(57)【要約】  本発明は、ラベルが試料中に導入され、前記試料上に平坦な表面が調製され、かつ前記試料表面の一連の像がたとえば走査電子顕微鏡によって撮られる、方法に関する。前記ラベルは、金のラベル又はたとえば蛍光ラベルであって良い。各像を取得する間に表面層を除去することによって、一の像での表面のラベルが除去され、そのラベルは次の像では見えない。それにより前記試料中でのラベルの位置を3D再構成することが可能となる。
2009523227.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料の分析方法であって、
当該方法は、
前記試料上に実質的に平坦な表面を調製する手順、
ラベルを含むラベリング剤に前記試料を曝露することによって、前記試料にラベルを導入する手順、
前記試料の情報を含む前記像の一連の像を取得する手順であって、前記情報は前記試料を粒子ビームに曝露することによって入手可能となる手順、
取得された前記像の各々での前記ラベルの相対位置を取得する手順、及び
取得された前記相対位置から、前記のラベルの相対位置の3D再構成を得る手順、
を有し、
前記像の各々が実質的に同一配向での前記試料を示し、かつ
前記一連の像のうちの連続する像の間に前記試料から表面層が除去されることで、新たな表面層が、最初に形成された前記平坦な表面に対して実質的に平行のままとなる、
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ラベルは蛍光ラベルで、
前記粒子ビームは前記試料表面にわたって走査される微細に集束された粒子ビームで、かつ
前記情報は前記粒子ビームへの曝露に応じて前記ラベルから放出される光の量に比例する情報を有する、
請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記発光ラベルは無機のナノ粒子で、
該ナノ粒子は発光中心として機能する発光活性化イオンがドーピングされた母体格子を有し、かつ
前記の像を取得する手順は前記活性化イオンから放出される光を検出する手順を有する、
請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記発光ラベルが無機の量子ドットナノ粒子である、請求項2に記載の方法。
【請求項５】
前記発光ラベルが有機のラベルである、請求項2に記載の方法。
【請求項６】
前記ラベルが高Z材料を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記高Z材料は金のナノ粒子である、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記金のナノ粒子は、銀又は金によって改善される、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記の像を取得する手順が、粒子検出器によって検出される信号を処理する手順を有する、請求項6-8のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記の像を取得する手順が、X線検出器によって検出される信号を処理する手順を有する、請求項6-8のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記1層以上の表面層は粒子ビームを用いて除去される、上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記粒子ビームが微細に集束されたビームである、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記1層以上の表面層が電磁放射線ビームによって除去される、請求項1-10のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記1層以上の表面層が昇華によって除去される、請求項1-10のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記1層以上の表面層の除去が、粒子光学装置内にてその場で行われる、上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
ラベルの上限が、ある像中での前記ラベルの不存在及び次の像中での前記ラベルの存在に基づいて決定され、かつ
ラベルの下限が、ある像中での前記ラベルの存在及び次の像中での前記ラベルの不存在に基づいて決定される、
上記請求項のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は試料の分析方法に関する。当該方法は、
・前記試料上に実質的に平坦な表面を調製する手順、
・ラベルを含むラベリング剤に前記試料を曝露することによって、前記試料にラベルを導入する手順、
・前記試料の一連の像を取得する手順、
・取得された前記像の各々での前記ラベルの相対位置を取得する手順、及び
・取得された前記相対位置から、前記のラベルの相対位置の3D再構成を得る手順、
を有する。
【背景技術】
【０００２】
係る方法は、非特許文献1に記載されている電子断層撮影から既知である。
【０００３】
生物学及び組織学では、特定の過程がたとえば生体試料中のどこでそしてどのようにして発生するのかについての知見を得るため、たとえば生体試料中に存在する、タンパク質、抗体、及びヌクレオチドのような特定分子の位置を決定する必要がある。同様の必要性は、たとえばポリマーの分析中にも生じる。
【０００４】
電子断層撮影では、透過電子顕微鏡(TEM)というそれ自体は既知である装置内で、薄い試料に電子ビームが照射される。TEMは典型的には、80keVから300keVのエネルギーを有する。試料は、電子が部分的に透過するのに十分な程度に薄い。試料の各異なる部分は各異なる透過率を示す。その結果妨害されずに試料を透過する電子の量は場所に依存する。各像を作成する間に試料を傾けながら（所謂チルトシリーズ）一連の像を作成し、かつこの一連の像からデータを収集することによって、試料の3D再構成が可能となる。
【０００５】
たとえば生体組織内の特定の構造を可視化するためには、所謂ラベルを特定分子に付着させて良い。これらのラベルは、高コントラストを示し、かつたとえば特定の種類の抗体に非常に特異的に付着し、他の種類の抗体及び分子には付着しないことを特徴とする。試料中のラベル位置を検出することによって、たとえば抗体の存在及び位置を決定することができる。
【０００６】
試料を透過する電子と試料を構成する原子との相互作用が、原子の陽子数Zに強く依存するので、このようにして、特に試料の原子組成の局所変化を画像化することが可能である。生体材料はほとんど高Z原子を含まないので、特に高Z材料を含むラベルによるラベリングは非常に有効である。係るラベルは、タンパク質-金の複合体を含むラベルであって良い。その複合体中では、典型的な直径が1から50nmの金ナノ粒子として金が存在する。係るラベルは、たとえばナノプローブ株式会社（Nanoprobes  Inc.）からナノゴールド(Nanogold)（登録商標）の名称で市販されている。
【０００７】
他のラベリング方法は蛍光ラベルを用いる。これらのラベルは、光又はたとえば電子ビームの照射に応じて、大抵の場合非常に特定の波長を有する蛍光を放出する。そのように放出される光子は光子検出器によって検出可能である。それによりその位置でのラベルの存在が示唆される。係る蛍光ラベルの例は、たとえば所謂半導体量子ドットで、たとえばエビデントテクノロジー(Evident  Technologies)社からエビタグ(EviTag)（登録商標）の名称で販売されている。また有機蛍光ラベルも知られていて、かつ広く用いられている。他の種類の（無機）ラベルは特許文献1に記載されている。
【０００８】
試料上に平坦な表面を調製する手順と前記試料をラベリング剤に曝露する手順は、この順序で実行されなくても良いことに留意して欲しい。つまり最初にラベルを試料に供し、続いて平坦な表面を調製することも可能である。たとえば非特許文献2を参照のこと。
【０００９】
電子断層撮影の欠点の一は、電子が試料を透過しなければならないため、極端に薄い試料にしか用いることができないことである。非特許文献1の25頁に示されているように、通常は厚さ1μm未満又は100nm未満であることが必要である。たとえば細胞内の特定構造を調査するためには、調査中の特徴部分が存在しなければならない。よって試料の厚さよりも大きな構造の全体を調査することはできない。関連する危険性として、調査される構造が、薄い試料中では全く見つからないことがある。
【００１０】
他の電子断層撮影の欠点は、非特許文献1の第3章に記載されているように、多くの試料像を作成しなくてはならない結果、その試料に照射される電子の総量が大きくなってしまうことである。従って電子断層撮影の実行中の損傷を最小限に抑制するため、たとえば-像の信号対雑音比は劣悪となるが-低照射量条件で動作させる、及び/又は、たとえば液体窒素温度又は液体ヘリウム温度のような極低温にまで試料を冷却するといったような、この損傷を最小限に抑制する対策をとることが必要となる。
【特許文献１】欧州特許出願第05112781号明細書
【特許文献２】米国特許第6546788号明細書
【非特許文献１】フランク(J.Frank)編、「電子断層撮影、透過電子顕微鏡」（Electron  tomography、three-dimensional  imaging  with  the  transmission  electron  microscope）、クルーワー学術出版(Kluwer  Academic  Publication)
【非特許文献２】ゴンザレス-メレンジ(P.Gonzalez-Melendi)他、「EM内での3D金のその場ラベリング」（”3-D  gold  in  situ  labeling  in  the  EM”）、プラント誌、第29巻、pp.237-243、2002年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、従来技術に係る方法で可能な厚さよりも厚い試料中のラベルを特定する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的のため、本発明による方法は、
・各像が実質的に同一配向での試料を示す、及び
・一連の像のうちの連続する像の間に試料から表面層が除去されることで、新たな表面層が、最初に形成された平坦な表面に対して実質的に平行のままとなる、
ことを特徴とする。
【００１３】
各像Iiでのラベル位置を決定することによって、ラベルの消失を検出することができる。ラベルが像Iiに存在し、かつ次の像Ii+1に存在しないと仮定すると、そのラベルは、像Iiと像Ii+1を取得する間に除去された層に存在していた。試料から多くの層を薄く切ることによって、各ラベルが存在する層を決定することができて、かつ3D再構成が可能となる。
【００１４】
同様にラベルが視認可能になるということは、励起及び検出が可能な程度にそのラベルが表面に存在する（蛍光ラベルの場合）、又は、高Z材料を含むラベルの場合では、そのラベルから放出される後方散乱電子が検出可能である、ことを意味する。これは、たとえば電子又はイオンのようなエネルギー粒子ビームによってラベルを検出する場合に特に有用である。なぜならそのような粒子の到達距離は、通常たとえば1μm以下だからである。
【００１５】
本発明はまた、走査電子顕微鏡(SEM)を用いた試料中でのラベル位置の3D再構成をも可能にする。走査電子顕微鏡自体は既知である。走査電子顕微鏡では、たとえば1〜50keVのビームエネルギーを有する微細に集束された電子ビームが、試料表面にわたって走査される。ビームが試料に衝突する位置から、たとえば後方散乱電子又は光子のような2次放射線が放出されて、たとえば後方散乱電子検出器又は光子検出器のような適当な検出器によって検出される。1つ以上の検出器の信号は、試料表面の像を構築するのに用いられる。電子のエネルギーはかなり低いため、試料への損傷もまた大幅に緩和される。
【００１６】
1つの試料から多くの像を取得し、かつ1つの試料の3D再構成を得るために複数の層を除去する方法は、特許文献2から既知であることに留意して欲しい。特許文献2は、試料の表面形状を決定する制御装置を有する顕微鏡によって、各層を除去した後にその試料の表面形状が決定され、かつ走査プローブ顕微鏡(SPM)によって、たとえば伝導率、電子密度などの表面特性が決定される方法について説明している。SPMを用いる代わりとして、光学顕微鏡を用いることについても開示されている。表面形状を決定する顕微鏡の代わりとして、位相干渉顕微鏡、共焦点レーザー顕微鏡及びSPMが開示されている。
【００１７】
特許文献2に係る方法は本発明の方法とは以下の点で異なる。その異なる点とは、特許文献2は平坦でない表面の調査に関するものであり、特許文献2では、顕微鏡は表面形状の決定に用いられ、かつSPMは関心ある特性の決定に用いられている点である。また特許文献2に係る方法は本発明の方法とは以下の点で異なる。それは、各層について、特許文献2に係る方法は少なくとも2つの異なる成分から得られる像を利用し、得られた像の各々は解析される像を形成し、その一は表面形状用でその他は決定される特性用である点である。さらに特許文献2は、ラベルを用いることによって試料中の特定構造を改善することについては開示していないし、また粒子ビームを用いて係るラベル位置を決定することについても開示していない。
【００１８】
本発明による方法の実施例では、ラベルは蛍光ラベルで、粒子ビームは試料表面にわたって走査される微細に集束された粒子ビームで、かつ情報は粒子ビームへの曝露に応じて前記ラベルから放出される光の量に比例する情報を有する。
【００１９】
たとえば電子ビームのような微細に集束された粒子ビームを試料にわたって走査させることによって、蛍光ラベルが励起される。これらのラベルは光子を放出して、その光子は光子検出器によって検出される。これにより、高分解能でのラベル位置の決定が可能となる。低いビームエネルギーでは、25nmよりも良好な分解能が示された。
【００２０】
たとえば2次電子及び後方散乱電子のような、微細に集束されたビームによって試料を照射することによって発生する2次粒子によってラベルは励起されるので、得られる分解能は粒子ビーム自体の分解能よりも劣る恐れがあることに留意して欲しい。
【００２１】
本発明による方法の他の実施例では、蛍光ラベルは無機のナノ粒子であり、該ナノ粒子は発光中心として機能する発光活性化イオンがドーピングされた母体格子を有し、かつ像を取得する手順は前記活性化イオンから放出される光を検出する手順を有する。
【００２２】
この種類の発光ラベルは特許文献1に記載されている。この種類のラベルを用いる利点は、たとえば電子の照射に対して非常に強い耐性を有すること、及び光退色（つまり発光特性の劣化）がほとんど起こらないことである。
【００２３】
本発明による方法に係る他の実施例では、発光ラベルは無機の量子ドットナノ粒子である。
【００２４】
本発明による方法に係るさらに他の実施例では、発光ラベルは有機ラベルである。
【００２５】
有機ラベルはここしばらくの間で広まった。特定分子に結合することを意図した多くの異なる発光ラベルが知られている。
【００２６】
本発明による方法に係る他の実施例では、ラベルは高Z材料を有する。
【００２７】
たとえばポリマー及び生体組織は主として、たとえば炭素、水素、酸素などの低Z材料で作られていて、大抵の場合高Z材料をほとんど含まない。従って高Z材料を含むラベルは、TEM（透過電子顕微鏡）とSEM（走査電子顕微鏡）のいずれを用いたときでも優れたコントラストを示す。
【００２８】
本発明による方法に係る他の実施例では、高Z材料は金のナノ粒子を含む。
【００２９】
金のナノ粒子を含むラベルは周知で、かつたとえばナノゴールド(Nanogold)（登録商標）の名称で市販されている。
【００３０】
本発明による方法に係るさらに他の実施例では、金のナノ粒子は銀又は金によって改善される。
【００３１】
試料中にすでに存在するナノ粒子に銀又は金を加えることによって、電子顕微鏡を用いたときの金ナノ粒子のコントラストを改善することは、当業者には既知の方法である。
【００３２】
本発明による方法に係る他の実施例では、像を取得する手順は粒子検出器によって検出される信号を処理する手順を有する。
【００３３】
たとえば周知であるエバハルト-ソーンレイ検出器又は固体後方散乱電子検出器のような粒子検出器は、試料から放出される2次粒子を検出するのに用いられて良い。係る検出器の出力によって、像が構築されて良い。
【００３４】
また、特に約1〜25mbarの圧力での動作に適した気体2次電子検出器が用いられても良い。この圧力では水の平衡蒸気圧以上の圧力の試料の観察が可能になるため、この圧力は魅力的である。そのような高圧で動作する検出器及び他のものは、たとえば環境型走査電子顕微鏡(ESEM)（登録商標）又は可変圧力型走査電子顕微鏡(VP-SEM)内で用いられて良い。
【００３５】
本発明による方法に係るさらに他の実施例では、像を取得する手順はX線検出器によって検出された信号を処理する手順を有する。
【００３６】
試料中に発生した2次粒子を検出する代わりに、その試料中に発生したX線が検出されても良い。
【００３７】
本発明による方法に係るさらに他の実施例では、1層以上の表面層は粒子ビームを用いて除去される。
【００３８】
たとえばイオンビームのような粒子ビームで試料をスパッタリングすることによって表面層を除去する手順自体は既知の方法である。
【００３９】
本発明による方法に係るさらに他の実施例では、粒子ビームは微細に集束されたビームである。
【００４０】
たとえばイオンビームを用いることによって、表面材料は試料からミリングされて良い。この方法は通常、たとえば微細に集束されたイオンビームを生成するイオン鏡筒と、微細に集束された電子ビームを生成する電子鏡筒の両方を有する装置で用いられる。電子ビームは、試料の観察及びラベルの位置決定（蛍光ラベル又は高Z材料ラベルの場合）に用いられて良い。イオンビームは試料から表面材料を除去するのに用いられて良い。表面にわたって走査されるそのような微細に集束されたビームを用いる結果、均一な厚さで層が除去される。
【００４１】
表面層を除去する速度を増大させるため、表面の一部分だけが除去されて良く、かつ表面層が完全に除去されなくても良いことに留意して欲しい。
【００４２】
また当業者にとって既知であるように、ミリング速度は、試料付近に特定の流体を収容することによって顕著に改善できることにも流して欲しい。用いられる流体は、調査する試料の組成に強く依存する。
【００４３】
本発明による方法に係る他の実施例では、1層以上の表面層が電磁放射線ビームによって除去される。
【００４４】
たとえばレーザーによって発生した光による表面層の除去は既知の方法である。
【００４５】
本発明による方法に係る他の実施例では、1層以上の表面層は昇華によって除去される。
【００４６】
前述したように、試料への損傷の最小化すなわち試料の変形を防ぐために、試料は極低温にまで冷却されて良い。しかしそれによりアーティファクトが発生する。発明者らは、昇華によって非常にわずかな層を除去することが可能であることを発見した。昇華は複数の像を取得する間に行われて良いが、画像化中に昇華することも可能である。後者の場合、1つの像を取得する間に表面層が除去されるが、その期間には限定されない。
【００４７】
本発明による方法に係る他の実施例では、1層以上の表面層の除去は、粒子光学装置内にてその場で行われる。
【００４８】
その場で本発明を実行することで、分析のスループットタイムが向上する。その理由は、調査される試料が存在する係る装置のチャンバを排気する必要がなくなるため、及び試料を再設置する必要がなくなるためである。
【００４９】
ここで本発明を図によって明らかにする。図中、同一番号は同一部位を指すものとする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
図1は、生体試料のSEM像を図示している。試料は2nmの金ラベルによってラベリングされている。このラベルはその後銀によって改善される。図示された像は、5kV電子ビームの設定を用いて得られた。一方後方散乱電子検出器が検出器として用いられる。
【００５１】
像1では、ラベルは、ダークスポット2,2Aとして示されている。これらのうちのいくつかが番号によって示されている。コントラストが低いため、試料中の構造3はかろうじて見える。
【００５２】
図2は、薄い表面層の除去後に画像化された試料の同一部分の像4を図示している。たとえば像1において2Aで示されたラベル（図1）など複数のラベルが消失している。よってこれらのラベルは第1像1と第2像4の間に除去された層内に存在する。このようにして試料中でのラベル位置の3D再構成を決定することができる。
【００５３】
像1及び像4の両方から分かるように、複数のスポット2は、他よりもかなり大きい。発明者らは、これがラベルの大きさの差異に起因するものではなく、より大きなドットは試料中のより深くに存在するラベルを表していることを発見した。換言すると、深くに存在するとは、表面からより除去されているということである。これは恐らく、試料中での電子ビームの相互作用体積に起因するものである。当業者には既知であるように、その体積は程度の差はあるが西洋なし形状で、表面付近で小さな直径を示し、かつ材料中を深く進むに従って大きな直径を示す。それにより、相互作用体積の小さな表面付近のラベルは、相互作用体積が大きくなる表面からさらに離れたラベルよりも、より高分解能で検出される。
【００５４】
よって本発明による方法に係る驚くべき利点は、除去される表面層が粒子ビームの侵入深さよりも小さな場合に分解能を向上させることができることである。なぜならその場合、各ラベルは、いつかは相互作用体積の小さい表面に近づくからである。
【００５５】
同様の像は、TEM又はSTEM（走査型透過電子顕微鏡）によって取得されても良いことに留意して欲しい。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】表面層が除去される前のSEM像を概略的に図示している。
【図２】表面層が除去された後のSEM像を概略的に図示している。
【図１】
2009523227.tif 000003
【図２】
2009523227.tif 000004
【国際調査報告】
2009523227.tif 000005
2009523227.tif 000006
2009523227.tif 000007