(57)【要約】本発明は、成熟型ヒトＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３を中和する非常に高い親和性を有する抗体またはその抗原結合断片を提供する。本発明の抗体は哺乳類の細胞増殖性障害の治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
成熟型ヒトＴＧＦ−β１、成熟型ヒトＴＧＦ−β２、および成熟型ヒトＴＧＦ−β３を中和し、成熟型ヒトＴＧＦ−β１に対してＫdが４．０×１０-12以下であり、成熟型ヒトＴＧＦ−β２に対してＫdが８．０×１０-12以下であり、並びに成熟型ヒトＴＧＦ−β３に対してＫdが４．０×１０-12以下である、ヒト化モノクローナル抗体。
【請求項２】
成熟型ヒトＴＧＦ−β１、成熟型ヒトＴＧＦ−β２、および成熟型ヒトＴＧＦ−β３を中和し、インビトロＨＴ−２セル中和アッセイにおいて、成熟型ヒトＴＧＦ−β１に対してＩＣ50が１００ｐＭ以下であり、成熟型ヒトＴＧＦ−β２に対してＩＣ50が４００ｐＭ以下であり、並びに成熟型ヒトＴＧＦ−β３に対してＩＣ50が２００ｐＭ以下である、抗ＴＧＦ−βモノクローナル抗体。
【請求項３】
前記抗体は重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含んでなり、前記ＨＣＶＲは配列番号９６または配列番号１００に示すペプチドをＣＤＲＨ１に、配列番号９７、配列番号９９，配列番号１０１または配列番号１０２に示すペプチドをＣＤＲＨ２に、配列番号９８に示すペプチドをＣＤＲＨ３に含んでなり、前記ＬＣＶＲは配列番号８８、配列番号９１、配列番号９２、または配列番号９３に示すペプチドをＣＤＲＬ１に、配列番号８９または配列番号９４に示すペプチドをＣＤＲＬ２に、配列番号９０または配列番号９５に示すペプチドをＣＤＲＬ３に含んでなる、請求項１または請求項２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
さらにヒトフレームワーク領域を含んでなる、請求項２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
配列番号６４、６８、６９、７０および７４からなる群から選ばれる配列を有するＨＣＶＲ、並びに配列番号４１、４３、４５、４６および５０からなる群から選ばれる配列を有するＬＣＶＲを含んでなる、請求項１から３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
配列番号６９に示す配列を有するＨＣＶＲ並びに配列番号４５に示す配列を有するＬＣＶＲを含んでなる、請求項４に記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
配列番号７７、７９、８１、８３および８５からなる群から選ばれる配列を有する重鎖、並びに配列番号７６、７８、８０、８２および８４からなる群から選ばれる配列を有する軽鎖を含んでなる、モノクローナル抗体。
【請求項８】
配列番号８１に示す配列を有する重鎖、および配列番号８０に示す配列を有する軽鎖を含んでなる、請求項７に記載のモノクローナル抗体。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか１項に記載の前記抗体、および製薬的に許容できるキャリアを含んでなる組成物。
【請求項１０】
医薬として用いる、請求項１から８のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１１】
治療を必要とする患者における細胞増殖性障害の治療のための医薬の製造における、請求項１から８のいずれか１項に記載の前記抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＧＦ−βを伴う細胞増殖性疾患、障害および症状の治療に関する。
特に、本発明は、成熟型ヒトＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３を中和する抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＧＦ−βタンパクファミリーは、細胞増殖性、炎症性および循環器の症状等の疾病状態に影響する複数の遺伝子応答を、活性化および調節する複数の経路を有する、３つの異なるアイソフォーム（ＴＧＦ−β１、−β２および−β３）からなる。癌におけるＴＧＦ−βアイソフォーム発現は、ＴＧＦ−βアイソフォームの様々な組み合わせが特定の癌において様々な役割を有して、複雑かつ多様である。例えば、ＴＧＦ−β１およびβ３は卵巣癌およびその進行においてＴＧＦ−β２よりも大きな役割を演じ、一方、ＴＧＦ−β１およびβ２は軟骨肉腫においてＴＧＦ−β３よりも高度に発現する。ヒト乳癌においては、ＴＧＦ−β１およびβ３が高度に発現し、ＴＧＦ−β３発現は全生存期間と相関し、転移およびＴＧＦ−β３発現陽性が見られる患者は生命予後が低い結果となる。しかしながら、大腸癌においてはＴＧＢ−β１およびβ２がβ３よりも高率で発現し、癌のない人よりも高い血中レベルで存在する。グリオーマ癌において、ＴＧＦ−β２は細胞転移にとって重要である。したがって、癌等の細胞増殖症状において複数のＴＧＦ−βアイソフォーム発現を調節することが必要である。
【０００３】
米国特許第５５７１７１４号は、悪性腫瘍および転移性の癌治療における抗ＴＧＦ抗体の使用を開示し、とりわけ、ＴＧＦ−β１およびβ２と結合すると言われる、１Ｄ１１．１６（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＢ９８９４）と命名されたマウス抗体の使用を開示している。当該文献は、抗体１Ｄ１１．１６はわずか３．４×１０8Ｌ／ｍｏｌのＫａ（Ｋｄ＝１／Ｋａ）でＴＧＦ−β２と結合すると述べている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
悪性腫瘍や癌等の細胞増殖性障害は、結合反応速度および親和性を改良した、成熟型ヒトＴＧＦ−β１−β２および−β３を中和する抗体の使用により改善しうる。医薬品として、本質的な物理的化学的安定性、適切な薬物動態論、および良好な溶解性も所望される。したがって、細胞増殖性障害の薬理学的治療に適した特性を有する抗体が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、成熟型ヒトＴＧＦ−β１に対して４ｐＭ以下のＫｄで、成熟型ヒトＴＧＦ−β２に対して８ｐＭ以下のＫｄで、成熟型ヒトＴＧＦ−β３に対して４ｐＭ以下のＫｄで、成熟型ヒトＴＧＦ−β１、−β２および−β３を中和するモノクローナル抗体組成物を提供する。さらに本発明は、配列番号２７および５１、２７および５９、２７および６０、２７および６１、２７および６２、２７および６３、２７および６４、２８および５２、２９および５１、３０および５３、３１および５４、３２および５５、３３および５６、３４および５１、３４および５７、３５および５８、３６および５１、３６および６９、３６および７５、３７および５１、３８および５１、３９および５１、４０および５１、４１および６４、４１および６７、４２および６６、４３および６８、４４および６６、４５および５１、４５および６９、４６および７０、４６および７１、４７および７１、４８および７２、４９および７３、５０および６５、若しくは５０および７４、の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の組み合わせを有する抗体を提供する。本発明は、当該抗体の抗原結合断片、並びに、ヒトまたはヒト化フレームワーク領域および定常領域を有する抗体および断片も含む。本発明の抗体および断片は、細胞増殖性疾患、障害および症状の治療に有用である。
【０００６】
一実施形態において、本発明の抗体は、成熟型ヒトＴＧＦ−β１、成熟型ヒトＴＧＦ−β２、および成熟型ヒトＴＧＦ−β３を中和し、インビトロＨＴ−２セル中和アッセイにおいて、成熟型ヒトＴＧＦ−β１に対してＩＣ50が１００ｐＭ以下であり、成熟型ヒトＴＧＦ−β２に対してＩＣ50が４００ｐＭ以下であり、並びに成熟型ヒトＴＧＦ−β３に対してＩＣ50が２００ｐＭ以下である。
【０００７】
一実施形態において、本発明の抗体は重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含んでなり、前記ＨＣＶＲは配列番号９６または配列番号１００に示すペプチドをＣＤＲＨ１に、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１または配列番号１０２に示すペプチドをＣＤＲＨ２に、配列番号９８に示すペプチドをＣＤＲＨ３に含んでなり、前記ＬＣＶＲは配列番号８８、配列番号９１、配列番号９２、または配列番号９３に示すペプチドをＣＤＲＬ１に、配列番号８９または配列番号９４に示すペプチドをＣＤＲＬ２に、配列番号９０または配列番号９５に示すペプチドをＣＤＲＬ３に含んでなる。
【０００８】
一実施形態において、本発明の抗体はさらにヒトフレームワーク領域を含んでなる。
【０００９】
別の実施形態において、本発明の抗体は、配列番号６４、６８、６９、７０、７４からなる群から選ばれる配列を有するＨＣＶＲ、並びに配列番号４１、４３、４５、４６および５０からなる群から選ばれる配列を有するＬＣＶＲを含んでなる。
【００１０】
別の実施形態において、本発明の抗体は、配列番号６９に示す配列を有するＨＣＶＲ並びに配列番号４５に示す配列を有するＬＣＶＲを含んでなる。
【００１１】
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号７７、７９、８１、８３、８５からなる群から選ばれる配列を有する重鎖、並びに配列番号７６、７８、８０、８２、８４からなる群から選ばれる配列を有する軽鎖を含んでなる。
【００１２】
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号８１に示す配列を有する重鎖および配列番号８０に示す配列を有する軽鎖を含んでなる。
【００１３】
本発明は、哺乳類、好適には霊長類、さらに好適にはヒトにおける細胞増殖性障害の治療方法を提供し、本発明の抗体またはその断片の有効量を、当該治療を必要とする哺乳類に投与することを含んでなる。
【００１４】
本発明は、哺乳類、好適には霊長類、さらに好適にはヒトにおいて、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）／骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、肝細胞癌、膵臓癌、多発性骨髄腫、結直腸癌、他の血液癌（有毛細胞白血病、ＣＭＬ、ＡＭＬ他）を含んでなるＴＧＦ−β介在性の繊維形成および／または血管形成が関係する疾患または症状を治療し、当該治療を必要とする哺乳類に本発明の抗体またはその断片の有効量を投与することを含む、方法を提供する。これはさらに、化学療法剤、抗血管形成剤、または細胞毒性化学療法等、抗ＴＧＦ−β抗体以外の治療薬剤の有効量を当該哺乳類に投与することを含んでもよい。
【００１５】
別の実施形態において、本発明は、本発明の抗体およびＨＥＲ−２受容体を介する情報伝達をブロックする抗体（即ちトラスツズマブ）の有効量を患者に投与することを含んでなる、ＨＥＲ−２を過剰発現する転移性乳癌の治療方法を提供する。
【００１６】
本発明は、製薬的に許容できるキャリア、希釈剤または賦形剤と組み合わせた、本発明の抗体を含んでなる医薬組成物も提供する。
【００１７】
本発明は、哺乳類における細胞増殖性障害治療のための医薬の製造のための、本発明の抗体の使用も提供する。加えて、本発明は、１以上の製薬的に許容できる賦形剤、キャリアまたはそれらの希釈剤を組み合わせた、本発明の抗体を含んでなる細胞増殖性障害の治療に適した医薬組成物を提供する。
本発明は、ＴＧＦ−β活性を中和することにより疾患または症状治療を改善または予防することが可能な医薬の製造のための、本発明の抗体の使用も提供する。
【００１８】
本発明は、哺乳類、好適には霊長類、さらに好適にはヒトにおいて、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）／骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、肝細胞癌、膵臓癌、多発性骨髄腫、結直腸癌、他の血液癌（有毛細胞白血病、ＣＭＬ、ＡＭＬ他）を含んでなるＴＧＦ−β介在性の繊維形成および／または血管形成が関係する疾患または症状を治療するための医薬の製造のための、当該治療を必要とする哺乳類に本発明の抗体またはその断片の有効量を投与することを含んでなる、本発明の抗体の使用も提供する。これはさらに、化学療法剤、抗血管形成剤、または細胞毒性化学療法等の抗ＴＧＦ−β抗体、若しくはサイトカイン以外の治療薬剤の有効量を当該哺乳類に投与することを含んでもよい。さらに、本発明は、１以上の製薬的に許容できる賦形剤、キャリアまたは希釈剤と組み合わせた、本発明の抗体を含んでなる、ＭＤＳ／ＭＰＤ、乳癌、前立腺癌、卵嚢癌、肝細胞癌、膵臓癌、多発性骨髄腫、結直腸癌、他の血液癌（ヘアリーセル白血病、ＣＭＬ、ＡＭＬ，ｅｔｃ）を含む、哺乳類においてＴＧＦ−β活性の中和または低減が有益な状態の治療に適する医薬組成物を提供する。
本発明は、ＴＧＦ−β活性を中和することにより疾患または状態を改善または予防することが可能な医薬の製造のための、本発明の抗体の使用も提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
用語「モノクローナル抗体」は、ジスルフィド結合を介して相互に結合する４個のペプチド鎖、２個の重鎖（Ｈ）および２個の軽鎖（Ｌ）を含んでなる均一の抗体の集合（population）を有する組成物を指す。鎖それぞれの末端アミノ部分は約１００−１１０個以上のアミノ酸可変領域を含む。このそれぞれの鎖の可変領域は、特定の抗原を認識して結合する、３個の相補性決定領域（ＣＤＲｓ、Complementary Determining Regions）を含む。「モノクローナル抗体」は、（完全な軽鎖および完全な重鎖を含んでなる）無傷の（intact）抗体、実質的に無傷の抗体、若しくは抗体のＦａｂ断片またはＦ（ａｂ’）2断片等の抗原結合部位を含む抗体部位または断片でありうる。さらに、「モノクローナル抗体」はフレキシブルなペプチドリンカーにより共に結合した抗体の、可変重鎖領域（ＶＨ）および可変軽鎖領域（ＶＬ）からなる単鎖可変断片（ｓｃＦｖ、single chain Fragment variable）でありうる。
【００２０】
「均一の抗体の集合」は、均一または実質的に均一な抗体の集合を指す（すなわち、当該集合中の少なくとも約８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、より好適には少なくとも約９７％または９８％、若しくは最も好適には少なくとも９９％の抗体が、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて同一の抗原またはエピトープについて競合する）。抗体はグリコシル化していてもよく、しないなくてもよく、いずれも本発明の範囲にある。モノクローナル抗体は、例えばグリコシル化等の翻訳後修飾に差異があっても、同一のアミノ酸配列を有する場合は均一としてもよい。
【００２１】
用語「有効量」は、所望の薬理学的効果を達成するために要する式Ｉの化合物の用量を意味するものと解釈する。
【００２２】
用語「エピトープ」は、抗体の１以上の抗原結合領域において、抗体が認識し結合しうる分子の部分を指す。エピトープは、アミノ酸または糖鎖等の、化学的に活性な表面分子群を含み、特定の３次元構造特性並びに特定の電荷特性を有する場合がある。
【００２３】
用語「Ｋｄ」は、特定の抗体抗原相互作用の解離定数を指す。これは、ｋoff／ｋon＝Ｋｄにより計算される。用語「ｋon」は、順方向または複合体形成反応の、会合またはオン速度定数、若しくは特定の反応速度を指し、Ｍ-1秒-1の単位で測定される。用語「ｋoff」は、抗体／抗原複合体からの抗体の解離に対する、解離またはオフ速度定数、若しくは特定の反応速度を指し、１／秒の単位で測定される。本発明のモノクローナル抗体の親和性は、高いｋonよりも低いｋoffと相関することが多いが、理論に束縛されることなく、ｋoffおよびｋonの両者を改善する実施形態を包含する。より好適な実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、一般に低いｋoff値を示す高い効力の抗体またはその断片である。
【００２４】
本発明のモノクローナル抗体の活性に関して本願明細書に使用の用語「中和」は、生物活性または特性、疾患若しくは状態を含んでなるがこれらに限らず阻害されるものの進行または重症度等に対し、実質的に拮抗、抑制、妨害、防止、低下、抑制、擾乱、消去、停止、減少または逆転する能力を指す。抑制または中和は、好適には少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上である。
【００２５】
本発明の抗体の結合または中和能力に関し、本願明細書にて参照するＴＧＦ−βは、成熟型ヒトＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３の生物学的に活性な形態（配列番号１、２、および３）である。例えば、成熟型ヒトＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３の各ＤＮＡおよびアミノ酸配列（これらの前駆体ドメインおよび成熟部を含む）を記載している、ＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ：Ｐ０１１３７、ＮＰ＿００３２２９、およびＮＰ＿００３２３０を参照。成熟型ジスルフィド結合ホモダイマーのヒトＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３は、２個の１１２アミノ酸残基ポリペプチドを含み、約２５ｋＤａの推定分子量を有する。本発明の抗体は、当該成熟型ＴＧＦ−βアイソフォームと結合して中和するが、同様の条件下では、潜在的ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３アイソフォームへの有意の結合を示さない。
【００２６】
親和性および結合速度を向上することは、例えば、薬物動態のおよび安全上の特性の向上に寄与することにより；用量、毒性および治療リスクを低減することにより；並びに生物学的有効性を改善することにより、抗体の問題を解決する。抗体の解離定数（Ｋd）は、例えば、Ｋｉｎｅｘａ（登録商標）（例えばＤａｒｌｉｎｇら、２００４年、ＡＳＳＡＹ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、２巻、６４７−５７ページを参照）またはＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）（Ｕｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、若しくはＫａｒｌｓｓｏｎら、１９９１年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１４５巻、２９９−３４０ページを適用すること等の、当分野における方法から見出してもよい。本願明細書の用語”ｋon”は、会合またはオン速度定数、若しくは進行方向の特定の反応速度または抗体：抗原複合体形成（Ｍ-1秒-1）を指す。本願明細書の用語”ｋoff”は、解離または”オフ速度”定数、若しくは抗体：抗原複合体から抗体が解離（秒-1）する特定の反応速度を指す。本願明細書の用語”Ｋd”は、Ｋd＝ｋoff／ｋonで計算される、特定の抗体：抗原複合体の解離定数を指す。ＫaはＫdの逆数である。
【００２７】
成熟型ヒトＴＧＦ−β１に対する本発明の抗体のＫdは、約０．０００１ｐＭから約５．０ｐＭの範囲にある。より好適には、約０．００１ｐＭから約３．０ｐＭの範囲である。最も好適には、約０．０１ｐＭから約０．５ｐＭの範囲である。成熟型ヒトＴＧＦ−β２に対する本発明の抗体のＫdは、約０．０１ｐＭから約５．０ｐＭの範囲にある。より好適には、約０．０５ｐＭから約２．０ｐＭの範囲であり、最も好適には、約０．１ｐＭから約１．５ｐＭの範囲である。成熟型ヒトＴＧＦ−β３に対する本発明の抗体のＫdは、約０．００５ｐＭから約３．０ｐＭの範囲にある。より好適には、約０．０５ｐＭから約２．８ｐＭの範囲である。最も好適には、約０．２ｐＭから約２ｐＭの範囲である。好適には本発明の抗体は、成熟型ヒトＴＧＦ−β１に対するＫdが４．０×１０-12以下であり、成熟型ヒトＴＧＦ−β２に対するＫdが８．０×１０-12以下であり、成熟型ヒトＴＧＦ−β３に対するＫdが４．０×１０-12以下であるという特徴を有する。
【００２８】
ヒトＴＧＦ−β１に対する本発明の抗体のＫdは少なくともＴＧＦ−β１に対する１Ｄ１１．１６のＫdの２倍以上であり、より好適には少なくとも２５倍以上であり、最も好適には少なくとも５０倍以上である。明らかに、親和性が高ければＫｄ値はより小さくなる。ヒトＴＧＦ−β２に対する本発明の抗体のＫdは少なくともＴＧＦ−β２に対する１Ｄ１１．１６のＫdの１．５倍以上であり、より好適には少なくとも１０倍以上であり、最も好適には少なくとも２０倍以上である。ヒトＴＧＦ−β３に対する本発明の抗体のＫdは少なくともＴＧＦ−β３に対する１Ｄ１１．１６のＫdの４倍以上であり、より好適には少なくとも６倍以上であり、最も好適には少なくとも１０倍以上である。
【００２９】
成熟型ヒトＴＧＦ−β１に対する本発明のＦａｂのＫdは、約０．００９ｐＭから約７５．０ｐＭの範囲であり、より好適には約０．０１８ｐＭから約５０ｐＭの範囲であり、最も好適には約０．０２ｐＭから約２５ｐＭの範囲である。成熟型ヒトＴＧＦ−β２に対する本発明のＦａｂのＫdは、約０．００４５ｐＭから約６０ｐＭの範囲であり、より好適には約０．００２ｐＭから約４５ｐＭの範囲であり、最も好適には約０．０２ｐＭから約３５ｐＭの範囲である。ＴＧＦ−β１に対する本発明のＦａｂのＫdは少なくともＴＧＦ−β１に対する１Ｄ１１．１６のＫdの３０倍以上であり、より好適には少なくとも３００倍以上であり、最も好適には少なくとも１５００倍以上である。ＴＧＦ−β２に対する本発明のＦａｂのＫdは少なくともＴＧＦ−β１に対する１Ｄ１１．１６のＫdの１０倍以上であり、より好適には少なくとも１００倍以上であり、最も好適には少なくとも５００倍以上である。
【００３０】
成熟型ヒトＴＧＦ−β１に対する本発明の抗体のｋoffは、好適には約１１０から約１（全てのｋoff値は×１０-6秒-1である）の範囲であり、より好適には約５０から約６の範囲であり、さらにより好適には約１５から約４の範囲であり；成熟型ヒトＴＧＦ−β２に対しては、好適には約２４０から約１の範囲であり、より好適には約５０から約２の範囲であり、さらにより好適には約２０から約４の範囲であり；並びに、成熟型ヒトＴＧＦ−β３に対しては、好適には約９０から約１の範囲であり、より好適には約５０から約４の範囲であり、さらにより好適には約３５から約６の範囲である。本発明の抗体は、ＴＧＦ−β１、−β２、−β３に対して１Ｄ１１．１６の約２から約５０倍、より好適には約２．５から約２５倍、最も好適には約３から約１５倍のｋoffの改善を示す。
【００３１】
別の実施形態において、本発明の抗体は、成熟型ヒトＴＧＦ−β１に対して５以上、成熟型ヒトＴＧＦ−β２に対して２．５以上、成熟型ヒトＴＧＦ−β３に対して１．５６以上のｋonを有する（全てのｋon値は×１０7Ｍ-1秒-1である）。成熟型ヒトＴＧＦ−β１に対するｋonは、好適には約１．５から約６０の範囲であり、より好適には約２から約４５の範囲であり、さらにより好適には約３から約３０の範囲であり；成熟型ヒトＴＧＦ−β２に対するｋonは、好適には約１から約４０の範囲であり、より好適には約１から約２５の範囲であり、さらにより好適には約１から約１５の範囲であり；並びに、成熟型ヒトＴＧＦ−β３に対するｋonは、好適には約１．２から約２０の範囲であり、より好適には約１．２から約１０の範囲であり、さらにより好適には約１．２から約５の範囲である。本発明の抗体は、ＴＧＦ−β１、−β２、−β３に対して１Ｄ１１．１６の約１．５から約４０倍、より好適には約２から約１５倍、最も好適には約２から約１０倍のｋonの改善を示す。好適な実施形態において、本発明の抗体はＴＧＦ−β２および−β３以上にＴＧＦ−β１に結合する。
【００３２】
抗体が抗原に結合して抗原の生物的機能を完全にまたは部分的に阻害または低減するならば、抗体は抗原を”中和”するという。ＴＧＦ−βアイソフォームの生物的活性の中和は、受容体結合、細胞成長への阻害効果、走化性、アポトーシス、細胞内タンパク質リン酸エステル化または細胞情報伝達等、ＴＧＦ−β活性の１以上の指標がインビトロまたはインビボで完全または部分的に阻害または低減することを測定して試験される。最も好適には、ＴＧＦ−β活性の中和能は、本願明細書に記載のように、ＨＴ−２セル増殖アッセイにより、またはＳｍａｄ２リン酸エステル化阻害の測定により試験される。
【００３３】
本発明の抗体は、成熟型ヒトＴＧＦ−β１、成熟型ヒトＴＧＦ−β２および成熟型ヒトＴＧＦ−β３を中和し、インビトロＨＴ−２セル増殖アッセイにおいて、成熟型ヒトＴＧＦ−β１に対して約１００ｐＭ、７５ｐＭ、５０ｐＭ、２５ｐＭ、１７．５ｐＭ、１０ｐＭ、４ｐＭ、または３ｐＭ以下のＩＣ50を、成熟型ヒトＴＧＦ−β２に対して約４００ｐＭ、３４５ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、７７．５ｐＭ、５０ｐＭ、４０ｐＭ、または２３ｐＭ以下のＩＣ50を、並びに成熟型ヒトＴＧＦ−β３に対して約２００ｐＭ、１１５ｐＭ、１０５ｐＭ、７５ｐＭ、５０ｐＭ、４５ｐＭ、または３５ｐＭ以下のＩＣ50を有する。
【００３４】
中和活性の改善は薬物動態および安全性特性を向上し、用量、毒性および治療リスクを低減し、生物学的有効性を改善する。好適な実施形態において、本発明の抗体のＨＴ−２セル増殖／中和アッセイにおけるＩＣ50は、本願明細書に記載のように、ＴＧＦ−β１において約２０ｐＭ以下、ＴＧＦ−β２において約３２５ｐＭ以下、ＴＧＦ−β３において約１２５ｐＭ以下である。ＴＧＦ−β１に対して、本発明の抗体は好適には約０．１から約５０ｐＭの範囲の、より好適には約０．１から約３０ｐＭの範囲の、最も好適には約０．１から約２０ｐＭの範囲のＩＣ50を有する。ＴＧＦ−β２に対して、本発明の抗体は好適には約１から約４００ｐＭの範囲の、より好適には約１０から約３５０ｐＭの範囲の、最も好適には約１５から約３２５ｐＭの範囲のＩＣ50を有する。ＴＧＦ−β３に対して、本発明の抗体は好適には約０．１から約２００ｐＭの範囲の、より好適には約１から約１５０ｐＭの範囲の、最も好適には約１０から約１２５ｐＭの範囲のＩＣ50を有する。
【００３５】
別の実施形態において、本発明の抗体は、ＨＴ−２セル増殖アッセイにおいて、１Ｄ１１．１６と比較して、ＴＧＦ−β１について約１００から約６００倍の範囲の、より好適には約２００から約５００倍の範囲の、さらにより好適には約３００から約４００倍の範囲の；ＴＧＦ−β２について約１０から約４００倍の範囲の、より好適には約２５から約３００倍の範囲の、さらにより好適には約５０から約２００倍の範囲の；ＴＧＦ−β３について約２から約２００倍の範囲の、より好適には約４から約５０倍の範囲の、さらにより好適には約６から約２５倍の範囲のＩＣ50の改善を示す。
【００３６】
ＴＧＦ−β活性の中和に要する抗体濃度は、例えば、サイトカイン濃度、セルタイプ、成長条件、および試験する活性の種類等、種々のパラメータに依存する。本発明の抗体の中和特性は、本願明細書に記載のように、Ｕ８７ＭＧヒト腫瘍異種移植モデルアッセイにおけるＳｍａｄ２タンパクのリン酸エステル化阻害の度合いを測定することにより試験される。別の好適な実施形態において、本発明の抗体は、このようなアッセイにおけるＴＥＤ50（治療効果用量、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  Ｄｏｓｅ）が約１００から約２００ｍｇ／ｋｇの範囲、より好適には約５０から約８０ｍｇ／ｋｇの範囲、さらにより好適には約５から約２５ｍｇ／ｋｇの範囲である。
【００３７】
本発明の特定の抗体および断片は、特異的なＣＤＲ領域であるＶＨＣＤＲ１  Ｘ1Ｘ2ＷＭＮ［配列番号１０、式中、Ｘ1はＴまたはＳのいずれか；Ｘ2はＥまたはＹのいずれかである］、ＶＨＣＤＲ２  ＱＩＦＰＸ1Ｘ2ＧＳＴＮＹＸ3ＥＭＸ4ＥＧ［配列番号１１、式中、Ｘ1はＡまたはＦのいずれか；Ｘ2はＳ、ＴまたはＬのいずれか；Ｘ3はＮ、Ｇ、Ｓ、ＤまたはＡのいずれか、Ｘ4はＦまたはＹのいずれかである］、ＶＨＣＤＲ３  ＧＸ1ＧＮＹＡＬＤＡＭＤＹ［配列番号１２、式中、Ｘ1はＤ、Ｉ、Ｍ、Ｙ、Ｌ、Ｖ、ＱまたはＦのいずれかである］、ＶＬＣＤＲ１  ＲＡＳＥＳＶＤＸ1Ｘ2ＧＮＳＦＭＨ［配列番号１３、式中、Ｘ1はＳ、Ｙ、ＦまたはＬのいずれか；Ｘ2はＹまたはＷのいずれかである］、ＶＬＣＤＲ２  Ｘ1ＡＳＮＬＥＳ［配列番号１４、式中、Ｘ1はＬまたはＹ］；並びに、ＶＬＣＤＲ３  Ｘ1ＱＸ2Ｘ3ＥＤＰＬＴ［配列番号１５、式中、Ｘ1はＱ、ＴまたはＣのいずれか；Ｘ2はＮまたはＨのいずれか；Ｘ3はＮ、Ｉ、Ｍ、Ｄ、ＴまたはＡのいずれかである］を有する。
【００３８】
さらに、成熟型ヒトＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３を中和する本発明の組成物を作成するために、ヒトまたはヒト化抗体フレームワーク配列においてＣＤＲ領域を（適切な配向に）エンジニアリングした、当該ＣＤＲ領域を用いて作成された抗体が包含される。フレームワーク配列に特定のＣＤＲ領域を取り込むために、任意の公知の手法を用いてもよい。記載したように、任意の生殖系列または再編成したヒト可変領域、若しくは、例えば公知のヒト可変ドメインのコンセンサス配列に基づく合成可変ドメインから、ヒトまたはヒト化可変フレームワーク配列が由来しうる。好適な可変ドメインフレームワーク配列は、実施形態の抗ＴＧＦ−β１、−β２および−β３抗体の生物学的特性に有意の影響がないもの、すなわち、成熟型ヒトＴＧＦ−β１、−β２および−β３と高い親和性を有して結合、中和するものである。好適には、そのようなフレームワークは、ヒトに投与されても有意の免疫反応を誘発しない。フレームワーク配列は、ヒトの抗体に自然に存在する配列、または数種類のヒト抗体のコンセンサス配列である。
【００３９】
本発明の抗体の実施形態の重鎖可変領域に対するフレームワーク配列の例としては、ＶＨセグメントＤＰ−５（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、１９９２年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７巻、７７６−９８ページ）およびＪセグメントＪＨ４、ＪＨ１またはＪＨ５（Ｒａｖｅｔｃｈら、１９８１年、Ｃｅｌｌ、２７巻、５８３−９１ページ）が挙げられるがこれに限定されない。ＶｋセグメントＬ１（Ｃｏｘら、１９９４年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４巻、８２７−３６ページ）およびＪセグメントＪｋ４（Ｈｉｅｔｅｒら、１９８２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１０巻、１５１６−２２ページ）は、軽鎖可変領域に対するフレームワーク配列の例であるが、これらに限定されない。
【００４０】
好適な実施形態において、ＨＣＶＲ  ＦＲ１フレームワークは［配列番号１６］を含み；ＨＣＶＲ  ＦＲ２フレームワークは［配列番号１７］を含み；ＨＣＶＲ  ＦＲ３フレームワークは［配列番号１８］を含み；ＨＣＶＲ  ＦＲ４フレームワークは［配列番号１９］を含んでなる。別の好適な実施形態において、ＬＣＶＲ  ＦＲ１フレームワークは［配列番号２０］を含み；ＬＣＶＲ  ＦＲ２フレームワークは［配列番号２１］を含み；ＬＣＶＲ  ＦＲ３フレームワークは［配列番号２２］を含み；ＬＣＶＲ  ＦＲ４フレームワークは［配列番号２３］を含んでなる。別の好適な実施形態において、ＨＣＶＲフレームワークは［配列番号８６］を含み、Ｘ1はＳ、Ｙ、Ｆ、またはＬのいずれかであり；Ｘ2はＹまたはＷのいずれかであり；Ｘ3はＡまたはＦのいずれかであり；Ｘ4はＳ、ＴまたはＬのいずれかであり；Ｘ5はＮ、Ｇ、Ｓ、ＤまたはＡのいずれかであり；Ｘ6はＦまたはＹのいずれかであり；並びにＸ7はＤ、Ｉ、Ｍ、Ｙ、Ｌ、Ｖ、ＱまたはＦのいずれかである。別の好適な実施形態において、ＬＣＶＲフレームワークは［配列番号８７］を含み、Ｘ1はＴまたはＳのいずれかであり；Ｘ2はＥまたはＹのいずれかであり；Ｘ3はＬまたはＹのいずれかであり；Ｘ4はＱ、Ｔ、またはＣのいずれかであり；Ｘ5はＮまたはＨのいずれかであり；並びにＸ6はＮ、Ｉ、Ｍ、Ｄ、ＴまたはＡのいずれかである。
【００４１】
別の好適な実施形態において、フレームワークおよび定常領域は、ヒトの配列と比較して、変更、欠失、付加、置換、またはこれらの任意の組み合わせを含んでなる。１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸を任意の組み合わせにおいて置換、欠失、または付加したフレームワークおよび定常領域が好適である。別の実施形態において、当該フレームワークは本願明細書にて開示のフレームワークと８５−９９％の配列同一性を有する。
【００４２】
一実施形態において、本発明の抗体結合組成物と共に用いる好適な重鎖定常領域は、ＩｇＧ定常領域である。より好適な実施形態において、当該ＩｇＧ定常領域は、ＩｇＧ１定常領域またはＩｇＧ４定常領域（さらにより好適には［配列番号２４］または［配列番号２５］の定常領域）である。本発明の好適な軽鎖定常領域は、［配列番号２６］である。別の好適な実施形態において、組成物に結合する抗体は、ＩｇＧ１重鎖定常領域またはＩｇＧ４重鎖定常領域と、カッパ軽鎖定常領域を含んでなる。
【００４３】
本発明の抗体をコードするポリヌクレオチド配列も包含される。本発明のＣＤＲｓを用いる抗体の設計を行う場合、抗原結合ドナーおよびアクセプター配列に影響しそうな抗体フレームワーク内残基の同定は、抗体レパートリーに由来する配列テンプレートを整列することにより決定してもよい。「不変異残基」（Ｋａｂａｔら、１９９１年）および「キー残基」（Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９年）を同定してもよく、配列テンプレートに対して提案された配列をスクリーニングして、ドナー抗原結合ループＬ１−Ｌ３、Ｈ１およびＨ２それぞれの基準クラスの帰属を決定してもよい（例えば、ＭａｒｔｉｎおよびＴｈｏｒｎｔｏｎ、１９９６年、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６３巻、８００−１５ページを参照）。ＶＨ／ＶＬインタフェースにおける残基（Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８５年）およびコアサイトにおいて構造保存が知られた残基（Ｃｈｏｔｈｉａら、１９９８年）は、対応するドナーおよびアクセプター残基と比較される。これらのサイトにおける不適合ドナーおよびアクセプターフレームワーク残基は、公知構造の他の抗体からの情報に基づいて分析される（Ｂｅｒｍａｎら、２０００年、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２８巻、１号、２３５−４２ページ）。非ヒトＶ領域のヒト化のために、ヒトのフレームワークをテンプレートとして選択すると、引き続いてどの残基をヒト化するかに関する決定が定義されうる。公知の結晶構造を有する抗体から、生殖系列、非生殖系列、または利用可能なデータベース由来のコンセンサス配列から、ホモログテンプレートを選択することも用いうる（例えば、Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅら（Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅら、１９９３年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍａｎ（Ｍ．Ｃｌａｒｋ編集）、ｐｐ１４−４４、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｔｉｔｌｅｓ、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ、イギリス）；およびＢ．Ｌｏ、２００４年、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）を参照）。抗体設計の他の方法は、ベストフィットストラテジを用いてデータベース内の生殖系列配列を検索し、ドナーＣＤＲｓを受容するフレームワークとして、ヒト生殖系列に最も近い配列を選択することである（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、１９９２年）。ヒト生殖系列は、強力な免疫原性である体細胞性の過剰変異を示さないので、生殖系列をフレームワークとする方法は有用である。フレームワーク領域および修飾したヒトフレームワークに埋め込まれた本発明のＣＤＲｓを組み合わせた、変異型の本発明の抗体をコードする核酸分子は、ヒトのサブグループをフレームワークに用いる、コンセンサスなヒト生殖系列のストラテジにより設計しうる（例えば、Ｐｒｅｓｔａら、１９９３年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻、２６２３−３２ページ；Ｃｏｕｔｏら、１９９４年、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１３巻、２１５−９ページ；Ｃｏｕｔｏら、１９９５年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（Ｓｕｐｐｌ．）、５５巻、５９７３ｓ−７ｓページ；Ｗｅｒｔｈｅｒら、１９９６年、Ｊ．���ｍｍｕｎｏｌ．、１５７巻、４９８６−９５ページ；Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒら、１９９８年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｎｇ、１１巻、３２１−８ページを参照）。
【００４４】
抗体断片（記載のような）、または本願明細書の部分配列または配列番号も包含される。このようなタンパクおよび／またはポリペプチドは「フリースタンディング」であるか、若しくはより大きなポリペプチドまたはタンパクを含む場合があり、その断片は、フュージョンタンパク内に接続したもの等、例えば本願明細書の配列番号の単一連続領域等の部分または領域を形成する。こうした断片をコードするポリペプチドも包含される。
【００４５】
本発明の抗体は、化学合成、組み換え、遺伝子または分子操作等の、当業者に公知の任意の方法により作製されるが、製作方法は限定されない。典型的には、本発明の抗体をコードする核酸は、天然付随または異種性のプロモータ領域を含み、コードする配列に作動可能に結合した発現制御ポリヌクレオチド配列を含んでなる。好適には、発現制御配列は、真核生物の宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするベクター中の真核生物のプロモータシステムであるが、原核生物宿主用の制御配列も用いる。ベクターは、適切な宿主細胞に取り入れられると、配列を発現するための、並びに所望により、軽鎖、重鎖、軽鎖／重鎖二量体、または未処理の抗体、結合断片または他の免疫グロブリン形態の収集および精製のための、好適な条件下で増殖される。ヒト定常領域ＤＮＡ配列は、種々のヒト細胞、好適には不死化したＢ細胞から当業者に公知の方法により単離される。ポリヌクレオチド配列のための好適な原料細胞、および免疫グロブリン発現および分泌のための宿主細胞は、当業者に公知の原料から得られる。
【００４６】
本発明は、例えば残基マッチング最適化等の当業者に公知の方法を用い、本願明細書の配列に対して実質的な配列類似性（例えば、本発明の配列（または断片）に対して少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％同一）を有する、機能性ポリペプチド配列を包含する。当該配列は、本発明の抗体の機能的特性（例えば、本願明細書に記載のアッセイにおいて成熟型ヒトＴＧＦ−β１、−β２および−β３に結合し中和する）を有する任意のものを含んでなる。このような機能に関連した実施形態は、ＣＤＲまたは定常領域において本発明の配列のアミノ酸残基の付加、置換、および／または欠失を含んでなる。アミノ酸置換および／または付加は、含まれる残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の性質における類似性に基づいてもよい。同様に、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸アナログを、ポリペプチド配列中に置換または付加してもよい。このような変種は全て、本発明のユニークな処方またはポリペプチド配列並びに機能的な限定を特定している本願明細書にて教示を与えられる、分子生物学の当業者の想定内にある。
【００４７】
本発明の組成物の好適な実施形態は、以下の特性の１以上を有する。ＫdはＴＧＦ−β１に対して２×１０-13Ｍ未満、ＴＧＦ−β２に対して５×１０-13Ｍ未満、ＴＧＦ−β３に対して８×１０-13Ｍ未満；ｋoffはＴＧＦ−β１に対して８×１０-6ｓ-1未満、ＴＧＦ−β２に対して１１×１０-6ｓ-1未満、ＴＧＦ−β３に対して１３×１０-6ｓ-1未満；ｋonはＴＧＦ−β１に対して５×１０7Ｍ-1ｓ-1より大きく、ＴＧＦ−β２に対して２×１０7Ｍ-1ｓ-1より大きく、ＴＧＦ−β３に対して１．５×１０7Ｍ-1ｓ-1より大きく；ＴＧＦ−β１に対するＦａｂ組成物のＫd改善は、ＴＧＦ−β１に対する１Ｄ１１．１６  Ｆａｂに比べ少なくとも６０００倍；抗体組成物のＫd改善は１Ｄ１１．１６に比べ、ＴＧＦ−β１に対し約３４倍より大きく、ＴＧＦ−β２に対して約１３倍より大きく、ＴＧＦ−β３に対して約９倍より大きく；ＩＣ50はＨＴ−２アッセイ中１Ｄ１１．１６のＩＣ50値の約３００倍よりも高く；Ｓｍａｄ２リン酸エステル化（本願明細書に記載）抑制のためのＵ８７ＭＧヒト腫瘍の異種移植モデルにおいて、ＥＤ50値は約１１から１７ｍｇ／ｋｇの範囲；３０日間貯蔵後（標準バッファ（例えばクエン酸塩（２０ｍＭ）、リン酸塩（１０ｍＭ）、またはＰＢＳ（１０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ含有）等）中、ｐＨ（５．０、６．５、または７．４）、濃度１ｍｇ／ｍＬ、４０℃）のサイズ排除クロマトグラフィーによる計測から本発明の組成物の凝集が５．０％未満；標準バッファ（例えばクエン酸塩（２０ｍＭ）、リン酸塩（１０ｍＭ）、またはＰＢＳ（１０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ含有）等）中、ｐＨ＜７．０、濃度１ｍｇ／ｍＬ、３５℃未満）で３０日間貯蔵後のカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）による計測から、分解生成物１％未満または酸の形成なし；濃度２ｍｇ／ｍＬ、４℃で２週間貯蔵後、当業者に公知の方法およびｐＨ６．０での透析回収による本発明の組成物のタンパク回収率が８０％よりも大きい。
【００４８】
本発明の組成物は、ＴＧＦ−β１、−β２および−β３の１以上に関連する疾患、障害、状態、症候、または症状を、調節、治療、抑制、寛解、または予防するための治療薬剤として有用である。抗体は、任意の公知の方法を用いて投与でき、通常の製薬的に許容できるキャリア、希釈剤、安定剤、および賦形剤と組み合わせて用いてもよい。これらの組み合わせは、密閉服用バイアル中の凍結乾燥により、または安定化した水溶性調製物中の貯蔵等により、服用形態になりうる。製薬的に許容できるキャリア、希釈剤、安定剤、および賦形剤は、公知またはＭｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．、Ｒａｈｗａｙ、米国ニュージャージー州、等に記載のものである。
【００４９】
とりわけ、本発明の抗体（または断片）は、良性であれ悪性であれ、細胞、細胞群、または組織の単一または複数の局在的異常増殖という特徴を有して、任意の細胞、組織、任意の部位または任意の臓器、組織または身体部分の組み合わせに影響を与え、任意の疾患、症候群、障害、症状または状態を含んでなる、細胞増殖性障害の治療に有用である。本願明細書に定義のように、細胞増殖性障害は、例えば、血液癌（ＭＤＳまたはＭＰＤ等、巨核球の巻き込みを伴うもの等（例えばＳａｋａｍａｋｉら、１９９９年、Ｂｌｏｏｄ、９４年、６巻、１９６１−７０ページ等を参照）、有毛細胞白血病および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）等の他の血液癌；肺非小細胞癌；乳癌；前立腺癌（ホルモン抵抗性を含む）；卵嚢癌；肝細胞癌；膵臓癌；多発性骨髄腫；結腸、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌系（例えば副腎腺、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺または甲状腺等）、眼、頭部、頚部、神経系（中枢または末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、脾臓、胸部および泌尿生殖器系の新生物等を包含される。加えて、本発明の抗体は、筋消耗（悪液質等）の治療、筋成長促進（疾病後、外傷、再構成、置換等）等の骨格筋の疾患に対して有用である。
【００５０】
「化学療法剤」は癌治療に有用な化合物である。化学療法剤の例は、シクロホスファミドおよびフロロウラシル等のアルキル化剤；フロロウラシルおよびゲムシタビン等の代謝拮抗物質；アドリアマイシン等の抗生物質；並びに、ビンクリスチンおよびビノレルビン等の抗縮瞳剤等を含んでなる。
【００５１】
「抗血管形成剤」は、血管形成を、ある程度、阻止または妨害する化合物を指す。抗血管形成剤は、例えば、成長因子または血管形成の促進に関与する成長因子受容体に結合する低分子または抗体である。
【００５２】
本願明細書に用いる用語「細胞毒性化学療法」は、細胞の機能を抑制または妨害、および／または細胞破壊を起こす物質を指し、放射性同位体（Ａｔ211、Ｉ131、Ｉ125、Ｙ90、Ｒｅ186、Ｒｅ188、Ｓｍ153、Ｂｉ212、Ｐ32およびＬｕの放射性同位体）、および低分子毒またはバクテリア、菌、植物または動物起源の酵素活性毒物等の毒物を含んでなり、これらの断片および／または変異体を含んでなる。
【００５３】
ポリヌクレオチドが他のポリヌクレオチドと共に機能的な関係にあるとき、「動作可能に結合」するという。例えば、プロモータまたはエンハンサは、配列の転写に影響を及ぼす場合に、コードする配列に動作可能に結合する。ペプチドは、それをコードするポリヌクレオチドが動作可能に結合するとき、好適には同一のオープンリーディングフレームにある場合に、他のペプチドに「動作可能に結合」する。
【００５４】
用語「ベクター」は、プラスミドまたはウィルス性ベクターを含んでなるが限定されず、結合したものに他の核酸を輸送しうる核酸分子を含んでなる。ある種のベクターは導入された宿主細胞中で自律的に複製が可能であり、一方では、宿主細胞中への導入時に宿主細胞の遺伝子に統合されることにより、宿主遺伝子に伴って複製されるベクターもある。さらに、ある種のベクターは、動作可能に結合する遺伝子の発現を指揮しうる。このようなベクターは、本願明細書における「組み換え発現ベクター」（または単純に「発現ベクター」）を指し、ベクターの例は当業者に公知である。
【００５５】
本願明細書に使用のように、「セル」「宿主細胞」「セルライン」および「細胞培養液」という表現は交換可能に用いられ、ＨＣＶＲ、ＬＣＶＲまたは本発明のモノクローナル抗体をコードする配列を含む、任意の単離された本発明のポリヌクレオチドまたは任意の組み換えベクターを受け入れるものである、個別の細胞または細胞培養を含んでなる。宿主細胞は単一の宿主細胞の子孫を含んでなり、この子孫は、自然、偶然、または計画的変異および／または変化によって、必ずしも最初の親細胞と完全に同一（形態学的にまたは全ＤＮＡ補完において）でなくてもよい。宿主細胞は、インビボまたはインビトロにおいて、本発明のモノクローナル抗体若しくはその軽鎖または重鎖を発現する１以上の組み換えベクターまたはポリヌクレオチドで、形質転換、形質導入、または感染した細胞を含んでなる。本発明の組み換えベクターを含んでなる宿主細胞は（宿主のクロモソームへの取り込みが安定であってもなくても）、「組み換え宿主細胞」と呼ぶ。本発明の使用に好適な宿主細胞は、ＣＨＯセル（例えばＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０９６）、ＮＳ０セル、ＳＰ２／０セルおよびＣＯＳセル（例えばＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０、ＣＲＬ−１６５１）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）である。本発明の使用のためのさらなる宿主細胞は、植物細胞、酵母細胞、他の哺乳類細胞および原核生物細胞を含んでなる。
【００５６】
（抗体発現および精製）
本発明の抗体を発現するためには、軽鎖および／または重鎖の一部または全長をコードするＤＮＡを、転写および翻訳制御配列に遺伝子が動作可能に結合するよう、発現ベクターに挿入する。発現ベクターおよび発現制御配列は、発現宿主細胞と互換性のあるものを選択する。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は別々のベクターに挿入されうるか、あるいは、より典型的には両者の遺伝子は同一の発現ベクターに挿入される。抗体遺伝子は標準的な方法により発現ベクターに挿入される。加えて、組み換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗ＴＧＦ−βモノクローナル抗体軽鎖および／または重鎖の分泌を容易にするシグナルペプチドをコードしうる。抗ＴＧＦ−βモノクローナル抗体軽鎖および／または重鎖の遺伝子は、抗体鎖遺伝子のアミノ末端に対し、フレーム内でシグナルペプチドが動作可能に結合するよう、ベクター中にクローンしうる。シグナルペプチドは免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種性シグナルペプチドでありうる。
【００５７】
抗体重鎖および／または軽鎖遺伝子に加えて，本発明の組み換え発現ベクターは、宿主細胞内で抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を輸送する。用語「調節配列」は、プロモータ、エンハンサ、その他の、必要であれば抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御する発現制御エレメント（例えばポリアデニル化シグナル）を含むものとする。発現ベクターの設計は、調節配列の選択を含み、形質転換のための宿主細胞の選択、所望のタンパクの発現レベル等の要因に依存する場合がある。哺乳類宿主細胞発現のための好適な調節配列は、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、サルウィルス４０（ＳＶ４０）、アデノウィルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｍａｊｏｒ  ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ＡｄＭＬＰ））、およびポリオーマウィルス等の、哺乳類細胞中で高レベルのタンパク発現を指揮するウィルスのエレメントを含んでなる。
【００５８】
抗体重鎖および／または軽鎖遺伝子に加えて，本発明の組み換え発現ベクターは、宿主細胞中でのベクター複製（例えば複製起点）を調節する配列、および１以上の選択可能マーカー遺伝子等の、さらなる配列を有していてもよい。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選別を容易にする。例えば、典型的には選択可能マーカー遺伝子は、当該ベクターが導入された宿主細胞上で、Ｇ４１８、ヒグロマイシン、またはメトトレキサート等の薬剤への抵抗性を与える。好適な選択可能マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（ＤＨＦＲマイナス宿主細胞中、メトトレキサート選別／増幅と共に用いるため）、および選別／増幅用ＧＳネガティブセルライン（ＮＳ０等）中のグルタミン合成酵素（ＧＳ）を含んでなる。
【００５９】
軽鎖および／または重鎖の発現のため、軽鎖および／または重鎖をコードする発現ベクターを、電気穿孔、リン酸カルシウム塩析、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、形質導入、感染等の標準的な方法により宿主細胞に導入する。本発明の抗体は、理論的には原核または真核宿主細胞のいずれでも発現しうるが、真核宿主細胞が好適であり、哺乳動物の宿主細胞が最も好適である。このような細胞は、適切に折り畳まれ免疫学的に活性な抗体を形成し分泌する可能性が高いためである。本発明の組み換え抗体を発現するための好適な哺乳類の宿主細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えば、Ｒ．Ｊ．ＫａｕｆｍａｎおよびＰ．Ａ．Ｓｈａｒｐ、１９８２年、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５９巻、６０１−６２１ページ記載のＤＨＦＲ選別可能マーカーと共に用いられる、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、１９８０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７巻、４２１６−４２２０ページに記載のＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２／０細胞を含んでなる。
抗体遺伝子をコードする組み換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入するときは、抗体が宿主細胞中で発現でき、より好適には宿主細胞を増殖する培地中へ抗体を分泌しうるための十分な期間、宿主細胞を培養することにより、抗体を生産する。抗体は、標準的なタンパク質精製の方法を用いて、培地から回収しうる。
【００６０】
宿主細胞は、通常の技法により、インタクトな抗体、例えばＦａｂフラグメントまたはｓｃＦｖ分子等の部分または断片の作製に用いうる。当業者であれば、上記手順の変異体が本発明の範囲内であることを理解する。例えば、本発明の抗体の軽鎖または重鎖のいずれかをコードするＤＮＡを、宿主細胞に移入するのが望ましいことがある。組換えＤＮＡ技術は、ＴＧＦ−βへの結合に不要である軽鎖および重鎖のいずれかまたは両方をコードするＤＮＡの一部または全部を除去するために用いてもよい。そのような切断ＤＮＡ分子から発現した分子も、本発明の抗体に包含される。
【００６１】
本発明の抗体の組み換え発現のための好適なシステムにおいては、抗体重鎖および抗体軽鎖の両方をコードする組み換え発現ベクターを、電気穿孔によりＧＳ−ＣＨＯセルに導入する。組み換え発現ベクター内では抗体重鎖および軽鎖遺伝子はそれぞれエンハンサ／プロモータ調節エレメント（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、アデノウィルス等に由来する、ＣＭＶエンハンサ／ＡｄＭＬＰプロモータ調節エレメントまたはＳＶ４０エンハンサ／ＡｄＭＬＰプロモータ調節エレメント）に動作可能に結合し、遺伝子を高レベルで転写させる。組み換え発現ベクターはＤＨＦＲ遺伝子も輸送し、これによりメトトレキサート選別／増幅を用いるベクターでトランスフェクトされたＣＨＯセルの選別が可能になる。選択された形質転換宿主細胞を培養して抗体重鎖および軽鎖を発現させ、培地から無傷の抗体を回収する。標準的な分子生物学の技法を用いて組み換え発現ベクターを調製し、宿主細胞をトランスフェクトし、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養して培地から抗体を回収する。本発明の抗体またはその抗原結合部位は、ヒト免疫遺伝子を導入した動物（マウス等）中で発現しうる（例えばＴａｙｌｏｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２０巻、６２８７−９５ページ、１９９２年等を参照）。
【００６２】
いったん発現すると、本発明の無傷の抗体、二量体、独立した軽鎖および重鎖、または他の免疫グロブリン形態は、硫酸アンモニウム塩析、イオン交換、アフィニティ、逆相、疎水性相互作用カラムクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、および同様のものを含んでなる、当分野の標準的な手順に従って精製されうる。少なくとも約９０％、９２％、９４％、または９６％均一の実質的に純粋な免疫グロブリンが好適であり、９８％から９９％またはより以上の均一度が、薬理学的使用において最も好適である。部分的または所望の均一度となるまで精製した後に、本願明細書に記載のように、ペプチドを治療または予防に用いてもよい。
【００６３】
（組成物）
本発明の抗体は、患者への投与に適切な医薬組成物に取り入れることが可能である。本発明の化合物は、単独で、または、製薬的に許容できるキャリア、希釈剤および／または賦形剤と組み合わせて、単一または複数の服用において投与してもよい。投与のための組成物は、選択した投与様式において適切であるように設計され、製薬的に許容できる希釈剤、キャリア、および／または分散剤、バッファ、界面活性剤、保存料、可溶化剤、等張剤、安定剤および同様のもの等の賦形剤が適切に使用される。前記組成物は、例えば、一般的に当業者に公知の処方技術の概要を提供するＲｅｍｉｎｇｔｏｎ、”Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ”、第１９版、Ｇｅｎｎａｒｏ編集、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、米国フィラデルフィア州、１９９５年、等に記載の通常の技法に従って設計される。
【００６４】
本発明の抗体を含んでなる組成物は、静脈内、腹腔内、皮下、肺、経皮、筋肉内、鼻腔内、頬、舌下、または坐剤投与を含んでなる標準的な投与技術を用いて、本願明細書に記載の病理または障害を表す患者に投与されてもよい。
【００６５】
本発明の抗体の投与経路は非経口でもよい。好適には、本発明の抗体は、非経口薬投与に好適な医薬組成物中に取り入れうる。本願明細書に使用の非経口という用語は、静脈内、筋肉内、皮下、直腸、膣、または腹腔内投与を含んでなる。静脈内または腹腔内または皮下注射による末梢性全身輸送が好適である。
【００６６】
典型的には、組成物は、密閉バイアルまたは注射器等を含んでなる、製造および用意された容器内での貯蔵条件下において、無菌かつ安定でなければならない。従って、組成物は、処方作製後に無菌フィルター処理してもよく、あるいは微生物学的に許容できるよう作製してもよい。静脈内注入液のための典型的な組成物は、リンゲル溶液、生理食塩水、デキストロース液およびハンク溶液等、２５０−１０００ｍｌの流体体積、並びに治療上有効な投与量の抗体濃度（例えば１から１００ｍｇ／ｍＬ）を有しうる。投与量は疾患の種類や重症度に依存して変化してもよい。医療技術において公知であるように、任意の１人の患者への投与量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与する特定の化合物、性別、時間および投与経路、一般的健康状態、並びに同時に投与される他の薬物を含んでなる多くの要因に依存する。
例えば、典型的な投与量は０．００１から１０００μｇの範囲であるが、この例の範囲を下回るまたは上回る投与量も、特に上述の要因を考慮して包含される。１日の非経口投与量の投与計画は、全体重に対し約０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、好適には約１０μｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇ、より好適には１日あたり体重に対して約１０μｇ／ｋｇから約３ｍｇ／ｋｇでありうる。一定周期の試験により進行をモニターしてもよい。数日以上に渡る繰り返し投与においては、症状にもよるが、疾病症候に所望の抑制が発生するまで、治療を繰り返す。しかしながら、他の投与計画も有用である場合があり、本願明細書において排除することはない。所望の投与量は、抗体の１回のボーラス投与により、複数回のボーラス投与により、または継続的注入により、当業者が望む薬物動態の減衰パターンに依存して輸送されうる。
【００６７】
これらの示唆した抗体量は、治療学的な裁量に大きく従う。適切な用量および日程計画の選択における重要な要因は、得られる結果である。こうした文脈において考慮すべき要因は、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳類、個々の患者の臨床条件、障害の原因、抗体の輸送部位、特定の抗体の種類、投与方法、投与計画、および他の医療実務者に公知の要因を含んでなる。
【００６８】
本発明の治療薬剤は、貯蔵のために凍結または凍結乾燥してもよく、使用前に適切な無菌のキャリア中に再構成してもよい。凍結乾燥および再構成により、抗体活性の損失の程度は変化しうる。補償のために投与量を調節してもよい。一般的にはｐＨ６から８が好適である。
【００６９】
（製品）
本発明の別の実施形態において、上記記載の障害または症状を治療するために有用な材料を含んでなる製品を提供する。製品は容器およびラベルを含んでなる。好適な容器は、例えば、ビン、バイアル、注射器および試験管を含んでなる。容器は、ガラスまたはプラスチック等の種々の材料で形成してもよい。容器は、障害または症状を治療するために有効な本発明の組成物を保持し、無菌のアクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、皮下注射針により貫通可能なストッパを有する静脈注入バッグまたはバイアルでもよい）。組成物中の活性成分は、本発明の抗ＴＧＦ−β抗体である。容器の表面または添付ラベルは、組成物が選択症状の治療用であることを表示する。製品は、さらに、リン酸緩衝食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液等の、製薬的に許容できるバッファを含んでなる第２の容器を含んでもよい。さらに、他のバッファ、希釈剤、フィルタ、針、注射器、および使用機器を伴うパッケージ内挿物を含んでなる、商用およびユーザの観点から望まれる他の材料を含んでもよい。
【００７０】
以下の実施例は単なる例示を目的とし、いかなる点においても本発明の範囲を限定する意図はない。
【００７１】
（実施例１：抗体生産および生成）
本発明の抗体の軽鎖および重鎖の同時発現のために、重鎖および軽鎖をコードする両者の遺伝子をクローンし、分離したｈＣＭＶ−ＭＩＥプロモータの制御下で、それぞれの遺伝子を有するダブルジーンベクターを生成した。軽鎖および重鎖コード配列の両者をＤＮＡシーケンシングし、正しいコード配列を確認した。
【００７２】
本発明の抗体の軽鎖および重鎖の同時発現のための発現プラスミドは、シングルカッティング酵素Ｓａｌ  Ｉにより直線化し、酢酸ナトリウムおよびエタノール中で沈殿させ、氷冷７０％エタノールで洗浄し、無菌バイオセーフティキャビネット内で風乾した。次いでＤＮＡペレットをトランスフェクション培養液に再溶解し、ＣＨＯセルへのトランスフェクションに用いた。トランスフェクションは、ＧｅｎｅＰｕｌｓａｒ（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、米国カリフォルニア州）を３００Ｖ、１１２０μＦｄで用い、セル−ＤＮＡ混合物を電気穿孔して実施した。次いで、本発明の抗体を発現するクローンを限界希釈法により生成し、さらに抗体生産および精製のために増殖した。本発明の抗体は、硫酸アンモニウム塩析、イオン交換、アフィニティ、逆相、疎水性相互作用カラムクロマトグラフィ、ゲル電気泳動法等を含んでなる、当分野の標準技法に従って精製した。
【００７３】
（実施例２：ＥＬＩＳＡ）
Ｃｏｓｔａｒ３３６６をコーティングしたマイクロタイタープレートを用いてＥＬＩＳＡを実施した（終夜、４℃、０．４μｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、またはＴＧＦ−β３）。次いでプレートを洗った後（２回）、ブロック液（洗浄バッファ中１０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）を加えた（１００μＬ）。Ｆａｂ希釈物を、コーティングしたウェル中でインキュベートした（１．５時間、２２℃）。洗浄後、抗ヒトカッパアルカリホスファターゼコンジュゲートを加えてインキュベートした（１時間、２２℃）。よく洗浄した後に比色試薬を加え、吸光度を測定した（Ａ５６０）。
【００７４】
別の例において、結合組成物を競合ＥＬＩＳＡで試験した。典型的には、抗体等の、抗体への結合において抗原と競合しうる化合物が、まず溶液中で抗体と結合し、次いで抗体と抗原の結合度を続いて測定する、溶液相アッセイを実施した。材料：カーボネートコーティングバッファ（５０ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６）。抗原：ＧＦ−β１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２４０−Ｂ／ＣＦ、２３９μｇ／ｍｌ）、ＴＧＦ−β２（ＲＤＩ、カタログ番号ＲＤＩ−１０３５、５０μｇ／ｍｌ）、およびＴＧＦ−β３（ＲＤＩ、カタログ番号ＲＤＩ−１０３６／ＣＦ、５０μｇ／ｍｌ）をコーティングバッファ中で０．４μｇ／ｍＬに希釈した。洗浄バッファ（０．０２Ｍトリス、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）および洗浄バッファに溶解したブロッキング液１０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａ−４５０３）。ポジティブコントロールに用いたタンパクは、マウス抗ヒトＴＧＦ−β１、−β２または−β３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１Ｄ１１）、マウス抗ヒトＴＧＦ−β２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＢＡＦ３０２）およびマウス抗ヒトＴＧＦ−β３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＢＡＦ２４３）であり、ブロックバッファ中１μｇ／ｍｌに希釈した。検出抗体コンジュゲートは、抗マウスカッパ−ペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号１０５０−０５）とした（ブロッキング液中での使用濃度１：２０００）。呈色反応試薬は、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）タブレット（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ−６９１２）を、試薬バッファ（０．１Ｍ  Ｎａ2ＨＰＯ4、０．０５Ｍクエン酸にてｐＨ５．０）に溶解した。ＯＰＤ使用溶液（すなわち１つの１９６ウェルプレートに対する体積）は、基質バッファ１２．５ｍＬに５ｍｇのＯＰＤタブレット１個を、次いで５μｌの３０％  Ｈ2Ｏ2を溶解し、それぞれのプレート発現前に都度作製した。プロトコル：１つの９６ウェルプレートを抗原（ＴＧＦ−β１、−β２または−β３、０．４μｇ／ｍｌ、ウェルあたり５０μｌ分注）でコーティングし、テープで封入して貯蔵した（１６−２０時間、４℃）。プレートを洗浄バッファ中で洗浄（２回）した後、ブロッキング液（各ウェル１００μＬ、洗浄バッファ中１０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）を加えた。インキュベート（約１時間、−２２℃）後、プレートを洗浄バッファで洗浄（２回）し、次いで１００μＬの試料（バッファ希釈）または参照（ＰＢＳ希釈）のいずれかを各ウェルに加えてインキュベートした（１．５時間、−２２℃）。インキュベート後、プレートを洗浄バッファで洗浄（６回）し、次いで抗マウスカッパ−ペルオキシダーゼコンジュゲート（ブロッキング溶液中１：２０００に希釈）またはＳＡ−ＨＲＰ（ブロッキング溶液中１：１００００に希釈）のいずれかを加えた（１００μＬ／ウェル）。被検試料をインキュベートし続け（１時間、−２２℃）た後、ＯＰＤ基質をウェルあたり１００μＬ加えた。呈色が現れた後（約１０分）、４９０ｎｍの吸光度で９６ウェルプレートを測定した。
【００７５】
（実施例３：Ｆａｂｓの速度定数）
ＫｉｎＥｘＡ３０００（Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔ．  Ｉｎｃ．）で結合速度を測定した。端的には、抗原をアズラクトンビーズに共有結合させ、本発明を含まないＦａｂのビーズへの結合を計測機器で検出した。Ｋd測定のため、減少方向に順次希釈した抗原（０−２５０ｎＭ）を有する２０ｐＭ  Ｆａｂ（抗体として２００ｐＭ）を含むそれぞれの試験管を、インキュベート（１−６日、−２５℃、１％ＢＳＡ、０．０２％アジドおよび０．０１％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳ中）した。インキュベート後、平衡化した各試料中のフリーのＦａｂを、製造メーカーの取扱説明書に従いＫｉｎＥｘａ３０００で計測した。Ｋd値は、ＫｉｎＥｘａ３０００ソフトウェアを用いて決定した。ｋon測定のため、２ｎＭのＦａｂそれぞれを、製造メーカーの取扱説明書に従い、注入法を用いて０−２４０ｎＭの抗原と混合し、未結合のＦａｂを検出した。結果のデータを、ＫｉｎＥｘａ３０００ソフトウェアでのｋonの計算に用いた。ｋoffは、式Ｋd＝ｋoff／ｋonを用いて算出した。以下の表１に、ＴＧＦベータ１に結合する態様のＦａｂに対してＫｉｎＥｘＡ（著作権）条件下で得られたアフィニティのデータを示す。
【表１】
2009521496.tif 000002
同様の、ＴＧＦ−β２のアフィニティ結合に対するＫｉｎＥｘＡ（著作権）条件下でのＦａｂデータでは、Ｋd＜３５ｐＭを示した。
【００７６】
（実施例４：抗体の速度定数）
速度定数測定の別法も知られている。例えば、ＴＧＦ−β１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２４０−Ｂ／ＣＦ）、ＴＧＦ−β２（ＲＤＩ、カタログ番号ＲＤＩ−１０３５）、およびＴＧＦ−β３（ＲＤＩ、カタログ番号ＲＤＩ−１０３６／ＣＦ）に対する本発明抗体のアフィニティはＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）２０００により測定される。本発明の全長モノクローナル抗体に対する結合アフィニティ測定は、Ｂｉａｃｏｒｅを用いて計測した。記載を除き、全ての試薬および機器はＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）ＡＢ（Ｕｐｓａｌａ、スウェーデン）から購入した。全ての測定は室温で行った。試料は、ＨＢＳ−ＥＰバッファ（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％（ｗ／ｖ）界面活性剤Ｐ−２０および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）に溶解した。組み換えタンパクＡを、アミン結合キットを用い、４００−４５０反応ユニット（ＲＵ）のレベルで、ＣＭ４センサーチップの４フローセル全てに固定した。複数の分析サイクルを用いて結合を評価した。各サイクルは、５０μＬ／分のフローレートで次のステップを含めて実施した：０．５μｇ／ｍＬ抗体を１２μＬ注入、ＴＧＦ−β１を２５０μＬ注入（各サイクル５ｎＭで開始し、０．１３ｎＭまで順次２倍希釈、各濃度で２回注入）した後、短時間（５分）または長時間（１２０分）のいずれかで解離、１０ｍＭグリシン塩酸塩、ｐＨ１．５、５０μＬを２回注入して再生。サイクルあたりの会合および解離速度は、ｋonおよびｋoff速度定数を抽出するためのＣｌａｍＸＰ（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｕｎｉｖ．ｏｆ  Ｕｔａｈ）を用いる単純会合モデルでバイオセンサーのデータをフィッティングすることにより求め、平衡結合定数Ｋdを、Ｋd＝ｋoff／ｋonから算出した。
【００７７】
本発明の全長モノクローナル抗体は、標準の方法を用い、ＩｇＧ４  Ｆｃ領域に動作可能に結合したＦａｂにより構築した：ｍＡｂ  ３．Ａ（配列番号７６の軽鎖および配列番号７７の重鎖を含んでなる）；ｍＡｂ  ４．１７（配列番号８４の軽鎖および配列番号８５の重鎖）；ｍＡｂ  １２．４（配列番号７８の軽鎖および配列番号７９の重鎖）；ｍＡｂ  １２．７（配列番号８０の軽鎖および配列番号８１の重鎖）；並びに、ｍＡｂ  １２．８（配列番号８２の軽鎖および配列番号８３の重鎖）。上述のアッセイを用いてｍＡｂを測定した結果を、下記の表２に示す。
【表２】
2009521496.tif 000003
【００７８】
（実施例５：特異性）
ＢＩＡｃｏｒｅは、潜在的形態のＴＧＦ−β１、−β２および−β３等の、物質に対する抗体の特異性の試験に用いた。全ての測定は室温で実施した。試料をＨＢＳ−ＥＰバッファ（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％（ｗ／ｖ）界面活性剤Ｐ−２０および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）に溶解した。組み換えタンパクＡを、アミン結合キットを用い、４００−４５０反応ユニット（ＲＵ）のレベルで、ＣＭ４センサーチップの４フローセル全てに固定した。複数の分析サイクルを用いて結合を評価した。各サイクルは、１００μＬ／分のフローレートで次のステップを含めて実施した：１μｇ／ｍＬの抗体結合組成物を１５μＬ注入、５ｎＭ  ＴＧＦ−β１、５ｎＭ潜在的ＴＧＦ−β２、または５ｎＭ  ＴＧＦ−β３のいずれかを２５０μＬ注入した後、短時間（５分）解離させ、１０ｍＭグリシン塩酸塩、ｐＨ１．５、５０μＬを２回注入して再生。抗体、次いでリガンドを捕獲後の信号量を、機器制御ソフトウェアを用いて計測した。信号は、捕獲したタンパクの質量に比例するので、捕獲したリガンドの化学量論が直ちに算出できる。このような条件下では、本発明の抗体に対するデータは、潜在的ＴＧＦアイソフォームの特異的結合を顕著には示さなかった。
【００７９】
（実施例６：ＨＴ−２セル中和アッセイ）
抗体のＴＧＦ−β生物活性中和能の試験には、Ｔｓａｎｇら（１９９５年、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、７巻、３８９−９７ページ）のＨＴ−２細胞増殖アッセイを用いうる。ＨＴ−２アッセイは、ＩＬ−４依存ＨＴ２セルラインの細胞増殖を抑制および／または顕著に減少させることにより、ＴＧＦ−βの生物活性における抗体の中和特性を評価する。端的には、ＨＴ−２セルはＩＬ−４により投与量依存的に増殖するが、ＴＧＦ−βによりアポトーシスが起きる。ＴＧＦ−βの増殖抑制は、抗ＴＧＦ−β抗体の添加により阻止される。ヒトＨＴ−２セルは、ＩＬ−４に応答して増殖するが、ＴＧＦ−β１、−β２または−β３はＩＬ−４誘発性の増殖を抑制する。よって、ＩＬ−４誘発性のＨＴ−２セルに対するＴＧＦ−βの通常抑制効果を抗体が妨害するならば、抗体には中和作用がある。従って、細胞増殖を抑制する量のＴＧＦ−β１、−β２または−β３を含んでなるＨＴ−２セル混合物に、ＴＧＦ−β１、−β２および−β３に特異的に結合する組成物の十分な量を添加するならば、ＩＬ−４誘発性の細胞増殖は制約なく進行するはずである。投与量応答性の中和能試験は、特定のＴＧＦ−βアイソフォームおよびＩＬ−４増殖シグナルの存在下でＨＴ−２アッセイを用いて行った。
【００８０】
細胞増殖度は、市販の細胞増殖アッセイ（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ社製ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）を用いて計測した。ＨＴ−２セルは、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン（それぞれ１００Ｕ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌ）、５０μＭベータメルカプトエタノールおよび１０ｎｇ／ｍｌ  ｈＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補給したＲＰＭＩ  １６４０中に維持した。セルは、Ｊｏｕｖａｎ  ＣＲ４２２遠心分離器にて１０００ＲＰＭで遠心分離し、ＰＢＳで再懸濁した。ＰＢＳで洗浄（２回）後、セルを最終的に再懸濁した（Ａｓｓａｙ  Ｍｅｄｉａ（２％  ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン（それぞれ１００Ｕ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌ）、５０μＭベータメルカプトエタノールを補給した、フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ  １６４０）中、０．１５×１０6セル／ｍｌ）９６ウェルプレートの各ウェルに、Ａｓｓａｙ  Ｍｅｄｉａ中のセル５０μｌを加えた。種々の濃度の本発明の抗体を、組み換えＴＧＦ−β１、−β２または−β３（Ａｓｓａｙ  Ｍｅｄｉａ中３００ｐｇ／ｍｌ）と共にプレインキュベートした。３０分プレインキュベートした後、ＴＧＦ−β／抗体の混合物５０μｌをＨＴ−２セルに加え、直ちに６．０ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ−４（最終２．０ｎｇ／ｍｌ）を含むＡｓｓａｙ  Ｍｅｄｉａ  ５０μｌを加えた。Ａｓｓａｙ  Ｍｅｄｉａでインキュベート（２０−４８時間、加湿、５％ＣＯ2大気中、３７℃）した後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ）３５μｌを加えた。さらにインキュベート（２−３時間、上述同様）した後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）比色アッセイ（４９０ｎｍの吸光量により測定されるホルマザン生成物量は直接的に生存細胞数に比例する）を用い、ＥＬＩＳＡプレート上、４９０ｎＭにおける分析によりアッセイを定量した。１Ｄ１１．１６、すなわちＡＴＣＣ−ＨＢ９８４９と比較して、本発明の抗体は、表３に示すように、ＴＧＦ−β１、−β２および−β３誘発性細胞死の中和および中和能の改善を示した（例えば、ＩＣ５０＜０．１ｍｇ／ｍＬまたは＜１２５ｐＭ）。
【表３】
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【００８１】
（実施例７：異種移植中和アッセイ）
ＴＧＦ−βリガンドは、ＴＧＦ−βＲＩおよびＴＧＦ−βＲＩＩ受容体に結合すると、Ｓｍａｄ−２タンパクがリン酸エステル化して下流に癌等の生物学的作用を生じる、情報伝達カスケードを活性化する。
Ｓｍａｄ２リン酸エステル化の抑制および／または有意の減少は、転写活性を介するＴＧＦ−βの生物活性を中和することが証明された（例えば、Ｌｉら、２００５年、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｓｕｒｇ．、２９巻、３号、３０６−１１ページを参照）。抗体のインビボでの中和の有効性を評価するため、異種移植モデルおよび／または複数の臓器または組織中において、本発明の抗体に曝露した後の、例えば癌等の細胞増殖性症状における中和有効性の証拠を提供する、リン酸−Ｓｍａｄ２レベルを求めた。インビボの有効性試験は、高度に血管化したＵ８７ＭＧヒト腫瘍異種移植モデルを用いるｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｍａｄ２阻害度測定アッセイ（Ｐｌｏｗｍａｎら、１９９７年、"Ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｍｏｄｅｌｓ"、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｇｕｉｄｅ、  Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ，  ａｎｄ  Ａｐｐｒｏｖａｌ、  Ｔｅｉｃｈｅｒ  Ｂ編集、１０１−２５ページ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、米国ニュージャージー州、を参照）により行った。雌性胸腺欠損ｎｕ／ｎｕヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、約２２−２４ｇ）を検疫および維持（７日、随時食事および水）した後、実験操作した。サブコンフルエント状態のヒトＵ８７ＭＧグリオブラストーマ細胞（腫瘍成長用Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１：１ｖ／ｖ）混合培地０．２ｍｌ中、約５×１０6／動物）を脇腹注射（ｓ．ｃ．）して、試験を開始した。次いで、腫瘍体積が約３００ｍｍ3に達するまで異種移植をモニターし、次いで動物はランダムに治療グループ（１０／グループ）に分割して投与を開始した。２週間の投与期間中に週２回（ｑ４ｄ）、食塩水ビヒクル中の種々の投与量（例えば、１、１０、１００μｇ／動物）でｍＡｂ  １２．７を投与（ｉ．ｐ．）した時を、腫瘍インプラント後治療の開始とした。食塩水およびヒトＩｇＧ４参照（１００μｇ）を平行して投与した。最終投与の４８時間後に動物を屠殺し、腫瘍および肺試料を収集し、液体窒素で急速凍結した。引き続き、リン酸化または全Ｓｍａｄ２に対する抗体を用いるＥＬＩＳＡにより、Ｓｍａｄ２リン酸化を分析するため、試料を粉砕溶解した。心臓穿刺を行い、ＥＤＴＡ処理チューブで血液も収集した。血液試料を遠心分離（８００ｒｐｍ、４℃、３０分；次いで３０００ｒｐｍ、４℃、１０分）して血漿試料を得て、分析まで貯蔵した（−８０℃）。ＪＭＰ５．１（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を用いてＳｍａｄ２リン酸エステル化の統計的比較を実施した。参照と共に一方向ＡＮＯＶＡおよびＤｕｎｎｅｔｔテストも用いた。本発明の組成物での処理により誘発されるターゲットの抑制を評価するために、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｍａｄ２レベルを試験した。組織サイズおよびプロセス取り扱いによる分散を最小化するため、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｍａｄ２レベルを全Ｓｍａｄ（または全タンパク）に対して正規化した。このＵ８７ＭＧ異種移植モデルのデータは、投与量依存性のＳｍａｄ２リン酸エステル化抑制を示し、細胞増殖におけるＴＧＦ−βの作用の調節における、インビボでの中和能を示している。データは１０μｇの投与���がＳｍａｄ２リン酸エステル化を６０％（ｐ＝０．０１５）抑制することを示し、１００μｇの投与では７２％抑制（ｐ＜０．０００１）された。さらに、本発明の組成物の１００μｇの投与において、肺組織ではＳｍａｄ２リン酸エステル化における７５％の抑制（ｐ＜０．００１）が認められた。リン酸−Ｓｍａｄ２レベルの投与量に依存する減少（全Ｓｍａｄ（Ｔ−Ｓｍａｄ）に対する相対値）および、肺組織におけるリン酸−Ｓｍａｄ２レベルの減少（１００μｇ投与）もあった。リン酸−Ｓｍａｄ２レベルを全Ｓｍａｄレベルまたは全Ｓｍａｄ（ｔＳｍａｄ）の平方根で正規化すると同様のデータが得られることから、腫瘍成長抑制の割合が本発明の結合組成物の投与量の増大に相関することがさらに示された。
【００８２】
配列表
配列番号１は成熟型ヒトＴＧＦ−β１鎖のアミノ酸配列である。
配列番号２は成熟型ヒトＴＧＦ−β２鎖のアミノ酸配列である。
配列番号３は成熟型ヒトＴＧＦ−β３鎖のアミノ酸配列である。
配列番号４は本発明の抗体のＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列である。
配列番号５は本発明の抗体のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列である。
配列番号６は本発明の抗体のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列である。
配列番号７は本発明の抗体のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列である。
配列番号８は本発明の抗体のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列である。
配列番号９は本発明の抗体のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列である。
配列番号１０は本発明の抗体のＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列である。
配列番号１１は本発明の抗体のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列である。
配列番号１１は本発明の抗体のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列である。
配列番号１３は本発明の抗体のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列である。
配列番号１４は本発明の抗体のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列である。
配列番号１５は本発明の抗体のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列である。
配列番号１６はヒトＨＣＶＲ  ＦＲ１フレームワークのアミノ酸配列である。
配列番号１７はヒトＨＣＶＲ  ＦＲ２フレームワークのアミノ酸配列である。
配列番号１８はヒトＨＣＶＲ  ＦＲ３フレームワークのアミノ酸配列である。
配列番号１９はヒトＨＣＶＲ  ＦＲ４フレームワークのアミノ酸配列である。
配列番号２０はヒトＬＣＶＲ  ＦＲ１フレームワークのアミノ酸配列である。
配列番号２１はヒトＬＣＶＲ  ＦＲ２フレームワークのアミノ酸配列である。
配列番号２２はヒトＬＣＶＲ  ＦＲ３フレームワークのアミノ酸配列である。
配列番号２３はヒトＬＣＶＲ  ＦＲ４フレームワークのアミノ酸配列である。
配列番号２４はヒト重鎖定常領域アミノ酸配列である。
配列番号２５は別のヒト重鎖定常領域アミノ酸配列である。
配列番号２６はヒト軽鎖定常領域アミノ酸配列である。
配列番号２７−５０は本発明の特定の抗体のヒト化軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）アミノ酸配列である。
配列番号５１−７５は本発明の特定の抗体のヒト化重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）アミノ酸配列である。
配列番号７６−８５は本発明の特定の抗体のヒト化重鎖及び軽鎖（ＨＣ及びＬＣ）アミノ酸配列である。
配列番号８６−８７は本発明の特定の抗体のヒト化重鎖及び軽鎖（ＨＣ及びＬＣ）アミノ酸配列である。
配列番号８８−１０２は本発明の好適な抗体の重鎖及び軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列である。
配列番号１０３−１１２は本発明の好適なＬＣＶＲ及びＨＣＶＲをコードするＤＮＡ配列である。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】ＡおよびＢは、それぞれ本発明の好適な抗体の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。ＣＤＲ領域を太字で示す。
【図２】ＡおよびＢは、それぞれ本発明の好適な抗体のＣＤＲ領域のアミノ酸配列の配列比較を示す。差異を太字および下線で示す。
【図３】本発明のモノクローナル抗体、すなわちｍＡｂ１２．７の軽鎖および重鎖アミノ酸配列を列挙する。
【図１】
2009521496.tif 000005
【図２】
2009521496.tif 000006
【図３】
2009521496.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成20年8月21日(2008.8.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2009521496000001.app
【国際調査報告】
2009521496.tif 000008
2009521496.tif 000009
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