(57)【要約】  本発明は、ある範囲の癌、例えばMAGE陽性癌、例として限定されるものではないが、メラノーマ及び非小細胞肺癌（NSCLC）などを治療するための方法に関する。本発明は、補助的（例えば術後）療法における及び活動性疾患の療法における癌の治療方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
補助的（例えば、術後）療法において、癌、例えばMAGE陽性癌、例えば非小細胞肺癌（NSCLC）を有する患者を治療する方法であって、腫瘍関連抗原、例えばMAGEタンパク質ファミリー由来の抗原、又は前記腫瘍関連抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を前記患者に投与することを含み、最初の５〜８回のワクチン接種には３週間間隔で、続いて次の８又は９回以上のワクチン接種には３カ月間隔で前記抗原が投与される、前記方法。
【請求項２】
補助的（例えば、術後）療法において、癌、例えばMAGE陽性癌、例えば非小細胞肺癌（NSCLC）を有する患者を治療するための医薬の製造における、腫瘍関連抗原、例えばMAGEタンパク質ファミリー由来の抗原、又は前記腫瘍関連抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組成物の使用であって、該療法において最初の５〜８回のワクチン接種には３週間間隔で、続いて次の８又は９回以上のワクチン接種には３カ月間隔で前記抗原が投与される、前記使用。
【請求項３】
以下に示すスケジュール：
誘導：３週間間隔（0、6、9、12週目）で５回のワクチン接種
維持：３カ月間隔で９回のワクチン接種
に従って前記抗原が投与される、請求項１に記載の方法又は請求項２に記載の使用。
【請求項４】
活動性疾患の療法（active disease setting）において、癌、例えばMAGE陽性癌、例えば非小細胞肺癌（NSCLC）又はメラノーマを有する患者を治療する方法であって、腫瘍関連抗原、例えばMAGEタンパク質ファミリー由来の抗原、又は前記腫瘍関連抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を前記患者に投与することを含み、治療の最初の６カ月から１年の間に２週間又は３週間間隔で前記抗原が投与される、前記方法。
【請求項５】
活動性疾患の療法において、癌、例えばMAGE陽性癌、例えば非小細胞肺癌（NSCLC）又はメラノーマを有する患者を治療するための医薬の製造における、腫瘍関連抗原、例えばMAGEタンパク質ファミリー由来の抗原、又は前記腫瘍関連抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組成物の使用であって、該療法において治療の最初の６カ月から１年の間に２週間又は３週間間隔で前記抗原が投与される、前記使用。
【請求項６】
最初の４〜10回のワクチン接種には２週間間隔で、続いて次の４〜10回のワクチン接種には３週間間隔で、次いで次の３〜７回のワクチン接種には６週間間隔で前記抗原が投与される、請求項４に記載の方法又は請求項５に記載の使用。
【請求項７】
３〜５回のワクチン接種には３カ月間隔で、続いて次の３〜５回のワクチン接種には６カ月間隔で抗原がさらに投与される、前記請求項のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項８】
以下に示すスケジュール：
サイクル１：２週間間隔（1、3、5、7、9、11週目）で６回のワクチン接種
サイクル２：３週間間隔（15、18、21、24、27、30週目）で６回のワクチン接種
サイクル３：６週間間隔（34、40、46、52週目）で４回のワクチン接種
長期治療：  ３カ月間隔で４回のワクチン接種
６カ月間隔で４回のワクチン接種
に従って抗原が投与される、請求項４から７のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項９】
前記MAGE抗原が、MAGE-A1のアミノ酸195〜279に相当する特徴的なコアMAGE（core MAGE signature）を少なくとも含むMAGE-Aタンパク質である、前記請求項のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項１０】
前記MAGE抗原が、MAGE A1、MAGE A2、MAGE A3、MAGE A4、MAGE A5、MAGE A6、MAGE A7、MAGE A8、MAGE A9、MAGE A10、MAGE A11、MAGE A12、MAGE B1、MAGE B2、MAGE B3、MAGE B4、MAGE C1、及びMAGE C2の群より選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項１１】
前記抗原が、免疫学的融合パートナー又は発現エンハンサーパートナーに連結されている、前記請求項のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項１２】
前記融合パートナーが、インフルエンザ菌B型（Haemophilus influenzae B）のプロテインD若しくはその断片;インフルエンザ（influenza）のNS1タンパク質若しくはその断片;又は肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）のLytA若しくはその断片からなる群より選択される、請求項11に記載の方法又は使用。
【請求項１３】
前記プロテインD又はその断片が、脂質化形態のプロテインDである、請求項12に記載の方法又は使用。
【請求項１４】
前記抗原がアフィニティタグをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項１５】
前記抗原が誘導体化遊離チオールをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項１６】
前記誘導体化遊離チオールが、カルボキシアミド又はカルボキシメチル化誘導体である、請求項15に記載の方法又は使用。
【請求項１７】
前記ヌクレオチド配列がベクター内に含まれている、前記請求項のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項１８】
前記ベクターが宿主細胞内に含まれている、請求項17に記載の方法又は使用。
【請求項１９】
前記組成物が、アジュバント及び/又は免疫刺激性サイトカイン若しくはケモカインをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項２０】
前記アジュバントが3D-MPL、QS21、及びCpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドのうちの１以上を含む、請求項19に記載の方法又は使用。
【請求項２１】
前記抗原が水中油型又は油中水型エマルジョン基剤中に存在する、前記請求項のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項２２】
前記組成物が１以上の他の抗原をさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項２３】
前記NSCLCがステージIb、II、又はIIIaである、前記請求項のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項２４】
前記MAGE陽性癌がMAGE-3陽性癌である、前記請求項のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項２５】
前記腫瘍関連抗原が、MAGE A1、A2、A3、A4、A5、A6、MAGE C1、C2、PRAME、BAGE、LAGE1、LAGE2、SAGE、HAGE、XAGE、PSA、PAP、PSCA、プロステイン、P501S、HASH2、Cripto、B726、NY-BR1.1、P510、MUC-1、プロスターゼ、STEAP、チロシナーゼ、テロメラーゼ、サバイビン、CASB616、P53、又はher 2 neuから選択された１以上の抗原を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項２６】
前記補助的療法が、すべての検出可能な癌組織の外科的全切除を受けた患者における療法である、請求項１から３又は９から25のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項２７】
前記癌が、メラノーマ、乳癌、肝臓癌、移行上皮癌を含む膀胱癌、非小細胞肺癌（NSCLC）を含む肺癌、扁平上皮癌を含む頭頸部癌及び食道癌、大腸癌、セミノーマ、並びに多発性骨髄腫である、前記請求項のいずれかに記載の方法又は使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ある範囲のMAGE発現癌、例えば限定されるものではないが、メラノーマ、乳癌、肝癌、膀胱癌（移行上皮癌を含む）、肺癌（非小細胞肺癌（NSCLC）を含む）、頭頸部癌（扁平上皮癌を含む）及び食道癌、大腸癌、セミノーマ、並びに多発性骨髄腫などを治療するための方法に関する。本発明は、補助的（例えば術後）療法における及び活動性疾患におけるMAGE発現癌の治療方法、並びにこれらの療法でのMAGE発現癌に罹患した患者の治療におけるワクチンの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
MAGE抗原
MAGE抗原は、メラノーマ関連抗原遺伝子（MAGE）のファミリーによってコードされる抗原である。MAGE遺伝子は、メラノーマ細胞（悪性メラノーマを含む）、並びに他のいくつかの癌、例えばNSCLC（非小細胞肺癌）、頭頸部癌（扁平上皮癌を含む）、食道癌、膀胱癌（移行上皮癌を含む）において主に発現されるが、精巣及び胎盤を除く正常組織では検出されない（Gaugler, 1994；Weynants, 1994；Patard, 1995）。MAGE-3はメラノーマの69％において発現され（Gaugler, 1994）、またNSCLCの44％（Yoshimatsu 1988）、頭頸部扁平上皮癌の48％、膀胱移行上皮癌の34％、食道癌の57％、大腸癌の32％、そして乳癌の24％においても検出される（Van Pel, 1995；Inoue, 1995；Fujie 1997；Nishimura 1997）。MAGEタンパク質を発現する癌は、MAGE関連腫瘍として知られる。
【０００３】
MAGE-1遺伝子は、Ｘ染色体に位置し、互いにそのコード配列において64〜85％の相同性を有する、12種の非常に関連性の遺伝子、すなわちMAGE 1、MAGE 2、MAGE 3、MAGE 4、MAGE 5、MAGE 6、MAGE 7、MAGE 8、MAGE 9、MAGE 10、MAGE 11、MAGE 12のファミリーに属する（De Plaen, 1994）。これらは、MAGE A1、MAGE A2、MAGE A3、MAGE A4、MAGE A5、MAGE A6、MAGE A7、MAGE A8、MAGE A9、MAGE A10、MAGE A11、MAGE A12（MAGE Aファミリー）として知られることもある。
【０００４】
他の２つのタンパク質群もMAGEファミリーの一部であるが、その関連性はより少ない。これらはMAGE B群及びMAGE C群である。MAGE Bファミリーには、MAGE B1（MAGE Xp1及びDAM 10としても知られる）、MAGE B2（MAGE Xp2及びDAM 6としても知られる）、MAGE B3及びMAGE B4が含まれ、Mage Cファミリーには現在MAGE C1及びMAGE C2が含まれる。
【発明の概要】
【０００５】
一般的な用語において、MAGE Aタンパク質は、このタンパク質のＣ末端に向かって位置する特徴的なコア配列（core sequence signature）を含むものと定義しうる。例えば309アミノ酸のMAGE A1タンパク質（配列番号11、GenBank protein Sequence Reference No. 004979も参照のこと）に関して、特徴的なコアはアミノ酸195〜279に相当する。
【０００６】
従って、この特徴的なコアの共通（コンセンサス）パターンは以下のように記載される。ここで、ｘは任意のアミノ酸を表し、小文字の残基は保存されており（許容される保存的変異）、大文字の残基は完全に保存されている。
【０００７】
特徴的なコア配列
2009538286.tif 000002
【０００８】
保存的置換は周知であり、一般的には配列アライメントコンピュータプログラムにおいてデフォルトスコアマトリクスとして設定される。これらのプログラムとしては、PAM250（Dayhoft M.O.ら、(1978), “A model of evolutionary changes in proteins”, “Atlas of Protein sequence and structure” 5(3) M.O. Dayhoft (編), 345-352）（National Biomedical Research Foundation, Washington）、Blosum 62（Steven Henikoft and Jorja G. Henikoft (1992), “Amino acid substitution matricies from protein blocks”）（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (Biochemistry): 10915-10919）が挙げられる。
【０００９】
一般的な用語において、以下のグループ内の置換は保存的置換であるが、グループ間の置換は非保存的とみなされる。このグループは以下のとおりである：
i）アスパラギン酸/アスパラギン/グルタミン酸/グルタミン
ii）セリン/トレオニン
iii）リシン/アルギニン
iv）フェニルアラニン/チロシン/トリプトファン
v）ロイシン/イソロイシン/バリン/メチオニン
vi）グリシン/アラニン。
【００１０】
一般的にそして本発明の関係では、MAGEタンパク質は、このコア領域においてMAGE A1（配列番号11）のアミノ酸195〜279とおよそ50％の同一性を有するものである。
【００１１】
MAGEタンパク質誘導体もまた当技術分野で公知である（WO99/40188号参照）。かかる誘導体は、ある範囲の種類の腫瘍の治療に好適な治療用ワクチン製剤において使用するのに好適である。
【００１２】
癌の種類
本発明は、MAGE発現癌、例えば、メラノーマ、乳癌、膀胱癌（移行上皮癌を含む）、肺癌（NSCLCを含む）、頭頸部癌（扁平上皮癌を含む）、及び食道癌、大腸癌、多発性骨髄腫などを有する患者に使用することができる。一実施形態において、本発明は、そのような癌の補助的（例えば原発腫瘍の外科的切除後の）療法において使用することができる。別の実施形態において、本発明は、活動性疾患の療法（active disease setting）において使用することができる。本発明はまた、他の腫瘍抗原を発現する癌を有する患者に使用することができるが、その場合、癌免疫療法は抗原特異的癌免疫療法であり、すなわちその免疫療法は腫瘍が発現する少なくとも１つの抗原に基づいている。
【００１３】
肺癌
肺癌には２つの種類、すなわち非小細胞肺癌（NSCLC）と小細胞肺癌（SCLC）がある。この名称は、腫瘍に存在する細胞の種類を単に説明するものである。NSCLCには扁平上皮癌、腺癌及び大細胞癌が含まれ、これは肺癌の約80％を占める。NSCLCは難治性であり、可能な限り生存期間を長くし、疾患の症候を緩和することを目的とする治療が利用される傾向にある。  
早期NSCLCを完全に切除した全患者のおよそ半分は再発する。
【００１４】
この補助的療法（例えば原発腫瘍の外科的切除後）中の患者は、原発腫瘍が外科的に切除された患者、あるいは検出可能な癌組織（原発性及び／若しくは転移性）がない又は実質的にない患者として定義される。現在、補助的療法である化学療法は再発の回数を低減する可能性のあるものであるが、これはかなりの毒性を伴うこともある。
【００１５】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において、特に明記しない限り、「含む（comprise及びinclude）」という単語又は「含んでいる（comprising、comprises、including、includes）」などの変形は包括的に解釈されるべきであり、従って、これらの用語の使用は具体的に明記されていない数値又は要素を含む可能性がある。
【００１６】
本明細書で使用する「スイスタイプ」又は「使用」の文言は、必要に応じて「治療方法」の文言に置き換えることができる。
【００１７】
本明細書において引用した全ての刊行物、例えば限定されるものではないが、特許及び特許出願などは、その個々の刊行物があたかも全体が記載されているように参照により本明細書に組み入れると明示的にかつ個々に示されているように、参照により本明細書に組み入れる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１−１】リポプロテインD断片とMAGE A3断片とヒスチジンテールとの融合タンパク質のヌクレオチド及びコードされるアミノ酸配列（配列番号１及び２）を示す。
【図１−２】図１−１の続き
【図１−３】図１−１の続き
【図２−１】リポプロテインD断片とMAGE A1断片とヒスチジンテールとの融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。
【図２−２】図２−１の続き
【図３−１】リポプロテインDとMAGE A1とヒスチジンテールとの融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図３−２】図３−１の続き
【図４−１】NS-1、MAGE A3及びヒスチジンテールの融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号５）を示す。
【図４−２】図４−１の続き
【図５】NS-1、MAGE A3及びヒスチジンテールの融合タンパク質のヌクレオチド配列（配列番号６）を示す。
【図６−１】CLYTA、MAGE A1及びヒスチジンテールの融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号７）を示す。
【図６−２】図６−１の続き
【図７】NS-1、MAGE A1及びヒスチジンテールの融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号８）を示す。
【図８−１】CLYTA、MAGE A3及びヒスチジンテールの融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号９）を示す。
【図８−２】図８−１の続き
【図９】CLYTA、MAGE A3及びヒスチジンテールの融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号１０）を示す。
【図１０】MAGE A1タンパク質の309アミノ酸配列（配列番号１１、GenBank protein Sequence Reference No. 004979も参照のこと）を示す。特徴的なコア（core signature）はアミノ酸195〜279に相当する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
発明の説明
本発明の一実施形態では、補助的（例えば術後）療法における、癌、例えばMAGE発現癌、例としてメラノーマ、乳癌、膀胱癌（移行上皮癌を含む）、肺癌（NSCLCを含む）、頭頸部癌（扁平上皮癌を含む）及び食道癌、大腸癌、多発性骨髄腫など、を有する患者の治療方法であって、該患者に、腫瘍関連抗原（例えばMAGEタンパク質ファミリー由来の抗原）又は該腫瘍関連抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００２０】
MAGEタンパク質は、少なくともMAGEの特徴的なコア（MAGE-A1のアミノ酸195〜279に相当する）を有するMAGE-Aタンパク質を含みうる。
【００２１】
一実施形態において、MAGEタンパク質は、MAGE A1、MAGE A2、MAGE A3、MAGE A4、MAGE A5、MAGE A6、MAGE A7、MAGE A8、MAGE A9、MAGE A10、MAGE A11、MAGE A12、MAGE B1、MAGE B2、MAGE B3及びMAGE B4、MAGE C1、MAGE C2の群より選択される。一実施形態において、MAGEタンパク質は、MAGE-A1又はMAGE-A3より選択される。
【００２２】
本発明の一実施形態では、他の抗原を発現する腫瘍の治療のために、MAGE以外の（又はそれに加えた）抗原による療法を考慮してもよい。抗原又は誘導体若しくは断片の例としては、癌精巣抗原PRAME（WO96/10577号）、BAGE、RAGE、LAGE 1（WO98/32855号）、LAGE 2（NY-ESO-1としても知られる、WO98/14464号）、XAGE（Liuら、Cancer Res, 2000, 60:4752-4755；WO02/18584号）、SAGE、及びHAGE（WO99/53061号）又はGAGE（Robbins and Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, pps 628-636；Van den Eyndeら、International Journal of Clinical & Laboratory Research (1997)；Correaleら(1997), Journal of the National Cancer Institute 89, p293）が挙げられる。実際、これらの抗原は、広範な種類の腫瘍、例えばメラノーマ、肺癌、肉腫及び膀胱癌において発現している。
【００２３】
本明細書において使用する用語「陽性」、例えばMAGE陽性は、抗原が細胞によって発現されているかどうかの説明において、用語「発現する」、例えばMAGEを発現する（MAGE発現）と互換性である。
【００２４】
一実施形態において、本発明において使用するための抗原は、ウイルムス腫瘍遺伝子によって発現されるWT-1、又は約若しくはおよそアミノ酸１〜249を含むそのＮ末端断片WT-1Fを含む又はそれからなる。
【００２５】
一実施形態では、前立腺抗原、例えば前立腺癌抗原若しくは前立腺特異的分化抗原（PSA）、PAP、PSCA（PNAS 95(4) 1735-1740 1998）、PSMA、又はプロスターゼとして知られる抗原などを使用することができる。
【００２６】
一実施形態において、前立腺抗原は、P501S又はその断片である。P501Sは、プロステインとも呼ばれ（Xuら、Cancer Res. 61, 2001, 1563-1568）、553アミノ酸のタンパク質（WO98/37814号の配列番号113）である。上記参照特許出願には、少なくとも20、少なくとも50、又は少なくとも100の連続するアミノ酸を含むその免疫原性断片及び部分が開示されており、それを本発明において抗原として使用することができる。断片は、WO98/50567号（PS108抗原）に、そして前立腺癌関連タンパク質（WO99/67384号の配列番号9）として開示されている。他の断片は、全長P501Sタンパク質のアミノ酸51〜553、34〜553又は55〜553である。
【００２７】
プロスターゼ（prostase）は、254アミノ酸長の前立腺特異的セリンプロテアーゼ（トリプシン様）であり、保存されたセリンプロテアーゼ触媒性三アミノ酸H-D-Sとアミノ末端プレ−プロペプチド配列を有し、これが、潜在的な分泌機能を示している（P. Nelson, Lu Gan, C. Ferguson, P. Moss, R. linas, L. Hood & K. Wand, “Molecular cloning and characterisation of prostase, an androgen-regulated serine protease with prostate restricted expression, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96, 3114-3119）。推定グリコシル化部位が記載されている。予想構造は他の既知のセリンプロテアーゼと非常に類似しており、このことは、成熟ポリペプチドが単一のドメインに折りたたまれることを示している。成熟タンパク質は224アミノ酸長であり、天然にプロセシングされることが示されている少なくとも１つのA2エピトープを有する。プロスターゼのヌクレオチド配列及び推定ポリペプチド配列、並びに相同配列は、Fergusonら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 3114-3119）、並びに国際特許出願第WO98/12302号（及び対応の発行特許である米国特許第5,955,306号）、WO98/20117号（及び対応の発行特許である米国特許第5,840,871号及び同第5,786,148号）（前立腺特異的カリクレイン）及びWO00/04149号（P703P）に開示されている。
【００２８】
本発明で用いることができる他の前立腺特異抗原は、WO98/37418号及びWO/004149号からわかる。別のものはSTEAP（PNAS 96 14523 14528 7-12 1999）である。
【００２９】
本発明の目的で有用な他の腫瘍関連抗原としては、Plu-1（J Biol. Chem 274 (22) 15633-15645, 1999）、HASH-1、HASH-2（Alders,M.ら、Hum. Mol. Genet. 1997, 6, 859-867）、Cripto（Salomonら、Bioessays 199, 21 61-70、米国特許第5654140号）、CASB616（WO00/53216号）、Criptin（米国特許第5,981,215号）が挙げられる。用いることができるさらなる抗原としては、チロシナーゼ、テロメラーゼ、P53、NY-Br1.1（WO01/47959号）、及びその断片、例えばWO00/43420号に記載されているものなど、B726（WO00/60076号、配列番号469及び463；WO01/79286号、配列番号474及び475）、P510（WO01/34802号、配列番号537及び538）、並びにサバイビン（survivin）が挙げられる。
【００３０】
用いることができる他の抗原としては、乳癌抗原、例えばHer-2/neu、マンマグロビン（米国特許第5,668,267号）、B305D（WO00/61753号、配列番号299、304、305及び315）、又はWO00/52165号、WO99/33869号、WO99/19479号、WO98/45328号に開示されているものが挙げられる。Her-2/neu抗原は、特に米国特許第5,801,005号に開示されている。一実施形態において、この抗原は、Her-2/neuの細胞外ドメイン全体（およそアミノ酸１〜645を含む）又はその断片、及び細胞内ドメイン全体（およそＣ末端の580アミノ酸）の少なくとも免疫原性部分を含みうる。特に、細胞内部分は、リン酸化ドメイン又はその断片を含みうる。このような構築物はWO00/44899号に開示されている。使用することができるHer-2/neu構築物の１つはECD-PDとして知られ、２つ目はECD deltaPD（WO00/44899号参照）として知られ、dHer2とも呼ばれている。本発明において用いることができるHer-2/neuは、ラット、マウス又はヒトに由来するものとすることができる。
【００３１】
一実施形態では、腫瘍抗原は、小ペプチド抗原（すなわち約50アミノ酸未満）とすることができる。ペプチドの例としては、ムチン誘導ペプチド、例えばMUC-1などがある（例えば米国特許第5,744,144号、同第5,827,666号、WO88/05054号、米国特許第4,963,484号参照）。具体的には、MUC-1ペプチドの少なくとも１つのリピートユニット、好ましくは少なくとも２つの当該リピートを含み、SM3抗体により認識される、MUC-1誘導ペプチドを意図している（米国特許第6,054,438号）。他のムチン誘導ペプチドにはMUC-5由来のペプチドが含まれる。
【００３２】
本発明において使用するための腫瘍抗原は、全長の非改変（native）タンパク質であってもよいし、又は化学的若しくは遺伝的に修飾されたその誘導体であってもよい。あるいは、例えば9〜20アミノ酸（9〜100アミノ酸など）を含む、タンパク質の免疫原性断片を用いることも可能である。
【００３３】
一実施形態において、抗原は、免疫学的融合パートナー又は発現エンハンサーパートナーに連結された、本明細書に記載の腫瘍抗原を含みうる。
【００３４】
抗原及びパートナーは、化学的に結合（コンジュゲート）してもよいし、又は組換え融合タンパク質として発現させてもよい。抗原及びパートナーを組換え融合タンパク質として発現させる実施形態では、発現系においてこれを非融合タンパク質と比較して高いレベルで産生されるようにすることができる。従って、融合パートナーは、Ｔヘルパーエピトープ、好ましくはヒトによって認識されるＴヘルパーエピトープの提示を補助する（免疫学的融合パートナー）、かつ／又は非改変（native）の組換えタンパク質よりも高収率でのタンパク質の発現を補助する（発現エンハンサー）ものでありうる。一実施形態において、融合パートナーは、免疫学的融合パートナー及び発現エンハンサーパートナーの両方であってもよい。
【００３５】
本発明の一実施形態において、使用することができる免疫学的融合パートナーは、グラム陰性細菌であるインフルエンザ菌B型（Haemophilus influenzae B）の表面タンパク質であるプロテインD（WO91/18926号）又はその誘導体から誘導される。プロテインD誘導体は、該タンパク質の最初の1/3又は該タンパク質のおおよそ若しくはほぼ最初の1/3を含んでおり、特にＮ末端側の最初の100〜110アミノ酸又はＮ末端側のおおよそ最初の100〜110アミノ酸を含む。一実施形態において、プロテインD又はその誘導体は脂質化されていてもよい。一般的に、プロテインD誘導体は、該タンパク質のおおよそ若しくはほぼ最初の1/3を含んでおり、特にＮ末端側のおおよそ最初の100〜120アミノ酸、例えば最初の109〜111アミノ酸、より具体的には最初の109アミノ酸（又はその108アミノ酸）を含む。
【００３６】
リポプロテインD融合パートナーの最初の109残基は、ワクチン候補抗原に追加の外因性Ｔ細胞エピトープを付与し、また大腸菌（E. coli）での発現レベルを増大させる（したがって発現エンハンサーの機能も果たす）。脂質尾部は抗原の抗原提示細胞への最適な提示を保証する。
【００３７】
一実施形態において、融合パートナーは、プロテインDの最初の1/3をそのシグナル配列なしで含む又はそれからなり、例えば融合パートナーは、アミノ酸20〜127を含むか、又はおよそアミノ酸20からおよそアミノ酸127を含む若しくはそれからなる配列を含む。一態様において、本発明は、プロテインDのＮ末端部分（上述したとおり）が癌精巣抗原又はその免疫原性断片のＮ末端と融合している融合タンパク質を提供する。より具体的には、プロテインDと腫瘍抗原のＮ末端との融合は、癌精巣抗原が、切除されているプロテインDのＣ末端断片と置き換わるように行われる。そのため、プロテインDのＮ末端が融合タンパク質のＮ末端となる。
【００３８】
本発明の融合タンパク質には、アフィニティタグ、例えば、５〜９個の（６個などの）ヒスチジン残基を含むヒスチジンテールなどが含まれてもよい。これらの残基は、例えば、プロテインDの末端部分（例えばプロテインDのＮ末端部分）に存在してもよいし、かつ／又は腫瘍抗原の末端部分に融合してもよい。しかしながら、ヒスチジンテールは、癌精巣抗原の末端部分、例えば腫瘍抗原のＣ末端に位置することが一般的である。ヒスチジンテールは、精製を行うために有利である。
【００３９】
本発明の組成物は、本明細書に記載のような１以上の腫瘍抗原、及び／又は１以上のそのペプチド、及び／又は１以上のその融合タンパク質、の混合物を含むものであってもよい。
【００４０】
あるいは、タンパク質又はその免疫原性断片をコードするDNAを含むベクターを投与することも可能である。
【００４１】
コードDNAを含むベクターに対する免疫応答が生起され、それゆえ一般的な免疫応答は強化（ブースト）されうる（すなわち、ベクターそのものがアジュバントとして作用する）。
【００４２】
免疫療法は、例えばプライム・ブースト法において投与することができる。
【００４３】
使用することができる他の融合パートナーとしては、インフルエンザウイルス由来の非構造タンパク質であるNS1（血液凝集素）が挙げられる。典型的にはNS1のＮ末端の81アミノ酸が利用されるが、Ｔヘルパーエピトープを含むものであれば種々の断片を使用することができる。
【００４４】
別の実施形態において、免疫学的融合パートナーはLytAとして知られるタンパク質である。LytAは肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）に由来するが、この細菌はペプチドグリカン骨格の特定の結合を特異的に分解する自己溶解酵素であるN-アセチル-L-アラニンアミダーゼ、すなわちアミダーゼLytA（LytA遺伝子によりコードされる（Gene, 43 (1986) page 265-272））を合成する。LytAタンパク質のＣ末端ドメインは、コリンまたはいくつかのコリンアナログ（例えばDEAE）に対するアフィニティに関与する。この性質は、融合タンパク質の発現に有用な大腸菌C-LytA発現プラスミドの開発に利用されている。アミノ末端にC-LytA断片を有するハイブリッドタンパク質の精製が記載されている（Biotechnology: 10, (1992) page 795-798）。一実施形態では、該分子のＣ末端部分を使用することができる。ある実施形態では、Ｃ末端に存在し残基178から始まるLytA分子のリピート部分を利用することが可能である。一実施形態において、LytAの部分は残基188〜305を組み入れたものである。
【００４５】
本発明の一実施形態では、MAGEタンパク質は、誘導体化遊離チオールを含みうる。このような抗原はWO99/40188号に記載されている。特にカルボキシアミド化又はカルボキシメチル化誘導体を用いることができる。
【００４６】
本発明の一実施形態では、抗原は、MAGE-A3-プロテインD分子を含む。この分子のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を図１（それぞれ配列番号１及び２）に示す。この抗原及び以下に概説するものは、WO99/40188号により詳細に記載されている。
【００４７】
本発明のさらなる実施形態において、腫瘍関連抗原は、本明細書に記載するMAGE抗原を、以下の融合タンパク質のいずれかで含みうる：
リポプロテインD断片とMAGE1断片とヒスチジンテールとの融合タンパク質（例えば図２及び３に示すものなど）、NS1-MAGE3とヒスチジンテールとの融合タンパク質（例えば図４及び５に示すものなど）、CLytA-MAGE1-ヒスチジンの融合タンパク質（例えば図６及び７に示すものなど）、CLytA-MAGE3-ヒスチジンの融合タンパク質（例えば図８及び９に示すものなど）。
【００４８】
本発明のさらなる実施形態は、本明細書に記載する抗原をコードする核酸分子を含む。かかる配列は、好適な発現ベクターに挿入して、DNA/RNAワクチン接種において使用したり、又は好適な宿主において発現させるために用いることができる。この核酸を発現する微生物ベクターを用いることも可能である。このようなベクターとしては、例えば、ポックスウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス及びリステリアが挙げられる。
【００４９】
核酸配列の取得及び発現ベクターの作製のための慣用の組換え技法は、Maniatisら、Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982-1989に記載されている。
【００５０】
特に、このプロセスは、
i）宿主細胞においてタンパク質又はその免疫原性誘導体をコードするヌクレオチド配列を含むDNAポリマーを発現することが可能な、複製型又は組み込み型発現ベクターを調製するステップ;
ii）宿主細胞を上記ベクターで形質転換するステップ;
iii）上記形質転換宿主細胞を、該DNAポリマーの発現を可能にする条件下で培養して、上記タンパク質を産生させるステップ;及び
iv）上記タンパク質を回収するステップ
を含む。
【００５１】
本明細書に記載する方法は、場合により１以上の他の腫瘍関連抗原、例えばMAGE及びLAGEファミリーに属する他のメンバー、を含んでもよい組成物を含みうる。一実施形態において、本発明の抗原との組合せに含めることができる他の腫瘍関連抗原としては、MAGE-A1、MAGE-A3、LAGE-1、GAGE-1又はチロシナーゼタンパク質が挙げられる。
【００５２】
本発明のタンパク質は、液体形態に溶解して、又は凍結乾燥形態のいずれかで提供される。
【００５３】
一般に、各ヒト用量は、1〜1000μgのタンパク質、好ましくは30〜300μgを含むと予想される。
【００５４】
本明細書に記載する方法は、アジュバント、及び／又は免疫刺激性サイトカイン若しくはケモカインをさらに含む組成物を含んでもよい。
【００５５】
免疫療法の成分に関連して本明細書においてアジュバントを使用する場合、これは一般に、免疫療法の抗原成分に対する免疫応答を高める（ブースト）物質に関連している。
【００５６】
このようなアジュバントは、当技術分野で周知であり、別々の製剤として投与してもよいし、又は免疫療法の主成分を含む製剤の成分であってもよい。
【００５７】
本発明において使用するために好適なアジュバントは、例えば、フロイント不完全アジュバント及び完全アジュバント（Difco Laboratories, Detroit, MI）；Merckアジュバント65（Merck and Company, Inc., Rahway, NJ）；AS-2（SmithKline Beecham, Philadelphia, PA）；アルミニウム塩、例えば、水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）若しくはリン酸アルミニウム；カルシウム、鉄若しくは亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アシル化糖；カチオン性若しくはアニオン性に誘導体化した多糖；ポリホスホスファゼン；生分解性ミクロスフェア；モノホスホリルリピドＡ及びquil Aなどを市販品として入手可能である。サイトカイン、例えばGM-CSF又はインターロイキン-2、-7若しくは-12、及びケモカインもまたアジュバントとして使用することができる。
【００５８】
本発明の製剤において、アジュバントは主にTh1型の免疫応答を誘導することが望ましい。高レベルのTh1型サイトカイン（例えば、IFN-γ、TNFα、IL-2及びIL-12）は、投与された抗原に対して細胞媒介免疫応答を誘導する傾向にある。応答が主にTh1型である一実施形態では、Th1型サイトカインのレベルをTh2型サイトカインのレベルよりも非常に高いレベルに増大させる。これらのサイトカインのレベルは、標準的なアッセイを使用して簡便に評価することができる。サイトカインのファミリーについての概説は、Mosmann and Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7:145-173, 1989を参照されたい。
【００５９】
従って、主にTh1型応答を誘発するために使用することができる好適なアジュバントとしては、例えば、モノホスホリルリピドＡ、例えば3-脱-O-アシル化モノホスホリルリピドＡ（3D-MPL）と、アルミニウム塩との組み合わせが挙げられる。3D-MPL又は他のtoll様受容体4（TLR4）リガンド、例えばWO9850399号、WO0134617号及びWO03065806号に開示されているようなアミノアルキルグルコサミニドホスフェートなどもまた主にTh1型応答を生起させるために単独で用いることができる。
【００６０】
TH1型免疫応答を選択的に誘導することができる他の公知のアジュバントとしては、TLR9アンタゴニスト、例えば非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドが挙げられる。このオリゴヌクレオチドは、CpGジヌクレオチドが非メチル化されていることを特徴とする。このようなオリゴヌクレオチドは周知であり、例えばWO96/02555号に記載されている。
【００６１】
好適なオリゴヌクレオチドとしては以下が挙げられる：
オリゴ 1（配列番号12）：TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT（CpG 1826）
オリゴ 2（配列番号13）：TCT CCC AGC GTG CGC CAT（CpG 1758）
オリゴ 3（配列番号14）：ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG
オリゴ 4（配列番号15）：TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT（CpG 2006）
オリゴ 5（配列番号16）：TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT（CpG 1668）。
【００６２】
CpG含有オリゴヌクレオチドはまた、単独で、又は他のアジュバントと組み合わせて用いることができる。例えば、本発明において用いることができる１つの系は、CpG含有オリゴヌクレオチドとサポニン誘導体との組合せ、特にWO00/09159号及びWO00/62800号に開示されるようなCpGとQS21との組合せを含む。用いることができる別のアジュバント製剤は、CpG若しくはその等価物、又は水中油型エマルジョン若しくはリポソーム製剤中のCpRと組み合わせた、QS21、3D-MPLである。一般に、免疫療法のためのアジュバントは、TLR7、8又は9アゴニスト、例えばTLR 9アゴニストである。
【００６３】
製剤は、水中油型エマルジョン及び／又はトコフェロールをさらに含んでもよい。
【００６４】
別の好適なアジュバントは、サポニン、例えばQS21（Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA）であり、単独で、又は他のアジュバントと組み合わせて用いることができる。例えば、増強された系には、モノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体との組合せ、例えばWO94/00153号に記載されているようなQS21と3D-MPLとの組合せ、又はWO96/33739号に開示されているようなQS21をコレステロールでクエンチする低反応原性（less reactogenic）アジュバントが含まれる。他の好適な製剤は、水中油型エマルジョンとトコフェロールを含む。使用することができる別のアジュバント製剤は、水中油型エマルジョン中のQS21、3D-MPL及びトコフェロールを含み、WO95/17210号に記載されている。
【００６５】
別の実施形態において、アジュバントはリポソーム組成物に製剤化してもよい。
【００６６】
使用する3D-MPL量は、一般的には少量であるが、ワクチン製剤に応じて異なり、用量当たり1〜1000μg、好ましくは用量当たり1〜500μg、より好ましくは用量当たり1〜100μgの範囲とすることができる。
【００６７】
本発明のアジュバント又はワクチンにおけるCpG又は免疫刺激性オリゴヌクレオチドの量は、一般的には少量であるが、ワクチン製剤に応じて異なり、用量当たり1〜1000μg、好ましくは用量当たり1〜500μg、より好ましくは用量当たり1〜100μgの範囲とすることができる。
【００６８】
本発明のアジュバントに使用するためのサポニンの量は、用量当たり1〜1000μg、好ましくは用量当たり1〜500μg、より好ましくは用量当たり1〜250μg、最も好ましくは用量当たり1〜100μgの範囲とすることができる。
【００６９】
一般に、各ヒト用量は、0.1〜1000μgの抗原、好ましくは0.1〜500μg、好ましくは0.1〜100μg、最も好ましくは0.1〜50μgを含むことが予想される。特定のワクチンについての最適量は、ワクチン接種した被験体における適切な免疫応答の観察を含む標準的な試験によって確認することができる。最初のワクチン接種後、適当な間隔をおいて１又は数回の追加免疫（ブースター）を被験体に行ってもよい。
【００７０】
他の好適なアジュバントとしては、MontanideTM ISA 720（Seppic, France）、SAF（Chiron, California, United States）、ISCOMS（CSL）、MF-59（Chiron）、Ribi Detox、RC-529（GSK, Hamilton, MT）、及び他のアミノアルキルグルコサミン4-リン酸（AGP）が挙げられる。
【００７１】
従って、本明細書に開示する抗原と、3D-MPL、QS21、CpG オリゴヌクレオチド、ポリエチレンエーテル若しくはエステルの１以上、又はこれらのアジュバントの２以上の組合せを含むアジュバントとを含む、本発明の方法に使用するための免疫原性組成物を提供する。免疫原性組成物中の抗原は、水中油型若しくは油中水型エマルジョン基剤中に、又はリポソーム製剤中に存在しうる。
【００７２】
一実施形態において、アジュバントは、3D-MPL、QS21及び免疫刺激性CpGオリゴヌクレオチドを１以上含んでもよい。ある実施形態では、３つの免疫刺激剤全てが存在する。別の実施形態では、3D-MPL及びQS21が水中油型エマルジョンに存在し、CpGオリゴヌクレオチドは存在しない。
【００７３】
本発明の方法で使用するための本明細書に記載の組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含んでいてもよい。
【００７４】
治療スケジュールの方法
補助的療法
本発明の一実施形態では、補助的療法において、MAGE発現癌、例えば限定されるものではないが、メラノーマ、乳癌、移行上皮癌を含む膀胱癌、非小細胞肺癌（NSCLC）を含む肺癌、扁平上皮癌を含む頭頸部癌及び食道癌、大腸癌、多発性骨髄腫など、の治療に使用するための治療スケジュールの方法であって、本明細書に記載した腫瘍によって発現されるMAGE抗原に適合したMAGE抗原を、以下のスケジュールに従って投与することを含む方法を提供する。
【００７５】
「補助的療法」とは、体からすべて又は実質的にすべての検出可能な癌組織を除去するための治療、例えば外科手術、を患者が受けたことを意味する。上記患者は、表面的に疾患のない状態にあってもよい。一実施形態では、上記患者は、癌組織を除去するための以下の手順、すなわち外科手術、放射線療法及び化学療法のうちの１つ若しくは複数、又はすべてを受けていてもよい。当業者には知られているが、原発腫瘍の除去では、患者体内に微小転移巣が依然として残っている可能性がある。本明細書で使用される場合、微小転移巣は、原発腫瘍から体の他の部分に拡散しているが、利用可能なスクリーニング又は診断検査で同定するには数が少ない少数の癌細胞を指す。「外科的全切除」は、すべての微小転移巣の除去を含むものではない。
【００７６】
最初の５〜８回のワクチン接種には３週間間隔で抗原投与を行い、続いて次の８又は９回以上のワクチン接種には３カ月間隔で抗原投与を行う。
【００７７】
上記抗原は、指示された正確な時間枠で投与してもよいし、あるいは必要に応じて又は実際的に、正確な間隔を置いた日の１日、２日、３日又は４日前又は後に抗原を投与してもよい。このスケジュールの例を以下の表に示す。
【００７８】
誘導：３週間間隔（0、6、9、12週目）で５回のワクチン接種
維持：３カ月間隔で９回のワクチン接種
【００７９】
活動性疾患（active disease）
本発明のさらなる実施形態では、活動性疾患又は切除不能な疾患において、MAGE発現癌、例えば限定されるものではないが、メラノーマ、乳癌、移行上皮癌を含む膀胱癌、非小細胞肺癌（NSCLC）を含む肺癌、扁平上皮癌を含む頭頸部癌及び食道癌、大腸癌、並びに多発性骨髄腫など、に使用するための治療スケジュールの方法であって、本明細書に記載の抗原を、治療の最初の６カ月から１年の間に２週間又は３週間間隔で投与することを含む方法を提供する。スケジュールは、以下のパターンの注射を含むものとすることができる。すなわち、最初の４〜10回のワクチン接種には２週間間隔で、それに続いて、次の４〜10回のワクチン接種には３週間間隔で、その後、次の３〜７回のワクチン接種には６週間間隔で、上記抗原を投与する。その後、３〜５回のワクチン接種には３カ月間隔、それに続いて、次の３〜５回のワクチン接種には６カ月間隔のワクチン接種で長期治療を続けてもよい。
【００８０】
上記抗原は、指示された正確な時間枠で投与してもよいし、あるいは必要に応じて又は実際的に、正確な間隔を置いた日の１日、２日、３日又は４日前又は後に上記抗原を投与してもよい。
【００８１】
このスケジュールの例を以下の表に示す：
サイクル１：２週間間隔（1、3、5、7、9、11週目）で６回のワクチン接種
サイクル２：３週間間隔（15、18、21、24、27、30週目）で６回のワクチン接種
サイクル３：６週間間隔（34、40、46、52週目）で４回のワクチン接種
長期治療：  ３カ月間隔で４回のワクチン接種
６カ月間隔で４回のワクチン接種
【００８２】
上述した補助的療法及び積極的（活動性）療法の治療計画の両方に関して、治療の後に、必要に応じて追加のワクチン接種を行ってもよい。
【００８３】
一般的に、各ヒト用量は、1〜1000μg、好ましくは30〜300μgのタンパク質を含むことが予測される。一実施形態では、各ヒト用量が300μgのタンパク質を含む。
【００８４】
疾患の積極的（活動性）治療のためのスケジュールは、通常、より攻撃的である。しかし、本発明の一実施形態では、本明細書に記載の「活動性疾患」療法スケジュールが、「補助的療法」で患者に使用されうる。例えば、補助的療法のWT1陽性白血病で、WT-1抗原特異的癌免疫療法を用いて活動性疾患のためのスケジュールを用いてもよい。
【実施例１】
【００８５】
NSCLC（補助的療法）
実施例1.1  方法
全切除されたステージIB又はIIのMAGE-A3陽性（定量的RT-PCRで評価した）NSCLCを有する患者を登録し、二重盲検法でランダムに術後MAGE-3ワクチン接種又はプラセボに2：1で割り当てた。試験治療は、補助的治療として行われ、アジュバントAS02B、0.5ml中に処方された組換えProt.D MAGE-A3/His 300μgで構成されている。これを、又は適合しているプラセボ（水中油型エマルジョン0.5ml中に溶解されたショ糖）を、筋肉内注射で投与した。アジュバントAS02Bは、水中油型エマルジョン中にMPL及びQS21を含み、以下の通りに調製できる。すなわち、水中油型エマルジョンの調製は、WO95/17210号に記載のプロトコールに従った。上記エマルジョンは、5％スクワレン、5％トコフェロール、2.0％ tween 80を含有し、粒径が180nmである。
【００８６】
水中油型エマルジョン（2倍濃縮）の調製
Tween80をリン酸緩衝食塩水（PBS）中に溶解して、2％のPBS溶液を得た。2倍濃縮のエマルジョン100mlを得るために、完全に混合されるまで、DL-α-トコフェロール5g及びスクワレン5mlをボルテックスにかけた。PBS/Tween溶液90mlを添加し、完全に混合させた。その後、得られたエマルジョンをシリンジに通過させ、最後に、M110Sマイクロフルイディクス器械を用いることによってマイクロ流体化した。得られた油滴は、約180nmのサイズを有する。
【００８７】
エマルジョン1mlあたり250μl又は500μl（v/v）の最終濃度に達するように、PBSに無菌バルクエマルジョンを添加する。その後、100μg/mlの最終濃度に達するように3D-MPLを添加し、次に、1mlあたり100μgの最終濃度に達するようにQS21を添加する。成分の添加それぞれの間に、中間生成物を5分間撹拌した。抗原を添加した後、pHを調整することができる。
【００８８】
記載の臨床試験に含めるには、患者は、腫瘍の外科的全切除を受けている必要があった。患者は、抗癌ネオアジュバント治療を受けていてはならず、放射線療法の候補者ではなく、脳、胸部及び上腹部のネガティブベースライン（negative baseline）コンピュータ断層写真（CTスキャン）、並びに任意選択で放射性核種の骨スキャンで示されている限り、いかなる無症候性の転移も含まない状態でなければならない。
【００８９】
ワクチン接種は、手術後６週間より前に、３週間間隔で５回のワクチン接種で開始し、それに続いて、３カ月毎に８回のワクチン接種を行った。ランダム化は、ステージ（IB 対 II）、組織学（扁平上皮 対 その他）、及びリンパ節手順（サンプル採取 対 解剖）に関して層別化した。試験中には、他の抗癌補助的療法は許可しなかった。
【００９０】
主要な評価項目は、再発までの時間とした。他の評価項目は、様々な時点での再発率、及び生存率とした。患者180人のサンプルサイズ（実薬120人、プラセボ60人）によって、プラセボ群における30カ月目の再発率を40％と仮定して、10％の差異を検出するのに、48％の検出力（α＝10％）が達成された（ログランク検定）。募集完了の18カ月後に、独立的な統計学者による完全な中間有効性解析（すべての検査者及びスポンサーがわからないようになっている）が計画されている。
【００９１】
実施例1.2  結果
59の治療センターから得られた1089の生検のうち約35％がMAGE-3陽性であった。2年間で、182人の患者がランダム化された（ステージIB 121人、ステージII 61人）。中間解析のためのデータ収集は、2005年12月19日に開始した。フォローアップは中央値で21カ月であり、62回の再発が記録された。全体的に見て、治療は良好に許容され、プロトコールコンプライアンスが高かった。
【００９２】
実施例1.3  結論
この検査は、早期NSCLCにおけるMAGE-3抗原の発現頻度（35％）を確認し、術後MAGE-3ワクチン接種の良好な耐容性を実証した。ランダム化第II相試験の中間解析は、全体的に適度に信頼できる結果を示し、AS02B免疫学的アジュバント（水中油型エマルジョン中にMPL及びQS21）と混合したMAGE-A3組換えタンパク質を投与した群では、約33％の無病生存のリスク低減があった。リスク低減は統計的有意性に達しなかった（p＝0.121）。しかし、これは、統計的有意性をもってそのような差異を検出するようには設計されていなかったので驚くべきことでない。
【実施例２】
【００９３】
メラノーマ癌
実施例2.1  方法
進行中の第II相臨床試験では、2種の異なった免疫学的アジュバントのうちの1種と混合したMAGE-3-プロテインD-His抗原を患者群に投与する。すなわち、第1群では、上記抗原をAS02B（水中油型エマルジョン中にMPL及びQS21）と混合し、第2群では、上記抗原をAS15（QS21及びCpG7909と混合された、MPLのリポソーム製剤）と混合する。
【００９４】
AS02Bは、上述の通りに調製することができる。AS15は、以下に示すプロトコールに従って、調製することができる。
【００９５】
最終濃度100μg/mlに達するように、無菌のバルクCpGをPBS溶液に添加した。PBSの組成は、Na2HPO4: 9mM; KH2PO4: 48mM; NaCl: 100mM（pH6.1）であった。その後、抗原を、所定範囲に添加する。最後に、3D-MPL及びQS21の最終濃度が10μg/mlに達するように、3D-MPL及びQS21を含有する無菌バルクの小さな一枚膜小胞（SUV）プレミックス（DQMPLと呼ばれる）としてQS21及び3D-MPLを添加した。
【００９６】
有機溶剤中の脂質（卵黄由来又は合成のいずれかのホスファチジルコリンなど）、コレステロール、及び3D-MPLの混合物を真空下（又は別法として不活性気体の気流下）で乾燥させた。その後、水溶液（リン酸緩衝食塩水など）を添加し、すべての脂質が懸濁するまで容器を振とうさせた。その後、リポソームサイズが約100nmに低減するまで、この懸濁液をマイクロ流体化し、その後、0.2μmフィルターに通して滅菌濾過した。押出し又は超音波処理をこのステップの代替にすることができる。
【００９７】
コレステロール:ホスファチジルコリン比は典型的には1:4（w/w）であった。そして、最終コレステロール濃度が5〜50mg/mlとなるように水溶液を添加した。
【００９８】
上記リポソームは、100nmという特定のサイズを有し、SUV（小さな一枚膜小胞を表す）と呼ばれる。リポソームは、単独では経時的に安定であり、膜融合能を有しない。3D-MPLの最終濃度が10μg/ml、20μg/ml、又は100μg/mlに達するように、SUVの無菌バルクをPBSに添加した。PBSの組成は、Na2HPO4: 9mM; KH2PO4: 48mM; NaCl: 100mM（pH6.1）であった。水溶液中のQS21を上記SUVに添加した。この混合物はDQMPLinと呼ばれる。
【００９９】
上述したメラノーマ試験（MAGE008）で使用するためのMAGE-3-AS15組成物は、3本のバイアル、すなわち、(1)凍結乾燥MAGE3タンパク質300μg；(2)液体CpG（500μg）；及び(3)液体AS01B（50μg QS21-50μg MPL）を混合することによって調製する。
【０１００】
MAGE3タンパク質及びCPGを同時凍結乾燥させて液体AS01B中に再懸濁する場合には、MAGE3 AS15を2バイアル法で得ることもできる。臨床試験MAGE008で使用するためのAS15の調製は、等容積のアジュバントAS7A及びAS1Bの混合物の混合を含んでいた。AS7Aは、500μl中に500μgのCpG7909を含有する。AS1Bは、50μgのQS21及び50μgのMPLを含有し、リポソームの懸濁液で500μlに調製されている。
【０１０１】
この試験の目的は、安全性プロフィール、臨床反応、及び免疫学的応答の面からアジュバントを区別することであった。この試験は、オープン、ランダム化、2群（AS02B 対 AS15）試験であり、これには、合計68人の患者が含まれていた。CpG7909は、Coley Pharmaceuticals社から入手可能である。
【０１０２】
この試験では、皮膚及び/又はリンパ節の限局性又は遠隔病変（切除不能なステージIII及びステージIV M1a）を有する進行性の転移性メラノーマの患者に上記抗原を投与する。この腫瘍によるMAGE-A3遺伝子の発現を定量PCRによって評価した。選択された患者は、それ以前にメラノーマの治療を受けておらず（MAGE-A3抗原が第1選択治療として投与される）、内臓疾患を有していなかった。
【０１０３】
層別化因子
患者は、3つの層別化因子、すなわち、
- ステージIII移行中 対 ステージIII切除不能 対 ステージIV M1a、
- 20mm以上の病変の存在又は不在、
- 医療センター
に従って含まれる。
【０１０４】
目的
この試験の主目的は以下の通りである：
- 注射の安全性
- 客観的な臨床反応
【０１０５】
2次評価項目は以下の通りである：
- 病勢安定率
- 混合反応率（the rate of mixed response）（腫瘍退縮、ただし臨床的活動性を表す客観的反応がない）
- 免疫応答率（定量的及び定性的に分析する）。
【０１０６】
7.1 MAGE008試験の客観的な腫瘍反応−RECIST判定規準
本明細書に記載の臨床試験では、この試験の主要評価項目として、客観的な腫瘍反応をRECIST判定規準に従って判定した。
【０１０７】
反応判定規準は、本質的には、標的病変としてベースラインで同定された1セットの測定可能病変に基づいており、疾患の進行まで追跡される。
【０１０８】
以下の段落は、この試験に関連するRECIST判定規準（参考文献11）への簡易参照である。完全な判定規準は、http://www3.oup.co.uk/jnci/extra/920205.pdfで入手可能である。
【０１０９】
7.1.1.ベースラインにおける腫瘍病変の測定可能性
7.1.1.1.定義
・測定可能疾患：少なくとも1つの測定可能病変の存在。測定可能疾患が孤立性病変に限定される場合、その腫瘍性の性質は、細胞学/組織学によって確認するべきである。  
・測定可能病変：少なくとも一次元で正確に測定でき、最長径が20mm以上である病変。上記病変は、スパイラルCTスキャンで、少なくとも一次元で10mm以上でなければならない。  
・測定不能病変：小さな病変（慣用技術で、最長径が20mmを超える、又はスパイラルCTスキャンで10mmを超える）及び他の測定不能病変を含めた他のすべての病変。これらには、骨病変、軟髄病変;腹水;胸水/心膜液;炎症性乳腺疾患;皮膚リンパ管炎/肺リンパ管炎;造影技術で確認及び追跡されない腹部腫瘤;並びに嚢胞性病変が含まれる。
【０１１０】
あらゆる測定値は、定規又はノギスの使用によって、メートル法で記録するべきである。あらゆるベースライン評価は、可能な限り治療開始と近接した時期に実施するべきであり、治療開始前4週間以内でなくてはならない。
【０１１１】
7.1.1.2.測定の方法
本明細書に記載の臨床試験では、ベースライン及びフォローアップ期間中を通じて、同定及び報告された各病変の特徴付けを行うのに、同じ評価法及び同じ技術を用いるべきである。
【０１１２】
・臨床的に検出された病変が測定可能とみなされるのは、それらが表在性（例えば、皮膚小結節、触知可能なリンパ節）の場合に限られる。皮膚病変の場合は、病変の大きさを評価するための定規を含めたカラー写真による記録が必要である。
【０１１３】
・CT及びMRIは、反応を評価するために選択された標的病変を測定するのに、現在もっとも広く利用可能で、かつもっとも再現性に優れた方法である。慣用のCT及びMRIは、スライス厚10mm以下の連続断面で行うべきである。スパイラルCTは、5mmの連続再構成アルゴリズムを用いて行うべきである。このスペックは胸部、腹部、及び骨盤の腫瘍に適用されるが、頭頸部腫瘍及び四肢の腫瘍には通常特殊なプロトコールが必要である。
【０１１４】
・臨床的に到達が容易でない腫瘍病変を測定するのに、超音波（US）を用いるべきでない。超音波は、表在性の触知可能なリンパ節及び皮下病変の臨床測定の潜在的代替手段として使用できる。臨床検査によって評価するのが一般的である表在性病変の完全消失を確認するのにも超音波は有用でありうる。超音波法は、優先的に同じ検査員が行うべきである。
【０１１５】
7.1.2.本明細書に記載の臨床試験における腫瘍反応の評価
7.1.2.1.「標的」及び「非標的」病変のベースライン記録
関係するすべての臓器の代表として、1臓器につき最大5箇所の病変、合計で10箇所の病変までのすべての測定可能病変を標的病変として特定するべきである。それらは、ベースラインにおいて記録及び測定される。
【０１１６】
標的病変は、それらのサイズ（最長径を用いた大きさ）と、繰り返して正確に測定することにそれらが適しているかどうか（画像診断又は臨床的評価のいずれか）に基づいて選択するべきである。
【０１１７】
すべての標的病変の最長径（LD）の和が算出され、ベースラインLD和として報告される。ベースラインLD和は、客観的な腫瘍反応を特徴付けるための参照として使用される。
【０１１８】
他のすべての病変（又は疾患部位）は、非標的病変として特定されるべきであり、これらも、ベースラインにおいて記録及び測定するべきである。フォローアップ期間中を通じて、非標的病変の測定は必要ではないが、各々の病変の有無は記録するべきである。
【０１１９】
7.1.2.2.反応判定規準
標的病変の評価
完全反応（CR）- すべての標的病変の消失。  
部分反応（PR）- ベースラインLD和を参照として、標的病変のLDの和が少なくとも30％減少。  
安定した疾患（stable disease）（SD）- PRとするには、腫瘍の収縮が不十分であり、かつPDとするには、治療開始以降の最少のLD和を参照として、腫瘍の増大が不十分である。  
進行性疾患（progressive disease）（PD）- 治療開始以降に記録された最少のLD和を参照として、標的病変のLD和が少なくとも20％増大、又は1若しくは複数箇所の新規病変の出現、又はこれら両方。  
完全反応（CR）- すべての非標的病変の消失。  
不完全反応/安定した疾患- 1つ又は複数の非標的病変の残存。  
進行性疾患（PD）- 1つ若しくは複数の新規病変の出現及び/又は既存の非標的病変の明らかな進行（*）。  
（*）「非標的」病変のみが明らかな進行を示すことはまれであるが、そのような状況では、治療している医師の意見が尊重されるべきである。
【０１２０】
最良総合反応の評価−本明細書に記載の臨床試験で用いられる定義
最良総合反応とは、治療開始から進行/再発までに記録された最良の反応のことである（治療開始以降に記録された最小の測定値を進行性疾患の参照とする）。通常、患者における最良総合反応の判定は、測定値と確定の規準の両方の成績に依存する。
【０１２１】
健康状態の全般的な悪化により、その時点で進行の客観的証拠が得られないまま、治療の中止が必要とされる患者は、「病状悪化」として報告されるべきである。治療中止の後でさえ、客観的な進行を記録するためにあらゆる努力を払うべきである。
【０１２２】
状況によっては、残存病変を正常組織と区別することが困難な場合がある。完全反応の評価がこの判定に依存する場合、完全反応状態を確定する前に残存病変の検査（細針吸引/生検）を行うことが推奨される。
【０１２３】
免疫感作のスケジュール
免疫感作スキームは、積極的フェーズ（active phase）と長期治療フェーズとを含む。積極的フェーズは、54週間の期間にわたる3サイクルを含む。誘導（サイクル1）中は、2週間毎に6回の注射を行う。維持には、サイクル2で、3週間毎に6回の注射を行い、サイクル3で、6週間毎に4回の注射を行う。長期治療は、3カ月毎の4回の注射と、その後の6カ月毎の4回の注射とを含む。全体で、約4年間の期間にわたって24回の注射が行われうる。
【０１２４】
検査状況
スクリーニングされた合計133人のメラノーマ患者のうち、121の腫瘍をMAGE-A3発現に関して試験し、これらのうち70人（58％）がMAGE-A3陽性であった。合計68人のランダム化された患者を得る目的で、MAGE-A3陽性腫瘍を有する患者のうち、これまで58人がランダム化された。
【０１２５】
実施例2.2  結論
本発明者らは、2群間で反応に差異があるようだと結論できる。すなわち、進行性疾患の患者数の減少によって、AS15アジュバント中のMAGE-A3抗原の効力が良好であることが示唆されている。この検査の完了後に、さらなる解析が行われる。
【配列表フリーテキスト】
【０１２６】
配列番号１：リポプロテインD断片とMAGE A3断片とヒスチジンテールとの融合タンパク質のヌクレオチド
配列番号２：リポプロテインD断片とMAGE A3断片とヒスチジンテールとの融合タンパク質のアミノ酸配列
配列番号３：リポプロテインD断片とMAGE A1断片とヒスチジンテールとの融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列
配列番号４：リポプロテインDとMAGE A1とヒスチジンテールとの融合タンパク質のアミノ酸配列
配列番号５：NS-1、MAGE A3及びヒスチジンテールの融合タンパク質のアミノ酸配列
配列番号６：NS-1、MAGE A3及びヒスチジンテールの融合タンパク質のヌクレオチド配列
配列番号７：CLYTA、MAGE A1及びヒスチジンテールの融合タンパク質のアミノ酸配列
配列番号８：NS-1、MAGE A1及びヒスチジンテールの融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列
配列番号９：CLYTA、MAGE A3及びヒスチジンテールの融合タンパク質のアミノ酸配列
配列番号10：CLYTA、MAGE A3及びヒスチジンテールの融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列
配列番号11：MAGE A1の309アミノ酸の配列
配列番号12：CpG含有オリゴヌクレオチド（CpG1826）
配列番号13：CpG含有オリゴヌクレオチド（CpG1758）
配列番号14：CpG含有オリゴヌクレオチド
配列番号15：CpG含有オリゴヌクレオチド（CpG2006）
配列番号16：CpG含有オリゴヌクレオチド（CpG1668）
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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