(57)【要約】【解決手段】Ｇ−２ＭｅＰＥのマイクロエマルジョン、粗エマルジョン、液晶、錠剤およびカプセル形態でのＧ−２ＭｅＰＥの経口製剤は、従来の水溶性製剤よりも生物利用効率を改善した。とりわけ、微小粒子、ナノ粒子およびマイクロエマルジョンは、経口投与後に、すばらしい神経保護効果を示すことができる。マイクロエマルジョン製剤では、Ｇ−２ＭｅＰＥは、脳卒中が起こった後でさえ、動物の脳卒中モデルにおいて、脳の梗塞をほぼ完全に阻害することができる。したがって、改善された経口製剤は、様々な神経変性状態を治療するために、便宜性および効能を向上させて好適に用いられることができる。【選択図】図１６Ａ
2009538269.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの油を含む連続疎水性相、
少なくとも１つの界面活性剤、及び
グリシル−２−メチルプロリルグルタミン酸塩（Ｇ−２ＭｅＰＥ）を含有する不連続で親水性の水相、
を含む油中水滴エマルジョンを含有する医薬組成物。
【請求項２】
前記界面活性剤が、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート（ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０（登録商標））、ソルビタンモノオレエート（スパン（Ｓｐａｎ）８０（登録商標））およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
さらに、カプリン酸ナトリウムおよびタウロコール酸ナトリウムからなる群から選択される透過促進剤をさらに有する、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
マイクロエマルジョンである請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
粗エマルジョンである請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
液晶である請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
さらに、微小粒子またはナノ粒子を有し、前記微小粒子またはナノ粒子は、コーティングにより周囲を取り囲まれたＧ−２ＭｅＰＥを有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
さらに、酵素阻害剤を有する請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
請求項４または請求項６に記載の１つまたは複数の組成物を、請求項５に記載の組成物と組み合わせて含有する製剤を有する医薬組成物。
【請求項１０】
Ｇ−２ＭｅＰＥと、
結合剤と、
腸溶コーティングと
を有する錠剤。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物と、
追加的な神経保護剤と
を有する、神経障害を治療するための経口組成物。
【請求項１２】
神経障害を治療するための薬剤を製造するために、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のものの使用。
【請求項１３】
前記障害は、外傷性脳損傷、脳卒中、低酸素症／虚血、心臓動脈バイパス手術、心筋梗塞、アルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン病からなる群から選択される、請求項１２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、合衆国法典第３５編１１９条（ｅ）に基づき、米国仮特許出願６０／７８２，１４８号（２００６年３月１４日出願、名称「グリシル−２−メチルプロリルグルタミン酸塩の製剤」、発明者Ｊｉｎｇｙｕａｎ  Ｗｅｎ他）への優先権を主張する。この仮出願は、本願中に参照することにより完全に盛り込まれている。
本発明は、グリシル−２−メチルプロリルグルタミン酸塩（Ｇ−２ＭｅＰＥ）の経口利用可能な製剤に関する。とりわけ、本発明は、神経保護剤であるＧ−２ＭｅＰＥのマイクロエマルジョン、液晶およびカプセル剤と、これらの製造方法と、これらを含有する医薬組成物と、神経障害を治療する上でのこれらの使用とに関する。
【背景技術】
【０００２】
米国特許７，０４１，３１４号（名称「ＧＰＥ類似体およびペプチド模倣体」、２００２年５月２４日出願、合衆国法典第３５編１１９条（ｅ）に基づき、米国仮出願６０／２９３，８５３号（２００１年３月２４日出願）への優先権を主張）は、インビトロで、有害な神経損傷から神経細胞を保護するための、Ｇ−２ＭｅＰＥおよびその他の合成ＧＰＥ類似体の物質の組成と、水溶調製液の使用とを開示している。
【０００３】
米国特許出願１１／３１４，４２４号（名称「神経変性に対するＧ−２ＭｅＰＥの効果」、２００５年１２月２０日出願）および米国特許出願１１／３１５，７８４号（名称「Ｇ−２ＭｅＰＥを用いた認知促進および認知治療」、２００５年１２月２１日出願）は、脳卒中および外傷性脳損傷により誘発された神経損傷から動物を守るために、Ｇ−２ＭｅＰＥの水溶性調製液を使用する方法を開示している。
【０００４】
米国特許出願１１／３９８，０３２号（名称「脳損傷におけるＧ−２−メチルプロリルグルタミン酸塩を用いた非痙攣性発作の治療」、２００６年４月４日出願）には、貫通弾道のような脳損傷を受けた動物の脳における非痙攣性発作の治療するために、Ｇ−２ＭｅＰＥの水溶性製剤を用いる方法が開示されている。
【０００５】
しかし、当該分野では、現在のＧ−２ＭｅＰＥの水溶液よりも生物利用効率を改善し、効能も高い、改善された経口活性製剤を提供する必要性がある。
【発明の開示】
【０００６】
本発明の１つの観点は、生物活性および経口効能を改善した、錠剤、カプセル、エマルジョンおよび液晶として、Ｇ−２ＭｅＰＥの経口製剤を作る方法を提供することである。製剤によっては、微小粒子、ナノ粒子および／または透過促進剤を含むものもある。本発明の別の観点は、神経変性状態を治療するために、Ｇ−２ＭｅＰＥの経口製剤を用いる方法を提供することである。Ｇ−２ＭｅＰＥのマイクロエマルジョンおよび微小粒子製剤は、水溶性溶液よりも実質的に改善された神経保護効果を提供することができ、Ｇ−２ＭｅＰＥの調製液に所望の薬物速度論的特性を与えることができ、したがって治療効果およびその持続性を改善することができる。
【０００７】
本発明を、特定の実施形態を参照して説明する。本発明の実施形態のこれ以外の特徴は、図面より理解されうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
定義
投与量または時間に関して用いる場合の「約」という用語は、特定の変数とその周囲の範囲、すなわち、この変数の値の通常の測定誤差内またはこの変数の値の約２０％内にある範囲とを指す。
【０００９】
「動物」という用語は、ヒトおよびヒト以外の動物であって、例えば、家畜（猫、犬など）と、畜産家畜（牛、馬、羊、ヤギ、豚など）を含む。
【００１０】
「疾病」という用語は、動物の任意の非健康的な状態を含み、これには、とりわけ、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、糖尿病、運動障害、発作、および、加齢による認知機能障害を含む。
【００１１】
「損傷」という用語は、動物の任意の急性損傷を含み、これには、脳出血発作、外傷性脳損傷、周生期仮死（早期剥離、へその緒閉塞などに続く胎児仮死に関連する仮死、または子宮内発育遅延に関連する仮死）、適切な蘇生または呼吸が出来なかったために起こる周生期仮死、ほぼ溺死またはほぼ乳幼児突然死と関連する重度の中枢神経系外傷、一酸化炭素吸入、アンモニアまたはその他のガス中毒、心不全、昏睡、髄膜炎、低血糖および癲癇重積症、冠状動脈バイパス手術に関連する脳仮死の発現、低血圧症状の発現および高血圧性クリーゼ、脳外傷、ならびに毒性障害を含む。
【００１２】
「記憶障害」または「認知障害」とは、情報を学習、記憶、思い出すことに関する、永久的または一時的な機能障害または能力の欠如である。記憶障害は、通常の加齢、脳への損傷、腫瘍、神経変性病、血管疾患、遺伝子状態（ハンチントン病）、水頭、これ以外の疾病（ピック病、クロイツフェルト・ヤコブ病、ＡＩＤＳ、髄膜炎）、有毒物質、栄養失調、生化学的障害、心理的機能障害、または、精神機能障害より生じうる。ヒトにおいて記憶障害があることの立証は、患者病歴の調査、身体検査、臨床検査、想像力検査、神経心理テストにより行われうる。標準的な神経心理テストは、特に限定されないが、以下を含む。すなわち、修正短時間視覚記憶検査（Ｂｒｉｅｆ  Ｖｉｓｕａｌ  Ｍｅｍｏｒｙ  Ｔｅｓｔ−Ｒｅｖｉｓｅｄ）（ＢＶＭＴ−Ｒ）、ケンブリッジ神経心理学自動検査（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｅｓｔ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｂａｔｔｅｒｙ（ＣＡＮＴＡＢ））、子供用記憶検査（Ｃｈｉｌｄｒｅｎ'ｓ  ＭＥＭＯＲＹ  Ｓｃａｌｅ（ＣＭＳ））、文脈記憶検査（Ｃｏｎｔｅｘｔｕａｌ  ＭＥＭＯＲＹ  Ｔｅｓｔ）、連続認識記憶検査（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  Ｍｅｍｏｒｙ  Ｔｅｓｔ（ＣＭＲＴ））、管理された口頭単語連想検査および記憶機能質問書（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｏｒａｌ  Ｗｏｒｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ  ａｎｄ  Ｍｅｍｏｒｙ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｇ  Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ）、デンマン神経心理記憶検査（Ｄｅｎｍａｎ  Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｌｏｇｙ  Ｍｅｍｏｒｙ  Ｓｃａｌｅ）、ウェクスラー成人知能検査−ＩＩＩの桁長さおよび文字数字列サブ検査（Ｄｉｇｉｔ  Ｓｐａｎ  ａｎｄ  Ｌｅｔｔｅｒ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｕｂ−ｔｅｓｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｅｃｈｓｌｅｒ  Ａｄｕｌｔ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ  Ｓｃａｌｅ−ＩＩＩ）、フルト物体記憶評価（Ｆｕｌｄ  Ｏｂｊｅｃｔ  Ｍｅｍｏｒｙ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（ＦＯＭＥ））、グラハム−ケンダールデザイン用の記憶検査（Ｇｒａｈａｍ−Ｋｅｎｄａｌｌ  Ｍｅｍｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｄｅｓｉｇｎｓ  Ｔｅｓｔ）、ギルド記憶検査（Ｇｕｉｌｄ  Ｍｅｍｏｒｙ  Ｔｅｓｔ）、ホプキンス言語学習検定（Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｖｅｒｂａｌ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  Ｔｅｓｔ）、  学習および記憶検査（Ｌｅａｒｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍｅｍｏｒｙ  Ｂａｔｔｅｒｙ）（ＬＡＭＢ）、記憶評価臨床自己評価検査（Ｍｅｍｏｒｙ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｓｅｌｆ−Ｒａｔｉｎｇ  Ｓｃａｌｅ）（ＭＡＣ−Ｓ）、記憶評価検査（Ｍｅｍｏｒｙ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｓｃａｌｅｓ）（ＭＡＳ）、ラント記憶検査（Ｒａｎｄｔ  Ｍｅｍｏｒｙ  Ｔｅｓｔ）、認知記憶検査（Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｍｅｍｏｒｙ  Ｔｅｓｔ）（ＲＭＴ）、レイ聴覚および言語学習検査（Ｒｅｙ  Ａｕｄｉｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｖｅｒｂａｌ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  Ｔｅｓｔ）（ＲＡＶＬＴ）、ライバーミード行動記憶検査（Ｒｉｖｅｒｍｅａｄ  Ｂｅｈａｖｉｏｕｒａｌ  Ｍｅｍｏｒｙ  Ｔｅｓｔ）、ウェクスラー成人記憶検査のラッセル版（Ｒｕｓｓｅｌｌ'ｓ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｅｃｈｓｌｅｒ  Ｍｅｍｏｒｙ  Ｓｃａｌｅ）（ＲＷＭＳ）、空間作業記憶（Ｓｐａｔｉａｌ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｍｅｍｏｒｙ）、記憶および学習検査（Ｔｅｓｔ  ｏｆ  Ｍｅｍｏｒｙ  ａｎｄ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ）（ＴＯＭＡＬ）、バーモント記憶検査（Ｖｅｒｍｏｎｔ  Ｍｅｍｏｒｙ  Ｓｃａｌｅ）（ＶＭＳ）、ウェクスラー記憶検査（Ｗｅｃｈｓｌｅｒ  Ｍｅｍｏｒｙ  Ｓｃａｌｅ）、記憶および学習の広範囲評価（Ｗｉｄｅ  ＲａｎｇｅＡｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｅｍｏｒｙ  ａｎｄ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ）（ＷＲＡＭＬ）である。
【００１３】
「医薬的に容認可能な賦形剤」という用語は、全般的に安全で、毒性がなく、好ましい医薬組成物を調製するのに有用である賦形剤を意味し、かつ、獣医用やヒトの医薬的使用として容認可能な賦形剤を含む。このような賦形剤は、固体、液体、半固体、または、エアゾール組成物の場合は気体である。
【００１４】
「医薬的に容認可能な塩」という用語は、医薬的に容認可能であり、所望の医薬特性を有する塩を意味する。このような塩は、化合物中にある酸性タンパク質が、無機または有機塩基と反応した際に形成されうる塩を含む。適切な無機塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムおよびアルミニウムなどのアルカリ金属と共に形成される塩を含む。適切な有機塩は、例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタシン、Ｎ−メチルグルカミン他のアミンなどの有機塩基と共に形成されるものを含む。また、アミン基または化合物中にある基が酸と反応することにより形成される酸付加塩も含む。適切な酸には、無機塩（たとえば、塩酸および臭化水素酸）および有機塩（例えば、酢酸、クエン酸、マレイン酸、ならびに、メタンスルホン酸やベンゼンスルホン酸などのアルカンおよびアレーンのスルホン酸）が含まれる。化合物中に２つの酸性基がある場合、医薬的に容認可能な塩は、一酸の単塩またはジ塩であってもよい。同様に、２つを上回る酸性基がある場合、いくつかの基または全ての基が塩化されうる。同様のことが、化合物中に２つ以上のアミン基がある場合に考えられる。
【００１５】
「治療効果のある量」とは、疾病を治療するために動物に薬剤を投与する際に、その分野で認知されているテスト系を用いて測定した場合に、その疾病の治療に対して十分効果を奏する薬剤の量を意味する。
【００１６】
「治療する」または「治療」という用語は、その疾病にかかりやすくなっているかもしれないが、まだその疾病にかかっていないまたはその症状を呈していない動物において、その疾病が生じることを防ぐ（予防治療）こと、その疾病を阻害する（疾病の進行速度を遅くするまたは阻む）こと、その疾病の症状または副作用を癒すこと（緩和治療を含む）、および、その疾病を取り除く（その疾病を退化させる）ことを含む。
【００１７】
「機能障害」という用語は、神経障害に関連する行動欠陥を意味する。このような欠陥には、パーキンソン病の患者に見られるような歩行障害や、ハンチントン病の患者に見られるような運動異常も含まれる。機能障害には、足位置の異常や本願中に記載する記憶障害も含まれる。
【００１８】
「Ｇ−２ＭｅＰＥ」または「ＮＮＺ−２５６６」という用語は、トリペプチドの類似体であるグリシル−２−メチルプロリルグルタミン酸塩を意味する。
【００１９】
「発作」という用語は、異常な動きを生じさせる、運動障害または運動調節の欠陥を引き起こす、脳における神経作用の異常パターンを意味し、痙攣性動作を含む。「発作」とは、異常な運動活動を伴うあるいは伴わない脳波異常を含む。
【００２０】
神経障害の治療
神経細胞の変性および神経細胞の死を含む神経障害は、治療が困難であると考えられてきた。最近まで、神経細胞の変性を覆す、または、神経変性をうまく治療する方法は存在しなかった。このような疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病およびこれ以外の周知の慢性疾患などの慢性疾患を含む。さらに、神経変性を伴う急性疾患には、外傷性脳損傷またはＴＢＩ（貫通弾道のような脳損傷またはＰＢＢＩ、および鈍器でなぐられてできた傷を含む）、脳卒中、心筋梗塞（ＭＩ）、心臓動脈バイパス移植手術（ＣＡＢＧ）、低酸素症／虚血（ＨＩ）およびこれ以外の周知の疾患を含む。
【００２１】
最近、神経変性を治療する新たな方策がいくつか現れている。これらには、インシュリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−１）、ＩＧＦ−１のＮ−末端トリペプチドすなわちグリシルプロリルグルタミン酸塩（ＧＰＥ）、ＧＰＥの類似体、および、ＧＰＥの合成類似体が含まれる。この中の１つであるグリシル−２−メチルプロリルグルタミン酸塩（Ｇ−２ＭｅＰＥ）は、米国特許７，０４１，３１４号（名称「ＧＰＥ類似体およびペプチド模倣体」、２００６年５月９日発行）に記載され、この特許は、本願中に参照することにより明示的に盛り込まれているが、この特許は、ＧＰＥの合成類似体の合成と使用とについて記載している。
【００２２】
また、米国特許出願１１／３１５，７８４号（公開番号米国２００７／０００４６４１号、名称「グリシル−２−メチルプロリルグルタミン酸塩を用いた認知促進および認知治療」、２００５年１２月２１日出願）は、インビボでのラットの認知を改善するＧ−２ＭｅＰＥの効果について記載している。
【００２３】
米国特許出願１１／３１４，４２４号（名称「神経変性に対するグリシル−２−メチルプロリルグルタミン酸塩の効果」）は、以下に対するＧ−２ＭｅＰＥの効果を記載している。すなわち、ラットにおいて、エンドセリン−１により誘発された外傷性脳損傷および脳卒中モデル、毒物により引き起こされたインビトロでの神経保護作用、インビボでの低酸素性虚血損傷、インビボでの多発性硬化症、実験的な自己免疫脳症（ＥＡＥ）のモデルに対する効果を記載している。
【００２４】
米国特許出願１１／３９８，０３２号、（２００６年４月４日出願、名称「Ｇ−２−メチルプロリルグルタミン酸塩を用いた、脳損傷における非痙攣性発作の治療」）は、「静かな」発作、すなわち、明らかな運動の要素を持たない発作を治療する目的でのＧ−２ＭｅＰＥの使用に関して記載している。このような非痙攣性発作は、外傷性脳損傷、脳卒中、低酸素症／虚血および毒性損傷に関連しうる。
【００２５】
上述の複数の特許出願は、Ｇ−２ＭｅＰＥの製造および有用性を示しているが、薬物速度論的特性（ＰＫ）または薬理学的特性（ＰＤ）を改善した製剤を作ることが望まれている。本発明の製剤は、この必要性を満足している。
【００２６】
ここで記述するＧ−２ＭｅＰＥに加えて、組成物は、本発明による化合物に加えて、随意選択的に、以下より選択される少なくとも１つの追加的な神経保護剤を含有してもよい。すなわち、例えば、成長因子およびこれに関連する誘導体（インシュリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ））、インシュリン様成長因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、形質転換成長因子−β１、アクティビン、成長ホルモン、神経成長因子、成長ホルモン結合タンパク質、ＩＧＦ結合タンパク質（特に、ＩＧＦＢＰ−３）、塩基性線維芽細胞成長因子、酸性線維芽細胞成長因子、ｈｓｔ／Ｋｆｇｋ遺伝子産物、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−６、ケラチン成生細胞成長因子、男性ホルモン誘導成長因子）から選択される少なくとも１つの追加的な神経保護剤を含有してもよい。ＦＧＦファミリーのこれ以外の構成員には、例えば、ｉｎｔ−２，線維芽細胞成長因子同種因子−１（ＦＨＦ−１）、ＦＨＦ−２、ＦＨＦ−３およびＦＨＦ−４、ケラチン成生細胞成長因子２、グリア活性化因子、ＦＧＦ−１０およびＦＧＦ−１６、毛様体神経栄養因子、脳由来成長因子、ニュートロフィン３、ニュートロフィン４、骨形態形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）、グリア細胞株由来神経栄養因子、活性依存神経栄養因子、サイトカイン白血病阻害因子、オンコスタチンＭ，インターロイキン、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、コンセンサスインターフェロン、ならびに、ＴＮＦ−αが含まれる。これ以外の形態の神経防護作用治療薬には、例えば、クロメチアゾール；  キヌレン酸、セマックス（Ｓｅｍａｘ）、タクロリムス、Ｌ−トレオ−１−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール、副腎皮質刺激ホルモン−（４−９）類似体（ＯＲＧ  ２７６６）およびジゾシルピン（ＭＫ−８０１）、セレギリン；  ＮＰＳ１５０６、ＧＶ１５０５２６０、ＭＫ−８０１およびＧＶ１５０５２６などのグルタミン酸塩阻害因子；  ２，３−ジヒドロキシ−６−ニトロ−７−スルファモイルベンゾ（ｆ）キノキサリン（ＮＢＱＸ）、ＬＹ３０３０７０およびＬＹ３００１６４などのＡＭＰＡ阻害因子；  抗ＭＡｄＣＡＭ−１ｍＡｂＭＥＣＡ−３６７（ＡＴＣＣ受入番号、ＨＢ−９４７８）などの、アドレシンＭＡｄＣＡＭ−１および／またはそのインテグリンα４レセプタ（α４β１およびα４β７）に向けた抗炎症薬が含まれる。これらの薬剤のほとんど、特に、成長因子などのペプチドは、経口では活性がなく、注射、点滴による投与または本発明の経口活性製剤に取り込むことにより有益となることができる。
【００２７】
投与
本発明の製剤は、神経変性またはその兆候をもたらしうる状態の発現の前または後に投与可能である。例えば、低酸素症／虚血は、冠状動脈バイパス移植手術（ＣＡＢＧ）中におこりうることが知られている。したがって、体外酸素吸入システムをつける前に、患者に、本発明の化合物で予め治療されうる。実施形態によっては、手術の４時間前、または、外傷性神経損傷もしくはこれ以外の神経損傷に至りうる出来事の前に、本発明の化合物を投与することが望ましい場合もありうる。実施形態によっては、脳卒中、ＴＢＩ、ＣＡＢＧまたはこれ以外の神経障害ゆえに神経変性またはその兆候を起こし、回復しつつある患者に本発明の製剤を、亜急性に投与することができる。さらに別の実施形態では、このような製剤を、認知障害に苦しむ患者に投与することができる。さらに別の実施形態では、このような製剤を、神経損傷に関連して機能障害に苦しむ患者に投与することができる。
【００２８】
Ｇ−２ＭｅＰＥの経口投与
薬物デリバリーにおいて、経口デリバリーは、最も安全で、最も便利で、かつ経済的な方法である。今日の経口デリバリーされる製品の治療上の利点は、有効成分に関して、予測可能性が極めて高く、デリバリーの管理が極めてよくできることに集中し、その結果、治療効能を高め、副作用を減らすことができる。この点と、投与の頻度を減らすこととを組み合わせることにより、患者の薬剤服用遵守力を改善し、したがって、治療の結果も改善する。経口薬物デリバリーは、通常、感染の危険性を減らすことができるが、これは、この投与方法での投与中は、体内の自然の防衛機構が破られないからである。
【００２９】
所望の治療効果を得るために、神経保護剤特にペプチドまたはペプチド類似体が、薬物安定性を維持し、かつ最適の目標組織へのデリバリーが可能となる、製剤およびデリバリーシステムを用いて投与されることが好ましい。適切な製剤戦略が用いられない場合、吸収を制限する生化学障壁および物理的障壁のために、経口投与ペプチドの生体利用効率は低くなりうる。さらに、血液脳関門（ＢＢＢ）も、抹消投与に次いで脳まで薬物をデリバリーする上で、手ごわい障害となりうる。ＢＢＢは、特別な微小血管内皮細胞網からなり、全身から中枢神経系（ＣＮＳ）への分子の輸送を選択的に行う部分である。
【００３０】
多くの生化学的、生理学的および物理化学的因子、ならびに、製剤投与形態が、経口投与後の薬物の吸収の度合い、生体内分布および薬理学的効果を決める。とりわけ、ペプチドでは、これらの因子には、腸内透過性、酵素安定性、デリバリーシステムの種類、および、製剤の輸送時間が含まれる。これらの因子の中で、生化学的障壁および物理的障壁は、経口投与ペプチドの効能に影響を与えるという意味合いで、重要になりうる。これらの２つの障壁は、目標のペプチドがＢＢＢを通る前に、合理的なデリバリーシステムを用いて、克服せねばならない。経口活性ペプチド製剤の合理的な設計は、以下の１つまたは複数の戦略に基づくべきである。すなわち、（ａ）ペプチドを分解するタンパク質分解作用を阻害または調節すること、（ｂ）ペプチドの細胞間隙輸送または細胞間輸送を増進させること、（ｃ）粘膜障壁を通るペプチド透過を改善させること、（ｄ）治療効能のために持続的に存在することが要求されるペプチドに関して、循環内でのペプチドの半減期を長くすること、（ｅ）生物活性を保持する抗プロテアーゼペプチド類似体を開発すること、および／または、（ｆ）担体分子との結合により、または、カプセル化によりペプチドを安定させること、の戦略の１つまたは複数である。
【００３１】
この点を頭において、保存中に安定性を最大限にし、腸管中でタンパク質分解酵素からＧ−２ＭｅＰＥを保護し、吸収に好適な胃腸管でペプチド部位を放出し、かつ、腸上皮に渡って薬物の吸収を改善するのに適切なＧ−２ＭｅＰＥの製剤戦略を設計した。
【００３２】
予想外に、マイクロエマルジョン、粗エマルジョン、液晶および錠剤に製剤したＧ−２ＭｅＰＥが、所望の特性を提供することを見出し、これらは、神経変性または神経の死の特徴を有する状態を治療するのに有用な製剤になった。
【００３３】
特定の実施形態では、本発明は、油中水滴エマルジョンを有する医薬調製を提供する。
【００３４】
Ｇ−２ＭｅＰＥ含有エマルジョン
油中水滴エマルジョンが、長鎖カルボン酸、または、これのエステルもしくはアルコールからなる油相と、界面活性剤または表面活性剤と、主に水およびＧ−２ＭｅＰＥを含有する水相とを含有する実施形態もある。
【００３５】
脂質とアルコール
長鎖カルボン酸は、Ｃ16〜Ｃ22の範囲のものであり、３つまでの不飽和結合（分岐も）を有するものである。飽和直鎖酸の例として、ｎ−ドデカン酸、ｎ−テトラデカン酸、ｎ−ヘクサドデカン酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、モンタン酸およびメリシン酸が挙げられる。不飽和モノオレフィン直鎖モノカルボン酸も有用である。この例は、オレイン酸、ガドレイン酸およびエルカ酸である。不飽和（ポリオレフィン）直鎖モノカルボン酸も有用である。この例は、リノール酸、リシノール酸、リノレン酸、アラキドン酸およびベヘノール酸である。有用な分岐鎖酸には、例えば、ジアセチル酒石酸が含まれる。
【００３６】
長鎖カルボン酸エステルの例は、限定されるわけではないが、以下の群からの物質、すなわち、グリセリルモノステアリン酸エステル；グリセリルモノパルミチン酸エステル；グリセリルモノステアリン酸エステルとグリセリルモノパルミチン酸エステルとの混合物；グリセリルモノリノール酸エステル；グリセリルモノオレイン酸エステル；グリセリルモノパルミチン酸エステルと、グリセリルモノステアリン酸エステルと、グリセリルモノオレイン酸エステルと、グリセリルモノリノール酸エステルとの混合物；グリセリルモノリノレン酸エステル；グリセリルモノガドレイン酸エステル；グリセリルモノパルミチン酸エステルと、グリセリルモノステアリン酸エステルと、グリセリルモノオレイン酸エステルと、グリセリルモノリノール酸エステルと、グリセリルモノリノレン酸エステルと、グリセリルモノガドレイン酸エステルとの混合物；希釈されたアセチル化されたモノグリセリドなどのアセチル化されたグリセリド；プロピレングリコールモノエステルと、希釈されたモノグリセリド、ステアロイル乳酸ナトリウムと、二酸化ケイ素との混合物；ｄ−α−トコフェロールポリエチレングリコール１０００琥珀酸エステル；アトムル（Ａｔｍｕｌ）などのモノグリセリドと、ジグリセリドエステルとの混合物；ステアロイル乳酸カルシウム；エトキシル化されたモノグリセリドおよびジグリセリド；乳酸加モノグリセリドおよびジグリセリド；グリセロールおよびプロピレングリコールの乳酸カルボン酸エステル；長鎖カルボン酸の乳酸エステル；長鎖カルボン酸のポリグリセロールエステル、長鎖カルボン酸のプロピレングリコールモノエステルおよびジエステル；ステアロイル乳酸ナトリウム；モノオレイン酸ソルビタン；長鎖カルボン酸のこれ以外のソルビタンエステル；コハク酸化モノグリセリド；ステアリルモノグリセリルクエン酸エステル；ステアリルヘプタン酸エステル；蝋のセチルエステル；ステアリルオクタン酸エステル；Ｃ10、Ｃ30コレステロール／ラボステロールエステル；およびショ糖長鎖カルボン酸エステルが含まれる。
【００３７】
自己乳化長鎖カルボン酸エステルの例には、ステアリン酸エステル、パルミチン酸エステル、リシノール酸エステル、オレイン酸エステル、ベヘン酸エステル、リシノール酸エステル、ミリスチン酸エステル、ラウリン酸エステル、カプリル酸エステルおよびカプロン酸エステルの群からのものが含まれる。
【００３８】
本発明中で有用なアルコールの例としては、上で例示したカルボン酸のヒドロキシ形態およびステアリルアルコールが挙げられる。
【００３９】
実施形態によっては、油相は、２つ以上の長鎖カルボン酸、または、これらのエステルもしくはアルコールの組み合わせを含みうる。
【００４０】
実施形態によっては、この油相は、カプリル／カプリントリグリセリドと、カプリル酸のＣ８／Ｃ１０モノグリセリド／ジグリセリドとの混合物を有しうる。
【００４１】
表面活性剤
表面活性剤または界面活性剤は、親水性／疎水性（水／油）界面に蓄積することができ、かつ、この界面での界面張力を低くすることができる長鎖分子である。この結果、これらは、エマルジョンを安定化することができる。本発明のいくつかの実施形態では、界面活性剤は、以下を有してもよい。すなわち、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０（登録商標）（ポリオキシエチレンソルベート）界面活性剤群、スパン（Ｓｐａｎ）８０（登録商標）（ソルビタン長鎖カルボン酸エステル）界面活性剤群、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）（登録商標）（エチレンまたはプロピレンオキシド・ブロックコポリマー）界面活性剤群、ラブラゾル（Ｌａｂｒａｓｏｌ）（登録商標）、ラブラフィル（Ｌａｂｒａｆｉｌ）（登録商標）およびラブラファック（Ｌａｂｒａｆａｃ）（登録商標）（各々、ポリ加グリコール分解されたグリセリド）界面活性剤群、オレイン酸、ステアリン酸、ラウリン酸もしくはこれ以外の長鎖カルボン酸のソルビタンエステル、ポロクサマー（ポリエチレン−ポリプロピレングリコール・ブロックコポリマーもしくはプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）（登録商標））、これ以外のソルビタンもしくはショ糖の長鎖カルボン酸エステル、モノグリセリドまたはジグリセリド、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリドのＰＥＧ誘導体およびこれらの混合物、または、上述の２つ以上の混合物を有してもよい。
【００４２】
いくつかの実施形態では、界面活性剤相は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート（ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０（登録商標））と、ソルビタンモノオレエート（スパン（Ｓｐａｎ）８０（登録商標））との混合物を有してもよい。
【００４３】
水溶性相は、水および緩衝液に懸濁されたＧ−２ＭｅＰＥを有してもよい。Ｇ−２ＭｅＰＥが、水溶性相中に、１ｍｇ：３００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している実施形態もある。
【００４４】
いくつかの実施形態では、このようなエマルジョンは、粗エマルジョン、マイクロエマルジョンおよび液晶エマルジョンである。このようなエマルジョンが随意選択的に透過促進剤を有しうる実施形態もある。Ｇ−２ＭｅＰＥのような水溶性薬剤では、薬物をエマルジョンの水相中に含めることがとりわけ望ましい。このような「油中水滴」製剤は、薬物にとって適した生物理学的環境を提供し、薬物を分解しうるｐＨまたは酵素の弊害から薬物を保護することができる油水界面を提供することができる。さらに、このような油中水滴製剤は、脂質層を提供することができ、この脂質層が、体内細胞の脂質と好適に相互作用することができ、細胞膜上の製剤の仕切りを増やすことができる。このような仕切りは、このような製剤での薬物の循環への吸収を増進させ、したがって、薬物の生物利用効率を向上させることができる。
【００４５】
微小粒子またはナノ粒子を含有するカプセル化したマイクロエマルジョン、粗エマルジョンまたは液晶が、有利に用いられることができる実施形態もある。Ｇ−２ＭｅＰＥおよび結合剤、賦形剤、ならびに、随意選択的に腸溶コーティングを含有する錠剤が有利に用いられることができる実施形態もある。これらの製剤は、Ｇ−２ＭｅＰＥが胃で分解されないよう、これを保護し、吸収が行われうる胃腸管の部位まで、薬物の輸送を支援することができる。
【００４６】
驚くべきことに、Ｇ−２ＭｅＰＥの特定の製剤は、他のより周知の神経保護剤に比較して予想しない特性を有することを見出した。さらに、予想しなかったことであるが、Ｇ−２ＭｅＰＥは、Ｇ−２ＭｅＰＥの水溶性溶液を含む通常の水溶性溶質とは異なる挙動を行うことを見出した。
【実施例】
【００４７】
以下の実施例は、本発明の実施形態を例証するためのもので、特定の実施例に範囲を限定する意図はない。当業者は、本願の教示および開示が、これ以外の明らかな変型例を開発するための教示を提供していることを、容易に理解できる。これらの変型例は、本発明の一部であると考えられる。
【００４８】
実施例１
ヒトの結腸癌から取ったＣａｃｏ−２細胞株
化合物の経口デリバリーの適性を検査するために、インビトロでのモデルを設けた。最初の目的は、消化管からの神経保護ペプチドの吸収を改善するために、酵素障壁および物理的な障壁に打ち勝つことにあった。
【００４９】
Ｃａｃｏ−２細胞株は、腸の挙動を模倣するために広く用いられてきた（米港特許５，８２４，６３３号参照）。Ｃａｃｏ−２株は、成功裡に作られ、組織培養研究室で日常的に維持されていた。この２０年の間で、Ｃａｃｏ−２細胞培養システムは、腸での薬物吸収を迅速に選別する上での適切なインビトロでのモデルとして認められてきた。Ｃａｃｏ−２細胞は、もとはヒトの結腸腺癌から分離されたが、密集細胞として、トランスウェル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）細胞培養プレート中で、日常的に培養された。培養における差別化において、これは、正しい形態を呈し、ヒトの腸上皮に典型的である刷子縁加水分解酵素、イオン輸送特性、搬送システムの多くを示す。さらに、成長した無傷のＣａｃｏ−２細胞培養物は、特徴的な経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を示すが、これは、隣接する細胞間での密接な結合複合体の存在と、腸細胞の本来的なイオン輸送機能とを反映したものである。正常なヒトの腸粘膜と同様、Ｃａｃｏ−２細胞は、第１相薬物代謝酵素（すなわち、シトクロムＰ４５０  １Ａ１および１Ａ２）および第２相薬物代謝酵素（すなわち、ＵＤＧ−グルクロノシルトランスフェラーゼ）、ならびに、Ｐタンパク質などの薬物輸送体などを顕著な量有する。したがって、Ｃａｃｏ−２細胞培養系は、小さい分子量の（親水性および親油性薬物）および治療用ペプチドの輸送、およびそのメカニズムを研究するために、幅広く使用されてきた。したがって、Ｃａｃｏ−２細胞培養物を用いて得られた結果は、ヒトの腸による薬物吸収を予測している。
【００５０】
実施例２
Ｃａｃｏ−２細胞の存在下でのＧＰＥおよびＧ−２ＭｅＰＥの安定性
目的
本研究の目的は、Ｃａｃｏ−２培養物中でペプチダーゼの存在下での、ＧＰＥおよびＧ−２ＭｅＰＥの酵素安定性を調査することである。
【００５１】
方法
Ｃａｃｏ−２結腸癌細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手し、１０％ウシ胎仔血清およびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）を加えた、高グルコースＤＭＥＭ中で、３７℃、５％のＣＯ2中で培養、維持した。細胞は、約５〜７日継代培養した。５０〜１００μｇ／ｍｌのＧＰＥおよび５０〜１００μｇ／ｍｌのＧ−２ＭｅＰＥそれぞれを、Ｃａｃｏ−２単層と共に、Ｔ７５フラスコ中のハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）緩衝液（ｐＨ  ７．４）中、３７℃で培養し、空気中の５％のＣＯ2にさらした。標本を、０、１５、３０、４５、６０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０、３６０および１４４０分で採取した。
【００５２】
標本をそれぞれ５０μｌずつ含有する試験管に、０．０４Ｍの硫酸を４００μｌ加えることにより、採取した標本を抽出した。試験管を、氷上に５分間放置し、ボルテックスした。各試験管に、１０％タングステン酸ナトリウムを５０μｌ加え、直後に各試験管をボルテックスし、氷上に１０分間放置し、再びボルテックスし、氷上にさらに１０分間放置した。細胞を、４℃で２０分間、２０，０００ｇで遠心分離機にかけた。試験用に上澄みを採取した。
【００５３】
無傷のＧＰＥ、Ｇ−２ＭｅＰＥおよびその代謝産物を、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。この高圧液体クロマトグラフィーでの分析は、アクア（Ａｑｕａ）  ５μ、２５０×４．６ｍｍ、Ｃ１８カラム（フェノメネックス（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）、ニュージーランド、オークランド在）を、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）  ２６９５アライアンス（Ａｌｌｉａｎｃｅ）分離モデル、および、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）２９９６ＰＤＡ検出器に接続し、２００ｎｍにセットした吸収で行った。標本のタンパク質含有量は、ローリー（Ｌｏｗｒｙ）検定を用いて、測定した。
【００５４】
結果
Ｃａｃｏ−２細胞の存在下で、ＧＰＥの分解からは４つの代謝産物が特定された。Ｇ−２ＭｅＰＥは、ＧＰＥよりも、Ｃａｃｏ−２細胞の酵素による酵素分解に対して、より耐性があった（図１）。Ｇ−２ＭｅＰＥ類似体には、代謝産物が見つからず、Ｃａｃｏ−２細胞の存在下での、Ｇ−２ＭｅＰＥ類似体の安定性が確認された。
【００５５】
結論
腸上皮細胞に接触した際に、Ｇ−２ＭｅＰＥは酵素的に安定であるとの結論に達した。
【００５６】
実施例３
異なるｐＨにおける、Ｃａｃｏ−２細胞存在下でのＧ−２ＭｅＰＥ酵素安定性
目的
本研究の目的は、Ｃａｃｏ−２細胞によるＧ−２ＭｅＰＥの分解におけるｐＨの効果を決めることである。
【００５７】
方法
異なるｐＨ状態のＣａｃｏ−２細胞の密集培養物の尖端側に、１００μｇ／ｍｌのＧ−２ＭｅＰＥを加えた。標本を、０、１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０および２４０分後に採取した。標本を、１５分間、２０，０００ｇで遠心分離機にかけた。５０μｌの上澄みをＨＰＬＣのカラムに投入した。Ｇ−２ＭｅＰＥおよび代謝産物の分析は、アクア（Ａｑｕａ）  ５ｕ、２５０×４．６ｍｍ、Ｃ１８カラム（フェノメネックス（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）、ニュージーランド、オークランド在）を、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）  ２６９５アライアンス（Ａｌｌｉａｎｃｅ）分離モデル、および、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）２９９６ＰＤＡ検出器に接続し、２１０ｎｍでの吸収を測定して行った。異なるｐＨにおけるＧ−２ＭｅＰＥのペプチド分解作用および半減期を決めた。
【００５８】
結果
Ｇ−２ＭｅＰＥのペプチド分解作用の最高値は、ｐＨ６．５において見られた。Ｇ−２ＭｅＰＥのペプチド分解作用の最低値は、ｐＨ５．５未満の酸性条件において見られた（図２）。中程度のＧ−２ＭｅＰＥの分解は、塩基性条件（ｐＨ７〜９．５）にも見られた。
【００５９】
結論
Ｇ−２ＭｅＰＥは、ｐＨ≦５．５において安定している。したがって、Ｇ−２ＭｅＰＥは、胃の比較的酸性である環境（例えば、ｐＨ＜３．０）では保護されうるが、十二指腸、回腸または結腸のより中性環境においては、おそらくは、保護の程度はより低いであろう。
【００６０】
実施例４
阻害剤の存在下でのＧＰＥの酵素分解
目的
本研究の目的は、Ｃａｃｏ−２細胞ペプチダーゼまたはプロテアーゼが、ＧＰＥを分解できるか否かを決定することである。この論拠は、ＧＰＥがＣａｃｏ−２細胞により酵素的に分解されうるならば、Ｇ−２ＭｅＰＥも酵素分解の対象になるであろうということであった。このような分解を阻害することにより、Ｇ−２ＭｅＰＥの生物利用効率を改善することができる。
【００６１】
方法
酵素阻害剤であるＳＤＡ（胆汁塩）およびＥＤＴＡの存在下または非存在下で、ＧＰＥを、Ｃａｃｏ−２細胞の密集培養物で、４時間培養した。標本を、異なる時点で採取した。無傷のＧＰＥを、ＨＰＬＣで分析し、標本のタンパク質含有量をローリー検定により推定した。阻害百分率を用いて、ＧＰＥの分解の阻害における胆汁塩およびＥＤＴＡの効果を評価した。
【００６２】
結果
図３に、培養Ｃａｃｏ−２細胞の存在下での、ＧＰＥのペプチド分解に対する胆汁塩（ＳＤＡ）およびＥＤＴＡの効果について示す。ＧＰＥの分解は、ＳＤＡ（≧５ｍＭ）およびＥＤＴＡ（≧２０ｍＭ）において、有意に阻害された。Ｃａｃｏ−２の存在下でＧＰＥのペプチド分解を妨げる効果の序列は、ＳＤＡ（２０ｍＭ）＞ＳＤＡ（１０ｍＭ）＞ＥＤＴＡ（２０ｍＭ）＞ＳＤＡ（５ｍＭ）＞ＳＤＡ（２ｍＭ）であった。ＧＰＥのペプチド分解の阻害は、用いたＳＤＡの投与量に比例した。
【００６３】
結論
このインビトロでの研究により、アミノペプチダーゼおよびエンドペプチダーゼを含むペプチダーゼが、Ｃａｃｏ−２細胞によるＧＰＥの分解に関与できることが示された。ＳＤＡ（５〜２０ｍＭ）およびＥＤＴＡ（２０ｍＭ）は、このような分解を防ぐように、有意に阻害することが示された（図３）。したがって、ペプチダーゼ阻害剤またはプロテアーゼ阻害剤は、Ｇ−２ＭｅＰＥの生物利用効率を改善することができる。
【００６４】
実施例５
ＧＰＥおよびＧ−２ＭｅＰＥの細胞毒性
目的
本研究の目的は、ＧＰＥおよび／またはＧ−２ＭｅＰＥが、細胞の成長を阻害しうるか否かを決めることである。この論拠は、もしＧ−２ＭｅＰＥが腸の細胞成長を阻害するのであれば、このような成長の阻害は、許容可能なＧ−２ＭｅＰＥの投与量を限定しうるからである。スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）を用い、Ｃａｃｏ−２細胞の成長を阻害するのに必要な５０％阻害濃度（ＩＣ50）を決めた。Ｃａｃｏ−２細胞単層を通過する輸送研究のために安全な投与量を決定したいと考えた。
【００６５】
方法
スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）は、培養細胞の細胞タンパク質の定量化に用いる際に有用なタンパク質染料であると判明している。この染料は、細胞内タンパク質の塩基性アミノ酸に結合すると考えられている。したがって、結合染料の比色分析測定をすることにより、推定細胞数を得ることができる。この検定方法は、単純で再現性があり、この終点測定では、時間は問題とはならず、テトラゾリウム誘導体を用いた検定に対して、有意な利点がある。
【００６６】
Ｃａｃｏ−２細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から購入し、１０％ウシ胎仔血清、１％ペニシリン・ストレプトマイシン・グルタミン酸塩、１％の非必須アミノ酸およびトリプシンＥＤＴＡを含有する殺菌したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養された。殺菌したＴ７５フラスコ、２４ウェル培養プレート、９６ウェルマイクロタイタープレート、遠心分離管および先端部は、ライフ・テクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）（ニュージーランド、オークランド在から）から購入した。スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、酢酸、非緩衝トリス塩基（ｐＨ１０．５）およびＤグルコースは、シグマ・アルドリッチ・ケミカルズ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏ．）（ニュージーランド、オークランド在）から購入した。トリパンブルー、および、Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ'−［４−ブタンスルホン酸］（ＨＥＰＥＳ）は、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）から入手した。１２ウェルのトランスウェルインサート（透過性のポリカーボネート膜２４ｍｍ径および１２ｍｍ径、細孔径０．４μｍ）およびプレートは、コーニング・コスター社（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ  Ｃｏｒｐ．（アメリカ合衆国、ニューヨーク州在））から購入した。
【００６７】
ＧＰＥおよびＧ−２ＭｅＰＥを、Ｃａｃｏ−２細胞と共に、９６ウェルプレートで、２４、４８、７２、９６および１２０時間培養した。細胞は、ＴＣＡにより固定され、ＳＲＢが、各ウェルに加えられた。細胞結合染料が、トリス塩基緩衝液を用いて抽出され、この染料を可溶化し、吸収度は、プレートリーダーを用いて５７０ｎｍで決められた。成長の阻害は、相対的な生存能力（％  対照）として表され、ＩＣ50は、対数／プロビット変換後の濃度反応曲線から算出された。
【００６８】
結果
Ｃａｃｏ−２細胞成長に関するＧ−２ＭｅＰＥ（２４〜１２０時間）のＩＣ50は１〜４．６ｍＭであると見出した。ＧＰＥは１５ｍＭの濃度でさえも、Ｃａｃｏ−２細胞の成長を３５％しか阻害せず、したがってＣａｃｏ−２細胞成長のＩＣ50は≧１５ｍＭであった（表１）。
【００６９】
表１：  Ｇ−２ＭｅＰＥの存在下でのＣａｃｏ−２細胞の成長のＩＣ50
2009538269.tif 000003
【００７０】
米国特許７，０４１，３１４号中で、われわれは、Ｇ−２ＭｅＰＥが１０ｎｍ〜１ｍＭの範囲の濃度において、効果的なインビトロでの神経保護化合物であり、１０ｎＭ〜１０μＭという効果的な濃度の範囲が広範囲に渡って水平状態であると見出した（米国特許７，０４１，３１４号図１５参照）。
【００７１】
結論
Ｇ−２ＭｅＰＥのＩＣ50は、インビトロで神経保護を行うと知られているＧ−２ＭｅＰＥの濃度よりも高い。したがって、インビトロで有効であると見出されたのと等価の濃度で、インビボでＧ−２ＭｅＰＥを使用することは、腸上皮細胞に対して毒性を有さないであろうと結論づけた。
【００７２】
実施例６
フルオレセインのＣａｃｏ−２細胞透過性
目的
本研究の目的は、通常の親水性材料がＣａｃｏ−２上皮細胞の密集培養物を通過することにより引き起こされる、みかけの透過係数（Ｐａｐｐ）および経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を決めることである。
【００７３】
方法
Ｃａｃｏ−２細胞培養の完全性は、密集培養物を通るＴＥＲＲおよび14Ｃマンニトールまたはフルオレセインの漏れを測定することにより評価した。密集細胞培養物を有するインサートおよび３００Ω／ｃｍ2の電気抵抗が、本研究には適切であると考えられた。フルオレセインまたは０．５μＣｉ／５０μｌ14Ｃマンニトールが、頂端細胞に加えられ、１〜４時間培養された。容認可能な漏れは、０．５〜１％未満であると考えられた。優良な完全性を持つ６つのインサートが選択されて、輸送緩衝液で洗浄された。全ての頂端細胞および全ての基底外側ウェルの培地は除去された。細胞培養物は、３７℃の暖かい輸送緩衝液で洗浄された。
【００７４】
透過促進剤の効果を決めるために、様々な透過促進剤の存在下または非存在下で、Ｃａｃｏ−２細胞を含有するトランスウェルのドナー側（膜上方で）で、フルオレセインナトリウム（ＭＷ＝３７６）を培養した。標本（０．４ｍｌ）を、レセプター側（膜の下の側）から、１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０および３６０分にそれぞれ採取した。次に、トランスウェルのレセプター側の溶液を、０．４ｍｌの新鮮なＨＢＢＳと置き換え、ドナー側から０．１ｍｌ採取し、（次に、０．１ｍｌの同じ濃度のフルオレセインナトリウムと置き換えた。）。反応は、ドナー側から、各標本に同じ量のＨＣＬ（０．２Ｍ）を加えるか、２％の酢酸と共に３：１でアセトニトリル／メタノールを加えることにより終了した。標本を、１５分間、３０００ｇで遠心分離機にかけた。上澄みを採取し、スピードバキューム（Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃｕｕｍ）で乾燥し、移動相で希釈し、結果として生じた標本を、分光蛍光光度計で分析した。みかけの透過係数を用いて、対照群と処理群との間の透過性を比較した（図４）。ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）電圧計を用いて、様々な時点での経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を測定した。３０〜１８０分の間のＴＥＥＲ値の平均値を、対照群と処理群との間で比較した（図５）。
【００７５】
結果
カプリン酸ナトリウム（１０ｍＭまたは２０ｍＭ）、タウロコール酸ナトリウム（３０ｍＭ）、ＥＤＴＡ（４０ｍＭ）およびＳＤＡ（１ｍＭ）は、それぞれ、３時間の輸送実験中で、Ｃａｃｏ−２上皮細胞のフルオレセインに対する透過性を有意に高め（Ｐ＜０．０５）、ＴＥＥＲを低減した（図４および図５）。しかし、カプリン酸ナトリウム（２０ｍＭ）の効果は、同じ濃度のタウロコール酸塩の効果よりも大きかった（図４）。
【００７６】
結論
タウロコール酸ナトリウム（≧２０ｍＭ）、カプリン酸ナトリウム（≧１０ｍＭ）、ＥＤＴＡ（４０ｍＭ）またはＳＤＡ（１ｍＭ）を用いて、細胞間経路および細胞間隙経路に影響を与えることにより、Ｃａｃｏ−２上皮細胞膜を通過する親水性化合物（フルオレセイン）の透過性を改善することができた。
【００７７】
実施例７
Ｃａｃｏ−２細胞のＧ−２ＭｅＰＥの取り込み
目的
本研究の目的は、Ｃａｃｏ−２細胞によるＧ−２ＭｅＰＥの取り込みを評価し、腸細胞を通過するペプチドの能動活性を探索し、Ｃａｃｏ−２細胞によるＧ−２ＭｅＰＥの取り込みに関して、培養培地のｐＨ、時間、温度および基材の濃度の効果を決めることである。
【００７８】
方法
Ｃａｃｏ−２培養物（５ｍｌのＤＭＥＭ培地中に５×１０5個の細胞）を、６０ｍｍのプラスチック培養ディッシュで成長させた。２〜３日毎に、新鮮な培地に取り替えた。取り込み検定研究のために、細胞を３７℃で１２〜１４日間培養した。取り込み検定研究は、細胞が密集状態になった後、すなわち、１２〜１４日間培養した後に開始した。各ディッシュを、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した。Ｇ−２ＭｅＰＥを、各６０ｍｍの培養ディッシュに加え、３７℃で培養した。Ｇ−２ＭｅＰＥを加えた後、５秒、１５秒、３０秒、４５秒、１分、２分、５分、１０分、１５分、３０分および１２０分の時点で標本を採取した。セルスクレーパーで細胞を擦り取った後、抽出溶液中にいれ、２０分間、２０，０００ｇで遠心分離機にかけた。上澄みをＨＰＬＣで分析し、Ｇ−２ＭｅＰＥとその代謝産物を識別した。ペレットは、ＮａＯＨで希釈され、ローリー検定によりタンパク質含有量を決めた。
【００７９】
結果および議論
この研究は、Ｇ−２ＭｅＰＥが、Ｃａｃｏ−２細胞により取り込まれたことを示す（すなわち、１．３％、図６）。Ｇ−２ＭｅＰＥの取り込みは、時間に依存し、投与量に依存した。
【００８０】
実施例８
Ｃａｃｏ−２細胞を通過するＧ−２ＭｅＰＥの透過性、透過促進剤の効果
目的
本研究の目的は、透過促進剤が、Ｃａｃｏ−２細胞膜を通過するＧ−２ＭｅＰＥの輸送を増加させることができるか否かを決めることである。
【００８１】
方法
細胞培養の完全性は、実施例６で記載したように確認された。様々な透過促進剤の存在下または非存在下で、Ｃａｃｏ−２細胞を含むトランスウェルのドナー側に、Ｇ−２ＭｅＰＥが、３回または６回繰り返して加えられた（図４）。１．５ｍｌの輸送緩衝液が、レセプター側に加えられた。その後、トランスウェルは、培養のために放置された。標本（各０．４ｍｌ）は、レセプター側で、異なる時点（１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０および３６０分）で採取された。各標本の採取後、０．４ｍｌの新鮮な緩衝液を、トランスウェルの側に加え、そこから標本を取った。続いて、０．１ｍｌのドナー溶液を採取して、無傷のＧ−２ＭｅＰＥの濃度を測定した。各サンプリングの後、０．１ｍｌの同じ濃度のＧ−２ＭｅＰＥで置き換えられた。
【００８２】
ペプチド分解は、各標本に同じ量のＨＣＬ（０．２Ｍ）を加えることにより終了した。結果として得られた標本は、１５分間、３０００ｇで遠心分離機にかけた。上澄みを採取し、スピードバキューム（Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃｕｕｍ）で乾燥させ、移動相で希釈し、分光蛍光光度計で分析した。みかけの透過係数を算出し、これを用いて、対照群と処理群との間の透過性を比較した（図７）。ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）電圧計を用いて、様々な時点での経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を測定した。３０〜１８０分間のＴＥＥＲ値の平均値を、対照群と処理群との間で比較した。
【００８３】
結果
ＥＤＴＡ（３０ｍＭ）、カプリン酸ナトリウム（２０ｍＭ）、タウロコール酸ナトリウム（２０ｍＭおよび３０ｍＭ）、クエン酸（３０ｍＭ）およびバシトラシン（３．５ｍＭ）は、それぞれ、Ｇ−２ＭｅＰＥに対するＣａｃｏ−２上皮細胞の透過性を有意に高めた（図７）。ＴＥＥＲは、ＥＤＴＡ（３０ｍＭ）、カプリン酸ナトリウム（２０ｍＭ）、タウロコール酸ナトリウム（２０ｍＭおよび３０ｍＭ）、クエン酸（３０ｍＭ）を用いることにより、有意に低減した（データ不図示）。
【００８４】
結論
タウロコール酸ナトリウム（≧２０ｍＭ）、カプリン酸ナトリウム（≧１０ｍＭ）、ＥＤＴＡ（４０ｍＭ）またはＳＤＡ（１ｍＭ）を用いて、おそらくは細胞間経路および細胞間隙経路に影響を与えることにより、Ｃａｃｏ−２上皮細胞膜を通過するＧ−２ＭｅＰＥの透過性を改善することができた（図７）。
【００８５】
顕著なことに、および、全く予期しなかったことであるが、カプリル酸塩およびタウロコール酸塩のフルオレセインおよびＧ−２ＭｅＰＥの取り込みに関する効果は、相当異なっていた。フルオレセインに関しては上述したように（図４）、２０ｍＭカプリル酸塩の効果は、２０ｍＭのタウロコール酸塩の効果よりも大きかった。しかし、驚くべきことに、Ｇ−２ＭｅＰＥの取り込みに関しては、２０ｍＭのタウロコール酸塩は、２０ｍＭのカプリル酸塩よりも、はるかに大きい効果があった（図７）。この観察のメカニズムについてはわかっていないが、フルオレセインとは異なる、Ｇ−２ＭｅＰＥの予期せぬ特性を示している。
【００８６】
実施例９
インビトロでのＧＰＥおよびＧ−２ＭｅＰＥのタンパク質結合
目的
本研究の目的は、ＧＰＥおよびＧ−２ＭｅＰＥに対する血清タンパク質結合が、インビボでのこれらの薬物の生物利用効率を変えうるか否かに関する。この論拠は、もしこれらの薬物が、血漿タンパク質により結合されるのであれば、遊離（結合されない）薬物を低減し、神経保護効能を低減することになりうる。
【００８７】
方法
限外ろ過法を用いて、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社、アメリカ合衆国在）の存在下での遊離ＧＰＥおよびＧ−２ＭｅＰＥの画分測定する。異なる分量のＧＰＥおよびＧ−２ＭｅＰＥ（１ｇ／Ｌ）を、アルブミン（８８ｇ／Ｌ）またはミリＱ（ＭｉｌｌｉＱ）水と共に混合し、各システムを３部（全体量は１０ｍｌ）調製した。各システムの結合分画および未結合分画を、ウシ血清アルブミンから、限外ろ過ユニット（セントリザルト（Ｃｅｎｔｒｉｓａｒｔ）  Ｉ（登録商標），分子量１０，０００ダルトンを除去、ザルトリウス・バイオラボ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｂｉｏｌａｂ））を用いて分離した。
【００８８】
システム１（図８および図９中の、左の３つの棒）は、５ｍｌのＧＰＥまたは５ｍｌのＧ−２ＭｅＰＥを、それぞれ５ｍｌアルブミンと１：８８の割合で混合して調製した。
【００８９】
システム２（図８および図９中の、中央の３つの棒）は、５ｍｌアルブミンと、２．５ｍｌのＧＰＥまたは２．５ｍｌのＧ−２ＭｅＰＥと、２．５ｍｌのミリＱ水とを、薬物対アルブミンの割合がそれぞれ１：１７６になるように混合して調製した。
【００９０】
システム３（図８および図９中の、右の３つの棒）は、２．５ｍｌアルブミンと、５ｍｌのＧＰＥまたは５ｍｌのＧ−２ＭｅＰＥと、２．５ｍｌのミリＱ水とを、薬物対アルブミンの割合がそれぞれ１：４４になるように混合して調製した。非特定的な対照は、様々なシステムの存在下での、最初のＧＰＥまたはＧ−２ＭｅＰＥの全量として、２．５ｍｌまたは５ｍｌのＧＰＥまたはＧ−２ＭｅＰＥと、７．６ｍｌまたは５ｍｌの水と混合して調製した。全システムともに、よく混ぜ合わせ、４℃で１．５時間放置した。
【００９１】
各システムから２ｍｌの標本を取り、別の限外ろ過ユニットに移した。全標本を、遠心分離する前に２５℃で平衡させた。３部にした標本を５分間、１０００ｇで予め遠心分離し、標本とユニットの膜とを十分接触させた。予めの遠心分離の後、全標本を、３０分間、２５００ｇで遠心分離した。限外ろ過液（Ｃｕ）中の、各システムの非結合のＧＰＥまたはＧ−２ＭｅＰＥ（ろ過された液体）を、注意して、ラベルをつけた乾燥管中に除去し、ＨＰＬＣにより、アクア（Ａｑｕａ）５ｕ、２５０×４．６ｍｍ、Ｃ１８カラム（フェノメネックス（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）、ニュージーランド、オークランド在）を、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）  ２６９５アライアンス（Ａｌｌｉａｎｃｅ）分離モデル、および、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）２９９６ＰＤＡ検出器に接続し、２１０ｎｍにおける吸収を測定して、分析した。ＧＰＥまたはＧ−２ＭｅＰＥの結合百分率を、以下の式により決めた。
ＧＰＥまたはＧ−２ＭｅＰＥの結合百分率＝［１−Ｃｕ／ｃｔ］×１００
ここで、Ｃｔは、アルブミンでの培養前に限外ろ過ユニット中に存在する、全ＧＰＥまたはＧ−２ＭｅＰＥの濃度を示し、
ここで、Ｃｕは、アルブミンでの培養後に限外ろ過ユニット中に存在する、全ＧＰＥまたはＧ−２ＭｅＰＥの濃度を示す。
【００９２】
結果
図８の各システムの左側の棒は、アルブミンでの培養前のシステム１、２および３の各システム中にあるＧＰＥの量（単位  ｍｇ）を示す。図８の各システムの中央の棒は、ＧＰＥでの培養前のシステム１、２および３の各システム中にあるアルブミンの量（単位  ｍｇ）を示す。図８の各システムの右側の棒は、アルブミンへのＧＰＥの結合百分率を示す。
【００９３】
図９の各システムの左側の棒は、アルブミンでの培養前のシステム１、２および３の各システム中にあるＧ−２ＭｅＰＥの量（単位  ｍｇ）を示す。図９の各システムの中央の棒は、Ｇ−２ＭｅＰＥでの培養前のシステム１、２および３の各システム中にあるアルブミンの量（単位  ｍｇ）を示す。図９の各システムの右側の棒は、アルブミンへのＧ−２ＭｅＰＥの結合百分率を示す。
【００９４】
Ｇ−２ＭｅＰＥは、ＧＰＥよりもタンパク質結合が少なく、結合レベルは、用いたタンパク質の量に比例した（図８および図９）。
【００９５】
結論
予想外であるが、Ｇ−２ＭｅＰＥはＧＰＥよりもたんぱく質結合が低く、したがって、Ｇ−２ＭｅＰＥはインビボでの使用に適していると見出した。図８と図９とを比較すると認識できるように、薬物対タンパク質の割合が最高値である（１：８８および１：４４）であるときに、Ｇ−２ＭｅＰＥのアルブミンへの結合はより少なかった。これに対して、薬物対タンパク質の割合が同じ場合で（１：８８および１：４４）、より多いＧＰＥが結合されたままの状態であった。この驚くべき現象のメカニズムの説明はつかないが、薬物と血漿タンパク質との結合は、薬物の薬物速度論的特性および薬理学的特性に、著しく影響を与えることができる。これは、分子量が小さいことにより、非結合の薬物は、血管壁をより容易に通り抜けることができ、タンパク質結合薬物は、分子量が大きいためこれができないという事実による。さらに、ヒトの血清アルブミン（ＨＳＡ）やα−１−酸−グリコタンパク質（ＡＧＰ）などの血漿タンパク質の本来的なキラリティにより、薬物と血漿タンパク質との結合は、立体選択的な性質も有する。さらに、多くの治療用分子は、タンパク質と結合している間は、それほど活性がない。
【００９６】
したがって、タンパク質結合が多いほど、薬剤の有効濃度が小さくなり、したがって、治療効能も小さくなる。Ｇ−２ＭｅＰＥは、生物利用効率が高いので、Ｇ−２ＭｅＰＥはインビボにおける経口使用において、有効な神経保護剤でありえる。
【００９７】
実施例１０
腸溶コーティング錠剤は、Ｇ−２ＭｅＰＥの安定性を改善する
目的
本研究の目的は、腸溶コーティング錠剤が、Ｇ−２ＭｅＰＥの生物利用効率を高めることができるか否かを決定することである。
【００９８】
方法
錠剤調製
Ｇ−２ＭｅＰＥ、クエン酸錠剤分解物質、ポリビニルピロリドン、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよびラクトースを含有する０．１４〜０．２ｇの粉末の混合物を、錠剤空洞に充填し、直接錠剤に圧縮した。オイドラギット（ＥＵＤＲＡＧＩＴ）（登録商標）Ｌ１００−５５、ジブチルフタレート、タルクおよびイソプロパノールを含有するコーティング溶液を用いて、錠剤をコーティングした。コーティング工程は、特定のコーティング施設を用いて行った。コーティング材料は、錠剤重量の約１％であった。
【００９９】
ＢＰ崩壊試験
崩壊試験は、ビーカーを１１個と、３０ｒｐｍで上下に動き、かつ、錠剤用のラックアセンブリを含む硬いバスケットを運ぶ電動式シャフトとを用いて行った。アセンブリは、各管からなる。崩壊アセンブリのそれぞれに、６つの錠剤を入れた。各アセンブリは、０．１Ｍの塩酸を含有するビーカー内でつるされ、１２０分間ディスクなしで作動された。次に、アセンブリを液体から取り出し、これを調べた。コーティングの破片以外、含有物が出たことを示す割れ目の兆候や、崩壊の兆候を示した錠剤はなかった。ビーカー中の０．１Ｍの塩酸をｐＨ７のリン酸塩緩衝液に置き換えて、各管にディスクを付け加えた。さらに６０分間３０ｒｐｍで、装置を作動した。錠剤は、６つの錠剤全てが崩壊しなかった場合に、試験合格とした。
【０１００】
結果と結論
腸溶コーティング錠剤を製剤し、これらがＢＰ崩壊試験に合格した。腸溶コーティング錠剤は、Ｇ−２ＭｅＰＥの経口投与にとって適切な製剤になることができるとの結論に至った。
【０１０１】
実施例１１
Ｇ−２ＭｅＰＥ微小粒子
目的
本研究の目的は、微小粒子が、Ｇ−２ＭｅＰＥを胃内のペプシンなどの酵素分解から保護することができるか否かを決めることである。このために、インビトロで、様々なｐＨの溶液中で一連の実験を行った。
【０１０２】
方法
様々な量のＧ−２ＭｅＰＥまたはフルオレセインナトリウムを、オイドラギット（ＥＵＤＲＡＧＩＴ）（登録商標）ＦＳ３０Ｄの３０％分散液で溶かし、遠心分離機の管に移した。標本を含有する管を、−８０℃で凍結し、標本を一晩乾燥させるために乾燥凍結機に移した。乾燥後、遠心分離管の重量を測定した。微小粒子の調製液各２０ｍｇ（ポリマーと薬物の割合は、約２０：１、１０：１、１：５および１：２．５）を０．１Ｍ塩酸２００ｍｌまたは０．２Ｍのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７）２００ｍｌを含有する溶液に加えた。様々な時点で標本を採取した。
【０１０３】
フルオレセインナトリウムを分析するために、９６ウェルプレート中に、３部にした標本を加えた。このプレートを、蛍光マイクロプレートリーダー（ワラック（Ｗａｌｌａｃ）１４２０、ビクター（Ｖｉｃｔｏｒ）、複数のリーダー）の４９５ｎｍの励起波長を用いて、および、５２０ｎｍでの蛍光読み取りすることにより、読み取った。Ｇ−２ＭｅＰＥの標本３部の分析は、ＨＰＬＣにより、アクア（Ａｑｕａ）５μ、２５０×４．６ｍｍ、Ｃ１８カラム（フェノメネックス（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）、ニュージーランド、オークランド在）を、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）  ２６９５アライアンス（Ａｌｌｉａｎｃｅ）分離モデル、および、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）２９９６ＰＤＡ検出器に接続し、２１０ｎｍにセットした吸収で行った。
【０１０４】
結果と結論
微小粒子を調製し、インビトロで、酸性培地と中性培地とで試験を行った。腸溶コーティングポリマーであるオイドラギット（ＥＵＤＲＡＧＩＴ）（登録商標）を含む微小粒子は、胃の酸に対して耐性があり、腸管の至る所で放出された。親水性化合物のモデルであるフルオレセインナトリウムの微小粒子からの放出は、ｐＨ７において、ｐＨ１の培地中の放出よりも、約４倍速かった。この結果により、腸溶コーティングポリマーが、経口投与後にＧ−２ＭｅＰＥの治療効率を高めることができることが確認された。微小粒子は、持続放出が可能である物質の放出時間の制御も行った。（図１０Ａおよび図１０Ｂ）。
【０１０５】
腸溶コーティングは、ｐＨが小さい（例えば、＜３．０）胃中でのＧ−２ＭｅＰＥの放出を遅らせることができ、ｐＨが中性により近い十二指腸、空腸、回腸または結腸においては、この放出を高めることができるとの結論に至った。
【０１０６】
実施例１２
Ｇ−２ＭｅＰＥマイクロエマルジョン
目的
本研究の目的は、Ｇ−２ＭｅＰＥを含有する油中水滴マイクロエマルジョンの製剤を行うことである。
【０１０７】
材料および方法
オイル：  カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド（クロダモル（Ｃｒｏｄａｍｏｌ）  ＧＴＣＣ（登録商標））は、ケムカラー・インダストリーズ（ＮＺ）社（Ｃｈｅｍｃｏｌｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  （ＮＺ）Ｌｔｄ）（ニュージーランド、オークランド在）から供給を受けた。Ｃ８／Ｃ１０のモノ／ジグリセリドは、アビテック社（Ａｂｉｔｅｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（ウィスコンシン州、ジェーンズヴィル在）から供給を受けた。
【０１０８】
界面活性剤：  ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート（ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０（登録商標））、ソルビタンモノオレエート（スパン（Ｓｐａｎ）８０（登録商標））は、ジグマ−アルドリッヒ・ヒェミー（ドイツ、シュタインハイム在）から入手した。
【０１０９】
薬物およびその他の化学物質：  Ｇ−２ＭｅＰＥは、米国特許７，０４１，３１４号（本願中に参照することにより完全に盛り込まれている）に記載された方法で、製造された。リン酸二水素カリウム、塩化カリウムおよびオルトリン酸は、シャルラウ・ケミー（Ｓｃｈａｒｌａｕ  Ｃｈｅｍｉｅ）（スペイン、バルセロナ在）から購入した。
【０１１０】
擬三次ダイアグラムの構成：  クロダモル（Ｃｒｏｄａｍｏｌ）  ＧＴＣＣ（登録商標）およびカプマルＭＣＭ（登録商標）を、別々に重量測定し、それぞれ３：１の割合（４５ｇ：１５ｇ）で混合し、完全に混合するためにボルテックスした。界面活性剤であるツイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０（登録商標）およびスパン（Ｓｐａｎ）８０（登録商標）を、別々に重量測定し、それぞれ３：２の重量割合（３６ｇ：２４ｇ）で混合した。この混合は、十分に行った。３００ｍｇ／ｍｌのＧ−２ＭｅＰＥ原液の調製を９００ｍｇのＧ−２ＭｅＰＥを３ｍｌの生理食塩水中で懸濁させて、さらにこの溶液を、Ｇ−２ＭｅＰＥの濃度（１５０ｍｇ／ｍｌ）になるように、３ｍｌのリン酸塩緩衝液ｐＨ３（イオン強度は０．１モル／リットルに等しい）（１：１）に希釈することにより行った。Ｇ−２ＭｅＰＥを含有する水相を、一晩室温で放置し、平衡させた。オイル（クロダモル（Ｃｒｏｄａｍｏｌ）  ＧＴＣＣ（登録商標）およびカプマルＭＣＭ（登録商標）の、３：１の割合での混合物）と、非イオン性界面活性剤（ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０（登録商標）とスパン（Ｓｐａｎ）８０（登録商標）との、３：２の割合での混合物）と、Ｇ−２ＭｅＰＥを１５０ｍｌ／ｍｌの濃度で含有する水相とを含む、多くの標本（２５０を上回る標本）を調製し、一晩室温で放置し、平衡させた。通常光の顕微鏡検査および偏光顕微鏡検査を用いて、マイクロエマルジョン、液晶または粗エマルジョンを生じさせる組み合わせを特定した。
【０１１１】
Ｇ−２ＭｅＰＥを含有するマイクロエマルジョンの調製：  クロダモル（Ｃｒｏｄａｍｏｌ）ＧＴＣＣ（登録商標）およびカプマルＭＣＭ（登録商標）を上述の割合で混合した。非イオン性界面活性剤を、上述の割合で混合した。Ｇ−２ＭｅＰＥ含有原液を、上述のように調整した。クロダモルとカプマルとの混合物（７．６ｇ）を、小さなビーカーに加え、続いて、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０（登録商標）とスパン（Ｓｐａｎ）８０（登録商標）との混合物（２ｇ）を加え、１０分間１０００ｒｐｍで攪拌する磁石を用いて、２つの成分を完全に混合した。
【０１１２】
Ｇ−２ＭｅＰＥ溶液（０．４ｇ）を、上述の混合物に、滴として加えた。（滴毎に１０μｌ）１０ｇのマイクロエマルジョンシステム中の、クロダモルおよびカプマル：ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０（登録商標）およびスパン（Ｓｐａｎ）８０：Ｇ−２ＭｅＰＥの割合は、７．６：２：０．４であった。１リットル毎に６ｍｇのＧ−２ＭｅＰＥを含有するマイクロエマルジョンは、視覚的に、等方性がある透明な溶液として特定され、熱力学的に安定していた。粗エマルジョンは、その濁度と等方性とにより特定された。液晶は、その特徴的な複屈折性（すなわち、等方性がないこと）および偏光中の干渉パターンの外観により特定された。液晶のこのような特性は、大きなクラスタ中で互いに平行である分子の方向性にも関連付けられることができ、これは顕微鏡下で見ることができる。
【０１１３】
結果および結論
成分の擬三次ダイアグラム（図１１）を作り、異なる領域の境界を特定した。ＭＥはマイクロエマルジョン、ＬＣは液晶、ｃｏａｒｓｅは、粗エマルジョンである。三角内の点線領域は、粗エマルジョンを提供する割合である。レンガ模様で示した領域は、液晶製剤を示し、チェック模様で示した領域は、マイクロエマルジョンを示す。
【０１１４】
Ｇ−２ＭｅＰＥマイクロエマルジョンは、２００ｎｍ未満の均一な滴サイズを持つことが観察された。脂質ベースのマイクロエマルジョンは、酵素分解に対して薬物を保護し、かつ界面活性剤により膜流動性の増進が誘発され、薬物の吸収が増進されるので、薬物の安定性を向上させることができ、ペプチドを含む薬物の経口デリバリーには有利である。マイクロエマルジョン、粗エマルジョンおよび液晶製剤を用いて、経口利用可能なＧ−２ＭｅＰＥをデリバリーすることができるとの結論に至った。
【０１１５】
実施例１３
ポリマーナノカプセル（Ｎａｃ）中のＧ−２ＭｅＰＥ
目的
本研究の目的は、化合物を分解しないように保護し、腸上皮を通じた輸送を容易にする、Ｇ−２ＭｅＰＥのナノカプセル・デリバリーシステムを開発することである。
【０１１６】
方法
界面重合法を用いて、ポリマーナノカプセル（Ｎａｃ）を調製した。まず、実施例１２で記載した方法を用いて、マイクロエマルジョンを調製した。次に、マイクロエマルジョン２（ＭＣ２）１０ｇを、以下の実施例１４で記載する方法で調製した。ＥＣＡ（エチル−２−シアノアクリレート）モノマー（シグマ社、ミズーリ州、セントルイス在）１００ｍｇ、１５０ｍｇまたは３００ｍｇを、３００ｇのクロロホルムと共に、エッペンドルフチューブ中で混合し、ボルテックスした。約８００ｒｐｍで４℃での磁性攪拌中に、このモノマー溶液をＭＣ２に滴として加え、一晩放置し、ポリマー重合を生じさせた。
【０１１７】
結果として得られた生成物を、２５℃で６０分間、５１，５００ｇで遠心分離機（ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）  Ｌ−７０遠心分離機、７０Ｔｉロータ）にかけて、Ｎａｃを単離した。上澄みを除去した後、沈殿物を空気乾燥し、続いてボルテックスによりエタノール中で分散させ、次に、過剰なオイルと界面活性剤とを除去するために超音波処理した。これを、次に２５℃で１５分間、〜１６００ｘｇで遠心分離機にかけた（シグマ  １〜１３マイクロ遠心分離機）。洗浄工程を３度繰り返し、各標本から、全ての残留物が確かに除去されるようにした。
【０１１８】
その後、結果として得られた生成物を、ミリＱ水中で再分散させ、一晩−２０℃で凍結させ（レオナルド（Ｌｅｏｎａｒｄ）大型冷凍庫、フィッシャーアンドパイケル社（Ｆｉｓｃｈｅｒ ａｎｄ Ｐａｙｋｅｌ Ｌｔｄ．）、ニュージーランド在）、続いて、１日間−５２℃で、バルク・トレイ・ドライヤー・システム（Ｂｕｌｋ Ｔｒａｙ Ｄｒｙｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ）（ラブコンコ社、アメリカ合衆国在）を用いて、３０×１０-3ミリバールの真空で、凍結乾燥させた。
【０１１９】
結果および結論
Ｇ−２ＭｅＰＥマイクロエマルジョン含有ポリマーナノカプセルは、小さい球面のカプセルで、概して径が１００〜２００ｎｍの範囲の大きさのものである（図１２Ａおよび図１２Ｂ）。ナノカプセルは、ペプチドの経口生物利用効率を高めるために使われてきたが、これはナノカプセルが、タンパク質分解からペプチドを保護することができるからである。さらに、ナノカプセルは、腸粘膜を通過し、したがって、腸管腔からのペプチドの吸収を容易にすることができる。ナノ粒子は、３つの異なる経路で、腸粘膜を通って移動することがわかっている。この３つの経路とは、ＧＡＬＴのパイエル板、細胞内経路および細胞間経路である。
【０１２０】
Ｇ−２ＭｅＰＥ含有ナノカプセルを、Ｇ−２ＭｅＰＥの有効な経口デリバリーとして用いることができるとの結論に達した。
【０１２１】
実施例１４
マイクロエマルジョン、液晶および粗エマルジョンからのＧ−２ＭｅＰＥの放出
目的
本研究の目的は、本発明の異なる相システムからのＧ−２ＭｅＰＥの放出特性を決めることである。
【０１２２】
方法
薬物放出研究は、垂直型フランツ細胞（モデル  ＶＴＣ−２００）を用いて行われた。実施例１２に基づいて調製された３つの異なる相システムのそれぞれから、１つの製剤を選択した。マイクロエマルジョン１（ＭＣ１）は、リン酸塩緩衝液ｐＨ３中の、ＧＴＣＣ：ＭＣＭ（３：１）を６０％と、界面活性剤（ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０（登録商標）：スパン（Ｓｐａｎ）８０（登録商標））（３：２）を３０％と、１５０ｍｇ／ｍｌのＧ−２ＭｅＰＥを１０％とからなる。マイクロエマルジョン２（ＭＣ２）は、リン酸塩緩衝液ｐＨ３中の、ＧＴＣＣ：ＭＣＭ（３：１）を４５％と、界面活性剤（ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０（登録商標）：スパン（Ｓｐａｎ）８０（登録商標））（３：２）を２５％と、１５０ｍｇ／ｍｌのＧ−２ＭｅＰＥを３０％とからなる。液晶は、リン酸塩緩衝液ｐＨ３中の、ＧＴＣＣ：ＭＣＭ（３：１）を１５％と、界面活性剤（ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０（登録商標）：スパン（Ｓｐａｎ）８０（登録商標））（３：２）を７０％と、１５０ｍｇ／ｍｌのＧ−２ＭｅＰＥを１５％とからなる。粗エマルジョンは、リン酸塩緩衝液ｐＨ３中の、ＧＴＣＣ：ＭＣＭ（３：１）を１６％と、界面活性剤（ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０（登録商標）：スパン（Ｓｐａｎ）８０（登録商標））（３：２）を１４％と、１５０ｍｇ／ｍｌのＧ−２ＭｅＰＥを７０％とからなる。上述の様々な量の製剤のＧ−２ＭｅＰＥ標本０．２５ｇを三部、フランツ細胞に移し、薬物放出研究を行った。
【０１２３】
セルロース膜透析管を、実験開始前に２４時間水に浸した。この膜は、Ｇ−２ＭｅＰＥの透過を選択的に許容し、ＭＣ成分がドナーコンパートメント中に分散するのを回避する。この研究中、垂直型フランツ細胞を用いて、薬物放出曲線を得た。垂直型フランツ細胞は、上部がドナー室からなり、その下にレセプター室があり、これが、透析膜により分離されている。周期的に、標本を、サンプリングポートを通じて、レセプター室から採取した。レセプター室の壁は、加熱器に連結されたウォータージャケットにより取り囲まれ、細胞中の温度が一定に保たれた。
【０１２４】
各フランツ細胞のレセプターコンパートメントを、ｐＨ７．４のリン酸塩緩衝液で充填した。一方、ドナーコンパートメントは、選択したＧ−２ＭｅＰＥの製剤を含有させた。ドナーコンパートメントは、密閉フィルム（パラフィルム（Ｐａｒａｆｉｌｍ）「Ｍ」、ペシニー・プラスチック・パッケージング社（Ｐｅｃｈｉｎｅｙ  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ）、イリノイ州、シカゴ在）で密閉した。この実験を通じて、３つのフランツ細胞を、上述のように調製した各製剤に割り当てた。ここでレセプター培地は、〜３７℃の温度に保たれた。標本（４００μｌ）を、０、２、５、１０、１５、２０、３０、４５、６０、９０、１２０、１８０、２４０、３００、４８０、６００、７２０および１４４０分でレセプターコンパートメントから採取し、同量の新鮮な緩衝液をレセプターに再充填した。各標本の吸収度を、ＵＶ分光光度計（バイオクロム  リブラ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  Ｌｉｂｒａ）  Ｓ３２ＰＣ）を用いて、波長２１０ｎｍで測定した。各標本のＧ−２ＭｅＰＥの濃度を算定するために、標準的な曲線を用いた。薬物放出曲線を、図１３に示した。
【０１２５】
結果
薬物放出曲線は、マイクロエマルジョンおよび液晶製剤が、持続的にＧ−２ＭｅＰＥを放出することを示したが、予想外に、粗エマルジョンは、Ｇ−２ＭｅＰＥをかなり迅速に放出した（図１３）。ＭＣ２は、実施例１７および実施例１８に記載するインビボ研究用に選択した。
【０１２６】
結論
これらの研究から、これら３つの相システムはいずれも、Ｇ−２ＭｅＰＥを用いた治療に有益であるとの結論に達した。まず、マイクロエマルジョンおよび液晶は、比較的ゆっくりとしたＧ−２ＭｅＰＥの持続放出が望ましい状況下で用いることができる。次に、粗エマルジョンは、比較的迅速なＧ−２ＭｅＰＥの放出が望ましい時に用いることができる。最後に、マイクロエマルジョンと粗エマルジョンとの組み合わせ、または、液晶と粗エマルジョンとの組み合わせは、Ｇ−２ＭｅＰＥの迅速な放出と持続放出との両方が望まれるときに、用いられるのが望ましい。
【０１２７】
実施例１５
経口投与されたＧ−２ＭｅＰＥの生物利用効率
目的
本研究の目的は、インビボでの様々なデリバリーシステムからのＧ−２ＭｅＰＥの放出を調べることである。
【０１２８】
方法
実験には、７〜９週齢の雄のウィスターラット（Ｗｉｓｔａｒ  Ｒａｔ）を用いた。この動物に、５％のハロタン／酸素混合物を用いて麻酔にかけ、実験を通して、３％のハロタン／酸素混合物下においた。首の正中線に沿って、１０ｍｍの切開を行った。先端が丸い鉗子を用いて、気管の右側に沿って筋肉を分離し、右側頸静脈を露出させた。ポリエチレンカテーテル（外形１．５ｍｍ、内径０．６ｍｍ）を頸静脈に挿入し、縫合により、適所に保った。このカテーテルにより、Ｇ−２ＭｅＰＥの薬物速度論的研究用に、選択した複数の時点で、標本（１００μｌ）を採取することができた。カテーテルを、ヘパリン化された生理食塩水（４０ＩＵ／ｍｌ）で充填し、血栓による閉塞を防いだ。サンプリングは、ラットが完全な全身麻酔下にある間に行い、ラットは、実験終了時に安楽死させた。
【０１２９】
脳脊髄液からのサンプリング
脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプリングされるラットに、５％のハロタン／酸素で麻酔をかけた。ラットの頭部を、固定フレームに載せた。切開は、頭頂を横切る形で行い、頭蓋底を露出させた。２９ゲージの超細針と注射器とを用いて、大槽からＣＳＦをサンプリングした。その後、これらの動物は、ペントバルビタールを過剰投与して（すなわち、１８０ｍｇ／ｋｇ）、心臓を介して、０．９％の生理食塩水を灌流し、安楽死させた。組織は、分析のために採取した。
【０１３０】
インビボでのＧ−２ＭｅＰＥ薬物速度論および生物利用効率
様々な製剤でのＧ−２ＭｅＰＥを選別し、経口生物利用効率の効果を評価した。以下の製剤をテストした。
製剤１（Ｇ−２ＭｅＰＥを、３５．３ｍＭのタウロコール酸（ＴＡ）に溶解させ、１０ｍｇ／ｋｇ  ｎ＝６に投与）
製剤２（Ｇ−２ＭｅＰＥを、微小粒子（ＭＰ）に製剤し、３５．３ｍＭのタウロコール酸（ＴＡ）に分散させ、１０ｍｇ／ｋｇ  ｎ＝６に投与）
製剤３（Ｇ−２ＭｅＰＥを、ＭＰに製剤し、５ｍＭのバシトラシンを含有する３５．３ｍＭのタウロコール酸（ＴＡ）に分散させ、３０ｍｇ／ｋｇ  ｎ＝６に投与）
製剤４（Ｇ−２ＭｅＰＥを、マイクロエマルジョン（ＭＣ）として製剤し、３０ｍｇ／ｋｇ  ｎ＝６に投与）
製剤５（Ｇ−２ＭｅＰＥを、５ｍＭのバシトラシンを含有するＭＣとして製剤し、３０ｍｇ／ｋｇ  ｎ＝６に投与）
製剤６（Ｇ−２ＭｅＰＥを、３５．３ｍＭのＴＡに溶解させ、ＭＣを製剤し、次に、実施例１３のように、このマイクロエマルジョンにＥＣＡを加え、３０ｍｇ／ｋｇ  ｎ＝６に投与）
製剤７（Ｇ−２ＭｅＰＥを、３５．３ｍＭのＴＡに溶解させ、まずＭＣを製剤し、次にＥＣＡモノマーを加え、５ｍＭのバシトラシンを加え、３０ｍｇ／ｋｇ  ｎ＝６に投与）。対照群（ｎ＝６）もテストし、これには、生理食塩水に溶解したＧ−２ＭｅＰＥを、３０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与した。
【０１３１】
採取した血液標本を、１５分間、３３００ｇで遠心分離機にかけた血漿を得た。血漿標本を−８０℃で保存した。その後、血漿標本を解凍し、液体クロマトグラフ／質量分析法（ＬＣＭＳ）で分析した。異なる製剤による、Ｇ−２ＭｅＰＥの生物利用効率および経口投与後の半減期を算出した（表２および図１４）。
【０１３２】
結果
生理食塩水中のＧ−２ＭｅＰＥを投与した場合に比べて、製剤１〜７で投与した場合、Ｇ−２ＭｅＰＥの生物利用効率は有意に増加した（Ｐ＞０．０５）。7つの製剤中、マイクロエマルジョン中のＧ−２ＭｅＰＥおよび微小粒子中のＧ−２ＭｅＰＥが、最高の生物利用効率を示した（図１４）。
【０１３３】
表２：G-2MePE 半減期および生物利用効率
2009538269.tif 000004
** は P < 0.01を表す 
【０１３４】
結論
水溶性の製剤１に比べて、製剤２〜７で、Ｇ−２ＭｅＰＥの生物利用効率は有意に増加した。Ｇ−２ＭｅＰＥの最高の生物利用効率は、マイクロエマルジョンおよび微小粒子を用いた際に見られた（図１４）。したがって、Ｇ−２ＭｅＰＥのエマルジョンおよびカプセル形態が、有効な経口投与型の神経保護剤の製剤であることができるとの結論に達した。
【０１３５】
実施例１６
エンドセリン−１誘発中大脳動脈閉塞症
目的
本研究の目的は、経口投与されたＧ−２ＭｅＰＥが、神経損傷状態を治療する上で有効でありえるか否かを決めることである。
【０１３６】
このために、我々は、ラットに人工的に認識される脳卒中モデルすなわちエンドセリン−１により誘発される中大脳動脈閉塞症（ＭＣＡＯ）を引き起こし、一連の研究を行った。このシステムは、ヒトの脳卒中における神経および行動の、兆候および症状を模倣することで知られており、したがって、得られた結果は、脳卒中を起こしたヒトでの治療効果を予測するものである。梗塞の大きさ、および、ＭＣＡＯが誘発された日と、ＭＣＡＯ誘発の３日後との重量の変化を測定した。
【０１３７】
材料および方法
エンドセリン−１誘発中大脳動脈閉塞症
本研究中で行われた全ての手術および実験手順は、オークランド大学動物倫理委員会によって認証されている。動物の苦痛を最小限に抑えるあらゆる努力がなされ、用いた動物の数を最小限に抑える努力がなされた。雄の成獣であるスプレーグ・ドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）ラット（２８０〜３５０ｇ）を用いた。
【０１３８】
吸入麻酔剤（ハロタン）を、酸素と共に投与し、ラットに麻酔をかけた。始めに、５％のハロタン／酸素混合物を用いて動物に麻酔にかけ、その後、２．５％のハロタンを用いて麻酔状態を維持した。麻酔にかかった後、ガイドカニューレを麻酔がかかったラットの頭蓋骨に埋め込み、歯科用セメントを用いてカニューレを適所に保った。この埋め込み後に、動物の頸静脈にもカニューレを挿入した。２〜３日後に、ラットを再度上述のように麻酔にかけ、シャーキーおよびその同僚による方法（Ｓｈａｒｋｅｙ ｅｔ ａｌ、１９９３年）により、ＭＣＡＯにかからせた。この方法には、各ラットの頭部を固定フレームに載せ、適所に固定することも含まれている。動物は、加熱パッドにも載せた。この加熱パッドは、手術中に、体温を生理的範囲内に維持するよう設計されている。
【０１３９】
頭皮上の毛髪は、はさみで短く刈り取られ、スポンジでふき取られ、ベタジン（Ｂｅｔａｄｉｎｅ）（登録商標）（アイオダイン）で拭い取って乾燥させた。これに続き、頭皮を通る正中線皮膚切開を行い、頭蓋骨の頭蓋幹線（ブレグマ）を露出させた。その後、以下の座標、すなわちブレグマより前方に０．２ｍｍ、および、ブレグマより側方５．２ｍｍの座標で、頭蓋骨を通る形で小さい開口を設けた。ガイドカニューレを通って、２８ゲージ点滴針を、３μｌの生理食塩水中に１００ρモルのブタのエンドセリン−１（Ｅｔ−１，シグマ−アルドリッチ社、アメリカ合衆国、ミズーリ州、セントルイス在）を含有する１０μｌの注射器に連結し、これを頭蓋骨の表面下８．７ｍｍの深さに垂直に挿入した。
【０１４０】
中大脳動脈を収縮させるため、エンドセリン含有溶液を、毎分１μｌの速度で３分間注入した。この点滴後、針を脳から引き抜く前に、さらに５分間適所に保った。皮膚の切開は縫合され、動物は手術からの回復のために加熱された培養器（３７℃）に移された。動物は覚醒すると、ケージに移され、そこで餌および水を自由に摂取できた。ＭＣＡＯ誘発後第２日目に、1匹の動物を研究から除外したが、これは、容認できないほどの体重減少が激しかった（１５％）ためである。
【０１４１】
組織学的手順
薬物での治療後３日目に、これらの動物は、ペントバルビタールナトリウムを過剰投与して犠牲にし、神経細胞の生存を組織学的に評価するために、脳を採取した。ラットには、動脈を通じて０．９％の生理食塩水を灌流させ、続いて１０％のホルマリンを灌流させた。脳を頭蓋骨から除去し、同じ固定液中で少なくとも２４時間保存した。げっ歯類の脳マトリックス（ＲＢＭ−３０００Ｃ／ＲＢＭ−４０００Ｃ、ＡＳＩインストゥルメンツ、アメリカ合衆国在）を用いて、３つの２ｍｍの冠状断面を切り取った。断面Ａは、視神経交差の直前、断面Ｂは、視神経交差の直後で断面Ａの直後、Ｃは、断面Ｂの直後の部分である。これらの断面を、１０％のホルマリン中に、少なくとも２４時間保持し、より高い％のアルコールおよびクロロホルム中で処理し、さらに切断するためにパラフィン中に埋め込んだ。冠状切片は、ライカ（Ｌｅｉｃａ）（登録商標）マイクロトーム（ライカ  インスツルメント（Ｌｅｉｃａ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、ヌスロッホ、ドイツ在）上で、８μｍの厚さに切断され、ポリサイン（Ｐｏｌｙｓｉｎｅ）（登録商標）顕微鏡用被覆スライド（バイオラボ・サイエンティフィック（ＢｉｏＬａｂ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ニュージーランド在）に載せられ、顕微鏡検査の前にチオニン酸フクシンで染められた。
【０１４２】
重量測定
重量変化百分率は、以下の式を使って算出された。
ｗ２−ｗ１／ｗ１×１００％
ここで、ｗ２は、エンドセリン注入後３日目の体重であり、ｗ１は、エンドセリン注入の時点での体重である。
【０１４３】
統計的分析
統計的分析は全て、グラフパッド・プリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）（登録商標）ソフトウェア（バージョン３．０２、グラフパッド・ソフトウェア社（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）、アメリカ合衆国、カリフォルニア州、サンディエゴ在）を用いて行われた。データは平均値±標準誤差を用いて示され、優位性は、ｐ＜０．０５で定義された。
【０１４４】
実施例１７
Ｇ−２ＭｅＰＥのマイクロエマルジョンを経口投与することによりＭＣＡＯを治療
材料および方法
エンドセリン−１誘発中大脳動脈閉塞症
実施例１６で記載したＭＣＡＯ誘発方法を用いた。２４匹の動物にカニューレを挿入し、全動物が、２時間、その後４時間で、エンドセリン−１注入を受けた。１２匹の動物が、Ｇ−２ＭｅＰＥ含有マイクロエマルジョンで経口投与治療を受け、残りの１２匹は、賦形剤で治療を受けた。
【０１４５】
マイクロエマルジョンの調製
Ｇ−２ＭｅＰＥ含有マイクロエマルジョンは、実施例１２に記載の方法で調製された。
【０１４６】
Ｇ−２ＭｅＰＥ治療
ラットには、ＭＣＡＯ後２時間および４時間の時点で、ミリＱ水（ｎ＝１２）またはＧ−２ＭｅＰＥ含有マイクロエマルジョン（Ｇ−２ＭｅＰＥの分量は、マイクロエマルジョン１ｍｌ当り１２ｍｇに相当する）、全体でラット一匹当り８０ｍｇ／ｋｇが投与された。
【０１４７】
組織学的手順、重量測定および統計学的分析
組織学的測定および重量測定は、実施例１６に記載の方法で行った。
【０１４８】
結果
図１５Ａに、Ｇ−２ＭｅＰＥのマイクロエマルジョン製剤が、梗塞サイズを減少させたことを示す。全投与量は、８０ｍｇ／ｋｇであった。賦形剤（ｎ＝１２）：Ｇ−２ＭｅＰＥ（ｎ＝１１）。対応のないｔ検定、ｐ＜０．０００１。
【０１４９】
図１５Ｂに、Ｇ−２ＭｅＰＥのマイクロエマルジョン製剤が、ＭＣＡＯに関連する体重減少を低減させたことを示す。賦形剤（ｎ＝１２）：Ｇ−２ＭｅＰＥ（ｎ＝１１）。Ｇ−２ＭｅＰＥで治療された動物は、賦形剤で治療された動物よりも、体重減少が少なかった。ｐ＝０．００３５。
【０１５０】
結論
この研究から、Ｇ−２ＭｅＰＥのマイクロエマルジョンは、経口投与後、ラットにおけるＭＣＡＯに対する有効な治療であることができるとの結論に至った。この実験システムは、ヒトにおける脳卒中で見られる効果を予測しているので、Ｇ−２ＭｅＰＥのマイクロエマルジョンは、脳卒中にかかったヒトを治療するためにも、経口で活性であることができるとの結論にも達した。
【０１５１】
実施例１８
Ｇ−２ＭｅＰＥマイクロエマルジョンの経口での用量反応研究
目的
本研究の目的は、マイクロエマルジョン１ｍｌあたり６ｍｇのＧ−２ＭｅＰＥを含有するマイクロエマルジョンの、用量反応曲線を確立させることである。
【０１５２】
材料および方法
エンドセリン−１誘発中大脳動脈閉塞症
上述の実施例１６で記載したＭＣＡＯ誘発方法を用いた。３９匹の動物にカニューレを挿入し、全動物が、エンドセリン−１注入を受けた。ＭＣＡＯ後３日の生存期間の終了前に７匹が死に、または犠牲になった。
【０１５３】
マイクロエマルジョンの調製
マイクロエマルジョンは、実施例１２に記載の方法で調製された。
【０１５４】
Ｇ−２ＭｅＰＥでの治療
動物には、ＭＣＡＯ誘発後３時間の時点で治療を行った。動物は、６ｍｇのＧ−２ＭｅＰＥ含有マイクロエマルジョン、または、賦形剤としてのミリＱ水で治療された。薬物は、体重にあわせた分量が与えられ、１５、３０または６０ｍｇ／ｋｇがデリバリーされた。
【０１５５】
組織学的手順、重量測定および統計学的分析
梗塞サイズの測定、体重測定および統計学的分析は、実施例１６に記載の方法で行った。
【０１５６】
結果
経口投与Ｇ−２ＭｅＰＥは、投与量に依存して、脳の梗塞サイズを減少させた。Ｇ−２ＭｅＰＥの最高投与量では、阻害の程度は９４．５％であった（図１６Ａ）。経口投与されたＧ−２ＭｅＰＥが、ＭＣＡＯに関連づけられる体重減少を低減させたことも見出した（図１６Ｂ）。
【０１５７】
結論
経口投与されたＧ−２ＭｅＰＥ含有マイクロエマルジョン製剤は、ラットにおける脳卒中の有害効果を覆すのに有効であることができるとの結論に至った。これ以外の本発明のＧ−２ＭｅＰＥ製剤も、ＭＣＡＯの有害効果を覆すのに有効であることができるとの結論に至った。さらに、ここで研究したＭＣＡＯシステムは、ヒトにおいて見られる治療効果を予測しているので、本発明のＧ−２ＭｅＰＥ含有製剤は、慢性および／または急性の神経障害にかかったヒトを治療するためにも、有効であることができるとの結論にも達した。この神経障害には、脳卒中またはこれ以外の脳損傷および疾患（低酸素症／虚血、アルツハイマー病、パーキンソン病およびこれ以外の慢性的な神経変性疾患など）が含まれる。最後に、本発明のＧ−２ＭｅＰＥ製剤は、急性の損傷（外傷性脳損傷、心筋梗塞、急性の低酸素症もしくは虚血、または、神経変性または細胞死により特徴づけられるこれ以外の障害を含む）に関連する神経変性効果を治療するのにも有用であることができるとの結論に至った。
【０１５８】
実施例１９
Ｇ−２ＭｅＰＥの水溶性製剤の経口投与
目的
Ｇ−２ＭｅＰＥ含有マイクロエマルジョンと、Ｇ−２ＭｅＰＥ含有水溶性製剤との効能を比較する根拠を提供するために、上述に匹敵する研究を行った。しかし、マイクロエマルジョン製剤の代わりに、生理食塩水に溶解されたＧ−２ＭｅＰＥを用いた。
【０１５９】
材料および方法
エンドセリン−１誘発中大脳動脈閉塞症
上述の実施例１６で記載したＭＣＡＯ誘発方法を用いた。
【０１６０】
Ｇ−２ＭｅＰＥ治療
凍結乾燥させたＧ−２ＭｅＰＥを、１０ｍｇ／ｍｌの水で溶解した。エンドセリン−１後５時間の時点で、２ｍｌのＧ−２ＭｅＰＥ製剤、すなわち、６０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝１１）、または、２ｍｌのミリＱ水（賦形剤治療群、ｎ＝１３）を、ＭＣＡＯ後３時間の時点で経口チューブで、各動物に投与した。
【０１６１】
組織学的手順、重量測定および統計学的分析
組織学的手順、体重測定および統計学的分析は、実施例１６に記載の方法で行った。
【０１６２】
結果
Ｇ−２ＭｅＰＥ水溶性溶液の梗塞サイズへの効果
Ｇ−２ＭｅＰＥの水溶性溶液（６０ｍｇ／ｋｇ）の経口投与により、賦形剤治療群（ｎ＝１３、＊Ｐ＜０．０５）に比較して、梗塞領域が有意に減少した（図１７Ａ）。水溶性Ｇ−２ＭｅＰＥによる阻害は、賦形剤治療動物の約６３％であった（図１７Ａ）。これに対して、Ｇ−２ＭｅＰＥのマイクロエマルジョン製剤による阻害は、水溶性製剤によるそれと比べて大きかった（図１６Ａ参照。すなわち、９４％の阻害）。
【０１６３】
体重変化百分率に関する、Ｇ−２ＭｅＰＥの水溶性溶液の効果
Ｇ−２ＭｅＰＥの水溶性溶液（６０ｍｇ／ｋｇ）の経口投与により、ＭＣＡＯにかかった動物での体重減少が、約４分の３低減したが、この効果は統計学的には有意ではなかった（Ｐ＜０．２）（図１７Ｂ）。しかし、Ｇ−２ＭｅＰＥで治療した動物では、体重変化が、統計学的に０ではなかった。
【０１６４】
結論 
この研究から、Ｇ−２ＭｅＰＥのエマルジョン製剤は、単なる水溶性溶液に比べて、薬物の生物利用効率を改善することができ、動物中の薬物濃度を持続し、その結果、これらの製剤は、ヒトおよびこれ以外の動物のインビボでの使用で有用であるとの結論に至った。
【０１６５】
驚くべきことに、経口デリバリーされたマイクロエマルジョンによる神経保護の程度（９５％）は、梗塞サイズの測定によれば、ほぼ完全であると見出した。Ｇ−２ＭｅＰＥの水溶性溶液を経口投与した場合（６３％）に比較して、この効果が予想外により大きいことは、本発明のＧ−２ＭｅＰＥ製剤が、水溶性調製液に対して有利となりうること意味する。したがって、Ｇ−２ＭｅＰＥのカプセル調製液またはマイクロエマルジョン調製液は、神経変性に特徴付けられる様々な状態（脳卒中、低酸素症／もしくは虚血、ＴＢＩ、ＣＡＢＧおよび慢性的な神経変性状態を含む）の治療に関連する神経変性効果を治療するのにも有用であることができる。
【０１６６】
実施例２０
Ｇ−２ＭｅＰＥの静脈注射と経口投与との比較
目的
本研究の目的は、Ｇ−２ＭｅＰＥの水溶性溶液の静脈投与の効果と、マイクロエマルジョン製剤形態でＧ−２ＭｅＰＥを用いた上述の研究中で観察された効果（図１６Ａ）とを比較することである。
【０１６７】
方法
実施例１６と同様に準備した動物を用い、エンドセリン−１誘発ＭＣＡＯを起こした。この場合は、しかし、Ｇ−２ＭｅＰＥを、水溶性溶液として、１．２ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇおよび１２０ｍｇ／ｋｇの投与量で、静脈から、ＭＣＡＯ後４時間に渡って投与した。
【０１６８】
１２匹の動物を、賦形剤（生理食塩水）で治療し、１１匹をＧ−２ＭｅＰＥの水溶性溶液（静脈）で治療した。
【０１６９】
結果
この研究の結果を図１８に示すが、この図は、エンドセリン−１誘発ＭＣＡＯ後に見られた平均的な梗塞範囲を示しているグラフである。静脈投与されたＧ−２ＭｅＰＥの水溶性溶液は、投与量に依存して、梗塞サイズを減少させ、最大の効果は、Ｇ−２ＭｅＰＥの全投与量が１２０ｍｇ／ｋｇの場合に見られた。この水溶性Ｇ−２ＭｅＰＥの投与量による神経保護の程度は、賦形剤で治療した対照動物と比較して約７４．４％であった。データは、一元配置分散分析法とダネットの事後解析テストを用いて（＊＊ｐ＜０．０１）、平均値±標準誤差を用いて示された。
【０１７０】
驚くべきことに、この投与量の半分の投与量（すなわち、６０ｍｇ／ｋｇ）のＧ−２ＭｅＰＥエマルジョン製剤を経口投与することにより、Ｇ−２ＭｅＰＥの水溶性溶液で見られたのよりも、実質的に大きい梗塞サイズの阻害がなされた（９４．５％阻害）ことを見出した。この結果は、Ｇ−２ＭｅＰＥの効果に関するこれ以前の理解に基づくと、全くの予想外であった。
【０１７１】
この研究から、我々の新規のＧ−２ＭｅＰＥの製剤は、急性および／または慢性の神経障害による神経変性を治療する際、ヒトを含む動物にインビボで経口投与するのに有益であることができるとの結論に達した。したがって、これらの製剤は、従来治療が困難であった神経疾患および損傷の治療に進歩をもたらす。
【０１７２】
本願中の記載、実施例および図は、本発明の特定の実施形態を示すために用いられていることを理解されたい。当業者は、これらの開示および本願の教示を用いて、本発明の範囲から離れることなく、自明の変型例、修正例およびこれに代わる実施例を作ることができる。これら全ての変型例、修正例およびこれに代わる実施例は、本発明の一部分であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１７３】
【図１】Ｃａｃｏ−２細胞単層の存在下でのＧＰＥおよびＧ−２ＭｅＰＥ（Ｇ−２ＭｅＰＥ）の安定性を示したグラフである。
【図２】Ｃａｃｏ−２細胞の存在下でのＧ−２ＭｅＰＥの安定性に関してｐＨの効果を示したグラフである。
【図３】Ｃａｃｏ−２細胞によるＧＰＥの分解における酵素阻害剤効果について示すグラフである。
【図４】Ｃａｃｏ−２細胞培養を通過するフルオレセインナトリウムの輸送に関して、透過性促進剤の効果を示すグラフである。
【図５】Ｃａｃｏ−２細胞培養の経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）に関して、透過促進剤の効果を示すグラフである。
【図６】Ｃａｃｏ−２細胞によるＧ−２ＭｅＰＥの取り込みを示すグラフである。
【図７】Ｃａｃｏ−２細胞を通過するＧ−２ＭｅＰＥの輸送に関する透過促進剤の効果を示すグラフである。
【図８】インビトロでのアルブミンによるＧＰＥのタンパク質結合を示すグラフである。
【図９】インビトロでのアルブミンによるＧ−２ＭｅＰＥのタンパク質結合を示すグラフである。
【図１０Ａ】ｐＨ１の培地における、微小粒子からのフルオレセインナトリウムの放出を示すグラフである。
【図１０Ｂ】ｐＨ７の培地における、微小粒子からのフルオレセインナトリウムの放出を示すグラフである。
【図１１】Ｇ−２ＭｅＰＥを含有するマイクロエマルジョンの擬三次ダイアグラムのグラフである。
【図１２Ａ】本発明のナノカプセルの、凍結破断透過型電子顕微鏡の顕微鏡写真である。
【図１２Ｂ】ナノカプセル中に取り込まれた薬物を示す概略図である。
【図１３】Ｇ−２ＭｅＰＥの異なる製剤から放出された薬物の曲線を示すグラフである。
【図１４】Ｇ−２ＭｅＰＥを含有するいくつかの製剤を経口治療した後のラットの血漿中での薬物速度論的グラフである。
【図１５Ａ】ラットにおける中大脳動脈閉塞症（ＭＣＡＯ）後、２時間および４時間の時点でＧ−２ＭｅＰＥ含有マイクロエマルジョン製剤を経口投与した時の、梗塞サイズへの効果を示すグラフである。Ｇ−２ＭｅＰＥの全投与量は、８０ｍｇ／ｋｇであった。賦形剤（ｎ＝１２）：Ｇ−２ＭｅＰＥ（ｎ＝１１）。賦形剤で治療した動物と、Ｇ−２ＭｅＰＥで治療した動物との差は、スチューデントの対応のないｔ検定、ｐ＜０．０００１を用いて検査したところ統計的に有意な差を示した。
【図１５Ｂ】中大脳動脈閉塞症後における、Ｇ−２ＭｅＰＥ含有マイクロエマルジョンの体重変化への効果を示すグラフである。Ｇ−２ＭｅＰＥは、ＭＣＡＯ後、２時間および４時間後に経口投与した。Ｇ−２ＭｅＰＥの全投与量は、８０ｍｇ／ｋｇであった。賦形剤（ｎ＝１２）：Ｇ−２ＭｅＰＥ（ｎ＝１１）。Ｇ−２ＭｅＰＥで治療した動物は、賦形剤で治療した対照動物よりも体重減少が少なかった。スチューデントの対応のないｔ検定によりｐ＝０．００３５。
【図１６Ａ】ＭＣＡＯ後３時間の時点で経口投与した場合の、異なる投与量のＧ−２ＭｅＰＥを含有するマイクロエマルジョンの、梗塞サイズへの効果を示すグラフである。データは、ダネットの事後解析テストと共に、一元配置分散分析法を用いて分析した。データは平均値±標準誤差として示された。賦形剤（ｎ＝９）、１５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝８）、３０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝８）、６０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝７）。＊、ｐ≦０．０５；  ＊＊、ｐ≦０．０１；  ＊＊＊、ｐ≦０．００１。
【図１６Ｂ】ＭＣＡＯ後３時間の時点で経口投与した場合の、異なる投与量のＧ−２ＭｅＰＥを含有するマイクロエマルジョンの、体重変化への効果を示すグラフである。データは、ダネットの事後解析テストと共に、一元配置分散分析法を用いて分析した。データは平均値±標準誤差として示された。賦形剤（ｎ＝８）、１５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝７）、３０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝７）、６０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝７）。＊、ｐ≦０．０５；＊＊、ｐ≦０．０１；＊＊＊、ｐ≦０．００１である。
【図１７Ａ】ＭＣＡＯを引き起こすためのエンドセリン−１（Ｅｔ−１）の注入に続いて、Ｇ−２ＭｅＰＥの水溶性溶液を経口投与しまたは賦形剤で治療し、これによる梗塞範囲（単位、ｍｍ2）への効果を示すグラフである。エンドセリン−１注入の３時間後、Ｇ−２ＭｅＰＥ（６０ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝１１）または賦形剤（ミリＱ水）（ｎ＝１３）をラットに経口投与した。データは、平均値±標準誤差として示す。優位性は、Ｐ＜０．０５で定義した。
【図１７Ｂ】ラットにおいて、Ｅｔ−１により誘発されたＭＣＡＯに続いて、Ｇ−２ＭｅＰＥの水溶性溶液を経口投与しまたは賦形剤で治療し、これによる体重変化への効果を示すグラフである。
【図１８】エンドセリン−１により誘発されたＭＣＡＯに関する、静脈投与されたＧ−２ＭｅＰＥの水溶性溶液の効果を示すグラフである。
【図１】
2009538269.tif 000005
【図２】
2009538269.tif 000006
【図３】
2009538269.tif 000007
【図４】
2009538269.tif 000008
【図５】
2009538269.tif 000009
【図６】
2009538269.tif 000010
【図７】
2009538269.tif 000011
【図８】
2009538269.tif 000012
【図９】
2009538269.tif 000013
【図１０Ａ】
2009538269.tif 000014
【図１０Ｂ】
2009538269.tif 000015
【図１１】
2009538269.tif 000016
【図１２Ａ】
2009538269.tif 000017
【図１２Ｂ】
2009538269.tif 000018
【図１３】
2009538269.tif 000019
【図１４】
2009538269.tif 000020
【図１５Ａ】
2009538269.tif 000021
【図１５Ｂ】
2009538269.tif 000022
【図１６Ａ】
2009538269.tif 000023
【図１６Ｂ】
2009538269.tif 000024
【図１７Ａ】
2009538269.tif 000025
【図１７Ｂ】
2009538269.tif 000026
【図１８】
2009538269.tif 000027
【国際調査報告】
2009538269.tif 000028