(57)【要約】  本発明は医薬分野に属し、具体的には、遺伝子物質を含んだ製剤を用いて患者を治療する方法に関し、発癌遺伝子および抑制遺伝子の遺伝子突然変異ならびに悪性形質転換を被る細胞の対立遺伝子のトータル遺伝子ホモ接合によって引き起こされる腫瘍性疾患に罹患した患者の治療に用いることができる。前記方法によって、適用領域を拡大することが可能になるとともに、生理学的かつ遺伝的に健常なドナーの完全ゲノムの形態で具現化される相同的ＤＮＡ断片を生体に注入することによって、発癌遺伝子および抑制遺伝子の遺伝子突然変異ならびに細胞の対立遺伝子のトータル遺伝子ホモ接合によって引き起こされる腫瘍性疾患に罹患した患者を治療することが可能になる。注入されるＤＮＡの量は患者の血漿および組織液のＤＮＡ異常であるが、３０μｇ／ｍｌに等しい最大許容量以下であることを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
断片化ＤＮＡを患者に導入することを含む腫瘍性疾患の治療方法であって、生物学的に活性のある大きさを有し、生理学的かつ遺伝的に健常なドナーの完全ゲノムを含んだ相同ＤＮＡの断片を断片化ＤＮＡとして用いることを特徴とする、腫瘍性疾患の治療方法。
【請求項２】
患者に導入する断片化ＤＮＡの量が、血漿および組織液中の自己のＤＮＡの量以上であるが、３０μｇ／ｍｌに等しい最大許容量以下である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬分野に属し、具体的には、遺伝子物質を含んだ製剤を用いて患者を治療する方法に属し、発癌遺伝子、癌抑制遺伝子、および悪性形質転換を被る細胞のトータル遺伝子ホモ接合（total gene homozygotization）の突然変異によって引き起こされる腫瘍性疾患に罹患した患者の治療に用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
細胞の点突然変異の修復に基づいた治療法が知られている（１９９８年８月１８日公開の米国特許第５，７９５，９７２号（特許文献１））。
【０００３】
この方法は治療開始前に突然変異を正確に決定する必要があるため、治療効率が比較的低く、投与範囲が限られる。
【０００４】
癌の原因となる特定の突然変異に関しては信頼できる立証が未だないので、上記方法の開発にはきわめて注意深く、長期にわたるリサーチを行って、補正を必要とする特定の突然変異を検出することが必要となる。このため、悪性化を誘発したゲノムの特定の変化に注目することなく、既に利用可能な癌の原因に関する知識に基づいて適用可能な方法を開発することが必要である。
【０００５】
患者の皮膚の前癌性状態および日焼けの刺激を治療するためのＤＮＡ断片の局所投与に関する方法も知られている（１９９９年９月２１日公開の米国特許第５，９５５，０５９号、１９９５年１１月２８日公開の米国特許第５，４７０，５７７号（特許文献２、３））。
【０００６】
対応する特許には具体的なＤＮＡ配列もＤＮＡ源も特定されていないので、これらの方法の適用性は限定される。それらの特許は、「任意の適した供給源」、例えば、二量体を含む、長さが２００ｂｐからモノヌクレオチドおよびヌクレオシドまでのサケＤＮＡからの天然ＤＮＡおよび合成ＤＮＡを用いることを提案しており、このような供給源は当該発明者らの試験によれば、最も効果的である。しかし、外来ＤＮＡを人体に投与することの効果およびその結果は未だ詳細に研究されておらず、これらの方法を適用する際にはある種の危険を避けられない。
【０００７】
提案された方法に本質的に最も近い方法は、細胞においてＤＮＡ修復を活性化することに基づくものであり、この方法によれば、修復酵素を皮膚細胞に送達する（１９９４年４月１２日公開の米国特許第５，３０２，３８９号（プロトタイプ）（特許文献４））。
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５，７９５，９７２号明細書
【特許文献２】米国特許第５，９５５，０５９号明細書
【特許文献３】米国特許第５，４７０，５７７号明細書
【特許文献４】米国特許第５，３０２，３８９号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
この技術的に最も近い解決策の欠点は、適用領域が限定されることであり、これはこの方法が皮膚の腫瘍性疾患のみの治療を意図したもので、既存の突然変異を修復することを意味していないことによる。
【００１０】
これらの方法はどれも、遺伝子突然変異を補正する方法の必要性が未だに最も話題になることを示している。それは発癌遺伝子および癌抑制遺伝子の突然変異によって引き起こされる腫瘍性疾患ならびにトータル遺伝子ホモ接合によって引き起こされる腫瘍性疾患に罹患した患者の治療に相当な程度まで言及している。
【００１１】
解決すべき問題は、発癌遺伝子および癌抑制遺伝子の突然変異によって引き起こされる腫瘍性疾患ならびにトータル遺伝子ホモ接合によって引き起こされる腫瘍性疾患に罹患した患者の適用領域および治療を拡大することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
より広範な局面においては、本発明の技術的問題は、細胞が癌細胞の主要な特徴である無限の増殖活性を失わせる逆の遺伝子形質転換を受けるときに遺伝子安定性が変えられるように、ヒト腺癌細胞培養ならびに人工的に誘起したマウス腫瘍のモデルを用いて実験的に裏付けられた癌細胞および腫瘍全体に影響を及ぼす方法を開発することである。
【００１３】
必要な結果は、断片化したＤＮＡを生体に導入することに基づいて腫瘍性疾患を治療する方法が、生理学的かつ遺伝的に健常なドナーの完全ゲノムを含んだ相同ＤＮＡの断片を用いることによって達成される。この方法では、導入されるＤＮＡの量は、患者の血漿および組織液の自己のＤＮＡの量以上であるが、３０μｇ／ｍｌに等しい最大許容量以下である。
【００１４】
現在の文献には、断片化した遺伝的に健常なＤＮＡ、染色体間の空間内でのそのＤＮＡの送達および付着の自然な機構、および送達された断片とそれに対応して特定の細胞の癌性形質転換を引き起こした突然変異体を有する染色体領域との間の相同的組換えを用いて
腫瘍性疾患に罹患した患者を治療するための提案した方法への言及がない。
【００１５】
したがって、本発明の提案は新規性の基準および発明レベルの基準を満たすものである。
【００１６】
本発明が実用的（産業的）適用性の基準も満たすことを裏付ける理論的データおよび実験データを以下に示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
腫瘍性疾患を治療するために提案した方法は、以下のように実現される。
【００１８】
この方法によれば、断片化ＤＮＡが、（静脈注射、筋肉注射、または皮内注射によって；皮下；腹腔内；粘膜および／または皮膚の洗浄あるいはそれへの塗布によって；酸性の胃の培養液の事前中和を用いるか、または用いない、あるいは胃で溶解する特別なカプセルを用いた経口投与によって；直腸内；膣内；眼内；鼻腔内；腫瘍への導入によって；脳内；眼内注射による；吸入によって、あるいは脳脊髄管への注入によって）患者の生体に導入される。
【００１９】
この目的のために、生理学かつ遺伝的に健常なドナーの完全ゲノムを含んだ相同ＤＮＡの断片が用いられる。
【００２０】
導入される断片化ＤＮＡの量は健常なドナーの血漿および組織液の自己のＤＮＡの量以上である。しかし、この量は２０μｇ／ｍｌに等しい最大許容量以下である。
【００２１】
このプロセスでは、生物学的活性がある大きさであるＤＮＡ断片は、患者の生体に入ると、自然の送達機構（血流、および分裂細胞の表面に位置し、該当するＤＮＡ断片との高い親和性を示す特異的受容体）を介して、人体の活動的に分裂する細胞（悪性化した細胞を含む）まで送達される。
【００２２】
この後、細胞内腔まで送達されたＤＮＡ断片は、核の染色体間のコンパートメント内に付着して核内のプロセシングを受ける。
【００２３】
この場合、核の染色体間のコンパートメント内に付着したＤＮＡ断片は、相同的組換えの自然な機構に従って、細胞の悪性化を引き起こした遺伝子突然変異体の変異体領域を健常な領域と置き換えるほか、（健常な状態の特徴である）ヘテロ接合状態を修復しながら（悪性形質転換を被った細胞の特徴である）ホモ接合化した対立遺伝子を置換する。このような事象の結果、先にある癌細胞の完全または部分的な逆形質転換が起こり、これによってこの細胞による制御されない細胞増殖の状態が除去される。
【００２４】
したがって、生理的かつ遺伝的に健常なドナーからの相同的な断片化ＤＮＡを生体に導入すると、この断片化ＤＮＡは活発に分裂する細胞に特徴的な自然な送達機構（受容体媒介性の飲作用）を介して、活発に分裂する悪性細胞によって取り込まれる。核コンパートメント−染色体間の空間に送達された断片化ＤＮＡはそこに付着し、対応する染色体座との相同的交換に関与する。相同的組換えの自然な機構により、染色体間の空間に付着したＤＮＡ断片は、遺伝子の突然変異領域（細胞悪性化を引き起こす突然変異）を対応する健常な断片と置換するほか、対象のＤＮＡ断片は（健常な状態の特徴である）ヘテロ接合状態を修復しながら（悪性形質転換を被った細胞の特徴である）ホモ接合化した対立遺伝子を置換する。このような事象の結果、先にある癌細胞の完全または部分的な逆形質転換が起こり、これによって、この細胞は分化した細胞の発生経路に切り替えられる。
【００２５】
提案した本発明を用いたときに達成される効果は、以下の理論データによって正当化できる。
【００２６】
生体の各細胞はゲノムＤＮＡを含み、ゲノムＤＮＡは、生体の細胞の全タンパク質に関する情報およびこれらタンパク質すべての正確な時空間的発現に必要な核内の遺伝子の空間的組織に関する情報をコードする。このように、ゲノムＤＮＡは生体の生命のためのテンプレートであり、生体全体およびその発達両方に関する情報を含む。まず、ゲノムＤＮＡは生体の全細胞において同一である。しかし、生体の成長に伴い、環境的要因の作用および細胞複製ならびに細胞修復中に発生するエラーに起因して、各細胞のゲノムＤＮＡは突然変異する。この修復機構は誤ったＤＮＡ塩基または損傷したＤＮＡ塩基と置き換わり、突然変異事象直後の一本鎖切断または二本鎖切断（ＤＳＢ）の後のＤＮＡ分子の末端を連結することが知られている。このため、修復機構は第２のＤＮＡ鎖をテンプレートとして用い得る。影響を受けた領域が非常に長く、両方のＤＮＡ鎖に及ぶ場合、修復には問題が生じ、突然変異が機能障害の結果として現われる可能性がある。したがって、突然変異原性の環境的要因ならびに細胞修復および細胞複製の誤りは、細胞における体細胞突然変異の原因となる。発癌に関する現代の科学的概念は、突然変異体が細胞に徐々に蓄積することが多段階的な癌の形質転換を引きこすと述べている。
【００２７】
細胞および癌自体の悪性化（malignization）の多段階的突然変異の遺伝的性質は、癌を治療する本方法は疾患原因の除去に、そして何よりもまず突然変異の治療（補正）に向けられるべきであることを示唆している。（腫瘍性疾患が属する）遺伝的障害に関連する疾患を治療する唯一の主要なアプローチは、１つまたは別の方法および健常な細胞の最初の遺伝的安定性の復元によって患者の生体の悪性細胞のゲノムを変えることである。非常に多くの遺伝子療法がこのアプローチの枠内で開発されている。しかし、これらの方法はいずれも重大な短所があり、複雑な真核生物に関しては効果がない。
【００２８】
ウイルス構築物を用いて染色体突然変異を補正することに向けられた従来の遺伝子療法（遺伝子ターゲティング）は、遺伝子の機能している複製を細胞ゲノム内に効果的に導入することができる。それにもかかわらず、遺伝子およびその調節領域の無作為な挿入に起因して、これらのアプローチは、遺伝子発現がそれが組み込まれた部位に依存すること、導入されたウイルスゲノムのサイレンシング、および発癌に関連する挿入突然変異に関わる多くの問題を避けられない（Khon,D.B., Sadelain M., Glorioso J.C.「Ｘ連鎖性重症複合型免疫不全の遺伝子治療に続いて起こる白血病の発生（Occurence of leukaemia following gene therapy of X-linked SCID.）」、Nature Rev. Cancer, 477-488(2003)、Persons,D.A., Nienhuis,A.W,「ヘモグロビン以上の遺伝子治療（Gene therapy of hemoglobin disorders.）」Hematol. Rep.2, 348-355(2003)）。問題の突然変異が無い細胞へ送達されたＤＮＡテンプレートとのその自然な相同性組換えにより染色体内の遺伝子変異体を補正または置換することは、このアプローチの効果が非常に低いことがこの方法を適用する初期の試みにおいて証明されたことを別にすれば、これらの方法に代わる魅力的な代替方法となり得る（Yanez,R.J. and Porter,A.C.G.「遺伝子標的療法（Therapeutic gene targeting）」、Gene Therapy.5, 149-159(1998)、Rothstein,R.J.「酵母内における一段階遺伝子破壊（One-step gene disruption in yeast）」、Methods Enzymol. 101:202-211(1983)）。歴史的には、酵母、後には哺乳動物細胞における挿入突然変異の問題を克服する目的で開発された遺伝子置換戦略は、置換される標的遺伝子およびそれ自身が選択可能なマーカーで置換された遺伝子に隣接する領域とその末端が相同的である直線的な組換えＤＮＡを使用することに及んだ（Thomas,K.R., Capecchi,M.R.「マウス胚由来幹細胞における遺伝子ターゲティングによる部位特異的突然変異誘発法（Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells）」、Cell. 51(3) :503-512(1987)）。このタイプの遺伝子ターゲティングは「エンドアウト（ends-out）」と呼ばれ、これはこの構築物の末端が標的遺伝子から出てくる染色体ＤＮＡの２つの配列に相当するからである。このプロセスでは、エンドアウト遺伝子ターゲティング構築物の末端は組換え遺伝子的（recombinogenic）であり、末端相同性領域間に位置する遺伝子配列の置換を容易にする。近年、完全な遺伝子を異種配列と置換するか、この方法によって突然変異した１つの塩基対を酵母において置換するとき、プロセスは独立した２つのストランド進入によって開始されることが明らかとなっており、これは、相同性と治療用構築物の２つの末端区間が関与する組換え事象とを調べることを示唆している（Langston,L.D.,Symingtom,L.S.「酵母における遺伝子ターゲティングは独立した２つのストランド進入によって開始される。（Gene targeting in yeast is initiated by two independent strand invasions.）」、Proc NM Acad Sci USA. 101(43):15392-15397(2004)）。初期には、このメカニズムは哺乳類細胞におけるエンドアウト遺伝子ターゲティングを説明するために提案された（Li,J., Read,L.R., Baker,M.D.「哺乳類遺伝子の置き換えのメカニズムは２つの交差事象に関連するヘテロ２本鎖ＤＮＡの長領域の構成に一致する。（The mechanism of mammalian gene replacement is consistent with the formation of long regions of heteroduplex DNA associated with two crossing-over events.）」���Mol. Cell Biol. 21(2) :501-510(2001)）。体細胞の相同的組換えは全生物界にとって普遍の不可欠な機能を明白に実行するとともに、その機能を効果的に実行しなければならない。これはその機能が何十億年にわたって進化的に保存されてきたためである。単細胞酵母における体細胞の相同的組換えは正確なＤＳＢ修復の主要な機構であるので、その効果は個体のレスキューを提供するために非常に高いものでなければならない。細胞核にプラスミドをマイクロインジェクションすることによる初期の実験（Capecchi, M.、「標的突然変異を持つネズミの発生（Generating mice with targeted mutations）」、Nature Medicine 7, 1086-1090(2001)）からは、注入されたすべての（多くの場合、１００を超える）プラスミドから成る単一の鎖状体として細胞ゲノム内に組み込まれた全例においてプラスミドは頭尾（ｔａｉｌ−ｔｏ−ｈｅａｄ）的に１個の分子へと連結しており、この結果は相同的組換えメカニズムの驚異的に効果的な働きであったことが見出された。しかし、体細胞の相同的組換え使用を伴う従来の遺伝子ターゲティングの効率が低い原因は、相同的組換えのゴールと進化によって選択されたそれ自体を行うことのできるその能力（未だに機能は不明であるが）との間の相違にあると考えられる。
【００２９】
相同的組換え機構を効果的に操作するためには、組換え複合体が位置する場所まで送達されるＤＮＡ断片の直線のサイズが重要である。例えば、補正構築物における相同領域の長さを２ｋｂｐから１４．５ｋｂｐまで増大したとき、遺伝子ターゲティング効率における１００倍の指数増殖が記録された。しかし、達成された効率（細胞１個当たり１０−５の遺伝子補正イベント）はこの方法を選択なしに適用するにはまだ不十分である（Deng,C and Capecchi.M.K.、「ターゲットベクターとターゲット部位の相同の範囲の機能としての遺伝子ターゲティングの頻度の再検討（Reexainination of gene targeting frequency as a function of the extent of homology between the targeted vector and the target locus）」、Mol. Cell Biol.12, 3365-3371(1992)）。小断片相同置換（ＳＦＨＲ：small fragments homologous replacement）を用いて突然変異遺伝子を補正することに関する結果は、上記データとは劇的に対照的なものとなった（補正率は細胞１個当たり１〜２０％に達した）（１９９５年１１月２８日公開米国特許第５，４７０，５７７号、Gruenert,D., Bruscia,E., Novelli,G., Colosimo,A., Dallapiccola,B., Sangiuolo,F., Goncz,K.、「小ＤＮＡ断片によるゲノムＤＮＡの配列特異的修正（Sequence-specific modification of genomic DNA by small DNA fragments）」，Clin Invest,112,637-641(2003)］。これらの実験で得られた遺伝子ターゲティング効率は、相同的組換えは短い断片を用いて働くことを好むか、リガーゼＩＶによるＤＮＡ断片の頭尾配向に従った連結を介して短い断片から（組換え事象において最も効果的な）多重連結した断片を形成することを好むことを意味し得る。
【００３０】
哺乳類細胞における組換え産物を得るために必要な条件は、末端相同性の長さであり、それは約２００ｂｐに達する（Lin,Y., Lukacsovich,T., Waldman,A.S.、「哺乳類の染色体におけるＤＮＡ二本鎖切断の修復のための多重経路（Multiple pathways for repair of DNA double-strand breaks in mammalian chromosomes）」、Mol.Cell Biol.19, 8353-60(1999)、Nassif,N., Engels,W.、「ショウジョウバエにおける分裂ギャップ修復のためのＤＮＡ相同性要件（DNA homology requirements for mitotic gap repair in Drosophila）」、Proc. Natl. Acad. Sci., USA.90(4):1262-6(1993)）。
【００３１】
相同的組換えを実行するための主要条件は、供給源の二本鎖末端として送達された治療用ＤＮＡが直線形状であることにある。治療用プラスミドの円形形状は相同組換えには実質的には関与しない。ＤＳＢの発生およびＤＮＡ分子の二本鎖末端の形成は局所的に活性化し、染色体および染色体外の組換えならびに遺伝子ターゲティングを支援する（Kucherlapati,R.S., Eves,E.M., Song,K.Y., Morse,B.S., Smithies,O、「哺乳類細胞におけるプラスミド間の相同組み換えはインプットしたＤＮＡの処理により高められる（Homologous recombination between plasmids in mammalian cells can be enhanced by treatment of input DNA）」、Proc. Natl. Acad. Sci., USA.81, 3153-3157(1984)）。Ｎａｔｕｒｅ誌の近刊（Urnov,F.D., Miller,J.C., Lee,Y.L., Beausejour,C.M., Rock,J.M., Augustus,S., Jamieson,A.C., Proteus,M.H., Gregory,P.D., Holmes,M.C.、「設計された亜鉛フィンガーヌクレアーゼを使用する高効率内因性ヒト遺伝子（Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases）」、Nature.435, 646-651(2005)）は、この原理をＸ染色体に連結しているＩＬ２Ｒ遺伝子の補正に用いることを報告している。この遺伝子はエキソン５の点突然変異が致死的な遺伝性疾患である重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）を引きこす。著者らは、（ゲノムＤＮＡのＩＬ２Ｒ遺伝子の突然変異体の近傍で配列を特異的に切断することのできる）人工ジンクフィンガー・ヌクレアーゼを発現する遺伝子構築物と、ＳＣＩＤ突然変異の領域をカバーする同じ遺伝子の突然変異していない断片を有するプラスミドとを細胞にトランスフェクションすることによって、遺伝子補正のレベルが高く（２０％まで）なることを明らかにした。
【００３２】
恐らくは、原理上は遺伝子補正を常に効果的に実行する相同的組換えの能力は、核空間の遊離した二本鎖ＤＮＡ末端の登場によるプロセスの開始にその末端の起源とは無関係に関連する。つまり、それらが形成された切断された染色体の末端であるかどうかは、核に送達され、典型的なエンドアウト構造を示すＤＳＢまたは二本鎖末端の結果である。２つの末端が染色体ＤＮＡの２つの配列と相同的で、対応するゲノム断片を置換するとともに突然変異を補正することのできる中央部分を有するゲノムＤＮＡの任意の未修飾の断片は、典型的なエンドアウト構築物である。このことは断片の末端が相同性の調査およびゲノムＤＮＡとの相同的組換えを開始し、ゲノムＤＮＡ断片が、外部空間から細胞へ送達された断片の中央部分と置換される。遺伝的に正確な外来性ＤＮＡを用いた条件下では、これらの事象は遺伝的欠陥の補正へと至る（Yakubov,L., Popova,N., Nikolin,V., Semenov,D., Bogachev,S., Oskina,I.、「細胞外のゲノムＤＮＡは放射線および化学的突然変異誘発要因からマウスを保護する（Extracellular genomic DNA protects mice against radiation and chemical mutagens）」、Genome Biology.5 :P3(2003)）   。
【００３３】
哺乳動物およびヒトの血漿および間質液は通常、自然な細胞死の間のゲノムＤＮＡ断片化の結果として形成されたゲノムＤＮＡの断片を含んでいる（Anker,P., Zajac,V., Lyautey,J., Lederrey,C., Dunand,C., Lefort,F., Mulcahy,H., Heinemann,J., Stroun,M.、「培養液中におけるバクテリアからヒト細胞へのＤＮＡ伝承：腫瘍形成における関与の可能性（Transcession of DNA from bacteria to human cells in culture:a possible role in oncogenesis）」、Ann.NY Acad Sci.1022, 195-201(2004)、Anker,P., Mulcahy,H., Chen,X.Q., Stroun,M.、「癌患者の血液（血漿／血清）中に循環する腫瘍ＤＮＡの発見（Detection of circulating tumor DNA in the blood(plasma/serum) of cancer patients）」、Cancer Metastasis Rev.18, 65-73(1999)）。これらのＤＮＡ断片は活発に分裂する細胞の貪食および細胞コンパートメントへの送達を介して絶え間なく起こっているＤＮＡ交換に関与する。細胞外ＤＮＡの送達は、特異的な膜受容体の関与を伴って活性のある受容体媒介性の飲作用を介して行われる（Yakubov,L.A., Deeva,E.A., Zarytova,V.F., Ivanova,E.M., Ryte,A.S., Yurchenko,L.Y., Vlassov,V.V.、「細胞により取り込まれるオリゴヌクレオチドのメカニズム：特定のレセプターが関与しているのか？（Mechanisms of oligonucleotide uptake by cells:Involvement of specific receptors?）」、Proc. Nail. Acad. Sci. USA 86, 6454-6458(1989)、Doerfler,W., Remus,R., Muller,K., Heller,H., Hohlweg,U., Schubbert,R.、「哺乳類細胞および生物における外来ＤＮＡの行方（The fate of foreign DNA in mammalian cells and organisms）」、Dev. Biol. (Basel), 106, 89-87,(2001)）。遺伝子導入には多くの方法があるが、これらの方法は考察された受容体媒介性の機構によってそれらを輸送するのに必要な治療用ＤＮＡの小さなパッケージングしか提供しない（Budker,V., Budker,T., Zhang,G., Subbotin,V., Loomis,A., Wolff,J.A.、「仮説：むき出しのプラスミドＤＮＡは受容体を介したプロセスにより生体内において細胞によって持ち上げられる（Hypothesis: naked plasmid DNA is taken up by cells in vivo by a receptor-mediated process）」、Gene Med. 2(2), 6-88,(2000)、Satkauskas,S., Bureau,M.F., Mahfoudi,A., Mir,L.M.、「筋細胞におけるプラスミドのゆっくりとした蓄積：受容体を介した飲食作用によって取り込まれるＤＮＡのメカニズムを裏付ける証拠（Slow accumulation of plasmid in muscle cells: supporting evidence for a mechanism of DNA uptake by receptor-mediated endocytosis）」、Mol.Ther.4,317-323(2001)）。断片化した遺伝的に正確なＤＮＡを高濃度で血漿および間質液に生み出せば、血中を循環し、染色体の対応する領域との相同的組換えの一定のプロセスからの癌細胞死の結果として現われる病理学的ＤＮＡ断片の競争に基づく置換が出現する。そういった作用が長期間続くことで、細胞の健常な遺伝子型が復元し、正常への逆形質転換が起こる（Yakubov,L., Popova,N., Nikolin,V., Semenov,D., Bogachev,S., Oskina,I.、「細胞外ゲノムＤＮＡは放射線および化学的突然変異誘発要因からマウスを保護する（Extracellular genomic DNA protects mice against radiation and chemical mutagens）」、Genome Biology.5 :P3(2003)、Yakubov,L.A., Petrova,N.A., Popova,K.A., Semenov,D.V., Nikolin,V.P., Oskina,I.N.、「細胞ゲノムの安定性および可変性の維持における細胞外ＤＮＡの役割（Role of extracellular DNA in maintaining of stability and variability of cellular genomes）」、Dokl. Biokhim. Biofiz. 382, 31-34(2002)）。
【００３４】
述べられている技術的問題は、生体における細胞外ＤＮＡの代謝回転に関する開発された論理的概念（多数の発現的裏付けが認められた）に基づいて解決される。真核生物における細胞外ＤＮＡの代謝回転の概念に関する主な命題を以下に記載する。
【００３５】
対応する細胞の突然変異の頻度に相当する割合で変異配列を含んだ細胞外断片化ゲノムＤＮＡは、プログラムされた細胞死、つまりセルのアポトーシスの結果として形成され、通常は細胞間隙および血漿に存在する（Anker,P., Mulcahy,H., Chen,X.Q., Stroun,M.、「癌患者の血液（血漿／血清）中に循環する腫瘍ＤＮＡの発見（Detection of circulating tumor DNA in the blood(plasma/serum) of cancer patients）」、Cancer Metastasis Rev. 18, 65-73(1999)、Giacona,M.B., Ruben,G.C., Iczkowski,K., Roots,T., Porter,D., Sorenson,G.、「ヒト血漿における無細胞ＤＮＡ：膵臓癌患者と健康管理の側長（Cell-free DNA in human blood plasma: length measurements in patients with pancreatic cancer and healthy controls）」、Pancreas.17, 89-97(1998)）。細胞は形成されたＤＮＡまたはクロマチン断片を受容体媒介性の機構を介して貪食し、これらの断片を細胞核へ輸送することができる（Yakubov,L.A., Deeva,E.A., Zarytova,V.F., Ivanova,E.M., Ryte,A.S., Yurchenko,L.Y., Vlassov,V.V.、「細胞により取り込まれるオリゴヌクレオチドのメカニズム：特定のレセプターが関与しているのか？（Mechanisms of oligonucleotide uptake by cells:Involvement of specific receptors?）」、Proc.Nail.Acad.Sci.USA 86,6454-6458(1989)、Shestova,O.E., Andreeva,A.Yu., Vlassov,V.V., Yakubov,L.A.、「細胞表面タンパク質を備えたオリゴヌクレオチド複合体の細胞核への輸送（Transportation of the complexes of oligonucleotides with cell surface proteins into the cell nucleus）」、Dokl. Ross. Akad. Nauk 368, 264-267(1999)）。送達された断片は相同的組換えの機構に従って核内のゲノムＤＮＡと再連結し、このプロセスを自分自身で開始することができる。これら３つプロセスの組み合わせが、突然変異を補正することによるか、組織液および血漿の細胞外ＤＮＡを遺伝子の外部標準として用いて細胞の遺伝的変化を誘発することによって、生体全体のレベルで体細胞の遺伝的特徴を制御することのできる機構を構成するものと考えられる。こういった機構の研究は生体細胞のゲノム統一性（genome unity）のバックグラウンドを形成し得る。この機構は、細胞外ＤＮＡ標準の変異配列の助けを借りて、出現して固定された突然変異体を除去し得るほか、細胞へ突然変異体を挿入し得る。有害な突然変異体を実質的に有さないＤＮＡ標準を用いる場合、その唯一の機能は身体の細胞から突然変異体を除去する。対立遺伝子には通常高い相同性があり、変えられた配列の比較的小さい領域では頻繁に異なるので、この推定上の機構の機能の他方の特徴は、変異配列を非変異配列と置換することと同様、染色体における対立遺伝子の配列を代替配列との置換である。
【００３６】
述べられた技術的問題は、ある固体の完全ゲノムをゲノムＤＮＡの断片であるポリヌクレオチド分子のセットとして生体に導入し（ここでは、完全ゲノムが循環する）、細胞によって貪食させ、核（ここで、完全ゲノムは付着し、細胞のゲノムＤＮＡとの相同的組換えに関与する）に達することによっても解決される。従って、遺伝的欠陥のないゲノムＤＮＡの断片であるポリヌクレオチド分子のセットとして完全ゲノムを生体へ導入することによって遺伝的欠陥を補正することの可能性、および本発明に記載の方法に基づいて遺伝子突然変異に関連する疾患および障害に罹患した患者に有効な治療を提供する可能性も生まれる。提案された治療法は、核マトリクスのタンパク質に関連する生理的かつ遺伝的に健常な個体の完全ゲノムを含んだゲノムＤＮＡの断片を利用する。外来性断片の大きさは、アポトーシス性の核溶解（apoptotic nucleolysis）（１〜３０個のヌクレオソーム単位）に起因して出現した治療された生体の血漿中を循環している断片の大きさに適合する。この原型はある個体の完全ゲノムを表さない種々の人工ＤＮＡ構築物を使用する。このＤＮＡは核マトリクスのタンパク質とは関連せず、１〜３０個のヌクレオソーム単位に達し、天然のアポトーシスＤＮＡの大きさに適合しない。
【００３７】
細胞において多数の突然変異が生じる事象の結果として誘発された腫瘍性疾患を治療するための提案した方法の明確な特徴をヒト乳腺癌細胞培養を用いて試験した（インビトロ）。腫瘍性疾患を治療するための提案した方法をマウスに誘発させた腫瘍を用いた実験で試験した（インビボ）。投与するために提案され認定された治療方法で特定された最大限許容可能な量の治療ＤＮＡは、ヒト細胞培養を用いて行った細胞毒性の試験で決定された（インビトロ）。
【００３８】
内部の細胞コンパートメント内への外来性起源の断片化ゲノムＤＮＡの送達（提案した治療法で決定された）は、ヒト乳腺癌細胞培養のモデルを用いて試験した。
【００３９】
〔材料と方法〕
（細胞培養）
１０ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（シグマ社、米国所在）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｂｉｏｌｏｔ社、ロシア所在）の存在下、５％ＣＯ２の雰囲気中、３７℃で、ヒト乳腺癌（ＭＣＦ−７）細胞を２４ウェルプレートの４ウェル当たりの密度が０．７×１０７個になるまで培養した。
【００４０】
（ＤＮＡおよび前駆物質の調製）
５００ｂｐに断片化したヒト胎盤ＤＮＡ（１０μｇ）をＫｌｅｎｏｗ断片（３つの低温のｄＮＴＰ、１つの熱いｄＮＴＰ）の存在下でニックトレンスレーション法によって標識した。Ｇｌｏｖｅｒによって記載されたプロトコル（Glover,D., 1988.「ＤＮＡクローニング：実践的アプローチ（DNA Cloning: A Practical Approach）」、IRL Press, Oxford, 1985、タイトル Klonirovanie DNK. Metody. Mir, Moscow からの翻訳）に従って、イソプロパノール用いた２回の沈殿によって、組み込まれなかった前駆物質を除去した。精製したときの標識したＤＮＡの収量は７〜１５μｇに達した。ＤＮＡを適した量の蒸留水に溶解し、プレートのウェルに加えた（１ウェル当たり２０μｌ以下）。各ウェルには培地の２５０〜３５０μｌを入れた。作業中の体積から１μｌのアリコートを取って放射活性を決定した。
【００４１】
α−ｄＮＴＰ＊のアリコートを適量の水で希釈し、希釈された三リン酸の１μｌをサンプリングして放射活性を計数した。ＤＮＡに対して（放射活性カウントおよび量に関して）ほぼ同量のαを各ポイントに加えた。
【００４２】
３回の実験についてのＤＮＡ（μｇおよびｃｐｍ）およびα−ｄＮＴＰ＊（ｃｐｍ）の量を表１に示す。
【００４３】
【表１】
2009523788.tif 000002
【００４４】
〔結果〕
完全なヒトゲノムを含んだ断片のプールによって細胞コンパートメントの上に表した５００ｂｐの長さを有する細胞外ＤＮＡの分布
実験結果の定量評価に必要とされる数字：
実験ポイント一つ当たりのヒト乳腺癌細胞ＭＣＦ−７の数は０．７×１０６であった。
ＭＣＦ−７のプロトコルによれば、１０７個の細胞は６０μｇのＤＮＡを含む。
１個の細胞は６ピコグラムのＤＮＡを含む。
実験ポイントにおけるＤＮＡ総量は４．２ｇであった。
実験ポイントに加えた標識したＤＮＡの量を表１に示す。
加えたＤＮＡの放射能計数（ｃｐｍ）を表１に示す。
実験ポイント１つ当たりのα−ｄＮＴＰ＊の放射能計数（ｃｐｍ）は表１に示した値に達した。
ヒトの一倍体ゲノムは３．３×１０９ｂｐを含む。
培地に加えた標識したＤＮＡ断片の最初の大きさは５００ｂｐに達した。
【００４５】
培養成長の２段階（指数増殖期と接触阻止期）および（未変性条件および変性条件下の）２種類の電気泳動分析を選択して、細胞外ＤＮＡ挙動を分析した。細胞内の細胞外ＤＮＡ挙動の定性的特長および定量的パラメータを分析した。
【００４６】
標識した材料（未変性条件）の定性的挙動特徴。ＤＮＡおよび前駆物質を培養培地に添加した瞬間の細胞成長の指数増殖期（図１）。
【００４７】
この図は電気泳動パターン（右側）と、乾燥時に同じアガロースブロックに曝露させることにより得られた、この電気泳動パターンに対応するＸ線パターン（左側）とを含む。
【００４８】
〔細胞質画分（ブロックの上部群）〕
ＤＮＡは実質的に直ぐに細胞質に入る。ゼロ地点では、その移動度の点で最初に標識した材料に相当する低分子量画分が観察される。標識はゼロ地点の開始時には見られない。残りの試料はすべて相当な量の標識した材料が開始時に有ることを示す。このことから、ＤＮＡが細胞質の成分と共に高分子量の複合体を形成することが示唆され得る。沈殿したＤＮＡのはっきりとしたクラゲは検出できなかった。試料はすべて、培地に添加した最初に標識したＤＮＡの移動度と一致する等しい移動度を有するＤＮＡ画分を有していた。このことは細胞質画分に運ばれたＤＮＡの自由に移動する部分は、可視的な代謝的変換を全く受けないことを意味するものである。開始時に観察されたＤＮＡの他の部分はある様式で変換されたか、高分子量複合体に組み込まれた。
【００４９】
〔染色体間画分（ブロックの中央群）〕
ＤＮＡは実質的に直ぐに染色体間画分にも入る。ゼロ地点では、その移動度の点で最初に標識した材料に相当する低分子量画分が観察される。標識はゼロ地点の開始時および残りのすべての試料の開始時には見られなかった。高分子量ＤＮＡ画分全体が遠心分離中にレンズ状の沈降物を形成したが、これは核液中には検出できなかった。ゼロ地点を除き、全試料中でＤＮＡ移動度の変化が認められた。ＤＮＡはアガロースブロックのより低い部分から高分子量領域へと上昇する「不鮮明な雲（fuzzy cloud）」状の高分子量プールを形成する。さらに、均一な雲の背景にはサイズ依存性の別々のバンドがいくつか観察された。クロマチン画分は、染色体間の物質による汚染が僅かしか存在せず（クロマチン沈降物は洗浄しなかった）、特にはっきりとしたバンドを示している。標識した材料のこの分布パターンからは、次の事象が示唆される。核に入った断片化ＤＮＡはＤＮＡ鎖の合成のためのプライマーとして働くと考えられる。種々の大きさの標識したＤＮＡ断片のセットが発生する際に現われ、その電気泳動パターンにおいては、大きさが１０ｂｐに達する、標識した材料の不鮮明な雲として観察される。別の可能性として、ＤＮＡ断片はその末端に連結する。この仮説は標識したバンドの別々のパターンが大きさの点で最初のＤＮＡの倍数になっていることから来るものである。核の染色体間の空間における細胞外ＤＮＡの直線サイズの増大が様々に組み合わされることも可能である。
【００５０】
〔クロマチン（ブロックの下方の群）〕
ＤＮＡ（それ自身または他の任意の形式の標識）は実質的に直ちに核に入り、核クロマチンの画分に組み込まれる。明確に分離している領域では、断片のはっきりしたラダーが長さの点で最初のＤＮＡの倍数になっていることが認められた（この材料は染色体間画分による汚染が僅かであることから、高比活性標識を含んでいるものと思われる）。
【００５１】
〔α−ｄＡＴＰ＊（全ブロックにおいて１８０αで指定）〕
α−ｄＡＴＰ＊は細胞質画分を欠いている。しかし、実験に用いたＤＮＡと大きさが一致する標識した断片が存在する。染色体間画分では、その断片は不鮮明な雲は弱いものの、標識したＤＮＡを有する類似の画分に見られる雲と形態学的に完全に一致する類似した雲を形成する。標識は１８０分後にクロマチン内で検出可能である。α−ｄＡＴＰ＊の他の時間ポイントについてはモニターしなかった。１８０分の時間ポイントにおけるこの培養培地の試料中の標識数は、標識したＤＮＡおよびα−ｄＡＴＰ＊に関してほぼ等しい（表１および２を参照）。しかし、α−ｄＡＴＰ＊を用いてこの実験ポイントにて検出された標識された材料の量は、ＤＮＡを有する変異体と比較して約１／６である。
【００５２】
〔標識した材料の定性的挙動特性〕
種々の細胞コンパートメントの実験ポイントにおける数の比較に基づいて行った定量評価をすべて表１および表２と表３に示す。全手順における材料は絶対量を示すことに留意されたい。したがって、データを比較し、その量を培養培地に最初に導入した標識と関連付けることが適切である。
【００５３】
【表２】
2009523788.tif 000003
【００５４】
【表３】
2009523788.tif 000004
【００５５】
各実験からは予期しない結果が得られた。まず、α−ｄＡＴＰ＊はモノマーとしてではなく、しかし約５００ｂｐ長のＤＮＡ断片内で、細胞コンパートメント全部に運ばれた。また、このＤＮＡは培地に添加したＤＮＡと同様のプロセス全部に関与している。あらゆる点で、α−ｄＡＴＰ＊利用の活性は、標識した細胞外ＤＮＡの利用と比較して数分の一未満の強さである。また、細胞外ＤＮＡは実質的に直ちに（細胞が活発に分裂している場合には、１分未満）に分析した細胞コンパートメント（細胞質と核空間）の全部に送達され、クロマチンに組み込まれた。活発に分裂する細胞の細胞質においては、ほぼ等しい量の標識したＤＮＡが、ゼロ地点を除く実験ポイントのすべてに存在した。標識したＤＮＡへの曝露時間に応じて核コンパートメント蓄積された標識は培養液中に存在する。ＤＮＡは核の染色体間の空間内に種々の長さの断片として存在した。活発に分裂する細胞中のゼロ地点における断片の大きさは、培地に添加した細胞外ＤＮＡの大きさに相当する。残りの変異体すべてにおいて、線状ＤＮＡの大きさは約１０ｋｂｐまで増大した。さらに、検出されたバンドの「ラダー」からは、断片の一部が頭尾的に連結されたことが示唆される。接触阻止段階のこの培地の細胞では、ＤＮＡプロセシング（変性条件のデータは示さず）は顕著な動態を示した。恐らく、細胞培養成長のこの段階での代謝プロセスは減速されるので、我々は核内の最初のＤＮＡ断片のマルチマーを形成するプロセスの動力学的段階を検出することに成功した。核空間に送達されるＤＮＡ分子の直線サイズが増大するのは、修復事象に関与する特異的なＤＮＡリガーゼＩＶ活性化によるものと考えられる（Lees-Miller, S.P., Meek,K.、「非相同末端結合によるＤＮＡ二本鎖切断の修復（Repair of DNA double strand breaks by non-homologous end joining）」、Biochimie 85, 1161-1173(2003)を参照されたい）。
【００５６】
報告されたデータは、腫瘍性疾患を治療するための提案した方法では、ある量のＤＮＡが癌細胞の核に送達され、染色体間の空間に常に存在し、ゲノムに組み込まれることを示唆している。染色体間の空間では、ＤＮＡはその直線サイズを約１０ｋｂｐまで増大させる変化を受ける。
【００５７】
ヒト腺癌からの突然変異したカスパーゼ３遺伝子を用いて、（本願および癌疾患を治療するための提案された方法において考察された）細胞外ＤＮＡの癌細胞に対する作用によって突然変異を補正することの実行可能性を試験した。行った試験からは、ヒト乳腺癌ＭＣＦ−７の細胞におけるカスパーゼ３遺伝子の活性復元および細胞外ＤＮＡの作用下の先の癌細胞のアポトーシスの発達経路が明らかとなった。
【００５８】
（材料と方法）
〔細胞培養液および培養条件〕
ヒト乳腺癌（ＭＣＦ−７）細胞およびマウス肉腫細胞（Ｌ９２９）は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、ＳＲＣＶＢ Ｖｅｃｔｏｒから入手した。１０ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（シグマ社、米国所在）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｂｉｏｌｏｔ社、サンクトペテルブルグ，ロシア所在）の存在下、５％ＣＯ２の雰囲気において３７℃でこの細胞を培養した。トランスフェクションのために、１０ｍＭＬ−グルタミンおよび５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ １６４０培地を用いて、５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および０．１〜０．２ｍｇ／ｍｌのヒト胎盤ＤＮＡの存在下でＭＣＦ−７細胞を培養した。培養の時間は、図に示されるように５から４０日間までさまざまであった。
【００５９】
〔ＰＣＲ分析〕
Ｍｅｄｉｇｅｎ社（ロシア所在）キットおよびＢｉｏＲａｄ社（米国所在）キットを用いて標準的なプロトコルに従ってＰＣＲ分析を行った。ＢｉｏＲａｄ社のプロトコルに従ってリアルタイムＰＣＲアッセイを行った。
【００６０】
カスパーゼ３遺伝子のｍＲＮＡを分析するために、以下のプライマーを合成した：
プライマー１（Ｐｒ．１）  ＧＡＡＴＧＡＣＡＴＣＴＣＧＧＴＣＴＧＧＴＡ（２１）；
プライマー２（Ｐｒ．２）  ＴＧＡＡＴＡＡＴＧＡＡＡＡＧＴＴＴＧＧＧＴ（２１）；
プライマー３（Ｐｒ．３）  ＣＴＣＴＧＧＡＡＴＡＴＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＣＡ（２３）；および
プライマー４（Ｐｒ．４）  ＣＡＴＣＡＣＧＣＡＴＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡＡＴ（２２）。
【００６１】
増幅したＤＮＡ断片を２％アガロースゲルで分離し、エチジウムブロマイド染色した。
【００６２】
〔細胞培養からのＲＮＡ単離〕
トータルＲＮＡ精製キット（V-gene Biotechnology Limited社製）を用いてＲＮＡを単離した。この手順は以下のプロトコルに従って行った。
【００６３】
〔ヒト細胞外ＤＮＡに長期接触後のＭＣＦ−７細胞のｍＲＮＡのＰＣＲ分析〕
ヒトＤＮＡで処理した細胞の抽出物中に酵素カスパーゼ３を検出するか、エキソン４にレスキュー突然変異を有する対応するｍＲＮＡを検出することは、治療用断片が突然変異細胞へ相同的に組み込まれたことの直接的裏付けを表し得る。我々はエキソンスプライシングの部位とレスキューされたｍＲＮＡの突然変異の存在との検出を直接配列決定により可能にする、対応するｍＲＮＡの検出および分析に関連するアプローチを選択する。我々はＲＴ（逆転写）−ＰＣＲ手順を用いて、エキソン４、５、および６を含んでいるｍＲＮＡ領域を増幅した。ここでは、ＭＣＦ−７細胞のゲノムには存在しない、エキソン４からの４７ｂｐと相同的なオリゴヌクレオチド（プライマー３）を前方プライマーとして用いた。エキソン６の末端部分と相補的なオリゴヌクレオチド（最後のヌクレオチドがエキソン６の最後のヌクレオチドに相当する）を後方プライマーとして用いた。まず、ヒトＤＮＡを用いて１５日間インキュベートしたＭＣＦ−７細胞からトータルＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを合成した。プライマー２および３（Ｐｒ．２およびＰｒ．３）を用いて、カスパーゼ３に対応するとともに修復されたエキソン４の欠失を含んだｍＲＮＡ領域を検出した。この増幅によって求められた断片化が生じ、これはスプライスされたエキソン４（最初の２０個のヌクレオチドが欠損）、エキソン５、およびエキソン６を含み、４３１ｂｐの大きさを有する。トータルＲＮＡの画分にこの断片が検出されたことは、そのトータルＲＮＡが修復された４７ｂｐを有するカスパーゼ３遺伝子のｍＲＮＡを含んでいることを意味している。４３１ｂｐ断片の増幅の精度をコントロールするために、２つのインナープライマー（Ｐｒ．１およびＰｒ４）、２つの末端プライマー（Ｐｒ．３およびＰｒ．４）、および４３１ｂｐＤＮＡ断片をテンプレートとして用いて、予想される２つのＰＣＲ産物（長さが２３６ｂｐおよび３０４ｂｐの断片）を得た（図３）。両方の断片を配列決定することで、我々は以下のことを推論することができた。４３１ｂｐ断片はスプライスされたエキソン４（最初の２０個のヌクレオチドが欠損）、エキソン５、およびエキソン６を含んだカスパーゼ３ｍＲＮＡの領域のｃＤＮＡの複製である（図３）。４３１ｂｐ断片の左側は、欠損している４７のヌクレオチドを含んだエキソン４の修復された領域（カスパーゼｍ３ＲＮＡの領域３２０〜３６７）であり、この領域は最初のＭＣＦ−７培地には無く、隣の２つのエキソンを用いて正確にスプライスされている。このことはこの治療用断片がエキソン４の欠陥のある領域に相同的に組み込まれることを証明するものである。組み込まれた断片の中央部分が組み込みのプロセスにとって重要でない場合、この組み込みは、（Langston,L.D., Symingtom,L.S.「酵母における遺伝子ターゲティングは独立した２つのストランド進入によって開始される。（Gene targeting in yeast is initiated by two independent strand invasions）」、Proc NM Acad Sci USA. 101(43):15392-15397(2004)、Li,J.、Read,L.R.、Baker,M.D.「哺乳類遺伝子の置き換えのメカニズムは２つの交差事象に関連するヘテロ２本鎖ＤＮＡの長領域の構成に一致する。（The mechanism of mammalian gene replacement is consistent with the formation of long regions of heteroduplex DNA associated with two crossing-over events）」、Mol. Cell Biol. 21(2) :501-510(2001)］に記載されている機構に従っている。エキソン４、５、および６を含んだ４３１ｂｐ断片のスプライス配列を元の配列と比較すると、我々は６個のヌクレオチド各々で２つの挿入（カスパーゼ３ｍＲＮＡの領域３７０および３９０）を検出した。両挿入はフレームシフトを生じない。実験の配列においては、カスパーゼ３遺伝子の位置３７０には存在しないシステインが、位置３５０のシステインによって補償されているものと考えられる。これら２つの挿入が出現したことは、カスパーゼ３遺伝子のエキソン４に変異があることに関連するものであるか、染色体外断片が染色体に組み込まれた結果である。配列の残りの部分は重要でない置換を殆ど含まない。配列決定したテンプレートの残りの部分（エキソンスプライシング部位はＧｅｎＢａｎｋの配列に相当する）が実質的に完全な相同性であることは、スプライシングの精度を裏付けるものである。修復されたｍＲＮＡが検出されたことおよび特徴的なヌクレオソームサイズの断片を有する活性アポトーシスが証明されたことは、機能的活性酵素が出現したことを示すものである。
【００６４】
カスパーゼ遺伝子は第四染色体に限局し、大きさが２１ ７５１ｂｐで、８個のエキソンから構成されていることが知られている。この遺伝子の２つの発現産物は細胞代謝中に存在し得る：１７および１９ｋｂｐの転写物ならびにそれらのタンパク質産物（Wolf, B.B., Schuler,M., Echiverri,F., Green,D.R.、「カスパーゼ３はカスパーゼ活性デオキシリボヌクレアーゼ不活性化のＤＮＡ断片ファクター−４５／抑制因子を介するアポトーシスＤＮＡ断片のプライマリー活性化因子である（Caspase-3 is the primary activator of apoptotic DNA fragmentation via DNA fragmentation factor-45/inhibitor of caspase-activated DNase inactivation）」、J. Biol. Chem. 274, 30651-30656(1999)）。８個のエキソンをスプライスする場合、機能酵素であるカスパーゼ３が出現するためにはｍＲＮＡ翻訳の複雑なプロセスが必要となる。エキソン４における４７ｂｐの欠損は、ＲＮＡ合成の機能障害のスプライシング中のエキソン４の除去および活性酵素の発現をもたらす。培養培地中に存在するＤＮＡを５００〜１０００の大きさに流体力学的に断片化し、これは機能的酵素を生じるフルサイズの産物を合成するのに使用可能な断片が原理上は存在しないことを意味する。カスパーゼ３遺伝子のためのオープン・リーディング・フレームの復元に至った正確な配向で必要な断片が連結する可能性や、これによって酵素の合成に適した染色体外のテンプレートが形成される可能性は無視できるほど小さい。我々の考えるところ、実施した実験によれば、カスパーゼ３遺伝子を正常に戻した健常な断片のゲノムへの組み込みは、これらの実験における細胞外ＤＮＡの輸送に関連する事象の最も可能性のある結末である。
【００６５】
このように、行った実験の結果から、新しい形質が細胞培養に出現することがわかり、この排他的キャリアは断片化された細胞外の同種異系ＤＮＡであった。
【００６６】
報告されたデータから、腫瘍性疾患を治療するための提案した方法においては、自然の細胞機構によって送達される細胞外ＤＮＡの断片はその相同部分が染色体にあることを発見し、その相同部分と連結することが示唆される。また、染色体領域が突然変異体を有している場合、相同性の細胞外ＤＮＡ断片は突然変異した領域の相同的置換によりこの突然変異体を補正することができる。
【００６７】
腫瘍性疾患を治療するために提案した方法を、実験用のマウス腫瘍を用いてインビボ系で試験した。
【００６８】
（材料と方法）
Institute of Cytology and Genetics（Siberian Branch of the Russian Academy of Science）の動物繁殖施設から入手した３〜４カ月齢のＡ／Ｓｎマウス、ＣＢＡ／Ｌａｃマウス、Ｃ５７ＢＬ／６マウス、およびＩＣＲマウス用いて実験を行った。試験には連続する腫瘍の３つの系統（エールリッヒ癌、ＧＡ−１型肝癌、およびルイス腫瘍）を用いた。エールリッヒ腹水癌およびルイス肺癌はInstitute of Oncology（Tomsk Scientific Center,Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences）から入手した。ＧＡ−１型肝癌はまず、オルトアミノアゾトルエン（orthoaminoazotoluene）を用いてＡ／Ｈｅマウスに誘発させ、Ａ／Ｓｎマウスに腹水形態で維持した。この腫瘍は皮下移植または筋内移植によって誘導可能であり、移植部位にて固体モード（solid mode）で成長し、肝臓へ多数が転移する。
【００６９】
分娩中の健常な女性の胎盤をヒトＤＮＡの供給源；マウスＤＮＡの臓器（肝、腎、膵、および胸腺）の混合物とした。フェノールを用いない方法（Institute of Cytology and Geneticsの研究所規則）を用いてＤＮＡを単離した。この方法により、インビボ条件下で核マトリクスタンパク質に安定して連結される断片が保たれた成熟したゲノムＤＮＡを作製することが可能になる。ＤＮＡを超音波破砕器で断片化して、大きさが２００〜６０００ｂｐの断片の混合物を調製した。この調製物をアリコートとしてパックして１８度の温度で冷蔵庫に保管した。使用前、必用な量のＤＮＡを解凍し生食水を用いてその濃度を調製した。
【００７０】
コンピュータプログラムのＳｔａｔｉｓｔｉｋａを用いてデータを統計学的に処理した。スチューデントｔ−検定およびＷｈｉｔｎｅｙ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定に従って、差の有意性を評価した。
【００７１】
（結果）
行った実験から、断片化ゲノムＤＮＡの製剤はこれらの腫瘍の成長を遅らせる能力があることを示し、転移の進行を適度に阻害する作用を有することが明らかである（表４および５；図３）。
【００７２】
【表４】
2009523788.tif 000005
【００７３】
【表５】
2009523788.tif 000006
【００７４】
提案した治療方法において決定したある投与量でのＤＮＡの細胞毒性効果および異常効果をヒトｈＴＥＲＴ−ＢＪ１細胞培養のモデルで評価した。
【００７５】
（材料と方法）
実験では濃度が１．６９５ｍｇ／ｍｌの断片化ＤＮＡ溶液を用いた。同じ条件下でイクラから単離したＤＮＡを参照調製物として用いた。２倍体ｈＴＥＲＴ−ＢＪ１細胞系（CLONTECH Laboratories社、カタログ番号＃Ｃ４００１−１）の培地を用いた。ある等しい濃度の細胞を６ウェルプレートで培養した。２４時間後、３００または３０μｇ／ｍｌの濃度のヒトまたはサケＤＮＡをウェルに補充し、ＤＮＡ添加の４８時間および７２時間後にＧｏｒｙａｅｖチャンバを用いて細胞数を決定した。統系に基づくデータ製法は元のプログラムを使用して行われた。
【００７６】
染色体再構成を調べるために、ヒトまたはサケＤＮＡにさらされた細胞をスライドガラスに固定し、ギムザ染色法に従って従来のように染色した。
【００７７】
（結果）
〔異なる供給源から単離し、異なる投与量で適用した断片化ＤＮＡの細胞毒性効果のデータ〕
得られたデータを分析したところ、ヒトおよびサケＤＮＡを３００μｇ／ｍｌの濃度で導入すると、添加後３日目に培養物の成長が阻害されたことがわかった。ＤＮＡ調製物の濃度を３０μｇ／ｍｌしたところ、ｈＴＥＲＴ−ＢＪ１細胞培養に対して統計学的に有意な作用はみられなかった（表６）。
【００７８】
【表６】
2009523788.tif 000007
【００７９】
〔異なる供給源から単離した断片化ＤＮＡの異常な作用に関するデータ〕
得られたデータを分析したところ、ヒトまたはサケＤＮＡの投与量が３００μｇ／ｍｌの時点で染色体異常のレベルが上昇することが観察されたことがわかった。しかし、この異種ＤＮＡは同種異系ヒトＤＮＡに比して異常な作用が大きかった（表７）。
【００８０】
【表７】
2009523788.tif 000008
【００８１】
３００μｇ／ｍｌ以上に等しい濃度の断片化ＤＮＡは細胞成長を阻害し、染色体再構成を誘発する可能性があることが実験で明らかとなった。３０μｇ／ｍｌの濃度では細胞毒性効果はみられなかった。治療目的で用いるＤＮＡ製剤の推奨投与量は、１回の投与につき５μｇ／ｍｌである。これは血液１Ｌ当たり１ｍｇのＤＮＡ（１μｇ／ｍｌの作用濃度）に相当し、これは好ましくない作用を生じた濃度の１／３００未満であり、ヒト細胞のｈＴＥＲＴ−ＢＪ１培養に対して細胞毒性効果を示さない外来ＤＮＡ濃度の１／３０未満である。
【００８２】
このように、腫瘍性疾患を治療するための提案した方法は所定の結果（方法の適用および腫瘍性疾患に罹患した患者の治療の領域を拡大すること）に達する。この方法によりその疾患の原因を処置することが可能になる。すなわち、発癌遺伝子および癌抑制遺伝子の突然変異を補正することおよびヘテロ接合型の対立遺伝子を細胞のホモ接合型遺伝子に導入することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】培養培地のＤＮＡへの細胞露出の時間に応じた、ＭＣＦ−７細胞培養の細胞コンパートメント間の断片化ヒト細胞外ＤＮＡの分布の分析結果を示す（電気泳動の未変性条件；対数的培養成長）。エチジウムブロマイド染色したアガロースブロックを右に示し、乾燥後の同ブロック上のＸ線パターンを左に示す。ブロック上の数字は標識したエチジウムブロマイドおよびα−ｄＡＴＰ＊による培地培養の時間を表す。ブロックの左右にある数は分子量のマーカー（ｋｂｐ）、αは最初のα−ｄＡＴＰ＊前駆物質である。
【図２】健常な配列および修復されたエキソン４とエキソン５およびエキソン６とを含んだカスパーゼ３ｍＲＮＡの特異的領域の配列を示す。図面にはプライマーのセットおよびＲＴ手順における大きさが４３１ｂｐのカスパーゼ３遺伝子の予想されるＰＣＲ断片を示し、プライマーのセットおよび大きさが２３６および３０４ｂｐの予想されるＰＣＲ断片は４３１ｂｐの属性を裏付けている。４３１ｂｐを増幅したところ、修復されたカスパーゼ３遺伝子から合成されるｍＲＮＡが存在していることが明らかとなった。２３６ｂｐ断片および３０４ｂｐ断片を増幅したところ、４３１ｂｐ断片の内部構造は修復されたエキソン４とエキソン５およびエキソン６とを含むカスパーゼ３ｍＲＮＡの対応する領域に一致する。エキソン４、５および６を含むカスパーゼ３ｍＲＮＡの配列と４３１ｂｐ断片のテンプレートから得た内部区間である配列決定した２３６ｂｐ断片および３０４ｂｐ断片との比較である。
【図３】エールリッヒ腹水癌の成長に対するＤＮＡ製剤の効果を示すグラフである。
【図２】
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【図３】
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【図１】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年3月24日(2009.3.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的に活性のある大きさを有し、生理学的かつ遺伝的に健常なドナーの完全ゲノムを含んだ相同ＤＮＡの断片を断片化ＤＮＡとして含有する、腫瘍性疾患の治療用製剤。
【請求項２】
前記断片化ＤＮＡが、血漿および組織液中の自己のＤＮＡの量以上であるが、３０μｇ／ｍｌに等しい最大許容量以下で患者に導入される、請求項１に記載の腫瘍性疾患の治療用製剤。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
必要な結果は、腫瘍性疾患の治療のために断片化ＤＮＡが患者の生体に導入されることによって達成され、生物学的に活性のある大きさを有し、生理学的かつ遺伝的に健常なドナーの完全ゲノムを含んだ相同ＤＮＡの断片を断片化ＤＮＡとして含有する、腫瘍性疾患の治療用製剤を用いる。断片化ＤＮＡは、患者の血漿および組織液の自己のＤＮＡの量以上であるが、３０μｇ／ｍｌに等しい最大許容量以下の量が使用される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
導入される断片化ＤＮＡの量は健常なドナーの血漿および組織液の自己のＤＮＡの量以上である。しかし、この量は３０μｇ／ｍｌに等しい最大許容量以下である。
【国際調査報告】
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