸デヒドロゲナーゼなどの活性である。他の実施形態において、ミトコンドリア機能のインジケータは、患者の細胞あたりのミトコンドリアＤＮＡの相対量または絶対量である。
【０１０３】
「ミトコンドリア機能の改善」または「ミトコンドリア機能の改変」は、それぞれ、（ａ）グルコース応答性の低下ならびにミトコンドリアの質量減少および／またはミトコンドリア機能の障害を有する細胞において、グルコース応答性の少なくとも１つのインジケータを、実質的に（例えば、統計学的に有意な様式で、好ましくは、予後、臨床スコアまたは成績などの臨床パラメータの統計学的に有意な改善を促進する様式で）正常レベルまで回復させること；あるいは（ｂ）ミトコンドリア機能の障害を有する細胞、または正常なミトコンドリア機能を有する細胞において、少なくとも１つのミトコンドリア機能のインジケータを、実質的に（例えば、統計学的に有意な様式で、好ましくは、予後、臨床スコアまたは成績などの臨床パラメータの統計学的に有意な改善を促進する様式で）正常レベルまで回復させること、または正常レベルより上および超えるレベルまで増加させることを示し得る。ミトコンドリア機能の改善または改変は、ミトコンドリア遺伝子とミトコンドリア外遺伝子および／またはその遺伝子産物間の直接的な相互作用における、あるいは、かかる相互作用の結果、形成され得る中間体（例えば、代謝産物、異化代謝産物、基質、前駆物質、補因子）間の相互作用の結果として起こる構造的または機能的変化における、ミトコンドリア外の構造または事象の変化、ならびにミトコンドリアの構造または事象によってもたらされ得る。
【０１０４】
「ミトコンドリア機能の障害」としては、生物学的供給源の細胞の一部または全部における任意の呼吸性、代謝性または他の生化学的もしくは生物物理学的活性のレベルおよび／または割合の完全または一部減少、阻害、減退、低下または他の障害が挙げられ得る。非限定的な例として、電子伝達系（ＥＴＣ）活性の著しい障害は、ミトコンドリア機能の障害と関連するものであり得、これは、反応性酸素種（ＲＯＳ）の増加または酸化的リン酸化の欠陥が生じるためであり得る。さらなる例として、ミトコンドリア膜電位の改変、アポトーシス経路の誘導ならびに細胞内での典型的な化学的および生化学的架橋種の形成（酵素的または非酵素的いずれかの機構）は、すべて、ミトコンドリア機能を示すとみなされ得る。ミトコンドリア機能の障害のこれらのおよび他の非限定的な例を、以下にさらに詳細に記載する。
【０１０５】
本明細書で用いる他の技術用語は、該用語が使用される技術分野におけるその通常の意味を有し、さまざまな専門辞典、例えば、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｓｔｅｄｍａｎ’ｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙに例示されている。
【０１０６】
２．例示的な使用
特定のある態様において、本発明は、ＣＬＫタンパク質のレベルおよび／または活性をモジュレートするための方法、ならびにその使用方法を提供する。
【０１０７】
特定のある実施形態において、本発明は、ＣＬＫ阻害化合物を使用するための方法を提供する。ＣＬＫ阻害化合物は、さまざまな治療適用用途、例えば、細胞の寿命の増大、ならびに多種多様な疾患および障害、例えば、加齢もしくはストレスに関連する疾患もしくは障害、糖尿病、肥満、神経変性疾患、心血管疾患、血液凝固障害、炎症、癌および／または紅潮などの処置および／または予防などに有用であり得る。ＣＬＫ阻害化合物はまた、筋肉機能の増強、筋肉ＡＴＰレベルの増加、または低酸素症もしくは虚血と関連している筋肉組織の損傷の処置もしくは予防のために、被験体において、ミトコンドリア活性の増大から利益を受ける疾患または障害を処置するために使用され得る。該方法は、医薬有効量のＣＬＫ阻害化合物を、それを必要とする被験体に投与することを含む。
【０１０８】
他の実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、さまざまな治療適用用途、例えば、ストレスに対する細胞の感受性の増大（放射線感受性および／または化学的感受性の増大を含む）、アポトーシスの量および／または速度の増大、癌の処置（任意選択で、別の化学療法剤との組合せで）、食欲の刺激および／または体重増加の刺激などに有用であり得る。該方法は、医薬有効量のＣＬＫ阻害化合物を、それを必要とする被験体に投与することを含む。
【０１０９】
特定のある実施形態において、本明細書に記載のＣＬＫモジュレート化合物は、単独または他の化合物との組合せで摂取され得る。一実施形態において、２種類以上のＣＬＫモジュレート化合物の混合物が、それを必要とする被験体に投与され得る。別の実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、１種類以上のサーチュイン活性化化合物とともに投与され得る。例示的なサーチュイン活性化化合物としては、例えば、レスベラトロール、ブテイン、フィセチン、ピセアタンノール、ケルセチン、ニコチンアミドリボシド、および前述のものの誘導体または類縁体、ならびに米国特許出願公開公報第２００５／０１３６５３７号に記載されたサーチュイン活性化化合物が挙げられる。例示的な一実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、ニコチン酸との組合せで投与され得る。別の実施形態において、ＣＬＫ活性化化合物は、１種類以上のサーチュイン阻害化合物とともに投与され得る。例示的なサーチュイン阻害化合物としては、例えば、ニコチンアミド（ＮＡＭ）、スラニム（ｓｕｒａｎｉｍ）；ＮＦ０２３  （Ｇタンパク質アンタゴニスト）；ＮＦ２７９（プリン（ｐｕｒｉｎｅｒｇｉｃ）受容体アンタゴニスト）；トロロックス（６−ヒドロキシ−２，５，７，８，テトラメチルクロマン−２−カルボン酸）；（−）−エピガロカテキン（３、５、７、３’、４’、５’  位上にヒドロキシ）；（−）−エピガロカテキンガレート（ヒドロキシが５、７、３’、４’、５’位およびガレートエステルが３位）；塩化（ｃｈｏｌｏｒｉｄｅ）シアニジン（３，５，７，３’，４’−ペンタヒドロキシフラビリウムクロリド）；デルフィニジンクロリド（３，５，７，３’，４’，５’−ヘキサヒドロキシフラビリウムクロリド）；ミリセチン（カンナビスセチン；３，５，７，３’，４’，５’−ヘキサヒドロキシフラボン）；３，７，３’，４’，５’−ペンタヒドロキシフラボン；ゴシッペチン（３，５，７，８，３’，４’−ヘキサヒドロキシフラボン）；サーチノール；スプリトミシン（例えば、Ｈｏｗｉｔｚら（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  ４２５：１９１；Ｇｒｏｚｉｎｇｅｒら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３８８３７；Ｄｅｄａｌｏｖら（２００１）ＰＮＡＳ  ９８：１５１１３；およびＨｉｒａｏら（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７８：５２７７３を参照のこと）；ならびに米国特許出願公開公報第２００５／０１３６５３７号に記載されたサーチュイン阻害化合物が挙げられる。また別の実施形態において、１種類以上のＣＬＫモジュレート化合物は、種々の疾患、例えば、癌、糖尿病、神経変性疾患、心血管疾患、血液凝固、炎症、紅潮、肥満、加齢、ストレス、眼の障害などの処置または予防のための１種類以上の治療用薬剤とともに投与され得る。別の実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、ミトコンドリアバイオジェネシス、ミトコンドリア活性および／または筋肉機能を促進する１種類以上の薬剤とともに投与され得る。種々の実施形態において、ＣＬＫモジュレート化合物を含む併用療法剤は、（１）１種類以上のＣＬＫモジュレート化合物を、１種類以上の治療用薬剤との組合せで含む医薬組成物；および（２）１種類以上のＣＬＫモジュレート化合物と１種類以上��治療用薬剤との共投与（このとき、ＣＬＫモジュレート化合物および治療用薬剤は、同じ組成物内に製剤化されたものではない）を示すものであり得る。別々の製剤を使用する場合、ＣＬＫモジュレート化合物は、別の治療用薬剤の投与と同時、断続的、時差的、その前、その後またはこれらの組合せで投与され得る。
【０１１０】
特定のある実施形態において、ＣＬＫタンパク質の活性化を伴う疾患または障害を低減、予防または処置するための方法は、ＣＬＫ（例えば、ヒトＣＬＫ１、ＣＬＫ２、ＣＬＫ３および／またはＣＬＫ４あるいはそのホモログのタンパク質レベルを増大させることを含み得る。タンパク質レベルの増加は、細胞内に１コピー以上のＣＬＫタンパク質をコードする核酸を導入することによりなされ得る。例えば、ＣＬＫタンパク質のレベルは、哺乳動物細胞において、哺乳動物細胞内にＣＬＫタンパク質をコードする核酸を導入することにより増大され得る、例えば、ＣＬＫ１のレベルは、配列番号：１で示されるアミノ酸配列をコードする核酸を導入することにより増大される、および／またはＣＬＫ２のレベルは、配列番号：２で示されるアミノ酸配列をコードする核酸を導入することにより増大される、および／またはＣＬＫ３のレベルは、配列番号：３で示されるアミノ酸配列をコードする核酸を導入することにより増大される、および／またはＣＬＫ４のレベル配列番号：４で示されるアミノ酸配列をコードする核酸を導入することにより増大される。該核酸は、ＣＬＫ１、ＣＬＫ２、ＣＬＫ３および／またはＣＬＫ４核酸の発現を調節する転写調節配列（例えば、プロモーター）の制御下に存在するものであり得る。あるいはまた、該核酸は、細胞のゲノム内のプロモーターの下流の位置に導入され得る。このような方法を用いてタンパク質のレベルを増大させるための方法は、当該技術分野でよく知られている。
【０１１１】
ＣＬＫのタンパク質レベルを増大させるために細胞内に導入される核酸は、ＣＬＫ配列、例えば、ＣＬＫ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ４９７５９および番号ＡＡＨ３１５４９）、ＣＬＫ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００３９８４およびＡＡＨ５３６０３）、ＣＬＫ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ４９７６１およびＡＡＨ１９８８１）および／またはＣＬＫ４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｑ９ＨＡＺ１またはＮＰ＿０６５７１７）タンパク質と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であるタンパク質をコードするものであり得る。例えば、該タンパク質をコードする核酸は、ＣＬＫ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０３１５４９）、ＣＬＫ２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０５３６０３）、ＣＬＫ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０１９８８１）および／またはＣＬＫ４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２０６６６）タンパク質をコードする核酸と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であり得る。該核酸はまた、好ましくは、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、野生型ＣＬＫ、例えば、ＣＬＫ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ４９７５９および番号ＡＡＨ３１５４９）、ＣＬＫ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００３９８４およびＡＡＨ５３６０３）、ＣＬＫ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０１９８８１）および／またはＣＬＫ４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２０６６６）タンパク質をコードする核酸
にハイブリダイズする核酸であり得る。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件としては、０．２×ＳＳＣ中６５℃でのハイブリダイゼーションおよび洗浄が挙げられ得る。野生型ＣＬＫタンパク質（例えば、野生型ＣＬＫの断片であるタンパク質など）と異なるタンパク質をコードする核酸を使用する場合、該タンパク質は、好ましくは、生物学的に活性である（例えば、基質ポリペプチドをリン酸化し得るものである）。必要なのは、細胞内で、ＣＬＫの生物学的に活性な部分を発現させることである。タンパク質が生物学的機能（例えば、リン酸化能力）を保持しているか否かは、当該技術分野で知られた方法に従って判定され得る。
【０１１２】
特定のある実施形態において、ＣＬＫタンパク質活性の阻害を伴う疾患または障害を低減、予防または処置するための方法は、１種類以上のＣＬＫタンパク質（例えば、ヒトＣＬＫ１、ＣＬＫ２、ＣＬＫ３および／またはＣＬＫ４あるいはそのホモログのタンパク質レベルを低下させることを含み得る。ＣＬＫタンパク質レベルの低下は、当該技術分野で知られた方法に従ってなされ得る。例えば、ＣＬＫタンパク質をコードする核酸に標的化されるｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸またはリボザイムが、細胞内に導入され、発現され得る。ドミナントネガティブＣＬＫ変異型、例えば、キナーゼ活性をもたない変異型もまた使用され得る。あるいはまた、転写を阻害する薬剤を用いてＣＬＫ発現を低減させ得る。
【０１１３】
ＣＬＫタンパク質レベルをモジュレートするための方法には、ＣＬＫをコードする遺伝子の転写をモジュレートするための方法、対応するｍＲＮＡを安定化／不安定化させるための方法、および当該技術分野で知られた他の方法も含まれる。
【０１１４】
特定のある実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、選択的、非正常（ａｂｎｏｒｍａｌ）、異常（ａｂｅｒｒａｎｔ）または望ましくないスプライシング（例えば、スプライス部位周囲の変異に関連する非正常スプライシング、スプライス部位の変異に関連していない非正常スプライシング、特定のスプライス部位の高すぎる、もしくは低すぎるスプライシングのレベルと関連している非正常スプライシング、および／またはスプライス部位の選択と関連している非正常スプライシングと関連している疾患および障害を処置および／または予防するために使用されるものではない。例示的な実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、以下の疾患または障害：β−サラセミア、ＦＴＤＰ−１７、ＮＦ２、ＦＲＡＳＩＥＲ、ウィルムス腫、乳癌、卵巣癌、腎臓癌、肺癌、尿路上皮癌、胃癌、甲状腺乳頭癌、ＨＮＳＣＣ、浸潤性乳癌、骨巨細胞腫、前立腺癌、黒色腫、リンパ腫、口腔癌、咽頭癌、早老症、神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、脊髄小脳性運動失調症、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）ならびに癲癇、進行性核上性麻痺および／またはピック病の１種類以上を処置および／または予防するために使用されるものではない。
ｉ．加齢／ストレス
一実施形態において、本発明は、細胞をＣＬＫ阻害化合物と接触させることにより、細胞の寿命を延長する、細胞の増殖能を拡張する、細胞の加齢を遅滞させる、細胞の生存を促進する、細胞において細胞老化を遅延させる、カロリー制限の効果を模倣する、ストレスに対する細胞の抵抗性を増大させる、または細胞のアポトーシスを抑制する方法を提供する。
【０１１５】
本明細書に記載の方法は、細胞、特に一次細胞（すなわち、生物体、例えば、ヒトから得た細胞）が、細胞培養状態で生きたまま維持され得る時間量を増大させるために使用され得る。胚性幹（ＥＳ）細胞および多能性細胞、ならびにこれらから分化した細胞もまた、該細胞またはその子孫を培養状態で長期間維持するために、ＣＬＫ阻害化合物で処理され得る。また、かかる細胞は、例えばエキソビボ修飾後に、被験体内への移植のために使用され得る。
【０１１６】
一実施形態において、長期間保存することが意図される細胞が、ＣＬＫ阻害化合物で処理され得る。該細胞は、懸濁状態（例えば、血球、血清、生物学的増殖培地など）または組織または器官内のものであり得る。例えば、輸血の目的で個体から採取された血液が、該血球を長期間保存するためにＣＬＫ阻害化合物で処理され得る。法医学的な目的に使用される血液もまた、ＣＬＫ阻害化合物を用いて保存され得る。その寿命を延長するため、またはアポトーシスに対する保護のために処理され得る他の細胞としては、消費のための細胞、例えば、非ヒト哺乳動物由来の細胞（例えば、食肉など）または植物細胞（例えば、野菜など）が挙げられる。
【０１１７】
ＣＬＫ阻害化合物はまた、発達および／または成長過程を改変、遅延または加速させるために、哺乳動物、植物、昆虫または微生物の発達期および成長期に適用され得る。
【０１１８】
別の実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、移植または細胞療法に有用な細胞、例えば、充実性組織移植片、移植臓器、細胞懸濁物、幹細胞、骨髄細胞などを処理するために使用され得る。該細胞または組織は、自己移植片、同種移植片、同族移植片または異種移植であり得る。該細胞または組織はＣＬＫ阻害化合物で、被験体内への投与／移植前、投与／移植と同時および／または投与／移植後に処理され得る。該細胞または組織は、ドナー個体から細胞を取り出す前、ドナー個体から細胞もしくは組織を取り出した後エキソビボで、またはレシピエントへの移植後に処理され得る。例えば、ドナーまたはレシピエント個体は、ＣＬＫ阻害化合物で全身処理されてもよく、ＣＬＫ阻害化合物で局所処理された細胞／組織のサブセットを有していてもよい。ある特定の実施形態では、細胞または組織（あるいはドナー／レシピエント個体）は、移植片の生存を延長させるのに有用な別の治療用薬剤、例えば、免疫抑制剤、サイトカイン、血管形成因子などでさらに処理され得る。
【０１１９】
また他の実施形態において、細胞は、例えば、その寿命を増大させるため、またはアポトーシスを抑制するために、インビボにてＣＬＫ阻害化合物で処理され得る。例えば、皮膚は、皮膚または上皮細胞をＣＬＫ阻害化合物で処理することにより、加齢（例えば、しわの発生、弾力性の喪失など）から保護され得る。例示的な一実施形態において、皮膚を、ＣＬＫ阻害化合物を含む医薬用または化粧用組成物と接触させる。本明細書に記載の方法に従って処理され得る例示的な皮膚罹病状態または皮膚状態としては、炎症、日焼けによる損傷または自然な加齢と関連するか、またはこれらによって引き起こされる障害または疾患が挙げられる。例えば、ＣＬＫ阻害化合物を含む組成物には、接触皮膚炎（例えば、刺激性接触皮膚炎およびアレルギー性接触皮膚炎）、アトピー性皮膚炎（アレルギー性湿疹としても知られる）、光線性角化症、角質化障害（例えば、湿疹）、表皮水疱症疾患（例えば、天疱瘡（ｐｅｎｆｉｇｕｓ））、剥脱性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、紅斑（例えば、多形性紅斑および結節性紅斑）、日光または他の光源によって引き起こされる損傷、円板状エリテマトーデス、皮膚筋炎、乾癬、皮膚癌ならびに自然な加齢の影響の予防または処置における有用性が見出される。別の実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、治癒を促進させるために、創傷および／または火傷、例えば、１、２または３度の火傷および／または熱、化学薬品もしくは電気による火傷などの処置のために使用され得る。該製剤は、経表面的に皮膚または粘膜組織に、軟膏、ローション剤、クリーム剤、マイクロエマルジョン剤、ゲル剤、液剤などとして（本明細書においてさらに記載する）、所望の結果をもたらすのに有効な投薬レジメンの状況において投与され得る。
【０１２０】
１種類以上のＣＬＫ阻害化合物を含む経表面的製剤はまた、予防用、例えば、化学予防用組成物として使用され得る。化学予防的方法において使用される場合、易感染性の皮膚を、特定の個体においてなんらかの可視的な状態が現れる前に処理する。
【０１２１】
ＣＬＫ阻害化合物は、被験体に対して局所または全身に送達され得る。一実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、注射、経表面的製剤などによって、被験体の組織または器官に対して局所に送達される。
【０１２２】
別の実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、被験体において細胞老化によって誘発されるか、または悪化する疾患または状態を処置または予防するため；例えば、老化の開始後、被験体の老化の速度を減少させるための方法；被験体の寿命延長するための方法；寿命に関連する疾患または状態を処置または予防するための方法；細胞の増殖能に関連する疾患または状態を処置または予防するための方法；および細胞損傷または細胞死に起因する疾患または状態を処置または予防するための方法に使用され得る。ある特定の実施形態において、該方法は、被験体の寿命を縮める疾患の発生速度を減少させることにより作用するものではない。ある特定の実施形態において、該方法は、癌などの疾患によって引き起こされる致死性を低下させることにより作用するものではない。
【０１２３】
また別の実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は被験体に対して、一般的に、その細胞の寿命を増大させるため、ならびにその細胞をストレスおよび／またはアポトーシスに対して保護するために投与され得る。被験体を本明細書に記載の化合物で処置することは、被験体をホルメシスに供すること、すなわち、生物体に有益であり、その寿命を延長し得る軽度のストレスに供することに似ていると考えられる。
【０１２４】
ＣＬＫ阻害化合物は被験体に対して、加齢および加齢関連の影響または疾患、例えば、脳卒中、心臓疾患、心不全、関節炎、高血圧およびアルツハイマー病などを予防するために投与され得る。処置され得る他の状態としては、眼障害（例えば、眼の加齢に伴うもの）、例えば、白内障、緑内障および黄斑変性症などが挙げられる。ＣＬＫ阻害化合物はまた、被験体に対して、疾患、例えば、細胞死と関連する慢性疾患の処置のため、細胞を細胞死から保護するために投与され得る。例示的な疾患としては、神経細胞死、ニューロン機能不全または筋細胞の死もしくは機能不全と関連しているもの、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｎｉｏｔｒｏｐｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）および筋ジストロフィー；ＡＩＤＳ；劇症肝炎；脳の変性に関連する疾患、例えば、クロイツフェルト−ヤーコプ病、色素性網膜炎および小脳変性など；骨髄異形成、例えば、無形成貧血など；虚血性疾患、例えば、心筋梗塞および脳卒中など；肝臓疾患、例えば、アルコール性肝炎、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎など；関節疾患、例えば、変形性関節症など；アテローム性動脈硬化；脱毛症；ＵＶ光による皮膚に対する損傷；扁平苔癬；皮膚の萎縮；白内障；ならびに移植片拒絶などが挙げられる。細胞死はまた、手術、薬物療法、化学的曝露または放射線曝露によっても引き起こされ得る。
【０１２５】
ＣＬＫ阻害化合物はまた、急性疾患、例えば器官または組織に対する損傷に苦しむ被験体、例えば、脳卒中もしくは心筋梗塞を患う被験体または脊髄損傷に苦しむ被験体に投与され得る。ＣＬＫ阻害化合物はまた、アルコール性肝を修復するために使用され得る。
ｉｉ．心血管疾患
別の実施形態において、本発明は、ＣＬＫ阻害化合物を、それを必要とする被験体に投与することによる、心血管疾患を処置および／または予防するための方法を提供する。
【０１２６】
ＣＬＫ阻害化合物を用いて処置または予防され得る心血管疾患としては、心筋症または心筋炎；例えば、特発性心筋症、代謝性  心筋症、アルコール性心筋症、薬物誘発性心筋症、虚血性心筋症および高血圧性心筋症などが挙げられる。また、ＣＬＫ阻害化合物および本明細書に記載の方法を用いて処置可能または予防可能であるのは、主要血管（大血管疾患）、例えば、大動脈、冠状動脈、頚動脈、脳血管の動脈、腎動脈、腸管動脈、大腿動脈および膝窩動脈などのアテローム性障害である。処置または予防され得る他の血管疾患としては、網膜細動脈、糸球体細動脈、神経の脈管、心臓細動脈、ならびに目、腎臓、心臓ならびに中枢神経系および末梢神経系の関連する毛細血管床と関連するものが挙げられる。ＣＬＫ阻害化合物はまた、個体の血漿中ＨＤＬレベルを増大させるために使用され得る。
【０１２７】
ＣＬＫ阻害化合物で処理され得るまた他の障害としては、再狭窄（例えば、冠動脈インターベンション後）ならびに高密度および低密度コレステロールの非正常レベルに関連する障害が挙げられる。
【０１２８】
一実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、別の心血管作動薬、例えば、抗不整脈剤、抗高血圧剤、カルシウムチャネル遮断薬、心筋保護（ｃａｒｄｉｏｐｌｅｇｉｃ）液、強心剤、線維素溶解剤、硬化液、血管収縮剤、血管拡張剤、一酸化窒素供与体、カリウムチャネル遮断薬、ナトリウムチャネル遮断薬、スタチンまたはナトリウム排泄増加（ｎａｔｕｒｉｕｒｅｔｉｃ）剤などとの併用療法剤の一部として投与され得る。
【０１２９】
一実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、抗不整脈薬剤との併用療法剤の一部として投与され得る。抗不整脈薬剤は、多くの場合、その作用機序に従って、主な４つの群：Ｉ型、ナトリウムチャネル遮断；ＩＩ型、β−アドレナリン作動遮断；ＩＩＩ型、再分極延長；およびＩＶ型、カルシウムチャネル遮断に体系化される。Ｉ型抗不整脈剤としては、リドカイン、モリシジン、メキシレチン、トカイニド、プロカインアミド、エンカイニド、フレカイニド、トカイニド、フェニトイン、プロパフェノン、キニジン、ジソピラミド、およびフレカイニドが挙げられる。ＩＩ型抗不整脈剤としては、プロプラノロールおよびエスモロールが挙げられる。ＩＩＩ型としては、作用可能性の持続期間を延長することにより作用する薬剤、例えば、アミオダロン、アルチリド、ブレチリウム、クロフィリウム、イソブチリド、ソタロール、アジミリド、ドフェチリド、ドロネダロン、エルセンチリド、イブチリド、テジサミル、およびトレセチリドなどが挙げられる。ＩＶ型抗不整脈剤としては、ベラパミル、ジルチアゼム（ｄｉｌｔａｉｚｅｍ）、ジギタリス、アデノシン、塩化ニッケル、およびマグネシウムイオンが挙げられる。
【０１３０】
別の実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、別の心血管作動薬との併用療法剤の一部として投与され得る。心血管作動薬の例としては、血管拡張薬、例えば、ヒドララジン；アンギオテンシン変換酵素阻害剤、例えば、カプトプリル；抗狭心症剤、例えば、硝酸イソソルビド、トリニトログリセリンおよびペンタエリスリトールテトラニトレート；抗不整脈剤、例えば、キニジン、プロカインアルチド（ｐｒｏｃａｉｎａｌｔｉｄｅ）およびリグノカイン；心臓グリコシド（ｃａｒｄｉｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）、例えば、ジゴキシンおよびジギトキシン；カルシウムアンタゴニスト、例えば、ベラパミルおよびニフェジピン；利尿薬、例えば、チアザイド系および関連化合物、例えば、ベンドロフルアザイド、クロロチアザイド、クロロサリドン、ヒドロクロロチアザイドおよび他の利尿薬、例えば、フルセミドおよびトリアムテレン、ならびに鎮静薬、例えば、ニトラゼパム、フルラゼパムおよびジアゼパムが挙げられる。
【０１３１】
他の例示的な心血管作動薬としては、例えば、シクロオキシゲナーゼ阻害剤（アスピリンまたはインドメタシンなど）、血小板凝集阻害剤（クロピドグレル、チクロピジン（ｔｉｃｌｏｐｉｄｅｎｅ）またはアスピリンなど）、フィブリノゲンアンタゴニストまたは利尿薬（クロロチアザイド、ヒドロクロロチアザイド、フルメチアザイド、ヒドロフルメチアザイド、ベンドロフルメチアザイド、メチルクロルチアザイド、トリクロロメチアザイド、ポリチアザイドまたはベンズチアザイドならびにエタクリン酸トリクリナフェン（ｔｒｉｃｒｙｎａｆｅｎ）、クロルタリドン、フロセミド、ムソリミン（ｍｕｓｏｌｉｍｉｎｅ）、ブメタニド、トリアムテレン、アミロライドおよびスピロノラクトンならびにかかる化合物の塩など）、アンギオテンシン変換酵素阻害剤（カプトプリル、ゾフェノプリル、フォシノプリル、エナラプリル、セラノプリル、シラゾプリル（ｃｉｌａｚｏプリル）、デラプリル、ペントプリル、キナプリル、ラミプリル、リシノプリル、ならびにかかる化合物の塩など）、アンギオテンシンＩＩアンタゴニスト（ロサルタン、イルベサルタンまたはバルサルタンなど）、血栓溶解剤（組織プラスミノゲンアクチベータ（ｔＰＡ）、組換えｔＰＡ、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、およびアニソイレート化プラスミノゲンストレプトキナーゼアクチベータ複合体（ＡＰＳＡＣ、Ｅｍｉｎａｓｅ，Ｂｅｅｃｈａｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、または動物唾液腺プラスミノゲンアクチベータなど）、カルシウムチャネル遮断剤（ベラパミル、ニフェジピンまたはジルチアゼムなど）、トロンボキサン受容体アンタゴニスト（イフェトロバン、プロスタサイクリン模倣物、またはホスホジエステラーゼ阻害剤など）が挙げられる。かかる併用製剤は、固定用量として製剤化される場合、上記に記載の用量範囲内の本発明の化合物、およびその承認された用量範囲のその他の薬学的に活性な薬剤が使用される。
【０１３２】
また他の例示的な心血管作動薬としては、例えば、血管拡張薬、例えば、ベンシクラン、シンナリジン、シチコリン、シクランデラート、シクロニケート、エブマモニン、フェノキセジル、フルナリジン、イブジラスト、イフェンプロジル、ロメリジン、ナフロール、ニカメート（ｎｉｋａｍａｔｅ）、ノセルゴリン、ニモジピン、パパベリン、ペンチフィリン、ノフェドリン（ｎｏｆｅｄｏｌｉｎｅ）、ビンカミン、ビンポセチン、ビキジル、ペントキシフィリン、プロスタサイクリン誘導体（プロスタグランジンＥ１およびプロスタグランジンＩ２など）、エンドセリン受容体遮断薬（ボセンタンなど）、ジルチアゼム、ニコランジル、およびニトログリセリンが挙げられる。脳保護薬の例としては、ラジカルスカベンジャー（エダラボン、ビタミンＥ、およびビタミンＣなど）、グルタミン酸アンタゴニスト、ＡＭＰＡアンタゴニスト、カイニン酸アンタゴニスト、ＮＭＤＡアンタゴニスト、ＧＡＢＡアゴニスト、増殖因子、オピオイドアンタゴニスト、ホスファチジルコリン前駆物質、セロトニンアゴニスト、Ｎａ＋／Ｃａ２＋チャネル阻害薬、およびＫ＋チャネル開放薬が挙げられる。脳代謝刺激薬の例としては、アマンタジン、チアプリド、およびγ−アミノ酪酸が挙げられる。抗凝固剤の例としては、ヘパリン類（ヘパリンナトリウム、ヘパリンカリウム、ダルテパリンナトリウム、ダルテパリンカルシウム、ヘパリンカルシウム、パナパリンナトリウム、レビパリンナトリウム、およびダナパロイドナトリウムなど）、ワルファリン、エノキサパリン、アルガトロバン、バトロキソビン、およびクエン酸ナトリウムが挙げられる。抗血小板薬の例としては、チクロピジン塩酸塩、ジピリダモール、シロスタゾール、イコサペント酸エチル、サルポグレラート塩酸塩、ジラゼプ塩酸塩、トラピジル、非ステロイド系抗炎症性薬剤（アスピリンなど）、ベラプロストナトリウム、イロプロスト、およびインドブフェンが挙げられる。血栓溶解薬の例としては、ウロキナーゼ、組織型プラスミノゲンアクチベータ（アルテプラーゼ、チソキナーゼ、ナテプラーゼ、パミテプラーゼ、モンテプラーゼ、およびラテプラーゼなど）、ならびにナサルプラーゼが挙げられる。抗高血圧性薬物の例としては、アンギオテンシン変換酵素阻害剤（カプトプリル、アラセプリル、リシノプリル、イミダプリル、キナプリル、テモカプリル、デラプリル、ベナゼプリル、シラザプリル、トランドラプリル、エナラプリル、セロナプリル、フォシノプリル、イマダプリル、モベルトプリル、ペリンドプリル、ラミプリル、スピラプリル、およびランドラプリルなど）、アンギオテンシンＩＩアンタゴニスト（ロサルタン、カンデサルタン、バルサルタン、エプロサルタン、およびイルベサルタンなど）、カルシウムチャネル遮断薬（アラニジピン、エホニジピン、ニカルジピン、バミジピン、ベニジピン、マニジピン、シルニジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン、ニフェジピン、ニルバジピン、フェロジピン、アムロジピン、ジルチアゼム、ベプリジル、クレンチアゼム、フェンジリン、ガロパミル、ミベフラジル、プレニルアミン、セモチアジル、テロジリン、ベラパミル、シルニジピン、エルゴジピン、イスラジピン、ラシジピン、���ルカニジピン、ニモジピン、シンナリジン、フルナリジン、リドフラジン、ロメリジン、ベンシクラン、エタフェノン、およびペルヘキシリンなど）、β−アドレナリン受容体遮断薬（プロプラノロール、ピンドロール、インデノロール、カルテオロール、ブニトロロール、アテノロール、アセブトロール、メトプロロール、チモロール、ニプラジロール、ペンブトロール、ナドロール、チリソロール、カルベジロール、ビソプロロール、ベタキソロール、セリプロロール、ボピンドロール、ベバントロール、ラベタロール、アルプレノロール、アモスラロール、アロチノロール、ベフノロール、ブクモロール、ブフェトロール、ブフェラロール、ブプランドロール、ブチリジン、ブトフィロロール、カラゾロール、セタモロール、クロラノロール、ジレバロール、エパノロール、レボブノロール、メピンドロール、メチプラノロール、モプロロール、ナドキソロール、ネビボロール、オキシプレノロール、プラクトール、プロネタロール、ソタロール、スフィナロール、タリンドロール、テトラロール、トリプロロール、キシベノロール、およびエスモロール）、α−受容体遮断薬（アモスラロール、プラゾシン、テラゾシン、ドキサゾシン、ブナゾシン、ウラピジル、フェントールアミン、アロチノロール、ダピプラゾール、フェンスピリド、インドラミン、ラベタロール、ナフトピジル、ニセルゴリン、タムスロシン、トラゾリン、トリマゾシン、およびヨヒンビンなど）、交感神経阻害剤（クロニジン、グアンファシン、グアナベンツ、メチルドパ、およびレセルピンなど）、ヒドララジン、トドララジン、ブドララジン、およびカドララジンが挙げられる。抗狭心症薬の例としては、硝酸塩系薬（亜硝酸アミル、ニトログリセリン、およびイソソルビド）、β−アドレナリン受容体遮断薬（プロプラノロール、ピンドロール、インデノロール、カルテオロール、ブニトロロール、アテノロール、アセブトロール、メトプロロール、チモロール、ニプラジロール、ペンブトロール、ナドロール、チリソロール、カルベジロール、ビソプロロール、ベタキソロール、セリプロロール、ボピンドロール、ベバントロール、ラベタロール、アルプレノロール、アモスラロール、アロチノロール、ベフノロール、ブクモロール、ブフェトロール、ブフェラロール、ブプランドロール、ブチリジン、ブトフィロロール、カラゾロール、セタモロール、クロラノロール、ジレバロール、エパノロール、レボブノロール、メピンドロール、メチプラノロール、モプロロール、ナドキソロール、ネビボロール、オキシプレノロール、プラクトール、プロネタロール、ソタロール、スフィナロール、タリンドロール、テトラロール、トリプロロール、およびキシベノロールなど）、カルシウムチャネル遮断薬（アラニジピン、エホニジピン、ニカルジピン、バミジピン、ベニジピン、マニジピン、シルニジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン、ニフェジピン、ニルバジピン、フェロジピン、アムロジピン、ジルチアゼム、ベプリジル、クレンチアゼム、フェンジリンｅ、ガロパミル、ミベフラジル、プレニルアミン、セモチアジル、テロジリン、ベラパミル、シルニジピン、エルゴジピン、イスラジピン、ラシジピン、レルカニジピン、ニモジ���ン、シンナリジン、フルナリジン、リドフラジン、ロメリジン、ベンシクラン、エタフェノン、およびペルヘキシリンなど）トリメタジジン、ジピリダモール、エタフェノン、ジラゼプ、トラピジル、ニコランジル、エノキサパリン、およびアスピリンが挙げられる。利尿薬の例としては、チアザイド系利尿薬（ヒドロクロロチアザイド、メチクロチアザイド、トリクロルメチアザイド、ベンジルヒドロクロロチアザイド、およびペンフルチジドなど）、ループ利尿薬（フロセミド、エタクリン酸、ブメタニド、ピレタンニド、アゾセミド、およびトラセミドなど）、Ｋ＋保持性利尿薬（スピロノラクトン、トリアムテレン、およびカンレノ酸カリウム）、浸透圧利尿薬（イソソルビド、Ｄ−マンニトール、およびグリセリンなど）、非チアザイド利尿薬（メチクラン、トリパミド、クロルタリドン、およびメフルシドなど）、およびアセタゾラミドが挙げられる。強心薬の例としては、ジギタリス系製剤（ジギトキシン、ジゴキシン、メチルジゴキシン、デスラノシド、ベスナリノン、ラナトシドＣ、およびプロスシラリジンなど）、キサンチン系製剤（アミノフィリン、コリンテオフィリン、ジプロフィリン、およびプロキシフィリンなど）、カテコールアミン系製剤（ドパミン、ドブタミン、およびドカルパミン）、ＰＤＥ  ＩＩＩ阻害剤（アムリノン、オルプリノン、およびミルリノンなど）、デノパミン、ユビデカレノン、ピモベンダン、レボシメンダン、アミノエチルスルホン酸、ベスナリノン、カルペリチド、およびコルホルシンダロパートが挙げられる。抗不整脈薬の例としては、アジマリン、ピルメロール、プロカインアミド、シベンゾリン、ジソピラミド、キニジン、アプリンジン、メキシレチン、リドカイン、フェニロイン、ピルシカイニド、プロパフェノン、フレカイニド、アテノロール、アセブトロール、ソタロール、プロプラノロール、メトプロロール、ピンドロール、アミオダロン、ニフェカラント、ジルチアゼム、ベプリジル、およびベラパミルが挙げられる。抗高脂血症薬の例としては、アトルバスタチン、シムバスタチン、プラバスタチンナトリウム、フルバスタチンナトリウム、クリノフィブラート、クロフィブラート  、シンフィブラート、フェノフィブラート、ベザフィブラート、コレスチミド、およびコレスチラミンが挙げられる。免疫抑制薬の例としては、アザチオプリン、ミゾリビン、シクロスポリン、タクロリムス、グスペリムス、およびメトトレキサートが挙げられる。
【０１３３】
ｉｉｉ．細胞死／癌
ＣＬＫ阻害化合物は、最近、ある線量の放射線またはある用量の毒素を受けたか、またはおそらく受ける被験体に投与され得る。一実施形態において、該線量の放射線または該用量の毒素は、仕事関連または医療処置、例えば、原子力発電所内での作業、航空機の飛行、Ｘ線、ＣＡＴスキャンまたは医療用イメージングのための放射性色素の投与の一部として受けたものである；かかる実施形態において、該化合物は、予防的手段として投与される。別の実施形態において、該放射線または毒素曝露は、例えば、産業事故、自然放射線のある場所での居住、テロ行為または放射性物質もしくは毒性物質を伴う戦争行為の結果として知らずに受けるものである。かかる場合において、該化合物は、好ましくは、アポトーシスおよびその後の急性放射線症候群の発症を抑制するため、曝露後できるだけ早期に投与される。
【０１３４】
ＣＬＫモジュレート化合物はまた、癌を処置および／または予防するために使用され得る。特定のある実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物が、癌を処置および／または予防するために使用され得る。したがって、ＣＬＫタンパク質のレベルおよび／または活性の低下は、例えば癌などの加齢関連障害の発症を処置および／または予防するために有用であり得る。他の実施形態において、ＣＬＫ活性化化合物が、癌を処置または予防するために使用され得る。例えば、ＣＬＫ活性化化合物は、アポトーシスを増大させるため、ならびに細胞および生物体の寿命を短縮するため、これらをストレスに対してより感受性にするため、および／または細胞もしくは生物体の放射線感受性および／または化学的感受性を増大させるために使用され得る。したがって、ＣＬＫ活性化化合物は、例えば、癌の処置のために使用され得る。ＣＬＫモジュレート化合物を用いて処置され得る例示的な癌は、脳および腎臓のもの；ホルモン依存性癌（例えば、乳癌、前立腺癌、精巣癌および卵巣癌）；リンパ腫、ならびに白血病である。充実性腫瘍と関連している癌において、モジュレート化合物は、腫瘍内に直接投与され得る。血球の癌、例えば白血病は、モジュレート化合物を血流中または骨髄内に投与することにより処置され得る。良性細胞の増殖（例えば、いぼ）もまた処置され得る。処置され得る他の疾患としては、自己免疫細胞が除去されるべきである自己免疫疾患、例えば、全身性エリテマトーデス、強皮症および関節炎が挙げられる。ウイルス感染症、例えば、ヘルペス、ＨＩＶ、アデノウイルスならびにＨＴＬＶ−１関連の悪性および良性障害などもまた、ＣＬＫ活性化化合物の投与によって処置され得る。あるいはまた、細胞を被験体から採取し、エキソビボで処理して特定の望ましくない細胞（例えば、癌細胞）を除去し、同じまたは異なる被験体に投与して戻してもよい。
【０１３５】
ＣＬＫ活性化化合物（例えば、アポトーシスを誘導する化合物、寿命を短くする化合物、または細胞をストレスに対して感受性にする化合物）とともに共投与され得る化学療法剤としては、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、ｂｃｇ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カンポテシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブチル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コルヒチン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエネストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゲニステイン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イフォスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、イロノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトーテン、ミトザントロン、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、スラミン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストステロン、チオグアニン、チオテパ、塩化チタノセン、トポテカン、トラスツズマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビンが挙げられる。
【０１３６】
これらの化学療法剤は、その作用機序によって、例えば、以下の群：代謝拮抗薬／抗癌剤、例えば、ピリミジン類縁体（５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、カペシタビン、ゲムシタビンおよびシタラビン）ならびにプリン類縁体、葉酸アンタゴニストならびに関連阻害剤（メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチンおよび２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン））など；抗増殖剤／抗有糸分裂剤、例えば、ビンカアルカロイド類などの天然生成物（ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビン）、タキサンなどの微小管破壊剤（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ）（パクリタキセル、ドセタキセル）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポチロンおよびナベルビン、エピジポドフィロ（ｅｐｉｄｉｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏ）毒素（テニポシド）、ＤＮＡ傷害剤（アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン系、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブチル、シスプラチン、シクロホスファミド、シトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミンオキサリプラチン、イフォスファミド、メルファラン、メルクロレタミン、マイトマイシン、ミトザントロン、ニトロソウレア、パクリタキセル、プリカマイシン、プロカルバジン、テニポシド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびエトポシド（ＶＰ１６））；抗生物質、例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン  （アドリアマイシン）、イダルビシン、アントラサイクリン系、ミトザントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）およびマイトマイシンなど；酵素（Ｌ−アスパラギナーゼ、これは、全身でＬ−アスパラギンを代謝し、自身のアスパラギンを合成する能力をもたない細胞を枯渇させる）；抗血小板薬剤；ナイトロジェンマスタードなどの抗増殖剤／抗有糸分裂アルキル化剤（メクロレタミン、シクロホスファミドおよび類縁体、メルファラン、クロラムブチル）、エチレンイミンならびにメチルメラミン（ヘキサメチルメラミンおよびチオテパ）、アルキルスルホン酸塩−ブスルファン、ニトロソウレア（カルムスチン（ＢＣＮＵ）および類縁体、ストレプトゾシン）、トラゼン（ｔｒａｚｅｎｅ）−ダカルバジン（ＤＴＩＣ）；抗増殖剤／抗有糸分裂性代謝拮抗薬、例えば、葉酸類縁体（メトトレキサート）など；白金配位錯体（シスプラチン、カルボプラチン）、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、ミトーテン、アミノグルテチミド；ホルモン、ホルモン類縁体（エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド）およびアロマターゼ阻害剤（レトロゾール、アナストロゾール）；抗凝固剤（ヘパリン、合成ヘパリン塩および他のトロンビン阻害剤）；線維素溶解剤（組織プラスミノゲンアクチベータ、ストレプトキナーゼおよびウロキナーゼなど）、アスピリン、ＣＯＸ−２阻害剤、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ；抗偏頭痛剤；抗分泌剤（ブレベルジン）；免疫抑制剤（シクロスポリン、タクロリムス  （ＦＫ−５０６）、シロリマス（ラパマイシン）、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）；抗血管新生化合物（ＴＮＰ−４７０、ゲニステイン）および増殖因子阻害剤（血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）阻害剤、上皮増殖因子（ＥＧＦ）阻害剤）；アンギオテンシン受容体遮断薬；一酸化窒素供与体；アンチセンスオリゴヌクレオチド；抗体（トラスツズマブ）；細胞周期阻害剤および分化誘導剤（トレチノイン）；ｍＴＯＲ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤（ドキソルビシン（アドリアマイシン）、アムサクリン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エニポシド、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イリノテカン  （ＣＰＴ−１１）ａｎｄ  ミトザントロン、トポテカン、イリノテカン）、コルチコステロイド類（コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン（ｍｅｔｈｙｌｐｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、プレドニゾン、およびプレドニゾロン（ｐｒｅｎｉｓｏｌｏｎｅ））；増殖因子シグナル伝達キナーゼ阻害剤；ミトコンドリア機能不全誘導剤およびカスパーゼアクチベータ；クロマチン破壊剤に分類され得る。
【０１３７】
これらの化学療法剤は、それ自体をＣＬＫ活性化化合物（例えば、細胞死を誘導するか、寿命を短くするか、またはストレスに対する感受性を増大させる化合物）とともに、および／または他の化学療法剤との組合せで使用され得る。多くのコンビナトリアル療法が開発されており、限定されないが、表１に一覧にしたものが挙げられる。
【０１３８】
【表１】
2009521408.tif 000003
【０１３９】
【表２】
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【０１４０】
【表３】
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【０１４１】
【表４】
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【０１４２】
【表５】
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【０１４３】
【表６】
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従来の化学療法剤に加え、本明細書に記載のＣＬＫ活性化化合物もまた、細胞死を誘導または寿命を短くし得るため、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉまたは他のポリヌクレオチドとともに用いて、従来の化学療法の標的である好ましくない細胞増殖に寄与する細胞成分の発現を阻害することができる。かかる標的は、単なる例示であるが、増殖因子、増殖因子受容体、細胞周期調節タンパク質，転写因子またはシグナル伝達キナーゼである。
【０１４４】
ＣＬＫ活性化化合物および従来の化学療法剤を含む併用療法剤は、併用により、従来の化学療法剤が、より少ない投薬量でより大きな効果を発揮することが可能になるため、当該技術分野で知られた併用療法よりも好都合であり得る。好ましい実施形態において、化学療法剤または従来の化学療法剤の組合せの有効用量（ＥＤ５０）は、ＣＬＫ活性化化合物と組合せて使用される場合、該化学療法剤単独のＥＤ５０の少なくとも２倍未満、さらにより好ましくは、５倍未満、１０倍未満または２５倍未満でさえある。逆に、かかる化学療法剤またはかかる化学療法剤の組合せの治療指数（ＴＩ）は、本明細書に記載のＣＬＫ活性化化合物と組合せて使用される場合、従来の化学療法レジメン単独のＴＩよりも少なくとも２倍大きい、さらにより好ましくは、５倍大きい、１０倍大きいまたは２５倍も大きいことさえあり得る。
【０１４５】
ｉｖ．神経疾患／障害
特定のある態様において、ＣＬＫ阻害化合物は、神経変性疾患、および中枢神経系（ＣＮＳ）、脊髄または末梢神経系（ＰＮＳ）に対する外傷性または機械性損傷に苦しむ患者を処置するために使用され得る。神経変性疾患は、典型的には、ヒトの脳の質量および容積の減少を伴い、これは、脳細胞の萎縮および／または死によるものであり得、健常人における加齢に起因するものよりもずっとより顕著である。神経変性疾患は、長期間の正常な脳機能の後、特定の脳領域の進行性の変性（例えば、神経細胞の機能不全および死）により、徐々に進展する。あるいはまた、神経変性疾患は、外傷または毒素と関連するものなどの急速に発症するものであり得る。脳変性の実際の開始は、臨床的に発現するまでに何年もかかり得る。神経変性疾患の例としては、限定されないが、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；ルー・ゲーリグ病）、びまん性レヴィー小体病、舞踏病有棘赤血球増加症、原発性側索硬化症、眼の疾患（眼の神経炎）、化学療法誘発性神経障害（例えば、ビンクリスチン、パクリタキセル、ボルテゾミブに起因）、糖尿病誘発性神経障害およびフリートライヒ運動失調が挙げられる。ＣＬＫ阻害化合物は、これらの障害および後述する他のものを処置するために使用され得る。
【０１４６】
ＡＤは、徐々に発症し、記憶喪失、異常な挙動、人格の変化および思考能力の低下をもたらす慢性で不治の抑止できないＣＮＳ障害である。このような喪失低下は、特定の型の脳細胞の死ならびに該細胞間の連結およびその支持ネットワーク（例えば、グリア細胞）の崩壊と関連している。ＡＤは、通常とは逆に、小児期に発生することが報告されている。ＡＤを有する人のほとんどは、症状が６０歳を過ぎて現れる。最も初期の症状としては、最近の記憶の喪失、誤った判断および人格の変化が挙げられる。該疾患の後期では、ＡＤを有する人は、手を洗うなどの単純な作業の仕方を忘れることがあり得る。最終的に、ＡＤを有する人は、あらゆる推論能力を失い、毎日の介護を他人に依存するようになる。最終的に、該疾患は、たいへん衰弱性となるため、患者は、寝たきりとなり、典型的には合併症を発症する。
【０１４７】
ＰＤは、徐々に発症し、抑止できない身体の動き、硬直、振せんおよびジスキネジーがもたらされる慢性で不治の抑止できないＣＮＳ障害である。これらの運動系の問題は、筋肉活性を制御するのを補助する化学物質であるドパミンを産生する脳の領域内の脳細胞の死と関連している。ＰＤを有する人のほとんどは、症状が５０歳を過ぎて現れる。ＰＤの初期症状は、四肢に影響する著しい振せん（特に、手または唇）である。ＰＤのその後の特徴的症状は、硬直または干満な動作、足をひきずった歩行、前傾姿勢、および平衡障害である。記憶喪失、痴呆、鬱、感情の起伏の変化、嚥下困難、異常な発話、性的機能不全、ならびに膀胱および腸の問題などの広範な二次症状がある。これらの症状が始まると、フォークを持つことや新聞を読むことなどの日常の活動に障害がでる。最終的に、ＰＤを有する人は、著しく身体障害者となるため、寝たきりとなる。
【０１４８】
ＡＬＳ（運動ニューロン疾患）は、脳を骨格筋に連結するＣＮＳの成分である運動ニューロンが攻撃される慢性で不治の抑止できないＣＮＳ障害である。ＡＬＳでは、運動ニューロンが崩壊し、最終的に死滅するが、その人の脳は正常なままで充分に機能を果たし、動作の命令が絶対に筋肉に達しないように警告する。ＡＬＳになる人のほとんどは、４０〜７０歳である。衰弱する最初の運動ニューロンは、腕または脚を制御するものである。ＡＬＳを有する人は、歩行困難を有することがあり得、ものを落としたり、転んだり、ろれつが回らなかったり、抑えきれないほと笑ったり泣いたりすることがあり得る。最終的に、四肢の筋肉は、非活動のため萎縮し始める。この筋肉の衰弱は、衰弱性となり、人は、車椅子が必要となったり、起き上がって働くことができなくなる。
【０１４９】
このような神経疾患の原因は、多くが未知のままである。従来、これは、別個の疾患と規定されていたが、基本的な過程において非常に大きな類似性を明白に示し、一般に、単独で偶然に予測され得るものよりはるかに大きな重複する症状を示す。現在の疾患の定義では、重複の問題が適正に対処されておらず、神経変性障害の新たな分類が必要とされている。
【０１５０】
ＨＤは、脳のある特定の領域のニューロンの遺伝子にプログラムされた変性に起因する別の神経変性疾患である。この変性により、抑止できない動作、知能の低下および情緒障害が引き起こされる。ＨＤは家族性の疾患であり、野生型遺伝子の優性変異を介して親から子に受け継がれる。ＨＤの一部の初期症状は、気分のむら、鬱、いらいらまたは運転、新しいことの学習、事実の記憶または決断における困難である。該疾患が進行するにつれて、知的作業に対する集中力は、漸増的に困難となり、患者は、摂食および嚥下に困難を有するようになり得る。
【０１５１】
テイ−サックス病およびザントホフ病は、リソソームβ−ヘキソサミニダーゼの欠損によって引き起こされる糖脂質貯蔵疾患である（Ｇｒａｖｅｌら、Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ、編集Ｓｃｒｉｖｅｒら、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐｐ．２８３９−２８７９、１９９５）。両障害では、ＧＭ２ガングリオシドおよびβ−ヘキソサミニダーゼの関連糖脂質基質が神経系内に蓄積し、急性神経変性が誘発される。最も重症な形態では、症状の発生は、早期の乳児期に始まる。次いで、急激な神経変性過程が起こり、罹患した乳児は、運動機能不全、発作、視力障害および難聴を示す。通常、２〜５歳で死亡する。アポトーシス機構によるニューロン減少が示されている（Ｈｕａｎｇら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．６：１８７９−１８８５、１９９７）。
【０１５２】
アポトーシスが免疫系においてＡＩＤＳの病因にある役割を果たしていることは、よく知られている。しかしながら、ＨＩＶ−１は、神経疾患もまた誘導する。Ｓｈｉら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：１９７９−１９９０、１９９６）は、ＣＮＳのＨＩＶ−１感染によって誘導されるアポトーシスを、インビトロモデルおよびＡＩＤＳ患者由来の脳組織において調べ、脳の初代培養物のＨＩＶ−１感染により、インビトロでニューロンおよび星状細胞においてアポトーシスが誘導されることを見出した。ニューロンおよび星状細胞のアポトーシスはまた、ＡＩＤＳ患者の１０／１１例の脳組織（ＨＩＶ−１痴呆を有する５／５例の患者および４／５例の非痴呆患者を含む）においても検出された。
【０１５３】
ＨＩＶと関連している主な末梢神経障害は４つあり、すなわち、感覚神経障害、ＡＩＤＰ／ＣＩＰＤ、薬物誘発性神経障害およびＣＭＶ関連である。
【０１５４】
ＡＩＤＳと関連する神経障害の最も一般的な型は、遠位性対称性多発性神経障害（ＤＳＰＮ）である。この症候群は、神経変性の結果であり、しびれ感およびピンや針で刺されたような知覚を特徴とする。ＤＳＰＮでは、重篤な異常はほとんどが引き起こされないが、たいていの場合、足のしびれ感または刺痛および足首の反射の遅滞がもたらされる。これは、一般的に、より重症な免疫抑制を伴って起こり、着実に進行する。三環系抗うつ薬での処置により症状は緩和するが、原因の神経損傷には影響しない。
【０１５５】
頻度は低いが、より重症な型の神経障害は、急性または慢性炎症性脱髄性多発性神経障害（ＡＩＤＰ／ＣＩＤＰ）として知られるものである。ＡＩＤＰ／ＣＩＤＰでは、神経インパルスを覆う脂肪膜に損傷がある。この種の神経障害は炎症を伴い、ＡＺＴの長期使用により多くの場合で確認される筋肉の劣化に類似する。患者が、痛みを訴えることはなくても標準的な反射試験に応答しないことがあり得る場合、ＨＩＶ感染の最初の発現であり得る。この種の神経障害は、セロコンバージョンと関連するものであり得、この場合、時として自然に消散し得る。これは、ＨＩＶ感染の徴候として有用であり得、時期を選んで抗ウイルス療法が考慮され得ることを示し得る。ＡＩＤＰ／ＣＩＤＰは起源が自己免疫のものであり得る。
【０１５６】
薬物誘発性、または毒性の神経障害は、非常に有痛性であり得る。抗ウイルス薬は一般的に、他の薬物、例えば、ビンクリスチン、ジランチン（抗発作薬）、高用量ビタミン類、イソニアジドおよび葉酸アンタゴニストのように、末梢神経障害を引き起こす。末梢神経障害は、多くの場合、抗ウイルス薬に対する臨床試験において、用量限界副作用（これは、それ以上薬物を投与すべきでないことを意味する）として使用される。さらに、かかる薬物の使用により、使用しない場合は軽微だが、神経障害が悪化することがあり得る。通常、このような薬物誘発性神経障害は、薬物の中止により可逆性となる。
【０１５７】
ＣＭＶにより、ＡＩＤＳにおいて、いくつかの神経学的症候群、例えば、脳炎、脊髄炎および多発神経根障害が引き起こされる。
【０１５８】
また、ニューロン減少は、プリオン疾患、例えば、ヒトのクロイツフェルト−ヤーコプ病、畜牛のＢＳＥ（狂牛病）、ヒツジおよびヤギのスクレイピー病、ならびにネコのネコ海綿状脳症（ＦＳＥ）に顕著な特徴である。ＣＬＫ阻害化合物は、これらのプリオン（ｐｒｉｏｒ）疾患によるニューロン減少の処置または予防に有用であり得る。
【０１５９】
別の実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、軸索障害を伴う任意の疾患または障害を処置または予防するために使用され得る。遠位軸索障害は、末梢神経系（ＰＮＳ）ニューロンのなんらかの代謝性または毒性の錯乱に起因する末梢神経障害の型の一例である。これは、代謝性または毒性のかく乱に対する神経の最も一般的な応答であり、そのため、代謝性疾患、例えば、糖尿病、腎不全、欠乏（ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）症候群（栄養失調およびアルコール依存症など）、または毒素もしくは薬物の影響などによって引き起こされ得る。遠位軸索障害の最も一般的な原因は糖尿病であり、最も一般的な遠位軸索障害は、糖尿病性神経障害である。通常、軸索の最も遠位の部分が最初に変性し、軸索萎縮が神経の細胞体に向かってゆっくりと進行する。有害な刺激除かれたら、再生が可能であるが、予後は、刺激の持続期間および激しさに応じて低下する。遠位軸索障害を有する者は、通常、対称的な手袋−ストッキング（ｇｌｏｖｅ−ｓｔｏｃｋｉｎｇ）感覚−運動障害を示す。深部腱反射および自律神経系（ＡＮＳ）機能もまた、罹患領域において低下または減衰する。
【０１６０】
糖尿病性神経障害は、真性糖尿病と関連している神経障害である。このような状態は、通常、神経に供給物を与える小血管（神経の脈管）が関与する糖尿病性の微小血管損傷に起因する。糖尿病性神経障害と関連するものであり得る比較的一般的な状態としては、第三神経の麻痺；単神経障害；多発性単神経炎；糖尿病性筋萎縮症；有痛性多発性神経障害；自律神経障害；および胸腹部神経障害が挙げられる。糖尿病性神経障害の臨床徴候としては、例えば、感覚運動多発性神経障害（しびれ感、感覚消失、異感覚および夜間痛など；自律神経障害（胃の排泄遅延または胃不全麻痺など）；ならびに脳神経障害（胸部または腰椎神経の動眼（第三）神経障害または単神経障害など）が挙げられる。
【０１６１】
末梢神経障害は、神経の疾患または全身性の疾病の副作用のいずれかによって引き起こされ得る末梢神経系の神経に対する損傷の医学用語である。末梢神経障害は、その提示および起源が種々であり、神経または神経筋接合部が冒され得る。末梢神経障害の主な原因としては、発作、栄養不足およびＨＩＶが挙げられるが、ほとんどが糖尿病である。また、あまりにも長い時間、同じ姿勢のままでいることによる機械的圧力、腫瘍、神経内出血、極端な条件（放射線、低温または毒性物質に）に身体を曝すことによっても末梢神経障害が引き起こされ得る。
【０１６２】
例示的な一実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、多発性硬化症（ＭＳ）、例えば、再発性ＭＳおよび単一症状ＭＳ、ならびに他の脱髄状態、例えば、慢性（ｃｈｒｏｍｉｃ）炎症性脱髄性多発性神経障害（ＣＩＤＰ）など、またはこれらに伴う症状を処置または予防するために使用され得る。
【０１６３】
ＭＳは慢性であり、多くの場合、中枢神経系の身体障害性疾患である。種々の合致性の一連の証拠によって、該疾患が免疫機能における障害によって引き起こされるという可能性が指摘されているが、この障害の原因は、確立されていない。この障害により、免疫系の細胞が、中枢神経系（「ＣＮＳ」）内に存在する神経軸索を覆う絶縁性の鞘を内包する脂肪であるミエリンを「攻撃する」ことが許容される。ミエリンが損傷を受けると、電気パルスが脳および脊髄内の神経線維の経路に沿って速やかに、または正常に伝達され得なくなる。これにより、軸索内で正常な電気伝導の途絶、、疲労、ならびに視力、体力、協調、平衡、感覚ならびに膀胱および腸機能の障害がもたらされる。
【０１６４】
そのため、ＭＳは、現在では、ＣＮＳのどこにでも生じ得る炎症および脱髄の発作性の斑（ｅｐｉｓｏｄｉｃ  ｐａｔｃｈ）を特徴とする、一般的でよく知られた神経障害である。しかしながら、ほぼ常に、関連する末梢神経はなんら関与していない。脱髄により、電気コードを覆う絶縁体の亀裂または裂傷に起因するものと類似した状況がもたらされる。すなわち、絶縁性の鞘が破断すると、回路が「ショート」し、連結された電気装置は、断続的に機能するか、または全く機能しなくなる。神経線維を覆うかかるミエリンの減少により、脳および脊髄内を通る神経においてショートがもたらされ、それにより、ＭＳの症状がもたらされる。さらに、かかる脱髄は、ＣＮＳ全体に沿った場合とは反対に、斑内で起こることがわかった。また、かかる脱髄は断続的であり得る。したがって、かかる斑は、時間および空間の両方において散在性である。
【０１６５】
その病因には、血液脳関門の局所途絶が関与し、それにより、限局性の免疫および炎症性応答が引き起こされ、その結果、ミエリンが、従ってニューロンが損傷されると考えられる。
【０１６６】
臨床的には、ＭＳは、両性において存在し、任意の年齢で起こり得る。しかしながら、その最も一般的な提示は、比較的若年の成人においてであり、多くの場合、単一の局所性病変、例えば、視神経の損傷、一領域の無感覚（感覚の喪失）もしくは感覚異常（感覚の限局性喪失）、または筋肉の衰弱を伴う。また、めまい、複視、限局性の痛み、失禁、ならびに腕および脚における痛みが、首を動かすと起こり得、ならびに多種多様なあまり一般的な症状が起こり得る。
【０１６７】
ＭＳの初期の発現は、多くの場合、一過性であり、数週間、数ヶ月または数年にさらなる発現が生じ得る。一部の個体は、非常に長い年月、安定で比較的無事象の状態を享受し得るが、一部のあまり幸運でない個体は、継続的な衰退の経過をたどり、完全な麻痺に至り得る。最も一般的には、寛解および再発の連続が存在し、この場合、再発毎に、患者は以前よりもいくぶん悪化する。再発は、ストレスの多い事象、ウイルス感染症または毒素によって誘発され得る。このとき、体温の上昇、すなわち発熱により状態が悪化するか、または例えば冷水浴により体温の低下により、状態は良くなり得る。
【０１６８】
また別の実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、神経に対する外傷、例えば、疾患、損傷（外科的介入を含む）による外傷、または環境的外傷（例えば、神経毒、アルコール依存症など）を処置するために使用され得る。
【０１６９】
ＣＬＫ阻害化合物はまた、種々のＰＮＳ障害の症状（後述するものなど）を予防、処置および緩和するのに有用であり得る。ＰＮＳは、脊髄およびＣＮＳに至る、またはこれらから分岐している神経で構成されている。末梢神経は、身体内の多様な機能群、例えば、感覚、運動および自律機能を担う。個体が末梢神経障害を有する場合、ＰＮＳの神経は損傷を受けている。神経の損傷は、いくつかの原因、例えば、疾患、身体の負傷、中毒または栄養失調などにより生じ得る。これらの因子は、求心性神経または遠心性神経のいずれかを冒し得る。損傷の原因に応じて、神経細胞軸索、その保護的ミエリン鞘または両方が障害または破壊され得る。
【０１７０】
用語「末梢神経障害」には、脳および脊髄の外側の神経（すなわち、末梢神経）が損傷を受けている広範な障害を包含される。末梢神経障害はまた、末梢神経炎を指すものであり得、または多くの神経が関与する場合は、多発神経障害または多発神経炎という用語が使用され得る。
【０１７１】
末梢神経障害は、広く知られた障害であり、根本的な原因がたくさんある。このような原因には一般的ものもあれば（例えば、糖尿病など）、極めて稀なものもある（アクリルアミド中毒および特定の遺伝性障害など）。末梢神経障害の最も一般的に広く知られた原因は、らい病である。らい病は、細菌（らい菌）によって引き起こされ、これは、罹患した人の末梢神経を攻撃する。
【０１７２】
米国では、らい病は極めて稀であり、糖尿病が最も一般的に知られた末梢神経障害の原因である。欧米では１７００万人より多くの人が糖尿病関連多発神経障害を有する推定されている。多くの神経障害は特発性であり、既知原因は見出され得ない。米国における遺伝性末梢神経障害で最も一般的なものはシャルコー−マリー−ツース病であり、およそ１２５，０００人が罹患している。
【０１７３】
よく知られた別の末梢神経障害はギヤン−バレー症候群であり、これは、ウイルス性の疾病（例えば、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルスおよびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）など）または細菌感染（例えば、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）およびライム病に伴う合併症に起因する。全世界での発症率は、年間で１００，０００人あたりおよそ１．７例である。他のよく知られた末梢神経障害の原因としては、慢性アルコール中毒、水痘−帯状疱疹ウイルス感染、ボツリヌス中毒および灰白髄炎が挙げられる。末梢神経障害は、初期症状として発現され得るか、または別の疾患によるものであり得る。例えば、末梢神経障害は、アミロイド神経障害、ある種の癌または遺伝性神経病性障害などの疾患の唯一の症状である。かかる疾患により、ＰＮＳおよびＣＮＳならびに他の身体組織が冒され得る。
【０１７４】
ＣＬＫ阻害化合物により処置可能な他のＰＮＳ疾患としては、腕神経叢ニューロパシー（腕神経叢の頚部および第１胸部根（ｆｉｒｓｔ  ｔｈｏｒａｃｉｃ  ｒｏｏｔ）、神経幹、索（ｃｏｒｄ）、および末梢神経成分の疾患が挙げられる。臨床徴候としては、限局性の痛み、感覚異常；筋衰弱および上肢の感覚低下が挙げられる。このような障害は、外傷、例えば、分娩外傷；胸郭出口症候群；新生物、神経炎、放射線療法と関連するものなどの状態（Ａｄａｍｓら，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，第６版，ｐｐ１３５１−２を参照）；糖尿病性神経障害（真性糖尿病に伴う末梢、自律および脳神経障害）であり得る。これらの状態は、通常、神経に供給された小血管（神経の脈管）が関与する糖尿病性微小血管の損傷の結果生じる。糖尿病性神経障害に伴い得る比較的よく見られる状態としては、第三神経麻痺；単神経障害；多発性単神経炎；糖尿病性筋萎縮症；有痛多発神経障害；自律神経障害；および胸腹神経障害（Ａｄａｍｓら，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，第６版，ｐ１３２５参照）；単神経障害（びまん性末梢神経機能不全の徴候に対して孤立性、または釣り合いを失った単一の末梢神経が関与する疾患または外傷が挙げられる。多発性単神経炎は、多数の孤立性の神経損傷を特徴とする状態をいう。単神経障害は、多種多様な原因、例えば、虚血；外傷性損傷；圧迫；結合組織病；蓄積外傷疾患などの状態；神経痛（末梢または脳神経の経路または分布に沿って起こる激痛またはうずく痛み）；末梢神経系新生物（末梢神経組織から生じる新生物）の結果、生じ得る。これには、神経線維腫；神経鞘腫；顆粒細胞腫；および悪性  末梢神経鞘腫瘍が含まれる。ＤｅＶｉｔａ  Ｊｒら，Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，第５版，ｐｐｌ７５０−１参照）；神経圧迫症候群（内因または外因による神経または神経根の機械的圧迫。これらは、例えば、ミエリン鞘機能不全または軸索消失により、神経インパルスに対して伝導ブロックをもたらし得る。神経および神経鞘の損傷は、虚血；炎症；または直接的な機械的影響；神経炎（末梢神経もしくは脳神経の炎症を示す一般用語）によって引き起こされ得る。臨床徴候としては、痛み；感覚異常；不全麻痺；または知覚過敏（ｈｙｐｅｒｔｈｅｓｉａ）；多発神経障害（多数の末梢神経の疾患）が挙げられ得る。種々の形態は、罹患神経の型（例えば、感覚、運動または自律神経）、神経損傷の分布（例えば、遠位対近位）、主な罹患神経成分（例えば、脱髄性対軸索性）、病因または遺伝パターンによって分類される。
【０１７５】
別の実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、化学療法剤誘発性神経障害を処置または予防するために使用され得る。ＣＬＫ阻害化合物は、化学療法剤の投与前、化学療法薬の投与と同時、および／または化学療法薬の投与の開始後に投与され得る。ＣＬＫ阻害化合物が化学療法薬の投与の開始後に投与される場合、ＣＬＫ阻害化合物は、化学療法剤誘発性神経障害の最初の徴候の前または該徴候時に投与されることが望ましい。
【０１７６】
化学療法薬は、神経系の任意の部分を障害し得る。脳障害および脊髄障害は、幸運なことに非常に稀である。末梢神経に対する損傷は、ずっとより一般的であり、リンパ腫などの癌を有する人が受ける処置の副作用であり得る。神経障害のほとんどは、運動神経よりもむしろ感覚神経を冒すものである。したがって、その一般的な症状は、刺痛、しびれ感または平衡の喪失である。体内で最も長い神経が最も敏感なようであり、したがって、実際、ほとんどの患者が手足にしびれ感またはピンや針で刺されたような知覚を報告する。
【０１７７】
最も一般的に神経障害と関連している化学療法薬は、ビンカアルカロイド類（最初に植物属の一構成員であるツルニチソウから誘導された抗癌薬）およびシスプラチンと呼ばれる白金含有薬物である。ビンカアルカロイド類としては、薬物ビンブラスチン、ビンクリスチンおよびビンデシンが挙げられる。リンパ腫のための多くの併用化学療法処置剤、例えば、ＣＨＯＰおよびＣＶＰは、この問題を最も高頻度に引き起こすことが知られた薬物であるビンクリスチンを含有するものである。実際、投与され得るビンクリスチンの用量を制限することは、神経障害のリスクである。
【０１７８】
実施された研究により、ほとんどの患者が、ビンクリスチンでの処置の結果、脚において一部反射を失い、多くが、指およびつま先にある程度の刺痛（感覚異常）を経験することが示されている。神経障害は、通常、処置の開始時にそれ自体の徴候が直ちに現れていないが、一般的に、数週間かけて奏効し出す。症状が最初に現れたときに薬物を止めることは必須ではないが、神経障害が進行している場合は、これは必要であり得る。患者はかかる症状をその医師に報告するべきであることは、薬物を中断すると神経損傷が大きく可逆性となるため、非常に重要である。ほとんどの医師は、多くの場合、症状が軽い場合は、ビンクリスチンの用量を少なくするか、別の形態のビンカアルカロイド（ビンブラスチンもしくはビンデシンなど）に切り替える。場合によっては、腸に供給される神経が冒され、腹痛および便秘が引き起こされる。
【０１７９】
別の実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、ポリグルタミン病を処置または予防するために使用され得る。ハンチントン病（ＨＤ）および脊髄小脳性運動失調症１型（ＳＣＡ１）は、トリプレット配列の反復配列の伸長部（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）を伴う動的変異によって引き起こされる一類型の遺伝疾患のちょうど２つの例である。この一般的な機構に関連して、これらの障害は、トリヌクレオチド反復配列疾患と呼ばれる。少なくとも１４のかかる疾患が、ヒトの疾病であることが知られている。そのうち９つ（例えば、ＳＣＡ１およびハンチントン病）は、反復配列としてＣＡＧを有するものである（以下の表１を参照）。ＣＡＧはグルタミンと呼ばれるアミノ酸をコードするため、これらの９つのトリヌクレオチド反復配列障害は、集合的に、ポリグルタミン病として知られている。
【０１８０】
異なるポリグルタミン病に関与する遺伝子は共通点がほとんどないが、これらによって引き起こされる障害は、著しく類似した経過をたどる。各疾患は、異なる群の神経細胞の進行性の変性を特徴とする。これらの疾患の主な症状は類似しているが、同一ではなく、通常、中年の人に罹患する。症状の類似性を考慮すると、ポリグルタミン病は、共通の細胞機構を介して進行するという仮説が立てられる。近年、科学者らによって、その機構がどのようなものであるかの解明において長足の進歩がなされている。
【０１８１】
一定の閾値より上では、タンパク質内のグルタミン反復配列の数が多いほど、疾患の発症が早く、その症状はより重症である。これは、異常に長いグルタミン域によって、該宿主タンパク質は神経細胞に対して毒性となることを示す。
【０１８２】
この仮説を試験するため、科学者らは、長いポリグルタミン域を有するタンパク質を発現する遺伝子操作マウスを作製した。マウスは、完全長のタンパク質を発現するか、またはポリグルタミン域を含む該タンパク質の一部のみを発現するかとは無関係に、ポリグルタミン病の症状を現した。これは、長いポリグルタミン域それ自体が細胞に障害を与えており、機能的タンパク質のその障害を引き起こす部分でなくてもよいことを示す。
【０１８３】
例えば、ＳＣＡ１の症状は、正常なアタキシン−１機能の喪失によって直接引き起こされるものではなく、むしろ、アタキシン−１とＬＡＮＰと呼ばれる別のタンパク質間の相互作用によって引き起こされると考えられる。ＬＡＮＰは、神経細胞が互いに連絡するため、したがって、その生存ために必要とされる。変異型アタキシン−１タンパク質は、神経細胞内部に蓄積されると、ＬＡＮＰタンパク質を「捕捉（ｔｒａｐ）」し、その正常な機能を妨げる。その後しばらくすると、ＬＡＮＰ機能の非存在により、神経細胞に機能不全が引き起こされると思われる。
【０１８４】
【表７】
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また、多くの転写因子が、種々の疾患のニューロンの封入体に見出されている。これらの転写因子はポリグルタミン含有タンパク質と相互作用し、次いで、ニューロンの封入体内に捕捉された状態になることが考えられ得る。これにより、転写因子は、必要に応じて細胞によって遺伝子のオンおよびオフされないようになり得る。別の観察結果は、罹患細胞内でのヒストンの脱アセチル化である。これにより、ヒストンのアセチル化を増大させることが知られているクラスＩ／ＩＩヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ  Ｉ／ＩＩ）阻害剤が、ポリグルタミン病の新規な治療法となり得るという仮説が導かれた（米国特許出願公開公報第２００４／０１４２８５９号；「デアセチラーゼ阻害剤による神経変性性精神医学的障害および他の障害の処置方法」）。
【０１８５】
また別の実施形態において、本発明は、虚血性の損傷または疾患、例えば、冠性心疾患（例えば、鬱血性心不全および心筋梗塞）、脳卒中、気腫、出血性ショック、末梢血管疾患（上肢および下肢）ならびに移植関連損傷などに関連している神経障害を処置または予防するための方法を提供する。
【０１８６】
特定のある実施形態において、本発明は、中枢神経系の細胞を処置して、細胞への血流の減少に応答した損傷を予防するための方法を提供する。典型的には、予防され得る損傷の重症度は、大部分が、細胞への血流の低下の程度および低下の持続期間に依存する。一例として、ヒトの脳灰白質に対する灌流の通常の量は、約６０〜７０ｍＬ／１００ｇ脳組織／分である。中枢神経系の細胞死は、典型的には、血流がほぼ８〜１０ｍＬ／１００ｇ脳組織／分未満の範囲の場合で起こるが、わずかに高いレベル（すなわち、２０〜３５ｍＬ／１００ｇ脳組織／分）では、該組織は、生存状態が維持されるが、機能を果たすことはできない。一実施形態において、アポトーシス性または壊死性の細胞死が抑制され得る。なおさらなる実施形態において、虚血媒介性の損傷、例えば、細胞傷害性浮腫または中枢神経系の組織の無酸素血症が抑制され得る。各実施形態において、中枢神経系の細胞は、脊髄細胞または脳細胞であり得る。
【０１８７】
別の態様は、中枢神経系の虚血状態を処置するために、ＣＬＫ阻害化合物を被験体に投与することを包含するものである。いくつかの中枢神経系の虚血状態が、本明細書に記載のＣＬＫ阻害化合物によって処置され得る。一実施形態において、虚血状態は、任意の型の虚血性中枢神経系損傷、例えば、アポトーシス性もしくは壊死性の細胞死、細胞傷害性浮腫または中枢神経系の組織無酸素症などをもたらす脳卒中である。脳卒中は、脳の任意の領域に影響を与えるもの、または脳卒中の発症をもたらすことが一般に知られた任意の病因によって引き起こされるものであり得る。この実施形態の択一的な一例において、脳卒中は脳幹の脳卒中である。一般的に言うと、脳幹の脳卒中は、不随意の生命を維持する機能（呼吸、血圧および心臓の拍動など）を制御する脳幹を襲う。この実施形態の別の択一的な一例において、脳卒中は小脳の脳卒中である。典型的には、小脳の脳卒中は、平衡および協調を制御する脳の領域である小脳に影響を与える。さらに別の実施形態において、脳卒中は塞栓性脳卒中である。一般論として、塞栓性脳卒中は、脳の任意の領域に影響を与えるものであり得、典型的には、血管閉塞による動脈の遮断によって起こる。また別の択一的な一例では、脳卒中は出血性脳卒中であり得る。虚血性脳卒中と同様、出血性脳卒中は、脳の任意の領域に影響を与えるものであり得、典型的には、脳内または脳周囲の出血（ｈｅｍｏｒｒａｈａｇｅ／出血））を特徴とする血管の断裂によって起こる。さらなる実施形態において、脳卒中は血栓性脳卒中である。典型的には、血栓性脳卒中は、蓄積された沈着物による血管の遮断によって起こる。
【０１８８】
別の実施形態において、虚血状態は、中枢神経系外の被験体の身体の一部において生じたものであるが、なお中枢神経系への血流の低下を引き起こす障害に起因するものであり得る。このような障害としては、限定されないが、末梢血管障害、静脈血栓症、肺動脈塞栓、不整脈（例えば、心房性細動）、心筋梗塞、一過性の虚血性発作、不安定狭心症、または鎌状赤血球貧血が挙げられ得る。さらに、中枢神経系の虚血状態は、被験体が外科的処置を受ける結果、起こり得る。一例として、被験体は、心臓手術、肺の手術、脊髄の手術、脳手術、血管の手術、腹部の手術、または臓器移植手術を受けている被験体であり得る。臓器移植手術としては、心臓、肺、膵臓、腎臓または肝臓移植手術が挙げられ得る。さらに、中枢神経系の虚血状態は、中枢神経系外の被験体の身体の一部に対する外傷または損傷の結果、起こるものであり得る。一例として、該外傷または損傷は、被験体の身体内の血液の総容量を有意に低減させる程度の出血を引き起こすものであり得る。この総容量の低減のため、中枢神経系に対する血流量も付随して低減される。さらなる一例として、該外傷または損傷はまた、中枢神経系への血流が制限される血管閉塞の形成をもたらすものであり得る。
【０１８９】
もちろん、ＣＬＫ阻害化合物が、状態の原因とは無関係に、中枢神経系の虚血状態を処置するために使用され得ることが想定される。一実施形態において、虚血状態は血管閉塞によって起こる。血管閉塞は、任意の型の閉塞であり得るが、典型的には、脳血栓症または塞栓症である。さらなる実施形態において、虚血状態は出血によって起こるものであり得る。出血は、任意の型の出血であり得るが、一般的には脳出血またはくも膜下（ｓｕｂａｒａｒａｃｈｎｏｉｄ）出血である。さらに別の実施形態において、虚血状態は、血管が狭小になることによって起こるものであり得る。一般的に言うと、血管は、血管収縮（血管痙攣中に起こるものなど）の結果、または動脈硬化により狭小となり得る。また別の実施形態において、虚血状態は脳または脊髄に対する損傷によって起こる。
【０１９０】
また別の態様において、ＣＬＫ阻害化合物は、中枢神経系の虚血状態後の虚血性芯梗塞の大きさを縮小させるために投与され得る。さらに、ＣＬＫ阻害化合物はまた、中枢神経系の虚血状態後の虚血性半影部または移行性ゾーンの大きさを縮小させるために有益に投与され得る。
【０１９１】
一実施形態において、併用薬レジメンは、神経変性障害または該状態と関連している続発性状態の処置または予防ための薬物または化合物を含むものであり得る。したがって、併用薬レジメンは、１種類以上のＣＬＫ阻害化合物と１種類以上の抗神経変性薬剤とを含むものであり得る。例えば、１種類以上のＣＬＫ阻害化合物は、有効量の１種類以上のＬ−ＤＯＰＡ；ドパミンアゴニスト；アデノシンＡ２Ａ受容体アンタゴニスト；ＣＯＭＴ阻害剤；ＭＡＯ阻害剤；Ｎ−ＮＯＳ阻害剤；ナトリウムチャネルアンタゴニスト；選択的Ｎ−メチルＤ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体アンタゴニスト；ＡＭＰＡ／カイニン酸受容体アンタゴニスト；カルシウムチャネルアンタゴニスト；ＧＡＢＡ−Ａ受容体アゴニスト；アセチル−コリンエステラーゼ阻害剤；マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤；ＰＡＲＰ阻害剤；ｐ３８  ＭＡＰキナーゼもしくはｃ−ｊｕｎ−Ｎ末端キナーゼの阻害剤；ＴＰＡ；ＮＤＡ  アンタゴニスト；β−インターフェロン；増殖因子；グルタミン酸阻害剤とともに、および／または細胞療法剤の一部として併用され得る。
【０１９２】
例示的なＮ−ＮＯＳ阻害剤としては、４−（６−アミノ−ピリジン−２−イル）−３−メトキシフェノール６−［４−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−２−メトキシ−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［４−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−２，３−ジメチル−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［４−（２−ピロリジニル−エトキシ）−２，３−ジメチル−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［４−（４−（ｎ−メチル）ピペリジニルオキシ）−２，３−ジメチル−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［４−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−３−メトキシ−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［４−（２−ピロリジニル−エトキシ）−３−メトキシ−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−｛４−［２−（６，７−ジメトキシ−３，４−ジヒドロ−１ｈ−イソキノリン−２−イル）−エトキシ］−３−メトキシ−フェニル｝−ピリジン−２−イル−アミン、６−｛３−メトキシ−４−［２−（４−フェネチル−ピペラジン−１−イル）−エトキシ］−フェニル｝−ピリジン−２−イル−アミン、６−｛３−メトキシ−４−［２−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−エトキシ］−フェニル｝−ピリジン−２−イル−アミン、６−｛４−［２−（４−ジメチルアミノ−ピペリジン−１−イル）−エトキシ］−３−メトキシ−フェニル｝−ピリジン−２−イル−アミン、６−［４−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−３−エトキシ−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［４−（２−ピロリジニル−エトキシ）−３−エトキシ−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［４−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−２−イソプロピル−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、４−（６−アミノ−ピリジン−イル）−３−シクロプロピル−フェノール６−［２−シクロプロピル−４−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［２−シクロプロピル−４−（２−ピロリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、３−［３−（６−アミノ−ピリジン−２イル）−４−シクロプロピル−フェノキシ］−ピロリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル６−［２−シクロプロピル−４−（１−メチル−ピロリジン−３−イル−オキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、４−（６−アミノ−ピリジン−２−イル）−３−シクロブチル−フェノール６−［２−シクロブチル−４−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［２−シクロブチル−４−（２−ピロリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［２−シクロブチル−４−（１−メチル−ピロリジン−３−イル−オキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、４−（６−アミノ−ピリジン−２−イル）−３−シクロペンチル−フェノール６−［２−シクロペンチル−４−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［２−シクロペンチル−４−（２−ピロリジン−１イル−エトキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、３−［４−（６−アミノ−ピリジン−２イル）−３−メトキシ−フェノキシ］−ピロリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔブチルエステル６−［４−（１−メチル−ピロリジン−３−イル−オキシ）−２−メトキシ−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、４−［４−（６−アミノ−ピリジン−２イル）−３−メトキシ−フェノキシ−］−ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔブチルエステル６−［２−メトキシ−４−（１−メチル−ピペリジン−４−イル−オキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［４−（アリルオキシ）−２−メトキシ−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、４−（６−アミノ−ピリジン−２−イル）−３−メトキシ−６−アリル−フェノール１２および４−（６−アミノ−ピリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−アリル−フェノール１３  ４−（６−アミノ−ピリジン−２−イル）−３−メトキシ−６−プロピル−フェノール６−［４−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−２−メトキシ−５−プロピル−フェニル］−ピリジン−イル−アミン、６−［２−イソプロピル−４−（ピロリジン−３−イル−オキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［２−イソプロピル−４−（ピペリジン−３−イル−オキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［２−イソプロピル−４−（１−メチル−アゼチジン−３−イル−オキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［２−イソプロピル−４−（１−メチル−ピペリジン−４−イル−オキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［２−イソプロピル−４−（１−メチル−ピロリジン−３−イル−オキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン  ６−［２−イソプロピル−４−（１−メチル−ピロリジン−３−イル−オキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［２−イソプロピル−４−（２−メチル−２−アザ−ビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−イル−オキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［４−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−２−メトキシ−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−｛４−［２−（ベンジル−メチル−アミノ）−エトキシ］−２−メトキシ−フェニル｝−ピリジン−２−イル−アミン、６−［２−メトキシ−４−（２−ピロリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、２−（６−アミノ−ピリジン−２−イル）−５−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−フェノール２−［４−（６−アミノ−ピリジン−２−イル）−３−メトキシ−フェノキシ］−アセトアミド  ６−［４−（２−アミノ−エトキシ）−２−メトキシ−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−｛４−［２−（３，４−ジヒドロ−１ｈ−イソキノリン−２−イル）−エトキシ］−２−メトキシ−フェニル｝−ピリジン−２−イル−アミン、２−［４−（６−アミノ−ピリジン−２−イル）−３−メトキシ−フェノキシ］−エタノール  ６−｛２−メトキシ−４−［２−（２，２，６，６−テトラメチル−ピペリジン−１−イル）−エトキシ］−フェニル｝−ピリジン−２−イル−アミン、６−｛４−［２−（２，５−ジメチル−ピロリジン−１−イル）−エトキシ］−２−メトキシ−フェニル｝−ピリジ���−２−イル−アミン、６−｛４−［２−（２，５−ジメチル−ピロリジン−１−イル）−エトキシ］−２−メトキシ−フェニル｝−ピリジン−２−イル−アミン、２−［４−（６−アミノ−ピリジン−２−イル）−３−メトキシ−フェノキシ］−１−（２，２，６，６−テトラメチル−ピペリジン−１−イル）−エタノン  ６−［２−メトキシ−４−（１−メチル−ピロリジン−２−イル−メトキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［４−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−２−プロポキシ−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−｛４−［２−（ベンジル−メチル−アミノ）−エトキシ］−２−プロポキシ−フェニル｝−ピリジン−２−イル−アミン  ６−［４−（２−エトキシ−エトキシ）−２−メトキシ−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［４−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−２−イソプロポキシ−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［４−（２−エトキシ−エトキシ）−２−イソプロポキシ−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［２−メトキシ−４−（３−メチル−ブトキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［４−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−２−エトキシ−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−｛４−［２−（ベンジル−メチル−アミノ）−エトキシ］−２−エトキシ−フェニル｝−ピリジン−２−イル−アミン、６−［２−エトキシ−４−（３−メチル−ブトキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、１−（６−アミノ−３−アザ−ビシクロ［３．１．０］ヘキソ−３−イル）−２−［４−（６−アミノ−ピリジン−２−イル）−３−エトキシ−フェノキシ］−エタノン  ６−［２−エトキシ−４−（２−ピロリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、３−｛２−［４−（６−アミノ−ピリジン−２−イル）−３−エトキシ−フェノキシ］−エチル｝−３−アザ−ビシクロ［３．１．０］ヘキソ−６−イル−アミン、１−（６−アミノ−３−アザ−ビシクロ［３．１．０］ヘキソ−３−イル）−２−［４−（６−アミノ−ピリジン−２−イル）−３−メトキシ−フェノキシ］−エタノン  ３−｛２−［４−（６−アミノ−ピリジン−２−イル）−３−メトキシ−フェノキシ］−エチル｝−３−アザ−ビシクロ［３．−１．０］ヘキソ−６−イル−アミン、６−［２−イソプロポキシ−４−（２−ピロリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−｛４−［２−（ベンジル−メチル−アミノ）−エトキシ］−２−イソプロポキシ−フェニル−｝−ピリジン−２−イル−アミン、６−［４−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−２−メトキシ−５−プロピル−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［５−アリル−４−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−２−メトキシ−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［５−アリル−２−メトキシ−４−（２−ピロリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［３−アリル−４−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−２−メトキシ−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［２−メトキシ−４−（ピロリジン−３−��ル−オキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［２−メトキシ−４−（１−メチル−ピロリジン−３−イル−オキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［２−エトキシ−４−（ピロリジン−３−イル−オキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［２−イソプロポキシ−４−（ピロリジン−３−イル−オキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［２−メトキシ−４−（ピペリジン−４−イル−オキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［２−メトキシ−４−（２，２，６，６−テトラメチル−ピペリジン−４−イル−オキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［２−イソプロポキシ−４−（ピロリジン−３−イル−オキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、３−［４−（６−アミノ−ピリジン−２−イル）−３−メトキシ−フェノキシ］−アゼチジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル６−［４−（アゼチジン−３−イル−オキシ）−２−メトキシ−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［２−メトキシ−４−（１−メチル−アゼチジン−３−イル−オキシ）−フェニル］−ピリジン−２−ｙ−ｌ−アミン、６−［２−イソプロポキシ−４−（ピロリジン−３−イル−オキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［２−イソプロポキシ−４−（ピロリジン−３−イル−オキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［２−メトキシ−４−（ピロリジン−３−イル−オキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［２−メトキシ−４−（１−メチル−ピロリジン−３−イル−オキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［２−メトキシ−４−（１−メチル−ピロリジン−３−イル−オキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［２−メトキシ−４−（２−メチル−２−アザ−ビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−イル−オキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［２−メトキシ−４−（１−メチル−ピペリジン−４−イル−オキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［４−（１−エチル−ピペリジン−
４−イル−オキシ）−２−メトキシ−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［５−アリル−２−メトキシ−４−（１−メチル−ピロリジン−３−イル−オキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［４−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−２，６−ジメチル−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［２，６−ジメチル−４−（３−ピペリジン−１−イル−プロポキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［２，６−ジメチル−４−（２−ピロリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−｛２，６−ジメチル−４−［３−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−プロポキシ］−フェニル｝−ピリジン−２−イル−アミン、６−［２，６−ジメチル−４−（２−モルホリン−４−イル−エトキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−｛４−［２−（ベンジル−メチル−アミノ）−エトキシ］−２，６−ジメチル−フェニル｝−ピリジン−２−イル−アミン、２−［４−（６−アミノ−ピリジン−２−イル）−３，５−ジメチル−フェノキシ］−アセトアミド  ６−［４−（２−アミノ−エトキシ）−２，６−ジメチル−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［２−イソプロピル−４−（２−ピロリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、２−（２，５−ジメチル−ピロリジン−１−イル）−６−［２−イソプロピル−４−（２−ピロリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル］−ピリジン６−｛４−［２−（３，５−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−エトキシ］−２−イソプロピル−フェニル｝−ピリジン−２−イル−アミン、６−［４−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−２−イソプロピル−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［２−ｔｅｒｔ−ブチル−４−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［２−ｔｅｒｔ−ブチル−４−（２−ピロリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル−］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［４−（２−ピロリジニル−エトキシ）−２，５−ジメチル−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［４−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−２，５−ジメチル−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［４−（２−（４−フェネチルピペラジン−１−イル）−エトキシ）−２，５−ジメチル−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［２−シクロプロピル−４−（２−ジメチルアミノ−１−メチル−エトキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［シクロブチル−４−（２−ジメチルアミノ−１−メチル−エトキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［４−（アリルオキシ）−２−シクロブチル−フェニル］−ピリジン−２イルアミン、２−アリル−４−（６−アミノ−ピリジン−２−イル）−３−シクロブチル−フェノールおよび２−アリル−４−（６−アミノ−ピリジン−２−イル）−５−シクロブチル−フェノール４−（６−アミノ−ピリジン−２イル）−５−シクロブチル−２−プロピル−フェノール４−（６−アミノ−ピリジン−２イル）−３−シクロブチル−２−プロピル−フェノール６−［２−シクロブチ���−４−（２−ジメチルアミノ−１−メチル−エトキシ）−５−プロピル−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［２−シクロブチル−４−（２−ジメチルアミノ−１−メチル−エトキシ）−３−プロピル−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［２−シクロブチル−４−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−５−プロピル−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［２−シクロブチル−４−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−３−プロピル−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［２−シクロブチル−４−（１−メチル−ピロリジン−３−イル−オキシ）−５−プロピル−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［シクロブチル−４−（１−メチル−ピロリジン−３−イル−オキシ）−３−プロピル−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、２−（４−ベンジルオキシ−５−ヒドロキシ−２−メトキシ−フェニル）−６−（２，５−ジメチル−ピロロ−１−イル）−ピリジン  ６−［４−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−５−エトキシ−２−メトキシ−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［５−エチル−２−メトキシ−４−（１−メチル−ピペリジン−４−イル−オキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［５−エチル−２−メトキシ−４−（ピペリジン−４−イル−オキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［２，５−ジメトキシ−４−（１−メチル−ピロリジン−３−イル−オキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミン、６−［４−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−５−エチル−２−メトキシ−フェニル］−ピリジン−２−イル−アミンが挙げられる。
【０１９３】
例示的なＮＭＤＡ受容体アンタゴニストとしては、（＋）−（１Ｓ、２Ｓ）−１−（４−ヒドロキシ−フェニル）−２−（４−ヒドロキシ−４−フェニルピペリジノ）−１−プロパノール、（１Ｓ、２Ｓ）−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−２−（４−ヒドロキシ−４−フェニルピペリジノ）−１−プロパノール、（３Ｒ、４Ｓ）−３−（４−（４−フルオロフェニル）−４−ヒドロキシピペリジン−１−イル−）−クロマン−４，７−ジオール、（１Ｒ＊、２Ｒ＊）−１−（４−ヒドロキシ−３−メチルフェニル）−２−（４−（４−フルオロ−フェニル）−４−ヒドロキシピペリジン−１−イル）−プロパン−１−オール−メシラートまたはその薬学的に許容され得る酸付加塩が挙げられる。
【０１９４】
例示的なドパミンアゴニストとしては、ロピニノール（ｒｏｐｉｎｉｎｏｌｅ）；Ｌ−ドパデカルボキシラーゼ阻害剤（カルビドパまたはベンセラジド、ブロモクリプチン、ジヒドロエルゴクリプチン、エチスレルギン、ＡＦ−１４、アラプチド、ペルゴリド、ピリベジルなど）；ドパミンＤ１受容体アゴニスト（Ａ−６８９３９、Ａ−７７６３６、ジヒドレキシンおよびＳＫＦ−３８３９３など）；ドパミンＤ２受容体アゴニスト（カルベルゴリン、リスリド、Ｎ−０４３４、ナキサゴリド、ＰＤ−１１８４４０、プラミペキソール、キンピロールおよびロピニロールなど）；ドパミン／β−アドレナリン受容体アゴニスト（ＤＰＤＭＳおよびドペキサミンなど）；ドパミン／５−ＨＴ取込み阻害剤／５−ＨＴ−１Ａ  アゴニスト（ロキシンドールなど）；ドパミン／アヘン剤受容体アゴニスト（ＮＩＨ−１０４９４など）；α２−アドレナリン作動性アンタゴニスト／ドパミンアゴニスト（テルグリドなど）；α２−アドレナリン作動性アンタゴニスト／ドパミンＤ２アゴニスト（エルゴリンおよびタリペキソールなど）；ドパミン取込み阻害剤（ＧＢＲ−１２９０９、ＧＢＲ−１３０６９、ＧＹＫＩ−５２８９５およびＮＳ−２１４１など）；モノアミンオキシダーゼ−Ｂ阻害剤（セレギリン、Ｎ−（２−ブチル）−Ｎ−メチルプロパギルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ−（２−ペンチル）プロパギルアミン、ＡＧＮ−１１３３、麦角誘導体、ラザベミド、ＬＵ−５３４３９、ＭＤ−２８００４０およびモフェギリンなど）；ならびにＣＯＭＴ阻害剤（ＣＧＰ−２８０１４など）が挙げられる。
【０１９５】
例示的なアセチルコリンエステラーゼ阻害剤としては、ドネピジル、１−（２−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾル−５−イル）−３−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジニル］−１−プロパノン；１−（２−フェニル−１Ｈ−ベンズイミダゾル−５−イル）−３−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジニル］−１−プロパノン；１−（１−エチル−２−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾル−５−イル）−３−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジニル］−１−プロパノン；１−（２−メチル−６−ベンゾチアゾリル）−３−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジニル］−１−プロパノン；１−（２−メチル−６−ベンゾチアゾリル）−３−［１−［（２−メチル−４−チアゾリル）メチル］−４−ピペリジニル］−１−プロパノン；１−（５−メチル−ベンゾ［ｂ］チエン−２−イル）−３−［１−（フェニルメチル）４−ピペリジニル］−１−プロパノン；１−（６−メチル−ベンゾ［ｂ］チエン−２−イル）−３−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジニル］−１−プロパノン；１−（３，５−ジメチル−ベンゾ［ｂ］チエン−２−イル）−３−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジン−イル］−１−プロパノン；１−（ベンゾ［ｂ］チエン−２−イル）−３−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジニル］−１−プロパノン；１−（ベンゾフラン−２−イル）−３−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジニル］−１−プロパノン；１−（１−フェニルスルホニル−６−メチル−インドル−２−イル）−３−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジニル］−１−プロパノン；１−（６−メチル−インドル−２−イル）−３−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジニル］−１−プロパノン；１−（１−フェニルスルホニル−５−アミノ−インドル−２−イル）−３−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジニル］−１−プロパノン；１−（５−アミノ−インドル−２−イル）−３−［１−（フェニルｍｅｔ−ｈイル）−４−ピペリジニル］−１−プロパノン；および１−（５−アセチルアミノ−インドル−２−イル）−３−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジニル］−１−プロパノン．１−（６−キノリル）−３−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジニル］−１−プロパノン；１−（５−インドリル）−３−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジニル］−１−プロパノン；１−（５−ベンズチエニル）−３−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジニル］−１−プロパノン；１−（６−キナゾリル）−３−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジニル］−１−プロパノン；１−（６−ベンズオサゾリル）−３−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジニル］−１−プロパノン；１−（５−ベンゾフランイル）−３−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジニル］−１−プロパノン；１−（５−メチル−ベンズイミダゾル−２−イル）−３−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジニル］−１−プロパノン；１−（６−メチル−ベンズイミダゾル−２−イル）−３−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジニル］−１−プロパノン；１−（５−クロロ−ベンゾ［ｂ］チエン−２−イル）−３−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジン−イル］−１−プロパノン；１−（５−アザインドル−２−イル）−３−［１−（フェニルメチル）４−ピペリジニル］−１−プロパノン；１−（６−アザベンゾ［ｂ］チエン−２−イル）−３−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジニル］−１−プロパノン；１−（１Ｈ−２−オキソ−ピロロ［２’，３’，５，６］ベンゾ［ｂ］チエノ−２−イル）−３−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジニル］−１−プロパノン；１−（６−メチル−ベンゾチアゾル−２−イル）−３−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジニル］−１−プロパノン；１−（６−メトキシ−インドル−２−イル）−３−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジニル］−１−プロパノン；１−（６−メトキシ−ベンゾ［ｂ］チエン−２−イル）−３−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジニル］−１−プロパノン；１−（６−アセチルアミノ−ベンゾ［ｂ］チエン−２−イル）−３−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジニル］−１−プロパノン；１−（５−アセチルアミノ−ベンゾ［ｂ］チエン−２−イル）−３−［１−（フェニルメチル−）−４−ピペリジニル］−１−プロパノン；６−ヒドロキシ−３−［２−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジン−イル］エチル］−１，２−ベンズイソキサゾール；５−メチル−３−［２−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジニル−］エチル］−１，２−ベンズイソキサゾール；６−メトキシ−３［２−［１（フェニルメチル）−４−ピペリジニル］ｅｔ−ｈｙｌ］−１，２−ベンズイソキサゾール；６−アセトアミド−３−［２−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジニル］−エチル］−１，２−ベンズイソキサゾール；６−アミノ−３−［２−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジニル］エチル］−１，２−ベンズイソキサゾール；６−（４−モルホリニル）−３−［２−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジン−イル］エチル］−１，２−ベンズイソキサゾール；５，７−ジヒドロ−３−［２−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジニル］エチル］−６Ｈ−ピロロ［４，５−ｆ］−１，２−ベンズイソキサゾール−６−オン；３−［２−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジニル］エチル］−１，２−ベンズイソチアゾール；３−［２−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジニル］エテニル］−１，２−ベンズイソキサゾール；６−フェニルアミノ−３−［２−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジニル］エチル］−１，２，−ベンズイソキサゾール；６−（２−チアゾリル）−３−［２−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジニル］エチル］−１，２−ベンズイソオキサゾール；６−（２−オキサゾリル）−３−［２−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジニル］エチル］−１，２−ベンズイソオキサゾール；６−ピロリジニル−３−［２−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジニル］エチル］−１，−２−ベンズイソキサゾール；５，７−ジヒドロ−５，５−ジメチル−３−［２−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジニル］エチル］−６Ｈ−ピロロ［４，５−ｆ］−１，２−ベンズイソキサゾール−６−オン；６，８−ジヒドロ−３−［２−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジニル］エチル］−７Ｈ−ピロロ［５，４−ｇ］−１，２−ベンズイソキサゾール−７−オン；３−［２−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジニル］エチル］−５，６，−８−トリヒドロ−７Ｈ−イソキサゾロ［４，５−ｇ］−キノリン−７−オン；１−ベンジル−４−（（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イル）メチルピペリジン、１−ベンジル−４−（（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イリデニル）メチルピペリジン、１−ベンジル−４−（（５−メトキシ−１−インダノン）−２−イル）メチルピペリジン、１−ベンジル−４−（（５，６−ジエトキシ−１−インダノン）−２−イル）メチルピペリジン、１−ベンジル−４−（（５，６−メチレン（ｍｅｔｈｎｙｌｅｎｅ）ジオキシ−１−インダノン）−２−イル）メチルピペリジン、１−（ｍ−ニトロベンジル）−４−（（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イル）メチルピペリジン、１−シクロヘキシメチル−４−（（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イル）メチルピペリジン、１−（ｍ−フロロベンジル）−４−（（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イル）メチルピペリジン、１−ベンジル−４−（（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イル）プロピルピペリジン、および１−ベンジル−４−（（５−イソプロポキシ−６−メトキシ−１−インダノン）−２−イル）メチルピペリジンが挙げられる。
【０１９６】
例示的なカルシウムチャネルアンタゴニストとしては、ジルチアゼム、ω−コノ毒素ＧＶＩＡ、メトキシベラパミル、アムロジピン、フェロジピン、ラシジピン、およびミベフラジルが挙げられる。
【０１９７】
例示的なＧＡＢＡ−Ａ受容体モジュレータとしては、クロメチアゾール；ＩＤＤＢ；ガボクサドール（４，５，６，７−テトラヒドロイソキサゾロ［５，４−ｃ］ピリジン−３−オール）；ガナキソロン（３α−ヒドロキシ−３β−メチル−５α−プレグナン−２０−オン）；フェンガビン（２−［（ブチルイミノ）−（２−クロロフェニル）メチル］−４−クロロフェノール）；２−（４−メトキシフェニル）−２，５，６，７，８，９−ヘキサヒドロ−ピラゾロ［４，３−ｃ］シンノリン−３−オン；７−シクロブチル−６−（２−メチル−２Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イルメトキシ）−３−フェニル−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ｂ］ピリダジン；（３−フルオロ−４−メチルフェニル）−Ｎ−（｛−１−［（２−メチルフェニル）メチル］−ベンズイミダゾル−２−イル｝メチル）−Ｎ−ペンチルカルボキサミド；および３−（アミノメチル）−５−メチルヘキサン酸が挙げられる。
【０１９８】
例示的なカリウムチャネル開放薬としては、ジアゾキシド、フルピルチン、ピナシジル、レブクロマカリム、リルマカリム、クロマカリム、ＰＣＯ−４００およびＳＫＰ−４５０（２−［２’’（１’’，３’’−ジオキソロン）−２−メチル］−４−（２’−オキソ−１’−ピロリジニル）−６−ニトロ−２Ｈ−１−ベンゾピラン）が挙げられる。
【０１９９】
例示的なＡＭＰＡ／カイニン酸受容体アンタゴニストとしては、６−シアノ−７−ニトロキノキサリン−２，３−ジオン（ＣＮＱＸ）；６−ニトロ−７−スルファモイルベンゾ［ｆ］キノキサリン−２，３−ジオン（ＮＢＱＸ）；６，７−ジニトロキノキサリン−２，３−ジオン（ＤＮＱＸ）；１−（４−アミノフェニル）−４−メチル−７，８−メチレンジオキシ−５Ｈ−２，３−ベンゾジアゼピン塩酸塩；および２，３−ジヒドロキシ−６−ニトロ−７−スルファモイルベンゾ−［ｆ］キノキサリンが挙げられる。
【０２００】
例示的なナトリウムチャネルアンタゴニストとしては、アジマリン、プロカインアミド、フレカイニドおよびリルゾールが挙げられる。
【０２０１】
例示的なマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤としては、４−［４−（４−フルオロフェノキシ）ベンゼンスルホン−イルアミノ］テトラヒドロピラン−４−カルボン酸ヒドロキシアミド；５−メチル−５−（４−（４’−フルオロフェノキシ）−フェノキシ）−ピリミジン−２，４，６−トリオン；５−ｎ−ブチル−５−（４−（４’−フルオロフェノキシ）−フェノキシ）−ピリミジン−２，４，６−トリオンおよびプリノミスタットが挙げられる。
【０２０２】
ポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）は、ＤＮＡ鎖の１回の破断によって活性化され、ＮＡＤからポリ（ＡＤＰリボース）を合成する豊富な核酵素である。通常の条件下では、ＰＡＲＰは、核内のＤＮＡ修復酵素の活性化および漸増による、酸化的ストレスによって引き起こされる塩基切除の修復に関与している。したがって、ＰＡＲＰは、細胞壊死およびＤＮＡ修復においてある役割を果たしている。ＰＡＲＰはまた、炎症を媒介するサイトカイン発現の調節に関与している。ＤＮＡ損傷が過剰である（例えば、病原性の障害への急性の過剰な曝露などによる）条件下では、ＰＡＲＰは過剰活性化され、ＮＡＤ枯渇を特徴とする細胞系のエネルギー障害がもたらされ、ＡＴＰ消費、細胞の壊死、組織損傷および器官損傷／機能不全に至る。ＰＡＲＰは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）を枯渇させ、次いで、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ；ＣｏｓｉおよびＭａｒｉｅｎ、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８９０：２２７、１９９９）が減少して細胞死に寄与することにより神経変性に寄与すると考えられており、これは、ＰＡＲＰ阻害剤によって予防され得る。例示的なＰＡＲＰ阻害剤は、ＳｏｕｔｈａｎおよびＳｚａｂｏ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１０：３２１，２００３を見るとよい。
【０２０３】
ｐ３８  ＭＡＰ  キナーゼおよびｃ−ｊｕｎ−Ｎ末端キナーゼの例示的な阻害剤としては、ピリジルイミダゾール類、例えば、ＰＤ  １６９３１６、異性体のＰＤ  １６９３１６、ＳＢ  ２０３５８０、ＳＢ  ２０２１９０、ＳＢ  ２２００２６およびＲＷＪ  ６７６５７が挙げられる。他は、米国特許第６，２８８，０８９号に記載されたものであり、引用により本明細書に組み込む。
【０２０４】
例示的な一実施形態において、ＭＳの処置または予防のための併用療法剤は、治療有効量の１種類以上のＣＬＫ阻害化合物および１種類以上のＡｖｏｎｅｘ（登録商標）（インターフェロンβ−１ａ）、Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標）（ナタリツマブ）またはＦｕｍａｄｅｒｍ（登録商標）（ＢＧ−１２／経口用フマレート）を含む。
【０２０５】
別の実施形態において、糖尿病性神経障害またはこれと関連している状態の処置または予防のための併用療法剤は、治療有効量の１種類以上のＣＬＫ阻害化合物および１種類以上の三環系抗うつ薬（ＴＣＡｓ）（例えば、イミプラミン、アミトリプチリン、デシプラミンおよびノルトリプチリンなど）、セロトニン再取込み阻害剤（ＳＳＲＩ）（例えば、フルオキセチン、パロキセチン、セルトラレンおよびシタロプラムなど）ならびに抗癲癇薬（ＡＥＤ）（例えば、ガバペンチン、カルバマゼピンおよびトピミレート（ｔｏｐｉｍｉｒａｔｅ）など）を含む。
【０２０６】
別の実施形態において、本発明は、少なくとも１種類のＣＬＫ阻害化合物および少なくとも１種類のＨＤＡＣ  Ｉ／ＩＩ阻害剤を含む組合せを用いて、ポリグルタミン病を処置または予防するための方法を提供する。ＨＤＡＣ  Ｉ／ＩＩ阻害剤の例としては、ヒドロキサム酸、環状ペプチド、ベンズアミド、短鎖脂肪酸およびデプデシンが挙げられる。
【０２０７】
ヒドロキサム酸およびヒドロキサム酸誘導体の例としては、限定されないが、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、オキサムフラチン、スベリック（ｓｕｂｅｒｉｃ）ビスヒドロキサム酸（ＳＢＨＡ）、ｍ−カルボキシ−桂皮酸ビスヒドロキサム酸（ＣＢＨＡ）、バルプロ酸およびピロキサミドが挙げられる。ＴＳＡは、抗真菌抗生物質として単離され（Ｔｓｕｊｉら（１９７６）Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ  （Ｔｏｋｙｏ）２９：１−６）、哺乳動物のＨＤＡＣの強力な阻害剤であることがわかった（Ｙｏｓｈｉｄａら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１７１７４−１７１７９）。ＴＳＡ抵抗性細胞株が改変されたＨＤＡＣを有するという所見は、この酵素がＴＳＡの重要な標的であることを証明する。他のヒドロキサム酸系ＨＤＡＣ阻害剤であるＳＡＨＡ、ＳＢＨＡおよびＣＢＨＡは、インビトロまたはインビボにてマイクロモル濃度以下でＨＤＡＣを阻害し得る合成化合物である。Ｇｌｉｃｋら（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：４３９２−４３９９。これらのヒドロキサム酸系ＨＤＡＣ阻害剤はすべて、不可欠な構造的特徴：疎水性メチレンスペーサー（例えば、６炭素長）を介して、末端疎水性部分（例えば、ベンゼン環）に結合された別の極性部位に連結された極性のヒドロキサム酸末端を有する。かかる不可欠な特徴を有するように開発された化合物もまた、ＨＤＡＣ阻害剤として使用され得るヒドロキサム酸の範囲に含まれる。
【０２０８】
ＨＤＡＣ阻害剤として使用される環状ペプチドは、主に、環状テトラペプチドである。環状ペプチドの例としては、限定されないが、トラポキシンＡ、アピシジンおよびデプシペプチドが挙げられる。トラポキシンＡは、２−アミノ−８−オキソ−９，１０−エポキシ−デカノイル（ＡＯＥ）部分を含有する環状テトラペプチドである。Ｋｉｊｉｍａら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２４２９−２２４３５。アピシジンは、真菌の代謝産物であり、強力な広域の抗原虫活性を示し、ナノモル濃度でＨＤＡＣ活性を阻害する。Ｄａｒｋｉｎ−Ｒａｔｔｒａｙら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３；１３１４３−１３１４７。デプシペプチドは、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍから単離されたものであり、マイクロモル濃度でＨＤＡＣ活性を阻害することが示されている。
【０２０９】
ベンズアミドの例としては、限定されないが、ＭＳ−２７−２７５が挙げられる。Ｓａｉｔｏら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９６：４５９２−４５９７。短鎖脂肪酸の例としては、限定されないが、酪酸塩（例えば、酪酸、アルギニン酪酸塩および酪酸フェニル（ＰＢ））が挙げられる。Ｎｅｗｍａｒｋら（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．７８：１−５；およびＣａｒｄｕｃｃｉら（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１７：３９７２−３９７３。また、マイクロモル濃度でＨＤＡＣを阻害することが示されているデプデシン（Ｋｗｏｎら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９５：３３５６−３３６１）もまた、本明細書に記載のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の範囲に含まれる。
【０２１０】
ｖ．血液凝固障害
他の態様において、ＣＬＫ阻害化合物は、血液凝固障害（または止血障害）を処置または予防するために使用され得る。本明細書において互換的に用いられる用語「止血」、「血液凝固」および「血液凝固」は、出血の制御、例えば、血管収縮および凝固の生理学的特性をいう。血液凝固は、損傷、炎症、疾患、先天的欠陥、機能不全または他の途絶後の哺乳動物の血液循環の完全性の維持を補助する。凝血の開始後、血液凝固は、ある種の血漿プロ酵素のその酵素形態への逐次的活性化により進行する（例えば、Ｃｏｌｅｍａｎ、Ｒ．Ｗ．ら（編）Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９８７）を参照のこと）。このような血漿糖タンパク質、例えば、第ＸＩＩ因子、第ＸＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＶＩＩ因子およびプロトロンビンは、セリンプロテアーゼのチモーゲンである。これらの血液凝固酵素のほとんどは、生理学的規模において、膜表面でタンパク質補因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子および第Ｖ因子など）との複合体に組織化された場合のみ有効である。他の血液因子は、血餅形成をモジュレートし、局在させるか、または血餅を溶解させるものである。活性化されたプロテインＣは、凝血促進成分を不活化させる特異的酵素である。カルシウムイオンは、該成分の反応の多くに関与している。血液凝固は、固有の経路（この場合、タンパク質成分のすべてが血液中に存在する）、または外因性経路（この場合、細胞膜タンパク質組織因子が重要な役割を果たす）のいずれかに従う。血餅形成は、フィブリノゲンがトロンビンによって切断され、フィブリンが形成された場合に起こる。血餅は、活性化された血小板およびフィブリンで構成されている。
【０２１１】
さらに、血餅の形成は、損傷の場合の出血を制限するだけでなく（止血）、重要な動脈または静脈の閉塞によって、アテローム硬化性疾患の状況では重篤な器官の損傷および死がもたらされ得る。したがって、血栓症は、誤った時点および場所における血餅形成である。これは、循環血液タンパク質（凝固因子）、血液細胞（特に、血小板）および損傷血管壁の要素間の複雑で規制された生化学的反応のカスケードを伴う。
【０２１２】
したがって、本発明は、血液凝固障害、例えば、心筋梗塞、脳卒中、末梢動脈疾患による肢部の喪失または肺動脈塞栓症などを予防または処置するために、血餅形成の阻害を目的とする抗凝固処置および抗血栓処置を提供する。
【０２１３】
本明細書において互換的に用いる「止血をモジュレートすること、またはモジュレーション」および「止血を調節すること、または調節」は、止血の誘導（例えば、刺激または増大）、ならびに止血の阻害（例えば、低下または減少）を含む。
【０２１４】
一態様において、本発明は、ＣＬＫ阻害化合物を投与することにより、被験体において
止血を低減または阻止するための方法を提供する。本明細書に開示した組成物および方法は、血栓性障害の処置または予防に有用である。本明細書で用いる場合、用語「血栓性障害」は、過度もしくは好ましくない凝固もしくは止血活性、または凝固能亢進状態を特徴とする任意の障害または状態を含む。血栓性障害としては、血小板粘着および血栓形成を伴う疾患または障害が挙げられ、血栓を形成する傾向の増大、例えば、血栓の数の増大、早期の血栓症、血栓症に対する家族性傾向、および非通常部位における血栓症として発現され得る。血栓性障害の例としては、限定されないが、血栓塞栓症、深静脈血栓症、肺動脈塞栓症、脳卒中、心筋梗塞、流産、アンチトロンビンＩＩＩ欠損と関連する栓友病、プロテインＣ欠損、プロテインＳ欠損、活性化されプロテインＣに対する抵抗性、異常フィブリノゲン血症、線維素溶解性障害、ホモシスチン尿症、妊娠、炎症性障害、骨髄増殖性障害、動脈硬化、狭心症、例えば、不安定狭心症、播種性血管内凝固症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、癌転移、鎌状赤血球症、糸球体腎炎および薬物誘発性血小板減少症（例えば、ヘパリン誘発性血小板減少症など）が挙げられる。また、ＣＬＫ阻害化合物は、血栓性事象を予防するため、または治療的血餅溶解または血管形成術もしくは外科処置などの手順の間またはその後の再閉塞を予防するために投与され得る。
【０２１５】
別の実施形態において、併用薬レジメンは、血液凝固障害または該状態と関連している続発性状態の処置または予防のための薬物または化合物を含むものであり得る。したがって、併用薬レジメンは、１種類以上のＣＬＫ阻害化合物および１種類以上の抗凝固剤または抗血栓症薬剤を含むものであり得る。例えば、１種類以上のＣＬＫ阻害化合物は、アスピリン、ヘパリン、およびＶｉｔ  Ｋ依存性因子を阻害する経口ワルファリン、第Ｘ因子および第ＩＩ因子を阻害する低分子量ヘパリン、トロンビン阻害剤、血小板ＧＰ  ＩＩｂＩＩＩａ受容体の阻害剤、組織因子（ＴＦ）の阻害剤、ヒトフォン・ヴィレブランド因子の阻害剤、止血に関与している（特に、凝固カスケードにおいて）１種類以上の因子の阻害剤の１種類以上の有効量と併用され得る。また、ＣＬＫ阻害化合物は、血栓溶解剤、例えば、ｔ−ＰＡ、ストレプトキナーゼ、レプチラーゼ、ＴＮＫ−ｔ−ＰＡおよびスタフィロキナーゼと併用され得る。
【０２１６】
ｖｉ．体重制限
別の態様において、ＣＬＫ阻害化合物は、被験体において体重増加または肥満を処置または予防するために使用され得る。例えば、ＣＬＫ阻害化合物は、例えば、遺伝性肥満、食事性肥満、ホルモン関連肥満、薬物投与と関連する肥満を処置または予防するため、被験体の体重を減少させるため、または被験体において体重増加を低減もしくは抑制するために使用され得る。かかる処置を必要とする被験体は、肥満である、おそらく肥満になる、太り過ぎ、またはおそらく太り過ぎになる被験体であり得る。おそらく肥満または太り過ぎになる被験体は、例えば、家族歴、遺伝的特徴、食事、活動レベル、治療薬摂取またはこれらの種々の組合せに基づいて特定され得る。
【０２１７】
また他の実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、被験体において体重減少を促進させることにより処置または予防され得るさまざまな他の疾患および状態に苦しむ被験体に投与され得る。かかる疾患としては、例えば、高血圧、高血圧症、高血中コレステロール、脂質代謝異常、２型糖尿病、インスリン抵抗性、耐糖能障害、高インスリン血症、冠動脈心臓疾患、狭心症、うっ血性心不全、脳卒中、胆石、胆嚢炎および胆石症、痛風、変形性関節症、閉塞性睡眠時無呼吸および呼吸困難、ある種の癌（子宮内膜、乳房、前立腺および結腸）、妊娠合併症、女性の不充分な生殖上の健康（例えば、月経不順、不妊、不規則な排卵）、膀胱制御困難（例えば、緊張性尿失禁）；尿酸腎結石症；精神的障害（例えば、鬱病、摂食障害、身体イメージの崩壊および低い自己評価など）が挙げられる。Ｓｔｕｎｋａｒｄ  ＡＪ，Ｗａｄｄｅｎ  ＴＡ．（編）Ｏｂｅｓｉｔｙ：ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ、第２版．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３。最後に、ＡＩＤＳ患者は、ＡＩＤＳの併用療法に応答した脂肪異栄養症またはインスリン抵抗性を発現し得る。
【０２１８】
別の実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、脂肪生成または脂肪細胞分化を、インビトロであろうとインビボいずれかで抑制するために使用され得る。特に、高循環レベルのインスリンおよび／またはインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）１が、前駆脂肪細胞を漸増させて脂肪細胞に分化させることが抑制される。かかる方法は、肥満を処置または予防するために使用され得る。
【０２１９】
他の実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、食欲の低下および／または満腹感の増大により、体重減少を引き起こすか、または体重増加回避するために使用され得る。かかる処置を必要とする被験体は、太り過ぎ、肥満である被験体、またはおそらく太り過ぎ、もしくは肥満になる被験体であり得る。該方法は、毎日または１日おき、または週１回、ある用量を、例えば丸剤の形態で被験体に投与することを含むものであり得る。用量は、「食欲低下用量」であり得る。
【０２２０】
他の実施形態において、ＣＬＫ活性化化合物は、食欲および／または体重増加を刺激するために使用され得る。該方法は、ＣＬＫタンパク質のレベルおよび／または活性を増大させるＣＬＫ活性化化合物（ＣＬＫ１、ＣＬＫ２、ＣＬＫ３および／またはＣＬＫ４など）の医薬有効量を、被験体（それを必要とする被験体など）に投与することを含むものであり得る。かかる処置を必要とする被験体は、悪液質を有するか、またはおそらく悪液質を発症し得る被験体であり得る。薬剤の組合せもまた投与され得る。該方法は、さらに、被験体において疾患またはＣＬＫの活性化の状態（例えば、脂肪組織における）をモニタリングすることを含むものであり得る。
【０２２１】
例えば、体重増加を予防する他の薬物を同定するために使用され得る体重増加の細胞モデルを確立するため、細胞内の脂肪蓄積を刺激するための方法がインビトロで使用され得る。
【０２２２】
また、インビトロまたはインビボいずれかで脂質生成または脂肪細胞分化をモジュレートするための方法が提供される。特に、高循環レベルのインスリンおよび／またはインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）１が、前駆脂肪細胞を漸増させて脂肪細胞に分化させることが抑制される。かかる方法は、肥満を調節するために使用され得る。脂質生成を刺激するための方法は、細胞をＣＬＫ活性化化合物と接触させることを含むものであり得る。
【０２２３】
別の実施形態において、本発明は、ＣＬＫ活性化化合物を投与することにより被験体において、脂肪または脂質代謝を低減させる方法を提供する。該方法は、被験体に、ある量のＣＬＫ活性化化合物を、例えば、ＷＡＴ細胞から血液への脂肪の代謝を低下させるため、および／またはＢＡＴ細胞による脂肪燃焼を低下させるために有効な量で投与することを含む。
【０２２４】
食欲および／または体重増加を促進するための方法は、例えば、被験体が脂肪または脂質代謝の低減が必要であると確認される（例えば、被験体の体重測定によって）前に、被験体のＢＭＩを測定すること、または被験体の脂肪含量もしくは被験体の細胞におけるＣＬＫ活性を評価することを含むものであり得る。また、該方法は、例えば、ＣＬＫ活性化化合物の投与中および／または投与後に、被験体をモニタリングすることを含むものである得る。投与は、例えばボーラスで、または連続的に送達される１回以上の投薬量を含むものであり得る。モニタリングは、ホルモンまたは代謝産物を評価することを含むものであってもよい。例示的なホルモンとしては、レプチン、アジポネクチン、レジスチンおよびインスリンが挙げられる。例示的な代謝産物としては、トリグリセリド、コレステロールおよび脂肪酸が挙げられる。
【０２２５】
一実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、組織、例えば、顔面組織または首、手、脚または唇の他の表面関連組織内の皮下脂肪の量を調節する（例えば、減少させる）ために使用され得る。ＣＬＫ阻害化合物は、はり（ｒｉｇｉｄｉｔｙ）、水分貯留または組織の支持特性を増大させるために使用され得る。例えば、ＣＬＫ阻害化合物は、例えば表面関連組織の処置のため、経表面的に、例えば、別の薬剤と関連させて適用され得る。また、ＣＬＫ阻害化合物は、皮下に、例えば、皮下脂肪の変動が所望される領域内に注射され得る。
【０２２６】
体重を調節するための方法は、さらに、被験体の体重および／または例えば脂肪組織におけるＣＬＫモジュレーションのレベルをモニタリングすることを含むものであり得る。
【０２２７】
例示的な一実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、体重増加または肥満の処置または予防のための併用療法剤として投与され得る。例えば、１種類以上のＣＬＫ阻害化合物が、１種類以上の抗肥満薬剤との組合せで投与され得る。例示的な抗肥満薬剤としては、フェニルプロパノールアミン、エフェドリン、プソイドエフェドリン、フェンテルミン、コレシストキニン−Ａ作動薬、モノアミン再取り込み阻害剤（例えば、シブトラミンなど）、交感神経様作用剤、セロトニン作動剤（例えば、デキスフェンフルラミンもしくはフェンフルラミンなど）、ドパミン作動薬（例えば、ブロモクリプチンなど）、メラニン細胞刺激ホルモン受容体作動薬または模倣薬、メラニン細胞刺激ホルモン類縁体、カンナビノイド受容体拮抗剤、メラニン凝集ホルモン拮抗剤、ＯＢタンパク質（レプチン）、レプチン類縁体、レプチン受容体作動薬、ガラニン拮抗剤またはＧＩリパーゼ阻害剤もしくは減少剤（ｄｅｃｒｅａｓｅｒ）（例えば、オーリスタットなど）が挙げられる。他の食欲抑制剤としては、ボンベシン作動薬、デヒドロエピアンドロステロンまたはその類縁体、グルココルチコイド受容体作動薬および拮抗剤、オレキシン受容体拮抗剤、ウロコルチン結合タンパク質拮抗剤、グルカゴン様ペプチド−１受容体（例えば、エキセンディンなど）および毛様体神経栄養因子（例えば、アクソカインなど）の作動薬が挙げられる。
【０２２８】
別の実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、薬物誘発性体重増加を低減させるために投与され得る。例えば、ＣＬＫ阻害化合物は、食欲を刺激するもの、または体重増加（特に、水分貯留以外の要素による体重増加）を引き起こすものであり得る薬物療法剤との併用療法剤として投与され得る。体重増加を引き起こしえる薬物療法剤の例としては、例えば、糖尿病処置薬、例えば、スルホニル尿素（グリピジドおよびグリブリドなど）、チアゾリジンジオン（ピオグリタゾンおよびロシグリタゾン）、メグリチナイド、ナテグリニド、レパグリニド、スルホニル尿素系薬およびインスリン；抗鬱薬、例えば、三環系抗鬱薬（アミトリプチリンおよびイミプラミンなど）、不可逆性モノアミンオキシダーゼ阻害剤（ＭＡＯＩ）、選択的セロトニン再取込み阻害剤（ＳＳＲＩ）、ブプロピオン、パロキセチンおよびミルタザピンなど；ステロイド類、例えば、プレドニゾンなど；ホルモン療法剤；炭酸リチウム；バルプロ酸；カルバマゼピン；クロルプロマジン；チオチキセン；β遮断薬（プロプラノロールなど）；α遮断薬（クロニジン、プラゾシンおよびテラゾシンなど）；ならびに避妊薬、例えば、経口避妊薬（避妊用ピル）またはエストロゲンおよび／またはプロゲステロンを含有する他の避妊薬（Ｄｅｐｏ−Ｐｒｏｖｅｒａ、Ｎｏｒｐｌａｎｔ、Ｏｒｔｈｏ）、テストステロンまたはメゲストロールが挙げられる。別の例示的な実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、禁煙プログラムの一部として体重増加を予防するため、または既に増えた体重を減少させるために投与され得る。
【０２２９】
ｖｉｉ．代謝障害／糖尿病
別の態様において、ＣＬＫ阻害化合物は、代謝障害、例えば、インスリン抵抗性、プレ糖尿病性状態、ＩＩ型糖尿病および／またはその合併症などを処置または予防するために使用され得る。ＣＬＫ阻害化合物の投与により、被験体においてインスリン感受性が増大および／またはインスリンレベルが減少され得る。かかる処置を必要とする被験体は、インスリン抵抗性もしくはＩＩ型糖尿病の他の前兆症状を有する被験体、ＩＩ型糖尿病を有する被験体、またはおそらく任意のこれらの状態を発現する被験体であり得る。例えば、被験体は、インスリン抵抗性を有する被験体、例えば、高循環レベルのインスリンおよび／または関連状態、例えば、高脂血症、脂質生成不全（ｄｙｓｌｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ）、高コレステロール血症、グルコース寛容減損、高血中ブドウ糖レベル、Ｘ症候群の他の徴候、高血圧症、アテローム性動脈硬化および脂肪異栄養症を有する被験体であり得る。
【０２３０】
例示的な一実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、代謝障害を処置または予防するための併用療法剤として投与され得る。例えば、１種類以上のＣＬＫ阻害化合物は、１種類以上の抗糖尿病剤と組み合わせて投与され得る。例示的な抗糖尿病剤としては、例えば、アルドースレダクターゼ阻害剤、グリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤、ソルビトールデヒドロゲナーゼ阻害剤、タンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ阻害剤、ジペプチジルプロテアーゼ阻害剤、インスリン（例えば、経口用の生物学的利用可能なインスリン調製物）、インスリン模倣薬、メトホルミン、アクラボス、ペルオキシソーム増殖薬活性化受容体−γ（ＰＰＡＲ−γ）リガンド、例えば、トログリタゾン、ロシグリタゾン（ｒｏｓａｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、ピオグリタゾンまたはＧＷ−１９２９など、スルホニル尿素、グリパジド、グリブリドまたはクロルプロパミドが挙げられ、ここで、第１および第２の化合物の量が治療効果をもたらす。他の化合物抗糖尿病剤としてはグルコシダーゼ阻害剤、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、インスリン、ＰＰＡＲα／γデュアル作動薬、メグリチミド（ｍｅｇｌｉｔｉｍｉｄｅ）およびαＰ２阻害剤が挙げられる。例示的な一実施形態において、抗糖尿病剤は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰ−ＩＶまたはＤＰＰ−ＩＶ）阻害剤、例えば、ＬＡＦ２３７（Ｎｏｖａｒｔｉｓ製）（ＮＶＰ  ＤＰＰ７２８；ｌ−［［［２−［（５−シアノピリジン−２−イル）アミノ］エチル］アミノ］アセチル］−２−シアノ−（Ｓ）−ピロリジン）またはＭＫ−０４３０１（Ｍｅｒｃｋ製）などであり得る（例えば、Ｈｕｇｈｅｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８：１１５９７−６０３（１９９９）参照）。
【０２３１】
ｖｉｉｉ．炎症性疾患
他の態様において、ＣＬＫ阻害化合物は、炎症と関連する疾患または障害を処置または予防するために使用され得る。ＣＬＫ阻害化合物は、炎症の発生の前、発生時または発生後に投与され得る。予防的に用いる場合、該化合物は、好ましくは、任意の炎症性応答または症状の前に提供される。該化合物の投与により、炎症性応答または症状が予防または減弱され得る。
【０２３２】
例示的な炎症性状態としては、例えば、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬性関節炎、変形性関節症、脊椎性関節症（ｓｐｏｎｄｏｕｌｏａｒｔｈｒｏｐａｔｈｉｅｓ）、痛風性関節炎、全身性エリテマトーデス、若年性関節炎、関節リウマチ、変形性関節症、骨粗鬆症、糖尿病（例えば、インスリン依存性真性糖尿病もしくは若年発症糖尿病）、月経痛、嚢胞性線維症、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、クローン病、粘液性大腸炎、潰瘍性大腸炎、胃炎、食道炎、膵炎、腹膜炎、アルツハイマー病、ショック、強直性脊椎炎、胃炎、結膜炎、膵炎（ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ）（急性もしくは慢性）、多臓器機能障害症候群（例えば、敗血症もしくは外傷に続発性）、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化、脳卒中、再灌流障害（例えば、心肺バイパスもしくは腎臓透析による）、急性糸球体腎炎、脈管炎、熱傷（すなわち、日焼け）、壊死性腸炎、顆粒球輸血関連症候群および／またはシェーグレン症候群が挙げられる。例示的な皮膚の炎症性状態としては、例えば、湿疹、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、じんま疹、強皮症（ｓｃｈｌｅｒｏｄｅｒｍａ）、乾癬および急性炎症性成分による皮膚病が挙げられる。
【０２３３】
別の実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、アレルギーおよび呼吸器病、例えば、喘息、気管支炎、肺線維症、アレルギー性鼻炎、酸素毒性、気腫、慢性気管支炎、急性呼吸促迫症候群、および任意の慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を処置または予防するために使用され得る。該化合物は、慢性肝炎感染、例えば、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎を処置するために使用され得る。
【０２３４】
さらに、ＣＬＫ阻害化合物は、自己免疫疾患および／または自己免疫疾患と関連する炎症、例えば、器官−組織自己免疫疾患（例えば、レイノー症候群）、強皮症、重症筋無力症、移植拒絶、内毒素性ショック、セプシス、乾癬、湿疹、皮膚炎、多発性硬化症、自己免疫甲状腺炎、ブドウ膜炎、全身性エリテマトーデス、アディソン病、多腺性自己免疫疾患（多腺性自己免疫症候群としても知られる）およびグレーヴズ病などを処置するために使用され得る。
【０２３５】
特定のある実施形態において、１種類以上のＣＬＫ阻害化合物は、炎症を処置または予防するのに有用な他の化合物と組み合わせて摂取され得る。例示的な抗炎症剤としては、例えば、ステロイド（例えば、コルチゾル、コルチゾン、フルドロコルチゾン、プレドニゾン、６α−メチルプレドニゾン、トリアムシノロン、ベータメタゾンもしくはデキサメタゾン）、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ（例えば、アスピリン、アセトアミノフェン、トルメチン、イブプロフェン、メフェナム酸、ピロキシカム、ナブメトン、ロフェコキシブ、セレコキシブ、エトドラクもしくはニメスリド）が挙げられる。別の実施形態において、その他の治療用薬剤は、抗生物質（例えば、バンコマイシン、ペニシリン、アモキシリン、アンピシリン、セフォタキシム、セフトリアキソン、セフィキシム、リファンピンメトロニダゾール、ドキシサイクリンまたはストレプトマイシン）である。別の実施形態において、その他の治療用薬剤はＰＤＥ４阻害剤（例えば、ロフルミラストまたはロリプラム）である。別の実施形態において、その他の治療用薬剤は、抗ヒスタミン薬（例えば、シクリジン、ヒドロキシジン、プロメタジンまたはジフェンヒドラミン）。別の実施形態において、その他の治療用薬剤は抗マラリア薬（例えば、アルテミシニン、アルテメサ、アルテスネート、リン酸クロロキン、塩酸メフロキン、ドキシサイクリンハイクレート、塩酸プログアニル、アトバクオンまたはハロファントリン）。一実施形態において、その他の治療用薬剤はロトレコギン・アルファである。
【０２３６】
抗炎症剤のさらなる例としては、例えば、アセクロフェナック、アセメタシン、ｅ−アセトアミドカプロン酸、アセトアミノフェン、アセトアミノサロール、アセトアニリド、アセチルサリチル酸、Ｓ−アデノシルメチオニン、アルクロフェナック、アルクロメタゾン、アルフェンタニル、アルゲストン、アリルプロジン、アルミノプロフェン、アロキシプリン、αプロジン、アルミニウムビス（アセチルサリチル酸塩）、アムシノニド、アムフェナク、アミノクロルテノキサジン、３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸、２−アミノ−４−ピコリン、アミノプロピロン、アミノピリン、アミキセトリン、サリチル酸アンモニウム、アンピロキシカム、アムトリメチングアシル、アニレリジン、抗ピリン、アントラフェニン、アパゾン、ベクロメタゾン、ベンダザック、ベノリレート（ｂｅｎｏｒｙｌａｔｅ）、ベノキサプロフェン、ベンズピペリロン、ベンジダミン、ベンジルモルヒネ、ベルモプロフェン、ベータメタゾン、ベータメタゾン−１７−吉草酸塩、ベジトラミド、α−ビサボロール、ブロムフェナク、ｐ−ブロモアセトアニリド、５−ブロモサリチル酸酢酸塩、ブロモサリゲニン、ブセチン、ブクロキシン酸、ブコローム、ブデソニド、ブフェキサマク、ブマジゾン、ブプレノルフィン、ブタセチン、ブチブフェン、ブトルファノール、カルバマゼピン、カルビフェン、カルプロフェン、カルサラム、クロロブタノール、クロロプレドニゾン、クロルテノキサジン、コリンサリチル酸塩、シンコフェン、シンメタシン、シラマドール、クリダナク、クロベタゾール、クロコルトロン、クロメタシン、クロニタゼン、クロニキシン、キウロピラク、クロプレドノール、クローブ、コデイン、コデインメチルブロミド、リン酸コデイン、硫酸コデイン、コルチゾン、コルチバゾール、クロプロパミド、クロテサミド（ｃｒｏｔｅｔｈａｍｉｄｅ）、シクラゾシン、デフラザコルト、デヒドロテストステロン、デソモルヒネ、デソニド、デソキシメタゾン、デキサメタゾン、デキサメタゾン−２１−イソニコチネート、デキソキサドロール、デキストロモラミド（デキストロモラミミド）、デキストロプロポキシフェン、デオキシコルチコステロン、デゾシン、ジアンプロミド、ジアモルホン、ジクロフェナック、ジフェナミゾール、ジフェンピラミド、ジフロラゾン、ジフコルトロン、ジフルニサル、ジフルプレドネート、ジヒドロコデイン、ジヒドロコデイノンエノールアセテート、ジヒドロモルヒネ、アセチルサリチル酸ジヒドロキシアルミニウム、ジメノキサドール、ジメフェプタノール、ジメチルチアンブテン、ジオキサフェチルブチレート、ジピパノン、ジプロセチル、ジピロン、ジタゾール、ドロキシカム、エモルファゾン、エンフェナム酸、エノキソロン、エピリゾール、エプタゾシン、エテルサレート、エテンザミド、エトヘプタジン、エトキサゼン、エチルメチルチアンブテン、エチルモルヒネ、エトドラク、エトフェナメート、エトニタゼン、オイゲノール、フェルビナク、フェンブフェン、フェンクロジン酸、フェンドサル、フェノプロフェン、フェンタニル、フェンチアザク、フェプラジノール、フェプラゾン、フロクタフェニン、フルアザコート、フルクロニド、フルフェナム酸、フルメタゾン、フ��ニゾリド、フルニキシン、フルノキサプロフェン、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルオシノロンアセトニド、フルオコルチンブチル、フルオコルトロン、フルオレゾン、フルオロメトロン、フルペロロン、フルピルチン、フルプレドニデン、フルプレドニゾロン、フルプロキアゾン、フルランドレノリド、フルルビプロフェン、フルチカゾン、ホルモコルタル、ホスホサル、ゲンチシン酸、グラフェニン、グルカメタシン、グリセロールサリチレート、グアイアズレン、ハルシノニド、ハロベタゾール、ハロメタゾン、ハロプレドノン、ヘロイン、ヒドロコドン、ヒドロコルタメート、ヒドロコルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、コハク酸ヒドロコルチゾン、ヘミコハク酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン２１−リシネート、シピオン酸ヒドロコルチゾン、ヒドロモルホン、ヒドロキシペンチジン、イブフェナク、イブプロフェン、イブプロキサム、サリチル酸イミダゾール、インドメタシン、インドプロフェン、イソフェゾラク、イソフルプレドン、酢酸イソフルプレドン、イソラドール、イソメタドン、イソニキシン、イソキセパク、イソキシカム、ケトベミドン、ケトプロフェン、ケトロラク、ｐ−ラクトフェンチド、レフェタミン、レバロルファン、レボルファノール、レボフェンアシル−モルファン、ロフェンタニル、ロナゾラク、ロルノキシカム、ロキソプロフェン、リシンアセチルサリチル酸塩、マジプレドン、メクロフェナム酸、メドリゾン、メフェナム酸、メロキシカム、メプレリジン、メプレドニゾン、メプタジノール、メサラミン、メタゾシン、メタドン、メトトリメプラジン、メチルプレドニゾロン、酢酸メチルプレドニゾロン、コハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム、メチルプレドニゾロンスレプトネート（ｓｕｌｅｐｔｎａｔｅ）、メチアジン酸、メトホリン、メトポン、モフェブタゾン、モフェゾラク、モメタゾン、モラゾン、モルヒネ、モルヒネ塩酸塩、モルヒネ硫酸塩、モルホリンサリチル酸塩、ミロフィン、ナブメトン、ナルブフィン、ナロルフィン、１−ナフチルサリチル酸塩、ナプロキセン、ナルセイン、ネホパム、ニコモルヒネ、ニフェナゾン、ニフルム酸、ニメスリド、５’−ニトロ−２’−プロポキシアセトアニリド、ノルレボルファノール、ノルメタドン、ノルモルヒネ、ノルピパノン、オルサラジン、アヘン、オキサセプロール、オキサメタシン、オキサプロジン、オキシコドン、オキシモルホン、オキシフェンブタゾン、パパベレタム、パラメタゾン、パラニリン、パルサルミド、ペンタゾシン、ペルイソキサール、フェナセチン、フェナドキソン、フェナゾシン、フェナゾピリジン塩酸塩、フェノコル、フェノペリジン、フェノピラゾン、フェノモルファン、アセチルサリチル酸フェニル、フェニルブタゾン、サリチル酸フェニル、フェニルラミドール、ピケトプロフェン、ピミノジン、ピペブゾン、ピペリロン、ピラゾラク、ピリトラミド、ピロキシカム、ピルプロフェン、プラノプロフェン、プレドニカルベート、プレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニバル、プレドニリデン、プログルメタシン、プロヘプタジン、プロメドール、プロパセタモｌ、プロペリジン、プロピラム、プロポキシフェン、プロピフェナゾン、プロキアゾン、プロ��ジン酸、プロキサゾール、ラミフェナゾン、ラミフェンタニル、リマゾリウムメチル（ｍｅｔａｌ）硫酸塩、サラセタミド、サリシン、サリチルアミド、サリチルアミドｏ−酢酸、サリチル酸、サリチル硫酸、サラサレート、サルベリン、シメトリド、スフェンタニル、スルファサラジン、スリンダク、スーパーオキシドジスムターゼ、スプロフェン、スキシブゾン、タルニフルメート、テニダプ、テノキシカム、テロフェナメート、テトランドリン、チオゾリノブタゾン、チアプロフェン酸、チアラミド、チリジン、チノリジン、チキソコルトール（ｔｉｘｏｃｏｒｔｏｌ）、トルフェナム酸、トルメチン、トラマドール、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、トロペシン、ビミノール、キセンブシン、キシモプロフェン、ザルトプロフェンおよびゾメピラクが挙げられる。
【０２３７】
例示的な一実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、炎症を処置または予防するための選択的ＣＯＸ−２阻害剤とともに投与され得る。例示的な選択的ＣＯＸ−２阻害剤としては、例えば、デラコキシブ、パレコキシブ、セレコキシブ、バルデコキシブ、ロフェコキシブ、エトリコキシブ、ルミラコキシブ、２−（３，５−ジフルオロフェニル）−３−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−２−シクロペンテン−１−オン、（Ｓ）−６，８−ジクロロ−２−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸、２−（３，４−ジフルオロフェニル）−４−（３−ヒドロキシ−３−メチル−１−ブトキシ）−５−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−３−（２Ｈ）−ピリダジノン、４−［５−（４−フルオロフェニル）−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラソル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド、１ベンジル−４−［（４−オキソピペリジン−１−イル｝スルホニル］ピペリジン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル、４−［５−（フェニル）−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラソル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド、その塩およびプロドラッグが挙げられる。
【０２３８】
ｉｘ．紅潮
別の態様において、ＣＬＫ阻害化合物は、ある障害の症状である紅潮および／またはほてりの発生および／または重症度を低減させるために使用され得る。例えば、主題の方法は、癌患者において紅潮および／またはほてりの発生および／または重篤度を低下させるために、単独または他の薬剤との組み合わせでＣＬＫ阻害化合物を使用することを含む。他の実施形態において、該方法は、閉経期および閉経後の女性において、紅潮および／またはほてりの発生および／または重篤度を低減させるためのＣＬＫ阻害化合物の使用を提供する。
【０２３９】
別の態様において、ＣＬＫ阻害化合物は、別の薬物治療の副作用である紅潮および／またはほてり（例えば、薬物誘発性紅潮）の発生または重篤度を低下させるための治療法として使用され得る。特定のある実施形態において、薬物誘発性紅潮を処置および／または予防するための方法は、少なくとも１種類の紅潮誘発性化合物および少なくとも１種類のＣＬＫ阻害化合物を含む製剤を、それを必要とする患者に投与することを含む。他の実施形態において、薬物誘発性紅潮を処置するための方法は、紅潮を誘発する１種類以上の化合物および１種類以上のＣＬＫ阻害化合物を別々に投与することを含み、例えば、この場合、ＣＬＫ阻害化合物および紅潮誘発性薬剤は、同じ組成物中に製剤化されていない。個別の製剤を用いる場合、ＣＬＫ阻害化合物は、（１）紅潮誘発性薬剤の投与と同時、（２）紅潮誘発性薬剤とともに断続的に、（３）紅潮誘発性薬剤の投与に対して時差的、（４）紅潮誘発性薬剤の投与前、（５）紅潮誘発性薬剤の投与後、および（６）これらの種々の組合せで投与され得る。例示的な紅潮誘発性薬剤としては、例えば、ナイアシン、ファロキシフェン（ｆａｌｏｘｉｆｅｎｅ）、抗鬱薬、抗精神病薬、化学療法薬、カルシウムチャンネル遮断薬および抗生物質が挙げられる。
【０２４０】
一実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、血管拡張薬または抗高脂血症剤（例えば、抗コレステロール血症剤および脂好性剤）の紅潮副作用を低減させるために使用され得る。例示的な一実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、ナイアシンの投与と関連している紅潮を低減させるために使用され得る。
【０２４１】
ニコチン酸、３−ピリジンカルボン酸またはナイアシンは、例えば、Ｎｉｃｏｌａｒ（登録商標）、ＳｌｏＮｉａｃｉｎ（登録商標）、Ｎｉｃｏｂｉｄ（登録商標）およびＴｉｍｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｎｉａｃｉｎ（登録商標）の商標名で市販されている抗高脂血症剤である。ニコチン酸は、高脂血症性障害、例えば、高脂血症、高コレステロール血症およびアテローム性動脈硬化などの処置において長年使用されている。この化合物は、これまで人体において、総コレステロール、低密度リポ蛋白、すなわち「ＬＤＬコレステロール」、トリグリセリドおよびアポリポタンパク質ａ（Ｌｐ（ａ））を低下させるが、望ましい高密度リポ蛋白、すなわち「ＨＤＬ  コレステロール」は増加させるという有益な効果を示すことが知られている。
【０２４２】
典型的な用量は、１日あたり約１グラム〜約３グラムの範囲である。ニコチン酸は、通常、選択される投薬形態に応じて、１日２〜４回食後に投与される。ニコチン酸は、現在、市販品として２つの投薬形態で入手可能である。一方の投薬形態は即時または高速放出錠剤であり、これは、１日あたり３または４回投与されるのがよい。即時放出（「ＩＲ」）ニコチン酸製剤は、一般的に、ほぼすべてのそのニコチン酸を、摂取後約３０〜６０分以内に放出する。他方の投薬形態は、徐放性形態であり、これは、１日２〜４回の投与に適している。ＩＲ製剤とは対照的に、徐放性（「ＳＲ」）ニコチン酸製剤は、治療的レベルのニコチン酸を、摂取後長期間（例えば、１２または２４時間）にわたって維持するため、有意な量の薬物が特定の時間間隔で血流中に吸収されるように放出されるように設計される。
【０２４３】
本明細書で用いる場合、用語「ニコチン酸」は、ニコチン酸、またはニコチン酸そのもの以外であって、身体によってニコチン酸に代謝され、したがってニコチン酸と本質的に同じ効果をもたらす化合物を包含することが意図される。ニコチン酸と同様の効果をもたらす例示的な化合物としては、例えば、ニコチニルアルコールの酒石酸エステル、ｄ−グルシトールのヘキサニコチン酸エステル、ニコチン酸アルミニウム、ニセリトロールおよびｄ，ｌ−α−トコフェリルニコチン酸が挙げられる。かかる化合物の各々を、本明細書において集合的に「ニコチン酸」とよぶ。
【０２４４】
別の実施形態において、本発明は、紅潮副作用が低減した、高脂血症を処置および／または予防するための方法を提供する。該方法は、治療有効量のニコチン酸およびＣＬＫ阻害化合物を、それを必要とする被験体に、紅潮を低減させるのに充分な量で投与する工程を含む。例示的な一実施形態において、ニコチン酸および／またはＣＬＫ阻害化合物は、夜間に投与され得る。
【０２４５】
別の代表的な実施形態において、該方法は、ラロキシフェンの紅潮副作用を低減させるためのＣＬＫ阻害化合物の使用を伴うものである。ラロキシフェンは、体内のある特定の部分でエストロゲンと同様の作用をするが、ホルモンではない。これは、閉経期に達した女性における骨粗鬆症の予防を補助する。骨粗鬆症は、骨を徐々に細く脆くし、骨折し易くするものである。エビスタは、閉経期に伴って起こる骨量減少を遅延させ、骨粗鬆症による脊椎骨折のリスクを低下させる。ラロキシフェンの一般的な副作用はほてり（発汗および紅潮）である。これは、既に閉経期によるほてりを有する女性にとって不快なものであり得る。
【０２４６】
別の代表的な実施形態において、該方法は、抗鬱薬または抗精神病剤の紅潮副作用を低減させるためのＣＬＫ阻害化合物の使用を伴うものである。例えば、ＣＬＫ阻害化合物は、セロトニン再取り込み阻害剤、５ＨＴ２受容体拮抗剤、抗痙攣薬、ノルエピネフリン再取り込み阻害剤、α−アドレナリン作用性受容体拮抗薬、ＮＫ−３拮抗剤、ＮＫ−１受容体拮抗剤、ＰＤＥ４阻害剤、神経ペプチドＹ５受容体拮抗剤、Ｄ４受容体拮抗剤、５ＨＴ１Ａ受容体拮抗剤、５ＨＴ１Ｄ受容体拮抗剤、ＣＲＦ拮抗剤、モノアミンオキシダーゼ阻害剤または鎮静催眠薬と組み合わせて使用（別々または一緒に投与）され得る。
【０２４７】
特定のある実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、紅潮を低減させるためのセロトニン再取り込み阻害剤（ＳＲＩ）での処置の一部として使用され得る。特定のある好ましい実施形態において、ＳＲＩは、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）、例えば、フルオキセチノイド（フルオキセチン、ノルフルオキセチン）またはネファゾドノイド（ネファゾドン、ヒドロキシネファゾドン、オキソネファゾドン）などである。他の例示的なＳＳＲＩとしては、ドロキセチン、ベンラファキシン、ミルナシプラン、シタロプラム、フルボキサミン、パロキセチンおよびセルトラリンが挙げられる。ＣＬＫ阻害化合物はまた、鎮静催眠薬、例えば、ベンゾジアゼピン（例えば、アルプラゾラム、クロルジアゼポキシド、クロナゼパム、クロラゼペート、クロバザム、ジアゼパム、ハラゼパム、ロラゼパム、オキサゼパムおよびプラゼパムなど）、ゾルピデム、ならびにバルビツール酸系からなる群より選択されるものなどでの処置の一部として使用され得る。さらに他の実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、５−ＨＴ１Ａ受容体部分作用薬、例えば、ブスピロン、フレシノキサン、ゲピロンおよびイプサピロンからなる群より選択されるものなどでの処置の一部として使用され得る。ＣＬＫ阻害化合物はまた、ノルエピネフリン再取り込み阻害剤、例えば、第３級アミン三環系および第２級アミン三環系から選択されるものなどでの処置の一部として使用され得る。例示的な第３級アミン三環系としては、アミトリプチリン、クロミプラミン、ドキセピン、イミプラミンおよびトリミプラミンが挙げられる。例示的な第２級アミン三環系としては、アモキサピン、デシプラミン、マプロチリン、ノルトリプチリンおよびプロトリプチリンが挙げられる。特定のある実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、モノアミンオキシダーゼ阻害剤、例えば、イソカルボキサジド、フェネルジン、トラニルシプロミン、セレギリンおよびモクロベマイドなどでの処置の一部として使用され得る。
【０２４８】
さらに別の実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、化学療法薬、例えば、シクロホスファミド、タモキシフェンなどの紅潮副作用を低減させるために使用され得る。
【０２４９】
別の実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、使用され得る。カルシウムチャンネル遮断薬、例えば、アムロジピンなどの紅潮副作用を低減させるために使用され得る。
【０２５０】
別の実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、抗生物質の紅潮副作用を低減させるために使用され得る。例えば、ＣＬＫ阻害化合物は、レボフロキサシンと組み合わせて使用され得る。レボフロキサシンは、易感染性細菌によって引き起こされる洞、皮膚、肺、耳、気道、骨および関節の感染症を処置するために使用される。レボフロキサシンはまた、尿路感染症（例えば、他の抗生物質に対して抵抗のもの、ならびに前立腺炎）を処置するために高頻度に使用される。レボフロキサシンは、大腸菌、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉおよび赤痢菌によって引き起こされる感染性の下痢の処置に有効である。レボフロキサシンはまた、種々の産科感染症、例えば乳腺炎を処置するために使用され得る。
【０２５１】
ｘ．眼障害
本発明の一態様は、患者に、治療投薬量のＣＬＫ阻害化合物または薬学的に許容され得るその塩、プロドラッグもしくは代謝性誘導体を投与することにより視力障害を抑制、低減あるいは処置するための方法である。
【０２５２】
本発明の特定のある態様において、視力障害は、視神経または中枢神経系に対する損傷によって引き起こされるものである。特別な実施形態において、視神経の損傷は、緑内障によってもたらされるものなどの高眼圧によって引き起こされる。他の特別な実施形態において、視神経の損傷は神経の腫脹によって引き起こされ、該腫脹は、多くの場合、感染または免疫（例えば、自己免疫）応答と関連しているもの（視神経炎など）である。
【０２５３】
緑内障は、視野欠損、視神経円板の杯形成および視神経の損傷と関連している一群の障害を表現した言葉である。これらは、一般に、緑内障性視神経障害と呼ばれる。ほとんどの緑内障は、通常（常にではないが）、眼圧の上昇と関連している。緑内障の例示的な形態としては、緑内障および全層角膜移植、急性閉塞隅角、慢性閉塞隅角、慢性開放隅角、隅角後退、無水晶体および偽水晶体、薬物誘導型、前房出血、眼内腫瘍、若年性レンズ粒子、低眼圧、悪性、血管新生、水晶体融解、水晶体形態性、色素性、プラトー虹彩、原発性先天性、原発性開放隅角、偽性落屑、続発性先天性、成人型Ｓｕｓｐｅｃｔ、片側性、ブドウ膜炎性、眼性高血圧症、眼性低張、ポスナー  シュロスマン症候群および眼性高血圧症＆原発性開放隅角緑内障における強膜拡大処置が挙げられる。
【０２５４】
眼圧はまた、種々の外科的処置、例えば、水晶体超音波吸引術（すなわち、白内障手術）および人工水晶体などの構造体の埋め込みなどによっても上昇し得る。また、特に脊髄の手術、または患者が長時間うつ伏せになる任意の手術によっても、眼圧の上昇がもたもたらされ得る。
【０２５５】
視神経炎（ＯＮ）は、視神経の炎症であり、急性視力の喪失により、が引き起こされる。これは、多発性硬化症（ＭＳ）患者の１５〜２５％が初期にＯＮを示し、ＯＮ患者の５０〜７５％がＭＳと診断されるため、ＭＳと高度に関連している。ＯＮはまた、感染（例えば、ウイルス感染、髄膜炎、梅毒）、炎症（例えば、ワクチンによる）、浸潤および虚血ともと関連している。
【０２５６】
視神経の損傷をもたらす別の状態は、前部虚血性視神経障害（ＡＩＯＮ）である。ＡＩＯＮには２つの型がある。動脈炎性のＡＩＯＮは、巨細胞動脈炎（脈管炎）によるものであり、急性の失明をもたらす。非動脈炎性のＡＩＯＮには、巨細胞動脈炎によるもの以外の虚血性視神経障害のあらゆる症例が包含される。ＡＩＯＮの病態生理学は明らかでないが、炎症性機構および虚血性機構の両方が関与しているようである。
【０２５７】
視神経に対する他の損傷は、典型的には、脱髄（ｄｅｍｙｌｅｉｎａｔｉｏｎ）、炎症、虚血、毒素、または視神経に対すると関連しているものである。視神経が損傷を受ける例示的な状態としては、脱髄性視神経症（視神経炎、球後視神経炎）、視神経鞘髄膜腫、成人型視神経炎、小児型視神経炎、前部虚血性視神経症、後部虚血性視神経症、圧迫性視神経症、乳頭浮腫、偽性乳頭浮腫および中毒性／栄養性視神経症が挙げられる。
【０２５８】
視神経に対する損傷と直接関連していなくても失明と関連している他の神経状態としては、弱視、ベル麻痺  、慢性進行性外眼筋麻痺、多発性硬化症、偽腫瘍脳神経痛および三叉神経痛が挙げられる。
【０２５９】
本発明の特定のある態様において、視力障害は、網膜の損傷によって引き起こされる。特別な実施形態において、網膜の損傷は、目に対する血流障害（例えば、動脈硬化、脈管炎）によって引き起こされる。特別な実施形態において、網膜の損傷は、斑の崩壊（ｄｉｓｒｕｐｔｏｎ）（例えば、滲出性あるいは非滲出性黄斑変性）によって引き起こされる。
【０２６０】
例示的な網膜の疾患としては、滲出性加齢性黄斑変性、非滲出性加齢性黄斑変性、網膜の電子制御プロテーゼおよびＲＰＥ移植加齢性黄斑変性、急性多巣性鱗状網膜色素上皮症、急性網膜壊死、ベスト病、分岐型方網膜動脈閉塞、分岐型網膜静脈閉塞、癌関連自己免疫網膜症、網膜中心動脈閉塞、網膜中心静脈閉塞、Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｓｅｒｏｕｓ  Ｃｈｏｒｉｏ網膜症、イールズ病、Ｅｐｉｍａｃｕｌａｒ膜、Ｌａｔｔｉｃｅ  変性、Ｍａｃｒｏａｎｅｕｒｙｓｍ（異常肥大動〔静〕脈瘤、糖尿病性斑浮腫、アーヴァイン−ガス斑浮腫、斑孔、網膜下新血管膜、びまん性片側性  亜急性神経網膜炎、非偽性Ｃｙｓｔｏｉｄ斑浮腫、Ｐｒｅｓｕｍｅｄ  Ｏｃｕｌａｒ  Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ症候群、滲出性網膜剥離、術後網膜剥離、増殖性網膜剥離、破裂性網膜剥離、Ｔｒａｃｔｉｏｎａｌ網膜剥離、色素性網膜炎、ＣＭＶ  網膜炎、網膜芽細胞腫、未熟児の網膜症、Ｂｉｒｄｓｈｏｔ網膜症、糖尿病背景性網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、ヘモグロビン症網膜症、プルチャー網膜症、Ｖａｌｓａｌｖａ網膜症、若年性網膜分離症、老年性網膜分離症、ターソン症候群およびホワイトドット症候群を含む典型的な網膜疾病が挙げられる。
【０２６１】
他の例示的な疾患としては、眼の細菌感染症（例えば、結膜炎、角膜炎、結核、梅毒、淋病）、ウイルス感染症（例えば、眼の単純ヘルペスウイルス、帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス網膜炎、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ））ならびにＨＩＶまたは他のＨＩＶ関連および他の免疫不全関連の眼の疾患に続発性の進行性の外網膜の壊死が挙げられる。また、眼の疾患としては、真菌の感染症（例えば、カンジダ脈絡膜炎（Ｃａｎｄｉｄａ  脈絡膜ｉｔｉｓ）、ヒストプラスマ症）、原虫感染症（例えば、トキソプラズマ症）および眼のトキソカラ症およびサルコイドーシスなどの他のものが挙げられる。
【０２６２】
本発明の一態様は、化学療法薬（例えば、神経毒性の薬物、ステロイド類などの眼圧を上昇させる薬物）での処置を受けている被験体において視力障害を抑制、低減または処置するための方法であって、かかる処置を必要とする被験体に治療投薬量のＣＬＫ阻害化合物を投与することにより処置する方法である。
【０２６３】
本発明の別の態様は、手術、例えば、眼の手術またはうつ伏せ状態で行われる他の手術（脊髄手術など）を受けている被験体において視力障害を抑制、低減または処置するための方法であって、かかる処置を必要とする被験体に本明細書に開示されたＣＬＫ阻害化合物の治療投薬量を投与することにより処置する方法である。眼の手術としては、白内障、虹彩切開術およびレンズ交換が挙げられる。
【０２６４】
本発明の別の態様は、例えば（ｉｎｃｌｕｄｅ）、白内障、ドライアイ、網膜の損傷などの加齢性の眼の疾患の阻害および予防的処置などの処置であって、かかる処置を必要とする被験体に治療投薬量のＣＬＫ阻害化合物を投与することによる処置である。
【０２６５】
白内障の形成は、目のレンズ内のいくつかの生化学的変化、例えば、抗酸化剤アスコルビン酸およびグルタチオンレベルの減少、脂質、アミノ酸およびタンパク質の酸化の増大、ナトリウムおよびカルシウムの上昇、アミノ酸の減損ならびにレンズ代謝の低下などと関連している。レンズは、血管がなく、目の前部の細胞外液中に浮遊している。アスコルビン酸、グルタチオン、ビタミンＥ、セレン、バイオフラボノイド類およびカロチノイドなどの栄養素が、レンズの透明性の維持に必要とされる。セレンレベルが低いと、フリーラジカル誘導性の過酸化水素の増加がもたらされ、これは、セレン依存性抗酸化剤酵素グルタチオンペルオキシダーゼによって中和される。また、レンズ保護性グルタチオンペルオキシダーゼは、アミノ酸メチオニン、システイン、グリシンおよびグルタミン酸に依存性である。
【０２６６】
白内障はまた、ラクトース、単糖のガラクトースおよびグルコースで構成される二糖を含有する乳製品中にあるガラクトースが適正に代謝されないことによっても発症し得る。白内障は、早期に検出され、代謝的に矯正させると、予防、遅延、遅滞され得、場合によっては逆転されることさえあり得る。
【０２６７】
網膜の損傷は、とりわけ、緑内障、糖尿病性網膜症および加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）におけるフリーラジカル開始型反応に起因する。目は、中枢神経系の一部であり、再生能力は限定的である。網膜は、最の高い濃度のポリ不飽和脂肪酸（ＰＦＡ）を含み、酸化の対象である多数の神経細胞で構成されている。フリーラジカルは、目ならびに光を視覚インパルスに変換するのに必要なエネルギーを生成する杆状体および網膜錐体内のミトコンドリアに入るＵＶ光によって生成される。フリーラジカルにより、ヒドロキシルラジカルまたはスーパーオキシドラジカルによってによるＰＦＡの過酸化が引き起こされ、これにより、続いて、さらなるフリーラジカルが成長する。フリーラジカルにより、一時的または永続的な網膜組織への損傷が引き起こされる。
【０２６８】
緑内障は、通常、永続的な網膜の神経線維への損傷をもたらす眼圧（ＩＯＰ）の上昇を引き起こす障害とみなされている。すべての緑内障勝利得の６分の１では、ＩＯＰの上昇は生じない。この障害は、現在、血管灌流の低下および神経毒性因子の増加の１種と理解されている。最近の研究により、眼内のグルタミン酸塩、一酸化窒素およびペルオキシ亜硝酸イオンのレベルの上昇が、網膜の神経節細胞死の原因であることが示唆された。神経保護剤は、緑内障のケアに有望であり得る。例えば、一酸化窒素シンターゼ阻害剤は、一酸化窒素およびスーパーオキシドからのペルオキシ亜硝酸イオンの形成を阻止する。最近の研究において、一酸化窒素シンターゼ阻害剤であるアミノグアニジンで処置された動物が、網膜の神経節細胞の減損の低減を有した。眼内の一酸化窒素によって、多くの組織において細胞傷害性が、および中枢神経系において神経毒性が引き起こされると結論付けられた。
【０２６９】
糖尿病性網膜症は、下層の血管が、主に微細動脈瘤および網膜内出血からなる微小血管の異常を発現した場合に起こる。酸化的代謝産物は、糖尿病性網膜症の病因に直接関与しており、フリーラジカルは、増殖性活性の増強をもたらす増殖因子の生成を増大させる。また、血管の内皮細胞によって生成される一酸化窒素により、平滑筋細胞の弛緩が引き起こされ得、血管セグメントの血管拡張がもたらされ得る。網膜の虚血および低酸素症は、動脈の基底膜の肥厚、内皮増殖および周皮細胞の減損が生じると起こる。酸素付加が不充分だと、毛細血管の閉塞または非灌流、動静脈シャント、血流緩慢およびＲＢＣが酸素を放出する能力の障害が引き起こされる。また、網膜組織の脂質過酸化も、フリーラジカル損傷の結果として起こる。
【０２７０】
黄斑（ｍａｃｕｌａ）は、人間の急性の中心視を担い、光感受性細胞（網膜錐体）で構成されているが、下層の網膜色素上皮（ＲＰＥ）および脈絡膜に栄養分を供給し、老廃物の除去を補助する。ＲＰＥは、網膜錐体に、光感受性色素のビタミンＡ基質を栄養補給し、網膜錐体を消化して外先端が剥離（ｓｈｅｄ）する。ＲＰＥは、高レベルのＵＶ放射線に曝露され、新脈管形成を阻害する因子を分泌する。脈絡膜は、栄養分を供給し、老廃物を除去する密な血管のネットワークを含む。
【０２７１】
ＡＭＤでは、剥離された網膜錐体先端がＲＰＥによって非消化性となり、この場合、該細胞は膨潤し、未消化物が蓄積され過ぎると死滅する。ドルーゼンと呼ばれる未消化老廃物の蓄積は、ＲＰＥ下で形成される。また、光毒性（ｐｈｏｔｏｘｉｃ）損傷によっても、ＲＰＥ細胞内でのリポフスチンの蓄積が引き起こされる。ブルーフ膜内での細胞内リポフスチンおよびドルーゼンの蓄積により、網膜組織への酸素および栄養分の輸送が妨げられ、最終的に、ＲＰＥおよび光受容体の機能不全がもたらされる。滲出性ＡＭＤでは、血管がブルーフ膜の欠陥により脈絡毛細管枝から成長し、ＲＰＥ下で成長してこれを脈絡膜から剥離させ、液の漏出または出血が起こることもあり得る。
【０２７２】
黄斑色素は、日光による網膜の損傷を妨げる保護因子の１つであり、栄養分由来のカロチノイド、例えば、ルテイン（脂肪の黄色色素、これは、他の重要な栄養分の送達媒体の機能を果たす）およびゼアキサンチンなどの蓄積によって形成される。ビタミンＣおよびＥ、ベータカロチンおよびルテインならびに亜鉛、セレンおよび銅などの抗酸化剤はすべて、健常な黄斑内に見られる。栄養分の供給に加え、これらの抗酸化剤は、黄斑変性を起こすフリーラジカル損傷から保護する。
【０２７３】
本発明の別の態様は、ストレス、化学的傷害または放射線によって引き起こされる目に対する損傷の予防または処置であって、かかる処置を必要とする被験体に、治療投薬量のＣＬＫモジュレータ、特に、本明細書に開示されたＣＬＫ阻害化合物を投与することによる処置である。目に対する放射線または電磁的損傷としては、ＣＲＴまたは日光もしくはＵＶへの曝露によって引き起こされるものが挙げられ得る。
【０２７４】
一実施形態において、併用薬レジメンは、眼の障害またはこのような状態と関連している続発性状態の処置または予防のための薬物または化合物を含むものであり得る。したがって、併用薬レジメンは、１種類以上のＣＬＫ阻害剤および眼の障害の処置のための１種類以上の治療用薬剤を含むものであり得る。例えば、１種類以上のＣＬＫ阻害化合物は、眼圧を低下させる薬剤、緑内障を処置するための薬剤、視神経炎を処置するための薬剤、ＣＭＶ網膜症を処置するための薬剤、多発性硬化症を処置するための薬剤および／または抗生物質などの１種類以上の有効量と併用され得る。
【０２７５】
一実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、眼圧を低下させるための治療剤とともに投与され得る。ある一群の治療剤は、水分生成（ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）の阻止に関与するものである。例えば、経表面的β−アドレナリン作動性アンタゴニスト（チモロールおよびベタキソロール）は、水分生成を減少させる。経表面的チモロールにより、３０分でＩＯＰの低下がもたらされ、ピーク効果は１〜２時間後である。合理的なレジメンは、チモプチック０．５％、３０分毎に１滴を２回投与である。カルボニックアンヒドラーゼ阻害剤であるアセタゾラミドもまた水分生成を減少させ、経表面的β−アンタゴニストとともに与えるのがよい。５００ｍｇの初期用量を投与した後、２５０ｍｇを６時間毎に投与する。この投薬は、経口、筋肉内または静脈内で行なわれ得る。また、α２−アゴニスト（例えば、アプラクロニジン）は、水分生成を減少させることにより作用する。その効果は、経表面的に投与されるβ−遮断薬に付加的である。これは、前眼房レーザー処置後の圧力の急上昇の制御における使用が認可されているが、急性閉塞隅角緑内障の処置に有効であることが報告されている。合理的なレジメンは、３０分毎に１滴を２回投与である。
【０２７６】
眼圧を低下させるための第２の群の治療剤は、ガラス体容積の減少に関与するものである。急性発作を処置するのに、高浸透圧剤が使用され得る。このような薬剤は、血液を高浸透圧性とすることにより、眼球から水分を排出する。多くの場合、冷５０％溶液（より口当たりをよくするため、レモンジュースと混合する）中、１ｍＬ／ｋｇの用量の経口用グリセロールが使用される。グリセロールは、肝臓内でグルコースに変換され、糖尿病を有する人は、グリセロールの摂取後に高血糖性となった場合、さらなるインスリンが必要となり得る。経口用イソソルビドは、代謝的に不活性なアルコールであり、これもまた、急性閉塞隅角緑内障の患者に対する浸透圧性薬剤として使用され得る。有用な用量は、ｐ．ｏ．で摂取される１００ｇ（４５％溶液２２０ｃｃ）である。この不活性アルコールは、狭心症および鬱血性心不全に使用されつ硝酸塩系の心臓用薬物であるイソソルビドジニトレートと混同されてはならない。１．０〜１．５ｍｇ／ｋｇの用量の静脈内マンニトールもまた有効であり、悪心および嘔吐を伴う患者にも充分許容される。このような高浸透圧剤は、鬱血性心不全の病歴を有する患者はいずれも、注意して使用すべきである。
【０２７７】
第３の群の治療剤は、目からの水分排出（ａｑｕｅｏｕｓ  ｏｕｔｆｌｏｗ）の助長に関与するものである。縮瞳薬は、虹彩角膜角から虹彩を引き、末梢虹彩による小柱網の閉塞を緩和するのを補助し得る。ピロカルピン２％（青目）〜４％（茶色の目）が、１５分毎に最初の１〜２時間に投与され得る。より高頻度の投与またはより高用量では、投与により、全身性コリン作動性クリーゼが促進され得る。場合によっては、ＮＳＡＩＤＳが炎症の低減に使用される。
【０２７８】
眼圧を下げるための例示的な治療用薬剤としては、ＡＬＰＨＡＧＡＮ（登録商標）Ｐ（Ａｌｌｅｒｇａｎ）（酒石酸ブリモニジン眼科用液剤）、ＡＺＯＰＴ（登録商標）（Ａｌｃｏｎ）（ブリンゾルアミド眼科用懸濁剤）、ＢＥＴＡＧＡＮ（登録商標）（Ａｌｌｅｒｇａｎ）（塩酸レボブノロール眼科用液剤、ＵＳＰ）、ＢＥＴＩＭＯＬ（登録商標）（Ｖｉｓｔａｋｏｎ）（チモロール眼科用液剤）、ＢＥＴＯＰＴＩＣ  Ｓ（登録商標）（Ａｌｃｏｎ）（ベタキソロールＨＣｌ）、ＢＲＩＭＯＮＩＤＩＮＥ  ＴＡＲＴＲＡＴＥ（Ｂａｕｓｃｈ  ＆  Ｌｏｍｂ）、ＣＡＲＴＥＯＬＯＬ  ＨＹＤＲＯＣＨＬＯＲＩＤＥ（Ｂａｕｓｃｈ  ＆  Ｌｏｍｂ）、ＣＯＳＯＰＴ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ）（塩酸ドルゾラミド−マレイン酸チモロール眼科用液剤）、ＬＵＭＩＧＡＮ（登録商標）（Ａｌｌｅｒｇａｎ）（ビマトプロスト眼科用液剤）、ＯＰＴＩＰＲＡＮＯＬＯＬ（登録商標）（Ｂａｕｓｃｈ  ＆  Ｌｏｍｂ）（メチプラノロール眼科用液剤）、ＴＩＭＯＬＯＬ  ＧＦＳ（Ｆａｌｃｏｎ）（マレイン酸チモロール眼科用ゲル形成性液剤）、ＴＩＭＯＰＴＩＣ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ）（マレイン酸チモロール眼科用液剤）、ＴＲＡＶＡＴＡＮ（登録商標）（Ａｌｃｏｎ）（トラボプロスト眼科用液剤）、ＴＲＵＳＯＰＴ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ）（塩酸ドルゾラミド眼科用液剤）およびＸＡＬＡＴＡＮ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＆  Ｕｐｊｏｈｎ）（ラタノプロスト眼科用液剤）が挙げられる。
【０２７９】
一実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、緑内障を処置および／または予防するための治療剤とともに投与され得る。緑内障用薬物の一例は、ＤＡＲＡＮＩＤＥ（登録商標）錠剤（Ｍｅｒｃｋ）（ジクロルフェンアミド）である。
【０２８０】
一実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、視神経炎を処置および／または予防するための治療剤とともに投与され得る。視神経炎用の薬物の例としては、ＤＥＣＡＤＲＯＮ（登録商標）リン酸塩注射用剤（Ｍｅｒｃｋ）（リン酸デキサメタゾンナトリウム）、ＤＥＰＯ−ＭＥＤＲＯＬ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＆  Ｕｐｊｏｈｎ）（酢酸メチルプレドニゾロン）、ＨＹＤＲＯＣＯＲＴＯＮＥ（登録商標）錠剤（Ｍｅｒｃｋ）（ヒドロコルチゾン）、ＯＲＡＰＲＥＤ（登録商標）（Ｂｉｏｍａｒｉｎ）（リン酸プレドニゾロンナトリウム経口溶液）ａｎｄ  ＰＥＤＩＡＰＲＥＤ（登録商標）（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）（リン酸プレドニゾロンナトリウム、ＵＳＰ）が挙げられる。
【０２８１】
一実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、ＣＭＶ網膜症を処置および／または予防するための治療剤とともに投与され得る。ＣＭＶ網膜症の処置薬としては、ＣＹＴＯＶＥＮＥ（登録商標）（ガンシクロビルカプセル剤）およびＶＡＬＣＹＴＥ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（バルガンシクロビル塩酸塩  錠剤）が挙げられる。
【０２８２】
一実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、多発性硬化症を処置および／または予防するための治療剤とともに投与され得る。かかる薬物の例としては、ＤＡＮＴＲＩＵＭ（登録商標）（Ｐｒｏｃｔｅｒ  ＆  Ｇａｍｂｌｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（ダントロレンナトリウム）、ＮＯＶＡＮＴＲＯＮＥ（登録商標）（Ｓｅｒｏｎｏ）（ミトザントロン）、ＡＶＯＮＥＸ（登録商標）（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）（インターフェロンβ−１ａ）、ＢＥＴＡＳＥＲＯＮ（登録商標）（Ｂｅｒｌｅｘ）（インターフェロンβ−１ｂ）、ＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標）（Ｔｅｖａ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）（酢酸グラチラマー注射用剤）およびＲＥＢＩＦ（登録商標）（Ｐｆｉｚｅｒ）（インターフェロンβ−１ａ）が挙げられる。
【０２８３】
また、多重活性を有するマクロライド系および／またはミコフェノール酸が、ＣＬＫ阻害化合物とともに共投与され得る。マクロライド系抗生物質としては、タクロリムス、シクロスポリン、シロリマス、エベロリムス、アスコマイシン、エリスロマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、クリンダマイシン、リンコマイシン、ジリスロマイシン、ジョサマイシン、スピラマイシン、ジアセチル−ミデカマイシン、タイロシン、ロキシスロマイシン、ＡＢＴ−７７３、テリスロマイシン、ロイコマイシン、およびリンコサミドが挙げられる。
【０２８４】
ｘｉ．ミトコンドリア関連の疾患および障害
特定のある実施形態において、本発明は、ミトコンドリア活性の増大から利益を受ける疾患または障害を処置するための方法を提供する。該方法は、治療有効量のＣＬＫ阻害化合物をそれを必要とする被験体に投与することを伴う。ミトコンドリア活性の増大は、ミトコンドリアの総数（例えば、ミトコンドリアの質量）は維持されたままでのミトコンドリアの活性の増大、ミトコンドリアの数の増加によるミトコンドリア活性の増大（例えば、ミトコンドリアバイオジェネシスの刺激による）、またはその組合せをいう。特定のある実施形態において、ミトコンドリア活性の増大から利益を受ける疾患および障害としては、ミトコンドリア機能不全と関連している疾患または障害が挙げられる。
【０２８５】
特定のある実施形態において、ミトコンドリア活性の増大から利益を受ける疾患または障害を処置するための方法は、ミトコンドリア機能不全に苦しむ被験体を特定することを含むものであり得る。ミトコンドリア機能不全の診断方法は、分子遺伝学的、病理学的および／または生化学的解析を伴うものであり得、ＣｏｈｅｎおよびＧｏｌｄ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、６８：６２５−６４２（２００１）に概要が示されている。ミトコンドリア機能不全の診断方法の一例は、Ｔｈｏｒ−Ｂｙｒｎｅ−ｉｅｒ測定尺度である（例えば、ＣｏｈｅｎおよびＧｏｌｄ（前掲）；Ｃｏｌｌｉｎ  Ｓ．ら、Ｅｕｒ  Ｎｅｕｒｏｌ．３６：２６０−２６７（１９９６）を参照のこと）。ミトコンドリアの数および機能を測定するための他の方法としては、例えば、酵素的アッセイ（例えば、ミトコンドリア酵素またはＡＴＰ生合成因子（ＥＴＣ酵素もしくはクレブスサイクル酵素など））、ミトコンドリアの質量、ミトコンドリア容積および／またはミトコンドリアの数の（ｏｒ）測定、ミトコンドリアＤＮＡの定量、細胞内カルシウム恒常性のモニタリングおよび／またはこの恒常性の乱れに対する細胞応答に対する応答の評価、アポトーシス性（アポトーシス原ｉｃ）刺激、フリーラジカル生成の測定が挙げられる。かかる方法は当該技術分野で知られており、例えば、米国特許出願公開公報第２００２／００４９１７６号およびそこに挙げられた参考文献に記載されている。
【０２８６】
ミトコンドリアは、ほぼすべての型の真核生物細胞の生存および適正な機能に不可欠である。事実上任意の細胞型のミトコンドリアが、その機能に影響を及ぼす先天性または後天性の欠陥を有し得る。したがって、呼吸鎖機能に影響を及ぼすミトコンドリア欠陥の臨床的に有意な徴候および症状は、細胞間の欠陥性ミトコンドリアの分布およびその欠陥の重症度に応じて、ならびに罹患細胞に対する生理学的要求量に応じて不均質で種々である。高いエネルギー要件を伴う非分裂組織、例えば、神経組織、骨格筋および心筋は、特にミトコンドリアの呼吸鎖機能不全に陥りやすいが、任意の器官系が冒され得る。
【０２８７】
ミトコンドリア機能不全と関連している疾患および障害としては、ミトコンドリアの呼吸鎖活性の欠陥が哺乳動物において、かかる疾患または障害の病態生理の発生に寄与する疾患および障害が挙げられる。これには、１）ミトコンドリアの呼吸鎖の１種類以上の成分の活性の先天性の遺伝的欠如；ならびに２）ミトコンドリアの呼吸鎖の１種類以上の成分の活性の後天性欠如（この場合、かかつ欠如は、ａ）加齢時の酸化的損傷；ｂ）細胞内カルシウムの上昇；ｃ）一酸化窒素への罹患細胞の曝露；ｄ）低酸素症もしくは虚血；ｅ）ミトコンドリアの軸索輸送における微小管関連の欠陥、またはｆ）ミトコンドリアでの脱共役タンパク質の発現によって引き起こされる）が含まれる。
【０２８８】
ミトコンドリア活性の増大から利益を受ける疾患または障害としては、一般的に、例えば、フリーラジカル媒介性酸化的損傷によって組織変性がもたらされる疾患、細胞が不適切にアポトーシスを受ける疾患、および細胞がアポトーシスを実行できない疾患が挙げられる。例示的なミトコンドリア活性の増大から利益を受ける疾患または障害としては、例えば、ＡＤ（アルツハイマー病）、ＡＤＰＤ（アルツハイマー病およびパーキンソン病）、ＡＭＤＦ（運動失調、ミオクローヌスおよび難聴）、自己免疫疾患、癌、ＣＩＰＯ（ミオパシーおよび眼筋麻痺を伴う慢性腸偽閉塞）、先天性筋ジストロフィー、ＣＰＥＯ（慢性進行性外眼筋麻痺）、ＤＥＡＦ（母性遺伝性難聴またはアミノグリコシド誘発性難聴）、ＤＥＭＣＨＯ（痴呆および舞踏病）、真性糖尿病（Ｉ型またはＩＩ型）、ＤＩＤＭＯＡＤ（尿崩症、真性糖尿病、眼球萎縮、難聴）、ＤＭＤＦ（真性糖尿病および難聴）、ジストニー、運動不耐性、ＥＳＯＣ（癲癇、脳卒中、眼球萎縮および認知低下）、ＦＢＳＮ（家族性両側線状体壊死症）、ＦＩＣＰ（致死性幼児性心筋ミオパシー＋ＭＥＬＡＳ関連心筋症）、ＧＥＲ（胃腸管逆流）、ＨＤ（ハンチントン病）、ＫＳＳ（キーンズ・セイアー症候群）、「後期発症型」ミオパシー、ＬＤＹＴ（レーバー遺伝性視神経障害およびジストニー）、ライ症候群、ＬＨＯＮ（レーバー遺伝性視神経症）、ＬＩＭＭ（致死性幼児性ミトコンドリアミオパシー）、ＭＤＭ（ミオパシーおよび真性糖尿病）、ＭＥＬＡＳ（ミトコンドリア脳ミオパシー、乳酸アシドーシス、および脳卒中様症状発現）、ＭＥＰＲ（ミオクローヌス癲癇および精神運動発達退行）、ＭＥＲＭＥ（ＭＥＲＲＦ／ＭＥＬＡＳ重複疾患）、ＭＥＲＲＦ（ミオクローヌス癲癇および集積筋繊維）、ＭＨＣＭ（母性遺伝肥大性心筋ミオパシー）、ＭＩＣＭ（母性遺伝心筋ミオパシー）、ＭＩＬＳ（母性遺伝ライ症候群）、ミトコンドリア脳心筋症、ミトコンドリア脳ミオパシー、ＭＭ（ミトコンドリアミオパシー）、ＭＭＣ（母性ミオパシーおよび心筋ミオパシー）、ＭＮＧＩＥ（ミオパシーおよび外眼筋麻痺症、神経症、胃腸管、脳障害）、多系統ミトコンドリア病（ミオパシー、脳障害、盲目、聴覚障害、末梢神経障害）、ＮＡＲＰ（神経性筋肉衰弱、運動失調、および色素性網膜炎；この遺伝子座の代替型表現型はライ病と報告）、ＰＤ（パーキンソン病）、ピアソン症候群、ＰＥＭ（進行性脳障害）、ＰＥＯ（進行性外眼筋麻痺）、ＰＭＥ（進行性ミオクローヌス癲癇）、ＰＭＰＳ（ピアソン髄−膵臓症候群）、乾癬、ＲＴＴ（レット症候群）、統合失調症、ＳＩＤＳ（乳児突然死症候群）、ＳＮＨＬ（知覚神経性難聴）、多様性家族性提示（臨床的徴候は痙攣性麻痺から多系統進行性の障害および致死性心筋症から幹性運動失調、ジストニア、重症な聴覚障害、精神後退、下垂症、眼性機能不全、遠位シクロン、および真性糖尿病）、またはウォルフラム症候群が挙げられる。
【０２８９】
他のミトコンドリア活性の増大から利益を受ける疾患および障害としては、例えば、フリートライヒ運動失調および他の運動失調、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）および他の運動ニューロン疾患、黄斑変性、癲癇、アルパーズ症候群、多ミトコンドリアＤＮＡ欠失症候群、ＭｔＤＮＡ枯渇症候群、複合体Ｉ欠損症、複合体ＩＩ（ＳＤＨ）欠損症、複合体ＩＩＩ欠損症、シトクロムｃオキシダーゼ（ＣＯＸ、複合体ＩＶ）欠損症、Ｖ型複合体欠損症、アデニンヌクレオチドトランスロケーター（ＡＮＴ）欠損症、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）欠損症、乳酸血症を伴うエチルマロン酸性尿、乳酸血症を伴う３−メチルグルタコン酸性尿、感染中の衰弱を伴う難治性癲癇、感染中の衰弱を伴うアスペルガー症候群、感染中の衰弱を伴う自閉症、注意欠陥過活動性障害（ＡＤＨＤ）、感染中の衰弱を伴う脳性麻痺、感染中の衰弱を伴う失読症、母性遺伝性血小板減少症および白血病症候群、ＭＡＲＩＡＨＳ症候群（ミトコンドリア運動失調、再発性感染症、失語症、低尿酸血症／髄鞘低形成、発作およびジカルボン酸性尿）、ＮＤ６ジストニー、感染中の衰弱を伴う周期性嘔吐症候群、乳酸血症を伴う３−ヒドロキシイソ酪酸性尿、乳酸血症を伴う真性糖尿病、ウリジン応答性神経学的症候群（ＵＲＮＳ）、拡張型心筋症、膵リンパ腫、ならびに尿細管性アシドーシス／糖尿病／アタキス（Ａｔａｘｉｓ）症候群が挙げられる。
【０２９０】
他の実施形態において、本発明は、限定されないが、外傷後の頭部損傷および脳浮腫、脳卒中（本発明の方法は、再灌流損傷の予防に有用である）、レヴィー小体痴呆、肝腎症候群、急性肝臓機能不全、ＮＡＳＨ（非アルコール性脂肪性肝炎）、癌の転移予防／分化促進療法、特発性鬱血性心不全、心房細動（非弁性）、ウォルフ−パーキンソン−ホワイト症候群、特発性心臓ブロック、急性心筋梗塞における再灌流損傷の予防、家族性偏頭痛、過敏性腸症候群、非Ｑ波心筋梗塞の続発予防、月経前症候群、肝腎症候群における腎不全の予防、抗リン脂質抗体症候群、子癇／前子癇、卵停止（Ｏｏｐａｕｓｅ）不妊、虚血性心臓疾患／狭心症、およびシャイ・ドレーガーおよび分類されない自律神経障害症候群によって生じるミトコンドリア病に苦しむ被験体を処置するための方法を提供する。
【０２９１】
さらに別の実施形態において、薬理学的薬物関連副作用と関連しているミトコンドリア病の処置のための方法が提供される。ミトコンドリア病と関連している医薬用薬剤の型としては、逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、ＤＨＯＤの阻害剤などが挙げられる。逆転写酵素阻害剤の例としては、例えば、アジドチミジン（ＡＺＴ）、スタブジン（Ｄ４Ｔ）、ザルシタビン（ｄｄＣ）、ジダノシン（ＤＤＩ）、フルオロヨードアラウラシル（ＦＩＡＵ）などが挙げられる。プロテアーゼ阻害剤の例としては、例えば、リトナビル、インジナビル、サキナビル、ナルフィナビルなどが挙げられる。ジヒドロオロト酸デヒトロゲナーゼ（ＤＨＯＤ）の阻害剤の例としては、例えば、レフルノミド、ブレキナルなどが挙げられる。
【０２９２】
ミトコンドリア病の一般的な症状としては、心筋症、筋肉の衰弱および萎縮、発達遅延（運動、言語、認知または実行機能を含む）、運動失調、癲癇、腎尿細管性アシドーシス、末梢神経障害、視神経障害、自律神経障害、神経性腸機能不全、感音難聴、神経性膀胱機能不全、拡張型心筋症、偏頭痛、肝機能不全、乳酸血症、および真性糖尿病が挙げられる。
【０２９３】
特定のある実施形態において、本発明は、１種類以上のＣＬＫ阻害化合物を、別の治療用薬剤、例えば、ミトコンドリア機能不全の処置に有用な薬剤（抗酸化剤、ビタミン類もしくは呼吸鎖補因子など）、ミトコンドリア機能不全が関与している疾患または障害と関連している症状の低減に有用な薬剤（抗発作剤、神経障害性疼痛の軽減に有用な薬剤、心機能不全を処置するための薬剤）、心血管作動薬（以下に詳述するものなど）、化学療法剤（以下に詳述するものなど）、または抗神経変性薬剤（以下に詳述するものなど）などとの組合せで、それを必要とする被験体に投与することを伴う、ミトコンドリア活性の増大から利益を受ける疾患または障害を処置するための方法を提供する。例示的な一実施形態において、本発明は、１種類以上のＣＬＫ阻害化合物を、以下：コエンザイムＱ１０、Ｌ−カルニチン、チアミン、リボフラビン、ナイアシンアミド、葉酸塩、ビタミンＥ、セレン、リポ酸またはプレドニゾンの１種以上との組合せで、それを必要とする被験体に投与することを伴う、ミトコンドリア活性の増大から利益を受ける疾患または障害を処置するための方法を提供する。かかる組合せを含む組成物もまた、本明細書において提供する。
【０２９４】
例示的な実施形態において、本発明は、被験体に治療有効量のＣＬＫ阻害化合物を投与することによりミトコンドリアの活性（ａｃｉｔｉｖｔｙ）の増大の恩恵を受け得る疾患または障害を処置するための方法を提供する。例示的な疾患または障害としては、例えば、神経筋障害（例えば、フリードライヒ失調症、筋ジストロフィー、多発性硬化症など）、ニューロン不安定性の障害（例えば、発作障害、偏頭痛（ｍｉｇｒａｎｅ）など）、発達遅延、神経変性障害（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症など）、虚血、腎尿細管性アシドーシス、加齢性神経変性および認知低下、化学療法  疲労、加齢性もしくは化学療法誘発性閉経または不規則な月経周期もしくは排卵、ミトコンドリアミオパシー、ミトコンドリアの損傷（例えば、カルシウム蓄積、興奮性毒性、一酸化窒素曝露、低酸素症など）、ならびにミトコンドリア調節異常が挙げられる。
【０２９５】
最も一般的な遺伝性運動失調であるフリードライヒ失調症（ＦＡ）の原因である遺伝子欠陥が、最近同定され、「フラタキシン」と命名されている。ＦＡでは、ある期間の正常な発達後、協調における欠陥が発生し、進行して、典型的には３０〜４０歳の間で麻痺および死に至る。最も重症に冒される組織は、脊髄、末梢神経、心筋層および膵臓である。患者は、典型的には、運動制御を失い、車椅子に拘束されることになり、一般に、心不全および糖尿病に罹る。ＦＡの遺伝的根拠は、フラタキシンをコードする遺伝子内のイントロン領域内のＧＡＡトリヌクレオチド反復配列が関与する。このような反復配列の存在により、該遺伝子の転写および発現の低減がもたらされる。フラタキシンは、ミトコンドリアの鉄分含量の調節に関与している。細胞内のフラタキシン含量が正常以下である場合、過剰の鉄分がミトコンドリア内に蓄積され、酸化的損傷が促進され、結果としてミトコンドリアの変性および機能不全が促進される。中間数のＧＡＡ反復配列がフラタキシン遺伝子イントロン内に存在する場合、運動失調の重症な臨床的表現型が発現され得る。しかしながら、このような中鎖トリヌクレオチド伸長は、非糖尿病集団約５％であるのに比べ、インスリン非依存性真性糖尿病の患者では２５〜３０％に見られる。特定のある実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、フラタキシンの欠損または欠陥に関連する障害を有する患者（例えば、フリードライヒ失調症、心筋機能不全、真性糖尿病および糖尿病の合併症（末梢神経障害など））の処置のために使用され得る。
【０２９６】
筋ジストロフィーは、神経筋構造および機能の崩壊を伴い、多くの場合、骨格筋の萎縮および心筋機能不全がもたらされる一群の疾患をいう。デュシェーヌ筋ジストロフィーの場合、特定のタンパク質ジストロフィンの変異または欠損が、その病因に関与している。ジストロフィン遺伝子が不活化されたマウスは、筋ジストロフィーの一部の特徴を示し、ミトコンドリアの呼吸鎖活性がほぼ５０％欠損する。ほとんどの場合において、神経筋変性の最終的な一般的経路は、ミトコンドリア機能のカルシウム媒介性障害である。特定のある実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、筋ジストロフィーの患者において筋肉機能能力の低下速度を低減させるため、および筋肉機能状態を改善するために使用され得る。
【０２９７】
多発性硬化症（ＭＳ）は、脳の白質の局所性（ｆｏｃａｌ）炎症性の自己免疫変性を特徴とする神経筋疾患である。周期的な増悪または発作は、上気道および他の感染症（細菌性およびウイルス性の両方）と有意に相関しており、ミトコンドリア機能不全がＭＳにおいてある役割を果たしていることを示す。一酸化窒素（星状細胞および炎症に関与する他の細胞によって生成される）によって引き起こされるニューロンのミトコンドリアの呼吸鎖活性の抑制は、ＭＳに寄与する分子機構であることが示唆される。特定のある実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、多発性硬化症の患者の処置のために、予防的および疾患増悪の症状発現中の両方で使用され得る。
【０２９８】
癲癇は、多くの場合、一連の重症度および頻度の発作（例えば、非存在、緊張性、弛緩性、ミオクローヌスおよび痙攣重積状態、孤立性症状発現または１日に多数回で起こる）
を伴うミトコンドリア細胞障害を有する患者において存在する。特定のある実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、ミトコンドリア機能不全に続発性の発作の患者の処置のため、例えば、発作の活発性の頻度および重症度を低減させるために使用され得る。
【０２９９】
再発性偏頭痛を有する患者に関する代謝試験により、一般にミトコンドリア活性における欠陥がこの障害と関連しており、酸化的リン酸化障害および過剰乳酸生成として示されることが示されている。かかる欠陥は、必ずしもミトコンドリアＤＮＡの遺伝子欠陥によるものではない。偏頭痛患者は、シトクロムｃオキシダーゼの内因性阻害剤である一酸化窒素に対して超過敏性である。また、ミトコンドリア細胞障害（例えば、ＭＥＬＡＳ）を有する患者は、多くの場合、再発性偏頭痛を有する。特定のある実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、再発性偏頭痛（例えば、麦角化合物またはセロトニン受容体アンタゴニストに不応性の頭痛）の患者の処置のために使用され得る。
【０３００】
神経学的または神経心理学的発達の遅延は、多くの場合、ミトコンドリア病の小児に見られる。神経の連結の発達および再構築には、強力な生合成活性が必要とされ、特に、ニューロンの膜およびミエリン合成を伴い、これらはともに、補因子としてピリミジンヌクレオチドを必要とする。ウリジンヌクレオチドは、糖脂質および糖タンパク質への糖類の不活性化および転移に関与している。シチジンヌクレオチドは、ウリジンヌクレオチドから誘導され、ホスファチジルコリン（これは、コリン部分をシチジンジホスホコリンから受ける）などの主な膜リン脂質構成成分の合成に不可欠である。ミトコンドリア機能不全（ミトコンドリアＤＮＡ欠陥または任意の後天性もしくは条件付き欠陥（興奮性毒性あるいは一酸化窒素媒介型ミトコンドリア機能不全など）のいずれかによる）またはピリミジン合成の障害をもたらす他の状態の場合、細胞増殖および軸索伸長は、神経の相互連結および回路の発達において不可欠な段階で障害され、言語、運動、社交、実行機能および認知技能などの神経心理学的機能の発達の遅延または停止がもたらされる。自閉症では、例えば、脳のリン酸塩化合物の磁気共鳴スペクトルの測定により、広範囲で膜および膜前駆物質の合成が不充分である（膜合成に関与するウリジンジホスホ糖類およびシチジンヌクレオチド誘導体のレベルの低下によって示される）ことが示されている。発達遅延を特徴とする障害としては、レット症候群、広汎発達遅延（または、ＰＤＤ−ＮＯＳ「特定不能の広汎性発達障害」、自閉症などの特定の下位分類と区別するため）、自閉症、アスペルガー症候群、および注意欠陥過活動性障害（ＡＤＨＤ）（これは、実行機能の基礎となる神経回路構成の発達の遅延または遅滞であると認識されてきている）が挙げられる。特定のある実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、神経発達遅延（例えば、運動、言語、実行機能および認知技能など）、または神経系の神経学的および神経心理学的発達、ならびに筋肉および内分泌腺などの非神経組織の身体的発達の他の遅延もしくは停止を有する患者の処置（ｔｒｅａｔｉｎｇ  ｔｒｅａｔｉｎｇ）に有用であり得る。
【０３０１】
加齢と関連する最も有意に重症な神経変性疾患の２つであるアルツハイマー病（ＡＤ）およびパーキンソン病（ＰＤ）は、ともに、その病因にミトコンドリア機能不全が関与している。複合体Ｉ欠損症は、特に、パーキンソン病において変性されている黒質線状体ニューロンにおいてだけでなく、パーキンソン病患者の末梢組織ならびに筋肉および血小板などの細胞においても高頻度に見られる。アルツハイマー病では、多くの場合、ミトコンドリアの呼吸鎖活性、特に複合体ＩＶ（シトクロムｃオキシダーゼ）が抑制されている。さらに、ミトコンドリアの呼吸機能は、加齢の結果、完全に抑制され、呼吸鎖機能を冒すさらなる分子病変の有害な続発症がさらに増幅される。主なミトコンドリア機能不全に加えて他の要素が、ＡＤ、ＰＤおよび関連障害における神経変性の原因となっている。興奮性毒性の刺激および一酸化窒素は、両方の疾患に関与しており、ともに、ミトコンドリアの呼吸鎖欠陥を悪化させ、その有害な作用が呼吸鎖機能不全の背景において強調される因子である。ハンチントン病もまた、脳の罹患領域においてミトコンドリア機能不全が関与しており、興奮性毒性刺激とミトコンドリア機能不全の協働的相互作用がニューロン変性に寄与する。特定のある実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、ＡＤおよびＰＤなどの加齢性神経変性疾患の進行の処置および軽減に有用であり得る。
【０３０２】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳまたはルー・ゲーリック病）の患者における主な遺伝子欠陥の１つは、抗酸化剤酵素である銅・亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ  １）、変異または欠損である。ミトコンドリアは、反応性酸素種を生成するとともに、その主な標的でもある。ミトコンドリア内での酸素への電子の非効率的な伝達は、哺乳動物の系において、フリーラジカルの最も重要な生理学的供給源である。抗酸化剤または抗酸化剤酵素の欠損により、ミトコンドリアの変性がもたらされ得るか、または悪化され得る。変異型ＳＯＤ１が遺伝子組換えされたマウスは、ヒトＡＬＳのものに類似した症状および病態を示す。このような動物における該疾患の発生は、ミトコンドリアの酸化的崩壊の後、運動ニューロン機能低下および臨床的症状の発現を伴うことが示されている。ＡＬＳ患者の骨格筋は、ミトコンドリア複合体Ｉの活性が低い。特定のある実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、ＡＬＳの処置、その臨床的症状の進行の逆転または遅滞に有用であり得る。
【０３０３】
酸素欠損症は、細胞から、複合体ＩＶにおけるシトクロムｃ再酸化のための末端電子受容体を枯渇させることによるミトコンドリアの呼吸鎖活性の直接的阻害と、特に神経系において、副次的な無酸素後興奮性毒性および一酸化窒素形成による間接的阻害の両方をもたらす。脳の無酸素症、狭心症または鎌状赤血球貧血危機などの状態では、組織は、比較的低酸素性である。かかる症例では、ミトコンドリア活性を増大させる化合物が、低酸素症の有害効果からの罹患組織の保護をもたらし、副次的な細胞死の遅延を減衰させ、低酸素性組織ストレスおよび損傷からの回復を加速する。特定のある実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、脳への虚血性または低酸素性傷害後の細胞死（脳の虚血の症状発現後、約２〜５日間で起こる海馬または皮質などの領域におけるアポトーシス）の遅延の予防に有用であり得る。
【０３０４】
腎機能不全によるアシドーシスは、多くの場合、根本的原因である呼吸鎖機能不全が先天性であれ、虚血または細胞傷害剤（シスプラチンなど）によって誘導されたものであれ、ミトコンドリア病の患者において観察される。尿細管性アシドーシスは、多くの場合、血液および組織のｐＨを維持するために、外因性重炭酸ナトリウムの投与が必要とされる。特定のある実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、腎尿細管性アシドーシスおよびミトコンドリアの呼吸鎖の欠陥によって引き起こされる他の形態の腎機能不全の処置に有用であり得る。
【０３０５】
通常の加齢の際には、進行性のミトコンドリア呼吸鎖機能の低下がみられる。ヒトでは、４０歳くらいから始まり、ミトコンドリアＤＮＡ欠陥の蓄積に指数関数的な上昇、および同時にミトコンドリアの呼吸性活性の核調節エレメントの減少がみられる。多くのミトコンドリアＤＮＡ病変は、ミトコンドリアの代謝回転時に、特に有糸分裂後の細胞において選択アドバンテージ（ａｄｖａｎｔａｇｅ）を有する。提案されている機構は、欠陥性の呼吸鎖を有するミトコンドリアは、インタクトな機能的呼吸鎖を有するミトコンドリアよりも、自身に対してもたらされる酸化的損傷が少ないというものである（ミトコンドリアの呼吸は、体内のフリーラジカルの主な供給源である）。したがって、正常に機能しているミトコンドリアでは、欠陥性ミトコンドリアよりも膜脂質に対する酸化的損傷がより急速に蓄積され、したがって、リソソームによる分解に対する「タグ化」が行なわれる。細胞内のミトコンドリアは、約１０日間の半減期を有するため、選択アドバンテージにより、特に分裂の遅い細胞では、機能的ミトコンドリアが呼吸性活性が低下したものに急速に置換され得る。正味の結果、ミトコンドリアに対する酸化的損傷を低減するミトコンドリアのタンパク質の遺伝子における変異が起こると、かかる欠陥性ミトコンドリアは、急速に細胞内で数を増やし、その呼吸能力を減衰または消去する。かかる細胞の蓄積により、生物体レベルで加齢または変性疾患がもたらされる。これは、筋肉内の欠陥性の電子輸送活性を有する細胞の進行性のモザイク状の外観、正常な活性を有する細胞中にランダムに散在するシトクロムｃオキシダーゼ（ＣＯＸ）活性がほとんど枯渇した細胞、および高齢被験体由来の生検材料中のＣＯＸ陰性細胞の高い存在率と整合する。加齢時またはさまざまなミトコンドリア病の生物体は、したがって、ミトコンドリアの呼吸鎖機能の不可避的（ｉｎｅｘｏｒａｂｌｅ）進行性の低下の状況において、置換不能な有糸分裂後の細胞（例えば、ニューロン、骨格筋および心筋）が保存されなければならず、その機能が有意な程度まで維持されなければならない状況に直面する。機能不全のミトコンドリアを有するニューロンは、興奮性毒性損傷などの傷害に対して進行的により感受性となる。ミトコンドリア機能不全は、加齢に伴うほとんどの変性疾患（特に神経変性）に寄与する。先天性のミトコンドリア病は、多くの場合、基本的な機構が、正常なミトコンドリアをもって生まれた人の加齢時に起こる障害に類似した早期発症神経変性を伴う。特定のある実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、認知低下および他の変性性の加齢の結果の処置または減弱するのに有用であり得る。
【０３０６】
ミトコンドリアＤＮＡの損傷は、ミトコンドリアＤＮＡの修復の方が脆弱性が大きいこと、およびあまり効率的でないことの両方のため、酸化的ストレスまたは癌化学療法剤（シスプラチンなど）に供された細胞内の核ＤＮＡの損傷よりも広範で長期間持続する。ミトコンドリアＤＮＡは核ＤＮＡよりも損傷に対して感受性であることもあり得るが、状況によっては、化学的発癌物質による変異誘発に対して比較的抵抗性である。これは、ミトコンドリアが、その欠陥性ゲノムを修復しようとするのではなく破壊することにより、一部の型のミトコンドリアＤＮＡ損傷に応答するためである。これにより、細胞傷害性化学療法の後、長期間、全体的なミトコンドリア機能不全がもたらされる。シスプラチン、マイトマイシンおよびシトキサンなどの化学療法剤の臨床的使用は、多くの場合、衰弱性の「化学療法時の疲労感」を伴い、これは、長期間の衰弱および運動不耐性であり、かかる薬剤の血液学的毒性および胃腸毒性からの回復後であっても持続することがあり得る。特定のある実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、ミトコンドリア機能不全に関連する癌化学療法の副作用の処置および予防に有用であり得る。
【０３０７】
卵巣の不可欠な機能は、胎児に受け継がれるミトコンドリアはすべて、受精時に卵母細胞内に存在するものに由来するため、卵母細胞内のミトコンドリアゲノムの完全性を維持することである。ミトコンドリアＤＮＡにおける欠失は、閉経年齢ごろに検出可能となり、月経周期の異常とも関連している。細胞は、直接ミトコンドリアＤＮＡにおける欠陥を検出して応答することができないが、呼吸障害、レドックス状態またはピリミジン合成における欠陥などの細胞質に影響を及ぼす副次効果を検出することのみ可能なため、かかるミトコンドリア機能の産物は、卵母細胞選択および卵胞閉鎖のシグナルとして関与し、最終的に、ミトコンドリアゲノムの忠実度および機能的活性の維持がもはや保証され得なくなると閉経が誘発される。これは、修復プロセスによってゲノムの忠実度がもはや達成され得なくなると、活発な細胞自殺プロセスを受けるＤＮＡ損傷を有する細胞におけるアポトーシスに類似する。性腺が冒されたミトコンドリア細胞障害を有する女性は、多くの場合、早発閉経となるか、主に周期異常を示す。細胞傷害性癌化学療法剤は、多くの場合、早発閉経を誘導し、その結果、骨粗鬆症のリスクの増大を伴う。化学療法誘発性無月経は、一般的に、主に卵巣機能不全によるものである。化学療法誘発性無月経の発生は、化学療法を受けた閉経前の女性において年齢の関数として増加し、ミトコンドリアの関与が指摘されている。ミトコンドリアの呼吸またはタンパク質合成の阻害剤は、ホルモン誘発性排卵を阻害し、さらに、下垂体性ゴナドトロピンに応答した卵巣のステロイドホルモンの産生を阻害する。ダウン症候群の女性は、典型的には、早期に閉経し、また、アルツハイマー様痴呆の早期発症に供される。シトクロムオキシダーゼの低活性が、ダウン症患者の組織および後期発症型アルツハイマー病に一貫して見られる。したがって、適切なミトコンドリア機能の補助またはミトコンドリア機能不全の代償は、加齢性もしくは化学療法誘発性の閉経または不規則な月経周期もしくは排卵に対して保護するに有用である。特定のある実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、無月経、排卵不順、閉経、または閉経の副次的な結果の処置および予防に有用であり得る。
【０３０８】
特定のある実施形態において、ＣＬＫモジュレート化合物、特に、ＣＬＫ阻害化合物は、ミトコンドリアミオパシーの処置に有用であり得る。ミトコンドリアミオパシーは、軽度のゆっくりとした進行性の外眼筋の衰弱から、重症な致死性の乳児ミオパシーおよび多系統（ｍｕｌｔｉｓｙｓｔｅｍ）脳筋症の範囲に及ぶ。一部の症候群は規定されており、一部は、重複する部分がある。筋肉が冒される確立された症候群としては、進行性の外眼筋麻痺症、キーンズ・セイアー症候群（眼筋麻痺、色素性網膜症、心伝導系欠陥、小脳の運動失調および感音難聴を伴う）、ＭＥＬＡＳ症候群（ミトコンドリア脳筋症、乳アシドーシスおよび脳卒中様症状発現）、ＭＥＲＦＦ症候群（ミオクローヌス癲癇および不規則な赤筋線維）、肢帯分布の衰弱、ならびに乳児ミオパシー（良性または重症で致死性）が挙げられる。修飾ゴルジ三色染料で染色した筋肉生検の検体は、ミトコンドリアの過剰蓄積による不規則な赤筋線維を示す。基質の輸送および利用、クレブス回路、酸化的リン酸化または呼吸鎖における生化学的欠陥は検出可能である。数多くのミトコンドリアＤＮＡの点変異および欠失が、報告されており、母性非メンデル遺伝パターンで伝達される。核コードミトコンドリア酵素における変異が起こる。
【０３０９】
特定のある実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、ミトコンドリアに対する毒性損傷、例えば、カルシウム蓄積、興奮性毒性、一酸化窒素曝露または低酸素症による毒性損傷などに苦しむ患者の処置に有用であり得る。
【０３１０】
細胞損傷の基本的な機構は、特に興奮性組織では、原形質膜からの漏出または細胞内カルシウム処理機構における欠陥のいずれかの結果として、細胞内への過剰なカルシウム侵入を伴う。ミトコンドリアは、カルシウム捕捉の主要部位であり、呼吸鎖からのエネルギーを、ＡＴＰ合成よりもカルシウム取込みのために優先的に利用する。ミトコンドリア内へのカルシウム取込みによってエネルギー伝達能力の減弱がもたらされるため、該優先的利用により、ミトコンドリアの機能不全の下方スパイラルがもたらされる。
【０３１１】
興奮性アミノ酸でのニューロンの過剰な刺激は、中枢神経系における細胞死または損傷の一般的な機構である。グルタミン酸塩受容体、特にＮＭＤＡ受容体と称されるサブタイプの活性化により、一部、興奮性毒性刺激中の細胞内カルシウムの上昇によってミトコンドリア機能不全がもたらされる。逆に、ミトコンドリアの呼吸および酸化的リン酸化における欠陥により、細胞が興奮性毒性刺激に対して感作され、正常細胞に対しては無毒であり得るレベルの興奮性毒性神経伝達物質または毒素への曝露中に細胞死または損傷がもたらされる。
【０３１２】
一酸化窒素（約１マイクロモル）は、シトクロムオキシダーゼ（複合体ＩＶ）を阻害し、それによりミトコンドリアの呼吸が阻害され、さらに、一酸化窒素（ＮＯ）への長期曝露により、複合体Ｉ活性が不可逆的に低下する。従って、生理学的または病態生理学的濃度のＮＯにより、ピリミジン生合成が阻害される。一酸化窒素は、さまざまな神経変性障害、例えば、中枢神経系の炎症性疾患および自己免疫疾患に関与しており、ニューロンに対する興奮性毒性および低酸素後の損傷の媒介に関与している。
【０３１３】
酸素は、呼吸鎖における末端の電子受容体である。酸素欠損症により、電子伝達系活性が障害され、ピリミジン合成の減弱ならびに酸化的リン酸化によるＡＴＰ合成の減弱がもたらされる。ヒト細胞は、ウリジンおよびピルビン酸塩（またはＮＡＤＨを酸化して解糖ＡＴＰ産生を至適化するための同様に有効な薬剤）が提供された場合、事実上、嫌気性条件下で増殖し、生存能を保持する。
【０３１４】
特定のある実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、ミトコンドリア調節異常と関連している疾患または障害の処置に有用であり得る。
【０３１５】
呼吸鎖成分をコードするミトコンドリアＤＮＡの転写には、核因子が必要とされる。ニューロンの軸索では、ミトコンドリアは、呼吸鎖活性を維持するため、核に向かって前後にシャトルしなければならない。軸索輸送が低酸素症またはタキソールなどの微小管の安定性に影響を及ぼす薬物によって障害された場合、核から遠いミトコンドリアは、シトクロムオキシダーゼ活性の低下を受ける。したがって、ＣＬＫ阻害化合物での処置は、核−ミトコンドリアの相互作用を促進させるために有用であり得る。
【０３１６】
ミトコンドリアは、特に、１種類以上の呼吸鎖成分における欠陥によって、代謝性中間体から酸素分子への電子の秩序ある伝達が障害されると、ミトコンドリアの呼吸鎖から漏出（ｓｐｉｌｌｏｖｅｒ）するため、フリーラジカルおよび反応性酸素種の主な供給源である。酸化的損傷を低減するため、細胞は、ミトコンドリア脱共役タンパク質（ＵＣＰ）（そのいくつかは同定されている）を発現することにより代償を行ない得る。ＵＣＰ−２は、酸化的損傷、炎症性サイトカインまたは過剰脂質負荷（例えば、脂肪肝および脂肪性肝炎）に応答して転写される。ＵＣＰは、ミトコンドリア内膜のプロトン勾配を放電させることにより、実際には、代謝によって生成されるエネルギーを消耗し、細胞を、酸化的損傷の低減の代償としてエネルギーストレスに対して脆弱にすることにより、ミトコンドリアからの反応性酸素種の漏出を低減する。
【０３１７】
ｘｉｉ．筋肉機能
他の実施形態において、本発明は、治療有効量のＣＬＫ阻害化合物を投与することにより、筋肉機能を増強するための方法を提供する。例えば、ＣＬＫ阻害化合物は、身体の耐久力（例えば、運動、肉体労働、スポーツ活動などの肉体作業などのを行なう能力）を改善するため、身体の疲労を抑制もしくは遅延させるため、血中酸素レベルを向上させるため、健常な個体においてエネルギーを増強するため、労働能力や耐久力を増強するため、筋肉疲労を低減するため、ストレスを低減するため、心臓や心血管機能を増強するため、性的能力を改善するため、筋肉ＡＴＰレベルを増加させるため、および／または血中の乳酸を低減させるために有用であり得る。特定のある実施形態において、該方法は、ミトコンドリア活性を増大させる量、ミトコンドリアバイオジェネシスを増大させる量、ミトコンドリアの質量を増大させる量のＣＬＫ阻害化合物、または高用量のＣＬＫ阻害化合物を投与することを伴う。
【０３１８】
スポーツパフォーマンスは、スポーツ活動に参加したときに発揮される運動選手の筋肉能力をいう。スポーツパフォーマンス、体力、スピードおよび耐久力の増強は、筋肉の収縮強度の増大、筋肉収縮の大きさの増大、刺激と収縮の間の筋肉反応時間の短縮によって測定される。運動選手は、任意のレベルスポーツに参加する個体であって、そのパフォーマンスにおいて体力、スピードおよび耐久力のレベルの改善の達成を追求する個体、例えば、例えば、ボディビルダー、競輪選手、長距離ランナー、短距離ランナーなどをいう。運動選手は、ハードなトレーニングを行なっている個体であり得る、すなわち、１週間に３日間超または試合のために  激しくスポーツ活動を行なう。運動選手はまた、フィットネスに熱中している個体であって、一般健康状態および満足のいく状態の改善、エネルギーレベルの改善を追求し、１週間に約３回、約１〜２時間運動する個体であり
得る。スポーツパフォーマンスの増強は、筋肉疲労を克服する能力、活動を長期間維持する能力、によって顕現され（ｉｎ  ｍａｎｉｆｅｓｔｅｄ）、運動がより有効な有効になる。
【０３１９】
運動選手の筋肉機能において、より高レベルの抵抗性で長時間、試合またはトレーニングが許容される状態がもたらされることが望ましい。しかしながら、急性で激しい嫌気性での骨格筋の使用により、多くの場合、運動能力の障害がもたらされ、力および動きの出力が低下し、筋肉疲労、痛みおよび機能不全の開始が増大する。現在、１回の消耗性の運動活動でさえ、それに関して身体に対する任意の急性外傷、例えば、筋肉損傷、抵抗力もしくは消耗性の筋肉運動など、または待機手術は、短期的および長期的の両方において筋肉機能に影響を及ぼす代謝の混乱を特徴とすることが認識されている。筋肉代謝性／酵素活性および遺伝子発現の両方が影響を受ける。例えば、骨格筋窒素代謝の途絶ならびに代謝性エネルギーの供給源の枯渇は、激しい筋肉活動の際に起こる。アミノ酸（分枝鎖アミノ酸を含む）が筋肉から放出された後、その脱アミノ化により、筋肉燃料供給源として血清アンモニアおよび局所酸化が上昇し、これにより、代謝性アシドーシスが増大される。また、筋肉収縮事象の触媒効率の低下ならびに窒素およびエネルギー代謝の酵素活性の改変がみられる。さらに、タンパク質異化作用が開始され、この場合、タンパク質合成速度は、非収縮性のタンパク質の分解の増加とともに、減少する。このような代謝プロセスはまた、フリーラジカル生成によっても行なわれ、これにより筋肉細胞がさらに損傷される。
【０３２０】
急性および激しい運動中の疲労からの回復には、代謝性および非代謝性疲労因子の逆転が必要とされる。ヒト筋肉疲労に関与する既知因子、例えば、乳酸、アンモニア、水素イオンなどでは、疲労／回復プロセスの説明が不完全で不充分であり、おそらく、さらなる未知因子が関与している（Ｂａｋｅｒら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．７４：２２９４−２３００、１９９３；Ｂａｚｚａｒｒｅら、Ｊ  Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｎｕｔｒ．１１：５０５−５１１、１９９２；Ｄｏｈｍら、Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．４４：３４８−３５２、１９８５；Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｉｎ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｅｘｅｒｃｉｓｅ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｉｆｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｅｘｅｒｃｉｓｅ（Ｋｕｔｒｇｅｎ、Ｖｏｇｅｌ、Ｐｏｏｒｍａｎｓ編）、１９８３；ＭａｃＤｏｕｇａｌｌら、Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．１４６：４０３−４０４、１９９２；Ｗａｌｓｅｒら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．３２：１２３−１２８、１９８７）。また、いくつかの研究により、筋肉機能の増強における栄養サプリメントおよびハーブサプリメントの効果が解析された。
【０３２１】
耐久性運動中の筋肉機能とは別に、フリーラジカルおよび酸化的ストレスパラメータが、病態生理学的状態において影響を受ける。現在、実データにより、酸化的ストレスが病態生理学的状態において筋肉の消耗または萎縮に寄与することが示されている（Ｃｌａｒｋｓｏｎ，Ｐ．Ｍ．Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．Ｎｕｔｒ．３５：３１−４１；１９９５；Ｐｏｗｅｒｓ、Ｓ．Ｋ．；Ｌｅｎｎｏｎ，Ｓ．Ｌ．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  フｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌｓ：Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  ｅｘｅｒｃｉｓｅ  ａｎｄ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎｕｔｒ．Ｓｏｃ．５８：１０２５−１０３３；１９９９に概説）。例えば、筋肉の持久力および機能の両方が代償される場合の筋肉の障害に関して、一酸化窒素（ＮＯ）の役割が示唆されている。筋ジストロフィー、特に、ジストロフィン−糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）を構成するタンパク質の欠陥によるものでは、ＮＯを合成する酵素である一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）が関連している。ＤＧＣ欠陥に関連するジストロフィーの最近の研究により、細胞損傷の機構の１つが、細胞ＮＯＳにおける改変およびＮＯの正常な保護作用の途絶に関連する機能的虚血であることが示唆されている。この保護作用は、交感神経性血管収縮における収縮誘発性増大中の局所虚血の予防である。Ｒａｎｄｏ（Ｍｉｃｒｏｓｃ  Ｒｅｓ  Ｔｅｃｈ  ５５（４）：２２３−３５、２００１）により、病理学的変化の前に酸化的損傷が起こること、およびＤＧＣに欠陥を有する筋肉細胞が酸化剤刺激に対する感受性の増大を有することが示された。フリーラジカルによる過剰な脂質過酸化もまた、マッカードル病などの筋障害性疾患の因子であることが示された（Ｒｕｓｓｏら、Ｍｅｄ  Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ．３９（２）：１４７−５１、１９９２）。さらにまた、ミトコンドリア機能不全は、加齢性筋肉消耗（サルコペニア）のよく知られた相関因子であり、フリーラジカル損傷は、調査は不充分であるが、寄与因子であるが示唆されている（Ｎａｖａｒｒｏ、Ａ．；Ｌｏｐｅｚ−Ｃｅｐｅｒｏ，Ｊ．Ｍ．；Ｓａｎｃｈｅｚ  ｄｅｌ  Ｐｉｎｏ，Ｍ．Ｌ．Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：Ｄ２６−４４；２００１に概説）。他の指標としては、急性サルコペニア、例えば、筋肉萎縮および／または火傷と関連している悪液質、床上安静、肢部不動化、あるいは主な胸部、腹部および／または整形外科手術が挙げられる。本発明の方法はまた、筋肉関連病理学的状態の処置においても有効であることが想定される。
【０３２２】
特定のある実施形態において、本発明は、ＣＬＫ阻害化合物を含む新規なダイエット用組成物、その調製方法、およびスポーツパフォーマンスの改善のための該組成物の使用方法を提供する。したがって、広く規定される運動、例えば、耐久力が必要とされるスポーツおよび反復的な筋肉労作が必要とされる労働に関与している人のための、身体の耐久力を改善する作用および／または身体の疲労を抑制する作用を有する治療用組成物、食品および飲料が提供される。かかるダイエット用組成物は、さらに、電解質、カフェイン、ビタミン類、炭水化物などを含むものであってもよい。
【０３２３】
ｘｉｉｉ．他の用途
ＣＬＫ阻害化合物は、ウイルス感染症（インフルエンザ、ヘルペスもしくはパピローマウイルスによる感染症など）を処置もしくは予防するため、または抗真菌剤として使用され得る。特定のある実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、ウイルス性疾患の処置のための別の治療用薬剤、例えば、アシクロビル、ガンシクロビルおよびジドブジンとの併用薬療法剤の一部として投与され得る。別の実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、別の抗真菌剤、例えば、経表面的抗真菌薬、例えば、シクロピロック、クロトリマゾール、エコナゾール、ミコナゾール、ナイスタチン、オキシコナゾール、テルコナゾールおよびトルナフテートなど、または全身性抗真薬、例えば、フルコナゾール（Ｄｉｆｌｕｃａｎ）、イトラコナゾール（Ｓｐｏｒａｎｏｘ）、ケトコナゾール（Ｎｉｚｏｒａｌ）、およびミコナゾール（Ｍｏｎｉｓｔａｔ  Ｉ．Ｖ．）などとの併用薬療法剤の一部として投与され得る。
【０３２４】
本明細書に記載のようにして処置され得る被験体としては、真核生物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト、ヒツジ、ウシ、ウメ、ブタ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類、マウスおよびラットなどが挙げられる。処理され得る細胞としては、真核生物細胞、例えば、上記の被験体由来のもの、または植物細胞、酵母細胞および原核生物細胞、例えば、細菌細胞が挙げられる。例えば、モジュレート化合物は家畜用動物に対し、飼育条件に対してより長期間耐えられる能力を改善するために投与され得る。
【０３２５】
ＣＬＫ阻害化合物はまた、植物において寿命、ストレス抵抗性およびアポトーシスに対する抵抗性を増大させるために使用され得る。一実施形態において、該化合物は、植物に対して例えば定期的に、または真菌に対して適用される。別の実施形態において、植物は、該化合物を産生するように遺伝的に修飾されたものである。別の実施形態において、植物および果実は該化合物で、輸送中での損傷に対する抵抗性を増大させるために収穫および輸送前に処理される。また、植物の種子を、例えば貯蔵のために、本明細書に記載の化合物と接触され得る。
【０３２６】
他の実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、酵母細胞において寿命をモジュレートするために使用され得る。酵母細胞の寿命を延長させることが望まれ得る状況としては、酵母が用いられる任意のプロセス、例えば、ビール、ヨーグルトおよびベーカリー製品、例えばパンの製造が挙げられる。寿命が延長された酵母の使用により、酵母の使用量が少なくなり得るか、または酵母をより長期間活性にし得る。また、タンパク質を組換えにより作製するために使用される酵母または他の哺乳動物細胞も、本明細書に記載のようにして処置され得る。
【０３２７】
ＣＬＫ阻害化合物はまた、昆虫において寿命、ストレス抵抗性およびアポトーシスに対する抵抗性を増大させるために使用され得る。この実施形態では、該化合物は、有用な昆虫、例えば、ハチおよび植物の受粉に関与している他の昆虫に適用され得る。具体的な一実施形態において、該化合物は、ハチミツの生成に関与しているハチに適用され得る。一般的に、本明細書に記載の方法は、商業的重要性を有し得る任意の生物体（例えば、真核生物）に適用され得る。例えば、該方法は、魚（水産養殖）ならびに鳥類（例えば、ニワトリおよび家禽）に適用され得る。
【０３２８】
また、高用量のＣＬＫ阻害化合物が、発生中でのサイレンス遺伝子の調節およびアポトーシスの調節を妨げることにより、殺虫剤として使用され得る。この実施形態では、該化合物は植物に、該化合物が昆虫の幼虫に対して生物学的利用可能であるが植物に対してはそうでないことが確実な、当該技術分野において知られた方法を用いて適用され得る。
【０３２９】
他の実施形態において、ＣＬＫ阻害化合物は、昆虫、動物および微生物などの生物体の生殖に影響を及ぼすために適用され得る。
【０３３０】
３．ＣＬＫモジュレート化合物
種々の実施形態において、本明細書に記載の方法に有用なＣＬＫモジュレータは、ポリペプチド（抗体を含む）または核酸（例えば、アンチセンス核酸、リボザイムおよび低分子干渉ＲＮＡあるいはｓｉＲＮＡ）であり得る。小分子ＣＬＫ阻害化合物の例は、米国特許出願公開公報第２００５／０１７１０２６号（「過剰キナーゼ誘導によって引き起こされる非正常スプライシングを標的化する治療用組成物」）に記載されたもの、または本明細書の図１４に示したものである。
【０３３１】
別の実施形態において、ＣＬＫモジュレータは、アンチセンス核酸であり得る。「アンチセンス核酸」により、ＲＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−ＰＮＡ（タンパク質核酸）相互作用によって標的核酸に結合し、該標的核酸の活性を改変する非酵素的核酸化合物が意図される（概説については、ＳｔｅｉｎおよびＣｈｅｎｇ、１９９３  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１、１００４ならびにＷｏｏｌｆら、米国特許第５，８４９，９０２号を参照のこと）。典型的には、アンチセンス分子は、該アンチセンス分子の単一の連続的な配列に沿って標的配列に相補的である。しかしながら、特定のある実施形態において、アンチセンス分子は、ループを形成することがあり得、ループを形成する基質核酸に結合する。したがって、アンチセンス分子は、２つ（もしくはそれ以上）の非連続的な基質の配列に相補的なものであり得るか、またはアンチセンス分子の２つ（もしくはそれ以上）の非連続的な配列部分が、標的配列に相補的であり得るか、または両方であり得る。現行のアンチセンスストラテジーの概説については、Ｓｃｈｍａｊｕｋら，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，２１７８３−２１７８９，Ｄｅｌｉｈａｓら，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ，１５，７５１−７５３，Ｓｔｅｉｎら，１９９７，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎ．Ａ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．，７，１５１，Ｃｒｏｏｋｅ，２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３１３，３−４５；Ｃｒｏｏｋｅ，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ．，１５，１２１−１５７，Ｃｒｏｏｋｅ，１９９７，Ａｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４０，１−４９を参照のこと。
【０３３２】
他の実施形態において、ＣＬＫモジュレート化合物はｓｉＲＮＡであり得る。用語「低分子干渉ＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」または「低分子干渉核酸」は、細胞内で（ｂｅ  ａ  ｃｅｌｌ）適切にプロセッシングされた場合、ＲＮＡｉまたは遺伝子サイレンシングを媒介し得る任意の核酸化合物をいう。例えば、ｓｉＲＮＡは、自己相補性のセンスおよびアンチセンス領域を含み、該アンチセンス領域が標的核酸化合物（例えば、ＣＬＫタンパク質）に対する相補性を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子であり得る。ｓｉＲＮＡは、自己相補性のセンスおよびアンチセンス領域を有し、該アンチセンス領域が標的核酸化合物に対する相補性を含む単鎖ヘアピンポリヌクレオチドであり得る。ｓｉＲＮＡは、２つ以上のループ構造、ならびに自己相補性のセンスおよびアンチセンス領域を含む幹を有する環状単鎖ポリヌクレオチドであり得、ここで、該アンチセンス領域は、標的核酸化合物に対する相補性を含み、環状ポリヌクレオチドは、ＲＮＡｉを媒介し得る活性なｓｉＲＮＡが生成されるようにインビボまたはインビトロのいずれでプロセッシングされたものであり得る。ＳｉＲＮＡはまた、標的核酸化合物に対する相補性を有する単鎖ポリヌクレオチドを含むものであり得、該単鎖ポリヌクレオチドは、さらに、末端リン酸基、例えば、５’−リン酸基（例えば、Ｍａｒｔｉｎｅｚら、２００２，  Ｃｅｌｌ．，１１０，  ５６３−５７４を参照のこと）、または５’，３’−ジリン酸基を含むものであってもよい。  
【０３３３】
本明細書に記載のように、被験体ｉＲＮＡは、ほぼ１９〜３０ヌクレオチド長、さらにより好ましくは２１〜２３ヌクレオチド長である。ＳｉＲＮＡは、ヌクレアーゼ複合体を漸増させ、特異的配列に対合することにより該複合体を標的ｍＲＮＡに誘導すると理解されている。その結果、標的ｍＲＮＡは、該タンパク質複合体内の該ヌクレアーゼによって分解される。特別な一実施形態において、２１〜２３ヌクレオチドｓｉＲＮＡ分子は、３’ヒドロキシル基を含む。特定のある実施形態において、ｓｉＲＮＡ構築物は、例えば、酵素切断体（ｄｉｃｅｒ）の存在下で、より長鎖の二本鎖ＲＮＡのプロセッシングによって生成されたものであり得る。一実施形態において、ショウジョウバエインビトロ系が使用される。この実施形態では、ｄｓＲＮＡをショウジョウバエ胚由来の可溶性の抽出物と合わせ、それにより、組合せをもたらす。該組合せを、ｄｓＲＮＡが約２１〜約２３  ヌクレオチドのＲＮＡ分子にプロセッシングされる条件下に維持する。ｓｉＲＮＡ分子は、当業者に知られたいくつかの手法を用いて精製され得る。例えば、ゲル電気泳動を用いてｓｉＲＮＡが精製され得る。あるいはまた、非変性方法、例えば、非変性カラムクロマトグラフィーを用いてｓｉＲＮＡが精製され得る。また、クロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー）、グリセロール勾配遠心分離、抗体を用いたアフィニティ精製を用いて、ｓｉＲＮＡが精製され得る。
【０３３４】
ｓｉＲＮＡの作製は、化学的合成方法または組換え核酸手法によって行なわれ得る。処理した細胞の内因性ＲＮＡポリメラーゼにより、転写をインビボを媒介させ得るか、またはクローニングされたＲＮＡポリメラーゼが、インビトロでの転写に使用され得る。本明細書で用いる場合、開示のｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡのみを含有する分子に限定される必要はなく、化学修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドがさらに包含される。例えば、ｄｓＲＮＡは、例えば、細胞ヌクレアーゼに対する感受性を低下させるため、バイオアベイラビリティを改善するため、製剤特性を改善するため、および／または他の薬物動態特性を変更するために、リン酸基−糖主鎖またはヌクレオシドのいずれかに対する修飾を含むものであり得る。例示すると、天然ＲＮＡのホスホジエステル結合は、窒素またはイオウへテロ原子の少なくとも一方を含むように修飾され得る。ＲＮＡ構造における修飾は、ｄｓＲＮＡに対する一般的な応答を回避しつつ、特定の遺伝子阻害が許容されるように調整され得る。同様に、塩基は、アデノシンデアミナーゼ活性を阻止するように修飾され得る。ｄｓＲＮＡは、酵素的に、または部分／完全有機合成によって作製され得、任意の修飾リボヌクレオチドが、インビトロ酵素合成または有機合成によって導入され得る。ＲＮＡ分子を化学的に修飾する方法は、ｄｓＲＮＡの修飾に適合させ得る（例えば、Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２５：７７６−７８０；Ｗｉｌｓｏｎら（１９９４）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇ  ７：８９−９８；Ｃｈｅｎら（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２３：２６６１−２６６８；Ｈｉｒｓｃｈｂｅｉｎら（１９９７）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  ７：５５−６１を参照のこと）。単なる例示であるが、ｄｓＲＮＡの主鎖は、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、ホスホジチオエート、キメラメチルホスフェート−ホスホジエステル、ペプチド核酸、５−プロピニル−ピリミジン含有オリゴマーまたは糖修飾（例えば、２’−置換リボヌクレオシド、ａ−配置）を用いて修飾され得る。特定のある場合では、開示のｄｓＲＮＡは、２’−ヒドロキシ（２’−ＯＨ）含有ヌクレオチドを欠いている。
【０３３５】
具体的なある実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖は、約１〜約６ヌクレオチド長（２〜４ヌクレオチド長であってもよい）の３’突出端を有する。より好ましくは、３’突出端は１〜３ヌクレオチド長である。特定のある実施形態において、一方の鎖が３’突出端を有し、他方の鎖は、平滑端であるか、またはこれも突出端を有する。突出端の長さは、各鎖で同じであっても異なっていてもよい。ｓｉＲＮＡの安定性をさらに増強するため、３’突出端は分解に対して安定化され得る。一実施形態において、ＲＮＡは、プリンヌクレオチド（例えば、アデノシンまたはグアノシンヌクレオチドなど）を含めることにより安定化される。あるいはまた、修飾類縁体によるピリミジンヌクレオチドの置換、例えば、２’−デオキシチミジンによるウリジンヌクレオチド３’突出端の置換が許容され、ＲＮＡｉの効率には影響しない。２’ヒドロキシルの非存在によって、組織培養培地中の突出端のヌクレアーゼ抵抗性が有意に増強され、インビボで有益であり得る。
【０３３６】
別の具体的な実施形態では、主題のｄｓＲＮＡはまた、長鎖二本鎖ＲＮＡの形態であり得る。例えば、ｄｓＲＮＡは、少なくとも２５、５０、１００、２００、３００または４００塩基である。場合によっては、ｄｓＲＮＡは４００〜８００塩基長である。任意選択で、ｄｓＲＮＡは、細胞内消化され、例えば、細胞内でｓｉＲＮＡ配列が生成される。しかしながら、インビボでの長鎖二本鎖ＲＮＡの使用は、おそらく、配列非依存性ｄｓＲＮＡ応答によって引き起こされ得る有害効果のため、常に実用的とは限らない。かかる実施形態において、局所送達系および／またはインターフェロンもしくはＰＫＲの効果を低下させる薬剤の使用が好ましい。
【０３３７】
さらなる具体的な実施形態において、ｄｓＲＮＡは、ヘアピン構造（ヘアピンＲＮＡと命名）の形態である。ヘアピンＲＮＡは、外因的に合成され得るか、またはインビボでのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターからの転写により形成され得る。哺乳動物細胞における遺伝子サイレンシングのためのかかるヘアピンＲＮＡの作製および使用の例は、例えば、Ｐａｄｄｉｓｏｎら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、２００２、１６：９４８−５８；ＭｃＣａｆｆｒｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ、２００２、４１８：３８−９；ＭｃＭａｎｕｓら、ＲＮＡ、２００２、８：８４２−５０；Ｙｕら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、２００２、９９：６０４７−５２）に記載されている。好ましくは、かかるヘアピンＲＮＡは、所望の遺伝子の連続的で安定な抑制が確保されるように、細胞または動物内で操作される。ｓｉＲＮＡが細胞内でヘアピンＲＮＡのプロセッシングによって作製され得ることは、当該技術分野で知られている。
【０３３８】
ＰＣＴ特許出願ＷＯ  ０１／７７３５０には、真核生物細胞において同じ導入遺伝子のセンスおよびアンチセンス両方のＲＮＡ転写物を得るために、導入遺伝子の二重指向型（ｂｉ−ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ）転写のための例示的なベクターが記載されている。したがって、特定のある実施形態において、本発明の開示は、以下：対抗する向きに配置され、目的のｄｓＲＮＡの導入遺伝子に隣接する２つの重複転写単位を有するウイルスレプリコンを含み、該２つの重複転写単位によって、宿主細胞内でセンスおよびアンチセンス両方のＲＮＡ転写物が同じ導入遺伝子断片がもたらされるという特殊な特性を有する組換えベクターを提供する。
【０３３９】
別の実施形態において、ＣＬＫモジュレータは、ＣＬＫタンパク質に結合する抗体であり得る。用語「抗体」は、本明細書で用いる場合、同様に本発明のポリペプチドと特異的反応性であるその断片を含むことが意図される。抗体は、慣用的な手法を用いて断片化されたものであり得、該断片は、完全体の抗体に対して好適なものと同様にして、有用性についてスクリーニングされ得る。例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片は、抗体をペプシンで処理することによって生成され得る。得られたＦ（ａｂ’）２断片は、ジスルフィド結合を還元してＦａｂ’断片が得られるように処理され得る。本発明の抗体は、さらに、二重特異性およびキメラ分子、ならびに単鎖（ｓｃＦｖ）抗体を含むことが意図される。また、三量体抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体および単鎖抗体が包含される。抗体ならびに抗体断片のこれらの修飾形態はすべて、用語「抗体」に含まれることが意図される。
【０３４０】
抗体は、当該技術分野で知られた方法によって惹起され得る。例えば、マウス、ハムスターまたはウサギなどの哺乳動物が、免疫原性形態のＣＬＫタンパク質（例えば、抗体応答を惹起し得る抗原性断片）で免疫処置され得る。あるいはまた、免疫処置は、インビボでＣＬＫタンパク質を発現し、観察される免疫原性応答をもたらす核酸を用いて行なわれ得る。タンパク質またはペプチドに対して免疫原性を付与するための手法としては、担体へのコンジュゲーションまたは他の当該技術分野でよく知られた手法が挙げられる。例えば、本発明のポリペプチドのペプチジル部分が、アジュバントの存在下で投与され得る。免疫処置の進行は、血漿または血清中の抗体力価の検出によってモニターされ得る。標準的なＥＬＩＳＡまたは他のイムノアッセイが、抗体レベルを評価するための抗原としての免疫原とともに使用され得る。
【０３４１】
免疫処置後、本発明のポリペプチドと反応性である抗血清が得られ得、所望により、ポリクローナル抗体が血清から単離され得る。モノクローナル抗体を作製するため、抗体産生細胞（リンパ球）が免疫処置動物から回収され得、骨髄腫細胞などの不死化細胞を用いてハイブリドーマ細胞を得る標準的な体細胞融合手順によって融合させ得る。かかる手法は、当該技術分野でよく知られており、例えば、ハイブリドーマ手法（最初にＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎによって開発、（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５−４９７）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ手法（Ｋｏｚｂａｒら、（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、４：７２）、およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ手法（Ｃｏｌｅら、（１９８５）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．ｐｐ．７７−９６）が挙げられる。ハイブリドーマ細胞は、本発明のポリペプチドと特異的反応性である抗体の産生について免疫化学的にスクリーニングされ、モノクローナル抗体が単離され得る。
【０３４２】
４．アッセイ
本明細書において想定されるまた他の方法としては、ＣＬＫタンパク質をモジュレートする化合物または薬剤を同定するためのスクリーニング方法が挙げられる。薬剤は、アプタマーなどの核酸であり得る。アッセイは、細胞系または無細胞形式で行なわれ得る。例えば、アッセイは、ＣＬＫを試験薬剤と、ＣＬＫをモジュレートすることがわかっている薬剤によってＣＬＫがモジュレートされ得る条件下でインキュベートすること（または接触させること）、ＣＬＫモジュレーションのレベルを、試験薬剤の非存在と比べて試験薬剤の存在下でモニタリングまたは測定することを含むものであり得る。ＣＬＫモジュレーションのレベルは、基質を脱アセチル化するその能力を測定することにより測定され得る。
【０３４３】
インビボでＣＬＫをモジュレートする、例えば、刺激または阻害する薬剤を同定するための方法は、（ｉ）細胞を試験薬剤および細胞内に侵入し得る基質と、試験薬剤の非存在下で  ＣＬＫが基質ををリン酸化するのに適切な条件下で接触させること；ならびに（ｉｉ）基質のリン酸化レベルを測定することを含むものであり得、ここで、（ｉ）試験薬剤の存在下での基質のリン酸化レベルが、試験薬剤の非存在下でのリン酸化レベルと比べて低いことは、試験薬剤がＣＬＫによるリン酸化を阻害することを示すか、または（ｉｉ）試験薬剤の存在下での基質のリン酸化レベルが、試験薬剤の非存在下でのリン酸化レベルと比べて高いことは、試験薬剤がＣＬＫによるリン酸化を活性化することを示す。
【０３４４】
また他の実施形態において、動物またはヒト被験体の細胞において、ミトコンドリアの質量および／またはミトコンドリア機能をモジュレートするのに有用な薬剤（例えば、ＣＬＫモジュレート化合物など）を同定するための方法（例えば、スクリーニングアッセイまたはハイスループットスクリーニングなどのアッセイ）が提供される。特定のある実施形態において、候補薬剤は、ミトコンドリアの質量を増加させる、および／またはミトコンドリア機能を改善するその能力についてスクリーニングされる。例示的な一実施形態において、本明細書に記載の方法は、細胞内でミトコンドリアの質量を増加させる、および／またはミトコンドリア機能を改善する薬剤（例えば、ＣＬＫ阻害化合物など）を同定するために使用され得る。
【０３４５】
一実施形態において、ミトコンドリアの質量および／または機能をモジュレートする薬剤を同定するための方法は、候補薬剤を、ミトコンドリア含有細胞を含む試料と接触させること、および少なくとも１種類のミトコンドリア機能のインジケータのレベルを測定することを含み、ここで、候補薬剤が、該薬剤の非存在下でのインジケータレベルと比べて、ミトコンドリア機能のインジケータのレベルを改変することは、該薬剤がミトコンドリア機能を改変することを示す。
【０３４６】
別の実施形態において、ミトコンドリアの質量および／または機能をモジュレートする薬剤を同定するための方法は、ミトコンドリアバイオジェネシスの調節因子を同定することを含む。該方法は、刺激をミトコンドリア含有細胞と、ミトコンドリアバイオジェネシスが誘導される条件下で該誘導に充分な時間接触させること；および候補シグナル伝達分子の改変されたレベルを測定することを含み、ここで、ミトコンドリアバイオジェネシスを誘導する刺激と接触させなかった細胞における候補シグナル伝達分子のレベルと比べて、該刺激と接触させた細胞における候補シグナル伝達分子のレベルが改変されることは、候補シグナル伝達分子がミトコンドリアバイオジェネシスの調節因子であることを示すものであり得る。さらなる一実施形態において、刺激は、低温ストレス、電気的刺激またはアドレナリン作動性刺激から選択される（ｓｅｌｅｃｔｅｄ）。特定のある他の実施形態において、ミトコンドリアバイオジェネシスは、酸素消費、ミトコンドリアＤＮＡの量、ミトコンドリアの質量またはＡＴＰ生合成因子であるミトコンドリア機能のインジケータを測定することにより検出される。特定のある他の実施形態において、候補シグナル伝達分子は、ＰＧＣ遺伝子またはＮＲＦ遺伝子である遺伝子の活性を調節する。特定のある他の実施形態において、候補シグナル伝達分子は、ＰＧＣ遺伝子またはＮＲＦ遺伝子である遺伝子によって調節される。特定のある他の実施形態において、候補シグナル伝達分子の改変されたレベルは、核酸のレベル、、ポリペプチドのレベルおよびタンパク質のリン酸化レベルである。
【０３４７】
特定のある実施形態において、ミトコンドリア機能のインジケータは、ミトコンドリア電子伝達系酵素であり得る。該方法は、電子伝達系酵素触媒活性を測定すること、試料中のミトコンドリアあたりの酵素活性を測定すること、試料中の単位タンパク質あたりの酵素活性を測定すること、電子伝達系酵素量を測定すること、試料中のミトコンドリアあたりの酵素量を測定すること、および／または試料中の単位タンパク質あたりの酵素量を測定することを含むものであり得る。特定のある実施形態において、ミトコンドリア電子伝達系酵素は、ミトコンドリア複合体１、ミトコンドリア複合体ＩＩ、ミトコンドリア複合体ＩＩＩ、ミトコンドリア複合体ＩＶおよび／またはミトコンドリア複合体Ｖの少なくとも１種類のサブユニットを含む。ミトコンドリア複合体ＩＶサブユニットは、ＣＯＸ１、ＣＯＸ２またはＣＯＸ４であり得、ミトコンドリア複合体Ｖサブユニットは、ＡＴＰシンターゼサブユニット８またはＡＴＰシンターゼサブユニット６であり得る。
【０３４８】
他の実施形態において、ミトコンドリア機能のインジケータは、糸粒体基質成分、ミトコンドリア膜成分および／またはミトコンドリアの内膜成分であり得る。ミトコンドリア膜成分は、アデニンヌクレオチドトランスロケーター（ＡＮＴ）、電位依存性アニオンチャネル（ＶＤＡＣ）、マレエート−アスパルテートシャトル、カルシウムユニポータ、ＵＣＰ−１、ＵＣＰ−２、ＵＣＰ−３（例えば、Ｂｏｓｓら、２０００  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４９：１４３；Ｋｌｉｎｇｅｎｂｅｒｇ  １９９９  Ｊ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ３１：４１９）、ヘキソキナーゼ、末梢ベンゾジアゼピン受容体、ミトコンドリア内膜クレアチンキナーゼ、シクロフィリンＤ、Ｂｃ１−２  遺伝子ファミリーコードポリペプチド、トリカルボキシレート担体またはジカルボキシレート担体であり得る。
【０３４９】
特定のある実施形態において、ミトコンドリア機能のインジケータは、クレブスサイクル酵素である。該方法は、クレブスサイクル酵素触媒活性を測定すること、試料中のミトコンドリアあたりの酵素活性を測定すること、試料中の単位タンパク質あたりの酵素活性を測定すること、クレブスサイクル酵素量を測定すること、試料中のミトコンドリアあたりの酵素量を測定すること、および／または試料中の単位タンパク質あたりの酵素量を測定することを含むものであり得る。クレブスサイクル酵素は、シトレートシンターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−補酵素Ａシンセターゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、フマル酸またはリンゴ酸デヒドロゲナーゼであり得る。
【０３５０】
他の実施形態において、ミトコンドリア機能のインジケータは、試料中の細胞あたりのミトコンドリアの質量であり得る。ミトコンドリアの質量は、ミトコンドリア選択剤（ノニルアクリジンオレンジなど）を用いて、または形態計測解析によって測定され得る。特定のある実施形態において、ミトコンドリア機能のインジケータは、試料中の細胞あたりのミトコンドリアの数であり得、これは、蛍光試薬などのミトコンドリア選択試薬を用いて測定され得る。
【０３５１】
他の実施形態において、ミトコンドリア機能のインジケータは、試料中の細胞あたりのミトコンドリアＤＮＡの量（「ｍｔＤＮＡ」）であり得る。細胞あたりのミトコンドリアＤＮＡの量は、絶対（例えば、細胞あたりのｍｔＤＮＡの質量）または相対（例えば、核ＤＮＡ  に対するｍｔＤＮＡの割合）的に測定されおよび／または表示され得る。特定のある実施形態において、ミトコンドリアＤＮＡは、ミトコンドリアＤＮＡを含有する生物学的試料を、ミトコンドリアＤＮＡ内に存在する配列に相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと、ミトコンドリアＤＮＡへのプライマーのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、該ハイブリダイゼーションを可能にするのに充分な時間接触させること；およびミトコンドリアＤＮＡへのプライマーのハイブリダイゼーションを測定し、それによりミトコンドリアＤＮＡを定量することにより測定される。特定のある実施形態において、該検出工程は、ポリメラーゼ連鎖反応、オリゴヌクレオチドプライマー伸長アッセイ、リガーゼ連鎖反応、または制限断片長多型解析であり得る手法を含む。特定のある実施形態において、ミトコンドリアＤＮＡは、増幅されたミトコンドリアＤＮＡを含有する試料を、増幅されたミトコンドリアＤＮＡ内に存在する配列に相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと、ミトコンドリアＤＮＡへのプライマーのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、該ハイブリダイゼーションを可能にするのに充分な時間接触させること；およびミトコンドリアＤＮＡへのプライマーのハイブリダイゼーションを測定し、それによりミトコンドリアＤＮＡを定量することにより測定される。特定のある実施形態において、該検出工程は、ポリメラーゼ連鎖反応、オリゴヌクレオチドプライマー伸長アッセイ、リガーゼ連鎖反応、または制限断片長多型解析であり得る手法を含む。特定のある実施形態において、ミトコンドリアＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応、転写増幅系または自立型配列複製であり得る手法を用いて増幅される。特定のある実施形態において、ミトコンドリアＤＮＡは、ミトコンドリアＤＮＡを含有する生物学的試料を、ミトコンドリアＤＮＡ内に存在する配列に相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと、ミトコンドリアＤＮＡへのプライマーのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、該ハイブリダイゼーションを可能にするのに充分な時間接触させること；ならびにミトコンドリアＤＮＡに対するプライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長による産物の生成を測定し、それによりミトコンドリアＤＮＡを定量することにより測定される。特定のある実施形態において、該比較工程は、増幅されたミトコンドリアＤＮＡを含有する試料を、増幅されたミトコンドリアＤＮＡ内に存在する配列に相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと、ミトコンドリアＤＮＡへのプライマーのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、該ハイブリダイゼーションを可能にするのに充分な時間接触させること；およびミトコンドリアＤＮＡに対するプライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長による産物の生成を測定し���それによりミトコンドリアＤＮＡを定量することにより、ミトコンドリアＤＮＡを測定することを含む。特定のある実施形態において、ミトコンドリアＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、例えば、定量的および競合的ＰＣＲ（Ａｈｍｅｄら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２６：２９０−３００、１９９９）、転写増幅系または自立型配列複製であり得る手法を用いて増幅される。特定のある実施形態において、試料中のミトコンドリアＤＮＡの量は、オリゴヌクレオチドプライマー伸長アッセイを用いて測定される。他の実施形態において、ミトコンドリアＤＮＡの量は、二本鎖核酸に結合する検出可能に標識された化合物（例えば、エチジウムブロミド）の存在下で、試料を塩化セシウム勾配に供して核ＤＮＡから分離し（例えば、Ｗｅｌｔｅｒら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１３：１７−１２０、１９８８を参照のこと）、ミトコンドリアＤＮＡおよび核ＤＮＡに対応する相対および／または絶対シグナルを比較することにより測定される。
【０３５２】
他の実施形態において、ミトコンドリア機能のインジケータは、試料中の細胞あたりのＡＴＰの量である。該方法は、試料中のミトコンドリアあたりのＡＴＰの量を測定すること、試料中の単位タンパク質あたりのＡＴＰの量を測定すること、試料中の単位ミトコンドリア質量あたりのＡＴＰの量を測定すること、試料中の単位ミトコンドリア（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ）タンパク質あたりのＡＴＰの量を測定することを含むものであり得る。特定のある実施形態において、ミトコンドリア機能のインジケータは、試料またはＡＴＰ生合成因子におけるＡＴＰ合成速度である。該方法は、ＡＴＰ生合成因子触媒活性を測定すること、試料中のミトコンドリアあたりのＡＴＰ生合成因子活性を測定すること、試料中の単位ミトコンドリア質量あたりのＡＴＰ生合成因子活性を測定すること、試料中の単位タンパク質あたりのＡＴＰ生合成因子活性を測定すること、ＡＴＰ生合成因子量を測定すること、試料中のミトコンドリアあたりのＡＴＰ生合成因子量を測定すること、および／または試料中の単位タンパク質あたりのＡＴＰ生合成因子量を測定することを含むものであり得る。
【０３５３】
他の実施形態において、ミトコンドリア機能のインジケータは、以下：フリーラジカル生成、反応性酸素種、タンパク質ニトロシル化、タンパク質カルボニル修飾、ＤＮＡ酸化、ｍｔＤＮＡ酸化、タンパク質酸化、タンパク質カルボニル修飾、マロンジタンパク質のアルデヒド付加物、グリコキシデーション（ｇｌｙｃｏｘｉｄａｔｉｏｎ）生成物、リピドキシデーション（ｌｉｐｏｘｉｄａｔｉｏｎ）生成物、８’−ＯＨ−グアノシン付加物、ＢＡＲＳ、細胞内カルシウムの上昇に対する細胞応答および／または少なくとも１種類のアポトーシス原に対する細胞応答の１つ以上であり得る。特定のある実施形態において、ミトコンドリア機能のインジケータは、酸素消費であり、これは、任意のさまざまな既知の方法論（例えば、Ｗｕら、１９９９  Ｃｅｌｌ  ９８：１１５；Ｌｉら１９９９  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１７５３４）に従って測定され得る。
【０３５４】
機能的ミトコンドリアは、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）内に存在するミトコンドリア遺伝子、および環状ミトコンドリアゲノム内に存在しないミトコンドリア外遺伝子（例えば、核遺伝子）にコードされた遺伝子産物を含有する。１６．５  ｋｂ  ｍｔＤＮＡは、２２のｔＲＮＡ、２つのリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、および電子伝達系（ＥＴＣ）（複雑な多複合体ミトコンドリアのアセンブリであって、例えば、呼吸性酸化的リン酸化が行なわれる）の１３の酵素をコードする。ミトコンドリアの構造的および機能的タンパク質の圧倒的多数は、ミトコンドリア外にコードされ、ほとんどの場合、おそらく核遺伝子ににコードされている。したがって、ミトコンドリア遺伝子およびミトコンドリア外遺伝子は、直接、または遺伝子産物およびその下流中間体、例えば、代謝産物、異化代謝産物、基質、前駆物質、補因子などを介して間接的に相互作用し得る。したがって、ミトコンドリア機能における改変、例えば、電子輸送活性の障害、欠陥性の酸化的リン酸化またはフリーラジカル生成の増大は、欠陥性ｍｔＤＮＡ、欠陥性ミトコンドリア外ＤＮＡ、欠陥性ミトコンドリア遺伝子産物もしくはミトコンドリア外遺伝子産物、欠陥性下流中間体、またはこれらのおよび他の要素の組合せの結果、生じ得る。
【０３５５】
特定のある実施形態において、酵素は、本明細書に示したミトコンドリア機能のインジケータである。該酵素は、ミトコンドリア酵素であり得、これは、さらにＥＴＣ酵素またはクレブスサイクル酵素であり得る。該酵素はまた、ＡＴＰ生合成因子であり得、ＥＴＣ酵素および／またはクレブスサイクル酵素、あるいは本明細書に示したようなＡＴＰ生成に関連する他の酵素または細胞成分が挙げられ得る。「非酵素」は、酵素ではない（すなわち、本明細書に示したようなミトコンドリア酵素またはＡＴＰ生合成因子ではない）ミトコンドリア機能のインジケータをいう。特定の他のある実施形態において、酵素は、ミトコンドリア機能の補助（ｃｏ−）インジケータである。以下の酵素：シトレートシンターゼ（ＥＣ  ４．１．３．７）、ヘキソキナーゼＩＩ（ＥＣ  ２．７．１．１）、シトクロムｃオキシダーゼ（ＥＣ  １．９．３．１）、ホスホフルクトキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１１）、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．１２）、グリコーゲンホスホリラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．１）クレアチンキナーゼ（ＥＣ  ２．７．３．２）、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．６．５．３）、グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．８）、トリオースリン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．１２）およびリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．３７）は、本発明によるミトコンドリア機能のインジケータではないが、本明細書に示したようなミトコンドリア機能の補助インジケータであり得る。
【０３５６】
他の実施形態において、ミトコンドリア機能のインジケータは、任意のＡＴＰ生合成因子、ＡＴＰ生成、ミトコンドリアの質量もしくはミトコンドリアの数、フリーラジカル生成、細胞内カルシウムの上昇に対する細胞応答および／またはアポトーシス原に対する細胞応答である。特定のある実施形態において、ミトコンドリアＤＮＡ含量は、ミトコンドリア機能のインジケータではないが、本明細書に示したような、ミトコンドリア機能の補助予測因子またはミトコンドリア機能の補助インジケータであり得る。
【０３５７】
ｉ．酵素であるミトコンドリア機能のインジケータ
特定のある実施形態において、ミトコンドリアの質量および／または機能をモジュレートする薬剤を同定するための方法は、生物学的試験試料中における少なくとも１種類のミトコンドリア機能のインジケータの検出および／または絶対的もしくは相対的測定を含み、ここで、ミトコンドリア機能のインジケータが酵素である。本明細書に示すように、かかる酵素は、ミトコンドリア酵素または酵素であるＡＴＰ生合成因子、例えば、ＥＴＣ酵素またはクレブスサイクル酵素であり得る。
【０３５８】
ミトコンドリアの質量および／または機能をモジュレートする薬剤を同定するための方法との関連において、「酵素量」、「酵素触媒活性」または「酵素発現レベル」に対する言及は、ミトコンドリア酵素量、活性もしくは発現レベル、またはＡＴＰ生合成因子量、活性もしくは発現レベルのいずれかに対する言及を含むことを意味し、これらはいずれも、さらに、例えば、ＥＴＣ酵素量、活性もしくは発現レベル、またはクレブスサイクル酵素量、活性もしくは発現レベルを含み得る。本発明の最も好ましい実施形態において、酵素は、本明細書に示したような酵素触媒活性を有する天然または組換えのタンパク質またはポリペプチドである。かかる酵素は、非限定的な例として、酵素、ハロ酵素、酵素複合体、酵素サブユニット、酵素断片、誘導体または類縁体など、例えば、切断型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）、プロセッシングされたものまたは切断（ｃｌｅａｖｅｄ）酵素であり得る。
【０３５９】
本明細書に示したようなミトコンドリア機能のインジケータであり得るミトコンドリア酵素は、酵素触媒活性に影響を及ぼし得る酵素補因子としての酵素触媒活性および／または機能を有するミトコンドリアの分子成分をいう。本明細書で用いる場合、ミトコンドリアは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸もしくはその誘導体；脂質、脂肪酸など、もしくはその誘導体；炭水化物、糖など、もしくはその誘導体、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、プリン、ピリミジンもしくは関連分子、もしくはその誘導体など；または任意のこれらの成分の共有結合性もしくは非共有結合性の複雑な組合せ、またはミトコンドリアの安定もしくは一過性構成成分である任意の他の生物学的分子であり得る「ミトコンドリアの分子成分」で構成されたものである。
【０３６０】
本明細書に示したようなミトコンドリア機能のインジケータもしくはミトコンドリア機能の補助インジケータであり得るミトコンドリア酵素、または本明細書に示したようなミトコンドリア機能のインジケータであり得るＡＴＰ生合成因子は、ＥＴＣ酵素を含むものであり得、該酵素は、ミトコンドリア内膜および糸粒体基質と会合しているミトコンドリア電子伝達系（ＥＴＣ）複合体のミトコンドリア酵素成分である任意のミトコンドリアの分子成分をいう。ＥＴＣ酵素には、ミトコンドリア遺伝子および核遺伝子にコードされた任意の多ＥＴＣサブユニットポリペプチドが含まれ得る。ＥＴＣは、典型的には、複合体Ｉ（ＮＡＤＨ：ユビキノンレダクターゼ）、複合体ＩＩ（コハク酸デヒドロゲナーゼ）、複合体ＩＩＩ（ユビキノン：シトクロムｃオキシドレダクターゼ）、複合体ＩＶ（シトクロムｃオキシダーゼ）および複合体Ｖ（ミトコンドリアのＡＴＰシンセターゼ）（各複合体は、多数のポリペプチドおよび補因子を含む）を含むものと説明される（概説については、例えば、Ｗａｌｋｅｒら、１９９５  Ｍｅｔｈｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６０：１４；Ｅｍｓｔｅｒら、１９８１  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９１：２２７ｓ−２５５ｓ、およびそこに挙げられた参考文献を参照のこと）。
【０３６１】
本明細書に示したようなミトコンドリア機能のインジケータであり得るミトコンドリア酵素、または本明細書に示したようなミトコンドリア機能のインジケータであり得るＡＴＰ生合成因子はまた、クレブスサイクル酵素を含むものであり得、該酵素としては、一連の生化学的／生体エネルギー反応（クエン酸回路またはトリカルボン酸回路としても知られる）を媒介するミトコンドリアの分子成分が挙げられる（例えば、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９７５  Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｖｏｅｔ  ａｎｄ  Ｖｏｅｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９０  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｍａｔｈｅｗｓ  ａｎｄ  ｖａｎ  Ｈｏｌｄｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９０  Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｃｕｍｍｉｎｇｓ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆを参照のこと）。クレブスサイクル酵素としては、シトレートシンターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、ａ−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体、スクシニルＣｏＡシンセターゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、フマラーゼおよびリンゴ酸デヒドロゲナーゼのサブユニットおよび補因子が挙げられる。クレブスサイクル酵素としては、さらに、クレブス回路の反応に機能的に連結された酵素および補因子、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、補酵素Ａ、チアミンピロリン酸、リポアミド、グアノシン二リン酸、フラビンアデニンジヌクレオチドおよびヌクレオシドジホスホキナーゼなどが挙げられる。
【０３６２】
本明細書に記載の方法はまた、一部、２型糖尿病と、ＡＴＰ生合成因子、改変されたＡＴＰの量または改変されたＡＴＰ産生量であり得るミトコンドリア機能のインジケータとの相関に関する。例えば、ミトコンドリアのＡＴＰ生合成の低減は、２型糖尿病のリスクが同定され得るミトコンドリア機能のインジケータであり得る。
【０３６３】
「ＡＴＰ生合成因子」は、ミトコンドリアにおけるＡＴＰ生成効率に寄与する任意の天然に存在する細胞成分をいう。かかる細胞成分は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸またはその誘導体、脂質、脂肪酸など、またはその誘導体；炭水化物、糖など、またはその誘導体、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、プリン、ピリミジンもしくは関連分子、またはその誘導体などであり得る。ＡＴＰ生合成因子としては、少なくともＥＴＣおよびクレブスサイクルの成分（例えば、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９７５  Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ＶｏｅｔおよびＶｏｅｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９０  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｍａｔｈｅｗｓおよびｖａｎ  Ｈｏｌｄｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９０  Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｃｕｍｍｉｎｇｓ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆを参照のこと）、ならびに任意のタンパク質、酵素またはＡＴＰ合成に関与する他の細胞成分（かかるＡＴＰ生合成因子が核遺伝子の産物であるか核外遺伝子（例えば、ミトコンドリア遺伝子）の産物であるか無関係）が挙げられる。ＡＴＰ合成における関与としては、限定される必要はないが、任意のＡＴＰ合成関連反応の触媒作用、ＡＴＰまたは酵素補因子の貫膜流入および／または流出、ミトコンドリア酵素をコードする遺伝子の転写、および／またはかかる遺伝子転写物の翻訳が挙げられ得る。
【０３６４】
細胞成分がＡＴＰ生合成因子か否かを調べるための組成物および方法は、当該技術分野でよく知られており、ＡＴＰ生成を測定するための方法（試料中でのＡＴＰ生成速度の測定を含む）およびＡＴＰ自体を定量するための方法が挙げられる。ＡＴＰ生成に対するＡＴＰ生合成因子の寄与は、例えば、単離されたＡＴＰ生合成因子（これは、細胞系または無細胞系に添加される）を用いて測定され得る。ＡＴＰ生合成因子は、ＡＴＰ生成に影響を及ぼす生合成経路の１つ以上の工程を直接または間接的に媒介し得る。例えば、ＡＴＰ生合成因子は、ＡＴＰ生成をもたらすある特定の化学的反応を触媒する酵素であり得る。別の例として、ＡＴＰ生合成因子は、かかる酵素の効率を増強する補因子であり得る。別の例として、ＡＴＰ生合成因子は、細胞内または無細胞系に導入され、ＡＴＰ生合成経路に直接または間接的に影響を及ぼす外因性遺伝要素であり得る。当業者は、候補ＡＴＰ生合成因子の存在下および非存在下において、ＡＴＰ生合成経路によるＡＴＰ生成を容易に比較することができよう。ＡＴＰ生成の常套的な測定は、定量的ＡＴＰ検出のための任意の機知の方法を用いて、例えば、一例であって限定されないが、任意選択で、クロマトグラフィー単離物を含む試料からの差示的抽出；分光測光法；適当な形態の検出可能に標識されたＡＴＰ前駆体分子（例えば、３２Ｐなど）と接触させた試料から回収された標識ＡＴＰの定量；  ＡＴＰ合成もしくは分解と関連している酵素活性の定量；または当該技術分野で知られた他の手法によってなされ得る。したがって、本発明の特定のある実施形態において、生物学的試料中のＡＴＰの量または生物学的試料中のＡＴＰの生成（ＡＴＰ生成速度を含む）は、ミトコンドリア機能のインジケータであり得る。一実施形態において、例えば、ＡＴＰは、ＡＴＰ依存性プロセスであるＤ−ルシフェリンのルシフェラーゼ触媒型酸化の発光を測定することにより定量され得る。
【０３６５】
「酵素触媒活性」は、ある特定の酵素または１種類以上の特定の細胞の機能（１種または複数種）に指向される類型の酵素発揮される任意の機能をいう。例えば、「ＡＴＰ生合成因子触媒活性」は、ＡＴＰの生成に寄与する本明細書に示したようなＡＴＰ生合成因子によって発揮される任意の機能をいう。典型的には、酵素触媒活性は、ある特定の酵素、例えば、ＡＴＰ生合成因子である酵素による化学的反応の助長として顕現され、この場合、少なくとも１種類の酵素基質または反応体が、共有結合により修飾されて生成物が形成される。例えば、酵素触媒活性は、共有結合性化学結合の形成または切断によって修飾された基質または反応体をもたらすものであり得るが、本発明をそのようなものに限定する必要はない。酵素触媒活性を測定するための種々の方法が当業者に知られており、測定対象の具体的な活性に依存する。
【０３６６】
多くの酵素、例えば、本明細書に示したようなミトコンドリア酵素またはＡＴＰ生合成因子である酵素では、酵素触媒活性に対する定量的基準が充分確立されている。このような基準としては、例えば、国際単位（ＩＵ）、酵素代謝回転数、触媒の速度定数（Ｋｃａｔ）、ミカエリス−メンテン定数（Ｋｍ）、比活性または少なくとも１種類の酵素触媒活性のレベルを測定するための当該技術分野で知られた任意の他の酵素学的方法によって規定され得る活性が挙げられる。ＡＴＰ生合成因子などのミトコンドリア酵素の比活性は単位時間あたりの、任意選択で、さらに単位試料質量あたり（例えば、単位タンパク質あたりまたは単位ミトコンドリア質量あたり）の生成物に対する検出可能に変換された基質の単位で表示され得る。
【０３６７】
特定のある実施形態において、酵素触媒活性は、試料中の単位全タンパク質あたりの単位時間あたりの生成物に対する酵素によって検出可能に変換された基質の単位で、試料中の単位ミトコンドリア質量あたりの単位時間あたりの生成物に対する酵素によって検出可能に変換された基質の単位で、または試料中の単位ミトコンドリアのタンパク質質量あたりの単位時間あたりの生成物に対する酵素によって検出可能に変換された基質の単位で表示され得る。酵素触媒活性の産物は、具体的な産物の量および物理化学的特性に依存する適当な方法によって検出され得る。したがって、検出は、例えば、一例であって限定されないが、放射分析、比色分析、分光測光の、蛍光測定、イムノメトリーもしくは質量分析手順によるもの、または当業者には容易にわかる他の適当な手段によるものであり得る。
【０３６８】
特定のある実施形態において、酵素触媒活性の産物の検出は直接行なわれ得、
特定の他のある実施形態では、産物の検出は、基質または反応体内への検出可能なレポーター部分または標識、例えば、マーカー酵素、色素、放射性核種、発光基、蛍光基またはビオチンなどの導入によって行なわれ得る。酵素触媒活性をアッセイするための反応後、未反応基質および／または反応生成物として存在する斯かる標識の量が、次いで、特定の検出可能なレポーター部分または標識に適切な方法を用いて測定される。放射性基には、放射性核種崩壊モニタリング、シンチレーション計数、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）またはオートラジオグラフィー法が一般的に好適である。
イムノメトリー測定には、適当に標識された抗体、例えば、放射性核種、フルオロフォア、親和性タグ、ビオチンもしくはビオチン模倣配列で標識されたもの、または抗体−酵素コンジュゲートとして調製されたものが調製され得る（例えば、Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９８６、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｏｓｔｏｎ；Ｓｃｏｕｔｅｎ、Ｗ．Ｈ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １３５：３０−６５、１９８７；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８；Ｈａｕｇｌａｎｄ、１９９６  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ−第６版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．；Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．Ｋ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、１９８７、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．ら、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９２、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｌｕｏら、１９９８  Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６５：２２５およびそこに挙げられた参考文献を参照のこと）。分光測光法は、色素（例えば、酵素反応の比色分析生成物）、発光基および蛍光基を検出するために使用され得る。ビオチンは、異なるレポーター基（一般には、放射性性蛍光基または酵素）カップリングされたアビジンまたはストレプトアビジンを用いて検出され得る。酵素レポーター基は、一般的に、基質の添加（一般的には、特定の時間長）の後、反応生成物の分光測光解析、分光測光解析または他の解析によって検出され得る。標準物質および標準的な添加物質を使用し、よく知られた手法を用いて、試料中の酵素触媒活性のレベルが測定され得る。
【０３６９】
上記のように、ＡＴＰ生合成因子の酵素触媒活性としては、さらに、基質または反応体の共有結合性改変を伴うものの他にＡＴＰ生成がもたらされる他の機能的活性が挙げられ得る。例えば、一例であって限定されないが、酵素であるＡＴＰ生合成因子は、その酵素触媒活性を通して、細胞区画間での代謝産物の移動を助長する貫膜輸送体分子をいう場合がある。かかる代謝産物は、ＡＴＰまたはＡＴＰ合成に関与している他の細胞成分、例えば、遺伝子産物およびその下流中間体（例えば、代謝産物、異化代謝産物、基質、前駆物質、補因子）などであり得る。別の非限定的な例として、酵素であるＡＴＰ生合成因子は、その酵素触媒活性を通して、ＡＴＰ合成に関与している細胞成分に、ＡＴＰ合成を促進する様式で一過的に結合するものであり得る。かかる結合事象により、例えば、細胞成分が、ＡＴＰ合成に関与している別の酵素に送達され得る、および／または細胞成分のコンフォメーションが、ＡＴＰ合成を促進する様式で改変され得る。この実施例に関してさらに、かかるコンフォメーションの改変は、細胞成分間の相互作用によりＡＴＰ生成がもたらされるシグナル伝達経路、アロステリック活性化経路、転写活性化経路などの一部であり得る。
【０３７０】
したがって、ＡＴＰ生合成因子としては、例えば、ミトコンドリア膜タンパク質が挙げられ得る。好適なミトコンドリア膜タンパク質としては、アデニンヌクレオチド輸送体（ＡＮＴ；例えば、Ｆｉｏｒｅら、１９９８  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ８０：１３７；Ｋｌｉｎｇｅｎｂｅｒｇ  １９８５  Ａｎｎ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．４５６：２７９）、電位依存性アニオンチャネル（ＶＤＡＣ、ポリンとも称される；例えば、Ｍａｎｅｌｌａ、１９９７  Ｊ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒ．２９：５２５）、マレイン酸−アスパラギン酸シャトル、ミトコンドリアのカルシウムユニポータ（例えば、Ｌｉｔｓｋｙら、１９９７  Ｂｉｏｃｈｅｍ．３６：７０７１）、脱共役タンパク質（ＵＣＰ−１、−２、−３；例えば、Ｊｅｚｅｋら、１９９８  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３０：１１６３を参照のこと）、ヘキソキナーゼ、末梢ベンゾジアゼピン受容体、ミトコンドリア内膜クレアチンキナーゼ、シクロフィリンＤ、Ｂｃｌ−２遺伝子ファミリーにコードされるポリペプチド、トリカルボキシレート担体（例えば、Ｉｏｃｏｂａｚｚｉら、１９９６  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １２８４：９；Ｂｉｓａｃｃｉａら、１９９０  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０１９：２５０）およびジカルボキシレート担体（例えば、Ｆｉｅｒｍｏｎｔｅら、１９９８  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２４７５４；Ｉｎｄｉｖｅｒｉら、１９９３  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１４３：３１０；ミトコンドリア膜輸送体の一般的な概説については、例えば、Ｚｏｎａｔｔｉら、１９９４  Ｊ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒ．２６：５４３  およびそこに挙げられた参考文献を参照のこと）などのミトコンドリアの成分が挙げられる。
【０３７１】
ミトコンドリアの質量および／または機能のモジュレータを同定するための方法に関して本明細書において使用される酵素量は、ミトコンドリア酵素もしくは本明細書に示したようなＡＴＰ生合成因子である酵素などの酵素の量、または存在する別のＡＴＰ生合成因子の量（すなわち、酵素触媒活性とは無関係にミトコンドリア機能のインジケータとして選択された酵素もしくはＡＴＰ生合成因子の物理的存在）をいう。ある特定の酵素またはＡＴＰ生合成因子の物理化学的特性に応じて、酵素量を測定するための好ましい方法は種々である。本発明の最も高度に好ましい実施形態において、酵素量の測定は、当業者には容易にわかるタンパク質化学における常套的な方法（例えば、一例であって限定されないが、以下により詳細に記載するもの）を用いたタンパク質またはポリペプチドのレベルの定量的測定を伴う。
【０３７２】
したがって、酵素量の測定は、本明細書に示したような酵素またはＡＴＰ生合成因子である特定のある細胞成分、好ましい実施形態では、タンパク質またはポリペプチドである特定のある細胞成分を定量するための当該技術分野で知られた任意の適当な方法であり得る。酵素またはＡＴＰ生合成因子の性状および物理化学的特性に応じて、酵素量の測定は、濃度測定、質量分析、分光測定、分光光測定、蛍光測定、免疫測定、クロマトグラフィー、電気化学的またはある特定の細胞成分を定量的に検出する任意の他の手段によるものであり得る。また、酵素量を測定するための方法としては、酵素触媒活性の産物を検出するのに有用な上記の方法、例えば、酵素量を直接測定するもの、および検出可能な標識またはレポーター部分を測定するものが挙げられる。本発明の特定のある好ましい実施形態において、酵素量は、単離された酵素またはＡＴＰ生合成因子のイムノメトリー測定によって測定される。本発明の特定のある好ましい実施形態において、酵素またはＡＴＰ生合成因子などの生体分子の定量的測定のためのこれらおよび他の免疫学的手法および免疫化学的手法は、当業者に知られた様々なアッセイ形式、例えば、限定されないが、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫蛍光測定、免疫沈降、平衡透析、免疫拡散および他の手法を用いて使用され得る（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８；Ｗｅｉｒ、Ｄ．Ｍ．、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９８６、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｏｓｔｏｎを参照のこと）。例えば、アッセイはウエスタンブロット形式で行なわれ得、この場合、生物学的試料由来のタンパク質を含む調製物がゲル電気泳動に供され、適当な膜に移され、タンパク質またはポリペプチドである酵素またはＡＴＰ生合成因子に特異的な抗体と反応させる。次いで、膜上の抗体の存在が、適当な検出試薬（これは、当該技術分野でよく知られており、上記に記載している）を用いて検出され得る。
【０３７３】
特定のある実施形態において、ミトコンドリア機能のインジケータ（または補助インジケータ）（例えば、本明細書に示したような酵素など）は、単離された形態、例えば、その元の環境（例えば、天然に存在する場合は、天然の環境）から取り出さされた形態で存在で存在するものであり得る。例えば、生体動物内に存在する天然に存在するポリペプチドは単離されたものではないが、天然の系で共存している物質の一部または前部から分離されている同ポリペプチドは、単離されたものである。かかるポリペプチドは、組成物の一部であり得、かかる組成物がその天然の環境の一部ではないという点で、やはり単離されたものである。
【０３７４】
親和性手法は、酵素もしくはＡＴＰ生合成因子タンパク質または本発明の方法による使用のためのポリペプチドの単離との関連において有用であり、分離を行なうための、酵素またはＡＴＰ生合成因子が関与する特異的結合相互作用を利用する任意の方法が挙げられ得る。例えば、酵素もしくはＡＴＰ生合成因子タンパク質または該ポリペプチドは、共有結合により結合されたオリゴ糖部分を含有するものであり得るため、酵素（またはＡＴＰ生合成因子）を適当な固定化レクチンに、該レクチンによる炭水化物結合が可能な条件下で結合させることなどの親和性手法は、特に有用な親和性手法であり得る。
【０３７５】
他の有用な親和性手法としては、特異的タンパク質またはポリペプチド抗原（例えば、酵素またはＡＴＰ生合成因子）を単離および／または検出するための免疫学的手法であって、抗原に対する抗体結合部位と、該因子上に存在する抗原性決定基間の特異的結合相互作用に依存する手法が挙げられる。抗原への抗体または他の親和性試薬の結合は、結合相互作用が、約１０４Ｍ−１以上、好ましくは約１０５Ｍ−１以上、より好ましくは約１０６Ｍ−１以上、さらにより好ましくは約１０７Ｍ−１以上のＫａを伴うものである場合、「特異的」である。結合パートナーまたは抗体の親和性は、慣用的な手法、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら、Ａｎｎ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０（１９４９）に記載のものなどを用いて容易に測定され得る。
【０３７６】
免疫学的手法としては、イムノアフィニティクロマトグラフィー、免疫沈降、固相免疫吸着または他の免疫親和性方法が挙げられるが、これらに限定する必要はない。これらおよび他の有用な親和性手法については、例えば、複合体を単離およびキャラクタライズする手法（例えば、親和性手法）に関する詳細についてのＳｃｏｐｅｓ，Ｒ．Ｋ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、１９８７、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｗｅｉｒ、Ｄ．Ｍ．、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９８６、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｏｓｔｏｎ；およびＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．ら、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９２、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ；（これらは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれており、合成物の単離およびキャラクタライズに関する手法の詳細にはアフィニティ手法が含まれる）を参照のこと。
【０３７７】
上記のようにミトコンドリア機能のインジケータは、タンパク質またはポリペプチド、例えば、酵素またはＡＴＰ生合成因子であり得る。該タンパク質またはポリペプチドは、未修飾ポリペプチドであってもよく、例えば、グリコシル化、リン酸化、脂肪酸アシル化（例えば、グリコシルホスファチジルイノシトール固定修飾など）、ホスホリパーゼ切断（ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼｃ媒介型加水分解など）、プロテアーゼ切断、脱リン酸化または任意の他の型のタンパク質翻訳後修飾（共有結合性化学結合の形成または切断を伴う修飾によって翻訳後修飾されたポリペプチドであってもよい。
【０３７８】
ｉｉ．ミトコンドリアの質量、ミトコンドリアの容積またはミトコンドリアの数であるミトコンドリア機能のインジケータ
特定のある実施形態において、ミトコンドリアの質量および／または機能をモジュレートする薬剤を同定するための方法は、生物学的試験試料中における少なくとも１種類のミトコンドリア機能のインジケータの検出および／または測定を含み、ここで、該ミトコンドリア機能のインジケータは、絶対または相対的なミトコンドリアの質量、ミトコンドリアの容積またはミトコンドリアの数である。
【０３７９】
ミトコンドリアの質量、容積および／またはミトコンドリアの数を定量するための方法は、当該技術分野で知られており、例えば、代表的な生物学的試料の定量的染色が挙げられ得る。典型的には、ミトコンドリアの定量的染色は、細胞小器官選択的プローブまたは色素、例えば限定されないが、ミトコンドリア選択試薬、例えば、ミトコンドリアの分子成分に結合する蛍光色素（例えば、ノニルアクリジンオレンジ、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒｓ）またはミトコンドリア内膜電気化学的電位の関数としてミトコンドリア内に蓄積される強力なイオメトリック色素を用いて行なわれ得る（例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ、１９９６  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、第６版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇを参照のこと）。別の例として、ミトコンドリアの質量、容積および／または数は、形態計測解析によって定量され得る（例えば、Ｃｒｕｚ−Ｏｒｉｖｅら、１９９０  Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５８：Ｌ１４８；Ｓｃｈｗｅｒｚｍａｎｎら、１９８６  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０２：９７）。試料中のミトコンドリアの質量、容積および／またはミトコンドリアの数を定量するためのこれらまたは当該技術分野で知られた任意の他の手段は、本発明の想定される範囲内である。例えば、ミトコンドリアの密度を計算する目的のためのかかる定量的測定の使用が想定されるが、限定されない。特定のある実施形態において、試料中のミトコンドリアのタンパク質質量は、よく知られた手順を用いて測定される。例えば、当業者は、単離されたミトコンドリア画分を生物学的試料から、確立された細胞分別手法を用いて容易に調製し、それからタンパク質含量を、当該技術分野でよく知られたいくつかのタンパク質定量方法論のいずれかを用いて測定することができよう。
【０３８０】
ｉｉｉ．ミトコンドリアＤＮＡ含量を含むミトコンドリア機能のインジケータ
他の実施形態において、ミトコンドリアの質量および／または機能のモジュレータを同定するための方法は、生物学的試験試料中の少なくとも１種類のミトコンドリア機能のインジケータの検出および／または測定を含み、ここで、該ミトコンドリア機能のインジケータは、絶対または相対的なミトコンドリアＤＮＡの量である。ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）含量の定量は、この目的に有用な任意のさまざまな確立された手法、例えば、限定されないが、ミトコンドリアＤＮＡ配列に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用するオリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行なわれ得る（例えば、Ｍｉｌｌｅｒら、１９９６  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６７：１８９７；Ｆａｈｙら、１９９７  Ｎｕｃｌ．Ａｃ．Ｒｅｓ．２５：３１０２；米国特許出願第０９／０９８，０７９号；Ｌｅｅら、１９９８  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ４２：１６１；Ｌｅｅら、１９９７  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４６（増補版１）：１７５Ａを参照のこと）。特に有用な方法は、Ｆａｈｙら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３１０２、１９９７）およびＧｈｏｓｈら（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５８：３２５、１９９６）に開示されたプライマー伸長アッセイである。好適なハイブリダイゼーション条件は、引用した参考文献を見るとよく、具体的な核酸標的および選択されるオリゴヌクレオチドプローブに従って、当業者によく知られた方法論を用いて変更され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、１９８７；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９を参照のこと）。
【０３８１】
試料中に存在する特異的核酸標的配列（例えば、ｍｔＤＮＡ）の量を、標的配列に対するプライマーの特異的ハイブリダイゼーションに基づいて測定するための他の有用な手法の例としては、標的核酸配列の特異的増幅および増幅産物の定量、例えば、限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、Ｇｉｂｂｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃ．Ｒｅｓ．１７：２４３７、１９８９）、転写増幅系（例えば、Ｋｗｏｈら、１９８９  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：１１７３）；鎖置換増幅（例えば、Ｗａｌｋｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃ．Ｒｅｓ．２０：１６９１、１９９２；Ｗａｌｋｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：３９２、１９９２）および自立型配列複製（３ＳＲ、例えば、Ｇｈｏｓｈら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｖｉｒｕｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、１９９５  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐｐ．２８７−３１４；Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：１８７４、１９９０を参照のこと）、それらに挙げられた参考文献（引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）が挙げられる。他の有用な増幅手法としては、例えば、リガーゼ連鎖反応（例えば、Ｂａｒａｎｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：１８９、１９９１）、Ｑ−ｂｅｔａ  ｒｅｐｌｉｃａｓｅ  ａｓｓａｙ（Ｃａｈｉｌｌら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３７：１４８２、１９９１；Ｌｉｚａｒｄｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：１１９７、１９８８；Ｆｏｘら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ３：３７８、１９８９）およびサイクル型プローブ手法（例えば、Ｃｌｏｎｅｙら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４０：６５６、１９９４）、ならびに当業者に知られた他の適当な方法が挙げられる。
【０３８２】
プライマー伸長アッセイ産物の配列の長さまたは分子量は、核酸配列の大きさをキャラクタライズするための、当業者が熟知している任意の既知の方法を用いて測定され得る。一実施形態において、プライマー伸長産物は、ゲル電気泳動によってキャラクタライズされる。別の実施形態において、プライマー伸長産物は、質量分析（ＭＳ）（これには、さらに、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法／飛行時間型質量分析解析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）解析または当業者に知られた他のＭＳ手法が含まれ得る）によってキャラクタライズされる。例えば、米国特許第５，６２２，８２４号、同第５，６０５，７９８号および同第５，５４７，８３５号を参照のこと。別の実施形態において、プライマー伸長産物は、液体またはガスクロマトグラフィー（これには、さらに、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）または他のよく知られたクロマトグラフィー方法論が含まれ得る）によってキャラクタライズされる。
【０３８３】
ｉｖ．細胞内カルシウムの上昇に対する細胞応答であるミトコンドリア機能のインジケータ
本発明の特定のある態様は、ミトコンドリア機能のインジケータの検出および／または測定に関するものであるため、この恒常性の乱れ（生理学的および病態生理学的カルシウム調節を含む）に対する細胞内カルシウム恒常性および／または細胞応答のモニタリングを伴う。細胞内カルシウムの上昇に対する細胞応答の範囲は、かかる応答の検出のための方法および試薬の範囲と同様に広い。多くの特異的細胞応答が当業者に知られており、このような応答は、選択された生物学的試料中に存在する具体的な細胞型に依存する。非限定的な例として、細胞内カルシウムの上昇に対する細胞応答としては、特異的分泌産物の分泌、特定の予備形成成分のエキソサイトーシス、グリコゲン代謝の増大および細胞増殖が挙げられる（例えば、Ｃｌａｐｈａｍ、１９９５  Ｃｅｌｌ  ８０：２５９；Ｃｏｏｐｅｒ、Ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ−−Ａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、１９９７  ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．；Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｂ．、Ｂｒａｙ，Ｄ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ、１９９５  Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）。
【０３８４】
簡単な背景として、ミトコンドリア内カルシウムの通常の改変は、正常な代謝性調節と関連している（Ｄｙｋｅｎｓ、１９９８、Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ＆  Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｂｅａｌ、ＨｏｗｅｌｌおよびＢｏｄｉｓ−Ｗｏｌｌｎｅｒ編、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐｐ．２９−５５；Ｒａｄｉら、１９９８、Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ＆  Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｂｅａｌ、ＨｏｗｅｌｌおよびＢｏｄｉｓ−Ｗｏｌｌｎｅｒ編、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐｐ．５７−８９；ＧｕｎｔｅｒおよびＰｆｅｉｆｆｅｒ、１９９１、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏ．２７：Ｃ７５５；Ｇｕｎｔｅｒら、１９９４、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６７：３１３）。例えば、ミトコンドリアの遊離カルシウムレベルの変動は、酵素のアロステリック調節によるＡＴＰ利用の増大（Ｃｒｏｍｐｔｏｎら、１９９３  Ｂａｓｉｃ  Ｒｅｓ．Ｃａｒｄｉｏｌ．８８：５１３−５２３に概説）およびグリセロリン酸塩シャトル（Ｇｕｎｔｅｒら、１９９４  Ｊ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．Ｂｉｏｍｅｍｂｒ．２６：４７１）に応答した酸化的代謝の調節が原因であり得る。
【０３８５】
正常なミトコンドリア機能としては、糸粒体基質内の過剰カルシウム封鎖によるサイトゾルの遊離カルシウムレベルの調節が挙げられる。細胞型によるが、サイトゾルのカルシウム濃度は、典型的には５０〜１００ｎＭである。正常に機能している細胞では、カルシウムレベルが２００〜３００ｎＭに達すると、ミトコンドリアがカルシウムを、カルシウムユニポータによるミトコンドリア内膜内への流入と、ナトリウム依存性カルシウム担体およびナトリウム非依存性カルシウム担体の両方によるカルシウム流出間の平衡の関数として蓄積させ始める。場合によっては、細胞内カルシウム恒常性のかかる乱れは、カルシウム調節機能不全がミトコンドリア機能の原因であるか結果であるかとは無関係に、ミトコンドリア機能と関連している疾患（２型糖尿病など）の特徴である。
【０３８６】
したがって、ミトコンドリアのカルシウムレベルの上昇は、上記のようなサイトゾルの遊離カルシウムにおける初期上昇に応答して累積され得る。かかるミトコンドリアのカルシウム濃度の上昇とＡＴＰの低下との組合せまたはミトコンドリアの原因と関連している他の状態により、ミトコンドリア内膜が崩壊する可能性がもたらされ得る（Ｇｕｎｔｅｒら、１９９８  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３６６：５；ＲｏｔｔｅｎｂｅｒｇおよびＭａｒｂａｃｈ、１９９０、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０１６：８７を参照のこと）。生物学的試料中のカルシウムのミトコンドリア外（サイトゾル）レベルが、ミトコンドリア内に存在するものより大きいことは、個体における２型糖尿病の危険因子として使用され得る。２型糖尿病の場合、ミトコンドリアまたはサイトゾルのカルシウムレベルは、上記の範囲で種々であり得、例えば、約１ｎＭ〜約５００ｍＭ、典型的には、約１０ｎＭ〜約１００ｍＭ、通常、約２０ｎＭ〜約１ｍＭの範囲であり得、ここで、「約」は、＋／−１０％を示す。さまざまなカルシウムインジケータが当該技術分野で知られており、限定されないが、例えば、ｆｕｒａ−２（ＭｃＣｏｒｍａｃｋら、１９８９  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ９７３：４２０）；ｍａｇ−ｆｕｒａ−２；ＢＴＣ（米国特許第５，５０１，９８０号）；ｆｌｕｏ−３、ｆｌｕｏ−４およびｆｌｕｏ−５Ｎ（米国特許第５，０４９，６７３号）；ｒｈｏｄ−２；ベンゾチアザ−１；およびベンゾチアザ−２（これらはすべて、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ．から入手可能である）が挙げられる。細胞内カルシウムをモニタリングするためのこれらまたは任意の他の手段が、２型糖尿病のリスクを同定するための主題の本発明の方法に従って想定される。
【０３８７】
細胞内カルシウムの上昇に対する細胞応答であるミトコンドリア機能のインジケータをモニタリングでは、細胞質およびミトコンドリアのカルシウム濃度の増大を誘導する化合物、例えば、カルシウムイオノフォアが当業者によく知られており、これは、細胞内カルシウムおよびミトコンドリア内カルシウムを測定するための方法（例えば、ＧｕｎｔｅｒおよびＧｕｎｔｅｒ、１９９４  Ｊ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．Ｂｉｏｍｅｍｂｒ．２６：４７１；Ｇｕｎｔｅｒら、１９９８  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３６６：５；ＭｃＣｏｒｍａｃｋら、１９８９  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ９７３：４２０；ＯｒｒｅｎｉｕｓおよびＮｉｃｏｔｅｒａ、１９９４  Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ．Ｔｒａｎｓｍ．Ｓｕｐｐｌ．４３：１；ＬｅｉｓｔおよびＮｉｃｏｔｅｒａ、１９９８  Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３２：７９；ならびにＨａｕｇｌａｎｄ、１９９６  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、第６版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ．を参照のこと）。したがって、当業者により、本開示およびよく知られた方法に従って本発明において使用するための適当なイオノフォア（もしくは細胞質および／またはミトコンドリアのカルシウムイオン濃度の増大がもたらされる別の化合物）および細胞内および／またはミトコンドリア内カルシウムを検出するための適切な手段が容易に選択され得よう。
【０３８８】
ミトコンドリア内へのカルシウムイオン流入は、電子伝達によってミトコンドリア内膜で確立される負の膜内外電気化学的電位差（ＤＹ）に大きく依存していると思われ、完全に依存性の場合もあり得、かかる流入は、８倍のカルシウム濃度勾配が負荷された場合であっても、ＤＹの非存在下では起こらない（Ｋａｐｕｓら、１９９１  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２８２：６１）。したがって、ミトコンドリアは、２，４−ジニトロフェノールおよびカルボニルシアニドｐ−トリフルオロ−メトキシフェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）などの脱共役剤の場合に起こるように、膜電位差が消失するとカルシウムを放出し得る。したがって、本発明の特定のある実施形態によれば、ＤＹの崩壊は、ミトコンドリア内へのサイトゾルの遊離カルシウムの流入によって増強され得、これは、ある種の生理学的条件下（例えば、２型ＤＭを有する被験体の細胞で見られるもの）で起こり得る。かかる崩壊の検出は、本明細書に示したようなさまざまな手段によって行なわれ得る。
【０３８９】
典型的には、ミトコンドリアの膜電位差は、当業者に容易にわかる方法に従って、例えば、限定されないが、検出可能な化合物、例えば、蛍光インジケータ、光学的プローブおよび／または感受性ｐＨの検出および／または測定、ならびにイオン選択的電極などによって測定され得る（例えば、Ｅｒｎｓｔｅｒら、１９８１  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９１：２２７ｓおよびそこに挙げられた参考文献を参照のこと；また、Ｈａｕｇｌａｎｄ、１９９６  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、第６版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ．、ｐｐ．２６６−２７４および５８９−５９４も参照のこと）。例えば、一例であって限定されないが、蛍光プローブ２−，４−ジメチルアミノスチリル−Ｎ−メチルピリジニウム（ＤＡＳＰＭＩ）およびテトラメチルローダミンエステル（例えば、テトラメチルローダミンメチルエステル、ＴＭＲＭ；テトラメチルローダミンエチルエステル、ＴＭＲＥ）または関連化合物（例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ、１９９６（前掲）を参照のこと）が、ミトコンドリア膜電位差に依存性で比例的なプロセスであるミトコンドリア内への蓄積後に定量され得る（例えば、Ｍｕｒｐｈｙら、１９９８、Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ＆  Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｂｅａｌ、ＨｏｗｅｌｌおよびＢｏｄｉｓ−Ｗｏｌｌｎｅｒ編、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐｐ．１５９−１８６  およびそこに挙げられた参考文献；ならびにワールドワイドウェブ上のｐｒｏｂｅｓ．ｃｏｍ／ｈａｎｄｂｏｏｋ／ｔｏｃ．ｈｔｍｌのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｏｎ−ｌｉｎｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓを参照のこと）。使用され得る他の蛍光検出可能な化合物としては、限定されないが、ローダミン１２３、ローダミンＢヘキシルエステル、ＤｉＯＣ．ｓｕｂ．６（３）、ＪＣ−１［５，５’，６，６’−テトラクロロ−１，１’，３，３’−テトラエチルベンズ（ｂｅｚ−）イミダゾルカルボシアニドイオダイド］（Ｃｏｓｓａｒｉｚｚａら、１９９３  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９７：４０；Ｒｅｅｒｓら、１９９５  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６０：４０６を参照のこと）、ｒｈｏｄ−２（米国特許第５，０４９，６７３号を参照のこと；前述の化合物はすべて、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ．から入手可能である）、およびローダミン８００（Ｌａｍｂｄａ  Ｐｈｙｓｉｋ、ＧｍｂＨ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ；Ｓａｋａｎｏｕｅら、１９９７  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２１：２９を参照のこと）が挙げられる。ミトコンドリア膜電位差をモニタリングするための方法はまた、米国特許出願第０９／１６１，１７２号にも開示されている。
【０３９０】
また、ミトコンドリア膜電位差は、非蛍光手段、例えば、ＴＴＰ（テトラフェニルホスホニウムイオン）およびＴＴＰ感受性電極を使用することによって測定され得る（Ｋａｍｏら、１９７９  Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｌ．４９：１０５；ＰｏｒｔｅｒおよびＢｒａｎｄ、１９９５  Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６９：ＲＩ２１３）。当業者は、適切な検出可能な化合物またはＤＹｍを測定するための他の適切な手段を選択することができよう。一例であって限定されないが、ＴＭＲＭはＴＭＲＥよりもいくぶん好ましく、それは、ミトコンドリアからの流出後、ＴＭＲＥがＴＭＲＭよりも、小胞体および細胞質内でわずかに多い残留シグナルをもたらすためである。
【０３９１】
別の非限定的な例として、膜電位差は、付加的または択一的に、マトリックス容積および／またはピリジンヌクレオチドレドックス測定を分光測光的または蛍光測定的定量と組み合わせて使用し、検出可能な荷電溶質に対するミトコンドリアの透過性の間接的な測定から算出され得る。また、ミトコンドリア内膜を通過する膜電位差依存性基質交換拡散の測定は、膜電位の間接的な測定を提供し得る（例えば、Ｑｕｉｎｎ、１９７６、Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐａｒｋ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄ．、ｐｐ．２００−２１７  およびそこに挙げられた参考文献を参照のこと）。
【０３９２】
上記のような細胞内カルシウムの上昇に起因する非常なミトコンドリアでのカルシウムの蓄積に対する鋭敏な感受性もまた、２型糖尿病を特徴付けるものであり得る。かかるミトコンドリアの感受性は、本発明によるミトコンドリア機能のインジケータを提供し得る。さらに、さまざまな生理学的に関連のある因子、例えば、ヒドロペルオキシドおよびフリーラジカルが、カルシウムと相乗的にＤＹの崩壊を誘導し得る（Ｎｏｖｇｏｒｏｄｏｖら、１９９１  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０５８：２４２；Ｔａｋｅｙａｍａら、１９９３  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２９４：７１９；Ｇｕｉｄｏｘら、１９９３  Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３０６：１３９）。
【０３９３】
ｖ．アポトーシス性刺激に対する応答を含むミトコンドリア機能のインジケータ
別の実施形態において、ミトコンドリアの質量および／または機能のモジュレータを同定するための方法は、ミトコンドリア機能のインジケータ検出および／または測定を含むものであり得、ここで該ミトコンドリア機能は、プログラムされた細胞死またはアポトーシスが関与するものである。種々の既知のアポトーシス性刺激に対する応答の範囲は、かかる応答の検出のための方法および試薬の範囲と同様に広い。
【０３９４】
ミトコンドリア機能不全は、種々の細胞型におけるアポトーシスをもたらす事象のカスケードに不可欠であると考えられている（Ｋｒｏｅｍｅｒら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ９：１２７７−８７、１９９５）。ミトコンドリア生理機能は、中でも、プログラムされた細胞死における最も早期の事象であり（Ｚａｍｚａｍｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：３６７−７７、１９９５；Ｚａｍｚａｍｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：１６６１−７２、１９９５）、かかるミトコンドリア機能に起因する反応性酸素種（ＲＯＳ）レベルの上昇により、アポトーシス性カスケードが開始され得る（Ａｕｓｓｅｒｅｒら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４：５０３２−４２、１９９４）。いくつかの細胞型では、ミトコンドリア膜電位差（ＤＹｍ）の減少が、アポトーシスを伴う核ＤＮＡの分解より先に起こる。無細胞系では、核ではなくミトコンドリアの画分富化によって、核のアポトーシスが誘導され得る（Ｎｅｗｍｅｙｅｒら、Ｃｅｌｌ  ７０：３５３−６４、１９９４）。細胞の代謝性状態の改変（例えば、細胞内ＲＯＳの上昇）をもたらすミトコンドリアの呼吸性活性の乱れは、２型糖尿病において起こり得、さらに、アポトーシス性機構による病原性の事象が誘導され得る。酸化的ストレスのあるミトコンドリアは、アポトーシスの前に起こる事象である染色体凝縮を誘導し得る予備形成可溶因子を放出し得る（Ｍａｒｃｈｅｔｔｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：２０３３−３８、１９９６）。また、抗アポトーシス遺伝子産物のＢｃｌ−２ファミリーの構成員は、ミトコンドリア外膜内に存在しており（Ｍｏｎａｇｈａｎら、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４０：１８１９−２５、１９９２）、このようなタンパク質は、酸化的ストレスから該膜を保護すると考えられる（Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ．１２７１：６３、１９９５）。この膜へのＢｃｌ−２の局在は、アポトーシスのモジュレーションに不可欠であると考えられる（Ｎｇｕｙｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１６５２１−２４、１９９４）。したがって、ミトコンドリアの生理機能の変化は、アポトーシスの重要なメディエータであり得る。
【０３９５】
したがって、ミトコンドリア機能の障害は、１種類以上のアポトーシス原によるアポトーシスの誘導の閾値の低下に反映され得る。さまざまなアポトーシス原が当業者に知られており（例えば、Ｇｒｅｅｎら、１９９８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１３０９  およびそこに挙げられた参考文献を参照のこと）、一例であって限定されないが：腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−ａ）；Ｆａｓリガンド；グルタミン酸塩；Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）；インターロイキン−３（ＩＬ−３）；ヘルビマイシンＡ（Ｍａｎｃｉｎｉｔら、１９９７  Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３８：４４９−４６９）；パラコート（Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉら、１９９５  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ９９：１−２）；エチレングリコール；プロテインキナーゼ阻害剤、例えば、スタウロスポリン、カルホスチンＣ、カフェイン酸フェネチルエステル、塩化ケレリトリン、ゲニステイン；１−（５−イソキノリンスルホニル）−２−メチルピペラジン；ＫＮ−９３；Ｎ−［２−（（ｐ−ブロモシンナミル）アミノ）エチル］−５−５−イソキノリンスルホンアミド；ｄ−エリスロスフィンゴシン誘導体；ＵＶ照射；イオノフォア、例えば、イオノマイシンおよびバリノマイシン；ＭＡＰキナーゼ誘導体、例えば、アミソマイシン、アナンダミン；細胞周期遮断薬、例えば、アフィジコリン、コルセミド、５−フルオロウラシル、ホモハリントニン；アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、例えば、ベルベリン；抗エストロゲン、例えば、タモキシフェン；酸化促進剤、例えば、：ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシド、過酸化水素；フリーラジカル、例えば、一酸化窒素；無機金属イオン、例えば、カドミウム；ＤＮＡ合成阻害剤、例えば、アクチノマイシンＤ；ＤＮＡインターカレーター、例えば、ドキソルビシン、硫酸ブレオマイシン、ヒドロキシウレア、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、カンプトテシン、ダウノルビシン；タンパク質合成阻害剤、例えば、シクロヘキシミド、プロマイシン、ラパマイシン；微小管の形成または安定性に影響を及ぼす薬剤、例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、コルヒチン、４−ヒドロキシフェニルレチンアミド、パクリタキセル；悪性タンパク質、Ｂｉｄタンパク質およびＢａｘタンパク質（例えば、Ｊｕｒｇｅｎｍｅｉｅｒら、１９９８  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：４９９７−５００２  およびそこに挙げられた参考文献を参照のこと）；カルシウムならびに無機リン酸塩（Ｋｒｏｅｍｅｒら、１９９８  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  ６０：６１９）が挙げられ得る。
【０３９６】
一実施形態において、ミトコンドリア機能のインジケータがアポトーシス原に対する細胞応答である場合、アポトーシスを実行中であることが疑われる生物学的試料中の細胞は、形態学的、透過性またはアポトーシス状態を示す他の変化について検査され得る。例えば、一例であって限定されないが、多くの細胞型ではアポトーシスによって、形態学的外観の改変、例えば、原形質膜水疱形成、細胞形状の変化、基質付着特性の低下など、または当業者によって容易に検出され得る（例えば、光学顕微鏡検査によって）他の形態学的変化が引き起こされ得る。別の例として、アポトーシスを実行中の細胞は、染色体の断片化および崩壊を示すことがあり得、これは、顕微鏡検査および／または当該技術分野で知られたＤＮＡ特異的もしくはクロマチン特異的色素（例えば、蛍光色素）の使用によって明示され得る。かかる細胞はまた、原形質膜透過特性の改変を示すことがあり得、これは、生体用（ｖｉｔａｌ）色素（例えば、ヨウ化プロピジウム、トリパンブルー）の使用により、または細胞外環境内への乳酸デヒドロゲナーゼ漏出の検出によって容易に検出され得る。形態学的基準、原形質膜透過性の改変および関連する変化によってアポトーシス細胞を検出するためのこれらおよび他の手段は、当業者に自明である。
【０３９７】
別の実施形態において、ミトコンドリア機能のインジケータがアポトーシス原に対する細胞応答である場合、生物学的試料中の細胞は、原形質膜の内層から外層への細胞膜ホスファチジルセリン（ＰＳ）のトランスロケーションについてアッセイされ得、これは、例えば、ＰＳ特異的タンパク質アネキシンによる外層への結合を測定することにより検出され得る（Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：１５４５、１９９５；Ｆａｄｏｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２２０７、１９９２）。さらに別の実施形態において、アポトーシス原に対する細胞性／生化学的応答は、カスパーゼとして知られるアポトーシス活性化プロテアーゼファミリーの任意の構成員における特異的プロテアーゼ活性の誘導に関するアッセイによって測定される（例えば、Ｇｒｅｅｎら、１９９８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１３０９を参照のこと）。当業者には、カスパーゼ活性を測定するための方法が容易にわかるであろう（例えば、特異的に認識されるタンパク質基質のカスパーゼ媒介型切断の測定によるもの）。このような基質としては、例えば、ポリ−（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）または当該技術分野で知られたカスパーゼによって切断される他の天然もしくは合成ペプチドおよびタンパク質が挙げられ得る（例えば、Ｅｌｌｅｒｂｙら、１９９７  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７：６１６５を参照のこと）。合成ペプチド基質は規定されている（Ｋｌｕｃｋら、１９９７  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：１１３２；Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、１９９５  Ｎａｔｕｒｅ  ３７６：３７）。基質の他の非限定的な例としては、核タンパク質、例えば、Ｕ１−７０  ｋＤａおよびＤＮＡ−ＰＫｃｓ（ＲｏｓｅｎおよびＣａｓｃｉｏｌａ−Ｒｏｓｅｎ、１９９７  Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：５０；Ｃｏｈｅｎ、１９９７  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２６：１）が挙げられる。
【０３９８】
上記のように、ミトコンドリア内膜は、多くの小分子溶質に対して高度に選択的で調節された透過性を示すことがあり得るが、大きな（１０ｋＤａ程度未満）の分子には不透過性で
ある（例えば、Ｑｕｉｎｎ、１９７６  Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐａｒｋ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄ．  を参照のこと）。しかしながら、アポトーシスを実行中の細胞では、ミトコンドリア膜電位差の崩壊は、巨大分子拡散がミトコンドリア膜を通過するのを許容する透過性の増大が付随し得る。したがって、ミトコンドリア機能のインジケータがアポトーシス原に対する細胞応答である主題の本発明の方法の別の実施形態では、ミトコンドリアのタンパク質、例えば、アポトーシス細胞においてミトコンドリアから逸出されたシトクロムｃの検出により、アポトーシス原に対する応答の証拠が提供され得、これは、容易に測定され得る（Ｌｉｕら、Ｃｅｌｌ  ８６：１４７、１９９６）。シトクロムｃのかかる検出は、分光測光的、免疫化学的に、または特異的タンパク質の存在を測定するための他の充分確立された方法によって行なわれ得る。
【０３９９】
例えば、アポトーシス性刺激（例えば、よく知られたカルシウムイオノフォアであるイオノマイシン）によって刺激された細胞からのシトクロムｃの放出は、さまざまな免疫学的方法によって追跡され得る。マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析解析と、親和性捕捉との組合せは、アポ−シトクロムｃおよびホロ−シトクロムｃが、その特異な分子量に基づいて識別され得るため、かかる解析に特に適している。例えば、表面増強レーザー脱離イオン化（Ｓｕｒｆａｃｅ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＳＥＬＤＩ）システム（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ）は、アポトーシス原処理細胞におけるミトコンドリアからのシトクロムｃ放出を検出するために利用され得る。このアプローチでは、固相支持体上に固定化されたシトクロムｃ特異抗体を用いて、可溶性の細胞抽出物中に存在する放出されたシトクロムｃを捕捉する。捕捉された該タンパク質は、次いで、エネルギー吸収分子（ＥＡＭ）のマトリックス内に取り込まれ、固相支持体表面から、パルス化レーザー励起を用いて脱着される。該タンパク質の分子量は、ＳＥＬＤＩ質量分析装置の検出器までのその飛行時間によって測定される。
【０４００】
当業者には、アポトーシスを定量するための他の適当な手法が存在し得、アポトーシス性刺激に対する細胞応答であるミトコンドリア機能のインジケータを測定する目的のためのかかる手法が、本発明によって提供される方法の範囲内であることは容易に認識されよう。
【０４０１】
ｖｉ．ミトコンドリア機能のインジケータとしてのフリーラジカル生成
特定のある実施形態において、ミトコンドリアの質量および／または機能のモジュレータを同定するための方法は、ミトコンドリア機能のインジケータとしての、生物学的試料中のフリーラジカル生成の検出を伴う。ミトコンドリアは、生体の系においてフリーラジカルの主な供給源である（例えば、Ｍｕｒｐｈｙら、１９９８、Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ａｎｄ  Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｂｅａｌ、Ｈｏｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｂｏｄｉｓ−Ｗｏｌｌｎｅｒ編、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐｐ．１５９−１８６  およびそこに挙げられた参考文献を参照のこと）が、本明細書に記載の方法は、そのように限定されないものとし、フリーラジカル生成は、具体的な非細胞供給源部位とは無関係に、ミトコンドリア機能のインジケータであり得る。例えば、フラビン結合オキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼまたは一酸化窒素シンセターゼなどの酵素により触媒される反応による過酸化水素、一酸化窒素またはスーパーオキシドラジカルなどの代謝産物の生成によってラジカルの形成がもたらされる数多くの細胞内生化学的経路が当該技術分野で知られており、これらは、かかるラジカルを検出するための方法である（例えば、Ｋｅｌｖｅｒ、１９９３  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２３：２１；Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ  Ｂ．およびＪ．Ｍ．Ｃ．Ｇｕｔｔｅｒｉｄｇｅ、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９８９  Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ；Ｄａｖｉｅｓ、Ｋ．Ｊ．Ａ．およびＦ．Ｕｒｓｉｎｉ、Ｔｈｅ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｐａｒａｄｏｘ、Ｃｌｅｕｐ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ、Ｐａｄｏｖａ、ＩＴを参照のこと）。また、ＥＴＣの任意の段階での機能不全などのミトコンドリア機能により、高度に反応性のフリーラジカルの生成がもたらされ得る。上記のような、ミトコンドリア機能に起因するラジカルとしては、反応性酸素種（ＲＯＳ）、例えば、スーパーオキシド、ペルオキシ亜硝酸イオンおよびヒドロキシルラジカル、ならびに細胞に対して毒性であり得る潜在的に反応性の種が挙げられる。したがって、特定のある実施形態において、ミトコンドリア機能のインジケータは、生物学的試料中に存在する検出可能なフリーラジカル種であり得る。特定のある実施形態において、検出可能なフリーラジカルはＲＯＳである。
【０４０２】
ミトコンドリア機能のインジケータとして有用であり得るフリーラジカルを検出するための方法は、当該技術分野で知られており、具体的なラジカルに依存する。典型的には、生物学的試料中のフリーラジカルの生成レベルは、当業者に容易にわかる方法、例えば、限定されないが、グリコキシデーション生成物、例えば、ペントシジン、カルボキシメチリジンおよびピロリン；リピドキシデーション生成物、例えば、グリオキサル、マロンジアルデヒドおよび４−ヒドロキシノネナール  ；チオバルビツール酸反応性の物質（ＴＢＡＲＳ；例えば、Ｓｔｅｉｎｂｒｅｃｈｅｒら、１９８４  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３８８３；Ｗｏｌｆｆ、１９９３  Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．４９：６４２を参照のこと。）および／または他の化学的検出手段（ヒドロキシルラジカルのサリチル酸塩捕捉など）（例えば、Ｇｈｉｓｅｌｌｉら、１９９８  Ｍｅｔｈｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０８：８９；Ｈａｌｌｉｗｅｌｌら、１９９７  Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｒｅｓ．２７：２３９）あるいは特異的付加物の形成（例えば、Ｍｅｃｏｃｃｉら１９９３  Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．３４：６０９；Ｇｉｕｌｉｖｉら、１９９４  Ｍｅｔｈｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２３３：３６３を参照のこと）、例えば、マロンジアルデヒド形成、タンパク質ニトロシル化、ＤＮＡ酸化（例えば、ミトコンドリアＤＮＡ酸化）、８−ＯＨ−グアノシン付加物（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎら、１９９９  Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．４２４：５１）、タンパク質酸化、タンパク質カルボニル修飾（例えば、Ｂａｙｎｅｓら、１９９１  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４０：４０５；Ｂａｙｎｅｓら、１９９９  糖尿病４８：１）；電子ピン共鳴（ＥＳＲ）プローブ；サイクリックボルンタメトリー；蛍光および／または化学発光インジケータの検出および／または測定に従って測定され得る（また、例えば、Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ、Ｒ．Ａ．（編．）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９８５  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．；Ａｃｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｂａｉｌｅｙ、（編）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、１９９５  ＥＳＡ，Ｉｎｃ．、Ｃｈｅｌｍｓｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．；Ｙｌａ−Ｈｅｒｔｔｕａｌａら、１９８９  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８４：１０８６；Ｖｅｌａｚｑｕｅｓら、１９９１  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ８：７５２；Ｂｅｌｃｈら、１９９５  Ｉｎｔ．Ａｎｇｉｏｌ．１４：３８５；Ｓａｔｏら、１９７９  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｅｄ．２１：１０４；Ｔｒａｖｅｒｓｏら、１９９８  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ４１：２６５；Ｈａｕｇｌａｎｄ、１９９６  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ−−第６版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ．、ｐｐ．４８３−５０２、およびそこに挙げられた参考文献を参照のこと）。例えば、一例であって限定されないが、蛍光プローブであるジクロロジヒドロフルオレセイン二酢酸およびそのカルボキシル化誘導体であるカルボキシジクロロジヒドロフル��レセイン二酢酸（例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ、１９９６（前掲）を参照のこと）の酸化は、反応性酸素種の存在に依存性で比例的であるプロセスである細胞内蓄積後に定量され得る（例えば、ワールドワイドウェブ上のｐｒｏｂｅ．ｃｏｍ／ｈａｎｄｂｏｏｋ／ｔｏｃ．ｈｔｍｌのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｏｎ−ｌｉｎｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、もまた参照のこと）。フリーラジカル生成の検出のために本発明において使用され得る他の蛍光検出可能な化合物としては、限定されないが、ジヒドロローダミンおよびジヒドロローザミン誘導体、シス−パリナリン酸、レソルフィン誘導体、ルシゲニンおよび当業者に知られたものであり得る任意の他の適当な化合物が挙げられる。
【０４０３】
したがって、上記にも記載のように、フリーラジカル媒介性損傷により、ＥＴＣの無数のタンパク質の１種類以上が不活化され得、その際、酸化的リン酸化およびＡＴＰ生成を担うミトコンドリアの化学振盪機構が脱共役され得る。ＡＴＰ生合成因子（例えば、ＡＴＰ生成の測定）であるミトコンドリア機能のインジケータを、本明細書においてより詳細に記載する。また、ミトコンドリア機能の完全性に対するフリーラジカル媒介性損傷は、ミトコンドリア内膜によって維持される電気化学的電位の崩壊がもたらされ得るミトコンドリア機能と関連している多数の機構の単なる一例である。
【０４０４】
他の実施形態において、ミトコンドリアの質量および／または機能の増大の恩恵を受け得る個体を処置するための方法が提供される。該方法は、まず、ミトコンドリア機能不全に苦しむ患者を同定することを含むものであり得る。ミトコンドリアの質量および／または機能をモジュレートする薬剤を同定するための上記の方法はまた、ミトコンドリアの質量および／または活性の増大の恩恵を受け得る個体を同定するために使用され得る。例えば、上記の方法は、ある一個体由来の生物学的試料中のミトコンドリアの質量および／または機能を、個体（例えば、正常なミトコンドリアの質量および／または機能を有する個体）、対照集団、あるいはミトコンドリアの質量および／または機能の標準的な所定の値と比較して測定するために使用され得る。
【０４０５】
５．医薬組成物
本明細書に記載のＣＬＫモジュレート化合物は、慣用的な様式で、１種類以上の生理学的に許容され得る担体または賦形剤を用いて製剤化され得る。例えば、ＣＬＫモジュレート化合物ならびにその生理学的に許容され得る塩および溶媒和物は、例えば、注射（例えば、ＳｕｂＱ、ＩＭ、ＩＰ）、吸入もしくは吹入（口もしくは鼻のいずれかを介して）または経口、口腔内、舌下、経皮、経鼻、非経口または経直腸投与による投与のために製剤化され得る。一実施形態において、ＣＬＫモジュレート化合物は、標的細胞が存在する部位、すなわち、特異的組織、器官または体液（例えば、血液、脳脊髄液など）に局所投与され得る。
【０４０６】
ＣＬＫモジュレート化合物は、さまざまな投与様式、例えば、全身性および経表面的または限局性投与のために製剤化され得る。手法および製剤は、一般的には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｅａｄｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡを見るとよい。非経口投与には、例えば、筋肉内、静脈内、腹腔内および皮下注射が好ましい。注射のためには、該化合物は液状の液剤に、好ましくは、生理学的に適合性のバッファー（例えば、ハンクス液またはリンゲル液）中で製剤化され得る。また、該化合物は、固形形態に製剤化され得、使用直前に再溶解または懸濁され得る。凍結乾燥形態もまた含まれる。
【０４０７】
経口投与用には、医薬組成物は、薬学的に許容され得る賦形剤、例えば、結合剤（例えば、アルファー化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンもしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微晶質セルロースもしくはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクもしくはシリカ）；崩壊剤（例えば、イモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などを用いて慣用的な手段によって調製される、例えば、錠剤、ロゼンジ剤またはカプセル剤の形態が採用され得る。錠剤は、当該技術分野でよく知られた方法によってコーティングされたものであってもよい。経口投与用の液状調製物には、例えば、液剤、シロップ剤もしくは懸濁剤の形態が採用され得るか、または使用前に水もしくは他の適当なビヒクルを用いて構成するための乾燥粉末剤として提示され得る。かかる液状調製物は、慣用的な手段によって、薬学的に許容され得る添加剤、例えば、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ剤、セルロース誘導体または水添食用脂）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アチオンド（ａｔｉｏｎｄ）油、油性エステル、エチルアルコールまたは分画植物油）；および保存料（例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）などを用いて調製され得る。該調製物は、適宜、緩衝塩、フレーバー剤、着色剤および甘味剤もまた含有するものであってもよい。経口投与用の調製物は、活性化合物の制御放出がもたらされるように適切に製剤化され得る。
【０４０８】
吸入（例えば、肺送達）による投与のためには、ＣＬＫモジュレート化合物は、適当なプロペラント、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当なガスの使用により、加圧パックまたはネブライザーからのエーロゾルスプレー剤提示の形態で簡便に送達され得る。加圧エーロゾルの場合、投薬単位は、定量を送達するための弁を設けることにより決定され得る。吸入器または吹入器における使用のためのカプセル剤およびカートリッジ剤（例えば、ゼラチン製）は、該化合物と適当な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプン）との粉末剤混合物を含有するように製剤化され得る。
【０４０９】
ＣＬＫモジュレート化合物は、注射、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与用に製剤化され得る。注射用製剤は、単位投薬形態内に、例えば、アンプルまたは反復投与用容器内に、保存料を添加して提示され得る。該組成物には、懸濁剤、液剤またはエマルジョン剤（油性もしくは水性ビヒクル中）などの形態が採用され得、製剤用薬剤、例えば、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などを含めたものであり得る。あるいはまた、活性成分は、使用前に、適当なビヒクル、例えば、滅菌パイロジェンフリー水を用いて構成するための粉末形態であり得る。
【０４１０】
ＣＬＫモジュレート化合物はまた、例えば、慣用的な坐剤用基剤（ココアバターまたは他のグリセリドなど）を含有する経直腸組成物、例えば、坐剤または持続性浣腸剤などに製剤化され得る。
【０４１１】
先に記載の製剤に加え、ＣＬＫモジュレート化合物はまた、デポー調製物として製剤化され得る。かかる長期作用性製剤は、埋入（例えば、皮下もしくは筋肉内）または筋肉内注射によって投与され得る。したがって、例えば、ＣＬＫモジュレート化合物は、適当なポリマー材料または疎水性材料とともに（例えば、許容され得る油中のエマルジョン剤として）もしくはイオン交換樹脂とともに、またはやや溶けにくい誘導体、例えばやや溶けにくい塩として製剤化され得る。制御放出製剤（ｆｏｒｍｕｌａ）には、貼付剤も含まれる。
【０４１２】
特定のある実施形態において、本明細書に記載の化合物は、中枢神経系（ＣＮＳ）への送達のために製剤化され得る（Ｂｅｇｌｅｙ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  １０４：２９−４５（２００４）に概説）。ＣＮＳへの薬物送達のための慣用的なアプローチとしては、神経外科的ストラテジー（例えば、脳内注射または脳室内注入）；薬剤の分子操作（例えば、ＢＢＢの内因性輸送経路の１つを利用する試みにおいて、内皮細胞表面分子に対する親和性を有する輸送ペプチドを、それ自体は血液脳関門（ＢＢＢ））を通過し得る薬剤との組合せで含むキメラ融合タンパク質の作製；薬剤の脂質可溶性が増大するように設計された薬理学的ストラテジー（例えば、脂質またはコレステロール担体への水溶性薬剤のコンジュゲーション）；ならびに高浸透圧破壊によるＢＢＢの完全性の一過的な破壊（頚動脈内へのマンニトール溶液の注入または生物学的に活性な薬剤、例えば、アンギオテンシンペプチドなどの使用によりもたらす）が挙げられる。
【０４１３】
徐放速度論を達成するための可能性の１つは、活性化合物をナノ粒子内に包埋またはカプセル封入することである。ナノ粒子は、粉末剤、添加された賦形剤との粉末剤混合物、または懸濁剤として投与され得る。ナノ粒子のコロイド状懸濁剤は、小径のカニューレを介して容易に投与され得る。
【０４１４】
ナノ粒子は、約５ｎｍ〜約１０００ｎｍまでの直径を有する粒子である。用語「ナノ粒子」は、以下、本明細書で用いる場合、内部に活性化合物が分散されたポリマーマトリックスによって形成される粒子（「ナノスフィア」としても知られる）をいい、また、ポリマー膜で囲まれた活性化合物を含有する芯で構成されるナノ粒子（「ナノカプセル」としても知られる）をいう。特定のある実施形態において、約５０ｎｍ〜約５００ｎｍ、特に約１００ｎｍ〜約２００ｎｍの直径を有するナノ粒子が好ましい。
【０４１５】
ナノ粒子は、分散されたモノマーのインサイチュ重合によって、または予備形成ポリマーを使用することにより調製され得る。インサイチュで調製されるポリマーは、多くの場合、生分解性ではない、および／または毒物学的に重篤な副生成物を含有するため、予備形成ポリマー由来のナノ粒子が好ましい。予備形成ポリマー由来のナノ粒子
は、種々の手法、例えば、エマルジョンエバポレーション、溶媒置換、塩析、機械的磨砕、微量沈降、および乳化拡散によって調製され得る。
【０４１６】
本明細書において上記の方法では、ナノ粒子は、種々の型のポリマーを用いて形成され得る。本発明の方法における使用のためには、生体適合性のポリマーで作製されたナノ粒子が好ましい。用語「成体適合性の」は、生物学的環境内への導入後、該生物学的環境に対して重篤な影響をもたない材料をいう。生体適合性のポリマー由来であって生分解性でもあるポリマーが特に好ましい。用語「生分解性」は、生物学的環境内への導入後、酵素的または化学的に分解されてより小さな分子になる（これは、その後、排除され得る）材料をいう。例は、ヒドロキシカルボン酸由来のポリエステル、例えば、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、乳酸とグリコール酸（ＰＬＧＡ）のコポリマー、乳酸とカプロラクトンのコポリマー、ポリεカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸およびポリ（オルト）エステル、ポリウレタン、ポリ無水物、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート、天然のポリマー、例えば、アルギン酸塩および他の多糖類（例えば、デキストランおよびセルロース）、コラーゲンおよびアルブミンなどである。適当な表面改質剤が、好ましくは、既知の有機および無機医薬用賦形剤から選択され得る。かかる賦形剤としては、種々のポリマー、低分子量オリゴマー、天然産物および界面活性剤が挙げられる。好ましい表面改質剤としては、非イオン系およびイオン系界面活性剤が挙げられる。表面改質剤の代表例としては、ゼラチン、カゼイン、レシチン（ホスファチド）、アラビアゴム、コレステロール、トラガカント、ステアリン酸、塩化ベンズアルコニウム、ステアリン酸カルシウム、グリセロールモノステアレート、セトステアリルアルコール、セトマクロゴル乳化性ワックス、ソルビタンエステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、例えば、マクロゴルエーテル（セトマクロゴル１０００など）、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、例えば、市販のＴｗｅｅｎｓＴＭ、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレンステアレート、コロイド状二酸化ケイ素、リン酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、非晶質セルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、トリエタノールアミン、ポリビニルアルコール、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）が挙げられる。これらの表面改質剤のほとんどは、既知の医薬用賦形剤であり、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎおよびＴｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎ共同出版、ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６に詳細に記載されている。
【０４１７】
ナノ粒子の調製に関するさらなる記載は、例えば、米国特許第６，２６４，９２２号（その内容は、引用により本明細書に組み込まれる）を見るとよい。
【０４１８】
リポソームは、容易に注射可能なさらなる薬物送達系である。したがって、本発明の方法において、活性化合物はまた、リポソーム送達系の形態で投与され得る。リポソームは当業者によく知られている。リポソームは、さまざまなリン脂質、例えば、コレステロール、ホスファチジルコリンのステアリルアミンなどから形成され得る。本発明の方法に使用可能なリポソームには、あらゆる型のリポソーム、例えば、限定されないが、小さな単層小胞、大きな単層小胞および多層小胞が包含される。
【０４１９】
リポソームは、さまざまな治療目的に使用され、特に、治療用薬剤を標的細胞に運ぶために使用される。好都合には、リポソーム薬物製剤は、薬物送達特性（例えば、薬物制御放出が挙げられる）の改善の可能性を提供する。多くの場合、リポソームが標的の領域、細胞または部位に達するためには、長い循環時間が必要とされる。特に、これは、標的の領域、細胞または部位が投与部位付近に位置しない場合に必要となる。例えば、リポソームが全身投与される場合、リポソームの血液循環寿命を延長させるため、リポソームを親水性薬剤でコートすること（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの親水性ポリマー鎖のコーティング）ことが望ましい。かかる表面修飾リポソームは、一般に、「長循環性」または「立体的に安定化された」リポソームと称される。
【０４２０】
リポソームに対する表面修飾の一例は、典型的には、約１０００ダルトン（Ｄａ）〜約５０００Ｄａの分子量を有し、そのリポソームを構成する脂質の約５モルパーセント（％）までのＰＥＧ鎖の結合である。（例えば、Ｓｔｅａｌｔｈ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌａｓｉｃ、Ｄ．およびＭａｒｔｉｎ，Ｆ．編、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．，（１９９５）、およびそこに挙げられた参考文献を参照のこと）。かかるリポソームによって示される薬物動態は、表面非修飾リポソーム（これは、血液から急速に除去され、肝臓および脾臓内に蓄積される傾向にある）と比べ、単核食細胞系（ＭＰＳ）による肝臓および脾臓によるリポソーム取込みの用量非依存性低減、ならびに有意に延長された血液循環時間を特徴とする。
【０４２１】
特定のある実施形態において、該複合体は、複合体の循環半減期を増大させるためにシールド（ｓｈｉｅｌｄ）されたもの、または分解（例えば、ヌクレアーゼによる分解）に対する核酸の抵抗性を増大させるためにシールドされたものである。
【０４２２】
本明細書で用いる場合、「シールディング」、および「シールドされた」などのその同語源の語は、本明細書に記載の複合体と血清補体または血清中に存在する他の種との非特異的相互作用をインビトロまたはインビボで低減させる「シールディング部分」の能力をいう。シールディング部分は、複合体が、１種類以上の機構、例えば、非特異的立体的または非特異的電子的相互作用などを介してこれらの種と相互作用することまたは該種に結合するのを低減させる。かかる相互作用の例としては、非特異的静電的相互作用、電荷相互作用、ファンデルワールス相互作用、立体障害などが挙げられる。シールディング部分として作用する部分に関して、血清補体または他の種との相互作用、会合または結合が低減され得る機構（１つまたは複数）を同定する必要はない。ある部分がシールディング部分として作用し得るか否かは、複合体が血清種に結合するか否か、またはどの程度結合するかを調べることにより決定され得る。
【０４２３】
「シールディング部分」は、多機能的であり得ることに注意されたい。例えば、シールディング部分はまた、例えば、標的化因子としての機能を果たすものであり得る。シールディング部分はまた、複合体がシールドされる機構（１つまたは複数）に関して多機能的とも称され得る。提案する機構または理論に限定されることを望まないが、かかる多機能的シールディング部分の例は、ｐＨ感受性エンドソーム膜破壊性合成ポリマー、例えば、ＰＰＡＡまたはＰＥＡＡなどである。ある種のポリ（アルキルアクリル酸）は、外側の細胞表面膜をインタクトに維持したまま、エンドソーム膜を破壊することが示されている（Ｓｔａｙｔｏｎら（２０００）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ  ６５：２０３−２２０；Ｍｕｒｔｈｙら（１９９９）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ  ６１：１３７−１４３；ＷＯ９９／３４８３１）、それにより、細胞のバイオアベイラビリティを増大させ、標的化因子としての機能を果たす。しかしながら、ＰＰＡＡは、自身が組み込まれた複合体への血清補体の結合低減させ、したがって、シールディング部分としての機能を果たす。
【０４２４】
ＣＬＫモジュレータの製剤、特に液剤を作製するための別の方法は、シクロデキストリンの使用によるものである。シクロデキストリンにより、α−、β−またはγ−シクロデキストリンが意図される。シクロデキストリンは、Ｐｉｔｈａらの米国特許第４，７２７，０６４号（これは、引用により本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されている。シクロデキストリンはグルコースの環状オリゴマーであり、このような化合物により、シクロデキストリン分子の脂肪親和性誘引空洞内にその分子が嵌め込まれ得る任意の薬物との包含（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）複合体が形成される。
【０４２５】
本発明による組成物のシクロデキストリンは、α−、β−またはγ−シクロデキストリンであり得る。α−シクロデキストリンは６つのグルコピラノース単位を含有し、β−シクロデキストリンは７つのグルコピラノース単位を含有し、γ−シクロデキストリンは８つのグルコピラノース単位を含有する。該分子は、α−、β−またはγ−シクロデキストリンにおいて、それぞれ、４．７〜５．３オングストローム、６．０〜６．５オングストローム、および７．５〜８．３オングストロームのコア開口部を有する切断型円錐体を形成すると考えられている。本発明による組成物は、α−、β−またはγ−シクロデキストリンの２種類以上の混合物を含むものであり得る。しかしながら、典型的には、本発明による組成物は、α−、β−またはγ−シクロデキストリンのうちの１種類のみを含むものである。
【０４２６】
本発明による組成物における最も好ましいシクロデキストリンは、非結晶質性シクロデキストリン化合物である。非結晶質性シクロデキストリンにより、シクロデキストリンの非結晶性の混合物であって、α−、β−またはγ−シクロデキストリンから調製される混合物が意図される。一般に、非結晶質性シクロデキストリンは、所望のシクロデキストリン種の非選択的アルキル化によって調製される。この目的に好適なアルキル化剤としては、限定されないが、プロピレンオキシド、グリシドール、ヨードアセトアミド（ｉｏｄｏａｃｅｔａｒｎｉｄｅ）、クロロ酢酸塩、および２−ジエチルアミノエチル（ｅｔｈｌｙ）クロリドが挙げられる。反応は、複数の成分を含む混合物が得られるように行なわれ、それにより、シクロデキストリンの結晶化を抑制する。種々のアルキル化シクロデキストリンが作製され得るが、もちろん、使用されるシクロデキストリンの出発種およびアルキル化剤に応じて種々である。非結晶質性シクロデキストリンの中で、本発明による組成物に適するのは、β−シクロデキストリンののヒドロキシプロピル、ヒドロキシエチル、グルコシル、マルトシルおよびマルトトリオシル誘導体、カルボキシアミドメチル−β−シクロデキストリン、カルボキシメチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンならびにジエチルアミノ−β−シクロデキストリンである。
【０４２７】
上記のように、本発明の物質組成物は、好ましくは、置換された非結晶質性シクロデキストリンと１種類以上のＣＬＫモジュレータとの水性調製物を含むものである。ＣＬＫモジュレータとシクロデキストリンとの相対量は、各ＣＬＫモジュレータの相対量および該化合物に対するシクロデキストリンの効果に応じて種々である。一般に、シクロデキストリン化合物の重量に対するＣＬＫモジュレータ化合物の重量比は、１：１〜１：１００の範囲である。シクロデキストリンに対し、選択されるＣＬＫモジュレータ化合物は、１：５〜１：５０の範囲、より好ましくは１：１０〜１：２０の範囲の重量対重量比が、ＣＬＫモジュレータの循環利用能の増大に最も有効であると考えられる。
【０４２８】
重要なことに、ＣＬＫモジュレータおよびシクロデキストリンを含む水性溶液が非経口投与される場合、特に、静脈内経路による場合では、シクロデキストリンは発熱性汚染物質を実質的に含まない。種々の形態のシクロデキストリン、例えば、非結晶質性形態のシクロデキストリンが、いくつかの販売元、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．、ＵＳＡ）から購入され得る。ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを作製するための方法は、Ｐｉｔｈａらの米国特許第４，７２７，０６４号（これは、引用により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【０４２９】
化合物を可溶化させるためのシクロデキストリンの使用のさらなる説明は、ＵＳ２００５／００２６８４９（その内容は、引用により本明細書に組み込まれる）を見るとよい。
【０４３０】
急速に崩壊または溶解する投薬形態は、薬学的に活性な薬剤の急速吸収、特に、口腔内および舌下吸収に有用である。高速融解投薬形態は、カプレット剤および錠剤などの典型的な固形投薬形態の嚥下が困難である高齢および小児患者などの患者に有益である。さらに、高速融解投薬形態により、例えば、活性薬剤が患者の口内に長時間留まり、味覚マスキングの量および患者が活性薬剤の喉でのザラザラ感を嫌がり得る程度の決定に重要な役割を果たすチュアブル投薬形態に伴う欠点が回避される。
【０４３１】
かかる問題を解決するため、製造業者により、いくつかの高速融解固形投与経口製剤を開発された。これらは、Ｃｉｍａ  Ｌａｂｓ、Ｆｕｉｓｚ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ．、Ｐｒｏｇｒａｐｈａｒｍ，Ｒ．Ｐ．Ｓｃｈｅｒｅｒ，Ｙａｍａｎｏｕｃｈｉ−Ｓｈａｋｌｅｅ、およびＭｃＮｅｉｌ−ＰＰＣ，Ｉｎｃ．などの製造業者から入手可能である。これらの製造業者はすべて、異なる型の高速溶解性固形経口投薬形態を市販している。例えば、Ｃｉｍａ  Ｌａｂｓによる特許および特許公開公報（米国特許第５，６０７，６９７号、同第５，５０３，８４６号、同第５，２２３，２６４号、同第５，４０１，５１３号、同第５，２１９，５７４号および同第５，１７８，８７８、ＷＯ９８／４６２１５、ＷＯ９８／１４１７９など）；Ｆｕｉｓｚ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（現在、一部、ＢｉｏＶａｉｌのもの）に対する特許（米国特許第５，８７１，７８１号、同第５，８６９，０９８号、同第５，８６６，１６３号、同第５，８５１，５５３号、同第５，６２２，７１９号、同第５，５６７，４３９号および同第５，５８７，１７２号など）；Ｐｒｏｇｒａｐｈａｒｍに対する米国特許第５，４６４，６３２号；Ｒ．Ｐ．Ｓｃｈｅｒｅｒに対する特許（米国特許第４，６４２，９０３号、同第５，１８８，８２５号、同第５，６３１，０２３号および同第５，８２７，５４１号など）；Ｙａｍａｎｏｕｃｈｉ−Ｓｈａｋｌｅｅに対する特許（米国特許第５，５７６，０１４号および同第５，４４６，４６４号など）；Ｊａｎｓｓｅｎに対する特許（米国特許第５，８０７，５７６号、同第５，６３５，２１０号、同第５，５９５，７６１号、同第５，５８７，１８０号および同第５，７７６，４９１号など）；Ｅｕｒａｎｄ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．に対する米国特許第５，６３９，４７５号および同第５，７０９，８８６号；Ｌ．Ａ．Ｂ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈに対する米国特許第５，８０７，５７８号および同第５，８０７，５７７号；Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに対する特許（米国特許第５，１１２，６１６号および同第５，０７３，３７４号など）；Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ  Ｌ．ＬａＦｏｎに対する米国特許第４，６１６，０４７号；Ｔａｋｅｄａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｌｔｄ．に対する米国特許第５，５０１，８６１号；ならびにＥｌａｎに対する米国特許第６，３１６，０２９号を参照のこと。
【０４３２】
高速融解錠剤調製物の一例において、噴霧乾燥または予備圧密化いずれかのプロセスによって作製される高速融解錠剤のための顆粒剤が、賦形剤と混合され、慣用的な錠剤作製機を用いて錠剤に圧縮される。顆粒剤は、さまざまな担体、例えば、低密度で高成型能の糖類、低成型能の糖類、ポリオールの組合せと合わされ、次いで、直接錠剤に圧縮され得、これは、改善された溶解および崩壊プロフィールを示す。
【０４３３】
本発明による錠剤は、典型的には、約２〜約６Ｓｔｒｏｎｇ−Ｃｏｂｂ単位（ｓｃｕ）の硬度を有する。この硬度範囲内の錠剤は、噛んだときに、急速に崩壊または溶解する。さらに、該錠剤は、水中で急速に崩壊（ｄｉｓｅｎｔｅｇｒａｔｅ）する。平均すると、典型的な１．１〜１．５グラムの錠剤は、攪拌なしで１〜３分で崩壊する。この急速崩壊により、活性物質の送達が助長される。
【０４３４】
錠剤の作製に使用される顆粒剤は、例えば、低密度アルカリ土類金属塩または炭水化物の混合物であり得る。例えば、アルカリ土類金属塩の混合物としては、炭酸カルシウムと水酸化マグネシウムの組合せが挙げられる。同様に、高速融解錠剤は、Ａ）噴霧乾燥された非常に軽量の炭酸カルシウム／マルトデキストリン、Ｂ）水酸化マグネシウムならびにＣ）共晶ポリオールの組合せ（例えば、例えば、Ｓｏｒｂｉｔｏｌ  Ｉｎｓｔａｎｔ、キシリトールおよびマンニトールの使用が組み込まれた本発明の方法に従って調製され得る。これらの材料は、非常に容易に溶解し、活性成分の高速崩壊を促進する低密度錠剤を作製するために組み合わされている。さらに、予備圧密化顆粒剤および噴霧乾燥顆粒剤を、同じ錠剤中で合わせてもよい。
【０４３５】
高速融解錠剤調製物のためには、本発明に有用なＣＬＫモジュレータは、固形、微粒状、顆粒、結晶性、油性または溶液などの形態であり得る。本発明における使用のためのＣＬＫモジュレータは、噴霧乾燥生成物またはより硬質の顆粒形態に予備圧密化して医薬の味を低減させた吸着質であり得る。本発明における使用のための医薬活性成分は、噛んだときに活性成分が錠剤から容易に抽出されるのを抑制する担体とともに噴霧乾燥され得る。
【０４３６】
本発明の錠剤への直接添加に加え、医薬薬物それ自体を、製剤中に組み込む前に、密度を増大させる予備圧密化プロセスによって処理してもよい。
【０４３７】
本発明に用いられる予備圧密化プロセスは、可溶性が不充分な医薬材料を、従来の投薬形態よりもかかる医薬材料の放出が改善されるように送達するために使用され得る。これにより、より少ない投薬量レベルの使用で、同等の生物学的に利用可能なレベルの薬物の送達が可能となり得、それにより、現在市販されている薬物および新たな化学的存在体の両方の毒性レベルが低下され得る。可溶性が不十分な医薬材料は、ナノメートルサイズの粒子であるナノ粒子の形態で使用され得る。
【０４３８】
活性成分および低密度アルカリ土類金属塩および／または水可溶性の炭水化物から調製される顆粒剤に加え、高速融解錠剤は、慣用的な担体または賦形剤および充分に確立された製薬手法を用いて製剤化され得る。慣用的な担体または賦形剤としては、限定されないが、希釈剤、結合剤、接着剤（すなわち、セルロース誘導体およびアクリル系誘導体）、滑沢剤（すなわち、ステアリン酸マグネシウムまたはカルシウム、植物油、ポリエチレングリコール、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンモノステアレート）、崩壊剤、着色剤、フレーバー剤、保存料、甘味料および種々の多くの物質、例えば、バッファーおよび吸着剤などが挙げられる。高速融解錠剤の調製のさらなる説明は、例えば、米国特許第５，９３９，０９１号（その内容は、引用により本明細書に組み込まれる）を見るとよい。
【０４３９】
医薬組成物（化粧用調製物を含む）は、重量基準で、約０．００００１〜１００％、例えば、０．００１〜１０％または０．１％〜５％の１種類以上の本明細書に記載のＣＬＫモジュレート化合物を含むものであり得る。
【０４４０】
一実施形態において、本明細書に記載のＣＬＫモジュレート化合物は、一般的に経表面的薬物投与に適した経表面用担体を含有し、当該技術分野で知られた任意のかかる物質を含む経表面用製剤中に組み込まれる。経表面用担体は、所望の形態の、例えば、軟膏、ローション剤、クリーム剤、マイクロエマルジョン剤、ゲル剤、油性剤、液剤などとしての組成物が提供されるように選択され得、天然または合成起源の物質で構成されたものであり得る。選択される担体は、経表面用製剤の活性薬剤または他の成分に有害な影響を与えないものであることが好ましい。本明細書における使用に適した経表面用担体の例としては、水、アルコールおよび他の無毒性の有機溶媒、グリセリン、鉱油、シリコーン、ワセリン、ラノリン、脂肪酸、植物油、パラベン、ワックスなどが挙げられる。
【０４４１】
製剤は、無色、無臭の軟膏、ローション剤、クリーム剤、マイクロエマルジョン剤およびゲル剤であり得る。
【０４４２】
ＣＬＫモジュレート化合物は、一般的に半固形調製物であって典型的にはワセリンまたは他の石油誘導体を主成分とする軟膏中に組み込まれ得る。使用される具体的な軟膏基剤は、当業者によって認識されようが、最適な薬物送達をもたらし、好ましくは、他の所望の特性（例えば、エモリエント性など）も同様にもたらすものである。他の担体またはビヒクルと同様、軟膏基剤は、不活性で安定な非刺激性および非感作性であるのがよい。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ（前掲）に説明されているように、軟膏基剤は、４つの類型：油性基剤；乳化性基剤；エマルジョン基剤；および水溶性基剤に分類され得る。油性の軟膏基剤としては、例えば、植物油、動物から得られる脂肪、および石油から得られる半固形炭化水素が挙げられる。乳化性の軟膏基剤はまた、吸収性軟膏基剤としても知られ、水分をほとんどまたは全く含有しないものであり、例えば、ヒドロキシステアリン硫酸塩、無水ラノリンおよび親水性ワセリンが挙げられる。エマルジョンの軟膏基剤は、油中水型（Ｗ／Ｏ）エマルジョンまたは水中油型（Ｏ／Ｗ）エマルジョンのいずれかであり、例えば、セチルアルコール、モノステアリン酸グリセリル、ラノリンおよびステアリン酸が挙げられる。例示的な水溶性軟膏基剤は、種々の分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）から調製されるものであり、この場合も、さらなる情報については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ（前掲）を参照されたい。
【０４４３】
ＣＬＫモジュレート化合物は、ローション剤中に組み込まれ得、ローション剤は、一般的に、摩擦なく皮膚表面に適用するための調製物であり、典型的には、活性薬剤などの固形粒子を水またはアルコール基剤中に存在させた液状または半液状の調製物である。ローション剤は、通常、固形物の懸濁液であり、水中油型の液状油性エマルジョンを構成したものであり得る。ローション剤は、より流動性の組成物が容易に適用されるため、広い体表面積を処置するのに好ましい製剤である。一般的に、ローション剤中の不溶分は微細化されていることが必要である。ローション剤は、典型的には、より良好な分散をもたらすための懸濁剤、ならびに活性薬剤を局在させ、皮膚と接触した状態に保持するのに有用な化合物（例えば、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなど）を含有するものである。本発明の方法とともに使用するための例示的なローション剤製剤は、親水性ワセリン（これは、商標ＡｑｕａｐｈｏｒＴＭでＢｅｉｅｒｓｄｏｒｆ、Ｉｎｃ．（Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）から得られるものであり得る）と混合されたプロピレングリコールを含有するものである。
【０４４４】
ＣＬＫモジュレート化合物は、クリーム剤中に組み込まれ得、クリーム剤は、一般的に、粘性の液状または半固形のエマルジョン剤（水中油型または油中水型いずれか）である。クリーム剤の基剤は水洗可能であり、油相、乳化剤および水相を含有するものである。油相は、一般的に、ワセリンおよび脂肪族アルコール（セチルまたはステアリルアルコールなど）で構成され、水相は、通常（必ずしもそうでなくてもよいが）、油相よりも容積が大きく、一般的に湿潤剤を含有するものである。クリーム剤製剤中の乳化剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ（前掲）に説明されているように、一般的に、非イオン系、アニオン系、カチオン系または両性界面活性剤である。
【０４４５】
ＣＬＫモジュレート化合物は、マイクロエマルジョン剤中に組み込まれ得、マイクロエマルジョン剤は、一般的に、熱力学的に安定であり、２種類の非混和性の液体（油と水など）等方的に透明な分散液であって、界面活性剤分子の界面膜によって安定化されものである（Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、１９９２）、容積  ９）。マイクロエマルジョン剤の調製には、界面活性剤（乳化剤）、補助界面活性剤（補助乳化剤）、油相および水相が必要である。好適な界面活性剤としては、エマルジョン剤の調製に有用な任意の界面活性剤、例えば、クリーム剤の調製に典型的に使用される乳化剤が挙げられる。補助界面活性剤（または「補助乳化剤」）は、一般的に、ポリグリセロール誘導体、グリセロール誘導体および脂肪族アルコールの群から選択される。好ましい乳化剤／補助乳化剤組合せは、一般的に（必ずしもそうでなくてもよいが）、モノステアリン酸グリセリルおよびポリオキシエチレンステアレート；ポリエチレングリコールおよびエチレングリコールパルミトステアレート；ならびにカプリン酸およびカプリル酸トリグリセリドならびにオレイルマクロゴルグリセリドからなる群より選択される。水相としては、水だけでなく、典型的には、バッファー、グルコース、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、好ましくは、低分子量ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ  ３００およびＰＥＧ  ４００）および／またはグリセロールなどが挙げられ、一方、油相は、一般的に、例えば、脂肪酸エステル、改質植物油、シリコーン油、モノ−、ジ−およびトリグリセリドの混合物、ＰＥＧのモノ−およびジエステル（例えば、オレイルマクロゴルグリセリド）などを含むものである。
【０４４６】
ＣＬＫモジュレート化合物は、ゲル製剤中に組み込まれ得、ゲル製剤は、一般的に、小さな無機粒子で構成された懸濁剤（二相系）、または担体液中に全体に実質的に均一に分布された大きな有機分子（単相ゲル剤）のいずれかからなる半固形の系である。単相ゲル剤は、例えば、活性薬剤、担体液および適当なゲル化剤、例えば、トラガカント（２〜５％で）、アルギン酸ナトリウム（２〜１０％で）、ゼラチン（２〜１５％で）、メチルセルロース（３〜５％で）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（２〜５％で）、カルボマー（０．３〜５％で）またはポリビニルアルコール（１０〜２０％で）を一緒に合わせ、特徴的な半固形生成物が得られるまで混合することにより作製され得る。他の適当なゲル化剤としては、メチルヒドロキシセルロース、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン、ヒドロキシエチルセルロースおよびゼラチンが挙げられる。ゲル剤には、一般に水性担体液が使用されるが、アルコールおよび油類も同様に、担体液として使用され得る。
【０４４７】
当業者に知られた種々の添加剤を製剤（例えば、経表面用製剤）中に含めてもよい。添加剤の例としては、限定されないが、可溶化剤、皮膚透過性向上剤、乳濁剤、保存料（例えば、抗酸化剤）、ゲル化剤、緩衝剤、界面活性剤（特に、非イオン系および両性界面活性剤）、乳化剤、エモリエント剤、増粘剤、安定剤、湿潤剤、着色剤、香料などが挙げられる。可溶化剤および／または皮膚透過性向上剤を、乳化剤、エモリエント剤および保存料とともに含めることは特に好ましい。最適な経表面用製剤は、ほぼ２ｗｔ％〜６０ｗｔ％、好ましくは２ｗｔ％〜５０ｗｔ％の可溶化剤および／または皮膚透過性向上剤；２ｗｔ％〜５０ｗｔ％、好ましくは２ｗｔ％〜２０ｗｔ％の乳化剤；２ｗｔ％〜２０ｗｔ％のエモリエント剤；ならびに０．０１〜０．２ｗｔ％の保存料を、活性薬剤および製剤の残部を構成する担体（例えば、水）とともにを含むものである。
【０４４８】
皮膚透過性向上剤は、治療レベルの活性薬剤が、傷のない皮膚の妥当な大きさの面積を通過することを助長する機能を果たす。好適な向上剤は、当該技術分野でよく知られており、
例えば、低級アルカノール（メタノール  エタノールおよび２−プロパノールなど）；アルキルメチルスルホキシド（ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、デシルメチルスルホキシド（Ｃ１０  ＭＳＯ）およびテトラデシルメチルスルホキシドなど）；ピロリドン（２−ピロリドン、Ｎ−メチル−２−ピロリドンおよびＮ−（−ヒドロキシエチル）ピロリドンなど）；尿素；Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルアミド；Ｃ２〜Ｃ６アルカンジオール；種々の他の溶媒（ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）およびテトラヒドロフルフリルアルコールなど）；ならびに１−置換アザシクロヘプタン−２−オン、特に、１−ｎ−ドデシルシクラザシクロヘプタン−２−オン（ラウロカプラム；商標ＡｚｏｎｅＲＴＭでＷｈｉｔｂｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｖａ．から入手可能）が挙げられる。
【０４４９】
可溶化剤の例としては、限定されないが、以下のもの：親水性エーテル（ジエチレングリコールモノエチルエーテル（エトキシジグリコール、ＴｒａｎｓｃｕｔｏｌＲＴＭとして入手可能）およびジエチレングリコールモノエチルエーテルオレエート（ＳｏｆｔｃｕｔｏｌＲＴＭとして入手可能）など）；ポリエチレンヒマシ油誘導体（ポリオキシ３５  ヒマシ油、ポリオキシ４０水添ヒマシ油など）；ポリエチレングリコール、特に、低分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ  ３００およびＰＥＧ  ４００など）ならびにポリエチレングリコール誘導体（ＰＥＧ−８カプリン酸／カプリル酸グリセリド（ＬａｂｒａｓｏｌＲＴＭとして入手可能）など）；アルキルメチルスルホキシド（ＤＭＳＯなど）；ピロリドン（２−ピロリドンおよびＮ−メチル−２−ピロリドンなど）；ならびにＤＭＡが挙げられる。また、多くの可溶化剤が吸収向上剤としても作用し得る。単独の可溶化剤が、製剤中に組み込まれてもよく、可溶化剤の混合物が組み込まれてもよい。
【０４５０】
好適な乳化剤および補助乳化剤としては、限定されないが、マイクロエマルジョン剤製剤に関して記載した乳化剤および補助乳化剤が挙げられる。エモリエント剤としては、例えば、プロピレングリコール、グリセロール、ミリスチン酸イソプロピル、ポリプロピレングリコール−２（ＰＰＧ−２）ミリスチルエーテルプロピオネートなどが挙げられる。
【０４５１】
また、他の活性薬剤を例えば、他の抗炎症剤、鎮痛剤、抗菌剤、抗真菌剤、抗生物質、ビタミン類、抗酸化剤、および一般にサンスクリーン製剤に見られる日焼け止め剤、例えば、限定されないが、アントラニル酸塩、ベンゾフェノン（特に、ベンゾフェノン−３）、カンファー誘導体、シンナメート（例えば、桂皮酸オクチルメトキシ）、ジベンゾイルメタン（例えば、ブチルメトキシジベンゾイルメタン）、ｐ−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）およびその誘導体、ならびにサリチレート（例えば、サリチル酸オクチル）を製剤中に含めてもよい。
【０４５２】
特定のある経表面用製剤では、活性薬剤を、製剤のほぼ０．２５ｗｔ％〜７５ｗｔ％の範囲、好ましくは製剤のほぼ０．２５ｗｔ％〜３０ｗｔ％の範囲、より好ましくは製剤のほぼ０．５ｗｔ％〜１５ｗｔ％の範囲、
最も好ましくは製剤のほぼ１．０ｗｔ％〜１０ｗｔ％の範囲の量で存在させる。
【０４５３】
経表面的皮膚処置用組成物は、その粘性および消費者が意図する用途に適合する適当な容器内にパッケージングされ得る。例えば、ローション剤またはクリーム剤は、ビンまたはロール曲げアプリケータもしくはプロペラント駆動型エーロゾルデバイスまたは指での操作に適したポンプが取り付けられた容器内にパッケージングされ得る。該組成物がクリーム剤である場合、ｉこれは、変形不可能なビンまたは搾り出し容器（チューブまたは蓋付瓶など）内に単純に保存され得る。また、該組成物を、米国特許第５，０６３，５０７米国特許第  号５，０６３，５０７に記載のものなどのカプセル剤に含めてもよい。したがって、本明細書において規定される化粧用として許容され得る組成物を入れた密閉容器もまた提供される。
【０４５４】
択一的な実施形態において、医薬製剤は、経口または非経口投与のために提供され、その場合、製剤は、上記のようなモジュレート化合物含有マイクロエマルジョン剤を含むものであり得るが、経口または非経口薬物投与に特に適した代替的な薬学的に許容され得る担体、ビヒクル、添加剤などを含有するものであってもよい。あるいはまた、モジュレート化合物含有マイクロエマルジョン剤は、変更することなく実質的に上記のようにして経口または非経口投与され得る。
【０４５５】
目の状態は、例えば、ＣＬＫモジュレート化合物の全身性、経表面的、眼内注射によって、またはＣＬＫモジュレート化合物を放出する徐放デバイスの挿入によって処置または予防され得る。ＣＬＫタンパク質のレベルおよび／または活性を増大または低下させるＣＬＫモジュレート化合物は、薬学的に許容され得る眼科用ビヒクルにて、該化合物が眼の表面と、該化合物が角膜および目の内部領域、例えば、前眼房、後眼房、ガラス体、眼房水、がらす体液、角膜、虹彩／睫毛、レンズ、脈絡膜／網膜および強膜などを透過することを可能にするのに充分な期間接触した状態で維持されるように送達され得る。薬学的に許容され得る眼科用ビヒクルは、例えば、軟膏、植物油またはカプセル封入用材料であり得る。あるいはまた、本発明の化合物は、ガラス体液および眼房水中に直接注射され得る。さらなる択一法では、該化合物は、目の処置のために、静脈内注入または注射などによって全身投与され得る。
【０４５６】
本明細書に記載のＣＬＫモジュレート化合物は、当該技術分野の方法に従って、無酸素環境内に保存され得る。
【０４５７】
例えば、ＣＬＫモジュレート化合物によりエキソビボで処理された細胞は、被験体に移植片を投与する方法に従って投与され得、これは、例えば、免疫抑制薬薬物、例えばシクロポリンＡの投与伴うものであり得る。医薬用製剤の一般的な原理については、Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、およびＣｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、Ｇ．Ｍｏｒｓｔｙｎ  ＆  Ｗ．Ｓｈｅｒｉｄａｎ編、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６；ａｎｄ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｅ．Ｄ．Ｂａｌｌ、Ｊ．Ｌｉｓｔｅｒ  ＆  Ｐ．Ｌａｗ、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、２０００を参照されたい。
【０４５８】
ＣＬＫモジュレート化合物の毒性および治療有効性は、標準的な製薬手順によって、細胞培養または実験動物において測定され得る。ＬＤ５０は、集団の５０％に対して致死性の用量である。ＥＤ５０は、集団の５０％に対して治療有効性である用量である。毒性と治療効果（ＬＤ５０／ＥＤ５０）間の用量比は、治療指数である。大きな治療指数を示すＣＬＫモジュレート化合物が好ましい。毒性の副作用を示すＣＬＫモジュレート化合物を使用してもよいが、かかる化合物を罹患組織部位に、非感染細胞に対する損傷の可能性を最小限に抑え、それにより副作用が低減されるように標的化する送達系が設計されるように注意しなければならない。
【０４５９】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータを用いて、ヒトにおける使用のための投薬量範囲が策定され得る。かかる化合物の投薬量は、毒性がほとんどまたは全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内であり得る。該投薬量は、使用される投薬形態および使用される投与経路に応じて、この範囲内で種々であり得る。任意の化合物に対して、治療有効用量は、最初に、細胞培養アッセイから推定され得る。ＩＣ５０を含む循環血漿濃度範囲（すなわち、症状の最大阻害の半分が達成される試験化合物の濃度）が達成される用量が、細胞培養で測定したようにして、動物モデルにおいて策定され得る。かかる情報を用い、ヒトにおける有用な用量が、より正確に決定され得る。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
【０４６０】
６．キット
また、本明細書においてキット、例えば、治療目的のためのキット、または細胞の寿命をモジュレートするため、もしくはアポトーシスをモジュレートするためのキットが提供され得る。キットは、１種類以上のＣＬＫモジュレート化合物を、例えば所定の用量で含むものであり得る。キットは、任意選択で、細胞を該化合物と接触させるためのデバイス、および使用のための使用説明書を含むものであり得る。デバイスとしては、シリンジ、ステントおよびＣＬＫモジュレート化合物を被験体（例えば、被験体の血管内）に導入するため、または被験体の皮膚に適用するための他のデバイスが挙げられる。
【０４６１】
本発明の方法の実施には、特に記載のない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子組み換え生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の慣用的な手法が用いられ、それらは、当該技術分野の技量の範囲内である。かかる手法は、文献に充分に説明されてる。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ  編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓら
米国特許第４，６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  編集１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  編集１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ  編、１９８７、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５４および１５５巻（Ｗｕら編集）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８６）を参照のこと。
【実施例】
【０４６２】
本発明は、ここで一般的に記載され、本発明のある種の態様および実施形態の例示目的のために単に含まれる以下の実施例を参照することによって理解され、そして、いかなる形であれ発明を限定することを目的としない。
【０４６３】
実施例１：ＣＬＫは、サーチュインおよびＰＧＣ−１αタンパク質と相互作用し、リン酸化する
ＣＬＫおよびサーチュインまたはＰＧＣ−１αの間の相互作用を試験するために、種々の実験を行った。これらの実験の結果は、図中で例示される。図に示される実験を行うために使用される材料および方法を、以下に記載する。
【０４６４】
細胞培養。ＨＥＫ２９３細胞を、ＤＭＥＭ＋１０％ＣＣＳで培養した。ＦＡＯラット肝細胞を、５％ＦＢＳを有するハムのＦ−１２培地で育成した。実験またはアデノウイルス感染の前に、培地をＲＰＭＩ＋０．５％ＢＳＡに交換した。Ｈ２．３５マウス肝細胞を、ＤＭＥＭ（低グルコース）＋４％ＦＢＳおよび２Ｍデキサメタゾンで育成した。実験および感染の前に、培地を、ＤＭＥＭ（低グルコース）＋０．５％ＢＳＡに交換した。ＣＬＫ阻害剤、ＴＧ００３（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ）をＤＭＳＯに溶解させた。図４Ａ、９Ａ、９Ｂ、１１Ａおよび１１Ｂで示されるように、処置は、以下の最終濃度であった：２００ｎＭインスン、デキサメタゾン１μＭおよびホルスコリン５μＭ。
【０４６５】
プラスミドおよびアデノウイルス構造。マウスＣＬＫ２（ｍＣＬＫ２）を、Ｔａｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でスーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）のワンステップＲＴ−ＰＣＲを使用してマウス肝臓ＲＮＡからクローン化し、Ｎ末端フラグタグ化されたｐｃＤＮＡ３にクローン化した。ＣＬＫ２  Ｋ１９２Ｒ変異は、部位特異的変異誘発によって引き起こされた。フラグ−ＣＬＫ２をｐＡＤ−Ｔｒａｃｋ−ＣＭＶにクローン化することによってアデノウイルスを構築し、ＢＪ５１８３−ＡＤ−１バクテリア（ストラタジーン）中でｐＡｄ−Ｅａｓｙ−１を用いた組換えによって、全長アデノウイルスを作製した。マウス、ラットおよびヒトＣＬＫ２（５’ｃｃｔ  ｔｃｇ  ａｔｔ  ｔｃｃ  ｔｃａ  ａａｇ  ａｃａ）（配列番号：１５）および対照ｓｉＲＮＡ（５’  ｃｃｔ  ｔｃｇ  ａｔｔ  ｃｃｃ  ｔｃａ  ａａｇ  ａｃａ）（配列番号：１６）に対応するオリゴ糖を、ｐＬＫ０−ｐｕｒｏにアニールした。Ｕ６プロモーターおよびｓｉＲＮＡ配列を、ｐＡｄ−Ｔｒａｃｋにクローン化することによって、アデノウイルスを構築した。
【０４６６】
一過性トランスフェクション。ＰｏｌｙＦｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ＨＥＫ２９３をトランスフェクトした。ｐｃＤＮＡマウスＰＧＣ−１αおよびｐｃＤＮＡ  Ｆｌａｇ−ＣＬＫ２を用いて、２５ｎｇのリポーター（ｇＡＦ１−ルシフェラーゼ）および２５ｎｇのｐｃＤＮＡマウスＨＮＦ４−αをトランスフェクトした。空のベクターｐｃＤＮＡの適量を加えることによって、等量の全ＤＮＡを、全トランスフェクションに使用した。トランスフェクションの４時間後に、ＴＧ００３（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を添加し、細胞を翌朝収集した。示されるデータは、単回の実験からの３つの複製の平均であるが、全てのルシフェラーゼ実験を、類似の結果で少なくとも３回実行した。
【０４６７】
免疫沈降および免疫共沈降。ホスファターゼ阻害剤（５ｍＭグリセロール−２−ホスフェート、２０ｍＭ  ＮａＦ、および０．２ｍＭ  Ｎａオルトバナデート）を含有するＰＢＳで、細胞を１回洗浄し、管内にこすり落とし、回転数を下げ、そして、０．４％トリトン、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＫＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．９）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ホスファターゼ阻害剤、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、および１×プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｓｈｅ）中での２回凍結融解周期によって溶解させた。４℃で２時間回転させる間、Ｍ２抗−フラグアガロース（Ｓｉｇｍａ）または抗−ＨＡアガロース（Ｒｏｃｈｅ）を用いて免疫沈降を実行し、続いて溶解緩衝液中で３回洗浄した。生成物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって溶解させ、ウエスタンブロット分析のためにＰＶＤＦ膜に移行させた。
【０４６８】
代謝標識。ＨＥＫ２９３を、先に述べたようにトランスフェクトした。翌朝、細胞を、３０分間ＰＯ４＋１０％ＣＣＳなしのＤＭＥＭに交換し、次いで、細胞を、３０分間ＴＧ００３を用いて、または用いずに処置し、次いで、２００μＣｉの３２ＰＯ４を、２時間添加した。上記のように細胞を収集して免疫沈降を実行した。免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって溶解させ、ＰＶＤＦ膜に移行し、膜をホスホイメージングスクリーンにさらし、続いて抗フラグ抗体（Ｍ２、Ｓｉｇｍａ）を使用したウエスタンブロットによって、３２ＰＯ４を検出した。
【０４６９】
ＦＡＯ肝細胞を、ＲＰＭＩ＋０．５％ＢＳＡで２日間、図に示すとおりのアデノウイルスで感染させた。細胞が４時間、３２ＰＯ４でインキュベートされる以外は、上記のとおり代謝標識を実行した。
【０４７０】
ノザンブロットおよびＲＮＡ分析。ＦＡＯ肝細胞を、ＰＲＭＩ＋０．５％ＢＳＡで一夜、指示されたアデノウイルスで感染させた。細胞を、ＲＰＭＩ＋０．５％ＢＳＡでさらに２日間成長させた。細胞を指示のように処置した。全ＲＮＡを、トリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して分離した。指示されたｃＤＮＡを使用しているノザンブロットを、１５μｇの全ＲＮＡの上で実行した。膜をリン光体−イメージャ・スクリーンにさらすことによって、ＲＮＡの定量化を実行し、そして、バイオラッド・パーソナル・イメージャ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｉｍａｇｅｒ）ＦＸおよびＱｕａｎｔｉｔｙ−Ｏｎｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって分析した。
【０４７１】
スプライシング分析。指示された阻害剤、その後インスリンで２時間前処理されたＦＡＯ肝細胞から、全ＲＮＡを単離した。Ｃｌｋ２およびＣｌｋ１上でエキソン４の側方のプライマーを使用して、１ｕｇの全ＲＮＡ上のｔａｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたスーパースクリプトのワンステップＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＲＴ−ＰＣＲを実行した。
【０４７２】
ＣＬＫ１および２の発現および精製。発現プロトコールは、ｐｄｂデータベース（１Ｚ５７）で報告され且つ図１３Ａおよび１３Ｂで示されるとおり、１．７Åでの１０Ｚ−２ヒメニアルジシンとの複合体でのヒトＣＬＫ１および結晶構造に関するタンパク質用の精製プロトコールに部分的に基づいている。
【０４７３】
簡潔に、ＣＬＫ１およびＣＬＫ２の発現についてＴ７プロモーターに基づいたベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＰまたはＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換させ、ＬＢ寒天プレート上に置いた。新たに成長したコロニーの１つを採集し、３７℃で、一晩、少量培養物（５ｍｌ、ＬＢ、テリフィックブロス、スーパーブロス（販売者はいずれもＲＰＩ）またはＭ９培地（販売者Ｔｅｃｋｎｏｖａ）のいずれかの１００ｍｇ／ｍＬアンピシリン（ＡＭＰ）中で成長させる。培養物を、ＡＭＰ（最終濃度１ｍＭ）を含む新たな培地に１００倍に希釈し、０．８のＯＤ６００まで３７℃で成長させる。培養物を、ＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）を用いた誘導の前に１８℃の温度に冷却する。培養物を、１８℃で１２時間の誘発時間の後に収集する。
【０４７４】
６分間、８０００×ｇで細胞を収集し、溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール）で再懸濁し、３０分間リゾチーム（ｌｙｚｏｚｙｍｅ）（５ｍｇ／ｇ細胞ペースト）で、続いて１０分間超音波で溶解させる。その後、細胞を、４５分間、３０，０００×ｇで遠心分離し、上澄を、核酸除去のためにＤＥ５２カラム（Ｗｈａｔｍａｎ）にかける。貫流を収集し、アフィニティクロマトグラフィ用のＮｉキレートカラムにかけた。カラムを洗浄用緩衝液（２０ｍＭイミダゾール、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ８．０））で洗浄して、内在性結合タンパク質を除去する。ＴＥＶまたはＰｒｅ切断プロテアーゼ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のいずれかを用いて、一晩、タンパク質をカラムから取り、並びにＧＳＴタグ化ラムダホスファターゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ビバリー）で脱リン酸化する。上澄を収集し、サイズ排除クロマトグラフィ用に１２ｍｇ／ｍＬまで濃縮する。２ｍＬ分画の濃縮タンパク質を、Ｓ２００  １６／６グローバルサイジングカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかけ、タンパク質ピークを収集し、ＳＤＳおよび生来のポリアクリルアミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって可溶性について分析する。イオン交換クロマトグラフィ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた別の精製は任意選択的である。
【０４７５】
タンパク質を、１５ｍｇ／ｍＬに濃縮し、保存緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０％グリセロール、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））に対して透析し、８０℃にて一定分量で保存する。
【０４７６】
ＣＬＫインビトロキナーゼアッセイ。ＣＬＫの活性を測定する例示的キナーゼアッセイを、図１２で模式的に示す。簡潔には、４０μＬの最終体積中に２００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、８ｍＭジチオスレイトール、４ｍＭ  ＥＧＴＡ、１−２０μＭ  ＡＴＰ、１μＣｉの［ガンマ−３２Ｐ］ＡＴＰ、ＳＦ２／ＡＳＦ  ＲＳドメインの合成ペプチド（ＮＨ２−ＲＳＰＳＹＧＲＳＲＳＲＳＲＳＲＳＲＳＲＳＲＳＮＳＲＳＲＳＹ−ＯＨ）（配列番号：９）１μｇ、および精製キナーゼ０．１−１μｇを含有する反応混合物中でＣＬＫを評価する。阻害剤濃度にかかわらず、ＤＭＳＯの最終濃度を１％に調整する。反応混合物を、１０分間３０℃でインキュベートし、半分をＰ８１ホスホセルロース膜（Ｗｈａｔｍａｎ）にスポット付けする。インキュベーション期間およびキナーゼと基質との濃度を含めたキナーゼアッセイ条件を、インキュベートの間、線形性を維持するように最適化する。少なくとも１５分間、膜を、５％リン酸溶液で洗浄する。液体シンチレーション計測器を使用して放射活性を測定する。キナーゼなしに反応混合物からバックグランド数を差引くことによって総放射活性を推定し、データは、溶媒を含有する対照サンプルに対する百分率として表現される。
【０４７７】
ＣＬＫ阻害剤の例。図１４は、米国特許出願第２００５／０１７１０２６号で記述されるとおり既知ＣＬＫ阻害剤の構造を示す。図１５は、１つの代表的ＣＬＫ阻害剤の合成を記述する。特に、５−メトキシ−２−メチルベンゾチアゾール（２０２ｍｇ、１．１２ミリモル）およびヨウ化エチル（２．７０ｍｌ、３３．７ミリモル）を、２４．５時間環流させた。沈殿物を濾過し、漏斗にて酢酸エチル（２０ｍｌ）を用いて洗浄し、減圧下で乾燥させて、ヨウ化３−エチル−５−エトキシ−２−メチルベンゾチアゾリウム（２７０ｍｇ、０．８０５ミリモル、７１．９％）を淡緑色固体として得た。アセトニトリル（２．０ｍｌ）中のヨウ化３−エチル−５−メトキシ−２−メチルベンゾチアゾリウム（５０２ｍｇ、１．４９ミリモル）の懸濁液に、無水酢酸（３３０μＬ、３．４９ミリモル）およびトリエチルアミン（４９０μｌ、３．５１ミリモル）を室温で継続的に添加した。２時間の環流の後、混合物を室温に冷却し、減圧下で濃縮した。その残渣に水（５０ｍｌ）を添加し、混合物を酢酸エチル（１５ｍｌで３回）で抽出した。合わせた有機抽出物を、ブライン（３０ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィ（１８ｇ、ＣＨ２Ｃｌ２／酢酸エチル、４：１）によって残渣を精製して、（Ｚ）−１−（３−エチル−５−メトキシ−２，３−ジヒドロベンゾチアゾール−２−イリデン）プロパン−２−オン（２０１ｍｇ、０．８０６ミリモル、５４．１％）を淡黄色固体として得た。
【０４７８】
実施例２：サーチュイン発現および活性アッセイ
サーチュインの活性を測定するために、蛍光偏光または質量スペクトル測定法に基づいたアッセイを使用できる。ＣＬＫによるリン酸化などの翻訳後修飾に起因するサーチュイン酵素活性における変動を測定するために、同アッセイを使用できる。サーチュインの翻訳後修飾および活性を調節する小型分子の影響を見るために、同アッセイを使用できる。蛍光偏光アッセイは、既知サーチュイン脱アセチル化標的であるｐ５３断片に基づいた２つの異なるペプチドのうちの１つを含む多様なペプチド基質を利用できる。基質は、以下のとおり１４のアミノ酸残基を有するペプチド１：ＧＱＳＴＳＳＨＳＫ（Ａｃ）ＮｌｅＳＴＥＧ（配列番号：１１）（Ｋ（Ａｃ）が、アセチル化リジン残基であり、Ｎｌｅが、ノルロイシンである）、または以下の通りに２０のアミノ酸残基を有するペプチド２：ＥＥ−Ｋ（ビオチン）−ＧＱＳＴＳＳＨＳＫ（Ａｃ）ＮｌｅＳＴＥＧ［０］−Ｋ（ＭＲ１２１）−ＥＥ−ＮＨ２（配列番号：１３）（Ｋ（ビオチン）は、ビオチン化リジン残基であり、Ｋ（Ａｃ）はアセチル化リシン残基であり、Ｎｌｅはノルロイシンであり、そしてＫ（ＭＲ１２１）はＭＲ１２１フルオロフォアによって修飾されたリシン残基である）を含有しうる。Ｃ末端にフルオロフォアＭＲ１２１（励起６３５ｎｍ／発光６８０ｎｍ）で、およびＮ末端にビオチンで、ペプチドを標識した。代替の基質は、以下と同じ２０のアミノ酸残基を有するペプチド：Ａｃ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ（ビオチン）−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ（Ａｃ）−Ｎｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（５ＴＭＲ）−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−ＮＨ２（配列番号：１４）（Ｋ（Ａｃ）はアセチル化リシン残基であり、Ｎｌｅはノルロイシンであり、Ｋ（５ＴＭＲ）はＭＲ１２１フルオロフォアによって修飾されたリシン残基である）を含有する。ペプチドを、Ｃ末端でフルオロフォア５ＴＭＲ（励起５４０ｎｍ／発光５８０ｎｍ）で標識する。ペプチドおよび基質の両方の配列は、いくつかの修飾を有するｐ５３に基づく。特に、ペプチドが脱アセチル化の不在下でトリプシン切断の影響を受けやすくないようにするために、アセチル化リシン以外の全アルギニンおよびロイシン残基をセリンと置換した。さらに、メチオニンが合成および精製の際に酸化の影響を受けやすい場合があるので、配列中に天然に存在するメチオニン残基をノルロイシンに置換した。
【０４７９】
ＮＡＤ＋の存在下で、翻訳後修飾の前後のいずれかに、ペプチド基質をサーチュインタンパク質にさらして、基質の脱アセチル化を可能にし、かつ基質にトリプシンによる切断に敏感にさせる。その後、トリプシンを添加し、そして完了する（すなわち、脱アセチル化基質を切断する）まで反応を実施し、それによりＭＲ１２１または５ＴＭＲ断片を放出する。未切断基質（すなわち残りのいずれかのアセチル化基質）と切断ペプチド基質の非蛍光部分（すなわちビオチン含有断片）とを、ストレプトアバジン（ｓｔｒｅｐｔａｖａｄｉｎ）を使用した反応から除去する。ストレプトアビジンに対する全長ペプチド基質結合について観察される蛍光偏光シグナルは、放出ＭＲ１２１または５ＴＭＲ  Ｃ末端断片について観察される蛍光偏光シグナルより高い。このようにして、得られた蛍光偏光は、脱アセチル化（例えば、シグナルは、サーチュインタンパク質の活性に反比例する）のレベルに反比例する。結果は、適切な励起および発光フィルターを有するマイクロプレート蛍光偏光読取装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  ＭＤ）で読取る。
【０４８０】
ペプチド１を使用した蛍光偏光アッセイを以下の通りに行うことができる：０．５μＭペプチド基質および１５０μＭ  βＮＡＤ＋を、反応緩衝液（２５ｍＭのトリス−酢酸塩（ｐＨ８）、１３７ｍＭ  Ｎａ−Ａｃ、２．７ｍＭ  Ｋ−Ａｃ、１ｍＭ  Ｍｇ−Ａｃ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、０．１％のプルロニックＦ１２７、１０ｍＭのＣａＣｌ２、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．０２５％  ＢＳＡ、０．１５ｍＭニコチンアミド）中で、３７℃で６０分間、０．１μｇ／ｍＬ  ＳＩＲＴ１と共にインキュベートした。ペプチド２を使用した蛍光偏光アッセイを、以下の通りに行うことができる：０．５μＭペプチド基質および１２０μＭ  βＮＡＤ＋を、反応緩衝液（２５ｍＭ  トリス−酢酸塩（ｐＨ８）、１３７ｍＭ  Ｎａ−Ａｃ、２．７ｍＭ  Ｋ−Ａｃ、１ｍＭ  Ｍｇ−Ａｃ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０、０．１％のプルロニックＦ１２７、１０ｍＭのＣａＣｌ２、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．０２５％ＢＳＡ）中で、２５℃で２０分間、３ｎＭ  ＳＩＲＴ１と共にインキュベートした。試験化合物の影響は、試験化合物を反応混合物に添加し、続いてＤＭＳＯ中での可溶化によって見ることができる。たとえば０．７μＭから３００μＭまでの範囲にある多様な濃度で反応に試験化合物を添加できる。アッセイで使用されるＳＩＲＴ１タンパク質は、Ｈｉｓ−タグ融合体として大腸菌で過剰発現して、標準技術を使用してニッケルキレートカラムで精製した。ＳＩＲＴ１を用いた６０分インキュベーションの後、３ｍＭの最終濃度まで反応にニコチアミドを添加して脱アセチル化反応を停止し、そして０．５μｇ／ｍＬのトリプシンを添加して、脱アセチル化基質を切断する。反応液を、１ｍＭストレプトアビジンの存在下３７℃で３０分間インキュベートする。蛍光偏光を、励起（６５０ｎｍ）および発光（６８０ｎｍ）波長で測定する。その後、種々の濃度の試験化合物の存在下でのサーチュインタンパク質の活性のレベルを測定し、試験化合物の不在下でサーチュインタンパク質の活性のレベルと、および／または負の対照（たとえば阻害のレベル）および陽性対照（たとえば活性化のレベル）でのサーチュインタンパク質の活性のレベルとを比較することができる。
【０４８１】
蛍光偏光アッセイについては、反応（たとえば、最大限のサーチュイン阻害の測定を可能にする）の開始時に負の対照として１μＬの５００ｍＭニコチンアミドを添加することによって、サーチュイン活性の阻害についての制御を行う。化合物の代わりに１μＬのＤＭＳＯと共に３ｎＭのサーチュインタンパク質を使用して、サーチュイン活性の活性化の制御を行って、基質の最大脱アセチル化を達成した（例えば、最大サーチュイン活性化を測定する）。
【０４８２】
質量分析に基づくアッセイは、以下の通りに２０のアミノ酸残基を有するペプチド：Ａｃ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ（ビオチン）−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ（Ａｃ）−Ｎｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（５ＴＭＲ）−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−ＮＨ２（配列番号：１４）（Ｋ（Ａｃ）は、アセチル化されたリシン残基であり、Ｎｌｅはノルロイシンである）を利用する。ペプチドを、Ｃ末端でフルオロフォア５ＴＭＲ（励起５４０ｎｍ／発光５８０ｎｍ）を用いて標識する。ペプチド基質の配列は、いくつかの修飾を有するｐ５３に基づく。さらに、メチオニンが合成および精製の際に酸化の影響を受けやすい場合があるので、配列中に天然に存在するメチオニン残基を、ノルロイシンと置換した。
【０４８３】
質量分析アッセイは、以下の通りに行われる：０．５μＭのペプチド基質および１２０μＭ  βＮＡＤ＋を、反応緩衝液（５０ｍＭのトリス−酢酸塩（ｐＨ８）、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．０５％ＢＳＡ）中で、２５℃で２５分間、１０ｎＭ  ＳＩＲＴ１と共にインキュベートする。試験化合物を、上記のとおり反応液に添加することができる。ＳｉｒＴ１遺伝子を、ベクターを含有するＴ７−プロモーターにクローン化し、そしてＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換する。ＳＩＲＴ１との２５分のインキュベーションの後、１０μＬの１０％蟻酸を添加して、反応を停止させた。反応液を密閉し、そして後の質量スペクトル分析のために凍結する。基質ペプチドの質量の測定は、脱アセチル化ペプチド（生成物）と比較して、アセチル化の程度（すなわち出発原料）の正確な測定を可能にする。
【０４８４】
質量分析に基づくアッセイについて、サーチュイン活性の阻害のための制御を、反応の開始時（例えば、最大のサーチュイン阻害の測定を可能にする）に負の対照として１μＬの５００ｍＭニコチンンアミドを添加することによって行う。サーチュイン活性の活性化の制御を、化合物の代わりに１μＬのＤＭＳＯを用いて、１０ｎＭのサーチュインタンパク質を使用して行って、そのアッセイの線形範囲内で、所定の時点での基質の脱アセチル化の量を測定する。この時点は、試験化合物のために使用されるものと同じであり、そして線形範囲内であり、終点は、速度における変動を示す。
【０４８５】
ＳｉｒＴ１遺伝子を、Ｔ７−プロモーター含有ベクターにクローン化し、そしてＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させた。タンパク質を、１８℃で一晩、Ｎ末端のＨｉｓ−タグ融合タンパク質として１ｍＭのＩＰＴＧを用いた誘導によって発現させ、そして３０，０００ｘｇで収集した。細胞を、溶解緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２ｍＭのトリス［２−カルボキシエチル）］ホスフィン（ＴＣＥＰ）、１０μＭ  ＺｎＣｌ２、２００ｍＭ  ＮａＣｌ）中リゾチームによって溶解し、さらに完全な溶解のために１０分間の超音波処理で処置した。タンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上で精製し、そして純粋なタンパク質を含有する分画を貯蔵し、濃縮し、そしてサイジングカラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｓ２００  ２６／６０グローバル）にかけた。可溶性タンパク質を含んでいるピークを収集し、イオン交換カラム（ＭｏｎｏＱ）にかけた。勾配溶出（２００ｍＭ−５００ｍＭのＮａＣｌ）によって純粋なタンパク質を得た。このタンパク質を濃縮し、一晩、透析緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、２ｍＭ  ＴＣＥＰ）に対して透析した。タンパク質は等分し、更なる使用まで−８０℃で凍結した。
【０４８６】
ＳＩＲＴ１などのサーチュインの翻訳後修飾は、上記のとおりに組換えで産生されたＣＬＫ酵素と共に、組換えで産生されたＳＩＲＴ１タンパク質をインキュベートすることによって達成される。ＳＩＲＴ１などのサーチュインのＣＬＫリン酸化は、上述のビトロアッセイでＣＬＫについて記載されるもののような条件で行う。リン酸化の程度およびリン酸化の部位（配列番号：１０のセリン１７２、１７３および／または１７４）コンフォメーションは、標準の質量分析計に基づくペプチド分析によって達成される。
【０４８７】
実施例３：ＣＬＫスプライシングアッセイ
ｉ）インビトロスプライシングアッセイ。ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ（Ｍａｙｅｄａ、Ａ．およびＫｒａｉｎｅｒ、Ａ．Ｒ．（１９９２）Ｃｅｌｌ６８、３６５）で、線形化されたヒトβ−グロビン鋳型ＤＮＡの流出転写によって、ｍ７ＧｐｐｐＧ被覆され、かつ３２Ｐ標識されたプレｍＲＮＡ基質を作製する。ＨｅＬａ細胞Ｓ１００抽出物および精製ＳＦ２／ＡＳＦを、記述されるとおり（Ｍａｙｅｄａ、Ａ．、およびＫｒａｉｎｅｒ、Ａ．Ｒ．（１９９９）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１８、３０９）に作製する。ＨｅＬａ  Ｓ１００抽出物、精製ＳＦ２／−ＡＳＦ、および２０ｆｍｏｌの３２Ｐ標識プレｍＲＮＡを含有するインビトロスプライシング反応混合物を、３〜４時間の間３０℃で、ＣＬＫモジュレータと共に／無しにインキュベートする（Ｍａｙｅｄａ、Ａ．、および、Ｋｒａｉｎｅｒ、Ａ．Ｒ．（１９９９）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１８、３０９）。５．５％のポリアクリルアミド、７Ｍ尿素ゲルおよびオートラジオグラフィでの電気泳動によって、ＲＮＡ産物を分析する。
【０４８８】
ｉｉ）インビボスプライシングアッセイ。６０ｍｍ皿で成長させたＣＯＳ−７細胞を、製造業者の指示に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、記述（Ｃａｃｅｒｒｅｓ，Ｊ．Ｆ．、Ｓｔａｍｍ，Ｓ．、Ｈｅｌｆｍａｎ、Ｄ．Ｍ．、およびＫｒａｉｎｅｒ、Ａ．Ｒ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６５、１７０６））されるとおり組換えＣＬＫ発現ベクターでトランスフェクトする。トランスフェクションの２４時間後に、ＩＳＯＧＥＮ（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ）を使用して、総ＲＮＡを抽出するか、またはＳＤＳ−ゲルローディング緩衝液（０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、０．２Ｍジチオスレイトール、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール）で溶解するかのいずれかで、総細胞タンパク質抽出物を作製する。５マイクログラムのＲＮＡを、逆転写（ＲＴ）に使用し、その後、１：５０をＰＣＲ増幅に使用した。サイクルの数および鋳型濃度を含めたＰＣＲ条件を、増幅の際、線形性を維持するために最適化する。ＰＣＲ産物を、アガロースゲルで分離し、臭化エチジウムで染色する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで総タンパク質を分離して、ＰＶＤＦ膜に移行させた。
【０４８９】
内因性遺伝子についてのスプライシングアッセイに関して、マウス胚線維芽細胞（ＳＴＯ細胞）を、４時間、ＣＬＫモジュレータの存在または不在下でインキュベートし、そしてＰｉｌｃｈら（Ｐｉｌｃｈ，Ｂ．，Ａｌｌｅｍａｎｄ，Ｅ．，Ｆａｃｏｍｐｒｅ，Ｍ．，Ｂａｉｌｌｙ，Ｃ．，Ｒｉｏｕ，Ｊ．Ｆ．，Ｓｏｒｅｔ，Ｊ．，およびＴａｚｉ，Ｊ．（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１，６８７６）のように設計されたＳＣ３５およびＣｌｋ１／Ｓｔｙについてのプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲの前に、ＴＲＩゾル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して総ＲＮＡを抽出する。
【０４９０】
ｉｉｉ）ウエスタンアッセイ。ＳＲタンパク質（ＳＲｐ７５、ＳＲｐ７０、ＳＲｐ５５、ＳＲｐ４０、ＳＲｐ３０およびＳＲｐ２０）は、セリン−アルギニン豊富なタンパク質であって、かつＣＬＫキナーゼの標的であるＲＳドメイン中で保存されたリン酸化部位を有す。モノクローナル抗体ｍＡＢ１０４（ＡＴＣＣ（登録商標）番号：ＣＲＬ−２０６７（商標））は、このホスホ−エピトープを認識し、そして、ウエスタンアッセイでＣＬＫキナーゼによってリン酸化の効率を監視するために使用される場合がある。ウエスタンブロット法による化合物阻害アッセイを行うために、Ｈｅｌａ核抽出物またはＳ１００抽出物のいずれかを、スプライシングアッセイ緩衝液（１２ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）、２０ｍＭクレアチンホスフェート、０〜４２ｍＭの（ＮＨ）４ＳＯ４、２０〜６０ｍＭのＫＣｌ、２．１〜３．２ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１２ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ｍＭのジチオスレイトール、２．６％のポリバイナル（ｐｏｌｙｖｉｎａｌ）アルコール、２ＵのＲＮアシンおよび６〜１０％のグリセロール）中で組換え体ＣＬＫキナーゼと共にインキュベートする。データを、抗−ＳＲタンパク質（ＡＴＣＣ（登録商標）番号：ＣＲＬ−２３８３）を用いて同時に正規化することができる。反応（９０分）の終わりに、スプライシングアッセイでのタンパク質を水で１０倍に希釈し、氷上で６０分間１０％の三塩化酢酸で沈降させた。ペレットをアセトンで洗浄した後、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲルサンプル緩衝液中に再懸濁させる。次いで、タンパク質をＳＤＳ−１０％ＰＡＧＥによって分画し、次いで、ＰＶＤＦ膜に移行させてから、上記のとおりモノクローナル抗体（ＭＡｂ）１０４で明確にする。
【０４９１】
ｉｖ）レポーターアッセイ。ＨＩＶｔａｔプレ−ｍＲＮＡは、ＡＳＦ／ＳＦ２識別配列に類似のｔａｔプレ−ｍＲＮＡエキソン中に弱い３’スプライス部位およびいくつかのプリン豊富配列を有する。キナーゼのＣＩＫファミリーは、ＡＳＦ／ＳＦ２タンパク質に直接作用し、害タンパク質を阻害することによってそれらのスプライシング能力を制御する。Ｔａｕタンパク質のエキソン１０の飛び越しは、別のＣＬＫキナーゼ依存性現象である。ＣＬＫ２キナーゼの存在下で、ｔａｕのエキソン１０の飛び越しは、３０％〜７０％まで増大される。ゲノム中に組み込まれたルシフェラーゼまたはＧＦＰレポーターを有する上記２つのタンパク質のスプライス部位を利用することによって、ＣＬＫ２キナーゼ活性に対して応答性のある新規アッセイシステムを作成できる。化合物によって調節されるＣＬＫ２活性のよって、ＧＦＰまたはルシフェラーゼ遺伝子をインビボでスプライシングでき、そしてＣＬＫ２の活性について読取りを作成できる。
【０４９２】
実施例４：ＣＬＫ細胞に基づくアッセイ
ｉ）脂肪代謝アッセイ。３Ｔ３Ｌ１細胞を、２４穴プレート上に２ｍｌの３０，０００細胞／ｍｌで、ダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）／１０％新生仔ウシ血清に植え付ける。その後、１００ｎＭロシグリタゾンの添加により、個々のウエルを分化させる。未分化対照細胞を、アッセイの期間中、新たなＤＭＥＭ／１０％新生仔ウシ血清中で維持する。４８時間（２日）で、ＤＭＥＭ／１０％新生仔ウシ血清／０．５ｍＭ  ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）／１μＭデキサメタゾンの添加によって、脂質生成を開始させる。９６時間（４日）で、培地の除去、および１０μｇ／ｍＬインスリンまたは１００ｎＭロシグリタゾンのいずれかと一緒に、各ウエルに２ｍｌのＤＭＥＭ／１０％仔ウシ血清を添加することによって、脂質生成を進行させる。１４４時間（６日）および１９２時間（８日）で、全ウエルを、ＤＭＥＭ／１０％新生仔ウシ血清に変える。
【０４９３】
２４０時間（最初の細胞プレーティングから１０日）で、ある範囲の濃度にある試験化合物を、１００ｎＭロシグリタゾンと一緒に、三重に個々のウエルに添加する。未分化細胞の３つのウエルを、ＤＭＥＭ／１０％新生仔ウシ血清で維持し、分化対照細胞の３つのウエルを、１００ｎＭロシグリタジンと共に、新鮮なＤＭＥＭ／１０％新生仔ウシ血清中で維持する。脂肪代謝についての陽性対照として、レスベラトロール（ＳＩＲＴ１アクチベーター）を、三倍希釈で、１００μＭ〜０．４μＭの濃度範囲で使用する。
【０４９４】
３１２時間（１３時間）で、培地を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄する。０．５ｍＬのオイルレッドＯ溶液（脂質生成アッセイキットで供給される、カタログ番号ＥＣＭ９５０、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｍｅｃｕｌａ  ＣＡ）を、バックグランド対照として細胞を有しないウエルを含めたウエルごとに添加する。プレートを１５時間、室温でインキュベートし、次いでオイルレッドＯ染色溶液を除去し、ウエルを、１ｍＬ洗浄溶液（脂質生成アッセイキット）で３回洗浄する。最後の洗浄を除いた後、染色されたプレートを可視化させ、走査または写真撮影する。染料を抽出（脂質生成アッセイキット）し、そして５２０ｎＭでプレート読取機で定量する。定量結果を図１６に示す。
【０４９５】
ＩＩ）一次後根神経節（ＤＲＧ）細胞保護アッセイ。記述されるとおり（Ａｒａｋｉら、（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０５（５６８６）：１０１０−３）、ＣＬＫモジュレータを、軸索突起保護アッセイで試験する。簡潔には、Ｅ１２．５胚からのマウスＤＲＧ外植片を、１ｎＭ神経成長因子の存在下で培養する。５−フルオロウラシルを培養培地に添加することによって、非神経性細胞を培養物から除去する。軸索突起切除の１２〜２４時間前にＣＬＫモジュレータを添加する。神経細胞体を除去するために１８ゲージ針を使用してインビトロ（ＤＩＶ）にて１０−２０日で軸索突起の切断を実行した。
【０４９６】
実施例５：正常なマウスでのＣＬＫモジュレータの影響
Ｃ５７ＢＬ６マウス（雄、６週齢）を４８時間順応させる。マウスを４つの群（ｎ＝１０）に分け、７日間、ＣＬＫモジュレータ（１０、３０または１００ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルの単回の毎日の腹腔内注射を受ける。毎日の体重および外見の観察を記録する。投与期間の終わりに、マウスを、ＣＯ２窒息（ａｐｈｙｘｉａｔｉｏｎ）によって犠牲にし、そして血液、脳、脚筋肉および肝臓を収集する。血液は、血漿、白および赤血球細胞の収集のために処理する。全組織は、アッセイの前に保存のために簡易凍結する。
【０４９７】
実施例６：ＣＬＫモジュレータを使用した筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）（ネズミのモデル）の処置
ＡＬＳは、必ず死に至る急速に進行する運動神経疾患である。米国単独で、２０，０００人程度のヒトが影響を受け、さらに５，０００人が毎年その疾患と診断されると概算される。ＡＬＳは、４０〜６０歳の年齢の間で、最も一般に人々に影響を及ぼす。大多数の患者において、ＡＬＳは、散発的で、かつ明確に付随する危険因子なしで外見上起こる。ＡＬＳの特に破壊的な効果として、ヒトの心、性格、知能または記憶が影響を受けないが、反応し、通信し、そして随意および不随意筋を制御するそれらの能力は失われることである。
【０４９８】
放射線標識化合物のＣＮＳ浸透および分布。ＡＬＳの動物モデルで効力を示す化合物については、ＣＮＳ内での治療的濃度に到達し、観察される変性に関連があるＣＮＳ内の部位に達する必要がある。ＡＳＬのマウスモデルで、神経細胞の損失の原発部位は、後脚および尾部を神経支配する腰髄である。目的の化合物がＣＮＳに到達することを確認するために、脳および脊髄の浸透および分布を研究する。目的の化合物を放射線標識してマウスに投与する。ＣＮＳ範囲内の化合物の分布は、オートラジオグラフィおよび抽出によって測定する。
【０４９９】
簡潔には、実験時の体重が２０−２５ｇである雄のスイス・ウェブスター・マウスを、２１±２℃の室温で、５０±１５％の湿度で、１２時間−１２時間の明暗サイクルの下で維持する。マウスは、市販のマウス食物および水道水を自由に利用できる。
【０５００】
１４Ｃ標識ＣＬＫモジュレータを、２日間、１２時間毎に、マウスに腹膜内（腹腔内）注射として投与する。注入された１４Ｃ−標識化合物の量を、その比放射能およびインビトロ活性に基づいて測定する。
【０５０１】
投与に続いて、動物を３０分、３時間および６時間で犠牲にする。脳および脊髄を迅速に除去し、２−メチルブタン中−２０℃で凍結させ、次いで、切断または固相抽出まで−７０℃未満に保つ。
【０５０２】
凍結脳を、クリオスタッドチャック（ｃｈｕｃｋ）に載せ、そしてＭｉｃｒｏｍ  ＨＭ５００  Ｏマイクロトーンクリオスタッド中で、−２０℃で２０μｍ厚の冠状切片に切断する。切片をスライドの先端付近に解凍積載し、穏やかな流れの空気下で一晩乾燥させる。スライドを、３日間５℃で１４Ｃ高感度フィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＭＰ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にさらす。ＨＰ  Ｓｃａｎｊｅｔ  ８２００Ｃスキャナを使用して画像を分析し、画像分析ソフトウエアパッケージ（Ｉｍａｇｅ、ＮＩＨソフトウエア）を使用して分析する。１４Ｃ水準（１４Ｃ−マイクロスケール）（３０−８６０ｎＣｉ／ｇ）を、オートラジオグラムを定量するために使用する。既知の放射活性の水準についての密度読取りは、膜の各シート上のアイソトープレベルと光学密度との比較のために取る。光学密度をｎＣｉ／ｇ値に変換するための標準曲線は、線形形質転換に最も適している。光学密度のバックグランド読取りを、各切片に結合した薬剤の相対量を決定するために使用する。１４Ｃ標識化合物で標識するために選択された脳の様々な領域を試験する。脳の図譜を使用して領域を識別する（Ｐａｘｉｎｏｓ  Ｇ．、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｋ．Ｂ．Ｊ．、Ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｂｒａｉｎ  ｉｎ  ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ，２００３）。各領域に結合した１４Ｃ標識化合物の量は、各スライドの手段として表される（スライド当たり３切片）。左半球および右半球の両方で見出される領域から取ったデータを、脳のその領域についての全体的手段を決定するために各切片から保存する。
【０５０３】
脊髄に対する化合物暴露を決定するために、脊髄を均一化し、遠心分離して、サンプルからいずれかのスライドを除去する。一定分量のサンプルを、９６穴プレートに水と共に１％リン酸と合せ、混合する。サンプルを、メタノールと水とで平衡にされたフェノメネックスストラタ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｓｔｒａｔａ）Ｘ抽出プレートに添加する。洗浄後、サンプルを、１００％アセトニトリルできれいな９６穴プレートに溶出する。Ｎ２流下にサンプルを蒸散させ、そして残渣を溶媒中で再構築する。質量分析計測器（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって化合物の量を評価する。
【０５０４】
ソフトウエア「スタットビュー（Ｓｔａｔｖｉｅｗ）」（ＢｒａｉｎＰｏｗｅｒ、Ｃａｌａｂａｓａｓ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用したＡＮＯＶＡおよびダネットｔ検定によって、データを統計学的有為性について分析する。統計的有為性は、ｐ＜０．０５とする。
【０５０５】
進行性運動神経細胞疾患（ｐｍｎ／ｐｍｎ）の動物モデルにおける化合物効力。ｐｍｎマウスモデルを、運動神経細胞の変性を研究するための広く使用される遺伝子動物モデルである。そのマウスは、進行性運動神経細胞傷害（Ｓｃｈｍａｌｂｒｕｃｈ、Ｈ．、ら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ（１９９１）５０（３）：１９２−２０４）をもたらす自発的な常染色体劣性変異を担持する。ｐｍｎホモ接合マウスは、生涯の第３週の間に後脚で虚弱を現して、約６週齢で死亡する。この後者の年齢で、動物は、特に胸および骨盤領域の筋肉のもので、重篤な筋肉の消耗を示す。ヘテロ接合ｐｍｎマウスは、表現型的に正常である。組織学研究では、ｐｍｎ動物の坐骨神経および横隔神経が非常に影響を受けていることが分かり（Ｓｃｈｍａｌｂｒｕｃｈ、Ｈ．、ら、上記；Ｓａｇｏｔ、Ｙ．、ら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ（１９９５）．７（６）：１３１３−２２；Ｓａｇｏｔ、Ｙ．、ら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ（１９９５）１５（１１）：７７２７−３３；およびＳａｇｏｔ、Ｙ．、ら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ（１９９６）１６（７）：２３３５−４１）、顔面神経核運動神経細胞の３０％は、変性する（Ｓｅｎｄｔｎｅｒ、Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９２）３５８（６３８６）：５０２−４）。運動神経細胞疾患のｐｍｎマウスモデルを使用して、ＣＬＫモジュレータの潜在的神経保護特性を試験する。ｐｍｎ／ｐｍｎマウスの疾患発病、運動機能、運動神経細胞損失、および生存率におけるＣＬＫモジュレータの効果を決定する。
【０５０６】
ヘテロ接合ｐｍｎマウスは、Ｃｅｎｔｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｉｒｅ（スイス国ジュネーブ）にあるＡｎｎ  Ｋａｔｏ博士の実験室から得る。ｐｍｎマウスの大きなコロニーを発生し、ｐｍｎ／ｐｍｎホモ接合体は不妊症で、２５％のメンデル比で、二倍のヘテロ接合体交差から得られる。１２日齢で開始して、マウスを後脚足の把握活性について試験する。虚弱の第１の臨床徴候は、通常１４および１６日目に現れる。動物を２週齢で群に分ける。対照および処置ｐｍｎマウスは、本研究の全体を通じて市販の食物および水道水を適宜に利用する。マウスが乾燥食物および／または水に到達することができないことが実験者によって決定される場合、水性栄養ゲルを、ケージの底部に配置し、そしてより長い注ぎ口を水筒に取り付ける。
【０５０７】
マウスを、４つの試験群に分ける。Ａ群：ビヒクルで処置された負の対照動物（ヘテロ接合体および野生型マウス）；Ｂ群：ビヒクルで処置された陽性対照動物（ｐｍｎ／ｐｍｎホモ接合体）；Ｃ群：ＣＬＫモジュレータで処置されたｐｍｎ／ｐｍｎホモ接合体（用量１）；およびＤ群：ＣＬＫモジュレータで処置されたｐｍｎ／ｐｍｎホモ接合体（用量２）。
【０５０８】
簡潔には、Ａ群は、運動神経細胞損失を示さない負の対照動物（ヘテロ接合体および野生型マウス）として機能する。Ａ群を、研究の間を通して毎日、ビヒクルで処置する。Ｂ群は、陽性対照動物であり、そして研究の間を通して毎日、ビヒクルで処置する。ＣおよびＤ群を、２つの異なる用量でＣＬＫ調節化合物によって処置する。上記のとおり放射標識化合物を使用して測定されるインビトロでの化合物活性およびＣＮＳ浸透に基づいて用量を決定する。これらの研究について、試験化合物またはビヒクルを、注射の間１０〜１２時間で、毎日２回腹腔内に投与する。研究の間を通して２週齢から処置を行う。各群からの動物を、組織学的評価のために使用する。これらのマウスを、運動神経細胞損失の程度および神経膠症の範囲を評価するために後期疾患段階（３５日）で犠牲にする。
【０５０９】
本研究におけるパラメータは、体重、行動、運動神経細胞損失、神経膠症、および寿命である。本研究を通して、ＣＬＫモジュレータまたはビヒクルの投与の前に、毎朝同時に動物を秤量することによって、体重を毎日測定する。体重評価は、当初の体重の百分率で変動の累積合計として表される。
【０５１０】
行動評価については、マウスを、以下の行動試験を実行するマウスの能力について試験する：後脚把握、Ｐｌａｎｄｅ試験およびグリップ試験を含めた棒の横断。
【０５１１】
後脚把握。この試験は、ｐｍｎマウスが後脚でケージの側面上に保持する能力を測定する。尾で逆さに保持されているマウスにケージを握らせ、ぶら下がったままにする。１５日目程度の早さで、ｐｍｎホモ接合体動物を、ケージの側面上に掴まる能力によって診断できる。マウスを２日毎に試験する。
【０５１２】
棒の横断。本試験では、２５ｃｍ長の円筒形の棒を横断する時間を測定する。マウスがその棒から落下する場合、その試験は、不成功であると考えられ、そして３回繰返される。マウスを２日毎に試験する。
【０５１３】
傾斜平面試験。マウスを、最大５秒内で、傾斜平面に維持する能力について週当たり１回試験する。各動物がその平面に残る斜面を記録する。
【０５１４】
グリップ試験。マウスを、最大３０秒内で、水平の棒に２回保持する能力について週当たり１回試験する。各動物がその棒に残っている時間を記録する。
【０５１５】
組織学的および立体解析学的分析については、マウスを、リン酸緩衝生理食塩水で、続いてパラホルムアルデヒドで灌流する。脊髄を解剖し、腰椎セグメントを識別する。組織を後固定し、そしてブロックを凍結保存する。運動神経細胞数を定量するために、高精度立体解析学的分析を行う。連続冠状切片に、腰椎（Ｌ１〜Ｌ４）の脊髄を横断させる。切片をスライドに乗せ、クレシルバイオレットを使用してニッセル物質について染色する。別個の組の切片を自由浮遊切片として収集し、そして免疫組織化学について処理し、そしてそれは、神経膠症または星状膠細胞および小膠細胞の関与の程度を決定する目的である。二重標識免疫蛍光を使用して、切片を、ＣＤ４０（小膠細胞マーカー）およびＧＦＡＰ（星状膠細胞マーカー）で免疫染色する。
【０５１６】
各試験群について寿命を決定する。動物の苦痛を減じるために、終点（生存）を決定する新たな指針を樹立した。以下のもののいずれもできない場合に、動物を安楽死させる：それらの側に乗せられた場合に１５秒以内に自分で正すこと、顔の手入れ（一方または両方の目での感染によって決定される）、またはケージの底部に置かれた食品に達するために、前脚の使用にさえよるケージ周辺での運動。負の対照動物を、本研究の終わりに、ＣＯ２吸入によって安楽死させる。
【０５１７】
データの統計的評価については、寿命結果を、カプラン−マイヤー検定に提出する。統計学的有為性を測定する２つの異なる試験を使用する。ログ−ランク試験およびウィルコキソン試験。定量的行動評価に関連したデータを、クラスカル−ワリスで、続いて非パラメータ性マン−ウィットニーＵ試験で解析する。有為性は、ｐ＜０．０５と考えられる。
【０５１８】
ＡＬＳ疾患の動物モデル（ＳＯＤＩＧ９３Ａ）での化合物効力。ＳＯＤＩＧ９３Ａマウスは、ジャクソンラボラトリーズから得る（Ｇｕｒｎｅｙ，Ｍ．Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４．２６４（５１６６）：ｐ．１７７２−５）。マウスは、位置９３でグリシンからアラニンへの置換を含む高レベルのヒトＳＯＤ１を発現する。この変異は、家族性ＡＬＳ患者の２０％で変異が見られ、したがってＣＬＫモジュレータの効力を研究するのに有用で関連のあるモデルを表す。標準実験のパラメータにわたるＣＬＫモジュレータの影響を実験する：ＳＯＤＩＧ９３Ａマウスの疾患の発生、運動機能、運動神経細胞損失、神経膠症、および生存率。
【０５１９】
Ｇ１Ｈと称される特定のマウス株を、Ｃ５７Ｂ６／ＪおよびＳＪＬマウスの間の交雑であるヘテロ接合体ハイブリッドラインとして維持する。トランスジェニックの雄を、非トランスジェニックＢ６ＳＪＬＦ１ファミリーと交雑させる。尾部生検から抽出したＤＮＡからのＰＣＲ増幅によって、動物は、およそ２１〜３０日齢の離乳時に遺伝子型で分ける一方で、イソフルランの吸入によって動物に一時的に麻酔する。ＤＮＡ抽出について、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）由来のＱＩＡアンプ組織キットを使用する。ヒトＳＯＤ１遺伝子のエキソン４に特異的なプライマー対を使用して、ＰＣＲ増幅を行う。３０日齢で、マウスを、３つの異なる処置アームに無作為化する。全動物は、本研究を通して随意に市販の食料および水道水を入手できる。マウスが、乾燥食料および／または水に到達できないと実験者によって決定された場合、水性栄養ゲルが、ケージの底部に置かれ、そしてより長い口が水の容器に取り着けられる。
【０５２０】
以下の３つの試験群を研究する：Ａ群：ビヒクルで処置されたＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスは、陽性対照群として役割を果たす；Ｂ群：ＣＬＫモジュレータで処置されたＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウス（用量１）；およびＣ群：ＣＬＫモジュレータで処置されたＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウス（用量２）。
【０５２１】
簡潔には、Ａ群は、運動神経細胞損失を示す陽性対照動物として役割を果たす。Ａ群を、研究を通して毎日、ビヒクルで処置する。Ｂ群およびＣ群を、２つの異なる用量で、ＣＬＫ調節化合物で処置する。インビトロでの化合物活性およびＣＮＳ浸透に基づいて、用量を決定する。これらの研究について、試験化合物またはビヒクルを、注射の間１０〜１２時間、毎日２回腹腔内に投与する。処置を３０日目に開始し、そして本研究を通して継続する。各群からの動物を、組織学的評価のために使用する。これらのマウスを、運動神経細胞損失の程度および神経膠症の程度を評価するためにその疾患における後期段階（１２０日）で犠牲にする。
【０５２２】
本研究におけるパラメータは、体重、疾患発生、増量、寿命、運動神経細胞損失、および神経膠症である。本研究を通して、試験化合物またはビヒクルの投与の前に、毎朝同時に動物を秤量することによって、体重を測定する。体重評価は、当初の体重の百分率で変動の累積合計として表される。
【０５２３】
疾患の発生を決定するために、マウスを週に２回試験する。発生は、その動物が尾によって単にぶら下がったままでいる場合に、脚の震えの最初の出現の日として定義される。これは、通常、片方で始まり、続いて影響を受けた脚で双方の震えおよび衰弱を示す。当初の診断に続いて、動物を、後脚麻痺の初期段階について毎日試験する。
【０５２４】
試験群の運動機能を評価するために、歩行分析を行う。簡潔には、それぞれ、青色および赤色非毒性の水性塗料に浸かったマウスの前足および後足を使用して、足跡パターンを研究する。マウスを、遠位末端の一方に固定された黒色ゴールボックスを有するきれいなパースペックス（Ｐｅｒｓｐｅｘ）通路に入れる。白色紙を、通路床を裏打ちするために使用する。マウスに、通路の反対端からゴールボックスまで歩くことを可能にし、したがって、マウスの足跡にその紙の上にパターンを残させる。５つの別個のパラメータを測定する：歩長さ、前足および後足の基本幅、前足と後足との間の重複、および通路を移動する潜伏期。
【０５２５】
寿命決定、組織学的分析、立体解析学的分析および統計学的評価を、上記のとおりに行う。
【０５２６】
実施例７：ＣＬＫモジュレータを使用した多発性硬化症（ＭＳ）（ネズミ・モジュレータ）の処置
ＣＬＫモジュレータ
多発性硬化症（ＭＳ）は、若年成人に影響を及ぼす非外傷性神経学的機能障害の最も一般的な原因である。およそ世界中で２．５百万人が、そして米国でおよそ４００，０００人がＭＳを有する（出典：ＮＩＮＤＳ）。ＭＳは、脱髄および軸索損傷が永続的神経学的機能障害を生じる中枢神経系（ＣＮＳ）の炎症性疾患である。その疾患は、原発性進行性（寛解なしの機能障害の累積）または再発寛解（急性発作、続いて回復の期間）などの様々の形態で現れる可能性がある。患者の約４０％は、二次進行性段階（増悪の間に進行性機能障害を導く不完全な回復を伴う発作）に入る。ＭＳについての治癒法はない。最近承認された薬剤は、疾患の炎症性の自己免疫成分に焦点を有し、そしてそれらの薬剤は、再発を制御するように見え、そして再発寛解から二次進行まで進行を示す上で有効でありうる。しかし、これらの免疫調節介入は、根底にある軸索損傷に取り組まず、したがって、急性脱髄事象、急性軸索切除および軸索損失から生じる神経学的損傷に影響を及ぼさない。
【０５２７】
実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）を用いた免疫化によって誘発されるＭＳの動物モデルである。動物は、ＭＳ患者に類似の脳、脊髄、および視神経における炎症、脱髄、および神経損傷を生じる免疫応答を開始する。胸髄における脱髄および軸索損傷の臨床／神経学的兆候の評価、および組織学的分析を試験した。
【０５２８】
０．２ｍｌの総体積で、ＰＬＰ１３９−１５１ペプチドを含有するエマルジョンおよび１５０μｇのペプチドおよび２００μｇの結核菌を含有する完全フロイントアジュバンドと共に皮下（ｓ．ｃ．）注射により、８−１２週齢の雌のＳＪＬマウスで慢性再発ＥＡＥを誘発する。さらに、マウスに、０日目（免疫化の日数）に、そして再度２日目に０．１ｍｌ  ＰＢＳ中の２００ｎｇ百日咳毒素（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ＣＡ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）で注射する。その動物を標準条件：一定温度（２２±１℃）、湿度（相対的、２５％）、および１２時間明／１２時間暗周期で飼育し、そして食料および水を自由に入手させる。体重およびＥＡＥの臨床兆候について、動物を毎日評価し、免疫化の１１日後に開始する。臨床的評価は、０から５までの等級による（「５」は瀕死であり、「４」は、見掛け上健康な動物である「０」まで通して四肢麻痺である）。評価は、当初の接種の４０日後まで継続する。この時点で、動物は、ＥＡＥの初期段階を経て、続いて回復する。ＥＡＥの再発は、典型的には、２０〜３０日後免疫付与を引き起こす。マウスは、５日以上の期間の安定または改善した外見の後に、２日以上の間、臨床規模で１の増大を示す場合に、再発したとみなされる。
【０５２９】
神経変性におけるＣＬＫモジュレータの影響を評価するために、疾患過程で早くにエフェクタ細胞のリンパ球発生に干渉しないことが重要である。したがって、臨床的ＥＡＥの発病時にＣＬＫモジュレータを投与する。臨床的ＥＡＥの発病時に、マウスを、無作為に群に分け、そしてＣＬＫモジュレータ（５０、１００および２００ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルで処置する。全処置は、その研究の終末まで毎日腹腔内注射（ｉ．ｐ．）によってなされる。
【０５３０】
後免疫付与の４０日目に、各群から得られるマウスを、ケタミン／キシラジンの過剰投与で犠牲にする。脊髄を切除し、１０％緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンで埋設する。５ミクロン厚の切片を、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）およびルクソールファストブルー（ＬＦＢ）で染色して、ミエリン損失を評価する。ビエルショウスキーの銀含浸を、軸索取込を評価するために使用する。軸索損失の量を評価するために、パラフィン切片を、マウスの非リン酸化ニューロフィラメントＨに対するモノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｅ  ＳＭＩ−３２、Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＵＳＡ）、およびＡＰＰに対するモノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｅ  ２２Ｃ１１、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）にさらす。Ｃｙ３標識抗体を用いてＳＭＩ−３２を検出し、蛍光顕微鏡によって可視化する。ＣｏｌｏｎｏＰＡＰとのインキュベーションによって、抗−ＡＰＰ抗体を検出し、ＡＰＰの陽性の軸索を、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を用いて可視化する。
【０５３１】
軸索損失の程度を評価するために、スライドの画像を捕捉し、免疫組織化学によって染色された領域を、処置状況に目をつぶって定量する。軸索完全性および脱髄を定量的に評価する。
【０５３２】
免疫抑制は、ＥＡＥの初期段階の臨床的重篤度を減じる原因でさえあるが、最近の研究は、免疫抑制と神経保護との組合せが、再発、脱髄および軸索損傷を有効に阻害するのに重要であること、および有効な神経保護の不在下での慢性免疫抑制が、ＥＡＥ、おそらくＭＳにおける臨床的予後を悪化させる場合があることを示唆する。ＰＬＰ誘発ＥＡＥマウスモデルにおける神経保護（ＣＬＫモジュレータによる）と組み合わせた免疫抑制の効果を（Ｃｏｐａｘｏｎｅ（酢酸グラチラマー）により）評価することによって、この問題に取り組む。
【０５３３】
慢性再発性ＥＡＥは、上記のとおりに誘発される。マウスを、３つの処置群に分ける：１群：ビヒクル対照、シクロデキストリンの毎日腹腔内注射（１２〜３９日目）；２群：Ｃｏｐａｘｏｎｅ処置、毎日皮下注射（０〜９日目）；および３群：Ｃｏｐａｘｏｎｅ（０〜９日目）およびＣＬＫモジュレータ（１２〜３９日目）。上記のとおり、疾患進行を監視し、各群から得られるマウスを犠牲にし、脊髄を回収し、脱髄、軸索完全性および軸索損傷について分析する。
【０５３４】
実施例８：ＣＬＫモジュレータを用いたハンチントン病（ネズミのモデル）の処置
ハンチントン病（ＨＤ）のＲ６／２変異型マウスモデルを、ＨＤ疾患関連症候を軽減するＣＬＫ調節化合物の効力を試験するために使用する。
【０５３５】
Ｒ６／２マウスを、少なくとも１２週間、ＣＬＫ調節化合物で処置する。マウスを、４、６、８および１２週齢（グリップ強度が、１２週齢のみで試験されたことを除いて）で、ロータロッド、グリップ強度、立ち上り／登り、オープンフィールド、および体重／生存試験を使用して評価する。
【０５３６】
研究の過程を通して、１２／１２明／暗周期を維持する。室温は、２０〜２３℃で維持し、相対湿度は、５０％付近で維持する。固形飼料および水は、随意に研究の期間中提供される。各マウスは、投与群にわたって無作為に割当てられ、そしてケージ数によって均衡をとる。特に指示されない限り、動物の光周期段階の間に試験を行う。
【０５３７】
ロータロッド。４、６、８および１２週齢で運動神経および運動許容量を評価する。３つの別個の日に、１日当たり４つの尾部で試験を行う。動物を、継続的回転棒（Ａｃｃｕｓｃａｎ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ）に一度に８匹の動物を乗せる。それらのマウスに、４ｒｐｍの低速度で５分の訓練期間が与えられる。動物が棒から落下する場合、その動物を、５分間の訓練期間、棒に戻す。その後、動物をホームに戻すか、または実際の試験の前の少なくとも１時間試験ケージに戻す。その後、そのマウスを、ロータロッドに乗せ、そして速度を３００秒まで４０ｒｐｍの速度まで徐々に、そして均一に増大させる。各マウスが、発泡体パッド上に２０ｃｍ落下する前に回転中の棒に残っている時間を記録する。いずれの異常行動も注目すべきであり、すなわち、ルーピング行動は、活動試験当たり回転回数の数、棒の方向に対して向かう歩行、および糞便の数を記録する。ロータロッド試験の後、動物を、試験またはホームケージに戻す。
【０５３８】
グリップ強度試験。脚の筋肉における筋肉強度を評価するためにグリップ強度を使用し、マウスを１２週齢で試験する。マウスに尾部で保持し、そのマウスが両方の前足で掴むまで、プッシュプル・ゲージ（ＳａｎＤｉｅｇｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）でメッシュのグリップ片に向かって下げる。動物をプラットホームに向かって下げ、その動物がそのグリップを離すまで、実験者によって一定の力で後方に穏やかに引く。前足のグリップ力をひずみゲージで記録する。その動物の後足が、プッシュプル・ゲージでメッシュのグリップ片を掴むまで、実験者は、引き続き動物をプラットホームに沿って後方に引っ張る。その動物がそのグリップを離すまで、それを、実験者による一定の力で、後方にゆっくり引く。ひずみゲージで後足のグリップ力を記録する。試験後、動物を、試験またはホームケージに戻す。
【０５３９】
立ち上り／登り。運動による移動および運動神経を評価するために、立ち上り／登り行動を使用する。マウスを、平坦な表面に乗せ、閉鎖頂部ワイヤーメッシュ円筒１５ｃｍ×２０ｃｍ丈をマウスに載せる。動物の行動をビデオ録画する。その後、５分間かけて以下のパラメータを測定する：自由な立ち上りの数、動物が壁と接触して立ち上がる時間の数、動物が１、２または３つの足のいずれかを床から持ち上げる時間の数、登り事象の数（４つの足を持ち上げること）、ぶら下がり事象（メッシュからの）の数、およびぶら下がりおよび登りに費やされる時間。５分間の後、動物をホームケージに戻す。
【０５４０】
オープンフィールド−自発運動。マウスに、試験を開始する少なくとも１時間前に、試験室に順応させる。不安様行動と自発運動との両方を評価するために、オープンフィールド試験（ＯＦ）を使用する。オープンフィールドチャンバは、赤外光ビーム源（１６×１６×１６）によって囲まれたプレキシガラスの正方形チャンバ（２７．３×２７．３×２０．３ｃｍ；Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｉｎｃｓ．，Ｓｔ  Ａｌｂａｎｓ，ＶＴ）である。囲い地は、オープンフィールドを中心および周辺ゾーンに分割するように設計されており、そして光セルビームは、ＯＦチャンバの中心で、および周辺で活動を測定するために設定されている。高レベルの不安または低レベルの活動を示す動物は、ＯＦ囲い地の隅にとどまる傾向にある。他方では、高レベルの活動および低レベルの不安を有するマウスは、囲い地の中心で多くの時間を費やす傾向にある。水平の活動（距離移動）および垂直の活動（立ち上り）を、継続的ビーム中断から測定する。動物を、３０分間、ＯＦチャンバに入れる。中心および周辺での歩行距離；中心および周辺での立ち上がり；ゾーン進入の数、平均速度を測定する。
【０５４１】
体重および生存率。体重を毎日測定する。上記のとおり試験されたマウスの生存数を測定する。測定された他のパラメータの内容で、致死率を評価する。Ｒ６／２ハンチントン病モデルマウスでの我々の先の研究で、我々は、実験対非実験群での生存数の間に差がないことを見出した。
【０５４２】
統計学的分析。分散（ＡＮＯＶＡ）の一方向または双方向分析、続いて事後比較によって、データを解析する。影響は、ｐ＜０．０５である場合に有為であると考えられる。データは、平均および平均に対する標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）として表す。データが平均から離れた２つの標準偏差である場合、動物を、その群から除く。
【０５４３】
実施例９：ＣＬＫモジュレータを使用した化学療法誘発神経障害（ゲッ歯類モデル）の処置
腫瘍学薬剤タキソール（パクリタキセル）は、卵巣癌、肺癌、乳癌および他の癌の有効な治療であるが、しかしその抗微小管活性は、末梢神経障害を誘発する。単回大量投与または数回少量投与のいずれかでのタキソール投与は、げっ歯類モデルでの感覚運動欠損および組織学的に同定される軸索異常の両方を発生することが示されてきた。これらのモデルは、種々の形態の癌についての化学療法のためにタキソールを投与された患者でしばしば見られる神経障害の予測と考えられる。タキソールで処置され、ビヒクルまたはＣＬＫモジュレータのいずれかで併用して処置された動物での神経組織の感覚運動行動試験および組織学的評価の両方を、末梢神経系でのタキソールの影響を弱めるＣＬＫ調節化合物の有効率を評価するために使用する。
【０５４４】
雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ  Ｉｎｃ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ，ＵＳＡ）に、シリンジおよび滅菌針を使用して、０日目に２０ｍＬ／ｋｇ（腹腔内）（３２ｍｇ／ｋｇ総用量）でタキソールを腹腔内で注射する。第１の組のラットを、通常の生理食塩水ビヒクルで処置する。ラットに、タキソールと組み合わせて０日目に投与し、シリンジおよび滅菌針を使用して皮下で注射する。この投与手段は、タキソール注射の２４時間および４８時間後に繰返す。投与されるビヒクルの量は、１ｍｌ／ｋｇ体重である。第２の組のラットをＣＬＫ調節化合物で処置する。ラットをＣＬＫ調節化合物で処置し、タキソールと組み合わせて０日目に開始する。
【０５４５】
行動試験。行動試験は、疼痛評価試験のための熱の足刺激、および活動についてのオープンフィールド試験を含む。
【０５４６】
熱の足刺激は、げっ歯類での痛覚鈍麻および痛覚過敏を評価するために一般に使用される方法である。熱の足刺激因子（ＵＣＳＤ）を使用して、ラットがその足を持ち上げる潜伏期を、後足の下に置かれた熱源に対する反応で記録する。ラットを、一定温度（３０±１℃）に維持されたガラス表面に乗せ、その後、試験の前におよそ１５分間、装置に慣らす。足持ち上げの潜伏期の２回の測定値が互いに２分以内である場合には、各々の動物について平均する。そうでない場合には、この基準を満たすまで、さらに試験を行う。３日目に基準試験を行う。別の試験を、４日目および７日目に行う。
【０５４７】
剖検。１４日目に、動物を、ＣＯ２窒息および頸部脱臼によって安楽死させる。安楽死に続いて、腰椎の背側神経節、坐骨神経および後足の真皮を収集し、１０％中性緩衝ホルマリンで一晩固定する。
【０５４８】
組織学。収集した組織を遮断し、パラフィンで埋設し、切断し、そしてＨ＆Ｅで染色する。光学顕微鏡を使用して組織を試験し、治療計画に対する盲検を評価者によって点数付けする。組織は、切片で観察される軸索破損の程度および量に基づいて、０から３までの等級に分けられ、そして０は、軸索の正常な外見であり、１から２までは軸索の軽度から中程度までの破壊であり、そして３は、軸索の完全破壊およびウォーラー変性である。
【０５４９】
統計学。これらのラットでの行動特性における時間および処置の効果を評価するために、熱的な足刺激およびオープンフィールド測定（群×時間）で、双方向の繰返し測定法ＡＮＯＶＡを行う。いずれかの全般的有意差がある場合、その差が起こった場所を決定するために、特定時点で、要因ＡＮＯＶＡを行う。神経解剖学的評価を、軸索破壊についての格付け等級の非パラメータ分析を使用して統計学的有為性について評価する。
【０５５０】
実施例１０：食餌性肥満（ＤＩＯ）マウスモデルにおけるＣＬＫ阻害剤の代謝活性
ＣＬＫ阻害剤が、肥満および関連インスリン耐性の発生に対して保護するかどうかを定義するために、ＣＬＫ阻害剤を、１６週間、高脂肪食に付されている雄のＣ５７ＢＬ６Ｊマウスに慢性的に投与（食事混合物を介してなど）する。そのマウスは、大規模な表現型分析および分子分析を経て、ＣＬＫ阻害によって影響される調節経路を定義する。
【０５５１】
この長期研究で、５０匹のＣ５７ＢＬ６Ｊマウス（５週齢）を、１８週の期間分析する。１０匹の動物の５つの群を、以下のとおりに割り当てた。
１．固形飼料
２．固形飼料＋ＣＬＫ阻害剤（２００ｍｇ／ｋｇ／日）
３．高脂肪食
４．高脂肪食＋ＣＬＫ阻害剤（２００ｍｇ／ｋｇ／日）
５．高脂肪食＋ＣＬＫ阻害剤（４００ｍｇ／ｋｇ／日）
全研究を通して、体重および食物摂取は、週に二回監視する。
【０５５２】
第１週の間に、全ての群について、二重エネルギーＸ線吸収測定法（デキサスキャン）によって、身体組成を分析する。
【０５５３】
第２週の間に、グルコース、トリグリセリド、コレステロール、ＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃおよびインスリンの血清濃度を１２時間の絶食期間の後、全群について測定し、その後、指示のように飼料に置く。
【０５５４】
第１０週の間に、全ての動物を腹腔内グルコース負荷試験（ＩＰＧＩＩ）に付すことによって、グルコース負荷を測定する。動物を、この試験の前に１２時間絶食させる。
【０５５５】
１群、３群および５群の夜間エネルギー消費（固形飼料、高脂肪食および高脂肪食４００ｍｇ）を、間接的熱量測定によって測定する。
【０５５６】
第１２週の間に、全ての群についてデキサスキャンにより体重組成を再度分析する。
【０５５７】
第１３週の間に、３群、４群および５群の日周性活動（高脂肪食が供給されたマウス）を３０時間の間研究する。
【０５５８】
第１４週の間に、３群、４群および５群で血圧および心拍数の測定を行う。
【０５５９】
第１５週の間に、全動物の直腸温度を午前１０：００に室温で測定する。
【０５６０】
１群、２群および３群について、日周活動測定を行う。
【０５６１】
第１６週の間に、３群、４群および５群の動物のサブセット（ｎ＝５）での経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）を、動物の別のサブセット（ｎ＝５）での腹腔内インスリン感受性試験（ＩＰＩＳＴ）を行うことによって、グルコース負荷を分析する。これらの実験の間に、血液もインスリン濃度を分析するために収集する。動物を、これらの試験の１２時間前に絶食させる。
【０５６２】
２４時間の期間にわたって、糞便を収集し、糞便脂質含量を測定する。
【０５６３】
第１７週の間に、明周期の開始に対応する午前７：００にマウスのサブセット（ｎ＝５）で、および３時間後（午前１０：００）にマウスの別のサブセット（ｎ＝５）で血清濃度を測定する。さらに、午前７：００に収集された血液中で、甲状腺ホルモンＴ３濃度を、そして午前１０：００に収集された血液中で血漿リポタンパク質濃度を測定する。
【０５６４】
第１８週の間に、４℃にさらされた動物の体温を測定することによって、全ての動物で冷却試験を行う。
【０５６５】
３日後、動物を犠牲にする。
【０５６６】
犠牲にするときに、血液を収集し、そして血漿脂質（ＴＣ、ＴＧ、ＨＤＬ−Ｃ、ＦＦＡ）；肝機能（ＡＬＡＴ、ＡＳＡＴ、アルカリ性Ｐａｓｅ、γ−ＧＴ）；および血漿の選択群のグルコースおよびインスリンリポタンパク質特性（サイズ排除クロマトグラフィ）について分析する。
【０５６７】
肝臓、小腸、脂肪組織（ＷＡＴおよびＢＡＴ）、膵臓、心臓および筋肉を収集し、秤量する。標準組織学（ＨＥ染色、コハク酸デヒドロゲナーゼ染色、オイルレッド−Ｏ染色およびセル形態学）によって；組織脂肪含量について；およびミトコンドリアを分析するためにＢＡＴおよび筋肉での電子顕微鏡法によってこれらを分析できる。定量ＲＴ−ＰＣＲによって、代謝およびエネルギー恒常性に関与した選択遺伝子の発現研究について、ＲＮＡ単離を行うことができる。選択組織でマイクロアレイ実験を行うこともできる。さらに、タンパク質濃度での変動、および目的のタンパク質（たとえばＰＧＣ−１α）のアセチル化などの翻訳後修飾の研究について、タンパク質抽出を行うことができる。
【０５６８】
方法
動物収容および取扱い。欧州共同体の明細書にしたがって、温度（２０〜２２℃）および湿度が制御された生態動物圏で、１２時間：１２時間（７：００時点で）明暗周期で、特定の病原体不含の条件で、マウスを、群（５匹の動物／ケージ）で収容する。動物に水および食事に自由に入手させる。
【０５６９】
飲料水。ストラスブールのＵＬＰのｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ｄ’Ｈｙｄｒｏｌｏｇｉｅで潜在的毒性物質の不在を検証するために、水道水の化学組成を、定期的に分析する。飲料水をＨＣｌおよびＨＣｌＯ４で処理して、ｐＨ５〜５．５および塩素濃度５〜６ｐｐｍに維持する。
【０５７０】
飼料。ＵＡＲから標準げっ歯類固形飼料を得て、高脂肪食を、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔから得る。固形飼料（１６％タンパク質、３％脂肪、５％ファイバー、５％灰分）で、または高脂肪飼料（２６，２％タンパク質、２６．３％炭化水素、３４，９％脂肪）でのいずれかでマウスを飼育する。ＣＬＫモジュレータを、粉末状飼料または粉末状高脂肪飼料のいずれかと混合し、そしてペレットを再構成する。対照群は、会社によって提供されるとおりペレットを受ける。再構成することが困難である固形飼料の場合には、最少量の水を、粉末に添加して、ペレットを再構成し、そしてその後、空気で乾燥させる。新たなバッチの食料を週ごとに準備する。
【０５７１】
血液収集。後眼窩洞から、または尾部静脈からのいずれかから血液を収集する。
【０５７２】
麻酔。ｄｅｘａ走査実験については、動物を、腹腔内注射によって投与されるケタミン（２００ｍｇ／ｋｇ）／キシラシン（１０ｍｇ／ｋｇ）の混合物で麻酔する。
【０５７３】
脂質およびリポタンパク質の分析。酵素的アッセイによって、血清トリグリセリド、総およびＨＤＬコレステロールを測定する。リンタングステン酸／Ｍｇ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたアポＢ含有リポタンパク質の沈降の後、血清ＨＤＬコレステロール含量を測定する。供給者によって特定されるとおりワコーから得られるキット（Ｎｅｕｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、遊離脂肪酸濃度を測定する。
【０５７４】
代謝および内分泌探査。Ｍｅｄｉｓｅｎｓｅ  Ｐｒｅｃｉｓ電極（Ａｂｂｏｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｅｄｉｓｅｎｓｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＵＳＡ）を使用して、精度Ｑ．Ｉ．Ｄ分析装置（Ｍｅｄｉｓｅｎｓｅ  ｓｙｓｔｅｍ）によって血中グルコース濃度を測定する。精度Ｑ．Ｉ．Ｄ分析装置の値を、典型的なグルコース測定結果と比較することによって、この方法を有効にした。最小量の血液を必要とするので精度Ｑ．Ｉ．Ｄ法を選択し、そしてＩＰＧＴＴの間などの複数の測定法のために使用できる。製造業者の明細書にしたがって、ＥＬＩＳＡによって、血漿インスリン（クリスタル・ケム、イリノイ州シカゴ）を測定する。提供者によって特定されるプロトコールに従って、標準放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）によって、Ｔ３の血漿濃度を測定する。
【０５７５】
リポタンパク質特性。高速タンパク質液体クロマトグラフィによって、リポタンパク質特性を得て、それにより３つの主要リポタンパク質分類ＶＬＤＬ、ＬＤＬおよびＨＤＬの分離を可能にする。
【０５７６】
腹腔内クルコース負荷試験−経口グルコース負荷試験。一晩（１２時間）絶食にされたマウスでＩＰＧＴＴおよびＯＧＴＴを行う。滅菌生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）中に２０％グルコースの溶液で、２ｇグルコース／ｋｇ体重の用量で、マウスに、腹腔内で（ＩＰＧＴＴ）注射するか、または経口で経管栄養（ＯＧＴＴ）を与えるかのいずれかである。グルコース溶液の投与の１５、３０、４５、７５、９０、１２０、１５０、１８０分より前およびその時間に、グルコースおよびインスリン観察のために、尾部静脈から血液を収集する。インスリン感受性の測定値としてグルコース曲線の増大面積を計算する一方で、対応のインスリン濃度は、インスリン分泌貯蔵を示す。
【０５７７】
腹腔内インスリン感度試験。通常のブタのインスリンのＩＰ注射（０．５〜１．０ＩＵ／ｋｇ；Ｌｉｌｌｙ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）に、絶食された動物を提供する。注射の０、１５、３０、４５、６０および９０分後に、血液を収集し、グルコースを、上記のとおりに分析する。インスリンの注射の後、時間をかけたグルコースでの下降の斜面として、インスリン感度を測定する。
【０５７８】
エネルギー消費。１２時間、オキシマックス装置（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ）を用いて酸素消費を測定することによって、エネルギー消費を、間接的熱量測定法を通して評価する。このシステムは、プラスチック製ケージ（ケージ当たり１匹のマウス）の空気の出入りを有する開放回路からなる。動物に、食料および水を自由に利用させる。非常に正確なＣＯ２およびＯ２センサが、両方の空気体積でのＣＯ２およびＯ２濃度における差を測定し、ケージでの空気の入りの気流が一定であることを考慮して、ある期間に消費された酸素の量を示す。装置から流出するデータを、接続したコンピュータで処理し、分析し、そして輸出可能なエクセルファイルで示す。その値は、ｍｌ・ｋｇ−１時間−１として表され、そして一般にＶＯ２として知られている。
【０５７９】
Ｄｅｘａ走査による体脂肪含量の測定。超高解像度ＰＩＸＩＭＵＳシリーズ密度測定装置（０．１８×０．１８ｍｍピクセル、ＧＥ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉ，ＵＳＡ）によって、Ｄｅｘａ分析を行う。ＰＩＸＩＭＵＳソフトウエア（バジョン１．４ｘ、ＧＥ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用することによって、骨ミネラル密度（ｇ／ｃｍ２でＢＭＤ）および身体組成を測定する。
【０５８０】
非浸潤性血圧および心拍測定法。ＶｉｓｉｔｅｃｈのＢＰ−２０００血圧分析システムは、操作者の介入なしに自発的に４匹の覚醒状態のマウスで複数の測定値を取るために使用されるコンピュータ自動化尾部カフシステムである。マウスは、尾部カフを通して通り抜けた尾部と共に、加熱されたプラットフォーム上の個々の暗いチャンバに収容されている。そのシステムは、尾部への血流が排除されているカフ圧力を測定することによって、血圧を測定する。光電子センサは、試験片の脈拍を検出する。システムは、出願人が、頚動脈で同時に測定される平均動脈内圧と密接な応答を示した結果を生じる。これは、収縮期血圧および心臓の拍動数の再現可能な値を得ることが可能になる。これは、システムでの１週間の動物の訓練を必要とする。
【０５８１】
日周活動。個々のボックスを使用して自発運動活性を測定し、各々は、滑り床、取り外し可能なケージを伴って構成され、赤外カプターを具備し、それにより携帯式自発運動活性および立ち上りの測定を可能にする。電子インターフェイス（Ｉｍｅｔｒｏｎｉｃ，Ｐｅｓｓａｃ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、ボックスを、コンピュータに連結する。装置に対する馴化、並びに夜行性活動および昼行性活動を測定するために、マウスを、３２時間試験する。自動リコメータ（ｌｉｃｋｏｍｅｔｅｒ）を使用して、試験期間中に消費される水の量を測定する。
【０５８２】
実施例１１：肝細胞におけるＣＬＫ指向性事象
本実験は、ＣＬＫ２リン酸化がインスリンによって刺激されることを示す。Ｈ２．３５肝細胞を、２日間、低グルコースＤＭＥＭ４％ＦＢＳ中でアデノウイルスフラグ−Ｃｌｋ２で感染させた。その後、細胞を、２４時間、低グルコースＤＭＥＭ０．５％ＢＳＡで血清不足にさせた。４０分間の２００ｍＭインスリンを用いた刺激の前に３０分間、阻害剤で、細胞を予備処理した。細胞を溶解させ、そして図１８に示されるとおり、抗フラグアガロース（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ４５９６）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析される場合の免疫沈降物、および抗−ホスホ−ａｋｔ基質抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号９６１４）を使用したウエスタンブロッティングを使用して、ＣＬＫ２を免疫精製した。
【０５８３】
次の実験は、インビトロでＡＫＴリン酸化物ＣＬＫ２を示した。精製組換えＧＳＴ−ＣＬＫ２、ＧＳＴ−Ｃｌｋ２Ｋ１９２Ｒ（触媒変異型）、ＧＳＴ−ＦＫＨＲＡＡｓ１−３００（対照ＧＳＴ融合タンパク質）、またはＧＳＴ単独を、１０μＣｉの３２Ｐ  ＡＴＰおよび５０μＭ冷ＡＴＰを有する組換えＡｋｔ１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号７５００）と共に一晩インキュベートした。図１９で示されるとおり、ゲルを、負荷を支援すためにクマシン染色し、その後乾燥させ、そして３２Ｐの検出のために膜にさらした。
【０５８４】
インビボでのＰＧＣ−１αおよびＳＩＲＴ１リン酸化をインスリンによって刺激し、そしてアデノウイルスのフラッグ−Ｈａ−ＰＧＣ−１αまたはフラッグ−ＨＡ−ＳＩＲＴ１で感染されたＨ２．３５細胞の代謝性３２Ｐ  ＰＯ４標識によって測定される場合にＬＹおよびＴＧ００３によって遮断する。細胞に、２４時間、低グルコースＤＭＥＭ４％ＦＢＳを感染させ、その後２４時間、低グルコースＤＭＥＭ０．５％ＢＳＡで血清欠乏にさせた。その後、培地を、３０分間、ＰＯ４不含ＤＭＥＭ０．５％ＢＳＡに交換し、その後細胞を、１００ｕＣｉ３２Ｐ  ＰＯ４の添加の前に３０分間、ＬＹまたはＴＧ００３で予備処理した。４０分のインスリン刺激の前に２０分間、細胞を３２Ｐ  ＰＯ４中でインキュベートした。その後、細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、収集して溶解させた。フラッグ−ＨＡ−ＰＣＣ−１αおよびフラッグ−ＨＡ−ＳＩＲＴ１を、抗−フラッグアガロース（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ４５９６）を使用して、免疫沈降させた。免疫沈降物を、集約的に洗浄し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、３２Ｐシグナルが、ＢｉｏＲａｄのＰｈｏｓｐｈｏｒ−Ｉｍａｇｅｒ（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｌａｔｏｒｉｅｓ）（図２０Ａ）によって分析される場合に、ＰＶＤＦ膜に移行させ、そしてＶｅｒｓａ−Ｄｏｃカメラシステムにより抗−フラッグ抗体および定量ソフトウエア（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｌａｔｏｒｉｅｓ）（図２０Ｂ）を使用したウエスタンブロットによって定量されるタンパク質に正常化された。
【０５８５】
ＣＬＫ２は、ＣＬＫ２ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡをコードするアデノウイルスで感染したＦＡＯ肝細胞で示されるとおり、ＰＥＰＣＫのＴＧ００３誘発を指向する。Ｆ−１２＋５％ＦＢＳ中で細胞を成長させ、１０％ＦＢＳに交換し、そして７時間、２０ｕＭＴＧ００３で、またはなしに処理した。トリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１５５９６−０２６）を使用して総ＲＮＡを単離し、オリゴｄＴおよびスーパースクリプトＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１８０６４−０１４）を使用して逆転写した。Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲによって、３６Ｂ４対照ｍＲＮＡに関連があるＰｅｃｋ  ｍＲＮＡを測定した。各棒は、平均＋／−ｓｔｄｅｖＮ＝３である。結果は、図２１Ａに示される。
【０５８６】
ＣＬＫ２ノックダウンは、ＣＬＫ２ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡをコードするアデノウイルスで感染されたＦＡＯ肝細胞で示されるとおり、部分的インスリン耐性を引き起こす。細胞を、血清不足Ｏ／Ｎにさせ、その後２時間、２００ｎＭインスリンで、またはなしに処理した。トリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１５５９６−０２６）を使用して、総ＲＮＡを単離し、オリゴｄＴおよびスーパースクリプトＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１８０６４−０１４）を使用して逆転写した。Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲによって、３６Ｂ４対照ｍＲＮＡに関連があるＰｅｃｋ  ｍＲＮＡを測定した。各棒は、平均＋／−ｓｔｄｅｖＮ＝３である。結果は、図２１Ｂに示される。
【０５８７】
実施例１２：インビボでのＣＬＫ２調節の効果
肝ＣＬＫ２ノックダウンは、全動物で部分的インスリン耐性を引き起こす。６匹の８週齢雄Ｂａｌｂ／ｃアルビノマウスを、５日間、対照ｓｉＲＮＡまたはＣｌｋ２ｓｉＲＮＡアデノウイルスの５×１０９感染性粒子／動物で感染させた。ＰＢＳ中の０．６Ｕ／ｋｇインスリンの注射の前に、マウスを、１２時間絶食させた。図２２で示される時点で、Ａｓｃｅｎｃｉａ  Ｅｌｉｔｅ  Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ（Ｂａｙｅｒ）を使用して尾部出血によって、血中グルコース濃度を測定した。図は、平均＋／−ＳＥＭ（Ｎ＝８）である。両側の対でないｓｔｕｄｅｎｔｓＴ検定によって、有為性を測定した。
【０５８８】
肝臓ＣＬＫ２ノックアウトは、血清および肝臓トリグリセリドに影響を及ぼす。６−８週齢の雄Ｂａｌｂ／ｃアルビノマウスに、８日間、対照ｓｉＲＮＡまたはＣｌｋ２ｓｉＲＮＡアデノウイルスの５×１０９感染性粒子／動物で感染させた。犠牲にするときに、マウスを、給餌、１５時間絶食、または１５時間絶食、続いて５時間の再給餌をするかのいずれかであった。トリグリセリド試薬（Ｓｉｇｍａ）および遊離グリセロール試薬（Ｓｉｇｍａ）を使用して、犠牲時に採取した血清サンプルから、または組織重量に正常化された肝臓組織から得られるトリグリセリドを測定した。結果は、図２３Ａで示される。各棒は、平均＋／−ＳＥＭ  Ｎ＝４である。両側の対でないｓｔｕｄｅｎｔｓＴ検定によって、有為性を測定した。
【０５８９】
肝臓ＣＬＫ２ノックアウトは、血清不含脂肪酸および糖血症に影響を及ぼす。６−８週齢の雄雄Ｂａｌｂ／ｃアルビノマウスに、８日間、対照ｓｉＲＮＡまたはＣｌｋ２ｓｉＲＮＡアデノウイルスの５×１０９感染性粒子／動物で感染させた。犠牲にするときに、マウスを、給餌、１５時間絶食、または１５時間絶食、続いて５時間の再給餌をするかのいずれかであった。ＮＥＦＡ−Ｃキット（Ｗａｋｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して血清不含脂肪酸を測定し、そして犠牲時にＡｓｃｅｎｃｉａ  Ｅｌｉｔｅ  Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ（Ｂａｙｅｒ）を使用して糖血症を測定した。結果は、図２３Ｂで示される。各棒線は、平均＋／−ＳＥＭ  Ｎ＝４である。両側の対応のないスツーデンツＴ検定によって、有為性を測定した。
【０５９０】
肝臓ＣＬＫ２ノックアウトは、肝臓脂質を減少させる。６−８週齢の雄Ｂａｌｂ／ｃアルビノマウスに、８日間、対照またはＣｌｋ２ｓｉＲＮＡアデノウイルスの５×１０９感染性粒子／動物で感染させた。２４時間の絶食を伴う１７時間の再給餌の後に、マウスを犠牲にした。トリグリセリド試薬（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｔ２４４９）および遊離グリセロール試薬（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｆ６４２８）を使用してトリグリセリドを測定し、ＮＥＦＡ−Ｃキット（Ｗａｋｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して遊離脂肪酸を測定し、そしてコレステロール試薬（Ｐｏｉｎｔｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｃ７５１０）を使用して、グリセロールを測定した。全測定値を、肝臓抽出物のタンパク質含量に正常化させた。結果は、図２４で示される。各棒は、平均＋／−ＳＥＭ  Ｎ＝４である。両側の対でないｓｔｕｄｅｎｔｓＴ検定によって有為性を測定した。
【０５９１】
ＣＬＫ２ｓｉＲＮＡのアデノウイルス送達で実施例１２で例証されるとおりＣＬＫ２の肝臓のみ阻害で観察される結果は、肝臓または肝細胞でのＳｉｒｔ１および／またはＰＧＣ１αの調節（Ｒｏｄｇｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ、４３４、１１３−１１８；Ｒｈｅｅら、ＪＢＣ．２８１（２１）１４６８３−１４６９０）に関与する先の実験と一致する。この知見は、Ｓｉｒｔ１またはその下流標的ＰＧＣ１αのいずれかの活性化または過剰発現に類似であるＣＬＫ２阻害についての役割を支持する。肝臓に限定されるＣＬＫ阻害が、インスリン耐性における増大および肝臓トリグリセリド、肝臓遊離脂肪酸およびコレステロールでの減少を導くが、全身送達によって観察されるＣＬＫ阻害の効果は、糖尿病、インスリン耐性、代謝障害、体重減少、および他の疾患または障害などの障害の治療のためにＳＩＲＴ１活性化に類似のＣＬＫ阻害の有益な効果を支持する。特に、実施例１４および図２５−２９は、ＣＬＫ阻害剤の全身性腹腔内送達が、体重減少、血中インスリン濃度減少、および血中グルコース濃度減少を導くことを示し、その全ては、糖尿病または他の代謝性疾患および障害の治療に有益であるであろう。理論に結び付けられることを望まないが、全身暴露を伴うここで使用される特定のＣＬＫ２阻害剤（ＴＧ００３）の正味の陽性の影響は、化合物が該臓器でのその効果を限定する肝臓で急に代謝されるため、または非肝臓組織でのＣＬＫ２の阻害の影響が肝臓でのＣＬＫ２阻害の影響よりはるかに重要であるために、生じる場合がある。
【０５９２】
実施例１３：マウスでのＰＯおよびＩＰでのＴＧ００３投与
５週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（雄、１８−２２グラム、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ，Ｗｉｌｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）に、１０、３０および１００ｍｇ／ｋｇ（注射の総体積：用量当たり０．２ｍｌ、１２マウス）で、ＩＰ（腹腔内）注射を介して２％ＨＰＭＣ＋０．２％ＤＯＳＳ中のＴＧ００３を投与した。代わりに、マウスに、３０および１２０ｍｇ／ｋｇ（強制給餌の総体積：用量当たり０．２ｍｌ、１２マウス）で、経口強制給餌を介して２％ＨＰＭＣ＋０．２％ＤＯＳＳ中のＴＧ００３を投与した。
【０５９３】
マウスに、２分毎の時間で１回投与する。マウスを、ＣＯ２過剰投与（時点の４０秒前にＣＯ２チャンバに入れる）を使用して適切な時点で犠牲にする（投与後５、３０、１２０および３６０分）。３匹のマウスを、時点当たり投与レベル当たりで犠牲にする。およそ０．５ｍｌの血液を、２５Ｇ  １ｍｌシリンジを用いて、心臓固着を介して即時に採取する。針を取り除き、サンプルを、Ｌｉｔ．ヘパリンと一緒にＢＤｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ管に添加し、そして回転準備ができるまで氷上に乗せる。３つのサンプルを１５分毎に回転させる。血漿をスナップ管に移行させ、ドライアイスで凍結させる。ＴＧ００３血漿濃度をＧＣ／質量分析によって測定する。
結果
所定投与量での経口またはＩＰ投与後のＴＧ００３の血漿濃度は、それぞれ、図２５Ａおよび２５Ｂに示す。
【０５９４】
実施例１４：ＤＩＯマウスモデルでのＴＧ００３のＩＰ投与
肥満およびＩＩ型糖尿病は、動物モデル、特にマウスで集中的に研究されつつある。このようなモデルの１つは、一般に飼料誘発肥満（ＤＩＯ）モデルと称される。典型的には、Ｃ５７ＢＬ／６雄に、８から１２週の間、高脂肪食で給餌し、そして結果として肥満、軽度から中程度の高血糖性、およびグルコース不耐性になる。その後、これらのマウスを、肥満およびＩＩ型糖尿病の遺伝的および生理学的機構を研究するために使用する。
【０５９５】
特に、５週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雄、１８−２２グラム、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ，Ｗｉｌｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を、高脂肪食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｅｉｃｋ，ＮＪ、６０％キロカロリー脂肪げっ歯類飼料、カタログ番号Ｄ１２４９２）または通常の固形飼料のいずれかの上に乗せる。マウスを５週間、週に１回秤量し、試験基準では、グルコース、ラクテート、トリグリセリドおよびインスリンを供給する。およそ６週、またはＤＩＯ群の平均重量が４０グラムに達するときに、投与を開始する。ＴＧ００３を、３０または１００ｍｇ／ｋｇ（先の実施例でのように２％ＨＰＭＣ＋０．２％ＤＯＳＳ中に懸濁されたＴＧ００３）のいずれかで、ＩＰ注射を介して投与した。対照ＤＩＯおよび固形飼料を給餌された動物に、ビヒクルのみのＩＰ注射で投与した。投与を開始すると、以下の通りデータを収集する：第１週時点は、絶食された血中グルコース測定値を含み、第２週は、血液収集を、第３週は、ＩＰＧＴＴを、そして第４週は、終点の血液および組織収集である。
【０５９６】
マウスに、毎日同じ回数投与する。体重は、投与を開始すると週に２回取る。給餌されたグルコース、ラクテート、トリグリセリドおよびインスリンの基準測定値を、時点０で採取する（投与量の開始）。
結果
体重：投与の開始における各群でのマウスの体重での変動は、１００ｍｇ／ｋｇＴＧ００３研究については図２６で、そして３０／ｋｇＴＧ００３研究については図３０で示す。
【０５９７】
インスリンアッセイ。リンコ・ラット／マウスのインスリンＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＥＺＲＭＩ−１３Ｋ）を使用して、マウスのインスリン濃度を測定した。第０週、第２週および第４週の血中インスリン濃度は、１００ｍｇ／ｋｇＴＧ００３研究についてそれぞれ、図２７Ａ、図２７Ｂおよび図２７Ｃで示す。第０週、第２週および第４週の血中インスリン濃度は、３０ｍｇ／ｋｇＴＧ００３研究についてそれぞれ図３１Ａ、図３１Ｂおよび図３１Ｃで示す。
【０５９８】
給餌血中グルコース：マウスで供給された血中グルコース濃度を、１００ｍｇ／ｋｇＴＧ００３研究（図２８Ａおよび２８Ｂ）の第０週および第２週で、そして３０ｍｇ／ｋｇＴＧ００３研究（図３２Ａ、３２Ｂおよび３２Ｃ）の第０週、第２週および第４週で測定した。さらに、第３週での絶食された血中グルコースは、３０ｍｇ／ｋｇＴＧ００３研究について図３３で示す。
【０５９９】
ＩＰＧＴＴ：マウスを最小の１６時間絶食させる。グルコース読取りを、グルコース測定器を使用して時間ゼロで取る。マウスに、１分の時点で、２ｇ／ｋｇのＤ−グルコースを注射する。グルコース読取りを、１５、３０、６０および１２０分で取る（Ｍｅｄｉｓｅｎｓｅ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｅｘｔｒａ、血中グルコース測定器、アボットカタログ番号７０２９７−０１）。第３週での当初絶食された血中グルコースは、図２９Ａで示し、そしてＩＰＧＴＴ曲線は、図２９Ｂで示す。
【０６００】
実施例１５：ＤＩＯマウスモデルでのＴＧ００３の経口投与
２９週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、６０％ｋｃａｌ％脂肪食（脂肪から熱量の６０％を有する高脂肪食；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｅｉｃｋ，ＮＪ、カタログ番号Ｄ１２４９２）に乗せ、そして１５匹マウスを通常の固形飼料に置いた。マウスを、５週間週に１回秤量し、基準の給餌グルコース、トリグリセリド、およびインスリンを測定した。高脂肪食でのおよそ６週で、またはＤＩＯマウスの平均体重が４０グラムになったときに、投与を、種々の用量および製品で始めた。マウスに、ビヒクル（２％ＨＰＭＣ＋０．２％ＤＯＳＳ）で、またはビヒクル中に懸濁されたＴＧ００３でのいずれかで毎日投与し、そして１００ｍｇ／ｋｇ（ＤＩＯ群で各々１０匹の動物；ビヒクル固形飼料群で９匹の動物、およびＴＧ００３固形飼料で６匹の動物）で経口強制栄養を介して投与した。その研究を、平均体重／ケージを示すＤＩＯ群に分けた。固形飼料を給餌された群も、中央平均体重／ケージによって仕分けた。体重を測定して、体重について投与濃度を週に１回調節した。
【０６０１】
グルコース、トリグリセリド、インスリンなどについての全マウスでの基準血液を、１時間の給餌停止の後で採取した。投与を開始すると、データ収集は以下のとおりであった：第１週時点は、選択群についての絶食された血中グルコースおよび体温、第２週は、給餌された血液収集であり、第３週は、絶食された血中グルコースであり、第４週は、選択群での体温、および終末点での血液および組織収集であった。第１週および第４週での投与後の選択群の体温も得た。ＴＧ００３化合物の濃度を、毎週、各群についての平均重量によって適切な用量に調節する。当初のＰＫと比較した血液中の薬剤の濃度を決定するために、全群の最終血液収集を、投与の１時間後に行った。マウスに、第２週の日に血液収集を投与しなかった。典型的には、午前中マウスに投与するか、１６時間絶食に続く日に午後に投与するのみである。遊離脂肪酸についての試験を、血漿最終血液収集で、および最終血漿収集で行わせる。上記のとおり、ＴＧ００３ＩＰ投与例についてのアッセイを行った。
【０６０２】
結果
投与の開始により各群でのマウスの体重における変動は、ＤＩＯおよび固形飼料給餌群の両方において、１００ｍｇ／ｋｇＴＧ００３対ビヒクルでの経口投与については図３４Ａで示す。投与後の第１週および第４週で、全４つの群についての体温を測定した。図３４Ｂから明らかなように、１週の投与後にＴＧ００３が投与されたＤＩＯ動物における体温における明らかな降下、および４週の投与後に２度の降下があった。ＴＧ００３は、固形飼料を給餌された群での体温における明らかな影響を示さなかった。
【０６０３】
２週給餌されたインスリンおよび４週給餌された血中グルコースの結果は、ＤＩＯおよび固形飼料給餌群の両方での１００ｍｇ／ｋｇＴＧ００３対ビヒクルで経口投与についてそれぞれ図３５Ａおよび３５Ｂで示す。一般に、ＤＩＯまたは固形飼料群のいずれかでのインスリンまたは血中グルコース濃度のいずれかについてビヒクルと比較した場合、ＴＧ００３の経口投与における影響がそれほど多くなかった。
【０６０４】
ＴＧ００３のＩＰ対経口投与の当初のＰＫ比較は、１００ｍｇ／ｋｇ経口投与と比較した場合、３０ｍｇ／ｋｇＩＰ投与について類似の全体的薬剤暴露を示唆した一方で、体重におけるインビボでの影響、血中グルコースおよびインスリンは経口投与と共に繰返さなかった。これについての１つの説明は、ＩＰ投与については、薬剤が、犠牲により腹腔洞で観察されたことである。これは、貯蔵物として供給され、それにより、特に複数回注射の後、経口投与に比較した場合非常に異なる全体的薬剤暴露に対処できる。ＩＰ投与の後に観察されるＴＧ００３の全体的影響は、経口投与から達成できるよりさらに継続的な薬剤暴露に起因する場合がある。将来の実験は、ＤＩＯマウスモデルでのＴＧ００３の継続的放出のための移植可能なミニポンプを含めたこの可能性を扱うであろう。
【０６０５】
等価物
本発明は、とりわけ、ＣＬＫ−調節化合物およびそれを使用する方法を提供する。本発明の特定の実施形態が議論されるが、上記明細書は例であって限定的ではない。本発明の多くの変形は、本明細書の概説により当業者に明らかになるであろう。本発明の全範囲は、等価物のそれらの全範囲と共に請求項を参照して、ならびにそのような変形と共に明細書を参照して決定されるべきである。
【０６０６】
参照による組込み
本明細書で明記される全刊行物および特許は、個々の刊行物または特許が、特に、そして個別に参照して組み込まれることが指示される場合には、それらの全体が参照してここに組み込まれる。対立する場合には、本明細書におけるいずれの定義も含めて本出願が支配する。
【０６０７】
さらに、ゲノム研究所（ＴＩＧＲ）（ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ）および／または全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）によって維持されているものなど、公的データベースでのエントリーに相互に関連する受託番号を参照するあらゆるポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列についても、それらの全体が参照により組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０６０８】
【図１】図１は、質量分析によって確認されたＳｉｒｔ１リン酸化部位を示す。表示したヒト、マウス、ラット、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓおよび／またはニワトリ間でのリン酸化部位の保存を、Ｓｉｒｔ１／Ｓｉｒ２タンパク質配列のアラインメントによって測定した。１つまたはいくつかのセリン（Ｓ１６４、Ｓ１６５、Ｓ１６６）のリン酸化は、種間でのその保存のため、特に重要である。これらの部位は、Ｓｃａｎｓｉｔｅ  ＜ｈｔｔｐ：／／ｓｃａｎｓｉｔｅ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／＞によって潜在的ＣＬＫ２キナーゼ標的と確認された。図１に示すＳ１６４−１６６〜リン酸化部位は、マウスＳＩＲＴ１タンパク質の配列（配列番号：１２）に対応する。ヒトＳＩＲＴ１における対応残基は、Ｓ１７２、Ｓ１７３およびＳ１７４（配列番号：１０）に見られる。他のサーチュインタンパク質における対応残基は、当業者によって、公に入手可能なデータベースを用いてサーチュインタンパク質をアラインメントすることにより決定され得る（Ｒ．Ａ．Ｆｒｙｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２７３：７９３−７９８９  （２０００）もまた参照のこと）。
【図２】図２は、Ｓｉｒｔ１がＣＬＫ２キナーゼの標的であることを示す。図２Ａは、ＣＬＫ２の過剰発現によって、Ｓｉｒｔ１可動性においてシフトがもたらされることを示す。ＨＥＫ  ２９３細胞をエンプティベクター（ｐｃＤＮＡ）または過剰発現Ｆｌａｇ−ＣＬＫ２構築物でトランスフェクトした。ＣＬＫ２の過剰発現により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗Ｓｉｒｔ１抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ）を用いたウエスタンブロットによって測定したとき、Ｓｉｒｔ１可動性における著しいシフトが引き起こされた。図２Ｂは、ＣＬＫ２がＳＩＲＴ１をリン酸化することを示す（代謝標識によって測定）。ＨＥＫ  ２９３細胞を、二重タグ化Ｆｌａｇ−ＨＡ−Ｓｉｒｔ１野生型構築物、または１６４、１６５および１６６の部位のセリンの代わりに３つのアラニンを含有する構築物（Ｆｌａｇ−ＨＡ−Ｓｉｒｔ１  Ｓ１６４〜６Ａ）のいずれかでトランスフェクトした。Ｆｌａｇ−ＨＡ−Ｓｉｒｔ１  ＷＴは３２リン酸基の組込みを示し、これは、４０ｕＭのＴＧ００３（ＣＬＫキナーゼ阻害剤）で処理すると顕著に減少した。ＣＬＫ２の過剰発現により、Ｓｉｒｔ１可動性におけるシフトが引き起こされ、これは、４０ｕＭのＴＧ００３での処理によって消失した。キナーゼデッド（ｄｅａｄ）ＣＬＫ２変異型（Ｋ１９２Ｒ）の過剰発現では、Ｓｉｒｔ１可動性におけるシフトは引き起こされなかった。Ｆｌａｇ−ＨＡ−Ｓｉｒｔ１  Ｓ１６４〜６Ａは、基本的なリン酸化を示すが、ＣＬＫ２の過剰発現では、なお可動性におけるシフトが引き起こされるが、全体的なリン酸化は劇的に低減され、おそらく、Ｓ１６４、Ｓ１６５およびＳ１６６は、マウスＳｉｒｔ１上の唯一のＣＬＫ２リン酸化部位ではない可能性があることを示す。マウスＳＩＲＴ１（配列番号：１２）、マウスＣＬＫ２、マウスＰＧＣ−１α（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＨ６６８６８  ｏｒ  Ｏ７０３４３）、およびマウスＨＮＦ４αを、図２〜４、６〜９および１１に記載の実験に使用した。
【図３】図３は、ＣＬＫ阻害により、肝細胞においてＰＧＣ−１αおよびＳｉｒｔ１の全体的なリン酸化が減少することを示す。ラットヘパトーマ肝細胞であるＦＡＯ細胞を、アデノウイルス過剰発現Ｆｌａｇ−ＨＡ−ＰＧＣ−１αまたはＦｌａｇ−Ｓｉｒｔ１に感染させ、４０μＭのＴＧ００３とともに、または無しでインキュベートした。タンパク質レベルに対する３２リン酸基の組込みによって測定されるように、ＰＧＣ−１αおよびＳｉｒｔ１の全体的なリン酸化は、ＴＧ００３で処理された細胞において低減される。
【図４Ａ】図４は、ＣＬＫ２は、Ｓｉｒｔ１およびＰＧＣ−１αと相互作用することを示す。図４Ａは、ＣＬＫ２がＳＩＲＴ１と相互作用することを示す。ＨＥＫ  ２９３細胞をＦｌａｇ−ＣＬＫ２でトランスフェクトし、表示したとおりに処理した。細胞を回収し、Ｍ２抗Ｆｌａｇアガロース（Ｓｉｇｍａ）を用いた免疫沈降に供した。内因性Ｓｉｒｔ１は、ＣＬＫ２とともに共免疫沈降することができた。興味深いことに、ＴＧ００３で処理すると、共免疫沈降されたＳｉｒｔ１は、より高速の可動性を有するバンドにシフトした。図４Ｂは、ＣＬＫ２は、肝細胞においてＳｉｒｔ１およびＰＧＣ−１αと相互作用することを示す。ＦＡＯ肝細胞を表示したとおりに感染させ、回収し、抗ＨＡアガロース（Ｒｏｃｈｅ）を用いた免疫沈降に供した。過剰発現されたＦｌａｇ−ＨＡ−Ｓｉｒｔ１およびＦｌａｇ−ＨＡ−ＰＧＣ−１αの免疫沈降により、ＣＬＫ２を共免疫沈降させることができた。
【図４Ｂ】図４は、ＣＬＫ２は、Ｓｉｒｔ１およびＰＧＣ−１αと相互作用することを示す。図４Ａは、ＣＬＫ２がＳＩＲＴ１と相互作用することを示す。ＨＥＫ  ２９３細胞をＦｌａｇ−ＣＬＫ２でトランスフェクトし、表示したとおりに処理した。細胞を回収し、Ｍ２抗Ｆｌａｇアガロース（Ｓｉｇｍａ）を用いた免疫沈降に供した。内因性Ｓｉｒｔ１は、ＣＬＫ２とともに共免疫沈降することができた。興味深いことに、ＴＧ００３で処理すると、共免疫沈降されたＳｉｒｔ１は、より高速の可動性を有するバンドにシフトした。図４Ｂは、ＣＬＫ２は、肝細胞においてＳｉｒｔ１およびＰＧＣ−１αと相互作用することを示す。ＦＡＯ肝細胞を表示したとおりに感染させ、回収し、抗ＨＡアガロース（Ｒｏｃｈｅ）を用いた免疫沈降に供した。過剰発現されたＦｌａｇ−ＨＡ−Ｓｉｒｔ１およびＦｌａｇ−ＨＡ−ＰＧＣ−１αの免疫沈降により、ＣＬＫ２を共免疫沈降させることができた。
【図５Ａ】図５は、Ｃｄｃ−２様キナーゼ（Ｃｌｋ）ファミリーのキナーゼの概略図および配列アラインメントを示す。図５Ａは、哺乳動物のＣＬＫキナーゼ１〜４の保存されたＣＬＫ／ＬＡＭＭＥＲキナーゼドメインおよび高度可変Ｎ末端の図を示す。ＣＬＫ阻害剤ＴＧ００３に対する各ＣＬＫファミリーの感受性を右側に示す（Ｍｕｒａｋｉ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ（２００４）２７９（２３）：２４２４６−５４を参照のこと）。マウスＣＬＫ上の潜在的なリン酸化部位ＡＫＴ／ｐＫＢまたはｐＫＡ（Ｐ＜０．０１である）を、Ｓｃａｎｓｉｔｅ（ｓｃａｎｓｉｔｅ．ｍｉｔ．ｅｄｕのワールドワイドウェブを参照のこと）を用いて決定した。
【図５Ｂ】図５は、Ｃｄｃ−２様キナーゼ（Ｃｌｋ）ファミリーのキナーゼの概略図および配列アラインメントを示す。図５Ｂは、ヒトＣＬＫアミノ酸配列のアラインメントを示す。ｓｅｑＣＬＫ１、ｓｅｑＣＬＫ２、ｓｅｑＣＬＫ３およびｓｅｑＣＬＫ４は、それぞれ、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３および配列番号：４に対応する。
【図６】図６は、ＣＬＫ２が、核内受容体のＰＧＣ−１α同時活性化を抑制することを示す。ＨＥＫ  ２９３細胞を、ｇＡＦ１−ルシフェラーゼ（ＨＮＦ４α応答エレメント）およびＨＮＦ４α（肝細胞核因子４α）でトランスフェクトした。ＰＧＣ−１αの過剰発現は、ルシフェラーゼ活性の約１０００倍の活性化を示し、これは、ＣＬＫ２の過剰発現によって著しく低減される。２０μＭのＴＧ００３での該細胞の処理により、ＰＧＣ−１αのＣＬＫ２抑制が一部救済される。また、核内受容体のＰＧＣ−１α同時活性化のＣＬＫ２による同様の抑制が、ＰＰＡＲ−α（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体α）、ＥＲＲ−α（エストロゲン関連受容体α）、およびグルココルチコイド受容体（ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）で見られた。
【図７】図７は、ＣＬＫ阻害剤ＴＧ００３が、肝細胞において糖新生遺伝子を誘導することを示す。ＦＡＯ肝細胞を、ＰＧＣ−１α過剰発現アデノウイルスに感染させ、漸増量のＴＧ００３で処理した。糖新生遺伝子（ＰＧＣ−１α標的）、Ｐｅｐｃｋ（ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ）およびＧ６Ｐアーゼ（グルコース−６−ホスファターゼ）の誘導が、ＴＧ００３の増加とともに用量依存的に見られた。脂肪酸酸化遺伝子、ＭＣＡＤ（中鎖アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）、別のＰＧＣ−１α（ａｌｐａ）標的もまた同様の誘導を示した。
【図８】図８は、ＣＬＫ２  ｓｉＲＮＡが、ＨＥＫ  ２９３細胞においてＣＬＫ２発現を有意に低減させることを示す。Ｆｌａｇ−ＣＬＫ２および／またはＣＬＫ２  ｓｉＲＮＡを含むアデノウイルス構築物を、ＨＥＫ  ２９３細胞内に導入した。レーン２（Ａｄ−Ｆｌａｇ−ＣＬＫ２）は、Ｆｌａｇ−Ｃｌｋ２アデノウイルス構築物が導入されると、ＨＥＫ  ２９３細胞においてＦｌａｇ−ＣＬＫ２が過剰発現されることを示す。マウス、ラットおよびヒトのＣＬＫ２に対応する短鎖２１ヌクレオチドヘアピンｓｉＲＮＡを発現するように設計されたアデノウイルス構築物は、ＨＥＫ  ２９３細胞において、ＣＬＫ２配列の単一塩基対変異を含むアデノウイルス対照ｓｉＲＮＡと比べ（レーン３；Ａｄ−Ｆｌａｇ−ＣＬＫ２＋Ａｄ−対照ＳｉＲＮＡ）、アデノイルスＣＬＫ２過剰発現のタンパク質発現を大きく低減する能力を有した（レーン４；Ａｄ−Ｆｌａｇ−ＣＬＫ２＋Ａｄ−ＣＬＫ２  ｓｉＲＮＡ）。
【図９Ａ】図９は、糖新生遺伝子のＰＧＣ−１α誘導のＣＬＫ２抑制およびＣＬＫ２阻害剤ＴＧ００３による救済を示す。図９Ａは、ＣＬＫ２が糖新生遺伝子のＰＧＣ−１α誘導を抑制することを示す。ＦＡＯ肝細胞を、表示したアデノウイルス（Ａｄ−ＧＦＰ、Ａｄ−ＰＧＣ−１ａ＋Ａｄ−ＧＦＰ、およびＡｄ−ＰＧＣ−１ａ＋Ａｄ−ＣＬＫ２）に、一晩、ＲＰＭＩ＋０．５％ＢＳＡ中で感染させた。感染の４８時間後、細胞を、処理しない（ＲＰＭＩ＋ＢＳＡ）か、フォルスコリンおよびデキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｍｅ）（Ｆｓｋ＋Ｄｅｘ）で３．５時間処理するか、またはフォルスコリンおよびＤｅｘで２時間で処理した後、インスリン（Ｆｓｋ＋Ｄｅｘ  ｔｈｅｎ  Ｉｎｓ）ｆｏｒ  １．５時間処理するかのいずれかとした。上パネルは、全ＲＮＡ単離物のノザンブロットを示す。下パネルは、ホスホイメージャー（ホスホ−ｉｍａｇｅｒ）解析によって行なったＧ６Ｐアーゼの定量および３６ｂ４により補正されたＰｅｐｃｋ発現である。
【図９Ｂ】図９は、糖新生遺伝子のＰＧＣ−１α誘導のＣＬＫ２抑制およびＣＬＫ２阻害剤ＴＧ００３による救済を示す。図９Ｂは、糖新生遺伝子のＰＧＣ−１α誘導のＣＬＫ２抑制が、ＣＬＫ阻害剤ＴＧ００３によって救済されることを示す。ＦＡＯ肝細胞を、表示したアデノウイルス（Ａｄ−ＰＧＣ−１ａ＋Ａｄ−ＧＦＰおよびＡｄ−ＰＧＣ−１ａ＋Ａｄ−ＣＬＫ２）に一晩、ＲＰＭＩ＋０．５％ＢＳＡ中で感染させた。感染の４８時間後、細胞を、４０μＭのＴＧ００３とともに、または無しで１時間インキュベートした後、フォルスコリンおよびデキサメタゾン（Ｆｓｋ＋Ｄｅｘ）で表示したとおりに処理した。上パネルは、全ＲＮＡ単離物のノザンブロットを示す。下パネルは、ホスホイメージャー解析によって行なったＧ６Ｐアーゼの定量および３６ｂ４により補正されたＰｅｐｃｋ発現である。
【図１０】図１０は、ＣＬＫ２の転写構造およびスプライシングの概略図である。ＣＬＫは、自身の転写物の選択的スプライシングを調節する。ＣＬＫ２  ｍＲＮＡ内にエキソン４を含めることにより、完全長の触媒的に活性なＣＬＫ２タンパク質がもたらされる。エキソン４を排除することにより、切断型の触媒的に不活性なペプチドがもたらされる。活性なＣＬＫは、エキソン４排除をもたらす「エキソンスキッピング（ｓｋｉｐｐｉｎｇ）」を促進する（例えば、ＤｕｎｃａｎらＭｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１７  （１０）：５９９６を参照のこと）。
【図１１】図１１は、ＣＬＫ２がインスリンによって活性化されることを示す。図１１Ａ（上）は、ＣＬＫ２転写アッセイの結果を示す。エキソン４に隣接するプライマーにより、エキソン４がＣＬＫ転写物に含まれている場合は１９５塩基対の生成物が、またはエキソン４が排除されている場合は１１０塩基対の生成物が得られる。図１１Ａ（下）は、インスリン単独（ＮＴ＝処理なし）、または２０μＭのＴＧ００３、ＬＹ９４００２  （ＬＹ）ＰＩ３キナーゼ阻害剤、Ｕ０１２６  ＭＥＫキナーゼ阻害剤もしくはラパマイシン（Ｒａｐａｍｍｙｃｉｎ）ｍＴＯＲ阻害剤の存在下にてインスリンで処理した、または処理無しのＦＡＯ細胞でのＣＬＫ２転写物のＲＴ−ＰＣＲを示す。完全長ＣＬＫ２転写物は、ＲＰＭＩ＋ＢＳＡ中で培養したＦＡＯ細胞における主要な転写産物であるが、インスリンでの処理後、切断型ＣＬＫ２転写物のアバンダンスが劇的に増加する。ＴＧ００３での該細胞の前処理により、選択的スプライシングのインスリン誘導が遮断され、これは、選択的スプライシングの誘導にＣＬＫキナーゼ活性が必要とされることを示す。さらに、ＬＹおよびラパマイシンでの処理によりＣＬＫ選択的スプライシングのインスリン誘導が遮断されるが、Ｕ０１２６では遮断されず、これは、ＣＬＫ２がインスリン経路内に存在することを暗示する。このＣＬＫ２スプライシングの調節は、ＣＬＫ１がスプライシング調節を示さないため、特異的であると思われる。図１１Ｂは、ＡＫＴコンセンサス部位におけるＣＬＫ２リン酸化が  インスリン処理によって誘導されることを示す。マウスＨ２．３５  ＳＶ４０形質転換肝細胞を、Ｆｌａｇ−ＣＬＫ２  アデノウイルスに感染させ、インスリンで処理、または処理無しとした。抗ｆｌａｇアガロースを用いてＣＬＫ２を免疫沈降させ、抗ホスホ−Ａｋｔ基質抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を使用するウエスタンブロットに供した。インスリンで処理すると、Ａｋｔコンセンサス部位においてＣＬＫ２リン酸化が劇的に誘導された。ホスホ−Ａｋｔ基質抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）は、エピトープＲＸＲＸＸ（Ｓ／Ｔ）＊（式中、ｘは任意のアミノ酸を示し、＊は、ホスホ（ｐｈｏｓｐｈｏｒ）セリンまたはトレオニンを表す）を認識する。ＣＬＫ２は、この抗体に対する少なくとも３つの可能な認識部位、例えば、Ｓ３４、Ｓ１２５およびＴ１２７を有する（図５Ａ）。
【図１２】図１２は、ＣＬＫ２アッセイの概略図を示す。
【図１３】図１３は、ＣＬＫおよびＣＬＫ阻害剤に関する構造の情報を示す。図１３Ａは、１．７オングストロームの１０Ｚ−２ヒメニアルジシン（ｈｙｍｅｎｉａｌｄｉｓｉｎｅ）（ｐｄｂデータベースに１Ｚ５７としてに報告）と複合体状態のｈＣＬＫ１結晶構造の図を示す。図１３Ｂは、１０Ｚ−２ヒメニアルジシンの構造のを示す。
【図１４】図１４は、ＣＬＫ阻害剤の例を示す。
【図１５】図１５は、ＣＬＫ阻害剤であるＴＧ００３の合成の概略図である。
【図１６】図１６は、脂肪代謝細胞系アッセイにおいて合成されたＴＧ００３の結果を示す。
【図１７−１】図１７は、以下のヌクレオチドおよびアミノ酸配列：配列番号：１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ４９７５９および番号ＡＡＨ３１５４９、ＣＬＫ１（ＣＤＣ様キナーゼ１）、ヒト、４８４  ａａ）、配列番号：２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００３９８４およびＡＡＨ５３６０３、ＣＬＫ２（ＣＤＣ様キナーゼ２）、ヒト、４９８  ａａ）、配列番号：３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ４９７６１およびＡＡＨ１９８８１、ＣＬＫ３（ＣＤＣ様キナーゼ３）、ヒト、４９０  ａａ）、配列番号：４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｑ９ＨＡＺ１またはＮＰ＿０６５７１７、ＣＬＫ４（ＣＤＣ様キナーゼ４）、ヒト、４８１  ａａ）、配列番号：５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０３１５４９、ＣＬＫ１  ｍＲＮＡ、ヒト、１７７３  ｂｐ）、配列番号：６（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０５３６０３、ＣＬＫ２  ｍＲＮＡ、ヒト、２１１０  ｂｐ）、配列番号：７（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０１９８８１、ＣＬＫ３  ｍＲＮＡ（ＣＤＣ様キナーゼ３）、ヒト、１７６０  ｂｐ）、配列番号：８（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２０６６６、ＣＬＫ４  ｍＲＮＡ（ＣＤＣ様キナーゼ４）、ヒト、２５２４  ｂｐ）、配列番号：９（ＳＦ２／ＡＳＦ  ＲＳドメインの２９アミノ酸合成ペプチド）、配列番号：１０（ヒトＳＩＲＴ１）、配列番号：１１（ｐ５３に由来する１４アミノ酸のアセチル化ペプチド）、配列番号：１２（マウスＳＩＲＴ１）、配列番号：１３（ｐ５３に由来する２０アミノ酸のアセチル化された蛍光タグ化ペプチド）、配列番号：１４（ｐ５３に由来する２０アミノ酸のアセチル化された蛍光タグ化ペプチド）、配列番号：１５（マウス、ラットおよびヒトＣＬＫ２）に対応するオリゴヌクレオチドならびに配列番号：１６（対照ｓｉＲＮＡ）を示す。
【図１７−２】図１７は、以下のヌクレオチドおよびアミノ酸配列：配列番号：１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ４９７５９および番号ＡＡＨ３１５４９、ＣＬＫ１（ＣＤＣ様キナーゼ１）、ヒト、４８４  ａａ）、配列番号：２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００３９８４およびＡＡＨ５３６０３、ＣＬＫ２（ＣＤＣ様キナーゼ２）、ヒト、４９８  ａａ）、配列番号：３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ４９７６１およびＡＡＨ１９８８１、ＣＬＫ３（ＣＤＣ様キナーゼ３）、ヒト、４９０  ａａ）、配列番号：４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｑ９ＨＡＺ１またはＮＰ＿０６５７１７、ＣＬＫ４（ＣＤＣ様キナーゼ４）、ヒト、４８１  ａａ）、配列番号：５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０３１５４９、ＣＬＫ１  ｍＲＮＡ、ヒト、１７７３  ｂｐ）、配列番号：６（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０５３６０３、ＣＬＫ２  ｍＲＮＡ、ヒト、２１１０  ｂｐ）、配列番号：７（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０１９８８１、ＣＬＫ３  ｍＲＮＡ（ＣＤＣ様キナーゼ３）、ヒト、１７６０  ｂｐ）、配列番号：８（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２０６６６、ＣＬＫ４  ｍＲＮＡ（ＣＤＣ様キナーゼ４）、ヒト、２５２４  ｂｐ）、配列番号：９（ＳＦ２／ＡＳＦ  ＲＳドメインの２９アミノ酸合成ペプチド）、配列番号：１０（ヒトＳＩＲＴ１）、配列番号：１１（ｐ５３に由来する１４アミノ酸のアセチル化ペプチド）、配列番号：１２（マウスＳＩＲＴ１）、配列番号：１３（ｐ５３に由来する２０アミノ酸のアセチル化された蛍光タグ化ペプチド）、配列番号：１４（ｐ５３に由来する２０アミノ酸のアセチル化された蛍光タグ化ペプチド）、配列番号：１５（マウス、ラットおよびヒトＣＬＫ２）に対応するオリゴヌクレオチドならびに配列番号：１６（対照ｓｉＲＮＡ）を示す。
【図１７−３】図１７は、以下のヌクレオチドおよびアミノ酸配列：配列番号：１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ４９７５９および番号ＡＡＨ３１５４９、ＣＬＫ１（ＣＤＣ様キナーゼ１）、ヒト、４８４  ａａ）、配列番号：２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００３９８４およびＡＡＨ５３６０３、ＣＬＫ２（ＣＤＣ様キナーゼ２）、ヒト、４９８  ａａ）、配列番号：３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ４９７６１およびＡＡＨ１９８８１、ＣＬＫ３（ＣＤＣ様キナーゼ３）、ヒト、４９０  ａａ）、配列番号：４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｑ９ＨＡＺ１またはＮＰ＿０６５７１７、ＣＬＫ４（ＣＤＣ様キナーゼ４）、ヒト、４８１  ａａ）、配列番号：５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０３１５４９、ＣＬＫ１  ｍＲＮＡ、ヒト、１７７３  ｂｐ）、配列番号：６（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０５３６０３、ＣＬＫ２  ｍＲＮＡ、ヒト、２１１０  ｂｐ）、配列番号：７（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０１９８８１、ＣＬＫ３  ｍＲＮＡ（ＣＤＣ様キナーゼ３）、ヒト、１７６０  ｂｐ）、配列番号：８（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２０６６６、ＣＬＫ４  ｍＲＮＡ（ＣＤＣ様キナーゼ４）、ヒト、２５２４  ｂｐ）、配列番号：９（ＳＦ２／ＡＳＦ  ＲＳドメインの２９アミノ酸合成ペプチド）、配列番号：１０（ヒトＳＩＲＴ１）、配列番号：１１（ｐ５３に由来する１４アミノ酸のアセチル化ペプチド）、配列番号：１２（マウスＳＩＲＴ１）、配列番号：１３（ｐ５３に由来する２０アミノ酸のアセチル化された蛍光タグ化ペプチド）、配列番号：１４（ｐ５３に由来する２０アミノ酸のアセチル化された蛍光タグ化ペプチド）、配列番号：１５（マウス、ラットおよびヒトＣＬＫ２）に対応するオリゴヌクレオチドならびに配列番号：１６（対照ｓｉＲＮＡ）を示す。
【図１７−４】図１７は、以下のヌクレオチドおよびアミノ酸配列：配列番号：１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ４９７５９および番号ＡＡＨ３１５４９、ＣＬＫ１（ＣＤＣ様キナーゼ１）、ヒト、４８４  ａａ）、配列番号：２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００３９８４およびＡＡＨ５３６０３、ＣＬＫ２（ＣＤＣ様キナーゼ２）、ヒト、４９８  ａａ）、配列番号：３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ４９７６１およびＡＡＨ１９８８１、ＣＬＫ３（ＣＤＣ様キナーゼ３）、ヒト、４９０  ａａ）、配列番号：４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｑ９ＨＡＺ１またはＮＰ＿０６５７１７、ＣＬＫ４（ＣＤＣ様キナーゼ４）、ヒト、４８１  ａａ）、配列番号：５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０３１５４９、ＣＬＫ１  ｍＲＮＡ、ヒト、１７７３  ｂｐ）、配列番号：６（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０５３６０３、ＣＬＫ２  ｍＲＮＡ、ヒト、２１１０  ｂｐ）、配列番号：７（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０１９８８１、ＣＬＫ３  ｍＲＮＡ（ＣＤＣ様キナーゼ３）、ヒト、１７６０  ｂｐ）、配列番号：８（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２０６６６、ＣＬＫ４  ｍＲＮＡ（ＣＤＣ様キナーゼ４）、ヒト、２５２４  ｂｐ）、配列番号：９（ＳＦ２／ＡＳＦ  ＲＳドメインの２９アミノ酸合成ペプチド）、配列番号：１０（ヒトＳＩＲＴ１）、配列番号：１１（ｐ５３に由来する１４アミノ酸のアセチル化ペプチド）、配列番号：１２（マウスＳＩＲＴ１）、配列番号：１３（ｐ５３に由来する２０アミノ酸のアセチル化された蛍光タグ化ペプチド）、配列番号：１４（ｐ５３に由来する２０アミノ酸のアセチル化された蛍光タグ化ペプチド）、配列番号：１５（マウス、ラットおよびヒトＣＬＫ２）に対応するオリゴヌクレオチドならびに配列番号：１６（対照ｓｉＲＮＡ）を示す。
【図１７−５】図１７は、以下のヌクレオチドおよびアミノ酸配列：配列番号：１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ４９７５９および番号ＡＡＨ３１５４９、ＣＬＫ１（ＣＤＣ様キナーゼ１）、ヒト、４８４  ａａ）、配列番号：２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００３９８４およびＡＡＨ５３６０３、ＣＬＫ２（ＣＤＣ様キナーゼ２）、ヒト、４９８  ａａ）、配列番号：３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ４９７６１およびＡＡＨ１９８８１、ＣＬＫ３（ＣＤＣ様キナーゼ３）、ヒト、４９０  ａａ）、配列番号：４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｑ９ＨＡＺ１またはＮＰ＿０６５７１７、ＣＬＫ４（ＣＤＣ様キナーゼ４）、ヒト、４８１  ａａ）、配列番号：５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０３１５４９、ＣＬＫ１  ｍＲＮＡ、ヒト、１７７３  ｂｐ）、配列番号：６（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０５３６０３、ＣＬＫ２  ｍＲＮＡ、ヒト、２１１０  ｂｐ）、配列番号：７（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０１９８８１、ＣＬＫ３  ｍＲＮＡ（ＣＤＣ様キナーゼ３）、ヒト、１７６０  ｂｐ）、配列番号：８（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２０６６６、ＣＬＫ４  ｍＲＮＡ（ＣＤＣ様キナーゼ４）、ヒト、２５２４  ｂｐ）、配列番号：９（ＳＦ２／ＡＳＦ  ＲＳドメインの２９アミノ酸合成ペプチド）、配列番号：１０（ヒトＳＩＲＴ１）、配列番号：１１（ｐ５３に由来する１４アミノ酸のアセチル化ペプチド）、配列番号：１２（マウスＳＩＲＴ１）、配列番号：１３（ｐ５３に由来する２０アミノ酸のアセチル化された蛍光タグ化ペプチド）、配列番号：１４（ｐ５３に由来する２０アミノ酸のアセチル化された蛍光タグ化ペプチド）、配列番号：１５（マウス、ラットおよびヒトＣＬＫ２）に対応するオリゴヌクレオチドならびに配列番号：１６（対照ｓｉＲＮＡ）を示す。
【図１７−６】図１７は、以下のヌクレオチドおよびアミノ酸配列：配列番号：１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ４９７５９および番号ＡＡＨ３１５４９、ＣＬＫ１（ＣＤＣ様キナーゼ１）、ヒト、４８４  ａａ）、配列番号：２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００３９８４およびＡＡＨ５３６０３、ＣＬＫ２（ＣＤＣ様キナーゼ２）、ヒト、４９８  ａａ）、配列番号：３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ４９７６１およびＡＡＨ１９８８１、ＣＬＫ３（ＣＤＣ様キナーゼ３）、ヒト、４９０  ａａ）、配列番号：４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｑ９ＨＡＺ１またはＮＰ＿０６５７１７、ＣＬＫ４（ＣＤＣ様キナーゼ４）、ヒト、４８１  ａａ）、配列番号：５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０３１５４９、ＣＬＫ１  ｍＲＮＡ、ヒト、１７７３  ｂｐ）、配列番号：６（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０５３６０３、ＣＬＫ２  ｍＲＮＡ、ヒト、２１１０  ｂｐ）、配列番号：７（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０１９８８１、ＣＬＫ３  ｍＲＮＡ（ＣＤＣ様キナーゼ３）、ヒト、１７６０  ｂｐ）、配列番号：８（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２０６６６、ＣＬＫ４  ｍＲＮＡ（ＣＤＣ様キナーゼ４）、ヒト、２５２４  ｂｐ）、配列番号：９（ＳＦ２／ＡＳＦ  ＲＳドメインの２９アミノ酸合成ペプチド）、配列番号：１０（ヒトＳＩＲＴ１）、配列番号：１１（ｐ５３に由来する１４アミノ酸のアセチル化ペプチド）、配列番号：１２（マウスＳＩＲＴ１）、配列番号：１３（ｐ５３に由来する２０アミノ酸のアセチル化された蛍光タグ化ペプチド）、配列番号：１４（ｐ５３に由来する２０アミノ酸のアセチル化された蛍光タグ化ペプチド）、配列番号：１５（マウス、ラットおよびヒトＣＬＫ２）に対応するオリゴヌクレオチドならびに配列番号：１６（対照ｓｉＲＮＡ）を示す。
【図１７−７】図１７は、以下のヌクレオチドおよびアミノ酸配列：配列番号：１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ４９７５９および番号ＡＡＨ３１５４９、ＣＬＫ１（ＣＤＣ様キナーゼ１）、ヒト、４８４  ａａ）、配列番号：２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００３９８４およびＡＡＨ５３６０３、ＣＬＫ２（ＣＤＣ様キナーゼ２）、ヒト、４９８  ａａ）、配列番号：３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ４９７６１およびＡＡＨ１９８８１、ＣＬＫ３（ＣＤＣ様キナーゼ３）、ヒト、４９０  ａａ）、配列番号：４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｑ９ＨＡＺ１またはＮＰ＿０６５７１７、ＣＬＫ４（ＣＤＣ様キナーゼ４）、ヒト、４８１  ａａ）、配列番号：５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０３１５４９、ＣＬＫ１  ｍＲＮＡ、ヒト、１７７３  ｂｐ）、配列番号：６（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０５３６０３、ＣＬＫ２  ｍＲＮＡ、ヒト、２１１０  ｂｐ）、配列番号：７（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０１９８８１、ＣＬＫ３  ｍＲＮＡ（ＣＤＣ様キナーゼ３）、ヒト、１７６０  ｂｐ）、配列番号：８（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２０６６６、ＣＬＫ４  ｍＲＮＡ（ＣＤＣ様キナーゼ４）、ヒト、２５２４  ｂｐ）、配列番号：９（ＳＦ２／ＡＳＦ  ＲＳドメインの２９アミノ酸合成ペプチド）、配列番号：１０（ヒトＳＩＲＴ１）、配列番号：１１（ｐ５３に由来する１４アミノ酸のアセチル化ペプチド）、配列番号：１２（マウスＳＩＲＴ１）、配列番号：１３（ｐ５３に由来する２０アミノ酸のアセチル化された蛍光タグ化ペプチド）、配列番号：１４（ｐ５３に由来する２０アミノ酸のアセチル化された蛍光タグ化ペプチド）、配列番号：１５（マウス、ラットおよびヒトＣＬＫ２）に対応するオリゴヌクレオチドならびに配列番号：１６（対照ｓｉＲＮＡ）を示す。
【図１８】図１８は、ＣＬＫ２リン酸化がインスリンによって刺激されることを示す。
【図１９】図１９は、ＡＫＴがＣＬＫ２をインビトロでリン酸化することを示す。
【図２０】図２０Ａおよび２０Ｂは、ＰＧＣ−１αおよびＳＩＲＴ１リン酸化がインビボで、インスリンによって刺激され、ＬＹおよびＴＧ００３によって遮断されることを示す。
【図２１】図２１Ａおよび２１Ｂは、ＣＬＫ２がＰＥＰＣＫ  ｍＲＮＡ  発現の誘導に関与しており（図２１Ａ）、ＣＬＫ２ノックダウンにより、部分インスリン抵抗性が引き起こされる（図２１Ｂ）ことを示す。
【図２２】図２２は、肝ＣＬＫ２ノックダウンにより、動物全体において部分インスリン抵抗性が引き起こされることを示す。
【図２３Ａ】図２３Ａおよび２３Ｂは、肝ＣＬＫ２ノックダウンが血清および肝臓トリグリセリドに影響し（図２３Ａ）、肝ＣＬＫ２ノックダウンが無血清脂肪酸および血糖に影響する（図２３Ｂ）ことを示す。
【図２３Ｂ】図２３Ａおよび２３Ｂは、肝ＣＬＫ２ノックダウンが血清および肝臓トリグリセリドに影響し（図２３Ａ）、肝ＣＬＫ２ノックダウンが無血清脂肪酸および血糖に影響する（図２３Ｂ）ことを示す。
【図２４】図２４は、肝ＣＬＫ２ノックダウンにより肝臓脂質が減少することを示す。
【図２５】図２５Ａおよび２５Ｂは、表示した用量での経口（図２５Ａ）またはＩＰ（図２５Ｂ）投与後のＴＧ００３の血漿レベルを示す。
【図２６】図２６は、食餌誘発型肥満（ＤＩＯ）動物または飼料動物における、ＴＧ００３（１００ｍｇ／ｋｇのＩＰ投与）またはビヒクルでの種々の処置群のマウスの体重の変化を示す。
【図２７】図２７Ａ、２７Ｂおよび２７Ｃは、０週間（図２７Ａ）、２週間（図２７Ｂ）または４週間（図２７Ｃ）でのＤＩＯまたは飼料摂取動物における、ビヒクルと比較した１００ｍｇ／ｋｇのＴＧ００３のＩＰ投与後のマウスの血中インスリンレベルを示す。
【図２８】図２８Ａおよび２８Ｂは、０週間（図２８Ａ）または２週間（図２８Ｂ）での、ＤＩＯまたは飼料摂取動物における、ビヒクルと比較した１００ｍｇ／ｋｇのＴＧ００３のＩＰ投与後のマウスにおける摂取時血中グルコースレベルを示す。
【図２９】図２９Ａおよび２９Ｂは、３週間での空腹時血糖（図２９Ａ）およびＤＩＯまたは飼料摂取動物における、ビヒクルと比較した１００ｍｇ／ｋｇのＴＧ００３のＩＰ投与後のＩＰＧＴＴ曲線（図２９Ｂ）を示す。
【図３０】図３０は、ＤＩＯまたは通常飼料動物における、ＴＧ００３（３０ｍｇ／ｋｇのＩＰ投与）またはビヒクルでの種々の処置群のマウスの体重の変化を示す。
【図３１】図３１Ａ、３１Ｂおよび３１Ｃは、０週間（図３１Ａ）、２週間（図３１Ｂ）または４週間（図３１Ｃ）でのＤＩＯまたは飼料摂取動物における、ビヒクルと比較した３０ｍｇ／ｋｇのＴＧ００３ＩＰ投与後のマウスにおける血中インスリンレベルを示す。
【図３２】図３２Ａ、３２Ｂおよび３２Ｃは、０週間（図３２Ａ）、２週間（図３２Ｂ）または４週間（図３２Ｃ）でのＤＩＯまたは飼料摂取動物における、ビヒクルと比較した３０ｍｇ／ｋｇのＴＧ００３ＩＰ投与後のマウスにおける摂取時血中グルコースレベルを示す。
【図３３】図３３は、ＤＩＯまたは飼料摂取動物における、ビヒクルと比較した３０ｍｇ／ｋｇのＴＧ００３ＩＰ投与３週後の空腹時血糖を示す。
【図３４】図３４Ａおよび３４Ｂは、ＤＩＯまたは飼料動物（図３４Ａ）における、ＴＧ００３（１００ｍｇ／ｋｇの経口（ＰＯ）投与）またはビヒクルでの種々の処置群のマウスの体重の変化を示す。ＤＩＯまたは飼料動物における、ＴＧ００３（１００ｍｇ／ｋｇのＰＯ投与）またはビヒクルでの種々の処置群のマウスの体温の変化（図３４Ｂ）。
【図３５】図３５Ａおよび３５Ｂは、ＤＩＯまたは飼料動物における、ＴＧ００３（１００ｍｇ／ｋｇのＰＯ投与）またはビヒクルでの種々の処置群のマウスの、投与２週間後の摂取時インスリンレベル（図３５Ａ）および投与４週間後の血中グルコースレベル（図３５Ｂ）を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１７−４】
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【図１７−５】
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【図１７−６】
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【図１７−７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【配列表】
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