(57)【要約】  本発明は、Ｂｅｔ  ｖ１特異的抗体またはそのフラグメント、ならびにアレルギー誘導性疾患の予防および処置におけるこれらの使用に関する。上記抗体は、Ｂｅｔ  ｖ１に対するＩｇＥの結合をブロックする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体の受動免疫についての医薬を製造するための、抗体またはその誘導体の使用であって、
該医薬は、該個体においてカバノキ花粉アレルゲンへの曝露によって引き起こされたアレルギー反応を予防および／または処置するための医薬であり、
該抗体は、アミノ酸３０〜５９（配列番号１）またはアミノ酸７５〜１０４（配列番号２）を含んでいるＢｅｔ  ｖ１フラグメントに結合する
ことを特徴とする、使用。
【請求項２】
前記抗体が、ＩｇＧ抗体、特にＩｇＧ１アイソタイプまたはＩｇＧ４アイソタイプのＩｇＧ抗体である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記抗体がマウス抗体である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記抗体がキメラ抗体である、請求項１または３に記載の使用。
【請求項５】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用であって、
前記抗体が、ブタペスト条約の下で２００６年５月９日にＤＳＭＺに寄託された、受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２７８２、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７８３、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７８５、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７８４、およびＤＳＭ  ＡＣＣ２７８６によって示されるハイブリドーマによって分泌されるモノクローナル抗体である
ことを特徴とする、使用。
【請求項８】
アミノ酸３０〜５９（配列番号１）またはアミノ酸７５〜１０４（配列番号２）からなるＢｅｔ  ｖ１フラグメントに結合する、抗体またはその誘導体。
【請求項９】
ＩｇＧ抗体、特にＩｇＧ１アイソタイプまたはＩｇＧ４アイソタイプのＩｇＧ抗体である、請求項８に記載の抗体またはその誘導体。
【請求項１０】
マウス抗体である、請求項８または９に記載の抗体またはその誘導体。
【請求項１１】
キメラ抗体である、請求項８または１０に記載の抗体またはその誘導体。
【請求項１２】
ヒト化抗体である、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の抗体またはその誘導体。
【請求項１３】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の抗体またはその誘導体。
【請求項１４】
請求項８〜１２のいずれか１項に記載の抗体またはその誘導体であって、
前記抗体が、ブタペスト条約の下で２００６年５月９日にＤＳＭＺに寄託された、受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２７８２、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７８３、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７８５、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７８４、およびＤＳＭ  ＡＣＣ２７８６によって示されるハイブリドーマによって分泌されるモノクローナル抗体である
ことを特徴とする、抗体またはその誘導体。
【請求項１５】
請求項８〜１４のいずれか１項に記載の抗体を含んでいる、ワクチン処方物。
【請求項１６】
筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与または粘膜投与のために適合される、請求項１５に記載のワクチン処方物。
【請求項１７】
配列番号３〜２９８からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含んでいる、核酸分子。
【請求項１８】
請求項１７に記載の核酸分子によってコードされる、ポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１８に記載のポリペプチドを含んでいる、抗体またはそのフラグメント。
【請求項２０】
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなる群より選択される免疫グロブリンである、請求項１９に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項２１】
請求項１８または１９に記載の抗体またはそのフラグメントであって、
該フラグメントが、免疫グロブリンの定常領域、免疫グロブリンの可変領域、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ（ｄｓＦｖ）、Ｆａｂ、またはこれらの組合せである
ことを特徴とする、抗体またはそのフラグメント。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、抗体、ならびにアレルゲンによって誘導される疾患の処置および予防のための薬学的処方物に関する。
【０００２】
約１億人のアレルギー患者が、カバノキ（Ｂｅｔｕｌａ  ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）の花粉アレルゲンであるＢｅｔ  ｖ１に感作している。Ｂｅｔ  ｖ１は１７ｋＤａのタンパク質であり、Ｆａｇａｌｅｓ目に属する樹木の花粉中に存在し、欧州、北米、ロシアおよびオーストラリアにおいて広く分布している（Ｂｒｅｉｔｅｎｅｄｅｒら、１９８９）。Ｂｅｔ  ｖ１をコードするｃＤＮＡが単離され（Ｂｒｅｉｔｅｎｅｄｅｒら、１９８９）、天然のＢｅｔ  ｖ１野生型に匹敵するリコンビナントＢｅｔ  ｖ１が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにて発現された。（Ｖａｌｅｎｔａら、１９９１；Ｆｅｒｒｅｉｒａら、１９９３）。樹木花粉および食品に対してアレルギーを示す患者のＩｇＥ抗体による、Ｂｅｔ  ｖ１の認識は、平均約９５％であり、その約６０％がＢｅｔ  ｖ１に対して排他的に感受性である（Ｊａｒｏｌｉｍら、１９８９）。このため、アレルゲンの認識は、コンフォーメーショナルなエピトープに依存し、よって、フォールディングされた分子を必要とする。これまでに行われた、インビトロおよびインビボでの広範囲での特徴付けのために、リコンビナントＢｅｔ  ｖ１分子は、しばしば、診断目的および治療目的に使用されることが提唱された（Ｖａｌｅｎｔａら、１９９５，１９９６）。近年、カバノキ花粉のメジャーアレルゲンの、非アナフィラキシー性の表面提示ペプチドが、生成され、インビボでの抗体応答（能動免疫）を誘導するに十分なサイズ（２５〜３２アミノ酸）を有するペプチドとして特徴付けられた。これらのペプチドは、フォールディングされておらず、アレルギーの活性を欠いている。しかし、ペプチドのワクチン接種は、Ｂｅｔ  ｖ１特異的ポリクローナルＩｇＧの産生を誘導した（Ｆｏｃｋｅら、２００４）。
【０００３】
ＷＯ９４／１０１９４は、Ｆａｇａｌｅｓ目の樹木に由来するペプチドに関する。
【０００４】
ＥＰ１２１９３００には、アレルギーの処置のための医薬を製造するためのアレルゲン誘導体の使用が記載されている。
【０００５】
本発明の目的は、カバノキ花粉アレルゲンであるＢｅｔ  ｖ１またはそのフラグメントによって引き起こされるアレルギー反応の処置および予防のための、手段および方法を提供することにある。
【０００６】
従って、本発明は、カバノキ花粉アレルゲンに曝露されたことによって個体において生じたアレルギー反応の予防および／または処置のための、個体の受動免疫についての医薬を製造するための、抗体またはその誘導体の使用に関する。ここで、この抗体は、アミノ酸３０〜５９（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．）１）またはアミノ酸７５から１０４（配列番号２）を含むＢｅｔ  ｖ１フラグメントに結合する。
【０００７】
驚くべきことに、上記Ｂｅｔ  ｖ１フラグメントに結合する抗体またはその誘導体は、カバノキ花粉アレルゲンＢｅｔ  ｖ１に特異的に結合し得、このような分子を使用して、Ｂｅｔ  ｖ１特異的ＩｇＥのカバノキ花粉アレルゲンに対する結合をブロックし得る。本発明に係る抗体のエピトープに対する結合は、アレルゲンに対するＩｇＥの結合を低減、まさに完全に低減させる。上記エピトープは、Ｂｅｔ  ｖ１および／またはこのアレルゲンのコンフォメーショナルな改変体（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）の、ＩｇＥ結合主要部位の内部または非常に近接した部分に存在し、その結果、ＩｇＥエピトープまたはその一部が、もはやＩｇＥに接近し得ない。実験データは、異なるエピトープ特異性を有する、ペプチド特異的な２つの抗体の混合物が、個々の抗体よりも強いＩｇＥ結合阻害をもたらさないことを示し、一方の抗体がアレルゲンのコンフォメーションを改変し、第２の抗体（すなわちＩｇＥ）がこのアレルゲンに結合することを阻害するということを実証している。
【０００８】
抗体の産生のために、種々の宿主動物が、Ｂｅｔ  ｖ１抗原またはそのフラグメント、特に、アミノ酸３０〜５９（配列番号１）またはアミノ酸７５〜１０４（配列番号２）からなるＢｅｔ  ｖ１フラグメントを注入することによって免疫化され得る。このような宿主動物としては、例えば、ブタ、ウサギ、マウス、ヤギ、およびラットが挙げられ得る。最も好ましくは、ヒト個体からポリクローナル抗体が単離される。このような抗体の使用は、免疫系が、「外因性の」抗体に由来する抗原に応答する危険性を低減させる。抗体は、これらの動物の血清から単離され得る。
【０００９】
本発明に係る抗体は、静脈内、筋肉内、皮下、および局所投与のために処方され得、このような処方物を得るためのプロトコルは、当業者に公知である。
【００１０】
もちろん、本発明に係るＢｅｔ  ｖ１フラグメントに対する抗体を、Ｂｅｔ  ｖ１アレルゲンに曝露されたヒト個体から単離することもまた可能である。Ｂｅｔ  ｖ１特異的抗体の、ヒト個体からの単離は、当該分野において公知の方法によって達成され得る。
【００１１】
本明細書中で使用される場合、「抗体」は、インタクトな免疫グロブリンまたはそのフラグメントをいう。このようなフラグメントは、例えば、種々のペプチダーゼで消化して生成されるか組換え的に生成される。もちろん、他のタンパク質もしくはそのフラグメントに融合された、免疫グロブリンの抗原結合領域を含む分子もまた、本発明に係る抗体であることが企図される。「抗原結合領域」は、免疫グロブリン分子の一部をいい、抗原結合を担う。抗原結合領域は、重鎖または軽鎖のＮ末端可変領域のアミノ酸残基によって形成される。よって、用語「抗体」は、（例えば、抗体の、ヒンジ領域におけるジスルフィド結合以下をペプシン消化によって生成されたか、または組換え技術によって生成された）Ｆａｂ、単鎖抗体（単一のポリペプチド鎖として存在する抗体）、より好ましくは、単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）（ここで、重鎖可変領域および軽鎖可変領域が一緒に連結されて（直接的にか、またはペプチドリンカーを介して）連続的なポリペプチドが形成されている。）、キメラ分子、ヒト化分子などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１２】
本発明に係る抗体はまた、組換えＤＮＡ技術、酵素学的などによって化学的に改変され、例えば、「技術的に改変された抗体」を生じている誘導体を包含する。「技術的に改変された抗体」としては、例えば、合成された抗体、キメラ抗体もしくはヒト化抗体、またははこれらの混合物、あるいは、定常領域を部分的または全体的に欠如した抗体フラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ）’２など）が挙げられるがこれらに限定されない。これらの技術的に改変された抗体において、例えば、軽鎖および／または重鎖の一部が置換され得る。このような分子は、例えば、ヒト化された重鎖および改変されていない軽鎖（またはキメラ軽鎖）、あるいはヒト化された軽鎖および改変されていない重鎖（またはキメラ重鎖）からなる抗体を含み得る。用語Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ）２は、先行技術（Harlow E. and Lane D., in "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）に記載されているように使用される。この意味において、抗体の「誘導体」は、本発明に係る抗体全長が関与する機能的活性の１つ以上を含んでいる、タンパク質分解された分子をいう。よって、本発明に係る抗体誘導体は、アミノ酸３０〜５９（配列番号１）またはアミノ酸７５〜１０４（配列番号２）を含むＢｅｔ  ｖ１フラグメントに結合し得る。本発明に係る抗体はまた、任意のタイプの分子が抗体に共有結合されることによって改変されている誘導体を含む。抗体誘導体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解的な消化、細胞性リガンドもしくは他のタンパク質への連結などによって改変された抗体を含むが、これらに限定されない。多くの化学的改変のいずれかが、公知の技術によって実施され得る。このような技術としては、特異的化学的消化、アセチル化、ホルミル化、チュニカマイシンの代謝的な合成などが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、誘導体は、非古典的アミノ酸を１つ以上含み得る。本発明に係る誘導体はまた、アミノ酸３０〜５９（配列番号１）またはアミノ酸７５〜１０４（配列番号２）を含むＢｅｔ  ｖ１フラグメントになお結合し得るフラグメント（例えば、本発明に係る抗体のＣＤＲ領域）を含み得る。
【００１３】
本発明に係る抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。このような抗体は、
特定の抗原に対する抗体の同種集団であり、細胞株の連続培養によって抗体分子の産生のために提供される任意の技術によって取得され得る。これらの技術としては、例えば、Koehler and Milsteinのハイブリドーマ技術（1975, Nature 256: 495-497 and U.S. Pat. No. 4,376,110）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72; Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030）、およびEBV-ハイブリドーマ技術（Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc.,pp. 77-96）が挙げられる。このような抗体は、任意の免疫グロブリンクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびこれらの任意のサブクラス）であり得る。本発明に係る、ハイブリドーマが産生するｍＡｂは、インビトロまたはインビボで培養され得る。高力価の抗体のインビボでの産生は、現在好ましい産生方法である。もちろん、真核生物細胞、酵母、昆虫および植物細胞、ならびに植物における組換え技術によって、モノクローナル抗体が産生されることもまた可能である。モノクローナル抗体の、上記細胞からの単離のための、上記発現系および方法は、当該分野において周知である。本発明に係る、Ｂｅｔ  ｖ１フラグメントに対するモノクローナル抗体が、Ｂｅｔ  ｖ１アレルゲン全体に曝露された哺乳動物に発現することによって産生されたポリクローナル抗血清（例えば、Focke et al., 2004）と同様の阻害を示すことは、非常に驚くべきことである。特に、ポリクローナル抗体が通常１つよりも多くのエピトープに指向することを考慮すると、驚くべきことである。モノクローナル抗体の産生は、抗血清から得られるポリクローナル抗体よりも、より均質でありかつ純度が高く、そして再現性をもって生成物を導く。
【００１４】
Ｂｅｔ  ｖ１への曝露によって引き起こされたアレルギー疾患を処置および／または予防するために使用され得るモノクローナル抗体の産生に好適なペプチドの選択は些細なことではない。例えば、Lebeque et al. (1997)は、Ｂｅｔ  ｖ１に対して惹起した種々のモノクローナル抗体を用いて、Ｂｅｔ  ｖ１アレルゲンに対してアレルギーを示す患者からのＩｇＥの、Ｂｅｔ  ｖ１に対する結合に対する効果を検証した。これらの研究は、Ｂｅｔ  ｖ１アレルゲンの領域に対して産生される抗体の特異性を議論することなく、特定のモノクローナル抗体が、Ｂｅｔ  ｖ１に対するＩｇＥ結合を低減させるよりもむしろ増強することを示している。従って、本発明に係る抗体が、野生型Ｂｅｔ  ｖ１へのＩｇＥの結合を強く阻害することは、驚くべきことである。
【００１５】
本発明に係る抗体、および該抗体を含むワクチン処方物は、アレルギー反応を処置するために用いられるだけでなく、このような反応を予防するためや、Ｂｅｔ  ｖ１アレルゲンに対して個体を感受性にするために使用され得る。子供または新生児がカバノキ花粉に接触する前に、本発明に係る抗体またはワクチン処方物を用いて、これらの子供または新生児にワクチン接種することもまた可能である。このようなアプローチは、上記子供または新生児において、Ｂｅｔ  ｖ１特異的ＩｇＥ抗体を産生することを防止し、Ｂｅｔ  ｖ１に対して感受性になることを防止する。本発明に係る抗体を１〜３歳の子供に投与することは特に有利である。なぜなら、この年齢では、子供はカバノキ花粉アレルゲンに感作されていないからである。
【００１６】
本発明の好ましい実施形態において、抗体は、ＩｇＧ抗体であり、特に、ＩｇＧ１アイソタイプまたはＩｇＧ４アイソタイプのＩｇＧ抗体である。
【００１７】
Sellge et al.（Clin. Exp. Allergy (2005) 35: 774-781）は、肥満細胞または好塩基球を活性化する、より大きなアレルゲン凝集体の処方によって、Ｂｅｔ  ｖ１抗体に対するＩｇＧ抗体がアレルギー反応を増強されることを示している。Laffer et al. （J Immunol (1996) 157: 4953-4962）およびDenepoux et al. （FEBS letters (2000) 465: 39-46）に開示された実験によって、同様の結果が得られている。しかし、本発明に係る、Ｂｅｔ  ｖ１フラグメントに対するＩｇＧ抗体の使用は、これらの効果を示さなかった。従って、ＩｇＧ抗体は、本発明に従って使用され得る。
【００１８】
本発明に係る、より好ましい抗体は、ヒトＩｇＧ４またはマウスＩｇＧ４のような、非補体活性化抗体である。
【００１９】
本発明に係る抗体は、好ましくは、マウス抗体またはヒト抗体である。
【００２０】
本発明の別の実施形態において、抗体はキメラ抗体である。
【００２１】
「キメラ抗体」の産生のために開発された技術（Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81: 6851- 6855; Neuberger et al., 1984, Nature, 312: 604-608; Takeda et al., 1985, Nature, 314: 452-454）が使用され得る。これらの技術は、適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子からの遺伝子を、適切な生物学的活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子とともにスプライシングすることによる技術である。キメラ抗体は、異なる動物種、免疫グロブリンクラス、サブクラス（アイソタイプ）、タイプおよびサブタイプに由来する異なる部分から構成される一分子（例えば、マウスｍＡｂに由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する分子）である。さらに、本発明に係るキメラ抗体は、１つより多い特異性（例えば、ダイアボディまたはテトラボディ）を含み得る。
【００２２】
本発明に係る抗体は、好ましくはヒト化されている。
【００２３】
非ヒト抗体の、より免疫原性の低いフラグメントを生成する、「ヒト化」のための方法は周知である。ヒト化抗体は、抗原認識部位、すなわち、相補性を決定する超可変領域（ＣＤＲ）のみが非ヒト起源である抗体であり、可変ドメインの全てのフレームワーク領域（ＦＲ）がヒト遺伝子産物である。
【００２４】
非ヒト抗体は、当該分野において公知の方法のいずれかによってヒト化され得る。１つの方法において、非ヒトＣＤＲが、ヒト抗体または抗体フレームワークコンセンサス配列に挿入される。次いで、親和性または免疫原性を改変するために、さらなる変化が、抗体フレームワークに導入され得る。以下は、血清半減期を改善し、かつヒト宿主における免疫原性をより低くする（すなわち、ヒト抗体が非ヒト抗体に応答することを防ぐ）ために、カバノキ花粉アレルゲンのフラグメントに対するモノクローナル抗体を「ヒト化」することによって、ヒトにおける製薬としてこのモノクローナル抗体を改善するためのプロトコルである。ヒト化の原理は文献に記載されており、抗体タンパク質のモジュラー配置（modular arrangement）によって容易にされる。補体結合の可能性を最小化するために、ＩｇＧ１アイソタイプのヒト化抗体が好ましい。例えば、ヒト化のレベルは、目的の非ヒト抗体タンパク質の可変ドメインをヒト抗体分子の定常領域とともに含んでいるキメラ抗体を生成することによって達成される（例えば、Morrison et al., Adv. Immunol., 1989, 44, 65-92）。Ｂｅｔ  ｖ１特異的抗体の可変ドメインは、目的のハイブリドーマから単離されたｍＲＮＡから生成されたｃＤＮＡよりクローニングされ得る。可変領域遺伝子フラグメントは、ヒト抗体定常ドメインをコードするエクソンに連結され、生じた構築物は、適切な哺乳動物宿主細胞（例えば、骨髄腫細胞またはＣＨＯ細胞）において発現される。優れたレベルのヒト化を達成するために、非ヒトモノクローナル抗体遺伝子の、抗原に結合する相補性決定領域（「ＣＤＲ」）をコードする、可変領域遺伝子フラグメントの部分のみが、ヒト抗体配列中にクローニングされ得る（例えば、Jones et al., Nature, 1986, 321, 522-525, Riech-mann et al., Nature, 1988, 332, 323-327, Verhoeyen et al, Science, 1988, 239, 1534-36、およびTempest et al., Bio/Technology, 1991, 9, 266-71）。ＣＤＲ３領域を取り囲むβシートフレームワークもまた、元々のモノクローナル抗体の抗原結合ドメインの三次元構造をより密接に反映するように改変され得る（Kettle-borough et al., Protein Engin., 1991, 4, 773-783、およびFoote et al., J. MoI. Biol., 1992, 224, 487-499を参照のこと）。代替のアプローチにおいて、目的の非ヒトモノクローナル抗体の表面が、例えば、部位特異的変異誘発法によって、非ヒト抗体の選択された表面残基を変更する一方で、非ヒト化抗体の内部の全ておよび接触する残基をそのままにしておくことによってヒト化されている（Padlan, Molecular Immunol, 1991, 28, 489-98）。
【００２５】
本発明の別の局面は、Ｂｅｔ  ｖ１のフラグメントに結合する抗体またはそのフラグメントに関する。このＢｅｔ  ｖ１フラグメントは、アミノ酸３０〜５９（配列番号１）またはアミノ酸７５〜１０４（配列番号２）からなる。
【００２６】
本発明に係る抗体は、好ましくは、ブダペスト条約の下で、２００６年５月９日にＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Germany）に寄託されたハイブリドーマ（受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２７８２、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７８３、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７８５、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７８４、およびＤＳＭ  ＡＣＣ２７８６が付与されている）によって分泌されるモノクローナル抗体である。
【００２７】
本発明の別の局面は、本発明に係る抗体を含むワクチン処方物に関する。
【００２８】
本発明の抗体は、哺乳動物、特に、ヒトに、種々の方法にて投与するために処方され得る。いくつかの実施形態において、抗体は、滅菌水溶液または生物学的な体液（例えば、血清）の形態である。水溶液は、緩衝化されていても緩衝化されていなくてもよく、さらなる活性成分または不活性成分を有していてもよい。さらなる成分としては、イオン強度を調節するための塩、保存剤（抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤などを含むがこれらに限定されない。）、および栄養素（グルコース、デキストロース、ビタミンおよびミネラル）が挙げられる。あるいは、抗体は、固体形態にて投与のために調製され得る。抗体は、多くの不活性なキャリアまたは賦形剤（例えば、以下が挙げられるがこれらに限定されない：結合剤（例えば、微結晶セルロース、ガムトラガカントまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたはラクトース）；分散剤（例えば、アリジニン酸、プリモゲルまたはコーンスターチ）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）；滑剤（例えば、二酸化シリコンコロイド）；甘味料（例えば、スクロースまたはサッカリン）；または香味料（例えば、ペパーミントまたはサリチル酸メチル）と組み合わせられ得る。抗体またはその処方物は、その抗体を標的に送達するに効果的な任意の手段によって哺乳動物に投与され得る。このような手段としては、静脈内、筋肉内、皮下、経口、鼻腔内、経粘膜または経皮の投与形態が挙げられる。本発明に係る抗体またはワクチン処方物の局所投与が好ましい。リン酸緩衝化緩衝液（ＰＢＳ）が、注入可能な処方物、または鼻腔内投与され得る処方物に好ましいキャリアである。薬学的に有効な量の治療剤を得るための抗体の用量決定は、種々の因子に依存する。例えば、患者の年齢、感受性、耐性、および他の特徴が、用量に影響する。さらに、使用される抗体の血漿レベルおよび半減期ならびにこれらの認識部位についての親和性、ならびに他の因子が、効果的な用量のために考慮されることが必要である。本発明に係る抗体の全身性投与のために、約１ｍｇ／ｋｇ患者／日〜約５００ｍｇ／ｋｇ患者／日、好ましくは約５ｍｇ／ｋｇ患者／日〜約２５０ｍｇ／ｋｇ患者／日、より好ましくは約１０ｍｇ／ｋｇ患者／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ患者／日の範囲の用量が使用され得る。しかし、投与の簡便さおよびコスト効率のためには、これらの範囲における最低限の用量が好ましい。用量は、例えば、抗体の特定の血漿レベル（例えば、約０．０５〜２００μｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．１〜１００μｇ／ｍｌ）を提供するために、そしてこのレベルを（例えば、一定期間、または臨床的な結果が得られるまで）維持するために、調整され得る。より緩やかに清浄化されることが期待されるキメラ抗体およびヒト化抗体は、効果的な血漿レベルを維持するためにより少ない用量が求められる。また、Ｂｅｔ  ｖ１フラグメントに対する高親和性を有する抗体は、好ましくは、より低い親和性の抗体よりも、低頻度または低用量で投与される。抗体の治療的に有効な用量が、処置の経過の間、アレルギー反応の低減を示すことによって決定され得る。好ましくは、本発明にかかるワクチン処方物および医薬は、花粉の季節の１週間前または２週間前までに個体に投与される。
【００２９】
ワクチン処方物は、好ましくは筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与または経粘膜投与に適合される。
【００３０】
本発明に係る処方物は、種々の方法で投与され得る。ここで、筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与または経粘膜投与が好ましい。アミノ酸３０〜５９（配列番号１）またはアミノ酸７５〜１０４（配列番号２）からなるＢｅｔ  ｖ１フラグメントに特異的に結合する抗体は、カバノキ花粉アレルゲンＢｅｔ  ｖ１によって引き起こされるアレルギー反応を処置または予防するために個体に投与され得る。特に、本発明に係る抗体の経粘膜投与が、伝統的な免疫化レジメンよりも多くの利点を有している。これらの中で最良の事項は、気道の局所的な粘膜免疫系をより効果的に刺激することであり、ワクチン取込み率が増加する見込みである。なぜなら、注射に関する恐怖や不安が避けられるからである。本発明に係る、アレルゲンに結合する抗体の使用は、アレルゲンに対するＩｇＥの結合を阻害することによってアレルギー反応に対抗することを補助し得る。この阻害の結果として、アレルゲンとの接触の際に正常に増加するＩｇＥ産生が低減され得る。
【００３１】
本発明の別の局面は、配列番号３〜２９８からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。
【００３２】
配列番号３〜２９８のヌクレオチド配列は、単独でＢｅｔ  ｖ１に結合し得るＩｇＥ分子の可変領域をコードする（すなわち、Ｂｅｔ  ｖ１アレルゲンに結合するポリペプチドをコードする）ｍＲＮＡに由来する。
【００３３】
本発明の別の局面は、配列番号３〜２９８からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされるポリペプチドに関する。
【００３４】
本発明のなお別の局面は、配列番号３〜２９８からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされるポリペプチドを含む、抗体またはそのフラグメントに関する。
【００３５】
本発明に係るポリペプチドおよび核酸分子は、抗体またはそのフラグメントに（例えば、分子生物学的な方法によって）含有され得、その結果、該抗体またはそのフラグメントは、例えば、Ｂｅｔ  ｖ１に対する受動免疫のために使用され得る。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態において、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなる群より選択される免疫グロブリンである。
【００３７】
本発明の別の好ましい実施形態において、フラグメントは、面系グロブリンの定常領域、面系グロブリンの可変領域、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ（ｄｓＦｖ）、Ｆａｂ、またはこれらの組合せである。
【００３８】
本発明は、以下の実施例および図面によってさらに例証されるが、これらに限定されない。
【００３９】
図１は、実験設計を示す。２群のＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝４／群）を、ｒＢｅｔ  ｖ１／Ａｌ（ＯＨ）３を用いて、１日目、１４日目および２８日目にｉ．ｐ．で感作した。３６日目に血液を回収した（抗血清）。同日に、第一群は、ｒＢｅｔ  ｖ１特異的ＩｇＧを用いてｉ．ｐ．にて注入し、第二群は、無関係のアレルゲン（Ｐｈｌｐ５）についてのＩｇＧを得た。２４時間後（３７日目）に、血液を回収した（後血清）。
【００４０】
図２は、ｒＰｈｌ  ｐ５特異的ＩｇＧ抗体による、β−ヘキソサミニダーゼの放出の阻害を示す。漸増濃度のｒＰｈｌ  ｐ５（０．０２μｇ／ｍｌ〜０．５μｇ／ｍｌ）を、マウス抗血清および後血清とともに予めインキュベートし、ＲＢＬ細胞に曝露し、そしてβ−ヘキソサミニダーゼの放出を測定した。β−ヘキソサミニダーゼの放出を、β−ヘキソサミニダーゼの総放出量のパーセントとして示した。
【００４１】
図３は、ｒＢｅｔ  ｖ１特異的ＩｇＧ抗体によるβ−ヘキソサミニダーゼの放出の阻害を示す。漸増濃度のｒＢｅｔ  ｖ１（０．０２μｇ／ｍｌ〜０．５μｇ／ｍｌ）を、マウス抗血清および後血清とともに予めインキュベートし、ＲＢＬ細胞に曝露し、そしてβ−ヘキソサミニダーゼの放出を測定した。β−ヘキソサミニダーゼの放出を、β−ヘキソサミニダーゼの総放出量のパーセントとして示した。
【００４２】
図４は、Ｂｅｔ  ｖ１に結合し得るＩｇＥ可変領域をコードするＤＮＡ配列を示す。
【００４３】
〔実施例〕
〔実施例１：アレルゲンを特異的にブロックするＩｇＧ１抗体を分泌するハイブリドーマの生成および特徴付け〕
〔実施例１．１：アレルゲンをブロックするＩｇＧ１抗体を分泌するハイブリドーマの生成〕
リコンビナントのカバノキ花粉アレルゲンＢｅｔ  ｖ１をＥ．ｃｏｌｉに発現させて、既報（Hoffmann-Sommergruber et al., 1997）に記載されたように精製した。Applied Biosystems peptide synthesizer Model 433A（Foster City, CA, USA）でペプチドを合成した。キャリアへの結合を容易にするために、各合成ペプチドの元々の配列にシステイン残基を１つ付加している（Focke et al., 2004）。表１は、非アナフィラキシー性のＢｅｔ  ｖ１由来の合成ペプチドの特徴付けを要約した。
【００４４】
【表１】
2009537117.tif 000002
合成ペプチド（ペプチド２（配列番号１）、ペプチド６（配列番号２））を、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ；ＭＷ  ４．５×１０５〜１．３×１０７；Pierce, USA）に、製造業者のプロトコルに従って結合し、Conjugation Kit（Pierce）を用いて精製した。Ｂａｌｂ／ｃマウス（Charles River, Germany）を、Ａｌ（ＯＨ）３（７５μＬ／マウス）に吸着させたＫＬＨ結合ペプチド（３０μｇ／ｍＬ／マウス）で３回免疫した（表２）。血清中のアレルゲン特異的ＩｇＧ１の力価をＥＩＬＳＡによって決定した。
【００４５】
【表２】
2009537117.tif 000003
最終免疫の３日後に脾細胞を回収し、ハイブリドーマを、慣用的なハイブリドーマ技術（Koehler and Milstein, 1975）を若干改変した手順によって、ＨＡＴ感受性の、非分泌性ミエローマ細胞株X63Ag8.653（Kearney et al., 1979）を融合パートナーとして用いて惹起した。ミエローマを、Ｌ−グルタミン（２００ｍＭ）、１０％ＦＢＳ、ファンギゾン（２００Ｕ／ｍＬ）およびペニシリン／ストレプトマイシン（１００００Ｕ／ｍＬ）を補充したＲＰＭＩ１６４０からなるハイブリドーマ増殖培地中で、増殖させた。マウスの脾臓を、記載されているように除去し、細胞を、無血清ハイブリドーマ増殖培地中に懸濁した。１７５０ｒｐｍ（４℃で５分間）にて遠心分離した後、赤血球を、溶解緩衝液（８．３ｇ／Ｌ塩化アンモニウム、１．０ｇ／Ｌ二酸化カリウム、０．０３７ｇ／Ｌ  ＥＤＴＡ三ナトリウム（ｐＨ７．４））にて室温で２分間溶解し、１７５０ｒｐｍ（４℃で５分間）での遠心分離によって細胞を３回洗浄した。毎回、細胞ペレットを、無血清ハイブリドーマ増殖培地で緩やかに再懸濁した。次いで、生存可能な脾細胞およびミエローマ細胞（対数増殖期にある）を、２：１（脾細胞：ミエローマ）の割合で一緒に混合し、遠心分離した後に、１．５ｍＬの、予め暖めておいた（３７℃）４１．３％ｗ／ｖポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４０００を添加し、細胞ペレットを１分間緩やかに攪拌した。次いで、細胞を、８００ｒｐｍ（４℃で５分間）遠心分離し、フィーダー細胞を補充したＨＡＴ培地中に懸濁し、９６ウェルプレートに播種し、ＣＯ２インキュベータ（５％）中にて３７℃でインキュベートした。細胞を約２週間増殖させ、培養上清を酵素免疫アッセイにおける抗体産生についてスクリーニングした。
【００４６】
ＥＬＩＳＡプレートを、４℃で一晩のインキュベートによって、ＰＢＳで希釈したｒＢｅｔ  ｖ１（１０μｇ／ｍＬ）でコートした。ＰＢＥ−Ｔ（ＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）中０．５％ｗ／ｖＢＳＡで、３７℃で１時間ブロッキングした後、プレートを、希釈していないハイブリドーマ上清とともにインキュベートし、３７℃で２時間反応させた。検出のために、プレートを、１：１０００に希釈した一次抗体（精製したラット抗マウスＩｇＧ１）とともに、３７℃で２時間インキュベートし、１：２０００に希釈した酵素標識二次抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼが種特異的抗体全長に連結した抗ラットＩｇＧ）とともに、３７℃および４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション工程の間、プレートを、ＰＢＳ−Ｔで繰り返し洗浄した。最終的に、プレートを、ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）二アンモニウム塩（Sigma-Aldrich）とともに室温でインキュベートし、４０５ｎｍで吸光度を測定した。Ｂｅｔ  ｖ１に特異的なＩｇＧ１抗体ハイブリッドを分泌する細胞を、限定希釈法によってクローニングした。すなわち、陽性ハイブリドーマを拡張し、単一クローン性を確認するためにサブクローニングし、そして低温保存した。
【００４７】
〔実施例１．２：アレルゲンを特異的にブロックするＩｇＧ１抗体を分泌するハイブリドーマの特徴付け〕
ＥＬＩＳＡによって得られたモノクローナルＩｇＧ１抗体の結合特異性を詳細に特徴付けるために、マイクロタイタープレートを、ＰＢＳで希釈したｒＢｅｔ  ｖ１（５μｇ／ｍＬ）、ペプチド２（ａａ３０−５９）、ペプチド６（ａａ７５−１０４）、Ｂｅｔ  ｖ１トリマー、Ｂｅｔ  ｖ１フラグメント（ａａ１−７４）、Ｂｅｔ  ｖ１フラグメント２（ａａ７５−１６０）、ＫＬＨおよびｒＰｈｌ  ｐ１でコートした。ＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）中０．５％ｗ／ｖ  ＢＳＡを添加することによって、３７℃で１．５時間ブロッキングし、その後、希釈していないハイブリドーマ上清を添加して３７℃で２時間インキュベートした。ｍＡｂの特異的結合を、一次抗体、引き続く二次抗体（上述したように酵素標識した抗体）を用いて検出した。
【００４８】
カバノキ花粉アレルギー患者からの４４個の血清（総ＩｇＥレベル：２４．１→５０００ｋＵＡ／Ｌ；カバノキ花粉特異的ＩｇＥ：１０．７→１００ｋＵＡ／Ｌ）を、病歴に従って選択し、非アレルギー患者からの血清を、コントロール目的で含ませた。カバノキ花粉アレルギー患者群は、１９名の女性および２５名の男性（平均年齢３７歳（２１〜７０歳））からなる。表３は、選択されたカバノキ花粉アレルギー患者からの血清の特徴付けを要約する。
【００４９】
【表３】
2009537117.tif 000004
表６−９に示すように、個体を番号付けした。人口統計データは、阻害実験に用いられたカバノキ花粉アレルギー患者の性別および年齢を示す。血清学的な特徴付けは、総ＩｇＥ、カバノキ花粉特異的ＩｇＥおよびＲＡＳＴクラスを示す。ＮＳは、特定されていない。
【００５０】
ＥＬＩＳＡプレートを、ｒＢｅｔ  ｖ１（１μｇ／ｍＬ）を用いて４℃で一晩コートした。ＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）中０．５％ｗ／ｖのＢＳＡでブロッキングした後、プレートを、希釈していない、単一のクローン（クローン２（ＤＳＭ  ＡＣＣ２７８２）、クローン４（ＤＳＭ  ＡＣＣ２７８３）、クローン１０（ＤＳＭ  ＡＣＣ２７８５）、クローン１２（ＤＳＭ  ＡＣＣ２７８４）、クローン１３（ＤＳＭ  ＡＣＣ２７８６））および混合したクローン（クローン２およびクローン１３）、ＩｇＧ１抗体産生ハイブリドーマ培養上清を用いて、４℃で一晩プレインキュベートした。最終的に、プレートを１：５に希釈した、４４名のカバノキ花粉アレルギー患者からの血清とともにインキュベートし（４℃で一晩）、結合したＩｇＥ抗体を、１：１０００に希釈したアルカリホスファターゼ結合マウスモノクローナル抗ヒトＩｇＥ抗体で検出した。インキュベーション工程の間、ＰＢＳ−Ｔでプレートを繰り返し洗浄した。ＩｇＧ１モノクローナル抗体でのプレインキュベーションの後の、ｒＢｅｔ  ｖ１に対するＩｇＥ結合の阻害の割合（％阻害）を、以下のように算出した：％阻害＝１００−（ＯＤｐ×１００／ＯＤｎｐ）。ＯＤｐおよびＯＤｎｐは、それぞれ、ハイブリドーマ培養上清あり（ＯＤｐ）およびハイブリドーマ培養上清なし（ＯＤｎｐ）でのプレインキュベーション後の吸光度を示す。
【００５１】
〔実施例１．３：結果〕
融合した脾細胞のプレーティングおよびインキュベーションの後に、マイクロタイターウェルからの各上清を、上述したようにＥＬＩＳＡによって分析し、免疫反応性のハイブリドーマを単離した。さらに、陽性ハイブリドーマの増殖（propagation）は、１４個の、安定かつモノクローナルなペプチド特異的抗体の選択をもたらした。これらのモノクローナル抗体のそれぞれが、ＩｇＧ１アイソタイプに属し、κ軽鎖を発現している。表４は、得られたクローンのリストである。クローン２、４、１０、１２および１３を、ブダペスト条約の下で、２００６年５月９日にＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Germany）に寄託し、それぞれに受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２７８２（クローン２）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７８３（クローン４）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７８５（クローン１０）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７８４（クローン１２）、およびＤＳＭ  ＡＣＣ２７８６（クローン１３）が付与されている。
【００５２】
【表４】
2009537117.tif 000005
１４個のペプチド特異的抗体産生クローンを、ｒＢｅｔ  ｖ１、Ｂｅｔ  ｖ１ペプチドおよびＢｅｔ  ｖ１誘導体（例えば、Ｂｅｔ  ｖ１トリマー（共有結合した３つのＢｅｔ  ｖ１コピー（Vrtala et al., 2001）））、ならびに２つのｒＢｅｔ  ｖ１フラグメント（Ｂｅｔ  ｖ１のａａ１−７４（１）からなるフラグメントおよびａａ７５−１６０（２）からなるフラグメント（Vrtala et al., 2000））に対するそれぞれの結合特異性について、さらに試験した。さらに、ネガティブコントロール（例えば、ＫＬＨおよびｒＰｈｌ  ｐ１）に対する、上記モノクローナル抗体の結合を決定した。表５は、１４個のモノクローナル抗体の結合特性を要約している。１４個のペプチド特異的抗体のいずれもが、ＫＬＨまたはｒＰｈｌ  ｐ１に対する反応性を示さなかった。しかし、これらの全てが、ｒＢｅｔ  ｖ１およびＢｅｔ  ｖ１トリマーに対して強い反応性を示した。免疫原に従って、クラス番号１−１１は、ペプチド２（ａａ３０−５９）特異的抗体を産生し、ペプチド２に対する抗体反応性を示したが、ペプチド６（ａａ７２−１０４）とは反応し、一方、ペプチド６（ａａ７２−１０４）特異的抗体は、クローン番号１２−１３によって産生され、免疫原への結合を示したが、ペプチド２（ａａ３０−５９）に対して結合しなかった。Ｂｅｔ  ｖ１フラグメント１（ａａ１−７４）およびフラグメント２（ａａ７５−１０６）を用いたさらなる実験によって、ペプチド２特異的抗体（クローン１−１１）がフラグメント１（ａａ１−７４）に対する反応性を示したが、ペプチド６特異的抗体（クローン１２−１３）はフラグメント２（ａａ７５−１６０）に対する反応性を示した。
【００５３】
【表５】
2009537117.tif 000006
表６は、上記モノクローナル抗体が、Ｂｅｔ  ｖ１交差反応性アレルゲン（例えば、ハンノキ花粉からのメジャーアレルゲン（Ａｌｎ  ｇ１）またはリンゴからのメジャーアレルゲン（Ｍａｌ  ｄ１））に対する、アレルギー患者ＩｇＥの結合を阻害することを示している。
【００５４】
【表６】
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カバノキ花粉アレルギー患者からの血清についての、ＩｇＧ１  ｍＡｂ（クローン２、４、１０）を用いて得られた、完全なｒＢｅｔ  ｖ１に対するＩｇＥ結合の％阻害を示す。平均％阻害を表の下に示す。
【００５５】
４４名のカバノキ花粉アレルギー患者からの血清を用いて、ペプチド特異的抗体が、完全なｒＢｅｔ  ｖ１に対するアレルギー患者ＩｇＥの結合を阻害する能力を、ＥＬＩＳＡ相補実験によって決定した（表７−９）。患者ＩｇＥに曝露する前のｒＢｅｔ  ｖ１とのプレインキュベーションのために、全部で１４個のクローンのうち５つを選択した。ペプチド６（ａａ７５−１０４）特異的抗体を用いたプレインキュベーションの後にＩｇＥ結合が最も阻害されたことを観察した（クローン１２：６０．４％−７４．８％平均阻害；クローン１３；５８．５％−７２．６％平均阻害）。一方、ペプチド２（ａａ３０−５９）特異的抗体もまた、程度が低いとはいえ、ｒＢｅｔ  ｖ１に対する患者ＩｇＥ結合を阻害した（クローン２：４６．２％−６２．７％平均阻害；クローン４；４４．３％−５８．７％平均阻害；クローン１０；４１．０％−５２．４％平均阻害）。驚くことに、ペプチド２特異的モノクローナル抗体（クローン２）とペプチド６特異的モノクローナル抗体との混合物は、単一のモノクローナル抗体のみよりもＩｇＥ結合を強く阻害した（表７−９）。
【００５６】
【表７】
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１０名のカバノキ花粉アレルギー患者（ａ１−ａ１０）からの血清、およびコントロールとしての非アレルギー患者からの血清について、ＩｇＧ１  ｍＡｂ（クローン２、４、１０、１２、１３）を用いて得られた、完全なｒＢｅｔ  ｖ１に対するＩｇＥ結合の％阻害を示す。平均％阻害を表の下に示す。
【００５７】
【表８】
2009537117.tif 000009
３４名のカバノキ花粉アレルギー患者（ｂ１−ｂ３４）からの血清、およびコントロールとしての非アレルギー患者からの血清について、ＩｇＧ１  ｍＡｂ（クローン２、４、１０、１２、１３）を用いて得られた、完全なｒＢｅｔ  ｖ１に対するＩｇＥ結合の％阻害を示す。平均％阻害を表の下に示す。
【００５８】
【表９】
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１０名のカバノキ花粉アレルギー患者（ａ１−ａ１０）からの血清について、単一のＩｇＧ１  ｍＡｂ（クローン２、クローン１３）を用いて得られた、完全なｒＢｅｔ  ｖ１に対するＩｇＥ結合の％阻害を、ＩｇＧ１  ｍＡｂ混合物（クローン２／１３ｍｉｘ）による阻害と比較して示す。平均％阻害を表の下に示す。
【００５９】
アレルギー反応における重要な事象は、多価アレルゲンによるＩｇＥ抗体が結合したエフェクター細胞の架橋である。これにより、顆粒のエキソサイトーシスおよび生物学的メディエータ（すなわち、ヒスタミン、ロイコトリエン）の放出が引き起こされ、これらは、次いで即時型アレルギー性炎症を引き起こし、次いで、アレルギー性鼻炎、結膜炎、喘息を引き起こす。この局面において、アレルゲン−ＩｇＥ抗体相互作用は、アレルゲンとＩｇＥ抗体との間の相互作用を阻害することを目的とする、アレルゲン特異的な受動免疫治療の標的であり得る（Valenta et al., 1998）。このために、特定の治療形態を開発するためには、ＩｇＥエピトープの定義付けは重要な必要条件である。連続的なＩｇＥエピトープを有するメジャーアレルゲン（例えばＰｈｌ  ｐ１）の場合において、アレルゲンをＩｇＥ結合ハプテンに寸断することが可能である。ハプテンは、アレルゲン曝露前にＩｇＥが結合したエフェクター細胞を飽和させ、これにより、架橋およびエフェクター細胞活性化を防ぐ（Ball et al., 1994）（チャプター１：ハプテンの原理もまた参照のこと）。対照的に、カバノキ花粉のメジャーアレルゲンであるＢｅｔ  ｖ１のＩｇＥエピトープは、主に立体配座型（非連続型）に属する。この場合、アレルゲン−ＩｇＥ抗体相互作用は、アレルゲン上の結合部位を患者ＩｇＥと競合する、治療的なアレルゲン特異的抗体でブロックされ得る。このような治療的アプローチは、患者が、少数のメジャーアレルゲンにのみ感受性である場合に、特に適切である。
【００６０】
本実施例において、１４個のモノクローナルＢｅｔ  ｖ１ペプチド特異的抗体（これらの全てがＩｇＧ１サブクラスに属する。）は、それらのエピトープ特異的結合特性について、ならびに、Ｂｅｔ  ｖ１アレルゲンに結合するアレルゲン患者のＩｇＥと干渉する能力について、特徴付けられる。
【００６１】
これらのペプチドの結合特性に従って、モノクローナル抗体は、二群に分けられ得る：第１群（クローン１−１１）、ペプチド２（ａａ３０−５９）を強く認識するモノクローナル抗体；第２群（クローン１２−１３）、ペプチド６（ａａ７５−１０４）を強く結合するモノクローナル抗体。全てのモノクローナル抗体が、ｒＢｅｔ  ｖ１およびｒＢｅｔ  ｖ１トリマーを強く結合し、特異性を示した。なぜなら、これらは、無関係のコントロールペプチド（例えばＫＬＨおよびｒＰｈｌ  ｐ１）を認識しなかったからである。
【００６２】
Ｂｅｔ  ｖ１に対する患者ＩｇＥの結合を干渉することについて試験した場合、モノクローナル抗体の各々が、ＩｇＥ結合を実質的な程度まで（いくつかにおいては、特定の患者における９４％まで）阻害した。驚くことに、これらの結果は、単一のモノクローナル抗体が、患者のポリクローナルなＩｇＥ結合を競合するに十分であることを示した。ペプチド６特異的なモノクローナル抗体は、ペプチド２特異的なモノクローナル抗体と比較して、より強力な阻害能力を示した。
【００６３】
異なるエピトープ特異性を有する個々のモノクローナルＩｇＧ抗体（クローン２：ペプチド２特異的；クローン１３：ペプチド６特異的）の阻害能力を、異なる特異性を有する２つの抗体の混合物と比較すると、抗体混合物を用いた場合には、患者ＩｇＥ結合の阻害がもはや強くなかった。
【００６４】
基本的には、これらのペプチド特異的ＩｇＧ１抗体のブロック活性について、２つの解釈が考えられ得る。第一に、この阻害は、得られたモノクローナル抗体が、Ｂｅｔ  ｖ１のＩｇＥ結合主要部位内の、または該結合部位に非常に近接したエピトープを認識するという事実によって説明され得る。第二に、このブロック活性は、アレルゲンのコンフォーメーションの改変によって生じ得、その結果、ＩｇＥエピトープまたはそのほんの一部が、もはやＩｇＥに接近し得ない。よりよい解釈は、異なるエピトープ特異性を有する２つのペプチド特異的モノクローナル抗体の混合物が、個々のモノクローナル抗体よりもＩｇＥ結合のより強い阻害をもたらさなかったことを示す、阻害実験の結果に合致する。この論理は、アレルゲン−抗体複合体の構造分析のよって確認され得る。
【００６５】
治療能力を有するいくつかのヒトモノクローナル抗体およびマウスモノクローナル抗体が、供給源としてのアレルギー患者または免疫化したマウスからのＢ細胞を用いる、古典的な組織培養およびコンビナトリアルクローニング技術によってすでに単離されている（Sun et al., 1995; Visco et al., 1996; Lebeque et al., 1997; Flicker et al., 2002）。これらの抗体は、アレルゲン−ＩｇＥ相互作用を阻害し得、そしてアレルゲン誘導性の好塩基球脱顆粒を防ぎ得る。
【００６６】
また、Ｂｅｔ  ｖ１特異的ヒトブロック抗体が、免疫療法によって処置された患者からのハイブリドーマ細胞株の生成によってすでに産生されている（Visco et al., 1996）。Ｂｅｔ  ｖ１特異的マウスモノクローナル抗体が、古典的なハイブリドーマ技術によって単離されている（Lebeque et al., 1997）。これまでにすでに取得されているＢｅｔ  ｖ１特異的モノクローナル抗体と比較して、本実施例に記載の抗体は、特定のアミノ酸配列を有するＢｅｔ  ｖ１由来ペプチドで免疫化したマウスから単離されており、これにより、手順の開始時にはすでに特異的エピトープを決定している。
【００６７】
上述したようなブロック抗体はまた、これらの免疫原性を低減するために、ヒト化されてもよく、リコンビナント抗体フラグメントとして生成されてもよい。治療的なアレルゲン特異的抗体は、アレルゲンの侵入に対する適切な防御ラインを形成するために、アレルギーの標的器官（例えば、鼻内、または気管支粘膜、結膜）に局所的に、または全身性に（例えば、受動ワクチン）投与され得る（Valenta et al., 1997）。
【００６８】
結論として、本発明に係るモノクローナル抗体はまた、局所的な治療または受動ワクチン接種による、標的器官におけるアレルゲン誘導性のメディエータ放出の防御に使用され得る。
【００６９】
〔実施例２〕
アレルゲン特異的ＩｇＧ抗体を用いた受動ワクチン接種の効果をインビボで検証するためのモデルマウスを樹立した（図１）。
【００７０】
マウス（Charles Rive, Germany）を、Ａｌ（ＯＨ）３（Alu-Gel-S; Serva, Germany）に吸収させた、カバノキ花粉のメジャーアレルゲンであるｒＢｅｔ  ｖ１（Biomay, Austria）５μｇで、１日目、１４日目および２８日目に腹腔内にて感作した。血液サンプル（抗血清）を、感作したマウスの尾静脈から３６日目に採取した。Ｂｅｔ  ｖ１に対するアレルギー性の感作を、上記血清におけるＢｅｔ  ｖ１特異的ＩｇＥ抗体の測定によって確認した（Vrtala et al., 1998）。８つ全ての血清のＢｅｔ  ｖ１特異的ＩｇＥレベルを比較した（表１０、抗血清）。
【００７１】
次いで、マウスを二群に分けた：第１群を、０．５ｍＬのＢｅｔ  Ｖ１特異的ＩｇＧでｉ．ｐ．処置した。第２群（コントロール群）に、無関係のアレルゲンであるＰｈｌ  ｐ５に対するＩｇＧ（０．５ｍＬ）を注入した。３７日目に、両群のマウスの尾静脈から血液を採取した（後血清（ｐｏｓｔ−ｓｅｒｕｍ））。ｒＢｅｔ  ｖ１に対するＩｇＥ反応性を、抗血清のものと比較した。この目的のために、５μｇ／ｍＬのｒＢｅｔ  ｖ１を、ＥＬＩＳＡプレート上に一晩コーティングし、プレートを３％  ＢＳＡ／ＴＢＳＴ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％ｗ／ｖ  ＢＳＡ、０．０５％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ）でブロッキングした。マウス血清を、ＴＢＳＴで１：１０に希釈し、一晩インキュベートし、結合したＩｇＥを、モノクローナルラット抗マウスＩｇＥ抗体（BD Pharmingen; USA）およびＨＲＰ標識化ヤギ抗ラット抗血清（Amersham, U.K.）を用いてそれぞれ検出した。表１０は、１０％未満のワクチン接種での２連の決定の代表的な平均を示す。カラム１および２は、ＩｇＧでの処置前（抗血清）および処置後（後血清）におけるｒＢｅｔ  ｖ１に対するマウスのＩｇＥ結合を示す。後血清におけるｒＢｅｔ  ｖ１に対するＩｇＥ結合の％阻害（第３カラム）を、以下のように算出した：％阻害＝１００−ＯＤ後血清×１００／ＯＤ抗血清。阻害の割合は、２３．４％〜５４．６％の間の範囲であった（表１０）。
【００７２】
表１０は、ｒＢｅｔ  ｖ１特異的ＩｇＧ抗体による、ｒＢｅｔ  ｖ１に対するマウスＩｇＥ結合の阻害を示す。ｒＢｅｔ  ｖ１特異的ＩｇＧまたはＰｈｌ  ｐ５特異的ＩｇＧでの処置の前（抗血清；第１カラム）および処置の後（後血清；第２カラム）における、ｒＢｅｔ  ｖ１に対するＩｇＥ結合を示した。後血清のＩｇＥ結合の％阻害を、第３カラムに示した。
【００７３】
【表１０】
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ｒＢｅｔ  ｖ１に対するＩｇＥ結合の阻害は、Ｐｈｌ  ｐ５に対する特異性を有するＩｇＧが得られた第２群のマウスにおいてほとんど観察されなかった。Ｐｈｌ  ｐ５アレルギーマウスについて同様の実験が行われ、Ｐｈｌ  ｐ５特異的ＩｇＧでの処置によって達成されたＩｇＥ結合の％阻害は、７．７〜５８％の範囲であった（表１１）。
【００７４】
表１１は、ｒＰｈｌ  ｐ５特異的ＩｇＧ抗体による、ｒＰｊｌ  ｐ５に対するマウスＩｇＥ結合の阻害を示す。ｒＰｈｌ  ｐ５に対するＩｇＥ結合（ＯＤレベル）を、ｒＰｈｌ  ｐ５特異的ＩｇＧまたはｒＢｅｔ  ｖ１特異的ＩｇＧでの処置前（抗血清；第１カラム）および処置後（後血清；第２カラム）に示した。後血清のＩｇＥ結合の％阻害を、第３カラムに示す。
【００７５】
【表１１】
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アレルゲン特異的ＩｇＧ抗体がアレルゲン誘導性の即時型アレルギー反応を阻害し得るか否かを、ラット好塩基球（ＲＢＬ）からのβ−ヘキソサミニダーゼ放出アッセイを用いて分析した。ＲＢＬ−２Ｈ３細胞（Eccleston et al., 1973）を、９６ウェル組織培養プレートにプレーティングし（４×１０４個／ウェル）、５％ＣＯ２下にて３７℃で２４時間培養した。これらの細胞を、Tyrode's Buffer（Sigma-Aldrich, Austria）（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．４ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５．６ｍＭ  Ｄ−グルコース、１２ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１０ｍＭ  Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、および０．１％ｗ／ｖ  ＢＳＡ（ｐＨ７．２））で２回洗浄した。異なる濃度のアレルゲン（０．５μｇ／ｍＬ；０．１μｇ／ｍＬ；０．０２μｇ／ｍＬ）を、マウス抗血清およびマウス後血清（Tyrode's Bufferにて１：１０に希釈した）とともにインキュベートした。アレルゲン／ＩｇＥ複合体およびアレルゲン／ＩｇＧ複合体を、ＲＢＬ細胞に曝露し、３７℃で湿潤環境下にて２時間インキュベートした。β−ヘキソサミニダーゼ放出のレベルを、蛍光顕微鏡（CYTO FLUORTM 2350, Millipore, USA）で測定した。１％ｖ／ｖ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の添加によって得られたβ−ヘキソサミニダーゼ総放出のパーセントとして結果を示した。図２および３は、細胞をアレルゲン＋後血清とともにインキュベートした際のＲＢＬ細胞のβ−ヘキソサミニダーゼ放出が、アレルゲン＋後血清と比較して低いことを示している。
【００７６】
さらなる実験において、ブロック抗体の概念を、別の重要な季節性のアレルゲンであるグラス花粉のメジャーアレルゲンＰｈｌ  ｐ１、通年性のアレルゲンであるＤｅｒ  ｐ２、ハウスダストからのメジャーアレルゲン、およびサカナのメジャーアレルゲンであるＣｙｐ  ｃ１に拡張した。さらに、単一のＩｇＧ抗体投与の、アレルゲン特異的マウスＩｇＥ結合に対する長期効果を調べた。
【００７７】
表１２は、ｒＰｈｌ  ｐ１特異的ＩｇＧ抗体による、ＩｇＧ投与３週間後のｒＰｈｌ  ｐ１に対するマウスＩｇＥ結合の％阻害を示す。後血清の阻害の割合は、６３．３〜３９．５％の範囲である。Ｄｅｒ  ｐ２で感作したマウスについて同様の実験を行い、ｒＤｅｒ  ｐ２特異的ＩｇＧでの処置によって達成された％阻害は、６３．５〜２７．５％の範囲であった（表１３）。ｒＣｙｐ  ｃ１で感作したマウスについて、特異的ＩｇＥ結合の阻害の割合は、５９．８〜３６％に達した（表１４）。
【００７８】
〔表１２：ｒＰｈｌ  ｐ１特異的ＩｇＧ抗体による、ｒＰｈｌ  ｐ１に対するマウスＩｇＥ結合の阻害〕
Ｐｈｌ  ｐ１に対する後血清のＩｇＥ結合のパーセントを、ｒＰｈｌ  ｐ１特異的ＩｇＧ（第１群）またはＢｅｔ  ｖ１特異的ＩｇＧ（第２群）での処置後の、異なる時点で示した。抗血清のＩｇＥ結合を、１００％反応として算出した。
【００７９】
【表１２】
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【００８０】
〔表１３：ｒＤｅｒ  ｐ２特異的ＩｇＧ抗体による、ｒＤｅｒ  ｐ２に対するマウスＩｇＥ結合の阻害〕
Ｄｅｒ  ｐ２に対する後血清のＩｇＥ結合のパーセントを、ｒＤｅｒ  ｐ２特異的ＩｇＧ（第１群）またはＢｅｔ  ｖ１特異的ＩｇＧ（第２群）での処置後の、異なる時点で示した。抗血清のＩｇＥ結合を、１００％反応として算出した。
【００８１】
【表１３】
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【００８２】
〔表１４：ｒＣｙｐ  ｃ１特異的ＩｇＧ抗体による、ｒＣｙｐ  ｃ１に対するマウスＩｇＥ結合の阻害〕
Ｃｙｐ  ｃ１に対する後血清のＩｇＥ結合のパーセントを、ｒＣｙｐ  ｃ１特異的ＩｇＧ（第１群）またはＢｅｔ  ｖ１特異的ＩｇＧ（第２群）での処置後の、異なる時点で示した。抗血清のＩｇＥ結合を、１００％反応として算出した。
【００８３】
【表１４】
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【００８４】
〔実施例３〕
他のＢｅｔ  ｖ１特異的抗体を得るために、ＩｇＥ応答が排他的にカバノキ花粉メジャーアレルゲンＢｅｔ  ｖ１を指向している患者を同定した。そのＩｇＥ可変領域のＤＮＡ配列を、ファミリー特異的プライマー（ＶＨ１−ＶＨ６）を第１定常ε領域に位置されるプライマーとともに用いた逆転写およびＰＣＲに供した上記患者より得た。上記アレルギー患者の、合計３３６個のＢｅｔ  Ｖ１特異的重鎖可変配列を同定した（図４）。これは、Ｂｅｔ  ｖ１のＩｇＥエピトープを認識し、ブロック抗体として反応する。
【００８５】
〔花粉数、アレルギー患者の特徴付け〕
５００名のアレルギー患者のうち、カバノキ花粉に対して排他的なアレルギー感受性を有している６名を、４６種のアレルゲン供給源（ハンノキ花粉、アーモンド、アルテルナリア、リンゴ、菌類（Aspergillus）、カバノキ花粉、ニンジン、カゼイン、ネコ皮膚あか（dander）、セロリ、クラドスポリウム、ゴキブリ、タラ、ダニ（Dermatophagoides farinae）、ダニ（Dermatophagoides pteronyssinus）、イヌ皮膚あか、グラス混合物、モルモット皮膚あか、ハムスター皮膚あか、カシバミ花粉、ハシバミ、ウマ皮膚あか、トショウ、ラテックス、乳タンパク質、ヨモギ、オリーブの木、ヒカゲミズ（Parietaria）、モモ、ピーナッツ、ペニシリン、マツ混合物、プランタン、羽毛混合物、ジャガイモ、ウサギ、ブタクサ、ライムギ、ライムギの花、ゴマ、エビ、ダイズ、トマト、クルミ、コムギコ、全卵）を含む、マルチアレルゲン試験システム（MAST CLA アレルゲン特異的ＩｇＥアッセイ、Hitachi Chemical Diagnostics）を用いて同定した。６名のアレルギー患者からの血液サンプルを、２００２年および２００５年の春および夏に得た。各地点（ａｐｐｏｉｎｔｍｅｎｔ）において、血漿中のＢｅｔ  ｖ１特異的ＩｇＥレベルを、CAP-RAST測定（Phadia）によって定量し、アレルギー症状および抗アレルギー剤を記録した。選択された患者はいずれも、任意の種類のアレルゲン特異的免疫療法を受けなかった。
【００８６】
個体の居住地域におけるカバノキ花粉曝露を、Drachenberg KJ et al., Allergy 56 (2001): 498-505に記載されているように記録した。
【００８７】
〔アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体の同定〕
選択されたアレルギー患者のアレルゲンプロファイルを特定するために、リコンビナントＢｅｔ  ｖ１を用いた阻害実験を行った。リコンビナントＢｅｔ  ｖ１（Biomayより購入）を、製造業者の指示書に従って、５ｍｇタンパク質／ｍＬ媒体の濃度で、ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（GE Healthcare Bio-Sciences AB）に結合させた。６名のアレルギー患者の血漿１５００μＬを、５００μＬのアレルゲン結合ゲルとともに、４℃で一晩３６０°（ｅｎｄ−ｏｖｅｒ−ｅｎｄ）の旋回によってインキュベートした。遠心分離（５０００ｇ、４℃で５分間）によって血清を回収した。食物アレルゲン混合物（卵白、乳タンパク質、タラ、コムギコ、ピーナッツおよびダイズ）および呼吸器系（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ）混合物（ヨモギ、カバノキ花粉、ヒカゲミズ、オオアワガエリおよびオオバコ）に対するＩｇＥレベル、ならびにカバノキ花粉抽出物に対するＩｇＥレベルを、CAP-RAST測定（Phadia）による枯渇の前および後に測定した（Eibensteiner P et al., Immunology 101 (2000): 112-9）。カバノキ花粉におけるＢｅｔ  ｖ１に対して排他的に反応した３名の患者を用いて、さらなる実験を行った。
【００８８】
〔ＰＢＭＣ単離およびＩｇＥ転写物のＲＴ−ＰＣＲ増幅〕
血清収集時に、末梢単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離によって単離した。細胞性の総ＲＮＡを、グアニジンイソチオシアネート法およびＣｓＣｌ勾配遠心分離を用いて単離した。
【００８９】
ＶＨ１−ＶＨ６ファミリー特異的プライマーをＩｇＥ重鎖の第１定常領域に特異的なプライマーとともに使用して、ＩｇＥ転写物を、Platinum Taq（登録商標）（Invitrogen）を用いたＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ一工程ＲＴ−ＰＣＲによって生成した（表１５）。
【００９０】
【表１５】
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ＰＣＲ増幅手順は、４７℃で３０分間および９４℃で５分間の第１工程に続いて、９４℃で２０秒間、５９℃で３０秒間、７２℃で１分間を４０サイクル、さらに７２℃で５分間の最終伸長からなる。予想したサイズのＰＣＲ産物の全てを、製造業者の指示書に従ってWizard（登録商標）SV GelおよびPCR Clean-Up System（Promega）を用いて、アガロースゲル精製した。続いて、ｃＤＮＡを、AccepTorTMベクター（Novagen）にクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−ｂｌｕｅに形質転換した。３ｍＬの一晩培養物（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む）から、Wizard（登録商標） Plus SV Miniprep DNA Purification System（Promega）を用いて、プラスミドＤＮＡを精製し、制限酵素ＫｐｎＩおよびＳａｃＩ（Roche）を用いて消化した。正しいサイズの挿入物を有しているプラスミドを、Microsynth AG（Switzerland）によって配列決定した。
【００９１】
〔参考文献〕
【００９２】
【化１】
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【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】図１は、実験設計を示す図である。
【図２】図２は、ｒＰｈｌｐ５特異的ＩｇＧ抗体による、β−ヘキソサミニダーゼの放出の阻害を示す図である。
【図３】図３は、ｒＢｅｔ  ｖ１特異的ＩｇＧ抗体による、β−ヘキソサミニダーゼの放出の阻害を示す図である。
【図４】図４は、Ｂｅｔ  ｖ１に結合し得るＩｇＥ可変領域をコードするＤＮＡ配列を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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