(57)【要約】レタスに受粉するための方法および交雑種レタス種子を生産するための方法が記載されている。上記方法は、レタス植物体を提供するステップと、メガチレ・ロツンダタバチを放飼するか、または受粉媒介者を誘引するステップとを含む。本発明の方法を用いて生産される交雑種レタス種子および植物体、ならびに本発明において使用される雄性不稔性レタス系統もまた記載されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）花粉を有する第一レタス植物体を提供するステップと、
ｂ）少なくとも一つの除雄されたレタス植物体を提供するステップと、
ｃ）ハキリバチ属のハチを放飼するステップであって、該ハチが上記第一レタス植物体から上記除雄されたレタス植物体に花粉を移動させ、上記除雄されたレタス植物体に受粉するステップと、
を包含する除雄されたレタス植物体に受粉する方法。
【請求項２】
上記ハキリバチ属のハチは、メガチレ・ロツンダタ、メガチレ・レラティヴァおよびメガチレ・プグナタからなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記ハキリバチ属のハチがメガチレ・ロツンダタであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記第一レタス植物体が近交系またはＦ１レタス植物体であり、
上記提供とは、上記近交系またはＦ１レタス植物体のための種子を植え、該種子が発芽して上記近交系またはＦ１レタス植物体に成長することを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上記除雄されたレタス植物体が花粉を生産しないレタス植物体であり、
上記提供とは、上記除雄されたレタス植物体のための種子を植え、該種子が発芽して上記除雄されたレタス植物体に成長することを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
花粉を生産しない上記植物体が雄性不稔性レタス植物体であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
上記除雄されたレタス植物体が葯を有する花を含む植物体であり、該葯を除去するか、または霧吹きをすることによって上記植物体を除雄することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
オープンフィールドにおいて、上記放飼するステップが実施されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
閉鎖区域またはケージで囲まれた区域において、上記放飼するステップが実施されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
上記第一レタス植物体および上記除雄された植物体が開花時期に開花しており、
上記開花時期に、週毎に一群のハチを放飼することによって、上記放飼するステップが実施されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも約７４°Ｆの温度下で上記放飼するステップが実施されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
上記レタス植物体がラクツカ・サティバ種またはラクツカ・セリオラ種であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ａ）花粉を有する第一レタス植物体を提供するステップと、
ｂ）少なくとも一つの除雄されたレタス植物体を提供するステップと、
ｃ）ハキリバチ属のハチを放飼するステップであって、該ハチが上記第一レタス植物体から上記除雄されたレタス植物体に花粉を移動させ、受粉したレタス植物体を形成するステップと、
ｄ）上記受粉したレタス植物体を育てて交雑種レタス種子を生産するステップと、
を包含する交雑種レタス種子を生産する方法。
【請求項１４】
上記ハキリバチ属のハチは、メガチレ・ロツンダタ、メガチレ・レラティヴァおよびメガチレ・プグナタからなる群より選択されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
上記ハキリバチ属のハチがメガチレ・ロツンダタであることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
上記第一レタスが近交系またはＦ１レタス植物体であり、
上記提供とは、上記近交系またはＦ１レタス植物体のための種子を植え、該種子が発芽して上記近交系またはＦ１レタス植物体に成長することを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
上記除雄されたレタス植物体は花粉を生産しないレタス植物体であり、
上記提供とは、上記除雄されたレタス植物体のための種子を植え、該種子が発芽して上記除雄されたレタス植物体に成長することを含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
閉鎖区域またはオープンフィールドにおいて、上記放飼するステップが実施されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
上記第一レタス植物体および上記除雄された植物体が開花時期に開花しており、
上記開花時期に、週毎に一群のハチを放飼することによって上記放飼するステップが実施されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも約７４°Ｆｍの温度下で上記放飼するステップが実施されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
上記レタス植物体がラクツカ・サティバ種またはラクツカ・セリオラ種であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
花粉を有する第一レタス植物体と除雄されたレタス植物体との交雑の結果得られる交雑種レタス種子であって、
ａ）ハキリバチ属のハチを放飼するステップであって、該ハチが上記第一レタス植物体から上記除雄されたレタス植物体に花粉を移動させ、受粉したレタス植物体を形成するステップと、
ｂ）上記受粉したレタス植物体を育てて交雑種レタス種子を生産するステップと、
を包含する工程によって上記交雑が実施されることを特徴とする交雑種レタス種子。
【請求項２３】
上記第一レタス植物体の平均頭部重量よりも重い平均頭部重量を有する植物体を作り出すことを特徴とする請求項２２に記載の交雑種レタス種子。
【請求項２４】
ａ）花粉を有する第一レタス植物体を提供するステップと、
ｂ）少なくとも一つの除雄されたレタス植物体を提供するステップと、
ｃ）上記第一レタス植物体にハキリバチ属のハチを誘引するステップであって、上記ハキリバチ属のハチが上記第一レタス植物体から上記除雄されたレタス植物体に花粉を移動させ、受粉したレタス植物体を形成するステップと、
を包含する除雄されたレタス植物体を受粉させる方法。
【請求項２５】
上記レタス植物体の近くに上記ハキリバチ属のハチを誘引する誘引物を設置することによって、上記ハキリバチ属のハチが誘引されることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
上記レタス植物体の近くに植物生成物を設置することによって、上記ハキリバチ属のハチが誘引されることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
上記レタス植物体の近くにアルファルファを設置することによって、上記ハキリバチ属のハチが誘引されることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
ａ）花粉を有する第一レタス植物体を提供するステップと、
ｂ）少なくとも一つの除雄されたレタス植物体を提供するステップと、
ｃ）上記第一レタス植物体にハキリバチ属のハチを誘引するステップであって、該ハキリバチ属のハチが上記第一レタス植物体から上記除雄されたレタス植物体に花粉を移動させ、受粉したレタス植物体を形成するステップと、
ｄ）上記受粉したレタス植物体を育てて交雑種レタス種子を生産するステップと、
を包含する交雑種レタス種子を生産する方法。
【請求項２９】
花粉を有する第一レタス植物体と除雄されたレタス植物体との交雑の結果得られる交雑種レタス種子であって、
ａ）ハキリバチ属のハチを誘引するステップであって、該ハキリバチ属のハチが上記第一レタス植物体から上記除雄されたレタス植物体に花粉を移動させ、受粉したレタス植物体を形成するステップと、
ｂ）上記受粉したレタス植物体を育てて交雑種レタス種子を生産するステップと、
を包含する工程によって上記交雑が実施されることを特徴とする交雑種レタス種子。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔関連出願〕
本発明は、参照として本明細書に取り込まれた、ＵＳ仮出願番号６０／８１４，６４１（出願日：２００６年６月１５日）の利益を主張するものである。
【０００２】
〔本発明の背景〕
レタスは一般的な作物である。世界的なレタス消費は増え続けており、この需要の結果、新たなレタス種が常に必要とされている。
【０００３】
レタスは、偏性自家受粉種である。これは、柱頭が現れる前に花粉が出され、１００％の自家受粉が確実なものとなることを意味する。レタスの花の各は、約１０〜２０の個別の小花の集合体である（キク科植物の典型である）。
【０００４】
異花授粉種および自家受粉種の両方で、雑種強勢（Hybrid vigor）またはヘテローシス（heterosis）が生じる。レタスの雑種強勢として一般的に現れるものは、収穫高、頭部の大きさおよび重さの増大、品質向上、ならびに、不利な環境要素に対する抵抗力の向上である。雑種強勢として他に現れるものは、均等に成長することがあり、これによって機械収穫により適した品種となる。
【０００５】
レタスの交雑のための従来の方法は、相当の労力を必要とする方法である。例えば、手作業で、花から葯筒（ａｎｔｈｅｒ  ｔｕｂｅ）を取り除いてもよい。これは、自家受粉の可能性を完全に確実に排除するには有効な方法ではあるが、交雑を多数行う必要があるときには非常に面倒であり、時間がかかる。受粉に先立って花粉を洗い流すために、特定の雄花に霧状の水を吹き付けることによっても交雑がなされ得る。ドナー親個体の柱頭および花柱を軽くこすりつけることによって、他種またはドナー親個体からの花粉が、雌性親個体に導入される。経過を把握するために、日時および系統についての正確な情報を有するタグを花に取り付ける。受粉後約３週間で総苞が熟し、種が収穫される。最終的には、その種を蒔き、葉の色や葉縁などの特徴によって、自家受粉の幼苗あるいは植物体か、または、雌性個体の幼苗あるいは植物体かを識別する。一般的に、明白な特徴はなく、栽培者は目的とする遺伝特性のための想定分離パターンが生じ得るＦ２世代まで待つ必要がある。この後者の状況では、交雑種を生産するかどうか決めるために長期間待たなければならない。これらの方法は効果的ではあるが、面倒な労力を必要とする複数のステップを有する。５つの融合葯（ｆｕｓｅｄ  ａｎｔｈｅｒｓ）に包まれた花柱を有するレタスの花の構造から、操作が特に難しくなり、これらの方法の有効性が低くなる。
【０００６】
他のタイプの交雑方法として、雄性不稔性システムを利用したものがある。タペート特異的プロモータの制御下でリボヌクレアーゼ遺伝子を発現させることによって、レタスにおける雄性不稔性が操作されてきた（Reynaerts et al., Engineered genes for fertility control and their application in hybrid seed production, Scientia Horticulturae (1993) 55 (1-2): 125-129）。しかし、そのような系統は必ずしも不稔性であるわけではなく、また、異常な形状の葉を有する。他の雄性不稔性システムでは、タペート特異的プロモータを介したβグルカナーゼの発現を含む（Curtis et al., Genomic male sterility in lettuce, a baseline for the production of F1 hybrids, Plant Science Limerick (1996) 113(1): 113-119）。Ｅｄｗａｒｄ  Ｒｙｄｅｒ博士は複数の雄性不稔性システムについて記述しているが、その各は、分離比が予想しにくく、とりわけ稔性と不稔性との区別ができない、部分的に稔性の「不稔性植物」という商業使用を妨げる特性を有している。
【０００７】
遺伝子組み換えによる不稔性も可能であるが、それは遺伝子組み換え生物（ＧＭＯ）とみなされ、好ましい形式ではない。
【０００８】
したがって、レタス交雑生産方法の技術において、人間の労力による介入がいらない方法が必要とされている。
【０００９】
〔本発明の概要〕
ある形態において、本発明は、花粉を有する第一レタス植物体を提供し、少なくとも１つの除雄された栽培レタスを提供し、ハキリバチ属のハチを放飼することによって、除雄された栽培レタスの受粉を行う方法を提供する。本発明において、ハチの放飼では、除雄されたレタス植物体に受粉するために、ハチが第一レタス植物体から除雄されたレタス植物体に花粉を移動させる。除雄された植物体とは、花粉を作らない植物体および花粉が取り除かれた植物体のいずれかであってもよい。好ましい実施形態において、除雄された植物体とは花粉を作らない植物体であって、最も好ましくは、雄性不稔系統の植物体である。他の実施形態において、除雄された植物体とは、例えば葯の除去や霧吹きなどで花粉が取り除かれた植物体である。
【００１０】
さらなる形態において、本発明は、ハキリバチ属のハチを誘引するための付加的ステップを含む上記のような除雄された植物体に受粉する方法を提供する。
【００１１】
レタス植物体の近くに１つ以上の誘引物質を配置することによってこれらハキリバチ属のハチを誘引してもよく、そこで、ハキリバチ属のハチが、第一レタス植物体から、除雄されたレタス植物体に花粉を移動させる。また、レタスの植物体の近くにハキリバチを誘引する植物または植物生成物を配置することによってハキリバチ属のハチを誘引してもよい。誘引物質は、好ましくはアルファルファである。
【００１２】
さらに他の形態において、本発明は交雑種のレタス種子を生産する方法を提供する。好ましい実施形態において、上記方法は花粉を有する第一レタスを提供するステップと、少なくとも一つの除雄されたレタス植物体を提供するステップと、ハキリバチ属のハチを放飼するステップであって、ハチが第一レタス植物体から、除雄されたレタス植物体に花粉を移動させ、受粉したレタス植物体を形成するステップと、受粉したレタス植物体を育てて交雑種のレタス種子を生産するステップとを含む。他の好ましい実施形態において、上記方法は、花粉を有する第一レタス植物体を提供するステップと、少なくとも一つの除雄されたレタス植物体を提供するステップと、第一レタス植物体にハキリバチ属のハチを誘引するステップであって、ハキリバチ属のハチが第一レタス植物体から、除雄されたレタス植物体に花粉を移動させ、受粉したレタス植物体を形成するステップと、受粉したレタス植物体を育てて交雑レタス種子を生産するステップとを含む。
【００１３】
さらに他の形態において、本発明は、花粉を有する第一レタス植物体を提供するステップと、少なくとも一つの除雄されたレタス植物体を提供するステップと、第一レタス植物体にハキリバチ属のハチをおびき寄せるステップであって、ハキリバチ属のハチは、第一レタス植物体から、除雄されたレタス植物体に花粉を移動させ、受粉したレタスを形成するステップとを含む、除雄されたレタス植物体に受粉する方法を提供する。
【００１４】
本発明に係る好ましい実施形態の方法において、ハキリバチ属のハチは、メガチレ・ロツンダタ（Ｍｅｇａｃｈｉｌｅ  ｒｏｔｕｎｄａｔａ）、メガチレ・レラティヴァ（Ｍｅｇａｃｈｉｌｅ  ｒｅｌａｔｉｖａ）、または、メガチレ・プグナタ（Ｍｅｇａｃｈｉｌｅ  ｐｕｇｎａｔａ）である。第一レタス植物体は、近交系またはＦ１系統であり得る。好ましい実施形態において、除雄された植物体は雄性不稔性育種系統（雌性系統としても知られる）である。レタス植物体は好ましくはアイスバーグ（ｉｃｅｂｅｒｇ）、ロメイン（ｒｏｍａｉｎ）、レッドリーフ（ｒｅｄｌｅａｆ）、バター（ｂｕｔｔｅｒ）、セリオラ（ｓｅｒｒｉｏｌａ）、または、グリーンリーフ（ｇｒｅｅｎｌｅａｆ）品種である。
【００１５】
オープンフィールドまたは閉鎖区域において、ハキリバチ属のハチを放飼することができる。ハチは、例えば５０，０００匹／群または１００，０００匹／群で、一週間単位で数群放してもよい。好ましい実施形態において、放飼のステップは、レタスの開花時期で、日中の気温が少なくとも約７４°Ｆに達する気候のときに実施される。
【００１６】
他の態様において、本発明は交雑種のレタス種子を提供する。好ましい実施形態において、花粉を有する第一レタス植物体と除雄されたレタス植物体との交雑の結果、交雑種のレタス種子が得られる。当該実施形態において、ハキリバチ属のハチを放飼するステップであって、ハチが第一レタス植物体から、除雄されたレタス植物体に花粉を移動させ、受粉したレタス植物体を形成するステップと、受粉したレタス植物体を育てて交雑種のレタス種子を生産するステップとを包含する工程によって、交雑（受粉）が行われる。他の好ましい実施形態において、花粉を有する第一レタス植物体と除雄された植物体との交雑の結果、交雑種のレタス種子が得られる。当該実施形態において、ハキリバチ属のハチを誘引するステップであって、ハチが第一レタス植物体から、除雄されたレタス植物体に花粉を移動させ、受粉したレタス植物体を形成するステップと、受粉したレタス植物体を育てて交雑種のレタス種子を生産するステップとを包含する工程によって、交雑が行われる。
【００１７】
除雄されたレタス植物体を移植するか、レタス植物体を移植してそれらを除雄するか、または、発芽して除雄されたレタス植物体に成長する種子あるいは除雄可能な植物体に成長する種子を植えることによって、除雄されたレタス植物体が得られる。花粉を有するレタス植物体を移植するか、花粉を生成するように成長するレタス植物体を移植するか、または、発芽して除雄されたレタス植物体に成長する種子を植えるかによって、花粉を有する植物体が得られる。
【００１８】
〔本発明の詳細な説明〕
＜定義＞
本明細書において使用する場合、用語「レタス」は、ラクツカ・サティバ（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．）およびラクツカ・セリオラ（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓｅｒｒｉｏｌａ）を含むキク科の全ての栽培種を指す。レタスは、野生のレタスである、ラクツカ・カナデンシス（Ｌａｃｔｕｃａ  Ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）を指さない。
【００１９】
本明細書において使用する場合、用語「放飼する（ｒｅｌｅａｓｉｎｇ）」は、狭い空間での栽培レタス植物体から、存在する栽培レタス植物体までハチを移動させるのに、人間の介入を必要とするあらゆる行為を指す。
【００２０】
本明細書において使用する場合、用語「配置する」は、ハキリバチ属のハチを誘引してレタス植物体の受粉の頻度を高くするために、レタス植物体から十分近い距離に植物体または植物由来産物を置くことを指す。
【００２１】
本明細書において使用する場合、用語「近くに」は、ハキリバチ属のハチを誘引してレタス植物体の受粉の頻度を高くするのに十分な短距離内であることを指す。
【００２２】
本明細書において使用する場合、用語「誘引する」は、レタス植物体の近くのレタス花粉媒介者の数および／または密度を高めることを目的とするか、またはその効果を得るために行われるあらゆる行為を指す。
【００２３】
用語「除雄された」は、花粉が除去されたか、または生成されない栽培レタス植物体を指す。レタスは、雄性不稔性植物を生育させるための伝統的栽培法、遺伝子操作された雄性不稔性、葯筒除去、および花粉洗浄を含む当該技術分野で周知の方法を介して除雄されてもよい。そのような除雄された植物体は、雄性不稔性植物または雌性植物としても知られる。栽培された雄性不稔性のレタス植物体は、少量の花粉を生成する可能性があることを理解されたい。そのような植物体は、自家受粉によって少量の種を生成する可能性がある。
【００２４】
〔受粉および交雑種のレタス種子生産のための方法〕
本発明は、除雄された栽培レタス植物体に受粉し、交雑種のレタス種を生産するための方法を提供する。
【００２５】
＜レタス＞
本発明に係るレタス植物体は、ここに説明された方法によって受粉可能なラクツカ・サティバ（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）またはラクツカ・セリオラ種の全ての栽培種であり得る。好ましいレタスの種類は、アイスバーグ、ロメイン、グリーンリーフ、レッドリーフ、バターおよびセリオラ品種を含む。
【００２６】
本明細書に記載された方法に係る好ましい実施形態において、花粉を生成することができる栽培レタス植物体の種子と、花粉を生成することができないか、または受粉に先立って花粉が除去されるレタス植物体（除雄されるか、または、除雄される予定のレタス植物体）の種子とが、互いに近接して植えられており、本明細書に記載された受粉処理の使用によって交雑種のレタス植物体の生産が可能となる。花粉の生産が可能で花粉の提供に使用されるレタス植物体は、近交系かＦ１系統かのいずれかであり得、かつ、交雑植物において求められる特性を有するか、または、所望の特性を有する交雑植物を生産することが想定される遺伝子型を有する、ラクツカ・サティバまたはラクツカ・セリオラの全ての種類であり得る。
【００２７】
除雄されたレタス植物体は、花粉が除去されるか、または生産されないレタス植物体である。葯を取り除くか、または、花粉を洗い流すために葯に霧状の水を吹き付けることによって、花粉を除去することができる。霧吹きの処理は、確実に交雑を行うことができる花粉除去方法として実証済みの、有効な方法である。日の出から約６０分〜９０分後に交雑に使う花を選択する。選択の基準は、開花した花であって、柱頭が現れており、一つの柱頭に花粉が付着しているのが見えるもの（約１０〜２０の柱頭）である。通常のスプレーボトルの水３、４プッシュを用いて、花粉粒を取り除くのには十分な、しかし、花柱を傷つけない程度の圧力で、花粉を洗い流す。清潔なペーパータオルで余分な水をふき取る。約３０分後、花柱が再びぴんと立ち、柱頭の２つの葉部（ｌｏｂｅ）がＶ型に開いているのが見える。当業者にとって公知のいかなる方法を用いても葯を取り除くことができる。ある方法では、未開花の葯錐体の側面をピンセットでつまみ、葯をまっすぐ引っ張り出す。
【００２８】
交雑種のレタス種子および植物体を生産するために、花粉を生成しない（または、微量の花粉を生成する）レタス系統を利用することも可能である。そのような除雄された植物体は雄性不稔性レタス植物体でもあり得る。雄性不稔性は、細胞性、遺伝性、細胞質遺伝性、機能性であってもよいし、または、自家不和合性に起因するものであってもよい。そのような除雄された植物体は、雌性レタス植物体または雄性不稔性の植物体としても知られている。花粉を生成する植物体は、雄性植物体としても知られている。雄性不稔性のレタス系統も入手可能である。例えば、米農務省サリーナスカリフォルニア研究施設のＥｄｗａｒｄ  Ｒｙｄｅｒ博士から、雄性不稔性系統ＭＳ７  Ｘ  Ｓａｌｉｎａｓ８８，ＢＣ４が入手可能である。ＭＳ７は、Ryder、Genetic Studies in Lettuce (Lactuca sativa L.)、J. Amer. Soc. Hort. Sci. (1971) 96(6): 826-828において最初に記述された。
【００２９】
栽培レタス種との交雑によってさらなる雄性不稔性系統を生産するために、ＭＳ７  Ｘ  Ｓａｌｉｎａｓ８８，ＢＣ４を利用することができる。例えば、Ｆ１種子を生産するために、ＭＳ７Ｘ  Ｓａｌｉｎａｓ８８，ＢＣ４と、アイスバーグ、ロメイン、レッドリーフ、セリオラまたはグリーンリーフ栽培種とを交雑することができる。ある実施形態において、Ｆ１種子を植えつけ、挿し木を取って、組織培養において維持する。開花段階で、不稔性植物体の区別をできる。不稔性植物体を組織培養において増加させる。組織培養された植物体を土壌に移し、そこで開花段階まで育て、その後、花粉生産を行う花と交雑して種子を生産する。種子を収穫する。収穫した種子を植え、そこからできた植物体をさらに選別し、均質性および所望の特質のために不良の変種を取り除く。雄性不稔性雌性系統の同型接合性を高めるために、付加的な戻し交配を行うことができる。この処理を繰り返すことができる。そのような雄性不稔性系統が安定し均質のものになれば、本明細書に記載された方法を用いて、花粉生産を行う近交系レタス植物体と交雑することによって交雑レタスを生産する雄性不稔性植物体として、これらの系統を使用することができる。
【００３０】
＜栽培レタス植物体の種子の植え付け＞
好ましい実施形態において、交雑種のレタス種子を生産するのに用いられる栽培レタス植物体の種子を、花の咲く他の作物から十分に離れた距離（または、異なる時期）に植えつける。これは、ハキリバチ属のハチがレタスではなく他の花を好む可能性を最小限にするためである。ハキリバチ属のハチがレタス以外の花の種類を好むとしたら、レタス植物体の受粉率が下がる可能性がある。
【００３１】
好ましい実施形態において、雌性（除雄されたか、または雄性不稔性である）植物体が、雄性（花粉を生成する）植物体の割合よりも高くなるように栽培レタス植物体の種子を植える。レタス植物体は、一般的に列をなして生育させる。ある実施形態において、雄性対雌性が交互の列で１：１であるか、または、列において、雄性対雌性が１：２である。
【００３２】
＜受粉媒介者＞
本明細書に詳述するように、特定のハチを使用することによって、雄性不稔性（雌性）レタス植物体の受粉が促進される。本明細書に記載された方法は、ハキリバチ種のハチを放すステップを含む。好ましくは、ハチはメガチレ・ロツンダタ、メガチレ・プグナタ、または、メガチレ・レラティヴァである。理論に縛られることは望ましくないが、ハキリバチ種のハチの行動形態によって効果的に受粉ができるため、この種のハチは本発明の方法に特に有効であると考えられる。例えば、好ましい温度下において、ハキリバチ種は、レタスが開花しており受粉が可能な朝の短時間の間、活動する。さらに、ハキリバチ種は小型で敏捷なハチなので、開花したレタス植物体の茎および枝にある粘着質の厚い乳液（ｌａｔｅｘ）に邪魔されることがないと考えられる。また、小型なので、ハチは小さいレタスの花の奥深くにエサを探しにいくことができ、その結果受粉を生じさせることができる。ハキリバチ種はレタスの花の上にエサを探しにいき、雄性不稔性の花と雄性稔性の花とで選り好みをしないことが観察されている。加えて、ハキリバチ種は毎夕自らの巣に戻るので、放されても他の場所に飛び去ってしまうことがない。さらに、それらはミツバチのように互いに意思疎通をすることがないので、花粉／花蜜がより豊富なエサ場を探して大群で飛び去ってしまう可能性が低い。
【００３３】
ハキリバチ属のハチは単独行動のハチ、すなわち、雌の各が卵を産み、自分の巣部屋を作るハチである。ハキリバチ属のハチは単独行動ではあるが、同種の他のハチの近くに住むことを好む群生のハチでもある。
【００３４】
ハキリバチ属のハチは乾燥した日当たりの良い気候を好むので、一般的に約７４°Ｆ〜８０°Ｆまたはそれ以上の気温下で受粉を行う。これらのハチは気温の低い曇りの日や雨の日にはあまり受粉を行わない。ハキリバチ属のハチの養蜂方法は十分に確立されているので、比較的ローコストでサナギを購入することができる。
【００３５】
カナダおよびアイダホ州などの西アメリカの商業供給業者からハキリバチ属のハチを手に入れているインターナショナル・ポリネーション・システムズ株式会社からそれらのハチを入手することができる。一般的に、ハキリバチ属のハチは、葉室に包まれた高齢幼虫（ｌａｔｅ  ｉｎｓｔａｒ  ｌａｒｖａｅ）のときに納品される。室は、一般的にガロン量で販売され、１ガロンで約１０，０００室を含む。高品質の室では、約８０％のハチが羽化する。ハキリバチ属のハチの室は一般的に、４０°Ｆ（４℃）で、網のトレイに保管されるか、または、通気孔を設けたパイントのガラス・ジャーに保管される。ハチの羽化を減らさないようにするために、約３．８ｃｍ以下の層内に室を保つ必要がある。というのも、室の深みが大きくなると過熱状態になり、室の層の底にいる幼虫が死ぬからである。受粉に関して米農務省のウェブサイトに記載されているように、全てのハチが羽化するまで、約３０日間ハチの室を温める必要がある。そのような保温は、一般的にインキュベータ内で行われる。
【００３６】
ハチによるあるレタス植物体から他への花粉運搬が最適化されるように、ハチの放飼の時期を決める。好ましくは、レタス植物体が成熟し、初期の開花段階でハチを放す。ハチが環境に慣れて有効な受粉媒介者になるまでに一定期間かかるので、受粉に最適な時期の開始の少し前にハチを放すべきである。
【００３７】
既定のレタス植物体の近くにハチを放す。ハチがレタスに到達し、あるレタス植物体から別のレタス植物体へ花粉を運搬するために移動することが可能な、花粉を有するレタス植物体からの距離にハチを放してもよい。この距離は、ハチの巣箱から植物体までの距離が約０から２００フィートであってもよい。特定の実施形態において、距離は約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、約７６、約７７、約７８、約７９、約８０、約８１、約８２、約８３、約８４、約８５、約８６、約８７、約８８、約８９、約９０、約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、約１００、約１０１、約１０２、約１０３、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１１０、約１１１、約１１２、約１１３、約１１４、約１１５、約１１６、約１１７、約１１８、約１１９、約１２０、約１２１、約１２２、約１２３、約１２４、約１２５、約１２６、約１２７、約１２８、約１２９、約１３０、約１３１、約１３２、約１３３、約１３４、約１３５、約１３６、約１３７、約１３８、約１３９、約１４０、約１４１、約１４２、約１４３、約１４４、約１４５、約１４６、約１４７、約１４８、約１４９、約１５０、約１５１、約１５２、約１５３、約１５４、約１５５、約１５６、約１５７、約１５８、約１５９、約１６０、約１６１、約１６２、約１６３、約１６４、約１６５、約１６６、約１６７、約１６８、約１６９、約１７０、約１７１、約１７２、約１７３、約１７４、約１７５、約１７６、約１７７、約１７８、約１７９、約１８０、約１８１、約１８２、約１８３、約１８４、約１８５、約１８６、約１８７、約１８８、約１８９、約１９０、約１９１、約１９２、約１９３、約１９４、約１９５、約１９６、約１９７、約１９８、約１９９、および、約２００フィートである。好ましくは、日中常に日が当たる南向きにハチの巣板を設置する。
【００３８】
レタス植物体の成長を支え、かつ、ハチが花粉を運搬するのに十分な時間活動できる全ての環境において、ハチを放すことができる。放飼の一般的な環境は、オープンフィールドか、または網の張ったケージや温室などの閉鎖された区域を含む。上記環境の温度は、レタスの花の開花時期に少なくとも約７４°Ｆに達するものである。
【００３９】
全ての環境において、ハチが他の種類の他の植物の間ではなく、あるレタスから別のレタスへ花粉を運搬するような状況にする必要がある。好ましくは、ハチの放飼場所は、ハチを誘引する他の植物から離れた場所にある、および／または、ハチを誘引する他の植物の割合が低い場所である。
【００４０】
ハチの放飼の回数および頻度は、受精が行われるのに十分な受粉を確保するほどハチの密度が十分に高くなっている必要がある。好ましくは、十分な量のＦ１レタス種子を生産するのに十分高い密度である。好ましくは、ハチの密度が約１００，０００匹／エーカーである。ハチの密度が好適なレベルを下回る場合、ハチを追加して放す。
【００４１】
放飼の好適な頻度は、具体的な環境によって異なる。例えば、網のケージおよびフィールドの条件下では、週単位で群れでハチを放すのが好ましい。放飼するハチの数もまた、具体的な環境によって異なる。例えば、約２エーカーのオープンフィールドにハチを放すとき、開花時期を通じて少なくとも約２００，０００匹のハキリバチ属のハチの個体群を維持する必要がある。
【００４２】
＜交雑種のレタス種子＞
交雑種のレタス品種の育成および栽培において、雄性不稔性系統を利用してもよい。雌性親個体の雄性不稔性（花粉の欠如）は、自家の花粉と外部の花粉との間の競争を最小限に抑えるので、Ｆ１交雑種の種子の生産率を高める。雄性親個体（花粉を生成する植物体）からの花粉がハキリバチ属のハチを介して雌性（雄性不稔性）親個体の無花粉柱頭に運ばれるときに、Ｆ１種子が生産される。
【００４３】
ある実施形態において、雄性稔性のレタス植物体の種子と、雄性不稔性のレタス植物体の種子とを交互の列にして土壌に植える。レタスが抽台し、花をつけるように、生育させる。開花の初期段階において、雄性不稔性の列から不良個体を取り除き、分離された雄性稔性植物体を雄性不稔性系統の列から除去する。複合花内部の花粉の存在によって、雄性稔性植物体を識別する。ある構成において、フィールドの縁の地面から高められ、かつ、巣の筒の開口部が南を向くように、ハキリバチ属のハチの巣箱を柱の上に置く。ある構成において、フィールドの北側に沿って約１００フィート毎に巣箱を設置する。一般的に、ハキリバチ属のハチの最初の放飼は、１００，０００匹／エーカーと同等の密度になるように設計されている。雄性不稔性植物体の開花時期を通してこの密度を維持するように、ハキリバチ属のハチを追加で放すことができる。一旦雄性不稔性植物体において開花が終わると、種子の汚染を防ぐためにフィールドから雄性稔性植物体を取り除く。種子を結実させ、植物体を十分に乾燥させてから、雄性不稔性レタスの花から生産されたＦ１種子を収穫する。Ｆ１種子を洗浄し、処理して植え、Ｆ１交雑レタス植物体を生産する。
【００４４】
雄性不稔性系統を用いることで、自家受精を減らすために親のうちの一つを除雄する必要がなくなる。例えば、柱頭から花粉を洗い流し、除粉された雌性系親に手作業で花粉を移動させる代わりに、手作業かハキリバチ属のハチを用いるかのいずれかによって雄性不稔性親個体に花粉を運搬する単一のステップで交雑種種子の生産が可能となる。ある実施形態において、本明細書に記載されたような近交雄性不稔性系統および他の近交花粉生産系統を供給し、ハキリバチ属のハチを放して近交の花粉生産を行う雄性系親から雄性不稔性雌性系統に花粉を運搬することによって、交雑種のレタス植物体が生産される。
【００４５】
ある実施形態において、本発明は、本明細書に記載された方法の利用によって得られた交雑種レタス種子およびそれから得られた植物体である。花粉を有するレタス植物体と除雄された植物体とが供給され、ハキリバチ属のハチが放される。ハチが、花粉を有するレタス植物体から除雄された植物体に花粉を運搬する。受精によってＦ１交雑種種子が生産される。これらＦ１種子から交雑種レタス植物体が成長する。
【００４６】
Ｆ１交雑種レタス植物体は、遺伝的に異なる二つの系統の花を異花受粉させた後の第一子世代から生産されたレタス植物体である。好ましい実施形態において、交雑種レタス植物体は、親植物体と比べてよりよい成長パラメータを有する植物体、すなわち雑種強勢を有する植物体である。最も好ましくは、交雑種レタス植物体は、親系統より頭部の平均重量が重い植物体である。頭部の重量の増加は、約１１０%、約１００%、約９０%、約８０%、約７０%、約６０%、約５０%、約４０%、約３０%、約２０%、または約１０%であり得る。他の実施形態において、植物体は、エーカー毎の頭部収量が向上した植物体であり、または、ポンド総量あるいはトン総量という観点において、生重量が増加した植物体である。
【００４７】
＜交雑種の植物体を生産するためのハキリバチ属のハチの誘引＞
ハキリバチ属のハチを誘引するステップを含むレタスの受粉方法および交雑種のレタスの生産方法もまた、提供される。ハキリバチ属のハチを誘引するステップは、栽培レタスの受粉方法における唯一のステップであってもよいし、または、栽培レタスの受粉方法における複数のステップのうちの一つであってもよい。例えば、レタスの受粉を行うための方法は、ハキリバチ属のハチの放飼、ハキリバチ属のハチの誘引、またはそれらの組み合わせであり得る。
【００４８】
ハキリバチ属のハチを特定の場所に誘引するために当業者が用いるあらゆる方法によって、ハキリバチ属のハチをレタスに誘引することができる。例えば、ハキリバチ属のハチに対して誘因性があるとされるアルファルファなどの植物をレタスの近くで育てることができる。また、ハキリバチ属のハチを誘引する植物組成物を含む植物抽出産物を、レタスの近くか、またはレタスに接触させて置くことができる。レタス植物体が開花するとき、ハキリバチ属のハチがレタス植物体に集中するように、アルファルファの花を切り落とす（ｄｉｓｋ  ｄｏｗｎ）ことができ、または、植物産物を取り除くことができる。レタス植物体の上にそのような植物産物を吹き付けることも可能である。巣板や巣用の筒などのハチが好む環境を作り出すことによって、野生のハキリバチ属のハチも誘引し得る。
【００４９】
ある実施形態において、雄性稔性レタス植物体の種子と雄性不稔性レタス植物体の種子とを交互の列にしてフィールドに植え、ハキリバチ属のハチをおびき寄せるためにアルファルファを生垣の列にしてフィールドに植える。抽台し、花をつけるように、レタス植物体を生育させる。開花の第一段階において、雄性不稔性の列の不良個体を取り除き、分離された雄性稔性植物体を雄性不稔性系統の列から取り除く。複合花の内部に花粉があるかによって、雄性稔性植物体を識別する。雄性不稔性植物体において一旦開花が終ると、種子の汚染を防ぐためにフィールドから雄性稔性植物体を取り除く。種子を結実させてから植物体を十分に乾燥させ、雄性不稔性レタスの花から生産されたＦ１種子を収穫する。Ｆ１種子を、洗浄、処理し、植え付けて、Ｆ１交雑種レタス植物体を生産する。
【００５０】
下記の実施例を参照することによって、本説明がよりよく理解できるであろう。本明細書に引用する文献はすべて、参照することによって本明細書に取り込まれている。
【００５１】
〔実施例〕
＜実施例１：レタスの虫媒の可能性に関する対照研究＞
エサ探しおよびレタスの花の受粉に関する潜在的効果について、下記の昆虫種をテストした。
【００５２】
【表１】
2009539409.tif 000002
【００５３】
下記の野生種のハチについて、レタスの花の上でエサ探しを行うのが観察された。
【００５４】
【表２】
2009539409.tif 000003
【００５５】
ケージ内か、またはオープンフィールド条件下で、開花した雄性稔性レタス植物体および雄性不稔性レタス植物体に対して虫媒実験を行った。一般的に、５０個以下の開花する植物体を含む小区画か、またはケージに限定して実験を行った。午前中、各小区画に一連の昆虫種を放して観察した。レタスの花は一般的には、毎朝午前７時〜午後１２時半までの特定の期間、約１〜２時間開花するだけなので、昆虫の朝の活動が重要である。気候条件および具体的なレタスの種類によって、開花時期および開花の持続時間が異なる。
【００５６】
放飼および観察を行ったハチは、ハキリバチであるメガチレ・レラティヴ（Ｍｅｇａｃｈｉｌｅ  ｒｅｌａｔｉｖｅ）、商業的に“Ｍａｃｈｏ  Ｐｏｌ”として知られる雄のマルハナバチであるボンバス・インパティエンス（Ｂｏｍｂａｓ  ｉｍｐａｔｉｅｎｓ）の雄、一般的なミツバチであるアピス・メリフェラ（Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）、および、ミヤマクロバエのカリフォラ・ボミトリア（Ｃａｌｌｉｐｈｏｒａ  ｖｏｍｉｔｏｒｉａ）種である。周りを囲った環境、およびオープンフィールドにおいて昆虫の活動を観察した。これらの夏期実験期間の観察によると、観察対象の昆虫は確実な受粉を全く行わず、エサ探しをせず、さらには、レタスの花に全く興味を示さなかった。オープンフィールドでの観察において、レタスの花を訪れた昆虫は全くいなかった。ケージ内での観察でも同様の結果が得られ、昆虫の大半がケージから逃げようとしているのが観察された。カリフォルニア州サリーナスバレーの隔離された研究施設において、通年で２回の夏期虫媒実験を行った。
【００５７】
＜実施例２：レタスの虫媒の可能性に関するより広範囲の対照研究＞
実施例１と同様の実験をより広い範囲で再度行った。カリフォルニア州サンタクルーズ郡の隔離された研究施設において、約２分の１エーカーにレタスを植えて、開花させた。放飼および観察を行ったハチは、アルファルファハキリバチであるメガチレ・ロツンダタ、雄のマルハナバチであるボンバス・インパティエンスの雄、ミツバチであるアピス・メリフェラ、および、ミヤマクロバエのカリフォラ・ボミトリア種である。これら同じ昆虫についても、周りを囲った環境で観察した。フィールドおよびケージ内の観察によると、前回と同様に、放飼された昆虫の中でエサ探しに関心を示す虫はおらず、また、レタスの花に受粉をした虫はいなかった。アルファルファハキリバチは巣の筒から出なかったので、飛んでいる姿が一度も観察されなかった。
【００５８】
＜実施例３：より温暖な気候における虫媒の潜在的効果に関する対照研究：ケージ内およびフィールド研究＞
中央カリフォルニア沿岸水域の気候はレタスの商業生産には理想的であるが、レタス種子生産の理想よりはるかに涼しすぎると考えられる。さらなる研究においては、理想的な虫の活動に、より高い温度が必要であることがわかった。特にハキリバチ属のハチについては明らかであった。
【００５９】
そのため、より温暖な気候のサンウォーキン渓谷に場所を変更して受粉研究を行った。雄性稔性の開花するレタス植物体と雄性不稔性の開花するレタス植物体との両方を用いて、オープンフィールドおよびケージ内におけるより広範な受粉実験を再び行った。第４年の春および夏に、２．５エーカーのレタス植物体の近接植え付けが行われた。５月上旬に初めの１．５エーカーが移植され、６月中旬に二回目が行われた。観察対象の植物体の開花時期を長くするために、時期をずらして植える必要がある。各植え付けは、雄性不稔性植物体の交互の苗床上に小区画があった。これら小区画は、各、約１００個の植物体を含んでおり、全フィールドにわたってランダムに配置された。雄性不稔性植物体の各小区画は、両側に雄性稔性植物体の列を有する。実験に使用した雄性不稔性系統は、稔性に関して５０／５０で分離するので、毎日、最初の開花時に、花粉の有無によって間引きをおこなった。雄性不稔性の小区画内で花粉を有するものは全て取り除いた。
【００６０】
この同じ生産区域において、１０フィート×１０フィート×８フィートのケージ２つを組み立て、各、約５０ポットのレタス植物体で満たした。各ケージは２５個の雄性不稔性の植物体、および２５個の雄性稔性の植物体を収容した。
【００６１】
上記生産地において下記の観察を行い、記録した。
【００６２】
（スクリーンケージ研究）
アルファルファハキリバチ：６月１３日、木の巣板の中で、５，０００匹のアルファルファハキリバチ（メガチレ・ロツンダタ）が孵化を始めた。同年６月２８日、５，０００匹のアルファルファハキリバチ（ＡＬＢ：alfalfa leafcutting bee）の第二群が始まった。７月１２日、西ケージにおいて第一群をスクリーンケージに放した。７月２０、東ケージにおける隣接のケージに第二群を放した。孵化の温度は６２°Ｆから９８°Ｆの範囲であった。雄ハチは、３７６度日（基準６０°Ｆ）後に第一板から羽化し始め、３８４度日後に第二板から羽化し始めた。
【００６３】
雄および雌のアルファルファハキリバチが花を訪れるのが観察された。雌ハチは花の周りを旋回しながら花を口吻で探っていた。いくつかの花を訪れた後、おそらくは植物体から染み出た乳液が原因で、雌は頻繁に休止して数分間身づくろいをしていた。
【００６４】
７月１６日、２匹の雌のアルファルファハキリバチが花を訪れているのが観察された。ハチが花毎に費やした時間は平均１１．５秒（ｎ＝９）であり、一つの花の上で費やす時間は４．２秒から２５．０秒の範囲であった。７月２３日、２分間隔でアルファルファハキリバチを観察したところ、１分当たりに訪れた花は平均４．６個（ｎ＝１０）であった。
【００６５】
８月２４日、アルファルファハキリバチ（ＡＬＢ）が訪れた後に標識を付けた雄性不稔性の花２４個について、結実があるか調べた。雌のＡＬＢが訪れた花は、平均５．６種子（ｎ＝１６、０〜１８の幅）であり、雄のＡＬＢが訪れた花は、平均１０．０種子（ｎ＝４、０〜１７の幅）であった。
【００６６】
７月２１日頃に西ケージは開花時期が終わり、７月３０日頃に東ケージが終った。東のケージは、ケージの半分（西側）を布で覆って日陰を作り、日中遅くに受粉媒介者用に追加の花を与えるためにラベンダーの鉢を置いた。これらの努力によって、ケージ内のハキリバチの寿命が延びたと考えられる。
【００６７】
オスミア・カリフォルニカ（Ｏｓｍｉａ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）：オスミア・カリフォルニカは、キク科の多くの種類を訪れる野生種である。休眠状態の成体を含む葦をユタ州の業者から手に入れた。５つの葦に関する培養テストによると、培養の２日後に雄が羽化を始めた。雌は６日後に羽化し始めた。これら５つの葦において、合計３６匹のハチがいた（１つの葦につき、７．２匹）。それらのうち、１９匹が羽化した（５２%）。この種に関しては一部が羽化することは普通のことである。一部が一年目に羽化し、残りが次の年に羽化する。
【００６８】
第４年の７月１２日、西ケージにオスミア・カリフォルニカの２０の葦（約１４４匹のハチ）を放した。第４年の７月１６日、東ケージに４０の葦（約２８８匹のハチ）を置いた。第４年の７月１４日、１匹のオスミア・カリフォルニカが花を訪れているのが観察された。オスミア・カリフォルニカハチがケージ内で死んでいるのが発見された。数匹は羽化したが、ケージ内の生き残りの数は少なかった。
【００６９】
ミヤマクロバエ：アイダホ州から、ミヤマクロバエ（カリフォラ・ボミトリア）の蛹を手に入れた。第４年の７月２３日、東ケージに蛹３カップ（５１００匹のハエ）を設置し、西ケージに１カップ（１７００匹のハエ）を設置した。第４年の７月２５日に、ケージ内でハエを観察したが、殆どが花を訪れていなかった。それらのハエを花の上で見かけたとき、蜜を探しているようではなかった。それらのハエは無関心で、大型ケージでの受粉媒介者としては役に立たないと考えられた。
【００７０】
マルハナバチ：クラスＣのマルハナバチ（ボンブス・インパティエンス；Ｎａｔｕｐｏｌ）の１コロニーを手に入れ、７月２３日に東ケージにおける柵の支柱に取り付けた。マルハナバチがケージの周りを飛んでいるのが観察され、試験継続中生存していた。おそらく、コロニーで供給されるエサを糧にしていたのだろう。時々、マルハナバチが花を訪れるのが観察され、数匹のマルハナバチが後脚に花粉を付けているのが見られた。第４年の７月３０日、脚に花粉をつけた１匹のマルハナバチが、２分間で２７個の花（１分当たり１３．５個の花）を訪れているのが観察された。しかし、そのハチは雄性稔性の花のみを訪れていた。殆どのマルハナバチがケージから逃げようとしていることがわかった。
【００７１】
（フィールド研究）
アントフォラ・ウルバナ（Ａ．ｕｒｂａｎａ）：サンウォーキン渓谷の区域でアントフォラ．ウルバナを観察した。９月２９日、一個体が４０秒間で９個の花（１分間で１３．５個の花）を訪れた。
【００７２】
メリソデス・スピーシーズ（Ｍｅｌｉｓｓｏｄｅｓ  ｓｐ）：サンウォーキン渓谷の区域でメリソデスの個体が発見された。８月２４日、一個体が２分間で９個の花（１分当たり４．５個の花）を訪れているのが観察された。
【００７３】
ミツバチ：サンウォーキン渓谷の区域（３エーカー）の隣に、ミツバチのコロニー６０個を設置した。個体数の多さにも関わらず、レタスフィールドにおいてエサを探すハチの数はまばらだった。９月２９日、ミツバチが１分間で平均１５．６個の花（ｎ＝３、１分当たり１０．３〜１９．５個の花の幅）を訪れているのが観察された。
【００７４】
アルファルファハキリバチ：南向きのフィールドにおける北端に沿った３つのシェルター内にＡＬＢを投入した。８月３１日、９月７日、９月１０日および９月２２日に、５０００匹のハチを放した。これらのＡＬＢの群れは、２０日、２０日、１６日、および２１日間それぞれインキュベートされていた。ＡＬＢは、レタスの花の上でエサを探し、切断した葉および花粉を持った雌が巣箱に戻るのが観察された。しかし、フィールドで発見された個体密度は低かった。９月２９日、ＡＬＢが１分毎に平均３．７個の花を訪れているのが観察された（ｎ＝４（雌雄各２匹）、１分当たり３．０〜４．７個の花の幅）。雄性稔性植物体は、雄性不稔性植物体よりも早く花を閉じるという傾向があった。雄性稔性植物体が花を閉じた後、開花している雄性不稔性の花の上でエサ探している雄および雌のＡＬＢを見つけるのは困難ではなかった。
【００７５】
オスミア・カリフォルニカ：第４年の８月３１日、９月７日、９月１０日および９月２２日に、約７５の葦（２８０匹のハチ）をフィールドに設置した。巣を作るか、またはエサ探しをしているオスミア・カリフォルニカは１匹も観察されなかった。
【００７６】
ミヤマクロバエ：ＡＬＢ放飼と同じ日に、ＡＬＢの巣の中にミヤマクロバエの蛹を放した。フィールドでエサ探しをしているミヤマクロバエは一匹もいなかった。
【００７７】
他の野生種：フィールドでエサ探しをする数匹のハナアブが観察された。また、オオアメリカモンキチョウ（コリアス・オイテメ（Ｃｏｌｉａｓ  ｅｕｙｔｈｅｍｅ））が多数飛んでおり、レタスの花を訪れていた。
【００７８】
（要約）
アルファルファハキリバチは、スクリーンケージ内とフィールド条件との両方において、雄性不稔性の花を含むレタスの花の上で活発にエサ探しを行うことが示された。最良の結果を得るために、週毎にＡＬＢを群れで投入する必要がある。フィールドでは、より多数のハチ（例えば、１エーカーあたり５０，０００匹以上）を使用すべきであり、他の誘因性の植物からは離れた場所に配置するのが好ましい。
【００７９】
＜実施例４：雄性不稔性系統の生産＞
米農務省サリーナスカリフォルニア研究施設所属のＥｄｗａｒｄ  Ｒｙｄｅｒ博士から、ＭＳ７  Ｘ  Ｓａｌｉｎａｓ８８，ＢＣ４系統の種子２５０粒を得た。ＭＳ７は、Ryder, Genetic Studies in Lettuce (Lactuca sativa L.), J. Amer. Soc. Hort. Sci. (1971) 96(6): 826-828に最初に記述されている。
【００８０】
プロジェニー・アドバンスド・ジェネティクスから、モニュメント（Ｍｏｎｕｍｅｎｔ）、サンデビル（Ｓｕｎ  Ｄｅｖｉｌ）およびアイコン（Ｉｃｏｎ）レタス種子が市販されている。モニュメント、サンデビル、アイコン、およびプロジェニー・アドバンスド・ジェネティクスの他のレタス種の種子を開花段階まで育て、ＭＳ７  Ｘ  Ｓａｌｉｎａｓ８８，ＢＣ４の植物体と交雑させ、モニュメント、サンデビル、アイコン、および他の雄性不稔性Ｆ１種子を生産した。
【００８１】
モニュメント、サンデビルおよびアイコンＦ１雄性不稔性レタス種子を植えた。モニュメント、サンデビルおよびアイコン雄性不稔性植物体を育成し、切断部分を採って組織培養で維持した。開花段階で、不稔性植物体を識別した。それから、不稔性植物体を組織培養で殖やした。組織培養された植物体を土壌に移し、そこで開花段階まで育て、モニュメント、サンデビルおよびアイコンならびに他の対応する花粉生産植物体からできたモニュメント、サンデビルおよびアイコン花粉と戻し交配を行い、種子を生産した。種子を収穫した。
【００８２】
収穫した種子を植えて、得られた植物体をさらに選別し、均等化および好適な特性のために不良個体を取り除く。モニュメント、サンデビル、アイコンおよび他の系統に対して付加的に行う戻し交配は、雄性不稔性母系系統の同型接合性を高め、ＢＣ１、ＢＣ２、ＢＣ３、ＢＣ４、ＢＣ５（ＢＣ＝戻し交配（backcross））種子を生産するために行った。
【００８３】
＜実施例５：ハキリバチ属のレタス植物体受粉に関する追加研究＞
実施例３に記載したように、ハキリバチ属のハチはスクリーンケージ内でレタス種子を受粉させることができる。オープンフィールドにおいてハキリバチ属のハチを有効に利用できるかどうかは明らかではなかった。そのため、オープンフィールドにおいてハキリバチ属のハチが交雑種レタス種子を受粉するかどうか、さらに、良好な結実を生むのに必要なハチのレベルを決定するために、実験を行った。
【００８４】
実施例４に概説したように雄性不稔性系統を育成した。雄性不稔性および雄性稔性系統の種子を植えて実生まで育成した。カリフォルニア州サンウォーキンバレーおよびカリフォルニア州サンファンバウティスタのフィールドに雄性不稔性および雄性稔性植物体を移植した。この移植は、雄性不稔性と雄性稔性とを交互の列にし、東から西へと延びる８つの列に及んだ。北２列には雄性稔性植物体を植え、その次に雄性不稔性植物体の列を植えた。列４および５は、雄性稔性植物体であり、列６および７は雄性不稔性であった。最南にある列８には雄性稔性レタス植物体を植えた。また、雄性不稔性系統は、雄性稔性について５０／５０で分離した。開花の初期段階で、不稔性の列から不良個体を取り除き、花粉を生成する植物体を除去した。
【００８５】
カリフォルニア州サンウォーキンバレーおよびサンファンバウティスタに研究用地を置いた。サンウォーキンバレーフィールド用地は、互いに３０インチ離れた８列で構成されている帯状の中にある１エーカーの広さのフィールドであった。このフィールドの１００フィート区域をケージで囲った（２０００平方フィート、または０．０４６エーカー）。サンファンバウティスタ用地は、１４４平方フィート（０．００６６エーカー）のケージ２つで構成されていた。カナダの業者からハチを購入している、アイダホ州のインターナショナル・ポリネーション・システムズ株式会社から５００，０００匹のハキリバチ属のハチを手に入れた。それらのうち２７０，０００匹は分離した室（ｌｏｏｓｅ  ｃｅｌｌ）であり、２３０，０００匹を木製の巣板内に置いた。
【００８６】
（ハチの準備）
テスト用の昆虫を収容するために、３０ｆｔ×１００ｆｔ×７０ｆｔのケージをフィールドの一部に建設した。ケージは、１００フィート全８列の植え付けに及んだ。追加のハキリバチ属のハチを導入し、下記の観察を行った。
【００８７】
４月１９日、カリフォルニアにハチが到着した。木製の巣板をガレージ内に室温で保管し、一方、分離した室を冷蔵庫内で保管した。
【００８８】
ハキリバチ属のハチ（アルファルファハキリバチ）の成長閾値は６０°Ｆである。言い換えれば、保護覆い（ｃｏｃｏｏｎｓ）が６０°Ｆを下回る場合、ハチは休眠状態にあり、６０°Ｆを超えると成長し始める。アルファルファハキリバチの成長を促す最適温度は８６°Ｆである。一終日８６℃にすることによって、ハチは２６度日獲得する。アルファルファハキリバチ（ＡＬＢ）に関して、一度日とは、ハチが、６０度Ｆのインキュベーション温度またはそれ以上の温度にある日数である。８６°Ｆにおいて、ＡＬＢの雄は羽化するのに平均１９．４日（５０４度日）を必要とし、ＡＬＢの雌は平均２１．５日（５５９度日）を必要とする。
【００８９】
５月６日に木製の巣板をハチのインキュベーション室に移動させる前に、１６０度日すなわち６．２日のインキュベーション日数を蓄積した。ハチのインキュベーション室は、２つの小型空調設備を備えており、外気温がしばしば１０５°Ｆに到達する７月に、室温を６６°Ｆ未満に維持することができた。これらの温度下でハチを維持し、ハチを必要とする約１週間前まで、徐々に度日を蓄積し、それから温めてその必要なときにインキュベートを完了させることができると考えられた。
【００９０】
５月２０日（８６°Ｆでのインキュベーションの第７日付近の表示）、プテロマルス（ｐｔｅｒｏｍａｌｕｓ）寄生虫が羽化し始め、６月２日（インキュベーション第１２日の表示）、ハキリバチ属のハチが羽化し始めた。７月６日（第１６日の表示）、最初の雄のアルファルファハキリバチ（ＡＬＢ）が見つかった。８月２９日、最初のハチをインキュベーターから取り除いた（４６００匹のハチをサンファンバウティスタに放した）。
【００９１】
（フィールドおよびケージへのハチの放飼）
８月３１日、サンウォーキンバレー用地の８つのシェルター内で、１００，０００匹のハチを放した。そのシェルターのうち２つはスクリーンケージ内にあった。９月２日、さらに１００，０００匹をサンウォーキンバレー用地に運搬した。そのとき、残りの木製の巣板をサンプリングし、生存しているハチが殆どいないことがわかった。そのほとんどが羽化は完了していたが、巣穴の中かインキュベーターの床の上で死んでいた。
【００９２】
９月３日、分離した室からの１３５，１００匹のハチをサンウォーキンバレーに運んだ。フィールドに１０１，３００匹を放し、ケージ内に３３，８００匹を放した。これらのハチの放飼は計画よりも早かったが、本ケースでは、木製の巣板から孵化するハチが殆どいないと想定された。これらのハチは、他のハチより遅い時期に、アイダホ・インターナショナル・ポリネーション・システムズ株式会社から出荷され、アイダホで予め温められていた。それらのハチのうち２０〜３０％が死滅していたと想定された。これらのハチは直ちに羽化し始め、雄および雌のハチがフィールドの花の上にいるところ、さらに、シェルター内の巣に帰っているところが容易に発見できた。
【００９３】
しかし、９月７日まで、放飼されたハチの殆どが活動していなかった。この時点で、ケージ外のレタスの２つの大区画およびケージ内全範囲を削減し、レタス植物体が１〜２週間以内に開花するように植物体を配置しなおすことにした。
【００９４】
９月１４日、１１３，７００匹のハチを放した（フィールドに９６，３００匹、ケージ内に１７，４００匹）。また、サンファンバウティスタケージの各に５，４００匹のハチを放した。
【００９５】
９月１９日、サンウォーキンバレーにおいて、フィールドに１０，７００匹のハチ、ケージ内に４，０００匹のハチを追加した。９月１４日および１９日に放されたハチは、最高のプレ・インキュベーションおよびインキュベーション条件であったので、これらの放飼によって最良の飛行および受粉活動を行うと予想された。９月２８日、飛行活動はすばらしいものであった。複数のＡＬＢが巣を出て、飛行し、レタスの花の上でエサ探しを行い、花粉を付けて巣に戻っていることが観察された。また、多くの雌雄のハチがレタスの花を訪れているのが観察された。ＡＬＢは雄性不稔性と雄性稔性の花とで選り好みをしているように見えなかった。９月２１日頃、多数のアルファルファハキリバチが雄性不稔性植物体の花の上で観察された。
【００９６】
１０月５日、ＡＬＢの受粉活動は依然としてすばらしいものだった。１３匹の異なるＡＬＢの雌が２分間毎に観察され、１分間平均７．１の花を訪れているのが見られた（１分間当たり、最低＝４、最高＝１４）。
【００９７】
合計約１７７，９００匹のハチがフィールドに放され（１エーカー当たり１８７，０００匹）、４５，１００匹のハチがケージ内に放された（１エーカー当たり９０２，０００匹）。概要を表１に示す。
【００９８】
【表３】
2009539409.tif 000004
【００９９】
（結果の概要）
結実を判断するために植物体を観察した。調査された全ての雄性不稔性系統の全区画において、ケージ、オープンフィールドともに、交雑種種子の生産が非常に優れたものであることが観察された。
【０１００】
ＡＬＢはレタスについて非常に有効な受粉媒介者であり、雄性不稔性の花に花粉がなくても関係ないと考えられる。
【０１０１】
オープンフィールドにおいて、ＡＬＢをレタスの受粉に利用できる。
【０１０２】
開花時期における週単位のＡＬＢの放飼は受粉率を高めるのに有効なストラテジーである。
【０１０３】
週当たり１００，０００匹／エーカーのハチという家畜密度が有効な受粉に最適である。
【０１０４】
夏期、特に晩夏の放飼が必要な場合、ＡＬＢの成長を止めるためにはそれらを６０°Ｆ未満で飼育する必要がある。
【０１０５】
＜実施例６：本発明の方法によって生産されるレタス交雑種の比較テスト＞
Ａ００５×ＰＭ５００４、Ａ００６×ＰＭ５００４、Ａ００９×ＰＭ５０２３のように、雄性不稔性系統と近交系とを交雑することによって交雑種種子を生産した。ＰＭ５０２３、Ａ００９およびＡ００５は実施例４に示すように生産されたプロジェニー・アドバンスド・ジェネティックス・アイスバーグレタス雄性不稔性研究系統である。Ａ００６は実施例４に示すように生産されたモニュメント雄性不稔性系統である。ＰＭ５００４は、セミニス・ベジタブル・シーズ（Ｓｅｍｉｎｉｓ  Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ  Ｓｅｅｓ）から入手可能なカナリーロウ（Ｃａｎｎｅｒｙ  Ｒｏｗ）雄性稔性（花粉生産）系統である。
【０１０６】
サンウォーキンバレーのオープンフィールド種子生産作物（ｓｅｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｃｒｏｐ）において、交雑種種子を生産した。フィールドには、雄性稔性レタス植物体と雄性不稔性レタス植物体とを交互に植えた。長い開花時期の一ヶ月の間、３つの異なるときにハキリバチを放した。フィールド全体で複数の区域にハチの巣を設置し、木板と発泡スチロール板との組合せたもの、および、ハキリバチを収容している分離した室を巣の中に設置した。活動中のハキリバチの数の多さを維持するために、開花中に３回、追加の板および分離した室を加えた。ハキリバチは通常午前半ば、気温が７４度に達した後で巣およびシェルターから出てきており、レタスの花はおよそ１時間開花していた。その後、ハキリバチが巣から飛んで行き、雄性不稔性の花と雄性稔性の花の両方の上でエサ探しを行うのが観察された。このエサ探しの間に、ハキリバチは雄性稔性（花粉生産）植物体の花から雄性不稔性植物体の花へ花粉を運搬した。このメカニズムによって受粉が起こり、交雑種種子が生産された。最初のハキリバチの放飼から約３週間で、雄性不稔性植物体において結実が見られた。ハキリバチの最初の放飼から約１ヶ月でレタスの開花時期が終わり、種子が成熟可能となった。成熟した種子を手摘みした。
【０１０７】
交雑種種子Ａ００５×ＰＭ５００４、Ａ００６×ＰＭ５００４、Ａ００９×ＰＭ５０２３およびそれぞれの親個体は、比較分析のためにガウン（ｇｏｗｎ）であった。カリフォルニア州サリーナスバレーにおいて、反復試験のための植え付けを２回行った。
【０１０８】
交雑種種子および親品種を各試験で３回、各反復で４０植物体複製した。各小区画は、４０インチ中心の揚床上にあり、長さ２０フィート、揚床毎に２列の種子の列である。植物体が１２インチ間隔となるように間引いた。全小区画を同様に処理した。
【０１０９】
各小区画（各種子列から５つ）から、１０個の連続した植物体を切断し、最も近いグラムまで個々の植物体の重量を測り、最も近い４分の１インチまで頭囲を測定した。下記の表２〜７に研究結果を示す。
【０１１０】
表２は、ＰＭ５００４親種と比較したＡ００５×ＰＭ５００４交雑種の相対的な頭部重量および頭囲を示す。ＰＭ５００４親種と比較して、Ａ００５×ＰＭ５００４交雑種の頭部重量は３３．２%、３５．８%および３７．７%増加していた。
【０１１１】
表３は、Ａ００５親種と比較したＡ００５×ＰＭ５００４交雑種の相対的な頭部重量および頭囲を示す。Ａ００５親種と比較して、Ａ００５×ＰＭ５００４交雑種の頭部重量は３１．４%、２９．０%および２０．１%増加していた。
【０１１２】
表４は、Ａ００６親種と比較したＡ００６×ＰＭ５００４交雑種の相対的な頭部重量および頭囲を示す。Ａ００６親種と比較して、Ａ００６×ＰＭ５００４交雑種の頭部重量は５５．６%、５２．３%および２７．０%増加していた。
【０１１３】
表５は、ＰＭ５００４親種と比較したＡ００６×ＰＭ５００４交雑種の相対的な頭部重量、頭囲および芯の長さを示す。ＰＭ５００４親種と比較して、Ａ００６×ＰＭ５００４交雑種の頭部重量は３６．４%、２８．５%および１９．２%増加し、芯の長さは２６．２%、２８．３%および１０．９%増加していた。
【０１１４】
表６は、ＰＭ５０２３親種と比較したＡ００９×ＰＭ５０２３交雑種の相対的な頭部重量および頭囲を示す。ＰＭ５０２３親種と比較して、Ａ００９×ＰＭ５０２３交雑種の頭部重量は３４．１%、３７．４%および４６．１%増加していた。
【０１１５】
表７は、Ａ００９親種と比較したＡ００９×ＰＭ５０２３交雑種の相対的な頭部重量および頭囲を示す。Ａ００９親種と比較して、Ａ００９×ＰＭ５０２３交雑種の頭部重量は２２．９%、３１．９%および５５．７%増加していた。
【０１１６】
【表４】
2009539409.tif 000005
【０１１７】
【表５】
2009539409.tif 000006
【０１１８】
【表６】
2009539409.tif 000007
【０１１９】
【表７】
2009539409.tif 000008
【０１２０】
【表８】
2009539409.tif 000009
【０１２１】
【表９】
2009539409.tif 000010
【国際調査報告】
2009539409.tif 000011
2009539409.tif 000012