(57)【要約】１つ以上のＰＫＣイソフォームのための親和性を有する、ペプチド認識要素（ＰＲＥ）に動作可能なように関連する、タンパク質キナーゼ活性を抑制することができる、抑制剤部分を有する哺乳類タンパク質キナーゼＣイソフォームの抑制剤を提供する。本発明の標的抑制分子（ＴＩＭ）は、１つ以上のＰＫＣイソフォームを抑制することができる。ＴＩＭは、そのＰＫＣイソフォームを選択的に標的にすると見られるＰＲＥ成分を選択することによって、特異的ＰＫＣイソフォームを標的にするよう考案することができる。ＴＩＭは、癌、乾癬、血管形成、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、心臓血管疾患、高血圧症、糖尿病、神経疾患、関節リウマチ、腎臓疾患、炎症性疾患および自己免疫疾患などの、ＰＫＣに関連する疾病または疾患の治療における治療薬として有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
長さで約５から約３０のアミノ酸残基のペプチドに動作可能なように関連するＰＫＣの活性を抑制することができる抑制剤部分を含む標的タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）抑制剤であって、前記ペプチドは一般式（Ｉ）の配列、またはそのレトロ型を有し、
Ｘ−［（ＨＹ−ＨＢ）ｎ−リンカー］ｍ−（ＨＢ−ＨＹ）２−ＨＢ−（ＨＹ）ｍ−Ｚ（Ｉ）
式中、
ＨＹは、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＰｈｅおよびＶａｌのグループから選択される１つから４つのアミノ酸残基を表し、
ＨＢは、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＬｙｓおよびＳｅｒのグループから選択される１つから４つのアミノ酸残基を表し、
「リンカー」は１から４のＧｌｙ残基を表し、
ｎは１、２または３であり、
ｍは０または１であり、
Ｘは前記ペプチドのＮ末端またはその修飾型を表し、
Ｚは前記ペプチドのＣ末端またはその修飾型を表す、標的タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）抑制剤。
【請求項２】
前記抑制剤部分および前記ペプチドは、スペーサーを介して動作可能なように関連する、請求項１に記載の標的ＰＫＣ抑制剤。
【請求項３】
前記スペーサーは、長さで約１と約１８のアミノ酸残基との間のアミノ酸配列である、請求項２の記載の標的ＰＫＣ抑制剤。
【請求項４】
前記ペプチドは一般式（ＩＩ）の配列、またはそのレトロ型を有し、
Ｘ−［（ＨＹ−ＨＢ１）ｎ−リンカー］ｍ−（ＨＢ−ＨＹ）２−ＨＢ２−（ＨＹ）ｍ−Ｚ（ＩＩ）
式中、
ＨＢ１は、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＬｙｓおよびＳｅｒのグループから選択される１つから３つのアミノ酸残基を表し、
ＨＢ２は、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＬｙｓおよびＳｅｒのグループから選択される１つまたは２つのアミノ酸残基を表す、請求項１、２または３のいずれか１つに記載の標的ＰＫＣ抑制剤。
【請求項５】
前記ペプチドは一般式（ＩＩＩ）の配列、またはそのレトロ型を有し、
Ｘ−（ＨＢ−ＨＹ）２−ＨＢ２−（ＨＹ）ｍ−Ｚ  （ＩＩＩ）
式中、
ＨＢ２は、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＬｙｓおよびＳｅｒのグループから選択される１つまたは２つのアミノ酸残基を表す、請求項１、２または３のいずれか１つに記載の標的ＰＫＣ抑制剤。
【請求項６】
前記「リンカー」は、１から３のＧｌｙ残基を表す、請求項１、２または３のいずれか１つに記載の標的ＰＫＣ抑制剤。
【請求項７】
前記「リンカー」は、１から２のＧｌｙ残基を表す、請求項１、２または３のいずれか１つに記載の標的ＰＫＣ抑制剤。
【請求項８】
前記ペプチドは１つ以上の非自然発生的アミノ酸を有する、請求項１、２、３、４、５、６または７のいずれか１つに記載の標的ＰＫＣ抑制剤。
【請求項９】
前記ペプチドは１つ以上の修飾ペプチド結合を有する、請求項１、２、３、４、５、６または７のいずれか１つに記載の標的ＰＫＣ抑制剤。
【請求項１０】
前記ペプチドは１つ以上のＤ−アミノ酸を有する、請求項１、２、３、４、５、６または７のいずれか１つに記載の標的ＰＫＣ抑制剤。
【請求項１１】
前記ペプチドは、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４および配列番号：３５、またはそれらのレトロ型、インベルソ型もしくはレトローインベルソ型のグループから選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の標的ＰＫＣ抑制剤。
【請求項１２】
前記ペプチドは、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４および配列番号：３５のグループから選択される、アミノ酸配列を有する、請求項１に記載の標的ＰＫＣ抑制剤。
【請求項１３】
前記ペプチドは、配列番号：１、配列番号：５、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１および配列番号：２２のグループから選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の標的ＰＫＣ抑制剤。
【請求項１４】
前記ペプチドは、配列番号：２または配列番号：１３に記載の配列を有する、請求項１に記載の標的ＰＫＣ抑制剤。
【請求項１５】
前記抑制剤部分は一般式ＩＸの化合物であり、
（Ｃ１）Ｊ（Ｍ）−ＮｙＢｚＡｘＢｙＮｙＢｘ（ＩＸ）
式中、
Ｃ１はＮｘＢｙ（Ａ／Ｎ）ｘＢｙＮｙであり、Ｃ１の前記Ｎ−またはＣ末端からのペプチド結合によりＪに結合され、
Ｊは、Ｃｙｓ、ＬｙｓおよびＨｉｓのグループから選択される１〜４つのアミノ酸残基であり、
Ｍは存在しないか、またはＩｌｅ、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＧｌｙのグループから選択されるアミノ酸へ任意に連結されるＡＴＰ模倣剤部分であり、また側鎖またはＪのＬｙｓ残基のうちの１つの前記Ｎ末端もしくはＪの前記Ｃｙｓ残基のうちの１つの前記Ｎ末端を介してＪに結合され、
Ｎはそれぞれ独立してＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＧｌｙであり、
Ｂはそれぞれ独立してＡｒｇ、ＬｙｓまたはＴｙｒであり、
Ａはそれぞれ独立してＰｈｅ、ＨｉｓまたはＴｒｐであり、
ｘはそれぞれ独立して０〜１であり、
ｙはそれぞれ独立して０〜２であり、
ｚ＝０〜３であり、
配列ＮｙＢｚＡｘＢｙＮｙＢｘは長さで２つ以上のアミノ酸であり、
式中、
Ｊが１つのＣｙｓ残基を有する、またはＣｙｓ残基を持たない場合は、式（ＩＸ）の前記化合物は単一のペプチド鎖を有し、Ｃ１は、Ｃ１の前記Ｃ末端からのペプチド結合を介してＪの前記Ｎ末端アミノ酸に結合され、
Ｊが２つ以上のＣｙｓ残基を有する場合は、少なくとも２つの前記Ｃｙｓ残基は、ジスルフィド結合によって連結され、その結果式（ＩＸ）の前記化合物は、前記少なくとも２つのＣｙｓ残基のうちの第１残基およびＣ１を有する第１のペプチド鎖、ならびに前記少なくとも２つのＣｙｓ残基のうちの第２残基および配列−ＮｙＢｚＡｘＢｙＮｙＢｘを有する第２のペプチド鎖を有し、
Ｍが存在しない場合は、前記配列−ＮｙＢｚＡｘＢｙＮｙＢｘは少なくとも１つのＰｈｅまたはＴｒｐを含有する、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４のいずれか１つに記載の標的ＰＫＣ抑制剤。
【請求項１６】
前記抑制剤部分は式（Ｘ）の化合物であり、
（Ｃ１）Ｊ（Ｍ）−ＮｙＢｚＡｘＢｙＮｙ（Ｘ）
式中、
Ｃ１はＮｘＢｙ（Ａ／Ｎ）ｘＢｙＮｙであり、Ｃ１の前記Ｎ−またはＣ末端からのペプチド結合によりＪに結合され、
Ｊは、Ｃｙｓ、ＬｙｓおよびＨｉｓのグループから選択される１〜４つのアミノ酸残基であり、
Ｍは存在しないか、またはＩｌｅ、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＧｌｙのグループから選択されるアミノ酸へ任意に連結されるＡＴＰ模倣剤部分であり、また側鎖またはＪのＬｙｓ残基のうちの１つの前記Ｎ末端もしくはＪの前記Ｃｙｓ残基のうちの１つの前記Ｎ末端を介してＪに結合され、
Ｎはそれぞれ独立してＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＧｌｙであり、
Ｂはそれぞれ独立してＡｒｇ、ＬｙｓまたはＴｙｒであり、
Ａはそれぞれ独立してＰｈｅ、ＨｉｓまたはＴｒｐであり、
ｘはそれぞれ独立して０〜１であり、
ｙはそれぞれ独立して０〜２であり、
ｚ＝０〜３であり、
配列ＮｙＢｚＡｘＢｙＮｙは長さで２つ以上のアミノ酸であり、
式中、
Ｊが１つのＣｙｓ残基を有する、またはＣｙｓ残基を持たない場合は、式（Ｉ）の前記化合物は単一のペプチド鎖を有し、Ｃ１は、Ｃ１の前記Ｃ末端からのペプチド結合を介してＪの前記Ｎ末端アミノ酸に結合され、
Ｊが２つ以上のＣｙｓ残基を有する場合は、少なくとも２つの前記Ｃｙｓ残基は、ジスルフィド結合によって連結され、その結果式（Ｉ）の前記化合物は、前記少なくとも２つのＣｙｓ残基のうちの第１の残基およびＣ１を有する第１のペプチド鎖、ならびに前記少なくとも２つのＣｙｓ残基のうちの第２の残基および配列−ＮｙＢｚＡｘＢｙＮｙＢを有する第２のペプチド鎖を有する、請求項１５に記載の標的ＰＫＣ抑制剤。
【請求項１７】
前記抑制剤部分は式（ＸＩ）の化合物であり、
（Ｃ２）Ｊ（Ｍ）−ＮｙＢｚＡｘＢｙＮｙ（ＸＩ）
式中、
Ｃ２はＢｙ（Ａ／Ｎ）ｘＢｙＮｙであり、Ｃ２の前記Ｎ−またはＣ末端からのペプチド結合によりＪに結合され、
Ｊは２つのＣｙｓ残基ならびに任意に、ＨｉｓおよびＬｙｓから選択される、１〜２つの残基を有し、前記Ｃｙｓ残基はジスルフィド結合によって連結され、その結果、式（Ｉ）の前記化合物は、前記２つのＣｙｓ残基のうちの第１残基およびＣ２を有する第１のペプチド鎖、ならびに前記２つのＣｙｓ残基のうちの第２残基および配列−ＮｙＢｚＡｘＢｙＮｙＢｘを有する第２のペプチド鎖を有し、
ＭはＩｌｅ、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＧｌｙのグループから選択されるアミノ酸に任意に連結されるＡＴＰ模倣剤部分であり、Ｃｙｓ残基の１つのＮ末端を介してＪに結合され、
Ｎはそれぞれ独立してＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＧｌｙであり、
Ｂはそれぞれ独立してＡｒｇ、ＬｙｓまたはＴｙｒであり、
Ａはそれぞれ独立してＰｈｅ、ＨｉｓまたはＴｒｐであり、
ｘはそれぞれ独立して０〜１であり、
ｙはそれぞれ独立して０〜２であり、
ｚ＝０〜３である、
請求項１５に記載の標的ＰＫＣ抑制剤。
【請求項１８】
前記抑制剤部分は式（ＸＩＩ）の化合物であり、
ＮｘＢｙ（Ａ／Ｎ）ｘＢｙＮｙ−Ｊ（Ｍ）−ＮｙＢｚＡｘＢｙＮｙＢｘ（ＸＩＩ）
式中、
Ｊは１〜２つのＬｙｓ残基またはＣｙｓ基であり、
Ｍは存在せず、またはＬｙｓ残基の１つの側鎖もしくはシステイン残基のＮ末端を介してＪに結合されるＡＴＰ模倣剤部分であり、
Ｎはそれぞれ独立してＡｌａ、ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＧｌｙであり、
Ｂはそれぞれ独立してＡｒｇ、ＬｙｓまたはＴｙｒであり、
Ａはそれぞれ独立してＰｈｅ、ＨｉｓまたはＴｒｐであり、
ｘはそれぞれ独立して０〜１であり、
ｙはそれぞれ独立して０〜２であり、
ｚ＝０〜３である、請求項１５に記載の標的ＰＫＣ抑制剤。
【請求項１９】
前記抑制剤部分は、
【化１】
2009502983.tif 000053
2009502983.tif 000054
2009502983.tif 000055
のグループから選択される化合物である、請求項１５に記載の標的ＰＫＣ抑制剤。
【請求項２０】
前記標的ＰＫＣ抑制剤は、
【化２】
2009502983.tif 000056
2009502983.tif 000057
から選択される、請求項１５に記載の標的ＰＫＣ抑制剤。
【請求項２１】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のいずれか１つに記載の標的タンパク質キナーゼＣ抑制剤および薬学的に許容できる希釈剤、担体または賦形剤を含む薬剤組成物。
【請求項２２】
タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）に関連する疾病または疾患の治療に使用される、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のいずれか１つに記載の標的タンパク質キナーゼＣ抑制剤。
【請求項２３】
前記ＰＫＣに関連する疾病または疾患は癌、糖尿病に関連する疾患、または心臓血管の疾病または疾患である、請求項２２に記載の標的タンパク質キナーゼＣ抑制剤。
【請求項２４】
癌の治療に使用される、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のいずれか１つに記載の標的タンパク質キナーゼＣ抑制剤。
【請求項２５】
前記癌は、結腸癌、結腸直腸癌または乳癌である、請求項２４に記載の標的タンパク質キナーゼＣ抑制剤。
【請求項２６】
前記癌は薬物抵抗性癌である、請求項２４または２５に記載の標的タンパク質キナーゼＣ抑制剤。
【請求項２７】
前記使用は化学療法薬と組み合わせる、請求項２４、２５または２６のいずれか１つに記載の標的タンパク質キナーゼＣ抑制剤。
【請求項２８】
薬剤の製造に使用される、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のいずれか１つに記載の標的タンパク質キナーゼＣ抑制剤の使用。
【請求項２９】
前記薬剤は、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）に関連する疾病または疾患の治療用である、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
前記ＰＫＣに関連する疾病または疾患は癌、糖尿病に関連する疾患、または心臓血管の疾病または疾患である、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記薬剤は癌の治療用である、請求項２８に記載の使用。
【請求項３２】
前記癌は、結腸癌、結腸直腸癌または乳癌である、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
前記癌は薬物抵抗性癌である、請求項３１または３２に記載の使用。
【請求項３４】
前記治療は化学療法薬と組み合わせる、請求項３１、３２または３３のいずれか１つに記載の使用。
【請求項３５】
１つ以上のタンパク質キナーゼＣイソフォームを抑制する方法であって、前記１つ以上のＰＫＣイソフォームを、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のいずれか１つに記載の前記標的ＰＫＣ抑制剤の有効量に接触させるステップを含む、方法。
【請求項３６】
前記１つ以上のＰＫＣイソフォームは、ＰＫＣ−アルファ、ＰＫＣ−ベータＩ、ＰＫＣ−ベータＩＩ、ＰＫＣ−デルタ、ＰＫＣ−エプシロン、ＰＫＣ−イオタおよびＰＫＣ−ゼータのグループから選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記１つ以上のＰＫＣイソフォームは、ＰＫＣ−アルファ、ＰＫＣ−ベータＩ、ＰＫＣ−ベータＩＩ、ＰＫＣ−デルタ、およびＰＫＣ−エプシロンのグループから選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＰＫＣイソフォームはＰＫＣアルファである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記方法は体外法である、請求項３５、３６、３７または３８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項４０】
前記方法は生体内法である、請求項３５、３６、３７または３８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項４１】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のいずれか１つに記載の前記標的ＰＫＣ抑制剤の有効量を哺乳類に投与するステップを含む、タンパク質キナーゼＣに関連する疾病または疾患を有する前記哺乳類を治療する方法。
【請求項４２】
前記ＰＫＣに関連する疾病または疾患は癌、糖尿病に関連する疾患、または心臓血管の疾病または疾患である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のいずれか１つに記載の前記標的ＰＫＣ抑制剤の有効量を哺乳類に投与するステップを含む、癌を有する前記哺乳類を治療する方法。
【請求項４４】
前記癌は、結腸癌、結腸直腸癌または乳癌である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記癌は薬物抵抗性癌である、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記標的ＰＫＣ抑制剤は化学療法薬と組み合わせて投与される、請求項４３、４４または４５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項４７】
癌を有し、化学療法薬で治療を受けている哺乳類において前記化学療法薬の有効性を増加させる方法であって、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のいずれか１つに記載の前記標的ＰＫＣ抑制剤の有効量を前記哺乳類に投与するステップを含む、方法。
【請求項４８】
前記癌は、結腸癌、結腸直腸癌または乳癌である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記癌は薬物抵抗性癌である、請求項４７または４８に記載の方法。
タンパク質キナーゼＣイソフォームの抑制剤およびその使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はタンパク質キナーゼの分野、特にタンパク質キナーゼＣのイソフォームの抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）酵素は、細胞内シグナル形質導入において主要な役割を担う、リン脂質依存性、細胞質セリン／トレオニンタンパク質キナーゼである。従って、ＰＫＣは細胞増殖、分化およびアポトーシスを含む、多くの細胞の事象の重要なメディエイターである。様々な細胞内シグナル伝達事象において関与するため、ＰＫＣは潜在的薬剤標的として製薬産業およびバイオテクノロジー産業で注目されている。
【０００３】
現在、十一（１１）の既知のＰＫＣのイソフォームが存在し、構造および補因子調節により３つのサブファミリーに分類されている。α、βＩ、βＩＩおよびγイソフォームは従来または伝統的ＰＫＣサブファミリーに属し、δ、ε、θ、μおよびηイソフォームは新規ＰＫＣサブファミリーに属し、ζおよびι／λは非定型ＰＫＣサブファミリーに属す。それぞれのイソフォームは、正常レベルで、多くの細胞のプロセスにとって絶対不可欠である（Ｄｕｔｉｌ、Ｅ．Ｍ．＆Ｎｅｗｔｏｎ、Ａ．Ｃ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５（１４）、１０６９７―１０７０１；Ｎｅｗｔｏｎ，Ａ．Ｃ．（１９９５）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０（４８）、２８４９５―２８４９８）。
【０００４】
一連のＰＫＣのために活性を示す多くの「広域スペクトル」化合物が開発されてきたが（Ｇｏｅｋｊｉａｎ、Ｐ．Ｇ．＆Ｊｉｒｏｕｓｅｋ、Ｍ．Ｒ．、ｉｂｉｄ．；Ｇｏｅｋｊｉａｎ、Ｐ．Ｇ．＆Ｊｉｒｏｕｓｅｋ、Ｍ．Ｒ．、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ，１０：２１１７−２１４０参照）、特異的ＰＫＣイソフォームまたはイソフォームのグループのためだけに活性を示す「イソフォーム特異的」化合物の同定は、より得るのが難しいことが分かっている。ＰＫＣのイソフォームは、触媒およびＡＴＰ結合領域において堅調に保存されており、特に選択度の解決を難しくさせ（Ｘｕら、（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７９（４８）、５０４０１―５０４０９）、ＰＫＣ全体の結晶構造は未だに究明されていない。
【０００５】
米国特許第６，１６５，９７７号は、ＰＫＣ−εイソフォームのアイソザイム特異的活性剤／アゴニストを記載している。記載の活性剤／アゴニストは、アミノ酸８５と９２との間のＰＫＣ−εタンパク質の領域に対応する配列を有するペプチドである。ＰＫＣ−εのペプチド抑制剤もまた、Ｊｏｈｎｓｏｎ（Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｊ．Ａ．ら、（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１：２４９６２−２４９６６）によって記載されている。これらのペプチドは、ＰＫＣ−εタンパク質のＶ１領域から派生する配列を有する。米国特許出願第２００３／０２２３９８１号は、ＰＫＣ−γタンパク質のＶ５領域から発生する配列を有するＰＫＣ−γイソフォームのペプチド抑制剤を記載しているのに対して、国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ９３／００８１６（ＷＯ９３／２０１０１）は、特にＰＫＣ−ζイソフォームを標的にするペプチド抑制剤を記載している。
【０００６】
ＰＫＣのα−イソフォーム（ＰＫＣ−α）は、癌、心臓血管疾患、中枢神経系の疾患および糖尿病を含む、多くの疾病に関係付けられている（Ｇｏｅｋｊｉａｎ、Ｐ．Ｇ．＆Ｊｉｒｏｕｓｅｋ、Ｍ．Ｒ．、（１９９９）Ｃｕｒｒ．ＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍ．、６：８７７−９０３；Ｒｏｓｅｎｚｗｅｉｇ  Ｔら、（２００２）．Ｄｉａｂｅｔｅｓ、５１：１９２１−１９３０）による概説参照）。ＰＫＣ−αの役割はまた、多発性嚢胞腎（Ａｒｎｏｕｌｄ  Ｔら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１３：６０１３−６０１８）、高血圧症（ＵｎｇｖａｒｉＺら、（２００３）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１０８：１２５３−１２５８）および多発性硬化症（ＢａｒｔｏｎＡら、（２００４）Ｂｒａｉｎ、４：１−６）において示唆されてきた。
【０００７】
ＰＫＣ−αの異常レベルは多くのヒトの腫瘍において注目されてきており、ＰＫＣ−αの異常過剰発現は、細胞肺癌（Ｃｌａｒｋら、（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６３：７８０−７８６）、卵巣、乳房（Ｌａｈｎら、（２００４）Ａｃｔａ−Ｈａｅｍａｔｏｌ．１１５：１−８）、神経芽細胞腫、前立腺（Ｐｏｗｅｌｌら、（１９９６）ＣｅｌｌＧｒｏｗｔｈおよびＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ；７：４１９−４２８）、膀胱（Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、（２００４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ６４：５６９３−５７０１）および膵臓癌（Ｄｅｔｊｅｎら、（２０００）Ｊ．ＣｅｌｌＳｃｉ．、１１３：３０２５−３０３５）を含み、多くの型の癌で発生する。癌では、ＰＫＣ−αは、多薬物抵抗性をもたらす化学療法薬に対する悪性形質転換、増殖、アポトーシス、細胞移動、細胞活性化、脱感作腫瘍細胞に関連付けられている（Ｈａｎａｕｓｋｅ、Ａ−Ｒ．ら、（２００４）、Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓｉｇｎ、１０：１９２３−１９３６；Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｊ．、（２００４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ、４：１２５−１４６；Ｔｏｎｅｔｔｉ  Ｄら）（２００３）ＢｒｉｔｉｓｈＪ．Ｃａｎｃｅｒ、８８：１４００−１４０２による概説参照）。
【０００８】
ＰＫＣ−αイソフォームを標的にすることができることが知られている化合物は、様々な抗体、リガンドおよび偽基質を含む。例えば、ホルボールエステルは、ＰＫＣの伝統的ＰＫＣおよび新規ＰＫＣサブファミリーを活性化する（Ｂｒｏｏｋｓ  Ｇ．ら、（１９８９）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、１０，２８３−２８８）。これらのエステルは天然活性剤、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）と同じ部位に結合する（Ｗｒｉｇｈｔ  ＭおよびＭｃＭａｓｔｅｒ  Ｃ．（２００２）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．、３５，２２３−２２９）。ＤＡＧと類似した脂質もまたこの部位に結合し、活性化効果を発揮する。タンパク質ＰＩＣＫ−１はＰＫＣ−αイソフォームに結合するだけでなく、他のタンパク質（非タンパク質キナーゼを含む）にも結合する。ＰＩＣＫ−１はＰＫＣ細胞内転座に貢献すると考えられている（Ｗａｎｇ  Ｗ−Ｌら（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８、３７７０５−３７７１２）。プラズマ細胞膜に存在する他のタンパク質、ＲＡＣＫ−１は、Ｃ２分域で活性化ＰＫＣ−αおよびＰＫＣ−βに結合する（Ｒｏｔｅｎｂｅｒｇ  ＳおよびＳｕｎ  Ｘ−Ｇ（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３、２３９０−２３９５）。
【０００９】
いくつかのイソフォーム選択的ＰＫＣ抑制剤が、ＰＫＣ−α活性を抑制することができることが知られている。例えば、ＵＣＮ−０１（スタウロスポリンの類似体）、ＧＦ１０９２０３ＸおよびＧｏ６９７６は、伝統的ＰＫＣイソフォーム（α、βＩ、βＩＩおよびγ）に対して選択的である。アンチセンスオリゴヌクレオチドの一つであるＡｐｒｉｎｏｃａｒｓｅｎ（ＬＹ９００００３またはＡｆｆｉｎｉｔａｋＴＭとしても知られている）はＰＫＣ−αに対して選択的であるが、タンパク質それ自体よりもむしろｍＲＮＡコード化ＰＫＣ−αを標的にする（Ｈａｎａｕｓｋｅ、Ａ−Ｒ．ら、ｉｂｉｄ参照）。ＵＣＮ−０１、ブリオスタチン−１（ＧＰＣＢｉｏｔｅｃｈ  ＡＧによって開発された小分子抑制剤）、ＰＫＣ４１２（ＮｏｖａｒｔｉｓおよびＡｐｒｉｎｏｃａｒｓｅｎによって開発された、スタウロスポリンに基づく小分子抑制剤が着手された。しかしながら、ブリオスタチン−１およびＵＣＮ−０１の双方は第２相段階で打ち切られ、Ａｐｒｉｎｏｃａｒｓｅｎは容認できない半減期反応速度のため、中枢の第３相試験で失敗した（平均生存率に差異がなかった）。ＰＫＣ４１２による第２相試験は継続中である。
【００１０】
この背景事情は、出願人が本発明に関連する可能性があると信じる情報を知らしめることを目的として提供する。承認されることを必ずしも目的としておらず、これまでの情報のいずれも、本発明に対して不利となる従来技術を構成するものと解釈されるべきではない。
【発明の開示】
【００１１】
本発明の目的は、タンパク質キナーゼＣイソフォームの抑制剤およびその使用を提供することである。本発明の一側面によると、長さで約５から約３０のアミノ酸残基のペプチドに動作可能なように関連するＰＫＣの活性を抑制することができる抑制剤部分を含む標的タンパク質キナーゼＣ抑制剤を提供しており、前記ペプチドは一般式（Ｉ）の配列、またはそのレトロ型を有し、
Ｘ−［（ＨＹ−ＨＢ）ｎ−リンカー］ｍ−（ＨＢ−ＨＹ）２−ＨＢ−（ＨＹ）ｍ−Ｚ（Ｉ）
式中、
ＨＹは、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＰｈｅおよびＶａｌのグループから選択される１つから４つの疎水性アミノ酸残基のブロックを表し、
ＨＢは、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＬｙｓおよびＳｅｒのグループから選択される水素結合の形成が可能な１つから４つのアミノ酸残基のブロックを表し、
「リンカー」は１つから４つのＧｌｙ残基を表し、
ｎは１、２または３であり、
ｍは０または１であり、
Ｘは前記ペプチドのＮ末端またはその修飾型を表し、
Ｚは前記ペプチドのＣ末端またはその修飾型を表す。
【００１２】
本発明のその他の側面によると、前記標的ＰＫＣ抑制剤の前記抑制剤部分は、一般式ＩＸの化合物であり、
（Ｃ１）Ｊ（Ｍ）−ＮｙＢｚＡｘＢｙＮｙＢｘ（ＩＸ）
式中、
Ｃ１はＮｘＢｙ（Ａ／Ｎ）ｘＢｙＮｙであり、Ｃ１の前記Ｎ−またはＣ末端からのペプチド結合によりＪに結合され、
Ｊは、Ｃｙｓ、ＬｙｓおよびＨｉｓのグループから選択される１〜４つのアミノ酸残基であり、
Ｍは存在しない、またはＩｌｅ、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＧｌｙのグループから選択されるアミノ酸へ任意に連結されるＡＴＰ模倣剤部分であり、また側鎖またはＪのＬｙｓ残基のうちの１つの前記Ｎ末端もしくはＪの前記Ｃｙｓ残基のうちの１つの前記Ｎ末端を介してＪに結合され、
Ｎはそれぞれ独立してＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＧｌｙであり、
Ｂはそれぞれ独立してＡｒｇ、ＬｙｓまたはＴｙｒであり、
Ａはそれぞれ独立してＰｈｅ、ＨｉｓまたはＴｒｐであり、
ｘはそれぞれ独立して０〜１であり、
ｙはそれぞれ独立して０〜２であり、
ｚ＝０〜３であり、
配列ＮｙＢｚＡｘＢｙＮｙＢｘは長さで２つ以上のアミノ酸であり、
式中、
Ｊが１つのＣｙｓ残基を有する、またはＣｙｓ残基を持たない場合は、式（ＩＸ）の前記化合物は単一のペプチド鎖を有し、Ｃ１は、Ｃ１の前記Ｃ末端からのペプチド結合を介してＪの前記Ｎ末端アミノ酸に結合され、
Ｊが２つ以上のＣｙｓ残基を有する場合は、少なくとも２つの前記Ｃｙｓ残基は、ジスルフィド結合によって連結され、その結果式（ＩＸ）の前記化合物は、第１の前記少なくとも２つのＣｙｓ残基およびＣ１を有する第１のペプチド鎖、ならびに前記少なくとも２つのＣｙｓ残基および配列−ＮｙＢｚＡｘＢｙＮｙＢｘを有する第２のペプチド鎖を有し、Ｍが存在しない場合は、前記配列−ＮｙＢｚＡｘＢｙＮｙＢｘは少なくとも１つのＰｈｅまたはＴｒｐを含有する。
【００１３】
本発明のその他の側面によると、本発明の標的タンパク質キナーゼＣ抑制剤を含む薬剤組成物、および薬学的に許容できる希釈剤、担体または賦形剤が提供されている。
【００１４】
本発明のその他の側面によると、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）に関連する疾病または疾患の治療に使用される、本発明の標的タンパク質キナーゼＣ抑制剤が提供されている。
【００１５】
本発明のその他の側面によると、薬剤の製造に使用される、本発明の標的タンパク質キナーゼＣ抑制剤の使用が提供されている。
【００１６】
本発明のその他の側面によると、１つ以上のタンパク質キナーゼＣイソフォームを抑制する方法であって、前記１つ以上のＰＫＣイソフォームを、本発明の前記標的ＰＫＣ抑制剤の有効量に接触させるステップを含む方法が提供されている。
【００１７】
本発明のその他の側面によると、本発明の標的ＰＫＣ抑制剤の有効量を哺乳類に投与するステップを含む、タンパク質キナーゼＣに関連する疾病または疾患を有する前記哺乳類を治療する方法が提供されている。
【００１８】
本発明のその他の側面によると、本発明の標的ＰＫＣ抑制剤の有効量を哺乳類に投与するステップを含む、癌を有する前記哺乳類を治療する方法が提供されている。
【００１９】
本発明のその他の側面によると、癌を有し、化学療法薬で治療を受けている哺乳類において前記化学療法薬の有効性を増加させる方法であって、本発明の標的ＰＫＣ抑制剤の有効量を前記哺乳類に投与するステップを含む方法が提供されている。
【００２０】
このような特性および本発明の他の特性は、添付の図面を参照する以下の詳細な説明においてより明白となるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は哺乳類タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の抑制剤を提供する。本発明の標的抑制分子（ＴＩＭ）は、１つ以上のＰＫＣイソフォームを抑制することができ、ペプチド認識要素（ＰＲＥ）に動作可能なように関連する、タンパク質キナーゼ活性を抑制することができる抑制剤部分を有する。ＰＲＥは１つ以上のＰＫＣイソフォームのための親和性を有し、従ってこれらのＰＫＣイソフォームに関連する抑制剤部分を標的にすることができる。
【００２２】
抑制剤部分が標的ＰＫＣを抑制すること、およびＰＲＥに動作可能なように関連することの両方ができるならば、ＴＩＭに取り込まれる抑制剤の型は、本発明にとって重要ではない。抑制剤部分は特異的ＰＫＣ抑制剤、一般的ＰＫＣ抑制剤または広域スペクトルタンパク質キナーゼ抑制剤であってもよい。本発明の一実施例では、抑制剤部分は、一般的ＰＫＣ抑制剤または広域スペクトルタンパク質キナーゼ抑制剤である。他の実施例では、抑制剤部分は、細胞内で開裂される不安定連結を介してＰＲＥと動作可能なように関連する、一般的ＰＫＣ抑制剤または広域スペクトルタンパク質キナーゼ抑制剤であり、従って遊離抑制剤分子に、標的ＰＫＣと同様に、細胞内の多くの他のタンパク質キナーゼを抑制することを可能にさせる。
【００２３】
前述のとおり、本発明のＴＩＭに取り込まれるＰＲＥは、１つ以上のＰＫＣイソフォームに対して親和性を有する。従って本発明のＴＩＭは、１つのＰＫＣイソフォームを選択的または特異的に抑制することができるか、または１つ以上のＰＫＣイソフォームを抑制することができる。本発明のＴＩＭは、そのＰＫＣイソフォームを選択的に標的にすると見られるＰＲＥ成分を選択することによって、特異的ＰＫＣイソフォームを標的にするよう考案することができる。この選択度は、必要に応じて、このイソフォームに対していくつかの特異性を示す抑制剤部分を選択することによって向上させることができる。本発明の一実施例では、ＴＩＭはＰＫＣ−α、および任意に１つ以上の他のＰＫＣイソフォームを抑制する。この実施例によると、ＰＫＣ−α以外のＰＫＣイソフォームを抑制するＴＩＭの能力は、ＰＫＣ−αを抑制する能力以下であってもよい。
【００２４】
その他の実施例では、ＴＩＭはＰＫＣ−αに特異的であるか、またはＰＫＣ−αならびにＰＫＣ−β（ＰＫＣ−βＩおよび／またはＰＫＣ−βＩＩ）およびＰＫＣ−εより成るＰＫＣイソフォームの１つ以上のサブグループに対して親和性を有するＰＲＥを有する。これらの他のＰＫＣイソフォームに対するＰＲＥの親和性は、ＰＫＣ−αに対するＰＲＥの親和性以下であってもよい。従って一実施例では、本発明は、ＰＫＣ−αならびにＰＫＣ−βおよびＰＫＣ−εのうちの一つ以上を認識することができるＰＲＥから構成されるＴＩＭを提供する。本発明の他の実施例では、ＰＲＥはＰＫＣの他のイソフォームよりＰＫＣ−αに対する高い親和性を示す。従ってこの実施例では、本発明は、ＰＫＣ−αを特異的に標的にして抑制することによって、抑制剤部分と細胞内の他のキナーゼとの相互作用を最小限にするＴＩＭを提供する。
【００２５】
本発明によって提供されるＴＩＭは、１つ以上のＰＫＣイソフォームの活性を抑制することができ、その結果１つ以上のＰＫＣ媒介の生理学的効果を調節することができる。従ってＴＩＭは、癌、乾癬、血管形成、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、心臓血管疾患、高血圧症、糖尿病、神経疾患、関節リウマチ、腎臓疾患、炎症性疾患および自己免疫疾患などの、ＰＫＣに関連する疾病および疾患の治療における治療薬として有用である。従って本発明は、１つ以上のＴＩＭの有効量を投与することによって、哺乳類におけるＰＫＣ媒介の疾病または疾患を治療する方法を企図する。ＴＩＭは単独で、または他の既知の治療薬と組み合わせて使用することができる。一実施例では、本発明は癌の治療におけるＴＩＭの使用を提供する。他の実施例では、本発明は、癌の治療のための１つ以上の従来の化学療法と組み合わせたＴＩＭの使用を提供する。
【００２６】
本発明は、他のＰＫＣ抑制剤の開発における研究手段として、また様々な細胞過程および疾病におけるＰＫＣの役割を調査するためのＴＩＭの使用をさらに企図する。
【００２７】
本発明はまた、ＰＫＣの１つのイソフォームを特異的に標的にするＰＫＣ抑制剤を調製する方法を提供する。前記方法は一般に、候補イソフォーム特異的ＰＲＥのライブラリーを提供する手順、１つ以上のＰＫＣイソフォームに対してライブラリーをスクリーニングする手順、所望のイソフォーム特異度を有するＰＲＥを選択する手順およびこのＰＲＥをＰＲＥ抑制剤に共役させる手順を含む。
【００２８】
定義
別段の定義がある場合を除き、本明細書で使用するすべての専門用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００２９】
本発明の文脈では、用語「に動作可能なように関連する」とは、ＴＩＭにその標的ＰＫＣに到達させるのに十分な時間、生理学的条件に耐えるよう十分安定した化学結合、融合または関連を介して、直接的に、または間接的に抑制剤部分がＰＲＥに結び付けられることを指す。化学結合は、例えば、共有原子価結合、イオン結合、ジスルフィド結合、水素結合、ファンデルワールス結合、静電気結合などのうちの１つ以上であることができる。抑制剤分子は、抑制剤部分がＰＲＥに間接的に結び付けられる場合は、上述の結合のうちの１つを介してＰＲＥに次いで結び付けられるスペーサーにより、上述の結合のうちの１つを介してスペーサーに結び付けることができ、その結合は抑制剤部分をスペーサー分子に結びつけている結合と同じでもあっても、または異なってもよい。
【００３０】
ＰＫＣイソフォームのためのＰＲＥの「親和性」は、単独または本発明のＴＩＭに組み込まれる、ＰＲＥのＰＫＣイソフォームに特異的な抗体の標的ＰＫＣへの結合を妨げる能力を分析することにより決定する。イソフォームに特異的な抗体の標的ＰＫＣへの結合を妨げることができるＰＲＥは、そのイソフォームに対する親和性を有すると定義する。
【００３１】
本明細書で使用する用語「を妨げる」とは、低減または抑制することを指す。
【００３２】
ＰＲＥまたはＴＩＭに関して本明細書で使用する「ＰＫＣイソフォームに特異的」または「ＰＫＣイソフォームに対して特異的」とは、同様のアッセイ条件下で評価する場合、ＰＲＥ／ＴＩＭが、他のＰＫＣイソフォームに対する親和性と比較して、特定のＰＫＣイソフォームに対してより高い親和性を有する、および／またはＰＲＥ／ＴＩＭが、他のＰＫＣイソフォームよりも特定のＰＫＣイソフォームに選択的に結合することを指す。従って、例えば、本発明のＰＲＥまたはＴＩＭに関連して本明細書で使用する用語「ＰＫＣ−αに特異的」または「ＰＫＣ−αに対して特異的」とは、ＰＲＥ／ＴＩＭが、実質上同一のアッセイ条件下で、他のＰＫＣイソフォームよりＰＫＣ−αに対して、より高い親和性を有するか、および／またはＰＲＥ／ＴＩＭが、他のＰＫＣイソフォームよりもＰＫＣ−αに選択的に結合することを指す。
【００３３】
タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸などの目的物に関連して本明細書で使用する用語「自然発生的」とは、目的物が自然で見出すことができることを指す。例えば、生物に存在する、または自然の源から単離ことができ、研究室で人工的に意図的に修飾されていないタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸を自然発生的と見なす。
【００３４】
本明細書で使用する用語「アミノ酸残基」とは、自然発生的アミノ酸および非自然発生的アミノ酸の両方を包含する。非自然発生的アミノ酸の例は、Ｄ−アミノ酸（すなわち、自然発生型に対して逆のキラリティーのアミノ酸）、Ｎ−α−メチルアミノ酸、Ｃ−α−メチルアミノ酸、β−メチルアミノ酸およびＤ−またはＬ−β−アミノ酸を含むが、それらに限定されない。他の非自然発生的アミノ酸は、例えば、β−アラニン（β−Ａｌａ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、ホモアルギニ（Ｈａｒ）、４−アミノ酪酸（γ−Ａｂｕ）、２−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、６−アミノヘキサン酸（ε−Ａｈｘ）、オルニチン（ｏｒｎ）、サルコシン、α−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、２、３−ジアミノプロピオン酸（２、３−ｄｉａＰ）、Ｄ−またはＬ−フェニルグリシン、Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルアラニン、およびＤ−ｐ−フルオロフェニルアラニンを含む。
【００３５】
本明細書において、「ペプチド結合」は、自然発生的ペプチド結合または非自然発生的（すなわち、修飾）ペプチド結合であってもよい。適切な修飾ペプチド結合は当技術分野でよく知られており、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスまたはトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、−ＣＨ２ＳＯ−、−ＣＳ−ＮＨ−および―ＮＨ−ＣＯ−（すなわち、逆ペプチド結合）（例えば、Ｓｐａｔｏｌａ、Ｖｅｇａ  Ｄａｔａ  第１巻、第３号、（１９８３）；Ｓｐａｔｏｌａ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓにおいて、編集者Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、ニューヨーク、ページ２６７（１９８３）；Ｍｏｒｌｅｙ、Ｊ．Ｓ．、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．ページ４６３〜４６８（１９８０）；Ｈｕｄｓｏｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．１４：１７７−１８５（１９７９）；Ｓｐａｔｏｌａら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．３８：１２４３−１２４９（１９８６）；Ｈａｎｎ、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．Ｉ  ３０７−３１４（１９８２）；Ａｌｍｑｕｉｓｔら、Ｊ．Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．２３：１３９２−１３９８（１９８０）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２３：２５３３（１９８２）；Ｓｚｅｌｋｅら、ＥＰ４５６６５（１９８２）；Ｈｏｌｌａｄａｙら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２４：４４０１−４４０４（１９８３）；およびＨｒｕｂｙ，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．３１：１８９−１９９（１９８２）を含むが、それらに限定されない。
【００３６】
本明細書で使用する用語「レトロ配列」または「レトロペプチド」とは、基準アミノ酸配列の方向の逆転によって、基準アミノ酸配列に対して変更されたアミノ酸の配列を指す。例えば、基準配列「ＡＴＰＫＬ」に対して、レトロ配列は「ＬＫＰＴＡ」となる。
【００３７】
本明細書で使用する用語「インベルソ配列」または「インベルソペプチド」とは、配列のすべてのＬ−アミノ酸がＤ−アミノ酸と置換された、基準アミノ酸配列に対して変化したアミノ酸の配列を指す。
【００３８】
本明細書で使用する用語「レトロ−インベルソ配列」または「レトロ−インベルソペプチド」とは、アミノ酸配列が逆転し、すべてのＬ−アミノ酸がＤ−アミノ酸と置換された、基準アミノ酸配列に対して変更されたアミノ酸の配列を指す。基準ペプチドと比較すると、レトロ−インベルソペプチドは、側鎖の実質的に元の空間立体構造を保持する一方で逆バックボーンを有し、基準ペプチドに酷似するトポロジーを有する異性体をもたらす。
【００３９】
本明細書で使用する用語「アルキル」とは、１から１０の炭素原子の直鎖もしくは分岐炭化水素または３から１０の炭素原子の環状炭化水素基を指す。前記アルキル基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアルキル、アラルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アラルキルオキシ、アリールオキシ、カルボキシ、アシル、アロイル、ハロ、ニトロ、トリハロメチル、シアノ、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アラルコキシカルボニル、アシルアミノ、アロイルアミノ、ジアルキルアミノ、カルバモイル、アルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、アルキルチオ、アラルキルチオ、アリールチオ、アルキレンならびにＺ１およびＺ２が独立して水素、アルキル、アリール、およびアラルキルであるＮＺ１Ｚ２より成るグループから独立して選択される１つ以上の置換基と任意に置換される。この用語は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｌ−ブチル（または２−メチルプロピル）、シクロプロピルメチル、ｉ−アミル、ｎ−アミル、ヘキシル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルなどの基により例示される。
【００４０】
用語「アルケニル」とは、少なくとも１つの炭素二重結合を有する、２から１０の炭素原子を含む直鎖または分岐炭化水素を指す。前記アルケニル基は、前述のように１つ以上の置換基と任意に置換することができる。典型的な基は、アリルまたはビニルを含む。
【００４１】
用語「アルキニル」とは、少なくとも１つの炭素三重結合を有する、２から１０の炭素原子を含む直鎖または分岐炭化水素を指す。前記アルキニル基は、前述したように１つ以上の置換基と任意に置換することができる。典型的な基は、エチニルまたはプロパルギルを含む。
【００４２】
本明細書で使用する用語「ヘテロアルキル」とは、少なくとも１つの炭素がＮ、ＯまたはＳなどのヘテロ原子と置換される、２から１０の炭素原子を含むアルキル基を指す。
【００４３】
本明細書で使用する用語「アリール」（または「Ａｒ」）とは、約６から約１０の炭素原子含有する芳香族炭素環基、または少なくとも１つの環が６から約１０の炭素原子を含有する芳香族炭素環基である複数の縮合環を指す。前記アリールまたはＡｒ基は、前述のように１つ以上の置換基と任意に置換することができる。典型的なアリール基は、フェニル、トリル、キシリル、ビフェニル、ナフチル、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル、アントリル、フェナントリル、９−フルオレニル、などを含む。
【００４４】
本明細書で使用する用語「アラルキル」とは、直鎖または分鎖アルキル、アルケニルまたはアルキニル基を指し、ここで少なくとも１つの水素はアリール基と置換され、アリール基は、前述のように１つ以上の置換基と任意に置換することができる。典型的なアラルキル基は、ベンジル、４−フェニルブチル、３，３−ジフェニルプロピルなどを含む。
【００４５】
本明細書で使用する用語「アルコキシ」とはＲＯ−を指し、ここでＲは、アルキル、アルケニルおよびアルキニル基が前述のような、アルキル、アルケニルまたはアルキニルとする。典型的なアルコキシ基は、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、Ｉ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、およびヘプトキシを含む。
【００４６】
本明細書で使用する用語「アリールオキシ」とは、アリール基が前述のような、「アリール−Ｏ−」基を指す。典型的なアリールオキシ基は、フェノキシおよびナフトキシを含む。
【００４７】
本明細書で使用する用語「アルキルチオ」とはＲＳ−を指し、ここでＲは、アルキル、アルケニルおよびアルキニル基が前述のような、アルキル、アルケニルまたはアルキニルとする。典型的なアルキルチオ基は、メチルチオ、エチルチオ、Ｉ−プロピルチオおよびヘプチルチオを含む。
【００４８】
本明細書で使用する用語「アリールチオ」とは、アリール基が前述のような、「アリール−Ｓ−」基を指す。典型的なアリールチオ基は、フェニルチオおよびナフチルチオを含む。
【００４９】
本明細書で使用する用語「アラルキルオキシ」とは、アラルキル基が前述のような、「アラルキル−Ｏ−」基を指す。典型的なアラルキルオキシ基は、ベンジルオキシを含む。
【００５０】
本明細書で使用する用語「アラルキルチオ」とは、アラルキル基が前述のような、「アラルキル−Ｓ−」基を指す。典型的なアラルキルチオ基は、ベンジルチオを含む。
【００５１】
本明細書で使用する用語「ジアルキルアミノ」とは−ＮＺ１Ｚ２基を指し、ここでＺ１およびＺ２は、アルキル、アルケニルまたはアルキニルが前述のような、アルキル、アルケニルまたはアルキニルから独立して選択される。典型的なジアルキルアミノ基は、エチルメチルアミノ、ジメチルアミノおよびジエチルアミノを含む。
【００５２】
本明細書で使用する用語「アルコキシカルボニル」とはＲ−Ｏ−ＣＯ−を指し、ここでＲは、アルキル、アルケニルおよびアルキニルが前述のような、アルキル、アルケニルまたはアルキニルとする。典型的なアルコキシカルボニル基は、メトキシ−カルボニルおよびエトキシ−カルボニルを含む。
【００５３】
本明細書で使用する用語「アリールオキシカルボニル」とは、アリールが前述のような、「アリール−Ｏ−ＣＯ−」を指す。典型的なアリールオキシカルボニル基は、フェノキシ−カルボニルおよびナフトキシ−カルボニルを含む。
【００５４】
本明細書で使用する用語「アラルコキシカルボニル」とは、アラルキルが前述のような、「アラルキル−Ｏ−ＣＯ−」を指す。典型的なアラルコキシカルボニル基は、ベンジルオキシカルボニルを含む。
【００５５】
本明細書で使用する用語「アシル」とはＲＣ（Ｏ）−を指し、ここでＲは、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、複素環式、および芳香族複素環式が前述のような、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、複素環、または芳香族複素環とする。
【００５６】
本明細書で使用する用語「アロイル」とは、Ａｒが前述のような、ＡｒＣ（Ｏ）−基を指す。
【００５７】
本明細書で使用する用語「カルボキシ」とはＲＯＣ（Ｏ）−を指し、ここでＲは、Ｈ、アルキル、アルケニルまたはアルキニルが前述のような、アルキル、アルケニルまたはアルキニルとする。
【００５８】
本明細書で使用する用語「カルバモイル」とはＨ２Ｎ−ＣＯ−基を指す。
【００５９】
本明細書で使用する用語「アルキルカルバモイル」とは「Ｚ１Ｚ２Ｎ−ＣＯ−」基を指し、ここでＺ１およびＺ２のうちの１つは水素とし、Ｚ１およびＺ２のうちのもう一方は、アルキル、アルケニルおよびアルキニルが前述のような、アルキル、アルケニルおよびアルキニルから独立して選択される。
【００６０】
本明細書で使用する用語「ジアルキルカルバモイル」とは「Ｚ１Ｚ２Ｎ−ＣＯ−」基を指し、ここでＺ１およびＺ２は、アルキル、アルケニルまたはアルキニルが前述のような、アルキル、アルケニルまたはアルキニルから独立して選択される。
【００６１】
本明細書で使用する用語「アシルアミノ」とは、アシルが前述のような、「アシル−ＮＨ−」基を指す。
【００６２】
本明細書で使用する用語「ハロ」とはフルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードを指す。一実施例では、「ハロ」はフルオロ、クロロまたはブロモを指す。
【００６３】
本明細書の他の化学用語は、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ（編集者Ｐａｒｋｅｒ、Ｓ．、１９８５）、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、サンフランシスコ）により例示されるように、当技術分野での慣例的用法に準じて使用する。
【００６４】
本明細書で使用する用語「反応官能基」とは、第２の分子に結合することができる、または第２の分子に結合することができるよう修飾および／または活性化することができる第１の分子に存在する化学基を指す。
【００６５】
本明細書で置き替え可能に使用する用語「療法」および「治療」とは、対象の状態を改善する意図を持って実行される診療行為を指す。改善は自覚的または他覚的であってもよく、治療する疾病または疾患に関連する症状の改善、それらの進行の防止、またはそれらの病理学の変化に関係している。従って、用語療法および治療は最も広義に使用し、様々な段階での疾病または疾患の予防（予防法）、緩和、軽減、および治癒を含む。対象の状態の悪化予防もまた、前記用語に包含する。従って、療法／治療を必要としている対象は、、すでに疾病または疾患を有する対象、および、疾病または疾患の傾向がある、またはそれらを進行させるリスクがある、および疾病または疾患を予防すべき対象を含む。
【００６６】
用語「改善」は、治療される疾病または疾患の１つ以上の症状、徴候および特徴における一時的か、または長期的な阻止、予防、軽減または改善を含む。
【００６７】
本明細書で使用する用語「対象」または「患者」とは、治療を必要としている哺乳類を指す。
【００６８】
１つ以上のさらなる治療薬「と組み合わせる」本発明のＴＩＭの投与は、同時（併用）投与および連続投与を含むことを意図している。連続投与は、様々な順番で様々な投与法による、治療薬および本発明のＴＩＭの対象への投与を包含することを意図している。
【００６９】
本明細書において、用語「約」とは、公称値から＋／−１０％の偏差を指す。かかる偏差は、具体的に言及されているかを問わず、本明細書に記載した任意の所与の値に常に含まれることが理解されるものとする。
【００７０】
自然発生的アミノ酸は、ペプチド分野おいて一般に認められ、生化学命名法でのＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ委員会によって推奨されている、従来の３文字または以下に表示する１文字略語によって全体にわたり識別する。
【００７１】
【表１】
2009502983.tif 000002
【００７２】
本明細書に提示するペプチド配列はＮ末端アミノ酸が左方に、Ｃ末端アミノ酸が右方にある、一般に認められている慣習に従い記載してある。さらに慣習によって、Ｌ−アミノ酸を大文字で、またＤ−アミノ酸を小文字で表す。
【００７３】
標的抑制分子
前述のとおり、本発明の標的抑制分子（ＴＩＭ）は、１つ以上のＰＫＣイソフォームのための親和性を有し、従って標的ＰＫＣイソフォームに関連する抑制剤部分を標的にすることができるペプチド認識要素（ＰＲＥ）に動作可能なように関連する、タンパク質キナーゼ活性を抑制することができる、抑制剤部分を有する。
【００７４】
抑制剤分子とＰＲＥとの間の動作的結合は、２つの実体が生理学的条件下で容易に解離しないように強い結合であるか、または２つの実体に生理学的条件下で速やかに解離させる弱い（不安定な）結合であってもよい。
【００７５】
このように本発明のＴＩＭは、抑制剤部分およびＰＲＥ、ならびに任意にスペーサーを有する。以下により詳細に記載するように、ＰＲＥは定義済み構造のペプチドであり、抑制剤部分はペプチド性または非ペプチド性であってもよい、当技術分野で知られている多くのタンパク質キナーゼ抑制剤のうちの１つであってもよい。同様に、存在する場合は、スペーサーはペプチド性スペーサーまたは非ペプチド性スペーサーであってもよい。従って本発明の一実施例では、ＴＩＭは完全にペプチド性である。本発明のその他の実施例では、ＴＩＭはペプチド性および非ペプチド性成分の混合物である。
【００７６】
ＴＩＭは、抑制剤分子か、またはＰＲＥに共役する１つ以上のさらなる成分を有することができる。さらなる成分はまた、存在する場合は、スペーサーに共役することができる。かかるさらなる成分は、ＴＩＭを安定させる、さらなる標的を提供する、検出可能な標識を提供する、ＴＩＭの調製、単離および／または精製を容易にする、細胞組み込みを促進または容易にする、ＴＩＭの生理学的半減期を延長するなどの目的で作用することができる。当技術分野で知られている様々な化合物は、上に明記した目的のためにＴＩＭと共役することができる。
【００７７】
本発明は、ＴＩＭが適切なＰＲＥの選択により、特異的なＰＫＣイソフォーム、またはイソフォームのグループを標的とし得ることをさらに企図する。特異度は、必要に応じて、イソフォームまたは当該のイソフォームのための特異度を示す抑制剤部分の選択によって微調整することができる。
【００７８】
Ｉ．ペプチド認識要素
本発明のＴＩＭに含まれるペプチド認識要素（ＰＲＥ）は、長さで約５と約３０のアミノ酸残基間のペプチドであり、一般式（Ｉ）、またはそのレトロ型（一般式（Ｉ−Ｒ））によって表される配列を有し、
Ｘ−［（ＨＹ−ＨＢ）ｎ−リンカー］ｍ−（ＨＢ−ＨＹ）２−ＨＢ−（ＨＹ）ｍ−Ｚ（Ｉ）
Ｘ−（ＨＹ）ｍ−ＨＢ−（ＨＹ−ＨＢ）２−［リンカー−（ＨＢ−ＨＹ）ｎ］ｍ−Ｚ（Ｉ−Ｒ）
式中、
ＨＹは、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＰｈｅおよびＶａｌのグループから選択される１つから４つの疎水性アミノ酸残基のブロックを表し、
ＨＢは、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＬｙｓおよびＳｅｒのグループから選択される水素結合の形成が可能な１から４のアミノ酸残基のブロックを表し、
「リンカー」は１つから４つのＧｌｙ残基を表し、
ｎは１、２または３であり、
ｍは０または１であり、
ＸはペプチドのＮ末端またはその修飾型を表し、
ＺはペプチドのＣ末端またはその修飾型を表す。
【００７９】
一実施例では、本発明のＴＩＭに含まれるＰＲＥは、一般式（ＩＩ）、またはそのレトロ型（一般式（ＩＩ−Ｒ））によって表される配列を有し、
Ｘ−［（ＨＹ−ＨＢ１）ｎ−リンカー］ｍ−（ＨＢ−ＨＹ）２−ＨＢ２−（ＨＹ）ｍ−Ｚ（ＩＩ）
Ｘ−（ＨＹ）ｍ−ＨＢ２−（ＨＹ−ＨＢ）２−［リンカー−（ＨＢ１−ＨＹ）ｎ］ｍ−Ｚ（ＩＩ−Ｒ）
式中、
ＨＹ、ＨＢ、「リンカー」、ｎ、ｍ、ＸおよびＺは、式（Ｉ）のために前述したとおりであり、
ＨＢ１およびＨＢ２はＨＢブロックのサブブロックを表し、ここでＨＢ１はＨＢのために上に明記したグループから選択される１つから３つのアミノ酸残基より成り、またはＨＢ２はＨＢのために上に明記したグループから選択される１つまたは２つのアミノ酸残基より成る。
【００８０】
本発明のその他の実施例では、式（ＩＩ）または（ＩＩ−Ｒ）での「リンカー」は１つから３つのＧｌｙ残基を表す。さらなる実施例では、式（ＩＩ）または（ＩＩ−Ｒ）での「リンカー」は１つまたは２つのＧｌｙ残基を表す。
【００８１】
その他の実施例では、本発明のＴＩＭに含まれるＰＲＥは、一般式（ＩＩＩ）、またはそのレトロ型（一般式（ＩＩＩ−Ｒ））によって表される配列を有し、
Ｘ−（ＨＢ−ＨＹ）２−ＨＢ２−（ＨＹ）ｍ−Ｚ（ＩＩＩ）
Ｘ−（ＨＹ）ｍ−ＨＢ２−（ＨＹ−ＨＢ）２−Ｚ（ＩＩＩ−Ｒ）
式中、
ＨＹ、ＨＢ、ＨＢ２、ｍ、ＸおよびＺは、式（ＩＩ）のために前述したとおりである。
【００８２】
その他の実施例では、ＰＲＥは一般式（ＩＶ）、またはそのレトロ型（一般式（ＩＶ−Ｒ））によって表される配列を有し、
Ｘ−（ＨＢ−ＨＹ）２−ＨＢ２−Ｚ（ＩＶ）
Ｘ−ＨＢ２−（ＨＹ−ＨＢ）２−Ｚ（ＩＶ−Ｒ）
式中、
ＨＹ、ＨＢ、ＨＢ２、ＸおよびＺは、式（ＩＩＩ）のために前述したとおりである。
【００８３】
その他の実施例では、本発明のＴＩＭに含まれるＰＲＥは、一般式（Ｖ）、またはそのレトロ型（一般式（Ｖ−Ｒ））によって表される配列を有し、
Ｘ−（ＨＢ−ＨＹ）２−ＨＢ２−ＨＹ−Ｚ（Ｖ）
Ｘ−ＨＹ−ＨＢ２−（ＨＹ−ＨＢ）２−Ｚ（Ｖ−Ｒ）
式中、
ＨＹ、ＨＢ、ＨＢ２、ＸおよびＺは、式（ＩＩＩ）のために前述したとおりである。
【００８４】
本発明のその他の実施例では、式（Ｖ）または（Ｖ−Ｒ）では、ＨＢはＨＢのために上に明記したグループから選択される１つまたは２つのアミノ酸残基より成る。本発明のさらなる実施例では、式（Ｖ）または（Ｖ−Ｒ）では、ＨＢ２はＨＢのために上に明記したグループから選択される１つのアミノ酸残基より成る。
【００８５】
本発明の代替の実施例では、ＰＲＥは一般式（ＶＩ）、またはそのレトロ型（一般式（ＶＩ−Ｒ））によって表される配列を有し、
Ｘ−（ＨＹ−ＨＢ１）ｎ−リンカー−（ＨＢ−ＨＹ）２−ＨＢ２−（ＨＹ）ｍ−Ｚ（ＶＩ）
Ｘ−（ＨＹ）ｍ−ＨＢ２−（ＨＹ−ＨＢ）２−リンカー−（ＨＢ１−ＨＹ）ｎ−Ｚ（ＶＩ−Ｒ）
式中、
ＨＹ、ＨＢ、ＨＢ１、ＨＢ２、「リンカー」、ｎ、ｍ、ＸおよびＺは、式（ＩＩ）のために前述したとおりである。
【００８６】
その他の実施例では、ＰＲＥは一般式（ＶＩＩ）、またはそのレトロ型（一般式（ＶＩＩ−Ｒ））によって表される配列を有し、
Ｘ−（ＨＹ−ＨＢ１）３−リンカー−（ＨＢ−ＨＹ）２−ＨＢ２−ＨＹ−Ｚ（ＶＩＩ）
Ｘ−ＨＹ−ＨＢ２−（ＨＹ−ＨＢ）２−リンカー−（ＨＢ１−ＨＹ）３−Ｚ（ＶＩＩ−Ｒ）
式中、
ＨＹ、ＨＢ、ＨＢ１、ＨＢ２、「リンカー」、ＸおよびＺは、式（ＶＩ）のために前述したとおりである。
【００８７】
本発明のその他の実施例では、式（ＶＩＩ）または（ＶＩＩ−Ｒ）では、ＨＢおよびＨＢ１はＨＢのために上に明記したグループから選択される１つまたは２つのアミノ酸残基より成る。さらなる実施例では、式（ＶＩＩ）または（ＶＩＩ−Ｒ）では、ＨＢ２はＨＢのために上に明記したグループから選択される１つのアミノ酸残基より成る。
【００８８】
本発明のその他の実施例では、ＰＲＥは一般式（ＶＩＩＩ）、またはそのレトロ型（一般式（ＶＩＩＩ−Ｒ））によって表される配列を有し、
Ｘ−ＨＹ−ＨＢ１−リンカー−（ＨＢ−ＨＹ）２−ＨＢ２−ＨＹ−Ｚ    （ＶＩＩＩ）
Ｘ−ＨＹ−ＨＢ２−（ＨＹ−ＨＢ）２−リンカー−ＨＢ１−ＨＹ−Ｚ（ＶＩＩＩ−Ｒ）
式中、
ＨＹ、ＨＢ、ＨＢ１、ＨＢ２、「リンカー」、ＸおよびＺは、式（ＶＩ）のために前述したとおりである。
【００８９】
本発明のその他の実施例では、式（ＶＩＩＩ）または（ＶＩＩＩ−Ｒ）では、ＨＢはＨＢのために上に明記したグループから選択される１つまたは２つのアミノ酸残基より成る。さらなる実施例では、式（ＶＩＩＩ）または（ＶＩＩＩ−Ｒ）では、ＨＢ２はＨＢのために上に明記したグループから選択される１つのアミノ酸残基より成る。
【００９０】
本発明のその他の実施例では、式（ＶＩ）、（ＶＩ−Ｒ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩ−Ｒ）、（ＶＩＩＩ）または（ＶＩＩＩ−Ｒ）では、「リンカー」は１つから３つのＧｌｙ残基を表す。本発明のさらなる実施例では、式（ＶＩ）、（ＶＩ−Ｒ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩ−Ｒ）、（ＶＩＩＩ）または（ＶＩＩＩ−Ｒ）では、「リンカー」は１つまたは２つのＧｌｙ残基を表す。
【００９１】
本発明のさらなる実施例では、ＰＲＥは長さで約２５未満のアミノ酸残基である。その他の実施例では、ＰＲＥは長さで約５と約２５との間のアミノ酸残基である。さらなる実施例では、ＰＲＥは長さで約６と約２５との間のアミノ酸残基である。その他の実施例では、ＰＲＥは長さで約７と約２５との間のアミノ酸残基である。その他の実施例では、ＰＲＥは長さで約２２未満のアミノ酸残基である。その他の実施例では、ＰＲＥは長さで約５と約２２との間のアミノ酸残基、長さで約６と約２２との間のアミノ酸残基、長さで約７と約２２との間のアミノ酸残基、長さで約７と約２０との間のアミノ酸残基、長さで約８と約２０との間のアミノ酸残基、および長さで約１０と約２０との間のアミノ酸残基である。
【００９２】
本発明はまた、ＰＲＥが式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）または（ＶＩＩＩ）のいずれか１つのレトロ型、インベルソ型、またはレトロ−インベルソ型であることを企図する。本発明の一実施例では、ＰＲＥは一般式（Ｉ）のレトロ型である配列を有する。他の実施例では、ＰＲＥは一般式（Ｉ）のインベルソ型である配列を有する。さらなる実施例では、ＰＲＥは一般式（Ｉ）のレトロ−インベルソ型である配列を有する。他の実施例では、ＰＲＥは一般式（ＩＩＩ）のレトロ型、インベルソ型またはレトロ−インベルソ型である配列を有する。
【００９３】
上記の式（Ｉ）、（Ｉ−Ｒ）、（ＩＩ）、（ＩＩ−Ｒ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩ−Ｒ）、（ＩＶ）、（ＩＶ−Ｒ）、（Ｖ）、（Ｖ−Ｒ）、（ＶＩ）、（ＶＩ−Ｒ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩ−Ｒ）、（ＶＩＩＩ）および（ＶＩＩＩ−Ｒ）でのＸおよびＺは、それぞれ遊離アミノ（Ｎ）末端および遊離カルボキシ（Ｃ）末端、または修飾Ｎ末端およびＣ末端を表すことができる。従って、ＰＲＥは修飾Ｎ末端、修飾Ｃ末端、または修飾Ｎ末端および修飾Ｃ末端の両方を有することができる。ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端を修飾するために適切な化学置換基の例は当技術分野で知られており、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミノ、アリール、アラルキル、ヘテロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アラルキルオキシ、アリールオキシ、カルボキシ、アシル、アロイル、ハロ、ニトロ、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アラルコキシカルボニル、アシルアミノ、アロイルアミノ、ジアルキルアミノ、カルバモイル、アルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、アルキルチオ、アラルキルチオ、アリールチオ、アルキレン、ならびにＺ１およびＺ２が独立して水素、アルキル、アリール、またはアラルキルであるＮＺ１Ｚ２などを含むが、それらに限定されない。Ｆｍｏｃ（フルオレニルメチル−Ｏ−ＣＯ−）、カルボベンゾキシ（ベンジル−Ｏ−ＣＯ−）、モノメトキシスクシニル、ナフチル−ＮＨ−ＣＯ−、アセチルアミノ−カプロイルおよびアダマンチル−ＮＨ−ＣＯ−などの保護基もまた使用することができる。本発明によって企図される他の修飾は、例えば、Ｃ末端アミド化、エステル化、ヒドロキシメチル修飾、およびＯ−修飾（例えば、Ｃ末端ヒドロキシメチルベンジルエーテル）、および、アルキルアミドおよびヒドラジドの置換アミドなどのＮ末端修飾を含む。
【００９４】
本発明の一実施例では、Ｘはアシル基で修飾したＮ末端を表す。適切なアシル基の限定されない例は、ベンゾイル、アセチル、ｔ−ブチルアセチル、ｐ−フェニルベンゾイル、トリフルオロアセチル、シクロヘキシルカルボニル、フェニルアセチル、４−フェニルブタノイル、３，３−ジフェニルプロパノイル、４−ビフェニルアセチル、ジフェニルアセチル、２−ナフチルアセチル、３−フェニルブタノイル、α−フェニル−オルト−トルオイル、インドール−３−アセチル、３−インドールプロパノイル、３−インドールブタノイル、４−（４−メトキシフェニル）ブタノイルなどである。その他の実施例では、Ｘはアセチル基で修飾したＮ末端を表す。その他の実施例では、Ｚはアミノ基で修飾したＣ末端を表す。
【００９５】
ＰＲＥは１つ以上の非自然発生的アミノ酸を有することができる。適切な非自然発生的アミノ酸は当技術分野で知られており、上記に掲載したものを含む。当業者は、電荷、大きさ、極性、疎水性など、置換される天然型アミノ酸の特徴の検討に基づきＰＲＥに含有するための適切な非自然発生的アミノ酸を容易に選択できるであろう。ＰＲＥが２つ以上の非自然発生的アミノ酸を有する場合、非自然発生的アミノ酸は同じであっても、または異なっていてもよい。一実施例では、ＰＲＥは１つ以上のＤ−アミノ酸を有する。その他の実施例では、ＰＲＥはインベルソ配列であり、すなわち、含有するすべてがＤ−アミノ酸である。
【００９６】
本発明のＰＲＥに含まれるアミノ酸残基は、ペプチド結合によって連結される。ペプチド結合は、自然発生的または非自然発生的（修飾）ペプチド結合であってもよい。適切な修飾ペプチド結合の例は当技術分野で知られており、上記に掲載されたものを含む。ＰＲＥは１つ以上の修飾ペプチド結合を有することができる。ＰＲＥが２つ以上の修飾ペプチド結合を有する場合、修飾ペプチド結合は同じであっても、または異なっていてもよい。
【００９７】
本発明のＴＩＭに含有するために適切なＰＲＥの典型的な、限定されない例を表２に記載する。特定の実施例では、ＰＲＥは、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４および配列番号：３５、またはＰＲＥのＮ末端およびＣ末端のそれぞれが独立して遊離か、もしくは修飾される、それらのレトロ型、インベルソ型もしくはレトロ−インベルソ型のグループから選択されるアミノ酸配列を有する、長さで約３０未満のアミノ酸残基である。他の実施例では、ＰＲＥは、ＰＲＥ１、ＰＲＥ２、ＰＲＥ３、ＰＲＥ４、ＰＲＥ５、ＰＲＥ６、ＰＲＥ７、ＰＲＥ８、ＰＲＥ９、ＰＲＥ１０、ＰＲＥ１１、ＰＲＥ１２、ＰＲＥ１３、ＰＲＥ１４、ＰＲＥ１５、ＰＲＥ１６、ＰＲＥ１７、ＰＲＥ１８、ＰＲＥ１９、ＰＲＥ２０、ＰＲＥ２１、ＰＲＥ２２、ＰＲＥ２３、ＰＲＥ２４、ＰＲＥ２５、ＰＲＥ２６、ＰＲＥ２７、ＰＲＥ２８、ＰＲＥ２９、ＰＲＥ３０、ＰＲＥ３１、ＰＲＥ３２、ＰＲＥ３３、ＰＲＥ３４およびＰＲＥ３５のグループから選択されるアミノ酸配列を有する、長さで約３０未満のアミノ酸である（表２に示すように）。さらなる実施例では、ＰＲＥは、ＰＲＥ１、ＰＲＥ２、ＰＲＥ３、ＰＲＥ４、ＰＲＥ５、ＰＲＥ６、ＰＲＥ７、ＰＲＥ８、ＰＲＥ９、ＰＲＥ１０、ＰＲＥ１１、ＰＲＥ１２、ＰＲＥ１３、ＰＲＥ１４、ＰＲＥ１５、ＰＲＥ１６、ＰＲＥ１７、ＰＲＥ１８、ＰＲＥ１９、ＰＲＥ２０、ＰＲＥ２１、ＰＲＥ２２、ＰＲＥ２３、ＰＲＥ２４およびＰＲＥ２５のグループから選択されるアミノ酸配列を有する、長さで約３０未満のアミノ酸である（表２に示すように）。
【００９８】
【表２】
2009502983.tif 000003
【００９９】
本発明はまた、一般式（Ｉ）のキメラ型である配列を有する、すなわち、結合される一般式（Ｉ）の２つ以上の配列を有するＰＲＥを企図する。従って一実施例では、本発明は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４および配列番号：３５、またはＰＲＥのＮ末端およびＣ末端のそれぞれが独立して遊離か、もしくは修飾される、それらのレトロ型、インベルソ型もしくはレトロ−インベルソ型の１つ以上のアミノ酸配列を有する、長さで約３０未満のアミノ酸残基のＰＲＥを提供する。
【０１００】
ＩＩ．抑制剤部分
様々な既知のタンパク質キナーゼ抑制剤は、抑制剤部分として本発明のＴＩＭに含むことができる。一般に、１つ以上のＰＫＣイソフォームを抑制することができるタンパク質キナーゼ抑制剤が選択される。その際、抑制剤部分は、ＰＫＣ−αおよび他のタンパク質キナーゼを抑制することができる広域スペクトルタンパク質キナーゼ抑制剤、１つ以上のＰＫＣイソフォームを抑制することができるＰＫＣに特異的な抑制剤、または特定のＰＫＣイソフォームを抑制することができるＰＫＣ−イソフォームに特異的な抑制剤であってもよい。
【０１０１】
多様なタンパク質キナーゼ抑制剤が当技術分野で知られており、多くが市販されている（例えば、Ｂｉａｆｆｉｎ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ  ＫＧ、ドイツ、カッセル、ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カルフォルニア州、サンディエゴおよびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイスから）。適切なタンパク質キナーゼ抑制剤の例は、アピゲニン；ビスインドールイルマレイミドＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶ；カルフォスチンＣ；カルディオトキシン（Ｎａｊａｎｉｇｒｉｃｏｌｌｉｓ）；ヘレリスリン；コリンヘキサデシルリン酸塩；塩化デカリニウム；エデルホシン（エデルホシナまたはＥＴ１８ＯＣＨ３としても知られている）；エラグ酸；ゲニステイン；Ｇｏ６９７６；Ｈ−７（１−（５−イソキノリンスルホニル）−２−メチルピペラジン）；Ｈ−８（Ｎ−［２−（メチルアミノ）エチル］−５−イソキノリンスルホンアミド）；Ｈ−９（Ｎ−（２−アミノエチル）−５−イソキノリンスルホンアミド）；Ｈ−８９（Ｎ−［２−（ｐ−ブロモシンナミルアミノ）エチル］−５−イソキノリンスルホンアミド）；ＨＡ−１００（１−（５−イソキノリンスルホニル）ピペラジン）；ＨＡ−１００４（Ｎ−（２−グアニジノエチル）−５−イソキノリンスルホンアミド）；ＨＢＤＤＥ（２，２’，３，３’，４，４’−ヘクサヒドロキシ−１，１’−ビフェニル−６，６’−ジメタノールジメチルエーテル）；ヒスピジン；ヒペリシン；Ｋ−２５２ａ；メリチン；ＭＬ−７（１−（５−ヨードナフタレン−１−スルホニル）−１Ｈ−ヘキサヒドロ−１，４−ジアゼピン）；ミリセチン；ＮＧＩＣ−Ｉ（非グリコシドインドロカルバゾールＩ）；パルミトイル−ＤＬ−カルニチン；フロレチン；ピセアタンノール；硫酸ポリミキシンＢ；タンパク質キナーゼＣフラグメント１９−３６；シュードヒペリシン；ケルセチン；ロッテルリン；サンギバマイシン；スタウロスポリン；タモキシフェンおよびＴＥＲ１４６８７を含むが、それらに限定されない。
【０１０２】
本発明の一実施例では、抑制剤部分は、約５と約２０との間のアミノ酸を有するタンパク質キナーゼ抑制（ＰＫＩ）化合物であり、一般式（ＩＸ）を有し、
（Ｃ１）Ｊ（Ｍ）−ＮｙＢｚＡｘＢｙＮｙＢｘ（ＩＸ）
式中、
Ｃ１はＮｘＢｙ（Ａ／Ｎ）ｘＢｙＮｙであり、Ｃ１のＮ−またはＣ末端からのペプチド結合によりＪに結合され、
Ｊは、Ｃｙｓ、ＬｙｓおよびＨｉｓのグループから選択される１〜４つのアミノ酸残基であり、
Ｍは存在しないか、またはＩｌｅ、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＧｌｙのグループから選択されるアミノ酸へ任意に連結されるＡＴＰ模倣剤部分であり、また側鎖またはＪのＬｙｓ残基のうちの１つの前記Ｎ末端もしくはＪの前記Ｃｙｓ残基のうちの１つの前記Ｎ末端を介してＪに結合され、
Ｎはそれぞれ独立してＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＧｌｙであり、
Ｂはそれぞれ独立してＡｒｇ、ＬｙｓまたはＴｙｒであり、
Ａはそれぞれ独立してＰｈｅ、ＨｉｓまたはＴｒｐであり、
ｘはそれぞれ独立して０〜１であり、
ｙはそれぞれ独立して０〜２であり、
ｚ＝０〜３であり、
配列ＮｙＢｚＡｘＢｙＮｙＢｘは長さで２つ以上のアミノ酸であり、
式中、
Ｊが１つのＣｙｓ残基を有する、またはＣｙｓ残基を持たない場合は、式（ＩＸ）の前記化合物は単一のペプチド鎖を有し、Ｃ１は、Ｃ１の前記Ｃ末端からのペプチド結合を介してＪの前記Ｎ末端アミノ酸に結合され、
Ｊが２つ以上のＣｙｓ残基を有する場合は、少なくとも２つの前記Ｃｙｓ残基は、ジスルフィド結合によって連結され、その結果式（ＩＸ）の前記化合物は、第１の前記少なくとも２つのＣｙｓ残基およびＣ１を有する第１のペプチド鎖、ならびに前記少なくとも２つのＣｙｓ残基および配列−ＮｙＢｚＡｘＢｙＮｙＢｘを有する第２のペプチド鎖を有し、
Ｍが存在しない場合は、前記配列−ＮｙＢｚＡｘＢｙＮｙＢｘは少なくとも１つのＰｈｅまたはＴｒｐを含有する。
【０１０３】
当業者は、ＭがＩｌｅ、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＧｌｙ残基を有する場合、ＡＴＰ部分はＪに直接連結することができる、またはＩｌｅ、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＧｌｙ残基を介してＪに結合することができることを理解するであろう。同様に、Ｊがジスルフィド結合によって連結される２つのＣｙｓ残基およびＣｙｓ、ＨｉｓまたはＬｙｓから選択される１〜２つの他のアミノ酸を有する場合、Ｃ１および配列−ＮｙＢｚＡｘＢｙＮｙＢｘは、ジスルフィド結合を構成するそれぞれのＣｙｓ残基に直接、または１つ以上の介在Ｃｙｓ、ＨｉｓまたはＬｙｓ残基を介して結合することができる。
【０１０４】
本発明の一実施例では、式（ＩＸ）のＰＫＩ化合物は、修飾したＮ末端および／またはＣ末端を有する。
【０１０５】
本発明のその他の実施例では、式（ＩＸ）のＰＫＩ化合物は、１つ以上の酸性アミノ酸残基を有する、長さで１つと４つとの間のアミノ酸の「タグ」を含むようＣ末端で修飾される。タグに含まれる他の非酸性アミノ酸残基は、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、ＬｅｕおよびＬｙｓのグループから選択される。ＰＫＩ化合物のＣ末端で加えることができる適切なタグの例は、Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ；Ａｓｐ−Ａｓｐ、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ；Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ；Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−ＬｙｓおよびＧｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐを含むが、それらに限定されない。
【０１０６】
その他の実施例では、Ｊはジスルフィド結合によって連結される２つのＣｙｓ残基および式（ＩＸ）の化合物を有し、その結果、前記２つのＣｙｓ残基のうちの第１の残基のＮまたはＣ末端に結合されるＣ１を有する第１のペプチド鎖、および前記２つのＣｙｓ残基のうちの第２の残基のＣ末端に結合される配列−ＮｙＢｚＡｘＢｙＮｙＢｘを有する第２のペプチド鎖を有する。
【０１０７】
その他の実施例では、Ｊはジスルフィド結合によって連結される２つのＣｙｓ残基および式（ＩＸ）の化合物を有し、その結果、前記２つのＣｙｓ残基のうちの第１の残基のＣ末端に結合されるＣ１を有する第１のペプチド鎖、および前記２つのＣｙｓ残基のうちの第２の残基のＣ末端に結合される配列−ＮｙＢｚＡｘＢｙＮｙＢｘを有する第２のペプチド鎖を有する。
【０１０８】
本発明のその他の実施例では、式（ＩＸ）のＰＫＩ化合物では、Ｃ１および−ＮｙＢｚＡｘＢｙＮｙＢｘのそれぞれは長さで２つ以上のアミノ酸残基である。本発明のその他の実施例では、式（Ｉ）のＰＫＩ化合物は、−ＮｙＢｚＡｘＢｙＮｙＢｘは長さで３つ以上のアミノ酸残基である。さらなる実施例では、Ｃ１および−ＮｙＢｚＡｘＢｙＮｙＢｘのうちの少なくとも１つは、長さで３つ以上のアミノ酸残基である。その他の実施例では、Ｃ１および−ＮｙＢｚＡｘＢｙＮｙＢｘの両方が、長さで３つ以上のアミノ酸残基である。その他の実施例では、Ｃ１およびＮｙＢｚＡｘＢｙＮｙのそれぞれが、長さで４つ以上のアミノ酸残基である。
【０１０９】
本発明のその他の実施例では、式（ＩＸ）のＰＫＩ化合物は一般式（Ｘ）を有し、
（Ｃ１）Ｊ（Ｍ）−ＮｙＢｚＡｘＢｙＮｙ（Ｘ）
式中、
Ｃ１はＮｘＢｙ（Ａ／Ｎ）ｘＢｙＮｙであり、Ｃ１のＮまたはＣ末端からのペプチド結合によりＪに結合され、
Ｊは、Ｃｙｓ、ＬｙｓおよびＨｉｓのグループから選択される１〜４つのアミノ酸残基であり、
Ｍは存在しないか、またはＩｌｅ、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＧｌｙのグループから選択されるアミノ酸へ任意に連結されるＡＴＰ模倣剤部分であり、また側鎖またはＪのＬｙｓ残基のうちの１つの前記Ｎ末端もしくはＪの前記Ｃｙｓ残基のうちの１つの前記Ｎ末端を介してＪに結合され、
Ｎはそれぞれ独立してＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＧｌｙであり、
Ｂはそれぞれ独立してＡｒｇ、ＬｙｓまたはＴｙｒであり、
Ａはそれぞれ独立してＰｈｅ、ＨｉｓまたはＴｒｐであり、
ｘはそれぞれ独立して０〜１であり、
ｙはそれぞれ独立して０〜２であり、
ｚ＝０〜３であり、
配列ＮｙＢｚＡｘＢｙＮｙは長さで２つ以上のアミノ酸であり、
式中、
Ｊが１つのＣｙｓ残基を有する、またはＣｙｓ残基を持たない場合は、式（Ｘ）の前記化合物は単一のペプチド鎖を有し、Ｃ１はＣ１の前記Ｃ末端からのペプチド結合を介してＪの前記Ｎ末端アミノ酸に結合され、
Ｊが２つ以上のＣｙｓ残基を有する場合は、少なくとも２つの前記Ｃｙｓ残基はジスルフィド結合によって連結され、その結果式（Ｘ）の前記化合物は、
前記少なくとも２つのＣｙｓ残基のうちの第一の残基およびＣ１を有する第１のペプチド鎖、ならびに前記少なくとも２つのＣｙｓ残基のうちの第二の残基および配列−ＮｙＢｚＡｘＢｙＮｙＢｘを有する第２のペプチド鎖を有する。
【０１１０】
本発明のその他の実施例では、式（ＩＸ）のＰＫＩ化合物は一般式（ＸＩ）を有し、
（Ｃ２）Ｊ（Ｍ）−ＮｙＢｚＡｘＢｙＮｙ（ＸＩ）
式中、
Ｃ２はＢｙ（Ａ／Ｎ）ｘＢｙＮｙであり、Ｃ２のＮまたはＣ末端からのペプチド結合によりＪに結合され、
Ｊは２つのＣｙｓ残基ならびに任意に、ＨｉｓおよびＬｙｓから選択される、１〜２つの残基を有し、Ｃｙｓ残基はジスルフィド結合によって連結され、その結果式（Ｉ）の前記化合物は、
前記２つのＣｙｓ残基のうちの第１の残基およびＣ２を有する第１のペプチド鎖、ならびに前記２つのＣｙｓ残基のうちの第二の残基および配列−ＮｙＢｚＡｘＢｙＮｙＢｘを有する第２のペプチド鎖を有し、
ＭはＩｌｅ、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＧｌｙのグループから選択されるアミノ酸に任意に連結されるＡＴＰ模倣剤部分であり、ＪのＣｙｓ残基の１つのＮ末端を介してＪに結合され、
Ｎ、Ｂ、Ａ、ｘ、ｙおよびｚは、式（ＩＸ）のために前述したとおりである。
【０１１１】
さらなる実施例では、ＰＫＩ化合物は一般式（ＸＩ）を有し、式中、
Ｊは２つのＣｙｓ残基ならびに任意に、ＨｉｓおよびＬｙｓから選択される、１〜２つの残基を有し、Ｃｙｓ残基はジスルフィド結合によって連結され、その結果式（ＸＩ）の前記化合物は、
前記２つのＣｙｓ残基ののうちの第１の残基のＣ末端に結合されるＣ２を有する第１のペプチド鎖、および 前記２つのＣｙｓ残基のうちの第２の残基のＣ末端に結合される配列−ＮｙＢｚＡｘＢｙＮｙＢｘを有する第２のペプチド鎖を有する。
【０１１２】
本発明のその他の実施例では、式（ＩＸ）のＰＫＩ化合物は一般式（ＸＩＩ）を有し、
ＮｘＢｙ（Ａ／Ｎ）ｘＢｙＮｙ−Ｊ（Ｍ）−ＮｙＢｚＡｘＢｙＮｙＢｘ（ＸＩＩ）
式中、
Ｊは１〜２つのＬｙｓ残基または１つのＣｙｓ基であり、
Ｍは存在しないか、またはＪのＬｙｓ残基の１つの側鎖もしくはＪのシステイン残基のＮ末端を介してＪに結合されるＡＴＰ模倣剤部分であり、
Ｎ、Ｂ、Ａ、ｘ、ｙおよびｚは、式（ＩＸ）のために前述したとおりである。
【０１１３】
本発明のその他の実施例では、式（ＩＸ）のＰＫＩ化合物は一般式（ＸＩＩＩ）を有し、
ＮｘＢｙ（Ａ／Ｎ）ｘＢｙＮｙ−Ｊ（Ｍ）−ＮｙＢｚＡｘＢｙＮｙ（ＸＩＩＩ）
式中、
Ｊは１〜２つのＬｙｓ残基であり、
ＭはＬｙｓ残基の１つの側鎖を介してＪに結合されるＡＴＰ模倣剤部分であり、
Ｎ、Ｂ、Ａ、ｘ、ｙおよびｚは、式（ＩＸ）のために前述したとおりである。
【０１１４】
本発明のその他の実施例では、式（ＩＸ）のＰＫＩ化合物は一般式（ＸＩＶ）を有し、
ＮｘＢｙ（Ａ／Ｎ）ｘＢｙＮｙ−Ｊ−ＮｙＢｚＡＢｙＮｙ（ＸＩＶ）
式中、
Ｊは１つのＣｙｓ残基ならびに任意に、ＨｉｓおよびＬｙｓから選択される、１〜２つの残基を有し、
Ｎ、Ｂ、Ａ、ｘ、ｙおよびｚは、式（ＩＸ）のために前述したとおりである。
【０１１５】
本発明のさらなる実施例では、式（ＩＸ）のＰＫＩ化合物は、
式（ＸＶ）：（Ｃ１）−Ｌｙｓ（Ｍ）−ＮｙＢｚＡｘＢｙＮｙＢｘ（ＸＶ）；
式（ＸＶＩ）：（Ｃ１）−［Ｌｙｓ−Ｌｙｓ］（Ｍ）−ＮｙＢｚＡｘＢｙＮｙＢｘ（ＸＶＩ）；
式（ＸＶＩＩ）：（Ｃ１）−Ｃｙｓ−ＮｙＢｚＡｘＢｙＮｙＢｘ（ＸＶＩＩ）；
式（ＸＶＩＩＩ）：（Ｃ１）−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ（Ｍ）−ＮｙＢｚＡｘＢｙＮｙＢｘ（ＸＶＩＩＩ）；
式（ＸＩＸ）：  Ｍ−Ｃｙｓ−（Ｌｙｓ／Ｈｉｓ）ｙ−ＮｙＢｚＡｘＢｙＮｙＢｘ（ＸＩＸ）；
【数１】
2009502983.tif 000004
【数２】
2009502983.tif 000005
【数３】
2009502983.tif 000006
【数４】
2009502983.tif 000007
【数５】
2009502983.tif 000008
のグループから選択される式を有し、
式中、
−−−はジスルフィド結合を表し、
Ｃ１、Ｍ、Ｎ、Ａ、Ｂ、ｘ、ｙおよびｚは、式（ＩＸ）のために前述したとおりである。
【０１１６】
本発明のその他の実施例では、式（ＩＸ）のＰＫＩ化合物は、
ＢＡＢＢＪ（Ｍ）ＢＮＢ（ＸＸＶ）；
ＢＡＢＢＪ（Ｍ）ＮＢＮ（ＸＸＶＩ）；
ＢＮＢＢＮＪ（Ｍ）ＢＡＮ（ＸＸＶＩＩ）；
ＡＢＢＪＡＢＮ（ＸＸＶＩＩＩ）；
ＢＮＢＢＮＪＭＮＮＮＮ（ＸＸＩＸ）；
ＢＮＢＢＮＪ（Ｍ）ＮＮＮ（ＸＸＸ）；
ＮＢＢＮＪ（Ｍ）ＮＮ（ＸＸＸＩ）；
ＡＢＢＪ（Ｍ）ＡＢＮ（ＸＸＸＩＩ）；
Ｊ（Ｍ）ＮＢＡＢＢ（ＸＸＸＩＩＩ）；
ＢＮＢＢＪ（Ｍ）ＮＢ（ＸＸＸＩＶ）；
ＢＮＢＢＮＪ（Ｍ）ＮＮＮ（ＸＸＸＶ）；
ＢＡＢＢＮＪ（Ｍ）ＮＮＡ（ＸＸＸＶＩ）；
ＡＢＢＪ（Ｍ）ＮＮ（ＸＸＸＶＩＩ）；
ＢＡＢＢＮＪ（Ｍ）ＮＮＢ（ＸＸＸＶＩＩＩ）；
【数６】
2009502983.tif 000009
のグループから選択される式を有し、
式中、
Ｍ、Ｊ、Ｎ、ＡおよびＢは、式（ＩＸ）のために前述したとおりである。
【０１１７】
本発明のその他の実施例では、式（ＩＸ）のＰＫＩ化合物は、約５と約１８との間のアミノ酸残基を有する。さらなる実施例では、式（ＩＸ）のＰＫＩ化合物は、約５と約１６との間のアミノ酸残基を有する。その他の実施例では、式（ＩＸ）のＰＫＩ化合物は、約６と約２０との間のアミノ酸残基を有する。その他の実施例では、式（ＩＸ）のＰＫＩ化合物は、約６と約１８との間のアミノ酸残基を有する。その他の実施例では、式（ＩＸ）のＰＫＩ化合物は、約７と約２０との間のアミノ酸残基を有する。その他の実施例では、式（ＩＸ）のＰＫＩ化合物は、約７と約１８との間のアミノ酸残基を有する。
【０１１８】
本発明のその他の実施例では、式（ＩＸ）のＰＫＩ化合物は、表３に示す１つ以上のアミノ酸配列を有する。
【０１１９】
【表３】
2009502983.tif 000010
【０１２０】
本発明によって企図されるＰＫＩ化合物は、以下の例示的な化合物、
【化３】
2009502983.tif 000011
2009502983.tif 000012
2009502983.tif 000013
を含むが、それらに限定されない。
【０１２１】
上記の一般式（Ｉ）に示したように、ＰＫＩ化合物は単一のアミノ酸鎖状、または２つの架橋アミノ酸鎖状であってもよい。本発明の文脈では、「アミノ酸鎖」はペプチド結合によって連結するアミノ酸残基の配列である。
【０１２２】
ＰＫＩ化合物は１つまたは２つ以上の非自然発生的アミノ酸を有することができる。ＰＫＩ化合物が２つ以上の非自然発生的アミノ酸を有する場合、非自然発生的アミノ酸は同じであっても、または異なっていてもよい。
【０１２３】
ＰＫＩ化合物は遊離アミノ末端および／またはカルボキシ末端、または修飾アミノおよび／またはカルボキシ末端を有することができる。例えば、ＰＫＩ化合物のＮおよび／またはＣ末端は、化学置換基または他の化学修飾、保護基またはさらなるアミノ酸を含むように修飾することができる。ペプチドのアミノおよび／またはカルボキシ末端を修飾するために適切な化学置換基の例は当技術分野で知られており、例は上記に掲載してある。
【０１２４】
ＰＫＩ化合物の末端の１つに対する余分のアミノ酸の存在は、例えば、最終ＴＩＭの安定性の向上させる、同定、検出もしくは精製プロトコルに役立つ「タグ」を組み込む、溶解度を向上させる、または薬物動態学パラメーターを改善させるために望ましい場合がある。上で述べたように、本発明の一実施例では、ＰＫＩ化合物は１つ以上の酸性アミノ酸残基を有する、長さで１つと４つとの間のアミノ酸の「タグ」を含むようＣ末端で修飾する。ＰＫＩ化合物のＣ末端で１つ以上の酸性残基の追加することは、化合物と標的タンパク質キナーゼとの相互作用の改善に役立つことができる。タグに含まれる非酸性残基は、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、ＬｅｕおよびＬｙｓのグループから選択される。Ｃ末端側で加えることができる適切なタグの例は、Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ；Ａｓｐ−Ａｓｐ、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ；Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ；Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−ＬｙｓおよびＧｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐを含むが、それらに限定されない。
【０１２５】
本発明の一実施例では、ＰＫＩ化合物のＮ末端はアシル基で修飾する。その他の実施例では、Ｎ末端はアセチル基で修飾する。その他の実施例では、Ｃ末端はアミノ基で修飾する。
【０１２６】
ＰＫＩ化合物は１つまたは２つ以上の非自然発生的ペプチド結合を有することができる。ＰＫＩ化合物が２つ以上の非自然発生的ペプチド結合を有する場合、非自然発生的ペプチド結合は同じであっても、または異なっていてもよい。
【０１２７】
前述のとおり、ＰＫＩ化合物は２つのシステイン残基間でのジスルフィド結合を有することができる。本発明はまた、式（ＩＸ）のＰＫＩ化合物によって構成される２つのペプチド鎖を架橋するために適切な化学基の使用も企図する。そのような化学の例は当技術分野でよく知られている。
【０１２８】
前述のとおり、本発明の一実施例では、ＰＫＩ化合物はアデニンまたはアデニンの誘導体を含むＡＴＰ模倣剤部分を有する。本明細書で使用する「アデニンの誘導体」とは、アデニン（以下に示す）の芳香族複素環状構造を保持するが、環状構造および／またはアデニンと比較する場合、環状構造内の付加的な、より少数の、または異なるヘテロ原子に結合される、付加的な、より少数の、または異なる置換基を有してもよい化合物を指す。
【化４】
2009502983.tif 000014
【０１２９】
用語「アデニンの誘導体」とは、アデニンと等比体積である分子もさらに包含する。本発明の文脈では、アデニンと等比体積（「アデニン等量式」）である分子は、アデニンと構造および空間的定位の類似性、ならびに特に三次元的空間充填性に関して生じる性質の類似性を有する分子である。
【０１３０】
適切なアデニン誘導体は当技術分野で知られており、１−デアザアデニン；３−デアザアデニン；７−デアザアデニン；７−デアザ−８−アザアデニン；１−メチルアデニン；２−アミノアデニン；２−プロピルおよびアデニンの他の２−アルキル誘導体；２−アミノプロピルアデニン；８−アミノ、８−アザ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニン；８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン；Ｎ６−メチルアデニン；Ｎ６−イソペンテニルアデニン；２−アミノプリン；２，６−ジアミノプリン；２−アミノ−６−クロロプリン；６−チオ−２−アミノプリン；ヒポキサンチン；イノシン；キサンチン；２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシンおよびキサンチンの８−アザ誘導体；２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシンおよびキサンチンの７−デアザ−８−アザ誘導体；２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシンおよびキサンチンの１−デアザ誘導体；２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシンおよびキサンチンの７−デアザ誘導体；ならびに２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシンおよびキサンチンの３−デアザ誘導体；ならびに４−メチルインドールなどのアデニン等量式を含むが、それらに限定されない。
【０１３１】
本発明の一実施例によると、ＡＴＰ模倣剤部分は一般式（ＸＬＩ）のアデニンペプチド核酸（ＰＮＡ）である。
【化５】
2009502983.tif 000015
式中、
Ｒ１およびＲ２は、カルボキシル、カルボニル、アルコールまたは一級アミノ（すなわち、−ＣＯＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、式中ＲはアルキルまたはＨ、−ＯＨまたは−ＮＨ２）と独立して置換されるアルキルである。
【０１３２】
本発明の一実施例では、式（ＸＬＩ）では、Ｒ１は−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、Ｒ２は−ＣＨ２ＣＯＯＨである。
【０１３３】
式（ＩＸ）のＰＫＩ化合物では、ＡＴＰ部分（Ｍ）は、存在する場合、当技術分野で知られている多くの標準連結基を使用してペプチド部分に連結することができる。本発明の一実施例では、ＡＴＰ模倣剤部分は、芳香族複素環状構造での窒素原子に結合される連結基を介してＰＫＩ化合物のペプチド部分に結合される。アデニンのＮ６などの、置換アミノ基による結合もまた企図する。
【０１３４】
ＡＴＰ模倣剤部分を一般式（ＸＬＩ）のアデニンペプチド核酸（ＰＮＡ）として与える本発明の一実施例によると、この部分は、ペプチド部分のＮ末端ＮＨ２基もしくはＣ末端ＣＯ２Ｈ基、またはペプチド部分でのリジンまたはアルギニン残基の側鎖でのアミン基とのペプチド結合の形成によりペプチド部分に連結することができる。
【０１３５】
本発明の一実施例では、ＰＫＩ化合物は、Ｎ末端ＮＨ２基に対するペプチド結合によってペプチド部分に結合されるＡＴＰ模倣剤部分として、一般式（ＸＬＩ）のアデニンＰＮＡを有する。その他の実施例では、一般式（ＸＬＩ）のアデニンＰＮＡは、リジン残基の側鎖でのアミン基に対するペプチド結合によってペプチド部分に結合される。
【０１３６】
ＩＩＩ．スペーサー
前述のとおり、ＰＲＥおよび抑制剤部分は、直接的に結び付けるか、適切なスペーサーを介して間接的に結び付けることができる。
【０１３７】
本発明の文脈では、スペーサーはＴＩＭの２つの実体（すなわち、抑制剤部分およびＰＲＥ）を連結する分子ブリッジとしてとして機能する。スペーサーは、例えば、単に２つの実体を連結するのに便利な方法として、２つの実体を空間的に分離させる手段として、ＴＩＭにさらなる官能基を与えるために、またはそれらの組み合わせのために機能することができる。例えば、抑制剤部分およびＰＲＥを空間的に分離して、ＰＲＥが抑制剤部分の活性を妨げるのを防ぐことおよび／または逆の場合も同じであることが望ましい場合がある。スペーサーはまた、例えば、ＴＩＭの２つの成分間の接続に対する反応活性度、酵素開裂部位、安定配列、分子タグ、検出可能な標識、細胞透過性エンハンサー、またはそれらの様々な組み合わせを提供するのに使用することができる。
【０１３８】
一般に、選択されたスペーサーは二官能性または多官能性であり、すなわち、ＰＲＥに結合できる、または結合するよう修飾できるスペーサーの第１の端での、またはそれに近位の少なくとも第１の反応官能基、およびＴＩＭの抑制剤分子に結合できる、または結合するよう修飾できるスペーサーの反対端での、またはそれに近位の第２の反応官能基を含有する。２つ以上の反応官能基は同じであってもよく（すなわち、スペーサーはホモ二官能性）、または異なってもよい（すなわち、スペーサーはヘテロ二官能性）。スペーサーとして使用するのに適切な、様々な二官能性または多官能性架橋剤が当技術分野で知られている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、イリノイ州、ロックフォードから市販されているもの）。あるいは、これらの試薬はスペーサーをＰＲＥおよび／または抑制剤部分に連結するのに使用することができる。
【０１３９】
スペーサーの長さおよび組成は、分子ブリッジとしての目的を果たすことができれば、大幅に異なってもよい。スペーサーの長さおよび組成は一般に、スペーサーの意図した機能、および合成の容易さ、安定性、特定の化学的および／または任意に温度パラメーターに対する抵抗性、および生体適合性などの他の要因を考慮に入れて選択される。例えば、スペーサーはＰＲＥがＰＫＣを標的にする能力、または抑制剤部分の抑制活性を著しく妨げるべきではない。
【０１４０】
本発明の一実施例では、スペーサーの組成および長さは、適応性のあるスペーサーを提供するよう選択される。その他の実施例では、スペーサーの組成は非平面的スペーサーを提供するよう選択される。
【０１４１】
本発明の一実施例によると、スペーサーは分岐または非分岐、飽和または不飽和の、１つから１００の炭素原子を有する炭素水素鎖であり、ここで炭素原子の１つ以上が任意に−Ｏ−または−ＮＲ−（ここでＲはＨ、またはＣ１からＣ６アルキル）によって置換され、鎖は任意に（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルカノイルオキシ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシカルボニル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルチオ、アミド、アジド、シアノ、ニトロ、ハロ、ヒドロキシ、オキソ（＝Ｏ）、カルボキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、およびヘテロアリールオキシのグループから選択される１つ以上の置換基によって炭素上で置換される。
【０１４２】
適切なスペーサーの例は、１つから１００の原子の鎖長を有するペプチド、エタノールアミン、エチレングリコールおよび６つから１００の炭素原子の鎖長を有するポリエチレンなどのグループから派生するスペーサー、３から３０の反復単位を有するポリエチレングリコール、フェノキシエタノール、プロパノールアミド、ブチレングリコール、ブチレングリコールアミド、プロピルフェニル、ならびにエチル、プロピル、ヘキシル、ステリル、セチル、およびパルミトイルアルキル鎖を含むが、それらに限定されない。他の例は１，３−ジアミノプロパンまたはエタンベースのスペーサーを含む。
【０１４３】
一実施例では、スペーサーは分岐または非分岐、飽和または不飽和の、１つから５０の炭素原子を有する炭素水素鎖であり、ここで炭素原子の１つ以上が任意に−Ｏ−または−ＮＲ−（ここでＲは前述のとおりである）によって置換され、鎖は任意に（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルカノイルオキシ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシカルボニル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルチオ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシカルボニル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルチオ、アミド、ヒドロキシ、オキソ（＝Ｏ）、カルボキシ、アリールおよびアリールオキシのグループから選択される１つ以上の置換基によって炭素で置換される。
【０１４４】
その他の実施例では、スペーサーは非分岐、飽和の、１つから５０の炭素原子を有する炭素水素鎖であり、ここで炭素原子の１つ以上が任意に−Ｏ−または−ＮＲ−（ここでＲは前述のとおりである）によって置換され、鎖は任意に（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルカノイルオキシ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシカルボニル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルチオ、アミド、ヒドロキシ、オキソ（＝Ｏ）、カルボキシ、アリールおよびアリールオキシのグループから選択される１つ以上の置換基によって炭素上で置換される。
【０１４５】
本発明の特定の実施例では、スペーサーは、スペーサー１，３−ジアミノプロパンまたはエタンを有する、または１つから５０の原子の鎖長を有するペプチドである。他の実施例では、スペーサーは１つから４０の原子の鎖長を有するペプチドである。
【０１４６】
代替の実施例では、スペーサーは約１と約２０との間のアミノ酸残基のペプチドである。代替の実施例では、スペーサーは約１と約１８との間のアミノ酸残基のペプチドである。さらなる実施例では、スペーサーは約１と約１６との間のアミノ酸残基のペプチドである。他の実施例では、スペーサーは、約１と約１５との間、約１と約１４との間、約１と約１２との間、約１と約１０との間のアミノ酸残基のペプチドである。他の実施例では、スペーサーは、グリシン、アラニン、バリン、リジンおよびイソロイシンのグループから選択されるアミノ酸を有するペプチドである。他の実施例では、スペーサーは、グリシン、アラニン、バリンおよびイソロイシンのグループから選択されるアミノ酸を有するペプチドである。他の実施例では、スペーサーはポリグリシンペプチドである。
【０１４７】
ＩＶ．他の成分
本発明は、ＴＩＭは１つ以上のさらなる成分をさらに含んでもよいことを企図する。さらなる成分は、ＰＲＥで、抑制剤分子で、スペーサーで、またはそれらの組み合わせで適切な反応官能基に共役することができる。さらなる成分は、ＴＩＭを安定させる、さらなる標的官能基を提供する、検出可能な標識を提供する、ＴＩＭの調製、単離および／または精製を容易にする、ＴＩＭの生物学的利用能を向上させる、ＴＩＭの薬物動態論を改善させるなどのために作用することができる。
【０１４８】
従って、例えば、ＴＩＭは１つ以上のタンパク質、ペプチドまたは担体、親油性部分（例えば、オクチル、カプロイル、ラウリル、ステアロイル部分）、抗体または他の生物学的リガンド、検出可能な標識、細胞透過性エンハンサー、さらなる標的性を与える部分、ＴＩＭの生物学的利用能、生体内分布、および／または安定性を向上させる部分、ＴＩＭの調製、単離および／または精製を容易にする部分、またはＴＩＭの生理学的半減期を延長する部分に共役することができる。ＴＩＭはまたグリコシル化またはリン酸化することができる。
【０１４９】
ＴＩＭに共役することができる検出可能な標識の例は、例えば、ラジオアイソトープ、蛍光プローブ、化学発光団、コロイド粒子、蛍光微小粒子、発色団、蛍光半導体ナノ結晶、酵素基質、酵素補助因子、酵素抑制剤、染料、金属イオン、金属ゾル、リガンド（ビオチン、ストレパビジン、ハプテンなど）などを含む。当業者は、これらの標識が標識の検出を可能にするトリガー試薬、光、結合パートナーなどのさらなる成分を必要とする場合があることを理解するであろう。
【０１５０】
ＴＩＭに共役することができる細胞透過性エンハンサーの例は、ショウジョウバエのアンテナペディアタンパク質から派生するペネトラチンペプチド（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ；Ｑｂｉｏｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州、アーバインからのＰｅｎｅｔｒａｔｉｎＴＭ１ペプチドとして活性型でも入手可能）；ＨＩＶ  ｔａｔタンパク質の細胞透過性領域（アミノ酸４７―５７：ＲＲＲＱＲＲＫＫＲ）（Ｃｅｌｌ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ＰｅｐｔｉｄｅｓでのＶｉｖｅｓ、Ｅ．＆Ｌｅｂｌｅｕ、Ｂ．（２００２）、編集者Ｌａｎｇｅｌ、Ｕ．（ＣＲＣ、フロリダ州、ボカラトン）、第１巻、ページ３〜２３参照）；タンパク質輸送ドメイン、ＨＩＶウイルスから派生する配列（ＫＲＲＱＲＲＫＫＲ；ＦｕｃｈｓおよびＲａｉｎｅｓ、２００３、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４３：２４３８−４４）；Ｆｃペプチド（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲ；ＫｉｍＤら、（２００６）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３１２：１２７７−１２８８）；ＴｒａｎｓｐｏｒｔＴＭ（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．、メリーランド州、バルチモア）およびＢｉｏＴｒｅｋＴＭ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州、ラホヤ）を含むが、それらに限定されない。
【０１５１】
さらなる標的性は、細胞標的化合物、例えば、リシンＢ鎖またはその修飾物、ＤＰ１７８などのウイルス細胞融合を介在するペプチドの部分、ならびにＳＤＦ−１およびＲＡＮＴＥＳなどの小ケモカインへのＴＩＭの共役によって提供することができる。
【０１５２】
ＴＩＭの調製、単離および／または精製を容易にする部分は、例えば、Ｈｉｓ−タグ、ビオチン、ストレプトアビジン、グルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ）などを含む。
【０１５３】
本発明はまた、前述の化合物の１つ以上の性質を強化させるために、ＴＩＭに対してさらなる修飾を行ってもよいことを企図する。例えば、ＴＩＭでの１つ以上のアミノ酸は、エステル化、ペグ化、アセチル化および／またはアミド化することができる。
【０１５４】
当業者は、ＴＩＭへの共役のための他の成分が、標的ＰＫＣを標的にする、また抑制するＴＩＭの能力を妨げないように選択されるべきであることを理解するであろう。
【０１５５】
本発明の特定の実施例では、ＴＩＭはスペーサーを経由して、一般式（Ｉ）のＰＲＥに動作可能なように関連する一般式（ＩＸ）のＰＫＩ化合物を有する。その他の実施例では、本発明のＴＩＭは、スペーサーを介して一般式（Ｉ）のＰＲＥに連結される配列番号：３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２または６３のいずれか１つ規定されるアミノ酸配列を有するＰＫＩ化合物を有する。さらなる実施例では、ＴＩＭは、スペーサーを用いて一般式（Ｉ）のＰＲＥに連結される化合物ＰＫＩ  １、化合物ＰＫＩ  ２、化合物ＰＫＩ  ３、化合物ＰＫＩ  ４、化合物ＰＫＩ５、化合物ＰＫＩ  ６、化合物ＰＫＩ  ７、化合物ＰＫＩ  ８、化合物ＰＫＩ  ９、化合物ＰＫＩ  １０、化合物ＰＫＩ  １１、化合物ＰＫＩ  １２、化合物ＰＫＩ  １３、化合物ＰＫＩ  １４、化合物ＰＫＩ  １５、化合物ＰＫＩ  １６、化合物ＰＫＩ  １７、化合物ＰＫＩ  １８および化合物ＰＫＩ  １９のグループから選択されるＰＫＩ化合物を有する。さらなる実施例では、ＰＲＥは、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４および配列番号：３５、またはそれらのレトロ型、インベルソ型またはレトローインベルソ型のグループから選択されるアミノ酸配列を有する、長さで約３０未満のアミノ酸残基であり、ここでＰＲＥのＮ末端およびＣ末端のそれぞれは、独立して遊離か、または修飾される。さらなる実施例では、ＴＩＭは１つまたはサブセットのＰＫＣイソフォームを選択的に標的にするよう考案する。本明細書で記載する例に示すように、すべてのＰＲＥは少なくとも１つのＰＫＣイソフォームをすべて標的にし、いくつかは特定のイソフォームに対して特異性を示す。例えば、ＰＲＥ２はＰＫＣ−δに対して特異性を示し、ＰＲＥ４はＰＫＣ−αに対して特異性を示す。
【０１５６】
その他の実施例では、ＴＩＭは以下の、ＰＲＥ  １１とＰＫＩ  ３、ＰＲＥ  ４とＰＫＩ  １０、ＰＲＥ  ４とＰＫＩ  ３、ＰＲＥ  １０とＰＫＩ３、ＰＲＥ  ３とＰＫＩ４、ＰＲＥ  ３とＰＫＩ  ９、ＰＲＥ  １とＰＫＩ  ４、ＰＲＥ  ４とＰＫＩ  １、ＰＲＥ  ４とＰＫＩ  ３、ＰＲＥ  ４とＰＫＩ  ４、ＰＲＥ  ４とＰＫＩ  ５の、ＰＲＥとＰＫＩ化合物の組み合わせのうちの１つを有する。
【０１５７】
ＰＫＩ化合物は直接か、またはスペーサーを介してＮまたはＣ末端でＰＲＥに共役することができる。一実施例では、上述のＰＲＥおよびＰＫＩ成分はスペーサーを介して共役する。その他の実施例では、ＰＲＥおよびＰＫＩ成分はペプチドスペーサーを介して共役する。ＰＲＥまたはＰＫＩ化合物での１つ以上のアミノ酸は、修飾することができる。同様に、成分の一方または両方のＮおよび／またはＣ末端は修飾することができる。ＴＩＭは上述のさらなる成分をさらに有することができる。
【０１５８】
本発明のＴＩＭの限定されない典型的な例は、表２８に示す以下に記載の例を含む。
【０１５９】
標的抑制分子の調製
本発明のＴＩＭは、当技術分野で知られている標準合成手法を使用して調製することができる。ＴＩＭの成分は、連続的、同時的または単一過程の一部として調製することができる。例えば、ＰＲＥ分子は合成することができ、次いで標準共役化学的手法を使用して、別個に合成されているか、または販売元から入手していることが可能な、抑制分子に共役することができる。あるいは、ＰＲＥおよび抑制分子は、単一分子として合成することができる。同様に、スペーサーが存在する場合、スペーサーはＰＲＥおよび／または抑制分子と合成することができるか、またはそれは別個に合成、もしくは市販元から入手することができ、連続的または単一反応でＰＲＥおよび抑制剤部分に共役することができる。
【０１６０】
例えば、抑制剤部分がペプチド性化合物であり、ＰＲＥに直接結び付けられるか、またはペプチド性スペーサーを介して結び付けられる場合、ＴＩＭは連続的または単一分子として合成することができる。同様に、ペプチド性スペーサーが用いられ、非ペプチド性抑制剤部分の場合は、ＰＲＥおよびスペーサーは単一分子として合成され、次いで抑制剤部分と共役することができる。
【０１６１】
上述のように、本発明のＴＩＭに組み込むのに適切な多くのタンパク質キナーゼ抑制剤は、スペーサーとしてＴＩＭに組み込むのに適切な多くの二官能性架橋剤（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、イリノイ州、ロックフォード、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州、セントルイスからの）と同様に、市販元（例えば、Ｂｉａｆｆｉｎ  ＧｍｂＨ＆ＣｏＫＧ、ドイツ、カッセル、ＥＭＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カルフォルニア州、サンディエゴ、およびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州、セントルイス）から得ることができる。
【０１６２】
ＴＩＭのペプチド性成分、すなわち、ＰＲＥ、上述のＰＫＩ化合物などのペプチド性抑制剤部分、およびペプチド性スペーサーならびにこれらペプチド性成分の組み合わせは、当技術分で知られている標準ペプチド合成手法、例えば、専用固相合成、部分固相合成手法、フラグメント縮合および伝統的溶液合成などの標準溶液、懸濁液または固相合成法によって容易に調製することができる。
【０１６３】
本発明の一実施例では、固相手法を用いてＴＩＭのペプチド性成分を調製する。ペプチドの固相化学合成の原理は当業者ではよく知られており、Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ、Ｍ．Ｗ．およびＤｕｎｎ、Ｂ．Ｍ．，Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３５巻（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、１９９４）；Ｄｕｇａｓ、Ｈ．およびＰｅｎｎｅｙ、Ｃ．、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８１）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、ページ５４〜９２；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ｍ．、Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８５：２１４９（１９６２）、ならびにＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ、ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ページ２４〜６６、Ｆｒｅｅｍａｎ（サンフランシスコ、１９６９）などの当技術領域の一般的テキストに見られる場合がある。
【０１６４】
不溶性高分子担体（または樹脂）は、所要のα−アミノ酸の保護版を樹脂に結合させることによって出発物質を調製するのに使用する。それぞれさらなるα−アミノ酸が結合する際、樹脂は、ペプチド鎖を固定するよう作用し、固相ペプチド合成に使用する試薬および溶媒に化学的に不活性な粒子（直径略約２０〜５０μｍ）より成る。これらの粒子は溶媒中で著しく膨張し、リンカーアームをより接近可能にさせる。固相ペプチド合成で使用される樹脂の例は、クロロメチル化樹脂、ヒドロキシメチル、ベンズヒドリルアミン樹脂などを含む。固相ペプチド合成の適用に適切な様々な樹脂は、例えば、フェニルアセトアミドメチル（ＰＡＭ）樹脂、ヒドロキシメチルポリスチレン−ビニールベンゼン共重合体、ポリアミド、ｐ−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂（ワン樹脂）およびその修飾型、４−ヒドロキシメチルフェノキシメチル−コポリ（スチレン−１％ジビニルベンゼン）、および４−（２′，４′−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）フェノキシアセトアミドエチルならびに［５−（４−Ｆｍｏｃ−アミノメチル−３，５−ジメトキシフェノキシ）バレリアン酸］−ポリエチレングリコール−ポリスチレン樹脂（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州、フォスター市から市販されている）が市販されており、本発明のＴＩＭのペプチド性成分の調製の際に使用することができる。
【０１６５】
α−アミノ酸は、Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ′−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）またはＯ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウム−ヘキサフルオロリン酸エステル（ＨＢＴＵ）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の有無に関わらず、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム−ヘキサフルオロリン酸エステル（ＢＯＰ）またはビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）塩化ホスフィン（ＢＯＰＣｌ）などの標準カップリング試薬を使用して樹脂にカップリングすることができる。カップリングは一般に、ジクロロメタン、ＤＭＦまたはＮＭＰなどの溶媒中で行われる。
【０１６６】
最初のカップリングの後で、α−アミノ保護基は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の溶液、有機溶媒中の塩酸またはＤＭＦ溶媒中の２０％のピペリジンなどの標準試薬を使用して除去する。
【０１６７】
適切なα−アミノ保護基は当技術分野で知られており、例えば、アシル型保護基（ホルミル、トリフルオロアセチル、アセチルなど）、芳香族ウレタン型保護基（ベンジルオキシカルボイル（Ｃｂｚ）および置換Ｃｂｚなど）、脂肪族ウレタン保護基（ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、イソプロピルオキシカルボニルおよびシクロヘキシルオキシカルボニルなど）、アルキル型保護基（ベンジルおよびトリフェニルメチルなど）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）を含む。不安定基はアミノ酸のアルファ−アミノ基を保護する。次のα−アミノ保護アミノ酸を加えることができるように、この基は各カップリング反応後容易に除去されるべきである。
【０１６８】
使用する場合は、側鎖保護基はカップリングの間無傷を維持し、アミノ末端保護基の脱保護の間またはカップリングの間は通常除去されない。側鎖保護基は通常、最終ペプチドの合成が完了すると、ペプチドを変化させない反応条件化で除去可能となるように選択される。側鎖保護基の例は、Ａｓｐのためのベンジル、２，６−ジクロロベンジル、メチル、エチルおよびシクロヘキシル；Ｓｅｒのためのアセチル、ベンゾイル、トリチル、テトラヒドロピラニル、ベンジル、２，６−ジクロロベンジルおよびＣｂｚ；Ａｒｇのためのニトロ、トシル（Ｔｏｓ）、Ｃｂｚ、アダマントイルオキシカルボニルメシトイルスルホニル（Ｍｔｓ）またはＢｏｃ、ならびにＬｙｓのためのＣｂｚ、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２−Ｃｌ−Ｃｂｚ）および２−ブロモベンジルオキシカルボニル（２−ＢｒＣｂｚ）、ｉｖＤｄｅ、ＴｏｓまたはＢｏｃを含むが、それらに限定されない。他の例は当技術分野で知られている。
【０１６９】
α−アミノ保護基の除去後、残りの保護基は、所望の順序による段階的な手順でペプチド鎖にカップリングされる。それぞれの保護アミノ酸の過剰分は一般に、メチレンクロライドおよび／またはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中のジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ−［（ジメチルアミノ）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン−１−イルメチレン］−Ｎ−メチルメタンアミニウムヘキサフルオロリン酸Ｎ−酸化物（ＨＡＴＵ）、Ｎ−［１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル］−（ジメチルアミノ）メチレン］−Ｎ−メチルメタンアミニウムヘキサフルオロリン酸Ｎ−酸化物（ＨＢＴＵ）、および（ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ−オキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロリン酸（ＢＯＰ）などの適切なカルボキシル基活性剤とともに使用される。
【０１７０】
所望のアミノ酸配列が合成されると、安定した保護基が除去され、ペプチドはＴＦＡ（８２．５％）、チオアニソール（５％）、フェノール（５％）、Ｈ２Ｏ（５％）、１，２−エタンジチオールＥＤＴ、２．５％）を含む試薬Ｋなどの適切な試薬で処理することによって樹脂担体から減結合される。減結合試薬は、任意の側鎖保護基を同時に開裂してもよい。あるいは、側鎖保護基は別個の試薬、例えば、Ｆｍｏｃ基のためのＤＭＦ中の２０％のピペリジンまたはｉｖＤｄｅ基のためのＤＭＦ中の２％のヒドラジンを使用して開裂することができる。
【０１７１】
本発明の一実施例では、製造業者取扱説明書に従い、また必要に応じてアミノ酸側鎖を保護する適切な保護基を用いて、ＴＩＭのペプチド成分は市販のペプチド合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州、フォスター市から入手可能なＰｉｏｎｅｅｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒまたはＣＥＭ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、北カリフォルニア、マシューズからのＬｉｂｅｒｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍなど）で合成する。
【０１７２】
上記の手法はまた、１つ以上の非自然発生的アミノ酸を含む、ＴＩＭのペプチド成分を合成するのに使用することができる。共有結合修飾は、例えば、当業者に知られている選択したアミノ酸側鎖または末端残基と反応することができる有機誘導剤により標的アミノ酸残基を反応させることによって導入することができる。適切な有機誘導剤の選択は、当業者には容易に達成することができる。
【０１７３】
１つ以上の修飾ペプチド結合を有するペプチドを合成する方法は、当技術分野で知られている（例えば、「Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（編集者Ｆｉｅｌｄｓ、Ｇ．Ｂ．（１９９７）ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓ、サンディエゴ参照）。
【０１７４】
ＴＩＭのペプチド性成分はまた、その塩構造の形態で調製することができる。ペプチドは塩を形成するために、多くの無機塩基、無機酸または有機酸と反応するほど十分に酸性であっても、または十分に塩基性よい。酸付加塩を形成するために一般に用いる酸は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸などの無機酸、ならびにｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、ｐ−ブロモフェニル−スルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸などの有機酸である。
【０１７５】
塩基付加塩は、アンモニウムまたはアルカリまたはアルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩などの無機塩基から派生するものを含む。上記塩を調製する際に有用な塩基の例は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸カリウムなどを含むが、それらに限定されない。
【０１７６】
本発明はまた、ＴＩＭのペプチド性成分が自然発生的アミノ酸またはその若干の修飾型を有する場合、組み換えＤＮＡ手法によって調製できることを企図する。かかる方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら、（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク（１９９７および最新版））およびＳａｍｂｒｏｏｋら、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ−Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（２００１））に一般に記載されていることが分かる。一般に、ペプチド性成分をコードするＤＮＡ配列を調製して、適切な発現ベクターに挿入する。発現ベクターは続いて、例えば、安定または過渡トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、または組み換えウイルスベクターの感染による、当業者に知られている様々な方法のうちの１つによって、適切な宿主細胞または組織に導入する。宿主細胞または組織は、ペプチド性成分の発現が可能となる条件下で培養し、ペプチド性成分は続いて細胞／組織から単離される。
【０１７７】
適切な発現ベクターの例は、プラスミド、ファージミド、コスミド、バクテリオファージ、バキュロウイルスおよびレトロウイルス、ならびにＤＮＡウイルスを含むが、それらに限定されない。選択した発現ベクターは、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネータおよびポリアデニル化信号など、ペプチド性成分の発現を容易にするための、１つ以上の調節要素をさらに含むことができる。当業者は、かかる調節要素が細菌、真菌、ウイルス、哺乳類または昆虫遺伝子を含む多様な源から派生する可能性があることを理解するであろう。
【０１７８】
本発明の文脈では、発現ベクターは、発現したペプチド性成分の精製を容易にする異種核酸配列をさらに含有してもよい。かかる異種核酸配列の例は、金属親和性タグなどの親和性タグ、ヒスチジンタグ、アビジン／ストレパビジンコード化配列、グルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ）コード化配列およびビオチンコード化配列を含むが、それらに限定されない。
【０１７９】
当業者は、組み換えペプチド性成分の発現のために適切な宿主細胞の選択は、選んだベクターによって決まることを理解するであろう。適切な宿主細胞の例は、細菌、酵母、昆虫、植物および哺乳類細胞を含むが、それらに限定されない。
【０１８０】
ＴＩＭのペプチド性成分がコード化または発現できないが、コード化または発現できるペプチドと非常に類似している場合は、上述などの遺伝子工学技術を用いてコード化可能なペプチドを調製し、続いてコード化ペプチドが化学的または酵素的手法によって修飾される１つ以上の手順を用いて最終ペプチド性成分を調製することができる。
【０１８１】
当技術分野で知られている標準共役手法は、ＴＩＭの個別の成分を共役するのに、および／または必要に応じ、上述のものなど（例えば、ＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＢｏｙｄ、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第６版（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ、１９９２）；Ｊ．Ｍａｒｃｈ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第４版（Ｗｉｌｅｙ１９９２）；Ｇ．Ｔ．Ｈａｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）、およびＳ．Ｓ．Ｗｏｎｇ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ、（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９１）参照）の１つ以上のさらなる成分にＴＩＭを共役するのに用いることができる。
【０１８２】
成分は直接か、または基の修飾によって１つ以上の成分で反応官能基により共役し、第２の成分を共役することができる新しい化学基を導入する。様々な化学基は共役反応を受けることができる。例えば、ヒドロキシル基（−ＯＨ）は、ハロゲン化アルキル（Ｒ−Ｃｌ、Ｒ−Ｂｒ）、アシル無水物、ハロゲン化アシル、アルデヒド（−ＣＨＯ）、ヒドラジド（Ｒ−ｃｏ−ＮＨ−ＮＨ２）などと反応を通して第２の成分を共役させるのに使用することができる。一級アミノ基（−ＮＨ２）は、ハロゲン化アルキル（Ｒ−Ｃｌ、Ｒ−Ｂｒ、Ｒ−Ｉ）、アリールアジド、アシル無水物、ハロゲン化アシル、アシルエステ、カルボジイミドで活性化したカルボン酸塩、アルデヒド（−ＣＨＯ）などと反応を通して第２の成分を共役させるのに使用することができる。カルボン酸基（−ＣＯＯＨ）もまた、基が活性化した後、第２の成分を共役させるのに使用することができる。適切な活性化剤は、例えば、有機または無機酸ハロゲン化物（例えば塩化ピバロイル、エチルクロロギ酸エステル、塩化チオニル、ＰＣｌ５）、カルボジイミド（Ｒ−ＣＯ−ＯＨ＋Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ”、例えばＥＤＣ、ＤＣＣ）、ベンゾトリアゾリルウロニウムまたはホスホニウム塩（ＴＢＴＵ、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰ、ＨＴＢＵ）、ジアシルクロライド、ジイソシアン酸エステルなどを含む。
【０１８３】
上記の試薬のいくつかはまた、ＴＩＭの成分を共役させるのに用いることができる二官能性架橋試薬として使用することができる。かかる様々な架橋試薬が当技術分野で知られており、多くが市販されている（例えば、前記Ｓ．Ｓ．Ｗｏｎｇ、ならびにＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．およびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈからのカタログ参照）。例は、１，６−ジアミノヘキサンなどのジアミン；グルタルアルデヒドなどのジアルデヒド；エチレングリコール−ビス（コハク酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、グルタル酸ジスクシンイミジル、スベリン酸ジスクシンイミジル、およびエチレングリコール−ビス（コハク酸スクシンイミジル）などのビス−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル；ヘキサメチレンジイソシアナートなどのジイソシアナート；１，４ブタンジイルジグリシジルエーテルなどのビスオキシラン；スクシニルジサリチラートなどのジカルボン酸；３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどを含むが、それらに限定されない。
【０１８４】
共役の前に、ＴＩＭの１つ以上の成分は、最終ＴＩＭと同様に、１つ以上の精製手順に従うことができる。精製方法は当技術分野でよく知られており（例えば、Ｔ．Ｈａｎａｉ，ＨＰＬＣ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ、ＲＳＣ  Ｐｒｅｓｓ、英国１９９９；Ｌ．Ｍ．Ｈａｒｗｏｏｄ、Ｃ．Ｊ．ＭｏｏｄｙおよびＪ．Ｍ．Ｐｅｒｃｙ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｔａｎｄａｒｄ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、１９９８；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．、ら（編集者）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、（２００１および最新版）参照）、１つ以上のクロマトグラフィー手順、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性吸着／相互作用クロマトグラフィー、シリカゲル吸着クロマトグラフィー、および逆相ＨＰＬＣなどの様々な種類の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含むことができる。
【０１８５】
標的抑制分子の活性
本発明によると、ＴＩＭは１つ以上のＰＫＣイソフォームの活性を標的にして抑制することができ、また１つ以上のＰＫＣ媒介の生理学的効果を調節することができる。候補ＴＩＭは、当技術分野で知られている多くの標準手法を使用して上記の体外および／または生体内活性のために試験することができる。同様に、特に１つのＰＫＣイソフォームまたはサブグループのイソフォームを標的にするＴＩＭを調製する場合、選択したＴＩＭのＰＲＥ成分の親和性は、以下に記載のものなどの標準手法を使用して最初に評価することができる。
【０１８６】
Ｉ．親和性および結合アッセイ
本発明によると、本発明のＴＩＭに取り込まれるＰＲＥは、１つ以上のＰＫＣイソフォームのための親和性を有し、従って、ＴＩＭをＰＫＣイソフォームに標的にすることができる。上述のように、用語「親和性」とは、ＴＩＭまたはＰＲＥが、ＰＫＣ−イソフォームに特異的な抗体の、標的イソフォームへの結合を妨げることができることを指す。ＰＫＣのためのＰＲＥおよびＴＩＭの親和性は、当技術分野で知られている多くの標準アッセイ手法のうちの１つ以上を使用して試験することができる。
【０１８７】
通常、ＰＫＣイソフォームに特異的な抗体の、ＰＫＣ−αへの結合を妨げる候補ＰＲＥまたはＴＩＭの能力は、候補ＰＲＥ／ＴＩＭおよびＰＫＣイソフォームに特異的な抗体がＰＫＣと組み合わせられる、競合的結合アッセイで試験され、ＰＲＥ／ＴＩＭが抗体のＰＫＣへの結合を減少させる程度は、ＰＲＥ／ＴＩＭの非存在下で実施される対照アッセイとの比較により決定される。ＰＲＥ／ＴＩＭがアッセイで抗体のＰＫＣへの結合を減少させた程度は、例えば、タンパク質の量およびアッセイで形成された抗体錯体の定量化、ならびにこれとタンパク質の量および対照アッセイで形成された抗体錯体の比較によって決定することができる。ＰＫＣは精製または部分精製タンパク質としてアッセイに提供することができ、または粗もしくは部分精製細胞抽出物または細胞溶解物として提供してもよい。
【０１８８】
抗ＰＫＣ抗体は、タンパク質および抗体錯体の検出および／または定量化を容易にするために、検出可能な標識で標識化することができる。あるいは、抗ＰＫＣ抗体（一次抗体）は、一次抗体を明確に認識する標識化二次抗体を使用して検出することができる。必要ならば、タンパク質および抗体錯体は、検出および／または定量化の前に遊離ＰＫＣ（および必要に応じて他の試薬）から分離することができる。適切な分離法の例は当技術分野で知られており、例えば、ろ過、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、分画遠心法、サイズ排除クロマトグラフィーなどを含む。
【０１８９】
検出可能な標識は、直接的または間接的に検出することができる性質または特徴を有する部分である。当業者は、検出可能な標識を用いる場合、それが標的ＰＫＣのために抗体の親和性に影響を与えないように選択されることを理解するであろう。適切な標識の例は、例えば、ラジオアイソトープ、蛍光プローブ、化学発光団、コロイド粒子、蛍光微小粒子、発色団、蛍光半導体ナノ結晶、酵素、酵素基質、酵素補助因子、酵素抑制剤、染料、金属イオン、金属ゾル、リガンド（ビオチン、ストレパビジン、ハプテンなど）など含むが、それらに限定されない。当業者は、これらの標識が標識の検出を可能にするために、トリガー試薬、光、結合パートナーなどのさらなる成分を必要とする場合があることを理解するであろう。
【０１９０】
間接的に検出可能な標識は通常、同様に直接的に検出可能な標識に結合またはカップリングされる「複合体」とともに使用される結合要素である。結合要素および複合体は、１つの成分の結合要素が特に標的分子（ＰＲＥ／ＴＩＭ、標的ＰＫＣまたは一次抗体）に結合し、もう一方の要素である複合体が特に検出を可能にする結合要素に結合する、２つの員の「結合対」を表す。対の２つの員の間の結合は通常、化学的または物理的性質を有するである。かかる結合対の例は、抗原／ハプテンと抗体；抗体と抗抗体；受容体とリガンド；酵素／酵素断片と基質／基質類似体／リガンド；ビオチン／レクチンとアビジン／ストレプトアビジン；レクチンと炭水化物；ジゴキシンと抗ジゴキシン；Ｈｉｓ−タグとＮｉ２＋イオン；ベンズアミジンとトリプシンまたは他のセリンプロテアーゼ；タンパク質Ａと免疫グロブリン；ロイシンジッパーモチーフの対（例えば、米国特許第５，６４３，７３１号参照）、バシトラシンと１１リンのプレニルピロリン酸塩、および当技術分野で知られている様々なホモ二量体およびヘテロ二量体を含むが、それらに限定されない。
【０１９１】
本発明の一実施例では、ＰＫＣイソフォームに特異的な抗体のその標的ＰＫＣへの結合を妨げる候補ＰＲＥ／ＴＩＭの能力は、以下の一般的方法を使用して試験する。細胞溶解物は標準プロトコルを使用して適切な細胞株から得る。抽出物のタンパク質はゲル電気泳動法によって分離し、ウエスタンブロッティング法によって適切な膜を固定化する。膜は次いで、様々な濃度の候補ＰＲＥ／ＴＩＭを加えた適切なブロッキングバッファーを使用して封鎖される。一次ＰＫＣイソフォームに特異的な抗体は次いで、一次抗体の標的ＰＫＣへの結合を可能にする条件下で加え、続いて適切な二次抗体複合体を使用する標準手順によって検出する。
【０１９２】
本発明のその他の実施例では、候補ＰＲＥ／ＴＩＭは、上述のゲル電気泳動法およびウエスタンブロッティング法によるタンパク質の抽出物を分離する前に、様々な濃度のＰＲＥ／ＴＩＭを細胞抽出物に直接加えることによってスクリーニングする。
【０１９３】
上述のように、本発明の一実施例では、ＰＲＥ／ＴＩＭはＰＫＣ−α、および任意に１つ以上の他のＰＫＣイソフォームのための親和性を有する。それぞれのイソフォームのための親和性を同じ条件下で（すなわち、同じ濃度のＰＲＥ／ＴＩＭを使用した同じ一般的アッセイ手順で）試験する場合、本発明のＰＲＥ／ＴＩＭが他のＰＫＣイソフォームよりＰＫＣ−αに対して高い親和性を有するならば、それはＰＫＣ−αに特異的と見なされる。
【０１９４】
本発明の一実施例によると、ＰＲＥは標的ＰＫＣイソフォームに結合する。
候補ＰＲＥ、またはＰＲＥを有するＴＩＭのＰＫＣに結合する能力は、当技術分野で知られている標準結合アッセイによって決定することができる。一般に、これらのアッセイは、ペプチドおよびタンパク質錯体の形成を可能にする条件下で候補化合物および標的ＰＫＣを組み合わせる手順、次いでＰＫＣに結合している候補化合物を示すようないかなる錯体の存在も検出する手順を必要とする。上述の親和性アッセイの場合のように、ＰＫＣは精製または部分精製タンパク質として結合アッセイに提供することができ、または粗もしくは部分精製細胞抽出物または細胞溶解物として提供してもよい。
【０１９５】
候補ＰＲＥ／ＴＩＭか、またはＰＫＣは、ペプチドおよびタンパク質錯体の検出を容易にするために、検出可能な標識で標識化することができる。必要ならば錯体は、検出の前に遊離ＰＲＥ／ＴＩＭおよびＰＫＣ（および必要に応じて他の試薬）から分離することができる。適切な分離法の例は当技術分野で知られており、上記に掲載されたものを含む。適切な検出可能な標識もまた上に記載してある。当業者は、検出可能な標識が、ＰＫＣのためのＰＲＥ／ＴＩＭの結合に影響を与えないように選ばれることを理解するであろう。
【０１９６】
タンパク質およびペプチド錯体の検出のための様々な手法は当技術分野で知られており、本発明のスクリーニングアッセイで用いることができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅら、（編集者）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、（２００５および最新版）参照）。例は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、分画遠心法、サイズ排除クロマトグラフィー、蛍光偏光分光分析、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ、ミクロスフェアに組み入れられる閃光を利用する）、ウエスタン分析、ファーウエスタン分析、平衡沈降遠心分離（ＳＥＣ）、線上光散乱を有するＳＥＣ、沈降速度超遠心分離法、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（Ｒ）技術；Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ、スウェーデン、ウプサラを使用した）、および化学的架橋を含むが、それらに限定されない。
【０１９７】
本発明の一実施例では、候補ＰＲＥ／ＴＩＭおよびＰＫＣ間の結合は、例えば、ビオチン−ストレプトアビジン結合対を介して、候補ＰＲＥ／ＴＩＭを電磁ビーズに結合し、次いでＰＫＣを含有する溶液または細胞抽出物にＰＲＥ／ＴＩＭを接触させることによって決定する。溶液／細胞抽出物により適切な時間ビーズをインキュベートした後、ビーズは、例えば、遠心分離またはろ過によってアッセイの他の成分から分離する。分離したビーズは適切な試薬で処理し、任意のＰＲＥ／ＴＩＭ−ＰＫＣ錯体をビーズから遊離し、遊離した錯体は次いで、抗ＰＫＣ抗体を使用してウエスタンブロッティング法により検出する。
【０１９８】
本発明のその他の実施例では、候補ＰＲＥ／ＴＩＭと標的ＰＫＣ間の結合は、競合結合によって決定する。ＰＫＣは、例えば、タンパク質Ａ／Ｇ−プラスアガロースビーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．より）を使用して、ＰＫＣを含有する細胞抽出物から免疫沈降させる。ＰＫＣは電気泳動法により分離し、電子移動により適切な膜に移動させる。特異的な抗ＰＫＣ一次抗体の濃度を一定にした状態で、ＰＲＥ／ＴＩＭの濃度を上昇させ膜を分離する。ＰＫＣ帯はアルカリ性ホスファターゼ共役二次抗体により検出し、帯の密度はデンシトメトリー走査法により測定する。ＰＫＣイソフォーム帯の相対帯密度は、一次抗体との競合に起因してＰＲＥ／ＴＩＭに結合することによって低下する。その結果は、未処理の対照（ＰＲＥ／ＴＩＭなし）の帯密度のパーセンテージ、すなわち、相対強度として表される。相対強度の低下は、ＰＫＣイソフォームに対するＰＲＥ／ＴＩＭの結合の量と相関関係がある。
【０１９９】
上記の親和性および結合スクリーニングアッセイで使用するＰＫＣは、精製または部分精製されたタンパク質（天然か、または組み換え）であってもよく、または粗もしくは部分精製細胞抽出物または細胞溶解物の形であってもよい。様々な源（ヒトを含む）から派生する適切な精製ＰＫＣタンパク質および様々な組み換えＰＫＣ−αタンパク質は市販されている（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州；Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＧｍＢＨ、ドイツ；Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、ミシガン州、およびＴｅｂｕ−ｂｉｏ  ＳＡ、フランスより）。あるいは、ＰＫＣは標準手順を使用して適切な源から単離ことができる（例えば、Ｄｉａｎｏｕｘ、Ａ．Ｃ．ら、（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２８：４２４−４３１；Ｇｒｅｅｎｅ、Ｎ．Ｍ．ら、（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：６７１０−６７１７Ｏｈｇｕｒｏ、Ｈ．ら、（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：５２１５−５２２４およびＨｕａｎｇ、Ｋ．−Ｐ．ら、（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１２１３４−１２１４０参照）。
【０２００】
ＰＫＣはほぼすべての細胞に存在し、従って、様々な異なる細胞型からの抽出物またはそれの溶解物は、上記のアッセイでのＰＫＣの源として使用することができる。例えば、当技術分野で知られているように、ＰＫＣ−αは多くの異なる癌で過剰に発現し、従って癌細胞抽出物およびまたは溶解物もまた、ＰＫＣ−αのための適切な源の例となる。適切な細胞の他の例は、神経芽腫細胞、グリオーマ細胞、エストロゲン受容体陰性乳癌細胞、および非小細胞肺癌細胞を含むが、それらに限定されない。癌細胞もまた、他のＰＫＣイソフォームの適切な源となる。例えば、肺癌細胞、乳癌細胞、結腸癌細胞、前立腺癌細胞および膀胱癌細胞は、ＰＫＣ−βＩ、ＰＫＣ−βＩＩ、ＰＫＣ−δ、ＰＫＣ−ε、ＰＫＣ−ιおよびＰＫＣ−ζのための源として使用することができる。神経芽細胞腫、メサンギウム、前骨髄球性白血病およ膵臓腫瘍細胞もまた、ＰＫＣ−βＩの源として、また、ＰＫＣ−βＩＩのために悪性リンパ腫腫瘍、近位膵管および樹枝状細胞、ＰＫＣ−δのために内皮細胞および結腸癌細胞、ＰＫＣ−εのために神経芽細胞腫、上気道、膵管および原発性胃腫瘍細胞、ＰＫＣ−ιのために卵巣癌、非小細胞肺癌および乳癌細胞、ＰＫＣ−ζのために線維芽細胞、未成熟ＣＤ３４単球および含脂肪細胞を使用することができる。
【０２０１】
上記のアッセイに用いた特異的抗ＰＫＣ抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であってもよい。様々な抗ＰＫＣ抗体は市販されている（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、ミシガン州およびＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州より）。
【０２０２】
様々な他の試薬はスクリーニングアッセイに含めてもよい。例えば、最適なタンパク質と抗体、抗体と抗体および／またはタンパク質とペプチドの相互作用を促進し、非特異的または背景的相互作用を低下させ、および／またはそうでなければアッセイの効率を向上させる試薬を含むことができる。かかる試薬の限定されない例は、緩衝液、塩、アルブミンなどの中性阻止タンパク質、洗浄剤、プロテアーゼ抑制剤、ホスファターゼ抑制剤、ヌクレアーゼ抑制剤、抗菌薬剤などを含むが、それらに限定されない。
【０２０３】
スクリーニングアッセイは溶液中で実行することができ、もしくは固定担体中または固定担体上で実行することができ、または溶液および固相のある組み合わせを用いることができる。例えば、１つ以上の成分（候補ＰＲＥ／ＴＩＭ、標的ＰＫＣ、一次抗体、または結合対の員のうちの１つ）は固定担体上で固定することができる。適切な固定担体の例は当技術分野で知られている（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｊ．Ｅ．ら、（編集者）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、（２００５および最新版）；Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ＆Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）、およびＤｏｏｎａｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、ＴｈｅＨｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）参照）。例は、様々な樹脂およびゲル（シリカベースの樹脂／ゲル、セルロース樹脂／ゲル、架橋ポリアクリルアミド、デキストラン、アガロースまたはポリサッカリド樹脂／ゲルなど）、膜（トロセルロースまたはナイロン膜など）、ビーズ（ガラスビーズ、アガロースビーズ、架橋アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、様々な被膜および非被膜磁気ビーズ、ポリアクリルアミドビーズ、ラテックスビーズ、およびジメチルアクリルアミドビーズなど）、キチン、砂、軽石、ガラス、金属、シリコン、ゴム、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、フッ化ビニル樹脂、ポリカーボネート、ラテックス、ジアゾ化紙、多数のウェルプレートの内面などを限定されずに含み、そこでは、固定担体がアッセイの条件下で不溶性である。
【０２０４】
前述のとおり、固定担体は微粒（ペレット、ビーズなど）であってもよく、または連続平面（膜、メッシュ、プレート、スライド、ディスク、キャピラリー、中空ファイバ、針、ピン、チップ、固体ファイバ、ゲルなど）の形であってもよい。これらの担体は必要に応じて、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、前述の基の活性化版、および／または炭水化物部分などの、タンパク質またはペプチドの結合が可能となる反応基により修飾することができる。固定担体上の候補ＰＲＥ／ＴＩＭ、標的ＰＫＣまたは一次抗体を固定するのに用いることができるカップリング化学反応の例は、臭化シアン活性化、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド活性化、ならびにカルボジイミドカップリング化学反応のためのカルボキシルおよびアミノ誘導体を含む。
【０２０５】
あるいは、ＰＲＥ／ＴＩＭ、標的ＰＫＣまたは一次抗体は、適切に修飾された固定担体へのペプチドまたはタンパク質の結合を可能にする基により修飾することができる。例えば、固定担体上で固定されるペプチド／タンパク質がＮｉ２＋イオンを含有するよう修飾するＨｉｓ−タグ、固定担体上で固定されるペプチド／タンパク質がアビジン／ストレプトアビジンを含有するよう修飾するビオチン、または固定担体上で固定されるペプチド／タンパク質が対応する特異的抗体により修飾する抗原。他の例は当技術分野で知られており、上述の結合対を含む。
【０２０６】
結合アッセイの１つ以上の成分の固定化は、候補ＰＲＥ／ＴＩＭの「ハイスループット」スクリーニングを容易にすることができる。ハイスループットスクリーニングは、複数の試料を同時に処理する利益を提供し、多数の試料をスクリーニングするのに必要な時間を大幅に削減する。ハイスループットスクリーニングのために、反応成分は通常、同時に監視する、異なる候補ＰＲＥ／ＴＩＭをそれぞれ含有する複数のアッセイを可能にする、多数のウェルプレートなどの、多数の容器担体またはプラットホームに保管される。多くのハイスループットスクリーニングまたはアッセイシステムは、試料および試薬ピペット操作、液体調剤、定期インキュベーション、ハイスループット形式への試料の形式化および適切な検知器でのマイクロプレート読み取りなど、多くの手段のための自動化機能として現在市販されており、非常に高速のスループット時間をもたらす。
【０２０７】
ＩＩ．タンパク質キナーゼ抑制アッセイ
本発明のＴＩＭは、１つ以上のＰＫＣイソフォーム、任意に１つ以上の他のタンパク質キナーゼの活性を抑制することができる。ＰＫＣ活性、および他のタンパク質キナーゼの活性を抑制する候補ＴＩＭの能力は、標準体外アッセイを使用して最初に試験することができる。様々なタンパク質キナーゼの活性を決定するアッセイは、当技術分野でよく知られている。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（Ｅｎｎａ＆Ｗｉｌｌｉａｍｓ、編集者、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク州、ニューヨ−ク）を参照されたい。
【０２０８】
一般に、選択されたタンパク質キナーゼの活性を抑制する候補化合物の能力は、基質、ＡＴＰ、および任意の必要な共同因子（ホスファチジルセリ、ホルボールエステル、Ｍｎ２＋および／またはＣａ２＋など）とともに、適切な緩衝液中に標的タンパク質キナーゼを有する反応混合物に候補化合物を加えることによって評価する。適切なインキュベーション時間の後、基質のリン酸化反応の程度を監視し、対照反応、例えば、候補化合物の非存在下で、または既知のＰＫ抑制剤の存在下で実施する反応と比較する。アッセイで使用する基質は、研究中の特定のタンパク質キナーゼによってリン酸化することができるタンパク質またはペプチドである。ほとんどのアッセイでは、ペプチド基質が使用される。
【０２０９】
基質リン酸化の程度は、当技術分野で知られている多くの方法によって決定することができ、例えば、従来の方法はアッセイでの放射性標識ＡＴＰを用い、インキュベーション期間の終わりにリン酸化された基質に組み込まれた放射能の量を測定する。
【０２１０】
当技術分野で知られている代替の方法は、特に基質のリン酸化体に結合する、適切に標識化されたモノクローナル抗体を用いるものを含む。インキュベーション期間の間または終わりに反応混合物に抗体を加え、実行したの基質リン酸化の量を示すような結合抗体の量を測定する。他の方法は、蛍光標識された基質（例えば、ＰｅｐＴａｇ（Ｒ）Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ａｓｓａｙｓ，Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州、マディソン）、クエンチャー分子を伴う蛍光標識された基質（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．、イリノイ州、ロックフォードからのＩＱ（Ｒ）Ａｓｓａｙｓ）および未反応ＡＴＰの発光検出（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州、マディソンからのＫｉｎａｓｅ−ＧｌｏＴＭＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｋｉｎａｓｅ  Ａｓｓａｙｓ）の使用を含む。インキュベーション期間の終わりに、蛍光標識されたトレーサー分子、ならびにリン酸化された基質およびトレーサー分子の結合を可能にする抗体の追加を含む蛍光偏光法に基づく方法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、カールスバッドからのＰａｎＶｅｒａ（Ｒ）ＰｏｌａｒＳｃｒｅｅｎＴＭキットを参照）。
【０２１１】
上記に要約したものなどの体外アッセイは、特定のタンパク質キナーゼに対して多くの異なる候補抑制剤を同時にスクリーニングすることが可能となる、ハイスループットアッセイとして実行することができる。ハイスループットアッセイはまた、異なるタンパク質キナーゼの一団に対する特定のＴＩＭの活性のスクリーニングを可能にする。多くの市販のタンパク質キナーゼアッセイキットは、特にハイスループットスクリーニングが可能となるよう考案されている（例えば、前記のＩＱ（Ｒ）アッセイ、Ｋｉｎａｓｅ−ＧｌｏＴＭアッセイおよびＰａｎＶｅｒａ（Ｒ）ＰｏｌａｒＳｃｒｅｅｎＴＭキット、ならびに、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州、ビレリカからのＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ（Ｒ）ＨＴＳ−ＰＨ  Ｐｈｏｓｐｈｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｔｅ  Ａｓｓａｙｓ）。
【０２１２】
体外アッセイで用いるタンパク質キナーゼは、精製酵素、半精製酵素の形であってもよく、または当該の細胞株または組織から調製された、部分精製された、もしくは粗細胞溶解物に存在することができる。多くのタンパク質キナーゼが純粋または部分的に純粋な形で市販されている（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州、セントルイス、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．、イリノイ州、ロックフォード、およびＰｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州、マディソンから）。
【０２１３】
本発明のＴＩＭは、当該の細胞株をＴＩＭに接触させ、続いて上述のものなどの標準方法を使用して細胞から調製された細胞溶解物でのタンパク質キナーゼ活性を評価することによって、細胞状況における１つ以上のタンパク質キナーゼを抑制する能力を評価することができる。あるいは、適切な増殖条件下で維持された選択細胞株は、候補ＴＩＭで処理することができ、また細胞内に存在する自然発生的基質分子のリン酸化反応の程度は、未処理対照細胞、または標的タンパク質キナーゼの既知の抑制剤で処理された細胞を評価して比較することができる。例えば、候補ＴＩＭは、リン−ＧＳＫ３αに対する市販の抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、マサチューセッツ州、ビバリー）を使用して化合物で処理した細胞に存在するリン−ＧＳＫ３の量を決定することによって、ＰＫＢ活性を抑制する能力を評価することができる。あるいは、細胞は、候補ＴＩＭおよびミリストイル化アラニンの多いＣ−キナーゼ基質（ＭＡＲＣＫＳ）などの外因性タンパク質キナーゼ基質で処理することができ、また加えた基質のリン酸化反応の程度は、例えば、リン基質に対する市販の抗体を使用して決定することができる。
【０２１４】
ＩＩＩ．体外生理作用のためのアッセイ
本発明のＴＩＭは、体外での１つ以上のＰＫＣ媒介の生理学的効果を調節する能力をさらに評価することができる。本発明の文脈では、ＰＫＣ媒介の生理学的効果は、細胞増殖、細胞移動／侵入、細胞生存、アポトーシス、ギャップ結合形成、および薬剤耐性（特に、癌細胞での薬剤耐性）を含むが、それらに限定されない。
【０２１５】
一般に、ＰＫＣ媒介の生理学的効果を抑制する候補ＴＩＭの能力は、生理学的効果が明らかにされている細胞を候補化合物に接触させ、生理学的効果を評価するために適切な条件下で細胞をインキュベートすることによって評価することができる。必要ならば、細胞は、細胞によって化合物の摂取を促進する試薬、例えば、飲作用エンドサイトーシスを促進する試薬で処理することができる。生理学的効果の調節の程度は、被検細胞と適切な対照、例えば、同じ条件下でインキュベートされた未処理細胞、または既知のＰＫＣ抑制剤の存在する同じ条件下でインキュベートされた細胞との比較によって決定することができる。
【０２１６】
本発明の一実施例によると、ＴＩＭは細胞増殖を抑制する。細胞増殖を抑制する候補化合物の能力を評価する方法は、当技術分野でよく知られている。一般に、体外アッセイに関しては、特異的な被検細胞株の細胞を適切な密度（例えば、約１×１０４）まで増殖させ、候補化合物を加える。適切なインキュベーション時間（例えば、４８から７４時間）の後、細胞密度を評価する。細胞密度を測定する方法は当技術分野で知られており、例えば、細胞密度は、細胞単層で被覆された培養プレートの表面を測定することによって、またはレザズリン還元試験（Ｆｉｅｌｄｓ＆Ｌａｎｃａｓｔｅｒ（１９９３）Ａｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌａｂ．１１：４８―５０；Ｏ’Ｂｒｉｅｎら、（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：５４２１−５４２６および米国特許第５，５０１，９５９号）、スルホローダミンアッセイ（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎら、（１９９０）Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．８２：１１３−１１８）、ニュートラルレッド色素試験（Ｋｉｔａｎｏら、（１９９１）Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｇ．２１：５３−５８；Ｗｅｓｔら、（１９９２）Ｊ．ＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅＤｅｒｍ．９９：９５−１００参照）などの標準アッセイ、もしくはトリパンブルー排除アッセイを使用することによって倒立光学顕微鏡下で評価することができる。あるいは、細胞は、例えば、トリプシンによるインキュベーションによってプレートから分離させ、次いで血球計算板で計数することができる。細胞の増殖の抑制度は、処理済み培養中の細胞密度と、例えば、候補化合物で前処理していない培養、および／または細胞増殖を抑制する既知の対照化合物で前処理したものなど、対照培養中の細胞密度との比較によって計数することができる。細胞は候補化合物を加える前にマイトジェンで処理し、非刺激細胞または静止細胞とは対照的に、刺激細胞の増殖を抑制する化合物の能力を評価してもよい。マイトジェン刺激細胞の使用は、例えば、内皮細胞の増殖を抑制する候補化合物の能力を評価する際に有用となり得る。
【０２１７】
ＤＮＡ合成はまた、細胞増殖の兆候として評価することができる。例えば、［３Ｈ］チミジンの摂取によって。通常細胞は、増殖培地を細胞が静止する培地（例えば、ＤＭＥ０．５％血清）と交換した時点で適切な密度まで（一般に密集地点まで）増殖する。静止細胞は培地交換後適切な間隔で、希釈血清または増殖因子などの増殖刺激にさらされる。［３Ｈ］チミジンを続いて細胞に加え、細胞は３７℃に維持する。適切なインキュベーション時間の後、細胞を洗浄し、酸沈殿可能な放射能を抽出し、放射能の量を、例えば、シンチレーションカウンタを使用して決定する。
【０２１８】
上記の手法をさらに用いて、細胞生存および多数の薬物耐性細胞上のＴＩＭの効果を評価することができる。他の手法は当技術分野で知られている（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｅｎｎａ＆Ｗｉｌｌｉａｍｓ、編集者Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク州、ニューヨーク；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｏｒｇａｎ、Ｋ．、編集者、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク州、ニューヨーク参照）。
【０２１９】
内皮細胞、癌細胞およびケラチン生成細胞を含む、容易に利用可能な様々な細胞株は、上述の体外アッセイで利用することができる。適切な内皮細胞株の限定されない例は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ウシ大動脈血管内皮細胞（ＢＡＥＣ）、ヒト冠動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）、ウシ副腎毛細管内皮細胞（ＢＣＥ）および血管平滑筋細胞を含む。ＨＵＶＥＣは標準的方法を使用して臍帯から単離することができる（例えば、Ｊａｆｆｅら、）（１９７３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．５２：２７４５）、または他の適切な内皮細胞株も可能なように、ＡＴＣＣまたは様々な販売元から入手することができる。
【０２２０】
典型的な癌細胞株は、卵巣癌細胞株ＯＶ９０およびＳＫ−ＯＶ−３、乳癌細胞株ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１、結腸癌細胞株ＣａＣｏ、ＨＣＴ１１６およびＨＴ２９、子宮頸癌細胞株ＨｅＬａ、非小細胞肺癌細胞株Ａ５４９、Ｈ６６１およびＨ１２９９、膵臓癌細胞株ＭＩＡ−ＰａＣａ−２およびＡｓＰＣ−１、前立腺癌細胞株ＰＣ−３、膀胱癌細胞株Ｔ２４、肝臓癌細胞株ＨｅｐＧ２、脳腫瘍細胞株Ｕ−８７ＭＧ、メラノーマ細胞株Ａ２０５８、肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ４６０、および神経芽細胞腫細胞株ＩＭＲ−３２を含むが、それらに限定されない。他の適切な癌細胞株は、現在９５０の癌細胞株を提供している、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能なものを含む。
【０２２１】
適切な細胞株の他の例は、ヒトケラチン生成細胞（ＨａＣａＴ細胞など）、リウマチ性滑膜繊維芽細胞（ＲＳＦ）、およびＪｕｒｋａｔＴ細胞を含む。他の適切な細胞株は当技術分野で知られている。
【０２２２】
一般に、細胞移動を抑制する候補ＴＩＭの能力は、標準細胞移動アッセイならびに上述したものなどの内皮および／または癌細胞を使用して体外で評価することができる。通常、かかるアッセイは多数のウェルプレートで実施し、プレートのウェルは適切な膜によって上端部および下端部に分離する。適切な化合物で、評価する細胞型に応じて、また当業者によって容易に決定できる選択により膜を被覆する。例は、内皮細胞用にはコラーゲンまたはゼラチン、腫瘍細胞用にはマトリゲルを含む。ＥＧＭ−２、ｉｌ−８、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦなどの適切な化学誘引物質を、化学誘引物質として下端チャンバに加える。候補ＴＩＭとともに被検細胞のアリコートを上端チャンバに加え、通常候補ＴＩＭの様々な希釈物を試験する。適切なインキュベーション時間の後、膜をすずぎ、固定し、着色する。膜の上側の細胞をふき取り、次いで無作為に選択した下側の領域を計数する。
【０２２３】
様々な細胞株が、細胞移動アッセイで使用することができる。例は上述の内皮および癌細胞を含む。
【０２２４】
候補ＴＩＭで処理した細胞でのアポトーシスおよびギャップ結合形成は、例えば、標準免疫細胞化学法によって評価することができる。限定されない例は、本明細書の実施例に記載してある。他の手法は当技術分野で知られている（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｅｎｎａ＆Ｗｉｌｌｉａｍｓ、編集者Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク州、ニューヨーク；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ、Ｍｏｒｇａｎ、Ｋ．、編集者、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク州、ニューヨーク参照）。
【０２２５】
生体内生理作用のためのアッセイ
１つ以上のＰＫＣ媒介の生理学的効果を抑制する、本発明のＴＩＭの能力は、当技術分野で知られている適切な動物モデルを使用して生体内で試験することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｅｎｎａ＆Ｗｉｌｌｉａｍｓ，編集者、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク州、ニューヨーク参照）。
【０２２６】
例えば、虚血でのＴＩＭの効果は、ランゲンドルフかん流ラット心臓（例えば、Ｙａｏら、（１９９４）Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１７：５１７）を使用して生体外で、または心筋虚血／再かん流傷害のラットもしくはイヌモデルを使用して生体内で評価することができる。抗アテローム性動脈硬化作用および降圧作用は、例えば、自然発生高血圧ラットにおいて評価することができる（例えば、Ｋｕｂｏら、（１９９２）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｂｉｏｄｙｎ．１５：６５７参照）。被検化合物の抗炎症活性を試験するための様々な動物モデルが、当技術分野で知られており、それの例は、カラギーナン誘発の足浮腫、アジュバン誘発の関節炎およびカラギーナン空気嚢ラットモデル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、Ｅｎｎａ＆Ｗｉｌｌｉａｍｓ、編集者、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨ−ク州、ニューヨーク）、ならびに乾癬のラットモデル（例えば、Ｓｍｉｔｈ，Ｓ．ら、（１９９３）Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌ．１５：１３参照）である。
【０２２７】
生体内の腫瘍成長または増殖を抑制するＴＩＭの能力を評価するために、例えば、ヒトの腫瘍を動物に移植した異種移植モデルなどの標準動物モデルを使用することができる。ヒト癌の異種移植モデルの例は、すべて腫瘍成長アッセイで使用することができる、皮下注射または移植により移植されたヒト固体移植腫瘍、脂肪体注射により移植されたヒト固体腫瘍同系移植片、および適切な組織に直接移植されたヒト固体腫瘍同所異種移植片を含むが、それらに限定されない。マウスにおけるリンパ腫および白血病の実験モデル、およびマウスにおける肺転移の実験モデルを使用する生存アッセイもまた用いることができる。
【０２２８】
例えば、ＴＩＭは３０から６０ｍｇの腫瘍断片で相互に皮下移植または適切な数の癌細胞で移植されたマウスを使用して、０日めに、生体内の固体腫瘍で試験をすることができる。腫瘍を有する動物は、様々な治療および規制を受ける前に混ぜる。進行性腫瘍の治療の場合は、腫瘍を所望の大きさまで成長させ、腫瘍の成長が不十分な動物は失格とする。選択した動物は無作為に割り当て、治療および規制を受けさせる。腫瘍を有さない動物もまた、腫瘍での特異的効果から毒性効果を解離することができるように、腫瘍を有する動物と同じ治療を受けさせてもよい。化学療法は一般に、腫瘍の型に応じて移植後３日から２２日に開始し、動物を毎日観察する。本発明のＴＩＭは、例えば、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射または静脈内ボーラスによって動物に投与することができる。
【０２２９】
腫瘍は所定の時間枠の後測定する、または腫瘍が所定の大きさおよび／または重量に達するまで、もしくはこのようなことが発生するならば腫瘍が所定の大きさ／重量に達する前に動物が致死するまで、週約２回または３回測定することによって継続的に監視することができる。動物は次いで致死させ、腫瘍の組織の組織、大きさおよび／または増殖を評価する。
【０２３０】
白血病でのＴＩＭの効果の研究のために、動物に特定の数の細胞を移植し、対照と比較して治療したマウスの生存期間を延長することによって抗腫瘍活性を決定する。
【０２３１】
腫瘍転移でのＴＩＭの効果を研究するために、腫瘍細胞は通常、生体外で組成物により治療し、次いで適切な実験動物に注入する。注入の部位からの腫瘍細胞の広がりは次いで、適切な期間にわたり監視する。
【０２３２】
化合物の生体内試験のための適切な癌細胞株は、上記に掲載されたものを含む。
【０２３３】
ＴＩＭの生体内毒性効果は、治療中の動物の体重に対する効果を測定することによって、また動物を致死させた後、血液学的側面および肝酵素の分析を実行することによって評価することができる。
【０２３４】
薬剤組成物
対象に投与するために、本発明は、本発明のＴＩＭおよび１つ以上の非毒性の薬学的に許容できる担体、希釈剤、賦形剤および／またはアジュバントを有する薬剤組成物を提供する。必要に応じて、他のＴＩＭを含み他の治療薬を組成物に含めてもよい。
【０２３５】
薬剤組成物は約１％から約９５％の本発明のＴＩＭを有してもよい。単回投与の形で投与するよう処方された組成物は、例えば、約２０％から約９０％のＴＩＭを有してもよい一方で、単回投与の形でない組成物は、例えば、約５％から約２０％のＴＩＭを有してもよい。単位用量の形の限定されない例は、糖衣錠、錠剤、アンプル、水薬瓶、坐薬およびカプセル剤を含む。
【０２３６】
薬剤組成物は、様々な投与法によって投与するために処方することができる。例えば、組成物は経口、局所、直腸もしくは非経口的投与のために、または吸入またはスプレーによる投与のために処方することができる。本明細書で使用する用語「非経口的」とは、皮下注射、静脈注射、筋肉内、髄腔内、胸骨内または注入法を含む。癌の治療のためには、腫瘍内投与もまた企図される。
【０２３７】
経口用薬剤組成物は、例えば、錠剤、トローチ、薬用キャンデー、水性もしくは油性懸濁液、分散性粉剤もしくは顆粒、乳剤性硬もしくは軟カプセル剤、またはシロップ剤もしくはエリキシル剤として処方することができる。かかる組成物は、薬剤組成物の製造のために当技術分野で知られている標準的方法により調製することができ、薬学的洗練および良味の調製を提供するために、甘味剤、香味剤、着色剤、保存剤のグループから選択される１つ以上の薬剤を含有してもよい。錠剤は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、乳糖、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムなどの不活性希釈剤、コーンスターチ、またはアルギン酸などの造粒剤および崩壊剤、でんぷん、ゼラチンまたはアカシアなどの結合剤、ならびにステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクなどの平滑剤を含む、適切な非毒性の薬学的に許容できる賦形剤を有する混合剤中にＴＩＭを含有する。錠剤は素錠であってもよく、または胃腸管での分解および吸収を遅らせ、それにより長時間にわたり持続作用性を提供するために、既知の手法により被膜してもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの時間遅延物質を用いてもよい。
【０２３８】
経口用薬剤組成物はまた、有効成分が、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムもしくはカオリンなどの不活性固体希釈剤と混合する硬ゼラチンカプセル剤、または有効成分が、落花生油、液体パラフィンもしくはオリーブ油などの水または油溶媒と混合する軟ゼラチンカプセル剤として投与することができる。
【０２３９】
水性懸濁液として処方された薬剤組成物は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、トラガカントゴムおよびアカシアゴムなどの懸濁化剤と；自然発生的ホスファチド、例えば、レシチン、または脂肪酸を有するアルキレンオキシドの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンステアレート、または長鎖脂肪族アルコールを有するエチレンオキシドの縮合生成物、例えば、７−デカエチレンオキシセタノール、または脂肪酸およびヘキシトールから派生する部分エステルを有するエチレンオキシドの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、または脂肪酸およびヘキシトール無水物から派生する部分エステルを有するエチレンオキシドの縮合生成物、例えば、ポリエチレンソルビタンモノオレエートなどの分散剤または湿潤剤を有する、１つ以上の適切な賦形剤を有する混合剤中にＴＩＭを含有する。水性懸濁液はまた、１つ以上の保存料、例えば、エチル、またはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシ−安息香酸エステル、１つ以上の着色剤、１つ以上の香味剤、またはショ糖もしくはサッカリンなどの１つ以上の甘味剤を含有してもよい。
【０２４０】
薬剤組成物は、植物油、例えば、落花生油、オリーブ油、ゴマ油またはココナッツ油、または液体パラフィンなどの鉱物油中でＴＩＭを懸濁することによって油性懸濁液として処方することができる。油性懸濁液は、増粘剤、例えば、蜜ろう、固形パラフィンまたはセチルアルコールを含有してもよい。上述のものなどの甘味剤、および／または香味剤を添加し、良味の経口剤を提供してもよい。これらの組成物は、アスコルビン酸などの酸化防止剤の添加により保存することができる。
【０２４１】
薬剤組成物は、続いて水を加えることにより水性懸濁液を調製するのに使用することができる、分散性粉剤または顆粒として処方することができる。かかる分散性粉剤または顆粒は、１つ以上の分散剤または湿潤剤、懸濁化剤および／または保存料を有する混合剤中にＴＩＭを提供する。適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤は、すでに上述したものにより例示される。さらなる賦形剤、例えば、甘味剤、香味剤および着色剤もまた、これらの組成物に含めてもよい。
【０２４２】
本発明の薬剤組成物はまた、水中油型乳剤として処方することができる。油相は植物油、例えば、オリーブ油もしくは落花生油、または鉱物油、例えば、液体パラフィンであってもよく、あるいはこれらの油の混合物であってもよい。これらの組成物に含めるのに適切な乳化剤は、自然発生的ゴム、例えば、アカシアゴムもしくはトラガカントゴム；自然発生的ホスファチド、例えば、大豆、レシチン；または脂肪酸およびヘキシトールから派生するエステルもしくは部分エステル、無水物、例えば、ソルビタンモノオレエート、ならびにエチレンオキシド、例えば、ポリオキソエチレンソルビタンモノオレエートを有する前記部分エステルの縮合生成物を含む。乳剤もまた、任意に甘味剤および香味剤を含有することができる。
【０２４３】
薬剤組成物は、ＴＩＭと１つ以上の甘味剤、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトールまたはショ糖を組み合わせることによってシロップ剤またはエリキシル剤として処方することができる。かかる処方はまた、１つ以上の鎮痛薬、保存料、香味剤および／または着色剤を任意に含有することができる。
【０２４４】
薬剤組成物は、当技術分野で知られている方法により、また上述したものなどの１つ以上の適切な分散剤または湿潤剤および／または懸濁化剤を使用して、滅菌注入用水性または油性懸濁液として処方することができる。滅菌注入用製剤は、非経口で受け入れ可能な非毒性希釈剤または溶媒中の滅菌注入用溶液または懸濁液、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液であってもよい。用いることができる許容可能な媒体および溶媒は、水、リンガー溶液、乳酸加リンガー溶液および生理食塩液を含むがそれらに限定されない。他の例は、溶媒または懸濁化剤、および例えば、合成モノまたはジグリセリドを含む様々な無菌性固定油として従来用いられる滅菌、固定油を含む。オレイン酸などの脂肪酸もまた、注射液の製剤に使用することができる。
【０２４５】
他の薬剤組成物および薬剤組成物を調製する方法は、当技術分野で知られており、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」（かつての「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」）；Ｇｅｎｎａｒｏ、Ａ．、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、ペンシルベニア州、フィラデルフィア（２０００）に記載されている。
【０２４６】
ＴＩＭは使用目的を達成する有効量が薬剤組成物に含まれる。従って、用語「治療効果のある用量」とは、治療するＰＫＣ−α媒介の疾病または疾患の症状を改善するＴＩＭの量を指す。化合物の治療効果のある用量の決定は、十分に当業者が対応できる範囲にある。例えば、治療効果のある用量は、細胞培養アッセイか、または本明細書に記載したものなどの動物モデルで最初に予測することができる。動物モデルはまた、適切な濃度範囲および投与経路を決定するのに使用することができる。かかる情報は次いで、当業者に知られている標準的方法を使用して、ヒトを含む他の動物において有効な用量および投与経路を決定するのに使用することができる。
【０２４７】
治療効力および毒性もまた、例えば、５０％有効量、またはＥＤ５０（すなわち、母集団の５０％に治療効果のある用量）および５０％致死線量、またはＬＤ５０（すなわち、母集団の５０％に対して致死的な用量）の決定など標準製剤手順によって決定することができる。治療効果と毒性効果との用量比は、比率ＬＤ５０／ＥＤ５０として表される「治療指数」として知られている。細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータは、ヒトまたは動物用として用量幅を処方するのに使用することができる。かかる組成物に含有される用量は通常、ＥＤ５０を含み、非常に少ない毒性または非毒性を示す濃度範囲内にある。用量は用いる投薬形態、対象の刺激感応性、および投与経路などに応じてこの範囲内で異なる。
【０２４８】
対象に投与する正確な用量は、対象が必要とする治療に関連する要素を考慮に入れて、開業医が決定することができる。用量および投与は、ＴＩＭの十分なレベルを提供、および／または所望の効果を維持するよう調節される。適切な用量を決定する場合に考慮に入れてもよい要素は、病状の重篤性、対象の総体的な健康、対象の年齢、体重および性別、食事療法、投与の時間および頻度、混合薬、治療に対する反応感度および耐性／応答を含む。投与計画は、上記の要素および、特定の処方の半減期およびクリアランス率などの要素に応じて開業医が策定することができる。
【０２４９】
本発明のＴＩＭのための典型的な日用量は、１日あたり体重１キログラムにつき約０．０００１から約１００ｍｇ、例えば、１キログラムにつき約０．００１から約１０ｍｇ、または１キログラムにつき約０．０１から約５ｍｇに及ぶ。日用量は単回投与として投与することができ、または１日を通して適切な間隔で個別に投与するために２、３、４、５、６またはそれ以上のサブ用量、任意に単位用量形態に分割することができる。
【０２５０】
イソフォーム特異的ＰＫＣ抑制剤の選択方法
本発明は、特にＰＫＣの１つのイソフォームに結合するＰＲＥを最初にスクリーニングすることによって、イソフォーム特異的ＴＩＭの選択方法を提供する。前記方法は一般に、候補イソフォーム特異的ＰＲＥのライブラリーを提供する手順であって、それぞれのＰＲＥは一般式（Ｉ）、またはそのレトロ型によって表される配列を有する手順、１つ以上のＰＫＣイソフォームに対してライブラリーをスクリーニングする手順、および所望のイソフォーム特異度を有するＰＲＥを選択する手順を含む。このＰＲＥは次いでＰＫＣ抑制剤に共役させて、イソフォーム特異的ＴＩＭを提供することができる。
【０２５１】
この文脈での「ライブラリー」は、複数の候補ＰＲＥ、例えば、２と約１０００の間の数の候補ＰＲＥを有する。ライブラリーの大きさは、用いるスクリーニング法の容量に基づき選択することができる。例えば、ハイスループットスクリーニング法が利用可能な場合、ライブラリーは、約２０と約１０００との間の候補ＰＲＥ、または約５０と１０００との間の候補ＰＲＥなど、多数の候補ＰＲＥを有することができる。ロースループットスクリーニング法を用いる場合は、ライブラリーは比較的少数の候補ＰＲＥ、例えば、約２と約５０との間、または約２と約２０との間の候補を有することができる。
【０２５２】
候補ＰＲＥのライブラリーは、上述の固相ペプチド合成または溶液ペプチド合成などの標準ペプチド合成手法によって容易に調製することができる。候補ＰＲＥは、上述のものなどのアッセイ法を使用して、例えば、競合アッセイまたは他の結合アッセイによって、特にＰＫＣイソフォームに対する親和性のためにスクリーニングすることができる。候補ＰＲＥは単一のＰＫＣイソフォームに対してスクリーニングすることができ、または複数の異なるイソフォームに対してスクリーニングすることができる。前記方法は容易にハイスループットに適合することができ、その結果多数の候補ＰＲＥをスクリーニングでき、および／または候補ＰＲＥを複数のＰＫＣに対して同時にスクリーニングできる。
【０２５３】
標的抑制分子の使用
本発明のＴＩＭは、ＰＫＣ拮抗薬および作動薬の研究環境および開発過程と同様に、治療法の分野で多数の適用を有する。
【０２５４】
本発明は、１つ以上のＰＫＣイソフォーム、および任意に体外または生体内の１つ以上の他のタンパク質キナーゼの活性を抑制するＴＩＭの使用、ならびに本発明のＴＩＭの有効量を投与することによって、対象における１つ以上のＰＫＣイソフォームおよび任意に１つ以上の他のタンパク質キナーゼを抑制する方法を提供する。
【０２５５】
ＰＫＣは様々な疾病および疾患に関連付けられている。従って本発明は、癌、乾癬、血管形成、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、心臓血管疾患（不整脈など）、高血圧症、糖尿病、神経疾患、関節リウマチ、腎臓疾患、（多嚢胞性腎など）、炎症性疾患および自己免疫疾患などの、ＰＫＣに関連する疾病および疾患の治療において、単独での、または他の治療薬と組み合わせるＴＩＭの使用を企図する。
【０２５６】
本発明の一実施例は、癌、糖尿病の合併症（網膜症、高血圧、糖尿病依存性心臓血管疾患を含む）、多発性嚢胞腎、高血圧症、心肥大および心不全などのＰＫＣ−αに関連する疾患の治療におけるＴＩＭの使用を提供する。
【０２５７】
本発明のその他の実施例は、癌の治療におけるＴＩＭの使用を提供する。この文脈では、本発明のＴＩＭによる治療は、腫瘍の大きさの縮小、腫瘍の大きさの拡大の遅延または予防、腫瘍の消失または除去と再発との間の無病生存期間の延長、腫瘍の初期または後続発生（例えば、転移）の予防、進行するまでの時間の延長、腫瘍に関連する１つ以上の有害症状の低下、または癌を有する対象の総体的な生存期間の延長をもたらす可能性がある。
【０２５８】
ＴＩＭは、様々な腫瘍の成長および／または転移を抑制するのに使用することができる。典型的な腫瘍は、白血病、骨髄腫およびリンパ腫を含む血液学的新生物、腺癌および扁平上皮細胞癌を含む癌腫、メラノーマならびに肉腫を含むが、それらに限定されない。癌腫、メラノーマおよび肉腫はさらに、「固形腫瘍」または「固形癌」と頻繁に称される。普通に存在する固形腫瘍および癌の例は、脳、胸、頸部、結腸、頭部、首、腎臓、肺（非小細胞および小細胞を含む）、卵巣、膵臓、前立腺、胃、直腸、および子宮の癌を含むが、それらに限定されない。リンパ腫の様々な型はまた、固形腫瘍の形成をもたらす場合があり、従ってしばしば固形腫瘍とも見なされる。
【０２５９】
本発明によって包含されるさらなる癌は、例えば、多発性骨髄腫、神経芽腫、横紋筋肉腫、原発性血小板血症、原発性マクログロブリン血症、原発性脳腫瘍、神経膠腫、中皮腫、および髄芽細胞腫を含む。
【０２６０】
本発明の一実施例では、ＴＩＭは固形癌の治療に使用することができる。本発明のその他の実施例では、ＴＩＭは脳腫瘍、乳癌、結腸癌、肺癌、悪性黒色腫、卵巣癌、前立腺癌、神経芽腫、神経膠腫、結腸直腸癌または甲状腺癌の治療に使用する。さらなる実施例では、ＴＩＭは、ＰＫＣ−α発現の上方調節が発生することが知られている癌、例えば、膀胱癌、前立腺癌、および子宮内膜癌の治療で使用する。
【０２６１】
ＴＩＭはまた、多剤抵抗性腫瘍を含む、薬物抵抗性癌を治療するのに使用することができる。当技術分野で知られているように、化学療法に対する癌細胞の抵抗性は、癌の治療における中心問題の１つである。本発明の一実施例では、ＴＩＭは癌細胞の薬物抵抗性を低下または逆転させるのに使用する。一実施例では、ＴＩＭは、ＰＫＣ−α発現の上方調節が、発生することが知られている、例えば、薬物耐性結腸、結腸直腸または乳癌の薬物抵抗性癌の治療で使用する。
【０２６２】
前立腺および乳癌などの特定の癌は、ホルモン療法、すなわち、身体の天然ホルモンを遮断することによって、特定の癌の成長を遅延または停止させるホルモン剤または抗ホルモン剤によって治療することができる。かかる癌は、ホルモン療法に対する抵抗性を増加させる、または本質的に抵抗性を示す場合がある。本発明は、かかる「ホルモン抵抗性」または「ホルモン難治性」癌の治療におけるＰＫＩ化合物の使用をさらに企図する。
【０２６３】
本発明はまた、「感作物質」としてＴＩＭの使用を企図する。この場合は、ＴＩＭ単独では癌細胞での細胞傷害効果を有することはないが、細胞を弱らせ、１つ以上の標準化学療法に対するそれらの抵抗性を低下させることによって、従来の抗癌治療からの利益を促進する手段を提供する。
【０２６４】
治療する癌は緩慢性であってもよく、または侵襲性であってもよい。本発明は、難治性癌、進行性癌、再発性癌、および転移性癌の治療におけるＴＩＭの使用を企図する。
【０２６５】
本明細書で使用する「侵襲性癌」とは、急速に成長する癌を指す。当業者は、乳癌または前立腺癌などの一部の癌に関しては、用語「侵襲性癌」とは、所与の癌の再発回数の約初期３分の２の範囲内で再発した進行性癌を指す一方で、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）などの癌の他の型に関しては、ほぼすべての症例が侵襲性と見なされる急速に成長する癌を指すことを理解するであろう。従って前記用語は特定の癌型の小区分を包括することができ、またはその他の癌型のすべてを包含してもよい。「難治性」癌または腫瘍とは、治療に応答していない癌または腫瘍を指す。「進行性癌」とは患者における顕性疾病を指し、ここで顕性疾病は、外科手術または放射線治療法など、治療の局所モダリティによる治療に適していない。進行性疾病とは局所的進行性癌を指す場合もあり、または転移性癌を指す場合もある。用語「転移性癌」とは、身体の一部から別の部分に広がった癌を指す。進行性癌はまた切除不能な場合もあり、つまり、それらが周辺組織まで広がり、外科的に除去できないことである。
【０２６６】
本発明は、腫瘍発現および進行における様々な段階でＴＩＭの使用を企図する。従って、本発明は一次療法、新アジュバント療法（一次療法に対して）の一部として、または対象における癌を治療することを意図する、アジュバント療法投与計画の一部としてＴＩＭの使用を企図する。
【０２６７】
癌の治療に関して当技術分野で知られているように、「一次療法」とは、対象における癌の初期診断での第一線の治療を指す。典型的な一次療法は、外科手術、広範囲の化学療法および放射線治療法を伴う場合がある。「アジュバント療法」とは、一次療法に続いて行われ、再発のリスクにある対象に投与される療法を指す。アジュバント全身療法は一次療法の直後に開始し、再発を遅延させる、生存期間を延長させる、または対象を治療する。
【０２６８】
ＴＩＭは単独で、または１つ以上の他の化学療法薬と組み合わせて使用することができる。ＴＩＭと標準化学療法薬の組み合わせは、化学療法薬の有効性を改善するのに作用する場合があり、従って、標準癌療法を改善するのに使用することができる。この適用は、標準治療法では奏功しない薬物抵抗性癌の治療においてとりわけ重要である。一実施例では、本発明のＴＩＭは、１つ以上の標準化学療法との併用療法で使用する。その他の実施例では、本発明のＴＩＭは、薬物抵抗性癌の治療のために１つ以上の標準化学療法と組み合わせて使用する。
【０２６９】
臨床試験
当業者は、体外および動物モデルで本発明のＴＩＭの有効性を証明した直後に、その有効性をさらに評価し、治療で使用するために規制当局の許可を得るようＴＩＭは臨床試験に入ることを理解するであろう。任意の所与の臨床試験の詳細は、評価する疾病に応じて異なるが、癌治療用の治療法評価のための臨床試験プロトコルに関して以下に例示する一般形式に従う。
【０２７０】
当技術分野で知られているように、臨床試験は、第１、第２、第３および第４相として分類される試験段階を経て進行する。
【０２７１】
最初にＴＩＭは第１相試験で評価される。通常第１相試験は、投与の最良の形態（例えば、錠剤によって、または注射によって）、投与の頻度、および化合物の毒性を決定するのに使用する。第１相試験はしばしば、患者の身体内の化合物の効果を評価するために、血液検査および生検などの実験室試験を含む。第１相試験に関しては、癌患者の小集団はＴＩＭの特定用量で治療する。試験の間、用量は通常、化合物に関連する最大耐量（ＭＴＤ）および用量規定毒性（ＤＬＴ）を決定するために、グループごとに増加させる。この過程は、続く第２相試験で使用する適切な用量を決定する。
【０２７２】
第２相試験は、ＴＩＭの有効性および安全性をさらに評価するために実施することができる。第２相試験では、ＴＩＭは第１相試験で有効と認められた用量を使用して、一特異型の癌または関連する癌を有する患者集団に投与する。
【０２７３】
第３相試験は、いかに化合物と標準的または最も広く一般に認められた治療と比較するかを決定するのに焦点を当てる。第３相試験では、患者は無作為に２つ以上の「アーム」のうちの１つに割り当てられる。２つのアームを有する試験では、例えば、１つのアームは標準的治療を受け（対照群）、および別のアームはＴＩＭによる治療を受ける（治験群）。
【０２７４】
第４相試験は、化合物の長期安全性および有効性をさらに評価するのに使用する。第４相試験は、第１、第２および第３相試験と比べあまり一般的ではなく、ＴＩＭの標準的用法が承認された後に行われる。
【０２７５】
臨床試験のための患者の適任性
参加者適任性基準は、一般（例えば、年齢、性別、癌の型）から特定（例えば、前治療の型および数、腫瘍特徴、血球数、臓器機能）へ及ぶことができる。適任性基準はまた、試験相により異なってもよい。例えば、第１および第２相試験では、基準はしばしば、異常臓器機能または他の要因のために治験中の治療からリスクにある可能性のある患者を除外する。第２および第３相試験では、疾病の種類および段階、ならびに前治療の数および型に関して、さらなる基準がしばしば含められる。
【０２７６】
第１相癌試験は通常、他の治療法の選択肢が有効でなかった１５人から３０人の参加者を有する。第２相試験は通常、化学療法、外科手術、または放射線療法をすでに受けたが、治療法が有効でなかった最大１００人の参加者を有する。第２相試験での参加者はしばしば、受けた前処置に基づき制限される。第３相試験は通常、何百から何千もの参加者を有する。この多数の参加者は、ＴＩＭと標準治療法との有効性の真の相違点が存在するかどうか決定するために必要となる。第３相は、疾病連続体を網羅するために、最近癌と診断された者から広範な疾病を有する者に及ぶ患者を有してもよい。
【０２７７】
当業者は、治療法がより狭義の母集団に有効である可能性があるかどうか決定するために、調査対象集団をあまり広範にすることなく、できる限り包括的にするよう考案すべきであることを理解するであろう。試験に含まれる母集団が広範であればあるほど、結果は特に第３相試験において、一般集団に対してより適用できる可能性を有する。臨床試験のそれぞれの相での適切な参加者の選択は、当業者の通常の技量内にあると見なされる。
【０２７８】
治療前の患者の評価
研究の開始に先立ち、当技術分野で知られているいくつかの測定は、患者を最初に分類するのに使用することができる。例えば、Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ（ＥＣＯＧ）Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｓｔａｔｕｓ（ＰＳ）等級を使用して、患者を最初に評価することができる。ＥＣＯＧＰＳは、患者における機能障害を測定するように、患者の疾病の進行を評価するために広く一般に認めらており、ＥＣＯＧ  ＰＳ  ０は機能障害がないことを示し、ＥＣＯＧ  ＰＳ  １および２は患者が進行的により重度な機能障害を有するが、まだ歩行可能であることを示し、ＥＣＯＧ  ＰＳ  ３および４は進行的障害および機動性の欠如を示す。
【０２７９】
患者の総体的な生活の質は、例えば、ＭｃＧｉｌｌ  Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ  Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ（ＭＱＯＬ）（Ｃｏｈｅｎら（１９９５）Ｐａｌｌｉａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ９：２０７−２１９）を使用して、評価することができる。ＭＱＯＬは身体症状；身体的、精神的および実存的健康；支援；ならびに総体的な生活の質を測定する。嘔気、気分、食欲、不眠、機動性および疲労などの症状を評価するために、ＭｃＣｏｒｋｌｅおよびＹｏｕｎｇ（（１９７８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｎｕｒｓｉｎｇ１：３７３−３７８）によって開発されたＳｙｍｐｔｏｍ  Ｄｉｓｔｒｅｓｓ  Ｓｃａｌｅ（ＳＤＳ）を使用することができる。
【０２８０】
患者はまた、疾病の型および／もしくは段階、ならびに／または腫瘍の大きさに準じて分類することができる。
【０２８１】
薬物動態のモニタリング
第１相の基準を満たすために、ＴＩＭの分布は、例えば、血液または尿などの、定期的間隔で採取された試料の化学的分析によって監視される。例えば、試料は注入開始後約７２時間まで定期的間隔で採取することができる。
【０２８２】
分析を即刻実施しない場合は、試料採取後ドライアイスに載せ、続いて分析が実施できるまで−７０℃で保存する冷凍室に移す。試料は当技術分野で知られている標準手法を使用して分析のために調製することができ、ＴＩＭの存在する量は、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって測定することができる。
【０２８３】
薬物動態データは、熟練した臨床薬理学者と連携して生成および分析することができ、例えば、クリアランス、半減期、および最大血漿濃度を決定するために使用することができる。
【０２８４】
患者予後のモニタリング
臨床試験のエンドポイントは、評価段階にある化合物の有効性を示す測定可能な予後である。エンドポイントは試験の開始に先立ち設定し、臨床試験の型および相に応じて異なる。エンドポイントの例は、例えば、腫瘍反応率―通常パーセンテージで表す、腫瘍が特定の量によって大きさを縮小した、試験参加者の割合；無病生存率―通常月の単位で測定される、参加者が癌を発症または再発することなく生存する期間；全生存―通常臨床試験の開始から死亡時期まで測定される、参加者が存命する期間を含む。進行性癌および／または転移性癌に関しては、疾病安定―疾病が安定した、例えば、腫瘍が成長および／または転移を止めた試験参加者の割合は、エンドポイントとして使用することができる。他のエンドポイントは毒性および生活の質を含む。
【０２８５】
腫瘍反応率は第２相試験での典型的なエンドポイントである。しかしながら、治療が参加者の腫瘍の大きさを縮小して、無病生存率の期間を延長したとしても、それは全生存を延長しない場合もある。そのような場合には、副作用および全生存延長の不成功は、比較的長い無病生存率の利益より重要となり得る。あるいは、無腫瘍間隔の間の参加者の生活の質の向上は、他の要素より重要となり得る。このように、腫瘍反応率はしばしば暫定的であり、参加者の長期生存利益とはならないので、反応率は第２相試験で治療の有効性の妥当な手段である一方で、参加者生存および生活の質が通常第３相試験でエンドポントとして使用される。
【０２８６】
キット
研究用キット
本発明は、研究用途のために１つ以上のＴＩＭを有するキットを提供する。キットに提供さているＴＩＭは、フルオロフォア、放射性部分、酵素、ビオチン／アビジン標識、発色団、化学発光標識などの検出可能な標識を組み込むことができ、キットはＴＩＭを標識化するために試薬を含んでもよい。ＴＩＭは単一容器に提供する、別個の容器に等分する、または適切なアッセイ型に、例えば、マイクロタイタープレートに予め分注する、および／または固定担体上に固定することができる。
【０２８７】
キットは任意に、緩衝液、塩、抗体、酵素、酵素補助因子、基質、培地、検出試薬などの、スクリーニングアッセイを実施するために有用な試薬を含むことができる。実験試料の単離および／または処理のための緩衝液および溶液などの他の成分もまた、キットに含めてもよい。キットはさらに、精製または部分精製ＰＫＣなどの、１つ以上の対照を含んでもよい。
【０２８８】
キットの１つ以上の成分は凍結乾燥してもよく、キットは凍結乾燥済みの成分の再構成に適した試薬をさらに有してもよい。キットの様々な成分が適切な容器に提供されている。例えば、スクリーニングおよび診断目的のために、１つ以上の容器はマイクロタイタープレートであってもよい。適切な場合には、キットは任意に、反応容器、混合容器、および試薬または実験試料の調製を容易にする他の要素を含んでもよい。キットはまた、シリンジ、ピペット鉗子、計量スプーンなど実験試料を得るのに役立つ１つ以上の器具を含んでもよい。
【０２８９】
キットは任意に、印刷形式またはディスク、ＣＤ、ＤＶＤおなどのコンピュータ読み取り形式で提供してもよい、使用説明書を含むことができる。
【０２９０】
製剤キット
本発明は、本発明の１つ以上のＴＩＭ、またはＴＩＭを含む１つ以上の製剤組成物を含む治療キットまたはパックをさらに提供する。キットおよびパックは、タンパク質キナーゼ媒介の疾病または疾患の治療に使用することができる。キットの個別の成分は、適用できる場合には、通知がヒトまたは動物投与に対する、製造、使用または販売についての機関による承認を示す、薬学的または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する行政機関によって定められた形式の通知とともに、別個の容器に包装することができる。キットは任意に、本発明のＴＩＭと組み合わせて用いるために１つ以上の他の治療薬をさらに含むことができる。キットは任意に、ＴＩＭおよび／またはさらなる治療薬のための使用方法または投与計画を要約した使用説明書または指示書を含んでもよい。
【０２９１】
キットの成分が１つ以上の溶液中に提供される場合は、溶液は水溶液、例えば、滅菌水溶液であってもよい。この場合は、容器手段自身が、組成物を対象に投与してもよい、またはキットの他の成分に適用およびそれと混合してもよい、吸入器、シリンジ、ピペット、目薬の容器、またはそのような他の装置であってもよい。
【０２９２】
キットの成分はまた、乾燥型または凍結乾燥型で提供されてもよく、キットは凍結乾燥成分の再構成のために適切な溶媒をさらに含むことができる。容器の数または型に関係なく、本発明のキットはまた、患者への組成物の投与を支援するための器具を含んでもよい。かかる器具は、吸入器、シリンジ、ピペット、鉗子、計量スプーン、目薬の容器または医学的に承認された類似した供給手段であってもよい。
【０２９３】
以下に特定の実施例を参照にして本発明を説明する。以下の実施例は本発明の実施態様を説明するよう意図しており、決して本発明を限定するよう意図していないことが理解されるであろう。
【０２９４】
実施例
以下のペプチド認識要素は、標準固相合成法により作成された。
【０２９５】
【表４】
2009502983.tif 000016
【０２９６】
下記の実施例１〜１０に示されるように、試験されたＰＲＥは、少なくとも１つのＰＫＣイソフォームに対して親和性を有し、いくつかは１つのイソフォームまたはイソフォームのグループに対して特異的である。様々なＰＫＣイソフォームへＰＲＥの結合の特異性を測定したレベルが試験用に選択されたプロトコルにより若干異なることが予期されたので、下記に記載されるように、いくつかの手順がＰＲＥの結合特異性を評価するために使用された。プロトコル間およびプロトコル内での変動の考えられる原因は、ＰＫＣイソフォームの特異的一次抗体が標的を同程度に結合しないという事実を含み、それはイソフォーム間の定量比較を許容しないが、特定のイソフォームへのＰＲＥ結合の用量反応の正確な比較を許容する。さらに、市販の精製された酵素を使用する場合、調製は、部分的ＰＲＥ結合に対する結合容量査定を変える変性タンパク質を含むことがあり、細胞抽出物を使用する場合、分子の複合混合物を含み、未知分子が、ＰＲＥ結合に対し競合することがある。最後に、細胞では、ＰＲＥの過剰は、本イソフォームおよびその亜局在性の細胞内容量による標的イソフォームの結合部位に飽和する可能性がある。異なる手順の限界に関わらず、当業者は、結果を見るとそれぞれの試験されたＰＲＥの全体的な結合および特異性を把握できることを理解するであろう。
【０２９７】
実施例１：ＰＲＥおよびＰＫＣ−αを伴う体外競争実験：プロトコルＡ
ＰＫＣ−α−特異的ポリクローナル抗体にＰＫＣ−αへの結合を干渉するＰＲＥ１、２および３の能力（上記表３参照）を以下のプロトコルを使用して決定した。
【０２９８】
ＩＭＲ−３２（ヒト神経芽腫細胞）細胞かＣ６Ｃｘ４３細胞（コネキシン４３を過剰に発現するラットグリオーマの導入した細胞）のどちらかの細胞溶解物を標準プロトコルを使用して取得し、溶解物のタンパク質をＳＤＳ  ＰＡＧＥ電気泳動により分離し、ニトロセルロース膜に電子移動した。一次抗体の５倍か２０倍の濃度で、テストペプチドを含むブロッキングバッファー（ＴＢＳＴ）に３０分間、細胞膜をインキュベートした。その後、ＰＫＣ−αに対して特異な一次ポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，ＣＡ）を加え（１５μｇ／ｍｌ）、さらに４５分間、細胞膜をインキュベートした。最後に、標準手順を使用し、アルカリ性ホスファターゼに共役した二次抗体で一次抗体を検出した。ＰＫＣ−αに対応する帯の強度を走査し、Ｇｅｌ−Ｐｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）を使用するデンシトメトリーにより評価し、相対帯強度（平均３つの複製）を得た。ペプチドがないブロッキングバッファーを使用することを除き、上記に記載されるように、対照測定を実施した。
【０２９９】
下記の表５および６に結果を要約する。結果は、対照測定において、相対帯強度および対応する帯の強度の割合として表される（「相対強度（％）」）。「抑制率（％）」は、抗体にアクセスできないＰＫＣ−α帯の割合を意味する。
【０３００】
結果は、ＰＲＥ１およびＰＲＥ２の双方が膜上でＰＫＣ−αの抗原部位を覆い、ＰＲＥ２は、ＰＲＥ１よりもこの点でさらに有効であることを明らかに示す。これらの測定状態で、ＰＲＥ３は、抗体結合で効果を示さなかった。
【０３０１】
【表５】
2009502983.tif 000017
【０３０２】
【表６】
2009502983.tif 000018
【０３０３】
実施例２：ＰＲＥおよびＰＫＣ−βを伴う体外競争実験：プロトコルＡ
ペプチドのＰＲＥ１、ＰＲＥ２およびＰＲＥ３（表４参照）は、実施例１に記載された一般のプロトコルを使用し、ＰＫＣ−β−特異的ポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）の結合を干渉する能力を試験した。表７に結果を示し、ＰＲＥ１およびＰＲＥ２の双方とＰＫＣ−βとの間に交叉反応があることを示した。この点で、ＰＫＣ−αおよびＰＫＣ−βがＰＫＣの同一のサブグループ（ｃＰＫＣ）に属することは注目に値する。しかしながら、ＰＫＣ−βとの効果はかなり限定されており、これらの２つのペプチドがＰＫＣ−αに対して妥当な程度の特異性を有することを示す。これらの測定状態で、ＰＲＥ３は、ＰＫＣ−βへの抗体結合で効果を示さなかった。
【０３０４】
【表７】
2009502983.tif 000019
【０３０５】
実施例３：ＰＲＥおよびＰＫＣ−αを伴う体外競争実験：プロトコルＢ
ＰＫＣ−αへのＰＫＣ−α−特異的ポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）の結合を干渉するためにペプチドのＰＲＥ２およびＰＲＥ３（表４参照）を上記に要約されたプロトコルの修飾型を使用し、決定し、ウエスタンブロット法のための各ウェル（２０μｇ）のゲルに適用するタンパク質の濃度の５倍か１５倍の濃度で電気泳動する前に、テストペプチドを細胞抽出物へ直接加えた。
【０３０６】
表８に結果を示す。それぞれのペプチドとＰＫＣ−αとの間の相互関係は、電気泳動中、解離を防ぐためには十分強いものであり、ＰＲＥ２およびＰＲＥ３の双方は、ＰＫＣ−αへのＰＫＣ−α抗体結合を効果的に干渉することを結果は示す。ＰＲＥ３は、これらの測定状態でＰＲＥ２よりもさらに効果的であった。
【０３０７】
【表８】
2009502983.tif 000020
【０３０８】
実施例４：ＰＲＥおよびＰＫＣ−βを伴う体外競争実験：プロトコルＢ
ペプチドのＰＲＥ２およびＰＲＥ３（表４参照）は、実施例３に記載された一般のプロトコルを使用し、ＰＫＣ−βへのＰＫＣ−β−特異的ポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）の結合を干渉する能力を試験した。表９に結果を示し、ＰＲＥ２とＰＫＣ−βとの間に交叉反応があることを示した。しかしながら、これらの測定状態でより低い濃度で使用された場合、低濃度では、効果がかなり限定されており、ＰＲＥ２はＰＫＣ−αに対して妥当な程度の特異性を有することを示す。ＰＲＥ３は、、これらの状態で、ＰＫＣ−βへの抗体結合においてＰＫＣ−αへの抗体結合に示す効果と同様な効果を示した。
【０３０９】
【表９】
2009502983.tif 000021
【０３１０】
実施例５：ＰＲＥおよびＰＫＣ−α、ＰＫＣ−βＩおよびＰＫＣ−βＩＩを伴う体外競争実験：プロトコルＢ
ペプチドのＰＲＥ３およびＰＲＥ４（表４参照）は、実施例３に記載された一般のプロトコルを使用し、ＰＫＣ−α、ＰＫＣ−βＩまたはＰＫＣ−βＩＩへのイソフォーム特異的ポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）の結合を干渉する能力を試験した。表１０に結果を示す。結果では、ＰＲＥ４は、ＰＫＣ−βＩとＰＫＣ−βＩＩに対しある程度の交叉反応があることを示しているが、低濃度では、このペプチドがＰＫＣ−αに対して妥当な特異性があることを示した。上記の表９に示される結果と一致して、ＰＲＥ３は、、これらの状態で、ＰＫＣ−βＩおよびＰＫＣ−βＩＩへの抗体結合において、ＰＫＣ−αへの抗体結合に示す効果と同様の効果を示した。
【０３１１】
【表１０】
2009502983.tif 000022
【０３１２】
実施例６：ＰＲＥおよびＰＫＣ−εを伴う体外競争実験：プロトコルＢ
ペプチドのＰＲＥ２、ＰＲＥ３およびＰＲＥ４（表４参照）は、実施例３に記載された一般のプロトコルを使用し、ＰＫＣ−εへのイソフォーム特異的ポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）の結合を干渉する能力を試験した。ＰＫＣ−εの交互のスプライシング変異体を示す、２つの帯は、本抗ＰＫＣ−ε抗体を使用し、ウエスタンブロットで特定された。双方の帯についての結果を表１１に要約する。結果では、ＰＲＥ２およびＰＲＥ４は、低濃度でＰＫＣ−εとの間に交叉反応があることを示すが、これらのペプチドは、ＰＫＣ−αに対して妥当な特異性があることを示した。ＰＲＥ３は、ＰＫＣ−εへの抗体結合に示す効果に対して、これらの状態で、ＰＫＣ−αへの抗体結合にける効果と類似の効果を示した。
【０３１３】
【表１１】
2009502983.tif 000023
【０３１４】
実施例７：ＰＲＥを伴う体外毒性試験
ペプチドのＰＲＥ３、ＰＲＥ４およびＰＲＥ５の体外毒性試験（表４参照）が、下記に要約された一般のプロトコルに続いて実施された（「Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ＤＮＡ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ」  Ｒａｏ  Ｊ，Ｏｔｔｏ  Ｗ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０７：１８６−１９２、１９９２から修正）。
【０３１５】
測定は、９６ウェルプレートで実施され、１ウェルあたり３，０００のＩＭＲ−３２神経芽腫細胞を植え付け、処理ごとに８つの複製を実施した。普通の培地と飲作用エンドサイトーシス薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）か、評価中にＰＲＥを含む培地と飲作用エンドサイトーシス薬のどちらかを使用し、細胞を前処理した。細胞は、従来の状態で３日間成長させた。標準手順に従って、Ｈｏｅｃｈｓｔの試薬を使用し、それぞれのウェルのＤＮＡの容量を２４、４８および７２時間で評価した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製のプレートリーダー「サイトフルオル２３５０」を使用し、ウェルごとの蛍光強度を測定した。励起は、３６０ｎｍであり、発光は、４６０ｎｍであった。細胞の数は、ＤＮＡ容量と直接相関している。
【０３１６】
照合する未処理の対照と比較する場合、生存率に加えて、８つの複製ウェルに対して測定した平均相対蛍光強度も表１２〜１４に結果を示す。細胞毒性は、いずれのテストペプチドにも観察されなかった。
【０３１７】
【表１２】
2009502983.tif 000024
【０３１８】
【表１３】
2009502983.tif 000025
【０３１９】
【表１４】
2009502983.tif 000026
【０３２０】
実施例８：ＰＫＣ−αの細胞内局在性におけるＰＲＥ３およびＰＲＥ４の効力
飲作用エンドサイトーシスによりヒト神経芽腫細胞（ＩＭＲ−３２）に、ペプチドのＰＲＥ３またはＰＲＥ４（１０ｍｇ／ｍｌ）を導入した。ウサギＰＫＣ−α一次抗体および抗ウサギＡｌｅｘａ−４８８またはＡｌｅｘａ−８００二次抗体で細胞を固定し、染色した。
【０３２１】
図１Ａは、対照である、未処理の細胞に対する結果を示す。ほとんどの細胞では、ＰＫＣ−αは、細胞質内、細胞核周辺およびプラズマ細胞膜に位置すること（活性化される場所）が認められる。
【０３２２】
図１Ｂは、ＰＲＥ４による処理後の細胞の結果を示す。ＰＫＣ−αは、対照細胞と比較する場合、増加した蛍光強度に示されるように、処理済みの細胞の細胞質に堆積して見られる（図１）。従って、ＰＲＥ４の処置は、細胞膜へのＰＫＣ−αの転座を防ぎ、それは、酵素の活性化も防ぐであろう。
【０３２３】
図１Ｃは、ＰＲＥ３による処理後の細胞の結果を示す。ＰＫＣ−αは、細胞膜（白矢印）または細胞核周辺（黒矢印）にほとんど位置することが認められ、ＰＲＥ３は、ＰＫＣ−αの細胞内局在性を変えないことを意味する。
【０３２４】
実施例９：精製したＰＫＣイソフォームを伴う体外競合的結合測定
ペプチドのＰＲＥ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３（表３参照）は、競合的結合測定および精製したＰＫＣイソフォームを使用し、標的ＰＫＣイソフォームへのＰＫＣイソフォーム特異的抗体の結合を干渉する能力に対する検査を実施した。
【０３２５】
手順：競合的結合は、下記に記載されるように、９６ウェルプレートＥＬＩＳＡ法による検査を使用し、評価された。
【０３２６】
Ｇｒｅｉｎｅｒ社製の９６ウェルＥＬＩＳＡプレートは、ＰＢＳＮ（カルシウム／マグネシウムを有するＰＢＳ＋０．０５％のアジ化ナトリウムｗ／ｗ）内で希釈された適切なＰＫＣイソフォームでコーティングされた。２５０ｎｇ／ｍＬで５０μＬ／ｗｅｌｌを使用した。対照ウェルは、ＰＢＳＮのみ含有した。プレートを４℃で一晩中インキュベートした。
【０３２７】
ウェルごとに２００μＬのｄＨ２Ｏでプレートを３回洗浄し、その後、ウェルごとに１００μＬのブロッキング溶液を加え、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。ｄＨ２Ｏを使用する洗浄手順を繰り返し、５０μＬの適切なＰＲＥ溶液（ＰＢＳＮで希釈されたＰＲＥ原液［ＤＭＳＯ中の２０ｍＭ］）を加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。
【０３２８】
インキュベート後、５μＬの１．１：４００の抗ＰＫＣ（イソフォーム特異的抗体）をウェルごとに加えた（１：４０００の最終濃度を提供するため）。高低の結合親和性のため、ＰＫＣエプシロンに対して、１．１：８００の希釈を使用し、ＰＫＣ−ゼータに対して、１．１：１００の希釈を使用した。上記に記載されるように、ｄＨ２Ｏで洗浄した後、プレートを室温で１時間インキュベートした。
【０３２９】
その後、５０μＬの１：１０００のアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）合成抗体の希釈（抗ヤギであるゼータを除くすべてに対して抗ウサギ）を追加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。その後、ｄＨ２Ｏでの洗浄を繰り返した。最後に、１００μＬのｐＮＰＰ緩衝液中のｐＮＰＰ溶液に（２ｍＭのＭｇＣｌ２、水中の１００ｍＭの重炭酸ナトリウム、ｐＨ９．８）をすべてのウェルに加え、α、βＩ、βＩＩε、およびζに対して８分間、またはδに対して１５〜２０分間インキュベートした（十分な着色が観察されるまで）。ストップ溶液（２Ｎ  ＮａＯＨ）の添加により反応を停止し、ギャラクシープレートリーダーで４０５ｎｍで吸光度を読み取った。
【０３３０】
対照は、ＰＲＥを含まないＰＫＣであり、空の対照、およびＰＲＥを可溶化するために使用されるＤＭＳＯの最終濃度を含む対照であった。ＤＭＳＯに関連する非特異的結合容量も測定された。
【０３３１】
使用された抗体は以下のものである：抗ＰＫＣ  α（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＣ−２０８）、抗ＰＫＣ  βＩ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＣ−２０９）、抗ＰＫＣ  βＩＩ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＣ−２１０）、抗ＰＫＣ  δ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＣ−２１３）、抗ＰＫＣ  ε（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＣ−２１４）、抗ＰＫＣ  ζ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＣ−２１６−Ｇ）（すべてＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．より）。ＡＰ合成抗体は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から取得した（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）。
【０３３２】
計算：４０５ｎｍで測定されたＯＤ値は、ウェルごとにコーティングされた遊離ＰＫＣを示す。
ＰＫＣ単独のＯＤ４０５−各試料の空のＯＤ４０５＝コーティングされたイソフォームのＯＤ４０５
（試料ＸのＯＤ４０５／コーティングされたイソフォームのＯＤ４０５）×１００＝対照と比較されたＸ結合の割合を示す比率ｎ
１００−比率ｎ  検査したイソフォームに関してＸの相対結合能力を測定する。
その後、ＤＭＳＯ試料の見掛け結合容量をＸの結合能力から差し引いた。
【０３３３】
結果：表１５〜２０に結果を示す。すべての測定は、３部構成であり、表の値は、ＤＭＳＯの見掛け結合能力の減算後の平均計算された結合能力値を示す（２００、１００および５０μＭで検査したイソフォームを希釈するために使用されたＤＭＳＯの濃度に対応する１０．８０、１１．２０および１６．４０のそれぞれの１２の値の平均）。結果は、各表内の個別のイソフォームに関してそれぞれのＰＲＥの結合能力の定量的比較を可能にするが、二次抗体に関して特異的抗体の感度の差異があるため、イソフォーム間では定量的比較ができない。これは、特にＰＫＣ−デルタに適用する。上記に記載されるように、着色成果の持続を２〜３倍増大し、結果として、ＯＤ４０５の測定は、本イソフォームに対して過大評価される恐れがある。
【０３３４】
【表１５】
2009502983.tif 000027
【０３３５】
【表１６】
2009502983.tif 000028
【０３３６】
【表１７】
2009502983.tif 000029
【０３３７】
【表１８】
2009502983.tif 000030
【０３３８】
【表１９】
2009502983.tif 000031
【０３３９】
【表２０】
2009502983.tif 000032
【０３４０】
上記の表１５〜２０に認められるように、ＰＫＣ−αは、ＰＲＥ３およびＰＲＥ４の最も強い標的となり、ＰＫＣ−βＩは、ＰＲＥ１およびＰＲＥ３の最も強い標的になり、ＰＫＣ−βＩＩは、ＰＲＥ９の最も強い標的となり（５０μＭで）、ＰＫＣ−δは、ＰＲＥ１、ＰＲＥ３、ＰＲＥ１１およびＰＲＥ４の最も強い標的となり、ＰＫＣ−εは、ＰＲＥ３の最も強い標的になり、ＰＫＣ−ζは、ＰＲＥ３のみの標的になる。
【０３４１】
ＰＲＥ４は、ＰＫＣ−δに対する可能性のある親和性を除いて、ＰＫＣ−αに対する特異性を示し、上記に要約された理由に対して過大評価される可能性がある。
【０３４２】
ＰＲＥ３は、ＰＫＣ−βＩＩイソフォームを除いて、「ユニバーサル」ＰＫＣ標的ペプチドであると思われる。２つのイソフォームであるＰＫＣ−βＩおよびＰＫＣ−βＩＩの間の識別が従来的に困難であり、選択的なスプライシングに由来するため、これは興味深いものである。
【０３４３】
実施例１０：細胞抽出物を使用する体外競合的結合測定
また、実施例１に記載されるように、適切なＰＫＣイソフォームを発現する異なる細胞株からの細胞質抽出物を使用して、ペプチドのＰＲＥ２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３の結合効率および特異性（表４参照）を試験した。つまり、電気泳動によってタンパク質細胞質抽出物を分離し、標準ウエスタンブロッティング法によりニトロセルロースの細胞膜に転移した。ウエスタンブロッティング法の帯は、照合する一次抗体およびアルカリ性ホスファターゼに共役した二次抗体で検出された。その後、帯をスキャンし、相対密度測定を得た。
【０３４４】
ＰＲＥの結合特性を評価する手順は、一次抗イソフォームＰＫＣ特異的抗体の競合的結合に基づいている。測定した帯密度が低くなるほど、ＰＫＣイソフォームへのＰＲＥの結合が強いことを示す。抗原ペプチドと一次抗体との間での古典的な競合によって、ＰＲＥは、一次抗体の１０倍および２０倍（１０×、２０×）で追加された。以下の細胞株（ＡＴＣＣから取得）を使用した：Ｈ６６１−ＮＣＩヒト肺癌ＮＳＣＬＣ、ＭＤＡＭＢ２３１−胸水からのヒト高浸潤性乳癌細胞株、ＬＳ１８０−ヒト結腸腺癌、ＬｎＣＡＰ−ヒト前立腺腺癌、ＣＣＤ１６Ｌｕ−ヒト肺線維芽細胞、Ｄｕ１４５−ヒト前立腺癌の脳転移、およびＴ２４−ヒト膀胱癌。
【０３４５】
図２〜１３に結果を示す。図２から認められるように、対照（ＰＲＥのない）は、１０倍の負荷のあるタンパク質帯よりも密度において、時折、低かった。これらの場合には、対照と相対的な２０倍の帯密度の値および１０倍値は、信頼性があった。また、下記の表２０に結果を要約する。
【０３４６】
図２は、（Ａ）Ｈ６６１、ＭＤＡＭＢ２３１およびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−α、（Ｂ）Ｈ６６１、ＭＤＡＭＢ２３１およびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−βＩ、（Ｃ）Ｈ６６１、ＭＤＡＭＢ２３１およびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−δ、（Ｄ）ＭＤＡＭＢ２３１およびＬｎＣＡＰ細胞におけるＰＫＣ−ιおよび（Ｅ）ＭＤＡＭＢ２３１、ＬｎＣＡＰおよびＤｕ−１４５細胞におけるＰＫＣ−ζについてのＰＲＥ１の効力を示す。
【０３４７】
図３は、（Ａ）Ｈ６６１、ＭＤＡＭＢ２３１およびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−α、（Ｂ）Ｈ６６１、ＭＤＡＭＢ２３１およびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−βＩ（ウエスタンブロット法の第一の帯）、（Ｃ）Ｈ６６１、ＭＤＡＭＢ２３１およびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−βＩ（ウエスタンブロット法の第二の帯）、（Ｄ）Ｈ６６１、ＭＤＡＭＢ２３１およびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−βＩＩおよび（触媒断片）、（Ｅ）Ｈ６６１、ＭＤＡＭＢ２３１およびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−δ、（Ｆ）ＣＣＤ１６、ＬｎＣＡＰおよびＤｕ−１４５細胞におけるＰＫＣ−ε、（Ｇ）Ｈ６６１、ＣＣＤ１６およびＬｎＣＡＰ細胞におけるＰＫＣ−ιおよび（Ｈ）Ｈ６６１、ＣＣＤ１６およびＬｎＣＡＰ細胞におけるＰＫＣ−ζについてのＰＲＥ４の効力を示す。
【０３４８】
図４は、（Ａ）Ｈ６６１、ＭＤＡＭＢ２３１およびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−α、（Ｂ）Ｈ６６１、ＭＤＡＭＢ２３１およびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−βＩ、（Ｃ）Ｈ６６１、ＭＤＡＭＢ２３１およびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−δ、（Ｄ）ＣＣＤ１６、ＬｎＣＡＰおよびＤｕ−１４５細胞におけるＰＫＣ−ε、（Ｅ）Ｈ６６１、ＣＣＤ１６およびＬｎＣＡＰ細胞におけるＰＫＣ−ι、および（Ｆ）Ｈ６６１、ＣＣＤ１６およびＬｎＣＡＰ細胞におけるＰＫＣ−ζについてのＰＲＥ６の効力を示す。
【０３４９】
図５は、（Ａ）Ｈ６６１、ＭＤＡＭＢ２３１およびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−α、（Ｂ）Ｈ６６１、ＭＤＡＭＢ２３１およびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−βＩ、（Ｃ）Ｈ６６１、ＭＤＡＭＢ２３１およびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−βＩＩ、（Ｄ）Ｈ６６１、ＭＤＡＭＢ２３１およびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−δ、（Ｅ）ＭＤＡＭＢ２３１、ＬｎＣＡＰおよびＤｕ−１４５細胞におけるＰＫＣ−ε（ウエスタンブロット法の第一の帯）、（Ｆ）ＭＤＡＭＢ２３１、ＬｎＣＡＰおよびＤｕ−１４５細胞におけるＰＫＣ−ε（ウエスタンブロット法の第二の帯）、（Ｇ）ＭＤＡＭＢ２３１、ＬｎＣＡＰおよびＤｕ−１４５細胞におけるＰＫＣ−ιおよび（Ｈ）ＭＤＡＭＢ２３１、ＬｎＣＡＰおよびＤｕ−１４５細胞におけるＰＫＣ−ζについてのＰＲＥ３の効力を示す。
【０３５０】
図６は、（Ａ）Ｈ６６１、ＭＤＡＭＢ２３１およびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−α、（Ｂ）Ｈ６６１、ＭＤＡＭＢ２３１およびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−βＩ、（Ｃ）Ｈ６６１、ＭＤＡＭＢ２３１およびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−δ、（Ｄ）ＭＤＡＭＢ２３１、ＬｎＣＡＰおよびＤｕ−１４５細胞におけるＰＫＣ−ε、（Ｅ）ＣＣＤ１６、ＬｎＣＡＰおよびＤｕ−１４５細胞におけるＰＫＣ−ι、および（Ｆ）ＭＤＡＭＢ２３１、ＬｎＣＡＰおよびＤｕ−１４５細胞におけるＰＫＣ−ζについてのＰＲＥ７の効力を示す。
【０３５１】
図７は、（Ａ）Ｈ６６１、ＭＤＡＭＢ２３１およびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−α、（Ｂ）Ｈ６６１、ＭＤＡＭＢ２３１およびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−βＩＩ、（Ｃ）Ｈ６６１、ＭＤＡＭＢ２３１およびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−βＩ、および（Ｄ）ＭＤＡＭＢ２３１およびＤｕ−１４５細胞におけるＰＫＣ−εについてのＰＲＥ８の効力を示す。
【０３５２】
図８は、（Ａ）Ｈ６６１、ＭＤＡＭＢ２３１およびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−α、（Ｂ）Ｈ６６１、ＭＤＡＭＢ２３１およびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−βＩ、（Ｃ）Ｈ６６１、ＭＤＡＭＢ２３１およびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−βＩＩ、（Ｄ）Ｈ６６１、ＭＤＡＭＢ２３１およびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−δ、（Ｅ）ＭＤＡＭＢ２３１、ＬｎＣＡＰおよびＤｕ−１４５細胞におけるＰＫＣ−ε、（Ｆ）ＭＤＡＭＢ２３１、ＬｎＣＡＰおよびＤｕ−１４５細胞におけるＰＫＣ−ζについてのＰＲＥ９の効力を示す。
【０３５３】
図９は、（Ａ）Ｈ６６１、ＭＤＡＭＢ２３１およびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−α、（Ｂ）Ｈ６６１、ＭＤＡＭＢ２３１およびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−βＩ、（Ｃ）Ｈ６６１、ＭＤＡＭＢ２３１およびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−βＩＩ（触媒断片）、（Ｄ）Ｈ６６１、ＭＤＡＭＢ２３１およびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−δ、（Ｅ）ＭＤＡＭＢ２３１、ＬｎＣＡＰおよびＤｕ−１４５細胞におけるＰＫＣ−ε、および（Ｆ）ＭＤＡＭＢ２３１、ＬｎＣＡＰおよびＤｕ−１４５細胞におけるＰＫＣ−ζについてのＰＲＥ１０の効力を示す。
【０３５４】
図１０は、（Ａ）Ｈ６６１、Ｔ２４およびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−α、（Ｂ）Ｈ６６１、Ｔ２４およびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−βＩ、（Ｃ）Ｈ６６１、Ｔ２４およびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−δ、（Ｄ）ＭＤＡＭＢ２３１、ＬｎＣＡＰおよびＤｕ−１４５細胞におけるＰＫＣ−ε、および（Ｅ）ＭＤＡＭＢ２３１、ＬｎＣＡＰおよびＤｕ−１４５細胞におけるＰＫＣ−ζについてのＰＲＥ１１の効力を示す。
【０３５５】
図１１は、（Ａ）Ｈ６６１、ＭＤＡＭＢ２３１およびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−α、（Ｂ）Ｈ６６１、ＭＤＡＭＢ２３１およびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−βＩ、（Ｃ）Ｈ６６１、ＭＤＡＭＢ２３１およびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−βＩＩ（触媒断片）、（Ｄ）Ｈ６６１、ＭＤＡＭＢ２３１およびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−δ、（Ｅ）ＭＤＡＭＢ２３１、ＬｎＣＡＰおよびＤｕ１８０細胞におけるＰＫＣ−ε、（Ｆ）ＭＤＡＭＢ２３１、ＬｎＣＡＰおよびＤｕ−１４５細胞におけるＰＫＣ−ι、および（Ｇ）ＭＤＡＭＢ２３１、ＬｎＣＡＰおよびＤｕ−１４５細胞におけるＰＫＣ−ζについてのＰＲＥ１２の効力を示す。
【０３５６】
図１２は、（Ａ）Ｈ６６１、ＭＤＡＭＢ２３１およびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−α、（Ｂ）Ｈ６６１、ＭＤＡＭＢ２３１およびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−βＩ、（Ｃ）Ｈ６６１、ＭＤＡＭＢ２３１およびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−δ、（Ｄ）ＭＤＡＭＢ２３１、ＬｎＣＡＰおよびＤｕ−１４５細胞におけるＰＫＣ−ι、（Ｅ）ＭＤＡＭＢ２３１、ＬｎＣＡＰおよびＤｕ−１４５細胞におけるＰＫＣ−ζ、および（Ｆ）ＭＤＡＭＢ２３１、ＬｎＣＡＰおよびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−εについてのＰＲＥ１３の効力を示す。
【０３５７】
図１３は、（Ａ）Ｈ６６１、ＭＤＡＭＢ２３１およびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−α、（Ｂ）Ｈ６６１、Ｔ２４およびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−βＩ、（Ｃ）Ｈ６６１、Ｔ２４およびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−βＩＩ、（Ｄ）Ｈ６６１、Ｔ２４およびＬＳ１８０細胞におけるＰＫＣ−δ、（Ｅ）ＭＤＡＭＢ２３１、ＬｎＣＡＰおよびＤｕ−１４５細胞におけるＰＫＣ−ε、および（Ｆ）ＭＤＡＭＢ２３１、ＬｎＣＡＰおよびＤｕ−１４５細胞におけるＰＫＣ−ζについてのＰＲＥ５の効力を示す。
【０３５８】
細胞溶解物を伴う本実施例で得られた結果は、実施例１０において精製したイソフォームを使用して得られた結果と多くの点で相関している。特に、ＰＲＥ４は、本実施例に示され、実施例９においての、精製したイソフォームの結果がと同様に、ＰＫＣ−αに対して強い親和性を有する。しかしながら、いくつかの矛盾も起こる。特に、細胞抽出物を使用して、ＰＲＥ４は、ＰＫＣ−βＩに対して望ましい親和性を示し、ＰＫＣ−δに対しては何も示さず、一方、精製したイソフォームを使用して、ＰＲＥ４は、ＰＫＣ−δに対して親和性を示した。この矛盾は、精製した酵素が３次元構造を維持するとはいえ、ウエスタンブロット法において、酵素が変性化し、線形化したという事実から起こる恐れがある。さらに、酵素の相対濃度に対するＰＲＥ濃度は、精製した酵素を使用する場合、より制御することができ、本酵素の差異である、２つの手法の間のＰＲＥ比は、実験の感度における差異を導入する可能性がある。最後に、存在するがウエスタンブロット法では検出されない、および選択的な細胞株で異なって発現する未知のタンパク質へのＰＲＥの結合がある可能性がある。
【０３５９】
実施例９および１０に報告される実験の２つのセットの結果を表２１に要約する。
【０３６０】
【表２１】
2009502983.tif 000033
【０３６１】
実施例１１：化合物ＰＫＩ１〜ＰＫＩ１０を抑制するタンパク質キナーゼの調製
化合物ＰＫＩ１からＰＫＩ１０（下記参照）は、化合物ＰＫＩ３の調製に対する次のプロトコルにより示されるように、標準手順を使用して、合成された。ＰＮＡ部分を含まない化合物ＰＫＩ４は、製造業者により提供されるプロトコルに従って、アプライドバイオシステム社のパイオニアペプチド合成装置で合成された。
【化６】
2009502983.tif 000034
2009502983.tif 000035
【０３６２】
化合物ＰＫＩ３の調製
製造業者により提供されるプロトコルに従って、ｉｖＤｄｅ基を保護するアミンで側鎖を保護するＬｙｓを使用し、アプライドバイオシステム社のパイオニアペプチド合成装置でペプチド鎖ＦＲＲＫＦＲＬを合成した。
【０３６３】
ペプチド鎖を合成した後、ＤＭＦ、イソプロパノールおよびジクロロメタンで樹脂を洗浄し、２０分間樹脂を乾燥させ、その後、２％のヒトラジン（ＤＭＦ内）で３０分間洗浄することによりｉｖＤｄｅ保護基を除去した。その後、ＤＭＦ、イソプロパノールおよびジクロロメタンで樹脂を再度洗浄し、乾燥させた。
【０３６４】
ＤＭＦ溶剤中の樹脂を２ｅｑ活性剤ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ、２ｅｑＤＩＰＥＡおよび２ｅｑＰＮＡ（Ｂｈｏｃ）とともに振ることにより、ペプチド鎖のＬｙｓ残基の側鎖にアデニンペプチド核酸（ＰＮＡ（Ｂｈｏｃ））を結合した。１２時間後、樹脂を洗浄し、樹脂を２０％のピペリジン／ＤＭＦとともに６時間振ることにより、ＰＮＡからＦｍｏｃを除去する脱保護の手順を経た。最後に、標準プロトコルを使用し、樹脂からペプチドを開裂した。ろ過後、Ｈ２Ｏ（０．１％のＴＦＡ）にペプチドを溶解し、カラム・クロマトグラフィで精製した。
【０３６５】
質量分析法
以下のように、エレクトロスプレー質量分析法により、化合物の構造を確認した。ＰＮＡ部分を備える化合物に対して、ＰＮＡ部分の添加前後に質量スペクトル解析を実施した。
【０３６６】
正モードで操作している、空気圧補助電気スプレーイオニウム源を備えるＶＧ  Ｑｕａｔｔｒｏ  Ｉ（Ｆｉｓｏｎ，ＵＫ）質量スペクトロメータで、質量分析による分析を実施した。溶媒システムは、分速１５μｌの流速で０．２％のギ酸を伴い、アセトニトリル：水は１：１であった。源温度を８５ｏＣに設定し、円錐電圧設定２０Ｖでエレクトロスプレーキャピラリーを３．５ｋＶに設定した。１０秒間の掃引時間で、２００〜２０００ｍ／ｚの間の連続モードでデータを収集した。それぞれの化合物に対して得たスペクトルは、５連続スキャンとバックグラウンド除去法の合成であった。ＭａｓｓＬｙｎｘ３．５ソフトウェアの変換モードを使用し、それぞれの化合物の各質量を計算した。
【０３６７】
化合物ＰＫＩ１〜ＰＫＩ１０に対する計算質量および測定質量を表２２に示す。
【０３６８】
【表２２】
2009502983.tif 000036
【０３６９】
実施例１２：化合物ＰＫＩ１、ＰＫＩ２およびＰＫＩ３による精製したＰＫＣ−アルファの体外抑制
化合物ＰＫＩ１、ＰＫＩ２およびＰＫＩ３のそれぞれの、市販の精製したＰＫＣ−アルファの活性を抑制する能力の検査を実施した。ＰＫＣ−アルファは、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ番号１４−４８４から得た（Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ  ＮＹ）。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）製のキットである、ＩＱ  ＴＭ  ＰＫＣ測定キットを使用し、ＰＫＣ−アルファ活性検査を実施した。測定あたり１０μｇの濃度で、化合物１、２および３を使用した。図１５に示されるように、３つの化合物のすべてが抑制活性を示した。ギャラクシープレートリーダー（ＢＭＧ  ＬａｂＴｅｃｈ，ＧｍｂＨ，Ｏｆｆｅｎｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し、任意の蛍光強度単位に相対活量を表した。測定は、２重で実施され、２度繰り返された。図１５に示される値は、４つの検査の平均であり、「標準」は、いずれの抑制剤がない対照反応を示す。
【０３７０】
実施例１３：化合物ＰＫＩ１、ＰＫＩ２およびＰＫＩ３をによる細胞溶解物のＰＫＣ−アルファの体外抑制
４８時間、成長した神経芽細胞腫ＩＭＲ−３２細胞からの細胞溶解物であったＰＫＣ−アルファ酵素の源を除いて、上記（実施例１２）に記載されたと同様に、化合物ＰＫＩ１、ＰＫＩ２およびＰＫＩ３の検査を実施した。プロテアーゼ抑制剤およびバナジン酸の混合物で補完されたＲＩＰＡ緩衝液のフィルム下（４００μｌ）で、細胞（１×１０７）を−８０ｏＣで冷凍した。冷凍遠心器内で、１０分間、１４，０００ｘｇで抽出物を凍結し、遠心分離機にかけた。酵素源として、上澄液を使用した。図１６に結果を示し、「キナーゼ」は、未処理の抽出物の活性を示す。ＰＫＩ化合物の濃度は、図のように示す。
【０３７１】
化合物ＰＫＩ１（図１６Ａ）およびＰＫＩ２（図１６Ｂ）の双方は、望ましい活性を示すが、用量反応は観察されず、化合物が低濃度で活性であり、また、その他の細胞キナーゼが化合物に対して競合する可能性を示す。
【０３７２】
化合物ＰＫＩ３（図１６Ｃ）は、１μｇで望ましい活性を示し、低濃度で活性であることを示す。しかしながら、細胞溶解物に対して検査した場合、化合物ＰＫＩ３は、「用量に対して逆反応」を示し、１０μｇの用量で、化合物ＰＫＩ３が標準精製したＰＫＣ−アルファを大いに抑制する観察と対比した（図１５）。
【０３７３】
実施例１４：化合物ＰＫＩ１、ＰＫＩ２およびＰＫＩ３を伴う癌細胞増殖の体外抑制
ヒト神経芽腫細胞株ＩＭＲ−３２を使用し、癌細胞増殖を抑制するために化合物ＰＫＩ１、ＰＫＩ２およびＰＫＩ３の能力を体外検査した。単層細胞培養をトリプシン処理し、表２４に示される容量でテスト化合物を加え、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）製のキットである、Ｉｎｆｌｕｘ  ＴＭ  飲作用細胞負荷試薬を使用し、製造業者の提案に従い、飲作用エンドサイトーシスにより吸収した。表示された用量は、負荷媒体の濃度を意味し、１０μｌ容量で１×１０６細胞を使用し、すなわち、細胞あたり１０ｆｇから１００ｆｇを提供する１０μｇから１００μｇのテスト化合物を含む。しかしながら、本手法を使用し、化合物の小部分のみが吸収されたため、実際の用量はさらに低いものであることは注目に値する。実験の０日目に細胞を処理した。９６ウェルプレート（１ウェルあたり１００μｌの５，０００細胞）にテスト化合物で負荷された細胞を培養し、３日連続で増殖を監視した。集団の総ＤＮＡを測定するＨｏｅｃｈｓｔ試薬ベースの検査（ＲａｏおよびＯｔｔｏ，１９９２，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．．２０７：１８６−１９２から修正）を使用し、細胞集団の増加を定量化した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ  ２３５０プレートリーダー（励起３６０ｎｍおよび発光４６０ｍｎ）を使用し、蛍光を測定した。細胞の総数に直接相関関係のある、相対蛍光強度として測定を得た。表２３に結果を示す。単独で培養基で補完された照合する対照の割合としてデータを示す。
【０３７４】
化合物ＰＫＩ１を伴うＩＭＲ−３２細胞の抑制に明確な用量反応があった。表２３の結果に認めれるように、化合物ＰＫＩ１の濃度と抑制レベルとの間で逆相関があり、化合物は、最低用量で活性があるが、化合物が細胞に飽和する場合、多くの異なるタンパク質キナーゼにより競合する恐れがある。
【０３７５】
【表２３】
2009502983.tif 000037
【０３７６】
実施例１５：化合物ＰＫＩ１〜１０を伴うタンパク質キナーゼＣイソフォームの体外抑制
代表的な３つのＰＫＣのクラスである、ｃＰＫＣ（アルファ、ベータＩ／ＩＩ）、ｎＰＫＣ（デルタおよびエプシロン）、ａＰＫＣ（ゼータ）の精製した市販されているイソフォームにおいて、ＰｅｐＴａｇ（Ｒ）の非放射線ＰＫＣ測定（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用し、ＰＫＩ化合物１〜１０の抑制効果を測定した。キットに提供されている基質に対する親和性は、相対的に低かったが、ゼータイソフォームを本測定で試験した。ＰＫＣゼータ測定用の反応混合物の酵素量を２倍した。製造業者の提案に従い、その測定を使用した。測定の原理は、リン酸化した（負に帯電した）型と蛍光基質の非リン酸化した型との対比を管理する差異に基づく。Ｇａｌａｘｙ  ＦｌｕｏＳｔａｒプレートリーダー上の９６ウェルプレートで、ゲル電気泳動、切断された負に帯電された帯、および測定された蛍光（励起４４０ｎｍおよび発光５９０ｎｍ）により、２つの型を分離することができる。３つの用量である、１５０、３００および６００μＭ、抑制が高すぎる場合はさらに７５μＭで、ＰＫＩ化合物を測定混合物に加えた。測定は、厳密に生物化学的であり、従って、使用された化合物の用量は、一般にインビボ状態で相関性がない。表２４に結果を示す。
【０３７７】
【表２４】
2009502983.tif 000038
【０３７８】
表２４に認められるように、ＰＫＩ化合物は、触媒部位に対して類似構造を共有し、ｎＰＫＣ（デルタおよびエプシロン）に対してあまり強力でないｃＰＫＣ（アルファ、ベータＩ／ＩＩ）、およびｃＰＫＣの構造に対して異なる触媒部位構造を有することを報告するａＰＫＣ（ゼータ）に対してさらに活性であるという点で、パネルのＰＫＣイソフォームに関してある程度の特異性を示す。
【０３７９】
化合物ＰＫＩ１、４、５、７および８は、ＰＫＣエプシロンおよびゼータを除くすべてのＰＫＣイソフォームの非常に強力な抑制剤である。３００μＭの高濃度で、デルタへのＰＫＣアルファの抑制は、これらのすべての化合物でほぼ完全である。その一方、ＰＫＣエプシロンでは、最大６００μＭまで用量反応があり、１つの用量は、完全抑制を達成するには十分ではない。類似のパターンがＰＫＣゼータで観察され、化合物へのエプシロンよりも感度が少ない。化合物ＰＫＩ１のＲＧＲでの化合物ＰＫＩ６のアミノ酸ＬＲＬの変換は、ＰＫＣアルファに関して化合物のより高い特異性をもたらすように見える。
【０３８０】
実施例１６：癌細胞増殖における化合物ＰＫＩ１〜１０の効果
飲作用流入を通じて細胞への化合物ＰＫＩ１〜１０の個別結合に続き、代表的な異なる癌における１０細胞株での細胞死の誘導および細胞増殖の変化を研究した。５ｍＭおよび１０ｍＭの濃度で化合物を使用した。しかしながら、これらの濃度は、実施例１４に記載されるように、細胞により実際に受け取った化合物の量に直接相関していない。使用した細胞株は、以下のものである。Ｕ−２５１膠芽細胞腫細胞株、Ｈ−６６１非小細胞肺癌細胞株、ＩＭＲ−３２神経芽細胞腫細胞株、ＬＮＣａｐおよびＤＵ−１４５前立腺癌細胞株、ＬＳ−１８０結腸癌細胞株、ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞株、ＳＫＯＶ−３卵巣癌細胞株、およびＴ−２４膀胱癌細胞株。乳癌細胞株ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、エストロゲン受容体の発現（ＭＣＦ−７＋）および攻撃性の双方で異なる。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、Ｈｅｒ／Ｅｒｂ−２を発現するエストロゲンの陰性の細胞株であり、転移性乳癌の代表的なものである。同様に、２つの前立腺癌細胞株のうち、ＬＮＣａｐは、アンドロゲン不感受性細胞株であり、ＤＵ１４５は、アンドロゲン陽性細胞株である。
【０３８１】
使用された手順は以下のものである。始動細胞懸濁液の密度の開始は、１×１０６細胞／ｍｌであった。供給者の提案に従い、飲作用エンドサイトーシス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）により１０μｌで５ｍＭおよび１０ｍＭの濃度で、それぞれ与えられた細胞株にＰＫＩ化合物のそれぞれを組み入れた。１０％のＦＢＳを含む適切な媒体の９６ウェルプレートに５０００の細胞を分散し、２４、４８および７２時間成長させた。エンドサイトーシスに続き、死細胞の放出しないで、細胞懸濁液を平板培地した。さらに、細胞集団の大きさは、ＤＮＡの合計（細胞の数に直接関連する値、実施例１４参照）として評価された。
【０３８２】
上記に要約される実験の設定は、ＰＫＩ化合物の結合後、細胞死におけるそれぞれの化合物の最初の影響を２４時間、測定することを可能にした。従って、２４時間で対照の未処理細胞および処理細胞の集団の大きさの差異は、死細胞数の測定測定値である。次の４８時間、増殖パターンは、化合物は増殖を変るかどうか、また、化合物の安定性を間接的に示す。従って、実験の設定は、アポトーシス、耐性細胞または無負荷細胞の増殖指数および細胞内のＰＫＩ化合物の持続指数または内因性の安定性の同時推定可能にする。
【０３８３】
表２５および２６に２４時間（短期間）で細胞死する割合（％）を示す。
【０３８４】
【表２５】
2009502983.tif 000039
【０３８５】
【表２６】
2009502983.tif 000040
【０３８６】
すべての化合物は、５ｍＭの濃度で、少なくとも２つの検査された癌細胞株を１５％以上抑制できた。様々な細胞株に関して、化合物のある程度の特異性が認められるが、興味深いことに、結腸癌細胞株ＬＳ−１８０は、化合物の大部分、特に、化合物ＰＫＩ５、６、７、４、９および２により誘発された細胞死に対して感受性が強かった。化合物ＰＫＩ４およびＰＫＩ２の双方は、本結腸癌細胞株における強力な短期活性をおよぼし、中程度の再増殖が続いた。化合物の最も顕著な結果は、化合物の使用後、初めの２４時間における細胞死である。さらに、化合物の安定性は、少なくとも７２時間の定常状態での増殖の一般保守または増殖の減少に基づく。
【０３８７】
実施例１７：アポトーシスにおける化合物ＰＫＩ１〜１０の効果
化合物ＰＫＩ１〜１０の内面化から生じる短期細胞死は、上記表２５および２６に示される。しかしながら、ＤＮＡの抽出がゲルの塗布標本として示される場合、ＤＮＡ  ｌａｄｄｅｒｉｎｇは、明らかに観察されなかった。従って、代表的な化合物である、化合物ＰＫＩ３の効果は、２つの癌細胞株に用量反応として分析され、細胞核を染色するＨｏｅｃｈｓｔ試薬を使用し、その化合物は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞株およびＮＣＩ  Ｈ−６６１非小細胞肺癌細胞のいずれの短期細胞死を示さなかった。５０、２５０および５００μＭの濃度で化合物ＰＫＩ３で細胞を処理した。Ｈｏｅｃｈｓｔの染色は以下のように実施された。Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含む酢酸ナトリウム緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）で１回細胞を洗浄した。その後、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含むＰＢＳに調製した１％のパラホルムアルデヒド溶液で、２０分間室温で細胞を固定し、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含むＰＢＳで３回洗浄した。クロマチン凝縮、アポトーシスのマーカーを検出するために、ＰＢＳに２０分間、５μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８で細胞を染色した。最後に、ＰＢＳで３回細胞を洗浄した。励起４０５ｎｍおよび発光４５５ｎｍ強で、ＩＭＴ２−ＤＭＶフィルタを使用し、Ｎｉｋｏｎ  Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅに画像を収集し、Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅで分析した。
【０３８８】
図１７（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）および図１８（Ｈ−６６１）に結果を示す。１０倍の拡大図である、図１８のパネルＥを除いて、すべての画像は、２０倍の拡大図である。整合画像として、結果を示す。左側の画像は、逆相であり、右側画像は、Ｈｏｅｃｈｓｔ試薬で染色した細胞核を示す。細胞質の広範囲に及ぶ空胞変性が示すように、２つの細胞株は、細胞変性の増加を伴う明白な用量反応を示す。１０倍に拡大した逆相画像で特に複屈折細胞として細胞死を示す（図１８、パネルＥ）。ＤＮＡ  ｌａｄｄｅｒｉｎｇは、明らかに観察されなかったが、クロマチン凝縮およびクロマチン配置は、化合物ＰＫＩ３によりアポトーシス信号を誘発したことを意味する。
【０３８９】
実施例１８：細胞移動／浸潤性における化合物ＰＫＩ１〜１０の効果
Ｍａｔｒｉｇｅｌのマトリックスを通じて細胞の移動に基づく標準プロトコルを使用し、化合物の移動抑制の可能性を測定するためにＭＤＡ−ＭＢ−２３１、浸潤性乳癌細胞株（上皮細胞増殖因子の陽性）を使用した（実施例２９参照）。すべての処理を３部構成にした。表２７に結果を示す。対照細胞膜を通じた移動に関連するＭａｔｒｉｇｅｌのマトリックスおよび細胞膜を通じての浸潤性の割合（％）として、データを示す。浸潤率および浸潤抑制率は以下のように計算される。
浸潤率＝マトリゲル挿入細胞膜を通じて侵入する細胞の数の平均×１００
対照挿入細胞膜を通じて移動する細胞の数の平均
浸潤抑制率＝対照細胞の浸潤率−化合物処理された細胞の浸潤率
【０３９０】
【表２７】
2009502983.tif 000041
【０３９１】
Ｚｈａｎｇ  Ｗ．ら（（２００３）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，９９（６）：１０３９−４６）により記載される方法で運動性に対して化合物ＰＫＩ５、ＰＫＩ７およびＰＫＩ１０を試験した。簡単に、２００μＬのＲＰＭＩ＋１０％のＦＢＳの密度の２×１０４細胞で直径１０ｃｍの丸ペトリ皿の中央に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を平板培地した。対照および処理細胞を平板培地する前に、ペトリ皿の底の外側に４つの丸を描いた。湿気のある５％のＣＯ２環境で３７ｏＣ、６時間インキュベートした後、媒体を除去し、廃棄し、ペトリ皿の中央の付着細胞の円形域を形成した。これらの細胞を血清のない媒体で洗浄し、血清を含む新鮮な媒体で補完した。培養物をさらに６日間３７℃でインキュベートした。
【０３９２】
細胞運動を決定するために、中央域の周囲から事前に決定した距離で細胞数を３部構成で毎日数え、運動率を対照細胞と比較して計算し、１００％の運動率として考えた。
【０３９３】
５日後、運動性の抑制は、化合物ＰＫＩ１０、ＰＫＩ７、およびＰＫＩ５に対して、３．５％、３．０％および５．０％であった。３日目または４日目では抑制は観察されなかった。
【０３９４】
実施例１９：ＰＫＩ化合物に共役したＰＲＥを備える典型的な標的抑制分子（ＴＩＭ）の調製
ＰＫＩ化合物に共役したＰＲＥを備える以下のＴＩＭを合成した。化合物ＴＩＭ１０に対する典型的な合成プロトコルを以下に提供する。
【０３９５】
標準プロトコルおよび試薬（ＮＨ４）２ＣＯ３／ＡｃＯＨ／ＤＭＳＯを使用し、合成した後、２つの分離連鎖として化合物ＴＩＭ９を合成し、共に結合した。
【０３９６】
製造業者の提案した結合の手法を使用し、化合物ＴＩＭ９、低ペプチド鎖（表２８に示す）のＮ−末端へ細胞透過性を増強するペプチドＲＲＲＱＲＲＫＫＲを結合することにより化合物ＴＩＭ１１を合成した（ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＰＥＡを使用）。その後、標準手法により細胞透過性を増強するペプチドのＮ−末端をアセチル化し、化合物ＴＩＭ９に対して上記に記載されるように、化合物の２つのペプチドを共に結合した。
【０３９７】
【表２８】
2009502983.tif 000042
2009502983.tif 000043
2009502983.tif 000044
【０３９８】
化合物ＴＩＭ１０に対する一般的な合成手順を以下の通りである。第一に、製造業者により提供されたプロトコルに従い、ｉｖＤｄｅ基を保護するアミンで側鎖を保護するＬｙｓを使用し、アプライドバイオシステム社のパイオニアペプチド合成装置でペプチド鎖を合成した。
【０３９９】
ペプチド鎖を合成した後、ＤＭＦ、イソプロパノールおよびジクロロメタンで樹脂を洗浄し、２０分間樹脂を乾燥させ、その後、２％のヒトラジン（ＤＭＦ内）で３０分間洗浄することによりｉｖＤｄｅ保護基を除去した。その後、ＤＭＦ、イソプロパノールおよびジクロロメタンで樹脂を再度洗浄し、乾燥させた。
【０４００】
ＤＭＦ溶剤中の樹脂を２ｅｑ活性剤ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ、２ｅｑＤＩＰＥＡおよび２ｅｑＰＮＡ（Ｂｈｏｃ）とともに振ることにより、ペプチド鎖のＬｙｓ残基の側鎖にアデニンＰＮＡ（Ｂｈｏｃ）を結合した。１２時間後、樹脂を洗浄し、樹脂を２０％のピペリジン／ＤＭＦとともに６時間振ることにより、ＰＮＡからＦｍｏｃを除去する脱保護の手順に従った。最後に、標準プロトコルを使用し、樹脂からペプチドを開裂した。ろ過後、Ｈ２Ｏ（０．１％のＴＦＡ）にペプチドを溶解し、カラム・クロマトグラフィで精製した。
【０４０１】
実施例２０：化合物ＴＩＭ９による癌細胞増殖の体外抑制
ヒト神経芽腫細胞株ＩＭＲ−３２を使用し、実施例１４に記載された一般のプロトコルに従い、癌細胞増殖を抑制するために化合物ＴＩＭ９の能力を体外検査した。処置してから４８時間後の結果を表２９および図１９に示す。図２０は、化合物ＴＩＭ９で処置されたＩＭＲ−３２細胞の形態を示す。対照（Ａ）と比較して化合物ＴＩＭ９（Ｂ、Ｃ＆Ｄ）への用量反応は、化合物ＴＩＭ９の高濃度で細胞は集まり、死ぬことを示す。
【０４０２】
【表２９】
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【０４０３】
実施例２１：化合物ＴＩＭ１１による癌細胞増殖の体外抑制
細胞に浸透するＴＩＭ量を向上するために、ＴＩＭ１１を提供するために記載されたように（実施例１９および表２８参照）、細胞透過性を強化するペプチドＲＲＲＱＲＲＫＫＲで同時合成することにより化合物ＴＩＭ９を修飾した。内面化し、化合物から分離する際、ペプチドは、化合物ＴＩＭ１１の構造を変化しないようである（Ｂａｒａｎｙ−Ｗａｌｌｊｅ  Ｅら（２００５）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．ＢｉｏＦａｓｔ，２００５年７月２２日）。
【０４０４】
実施例１４に記載された一般のプロトコルに従い、化合物ＴＩＭ１１のＩＭＲ−３２癌細胞増殖を抑制する能力を体外試験した。処置してから２４、４８および７２時間後、表３０および図２１に結果を示す（２４時間）。ここで留意すべきは、すべての化合物が、細胞内に入るとは限らないので、化合物ＴＩＭ１１の用量は、概算であることである。
【０４０５】
処置されたＩＭＲ３２細胞はまた、様々な用量で化合物ＴＩＭ１１で処置してから２４時間後、形態変化を起こした。２．５μＭと同程度の低用量で、細胞質の拡大およびストレスファイバーが出現し、５μＭの用量で、染色細胞が見られる。１０〜２５μＭの用量で、用量が増加するにつれて、細胞変性の兆候に伴い、ストレスファイバーおよび細胞質の拡大が見られる。５０μＭの用量で、細胞質／細胞核の比は、劇的に減少する。アポトーシス小体は、ほとんどそれぞれの細胞内に観察された。１００μＭの用量で、細胞は、差異を認められ、細胞空胞変性を示し、２５０μＭの用量で、すべての細胞は死んだ。
【０４０６】
【表３０】
2009502983.tif 000046
【０４０７】
実施例２２：ヒト神経芽腫細胞（ＩＭＲ−３２）における化合物ＴＩＭ９によるＰＫＣ活性の抑制
ＰＫＣ酵素、ＭＡＲＣＫＳペプチド（１５４−１６５）（シグナル形質導入製品、カタログ番号Ｓ−１３０１）の天然基質のリン酸化反応を抑制するために化合物ＴＩＭ９の能力をＩＭＲ−３２細胞において研究を行った。飲作用エンドサイトーシス（ＭＰ）を使用し、ＭＡＲＣＫＳペプチドを細胞に組み込み、従来の固定法に従い、ウサギ抗ホスホチロシンＭＡＲＣＫＳ特異抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ．カタログ番号１００１８−３−ＡＰ）を使用し、免疫細胞化学的検出を実施した。図２２および２３に結果を示す。図２２は、ＭＡＲＣＫＳ（上方のパネル）を注射しない対照細胞、ＭＡＲＣＫＳの結合後（左上パネル）、３０分間、ＴＰＡによる処置後（右上パネル）、伝統的ＰＫＣ（Ｇｏ６９７６）の既知の抑制を伴う処置後（左下パネル）およびＴＰＡおよび化合物ＴＩＭ９を伴う処置後（右下パネル）を示す。図２２から認められるように、対照細胞は、ＭＡＲＣＫＳの限定された発現を示す。３０分間のＴＰＡ処置に続き、活性ＰＫＣの存在を示す、ペプチドリン酸化反応の増加がある。Ｇｏ６９７６によるｃＰＫＣの不活性化は、曝露してから３０分後もなお非常に低く、化合物ＴＩＭ９で処置してから３０分後、ｃＰＫＣの不活性化は、すでに顕著である。
【０４０８】
図２３は、図２２に記載されるものと同一の処置を行ってから２４時間後に得た結果を示す。対照細胞は、ＭＡＲＣＫＳの限定された発現を示す。２４時間のＴＰＡ処置に続き、ＰＫＣのＴＰＡ処置の既知の効果のペプチドリン酸化反応を示す減少がある（短時間曝露による活性化、長時間曝露後の不活性化）（右上パネル）。Ｇｏ６９７６によるｃＰＫＣの不活性化は、リンのＭＡＲＣＫＳ内因性レベルの蛍光放射の推定の減少により明白に示される（左下パネル）。比較して、化合物ＴＩＭ１１は、さらに劇的影響を示す（右下パネル）。
【０４０９】
実施例２３：化合物ＴＩＭ１０による非小細胞肺癌細胞増殖の抑制
実施例１４に記載された一般のプロトコルに従い、ヒト癌細胞株Ｈ６６１を使用し、ヒト癌細胞増殖を抑制するために化合物ＴＩＭ１０の能力を体外試験した。ＣＣＤ−１６Ｌｕ細胞（正常な不死化したヒト肺線維芽細胞）における化合物ＴＩＭ１０の効果をまた、同一のプロトコルにより評価した。処置してから２４、４８および７２時間後の結果を表３１（Ｈ６６１細胞株）および図２４（Ａ：ＣＣＤ−１６ＬＵ細胞株、およびＢ：Ｈ６６１細胞株）に示す。、低用量の化合物ＴＩＭ１０に対する正常細胞における４８および７２時間での用量効果の変化（図２４Ａ参照）は、もはや増殖に効果がない用量まで化合物ＴＩＭ１０のレベルを低下させる、化合物ＴＩＭ１０の予想される細胞内分解によるものであると解釈された。しかしながら、Ｈ６６１細胞では、１ｍＭの用量で、化合物ＴＩＭ１０は分解されず、ウエスタンブロット法および免疫細胞化学の画像化により評価されたように、その細胞内の局在性は変化しなかった。
【０４１０】
【表３１】
2009502983.tif 000047
【０４１１】
図２４に示された結果において、正常ＣＣＤ−１６ＬＵ肺細胞は、同一の臓器からのＨ６６１癌細胞よりも化合物ＴＩＭ１０により影響が少ないという事実が注目に値する。Ｈ６６１細胞は、化合物ＴＩＭ１０に対して非常に感受性が強く、細胞生存の抑制は、用量および時間に依存していた。細胞が、細胞周期のＧ２相で遮断されていることを示した（実施例３２参照）。
【０４１２】
実施例２４：化合物ＴＩＭ１０による神経芽腫細胞増殖の抑制
実施例１４に記載された一般のプロトコルに従い、ヒト神経芽腫ＩＭＲ−３２細胞株を使用し、癌細胞株を抑制するために化合物ＴＩＭ１０の能力を体外試験した。表３２および図２５にデータを示す。この悪性のヒト癌細胞株は、１０ｍＭで化合物ＴＩＭ１０による処置から２４時間後に、２５％の成長阻害率を示した。７２時間後に最大の成長阻害率を得て、これは、ＰＫＣ−αへのアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して前回得たデータに一致する。これらのデータはまた、神経芽腫細胞内で、化合物ＴＩＭ１０の効果は少なくとも７２時間継続することを示す。
【０４１３】
【表３２】
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【０４１４】
実施例２５：化合物ＴＩＭ１０による癌細胞におけるギャップ結合機能の回復
ヒト神経芽腫（ＩＭＲ−３２）細胞におけるギャップ結合機能を回復する化合物ＴＩＭ１０の能力を評価した。単分子層としてカバースリップにＩＭＲ−３２細胞を生育した。２４時間後、はじめにホルスコリンで細胞を処置して、コネキシンの細胞内レベルを増加し、その後、飲作用流入を通じて化合物１０（５０μＭ）を注射した。対照、ｃ−ＡＭＰおよび化合物１０処理した単分子層を３７ｏＣでインキュベートし、Ｌｕｃｉｆｅｒ  ｙｅｌｌｏｗを有する負荷をこすり取る状態に置かれた。これらの実験において、ｃＡＭＰの細胞透過アナログ（８−ｂｒｏｍｏ−ｃＡＭＰ）を使用した。ギャップ結合を通じる染色運動は、３時間および２４時間後、蛍光顕微鏡写真に明白に認められた。
【０４１５】
図２６にギャップ結合機能の定量的評価を示し、化合物ＴＩＭ１０（５０μＭ）による処置をされてから３時間および２４時間後、ＩＭＲ−３２細胞におけるギャップ結合を通じてＬｕｃｉｆｅｒ  ｙｅｌｌｏｗの染色運動の強度（画像ＰＲＯ  ｐｌｕｓ  ４．５  ソフトウェアにより測定）を示す。図２６は、化合物ＴＩＭ１０がこれらの細胞内でギャップ結合機能を回復できたことを明白に示す。
【０４１６】
実施例２６：ドキソルビシン耐性のヒト結腸癌細胞の生存における化合物ＴＩＭ１０の効果
多薬物抵抗性（ＭＤＲ）を構成的に発現する、発癌性の高いヒト結腸癌細胞（ＬＳ１８０、ＡＴＣＣ＃ＣＬ−１８７）を本実験に対して使用した。２×１０５の密度で、６ウェルプレートにＬＳ１８０細胞を植え付けた。２４時間の回復後、５０ｎｇ／ｍｌのドキソルビシン、２．５μＭの化合物ＴＩＭ１０、またはドキソルビシンと化合物ＴＩＭ１０を７２時間合成（２．５μＭおよび５μＭ）したもので細胞を処理した。ここで留意すべきは、細胞培養液に化合物ＴＩＭ１０を添加し、細胞内へ化合物を無理に送るためにプロトコルを使用しなかったことである。その後、標準トリパンブルー色素排除法を使用し、細胞をトリプシン処理し、合計した。図２７に結果を示し（棒は、２つの実験の平均を示す）、大部分の細胞はドキソルビシンによる処置の後生き延び、薬物抵抗性であることを示したが、化合物ＴＩＭ１０の単独では、細胞死を引き起こすことができた示す。化合物ＴＩＭ１０とドキソルビシンの合成は、ドキソルビシンに従来耐性があるＬＳ１８０細胞において細胞死を引き起こすのに非常に効果的であった。
【０４１７】
実施例２７：ヒト結腸癌細胞の薬物抵抗性における化合物１０の効果
癌細胞株において多薬物抵抗性（ＭＤＲ）が発現し、機能するか否かの決定は、一般に細胞からのカルセインＡＭまたはローダミン１２３の蛍光漏れの測定により行われる。これらの染色の流出は、化学治療薬が細胞に送り出される方法をシミュレートする。細胞がＰｇｐかＭＲＰ−１かのどちらか（ＭＤＲタンパク質の２つのファミリー）を発現する場合、カルセインＡＭを有する癌細胞は染色を流出するが、ローダミン１２３は、Ｐｇｐを発現する細胞からのみ流出するであろう。下記に記載されたように、ヒト結腸癌細胞（ＬＳ１８０）からのカルセインＡＭおよびローダミン１２３の双方の流出に影響を及ぼす化合物ＴＩＭ１０の能力を決定した。
【０４１８】
４×１０５でペトリ皿にＬＳ１８０細胞を植え付け、一晩中回復させるために放置した。翌日、ドキソルビシン（５０ｎｇ／ｍｌ）および／または化合物１０（２．５、５または１０μＭ）を添加し、所要期間中、細胞をインキュベートした。ここで留意すべきは、細胞培養液に化合物ＴＩＭ１０を添加し、細胞内へ化合物を無理に送るためにプロトコルを使用しなかったことである。７２時間終了時点で、ＤＭＳＯ内の２．５ｍＭのカルセインＡＭかＤＭＳＯ内の２００ｎｇ／ｍｌのローダミン１２３のどちらかで細胞を負荷し、３０分間（カルセイン）または１時間（ＲＨＯ１２３）染料にインキュベートした。インキュベーション後、染料を除去し、新鮮培地で置換し、染料を流出するために３７ｏＣで９０分間、細胞を放置した。その後、細胞をトリプシン処理し、フローサイトメトリーに対する調製における１ｍｌの培地に再懸濁した。
【０４１９】
図２８に結果を示す。（Ａ）化合物ＴＩＭ１０（１０、５および２．５μＭ）は、ＭＤＲ媒介カルセイン流出の減少に効果があった。本図の上列は、７２時間処置の最後の２４時間における化合物ＴＩＭ１０の添加を示し、下列は、全７２時間処置の化合物１０の添加を示す。未処置ＬＳ１８０結腸癌細胞において、Ｙ（左）軸方向に移動する蛍光で示す（色素流出を示す）ように、ＭＤＲの構成レベルを示す。５０ｎｇ／ｍｌのドキソルビシンにより７２時間処置された細胞において、ＭＤＲの機能レベルの増加によって、色素流出を増加する。化合物ＴＩＭ１０の添加は、右軸方向への蛍光の後退で示されるように、カルセイン色素流出において、大幅な減少を引き起こした。（Ｂ）化合物ＴＩＭ１０（５μＭ）は、ＭＤＲ媒介ローダミン１２３流出の減少において効果的であった。カルセイン流出と同様に、化合物ＴＩＭ１０の存在は、右軸方向への蛍光の後退で示されるように、ローダミン１２３色素流出において、大幅な減少を引き起こした。
【０４２０】
また、１２ウェルプレートに細胞を植え付け、ギャラクシープレートリーダーを使用し、ウェルで相対強度を決定することにより、カルセイン蛍光を定量化した。同一に生じる方法は、２．５、５および１０μＭで、化合物ＴＩＭ１０に対する図２９に示されるようなフローサイトメトリーデータを生じる。
【０４２１】
ローダミン１２３流出における化合物ＴＩＭ１０の効果は、既知であり、有効なＭＤＲ抑制剤であるベラパミルの効果とも比較された。ベラパミルは、体外のＭＤＲの減少に非常に効果的であるが、生体内および臨床用途に対してあまりにも有害であると判断される。図３０に示されるように、５μＭで化合物ＴＩＭ１０は、５μｇ／ｍｌのベラパミルよりもＬＳ１８０細胞内にＰｇｐ媒介ＭＤＲを抑制させるのにさらに効果的であった。ドキソルビシンに培養されたＬＳ１８０細胞株内におけるＰｇｐタンパク質の発現は、免疫組織化学の研究により確認された。
【０４２２】
実施例２８：ヒト結腸癌細胞におけるＰＫＣ−αおよびコネキシン４３のレベルでの化合物ＴＩＭ１０の効果
化合物ＴＩＭ１０（５または１０μＭ）で２４時間、ヒト結腸癌細胞（ＬＳ１８０）をインキュベートし、免疫細胞化学によりコネキシン４３（Ｃｘ４３）のレベルおよびＰＫＣ−αタンパク質を評価した。図３１の左欄に示すように、Ｃｘ４３タンパク質のレベルは、化合物１０により処置した細胞において増加した。ＰＫＣ−αタンパク質のレベルは、化合物ＴＩＭ１０により処置した細胞において減少した（図３１、右欄）。これは、ギャップ結合チャンネルの通門が、ギャップ結合機能の連続損失を有するＰＫＣ−αにより変化する前回の観察と一致し、ＰＫＣ−αは、Ｃｘ４３の発現を抑制することを示す。
【０４２３】
実施例２９：癌細胞移動／浸潤性における化合物ＰＫＩ１０の効果
化学誘引物質としてのＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）存在、および、非存在下で、ヒト乳癌細胞（ＭＤＡ  ＭＢ２３１）の移動において、化合物ＴＩＭ１０（５ｍＭ用量）の効果を調査するために実験を実施した。これらの実験のために、標準の２つのチェンバー培養システム（ＢＤ  ＢＩＯｃｏａｔＴＭ  ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ  Ｉｎｖａｓｉｏｎ  Ｃｈａｍｂｅｒ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔ、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｌａｂｗａｒｅ、Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用した。以下の実験で使用される対照チェンバーは、Ｍａｔｒｉｇｅｌのマトリックスが存在しないことを除いて、広範囲に及ぶチェンバーに類似しており、従って、細胞膜の気孔を介して低細胞膜の表面に細胞を自由に到達させる。
【０４２４】
化学誘引物質ＥＧＦに対して浸潤を測定しながら、誘引物質としてＦＢＳに対して定常浸潤活性を測定した。
【０４２５】
定常浸潤活性を測定するため、無血清培地における浸潤の上部チェンバーまたは対照チェンバーに細胞を植え付け、細胞膜下の媒体に１０％のＦＢＳを供給した。４８時間後、細胞の移動を評価した。細胞核を染色するためにＨｏｅｓｃｈｔ試薬を使用し、培養を染色した。表３３に結果を示し、対照細胞膜（Ｍａｔｒｉｇｅｌなし）を通じた移動に対するＭａｔｒｉｇｅｌのマトリックスおよび細胞膜を通じての浸潤性の割合（％）として、結果を示す。
浸潤率＝マトリゲル挿入細胞膜を通じて侵入する細胞の数の平均
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−×１００
対照挿入細胞膜を通じて移動する細胞の数の平均
【０４２６】
【表３３】
2009502983.tif 000049
【０４２７】
化学誘引物質として１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを使用し、上記に記載されるように、化学誘引物質ＥＧＦの存在において、ＭＤＡ  ＭＢ２３１細胞の浸潤／移動を抑制するために化合物ＴＩＭ１０の能力を測定した。４８時間後、長い過程で細胞変性（液胞化した細胞質）で細胞を示し、細胞膜の下側に移動したほとんどすべての細胞において、クロマチン凝縮は、非常に明白であった。結果は、化合物ＴＩＭ１０が化学誘引物質として１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦの存在でさえ、ＭＤＡ  ＭＢ−２３１の移動に強い阻害的影響があることを示す。
【０４２８】
化合物ＴＩＭ１０はまた、第一に細胞移動を遮断し、第二に細胞を殺す、ＭＤＡ  ＭＢ２３１細胞における二重の影響を発揮することが観察された。後者の影響は、移動抑制率の計算を不可能にした。
【０４２９】
ここで留意すべきは、化合物ＴＩＭ１０（５ｍＭ）により処置されてから２４時間後、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦの存在において、細胞増殖で２５％の抑制を観察したことである。
【０４３０】
実施例３０：化合物ＴＩＭ１０の特異性
以下のヒト癌細胞株において、通常下記に記載されるような、様々なＰＫＣイソフォームに対するタンパク質のレベルでの化合物ＴＩＭ１０の効果を評価した：ＭＤＡ  ＭＢ−２３１乳腺腺癌細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２６）、Ｔ２４  膀胱移行細胞癌種（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−４）、ＳＫＯＶ−３卵巣腺癌（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−７７）、ＭＣＦ−７乳腺腺癌（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２２）、Ｃａｐａｎ−２膵臓腺癌（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−８０）、ＮＣＩ−Ｈ６６１  ＮＳＣＬ大型細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１８３）、Ｃａｌｕ−６有望肺未分化癌（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−５６）およびＣａｌｕ−３肺腺癌（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−５５）。
【０４３１】
ＡＴＣＣ取扱説明書に従い、異なる癌のタイプを代表する細胞を培養した。サブコンフルエンスで、製造業者取扱説明書に従い、細胞をトリプシン処理し、化合物１０（５ｍＭ）を飲作用流入エンドサイトーシス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）に組み込んだ。賦形剤を化合物１０の代わりに組む込む場合を除いて、それに応じて、照合する対照を処理した。飲作用流入後、細胞を植え付け、２４時間、新鮮培地で生育させた。標準プロトコルに従い、ＲＩＰＡ分解緩衝液を使用し、細胞培養をさらに抽出した。ブラッドフォードタンパク質の評価手順（ＢｉｏＲａｄ）を使用し、それぞれの溶解物のタンパク質の容量を測定し、正規化した。試料緩衝液の添加後、電気泳動により１５μｌのそれぞれの抽出物からタンパク質を分離し、ニトロセルロース細胞膜へ電気移動し、適切な抗体を使用し、ＰＫＣの様々なイソフォームを検出した（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．，ＣＡ）。スキャン後、予期された分子量の帯の相対強度を推定し、対照に対して帯強度の減少率（％）を計算した。表３４に結果を示す。
【０４３２】
【表３４】
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【０４３３】
表３４に認められるように、化合物１０は、検査したすべての細胞株において、アルファイソフォームの帯強度を減少し、ｃＰＫＣ、ｎＰＫＣおよびＰＫＣ基のそれぞれ代表的なものであるＰＫＣベータ１、エプシロンおよびゼータにおける影響はない。
【０４３４】
また、２つの細胞株を除いて、デルタイソフォームに対して帯強度の減少を観察した。ＰＫＣ−αの細胞内レベルの減少により影響を及ぼしたＰＫＣ−δにおける細胞内含有量によるものである可能性がある。例えば、Ｒｏｍａｎｏｖａ，Ｌ．ら（１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７，５５５８−５５６５）は、ＰＫＣ−αおよびＰＫＣ−δの内因性レベルは関連し、特に、ＰＫＣ−αの過剰発現は、ｍＲＮＡの安定化およびｍＲＮＡ翻訳の強化を通じてＰＫＣ−δのレベルを安定させることを示す。
【０４３５】
実施例３１：癌細胞のアポトーシスにおける化合物ＰＫＩ１０の効果
ＰＢＳ中またはＰＢＳ中０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ１００に溶解する賦形剤を単独または化合物ＴＩＭ１０（５ｍＭ）を使用し、ヒト非小細胞肺癌細胞（Ｈ６６１）にはエンドサイトーシスが行われた。Ａｆｔｅｒ２４時間後、Ｈｏｅｃｈｓｔ試薬を使用し、細胞核を染色した。図３２〜３４に結果を示す。
【０４３６】
図３２は、賦形剤を単独で使用する、対照細胞にはエンドサイトーシスが行われたことを示す。細胞核は腎臓形であり、多くの細胞は、多核である（ＢおよびＣ）。ＡおよびＤは、サブコンフルエントかつコンフルエントな初期培養を示す照合する逆相である。
【０４３７】
図３３は、ＰＢＳ中０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ１００で溶解される５ｍＭの化合物ＴＩＭ１０原液の内面化後の細胞を示す。認められるように、細胞集団は大いに減少した。Ｈｏｅｃｈｓｔで染色された細胞核（白矢印）および核分裂（Ａの矢じり）でのクロマチン凝縮によるアポトーシスをＡおよびＣに示す。照合する逆相は、特性の脱落（二重矢印）およびアポートシス小体（Ｂの黒矢印）を示す。図３４は、ＰＢＳ中で溶解される５ｍＭの化合物ＴＩＭ１０原液の内面化後の細胞を示す。さらに、細胞集団は大いに減少した。Ｈｏｅｃｈｓｔで染色された細胞核（Ｂ）の核フラグメンテーションによりアポトーシスを示し、Ｃ（白矢印）でクロマチン凝縮を観察する。照合する逆相の顕微鏡写真は、典型的なアポトーシスの形である、すなわち脱落（Ｄ）およびアポートシス小体（黒矢印）を示す。
【０４３８】
実施例３２：細胞周期における化合物ＰＫＩ１０の効果
賦形剤を単独または化合物ＴＩＭ１０（５ｍＭ）を使用し、ヒト非小細胞肺癌細胞（Ｈ６６１）には飲作用エンドサイトーシスを行われ、フローサイトメトリーに対する従来のプロトコル（ＦＡＣＳ）を使用し、細胞周期分析およびアポートシスの決定のために処理した。Ｈ６６１細胞は、６倍性かつ１４２のモード数である（１３０〜１５３の範囲）。しかしながら、ＤＮＡは、全体の微細構造の異常を示さない。異常染色体数は、これらの細胞内で分析する細胞周期の研究を困難にする。図３５に結果を示す（細胞率（％）は、ｙ軸に、ＤＮＡ含有量をｘ軸にとる）。（Ａ）は、２４時間、賦形剤を単独で飲作用処理後の細胞周期相への細胞の分布を示す。濃い灰色のピークは、Ｇ１相における細胞率を示し、Ｓ相を斜め線のピークで示し、薄灰色のピークは、ＤＮＡ含有量の増加に伴う細胞の大配列を測るＧ２相を示す（４ｎ染色体）。（Ｂ）は、４８時間後のこれらの対照細胞の分布を示し、Ｓ相およびＧ２相へさらに細胞を移動する一方、非同期化の増殖型の細胞集団に対して期待されるように、Ｇ１相での細胞率の減少を示す。（Ｃ）は、５ｍＭの化合物ＴＩＭ１０の内面化後の細胞周期への細胞の分布を示す。細胞はすべて、可変のＤＮＡ含有量を有するＧ２相へ移動した。化合物ＴＩＭ１０による処置後、細胞は多核になり（顕微鏡検査で観察された場合）、使用したソフトウェアにより細胞が会合体になる場合、これは認識された。アポトーシスの少量が黒ピークに姿を現す。ここで留意すべきは、異常染色体数および細胞のＤＮＡ含有量のため、この手法を使用し、アポトーシス量を過小推定していることである。（Ｄ）は、化合物ＴＩＭ１０による処置により生じるＧ２相のブロックを示す、Ｇ２相での細胞の劇的な蓄積を示す。アポトーシスのピークは、増加し、Ｇ２相のブロックのためさらに増加するであろう。
【０４３９】
実施例３３：化合物ＴＩＭ１６の安定発現、ＰＫＣ−αイソフォームに関する特異性および有効性
ＩＭＲ３２神経芽腫細胞株および神経芽腫生検に発現する主要なイソフォームである３つのＰＫＣイソフォーム（α、δおよびε）において、細胞内に化合物ＴＩＭ１７の特異性および有効性（表２８参照）の検査を行った。
【０４４０】
ＴＩＭ１７をコード化するヌクレオチド配列を以下のように考案した。開始（ＡＴＧ）および終止（ＴＡＣ）コドンとともにＴＩＭ１７をコード化する配列を備えるコーディングオリゴヌクレオチドと、センスオリゴヌクレオチドの相補配列を備える相補的なオリゴヌクレオチドの２つのオリゴを調製した。
【０４４１】
コーディングオリゴヌクレオチド：５’−ＡＴＧ  ＴＴＴ  ＣＧＣ  ＣＧＣ  ＡＡＡ  ＴＴＴ  ＣＧＣ  ＣＴＧ  ＧＧＣ  ＧＧＣ  ＧＧＣ  ＧＧＣ  ＧＧＣ  ＧＧＣ  ＧＧＣ  ＡＡＡ  ＧＡＴ  ＧＣＧ  ＣＡＧ  ＡＡＣ  ＣＴＧ  ＡＴＴ  ＧＧＣ  ＡＴＴ  ＡＧＣ  ＡＴＴ  ＴＧＡ−３’［配列番号：６２］
相補的なオリゴヌクレオチド：５’−ＴＣＡ  ＡＡＴ  ＧＣＴ  ＡＡＴ  ＧＣＣ  ＡＡＴ  ＣＡＧ  ＧＴＴ  ＣＴＧ  ＣＧＣ  ＡＴＣ  ＴＴＴ  ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＧＣＣ    ＧＣＣ  ＣＡＧ  ＧＣＧ  ＡＡＡ  ＴＴＴ  ＧＣＧ  ＧＣＧ  ＡＡＡ  ＣＡＴ−３’［配列番号：６３］
コーディングオリゴヌクレオチドおよび相補的なオリゴヌクレオチドを交配し、二本鎖ＤＮＡ断片（「ＴＩＭ１７オリゴ」）を形成し、その後、以下のセンスおよびアンチセンスプライマーおよび下記に提供されたプロトコルを使用し、ＰＣＲを増幅した。
センスプライマー［配列番号：６４］：
５’−ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＧＡＴＧＴＴＴＣＧＣＣＧＣＡＡ  ＡＴＴＴ−３’
アンチセンスプライマー［配列番号：６５］：
５’−ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＡＡＡＴＧＣＴＡＡＴＧＣＣＡＡＴ−３’
【０４４２】
【表３５】
2009502983.tif 000051
【０４４３】
ＴＩＭ１７をコード化する配列を増幅する１４１ｂｐ  ＰＣＲ［配列番号：６６に示されるコード鎖］は、従来の手法を使用し、ｐＤＯＮＲＴ２２１ベクターに挿入された。
５’−ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＧＡＴＧＴＴＴＣＧＣＣＧＣＡＡＡＴＴＣＧＣＣＴＧＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＡＡＧＡＴＧＣＧＣＡＧＡＡＣＣＴＧＡＴＴＧＣＡＴＴＡＧＣＡＴＴＴＡＧＡＣＣＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＧＧＴＣＣＣＣ−３’［配列番号：６６］
【０４４４】
合成ＴＩＭ１７遺伝子は、ｐＲＥｘ−ＤＥＳＴ３１（７５５９）発現ベクターにサブクローンされ、標準手法を使用し、ＩＭＲ３２神経芽腫細胞に導入された。ＴＩＭ１７遺伝子の転写は、遺伝子発現にスイッチの切り換えをさせるテトラサイクリンプロモーターの制御下にある。ＴＩＭ１７遺伝子の発現は、４８時間、１５０ｎｇ／ｍｌのテトラサイクリンによる処理により、誘発された。
【０４４５】
図３６にＰＫＣ−α発現に対するフローサイトメトリー分析の結果を示す。２０，０００〜５０，０００の個別細胞からデータを得た。グラフのスケールは、蛍光のピークで測定された事象の数を報告し、さらに、特異性抗ＰＫＣアルファ抗体への明らかな細胞率を相対強度とともにグラフに示す（下記の割合に提供された数字を参照）。相対強度は、細胞集団でＰＫＣアルファの平均細胞内レベルと相関する。テトラサイクリンへの導入されない細胞の曝露は、ＰＫＣアルファ発現を変更しない（図３６ＡとＢを比較）。反対に、テトラサイクリンへのＴＩＭ１７の導入された細胞の曝露は、２つの細胞集団の間で識別する（図３６ＣとＤを比較）：３０％の細胞は、対照としてＰＫＣアルファのＰＫＣアルファに類似レベルを発現し、さらに、６９．８％の集団は、ＴＩＭ１７の発現にのみ起因することができるＰＫＣアルファ細胞含有量の劇的な減少を示す。
【０４４６】
また、ＳａｎｔａＣｒｕｚ社からの抗ＰＫＣ抗体およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社からの第二Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲートを使用し、蛍光画像化をすることによりＰＫＣ−α、δおよびεの発現レベルを評価した。エピ蛍光を搭載したＣｏｕｌｔｅｒ社の顕微鏡から顕微鏡画像を取得し、ＤＡＧＥ−ＭＴＩカメラを使用して、ＩｍａｇｅＰｒｏ＋ソフトウェアで画像を分析した。すべての画像に対して同一のゲートを一定に維持した。ＴＩＭ１７におけるＩＭＲ３２細胞内のＰＫＣ−αの細胞含有量の低下は、テトラサイクリンへの曝露により発現されるという結果を示す。しかしながら、ＴＩＭ１７の発現は、ＰＫＣデルタおよびＰＫＣエプシロンイソフォームの細胞内レベルを変更しなかった。また、上記の結果は、ウエスタンブロットでも確認された。
【０４４７】
実施例３４：癌細胞増殖における化合物ＴＩＭ１０、１３、１４および１５の効果
３つのヒト癌細胞株である、ＩＭＲ３２神経芽腫細胞株、ＭＤＡＭＢ２３１癌細胞株およびＵ２５１膠芽腫細胞株において、化合物ＴＩＭ１０、１３、１４および１５の効果（表２８参照）を研究した。９６時間、集団サイズの増加を監視し、修正されたＨｏｅｃｈｓｔ試験を使用し、集団の総ＤＮＡ含有量の相対的蛍光強度、細胞数と相関する値を測定した。
【０４４８】
ＩＭＲ３２細胞に対して、（図３７参照−結果は、照合する対照を超える比として報告される）すべての検査したＴＩＭ化合物は、７２時間後、細胞集団の減少を生じ、恐らくＴＩＭ化合物の低下のため、９６時間で効果が逆転した。化合物ＴＩＭ１３および１４は、最大効果を示したが、それが細胞に浸透する前に、恐らくエステラーゼによる低下のため、エステル化された化合物（ＴＩＭ１５）は、低有効性を示した。
【０４４９】
ＩＭＲ３２とは異なり、ＭＤＡＭＢ２３１乳癌の増殖およびＵ２５１膠芽腫細胞株は、検査したＴＩＭ化合物に、やや感受性があるだけてあった。ＰＫＣアルファ抑制後、増殖の対照は、機能的なギャップ結合チャンネルを通じてＩＭＲ３２に影響を及ぼすことがあり、コネキシン４３はＭＤＡＭＢ２３１に発現するが、機能的なチャンネルを形成しないため、上記は、予想される。同様に、Ｕ２５１細胞は、ＰＫＣアルファを発現するが、生存を促進する主要酵素は、これらの細胞内において、構成的活性化のため、ＡＫＴ／ＰＫＢである。Ｕ２５１細胞はまた、機能的なチャンネルを形成しないコネキシン４３を発現する。
【０４５０】
実施例３５：Ｈ−６９細胞の化合物ＴＩＭ１０および１３の毒性におけるＴＰＧＳの効果
化合物ＴＩＭ１０およびＴＩＭ１３では、豚、マウスおよびヒトの血清および血漿の未確認成分の軟凝集を生じることが示された。この軟凝集を防ぎ、ＴＩＭ化合物の有効性を増加させるために、ＴＰＧＳ（アルファトコフェロールポリエチレングルコールコハク酸）の特性をうまく生かした。また、アジュバントは、酸素分解からＴＩＭ化合物を保護してもよい。
【０４５１】
従来のＭＴＴ試験を使用して、２４時間処置した後に、ＴＩＭ１０または１３への曝露においてＮＣＩ−Ｈ６９小細胞性肺癌細胞の生存を評価した。ＴＰＧＳの有無に関わらず、ｕｇ／ｍｌの培地として、化合物を細胞に添加した。ＴＰＧＳ濃度は、１０から５０ｕｇに増加した。照合する対照の割合（％）として、生存を示す。
【０４５２】
図３８に結果を示す。ＴＰＧＳの増分は、ＴＩＭ１０の５０ｕｇ用量では大幅に変化しなかったが、固定したＴＰＧＳ用量でのＴＩＭ１０の用量増加は、大いに生存に影響を及ぼした。例外（１００ｕｇのＴＩＭ１０／２５ｕｇのＴＰＧＳ）は、間誤りである恐れがある。類似の型をＴＩＭ１３で観察した。これらの結果は、ＴＰＧＳの追加は、ＮＣＩ−Ｈ６９細胞死におけるＴＩＭ化合物の有効性を増加することを示す。
【０４５３】
実施例３６：様々なＰＫＣイソフォームの活性におけるＴＩＭ化合物の効果
製造業者の取扱説明書に従い、キナーゼ−ＧｌｏＴＭ発光キナーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ＃Ｖ６７１２／３／４）を使用し、ＰＫＣ−アルファ、ベータ１、デルタおよびエプシロンイソフォームの活性を抑制する能力に対して、化合物ＴＩＭ１０、１１、１３、１４、１５、および１８−２２（表２８参照）を検査した。表３５に結果を示す。
【０４５４】
【表３６】
2009502983.tif 000052
【０４５５】
化合物ＴＩＭ１０、１３、１４および１５はすべて、同一のコア構造を共有する。しかしながら、ＴＩＭ１３はさらに、ＰＴＤペプチドを含み、ＴＩＭ１４は、Ｆｃペプチドを含み、ＴＩＭ１５は、エステル化されたアスパラギン酸残留を含む。ＰＴＤペプチドは、細胞質へのＴＩＭを標的にし、Ｆｃペプチドは、細胞核へのＴＩＭを標的にし、エステル化は、ＴＩＭの細胞透過性を増加する。
【０４５６】
表３５に認められるように、ＰＫＣアルファへの効果は、化合物ＴＩＭ１０、１３、１４および１５に類似している。４つすべての化合物に対して、活性の同一「飽和」は観察さたが、ＴＩＭ１３は例外であり、高濃度で非常に強力であった。ＴＩＭ１０および１５の双方は、ＰＫＣデルタを抑制するが、ＴＩＭ１３および１４では抑制しない。ＴＩＭ１０およびＴＩＭ１３は、ＰＫＣベータ１を大いに抑制する。他の二つの化合物は抑制が少なく、ＰＫＣエプシロンはＴＩＭ１０、１３および１５に対して高濃度でのみ、感受性がある。測定では追加部分を開裂することができる酵素がないため、この測定で観察された活性における差異は、若干人工的であることをに留意することは重要である。細胞では、異なる結果が観察される可能性がある。
【０４５７】
ＴＩＭ１８は、ＰＫＣアルファの非常に強力な阻害剤であり、その結果は予想されたものであった。また、ＰＫＣデルタおよびベータ１の活性を抑制するが、ＰＫＣエプシロンには効果がない。ＴＩＭ１９は、そのＰＲＥ成分の親和性およびそのＰＫＩ成分の活性のため、ＰＫＣのその他の２つのグループから非定型ＰＫＣを識別することを予想された。予想されたように、本化合物は、ＰＫＣベータ１に対して非常に強力であった。低濃度で、伝統的および新規のグループにおける影響がほとんどないが、それは、ＰＫＣベータを抑制する。
【０４５８】
そのＰＲＥおよびＰＫＩ成分の活性から予想されるように、ＴＩＭ２０は、ＰＫＣデルタに対して望ましい特異性を示した。ＴＩＭ１１は、より少ない程度でＰＫＣアルファおよびデルタに対する望ましい阻害剤である。ＰＲＥ４部分の存在により、上記は予想された。
【０４５９】
ＴＩＭ２１は、ＰＫＣデルタの非常に望ましい阻害剤であり、ＰＫＣベータ１において活性化されないが、より少ない程度でＰＫＣアルファへの望ましい阻害剤である。ＴＩＭ２２は、ＰＫＣアルファを強く抑制することを意図して考案されたが、それは、ＰＫＣデルタの望ましい阻害剤でもある。
【０４６０】
本実験において観察された様々なＴＩＭ化合物の特異性は、実験的設定が非常に有効性があることをＰＲＥ成分に認めないため、ＰＫＩ成分から本質的に生じ得る。
【０４６１】
実施例３７：ＬＳ−１８０およびＩＭＲ−３２細胞におけるＴＩＭ１０および１３の亜局在性
ＴＩＭ１０および１３の細胞内亜局在性を決定するために、Ｂｉｏｔｉｎ−Ａｖｉｄｉｎシステムを使用した。本実験に関しては、リジン残基でビオチニル化され、修正版のＴＩＭ１０および１３を調製した。
【０４６２】
ビオチニル化した化合物を検出するために蛍光ＦＩＴＣに接合されるＡｖｉｄｉｎ（フルオレセインイソチオシアネート）を使用した。励起フィルタ４９６ｎｍおよび発光５２５ｎｍで、緑色蛍光により結合ＦＩＴＣ−ａｖｉｄｉｎ共役を視覚化することができる。
【０４６３】
２４時間および７２時間、ビオチニル化したＴＩＭ１０またはＴＩＭ１３の濃度を増加することでＬＳ１８０細胞を処置した。それぞれのインキュベーション期間の完了後、細胞を洗浄し、４％のパラホルムアルデヒド溶液で、３０分間固定し、０．１％のｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で、１０分間透過させた。
【０４６４】
ＰＢＳで細胞を３回洗浄し、ＰＢＳ中のＦＩＴＣ  １：５００の希釈で接合したａｖｉｄｉｎで１時間、室温で、インキュベートした。ＰＢＳで細胞を洗浄し、Ｉｍａｇｅ  ＰＲＯ  Ｐｌｕｓ  ４．５ソフトウェアを使用し、ＤＡＧＥ−ＭＴＩカメラで画像を撮影した。
【０４６５】
２４および７２時間の双方で、細胞のプラズマ細胞膜にのみに局在することがビオチニル化したＴＩＭ１０では観察され、それに対して予想されたように、細胞の細胞質に主に局在することがＴＩＭ１３では観察された。
【０４６６】
ＬＳ１８０細胞に対して上記に記載されるように、ビオチニル化したＴＩＭ１０または１３によりＩＭＲ３２細胞を処理した。また、ＩＭＲ３２細胞の細胞膜を標識化するためにビオチニル化したＴＩＭ１０を観察した。いくつかの細胞では、全体の細胞膜は、ＴＩＭ１０によりコーティングされていた。しかしながら、ほとんどの細胞では、細胞膜における定時の標識を観測し、本細胞株に結合するＴＩＭ１０の特異性を示した。
【０４６７】
２４時間の曝露後、予想されたように、細胞質内に局在することがＴＩＭ１３では観察された。また、細胞質内の斑点形成を観察し、特異的な細胞質分子への結合を示した。細胞膜の標識化と同様に、いくつかの細胞内において核周囲の配置に化合物の蓄積を観察した。４８時間の処置後、細胞質内にＴＩＭ１３化合物の限局性局在を観察した。
【０４６８】
以下の実施例３８から４０は、下記に本発明の化合物ＴＩＭ１０に対する生体内データを提供する（または「ＰｈＧアルファ１」）。標的ＰＫＣ−α阻害剤ＰｈＧアルファ１の最終考案に組み込まれる最強の断片とともに、ペプチド「断片」に対して厳密なスクリーニング過程を開発するために、ＰＫＣ−αのためのコンピュータモデル（図３９に代表的な型のみ表示）を使用した（ＴＩＭ１０）。結果は以下のように簡潔に要約することができる。
【０４６９】
薬物抵抗性（ＭＤＲ）結腸癌を定着し、増殖するためにかかる２倍以上の時間
結腸癌腫瘍の定着および増殖（日数で測定）は、未処理対照グループでのマウスに対して、広く使用されている化学療法薬との併用でＰｈＧアルファ１を受けるマウスにおいて、平均１００％遅延した。
【０４７０】
転移性の乳癌の定着の遅延
乳癌腫瘍の定着は、未処理対照グループでのマウスと比較して、ＰｈＧアルファ１を受けるマウスにおいて、平均６０％遅延した。
【０４７１】
良性を示す乳癌腫瘍
腫瘍分析は、未処理腫瘍癌細胞が悪性の再増殖を示し、一方、処理腫瘍癌細胞は、十分に識別され（すなわち、成熟）、本質的に良性であることを示した。
【０４７２】
無毒性
最高７５日間にわたり、７２時間周期で５０匹のマウスにＰｈＧアルファ１を投与した。病理学分析において、毒性の証拠は観察されない、または明らかではなかった。
【０４７３】
実施例３８：薬物抵抗性（ＭＤＲ）結腸癌の定着および増殖における化合物ＴＩＭ１０の効果
本実施例および実施例３９に関して、腫瘍を形成するために癌細胞とともに皮下注射をしたヌードマウス、ＣＤ１／ＣＤ１非近交系を使用した。選択した最終癌モデルは、元来はヒトであり、齧歯動物に常に移行されなかった。細胞株は、ＬＳ１８０ヒト結腸腺癌細胞（本実施例）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳房腺癌（実施例３９）であった。マウスあたり５×１０６の濃度で、左脇腹に細胞株を皮下注射した。選択したそれぞれの型の癌モデルに対して、Ｎ＝５から成る対照グループのマウスを使用した。対照マウスは、左脇腹に５×１０６細胞とともに皮下注射された。Ｎ＝５の追加の対照グループは、いずれの種類の注射も受けず、体重および行動測定の基準として使用された。
【０４７４】
未処理癌マウスと比較して、腫瘍出現（Ｍ１）またはＭ１（２×２ｍｍ）からＭ２（７×５ｍｍ）への移行のタイミングまたは腫瘍細胞分化およびタンパク質発現の増加におけるＴＩＭ１０の効果を調査した。５ｍｇ／ｋｇの用量で、７２時間ごとに左脇腹の皮下（腫瘍出現前）または腫瘍内（腫瘍が定着された場合）へＴＩＭ１０を提供した。ＬＳ１８０細胞を注射したマウスは、多剤耐性（ＭＤＲ）を誘発するために周知の服薬スケジュールで、尾静脈を介して１ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンの追加の処置を受けた。
【０４７５】
４つの処置区分にＬＳ１８０結腸癌マウスを分けた。（１）ＭＤＲを誘発するために治療量以下の用量で使用したドキソルビシンのような従来の化学療法、（２）５ｍｇ／ｋｇのＴＩＭ１０、（３）ドキソルビシンとＴＩＭ１０の併用投与、標識合成番号１、および（４）ドキソルビシン処置の１０日してから５ｍｇ／ｋｇのＴＩＭ１０との併用でドキソルビシンの継続処置、標識合成番号２。７２時間ごとにＴＩＭ１０を投与した。７５日間にわたり、研究を実行した。
【０４７６】
ＴＩＭ１０およびドキソルビシンによる前処置（トリガー薬物抵抗性に使用される化学療法薬）を受けたマウスとにおける腫瘍定着は、生理食塩水を受けた対照グループと比べて平均１４日遅延した（１４日で、生理食塩水グループでは腫瘍定着に到達したのに対して、処置グループでは２８日−図４０Ａ参照）。処置集団で認められる約１４日の差異は、対照グループに対して腫瘍定着において、１００％遅延したことを示す（ｐ＜０．０３）。腫瘍の定着は、１−２ｍｍ×２ｍｍのサイズで生じると判断された（Ｍ１段階）。
【０４７７】
定着後、約４−５ｍｍ×７−８ｍｍのサイズに到達するまで、ＬＳ１８０腫瘍増殖を監視した（Ｍ２段階）。ＴＩＭ１０およびドキソルビシンによる前処置を受けた集団において定着後に腫瘍増殖は、対照グループでは１３日であったのに対して３１日後に生じた。全体的に見て、初期注射からＭ２段階まで、対照グループでは２６日であったのに対して、ドキソルビシン／ＴＩＭ１０の処置グループでは５８日かかった（図４０Ｂを参照）。
【０４７８】
本試験の結果は、ＴＩＭ１０がＭＤＲを改良する強力な効果を有し、現在臨床用途である細胞毒性化学療法薬剤の有用性の増加に対するＴＩＭ１０の実用性を支援することを示す以前の生体内試験と一致する。
【０４７９】
実施例３９：転移性乳癌の定着を遅延することにおける化合物ＴＩＭ１５の効果
実施例３８に記載されるような手順に従い、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌マウスにおけるＴＩＭ１５の効果を調査した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を受けたマウスは、７２時間ごとに、５ｍｇ／ｋｇのＴＩＭ１５を直接腫瘍内注射する（または細胞周辺へ注射する）ことにより、ＴＩＭ１５で事前処置された。７５日間にわたり、研究を実行した。
【０４８０】
腫瘍定着は（Ｍ１−実施例３８に記載されるように定義された）、生理食塩水を受けた対照マウスと比べてＰｈＧアルファ１により処置されたマウスでは平均９日遅延した（１６日で、生理食塩水グループでは腫瘍定着に到達したのに対して、処置グループでは２５日−図４１参照）。処置集団で認められる約９日の差異は、対照グループに対する腫瘍定着において、約６０％遅延したことを示す（ｐ＜０．００１）。
【０４８１】
腫瘍の病理学分析では、ＰｈＧアルファ１により処置された集団における腫瘍の５つの試料のうち３つにおいて、最大９０％の脂肪組織と、わずか１０％の固形腫瘍から成り、一方、対照グループからの５つの腫瘍のうち４つにおいて、脂肪組織がないことを示した。限定された研究において腫瘍細胞試料の腫瘍形成能を評価した。継続増殖性特性を示すために、標準寒天プロトコルを使用し、未処置グループから除去された腫瘍細胞は、急速に増殖した。しかしながら、処置グループから得られた腫瘍細胞は、増殖または繁殖しなかった。小固形腫瘍の周辺の脂肪組織細胞を十分に識別され、本質的に良性であることが認められた。
【０４８２】
実施例４０：化合物ＴＩＭ１０の毒性
７５日の試験期間にわたり、ＴＩＭ１０の７２時間の服薬スケジュールで定期的に与えられたマウスにおいて、毒性の証拠がなかった（反復用量毒性研究）。マウスあたり２５マイクログラムの用量は、皮下注射によるマウスの集団に提供された。毒性についての生理学、行動または外部徴候は、観察されなかった。追加の病理学および組織学臓器研究はまた、毒性の徴候を示さなかった。
【０４８３】
急性の毒性研究は、３つの異なる送達経路である、ＩＶ（尾）、局所および経口を使用し、マウスに実施された。局所または経口で化合物ＴＩＭ１０を投与した場合、いずれの用量で、毒性効果は観察されなかった。ＩＶ研究から得たＬＤ５０は、マウスあたり７５０μｇ〜１ｍｇであることが決定された。「副作用が観察されないレベル」は、上記で検討された研究において、マウスにＴＩＭ１０の濃度の約２倍である、マウスあたり２５０μｇであると決定された。臓器の後遺症は、全身毒性を示さなかった。
【０４８４】
豚、マウス、および被験者の血液から分離された初代リンパ球を使用し、末梢血中のリンパ球の生存およびマイトジェンへの幼若化反応における化合物ＴＩＭ１０、１３、１４および１５の効果を調査する生体内研究は化合物が末梢血中のリンパ球のアポトーシスを誘発せず、幼若化反応を大幅に限定しないことを示した。ＰＴＤペプチド、ＴＩＭ１３を組み込むＴＩＭ化合物において最大効果は観察された。
【０４８５】
この結果は、広範囲に及ぶ用量範囲が動物およびヒトの臨床研究に対して利用可能であり、ＴＩＭ１０の臨床前の開発について重要な出来事であることを示す。さらに、ＴＩＭ１０は、ＰＫＣアルファに対して特異性があり（上記結果参照）、強力な有用性と低毒性を有し、ＡＴＰ競合阻害剤ではない（すなわち、さらに特異性があり、ＡＴＰ阻害剤よりも毒性が少ない場合がある）、標的ＰＫＣ−ＲＡＣＫタンパク質結合よりもむしろＰＫＣアルファを直接抑制し、ペプチド薬であり、その他の化学療法投与計画と併用してその投与を促進する。
【０４８６】
実施例４１：ＰＫＣ−α、ＭＲＰ−１およびＰ−ｇｐの発現におけるＴＩＭ１０化合物の効果
ＬＳ１８０結腸直腸癌細胞株は、タンパク質に関連する多薬物抵抗性（ＭＤＲ）の構成レベルを有し、ドキソルビシンによる処置により確実に強化される。ＭＤＲ活性におけるＴＩＭ１０の効果を分析するために、蛍光カルセイン−ＡＭを使用し、フローサイトメトリー研究（図２８Ａ参照）を使用した。広く使用されている化学療法薬である、ドキソルビシン（５０ｎｇ／ｍＬ）を使用し、ＬＳ１８０細胞の処置は、ＭＤＲ流出活性を増加した。ドキソルビシンは細胞を処置し、ＴＩＭ１０（５μＭ）を受けた場合、ＭＤＲチャンネル流出活性における減少を示した。
【０４８７】
生体内研究はまた、ＴＩＭ１０は、ＬＳ１８０細胞内の２つの優性ＭＤＲタンパク質およびＰＫＣアルファを下方制御することを示した。免疫細胞化学分析（図４２）は、ＰＫＣアルファと同様に、ＭＤＲ流出ポンプタンパク質、Ｐ−ｇｐおよびＭＲＰ−１の発現が、ＬＳ１８０細胞へのＴＩＭ１０投与後に減少したことを表わした。
【０４８８】
図４２にあるパネルＡは、ＰＫＣアルファ、Ｐ−ｇｐおよびＭＲＰ−１の構成レベルを示す、ＬＳ１８０対照を示す。パネルＢでは、ドキソルビシンにより処理された細胞（５０ｎｇ／ｍＬ）は、パネルＡ対照（ドキソルビシンがＬＳ１８０細胞内のＭＤＲ表現型を増加するため、予期された）に対して、ＭＤＲタンパク質発現（およびＰＫＣアルファ）の増加を示す。パネルＣでは、ＴＩＭ１０（５μＭ）およびドキソルビシンを受ける細胞は、ＭＤＲタンパク質発現の目立った減少を示す。
【０４８９】
ドキソルビシンへの細胞の曝露で、ＰＫＣアルファの増加する合成後でさえ、これらの化合物がＰＫＣアルファ特異的抗体による細胞の標識化強度を一貫して減少するという点において、化合物ＴＩＭ１３および１５を使用するＰＫＣ−アルファ発現における類似の効果を観察した。Ｆｃペプチドを含む、化合物ＴＩＭ１４は、ＰＫＣ−アルファ発現に影響を及ぼさなかった。しかしながら、ＰＫＣアルファが細胞質およびプラズマ細胞質に認められ、Ｆｃペプチドが細胞核へのＴＩＭを標的にするため、この結果は、予期された。ＴＩＭ１０、１３、１４、または１５により処置されたＣａｃｏ２結腸癌細胞において、類似の結果を観察した。
【０４９０】
実施例４２：化合物ＴＩＭ１０による体外用量反応研究
ヌードマウス、ＣＤ１／ＣＤ１非近交系を使用した。Ｎ＝４から成る対照グループのマウスは、体重および行動対照グループの基準として厳正に保持された。５×１０６のＬＳ１８０細胞を受けた研究におけるすべての他のマウスは、左脇腹に皮下注射された。
【０４９１】
それぞれの癌モデルは、２．５、５．０、７．５または１０．０ｍｇ／ｋｇのＴＩＭ１０の直接腫瘍内注射または静脈ドキソルビシン（１ｍｇ／ｋｇ）またはその組み合わせを受けた。腫瘍の出現前に、注射した癌細胞の周辺にＴＩＭ１０を注射した。ＬＳ１８０結腸癌マウスは、直接腫瘍内注射（またはその周辺に注射）を受け、４つの広範な処理区分に分けられた。すなわち、（１）生理学的生理食塩水処置、（２）ドキソルビシンのみの処置、（３）４つの異なる用量でのＴＩＭ１０の処置、および（４）１０日間ドキソルビシンのみ投与のみに続き、７２時間ごとのＴＩＭ１０による併用処置である。必要とされたヌードマウスの総数は、８４であり、研究の継続は、６０日間であった。
【０４９２】
測径器で日々の基準において腫瘍を測定した。図４３Ａは、１０のグループにわたり、腫瘍出現の平均日（Ｍ１−約２×２ｍｍのサイズを腫瘍として定義）を示す。図４３Ｂは、１０のグループにわたり、腫瘍移行の平均日（Ｍ１〜Ｍ２−約７×５ｍｍのサイズを腫瘍として定義）を示し、図４３Ｃは、１０のグループにわたり、著しい腫瘍進行の平均日（Ｍ３−約１２×９ｍｍのサイズを腫瘍として定義）を示す。
【０４９３】
それぞれの段階の腫瘍発達に対するすべての用量および処置にわたり、腫瘍定着（Ｍ１）および進行（Ｍ２およびＭ３）を遅延するためのＴＩＭ１０の最も有効な用量は、投与される最低量で２．５ｍｇ／ｋｇであった。統計に見られる動きを分析する手順を使用し、本観察を確認した。すべての場合において、化合物のピーク有用性は、２．５ｍｇ／ｋｇであり、効果は、対照集団に対して、統計的に有意である（ｐ＜０．０３９）。
【０４９４】
実施例４３：腫瘍試料のタンパク質分析
実施例４３に記載されるように研究の継続を通じて、４回腫瘍試料を収集し、腫瘍が発育するにつれて、ＰＫＣαおよびＭＤＲタンパク質ＰｇｐおよびＭＲＰ−１の発現において、変化のいずれの潜在的な時間的経過を試験した。標準ディスパーゼプロトコルを使用して、それぞれのグループからのＬＳ１８０腫瘍試料を分離した。ＴＩＭ１０へ暴露日数にわたり、フローサイトメトリーにより３つのタンパク質を試験した（３０日目、４０日目、および６０日目）。
【０４９５】
図４４に結果を示す。図４４Ａにある３０日目に認められるように、ドキソルビシン処置された腫瘍は、ＰＫＣαタンパク質の最高レベルを示し、５ｍｇ／ｋｇまたは７．５ｍｇ／ｋｇのＴＩＭ１０により処置された腫瘍から最低レベルを検出した。４０日目までに、ＰＫＣα発現は、ドキソルビシン処置された腫瘍において最高レベルを、５ｍｇ／ｋｇのＴＩＭ１０を受けた腫瘍に最低レベルを継続した。ＰＫＣαタンパク質発現は、研究の６０日目までにすべての処置にわたり、最高レベルである。生理食塩水処置した腫瘍は、ＰＫＣαの最高レベルを示し、２．５ｍｇ／ｋｇのＴＩＭ１０、５ｍｇ／ｋｇのＴＩＭ１０および２．５／ＤｏｘのＴＩＭ１０は、ＰＫＣαタンパク質の最低レベルを示す。要約すれば、５ｍｇ／ｋｇのＴＩＭ１０により処置された腫瘍は、体外研究の全体の時間的経過にわたり、ＰＫＣαタンパク質の最小量を一貫して示した。
【０４９６】
３０日目において、Ｇｌｉ２．５／Ｄｏｘ処置した腫瘍は、Ｐｇｐタンパク質の最高レベルを示した（図４４Ｂを参照）。最低レベルは、５ｍｇ／ｋｇまたは７．５ｍｇ／ｋｇのＴＩＭ１０により処置された腫瘍から検出された。４０日目までに、Ｐｇｐ発現は、ドキソルビシン処置された腫瘍において最高であり、ＴＩＭ１０を受けたすべての腫瘍において例外なく、より低い。Ｐｇｐタンパク質発現は、研究の６０日目までに、すべての処置にわたり最高レベルである。生理食塩水で処置された腫瘍は、Ｐｇｐの最高レベルを示し、ＴＩＭ１０のいずれの用量により処置された腫瘍は、Ｐｇｐタンパク質の最低レベルを示す。要約すれば、２．５ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇのＴＩＭ１０により処置された腫瘍は、体外研究の全体の時間的経過にわたり、Ｐｇｐタンパク質の最小量を示した。
【０４９７】
図４４Ｃは、３０日目に、５ｍｇ／ｋｇおよび７．５ｍｇ／ｋｇのＴＩＭ１０を除いて、すべての腫瘍は、ＭＲＰ−１タンパク質発現の一貫したレベルを示し、処置の後よりもかなり低かったことを示す。４０日目までに、ＭＲＰ−１発現の最高レベルを保持するドキソルビシン処置された腫瘍によるすべての処置にわたり、ＭＲＰ−１発現において、大幅な下落であった。総合ＭＲＰ−１タンパク質発現は、研究の６０日目までにすべての処置にわたり最高レベルである。生理食塩水で処置された腫瘍は、ＭＲＰ−１の最高レベルを示し、２．５ｍｇ／ｋｇのＴＩＭ１０により処置された腫瘍は、ＭＲＰ−１タンパク質の最低レベルを示す。
【０４９８】
実施例４４：ＣＤ４４およびＣＤ６６胆汁糖タンパク質発現
腫瘍関連の細胞表面抗原の発現は、腫瘍細胞の細胞分化の状態の表れである。前述の実施例４２および４３に記載されるように得られた腫瘍試料からの細胞は、分離され、ＭＥＭ培地に増殖された。Ｒ−ＰＥで共役したモノクローナル抗体クローンＢ６．２／ＣＤ６６で細胞を標識化し、フローサイトメトリーにより分析された。
【０４９９】
図４５に結果を示す。腫瘍細胞集団におけるＣＤ６６抗原を発現する陽性細胞の割合としてデータを示す。ＣＤ６６は、胆汁糖タンパク質と称する癌胎児性抗原に関連したタンパク質である（ＣＥＡＣＡＭ１）。ＣＥＡＣＡＭ１は、正常細胞に存在するが、その発現は、結腸癌の初期に劇的に減少することが知られている。発現を損失する細胞内のこれらのタンパク質の再導入は、正常様表現型を回復する。ＣＤ６６を発現する細胞は、腫瘍生検から分離した細胞内に分化の程度の表示を提供する。使用された第二の抗体はまた、細胞外基質タンパク質ＣＤ４４に対するモノクローナル抗体であり、食細胞糖タンパク質−１としても周知である８０−９５ｋＤａグリコシル化型Ｉ膜透過タンパク質を認識する。ＦＩＴＣで共役したＣＤ４４モノクローナル抗体で腫瘍から分離した細胞を標識化し、フローサイトメトリーにより分析された。（図４５参照）。双方の抗体の同時分析は、結腸癌腺癌細胞の分化の状態の信頼性のある測定である。
【０５００】
データは、２．５ｍｇ／ｋｇのＴＩＭ１０の単独およびドキソルビシンとの併用により処置された腫瘍から分離した細胞が生理食塩水により処置された生検、ドキソルビシン単独およびＴＩＭ１０の高用量およびドキソルビシンを併用したＴＩＭ１０から分離した細胞と比較した場合、分化において最高レベルを示した。
【０５０１】
それぞれの当該の個々の特許、出版物、およびデータベース入力を参照することによって明確かつ単独に取り込まれるように、公開された特許出願、および本明細書に参照されるデータベース入力を含む、すべての特許、出版物の開示は、同範囲にそれらは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０５０２】
本発明は、ある特定の実施例を参照して記載されるが、ここに添付された請求項に概要を示すように、当事者は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、その様々な修正をすることができる。
【０５０３】
独占的な財産または権利を請求する、本発明の実施例を特許請求の範囲のとおり定義する。
【図面の簡単な説明】
【０５０４】
【図１】図１は、（Ａ）未治療ヒト神経芽細胞腫（ＩＭＲ−３２）細胞、（Ｂ）ペプチドＰＲＥ４で治療されたＩＭＲ−３２細胞、および（Ｃ）ペプチドＰＲＥ３で治療されたＩＭＲ−３２細胞における内因性ＰＫＣ−αの細胞内局在性を示す。
【図２】図２は、様々なＰＫＣイソフォーム、（Ａ）ＰＫＣ−アルファ、（Ｂ）ＰＫＣ−ベータＩ、（Ｃ）ＰＫＣ−デルタ、（Ｄ）ＰＫＣ−イオタおよび（Ｅ）ＰＫＣ−ゼータを有するペプチドＰＲＥ１を使用した競合結合アッセイの結果を表す。
【図３】図３は、様々なＰＫＣイソフォーム、（Ａ）ＰＫＣ−アルファ、（Ｂ）ＰＫＣ−ベータＩ、（Ｃ）ＰＫＣ−ベータＩ、（Ｄ）ＰＫＣ−ベータＩＩ、（Ｅ）ＰＫＣ−デルタ、（Ｆ）ＰＫＣ−エプシロン、（Ｇ）ＰＫＣ−イオタおよび（Ｈ）ＰＫＣ−ゼータを有するペプチドＰＲＥ４を使用した競合結合アッセイの結果を表す。
【図４】図４は、様々なＰＫＣイソフォーム、（Ａ）ＰＫＣ−アルファ、（Ｂ）ＰＫＣ−ベータＩ、（Ｃ）ＰＫＣ−デルタ、（Ｄ）ＰＫＣ−エプシロン、（Ｅ）ＰＫＣ−イオタおよび（Ｆ）ＰＫＣ−ゼータを有するペプチドＰＲＥ６を使用した競合結合アッセイの結果を表す。
【図５】図５は、様々なＰＫＣイソフォーム、（Ａ）ＰＫＣ−アルファ、（Ｂ）ＰＫＣ−ベータＩ、（Ｃ）ＰＫＣ−ベータＩＩ、（Ｄ）ＰＫＣ−デルタ、（Ｅ）ＰＫＣ−エプシロン、（Ｆ）ＰＫＣ−エプシロン、（Ｇ）ＰＫＣ−イオタおよび（Ｈ）ＰＫＣ−ゼータを有するペプチドＰＲＥ３を使用した競合結合アッセイの結果を表す。
【図６】図６は、様々なＰＫＣイソフォーム、（Ａ）ＰＫＣ−アルファ、（Ｂ）ＰＫＣ−ベータＩ、（Ｃ）ＰＫＣ−デルタ、（Ｄ）ＰＫＣ−エプシロン、（Ｅ）ＰＫＣ−イオタおよび（Ｆ）ＰＫＣ−ゼータを有するペプチドＰＲＥ７を使用した競合結合アッセイの結果を表す。
【図７】図７は、様々なＰＫＣイソフォーム、（Ａ）ＰＫＣ−アルファ、（Ｂ）ＰＫＣ−ベータＩＩ、（Ｃ）ＰＫＣ−ベータＩおよび（Ｄ）ＰＫＣ−エプシロンを有するペプチドＰＲＥ８を使用した競合結合アッセイの結果を表す。
【図８】図８は、様々なＰＫＣイソフォーム、（Ａ）ＰＫＣ−アルファ、（Ｂ）ＰＫＣ−ベータＩ、（Ｃ）ＰＫＣ−ベータＩＩ、（Ｄ）ＰＫＣ−デルタ、（Ｅ）ＰＫＣ−エプシロンおよび（Ｆ）ＰＫＣ−ゼータを有するペプチドＰＲＥ９を使用した競合結合アッセイの結果を表す。
【図９】図９は、様々なＰＫＣイソフォーム、（Ａ）ＰＫＣ−アルファ、（Ｂ）ＰＫＣ−ベータＩ、（Ｃ）ＰＫＣ−ベータＩＩ、（Ｄ）ＰＫＣ−デルタ、（Ｅ）ＰＫＣ−エプシロンおよび（Ｆ）ＰＫＣ−ゼータを有するペプチドＰＲＥ１０を使用した競合結合アッセイの結果を表す。
【図１０】図１０は、様々なＰＫＣイソフォーム、（Ａ）ＰＫＣ−アルファ、（Ｂ）ＰＫＣ−ベータＩ、（Ｃ）ＰＫＣ−デルタ、（Ｄ）ＰＫＣ−エプシロンおよび（Ｅ）ＰＫＣ−ゼータを有するペプチドＰＲＥ１１を使用した競合結合アッセイの結果を表す。
【図１１】図１１は、様々なＰＫＣイソフォーム、（Ａ）ＰＫＣ−アルファ、（Ｂ）ＰＫＣ−ベータＩ、（Ｃ）ＰＫＣ−ベータＩＩ、（Ｄ）ＰＫＣ−デルタ、（Ｅ）ＰＫＣ−エプシロン、（Ｆ）ＰＫＣ−イオタおよび（Ｇ）ＰＫＣ−ゼータを有するペプチドＰＲＥ１２を使用した競合結合アッセイの結果を表す。
【図１２】図１２は、様々なＰＫＣイソフォーム、（Ａ）ＰＫＣ−アルファ、（Ｂ）ＰＫＣ−ベータＩ、（Ｃ）ＰＫＣ−デルタ、（Ｄ）ＰＫＣ−イオタ、（Ｅ）ＰＫＣ−ゼータおよび（Ｆ）ＰＫＣ−エプシロンを有するペプチドＰＲＥ１３を使用した競合結合アッセイの結果を表す。
【図１３】図１３は、様々なＰＫＣイソフォーム、（Ａ）ＰＫＣ−アルファ、（Ｂ）ＰＫＣ−ベータＩ、（Ｃ）ＰＫＣ−ベータＩＩ、（Ｄ）ＰＫＣ−デルタ、（Ｅ）ＰＫＣ−エプシロンおよび（Ｆ）ＰＫＣ−ゼータを有するペプチドＰＲＥ５を使用した競合結合アッセイの結果を表す。
【図１４】図１４は、本発明の一実施例による、タンパク質キナーゼ抑制（ＰＫＩ）化合物の構造の概略図を表す（Ｈ原子は省略）。
【図１５】図１５は、ＰＫＩ化合物１、２および３による、精製ＰＫＣ−αの体外抑制を表す。
【図１６】図１６は、様々な用量の（Ａ）ＰＫＩ化合物１、（Ｂ）ＰＫＩ化合物２、および（Ｃ）ＰＫＩ化合物３による、細胞溶解物から流出するＰＫＣ−αの体外抑制を表す。
【図１７】図１７は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞におけるアポトーシスでの化合物ＰＫＩ３の効果を表し、左方のパネル（Ａ、Ｃ、ＥおよびＧ）は逆相を示し、右方のパネル（Ｂ、Ｄ、ＦおよびＨ）は、Ｈｏｅｃｈｓｔ試薬で染色した細胞核を示す。
【図１８】図１８は、Ｈ−６６１非小細胞肺癌細胞におけるアポトーシスでの化合物ＰＫＩ３の効果を表し、左方のパネル（Ａ、Ｃ、ＥおよびＧ）は逆相を示し、右方のパネル（Ｂ、Ｄ、ＦおよびＨ）は、Ｈｏｅｃｈｓｔ試薬で染色した細胞核を示す。
【図１９】図１９は、様々な用量の化合物ＴＩＭ９による、ヒト神経芽腫細胞（ＩＭＲ−３２）の増殖の体外抑制を表す。
【図２０】図２０は、化合物ＴＩＭ９で治療したヒト神経芽腫細胞（ＩＭＲ−３２）の形態を表す。
【図２１】図２１は、様々な用量の化合物ＴＩＭ１１による、ヒト神経芽腫細胞（ＩＭＲ−３２）の増殖の体外抑制を表す。
【図２２】図２２は、３０分のインキュベーション後の、ＩＭＲ−３２細胞における内因性ＰＫＣによるＭＡＲＣＫＳペプチドのリン酸化反応での化合物ＴＩＭ９の効果を示す。
【図２３】図２３は、２４時間のインキュベーション後の、ＩＭＲ−３２細胞における内因性ＰＫＣによるＭＡＲＣＫＳペプチドのリン酸化反応での化合物ＴＩＭ９の効果を示す。
【図２４】図２４は、様々な用量の化合物ＴＩＭ１０による、（Ａ）正常ヒト肺細胞（ＣＣＤ−１６Ｌｕ）、および（Ｂ）ヒトＮＳＣＬＣ細胞（Ｈ６６１）の増殖の体外抑制を表す。
【図２５】図２５は、様々な用量の化合物ＴＩＭ１０による、ヒト神経芽腫細胞（ＩＭＲ−３２）の増殖の体外抑制を表す。
【図２６】図２６は、ヒト神経芽腫細胞（ＩＭＲ−３２）におけるギャップ結合機能での化合物ＴＩＭ１０の効果を定量的に表わす。
【図２７】図２７は、多薬物抵抗性ヒト結腸癌細胞（ＬＳ１８０）の生存における化合物ＴＩＭ１０の効果を表す。
【図２８】図２８は、多薬物抵抗性ヒト結腸癌細胞（ＬＳ１８０）からの蛍光染料の流出物である（Ａ）カルセインＡＭ流出物、および（Ｂ）ローダミン１２３流出物での化合物ＴＩＭ１０の効果を表す。
【図２９】図２９は、多薬物抵抗性ヒト結腸癌細胞（ＬＳ１８０）からのカルセインＡＭ流出物での化合物ＴＩＭ１０の効果を定量的に表す。
【図３０】図３０は、多薬物抵抗性ヒト結腸癌細胞（ＬＳ１８０）からのローダミン１２３の流出物での化合物ＴＩＭ１０およびベラパミルの効果の比較を表す。
【図３１】図３１は、化合物ＴＩＭ１０で処理したヒト結腸癌細胞（ＬＳ１８０）におけるコネキシン４３（Ｃｘ４３）およびＰＫＣ−αタンパク質のレベルを表す（倍率２００）。
【図３２】図３２は、Ｈｏｅｃｈｓｔ試薬で染色した未治療対照ヒトＮＳＣＬＣ細胞（Ｈ６６１）を表す。
【図３３】図３３は、ＰＢＳ中０．１％のＴｒｉｔｏｎ×１００で５ｍＭの化合物ＴＩＭ１０を吸収した後の、ヒトＮＳＣＬＣ細胞（Ｈ６６１）におけるアポトーシスの誘発を表す。
【図３４】図３４は、ＰＢＳ中の５ｍＭの化合物ＴＩＭ１０を吸収した後の、ヒトＮＳＣＬＣ細胞（Ｈ６６１）におけるアポトーシスの誘発を表す。
【図３５】図３５は、ヒトＮＳＣＬＣ細胞（Ｈ６６１）の細胞周期での化合物ＴＩＭ１０の効果を表す。
【図３６】図３６は、ＩＭＲ−３２神経芽腫細胞、（Ａ）対照細胞、（Ｂ）１５０ｎｇ／ｍｌのテトラサイクリンで治療した対照細胞、（Ｃ）ＴＩＭ１７コード化配列でトランスフェクトした細胞、および（Ｄ）ＴＩＭ１７コード化配列でトランスフェクトし、１５０ｎｇ／ｍｌのテトラサイクリンで治療した細胞におけるＰＫＣ−αの発現を表す。
【図３７】図３７は、ＩＭＲ−３２神経芽腫細胞の増殖での化合物ＴＩＭ１０、１３、１４および１５の効果を表す。
【図３８】図３８は、Ｈ−６９小細胞性肺癌細胞における化合物ＴＩＭ１０および１３の毒性でのＴＰＧＳ追加の効果を表す。
【図３９】図３９は、ＰＫＣアルファ分子の典型的（部分的リボン）画像を表す。
【図４０】図４０は、マウス異種移植モデルにおけるヒトＬＳ１８０結腸癌細胞での化合物ＴＩＭ１０の効果を表し、（Ａ）は、腫瘍形成（Ｍ１：２ｍｍ×１〜２ｍｍの腫瘍サイズ）が、対照集団に対してドキソルビシン＋化合物ＴＩＭ１０（１マウスにつき５ｍｇ／ｋｇ）で治療したマウスにおいて約１００％（１４日間）遅延されたことを示し、（Ｂ）は、Ｍ１からＭ２への腫瘍移行（Ｍ２：７〜８ｍｍ×４〜５ｍｍの腫瘍サイズ）が、対照集団に対してドキソルビシン＋化合物ＴＩＭ１０（１マウスにつき５ｍｇ／ｋｇ）で治療したマウスにおいて約１５０％（１８日間）遅延されたことを示す。
【図４１】図４１は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞を皮下注射したマウスにおける腫瘍形成での化合物ＴＩＭ１５の効果を表す。
【図４２】図４２は、ＬＳ１８０結腸癌細胞、パネルＡ：対照、パネルＢ：ドキソルビシン治療細胞、およびパネルＣ：ドキソルビシン＋化合物ＴＩＭ１０で処理した細胞におけるＰ−ｇｐおよびＭＲＰ−１発現での化合物ＴＩＭ１０の効果を表す。
【図４３】図４３は、マウス異種移植モデルにおけるヒトＬＳ１８０結腸癌細胞での化合物ＴＩＭ１０の異なる用量の効果、（Ａ）腫瘍形成に関する効果、（Ｂ）腫瘍移行に関する効果、および（Ｃ）腫瘍進行に関する効果を表す。
【図４４】図４４は、マウス異種移植モデルにおけるＬＳ１８０結腸癌細胞におけるタンパク質の発現での化合物ＴＩＭ１０の効果、（Ａ）ＰＫＣ−α、（Ｂ）Ｐ−ｇｐ、および（Ｃ）ＭＲＰ−１を表現する。
【図４５】図４５は、ＣＤ４４およびＣＤ６６の発現によって証明される腫瘍分化での化合物ＴＩＭ１０の効果を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ−Ｄ】
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【図１７Ｅ−Ｈ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2009502983.tif 000105
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