(57)【要約】  本発明は、難水溶性有効物質を製剤化するための両親媒性自己集合タンパク質の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
難水溶性有効物質を製剤化するための両親媒性自己集合タンパク質の使用。
【請求項２】
両親媒性自己集合タンパク質が微粒子形成性タンパク質である、請求項１記載の使用。
【請求項３】
両親媒性自己集合タンパク質が本質的に折りたたまれていないタンパク質である、請求項１記載の使用。
【請求項４】
両親媒性自己集合タンパク質がシルクタンパク質である、請求項１記載の使用。
【請求項５】
両親媒性自己集合タンパク質がクモシルクタンパク質である、請求項１記載の使用。
【請求項６】
両親媒性自己集合タンパク質がＣ１６クモシルクタンパク質である、請求項１記載の使用。
【請求項７】
使用する有効物質が医薬活性成分である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
使用する有効物質が作物保護活性成分である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
使用する有効物質が皮膚及び毛髪化粧品用活性成分である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
（ｉ）難水溶性有効物質を共通分散相において両親媒性自己集合タンパク質と混合し、
（ｉｉ）続いてタンパク質及び有効物質を多く含む相と、タンパク質及び有効物質をわずかに含む相への相分離を行う、
有効物質製剤の製造方法。
【請求項１１】
相分離（ｉｉ）をリオトロピック塩により実施する、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
実施温度が５〜５０℃である、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
タンパク質及び有効物質を多く含む相を硬化し、機械的に安定な有効物質含有タンパク質微粒子として分離し、そして適宜乾燥する、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１つの両親媒性自己集合タンパク質を用いて製剤化された難水溶性有効物質とさらなる化粧品用助剤を含む化粧品調製物。
【請求項１５】
少なくとも１つの両親媒性自己集合タンパク質を用いて製剤化された難水溶性有効物質とさらなる医薬品用助剤を含む医薬調製物。
【請求項１６】
少なくとも１つの両親媒性自己集合タンパク質を用いて製剤化された難水溶性有効物質とさらなる農薬用助剤を含む農薬調製物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、難水溶性有効物質を製剤化するための両親媒性自己集合タンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＥ１００５９２１３Ａ１は、タンパク質含有保護コロイドに活性物質を分散させ、保護コロイドでコーティングされた活性物質を凝集させて分離し、乾燥粉末に変換することによって、水不溶性又は難水溶性活性物質の固形調製物を製造する方法を記載している。好ましい保護コロイドとして、カゼイン、並びにウシゼラチン、ブタゼラチン及び魚類ゼラチンが記載されている。
【０００３】
ＤＥ１０２００４０５７５８７Ａ１は、難水溶性活性物質と単細胞生物由来のタンパク質材料の混合物の水性分散液、及びそれから製造される乾燥粉末を記載している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
水不溶性又は難水溶性活性物質及び有効物質を製剤化するための現在公知の方法は、特に化粧品及び医薬用途のために製剤化される活性物質において必要な要件、例えば熱安定性、酸化安定性、及び光安定性、機械的安定性、毒許容性などの全てを満たすものではない。
【０００５】
従って、難水溶性活性物質の製剤化を可能にし、先行技術で公知の方法よりも上記の規準を良好に満たす方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
第１の実施形態において、本発明は、難水溶性有効物質を製剤化するための両親媒性自己集合タンパク質の使用に関する。
【０００７】
両親媒性自己集合タンパク質は、難水溶性疎水性活性物質のための製剤助剤として好適である。これらの両親媒性分子の特性の結果、これらのタンパク質は水溶液中で疎水性活性物質を安定化することができる。それらの自己集合特性によって、これらのタンパク質は高分子量構造をとることができ、それゆえ疎水性活性物質を永久に封入する。
【０００８】
本発明はさらに、有効物質製剤の製造方法であって、
（ｉ）難水溶性有効物質を共通分散相において両親媒性自己集合タンパク質と混合し、
（ｉｉ）続いてタンパク質及び有効物質を多く含む相と、タンパク質及び有効物質をわずかに含む相への相分離を行う、
方法を提供する。
【０００９】
続いて、タンパク質及び有効物質を多く含む相を硬化し、機械的に安定な有効物質含有タンパク質微粒子として分離し、適宜乾燥する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
（ｉ）両親媒性自己集合タンパク質
両親媒性自己集合タンパク質は、アミノ酸、特に２０個の天然アミノ酸から構成されるポリペプチドからなる。アミノ酸はまた、修飾、例えばアセチル化、グリコシル化、ファルネシル化されていてもよい。
【００１１】
難水溶性有効物質の製剤化に好適な両親媒性自己集合タンパク質は、タンパク質微粒子を形成することができるタンパク質である。タンパク質微粒子は、平均粒径が０．１〜１００μｍ、特に０．５〜２０μｍ、好ましくは１〜５μｍ、特に好ましくは２〜４μｍの球状構造を有する。
【００１２】
タンパク質微粒子は、好ましくは以下に記載する方法によって製造することができる。
【００１３】
タンパク質を第１の溶媒に溶解する。ここで使用することができる溶媒は、例えば塩水溶液である。特に、２モル濃度を超える、特に４モル濃度を超える、特に好ましくは５モル濃度を超える濃度で、イオンがナトリウムイオン及び塩化物イオンよりも顕著なカオトロピック特性を有する高濃度塩溶液が好適である。そのような塩溶液の一例は、６Ｍチオシアン酸グアニジン又は９Ｍ臭化リチウムである。更に、タンパク質を溶解するために有機溶媒を使用することもできる。特に、フッ素化アルコール又は環状炭化水素又は有機酸が好適である。それらの例としては、ヘキサフルオロイソプロパノール、シクロヘキサン及びギ酸がある。タンパク質微粒子の製造は、記載されている溶媒中で行うことができる。あるいは、この溶媒を別の溶媒、例えば透析又は希釈による低濃度塩溶液（ｃ＜０．５Ｍ）で置き換えてもよい。溶解したタンパク質の最終濃度は、０．１〜１００ｍｇ／ｍｌとなるようにする。この方法を実施する温度は、通常０〜８０℃、好ましくは５〜５０℃、特に好ましくは１０〜４０℃である。
【００１４】
水溶液を用いる場合、これらは、バッファー、好ましくはｐＨが４〜１０、特に好ましくは５〜９、特に非常に好ましくは６〜８．５のバッファーと混合することもできる。
【００１５】
添加物を添加することにより、相分離を誘導する。ここで、溶媒及び添加物の混合物に乳化されたタンパク質を多く含む相が形成される。表面効果のため、乳化したタンパク質を多く含む液滴は円形となる。溶媒、添加物、及びタンパク質濃度の選択によって、タンパク質微粒子の平均粒径を０．１μｍ〜１００μｍの値に調整することができる。
【００１６】
使用することができる添加物は、一方では第１の溶媒と混和性であり、また一方ではタンパク質を多く含む相の形成を誘導する全ての物質である。微粒子形成を有機溶媒において行う場合、このために好適な有機物質は、溶媒よりも低い極性を有するもの、例えばトルエンである。水溶液中で、そのイオンがナトリウムイオン及び塩化物イオンよりも顕著な陽子特性（cosmotropic property）を有する塩（例えば硫酸アンモニウム、リン酸カリウム）を添加物として用いることができる。添加物の最終濃度は、添加物の性質に応じて、タンパク質溶液を基準に１重量％〜５０重量％とすべきである。
【００１７】
タンパク質を多く含む液滴は、円形を保持したまま硬化により固定する。固定は、ここでは強力な分子間相互作用の発生に基づく。相互作用の種類は、非共有結合（例えば分子間のβ折りたたみ葉状結晶の形成の結果としてのもの）であってもよいし、又は共有結合（例えば化学的架橋の結果としてのもの）であってもよい。硬化は、添加物の結果として、及び／又はさらなる好適な物質の添加の結果として行うことができる。硬化は、０〜８０℃、好ましくは５〜６０℃の温度で行うことができる。
【００１８】
このさらなる物質は、化学的架橋剤とすることができる。ここで、化学的架橋剤とは、少なくとも２つの化学的反応基をリンカーを介して結合する分子を意味するものと理解される。その例には、スルフヒドリル反応基（例：マレイミド、ピリジルジスルフィド、α−ハロアセチル、ビニルスルホン、スルファトアルキルスルホン、好ましくはスルファトエチルスルホン）、アミン反応基（例：スクシンイミジルエステル、カルボジイミド、ヒドロキシメチルホスフィン、イミドエステル、ＰＦＰエステル、アルデヒド、イソチオシアネートなど）、カルボキシ反応基（例：アミンなど）、ヒドロキシル反応基（例：イソシアネートなど）、非選択性基（例：アリールアジドなど）、及び光活性化基（例：ペルフルオロフェニルアジドなど）がある。これらの反応基は、タンパク質に存在するアミン、チオール、カルボキシル又はヒドロキシル基と共有結合を形成することができる。
【００１９】
安定化された微粒子は、好適な別の溶媒、例えば水で洗浄し、続いて当業者に公知の方法、例えば凍結乾燥、接触乾燥又は噴霧乾燥により乾燥する。粒子形成の成功は、走査電子顕微鏡法を用いて確認する。
【００２０】
タンパク質微粒子の作製に適当なものは、水溶液中で大部分が本質的に折りたたまれていない形態で存在するタンパク質である。この状態は、例えば、ＩＵｐｒｅｄプログラム（http://iupred.enzim.hu/index.html；The Pairwise Energy Content Estimated from Amino Acid Composition Discriminates between Folded and Intrinsically Unstructured Proteins；Zsuzsanna Dosztanyi, Veronika Csizmok, Peter Tompa and Istvan Simon; J. Mol. Biol. (2005) 347, 827-839）の基本となるアルゴリズムによって計算することができる。大部分が本質的に折りたたまれていない状態は、５０％を超えるアミノ酸残基についてこのアルゴリズムに従って計算した値が０．５を超える（予測タイプ：長い列（prediction type: long disorder））ときと推定される。
【００２１】
難水溶性有効物質を製剤化するための別の好適なタンパク質はシルクタンパク質である。以下の説明において、これらは、反復性の高いアミノ酸配列を含み、動物において液体形態で保存され、その分泌時にせん断又は紡績の結果として繊維を形成するタンパク質を意味するものと理解される（Craig, C.L. (1997) Evolution of arthropod silks. Annu. Rev. Entomol. 42: 231-67）。
【００２２】
難水溶性有効物質を製剤化するための特に好ましいタンパク質は、クモ類からその天然形態を単離することができるクモシルクタンパク質である。
【００２３】
特に非常に好適なタンパク質は、クモの「瓶状（Major Ampullate）」腺から単離することができるシルクタンパク質である。
【００２４】
好ましいシルクタンパク質は、ニワオニグモ（Araneus diadematus）の「瓶状」腺からのＡＤＦ３及びＡＤＦ４である（Guerette ら、Science 272, 5258:112-5 (1996)）。
【００２５】
同様に、難水溶性有効物質を製剤化するために好適なタンパク質は、天然シルクタンパク質から誘導され、遺伝子操作法を用いて原核又は真核生物発現系において異種産生された天然又は合成タンパク質である。発現原核生物の非限定的な例としては、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）などがある。発現真核生物の非限定的な例には、酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）など、糸状菌、例えばアスペルギルス・ニジェール（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、アクレモニウム・クリソゲナム（Acremonium chrysogenum）など、哺乳動物細胞、例えばＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞など、昆虫細胞、例えばＳｆ９細胞、ＭＥＬ細胞などがある。
【００２６】
難水溶性有効物質を製剤化するための特に好ましいものは、天然シルクタンパク質の反復単位に基づく合成タンパク質である。合成シルクタンパク質反復配列に加えて、１以上の天然シルクタンパク質非反復配列をさらに含んでもよい（Winkler and Kaplan, J Biotechnol 74:85-93 (2000)）。
【００２７】
難水溶性有効物質を製剤化するための合成シルクタンパク質の中で、天然クモシルクタンパク質の反復単位に基づく合成クモシルクタンパク質が好ましい。合成シルクタンパク質反復配列に加えて、１以上の天然シルクタンパク質非反復配列をさらに含んでもよい。
【００２８】
合成クモシルクタンパク質の中で、いわゆるＣ１６タンパク質が好ましいものとして挙げられる（Huemmerich ら、Biochemistry, 43(42):13604-13612 (2004)）。このタンパク質は配列番号１に示されるポリペプチド配列を有する。
【００２９】
配列番号１に示されるポリペプチド配列に加えて、この配列の機能的等価物、機能的誘導体及び塩もまた特に好ましい。
【００３０】
本発明において、「機能的等価物」とは、特に、上記のアミノ酸配列の少なくとも１つの配列位置において、具体的に記載されるアミノ酸以外のアミノ酸を有するが、それにもかかわらず難水溶性有効物質を封入する特性を有する変異体をも意味すると理解される。
【００３１】
したがって、「機能的等価物」には、１又はそれ以上のアミノ酸の付加、置換、欠失及び／又は逆位によって得られる変異体が含まれ、この変化は任意の配列位置に起こることが可能であるが、この変異体は本発明の特性プロフィールを有するものである。機能的等価性は、特に、変異体と非改変ポリペプチドとの反応パターンが質的に一致する場合にも存在する。
【００３２】
上記の意味では、「機能的等価物」はまた、記載したポリペプチドの「前駆体」、並びにポリペプチドの「機能的誘導体」及び「塩」でもある。
【００３３】
本明細書において「前駆体」とは、所望の生物学的活性の有無にかかわらず、そのポリペプチドの天然又は合成の前駆体である。
【００３４】
適切なアミノ酸置換の例を以下の表に示す：
【表１】
2009523767.tif 000002
【００３５】
「塩」という表現は、本発明のタンパク質分子内の、カルボキシル基の塩、そしてまたアミノ基の酸付加塩を意味すると理解される。カルボキシル基の塩は、それ自体が公知の方法によって調製することができ、例えばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄及び亜鉛塩などの無機塩；また、例えばアミン（トリエチルアミンなど）、アルギニン、リシン、ピペリジンなどの有機塩基を有する塩が挙げられる。酸付加塩、例えば、塩酸又は硫酸などの鉱酸との塩、並びに酢酸及びシュウ酸などの有機酸との塩なども同様に、本発明において提供される。
【００３６】
本発明のポリペプチドの「機能的誘導体」は同様に、公知の技術を用いて、機能性アミノ酸側鎖基又はそれらのＮ若しくはＣ末端で調製することができる。この種の誘導体としては、例えば、アンモニア又は一級若しくは二級アミンとの反応によって得られるカルボン酸基の脂肪族エステル、カルボン酸基のアミド；アシル基との反応によって調製される遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体；あるいはアシル基との反応によって調製される遊離ヒドロキシ基のＯ−アシル誘導体が含まれる。
【００３７】
（ｉｉ）難水溶性有効物質
以下本明細書において、難水溶性有効物質及び疎水性有効物質、並びに疎水性活性物質及びエフェクター分子という用語は同義に用いられる。以下本明細書において、難水溶性有効物質という用語は、その２０℃における水溶性が５重量％未満、好ましくは１重量％未満、特に好ましくは０．５重量％未満、特に非常に好ましくは０．１重量％未満である化合物を意味するために用いられる。
【００３８】
好適な難水溶性有効物質は、色素、特に下記の表に列挙されているものである：
特に有利な色素は、下記のリストに特定されている油溶性又は油分散性化合物である。カラーインデックス番号（ＣＩＮ）は、Rowe Colour Index, 3rd edition, Society of Dyers and Colourists, Bradford, England, 1971から採用する。
【表２】
2009523767.tif 000003
【００３９】
さらに好ましいエフェクター分子は、脂肪酸、特にアルキル分枝を有する飽和脂肪酸、特に好ましくは分枝状エイコサン酸、例えば１８−メチルエイコサン酸である。
【００４０】
さらに好ましいエフェクター分子は、カロテノイドである。本発明においては、カロテノイドは、下記の化合物及びそのエステル化又はグリコシル化誘導体を意味すると理解される。すなわち、個別又は混合物として、βカロテン、リコピン、ルテイン、アスタキサンチン、ゼアキサンチン、クリプトキサンチン、シトラナキサンチン、カンタキサンチン、ビキシン、β−アポ−４−カロテナール、β−アポ−８−カロテナール、β−アポ−８−カロテン酸エステル、ノイロスポレン、エチネノン、アドニルビン、ビオラキサンチン、トルレン、トルラロジンである。好ましく使用されるカロテノイドは、βカロテン、リコピン、ルテイン、アスタキサンチン、ゼアキサンチン、シトラナキサンチン及びカンタキサンチンである。
【００４１】
さらに好ましいエフェクター分子は、ビタミン、特にレチノイド及びそのエステルである。
【００４２】
本発明において、レチノイドとは、ビタミンＡアルコール（レチノール）及びその誘導体、例えばビタミンＡアルデヒド（レチナール）、ビタミンＡ酸（レチノイン酸）及びビタミンＡエステル（例えば酢酸レチニル、プロピオン酸レチニル及びパルミチン酸レチニル）などを意味する。本明細書においてレチノイン酸という用語には、オールトランスレチノイン酸、また１３−ｃｉｓ−レチノイン酸の両方が含まれる。レチノール及びレチナールという用語には、好ましくはオールトランス化合物が含まれる。本発明において製剤に使用される好ましいレチノイドはオールトランスレチノール（以下レチノールという）である。
【００４３】
別の好ましいエフェクター分子は、Ａ群、Ｃ群、Ｅ群及びＦ群からのビタミン、プロビタミン及びビタミン前駆体、特に、３，４−ジデヒドロレチノール、β−カロテン（ビタミンＡのプロビタミン）、アスコルビン酸のパルミチン酸エステル、トコフェロール、特にα−トコフェロール及びそのエステル（例えば酢酸エステル、ニコチン酸エステル、リン酸エステル及びコハク酸エステル）、またビタミンＦであり、これは必須脂肪酸、特にリノール酸、リノレン酸及びアラキドン酸を含むと理解される。
【００４４】
別の好ましいエフェクター分子は、ビタミンＥ群からの親油性の油溶性抗酸化剤、すなわちトコフェロール及びその誘導体、没食子酸エステル、フラボノイド及びカロテノイド、並びにブチルヒドロキシトルエン／アニソールである。
【００４５】
別の好ましいエフェクター分子は、リポ酸及び好適な誘導体（塩、エステル、糖、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ペプチド及び脂質）である。
【００４６】
別の好ましいエフェクター分子は、ＵＶ光保護フィルターである。これらは、紫外線を吸収し、吸収したエネルギーをより長い波長の放射線、例えば、熱の形で再び放出することのできる有機物質を意味すると理解される。
【００４７】
使用することができる油溶性ＵＶ−Ｂフィルターは、例えば、下記の物質である：
３−ベンジリデンカンフル及びその誘導体、例えば３−（４−メチルベンジリデン）カンフルなど；
４−アミノ安息香酸誘導体、好ましくは４−（ジメチルアミノ）安息香酸２−エチルヘキシル、４−（ジメチルアミノ）安息香酸２−オクチル及び４−（ジメチルアミノ）安息香酸アミル；
ケイヒ酸のエステル、好ましくは４−メトキシケイヒ酸２−エチルヘキシル、４−メトキシケイヒ酸プロピル、４−メトキシケイヒ酸イソアミル、４−メトキシケイヒ酸イソペンチル、２−シアノ−３−フェニルケイヒ酸２−エチルヘキシル（オクトクリレン）；
サリチル酸のエステル、好ましくはサリチル酸２−エチルヘキシル、サリチル酸４−イソプロピルベンジル、サリチル酸ホモメンチル；
ベンゾフェノンの誘導体、好ましくは２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−メトキシ−４’−メチルベンゾフェノン、２，２’−ジヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン；
ベンザルマロン酸のエステル、好ましくは４−メトキシベンズマロン酸ジ−２−エチルヘキシル；
トリアジン誘導体、例えば２，４，６−トリアニリノ−（ｐ−カルボ−２’−エチル−１’−ヘキシルオキシ）−１，３，５−トリアジン（オクチルトリアゾン）及びジオクチルブタミドトリアゾン（Uvasorb(登録商標) HEB）など；
プロパン−１，３−ジオン、例えば、１−（４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）−３−（４’−メトキシフェニル）プロパン−１，３−ジオンなど
である。
【００４８】
特に、ケイヒ酸のエステル、好ましくは４−メトキシケイヒ酸２−エチルヘキシル、４−メトキシケイヒ酸イソペンチル、２−シアノ−３−フェニルケイヒ酸２−エチルヘキシル（オクトクリレン）の使用が好ましい。
【００４９】
さらに、ベンゾフェノンの誘導体、特に２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−メトキシ−４’−メチルベンゾフェノン、２，２’−ジヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノンの使用、及びプロパン−１，３−ジオン、例えば、１−（４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）−３−（４’−メトキシフェニル）プロパン−１，３−ジオンなどの使用が好ましい。
【００５０】
意図する典型的なＵＶ−Ａフィルターは、
ベンゾイルメタンの誘導体、例えば、１−（４’−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）−３−（４’−メトキシフェニル）プロパン−１，３−ジオン、４−ｔｅｒｔ−ブチル−４’−メトキシジベンゾイルメタン又は１−フェニル−３−（４’−イソプロピルフェニル）プロパン−１，３−ジオンなど、
ベンゾフェノンのアミノヒドロキシ置換誘導体、例えば、ｎ−ヘキシル安息香酸Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノヒドロキシベンゾイルなどである。
【００５１】
ＵＶ−Ａ及びＵＶ−Ｂフィルターは、当然ながら混合して使用することもできる。
【００５２】
好適なＵＶフィルター物質を、下記の表に列挙する：
【表３】
2009523767.tif 000004
【００５３】
上記の２群の主要な光保護物質に加えて、紫外線が皮膚内に透過すると誘発される光化学反応の連鎖を中断する抗酸化タイプの二次的な光保護剤を使用することも可能である。その典型例は、トコフェロール（ビタミンＥ）及び油溶性アスコルビン酸誘導体（ビタミンＣ）である。
【００５４】
本発明においては、上記化合物の好適な誘導体（塩、エステル、糖、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ペプチド及び脂質）をエフェクター分子として使用することができる。
【００５５】
さらに、いわゆる過酸化物分解剤、すなわち過酸化物、特に好ましくは過酸化脂質を分解することのできる化合物が好ましい。これらには、例えば、５−ピリミジノール誘導体及び３−ピリジノール誘導体、並びにプロブコールなどの有機物質が含まれると理解される。
【００５６】
さらに、上記の過酸化物分解剤は、好ましくは特許出願ＷＯ／０２０７６９８及びＷＯ／０３０５９３１２（この内容はその全体が本明細書で参照される）に記載されている物質、好ましくはこれらに記載されている、フリーラジカル変換産物が形成されることなく過酸化物又はヒドロペルオキシドを対応するアルコールに還元することができるホウ素含有又は窒素含有化合物である。立体障害アミンもまたこの目的で使用することができる。
【００５７】
さらなる群は、紫外線によってダメージを受けた皮膚に対する抗炎症作用を有する抗刺激剤である。このような物質は、例えば、ビサボロール、フィトール及びフィタントリオールである。
【００５８】
難水溶性エフェクター物質のさらなる群は、作物保護に用いることができる活性物質、例えば除草剤、殺虫剤及び殺菌剤である。
【００５９】
さらに、難水溶性有効物質としては、医薬用途のための活性物質、特に経口投与用の活性物質が好適である。本発明に係る方法は、原理的には、医学的用途に関係のない多数の活性物質に対して用いることができる。
【００６０】
好適な難水溶性医薬活性物質の例を以下の表に示す。
【表４】
2009523767.tif 000005
【００６１】
（ｉｉｉ）疎水性活性物質の製剤化
難水溶性活性物質の製剤は、両親媒性自己集合タンパク質を用いて種々の方法で調製することができる。難水溶性の疎水性活性物質は、タンパク質微粒子に封入されるか、又は例えば微粒化バッチにおいて達成することのできるタンパク質皮膜によってコロイド分散状態で安定化される。疎水性活性物質の製剤化は、微粒子への封入によって行うことができる。この方法は、２つのステップを含む。最初のステップにおいて、疎水性活性物質及び両親媒性自己集合タンパク質を共通相に溶解する。このために、該活性物質及び該タンパク質は溶媒又は溶媒混合物に直接溶解することができる。あるいは、該活性物質及び該タンパク質は最初に異なる溶媒に溶解することができ、その後、それらの溶液を一緒に混合し、それによって共通相を生成する。共通相は、分子分散相又はコロイド分散相のいずれでもよい。
【００６２】
疎水性活性物質及びタンパク質の異なる溶媒への溶解と、続く２つの溶液の混合は、疎水性活性物質及びタンパク質が共通の溶媒又は溶媒混合物に溶解することができない場合に特に有利である。このようにして、この方法によって、好適な溶媒に溶解した活性物質を、活性物質が不溶性の別の溶媒で希釈することによって、疎水性活性物質のコロイド分散溶液を調製することも可能である。
【００６３】
タンパク質は一般的に容易に水に溶解するため、水溶液、並びに水と水混和性有機溶媒の混合物を用いて実施するのが好ましい。好適な水混和性の溶媒の例は、アルコール、例えばメタノール、エタノール及びイソプロパノールなど、フッ素化アルコール、例えばヘキサフルオロイソプロパノール及びトリフルオロエタノールなど、アルカノン、例えばアセトンなど、またスルホキシド、例えばジメチルスルホキシドなど、又はホルムアミド、例えばジメチルホルムアミドなど、あるいは他の有機溶媒、例えばテトラヒドロフラン及びアセトニトリル又はＮ−メチル−２−ピロリドンなどである。一般的には、タンパク質を溶解することができる全ての溶媒及び溶媒混合物を用いて実施することが可能である。好適な溶媒の例は、フッ素化アルコール、例えばヘキサフルオロイソプロパノール又はトリフルオロエタノールなど、イオン液体、例えばＥＭＩＭアセテートなど、カオトロピック塩の水溶液、例えば、尿素、塩酸グアニジン及びチオシアン酸グアニジンなど、あるいは有機酸、例えば、ギ酸など、並びにこれらの溶媒と他の有機溶媒との混合物である。タンパク質のための溶媒と混合することのできる溶媒の例は、特に、アルコール、例えばメタノール、エタノール及びイソプロパノールなど、アルカノン、例えばアセトンなど、スルホキシド、例えばジメチルスルホキシドなど、ホルムアミド、例えばジメチルホルムアミドなど、ハロアルカン、例えば塩化メチレンなど、また、例えばテトラヒドロフランなどの別の有機溶媒である。
【００６４】
微粒子における疎水性活性物質の製剤化の第２ステップは、タンパク質及び活性物質をわずかに含む相と、タンパク質及び活性物質を多く含む相への相分離と、それに続く硬化である。ここで、疎水性活性物質は、タンパク質の凝集形態に組み込まれる。相分離過程の表面効果のために、好ましくは円形タンパク質構造、いわゆる微粒子が形成される。
【００６５】
相分離は、好ましくはリオトロピック塩の水溶液をタンパク質と疎水性活性物質の混合物に添加することにより誘導する。好適なリオトロピック塩は、ホフマイスター系列で表される。特に硫酸アンモニウム及びリン酸カリウムが好適である。これらの溶液の添加は、単純な混合、滴加、又は透析によって行うことができる。
【００６６】
疎水性活性物質とタンパク質との相互作用は、本質的にそれらの疎水性特性に基づいているが、水素結合、イオン相互作用及びファンデルワールス相互作用もまた関与する可能性がある。疎水性活性物質は、その表面に結合して、微粒子に組み込まれる又は微粒子内で会合するのいずれでもよい。疎水性活性物質の微粒子への結合は、溶解した活性物質の集合混合物の減少によって決定することができる。活性物質の濃度は、その特性の定量的分析によって測定することができる。従って、光吸収性活性物質の結合は、例えば光度法により分析することができる。このために、例えば、製剤混合物における微粒子の着色又はタンパク質及び活性物質をわずかに含む相の脱色を、着色活性物質の吸収を測定することによって決定する。これらの方法を用いて、微粒子中の活性物質含有量がどの程度であるかを決定することも可能である。
【００６７】
微粒子からの活性物質の放出は、微粒子のプロテアーゼによる分解の結果として、又は好適な溶媒による微粒子の溶解によって、好適な溶媒中の脱離によって行うことができる。脱離に好適な溶媒は、活性物質が溶解することのできる全ての溶媒又は溶媒混合物である。好適なプロテアーゼを、工業グレードのプロテアーゼとしてタンパク質微粒子の懸濁液に標的化して添加してもよいし、あるいは、例えば皮膚プロテアーゼ、消化管プロテアーゼ（例：胃若しくは腸プロテアーゼ）又は微生物から放出されるプロテアーゼなどのように、エフェクター分子の所望の活性部位で自然に生じるものでもよい。微粒子を溶解することのできる溶媒は、例えば、フッ素化アルコール、例えばヘキサフルオロイソプロパノール又はトリフルオロエタノールなど、イオン液体、例えば、ＥＭＩＭアセテートなど、カオトロピック塩の水溶液、例えば尿素、塩酸グアニジン及びチオシアン酸グアニジンなど、あるいは有機酸、例えばギ酸など、並びにこれらの溶媒と他の有機溶媒との混合物である。エフェクター分子の放出の速度及び反応速度論は、例えば活性物質の電荷密度、微粒子のサイズ、及び／又は容量と表面面積の比率によって制御することができる。
【００６８】
難水溶性の疎水性活性物質の製剤化はまた、コロイド分散溶液の安定化、例えば微粒化（micronization）によって行うことができる。
【００６９】
本発明はさらに、医薬品、化粧品、作物保護製品、食品及び動物飼料における活性物質の保管、輸送又は放出のための、記載した両親媒性自己集合タンパク質を用いて作製されたタンパク質微粒子、又は例えば微粒化により作製されたコロイド分散タンパク質製剤の使用を提供する。これに関して、タンパク質微粒子はさらに、例えば、環境的影響、例えば酸化過程若しくは紫外線などに対する、又は製品の他の構成要素との反応による分解に対する、又は特定のプロテアーゼによる分解に対する、封入された活性物質の保護の役割を果たす。活性物質は、脱離、タンパク質分解、標的化放出若しくは徐放、又はこれらの機構の組合せによってタンパク質微粒子又はコロイド分散タンパク質製剤から放出される。
【００７０】
経口投与用医薬品におけるタンパク質微粒子及びそれを用いて製剤化された活性物質が好ましい。これに関して、有効成分の安定性は胃の通過時に増大しうる。これは、タンパク質微粒子のタンパク質分解が胃の一般的な条件下で起こらないためである。したがって経口投与された活性物質含有微粒子からの活性物質の放出は、腸内で起こる。タンパク質微粒子及びこれに組み込まれた医薬活性物質の局所投与もまた可能である。タンパク質微粒子の分解及びそれによって生じる活性物質の放出は、皮膚上及び／又は皮膚上層部に存在するプロテアーゼによって制御される。
【００７１】
医薬品、食品及び動物飼料、並びに作物保護製品において、記載した両親媒性自己集合タンパク質を用いた活性物質の製剤化は、さらに活性物質のバイオアベイラビリティの増大をもたらす。記載した両親媒性自己集合タンパク質を用いたタンパク質微粒子における医薬活性物質の封入、又は活性物質のコロイド分散製剤はまた、活性物質について血液脳関門を克服する又は腸粘膜による吸収を改善することができる。作物保護製品は、タンパク質微粒子への被包（encapsulation）及び／又は組込み（embedding）によって洗浄プロセスから防御される。例えば両親媒性自己集合タンパク質を用いた微粒化混合物による、タンパク質微粒子への封入又はコロイド分散製剤によって、良好に吸収される及び／又は良好なバイオアベイラビリティを有する特定の活性物質の粒子サイズを達成することができる。
【００７２】
記載した両親媒性自己集合タンパク質のアミノ酸配列を変更することにより及び／又は別のタンパク質若しくはペプチド配列との融合によって、特定の表面、例えば皮膚、毛髪、葉、根、又は腸表面若しくは血管表面を特異的に認識する構造、並びに／あるいはこれらの表面又は存在する受容体によって認識され結合される構造を生成することも可能である。
【００７３】
結果として、記載した両親媒性自己集合タンパク質内に製剤化された活性物質を、所望の活性部位により効果的にもたらすこと、及び／又は活性物質の吸収を改善することも可能である。医薬活性物質又は食品及び動物飼料中の活性物質のバイオアベイラビリティは、腸管内の細胞（例えば粘膜細胞）の特定の表面マーカー（例えば受容体）に結合するタンパク質と融合して及び／又は会合した形態でさらに存在するタンパク質微粒子内に封入された場合に増大する可能性がある。そのうなタンパク質は、例えば、ロイテリ菌（Lactobacillus reuteri）由来のＭａｐＡタンパク質若しくはコラーゲン結合タンパク質ＣｎＢＰ（Miyoshiら、2006, Biosci. Biotechnol. Biochem. 70:1622-1628）、又は他の微生物、主に天然の胃腸管微生物叢に由来する機能的に同等なタンパク質である。記載の結合タンパク質は、微生物が細胞表面に付着するのを媒介する。この結合タンパク質が記載する両親媒性自己集合タンパク質に結合及び／又は融合する結果として、これから得られる活性物質含有タンパク質微粒子は、対応の吸収部位により標的化させる及び／又はこれらの部位により長く残留するようにして、その結果、活性物質の放出及び吸収が延長され改善されることになる。
【００７４】
さらに、活性物質製剤化のために記載の両親媒性自己集合タンパク質のアミノ酸配列を変更することにより及び／又は他のタンパク質若しくはペプチド配列との融合により、活性物質を所望の活性部位に標的化することが可能であり、それにより例えば特異性を高め、活性物質消費若しくは活性物質用量を低くし、又は効果を迅速若しくは強力にすることを達成することができる。
【００７５】
実験の項
【実施例１】
【００７６】
ＴＨＦ及びＴＨＦ／イソプロパノールからのβ−カロテンの微粒子への封入と、タンパク質分解よる放出
β−カロテン溶液の調製
８０ｍｇのβ−カロテン及び１６ｍｇのトコフェロールを１０ｇのＴＨＦに溶解することによりストック溶液を調製した。次に、このストック溶液から、表１．１に示す希釈によって溶液１〜４を調製した。
【００７７】
溶液は全て使用する直前に調製し、希釈直後にさらなる処理を行った。
【００７８】
2009523767.tif 000006
【００７９】
リン酸カリウムの直接添加によるβ−カロテンの微粒子への封入
β−カロテンをＣ１６タンパク質微粒子に封入するために、Ｃ１６タンパク質とβ−カロテンの共通相を最初に調製した。このために、各場合に５ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８）中１０ｍｇ／ｍｌのＣ１６タンパク質の溶液５００μｌを５μｌ又は１００μｌのβ−カロテン溶液と混合した（溶液１〜４）（表１．２）。ＴＨＦ／イソプロパノールからのβ−カロテンを含むバッチ（バッチ１〜４）の場合にはオレンジ色分散液が得られ、ＴＨＦからのβ−カロテンを含むバッチ（バッチ５〜８）の場合には黄色分散液が得られた。
【００８０】
相分離によってＣ１６タンパク質微粒子形成を誘導するために、１０００μｌの１Ｍリン酸カリウム溶液（ｐＨ８．０）をバッチのそれぞれに添加した（表１．２）。室温で１５分間インキュベートした後、バッチを遠心分離により、β−カロテンを含有するＣ１６タンパク質微粒子の顕著に着色したペレットと無色上清とに分離させた。したがって、使用したβ−カロテンは相分離の間に完全に微粒子へと移動した。無色上清を分離して除いた。続いてペレットを蒸留水で２回洗浄し、再度分散させた。
【００８１】
Ｃ１６タンパク質微粒子を再度分散させた後、ＴＨＦ／イソプロパノールからのβ−カロテン溶液を含有するバッチ（バッチ１〜４）の場合にはオレンジ色分散液が得られ、ＴＨＦからのβ−カロテン溶液を含有するバッチ（バッチ５〜８）の場合には黄色分散液が得られた。
【００８２】
2009523767.tif 000007
【００８３】
リン酸カリウムに対する透析によるＣ１６タンパク質微粒子へのβ−カロテンの封入
β−カロテン及びＣ１６タンパク質の共通相へのリン酸カリウムの直接添加とは別に、１Ｍリン酸カリウムに対する透析によっても相分離を行うことができる。透析を透析管で実施したため、リン酸カリウム溶液の直接添加と比べて１０倍のバッチ容量を各場合にピペットで添加した（表１．３）。
【００８４】
2009523767.tif 000008
【００８５】
このために、Ｃ１６溶液（５ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．０）中１０ｍｇ／ｍｌ）を特定のβ−カロテン溶液と混合し、その直後に混合物を透析管に移して１Ｍリン酸カリウム溶液に対して透析を行った。一晩透析後、微粒子分散液を管から取り出し、遠心分離によって無色上清と着色ペレットに分離させた。Ｃ１６タンパク質及びβ−カロテンの共通相へのリン酸カリウムの直接添加の場合と同様に、β−カロテンはタンパク質微粒子の形態でＣ１６タンパク質と定量的に結合した。無色上清を分離して除いた。続いてペレットを蒸留水で２回洗浄し、再度分散させた。
【００８６】
タンパク質微粒子を再度分散させた後、ＴＨＦ／イソプロパノールからのβ−カロテン溶液を含有するバッチ（バッチＤ１〜Ｄ４）の場合にはオレンジ色分散液が得られ、ＴＨＦからのβ−カロテン溶液を含有するバッチ（バッチＤ５〜Ｄ８）の場合には黄色分散液が得られた（図１）。
【００８７】
図１：ＴＨＦ及びＴＨＦ／イソプロパノール水溶液からのβ−カロテンを含むＣ１６タンパク質微粒子の分散液。左から右へ：バッチＤ１〜Ｄ４（ＴＨＦ／イソプロパノール）及びバッチＤ５〜Ｄ８（ＴＨＦ）。Ｃ１６タンパク質微粒子におけるβ−カロテンの含有量は、Ｃ１６タンパク質微粒子の重量を基準にして重量％で表す。
【００８８】
ＴＨＦ及びＴＨＦ／イソプロパノールからのβ−カロテンを含有するＣ１６タンパク質微粒子の異なる着色を再現するために、バッチＤ４及びＤ５を大規模で反復した（表１．４）。再びＴＨＦからのβ−カロテンの場合には黄色Ｃ１６タンパク質微粒子が得られ、ＴＨＦ／イソプロパノールからのβ−カロテンの場合にはオレンジ色Ｃ１６タンパク質微粒子が得られた（図２）。
【００８９】
2009523767.tif 000009
【００９０】
図１：ＴＨＦ及びＴＨＦ／イソプロパノール水溶液からのβ−カロテンを含むＣ１６タンパク質微粒子の分散液。左から右へ：バッチＤ１〜Ｄ４（ＴＨＦ／イソプロパノール）及びバッチＤ５〜Ｄ８（ＴＨＦ）。Ｃ１６タンパク質微粒子におけるβ−カロテンの含有量は、Ｃ１６タンパク質微粒子の重量を基準にして重量％で表す。
【００９１】
ＴＨＦ及びＴＨＦ／イソプロパノールからのβ−カロテンを含有するＣ１６タンパク質微粒子の異なる着色を再現するために、バッチＤ４及びＤ５を大規模で反復した（表１．４）。再びＴＨＦからのβ−カロテンの場合には黄色Ｃ１６タンパク質微粒子が得られ、ＴＨＦ／イソプロパノールからのβ−カロテンの場合にはオレンジ色Ｃ１６タンパク質微粒子が得られた（図２）。
【００９２】
2009523767.tif 000010
【００９３】
図２：ＴＨＦ／イソプロパノール（０．９重量％のβ−カロテン、バッチＧ１、左）及びＴＨＦ（０．３重量％のβ−カロテン、バッチＧ２、右）からのβ−カロテンを含むＣ１６タンパク質微粒子の分散液。
【００９４】
プロテイナーゼＫを用いた消化によるＣ１６タンパク質微粒子からのβ−カロテンの放出
Ｃ１６タンパク質微粒子におけるβ−カロテンをタンパク質分解によって放出することができることを示すために、２００μｌの微粒子分散水溶液Ｇ１及びＧ２を５００μｌの５Ｍリン酸カリウム（ｐＨ８．０）と混合した。続いて５μｌのプロテイナーゼＫ（Ｒｏｃｈｅ，１９．４５ｍｇ／ｍｌ）を添加し、混合物を室温で一晩インキュベートした。各場合に、プロテイナーゼＫを用いないＣ１６タンパク質微粒子分散液の混合物を対照として用いた。一晩インキュベートした後、混合物を遠心した。
【００９５】
プロテアーゼの存在下において、Ｃ１６タンパク質微粒子を消化し、β−カロテンを放出させた。遠心分離後、ペレットは見えなくなった。上清は着色度が高かった。プロテアーゼがない場合には、完全なＣ１６タンパク質微粒子を遠心分離することができた。顕著な着色ペレットが観察された。上清は無色だった。
【００９６】
図３：プロテイナーゼＫによるＣ１６タンパク質微粒子分散液の消化。Ａ）プロテアーゼの非存在下における、ＴＨＦ／イソプロパノールからのβ−カロテンを含有するＣ１６タンパク質微粒子（０．９重量％のβ−カロテン、バッチＧ１）；Ｂ）プロテアーゼの存在下における、ＴＨＦ／イソプロパノールからのβ−カロテンを含むＣ１６タンパク質微粒子（０．９重量％のβ−カロテン、バッチＧ１）；Ｃ）プロテアーゼの非存在下における、ＴＨＦからのβ−カロテンを含有するＣ１６タンパク質微粒子（０．３重量％のβ−カロテン、バッチＧ２）；Ｄ）プロテアーゼの存在下における、ＴＨＦからのβ−カロテンを含有するＣ１６タンパク質微粒子（０．３重量％のβ−カロテン、バッチＧ２）。
【実施例２】
【００９７】
β−カロテンを含む微粒子の安定性と、タンパク質分解による微粒子からのβ−カロテンの放出
β−カロテンを含有するＣ１６タンパク質微粒子を、ヒトの胃及び／又は腸において活性を有する種々のプロテアーゼで処理することによって、医薬有効物質の貯蔵、輸送及び／又は送達系としてのタンパク質微粒子の安定性を実証することを目的とした。
【００９８】
β−カロテンを含有するＣ１６タンパク質微粒子を調製するため、８０ｍｇのβ−カロテン及び１６ｍｇのビタミンＥを１０ｍｌのＴＨＦに溶解し、続いて９０ｍｌのイソプロパノールで希釈した。この溶液の一部を、次に１０倍量のＣ１６タンパク質溶液（１０ｍｇ／ｍｌ、５ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８）中）と混合した。続いて、この混合物を２倍量の１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８）と混合した。得られたβ−カロテン含有Ｃ１６タンパク質微粒子を遠心し、水で沈殿物を洗うことにより過剰の遊離β−カロテンを除いた。
【００９９】
２０ｍｇのβ−カロテン含有Ｃ１６タンパク質微粒子を、２ｍｌの合成胃液（６．４ｍｇのペプシン、８０ｍＭ  ＨＣｌ、４ｍｇのＮａＣｌ）又は２ｍｌの合成腸液Ｉ（２０ｍｇのパンクレアチン、０．４５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、０．９ｍＭタウロコール酸ナトリウム）若しくは２ｍｌの合成腸液ＩＩ（２０ｍｇのパンクレアチン、０．４５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、６ｍＭタウロコール酸ナトリウム）に再懸濁し、振とう（１４０ｒｐｍ）しながら０、１、２、６、２４及び４８時間にわたり３７℃でインキュベートした。タンパク質分解により分解されなかったＣ１６タンパク質微粒子は、６００ｎｍにおける懸濁液の散乱により測定した（図４）。続いて完全なＣ１６タンパク質微粒子をろ別し、上清におけるβ−カロテン含有量を４４５ｎｍにおける吸収の測定によって分析した（図５）。
【０１００】
ペプシン含有合成胃液で処理した結果、４８時間後でさえも、Ｃ１６タンパク質微粒子はほとんど分解されず（図４）、従ってβ−カロテンがほとんど放出されなかった（図５）。一方、パンクレアチン含有合成腸液Ｉ及びＩＩで処理した場合には、Ｃ１６タンパク質微粒子はわずか６時間以内に可視的に完全に分解され（図４）、存在するβ−カロテンが放出された（図５）。よって、Ｃ１６タンパク質微粒子は、有意に分解されることなくヒトの胃の通過に耐え、腸管でのタンパク質分解の結果として結合したエフェクター物質を放出する。
【０１０１】
図４：６００ｎｍにおける吸収の光度測定による完全なＣ１６タンパク質微粒子の測定
図５：４４５ｎｍにおける吸収の光度測定によるＣ１６タンパク質微粒子から放出されたβ−カロテンの測定。
【実施例３】
【０１０２】
Ｃ１６クモシルクタンパク質による微粒化
２ｇの結晶質リコピン及び０．４ｇのα−トコフェロールを５００ｇのＴＨＦに溶解した。活性物質溶液を、流速２５．４ｇ／分で５ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８）中の０．２ｇ／ｌのＣ１６タンパク質からなる水溶液と、室温でかつ流速２．４２ｇ／分で連続的に混合した。ＴＨＦ／水混合物での混合時に形成される活性物質粒子は粒径１０３ｎｍを有していた。２時間後、未処理サンプル（図６Ａ）と比べてＣ１６タンパク質で処理したサンプル（図６Ｂ）の透明な分散液の安定化が観察された。その数日後でさえも、Ｃ１６タンパク質を含むリコピン分散液は安定のようであったが、未処理リコピン分散液は大部分が凝集した（図７）。Ｃ１６タンパク質で安定化されたリコピン分散液の一部は、濃縮して０．２８％の固形含量となった。この状態で、乾燥したリコピンはほどんど再分散することができなかった。別法において、Ｃ１６タンパク質で安定化されたリコピン分散液を３３０ｍＭリン酸カリウム（混合物中の最終濃度）で処理し、乾燥した。得られたリコピン粉末は容易に再分散可能であった。
【０１０３】
図６：Ｃ１６クモシルクタンパク質を用いたリコピンの製剤化。未処理リコピンサンプル（Ａ）及びＣ１６タンパク質で処理したリコピンサンプル（Ｂ）の、混合直後（黒色グラフ）及び混合の２時間後（赤色グラフ）の吸収。
【０１０４】
図７：Ｃ１６クモシルクタンパク質を用いたリコピンの製剤化。混合の約３０日後における未処理リコピン分散液（左）とＣ１６タンパク質で安定化されたリコピン分散液（右）の比較。
【実施例４】
【０１０５】
イソプロパノールからのメタザクロルの微粒子への封入と、タンパク質分解による放出
難水溶性植物活性物質を両親媒性自己集合タンパク質から調製されたタンパク質微粒子に封入し、またそれから放出することができる。このため、非限定的な例として除草剤活性物質メタザクロルを選択した。
【０１０６】
５００μｌの１０ｍｇ／ｍｌ  Ｃ１６タンパク質含有リン酸カリウム溶液（５ｍＭ、ｐＨ８．０）を１００μｌのメタザクロル溶液（イソプロパノール中５０ｍｇ／ｍｌ）と混合した。Ｃ１６タンパク質微粒子形成を、１ｍｌの１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）を添加することにより誘導した。この混合物を室温で１時間インキュベートし、続いて２００００×ｇで１０分間遠心した。ペレットを５ｍｌの再蒸留Ｈ２Ｏで２回洗浄し、次に凍結乾燥した。Ｃ１６タンパク質を含まない同じ混合物を対照として実施した。
【０１０７】
リン酸カリウムによる沈殿後、Ｃ１６タンパク質及びメタザクロルを含む混合物中で微粒子が形成された。これらは、Ｃ１６タンパク質を含むが活性物質を含まない標準混合物と形態学的に同じであった。Ｃ１６メタザクロル混合物においては、メタザクロル結晶は可視できなかった。一方、Ｃ１６タンパク質を含まないメタザクロルの混合物においては、活性物質の大きな結晶が形成された。これは、Ｃ１６タンパク質が、水性リン酸カリウムバッファーの存在下におけるメタザクロルの結晶化に対して有意な阻害作用を有していることを実証している。
【０１０８】
Ｃ１６タンパク質沈殿又はＣ１６微粒子形成後の上清におけるメタザクロル濃度の測定によって、約９０％の活性物質がタンパク質微粒子中の封入形態で及び／又はこれらと会合した形態で存在することが明らかとなった。それぞれの場合に、約２０％の活性物質が洗浄上清中に存在した。
【０１０９】
凍結乾燥したメタザクロル含有Ｃ１６タンパク質微粒子を、３７℃にて１時間かけて、１ｍｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー、０．１％ＳＤＳ、１００μｇのプロテイナーゼＫ中でタンパク質分解により消化した。１０分間の遠心（２００００×ｇ）後に残存する混合物からの活性物質結晶を５００μｌのイソプロパノールに溶解した。使用したメタザクロルの約１１％の量がプロテアーゼ消化の上清中に検出された。イソプロパノール中に再溶解した活性物質結晶は、使用したメタザクロルの約３５％の量であった。
【０１１０】
2009523767.tif 000011
【実施例５】
【０１１１】
タンパク質微粒子中のレチノールの封入及び安定化
酸素ラジカル、ＵＶなどの影響に対して不安定な難水溶性又は水不溶性活性物質を、両親媒性自己集合タンパク質から調製されたタンパク質微粒子内に封入することができる。これらはまた、その後にそれらから放出することができる。さらに、タンパク質微粒子への製剤化及び／又は封入の結果として、活性物質は、有害な影響及びそれから生じる分解に対して保護される。これを示すために、非限定的な例として活性物質レチノールを選択し、これをＣ１６タンパク質微粒子に封入し、空気スパージング及び均一混合しながら数時間撹拌した。さまざまな時点においてサンプルを取り出し、残存するレチノールをＴＨＦ抽出によって定量した。
【０１１２】
表５．１に示すバッチを調べた。このために、最初にレチノール−ＴＨＦ溶液をイソプロパノールで希釈し、続いてＣ１６タンパク質水溶液と混合し、その後バッチ１の場合にはＣ１６タンパク質微粒子形成を１Ｍリン酸カリウム溶液を添加して誘導した。Ｃ１６タンパク質封入バッチにおける、例えばリン酸カリウムによるカチオンの存在は原理的に、遊離して溶解されたレチノール又は粒子形態に存在するレチノールの酸化の増大の原因となるため、１５４ｍＭ塩化ナトリウム溶液を、Ｃ１６クモシルクタンパク質を含む及び含まないが、Ｃ１６タンパク質微粒子形成の誘導は行わない対照バッチに添加した（Fisherら、1972, Biochem. J. 132: 259-270）。プラスチック蓋で開閉可能なガラス容器において、磁気撹拌器で撹拌しながら、排管によって連続的にスパージングしながら、バッチを最大７時間にわたりインキュベートした。サンプル採取のために、各場合に４×３００μｌを採取し、そのそれぞれにおいて計算により最大９．３８μｇのレチノールが存在するようにした。取り出した後、封入バッチのＣ１６微粒子をろ別し、得られたレチノールを１．５ｍｌのＴＨＦで抽出し、３２５ｎｍにおける吸光光度法によって定量した。Ｃ１６微粒子を含まないバッチの場合には、１．５ｍｌのＴＨＦを直接３００μｌのサンプルに添加し、そのサンプルを混合し、遠心して、相分離を生じさせる。続いて、上部のＴＨＦ相に存在するレチノールを、同様に３２５ｎｍにおける吸光光度法によって定量した。
【０１１３】
2009523767.tif 000012
【０１１４】
Ｃ１６クモシルクタンパク質を含むバッチ（バッチ１：Ｃ１６微粒子に封入、バッチ２：可溶性Ｃ１６）の実験では、Ｃ１６タンパク質を含まない対照と比較して、大気中酸素に対するレチノールの有意な安定化が観察される（表５．２、図８）。バッチ２においては５〜７時間後にレチノール量が有意に低減しているのに対し、バッチ１においてはその有効成分がＣ１６微粒子に封入されていたため、７０％を超える完全なレチノールを７時間後でさえも検出することができる（表５．２、図８）。従って、Ｃ１６タンパク質微粒子へのレチノールの封入は、酸素ラジカルにより誘導される分解に対する安定化を達成することができる好適な方法であると考えられる。１ｍｌの５ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８）中のプロテイナーゼＫ（２．２５Ｕ）によるレチノール含有Ｃ１６微粒子のタンパク質分解の結果、有効成分を放出することができた。
【０１１５】
2009523767.tif 000013
【０１１６】
図８：インキュベーション時間の関数としての、Ｃ１６製剤バッチにおけるレチノール安定性の決定。
【０１１７】
Ｃ１６微粒子への活性物質の最大充填密度を決定するために、種々の量のレチノールを封入バッチにおいて用いた（バッチ１参照）。ここで活性物質のために使用した溶媒はＴＨＦのみである。次にＣ１６タンパク質微粒子形成を、１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）の添加により誘導した。このバッチを１０℃で１時間インキュベートした後、２００００×ｇで１０分間遠心した。ペレットを蒸留水で２回洗浄した。次にＣ１６タンパク質微粒子を２ｍｌのＴＨＦで洗浄して活性物質を溶解させ、３２５ｎｍにおける吸光光度法により定量した（表５．３参照）。この実験におけるレチノールの最大充填密度は、使用したＣ１６タンパク質５ｍｇ当たり約１．９ｍｇであることがわかった（表５．３）。Ｃ１６微粒子への定量的沈殿の場合には、レチノール活性物質濃度又は充填密度は約３８％である。
【０１１８】
2009523767.tif 000014
【実施例６】
【０１１９】
ＴＨＦからのイブプロフェンの微粒子への封入と、タンパク質分解による放出
難水溶性又は水不溶性の薬理活性を有する物質を、両親媒性自己集合タンパク質から調製されたタンパク質微粒子に封入することができる。これらはまた、その後にそれらから放出することができる。さらに、タンパク質微粒子への製剤化及び／又は封入により、これらの活性物質は、例えば特定のプロテアーゼ又は強酸性のｐＨ値などの有害な影響及びそれから生じる分解に対して保護される。両親媒性自己集合タンパク質を用いたタンパク質微粒子への封入及び／又は微粒化バッチによって、良好に吸収される及び／又は良好なバイオアベイラビリティを示す特定の活性物質の粒子サイズ又は活性物質の構造を確立することができる。これを示すために、非限定的な例として活性物質イブプロフェン［（ＲＳ）−２−（４−イソブチルフェニル）プロピオン酸］を選択した。
【０１２０】
５００μｌの１０ｍｇ／ｍｌ  Ｃ１６タンパク質含有リン酸カリウム溶液（５ｍＭ、ｐＨ８．０）を１００μｌのイブプロフェン溶液（イソプロパノール中５ｍｇ／ｍｌ）と混合した。Ｃ１６タンパク質微粒子形成を、１ｍｌの１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）を添加して誘導した。バッチを室温で１時間インキュベートした後、２００００×ｇにおいて１０分間遠心した。ペレットを５ｍｌの再蒸留Ｈ２Ｏで２回洗浄した。
【０１２１】
リン酸カリウムによる沈殿の後、Ｃ１６タンパク質及びイブプロフェンを含むバッチにおいて微粒子が形成された。これらは、Ｃ１６タンパク質を含むが活性物質を含まない標準バッチと形態学的な点で同じであった。Ｃ１６タンパク質微粒子へのイブプロフェンの封入は、このバッチにおいて定量的に行った。これは、イブプロフェンが微粒子形成の誘導後の上清において吸光光度法によって検出することができないためである。１ｍｌの５ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８）中のプロテイナーゼＫ（２．２５Ｕ）によるイブプロフェン含有Ｃ１６微粒子の特異的タンパク質分解の結果、活性物質が放出された。
【０１２２】
ペプシン含有バッチ（実施例２と同様）におけるイブプロフェン含有Ｃ１６タンパク質微粒子のタンパク質分解消化によって、活性物質の放出は起こらなかった。パンクレアチン含有バッチ（実施例２と同様）におけるイブプロフェン含有Ｃ１６タンパク質微粒子の処理では、活性物質が放出された。よって、Ｃ１６微粒子は、胃プロテアーゼ及び胃で一般的な酸性度の高いｐＨ値に対する保護をもたらすことができる。しかしながら、腸条件における放出は可能である。従って、Ｃ１６微粒子は、特に、腸において吸収される又は有効であり、胃の通過時に保護される必要のある経口投与用活性物質の封入及び製剤化に好適である。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】ＴＨＦ及びＴＨＦ／イソプロパノール水溶液からのβ−カロテンを含むＣ１６タンパク質微粒子の分散液を示す。
【図２】ＴＨＦ／イソプロパノール（０．９重量％のβ−カロテン、バッチＧ１、左）及びＴＨＦ（０．３重量％のβ−カロテン、バッチＧ２、右）からのβ−カロテンを含むＣ１６タンパク質微粒子の分散液を示す。
【図３】プロテイナーゼＫによるＣ１６タンパク質微粒子分散液の消化を示す。
【図４】６００ｎｍにおける吸収の光度測定による完全なＣ１６タンパク質微粒子の測定を示すグラフである。
【図５】４４５ｎｍにおける吸収の光度測定によるＣ１６タンパク質微粒子から放出されたβ−カロテンの測定を示すグラフである。
【図６】未処理リコピンサンプル（Ａ）及びＣ１６タンパク質で処理したリコピンサンプル（Ｂ）の、混合直後（黒色グラフ）及び混合の２時間後（赤色グラフ）の吸収を示すグラフである。
【図７】混合の約３０日後における未処理リコピン分散液（左）とＣ１６タンパク質で安定化されたリコピン分散液（右）の比較を示す。
【図８】インキュベーション時間の関数としての、Ｃ１６製剤バッチにおけるレチノール安定性の決定を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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