(57)【要約】  ｉｎ  ｖｉｖｏでアポ発光タンパク質を合成および発現することができる非ヒトトランスジェニック動物、その子孫、派生細胞、およびそれらの使用を記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アポ発光タンパク質遺伝子を発現することができ、細胞内カルシウム濃度の変化に応じて生物発光シグナルを生成することができる、非ヒトトランスジェニック動物、その子孫および派生細胞。
【請求項２】
前記アポ発光タンパク質遺伝子の発現および／または細胞内カルシウム濃度の変化に応じた生物発光シグナルの生成が偏在する、請求項１に記載の非ヒトトランスジェニック動物、その子孫および派生細胞。
【請求項３】
前記アポ発光タンパク質遺伝子の発現および／または細胞内カルシウム濃度の変化に応じた生物発光シグナルの生成が誘導性および／または器官、組織、細胞もしくは発生段階特異的である、請求項１に記載の非ヒトトランスジェニック動物、その子孫および派生細胞。
【請求項４】
非ヒト哺乳動物である、請求項１から３のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック動物、その子孫および派生細胞。
【請求項５】
げっ歯類である、請求項４に記載の非ヒトトランスジェニック動物、その子孫および派生細胞。
【請求項６】
マウスである、請求項５に記載の非ヒトトランスジェニック動物、その子孫および派生細胞。
【請求項７】
前記アポ発光タンパク質遺伝子が天然の、または組換えもしくは合成による任意のアポ発光タンパク質遺伝子である、請求項１から６のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック動物、その子孫および派生細胞。
【請求項８】
前記アポ発光タンパク質が、改善された発光活性および／またはカルシウム感受性を有する天然または変異誘発突然変異体である、請求項７に記載の非ヒトトランスジェニック動物、その子孫および派生細胞。
【請求項９】
前記アポ発光タンパク質遺伝子が、哺乳動物のコドン使用頻度に対して最適化されたおよび／またはミトコンドリア標的配列と融合した配列を有する、請求項８に記載の非ヒトトランスジェニック動物、その子孫および派生細胞。
【請求項１０】
前記アポ発光タンパク質の配列が配列番号１である、請求項１に記載の非ヒトトランスジェニック動物、その子孫および派生細胞。
【請求項１１】
前記アポ発光タンパク質の配列が以下の位置Ｇｌｙ１４２→Ｃｙｓで変異誘発されたＣｌｙｔｉｎ配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｑ０８１２１）である、請求項１に記載の非ヒトトランスジェニック動物、その子孫および派生細胞。
【請求項１２】
前記アポ発光タンパク質の配列が以下の１２の位置：Ｇ１ｙ５８→Ｇｌｕ、Ａｓｐ６９→Ｖａｌ、Ａ１ａ７０→Ｃｙｓ、Ｌｙｓ７６→Ａｒｇ、Ｌｙｓ７７→Ｇｌｙ、Ｉｌｅ７８→Ｃｙｓ、Ａｓｐ８１→Ｇｌｕ、Ｖａｌ８６→Ｉｌｅ、Ｇ１ｕ８７→Ａｌａ、Ａｌａ９０→Ｇｌｎ、Ｖａｌ９２→Ｌｅｕ、およびＧ１ｕ９７→Ｇｌｎで変異誘発されたＣｌｙｔｉｎ配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｑ０８１２１）である、請求項１に記載の非ヒトトランスジェニック動物、その子孫および派生細胞。
【請求項１３】
特定の標的遺伝子を発現することができる、または特定の細胞系列に分化して特定の標的遺伝子を発現する請求項１から１２のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック動物の派生細胞。
【請求項１４】
前記特定の細胞系列が筋肉心臓細胞系列または神経細胞系列または間葉細胞系列または造血細胞系列である、請求項１３に記載の非ヒトトランスジェニック動物の派生細胞。
【請求項１５】
細胞内Ｃａ＋＋の変化が得られるように特定の標的を刺激することができるリガンドを同定するための方法であって、
ａ）  請求項１３または１４に記載の派生細胞を用意するステップと、
ｂ）  前記標的を発現させるステップと、
ｃ）  基質として適する発色団を細胞に添加するステップと、
ｄ）  前記標的の推定リガンドを含む化合物ライブラリーと細胞を接触させるステップと、
ｅ）  発光タンパク質の生物発光を検出するステップ
を含む方法。
【請求項１６】
前記特定の細胞系列が筋肉心臓細胞系列または神経細胞系列である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ハイスループットスクリーニングによって実施する、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
細胞内Ｃａ＋＋の変化が得られるように、標的に対するアンタゴニストを同定するための方法であって、
ａ）  請求項１３または１４に記載の派生細胞を用意するステップと、
ｂ）  前記標的を発現させるステップと、
ｃ）  基質として適する発色団を細胞に添加するステップと、
ｄ）  前記標的の推定アンタゴニストを含む化合物ライブラリーと細胞を接触させるステップと、
ｅ）  前記標的を刺激することができるリガンドと細胞を接触させるステップと、
ｆ）  発光タンパク質の生物発光の変化を検出するステップ
を含む方法。
【請求項１９】
前記特定の細胞系列が筋肉心臓細胞系列または神経細胞系列または間葉細胞系列または造血細胞系列である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ハイスループットスクリーニングによって実施する、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
特定の細胞系列への請求項１３または１４に記載の派生細胞の分化を刺激する作用物質を同定するための方法であって、
ａ）  未分化段階の請求項１から１２のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック動物の派生幹細胞を用意するステップと、
ｂ）  推定分化誘導剤を含む化合物ライブラリーに前記派生幹細胞を曝すステップと、
ｃ）  少なくとも１つの特定の細胞系列標的を発現させるステップと、
ｄ）  基質として適する発色団を細胞に添加するステップと、
ｅ）  細胞内Ｃａ＋＋の変化が得られるようにリガンドによって前記特定の細胞系列標的を刺激するステップと、
ｆ）  発光タンパク質の生物発光を検出するステップ
を含む方法。
【請求項２２】
ハイスループットスクリーニングによって実施する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
特定の細胞系列への請求項１３または１４に記載の派生幹細胞の分化を阻害する作用物質を同定するための方法であって、
ａ）  未分化段階の請求項１から１２のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック動物の派生幹細胞を用意するステップと、
ｂ）  推定分化阻害剤を含む化合物ライブラリーに前記派生幹細胞を曝すステップと、
ｃ）  既知の分化誘導剤に前記派生幹細胞を曝して、少なくとも１つの特定の細胞系列標的を発現させるステップと、
ｄ）  基質として適する発色団を細胞に添加するステップと、
ｅ）  細胞内Ｃａ＋＋の変化を得るようにリガンドによって前記特定の細胞系列標的を刺激するステップと、
ｆ）  発光タンパク質の生物発光を検出するステップ
を含む方法。
【請求項２４】
ハイスループットスクリーニングによって実施する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＥＳ／発光タンパク質細胞の分化後に得られる「初代様」細胞の陽性対照としての、請求項１から１２のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック動物の派生細胞の使用。
【請求項２６】
レポーター系として発光タンパク質を含む前記派生細胞を化合物のスクリーニングに使用する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック動物の派生細胞の使用。
【請求項２７】
薬理学的ｅｘ−ｖｉｖｏ試験または動物モデルにおける移植実験のための、レポーター系として発光タンパク質を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック動物の派生組織または派生器官の使用。
【請求項２８】
バイオイメージング試験用の、請求項１から１２のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック動物およびその子孫の使用。
【請求項２９】
薬理学的関連がある動物モデルとの交配用の、請求項１から１２のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック動物およびその子孫の使用。
【請求項３０】
前記動物モデルがレポーター遺伝子を有するトランスジェニック動物、またはＫＯもしくはＫＩ突然変異動物モデルである、請求項２８に記載の非ヒトトランスジェニック動物およびその子孫の使用。
【請求項３１】
物質の毒性および／または奇形学的ｉｎ  ｖｉｖｏ試験用の、請求項１から１２のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック動物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏでアポ発光タンパク質（ａｐｏｐｈｏｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）を合成および発現することができるトランスジェニック非ヒト動物、およびそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、長期の細胞分裂によって自己再生することができる未分化細胞である（１）。さらに、幾つかの生理または実験条件下では、幹細胞は、鼓動する心筋細胞または膵臓のインシュリン産生細胞などの異なる細胞型に分化することができる（２、３）。
【０００３】
幹細胞は、それらの発生能に基づいて細分および分類することができる。全能性幹細胞は、卵と精子細胞の間の融合から生成される。受精卵細胞の最初の数回の分裂によって生成される細胞も、全能性である。これらの細胞は任意の型の細胞に増殖する可能性がある。多能性幹細胞は全能性細胞の子孫であり、全能性幹細胞以外の任意の細胞型に分化する可能性がある。多能性幹細胞は密接に関連があるファミリーの細胞である細胞（例えば、赤血球細胞、白血球細胞および血小板などの血液細胞）のみを生成することができる。（時折単能性と呼ばれる）前駆細胞は一種の細胞型のみを生成することができるが、それらを非幹細胞と区別する自己再生の性質を有する（３〜６）。
【０００４】
幹細胞は、それらの源によって成体または胚のいずれかとして分類することもできる。成体幹細胞は特定組織の分化細胞内で見られる未分化細胞であり、大部分は多能性であり、数個の限られた数の細胞型だけには限られないがそれらを生成することができる。成体幹細胞は新生児、臍帯、胎盤および羊水由来の幹細胞も含む。成体幹細胞は体性幹細胞、または組織幹細胞とも呼ばれ、分化組織中で見られ、その中で成体幹細胞は制御された形式で、分化および／または分裂して、それらが由来する組織のあらゆる特殊化細胞型を生成する（７〜９）。
【０００５】
胚幹細胞は、生殖細胞を含めたあらゆる型の特殊化細胞になる発生能（多能性）を有する。胚幹細胞は、分化を伴わずにそれらの増殖を可能にする条件下で、培養中に無限に増殖する能力を有する（３）。げっ歯類およびヒト由来の３つの型の多能性胚幹細胞が現在までに発見されてきている（１０）：
−着床前の胚盤胞段階の胚の内細胞塊由来の胚幹細胞（ＥＳ）。これらは通常の核型を有する。例えばマウスＥＳ  ＴＢＶ２、Ｒ１、Ｄ３細胞のような、幾つかの型のマウスおよびヒトの胚幹細胞が知られており、樹立されている（１１〜１３、６３）。
−奇形腫由来の胚性癌腫細胞（ＥＣ）。奇形腫は、３つの一次胚葉（内肺葉、中肺葉、および外肺葉）由来の広範囲の組織内に存在する、多能性幹細胞を含む性腺腫瘍である。最も使用される細胞系はマウスＥＣ  Ｐ１９細胞系である。これらの細胞は通常の核型を有していない（１４〜１８）。
−胎児の生殖隆起（ＰＧＣ）の培養始原生殖細胞由来の胚性生殖細胞（ＥＧ）。これらは通常の核型を有するが、遺伝的には異常に刷り込まれている（１９〜２２）。
【０００６】
ＥＳおよびＥＧ細胞をレシピエントマウスの胚盤胞に注入して、キメラ動物を生成することができる。キメラマウスでは、これらの多能性細胞は、生殖細胞系列を含めたそれぞれの細胞型に貢献する可能性がある（２０、２１、２３、２４）。対照的に、胚中に導入されたマウスＥＣ細胞は大部分の胚系列に定着するが、１つの実験を除いて（２５〜２７）生殖細胞系列には一般に定着しない。ＥＣ細胞が機能性配偶子を形成できないことは、それらの異常な核型を表す可能性が最も高い（２８）。
【０００７】
幹細胞はハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）技術の非常に強力なツールである、何故なら幹細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏで長時間培養および増殖することができ、自己再生の性質を維持し、さらにそれらは微細化を経る可能性があるからである。幹細胞は、純粋なＥＳ細胞群を調製するために選択および誘導マーカーの使用を可能にする。遺伝子標的化／相同的組換えの技術は、特定遺伝子のノックアウト（ＫＯ）またはノックイン（ＫＩ）を可能にする。さらに胚幹細胞は、初代細胞と似た任意の細胞型に分化することができる（何故ならそれらは非腫瘍細胞だからである）。このようにして、胚幹細胞は標的に本来の環境をもたらし、胚幹細胞は、本来の方法で制御および発現される（マルチサブユニットイオンチャンネルのような）複合標的に対処することができる。これは非常に重要な改良点である、何故なら通常ＨＴＳスクリーニングでは、細胞ベースのアッセイは腫瘍細胞系を使用して設定し、この腫瘍の環境は生理的細胞条件を変えることができることは知られているからである。
【０００８】
多能性胚幹細胞の使用は、製薬分野において基本的役割を得ている（２９）。薬剤発見における遺伝子機能の理解は成功の根本なので、例えば標的評価用に、マウスＥＳ細胞はＫＯマウスと比較してより迅速で安価なツールとなる。さらに致死的ＫＯの場合、ＥＳ細胞の使用は遺伝子機能の評価に非常に有用である可能性がある。
【０００９】
幹細胞は胚幹細胞試験（ＥＳＴ）用にも使用されてきており、これはＥＶＣＡＭ試験（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）によって肯定的に評価された。これは、３つの生殖細胞系列（内肺葉、中肺葉、および外肺葉）から生じる細胞および組織の分化に対する、薬剤の毒性および奇形学的試験である。幹細胞は、多能性幹細胞の分化によって得られた鼓動する心筋細胞における、変時作用に対する薬剤の二次的影響を分析するためにも非常に重要である。この種の試験は、毒性試験に使用する動物の数を減らすことができる。例えば欧州連合では、現在市場に出ている３００００までの化学物質を向こう１０年内に再度評価しなければならない。これは、約１千万の動物の使用を意味する。ＥＳＴのようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験の作成はこの意味において重要である可能性があり、従来の全動物実験より短い時間でより多くの化学物質の試験を可能にする可能性もある（３０、３１、３２）。
【００１０】
生物発光は、様々な化学発光反応系を介して生きている生物またはそれらに由来する物質によって、可視光線が発せられる現象である。生物発光反応は、３つの主な要素、ルシフェリン（基質）、ルシフェラーゼ（酵素）および分子酸素を必要とする。しかしながら、幾つかの反応では、カチオン（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋）および補因子（ＡＴＰ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）を含めた、他の要素が必要とされる可能性もある。ルシフェラーゼは基質、ルシフェリンの酸化を触媒する酵素であり、不安定な中間体を生成する。不安定な中間体がその基底条件に崩壊し、オキシルシフェリンを生成するとき、光が発せられる。多くの異なる無関係な型のルシフェリンが存在するが、少なくとも７個の門由来の多くの種は、セレンテラジンとして知られる同じルシフェリンを使用する。幾つかの動物（例えばクラゲ）では、ルシフェリン／ルシフェラーゼ系は、カルシウムの結合によって光を発する安定した「発光タンパク質」の形で抽出することができる。発光タンパク質は、それらがルシフェラーゼとルシフェリンの安定条件の酸化型中間複合体である点でルシフェラーゼと異なる。
【００１１】
発光タンパク質は多くの海洋腔腸動物中に存在し、これらの生物が繁殖、採食および防御を含めた様々な目的で光を発するのを可能にする（３３）。多くの発光生物が存在するが、わずか７個の発光タンパク質、すなわちサラシコリン（３４、３５）、エクオリン（３６、３７、３８）、ミトロコミン（ハリスタウリンとの合成）（３９、４０）、クリチン（フィアリジンとの合成）（４０、４１）、オーベリン（３４、３８、４２、４３）、ムネミオプシン（４４、４５）およびベロビン（４４、４５）がこれまで単離されてきている。全てのこれらのタンパク質は、アポタンパク質、イミダゾピラジン発色団（すなわち、セレンテラジン）および酸素によって形成される複合体である。それらのアミノ酸配列は、特に３つのカルシウム結合部位（ＥＦ−ハンド構造）を含む領域中で高度に保存されている。用語「発光タンパク質」は発光することができるセレンテラジン結合ポリペプチドを示し、一方「アポ発光タンパク質」はセレンテラジンを含まないタンパク質を示すために使用する。
【００１２】
最も試験されている発光タンパク質はエクオリアビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）から単離されるエクオリン（４６）、およびオーベリアロンギシマ（Ｏｂｅｌｉａ  ｌｏｎｇｉｓｓｉｍａ）から単離されるオーベリン（４７）である。発光タンパク質はセレンテラジン、分子酸素、ＥＤＴＡおよび２−メルカプトエタノールまたはジチオスレイトールとのインキュベーションによってアポ発光タンパク質から再生することができる。セレンテラジンは発光タンパク質エクオリン、ミトロコミン、クリチンおよびオーベリンによって使用される共通の発光基質なので、これら４個の発光タンパク質において発光反応はおそらく同じである（４８、４９、５０、５１）。
【００１３】
細胞事象およびそれらの制御の試験は、感度の良い、非侵襲性の分析法を必要とする。発光タンパク質および一般に生物発光の使用は優れたレポーター系である、何故ならそれらは、蛍光系とは対照的にバックグラウンドを実質的に有していないからである。
【００１４】
発光タンパク質は、シグナル伝達および遺伝子発現と関係がある細胞事象をモニタリングするためのレポーター遺伝子として、細胞培養系において広く使用されている（３３、３４、４６）。異なる刺激に応じたカルシウムの変化をモニタリングするために、哺乳動物細胞中で発光タンパク質を発現させる。細胞内カルシウム濃度は、アポ発光タンパク質を発現する哺乳動物細胞に補因子セレンテラジンを加えること、および細胞内カルシウム濃度の指標である光子放出を検出することによって測定することができる。細胞内カルシウム濃度の調節と関係があるアポ発光タンパク質と受容体の両方を発現する細胞の使用により、化合物を細胞内カルシウムの放出に対するそれらの影響に関してスクリーニングするための有効なシステムが提供される。
【００１５】
ハイスループットスクリーニングアッセイは、レポーター系として発光タンパク質を使用して設計されることが多い。系の感度およびそのノイズに対する高いシグナル比は、少ないアッセイ体積の使用を可能にする。
【００１６】
カルシウムフラックスアッセイは、多数のサンプルを同時分析するのに適しており発光画像化システムを備える光学スクリーニング装置を使用して、ＨＴＳ形式で一般に実施される。
【００１７】
しかしながら、カルシウム濃度の変化は、ＨＴＳアッセイにおいて最も使用されている機器の１つである、ＦＬＩＰＲ（登録商標）（蛍光イメージングプレートリーダー、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）のような蛍光測定機器を使用して、例えばＦｌｕｏ３、Ｆｌｕｏ４、Ｆｕｒａ２およびＣａｌｃｉｕｍ  ｄｙｅｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）のような蛍光カルシウム用色素を使用して検出することもできる。この装置は細胞単層上でのシグナル分離を可能にする光学的検出用デバイスを備えており、これによって細胞ベースのアッセイの感度を増大させる。
【００１８】
最も近年のＦＬＩＰＲ（登録商標）システムのバージョンは、ＣＣＤカメラベースの機器と比較して低い感度を有する場合でさえ、発光アッセイにも適した条件になっている。このシステムの低い発光感度を克服するために、増大した発光を有する発光タンパク質は非常に有利である。
【特許文献１】欧州特許第１４１３５８４号
【特許文献２】ＷＯ２００６／０９４８０５
【特許文献３】欧州特許出願第０５００５３９０．９号
【特許文献４】欧州特許出願第０６０００１７１号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明者らは、アポ発光タンパク質を発現することができる、元のゲノムの遺伝的改変によって得られる非ヒトトランスジェニック動物を開発した。動物モデルとして、アポ発光タンパク質を発現する胚幹細胞を偽妊娠メスマウスの胚盤胞に注入し、生成したキメラを野生型マウスと交配させることによって、トランスジェニックマウスを得た。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明の目的は、アポ発光タンパク質遺伝子を発現することができ、細胞内カルシウム濃度の変化に応じて生物発光シグナルを生成することができる、非ヒトトランスジェニック動物、その子孫および派生細胞である。
【００２１】
派生細胞は、初代または幹細胞、委任細胞（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ  ｃｅｌｌ）、分化細胞、細胞群、組織または器官である細胞であると考えられる。
【００２２】
好ましい態様では、アポ発光タンパク質遺伝子の発現および／または細胞内カルシウム濃度の変化に応じた生物発光シグナルの生成は偏在する。
【００２３】
他の好ましい態様では、アポ発光タンパク質遺伝子の発現および／または細胞内カルシウム濃度の変化に応じた生物発光シグナルの生成は、誘導性および／または器官、組織、細胞または発生段階特異的である。
【００２４】
好ましい実施形態では、非ヒトトランスジェニック動物は、非ヒト哺乳動物、より好ましくはげっ歯類、最も好ましくはマウスである。
【００２５】
本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、当技術分野で知られている技法、すなわちアポ発光タンパク質を発現することができ、細胞内カルシウム濃度の変化に応じて適切な発色団基質の存在下で生物発光シグナルを生成することができる胚幹細胞を使用することによって得られる。発光タンパク質、および一般に生物発光は、有効なレポーター系として使用されることが多い。
【００２６】
本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、アポ発光タンパク質を発現することができる、原型ゲノムの遺伝的改変によって得られる任意の非ヒト哺乳動物であると考えられる。典型的には、トランスジェニック動物は、当技術分野で知られている技法、すなわちアポ発光タンパク質を発現する胚幹細胞を偽妊娠メスの胚盤胞に注入し、生成したキメラを野生型動物と交配させることによって得られる。
【００２７】
アポ発光タンパク質は、天然の、または組換えもしくは合成による、任意のアポ発光タンパク質であると考えられる。アポ発光タンパク質は、改善された発光活性および／またはカルシウム感受性をさらに有する天然または変異誘発突然変異体、または発光タンパク質の活性プロファイルが、発光およびカルシウム応答性の点で維持されるかあるいは増大するという条件で、１つまたは複数のアミノ酸残基の欠失、付加または置換によってさらに他に修飾されている２つの異なる天然アポ発光タンパク質由来のキメラタンパク質であってよい。アポ発光タンパク質の配列は、哺乳動物のコドン使用頻度に対して最適化し、および／またはミトコンドリア標的配列と融合することもできる（５２、５３、５４）。増大した生物発光を有するアポ発光タンパク質、すなわちクリチン（Ｃｌｙｔｉｎ）タンパク質の領域を用いたタンパク質Ｏｂｅｌｉｎのキメラ化によって得られた、アポ発光タンパク質Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）（欧州特許第１４１３５８４号中に記載され、かつ本明細書では配列番号１として報告する）は、従来技術において既に開示されている。
【００２８】
増大した生物発光を有するアポ発光タンパク質は、以下の位置Ｇｌｙ１４２→Ｃｙｓで変異誘発したＣｌｙｔｉｎ配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｑ０８１２１）、または以下の１２の位置：Ｇ１ｙ５８→Ｇｌｕ、Ａｓｐ６９→Ｖａｌ、Ａ１ａ７０→Ｃｙｓ、Ｌｙｓ７６→Ａｒｇ、Ｌｙｓ７７→Ｇｌｙ、Ｉｌｅ７８→Ｃｙｓ、Ａｓｐ８１→Ｇｌｕ、Ｖａｌ８６→Ｉｌｅ、Ｇ１ｕ８７→Ａｌａ、Ａｌａ９０→Ｇｌｎ、Ｖａｌ９２→Ｌｅｕ、およびＧ１ｕ９７→Ｇｌｎで変異誘発されたＣｌｙｔｉｎ配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｑ０８１２１）など、ＷＯ２００６／０９４８０５中に記載されたのと同様に変異誘発から誘導することもできる。
【００２９】
レポーターアポ発光タンパク質は、偏在的、器官、組織、細胞または発生段階特異的または誘導性プロモーターの制御下でクローニングすることができることが好ましい。
【００３０】
幹細胞は一般に、胚または成体由来である、全能性および／または多能性非ヒト細胞、あるいはヒトまたは非ヒト腫瘍多能性細胞、あるいは多能性細胞またはその子孫として考えられる。トランスジェニック動物を作製するのに好ましい幹細胞は、全能性および多能性胚幹細胞である。
【００３１】
特に好ましい幹細胞はマウス胚幹細胞、好ましくはＥＳ  ＴＢＶ２（６３）細胞である。
【００３２】
典型的には、胚幹細胞は、アポ発光タンパク質コード配列を含む発現ベクターが安定的にトランスフェクトされる。
【００３３】
アポ発光タンパク質を発現する最終的な陽性クローンは、それらの発光タンパク質含有量、および適切な刺激に応答するそれらの能力に基づいて選択する。
【００３４】
胚幹細胞は、偽妊娠メスマウスの胚盤胞に注入する。このように作製したキメラマウスは、次いで他のマウスと交配させて、トランスジェニック異型動物を作出する。
【００３５】
同型動物を得るためには、２つの異型動物同士を交配する。
【００３６】
本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、薬理学的ｅｘ−ｖｉｖｏ試験または移植実験に使用することができる、組織または器官の貴重な供給源である。例えば膵臓ランゲルハンス島は、グルコースの（ｇｌｕｃｉｄｉｃ）または脱分極刺激によるカルシウムの動きをモニタリングするためにｅｘ−ｖｉｖｏで使用することができる。
【００３７】
本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、成体および胚由来の幹細胞および／または例えばマクロファージ前駆細胞のようなアポ発光タンパク質レポーター遺伝子を含む初代細胞などの、派生細胞の貴重な供給源である。この状況において派生細胞は、胚または成体起源である、初代細胞または幹細胞全能性または多能性または多分化能または前駆細胞である。
【００３８】
レポーター系としてアポ発光タンパク質を含む派生細胞を直接使用して、セレンテラジンを添加した後、あるいはセレンテラジンを動物に静脈内注射し、次いで試験用分子または刺激を加えた後に、細胞ベースのアッセイを作製することができる。
【００３９】
レポーター系としてアポ発光タンパク質を含む初代派生細胞は、特定の標的のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するためのスクリーニング目的で、あるいはＥＳ／発光タンパク質細胞の分化後に得る「初代様（ｐｒｉｍａｒｙ−ｌｉｋｅ）」細胞の陽性対照として直接使用することができる。
【００４０】
派生幹細胞を特定の細胞系列に分化させて、特定の標的を発現させることが可能である。派生幹細胞は、セレンテラジン添加後に分化条件で使用して細胞ベースのアッセイを作製することができ、特定の標的のアゴニストまたはアンタゴニストを同定することができ、あるいは未分化条件で使用して分化促進剤または分化阻害剤を同定することができる。
【００４１】
特定の細胞系列は、筋肉心臓細胞系列または神経細胞系列あるいは造血または間葉細胞系列由来の細胞系列であることが好ましい。
【００４２】
本発明は有利なことに、多くの用途、例えば治療、診断用途の化合物をｉｎ  ｖｉｖｏにおいて同定および／または試験するための方法を提供する。
【００４３】
本発明の状況では、化合物ライブラリーは、試験または同定する化合物の、合成または組換え体のいずれかの集合である。
【００４４】
本発明の他の目的は、細胞内Ｃａ＋＋の変化が得られるように特定の標的を刺激することができるリガンドを同定するための方法であって、
ａ）  初代細胞または幹細胞である本発明による派生細胞を用意するステップと、
ｂ）  最終的には前記細胞を特定の細胞系列に分化させることによって、前記標的を発現させるステップと、
ｃ）  基質として適した発色団を細胞に添加するステップと、
ｄ）  前記標的の推定リガンドを含む化合物ライブラリーと細胞を接触させるステップと、
ｅ）  発光タンパク質の生物発光を検出するステップとを含む方法である。
【００４５】
初代細胞または幹細胞は、標的を内因的に発現することができる。
【００４６】
特定の細胞系列は、筋肉心臓細胞系列もしくは神経細胞系列または造血もしくは間葉細胞系列由来の細胞系列であることが好ましい。
【００４７】
ハイスループットスクリーニングによって方法を実施することがより好ましい。
【００４８】
本発明の他の目的は、細胞内Ｃａ＋＋の変化が得られるように、標的に対するアンタゴニストを同定するための方法であって、
ａ）  初代細胞または幹細胞である本発明による非ヒトトランスジェニック動物の派生細胞を用意するステップと、
ｂ）  最終的には前記細胞を特定の細胞系列に分化させることによって、前記標的を発現させるステップと、
ｃ）  基質として適した発色団を細胞に添加するステップと、
ｄ）  前記標的の推定アンタゴニストを含む化合物ライブラリーと細胞を接触させるステップと、
ｅ）  前記標的を刺激することができるリガンドと細胞を接触させるステップと、
ｆ）  発光タンパク質の生物発光の変化を検出するステップとを含む方法である。
【００４９】
初代細胞または幹細胞は、標的を内因的に発現することができる。
【００５０】
特定の細胞系列は、筋肉心臓細胞系列または神経細胞系列あるいは造血または間葉細胞系列由来の細胞系列であることが好ましい。
【００５１】
ハイスループットスクリーニングによって方法を実施することがより好ましい。
【００５２】
本発明の他の目的は、特定の細胞系列への本発明による派生細胞の分化を刺激する作用物質を同定するための方法であって、
ａ）  未分化段階の請求項１から１２のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物の派生幹細胞を用意するステップと、
ｂ）  推定分化誘導剤を含む化合物ライブラリーに前記派生幹細胞を曝すステップと、
ｃ）  少なくとも１つの特定の細胞系列標的を発現させるステップと、
ｄ）  基質として適した発色団を細胞に添加するステップと、
ｅ）  細胞内Ｃａ＋＋の変化を得るようにリガンドによって前記特定の細胞系列標的を刺激するステップと、
ｆ）  発光タンパク質の生物発光を検出するステップとを含む方法である。
【００５３】
好ましい実施形態では、ハイスループットスクリーニングによって方法を実施する。
【００５４】
本発明の他の目的は、特定の細胞系列への本発明による派生幹細胞の分化を阻害する作用物質を同定するための方法であって、
ａ）  未分化段階の請求項１から１２のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物の派生幹細胞を用意するステップと、
ｂ）  推定分化阻害剤を含む化合物ライブラリーに前記派生幹細胞を曝すステップと、
ｃ）  知られている分化誘導剤に前記派生幹細胞を曝して、少なくとも１つの特定の細胞系列標的を発現させるステップと、
ｄ）  基質として適した発色団を細胞に添加するステップと、
ｅ）  細胞内Ｃａ＋＋の変化を得るようにリガンドによって前記特定の細胞系列標的を刺激するステップと、
ｆ）  発光タンパク質の生物発光を検出するステップとを含む方法である。
【００５５】
好ましい実施形態では、ハイスループットスクリーニングによって方法を実施する。
【００５６】
本発明の他の態様は、ＥＳ／発光タンパク質細胞の分化後に得られる「初代様」細胞の陽性対照としての、本発明による非ヒトトランスジェニック動物の派生細胞の使用である。
【００５７】
本発明の他の態様は、レポーター系として発光タンパク質を含む前記派生細胞を化合物、典型的にはアゴニスト、アンタゴニスト、分化促進剤または分化阻害剤のスクリーニングに使用する、本発明による非ヒトトランスジェニック動物の派生細胞の使用である。
【００５８】
本発明の他の態様は、薬理学的ｅｘ−ｖｉｖｏ試験および動物モデルにおける移植実験のための、レポーター系として発光タンパク質を含む本発明による非ヒトトランスジェニック動物の派生組織または派生器官の使用である。
【００５９】
本発明の他の態様は、バイオイメージング試験用の、本発明による非ヒトトランスジェニック動物およびその子孫の使用である。
【００６０】
本発明の他の態様は、薬理学的関連がある動物モデルとの交配用の、本発明による非ヒトトランスジェニック動物およびその子孫の使用である。動物モデルは、レポーター遺伝子を有するトランスジェニック動物、またはＫＯもしくはＫＩ突然変異動物モデルであることが好ましい。このような交配によって、他のトランス遺伝子（レポーターなど）および／または突然変異遺伝子（相同的組換えによって得た遺伝子など）と組合せて本発明の発光タンパク質レポーター遺伝子を有する、新たな動物モデルの子孫を作製することができる。
【００６１】
本発明の他の態様は、物質の毒性および／または奇形学的ｉｎ  ｖｉｖｏ試験用の、本発明による非ヒトトランスジェニック動物の使用である。
【００６２】
以下の図面を参照することによって、本発明を以下の実験項においてより詳細に記載する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６３】
材料および方法
発光タンパク質に関する記載
Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）
キメラ発光タンパク質Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）は欧州特許第１４１３５８４号中に記載されており、本明細書では配列番号１として報告する：
Ｍｅｔ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｔｒｐ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ  Ｈｉｓ  Ｍｅｔ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｇｌｎ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｔｒｐ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｔｒｐ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｔｒｐ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ
Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｃｙｓ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｔｒｐ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ
【００６４】
ｉ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）
ｉ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）（欧州特許出願第０５００５３９０．９号）は、Ｃｌｙｔｉｎ発光タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｑ０８１２１）の変異誘発Ｇｌｙ１４２→Ｃｙｓによって得られる。
【００６５】
ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）
ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）（欧州特許出願第０６０００１７１号）は、以下の１２の位置：Ｇ１ｙ５８→Ｇｌｕ、Ａｓｐ６９→Ｖａｌ、Ａ１ａ７０→Ｃｙｓ、Ｌｙｓ７６→Ａｒｇ、Ｌｙｓ７７→Ｇｌｙ、Ｉｌｅ７８→Ｃｙｓ、Ａｓｐ８１→Ｇｌｕ、Ｖａｌ８６→Ｉｌｅ、Ｇ１ｕ８７→Ａｌａ、Ａｌａ９０→Ｇｌｎ、Ｖａｌ９２→Ｌｅｕ、およびＧ１ｕ９７→ＧｌｎでのＣｌｙｔｉｎ配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｑ０８１２１）の変異誘発によって得られる。
【００６６】
哺乳動物細胞中での発現のための発光タンパク質の最適化
ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）およびｉ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）の遺伝子のコドン使用頻度を、高度に発現した哺乳動物遺伝子のコドンの傾向に適合させた。さらに、非常に高い（＞８０％）または非常に低い（＜３０％）ＧＣ含有率の領域は、可能な場合は回避した。
【００６７】
効率の良い翻訳開始のために、Ｋｏｚａｋ−コンセンサス配列を開始コドンの上流に導入した。２つの停止コドンを加えて効率の良い停止を確実にした。
【００６８】
クローニング手順
遺伝子をミトコンドリアタグ（ｍｉｔｏ）を含むかあるいは含まないｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でクローニングして、ｐｃＤＮＡ３  ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）、ｐｃＤＮＡ３  ｍｉｔｏ  ｉ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）、およびｐｃＤＮＡ３  ｉ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）を得た。ミトコンドリア標的化用に（５２〜５４）、ヒトシトクロムｃオキシダーゼ、サブユニットＶＩＩＩ、シグナル配列を使用した：
５'−ＡＴＧＴＣＣＧＴＣＣＴＧＡＣＧＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＧＧＧＧＣＴＴ
ＧＡＣＡＧＧＣＴＣＧＧＣＣＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＣＡＧＴＧＣＣＧＣＧＣＧＣ
ＣＡＡＧＡＴＣＣＡＴＴＣＧＴＴＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣ−３'  （配列番号２）。
【００６９】
得られた構築体は完全長ジデオキシのシークエンスによって確認した。
【００７０】
ＥＳ細胞の培養
ＥＳ細胞は標準的な方法を使用して培養した（５５、５６）。
【００７１】
ＥＳ培養培地、播種およびインキュベーション；
ＴＢＶ２（１２９Ｓ２／ＳｖＰａｓ）胚幹細胞（６３）を、１５％のウシ胎児血清、ＦＢＳ（ＥＳ適任、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１６１４１０７９）、ＤＭＥＭダルベッコの改変イーグル培地、ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ、ピルビン酸ナトリウム非含有（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０３１３０２１）、１００μＭのβ−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３１３５００１０）、２ｍＭのグルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号２５０３００２４）、１０００Ｕ／ｍｌの白血球阻害因子、ＬＩＦ（Ｐｒｏｄｏｔｔｉ  Ｇｉａｎｎｉ、カタログ番号ＥＳＧ１１０７）と共に、３７℃、５％ＣＯ２において培養する。
【００７２】
初代マウス胎児繊維芽（ＭＥＦ）細胞を、１０％のウシ胎児血清、ＦＢＳ（Ｃｅｌｂｉｏ、カタログ番号ＣＨＡ１１１５２）、ＤＭＥＭダルベッコの改変イーグル培地、ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０３１３０２１）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１３６００３９）、非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１１４０−０３５）、２ｍＭのグルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号２５０３００２４）と共に、３７℃、５％ＣＯ２において培養する。
【００７３】
安定的なトランスフェクション
発光タンパク質に対応するＤＮＡ構築体を、エレクトロポレーション法、３０〜４０μｇのｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）、ｍｉｔｏ  ｉ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）、およびＢｇｌ  ＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて線状にしたｉ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）ＤＮＡを使用してトランスフェクトし、７×１０６個のＥＳ細胞を使用してトランスフェクトし（エレクトロポレーション条件：５００μＦ、０．２４ｋＶ、ＢｉｏＲａｄ遺伝子パルサー）、１０〜２０分間氷上でインキュベートした。細胞懸濁液はＬＩＦを含むＥＳ細胞培地に希釈し、ゼラチン状１００ｍｍ径プレートに移した。約４８時間後、２００μｇ／ｍｌのＧ１４８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｇ５０１３）を含むＥＳ培地を使用して選択を開始した。
【００７４】
コロニーはエレクトロポレーション後８〜９日で採取する準備を概略的に整えた。
【００７５】
クローン選択法：
１．  １１４のＥＳ  ｐｃＤＮＡ３／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）、１３０のＥＳ  ｐｃＤＮＡ３／ｍｉｔｏ  ｉ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）および９９のＥＳ  ｐｃＤＮＡ３／ｉ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）クローンを採取した。
２．  播種後２４時間および４８時間で、トランスフェクトした細胞は２×９６ＭＴＰ白色プレート中、ＬＩＦを含むＥＳ培地中に平板培養した。
３．  培地はウエル当たり５０μｌのタイロード液（１３０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＮａＨＣＯ３および２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、２ｍＭのＣａ２＋）およびセレンテラジン１０μＭ（Ｐｈａｒｍａ  Ｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）と交換した。
４．  陽性クローンを選択し、以下のことを評価した：
−  １００μＭヒスタミン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ７１２５−５Ｇ）に対する応答性。ＣＣＤカメラベースの照度計条件：高感度、読み取り時間６０秒。
−  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００による細胞溶解後に測定した残留した全発光タンパク質の活性。ＣＣＤカメラベースの照度計条件：低感度、読み取り時間５秒。各構築体用に１２のクローンを選択して、増殖させ、計数細胞１００００〜２００００ｃ／ｗ９６ＭＴＰ中、および２５００ｃ／ｗ３８４ＭＴＰ中で再度試験した。
−  １００μＭヒスタミンに対する応答性。ＣＣＤカメラベースの照度計条件：高感度、読み取り時間６０秒。
−  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００による細胞溶解後に測定した残留した全発光タンパク質の活性。ＣＣＤカメラベースの照度計条件：低感度、読み取り時間５秒間。
【００７６】
ＤＮＡ抽出
ゼラチンコーティング皿上に平板培養したＥＳ細胞由来のＤＮＡを、標準的なプロテイナーゼＫによる消化およびフェノール−クロロホルム−イソプロパノール抽出法を用いて抽出した（５９）。
【００７７】
定量ＰＣＲによる挿入数の測定
ＱＰＣＲ（定量ポリメラーゼ連鎖反応）を、反応当たり約３ｎｇのＤＮＡ、および「Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）ＱＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ  ＵＤＧ」プロトコル（６０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＥＳ／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）細胞に実施した。使用したプライマーは、ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）（ＣＰＨ）およびネオマイシン（ｎｅｏ）遺伝子にＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して設計して、トランスフェクションにおいて使用しｇｕｓＢ遺伝子に特異的なプラスミドを検出し、ゲノムＤＮＡを検出した：
ＣＰＨ−正方向：ＣＡＣＣＡＡＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＡＧＧ（配列番号３）；
ＣＰＨ−逆方向：ＧＣＧＡＴＣＴＣＣＴＴＧＣＣＧＴＡＣＴＣ（配列番号４）；
ｎｅｏ−正方向：ＣＡＣＧＴＡＣＴＣＧＧＡＴＧＧＡＡＧＣＣ（配列番号５）；
ｎｅｏ−逆方向：ＣＣＣＴＧＡＴＧＣＴＣＴＴＣＧＴＣＣＡＧ（配列番号６）；
ｇｕｓＢ−正方向：ＧＧＡＧＧＴＧＡＴＴＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣ（配列番号７）；
ｇｕｓＢ−逆方向：ＴＣＧＧＣＴＴＣＴＧＡＴＧＣＧＴＣＴＴＡ（配列番号８）。
【００７８】
全てのＱＰＣＲ実験はＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００シークエンスディテクター（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。
【００７９】
ＰＣＲプロトコルは以下の通りであった：５０℃に２分間保つ、９５℃に２分間保つ、４０サイクルの：９５℃、１５秒間、６０℃、１分間；９５℃、１５秒間、２０分間の長さの温度勾配、６０℃〜９５℃（溶解曲線ステップ（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅ  ｓｔｅｐ））。
【００８０】
実験の最後に、ＰＣＲ中に得た蛍光データを、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００のユーザー用マニュアル中に記載されたのと同様に処理した。
【００８１】
ＰＣＲ産物の溶解温度プロファイル分析は、「Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｃｕｒｖｅｓ  １．０」ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施した。ＱＰＣＲ実験のいずれにおいてもプライマー−ダイマーは生成しなかった。
【００８２】
二倍体ゲノム当たり（すなわち、細胞当たり）のネオマイシンおよび／またはｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）遺伝子のコピー数を計算するために、我々はＣｔｓ（サイクルの閾値）およびＰＣＲ効率を以下の式に入れた：
【００８３】
細胞あたりのコピー数＝２Ｘ｛（ＰＣＲ効率標的）−（Ｃｔ標的）｝／｛（ＰＣＲ効率ｇｕｓＢ）−（Ｃｔ  ｇｕｓＢ）｝
【００８４】
上式で：
ＰＣＲ効率標的＝ネオマイシンまたはｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）遺伝子のＰＣＲ効率；
ＰＣＲ効率ｇｕａＢ＝ｇｕｓＢ遺伝子のＰＣＲ効率；
Ｃｔ標的＝ネオマイシンまたはｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）遺伝子のＣｔ；
ＣｔｇｕｓＢ＝ｇｕｓＢ遺伝子のＣｔ。
【００８５】
式の右側部分は、ｇｕｓＢコピー当たりの挿入ＤＮＡのコピー数を与える。２つのｇｕｓＢコピーが二倍体ゲノム中に存在するので、この部分に２を掛ける。
【００８６】
サザンブロット
ＥＳ／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）細胞の１０μｇのＥＳゲノムＤＮＡを異なる制限酵素、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ（Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、０．８％のアガロースゲル上に載せ、正に帯電したナイロン膜（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１４１７２４０）に移した。プローブとして、［３２Ｐ］ｄＣＴＰ−標識ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）コード配列を使用した（５９）。
【００８７】
ＥＳ／ｍｉｔｏ  ｉ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）およびＥＳ／ｉ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）細胞の１０μｇのＥＳゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ制限酵素（Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、０．８％のアガロースゲル上に載せ、正に帯電したナイロン膜（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１４１７２４０）に移した。プローブとして、［３２Ｐ］ｄＣＴＰ−標識ｉ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）コード配列を使用した（５９）。
【００８８】
免疫蛍光分析
１．  培地を除去し、１×ＰＢＳを用いて３回洗浄した。
２．  ＥＳ細胞を４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、ＭＥＲＣＫ、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＪ、ＵＳＡ、カタログ番号１．０４００５．１０００）溶液で２０分間室温において固定した。
３．  固定溶液を除去し、１×ＰＢＳを用いた３回の洗浄を室温で実施した。
４．  ブロッキングおよび透過処理手順は、細胞と１０％の正常ヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カタログ番号Ｓ２６−１００ｍｌ）／０．２％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を１×ＰＢＳ中で３０分間室温においてインキュベートして実施した。
５．  ブロッキング溶液を除去し、１×ＰＢＳを用いた２回の洗浄を室温で実施した。
６．  異なる抗体を、１０％の正常ヤギ血清０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ入り１００中１×ＰＢＳ中で、２時間室温においてインキュベートした。
−  マウスモノクローナル抗体抗ｏｃｔ３／４（Ｃ−１０）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号ＳＣ−５２７９）を１：１００希釈で使用した。
−  マウスモノクローナル抗体抗ＳＳＥＡ−１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号ＳＣ２１７０２）を、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００透過処理剤を含まなかったバッファー中に１：１００希釈で使用した。
−  ウサギポリクローナル抗体抗ミオシン重鎖（ＭＨＣ）（Ｈ−３００）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号ＳＣ−２０６４１）を１：５０希釈で使用した。
−  ウサギポリクローナル抗体抗ＧＡＴＡ−４（Ｈ−１１２）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号ＳＣ−９０５３）を１：５０希釈で使用した。
−  マウスモノクローナル抗体抗サルコメアα−アクチニン（ＥＡ−５３）（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ａ７８１１）を１：５０希釈で使用した。
−  ウサギポリクローナル抗体抗ニューロフィラメントＨ（ＮＦ−Ｈ）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カタログ番号ＡＢ１９８９）を１：１００希釈で使用した。
−  マウスモノクローナル抗体抗ニューロン核（ＮｅｕＮ）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カタログ番号ＭＡＢ３７７）を１：１００希釈で使用した。
−  ウサギポリクローナル抗体抗グリア細胞繊維性酸性タンパク質（Ｄａｋｏ、カタログ番号Ｚ０３３４）を１：１００希釈で使用した。
−  マウスモノクローナル抗体抗ネスチン（Ｒａｔ−４０１）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カタログ番号ＭＡＢ３５３）を１：１００希釈で使用した。
７．  １×ＰＢＳを用いた３回の洗浄を室温で実施した。
８．  二次抗体とのインキュベーションは、フルオレセイン標識抗マウス、または抗ウサギＦＩＴＣ二次抗体単独、あるいはローダミン標識抗マウス抗体（ヤギおよびマウスＩｇＧ／ＩｇＭローダミン、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カタログ番号ＡＰ１３０Ｒ）と組合せて、１０％の正常ヤギ血清／０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００入り１×ＰＢＳ中で１時間室温において実施した。抗体は１：２００希釈で使用した。
９．  １×ＰＢＳを用いた３回の洗浄を室温で実施した。
１０．  細胞は１×ＰＢＳ中に４℃で放置した。
【００８９】
心筋細胞分化プロトコルおよび胚様体（ＥＢ）形成ステップ
参考文献（５７）中に記載したプロトコルを参照
【００９０】
心筋細胞を用いたＣＣＤカメラベースの照度計による測定
−  ＥＢは分化第９日でＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カタログ番号ＳＣＲ００５）を用いて解離させ、計数し、１０μＭセレンテラジンを溶かした標準的なタイロード液バッファー（ＧｑＰＣＲに関する試験用）中およびＫＣｌを含まないタイロード液（Ｌ型カルシウムチャンネルに関する試験用）中で、３時間３７℃においてインキュベートした（２００００細胞／ウエル、９６ＭＴＰ中）。
−  試験は細胞播種後３時間で実施した。
−  ５０ｎＭのエンドセリン−１、１００μＭのノルエピネプリンに対する応答性を、ＣＣＤカメラベースの照度計（条件：高感度、読み取り時間６０秒）で測定した。
【００９１】
電位依存性カルシウムチャンネルを４０ｍＭのＫＣｌで刺激した。チャンネルの特異性は、５μＭのニフェジピン（特異的Ｌ型電位依存性カルシウムチャンネル阻害剤）（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｎ７６３４）を用いた測定前に１５分間細胞をインキュベートして調べた。
−  残留した全発光タンパク質の活性は、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００による細胞溶解後にＣＣＤカメラベースの照度計（条件：高感度、読み取り時間３０秒間）で測定した。
【００９２】
神経分化プロトコルおよび胚様体（ＥＢ）形成ステップ
参考文献（６４、６５）中に記載したプロトコルを参照
【００９３】
ニューロンに関するＣＣＤカメラベースの照度計による測定
−  レチノイン酸誘導型（ＲＡ．Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｒ−２６２５）ＥＢを解離させ、ポリＤ−リシン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ７１２１）コーティングした３８４ＭＴＰにウエル当たり６５００個の細胞を、他の分化期間用に９４ＭＴＰ形式でウエル当たり２４０００個の細胞を播種した。
【００９４】
分化第１４日で、それらは１０μＭセレンテラジンを溶かした標準的なタイロード液バッファー（グルタミン酸応答性の試験用）中、およびＫＣｌを含まないタイロード液（電位依存性カルシウムチャンネルに関する試験用、６μＭのオメガコノトキシンＧＶＩＡ（特異的Ｎ型電位依存性カルシウムチャンネル阻害剤）（ＢＡＣＨＥＭ、カタログ番号Ｈ６６１５．１０００）との１５分のプレインキュベーション時間有りまたは無し）中で、３時間３７℃においてインキュベートした。
−応答性は、ＣＣＤカメラベースの照度計で測定した（９６ＭＴＰにおけるグルタミン酸応答性に関する条件：低感度、読み取り時間６０秒；３８４ＭＴＰにおける電位依存性カルシウムチャンネル応答性に関する条件：高感度、読み取り時間６０秒）。
【００９５】
蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ（登録商標））による分化ニューロンおよび未分化ＥＳ／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）ＥＳ／２９クローンの測定
（レチノイン酸誘導型ＥＢの解離およびポリＤ−リシンコーティングした３８４黒壁透明底プレート上でのウエル当たり６５００個の細胞播種後に得た）分化細胞を第１６日で測定した。
【００９６】
未分化ＥＳ／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）ＥＳ／２９クローンは、ゼラチンコーティングした３８４黒壁透明底プレートに、試験２４時間前にウエル当たり１００００個の細胞で播種した。
【００９７】
実験を開始する前に、培地を除去し、ウエル当たり２５μｌの膜電位測定用色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、カタログ番号Ｒ８０３４）を溶かしたタイロード液中で、細胞を３７℃において３０分間インキュベートした。
【００９８】
ウエル当たり１２．５μｌのタイロード液および１２０ｍＭのＫＣｌ（３Ｘ）（１５ｍＭのＮａＣｌ、１２０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、５ｍＭのＮａＨＣＯ３および２０ｍＭのＨＥＰＥＳ）を注射し、蛍光シグナルは２５０秒間記録し、ＲＦＵ（相対的蛍光単位）として表した。
【００９９】
ＦＬＩＰＲ３８４設定：
実験時間：０．３秒
注射速度：２０μｌ／秒
注射体積（Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｈｅｉｇｈｔ）：５０μｌ
【０１００】
発光タンパク質トランスジェニックマウスにおける発光タンパク質組織の分析
第一実験
ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）トランス遺伝子に対して１匹が陽性であり１匹が陰性である２匹のマウスを使用した。２００μｌの血液のサンプルを２匹のマウスの尾静脈から取り出した。それらは生理溶液と共にかん流させて血液汚染を排除した。数種の組織を２匹のマウスから外植し（大脳、小脳、肝臓、脂肪、脾臓、骨格筋、坐骨神経、膵臓全体、肺、腎臓、血液、胃、精巣、心臓）、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＢＳＡ、２０μＭのセレンテラジンおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１８３６１４５）を含む溶液と共に室温において３時間インキュベートした。
【０１０１】
サンプルは全て外科用ハサミで切断して、組織を小部分に縮小した。
【０１０２】
サンプルは次いで、白色９６白色ウエル／プレートの３ウエルに等分した。
【０１０３】
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および２５０ｍＭのＣａＣｌ２の溶液の注射後に、サンプルは全てＣＣＤカメラベースの照度計、高感度、６０秒間、０．６秒の積分時間で読み取った。
【０１０４】
経時的な異なる組織／器官中の発光タンパク質レポータータンパク質の存在および安定性を調べるために、（ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）トランス遺伝子に対して３匹が陽性であり３匹が陰性である）６匹の動物を、異なる年齢：２匹のマウスは３カ月齢、２匹のマウスは６カ月齢、および２匹のマウスは１０カ月齢でさらに殺傷した。それらは全て生理溶液と共にかん流させて血液汚染を排除した。大脳、小脳、脾臓、肺、腎臓、胃、生殖腺、および心臓をマウスから外植し、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＢＳＡ、２０μＭのセレンテラジンおよびプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む溶液と共に室温において３時間インキュベートした。
【０１０５】
サンプルは全て外科用ハサミで切断して組織を小部分に縮小し、次いで白色９６白色ウエル／プレートに等分した。
【０１０６】
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および２５０ｍＭのＣａＣｌ２の溶液の注射後に、サンプルは全てＣＣＤカメラベースの照度計、高感度、６０秒間、０．６秒の積分時間で読み取った。
【０１０７】
第二実験
（ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）トランス遺伝子に対して１匹が陽性であり１匹が陰性である）２匹のマウスを使用した。セレンテラジン２．８ｍｇ／マウス１ｋｇを含む３００μｌのセレンテラジン溶液（３７３μＭのセレンテラジン、３．３％のＤＭＳＯ、９９０ｎＭのグルタチオン、生理溶液中）を尾静脈を介して注射した。
【０１０８】
３時間後、２００μｌの血液のサンプルを２匹のマウスの尾静脈から取り出した。
−  マウスはアベルチン（１２．５μｌ／体重１ｇ）で麻酔をかけた。肝管へのコラゲナーゼ（Ｖ型、１ｍｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）注射によって、マウスからの膵島の単離を実施した。次いでマウスは、腹部大静脈／大動脈の切断後に放血によって殺傷した。単離した膵臓は次いで消化し、β島は密度勾配（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７；Ｓｉｇｍａ）によって精製した。次いで膵島は、５％Ｃ０２での湿度雰囲気中、１０％のウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＭ１９９培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号２２３５０−０２９）中で３７℃において一晩培養した。
【０１０９】
ウエル当たり１０個のＭｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）トランスジェニックマウスの膵島を白色９６ＭＴＰに置き、１０μＭのセレンテラジンを含む標準的なタイロード溶液中で３７℃において４時間インキュベートした。膵島カルシウムの反応速度応答性を、グルコース刺激（１１ｍＭ）、または陰性対照としてマンニトール（ｌ１ｍＭ）による刺激後にＬｕｍｉｎｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）照度計；１５０秒間、積分時間０．５秒で測定した。次いでグルコース濃度を３ｍＭに標準化し、次いで膵島はＣＣＤカメラベースの照度計（高感度、６０秒間）で脱分極刺激（４０ｍＭのＫＣｌ）によって刺激した。膵島中の全発光タンパク質含有量を、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ベースのバッファーによる細胞溶解後に測定した（高感度、６０秒間）。
−  数種の組織を次いで２匹のマウスから外植し（大脳、小脳、肝臓、脂肪、脾臓、心臓、坐骨神経、胃、肺、精巣、骨、骨格筋、腎臓、皮膚、胸腺）、外科用ハサミで切断して組織を小部分に縮小した。
【０１１０】
全サンプルを２つのバッチに分けた。一部分は２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＢＳＡ、およびプロテアーゼ阻害剤カクテルを含みセレンテラジンを含まない溶液中に置き、ＣＣＤカメラベースの照度計ですぐに試験した；もう一部分はＣＣＤカメラベースの照度計による試験前に、代わりに２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＢＳＡ、２０μＭのセレンテラジンおよびプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む溶液と共に室温において３時間インキュベートした。
【０１１１】
次いで全てのサンプルを９６白色ウエル／プレートの２ウエルに等分した。
【０１１２】
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および２５０ｍＭのＣａＣｌ２の溶液の注射後に、サンプルは全てＣＣＤカメラベースの照度計、高感度、６０秒間、０．６秒の積分時間で読み取った。
【０１１３】
第三実験
１匹の他のｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）トランスジェニックマウスおよび１匹の陰性マウスを殺傷して、骨髄から単球を単離した（これらはｉｎ  ｖｉｔｒｏでマクロファージに分化させた）（６８）。
【０１１４】
ウエル当たり２００００個の各マウスに関する細胞を９６ＭＴＰプレートに播種し、細胞はＴｒｉｔｏｎＸ−１００の溶液により溶解して、全細胞の溶解活性を調べた（高感度、６０秒間、積分時間０．６秒）。
【０１１５】
Ｐ１９細胞の培養
Ｐ１９培養培地、播種およびインキュベーション
Ｐ１９胚性癌腫多能性幹細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ−１８２５）を、１０％のウシ胎児血清、ＦＢＳ（ＥＳ適任、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１６１４１０７９）、αＭＥＭ、ＧＬＵＴＡＭＡＸ添加最小必須イーグル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３２５７１０２８）、１％Ｐｅｎ．／Ｓｔｒｅｐ．（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１５１４０１２２）と共に、３７℃において５％ＣＯ２での湿度雰囲気中で培養する（６１）。
【０１１６】
Ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）による安定的なトランスフェクション
好ましいプロトコルと交換することができるエレクトロポレーション法を使用して、ＤＮＡ構築体をトランスフェクトした。
【０１１７】
ｐｃＤＮＡ３  ＤＮＡ中の約１０μｇのｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）をＢｇｌＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて線状にし、２．５×１０６個の細胞におけるエレクトロポレーションによってトランスフェクトした（エレクトロポレーション条件：５００μＦ、０．２４ｋＶ、ＢｉｏＲａｄ遺伝子パルサー）。
【０１１８】
７００μｇ／ｍｌのＧ１４８を用いたトランスフェクションから４８時間後に選択を開始した。
【０１１９】
コロニーはエレクトロポレーション後８〜９日で採取する準備を概略的に整えた。
【０１２０】
クローン選択法：
１．  Ｐ１９ｐｃＤＮＡ３／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）クローン。
２．  播種後２４時間および４８時間で、トランスフェクトした細胞は２×９６ＭＴＰ白色プレート中にウエル当たり１００００個および１５０００個の細胞で平板培養した。
３．  培地はウエル当たり５０μｌのタイロード液（２ｍＭのＣａ２＋およびセレンテラジン１０μＭ）と交換した。
４．  陽性クローンを選択し、以下のことを評価した：
−  １００μＭヒスタミンに対する応答性。ＣＣＤカメラベースの照度計条件：高感度、読み取り時間６０秒。
−  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００による細胞溶解後に測定した残留した全発光タンパク質の活性。ＣＣＤカメラベースの照度計条件：低感度、読み取り時間３０秒。
【０１２１】
Ｐ１９／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）／１Ａ１クローンｉｎ  ｖｉｔｒｏ神経分化
参考文献（６７）中に記載したプロトコルを参照
【０１２２】
Ｐ１９／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）／１Ａ１クローンに由来するニューロンのＣＣＤカメラベースの照度計による測定
神経分化のプロトコルの第８日および第１１日（ポリＤ−リシンコーティングした３８４ＭＴＰにおける播種後それぞれ第４日および第７日）に、Ｐ１９／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）／１Ａ１クローンから分化したニューロンを、ウエル当たり２５μｌの１０μＭセレンテラジンと共に標準的なタイロードバッファー中で３７℃において４時間インキュベートした。
【０１２３】
４０ｍＭのＫＣｌの注射によって誘導した脱分極刺激に対する応答性を、ＣＣＤカメラベースの照度計で記録した（条件：高感度、読み取り時間６０秒）。
【０１２４】
Ｐ１９／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）／１Ａ１クローンに由来するニューロンのＦＬＩＰＲ（登録商標）による測定
神経分化のプロトコルの第８日（ポリＤ−リシンコーティングした３８４ウエルプレートにおける播種後第４日）に、Ｐ１９／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）／１Ａ１クローンから分化したニューロンを、ウエル当たり２５μｌのＦｌｕｏ−４ＮＷ（登録商標）カルシウム感受性蛍光色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｆ３６２０５）と共に暗所でインキュベートした。
【０１２５】
プレートは３０分間３７℃で、次いでさらに３０分間室温でインキュベートした。
【０１２６】
ウエル当たり１２．５μｌの１２０ｍＭ  ＫＣｌ（３Ｘ）溶液を注射し、蛍光シグナルは３３０秒間記録し、ＲＦＵ（相対的蛍光単位）として表した。
【０１２７】
ＦＬＩＰＲ３８４設定：
実験時間：０．３秒
注射速度：２０μｌ／秒
注射体積：５０μｌ
【０１２８】
未分化Ｐ１９／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）／１Ａ１クローンおよびＰ１９／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）／１Ａ１クローンに由来するニューロンのＦＬＩＰＲ（登録商標）による測定
未分化Ｐ１９／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）／１Ａ１クローンに関しては、ウエル当たり３０００個の細胞をゼラチンコーティングした３８４ウエルプレートに播種した。播種後２４時間で、細胞をウエル当たり２５μｌのＦｌｕｏ−４ＮＷ（登録商標）カルシウム感受性蛍光色素と共に暗所でインキュベートした。
【０１２９】
Ｐ１９／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）／１Ａ１クローンから分化したニューロンに関しては、神経分化のプロトコルの第８日（ポリＤ−リシンコーティングした３８４ウエルプレートにおける播種後第４日）に、ウエル当たり２５μｌのＦｌｕｏ−４ＮＷ（登録商標）カルシウム感受性蛍光色素と共に暗所でインキュベートした。
【０１３０】
両方のプレートは３０分間３７℃で、次いで３０分間室温でインキュベートした。
【０１３１】
ウエル当たり１２．５μｌの以下の３Ｘ化合物を溶かしたタイロードバッファーを注射し、蛍光シグナルは３６０秒間記録しＲＦＵとして表した。
３Ｘ化合物：３００μＭのヒスタミン、および３００μＭのグルタミン酸。
【０１３２】
ＦＬＩＰＲ３８４設定：
実験時間：０．３秒
注射速度：２０μｌ／秒
注射体積：５０μｌ
【０１３３】
一過性トランスフェクションの分析：
１．  トランスフェクション後２４時間で、培地はウエル当たり５０μｌのタイロード液（２ｍＭのＣａ２＋およびセレンテラジン１０μＭ）と交換し、３７℃において４時間インキュベートした。
２．  ウエル当たり５０μｌの２００μＭヒスタミン（２Ｘ）を、Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して注射した。照度計の条件：積分時間１秒、読み取り時間６０秒。
−  残留全発光タンパク質の活性を、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００による細胞溶解後にＭｉｃｒｏｌｕｍａｔ  ＬＢ  ９６Ｐ（ＥＧ＆Ｇ  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）で測定した。読み取り時間３秒。
【０１３４】
Ｍｉｔｏ  ｉ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）およびｍｉｔｏ  Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）による安定的なトランスフェクション
好ましいプロトコルと交換することができるエレクトロポレーション法を使用して、ＤＮＡ構築体をトランスフェクトした。
【０１３５】
約１０μｇのｍｉｔｏ  Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）およびＤＮＡを、ＢｇｌＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて線状にし、２．５×１０６個の細胞におけるエレクトロポレーションによってトランスフェクトした（エレクトロポレーション条件：５００μＦ、０．２４ｋＶ、ＢｉｏＲａｄ遺伝子パルサー）。
【０１３６】
７００μｇ／ｍｌのＧ１４８を用いたトランスフェクションから４８時間後に選択を開始した。
【０１３７】
コロニーを集め、エレクトロポレーション後第９日で採取した。
−  ５０、１００および１５０μＭのヒスタミンに対する応答性。ＣＣＤカメラベースの照度計の条件：高感度、読み取り時間６０秒。
−  残留全発光タンパク質の活性を、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００による細胞溶解後に測定した。ＣＣＤカメラベースの照度計の条件：低感度、３０秒間。
【０１３８】
蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ（登録商標））による測定
ウエル当たり２００００個の細胞を３８４黒壁透明底プレート（ＭＡＴＲＩＸ、カタログ番号４３３２）に平板培養し（ウエル当たり２５μｌ）、試験は細胞播種後２４時間で実施した。実験を開始する前に、培地を除去し、ウエル当たり５０μｌのカルシウム３アッセイキット０．５Ｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、カタログ番号Ｒ８Ｏ９Ｏ）中で、細胞を３７℃において３０分間インキュベートした。ウエル当たり２５μｌのヒスタミン３００μＭ（３Ｘ）を注射し、蛍光シグナルは６０秒間記録し、ＲＦＵ（相対的蛍光単位）として表した。
【０１３９】
ＦＬＩＰＲ３８４設定：
実験時間：０．３秒
注射速度：２０μｌ／秒
注射体積：５０μｌ
【実施例】
【０１４０】
（実施例１）
発光タンパク質を用いてトランスフェクトしたＥＳ細胞系の作製
（実施例１．１．１）
Ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）ＥＳ  ＴＢＶ２クローン
マウスＥＳ  ＴＢＶ２  ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）細胞系を、ＢｇｌＩＩ制限酵素（材料および方法）を用いて線状にしたｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）発光タンパク質遺伝子を含むｐｃＤＮＡ３ベクターを用いたＥＳ  ＴＢＶ２  ｐｌ６細胞のエレクトロポレーションによって得た。
【０１４１】
トランスフェクション後４８時間で、２００μｇ／ｍｌのＧ４１８を用いて細胞を選択した。選択の８日後、１５２の薬剤耐性コロニーを採取した。形態分析後、約１１４のみがそれらが以下の９６ウエル／プレートにおける5回の反復実験においてコンフルエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）に達するまでＭＥＦ層で増殖した：
１−  ２回は、播種後２４および４８時間におけるＣＣＤカメラベースの照度計での試験用に、ゼラチンコーティングした９６白色ＭＴＰ上であった。
２−  １回は、ＤＮＡ抽出用にゼラチンコーティングした９６白色ＭＴＰ上であった。
３−  ２回は、−８０℃での凍結および保存用にフィーダー層上であった。
【０１４２】
（実施例１．１．２）
Ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）ＥＳ  ＴＢＶ２クローンの選択
測定４時間前に、陽性クローンの培地を、暗所で３７℃において５％Ｃ０２での湿度雰囲気中で、ウエル当たり５０μｌのタイロードバッファー、２ｍＭのＣａ２＋および１０μＭのセレンテラジンと交換して、活性発光タンパク質を再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ）させた。
【０１４３】
発光測定用に、ＥＳ内因性ヒスタミン−１受容体を刺激し（５８）細胞質Ｃａ２＋濃度を上昇させることが知られているヒスタミンに応答する能力（発光シグナル）に関して、細胞を最初に分析した。最初の６０秒中に１００μＭのヒスタミンの注射後に発せられた光子の数を、ＣＣＤカメラベースの照度計によって測定した。得られた応答の反応速度（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）は図１Ａ中に示す。
【０１４４】
各実験の最後に、（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む溶液によって）細胞を溶解させた。細胞中で発現された全発光タンパク質は遊離カルシウムと反応し、発光を測定した（図１Ｂ）。そのシグナルは、細胞内に含まれていた発光タンパク質の全量の指標である。
【０１４５】
１２個の最良ヒスタミン応答性クローンを選択し、９６ＭＴＰにおいて計数した細胞で再度試験した（図２ＡおよびＢ）。
【０１４６】
２個の最終クローンを、異なるパラメータに基づいて選択した。ヒスタミンに応答する能力（図３）および細胞溶解後の全発光タンパク質含有量（データ示さず）は主な識別因子であったが、細胞形態および増殖率も分析した。さらにサザンブロット分析（５９）および定量ＰＣＲ（６０）を実施した。サザンブロット分析は、ただ１つのランダムな挿入が起こったことを確かめるのに必須であった。これを調べるために、ゲノムＤＮＡは（連結を調べるために）トランスフェクトしたベクター中で１回のみ切断する制限酵素で消化し、あるいは発光タンパク質遺伝子を切除することができる（いずれも１回の消化において使用した）２つの酵素で二重消化し、結果の特異性を保証した。アッセイに使用したプローブは発光タンパク質遺伝子であった。定量ＰＣＲをさらに実施して、遺伝子挿入の数を分析した。
【０１４７】
最終クローンは、核型分析によってさらに特徴付けた（６１）。クローンＮ．２９および８４を選択した。クローンＮ．２９はゲノム中に組み込まれた１つのみの発光タンパク質遺伝子のコピーを有し、一方クローンＮ．８４はゲノム中に１回のみ組み込まれた逆位連結として２つのコピーを有する。
【０１４８】
それらはさらに、懸滴培養による胚様体形成の標準的方法後に自然に鼓動する心筋細胞に、およびレチノイン酸の存在下での胚様体形成後に神経細胞型に分化した（５７、６４、６５）。
【０１４９】
（実施例１．１．３）
ＥＳ／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）／２９クローンのステム形成（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）の実証
−  間接的な免疫蛍光アッセイをＥＳ／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）／２９クローンに実施して、特異的細胞表面抗原（ＳＳＥＡ−１）（図４Ａ）および転写因子ｏｃｔ３／４（図４Ｂ）のような、未分化多能性マウス胚幹細胞の特異的マーカーの存在を調べた。結果は良好であり、図４Ａおよび４Ｂ中に報告した。
−  これらの細胞によって示された他のステム形成の特徴は、ＥＬＦ（登録商標）ホスファターゼ染色キット（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＳＣＲＲ−３０１０）を用いて測定した、アルカリホスファターゼの酵素活性の存在である（図５）。
【０１５０】
（実施例１．１．４）
ＥＳ／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）／２９クローンで実施したｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化アッセイ
２９クローン細胞の多能性も、心筋細胞およびニューロンのような、異なる胚葉由来の細胞型にｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化するこれらの細胞の能力によって実証した。
【０１５１】
胚様体（ＥＢ）形成のステップを含む懸濁培養プロトコルおよび接着におけるプロトコル（データ示さず）のような異なる手法を使用して、分化の実験を実施した。
【０１５２】
ＥＢステップを含むプロトコルを使用して、特に最適な結果を得た（材料および方法を参照）。
【０１５３】
心筋細胞
前に記載した手順を使用して、分化第６日から始まった自然に鼓動する心筋細胞の出現を我々は発見した。鼓動領域を含むＥＢの割合は約８０％であった（図６）。異なる支持体、すなわちゼラチンコーティングした２４ＭＴＰ、９６ＭＴＰ、３８４ＭＴＰ、およびチャンバースライドのような支持体を使用して、この割合をさらに維持した（データ示さず）。
【０１５４】
成熟心筋細胞の存在を確認するために、免疫蛍光アッセイを実施して、細胞骨格タンパク質α−アクチニン（図７Ａ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）（図７Ｂ）、または転写因子ＧＡＴＡ−４（図７Ｃ）のような特異的心筋細胞マーカーの存在を検索した。
【０１５５】
Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）バッファーを用いた胚様体の解離、および１０μＭのセレンテラジンタイロード液バッファー中での再懸濁後に、予備機能試験をＣＣＤカメラベースの照度計装置で実施した。細胞を計数し、９６ＭＴＰにウエル当たり２００００個の細胞の細胞濃度で播種した。４時間後３７℃において、対照的として標準的なタイロード液バッファー、それぞれＧｑＰＣＲエンドセリン受容体およびα１−アドレナリン受容体のアゴニストでありいずれも心筋細胞中に高濃度で存在する、５０ｎＭのエンドセリン−１および１００μＭのノルエピネフリンで細胞を刺激した（ＣＣＤカメラベースの照度計の条件：高感度、６０秒間）。示された応答性は強く（特にエンドセリン受容体に関して）かつ特異的であった（図８Ａ）。同じ細胞を４０ｍＭのＫＣｌ、脱分極刺激で刺激して、心筋細胞中に高濃度で存在したＬ型電位依存性カルシウムチャンネルを活性化した。応答の特異性を、（ＫＣｌ注射前に）特異的Ｌ型電位依存性カルシウムチャンネル阻害剤である５μＭのニフェジピンと細胞の、１５分間のプレインキュベーション有りまたは無しで調べた（図８Ｂ）。
【０１５６】
残留発光タンパク質の活性を、細胞溶解バッファーを注射して調べた（ＣＣＤカメラベースの照度計の条件：高感度、３０秒間）（図８Ｃ）。
【０１５７】
ニューロン
神経分化に関しては、１μＭのオールトランス型レチノイン酸の存在下で胚様体が形成された。組織培養処理皿上への平板培養後２日で、その長さが経時的に増大する細胞の延長部分の存在を見ることができた（図９）。
【０１５８】
レチノイン酸処理したＥＢはさらに解離させ、異なるコーティング支持体に再度平板培養し、血清の不在下において神経特異的培地で培養することができる。
【０１５９】
これらの細胞において、免疫蛍光性（ニューロフィラメントＨ、ニューロン核抗原、２つの異なるフルオロクロムを用いた二重染色に関してここでは報告する−図１０ＡおよびＢ）、またはグリア細胞マーカー（グリア細胞繊維性酸性タンパク質、図１０Ｃ）、または神経前駆細胞のマーカー（ネスチン、図１０Ｄ）によって、特異的マーカーの存在を調べた。この種の細胞集団は完全に分化したニューロンによって形成されないが、グリア細胞および神経前駆細胞をさらに含むことを記すことは重要である。図１０中に、（分化第１８日での）このような集団の一例を報告する。
【０１６０】
これらの細胞の機能性をＣＣＤカメラベースの照度計で調べた。分化第１４日で、１０μＭのセレンテラジンを含むタイロード溶液と共に細胞を４時間インキュベートした。細胞はグルタミン酸受容体応答性を調べるために１００μＭのグルタミン酸を注射して刺激し（図１１Ａ）、あるいは６μＭのオメガコノトキシンＧＶＩＡの存在または不在下において４０ｍＭのＫＣｌで脱分極刺激して（１５分間のプレインキュベーション）、Ｎ型電位依存性カルシウムチャンネルを特異的に阻害した（図１１Ｂ）。
【０１６１】
これらの細胞の機能性はＦＬＩＰＲ３８４でも調べた。分化第１６日で培地を除去し、標準的なタイロード液に溶かした膜電位測定用色素と共に、３０分間３７℃において細胞をインキュベートした。４０ｍＭのＫＣｌによる刺激後、蛍光シグナルを１８０秒間記録し、ＲＦＵとして表した（図１２、連続線）。同じ実験を、対照として未分化ＥＳ／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）／２９クローンに実施した（図１２、破線）。
【０１６２】
（実施例１．１．５）
生殖細胞系伝達の分析
発光タンパク質レポーター遺伝子を含むマウス胚幹細胞（ＥＳ  ＴＢＶ２）を、生殖細胞系伝達によって試験した。クローンＮ．２９および８４を両方共、妊娠した宿主メスマウス（ＥＭＢＬ  Ｍｏｎｔｅｒｏｔｏｎｄｏ）の胚盤胞に注入した。子孫は、高度のキメラ性（ほぼ１００％）およびオスの表現型を示した。２９由来の２匹の最良キメラオスマウスを選択し、それらが成熟期に達したとき、ＢＬ６メスマウスと交配させて、トランスジェニックＥＳ細胞の生殖細胞系伝達能力を調べた。生殖細胞系伝達は、マウス胚幹細胞の全能性を実証するための唯一の明確な方法である。
【０１６３】
予想通り、これらの交配から生まれたマウスの半分は、発光タンパク質遺伝子が異型であるトランスジェニックマウスである。
【０１６４】
これらの異型トランスジェニックマウスを互いに交配させて、同型集団を得た。生まれたマウスの４分の１は同型で表現型が正常であり、トランス遺伝子は如何なる重要な遺伝子も破壊しなかったことを実証した。
【０１６５】
これらのｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）トランスジェニックマウスは、成体幹細胞（例えば造血、または間葉系幹細胞）、前駆細胞、およびさらに発光タンパク質を含む初代細胞などの細胞の、非常に重要な供給源である。
【０１６６】
発光タンパク質トランスジェニック動物由来の細胞は、（ＥＳ細胞からの分化後に得られる）「初代様」細胞の陽性対照として使用することができるが、これらの細胞はさらに、本来ＨＴＳプロセス用の発光タンパク質を含む初代細胞の良い供給源である。
【０１６７】
この理由のため、我々は発光タンパク質が発現される組織を調べることを決めた。
【０１６８】
ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）トランス遺伝子に対して１匹が陽性であり１匹が陰性である、２匹のマウスを我々は殺傷した。幾つかの組織を２匹のマウスから外植し、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＢＳＡ、２０μＭのセレンテラジンおよびプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む溶液と共にインキュベートした。３時間のインキュベーション後室温で、我々はＴｒｉｔｏｎＸ−１００および２５０ｍＭのＣａＣｌ２の溶液を注射して組織／器官を溶かして、不飽和カルシウム環境でサンプル中に存在する全発光タンパク質を放出させた（図１３Ａ）。異なる組織中の発光タンパク質トランス遺伝子の存在を、異なる年齢（３、６、１０カ月齢）の動物において経時的に調べ、同時に前に記載したのと同じ手順を用いてより多くの動物を分析した。サンプル量が標準化されなかった事実を考慮すると、測定したシグナルは保持時間中安定しているようである（図１３Ｂ）。
【０１６９】
次いで我々は第二実験を実施し、その中で我々は、尾静脈を介してセレンテラジン２．８ｍｇ／ｋｇを静脈内全身注射した後に異なる組織／器官中に存在する発光タンパク質を、拡散および帯電させるセレンテラジンの能力を調べた（６６）。３時間後、マウスを殺傷し幾つかの組織／器官を外植した。材料の半分は、細胞溶解およびカルシウム溶液の注射後に、ＣＣＤカメラベースの照度計で直接試験した（高感度、６０秒間、０．６積分時間）（図１４Ａ）。材料の他の半分は他の９６ＭＴＰに移し、２０μＭのセレンテラジンを含む溶液と共にさらに３時間インキュベートした。さらにこの他のプレートは、細胞溶解およびカルシウム溶液の注射後に、ＣＣＤカメラベースの照度計で試験した（高感度、６０秒間、０．６積分時間）（図１４Ｂ）。
【０１７０】
殺傷前に、我々は膵島の単離および精製も実施した（材料および方法を参照）。膵島は一晩３７℃で培養した。翌日膵島を手作業で採取し９６ＭＴＰに置いた（ウエル当たり１０個の膵島）。それらは３７℃において３時間、１０μＭのセレンテラジンを含む標準的なタイロード液中でインキュベートした。
【０１７１】
その後膵島を１１ｍＭのグルコースで刺激して、カルシウム介在性インシュリン経路を活性化した。対照として、他の糖（カルシウム介在性インシュリン応答を誘導することができない）、マンニトール（最終濃度１１ｍＭ）でも、膵島を刺激した。これらはＬｕｍｉｎｏｓｋａｎ照度計；１５０秒間、積分時間０．５で測定した（図１５Ａ）。
【０１７２】
次いでグルコース濃度を３ｍＭに標準化し、膵島はさらに脱分極物質（４０ｍＭのＫＣｌ）で刺激し、ＣＣＤカメラベースの照度計で測定した（高感度、６０秒間）（図１５Ｂ）。残留発光タンパク質の活性は、細胞溶解バッファーを注射して調べた（高感度、６０秒間）（図１５Ｃ）。
【０１７３】
トランスジェニック動物は、発光タンパク質を含む初代細胞の非常に重要な供給源でもある。この目的のため、初代細胞の例として、単球を陽性マウスおよび対照として陰性マウスの骨髄から単離した。次いでこれらの細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させてマクロファージを得た（６８）。細胞培養物を樹立した後、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の溶液で細胞を溶解することによって、ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）トランス遺伝子の存在を調べた（図１６）。
【０１７４】
（実施例１．２．１）
Ｍｉｔｏ  ｉ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）ＥＳ  ＴＢＶ２クローン
マウスＥＳ  ＴＢＶ２  ｍｉｔｏ  ｉ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）細胞系を、ＢｇｌＩＩ制限酵素を用いて線状にしたｍｉｔｏ  ｉ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）発光タンパク質遺伝子を含むｐｃＤＮＡ３ベクターで、ＥＳ  ＴＢＶ２ｐ１６細胞のエレクトロポレーションによって得た（材料および方法）。
【０１７５】
トランスフェクション後４８時間で、２００μｇ／ｍｌのＧ４１８を用いて細胞を選択した。選択の８日後、１３０の薬剤耐性コロニーを採取し、以下の９６ウエル／プレートにおける５回の反復実験においてコンフルエンシーに達するまでＭＥＦ層でそれらを増殖させた：
−  ２回は、播種後２４および４８時間におけるＣＣＤカメラベースの照度計での試験用に、ゼラチンコーティングした９６白色ＭＴＰ上であった。
−  １回は、ＤＮＡ抽出用にゼラチンコーティングした９６白色ＭＴＰ上であった。
−  ２回は、−８０℃での凍結および保存用にフィーダー層上であった。
【０１７６】
（実施例１．２．２）
Ｍｉｔｏ  ｉ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）ＥＳ  ＴＢＶ２クローンの選択
ＥＳ  ＴＢＶ２  ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）細胞系に関して前に報告したのと全く同様にクローンを選択した。
【０１７７】
最終クローンは番号７０および４３である。７０クローンは最高のヒスタミン応答性を示したが（図１７Ａ）、クローン４３も良いヒスタミン用量応答性を示した（データ示さず）。細胞溶解時の全体の発光は両方共良好である（図１７Ｂ）。
【０１７８】
それらはリアルタイムＰＣＲ用ではなく、唯一の積分値を示すサザンブロットによってさらに分析した。
【０１７９】
２つのクローンに関する核型は正確であった。
【０１８０】
（実施例１．３．１）
ｉ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）ＥＳ  ＴＢＶ２クローン
マウスＥＳ  ＴＢＶ２  ｉ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）細胞系を、ＢｇｌＩＩ制限酵素を用いて線状にしたｉ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）発光タンパク質遺伝子を含むｐｃＤＮＡ３ベクターで、ＥＳ  ＴＢＶ２ｐ１６細胞のエレクトロポレーションによって得た（材料および方法）。
【０１８１】
トランスフェクション後４８時間で、２００μｇ／ｍｌのＧ４１８を用いて細胞を選択した。選択の８日後、９９の薬剤耐性コロニーを採取し、以下の９６ウエル／プレートにおける５回の反復実験においてコンフルエンシーに達するまでＭＥＦ層でそれらを増殖させた：
−  ２回は、播種後２４および４８時間におけるＣＣＤカメラベースの照度計での試験用に、ゼラチンコーティングした９６白色ＭＴＰ上であった。
−  １回は、ＤＮＡ抽出用にゼラチンコーティングした９６白色ＭＴＰ上であった。
−  ２回は、−８０℃での凍結および保存用にフィーダー層上であった。
【０１８２】
（実施例１．３．２）
ｉ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）ＥＳ  ＴＢＶ２クローンの選択
ＥＳ  ＴＢＶ２  ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）細胞系に関して前に報告したのと全く同様にクローンを選択した。
【０１８３】
最終クローンは番号１１３および１０９ある。１１３クローンは最高のヒスタミン応答性を示した（図１８Ａ）。細胞溶解時の全体の発光は両方共良好である（図１８Ｂ）。
【０１８４】
それらはリアルタイムＰＣＲ用ではなく、唯一の積分値を示すサザンブロットによってさらに分析した。
【０１８５】
２つのクローンに関する核型は正確であった。
【０１８６】
（実施例２）
発光タンパク質を用いてトランスフェクトしたＰ１９細胞系の作製
（実施例２．１．１．Ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）Ｐ１９クローン）
Ｐ１９  ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）細胞系を、ＢｇｌＩＩ制限酵素を用いて線状にしたｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）発光タンパク質遺伝子を含むｐｃＤＮＡ３ベクターで、Ｐ１９細胞のエレクトロポレーションによって得た（材料および方法）。
【０１８７】
トランスフェクション後４８時間で、７００μｇ／ｍｌのＧ４１８を用いて細胞を選択した。選択の約第７〜８日後、薬剤耐性コロニーを採取し、増殖させた。
【０１８８】
（実施例２．１．２）
Ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）Ｐ１９の選択
測定４時間前に、培地を暗所で３７℃において５％ＣＯ２での湿度雰囲気中で、ウエル当たり５０μｌのタイロードバッファー、２ｍＭのＣａ２＋および１０μＭのセレンテラジンと置換して、活性発光タンパク質を再構成した。
【０１８９】
発光測定用に、Ｐ１９内因性ヒスタミン−１受容体を刺激し（５８）細胞質Ｃａ２＋濃度を上昇させることが知られているヒスタミンに応答する能力（発光シグナル）に関して、細胞を最初に分析した。
【０１９０】
２個の最終クローンを、ヒスタミンに応答する際の発光タンパク質の活性、およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００による細胞溶解後に測定した全発光タンパク質含有量に基づいて選択した（図１９）。心筋細胞発生のための誘導物質として０．５〜１％のＤＭＳＯおよびニューロン用にレチノイン酸の存在または不在下で胚様体形成を使用して得られる、自然に鼓動する心筋細胞およびニューロンに、分化プロセス後に分化するそれらの能力も考慮した（６１、６２、６４、６７）。
【０１９１】
（実施例２．１．３）
Ｐ１９／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）／１Ａ１クローンｉｎ  ｖｉｔｒｏでの神経系統への分化
多能性胚性癌腫Ｐ１９発現ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）細胞の１Ａ１クローンは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで神経細胞型に分化することができることを示した。これらの細胞がニューロフィラメントＨ（ＮＦＨ）およびニューロン核（ＮｅｕＮ）（図２０Ａおよび２０Ｂ）、または神経前駆細胞のマーカー（ネスチン）（図２０Ｃ）のような神経特異的マーカーを発現することを、免疫蛍光によって実証した。
【０１９２】
これらの細胞の機能性はＣＣＤカメラベースの照度計でも調べた。分化第８日および第１１日（ポリＤ−リシンコーティングした３８４ＭＴＰにおける胚様体の解離および播種後それぞれ第４日および第７日）に、１０μＭセレンテラジンを含むタイロード溶液と共に細胞を４時間インキュベートした。電位依存性カルシウムチャンネルは、４０ｍＭのＫＣｌまたは対照として標準的なタイロード液の注射で刺激し、最適な応答性を示した（図２１）。
【０１９３】
分化第８日に、同じ細胞を、ＦＬＵＯ−４ＮＷ（登録商標）と共に細胞をインキュベートし、４０ｍＭのＫＣｌ脱分極物質を注射し、ＦＬＩＰＲ３８４でさらに分析した。さらにこの場合、細胞中へのカルシウムの進入によるシグナルの感知し得る増大があり、最悪の反応速度の場合でさえ、発光レポーター系で観察されるシグナルをしたがって形成する（図２２）。
【０１９４】
同じ発生段階（第８日）のこれらの細胞を、代謝調節型またはイオンチャンネル型グルタミン酸受容体（図２３Ｂ、破線）あるいはヒスタミン−１受容体（ＧｑＰＣＲ）（図２３Ｂ、連続線）の存在に関してＦＬＩＰＲ３８４でさらに分析した。同じ実験を未分化Ｐ１９／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）１Ａ１クローンに（３８４ＭＴＰにウエル当たり３０００個の細胞の播種後２４時間で、図２３Ａ）同時に実施した。特に、ヒスタミン刺激後に記録したシグナルは未分化細胞中ではより大きく（それはその段階で高度に発現されるので予想通り）、分化中に低下する。反対のことがグルタミン酸刺激に関して示された、何故ならそれは未分化細胞中より分化細胞中に多量に存在するからである。グルタミン酸受容体の存在は、これらの細胞の神経関与の他の証拠である。
【０１９５】
（実施例３）
一過性トランスフェクション
Ｐ１９細胞を異なるミトコンドリアタグ発光タンパク質でトランスフェクトして（材料および方法）これらの他の発光タンパク質の能力を評価して、細胞内のカルシウム放出を測定し、発光タンパク質発現のレベルに関する情報を得た。
【０１９６】
測定４時間前に、培地を暗所で３７℃において５％Ｃ０２での湿度雰囲気中で、タイロードバッファーおよび１０μＭのセレンテラジンと置換して、活性発光タンパク質を再構成した。
【０１９７】
１００μＭのヒスタミン注射後に６０秒間蛍光シグナルを記録した。
【０１９８】
次いで細胞をＴｒｉｔｏｎＸ−１００で溶かして、全発光を検出した（図２４）。
【０１９９】
（実施例４）
安定的なトランスフェクション
Ｐ１９細胞における異なるミトコンドリアタグ発光タンパク質の安定的なトランスフェクション（材料および方法）を実施して、安定して組み込まれた形式での発光タンパク質発現のレベルを調べ、Ｐ１９細胞において安定して発現された発光タンパク質はいずれも、培養中の長期間毒性がないことを確認した。
【０２００】
測定４時間前に、培地を暗所で３７℃において５％ＣＯ２での湿度雰囲気中で、タイロードバッファーおよび１０μＭのセレンテラジンと交換して、活性発光タンパク質を再構成した。
【０２０１】
蛍光シグナルを５０、１００および１５０μＭのヒスタミン注射後に記録し、６０秒間測定した。
【０２０２】
次いで細胞をＴｒｉｔｏｎＸ−１００で溶かして、全発光を検出した（図２５）。
【０２０３】
（実施例５）
ＦＬＩＰＲ３８４での細胞ベースの蛍光アッセイ
Ｐ１９  ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）最終クローン（１Ａ１および１Ａ２）も、発光の代わりに蛍光を使用する検出法を用いて、内因性ヒスタミン１受容体の活性化によって誘導されるカルシウム濃度の変化を測定することによってＦＬＩＰＲ３８４で試験した。
【０２０４】
細胞はカルシウム３アッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）でインキュベートした。
【０２０５】
これらの実験を実施して、発光ベースのカルシウム検出の代わりに蛍光カルシウム検出法を使用して得た結果を比較し、蛍光に優る発光の利点を評価した。得られた結果は、蛍光ベースの方法は発光と比較して高いバックグラウンドを有することを示す。これは蛍光の低いシグナル対ノイズバックグラウンドを反映する。それとは反対に、発光に関するシグナル対ノイズバックグラウンドは高く、これは蛍光と比較して広いダイナミックレンジを反映する（図２６）。
［参考文献］
2009523024.tif 000002
2009523024.tif 000003
2009523024.tif 000004
2009523024.tif 000005
2009523024.tif 000006
2009523024.tif 000007
2009523024.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【０２０６】
【図１Ａ】１１４個のネオマイシン耐性クローンのクローン集合体の分析の図である。ヒスタミン応答反応速度（１００μＭ）をＣＣＤカメラベースの照度計で測定し、ＲＬＵ（相対的発光単位）値として記録した。実験は細胞播種後２４時間で９６ＭＴＰにおいて実施した。ＣＣＤカメラベースの照度計の条件：高感度、６０秒間。
【図１Ｂ】１１４個のネオマイシン耐性クローンのクローン集合体の分析の図である。全発光タンパク質の残留活性を、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００による細胞溶解後に測定した。ＣＣＤカメラベースの照度計の条件：低感度、読み取り時間５秒。
【図２Ａ】１２個のＥＳ／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）最良クローンの分析の図である。１２個の最良ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）ＥＳクローンのヒスタミン応答性（１００μＭ）を、ウエル当たり２００００個の細胞播種後２４時間で９６ＭＴＰにおいて測定した。ＣＣＤカメラベースの照度計の条件：高感度、読み取り時間６０秒。
【図２Ｂ】１２個のＥＳ／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）最良クローンの分析の図である。１２個の最良ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）ＥＳクローンの全発光タンパク質の残留活性を、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００による細胞溶解後に測定した。ＣＣＤカメラベースの照度計の条件：低感度、読み取り時間５秒。
【図３Ａ】２個のＥＳ／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）最終クローンの分析の図である。ヒスタミン応答性（１００μＭ）を、ウエル当たり１００００個の細胞播種後２４時間で９６ＭＴＰにおいて測定した。ＣＣＤカメラベースの照度計の条件：高感度、読み取り時間６０秒。
【図３Ｂ】２個のＥＳ／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）最終クローンの分析の図である。ヒスタミン応答性（１００μＭ）を、ウエル当たり２００００個の細胞播種後２４時間で９６ＭＴＰにおいて測定した。ＣＣＤカメラベースの照度計の条件：高感度、読み取り時間６０秒。
【図４Ａ】未分化ＥＳ／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）／２９クローンにおける免疫蛍光分析の図である。免疫蛍光アッセイは以下の抗体を使用して実施した：マウス抗ＳＳＥＡ−１  一次抗体＋抗マウスＦＩＴＣ二次抗体。
【図４Ｂ】未分化ＥＳ／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）／２９クローンにおける免疫蛍光分析の図である。免疫蛍光アッセイは以下の抗体を使用して実施した：マウス抗−ｏｃｔ３／４  一次抗体＋抗マウスＦＩＴＣ二次抗体。
【図５】ＥＬＦ（登録商標）ホスファターゼ染色キットを用いて測定した、アルカリホスファターゼ活性の図である。
【図６Ａ】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＥＳ／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）／２９クローンにおける心筋細胞分化アッセイの図である。分化第２日での懸濁液中の胚様体。
【図６Ｂ】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＥＳ／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）／２９クローンにおける心筋細胞分化アッセイの図である。ゼラチンコーティング皿上に平板培養する前の分化第５日での懸濁液中の胚様体。
【図６Ｃ】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＥＳ／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）／２９クローンにおける心筋細胞分化アッセイの図である。形態分析によって評価した脈動領域を含む胚様体の割合。
【図７Ａ】ＥＳ／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）／２９クローン由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した心筋細胞における免疫蛍光分析の図である。免疫蛍光アッセイは以下の抗体を使用して実施した：マウス抗サルコメアα−アクチニン一次抗体＋抗マウスＦＩＴＣ二次抗体。
【図７Ｂ】ＥＳ／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）／２９クローン由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した心筋細胞における免疫蛍光分析の図である。免疫蛍光アッセイは以下の抗体を使用して実施した：ウサギ抗ミオシン重鎖（ＭＨＣ）一次抗体＋抗ウサギＦＩＴＣ二次抗体。
【図７Ｃ】ＥＳ／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）／２９クローン由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した心筋細胞における免疫蛍光分析の図である。免疫蛍光アッセイは以下の抗体を使用して実施した：ウサギ抗ＧＡＴＡ４一次抗体＋抗ウサギＦＩＴＣ二次抗体。
【図８Ａ】ＥＳ／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）／２９クローン由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した心筋細胞におけるＣＣＤカメラベースの発光機能試験の図である。タイロード液バッファー、ノルエピネフリン（１００μＭ）、およびエンドセリン−１（５０ｎＭ）に対する応答性を、ウエル当たり２００００個の細胞播種後４時間で９６ＭＴＰにおいて測定した。ＣＣＤカメラベースの照度計の条件：高感度、読み取り時間６０秒。
【図８Ｂ】ＥＳ／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）／２９クローン由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した心筋細胞におけるＣＣＤカメラベースの発光機能試験の図である。５μＭのニフェジピンの存在または不在下で測定した脱分極刺激（４０ｍＭのＫＣｌ）。ＣＣＤカメラベースの照度計の条件：高感度、読み取り時間６０秒。
【図８Ｃ】ＥＳ／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）／２９クローン由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した心筋細胞におけるＣＣＤカメラベースの発光機能試験の図である。全発光タンパク質の残留活性を、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００による細胞溶解後に測定した。ＣＣＤカメラベースの照度計の条件：高感度、読み取り時間３０秒。
【図９Ａ】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＥＳ／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）／２９クローンにおける神経分化アッセイの可視画像の図である。分化第７日にゼラチンコーティング皿上に平板培養した胚様体。
【図９Ｂ】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＥＳ／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）／２９クローンにおける神経分化アッセイの可視画像の図である。分化第９日にゼラチンコーティング皿上に平板培養した胚様体。
【図９Ｃ】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＥＳ／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）／２９クローンにおける神経分化アッセイの可視画像の図である。分化第１１日にゼラチンコーティング皿上に平板培養した胚様体。
【図９Ｄ】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＥＳ／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）／２９クローンにおける神経分化アッセイの可視画像の図である。分化第１３日にゼラチンコーティング皿上に平板培養した胚様体。
【図１０Ａ】９６ＭＴＰにおけるＥＳ／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）／２９クローン由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化したニューロンにおける免疫蛍光分析の図である。免疫蛍光アッセイは以下の一次抗体を使用して実施した：ウサギ抗ニューロフィラメントＨ（ＮＦＨ）一次抗体＋抗ウサギＦＩＴＣ二次抗体（Ｂと同じ視野）。
【図１０Ｂ】９６ＭＴＰにおけるＥＳ／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）／２９クローン由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化したニューロンにおける免疫蛍光分析の図である。免疫蛍光アッセイは以下の一次抗体を使用して実施した：マウス抗ニューロン核（ＮｅｕＮ）一次抗体＋抗マウスローダミン標識二次抗体（Ａと同じ視野）。
【図１０Ｃ】９６ＭＴＰにおけるＥＳ／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）／２９クローン由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化したニューロンにおける免疫蛍光分析の図である。免疫蛍光アッセイは以下の一次抗体を使用して実施した：ウサギ抗グリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）一次抗体＋抗ウサギＦＩＴＣ二次抗体。
【図１０Ｄ】９６ＭＴＰにおけるＥＳ／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）／２９クローン由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化したニューロンにおける免疫蛍光分析の図である。免疫蛍光アッセイは以下の一次抗体を使用して実施した：マウス抗ネスチン一次抗体＋抗マウスＦＩＴＣ二次抗体。
【図１１Ａ】ＥＳ／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）／２９クローン由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化したニューロンにおけるＣＣＤカメラベースの発光機能試験の図である。標準的なタイロード液、およびグルタミン酸（１００μＭ）に対する応答性を、第１４日で９６ＭＴＰにおいて測定した。ＣＣＤカメラベースの照度計の条件：低感度、読み取り時間６０秒。
【図１１Ｂ】ＥＳ／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）／２９クローン由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化したニューロンにおけるＣＣＤカメラベースの発光機能試験の図である。標準的なタイロード液、および４０ｍＭのＫＣｌに対する応答性を、６μＭのオメガコノトキシンＧＶＩＡの存在または不在下において第１４日で３８４ＭＴＰにおいて測定した。ＣＣＤカメラベースの照度計の条件：高感度、読み取り時間６０秒。
【図１２】ＥＳ／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）／２９クローン由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏで未分化および分化条件の（第１６日）ニューロンにおけるＦＬＩＰＲ３８４機能試験の図である。ＦＬＩＰＲ３８４分析用に、細胞は膜電位アッセイキットを用いて３０分間３７℃においてインキュベートし、次いで４０ｍＭの最終濃度でＫＣｌを注射した。蛍光シグナルを２５０秒間記録し、ＲＦＵとして表した（ＦＬＩＰＲ３８４設定：実験時間：０．３秒；注射速度：２０μｌ／秒；注射体積：５０μｌ；読み取り時間：３６０秒）。
【図１３Ａ】トランスジェニックｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）マウスにおける発光タンパク質の組織局在の図である。１４の異なる組織／器官をｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）を発現する陰性および陽性マウスから外植し、室温において２０μＭのセレンテラジンと共に３時間インキュベートした。各組織中の発光タンパク質の含有量は、２５０ｍＭのＣａＣｌ２およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００の溶液を注射して測定した。ＣＣＤカメラベースの照度計の条件：高感度、読み取り時間６０秒。
【図１３Ｂ】トランスジェニックｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）マウスにおける発光タンパク質の組織局在の図である。ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）を発現する異なる年齢（３、６、１０カ月齢）の陰性および陽性マウスから外植し、室温において２０μＭのセレンテラジンと共に３時間インキュベートした８個の組織／器官の比較。各組織中の発光タンパク質の含有量は、２５０ｍＭのＣａＣｌ２およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００の溶液を注射して測定した。ＣＣＤカメラベースの照度計の条件：高感度、読み取り時間６０秒。
【図１４Ａ】異なる条件でセレンテラジンと共にインキュベートした組織および器官の図である。陽性トランスジェニックｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）マウスおよび陰性対照における、２．８ｍｇ／ｋｇのセレンテラジンの全身内注射後の異なる組織／器官のＣＣＤカメラベースの照度計による分析。３時間後、１６の異なる組織／器官を両方のマウスから外植した。材料の半分は白色９６ＭＴＰに直接播種した。
【図１４Ｂ】異なる条件でセレンテラジンと共にインキュベートした組織および器官の図である。室温において２０μＭのセレンテラジンと共に３時間さらにインキュベートした残りの材料の、ＣＣＤカメラベースの照度計による分析。全サンプルの発光タンパク質の含有量は、２５０ｍＭのＣａＣｌ２およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００の溶液の注射後に発せられた光を記録することによりＣＣＤカメラベースの照度計で分析した。ＣＣＤカメラベースの照度計の条件：高感度、読み取り時間６０秒。
【図１５Ａ】トランスジェニックｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）マウスから単離した膵島に実施した、ＣＣＤカメラベースの照度計の発光機能試験の図である。膵島は、１匹の陽性トランスジェニックｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）および１匹の陰性マウスから単離した。一晩の培養後、ウエル当たり１０個の膵島を白色９６ＭＴＰに置いた。１０個の膵島をそれぞれ含む２つの異なるウエルを１０μＭのセレンテラジンと共に３時間インキュベートし、１１ｍＭのグルコース、または陰性対照として１１ｍＭのマンニトールでそれぞれ刺激した。Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ照度計。積分時間０．５秒。読み取り時間１５０秒。
【図１５Ｂ】トランスジェニックｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）マウスから単離した膵島に実施した、ＣＣＤカメラベースの照度計の発光機能試験の図である。膵島は、１匹の陽性トランスジェニックｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）および１匹の陰性マウスから単離した。一晩の培養後、ウエル当たり１０個の膵島を白色９６ＭＴＰに置いた。次いで膵島を４０ｍＭのＫＣｌで刺激した。発せられた光は以下の設定：高感度、読み取り時間６０秒で、ＣＣＤカメラベースの照度計で測定した。
【図１５Ｃ】トランスジェニックｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）マウスから単離した膵島に実施した、ＣＣＤカメラベースの照度計の発光機能試験の図である。膵島は、１匹の陽性トランスジェニックｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）および１匹の陰性マウスから単離した。一晩の培養後、ウエル当たり１０個の膵島を白色９６ＭＴＰに置いた。膵島の全発光タンパク質の残留活性を、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む溶液を用いた細胞溶解後に発せられた光を記録することにより評価した。ＣＣＤカメラベースの照度計の条件：高感度、読み取り時間６０秒。
【図１６】ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）トランスジェニックマウス由来のマクロファージの細胞溶解時に測定した全発光の図である。ウエル当たり２００００個の細胞を９６ＭＴＰプレートに播種した。ＣＣＤカメラベースの照度計の条件：高感度、積分時間０．６秒。読み取り時間６０秒。
【図１７Ａ】２個のＥＳ／ｍｉｔｏ  ｉ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）最終クローンの分析の図である。ウエル当たり１００００個の細胞播種後２４時間で９６ＭＴＰにおいて測定したクローンＮ．７０のヒスタミン用量応答性。ＣＣＤカメラベースの照度計の条件：高感度、読み取り時間６０秒。
【図１７Ｂ】２個のＥＳ／ｍｉｔｏ  ｉ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）最終クローンの分析の図である。２個の最良ＥＳ／ｍｉｔｏ  ｉ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）クローンの全発光タンパク質の残留活性を、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む溶液を用いた細胞溶解後に測定した。ＣＣＤカメラベースの照度計の条件：低感度、読み取り時間５秒。
【図１８Ａ】２個のＥＳ／ｉ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）最終クローンの分析の図である。ウエル当たり１００００個の細胞播種後２４時間で９６ＭＴＰにおいて測定したクローンＮ．１１３のヒスタミン用量応答性。ＣＣＤカメラベースの照度計の条件：高感度、読み取り時間６０秒。
【図１８Ｂ】２個のＥＳ／ｉ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）最終クローンの分析の図である。２個の最良ＥＳ／ｉ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）クローンの全発光タンパク質の残留活性を、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む溶液を用いた細胞溶解後に測定した。ＣＣＤカメラベースの照度計の条件：低感度、読み取り時間５秒。
【図１９Ａ】Ｐ１９／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）２最終クローンの分析の図である。Ｐ１９／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）１Ａ１クローンのヒスタミン応答性を、ウエル当たり２００００個の細胞播種後２４時間で９６ＭＴＰにおいて測定した。ＣＣＤカメラベースの照度計の条件：高感度、読み取り時間６０秒。
【図１９Ｂ】Ｐ１９／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）２最終クローンの分析の図である。Ｐ１９／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）１Ａ２クローンのヒスタミン応答性を、ウエル当たり２００００個の細胞播種後２４時間で９６ＭＴＰにおいて測定した。ＣＣＤカメラベースの照度計の条件：高感度、読み取り時間６０秒。
【図１９Ｃ】Ｐ１９／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）２最終クローンの分析の図である。全発光タンパク質の残留活性を、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００による細胞溶解後に測定した。ＣＣＤカメラベースの照度計の条件：低感度、読み取り時間３０秒。
【図２０Ａ】９６ＭＴＰにおけるＰ１９／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）１Ａ１クローン由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化したニューロンに関する免疫蛍光分析の図である。免疫蛍光アッセイは以下の一次抗体を使用して実施した：ウサギ抗ニューロフィラメントＨ（ＮＦＨ）一次抗体＋抗ウサギＦＩＴＣ二次抗体。
【図２０Ｂ】９６ＭＴＰにおけるＰ１９／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）１Ａ１クローン由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化したニューロンに関する免疫蛍光分析の図である。免疫蛍光アッセイは以下の一次抗体を使用して実施した：蛍光顕微鏡および光学顕微鏡で見た、マウス抗ニューロン核一次抗体＋抗マウスローダミン標識二次抗体。
【図２０Ｃ】９６ＭＴＰにおけるＰ１９／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）１Ａ１クローン由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化したニューロンに関する免疫蛍光分析の図である。免疫蛍光アッセイは以下の一次抗体を使用して実施した：蛍光顕微鏡および光学顕微鏡で見た、マウス抗ネスチン一次抗体＋抗マウスＦＩＴＣ二次抗体。
【図２１Ａ】Ｐ１９／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）１Ａ１クローン由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化したニューロンにおけるＣＣＤカメラベースの機能試験の図である。タイロード、および４０ｍＭのＫＣｌに対する応答性を、第８日の分化したニューロンに関して３８４ＭＴＰにおいて測定した。ＣＣＤカメラベースの照度計の条件：高感度、読み取り時間６０秒。
【図２１Ｂ】Ｐ１９／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）１Ａ１クローン由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化したニューロンにおけるＣＣＤカメラベースの機能試験の図である。タイロード、および４０ｍＭのＫＣｌに対する応答性を、第１１日の分化したニューロンに関して３８４ＭＴＰにおいて測定した。ＣＣＤカメラベースの照度計の条件：高感度、読み取り時間６０秒。
【図２２】第８日のＰ１９／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）１Ａ１クローン由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化したニューロンにおけるＦＬＩＰＲ３８４機能試験の図である。ＦＬＩＰＲ３８４分析用に、培地はＦｌｕｏ−４ＮＷ（登録商標）カルシウム感受性蛍光色素と交換した。次いでプレートを３０分間３７℃および３０分間室温でインキュベートし、次いでＫＣｌ溶液（４０ｍＭの最終濃度）を注射した。蛍光シグナルは３６０秒間記録し、ＲＦＵとして表した（ＦＬＩＰＲ３８４設定：実験時間：０．３秒；注射速度：２０μｌ／秒；注射体積：５０μｌ；読み取り時間：３６０秒）。
【図２３Ａ】Ｐ１９／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）１Ａ１クローン由来の未分化および第８日のｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化条件のニューロンにおけるＦＬＩＰＲ３８４機能試験の図である。ＦＬＩＰＲ３８４分析用に、培地はウエル当たり２５μｌのＦｌｕｏ−４ＮＷ（登録商標）カルシウム感受性蛍光色素と交換した。プレートを１時間インキュベートし、次いでヒスタミンまたはグルタミン酸（１００μＭの最終濃度）を注射した。蛍光シグナルは３６０秒間記録し、ＲＦＵとして表した（ＦＬＩＰＲ３８４設定：実験時間：０．３秒；注射速度：２０μｌ／秒；注射体積：５０μｌ；読み取り時間：３３０秒）。播種後２４時間で試験した未分化Ｐ１９／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）１Ａ１クローン細胞３０００細胞／ウエルのＦＬＩＰＲ３８４の応答性。
【図２３Ｂ】Ｐ１９／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）１Ａ１クローン由来の未分化および第８日のｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化条件のニューロンにおけるＦＬＩＰＲ３８４機能試験の図である。ＦＬＩＰＲ３８４分析用に、培地はウエル当たり２５μｌのＦｌｕｏ−４ＮＷ（登録商標）カルシウム感受性蛍光色素と交換した。プレートを１時間インキュベートし、次いでヒスタミンまたはグルタミン酸（１００μＭの最終濃度）を注射した。蛍光シグナルは３６０秒間記録し、ＲＦＵとして表した（ＦＬＩＰＲ３８４設定：実験時間：０．３秒；注射速度：２０μｌ／秒；注射体積：５０μｌ；読み取り時間：３３０秒）。第８日のＰ１９／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）１Ａ１クローン由来の分化条件のニューロンのＦＬＩＰＲ３８４の応答性。
【図２４Ａ】Ｐ１９細胞における異なる発光タンパク質（ｍｉｔｏ  Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）、ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）、ｍｉｔｏ  ｉ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標））の一過性トランスフェクションの図である。１００μＭヒスタミンに対する応答性をＬｕｍｉｎｏｓｋａｎ照度計で測定した。読み取り時間６０秒。
【図２４Ｂ】Ｐ１９細胞における異なる発光タンパク質（ｍｉｔｏ  Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）、ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）、ｍｉｔｏ  ｉ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標））の一過性トランスフェクションの図である。全発光を、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００による細胞溶解後にＢｅｒｔｈｏｌｄ照度計で測定した。読み取り時間３秒。
【図２５Ａ】ｍｉｔｏ  ｉ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）で安定的にトランスフェクトしたＰ１９細胞の集合体の分析の図である。９６ＭＴＰにおける５０、１００および１５０μＭのヒスタミンに対する用量応答性を、ウエル当たり１００００個の細胞播種後２４時間で測定した。ＣＣＤカメラベースの照度計の条件：高感度、読み取り時間６０秒。
【図２５Ｂ】ｍｉｔｏ  Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）で安定的にトランスフェクトしたＰ１９細胞の集合体の分析の図である。９６ＭＴＰにおける５０、１００および１５０μＭのヒスタミンに対する用量応答性を、ウエル当たり１００００個の細胞播種後２４時間で測定した。ＣＣＤカメラベースの照度計の条件：高感度、読み取り時間６０秒。
【図２５Ｃ】全発光を、ウエル当たり１００００個および２００００個の細胞播種後２４時間で、９６ＭＴＰにおけるＴｒｉｔｏｎＸ−１００による細胞溶解後に測定した図である。ＣＣＤカメラベースの照度計の条件：低感度、読み取り時間３０秒。
【図２６Ａ】Ｐ１９／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）２最終クローンのＦＬＩＰＲおよびＣＣＤカメラベースの照度計での比較の図である。Ｐ１９／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）１Ａ１クローンのヒスタミン応答性を、ウエル当たり２００００個の細胞播種後２４時間で３８４ＭＴＰにおいて測定した。ＣＣＤカメラベースの照度計による分析用に、３７℃における１０μＭのセレンテラジン溶液での読み取り４時間前に培地を交換した（ＣＣＤカメラベースの照度計の条件：高感度、読み取り時間６０秒）。ＦＬＩＰＲ（登録商標）分析用に、カルシウム３アッセイキット０．５Ｘでの読み取り３０分前に培地を交換した（ＦＬＩＰＲ３８４設定：実験時間：０．２秒；注射速度：２０μｌ／秒；注射体積：５０μｌ；読み取り時間：６０秒）。両方の測定に関して、ヒスタミンの最終濃度は１００μＭであった。シグナル対ノイズ比を計算し、照度計（ＲＬＵ：相対的発光単位で表す）と蛍光計（ＲＦＵ：相対的蛍光単位で表す）の両方に関して報告した。
【図２６Ｂ】Ｐ１９／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）２最終クローンのＦＬＩＰＲおよびＣＣＤカメラベースの照度計での比較の図である。Ｐ１９／ｍｉｔｏ  ｃ−Ｐｈｏｔｉｎａ（登録商標）１Ａ２クローンのヒスタミン応答性を、ウエル当たり２００００個の細胞播種後２４時間で３８４ＭＴＰにおいて測定した。ＣＣＤカメラベースの照度計による分析用に、３７℃における１０μＭのセレンテラジン溶液での読み取り４時間前に培地を交換した（ＣＣＤカメラベースの照度計の条件：高感度、読み取り時間６０秒）。ＦＬＩＰＲ（登録商標）分析用に、カルシウム３アッセイキット０．５Ｘでの読み取り３０分前に培地を交換した（ＦＬＩＰＲ３８４設定：実験時間：０．２秒；注射速度：２０μｌ／秒；注射体積：５０μｌ；読み取り時間：６０秒）。両方の測定に関して、ヒスタミンの最終濃度は１００μＭであった。シグナル対ノイズ比を計算し、照度計（ＲＬＵ：相対的発光単位で表す）と蛍光計（ＲＦＵ：相対的蛍光単位で表す）の両方に関して報告した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2009523024.tif 000016
【図５】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
2009523024.tif 000019
【図８Ａ】
2009523024.tif 000020
【図８Ｂ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
2009523024.tif 000033
【図１７Ａ】
2009523024.tif 000034
【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
2009523024.tif 000036
【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０Ａ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
2009523024.tif 000048
【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図８Ｃ】
2009523024.tif 000058
【図９Ａ】
2009523024.tif 000059
【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2009523024.tif 000068
2009523024.tif 000069
2009523024.tif 000070
2009523024.tif 000071