(57)【要約】  薬剤溶出エンドプロテーゼは、対象の体内の再狭窄および血栓症を抑制し、病巣の治癒を促進するように構成されている。かかるエンドプロテーゼは、少なくとも１つの支持構造を含み、治療有効量のラパマイシン類似体が、その上に配置されている。治療有効量のラパマイシン類似体は、ラパマイシン類似体が支持構造から溶出して、再狭窄の抑制および／または血栓症の抑制に十分であるラパマイシン類似体の濃度を得ることを可能にする。また、治療有効量のラパマイシン類似体は、細胞の遊走を実質的に抑制せず、その結果遊走している細胞が病巣の治癒を促進する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の体内に入るように構成され、寸法を定められた支持構造と、および
支持構造上に配置された治療有効量のラパマイシン類似体（前記治療有効量のラパマイシン類似体は、対象の体内に配置された場合に、支持構造から溶出して、再狭窄を抑制するのに十分であり、支持構造に隣接する細胞の遊走を実質的に抑制しないラパマイシン類似体の濃度が得られ、その結果遊走する細胞が病巣の治癒を促進する。）と
を含む、対象の体内の病巣の治癒を促進するための薬剤溶出エンドプロテーゼ。
【請求項２】
ラパマイシン類似体が、式１の類似体またはこれの誘導体、塩もしくはプロドラッグである、請求項１に記載のエンドプロテーゼ。
【化４】
2009538212.tif 000007
【請求項３】
ラパマイシン類似体が、式２の類似体またはこれの誘導体、塩もしくはプロドラッグである、請求項２に記載のエンドプロテーゼ。
【化５】
2009538212.tif 000008
【請求項４】
ラパマイシン類似体が、式３の類似体またはこれの誘導体、塩もしくはプロドラッグである、請求項２に記載のエンドプロテーゼ。
【化６】
2009538212.tif 000009
【請求項５】
支持構造上に配置されたラパマイシン類似体を含有する薬学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項１に記載のエンドプロテーゼ。
【請求項６】
さらに、支持構造上に配置されたラパマイシン類似体を含有する被覆を含む、請求項１に記載のエンドプロテーゼ。
【請求項７】
被覆が生体適合性ポリマーである、請求項６に記載のエンドプロテーゼ。
【請求項８】
生体適合性ポリマーが、支持構造からラパマイシン類似体が溶出される速度を調節する、請求項７に記載のエンドプロテーゼ。
【請求項９】
ラパマイシン類似体が、エンドプロテーゼの長さ１ｍｍ当たり約１０ｎｇから約１０ｍｇの濃度で支持構造上に存在する、請求項１に記載のエンドプロテーゼ。
【請求項１０】
対象内に配置された場合に、再狭窄を抑制するのに十分であり、支持構造に隣接する細胞の遊走を実質的に抑制しないラパマイシン類似体の濃度が、約１０ｐｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載のエンドプロテーゼ。
【請求項１１】
ラパマイシン類似体が、約１０ｐｇ／日から約１０ｕｇ／日の速度で支持構造から溶出される、請求項１に記載のエンドプロテーゼ。
【請求項１２】
病巣が、血管、動脈、冠動脈、静脈、食道管腔および尿道から成る群から選択される体内管腔にある、請求項１に記載のエンドプロテーゼ。
【請求項１３】
対象の体内にエンドプロテーゼ（前記エンドプロテーゼは、
対象の体内に入るように構成されており、寸法が定められた支持構造および
支持構造上に配置された治療有効量のラパマイシン類似体を含む。）を配置する段階、
ラパマイシン類似体を、対象の体内に配置された場合、再狭窄を抑制するのに十分であり、前記支持構造に隣接する細胞の遊走を実質的に抑制しない、体内でのおよび支持構造に隣接するラパマイシン類似体の濃度が得られるように、その結果遊走する細胞が病巣の治癒を促進するように、支持構造から溶出させる段階
を含む、対象の体内の病巣の治癒を促進する方法。
【請求項１４】
ラパマイシン類似体が、式１の類似体またはこれの誘導体、塩もしくはプロドラッグである、請求項１３に記載の方法。
【化７】
2009538212.tif 000010
【請求項１５】
ラパマイシン類似体が、式２の類似体またはこれの誘導体、塩もしくはプロドラッグである、請求項１３に記載の方法。
【化８】
2009538212.tif 000011
【請求項１６】
ラパマイシン類似体が、式３の類似体またはこれの誘導体、塩もしくはプロドラッグである、請求項１３に記載の方法。
【化９】
2009538212.tif 000012
【請求項１７】
支持構造上に配置された薬学的に許容可能な担体からラパマイシン類似体を溶出する段階をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
支持構造上に配置された被覆からラパマイシン類似体を溶出する段階をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
被覆が生体適合性ポリマーである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ラパマイシン類似体が、エンドプロテーゼの長さ１ｍｍ当たり約１０ｎｇから約１０ｍｇの量にて支持構造上に存在する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
約１０ｐｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌの、エンドプロテーゼに隣接するラパマイシン類似体の局所濃度を達成する段階をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
約１０ｐｇ／日から約１０ｕｇ／日の速度でラパマイシン類似体を支持構造から溶出する段階を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
血管、動脈、冠動脈、静脈、食道管腔および尿道から成る群から選択される体内管腔に支持構造を置く段階をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
支持構造に隣接する体内管腔の再狭窄を抑制する段階をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２５】
支持構造によって引き起こされる体内管腔壁の病巣の治癒を促進する段階をさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
病巣の治癒が、病巣への内皮細胞の遊走によって促進される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
エンドプロテーゼに隣接する血栓症を抑制する段階をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＡＤＭＩＮＩＳＴＥＲＩＮＧ  ＺＯＴＡＲＯＬＩＭＵＳ  ＴＨＡＴ  ＤＯＥＳ  ＮＯＴ  ＩＮＨＩＢＩＴ  ＨＵＭＡＮ  ＣＯＲＯＮＡＲＹ  ＡＲＴＥＲＹ  ＥＮＤＯＴＨＥＬＩＡＬ  ＣＥＬＬ  ＭＩＧＲＡＴＩＯＮ」という名称の、２００６年５月２３日出願の出願番号第６０／８０２，７２９号を有する米国仮特許出願、ならびに「ＳＹＳＴＥＭＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＤＥＬＩＶＥＲＩＮＧ  Ａ  ＲＡＰＡＭＹＣＩＮ  ＡＮＡＬＯＧ  ＴＨＡＴ  ＤＯ  ＮＯＴ  ＩＮＨＩＢＩＴ  ＨＵＭＡＮ  ＣＯＲＯＮＡＲＹ  ＡＲＴＥＲＹ  ＥＮＤＯＴＨＥＬＩＡＬ  ＣＥＬＬ  ＭＩＧＲＡＴＩＯＮ」という名称の、２００７年５月２２日出願の出願番号第１１／７５２，０７９号を有する米国実用特許出願の利益を主張するものである。これらの出願は、発明者らとしてＭａｔｔｈｅｗ  Ｍａｃｋ、Ｓａｎｄｒａ  Ｂｕｒｋｅ、Ｊｏｈｎ  ＴｏｎｅｒおよびＫｅｉｔｈ  Ｃｒｏｍａｃｋを有し、具体的に参照することによって、これらの全体が本明細書に組み込まれている。
【０００２】
本発明は、ラパマイシン類似体を送達するための、ヒト冠動脈内皮細胞の遊走を実質的に抑制しないシステム、医療器具および方法に関する。さらに具体的に、本発明は、ラパマイシン類似体ゾタロリムス（即ち、ＡＢＴ−５７８）を、ヒト冠動脈内皮細胞の遊走を実質的に抑制しない形で送達するための、ステントなどのエンドプロテーゼの使用を含むシステム、医療器具および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ステント、グラフトおよび多様な他のエンドプロテーゼは周知であり、動脈瘤の治療、血管壁の被覆または修復、液体流の濾過または調節および閉塞もしくは虚脱血管の拡張または足場形成などのための介入処置で使用されている。かかるエンドプロテーゼは、ヒトまたは動物の事実上いずれかの進入可能な身体管腔に送達および使用でき、認識されている様々な方法のいずれかによって配置できる。ステントなどのエンドプロテーゼの認識されている適用の１つは、血管中のアテローム硬化性狭窄の治療に対するものであるが、ステントは、体内の血管および他の管腔に伴う様々な疾病を治療するために使用される。例えば、患者が経皮的経腔的冠動脈形成術または他の同様の介入処置を受けた後、しばしば、ステントが、治療部位に配置され、医療処置の結果を改善し、再狭窄の可能性を減少させる。しかし、血管へのステントの配置は、当該血管に損傷を与え、血管壁に病巣を引き起こす場合がある。
【０００４】
ステント埋め込みによって誘発される機械的損傷は、内皮裸出を引き起こす場合があり、当該裸出は、血管壁に病巣形成を直接併発する。血管壁の病巣形成は、血管の脈管構造壁内部で炎症応答を開始する可能性がある。したがって、これは、循環している血小板の活性化、好中球および単球の浸潤、および炎症誘発サイトカインおよび増殖因子の放出を引き起こす可能性がある。炎症は、平滑筋細胞表現型変化の主要な刺激因子であり、平滑筋細胞の活性化、増殖および新生内膜への遊走を生じることができ、この遊走が、再狭窄を引き起こす。また、最近の研究は、平滑筋細胞表現型のかかる変化が、平滑筋細胞の筋線維芽細胞表現型への分化の結果であり得ると示唆している。よって、ステントによって引き起こされる機械的損傷への生理的応答は、再狭窄を誘発する可能性がある。
【０００５】
さらに、ステント埋め込みに誘発される機械的損傷は、血管内皮細胞の増殖および遊走も引き起こす場合がある。血管内皮細胞の増殖および遊走は、ステント埋め込み血管の再内皮化を誘発し、それによって、血栓症病巣を減少させることができる。血管壁の病巣が再内皮化されない場合、病巣の血栓症が起こる場合があり、この病巣は問題である。したがって、ステント埋め込み後の再狭窄および血栓症を減少させることが必要である。
【０００６】
ラパマイシン被覆ステントは、内皮裸出に伴う増殖応答を抑制することによってステント誘発性再狭窄のリスクを減少させることが判明している。ラパマイシンは、サイトゾルＦＫＢＰ−１２に結合し、タンパク質キナーゼｍＴＯＲを抑制すると考えられる。ｍＴＯＲキナーゼは、ｐ７０Ｓ６キナーゼ（ｐ７０Ｓ６Ｋ）などの下流標的のリン酸化を変化させることによって細胞周期進行に関与することができる。したがって、ラパマイシンは、ｐ７０Ｓ６Ｋリン酸化を抑制し、これが、内皮細胞増殖を抑制できる。
【０００７】
ラパマイシンを負荷されているステントなどの薬剤溶出ステントは、再狭窄を抑制するのに好ましい応答を提供できるが、ステントから溶出される薬剤は、血栓症を招く場合もある。一部には、これは、薬剤が内皮細胞の遊走を抑制し、薬剤はこの抑制が病巣の再内皮化を抑制し、これによって血栓症を招くためである可能性がある。したがって、ステントの埋め込みから引き起こされる病巣の再内皮化を抑制しない薬剤溶出ステントが必要である。よって、病巣の再内皮化を可能にしながら再狭窄を抑制することと、それによって血栓症を抑制することの間でバランスの取れた薬剤溶出ステントが必要である。
【０００８】
したがって再狭窄および血栓症を抑制するエンドプロテーゼとこの使用法を有することが有利となるはずである。また、ｐ７０Ｓ６Ｋリン酸化を抑制し、それによって、細胞増殖を抑制するが、内皮細胞遊走が、血管壁の病巣を再内皮化し、これによって血栓症を抑制することを可能にするエンドプロテーゼおよびこの使用法を有することが有利となるはずである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、一般に、再狭窄を抑制でき、エンドプロテーゼに隣接する、または近位の細胞の遊走を実質的に抑制しない量でラパマイシン類似体をエンドプロテーゼから送達するためのエンドプロテーゼ、配置システムおよび方法を含む。さらに具体的には、本発明は、細胞の遊走を実質的に抑制しないラパマイシン類似体（例えば、ゾタロリムスまたはＡＢＴ−５７８）を送達するための、ステントなどのエンドプロテーゼの使用を含む。例えば、エンドプロテーゼが、ヒト冠動脈内に配置されるように構成されたステントである場合、ラパマイシン類似体は、冠動脈の再狭窄を抑制でき、当該ステントに遠位、隣接するまたは近位の冠動脈細胞遊走を実質的に抑制しない。さらに、ラパマイシン類似体は、エンドプロテーゼの配置から血管壁中に形成される可能性のある病巣の再内皮化を可能にする内皮細胞の遊走を抑制しない量で溶出することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一実施形態において、本発明は、対象の体内の再狭窄を抑制し、病巣の治癒を促進するように構成されている、薬剤溶出エンドプロテーゼを含む。かかるエンドプロテーゼは、少なくとも１つの支持構造およびラパマイシン類似体を含む。この支持構造は、体内管腔などの、対象の体内に入るように構成され、寸法が定められている。治療有効量のラパマイシン類似体は、支持構造上に配置される。治療有効量のラパマイシン類似体は、対象の体内に配置された場合に、ラパマイシン類似体が、支持構造から溶出して、再狭窄を抑制するのに十分であり、支持構造に隣接した細胞遊走を実質的に抑制しない体内のラパマイシン類似体濃度を得ることを可能にする。したがって、ラパマイシン類似体は、細胞遊走を実質的に抑制しないことによって、遊走する細胞が病巣の治癒を促進することを可能にする。場合によっては、病巣は、血管、動脈、冠動脈、静脈、食道管腔および尿道から成る群から選択される体内管腔にある。
【００１１】
一実施形態において、ラパマイシン類似体は、式１、式２もしくは式３またはこの誘導体、塩、プロドラッグもしくはエステルから成る群から選択される。
【００１２】
【化１】
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【００１３】
【化２】
2009538212.tif 000004
【００１４】
一実施形態において、エンドプロテーゼは、支持構造上に配置された、ラパマイシン類似体を含有する薬学的に許容可能な担体を含む。
【００１５】
一実施形態において、エンドプロテーゼは、支持構造上に配置された、ラパマイシン類似体を含有する被覆を含む。場合によって、この被覆は、生体適合性ポリマーである。別の選択肢において、この被覆は、支持構造からラパマイシン類似体が溶出される速度を調節する。
【００１６】
一実施形態において、ラパマイシン類似体は、エンドプロテーゼの長さ１ｍｍ当たり１０ｎｇから約１０ｍｇの量で支持構造上に存在する。
【００１７】
一実施形態において、ラパマイシン類似体は、約１０ｎｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で支持構造上に存在する。
【００１８】
一実施形態において、エンドプロテーゼから溶出されるラパマイシン類似体の局所濃度は、再狭窄を抑制するのに十分である。また、対象の体内に配置される場合、この局所濃度は、前記支持構造に隣接する細胞遊走を実質的に抑制しない。かかる局所濃度は、約１０ｐｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌである。
【００１９】
一実施形態において、ラパマイシン類似体は、約１０ｐｇ／日から約１０ｕｇ／日の速度で支持構造から溶出する。
【００２０】
一実施形態において、本発明は、対象の体内の再狭窄を抑制し、病巣の治癒を促進する方法を含む。かかる方法は、対象の体内に、ラパマイシン類似体を含有するエンドプロテーゼを配置する段階を含む。エンドプロテーゼは、対象の体内に入るように構成され、寸法が定められた支持構造を含む。治療有効量のラパマイシン類似体が支持構造上に配置される。ラパマイシン類似体は、対象の体内に配置された場合に、支持構造から溶出し、再狭窄を抑制するのに十分であり、当該支持構造に隣接するまたは近位の細胞の遊走の抑制を実質的に起こさない、体内でのおよび支持構造に隣接するまたは近位のラパマイシン類似体の濃度を得る。したがって、ラパマイシン類似体は、細胞遊走を実質的に抑制しないことによって、遊走する細胞が病巣治癒を促進することを可能にする。場合によって、病巣は、血管、動脈、冠動脈、静脈、食道管腔および尿道から成る群から選択される体内管腔内にある。
【００２１】
一実施形態において、この方法は、支持構造上に配置された薬学的に許容可能な担体からラパマイシン類似体を溶出する段階を含む。
【００２２】
一実施形態において、この方法は、支持構造上に配置された被覆からラパマイシン類似体を溶出する段階を含む。
【００２３】
一実施形態において、この方法は、約１０ｐｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌのラパマイシン類似体の局所濃度を達成する段階を含む。この局所濃度は、エンドプロテーゼに隣接する組織、細胞または体液内に存在し得る。
【００２４】
一実施形態において、この方法は、支持構造からラパマイシン類似体を溶出して、約１０ｐＭから約１０ｕＭの実質的に定常状態の濃度を達成する段階を含む。
【００２５】
一実施形態において、この方法は、支持構造に隣接する体内管腔の再狭窄を抑制する段階を含む。これは、支持構造によって引き起こされる体内管腔壁の病巣の治癒を促進しながら実施することもできる。病巣の治癒は、病巣への内皮細胞の遊走が実質的に抑制されないようにすることによって促進される。かかる細胞遊走は、病巣の再内皮化を招くことができる。
【００２６】
本発明のこれらおよび他の実施形態および特徴は、以下の詳細な説明および添付されている特許請求の範囲からさらに十分に明らかになり、あるいは、後述の通りの本発明の実施によって知ることができる。
【００２７】
本発明の上記および他の長所および特徴をさらに明らかにするために、添付図面で例示されている本発明の具体的実施形態を参照することによって、本発明のさらに詳細な説明が提示される。これらの図面は、本発明の典型的実施形態を示すにすぎず、したがって本発明の範囲を限定すると見なしてはならない。添付の図面の使用によって、本発明は、さらに具体的および詳細に記述および説明される。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】短期薬剤投与後のｈＣａＥＣ遊走に対するゾタロリムス、シロリムス、デキサメタゾンおよびパクリタキセルの効果を示すグラフである。細胞は、薬剤添加前、２４時間同調された。細胞は、遊走誘発前に前処理されなかった。
【図１Ｂ】短期薬剤投与後のヒト冠動脈平滑筋細胞遊走の抑制に対するゾタロリムス、シロリムス、デキサメタゾンおよびパクリタキセルの効果を示すグラフである。細胞は、薬剤添加前、２４時間同調された。細胞は、遊走誘発前に前処理されなかった。
【図１Ｃ】短期薬剤曝露後のヒト冠動脈平滑筋細胞およびヒト冠動脈内皮細胞の遊走に対するパクリタキセルの抑制効果のＩＣ５０を示すグラフである。
【図２】ヒト冠動脈内皮細胞の遊走の抑制に対するゾタロリムス、シロリムス、エベロリムス、デキサメタゾンおよびパクリタキセルによるヒト冠動脈内皮細胞の前処理の効果を示すグラフである。ｈＣａＥＣは、同調され、次いで、薬剤を含有するｈＣａＥＣ増殖培地中で２４時間処理された。次いで、遊走が、ｈＣａＥＣ増殖培地（即ち、５％ＦＢＳおよび増殖因子を含有する培地）への応答において評価された。細胞は、遊走中、薬剤を含有する基礎培地に再懸濁された。
【図３】ＦＢＳ誘発ヒト冠動脈内皮細胞遊走に対する各種濃度のゾタロリムス、デキサメタゾン、シロリムスおよびパクリタキセルの効果を示すグラフである。
【図４】ＦＢＳ誘発ヒト冠動脈平滑筋細胞遊走に対するゾタロリムス、デキサメタゾン、シロリムスおよびパクリタキセルの効果を示すグラフである。
【図５】ＰＤＧＦ−ＢＢ刺激ヒト冠動脈平滑筋細胞遊走に対するゾタロリムス、デキサメタゾンおよびパクリタキセルの効果を示すグラフである。
【図６Ａ】ヒト冠動脈内皮細胞におけるｐ７０Ｓ６Ｋ（Ｔ３８９）リン酸化に対する各種物質の効果を示すウェスタンブロットの図である。
【図６Ｂ】ヒト冠動脈内皮細胞からのウェスタンブロットの濃度測定を示すグラフである。
【図７】ヒト冠動脈平滑筋細胞におけるｐ７０Ｓ６Ｋ（Ｔ３８９）リン酸化に対する各種物質の効果を示すウェスタンブロットの図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
発明の詳細な説明
本発明は、一般に、再狭窄を抑制でき、エンドプロテーゼに隣接する細胞遊走を実質的に抑制しない量でラパマイシン類似体を送達するためのエンドプロテーゼ、配置システムおよび方法を含む。さらに具体的に、本発明は、配置されたエンドプロテーゼに隣接する細胞遊走を実質的に抑制しない、ラパマイシン類似体（例えば、ゾタロリムスまたはＡＢＴ−５７８）を送達するための、ステントなどのエンドプロテーゼの使用を含む。例えば、エンドプロテーゼが、ヒト冠動脈内に配置されるステントである場合、ラパマイシン類似体は、冠動脈の再狭窄を抑制でき、冠動脈細胞遊走を実質的に抑制しない。さらに、ラパマイシン類似体は、エンドプロテーゼの配置から形成される可能性のある病巣の再内皮化を可能にする内皮細胞および／または平滑筋細胞の遊走を抑制しない量で溶出することができる。したがって、本発明は、再狭窄および血栓症を抑制するエンドプロテーゼ、配置システムおよび方法を含む。
【００３０】
Ｉ．序論
一実施形態において、本発明は、ヒト冠動脈細胞遊走を抑制せず、それによって病巣の治癒を促進するラパマイシン類似体を送達するためのエンドプロテーゼ、配置システムおよび方法を含む。したがって、本発明は、ヒト冠動脈内皮および／または平滑筋細胞遊走を抑制しない形でラパマイシン類似体ゾタロリムス（例えば、ＡＢＴ−５７８）を送達するためのエンドプロテーゼ、配置システムおよびステントなどのエンドプロテーゼの使用を含む方法を含む。よって、本発明は、内皮および／または平滑筋細胞遊走を抑制せずに再狭窄および血栓症を抑制するエンドプロテーゼ、配置システムおよび方法に関する。本発明は、ヒト冠動脈に配置できる薬剤溶出ステントと関連して説明されているが、本発明のシステムおよび方法は、体内の他の血管または他の管腔通路に利用できる。本発明による薬剤溶出エンドプロテーゼは、細胞遊走を抑制することなく再狭窄を抑制して、病巣の再内皮化を促進し、その結果血栓症を抑制する適用分野で使用できる。
【００３１】
したがって、本発明による薬剤溶出エンドプロテーゼは、内膜平滑筋細胞過形成、再狭窄および血管閉塞などの過剰増殖性血管疾患の治療および／または防止に使用でき、血栓症への感受性を実質的に増加させない。かかる過剰増殖性血管疾患は、生物もしくは機械介在血管損傷後に起こる場合があり、本明細書に記述されている通りの薬剤溶出エンドプロテーゼの使用によって、血栓症を引き起こさずに治療または防止できる。
【００３２】
ＩＩ．薬剤送達システム
一実施形態において、本発明は、本明細書に記述されている治療有効量のラパマイシン類似体を含有する支持構造を有する薬剤送達システムを含む。ラパマイシン類似体の治療有効量は、配置されている支持構造に隣接する細胞遊走を実質的に抑制しない量である。例えば、ラパマイシン類似体の治療有効量は、実質的に、ヒト冠動脈内皮および／または平滑筋細胞の遊走を抑制しない。
【００３３】
支持構造は、多様な材料から、多様な立体配置で構成できる。この支持構造は、患者の体内で用いられるエンドプロテーゼなどの医療器具の一部であり得る。エンドプロテーゼの例は、ステント、冠動脈ステント、末梢ステント、グラフト、動静脈グラフト、バイパスグラフト、薬剤送達バルーン、薬剤送達デポー、カテーテル、ピックライン、弁などであり得る。医療器具が構成される材料は、生体適合性材料（ポリマー、プラスチック、金属、セラミックなど）、および患者の体内で利用可能な他の材料を含むことができる。
【００３４】
一実施形態において、前記支持構造は、形状記憶材料（「ＳＭＭ」）から成ることができる。例えば、ＳＭＭは、送達シャフト内にありながら、実質的に管状、直線状の配向を誘発するように制限させる方法で成形できるが、いったん送達シャフトから伸びると、支持構造の記憶形状を自動的に保持することができる。ＳＭＭは、ＳＭＭに特定の形状を覚えさせることができる形状記憶効果を有する。いったん形状を覚えると、ＳＭＭは、形を壊して曲がり、変形し、次いで、歪または加熱を排除することによって元の形状に回復することができる。典型的には、ＳＭＭは、合金から成る形状記憶合金（「ＳＭＡ」）、またはポリマーから成る形状記憶プラスチック（「ＳＭＰ」）であり得る。
【００３５】
通常、ＳＭＡは、非特徴的初期形状を有することができ、次いで、ＳＭＡを加熱し、所望の記憶形状に適合させることによって、記憶形状に構成できる。ＳＭＡが冷却された後、所望の記憶形状は保持できる。これは、必要な力の適用によって、ＳＭＡを曲げ、真っすぐにし、圧縮しおよび様々にねじることを可能にするが、この力が解除されると、ＳＭＡは、記憶形状に回復できる。ＳＭＡの主なタイプは、次の通りである：銅−亜鉛−アルミニウム；銅−アルミニウム−ニッケル；ニチノールとして既知のニッケル−チタン（「ＮｉＴｉ」）合金；およびエルジロイ（ｅｌｇｉｌｏｙ）として既知のコバルト−クロム−ニッケル合金またはコバルト−クロム−ニッケル−モリブデン合金。典型的には、ニチノールおよびエルジロイ合金が、より高価な場合があるが、銅主体ＳＭＡと比較して優れた機械的特性を有する。ＳＭＡがその結晶構造を変化させる温度は、合金に特徴的で、元素比を変動させることによって調整できる。
【００３６】
例えば、支持構造の主要材料は、超弾性ニチノールを形成するＮｉＴｉ合金から成ることができる。この場合、ニチノール材料は、特定の形状を覚えるように仕込まれ、伸ばしてシャフト、カテーテルまたは他のチューブに成形され、次いで、カテーテルまたはチューブから開放され、仕込みの形状に回復することができる。また、所望の特性に応じて、追加材料をニチノールに添加することも可能である。
【００３７】
ＳＭＰは、形状転移プラスチックで、本発明による支持構造に成形できる。また、多層体を形成するには、少なくとも１つのＳＭＡ層と少なくとも１つのＳＭＰ層を含むのが有益であり得る。しかし、多層支持構造を形成するために、材料のいずれの適切な組合せも使用できる。ＳＭＰが個々のポリマーの最低融点よりも高い温度を受ける場合、ブレンドは、ゴム状態に転移する。弾性率は、転移温度（「Ｔｔｒ」）を境にして、２桁以上変化することができる。したがって、ＳＭＰは、Ｔｔｒよりも高い温度でＳＭＰを加熱し、ＳＭＰを新しい形状に固定し、Ｔｔｒよりも低い温度まで材料を冷却することによって、支持構造の所望の形状に成形できる。次いで、ＳＭＰは、無理に一時的形状に整え、次いで、いったん力が加わると、記憶形状を回復することができる。ＳＭＰの例は、生分解性ポリマー（オリゴ（ε−カプロラクトン）ジオール、オリゴ（ｐ−ジオキサノン）ジオールなど）および非生分解性ポリマー（ポリノルボレン、ポリイソプレン、スチレンブタジエン、ポリウレタン系材料、酢酸ビニル−ポリエステル系化合物など）、およびまだ未確定の他の化合物を含むが、これらに限定されない。したがって、いずれのＳＭＰも、本発明によって使用できる。
【００３８】
さらに、支持構造は、ステンレススチール、銀、プラチナ、タンタル、パラジウム、コバルト−クロム合金（Ｌ６０５、ＭＰ３５ＮまたはＭＰ２０Ｎなど）、ニオビウム、イリジウム、これらのいずれかの等価物およびこれらの合金およびこれらの組合せを含む多様な既知の適切な変形可能材料から成ることができる。合金Ｌ６０５は、約５３％のコバルト、２０％のクロムおよび１０％のニッケルを含む、Ｃｏｌｌｅｇｅｖｉｌｌｅ、ＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａのＵＴＩ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されている合金の販売名であると理解される。合金ＭＰ３５ＮおよびＭＰ２０Ｎは、Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｐｒｅｓｓ  Ｃｏ．、Ｊｅｎｋｉｎｔｏｗｎ，  ＰＡから市販されている、コバルト、ニッケル、クロムおよびモリブデンの合金の販売名であると理解される。さらに具体的には、ＭＰ３５Ｎは、一般に、約３５％のコバルト、３５％のニッケル、２０％のクロムおよび１０％のモリブデンを含み、ＭＰ２０Ｎは、一般に、約５０％のコバルト、２０％のニッケル、２０％のクロムおよび１０％のモリブデンを含む。
【００３９】
さらに、支持構造は、体内管腔内の環境への曝露の際に膨張できる生体適合性材料を含むことができる。かかる生体適合性材料の例は、適切なハイドロゲル、親水性ポリマー、生分解性ポリマーおよび生体吸収性ポリマーを含むことができる。かかるポリマーの例は、ポリ（アルファ−ヒドロキシエステル）、ポリ乳酸、ポリラクチド、ポリ−Ｌ−ラクチド、ポリ−ＤＬ−ラクチド、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−ＤＬ−ラクチド）、ポリグリコール酸、ポリグリコリド、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリ（グリコリド−ｃｏ−ラクチド）、ポリ（グリコリド−ｃｏ−ＤＬ−ラクチド）、ポリ（グリコリド−ｃｏ−Ｌ−ラクチド）、ポリアンヒドリド、ポリ（アンヒドリド−ｃｏ−イミド）、ポリエステル、ポリオルトエステル、ポリカプロラクトン、ポリエステル、ポリアンヒドリド、ポリホスファゼン、ポリエステルアミド、ポリエステルウレタン、ポリカーボネート、ポリトリメチレンカーボネート、ポリ（グリコリド−ｃｏ−トリメチレン）カーボネート、ポリ（ＰＢＡ−カーボネート）、ポリフマレート、ポリプロピレンフマレート、ポリ（ｐ−ジオキサノン）、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリアミノ酸、ポリ−Ｌ−チロシン、ポリ（ベータ−ヒドロキシブチレート）、ポリヒドロキシブチレート−ヒドロキシ吉草酸、これらの組合せなどを含むことができる。
【００４０】
さらに、支持構造は、セラミック材料から形成できる。一態様において、セラミックは、場合によって多孔質であり得る生体適合性セラミックであり得る。適切なセラミック材料の例は、ヒドロキシアパタイト、ムライト、結晶性酸化物、非結晶性酸化物、炭化物、窒化物、ケイ化物、ホウ化物、リン化物、硫化物、テルライド、セレナイド、酸化アルミニウム、酸化ケイ素、酸化チタン、酸化ジルコニウム、アルミナ−ジルコニア、炭化ケイ素、炭化チタン、ホウ化チタン、窒化アルミニウム、窒化ケイ素、フェライト、硫化鉄などを含む。場合によって、セラミックは、エンドプロテーゼの形状に焼結される焼結性粒子またはこの層として提供できる。
【００４１】
さらに、エンドプロテーゼは、放射線不透過材料を含み、配置中の可視性を高めることができる。場合によって、放射線不透過材料は、エンドプロテーゼのいずれかの部分上の層または被覆であり得る。放射線不透過材料は、プラチナ、タングステン、銀、ステンレススチール、金、タンタル、ビスマス、硫酸バリウムまたは同様の材料であり得る。
【００４２】
１．薬剤溶出エンドプロテーゼ
一実施形態において、本発明は、対象の体内において、再狭窄を抑制し、病巣治癒を促進するように構成されている薬剤溶出エンドプロテーゼを含む。かかるエンドプロテーゼは、少なくとも１つの支持構造とラパマイシン類似体を含む。支持構造は、体内管腔などの、対象の体内に配置されるように構成され、寸法を定められる。支持構造上に治療有効量のラパマイシン類似体が配置される。ラパマイシン類似体の治療有効量は、対象の体内に配置された場合に、ラパマイシン類似体が支持構造から溶出し、それによって、再狭窄を抑制するのに十分で、当該支持構造に隣接するまたは近位の細胞遊走を実質的に抑制しないラパマイシン類似体濃度を入手し、その結果、遊走細胞が病巣の治癒を促進することを可能にする。場合によって、病巣は、血管、動脈、冠動脈、静脈、食道管腔および尿道から成る群から選択される体内管腔に存在し、かかる病巣は、エンドプロテーゼの配置によって引き起こされる可能性がある。
【００４３】
一実施形態において、本発明は、再狭窄および血栓症を抑制する治療有効量のラパマイシン類似体を有する、支持構造を含むエンドプロテーゼを含む。さらに、薬剤溶出エンドプロテーゼは、再狭窄および／または血栓症発現率を約０％から２５％のレベルまで減少させることができる。
【００４４】
２．ラパマイシン類似体
一実施形態において、エンドプロテーゼによって含まれる薬剤は、式１、式２、式３の構造またはこれらの組合せを有するラパマイシン類似体であり得る。
【００４５】
【化３】
2009538212.tif 000005
2009538212.tif 000006
【００４６】
式２のラパマイシン類似体は、ゾタロリムスまたはＡＢＴ−５７８と称され得る。さらに、当該薬剤は、ラパマイシン類似体のいずれかの薬学的に許容可能な塩またはプロドラッグであり得る。ゾタロリムスなどの生体活性剤の薬学的に許容可能な塩および／またはプロドラッグの調製は、当技術分野において周知である。
【００４７】
一実施形態において、ラパマイシン類似体は、式１−３に示される類似体の誘導体であり得る。誘導体は、水酸化、メチル化、エチル化、その他の形で置換基を最小限に変更することなどの軽微な置換を行うことによって調製できる。しかし、本発明によるラパマイシン類似体のいずれの誘導体も、上記のように、細胞遊走を抑制せずに、再狭窄を抑制する性質を有する必要がある。
【００４８】
ラパマイシン類似体は、様々な量および濃度で医療器具上に存在することができる。医療器具上の薬剤量を測定する周知の単位の１つは、医療器具の長さ当たりの量（即ち、重量またはモル）である。したがって、本発明によるエンドプロテーゼは、約１０ｎｇ／ｍｍから約１０ｍｇ／ｍｍエンドプロテーゼ長を含むことができる。さらに好ましくは、ラパマイシン類似体は、約１００ｎｇ／ｍｍから約１ｍｇ／ｍｍエンドプロテーゼ長で存在することができる。さらにより好ましくは、ラパマイシン類似体は、約１ｕｇ／ｍｍ
から約１００ｕｇ／ｍｍエンドプロテーゼ長で存在することができる。なおもさらに好ましくは、ラパマイシン類似体は、約５ｕｇ／ｍｍから約５０ｕｇ／ｍｍエンドプロテーゼ長で存在することができる。なおもさらに好ましくは、ラパマイシン類似体は、約８ｕｇ／ｍｍから約２５ｕｇ／ｍｍエンドプロテーゼ長で存在することができる。最も好ましくは、ラパマイシン類似体は、約１０ｕｇ／ｍｍエンドプロテーゼ長で存在することができる。例えば、式２のラパマイシン類似体は、１０ｕｇ／ｍｍステント長で存在することができる。
【００４９】
一実施形態において、エンドプロテーゼ上のラパマイシン類似体の量は、ラパマイシン類似体の総量として表すことができる。したがって、本発明によるエンドプロテーゼは、約１０ｎｇから約１０ｍｇを含むことができる。さらに好ましくは、ラパマイシン類似体は、約１００ｎｇから約１ｍｇで存在することができる。はるかに好ましくは、ラパマイシン類似体は、約１ｕｇから約５００ｕｇで存在することができる。なおもさらに好ましくは、ラパマイシン類似体は、約１０ｕｇから約２５０ｕｇであり得る。なおもさらに好ましくは、ラパマイシン類似体は、約１００ｕｇから約２００ｕｇで存在することができる。最も好ましくは、ラパマイシン類似体は、約１５０ｕｇで存在することができる。例えば、式２のラパマイシン類似体は、ステント上に１５０ｕｇで存在することができる。
【００５０】
一実施形態において、ラパマイシン類似体は、さらに詳細に後述するように、ポリマー被覆などの担体中に含まれ得る。したがって、本発明によるエンドプロテーゼは、ラパマイシン類似体を約１０ｎｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で含むことができる。さらに好ましくは、ラパマイシン類似体は、約１００ｎｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌで存在することができる。はるかに好ましくは、ラパマイシン類似体は、約１ｕｇ／ｍｌから約１００ｕｇ／ｍｌで存在することができる。なおもさらに好ましくは、ラパマイシン類似体は、約５ｕｇ／ｍｌから約５０ｕｇ／ｍｌで存在することができる。なおもさらに好ましくは、ラパマイシン類似体は、約８ｕｇ／ｍｌから約２５ｕｇ／ｍｌで存在することができる。最も好ましくは、ラパマイシン類似体は、約１０ｕｇ／ｍｌで存在することができる。例えば、式２のラパマイシン類似体は、１０ｕｇ／ｍｌで存在することができる。
【００５１】
一実施形態において、ラパマイシン類似体は、エンドプロテーゼに隣接するまたは近位の組織、細胞、細胞マトリックス、体液、血液などに類似体の局所濃度を生じる量でエンドプロテーゼ上に含まれ得る。したがって、本発明によるエンドプロテーゼは、約１０ｐｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌの局所濃度を生じることができる。さらに好ましくは、ラパマイシン類似体は、約１００ｐｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌの局所濃度を生じることができる。はるかに好ましくは、ラパマイシン類似体は、約１ｎｇ／ｍｌから約１００ｕｇ／ｍｌの局所濃度を生じることができる。なおもさらに好ましくは、ラパマイシン類似体は、約１０ｎｇ／ｍｌから約１０ｕｇ／ｍｌの局所濃度を生じることができる。なおもさらに好ましくは、ラパマイシン類似体は、約１００ｎｇ／ｍｌから約１ｕｇ／ｍｌの局所濃度を生じることができる。最も好ましくは、ラパマイシン類似体は、約５００ｕｇ／ｍｌの局所濃度を生じることができる。
【００５２】
一実施形態において、ラパマイシン類似体は、エンドプロテーゼに隣接するまたは近位の組織、細胞、細胞マトリックス、体液、血液などで、モル濃度として表示されるこの類似体の持続的局所濃度を生じる量でエンドプロテーゼ上に含まれ得る。したがって、本発明によるエンドプロテーゼは、約１０ｐＭから約１０ｍＭの持続的局所濃度を生じることができる。さらに好ましくは、ラパマイシン類似体は、約１００ｐＭから約１ｍＭの持続的局所濃度を生じることができる。はるかに好ましくは、ラパマイシン類似体は、約１ｎＭから約１００ｕＭの持続的局所濃度を生じることができる。なおもさらに好ましくは、ラパマイシン類似体は、約１０ｎＭから約１０ｕＭの持続的局所濃度を生じることができる。なおもさらに好ましくは、ラパマイシン類似体は、約１００ｎＭから約１ｕＭの持続的局所濃度を生じることができる。最も好ましくは、ラパマイシン類似体は、約３００ｎＭの持続的局所濃度を生じることができる。
【００５３】
３．ラパマイシン類似体配合物
一実施形態において、エンドプロテーゼは、支持構造上に配置された、ラパマイシン類似体を含有する薬学的に許容可能な担体を含む。薬学的に許容可能な担体は、エンドプロテーゼの支持構造上に適用されおよび保持され得る、薬剤学の分野で既知のいずれかの担体であり得る。
【００５４】
一実施形態において、エンドプロテーゼは、ラパマイシン類似体を含有する支持構造上に配置されている被覆として構成されている担体を含む。場合によって、この被覆は、生体適合性ポリマーである。別の選択肢において、この被覆は、支持構造からラパマイシン類似体が溶出される速度を調節する。本発明での使用に適した被覆は、薬剤が含有できるいずれかのポリマー材料を含むことができるポリマー被覆を含むが、これらに限定されない。この被覆は、親水性、疎水性、生分解性、非生分解性およびこれらの組合せであり得る。
【００５５】
エンドプロテーゼの被覆または本体での使用のためのポリマー被覆は、ポリカルボン酸、セルロースポリマー、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、無水マレイン酸ポリマー、ポリアミド、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド、グリコースアミノグリカン、ポリサッカライド、ポリエステル、ポリウレタン、シリコーン、ポリオルトエステル、ポリアンヒドリド、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシブチレート、ポリアクリルアミド、ポリエーテル、これらの混合物、これらの誘導体、これらのコポリマーおよび他の同様のポリマーから成る群から選択できる。ポリウレタン分散物（ＢＡＹＨＹＤＲＯＬなど）およびアクリル酸ラテックス分散物などのポリマー分散物から調製される被覆も本発明の治療薬とともに使用可能である。
【００５６】
エンドプロテーゼの被覆または本体において使用可能な生分解性ポリマーは、ポリ（Ｌ−乳酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸）、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシブチレート、ポリグリコリド、ポリ（ジオキサン）、ポリ（ヒドロキシバレレート）、ポリオルトエステル、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（ヒドロキシブチレート−ｃｏ−バレレート）、ポリ（グリコリド−ｃｏ−トリメチレン）カーボネート、ポリアンヒドリド、ポリホスフォエステル、ポリホスフォエステル−ウレタン、ポリアミノ酸、ポリシアノアクリレート、生体分子、フィブリン、フィブリノーゲン、セルロース、デンプン、コラーゲン、ヒアルロン酸、これらの混合物、これらの誘導体、これらのコポリマーおよび同様のポリマーから成る群から選択できる。
【００５７】
エンドプロテーゼの被覆または本体において使用可能な生体安定性ポリマーは、ポリウレタン、シリコーン、ポリエステル、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリカプロラクタム、ポリイミド、塩化ポリビニル、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルアルコール、アクリルポリマー、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、ビニルポリマー、オレフィンを含むポリマー（例えば、スチレンアクリロニトリルコポリマー、エチレンメチルメタクリレートコポリマー、エチレンビニルアセテートおよび他の同様のポリマー）、ポリエーテル、レーヨン、セルロース誘導体（例えば、酢酸セルロース、硝酸セルロース、プロピオン酸セルロースおよび他の同様のポリマー）、パリレン、これらの混合物、これらの誘導体、これらのコポリマーおよび同様のポリマーから成る群から選択できる。
【００５８】
さらに、エンドプロテーゼの被覆または本体に各種の他のポリマーが使用できる。かかるポリマーの例は、ポリ（ＭＰＣｗ：ＬＡＭｘ：ＨＰＭＡｙ：ＴＳＭＡｚ）（式中、ｗ、ｘ、ｙおよびｚは、ポリマー調製のための供給物に使用されているモノマーのモル比を表し、ＭＰＣは、２−メタクリオイルオキシエチルホスフォリルクロリン単位を表し、ＬＭＡは、メタクリル酸ラウリル単位を表し、ＨＰＭＡは、メタクリル酸２−ヒドロキシプロピル単位を表し、ＴＳＭＡは、メタクリル酸３−トリメトキシシリルプロピル単位を表す。）である。
【００５９】
本明細書で説明されているラパマイシン類似体は、エンドプロテーゼに適用できる。例えば、ラパマイシン類似体は、エンドプロテーゼに適用される被覆に組み込むことができる。あるいは、ラパマイシン類似体は、エンドプロテーゼ本体内部に含浸できる。エンドプロテーゼのポリマー被覆または本体へのラパマイシン類似体の組み込みは、ポリマーコートエンドプロテーゼまたは吸収性エンドプロテーゼをラパマイシン類似体含有溶液に十分な時間（例えば、５分間など）をかけて浸し、次いで、エンドプロテーゼを十分な時間（例えば、１０、１５または３０分間）をかけて乾燥することによって実施できる。ラパマイシン類似体を含むエンドプロテーゼは、周知のエンドプロテーゼ配置手段によって、冠動脈などの血管に送達できる。例えば、ステントは、バルーンカテーテルによって送達できる。
【００６０】
ラパマイシン類似体は、エンドプロテーゼに含まれることが可能で、および／またはエンドプロテーゼへのラパマイシン類似体の適用のために調製できる様々な薬学的に許容可能な配合物に配合できる。これは、薬学的に許容可能な担体とのラパマイシン類似体の配合を含むことができ、担体は、無毒の固体、半固体または液体フィラー、希釈剤、封入材料またはいずれかのタイプの配合補助剤である。エンドプロテーゼに含まれ得る組成物は、薬学的に許容可能な無菌水性溶液または非水性溶液、分散液、懸濁液、エマルジョン、加えて、エンドプロテーゼに含まれる直前の無菌溶液または分散液への還元用の無菌粉末から成ることができる。適切な水性および非水性担体、希釈剤、溶媒またはビヒクルの例は、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、カルボキシメチルセルロースおよびこれらの適切な混合物、植物油（例えば、オリーブ油）、オレイン酸エチルなどの有機エステルなどを含む。ラパマイシン類似体を含む組成物の適切な特性は、レシチンなどの被覆材料の使用によって、分散液の場合は、所要粒度の維持によって、および配合物中への界面活性剤の使用によって維持できる。
【００６１】
エンドプロテーゼに含まれ得るラパマイシン類似体含有組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントも含有できる。微生物作用の防止は、各種の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含めることによって確保できる。糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を含むのも望ましい。注射剤型の長時間吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅らせる物質を含めることによって引き起こすことができる。
【００６２】
ある場合、薬剤の効果を遅延させるためには、エンドプロテーゼからの当該薬剤の吸収を鈍化させるのが望ましい。これは、水溶解性の低い結晶性または非晶質材料の使用によって達成できる。薬剤の吸収速度は、その溶解速度に依存し得、この溶解速度は、今度は、結晶サイズおよび結晶の形に依存し得る。あるいは、エンドプロテーゼからのラパマイシン類似体の吸収遅延は、エンドプロテーゼに含有させる前にこの薬剤を油または疎水性担体に溶解または懸濁することによって達成できる。
【００６３】
さらに、ラパマイシン類似体は、エンドプロテーゼに含有させる前にマイクロカプセルマトリックスに配合することができる。したがって、ラパマイシン類似体は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー内に含めることができる。薬剤対ポリマー比および用いられる特定ポリマーの性質に応じて、薬剤放出速度が調節され得る。同様に、ラパマイシン類似体は、身体組織との適合性を示すリポソームまたはフィクロエマルジョンに含まれ得る。
【００６４】
また、ラパマイシン類似体は、以下のいずれかなどの不活性な、薬学的に許容可能な材料と混合できる：賦形剤または担体（クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウムなど）；フィラーまたは増量剤（デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよびケイ酸など）；結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよびアラビアゴムなど）；保湿剤（グリセロールなど）；崩壊剤（寒天、炭酸カルシウム、デンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩および炭酸ナトリウムなど）；溶解遅延剤（パラフィンなど）；吸収促進剤（四級アンモニウム化合物など）；湿潤剤（セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール）；吸収剤（カオリンおよびベントナイトクレーなど）；潤滑剤（タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコールおよびラウリル硫酸ナトリウムなど）。
【００６５】
さらに、ラパマイシン類似体は、液体の形態で含めることができ、エンドプロテーゼの被覆または本体に吸収され得る。かかる液体の形態は、薬学的に許容可能なエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップなどであり得る。ラパマイシン類似体に加えて、これら液体は、水、他の溶媒、可溶化剤、乳化剤、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油類（例えば綿実油、落花生油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステルならびに混合物などの当技術分野で一般的に使用されている不活性希釈剤を含有できる。
【００６６】
ＩＩＩ．ラパマイシン類似体の送達
一実施形態において、本発明は、対象の体内にラパマイシン類似体を送達する方法を含む。かかるラパマイシン類似体を送達する方法は、対象の体内において、再狭窄の抑制および病巣の治癒促進に使用できる。例えば、病巣は、この病巣への平滑筋細胞および／または内皮細胞の遊走を実質的に抑制しないラパマイシン類似体によって治癒できる。ラパマイシン類似体は、遊走を若干減少させる場合があるが、遊走は進行し、それによって、病巣の治癒を促進することができる。これは、エンドプロテーゼの配置によって引き起こされる病巣に特に有利であるといえる。病巣の治癒促進によって、血栓症は、発症する可能性が減少する。即ち、病巣の再内皮化は、血栓症の発現を顕著に減少させることができる、何故ならば、血餅形成材料が、遊走している細胞により覆われ得るからである。
【００６７】
したがって、一方法は、対象の体内に、ラパマイシン類似体を含有するエンドプロテーゼを配置する段階を含む。エンドプロテーゼは、対象の体内に入るように構成され、寸法が定められた支持構造を含む。治療有効量のラパマイシン類似体が支持構造上に配置される。ラパマイシン類似体は、支持構造から溶出されて、再狭窄を抑制するのに十分でありおよび支持構造に隣接する細胞の遊走を実質的に抑制しないような、体内でのおよび支持構造に隣接するまたは近位のラパマイシン類似体の濃度が得られ、その結果、遊走する細胞が病巣治癒を促進する。場合によって、病巣は、血管、動脈、冠動脈、静脈、食道管腔および尿道から成る群から選択される体内管腔にある。
【００６８】
一実施形態において、本発明は、対象の体内で再狭窄および血栓症を抑制する方法を含む。かかる方法は、対象の体内にラパマイシン類似体を含有するエンドプロテーゼを配置する段階を含む。エンドプロテーゼは、対象の体内に入るように構成され、寸法が定められた支持構造を含む。治療有効量のラパマイシン類似体が支持構造上に配置される。ラパマイシン類似体は、支持構造から溶出して、再狭窄および血栓症を抑制するのに十分である、体内でのおよび支持構造に隣接したラパマイシン類似体濃度を得る。
【００６９】
一実施形態において、本発明は、対象の体内の病巣の治癒を促進しながら、再狭窄および血栓症を抑制する方法を含む。かかる方法は、再狭窄および／または血栓症に感受性を示す対象の体内にラパマイシン類似体を送達する段階を含む。一部には、これは、治療有効量のラパマイシン類似体を送達することによって達成できる。ラパマイシン類似体の送達は、再狭窄および血栓症を抑制するのに十分である体内でのラパマイシン類似体濃度を得るように構成し、調節することができる。
【００７０】
本発明の化合物の治療有効量は、上記のもしくは他の治療において使用される場合、純粋状態で、またはかかる状態が存在する場合、薬学的に許容可能な塩、エステルまたはプロドラッグの形態で、用いることができる。あるいは、当該化合物は、１つまたは複数の薬学的に許容可能な賦形剤と組み合わせた、目的の化合物を含有する医薬組成物として投与できる。しかし、本発明の化合物および組成物の総１日使用量は、確実な医学的判断の範囲内で担当医によって決定されることが理解される。いずれの特定の患者にとっても具体的な治療有効量レベルは、治療対象疾患および当該疾患の重症度；使用される特定の化合物の活性；用いられる特定組成物；患者の年齢、体重、全身の健康状態、性別および食事状況；投与時間、投与経路；用いられる特定化合物の排泄率；治療期間；用いられる特定化合物と組み合わせてまたは同時に使用される薬剤；および医療技術上周知の同様の要因を含む様々な要因に依存する。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要な量よりも低いレベルで当該化合物の投与量を開始し、所望の効果が達成されるまで、徐々に投与量を増加させることは、十分に当分野の技術の範囲内にある。
【００７１】
一実施形態において、ラパマイシン類似体は、エンドプロテーゼに隣接するまたは近位の組織、細胞、細胞マトリックス、体液、血液などで類似体の局所濃度を生じる量で送達できる。これは、細胞遊走を抑制することなく、再狭窄および血栓症を抑制する濃度の達成を含むことができる。したがって、ラパマイシン類似体は、約１０ｐｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌの局所濃度を生じるように送達できる。さらに好ましくは、ラパマイシン類似体は、約１００ｐｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌの局所濃度を生じることができる。はるかに好ましくは、ラパマイシン類似体は、約１ｎｇ／ｍｌから約１００ｕｇ／ｍｌの局所濃度を生じることができる。なおもさらに好ましくは、ラパマイシン類似体は、約１０ｎｇ／ｍｌから約１０ｕｇ／ｍｌの局所濃度を生じることができる。なおもさらに好ましくは、ラパマイシン類似体は、約１００ｎｇ／ｍｌから約１ｕｇ／ｍｌの局所濃度を生じることができる。最も好ましくは、ラパマイシン類似体は、約５００ｕｇ／ｍｌの局所濃度を生じることができる。
【００７２】
一実施形態において、ラパマイシン類似体は、エンドプロテーゼに近位の組織、細胞、細胞マトリックス、体液、血液などに、モル濃度として表されるこの類似体の持続的局所濃度を生じる量で送達され得る。したがって、ラパマイシン類似体の送達は、約１０ｐＭから約１０ｍＭの持続的局所濃度を生じることができる。さらに好ましくは、ラパマイシン類似体は、約１００ｐＭから約１ｍＭの持続的局所濃度を生じることができる。はるかに好ましくは、ラパマイシン類似体は、約１ｎＭから約１００ｕＭの持続的局所濃度を生じることができる。なおもさらに好ましくは、ラパマイシン類似体は、約１０ｎＭから約１０ｕＭの持続的局所濃度を生じることができる。なおもさらに好ましくは、ラパマイシン類似体は、約１００ｎＭから約１ｕＭの持続的局所濃度を生じることができる。最も好ましくは、ラパマイシン類似体は、約３００ｎＭの持続的局所濃度を生じることができる。
【００７３】
ヒトもしくはヒトよりも下等な動物に投与される本発明の化合物の総１日量は、約０．０１から約１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であり得る。ステントから局所送達するためには、患者が受ける１日量は、ステントの長さに依存する。例えば、１５ｍｍ冠動脈ステントは、約１から約１２０ｍｇの範囲の量で薬剤を含有でき、この薬剤を数時間から数週間の範囲の期間をかけて送達できる。
【００７４】
一実施形態において、この方法は、支持構造上に配置されているポリマー被覆などの薬学的に許容可能な担体からラパマイシン類似体を溶出する段階を含む。したがって、この被覆は、本明細書に記述されている、当技術分野で周知の担体のいずれかであり得る。ある場合、この担体は、ラパマイシン類似体の溶出速度を調節するように構成することができ、溶出速度は、実質的に一定または定常速度を含むことができる。また、これは、初期バーストに続く０、一次または二次送達速度論を含むことができる。
【００７５】
一実施形態において、この方法は、支持構造に隣接する体内管腔の再狭窄を抑制する段階を含む。これは、支持構造によって引き起こされる体内管腔壁の病巣の治癒を促進しながら実施できる。病巣の治癒は、病巣への内皮細胞および／または平滑筋細胞の遊走を実質的に抑制しないことによって促進される。かかる細胞遊走は、当該病巣の再内皮化を招くことができる。
【００７６】
ウェスタンブロットは、ラパマイシン類似体（例えば、ゾタロリムス）に応答する特定のタンパク質に対する抗体を使って、特定のタンパク質のレベルを示している。結果は、インビトロにおいて、ヒト冠動脈内皮細胞中のｍＴＯＲエフェクターｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化に対する抗再狭窄剤の効果を示す。パクリタキセルおよびゾタロリムスは、ｐ７０Ｓ６Ｋの活性化を抑制することが認められている。他方、デキサメタゾンは、ｐ７０Ｓ６Ｋの活性化を抑制しないことが認められている。
【００７７】
さらに、インビトロにおいて、ヒト冠動脈内皮細胞の遊走を、パクリタキセルは抑制するが、ゾタロリムスまたはデキサメタゾンは抑制しないことが認められている。パクリタキセルだけは、遊走を妨害し、デキサメタゾンとｍＴＯＲ剤は遊走を妨害しないが、パクリタキセルも、ｍＴＯＲ剤も、ともにｐ７０Ｓ６Ｋ（Ｔ３８９）のリン酸化を減少させる。ゾタロリムスは、ｐＲｂリン酸化を減少させ、ゾタロリムスのｈＥＣ増殖抑制能と一致する。パクリタキセルは、遊走を妨害するが、全薬剤がｐ７０Ｓ６Ｋ（Ｔ３８９）のリン酸化を減少させる。ゾタロリムスは、ｐＲｂリン酸化を減少させ、ゾタロリムスのｈＥＣ増殖抑制能と一致する。これらの結果は、複数の増殖因子の存在下で、ｐ７０Ｓ６Ｋ単独の抑制では、遊走を減少させるには不十分であることを示唆している。デキサメタゾンおよびゾタロリムスは、血管病巣の再内皮化を抑制するとは予測されず、デキサメタゾンは、血管病巣の再内皮化を促進できる。対照的に、パクリタキセルは、内皮細胞および／または平滑筋細胞の遊走を妨害することによって、再内皮化を抑制する。
【実施例】
【００７８】
先に、薬剤溶出ステントは、再狭窄率を低下させたが、内皮細胞（ＥＣ）および／または平滑筋（ＳＭＣ）の遊走と病巣の再内皮化を妨害する薬剤を溶出し、これが、血栓症に到ることが見出されている。さらに具体的に、ヒトに薬剤溶出ステントが使用される場合、溶出されている薬剤は、細胞の遊走と病巣の再内皮化を妨害し、それによって、血栓症の機会を高める。したがって、Ｓ１Ｐ−１が介在する細胞遊走の効果を仲介することが報告されている細胞内分子ｐ７０Ｓ６Ｋの、遊走およびリン酸化に対する抗再狭窄剤であるゾタロリムス、シロリムス、パクリタキセルおよびデキサメタゾンの効果を決定することを目的に実験を実施した。リン酸化ｐ７０Ｓ６Ｋは、細胞の成長および増殖の１つの調節物質であり、これらを検討でき、それによって、細胞の遊走におけるリン酸化ｐ７０Ｓ６Ｋの役割に関して、抗再狭窄剤の効果が決定できる。
【００７９】
一部のｍＴＯＲ拮抗剤およびパクリタキセルが、これらの既知の抗増殖効果に加えて、新生内膜発達に到る平滑筋の遊走も防止し、この防止は、当該物質の抗再狭窄効果に寄与することが提案されている。ラパマイシン類似体シロリムスは、スフィンゴシン−１フォスフェート（Ｓ１Ｐ）に応答したラット血管平滑筋細胞の遊走および血小板由来増殖因子ホモダイマーＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）によって誘発されるブタ大動脈平滑筋細胞の遊走を抑制することが報告されている。ｍＴＯＲ拮抗剤（即ち、シロリムス、ゾタロリムスまたはエベロリムス）がその活性を発揮するメカニズムは、ｐ７０Ｓ６Ｋの抑制が関与する、と報告されている。この仮説によれば、ｍＴＯＲ拮抗剤は、ｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化および活性化を抑制し、自由延長開始因子４Ｆ（ｅＩＦ−４Ｆ）の減少およびタンパク質翻訳の抑制を生じる。細胞周期進行に重要なタンパク質の減少は、血管平滑筋を含む各種細胞タイプにおいて、Ｇ１期からＳ期移行での細胞周期停止を招き、可能性として、遊走の抑制をきたす。
【００８０】
癌化学療法剤のパクリタキセルは、微小管の恒常性を直接妨害し、ＥＣの遊走および増殖の抑制をきたし、これが血栓症の増加を招く可能性があるという仮説が立てられている。ｐ７０Ｓ６Ｋ活性化の低減単独だけでは、抗遊走活性を生じない。ヒト冠動脈平滑筋および内皮細胞の遊走に対するシロリムス、ゾタロリムス、デキサメタゾンおよびパクリタキセルの比較効果を検討するために、変更Ｂｏｙｄｅｎチャンバーを使って、試験を実施した。したがって、変更Ｂｏｙｄｅｎチャンバーを使って、ｈＦＧＦ、ｈＥＧＦ、ＶＥＧＦ、Ｒ３−ＩＧＦ−１およびＦＢＳに応答したＥＣ遊走を確認した。遊走は、増殖因子の、加えて血小板依存的増殖因子ホモダイマーＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）の存在下および不在下で、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含めた様々な走化性刺激を使って誘発した。抗遊走活性は、短期薬剤処理後、および基礎または増殖条件での前処理（２４時間）後に評価した。
【００８１】
Ｉ．細胞系の維持
Ｃａｍｂｒｅｘ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）から入手した初代ヒト冠動脈平滑筋細胞（ｈＣａＳＭＣ）および内皮細胞（ｈＣａＥＣ）は、常法通り、製造会社によって推奨されている培地中で維持された。ｈＣａＳＭＣは、適切なＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔ（登録商標）が補充され、５％ＦＢＳ、０．１％ｈＥＧＦ、０．２％ｈＦＧＦ−Ｂおよび０．１％インスリンを含有する完全培地（ｈＣａＳＭＣ増殖培地）となった平滑筋増殖培地（「最少培地」、ＳｍＢＭ、Ｃａｍｂｒｅｘ）中で増殖させた。ｈＣａＥＣは、適切なＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔ（登録商標）が補充され、５％ＦＢＳ、０．１％ｈＥＧＦ−Ｂ、０．４％ＦＧＦ、０．１％Ｒ３−ＩＧＦ、０．０４％ハイドロコーチゾン、０．１％ＶＥＧＦおよび０．１％アスコルビン酸を含有する完全培地（ｈＣａＥＣ増殖培地）となった内皮細胞増殖培地（「最少培地」、ＥＢＭ−２、Ｃａｍｂｒｅｘ）から成る対応完全培地中で維持された。細胞は、常法通り、５％ＣＯ２含有雰囲気下、３７℃に維持されている加湿インキュベーター中、適切な培地中で増殖させた。必要な場合、各細胞型は、集密度約７５％で継代培養した。
【００８２】
細胞は、全実験において、７回の細胞集団倍加に先行して維持され、使用された。アッセイに先行して細胞を増殖させるために、凍結ｈＣａＳＭＣまたはｈＣａＥＣ細胞を解凍し、Ｔ−１６２フラスコ中、それぞれ、適切な補充物を有する平滑筋増殖培地（ＳｍＧＭ）または内皮細胞増殖培地−２（ＥＧＭ−２）中で培養した。細胞培地は、細胞が７０から９０％の集密度を達成するまで、翌日、その後、１日置きに交換された。増殖培地を除去し、細胞をＰＢＳ（Ｃａ２＋およびＭｇ２＋無添加）で２回洗浄した。細胞を剥離するために、十分なトリプシン／ＥＤＴＡ（３ｍｌ）を添加し、細胞の単層を覆い、フラスコを室温で温置した。細胞が剥離した後、６ｍｌの完全培地の添加によってトリプシンを中和した。細胞をカウントし、５０ｍｌ試験管に移し、遠心分離した。細胞ペレットを実験のため、適切な細胞密度まで、増殖培地に再懸濁した。
【００８３】
ＩＩ．遊走実験
全遊走実験の前に、基礎培地で細胞（ｈＣａＥＣまたはｈＣａＳＭＣ）を２４時間同調させた。短期試験において、細胞を収集し、カウントし、２００，０００個のｈＣａＥＣまたは１６０，０００個のｈＣａＳＭＣを２４穴プレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で変更Ｂｏｙｄｅｎチャンバーの上部チャンバーに静置した。プレートは、ｈＣａＥＣおよびｈＣａＳＭＣ用に、それぞれ、３．０および８．０ｕｍの微孔質Ｆｌｕｏｒｏｂｌｏｋ膜を含有していた（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。ｈＣａＥＣ遊走実験に使用したチャンバーは、フィブロネクチン（ＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔ）で被覆した。前処理実験において、細胞を薬剤の存在下で同調させ、または、同調後、細胞のカウントおよび遊走前に、増殖培地中で２４時間処理した。全細胞を、遊走前に、薬剤または溶媒（対照）を含有する基礎培地中に再懸濁した。細胞は、走化性物質に応答して２２から２４時間遊走させた。遊走後、細胞をカルセイン−ＡＭで９０分間染色し、微孔質フィルターの底部によって放射される蛍光を測定することができるプレートリーダーを使って測定した。基礎培地に応答した遊走に伴う蛍光を使って、背景に対して補正した。データは、対照の蛍光のパーセントまたは倍数として表す。
【００８４】
図１Ａ−１Ｃは、短期薬剤曝露実験の結果を示す。図１Ａは、ヒト冠動脈内皮細胞の遊走抑制に対するｍＴＯＲ拮抗剤（ゾタロリムスおよびシロリムス）、デキサメタゾンおよびパクリタキセルの効果を示すグラフである。図１Ｂは、ヒト冠動脈平滑筋細胞の遊走抑制に対するｍＴＯＲ拮抗剤（ゾタロリムスおよびシロリムス）、デキサメタゾンおよびパクリタキセルの効果を示すグラフである。図１Ｃは、ヒト冠動脈平滑筋細胞およびヒト冠動脈内皮細胞に対するパクリタキセルのＩＣ５０を示すグラフである。細胞は、薬剤添加前に２４時間同調させた。細胞は、遊走誘発前には、前処理しなかった。５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）によって遊走を誘発し、細胞を、２２時間の遊走時間中、薬剤に曝露した。パクリタキセルは、ｈＣａＥＣの遊走を抑制し、２８．２±３．４ｎＭのＩＣ５０と９６．８±１．８％の最大効果を有する（図１Ｃ、平均値±標準誤差、ｎ＝３）。ｍＴＯＲ拮抗剤のシロリムスおよびゾタロリムスは、ｈＣａＥＣの遊走に無効であり、デキサメタゾンは、軽度の遊走促進効果を明らかに発揮した（図１Ａ）。ｈＣａＳＭＣでも、パクリタキセルは、有意な抗遊走効果を発揮し、８７．４±１８ｎＭのＩＣ５０と８６．９±２．９％の最大効果を有する（図１Ｂ）。パクリタキセルは、ｈＣａＳＭＣに比較してｈＣａＥＣにおいて、有意に高い抗遊走力を示す（図１Ｃ）。デキサメタゾンは、ＦＢＳに誘発されるｈＣａＳＭＣの遊走に対してわずかな抑制効果を有する（図１Ｂ）。したがって、パクリタキセルは、強力な抗遊走剤であり、デキサメタゾンは、ｈＣａＥＣの遊走を増強するが、ｈＣａＳＭＣでは、わずかに抑制する。
【００８５】
抗遊走活性を実証するには薬剤による前曝露が必要か否かを決定するために、同調後、ｈＣａＥＣを、ｈＣａＥＣ完全増殖培地中、薬剤で２４時間前処理した。ｈＣａＥＣの遊走を、完全増殖培地によって誘発し、薬剤のシロリムス、デキサメタゾン、ゾタロリムス、エベロリムスおよびパクリタキセルの効果を決定した。前処理後、細胞を数え、薬剤を含有する基礎培地中に再懸濁し、遊走を開始させた。図２のグラフは、薬剤前処理後、パクリタキセルだけが、完全増殖培地誘発ｈＣａＥＣ遊走を抑制することを示す。
【００８６】
完全増殖培地に含有されている増殖因子が、ｍＴＯＲ拮抗剤のシロリムスまたはゾタロリムスの遊走抑制不能に役割を果たすか否かを決定するために、追加実験を実施し、薬剤前処理が、追加増殖因子の不在下で５％ＦＢＳによって誘発される遊走に影響を与えるか否かを決定した。異なる濃度の薬剤を含有するｈＣａＥＣ増殖培地での前処理に応答した遊走を、薬剤のシロリムス、デキサメタゾン、ゾタロリムスおよびパクリタキセルについて決定した。ｈＣａＥＣにおけるこの効果を探究するために、細胞を同調させ、増殖培地中、薬剤で２４時間前処理し、薬剤含有基礎培地に再懸濁し、ＦＢＳに応答した遊走を測定した。結果を図３に示す。ｍＴＯＲ拮抗剤のシロリムスおよびゾタロリムスは、ｈＣａＥＣ遊走を有意に妨害しなかった。パクリタキセルは、遊走を有意に妨害する。
【００８７】
完全増殖培地に含有されている増殖因子が、ｍＴＯＲ拮抗剤の平滑筋細胞遊走を抑制することができないことにおいて役割を果たすか否かを決定するために、別の実験を実施した。異なる濃度の薬剤によるｈＣａＳＭＣの前処理に応答した遊走を、薬剤のデキサメタゾン、ゾタロリムス、ラパマイシンおよびパクリタキセルについて測定した。ｈＣａＳＭＣにおけるこの効果を検討するために、細胞を、同調させ、増殖培地中、薬剤で２４時間前処理し、薬剤含有基礎培地に再懸濁し、ＦＢＳ単独に応答した遊走を測定した。結果を図４に示す。ｈＣａＥＣにおけるｍＴＯＲ拮抗剤の効果と同様に、ｍＴＯＲ拮抗剤ラパマイシンおよびゾタロリムスは、ｈＣａＳＭＣ遊走を有意に妨害しなかった。デキサメタゾンは、ｈＣａＳＭＣにおいてわずかな抗遊走効果を発揮し、パクリタキセルは、遊走を有意に妨害する。
【００８８】
予想外にも、前記の結果は、ラパマイシンまたはゾタロリムスによるｈＣａＥＣまたはｈＣａＳＭＣの２４時間の前曝露とそれに続く２２から２４時間の追加薬剤曝露が、ＦＢＳまたは完全増殖培地によって誘発される遊走応答に対して効果を示さないことを示している。
【００８９】
ｍＴＯＲ剤シロリムスによる前曝露は、Ｓ１Ｐ−１に応答したラット大動脈平滑筋細胞の遊走、およびＰＤＧＦ−ＢＢに応答したブタ大動脈平滑筋を妨害することが報告されている。図５は、対実験で測定した、ＰＤＧＦ−ＢＢおよび血清誘発によるｈＣａＳＭＣの遊走に対する、デキサメタゾン、ゾタロリムスおよびパクリタキセルの２４時間前処理の効果を示す。ゾタロリムス、デキサメタゾンおよびパクリタキセルは、血清誘発遊走に当該薬剤が妨害できなかったこととは対照的に、すべて、単独の走化性物質ＰＤＧＦ−ＢＢ（２５ｎｇ／ｍｌ）に応答した遊走を抑制した。
【００９０】
ＩＩＩ．ウェスタンブロットアッセイ
ヒト冠動脈内皮細胞（ｈＣａＥＣ、Ｃａｍｂｒｅｘ）を１００ｍｍプラスチック皿に接種し（細胞１−３×１０５個／皿）、ｈＦＧＦ、ｈＥＧＦ、ＶＥＧＦ、Ｒ３−ＩＧＦ−１および５％ＦＢＳ（ＧＭ）を含有する完全増殖培地中、５％ＣＯ２下３７℃で温置した。当該皿が３０−４０％の集密度に達するまで、細胞を増殖させた。補充物無添加基礎培地（ＢＭ）中での２４時間温置によって、細胞を同調させた。同調後、ＢＭを被験化合物、ＤＭＳＯおよびＢＳＡを含有するＧＭに取り換えた（実験皿：３００ｎＭ被験化合物、０．１％ＢＳＡ含有ＧＭ；陽性対照：０．１％ＢＳＡおよび０．１％ＤＭＳＯ含有ＧＭ：陰性対照：０．１または０．５％ＦＢＳ、０．１％ＢＳＡおよび０．１％ＤＭＳＯ含有ＢＭ）。
【００９１】
細胞は、５％ＣＯ２下３７℃で２４または３６時間温置した。その後、前記皿は、５０−７０％の集密度に達した。皿を温ＰＢＳで洗浄され、過剰のＦＢＳが除去され、次いで氷上に静置された。４℃のＲＩＰＡ溶解緩衝液１５０−２００ｕｌ（５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、２ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭ  オルトバナジン酸ナトリウムおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を培養皿に添加することによって、全細胞溶解物を調製し、細胞スクレーパーでプレート表面を掻きとることによって、これを収集した。溶解物を、１ｍｌエッペンドルフ管に移し、氷上で、３０分間攪拌しながら温置した。次いで、サンプルを１００００ｒｐｍで８分間遠心分離した。上清を収集し、新しい試験管に移し、−７０℃で保存した。
【００９２】
サンプルの総タンパク質濃度を、標準品にウシγ−グロブリンを使って、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法変法（Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ  Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ａｓｓａｙ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により測定した。
【００９３】
充填サンプルの総体積は、１５ｕｌのサンプルバッファー（Ｌａｅｍｍｌｉ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）３回分を含有する４５ｕｌと、２５から５０ｕｇのタンパク質を含有するサンプル（３０ｕｌ）であった。サンプルは、同一タンパク質濃度まで希釈された。サンプルを混合し、９８℃で３−４分間沸騰させた。変性サンプルを、４−１５％グラジェントまたは１２％Ｒｅａｄｙ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．３）、１９２ｍＭグリシン、０．１％ＳＤＳの泳動バッファー中、１５０−１８０Ｖで６０−９０分間分離させ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．３）、１９２ｍＭグリシン、２０％メタノール中のＨｙｂｏｎｄ−ＥＣＬ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に１００Ｖで１時間移行させた。
【００９４】
膜へのタンパク質移行は、Ｐｏｎｃｅａｕ染色によって確認された。ＴＢＳ−Ｔ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で膜を５分間、３回洗浄することによって、Ｐｏｎｃｅａｕを除去した。この膜は、室温下、ＴＢＳ−Ｔ中脱脂粉乳の３％溶液（Ｂｌｏｔｔｉｎｇ−Ｇｒａｄｅ  Ｂｌｏｃｋｅｒ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって１時間遮断された。次いで、膜を、３％脱脂粉乳中ウサギ抗リン酸化−ｐ７０Ｓ６Ｋ（Ｔ３８９）モノクロナール抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）１：２００または１：４００とともに、＋４℃で一昼夜温置し、軽く振とうした。ヒト由来アクチンＣ末端に対するヤギポリクロナール抗体（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を１：８００の希釈率で使用した。
【００９５】
一次抗体との一昼夜温置後、抗体供給元の説明書に従って、膜をＴＢＳ−Ｔで３回、５分間洗浄し、続いて、３％脱脂粉乳中の適切な西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体とともに温置した。二次抗体との室温での１時間の温置後、膜を、再度、ＴＢＳ−Ｔを使って３回、５分間洗浄し、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使って展開した。多チャンネルスキャニング装置ＦＬＡ−５０００（ＦＵＪＩ  Ｆｉｌｍ）を使って、膜の画像を走査し、保存した。
【００９６】
血清誘発遊走にｐ７０Ｓ６Ｋの抑制が関与するか否かを決定するため、前記遊走実験の場合と同様の実験パラダイムを使って処理したｈＣａＥＣおよびｈＣａＳＭＣについてウェスタンブロット実験を実施した。細胞を基礎培地中で２４時間同調させ、続いて、増殖培地で３６時間薬剤処理した。ｈＣａＥＣにおけるｐ７０Ｓ６Ｋ  Ｔ３８９リン酸化に対する薬剤処理の効果を図６Ａ−６Ｂに示す。基礎培地中増殖因子およびＦＢＳの除去により、ｐ７０Ｓ６Ｋ  Ｔ３８９リン酸化の有意な抑制が生じることが明らかである。パクリタキセルも、Ｔ３８９リン酸化を低減させるが、この効果は、ｍＴＯＲ拮抗剤の効果よりも弱い。シロリムス、ゾタロリムスは、ともに、ｐ７０Ｓ６ＫのＴ３８９リン酸化を完全に妨害する。
【００９７】
図６は、ｈＣａＥＣにおけるｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化に対するｍＴＯＲ拮抗剤、デキサメタゾンおよびパクリタキセルの効果を示す。ｈＣａＥＣにおけるｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化を、デキサメタゾンはわずかに増強し、ｍＴＯＲ拮抗剤およびパクリタキセルは抑制する。薬剤（３００ｎＭ）または無血清培地（基礎対照）による処理後の細胞から調製されたｈＣａＥＣ溶解物からのウェスタンブロット濃度測定。図６Ｂに示すように、濃度測定分析結果は、ゾタロリムスの効果が、ｈＣａＥＣにおいて、増殖対照に比較すると、ｐ７０Ｓ６Ｋ  Ｔ３８９対アクチン比の有意な抑制を生じることを示している。図６Ａのウェスタンブロットは、３件のそれぞれの実験を例示するものである。
【００９８】
図７は、ｈＣａＳＭＣにおけるｐ７０Ｓ６Ｋ（Ｔ３８９）のリン酸化に対するｍＴＯＲ拮抗剤、デキサメタゾンおよびパクリタキセルの効果を示す。ｈＣａＳＭＣを、基礎培地中で２４時間同調させ、薬剤（３００ｎＭ）添加または無添加の増殖培地で３６時間温置した。膜をウサギ抗リン酸化−ｐ７０Ｓ６Ｋ（Ｔ３８９）モノクロナール抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）で探査した。図６−７は、薬剤が、両細胞型において、Ｔ３８９位でのｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化に対する同様の効果を生じることを示している。やはり、ｍＴＯＲ拮抗剤ゾタロリムスおよびシロリムスは、ｈＣａＳＭＣにおいて、ｐ７０Ｓ６Ｋ  Ｔ３８９のリン酸化を完全に抑制する。パクリタキセルは、ｍＴＯＲ剤と同程度に効果的ではないものの、ｐ７０Ｓ６Ｋを低減させ、デキサメタゾンは、無効である。ｍＴＯＲ拮抗剤は、Ｔ３８９でのｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化および活性化を完全に抑制できるにもかかわらず、血清に応答するいずれの細胞型の遊走も抑制しない。増殖因子とケモカインの混合物に誘発される遊走は、ｍＴＯＲ拮抗剤により抑制されないという結論に達し、ｐ７０Ｓ６Ｋに加えて、シグナリング経路が関与していることが示唆される。さらに、ｍＴＯＲ拮抗剤の抗遊走活性は、その抗再狭窄活性に寄与しないようである。逆に、パクリタキセルは、強力な抗遊走剤であり、この効果は、その抗再狭窄活性に寄与するようである。
【００９９】
したがって、ｈＣａＥＣなどの血管内皮細胞の遊走は、血管壁の治癒に寄与するので、これらの結果は、ｍＴＯＲ拮抗剤が、損傷を受けている血管壁の内皮細胞遊走および再内皮化を有意に妨害するとは予想されないことを示唆している。対照的に、これらのデータは、パクリタキセルが、内皮細胞遊走および再内皮化を強力に抑制し、おそらくは、治癒応答遅延を生じると予想されることを示している。
【０１００】
本発明は、本発明の精神または基本的特徴を逸脱せずに、他の特定の形態を実施できる。説明されている実施形態は、すべての点で例示にすぎず、制約を加えるものではないと見なすことが必要である。したがって本発明の範囲は、上記の説明よりもむしろ添付されている特許請求の範囲によって表される。特許請求の範囲の等価物の意味および範囲に入るすべての変更は、特許請求の範囲内に包含できる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【国際調査報告】
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