(57)【要約】  本発明の１つの態様は、少なくとも１つのフッ素化アミノ酸を含むポリペプチドに関する。本発明の別の態様は、第１のポリペプチドを修飾する方法に関し、前記第１のポリペプチド中の少なくとも１つのアミノ酸を、フッ素化アミノ酸で置換することにより、前記第１のポリペプチドに対して増大した安定性を有する第２のポリペプチドを生成することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）天然または非天然ペプチドを同定し、
（ｂ）前記天然または非天然ペプチドの配列に基づいて、修飾ペプチドを合成する、
各工程を有してなり、
前記天然または非天然ペプチドの少なくとも１つのアミノ酸は、前記修飾ポリペプチド中の少なくとも１つのフッ素化アミノ酸によって置換され、前記修飾ポリペプチドは、前記天然または非天然ペプチドに対して増大した安定性を有することを特徴とする、
修飾ペプチドの調製方法。
【請求項２】
前記増大した安定性が、化学的、熱的、またはタンパク質分解性であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記増大した安定性が化学的であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記増大した安定性が化学的であり、該安定性をΔΔＧ°アンフォールディングとして測定する場合、約１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下で増大することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記増大した安定性が化学的であり、該増大をΔΔＧ°アンフォールディングとして測定する場合、約０．１ｋｃａｌ／ｍｏｌよりも大きく、約１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記増大した安定性は化学的であり、該増大をΔΔＧ°アンフォールディングとして測定する場合、約０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌよりも大きく、約１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記増大した安定性が化学的であり、該増大をΔΔＧ°アンフォールディングとして測定する場合、約１ｋｃａｌ／ｍｏｌよりも大きく、約１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記増大した安定性が化学的であり、該増大をΔΔＧ°アンフォールディングとして測定する場合、約３ｋｃａｌ／ｍｏｌよりも大きく、約１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記増大した安定性が化学的であり、該増大をΔΔＧ°アンフォールディングとして測定する場合、約５ｋｃａｌ／ｍｏｌよりも大きく、約１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記増大した安定性が化学的であり、該増大をΔΔＧ°アンフォールディングとして測定する場合、約７ｋｃａｌ／ｍｏｌよりも大きく、約１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記増大した安定性が化学的であり、該増大をΔΔＧ°アンフォールディングとして測定する場合、約９ｋｃａｌ／ｍｏｌよりも大きく、約１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記増大した安定性が化学的であり、該増大をΔΔＧ°アンフォールディングとして測定する場合、約１１ｋｃａｌ／ｍｏｌよりも大きく、約１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記増大した安定性が熱的ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記増大した安定性が熱的であり、Ｔｍが約５０℃以下で増大することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記増大した安定性が熱的であり、Ｔｍが約１℃よりも大きく、約５０℃以下で増大することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記増大した安定性が熱的であり、Ｔｍが約５℃よりも大きく、約５０℃以下で増大することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記増大した安定性が熱的であり、Ｔｍが約１０℃よりも大きく、約５０℃以下で増大することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記増大した安定性は熱的であり、Ｔｍが約１５℃よりも大きく、約５０℃以下で増大することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記増大した安定性が熱的であり、Ｔｍが約２０℃よりも大きく、約５０℃以下で増大することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記増大した安定性は熱的であり、Ｔｍは、約２５℃よりも大きく、約５０℃以下で増大することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記増大した安定性は熱的であり、Ｔｍが約３０℃よりも大きく、約５０℃以下で増大することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記増大した安定性は熱的であり、Ｔｍが約３５℃よりも大きく、約５０℃以下で増大することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記増大した安定性は熱的であり、Ｔｍが約４０℃よりも大きく、約５０℃以下で増大することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記増大した安定性は熱的であり、Ｔｍが約４５℃よりも大きく、約５０℃以下で増大することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記増大した安定性がタンパク分解性であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記増大した安定性がタンパク分解性であり、該安定性が約１０9倍以下で増大することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記増大した安定性がタンパク分解性であり、該安定性が約１．１倍よりも大きく、約１０9倍以下で増大することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記増大した安定性がタンパク分解性であり、該安定性が約２倍よりも大きく、約１０9倍以下で増大することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記増大した安定性がタンパク分解性であり、該安定性が約４倍よりも大きく、約１０9倍以下で増大することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記増大した安定性がタンパク分解性であり、該安定性が約１０倍よりも大きく、約１０9倍以下で増大することを特徴とする請求項１に記載の方法
【請求項３１】
前記増大した安定性がタンパク分解性であり、該安定性が約５０倍よりも大きく、約１０9倍以下で増大することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記増大した安定性がタンパク分解性であり、該安定性が約１０2倍よりも大きく、約１０9倍以下で増大することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記増大した安定性がタンパク分解性であり、該安定性が約１０3倍よりも大きく、約１０9倍以下で増大することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記増大した安定性がタンパク分解性であり、該安定性が約１０4倍よりも大きく、約１０9倍以下で増大することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記増大した安定性がタンパク分解性であり、該安定性が約１０5倍よりも大きく、約１０9倍以下で増大することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記増大した安定性がタンパク分解性であり、該安定性が約１０6倍よりも大きく、約１０9倍以下で増大することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記増大した安定性がタンパク分解性であり、該安定性が約１０7倍よりも大きく、約１０9倍以下で増大することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記増大した安定性がタンパク分解性であり、該安定性が約１０8倍よりも大きく、約１０9倍以下で増大することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸が、トリフルオロロイシン、４，４，４−トリフルオロバリン、５，５，５−トリフルオロロイシン、トリフルオロバリン、ヘキサフルオロバリン、トリフルオロイソロイシン、トリフルオロノルバリン、ヘキサフルオロロイシン、５，５，５，５’，５’，５’−ヘキサフルオロロイシン、トリフルオロメチオニン、トリフルオロメチルメチオニンおよびフルオロフェニルアラニンから成る群から選択されることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記少なくとも１つのアミノ酸がロイシンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がヘキサフルオロロイシンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記少なくとも１つのアミノ酸がイソロイシンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がヘキサフルオロロイシンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記少なくとも１つのアミノ酸がアラニンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がヘキサフルオロロイシンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記少なくとも１つのアミノ酸がバリンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がヘキサフルオロロイシンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記少なくとも１つのアミノ酸がグリシンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がヘキサフルオロロイシンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記少なくとも１つのアミノ酸がグルタミン酸であり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がヘキサフルオロロイシンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記少なくとも１つのアミノ酸がフェニルアラニンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がヘキサフルオロロイシンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記少なくとも１つのアミノ酸がロイシンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がトリフルオロロイシンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記少なくとも１つのアミノ酸がイソロイシンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がトリフルオロロイシンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記少なくとも１つのアミノ酸がアラニンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がトリフルオロロイシンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記少なくとも１つのアミノ酸がバリンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がトリフルオロロイシンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記少なくとも１つのアミノ酸がグリシンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がトリフルオロロイシンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記少なくとも１つのアミノ酸がグルタミン酸であり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がトリフルオロロイシンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記少なくとも１つのアミノ酸がフェニルアラニンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸あトリフルオロロイシンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記少なくとも１つのアミノ酸がロイシンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がトリフルオロバリンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記少なくとも１つのアミノ酸がイソロイシンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がトリフルオロバリンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記少なくとも１つのアミノ酸がアラニンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がトリフルオロバリンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。        
【請求項５７】
前記少なくとも１つのアミノ酸がバリンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がトリフルオロバリンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記少なくとも１つのアミノ酸がグリシンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がトリフルオロバリンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記少なくとも１つのアミノ酸がグルタミン酸であり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がトリフルオロバリンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記少なくとも１つのアミノ酸がフェニルアラニンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がトリフルオロバリンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記少なくとも１つのアミノ酸がグリシンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がトリフルオロイソロイシンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記少なくとも１つのアミノ酸がグルタミン酸であり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がトリフルオロイソロイシンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記少なくとも１つのアミノ酸がフェニルアラニンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がトリフルオロイソロイシンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記少なくとも１つのアミノ酸がロイシンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がトリフルオロイソロイシンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記少なくとも１つのアミノ酸がイソロイシンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がトリフルオロイソロイシンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記少なくとも１つのアミノ酸がアラニンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がトリフルオロイソロイシンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記少なくとも１つのアミノ酸がバリンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がトリフルオロイソロイシンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記少なくとも１つのアミノ酸がロイシンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がトリフルオロノルバリンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記少なくとも１つのアミノ酸がイソロイシンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がトリフルオロノルバリンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
前記少なくとも１つのアミノ酸がアラニンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がトリフルオロノルバリンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
前記少なくとも１つのアミノ酸がバリンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がトリフルオロノルバリンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
前記少なくとも１つのアミノ酸がグリシンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がトリフルオロノルバリンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記少なくとも１つのアミノ酸がグルタミン酸であり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がトリフルオロノルバリンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記少なくとも１つのアミノ酸がフェニルアラニンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がトリフルオロノルバリンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記少なくとも１つのアミノ酸がロイシンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がトリフルオロメチオニンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記少なくとも１つのアミノ酸がイソロイシンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がトリフルオロメチオニンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
前記少なくとも１つのアミノ酸がアラニンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がトリフルオロメチオニンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
前記少なくとも１つのアミノ酸がバリンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がトリフルオロメチオニンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
前記少なくとも１つのアミノ酸がグリシンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がトリフルオロメチオニンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
前記少なくとも１つのアミノ酸がグルタミン酸であり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がトリフルオロメチオニンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
前記少なくとも１つのアミノ酸がフェニルアラニンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がトリフルオロメチオニンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
前記少なくとも１つのアミノ酸がロイシンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がトリフルオロメチルメチオニンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
前記少なくとも１つのアミノ酸がイソロイシンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がトリフルオロメチルメチオニンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記少なくとも１つのアミノ酸がアラニンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がトリフルオロメチルメチオニンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
前記少なくとも１つのアミノ酸がバリンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がトリフルオロメチルメチオニンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
前記少なくとも１つのアミノ酸がグリシンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がトリフルオロメチルメチオニンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
前記少なくとも１つのアミノ酸がグルタミン酸であり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がトリフルオロメチルメチオニンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
前記少なくとも１つのアミノ酸がフェニルアラニンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸がトリフルオロメチルメチオニンであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
前記天然または非天然ポリペプチドが、配列ＧＩＧＫＦＬＨＡＡＫＫＦＡＫＡＦＶＡＥＩＭＮＳを有することを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９０】
前記天然または非天然ポリペプチドが、配列ＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫを有することを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９１】
前記天然または非天然ポリペプチドが、配列ＴＲＳＳＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫを有することを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９２】
前記天然または非天然ポリペプチドが、配列ＱＨＷＳＹＬＬＲＰを有することを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９３】
前記天然または非天然ポリペプチドが、配列ＫＣＮＴＡＴＣＡＴＱＲＬＡＮＦＬＶＨＳＳＮＮＦＧＰＩＬＰＰＴＮＶＧＳＮＴＹを有することを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９４】
前記天然または非天然ポリペプチドが、配列ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＸＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳを有することを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９５】
前記天然または非天然ポリペプチドが、配列ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲを有することを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。        
【請求項９６】
前記天然または非天然ポリペプチドが、配列ＳＰＫＭＶＱＧＳＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣＫＶＬＲＲＫを有することを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９７】
前記天然または非天然ポリペプチドが、配列ＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＬＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮＷＦを有することを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９８】
前記天然または非天然ポリペプチドが、配列ＶＶＹＴＤＣＴＥＳＧＱＮＬＣＬＣＥＧＳＮＶＣＧＱＧＮＫＣＩＬＧＳＤＧＥＫＮＱＣＶＴＧＥＧＴＰＫＰＱＳＨＮＤＧＤＦＥＥＩＰＥＥＹＬＱを有することを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９９】
前記天然または非天然ポリペプチドが、配列ＭＰＬＷＶＦＦＦＶＩＬＴＬＳＮＳＳＨＣＳＰＰＰＰＬＴＬＲＭＲＲＹＡＤＡＩＦＴＮＳＹＲＫＶＬＧＱＬＳＡＲＫＬＬＱＤＩＭＳＲＱＱＧＥＳＮＱＥＲＧＡＲＡＲＬＧＲＱＶＤＳＭＷＡＥＱＫＱＭＥＬＥＳＩＬＶＡＬＬＱＫＨＳＲＮＳＱＧを有することを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１００】
前記天然または非天然ポリペプチドが、配列ＭＫＰＩＱＫＬＬＡＧＬＩＬＬＴＳＣＶＥＧＣＳＳＱＨＷＳＹＧＬＲＰＧＧＫＲＤＡＥＮＬＩＤＳＦＱＥＩＶＫＥＶＧＱＬＡＥＴＱＲＦＥＣＴＴＨＱＰＲＳＰＬＲＤＬＫＧＡＬＥＳＬＩＥＥＥＴＧＱＫＫＩを有することを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記天然または非天然ポリペプチドが、配列ＭＡＬＷＭＲＬＬＰＬＬＡＬＬＡＬＷＧＰＤＰＡＡＡＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＲＥＡＥＤＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＬＱＫＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮを有することを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０２】
少なくとも１つのフッ素化アミノ酸を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、ＧＩＧＫＦＸＨＡＡＫＫＦＡＫＡＦＶＡＥＸＭＮＳ、
ＧＩＧＫＦＸＨＡＸＫＫＦＸＫＡＦＸＡＥＸＭＮＳ、
ＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＸＸＲＫ、
ＴＲＳＳＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＸＸＲＫ、
ＨＸＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ、
ＨＡＸＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ、
ＨＸＸＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ、
ＨＸＸＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ、
ＨＸＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＸＩＡＷＬＶＫＧＲ、
ＨＡＸＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＸＡＷＬＶＫＧＲ、および
ＨＸＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＸＶＫＧＲ
から成る群から選択される配列を有し、
Ｘが独立して、フッ素化アミノ酸であることを特徴とする、
ポリペプチド。
【請求項１０３】
前記ポリペプチドが、配列ＧＩＧＫＦＸＨＡＡＫＫＦＡＫＡＦＶＡＥＸＭＮＳを有することを特徴とする請求項１０２に記載のポリペプチド。
【請求項１０４】
前記ポリペプチドが、配列ＧＩＧＫＦＸＨＡＸＫＫＦＸＫＡＦＸＡＥＸＭＮＳを有することを特徴とする請求項１０２に記載のポリペプチド。
【請求項１０５】
前記ポリペプチドが、配列ＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＸＸＲＫを有することを特徴とする請求項１０２に記載のポリペプチド。
【請求項１０６】
前記ポリペプチドが、配列ＴＲＳＳＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＸＸＲＫを有することを特徴とする請求項１０２に記載のポリペプチド。
【請求項１０７】
前記ポリペプチドが、
ＨＸＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ、
ＨＡＸＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ、
ＨＸＸＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ、
ＨＸＸＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ、
ＨＸＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＸＩＡＷＬＶＫＧＲ、
ＨＡＸＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＸＡＷＬＶＫＧＲ、および
ＨＸＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＸＶＫＧＲ
から成る群から選択される配列を有することを特徴とする請求項１０２に記載のポリペプチド。
【請求項１０８】
前記ポリペプチドが、配列ＨＸＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲを有することを特徴とする請求項１０２に記載のポリペプチド。
【請求項１０９】
前記ポリペプチドが、配列ＨＡＸＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲを有することを特徴とする請求項１０２に記載のポリペプチド。
【請求項１１０】
前記ポリペプチドが、配列ＨＸＸＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲを有することを特徴とする請求項１０２に記載のポリペプチド。
【請求項１１１】
前記ポリペプチドが、配列ＨＸＸＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲを有することを特徴とする請求項１０２に記載のポリペプチド。
【請求項１１２】
前記ポリペプチドが、配列ＨＸＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＸＩＡＷＬＶＫＧＲを有することを特徴とする請求項１０２に記載のポリペプチド。
【請求項１１３】
前記ポリペプチドが、配列ＨＡＸＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＸＡＷＬＶＫＧＲを有することを特徴とする請求項１０２に記載のポリペプチド。
【請求項１１４】
前記ポリペプチドが、配列ＨＸＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＸＶＫＧＲを有することを特徴とする請求項１０２に記載のポリペプチド。
【請求項１１５】
前記フッ素化アミノ酸Ｘが、独立して、トリフルオロロイシン、４，４，４−トリフルオロバリン、５，５，５−トリフルオロロイシン、トリフルオロバリン、ヘキサフルオロバリン、トリフルオロイソロイシン、トリフルオロノルバリン、ヘキサフルオロロイシン、５，５，５，５’，５’，５’−ヘキサフルオロロイシン、トリフルオロメチオニン、トリフルオロメチルメチオニンおよびフルオロフェニルアラニンから成る群から選択されることを特徴とする請求項１０２〜１１４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１１６】
少なくとも１つの置換された天然アミノ酸に対し、少なくとも１つのフッ素化アミノ酸置換を含むポリペプチドであって、
前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸置換が、トリフルオロロイシン、４，４，４−トリフルオロバリン、５，５，５−トリフルオロロイシン、トリフルオロバリン、ヘキサフルオロバリン、トリフルオロイソロイシン、トリフルオロノルバリン、ヘキサフルオロロイシン、５，５，５，５’，５’，５’−ヘキサフルオロロイシン、トリフルオロメチオニン、トリフルオロメチルメチオニン、およびフルオロフェニルアラニンから成る群から選択され、
前記ポリペプチドが、
ＧＩＧＫＦＬＨＡＡＫＫＦＡＫＡＦＶＡＥＩＭＮＳ、
ＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫ、
ＴＲＳＳＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫ、ＱＨＷＳＹＬＬＲＰ、
ＫＣＮＴＡＴＣＡＴＱＲＬＡＮＦＬＶＨＳＳＮＮＦＧＰＩＬＰＰＴＮＶＧＳＮＴＹ、
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＸＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ、
ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ、
ＳＰＫＭＶＱＧＳＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣＫＶＬＲＲＫ、
ＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＬＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮＷＦ、
ＶＶＹＴＤＣＴＥＳＧＱＮＬＣＬＣＥＧＳＮＶＣＧＱＧＮＫＣＩＬＧＳＤＧＥＫＮＱＣＶＴＧＥＧＴＰＫＰＱＳＨＮＤＧＤＦＥＥＩＰＥＥＹＬＱ、
ＭＰＬＷＶＦＦＦＶＩＬＴＬＳＮＳＳＨＣＳＰＰＰＰＬＴＬＲＭＲＲＹＡＤＡＩＦＴＮＳＹＲＫＶＬＧＱＬＳＡＲＫＬＬＱＤＩＭＳＲＱＱＧＥＳＮＱＥＲＧＡＲＡＲＬＧＲＱＶＤＳＭＷＡＥＱＫＱＭＥＬＥＳＩＬＶＡＬＬＱＫＨＳＲＮＳＱ、
ＭＫＰＩＱＫＬＬＡＧＬＩＬＬＴＳＣＶＥＧＣＳＳＱＨＷＳＹＧＬＲＰＧＧＫＲＤＡＥＮＬＩＤＳＦＱＥＩＶＫＥＶＧＱＬＡＥＴＱＲＦＥＣＴＴＨＱＰＲＳＰＬＲＤＬＫＧＡＬＥＳＬＩＥＥＥＴＧＱＫＫＩ、および
ＭＡＬＷＭＲＬＬＰＬＬＡＬＬＡＬＷＧＰＤＰＡＡＡＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＲＥＡＥＤＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＬＱＫＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ
から成る群から選択されることを特徴とするポリペプチド。
【請求項１１７】
前記少なくとも１つの置換された天然アミノ酸が、ロイシン、イソロイシン、バリンおよびアラニンから成る群から選択されることを特徴とする請求項１１６に記載のポリペプチド。
【請求項１１８】
前記少なくとも１つの置換された天然アミノ酸が、ロイシンであることを特徴とする請求項１１６に記載のポリペプチド。
【請求項１１９】
前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸置換が、５，５，５，５’，５’，５’−ヘキサフルオロロイシンであることを特徴とする請求項１１６に記載のポリペプチド。
【請求項１２０】
前記少なくとも１つの置換された天然アミノ酸が、ロイシン、イソロイシン、バリンおよびアラニンから成る群から選択され、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸置換が、５，５，５，５’，５’，５’−ヘキサフルオロロイシンであることを特徴とする請求項１１６に記載のポリペプチド。
【請求項１２１】
前記少なくとも１つの置換された天然アミノ酸がロイシンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸置換が、５，５，５，５’，５’，５’−ヘキサフルオロロイシンであることを特徴とする請求項１１６に記載のポリペプチド。
【請求項１２２】
少なくとも１つのフッ素化アミノ酸置換を含むポリペプチドであって、
前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸置換が、トリフルオロロイシン、５，５，５−トリフルオロロイシン、ヘキサフルオロロイシン、および５，５，５，５’，５’，５’−ヘキサフルオロロイシンから成る群から選択され、
Ｘの各例は独立して、ロイシンまたはフッ素化アミノ酸置換であり、
前記ポリペプチドは、
ＧＩＧＫＦＸＨＡＡＫＫＦＡＫＡＦＶＡＥＩＭＮＳ、
ＲＡＧＸＱＦＰＶＧＲＶＨＲＸＸＲＫ、
ＴＲＳＳＲＡＧＸＱＦＰＶＧＲＶＨＲＸＸＲＫ、ＱＨＷＳＹＸＸＲＰ、
ＫＣＮＴＡＴＣＡＴＱＲＸＡＮＦＸＶＨＳＳＮＮＦＧＰＩＸＰＰＴＮＶＧＳＮＴＹ、
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＸＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＸＩＥＷＸＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ、
ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＸＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＸＶＫＧＲ、
ＳＰＫＭＶＱＧＳＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＸＧＣＫＶＸＲＲＫ、
ＹＴＳＸＩＨＳＸＩＥＥＳＱＮＱＱＥＸＮＥＱＥＸＸＥＸＤＫＷＡＳＸＷＮＷＦ、
ＶＶＹＴＤＣＴＥＳＧＱＮＸＣＸＣＥＧＳＮＶＣＧＱＧＮＫＣＩＸＧＳＤＧＥＫＮＱＣＶＴＧＥＧＴＰＫＰＱＳＨＮＤＧＤＦＥＥＩＰＥＥＹＸＱ、
ＭＰＸＷＶＦＦＦＶＩＸＴＸＳＮＳＳＨＣＳＰＰＰＰＸＴＸＲＭＲＲＹＡＤＡＩＦＴＮＳＹＲＫＶＸＧＱＸＳＡＲＫＸＸＱＤＩＭＳＲＱＱＧＥＳＮＱＥＲＧＡＲＡＲＸＧＲＱＶＤＳＭＷＡＥＱＫＱＭＥＸＥＳＩＸＶＡＸＸＱＫＨＳＲＮＳＱＧ、ＭＫＰＩＱＫＸＸＡＧＸＩＸＸＴＳＣＶＥＧＣＳＳＱＨＷＳＹＧＸＲＰＧＧＫＲＤＡＥＮＸＩＤＳＦＱＥＩＶＫＥＶＧＱＸＡＥＴＱＲＦＥＣＴＴＨＱＰＲＳＰＸＲＤＸＫＧＡＸＥＳＸＩＥＥＥＴＧＱＫＫＩ、および
ＭＡＸＷＭＲＸＸＰＸＸＡＸＸＡＸＷＧＰＤＰＡＡＡＦＶＮＱＨＸＣＧＳＨＸＶＥＡＸＹＸＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＲＥＡＥＤＸＱＶＧＱＶＥＸＧＧＧＰＧＡＧＳＸＱＰＸＡＸＥＧＳＸＱＫＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＸＹＱＸＥＮＹＣＮ
から成る群から選択されることを特徴とするポリペプチド。
【請求項１２３】
前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸置換が、５，５，５，５’，５’，５’−ヘキサフルオロロイシンであることを特徴とする請求項１２２に記載のポリペプチド。
【請求項１２４】
少なくとも１つの置換された天然アミノ酸に対し、少なくとも１つのフッ素化アミノ酸置換を含むポリペプチドであって、
前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸置換が、トリフルオロロイシン、４，４，４−トリフルオロバリン、５，５，５−トリフルオロロイシン、トリフルオロバリン、ヘキサフルオロバリン、トリフルオロイソロイシン、トリフルオロノルバリン、ヘキサフルオロロイシン、５，５，５，５’，５’，５’−ヘキサフルオロロイシン、トリフルオロメチオニン、トリフルオロメチルメチオニン、およびフルオロフェニルアラニンから成る群から選択され、
Ｘの各例は独立して、フッ素化アミノ酸置換であり、
前記ポリペプチドは、
ＨＸＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ、
ＨＡＸＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ、
ＨＸＸＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ、
ＨＸＸＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ、
ＨＸＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＸＩＡＷＬＶＫＧＲ、
ＨＡＸＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＸＡＷＬＶＫＧＲ、および
ＨＸＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＸＶＫＧＲ
から成る群から選択されることを特徴とするポリペプチド。
【請求項１２５】
前記少なくとも１つの置換された天然アミノ酸が、ロイシン、イソロイシン、アラニン、グリシン、グルタミン酸、およびフェニルアラニンから成る群から選択されることを特徴とする請求項１２４に記載のポリペプチド。
【請求項１２６】
前記少なくとも１つの置換された天然アミノ酸が、ロイシンであることを特徴とする請求項１２４に記載のポリペプチド。
【請求項１２７】
前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸置換は、５，５，５，５’，５’，５’−ヘキサフルオロロイシンであることを特徴とする請求項１２４に記載のポリペプチド。
【請求項１２８】
前記少なくとも１つの置換された天然アミノ酸が、ロイシン、イソロイシン、アラニン、グリシン、グルタミン酸、およびフェニルアラニンから成る群から選択され、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸置換が、５，５，５，５’，５’，５’−ヘキサフルオロロイシンであることを特徴とする請求項１２４に記載のポリペプチド。
【請求項１２９】
前記少なくとも１つの置換された天然アミノ酸が、ロイシンであり、前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸置換が、５，５，５，５’，５’，５’−ヘキサフルオロロイシンであることを特徴とする請求項１２４に記載のポリペプチド。
【請求項１３０】
少なくとも１つのフッ素化アミノ酸置換を含むポリペプチドであって、
前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸置換が、トリフルオロロイシン、５，５，５−トリフルオロロイシン、ヘキサフルオロロイシン、および５，５，５，５’，５’，５’−ヘキサフルオロロイシンから成る群から選択され、
Ｘの各例は独立して、ロイシンまたはフッ素化アミノ酸置換であり、
前記ポリペプチドは、
ＨＸＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ、
ＨＡＸＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ、
ＨＸＸＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ、
ＨＸＸＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ、
ＨＸＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＸＩＡＷＬＶＫＧＲ、
ＨＡＸＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＸＡＷＬＶＫＧＲ、および
ＨＸＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＸＶＫＧＲ
から成る群から選択されることを特徴とするポリペプチド。
【請求項１３１】
前記少なくとも１つのフッ素化アミノ酸置換が、５，５，５，５’，５’，５’−ヘキサフルオロロイシンであることを特徴とする請求項１３０に記載のポリペプチド。
【請求項１３２】
少なくとも１つの放射性標識されたアミノ酸を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、配列ＤＬＳＫ*ＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳを有し、ここでＫ*が放射性標識されたアミノ酸であることを特徴とするポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の説明】
【０００１】
本出願は、２００６年１月１７日に出願された米国仮特許出願第６０／７５９，４４１号の優先権の利益を主張するものである。
【技術分野】
【０００２】
本発明の１つの態様は、少なくとも１つのフッ素化アミノ酸を含むポリペプチドに関する。本発明の別の態様は、第１のポリペプチドを修飾する方法に関し、前記第１のポリペプチド中の少なくとも１つのアミノ酸を、フッ素化アミノ酸で置換することにより、前記第１のポリペプチドに対して増大した安定性を有する第２のポリペプチドを生成することを含む。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質は、通常、立体構造の安定性に役立つ多数の非共有結合性相互作用の結果として、折り畳まれて、特有の三次元構造をとる。非特許文献１。水性溶媒からの疎水性表面領域の除去は、タンパク構造を安定させるために主要な役割を担う。非特許文献２および３。例えば、埋め込みロイシンまたはフェニルアラニン残基は、アラニンと比較して、〜２−５ｋｃａｌ／ｍｏｌの安定性を提供することができる。疎水性環境に存在する場合、水素結合および塩橋は、３ｋｃａｌ／ｍｏｌもの量をタンパク安定性へ提供することができるが、溶媒に曝露した静電相互作用は、それよりずっと少なく通常≦０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌを提供する。非特許文献４および５。小極性側鎖および骨格アミド間の水素結合は、Ｎ末端ヘリックスキャップの場合に見られるように、１〜２ｋｃａｌ／ｍｏｌに相当しうる。非特許文献６。これらの分子内力および溶媒との相互作用のエネルギーバランスは、折り畳みの形状および安定性を決定する。
【０００４】
設計構造上の静電相互作用は、熱力学的安定性を犠牲にして立体構造の特異性を提供でき、一方、疎水性相互作用は、構造を安定化させるための非常に強力な駆動力を利用可能にする。最近の研究は、タンパク質構造の有意な同時変化なく疎水性を増加させる手段として、非タンパク質新生のフッ素含有アミノ酸の導入に焦点を当てている。非特許文献７および８。推定平均質量は、ＣＦ2およびＣＦ3群のより大きな３８および９２Å3と比較して、ＣＨ2およびＣＨ3群は、それぞれ２７および５４Å3である。非特許文献９。疎水性効果は、溶媒に曝露した表面領域におおよそ比例することを考慮すると、トリフルオロメチル群の大きいサイズおよび質量は、フッ素原子の低分極率と組み合わせて疎水性の向上をもたらす。非特許文献１０。実際、分配係数は、ＣＨ3（Π＝０．５０）群よりも有意なＣＦ3（Π＝１．０７）の疎水性示す。非特許文献１１。また、フッ素の低分極率は、液体フッ化炭素の低凝集エネルギー密度をもたらし、分子内相互作用に対するそれらの低い特性において示される。非特許文献１２および１３。フッ素のこれらの特有の特性は、高フッ素内容物を有する生体高分子に疎水性および疎油性の特性を同時に与える。非特許文献１４。
【０００５】
タンパク質折り畳みの適切な位置に末端トリフルオロメチル群を含有するアミノ酸を導入することは、熱安定性を増強させ、化学的変性剤への耐性を向上させる。非特許文献７および８。さらに、特異的なタンパク質タンパク質相互作用は、フッ化炭素および炭化水素側鎖の使用によってプログラムされることができる。非特許文献１５。特異性は、すべての可能なタンパク質−タンパク質相互作用の熱力学的安定性によって判断されるため、種々の組み合わせの詳細な根本的理解が必須である。
【０００６】
最初はＤＮＡ結合タンパク質内で発見されたが、タンパク質結合タンパク質内でも発見された所謂「ロイシンジッパー」タンパク質モチーフは、タンパク質の１次配列における７つのアミノ酸ごとに反復される一連の４つまたは５つの連続的なロイシン残基から成る。ヘリックス構造において、ロイシンジッパーモチーフを含有するタンパク質は、ヘリックスの片側上に一列のロイシンを示す。２つのかかるヘリックスが互いに平行する状態で、ロイシンの配列は、ジッパーのように互いに噛み合い、および／または側側接触を形成することができるため、２つのヘリックス間において安定した連結を形成する。さらに、例えば、水素のフッ素との置換による、ロイシンジッパーモチーフにおけるロイシン側鎖の疎水性の増大は、ジッパーの強度を増大させるはずである。
【０００７】
生物学的に活性な化合物の選択的フッ素付加は、生理学的活性の劇的な変化を伴うことが多い。非特許文献１６およびそこに引用された非特許文献１７〜２３。さらに、フッ素化アミノ酸は、酵素の潜在的阻害剤および治療薬として合成および研究されている。非特許文献２４。また、潜在的な代謝拮抗物質として作用する、アミノ酸を含有するトリフルオロメチルも報告されている。非特許文献２５〜２７。
【０００８】
一般的な抗体への菌耐性出現は、ヒトの健康にとって深刻な脅威となり、抗微生物ペプチドへの興味を再燃させる。植物および動物はどちらも、構造が様々であり、微生物病原体に対抗して配置される短ペプチドを保有する。これらのペプチド間の一般的な際立った特性は、顔面両親媒性立体構造を形成し、陽イオン性および疎水性側鎖を分離させる能力である。α−ヘリックス（マガイニンおよびセクロピン）およびβ−シート（バクテネシンおよびデフェンシン）２次構造要素が示される。大概の真核生物は、侵入してくる細菌に対する第１の防御を提供する組織内の多くの異なるクラスからそのようなペプチドの組み合わせを発現させる。非特許文献２８〜３１。構造上の詳細は、作用の機構を明らかにしている。正電荷は、ペプチドが負の電荷を持つ細菌膜と、最終的に膜破裂に繋がる脂質二重層のアシル鎖領域との疎水性側鎖の相互作用とを、見つけられるようにする。これらのペプチドの広域なスペクトル活性および古代系統の結果として、菌耐性は、完全に阻止されてもよく、または適切な候補へ長期治療上の生存期間を提供するのに十分なほど抑制されてもよい。非特許文献３２および３３。
【０００９】
宿主防御ペプチドの抗菌作用を調節するための戦略は、他の１９個の天然アミノ酸による単一（または複数）部位での置換に主に依存している。このアプローチは、幾つかの向上した変異体をもたらしており、［アラニン］マガイニンＩＩアミドが最も顕著である。非特許文献８、３４および３５。一方、天然ペプチドの研究から得られた一般的原理は、抗微生物ペプチドおよび非天然構成要素を使用して、抗微生物ペプチドおよびポリマーの設計に活用されている。β−ペプチド、Ｄ，Ｌ−α−ペプチドおよびアリールアミドポリマーに基づくこれらの幾つかの構造は、目覚しい殺菌作用を示す。非特許文献３４および３６〜４１。
【００１０】
哺乳類のホルモングルカゴン様ペプチド１（７−３６）アミド（ＧＬＰ−１）は、抗糖尿病薬として大きな可能性を有する。非特許文献４２。ＧＬＰ−１は、膵臓β細胞上のＧＬＰ−１Ｒに結合し、疎水性相互作用は、受容体へのこの両親媒性α−ヘリックスペプチドの付随に関与する主な駆動力であり得る。非特許文献４３および４４。他の要因と伴に、ＧＬＰ−１は合成可能であり、高速な酵素的クリアランス速度を有し、疎水性受容体結合表面を有する。食物摂取に応じて腸Ｌ細胞から選択された３０残基ペプチドであるＧＬＰ−１は、特有のインスリン分泌性および特性のような増殖因子を有する。主に疎水性相互作用を介して、その特異的な７つの膜貫通Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）に結合する際に、（１）ＧＬＰ−１は、グルコース依存性のインスリン分泌を増強させ、膵臓β細胞の増殖および新生を刺激すると同時に、アポトーシスを抑え、グルカゴンの分泌を抑制し、胃腸の運動を遅らせ、満腹満をもたらす。非特許文献４５〜４８。他の抗糖尿病性治療法（例えば、スルホニル尿素）とは異なり、ＧＬＰ−１の投与によって生じる副作用としての低血糖症は見られなかった。しかしながら、天然ＧＬＰ−１の臨床的有用性は、アンタゴニストまたは部分アゴニストＧＬＰ−１（９−３６）アミドを送達するためのセリンプロテアーゼジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ ＩＶ、ＥＣ  ３．４．１４．５）による、その急速な酵素的非活性化によって大幅に妨げられる。擬態のＧＬＰ−１作用を可能にする小分子アゴニストは、当然高く所望されるが、小分子リガンドは、今までのところアンタゴニストであることが発見された。非特許文献４９。この理由により、より長い半減期を有するＧＬＰ−１Ｒに対するペプチド系アゴニストは、数時間から１０日を越える期間のヒトにおける長期半減期を有する、エクセンジン４、アルブミン結合ならびに脂質付加されたＧＬＰ−１誘導体ＮＮ２１１およびＣＪＣ−１１３１によって例示されるように、過去数十年に亘り、主要な興味の対象となっている。非特許文献５０。
【非特許文献１】Creighton, T. E. Proteins : Structures and Molecular Properties; 2nd ed.; W.H. Freeman: New York, 1993
【非特許文献２】Tanford, C. Science 1978, 200, 1012-1018
【非特許文献３】Kauzmann, W. Adv. Protein Chem. 1959, 14, 1-63
【非特許文献４】Yu, Y. et al. J. Mol. Biol. 1996, 255, 367-372
【非特許文献５】Lumb, K. J.; Kim, P. S. Science 1995, 268, 436-439
【非特許文献６】Aurora, R.; Rose, G. D. Protein Sci. 1998, 7, 21-38
【非特許文献７】Bilgicer, B.; Fichera, A.; Kumar, K. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 4393-4399
【非特許文献８】Tang, Y. et al. Biochemistry 2001, 40, 2790-2796
【非特許文献９】Israelachvili, J. N. et al. Biochim.Biophysica Acta 1977, 470, 185-201
【非特許文献１０】Tanford, C. The Hydrophobic Effect: Formation of Micelles and Biological Membranes; 2d ed.; Wiley: New York, 1980
【非特許文献１１】Resnati, G. Tetrahedron 1993, 49, 9385-9445
【非特許文献１２】Riess, J. G. Colloid Surf.- A 1994, 84, 33-48
【非特許文献１３】Scott, R. L. J. Am. Chem. Soc. 1948, 70, 4090-4093
【非特許文献１４】Marsh, E. N. G. Chem. Biol. 2000, 7, R153-R157
【非特許文献１５】Bilgicer, B.; Xing, X.; Kumar, K. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 11815-11816
【非特許文献１６】Welch, T.; Eswarakrishnan, S. Fluorine in Bioorganic Chemistry, Wiley-Interscience: New York, 1991
【非特許文献１７】Fluorine-containing Amino Acids; Kukhar, V. P., Soloshonok, V. A., Eds.; John Wiley & Sons: Chichester, 1994
【非特許文献１８】Williams, R. M. Synthesis of Optically Active α- Amino Acids, Pergamon Press: Oxford, 1989
【非特許文献１９】Ojima, I. et al. J. Org. Chem. 1989, 54, 4511-4522
【非特許文献２０】Tsushima, T. et al. Tetrahedron 1988, 44, 5375-5387
【非特許文献２１】Weinges, K.; Kromm, E. Liebigs Ann. Chem. 1985, 90-102
【非特許文献２２】Eberle, M. K. et al. Helv. Chim. Acta 1998, 81, 182-186
【非特許文献２３】Tolman, V. Amino Acids 1996, 11, 15-36
【非特許文献２４】Kollonitsch, J. et al. Nature 1978, 274, 906-908
【非特許文献２５】Walborsky, H. M.; Baum, M. E. J. Am. Chem. Soc. 1958, 80, 187-192
【非特許文献２６】Walborsky, H. M. et al. J. Am. Chem. Soc. 1955, 77, 3637-3640
【非特許文献２７】Hill, H. M. et al. J. Am. Chem. Soc. 1950, 72, 3289-3289
【非特許文献２８】Coates, A.et al. Nat. Rev. Drug Discov. 2002, 1, 895-910
【非特許文献２９】Zasloff, M. Nature 2002, 415, 389-395
【非特許文献３０】Tossi, A.et al. Biopolymers 2000, 55, 4-30
【非特許文献３１】Ganz, T. Nat. Rev. Immunol. 2003, 3, 710-720
【非特許文献３２】Brogden, K. A. Nat. Rev. Microbiol. 2005, 3, 238-250
【非特許文献３３】Hilpert, K. et al. Nat. Biotechnol. 2005, 23, 1008-1012
【非特許文献３４】Fernandez-Lopez, S. et al. Nature 2001, 412, 452-455
【非特許文献３５】Kobayashi, S. et al. Biochemistry 2004, 43, 15610-15616
【非特許文献３６】Zasloff, M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1987, 84, 5449-5453
【非特許文献３７】Chen, H. C. et al. FEBS Lett. 1988, 236, 462-466
【非特許文献３８】Porter, E. A. et al. Nature 2000, 404, 565-565
【非特許文献３９】Porter, E. A. et al. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 7324-7330
【非特許文献４０】Schmitt, M. A. et al. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 6848-6849
【非特許文献４１】Tew, G. N. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2002, 99, 5110-5114
【非特許文献４２】Meier, J. J.; Nauck, M. A. Diabetes-Metab. Res. Rev. 2005, 21, 91
【非特許文献４３】Wilmen, A. et al. Peptides 1997, 18, 301
【非特許文献４４】Adelhorst, K. et al. J. Biol. Chem. 1994, 269, 6275
【非特許文献４５】Holz, G. G. et al. Nature 1993, 361, 362
【非特許文献４６】Ammala, C. et al. Nature 1993, 363, 356
【非特許文献４７】Vilsboll, T.; Hoist, J. J. Diabetologia 2004, 47, 357
【非特許文献４８】Brubaker, P. L.; Drucker, D. J. Endocrinology 2004, 145, 2653
【非特許文献４９】Tibaduiza, E. C; Chen, C; Beinborn, M. J. Biol. Chem. 2001, 276, 37787
【非特許文献５０】Knudsen, L. B. J. Med. Chem. 2004, 47, 4128
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
注目すべきことに、高フッ素化残基を取り込むペプチド集合体は、より高い熱的および化学的安定性を有することを発見した。さらに、適切に設計されたフッ素化ペプチドは、細胞溶解メリチンの場合のように膜に対するより高い親和性を示し、また生体膜内の離散オリゴマー形成を方向付けることもできる。非特許文献７および１５、Bilgicer, B.; Kumar, K. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004, 101, 15324-15329; Niemz, A.; Tirrell, D. A. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 7407- 7413。膜親和性の増強、および、より優れた構造上の安定性は、プロテアーゼにより安定であるペプチド変異体を生成し、また、抗微生物ペプチドの作用強度の増加にも繋がることを発見した。とりわけ、設計、合成、特性および向上された熱的および化学的安定性およびフッ素化アミノ酸を含むペプチド系の生物活性を本明細書において記述する。
【００１２】
本発明の別の態様は、作用強度の向上、増強された熱的および化学的安定性、およびフッ素化アミノ酸側鎖の取り込みを介した生物学的に活性なペプチドの増大したプロテアーゼ耐性に関する。
【００１３】
本発明の別の態様は、その受容体、シグナル変換能力および酵素安定性への結合親和性についてのホルモンペプチド、ＧＬＰ−１のフッ素付加効果に関する。高フッ素化アミノ酸の取り込みが、効力に関して向上された酵素安定性および保存された生物活性をもたらしたことを示す。これらの結果は、フッ素化アミノ酸がペプチド薬候補を修飾するのに有用であり得る可能性を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
フッ素化アミノ酸を含むタンパク質の抗菌作用およびプロテアーゼ安定性
ＭＢＨＡおよびブチルオキシカルボニル−リジン（２−Ｃｌ−Ｚ）−Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂を用いた０．０７５ｍｍｏｌ規模へのｔ−ブチルオキシカルボニルケミストリーに対するその場中和の手順を使用して、ペプチドを手作業で合成した。チオフェノールの２０倍モル過剰を使用して、ヒスチジン上のジニトロフェニル保護基を除去した。ＨＦ／アニソール（９０：１０）を用いて０℃で２時間処置することにより、ペプチドを樹脂から開裂させ、その後、冷Ｅｔ2Ｏで沈殿させた。粗ペプチドを、ＲＰ−ＨＰＬＣ［Ｖｙｄａｃ  Ｃ18、１０μＭ、１０ｍｍ×２５０ｍｍ］によって精製した。ペプチドの純度は、分析的  ＲＰ−ＨＰＬＣ［Ｖｙｄａｃ  Ｃ18、５μＭ、４ｍｍ×２５０ｍｍ］で判断されたとおり、９５％を超えた。ペプチドのモル質量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで判断した。ペプチド濃度は、定量的アミノ酸分析で判断した。
【００１５】
既知の最も強力な抗微生物ペプチドのうちの２つである、Ｍ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１）およびブフォリンＩＩ［１−２１］（ＢＩＩ１）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２）を、フッ素付加の鋳型として選択した。両ペプチドは、低濃度でそれらの殺菌作用を発揮させる能力を有するが、それらの作用様式は極めて独特である。両方とも、静電相互作用によって負の電荷を持つ細菌細胞膜に最初は引き付けられるが、Ｍ２は、脂質二重層中にドーナツ形の細孔を形成することによって細胞溶解を発生させ、その一方で、ＢＩＩ１は、細胞内に浸透して、細胞内ＤＮＡおよびＲＮＡを結合することによって細菌を死滅させる。細孔形成および細胞内へのＢＩＩ１の転位は、どちらも疎水性相互作用によって制御されるようである。選択した位置での超疎水性ヘキサフルオロロイシンの取り込みは、膜親和性を増強させると同時により強力なプロテアーゼ安定性を提供することを想定した。本発明の研究において採用された第３の鋳型、ＢＩＩ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３）は、ＢＩＩ１よりも高い抗菌作用を有するＮ末端切断されたブフォリンＩＩ（５−２１）であった。ペプチドおよびフッ素化類似体の配列を図１に示す。これらのペプチドは両親媒性  ヘリックス立体構造を採用するため、ヘリックス回転図を活用して、フッ素付加の部位をヘリックスの非細孔面上で選択した（図２）。
【００１６】
グラム陽性（枯草菌）およびグラム陰性（大腸菌）細菌（図３）の両方に対する濁度アッセイを使用して、抗菌作用を、最小発育阻止濃度（minimal inhibitory concentration：ＭＩＣ）として評価した。すべてのフッ素化ペプチドは、Ｍ２Ｆ５を例外として、親ペプチドと比較して同等またはより強力な抗菌作用を有する。Ｍ２Ｆ２は、Ｍ２と同様のＭＩＣ値を呈示しており、Ｍ２Ｆ５は、枯草菌および大腸菌に対してそれぞれ４倍および１６倍活性が少ない。一方、ブフォリン類似体は、各対照よりも少なくとも強力（ＢＩＩ１Ｆ２）または４倍より強力（ＢＩＩ５Ｆ２）である。これらのデータは、抗菌作用が、フッ素付加後に保持または向上することを明白に示す。
【００１７】
ペプチドが哺乳類細胞よりも細菌細胞を溶解することができる選択性を、ヒト赤血球（ｈＲＢＣ）に対する溶血アッセイで調べた。２つのブフォリン類似体は、対照ペプチドと本質的に同一の溶血作用を有しており、膜全体への通過がフッ素付加によって損なわれなかったことが示唆された（図３、表１）。Ｍ２Ｆ２がＭ２よりも僅かに溶血性であった一方、Ｍ２Ｆ５は、親ペプチドよりも有意により溶血性であった。増強された疎水性は、溶血作用と相関することが以前に実証されている。本発明の結果はこの傾向に一致する。これらのデータは、フッ素付加が、哺乳類細胞浸透性への殺菌作用に対する選択性の保持に繋がらない場合のある、親ペプチド（図１で特定された条件下でＲＰ−ＨＰＬＣ中の溶出に必要な＞７５％溶媒Ｂ）の最大疎水性を指摘する。
【００１８】
本研究において使用された陽イオン性ペプチドに、リジンおよびアルギニンのＣ末端アミド結合の加水分解に触媒作用を及ぼすトリプシンによる開裂のテストを行った。すべてのフッ素化ペプチドは、プロテアーゼと同様またはプロテアーゼにより安定であった（図４）。ブフォリンＩＩ類似体ＢＩＩ５Ｆ２は、加水分解にさらに〜３倍耐性があり、一方、ＢＩＩ１Ｆ２は、ＢＩＩ１と同様であった。さらに、開裂の最初のＰ１部位は、ＢＩＩ１（Ｒ１７）よりもＢＩＩ１Ｆ２（Ｒ１４）において異なっていた。さらに、最初の開裂断片ＢＩＩ１Ｆ２（６−２１）は、ＢＩＩ１（６−２１）よりもずっと長く蓄積および持続した。両方の場合において、Ｐ１’およびＰ２’部位でのヘキサフルオロロイシンの存在は、Ｒ１７開裂部位への保護を与えるようである。同様の傾向がマガイニン類似体に対して観察された。Ｍ２Ｆ２は、Ｍ２に対して、〜１．２倍タンパク質分解により安定であり、一方、Ｍ２Ｆ５は、分解に極めて耐性があり、３時間後の溶液中にペプチドの＞７８％が残存していた。対照的に、Ｍ２は３３分間で完全に加水分解される。開裂に起因する最初の断片、Ｍ２Ｆ２（１−１４）は、Ｍ２（１−１４）よりもより多量蓄積し、３時間にわたって最小タンパク質分解性分解のみを受けた。
【００１９】
Ｍ２Ｆ２（１−１４）における位置６での単一ヘキサフルオロロイシン残基（Ｐ２’部位）の存在は、Ｋ４アミド結合を保護するための目覚しい利点を与える。フルオロメチルケトンまたはβ−フルオロα−ケトエステルおよび酸末端ペプチドとは異なり、この場合におけるフッ素置換は加水分解部位の近位ではない。電子的摂動が依然として使用することができるが場合があるが、プロテアーゼ保護は、活性部位からのペプチドの立体的閉鎖の結果である可能性または不安定なアミドへのプロテアーゼ接近を拒む折り畳み実体の増加した立体構造安定性のためである可能性が高い。
【００２０】
２次構造を調べるために、円偏光二色性（Circular dichroism：ＣＤ）分光法を使用した。Ｍ２Ｆ５を除き、すべてのペプチドは水溶液中のランダムコイルであった。しかし、トリフルオロエタノール（trifluoroethanol：ＴＦＥ）の量が増加するとともに、ペプチドはα−ヘリックス構造を採用した。５０％ＴＦＥで、Ｍ２およびＭ２Ｆ２はどちらも、〜６０％ヘリックスであった。対照的に、Ｍ２Ｆ５は、ＴＦＥを有さない緩衝水溶液において同程度までヘリックスであった。さらに、分析的超遠心分離法で判断されたとおり、Ｍ２は単量体であり、一方、Ｍ２Ｆ２およびＭ２Ｆ５はどちらも、多数のオリゴマー状態を存在させる傾向を有した。実際、Ｍ２Ｆ５は、減少した抗菌作用およびさらに向上されたプロテアーゼ安定性のどちらをも説明するヘリックス束を形成するようである。
【００２１】
タンパク質分解の安定性および生物活性へのＧＬＰ−１の選択的フッ素化の影響
ペプチド設計。ＧＬＰ−１は、膵臓β細胞上のＧＬＰ−１Ｒに結合し、疎水性相互作用は、この両親媒性α−ヘリックスペプチドのその受容体への付随に関与する主な駆動力であり得る。ドデシルホスフェートコリンミセルおよび２Ｄ  ＮＭＲによる３５％ＴＦＥの両方におけるＧＬＰ−１に関する構造上の研究は、ＧＬＰ−１が、Ｎ末端ランダムコイルセグメント（７〜１３）、２つのヘリックスセグメント（１３〜２０および２４〜３７）およびリンカー領域（２１〜２３）から成ることを示した。アミドプロトン交換実験で判断されたＣ末端ヘリックスは、Ｎ末端ヘリックスよりもより安定であり、ＧＬＰ−１Ｒへの結合の必須寄与体であった。アラニンへのフェニルアラニン28およびイソロイシン29の置換は、ＧＬＰ−１Ｒへの結合親和性の劇的な損失に繋がった。トリプトファン３１、ロイシン32、グリシン35を伴うこれら２つの残基は、ＧＬＰ−１と高親和性を有する合成ＧＬＰ−１Ｒアゴニストであるエクセンジン４との間に保存されており、Ｃ末端疎水性表面上に配置されている。ＧＬＰ−１のＧＬＰ−１Ｒへの結合親和性を向上させる試みにおいて、ヘキサフルオロロイシンの増強した疎水性は、結合親和性の向上をもたらす可能性があるという考えの下、フェニルアラニン28、イソロイシン29およびロイシン32を、ヘキサフルオロロイシンで選択的に置換した。この発色団がペプチド濃度の判断に使用されるためのみならず大側鎖量も有するため、トリプトファン31を変更しないままにした。また、提供された柔軟性が受容体結合に必須であることが提案されたため、グリシン35もそのままにした。
【００２２】
ＤＰＰ ＩＶへの耐性を与えるため、ＧＬＰ−１の急速な非活性化のための１次酵素、Ｎ末端残基（Ｐ１、Ｐ１’および／またはＰ２’位置）をヘキサフルオロロイシン、すなわち、アラニン8、グルタミン酸９、グリシン10ならびにアラニン8およびグルタミン酸9の両方で置換し、４つのフッ素化類似体を生成した。受容体にシグナルを送信するその特に重要な役割のために、ヒスチジン7を変更しないままにした。
【００２３】
要するに、Ｎ末端置換は、酵素安定性を向上させることを目的とし、Ｃ末端置換は、受容体への結合親和性に対するフッ素付加効果をテストすることを意図した。合計７つのフッ素化類似体、野生型ＧＬＰ−１、および［125Ｉ］−エクセンジン（９−３９）アミドは、図３５に記載した。
【００２４】
結合アッセイ。放射性リガンドとしての［125Ｉ］−エクセンジン（９−３９）アミドを使用して、フッ素化類似体の結合親和性を競合結合アッセイで測定した。このボルトンハンター標識化ペプチドは、リジン12側鎖での修飾が受容体結合を損傷させないため、エクセンジン（９−３９）アミドとしてのｈＧＬＰ−１Ｒへ同様の親和性を有すると想定した。相同アンタゴニスト競合結合実験は、エクセンジン（９−３９）アミドの結合が、以前の報告データと同等の２．９ｎＭの解離定数（３重の３つの独立した実験）を有することを示した。すべての７つのフッ素化ＧＬＰ−１類似体は、内因性ＧＬＰ−１Ｒを欠乏するＣＯＳ−７細胞上に発現したｈＧＬＰ−１Ｒに結合した。Ｆ９は、ｗｔ ＧＬＰ−１と比べて２．７倍減少した結合親和性を有し（ＩＣ50 ５．１ｎＭ対１．９ｎＭ、図１および表１）、一方、Ｆ２９およびＦ２８は、７倍および９．９倍減少した親和性を示した。Ｆ８、Ｆ８９、Ｆ１０およびＦ３２は、２７〜６０倍結合親和性を失った。リジン9による置換が結合親和性に関して劇的な損失をもたらしたため、グルタミン酸9のカルボン酸塩は、受容体結合にとって重要であることが判明した。そのアラニン9による置換は、比較的弱い受容体結合（３０〜１００倍高いＩＣ50）をもたらしたが、アスパラギン酸９による置換は、（同一のＩＣ50に関して）受容体結合における目覚しい変化を呈示しなかった。Ｆ９によって示された同様の結合親和性と伴に、グルタミン酸９が、ヘキサフルオロロイシンによって置換されたというこれらの事実は、ヘキサフルオロロイシンの「極性疎水性」は、結合親和性の不明確な損失に恐らく関与すること、またはこの位置での、かさ高い疎水性側鎖は、良好な耐容性を示すという妥当な説明をもたらした。本明細書におけるこれらのデータは、フッ素付加が、結果としてＧＬＰ−１Ｒへの結合親和性の減少を僅かに抑えたことを示す。Ｆ９を除き、Ｎ末端修飾は結合親和性の顕著な減少に繋がり、一方、Ｃ末端修飾は良好な耐容性を示した。
【００２５】
ｃＡＭＰの形成。フッ素化類似体が、完全アゴニスト、部分アゴニストまたはアンタゴニストとして機能的なままであるかどうかを検証するため、ｈＧＰＬ−１Ｒを有するＣＯＳ−７細胞をペプチドで刺激し、ｃＡＭＰの生成をラジオイムノアッセイで測定した。Ｆ８９を除き、すべてのフッ素化ペプチドは完全アゴニストのままであり、その後、用量反応をすべてのペプチドに対して測定した（図２）。Ｆ９、Ｆ３２、Ｆ２９およびＦ２８は、ｗｔ ＧＬＰ−１としての重要な有効性を残しながら、２．１、２．４、３．６および５．４倍減少した作用強度を有した（図２および表１）。Ｆ８およびＦ１０は、僅かに減少した有効性と伴に、中等度の６８および７３．８倍低い作用強度を示し、これは、ｐテストの結果統計的に有意ではなかった。予想外に、Ｆ８９は、テスト濃度の範囲においてＦ１０と同様の受容体への結合能力を保存する一方で、部分アゴニストであることが分かり、またｗｔ ＧＬＰ１より３７８倍低い作用強度の劇的な減少を有した。末端ランダムコイルのヒスチジン残基は、受容体へのシグナル開始に関与するため、この部分での２次構造の変化は、ｃＡＭＰ生成の刺激に明白な影響を及ぼし得る。または、ヘキサフルオロロイシンの側鎖は、受容体立体構造の変化を妨害する。概して、より低い受容体親和性を有する類似体は、全体的にアデニリルシクラーゼの活性化に関してより高いＥＣ50値を呈示した。
【００２６】
タンパク質分解安定性。Ｗｔ ＧＬＰ−１は、遍在性酵素ＤＰＰ ＩＶによって急速に非活性化され、治療薬としての天然ＧＬＰ−１に向けて障壁を設ける（ヒトｔ1／2≒１〜３分において）。ＤＰＰ ＩＶは、切断可能なアラニン−グルタミン酸アミド結合に関して、Ｐ２、Ｐ１、Ｐ１’およびＰ２’位置の基質残基に対する相対的な特異的要求を有する。特に、Ｐ１位置では、プロリンおよびアラニンが非常に好まれる。対照的に、この８位置での他のアミノ酸および誘導体は、報告された事例グリシン8、アミノイソ酪酸8、セリン8、スレオニン8、ロイシン8のように、ペプチド安定性を向上させた。本発明の以前の研究により、切断可能な結合に近いヘキサフルオロロイシンの取り込みは、加水分解性のプロテアーゼに対するペプチドの耐性を調節することができる。選択された実験条件下において、予期されたとおり、８、９、１０位置でのヘキサフルオロロイシンによる置換は、異なる程度へのＤＰＰ ＩＶ耐性を与えた。２４時間インキュベーション後に断片は検出されず、Ｆ８およびＦ８９は、目覚しい耐性を示した。安定性をさらに検証するため、Ｆ８を１０倍高い濃度でＤＰＰ ＩＶとともにインキュベートし、１時間後に断片は検出されなかった。Ｆ９およびＦ１０は、最初の１次速度定数を比較することによって〜１．２倍および２．９倍の耐性を呈示し（図３）、ＨＰＬＣ分析は、対応するペプチド断片ＧＬＰ−１（９−３６）アミドとしてのＥＳＩ−ＭＳによって同定されたもう１つの主なピークのみの形成を示した。ここで報告されたフッ素化ＧＬＰ−１類似体の動的データは、Ｄｅａｃｏｎらにより確立された体内の長期代謝的安定性と妥当に相関し得る。それらの研究において、Ｖａｌ8−ＧＬＰ−１の連日投与は、インスリンレベルの増強およびｗｔ ＧＬＰ−１を超える血漿グルコースの減少をもたらした。これらをもとに、Ｆ８、Ｆ９、Ｆ１０およびＦ２９は、さらなる動物の耐糖性研究に対する候補としての有望な可能性を示した。
【００２７】
図１１で見られるように、位置８で変異を有するＧＬＰ−１類似体の酵素的動的研究およびデカペプチド基質または阻害剤を有するヒトＤＰＰ ＩＶのＸ線結晶構造検討はどちらも、酵素が結合ポケット内に適合するように８位置で小側鎖を有するアミノ酸を要求することを示す。ヘキサフルオロロイシン（大側鎖官能基に耐える）は、Ｎ末端修飾で取り込まれるが、一方、ＤＰＰ ＩＶに対する耐性が観察された。ここでの結果は、前述の動的および構造上の研究と十分に一致している。また、ｔ Ｐ１’およびＰ２’位置でヘキサフルオロロイシンを含有するＦ９およびＦ１０も、ＤＰＰ ＩＶに対する中等度の向上した耐性を示した。ペグ化、糖鎖付加、および血清タンパク質アルブミンへの結合など、治療的ペプチド／タンパク質の半減期を延長させるために採用された他の手法とは対照的に、これらの非天然アミノ酸が、固相ペプチド合成により急速に取り込まれることがでるため、フッ素化アミノ酸の取り込みは、特に小ペプチドが修飾の標的である場合の潜在的な用途を明確に証明する。フッ素化類似体の作用強度の変化は、Ｎ末端ランダム領域での僅かな構造上の変形に起因し得る。Ｃ末端修飾は、受容体への結合親和性を向上させるように促されたが、これは達成されず、むしろ僅かに減少した結合親和性が観察された。ＧＬＰ−１とその受容体との素晴らしい相互作用は、リガンドの小さな構造上の変化がリガンドの減少した親和性をもたらし得るように、百万年にわたって生来進化しているため、これらの結果は意外ではないかもしれない。しかし、この鍵と鍵穴タイプの相互作用は、リガンドおよび受容体の詳細な構造上の情報が利用可能であれば設計によって、または大きなライブラリースクリーニングによって強化され得る。
【００２８】
故に、ヘキサフルオロロイシンを有するＧＬＰ−１のＮ終端における交互変化は、体外有効性の点で生物活性を保持しながらＤＰＰ ＩＶ耐性を与えるため、フッ素化アミノ酸を使用することは、保持および僅かに減少した生物活性のみで、生物活性ペプチドをより代謝的に安定にさせるための有望な手法であることが示唆される（図１１）。
【００２９】
定義
便宜上、本明細書、実施例、および付属の請求の範囲において採用された特定の用語を、以下にまとめた。
【００３０】
本明細書において使用される用語「ヘテロ原子」は、炭素または水素以外の任意の要素の原子を意味する。好適なヘテロ原子は、ホウ素、窒素、酸素、リン、硫黄およびセレンである。
【００３１】
本明細書において使用されるように、例えば、アミノ酸、ｍ、ｎ等の各表現の定義は、任意の構造において１回より多く発生する場合、同一構造内の他の部分ではその定義と無関係であることが意図される。
【００３２】
本明細書において使用されるように、語句「保護基」は、潜在的な反応性官能基を、所望されない化学変換から保護する一時的置換基を意味する。かかる保護基の例は、カルボン酸のエステル、アルコールのシリルエーテル、ならびに、アルデヒドおよびケトンのアセタールおよびケタールをそれぞれ含む。保護基の化学の分野は検討されている（Greene, T.W.; Wuts, P.G.M. Protective Groups in Organic Synthesis, 2<nd> ed.; Wiley: New York, 1991）。
【００３３】
本明細書において使用されるように、「天然」または「野生型」は、自然界で発見されるタンパク質またはポリペプチドを言い、「人工的」は、非天然配列および／またはアミノ酸を含むタンパク質またはポリペプチドを言う。用語「アミノ酸」は、広義で本明細書において使用され、自然発生のアミノ酸、ならびにアミノ酸類似体および誘導体を含む非自然発生のアミノ酸を含む。後者は、アミノ酸部分を含有する分子を含む。この広範な定義を考慮して、本明細書におけるアミノ酸への言及は、例えば、自然発生のタンパク新生のＬ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、アミノ酸類似体および誘導体などの化学的に修飾されたアミノ酸、自然発生の非タンパク新生のアミノ酸、ならびに当技術分野においてアミノ酸の特性であることが既知の性質を有する化学的に合成された化合物を含むことを、当業者は認識されたい。
【００３４】
本明細書において使用されるように、用語「非天然アミノ酸」は、その側鎖官能基中の２０個の自然発生のアミノ酸（アラニン、アルギニン、グリシン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、セリン、トレオニン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン）とは異なるアミノ酸を言う。
【００３５】
アミノ酸に関連して使用される場合、用語「疎水性」は、非極性側鎖を有するそれらのアミノ酸を言う。疎水性アミノ酸は、バリン、ロイシン、イソロイシン、システインメチオニン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンを含む。
【００３６】
本明細書において使用されるように、用語「フッ素化アミノ酸」は、その側鎖官能基における１つ以上の水素の代わりのフッ素の取り込みを介した自然発生のアミノ酸とは異なるアミノ酸を言う。例示的なフッ素化アミノ酸は、トリフルオロロイシン、４，４，４−トリフルオロバリン、５，５，５−トリフルオロロイシン、トリフルオロバリン、ヘキサフルオロバリン、トリフルオロイソロイシン、トリフルオロノルバリン、ヘキサフルオロロイシン、５，５，５，５’，５’，５’−ヘキサフルオロロイシン、トリフルオロメチオニン、トリフルオロメチルメチオニンおよびフルオロフェニルアラニンを含んでもよい。
【００３７】
本明細書において使用される場合、用語「ポリペプチド」は、長さ、官能性、環境または付随した分子にかかわらず、ペプチド結合によって連結された２つ以上のアミノ酸を言う。一般的に、ポリペプチドは、長さが少なくとも４つのアミノ酸残基であり、全長タンパク質にまで及ぶことができる。本明細書において使用される「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は同一の意味で使われる。
【００３８】
本発明の特定の化合物は、特定の幾何学的または立体異性の形状内に存在してもよい。本発明は、本発明の範囲内にある場合、シルおよびトランス異性体、ＲおよびＳエナンチオマー、ジアステレオマー、（Ｄ）異性体、（Ｌ）異性体、それらのラセミ混合物、およびそれらの他の混合物を含むすべてのかかる化合物を意図する。追加の非対称性炭素原子は、アルキル基などの置換基内に存在してもよい。すべてのかかる異性体およびそれらの混合物は、本発明に含まれることが意図される。
【００３９】
例えば、本発明の化合物の特定のエナンチオマーが所望される場合、結果として生じるジアステレオマー混合物が分離し、補助基が所望される純エナンチオマーを提供するように開裂する、非対称性合成によって、またはキラル補助基での誘導によって調製されてもよい。あるいは、分子が、アミノなどの基本官能基、またはカルボキシルなどの酸性官能基を含有する場合、ジアステレオマー塩は、適切な光学活性酸または塩基を用いて形成されるため、ジアステレオマーの分解は、その後、当技術分野においては既知の分別結晶またはクロマトグラフ手段によって形成され、純エナンチオマーの回復がもたらされる。
【００４０】
本発明の目的のために、化学的要素は、表紙裏のPeriodic Table of the Elements, CAS version, Handbook of Chemistry and Physics, 67th Ed., 1986-87に従って同定される。
【００４１】
本明細書において使用される場合、用語「生物学的に活性な」は、生物学的機能を呈示するための能力を言う。
【００４２】
「医薬的に許容可能な」という語句は、正しい医療判断の範囲内で、正当な利益／リスク比に相応し、過剰な毒性、刺激作用、アレルギー反応または他の問題もしくは合併症なくヒトおよび動物と接触するための使用に適したそれらの化合物、材料、組成物および／または剤形を意味するように本明細書において用いられる。
【００４３】
本明細書において使用されるように、「医薬的に許容可能な塩」は、開示された化合物の誘導体を言い、親化合物は、その酸または塩基塩を生成することによって修飾される。医薬的に許容可能な塩の例は、アミンなどの塩基性残基の鉱酸または有機酸塩、カルボン酸などの酸性残基のアルカリまたは有機塩等を含むが、それらに制限されない。医薬的に許容可能な塩は、従来の非毒性塩、または、例えば非毒性の無機または有機酸から形成される親化合物の４級アンモニウム塩を含む。例えば、かかる従来の非毒性塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸等の無機酸に由来するものと、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸，エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸等の有機酸から調製された塩と、を含む。
【００４４】
「処置する」という用語は、（ｉ）疾患、障害または状態が、該疾患、障害および／または状態になりやすい場合があるが、それらを有するとはまだ診断されていない動物に生じることを防ぐこと、（ｉｉ）該疾患、障害または状態を抑制すること、つまり、その進行を抑止すること、および（ｉｉｉ）該疾患、障害または状態をを軽減すること、つまり、該疾患、障害および／または状態の退縮を発生させることを言う。
【００４５】
発明の方法
特定の実施形態において、本発明は、修飾ペプチドを調製するための方法に関し、該方法は、
（ａ）天然または非天然ペプチドを同定し、
（ｂ）前記天然または非天然ペプチドの配列に基づいて、修飾ペプチドを合成する、
各工程を有してなり、
前記天然または非天然ペプチドの少なくとも１つのアミノ酸は、前記修飾ポリペプチド中の少なくとも１つのフッ素化アミノ酸によって置換され、前記修飾ポリペプチドは、前記天然または非天然ペプチドに対して増大した安定性を有する。
【００４６】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該増大した安定性は、化学的、熱的、またはタンパク質分解性である。
【００４７】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該増大した安定性は化学的である。
【００４８】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該増大した安定性は化学的であり、該安定性は、ΔΔＧ°アンフォールディングとして測定された場合、約１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下で増大する。
【００４９】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該増大した安定性は化学的であり、該増大は、ΔΔＧ°アンフォールディングとして測定された場合、約０．１ｋｃａｌ／ｍｏｌよりも大きく、約１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下である。
【００５０】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該増大した安定性は化学的であり、該増大は、ΔΔＧ°アンフォールディングとして測定された場合、約０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌよりも大きく、約１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下である。
【００５１】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該増大した安定性は化学的であり、該増大は、ΔΔＧ°アンフォールディングとして測定された場合、約１ｋｃａｌ／ｍｏｌよりも大きく、約１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下である。
【００５２】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該増大した安定性は化学的であり、該増大は、ΔΔＧ°アンフォールディングとして測定された場合、約３ｋｃａｌ／ｍｏｌよりも大きく、約１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下である。
【００５３】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該増大した安定性は化学的であり、該増大は、ΔΔＧ°アンフォールディングとして測定された場合、約５ｋｃａｌ／ｍｏｌよりも大きく、約１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下である。
【００５４】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該増大した安定性は化学的であり、該増大は、ΔΔＧ°アンフォールディングとして測定された場合、約７ｋｃａｌ／ｍｏｌよりも大きく、約１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下である。
【００５５】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該増大した安定性は化学的であり、該増大は、ΔΔＧ°アンフォールディングとして測定された場合、約９ｋｃａｌ／ｍｏｌよりも大きく、約１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下である。
【００５６】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該増大した安定性は化学的であり、該増大は、ΔΔＧ°アンフォールディングとして測定された場合、約１１ｋｃａｌ／ｍｏｌよりも大きく、約１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下である。
【００５７】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該増大した安定性は熱的である。
【００５８】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該増大した安定性は熱的であり、Ｔｍは、約５０℃以下で増大する。
【００５９】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該増大した安定性は熱的であり、Ｔｍは、約１℃よりも大きく、約５０℃以下で増大する。
【００６０】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該増大した安定性は熱的であり、Ｔｍは、約５℃よりも大きく、約５０℃以下で増大する。．
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該増大した安定性は熱的であり、Ｔｍは、約１０℃よりも大きく、約５０℃以下で増大する。
【００６１】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該増大した安定性は熱的であり、Ｔｍは、約１５℃よりも大きく、約５０℃以下で増大する。
【００６２】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該増大した安定性は熱的であり、Ｔｍは、約２０℃よりも大きく、約５０℃以下で増大する。
【００６３】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該増大した安定性は熱的であり、Ｔｍは、約２５℃よりも大きく、約５０℃以下で増大する。
【００６４】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該増大した安定性は熱的であり、Ｔｍは、約３０℃よりも大きく、約５０℃以下で増大する。
【００６５】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該増大した安定性は熱的であり、Ｔｍは、約３５℃よりも大きく、約５０℃以下で増大する。
【００６６】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該増大した安定性は熱的であり、Ｔｍは、約４０℃よりも大きく、約５０℃以下で増大する。
【００６７】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該増大した安定性は熱的であり、Ｔｍは、約４５℃よりも大きく、約５０℃以下で増大する。
【００６８】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該増大した安定性はタンパク分解性である。
【００６９】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該増大した安定性はタンパク分解性であり、該安定性は、約１０9倍以下で増大する。
【００７０】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該増大した安定性はタンパク分解性であり、該安定性は、約１．１倍よりも大きく、約１０9倍以下で増大する。
【００７１】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該増大した安定性はタンパク分解性であり、該安定性は、約２倍よりも大きく、約１０9倍以下で増大する。
【００７２】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該増大した安定性はタンパク分解性であり、該安定性は、約４倍よりも大きく、約１０9倍以下で増大する。
【００７３】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該増大した安定性はタンパク分解性であり、該安定性は、約１０倍よりも大きく、約１０9倍以下で増大する。
【００７４】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該増大した安定性はタンパク分解性であり、該安定性は、約５０倍よりも大きく、約１０9倍以下で増大する。
【００７５】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該増大した安定性はタンパク分解性であり、該安定性は、約１０２倍よりも大きく、約１０9倍以下で増大する。
【００７６】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該増大した安定性はタンパク分解性であり、該安定性は、約１０３倍よりも大きく、約１０9倍以下で増大する。
【００７７】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該増大した安定性はタンパク分解性であり、該安定性は、約１０４倍よりも大きく、約１０9倍以下で増大する。
【００７８】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該増大した安定性はタンパク分解性であり、該安定性は、約１０５倍よりも大きく、約１０9倍以下で増大する。
【００７９】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該増大した安定性はタンパク分解性であり、該安定性は、約１０６倍よりも大きく、約１０9倍以下で増大する。
【００８０】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該増大した安定性はタンパク分解性であり、該安定性は、約１０７倍よりも大きく、約１０9倍以下で増大する。
【００８１】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該増大した安定性はタンパク分解性であり、該安定性は、約１０８倍よりも大きく、約１０9倍以下で増大する。
【００８２】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸は、トリフルオロロイシン、４，４，４−トリフルオロバリン、５，５，５−トリフルオロロイシン、トリフルオロバリン、ヘキサフルオロバリン、トリフルオロイソロイシン、トリフルオロノルバリン、ヘキサフルオロロイシン、５，５，５，５’，５’，５’−ヘキサフルオロロイシン、トリフルオロメチオニン、トリフルオロメチルメチオニンおよびフルオロフェニルアラニンから成る群から選択される。
【００８３】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はロイシンであり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はヘキサフルオロロイシンである。
【００８４】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はイソロイシンであり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はヘキサフルオロロイシンである。
【００８５】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はアラニンであり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はヘキサフルオロロイシンである。
【００８６】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はバリンであり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はヘキサフルオロロイシンである。
【００８７】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はグリシンであり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はヘキサフルオロロイシンである。
【００８８】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はグルタミン酸であり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はヘキサフルオロロイシンである
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はフェニルアラニンであり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はヘキサフルオロロイシンである。
【００８９】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はロイシンであり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はトリフルオロロイシンである。
【００９０】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はイソロイシンであり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はトリフルオロロイシンである。
【００９１】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はアラニンであり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はトリフルオロロイシンである。
【００９２】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はバリンであり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はトリフルオロロイシンである。
【００９３】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はグリシンであり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はトリフルオロロイシンである。
【００９４】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はグルタミン酸であり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はトリフルオロロイシンである。
【００９５】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はフェニルアラニンであり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はトリフルオロロイシンである。
【００９６】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はロイシンであり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はトリフルオロバリンである。
【００９７】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はイソロイシンであり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はトリフルオロバリンである。
【００９８】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はアラニンであり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はトリフルオロバリンである。
【００９９】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はバリンであり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はトリフルオロバリンである。
【０１００】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はグリシンであり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はトリフルオロバリンである。
【０１０１】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はグルタミン酸であり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はトリフルオロバリンである。
【０１０２】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はフェニルアラニンであり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はトリフルオロバリンである。
【０１０３】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はグリシンであり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はトリフルオロイソロイシンである。
【０１０４】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はグルタミン酸であり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はトリフルオロイソロイシンである。
【０１０５】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はフェニルアラニンであり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はトリフルオロイソロイシンである。
【０１０６】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はロイシンであり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はトリフルオロイソロイシンである。
【０１０７】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はイソロイシンであり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はトリフルオロイソロイシンである。
【０１０８】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はアラニンであり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はトリフルオロイソロイシンである。
【０１０９】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はバリンであり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はトリフルオロイソロイシンである。
【０１１０】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はロイシンであり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はトリフルオロノルバリンである。
【０１１１】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はイソロイシンであり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はトリフルオロノルバリンである。
【０１１２】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はアラニンであり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はトリフルオロノルバリンである。
【０１１３】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はバリンであり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はトリフルオロノルバリンである。
【０１１４】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はグリシンであり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はトリフルオロノルバリンである。
【０１１５】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はグルタミン酸であり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はトリフルオロノルバリンである。
【０１１６】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はフェニルアラニンであり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はトリフルオロノルバリンである。
【０１１７】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はロイシンであり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はトリフルオロメチオニンである。
【０１１８】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はイソロイシンであり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はトリフルオロメチオニンである。
【０１１９】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はアラニンであり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はトリフルオロメチオニンである。
【０１２０】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はバリンであり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はトリフルオロメチオニンである。
【０１２１】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はグリシンであり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はトリフルオロメチオニンである。
【０１２２】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はグルタミン酸であり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はトリフルオロメチオニンである。
【０１２３】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はフェニルアラニンであり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はトリフルオロメチオニンである。
【０１２４】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はロイシンであり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はトリフルオロメチルメチオニンである。
【０１２５】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はイソロイシンであり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はトリフルオロメチルメチオニンである。
【０１２６】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はアラニンであり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はトリフルオロメチルメチオニンである。
【０１２７】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はバリンであり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はトリフルオロメチルメチオニンである。
【０１２８】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はグリシンであり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はトリフルオロメチルメチオニンである。
【０１２９】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はグルタミン酸であり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はトリフルオロメチルメチオニンである。
【０１３０】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該少なくとも１つのアミノ酸はフェニルアラニンであり、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸はトリフルオロメチルメチオニンである。
【０１３１】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該天然または非天然ポリペプチドは、配列ＧＩＧＫＦＬＨＡＡＫＫＦＡＫＡＦＶＡＥＩＭＮＳを有する。
【０１３２】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該天然または非天然ポリペプチドは、配列ＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫを有する。
【０１３３】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該天然または非天然ポリペプチドは、配列ＴＲＳＳＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫを有する。
【０１３４】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該天然または非天然ポリペプチドは、配列ＱＨＷＳＹＬＬＲＰ。
【０１３５】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該天然または非天然ポリペプチドは、配列ＫＣＮＴＡＴＣＡＴＱＲＬＡＮＦＬＶＨＳＳＮＮＦＧＰＩＬＰＰＴＮＶＧＳＮＴＹを有する。
【０１３６】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該天然または非天然ポリペプチドは、配列ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＸＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳを有する。
【０１３７】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該天然または非天然ポリペプチドは、配列ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲを有する。
【０１３８】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該天然または非天然ポリペプチドは、配列ＳＰＫＭＶＱＧＳＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣＫＶＬＲＲＫを有する。
【０１３９】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該天然または非天然ポリペプチドは、配列ＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＬＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮＷＦを有する。
【０１４０】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該天然または非天然ポリペプチドは、配列ＶＶＹＴＤＣＴＥＳＧＱＮＬＣＬＣＥＧＳＮＶＣＧＱＧＮＫＣＩＬＧＳＤＧＥＫＮＱＣＶＴＧＥＧＴＰＫＰＱＳＨＮＤＧＤＦＥＥＩＰＥＥＹＬＱを有する。
【０１４１】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該天然または非天然ポリペプチドは、配列ＭＰＬＷＶＦＦＦＶＩＬＴＬＳＮＳＳＨＣＳＰＰＰＰＬＴＬＲＭＲＲＹＡＤＡＩＦＴＮＳＹＲＫＶＬＧＱＬＳＡＲＫＬＬＱＤＩＭＳＲＱＱＧＥＳＮＱＥＲＧＡＲＡＲＬＧＲＱＶＤＳＭＷＡＥＱＫＱＭＥＬＥＳＩＬＶＡＬＬＱＫＨＳＲＮＳＱＧを有する。
【０１４２】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該天然または非天然ポリペプチドは、配列ＭＫＰＩＱＫＬＬＡＧＬＩＬＬＴＳＣＶＥＧＣＳＳＱＨＷＳＹＧＬＲＰＧＧＫＲＤＡＥＮＬＩＤＳＦＱＥＩＶＫＥＶＧＱＬＡＥＴＱＲＦＥＣＴＴＨＱＰＲＳＰＬＲＤＬＫＧＡＬＥＳＬＩＥＥＥＴＧＱＫＫＩを有する。
【０１４３】
特定の実施形態において、本発明は、上記の方法に関し、該天然または非天然ポリペプチドは、配列ＭＡＬＷＭＲＬＬＰＬＬＡＬＬＡＬＷＧＰＤＰＡＡＡＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＲＥＡＥＤＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＬＱＫＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮを有する。
【０１４４】
発明の化合物
特定の実施形態において、本発明は、少なくとも１つのフッ素化アミノ酸を含むポリペプチドに関し、該ポリペプチドは、ＧＩＧＫＦＸＨＡＡＫＫＦＡＫＡＦＶＡＥＸＭＮＳ、
ＧＩＧＫＦＸＨＡＸＫＫＦＸＫＡＦＸＡＥＸＭＮＳ、ＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＸＸＲＫ、ＴＲＳＳＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＸＸＲＫ、ＨＸＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ、ＨＡＸＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ、ＨＸＸＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ、ＨＸＸＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ、ＨＸＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＸＩＡＷＬＶＫＧＲ、ＨＡＸＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＸＡＷＬＶＫＧＲ、およびＨＸＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＸＶＫＧＲから成る群から選択される配列を有し、Ｘはフッ素化アミノ酸である。
【０１４５】
特定の実施形態において、本発明は、上記のポリペプチドに関し、該ポリペプチドは、配列ＧＩＧＫＦＸＨＡＡＫＫＦＡＫＡＦＶＡＥＸＭＮＳを有する。
【０１４６】
特定の実施形態において、本発明は、上記のポリペプチドに関し、該ポリペプチドは、配列ＧＩＧＫＦＸＨＡＸＫＫＦＸＫＡＦＸＡＥＸＭＮＳを有する。
【０１４７】
特定の実施形態において、本発明は、上記のポリペプチドに関し、該ポリペプチドは、配列ＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＸＸＲＫを有する。
【０１４８】
特定の実施形態において、本発明は、上記のポリペプチドに関し、該ポリペプチドは、配列ＴＲＳＳＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＸＸＲＫを有する。
【０１４９】
特定の実施形態において、本発明は、上記のポリペプチドに関し、該ポリペプチドは、
ＨＸＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ、
ＨＡＸＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ、
ＨＸＸＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ、
ＨＸＸＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ、
ＨＸＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＸＩＡＷＬＶＫＧＲ、
ＨＡＸＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＸＡＷＬＶＫＧＲ、および
ＨＸＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＸＶＫＧＲから成る群から選択される配列を有する。
【０１５０】
特定の実施形態において、本発明は、上記のポリペプチドに関し、該ポリペプチドは、配列ＨＸＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲを有する。
【０１５１】
特定の実施形態において、本発明は、上記のポリペプチドに関し、該ポリペプチドは、配列ＨＡＸＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲを有する。
【０１５２】
特定の実施形態において、本発明は、上記のポリペプチドに関し、該ポリペプチドは、配列ＨＸＸＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲを有する。
【０１５３】
特定の実施形態において、本発明は、上記のポリペプチドに関し、該ポリペプチドは、配列ＨＸＸＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲを有する。
【０１５４】
特定の実施形態において、本発明は、上記のポリペプチドに関し、該ポリペプチドは、配列ＨＸＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＸＩＡＷＬＶＫＧＲを有する。
【０１５５】
特定の実施形態において、本発明は、上記のポリペプチドに関し、該ポリペプチドは、配列ＨＡＸＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＸＡＷＬＶＫＧＲを有する。
【０１５６】
特定の実施形態において、本発明は、上記のポリペプチドに関し、該ポリペプチドは、配列ＨＸＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＸＶＫＧＲを有する。
【０１５７】
特定の実施形態において、本発明は、上記のポリペプチドに関し、該フッ素化アミノ酸Ｘは、トリフルオロロイシン、４，４，４−トリフルオロバリン、５，５，５−トリフルオロロイシン、トリフルオロバリン、ヘキサフルオロバリン、トリフルオロイソロイシン、トリフルオロノルバリン、ヘキサフルオロロイシン、５，５，５，５’，５’，５’−ヘキサフルオロロイシン、トリフルオロメチオニン、トリフルオロメチルメチオニンおよびフルオロフェニルアラニンから成る群から選択される。
【０１５８】
特定の実施形態において、本発明は、少なくとも１つの置換された天然アミノ酸に対し、少なくとも１つのフッ素化アミノ酸置換を含むポリペプチドに関し、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸置換は、トリフルオロロイシン、４，４，４−トリフルオロバリン、５，５，５−トリフルオロロイシン、トリフルオロバリン、ヘキサフルオロバリン、トリフルオロイソロイシン、トリフルオロノルバリン、ヘキサフルオロロイシン、５，５，５，５’，５’，５’−ヘキサフルオロロイシン、トリフルオロメチオニン、トリフルオロメチルメチオニンおよびフルオロフェニルアラニンから成る群から選択され、該ポリペプチドは、ＧＩＧＫＦＬＨＡＡＫＫＦＡＫＡＦＶＡＥＩＭＮＳ、
ＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫ、ＴＲＳＳＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫ、ＱＨＷＳＹＬＬＲＰ、
ＫＣＮＴＡＴＣＡＴＱＲＬＡＮＦＬＶＨＳＳＮＮＦＧＰＩＬＰＰＴＮＶＧＳＮＴＹ、
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＸＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ、
ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ、
ＳＰＫＭＶＱＧＳＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣＫＶＬＲＲＫ、
ＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＬＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮＷＦ、
ＶＶＹＴＤＣＴＥＳＧＱＮＬＣＬＣＥＧＳＮＶＣＧＱＧＮＫＣＩＬＧＳＤＧＥＫＮＱＣＶＴＧＥＧＴＰＫＰＱＳＨＮＤＧＤＦＥＥＩＰＥＥＹＬＱ、
ＭＰＬＷＶＦＦＦＶＩＬＴＬＳＮＳＳＨＣＳＰＰＰＰＬＴＬＲＭＲＲＹＡＤＡＩＦＴＮＳＹＲＫＶＬＧＱＬＳＡＲＫＬＬＱＤＩＭＳＲＱＱＧＥＳＮＱＥＲＧＡＲＡＲＬＧＲＱＶＤＳＭＷＡＥＱＫＱＭＥＬＥＳＩＬＶＡＬＬＱＫＨＳＲＮＳＱ、
ＭＫＰＩＱＫＬＬＡＧＬＩＬＬＴＳＣＶＥＧＣＳＳＱＨＷＳＹＧＬＲＰＧＧＫＲＤＡＥＮＬＩＤＳＦＱＥＩＶＫＥＶＧＱＬＡＥＴＱＲＦＥＣＴＴＨＱＰＲＳＰＬＲＤＬＫＧＡＬＥＳＬＩＥＥＥＴＧＱＫＫＩ、および
ＭＡＬＷＭＲＬＬＰＬＬＡＬＬＡＬＷＧＰＤＰＡＡＡＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＲＥＡＥＤＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＬＱＫＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ
から成る群から選択される。
【０１５９】
特定の実施形態において、本発明は、上記のポリペプチドに関し、該少なくとも１つの置換された天然アミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、バリンおよびアラニンから成る群から選択される。
【０１６０】
特定の実施形態において、本発明は、上記のポリペプチドに関し、該少なくとも１つの置換された天然アミノ酸は、ロイシンから成る群から選択される。
【０１６１】
特定の実施形態において、本発明は、上記のポリペプチドに関し、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸置換は、５，５，５，５’，５’，５’−ヘキサフルオロロイシンである。
【０１６２】
特定の実施形態において、本発明は、上記のポリペプチドに関し、該少なくとも１つの置換された天然アミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、バリンおよびアラニンから成る群から選択され、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸置換は、５，５，５，５’，５’，５’−ヘキサフルオロロイシンである。
【０１６３】
特定の実施形態において、本発明は、上記のポリペプチドに関し、該少なくとも１つの置換された天然アミノ酸は、ロイシンから成る群から選択され、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸置換は、５，５，５，５’，５’，５’−ヘキサフルオロロイシンである。
【０１６４】
特定の実施形態において、本発明は、少なくとも１つのフッ素化アミノ酸置換を含むポリペプチドに関し、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸置換は、トリフルオロロイシン、５，５，５−トリフルオロロイシン、ヘキサフルオロロイシン、および５，５，５，５’，５’，５’−ヘキサフルオロロイシンから成る群から選択され、Ｘの各例は独立して、ロイシンまたはフッ素化アミノ酸置換であり、該ポリペプチドは、
ＧＩＧＫＦＸＨＡＡＫＫＦＡＫＡＦＶＡＥＩＭＮＳ、
ＲＡＧＸＱＦＰＶＧＲＶＨＲＸＸＲＫ、
ＴＲＳＳＲＡＧＸＱＦＰＶＧＲＶＨＲＸＸＲＫ、ＱＨＷＳＹＸＸＲＰ、
ＫＣＮＴＡＴＣＡＴＱＲＸＡＮＦＸＶＨＳＳＮＮＦＧＰＩＸＰＰＴＮＶＧＳＮＴＹ、
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＸＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＸＩＥＷＸＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ、
ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＸＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＸＶＫＧＲ、
ＳＰＫＭＶＱＧＳＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＸＧＣＫＶＸＲＲＫ、
ＹＴＳＸＩＨＳＸＩＥＥＳＱＮＱＱＥＸＮＥＱＥＸＸＥＸＤＫＷＡＳＸＷＮＷＦ、
ＶＶＹＴＤＣＴＥＳＧＱＮＸＣＸＣＥＧＳＮＶＣＧＱＧＮＫＣＩＸＧＳＤＧＥＫＮＱＣＶＴＧＥＧＴＰＫＰＱＳＨＮＤＧＤＦＥＥＩＰＥＥＹＸＱ、
ＭＰＸＷＶＦＦＦＶＩＸＴＸＳＮＳＳＨＣＳＰＰＰＰＸＴＸＲＭＲＲＹＡＤＡＩＦＴＮＳＹＲＫＶＸＧＱＸＳＡＲＫＸＸＱＤＩＭＳＲＱＱＧＥＳＮＱＥＲＧＡＲＡＲＸＧＲＱＶＤＳＭＷＡＥＱＫＱＭＥＸＥＳＩＸＶＡＸＸＱＫＨＳＲＮＳＱＧ、
ＭＫＰＩＱＫＸＸＡＧＸＩＸＸＴＳＣＶＥＧＣＳＳＱＨＷＳＹＧＸＲＰＧＧＫＲＤＡＥＮＸＩＤＳＦＱＥＩＶＫＥＶＧＱＸＡＥＴＱＲＦＥＣＴＴＨＱＰＲＳＰＸＲＤＸＫＧＡＸＥＳＸＩＥＥＥＴＧＱＫＫＩおよび
ＭＡＸＷＭＲＸＸＰＸＸＡＸＸＡＸＷＧＰＤＰＡＡＡＦＶＮＱＨＸＣＧＳＨＸＶＥＡＸＹＸＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＲＥＡＥＤＸＱＶＧＱＶＥＸＧＧＧＰＧＡＧＳＸＱＰＸＡＸＥＧＳＸＱＫＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＸＹＱＸＥＮＹＣＮ
から成る群から選択される。
【０１６５】
特定の実施形態において、本発明は、上記のポリペプチドに関し、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸置換は、５，５，５，５’，５’，５’−ヘキサフルオロロイシンから成る群から選択される。
【０１６６】
特定の実施形態において、本発明は、少なくとも１つの置換された天然アミノ酸に対し、少なくとも１つのフッ素化アミノ酸置換を含むポリペプチドに関し、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸置換は、トリフルオロロイシン、４，４，４−トリフルオロバリン、５，５，５−トリフルオロロイシン、トリフルオロバリン、ヘキサフルオロバリン、トリフルオロイソロイシン、トリフルオロノルバリン、ヘキサフルオロロイシン、５，５，５，５’，５’，５’−ヘキサフルオロロイシン、トリフルオロメチオニン、トリフルオロメチルメチオニンおよびフルオロフェニルアラニンから成る群から選択され、Ｘの各例は独立して、フッ素化アミノ酸置換であり、該ポリペプチドは、
ＨＸＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ、
ＨＡＸＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ、
ＨＸＸＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ、
ＨＸＸＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ、
ＨＸＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＸＩＡＷＬＶＫＧＲ、
ＨＡＸＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＸＡＷＬＶＫＧＲ、および
ＨＸＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＸＶＫＧＲ
から成る群から選択される。
【０１６７】
特定の実施形態において、本発明は、上記のポリペプチドに関し、該少なくとも１つの置換された天然アミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、アラニン、グリシン、グルタミン酸、およびフェニルアラニンから成る群から選択される。
【０１６８】
特定の実施形態において、本発明は、上記のポリペプチドに関し、該少なくとも１つの置換された天然アミノ酸は、ロイシンから成る群から選択される。
【０１６９】
特定の実施形態において、本発明は、上記のポリペプチドに関し、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸置換は、５，５，５，５’，５’，５’−ヘキサフルオロロイシンである。
【０１７０】
特定の実施形態において、本発明は、上記のポリペプチドに関し、該少なくとも１つの置換された天然アミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、アラニン、グリシン、グルタミン酸、およびフェニルアラニンから成る群から選択され、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸置換は、５，５，５，５’，５’，５’−ヘキサフルオロロイシンである。
【０１７１】
特定の実施形態において、本発明は、上記のポリペプチドに関し、該少なくとも１つの置換された天然アミノ酸は、ロイシンから成る群から選択され、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸置換は、５，５，５，５’，５’，５’−ヘキサフルオロロイシンである。
【０１７２】
特定の実施形態において、本発明は、少なくとも１つのフッ素化アミノ酸置換を含むポリペプチドに関し、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸置換は、トリフルオロロイシン、５，５，５−トリフルオロロイシン、ヘキサフルオロロイシン、および５，５，５，５’，５’，５’−ヘキサフルオロロイシンから成る群から選択され、Ｘの各例は独立して、ロイシンまたはフッ素化アミノ酸置換であり、該ポリペプチドは、
ＨＸＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ、
ＨＡＸＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ、
ＨＸＸＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ、
ＨＸＸＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ、
ＨＸＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＸＩＡＷＬＶＫＧＲ、
ＨＡＸＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＸＡＷＬＶＫＧＲ、および
ＨＸＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＸＶＫＧＲ
から成る群から選択される。
【０１７３】
特定の実施形態において、本発明は、上記のポリペプチドに関し、該少なくとも１つのフッ素化アミノ酸置換は、５，５，５，５’，５’，５’−ヘキサフルオロロイシンから成る群から選択される。
【０１７４】
特定の実施形態において、本発明は、少なくとも１つの放射性標識されたアミノ酸を含むポリペプチドに関し、該ポリペプチドは、配列ＤＬＳＫ*ＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳを有し、Ｋ*は、放射性標識されたアミノ酸である。
【実施例】
【０１７５】
ここで本発明を一般的に記述し、下記の実施例を参照することによってより容易に理解されるが、本発明の特定の側面および実施形態の例証の目的のために含まれるものであって、本発明を制限するものではない。
【０１７６】
実施例１
ビストリフルオロメチルオレフィン（２）の合成
【化１】
2009523800.tif 000002
【０１７７】
カップリング反応の一般的な手順：乾燥Ｅｔ2Ｏ（３００ｍＬ）中のガーナーアルデヒド(Garner Aldehyde)１（７．０ｇ、３１．０ｍｍｏｌ）およびＰＰｈ3（５７ｇ、２１７ｍｍｏｌ）の攪拌溶液を、アルゴン存在下、−７８℃で２，２，４，４−テトラキス−（トリフルオロメチル）−１，３−ジチエタン（３９．５ｇ、１０８．５ｍｍｏｌ）に加えた。混合物を室温までゆっくりと温めながら３日間攪拌した。反応により、ゆっくりと不溶性白色固体が堆積され、これをろ過して、ろ液を濃縮した。残留物をｎ−ペンタン（３００ｍＬ）中にさらに溶解し、不溶性不純物を除去するために再度ろ過した。溶媒の除去後、溶離剤としてのｎ−ペンタン／Ｅｔ2Ｏ（６／１）を使用し、残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィーに供し、純２を淡黄色油として得た。1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ６．７０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），４．８１（ｂｓ，１Ｈ），４．２３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，９．３Ｈｚ），３．７９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．９Ｈｚ，９．３Ｈｚ），１．６５（ｓ，３Ｈ），１．５６（ｓ，３Ｈ），１．４２（ｓ，９Ｈ）；19Ｆ ＮＭＲ（２８２．６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3／ＣＦＣｌ3）δ−６５．０１（ｄ，３Ｆ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），−５８．４４（ｄ，３Ｆ，Ｊ＝５．９Ｈｚ）；ＦＴ−ＩＲ（フィルム，νmax，ｃｍ-1）２９８３ｍ，２９３５ｍ，２８８５ｗ，１７１３ｓ，１４７９ｗ，１４６０ｗ，１３７９ｓ，１２３０ｓ，１１６５ｓ，１１１０ｍ，９７１ｍ；［α］D26.1＝＋１２．３°（ｃ１．７，ＣＨＣｌ３）；ＧＣ−ＭＳ（ＣＩ，ＣＨ4）：３６４（１，［Ｍ＋１］＋），３３６（１８），３０８（１００），２８８（９８），２６４（３７），１０２（２），５７（９）。
【０１７８】
実施例２
オキサゾリジン（３）の合成
【化２】
2009523800.tif 000003
【０１７９】
５００ｍＬ丸底フラスコを、ＴＨＦ（２５０ｍＬ）中の２（１０．３ｇ、２８．３ｍｍｏｌ）および１０％Ｐｄ／Ｃ（４０ｇ）の溶液で電荷した。反応フラスコをアルゴンおよび水素で順次パージし、Ｈ2の取り込みが終わるまで室温の水素下で攪拌した（２４時間）。次いで、触媒をろ過により反応混合物から分離した（および再使用することができる）。ろ液を無水ＭｇＳＯ4で乾燥させて、回転蒸発によって濃縮し、３（１０．１ｇ、収率９８％）を淡黄色油として得た。1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ４．２３（４．０５）（ｍ，１Ｈ），４．００（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，９．３Ｈｚ），３．７３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），３．５８（３．０５）（ｍ，１Ｈ），２．１８（２．０１）（ｍ，２Ｈ），１．６２（１．５８）（ｓ，３Ｈ），１．４８（ｂｒ．ｓ，１２Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１５３．２２（１５１．５１）（Ｃ＝Ｏ），１２３．８９（ｑ，２×ＣＦ3，1ＪCF＝２８４．０），９４．４７（９４．０３）（Ｃ），８０．８５（８０．７３）（Ｃ），６７．２６（６６．６５）（ＣＨ２），５，５，５８（５５．１２）（ＣＨ），４５．４４（４５．１２）（quintet，ＣＨ，2ＪCF＝２７．２Ｈｚ），２８．９８（２８．００）（ＣＨ２），２８．２５（３×ＣＨ３），２７．５８（２６．９０）（ＣＨ3），２４．１５（２２．８６）（ＣＨ3）；19Ｆ ＮＭＲ（２８２．６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3／ＣＦＣｌ3）δ−６７．６８−６８．４２（ｍ）；ＦＴ−ＩＲ（フィルム，νmax，ｃｍ-1）：２９８４ｍ，２９４１ｍ，２８８４ｗ，１７０４ｓ，１４５７ｍ，１３９３ｓ，１２５８ｓ，１１６８ｓ，１１０４ｓ，８４７ｍ；［α］D22.4＝＋１７．５°（ｃ０．４，ＣＨＣｌ3）；ＧＣ−ＭＳ（ＣＩ，ＣＨ4）：３６６（４，［Ｍ＋１］＋），３３８  １６），３１０（１００），２９０（４８），２６６（４８），５７（８）。
【０１８０】
実施例３
Ｎ−ブチルオキシカルボニル−５，５，５，５’，５’，５’−（Ｓ）−ヘキサフルオロロイシノール（４）の合成
【化３】
2009523800.tif 000004
【０１８１】
ＣＨ2Ｃｌ2（３０ｍＬ）中の３（１０．１ｇ、２７．６ｍｍｏｌ）の溶液に、１０ｍＬのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えた。反応混合物を室温で５分間攪拌した。溶媒およびＴＦＡの除去後、残留物を１５０ｍＬのエチルエーテルと１００ｍＬのＨ2Ｏとに分配した。有機層を水（２０ｍＬ×４）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させて濃縮し、４（７．２ｇ、収率８０％）を白色固体として得た。ニンヒドリン活性材料からも明らかなように、ＢＯＣ部分の開裂のために、水層は完全に脱保護の生成物を含有する。このヘキサフルオロアミノアルコールは、ＢＯＣアミドのとして遊離アミン基を保護することによって、また４に転換することができる。1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ５．０３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），３．８４（ｍ，１Ｈ），３．７０（ｍ，２Ｈ），３．２０（ｍ，１Ｈ），３．１０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），１．９８（ｍ，２Ｈ），１．４５（ｓ，９Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１５６．５７（Ｃ＝Ｏ），１２４．００（ｑ，２×ＣＦ3，1ＪＣＦ＝２８４．０Ｈｚ），８０．５８（Ｃ），６６．０８（ＣＨ2），５０．５７（ＣＨ），４５．０９（ｍ，ＣＨ，2ＪCF＝２８．１  Ｈｚ），２８．３８（３×ＣＨ３），２６．４４（ＣＨ2）；19Ｆ ＮＭＲ（２８２．６  ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3／ＣＦＣｌ３）δ−６７．９６（ｍ），−６８．４６（ｍ）；ＦＴ−ＩＲ（ＫＢｒペレット，νmax，ｃｍ-1）３３９７ｓ（ｂｒ），３２５３ｓ，３０６８ｍ，２９８１ｓ，２９４８ｍ，１６８６ｓ，１５５２ｓ，１３６９ｓ，１２８９ｓ，１１７４ｓ，１１４５ｓ，１０５５ｓ；［α］D22.9＝−１４．４°（ｃ１．０，ＣＨ３ＯＨ）；ＧＣ−ＭＳ（ＣＩ，ＣＨ4）：３２６（８，［Ｍ＋１］＋），２９８（１４），２７０（１００），２２６（２０），５７（２）；ｍ．ｐ．＝１１４−１１５℃。
【０１８２】
実施例４
Ｎ−ブチルオキシカルボニル−５，５，５，５’，５’，５’−（Ｓ）−ヘキサフルオロロイシン（５）の合成
【化４】
2009523800.tif 000005
【０１８３】
ＤＭＦ（１５０ｍＬ）中の４（７．１ｇ、２１．８ｍｍｏｌ）および重クロム酸ピリジニウム（３３ｇ、８８ｍｍｏｌ）の混合物を、１５０ｍＬのＨ2Ｏを加える前にアルゴン下において室温で２４時間攪拌した。次いで、混合物をエチルエーテル（４００ｍＬ×２）で抽出した。組み合わせたエーテル層を１Ｎ ＨＣｌ（８０ｍＬ×２）で洗浄し、約１５０ｍＬの溶液が残されるまで濃縮した。この溶液を５％ＮａＨＣＯ3（１５０ｍＬ×３）で洗浄した。組み合わせた水層を３Ｎ  ＨＣｌでｐＨ２まで酸性化させ、エーテル（４００ｍＬ×２）で再び抽出した。次いで、エーテル層をＭｇＳＯ４で乾燥させて、濃縮し、５（５．２ｇ、７０％）を白色固体として得た。1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ７．３６（５．２１）（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），４．４１（ｍ，１Ｈ），３．３７（ｍ，１Ｈ），２．４３−２．１１（ｂｒ．ｍ，２Ｈ），１．４７（ｓ，９Ｈ）；１９Ｆ  ＮＭＲ（２８２．６  ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3／ＣＦＣｌ3）δ−６７．８７−６８．２３（ｍ）；ＦＴ−ＩＲ（ＫＢｒペレット，νmax，ｃｍ-1）３３５８−２５００ｍ（ｂｒ．），３２４５ｓ，３１０７ｍ，２９８９ｓ，２９８０ｍ，１７２５ｓ，１７１２ｓ，１６５７ｓ，１４７７ｓ，１４５８ｓ，１４０４ｓ，１２９６ｓ，１２７７ｓ，１２５８ｓ，９１６ｍ；［α］D21.8＝−２３．０°（ｃ１．０，ＣＨ３ＯＨ）；ＧＣ−ＭＳ（ＣＩ，ＣＨ４）：３４０（２１，［Ｍ＋１］＋），３１２（７），２８４（１００），２６４（１６），２４０（１９），５７（３９）；ｍ．ｐ．＝８５−９１℃。
【０１８４】
実施例５
５，５，５，５’，５’，５’−（Ｓ）−ヘキサフルオロロイシン（６）の合成
【化５】
2009523800.tif 000006
【０１８５】
５ｍＬのＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（２／３）中の５（５８１ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ）の溶液を３０分間攪拌した。溶媒の除去後、残留物を１Ｎ  ＨＣｌ（１０ｍＬ×３）とエチルエーテル（１０ｍＬ）とに分配した。組み合わせた水層を凍結乾燥して６（４４６ｍｇ、収率９５％）を白色固体として得た。
【０１８６】
実施例６
ジペプチド（８）の合成
【化６】
2009523800.tif 000007
【０１８７】
無水ＤＭＦ（１ｍＬ）中の５（１１ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（１３ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（１３ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）、およびＨ−セリン（ｔ−ブチル）−ＯＭｅ・ＨＣｌ（１４ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）を順次加えた。６ｍＬのＨ2Ｏを加える前に、混合物を室温で４０分間攪拌した。反応混合物をエーテル（１５ｍｌ）で抽出し、有機層を１Ｎ  ＨＣｌ（５ｍＬ×２）および５％ＮａＨＣＯ3溶液（５ｍｌ）でさらに洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させて濃縮し、８（１３ｍｇ、収率８７％）を白色固体として生じた。1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ６．６８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），５．２１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），４．６４（ｍ，１Ｈ），４．４０（ｍ，１Ｈ），３．８６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，９．３Ｈｚ），３．７６（ｓ，３Ｈ），３．５６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，９．３Ｈｚ），３．５０（ｍ，１Ｈ），２．３３−２．１０（ｂｒ．ｍ，２Ｈ），１．４５（ｓ，９Ｈ），１．１４（ｓ，９Ｈ）。
【０１８８】
実施例７
Ｎ−ブチルオキシカルボニル−４，４，４−トリフルオロバリノール（２）
【化７】
2009523800.tif 000008
【０１８９】
２０ｍＬの乾燥ＤＭＦ中のブチルオキシカルボニル−ＤＬ−トリフルオロバリン（１．３０ｇ、４．７９ｍｍｏｌ）およびＮａＨＣＯ３（１．２１ｇ、１４．３７ｍｍｏｌ）の懸濁液に、０．３３ｍＬのＣＨ3Ｉ（５．２７ｍｍｏｌ）をアルゴン下において室温で加えた。結果として生じる混合物を５時間攪拌し、次いで、７５ｍＬの酢酸エチルと５０ｍＬの水とに分配した。有機層を水（３×５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させて濃縮し、１．３６ｇ（９５％）のブチルオキシカルボニル−ＤＬ−トリフルオロバリンメチルエステルを淡黄色油として生成した。
【０１９０】
ブチルオキシカルボニル−ＴＦＶメチルエステル（８５５ｍｇ、３ｍｍｏｌ）を２０ｍＬのメタノール中に溶解し、ＮａＢＨ4（６８１ｍｇ、１８ｍｍｏｌ）を０℃で少量ずつ加えた。反応混合物を室温で一晩攪拌し、次いで、８０ｍＬの酢酸エチルで希釈し、水（３×５０ｍＬ）で洗浄してＭｇＳＯ４で乾燥させた。溶媒の除去後、溶離剤としてのｎ−ペンタン／Ｅｔ2Ｏ（１：１）を使用して粗生成物（ブチルオキシカルボニル−トリフルオロバリノール）をシリカゲルカラム（シリカゲル、３００ｇ）上でクロマトグラフにかけ、４５２ｍｇの２ａを淡黄色固体（５８％）として、および２１４ｍｇの２ｂを白色固体（２８％）として得た。
【０１９１】
（２Ｓ，３Ｒ）−，（２Ｒ，３Ｓ）−Ｎ−ブチルオキシカルボニル−４，４，４−トリフルオロバリノール（２ａ）
1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ５．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），４．０２（ｍ，１Ｈ），３．６２（ｍ，３Ｈ），２．６１（ｍ，１Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ），１．１５（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）；13Ｃ ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１５６．２０（Ｃ＝Ｏ），１２７．８３（ｑ，ＣＦ3，1ＪCF＝２７９．９Ｈｚ），８０．２６（Ｃ），６２．７８（ＣＨ2），５１．０９（ＣＨ），３８．４７（ｑ，ＣＨ，2ＪCF＝２５．６Ｈｚ），２８．４０（３×ＣＨ3），８．７６（ＣＨ3）；19Ｆ ＮＭＲ（２８２．６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3／ＣＦＣｌ3）δ−７０．６３（ｄ，３Ｆ，Ｊ＝９．０Ｈｚ）；ＦＴ−ＩＲ（ＫＢｒペレット，νmax，ｃｍ-1）３４３５ｓ，３３００ｓ，２９９０ｓ，２９７９ｍ，２９５４ｍ，１６９１ｓ，１５３９ｓ，１５３７ｓ，１２６５ｓ，１１７２ｓ，１１２５；ＧＣ−ＭＳ（ＣＩ，ＣＨ4）：２５８（１４，［Ｍ＋１］＋），２４２（４），２０２（１００），１５８（３７），５７（１４）。
【０１９２】
（２Ｓ，３Ｓ）−，（２Ｒ，３Ｒ）−Ｎ−ブチルオキシカルボニル−４，４，４−トリフルオロバリノール（２ｂ）
1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ５．１１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．６６（ｍ，２Ｈ），３．４５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），２．５３（ｍ，１Ｈ），１．４２（ｓ，９Ｈ），１．１５（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）；13Ｃ ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１５６．４３（Ｃ＝Ｏ），１２７．９１（ｑ，ＣＦ3，1ＪCF＝２８０．２Ｈｚ），８０．３０（Ｃ），６２．９２（ＣＨ２），５２．５６（ＣＨ），３８．８９（ｑ，ＣＨ，2ＪCF＝２４．８Ｈｚ），２８．４０（３×ＣＨ３），１０．５９（ＣＨ３）；19Ｆ ＮＭＲ（２８２．６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３／ＣＦＣｌ３）δ６８．７６（ｄ，３Ｆ，Ｊ＝８．５Ｈｚ）；ＦＴ−ＩＲ（フィルム，νmax，ｃｍ-1）：３４３６ｓ，３３０２ｓ，３０１２ｍ，２９９０ｍ，２９５４ｍ，１６９１ｓ，１５３２ｓ，１２６５ｓ，１１７２ｓ，１１２７ｓ；ＧＣ−ＭＳ（ＣＩ，ＣＨ4）：２５８（１４，［Ｍ＋１］＋），２４２（４），２０２（１００），１８２（８），５７（１４）。
【０１９３】
実施例８
（２Ｓ，３Ｒ）−，（２Ｒ，３Ｓ）−Ｎ−Ａｃ−４，４，４−トリフルオロバリン（３ａ）
【化８】
2009523800.tif 000009
【０１９４】
４ｍＬの乾燥ＤＭＦ中のアルコール２ａ（２５７ｍｇ、１ｍｍｏｌ）の溶液を、アルゴン下において室温でＰＤＣ（２．２６ｇ、６ｍｍｏｌ）を用いて処理し、一晩攪拌した。次いで、反応混合物を２０ｍＬのジエチルエーテル／３０ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ3溶液で希釈した。有機層を１０ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄した。組み合わせた水層を３Ｎ  ＨＣｌでｐＨ２まで酸性化させ、ジエチルエーテル（２×５０ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機層をＭｇＳＯ4で乾燥させて濃縮し、１７６ｍｇの対応するブチルオキシカルボニル−トリフルオロバリン（６５％）を生成した。
【０１９５】
ブチルオキシカルボニル−ＴＦＶ（１７６ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2中４ｍＬの４０％トリフルオロ酢酸で１０分間処理した。残留物を２ｍＬの水中に溶解し、ＮａＯＨ（２６０ｍｇ、６．５ｍｍｏｌ）で０℃で処理し、次に、無水酢酸（０．１３ｍＬ、１．３ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物が室温まで暖められる前に、０℃で３０分間攪拌した。さらに１．５時間攪拌後、混合物を１０ｍＬの水で希釈し、１Ｎ ＨＣｌでｐＨ２まで酸性化させ、酢酸エチル（２×６０ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機層をＭｇＳＯ4で乾燥させて濃縮し、所望の生成物３ａを白色固体として得た（１３２ｍｇ、９５％）。1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）δ４．９６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．０Ｈｚ），３．０７（ｍ，１Ｈ），２．０４（ｓ，３Ｈ），１．１５（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）；19Ｆ ＮＭＲ（２８２．６ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ／ＣＦ3ＣＯ2Ｈ）δ−７１．６３（ｄ，３Ｆ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）；ＦＴ−ＩＲ（ＫＢｒペレット，νmax，ｃｍ-1）３３９７ｓ（ｂｒ），３２５３ｓ，３０６８ｍ，２９８１ｓ，２９４８ｍ，１６８６ｓ，１５５２ｓ，１３６９ｓ，１２８９ｓ，１１７４ｓ，１１４５ｓ，１０５５ｓ；ＧＣ−ＭＳ（ＣＩ，ＣＨ４）：２１４（１００，［Ｍ＋１］＋），１９６（９），１７２（３３），８２（３３），５７（６）。
【０１９６】
（２Ｓ，３Ｓ）−，（２Ｒ，３Ｒ）−Ｎ−Ａｃ−４，４，４−トリフルオロバリン（３ｂ）
1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ４．６７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．３Ｈｚ），３．０７（ｍ，１Ｈ），２．０４（ｓ，３Ｈ），１．１７（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）；19Ｆ ＮＭＲ（２８２．６ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ／ＣＦ3ＣＯ2Ｈ）δ−６９．４３（ｄ，３Ｆ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）；ＦＴ−ＩＲ（ＫＢｒペレット，νmax，ｃｍ-1）３３９７ｓ（ｂｒ），３２５３ｓ，３０６８ｍ，２９８１ｓ，２９４８ｍ，１６８６ｓ，１５５２ｓ，１３６９ｓ，１２８９ｓ，１１７４ｓ，１１４５ｓ，１０５５ｓ；ＧＣ−ＭＳ（ＣＩ，ＣＨ４）：２１４（１００，［Ｍ＋１］＋），１９６（９），１７２（３３），１０１（１０），８２（３３），５７（６）。
【０１９７】
実施例９
（２Ｓ，３Ｒ）−４，４，４−トリフルオロバリン（４ａ）
【化９】
2009523800.tif 000010
【０１９８】
ｐＨ７．９、１ｍＬのＬｉＯＨ／ＨＯＡｃ水溶液中の３ａ（１０７ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）の溶液に、ブタの腎臓アシラーゼＩ（１０ｍｇ）を２５℃で加えた。混合物を２５℃で４８時間攪拌した（ｐＨは、１ＮのＬｉＯＨを周期的に加えることによって７．５に維持した）。次いで、反応物を５ｍＬの水で希釈し、ｐＨ５．０まで酸性化させ、Ｎｏｒｉｔで６０℃まで加熱して、ろ過した。ろ液をｐＨ１．５まで酸性化させ、酢酸エチル（２×１０ｍＬ）で抽出した。水層を凍結乾燥し、４９ｍｇの４ａ（９５％）を得た。組み合わせ有機層を濃縮し、残留物を３Ｎ  ＨＣｌ中で６時間還流させ、次いで、凍結乾燥して５０ｍｇの４ｃ（９８％）を得た。
【０１９９】
他の２つのジアステレオマーである４ｂおよび４ｄは、同一の工程を用いて３ｂから取得した。
【０２００】
（２Ｓ，３Ｒ）−４，４，４−トリフルオロバリン（４ａ）
1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）δ４．２４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１，３．９Ｈｚ），３．２３（ｍ，１Ｈ），１．３０（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）；19Ｆ ＮＭＲ（２８２．６ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ／ＣＦ3ＣＯ2Ｈ）δ−７１．６９（ｄ，３Ｆ，Ｊ＝９．３Ｈｚ）；［α］D23.7＝＋７．２°（ｃ０．７５，１Ｎ ＨＣｌ）。
【０２０１】
（２Ｓ，３Ｓ）−４，４，４−トリフルオロバリン（４ｂ）
1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）δ４．３５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝２．７Ｈｚ），３．２７（ｍ，１Ｈ），１．２２（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）；19Ｆ ＮＭＲ（２８２．６ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ／ＣＦ3ＣＯ2Ｈ）δ−７０．０４（ｄ，３Ｆ，Ｊ＝９．０Ｈｚ）；［α］D23.3＝＋１２．８°（ｃ０．５，１Ｎ ＨＣｌ）。
【０２０２】
（２Ｒ，３Ｓ）−４，４，４−トリフルオロバリン（４ｃ）
1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）δ４．２４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１，３．９Ｈｚ），３．２３（ｍ，１Ｈ），１．３０（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）；19Ｆ ＮＭＲ（２８２．６ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ／ＣＦ3ＣＯ2Ｈ）δ−７０．０４（ｄ，３Ｆ，Ｊ＝９．０  Ｈｚ）。
【０２０３】
（２Ｒ，３Ｒ）−４，４，４−トリフルオロバリン（４ｄ）
1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）δ４．３５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝２．７Ｈｚ），３．２７（ｍ，１Ｈ），１．２２（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）；19Ｆ ＮＭＲ（２８２．６ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ／ＣＦ3ＣＯ2Ｈ）δ−７１．６９（ｄ，３Ｆ，Ｊ＝９．３Ｈｚ）。
【０２０４】
実施例１０
Ｎ−ブチルオキシカルボニル−５，５，５−トリフルオロロイシンメチルエステル（６）
【化１０】
2009523800.tif 000011
【０２０５】
ブチルオキシカルボニル−ＤＬ−トリフルオロロイシン（１．２５ｇ、４．３８ｍｍｏｌ）、ヨードメタン（０．３ｍＬ、４．８２ｍｍｏｌ）、ＮａＨＣＯ3（１．１ｇ、１３．１５ｍｍｏｌ）、および乾燥ＤＭＦ（２０ｍＬ）の混合物を、室温でアルゴン下において６時間攪拌し、次いで、２００ｍＬの酢酸エチルで希釈し、水（４×１００ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥させて、濃縮し、１．２５ｇの生成物を淡黄色油（９５％）として得た。溶離剤としてＥｔ2Ｏ／ｎ−ペンタン（１：４）を使用したシリカゲル（５００ｇ）上のカラムクロマトグラフィーにより、４２０ｍｇの（２Ｓ，４Ｒ）−，（２Ｒ，４Ｓ）−Ｎ−ブチルオキシカルボニル−５，５，５−トリフルオロロイシンメチルエステル（６ａ）（３２％）、３４７ｍｇの（２Ｓ，４Ｓ）−，（２Ｒ，４Ｒ）−Ｎ−ブチルオキシカルボニル−５，５，５−トリフルオロロイシンメチルエステル（６ｂ）（２７％）、および３３７ｍｇの６ａおよび６ｂの混合物（２６％）を生じた。
【０２０６】
（２Ｓ，４Ｒ）−，（２Ｒ，４Ｓ）−Ｎ−ブチルオキシカルボニル−５，５，５−トリフルオロロイシンメチルエステル（６ａ）
1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ５．２９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），４．３２（ｍ，１Ｈ），３．７０（ｓ，３Ｈ），２．３１（ｍ，１Ｈ），２．１２（ｍ，１Ｈ），１．５８（ｍ，１Ｈ），１．３７（ｓ，９Ｈ），１．１１（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）；13Ｃ ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１７２．７２（Ｃ＝Ｏ），１５５．２９（Ｃ＝Ｏ），１２８．０９（ｑ，ＣＦ3，1ＪCF＝２７８．９Ｈｚ），８０．２７（Ｃ），５２．５４（ＣＨ3），５１．７０（ＣＨ），３５．１３（ｑ，ＣＨ，2ＪCF＝２６．４Ｈｚ），３２．９８（ＣＨ2），２８．３０（３×ＣＨ3），１３．１７（ＣＨ3）；19Ｆ ＮＭＲ（２８２．６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３／ＣＦＣｌ３）δ−７４．１５（ｄ，３Ｆ，Ｊ＝８．２Ｈｚ）；ＦＴ−ＩＲ（フィルム，νmax，ｃｍ-1）３３６０ｍ，２９８４ｍ，２９３８ｍ，１７４７ｓ，１７１６ｓ，１５２０ｓ，１３６８ｓ，１２６９ｓ，１１６８ｓ，１１３３ｍ；ＧＣ−ＭＳ（ＣＩ，ＣＨ４）：３００（２，［Ｍ＋１］＋），２８４（７），２４４（１００），２００（６６），８２（２１），５７（２４）。
【０２０７】
（２Ｓ，４Ｓ）−，（２Ｒ，４Ｒ）−Ｎ−ブチルオキシカルボニル−５，５，５−トリフルオロロイシンメチルエステル（６ｂ）
1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ５．０２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），４．３８（ｍ，１Ｈ），３．７６（ｓ，３Ｈ），２．３２（ｍ，１Ｈ），１．９１−１．７４（ｂｒ．ｍ，２Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ），１．２０（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）；13Ｃ ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１７３．０３（Ｃ＝Ｏ），１５５．８６（Ｃ＝Ｏ），１２８．２４（ｑ，ＣＦ3，1ＪCF＝２７８．９Ｈｚ），８０．５７（Ｃ），５２．８０（ＣＨ3），５０．８３（ＣＨ），３５．０２（ｑ，ＣＨ，2ＪCF＝２６．９Ｈｚ），３３．００（ＣＨ2），２８．４２（３×ＣＨ3），１２．２８（ＣＨ３）；19Ｆ ＮＭＲ（２８２．６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3／ＣＦＣｌ3）δ−７４．０３（ｄ，  ３Ｆ，Ｊ＝８．７Ｈｚ）；ＦＴ−ＩＲ（ＫＢｒペレット，νmax，ｃｍ−1）３３６８ｓ，３０１４ｍ，２９８３ｓ，２９６１ｍ，１７６３ｓ，１６８６ｓ，１５２７ｓ，１２６５ｓ，１２１４ｓ，１１７０ｓ，１０５３ｓ，１０２８ｓ；ＧＣ−ＭＳ（ＣＩ，ＣＨ4）：３００（２，［Ｍ＋１］＋），２８４（７），２４４（１００），２２４（３０），２００（６６），５７（２４）。
【０２０８】
実施例１１
（２Ｓ，４Ｒ）−，（２Ｒ，４Ｓ）−Ｎ−Ａｃ−５，５，５−トリフルオロロイシン（７ａ）
【化１１】
2009523800.tif 000012
【０２０９】
（２Ｓ，４Ｒ）−，（２Ｒ，４Ｓ）−Ｎ−ブチルオキシカルボニル−５，５，５−トリフルオロロイシノール
メタノール（１０ｍＬ）中の６ａ（４２０ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＮａＢＨ4（５３１ｍｇ、１４．０ｍｍｏｌ）を少量ずつ加えた。溶媒の除去前に反応混合物を室温で１時間攪拌した。残留物を１００ｍＬの酢酸エチルと５０ｍＬの水とに分配した。水層を１００ｍＬの酢酸エチルで抽出した。組み合わせた有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥して、濃縮し、３５７ｍｇの所望の生成物を白色固体（９４％）として生成した。1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ４．７４（ｍ，１Ｈ），３．７１（ｍ，２Ｈ），３．５８（ｍ，１Ｈ），２．３１（ｍ，１Ｈ），２．１４（ｍ，１Ｈ），１．９２（ｍ，１Ｈ），１．４５（ｓ，９Ｈ），１．１７（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）．13Ｃ ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１５６．２６（Ｃ＝Ｏ），１２８．４１（ｑ，ＣＦ3，1ＪCF＝２７９．４Ｈｚ），８０．１４（Ｃ），６４．７８（ＣＨ2），５０．７３（ＣＨ），３５．５９（ｑ，ＣＨ，2ＪCF＝２９．６Ｈｚ），３１．７４（ＣＨ2），２８．５２（３×ＣＨ3），１３．７１（ＣＨ3）；19Ｆ ＮＭＲ（２８２．６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3／ＣＦＣｌ3）δ−７３．８４（ｂｒ．ｓ，３Ｆ）；ＧＣ−ＭＳ（ＣＩ，ＣＨ4）：２７２（１００，［Ｍ＋１］＋），２１６（６８），１７２（２６），５７（１１）。
【０２１０】
（２Ｓ，４Ｓ）−，（２Ｒ，４Ｒ）−Ｎ−ブチルオキシカルボニル−５，５，５−トリフルオロロイシノール
1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ４．５８（ｍ，１Ｈ），３．７９  （ｍ，１Ｈ），３．６８（ｍ，１Ｈ），３．５８（ｍ，１Ｈ），２．２７（ｍ，１Ｈ），２．０５（ｍ，１Ｈ），１．８０（ｍ，１Ｈ），１．４５（ｓ，９Ｈ），１．１８（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）。13Ｃ ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１５６．４７（Ｃ＝Ｏ），１２８．５６（ｑ，ＣＦ3，1ＪCF＝２７８．７Ｈｚ），８０．２０（Ｃ），６６．３１（ＣＨ2），４９．４９（ＣＨ），３５．１５（ｑ，ＣＨ，2ＪCF＝２６．７Ｈｚ），３１．７１（ＣＨ2），２８．５０（３×ＣＨ3），１２．５６（ＣＨ3）；19Ｆ ＮＭＲ（２８２．６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3／ＣＦＣｌ3）δ−７３．９８（ｄ，３Ｆ，Ｊ＝８．５Ｈｚ）；ＧＣ−ＭＳ（ＣＩ，ＣＨ4）：２７２（１００，［Ｍ＋１］＋），１７２（２６），５７（１１）。
【０２１１】
（２Ｓ，４Ｒ）−，（２Ｒ，４Ｓ）−Ｎ−Ａｃ−５，５，５−トリフルオロロイシン  （７ａ）
（２Ｓ，４Ｒ）−，（２Ｒ，４Ｓ）−Ｎ−ブチルオキシカルボニル−５，５，５−トリフルオロロイシノール（３３０ｍｇ、１．２３ｍｍｏｌ）、ＰＤＣ（４．６２ｇ、１２．３ｍｍｏｌ）、および乾燥ＤＭＦ（２．５ｍＬ）の混合物を、アルゴン下において室温で４時間攪拌し、次いで、５０ｍＬの酢酸エチルおよび５０ｍＬの水で希釈した。有機層を３０ｍＬの１Ｎ  ＨＣｌおよび２×３０ｍＬの水で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させて、濃縮し、１９８ｍｇの（２Ｓ，４Ｒ）−，（２Ｒ，４Ｓ）−Ｎ−ブチルオキシカルボニル−５，５，５−トリフルオロロイシンを薄茶色がかった油（６０％）として得た。
【０２１２】
２ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中の上記生成物（１８０ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）の溶液を、室温で３０分間０．５ｍＬのトリフルオロ酢酸で処理した。溶媒の除去後、黄色がかった残留物を２ｍＬの水中で溶解し、０℃で、ＮａＯＨ（１２６ｍｇ、３．１５）で処理し、次いで、無水酢酸（０．１２ｍＬ、１．２６ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を０℃で３０分間攪拌し、次いで、室温までに暖めた。さらに１時間攪拌後、混合物を３０ｍＬの水で希釈し、３ＮのＨＣｌでｐＨ２まで酸性化させ、酢酸エチル（２×９０ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥させて、濃縮し、１３６ｍｇの７ａを白色固体（９５％）をして生成した。1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）δ４．４８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．１，８．８Ｈｚ），２．５１（ｍ，１Ｈ），２．２７（ｍ，１Ｈ），２．０６（ｓ，３Ｈ），１．７９（ｍ，１Ｈ），１．１８（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）；13Ｃ ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）δ１７５．４８（Ｃ＝Ｏ），１７４．６０（Ｃ＝Ｏ），１２８．５３（ｑ，ＣＦ3，1ＪCF＝２７８．９Ｈｚ），５１．２４（ＣＨ），３４．８８（ｑ，ＣＨ，2ＪCF＝２６．６Ｈｚ），３１．２１（ＣＨ2），２１．９０（ＣＨ3），１３．０３（ＣＨ3）；19Ｆ ＮＭＲ（２８２．６ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ／ＣＦ3ＣＯ2Ｈ）δ−７３．６８（ｄ，３Ｆ，Ｊ＝９．０Ｈｚ）；ＦＴ−ＩＲ（ＫＢｒペレット，νmax，ｃｍ-1）３３４３ｓ，３０６３−２４８７ｍ（ｂｒ．），２９３２ｍ，２８９４ｍ，１７０９ｓ，１６１３ｓ，１５４９ｓ，１２６６ｓ，１１７９ｓ，１１３７ｓ；ＧＣ−ＭＳ（ＣＩ，ＣＨ4）：２２８（１００，［Ｍ＋１］＋），２１１（４７），１８６（２６），１４０（１６），５７（１１）。
【０２１３】
（２Ｓ，４Ｓ）−，（２Ｒ，４Ｒ）−Ｎ−Ａｃ−５，５，５−トリフルオロロイシン  （７ｂ）
1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）δ４．４８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．８，１１．６Ｈｚ），２．４１（ｍ，１Ｈ），２．０７（ｓ，３Ｈ），２．１５−１．９１（ｂｒ．ｍ，２Ｈ），１．１６（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）；13Ｃ ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）δ１７８．３５（Ｃ＝Ｏ），１７７．３８（Ｃ＝Ｏ），１３１．０９（ｑ，ＣＦ3，1ＪCF＝２７８．３Ｈｚ），５２．７２（ＣＨ），３７．３１（ｑ，ＣＨ，2ＪCF＝２６．６Ｈｚ），３３．０６（ＣＨ2），２４．５０（ＣＨ３），１３．９０（ＣＨ３）；19Ｆ ＮＭＲ（２８２．６ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ／ＣＦ3ＣＯ2Ｈ）δ−７３．８７（ｄ，３Ｆ，Ｊ＝８．５Ｈｚ）；ＦＴ−ＩＲ（ＫＢｒペレット，νmax，ｃｍ-1）３３３６ｓ，２９７７ｍ，２９４９ｍ，２８９７ｍ，２６１５ｍ，２４７３ｓ，１７１１ｓ，１６２８ｓ，１５５１ｓ，１２７６ｓ，１２５０ｓ，１１２７ｓ，１０９５ｓ；ＧＣ−ＭＳ（ＣＩ，ＣＨ4）：２２８（１００，［Ｍ＋１］＋），２１１（４７），１８６（２６），１４０（１６），１２０（３），５７（１１）。
【０２１４】
実施例１２
（２Ｓ，４Ｒ）−５，５，５−トリフルオロロイシン（８ａ）
２ｍＬのｐＨ７．９水溶性ＬｉＯＨ／ＨＯＡｃ中の７ａ（１３６ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）の溶液にブタの腎臓アシラーゼＩ（１８ｍｇ）を２７℃で加えた。混合物を２７℃で４８時間攪拌した（ｐＨは、１ＮのＬｉＯＨを周期的に加えることによって７．５に維持した）。これをさらに５ｍＬの水で希釈し、ｐＨ５．０まで酸性化させ、Ｎｏｒｉｔで６０℃まで加熱して、ろ過した。ろ液をｐＨ１．５まで酸性化させ、酢酸エチル（２×５０ｍＬ）で抽出した。水層を凍結乾燥し、６３ｍｇの８ａ（９５％）を得た。組み合わせた有機層を濃縮し、残留物を３ＮのＨＣｌ中で６時間還流させ、次いで、凍結乾燥して６４ｍｇの８ｃ（９６％）を得た。
【０２１５】
他の２つのジアステレオマーである８ｂおよび８ｄは、同一の工程を用いて７ｂから取得した。
【０２１６】
（２Ｓ，４Ｒ）−５，５，５−トリフルオロロイシン（８ａ）
19Ｆ ＮＭＲ（２８２．６ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ／ＣＦ3ＣＯ2Ｈ）δ−７４．３３（ｄ，３Ｆ，Ｊ＝９．０Ｈｚ）；［α］D22.9＝＋２１．６゜（ｃ０．５，１Ｎ ＨＣｌ）。
【０２１７】
（２Ｓ，４Ｓ）−５，５，５−トリフルオロロイシン（８ｂ）
19Ｆ ＮＭＲ（２８２．６  ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ／ＣＦ3ＣＯ2Ｈ）δ−７４．１１（ｄ，３Ｆ，Ｊ＝８．２Ｈｚ）；［α］D23.6＝−４．０゜（ｃ０．８，１Ｎ ＨＣｌ）。
【０２１８】
（２Ｒ，４Ｓ）−５，５，５−トリフルオロロイシン（８ｃ）
19ＦＮＭＲ（２８２．６ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ／ＣＦ3ＣＯ2Ｈ）δ−７４．３３（ｄ，３Ｆ，Ｊ＝９．０Ｈｚ）。
【０２１９】
（２Ｒ，４Ｒ）−５，５，５−トリフルオロロイシン（８ｄ）
19ＦＮＭＲ（２８２．６ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ／ＣＦ3ＣＯ2Ｈ）δ−７４．１１（ｄ，３Ｆ，Ｊ＝８．２Ｈｚ）。
【０２２０】
実施例１３
ブチルオキシカルボニル−ＴＦＶ（２Ｓ，３Ｓ）−セリン（Ｏｔ−Ｂｕ）−ＯＭｅ（２Ｓ）
【化１２】
2009523800.tif 000013
【０２２１】
ＤＭＦ（１ｍＬ）中の（２Ｓ，４Ｓ）−５，５，５−トリフルオロバリン（４ｂ）（５ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、０．０１ｍＬ、０．０６ｍｍｏｌ）、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウレニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ、８ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）、および（２Ｓ）−Ｈ−セリン（Ｏｔ−Ｂｕ）−ＯＭｅ（９ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）のＨＣｌの塩を順次加えた。水（５ｍＬ）での希釈およびジエチルエーテル（１５ｍＬ）での抽出前に、混合物を室温で２０分間攪拌した。有機層を１Ｎ  ＨＣｌ（２×５ｍＬ）および５％ＮａＨＣＯ３（２×８ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させて、濃縮し、７ｍｇのジペプチド（８８％）を得た。1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ６．９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），５．１６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），４．６５（ｍ，１Ｈ），４．３９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１，８．８Ｈｚ），３．８１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７，９．０Ｈｚ），３．７４（ｓ，３Ｈ），３．５６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．０，９．０Ｈｚ），３．０４（ｍ，１Ｈ），１．４６（ｓ，９Ｈ），１．２３（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．１４（ｓ，９Ｈ）；19Ｆ ＮＭＲ（２８２．６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3／ＣＦＣｌ3）δ−６８．５７（ｄ，３Ｆ，Ｊ＝８．７Ｈｚ）。
【０２２２】
ブチルオキシカルボニル−ＴＦＶ（２Ｓ，３Ｒ）−セリン（Ｏｔ−Ｂｕ）−ＯＭｅ（２Ｓ）
19Ｆ ＮＭＲ（２８２．６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3／ＣＦＣｌ3）δ−７１．３６（ｄ，３Ｆ，Ｊ＝７．９Ｈｚ）。
【０２２３】
ブチルオキシカルボニル−ＴＦＶ（２Ｒ，３Ｓ）−セリン（Ｏｔ−Ｂｕ）−ＯＭｅ（２Ｓ）
19Ｆ ＮＭ（２８２．６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3／ＣＦＣｌ3）δ−７１．４８（ｄ，３Ｆ，Ｊ＝８．５Ｈｚ）。
【０２２４】
ブチルオキシカルボニル−ＴＦＶ（２Ｒ，３Ｒ）−セリン（Ｏｔ−Ｂｕ）−ＯＭｅ（２Ｓ）
19Ｆ ＮＭＲ（２８２．６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3／ＣＦＣｌ3）δ−６８．４９（ｄ，  ３Ｆ，Ｊ＝９．０Ｈｚ）。
【０２２５】
実施例１４
ペプチド合成
０．０７５ｍｍｏｌスケールでのｔ−ブチルオキシカルボニルケミストリーに対する生体内その場中和の手順を用いてペプチドを手作業で合成した。ＭＢＨＡおよびブチルオキシカルボニル−リジン（２−Ｃｌ−Ｚ）−Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂を、ペプチド  Ｍ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１）、Ｍ２Ｆ２およびＭ２Ｆ５ならびにペプチドＢＩＩ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２）、ＢＩＩ１Ｆ２、ＢＩＩ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３）およびＢＩＩ５Ｆ２にそれぞれ使用した。チオフェノールの２０倍モル過剰を用いて、ヒスチジン上のジニトロフェニル保護基を除去した。ペプチドは、ＨＦ／アニソール（９０：１０）を用いて０℃で２時間処置することにより樹脂から開裂させ、次いで、冷Ｅｔ2Ｏで沈殿させた。租ペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣ［Ｖｙｄａｃ Ｃ18、１０μＭ、１０ｍｍ×２５０ｍｍ］により精製した。分析的ＲＰ−ＨＰＬＣ［Ｖｙｄａｃ Ｃ18、５μＭ、４ｍｍ×２５０ｍｍ］で判断したように、ペプチドの純度は９５％を超えた。ペプチドのモル質量はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで決定した。ペプチド濃度は定量的アミノ酸分析で決定した。
【０２２６】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ性質決定：
Ｍ２：ｍ／ｚ  計算値（Ｍ）２４７６．４，測定値  ２４９６．１（Ｍ＋Ｎａ＋）。Ｍ２Ｆ２：ｍ／ｚ  計算値（Ｍ）２６９２．３，測定値  ２６９３．６（Ｍ＋Ｈ＋）。Ｍ２Ｆ５：ｍ／ｚ  計算値（Ｍ）３１１４．２，測定値  ３１１５．５（Ｍ＋Ｈ＋）。ＢＩＩ１：ｍ／ｚ  計算値（Ｍ）２４３２．４，測定値  ２４３４．９（Ｍ＋Ｈ＋）。ＢＩＩ１Ｆ２：ｍ／ｚ  計算値（Ｍ）２６４９．３，測定値  ２６５０．７（Ｍ＋Ｈ＋）。ＢＩＩ５：ｍ／ｚ  計算値（Ｍ）２００２．２，測定値  ２００３．５（Ｍ＋Ｈ＋）。ＢＩＩ５Ｆ２：ｍ／ｚ  計算値（Ｍ）２２１８．１，  測定値  ２２１８．９（Ｍ＋Ｈ＋）。ＧＬＰ−１  ｍ／ｚ  計算値（Ｍ）３２９５．６，測定値  ３２９７．６（Ｍ＋Ｈ＋）；Ｆ８  ｍ／ｚ  計算値（Ｍ）３４４５．７，測定値  ３４４７．３（Ｍ＋Ｈ＋）；Ｆ９  ｍ／ｚ  計算値（Ｍ）３３８９．７，測定値  ３３９８．８（Ｍ＋Ｈ＋）；Ｆ８９  ｍ／ｚ  計算値（Ｍ）３５３７．７，測定値  ３５４０．０（Ｍ＋Ｈ＋）；Ｆ１０  ｍ／ｚ  計算値（Ｍ）２４７６．４，測定値  ２４９６．１（Ｍ＋Ｎａ＋）；Ｆ２８  ｍ／ｚ  計算値  （Ｍ）２６９２．３，測定値  ２６９３．６（Ｍ＋Ｈ＋）；Ｆ２９  ｍ／ｚ  計算値（Ｍ）３１１４．２，測定値  ３１１５．５（Ｍ＋Ｈ＋）；Ｆ３２  ｍ／ｚ  計算値（Ｍ）３１１４．２，測定値  ３１１５．５（Ｍ＋Ｈ＋）。
【０２２７】
実施例１５
抗菌作用
中間対数増殖期細胞を用いて、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）をグラム陰性大腸菌（ＡＴＣＣ  ２３７１６）およびグラム陽性枯草菌（ＳＭＹ）に対して測定した。単一コロニーから細菌を攪拌してＬ培地において３７℃で一晩増殖させた。一定分量を取り、新鮮な培養液中で希釈し（１：５０）、〜２時間培養した。Ｍ２、Ｍ２Ｆ２およびＭ２Ｆ５に対する５×１０5コロニー形成単位／ｍＬ（ＣＦＵ／ｍＬ）の濃度またはＢＩＩ系列ペプチドに対する５×１０4ＣＦＵ／ｍＬの濃度まで細胞（ＯＤ590＝０．５）を希釈した。ｍＬ当りのコロニー形成単位は、Ａｇａｒプレート上に１０倍連続希釈した細胞懸濁液を３重で分散することによって定量化した。各ウェルにおいて５０μＬの最終容量となるまで、ペプチド溶液の２倍連続希釈を無菌９６ウェルプレート（ＭＩＣＲＯＴＥＳＴ（商標））で２重に行い、その後５０μＬの細胞懸濁液を加えた。プレートを３７℃で６時間インキュベートした。５９０ｎｍでの吸収度をマイクロタイタープレートリーダー（ＶＥＲＳＡｍａｘ）を使用して監視した。ＭＩＣを、細胞増殖の完全な抑制に必要とされるペプチド濃度として記録した（吸収度に変化なし）。
【０２２８】
実施例１６
溶血アッセイ
新鮮なヒト赤血球（ｈＲＢＣ）を３，５００ｒｐｍで遠心分離し、上澄みが取り除かれるまでＰＢＳ緩衝液で洗浄した。次いで、ｈＲＢＣをＰＢＳ中１％（ｖ／ｖ）の最終濃度まで再懸濁および希釈し、４℃で保管した。９６ウェルプレートにおけるＰＢＳ中のペプチドの２倍連続希釈により、各ウェル内で２０μＬの最終容量となり、８０μＬのｈＲＢＣを加えた。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、続いてＳＯＲＶＡＬＬ卓上用遠心分離機を用いて３，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄みの一定分量（５０μＬ）を、各ウェル内に５０μＬのＨ2Ｏを含有する新しい９６ウェルプレートへ移動した。プレートリーダーを使用して４１５ｎｍでの吸収度を測定した。１００〜４００μｇ／ｍＬのメリチンを含有するウェルは陽性対照として機能し、緩衝液およびｈＲＢＣのみを含有するウェルは陰性対照として機能した。方程式を用いて溶血率を計算した。  
2009523800.tif 000014
【０２２９】
ここで、完全な溶血は、１００〜４００μｇ／ｍＬメリチンを含有するすべてのウェルの平均吸収度として定義される
実施例１７
ペプチドのプロテアーゼ安定性
トリプシン（ウシの膵臓から、ＥＣ３．４．２１．４）に対するペプチドのタンパク質分解性安定性を分析的ＲＰ−ＨＰＬＣアッセイで決定した。標準的な基質であるＮ−α−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステル（ＢＡＥＥ）を使用し、２５４ｎｍでの吸収度を測定して酵素活性を確認した。酵素濃度（１ｍＭ  ＨＣｌ中）を２８０ｎｍの吸収度で決定した。一般的なトリプシン処理実験において、２００μＬのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４、１０ｍＭ  ＰＯ43-、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中の０．２５ｍＭペプチドならびにＭ２、Ｍ２Ｆ２およびＭ２Ｆ５に対する１μｇトリプシンならびにＢＩＩ１、ＢＩＩ５、ＢＩＩ１Ｆ２およびＢＩＩ５Ｆ２に対する０．５μｇトリプシン（０．１９ｍＭ）を使用した。タンパク質分解性反応の動態をＲＰ−ＨＰＬＣ（２３０ｎｍで検出）で分析することができるように、酵素の量を最適化した。ペプチドを３時間にわたり３７℃でトリプシンとともにインキュベートした。異なる反応時間で一定分量（１０μＬ）を取り、０．２％ＴＦＡ（４４０μＬ）で希釈して、−８０℃で保管した。ＡＣ18分析的カラム［Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ Ｃ18、５μＭ、４ｍｍ×２５０ｍｍ］を消化された生成物の分離および定量化に使用した。残存する全長ペプチド濃度を最初の濃度に関して規格化した。３時間後の動態的データをＩｇｏｒ  Ｐｒｏ５．０３を用いた指数崩壊関数を使用して適合させた。  
Ａ＝ａ＋ｂ・ｅ-k’t
次いで、方程式を用いてデータ（＜最初の２０分）を適合させることによって、偽１次速度定数を適合値±１標準偏差として取得した。  
ｌｎ［Ａ］＝−ｋｔ＋ｌｎ［Ａ］0
ここで、Ａはペプチドの規格化した濃度であり、ｋは擬１次速度定数であり、ｔは分での反応時間であり、［Ａ］0はペプチドの最初の濃度である。全長ペプチドから開裂した各断片は、開裂パターンを確立および比較することができるように、ＥＳＩ−ＭＳで同定した。 
実施例１８
円偏光二色性
１ｃｍ光路長キュベットを使用して、ＰＴＣ−４２３Ｓ単一位置ペルチェ温度調節器を取り付けたＪＡＳＣＯＪ−７１５分光偏光計上で、円偏光二色性スペクトルを２５℃で記録した。ペプチド定数（１０μＭ）の濃度を維持しながらＴＦＥのパーセンテージを変更させることで、ＴＦＥ滴定をＰＢＳ緩衝液中で行った。４回の走査を試料ごとに取得し、Ｓ／Ｎ率を向上させるように平均化した。ベースラインを記録し、各スペクトル後に減算した。方程式を用いて平均残基楕円率（［θ］、ｄｅｇ・ｃｍ2・ｄｍｏｌ-1）を計算した。  
［θ］＝θobs×ＭＲＷ／１０ｌ・ｃ
ここで、θobsは１０００分の１度の測定されたシグナル（楕円率）であり、ｌはｃｍの細胞の光路長であり、ｃはｍｇ／ｍＬのペプチドの濃度であり、ＭＲＷは平均残基分子量（残基数で割ったペプチドの分子量）である。
【０２３０】
ＧＬＰ−１研究では、１ｍｍ光路長キュベットを使用して、ＰＴＣ−４２３Ｓ単一位置ペルチェ温度調節器を取り付けたＪＡＳＣＯ  Ｊ−７１５分光偏光計上で、スペクトルを５℃で記録した。ペプチドを２０ｍＭリン酸ナトリウム、３５％ＴＦＥを含有する２０ｍＭリン酸ナトリウム、またはｐＨ７．４の４０ｍＭドデシルホスフェートコリン中で溶解し、１０μＭの最終濃度を送達した。４つの走査を試料ごとに取得し、２０ｎｍ／分の走査速度でＳ／Ｎ率を向上させるために平均化した。ベースラインを記録し、各スペクトル後に減算した。方程式を用いて平均残基楕円率（［θ］、ｄｅｇ・ｃｍ2・ｄｍｏｌ-1）を計算した。  
［θ］＝θobs／１０ｌ・ｃ・ｎ
ここで、θobsは１０００分の１度の測定されたシグナル（楕円率）であり、ｌはｃｍの細胞の光路長であり、ｃはｍｏｌ／Ｌのペプチドの濃度であり、ｎはタンパク質内の残基数である。
【０２３１】
実施例１９
分析超遠心
Ｍ２、Ｍ２Ｆ２およびＭ２Ｆ５への沈降平衡実験を、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＸＬ−Ｉ超遠心分離機上で、２５℃で行った。ＰＢＳ中に溶解されたペプチドを、３つの異なる濃度（Ｍ２およびＭ２Ｆ５への２５、５０、１００μＭ、Ｍ２Ｆ５への５０、１００、２００μＭ）で平衡細胞内に負荷した。１８時間の平衡後、２３０ｎｍでの吸収度データを３つの異なる回転子速度（３５，０００、４０，０００および４５，０００ｒｐｍ）で取得した。Ｉｇｏｒ  Ｐｒｏ  ５．０３使用して理想的な単一種の沈降について説明する下記の方程式を用いて取得したデータを適合させた。  
Ａｂｓ＝Ａ’ｅｘｐ（Ｈ×Ｍ［ｘ2−ｘ02］）＋Ｂ
ここで、Ａｂｓ＝半径ｘの吸収度であり、Ａ’＝基準半径ｘ０の吸収度であり、Ｈ＝（１−Ｖρ）ω2／２ＲＴであり、Ｖ＝偏比容（０．７６７３ｍＬ／ｇ）であり、ρ＝溶媒の密度（１．００１７ｇ／ｍＬ）であり、ω＝ラジアン／秒の角速度であり、Ｒ＝気体定数（８３，１４４，０００ｇ／ｍｏｌ・Ｋ）であり、Ｔ＝絶対温度（２９８Ｋ）であり、Ｍ＝見掛け分子量（Ｄａ）であり、Ｂ＝溶媒吸収度（ブランク）である。プログラムＳＥＤＮＴＥＲＰを使用して、ペプチドの偏比容をアミノ酸組成物に従って見積もった。
【０２３２】
実施例２０
Ｘ線結晶学
５，５，５，５’，５’，５’−２Ｓ−ヘキサフルオロロイシンの結晶をＭｅＯＨ中で増殖させ、Ｃｒｙｏｃｏｏｌ  ＮｅｖｅｒＩｃｅ低温装置が装備されているＢｒｕｋｅｒ／Ｓｉｅｍｅｎｓ  ＳＭＡＲＴ  ＡＰＥＸ器具（Ｍｏ Ｋα放射線、λ＝０．７１０７３Åを使用して、データを８６（２）Ｋで収集した。２０秒間フレーム当り０．３°のオメガ走査を使用してデータを測定し、データの完全球を収集した。構造は、直接的方法で溶解し、ＳＨＥＬＸＴＬプログラムパッケージを使用してＦ2の最小二乗法で精製した。
【０２３３】
実施例２１
細胞溶媒および受容体トランスフェクション
ＣＯＳ−７細胞を、１０％ＦＢＳ、ペニシリンＧナトリウム（１００ユニット／ｍｌ）および硫酸ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）で補完したＤＭＥ、２６ｍＭ重炭酸ナトリウム、３７℃でｐＨ７．２、５％ＣＯ2および高湿気環境において培養した。ＣＯＳ−７細胞（０．８×１０6細胞）をトランスフェクションの１日前に１０ｃｍ皿に蒔いた。野生型ヒトＧＬＰ−１受容体（ｈＧＬＰ１−Ｒ）をコードする全長ｃＤＮＡを含有する５μｇのｐｃＤＮＡ１ベクター（Ｄｒ．Ｂｅｉｎｂｏｒｎ  Ｍａｒｔｉｎ，米国マサチューセッツ州、タフツ−ニューイングランドメディカルセンター（Tufts-New England  Medical Center）から提供されたもの）を用いて、ジエチルアミノエチル−デキストラン（ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ）方法を使用して、細胞を過渡的にトランスフェクトした。この遺伝的コンストラクトは配列決定され、同一性を確認した。
【０２３４】
実施例２２
受容体結合分析
トランスフェクションの１日後に、ＣＯＳ−７細胞（１０ｋ細胞／ウェル）を２４ウェル組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ、Ｐｒｉｍａｒｉａ、BD sciences社（米国カリフォルニア州）製）上に継代培養した。翌日、放射性リガンドとしての１７°ｐＭ［125Ｉ］−エクセンジン（９−３９）アミドを用いて、競合結合実験を２５℃で１００分行った。テストしたペプチドは、２７０μＬ緩衝液中で３×１０−６から３×１０−１１Ｍの範囲の最終濃度を有した。１μＭの非標識ペプチドが存在する場合において、非特異的結合を決定した。新鮮な結合緩衝液を、０．２％ＢＳＡ、０．１５ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（phenylmethylsulfonyl fluoride：ＰＭＳＦ）、ｐＨ  ７．３の２５ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有するハンクス平衡塩類溶液内で調製した。１ｍＬの結合緩衝液を用いて、細胞単層をインキュベーション前１回およびインキュベーション後３回丁寧に洗浄した。細胞を１Ｎ ＮａＯＨ中に加水分解し、１Ｎ ＨＣｌで洗浄して、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｇａｍｍａカウンター５５００Ｂを使用し、ガンマ計測のためにポリプロピレンチューブ（Ｓｉｇｍａ社製）へ移動させた。
【０２３５】
実施例２３
ｃＡＭＰ形成の計測
ＣＯＳ−７細胞（１００ｋ細胞／ウェル）をトランスフェクションの１日後に２４ウェルプレート上に継代し、さらに２４時間培養した。１％ウシ血清アルブミン、１ｍＭイソブチル−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、０．４μＭ  Ｐｒｏ−Ｂｏｒｏ−Ｐｒｏ、およびｐＨ７．４の２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳで補完されたＤｕｌｂｅｃｃｏ変法イーグル培地（フェノールレッドなし）中で、細胞をＧＬＰ−１および類似体を用いて１時間２５℃で刺激した。強力ＤＰＰ ＩＶ阻害剤であるＰｒｏ−Ｂｏｒｏ−Ｐｒｏ（［１−（２−ピロリジニルカルボニル）−２−ピロリジニル］ボロン酸）は、Ｄｒ．Ｗ．Ｗ．Ｂａｃｈｏｖｃｈｉｎ（米国マサチューセッツ州、タフツ大学(Tufts University））によって提供されたものである。テストしたペプチドの最終濃度は、２７０μＬ緩衝液において１×１０-6から１×１０-11Ｍまでに１０倍増加した。ンキュベーション緩衝液の除去後、細胞を液体窒素中で凍結融解法によって溶解し、２００μＬのＭ−Ｐｅｒを加えて、確実に細胞をすべて溶解した。無水酢酸／ＤＩＥＡを使用してｃＡＭＰをアセチル化し、ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（登録商標）キット（PerkinElmer Life Sciences社製）を使用し、［125Ｉ］−ｃＡＭＰとの競合的結合によってその濃度を決定した。Ｐａｃｋａｒｄ  Ｔｏｐｃｏｕｎｔ（登録商標）シンチレーション近接カウンターを使用してプレート結合放射能を測定した。
【０２３６】
実施例  ２４
ＤＰＰ ＩＶに対するペプチドの分解
ＤＰＰ ＩＶ（ブタの腎臓から、ＥＣ３．４．１４．５）に対するペプチドのタンパク質分解性安定性を分析的ＲＰ−ＨＰＬＣアッセイ（２３０ｎｍで検出）で決定した。ｐＨ８．０の１００ｍＭ  トリス−ＨＣｌ中で△ε＝８８００Ｍ-1ｃｍ-1を用いて４１０ｎｍで吸収度を測定することによって比活性度を較正するため、グリシン−プロリン−ｐ−ニトロアニリドである色素生産性基質を採用した。２０ユニット／Ｌの酵素濃度で、ペプチド（８．３μＭ）を３７℃で１時間にわたって、５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ中のＤＰＰ ＩＶ、ｐＨ７．６の１ｍＭ  ＥＤＴＡとともに別々にインキュベートした。反応物は、時間間隔をおいて６００μＬの０．２％ＴＦＡで消光し、分析までドライアイス上に保管した。２成分溶媒系／Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡを用いて、分析的Ｃ18カラム［Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ Ｃ18、５μｍ、４ｍｍ×２５０ｍｍ］を未変化および消化ペプチドの分離および定量化に使用した。１次速度定数は、方程式を用いて適合させることにより適合値±１標準偏差として取得した。  
ｌｎ［Ａ］＝−ｋｔ＋ｌｎ［Ａ］0
ここで。Ａはペプチドの濃度であり、ｋは１次速度定数であり、ｔは分での反応時間であり、［Ａ］0はｔペプチドの最初の濃度である。全長ペプチドに由来する断片は手作業で収集し、ＥＳＩ−ＭＳで同定した。
【０２３７】
実施例２５
データ分析
放射性リガンド競合結合およびｃＡＭＰ生成濃度反応曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン３．０（ＧｒａｐｈＰａｄ社（米国カリフォルニア州サンディエゴ）製）を使用して適合させた。結合アッセイおよびｃＡＭＰアッセイの両方に対して、規格化はｗｔ ＧＬＰ−１と相対的であった。ＩＣ50およびＥＣ50値は、組み込み単一部位競合モデルまたはシグモイドモデルを有する非線形回帰を使用して適合させた。データは平均±ｓ．ｅ．ｍとして報告する。
【０２３８】
実施例２６
アンフォールディング（ΔＧ°アンフォールディング）の自由エネルギーの計算
ペプチドＨおよびＦは並行二量体コイルドコイルを形成するように設計された。これらのペプチドは、Ｈ中のずべての７つのロイシン（Ｌ）残基がＦ中の５，５，５，５’，５’−Ｓ−ヘキサフルオロロイシン（Ｘ）によって置換される場合を除き、同一の配列を有する。  
Ｈ：ＣＧＧＡＱＬＫＫＥＬＱＡＬＫＫＥＮＡＱＬＫＷＥＬＱＡＬＫＫＥＬＡＱ
Ｆ：ＣＧＧＡＱＸＫＫＥＸＱＡＸＫＫＥＮＡＱＸＫＷＥＸＱＡＸＫＫＥＸＡＱ
したがって、フッ素化ペプチドＦＦは、ヘリックス当たり７つのヘキサフルオロロイシン残基を含有する。
【０２３９】
非フッ素化ペプチドＨＨに対するアンフォールディングの自由エネルギーは、折り畳み状態と折り畳まれていない状態との２つの状態の平衡を推測することにより決定した。  
ＦHH ⇔ ＵHH
ここで、ＦHHは折り畳み種であり、ＵHHは完全に折り畳まれていないＨＨを表す。データは、Ｇｄｎ−ＨＣｌ濃度の関数として［θ］222を監視することにより取得した。データは線形外挿法で分析し、アンフォールディングの自由エネルギーを生成した。したがって、平衡定数△Ｇは、アンフォールディングの平均率から容易に決定される。遷移領域の変性剤濃度に対する△Ｇの１次従属がゼロ濃度を続けると仮定すると、データは、変性剤が存在しない場合の自由エネルギー差である△Ｇ°H2Oを取得するために外挿することができる。
【０２４０】
上記で報告した沈降平衡実験は、ＦＦが、２〜１５μＭの濃度範囲において四量体（ジスルフィド結合二量体の二量体）であることを示す。したがって、折り畳まれていない単量体に折り畳まれた二量体平衡は、アンフォールディングの△Ｇ°を計算するために使用することができる。  
ＦFF ⇔ ２ＵFF
ここで、Ｋｄ＝［ＵFF］2／［ＦFF］である（ＵFF＝折り畳まれていないＦＦおよびＦFF＝４つのヘリックスを有するＦＦの折り畳み二量体）。総ペプチド濃度Ｐυは、Ｐt＝２］［ＦFF］＋［ＵFF］によって得ることができるため、観察されたＣＤシグナルＹobsは、以下の式により、それぞれ折り畳みのベースラインＹフォールデッドおよび折り畳まれていないベースラインＹアンフォールデッドに関して説明することができる。  
2009523800.tif 000015
【０２４１】
さらに、Ｋｄは、アンフォールディングの自由エネルギーに関して表すことができる。  
Ｋd＝ｅｘｐ（−△Ｇ゜アンフォールディング／ＲＴ）
折り畳みＦＦＦと折り畳まれていないＵＦＦ状態との見掛け自由エネルギー差がＧｄｎ・ＨＣ１濃度に１次従属していると仮定すると、△Ｇ゜アンフォールディングは、以下のように表すことができる。  
△Ｇ゜アンフォールディング＝△Ｇ゜H2O−ｍ［Ｇｄｎ・ＨＣ１］
ここで、△Ｇ゜H2Oは、変性剤が存在しない場合の自由エネルギー差であり、ｍは、Ｇｄｎ・ＨＣ１の濃度に対するアンフォールディング遷移の依存度である。データは、非線形最小二乗適合（ＫａｌｉｅｄａＧｒａｐｈ  ｖ３．５）によって、２つのパラメータ、つまり△Ｇ゜H2Oおよびｍに対して適合させた。
【０２４２】
参照による組み込み
本明細書に引用されたすべての米国特許および米国特許出願は、参照することにより本願明細書に組み込まれる。２００２年２月２５日出願の米国特許出願第１０／４６８，５７４号は、参照することによりその全体が本願明細書に明確に組み込まれる。
【０２４３】
均等物
当業者は、単に定型化した実験を用いて、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識し、または確認することができるであろう。かかる均等物は、添付の請求の範囲に包含されることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０２４４】
【図１】図１は、抗微生物ペプチドの配列を示す。括弧内の数はそれぞれ、ｐＨ７．４０での正味荷電およびＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ  Ｃ１８カラム（５μｍ、４×２５０ｍｍ）上のＲＰ−ＨＰＬＣ上の溶出に必要なパーセンテージ溶媒Ｂ（９：１：０．００７ ＣＨ┐3ＣＮ／Ｈ2Ｏ／ＣＦ3ＣＯ2Ｈ）である。
【図２】図２（ａ）は、ペプチドおよびフッ素付加の部位に対する回転につき３．６残基のピッチを使用したヘリックス回転図を示す。（Ａ）ブフォリン系列（Ｂ）マガイニン系列、および（Ｃ）空間充てん図において示される、Ｍ２Ｆ２および（残基ロイシン６、アラニン９、グリシン１３、バリン１７およびイソロイシン２０）Ｍ２Ｆ５におけるフッ素付加（残基ロイシン６およびイソロイシン２０）の部位を示す、ドデシルホスホコリンミセル中のマガイニン２のＮＭＲ構造（ＰＤＢコード：２マグ）。（Ａ）および（Ｂ）において青色で示された残基は、ヘキサフルオロロイシンで置換され、フッ素化類似体を得た。ブフォリン系列ペプチドでは、疎水性面上の両ロイシン残基は、推定上のＤＮＡ／ＲＮＡ結合配列の一部を形成するヘキサフルオロ−ロイシンで置換された。
【図３】図３は、本発明の選択されたペプチドに対するＭＩＣおよび溶血率を提供する表１を含有する。
【図４】図４（Ａ）は、対照と比較したフッ素化ペプチドのタンパク質分解性開裂の相対速度、（Ｂ）は、断片Ｍ*（１−１４）出現および分解、および（Ｃ）は、断片ＢＩＩ１*（６−２１）出現および分解を示す。
【図５】図５は、トリフルオロメチルアミノ酸の光学分割方法を示す。ラセミ混合物は、無水酢酸（収率９０％）でＮアシル化し、続いて酵素開裂してα−Ｓ異性体（収率９９％）を生成する。β（トリフルオロバリン）およびγ（トリフルオロロイシン）炭素での立体化学は、依然未解決である。また、Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル保護されたアミノ酸の生成方法も示される。
【図６】図６は、メリチンに対する型Ｂ  ｈＲＢＣに対抗するペプチドの溶血作用を示す。各データ点［Ｍ２（○）、Ｍ２Ｆ２（●）、Ｍ２Ｆ５（■）、ＢＩＩ５（△）、ＢＩＩ５Ｆ２（▲）、ＢＩＩ１（▽）、ＢＩＩ１Ｆ２（▼）およびメリチン（◆）］は、２つの重複で行われた少なくとも２つの独立した実験の平均である。
【図７】図７は、Ｍ２（Ａ）およびＭ２Ｆ５（Ｂ）［２５℃、２３０ｎｍでの３５０００ｒｐｍ］に対する、代表的な平衡分析的超遠心分離法トレースを示す。単一の理想単一種モデルへの適合は、上部枠において残渣を有する固形物ラインとして示される。条件：［ペプチド］＝５０μＭ、１０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．４０、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ。観察された明らかな分子量は、２４１３（Ｍ２、単量体に対する計算値２４７８）および１２４３６（Ｍ２Ｆ５、四量体に対する計算値１２４６０）であった。Ｍ２（Ｃ）に対するｌｎ（Ａ）対ｒ２の線形描画は、単一の理想種を示し、一方Ｍ２Ｆ５（Ｄ）に対する非無作為残渣は、他の集合状態が存在する可能性を示す。
【図８】図８は、Ｍ２のトリプシン混合物のＨＰＬＣ分析を示す。
【図９】図９は、Ｍ２Ｆ２のトリプシン混合物のＨＰＬＣ分析を示す。
【図１０】図１０は、ＢＩＩ１のトリプシン混合物のＨＰＬＣ分析を示す。
【図１１】図１１は、ＢＩＩ１  Ｆ２のトリプシン混合物のＨＰＬＣ分析を示す。
【図１２】図１２は、ＢＩＩ５のトリプシン混合物のＨＰＬＣ分析を示す。
【図１３】図１３は、ＢＩＩ５  Ｆ２のトリプシン混合物のＨＰＬＣ分析を示す。
【図１４】図１４は、ＥＳＩ−ＭＳによるＭ２のタンパク分解された断片の同定を提供する表２を含む。
【図１５】図１５は、ＥＳＩ−ＭＳによるＭ２Ｆ２のタンパク分解された断片の同定を提供する表３を含む。
【図１６】図１６は、ＥＳＩ−ＭＳによるＢＩＩ５のタンパク分解された断片の同定を提供する表４を含む。
【図１７】図１７は、ＥＳＩ−ＭＳによるＢＩＩ５Ｆ２のタンパク分解された断片の同定を提供する表５を含む。
【図１８】図１８は、ＥＳＩ−ＭＳによるＢＩＩ１のタンパク分解された断片の同定を提供する表６を含む。
【図１９】図１９は、ＥＳＩ−ＭＳによるＢＩＩ１Ｆ２のタンパク分解された断片の同定を提供する表７を含む。
【図２０】図２０は、プロテアーゼ開裂からの初回擬１次速度定数を提供する表８を含む。
【図２１】図２１は、分析的ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して調査された、プロテアーゼ作用（トリプシン）の動態学を示す。Ｍ２系列（Ａ）およびＢＩＩ系列（Ｂ）におけるペプチドの分解。データは、２つの独立した実験の平均を表し、標準偏差を用いて示される。データは、Ｉｇｏｒ  Ｐｒｏ  ｖ  ５．０３を使用する指数崩壊関数使用して適合された。
【図２２】図２２は、２４時間３７℃のトリプシンを用いたＭ２Ｆ５のインキュベーション後の反応混合物のＨＰＬＣトレースを示す。
【図２３】図２３は、時間に応じて遊離されたＢＩＩ５およびＢＩＩ５Ｆ２からの消化断片濃度を示す。ｙ軸は、ピーク下の２３０ｎｍでの統合領域である。
【図２４】図２４は、複数のＴＦＥ（Ｍ２）濃度での円偏光二色性（ＣＤ）データを示す。
【図２５】図２５は、複数のＴＦＥ（Ｍ２Ｆ２）濃度でのＣＤデータを示す。
【図２６】図２６は、複数のＴＦＥ（Ｍ２Ｆ５）濃度でのＣＤデータを示す。
【図２７】図２７は、Ｍ２、Ｍ２Ｆ２およびＭ２Ｆ５のヘリックス内容物への効果を示す。
【図２８】図２８は、複数のＴＦＥ（ＢＩＩ１）濃度でのＣＤデータを示す。
【図２９】図２９は、複数のＴＦＥ（ＢＩＩ１Ｆ２）濃度でのＣＤデータを示す。
【図３０】図３０は、複数のＴＦＥ（ＢＩＩ５）濃度でのＣＤデータを示す。
【図３１】図３１は、複数のＴＦＥ（ＢＩＩ５Ｆ２）濃度でのＣＤデータを示す。
【図３２】図３２は、平衡沈降によって判断される明白な分子量を提供する表９を含む。すべての試料は、１０ｍＭリン酸塩ｐＨ７．４、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ中にある。
【図３３】図３３は、２つの独立した重複の実験（Ｍ２Ｆ５を除く）において新鮮な赤血球（型Ｂ）に対して測定されたすべての抗微生物ペプチドの溶血作用を示す。メリチンおよびＰＢＳ緩衝液はそれぞれ、陽性および陰性対照の役目を果たす。データは、平均±ｓ．ｄを表す。
【図３４】図３４は、大腸菌および枯草菌ならびにすべてのペプチドに対する溶血率に対する、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）（a値は、重複で行われた少なくとも２つの独立した実験のの平均であり、bパーセンテージは、メリチン（１００〜４００μｇ／ｍＬ）に対する溶血）を提供する表１０を含む。ＭＩＣ値は、２の誤り要因を有する。
【図３５】図３５は、野生型ＧＬＰ−１（７−３６）アミド、フッ素化類似体、エクセンジン（９−３９）、および［125Ｉ］−エクセンジン（９−３９）の配列を示す。すべてのペプチドは、Ｃ末端がアミド化され、置換された残基に下線を引いた。赤色の矢印は、ＤＰＰ ＩＶに本来備わっている切断可能な結合を示す。［125Ｉ］−エクセンジン（９−３９）アミドは、競合結合アッセイのための放射性リガンドとして採用し、野生型ＧＬＰ−１に対する保存残基は青色に色を付けた。Ｌは、５，５，５，５’，５’，５’−２Ｓ−ヘキサフルオロロイシンを表し、ヘキサフルオロロイシンメチルエステルの結晶構造、右下部に示す。
【図３６】図３６は、放射性リガンドとして［125Ｉ］−Ｅｘ（９−３９）を使用する競合結合アッセイによって検証されたＣＯＳ−７細胞上に発現した、ヒトＧＬＰ−１Ｒへのペプチドの結合を示す。データは、複製の５つの独立した実験を表す（平均±ｓ．ｅ．ｍ）。
【図３７】図３７は、ｗｔ ＧＬＰ−１およびフッ素化類似体によるｃＡＭＰ生成刺激を示す。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍとして、少なくとも３つの独立した重複の実験を表す。
【図３８】図３８は以下を示す。Ａ）５０ｍＭトリスＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．６中のＤＰＰ ＩＶによるペプチド分解の速度定数。エラーバーは標準偏差を現す。［ペプチド］＝１０μＭ。［ＤＰＰ ＩＶ］２０Ｕ／Ｌ、Ｂ）Ｆ８のＲＰ−ＨＰＬＣトレース。Ｐ１、Ｐ２およびＰ３は、［ＤＰＰ ＩＶ］＝２０Ｕ／Ｌで０，４８時間および［ＤＰＰ ＩＶ］＝２００Ｕ／Ｌで１時間のＦ８を表示する。Ｃ）Ｆ８９のＲＰ−ＨＰＬＣトレース。Ｐ１’、Ｐ２’およびＰ３’は、０，２０および６０分でのＦ８９を表示する。ＤＰＰ ＩＶを使用するＦ８およびＦ８９分解に対する検出可能な水素生成物はなかった。トレースは、クリアランスに対するｘ軸で弱まった。
【図３９】図３９は、受容体結合の概略、野生型ＧＬＰ−１のｃＡＭＰ生成および酵素安定性ならびにフッ素化類似体を提供する表１１を含む。
【図４０】図４０は、タフツ大学のＩＡＣＵＣにより確立された手順および指針に従って行われたＯＧＴＴ実験を示す。７〜８週齢の正常雄性マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ社から購入し、５群で収容して、１２時間光を当てた。陰性対照としてのＰＢＳ、ＧＬＰ−１、およびｐＨ７．４のＰＢＳ中のフッ素化ペプチド（３０ｎｍｏｌ／ｋｇ）のｉ．ｐ．注入（時間−３０分）前２０時間の間、食物を取り除いた。すべての注入は、最終的な体積の１０ｍｌ／ｋｇ体重で行った。時間０分で、マウスは、５ｇ／ｋｇ体重の投与での強制経口投与を介して、無菌グルコース溶液（５０％ｗ／ｖ）を受けた。その後の血糖濃度を、１５、３０、６０および１２０分時にワンタッチ・グルコースメータを使用して、尾静脈を介し重複の測定を行った。データは、平均±ｓ．ｅとして表した。
【図４１】図４１は、処置したマウスの体重比較を示す。すべてのマウス（６）を処置後５日間生存させた（２００６年１２月１９日）。そららの体重を処置日（２００６年１２月１４日）のものと比較する。体重誤差は、約±０．１ｇである。
【図４２】図４２は、３ｎｍｏｌ／ｋｇでの最終投与量のペプチドを用いて行われた一連の実験を示す。他の条件は、図４０で説明したものと同一であった。Ｄ−グルコース溶液を、新鮮に調製し、０．２μＭのフィルターでろ過した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２７】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４２】
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【図４】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３７】
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【図３８】
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【図４１】
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【国際調査報告】
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