(57)【要約】  本発明は、被験試料に存在するＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）種の遺伝子型を判定するための方法及び試薬を対象とする。本発明は、特に縮重増幅プライマーの混合物及び縮重配列決定プライマーの混合物、ならびに当該プライマーを使用する方法に関するものであり、それらのプライマーは複数のＨＣＶ種に相補的であり、各種について試料中に存在する種のタイプ及び／又はサブタイプを示す、ＨＣＶのＮＳ５Ｂの領域についてのヌクレオチド配列情報を産生することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験試料に存在するＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）種の遺伝子型を判定するための方法であって、以下の段階：
（ａ）被験試料に存在する該ＨＣＶ種の遺伝子型を示す、ＨＣＶのＮＳ５ｂ領域の少なくとも部分のヌクレオチド配列を判定する段階であって、複数のＨＣＶ種の対応するヌクレオチド配列が該ＨＣＶ種の異なる遺伝子型を示す段階；
（ｂ）（ａ）で判定されたＮＳ５ｂ領域の該部分のヌクレオチド配列を、該複数のＨＣＶ種の一つの遺伝子型に関連づける段階
を含む方法。
【請求項２】
ＨＣＶのＮＳ５ｂ領域の部分が、本質的に配列番号１のヌクレオチド位置約８３４４から約８５４７の領域からなる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＨＣＶのＮＳ５ｂ領域の部分が、本質的に配列番号１のヌクレオチド位置８３４４から８５４７の領域からなる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
被験試料に存在するＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）種の遺伝子型を判定するための方法であって、以下の段階：
（ａ）該被験試料に存在する該ＨＣＶ種の遺伝子型を示す、ＨＣＶのＮＳ５ｂ領域の少なくとも部分のヌクレオチド配列を判定する段階であって、ＨＣＶ遺伝子型１、２、３、４、５及び６を有する複数のＨＣＶ種のそれぞれの対応するヌクレオチド配列が、そのＨＣＶ種の異なる遺伝子型を示す段階；
（ｂ）（ａ）で判定されたＮＳ５ｂ領域の該部分のヌクレオチド配列を、該ＨＣＶ遺伝子型１、２、３、４、５及び６の一つに関連づける段階
を含む方法。
【請求項５】
ＨＣＶのＮＳ５ｂ領域の部分が、本質的に配列番号１のヌクレオチド位置約８３４４から約８５４７の領域からなる、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ＨＣＶのＮＳ５ｂ領域の部分が、本質的に配列番号１のヌクレオチド位置８３４４から８５４７の領域からなる、請求項４記載の方法。
【請求項７】
被験試料に存在するＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）種の遺伝子型及びサブタイプを判定するための方法であって、以下の段階：
（ａ）該被験試料に存在する該ＨＣＶ種の遺伝子型及びサブタイプを示す、ＨＣＶのＮＳ５ｂ領域の少なくとも部分のヌクレオチド配列を判定する段階であって、ＨＣＶ遺伝子型１、２、３、４、５及び６と、表１に示されるＨＣＶサブタイプのそれぞれとを有する、複数のＨＣＶ種のそれぞれの対応するヌクレオチド配列が、そのＨＣＶ種の異なる遺伝子型及びサブタイプを示す段階；
（ｂ）（ａ）で判定されたＮＳ５ｂ領域の該部分のヌクレオチド配列を、該ＨＣＶ遺伝子型１、２、３、４、５及び６の一つと、表１に示される該サブタイプの一つとに関連づける段階
を含む方法。
【請求項８】
ＨＣＶのＮＳ５ｂ領域の部分が、本質的に配列番号１のヌクレオチド位置約８３４４から約８５４７の領域からなる、請求項７記載の方法。
【請求項９】
ＨＣＶのＮＳ５ｂ領域の部分が、本質的に配列番号１のヌクレオチド位置８３４４から８５４７の領域からなる、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
被験試料に存在するＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）種の遺伝子型を判定するための方法であって、以下の段階：
（ａ）複数のＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域の少なくとも部分のヌクレオチド配列を産生することができる縮重オリゴヌクレオチド配列決定プライマーの混合物を提供する段階であって、該複数のＨＣＶ種のそれぞれの対応するヌクレオチド配列が、そのＨＣＶ種の異なる遺伝子型を示す段階；
（ｂ）該被験試料に存在する該ＨＣＶ種の遺伝子型を示す、ＮＳ５ｂ領域の該部分のヌクレオチド配列を判定する段階；及び
（ｃ）（ｂ）で判定された該ＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域の該部分のヌクレオチド配列を、該複数のＨＣＶ種の一つの遺伝子型に関連づける段階
を含む方法。
【請求項１１】
縮重オリゴヌクレオチド配列決定プライマーの混合物が、複数のＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域の、配列番号１のヌクレオチド約８２５６から約８２７８に相補的な縮重ヌクレオチド配列又はその相補体と、複数のＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域のヌクレオチド約８６１１から約８６３３に相補的な縮重ヌクレオチド配列又はその相補体とを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
縮重オリゴヌクレオチド配列決定プライマーの混合物が、複数のＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域の、配列番号１のヌクレオチド８２５６から８２７８に相補的な縮重ヌクレオチド配列又はその相補体と、複数のＨＣＶ種の該ＮＳ５ｂ領域のヌクレオチド８６１１から８６３３に相補的な縮重ヌクレオチド配列又はその相補体とを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
縮重オリゴヌクレオチド配列決定プライマーの混合物が、以下の式：
【表１】
2009521235.tif 000032
により定義される縮重オリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
被験試料に存在するＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）種の遺伝子型を判定するための方法であって、以下の段階：
（ａ）複数のＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域の少なくとも部分のヌクレオチド配列を産生することができる、縮重オリゴヌクレオチド配列決定プライマーの混合物を提供する段階であって、該複数のＨＣＶ種のそれぞれの対応するヌクレオチド配列が、ＨＣＶ遺伝子型１、２、３、４、５及び６の一つを示す段階；
（ｂ）該被験試料に存在する該ＨＣＶ種の遺伝子型を示す、ＮＳ５ｂ領域の該部分のヌクレオチド配列を判定する段階；
（ｃ）（ｂ）で判定された該ＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域の該部分のヌクレオチド配列を、ＨＣＶ遺伝子型１、２、３、４、５及び６の一つに関連づける段階
を含む方法。
【請求項１５】
縮重オリゴヌクレオチド配列決定プライマーの混合物が、複数のＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域の、配列番号１のヌクレオチド約８２５６から約８２７８に相補的な縮重ヌクレオチド配列又はその相補体と、複数のＨＣＶ種の該ＮＳ５ｂ領域のヌクレオチド約８６１１から約８６３３に相補的な縮重ヌクレオチド配列又はその相補体とを含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
縮重オリゴヌクレオチド配列決定プライマーの混合物が、複数のＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域の、配列番号１のヌクレオチド８２５６から８２７８に相補的な縮重ヌクレオチド配列又はその相補体と、複数のＨＣＶ種の該ＮＳ５ｂ領域のヌクレオチド８６１１から８６３３に相補的な縮重ヌクレオチド配列又はその相補体とを含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
縮重オリゴヌクレオチド配列決定プライマーの混合物が、以下の式：
【表２】
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により定義される縮重オリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
被験試料に存在するＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）種の遺伝子型を判定するための方法であって、以下の段階：
（ａ）複数のＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域の少なくとも部分のヌクレオチド配列を産生することができる縮重オリゴヌクレオチド配列決定プライマーの混合物を提供する段階であって、該複数のＨＣＶ種のそれぞれの対応するヌクレオチド配列が、ＨＣＶ遺伝子型１、２、３、４、５及び６の一つと、サブタイプの一つとを示す段階；
（ｂ）該被験試料に存在する該ＨＣＶ種の遺伝子型及びサブタイプを示す、ＮＳ５ｂ領域の該部分のヌクレオチド配列を判定する段階；及び
（ｃ）（ｂ）で判定された該ＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域の該部分のヌクレオチド配列を、ＨＣＶの遺伝子型及びサブタイプに関連づける段階
を含む方法。
【請求項１９】
縮重オリゴヌクレオチド配列決定プライマーの混合物が、複数のＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域の、配列番号１のヌクレオチド約８２５６から約８２７８に相補的な縮重ヌクレオチド配列又はその相補体と、複数のＨＣＶ種の該ＮＳ５ｂ領域のヌクレオチド約８６１１から約８６３３に相補的な縮重ヌクレオチド配列又はその相補体とを含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
縮重オリゴヌクレオチド配列決定プライマーの混合物が、複数のＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域の、配列番号１のヌクレオチド８２５６から８２７８に相補的な縮重ヌクレオチド配列又はその相補体と、複数のＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域のヌクレオチド８６１１から８６３３に相補的な縮重ヌクレオチド配列又はその相補体とを含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
縮重オリゴヌクレオチド配列決定プライマーの混合物が、以下の式：
【表３】
2009521235.tif 000034
により定義される縮重オリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
被験試料に存在するＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）種のＮＳ５ｂ領域の部分を増幅するための方法であって、以下の段階：
（ａ）複数のＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域の、配列番号１のヌクレオチド約８２４５から約８２６９に相補的な縮重ヌクレオチド配列又はその相補体と、
複数のＨＣＶ種の該ＮＳ５ｂ領域のヌクレオチド約８６１６から約８６４１に相補的な縮重ヌクレオチド配列又はその相補体と
を含む縮重オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーの混合物を提供する段階；及び
（ｂ）ＮＳ５ｂ領域の該部分のヌクレオチド配列を増幅させる段階
を含む方法。
【請求項２３】
縮重オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーの混合物が、
複数のＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域の、配列番号１のヌクレオチド８２５６から８２７８に相補的な縮重ヌクレオチド配列又はその相補体と、
複数のＨＣＶ種の該ＮＳ５ｂ領域のヌクレオチド８６１１から８６３３に相補的な縮重ヌクレオチド配列又はその相補体と
を含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
縮重オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーの混合物が、以下の式：
【表４】
2009521235.tif 000035
により定義される縮重オリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
縮重オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーの混合物が、以下の式：
【表５】
2009521235.tif 000036
により定義される縮重オリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
以下の式：
【表６】
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の一つ又は複数により定義される複数のオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを含む、縮重オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーの混合物。
【請求項２７】
以下の式：
【表７】
2009521235.tif 000038
により定義される複数のオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを含む、請求項２６記載の縮重オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーの混合物。
【請求項２８】
以下の式：
【表８】
2009521235.tif 000039
により定義される複数のオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを含む、請求項２６記載の縮重オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーの混合物。
【請求項２９】
以下の式：
【表９】
2009521235.tif 000040
により定義される複数のオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを含む、請求項２６記載の縮重オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーの混合物。
【請求項３０】
以下の式：
【表１０】
2009521235.tif 000041
の一つ又は複数により定義される複数のオリゴヌクレオチド配列決定プライマーを含む、縮重オリゴヌクレオチド配列決定プライマーの混合物。
【請求項３１】
以下の式：
【表１１】
2009521235.tif 000042
により定義される複数のオリゴヌクレオチド配列決定プライマーを含む、請求項３０記載の縮重オリゴヌクレオチド配列決定プライマーの混合物。
【請求項３２】
以下の式：
【表１２】
2009521235.tif 000043
により定義される複数のオリゴヌクレオチド配列決定プライマーを含む、請求項３０記載の縮重オリゴヌクレオチド配列決定プライマーの混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００５年１２月２３日に出願された米国仮特許出願第６０／７５３，７６１号の出願日の利益を主張し、その開示は、その全体がこの参照により組み入れられる。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は、一般に被験試料中に見出されるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）種を遺伝子型同定するための方法及び材料を対象とする。
【０００３】
発明の背景
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、世界中で約１億７０００万人に感染していると推定され、慢性肝疾患ならびに肝硬変及び肝細胞癌のリスク増加の原因である。ＨＣＶの処置は主に抗ウイルス方式に限られており、その効力は、ウイルスの遺伝子型などのいくつかの生物学的パラメーターに主として影響される。したがって、ＨＣＶの遺伝子型同定は、抗ウイルス療法に対する反応を予測するため、及び処置期間を最適化するために広く使用されている。ＨＣＶの遺伝子型同定は、疫学的研究及びＨＣＶによる汚染源の追跡のための不可欠なツールにもなっている。
【０００４】
プラス鎖のＨＣＶ  ＲＮＡゲノムは、約９６００ヌクレオチド長であり、約３０１０アミノ酸を有する少なくとも一つのオープンリーディングフレームをコードする。感染した細胞では、このポリタンパク質は、細胞プロテアーゼ及びウイルスプロテアーゼにより多数の部位で切断され、構造タンパク質及び非構造（ＮＳ）タンパク質を生成する。ＨＣＶ単離物は、非構造５Ｂ（ＮＳ５Ｂ）遺伝子によりコードされるＨＣＶ  ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの忠実度の欠如が原因の、高度の遺伝子変異性を特徴とする。加えて、内因性突然変異又は複数の種による感染の結果として、一人の患者に遺伝的に変異性のＨＣＶ疑似種もまた生じる。ＨＣＶの六つの主要遺伝子型及び１００個を超えるサブタイプが記載されている。
【０００５】
ＨＣＶの遺伝子変異性は、増幅、配列決定及び遺伝子型同定の工程を複雑にする。これらの工程は、典型的にはオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブ（例えばＰＣＲ増幅プライマー、配列決定プライマー及び部位特異的プローブ）の使用に頼っており、それらのプライマー及びプローブは、ＨＣＶゲノムの対応する核酸配列に相補的であり、それにハイブリダイゼーションすることができる。ＨＣＶゲノムの高度変異性の結果として、ＨＣＶの一種に相補的なオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブは、別の種に相補的であることはできない。したがって、当該プライマー及びプローブは、高度に保存された領域に特異的であるように設計しなければならない。又は、アッセイは、全ての種に相補的な縮重プライマー及びプローブの混合物を使用しなければならない。
【０００６】
いくつかの遺伝子型同定法が、５’非翻訳（５’ＮＣ）領域に焦点をあてている。ＨＣＶの５’非翻訳（ＮＣ）領域は高度に保存されているが、それでも遺伝子型同士を判別するために利用することができる型特異的多型を有する。今日まで、大部分の市販の５’ＮＣ領域遺伝子型同定アッセイは、ＰＣＲ増幅と、ＲＦＬＰによるフラグメント分析又はオリゴヌクレオチドプローブへのハイブリダイゼーションとに基づいてきた。これらの種類のアッセイは迅速であるが、配列同定に基づくアッセイほど正確ではない。この理由から、ＨＣＶの遺伝子型同定に使用するために、ＮＳ５Ｂ領域を含めた代替ゲノム領域が提案された。
【０００７】
ＨＣＶを遺伝子型同定する最も正確で直接的な方法は、ウイルスのタイプ及びサブタイプを判別するのに足る、様々な種の間で多岐にわたる領域においてウイルスゲノムを配列決定することである。同じ程度に重要なことには、これらの領域から産生した配列を分析するために、系統発生分析用データベースが容易に入手できなければならない。
【０００８】
配列決定に基づく市販のＨＣＶ遺伝子型同定アッセイには、例えばＴＲＵＧＥＮＥ  ＨＣＶ  ５’ＮＣ遺伝子型同定キット（Bayer HealthCare）があり、このキットは、ＨＣＶの５’ＮＣ領域を利用した配列同定に基づく迅速アッセイである。このアッセイにより産生した配列データは、系統発生５’ＮＣ領域データベース（TRUGENE HCV 5'NC software module v3.1.1）を利用して直接分析される。以前には、５’ＮＣデータベースは、決して完全には確証されていない様々な起源由来の配列を含み、場合によっては、５’ＮＣ又はＮＳ５Ｂ配列を分析したときに、特定の株についてのサブタイプの割り付けが不一致であった。
【０００９】
臨床分析及び治療的介入のためのＨＣＶの型及びサブタイプの同定を改良するために、配列決定に基づくＨＣＶアッセイを改良する必要が引き続きある。
【００１０】
発明の概要
本発明は、一般に被験試料に見出されるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）種を遺伝子型同定するための方法及び試薬を対象とする。さらに具体的には、本発明は、試料中のＨＣＶ種のＮＳ５Ｂ領域の部分を増幅及び配列決定し、かつその遺伝子型を判定する改良法を対象とする。
【００１１】
本発明の一局面は、ＨＣＶのＮＳ５Ｂ領域の少なくとも部分を配列決定することにより、被験試料に存在するＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）種の遺伝子型を判定するための方法に関するものであり、その部分は、複数のＨＣＶ種のそれぞれについてその種のタイプ及び／又はサブタイプを示す。
【００１２】
一態様では、この方法は、（ａ）被験試料に存在する前記ＨＣＶ種の遺伝子型を示す、ＨＣＶのＮＳ５ｂ領域の少なくとも部分のヌクレオチド配列を判定する段階であって、複数のＨＣＶ種の対応するヌクレオチド配列が、そのＨＣＶ種の異なる遺伝子型を示す段階；及び（ｂ）（ａ）で判定されたＮＳ５ｂ領域の前記部分のヌクレオチド配列を、前記複数のＨＣＶ種の一つの遺伝子型に関連づける段階を含む。
【００１３】
別の態様では、この方法は、（ａ）被験試料に存在する前記ＨＣＶ種の遺伝子型を示す、ＨＣＶのＮＳ５ｂ領域の少なくとも部分のヌクレオチド配列を判定する段階であって、ＨＣＶ遺伝子型１、２、３、４、５及び６を有する複数のＨＣＶ種のそれぞれの対応するヌクレオチド配列が、そのＨＣＶ種の異なる遺伝子型を示す段階、ならびに（ｂ）（ａ）で判定されたＮＳ５ｂ領域の前記部分のヌクレオチド配列を、前記ＨＣＶ遺伝子型１、２、３、４、５及び６の一つに関連づける段階を含む。
【００１４】
なお別の態様では、この方法は、（ａ）被験試料に存在する前記ＨＣＶ種の遺伝子型及びサブタイプを示す、ＨＣＶのＮＳ５ｂ領域の少なくとも部分のヌクレオチド配列を判定する段階であって、ＨＣＶ遺伝子型１、２、３、４、５及び６と、表１に示されるＨＣＶサブタイプのそれぞれとを有する各ＨＣＶ種の対応するヌクレオチド配列が、そのＨＣＶ種の異なる遺伝子型及びサブタイプを示す段階；ならびに（ｂ）（ａ）で判定されたＮＳ５Ｂ領域の前記部分のヌクレオチド配列を、前記ＨＣＶ遺伝子型１、２、３、４、５及び６の一つと、表１に示される前記ＨＣＶサブタイプの一つとに関連づける段階を含む。
【００１５】
上記方法の特定の一態様では、ＨＣＶのＮＳ５ｂ領域の部分は、本質的に配列番号１のヌクレオチド位置約８３４４から約８５４７の領域からなる。
【００１６】
上記方法の別の特定の態様では、ＨＣＶのＮＳ５Ｂ領域の部分は、本質的に配列番号１のヌクレオチド位置８３４４から８５４７の領域からなる。
【００１７】
別の態様では、本発明の方法は、（ａ）被験試料に存在する複数のＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域の少なくとも部分のヌクレオチド配列を産生することができる縮重オリゴヌクレオチド配列決定プライマーの混合物を提供する段階であって、前記複数のＨＣＶ種のそれぞれの対応するヌクレオチド配列が、そのＨＣＶ種の異なる遺伝子型を示す段階；（ｂ）被験試料に存在する前記ＨＣＶ種の遺伝子型を示すＮＳ５ｂ領域の前記部分のヌクレオチド配列を判定する段階；及び（ｃ）（ｂ）で判定された前記ＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域の前記部分のヌクレオチド配列を、前記複数のＨＣＶ種の一つの遺伝子型に関連づける段階を含む。
【００１８】
なお別の態様では、この方法は、（ａ）複数のＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域の少なくとも部分のヌクレオチド配列を産生することができる縮重オリゴヌクレオチド配列決定プライマーの混合物を提供する段階であって、前記複数のＨＣＶ種のそれぞれの対応するヌクレオチド配列が、ＨＣＶ遺伝子型１、２、３、４、５及び６の一つを示す段階；（ｂ）被験試料に存在する前記ＨＣＶ種の遺伝子型を示す、ＮＳ５ｂ領域の前記部分のヌクレオチド配列を判定する段階；ならびに（ｃ）（ｂ）で判定された前記ＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域の前記部分のヌクレオチド配列を、ＨＣＶ遺伝子型１、２、３、４、５及び６の一つと関連づける段階を含む。
【００１９】
なお別の態様では、この方法は、（ａ）複数のＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域の少なくとも部分のヌクレオチド配列を産生することができる縮重オリゴヌクレオチド配列決定プライマーの混合物を提供する段階であって、前記複数のＨＣＶ種のそれぞれの対応するヌクレオチド配列が、ＨＣＶ遺伝子型１、２、３、４、５及び６の一つと、表１に示されるサブタイプの一つとを示す段階；（ｂ）被験試料に存在する前記ＨＣＶ種の遺伝子型及びサブタイプを示す、ＮＳ５ｂ領域の前記部分のヌクレオチド配列を判定する段階；ならびに（ｃ）（ｂ）で判定された前記ＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域の前記部分のヌクレオチド配列を、ＨＣＶの遺伝子型及びサブタイプ（例えば、ＨＣＶ遺伝子型１、２、３、４、５及び６の一つならびに表１に示されるサブタイプの一つ）に関連づける段階を含む。
【００２０】
特定の一態様では、縮重オリゴヌクレオチド配列決定プライマーの混合物は、複数のＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域の、配列番号１のヌクレオチド約８２５６から約８２７８に相補的な縮重ヌクレオチド配列［ＣＬＩＰ配列決定プライマーＭ−ＮＳ５ｂ−Ｃｙ５．５］又はその相補体と、複数のＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域のヌクレオチド約８６１１から約８６３３に相補的な縮重ヌクレオチド配列（例えばＣＬＩＰ配列決定プライマーＭ−ＮＳ５ｂ−Ｃｙ５）又はその相補体とを含む。
【００２１】
別の特定の態様では、縮重オリゴヌクレオチド配列決定プライマーの混合物は、複数のＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域の、配列番号１のヌクレオチド８２５６から８２７８に相補的な縮重ヌクレオチド配列（例えばＣＬＩＰ配列決定プライマーＭ−ＮＳ５ｂ−Ｃｙ５．５）又はその相補体と、複数のＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域のヌクレオチド８６１１から８６３３に相補的な縮重ヌクレオチド配列（例えばＣＬＩＰ配列決定プライマーＭ−ＮＳ５ｂ−Ｃｙ５）又はその相補体とを含む。
【００２２】
なお別の特定の態様では、縮重オリゴヌクレオチド配列決定プライマーの混合物は、以下の式：
【００２３】
【表１３】
2009521235.tif 000003
の一つ若しくは複数により定義される縮重オリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含む。
【００２４】
本発明の別の局面は、被験試料に存在するＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）種の遺伝子型を判定するための方法に関するものであり、その方法は、複数のＨＣＶ種のそれぞれについてその種のタイプ及び／又はサブタイプを示す、ＨＣＶのＮＳ５Ｂ領域の少なくとも部分を増幅することによる。
【００２５】
一態様では、この方法は、（ａ）複数のＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域の、配列番号１のヌクレオチド約８２４５から約８２６９に相補的な縮重ヌクレオチド配列（例えばフォワードプライマーＦＦ１及び／又はＦＦ２）又はその相補体と、複数のＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域のヌクレオチド約８６１６から約８６４１に相補的な縮重ヌクレオチド配列（例えばリバースプライマーＲＲ１）又はその相補体とを含む縮重オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーの混合物を提供する段階；及び（ｂ）ＮＳ５ｂ領域の前記部分のヌクレオチド配列を増幅させる段階を含む。
【００２６】
特定の態様では、縮重オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーの混合物は、複数のＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域の、配列番号１のヌクレオチド８２５６から８２７８に相補的な縮重ヌクレオチド配列（例えばＣＬＩＰ配列決定プライマーＭ−ＮＳ５ｂ−Ｃｙ５．５）又はその相補体と、複数のＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域のヌクレオチド８６１１から８６３３に相補的な縮重ヌクレオチド配列（例えばＣＬＩＰ配列決定プライマーＭ−ＮＳ５ｂ−Ｃｙ５）又はその相補体とを含む。
【００２７】
別の特定の態様では、縮重オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーの混合物は、以下の式：
【００２８】
【表１４】
2009521235.tif 000004
の一つ若しくは複数により定義される縮重オリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含む。
【００２９】
なお別の特定の態様では、縮重オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーの混合物は、次式：
【００３０】
【表１５】
2009521235.tif 000005
の一つ若しくは複数により定義される縮重オリゴヌクレオチド配列、又はその相補体を含む。
【００３１】
発明の詳細な説明
定義
本出願に使用される用語は当技術分野の中で標準的であるが、明確さを確実にするためにある用語の以下の定義を提供する。
【００３２】
単位、接頭辞及び記号は、承認されたＳＩ形式で示すことができる。別に示さない限り、核酸は左から右に５’から３’方向で表記する。本明細書に引用される数値範囲は、その範囲を規定している数を含み、その規定される範囲内の各整数を含み、その整数を支持する。アミノ酸は、本明細書において一般に公知の三文字記号、又はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＭＢ命名委員会により勧告される一文字記号のいずれかにより表すことができる。同様にヌクレオチドは、一般に承認されている一文字コードにより表すことができる。別に示さない限り、「ａ」又は「ａｎ」という用語は、「少なくとも一つの」という意味として解釈すべきである。本明細書に使用される項の見出しは単に構成目的であり、記載される主題を限定するものとして解釈してはならない。特許、特許出願、記事、書籍及び論文を非限定的に含めた、本出願に引用される全ての文書又は文書の部分は、これにより任意の目的のためにその全体が参照により明白に組み入れられる。本出願の中で任意のアミノ酸又は核酸配列の不一致がある場合には、図を確認する。
【００３３】
本明細書に使用される「増幅」という用語は、反応混合物中の一つ又は複数の特異的遺伝子又は遺伝子フラグメントの相対的存在量を、他の遺伝子に対して増加させる工程を意味する。
【００３４】
「本質的になる」という用語は、本明細書において特定のヌクレオチド配列に関して使用するときに、配列の相補性及びその配列が複数のＨＣＶのタイプ又はサブタイプにハイブリダイゼーションする能力にあまり影響しない特定の配列及び任意の追加の配列を意味する。
【００３５】
本明細書に使用される「試料」は、ＲＮＡ又はＤＮＡなどの核酸を含むか、又は含むと疑われる任意の物質を表し、試料には、例えば皮膚、血漿、血清、髄液、リンパ液、滑液、尿、涙、血球、器官、腫瘍を、そして（細胞培養培地中の細胞の成長に起因する馴化培地、リコンビナント細胞、及び細胞構成要素を非限定的に含めた）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養構成要素の試料もまた非限定的に含めた、個体から単離された組織又は液体の試料が含まれる。
【００３６】
「ヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドであるアデノシン、シトシン、グアニン及びチミンがそれらの一文字コードであるＡ、Ｃ、Ｇ及びＴでそれぞれ表されることを意味する。縮重プライマーの表示では、記号ＲはＧ又はＡのいずれかを表し、記号ＹはＴ／Ｕ又はＣのいずれかを表し、記号ＭはＡ又はＣのいずれかを表し、記号ＫはＧ又はＴ／Ｕのいずれかを表し、記号ＳはＧ又はＣを表し、記号ＷはＡ又はＴ／Ｕのいずれかを表し、記号Ｂは「非Ａ」を表し、記号Ｄは「非Ｃ」を表し、記号Ｈは「非Ｇ」を表し、記号Ｖは「非Ｔ／Ｕ」を表し、そして記号Ｎは任意のヌクレオチドを表す。記号Ｉは、一般に任意のＣ、Ｔ又はＡと対形成するものである中性塩基のイノシンを表す。本出願の明細書及び特許請求の範囲において、縮重プライマーは、塩基の選択の任意又は全ての組み合わせを表し、かつＤＮＡ又は対応するＲＮＡ配列（すなわちＴがＵに置き換わっている）のいずれかを表す。したがって縮重プライマーは、単一種、又はその選択の範囲に入る二つの種の混合物、又はその選択の範囲に入る三つの選択の混合物などから最大全ての可能な組み合わせを含む混合物までに相当しうる。
【００３７】
「核酸」、「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、プライマー、プローブ、検出されるオリゴマーフラグメント、オリゴマー対照、及び未ラベルのブロッキングオリゴマーを表し、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）、及びプリン若しくはピリミジン塩基又は改変されたプリン若しくはピリミジン塩基のＮ−グリコシドである他の任意のタイプのポリヌクレオチドに一般的なものとする。「核酸」、「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語の間の長さに意図された区別はなく、これらの用語は相互交換可能に使用する。これらの用語は、分子の一次構造だけを表す。したがって、これらの用語には二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖及び一本鎖ＲＮＡが含まれる。オリゴヌクレオチドは、指定されたヌクレオチド配列の領域に対応する少なくとも約６ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約１０〜１２ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも約１５〜２５ヌクレオチドの配列を含む。参照ヌクレオチド配列に関して核酸配列を定義するために本明細書に使用される「対応する」という用語は、参照配列の全て又は一部とマッチするヌクレオチド配列、及び参照配列の全て又は一部と相補的なヌクレオチド配列を意味する。
【００３８】
オリゴヌクレオチドは、任意の現存する配列にも天然配列にも必ずしも物理的に由来しないが、化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、又はその組み合わせを含めた任意の方法で産生することができる。「オリゴヌクレオチド」又は「核酸」という用語は、ゲノムＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ｃＤＮＡ、半合成、又は合成起源のポリヌクレオチドを意図し、その合成起源のポリヌクレオチドは、その起源又は操作が理由で：（１）それが自然界で関連しているポリヌクレオチドの全て若しくは部分と関連しておらず；かつ／又は（２）それが自然界で結合しているポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドに結合しており；かつ（３）自然界に見られない。
【００３９】
モノヌクレオチドは、一つのモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸が、ホスホジエステル結合を介して一方向でその隣の３’酸素に結合するオリゴヌクレオチドを作るように反応することから、オリゴヌクレオチドの末端は、その５’リン酸がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素に結合していないならば「５’末端」と呼ばれ、その３’酸素が続くモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸に結合していないならば「３’末端」と呼ばれる。たとえさらに大きいオリゴヌクレオチドに内在しても、本明細書に使用される核酸配列もまた５’末端及び３’末端を有すると述べることができる。
【００４０】
二つの異なる重複しないオリゴヌクレオチドが、同じ直鎖相補的核酸配列の異なる領域にアニーリングし、一方のオリゴヌクレオチドの３’末端がもう一方のオリゴヌクレオチドの５’末端を向いているときに、前者を「上流」オリゴヌクレオチド、そして後者を「下流」オリゴヌクレオチドと呼ぶことができる。
【００４１】
「プライマー」という用語は、一つを超えるプライマーを表すことができ、精製された制限分解物中のように天然のものであろうと合成生成されたものであろうとオリゴヌクレオチドを表し、そのオリゴヌクレオチドは、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が触媒される条件に置かれたときに、相補鎖に沿った合成の開始点として作用することができる。そのような条件には、適切な緩衝液（「緩衝液」は、補因子である置換基又はｐＨ、イオン強度などに影響する置換基を含む）中で、適切な温度での四つの異なるデオキシリボヌクレオシド三リン酸とＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素などの重合誘導剤との存在が含まれる。
【００４２】
プライマーは、好ましくは最大効率の増幅のためには一本鎖であるが、代わりに二本鎖であってもよい。二本鎖ならば、プライマーは、最初にその鎖を分離するように処理されてから、伸長産物を調製するために使用される。好ましくは、プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、重合のための薬剤の存在下で伸長産物の合成をプライミングするのに充分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは、温度及びプライマーの起源ならびにその方法の用途を含めた多数の要因に依存するものである。例えば、ターゲット配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には１５〜２５ヌクレオチドを有するが、それよりも多い、又は少ないヌクレオチドを有することもある。一般にテンプレートと十分に安定なハイブリッド複合体を形成するためには、短いプライマー分子の方が低温を必要とする。
【００４３】
「伸長プライマー」という用語は、テンプレート配列に相補的で、ポリメラーゼ鎖反応条件でハイブリダイゼーションして配列を伸長することができるポリヌクレオチド配列を意味する。
【００４４】
二つの核酸配列に関して使用する場合の「相補体」及びそれに関連する形容詞形「相補的な」という用語は、二つの核酸配列が、逆平行関係で（一方の配列の５’末端がもう一方の配列の３’末端と対形成して）アライメントされるときに、それらの配列の対応するＧ及びＣヌクレオチド塩基が対形成し、対応するＡ及びＴヌクレオチド塩基が対形成することを意味する。天然核酸に一般に見出されないある塩基は、本発明の核酸に含まれることがあり、その塩基には、例えばイノシン及び７−デアザグアニンが含まれる。
【００４５】
遺伝子座におけるヌクレオチドの「配置」又は「位置」という用語は、遺伝子のゲノム配列のＣＤＮＡ配列から一般に採用された、その遺伝子の中でヌクレオチドに割り付けられた数を意味する。
【００４６】
「オリゴヌクレオチドプライマー」という用語は、三つを超えるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドからなる分子を意味する。その正確な長さは、温度及びアニーリング反応、ならびにプライマーの起源及び組成を含めたそのオリゴヌクレオチドプライマーの最終的な機能及び用途に関係する多数の要因に依存するものである。増幅プライマーは、重合のための薬剤の存在下で、伸長産物の合成をプライミングするのに十分な長さでなければならない。オリゴヌクレオチドプライマーは、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成を誘導する条件に置かれたときに、合成の開始点として作用することができる。その条件は、適切な温度及びｐＨで、ヌクレオチドと、ＤＮＡポリメラーゼなどの誘導剤との存在を含むことがある。好ましい態様では、プライマーは、誘導剤の存在下で特定の配列から伸長産物の合成をプライミングするのに十分な長さの一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドである。本発明の一局面では、オリゴヌクレオチドプライマーは、約１５から約３０ヌクレオチド長であるが、それよりも多い、又は少ないヌクレオチドを有することもある。オリゴヌクレオチドプライマーは、好ましくは少なくとも１５、１６、１７、１８、１９又は２０ヌクレオチド長である。さらに好ましくは、プライマーは約２０〜２５ヌクレオチドを有するものである。オリゴヌクレオチドプライマーの感度及び特異性は、プライマー長と、テンプレート核酸の所与の試料内の配列の特有性により決定される。例えば、短すぎるプライマーは、多様な配列に非特異的結合を示すことがある。
【００４７】
本発明の実施は、別に示さない限り、当該分野の技術の範囲内である、分子生物学、微生物学、リコンビナントＤＮＡ技法、オリゴヌクレオチド合成の従来技法を採用するものである。当該技法は、文献に十分に説明されている。酵素反応及び精製技法は、製造業者の仕様書通りに、又は当技術分野において通常遂行されるように、又は本明細書に記載されるように行われる。一般に前述の技法及び手順は、当技術分野で周知の従来法通りに、本明細書にわたり引用及び議論される様々な一般の参照及びより特定の参照に記載されるように行われる。例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual（2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)）；Oligonucleotide Synthesis（M. J. Gait, ed., 1984）；Nucleic Acid Hybridization（B. D. Hames & S. J. Higgins, eds., 1984）；A Practical Guide to Molecular Cloning（B. Perbal, 1984）；及びMethods in Enzymologyのシリーズ（Academic Press, Inc.）を参照されたい。これらの全ての参照の内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【００４８】
「逆転写」という用語は、ＲＮＡ分子に対してＤＮＡ相補体を産生する工程を意味し、一般に逆転写酵素を使用して実現される。プライマーは、重合を開始するために使用することができ、このプライマーは、ＰＣＲ増幅のために後に使用されるプライマー対の一つでありうる。次に、ＲＮＡ分子は、コピーされたＤＮＡ（「ｃＤＮＡ」）から分離されるか、又は酵素のＲＮＡｓｅ  Ｈ活性により分解されることにより、ｃＤＮＡの第二の鎖をテンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼにより産生できるようにする。この方法は、Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausubel, F. M. et al,（John Wiley & Sons; 1995）のユニット３．７及び１５．４に開示されており、その内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【００４９】
「配列決定」という用語は、遺伝子の少なくとも一部におけるヌクレオチドの順序の判定を意味する。
【００５０】
本発明の実施は、別に示さない限り、当該分野の技術の範囲内である、分子生物学、微生物学、リコンビナントＤＮＡ技法、オリゴヌクレオチド合成の従来技法を採用するものである。当該技法は、文献に十分に説明されている。酵素反応及び精製技法は、製造業者の仕様書通りに、又は当技術分野において通常遂行されるように、又は本明細書に記載されるように行われる。一般に前述の技法及び手順は、当技術分野で周知の従来法通りに、本明細書にわたり引用及び議論される様々な一般の参照及びより特定の参照に記載されるように行われる。例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual（2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)）；Oligonucleotide Synthesis（M. J. Gait, ed., 1984）；Nucleic Acid Hybridization（B. D. Hames & S. J. Higgins, eds., 1984）；A Practical Guide to Molecular Cloning（B. Perbal, 1984）；及びMethods in Enzymologyのシリーズ（Academic Press, Inc.）を参照されたい。これらの全ての参照の内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【００５１】
ＤＮＡの起源
本発明の一局面では、この方法は、最初に患者の試料から関心対象の突然変異を包含する二本鎖ポリヌクレオチドテンプレートを得る段階を含む。二本鎖ポリヌクレオチドテンプレートは、初めはゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのフラグメント、又はＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡを含むことがある。このテンプレートは、関心対象の突然変異だけを包含するのではなく、複数の疑似種を生じる鎖長多型を有する領域もまた包含することがある。
【００５２】
二本鎖ポリヌクレオチドテンプレートは、典型的には例えば溶解、細胞の破片を除去するための遠心分離、及びＤＮＡを露出させるためのタンパク質分解消化により、オリゴヌクレオチドプライマーとのハイブリダイゼーションのために試料中のＤＮＡの全て又は部分を利用可能にするために、ＤＮＡを含む患者の試料を処理することによって、患者の試料から調製されるものである。したがってＤＮＡテンプレートは、核ＤＮＡのみ、ミトコンドリアＤＮＡのみ、又は組織試料からの単離により得られた核ＤＮＡ若しくはミトコンドリアＤＮＡのいくつかの亜画分を含むことがある。ＤＮＡテンプレートは、総ｍＲＮＡ調製物又はＲＮＡウイルスのゲノムからｃＤＮＡへの、例えば逆転写による変換；プレート上に成長している個別の細菌コロニー又は濃縮された細菌培養物から単離されたＤＮＡ；及び実質的にウイルスゲノム全体が単離されているウイルスＤＮＡ調製物によってもまた調製することができる。
【００５３】
ＤＮＡは、溶解、細胞の破片を除去するための遠心分離、及びＤＮＡを露出させるためのタンパク質分解消化；塩析又は標準的なＳＤＳ−プロテイナーゼＫ−フェノール抽出を含めたいくつかの技法のうち任意のものにより、液体試料、例えば血液若しくは尿、又は組織試料から調製することができる。試料は、キット、例えばＰｕｒｅ  Ｇｅｎｅ  ＤＮＡ単離キット（Gentra）を使用してもまた調製することができる。
【００５４】
核酸の増幅
本発明は、その後の配列決定のために豊富な起源のＤＮＡを提供する、ＤＮＡ増幅のための方法及び試薬を含む。
【００５５】
典型的には、配列決定前に、配列決定されるターゲット領域を包含するＤＮＡの領域を最初に増幅させることによって、配列決定用テンプレートが調製される。増幅される配列が最初に純粋な形で存在する必要はなく、その配列は、複合混合物の副画分であってもよいし、核酸配列の部分であってもよい。出発核酸は、同一又は異なりうる一つを超える所望の特異的核酸配列を有してもよい。したがって、本工程は、一つの特異的核酸配列を大量に生成するためにだけではなく、配列に一つを超える塩基対の変異が存在するならば、同一又は異なる核酸分子に局在する一つを超える異なる特異的核酸配列を同時に増幅するためにも有用である。
【００５６】
本発明は、ＨＣＶの遺伝子型同定に使用される増幅プライマー及び配列決定プライマーを含めた方法及び試薬を対象とする。本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（又はＰＣＲ）の技法又はいくつかの他のプライマー伸長に基づく方法を使用た、特異的核酸配列を増幅するための周知の方法を利用する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法は、当技術分野において非常に広く知られている。当該方法は、例えば米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、及び第４，８００，１５９号；K. Mullis, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263-273 (1986)；ならびにC. R. Newton & A. Graham, Introduction to Biotechniques: ＰＣＲ, 2.sup.nd Ed., Springer-Verlag (New York: 1997)に記載されており、これらの開示は、参照により本明細書に組み入れられる。ＰＣＲは、一つのプライマーが二本鎖ＤＮＡの各相補鎖に対するものであるプライマー対の使用を必要とし（ここで、コード鎖は「センス鎖」と呼ばれ、その相補鎖は「アンチセンス鎖」と呼ばれる）、それらのプライマーは、遺伝子の中で関心対象の領域の両側に位置する部位でハイブリダイゼーションするものである。次に、鎖伸長重合が、関心対象の領域のコピー数を指数的に増加させるために、繰り返しサイクルで実施される。簡潔に概略すると、ＰＣＲ反応の第一段階では、二本鎖分子を変性させるために試料の核酸分子が一過性に加熱され、それから冷却される。フォワードプライマー及びリバースプライマーは、試料ターゲットに対して過剰濃度で増幅反応混合物中に存在する。ハイブリダイゼーション及び重合を促す条件で試料をインキュベーションすると、増幅が望まれる配列の相補体であるプライマーは、増幅が望まれる領域の配列の３’位置で核酸分子の相補鎖にハイブリダイゼーションする。ハイブリダイゼーションに応じて、プライマーの３’末端はポリメラーゼにより伸長される。プライマーの伸長は、所望の核酸試料ターゲットの相補体の正確な配列を有するＤＮＡ分子の合成を招く。ＰＣＲ反応は、所望の配列を有する分子の数を各サイクルでほぼ倍加させて、所望の核酸配列を指数的に増幅することができる。したがって、ハイブリダイゼーション、重合及び変性のサイクルを許すことによって、所望の核酸分子の濃度の指数的増加を実現することができる。増幅されたポリヌクレオチドは、配列決定反応のためのテンプレートとして使用することができる。Gelfandらは、Thermus aquaticusという生物から得られた熱安定性酵素「Ｔａｑポリメラーゼ」について記載しており、その酵素は、この増幅工程に有用である（参照により本明細書に組み入れられる米国特許第４，８８９，８１８号；第５，３５２，６００号；及び第５，０７９，３５２号を参照されたい）。ＮＡＳＢＡ、３ＳＲ、Ｑｂレプリカーゼ、及び分枝鎖増幅などの代替増幅技法が公知であり、当業者に利用できる。「ＲＴ−ＰＣＲ」という用語は、一般にＲＮＡ配列の増幅を許す逆転写段階を含む増幅を表す。
【００５７】
ポリヌクレオチド増幅テンプレートの調製
本発明は、ＨＣＶ及びその変異型の増幅及び配列決定に関するものである。本発明の方法は、例えばメッセンジャーＲＮＡを含めたＤＮＡ又はＲＮＡを採用することがあり、そのＤＮＡ又はＲＮＡは一本鎖であっても二本鎖であってもよい。さらに、それぞれの一つの鎖を有するＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを利用することができる。これらの核酸の任意の混合物もまた採用することができるし、同一又は異なるプライマーを使用して、本明細書における以前の増幅反応から産生された核酸をそのように利用することができる。増幅される特異的核酸配列は、より大きい分子の単なる画分のこともあるし、特異的配列が核酸全体を構成するように、異なる分子として最初に存在することもある。
【００５８】
増幅される配列が、純粋な形で最初に存在する必要はなく、その配列は、複合混合物の副画分であってもよいし、核酸配列の部分であってもよい。出発核酸は、同一又は異なりうる、一つを超える所望の特異的核酸配列を有してもよい。したがって、本工程は、一つの特異的核酸配列を大量に生成するためだけではなく、一つを超える塩基対の変異が配列に存在するならば、同一又は異なる核酸分子に局在する一つを超える異なる特異的核酸配列を同時に増幅するためにも有用である。
【００５９】
核酸テンプレートは、任意の起源、例えばｐＢＲ３２２などのプラスミドから、クローニングされたＤＮＡ若しくはＲＮＡから、又は任意の供給源由来の天然ＤＮＡ若しくはＲＮＡから得ることができる。ＤＮＡ又はＲＮＡは、Maniatisら（Molecular Cloning (1982), 280-281）により記載された技法のような、多様な技法により血液、組織材料又は羊膜細胞から抽出することができる。
【００６０】
細胞が溶解して細胞内構成要素の分散が起こるまで、細胞を低張緩衝液に懸濁し、一般に約１から１５分間約９０〜１００℃に加熱するならば、核酸を精製せずに細胞を直接使用することができる。加熱段階の後で、溶解した細胞に増幅試薬を直接加えることができる。この直接細胞検出法は、末梢血リンパ球及び羊膜細胞に使用することができる。
【００６１】
試料中に含まれるターゲット核酸は、最初はＲＮＡの形であるもので、好ましくはｃＤＮＡに逆転写され、それから当業者に公知の物理的、化学的又は酵素的手段を含めた任意の適切な変性法を使用して変性される。鎖分離のための好ましい物理的手段は、核酸が完全に（＞９９％）変性するまで加熱することを伴う。典型的な熱変性は、数秒から数分までの範囲の時間で約８０℃から約１０５℃の範囲の温度を伴う。変性の代わりとして、ターゲット核酸は試料中で一本鎖の形で、例えば一本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡウイルスの形で存在することがある。
【００６２】
次に、変性した核酸鎖は、予備選択されたオリゴヌクレオチドプライマー及び所望により増幅された配列を検出するためのラベル化オリゴヌクレオチド（本明細書では「プローブ」と呼ばれる）と共に、核酸一本鎖へのそのプライマー及びプローブの結合を容易にする条件でインキュベーションされる。当技術分野において公知のように、一つのプライマーから合成された伸長産物がそのテンプレート（相補体）から分離されたときに、その伸長産物が他のプライマーの伸長のためのテンプレートとして働いて所定の長さの複製鎖をもたらすような、二本鎖配列に沿った相対位置であるように、プライマーは選択される。
【００６３】
ＨＣＶの増幅
本発明の一局面は、複数のＨＣＶ種のそれぞれについてその種のタイプ及び／又はサブタイプを示す、ＨＣＶのＮＳ５Ｂ領域の少なくとも部分を増幅することによって、被験試料に存在するＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）種の遺伝子型を判定するための方法に関するものである。
【００６４】
一態様では、この方法は、（ａ）複数のＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域の、配列番号１のヌクレオチド約８２４５から約８２６９に相補的な縮重ヌクレオチド配列（例えばフォワードプライマーＦＦ１及び／又はＦＦ２）又はその相補体を含む縮重オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーと、複数のＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域の、ヌクレオチド約８６１６から約８６４１に相補的な縮重ヌクレオチド配列（例えばリバースプライマーＲＲ１）又はその相補体との混合物を提供する段階；及び（ｂ）前記ＮＳ５ｂ領域の部分のヌクレオチド配列を増幅させる段階を含む。
【００６５】
特定の態様では、縮重オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーの混合物は、複数のＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域の、配列番号１のヌクレオチド８２５６から８２７８に相補的な縮重ヌクレオチド配列（例えばＣＬＩＰ配列決定プライマーＭ−ＮＳ５ｂ−Ｃｙ５．５）又はその相補体と、複数のＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域のヌクレオチド８６１１から８６３３由来のＮＳ５ｂ領域（例えばＣＬＩＰ配列決定プライマーＭ−ＮＳ５ｂ−Ｃｙ５）に相補的な縮重ヌクレオチド配列又はその相補体とを含む。
【００６６】
別の特定の態様では、縮重オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーの混合物は、以下の式：
【００６７】
【表１６】
2009521235.tif 000006
の一つ又は複数により定義される縮重オリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含む。
【００６８】
なお別の特定の態様では、縮重オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーの混合物は、以下の式：
【００６９】
【表１７】
2009521235.tif 000007
の一つ又は複数により定義される縮重オリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含む。
【００７０】
核酸の配列決定
上記のようなＤＮＡの増幅の結果として、豊富な起源の配列決定用ＤＮＡが生じるものである。上記のように調製されたポリヌクレオチドテンプレートは、ヌクレオチドの配列決定のために当業者に利用でき、公知である数多くの方法のうち任意のものを使用して配列決定される。
【００７１】
ヌクレオチドを配列決定するために数多くの方法が当業者により利用でき、公知であり、そのうち任意のものを本発明の方法に使用することができる。配列決定の周知の一方法は、Sangerら（PNAS (USA) 74(12): 5463-5467 (1977)）により最初に記載され、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）２．０製品資料（Amersham Life Sciences, Cleveland）に詳述され、さらに最近では欧州特許ＥＰ−Ｂ１−６５５５０６に詳しく述べられた「鎖終結」法であり、これらの内容は、全て参照により本明細書に組み込まれる。この工程では、配列決定されるＤＮＡを単離し、一本鎖にし、四つの容器に入れる。各容器には、プライマーと配列決定されるＤＮＡとの間のハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションされたプライマーの鎖伸長の助けとなる緩衝液に入ったＤＮＡ鎖を複製するために必要な構成要素が入っており、その構成要素には、テンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼ、配列決定されるＤＮＡの配列決定開始部位に相補的な短鎖プライマー分子、ならびに塩基Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴのそれぞれについてのデオキシリボヌクレオチド三リン酸がある。加えて、各容器には、少量の１種類のジデオキシヌクレオチド三リン酸、例えばジデオキシアデノシン三リン酸（「ｄｄＡ」）、ジデオキシグアノシン三リン酸（「ｄｄＧ」）、ジデオキシシトシン三リン酸（「ｄｄＣ」）、ジデオキシチミジン三リン酸（「ｄｄＴ」）が入っている。各容器では、単離されたＤＮＡの各小片はプライマーとハイブリダイゼーションする。それからプライマーは、１回に一つの塩基が伸長し、テンプレートＤＮＡと相補的な新しい核酸ポリマーを形成する。ジデオキシヌクレオチドが伸長中のポリマーに組み込まれると、そのポリマーはさらなる伸長から防止される。したがって、容器中のジデオキシヌクレオチドに対応するヌクレオチドの位置を示す特定の長さの伸長したポリマーのセットが各容器で形成する。それから、これらのポリマーのセットは、配列を判定するためにゲル電気泳動を使用して評価する。
【００７２】
ポリヌクレオチドの配列決定は、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡのいずれかを使用して行うことができる。プライマー伸長のためのポリメラーゼの使用は、一本鎖ＤＮＡテンプレートを必要とする。好ましい態様では、本発明の方法は、配列決定の結果の確認用反対鎖の確認を取るために二本鎖ＤＮＡを使用する。二本鎖ＤＮＡテンプレートは、二つの相補的ＤＮＡテンプレートを一本鎖に分離するためにアルカリ変性又は熱変性のいずれかを使用して配列決定することができる。重合の間に、ＤＮＡテンプレートの各分子は、相補的プライマー伸長鎖として一度コピーされる。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴａｑ、Ｂｓｔ、Ｔｔｈ又はＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ）は、熱変性、プライマーアニーリング、伸長及びジデオキシ終結の交互の期間を経た配列決定反応において二本鎖ＤＮＡテンプレートの繰り返しサイクリングを可能にする。このサイクリング工程は、少量の投入ＤＮＡテンプレートを効果的に増幅して、配列決定に充分なテンプレートを産生する。
【００７３】
配列決定は、ＰＣＲ増幅反応産物に直接行うこともまたできる。増幅されたＤＮＡのクローニングは比較的直接的であるが、ＰＣＲ産物の直接配列決定は、配列情報の獲得を促進し、速める。ＰＣＲ反応物が、異なる増幅産物を生成する限り、その産物は直接配列決定しやすい。ＰＣＲ産物がクローニングされ、単一のクローンが配列決定される方法とは対照的に、ＰＣＲ産物の配列が直接分析されるアプローチは、一般に比較的高い誤差率のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによって影響を受けない。誤差は、分子にわたり確率論的に分布している可能性が強い。したがって、圧倒的多数の増幅産物は、正確な配列からなるものである。ＰＣＲ産物の直接配列決定は、クローニングされたＰＣＲ産物を配列決定することに比べて、（１）生きた細胞の使用に依存しない単純な酵素過程であることから、容易に標準化され、かつ（２）各試料について単一の配列だけを判定する必要がある点で、有利である。
【００７４】
本発明に使用される増幅方法は、配列決定と共に同時に使用することもまたできる。同時の増幅及び配列決定のための方法は、当技術分野において広く公知であり、それには、カップリングした増幅及び配列（coupled amplification and sequence）（ＣＡＳ）（Ruano and Kidd, Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 88(7): 2815-2819 (1991)及び米国特許第５，４２７，９１１号に記載されており、これらは、参照により本明細書に組み入れられる）及びＣＬＩＰ増幅及び配列決定（米国特許第６，００７，９８３号及びJ. Clin. Microbiology 41(4); 1586-1593 (April 2003)に記載されており、これらは、参照により本明細書に組み入れられる）が含まれる。ＣＬＩＰ配列決定は以前に産生したＰＣＲ増幅フラグメントを同時のＰＣＲ増幅及び直接配列決定に供する。ＣＡＳ配列決定では、第一反応段階で試料を二つのプライマーで処理し、いくつかのサイクルの間増幅させ、１００００から１０００００倍の増幅を実現する。次に、増幅反応の対数期の間にｄｄＮＴＰを加え、追加の熱サイクルの間に反応物を加工し、鎖終結配列決定用フラグメントを生成させる。ＣＡＳ工程は、中間での試薬（ｄｄＮＴＰ試薬）の添加を必要とし、それは誤差又は汚染の機会を持ち込み、自動化のために使用される任意の装置の複雑さを増大させる。したがってＣＡＳ法は、好ましくはＣＬＩＰ配列決定と組み合わせられ、ＣＬＩＰ配列決定は以前に産生したＰＣＲ増幅フラグメントを同時のＰＣＲ増幅及び直接配列決定に供する。ＣＬＩＰ（登録商標）法を使用した同時の増幅及び配列決定は、例えば本明細書に記載される試薬を使用して、ＴＲＵＧＥＮＥ（登録商標）ＨＣＶ遺伝子型同定キット（Bayer HealthCare LLC）などの市販のキットに記載されているものと類似した条件で実現することができる。
【００７５】
特定の局面では、本発明はＨＣＶの配列決定に関するものである。本発明の方法に使用される二本鎖ＤＮＡテンプレートは、例えばＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡを含めたＲＮＡから得ることができる、一本鎖又は二本鎖のことがある。加えて、ＤＮＡテンプレートは、ＤＮＡの一つの鎖及びＲＮＡの一つの鎖を有するＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの形であってもよい。これらの核酸のうち任意のものの混合物もまた採用することができるし、同一又は異なるプライマーを使用して本明細書における以前の増幅反応から産生された核酸をそのように利用してもよい。増幅される特異的核酸配列は、単により大きい分子の画分のことがあるし、特異的配列が核酸全体を構成するように異なる分子として最初に存在することもある。
【００７６】
ＨＣＶの遺伝子型同定
本発明は、ＨＣＶを含むと疑われるか、ＨＣＶを含むことが公知の試料中のＨＣＶを遺伝子型同定するための新規な方法及び試薬を含む。
【００７７】
本発明は、ＨＣＶの領域を包含するプライマーを提供することによって上に言及する問題に取り組む。
【００７８】
本発明の配列決定プライマーは、ＨＣＶのＮＳ５ｂ領域に特異的なオリゴヌクレオチドから成り、そのオリゴヌクレオチドは、ＨＣＶの部分を増幅させ配列決定するために使用することができる。当業者に公知の方法により、ＨＣＶに感染していると疑われる個体から得られた試料は、ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかの形のウイルスＲＮＡの回収に使用する。試料から得られたウイルスＨＣＶ  ＲＮＡは、ｃＤＮＡに逆転写される。次に、ポリメラーゼ連鎖反応又はいくつかの他のプライマー伸長に基づく方法を使用してｃＤＮＡテンプレートが増幅される。次に、結果として生じた増幅されたフラグメントは、ＨＣＶの所望のＮＳ５ｂ領域を包含するプライマーのセットを用いて、サイクル配列決定法又はＣＬＩＰ（商標）二方向配列決定を使用して最初に配列決定される。
【００７９】
本発明の特定の一局面は、ＨＣＶを含むと疑われる試料中の、ＨＣＶのＮＳ５ｂ領域の部分を増幅及び遺伝子型同定するための方法である。
【００８０】
ＨＣＶの配列決定
本発明は、一般に被験試料中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）種を遺伝子型同定するための改良法及び試薬を対象とする。本発明のある局面では、本発明は、試料中のＨＣＶ種のＮＳ５Ｂ領域の部分を配列決定し、その遺伝子型を判定する方法に関するものである。
【００８１】
一般に、本発明は、複数のＨＣＶ種のそれぞれについてその種のタイプ及び／又はサブタイプを示す、ＨＣＶのＮＳ５Ｂ領域の少なくとも部分を配列決定することにより、被験試料に存在するＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）種の遺伝子型を判定するための方法に関するものである。
【００８２】
本発明は、ＨＣＶのＮＳ５ｂ領域の配列又はその部分を判定するための方法及びプライマーもまた含む。本発明の配列決定プライマーは、検出可能なラベルでラベルされていることがあるフォワードプライマー及びリバースプライマーの両方を含む。最も一般的な配列決定装置のために、蛍光ラベルが理想的であるが、呈色ラベル、色素発生ラベル、蛍光発生ラベル（化学ルミネセンスラベルを含む）、及び放射性ラベルを含めた他の種類のレベルもまた採用することができる。プライマーの組み合わせは、逆転写、増幅又は配列決定に適切な他の試薬を含むことがあり、もちろん分析のためのＨＣＶ遺伝子材料を含むことがある。
【００８３】
下に開示される本発明の配列決定プライマーは、好ましくは下に開示される配列と同じ配列を有するプライマーの中から選択されるが、本発明は、当該分野の技術により設計及び構築することができる等価の特異性及び機能を有する縮重配列を含むことが考えられている。具体的には、配列決定プライマーは、１５以上のヌクレオチドの上記プライマーのフラグメントを含む。配列決定プライマーは、１６、１７、１８、１９又は２０以上のヌクレオチドの上記プライマーのフラグメントもまた含むことがある。そのような縮重配列の設計及び構築は、当業者に周知である。
【００８４】
増幅プライマーとは対照的に、配列決定プライマーは、３’塩基に関して同じ配置を有さないならば一緒に混合してはならないため、特定の縮重塩基位置だけを下に図示するが、３’配置を改変することもまたできることを了解されたい。例えば５’の長さは、より高い配列の保存性の領域を含むように、又は融解温度及び結合のストリンジェンシーを改変するように変化させることができる。一次プライマーで成功率が充分であることが見出されたならば、非縮重プライマーセットが好ましい。反応条件は、性能にも顕著に影響することがある。配列決定プライマーの潜在的改変は、以下の節及び実施例に例示する。
【００８５】
一態様では、本発明の方法は、前記ＨＣＶ種の遺伝子型を示す、ＨＣＶのＮＳ５ｂ領域の少なくとも部分のヌクレオチド配列を最初に判定する段階を含む。ＨＣＶのＮＳ５ｂ領域の部分であって、その遺伝子型を示す部分は、複数のＨＣＶ種のヌクレオチド配列に対応する同じ領域であって、その複数のＨＣＶ種のそれぞれの遺伝子型を示す領域であろう。したがって、本発明の一局面は、特定のＨＣＶ種のタイプ及び／又はサブタイプを示す、ＨＣＶ種に共通の領域の同定である。したがって、任意のＨＣＶ種のこの領域の配列決定は、上記段階で判定されたＮＳ５ｂ領域の前記部分のヌクレオチド配列を、公知の配列／遺伝子型の複数のＨＣＶ種の一つの遺伝子型に関連づけることにより、その種のタイプ及びサブタイプの判定を可能にする。
【００８６】
別の態様では、この方法は、（ａ）前記ＨＣＶ種の遺伝子型を示すＨＣＶのＮＳ５ｂ領域の少なくとも部分のヌクレオチド配列を判定する段階であって、遺伝子型１、２、３、４、５及び６を有する各ＨＣＶ種の対応するヌクレオチド配列が前記種の遺伝子型を示す段階；ならびに（ｂ）（ａ）で判定されたＮＳ５ｂ領域の前記部分のヌクレオチド配列を、ＨＣＶ遺伝子型１、２、３、４、５及び６の一つに関連づける段階を含む。
【００８７】
なお別の態様では、この方法は、（ａ）前記ＨＣＶ種の遺伝子型及びサブタイプを示す、ＨＣＶのＮＳ５ｂ領域の少なくとも部分のヌクレオチド配列を判定する段階であって、遺伝子型１、２、３、４、５及び６と、表１に示されるサブタイプのそれぞれとを有する各ＨＣＶ種の対応するヌクレオチド配列が、前記種の遺伝子型及びサブタイプを示す段階；ならびに（ｂ）（ａ）で判定されたＮＳ５ｂ領域の前記部分のヌクレオチド配列を、ＨＣＶ遺伝子型１、２、３、４、５及び６の一つと、表１に示されるサブタイプの一つとに関連づける段階を含む。
【００８８】
上記方法の特定の一態様では、ＨＣＶのＮＳ５ｂ領域の部分は、本質的に配列番号１のヌクレオチド位置約８３４４から約８５４７の領域からなる。
【００８９】
上記方法の別の特定の態様では、ＨＣＶのＮＳ５ｂ領域の部分は、本質的に配列番号１のヌクレオチド位置８３４４から８５４７の領域からなる。
【００９０】
別の態様では、本発明の方法は、（ａ）複数のＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域の少なくとも部分のヌクレオチド配列を産生することができる縮重オリゴヌクレオチド配列決定プライマーの混合物を提供する段階であって、前記複数のＨＣＶ種のそれぞれの対応するヌクレオチド配列が、前記種の遺伝子型を示す段階；（ｂ）前記種の遺伝子型を示すＮＳ５ｂ領域の前記部分のヌクレオチド配列を判定する段階；及び（ｃ）（ｂ）で判定された前記ＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域の前記部分のヌクレオチド配列を、前記複数のＨＣＶ種の一つの遺伝子型に関連づける段階を含む。
【００９１】
なお別の態様では、この方法は、（ａ）複数のＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域の少なくとも部分のヌクレオチド配列を産生することができる縮重オリゴヌクレオチド配列決定プライマーの混合物を提供する段階であって、前記複数のＨＣＶ種のそれぞれの対応するヌクレオチド配列が、ＨＣＶ遺伝子型１、２、３、４、５及び６の一つを示す段階；（ｂ）前記種の遺伝子型を示すＮＳ５ｂ領域の前記部分のヌクレオチド配列を判定する段階；ならびに（ｃ）（ｂ）で判定された前記ＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域の前記部分のヌクレオチド配列を、ＨＣＶ遺伝子型１、２、３、４、５及び６の一つに関連づける段階を含む。
【００９２】
なお別の態様では、この方法は、（ａ）複数のＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域の少なくとも部分のヌクレオチド配列を産生することができる縮重オリゴヌクレオチド配列決定プライマーの混合物を提供する段階であって、前記複数のＨＣＶ種のそれぞれの対応するヌクレオチド配列が、ＨＣＶ遺伝子型１、２、３、４、５及び６の一つと、表１に示されるサブタイプの一つとを示す段階；（ｂ）前記種の遺伝子型を示すＮＳ５ｂ領域の前記部分のヌクレオチド配列を判定する段階；ならびに（ｃ）（ｂ）で判定された前記ＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域の前記部分のヌクレオチド配列を、ＨＣＶの遺伝子型及びサブタイプ（例えばＨＣＶ遺伝子型１、２、３、４、５及び６の一つならびに表１に示されるサブタイプの一つ）に関連づける段階を含む。
【００９３】
特定の一態様では、縮重オリゴヌクレオチド配列決定プライマーの混合物は、複数のＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域の、配列番号１のヌクレオチド８２５６から８２７８に相補的な縮重ヌクレオチド配列（例えばＣＬＩＰ配列決定プライマーＭ−ＮＳ５ｂ−Ｃｙ５．５）又はその相補体と、複数のＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域のヌクレオチド８６１１から８６３３に相補的な縮重ヌクレオチド配列（例えばＣＬＩＰ配列決定プライマーＭ−ＮＳ５ｂ−Ｃｙ５）又はその相補体とを含む。
【００９４】
別の特定の態様では、縮重オリゴヌクレオチド配列決定プライマーの混合物は、複数のＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域の、配列番号１のヌクレオチド８２５６から８２７８に相補的な縮重ヌクレオチド配列（例えばＣＬＩＰ配列決定プライマーＭ−ＮＳ５ｂ−Ｃｙ５．５）又はその相補体と、複数のＨＣＶ種のＮＳ５ｂ領域のヌクレオチド８６１１から８６３３に相補的な縮重ヌクレオチド配列（例えばＣＬＩＰ配列決定プライマーＭ−ＮＳ５ｂ−Ｃｙ５）又はその相補体とを含む。
【００９５】
なお別の特定の態様では、縮重オリゴヌクレオチド配列決定プライマーの混合物は、以下の式：
【００９６】
【表１８】
2009521235.tif 000008
の一つ又は複数により定義される縮重オリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含む。
【００９７】
他のＨＣＶ変異体の検出を許すために、上記配列の他の変異を利用することができる。
【００９８】
実施例１  配列決定によるＨＣＶ  ＮＳ５ｂの遺伝子型同定
以下の実施例は、遺伝子型及びサブタイプを判定するためにＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５ｂ領域における２０４塩基対フラグメントの二方向配列を生成するための実験室プロトコールを記載する。
【００９９】
一般にウイルスＨＣＶ  ＲＮＡは、製造業者により説明されている通りにＱｉａｇｅｎ  ＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡミニキットを使用して、血漿試料から抽出する。簡潔には、抽出したＲＮＡ標本はランダムヘキサマーを使用して逆転写する。
【０１００】
ｃＤＮＡの合成後に、特異的プライマーを使用してｃＤＮＡテンプレート１０μLを増幅させ、３９８塩基対のアンプリコンを産生する。
【０１０１】
ＰＣＲ増幅後に、色素−プライマーＣＬＩＰ配列決定反応を行う。ＣＬＩＰ反応は、異なる蛍光色素（Ｃｙ５．５、Ｃｙ５；鎖伸長試薬）及び四つの鎖終結ジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）のうちの一つ、すなわちジデオキシアデノシン三リン酸（ｄｄＡＴＰ）、ジデオキシシチジン三リン酸（ｄｄＣＴＰ）、ジデオキシグアノシン三リン酸（ｄｄＧＴＰ）、又はジデオキシチミジン三リン酸（ｄｄＴＴＰ）でラベルされたフォワード（センス）プライマー及びリバース（アンチセンス）プライマーを使用することによって、ＤＮＡの両方の鎖を同時に配列決定する。この反応は、試料及びｄｄＮＴＰに対して高い親和性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの添加から開始する。反応混合物が熱サイクルされることから、プライマーはテンプレートＤＮＡにハイブリダイゼーションし、伸長し、次に通常はターゲットＤＮＡ配列に沿ったどこかで終結する。四つのＣＬＩＰ反応は、二つのＣＬＩＰプライマーの間のターゲットのフォワード配列及びリバース配列の両方をもたらす。反応は、各プライマーから高レベルの鎖終結反応産物を産生しながら４０サイクルを経て進行する。サイクリングプログラムの完了時に、Ｓｔｏｐ  Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｄｙｅ溶液を各反応チューブに加え、反応物を加熱して二本鎖ＤＮＡフラグメントを分離する。次に、特定の細孔径の成形マトリックスを有する超薄縦型重合ポリアクリルアミドゲルが入ったＭｉｃｒｏＣｅｌ（商標）５００カセットの上部に、各反応物の画分をロードする。このポリアクリルアミドゲルは、ＤＮＡフラグメントを１本鎖変性状態に維持するために高濃度の尿素を含む。緩衝溶液は、超薄ゲルの上部及び底部の両方と接触を維持する。高圧電場をかけ、ゲルを通して負荷電のＤＮＡフラグメントを陽極側に強制的に泳動させる。ＤＮＡフラグメントの泳動速度は、ポリアクリルアミドマトリックスにより形成される細孔径及びＤＮＡフラグメントのサイズに関係し、小さいフラグメントが速く泳動する。ポリアクリルアミドゲルの底部近くでは、レーザービームは、そのレーザーを通過して移動しているＤＮＡフラグメントに結合している蛍光色素を励起させ、検出器は蛍光色素によって生成される光の量及び波長を測定する。次に、シークエンサーによってこの光測定を収集し、データを記憶するワークステーションに送信する。各配列決定反応は、四つの鎖終結ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰ）のそれぞれについて一つずつ四つのレーンを必要とする。フォワード及びリバースＣＬＩＰ配列を組み合わせ、「最もよくマッチした」参照配列（Ｗ）の配列と比較する。オペレーターはフラグ付き位置でアライメントを検討し、必要に応じて塩基を編集する。ソフトウェアは、各試料についてＨＣＶ  ＮＳ５ｂのレポートを用意する。
【０１０２】
逆転写（ｃＤＮＡの合成）
ｃＤＮＡは、以下のプロトコール通りに試料由来のゲノムＲＮＡから合成する。
【０１０３】
下記のＲＴ試薬（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ及びＲＮａｓｅ阻害剤以外）をボルテックス処理し、微量遠心分離して分量を回収する。以下の処方に従って計算した体積を使用してＨＣＶ  ＮＳ５ｂ  ＲＴマスターミックスを調製する：
【０１０４】
【表１９】
2009521235.tif 000009
【０１０５】
ラベルの付いた各ＰＣＲチューブにＲＴ試薬（１５μL）を分注する。増幅後区域の空気停滞フードにチューブを移動させる。冷凍庫から試料及び対照ＲＮＡ抽出物を取り出し、室温で解凍する。解凍したＲＮＡ抽出物（１０μL）は、ＲＴ試薬が入った適切なチューブに添加する。トレーを軽くたたいて試薬とＲＮＡを混合する。
【０１０６】
以下の段階を行うようにプログラムされたサーモサイクラーにチューブを置く：
【０１０７】
【表２０】
2009521235.tif 000010
【０１０８】
サーモサイクラーからＲＴ試料を取り出し、４℃で保存する。
【０１０９】
ＰＣＲ増幅
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅は以下のように行う。ＰＣＲチューブを用意し、試料のためにラベルを付ける。下記のＰＣＲ試薬（AmpliTaq Gold酵素以外）をボルテックス処理し、微量遠心分離して分量を回収する。臨床的に関連する複数のＨＣＶ種を増幅するように設計された、以下のヌクレオチド配列を有する縮重プライマーの混合物を調製する：
【０１１０】
【表２１】
2009521235.tif 000011
【０１１１】
試薬の体積についてのワークシートを使用してＰＣＲマスターミックスを調製する。以下の処方に従って体積を計算する：
【０１１２】
【表２２】
2009521235.tif 000012
【０１１３】
ラベルの付いた各ＰＣＲチューブにＰＣＲマスターミックス（４０μL）を分注する。ＰＣＲ試薬が入った、適切なラベルの付いたチューブにＲＴ  ｃＤＮＡ（１０μL）を加え、以下の段階を行うようにプログラムされたサーモサイクラーにチューブを置く：
【０１１４】
【表２３】
2009521235.tif 000013
【０１１５】
ＰＣＲ試料をサーモサイクラーから取り出し、４℃で最長２週間保存してもよいし、下記のようにＣＬＩＰ配列決定に供してもよい。
【０１１６】
ＣＬＩＰ配列決定
複数の臨床的に関連するＨＣＶ種を配列決定するように設計され、以下のヌクレオチド配列を有する縮重配列決定プライマーの混合物を調製する：
【０１１７】
【表２４】
2009521235.tif 000014
【０１１８】
ＰＣＲストリップチューブ及びキャップの必要数をトレーに集め、冷却ブロックに入れる。各試料及び対照用のラベルを０．５mLチューブに付け、冷却ブロックに入れる。ＣＬＩＰ試薬（Thermo Sequenase酵素以外）を冷凍庫から取り出し、室温で解凍する。各構成要素（Thermo Sequenase酵素以外）をボルテックス処理し、短時間回転させて分量を回収する。調整可能な１０μLピペットを使用して、各ＰＣＲチューブのウェルのそれぞれのカラムの底に、適切なＣＬＩＰターミネーター混合物３μLを直接移す。
【０１１９】
Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ酵素をＴｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ希釈緩衝液に１：１０希釈したものを作製する。以下の処方に従って計算した試薬体積を使用してＣＬＩＰマスターミックスを調製する：
【０１２０】
【表２５】
2009521235.tif 000015
【０１２１】
ＣＬＩＰマスターミックス２０μLをラベルの付いた各チューブに分注し、ＣＬＩＰ試薬が入ったチューブに移す。ＣＬＩＰマスターミックスが入った適切なチューブにＰＣＲアンプリコン（２μL）を加え、短時間ボルテックス処理し、微量遠心分離し、チューブの底に分量を収集する。冷却ブロック中の４本のターミネーターチューブのそれぞれにＣＬＩＰミックス（５μL）を添加する。
【０１２２】
ＣＬＩＰ増幅／配列決定反応は、以下のプロトコール通りにサーモサイクラーで行う：
【０１２３】
【表２６】
2009521235.tif 000016
【０１２４】
サーモサイクラーからチューブを取り出し、各チューブにロード停止色素（６μL）を加え、ボルテックス処理し、混合する。サーモサイクラーにチューブを戻し、以下の変性条件に供する：
【０１２５】
【表２７】
2009521235.tif 000017
【０１２６】
サーモサイクラーからチューブを取り出し、保存するか、下記のようにゲル電気泳動に供する。
【０１２７】
Long-Read Tower Sequencerを製造業者によって説明されるように使用して、以下のシーケンサー制御設定を使用してゲル電気泳動を行う：
ゲル温度（℃）                      ６０℃
ゲル電圧（Ｖ）                      １８００Ｖ
レーザー出力（％）                  ５０％
運転時間（サンプリング間隔）        ０．５秒
運転時間（運転持続時間）            ５０分
【０１２８】
アッセイは、試料及び対照の情報と共に割り付けられる。
【０１２９】
実施例２  配列決定によるＨＣＶ  ＮＳ５ｂ遺伝子型同定の性能特性の評価
ＨＣＶ  ＮＳ５ｂ遺伝子型同定アッセイの性能特性は、以下の試薬を使用して実質的に上記実施例１のような遺伝子型同定アッセイに基づき評価した。
【０１３０】
【表２８】
2009521235.tif 000018
【０１３１】
【表２９】
2009521235.tif 000019
【０１３２】
以下の試料を使用した：
【０１３３】
【表３０】
2009521235.tif 000020
2009521235.tif 000021
2009521235.tif 000022
【０１３４】
分析精度の解析
本発明の方法及び試薬の分析精度を判定するために、遺伝子型１〜５を含む２５員パネル、遺伝子型１〜６を含む６員パネル、遺伝子型４〜１０を含む１２員パネルを使用して分析を行い、遺伝子型１〜６を含む追加の臨床試料１５個を分析し、結果を以前の遺伝子型と比較した。
【０１３５】
上記実施例１に記載した方法を使用して試料を遺伝子型同定し、ＬｉＰＡ若しくはＴｒｕＧｅｎｅ  ５’ＮＣ遺伝子型同定のいずれか、又は試料の項で詳述した別のＮＳ５ｂ法により以前にキャラクタリゼーションされた同試料の遺伝子型と比較し、分析精度を判定した。この分析の結果を以下の表にまとめる：
【０１３６】
【表３１】
2009521235.tif 000023
2009521235.tif 000024
2009521235.tif 000025
【０１３７】
分析した合計５８個の精度試料は、５１個のＮＳ５ｂ遺伝子型の結果をもたらした。ＮＳ５ｂを用いて遺伝子型同定可能な５１個中５１個、すなわち１００％の試料が、以前に判定された遺伝子型とタイプレベルで一致する遺伝子型をもたらした。５１個中４８個の試料がタイプレベル及びサブタイプレベルの両方で一致し、５１個中３個の試料がタイプレベルだけで一致した（三つ全てはＬｉＰＡにより１ｂであり、ＮＳ５ｂにより１ａであった）。７個の試料（遺伝子型６ａの５個及び遺伝子型７ｃの２個）は増幅に失敗し、ＮＳ５ｂにより遺伝子型同定できなかった。
【０１３８】
上記データは、本発明の遺伝子型同定アッセイの精度が、他の市販のアッセイよりも優れていることを実証している。このアッセイは、ＮＳ５ｂで遺伝子型同定可能であった５１個の試料について、タイプレベルで以前の遺伝子型の結果と１００％の一致を示した。ＮＳ５ｂを用いて遺伝子型同定不可能であった７個の試料は、この相の評価から除いた。遺伝子型同定不可能な７個の試料全てをこの評価の第２相で繰り返した。
【０１３９】
遺伝子型６ａ及び７ｃを増幅するための代替セットのＲＴ−ＰＣＲプライマーは、開発中であり、そのプライマーは、第２相分析に関連して続いて下記のように設計及び分析した。
【０１４０】
再現性の分析
本発明のＨＣＶ  ＮＳ５ｂ遺伝子型同定アッセイ及び試薬の再現性を判定するために、遺伝子型１〜１０を有する合計２２個の試料を二つの別々の試験で２人の作業者により分析し、タイプレベル及びサブタイプレベルでの一致について結果を比較した。８回の試験のそれぞれについての陽性対照の結果もまた比較した。
【０１４１】
【表３２】
2009521235.tif 000026
【０１４２】
【表３３】
2009521235.tif 000027
【０１４３】
２人の作業者により２２個の試料を別々に分析し、１６個のＮＳ５ｂ遺伝子型を得た。上記データは、ＮＳ５ｂ遺伝子型同定アッセイが、２人の作業者の間で、及び２回の試験の間でタイプレベル及びサブタイプレベルの両方で１６個中１６個、すなわち１００％のＮＳ５ｂ遺伝子型の一致を招いたことを実証している。
【０１４４】
６個の試料（遺伝子型６ａの４個及び遺伝子型７ｃの２個）は、両方の作業者に増幅も遺伝子型同定も不可能であった。試験間再現性：８回の試験からの陽性対照の８回の反復の間で１００％の一致。
【０１４５】
感度の分析
遺伝子型同定アッセイの感度レベルを判定するために、遺伝子型１〜１０の希釈パネルもまた下記のように調製した。
【０１４６】
【表３４】
2009521235.tif 000028
*販売元が与える分析証明書の値に基づき作製した感度パネルの希釈物。その後ｂＤＮＡにより判定されたウイルス量は、これらの感度パネルのメンバーについての公称値を再計算するために使用した。
**この試料は、ＬｉＰＡ及びＨＣＶ  ５’ＮＣ  ＴｒｕＧｅｎｅ遺伝子型同定により２ｂと確認され、ＮＳ５ｂ遺伝子型同定を用いて１ｂと遺伝子型同定される。この試料は、遺伝子型の不一致を解明する追加の試験のために参照検査室に送られる。
【０１４７】
ＨＣＶ遺伝子型１〜５の試料が正確かつ再現的に１０００c/mL（１９２IU/mL）で遺伝子型同定されたことから、上記データは、ＨＣＶ  ＮＳ５ｂ遺伝子型同定アッセイが、遺伝子型１〜５について許容される感度の基準に適合することを示す。
【０１４８】
しかし、ＨＣＶ  ＮＳ５ｂ遺伝子型同定アッセイは、ＨＣＶ遺伝子型６についての試料を一貫して遺伝子型同定しなかった。ＨＣＶ遺伝子型６の試料は、１０００c/mL（１９２IU/mL）で一貫して遺伝子型同定不可能であった。したがって、遺伝子型６〜１０についての感度用希釈物を用意する際の問題が原因で、１０００c/mLでの感度はこのデータから判定することができない。したがって、ＮＳ５ｂ遺伝子型同定アッセイは、遺伝子型１〜５について１０００c/mLで変動する一貫性で正確である。
【０１４９】
実施例３  配列決定によるＨＣＶ  ＮＳ５ｂ遺伝子型同定の性能特性の評価
分析精度の分析
遺伝子型１〜６を含む６員パネル、遺伝子型４〜１０を含む１２員パネル、ならびに遺伝子型４、５及び６を含む追加の四つの臨床試料からなる第１相検証用精度試料のサブセットを分析し、結果を以前の遺伝子型と比較する。試料は、ＬｉＰＡ若しくはＴｒｕＧｅｎｅ  ５’ＮＣ遺伝子型同定のいずれか、又は試料の項に詳述した別のＮＳ５ｂ法により以前にキャラクタリゼーションした。
【０１５０】
【表３５】
2009521235.tif 000029
【０１５１】
上記データは、ＨＣＶ  ＮＳ５ｂ遺伝子型同定アッセイの精度が、以前に失敗した二つの７ｃ試料及び四つの６ａ試料を含めた全ての試料についてタイプレベルで１００％一致することを示す。
【０１５２】
再現性の分析
四つの試験のそれぞれに関する陽性対照の結果を以下のように比較した：
【０１５３】
【表３６】
2009521235.tif 000030
【０１５４】
上記データは、４回の試験からの陽性対照の４回の反復の間で１００％の一致を示す。
【０１５５】
感度の分析
遺伝子型１〜６の希釈パネルを下に詳述するように調製した：
【０１５６】
【表３７】
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*この試料はＬｉＰＡ及びＨＣＶ  ５’ＮＣ  ＴｒｕＧｅｎｅ遺伝子型同定により２ｂと確認され、ＮＳ５ｂにより１ｂと遺伝子型同定される。この試料は、遺伝子型の不一致を解明する追加の試験のために参照検査室に送られる。
【０１５７】
このアッセイは、遺伝子型１〜５について１０００c/mL（１９２IU/mL）で正確で再現性のある遺伝子型を生じ、同様に遺伝子型６について５０００c/mL（９６２IU/mL）で正確で再現性のある遺伝子型を生じる。
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】本発明の特定の態様において利用されるＨＣＶ  ＮＳ５ｂドメイン及び関連する領域を示す概略図である。
【図２−１】ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ６７４６３に示される、ＨＣＶのＮＳ５ｂドメインのヌクレオチド配列を示す図である。プライマー領域を強調し、欄外に名称を示す。図２は配列番号１２に対応する。
【図２−２】ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ６７４６３に示される、ＨＣＶのＮＳ５ｂドメインのヌクレオチド配列を示す図である。プライマー領域を強調し、欄外に名称を示す。図２は配列番号１２に対応する。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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