(57)【要約】  本発明は、ＤＰ−ＩＶまたはＤＰ−ＩＶ様の酵素の活性に関連するおよび／またはそれにより引き起こされる病気および／または疾患の治療用薬剤の製造のための、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｃａｔｔｌｅｉａｎｕｍ、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｃａｔｔｌｅｉａｎｕｍ  ｓｓｐ．  Ｌｕｃｉｄｕｍ、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕｉｎｅｅｎｓｅ、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｌｉｔｔｏｒａｌｅ、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｍｏｌｌｅおよびＰｓｉｄｉｕｍ  ｓｃｈｉｅｄｅａｎｕｍからなるグループから選択された植物の抽出物の使用に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＰ−ＩＶまたはＤＰ−ＩＶ様の酵素の活性に関連するおよび／またはそれにより引き起こされる病気および／または疾患の治療用薬剤の製造のための、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｃａｔｔｌｅｉａｎｕｍ、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｃａｔｔｌｅｉａｎｕｍ  ｓｓｐ．  Ｌｕｃｉｄｕｍ、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕｉｎｅｅｎｓｅ、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｌｉｔｔｏｒａｌｅ、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｍｏｌｌｅおよびＰｓｉｄｉｕｍ  ｓｃｈｉｅｄｅａｎｕｍからなるグループから選択される植物の抽出物の使用。
【請求項２】
植物がＰｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
抽出物が葉、果実および／または植物の樹皮の抽出物である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
抽出物が、水、メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチル、およびそれらの混合物のグループから選択される溶媒を用いて調製された抽出物である、請求項１−３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
抽出物が固体の形である、請求項１−４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
グアヤベリンを０．５重量％またはそれ以上、好ましくは１０から５０重量％まで含むことを特徴とする、請求項１−５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
ＤＰ−ＩＶまたはＤＰ−ＩＶ様の酵素の活性に関連するまたはそれにより引き起こされる病気または疾患の治療用の薬剤の製造のための、グアヤベリンおよび／またはそれらの薬学的に許容される塩またはエステルの使用。
【請求項８】
病気および／または疾患が糖尿病、肥満、および／またはアテローム性動脈硬化症などのようなグルコース代謝疾患である、請求項１−７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
薬剤として使用するための、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｃａｔｔｌｅｉａｎｕｍ、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｃａｔｔｌｅｉａｎｕｍ  ｓｓｐ．  Ｌｕｃｉｄｕｍ、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕｉｎｅｅｎｓｅ、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｌｉｔｔｏｒａｌｅ、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｍｏｌｌｅおよびＰｓｉｄｉｕｍ  ｓｃｈｉｅｄｅａｎｕｍからなるグループから選択される植物の抽出物。
【請求項１０】
栄養成分として、例えば機能食品の組成物としてソフトドリンク中に、または化粧品中に成分として、グアヤベリンおよび／またはそれらの薬学的に許容される塩またはエステルの使用、および／またはＰｓｉｄｉｕｍ  ｃａｔｔｌｅｉａｎｕｍ、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｃａｔｔｌｅｉａｎｕｍ  ｓｓｐ．  Ｌｕｃｉｄｕｍ、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕｉｎｅｅｎｓｅ、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｌｉｔｔｏｒａｌｅ、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｍｏｌｌｅおよびＰｓｉｄｉｕｍ  ｓｃｈｉｅｄｅａｎｕｍからなるグループから選択される植物の抽出物の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｃａｔｔｌｅｉａｎｕｍ、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｃａｔｔｌｅｉａｎｕｍ  ｓｓｐ．  Ｌｕｃｉｄｕｍ、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕｉｎｅｅｎｓｅ、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｌｉｔｔｏｒａｌｅ、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｍｏｌｌｅおよびＰｓｉｄｉｕｍ  ｓｃｈｉｅｄｅａｎｕｍからなるグループから選択される植物の抽出物の医薬品的使用に関する。
【０００２】
近年、特に糖尿病Ｉ型およびＩＩ型のような、高血糖に関連するいくつかの病気は、ジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰ−ＩＶ）酵素の活性に関係することが発見された。
【０００３】
ＤＰ−ＩＶは、７６６アミノ酸からなる膜結合性のぺプチダーゼであり、多くの組織に広く分布する。ＤＰ−ＩＶは血漿中に可溶な循環型としても存在する。顕著なＤＰ−ＩＶ活性は、ヒトおよびげっ歯類由来の血漿中で検出可能である。膜結合性ＤＰ−ＩＶの第一の生物学的原理は、細胞内シグナル経路に関連する。ＤＰ−ＩＶの第二の主要な生物学的活性は、血漿における酵素的機能である。ＤＰ−ＩＶは、ぺプチダーゼとして、２位にアミノ末端プロリンまたはアラニンを有する基質を好むが、２位に好ましいアミノ酸を持たない基質を切断することも可能である。多くの研究室からの知見は、ＧＬＰ−１の生物学的活性の主要な決定要因として、ＤＰ−ＩＶを介したＧＬＰ−１の不活性化の重要性を描写した。いくつかのＤＰ−ＩＶ阻害剤が特徴付けられており、それらは血漿中のＧＬＰ−１およびＧＩＰの作用の延長を通して、糖尿病のげっ歯類において血中グルコースを低下させると思われる。糖尿病などのような病気の治療のためにＤＰ−ＩＶ阻害剤を使用することは、例えば米国特許６５００８０４  Ｂ２において提案されている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
今回、驚くべきことにグアヤベリン、すなわちフラボノールの化学分類のメンバーがＤＰ−ＩＶ阻害剤として非常に効果的であることが発見され、したがって、ＤＰ−ＩＶ活性に関連する病気の治療に適したこの化合物が提供される。
【０００５】
グアヤベリンは以下の化学式を有する。
【化１】
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【０００６】
フラボノールグループの化合物は、アルドース還元酵素の阻害効果を有することが報告されている（Ｍａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．  Ｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．７４（２００２），  Ｎｏ．７，  ｐｐ．  １３０１−１３０８；  Ｃｈａｕｄｒｙ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １９８３，  ３２（１３），  １９９５−１９９８；  Ｙｏｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ（Ｔｏｋｙｏ）  １９９８，  ４６（１），  １１３−１１９参照）。この分類の化合物は、したがって、糖尿病により引き起こされる網膜症などのような疾患の治療用に計画されている（特に生薬に関して、www.rain-tree.com/pedra.htmまたはhttp://www.e2121.com/ffood.html参照）。
【０００７】
さらに、ＵＳ２００２／０１４７３５３Ａ１、ＷＯ２００３／０２６５６１Ａ２、ＷＯ２００１／０４９２８５、ＪＰ０９−０９４０７７Ａ、およびＪＰ２０００−００１４３５Ａは、フラボノールグループの化合物およびそれらの効果を開示する。
【０００８】
しかし、グアヤベリンがＤＰ−ＩＶ活性に対して有効であり、したがって糖尿病またはその関連疾患の治療に適していること自体は、今回はじめて発見された。
【０００９】
グアヤベリンは、Ｍｙｒｃｉａ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒａなどのようなグアヤベリンを含んでいる植物由来の抽出物を調製し、既知の方法によって前記抽出物から望みの化合物を単離することにより得られる。
【００１０】
本発明の一形態は、ＤＰ−ＩＶまたはＤＰ−ＩＶ様の酵素の活性に関連するおよび／またはそれにより引き起こされる病気および／または疾患の治療用の薬剤の製造のためにＰｓｉｄｉｕｍ  ｃａｔｔｌｅｉａｎｕｍ、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｃａｔｔｌｅｉａｎｕｍ  ｓｓｐ．  Ｌｕｃｉｄｕｍ、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕｉｎｅｅｎｓｅ、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｌｉｔｔｏｒａｌｅ、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｍｏｌｌｅおよびＰｓｉｄｉｕｍ  ｓｃｈｉｅｄｅａｎｕｍからなるグループから選択される植物の抽出物を使用することに関連する。このグループの好ましい植物は、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａである。Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａはＭｙｒｔｏｉｄｅａｅ科の植物である。
【００１１】
上に挙げたグループの植物、特にＰｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａはグアヤベリンを相当量含む。
【００１２】
本発明に従って使用される植物抽出物は、植物の葉、果実、および／または樹皮の抽出物としてもよい。
【００１３】
抽出物は、水、メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチル、およびそれらの混合物のグループから選択される溶媒を用いて、既知の方法により調製されてもよい。さらに、抽出物は、例えば植物の果汁を用いた膜ろ過技術などのような他の方法により調製されてもよい。
【００１４】
好ましくは、本発明に従って使用される抽出物は、粉などのような固体の形で存在する。
【００１５】
本発明にしたがって使用される抽出物は、好ましくは０．５重量％またはそれ以上のグアヤベリンを含み、好ましくは１０から５０重量％のグアヤベリンを含んでもよい。通常、抽出物は、２重量％から４重量％のグアヤベリンを含みうる。
【００１６】
本発明のさらなる形態は、ＤＰ−ＩＶまたはＤＰ−ＩＶ様の酵素の活性に関連するまたはそれにより引き起こされる病気または疾患の治療用の薬剤の製造のために、グアヤベリンおよび／またはそれらの薬学的に許容される塩またはエステルを使用することに関する。
【００１７】
本発明に従って使用されるグアヤベリンおよび／または植物抽出物の使用は、糖尿病、肥満、アテローム性動脈硬化症などのような、グルコース代謝疾患である病気および／または疾患の治療に特に適している。
【００１８】
さらに、本発明に従って使用されるグアヤベリンおよび／または植物抽出物は、ＬＤＬコレステロールを低下させるため、抗酸化物質として、鎮痛薬として、および止血剤として、例えば女性の月経に関連する症状を和らげるためなど、他の治療目的のために使用されてもよい。
【００１９】
本発明のさらなる形態は、薬剤として使用するための、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｃａｔｔｌｅｉａｎｕｍ、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｃａｔｔｌｅｉａｎｕｍ  ｓｓｐ．  Ｌｕｃｉｄｕｍ、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕｉｎｅｅｎｓｅ、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｌｉｔｔｏｒａｌｅ、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｍｏｌｌｅおよびＰｓｉｄｉｕｍ  ｓｃｈｉｅｄｅａｎｕｍからなるグループから選択される植物の抽出物に関連する。
【００２０】
本発明に従って使用されるグアヤベリンおよび／または植物抽出物は、薬学的に許容される賦形剤を用いて、当該技術分野において既知の方法により、薬学的に許容される組成物に変換されてもよい。投与は、例えば経口、局所、または注射として知られている様々な方法で行われてもよい。
【００２１】
好ましくは、かかる組成物におけるグアヤベリンの含有量は０．５重量％またはそれ以上である。
【００２２】
グアヤベリンおよび／またはそれらの薬学的に許容される塩またはエステル、および／またはＰｓｉｄｉｕｍ  ｃａｔｔｌｅｉａｎｕｍ、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｃａｔｔｌｅｉａｎｕｍ  ｓｓｐ．  Ｌｕｃｉｄｕｍ、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕｉｎｅｅｎｓｅ、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｌｉｔｔｏｒａｌｅ、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｍｏｌｌｅおよびＰｓｉｄｉｕｍ  ｓｃｈｉｅｄｅａｎｕｍからなるグループから選択される植物の抽出物は、栄養成分の形で、例えば機能食品の組成物としてソフトドリンク中に、または化粧品中に成分として使用されてもよい。
【００２３】
さらに、本発明にしたがって使用されるグアヤベリンおよび／または植物抽出物は、他の植物抽出物、例えばニガウリ、桑の葉、およびバナナの葉等と混合されてもよい。
【００２４】
以下において、本発明は、本発明の好ましい実施態様を開示する図面および実施例に基づいてより詳細に記述される。
【実施例１】
【００２５】
Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ由来エタノール性抽出物の調製の一般的な説明
Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａの葉から抽出物を調製する製造プロセスは以下の工程により記述される：
−Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａの葉を細かい粉末に粉砕する
−エタノールで抽出する
−抽出液を減圧し、エタノールが蒸発するまで濃縮する
−遠心により不溶性の不純物を除去し、浄化された液体を得る
−浄化された液体をマクロ多孔性樹脂を充填したクロマトグラフィーのカラムにロードし、水によりさらに不純物を取り除き、その後エタノールにより脱着してエタノール性溶出液を集める
−抽出液を乾燥させ、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ抽出物を得る。
【００２６】
１．抽出物：粉末にしたＰｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａの葉は、６０±２℃にて８０％エタノールで２回抽出される。抽出時間は各２時間である。最終的なエタノールの体積の原料粉末の重量に対する比は、８：１である。
【００２７】
２．濃縮：圧力を下げ、抽出液を６０±２℃にてエタノールがなくなるまで濃縮する。減圧は−０．０８ＭＰａよりも高くすべきである。
【００２８】
３．クロマトグラフィー：遠心により得られた浄化された液体をマクロ多孔性樹脂にロードする。不純物の一部は水で洗浄される。液体が浄化され、色が少し黄色になるまで、９５％エタノールで溶出が行われる。流速は１５−２０ｍＬ／分に制御されるべきである。エタノールで脱着された液体の一部が集められる。
【００２９】
４．乾燥：圧力を下げ、溶出液は濃縮／乾燥される。減圧は−０．０８ＭＰａよりも高くすべきである。最終粉末が得られる。
【実施例２】
【００３０】
Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ抽出物の製造
細かく砕いた原料（生のＰｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａの果実）５００ｇが計量され、８０％エタノール２０００ｍＬ中に移される（三口丸底フラスコ）。混合物は６０℃にて２時間穏やかに混合される。溶液をろ過する。ろ液を集め、同様の条件下、８０％エタノール２０００ｍＬを用いて抽出を繰り返す。溶液は再びろ過され、両方のろ液を合わせる。
【００３１】
６０℃減圧下でエタノールがなくなるまで、ろ液は濃縮される。真空度は−０．０９ＭＰａである。得られたエタノールのない液体は遠心されて、固体の粒子が除去される。水２００ｍＬがペレットに添加され、混合物は再び遠心される。両方の上清を合わせる。浄化された液体を多孔性樹脂（Ｔｙｐｅ  Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ４）にロードし、最初に８００ｍＬの水を１７ｍＬ／分の流速でリンスして不純物の一部を洗い流す。その後、脱着のため８．５ｍＬ／分の流速の９５％エタノール１０００ｍＬに切り替え、溶出液を２時間かけて集める。溶出液は、６０℃減圧下で濃縮され、続いて５時間乾燥される。
【００３２】
Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ抽出物１．４ｇが得られる。ケルセチンの含有量は０．１０％であると判定され、グアヤベリンの含有量は０．８２％と判定された。
【実施例３】
【００３３】
Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ抽出物の製造
粉砕されたＰｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａの葉の粉末２０ｋｇが計量されて２５０Ｌのボイラーに入れられ、その後８０％エタノール１６０Ｌが添加され、混合物は６０℃にて２時間混合される。溶液がろ過され、再び８０％エタノール１６０Ｌが残渣に注がれる。混合物はさらに６０℃にて２時間抽出、ろ過され、その後二つの抽出工程のろ液は一緒に混合される。６０℃減圧下でエタノールがほとんどなくなるまで、得られた混合物は濃縮される。真空度は−０．０９ＭＰａである。得られた混合物は遠心される。遠心後、水４０Ｌを使用して残渣を洗浄し、ろ液は一緒に混合される。合わせられたろ液は、マクロクロスリンクしたマクロ多孔性樹脂（Ｔｙｐｅ  Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ４）を通して分離される。まず、水１６０Ｌを用いて吸着後の樹脂が洗浄され、それにより不純物の一部を取り除くことができる。次に８０％エタノール３５０Ｌが脱着工程のために使用される。黄褐色の脱着された液体が集められる。脱着された液体は、６０℃減圧下で濃縮される。その後、真空乾燥機中で５時間乾燥される。
【００３４】
Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ抽出物１．８ｋｇが得られる。ＨＰＬＣ解析により判定された通り、グアヤベリンの含有量は１２．４４％で、１．０２％のケルセチンを有する。
【００３５】
前記生成物はさらに濃縮することができる。生成物は水２００Ｌに溶解される。溶液はポリアミド樹脂（Ｍｅｓｓｒｓ．  Ｓｏｒｂｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．からのポリアミド６樹脂）を通して分離される：まず、水４０Ｌを用いて樹脂を洗浄し、不純物の一部を除去する。次に、８０％エタノール６０Ｌを脱着工程のために使用して、黄褐色の脱着された液体を集める。脱着された液体は６０℃減圧下で濃縮され、次に真空乾燥機中で５時間乾燥される。
【００３６】
Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ抽出物０．４５ｋｇが得られる。ＨＰＬＣ解析により判定された通り、グアヤベリンの含有量は４２．０９％で、０．９６％のケルセチンを有する。
【実施例４】
【００３７】
Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ抽出物のＤＰ−ＩＶ阻害効果の研究
方法：
ＤＰ−ＩＶの活性は、比色分析によって測定された。
【００３８】
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−４−ＮＡ（Ｇ０５１３、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、ＤＰ−ＩＶの（合成）発色基質は、ＤＰ−ＩＶによりジペプチドグリシン−プロリンと４−ニトロアニリンに加水分解され、その出現割合が４０５ｎｍにおいて追跡された。
【００３９】
アッセイバッファー４００μＬ（９．５ｇＨＥＰＥＳ／ｌ蒸留水、ｐＨ７．０に調整、Ｈ４０３４、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、ヒト血漿１５０μＬおよび阻害溶液（または溶媒）１００μＬが光度計のキュベットに移され、穏やかに混合されて３７℃で３分間プレインキュベートされた。その後、アッセイは７０μＬ基質溶液（１０ｍＬアッセイバッファー中にＧｌｙ−Ｐｒｏ−４−ＮＡ８．６ｍｇ）の添加により開始される。４０５ｎｍにおける吸収の増大は、２０分間にわたって記録された。
【００４０】
ＤＰ−ＩＶ活性は、２０分間の吸光度の線形変化として表される（デルタ  Ａｂｓ／分）。
【００４１】
試料調製：
実施例３に従って得られたＰｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ抽出物は、攪拌条件下、４５℃で２４時間、蒸留水に抽出された。その後、抽出物は、遠心（１５０００ｒｐｍ、１５分）、ろ過（シリンジフィルター、０．４５μＭ）により浄化され、適切に希釈されて試験アッセイにかけられた。
【００４２】
抽出物の濃度は、５ｇ粉末／１００ｍＬ水であった。希釈液は、浄化された抽出物から水の添加によって調製された。
【００４３】
比較目的のため、ＤＰ−ＩＶはＰ３２／９８（３Ｎ−[（２Ｓ，３Ｓ）−２−アミノ−３−メチル−ペンタノイル]−１，３−チアゾリジンヘミフマレート）、合成酵素阻害剤により、阻害された。
【００４４】
１．６０ｍｇＰ３２／９８／ｍＬアッセイバッファーの原液が調製され、アッセイバッファーで希釈して０．５０ｍｇ／ｍＬおよび０．０５ｍｇ／ｍＬ間の濃度を得た。これらの溶液の１００μＬがアッセイに“阻害”溶液として添加された。
【００４５】
比較実験は、以下の“結果”の欄にさらに記載されるように、同様の試験アッセイシステムにて行われた。
【００４６】
データ評価：
結果は、阻害剤を加えていない試料において得られた試験結果を、阻害剤またはＰｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ抽出物（どちらも濃度をふって）を加えた試料において得られた試験結果と比較して得られた％阻害として表される。
【００４７】
試験試料における阻害なし（０％）は、阻害剤を加えていない試料と比べて同様の吸収の増大を示す。完全な阻害（１００％）は、明らかな吸収の増大がないことを示す。
【００４８】
全ての試験結果は、２つの試料の平均を表す。これらの反復した試料の相対標準偏差は、常に７％未満であった。
【００４９】
結果：
アッセイはよく知られた通常の手順を用いて、較正された。
【００５０】
試験アッセイシステムの至適ｐＨは、ｐＨ６．０とｐＨ８．０の間の範囲であることが示された。３２から４２℃の範囲のアッセイ温度は、酵素活性に顕著には影響しない。５から１０μｇ／１０ｍＬの間の任意の基質濃度は、最大の酵素活性をもたらした。選択された基質濃度において、吸収の増大は４５分まで線形であることが示された。選択された条件下、１００から２００μＬの血漿体積は、吸収の増大の用量依存的な平行移動をもたらすことが示された。
【００５１】
最終試験アッセイ条件下での反復試験は、７％未満の相対標準偏差を生じる。
【００５２】
よく知られた非特異的な酵素阻害剤および多様な溶媒による酵素の阻害は、表１に示される結果をもたらした。
【００５３】
【表１】
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【００５４】
上記の通り、酵素ＤＰ−ＩＶは、選択された非特異的な酵素阻害剤によっては実質的にブロックされない。言及できる阻害は、有機溶媒により達成された。これらの結果より、もし有機溶媒が酵素活性をブロックしたとしたら、それらの溶媒の導入は解釈不可能な結果となったであろうから、手元の抽出物は水に溶解された。
【００５５】
合成阻害剤Ｐ３２／９８およびＰｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ抽出物を用いて行われた試験の結果は、各阻害剤の濃度が横軸にプロットされ、各観察されたＤＰ−ＩＶの阻害が縦軸にプロットされた図１および図２に示される。
【００５６】
図１に示されるように、合成阻害剤Ｐ３２／９８は、なめらかな用量／反応阻害曲線をもたらす。選択された試験アッセイシステムにおいて、約０．１０μｇ／アッセイ体積の濃度は、約５０％のＤＰ−ＩＶ阻害をもたらした。
【００５７】
図２に示されるように、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａの抽出物も、なめらかな用量／反応阻害曲線をもたらす。選択された試験アッセイシステムにおいて、１００から１０００μｇ／アッセイ体積間の濃度が、約５０％のＤＰ−ＩＶ阻害をもたらした。
【００５８】
したがって、Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ抽出物は、実質的にＤＰ−ＩＶを阻害することが示された。Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａと合成阻害剤Ｐ３２／９８間の有効性の違いは、約１０００となる。
【実施例５】
【００５９】
グアヤベリンのＤＰ−ＩＶ阻害効果の研究
以下において別段の指示がない限り、使用した原料および方法は、実施例４の原料および方法と同じであった。
【００６０】
試料の調製：
グアヤベリンはＨＥＰＥＳバッファーに溶解され（２０分。超音波処理に続いて室温にて２時間振とう）、適切に希釈されて試験アッセイにかけられた。希釈液はＨＥＰＥＳバッファーの添加により調製された。試験された濃度は、７０から２８０μｇ／ｍＬ試験アッセイの間であった。
【００６１】
データ評価：
結果は、陽性対照試料（阻害剤なし）において得られた試験結果を、グアヤベリンを異なる濃度で加えた試料において得られた試験結果と比較して得られた％活性として表される。
【００６２】
試験試料における１００％の活性とは、阻害剤なしの試料と比べて同様の吸収の増大を示す。ゼロ活性（０％）とは、明らかな吸収の増大がないことを示す。
【００６３】
全ての試験結果は、２つの試料の平均を表す。これらの反復した試料の相対標準偏差は、常に５％未満であった。
【００６４】
結果：
図３および４に示されるように、グアヤベリンは、ＤＰ−ＩＶの明確な用量依存性阻害をもたらす。選択された試験アッセイシステムにおいて、１４０から２１０μｇ／ｍＬ試験アッセイ（１００から１５０μｇ／アッセイ体積）間の濃度が、約５０％のＤＰ−ＩＶ阻害をもたらした。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】合成阻害剤Ｐ３２／９８によるＤＰ−ＩＶの阻害を示す。
【図２】Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａのエタノール抽出物によるＤＰ−ＩＶの阻害を示す。
【図３】グアヤベリンによるＤＰ−ＩＶの阻害を示す。
【図４】グアヤベリンによるＤＰ−ＩＶの阻害を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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2009514901.tif 000010
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2009514901.tif 000012
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