(57)【要約】親油性樹脂上で植物の水性抽出物または生理液を吸着し、続いて脱着し、溶離液を回収することによって、該抽出物または生体液由来の抱合型の親水水溶性天然生成物を回収および精製するための方法であって、該樹脂が、スチレンおよび／またはジビニルベンゼン部分で臭素化され、６００ｍ2／ｇ面積、１．３ｍｌ／ｇ体積（乾燥重量）、孔径約２００オングストロームの多孔性スチレンジビニルベンゼンポリマーであることを特徴とする方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
親油性樹脂上で植物の水性抽出物または生理液を吸着し、続いて脱着して溶離液を回収することにより、前記抽出物または生体液由来の抱合型の親水水溶性天然生成物を回収および精製するための方法であって、前記樹脂が、スチレンおよび／またはジビニルベンゼン部分で臭素化され、６００ｍ2／ｇ面積、１．３ｍｌ／ｇ体積（乾燥重量）、孔径約２００オングストロームの多孔性スチレンジビニルベンゼンポリマーであることを特徴とする方法。
【請求項２】
天然生成物が、イソフラボン、抗酸化物質もしくは抱合エストロゲンまたはそれらの混合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
イソフラボンを大豆またはムラサキツメクサから抽出する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
イソフラボンが、ゲニステイン、ダイゼイン、フォルムオノネチン、バイオチャニンＡを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
妊娠中の哺乳動物生体液由来の抱合エストロゲンの精製および回収のための、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
生理液の塩の混合物が、妊娠中の雌馬の尿である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
エストロン、エキリン、Δ8,9−デヒドロエストロン、１７α−エストラジオール；１７α−ジヒドロエキリン、１７β−ジヒドロエキリン、１７β−エストラジオール、エキレニン、１７α−ジヒドロエキレニン；１７β−ジヒドロエキレニンを含む、抱合エストロゲン混合物の塩混合物を調製するための、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
１７β−Δ8,9−デヒドロエストラジオール、１７ａ−Δ8,9−デヒドロエストラジオール、６−ＯＨ  １７α−ジヒドロエキレニン、６−ＯＨエキレニン、６−ＯＨ  １７β−ジヒドロエキレニン、および／または他の硫酸ステロイド系代謝産物の群からの１種または複数の抱合塩を更に含有する混合物を調製するための、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
抱合物がサルフェートで、塩がナトリウム塩である、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項１０】
樹脂が、Ｄｉａｉｏｎ  ＳＰ  ２０７（登録商標）、Ｄｉａｉｏｎ  ＳＰ  ２０５（登録商標）、およびＤｉａｉｏｎ  ＳＰ  ２０６（登録商標）の商品名の下に市販されるものから選択される、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物または植物源由来の薬理学的に興味深い天然化合物の単離および精製のための方法に関する。
【０００２】
より具体的には、本発明は、無機酸に抱合された形、例えば、サルフェート（ｓｕｌｆａｔｅｓ）の形で、またはグリコシル化された形で前記の産生源に存在する親水性および水溶性化合物の抽出に関する。
【０００３】
この方法は、親油性の高い樹脂上に前記化合物を含有する産生源の吸着と、その後の脱着および溶離液の回収を含む。
【０００４】
本発明の方法によって得られる化合物の好ましい例は、抗酸化および抗腫瘍活性等の様々な治療的または予防的薬理活性を有する動物または植物起源のステロイド性、ポリフェノール性構造に完全に抱合されたフィトエストロゲン（イソフラボン）、エストロゲンを含む。
【０００５】
高い純度および再現性で本発明の方法によって得られる化合物は、子宮および前立腺腫瘍、および急性または慢性炎症等の原発性病変と、加齢および／またはホルモン変調に関連する月経前症候群および緊張症、骨粗鬆症、アテローム硬化症等の異常生理状態から派生する病変との両方を治療するための薬物または補助栄養食品の調製に有用である。
【背景技術】
【０００６】
フィトセラピー用抽出物を基にした多くの補助栄養食品が存在するが、その組成と再現性は、使用する抽出技術次第で顕著に変化する。それらの変化は、所望したものとは異なった生成物の存在と主に関係がある。結果として、前記抽出物は、均一な組成および他の成分の不在という必須要件を満たさないので、薬物として使用できない。
【０００７】
国際公開第９３／２３０６９号、国際公開第９９／４３３３５号、および欧州特許第１１７４１４４号は、ゲニステイン、ダイゼイン、フォルムオノネチン、およびバイオチャニンＡの混合物を含有する大豆またはクローバー抽出物を開示している。
【０００８】
欧州特許第１１７４１４４号は、特にムラサキツメクサ（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓ）由来の乾燥微粉末状植物材料を水中浸軟し、次に水混和性溶媒（通常はエタノール）を添加して抽出し、植物性残渣を分離し、脂肪族炭化水素で水溶液を処理してワックスおよび脂肪を除去し、相を分離して炭化水素相を除去し、水混和性有機溶媒を真空で蒸発させ、濾過して乾燥し、固体（非水溶性イソフラボンアグリコン）を得るというイソフラボンアグリコンを抽出するための方法を請求している。ＨＰＬＣによる分析では、アグリコンの含有量は、１９．５％〜３８％ｗ／ｗの範囲に及ぶ一方で、出発材料に基づく収率は、０．６％〜２．２％の範囲に及ぶ。
【０００９】
国際公開第９３／２３０６９号は、乾燥植物材料を水：水溶性有機溶媒（例えば、エタノール）混合物で抽出し、水有機溶媒抽出物を分離し、有機溶媒を蒸散させ、水性相を濃縮して得られるイソフラボンフィトエストロゲンが濃縮された組成物を開示している。
【００１０】
国際公開第９９／４３３３５号は、「芳香族発色団」（ゲニステイン、ダイゼイン、フォルムオノネチン、およびバイオチャニンＡ）の存在を特徴とするイソフラボン含有クローバー抽出物の調製を開示している。ＨＰＬＣによるイソフラボンの更なる精製／単離ステップを含むのであるが、抽出手順は、実質的に国際公開第９３／２３０６９号の記載と同様である。
【００１１】
妊娠している動物由来の尿等の動物の生理液の場合は、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅｓ（登録商標）、Ｄｉａｉｏｎ  Ｓｅｐａｂｅａｄｓ（登録商標）、またはＨＰＤ−５００（登録商標）等の半極性だが著しく親水性で非イオン性の様々な吸着樹脂の使用による抱合エストロゲン混合物の調製のための方法が記載されている。例えば、米国特許第５７２３４５４号は、砂床濾過、遠心分離、または限外濾過によって予め清澄化された尿を、中度の極性（１．５〜２．０デバイの範囲の双極子モーメント）および４００〜５００ｍ2／ｇの比表面積を有するＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）非イオン性樹脂（架橋ポリアクリル酸エステル、例えば、Ｒｏｈｍ  ＆  Ｈａａｓ製ＸＡＤ−７）に曝露する（懸濁液中での接触またはカラム上での浸透により）、妊娠した雌馬の尿由来の抱合エストロゲン（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｅｓｔｒｏｇｅｎｓ）を抽出するための方法を開示している。この樹脂は、アルカリ水で繰り返し洗浄を受けると、エストロゲン混合物が、アルカリ水：混和性有機溶媒混合物で溶離することにより回収され、真空濃縮および乾燥によって固体形態で得られる。
【００１２】
米国特許出願第２００５／００１４７３８号、米国特許出願第２００３／０１０５３４４号、および米国特許出願２００４／００７２８１２号は、Ｄｏｗｅｘ（登録商標）ＸＡＤ２、Ｄｏｗｅｘ（登録商標）、Ｏｐｔｉｐｏｒｅ等の先と同じく中度の極性で主に親水性の樹脂を使用する抱合エストロゲンの同様の吸着／脱着法を開示している。米国特許出願第２００２／０１５６３０３号は、やはり中度の極性を有するＤｉａｉｏｎ（登録商標）ＨＰ−２０およびＳｅｐａｂｅａｄｓ（登録商標）ＳＰ−７００（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）樹脂の使用を記載している。中国特許公開第１３０８０３８号では、類似の特徴を有するＨｅｂｅｊ  Ｃｈａｎｇｚｈｏｕ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｆａｃｔｏｒｙ製の半極性樹脂ＨＰＤ−５００を利用している。吸収される材料の接触および抽出ステップは、やはり類似している。
【００１３】
前記方法の全ては、非イオン性で中度の極性があり、主として親水性の樹脂の使用を基にしており、吸着選択性に乏しく、それ故に抱合および非抱合エストロゲンと、それと共に顕著な量のクレゾール誘導体との混合物を生じる。このことは、吸着に続く一連の精製ステップを必要とし、場合によっては非抱合エストロゲンまたは他のポリフェノール性不純物の許容不能な含有量のために処理バッチの除去すら必要とする。
【００１４】
それ故、上述の問題を克服し、動物および植物起源の両方の抱合体の組成物を一定にして、非抱合生成物または他の不純物を含まないようにする再現性のある方法が必要なことは明白である。
【発明の開示】
【００１５】
６００ｍ2／ｇの面積、１．３ｍｌ／ｇ（乾燥重量）の体積、約２００オングストロームの孔径をもち、２種のポリマー成分の一方の臭素化を特徴とする高多孔性スチレンジビニルベンゼンポリマーの使用が、上述の化合物の高収率での精製および薬学分野におけるそれらの使用をもたらすことが、驚くべきことに今や見出された。
【００１６】
本発明の方法を、公知の方法で植物または動物源から得られる液体または固体の粗製出発抽出物として定義される「一次抽出物」と生理液との両方に適用することができる。
【００１７】
植物源の生成物の例には、単糖抱合水溶性形態で様々な植物源に存在するゲニステイン、ダイゼイン、フォルムオノネチン、バイオチャニンＡ、クメストロール、フェルラ酸およびイソフェルラ酸等のイソフラボンまたはリグナンが含まれる。
【００１８】
生理液から抽出可能な生成物の例には、妊娠中の雌の尿に存在し、無機酸に抱合されているエストロンおよびエストラジオール等のステロイド系エストロゲンが含まれる。特に、妊娠中の雌馬の尿は、エストロン、エキリン、Δ8,9−デヒドロエストロン、１７α―エストラジオール、１７α−ジヒドロエキリン、１７β−ジヒドロエキリン、１７β−エストラジオール、エキレニン、１７α−ジヒドロエキレニン、１７β−ジヒドロエキレニン、ならびに場合により１７β−Δ8,9−デヒドロエストラジオール、１７ａ−Δ8,9デヒドロエストラジオール、６−ＯＨ  １７α−ジヒドロエキレニン、６−ＯＨエキレニン、６−ＯＨ  １７β−ジヒドロエキレニンおよび／または他の硫酸化ステロイド系代謝産物の群からの１種または複数の抱合塩を含む抱合エストロゲン塩の混合物を提供する。抱合物は主としてサルフェートであるが、塩はナトリウム塩が好ましい。
【００１９】
樹脂の臭素化は、粒子の単位体積重量の増加（これにより、とりわけ直接浸透および膨張ベッド（ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  Ｂｅｄ）の双方を介してカラム中で作用することが可能となる）を伴い、現在まで使用されている他の非臭素化スチレンジビニルベンゼンポリマーより少ないポリマー水和、それ故の低い極性電荷、およびはるかに高い親油性を誘発する。このような特徴を有する臭素化樹脂は、Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏによって、例えば、次のようなものが製造されている。Ｄｉａｉｏｎ  ＳＰ２０７（登録商標）、Ｄｉａｉｏｎ  ＳＰ２０５（登録商標）、Ｄｉａｉｏｎ  ＳＰ２０６（登録商標）。
【００２０】
本発明により得られた結果は、精製すべき生成物の顕著な親水性および低下した親油性の特徴に照らしてみて予想外である。したがって、親油性の分子に対してより特異的な上記の樹脂のような、主に親油性の樹脂上での吸着に関するこれらの生成物の挙動は、驚くべきもので予想外である。
【００２１】
本発明の方法は、次のステップ、
予備濾過、遠心分離、または限外濾過によって任意選択で清澄化された、前記の一次抽出物または生体液のバルクでの、またはカラム上での、前記臭素化スチレンジビニルベンゼンポリマー上での直接浸透または膨張ベッド（すなわち、カラムの底部から）による吸着ステップであって、結果として活性成分またはそれらの混合物および任意の不純物の吸着を伴う吸着ステップ、
バルク処理する場合には、吸着固体相を後で廃棄する液体から分離し、搾り出す（真空濾過または遠心分離による）ステップ、
カラム中の吸着生成物である活性成分および不純物を、水：水混和性溶媒、および任意選択でｐＨの勾配（凹型または凸型のどちらか）により選択脱着するステップ、
溶離液を回収し、真空乾燥するステップ、
場合によっては、固体残渣を更に精製および／または結晶化するステップを含む。
【００２２】
樹脂と生体液または一次抽出物との間の接触は、不均一な塊を（樹脂の粉砕を避けるために）ゆっくり撹拌し続けるバルクで、または浸透もしくは膨張ベッドの技術によるクロマトグラフィーカラム中のどちらかで行うことができる。
【００２３】
方法の選択は、処理生成物の種類と量の両方に依存する。バルク技術における場合は、好ましい撹拌器は羽根型撹拌器である。この樹脂は、処理すべき生体液または一次抽出物の性質、および従来式分析（ＨＰＬＣ、ＧＣ）で分析する場合の活性成分の含有量に依存する量で使用されるが、通例は、生成実績が同じ場合には、この量は上記半極性樹脂のおよそ６０〜７５％である。バルク処理する場合は、カラム用の量よりも３〜４倍の量を使用する。吸着すべき溶液は、限外濾過による生体液の回収のために、既知の技術、例えば、適当な装置を使用して砂床上での濾過、または遠心分離によって清澄化することができる。バルク処理する場合は、吸着樹脂は回収され、真空濾過によって余剰な生体液を搾り出し、多孔質隔膜および冷却ジャケットを取り付けたカラムに収納される。吸着物を水：混和性溶媒混合物（例えば、７０−３０ｖ／ｖ水−エタノール）で溶離させ、水酸化ナトリウムで１１〜１３のアルカリｐＨに、好ましくは１１〜１２．５に調節する。次いで、任意選択で濃縮された粗製溶離液を、クロマトグラフィー直接処理用に記載された手順に従って、一次抽出物のために使用されたのと同じ臭素化樹脂上、または他の臭素化樹脂上でクロマトグラフィーによって精製する。バルクでの方法は、植物起源の誘導体を調製するためには特に有利である。
【００２４】
動物源由来の生体液のために好ましいクロマトグラフィー技術で処理する場合は、任意選択で濃縮される一次溶液を、浸透または膨張ベッドのどちらかによって樹脂ベッドを通過させる。後者の技術は、高い単位体積重量の臭素化樹脂粒子に向いており、わずかな過剰圧力で多孔性マイクロビーズが互いに分離する際に、溶液をより大きな吸着表面に有利に曝露するが、直接浸透を使用するときには、逆によりコンパクトなベッドを形成する。供給される溶液にわずかな過剰圧力を適用すると、吸着率が増加し、作用時間が減少する。吸着プロセスで使用し得る樹脂は、Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．製のＤｉａｉｏｎ  ＳＰ  ２０７（登録商標）、Ｄｉａｉｏｎ  ＳＰ  ２０５（登録商標）、およびＤｉａｉｏｎ  ＳＰ  ２０６（登録商標）等の高多孔性臭素化スチレンジビニルベンゼンポリマーである。Ｄｉａｉｏｎ  ＳＰ  ２０７（登録商標）が好ましい。処理すべき溶液に対する樹脂の比率は、使用されるＳＰの種類および抽出すべき活性成分の性質に依存して、溶液２５量につき樹脂体積１量から溶液２００量につき樹脂１量の範囲に及び得る。より詳細には、Ｄｉａｉｏｎ  ＳＰ  ２０７の場合には、前記比率は、２５〜１５０の範囲に及ぶことができる。溶離を２７０と２８０ｎｍの間の紫外検出で監視する。カラムの間隙になおも存在する吸着された溶液を取り出すための洗浄液の体積は、通常、カラムベッドの１．８〜２倍である。洗浄液は、不純物の性質および量ならびに吸着生成物の種類に従って変わる組成を有している。温度は、０℃〜３５℃の範囲におよび、好ましくは０℃〜５℃である。好ましい洗浄液は水であるが、少量（１〜５％）の水混和性溶媒（例えば、アセトンまたはエタノール）が入っていてもよい。
【００２５】
吸着生成物を、不純物の性質および材料の起源に応じて、その組成が１００％〜０．１０％水／溶媒の範囲に及び得る水：水混和性溶媒（例えば、ケトン、低分子アルコール、水溶性エーテル、またはエステル）混合物で溶離する。混合物を水酸化ナトリウムで、ｐＨ１１〜１３、好ましくは１１〜１２．５に調節する。溶離を２７０と２８０ｎｍとの間の紫外吸収によって監視する。分画を分析し、所望の化合物を含有するものを一緒にして真空で濃縮する。
【００２６】
次の実施例は、本発明を詳細に説明している。
実施例１
ムラサキツメクサの直接抽出による抱合イソフラボンの調製
５００ｇの乾燥して細かく挽いたムラサキツメクサを、２０００ｍｌの蒸留水で処理して室温で１０時間撹拌する。次いで固体を濾別し、抱合および非抱合イソフラボン含有量を求めて溶液をＨＰＬＣによって分析する。抱合イソフラボンの全含有量はおよそ５００ｍｇで、遊離アグリコンは実質的に含まれていない。溶液を真空中で２５０ｍｌに濃縮し、更に濾過し、次いで１〜１．５ｃｍ径で１０ｇのＳｅｐａｂｅａｄｓ  ２０７（登録商標）Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉを詰めたカラム上に浸透させ、分画を集め、２７０ｎｍの紫外線によって溶離を監視する。浸透の完了後に、間隙の約２倍の量の蒸留水で、次いでエタノールを５％含有する水（２００ｍｌ）でカラムを洗浄する。抱合イソフラボン（ＨＰＬＣ分析）を含有する分画を集める。溶液を濾過し、残渣を真空中で乾燥し（約４２０ｍｇ）、次いで乾燥アセトンに溶解して、出発水性抽出物を基準にして約８４％の収率で固体残渣を生じる。この残渣は、純度９８％でバイオチャニンＡ、フォルムオノネチン、ダイゼイン、およびゲニステインのグリコシドからなる。
実施例２
ムラサキツメクサの水性抽出物の抽出によるイソフラボンの調製
欧州特許第１１７４１４４号（実施例１）に従って得られる、約２０％の遊離イソフラボンおよび約３０％の抱合イソフラボン（ＨＰＬＣ）の含有量である乾燥抽出物２０ｇを５００ｍｌの水の中に分散し、懸濁液を真空濾過する。ＨＰＬＣ分析では、出発乾燥重量を基準にして、抱合アグリコンの含有量は約２８％で、非抱合アグリコンは約１％であることが示される（水に不溶性であるために、非抱合アグリコンを他の成分と共に除去する）。溶液を真空蒸留によって２００ｍｌまで濃縮し、吸着材Ｓｅｐａｂｅａｄｓ（登録商標）  ＳＰ  ２０７（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）８０ｇで処理する。撹拌を２時間続ける。次いで、吸着した樹脂を真空濾過し、搾り出して、多孔性隔膜を取り付けたカラムに収納する。次いで、カラムベッドの１．８体積分の０〜５℃に予冷された蒸留水を加える。その後、ベッド体積の２．５倍の９５／５の水／エタノール混合液を加え、溶離液を集め、乾燥するまで４０℃以下の温度で真空蒸留を施す。固体残渣をアセトンで、次いでアセトン／エチルエーテルで洗浄して粉砕し、真空蒸留で溶媒を蒸発させて固体を回収する。ＨＰＬＣ分析では、この生成物は、ゲニステイン、ダイゼイン、フォルムオネチン、およびバイオチャニンＡからなり、実質的に不純物は含まれていない（抱合イソフラボンの含有量、９０〜９５％）ことが示される。収率は、出発抽出物を基準にして８０〜８５％の範囲に及ぶ。
実施例３
妊娠雌馬の尿由来の抱合エストロゲンの抽出
初めに２０Ｌの妊娠雌馬の尿を約１０ｃｍの砂床で、次いで０．２μの膜を通して濾過する。抱合エストロゲンの含有量をＨＰＬＣまたはＧＣによって定量する。ｐＨを濃縮水酸化ナトリウムの添加によって約１２．５〜１３．５に調節する。全体を窒素下でおよそ１〜２時間機械的撹拌を施し続ける。次いで、ｐＨを、鉱酸、好ましくはＨＣｌまたはトリフルオロ酢酸で中性（ｐＨ７．５〜８．５、好ましくは８）に調節する。この溶液を真空の砂上で、次いで膜で更に濾過する。１５０〜１８０ｇのＳｅｐａｂｅａｄｓ  ２０７（登録商標）Ｄｉａｉｏｎ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）を詰めた７．５および１０ｃｍ径のカラム上で、膨張ベッドの場合には高さで３〜５％を超えるほどに樹脂ベッドが増加しないように、かつ直接浸透を使用するときには樹脂の密集を誘発しないようにわずかな過剰圧力をかけて、浸透または膨張ベッドのどちらかによって、清澄な濾液を通過させる。膨張ベッドの場合には、カラムベッドは、少なくとも３０〜５０ｃｍでなければならない。溶離の完了後は、０°〜５℃の冷却液の循環によって樹脂を冷却し、次いで吸着物を、間隙の少なくとも１．８〜２．５間隙体積分の０°〜５℃の蒸留水で洗浄する。次いで濃縮ＮａＯＨの添加によってｐＨ１１．５〜１３．０になった５°〜１０℃の温度の水（樹脂の２および４体積）でベッドに浸透（または流動）させる。次いで抱合エストロゲン複合体を、最小比３０：７０の水：水混和性溶媒（アセトン、エタノール、ＴＨＦ）混合物で溶離し、次いで、水酸化ナトリウムの添加によってｐＨ１０〜１３に、好ましくは１２．５〜１３に調節する。溶離液を回収し、中和し、真空乾燥して活性成分を得る。
【手続補正書】
【提出日】平成19年10月29日(2007.10.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親油性樹脂上で妊娠中の雌馬の尿を吸着させ、続いて脱着して溶離液を回収することにより、前記液体から抱合エストロゲンを回収および精製する方法であって、前記樹脂が、スチレンおよび／またはジビニルベンゼン部分で臭素化され、６００ｍ2／ｇ面積、１．３ｍｌ／ｇ体積（乾燥重量）、孔径２００オングストロームの多孔性スチレンジビニルベンゼンポリマーであることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記生理液が、妊娠中の雌馬の尿である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
エストロン、エキリン、Δ8,9−デヒドロエストロン、１７α−エストラジオール；１７α−ジヒドロエキリン、１７β−ジヒドロエキリン、１７β−エストラジオール、エキレニン、１７α−ジヒドロエキレニン；１７β−ジヒドロエキレニンを含む、抱合エストロゲン混合物の塩混合物を調製するための、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
１７β−Δ8,9−デヒドロエストラジオール、１７α−Δ8,9−デヒドロエストラジオール、６−ＯＨ  １７α−ジヒドロエキレニン、６−ＯＨエキレニン、６−ＯＨ  １７β−ジヒドロエキレニン、および／または他の硫酸ステロイド系代謝産物の群からの１種または複数の抱合塩を更に含有する混合物を調製するための、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
抱合物がサルフェートで、塩がナトリウム塩である、請求項３又は４に記載の方法。
【国際調査報告】
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