(57)【要約】本発明は、インフルエンザＡ型ウイルスに対する中和抗体を同定し、産生し、さらに、遺伝子操作する方法および手段、ならびに産生された中和抗体に関する。特に、本発明は、例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、およびＨ５サブタイプのすべてなど２つ以上のＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７およびＨ９に対する中和抗体を含む、種々のインフルエンザＡ型ウイルスサブタイプに対する中和抗体およびこの種の抗体を作る方法および手段に関する。さらに具体的に述べると、本発明は、インフルエンザＡ型ウイルスサブタイプの分離株を１つより多く、好ましくはすべてを中和し得る抗体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザＡ型ウイルスサブタイプの１つより多くの分離株および／または前記インフルエンザＡ型ウイルスの１つより多くのサブタイプを中和する中和抗体。
【請求項２】
インフルエンザＡ型ウイルスＨ１サブタイプの１つより多くの分離株を中和する、請求項１に記載の中和抗体。
【請求項３】
インフルエンザＡ型ウイルスＨ３サブタイプの１つより多くの分離株を中和する、請求項１に記載の中和抗体。
【請求項４】
インフルエンザＡ型ウイルスＨ１およびＨ３サブタイプを中和する、請求項１に記載の中和抗体。
【請求項５】
インフルエンザＡ型ウイルスＨ１および／またはＨ３サブタイプの１つより多くの分離株を中和する、請求項４に記載の中和抗体。
【請求項６】
インフルエンザＡ型ウイルスサブタイプの実質的にすべての分離株を中和する、請求項１に記載の中和抗体。
【請求項７】
前記サブタイプが、Ｈ５、Ｈ７およびＨ９サブタイプからなる群から選択される、請求項１または請求項６に記載の中和抗体。
【請求項８】
前記サブタイプが、前記Ｈ５サブタイプである、請求項７に記載の中和抗体。
【請求項９】
前記抗体が、インフルエンザＡ型ウイルスＨ５サブタイプの実質的にすべての分離株を中和する、請求項８に記載の中和抗体。
【請求項１０】
前記サブタイプが、前記Ｈ７サブタイプである、請求項７に記載の中和抗体。
【請求項１１】
前記抗体が、前記インフルエンザＡ型ウイルスＨ７サブタイプの実質的にすべての分離株を中和する、請求項１０に記載の中和抗体。
【請求項１２】
前記サブタイプが、前記Ｈ９サブタイプである、請求項７に記載の中和抗体。
【請求項１３】
前記抗体が、前記インフルエンザＡ型ウイルスＨ９サブタイプの実質的にすべての分離株を中和する、請求項１２に記載の中和抗体。
【請求項１４】
前記抗体が、さらに、インフルエンザＡ型ウイルスの追加のＨサブタイプを少なくとも１つ中和する、請求項７に記載の中和抗体。
【請求項１５】
前記追加Ｈサブタイプが、Ｈ１、Ｈ２およびＨ３サブタイプからなる群から選択される、請求項１４に記載の中和抗体。
【請求項１６】
前記インフルエンザＡ型ウイルスの追加Ｈサブタイプの１つより多くの分離株を中和する、請求項１５に記載の中和抗体。
【請求項１７】
前記インフルエンザＡ型ウイルスのＨ５Ｎ１サブタイプを中和する、請求項１に記載の中和抗体。
【請求項１８】
前記インフルエンザＡ型ウイルスのＨ５Ｎ１サブタイプの１つより多くの分離株を中和する、請求項１７に記載の中和抗体。
【請求項１９】
前記分離株の少なくとも１つがヒトに感染する能力を有する、請求項１８に記載の中和抗体。
【請求項２０】
前記分離株の少なくとも１つがヒト対象から得られた、請求項１９に記載の中和抗体。
【請求項２１】
前記ヒト対象が病気に罹患している、請求項２０に記載の中和抗体。
【請求項２２】
前記ヒト対象が前記インフルエンザＡ型ウイルスのＨ５Ｎ１サブタイプ感染から回復した、請求項２０に記載の中和抗体。
【請求項２３】
前記分離株の少なくとも１つがヒト以外の動物から得られた、請求項１９に記載の中和抗体。
【請求項２４】
前記ヒト以外の動物が鳥類である、請求項２３に記載の中和抗体。
【請求項２５】
前記ヒト以外の動物が野鳥である、請求項２４に記載の中和抗体。
【請求項２６】
前記ヒト以外の動物がニワトリである、請求項２４に記載の中和抗体。
【請求項２７】
前記インフルエンザＡ型ウイルスのＨ５Ｎ１サブタイプの実質的にすべての分離株を中和する、請求項１８に記載の中和抗体。
【請求項２８】
前記Ｈ５Ｎ１サブタイプおよびＨ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、およびＨ３Ｎ２サブタイプからなる群から選択された少なくとも１つの追加サブタイプを中和する、請求項１７に記載の中和抗体。
【請求項２９】
前記インフルエンザＡ型ウイルスのＨ５Ｎ１サブタイプのより多くの分離株を中和する、請求項２８に記載の中和抗体。
【請求項３０】
前記インフルエンザＡ型ウイルスのＨ５Ｎ１サブタイプの実質的にすべての分離株を中和する、請求項２９に記載の中和抗体。
【請求項３１】
前記追加サブタイプの１つより多くの分離株を中和する、請求項３０に記載の中和抗体。
【請求項３２】
前記追加サブタイプの実質的にすべての分離株を中和する、請求項３１に記載の中和抗体。
【請求項３３】
前記抗体がＨ５タンパク質に結合する、請求項１に記載の中和抗体。
【請求項３４】
前記抗体が前記Ｈ５タンパク質の１つより多くの改変体に結合する、請求項３３に記載の中和抗体。
【請求項３５】
前記抗体が前記Ｈ５タンパク質のすべての改変体に結合する、請求項３４に記載の中和抗体。
【請求項３６】
前記抗体が少なくとも１つの追加のＨタンパク質に結合する、請求項３５に記載の中和抗体。
【請求項３７】
前記追加のＨタンパク質が、Ｈ１、Ｈ２およびＨ３タンパク質からなる群から選択される、請求項３６に記載の中和抗体。
【請求項３８】
前記抗体が前記追加のＨタンパク質の１つより多くの改変体に結合する、請求項３７に記載の中和抗体。
【請求項３９】
前記抗体が前記追加のＨタンパク質の実質的にすべての改変体に結合する、請求項３８に記載の中和抗体。
【請求項４０】
請求項１から３９までのいずれか１項に記載の中和抗体を含む組成物。
【請求項４１】
インフルエンザＡ型ウイルスサブタイプの１つより多くの分離株またはインフルエンザＡ型ウイルスの１つより多くのサブタイプを中和し得る抗体を同定する方法であって、
前記インフルエンザＡ型ウイルスサブタイプの第１および第２の分離株の両方、または前記インフルエンザＡ型ウイルスの第１および第２のサブタイプと反応する抗体を、抗体ライブラリーにおいて同定すること、および前記第１および第２の分離株、または前記第１および第２のサブタイプそれぞれに結合する抗体の能力に基づいて、同定した前記抗体に選択の連続的交互ラウンドを受けさせることを含む、方法。
【請求項４２】
少なくとも２ラウンドの選択を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記第１および第２の分離株が、前記インフルエンザＡ型ウイルスのＨ５Ｎ１サブタイプの異なる分離株である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
第１および第２のインフルエンザＡ型ウイルスサブタイプ分離株の両方と反応する前記抗体が、それぞれ、前記第１分離株および前記第２分離株と反応する抗体の少なくとも２ラウンドの別々の濃縮により同定され、同定された前記抗体を組み換える、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記第１および前記第２のインフルエンザＡ型サブタイプ分離株の両方と反応し得る前記抗体が、前記第１および第２の分離株それぞれに結合する抗体の能力に基づいて、選択の前記連続交互ラウンドを受ける前に突然変異誘発を受ける、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記抗体ライブラリーがファージディスプレイ・ライブラリーである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
選択がバイオパニングによってなされる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記インフルエンザＡ型ウイルスサブタイプがＨ５Ｎ１サブタイプである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
前記第１分離株が前記Ｈ５Ｎ１ウイルスの２００６年のトルコ分離株である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記第１分離株が前記Ｈ５Ｎ１ウイルスの２００３／２００４年のベトナム分離株である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記第２分離株が前記Ｈ５Ｎ１ウイルスの２００３／２００４年のベトナム分離株である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記第２分離株が前記Ｈ５Ｎ１ウイルスの１９９７年の香港分離株である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記第１および第２の分離株が異なる種に由来する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５４】
前記種の少なくとも１つがヒトである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記種の少なくとも１つが鳥類である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記第１および第２の分離株に結合し得る前記抗体が、さらに、１つより多くのインフルエンザＡ型サブタイプに結合する前記抗体の能力に基づいて選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項５７】
請求項４１〜５６のいずれか１項に記載の方法により同定された前記中和抗体により共有される配列コレクション。
【請求項５８】
配列コレクションであって、図１１、１２、１３、および１４Ａ−Ｄに示された独特の１つ以上の重鎖および／または軽鎖の配列、または前記配列に基づくコンセンサス配列または改変体配列を含む、コレクション。
【請求項５９】
請求項４１〜５６のいずれか１項に記載の方法により同定可能な中和抗体またはその断片。
【請求項６０】
図１１、１２、１３、および１４Ａ−Ｄに示された独特の配列から選択された重鎖および／または軽鎖の配列、または前記配列に基づくコンセンサス配列または改変体配列またはこれらの断片を含む、請求項５９に記載の中和抗体。
【請求項６１】
インフルエンザＡ型ウイルス感染に対して鳥類または哺乳類の対象に受動免疫を与えることができる、請求項５９または請求項６０に記載の中和抗体または抗体断片。
【請求項６２】
前記哺乳類の対象がヒトである、請求項６１に記載の中和抗体または抗体断片。
【請求項６３】
前記インフルエンザＡ型ウイルス感染が、Ｈ５Ｎ１、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、およびＨ３Ｎ２サブタイプからなる群から選択されるウイルスにより引き起こされる、請求項６２に記載の中和抗体または抗体断片。
【請求項６４】
対象においてＡ型インフルエンザ感染を予防および／または処置する方法であって、前記対象に請求項４０に記載の組成物を有効量投与することを含む、方法。
【請求項６５】
対象のＡ型インフルエンザ感染を処置する方法であって、前記対象に請求項５９に記載の中和抗体を有効量投与することを含む、方法。
【請求項６６】
前記対象がヒトの患者である、請求項６４または請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
Ａ型インフルエンザ感染を予防する方法であって、Ａ型インフルエンザ感染を発症するリスクのある対象に請求項４０に記載の組成物を有効量投与することを含む、方法。
【請求項６８】
Ａ型インフルエンザ感染を予防する方法であって、Ａ型インフルエンザ感染を発症するリスクのある対象に請求項５９に記載の中和抗体を有効量投与することを含む、方法。
【請求項６９】
前記対象がヒトの患者である、請求項６７または請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
多様な多機能性抗体コレクションを作る方法であって、
（ａ）少なくとも２つの機能が異なる抗体のＣＤＲ配列を整列させ、（ｂ）前記整列させられたＣＤＲ配列の間に保存されたアミノ酸残基を同定し、（ｃ）前記整列させられたＣＤＲ配列の複数の改変体を産生するために、突然変異誘発された非保存位置における機能が異なる抗体に存在する少なくとも前記アミノ酸残基をコードする縮重オリゴヌクレオチドプローブを用いて、前記整列させられたＣＤＲ配列の少なくとも１つの配列において複数の非保存アミノ酸残基の突然変異誘発を行い、そして、望ましいならば、前記抗体コレクションが望ましい程度の多様性またはサイズに達するまで前記改変体の１つ以上を用いてステップ（ｂ）および（ｃ）を反復することを含む、方法。
【請求項７１】
前記整列させられたＣＤＲ配列が同じ長さを有する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
ステップ（ｃ）において産生された前記突然変異誘発された改変体が、前記整列させられたＣＤＲ配列の少なくとも２つに存在する保存されたすべての残基を保持する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
ステップ（ｃ）において産生された前記突然変異誘発された改変体が、前記整列させられたＣＤＲ配列のすべてに存在する保存されたすべての残基を保持する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７４】
前記機能的に異なる抗体が標的抗原上で異なるエピトープに結合する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７５】
前記機能的に異なる抗体が異なる標的抗原に結合する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７６】
前記異なる標的抗原が前記同じ抗原の改変体である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記機能的に異なる抗体が異なる結合親和性を有する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７８】
前記機能的に異なる抗体が異なる生物学的特性を有する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７９】
前記機能的に異なる抗体がインフルエンザＡ型ウイルスに結合する、請求項７０に記載の方法。
【請求項８０】
前記機能的に異なる抗体の少なくとも２つが同じインフルエンザＡ型ウイルスについて異なるエピトープに結合する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記機能的に異なる抗体が異なるインフルエンザＡ型ウイルスサブタイプに結合する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
前記機能的に異なる抗体の少なくとも２つが同じインフルエンザＡ型ウイルスサブタイプの異なる分離株に結合する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
前記機能的に異なる抗体の少なくとも２つが同じインフルエンザＡ型ウイルスサブタイプの異なる分離株および異なるインフルエンザＡ型ウイルスサブタイプに結合する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８４】
前記機能的に異なる抗体の少なくとも２つが異なる親和性を有する、請求項７０〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
前記機能的に異なる抗体の少なくとも２つは、これらが結合するインフルエンザＡ型ウイルスを中和する能力に違いがある、請求項７０〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
少なくとも１つの特性が互いに異なる複数の中和抗体を含む、抗体コレクション。
【請求項８７】
少なくとも約１００の中和抗体を含む、請求項８６に記載の抗体コレクション。
【請求項８８】
請求項７０〜８３のいずれか１項に記載の方法により調製された請求項８７に記載の抗体コレクション。
【請求項８９】
コレクション中の核酸を独自に同定する方法であって、前記コレクション中に存在する核酸配列に連結または前記配列に組み込まれる独特のバーコードで前記核酸を標識することを含む、方法。
【請求項９０】
前記バーコードが、１〜約２４個のヌクレオチド長の非コードヌクレオチド配列である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記非コードヌクレオチド配列が、標識された前記核酸配列の３’非コード領域に連結される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記バーコードが、標識された前記核酸配列内に組み込まれる１つ以上のサイレント突然変異のコード配列である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９３】
前記バーコードが、ペプチドまたはポリペプチドの配列である、請求項８９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、インフルエンザＡ型ウイルスに対する中和抗体を同定し、産生し、さらに、遺伝子操作する方法および手段、ならびに産生された中和抗体に関する。特に、本発明は、例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、およびＨ５サブタイプのすべてなど２つ以上のＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７およびＨ９に対する中和抗体を含む、種々のインフルエンザＡ型ウイルスサブタイプに対する中和抗体およびこの種の抗体を作る方法および手段に関する。さらに具体的に述べると、本発明は、インフルエンザＡ型ウイルスサブタイプの分離株を１つより多く、好ましくはすべてを中和し得る抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
インフルエンザは、インフルエンザウイルスにより引き起こされる接触伝染性の呼吸器疾患である。該ウイルスは軽症から重篤までの疾患を引き起こし、時には死に至ることもある。毎年米国では、国民の５〜２０％がインフルエンザにかかり、約２００，０００人が入院させられ、約３６，０００人が死亡する。
【０００３】
インフルエンザウイルスは、せきやくしゃみをした時に生じる呼吸器系のしぶきで広がり、該ウイルスは、通常、ヒトからヒトへ伝染する。インフルエンザ表面抗原に対する免疫、特にヘマグルチニンは、感染が起きた場合、感染の可能性および感染しても疾患の重篤性を低減する。インフルエンザワクチンは利用できるが、１つの型またはサブタイプのインフルエンザウイルスに対する抗体は、別の型またはサブタイプのインフルエンザに対する保護は限定的または全く保護できず、毎年インフルエンザワクチンに１つより多くの株を組み込む必要がある。
【０００４】
インフルエンザウイルスは、分節マイナス鎖（ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｓｔｒａｎｄ）ＲＮＡウイルスであり、オルトミクス・ウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）科に属する。インフルエンザＡ型ウイルスは９つの構造タンパク質からなり、さらに、制御的機能を有する１つの非構造ＮＳ１タンパク質をコードする。該非構造ＮＳ１タンパク質は、再現サイクルの間に大量に合成され、感染細胞の細胞質ゾルおよび核の中に局在化される。ウイルスゲノムの分節性により、種々のウイルス株を有する細胞の混合感染の間に起きる遺伝子的再集合（ゲノム分節の交換）のメカニズムが可能になる。インフルエンザＡ型ウイルスは、さらに、ウイルスタンパク質表面上に表示された種々のヘマグルチニン（ＨＡ：ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ：ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）ウイルスタンパク質により種々のサブタイプに分類される。
【０００５】
インフルエンザＡ型ウイルスサブタイプは、２つのウイルス表面糖タンパク質である、ヘマグルチニン（ＨＡまたはＨ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡまたはＮ）により同定される。各々のインフルエンザウイルスのサブタイプは、ＨおよびＮのタンパク質のその組み合わせにより同定される。ＨＡサブタイプが１６、ＮＡサブタイプが９種知られている。インフルエンザＡ型ウイルスは、ヒト、トリ、ブタ、ウマ、および他の動物に感染させることができるが、野鳥は、これらのウイルスの自然の宿主である。一部のインフルエンザＡサブタイプのみ（すなわち、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、およびＨ３Ｎ２）が、現在ヒトの間に循環しているが、１６のＨおよび９のＮＡサブタイプのすべての組み合わせは、鳥類、特に原野にいる水鳥および海岸で生息しているトリにおいて同定されている。さらに、Ｈ５およびＨ７インフルエンザウイルスがヒトを発病させうることを示す証拠も蓄積されつつある。
【０００６】
インフルエンザＡ型ウイルスのＨＡは、２つの構造的に異なる領域、すなわち、球状頭部領域およびステム領域を含んでいる。球状頭部領域は、標的細胞へのウイルスの取り付けに関与する受容体結合部位を含み、ＨＡのヘマグルチニン化活性に関与している。ステム領域は融合ペプチドを含み、該ペプチドは、細胞のウイルス外被とエンドソーム膜との間の膜の融合に必要であり、したがって、融合活性に関係する（Ｗｉｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５６：３６５−３９４（１９８７））。
【０００７】
パンデミックは、世界的な疾患の大流行である。インフルエンザのパンデミックは、新しいインフルエンザＡ型ウイルスが、（１）人間集団において該ウイルスに対して免疫がほとんどないか、全くないウイルスが出現し、（２）重病を引き起こし始め、（３）ヒトとヒトとの間で世界的に容易に広がる時に起きる。２０世紀の間に、この種のインフルエンザのパンデミックが３度発生した。最初は、１９１８年の「スペイン風邪」で、このインフルエンザパンデミックにより米国で少なくとも５００，０００人死亡し、世界の死者は４０００万人に上った。このパンデミックは、インフルエンザＡ  Ｈ１Ｎ１サブタイプにより発生した。２回目のインフルエンザパンデミックは、１９５７年の「アジア風邪」で、インフルエンザＡ  Ｈ２Ｎ２サブタイプにより発生し、死者は、米国で少なくとも７０，０００人、世界では１００〜２００万人に上った。最も最近のインフルエンザパンデミックは、１９６８年の「香港風邪」で、インフルエンザＡ  Ｈ３Ｎ２サブタイプにより発生し、死者は、米国で約３４，０００人、世界では７０万人であった。
【０００８】
１９９７年に、インフルエンザＡ  Ｈ５Ｎ１の最初の症例が、香港で報告された。この鳥類型ウイルスが直接ヒトに感染したのは、これが初めてであったが、ヒトからヒトへの感染が認められなかったので、パンデミックは起きなかった。
【０００９】
非特許文献１は、不活性化したＨ５Ｎ１ウイルスを予防接種したウマからの抗Ｈ５１  ＩｇＧｓおよびＨ５Ｎ１に感染したＢＡＬＢ／ｃマウスを保護すると説明されたＨ５Ｎ１−特異性Ｆ（ａｂ’）２断片の調製について報告している。
【００１０】
非特許文献２は、マウスの受動免疫法のインフルエンザＡ  Ｈ５  ウイルスヘマグルチニンに対して特異的なキメラモノクローナル抗体の使用について説明している。
【００１１】
特定のインフルエンザＡ型ウイルスにより生じた呼吸器疾患の重篤性、および潜在的なパンデミックの脅威に鑑みて、効率的な予防および処置方法を求める大きなニーズがある。本発明は、インフルエンザＡ型ウイルスのＨ１、およびＨ３サブタイプ、およびＨ５サブタイプを含むがこれらに限定されない、該ウイルスの種々のＨサブタイプに対するインフルエンザＡ中和抗体を提供することによりこのニーズに取り組んでいる。本発明は、さらに、種々のヒトおよびヒト以外の種から得られた分離株および種々のインフルエンザの大流行および／またはパンデミックの犠牲者および／または生存者からの分離株を含むがこれらに限定されないインフルエンザＡ型ウイルスの任意のサブタイプの分離株の１つより多い、好ましくはすべてを中和し得る抗体を提供する。
【００１２】
この種の中和抗体は、大流行またはパンデミックの場合、感染した人々または感染のリスクがある人々の受動免疫法を含むインフルエンザウイルス感染の予防および／または処置に利用することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｓｐ．Ｒｅｓ．７：４３（２００６）（ｄｏｉ：１０．１１８６／１４６５−９９２−７−４３）
【非特許文献２】Ｈａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｓｐ．Ｒｅｓ．７：１２６（ｄｏｉ：１０．１１８６／１４６５−９９２１−７−１２６）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
１つの態様では、本発明は、インフルエンザＡ型ウイルスサブタイプの１つより多くの分離株またはインフルエンザＡ型ウイルスの１つより多くのサブタイプを中和する中和抗体に関する。
【００１５】
１つの実施形態では、該抗体は、Ｈ５、Ｈ７およびＨ９サブタイプの１つ以上などインフルエンザＡ型ウイルスサブタイプの実質的にすべての分離株を中和する。
【００１６】
別の実施形態では、該抗体は、Ｈ５、Ｈ７およびＨ９サブタイプの１つ以上など特定のインフルエンザＡ型ウイルスサブタイプの１つより多くの分離株を中和する。
【００１７】
さらに別の実施形態では、該抗体は、インフルエンザＡ型ウイルスの１つより多くのサブタイプ、および少なくとも１つのサブタイプの１つより多くの分離株を中和する。
【００１８】
さらなる実施形態では、本明細書の該抗体により中和された少なくとも１つのサブタイプおよび／または分離株が、ヒトに感染する能力を有する。
【００１９】
別の実施形態では、少なくとも１つの分離株は、例えば、野鳥およびニワトリを含む鳥類に由来するものである。
【００２０】
特定の実施形態では、本明細書の抗体は、インフルエンザＡ型ウイルスのＨ５Ｎ１サブタイプを中和する。好ましくは、該抗体は、このインフルエンザＡ型ウイルスサブタイプの１つより多くの分離株、より好ましくは実質的にすべての分離株を中和する。
【００２１】
別の実施形態では、本明細書の該抗体は、Ｈ５Ｎ１サブタイプ、ならびにＨ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、およびＨ３Ｎ２サブタイプからなる群から選択される少なくとも１つの追加されたサブタイプを中和する。
【００２２】
追加の実施形態では、本明細書の抗体は、追加されたサブタイプ（単数および複数）の１つより多くの分離株、好ましくは実質的にすべての分離株を中和する。
【００２３】
別の実施形態では、本発明の中和抗体は、Ｈ５タンパク質に結合する。好ましくは、該抗体は、Ｈ５タンパク質の１つより多くの改変体、より一層好ましくは、Ｈ５タンパク質の実質的にすべての分離株を中和する。
【００２４】
他の実施形態では、本明細書の抗体は、Ｈ５タンパク質およびＨ１、Ｈ２および／またはＨ３のタンパク質など少なくとも１つの追加されたＨタンパク質に結合する。
【００２５】
異なる態様では、本発明は、本明細書で説明した該中和抗体を含む組成物に関する。
【００２６】
さらなる態様では、本発明は、単一のインフルエンザＡ型ウイルスサブタイプまたは複数のインフルエンザＡ型ウイルスサブタイプの１つより多くの分離株を中和し得る抗体を同定する方法に関する。この方法は、インフルエンザＡ型ウイルスサブタイプの第１および第２の分離株の両方、または該インフルエンザＡ型ウイルスの第１および第２のサブタイプと反応する抗体ライブラリーにおける抗体の同定、および第１および第２の分離株、または第１および第２のサブタイプ、それぞれ、に結合する該抗体の能力に基づいて、同定した該抗体を選択の連続的交互ラウンドを受けることを含む。
【００２７】
ある実施形態では、第１および第２のインフルエンザＡ型ウイルスサブタイプ分離株の両方と反応する抗体は、第１および第２の分離株と、それぞれ、反応し、同定された抗体を組み換える抗体の少なくとも２ラウンドの別々の濃縮により同定された。
【００２８】
別の実施形態では、第１および第２のインフルエンザＡ型ウイルスサブタイプ分離株の両方と反応することができる抗体は、第１および第２の分離株に、それぞれ、結合する該抗体の能力に基づいて、選択の連続的交互ラウンドを受ける前に突然変異誘発を受ける。望ましいならば、第１および第２の分離株に結合し得る該抗体は、さらに、１つより多くのインフルエンザＡ型サブタイプに結合する該抗体の能力に基づいて選択される。
【００２９】
この種の濃縮技法の適用は、一般に、抗体が結合する標的とは関係なく、同様に抗体に適用することができる。この種の一般的な濃縮／選択の方法は、本発明の一部として明らかに含まれている。
【００３０】
さらなる態様では、本発明は、本発明の中和抗体が共有する配列コレクションに関する。
【００３１】
さらにさらなる態様では、本発明は、本明細書の有効量の中和抗体または抗体組成物を対象に投与することを含むＡ型インフルエンザに感染している対象を処置する方法に関する。
【００３２】
別の態様では、本発明は、Ａ型インフルエンザに感染するリスクのある対象に本発明の中和抗体の有効量を投与することを含む、Ａ型インフルエンザの感染を予防する方法に関する。
【００３３】
異なる態様では、本発明は、（ａ）少なくとも２つの機能が異なる抗体のＣＤＲ配列を整列させ、（ｂ）整列させられたＣＤＲ配列間に保存されたアミノ酸残基を同定し、（ｃ）整列させられたＣＤＲ配列の複数の改変体を産生するために突然変異を誘発された非保存位置における機能が異なる抗体に存在する、少なくともアミノ酸残基をコードする縮重オリゴヌクレオチドプローブを用いて、整列させられたＣＤＲ配列の少なくとも１つの配列において複数の非保存アミノ酸残基の突然変異誘発を行い、ならびに、望ましいならば、該抗体コレクションが望ましい程度の多様性および／またはサイズに達するまで改変体の１つ以上と共にステップ（ｂ）および（ｃ）を反復することを含む、様々な多機能性抗体コレクションを作成する方法に関する。
【００３４】
特定の実施形態では、整列させられたＣＤＲ配列は同じ長さを有する。
【００３５】
別の実施形態では、保存された該アミノ酸残基類は、整列させられた少なくとも２つのＣＤＲ配列に保持される。
【００３６】
さらなる態様では、本発明は、少なくとも１つの特性が互いに異なる、複数の中和抗体を含む抗体コレクションに関する。
【００３７】
本発明は、さらに、この種のコレクションに存在する核酸の配列に連結されたか、または該配列に組み込まれる独特のバーコードで標識した核酸を含むコレクション中の核酸を独自に同定する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１Ａ】１５の既知のヘマグルチニン（Ｈ）タンパク質サブタイプのアミノ酸配列を示している。
【図１Ｂ】１５の既知のヘマグルチニン（Ｈ）タンパク質サブタイプのアミノ酸配列を示している。
【図１Ｃ】１５の既知のヘマグルチニン（Ｈ）タンパク質サブタイプのアミノ酸配列を示している。
【図１Ｄ】１５の既知のヘマグルチニン（Ｈ）タンパク質サブタイプのアミノ酸配列を示している。
【図１Ｅ】１５の既知のヘマグルチニン（Ｈ）タンパク質サブタイプのアミノ酸配列を示している。
【図１Ｆ】１５の既知のヘマグルチニン（Ｈ）タンパク質サブタイプのアミノ酸配列を示している。
【図１Ｇ】１５の既知のヘマグルチニン（Ｈ）タンパク質サブタイプのアミノ酸配列を示している。
【図１Ｈ】１５の既知のヘマグルチニン（Ｈ）タンパク質サブタイプのアミノ酸配列を示している。
【図１Ｉ】１５の既知のヘマグルチニン（Ｈ）タンパク質サブタイプのアミノ酸配列を示している。
【図１Ｊ】１５の既知のヘマグルチニン（Ｈ）タンパク質サブタイプのアミノ酸配列を示している。
【図２】２種類の標的、ＡおよびＢに対する反応性強度を高めるための典型的なパニング濃縮スキームを示している。各濃縮ラウンドは、個々の標的（単数および複数）に対するプールの反応性強度を高める。
【図３】標的ＡおよびＢと交差反応するクローンを選択する方法を示し、この方法では、各連続ラウンドは両標的に対して得られるプールの反応性強度を高める。
【図４】交差反応性を発生および／または高めるために並行発見プールを組み換えることにより２種類の標的（標的ＡおよびＢ）に対する反応性強度を高める方法を示している。組み換え抗体ライブラリーの各選択ラウンドは、両標的に対して得られるプールの反応性強度を高める。
【図５】標的Ａに対する反応性を維持しながら標的Ｂに対する交差反応性を高める方法を示している。第１に、標的Ａと反応するクローンが選択され、次いで、標的Ａと反応するクローンの突然変異誘発ライブラリーが調製され、選択が示されたようになされ、標的Ａおよび標的Ｂの両方と強い反応性を示す１つ以上の抗体クローンを生じる。
【図６】「目標突然変異誘発」法により多様な多機能性抗体コレクションを作る代表的な突然変異誘発法を示している。
【図７】トルコのＨ５Ｎ１鳥インフルエンザ大流行の６名の生存者から得られた血液試料についてＨ５ヘマグルチニン（ＨＡ）の血清学的研究結果を示している。これらのデータは、ＨＡ抗原に対する抗体の存在を実証している。
【図８】Ｈ５抗原（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４）およびＨ１Ｎ１（Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９）およびＨ３Ｎ２（Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９）ウイルスについてテストした、１２名のローカルドナーの血清試料を用いて得られた血清学的研究結果を示している。
【図９】抗体ファージライブラリーの構築において使われた独特のバーコード法を示している。
【図１０】Ｈ５タンパク質およびＨ５Ｎ１ウイルスについてトルコの鳥インフルエンザ生存者のプールされたライブラリーから得られた５種類のクローンのｓｃＦｖＥＬＩＳＡテストの結果を示している。
【図１１】報告されたトルコの分離株からＨ５ヘマグルチニンタンパク質の配列およびＬｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙの配列データベースからダウンロードした１つのベトナムの分離株を比較している配列アラインメントを示している。
【図１２】対応する軽鎖および生殖系列起源配列と共に、トルコドナーのプールされた抗体ライブラリーにおいて同定された独特のクローンの重鎖可変領域配列を示している。この図に示した配列（３〜２３重鎖クローン）は、３ラウンドのパニング後の、すべてのトルコドナーのすべての重鎖および軽鎖のプールされたライブラリーに由来する。
【図１３】対応する軽鎖および生殖系列起源配列と共に、トルコドナーのプールされた抗体ライブラリーにおいて同定された独特のクローンの重鎖可変領域配列を示している。この図に示した配列（３〜３０重鎖クローン）は、２ラウンドのパニング後の、すべてのトルコドナーのすべての重鎖および軽鎖のプールされたライブラリーに由来する。
【図１４Ａ】４ラウンドのパニング後、個々のトルコドナーの抗体ライブラリーから同定された、追加された独特のＨ５Ｎ１に特異な抗体重鎖可変領域配列を示している。
【図１４Ｂ】４ラウンドのパニング後、個々のトルコドナーの抗体ライブラリーから同定された、追加された独特のＨ５Ｎ１に特異な抗体重鎖可変領域配列を示している。
【図１４Ｃ】４ラウンドのパニング後、個々のトルコドナーの抗体ライブラリーから同定された、追加された独特のＨ５Ｎ１に特異な抗体重鎖可変領域配列を示している。
【図１４Ｄ】４ラウンドのパニング後、個々のトルコドナーの抗体ライブラリーから同定された、追加された独特のＨ５Ｎ１に特異な抗体重鎖可変領域配列を示している。
【図１５】トルコの鳥インフルエンザ生存者の血清および骨髄の分析により同定された抗体重鎖配列を用いて多様な抗体重鎖および軽鎖ライブラリーを作り出すために目標の突然変異誘発の使用を例示している。
【図１６】トルコの鳥インフルエンザ生存者の血清および骨髄の分析により同定された抗体軽鎖配列を用いて多様な抗体重鎖および軽鎖ライブラリーを作り出すために目標の突然変異誘発の使用を例示している。
【図１７】ＨＡタンパク質のトルコおよびインドネシアの改変体と共にＨ５Ｎ１ベトナムウイルスｓｃＦｖ抗体から得られた特定のＦａｂ断片の交差反応性を確認しているＥＬＩＳＡの結果を示している。
【図１８】ＨＡタンパク質のトルコおよびインドネシアの改変体と共にＨ５Ｎ１ベトナムウイルスｓｃＦｖ抗体から得られた特定のＦａｂ断片の交差反応性を確認しているＥＬＩＳＡの結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
Ａ．定義
特に明記しない限り、本明細書で使われる技術・科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が普通に理解している意味と同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １９９４）は、本出願において使われる多くの用語の手引書を当業者に提供する。
【００４０】
当業者は、本発明を実行する場合に使われる可能性がある、本明細書で説明した方法および物質と類似または同等な方法および物質が多数あることを認めるであろう。実際に、本発明は、説明した方法および物質に決して限定しない。本発明では、次のように用語を定義する。
【００４１】
用語「インフルエンザＡ型サブタイプ」または「インフルエンザＡ型ウイルスサブタイプ」は、相互互換的に使われ、ヘマグルチニン（Ｈ）およびノイラミニダーゼ（Ｎ）のウイルス表面タンパク質の種々の組み合わせにより特徴づけられるインフルエンザＡ型ウイルス改変体を意味し、したがって、例えば、Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２などのＨ数とＮ数の組み合わせにより呼ばれる。これらの用語は、通常突然変異から生じ、異なる病原性特性を示す、各サブタイプ内のすべての菌株（絶滅菌株を含む）を明らかに含んでいる。この種の菌株は、過去、現在および未来の分離株をすべて含む、ウイルスのサブタイプの種々の「分離株」も意味する。したがって、この文脈では、用語「菌株」と「分離株」は相互互換的に使われる。
【００４２】
用語「インフルエンザ」は、インフルエンザウイルスによって引き起こされた伝染性疾患を意味するのに使われる。
【００４３】
本発明の文脈では、用語「抗体」（Ａｂ：ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、最も広い意味で使われ、特定の抗原ならびに免疫グロブリンおよび抗原特異性に欠ける他の抗体状分子に対して結合選択性を示すポリペプチド類を含む。後の種類のポリペプチド類は、例えば、低レベルではリンパ系により、高レベルでは骨髄腫により産生される。本出願では、「抗体」は、限定なしに、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および抗体断片をカバーしている。
【００４４】
「未変性抗体」は、通常、２つの同一軽（Ｌ：ｌｉｇｈｔ）鎖と２つの同一重（Ｈ：ｈｅａｖｙ）鎖とからなる、約１５０，０００ドールトンのヘテロテトラマー性糖タンパク質である。各軽鎖は、共有ジサルファイド結合（単数および複数）により重鎖に連結し、ジサルファイド結合の数は、種々の免疫グロブリンのアイソタイプの重鎖間で変わる。各重鎖および軽鎖は、規則的に間隔をあけた鎖内ジサルファイド橋も有する。各重鎖は、１つの終端において可変ドメイン（ＶＨ）とそれに続く多数の定常ドメインを有する。各軽鎖は、１つの終端において可変ドメイン（ＶＬ）およびその他の終端において定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１定常ドメインを用いて整列させられ、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインを用いて整列させられている。特定のアミノ酸残基は、軽鎖および重鎖の可変ドメインの間で界面を形成すると考えられている。Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６：６５１（１９８５）；Ｎｏｖｏｔｎｙ  ａｎｄ  Ｈａｂｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：４５９２（１９８５）．
抗体鎖に関連した用語「可変」は、抗体内の配列で広範に違いがあり、その特定の抗原に対する特定の各抗体の結合および選択性に関与する該抗体の部分を意味するのに使われる。この種の可変性は、軽鎖および重鎖の両方の可変ドメインにおいて超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに濃縮されている。可変ドメイン類のより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ：ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ）と呼ばれる。未変性重鎖および軽鎖の可変ドメイン類は、各々が、４つのＦＲ（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４、それぞれ）を含み、大抵が３つの超可変領域により接続されたβ−シート配置を採用し、該超可変領域は、ループ接続、および一部の場合にはβ−シート構造の一部を形成している。各鎖の超可変領域は、ＦＲ類により、および他の鎖からの超可変領域を用いて近接して一緒に保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１），ｐａｇｅｓ  ６４７−６６９を参照のこと）。定常ドメイン類は、抗体の抗原への結合には直接には関与しないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与など種々のエフェクター機能を示す。
【００４５】
用語「超可変領域」は、本明細書で使われる場合、抗原結合に関与している抗体のアミノ酸残基類を意味している。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基類を含む（すなわち、軽鎖可変ドメインにおける残基３０−３６（Ｌ１）、４６−５５（Ｌ２）および８６−９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインにおける３０−３５（Ｈ１）、４７−５８（Ｈ２）および９３−１０１（Ｈ３）；ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９６。「フレームワーク」または「ＦＲ」残基類は、本明細書で定義された超可変領域残基類以外の可変ドメイン残基類である。
【００４６】
これらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列により、抗体は種々のクラスに帰属させることができる。抗体のクラスには、主なものが５つ、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのいくつかは、さらに、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２に分類することができる。
【００４７】
種々のクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメイン類は、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。
【００４８】
脊椎動物に由来する抗体の「軽鎖」は、これらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に異なる型の１つに帰属させることができる。
【００４９】
「抗体断片」は、全長抗体の一部、一般に、抗体の抗原結合または可変ドメインを含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片、線状抗体、単一鎖抗体分子、二重特異性抗体、および抗体断片から形成された多選択性抗体があるが、これらに限定されない。
【００５０】
用語「モノクローナル抗体」は、Ｂ細胞の単一クローンにより合成された抗体分子を意味するのに使われる。修飾語句「モノクローナル」は、ほぼ均一な抗体集団からえられている抗体のキャラクターを示しており、特定の方法により抗体の産生を必要とするものと解釈すべきではない。したがって、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１（１９７６）により最初に報告されたハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法により作るか、またはファージ抗体ライブラリーから分離してもよい。
【００５１】
用語「ポリクローナル抗体」は、Ｂ細胞の集団により合成された抗体分子の集団を呼ぶのに使われる。
【００５２】
「単一鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬ両ドメインを含み、これらのドメインは、単一ポリペプチド鎖中に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、さらに、ＶＨおよびＶＬ両ドメインの間にポリペプチドリンカーを含み、該リンカーは、ｓＦｖが、抗原結合について望ましい構造を形成することを可能にする。ｓＦｖの総説については、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）のＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎを参照のこと。単一鎖抗体は、例えば、国際公開第８８／０６６３０号および国際公開第９２／０１０４７号で開示されている。
【００５３】
用語「二重特異性抗体」は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を意味し、該断片は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）において、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上で２つのドメイン間にペアを作るには短かすぎるリンカーを用いることにより、これらのドメインは別の鎖の相補性ドメインとペアを作ることを強いられる。二重特異性抗体は、例えば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）により詳細に説明されている。
【００５４】
用語「二重特異性抗体」は、２つの異なる型の抗原に対して特異性を示す抗体を意味している。本明細書で使われる用語は、標的抗原および特定の組織への送達を容易にする別の標的に対して結合特異性を示す抗体を、無制限に特異的に含んでいる。同様に、多選択性抗体は、２つ以上の結合特異性を有する。
【００５５】
表現「線状抗体」は、抗原結合領域のペアを形成する一対の直列型のＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含むことを意味するのに使われる。線状抗体は、二重特異性または単一特異性であり、例えば、Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）により説明されている。
【００５６】
用語「中和抗体」は、本明細書では最も広い意味で使われ、インフルエンザウイルスは、中和が行われるメカニズムとは関係なく、標的細胞を複製により感染することを抑制するあらゆる抗体を意味している。したがって、例えば、ウイルスの連結または接着に関与する部位に、直接またはすぐそばに結合する抗体を遺伝子操作することにより、該ウイルスの細胞表面への連結または接着を抑制することにより、中和を実現することができる。ウイルス表面に向けられた抗体によりウイルスを凝集させることにより、中和を実現することもできる。中和は、さらに、標的細胞にウイルスを連結後ウイルスおよび細胞膜の融合の抑制、エンドサイトーシスの抑制、感染細胞から子孫ウイルスの抑制などにより、中和をさらに行うことができる。本発明の中和抗体は、中和が行われるメカニズムにより限定されない。
【００５７】
用語「抗体レパートリー」は、本明細書では最も広い意味で使われ、結合能力、結合特異性、胃腸内を輸送する能力、安定性、親和性などの特性を選別するのに使われる抗体または抗体断片のコレクションを意味している。この用語は、具体的には、例えば、制約なしに、単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含む、抗体ファージディスプレイ・ライブラリー、およびナイーブな合成、半合成ライブラリーを含むあらゆる供給源に由来するＦａｂ抗体ファージディスプレイ・ライブラリーなどすべての形のコンビナトリアルなライブラリーを含む抗体ライブラリーを含んでいる。
【００５８】
「ファージディスプレイ・ライブラリー」は、ファージ被覆タンパク質との融合物としてクローンタンパク質配列コレクションを発現するタンパク質発現ライブラリーである。したがって、フレーズ「ファージディスプレイ・ライブラリー」は、本明細書では、ファージ（例えば、糸状のファージ）のコレクションを意味し、該ファージは外部（通常異種）タンパク質を発現している。この外部タンパク質は、該ファージが接触している他の部分と自由に相互作用（該部分に結合）している。外部タンパク質を示している各ファージは、該ファージディスプレイ・ライブラリーの「メンバー」である。
【００５９】
「抗体ファージディスプレイ・ライブラリー」は、抗体または抗体断片を示すファージディスプレイ・ライブラリーを意味している。この抗体ライブラリーは、ファージの集団またはこの種のファージ集団をコードしているベクターのコレクション、またはこの種のファージまたはベクターのコレクションを宿す細胞を含んでいる。このライブラリーは、ファージ粒子につき平均して１つの単一鎖抗体または抗体断片を示す一価、あるいはファージ粒子につき平均して２個以上の抗体または抗体断片を示す多価でよい。用語「抗体断片」は、単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片およびＦａｂ断片を無制限に含んでいる。好ましい抗体ライブラリーは、平均して１０６より多い、または１０７より多い、または１０８より多い、または１０９より多い種類のメンバーを含む。
【００６０】
用語「糸状ファージ」は、その表面に不均一なポリペプチドを示し得るウイルス粒子を意味し、ｆ１、ｆｄ、Ｐｆ１、およびＭ１３を無制限に含んでいる。この糸状ファージは、テトラサイクリン（例えば、「ｆｄ−ｔｅｔ」）などの選択可能なマーカーを含んでよい。種々の糸状ファージディスプレイシステムが、当業者には周知である（例えば、Ｚａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ９：１２７−１４０（１９８０），Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１３１５−１３１７（１９８５）；ａｎｄ  Ｐａｒｍｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ  ７３：３０５−３１８（１９８８）参照のこと）。
【００６１】
用語「パニング」は、標的に対して高い親和性および特異性を有する抗体などのファージ搬送化合物の同定および分離における複数ラウンドの選別プロセスを意味している。
【００６２】
本明細書で使われる用語「ヒト以外の動物」には、例えば、ヒト以外の霊長類、げっ歯類（例えば、マウスおよびラット）、ならびに、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、ウマおよびロバなどのげっ歯類以外の動物があるが、これらに限定されない。「ヒト以外の動物」には、鳥類（例えば、ニワトリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、など）もある。本明細書で使われる用語「霊長類以外の動物」は、上で具体的に並べた哺乳類を含むがこれらに限定されない霊長類以外の哺乳類を意味している。
【００６３】
フレーズ「機能的に異なる抗体」およびこれらの抗体の文法的な改変体は、例えば、標的を中和する能力、生物活性の範囲または特質などの、結合特異性、結合親和性、および何らかの免疫学的または生物学的機能を無制限に含む少なくとも１つの特性において互いに異なる抗体を意味するのに使われる。
【００６４】
フレーズ「保存されたアミノ酸残基類」は、互いに整列させられた２つ以上のアミノ酸配列の間で同一であるアミノ酸残基類を意味するのに使われる。
Ｂ．一般的技法
本発明の方法を行う技法は、当該技術において周知であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｃｏｌｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９７）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌ，ｅｄｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｐ．Ｍ．Ｏ’Ｂｒｉａｎ  ａｎｄ  Ｒ．Ａｉｔｋｅｎ，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１７８；Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃ．Ｆ．Ｂａｒｂａｓ  ＩＩＩ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１；ａｎｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｇ．Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，ｅｄ．，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ，２００４；を含む研究室用標準教科書に記載されている。突然変異誘発は、例えば、部位特異的な突然変異誘発を用いて行うことができる（Ｋｕｎｋｃｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２（１９８５））。
【００６５】
次の説明では、本発明は、特定の型の抗体ライブラリーを参照しながら説明しているが、本発明は、特定の型の抗体ライブラリーの使用に限定されない。組換えモノクローナル抗体ライブラリーは、免疫断片またはナイーブな断片をベースにすることができる。免疫抗体ライブラリーに由来する抗体は、通常、ＶＨおよびＶＬ遺伝子プールを用いて構築され、該プールは、供給源のＢ細胞から、ランダムにコンビナトリアルなライブラリーを産生するために発現する適切なベクター内にクローン化され、該ライブラリーは、次いで、選択および／または選別される。他の型のライブラリーには、抗原に結合するクローンに対して明らかに偏っていない遺伝子の供給源に由来する抗原断片が含まれている。したがって、ナイーブな抗体ライブラリーは、天然の、免疫されていない、再整理されたＶ遺伝子から導かれる。合成抗体ライブラリーは、完全なまたは目的に合わせられた縮重のエリアを１つ以上のＶ遺伝子のＣＤＲ内に導入して、インビトロ法により完全に構築される。半合成ライブラリーは、天然と合成の多様性を併用し、所望のレベルの機能的多様性を維持しながら、天然の多様性を増すためにしばしば作り出される。したがって、この種のライブラリーは、例えば、天然のＣＤＲ領域を混ぜ合わせる（Ｓｏｄｅｒｌｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：８５２−８５６（２０００））か、または合成ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の多様性（Ｈｏｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：４５５−３８（２００５））を用いてヒトのＢ細胞に由来する自然に再整理されたＣＤＲ配列を併用することにより作り出すことができる。本発明は、ナイーブ、合成および半合成のライブラリーまたはこれらの併用使用を包含する。
【００６６】
同様に、本発明の方法は、抗体のディスプレイに使われる特定の技術により限定されない。本発明は、ファージディスプレイに関連して説明しているが、本発明の抗体は、リボソームまたはｍＲＮＡディスプレイ（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９０２２−９０２６（１９９４）；Ｈａｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：４９３７−４９４２（１９９７））、細菌ディスプレイなどの微生物細胞ディスプレイ（Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：２９−３４（１９９７）），または酵母細胞ディスプレイ（Ｋｉｅｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１０：１３０３−１３１０（１９９７）），レトロウイルスディスプレイなどの哺乳類細胞上のディスプレイ、胞子ディスプレイ、ウイルスディスプレイ（Ｕｒｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：ｅ３５（２００５），タンパク質−ＤＮＡ結合をベースにしたディスプレイ（Ｏｄｅｇｒｉｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：２８０６−２８１０（２００４）；Ｒｅｉｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：ｅ１０（２００５）），およびマイクロビーズディスプレイ（Ｓｅｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５３２；４５５−４５８（２００２））など他のディスプレイおよび濃縮技術によっても同定することができる。
【００６７】
リボソームディスプレイでは、該抗体およびコードｍＲＮＡはリボソームにより連結され、ディスプレイは、ｍＲＮＡの翻訳の終端においてポリペプチドを放出することなく停止される。選択は、全体として３元錯体に基づいている。
【００６８】
ｍＲＮＡディスプレイライブラリーでは、抗体と該コードｍＲＮＡとの間の共有結合は、アダプター分子として使われる、プロマイシンにより作られる（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：３７５０−３７５５（２００１））。ディスプレイ抗体にこの技法を使用する場合は、例えば、Ｌｉｐｏｖｓｅｋ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２９０：５１−６７（２００４）を参照のこと。
【００６９】
微生物細胞ディスプレイ技法には、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母上の表面ディスプレイがある（Ｂｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：５５３−５５７（１９９７））。したがって、例えば、抗体は、α−アグルチニン酵母接着受容体に融合することによりサッカロマイセス・セレヴィシエの表面にディスプレイすることができ、該受容体は酵母の細胞壁上に配置される。この方法は、フローサイトメトリーによりレパートリーを選択する可能性を提供する。蛍光標識付きの抗原および抗エピトープ標識試薬を用いて細胞を染色することにより、酵母細胞は、細胞表面上の抗原結合および抗体発現のレベルにより分類することができる。酵母ディスプレイプラットフォームは、ファージと併用することもできる（例えば、Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｕｃｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５４６：２８８−２９４（２００３））。
【００７０】
抗体ライブラリーを選択し、選別する技法の総説については、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（９）：１１０５−１１１６（２００５）を参照のこと。
Ｃ．好ましい実施形態に関する詳細な説明
本発明は、絶滅株の分離株を含むインフルエンザＡ型サブタイプの１つより多くの株（分離株）を中和するモノクローナル抗体、ならびにＨ５ヘマグルチニンの存在を特徴とするサブタイプを含む、１つより多くのインフルエンザＡ型サブタイプに対する中和抗体の選択、産生および使用に関する。特定の実施形態では、本発明は、１つより多くのインフルエンザＡ型のサブタイプおよび／または１つより多くの分離株、または２つより多い分離株、または３つより多い分離株、または４つより多い分離株、または５つより多い分離株、など、最も好ましくは１つ以上のサブタイプのすべての分離株を中和するモノクローナル抗体の選択、産生および使用に関する。
【００７１】
インフルエンザＡ型ウイルスのビリオンは、線状マイナス一本鎖ＲＮＡの８個のセグメントを含んでいる。ゲノム全長は、１３６００ヌクレオチドであり、該８個のセグメントの長さは、それぞれ、２３５０ヌクレオチド、２３５０ヌクレオチド、２２５０ヌクレオチド、１７８０ヌクレオチド、１５７５ヌクレオチド、１４２０ヌクレオチド、１０５０ヌクレオチド、９００ヌクレオチドである。インフルエンザＡ型ウイルスの宿主特異性および減弱は、個別にまたはウイルス遺伝子の併用において、ウイルスヘマグルチニン（Ｈ，ＨＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックス（Ｍ）、および非構造（ＮＳ）遺伝子に起因するとされた（例えば、Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２７：３６１−３７３（１９８３）；Ｓｃｈｏｌｔｉｓｓｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １４７：２８７−２９４（１９８５）；Ｓｎｙｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２４：４６７−４６９（１９８６）；Ｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５３：７７１−７７５（１９８５）；Ｔｒｅａｎｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７１：１−９（１９８９）を参照のこと。
【００７２】
ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼのタンパク質を含む、インフルエンザＡ型ウイルスおよびこれらの表面タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋおよび、例えば、ｔｈｅ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにより管理された、配列データベースｔｈｅ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅなど他の配列データベースから入手できる。インフルエンザＡ型ウイルス・ヘマグルチニン（Ｈ１−Ｈ１５）の１５の既知Ｈサブタイプのアミノ酸配列は、図１（配列番号：１−１５）に示している。追加のインフルエンザＡ型ウイルス・ヘマグルチニンサブタイプ（Ｈ１６）が、最近、スエーデンでユリカモメから単離され、Ｆｏｕｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９（５）：２８１４−２２（２００５）により報告された。各Ｈサブタイプには、非常に多様な株があることも知られている。例えば、図１においてＨ５  Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１５６／９７と指定されたＨＡタンパク質の配列は、１９９７年５月に香港においてヒトから単離されたインフルエンザＡ  Ｈ５Ｎ１ウイルスから決定され、Ｓｕａｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：６６７８−６６８８（１９９８）において他の関連Ｈ５Ｎ１分離株から得られたいくつかの追加株の配列と比較して示されている。
【００７３】
インフルエンザウイルスであるノイラミニダーゼの触媒および抗原の部位の構造は、Ｃｏｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３０３：４１−４（１９８３）により公表され、ノイラミニダーゼの配列は、ＧｅｎＢａｎｋおよび他の配列データベースから入手できる。
【００７４】
感染個体の免疫反応から得られるウイルス特異性抗体は、通常、ウイルスのヘマグルチニンとの相互作用により該ウイルスを中和することが知られている（Ａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２８：１−５４（１９８６）：Ｃｏｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｏｂｉｏｌ．３７：５２９−５４９（１９８３））。インフルエンザウイルス・ヘマグルチニンの３次元構造およびインフルエンザウイルス・ヘマグルチニンと中和抗体との間の錯体の結晶構造も、測定され、公表された、例えば、Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２８９：３６６−７３（１９８１）；Ｒｕｉｇｒｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９（Ｐｔ１１）：２７８５−９５（１９８８）；Ｗｒｉｇｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １３１（２）：３０８−１４（１９８３）；Ｄａｎｉｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１４５９−１４６５（１９８７）；ａｎｄ  Ｂｉｚｅｂａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７６：９２−９４（２００２）を参照のこと。
【００７５】
本発明によると、所望の特性を有する抗体は、１つ以上の抗体ライブラリーから同定され、該ライブラリーは、種々の供給源に由来し、種々の型をとることができる。
【００７６】
包括的なヒトインフルエンザ抗体ライブラリー
包括的なヒトインフルエンザ抗体ライブラリーは、以前のいろいろなインフルエンザ、季節的突発的流行、および１９６８年の香港風邪（Ｈ３Ｎ２）、１９５７年のアジア風邪（Ｈ２Ｎ２）、１９１８年のスペイン風邪（Ｈ１Ｎ１）、および２００４／２００５年の鳥インフルエンザ（Ｈ５Ｎ１）を含むパンデミックの回復期の患者から得られた抗体から作り出すことができる。この種のライブラリーを作るために、インフルエンザウイルスに感染したことが分かっているか、またはその疑いがある個体から血液または骨髄の試料を集める。周辺の血液試料、特に地理学的に離れた供給源からの試料は、輸送、および使用の前に安定化させる必要がある。このためのキットが周知であり、リンパ球の遠心精製の場合、ＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）ＣＰＴ（商標）細胞調製チューブが商業的に入手でき、グアニジウム、Ｔｒｉｚｏｌ、またはＲＮＡｌａｔｅｒを用いて該試料を安定化する。安定化されたリンパ球または全骨髄を受領すると、当該技術分野において周知の免疫グロブリンオリゴプライマーを用いて、重鎖および軽鎖のレパートリーを救出するためにＲＴ−ＰＣＲが行われる。ＰＣＲレパートリー製品は、当該技術分野で周知の手順に続いて、ｍ１３ｐＩＩＩを用いてフレーム内で直接クローン化するために、リンカーオリゴと併用してｓｃＦｖライブラリーを作成する。
【００７７】
典型的プロトコルでは、ヒト血清内の抗体は、例えば、周知のヘマグルチニン抑制（ＨＡＩ：ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）アッセイを含む周知の血清学的アッセイにより検出することができる（Ｋｅｎｄａｌ，Ａ．Ｐ．，Ｍ．Ｓ．Ｐｅｒｅｉｒａ，ａｎｄ  Ｊ．Ｊ．Ｓｋｅｈｅｌ．）１９８２．Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ−ｂａｓｅｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ．Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ａｔｌａｎｔａ，Ｇｅｏｒｇｉａ），ｏｒ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ（Ｈａｒｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２６：３３３−３３７（１９８８））。この検出ステップは、該血清試料がインフルエンザ中和抗体を含むことがすでに確認されているならば、必要なさそうである。全血からのリンパ球または骨髄に存在するリンパ球は、次に、当該技術分野で周知の方法により処理される。全ＲＮＡは、フレッシュな組織またはＲＮＡｌａｔｅｒ安定化組織からＴｒｉ  ＢＤ試薬（Ｓｉｇｍａ）により抽出する。次いで、単離ドナー全ＲＮＡは、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ精製（Ｑｕｉａｇｅｎ）を用いてさらにｍＲＮＡに精製する。次に、第１ストランドｃＤＮＡ合成は、ＡｃｃｕＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のプロトコルに従いランダム九量体オリゴヌクレオチドおよび／またはオリゴ（ｄＴ）１８プライマーを用いて行う。要するに、ＡｃｃｕｓｃｒｉｐｔのＲＴバッファー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中で、１００ｎｇのｍＲＮＡ、０．５ｍＭのｄＮＴＰおよび３００ｎｇのランダム九量体および／または５００ｎｇのオリゴ（ｄＴ）１８プライマーを６５℃で５分間インキュベートし、次いで、４℃へ急冷する。次いで、１００ｍＭのＤＴＴ、Ａｃｃｕｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ、およびＲＮＡｓｅ  Ｂｌｏｃｋを、各反応物に添加し、４２℃で１時間インキュベートし、７０℃で１５分間加熱して逆転写酵素を不活性化する。得られたｃＤＮＡは、該抗体重鎖および軽鎖のＶ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ増幅の鋳型として用いることができ、これらの遺伝子は、次いで、ベクター、またはファージディスプレイ・ライブラリーが意図されるならば、ファージミドベクターにクローン化することができる。この手順は、抗体重鎖および軽鎖の可変領域クローンのレパートリー（ＶＨおよびＶＬのライブラリー）を作り、このレパートリーは選別するために個別にまたは組み合わせて保持することができる。
【００７８】
早期の流行および１９１８年のスペイン風邪などのパンデミックの生存者の周辺リンパ球からの免疫グロブリンレパートリーは、上で説明した方法と類似した方法で回収され、安定化され、救出することができる。追加のＨ１およびＨ３のライブラリーでは、レパートリーは、適切な時間にワクチンを注射した局所調達ドナーから回収することができる。追加の選択肢として、商業的に利用できる骨髄総ＲＮＡまたはｍＲＮＡは、Ｈ１およびＨ３に適したライブラリー、およびドナーのバックグラウンドによっては、Ｈ２抗体選別にも適したライブラリー、を作るために販売元から購入することができる。
【００７９】
普遍的抗体ライブラリー（ＵＡＬ：Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ）−合成ヒト状レパートリー
本発明の方法では、合成ヒト抗体レパートリーは、普遍的抗体ライブラリーにより表すことができ、このライブラリーは、当該技術分野で周知または販売元から得た方法により作ることができる。したがって、この種のライブラリーのサブセットを含む普遍的免疫グロブリンライブラリーは、２００３年１２月１１日に発行された米国特許出願公開第２００３−０２２８３０２号で説明され、その全体の開示は、引用により明らかに本明細書に組み込まれている。要するに、この特許発行物は、興味深い原型免疫グロブリンのライブラリーについて説明しており、該免疫グロブリンでは、所定の単一アミノ酸が、興味深い免疫グロブリンの１つ以上の相補性決定領域における１つ以上の位置において置換されている。この種のライブラリーのサブセットには、突然変異した免疫グロブリンがあり、該免疫グロブリンでは、所定のアミノ酸が、可能なすべての組み合わせにおいて免疫グロブリンの６つの相補性決定領域における１つ以上の位置において置換されている。この種の突然変異は、例えば、米国特許第５，７９８，２０８、５，８３０，６５０、６，６４９，３４０号、および米国特許出願公開第２００３−０１９４８０７号に記載されたウォークスルー突然変異誘発により作ることができ、これらの開示内容の全体が引用により本明細書に明らかに組み込まれている。ウォークスルー突然変異誘発では、免疫グロブリンのライブラリーは、該ライブラリーにおいて所定の単一アミノ酸が、該免疫グロブリンの１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）またはフレームワーク（ＦＲ）領域などの該免疫グロブリンにおいて興味深い、規定された領域、またはいくつかの規定された領域の各位置に少なくとも一度組み込まれる。得られる突然変異免疫グロブリンは、原型免疫グロブリンにおける同じ位置（単数および複数）に存在した「未変性」または「野生型」アミノ酸の代わりに、該免疫グロブリンの１つ以上の領域（例えば、ＣＤＲまたはＦＲ領域）内で、これらの免疫グロブリンが１つ以上の位置に組み込まれた所定の単一アミノ酸を有することに、原型免疫グロブリンとの違いがある。突然変異された免疫グロブリンのセットには、興味深い規定された領域の各位置に対して個別に突然変異された免疫グロブリンがあり、したがって、興味深い規定された領域の各位置に対して（例えば、ＣＤＲまたはＦＲ）、突然変異された各免疫グロブリンは、原型免疫グロブリンに存在するアミノ酸か、または所定のアミノ酸および可能なすべての改変体を含む突然変異されたすべての免疫グロブリンの混合物を有する。
【００８０】
種々の突然変異を有する抗体重鎖および軽鎖の特定のサブライブラリーは、併用すると本発明の抗体のフレームワーク・コンストラクトを得ることができ、このコンストラクトは、次いで、重鎖および軽鎖両方のＣＤＲにおいて多様性を導入する。この多様性は、例えば、Ｋｕｎｋｅｌによる突然変異誘発などの当該技術分野において周知の方法により実現することができ、多様性をさらに増すために数回繰り返すことができる。したがって、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１およびＣＤ２領域内の多様性は、個別または同時に、複数ラウンドのＫｕｎｋｅｌ突然変異誘発により導入することができる。必要ならば、種々のＫｕｎｋｅｌクローンは、ＣＤＲ長さにより分離することができ、および／または標的ＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１またはＣＤＲ３）において多様性に欠けているクローンは、例えば、鋳型特異性制限酵素を用いた消化により除去することができる。これらのステップが完了すると、ライブラリーのサイズは、約１０９メンバーを超えるはずであるが、メンバーが比較的少ないライブラリーも有効である。
【００８１】
特定の実施形態では、免疫抗体ライブラリーおよび汎用抗体ライブラリーの両方が、本発明の中和抗体の同定に使われる。これら２つの型のライブラリーは、基本的には異なっている。汎用抗体ライブラリーは、タンパク質とペプチドとを結合する予想した能力を有するヒト様抗体の遡及的に合成したコレクションであり、一方、免疫レパートリーは、鳥類Ｈ５ヘマグルチニン、および／または場合によっては、Ｈ１、Ｈ２、またはＨ３ヘマグルチニンを特異的に認識する配列を含むであろう。したがって、免疫レパートリーは、標的インフルエンザサブタイプ（単数および複数）の必須成分を承認するために理論的に最適化される。これらの差の結果として、これら２つの方法は、抗体の種々のセットを産生し、このようにして、所望の中和抗体を同定するより効率的な方法を提供する。
【００８２】
過剰免疫を受けたヒト以外の霊長類の抗体ライブラリー
この方法では、抗体ライブラリーは、マカクまたはヒヒなどの過剰免疫を受けたヒト以外の霊長類から救出される。具体的には、ヒト以外の霊長類は、インフルエンザＡ型ウイルスの種々のサブタイプまたは種々のヘマグルチニン（Ｈ）タンパク質の免疫がある。免疫があるインフルエンザＡ型ウイルスまたはヘマグルチニンを認識している抗体のタイターを発現している動物は、犠牲にされ、該動物の脾臓を収集した。該免疫動物の血液または骨髄を集め、包括的なインフルエンザ抗体ライブラリーのために、上で説明したように産生された抗体を集め、増幅した。
【００８３】
本発明の中和抗体を単離する方法
用いた単数または複数の抗体ライブラリーの型とは無関係に、２種類のインフルエンザＡサブタイプおよび／または同じサブタイプの２つの株（分離株）、および／またはヒトおよびヒト以外の分離株と反応性を示すなどの２元特異性を有する抗体は、発見し、制御された交差反応性選択および／または定方向のコンビナトリアルな遺伝子操作および／または突然変異誘発遺伝子操作によって最適化することができる。
【００８４】
図２に例示された、典型的な濃縮スキームでは、標的ＡおよびＢとして指定された２つの標的に対して交差反応性を示す抗体を含むライブラリーは、複数ラウンドの濃縮を受ける。濃縮が標的Ａとの反応性に基づいているならば、各ラウンドの濃縮は、標的Ａに対するプールの反応性強度を高めるであろう。同様に、濃縮が標的Ｂとの反応性に基づいているならば、各ラウンドの濃縮は、標的Ｂに対するプールの反応性強度を高めるであろう。図２は、ファージディスプレイ・ライブラリーを選別する場合（下を参照のこと）、使われる選択方法であるパニングを指しているが、この方法は、当該技術分野において周知のもの以外の、上で説明したあらゆる型のライブラリー、およびあらゆる型のディスプレイ技法に同等に適用できる。標的ＡおよびＢは、インフルエンザウイルスの種々の分離株、型およびサブタイプを含むがこれらに限定されない、抗体が結合するあらゆる標的を含んでいる。
【００８５】
本発明の目的は、複数の特異性を有する中和抗体を同定することなので、交差反応発見選択スキームが開発された。単純にするために、このスキームは、二重特異性を有する抗体の選択を示す図３で例示する。この場合、２つの標的、すなわち、標的ＡおよびＢとの反応性を示している抗体を含む抗体ライブラリーは、まず、標的の１つ、例えば、標的Ａとの反応性について選択され、次いで、他の標的、例えば、標的Ｂとの反応性について選択される。各連続選択ラウンドが、両方の標的に対して得られるプールの反応性強度を高める。したがって、この方法は、二重特異性を有する抗体を同定する場合に特に有効である。もちろん、この方法は、追加の標的（単数および複数）に対する追加の濃縮ラウンドを含むことにより、さらなる標的に対して反応性を示す抗体の同定に拡大することができる。やはり、選別されたライブラリーがファージディスプレイ・ライブラリーであるならば、選択は、交差反応パニングによりなされるが、他のライブラリーおよび他の選択方法も使用することができる。
【００８６】
上で説明した２つの方法の併用には、標的Ａおよび標的Ｂ、それぞれ、に対する反応性について、２つの別々の濃縮ラウンドがある。すなわち、これら２つのラウンドは、上で説明したように、得られた２つのプールを組み換えるラウンドと、次の交差反応選択ラウンドである。この方法は、図４に例示されている。純粋な交差反応選択におけるように、組換えライブラリーの選択の各ラウンドは、両方の標的に対して得られるプールの反応性強度を高める。
【００８７】
図５で例示されたさらなる実施形態では、まず、標的Ａと強い反応性を示し、標的Ｂと検出可能な交差反応性を有するクローンが同定される。このクローンに基づいて、突然変異誘発ライブラリーが作られ、次いで、該ライブラリーは、標的Ｂおよび標的Ａとの反応性に対し、それぞれ、交互ラウンドにおいて選択される。このスキームは、標的Ａと強い反応性を維持しながら、標的Ｂとの反応性を高めた抗体を生じる結果になる。直前に記載されているように、選択はパニングによりなされるが、選別されたライブラリーがファージディスプレイ・ライブラリーであるとしても、他のライブラリー、他のディスプレイ技法、および選択方法も、同じ方法に続いて使用することもできる。
【００８８】
上で説明したように、標的ＡおよびＢは、例えば、インフルエンザＡ型ウイルスの２種類のサブタイプ、同じインフルエンザＡ型ウイルスの２種類の株（分離株）、２種類の種に由来するサブタイプまたは分離株でよいが、１つの種はヒトであることが好ましい。したがって、例えば、標的Ａは、Ｈ５Ｎ１ウイルスの２００４年ベトナム分離株の分離株でよく、標的Ｂは、Ｈ５Ｎ１ウイルスの１９９７年香港の分離株でよい。これらの実施例は、単なる例示であり、２個または３個以上の標的に対して二重および多重特異性を有する抗体は、類似の方法で同定、選択および最適化されうることが強調されている。
【００８９】
あるいは、個々のフレームワークおよびＣＤＲ長さの分離を可能にするＵＡＬなどの抗体ライブラリーが、標的Ａに対する抗体の発見に使われるならば、抗原Ｂは選別され、ライブラリーは類似のパラメータの多様なコレクションに限定されることもありうる。一旦、抗原Ｂに対する抗体が発見され、次いで、それぞれのＡおよびＢ抗体に基づいてキメラ抗体または突然変異抗体は二重特異性コレクションの遺伝子操作に使われる。
【００９０】
ファージディスプレイ
特定の実施形態では、本発明は、多重（二重を含む）特異性を有する中和モノクローナル抗体を機能的に発見するためにファージディスプレイ抗体ライブラリーを利用する。この種の抗体は、Ｈ５およびＨ１，Ｈ５およびＨ２，Ｈ５およびＨ３，Ｈ５、Ｈ１およびＨ２，Ｈ５、Ｈ１およびＨ３，Ｈ５、Ｈ２およびＨ３，Ｈ１、Ｈ２およびＨ３などのサブタイプなどの、Ｈ５、Ｈ７および／またはＨ９サブタイプを含む、例えば、１つより多くのインフルエンザＡ型ウイルスサブタイプ、および／または同じサブタイプの１つより多くの株（分離株）を中和し得るモノクローナル抗体でよい。
【００９１】
ファージ抗体ライブラリーを作るために、上で説明したライブラリーを含むあらゆる供給源から得られたｃＤＮＡライブラリーを、ファージミドベクター内にクローン化する。
【００９２】
したがって、例えば、上で説明したように、ＲＴ−ＰＣＲによりリンパ球または骨髄から救出した抗体重鎖および軽鎖レパートリーのコレクションは、ｍ１３  ｐＩＩＩタンパク質に融合したｓｃＦｖライブラリーとして再構築する。コンビナトリアルなライブラリーは、約１０６より多い、または１０７より多い、または１０８より多い、または１０９より多い種々のメンバーを含み、１０７より多い種々のメンバーまたはそれより上が好ましい。品質管理のために、ランダムクローンを配列し、レパートリー全体の複雑さを評価する。
【００９３】
同様に、ナイーブまたは免疫のあるヒト、あるいは過剰免疫のあるヒト以外の霊長類抗体ライブラリーから、重鎖および軽鎖可変領域の早期ＰＣＲ救出後、ＰＣＲ産生物をリンカーオリゴと結合し、ｓｃＦｖライブラリーを作りＭ１３  ｐＩＩＩ被覆タンパク質を有するフレーム内で直接クローン化する。このライブラリーは、約１０６より多い、または１０７より多い、または１０８より多い、または１０９より多い種々のメンバーを含み、１０７より多い種々のメンバーまたはそれより上が好ましい。品質管理のステップとして、レパートリー全体のサイズおよび複雑さを評価するために、ランダムクローンの配列を決める。
【００９４】
抗体ファージディスプレイ・ライブラリーは、単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）またはＦａｂフォーマットなどの種々のフォーマットにおいて抗体を含むことがある。総説については、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：１−３７（２００２）を参照のこと。
【００９５】
選別
所望の中和特性を有する抗体を選別する方法は、上で説明した。反応性は、所望のヘマグルチニンタンパク質への直接結合に基づいて評価することができる。
【００９６】
ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質の産生
ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質は、組換えＤＮＡ技術により産生することができる。この方法では、ＨＡ遺伝子は、適切なベクター、ヨトウガ（Ｓｆ９）細胞などのバキュロウイルス感染昆虫細胞において発現するために、バキュロウイルス発現ベクターにクローン化されるのが好ましい。
【００９７】
ＨＡタンパク質をコードする核酸は、ポリ−ｈｉｓ（ヘキサヒスチジン標識）などの
Ｃ−末端エピトープ標識がある場合とない場合がある、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などのバキュロウイルス発現ベクター内に挿入される。ポリ−ｈｉｓ標識は、ニッケルキレート・クロマトグラフィによる簡易精製を提供する。
【００９８】
一般に、クローン化は、個々に合成されたオリゴからアセンブリーＰＣＲによる基準ｃＤＮＡの作製を含む。分離株に対応する改変体ＨＡタンパク質は、適切な突然変異体オリゴを追加のアセンブリーＰＣＲ内に置換するか、またはＫｕｎｋｅｌ突然変異誘発による突然変異誘発技法により作られる。ＨＡタンパク質配列の２つのクラスターは、Ｈ５については、１９９７年および２００４年のサブタイプ分離株が存在する。したがって、単一基準タンパク質は、各クラスターについて作られる。同様に、基準タンパク質は、１９１８年のスペイン風邪（Ｈ１）、１９５８年のアジア風邪（Ｈ２）、１９６８年の香港風邪（Ｈ３）、および現在のＨ１、Ｈ２、Ｈ３分離株について作られる。
【００９９】
組換えバキュロウイルスは、リポフェクチン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬから市販されている）を用いて上のＢａｃｍｉｄをＳｆ９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７１１）に形質移入することにより作られる。２８℃で４〜５日インキュベート後、放出されたウイルスを取得し、さらなる増幅に使われる。ウイルス感染およびタンパク質発現は、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｏｘｆｏｒｄ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９４）により説明された通りになされる。
【０１００】
次いで、発現されたポリ−Ｈｉｓ−標識付きＨＡポリペプチドは、例えば、次に説明するように、Ｎｉ２＋キレート親和性クロマトグラフィにより精製することができる。上澄みは、Ｒｕｐｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：１７５−１７９（１９９３）が説明した、組換えウイルス感染Ｓｆ９細胞から集める。Ｎｉ２＋−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｕｉａｇｅｎから市販されている）は、ベッド容積５ｍＬにて用意し、２５ｍＬの水で洗浄し、２５ｍＬのローディングバッファーを用いて平衡化する。ろ過した細胞抽出物は、０．５ｍＬ／分にてカラムに入れる。カラムは、二次洗浄バッファーを用いてベースラインＡ２８０まで洗浄し、その時点でフラクションの収集を開始する。次に、このカラムを二次洗浄バッファー（５０ｍＭホスフェート、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ６．０）を用いて洗浄し、非特異的に結合したタンパク質を溶離する。Ａ２８０ベースラインに再度到達後、このカラムは、二次洗浄バッファー中の０〜５００ｍＭのイミダゾールグラジエントを用いて展開する。１ｍＬの各フラクションを集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色またはアルカリ性ホスファターゼに結合したＮｉ２＋−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いたウエスタン・ブロットにより分析した。溶離したＨｉｓ１０−標識付きＨＡポリペプチドを含むフラクションは、プールし、ローディングバッファーに対して透析する。
【０１０１】
あるいは、ＩｇＧ標識付き（またはＦｃ−標識付き）ＨＡポリペプチドの精製は、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａまたはｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇカラムクロマトグラフィを含む既知のクロマトグラフィ技法を用いて行うことができる。
【０１０２】
Ｓｆ９細胞ＨＡタンパク質を用いる代替として、他の組換え宿主細胞中に、原核生物、酵母、または比較的高い真核生物細胞を産生することもできる。適切な原核生物には、グラム陰性菌またはグラム陽性菌などの真正細菌（ｅｕｂａｃｔｅｒｉａ）、例えば、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルビニア菌属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、例えば、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、例えば、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、および赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ならびに枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびリケニホルミス菌（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（例えば、１９８９年４月１２日に発行されたＤＤ２６６，７１０で開示されたリケニホルミス菌４１Ｐ）などのバシラス属（Ｂａｃｉｌｌｉ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）などのシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）およびストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ）があるが、これらに限定されない。大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）、大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）、およびＫ５７７２（ＡＴＣＣ５３，６３５）などの種々の大腸菌株が、公然と利用できる。
【０１０３】
原核生物に加えて、糸状菌または酵母菌などの真核微生物が、ＨＡポリペプチドをコードする核酸を含むベクターの適切なクローニングまたは発現宿主である。サッカロマイセス・セレヴィシエは、普通に使われる比較的低級の真核宿主微生物である。しかし、多数の他の属、種、および株が、通常、利用でき、本明細書では、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）（Ｂｅａｃｈ  ａｎｄ  Ｎｕｒｓｅ，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：１４０（１９８１）；１９８５年５月２日に発行された欧州特許第１３９，３８３号）；例えば、Ｋ．ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）（ＭＷ９８−８Ｃ，ＣＢＳ６８３，ＣＢＳ４５７４；Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．７３７（１９８３）），Ｋ．フラジリス（ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ１２，４２４），Ｋ．ブルガリカス（ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ１６，０４５），Ｋ．ウイッケラミイ（ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ２４，１７８），Ｋ．ワルティー（ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ５６，５００），Ｋ．ドロソフィララム（ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒａｕｍ）（ＡＴＣＣ３６，９０６；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：１３５（１９９０））、Ｋ．サーモトレランス（ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、およびＫ．マルキシアヌス（ｍａｒｘｉａｎｕｓ）などのクリベロマイセス宿主（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｏｓｔ）（米国特許第４，９４３，５２９号；Ｆｌｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：９６８−９７５）；ヤロウイア属（ｙａｒｒｏｗｉａ）（欧州特許第４０２，２２６号）；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（欧州特許第１８３，０７０号；Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８：２６５−２７８（１９８８））；カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）；トリコデルマ・レージア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ（欧州特許第２４４，２３４号）；アスバンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）（Ｃａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：５２５９−５２６３（１９７９））；シュワニオマイセス・オクシデンタルス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）（１９９０年１０月３１日に発行された欧州特許第３９４，５３８号）などのシュワニオマイセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）；およびアカバンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）（１９９１年１月１０日に発行された国際公開第９１／００３５７号）などの糸状菌、および偽巣コウジ菌（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ｂａｌｌａｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１１２：２８４−２８９（１９８３）；Ｔｉｌｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ２６：２０５−２２１（１９８３）；Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１４７０−１４７４（１９８４））およびＡ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）Ｋ���ｌｌｙ  ａｎｄ  Ｈｙｎｅｓ，ＥＭＢＯ  Ｊ．４：４７５−４７９（１９８５）などのアスペルギルス属宿主（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）なども本明細書で有効である。メチルトローフ酵母は、本明細書に適しており、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ、クロエケラ属（ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、ピキア属、酵母菌属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、およびロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）からなる属から選択されたメタノール上で増殖し得る酵母を含むが、これらに限定されない。このクラスの酵母を代表する特異的な種のリストは、Ｃ．Ａｎｔｈｏｎｙ，Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ  ２６９（１９８２）に存在しているであろう。
【０１０４】
ＨＡタンパク質を発現させる適切な宿主細胞には、多細胞微生物の細胞がある。無脊椎動物の例には、上述のショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２およびプテラ属（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９、ならびに植物細胞がある。有効な哺乳類の宿主細胞株の例には、中国ハムスターの卵巣（ＣＨＯ：Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）およびＣＯＳ細胞がある。より特異的な例には、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）により形質転換されたサルの腎臓ＣＶ１株；ヒトの胚腎臓株（ＨＥＫ２９３または懸濁培養において増殖するためにサブクローン化されたＨＥＫ２９３細胞（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；中国ハムスターの卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））；マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；ヒトの肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒトの肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２，ＨＢ８０６５）；およびマウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）がある。適切な宿主細胞の選択は、当該技術分野のスキル内にあると考えられている。
【０１０５】
ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質パニング
ＨＡタンパク質は、上で説明したライブラリーを選別するために、マイクロタイターウエルまたは磁気ビードの表面に固定する。特定の実施形態では、各ライブラリーは、４度で２時間Ｈ５タンパク質を結合することができ、次いで、冷ＰＢＳを用いて十分洗浄し、０．２Ｍグリシン−ＨＣｌバッファー（ｐＨ２．５）を用いてＨＡ特異結合クローンを溶離する。回収されたファージは、ｐＨは中性で、感受性宿主大腸菌を感染させることにより増幅される。次いで、陽性クローンの濃縮および死傷者分類のためのその後のクローン単離を繰り返すために、ファージミド産生を誘発することができる。十分濃縮されると、プール全体は、可溶性ｓｃＦｖタンパク質を発現するためにＨＢ２１５１などの非アンバー抑制大腸菌株内に感染により移される。一方、プール（単数および複数）は、ｐＢＡＤなどのモノマー性ｓｃＦｖ発現ベクター内にサブクローン化され、組換え可溶性ｓｃＦｖタンパク質は、下で説明するように、インビトロ分析およびキャラクテリゼーションのために発現される。
【０１０６】
キャラクテリゼーション
Ｈ５クローンは、まず、上で説明した、産生されたＨ５タンパク質への結合親和性についてテストする。特定の実施例では、２００４Ｈ５タンパク質（Ｒｅｆｓｅｑ  ＡＡＳ６５６１８，Ｉｓｏｌａｔｅ；Ａ／Ｔｈａｉｌａｎｄ／２（ＳＰ−３３）／２００４（Ｈ５Ｎ１））への結合がテストされ、および１９９７Ｈ５タンパク質（Ｒｅｆｓｅｑ  ＡＡＦ７４３３１，Ｉｓｏｌａｔｅ；Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／４８６／９７（Ｈ５Ｎ１））に対する並行テストがなされ、他の分離株も単独または何らかの組み合わせで使用することができる。２００４および１９９７Ｈ５タンパク質を用いて得られた陽性クローンは、２つの広義のカテゴリー；２００４ｓｅｌｅｃｔｉｖｅおよび２００４／１９９７ｎｏｎｓｅｌｅｃｔｉｖｅに入る。中和に関する典型的な機能テストは、赤血球に対する全ウイルス結合を用いたヘマグルチニン抑制アッセイを含む。安全面の懸念により、組換えタンパク質および赤血球を用いた、代わりのヘマグルチニンアッセイが好ましい。全血の必要性を排除するために、ヘマグルチニン結合抑制アッセイは気道上皮細胞について行うことができる。この結合アッセイは、フローサイトメトリーまたは細胞ＥＬＩＳＡ（ｃＥＬＩＳＡ）をベースにしたアッセイを含む、無制限に、何らかの形態で行うことができる。ｃＥＬＩＳＡを用いると、高価なフローサイトメトリー装置を使用しなくてすみ、より高度に自動化されたクローン・アセスメントおよびより大きなデータコレクションが得られる利点がある。一方、フローサイトメトリーには、感度が高く、一貫性に優れ、高速である利点もある。
【０１０７】
ＨＩクローンは、現在の２００４Ｈ１への結合を含む、あらゆるＨ１タンパク質への結合、および並行して、１９１８年および１９７６年のタンパク質への結合についてテストすることができる。陽性クローンは、２つの広義のカテゴリー；２００４ｓｅｌｅｃｔｉｖｅおよび２００４ｎｏｎｓｅｌｅｃｔｉｖｅに入るであろう。やはり、上で説明した方法と類似な方法を用いて中和についてテストすることは必須である。
【０１０８】
Ｈ２およびＨ３などの他のＨＡタンパク質は、類似の方法で特性を明らかにすることができる。
【０１０９】
最適化
鳥類ウイルス（Ｈ５）により引き起こされたヒトの感染と関連した潜在的パンデミックを含むインフルエンザの流行およびパンデミックに効率的に対応するために、Ｈ５タンパク質、ならびに将来の突然変異など、Ｈタンパク質の現在の分離株を効率的に中和する抗体が必要である。この目標を達成するために、標的となるヘマグルチニンサブタイプ（単数および複数）の既知のすべての分離株に結合する、様々なＨ（例えば、Ｈ５）中和クローンを同定する必要がある。
【０１１０】
望ましいならば、例えば、２００５年６月２３日に公開された、米国特許出願公開第２００５−０１３６４２８号において説明された、ルックスルー・ムタジェネシス（ＬＴＭ：Ｌｏｏｋ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）など、当該技術分野において周知の方法により、交差反応性をさらに改良することができる。なお、この特許発行物は、引用により明らかに本明細書に組み込まれている。
【０１１１】
ルックスルー・ムタジェネシス（ＬＴＭ）は、選択されたアミノ酸のコンビナトリアルな突然変異を同時に評価および最適化する多次元突然変異法である。このプロセスは、１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）ドメイン内の正確な分布に焦点を当て、アミノ酸側鎖に関する化学の相乗的寄与を探っている。ＬＴＭは、ＣＤＲ内の単一変異の位置シリーズを作り、そこでは各野生型残基が、選択された多数のアミノ酸の１つにより系統的に置換される。突然変異ＣＤＲは併用され、すべての改変体の定量的ディスプレイに対して禁止的になることなく複雑さおよびサイズを増しながらコンビナトリアルな単一鎖可変断片（ｓｃＦｖ）ライブラリーを作る。正の選択後、改善された特性を有するクローンの配列が決定され、これらの有益な突然変異が位置づけられる。改善されたＨＡ結合特性の相乗的突然変異を同定するために、すべての有益な順列を発現しているコンビナトリアルなライブラリー（コンビナトリアルで有益な突然変異、ＣＢＭ：ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）は、最適化されたｓｃＦｖ候補のパネルを同定するために正に選択され、分析された混合ＤＮＡプローブにより産生することができる。この操作は、Ｆｖおよび他の抗体ライブラリーを用いて類似の方法で行うことができる。
【０１１２】
突然変異誘発は、上で説明したウォークスルー・ムタジェネシス（ＷＴＭ：ｗａｌｋ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）により行うこともできる。
【０１１３】
１つより多くのＡ型インフルエンザサブタイプおよび／または１つより多くの同じサブタイプの分離株を用いて、本明細書の抗体の交差反応性を意図的にデザインするための別の有効な突然変異誘発法は、本明細書では目標突然変異誘発と呼ばれる。目標突然変異誘発は、１つ以上の好ましくは反応性の異なる抗体クローンに基づく抗体のコレクションを合理的に遺伝子操作するために使うことができる。本発明の文脈において、目標突然変異誘発は、抗体の個々のＣＤＲにおける配列など同様の配列上の類似の位置により規定された単一または複数の残基をコードするのに使われる。この場合、これらのコレクションは、同等の位置に存在した残基の範囲を捕獲するためにオリゴ縮重を用いて作られる。このコレクション内には特異性の連続体が、親クローンのコレクションの間またはコレクションを超えて存在するであろうと期待される。目標突然変異誘発の目的は、２つ以上の分離実体またはコレクションの間に多様な多機能性抗体コレクションまたはライブラリーを作ることである。インフルエンザの場合、この方法は、２つの異なるエピトープ、分離株、またはサブタイプを認識する２つの抗体を使用し、両方の機能性品質を単一抗体に変えるために利用することができる。１例として、第１のインフルエンザＡ型抗体は、Ｈ５サブタイプのベトナム分離株に対して特異的であり、第２の抗体は、インフルエンザＡ型ウイルスのＨ５サブタイプのタイランドまたはトルコ分離株に対して特異的である。目標突然変異誘発ライブラリーを作成するために、両方の抗体のＣＤＲ配列がまず達成され、整列させられる。次に、保存されたアイデンティティのすべての位置は、適合残基に対する単一コドンを用いて固定される。非保存位置では、縮重コドンは、両方の残基をコードするために組み込まれる。一部の例では、縮重コドンは、この位置において２つの親残基をコードするのみである。しかし、一部の例では、追加の副産物が産生される。副産物産生のレベルは、副産物の産生を強制するか、またはサイズの限界または目標に依存するこの産生を排除するためにダイヤルを回すことができる。
【０１１４】
したがって、例えば、これら２つの抗体の最初の位置が、それぞれ、スレオニンおよびアラニンであるならば、最初の２つの位置においてＡ／Ｇ−Ｇ−を有する縮重コドンは、第３の位置の塩基とは関係なく、スレオニンまたはアラニンをコードするだけである。例えば、もし次の位置の残基がリジンおよびアルギニンであるならば、縮重コドンＡ−Ａ／Ｇ−Ａ／Ｇは、リジンまたはアルギニンをコードするだけであろう。しかし、縮重コドンＡ／Ｃ−Ａ／Ｇ−Ａ／Ｇ／Ｃ／Ｔが使われたならば、その場合は、アスパラギン、ヒスチジン、グルタミン、およびその上、セリン副産物が作られるであろう。
【０１１５】
便宜上、適合したＣＤＲ長さを有する抗体のみを用いると、より単純である。これを強制する１つの方法は、ＣＤＲ長さおよび最初に発見された抗体により与えられた潜在的に等しいフレームワーク制限に基づいて第２抗原のサイズ制限ライブラリーを選別することである。しかし、等しい長さのＣＤＲを用いることは、単なる便宜であり必要条件ではないことを指摘する必要がある。この方法は、インフルエンザＡ型ウイルス中和抗体の機能的に多様な大きなライブラリーを作成するためには有効であるが、その適用性が非常に広いことは、簡単に分かる。この突然変異誘発技法は、何らかの抗体の機能的に多様なライブラリーまたはコレクションを作るために使用することができる。したがって、図６は、突然変異誘発された親配列としてＴＮＦ−α抗体およびＣＤ１１ａ抗体のＣＤＲを用いた目標変異誘発方法の使用を例示するために本明細書に含まれている。
【０１１６】
他の代表的な突然変異誘発法には、飽和突然変異誘発および誤りがちなＰＣＲがある。
【０１１７】
飽和突然変異誘発（Ｈａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：３１０−３１５（１９９４））は、全２０のアミノ酸類が、タンパク質内の特定の位置で置換され、各改変体に対応するクローンが特定の表現についてアッセイされる技法である。（米国特許第６，１７１，８２０；６，３５８，７０９および６，３６１，９７４号も参照のこと。）
誤りがちなＰＣＲ（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  １：１１−１５（１９８９）；Ｃａｄｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｊｏｙｃｅ，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ａｐｐｌｉｃ．２：２８−３３（１９９２））は、クローン化遺伝子内にランダムポイント突然変異を導入する改変ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）技法である。得られるＰＣＲ産生物は、クローン化してランダム突然変異体ライブラリーを作るか、またはＴ７プロモーターが適切なＰＣＲプライマー内に組み込まれるならば、直接転写することができる。
【０１１８】
他の突然変異誘発技法も周知の技法であり、例えば、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｊ．Ｂｒａｍａｎ，Ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００１で説明されている。
【０１１９】
この場合、主な目標の１つは、現在のＨ５（またはＨ７またはＨ９）分離株ならびに将来の突然変異を効率的に処置するために抗体（単数および複数）を遺伝子操作することである。例えば、最近の２００４年分離株および以前の１９９７年分離株の両方を含む、種々のＨ５分離株に結合するクローンを中和する新しい分離株Ｈ５における突然変異を承認し得る耐性を有する抗体を遺伝子操作することは、確認すべきである。クローンが２００４年分離株について選択されるならば、そのクローンは、それほどの重要性はないが、１９９７年分離株を結合および／または中和するであろうことが期待される。この場合、目標は、２００４年分離株結合を改善する（または少なくとも維持する）文脈内で１９９７年承認を劇的に改善することである。したがって、選択はまず１９９７年基準タンパク質について改善がなされ、次いで、２００４年タンパク質に関する選択がこれに続く。そのようにすると、第２パラメータに対する圧力を維持しながら、新しい株に対する選択圧力をより大きなものにする。
【０１２０】
上で説明したライブラリーのいずれか、または当該技術分野で周知の何か他の型のライブラリーを、単独またはいずれかの組み合わせに基づいて最適化することができる。特定の実施形態において、最適化は、３つの型のＬＴＭライブラリー、すなわち、３種類の突然変異誘発軽鎖ライブラリー、３種類の突然変異誘発重鎖ライブラリー、および６種類の突然変異誘発（軽鎖＋重鎖）ライブラリー、を選別することにより開始することができる。Ｈ５は、小さな改変は望ましいかもしれないが、上で説明したように、本質的には、選別される。例えば、グリシン−ＨＣｌ溶離の前に、次の方法：室温または３７度における十分な洗浄、または過剰の可溶性親ｓｃＦｖの存在下における長時間のインキュベーション、のいずれかまたは両方によりラウンドごとに洗浄の厳しさを高めることにより改善された結合を選択することができる。これらの選択改変は、得られるクローンにおけるオフ率の動態を改善するはずである。３〜４ラウンドの選択後、我々はランダムクローンの配列を決め、ＥＬＩＳＡにより結合についてテストすることになる。改善されたクローンの配列分析後、許容できる改善された突然変異のすべては、Ｈ５分離株の両方の結合を相乗的に改善する場合に選択するコンビナトリアルな有益突然変異誘発（ＣＢＭ：ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）ライブラリーに一体化される。ＣＢＭライブラリーは、すべての位置において改善された、オリジナルな親の残基をすべて表すために縮重オリゴヌクレオチド類を合成することにより作られる。得られるライブラリーは、ＬＴＭ選別と同様に、厳しさを高めながら選択される。十分な選択後、上で説明した結合および中和のアッセイの大腸菌からのモノマー性ｓｃＦｖタンパク質を発現し、精製するために、プールはｐＢＡＤ発現ベクター内にサブクローン化される。
【０１２１】
Ｈ１中和抗体は、類似な方法で最適化することができる。この場合、１９１８年、１９７６年、および出発点または目標としての現在からの何らかの基準タンパク質配列を用いて選択し、最適化することができる。
【０１２２】
さらに、型間の承認は、中和抗体クローンを用いてテストする。型間の承認の１例は、Ｈ５から供給または最適化されたクローンからの同時発生的または遺伝子操作したＨ１結合である。
【０１２３】
所望の特性を有する中和抗体が、一旦、同定されると、この種の抗体の大部分により承認された優勢なエピトープ（単数および複数）を同定することが望ましい。エピトープをマッピングする方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｍｏｒｒｉｓ，Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．，Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６；ａｎｄ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｗｅｓｔｗｏｏｄ  ａｎｄ  Ｈａｙ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１において開示されている。
【０１２４】
種々のドナーからのライブラリーなどの、またはインフルエンザウイルスを含むが、これらに限定されない抗体ライブラリーのハンドリングは、種々の抗体コレクションを区別している独特のバーコードを適用することにより大いに促進される。これらのバーコードは、これらが標識付きのクローン（単数および複数）と同調して伝播し得るように選択されるのが好ましい。
【０１２５】
したがって、これらのバーコードは、配列決定または特定のＰＣＲプライマーによりデコンボリュートすることができる長さが約１〜２４個の非コードヌクレオチド類に等しい非コード配列でよい。このように、抗体レパートリーなどの核酸のコレクションは、クローン化ステップにおいて連結することができる。
【０１２６】
別の実施例では、これらのバーコードは、サイレント突然変異のコード配列である。これらのライブラリーが、中断回分配列（例えば、Ｓｆｉ  ＧＧＣＣＮＮＮＮＮＧＧＣＣ）を認識する制限酵素を利用するならば、抗体ライブラリーなどのクローンの種々のコレクションを区別するために「Ｎ」の代わりに別のヌクレオチド類を組み込むことができる。このバーコード法は、このレパートリーが増幅ステップにおいて連結される利点がある。
【０１２７】
別の例では、これらのバーコードは、免疫学的に異なるペプチドまたはファージ粒子に融合したタンパク質配列コードするコード配列である。実施例には、例えば、ｐＩＩＩ、ｐＶＩＩＩ、ｐＶＩＩ、またはｐＩＸファージへのエピトープ（例えば、Ｍｙｃ、ＨＡ、ＦＬＡＧ）融合物がある。これらのエピトープは、単独、または種々の組み合わせで使用することができる、シス（ライブラリーコードプラスミドで）配置として、またはトランス（特異的に改変されたヘルパーファージ）配置として提供することができる。
【０１２８】
可能なバーコード類の他の実施例には、無制限に、ハプテン類または蛍光染色体を有する化学的および酵素ファージ改変がある。この種の標識は、選択の単一ラウンドの場合好ましい。
【０１２９】
本明細書では、バーコードは、抗体ライブラリーを区別するものとして例示されるが、当業者は、説明された方法が、独自に標識する場合、および一般に、核酸分子および核酸のコレクションを区別する場合に広く適用できることを十分理解するであろう。
【０１３０】
中和抗体の産生
所望の中和特性を有する抗体が、一旦、同定されると、抗体断片を含むこの種の抗体は、例えば、ハイブリドーマ技法または組換えＤＮＡ技術を含む当該技術分野で周知の方法により産生することができる。
【０１３１】
ハイブリドーマ法では、マウスまたはハムスターなど他の適切な宿主動物が、免疫付与に使われるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生または産生し得るリンパ球を誘発するために免疫される。一方、リンパ球は、インビトロで免疫にされる。次いで、リンパ球は、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。
【０１３２】
したがって、このようにして調製されたハイブリドーマ細胞は、適切な培養媒体に播種され、増殖され、該媒体は、未融合の親の骨髄腫細胞の増殖または生存を抑制する１つ以上の物質を含むのが好ましい。例えば、親の骨髄腫細胞に構造ヒボキサンチングアニンホスホリボシル転換酵素（ＨＧＰＲＴ：ｈｙｐｏｘａｔｈｉｎｅ  ｇｕａｎｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅまたはＨＰＲＴ）が欠けているならば、該ハイブリドーマの培養媒体は、通常、ヒボキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（ＨＡＴ：ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ，ａｍｉｎｏｐｒｏｔｅｉｎ，ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ媒体）を含み、これらの物質は、ＨＧＰＲＴに欠けている細胞の増殖を防止する。
【０１３３】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞により抗体の安定した高レベル産生を支え、ＨＡＴ媒体などの媒体に敏感な骨髄腫細胞である。これらの中で、好ましい骨髄腫細胞株は、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡから入手できるＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍から導かれた細胞株などのマウス骨髄腫株およびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  ＵＳＡから入手できるＳＰ−２またはＸ−６３−Ａｇ８−６５３細胞などのマウス骨髄腫株である。ヒトの骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株も、ヒトのモノクローナル抗体の産生に対して説明されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１（１９８４）；ａｎｄ  Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７））。
【０１３４】
その中でハイブリドーマ細胞を増殖する培養媒体は、抗原に対抗するモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降または放射免疫アッセイ（ＲＩＡ：ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）または酵素免疫測定吸着法（ＥＬＩＳＡ：ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏａｂｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）などのインビトロ結合アッセイにより測定されるのが好ましい。
【０１３５】
組換えモノクローナル抗体は、例えば、必要な抗体鎖をコードするＤＮＡを単離し、周知の組換え発現ベクターを用いた同時発現のコード発現を用いた組換え宿主細胞を同時導入することにより産生することができる。組換え宿主細胞は、上で説明した原核細胞および真核細胞などでよい。
【０１３６】
ヒト化抗体を作る場合に使われるヒト可変ドメインの選択は、軽重両方ともに、抗原性を下げることが非常に重要である。いわゆる「最適」方法により、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列は、既知ヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対して選別される。次いで、げっ歯類の配列に最も近いヒト配列が、ヒト化抗体のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）として受け入れられる（Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｐｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７））。抗体が、抗原および他の好ましい生物学的特性に対して高い親和性を保持したまま、ヒト化されることが重要である。好ましい方法によりこの目標を達成するために、ヒト化された抗体が、親の配列およびヒト化された配列の３次元モデルを用いて種々の概念的なヒト化された産生物および親の配列を分析するプロセスにより作られる。
【０１３７】
さらに、ヒトの抗体は、当該技術分野で周知の次のような方法で作ることができる。例えば、内在性免疫グロブリンの産生がない場合にヒトの抗体のレパートリーの全体を、免疫付与の際に、産生し得る遺伝子導入動物（例えば、マウス）を作ることができる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ，７：３３（１９９３）；および米国特許第５，５９１，６６９、５，５８９，３６９および５，５４５，８０７号を参照のこと。
【０１３８】
中和抗体の使用
本発明のインフルエンザ中和抗体は、Ａ型インフルエンザ感染の予防および／または処置に使用することができる。治療に使う場合は、抗体または分子類は、それらの送達が、抗体（単数および複数）をベースにする輸送配列を用いることにより容易になり、通常、医薬組成物の形で使われる。技法および処方は、一般に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．１９９０）に記載されている。また、Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｓｏｎ”Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ；Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒｓ，”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｎｏ．１０，Ｓｕｐｐ．４２−２Ｓ（１９８８）も参照のこと。
【０１３９】
抗体は、通常、凍結乾燥された製剤または水溶液の形で処方される。許容できる担体、賦形剤、または安定剤は、用いる用量および濃度において受容者に対して無毒であり、燐酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などのバッファー、アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤、保存剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、ヘキサメトニウムクロライド、ベンザルコニウムクロライド、ベンゼトニウムクロライド、フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール、メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのパラベン類、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、およびｍ−クレゾールなど）、低分子量（残基約１０個未満）ポリペプチド類；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸類；単糖類、二糖類、およびグルコース、マノース、またはデキストリン類を含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；スクロース、マニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの砂糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン類；金属錯体類（Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
【０１４０】
これらの抗体は、例えば、コロイド状薬剤デリバリーシステム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）、またはマクロエマルジョンにおいて、液滴形成技法または界面重合（例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル、それぞれ）により調製されたマイクロカプセルに捕捉されることもありうる。この種の技法は、上記、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓで開示されている。
【０１４１】
本明細書で開示された中和抗体は、免疫リポソーム類として処方することもできる。抗体を含むリポソーム類は、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４０３０（１９８０）；米国特許第４，４８５，０４５および４，５４４，５４５号；および１９９７年１０月２３日に発行された国際公開第９７／３８７３１号において説明されているような当該技術分野で周知の方法により調製される。循環時間の長いリポソーム類は、米国特許第５，０１３，５５６号で開示されている。
【０１４２】
特に有効なリポソーム類は、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ−誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いて逆相蒸発法により作ることができる。リポソーム類は、規定されたポアサイズのフィルターを通して押し出され所望の直径を有するリポソーム類が得られる。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、ジサルファイド交換反応によりＭａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６−２８８（１９８２）で説明されたようにリポソーム類に接合することができる。化学療法剤は、任意に、リポソーム内に含まれる。Ｇａｂｉｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８１（１９）１４８４（１９８９）を参照のこと。
【０１４３】
疾患の予防または処置のために、抗体の適切な用量は、処置されるべき感染の型、疾患の重篤さおよびコース、および抗体を投与する目的が予防であるか、治療であるか、により変わる。抗体は、一度または処置シリーズにわたり、患者に適切に投与される。疾患の型および重篤さにより、抗体の患者への初期用量は、約１μｇ／ｋｇから約１５ｍｇ／ｋｇまでの範囲にあり、１回以上個別に投与する場合と、連続注入する場合とがある。
【０１４４】
本発明のより詳細な説明は、次の無制限にある実施例によりなされる。
【実施例】
【０１４５】
以前の鳥類インフルエンザ大流行の生存者からの抗体ライブラリーおよび中和抗体の調製
物質および方法
骨髄プロトコルおよび血清製剤
血液は、標準静脈穿刺により採血し、凝血させ、処理して血清を回収した。血清は、ドライアイスにのせて出荷するまで、３〜４日間−２０℃で貯蔵した。ドナーは、局所麻酔薬を注入して麻酔にかけ、５ｍｌの骨髄を各Ｈ５Ｎ１生存者の骨盤から採取した。次に、５ｍｌの骨髄を４５ｍｌのＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）を含む無菌の５０ｍｌのチューブに入れた。この混合物を、目視できる凝集塊がなくなるまで、約８〜２０回丁寧に反転させ、骨髄とＲＮＡｌａｔｅｒとをよく混合させた。次に、この試料を２〜１０℃で一晩冷蔵した。一晩冷蔵後、試料は、ドライアイスにのせて出荷するまで、３〜４日間−２０℃で貯蔵した。受け取り次第直ぐに、ＲＮＡｌａｔｅｒ／髄および血清含有チューブは、処理するまで−８０℃で貯蔵した。
【０１４６】
血清学：ＨＡ  ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ，Ｉｍｍｕｌｏｎ  ４ＨＢＸ  ９６Ｗ）は、１Ｘ  ＥＬＩＳＡプレートコーティング溶液（ＢｉｏＦＸ）中で１００μｌの１００ｎｇ／ｍＬのＨ５ヘマグルチニン（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４）で被覆し、室温で一晩インキュベーションした。次の日複数のプレートを３００μｌのＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）で３度洗浄した。洗浄後、３００μｌのブロッキング溶液（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０中４％無脂肪ドライミルク）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ブロッキングステップの後、これらのプレートは、３００μｌのＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）で３度洗浄した。次に、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ中で１：２０，０００に希釈した１００μｌの血清試料を、室温で１〜２時間インキュベートし、次いで、３００μｌのＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３度洗浄した。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ中で１：５，０００に希釈した抗ヒトＦｃ−ＨＲＰ接合体の１００μｌを室温で１〜２時間インキュベートし、次いで、３００μｌのＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３度洗浄した。この最終洗浄の後、１００μｌの発色基質溶液（ＴＭＢ１基質、ＢｉｏＦＸ）を添加し、十分な時間が経過した後、１００μｌのＳＴＯＰ溶液（ＢｉｏＦＸ）を添加して終結させた。４５０ｎｍにおける吸光度をプレートリーダー（Ｓｏｆｔｍａｘ  Ｐｒｏソフトウエアを備えたＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｔｈｅｒｍｏｍａｘマイクロプレートリーダー）で読み取り、データを記録し、次いで、エクセル（マイクロソフト）を用いてプロットした。
【０１４７】
骨髄：ＲＮＡ抽出およびｍＲＮＡの精製
予め−８０℃で貯蔵した骨髄（２０ｍｌのＲＮＡｌａｔｅｒ中約２．５ｍｌ）を、ＲＮＡｌａｔｅｒを除去するために遠心分離により回収し、次いで、３００μｌの酢酸を含む１１．２５ｍｌのＴＲＩＢＤ試薬（Ｓｉｇｍａ）に再懸濁した。次いで、このペレットは、激しく渦流状にした。次に、１．５ｍｌのＢＣＰ（１−ブロモ−３−クロロプロパン，Ｓｉｇｍａ）を添加し、渦流にすることにより混合し、室温で５分間インキュベートし、次いで、４℃で１５分間１２０００×ｇで遠心分離した。界面を乱さないように、水相を注意して除去した。次に、水相からの全ＲＮＡ２５ｍｌのイソプロパノールを添加して沈殿させ、室温で１０分間インキュベートし、４℃で１０分間１２０００×ｇで遠心分離した。イソプロパノールを添加後、残留ＲＮＡｌａｔｅｒにより２相が形成され、界面に沈殿ＲＮＡが沈降しているのが認められた。残留ＲＮＡｌａｔｅｒを排除し、ＲＮＡを最大限に回収するために、Ｈ２Ｏ中５０％のイソプロパノールの５ｍｌアリコートを添加し、相分離が認められなくなるまで混合し、その点で４℃で１０分間１２０００×ｇで遠心分離によりＲＮＡをペレット化した。ＲＮＡペレットを７５％ＥｔＯＨで洗浄し、ＲＮＡｓｅフリーの１．６ｍｌマイクロ遠心チューブに移し、遠心分離により再び回収した。最後に、ＲＮＡペレットを１００μｌの１ｍＭ燐酸ナトリウム、ｐＨ８．２に再懸濁させ、ＲＮＡ純度を決めるためにＡ２６０およびＡ２８０を読みとった。
【０１４８】
逆転写の前に、ｍＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  Ｏｌｉｇｏｔｅｘ  ｍＲＮＡ精製キットにより、全ＲＮＡから精製した。要するに、５０〜２００μｇの骨髄ＲＮＡをＲＮａｓｅフリーの水を用いて２５０μｌにし、２５０μｌのＯＢＢバッファーおよびＯｌｉｇｏｔｅｘ懸濁液と混合し、次いで、７０℃で３分間インキュベーションした。Ｏｌｉｇｏｔｅｘ粒子のオリゴｄＴ３０とｍＲＮＡポリ−Ａ−テールとの間のハイブリッド形成は、室温で１０分間行った。次いで、ハイブリッド形成された懸濁液は、スピンカラムに移し、１分間遠心分離した。スピンカラムは、４００μｌのバッファーＯＷ２で２度洗浄した。次いで、精製したｍＲＮＡは、２０μｌのホットな（７０℃）バッファーＯＥＢを用いて遠心分離により２度溶離した。典型的な収量は、全ＲＮＡとして５００ｎｇ〜１．５μｇであった。
【０１４９】
骨髄ｍＲＮＡについてＮ９およびオリゴｄＴを用いた逆転写
逆転写（ＲＴ：ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）反応は、７５〜１００ｎｇのｍＲＮＡを、２μｌの１０Ｘ  Ａｃｃｕｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、０．８μｌの１００ｍＭ  ｄＮＴＰ、およびＮ９（３００ｎｇ）と
オリゴｄＴプライマー（１００ｎｇ）とのいずれかとを一緒に混合し、次いで、水で最後に、容積を１７μｌにした。これらの混合物を６５℃で５分間加熱し、次いで、室温まで冷却した。次に、２μｌのＤＴＴ、０．５μｌのＲＮａｓｅ  Ｂｌｏｃｋ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、０．５μｌのＡｃｃｕｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、各反応物に添加した。次に、Ｎ９で予め刺激を受けた反応物を室温で１０分間インキュベートし、オリゴ−ｄＴで予め刺激を受けた反応物を氷上で１０分間インキュベートした。最後に、両方の反応物を４２℃で６０分間、次いで、７０℃で１５分間インキュベートし、酵素を撲滅した。
【０１５０】
骨髄誘導ｃＤＮＡからのＰＣＲ
抗体の重鎖および軽鎖のレパートリーは、ヒトの生殖細胞ＶおよびＪ領域に基づいて先に説明した方法および縮重プライマーを用いて本質的に骨髄ｃＤＮＡから増幅された（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｐ．Ｍ．，Ａｉｔｋｅｎ  Ｒ．Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｃＦｖ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ−Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｖｏｌ  １７８，５９−７１，２００１，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）。
【０１５１】
要するに、ラムダ軽鎖に対して先に刺激されたオリゴｄＴ  ｃＤＮＡ（７５ｎｇのｍＲＮＡから）および先に刺激されたＮ９  ｃＤＮＡ（カッパ軽鎖の７５ｎｇのｍＲＮＡから、重鎖の１００ｍｇのｍＲＮＡから）を用いたＰＣＲ反応は、５μｌの１０Ｘ増幅バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１．５μｌのｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、１μｌのＭｇＳＯ４（５０ｍＭ）、２．５μｌのＶｒｅｇｉｏｎプライマー（１０μＭ）および２．５μｌプライマー（１０μＭ）−ＶＨの場合１０μＭ、０．５μｌの白金Ｐｆｘポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および最終容積を５０μｌにする無菌ｄＨ２Ｏと一緒に混合した。ＰＣＲパラメータは、ステップ１−９５℃５分、ステップ２−９５℃３０秒、ステップ３−５８℃３０秒、ステップ４−６８℃１分、ステップ５−サイクルステップ２−４を４０回、ステップ６−６８℃５分であった。軽鎖ＰＣＲ産生物は、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎｕｐキットを用いてクリーンアップした。重鎖ＰＣＲ産生物は、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて１．５％アガロースゲルから精製し、次いで、再増幅したゲルであつた。重鎖再増幅は、次のようにして行った。すなわち、１０μｌの１０Ｘ増幅バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、３μｌのｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、２μｌのＭｇＳＯ４（５０ｍＭ）、５μｌのＶＨプライマー（１０μＭ）および５μｌのＪＨプライマー（１０μＭ）、５μｌの重鎖Ｐｒｉｍａｒｙ  ＰＣＲ産生物、１μｌの白金Ｐｆｘを混合し、水で容積を１００μｌに調節した。サイクリングパラメータは、ステップ１−９５℃５分、ステップ２−９５℃３０秒、ステップ３−５８℃３０秒、ステップ４−６８℃１分、ステップ５−サイクルステップ２−４を２０回、ステップ６−６８℃５分であった。再増幅した重鎖ＰＣＲ産生物は、Ｑｉａｇｅｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて１．５％アガロースＴＡＥゲルからクリーンアップした。
【０１５２】
抗体ファージライブラリーの構築
個々の鳥類インフルエンザの生存者に関する個別の抗体ライブラリーは、末端のｐＩＩＩストップコドンに続いて未翻訳領域に挿入した３−ヌクレオチドを同定する独特のバーコードを用いて構築した。
【０１５３】
軽鎖クローン化
プールされたカッパ軽鎖およびラムダ軽鎖をドナーにつき各々１μｇは、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて１．５％アガロースＴＡＥゲルから精製したゲル、ならびにＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化した。５μｇの各ベクターは、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて１％アガロースＴＡＥゲルから精製したゲル、ならびにＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化した。ライブラリーの連結は、２００ｍｇのゲル精製カッパまたはラムダの挿入物および１μｇのゲル精製ベクターを用いて、６０μｌ中ＲＴで１時間または１４℃で一晩行った。連結は、Ｅｄｇｅ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍ  Ｐｅｒｆｒｏｍａスピンカラムを用いて脱塩した。このライブラリーは、８０μｌのＴＧ−１またはＸＬ−１ブルーのアリコートにおいて５つの電気穿孔中で形質転換し、各々１ｍｌのＳＯＣとして回収し、プールし、３７℃で１時間増殖させた。形質転換体の総数は、形質転換の各々からのアリコートを蒔くことによりこの増殖後に測定した。残りの電気穿孔は、２００ｍｌの２ＹＴ＋５０μｇ／ｍｌのＡｍｐｉｃｉｌｌｉｎ＋２％グルコース中３７℃で一晩増殖することにより増幅させた。次の軽鎖ライブラリーは、Ｑｉａｇｅｎ高速Ｍａｘｉｐｒｅｐキットを用いてこれらの一晩培養物からプラスミド精製により回収した。
【０１５４】
重鎖クローン化
各々が１．５〜２μｇのドナー特異性重鎖類（ＶＨ１、ＶＨ２、５、６プール、ＶＨ３、およびＶＨ４）は、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて１．５％アガロースＴＡＥゲルから精製したゲル、ならびにＳｆｉＩおよびＸｈｏＩを有する
４０ユニット過剰／μｇのＤＮＡを用いて消化した。１５μｇの各軽鎖ライブラリーベクターは、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて１．５％アガロースＴＡＥゲルから精製したゲル、ならびにＳｆｉＩおよびＸｈｏＩを有する４０ユニット／μｇのＤＮＡを用いて消化した。ライブラリー連結は、消化された１．２μｇのＳｆｉＩ／ＸｈｏＩ、ゲル精製重鎖ドナーコレクションおよび５μｇの１４℃で一晩置かれた各軽鎖ライブラリー（カッパおよびラムダ）を併用して作成した。次いで、ライブラリー連結物は、Ｅｄｇｅ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍ  Ｐｅｆｒｏｍａスピンカラムを用いて脱塩し、８０μｌのＴＧ−１アリコート中でライブラリーあたり２０個の電気穿孔を介して形質転換され、各々は１ｍｌのＳＯＣ中に回収され、プールされ、３７℃で１時間増殖された。再び、この増殖の後、アリコートの各々を用いて、形質転換体の総数を測定し、残りは、１Ｌの２ＹＴ＋５０μｇ／ｍｌのＡｍｐｉｃｉｌｌｉｎ＋２％グルコースに移され、ＯＤ６００が約０．３になるまで激しく曝気処理しながら、３７℃で増殖させた。次のＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージは、５：１の感染多重度（ＭＯＩ：ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）で添加し、撹拌せずに３７℃で１時間インキュベートした。次に、遠心分離により細胞を取得し、１Ｌの２ＹＴ＋５０μｇ／ｍｌのＡｍｐｉｃｉｌｌｉｎ、７０μｇ／ｍｌのＫａｎａｍｙｃｉｎ中に再懸濁させ、ｓｃＦｖファージミドを産生させるために激しく曝気しながら３７℃で一晩増殖させた。次の朝、遠心分離により細胞を集め、ファージミドを含む上澄みを集めた。ファージミドは、０．２容量の２０％ＰＥＧ／５ＭのＮａＣｌ溶液を添加し、氷上で１時間インキュベーションして上澄みから沈殿させた。次いで、ファージミド・ライブラリーストックは、遠心分離により取得し、２０ｍｌの無菌ＰＢＳに再懸濁させた。残りの細菌は、追加の遠心分離により除去し、最終ファージミド・ライブラリーは、ＰＢＳ＋５０％グリセロール中−２０℃で貯蔵した。
【０１５５】
ファージミドパニングおよび増幅
ＥＬＩＳＡプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  ４ＨＢＸ平底、Ｎｕｎｃ）を、ＥＬＩＳＡプレートコーティング溶液（ＢｉｏＦＸ）中室温で一晩インキュベーションして１００μｌの１００ｎｇ／ｍＬのＨ５ヘマグルチニンタンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４）で被覆した。次の日プレート類は、３００μｌのＰＢＳＴで３度洗浄した。洗浄後、３００μｌのブロッキング溶液（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０中４％無脂肪ドライミルク）を添加し、氷上で３０分間インキュベートした。ブロッキングステップの後、これらのプレートは３００μｌのＰＢＳＴで３度洗浄した。ファージパニングの直前に、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａカラムを用いて、凍結ファージミドストックからグリセロールを除去し、次いで、４％無脂肪ドライミルク中に１５分間ブロックした。次に、ファージミドの１００μｌのアリコートを８つのウエル中に分配し、（全ファージ約１×１０１２ＣＦＵ）４℃で２時間インキュベートし、次いで、３００μｌのＰＢＳＴで８度洗浄した。ファージミドは、室温で１０分後に１００μｌ／ウエルの溶離バッファー（０．２Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．２、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ）に集めた。次いで、溶離液を、溶離液ｍｌあたり５６．２５μｌの２Ｍトリス塩基を添加して中和した。中和後、５ｍｌのＴＧ１細胞（ＯＤ６００約０．３）を振とうなしで２−ＹＴ中３７℃で３０分間０．５ｍｌの中和ファージで感染させた。このステップの後、一部の細胞をＬＢ  ＡＭＰグルコースプレート上に蒔き、ファージミドの総回収率を測定した。残りの接種液は、１０ｍｌのＹＡＴＧ（最終濃度２％グルコースおよび５０μｇ／ｍｌアンピシリン）に入れ、ＯＤ６００が約０．３になるまで激しく曝気しながら３７℃で増殖させた。次に、培養物を、５：１のＭＯＩにてＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージに感染させ、撹拌せずに３７℃で３０〜６０分間インキュベートした。これらの細胞は、遠心分離により集め、２５ｍｌの２−ＹＴＡＫ（Ａｍｐｉｃｉｌｉｎ  ５０μｇ／ｍｌ，Ｋａｎａｍｙｃｉｎ  ７０μｇ／ｍｌ）に再懸濁し、フレッシュな培養フラスコに移し、振とうしながら３７℃で成長させた。その後のラウンドは、同様に回収し、増幅した。
【０１５６】
ｓｃＦｖＥＬＩＳＡ
バイオパンされたファージからの大腸菌のＨＢ２１５１形質転換細胞の個々のコロニーを、１ｍｌの２ＹＴ＋１００μｇ／ｍｌのＡＭＰ中３７℃で一晩増殖させた。次の朝、これらの細胞は遠心分離により取得し、１．５ｍｌの周辺溶解バッファー（１ｍｌのＢＢＳ（Ｔｅｋｎｏｖａ）＋０．５ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム＋最終濃度が１０ｍＭになるＥＤＴＡ）に再懸濁させた。これらの細胞は、遠心分離により再びペレット化し、周辺可溶化液を含むｓｃＦｖを集めた。ｓｃＦｖ可溶化液は、希釈バッファー（ＰＢＳ／０．０５％ＢＳＡ）と１：１で混合し、先に抗原が希釈バッファーで被覆され、ブロックされたウエルに１００μｌを添加した。これらの試料を、室温で２時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎで３度洗浄した。次に、希釈バッファー中の１：５０００に希釈したビオチン抗ヒスチジンマウス（Ｓｅｒｏｔｅｃ）を１００μｌ各ウエルに添加し、室温で１時間インキュベートした。このインキュベーションの後、これらのウエルはＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎで３度洗浄し、次いで、各ウエルに１００μｌの１：２５００のストレプトアビジン：ＨＲＰ（Ｓｅｒｏｔｅｃ）を添加し、室温で２時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎで３度洗浄した。この最終洗浄の後、１００μｌの発色基質溶液（ＴＭＢ１基質、ＢｉｏＦＸ）を添加し、十分な時間が経過した後、１００μｌのＳＴＯＰ溶液（ＢｉｏＦＸ）を添加して終結させた。４５０ｎｍにおける吸光度は、プレートリーダー（Ｓｏｆｔｍａｘ  Ｐｒｏソフトウエアを備えたＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｔｈｅｒｍｏｍａｘマイクロプレートリーダー）で読み取り、データを記録し、次いで、エクセル（マイクロソフト）を用いてプロットした。
【０１５７】
塩基配列の決定
重鎖および軽鎖の配列を推定するために、個々のクローンを増殖させ、プラスミドＤＮＡを抽出した（Ｑｉａｇｅｎ）。プラスミドＤＮＡは、標準ＤＮＡ塩基配列決定法により配列を決めた。
【０１５８】
ヘマグルチニン抑制（ＨＡＩ）アッセイ
ヘマグルチニン抑制は、本質的には、Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１３１：３９４−４０８（１９８３）の方法により、ウイルスまたはタンパク質／ウエルの４ＨＡＵ（ヘマグルチネート化ユニット）を用いて丸底マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において行った。ＨＡＩ測定では、精製単一鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の２５μｌの試料が、各マイクロタイターウエルにおいてテストウイルスの４ＨＡＵを含むがこれらに限定されない２５μｌのＰＢＳと混合した。室温における１５分の予備インキュベーションの後、２５μｌの０．７５％ヒト赤血球を添加し、混合した。ＨＡＩ抗体活性は、室温で６０分インキュベーション後目視検査により測定した。
【０１５９】
結果
骨髄および血液の試料は、２００６年１月トルコで起きたＨ５Ｎ１鳥類インフルエンザの大流行の６名の生存者から、大流行の約４ヶ月後に採取した。６名の生存者全員について、トルコの保健省により承認された、理学的検査、臨床試験、および分子診断測定に続いて鳥インフルエンザの初期診断がなされた。これらの生存者のうち４名は、さらに、世界保健機関（ＷＨＯ）により確認された。血清試料は、上で説明した血清学プロトコルを用いてＨ５ヘマグルチニン（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４）に対する抗体の存在を確認するために分析した。図７に示したように、６名の患者全員の血液試料（それぞれ、ＳＬＢ  Ｈ１−Ｈ６と指定した）は、Ｈ５抗原に対する抗体の存在を示した。このことを確認後、これらの個体の骨髄試料からＲＮＡを抽出し、上で説明したプロトコルを用いて骨髄ｍＲＮＡを精製し、逆転写した。次いで、抗体の重鎖および軽鎖のレパートリーを、上で説明した骨髄ｃＤＮＡから増幅し、個別の抗体の重鎖および軽鎖のファージミドライブラリーを、個々のライブラリーを区別するために、上で説明した３ヌクレオチドバーコードを用いて各生存者について別々にクローン化した。
【０１６０】
骨髄および血液試料は、２００６年にインフルエンザ症状で処置を受けた１２名のローカルドナーからも採取した。Ｈ１、Ｈ３およびＨ５ヘマグルチニンに対する抗体の存在を確認するために上で説明した血清学的研究が、それぞれ、なされた。図８に示したように、テストしたすべての血清試料は、Ｈ１および／またはＨ３のヘマグルチニンの抗体について陽性であり、どのサブタイプが優勢であるかは、個々のドナーが自身の生活時間を通して最も多くさらされたインフルエンザＡ型ウイルスのサブタイプに左右された。その上、興味深いことに、血清にＨ５ヘマグルチニンの抗体を、なりのレベル含む患者がいた（図８のドナーＳＬＢ１およびＳＬＢ５）。この確認の後、ドナーの骨髄試料からＲＮＡを抽出し、上で説明したプロトコルを用いて骨髄ｍＲＮＡを精製し、逆転写した。次いで、抗体の重鎖および軽鎖のレパートリーを、上で説明した骨髄ｃＤＮＡから増幅し、個別の抗体の重鎖および軽鎖のライブラリーを、個々のライブラリーを区別するために、上で説明した３ヌクレオチドバーコードを用いて各生存者について別々にクローン化した。
【０１６１】
図９に例示したように、利用できる４つのヌクレオチド類の３個を用いると、６４の独特のバーコードを作ることができる。
【０１６２】
トルコ鳥インフルエンザの生存者の骨髄試料から調製し、プールされた抗体ライブラリーの３ラウンドのパニングの後、得られた４８のランダムクローンから、４０をＨ５ヘマグルチニンタンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４）への結合についてＥＬＩＳＡによりテストし、ベトナムＨ５Ｎ１ウイルス（ＣＢＥＲ，Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４）を不活性化した。これらのクローンの配列を決めた。４０のクローンの内、５つは異なっていることが判明した。図１０に示したように、全部で５つの異なるクローン（クローンＦ５およびＧ１は同じ配列を有する）は、Ｈ５タンパク質およびベトナムのＨ５Ｎ１ウイルスの両方に結合していた。図１１は、上の実験において使われたベトナムの分離株のＨ５ヘマグルチニン配列に対してトルコのドナーからのＨ５ヘマグルチニンタンパク質の配列を比較している配列アラインメントを示している。これらの実験の結果は、配列の違いにも関わらず、テストした抗体は、トルコおよびベトナムの両方のＨ５タンパク質およびウイルスに結合し、したがって、１つより多くのＨ５Ｎ１ウイルスの分離株と交差反応性を示した。
【０１６３】
追加された４つの独特のクローンは、第２ラウンドのパニングにより産生された１２のクローンの中から同定された。
【０１６４】
トルコドナーのプールされた抗体ライブラリーにおいて同定された独特のクローンの重鎖可変領域配列は、対応する軽鎖および生殖系列起源の配列と共に、図１２および１３に示している。特に、図１２に示した配列（３〜２３重鎖クローン）は、３ラウンドのパニング後の、すべてのトルコドナーのすべての重鎖および軽鎖のプールされたライブラリーに由来する。図１３に示した配列（３〜３０重鎖クローン）は、２ラウンドのパニング後の、すべてのトルコドナーのすべての重鎖および軽鎖のプールされたライブラリーに由来する。
【０１６５】
追加された独特のＨ５Ｎ１に特異な抗体重鎖可変領域配列は、４ラウンドのパニング後、上で説明したＥＬＩＳＡプロトコルを用いて個々のトルコドナーの抗体ライブラリーから同定した。これらのＨ５Ｎ１のＥＬＩＳＡ陽性クローンは、図１４Ａ−Ｄに示している。
【０１６６】
図１５および１６は、上で説明したトルコの鳥インフルエンザ生存者の血清および骨髄の分析により同定した抗体重鎖（図１５）および軽鎖（図１６）配列を用いて多様な抗体重鎖および軽鎖ライブラリーを作り出すために目標の突然変異誘発の使用を例示している。
【０１６７】
図１７および１８は、ＨＡタンパク質のトルコおよびインドネシアの改変体と共にＨ５Ｎ１ベトナムウイルスｓｃＦｖ抗体から得られた特定のＦａｂ断片交差反応性を確認しているＥＬＩＳＡの結果を示している。
【０１６８】
前述の説明では本発明は、特定の実施形態を参照しながら説明しているが、本発明はそのように限定されない。実際に、本発明で示しおよび説明した発明に加えて、前述の説明から当業者に明らかになり、添付した特許請求の範囲内に入る、本発明の種々の改変がある。
【０１６９】
本明細書を通じて引用された引用文献は、すべて、引用により本明細書に明らかに組み込まれている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図１Ｊ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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