(57)【要約】  （Ｉ）増幅される少なくとも１つの標的核酸の領域を同定および／または選択ステップと、ここで、前記領域が、平均増幅効率（ＡＥ）よりも高いＡＥを有し、（ＩＩ）選択される領域にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを設計するステップとを、任意の順序で含む核酸検出のための少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを設計する方法が提供される。（ｉ）少なくとも１つの生体試料を提供するステップと、（ｉｉ）生体試料中に含まれる核酸を増幅するステップと、（ｉｉｉ）生体試料中に標的核酸が存在する場合、少なくとも１つの標的核酸にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを提供するステップと、（ｉｖ）前記オリゴヌクレオチドを増幅された核酸に接触させ、標的核酸にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを検出するステップとを含む少なくとも１つの標的核酸を検出する方法もまた、提供される。具体的には、本方法は、少なくとも１つのヒト生体試料中の、少なくとも１つの病原体、例えばウイルスの存在を検出するためのものである。プローブは支持体、例えばマイクロアレイ上に配置してもよい。
2009504153.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ｉ）増幅される少なくとも１つの標的核酸の少なくとも１つの領域を同定および／または選択するステップと、ここで、領域が平均増幅効率（ＡＥ）よりも高いＡＥを有し、
（ＩＩ）同定および／または選択された領域にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを設計するステップと
を任意の順序で含む、核酸検出のための少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを設計する方法。
【請求項２】
選択される領域のＡＥが、フォワードプライマーｒiが位置ｉに結合することができ、リバースプライマーｒjが標的核酸の位置ｊに結合することができる確率である、増幅効率スコア（ＡＥＳ）として計算され、および｜ｉ−ｊ｜が、増幅されることが所望される標的核酸の領域である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
｜ｉ−ｊ｜が１００００ｂｐ以下である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
｜ｉ−ｊ｜が１０００ｂｐ以下である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
｜ｉ−ｊ｜が５００ｂｐ以下である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（Ｉ）が、幾何学的増幅バイアスまたは標的核酸の各位置の効果を判定すること、および平均増幅効率（ＡＥ）よりも高いＡＥを有する領域として増幅される少なくとも１つの領域を選択することを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
幾何学的増幅バイアスがＰＣＲバイアスである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
選択される領域にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、以下の基準：
（ａ）選択されたオリゴヌクレオチドは、４０％〜６０％のＣＧ含有量を有する；
（ｂ）オリゴヌクレオチドは、隣接モデルに基づいて計算される、最も高い自由エネルギーを有することによって選択される；
（ｃ）標的核酸ｖaおよびｖbのオリゴヌクレオチドｓaおよびオリゴヌクレオチドｓbサブストリングを仮定すると、ｓaはｓaと標的核酸ｖb由来の任意の長さｍのサブストリングｓbとの間のハミング距離ならびに／またはｓaおよびオリゴヌクレオチドｓbの最も長い共通するサブストリングに基づいて選択される；
（ｄ）標的核酸ｖaに特異的な長さｍの任意のオリゴヌクレオチドｓaについて、標的核酸と異なる核酸のいずれの領域ともいかなるヒットも有さない場合、オリゴヌクレオチドｓaが選択され、長さｍのオリゴヌクレオチドｓaが標的核酸と異なる核酸とヒットを有する場合、最も小さい最大アライメント長および／または最少の数のヒットを有する長さｍのオリゴヌクレオチドｓaが選択される；ならびに
（ｅ）ｐiが、増幅された標的核酸の位置ｉにハイブリダイズすると予測される場合、標的核酸の位置ｉのオリゴヌクレオチドｐiが選択される
の少なくとも１つに従って選択および設計される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
Ｐ（ｐi｜ｖa）＞λであり、式中λが０．５であり、Ｐ（ｐi｜ｖa）が、ｐiが標的核酸ｖaの位置ｉにハイブリダイズする確率である場合、基準（ｅ）に基づいて、標的核酸ｖaの位置Ｉのオリゴヌクレオチドｐiが選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
λが０．８である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
【数１】
2009504153.tif 000064
であり、式中Ｘはｖaの全てのオリゴヌクレオチドの増幅効率スコア（ＡＥＳ）値を表す確率変数であり、ｋはｖa中のオリゴヌクレオチドの数であり、ｃiはＡＥＳ値がｘi以下であるオリゴヌクレオチドの数である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
選択および／または設計されるオリゴヌクレオチドを調製するステップをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
（ｉ）少なくとも１つの生体試料を提供するステップと、
（ｉｉ）生体試料中に含まれる核酸を増幅するステップと、
（ｉｉｉ）生体試料中に標的核酸が存在する場合、少なくとも１つの標的核酸にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを提供するステップと、ここで請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法に従って前記オリゴヌクレオチドが設計および／または調製され、
（ｉｖ）前記オリゴヌクレオチドを増幅された核酸と接触させるステップおよび／または標的核酸にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを検出するステップと
を含む、少なくとも１つの標的核酸を検出する方法。
【請求項１４】
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
増幅ステップが、少なくとも１つのランダムフォワードプライマーおよび／または少なくとも１つのリバースランダムプライマーの存在下で行われる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
増幅ステップがＲＴ−ＰＣＲである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
位置ｉに結合しているフォワードランダムプライマーおよび標的核酸ｖaの位置ｊに結合しているリバースランダムプライマーが、
【数２】
2009504153.tif 000065
の標的核酸ｖaの各位置ｉについての増幅効率スコア（ＡＥＳI）を有するプライマーの間で選択され、
式中、
【数３】
2009504153.tif 000066
であり、Ｐf（ｉ）およびＰr（ｉ）は、それぞれ、フォワードプライマーおよびリバースプライマーとしてランダムプライマーｒiがｖaの位置ｉに結合する確率であり、１００００ｂｐ以下であるＺは、増幅されることが所望されるｖaの領域である、請求項２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
増幅ステップが、フォワードおよびリバースプライマーを含み、フォワードおよびリバースプライマーのそれぞれが、５’−３’配向で、不変のプライマー頭部および可変のプライマー尾部を含み、少なくとも可変の尾部が、標的核酸ｖaの一部にハイブリダイズする、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
増幅ステップが、配列番号１のヌクレオチド配列またはそのバリアントもしくは誘導体を有するフォワードおよび／またはリバースランダムプライマーを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
検出される標的核酸が、生体試料の核酸にとって外因性の核酸である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
検出される標的核酸が、少なくとも、病原体ゲノムまたはその断片である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
病原体核酸が、少なくとも、ウイルス、寄生生物、もしくは細菌由来の核酸、またはその断片である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
生体試料がヒトから得られ、標的核酸が生体試料中に存在する場合、前記標的核酸はヒト由来でない、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
プローブが不溶性支持体上に配置される、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
不溶性支持体がマイクロアレイである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
検出ステップ（ｉｖ）において、ｖaにハイブリダイズするプローブのシグナル強度の平均値が、ｖaに含まれないプローブの平均値よりも統計的に高く、それによって生体試料中のｖaの存在が示される、請求項１３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
検出ステップ（ｉｖ）において、ｖaにハイブリダイズするプローブのシグナル強度の平均値が、ｖaに含まれないプローブの平均値よりも統計的に高いことを特徴とし、高いシグナル強度を有する検出方法において使用されるプローブの割合に対する、高いシグナル強度を有しｖaに含まれないプローブの割合の相対的差異を計算するステップをさらに含む請求項１３〜２５のいずれか一項に記載の方法であって、プローブｖaのシグナル強度の密度分布が、ｖaに含まれないプローブのものよりも正に歪んでおり、それによって生体試料中のｖaの存在が示される方法。
【請求項２８】
検出ステップ（ｉｖ）において、生体試料中の少なくとも１つの標的核酸の存在が、０．１以下のｔ検定の値および／または０．０５以下のアンダーソン・ダーリン検定値および／または１．０以上の重み付きカルバック・ライブラー情報量の値によって示される、請求項１３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
ｔ検定値が０．０５以下である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
重み付きカルバック・ライブラー情報量の値が５．０以上である、請求項２８または請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
検出ステップ（ｉｖ）が、重み付きカルバック・ライブラー（ＷＫＬ）情報量スコア：
【数４】
2009504153.tif 000067
の分布を計算することによって、標的核酸ｖaについての各サインプローブセット（ＳＰＳ）におけるプローブのシグナル強度を評価することを含み、式中、Ｑa（ｊ）は瓶ｂjに見られるＰaにおけるプローブのシグナル強度の累積分布関数であり、
【数５】
2009504153.tif 000068
は瓶ｂjに見られる
【数６】
2009504153.tif 000069
におけるプローブのシグナル強度の累積分布関数であり、Ｐaはウイルスｖaのプローブのセットであり、
【数７】
2009504153.tif 000070
である、請求項１３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
標的核酸ｖaの非存在を表す各サインプローブセット（ＳＰＳ）が、正規分布したシグナル強度および／または５より小さい重み付きカルバック・ライブラー（ＷＫＬ）情報量スコアを有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
少なくとも１つの標的核酸ｖaの存在を表す各サインプローブセット（ＳＰＳ）が、正に歪んでいるシグナル強度分布および／または５より大きい重み付きカルバック・ライブラー（ＷＫＬ）情報量スコアを有する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ＷＫＬスコアの分布に関してアンダーソン・ダーリン検定を行うことをさらに含み、Ｐ＞０．０５の結果が、それによって標的核酸ｖaの非存在を示す、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
ＷＫＬスコアの分布に関してアンダーソン・ダーリン検定を行うことをさらに含み、Ｐ＜０．０５の結果が、それによって、標的核酸ｖaの存在を示す、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
さらなるアンダーソン・ダーリン検定が行われ、それによってさらなる重感染している標的核酸の存在が示される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも１つの標的核酸ｖaに対する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションを検出することを含み、ｖaにハイブリダイズするプローブのシグナル強度の平均値がｖaに含まれないプローブの平均値よりも統計的に高く、それによってｖaの存在が示される、少なくとも１つの標的核酸ｖaの存在を判定する方法。
【請求項３８】
ｖaにハイブリダイズするプローブのシグナル強度の平均値が、ｖaに含まれないプローブの平均値よりも統計的に高く、高いシグナル強度を有する検出方法において使用されるプローブの割合に対する、高いシグナル強度を有するｖaに含まれないプローブの割合の相対的差異を計算するステップをさらに含み、プローブｖaのシグナル強度の密度分布がｖaに含まれないプローブのものより正に歪んでおり、それによってｖaの存在が示される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
少なくとも１つの生体試料中の少なくとも１つの標的核酸の存在が、０．１以下のｔ検定の値および／または０．０５以下のアンダーソン・ダーリン検定値および／または１．０以上の重み付きカルバック・ライブラー情報量の値によって示される、請求項３７または請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ｔ検定値が０．０５以下である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
重み付きカルバック・ライブラー情報量の値が５．０以上である、請求項３９または請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
（ｉ）少なくとも１つの生体試料を提供するステップと、
（ｉｉ）生体試料中に含まれる少なくとも１つの核酸を増幅するステップと、
（ｉｉｉ）生体試料中に標的核酸が存在する場合、少なくとも１つの標的核酸にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを提供するステップと、
（ｉｖ）プローブを増幅された核酸と接触させ、標的核酸にハイブリダイズしたプローブを検出するステップと、ここで、ｖaにハイブリダイズするプローブのシグナル強度の平均値が、ｖaに含まれないプローブの平均値よりも統計的に高く、それによって生体試料中のｖaの存在が示されるステップと
を含む、少なくとも１つの標的核酸を検出する方法。
【請求項４３】
ステップ（ｉｖ）において、ｖaにハイブリダイズするプローブのシグナル強度の平均値が、ｖaに含まれないプローブの平均値よりも統計的に高いことを特徴とし、高いシグナル強度を有する検出方法において使用されるプローブの割合に対する、高いシグナル強度を有するｖaに含まれないプローブの割合の相対的差異を計算するステップをさらに含む請求項４２に記載の方法であって、プローブｖaのシグナル強度の密度分布が、ｖaに含まれないプローブのものよりも正に歪んでおり、それによって生体試料中のｖaの存在が示される、方法。
【請求項４４】
ステップ（ｉｖ）において、少なくとも１つの生体試料中の少なくとも１つの標的核酸の存在が、０．１以下のｔ検定の値および／または０．０５以下のアンダーソン・ダーリン検定値および／または１．０以上の重み付きカルバック・ライブラー情報量の値によって示される、請求項４２または請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ｔ検定値が０．０５以下である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
重み付きカルバック・ライブラー情報量の値が５．０以上である、請求項４４または請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
検出される標的核酸が、生体試料の核酸にとって外因性の核酸である、請求項３７〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
検出される標的核酸が、少なくとも１つの病原体ゲノムまたはその断片である、請求項３７〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
病原体核酸が、ウイルス、寄生生物、もしくは細菌由来の少なくとも１つの核酸、またはその断片である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
生体試料がヒトから得られ、標的核酸が、生体試料中に存在する場合、ヒトゲノム由来でない、請求項３７〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
少なくとも１つのプローブが、不溶性支持体上に配置される、請求項３７〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
支持体がマイクロアレイである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
（Ｉ）増幅される少なくとも１つの標的核酸の少なくとも１つの領域を同定および／または選択する、ここで、前記領域が平均増幅効率（ＡＥ）よりも高いＡＥを有する、ならびに
（ＩＩ）同定および／または選択される領域にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを設計する
ように構成された、核酸検出のための少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを設計するための装置。
【請求項５４】
選択される領域のＡＥが、フォワードプライマーｒiが位置ｉに結合することができ、リバースプライマーｒjが標的核酸の位置ｊに結合することができる確率である、増幅効率スコア（ＡＥＳ）として計算され、および｜ｉ−ｊ｜が、増幅されることが所望される標的核酸の領域である、請求項５３に記載の装置。
【請求項５５】
｜ｉ−ｊ｜が１００００ｂｐ以下、１０００ｂｐ以下、または５００ｂｐ以下である、請求項５４に記載の装置。
【請求項５６】
ステップ（Ｉ）が、幾何学的増幅バイアスまたは標的核酸の各位置の効果を判定すること、および平均増幅効率（ＡＥ）よりも高いＡＥを有する領域として増幅される少なくとも１つの領域を選択することを含む、請求項５３〜５５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項５７】
幾何学的増幅バイアスがＰＣＲバイアスである、請求項５６に記載の装置。
【請求項５８】
選択される領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドが、以下の基準：
（ａ）選択されたオリゴヌクレオチドが、４０％〜６０％のＣＧ含有量を有する；
（ｂ）オリゴヌクレオチドが、隣接モデルに基づいて計算される最も高い自由エネルギーを有することによって選択される；
（ｃ）標的核酸ｖaおよびｖbのオリゴヌクレオチドｓaおよびオリゴヌクレオチドｓbサブストリングを仮定すると、ｓaがｓaと標的核酸ｖb由来の任意の長さｍのサブストリングｓbとの間のハミング距離および／またはｓaおよびオリゴヌクレオチドｓbの最も長い共通するサブストリングに基づいて選択される；
（ｄ）標的核酸ｖaに特異的な長さｍの任意のオリゴヌクレオチドｓaについて、標的核酸と異なる核酸のいずれの領域ともいかなるヒットも有さない場合、オリゴヌクレオチドｓaが選択され、長さｍのオリゴヌクレオチドｓaが標的核酸と異なる核酸とヒットを有する場合、最も小さい最大アライメント長および／または最少の数のヒットを有する長さｍのオリゴヌクレオチドｓaが選択される；ならびに
（ｅ）標的核酸の位置ｉの少なくとも１つのオリゴヌクレオチドｐiが、ｐiが、増幅された標的核酸の位置ｉにハイブリダイズすると予測される場合に選択される
の少なくとも１つに従って選択および／または設計される、請求項５３〜５７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項５９】
Ｐ（ｐi｜ｖa）＞λであり、式中λが０．５であり、Ｐ（ｐi｜ｖa）が、ｐiが標的核酸ｖaの位置ｉにハイブリダイズする確率である場合に、基準（ｅ）に基づいて、標的核酸ｖaの位置ｉのオリゴヌクレオチドｐiが選択される、請求項５８に記載の装置。
【請求項６０】
λが０．８である、請求項５９に記載の装置。
【請求項６１】
【数８】
2009504153.tif 000071
であり、式中Ｘはｖaの全てのオリゴヌクレオチドの増幅効率スコア（ＡＥＳ）値を表す確率変数であり、ｋはｖa中のオリゴヌクレオチドの数であり、ｃiはＡＥＳ値がｘj以下であるオリゴヌクレオチドの数である、請求項５３〜６０のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６２】
構成が、選択および／または設計されたオリゴヌクレオチドを調製するステップをさらに含む、請求項５３〜６１のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６３】
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブおよび／またはプライマーである、請求項５３〜６２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６４】
（ｉ）少なくとも１つの生体試料を提供するステップと、
（ｉｉ）生体試料中に含まれる核酸を増幅するステップと、
（ｉｉｉ）生体試料中に標的核酸が存在する場合、少なくとも１つの標的核酸にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを提供するステップと、ここで前記オリゴヌクレオチドが、請求項５３〜６３のいずれか一項に記載の装置に従って構成されている装置に従って設計および／または調製され、
（ｉｖ）オリゴヌクレオチドを増幅された核酸と接触させる、および／または標的核酸にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを検出するステップと
のいずれか１つのステップを含む、少なくとも１つの標的核酸を検出するよう構成された装置。
【請求項６５】
増幅ステップが、少なくとも１つのランダムフォワードプライマーおよび／または少なくとも１つのリバースランダムプライマーの存在下で行われる、請求項５３〜６４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６６】
増幅ステップがＲＴ−ＰＣＲである、請求項５３〜６５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６７】
位置ｉに結合しているフォワードランダムプライマーおよび標的核酸ｖaの位置ｊに結合しているリバースランダムプライマーが、
【数９】
2009504153.tif 000072
の標的核酸ｖaの各位置ｉについての増幅効率スコア（ＡＥＳI）を有するプライマーの間で選択され、式中、
【数１０】
2009504153.tif 000073
であり、Ｐf（ｉ）およびＰr（ｉ）は、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして、ランダムプライマーｒiがｖaの位置ｉに結合する確率であり、１００００ｂｐ以下であるＺは増幅されることが所望されるｖaの領域である、請求項５３〜６６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６８】
増幅ステップが、フォワードおよびリバースプライマーを含み、フォワードおよびリバースプライマーのそれぞれが、５’−３’配向で、不変のプライマー頭部および可変のプライマー尾部を含み、少なくとも可変の尾部は、標的核酸ｖaの一部にハイブリダイズする、請求項５３〜６７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６９】
増幅ステップが、配列番号１のヌクレオチド配列またはそのバリアントもしくは誘導体を有するフォワードおよび／またはリバースランダムプライマーを含む、請求項５３〜６８のいずれか一項に記載の装置。
【請求項７０】
検出される標的核酸が、生体試料の核酸にとって外因性である少なくとも１つの核酸である、請求項５３〜６９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項７１】
検出される標的核酸が、少なくとも１つの病原体ゲノムまたはその断片である、請求項５３〜６９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項７２】
病原体核酸が、ウイルス、寄生生物、もしくは細菌由来の少なくとも１つの核酸、またはその断片である、請求項７１に記載の装置。
【請求項７３】
生体試料がヒトから得られ、標的核酸が生体試料中に存在する場合、前記標的核酸がヒト由来でない、請求項５３〜７２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項７４】
少なくとも１つのプローブを配置する少なくとも１つの不溶性支持体を含む、請求項５３〜７３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項７５】
不溶性支持体がマイクロアレイである、請求項７４に記載の装置。
【請求項７６】
検出ステップ（ｉｖ）において、ｖaにハイブリダイズするプローブのシグナル強度の平均値が、ｖaに含まれないプローブの平均値よりも統計的に高く、それによって生体試料中のｖaの存在が示される、請求項６４〜７５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項７７】
検出ステップ（ｉｖ）において、ｖaにハイブリダイズするプローブのシグナル強度の平均値が、ｖaに含まれないプローブの平均値よりも統計的に高いことを特徴とし、高いシグナル強度を有する検出方法において使用されるプローブの割合に対する、高いシグナル強度を有するｖaに含まれないプローブの割合の相対的差異を計算するステップをさらに含むよう構成された請求項６４〜７５のいずれか一項に記載の装置であって、プローブｖaのシグナル強度の密度分布がｖaに含まれないプローブのものよりも正に歪んでおり、それによって生体試料中のｖaの存在が示される、装置。
【請求項７８】
検出ステップ（ｉｖ）において、生体試料中の標的核酸の存在が、０．１以下のｔ検定の値および／または０．０５以下のアンダーソン・ダーリン検定値および／または１．０の重み付きカルバック・ライブラー情報量の値によって示される、請求項６４〜７５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項７９】
ｔ検定値が０．０５以下である、請求項７８に記載の装置。
【請求項８０】
重み付きカルバック・ライブラー情報量の値が５．０以上である、請求項７８または請求項７９に記載の装置。
【請求項８１】
検出ステップ（ｉｖ）が、重み付きカルバック・ライブラー（ＷＫＬ）情報量スコアの分布：
【数１１】
2009504153.tif 000074
を計算することによって、標的核酸についての各サインプローブセット（ＳＰＳ）におけるプローブのシグナル強度を評価することを含み、式中Ｑa（ｊ）は瓶ｂjに見られるＰaにおけるプローブのシグナル強度の累積分布関数であり、
【数１２】
2009504153.tif 000075
は瓶ｂjに見られる
【数１３】
2009504153.tif 000076
におけるプローブのシグナル強度の累積分布関数であり、Ｐaはウイルスｖaのプローブのセットであり、
【数１４】
2009504153.tif 000077
である、請求項６４〜７５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項８２】
標的核酸の非存在を表す各サインプローブセット（ＳＰＳ）が、正規分布したシグナル強度および／または５より小さい重み付きカルバック・ライブラー（ＷＫＬ）情報量スコアを有する、請求項８１に記載の装置。
【請求項８３】
少なくとも１つの標的核酸の存在を表す各サインプローブセット（ＳＰＳ）が、正に歪んでいるシグナル強度分布および／または５より大きい重み付きカルバック・ライブラー（ＷＫＬ）情報量スコアを有する、請求項８１に記載の装置。
【請求項８４】
ＷＫＬスコアの分布に関してアンダーソン・ダーリン検定を行うことをさらに含み、Ｐ＞０．０５の結果が、それによって標的核酸の非存在を示す、請求項８１〜８３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項８５】
ＷＫＬスコアの分布に関してアンダーソン・ダーリン検定を行うことをさらに含み、Ｐ＜０．０５の結果が、それによって標的核酸の存在を示す、請求項８１〜８３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項８６】
さらなるアンダーソン・ダーリン検定が行われ、それによってさらなる重感染している標的核酸の存在が示される、請求項８５に記載の装置。
【請求項８７】
少なくとも１つの電子記憶媒体上で構成が記憶される、請求項５３〜８６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項８８】
請求項１〜５２のいずれか一項に記載の方法を行うよう構成された、コンピュータプログラム製品。
【請求項８９】
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを設計するためおよび／または少なくとも１つの標的核酸を検出するために、ＷＫＬ情報量スコアおよび／またはアンダーソン・ダーリン検定を判定するよう構成されたソフトウエアを含む、コンピュータプログラム製品。
【請求項９０】
ＷＫＬ、アンダーソン・ダーリン検定、オリゴヌクレオチドプローブの設計、オリゴヌクレオチドプライマーの設計、および／または標的核酸の検出が、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の方法に従って定義される、請求項８９に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項９１】
請求項１〜５２のいずれか一項に記載の方法を行うよう構成されたソフトウエアを含む、取り外し可能な電子記憶媒体。
【請求項９２】
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを設計するため、オリゴヌクレオチドプライマーを設計するため、および／または少なくとも１つの標的核酸を検出するために、ＷＫＬ情報量スコアおよび／またはアンダーソン・ダーリン検定を判定するよう構成されたソフトウエアを含む、取り外し可能な電子記憶媒体。
【請求項９３】
ＷＫＬ、アンダーソン・ダーリン検定、オリゴヌクレオチドプローブの設計、オリゴヌクレオチドプライマーの設計、および／または標的核酸の検出が、請求項１〜５２のいずれか一項に従って定義される、請求項９２に記載の取り外し可能な電子記憶媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴヌクレオチド設計および／または核酸検出の分野に関する。本発明の方法、装置および／または製品は、病原体の検出、例えばウイルスの検出のために使用してもよい。
【背景技術】
【０００２】
ヒト患者および集団におけるウイルス性および細菌性病原体の正確かつ迅速な検出は、医学的および疫学的に非常に重要である。歴史的に、診断技術は、細胞培養継代および種々の免疫学的アッセイまたは染色手順に依存してきた。感染性疾患因子の正確かつ感度の高い検出は、この分野における進歩の長い歴史にもかかわらず、現在でも依然として困難である。疾患症状から診断までの遅れの問題、およびこれらの手法による微生物の検出限界にもかかわらず、微生物学研究室において、培養および抗体ベースの検出の典型的な方法は、依然として中心的な役割を果たしている。感染のより速い診断によって、例えばより早期の適切な抗菌治療の実施によって、罹患率および死亡率が減少し得る。過去数十年間で、これを達成するための種々の方法が提案されており、ＰＣＲおよびマイクロアレイベースの技術を含む核酸検出に基づくものが、最も見込みがあると思われている。具体的には、ＰＣＲベースのアッセイが実施されて、より高い検出感度で疑いのある病原体をより迅速に診断することが可能になった。しかしながら、臨床上の実施において、病原因子は、しばしば未確認のままであり、無数の様式で検出を免れる。例えば、いくつかのウイルスは、培養を施行できない。またある時には、患者の試料は、従来の技術による病原体検出には、質が悪過ぎるか、または力価が不十分である場合がある。さらに、ＰＣＲベースおよび抗体ベースの手法はともに、ＰＣＲプライマー結合部位の変化および抗原連続変異を生じる天然の遺伝子多様化だけのために、疑いのある病原体を認識できない場合がある。
【０００３】
複数の病原体を並行して検出する能力を有するＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドマイクロアレイが記載されてきた（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｕｒｉｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。しかしながら、未解決の技術的問題によって、臨床設定におけるそれらの日常的な使用が妨げられている。例えば、増幅およびクロスハイブリダイゼーションによるアーチファクトに照らして病原体の「サイン」を比較するための最も情報を与えるプローブをどのようにして選択するか？どのレベルの蛍光シグナルおよびサインプローブによって、病原体が検出されるか？最適化された検出アルゴリズムの精度および感度は何か？（Ｓｔｒｉｅｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｂｏｄｒｏｓｓｙ  ａｎｄ  Ｓｅｓｓｉｔｓｃｈ，２００４；Ｖｏｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【０００４】
したがって、この技術の分野において、核酸の検出の代替的および改良された方法が必要である。具体的には、病原体の検出のための代替的および／または改良された診断方法が必要とされる。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、上述の問題を扱い、具体的には、オリゴヌクレオチド設計の方法、装置および／または製品を提供する。具体的には、オリゴヌクレオチドプローブおよび／またはプライマー設計の方法、装置および／または製品が提供される。核酸検出の方法、装置および／または製品もまた提供される。
【０００６】
第一の態様によると、本発明は、
（Ｉ）増幅される少なくとも１つの標的核酸の少なくとも１つの領域を同定および／または選択するステップと、ここで、領域が平均増幅効率（ＡＥ）よりも高いＡＥを有し、
（ＩＩ）選択された領域にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを設計するステップと
を任意の順序で含む、核酸検出のための少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを設計する方法を提供する。
【０００７】
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのプローブおよび／またはプライマーであってもよい。具体的には、ステップ（Ｉ）において、ＡＥのスコアは、標的核酸またはその少なくとも１つの領域の範囲上の各位置ｉについて判定され、次いで、平均ＡＥスコアが得られる。平均よりも高いＡＥスコアを示す領域を、増幅される標的核酸の領域として選択してもよい。具体的には、選択される領域のＡＥは、増幅効率スコア（ＡＥＳ）として計算してもよく、これは、フォワードプライマーｒiが位置ｉに結合することができ、リバースプライマーｒjが標的核酸の位置ｊに結合できる確率であり、｜ｉ−ｊ｜は、増幅されることが所望される標的核酸の領域である。具体的には、領域｜ｉ−ｊ｜は１００００ｂｐ以下、より具体的には５０００ｂｐ以下、または１０００ｂｐ以下、例えば５００ｂｐ以下であってもよい。具体的には、フォワードおよびリバースプライマーは、ランダムプライマーであってもよい。
【０００８】
別の態様によると、ステップ（Ｉ）は、標的核酸の各位置についての幾何学的増幅バイアスの効果を判定すること、および平均増幅効率（ＡＥ）よりも高いＡＥを有する領域として増幅される少なくとも１つの領域を選択することを含む。例えば、幾何学的増幅バイアスは、ＰＣＲバイアスである。
【０００９】
ステップ（Ｉ）で選択される領域にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを設計するステップ（ＩＩ）は、当分野で公知の任意のオリゴヌクレオチド設計技術に従って行ってもよい。具体的には、選択される領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドは、以下の基準：
（ａ）選択されたオリゴヌクレオチドは、４０％〜６０％のＣＧ含有量を有する；
（ｂ）隣接モデルに基づいて計算される、最も高い自由エネルギーを有することによってオリゴヌクレオチドが選択される；
（ｃ）標的核酸ｖaおよびｖbのオリゴヌクレオチドｓaおよびオリゴヌクレオチドｓbサブストリングを仮定すると、ｓaと任意の長さｍのサブストリングｓbとの間のハミング距離に基づいて、ならびに／またはｓaおよびオリゴヌクレオチドｓbの最長の共通するサブストリングに基づいてｓaが選択される；
（ｄ）標的核酸ｖaに特異的な長さｍの任意のオリゴヌクレオチドｓaについて、標的核酸と異なる核酸のいずれの領域ともいかなるヒットも有さない場合、オリゴヌクレオチドｓaが選択され、長さｍのオリゴヌクレオチドｓaが標的核酸と異なる核酸とのヒットを有する場合、最小の最大アライメント長および／または最少の数のヒットを有する長さｍのオリゴヌクレオチドｓaが選択される；ならびに
（ｅ）ｐiが、増幅された標的核酸の位置ｉにハイブリダイズすると予測される場合、標的核酸の位置ｉのオリゴヌクレオチドｐiが選択される
の少なくとも１つに従って、選択および設計してもよい。
【００１０】
具体的には、オリゴヌクレオチドは、プローブおよび／またはプライマーであってもよい。
【００１１】
したがって、オリゴヌクレオチドを設計するために、上述の基準の２つ以上を用いてもよい。例えば、全ての基準（ａ）〜（ｅ）を適用することによって、オリゴヌクレオチドを設計してもよい。本明細書で言及されないが明らかに当業者の知識の範囲内である他の基準もまた、使用してもよい。
【００１２】
具体的には、基準（ｅ）に基づいて、Ｐ（ｐi｜ｖa）＞λであり、式中λが０．５であり、Ｐ（ｐi｜ｖa）が、ｐiが標的核酸ｖaの位置ｉにハイブリダイズする確率である場合、標的核酸ｖaの位置ｉのオリゴヌクレオチドｐiが選択される。より具体的には、λは０．８である。
【００１３】
具体的には、
【数１】
2009504153.tif 000003
であり、式中、Ｘは、ｖaの全てのオリゴヌクレオチドの増幅効率スコア（ＡＥＳ）値を表す確率変数であり、ｋはｖa中のオリゴヌクレオチドの数であり、ｃiは、ＡＥＳ値がｘi以下であるオリゴヌクレオチドの数である。
【００１４】
本発明の別の態様によると、上述のようにオリゴヌクレオチドを設計する方法は、選択および設計されたオリゴヌクレオチドを調製するステップをさらに含む。オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのプローブおよび／またはプライマーであってもよく、当分野で公知の任意の標準的な方法、例えば、化学合成またはフォトリソグラフィーによって調製してもよい。
【００１５】
別の態様によると、本発明は、
（ｉ）少なくとも１つの生体試料を提供するステップと、
（ｉｉ）生体試料中に含まれる核酸を増幅するステップと、
（ｉｉｉ）生体試料中に標的核酸が存在する場合、少なくとも１つの標的核酸にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを提供するステップと、ここで本明細書に記載される本発明の任意の態様による方法を用いることによって、前記オリゴヌクレオチドが設計および／または調製され、
（ｉｖ）前記オリゴヌクレオチドを増幅された核酸と接触させる、および／または標的核酸にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを検出するステップと
を含む、少なくとも１つの標的核酸を検出する方法を提供する。
【００１６】
具体的には、オリゴヌクレオチドはプローブである。
【００１７】
増幅ステップ（ｉｉ）は、ランダムプライマーの存在下で行ってもよい。例えば、増幅ステップ（ｉｉ）は、少なくとも１つのランダムフォワードプライマー、少なくとも１つのランダムリバースプライマーおよび／または２つより多いランダムプライマーの存在下で行ってもよい。当分野で公知の任意の増幅方法を用いてもよい。例えば、増幅方法は、ＲＴ−ＰＣＲである。
【００１８】
具体的には、位置ｉに結合しているフォワードランダムプライマーおよび標的核酸ｖaの位置ｊに結合しているリバースランダムプライマーは、標的核酸ｖaの各位置ｉについて、
【数２】
2009504153.tif 000004
の増幅効率スコア（ＡＥＳI）を有するプライマーの間から選択され、式中
【数３】
2009504153.tif 000005
であり、Ｐf（ｉ）およびＰr（ｉ）は、ランダムプライマーｒiが、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして、ｖaの位置ｉに結合することができる確率であり、１００００ｂｐ以下であるＺは、増幅されることが所望されるｖaの領域である。より具体的には、Ｚは５０００ｂｐ以下、１０００ｂｐ以下、または５００ｂｐ以下であってもよい。
【００１９】
増幅ステップは、フォワードおよびリバースプライマーを含んでもよく、フォワードおよびリバースプライマーのそれぞれは、５’−３’配向で、不変のプライマー頭部および可変のプライマー尾部を含んでもよく、少なくとも可変の尾部は、標的核酸ｖaの一部にハイブリダイズする。具体的には、増幅ステップは、配列番号１のヌクレオチド配列またはそのバリアントもしくは誘導体を有するフォワードおよび／またはリバースランダムプライマーを含んでもよい。
【００２０】
生体試料は、哺乳動物から、例えばヒトから採取された任意の試料であってもよい。生体試料は、組織、血清、鼻咽頭洗浄液、唾液、他の任意の体液、血液、尿、便等であってもよい。増幅ステップを行う前に、生体試料を処置して、生体試料中に含まれる核酸を取り除いてもよい。標的核酸は、検出されることが意図される任意の核酸であってもよい。検出される標的核酸は、少なくとも、生体試料にとって外因性の核酸であってもよい。したがって、生体試料がヒト由来である場合、検出される外因性標的核酸（生体試料中に存在する場合）は、ヒト由来でない核酸である。本発明の態様によると、検出される標的核酸は、少なくとも、病原体ゲノムまたはその断片である。病原体核酸は、少なくとも、ウイルス、寄生生物、もしくは細菌の核酸、またはその断片であってもよい。
【００２１】
したがって、本発明は、少なくとも、存在する場合、生体試料中の標的核酸の検出の方法を提供する。方法は、生体試料中の病原体の存在の検出のための診断方法であってもよい。例えば、生体試料がヒトから得られる場合、標的核酸は、生体試料中に存在する場合、ヒト由来でない。
【００２２】
本発明のいずれかの方法に従って設計および／または調製されたオリゴヌクレオチドは、溶液中で使用するか、または不溶性支持体上に配置してもよい。例えば、当分野で公知の任意の技術に従って、オリゴヌクレオチドプローブを、不溶性支持体上に塗布するか、スポットするか、または印刷してもよい。支持体は、マイクロアレイ、バイオチップ、膜／合成表面、固体支持体またはゲルであってもよい。
次いで、プローブを、生体試料の核酸と接触させ、存在する場合、標的核酸とプローブがハイブリダイズし、標的核酸の存在が検出される。具体的には、検出ステップ（ｉｖ）において、ｖaにハイブリダイズするプローブのシグナル強度の平均値は、統計的に、ｖaに含まれないプローブの平均よりも高く、それによって、生体試料中のｖaの存在が示される。
【００２３】
より具体的には、検出ステップに（ｉｖ）において、ｖaにハイブリダイズするプローブのシグナル強度の平均値は、統計的に、ｖaに含まれないプローブの平均値よりも高く、方法は、高いシグナル強度を有する検出方法において使用されるプローブの割合に対する、高いシグナル強度を有するｖaに含まれないプローブの割合の相対的差異を計算するステップをさらに含み、プローブｖaのシグナル強度の密度分布は、ｖaに含まれないプローブのものよりも正に歪んでおり、それによって、生体試料中のｖaの存在が示される。
【００２４】
例えば、検出ステップ（ｉｖ）において、そのプローブシグナル強度の密度分布が正規でない場合、すなわち、０．０５以下のアンダーソン・ダーリン検定値および／または０．１以下のｔ検定の値および／または１．０以上、好ましくは５．０以上の重み付きカルバック・ライブラー情報量の値によって示すと、より正に歪んでいる場合に、生体試料中の少なくとも１つの標的核酸が検出される。具体的には、ｔ検定値は０．０５以下である。
【００２５】
より具体的には、検出ステップ（ｉｖ）の方法は、重み付きカルバック・ライブラー（ＷＫＬ）情報量スコア：
【数４】
2009504153.tif 000006
の分布を計算することによって、標的核酸ｖaについての各病原体特異的サインプローブセット（ＳＰＳ）におけるプローブのプローブシグナル強度を評価することをさらに含み、
式中、Ｑa（ｊ）は、瓶ｂjに見られるＰaにおけるプローブのシグナル強度の累積分布関数であり、
【数５】
2009504153.tif 000007
は、瓶ｂjに見られる
【数６】
2009504153.tif 000008
におけるプローブのシグナル強度の累積分布関数であり、
【数７】
2009504153.tif 000009
は、瓶ｂjに見られる
【数８】
2009504153.tif 000010
におけるプローブのシグナル強度の累積分布関数であり、Ｐaは、ウイルスｖaのプローブのセットであり、
【数９】
2009504153.tif 000011
である。
【００２６】
例えば、標的核酸ｖaの非存在を表す各サインプローブセット（ＳＰＳ）は、正規分布したシグナル強度（０．０５以下のアンダーソン・ダーリン検定値によって評価される）および／または５より小さい重み付きカルバック・ライブラー（ＷＫＬ）情報量スコアを有する。少なくとも１つの標的核酸ｖaの存在を表す各サインプローブセット（ＳＰＳ）は、正に歪んでいるシグナル強度分布および／または５より大きい重み付きカルバック・ライブラー（ＷＫＬ）情報量スコアを有する。
【００２７】
本方法は、ＷＫＬスコアの分布に関してアンダーソン・ダーリン検定を行うことをさらに含み、Ｐ＞０．０５の結果は、それによって、標的核酸ｖaの非存在を示すか、または、Ｐ＜０．０５の結果は、それによって、標的核酸ｖaの存在を示す。また、さらなるアンダーソン・ダーリン検定を行って、それによって、さらなる重感染している標的核酸の存在を示してもよい。別の態様によると、本発明は、少なくとも１つの標的核酸ｖaへの、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブ（プローブは、当分野で公知の任意の本発明の方法に必ずしも限定されない方法に従って、選択および設計される）のハイブリダイゼーションを検出することを含む、標的核酸ｖaの存在を判定する方法を提供し、ｖaにハイブリダイズするプローブのシグナル強度の平均値は、ｖaに含まれないプローブの平均値よりも統計的に高く、それによって、ｖaの存在が示される。具体的には、ｖaにハイブリダイズするプローブのシグナル強度の平均値は、ｖaに含まれないプローブの平均値よりも統計的に高いことを特徴とし、本方法は、高いシグナル強度を有する検出方法において使用されるプローブの割合に対する、高いシグナル強度を有するｖaに含まれないプローブの割合の相対的差異を計算するステップをさらに含む方法であって、プローブｖaのシグナル強度の密度分布は、ｖaに含まれないプローブのものよりも正に歪んでおり、それによって、ｖaの存在が示される方法である。より具体的には、生体試料中の標的核酸の存在は、０．１以下のｔ検定の値および／または０．０５以下のアンダーソン・ダーリン検定値および／または１．０以上、好ましくは５．０以上の、重み付きカルバック・ライブラー情報量の値によって示される。例えば、ｔ検定値は０．０５以下であってもよい。
【００２８】
別の態様によると、本発明は、
（ｉ）少なくとも１つの生体試料を提供するステップと、
（ｉｉ）生体試料中に含まれる少なくとも１つの核酸を増幅するステップと、
（ｉｉｉ）生体試料中に標的核酸が存在する場合、少なくとも１つの標的核酸にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを提供するステップと、
（ｉｖ）前記オリゴヌクレオチドを増幅された核酸と接触させ、標的核酸にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを検出するステップと、ここで、ｖaにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドのシグナル強度の平均値が、ｖaに含まれないオリゴヌクレオチドの平均値よりも統計的に高く、それによって生体試料中のｖaの存在が示されるステップと
を含む、少なくとも１つの標的核酸を検出する方法を提供する。
【００２９】
具体的には、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドプローブである。
【００３０】
ステップ（ｉｖ）において、ｖaにハイブリダイズするプローブのシグナル強度の平均値は、ｖaに含まれないプローブの平均値よりも統計的に高いことを特徴とし、本方法は、高いシグナル強度を有する、検出方法において使用されるプローブの割合に対する、高いシグナル強度を有するｖaに含まれないプローブの割合の相対的差異を計算するステップをさらに含む方法であって、プローブｖaのシグナル強度の密度分布は、ｖaに含まれないプローブのものよりも正に歪んでおり、それによって、生体試料中のｖaの存在が示される方法である。具体的には、ステップ（ｉｖ）において、生体試料中の少なくとも１つの標的核酸の存在は、０．１以下のｔ検定の値および／または０．０５以下のアンダーソン・ダーリン検定値および／または１．０以上、好ましくは５．０以上の重み付きカルバック・ライブラー情報量の値によって示される。ｔ検定値は、０．０５以下であってもよい。検出される核酸は、生体試料の核酸にとって外因性の核酸である。検出される標的核酸は、少なくとも１つの病原体ゲノムまたはその断片であってもよい。病原体核酸は、ウイルス、寄生生物、もしくは細菌由来の少なくとも１つの核酸、またはその断片であってもよい。具体的には、試料がヒトから得られる場合、標的核酸は、生体試料中に存在する場合、ヒトゲノム由来でない。プローブは、不溶性支持体上に配置してもよい。支持体は、マイクロアレイ、バイオチップ、または膜／合成表面であってもよい。
【００３１】
本発明は、本発明の方法を行うための装置を含む本発明の装置を提供する。具体的には、装置は、核酸検出および／または増幅のためにオリゴヌクレオチドを設計するためであってもよく、装置は、増幅される少なくとも１つの標的核酸の少なくとも１つの領域を同定および／または選択するよう構成され、ここで前記領域は、平均増幅効率（ＡＥ）よりも高いＡＥを有し、同定および／または選択される領域にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが設計される。より具体的には、装置は、少なくとも１つの生体試料を提供するステップ；生体試料に含まれる核酸を増幅するステップ；生体試料中に存在する場合、少なくとも１つの標的核酸にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを提供し、オリゴヌクレオチドは、本発明に従って構成された装置に従って、設計および／または調製されるステップ；ならびにオリゴヌクレオチドを増幅された核酸と接触させる、および／または標的核酸にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを検出するステップのいずれか１つを含む少なくとも１つの標的核酸を検出するよう構成してもよい。
【００３２】
本発明はまた、本発明の方法を行うために構成された少なくとも１つのコンピュータプログラム製品を提供する。本発明の装置の構成を記憶する少なくとも１つの電子記憶媒体もまた提供される。一態様によると、本発明は、本発明の方法を行うよう構成されたソフトウエアを含む取り外し可能な電子記憶媒体を提供する。具体的には、取り外し可能な電子記憶媒体は、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブおよび／もしくはプライマーを設計するため、ならびに／または少なくとも１つの標的核酸を検出するためのＷＫＬ情報量スコアおよび／またはアンダーソン・ダーリン検定を判定するよう構成されたソフトウエアを含んでもよい。より具体的には、ソフトウエア構成を含む取り外し可能な電子記憶装置は、本発明に従って定義されるように、ＷＫＬ、アンダーソン・ダーリン検定、プローブを設計することおよび／または標的核酸を検出することを含んでもよい。したがって、上述のように構成されたソフトウエアもまた提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本明細書で言及される書誌参照は、便宜上、参考文献のリストの形態で列挙し、実施例の最後に加えている。このような書誌参照の内容全体は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００３４】
本発明は、従来技術の課題を扱い、具体的には、オリゴヌクレオチド設計の少なくとも１つの方法、装置および／または製品を提供する。具体的には、プローブおよび／またはプライマー設計の方法、装置および／または製品が提供される。核酸検出の方法、装置および／または製品もまた提供される。
【００３５】
オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションマイクロアレイを病原体の存在を判定するための手段として使用する概念は提案されているが、相当な障害が残っており、したがって、これらのマイクロアレイの日常的な使用が妨げられている（Ｓｔｒｉｅｂｅｌ，Ｈ．Ｍ．，２００３）。これらの障害としては、プローブ設計およびデータ分析が挙げられる（Ｓｔｒｉｅｂｅｌ，Ｈ．Ｍ．，２００３；Ｂｏｄｒｏｓｓｙ，Ｌ．およびＳｅｓｓｉｔｓｃｈ，Ａ．，２００４；Ｖｏｒａ，Ｇ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，２００４）。本発明者らは、細部に至るプローブ選択にもかかわらず、コンピュータ内で設計された最良のプローブは、必ずしも患者試料に十分ハイブリダイズしないことを試験的なマイクロアレイにおいて観察した。本発明者らは、患者材料に一貫して十分ハイブリダイズするプローブを作製するために、最適な設計の予測の判断材料を判定するようなプローブ設計の新規なおよび／または改良された方法を開発することが必要であることに気づいた。具体的には、実施例の部分に記載されているように、本発明者らは、３５のウイルスゲノム全体にタイリングされた重複する４０塩基長のプローブを含む、マイクロアレイを作製した。しかしながら、本発明は、この特定の適用、プローブの長さ、および標的核酸の型に限定されない。
【００３６】
本発明の特定の態様によると、本発明者らは、どのようにして、支持体、具体的にはマイクロアレイ基盤を標的核酸検出、具体的には病原体検出における実行可能な手段になるように最適化するかを説明している。本発明者らはまた、融解温度、プローブのＧＣ含有量、二次構造、ハミング距離、ヒトゲノムに対する類似性、ランダムＰＣＲ増幅効率におけるＰＣＲプライマータグの効果、および／または配列多型の効果を含むプローブ設計の予測の判断材料を同定した。プローブおよび／またはプライマー設計の方法および基準の開発に、これらの結果は考慮され、および／または組み込まれた。より具体的な態様によると、本発明者らは、病原体であるかどうかわからない標的核酸の存在を正確に予測できる、データ分析アルゴリズムを開発した。例えば、病原体は、ウイルス、細菌および／または寄生生物であってもよいが、これらに限定されない。プローブが理想的に設計されなくて、アルゴリズムを使用してもよい。この検出アルゴリズムは、プローブ設計方法論と組み合わせて予測の信頼度レベルを有意に向上させる（表６および７参照）。
【００３７】
特定の態様によると、本発明の方法は、あり得る病原体の予測を必要としない場合があるが、ほとんどの公知のヒトウイルス、細菌および／または寄生生物、ならびにいくつかの新しい種を公平に検出することができる場合がある。ゲノムまたはその断片は、生物の染色体中の全遺伝物質として定義される。特定の生物の染色体中の遺伝物質由来のＤＮＡは、ゲノムＤＮＡである。ゲノムライブラリーは、生物の全ゲノムを表すランダムに生成された重複するＤＮＡ断片の組から作製されたクローンの収集物である。本発明のこの検出基盤の背後にある論拠は、ウイルス、細菌および／または寄生生物の各種が、それらのゲノムの一次配列内に特有の分子特性を含むことである。これらの特徴的な領域の同定によって、個々の種、およびいくつかの場合、個々の系の、特異的検出のための合理的なオリゴヌクレオチドプローブ設計が可能になる。科および属のメンバーの間で最も高度に保存された領域を表すオリゴヌクレオチド（オリゴ）プローブの同時の設計および／または調製によって、いくつかの新しい病原体の検出および部分的な特徴づけが可能になる。さらに、単一の支持体中にこのようなプローブ全てを含むことによって、臨床的試料に同時に重感染している複数のウイルス、細菌および／または寄生生物の検出が可能になる場合がある。支持体は、不溶性支持体、具体的には固体支持体であってもよい（例えば、マイクロアレイまたはバイオチップアッセイ）。
【００３８】
特定の態様によると、本発明は、オリゴヌクレオチドプローブが設計される様式、ならびに／またはマイクロアレイによって生成されるデータがどのように解釈および分析されるかに依存して、診断手段として使用してもよい。
【００３９】
＜増幅効率の判定＞
第一の態様によると、本発明は、
（ｉ）増幅される少なくとも１つの標的核酸の少なくとも１つの領域を同定および／または選択するステップと、ここで、前記領域が平均増幅効率（ＡＥ）よりも高いＡＥを有し、
（ｉｉ）同定および／または選択された領域にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを設計するステップと
を任意の順序で含む、核酸検出のためのオリゴヌクレオチドプローブを設計する方法を提供する。
【００４０】
具体的には、ステップ（ｉ）において、ＡＥのスコアは、標的核酸の範囲またはその領域の各位置ｉについて判定され、平均ＡＥが得られる。増幅される標的核酸の領域として、平均よりも高いＡＥを示す領域が選択される。具体的には、選択される領域のＡＥは、フォワードプライマーｒiが位置ｉに結合することができ、リバースプライマーｒjが標的核酸の位置ｊに結合することができる確率である、増幅効率スコア（ＡＥ）として計算してもよく、および｜ｉ−ｊ｜は、増幅されることが所望される標的核酸の領域である。具体的には、領域｜ｉ−ｊ｜は、１００００ｂｐ以下、より具体的には５０００ｂｐ以下、または１０００ｂｐ以下、例えば５００ｂｐ以下であってもよい。具体的には、フォワードおよび／またはリバースプライマーはランダムプライマーであってもよい。
【００４１】
別の態様によると、増幅される標的核酸の領域の同定および／または選択のステップ（ｉ）は、標的核酸の各位置についての幾何学的増幅バイアスの効果を判定すること、および平均増幅効率（ＡＥ）よりも高いＡＥを有する領域として増幅される領域を選択することを含む。幾何学的増幅バイアスは、核酸のいくつかの領域が、他の領域よりも効率的に増幅される可能性として定義してもよい。例えば、幾何学的増幅バイアスは、ＰＣＲバイアスである。
【００４２】
＜増幅効率のモデリング＞
患者試料内にどの標的核酸（例えば病原体）が存在するかは未知なので、増幅ステップおよび／または逆転写（ＲＴ）プロセスの間にランダムプライマーを用いて、存在する全てのＲＮＡの、ＤＮＡへの公平な逆転写を確実にしてもよい。本発明の目的のために、当分野で公知の任意のランダム増幅方法を用いてもよい。本明細書において、ランダム増幅方法は、ＲＴ−ＰＣＲであってもよい。
【００４３】
しかしながら、本発明の方法がＲＴ−ＰＣＲに限定されないことが、当業者に明らかになる。具体的には、ＲＴ−ＰＣＲ手法は、プライマー−二量体結合によって引き起こされるシグナルの不正確さおよびＲＴ−ＰＣＲプロセスにおける乏しい増幅効率の影響を受けやすい場合がある（Ｂｕｓｔｉｎ，Ｓ．Ａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。この障害を克服するために、本発明者らは、ランダムプライマーを用いることによって、ＲＴ−ＰＣＲプロセスをモデリングした。
【００４４】
本発明の特定の態様によると、増幅ステップは、フォワードおよびリバースプライマーを含み、フォワードおよびリバースプライマーのそれぞれは、５’−３’配向で、不変のプライマー頭部および可変のプライマー尾部を含み、少なくとも可変の尾部は、標的核酸ｖaの一部にハイブリダイズする。固定されたプライマー頭部のサイズおよび可変のプライマー尾部のものは、本発明の方法の目的に適した、塩基長で任意のサイズであってもよい。固定された頭部は、１０〜３０塩基長、具体的には１５〜２５塩基長、例えば１７塩基長であってもよい。可変の尾部は、１〜２０塩基長、具体的には５〜１５塩基長、例えば９塩基長であってもよい。これらのフォワードおよびリバースプライマーの例を、図１に示す。より具体的には、増幅ステップは、ヌクレオチド配列５’−ＧＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＴＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮ−３’（配列番号１）を有するフォワードおよび／またはリバースランダムプライマーを含んでもよく、Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧまたはその誘導体のいずれか１つである。
【００４５】
特定の実施形態によると、図１でも例示されているが、本発明者らは、以下のようにランダムＲＴ−ＰＣＲプロセスをモデリングした。ｖaを、試料中の実際のウイルスとする。ＲＴ−ＰＣＲプロセスにおいて使用したランダムプライマーは、好ましくは、形態（５’−ＧＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＴＡＮＮＮＮＮＮＮＮ−３’）（配列番号１、および具体的には配列番号２〜７）の、固定された１７塩基長の頭部および可変の９塩基長の尾部を有する２６塩基長のプライマーであった。しかしながら、本発明のプライマーが配列番号１〜７の配列および図１に限定されないことは、当業者に明らかである。実際、プライマーの、特にその頭部および可変の尾部のヌクレオチドサイズは、上述の範囲内で変化および選択してもよい。ｖaの位置ｉとｊの間の領域におけるＲＴ−ＰＣＲ産物を得るために、本発明者らは、（１）位置ｉに結合しているフォワードプライマー、（２）｜ｉ−ｊ｜≦１００００、および（３）位置ｊに結合しているリバースプライマーを要した。具体的には、｜ｉ−ｊ｜は、増幅されることが所望される標的核酸の領域であり、５０００ｂｐ以下、より具体的には１０００以下、例えば５００ｂｐ以下であってもよい。ＲＴ−ＰＣＲ産物の質は、フォワードプライマーおよび／またはリバースプライマーがｖaにどれだけよく結合するかに依存する。いくつかのランダムプライマーは、他のものよりもよくｖaに結合することができる。このようなプライマー、およびそれらがどこでｖaに結合するかの同定によって、ｖaの特定の領域がどの程度増幅されそうかの目安が提供される。この手法を用いて、ｖaの各位置についての増幅効率スコア（ＡＥＳ）を計算する増幅効率モデルが提供される。
【００４６】
標的核酸ｖaの特定の位置ｉについて、Ｐf（ｉ）およびＰr（ｉ）は、ランダムプライマーｒiが、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとしてｖaの位置ｉに結合することができる確率である。簡単にするために、ランダムプライマーの最後の９ヌクレオチドがｖaのリバース相補物のサブストリング（フォワードプライマー）またはｖaのサブストリング（リバースプライマー）である場合に、ランダムプライマーがｖaにだけ結合することができると仮定する。これを図１に示す。確立したプライマー設計基準（Ｗｕ，Ｄ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，１９９１）に基づいて、ｒiが有意なプライマー−二量体を形成するか極度の融解温度を有する場合に、Ｐf（ｉ）は低いと推定した。他方では、ｒiがいかなる有意なプライマー−二量体を形成せず、最適な融解温度を有する場合、Ｐf（ｉ）は高くなる。ランダムプライマーの頭部がｖaに類似している場合に、これによって結合が助けられ、より高いＰf（ｉ）を生じる場合があることに留意されたい。同様に、Ｐr（ｉ）を計算した。
【００４７】
フォワードプライマーとしてのｖaの位置ｉでのランダムプライマーｒiの結合は、位置ｉの上流の少なくとも１００００ヌクレオチドについて、ＲＴ−ＰＣＲ産物の質に影響を及ぼす。同様に、リバースプライマーとしてのｖaの位置ｉでのランダムプライマーｒiの結合は、位置ｉの下流の少なくとも１００００ヌクレオチドについて、ＲＴ−ＰＣＲ産物の質に影響を及ぼす。したがって、増幅効率スコア、ｖaの各位置ｉについてのＡＥＳiは、これを増幅する全てのフォワードおよびリバースプライマー対の複合効果を考慮することによって計算することができ、
【数１０】
2009504153.tif 000012
であり、式中、
【数１１】
2009504153.tif 000013
であり、Ｐf（ｉ）およびＰr（ｉ）は、ランダムプライマーｒiが、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとしてｖaの位置ｉに結合することができる確率であり、１００００ｂｐ以下であるＺは、増幅されることが所望されるｖaの領域である。
【００４８】
したがって、Ｚは、１００００ｂｐ以下、５０００ｂｐ以下、１０００ｂｐ以下または５００ｂｐ以下であってもよい。ウイルスの異なる領域によって提示されるシグナル強度の変化がそれらの対応する増幅効率スコアと直接相関を有するかどうかを検証するために、ヒトに影響を及ぼす一般的な病原体、ヒト呼吸器多核体ウイルスＢ（ＲＳＶ−Ｂ）に関して、いくつかのマイクロアレイ実験（具体的な場合において、合計５つのマイクロアレイ実験）を行った。
【００４９】
＜増幅効率についてのＲＴ−ＰＣＲのモデリング＞
（Ｓｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；ＣＳＢ）の方法の改良である本発明の方法によると、逆転写のために使用されるプライマーは、固定されたオリゴヌクレオチドタグ（頭部）およびランダムなオリゴヌクレオチド尾部を含む。理論的には、ランダムなオリゴヌクレオチド尾部は、患者試料中の全ての核酸に無差別に結合して、第一の鎖合成を開始するべきである。第二の鎖合成の後、全ての逆転写された配列は、固定されたオリゴヌクレオチドタグ（頭部）を両端に有する。これらの配列を、プライマーとして固定されたオリゴヌクレオチドタグ（頭部）を用いて少なくとも長さ１００００ｂｐのＰＣＲ産物を生じてＰＣＲによって増幅する。具体的には、増幅されたＰＣＲ産物の大部分は、長さが５００〜１０００ｂｐの間である。特定の実施形態によると、逆転写（ＲＴ）のために使用される２６塩基長のプライマーは、９塩基長のランダムな尾部を有する固定された１７塩基長のタグ：５’−ＧＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＴＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮ−３’（配列番号１）を含む。
【００５０】
本発明者らのモデルにおいて、ｖaは、臨床試料中の病原体を示す。ｖaの位置ｉおよびｊによって定義されるゲノム中の任意の領域において、例えば５００〜１０００ｂｐの少なくとも１つのＰＣＲ産物を生成することは、５００＝｜ｉ−ｊ｜＝１００００、および具体的には５００＝｜ｉ−ｊ｜＝１０００であるように、位置Ｉに結合しているフォワードプライマーおよびアンチセンス方向で位置ｊに結合しているリバースプライマーを必要とする。プライマーの結合親和性は、少なくとも２つの要因、（１）プライマー二量体形成、および（２）ウイルスｖaに対するプライマーのハイブリダイゼーション親和性によって判定される。１００００ヌクレオチド、具体的には１０００または５００ヌクレオチド内で理想的なプライマー結合配置を有することによってうまく増幅されることができるゲノム領域は、ｖaの各位置の増幅効率スコア（ＡＥＳ）を計算することによって予測することができる（図１）。
【００５１】
＜増幅効率スコア（ＡＥＳ）＞
ｖaの各位置ｉについて、Ｐf（ｉ）およびＰr（ｉ）を、ランダムプライマーｒiが、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとしてｖaの位置ｉに結合することができる確率とする。簡単にするために、本発明者らは、プライマーのランダムな尾部のヌクレオチド（例えば、図１に示されるようなランダムプライマーの最後の９ヌクレオチド）がｖaのリバース相補物のサブストリング（フォワードプライマー）またはｖaのサブストリング（リバースプライマー、図１）である場合に、ランダムプライマーがｖaにのみ結合できると仮定する。確立したプライマー設計基準（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｕｇｏｚｚｏｌｉ，１９９１）に基づいて、本発明者らは、ｒiが有意なプライマー−二量体を形成するか、極端な融解温度を有する場合に、Ｐf（ｉ）が低いと推定した。他方では、ｒiが、いかなる有意なプライマー−二量体も形成せず、最適な融解温度を有した場合、Ｐf（ｉ）は高い。ランダムプライマーの固定されたオリゴヌクレオチドタグ（頭部）（例えば、図１に示されるような固定された１７塩基長のタグ）は、ｖaと類似しており、これはまた、結合を助け、より高いＰf（ｉ）を生じる場合がある。同様に、Ｐf（ｉ）を計算した。
【００５２】
フォワードプライマーとしてのｖaの位置ｉでのランダムプライマーｒiの結合は、位置Ｉの上流のヌクレオチド（例えば、位置ｉの上流の５００〜１０００ヌクレオチド）についてのＲＴ−ＰＣＲ産物の質に影響を及ぼす。同様に、リバースプライマーとしての、ｖaの位置ｉでのランダムプライマーｒiの結合は、位置Ｉの下流のヌクレオチド（例えば、位置ｉの下流の５００〜１０００ヌクレオチドについて）についてのＲＴ−ＰＣＲ産物の質および被覆に影響を及ぼす。ｖaの位置ｘを仮定する。位置ｉおよびｊにある全ての効果的なプライマー対は、それぞれｘでのＲＴ−ＰＣＲ産物の質に寄与する。ｉ＝ｘ＝ｊおよびｉ−ｊ＝１００００であることに留意されたい。例えば、５００〜１０００塩基対長である場合、本発明者らのＲＴ−ＰＣＲ産物から５００＝ｉ−ｊ＝１０００である。したがって、ｖaの各位置ｘについての増幅効率スコア、ＡＥＳXは、これを増幅する全てのプライマー対の複合効果を考慮することによって計算することができる。
【数１２】
2009504153.tif 000014
【００５３】
＜成功するＲＴ−ＰＣＲを予測するＡＥＳ閾値＞
ウイルスｖaのためのプローブ選択のための増幅効率スコアの閾値を、ＡＥＳ値ｖaの累積分布関数によって判定する。Ｘを、ｖaの全てのプローブのＡＥＳ値を表す確率変数とする。ｋを、ｖaにおけるプローブの数とする。このとき、本発明者らは、ＡＥＳ値がｘ以下である確率を
【数１３】
2009504153.tif 000015
と表し、式中、ｃは、ｘ以下のＡＥＳ値を有するプローブの数である。ｖaの位置ｉのプローブｐiについて、ｘiを、その対応するＡＥＳ値とする。プローブのシグナル強度はそのＡＥＳ値と高度に相関するので、本発明者らは、ｖaの存在下でｐiが高いシグナル強度を有する確率であるＰ（ｐi｜ｖa）を、Ｐ（Ｘ≦ｘi）と推定した。したがって、
【数１４】
2009504153.tif 000016
であり、式中、ｃiはＡＥＳ値がｘi以下であるｘiと等しいプローブの数である。
プローブ選択のために、Ｐ（ｐi｜ｖa）≧λである場合にプローブｐiを選択する。本発明者らの実験において、本発明者らは、λ＝０．８に設定した。この閾値（上位２０％ＡＥＳ）で、本発明者らは、期待されるプローブの５０％より多くが、異なる臨床試料に再現性良くハイブリダイズすることを観察した。より高いＡＥＳ（例えば、上位１０％ＡＥＳ）を有するプローブを用いることによって、再現性が向上するが、これによって、種のレベルで１０未満までいくつかのゲノムに残っている特有のプローブの数が減少し、結果として、アレイが病原体を特異的に同定する能力が損なわれる。したがって、上位２０％ＡＥＳを用いた。
【００５４】
＜病原体検出マイクロアレイ上でのクロスハイブリダイゼーション閾値の経験的判定＞
＜プローブ設計＞
選択される領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプローブの設計のステップ（ｉｉ）は、当分野で公知のプローブ設計技術のいずれか１つに選択してもよい。以下の説明はプローブ設計に関するが、プライマーの設計、具体的にはＲＴ−ＰＣＲのためのプライマーの設計にも、同じ原理が適用されることが当業者に明らかになる。
【００５５】
例えば、各ｖi∈Ｖについての標的核酸（例えば、ウイルスゲノム）Ｖ＝｛ｖ1，ｖ2，・・・，ｖn｝のセットを仮定すると、以下の条件を満たす長さｍのプローブのセット（ｖiのサブストリングである）を、例えば以下の、
（ａ）均質性、感度および特異性の確立されたプローブ設計基準（Ｓｕｎｇ，Ｗ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，２００３，ＣＳＢ）
（ｂ）ヒトゲノムゲノムに対する有意な配列類似性はない
（ｃ）本明細書に記載されているように、例えばＲＴ−ＰＣＲによってＡＥスコアを用いて効率的に増幅される
の少なくとも１つを考慮して設計してもよい。
【００５６】
クロスハイブリダイゼーションによるアーチファクトによって引き起こされるノイズの多い信号は、具体的には核酸の複合混合物中に存在する稀な病原体配列の同定のためのマイクロアレイデータの解釈への主な障害を提示する。例えば、臨床材料において、宿主組織に由来するもの等の混入している核酸配列は、配列相補性のある閾値を超える病原体特異的マイクロアレイプローブとクロスハイブリダイズする。これは、誤った結論につながる偽陽性シグナルを生じる場合がある。同様に、病原体配列は、その特異的プローブに結合することに加えて、他の非標的プローブ（すなわち、他の病原体を検出するよう設計されている）とクロスハイブリダイズする場合がある。この後者の現象は、問題があるように見えるがこのようなクロスハイブリダイゼーションを正確に予測することができる程度まで病原体同定のための有用な情報を提供することができた。アニーリング可能性および配列特異性を評価するための種々の評価指標で、マイクロアレイプローブは、昔から、（公知の標的への）最大の特異的ハイブリダイゼーションと（非特異的配列への）最小のクロスハイブリダイゼーションを確実にするよう設計されてきた。しかしながら、実際には、本発明者らは、多くのプローブは、最適なコンピュータ内でのパラメータを用いて設計されているが、不明な理由のために期待に従って機能しないことを見出した。
【００５７】
アレイベースの病原体検出の動力学を体系的に調査するために、本発明者らは、Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎアレイ合成技術（Ｎｕｗａｙｓｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）を用いてオリゴヌクレオチドアレイを作製した。アレイを設計して、各ゲノムの全長にわたって平均８塩基の分解能でタイリングされた４０塩基長のプローブを用いて３５までのＲＮＡウイルスを検出した（５３，５５５プローブ、図６、表１）。
【００５８】
【表１Ａ】
2009504153.tif 000017
【表１Ｂ】
2009504153.tif 000018
【表１Ｃ】
2009504153.tif 000019
【００５９】
各ウイルスプローブについての７つの複製、ならびにアレイ合成およびハイブリダイゼーションのための対照配列とともに（下記のように）、アレイは、合計３９０，４８２のプローブを含んだ。
【００６０】
＜均質性、感度および特異性＞
均質性は、類似した融解温度を有するプローブの選択を要する。低いＣＧ含有量を有するプローブが、信頼できるハイブリダイゼーションシグナル強度を生じないこと、および高いＣＧ含有量を有するプローブが非特異的結合を通して高いシグナル強度を生じる性向を有するがわかった。したがって、選択されたプローブのＣＧ含有量が４０％〜６０％であるべきであることが確立できた。
【００６１】
したがって、本発明は、４０％〜６０％のＣＧ含有量を有するプローブを選択することを含む核酸検出のためのオリゴヌクレオチドプローブを設計する方法を提供する。
【００６２】
用語「ハイブリダイゼーション」は、オリゴプローブが標的核酸またはその一部に非共有結合して、安定した二本鎖を形成するプロセスをいう。三重ハイブリダイゼーションもまた、理論的に可能である。
【００６３】
ハイブリダイゼーションプローブは、標的核酸の相補鎖に塩基特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドである。特異的にハイブリダイズすることは、分子が、ＤＮＡまたはＲＮＡの複合混合物（例えば、全細胞）中に配列が存在する場合に、ストリンジェントな条件下で、実質的に、または唯一、特定のヌクレオチド配列に、結合、二重化、またはハイブリダイズすることをいう。ハイブリダイゼーション、例えば対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーションは、一般に、ストリンジェントな条件下で行われる。例えば、塩濃度が約１モル以下（Ｍ）、温度が少なくとも２５℃、例えば、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  リン酸Ｎａ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４（５×ＳＳＰＥ）および約２５℃〜約３０℃の温度である条件。ハイブリダイゼーションは、通常、ストリンジェントな条件下で、例えば１Ｍ以下の塩濃度および少なくとも２５℃の温度で行われる。ストリンジェントな条件下については、例えば、その全体が上述の全ての目的のために参照によって本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）も参照されたい。
【００６４】
感度は、少量のｍＲＮＡを検出するために、有意な二次構造を形成することができないプローブが選択されることを要する。したがって、隣接モデルに基づいて計算される最も高い自由エネルギーを有するプローブが選択される（ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，Ｊ．，Ｊｒ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。
【００６５】
したがって、本発明は、核酸検出のための少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを設計する方法を提供し、プローブは、隣接モデルに基づいて計算される最も高い自由エネルギーを有することによって選択される。
【００６６】
特異性は、ウイルスゲノムに最も特有のプローブの選択を要する。これは、他の非標的核酸（例えば、ウイルスゲノム）とのプローブのクロスハイブリダイゼーションを最小限にすることである。標的核酸ｖaおよびｖbのプローブｓaおよびプローブｓbサブストリングを仮定すると、ｓaが、ｓaと標的核酸ｖb由来の任意の長さｍのサブストリングｓbとの間のハミング距離ならびに／またはｓaおよびプローブｓbの最も長い共通するサブストリングに基づいて選択される。具体的には、ｓaおよびｓbを、それぞれウイルスゲノムｖaおよびｖb由来の長さｍのサブストリングとし、ここで（ｖa≠ｖb）である。
【００６７】
設計されるプローブの長さは、本発明の目的のために有用な任意の長さであってよい。プローブは、１００塩基長未満、例えば２０〜８０塩基長、２５〜６０塩基長、例えば４０塩基長であってもよい。ハミング距離および／または最も長い共通するサブストリングもまた変化してもよい。
【００６８】
Ｋａｎｅの基準によると（Ｋａｎｅ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，２０００）、ｓaは、
（ａ）ｓaとウイルスゲノムｖb由来の任意の長さｍのサブストリングｓbとの間のハミング距離が０．２５ｍより多く、
（ｂ）ｓaおよびｓbの最も長い共通するサブストリングが１５未満である
場合、ｖaに特異的である。
【００６９】
ハミング距離についてのカットオフ値は、所望されるストリンジェンシーに従って選択してもよい。所望される特定のストリンジェンシーに従ってハミング距離カットオフをどのようにして選択するかは当業者に明らかになる。本明細書に記載されるプローブ設計の特定の実施例によると、本発明者らは、特定のプローブについての他の標的核酸に関して１０より大きく、および保存されたプローブについては１０より小さい、好ましくは５より小さいハミング距離カットオフを使用した。特定のプローブでは、特定の標的核酸にのみハイブリダイズするプローブが示されるが、保存されたプローブでは、標的核酸のファミリーの任意のメンバーにハイブリダイズすることができるプローブが示される。
【００７０】
したがって、本発明はまた、核酸検出のためのオリゴヌクレオチドプローブを設計する方法を提供し、生体試料中に含まれる標的核酸ｖaおよびｖbのプローブｓaおよびｓbサブストリングを仮定すると、ｓaは、ｓaと標的核酸ｖb由来の任意の長さｍのサブストリングｓbの間のハミング距離が０．２５ｍより多く、ｓaおよびプローブｓbの最も長い共通するサブストリングが１５未満である場合に選択される。
【００７１】
ヒトＲＮＡ由来のクロスハイブリダイゼーションの複雑性なしにアレイハイブリダイゼーション動力学を研究するために、ＳＡＲＳコロナウイルスおよびデング熱血清型１ウイルスＲＮＡを感染細胞系の培地から精製し、逆転写し、ウイルス特異的プライマーを用いてＰＣＲ増幅した（Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。各ゲノムｃＤＮＡを、（配列決定によって確認されるように）その全体を増幅し、Ｃｙ３で標識し、マイクロアレイ上で別々にハイブリダイズさせた。ＳＡＲＳ試料は、検出閾値を十分超えた蛍光（Ｃｙ３）シグナルを提示している（平均アレイシグナル強度よりも標準偏差の２倍を超える強度のプローブシグナル強度によって判定される；図７Ａ）全３，８０５のＳＡＲＳ特異的プローブで、ＳＡＲＳタイリングプローブに十分ハイブリダイズした。コロナウイルス科の他のメンバーならびにピコナウイルス科およびパラミクソウイルス科のいくつかの種についてのみ観察すると、他の病原体プローブセットとのクロスハイブリダイゼーションは最小であり、ＳＡＲＳが他の公知のウイルスと配列相同性をほとんど共有していないという観察と一致した（Ｋｓｉａｚｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。他方では、１型デング熱のハイブリダイゼーションパターンは、より複雑であった（図７Ｂ）。まず、本発明者らは、配列多型のために、１型デング熱プローブセットへのハイブリダイゼーションが部分的に不完全である（すなわち、シグナルのない領域）ことを観察した。アレイ上でハイブリダイズされた１型デング熱試料を、１９４４年のハワイの分離株（ＡＴＣＣカタログ番号ＶＲ−１２５４）から培養したが、アレイプローブセットは、１９９０年にシンガポールで単離されたＳ２７５／９０株の配列（Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）に基づく。ｃＤＮＡ標識とハイブリダイズできなかった１型デング熱プローブは、それぞれ、標的配列との少なくとも３つのミスマッチ（１５塩基の範囲内に）を含んだ。第二に、本発明者らは、アレイ上に存在するほとんど全てのウイルスプローブセット、具体的には他のフラビウイルス科メンバーのプローブと、ある程度のクロスハイブリダイゼーションが起こったことを観察し、４型デング熱血清型が６０〜７０％の相同性を共有していることと一致した。ハイブリダイゼーションシグナル出力とアニーリング特異性との間の関係を理解するために、本発明者らは、まず、類似性の２つの尺度：プローブハミング距離（ＨＤ）および最大連続マッチ（ＭＣＭ）を用いて、全てのプローブ配列を各ウイルスゲノムと比較した。ＨＤは、類似した配列については低いスコアで、２つの配列の全体の類似性距離を評価する（Ｈａｍｍｉｎｇ，１９５０）。ＭＣＭは、類似した配列については高いスコアで、正確な適合である連続した塩基の数を評価する（Ｋａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。
【００７２】
本発明者らは、ハワイの１型デング熱分離株に関連して、各プローブについてＨＤおよびＭＣＭスコアを計算し、これらのスコアが、それぞれプローブシグナル強度に対して反比例および直接の相関があることを観察した。ハワイの１型デング熱ゲノムに対して高い類似性を有する、すなわちＨＤ＝２（ｎ＝９４２）またはＭＣＭ＝２７（ｎ＝６２７）のアレイ上の全てのプローブは、バックグラウンドより３対数分高く、メジアンシグナル強度でハイブリダイズした。プローブの９８％は０〜４の低ＨＤ範囲または１８〜４０の高いＭＣＭ範囲で検出可能であったが、メジアンプローブシグナル強度は、配列距離の各増分で減少した。メジアンシグナル強度は、それぞれ４３％および４６％の検出可能なプローブで、ＨＤ＝７およびＭＣＭ＝１５でバックグラウンドレベルまで激減した。プローブの大部分（＞９６％、ｎ＞５１，０００）は、８〜２１の間のＨＤスコアおよび／または０〜１５の間のＭＣＭスコアを有し、それぞれその１．２３％および１．５７％が検出可能であった。
【００７３】
理想的な、クロスハイブリダイゼーション類似性閾値は、特定の病原体を同定する全てのプローブが、病原体配列の多型の存在下であっても、常にバックグラウンドノイズより高い検出可能なシグナル強度を有するものである。最適な類似性閾値ＨＤ＝４およびＭＣＭ＝１８で、９８％を超えるプローブが、バックグラウンドよりも２対数分高いメジアンシグナル強度で検出することができたが、閾値をＨＤ＝５およびＭＣＭ＝１７まで１段階下に調節することによって、わずか約８５％のプローブ検出、およびバックグラウンドよりも約１．２対数分高いメジアンシグナル強度が生じた（図８）。
【００７４】
これらの最適なＨＤおよびＭＣＭ閾値を用いてクロスハイブリダイゼーションを予測して、本発明者らは、全てのプローブを、所与の病原体を最も検出しそうなグループに分けた。本発明者らは、これらのグループを、特異的サインプローブセット（ＳＰＳ）と呼び、アレイ上に示される３５の病原体ゲノムのそれぞれについてのＳＰＳを定義した（表２）。
【００７５】
【表２Ａ】
2009504153.tif 000020
【表２Ｂ】
2009504153.tif 000021
【００７６】
各病原体のＳＰＳは、そのゲノム配列に由来するタイリングプローブ（ＨＤ＝０、ＭＣＭ＝４０）、ならびに他の病原体に由来するクロスハイブリダイズしているプローブを含んだ（ＨＤ＝４、ＭＣＭ＝１８）。
【００７７】
本発明者らは、次に、本発明者らのＳＰＳプローブの性能に影響を及ぼす確率のある他の非特異的ハイブリダイゼーション現象を考慮した。例えば、本発明者らは、プローブシグナルと％ＧＣ含有量との間の一般的な関係を観察した。以前の観察と一致して、本発明者らは、４０％未満のＧＣのプローブが、減少したシグナル強度を生じるが、６０％を超えるＧＣ含有量のプローブは、より高いシグナル強度を示すことを見出した（Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｍａｓｋｏｓ  ａｎｄ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，１９９３）。したがって、本発明者らは、さらなる選択フィルターとして％ＧＣ含有量を利用し、それによって、最適なＨＤおよびＭＣＭ値にもかかわらず、４０％未満のＧＣおよび６０％を超えるＧＣを有するプローブを本発明者らのＳＰＳから排除した。
【００７８】
＜ヒトゲノムに対する配列類似性＞
検出される標的核酸がヒトから（例えば、ウイルスゲノムを含むヒト試料）抽出される場合、ヒトゲノムに対して高い相同性を有するプローブもまた避けられるべきである。したがって、標的核酸ｖaに特異的な長さｍの任意のプローブｓaについて、標的核酸と異なる核酸のいずれの領域ともいかなるヒットも有さない場合、プローブｓaが選択され、長さｍのプローブｓaが標的核酸と異なる核酸とヒットを有する場合、最も小さい最大アライメント長および／または最少の数のヒットを有する長さｍのプローブｓaが選択される。具体的には、任意の長さｍのプローブｓaについて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムで、ヒトゲノムとのｓaのヒットが見られる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。（Ｗ＝１５）のＢＬＡＳＴ文字列サイズおよび１００の期待値を用いて、全てのヒットを見出した。ヒトゲノムといかなるヒットも有さない、すなわち、ｖaに特異的である場合、ｓaを選択する。しかしながら、ｖaの長さｍの全てのサブストリングがヒトゲノムとヒットを有する場合、最も小さい最大アライメント長および最少の数のヒットを有するものを選択した。
【００７９】
さらに、ヒト配列とのクロスハイブリダイゼーションはまた、結果を複雑にする可能性があったので、本発明者らは、１５の文字列サイズを用いたＢＬＡＳＴによって（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、全てのプローブをヒトゲノム集合（１７を構築）（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ．Ｉｎｉｔｉａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ４０９（６８２２）、８６０−９２１（２００１））と比較した。ＳＰＳから１００の期待値を有するプローブをさらにフィルタリングした（上記の表２参照）。
【００８０】
したがって、本発明は、核酸検出のためのオリゴヌクレオチドプローブを設計する方法を提供し、標的核酸ｖaに特異的な長さｍの任意のプローブｓaについて、標的核酸と異なる核酸のいずれの領域ともいかなるヒットも有さない場合、プローブｓaが選択され、長さｍのプローブｓaが標的核酸と異なる核酸とヒットを有する場合、最も小さい最大アライメント長および／または最少の数のヒットを有する長さｍのプローブｓaが選択される。
【００８１】
さらに、オリゴヌクレオチドプローブの設計はまた、本発明のＡＥＳによって行ってもよい。具体的には、本発明は、ｐiが増幅された標的核酸の位置ｉにハイブリダイズすると予測される場合に標的核酸の位置ｉのプローブｐiが選択される、プローブを選択および／または設計する方法を提供する。
【００８２】
具体的には、選択される領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプローブは、以下の基準：
（ａ）選択されたプローブが、４０％〜６０％のＣＧ含有量を有する；
（ｂ）隣接モデルに基づいて計算される最も高い自由エネルギーを有することによってプローブが選択される；
（ｃ）標的核酸ｖaおよびｖbのプローブｓaおよびプローブｓbサブストリングを仮定すると、ｓaと標的核酸ｖb由来の任意の長さｍのサブストリングｓbの間のハミング距離および／もしくはｓaおよびプローブｓbの最も長い共通するサブストリングに基づいて、ｓaが選択される；
（ｄ）標的核酸ｖaに特異的な長さｍの任意のプローブｓaについて、標的核酸と異なる核酸のいずれの領域ともいかなるヒットも有さない場合、プローブｓaが選択され、長さｍのプローブｓaが標的核酸と異なる核酸とヒットを有する場合、最も小さい最大アライメント長および／もしくは最少の数のヒットを有する長さｍのプローブｓaが選択される；ならびに／または
（ｅ）ｐiが増幅された標的核酸の位置ｉにハイブリダイズすると予測される場合、標的核酸の位置ｉのプローブｐiが選択される
の少なくとも１つに従って、選択および／または設計してもよい。
【００８３】
本発明の特定の態様によると、オリゴヌクレオチドプローブを設計するために、上述の基準の２つ以上を用いてもよい。例えば、全ての基準（ａ）〜（ｅ）を適用することによって、プローブを設計してもよい。本明細書で明らかに言及されていないが当業者に明らかな他の基準もまた用いてもよい。
【００８４】
具体的には、基準（ｅ）に基づいて、Ｐ（ｐi｜ｖa）＞λであり、式中λが０．５であり、Ｐ（ｐi｜ｖa）が、ｐiが標的核酸ｖaの位置ｉにハイブリダイズしなければならない確率である場合、標的核酸ｖaの位置ｉのプローブｐiが選択される。より具体的には、λは０．８である。
【００８５】
別の態様によると、本発明は、
【数１５】
2009504153.tif 000022
であり、式中Ｘはｖaの全てのプローブの増幅効率スコア（ＡＥＳ）値を表す確率変数であり、ｋはｖaにおけるプローブの数であり、ｃiはＡＥＳ値がｘi以下であるプローブの数である、上述のような方法を提供する。
【００８６】
別の態様によると、ＡＥＳを用いて、ランダムプライマータグを設計して、ランダムＰＣＲによって試料のランダム増幅を容易にすることもできる（病原体の検出、遺伝子発現の検出、クローンＤＮＡライブラリーの構築、および当業者がランダムＰＣＲを採用する他の用途等の用途における使用のために）。
【００８７】
＜支持体上のオリゴヌクレオチドプローブの合成＞
本発明の別の態様によると、上述のように少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを選択および／または設計する方法は、選択および／または設計されたプローブを調製するステップをさらに含む。プローブを設計することは、その配列を理解すること、および／または任意の適した手段によって、例えばソフトウエアを使用することによってそれを設計することを含む。プローブを調製するステップは、その物理的調製を含む。プローブは、当分野で公知の任意の標準的な方法に従って調製してもよい。例えば、プローブは、化学的に合成するか、またはクローニングによって調製してもよい。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，２００１に記載されているように。
【００８８】
本発明の任意の実施形態に従って調製された、支持体、例えばマイクロアレイまたはバイオチップもまた提供される。
【００８９】
本発明の任意の方法に従って設計および調製されたプローブは、溶液中で使用するか、または不溶性支持体上に配置してもよい。例えば、当分野で公知の任意の技術に従って、不溶性支持体に塗布するか、スポットするか、または印刷してもよい。支持体は、固体支持体またはゲルであってもよい。プローブを塗布された支持体は、マイクロアレイまたはバイオチップであってもよい。
【００９０】
より具体的には、本発明は、最初の組織試料から調製されたＰＣＲ増幅ｃＤＮＡ（具体的には、ランダムＰＣＲ増幅ｃＤＮＡ）からの、病原体、例えばウイルスおよび／または細菌病原体の迅速な検出および同定のためのオリゴマイクロアレイハイブリダイゼーションベースの手法を提供する。
【００９１】
以下の説明において、プローブの調製は、マイクロアレイに特に関連して行われる。しかしながら、支持体、ならびにプローブは、本出願の内容全体にわたる任意の記載に従って調製してもよい。具体的には、「アレイ」は、合成または生合成のいずれで調製されてもよい分子の意図的に作られた収集物である。アレイ中の分子は、互いに同一でも異なってもよい。アレイは、種々の形式、例えば、可溶性分子のライブラリー、樹脂ビーズ、シリカチップ、または他の固体支持体に繋ぎ止められた化合物のライブラリーの形をとってもよい。アレイプレートまたはプレートは、ウェルと呼ばれる、液体の通過に耐性があって領域または空間を形成する物理的障壁によって、各アレイが他のアレイから分離されている複数のアレイを有する物体である。
【００９２】
＜試料調製およびマイクロアレイへのハイブリダイゼーション＞
生体試料は、哺乳動物、例えばヒトから採取される、任意の試料であってもよい。生体試料は、血液、体液、唾液、尿、便等であってもよい。生体試料は、増幅ステップを行う前に生体試料中に含まれる核酸を取り除くよう処理してもよい。標的核酸は、検出されることが意図される任意の核酸であってもよい。検出される標的核酸は、少なくとも、生体試料の核酸にとって外因性である核酸であってもよい。したがって、生体試料がヒトに由来する場合、検出される外因性標的核酸（生体試料中に存在する場合）は、ヒト由来でない核酸である。本発明の態様によると、検出される標的核酸は、少なくとも、病原体ゲノムまたはその断片である。病原体核酸は、少なくとも、ウイルス、寄生生物、もしくは細菌由来の核酸、またはその断片であってもよい。
【００９３】
本発明の態様によると、標的核酸検出分析の方法が提供される。検出されることが所望される生体試料由来の標的核酸は、任意の標的核酸、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡであってもよい（例えば、ｍＲＮＡおよび／またはｃＤＮＡ）。より具体的には、検出される標的核酸は、病原体または非病原体であってもよい。例えば、少なくとも１つのウイルス、少なくとも１つの細菌および／または少なくとも１つの寄生生物のゲノムまたはその断片であってもよい。選択および／または調製されるプローブは、当業者に公知の任意の標準的な技術に従って支持体上に配置、塗布および／または固定されてもよい。支持体は、不溶性支持体、例えば固体支持体であってもよい（具体的には、マイクロアレイおよび／またはバイオチップ）。
【００９４】
特定の実施例によると、確立されたプロトコルおよび商業的キットを用いて、患者試料、例えば組織、血清、鼻咽頭洗浄液、便からＲＮＡおよびＤＮＡを抽出した。例えば、核酸抽出のためのＱｉａｇｅｎキットを用いてもよい。あるいは、フェノール／クロロホルムもまた、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの抽出のために用いてもよい。例えばＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ，２００１に記載されているような、当分野で公知の任意の技術を用いてもよい。Ｂｏｈｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２およびＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３によって記載されたプロトコルに基づいて、タグを付けたランダムプライマーを用いてＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。次いで、ランダムＰＣＲによってｃＤＮＡを増幅した。マイクロアレイへの試料の断片化、標識およびハイブリダイゼーションは、Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４によって記載されているように行った。
【００９５】
＜マイクロアレイ合成＞
実施例部分に記載されている特定の実験によると、本発明者らは、シンガポールにおけるウイルス疾患の最も一般的な原因を代表するいくつかのウイルスゲノムを選択した。Ｇｅｎｂａｎｋからダウンロードした全ゲノム配列を使用して、ゲノム全体にわたってタイリングされたオーバーラップ５塩基の解像度の４０塩基長のプローブを生成した。Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ技術（Ｎｕｗａｙｓｉｒ，Ｅ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，２００２）を用いて、各ウイルスプローブの７つの複製を、マイクロアレイ上に直接合成した。マイクロアレイ上でプローブをランダムに分配して、ハイブリダイゼーションのアーチファクトの効果を最小限にした。試料の、プローブへの非特異的ハイブリダイゼーションを制御するために、１０，０００のオリゴヌクレオチドプローブをマイクロアレイ上に設計および合成した。これらの１０，０００のオリゴヌクレオチドは、ヒトゲノムに対して、または病原性ゲノムに対していかなる配列類似性も有さなかった。これらは４０〜６０％のＣＧ含有量を有するランダムプローブであった。これらのプローブは、バックグラウンドシグナル強度を評価した。陽性対照として、免疫応答において公知または推定される機能を有するヒト遺伝子に対する４００のオリゴヌクレオチドプローブをアレイ上で合成した。合計およそ３８０，０００のプローブについて、植物ウイルス、ＰＭＭＶを陰性対照として含めた。以下の説明において、病原体検出チップ分析（ＰＤＣとも呼ばれる）に関連して、本発明が、より具体的に説明される。しかしながら、分析（方法）は、この特定の実施形態に限定されず、本出願の内容全体にわたって記載されるような本発明のいくつかの態様を包含する。
【００９６】
＜標的核酸を検出する方法＞
別の態様によると、本発明は、
（ｉ）生体試料を提供するステップと、
（ｉｉ）生体試料中に含まれる核酸を増幅するステップと、
（ｉｉｉ）生体試料中に存在する場合、少なくとも１つの標的核酸にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを提供するステップと、ここで、前記プローブが、本明細書に記載される本発明の任意の態様による方法を用いることによって調製され、
（ｉｖ）プローブを増幅された核酸と接触させ、少なくとも１つの標的核酸にハイブリダイズしたプローブを検出するステップと
を含む、少なくとも１つの標的核酸を検出する方法を提供する。
【００９７】
増幅ステップ（ｉｉ）は、ランダムな、部分的にランダムな（すなわち、固定された部分およびランダムな部分を含む）または特異的なプライマーの存在下で行ってもよい。具体的には、増幅ステップ（ＩＩ）は、少なくとも１つのランダムプライマーの存在下で行ってもよい。より具体的には、少なくとも１つのランダムフォワードプライマーおよび／または少なくとも１つのランダムリバースプライマーの存在下で。例えば、増幅ステップ（ｉｉ）は、２つより多いランダムプライマーの存在下で行ってもよい。当分野で公知の任意の増幅方法を用いてもよい。例えば、増幅方法は、ＲＴ−ＰＣＲである。
【００９８】
具体的には、本発明者らは、増幅効率スコア（ＡＥＳ）に基づいて、標的核酸にハイブリダイズしたプローブを検出する方法を開発した。これは、本明細書で、本発明のアルゴリズムとも呼ばれる。具体的には、
【数１６】
2009504153.tif 000023
の標的核酸ｖaの各位置ｉについての増幅効率スコア（ＡＥＳI）を有するプライマーの間で、位置ｉに結合しているフォワードランダムプライマーおよび標的核酸ｖaの位置ｊに結合しているリバースプライマーが選択され、式中、
【数１７】
2009504153.tif 000024
であり、Ｐf（ｉ）およびＰr（ｉ）は、ランダムプライマーｒiが、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとしてｖaの位置ｉに結合することができる確率であり、１００００ｂｐ以下であるＺは、増幅されることが所望されるｖaの領域である。より具体的には、Ｚは５０００ｂｐ以下、１０００ｂｐ以下、または５００ｂｐ以下であってもよい。
【００９９】
増幅ステップは、フォワードおよびリバースプライマーを含んでもよく、フォワードおよびリバースプライマーのそれぞれは、５’−３’配向で、不変のプライマー頭部および可変のプライマー尾部を含んでもよく、少なくとも可変の尾部は、標的核酸ｖaの一部にハイブリダイズする。具体的には、増幅ステップは、配列番号１〜７のいずれかのヌクレオチド配列、またはそのバリアントもしくは誘導体を有するフォワードおよび／またはリバースランダムプライマーを含んでもよい。
【０１００】
生体試料は、哺乳動物、例えばヒトから採取された任意の試料であってもよい。生体試料は、組織、血清、鼻咽頭洗浄液、唾液、任意の他の体液、血液、尿、便等であってもよい。増幅ステップを行う前に、生体試料を処置して、生体試料中に含まれる核酸を取り除いてもよい。標的核酸は、検出されることが意図される任意の核酸であってもよい。検出される標的核酸は、少なくとも、生体試料の核酸にとって外因性である核酸であってもよい。したがって、生体試料がヒト由来である場合、検出される外因性標的核酸（生体試料中に存在する場合）は、ヒト由来でない核酸である。
【０１０１】
本発明の態様によると、検出される標的核酸は、少なくとも、病原体ゲノムまたはその断片である。病原体核酸は、少なくとも、ウイルス、寄生生物、もしくは細菌由来の核酸、またはその断片であってもよい。
【０１０２】
したがって、本発明は、少なくとも、生体試料中に存在する場合、標的核酸の検出の方法を提供する。方法は、生体試料中の病原体の存在の検出のための診断方法であってもよい。例えば、生体試料がヒトから得られる場合、標的核酸は、生体試料中に存在する場合、ヒト由来でない。
【０１０３】
本発明の任意の方法に従って設計および／または調製されたプローブは、溶液中で用いてもよく、または、不溶性支持体上に配置してもよい。例えば、当分野で公知の任意の技術に従って不溶性支持体上に、塗布するか、スポットするか、または印刷してもよい。プローブを塗布された支持体は、固体支持体またはゲルであってもよい。具体的には、マイクロアレイまたはバイオチップであってもよい。
【０１０４】
次いで、プローブを生体試料の核酸に接触させ、存在する場合、標的核酸とプローブがハイブリダイズし、標的核酸の存在が検出される。具体的には、検出ステップ（ｉｖ）において、ｖaにハイブリダイズするプローブのシグナル強度の平均値は、ｖaに含まれないプローブの平均値よりも統計的に高く、それによって、生体試料中のｖaの存在が示される。
【０１０５】
より具体的には、検出ステップ（ｉｖ）において、ｖaにハイブリダイズするプローブのシグナル強度の平均値は、ｖaに含まれないプローブの平均値よりも統計的に高いことを特徴とし、本方法は、高いシグナル強度を有する検出方法において使用されるプローブの割合に対する、高いシグナル強度を有するｖaに含まれないプローブの割合の相対的差異を計算するステップをさらに含む方法であって、プローブｖaのシグナル強度の密度分布は、ｖaに含まれないプローブのものよりも正に歪んでおり、それによって、生体試料中のｖaの存在が示される方法である。
【０１０６】
例えば、検出ステップ（ｉｖ）において、生体試料中の標的核酸の存在は、０．１以下のｔ検定の値および／または０．０５以下のアンダーソン・ダーリン検定値および／または１．０以上、好ましくは５．０以上の重み付きカルバック・ライブラー情報量の値によって示される。具体的には、ｔ検定値は０．０５以下である。
【０１０７】
別の態様によると、本発明は、標的核酸ｖaへのプローブのハイブリダイゼーションを検出することを含む標的核酸ｖaの存在を判定する方法を提供し、ｖaにハイブリダイズするプローブのシグナル強度の平均値は、ｖaに含まれないプローブの平均値よりも統計的に高く、それによって、ｖaの存在が示される。具体的には、ｖaにハイブリダイズするプローブのシグナル強度の平均値は、ｖaに含まれないプローブの平均値よりも統計的に高いことを特徴とし、本方法は、高いシグナル強度を有する検出方法において使用されるプローブの割合に対する、高いシグナル強度を有するｖaに含まれないプローブの割合の相対的差異を計算するステップをさらに含む方法であって、プローブｖaのシグナル強度の密度分布は、ｖaに含まれないプローブのものよりも正に歪んでおり、それによって、ｖaの存在が示される方法である。より具体的には、生体試料中の標的核酸の存在は、０．１以下のｔ検定の値および／または０．０５以下のアンダーソン・ダーリン検定値および／または１．０以上、好ましくは５．０以上の重み付きカルバック・ライブラー情報量の値によって示される。例えば、ｔ検定値は、０．０５以下であってもよい。
【０１０８】
別の態様によると、本発明は、
（ｉ）少なくとも１つの生体試料を提供するステップと、
（ｉｉ）生体試料中に含まれる核酸を増幅するステップと、
（ｉｉｉ）生体試料中に存在する場合、少なくとも１つの標的核酸にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを提供するステップと、
（ｉｖ）プローブを増幅された核酸と接触させ、標的核酸にハイブリダイズしたプローブを検出するステップと、ここで、ｖaにハイブリダイズするプローブのシグナル強度の平均値が、ｖaに含まれないプローブの平均値よりも統計的に高く、それによって生体試料中のｖaの存在が示されるステップと
を含む、少なくとも１つの標的核酸を検出する方法を提供する。
【０１０９】
ステップ（ｉｖ）において、ｖaにハイブリダイズするプローブのシグナル強度の平均値は、ｖaに含まれないプローブの平均値よりも統計的に高いことを特徴とし、本方法は、高いシグナル強度を有する検出方法において使用されるプローブの割合に対する、高いシグナル強度を有するｖaに含まれないプローブの割合の相対的差異を計算するステップをさらに含む方法であって、プローブｖaのシグナル強度の密度分布は、ｖaに含まれないプローブのものよりも正に歪んでおり、それによって、生体試料中のｖaの存在が示される方法である。具体的には、ステップ（ｉｖ）において、生体試料中の標的核酸の存在は、０．１以下のｔ検定の値および／または０．０５以下のアンダーソン・ダーリン検定値および／または１．０以上、好ましくは５．０以上の重み付きカルバック・ライブラー情報量の値によって示される。ｔ検定値は０．０５以下であってもよい。検出される核酸は、生体試料の核酸にとって外因性の核酸である。検出される標的核酸は、少なくとも、病原体ゲノムまたはその断片であってもよい。病原体核酸は、少なくとも、ウイルス、寄生生物、もしくは細菌由来の核酸、またはその断片であってもよい。具体的には、試料がヒトから得られる場合、標的核酸は、生体試料中に存在する場合、ヒトゲノム由来でない。プローブは、不溶性支持体上に配置してもよい。支持体は、マイクロアレイまたはバイオチップであってもよい。
【０１１０】
＜ＲＳＶ−Ｂの鋳型配列を用いた試験＞
ウイルスの異なる領域によって提示されるシグナル強度の変動がそれらの対応する増幅効率スコアと直接的な相関を有するかどうかを検証するために、ヒトに影響を及ぼす一般的な病原体、ヒト呼吸器多核体ウイルスＢ（ＲＳＶ−Ｂ）に関して、合計５つのマイクロアレイ実験を行った。
【０１１１】
次に、ＮＣＢＩから得られたＲＳＶ−Ｂの鋳型配列（ＮＣ＿００１７８１）に、上述のようなプローブ設計基準を適用した。これは、各マイクロアレイ上に斑点をつけられた１９４８のプローブが得られた。ＲＳＶ−Ｂについての増幅効率マップもまた、実際の実験の前に計算し、図２に示す。この図は、平均ＡＥＳよりも高いＡＥＳを有するピークを示し、より高い増幅の確率を有するＲＳＶ−Ｂの領域が示される。
【０１１２】
ヒト呼吸器多核体ウイルスＢ（ＲＳＶ−Ｂ）を含む５つの試料を用いて、独立したマイクロアレイ実験を行った。１つのこのような実験についての得られたシグナル強度を、図３に示す。
【０１１３】
各実験について、１９４８のプローブのシグナル強度を、減少順で順位付けし、それらの対応するＡＥＳ値と関連付けた。ｐ値は、平均で２．２ｅ-16未満であるとわかった。これは、ＲＳＶ−Ｂの位置ｉのプローブのシグナル強度とＡＥＳiとの間の相関が全くランダムでないことを示す。さらなる調査によって、５つ全ての実験において一貫して高いシグナル強度を生じる約３００のプローブが、９０パーセンタイルレベルで増幅効率スコアを有することが明らかになった。
【０１１４】
説明された増幅効率モデルはＲＳＶ−Ｂゲノムに関して功を奏することを示してきたが、本発明の方法が他のウイルスゲノムにも拡張することができることを示すことが望まれた。ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）に関して、別のマイクロアレイ実験を行った。今回は、マイクロアレイ上に１７０５のプローブがあった。ここでも、ＨＭＰＶについての増幅効率マップを計算した。この実験において、シグナル強度と増幅効率スコアとの間の相関試験によって、１．３３５ｅ-9のｐ値が示された。
【０１１５】
したがって、本発明の増幅効率モデルは、説明された実験設定において、ウイルスゲノムの異なる領域によって生成されたシグナルの相対的強度を予測することができる。低い増幅効率スコアを有する領域由来のプローブは、シグナル強度を生じないか、または低いシグナル強度を生じる傾向が高い。これは、マイクロアレイ上で偽陰性を生じる。このようなプローブは、マイクロアレイデータの分析を複雑にし、これは、低いシグナル強度を有するプローブはその標的ゲノムが存在しないか、または単に増幅されなかったためである場合があるので、これがさらに複雑になる。そのようなものとして、適度に高い増幅効率スコアを有する領域におけるプローブを選択して、ランダムプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲプロセスによって引き起こされる不正確性を最小限にするべきである。
【０１１６】
ウイルスｖaのプローブ選択のための増幅効率スコアの閾値は、ＡＥＳ値ｖaの累積分布関数によって判定される。Ｘを、全てのプローブｖaのＡＥＳ値を表す確率変数とする。ｋを、ｖaにおけるプローブの数とする。次いで、本発明者らは、ＡＥＳ値がｘ以下である確率を、Ｐ（Ｘ≦ｘ）＝ｃ／ｋとし、式中ｃは、ｘ以下であるＡＥＳ値を有するプローブの数である。ｖaの位置ｉのプローブｐiについて、ｘiを、その対応するＡＥＳ値とする。プローブのシグナル強度はそのＡＥＳ値と高度に相関があるので、本発明者らは、ｖaの存在下でｐiが高いシグナル強度を有する確率であるＰ（ｐi｜ｖa）を、Ｐ（Ｘ≦ｘi）であると推定した。したがって、
【数１８】
2009504153.tif 000025
であり、式中ｃiは、ＡＥＳ値がｘi以下であるプローブの数である。
【０１１７】
プローブ選択のために、Ｐ（ｐi｜ｖa）＞λの場合に、プローブｐiが選択される。本実験において、λはλ＝０．８として設定される。
【０１１８】
したがって、本発明はまた、プローブ設計および／または標的核酸検出の方法を提供し、Ｐ（ｐi｜ｖa）＞λの場合、標的核酸ｖaの位置ｉのプローブｐiが選択され、式中、λは０．７５であり、Ｐ（ｐi｜ｖa）は、ｐiがｖaの存在下で高いシグナル強度を有する確率である。より具体的には、
【数１９】
2009504153.tif 000026
であり、式中Ｘは、ｖaの全てのプローブの増幅効率スコア（ＡＥＳ）値を表す確率変数であり、ｋはｖaにおけるプローブの数であり、ｃiは、ｘi以下であるＡＥＳ値を有するプローブの数である。
【０１１９】
＜標的核酸検出分析＞
以下の説明において、病原体検出チップ分析（ＰＤＣとも呼ばれる）に関連して、本発明をより具体的に説明する。しかしながら、分析（方法）は、この特定の実施形態に限定されず、本出願の内容全体にわたって記載されるような、本発明のいくつかの態様を包含する。したがって、具体的には、ウイルスゲノムのセットＶ＝｛ｖ1，ｖ2，・・・，ｖn｝のために設計される長さｍのプローブのセットＰ＝｛ｐ1，Ｐ2，・・・，ｐI｝を有するＰＤＣ仮定すると、病原体検出チップ分析の問題は、チップデータに基づいて試料中に存在するウイルスを検出することである。本明細書で、チップデータは、ＰＤＣ上のプローブシグナルによって提供される集合的な情報をいう。したがって、チップデータＤ＝｛ｄ1，ｄ2，・・・，ｄx｝は、ＰＤＣ上のプローブセットＰの対応するシグナルのセットである。
【０１２０】
試料を考慮すると、存在する場合、試料中に何の病原体が存在するか、いくつの異なる病原体が存在するのかは、全く不明である。しかしながら、ウイルスｖaが実際に試料中にある場合、ｖaのプローブのシグナル強度は、他のウイルス由来のプローブのシグナル強度と有意に異なるべきである。特に、他のウイルスと比較してｖaのより高い割合のプローブが、高いシグナル強度を有するべきである。したがって、ｖaにおけるプローブのシグナル強度の平均値が、ｖaに含まれないプローブのものよりも統計的に高いべきであると期待される。
【０１２１】
したがって、本発明は、ｖaにハイブリダイズするプローブのシグナル強度の平均値がｖaに含まれないプローブの平均値よりも統計的に高く、これが生体試料中のｖaの存在を示す方法を提供する。
【０１２２】
しかしながら、統計的により高い平均値を有することは、試料中にｖaが存在すると結論付けるには、依然として不十分である場合がある。好ましくは、さらなるステップが必要とされる場合がある。本発明者らは、高いシグナル強度を有するＰＤＣ上のプローブの割合に対する、高いシグナル強度を有するｖaに含まれないプローブの割合の相対的差異を計算する必要がある。これは、ｖaに含まれるプローブのシグナル強度の分布が、ｖaに含まれないプローブのものよりも正に歪んでいるという観察に基づく（図４Ａの矢印参照。比較のために、図４Ｂ参照）。
【０１２３】
上述の観察に基づいて、ウイルスの存在に関するチップデータＤを、以下のように分析した。各ウイルスｖa∈Ｖについて、本発明者らは、片側ｔ検定（Ｇｏｕｌｄｅｎ，Ｃ．Ｈ．，１９５６）を用いて、ｖaに含まれるプローブのシグナル強度の平均値が、ｖaに含まれないプローブのシグナル強度のものよりも統計的に高いかどうかを判定した。したがって、ｔ統計を計算した：
【数２０】
2009504153.tif 000027
式中、μa、σa2およびｎaは、それぞれｖaに含まれるプローブのシグナル強度の、平均値、分散、およびサイズであり、μa'、σa'2およびｎa'は、それぞれｖaに含まれないプローブのシグナル強度の平均値、分散、およびサイズである。
【０１２４】
差異の有意性を試験するために、有意性のレベルを０．０５に設定した。これは、ｖaに含まれるプローブのシグナル強度の平均値がｖaに含まれないプローブのシグナル強度のものよりも高いという仮説が、ｔaのｐ値が０．０５未満である場合にのみ許容されることを意味する。この場合、ｖaは、試料中に存在する見込みがある。
【０１２５】
ウイルスのシグナル強度の分布が他のウイルスのものと異なるかどうかを本発明者らが知ることができるｔ検定のみでは、特定のウイルスが試料中にあるかどうかを判定するのに十分でない。２つの分布がどれだけ類似または相違しているかを知ることも必須である。真の分布とモデル分布との間の類似性を測定するのに用いることができる尺度は、カルバック・ライブラー情報量（Ｋｕｌｌｂａｃｋ  ａｎｄ  Ｌｅｉｂｅｒ，１９５１）（相対エントロピーとしても公知）である。この適用において、ｖaにおけるプローブのシグナル強度の確率分布は真の分布であるが、Ｐにおける全てのプローブのシグナル強度の確率分布はモデル分布である。Ｐaをｖaにおけるプローブのセットとする。ＰaおよびＰのシグナル強度の確率分布のカルバック・ライブラー（ＫＬ）情報量は、
【数２１】
2009504153.tif 000028
であり、式中、μはＰにおけるプローブの平均シグナル強度であり、ｆa（ｘ）はシグナル強度ｘのＰaにおけるプローブの比率であり、ｆ（ｘ）はシグナル強度ｘのＰにおけるプローブの比率である。したがって、ＫＬ（Ｐa‖Ｐ）＝０の場合、Ｐaの確率分布は、Ｐのものとちょうど同じということになる。そうでなければ、それらは異なる。
【０１２６】
試料中に存在するウイルスは、母集団のものよりも高いシグナル強度を有するので、これは、ＫＬ（Ｐa‖Ｐ）＞０の場合にｖaが試料中に存在する確率を有することを含意する。したがって、ＫＬ（Ｐa‖Ｐ）の値が大きいほど、２つの確率分布はより異なり、ｖaが実際に試料中に存在する見込みが高くなる。
【０１２７】
２つの確率分布の全てのｘにわたるカルバック・ライブラー情報量が集合的な差異であることに留意することが重要である。したがって、カルバック・ライブラー情報量は確率分布の変化を見出すのには優れているが、拡散を見出すのには常にそれほど優れているわけではなく、これは確率分布の尾部に、より影響を及ぼす。図４（Ａ、Ｂ）に説明されているように、確率分布の尾部は、ウイルスが試料中に存在するかどうかについてのほとんどの情報を提供する。したがって、カルバック・ライブラー情報量統計は、このような観察をより正確に反映するように改良されなければならない。
【０１２８】
その感度を尾部の外に増大させるために、本発明者らは、カルバック・ライブラー情報量に安定化および重み付きされた統計、アンダーソン・ダーリン統計を導入した（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｍ．Ａ．（１９７４）．ＥＤＦ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｇｏｏｄｎｅｓｓ  ｏｆ  Ｆｉｔ  ａｎｄ  Ｓｏｍｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ  ６９，ｐｐ．７３０−７３７）。したがって、重み付きカルバック・ライブラー情報量（ＷＫＬ）は、
【数２２】
2009504153.tif 000029
であり、式中、Ｑ（ｘ）は、Ｐにおけるプローブのシグナル強度の累積分布関数である。
【０１２９】
経験的試験から、ウイルスがない試料中で、０．０５の有意性レベルでｔ検定を通過するウイルスが５．０未満のＷＫＬを有することが示される。実際にウイルスが存在する試料中で、実際のウイルスは、０．０５の有意性レベルでｔ検定を通過するだけでなく、５．０以上のＷＫＬを有する唯一のウイルスである。したがって、本発明者らは、試料中に存在するウイルスについての重み付きカルバック・ライブラー情報量閾値を、５．０に設定した。この解析フレームワークを図５に示す。
【０１３０】
＜本発明の方法を行う装置および／または製品＞
本発明において提供されるアルゴリズムおよび／または方法を行うことできるソフトウエアをどのようにして構成するかは、当業者に周知である。したがって、本発明はまた、本発明の任意の実施形態によるアルゴリズムおよび／または方法を行うよう構成されたソフトウエアおよび／またはコンピュータプログラム製品も提供する。少なくとも１つの電子記憶媒体もまた提供される。電子記憶媒体は、コンピュータハードドライブ、ＣＤ−ＲＯＭ、フラッシュメモリー素子（例えば、ＵＳＢメモリ）、フロッピー（登録商標）ディスク、または当分野の任意の他の電子記憶媒体であってもよい。ソフトウエアは、パソコン、メインフレーム、および任意の計算処理装置上で実行されてもよく、具体的な構成は、当業者に公知である。
【０１３１】
本発明が例によってのみ説明されてきたこと、ならびに本発明の精神および範囲から逸脱することなく設計における種々の変更を行ってもよいことは、当業者に理解される。
【０１３２】
ここで、本発明を一般的に説明してきたが、例示によって提供され、本発明を限定することを意図されない、以下の実施例を参照して、より容易にこれが理解される。
【実施例】
【０１３３】
当分野で公知で、具体的に説明されていない標準的な分子生物学技術は、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）に記載されているように従った。
【０１３４】
＜マイクロアレイ合成＞
本発明者らは、シンガポールにおけるウイルス疾患の最も一般的な原因を代表する３５のウイルスゲノムを選択した（上記の表１参照）。
【０１３５】
ＮＣＢＩ生物分類データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｔａｘｏｎｏｍｙ／ｔａｘｏｎｏｍｙｈｏｍｅ．ｈｔｍｌ／）から全ゲノム配列をダウンロードして、ゲノム全体にわたってタイリングされたオーバーラップ平均８塩基の解像度の４０塩基長のプローブ配列を生成した。Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ専売特許の技術（Ｎｕｗａｙｓｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）を用いて、マイクロアレイ上に直接、各ウイルスプローブの７つの複製を合成した。マイクロアレイ上にプローブをランダムに分布させて、ハイブリダイゼーションアーチファクトを最小限にした。プローブへの試料の非特異的ハイブリダイゼーションを制御するため、およびバックグラウンドシグナルを測定するために、マイクロアレイ上に１０，０００のオリゴヌクレオチドプローブを設計および合成した。それらはヒトゲノムまたは病原体ゲノムに対する配列類似性がなく、４０〜６０％のＧＣ含有量を有するランダムプローブである。陽性対照として、免疫応答において公知または推測される機能を有するヒト遺伝子に対する４００のオリゴヌクレオチドプローブを、アレイ上で合成した。植物ウイルス、ＰＭＭＶを、合計３９０，４８２のプローブで陰性対照として含めた。
【０１３６】
＜試料調製、マイクロアレイハイブリダイゼーションおよび染色＞
デング熱細胞系（ＡＴＣＣ  ＃ＶＲ−１２５４）をＡＴＣＣ推奨のように培養し、Ｓｉｎ８５０  ＳＡＲＳ細胞系を記載されているように（Ｖｅｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）培養した。臨床材料（鼻咽頭洗浄液）を、インドネシアの小児科集団から得て、ＲＮＡゾル（Ｌｅｅｄｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，ＴＸ）中、−８０℃で保存した。全ては特定の呼吸器疾患の臨床兆候を示す、肺炎の疑いのある７〜３８月齢の間の患者であった。製造業者の使用説明書に従って（Ｓｍａｌｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）、ＲＮＡゾルでＲＮＡを抽出した。抽出されたＲＮＡを、ＲＮＡ保存溶液（Ａｍｂｉｏｎ、米国）に再懸濁し、必要になるまで−８０℃で保存した。Ｂｏｈｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ａｎｄ  Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｂｏｈｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）によって記載されたプロトコルに基づいて、タグを付けられたランダムプライマーを用いてＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。次いでこれまでに記載されているように（Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）、ｃＤＮＡをランダムＰＣＲによって増幅し、断片化し、ビオチン標識で末端標識し、マイクロアレイ上にハイブリダイズさせ、染色した。本発明者らの最初の実験において本発明者らは、プローブＧＣ含有量によって、シグナル強度がプローブＧＣ含有量に正比例して増加する、シグナル強度測定におけるアーチファクトが生じる可能性があることを見出した。０．８２ＭのＴＭＡＣをＮｉｍｂｌｅｇｅｎの専売特許のＴＭＡＣハイブリダイゼーションバッファーに加えることによって、このアーチファクトが排除された。
【０１３７】
＜ＲＳＶおよびｈＭＰＶについてのリアルタイム診断用ＲＴ−ＰＣＲ＞
２μｌの精製された患者ＲＮＡ、５ＵのＭｕＬＶ逆転写酵素、８Ｕの組換えＲＮアーゼ阻害剤、ＵＮＧを含まない１０μｌの２ＸユニバーサルＰＣＲマスターミックス（全てＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから）、０．９μＭのプライマーおよび０．２μＭのプローブを含有する２０μｌの反応混合物。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＴ配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。４８℃で３０分間ＲＴを行い、続いてＤＮＡポリメラーゼの活性化のために９５℃で１０分間行った。９５℃で１５秒間および６０℃で１分間の４０サイクルによってＲＴ産物の増幅を行った。陰性対照およびプラスミドクローンの段階希釈（陽性対照）を各ＰＣＲアッセイに含んだ。増幅の間、各熱サイクルで蛍光発光をモニタリングした。閾値（ＣＴ）は、有意な蛍光が最初に検出されるサイクルを表す。既知の濃度の対照プラスミドを用いることによって、ＣＴ値をコピー数に変換した。ＲＳＶについては、２．６１×１０9コピーが１１．８９７のＣＴ値を有したが、ｈＭＰＶについては、７．５１×１０9コピーが１０．５１のＣＴ値を有した。
【０１３８】
＜コロナウイルスおよびライノウイルスについての一段階診断用ＲＴ−ＰＣＲ＞
陽性対照としての使用のために、ヒトコロナウイルスＯＣ４３、２２９Ｅおよびライノウイルス１６の凍結した生きた培養物を、ＡＴＣＣ（Ｃａｔ＃  ＶＲ−１５５８，ＶＲ−７４０，ＶＲ−２８３）から購入した。製造業者の使用説明書に従ってＲＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、これらの培養物からＲＮＡを抽出した。以下の診断用プライマー対：パンコロナウイルス（Ｃｏｒ−ＦＷ，Ｃｏｒ−ＲＶ）、ＯＣ４３（ＯＣ４３−ＦＷ，ＯＣ４３−ＲＶ）、２２９Ｅ（２２９Ｅ−ＦＷ，２２９Ｅ−ＲＶ）、ライノウイルス（アンプリマー１，アンプリマー２）を用いて、これまでに記載されているように試料を増幅した（Ｍｏｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｄｅｆｆｅｒｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【０１３９】
＜病原体マイクロアレイデータの分析＞
本発明者らの病原体マイクロアレイは、３５のウイルスゲノムＶ＝｛ｖ1，ｖ2，・・・，ｖ35｝について異なるプローブハイブリダイゼーションサインに分けられた、４０塩基長のプローブのセットＰ＝｛ｐ1，ｐ2，・・・，ｐs｝を含有する。病原体核酸のハイブリダイゼーションの際に、プローブセットＰに対応するプローブシグナル強度データのセットＤ＝｛ｄ1，ｄ2，・・・，ｄs｝が生じる。
【０１４０】
＜片側Ｔ検定＞
ウイルスｖaが存在する場合、次いでそのハイブリダイゼーションサインを含むプローブ（ｖaに含まれるプローブ）は、ｔ統計（片側Ｔ検定）によって判定すると、ｖaに含まれないプローブよりも統計的に高いシグナル強度を有するべきである。
【数２３】
2009504153.tif 000030
式中、μa、σa2およびｎaは、それぞれｖaに含まれるプローブのシグナル強度の平均値、分散、およびサイズであり、μa'、ｓa'2およびｎa'はそれぞれｖaに含まれないプローブのシグナル強度の平均値、分散、およびサイズである。
【０１４１】
有意性のレベルを０．０５に設定した。これは、ｖaに含まれるプローブのシグナル強度の平均値がｖaに含まれないプローブのシグナル強度のものよりも高いという仮説を、ｔaのｐ値が０．０５未満である場合にのみ許容することを意味する。この場合ｖaは、試料中に存在する見込みがある。しかしながらＴ検定の検出の方法は、多くの偽陽性信号を生じる。
【０１４２】
＜ＰＤＡ  ｖ．１＞
ＰＤＡ  ｖ．１は、重み付きカルバック・ライブラー検定およびＺスコア変換（ＷＫＬスコア）で始まり、正規性についてのアンダーソン・ダーリン検定が続く、一連の統計試験を含む。
【０１４３】
ウイルスｖaを考慮する。Ｐaをウイルスｖaのプローブのセットとし、
【数２４】
2009504153.tif 000031
である。［ｒlow，ｒhigh］をシグナル強度範囲とする。本発明者らはこれを、ｊ＝０，１，・・・，ｃ−１についてのｃ個の瓶
【数２５】
2009504153.tif 000032
に分割した。修正されていないカルバック・ライブラー情報量は、
【数２６】
2009504153.tif 000033
によって計算してもよく、式中ｎajおよび
【数２７】
2009504153.tif 000034
は、それぞれ瓶ｂjに含有されるＰaにおけるプローブおよび
【数２８】
2009504153.tif 000035
におけるプローブの数である。
【数２９】
2009504153.tif 000036
は、瓶ｂjに見られるＰaにおけるプローブの比率であり、
【数３０】
2009504153.tif 000037
は、瓶ｂjに見られる
【数３１】
2009504153.tif 000038
におけるプローブの比率である。
【０１４４】
確率分布の尾部のシグナル差異を比較するために、本発明者らは、
【数３２】
2009504153.tif 000039
【数３３】
2009504153.tif 000040
におけるプローブの平均シグナル強度、およびｒhigh＝最大シグナル強度に設定した。本発明者らは、瓶のデフォルト数をｃ＝２０に設定した。
【０１４５】
確率分布の尾部でのカルバック・ライブラー情報量の感度をさらに安定化および／または増大させるために、２つの修正を行った。まず本発明者らは、アンダーソン・ダーリン型重み付き関数をカルバック・ライブラー情報量に導入した。これによって分布の中央部よりも尾部に、より多くの重み付けが生じた。次いで本発明者らは、それらの確率密度関数の代わりに、２つの対応する累積分布関数に統計を適用した。本発明者らは、本発明者らの改善されたカルバック・ライブラー情報量を重み付きカルバック・ライブラー情報量（ＷＫＬスコア）と呼ぶ。
【０１４６】
【数３４】
2009504153.tif 000041
式中、Ｑa（ｊ）は、瓶ｂjに見られるＰaにおけるプローブのシグナル強度の累積分布関数であり；
【数３５】
2009504153.tif 000042
は、瓶ｂjに見られる
【数３６】
2009504153.tif 000043
におけるプローブのシグナル強度の累積分布関数である。
【０１４７】
したがってハイブリダイズした各試料については、本発明者らはＶに含まれる各ウイルスｖaのＷＫＬスコアを計算した。次に本発明者らは、Ｖに含まれる全てのウイルスｖaのＷＫＬスコアの分布が試料中にウイルスが存在しない場合、およそ正規であることを主張した。本発明者らはブートストラッププロセスによって、本発明者らの主張が正しいかどうかを経験的に検証した：ｎをＶにおけるウイルスの数とする。ｋ＝１，・・・，ｎである、Ｖに含まれる各ウイルスｖkについて本発明者らは、置換によってｖkの「乱された」シグナル強度分布を形成して、実際のデータセットＤからランダムに｜ｖk｜プローブシグナル強度を選択した。このような分布はｖkが試料Ｄ中に存在しない状況を模倣することができる。その後ｎ個のウイルスのセットについて、ｎ個のＷＫＬスコアが生じる。次に本発明者らは、９５％信頼区間での正規性についてのアンダーソン・ダーリン検定によって、ｎ個のＷＫＬスコアが正規分布に従うかどうかを調べた。ブートストラップを１００，０００回繰り返した。分布は９９％を超える回で正規であることがわかった。（ＮＢ：本発明者らのマイクロアレイ上に示される３５のウイルスゲノムがあったので、ｎ＝３５）
【０１４８】
上述の議論に基づいて本発明者らは、以下の帰無仮説および対立仮説を作成することによって、試料がウイルスを含有するかどうかを試験することができる。
Ｈ0：ＷＫＬスコアの分布は正規であり、すなわちウイルスは試料中に存在しない。
Ｈ1：ＷＫＬスコアの分布は正規でなく、すなわち少なくとも１つのウイルスが試料中に存在する。
＜定義＞
アンダーソン・ダーリン検定は、
Ｈ0：データは特定分布に従う。
Ｈa：データは特定分布に従わない。
検定統計：アンダーソン・ダーリン検定統計は、
Ａ2＝−Ｎ−Ｓ
として定義され、
式中、
【数３７】
2009504153.tif 000044
であり、Ｆは特定分布の累積分布関数である。Ｙ1が順序付けられたデータであることに留意されたい。
有意性レベル：α
臨界領域：アンダーソン・ダーリン検定についての臨界値は、試験されている特定分布に依存する。いくつかの特定分布（正規、対数正規、指数関数、ワイブル、ロジスティック、極値分布１型）についての表集計値および式は、公開されている（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，１９７４，１９７６，１９７７，１９７９）。検定は片側検定であり、分布が特定の形態であるという仮説は、検定統計Ａが臨界値よりも大きい場合に拒絶される。
として定義される。
【０１４９】
本発明者らは、ＷＫＬスコアの分布に関する正規性についてのアンダーソン・ダーリン検定の適用を進め、９５％の信頼区間を有するＨ0を拒絶する。ＷＫＬスコアの分布が正規でない場合本発明者らは、次いで範囲外のＷＫＬスコアを有するウイルスを排除し、再びアンダーソン・ダーリン検定を適用する。Ｈ0が許容されるまでこのプロセスを繰り返す（重感染している病原体の存在を同定するため）。
【０１５０】
本発明者らはＨ0がバックグラウンドＷＫＬ分布として許容される場合に、ＷＫＬスコアの分布を表示する。したがって排除されたウイルスは、それらのＷＫＬスコアがバックグラウンドＷＫＬ分布に従わないので、試料中に存在する可能性が非常に高い。
【０１５１】
本発明者らの実験において本発明者らは、ウイルスを含有する試料中で、所与のＷＫＬスコアで非正規分布が偶然によって起こる可能性であるＰが非常に低い、すなわちＰ＜１．０×１０-6であることを観察した（ＷＫＬスコアのＺスコア変換によって得られる）。本発明者らのウイルス検出アルゴリズムについての擬似コードを以下に示す。
【０１５２】
＜ウイルス検出アルゴリズム＞
ウイルスセットＶおよびプローブセットＰを有する病原体マイクロアレイデータＤを仮定し、
Ｖpresent＝Ｆとし、
Ｖに含まれる全てのｖについて、ＤWKLを
【数３８】
2009504153.tif 000045
のセットとし、
１．正規性についてのアンダーソン・ダーリン検定でＤWKLの正規性を判定する。ＤWKLが有意性レベル０．０５の正規分布である場合、Ｖpresentを返す。そうでなければステップ２に進む。
２．最も高いＷＫＬ（Ｐa‖Ｐa'）を有するウイルスｖaをＤWKLから見つける。
Ｖpresent＝Ｖpresent∪｛ｖa｝；ＤWKL＝ＤWKL−｛ＷＫＬ（Ｐa‖Ｐa'）｝とする；ステップ１に進む。
３．検出されたＳＰＳを除去し、ＷＫＬ分布が正規であることを検証する。
４．分布が正規でない場合、ステップ２に戻って重感染している病原体を見つける。
【０１５３】
＜ゲノム規模での増幅バイアスの予測＞
臨床材料中の未知の病原体を同定するためには、プライマー特異的増幅よりもランダムプライマー増幅が好ましい。しかしながら、既知の病原体を同定するためのランダムプライミング増幅を用いた最初の実験において本発明者らは、しばしば配列多型によって説明されない、ゲノム領域に渡る不完全なハイブリダイゼーションを観察した（図７Ｃ）。ゲノム二次構造、プローブ二次構造およびプローブＧＣ含有量もまた、これらの低シグナル強度プローブを説明することができなかった。したがって本発明者らは、不完全なハイブリダイゼーションが、ランダムプライマーが逆転写（ＲＴ）ステップでウイルスゲノムに結合する能力の差異から生じるＰＣＲバイアスによるかもしれないという仮説を立てた。本発明者らの実験において使用されるランダムプライマーは、固定された１７塩基長の配列（５’−ＧＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＴＡ）（配列番号１）でタグを付けられたランダムノナマー（３’）で構成される２６塩基長であり（図１も参照）、ここで固定された５’タグの目的は、ＲＴ産物のＰＣＲを容易にして、１００００ｂｐ未満のＰＣＲ断片、具体的には５００〜１０００ｂｐのＰＣＲ断片を生じることであった（Ｐａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。この現象を研究するために本発明者らは、アルゴリズム（ＡＥＳ）を設計して実験データを用いてＲＴ−ＰＣＲプロセスをモデリングした。成功するＲＴ−ＰＣＲはプライマーが鋳型に結合する能力に依存する。鋳型との間の二量体およびヘアピン形成等のプライマー内二次構造形成。タグとノナマーとの間の二量体およびヘアピン形成等のプライマー内二次構造形成、ならびにプローブ融解温度は、結合効率に影響を及ぼすことが公知である（Ｎｇｕｙｅｎ  ａｎｄ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，２０００；Ｒａｔｕｓｈｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。
【０１５４】
ランダムプライマーミックス中のノナマーがウイルスゲノムの配列を完璧に補完すると仮定して、アルゴリズムは５００〜１０００ｂｐの産物が、ゲノム中の可能性のある各開始位置から生じることができる確率を判定する。したがって１０００塩基のスライディングウインドウの各ヌクレオチドについて、これがうまく増幅される確率は、その増幅効率スコア（ＡＥＳ；上述の増幅効率スコア参照）に反映される。アルゴリズムを検証するために本発明者らは、ハイブリダイゼーションシグナル強度をＲＳＶゲノムについての全１，９４８のＳＰＳプローブについて順位付けし、それらをそれらのＡＥＳ値と比較した。ＲＳＶゲノム全体で本発明者らは、ＡＥＳがハイブリダイゼーションシグナル強度と極めて関連していることを観察し（Ｆｉｓｈｅｒの直接確率法Ｐ＝２．２×１０-16）、ＡＥＳとプローブ検出との間の強い相関が示された（図１２）。メタニューモウイルスについての１，７０５のＳＰＳプローブを用いた別の比較から類似した結果、Ｐ＝１．３×１０-9が示された。臨床試料中のＳＰＳプローブ検出の予測におけるＡＥＳの重要性を図１０に示す。とりわけ本発明者らは、ＡＥＳのより高い値が特に上位２０％のＡＥＳ値において、より大きい割合の検出可能なプローブと相関していたことを観察した。したがってＨＤ、ＭＣＭ、％ＧＣおよび配列独自性は、プローブ性能の有益なパラメータであるが、それらはＰＣＲバイアスを考慮せず、したがってＡＥＳなしで考えた場合、プローブ性能の不十分な予測の判断材料である。病原体ＳＰＳの選択における第一のフィルターとしての上位２０パーセンタイルのＡＥＳを用いることによって、より高いＷＫＬスコアおよび偽陽性信号の排除によって明らかなように病原体予測が有意に向上した（表３）。
【０１５５】
【表３】
2009504153.tif 000046
アレイ上でハイブリダイズした全ての患者試料についてのデータを、下記の表４に示す。
【０１５６】
【表４Ａ】
2009504153.tif 000047
【表４Ｂ】
2009504153.tif 000048
*ＬＲＴＩ：下気道感染
【０１５７】
ＡＥＳの重要性から、最適化されたＲＴ−ＰＣＲプライマータグを用いることによって、増幅効率およびそれに続くプローブ検出が向上することができることが示唆された。したがって本発明者らは、ランダムに生じた１７塩基長のタグ配列を用いてＡＥＳスコアを計算し、最も大きいＡＥＳスコアの全体的増大を生じる上位３つの最も相違するプライマーを選択した（図１３）。ＡＥＳ最適化プライマーを用いて本発明者らは、向上したＰＣＲ効率および検出感度で、臨床試料由来のメタニューモウイルスおよびＲＳＶを増幅した（図１４、表５）。
【０１５８】
【表５】
2009504153.tif 000049
【０１５９】
＜ＰＤＡ  ｖ．１−病原体を検出するためのアルゴリズム＞
臨床材料はしばしば、ゲノム増幅のために準最適である。それらは低いウイルス価を有するか、アレイ上の参考菌株由来の配列多型を有するか、または重感染している病原体を有する場合がある。マイクロアレイはまた、非特異的ハイブリダイゼーションおよび他のアーチファクト由来の内部雑音を有する。したがってマイクロアレイデータを解釈することは、プローブシグナル強度プロフィールをＳＰＳに適合させるか、または単純な統計的手法（例えば、Ｔ検定、ＡＮＯＶＡ等）を用いる簡単な問題ではない。この問題を扱うために本発明者らは、コンピュータ内で予測されるＳＰＳと関連してプローブシグナル強度の分布を分析して、ハイブリダイズした試料中に存在する病原体を同定する、ロバスト統計ソフトウエア、ＰＤＡ  ｖ．１を確立した（上記参照）。
【０１６０】
アレイ上の全てのプローブについてのシグナル強度は正規分布に分類されるが、試料中に存在する病原体ＳＰＳを含むプローブの大部分は右に歪んだ分布を生じる非常に強力なシグナル強度を有するという本発明者らの観察に基づいて、本発明者らは、プローブシグナル強度の分布を分析することによって、病原体の存在を検出することができると推測した（図９Ａ）。各ＳＰＳについてシグナル強度分布の尾部を調べることによっても、試料中で重感染している病原体の存在を同定することが可能になる。
【０１６１】
したがって、ＰＤＡ  ｖ．１は、２つの部分を含む。（１）各病原体ＳＰＳにおけるプローブのプローブシグナル強度を評価するための重み付きカルバック・ライブラー情報量（ＷＫＬ；本発明者らの、改良されたカルバック・ライブラー検定）、および（２）各ＳＰＳについてのＷＫＬスコアの分布が正規であるかどうかを判定するためのアンダーソン・ダーリン検定。
【０１６２】
元々のカルバック・ライブラーは確率分布の尾部の差異を確実に判定することができず、プローブ／ゲノムの数および各シグナル強度瓶のサイズに高度に依存している（Ｋｕｌｌｂａｃｋ  ａｎｄ  Ｌｅｉｂｌｅｒ，１９５１）。本発明者らはアンダーソン・ダーリン統計を組み込んで、各分布の尾部により多くの重みを与えることによって、および元々の確率分布の代わりに累積分布関数を用いることによって、これらの欠点を克服した（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｄａｒｌｉｎｇ，１９５２）。本発明者らは本発明者らの改良されたＫＬ情報量を、重み付きカルバック・ライブラー情報量（ＷＫＬ）と呼ぶ。
【０１６３】
【数３９】
2009504153.tif 000050
式中、Ｑa（ｊ）は、瓶ｂjに見られるＰaにおけるプローブのシグナル強度の累積分布関数であり；
【数４０】
2009504153.tif 000051
は、瓶ｂjに見られる
【数４１】
2009504153.tif 000052
におけるプローブのシグナル強度の累積分布関数である。病原体の非存在を表すＳＰＳは、正規のシグナル強度分布、および従って比較的低いＷＫＬスコアを有するべきであるが、病原体の存在を表すものは高い、統計的に有意な、範囲外のＷＫＬスコアを有するべきである（図９Ｂ）。ＰＤＡ  ｖ．１の第二の部分において、ＷＫＬスコアの分布を、正規性についてのアンダーソン・ダーリン検定に供する。Ｐ＜０．０５の場合ＷＫＬ分布は、正規でないと見なされ、範囲外のＷＫＬスコアを有する病原体が存在することが含意される。病原体の同定の際に、そのＷＫＬスコアなしで別々のアンダーソン・ダーリン検定を行って、重感染している病原体の存在について試験する。このようにして正規分布だけが残るまで（すなわち、Ｐ＞０．０５；上記の表３および表４参照）、手順を反復して適用する。ＰＤＡ  ｖ．１は非常に速く、ハイブリダイズしたマイクロアレイから約１０秒で診断を行うことができる。
【０１６４】
＜３３の臨床患者試料に関する病原体診断＞
本発明者らは図１１に示されるワークフローに従って、３３の臨床材料を本発明者らの病原体マイクロアレイ基盤にハイブリダイズすることによって、本発明者らの基盤を評価した。これらのうち２７の標本は、予めＲＳＶ  Ａ、ＲＳＶ−Ｂまたはメタニューモウイルスと診断されていた。本発明者らの基盤は２１／２７の試料から病原体を正確に検出した。ウイルスが検出されなかった６つの試料（偽陰性）は、リアルタイムＰＣＲによる検出限界（＜１０ウイルスコピー／反応）であり、このような低いウイルス量は患者の深刻な疾患に関与する病原因子である可能性は低かった。これらのうち２つは、マイクロアレイによってライノウイルスに感染していると正しく診断された。未知の病原体によって引き起こされた深刻な呼吸器疾患を有する別の６人の患者のスクリーニングにおいて、マイクロアレイは試料のうちの１つにおいて、病原因子（ライノウイルス）を同定した（上記の表４）。リアルタイムＰＣＲによってこれらの結果を検証した。期待されたように本発明者らは、非ウイルス性病因を有する肺炎患者から抽出された試料をハイブリダイズさせた場合、いかなる病原体も検出しなかった。
【０１６５】
＜データ解析＞
Ａｘｏｎ  ４０００ｂスキャナーおよびＧｅｎｅｐｉｘ  ４ソフトウエア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、５μｍ分解能でマイクロアレイをスキャンした。Ｎｉｍｂｌｅｓｃａｎ  ２．１ソフトウエア（ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてシグナル強度を抽出した。自動化スクリプトを使用して本発明者らは、各プローブの７つの複製からメジアンシグナル強度（ハイブリダイゼーションアーチファクトを排除するため）および標準偏差を計算した。プローブシグナル強度をゲノムによって分類し、配列順に配置し、次いでＪａｖａ（登録商標）  Ｔｒｅｅｖｉｅｗ（ｈｔｔｐ：／／ｊｔｒｅｅｖｉｅｗ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ）でシグナル強度を図式的に見るために、ＣＤＴ形式に再フォーマットした。並行してＰＤＡ  ｖ．１を用いてプローブメジアンシグナル強度を分析して、どの病原体が存在するか、および関連する予測の信頼水準を判定した。本発明者らは実験を行って、実験結果に対するプローブ設計の効果を示し、次いで本発明による分析アルゴリズムのロバスト性を示した。
【０１６６】
＜実験結果に対するプローブ設計の効果＞
ヒトに影響を及ぼす３５のウイルス由来の５３５５５の４０塩基長のプローブを含有するＰＤＣを、４つの独立したマイクロアレイ実験に使用した。これらの５３５５５のプローブを、各ウイルスの５ｂｐのタイリングに基づいて選択し、プローブ設計基準のいずれにも供さなかった。したがって本発明者らは、ＣＧ含有量、クロスハイブリダイゼーションおよび不十分な増幅によって生じる誤差が、うまく設計されたプローブを有するＰＤＣのものよりも有意に高いと期待した。本発明者らは４つの実験についてのこのような不利な設定において、本発明者らの分析アルゴリズムを試験した。
【０１６７】
本実施例において、未知の病原体を含むヒト試料をランダムプローブを用いたＲＴ−ＰＣＲプロセスによって増幅し、次いでＰＤＣ上にハイブリダイズさせた。本発明者らは、本発明者らのＰＤＣ上の３５のウイルスのそれぞれについてのプローブを、０．０５の有意性レベルの片側ｔ検定に供し、チップ上の全てのプローブのシグナル強度に対してそれらのシグナル強度の重み付きカルバック・ライブラー（ＷＫＬ）情報量を計算して、各実験について試料中にどのウイルスがあるかを判定した。ウエットラボＰＣＲによって本発明者らのプログラムによる分析の精度の確認を行って、試料中の実際のウイルスを同定した。表６の４つの実験についての本発明者らの分析の結果およびそれらの対応するＰＣＲ検証を、表６に示す。
【０１６８】
【表６Ａ】
2009504153.tif 000053
【表６Ｂ】
2009504153.tif 000054
【０１６９】
本結果から分析アルゴリズムが、最初の３つの実験において試験された試料中の実際のウイルスを正確に予測することが示される（上記の表６に示される結果）。さらに本発明者らは最後の実験において、試料がウイルスを有さないことを推測することができた。本発明者らが有意性のレベルが０．０５のｔ検定を使用しただけの場合、各試料について存在すると検出されたウイルスの数が下記の表７に示されることに留意されたい。
【０１７０】
【表７】
2009504153.tif 000055
【０１７１】
ｔ検定を通過するウイルスの重み付きカルバック・ライブラー情報量を用いることによって本発明者らは、全ての偽陽性ウイルスを除去して、実際のウイルスを同定することができた。したがって本発明者らの分析アルゴリズムは、高レベルの雑音下でウイルスを確実に判定することができる。
【０１７２】
次に本発明者らは、本発明者らの分析結果に対する、プローブ設計基準を適用したＰＤＣを用いることの効果を調べた。まず３５のウイルスのそれぞれについての増幅効率マップを計算した。次いで元々のＰＤＣ上のちょうど５３５５５のプローブを、プローブ設計基準に供した。極端なレベルのＣＧ含有量、ヒトおよび非標的ウイルスに対する高い類似性、ならびに低い増幅効率スコアを有するプローブをチップから除去した。合計１０９５５のプローブを、第二の組の実験のために保持した。第一の組の実験で使用された試料を用いて、本発明者らは新しいチップで、下記の表８の４つの実験を繰り返した。実験結果を表８に示す。
【０１７３】
【表８Ａ】
2009504153.tif 000056
【表８Ｂ】
2009504153.tif 000057
【０１７４】
以下の組の実験において分析アルゴリズムは、３つの試料、および陰性試料においても、実際のウイルスを正確に検出した。本発明者らのチップのための優れたプローブを設計した後、実験１、２および３における実際のウイルスの重み付きカルバック・ライブラー情報量は、プローブ設計のない対応する実験のものよりも大きかった。これは実際のウイルス由来のシグナル強度が、ＰＤＣにおけるバックグラウンドノイズよりも比較的高かったことを意味する。このことから、本発明者らのプローブ設計基準によってＰＤＣからいくつかの不良なプローブが除去され、それによってより正確な分析が生じたことが示された。
【０１７５】
ここでも有意性のレベルが０．０５のｔ検定を用いただけの場合、下記の表９に示される４つの実験の結果を示す。このとき各試料について存在すると検出されたウイルスの数を表９に示す。
【０１７６】
【表９】
2009504153.tif 000058
【０１７７】
表９から、プローブ設計によって試料３５２５９＿３２４および３５１７９＿１２２についてのｔ検定によって検出された偽陽性ウイルスの数が減少したことがわかる。より重要な点は、実際のウイルスについての重み付きカルバック・ライブラー情報量が４つ全ての試料において増大したことである。これはＰＤＣにプローブ設計基準が適用された場合に、実際のウイルスのシグナルがバックグラウンドシグナルよりも差異があったことを意味する。
【０１７８】
結論として本発明者らは、０．０５の有意性レベルの片側ｔ検定を用い、それに続いて各ウイルスのシグナル強度についての重み付きカルバック・ライブラー情報量を計算して、本発明者らがＰＤＣ上のデータを正確に分析し、高い確率で試料中の実際の病原体を判定することができたことを示した。分析アルゴリズムは高レベルのノイズ下でもうまく機能するが、本発明者らは、分析の精度が上述のプローブ設計基準を用いることによって改良されて、ＰＤＣについてのプローブの優れたセットが選択されることを示した。
【０１７９】
＜プローブ設計および病原体検出のための代替的方法＞
マイクロアレイ上のクロスハイブリダイゼーションを予測するのに利用可能なアルゴリズムはほとんどなく、１つのアルゴリズム、Ｅ−Ｐｒｅｄｉｃｔだけが、マイクロアレイ上で病原体を検出することについて報告および検証されている（Ｕｒｉｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。Ｅ−Ｐｒｅｄｉｃｔは、ハイブリダイゼーションサインを各マイクロアレイプローブについてのハイブリダイゼーションの理論的自由エネルギーに由来する、予測されるサインと適合させる。しかしながらＥ−ｐｒｅｄｉｃｔを用いて本発明者らのマイクロアレイを分析すると、多くの偽陽性信号を生じた（上記の表５参照）。例えばＥ−Ｐｒｅｄｉｃｔは、ＲＳＶ患者４１２においてコロナウイルスを検出した（図１５）。パンコロナウイルスプライマーならびにＯＣ４３および２２９Ｅコロナウイルスのための特定の診断用プライマーを用いた診断用ＰＣＲによって、患者４１２のコロナウイルスの非存在が確認された（上記の表４参照）。本発明者らは、Ｅ−Ｐｒｅｄｉｃｔを用いた偽陽性信号が、ヒトまたはＲＳＶゲノムとクロスハイブリダイズするコロナウイルスプローブから生じたという仮説を立てた。実際に最も高いシグナル強度を有する５０のコロナウイルスプローブの８５％がヒトゲノムとクロスハイブリダイズすると予測され、６５％がＲＳＶに関して１７未満のＨＤを有し、これは家族性クロスハイブリダイゼーションについての本発明者らの１２のＨＤ閾値のすぐ上である。さらにＥ−Ｐｒｅｄｉｃｔを最適化して、ヒトゲノムへのクロスハイブリダイゼーションが重要な考慮すべき事柄であるタイリングアレイの代わりに、ウイルスゲノム領域の間で高度に保存されたプローブを含有するマイクロアレイ上で機能させた。したがってこれらの２つの要因−異なるマイクロアレイ設計戦略およびヒトゲノムへのクロスハイブリダイゼーションは、本発明者らの基盤に関してＥ−ｐｒｅｄｉｃｔの貧弱な性能に寄与するようである。本発明者らのＥ−ｐｒｅｄｉｃｔでの経験から、ＰＤＡ  ｖ１はそれらは異なるプローブ長について設計され、他の適用および基盤について最適化されているので、他のアルゴリズムと比較するのは公正ではない。
【０１８０】
＜結論＞
クロスハイブリダイゼーション閾値を経験的に判定することによって、本発明者らは、臨床試料中に存在する特定のウイルスとよくハイブリダイズするプローブのみを含むコンピュータ内での病原体サインプローブセットを作製した。ＡＥＳアルゴリズムによってユニバーサルプライマータグを設計して、ウイルスゲノム全体を効率的に増幅することが可能になった。ＰＤＡ  ｖ．１検出アルゴリズムとともに、臨床試料由来のマイクロアレイ上に示される病原体のいずれかを確実に同定することができる。この手法によって、各病原体ハイブリダイゼーションサインの経験的な検証の必要性が排除され、病原体同定の強力な診断の基盤となる、１００００を越える病原体についてのプローブを含有する将来のマイクロアレイが可能になる。
本発明者らは、病原体検出マイクロアレイの設計および分析を最適化し、病院におけるそれらの使用を容易にした。本発明者らは、ランダムＰＣＲにおいて日常的に使用されるプライマータグが偏っており、病原体ゲノムの不均一な増幅を生じることを発見した。この偏りは、本発明者らのＡＥＳアルゴリズムを用いてプライマーを設計することによって避けることができる。本発明者らのコンピュータ内でのサインプローブセットによって、どのプローブがアレイ上に示されるいずれかの病原体にハイブリダイズするかを正確に予測することができる。ＰＤＡ  ｖ．１検出アルゴリズムとともに、この手法によって、各病原体ハイブリダイゼーションサインの経験的な検証の必要性が排除され、病原体同定のための強力な診断の基盤となる１００００を越える病原体についてのプローブを含有する将来のマイクロアレイが可能になる。
【０１８１】
ここで本発明者らは、ウイルス増幅効率、ハイブリダイゼーションシグナル出力、標的−プローブアニーリング特異性、および特注設計のマイクロアレイ基盤を用いた病原体検出の再現性の間の、複雑な関係の体系的調査の結果を報告する。本発明者らの発見によって、最適な病原体サインプローブセット（ＳＰＳ）のコンピュータ内での予測の新規の方法論の基礎が形成され、（マイクロアレイハイブリダイゼーションの前の）ウイルス増幅効率を左右する要因に光明が投じられ、ウイルス増幅効率スコア（ＡＥＳ）と最適なプローブ選択との間の重要な関連が示される。最後に本発明者らは、ウイルス価の範囲全体で臨床材料中の病原体を迅速かつ再現性良く同定することができる、新しい統計ベースの病原体検出アルゴリズム（ＰＤＡ）を説明する。
【０１８２】
本発明者らは、公的に利用可能なデータベースから得られたウイルスゲノム配列を用いて、少なくとも４０００のウイルスコピーが存在するかどうかの高い程度の確実性で、臨床試料中のウイルスを検出することの実行可能性を示した（上記の表３参照）。その感度は抗原検出方法のものに近づき、それによって臨床的に意義のある検出手段になる（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｍａｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。コンピュータ内で病原体ハイブリダイゼーションサインを正確に予測できることによって、最初にアレイを純粋な病原体試料にハイブリダイズさせることによる経験的な検証を必要とする現在のマイクロアレイ方法に対し、相当な進展が提供される。アレイ上に示される病原体の特異的同定に加えて、ＰＤＡ  ｖ．１によってアレイ上に特異的に示されないそれらのゲノムについて、病原体の綱、科または属の同定が可能になる（ＨＤおよびＭＣＭの閾値を緩めることによって）。この情報はしばしば、病院における治療法の決定に十分である。ＡＥＳ最適化タグで、本発明者らは非ＡＥＳ最適化タグを用いて増幅した場合に、以前は検出することができなかった臨床試料由来のウイルスを同定することができた。したがってＡＥＳによるタグの選択によって、ＰＣＲ効率および検出の感度が増大した。本発明のアルゴリズムは、ＤＮＡライブラリーの生成および再配列決定のためのＲＮＡの強化等の、他のタグベースのＰＣＲ用途に適用してもよい。
【０１８３】
【表１０Ａ】
2009504153.tif 000059
【表１０Ｂ】
2009504153.tif 000060
【図面の簡単な説明】
【０１８４】
【図１】ウイルス配列（配列番号１〜９）上のランダムプライマーの対のＲＴ−ＰＣＲ結合プロセスを示す。図１についての標識は以下のとおりである。  Ａ：逆転写（ＲＴ）。プライマーが鋳型に結合する。  Ｂ：タグを付けたＲＴ産物が生じる（詳細には、仮説上のウイルス配列鋳型および仮説上の特異的ランダムプライマーで）。  Ｃ：タグを組み込んで、第二の鎖合成を完了する。  Ｄ：ＰＣＲプライマーＧＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＴＡ（配列番号８）を使用した、タグを付けたＲＴ産物の増幅。
【図２】ＲＳＶ−Ｂゲノムについての増幅効率スコアリング（ＡＥＳ）マップを示す。
【図３】ＲＳＶ−Ｂについての一実験のオリゴヌクレオチドプローブシグナル強度を示す。
【図４】図４Ａは、試験した試料中のウイルスのシグナル強度の密度分布を示す。矢印は分布の正の歪みを示す。これは、ノイズはあるが有意な量の実信号もあることを示す。図４Ｂは、試料中にないウイルスのシグナル強度の密度分布を示す。これはノイズ領域である。
【図５】病原体検出チップデータの解析フレームワークを示す。
【図６】オリゴヌクレオチドプローブ設計スキーマ。これは、ＮＣ＿００１７８１ヒト呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）のゲノム全体で作製されたタイリングプローブを示す。数字は各プローブの開始および終止部分を表す。１９４８のプローブを合成して、１５２２５ｂｐのＲＳＶゲノム全体をカバーした。このプロセスを、残りの３４のウイルスゲノムについて繰り返した。
【図７】マイクロアレイバーの標識の手掛かり：
【表１１】
2009504153.tif 000061
ＳＡＲＳ  Ｓｉｎ８５０感染細胞系（Ａ）または１型デング熱感染細胞系（Ｂ）から単離されたＲＮＡを、それぞれＳＡＲＳ特異的または１型デング熱特異的ＲＴ−ＰＣＲの後、病原体マイクロアレイ上にハイブリダイズした。ＳＡＲＳは他のコロナウイルス科ゲノム、具体的には高度に保存されたゲノムの中間部分にクロスハイブリダイズした（黒色で示す）（Ｒｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。１型デング熱はそれらの配列類似性に基づいて、フラビウイルス科由来のプローブおよび他のゲノムにクロスハイブリダイズした。ハミング距離（ＨＤ）および最大連続マッチ（ＭＣＭ）スコアを調べることによって、クロスハイブリダイゼーションが起こるかどうかを予測する閾値を確立し、この情報を利用してコンピュータ内でのハイブリダイゼーションサインを生成した。（Ｃ）ＲＳＶを有すると診断された臨床患者から単離されたＲＮＡをランダムＲＴ−ＰＣＲを用いて増幅し、病原体マイクロアレイ上にハイブリダイズさせた。
【図８】プローブハミング距離（ＨＤ）、プローブ最大連続マッチ（ＭＣＭ）およびプローブシグナル強度の間の関係。平均プローブシグナル強度は、ＨＤが増大しＭＣＭが減少すると減少した。これは、検出可能なプローブのパーセンテージの減少と相関がある（シグナル強度＞平均値＋２ＳＤ）。最適なクロスハイブリダイゼーション閾値ＨＤ≦４またはＭＣＭ≧１８（影付き）で、９８％を超えるプローブを検出することができる。ＨＤ＝５またはＭＣＭ＝１７で、検出率は８５％に落ちる。
【図９】ＲＳＶ感染患者から単離されたＲＮＡを、病原体検出アレイにハイブリダイズさせた。（Ａ）全５３，５５５のプローブのプローブシグナル強度の分布から、正規分布（灰色の実線）が示される。非ＲＳＶプローブはゲノム特異的レベルで調べた場合、例えばパラインフルエンザ−１（灰色の点線）からも、正規分布が示される。ＲＳＶ特異的プローブのシグナル強度は正の歪みを有し、分布の尾部のシグナル強度がより高い（黒色の実線）。（Ｂ）大多数が−５〜３の間の範囲である３５のＳＰＳについてのＷＫＬスコアの分布頻度。しかしながら、ＲＳＶゲノムのＷＫＬスコアは１７であり、そのため分布は正規でない（アンダーソン・ダーリン検定によって、Ｐ＜０．０５）。異常値ゲノムを排除することによって正規分布が生じた。この計算から、ハイブリダイズした試料中にＲＳＶが存在すると結論付ける。
【図１０】ＡＥＳはプローブ増幅効率の指標である。高いＡＥＳを有するより高い割合のプローブが、５つの実験にわたってシグナル強度閾値より高く検出可能である。
【図１１】マイクロアレイを用いた病原体検出に必要なプロセスを示すスキーマ。
【図１２】ハイブリダイゼーションシグナル強度は増幅効率スコア（ＡＥＳ）と相関があり、Ｐ＝２．２×１０-16である。ＲＳＶ患者試料をマイクロアレイ上にハイブリダイズさせ、各プローブのシグナル強度を、計算したＡＥＳとともにプロットした。典型的なアレイ上での高信頼度検出のためのシグナル閾値を緑色の線によって示す。
【図１３】ランダムＲＴ−ＰＣＲのためのＡＥＳ最適化プライマータグを用いることによって、ＡＥＳが１０〜３０倍増大する。最適化プライマーは、マイクロアレイ上に示される全３５のゲノム全体で同じ性能を有すると予測された。ＡＥＳ最適化プライマーＡ２を用いてほとんどの患者試料を増幅した。
【表１２】
2009504153.tif 000062
【図１４】マイクロアレイバーの標識の手掛かり：
【表１３】
2009504153.tif 000063
ランダムＲＴ−ＰＣＲにおけるプライマータグの選択は、ＰＣＲ効率に対して有意な効果を有する。（Ａ）Ｂｏｈｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２によって記載された元々のプライマー、または（Ｂ）マイクロアレイ上に示された全てのゲノム（高ＡＥＳ）が確実に効率的に増幅されるようにＰＣＲモデリングに従って設計されたプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲの後、臨床ｈＭＰＶ試料にハイブリダイズしているプローブを示すヒートマップ。
【図１５】ＲＳＶ患者＃４１２についての診断ＰＣＲ結果から、患者がコロナウイルス感染を有さないことが確認される。（Ａ）パンコロナウイルスプライマーを用いたＰＣＲ。レーン１：ＯＣ４３コロナウイルス陽性対照、レーン２：２２９Ｅコロナウイルス陽性対照、レーン３：ＲＳＶ患者＃４１２、レーン４：ＰＣＲプライマーおよび試薬のみの陰性対照。１ｋｂラダー。（Ｂ）ＯＣ４３特異的プライマーを用いたＰＣＲ。レーン１：ＯＣ４３コロナウイルス陽性対照、レーン２：ＲＳＶ患者＃４１２、レーン３：ＡＴＣＣ由来の精製されたＲＳＶ、レーン４：ＰＣＲ陰性対照。５０ｂｐラダー。（Ｃ）２２９Ｅ特異的プライマーを用いたＰＣＲ。レーン１：２２９Ｅコロナウイルス陽性対照、レーン２：ＲＳＶ患者＃４１２、レーン３：ＰＣＲ陰性対照。１ｋｂラダー。
【図１】
2009504153.tif 000078
【図２】
2009504153.tif 000079
【図３】
2009504153.tif 000080
【図４Ａ】
2009504153.tif 000081
【図４Ｂ】
2009504153.tif 000082
【図５】
2009504153.tif 000083
【図６】
2009504153.tif 000084
【図７Ａ】
2009504153.tif 000085
【図７Ｂ】
2009504153.tif 000086
【図７Ｃ】
2009504153.tif 000087
【図８】
2009504153.tif 000088
【図９Ａ】
2009504153.tif 000089
【図９Ｂ】
2009504153.tif 000090
【図１０】
2009504153.tif 000091
【図１１】
2009504153.tif 000092
【図１２】
2009504153.tif 000093
【図１３】
2009504153.tif 000094
【図１４Ａ】
2009504153.tif 000095
【図１４Ｂ】
2009504153.tif 000096
【図１５】
2009504153.tif 000097
【配列表】
2009504153000001.xml
【国際調査報告】
2009504153.tif 000101
2009504153.tif 000102
2009504153.tif 000103
2009504153.tif 000104