(57)【要約】アナライトの標識付けの必要なしに、アナライト、特に、ＳＥ（Ｒ）ＲＳを用いるサンプルにおける核酸を検出する検出方法について開示している。その検出方法は、サンプルにおけるアナライトにより捕捉プローブから標識付けされた代替標的プローブの置き換えに基づく。本発明はまた、そのようなシステムで用いる置き換え可能カートリッジ、並びに代替標的プローブ及び捕捉プローブの組み合わせに対応する検出システムを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルにおける少なくとも１つのアナライトの存在及び／又は量を検出する方法であって：
（ａ）前記サンプルを、
（ｉ）前記アナライトにおける標的配列を特に結合することができるオリゴヌクレオチドを有する少なくとも１つの標的特異捕捉プローブ、及び
（ｉｉ）前記標的特異捕捉プローブを特に結合することができるオリゴヌクレオチドと、表面増強（共鳴）ラマン散乱（ＳＥ（Ｒ）ＲＳ）活性及び蛍光活性のどちらか又は両方を有する標識と、を有する少なくとも１つの置き換え可能代替標的プローブ、
と接触させるステップであって、
前記少なくとも１つの標的特異捕捉プローブが、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面と共有結合しているか又は、前記ステップ（ａ）が前記少なくとも１つの標的特異捕捉プローブをＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面と接触させるステップを更に有するかのどちらかである、
ステップ；並びに
（ｂ）前記少なくとも１つの置き換え可能代替標的プローブ及び前記少なくとも１つの標的特異捕捉プローブの結合により形成される少なくとも１つの代替ハイブリッドにおける前記標識により生成される前記信号を検出するステップであって、前記信号は、前記サンプルの前記少なくとも１つのアナライトの前記存在及び／又は量に対して釣り合っている、ステップ；
を有する方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記ステップ（ａ）は：
（Ｉ）少なくとも１つの代替ハイブリッドを得るように、前記少なくとも１つの標的特異捕捉プローブを前記少なくとも１つの置き換え可能代替標的プローブと接触させるステップであって、
前記少なくとも１つの標的特異捕捉プローブはＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面と共有結合し、少なくとも１つの表面吸着代替ハイブリッドが、それ故、得られる、又は、前記ステップ（Ｉ）は、前記少なくとも１つの標的特異捕捉プローブをＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面と接触させるステップを更に有する、又は、前記ステップ（Ｉ）は、前記少なくとも１つの代替ハイブリッドが少なくとも１つの表面吸着代替ハイブリッドとしての前記表面において吸着されるようになるように、前記少なくとも１つの代替ハイブリッドを前記ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面と接触させるステップを更に有する、
ステップ；
（ＩＩ）前記少なくとも１つのアナライトによる前記少なくとも１つの置き換え可能代替標的プローブの置き換えを可能にするように、前記少なくとも１つの表面吸着代替ハイブリッドを前記サンプルと接触させるステップ；
を有する方法であり、前記ステップ（ｂ）は、
（ＩＩＩ）ＳＥ（Ｒ）ＲＳ及び蛍光のどちらか又は両方を用いて、前記ステップ（Ｉ）の後に、前記少なくとも１つの表面吸着代替ハイブリッドにおける前記標的の前記信号を検出するステップ；及び
（ＩＶ）前記ステップ（ＩＩＩ）において用いられる同様の検出方法を用いて、前記ステップ（ＩＩ）の後に、前記少なくとも１つの表面吸着代替ハイブリッドの前記信号を検出するステップ；
を有し、前記ステップ（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）において得られた前記信号における差が、前記サンプルにおける前記少なくとも１つのアナライトの前記存在及び／又は量に対して釣り合うように取られる；
方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、前記ステップ（ａ）は：
（Ｖ）少なくとも１つの代替ハイブリッドを得るように、前記少なくとも１つの標的特異捕捉プローブを前記少なくとも１つの置き換え可能代替標的プローブと接触させるステップ；
（ＶＩ）前記少なくとも１つの代替ハイブリッドが少なくとも１つの表面吸着代替ハイブリッドを形成する前記表面において吸着されるようになるように、前記少なくとも１つの代替ハイブリッドを前記ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面と接触させるステップ；及び
（ＶＩＩ）前記少なくとも１つのアナライトによる前記少なくとも１つの置き換え可能代替標的プローブの置き換えを可能にするように、前記少なくとも１つの表面吸着代替ハイブリッドを前記サンプルと接触させるステップ；
を有する、方法。
【請求項４】
請求項２に記載の方法であって、前記ステップ（ＩＩ）は、前記サンプルにおける前記少なくとも１つのアナライトの前記少なくとも１つの捕捉プローブとのハイブリゼーションを可能にするように、適切なアニーリング条件を確実にするステップを有する、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、前記少なくとも１つの置き換え可能代替標的プローブは、前記少なくとも１つの捕捉プローブの前記オリゴヌクレオチド配列に対して１００％相補的でないオリゴヌクレオチド配列を有する、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記少なくとも１つの標的特異捕捉プローブは表面探索基を更に有し、前記少なくとも１つの標的特異捕捉プローブは前記表面探索基を介して前記ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面に結合する、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって：
ステップ（ｃ）であって、
（ｉｉｉ）オリゴヌクレオチド及び表面探索基を有する標準捕捉プローブ、及び
（ｉｖ）前記標準捕捉プローブの前記配列に対して１００％相補的であるオリゴヌクレオチドと、表面増強（共鳴）ラマン散乱（ＳＥ（Ｒ）ＲＳ）活性及び蛍光活性のどちらか又は両方を有する標識と、を有する標準プローブ、
を接触させ、それにより、表面吸着標準ハイブリッドを得る、
ステップ（ｃ）；並びに
（ｄ）前記表面吸着標準ハイブリッドにおいて前記標識により生成される前記信号を検出するステップ；
を更に有する方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、前記ステップ（ｃ）において得られた前記標準ハイブリッドは前記ステップ（ａ）における前記サンプルに付加され、前記標準プローブは、前記少なくとも１つの代替標的プローブに与えられた前記標識とは異なる標識を有する、方法。
【請求項９】
請求項７に記載の方法であって、前記標準捕捉プローブは、前記標的配列とハイブリダイズしないオリゴヌクレオチド配列を有する、方法。
【請求項１０】
請求項７に記載の方法であって、前記ステップ（ｃ）及び（ｄ）は前記ステップ（ａ）及び（ｂ）のバイアルとは異なるバイアルにおいて実行される、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記ステップ（ａ）及び（ｃ）における前記サンプルは制御サンプルである、方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、前記少なくとも１つの捕捉プローブは表面探索基を有する、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、前記表面探索基はベンゾチアゾールである、方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、前記ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面は、前記捕捉プローブを金ナノ粒子に共有結合させた後、銀ヒドロキノンの付加により銀がコーティングされた金ナノ粒子を有する、方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法であって、前記ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面は、銀又は金ナノ粒子のコロイド状懸濁液、又は該懸濁液の集合体化コロイドである、方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法であって、前記ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面は、１乃至数ｎｍの範囲内の金又は銀の薄膜がコーティングされた金又は銀を有する、方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法であって、前記ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面は銀又は金ナノ粒子の安定なクラスタを有する、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、前記クラスタは、前記クラスタに化学的に結合することが可能である二機能又は多機能高分子（テレマー）との架橋により構築される、方法。
【請求項１９】
代替標的プローブ及び捕捉プローブの組み合わせであって：
（ｉ）オリゴヌクレオチドを有する捕捉プローブ；並びに
（ｉｉ）前記捕捉プローブに結合することができるオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドは、前記捕捉プローブのオリゴヌクレオチドに対して１００％相補的であるオリゴヌクレオチドの融点より低い融点により特徴付けられる、オリゴヌクレオチドと、表面増強（共鳴）ラマン散乱（ＳＥ（Ｒ）ＲＳ）活性及び蛍光活性のどちらか又は両方を有する前記代替標的プローブに付着された標識と、を有する、代替標的プローブ；
を有する組み合わせ。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、前記ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面は銀又は金ナノ粒子の安定なクラスタを有する、方法。
【請求項２１】
請求項１９に記載の方法であって、前記捕捉プローブは、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面を結合することができる表面探索基を有する、方法。
【請求項２２】
サンプルにおける少なくとも１つのアナライトの存在及び／又は量を検出するシステムで用いる置き換え可能カートリッジであって：
（ａ）複数ソースの集合であって、
サンプルのソースと、
代替標的の少なくとも１つのソースと、
標的特異捕捉プローブの少なくとも１つのソースと、
前記検出において役立つ付加物の少なくとも１つのソースと、
を有する、ソースの集合；
（ｂ）前記複数ソースからの特定のボリュームと接触する手段；及び
（ｃ）前記複数ソースから前記接触する手段への流体の供給を確実にする手段；
を有する置き換え可能カートリッジ。
【請求項２３】
請求項２２に記載の置き換え可能カートリッジであって、内部標準試薬の少なくとも１つのソースを更に有する、置き換え可能カートリッジ。
【請求項２４】
請求項２２に記載の置き換え可能カートリッジであって、前記接触する手段において生成される信号を検出する窓を更に有する、置き換え可能カートリッジ。
【請求項２５】
サンプルにおいて少なくとも１つのアナライトの存在又は量を検出するシステムであって：
（ａ）前記サンプルを、
（ｉ）前記サンプルにおける標的配列を特に結合することができるオリゴヌクレオチドを有する少なくとも１つの標的特異捕捉プローブ、及び
（ｉｉ）前記捕捉プローブを特に結合することができるオリゴヌクレオチドと、表面増強ラマン散乱（ＳＥ（Ｒ）ＲＳ）活性及び蛍光活性のどちらか又は両方を有する標識と、を有する少なくとも１つの置き換え可能代替標的プローブ、
と接触させる手段；並びに
（ｂ）前記少なくとも１つの置き換え可能代替標的プローブ及び前記少なくとも１つの標的特異捕捉プローブの結合により形成される少なくとも１つの代替ハイブリッドにおける前記標識により生成される信号を検出する手段；
を有するシステム。
【請求項２６】
請求項２５に記載のシステムであって、前記複数ソースから前記接触する手段への試薬の供給における異なる時点において、前記接触手段において検出される前記信号を比較することにより、前記少なくとも１つのアナライトの量を計算する手段を更に有する、システム。
【請求項２７】
請求項２５に記載のシステムであって、前記検出する手段は、光源、フィルタ及び検出手段を有する、システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アナライト、特に、サンプル中の拡散を検出するのに優位性があるＳＥ（Ｒ）ＲＳ評価方法に関し、特に、それらの方法を実行する器具及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
サンプルにおける特定の生体分子の存在の特定及び高速検出は、分子診断アプリケーションについてかなり重要である。典型的には、所謂、捕捉プローブはセンサ表面において固定され、捕捉プローブへのターゲットの特定の結合が、標的に導入された標識の検出か又は標識が備えられた第２プローブのどちらかによりモニタリングされる。このことは、その表面への標的、プローブ及び標識の輸送を必要とする。高分子の拡散は比較的遅いために、表面への結合は、分析における時間臨界的ステップになる。表面への標的の結合は可逆的であることが可能であり、例えば、ＤＮＡハイブリダイゼーションにおいて、ハイビリダイズされた標的分子は、表面から取り除かれる又は溶解して除去されることが可能であり、基板は、洗浄後に再使用されることが可能である。しかしながら、これには時間を要する。それ故、所謂、均一測定、それによる分析が溶液中で行われ、そのことは有利である。実際には、拡散距離はかなり小さく、装置は容易に再使用可能である。それにも拘わらず、固定された捕捉プローブによる実施は、パターン状堆積による多重化（即ち、同時の異なる標的の決定）が容易である有利点を有する。
【０００３】
最近、均一溶液内の多重化された高感度測定、所謂、表面増強（共鳴）ラマン分光（ＳＥ（Ｒ）ＲＳ）を可能にする技術であって、検出されるべき分子がナノ構造化された貴金属表面に吸収される必要がある、技術が導入されている。ラマン信号は、励起ビームの光フィールドと金属表面におけるプラズモンフィールド（ＳＥＲＳ）との間の相互作用により、及び発色団の共鳴励起により、大きさを数桁、増強される。ＳＥ（Ｒ）ＲＳは、散乱光が、有効な１つの溶液における複数の分析の識別を行う、鮮鋭な分子特異振動帯域を有する特異な特徴を有する。ＤＮＡ検出へのＳＥＲＲＳの適用において、２つの機能を有するＳＥＲＲＳ標識が、例えば、ＰＣＲにより、当該のヌクレオチド配列に導入される。ＳＥＲＲＳ標識は、電気的に（正に）帯電した官能基により銀表面に付着する、及び染料部分によりラマン信号を生成する。ラマン信号は、閉じこめられた銀粒子の表面において生成されたプラズモンフィールドにより強く増幅され、かなり高感度な検出（ピコモル領域の）を可能にする。
【０００４】
それにも拘わらず、上記のシステムは、幾つかの制約を有することが観測されている。例えば、ＤＮＡの検出は、標識がＤＮＡに組み込まれるときにのみ実現可能であり、それは、一般に、増幅ステップを必要とする。更に、染料標識のＳＥＲＲＳスペクトルは、表面に付着した核酸の配列又は構造に依存せず、そのことは、組み込まれていないプライマー又はハイブリダイズされていないプローブはそれぞれ、測定前に溶液から分離される必要があることを意味する。
【０００５】
米国特許第６，７５０，０６５号明細書において、ＳＥ（Ｒ）ＲＳを用いたタンパク質の検出、それにより、アナライト特異抗体からＳＥ（Ｒ）ＲＳ標識付けアナライト状化合物を移動させる能力に基づいて抗原が検出されることについて記載されている。そのように移動されるときに、アナライト状化合物に結合されたＳＥ（Ｒ）ＲＳ標識は、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面の吸着により検出される。
【特許文献１】米国特許第６，７５０，０６５号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、アナライトのラベリングが必要ない、代替のＳＥ（Ｒ）ＲＳ測定を用いることにより、サンプルにおける核酸のｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出を容易にすることである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の目的は、本発明に従った優位性のあるＳＥ（Ｒ）ＲＳのための方法並びにその方法を用いる器具及び装置を提供することにより達成される。
【０００８】
本発明の有利点は、ＳＥ（Ｒ）ＲＳスペクトルの鮮鋭な分子特異振動帯域が、同時に、複数の標識の高感度且つ正確な検出を可能にするために、容易に実現可能であるということである。
【０００９】
更に、本発明の有利点は、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ及び蛍光が同時に測定されることが可能であり、本発明の方法の付加的な妥当性確認を提供することが可能であることである。
【００１０】
本発明の他の有利点は、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ、蛍光、又はそれらの両方のリアルタイムの測定が、特定のアナライトが存在するか否かに関する高速回答を提供することができることである。
【００１１】
更に、蛍光信号の存在は、サンプルにおけるアナライトの存在を容易に示す。高速の定量的試験が、それ故、蛍光のみの検出を介して与えられることが可能である。
【００１２】
本発明の有利点はまた、例えば、光学的検出、銀のナノ粒子の集合体等における変化についての補正を可能にする内部標準が提供されることである。
【００１３】
本発明の有利点はまた、表面に対する標識の直接的吸着を必要とすることなく、標識がＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面近傍に移動されることである。それに代えて、標識は、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを介して捕捉プローブに代わりの標的プローブの結合を介して表面の近傍に移動され、そのプロセスは容易に制御可能である。このようにして、現在のＳＥ（Ｒ）ＲＳベースの検出方法における課題である、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面に対する異なる標識の表面吸着プロセスの制御の欠如が回避される。
【００１４】
本発明の特定の且つ好適な特徴が、同時提出の独立請求項及び従属請求項に記載されている。従属請求項に記載の特徴は、必要に応じて且つ単に請求項に明示的に記載されているのではなく、独立請求項の特徴及び他の従属請求項の特徴と組み合わされることが可能である。
【００１５】
本発明の第１の特徴においては、サンプルにおける少なくとも１つのアナライトの存在及び／又は品質が、少なくとも１つの標的特異捕捉プローブ及び少なくとも１つの置き換え可能代替標的プローブ（ラベリングされた）とサンプルを接触させるステップに基づく置き換え測定により判定され、それにより、標的特異捕捉プローブは、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面に共有結合されるか又は、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面と標的特異捕捉プローブを接触させるステップ（ａ）と、置き換え可能代替標的プローブ及び標的特異捕捉プローブの結合により形成される代替ハイブリッドにおける標識により生成された信号であって、サンプルにおけるアナライトの存在及び／又は品質に対して釣り合いがとれた信号を検出するステップ（ｂ）と、を更に有するかどちらかである。
【００１６】
この方法においては、ステップ（ａ）は、代替ハイブリッドを得るように、置き換え可能代替標的プローブと標的特異捕捉プローブを接触させるステップ（Ｉ）であって、それにより、標的特異捕捉プローブはＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面に共有結合され、その表面に吸着された代替プローブが、それ故、得られるか、若しくは、ステップ（Ｉ）が、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面と標的特異捕捉プローブを接触させることを更に有する、又は代替ハイブリッドが表面に吸着される代替ハイブリッドとしてＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面に吸着されるようになるように、前記ステップ（Ｉ）がＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面と代替ハイブリッドを接触させることを更に有する、ステップ（Ｉ）と、アナライトにより置き換え可能代替標的特異捕捉プローブの置き換えを可能にするように、サンプルと表面に吸着される代替ハイブリッドを接触させるステップ（ＩＩ）と、を更に有することが可能である。
【００１７】
この方法においては、ステップ（ｂ）は、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ及び蛍光のどちらか又はそれらの両方を用いて、ステップ（Ｉ）の後に、表面に吸着される代替ハイブリッドにおける標識の信号を検出するステップ（ＩＩＩ）と、ステップ（ＩＩＩ）において用いられる同様の検出方法を用いて、ステップ（ＩＩ）の後に、表面に吸着される代替ハイブリッドの信号を検出するステップ（ＩＶ）と、を更に有することが可能である。
【００１８】
上記方法におけるステップ（ａ）はまた、代替ハイブリッドを得るように、置き換え可能な代替標的プローブと標的特異捕捉プローブを接触させるステップ（Ｖ）と、代替ハイブリッドが、表面に吸着される代替ハイブリッドを形成する表面に吸着されるようになるように、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面と代替ハイブリッドを接触させるステップ（ＶＩ）と、アナライトにより置き換え可能代替標的プローブの置き換えを可能にするように、サンプルと表面に吸着される代替ハイブリッドを接触させるステップ（ＶＩＩ）と、を更に有することが可能である。
【００１９】
変化、例えば、集合体変化又は光学的変化のための較正又は補正を可能にするように、標準捕捉プローブ及び標準プローブ（ラベリングされた）を接触させ、それにより、標準ハイブリッドを得る、並びに、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面と標準ハイブリッドを接触させ、それにより、表面に吸着される標準ハイブリッドを得るステップ（ｃ）と、前記表面に吸着される標準ハイブリッドにおける標識により生成される信号を検出するステップ（ｄ）と、により提供される上記方法には、標準が含まれている。
【００２０】
本発明の第２の特徴においては、代替標的プローブ及び捕捉プローブの組み合わせであって、それにより、代替標的プローブのオリゴヌクレオチドは、捕捉プローブのオリゴヌクレオチドに対して１００％相補的な、オリゴヌクレオチドの融点より低い融点と、代替標的プローブに付着された標識は表面増強（共鳴）ラマン散乱（ＳＥ（Ｒ）ＲＳ）及び蛍光活性のどちらか又は両方を有することと、により特徴付けられる、組み合わせについて開示されている。
【００２１】
本発明の第３の特徴においては、サンプルにおける少なくとも１つのアナライトの存在又は量を検出するシステムで用いられる置き換え可能なカートリッジが開示されていて、そのカートリッジは、サンプルのソース、代替標的の少なくとも１つのソース、標的特異捕捉プローブの少なくとも１つのソース、及び検出において機能する添加剤の少なくとも１つのソースを有するソースの集合（ａ）と、それらのソースからの特定のボリュームを接触させる手段（ｂ）と、ソースから接触させる手段への流体の供給を確実にする手段（ｃ）と、を有する。このカートリッジは、内部標準試薬の少なくとも１つのソース、及び前記接触される手段において生成される信号を検出するウィンドウを更に有することが可能である。
【００２２】
本発明の第４の特徴においては、サンプルにおける少なくとも１つのアナライトの存在又は量を検出するシステムについて開示されていて、そのシステムは、少なくとも１つの標的特異捕捉プローブ及び少なくとも１つの置き換え可能代替標的プローブ（標識が付着された）とサンプルを接触させる手段（ａ）と、置き換え可能な代替標的プローブ及び標的特異捕捉プローブの結合により形成される代替ハイブリッドにおける標識により生成される信号を検出する手段（ｂ）と、を有する。このシステムは、ソースから接触させる手段への試薬の供給において、異なる時点で接触される手段において検出される検出信号を比較することにより、アナライトの量を計算する手段を更に有することが可能である。
【００２３】
本発明の教示は、サンプルにおけるアナライトの検出のための改善された方法及び装置の設計を可能にする。
【００２４】
本発明についての上記の及び他の特徴、側面及び有利点については、下の詳細説明により明らかになり、例示として、本発明の原理を示している添付図と関連付けて理解することができる。以下の詳細説明は、本発明の範囲を逸脱することなく、単に例示目的で与えられるものである。下で引用する図は添付図である。
【００２５】
異なる図における同様の参照番号は同様の又は類似する要素を表している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明について、以下、特定の実施形態に関連付けて詳述するが、本発明は、それらの実施形態に限定されるのではなく、同時提出の特許請求の範囲のみにより限定される。図は、単に模式的であり、限定的なものではない。図中では、要素の一部の大きさは誇張され、例示目的であり、寸法通りには描かれていない。明細書及び特許請求の範囲において用いられている用語“を有する”は、他の要素又はステップを排除するものではない。明細書及び特許請求の範囲における名詞の単数表現は、特に断り書きがない限り、その名詞の複数の存在を包含するものである。
【００２７】
更に、明細書及び特許請求の範囲における用語、第１、第２、第３等は、類似する要素を区別するように用いられ、一連の又は順次の順序を表す必要がないものである。そのように用いられている用語は適切な環境下では互換性があり、以下で詳述する実施形態は、記載されている又は図示されている以外の順序で機能することができるものであることが理解される必要がある。
【００２８】
以下における用語又は定義は、本発明の理解を助けるためだけに与えられている。それらの定義は、少なくとも当業者が理解することができるものである。
【００２９】
定義
本明細書で用いる“アナライト”とは、本発明の方法により検出される及び／又は定量化される物質のことをいう。
【００３０】
本明細書で用いる“標的配列”とは、アナライトを具体的に検出するように用いられる、アナライトにおける特定のヌクレオチド配列のことをいう。
【００３１】
本明細書で用いる“サンプル”とは、当該アナライトの少なくとも１つを有すると考えられる組成のことをいう。
【００３２】
本明細書で用いる“制御サンプル”とは、サンプルと同様の又はサンプルにかなり似ている組成のことをいう。
【００３３】
本明細書で用いる“標識”とは、検出可能なＳＥ（Ｒ）ＲＳ信号又は蛍光信号を生成することが可能な分子又は材料のことをいう。
【００３４】
本明細書で用いる“オリゴヌクレオチド”とは、自然に存在するＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオチド、修飾ヌクレオチド又は合成ヌクレオチド又はヌクレオチド類縁体、ＤＮＡ、ＲＮＡＰＮＡ等の結合されたヌクレオチド、若しくは何れかのそれらの骨格誘導変異体のことをいう。
【００３５】
本明細書で用いる“捕捉プローブ”とは、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面への捕捉プローブの結合を可能にする表面探索官能基を有するオリゴヌクレオチド配列のことをいう。捕捉プローブのオリゴヌクレオチド配列は、標的配列（“標的特異捕捉プローブ”）に対して相補的であることが可能であり、並びに標的配列に対して特定のハイブリッド化が可能であり、又は標準プローブの一部である所定の異なる標準配列（“標準捕捉プローブ”）に対して相補的であることが可能である。
【００３６】
本明細書で用いる“代替標的プローブ”とは、捕捉プローブを特に結合することが可能である標識付けされた合成オリゴヌクレオチドのことをいう。“置き換え可能代替標的プローブ”は、捕捉プローブに対して１００％相補的であり、修飾されない配列の結合強度より小さい強度を有する捕捉プローブに結合した、代替標的プローブである。“非置き換え可能代替標的プローブ”においては、配列は、捕捉プローブ、即ち、標的特異捕捉プローブか又は標準捕捉プローブ（“標準プローブ”）のどちらかの配列に対して完全に相補的であり、対応する捕捉プローブに対する非置き換え可能代替標的プローブの強い結合をもたらす。例えば、共有結合により、代替標的プローブに標識が付着される、又は、標識は、代替標的プローブに結合する別個のエンティティであることが可能である。
【００３７】
本明細書で用いる“代替ハイブリッド”とは、代替標的プローブ及び捕捉プローブの組み合わせのことをいう。  
本明細書で用いる“標的ハイブリッド”とは、アナライトにおける標的配列及び標的特異捕捉プローブの組み合わせのことをいう。
【００３８】
本明細書で用いる“標準ハイブリッド”とは、標準プローブ及び標準捕捉プローブの組み合わせのことをいい、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面に共有結合しているか又は、非共有結合している。
【００３９】
本明細書で用いる“ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面”とは、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ標識の信号を増強することが可能である材料のことをいう。
【００４０】
本明細書で用いる“表面吸着代替ハイブリッド”、“表面吸着標的ハイブリッド”及び“表面吸着標準ハイブリッド”とは、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面に吸着された、代替ハイブリッド、標的ハイブリッド及び標準ハイブリッドのそれぞれのことをいう。
【００４１】
本発明は、サンプルにおける１つ又はそれ以上のアナライトの存在及び／又は定量性の検出のための方法、器具及び装置を提供する。
【００４２】
本発明は、標識が付着されたプローブの置き換えに基づいて、サンプルにおけるアナライトを検出することにより、アナライトの標識付けを必要としない１ステップアナライト特異方法が提供されるという観測に基づいている。これは、全てが標準的であり且つ予め製造される試薬を用いて実行されるために、検出の信頼性に対して更に寄与する、重要な時間節約の改善になる。
【００４３】
本発明の方法、器具及び装置は、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面に結合することが可能である標的特異捕捉プローブに対してハイブリダイズすることが可能であり、標識付けされる、置き換え可能代替標的プローブの使用に基づいている。置き換え可能代替標的プローブの標識がＳＥ（Ｒ）ＲＳ標識である場合、捕捉プローブに対するハイブリダイゼーション及びＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面との接触は、その標識の検出を増強する“表面吸着代替ハイブリッド”の生成をもたらす。置き換え可能代替標的プローブの配列における捕捉プローブの配列に対する少なくとも１つのミスマッチ（非相補的なヌクレオチド）の存在は、捕捉プローブに対する置き換え可能代替標的プローブの結合を弱くする。捕捉プローブに対して完全に相補的な標的配列を有するアナライトと、捕捉プローブに結合される代替標的プローブを接触させるとき、置き換え可能代替標的プローブは置き換えられる。
【００４４】
本発明の方法を用いて検出されるように考えられたアナライトは核酸である。特に、そのアナライトは、遺伝子、ウィルスのＤＮＡ、バクテリアのＤＮＡ、かびのＤＮＡ、哺乳類のＤＮＡ、プラスミドのＤＮＡ又はＤＮＡ断片等のＤＮＡである。アナライトはまた、ウィルスのＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ等のＲＮＡであることが可能である。アナライトはまた、ｃＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、又は合成ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、１つ又はそれ以上の合成オリゴヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、修飾オリゴヌクレオチド又は他の核酸誘導体であることが可能である。アナライトは、バクテリア、サルモネラ菌、連鎖球菌、レジオネラ菌、大腸菌、ジアルジア属、クリプトスポリジウム属、リケッチア属等の微生物、胞子、かび、酵母菌、藻類、アメーバ、渦鞭毛藻類、単細胞生物、病原体、若しくは動物又は人間等の多細胞生物の細胞等の生物から由来する核酸であることが可能であるが、それらに限定されるものではない。
【００４５】
アナライトの検出が本発明に従って考えられたサンプルの性質は重要でなく、そして核酸を有することが疑わしい何れかの調整物であることが可能である。サンプルは、生体組織、血液、唾液、精液、大便又は尿等の流体、及びそのような生物材料から由来する又は抽出される組成物を有するサンプルであることが可能である。サンプルは、例えば、組織細胞、赤色の血液細胞、白色の血液細胞、血小板、死滅した細胞等の生体材料の組成物を有することが可能である。その材料は、口内用スワブ（ｓｗａｂ）、喉用スワブ、膣用スワブ、尿道用スワブ、子宮頸部用スラブ、喉用スラブ、直腸用スラブ、傷害用スラブ、膿瘍用スラブ、鼻咽道用スラブ等を有するスワブとして組織から得られることが可能であるが、それらに限定されるものではない。サンプルは、リンパ流体、羊膜流体、脳脊髄流体、腹水、胸水、嚢胞からの流体、滑膜流体、硝子体液、房水、嚢の流体、洗眼剤、目の呼吸、血漿、血清、肺洗浄剤、肺呼吸、若しくはそれらの一部又は成分等の生体の流体を有することが可能である。サンプルは、生体における何れかの組織のバイオプシーから得られる。更に、上記の材料、一次細胞系、二次細胞系等の細胞、溶解物、抽出物、上澄み、又は何れかの細胞、組織又は器官から得られた材料を含む組織はまた、本明細書で用いられる用語“サンプル”の意味の範囲内にあると考えられる。微生物又はウィルスを有するサンプルはまた、本発明の方法を用いる核酸検出と関連付けて考えられる。法医学環境から得られる材料はまた、意図された用語“サンプル”の意味の範囲内にある。サンプルはまた、食料品、飲料、水、土壌、砂等の環境サンプルを有することが可能である。それらのリストは網羅的であるように意図されていない。
【００４６】
本発明の特定の実施形態においては、サンプルは、検出方法によるアナライトの検出を容易にするように、予め処理されている。ＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸の抽出は、本発明に関連して考えられるサンプルの典型的な前処理である。核酸を抽出するために適切な方法及び器具一式は、当該技術分野において利用可能であり、フェノール−クロロホルム抽出、塩析、ＤＮＡ抽出及びグアニジニウムチオシアネイト抽出に基づく方法及び器具一式を含む。
【００４７】
例示としての核酸分離技術は、（１）例えば、フェノール／クロロホルム有機試薬（例えば、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ａｕｓｂｅｌ等編（１９９５，ただし、２００３年６月増補）Ｊｈｏｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を用いて、好適には、自動化されたＤＮＡ抽出剤、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ社（米国ニューヨーク市）製のＭｏｄｅｌ  ３４１  ＤＮＡ抽出剤を用いる、エチルアルコールの析出により後続される有機抽出と、（２）固定相吸着法（例えば、米国特許第５２３４８０９号明細書（Ｂｏｏｍ等による）及びＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １０（４），ｐｐ．５０６−５１３（１９９１）（Ｗａｌｓｈ等による））と、（３）塩誘導ＤＮＡ析出法（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６（３），ｐｐ．９−１０（１９８８）（Ｍｉｌｅｒ等による））と、を有し、それらの析出方法を、典型的には、塩析という。ゲノムＤＮＡ純化器具及び全ＲＮＡ分離システム（両方共に、Ｐｒｏｍｅｇａ社（米国ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）製）等の方法を円滑に行うように、市販されているキットが用いられる。更に、そのような方法は、例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）６７００  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（米国カリフォルニア州フォスター市）製又はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）６１００Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ＰｒｅｐＳｔａｔｉｏｎ及び関連プロトコル等、例えば、ＮｕｃＰｒｅｐ（登録商標）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  Ａｎｉｍａｌ  ａｎｄ  Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ”，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ４３３３９５９  Ｒｅｖ．Ａ（２００２），“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｃｅｌｌｓ”，Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｍｓＰｒｏｔｏｃｏｌ  ４３３０２５４  Ｒｅｖ．Ａ（２００２））と、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ４３１６６０７  Ｒｅｖ．Ｃ（２００１））とを用いて、自動化又は半自動化されている。
【００４８】
上記の前処理方法は、例えば、酵素の消化、剪断又は超音波処理による断片化ステップ、並びに／若しくは、例えば、ＲＴ−ＰＣＲを含むＰＣＲによる酵素増幅ステップを更に有することが可能である。特に、核酸の感度検出が構想される場合、標的ＤＮＡのＰＣＲ増幅が、アナライトの検出に先行して実行されることが可能である。それ故、本実施形態に従って、その検出が実行されるサンプルは、増幅されたＰＣＲ産物を有する。
【００４９】
本発明の方法は、シングルストランド（ｓｓ）核酸の検出のためにデザインされている。それ故、ダブルストランド（ｄｓ）核酸は、本発明の方法により検出されるように、２つの標準を単一のヌクレオチド標準に分離するように変性される必要がある。ＤＮＡ変性方法は、高温での加熱を有し（ＤＮＡの融点以上の温度において、一般には、９５℃の温度が用いられ、サンプル中に存在する殆どの酵素活性の同時不活性化がもたらされる）、ストランドの変性を回避するように、氷で冷やすことがすぐに後続する。ＤＮＡはまた、低に塩濃度又は高いｐＨにより変性されることが可能である。複数の方法について、ＰＣＲ産物のｄｓＤＮＡからｓｓＤＮＡの生成のために記載されている。それらの方法は、ｓｓＤＮＡを分離する純化ステップが後続する、非対称なＰＣＲ、即ち、等しくない長さのストランドの合成をもたらす化学的に修飾されたプライマーを有するＰＣＲを有する（Ｐｒａｇｒａｔｉｓ  Ｎ．Ｃ．，１９９６，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２４，３６４５−３６４６）。
【００５０】
本発明は、検出及び／又は標識を用いる定量化を有する置き換え測定を提供する。本発明の方法は、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ標識が組み合わされた信号及びＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面の特異な特徴を利用する一方、サンプルにおけるアナライトの検出及び／又は定量化は、ＳＥ（Ｒ）ＲＳベースの検出又は標識の蛍光か若しくは、ＳＥ（Ｒ）ＲＳベースの検出及び蛍光ベースの検出の両方のどちらかを用いて、実行されることが可能である。本発明の方法のこの特徴は、ａ）殆どのＳＥ（Ｒ）ＲＳ標識は蛍光であること及びその逆も真であることと、ｂ）標識から検出されるＳＥ（Ｒ）ＲＳ信号及び蛍光信号へのＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面の近接に匹敵するが、逆の効果が存在することに基づいている。
【００５１】
ＳＥ（Ｒ）ＲＳ標識は、一般に、金属表面に近接して増強される信号強度からの恩恵を受ける。ラマン散乱が増強される距離を伴って、標識が、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面に対して又はそのＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面近傍に吸着されるとき、その標識の発する蛍光はクエンチングされる。標識がその表面から更に遠くに位置付けられるとき、ラマン散乱でなく、蛍光が増強される。
【００５２】
その距離が更に大きくなるとき、蛍光の増強はまた、なくなる、それ故、標識がＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面に近接しているとき、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ信号は増強され、蛍光信号はクエンチングされる。他方、標識がＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面の近接から離れるとき、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ信号はなくなる一方、蛍光信号は尚も、検出されることが可能である。
【００５３】
本発明の方法におけるアナライトの検出がＳＥ（Ｒ）ＲＳに基づいている場合、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ信号の検出及び／又はその強度は、サンプルにおけるアナライトの量に反比例する。実際には、信号は、ハイブリッド化された置き換え可能代替標的プローブと捕捉プローブ（所謂、“代替ハイブリッド）との複合体により与えられるため、サンプルにおけるアナライトの増加した濃度は、増加した置き換え可能代替標的プローブの置き換え及びＳＥ（Ｒ）ＲＳ信号の減少をもたらす。
【００５４】
更に、本発明の方法におけるアナライトのＳＥ（Ｒ）ＲＳ検出は、適切に照明されるときに、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ活性材料である、即ち、ＳＥＲＳスペクトル又はＳＥＲＲＳスペクトルを生成することができる標識であって、また、本明細書においては、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ標識又は色素ともいう、標識を必要とする。ＳＥ（Ｒ）ＲＳ標識の非限定的な例には、５−（及び６−）カルボキシ−４′，５′−ジクロロ−２′，７′−ジメトキシ・フルオレセイン、５−カルボキシ−２′，４′，５′，７′テトラクロロフルオレセイン等のフルオレセイン色素と、５−（及び、６−）カルボキシローダミン、６−カルボキシテトラメチルローダミン及び６−カルボキシローダミンＸ等のローダミン色素と、メチルフタロシアニン、ニトロシルフタロシアニン、スルホニルフタロシアニン及びアミノフタロシアニン等のフタロシアニン、アゾ色素、アゾメチン、シアニン、及びメチル誘導体、ニトロ誘導体、スルファノ誘導体及びアミノ誘導体等のキサンチン、並びにスクシニルフルオレセインがある。それらのＳＥ（Ｒ）ＲＳ標識の各々は、複数の通常の標識をもたらす、何れかの従来の様式で置き換えられることが可能である。標識の選択は、標識の共鳴周波数、サンプル内に存在する他の分子の共鳴周波数等の因子により影響されることに留意する必要がある。生体分子を検出するために用いられるＳＥ（Ｒ）ＲＳ標識については、米国特許第５３０６４０３号明細書、米国特許第６００２４７１号明細書及び米国特許第６１７４６７７号明細書等に記載されている。
【００５５】
標識の検出が蛍光に基づいている場合、信号の検出及び／又はその信号の強度は、サンプルにおけるアナライトの量に正比例する。実際には、置き換え可能代替標的プローブに結合される標識の蛍光信号は、それが捕捉プローブに結合されていない（又は捕捉プローブから置き換えられていない）ときにのみ検出されるため、サンプルにおけるアナライトの増加した濃度は、増加した置き換え可能代替標的プローブの置き換え及び蛍光信号の増加をもたらす。
【００５６】
標識の検出が蛍光に基づいている場合、蛍光標識が用いられる。蛍光標識は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）と、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、スルホローダミン１０１（Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ（登録商標））等のカルボキシフルオレセインと、蛍光赤色及び蛍光橙色と、フィコエリトリンと、フィコシアニンと、Ｃｒｙｐｔｏ−Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素等と、を有するが、それらに限定されるものではない。
【００５７】
特定の実施形態に従って、本発明の方法は、蛍光検出及びＳＥ（Ｒ）ＲＳ検出の両方の検出のために提供される。代替標的プローブの標識の蛍光信号及びＳＥ（Ｒ）ＲＳ信号の両方の検出を有する方法は、それらの方法が、サンプルにおけるアナライトの存在及び／又は数量の直接測定及び間接測定の両方を可能にするため、精度に付加制御を与える。それらの方法において、それらの両方の検出方法について適切である標識が用いられる。特に、本発明の方法は、ＨＥＸ（２，５，１‘，３’，７‘，９’，−ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオレセイン）、フルオレセイン及びＴＥＴ（６−カルボキシ−２‘、４’,７，７’テトラクロロフルオレセイン）を含む群から選択される標識を用いて実行される。
【００５８】
本発明に従って、標識が代替標的プローブに付けられ、その代替標的プローブは、置き換え可能代替標的プローブか又は非置き換え可能代替標的プローブのどちらかであることが可能である。オリゴヌクレオチドへの標識の付着は、従来技術（例えば、米国特許第６１２７１２０号明細書）に記載されている方法により実行されることが可能である。オリゴヌクレオチドに対して標識を組み込むことにより、標識付けされたオリゴヌクレオチドを調整する他の方法については、米国特許第４９６２０３７号明細書、米国特許第５４０５７４７号明細書、米国特許第６１３６５４３号明細書及び米国特許第６２１０８９６号明細書に記載されている。本発明の特定の実施形態においては、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ標識が用いられ、そのＳＥ（Ｒ）ＲＳ標識は、ヌクレオチドプローブに直接か又は、リンカー化合物を介してかのどちらかで付着される。ヌクレオチド又は核酸等の他の分子と共有反応するようにデザインされた反応基を有するＳＥ（Ｒ）ＲＳラベル（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社（米国オレゴン州Ｅｕｇｅｎｅ））製が入手可能である。ヌクレオチドプリカーサに共有的に付着されたＳＥ（Ｒ）ＲＳ標識は、通常のメーカー（例えば、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（米国インジアナ州Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．（米国ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）、Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．（米国テキサス州Ｔｅｘ）及びＡｍｅｒｓｈａｒｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ（米国ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔｏｗａｙ））から購入可能である。
【００５９】
本発明に従って、検出は、捕捉プローブに結合するアナライトとの競合を可能にするように、標識が付けられ、当該のアナライトにおける標的配列に類似する配列を有する、置き換え可能代替標的プローブを備えることにより実行される。置き換え可能代替標的プローブと競合し、且つその置き換え可能代替標的プローブを置き換えるアナライトの能力は、アナライトが捕捉プローブに結合している場合に比べて小さい強度を伴って捕捉プローブに結合している代替標的プローブを備えることにより確実にされる。特定の実施形態に従って、ハイブリッドの５０％がシングルストランドに変性される温度として規定される融点（Ｔｍ）は、標的ハイブリッドの温度に比べて低い。典型的には、このことは、捕捉プローブへの結合に影響を与える、置き換え可能代替標的プローブのヌクレオチド配列において１つ又はそれ以上の修飾を導入することにより確実にされる。適切な修飾は、１つ又はそれ以上の単一ヌクレオチド多型性（ＳＮＰ）、即ち、挿入（例えば、ヘアピン構造）の導入を有する。オリゴヌクレオチドの融点を計算する複数の異なる方法について、技術的に記載され、アルゴリズムに基づくＴｍを計算するサービスが、インターネットにおける異なるソースにより提供されている（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ：ｗｗｗ．ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ．ｃｏｍ／ＱＰＣＲ／ｔｎＣａｌｃ．ａｓｐ）。それらの方法は、Ｔｍで置き換え可能な標的プローブの配列において１つ又はそれ以上のミスマッチの取り込みの影響を評価することを可能にする。それらの方法の各々は、僅かに異なる結果を与えることが可能であり、最適なＴｍの値は経験的に決定される必要がある一方、それらの方法の殆どは、本発明に関連して、置き換え可能標的プローブの適合性の指標を与えるのに有用である。
【００６０】
置き換え可能代替標的プローブのオリゴヌクレオチド配列と標的配列との間の融点の差は、最適なアニーリング温度における差に対応する。そのアニーリング温度が高過ぎるように設定される場合、ヌクレオチド配列（例えば、プローブ、アナライト）は有効にアニールされることができず、アニーリング温度が低過ぎるように設定される場合、ヌクレオチド配列（例えば、プローブ、アナライト）は、非特異的にアニールされる。アナライトにより置き換え可能代替標的プローブの置き換えを確実にするように、本発明の方法を実行するとき、捕捉プローブ及び置き換え可能代替標的プローブとのアナライトの接触（代替ハイブリッドを形成することを任意に可能にする）が、置き換え可能代替標的プローブの融点と同様か又はその融点より好適に高いアニーリング温度で実行される。それ故、一実施形態に従って、その接触のステップは、置き換え可能代替標的プローブの融点において、より好適には、置き換え可能代替標的プローブの融点より０乃至１０℃高い、最適なアニーリング温度において、最も好適には、置き換え可能代替標的プローブの融点より０乃至５℃高い、最適なアニーリング温度において、実行されることが可能である。
【００６１】
置き換え可能代替標的プローブ及び捕捉プローブの接触ステップは、代替ハイブリッドの融点より２乃至６℃低い、最適なアニーリング温度におけるアニーリングステップを有することが考えられる。
【００６２】
置き換え可能代替標的プローブ及び捕捉プローブの接触ステップ（代替ハイブリッドを形成することを任意に可能にする）は、変性ステップ（典型的には、約９０乃至９５℃に加熱する）と、その後の、標的配列の最適なアニーリング温度（置き換え可能代替標的プローブの最適なアニーリング温度より高い）において実行されるアニーリングステップと、を有することがまた、考えられる。変性ステップは、アナライトがダブルストランドされ、ダブルストランドされたＤＮＡの変性が、検出を可能にするために必要であるとき、関心がもたれるものである。変性ステップは、サンプルにおけるアナライトについての定性的情報ばかりでなく、定量的情報が必要とされるときに、更に関心がもたれる。
【００６３】
特定の実施形態においては、代替ハイブリッドは、Ｔｍが、標的ハイブリッドのＴｍより約１５乃至２０℃低いようにデザインされる。このことは、例えば、代替標的プローブのオリゴヌクレオチドの一部に複数のミスマッチを含むことにより実行可能である。その結果、代替ハイブリッドは、標的ハイブリッドが保存されたまま保たれ、即ち、捕捉プローブが標的配列に対してアニールされたまま保たれる温度で、完全に融解される。この方法は、適度な温度で、１つの単独の融解ステップを用いることを可能にする。
【００６４】
本発明の方法においては、置き換え可能代替標的プローブに存在する標識の信号の検出により、融解及び／又はアニーリング中にリアルタイムにモニタリングされることが可能である。
【００６５】
本発明の方法で用いられる異なる試薬の接触は、所望の検出信号の性質（及び、その検出信号から得られる情報）に依存して、変わることが可能である。本発明の特定の実施形態に従って、捕捉プローブ及び置き換え可能代替標的プローブは先ず、接触され、代替ハイブリッドを形成することが可能になる。このハイブリッドへのＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面の付加の際、この代替ハイブリッドの信号は、検出されることが可能であり、そしてベースライン検出信号としての役割を果たす。その場合、サンプルは、代替ハイブリッドと接触し、置き換え可能代替標的プローブは、サンプルに存在するアナライトにより捕捉プローブから置き換えられる。残りの代替ハイブリッドの信号の検出は、サンプルにおけるアナライトの量を表す。代替として、サンプル、代替標的プローブ及び捕捉プローブは、同時に接触することが可能である。更なる実施形態に従って、サンプルは、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面の付加に先行して、代替ハイブリッドと接触する。後者の２つの実施形態においては、ベースラインの値の検出は存在せず、アナライトの存在における標識信号の表示のみが得られる。しかしながら、例えば、複数の類似するサンプルの測定の前に、例えば、制御サンプルにおいて、別個の測定が実行される場合に、ベースラインの値は決定されることが可能である。代替として、異なるＳＥ（Ｒ）ＲＳ標識を有する内部標準（下で説明する）がサンプルに導入される場合に、ベースラインの値は決定されることが可能である。更に、定性的な情報のみが必要な場合、蛍光の検出（置き換え可能代替標的プローブによる）は、サンプルにおける標的配列の存在を確認するように用いられることが可能である。本発明の特定の実施形態に従って、捕捉プローブは、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面に対して共有結合し、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面に対する吸着を有する付加ステップについての必要性を除去する。上記のように、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ信号の検出は、殆どの場合、蛍光信号の検出により補完される又は置き換えられることが可能である。
【００６６】
本発明の更なる特徴においては、アナライトの検出は、上記のような競合ＳＥ（Ｒ）ＲＳに基づき、それにより、集合体及び光学的変動に関して、測定を較正する（内部）標準ハイブリッドが含まれる方法が提供される。この特徴に従って、その方法は、“標準ハイブリッド”を形成することが可能である標準プローブ及び標準捕捉プローブである、相補的な標識付けされたプローブ及び捕捉プローブを付加するステップを更に含む。特定の実施形態に従って、標準ハイブリッドは内部標準であり、即ち、サンプルに付加される。サンプルにおいて標準ハイブリッドの信号を代替ハイブリッドの信号と区別することができるように、異なるＳＥ（Ｒ）ＲＳラベル（及び／又は蛍光ラベル）が用いられる。他の特定の実施形態に従って、標準ハイブリッドがサンプルの一部に付加される。他の特定の実施形態に従って、標準ハイブリッドは制御サンプルに付加される。後者の２つの実施形態は、複数の類似するサンプルを測定するときに、特に有用である。
【００６７】
一実施形態に従って、標準捕捉プローブの配列は、検出において用いられる捕捉プローブの配列と同じであり、標準プローブは置き換え可能代替標的プローブである。非置き換え可能代替標的プローブのＴｍは置き換え可能代替標的のＴｍより高いため、非置き換え可能代替標的プローブは、代替標的プローブのＴｍにおいてアナライトにより捕捉プローブから置き換えられない。代替として、標準捕捉プローブのヌクレオチド配列は標的に特異ではないが、対応する標準プローブを特別に結合する（任意の）配列である。これは、サンプルへの標準ハイブリッドの付加が検出（又は、必要に応じて、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面の付加）に先行していつでも、そしてハイブリッドか又は個別の構成要素のどちらかとして実行されることが可能である。アナライトと異なる標準プローブ及び標準捕捉プローブの組み合わせの供給は、異なる検出における同様の標準ハイブリッドの使用を可能にする。
【００６８】
本発明に従って、表面増強スペクトロスコピーの特定の特徴を用いる置き換え測定について説明する。ＳＥ（Ｒ）ＲＳのような表面増強スペクトロスコピーによる検出は、金属粗面上に又は金属粗面に近接して（≦±３０Å）吸着されたアナライトについて観測されるラマン散乱の強い増強に基づいている。本発明に従って、ＳＥ（Ｒ）ＲＳレベルは、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面の付加により検出される。典型的には、その表面は、貴金属（Ａｕ，Ａｇ，Ｃｕ）表面又はアルカリ金属（Ｌｉ，Ｎａ，Ｋ）表面である。その金属表面は、例えば、エッチングされた又は他の金属粗面、金属ゾルであることが可能であり、又は、特定の実施形態に従って、後者のような金属コロイド粒子の集合体は、ラマン散乱の１０８乃至１０１４より大きい増強を確実にすることが可能である。本発明の検出方法におけるＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面金属ナノ粒子はまた、金属ナノ粒子島状膜、金属コーティングナノ粒子ベースの基板、埋め込まれた金属ナノ粒子を有するポリマー膜等の状態で備えられることが可能である。金属表面はむき出しの金属であることが可能であり、又は金属表面における金属酸化膜層を有することが可能である。その金属表面は、吸着能力を高めるように、クエン酸塩又は適切なポリマー、ポリリシン、ポリフェノール等の有機コーティングを有することが可能である。
【００６９】
本発明の特定の実施形態に従って、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面を成す金属コロイド粒子は、米国特許出願公開２００５／０１３０１６３Ａ１号明細書に記載されているような制御方法で集合体化されたナノ粒子又はコロイドなの粒子である。ナノ粒子を調整する代替の方法が知られている（例えば、米国特許第６０５４４９５号明細書、米国特許第６１２７１２０号明細書及び米国特許第６１４９８６８号明細書を参照されたい）。ナノ粒子はまた、製造業者（例えば、Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．（米国ニューヨーク州Ｙａｐｈａｎｋ）、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．（米国Ｐａ州Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ））から入手可能である。その金属粒子は、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ効果をもたらす限り、何れの大きさのものであってもよい。典型的には、その金属粒子は、金属の種類に応じて、直径が約４乃至５０ｎｍ、特に、２５乃至４０ｎｍの範囲内である。
【００７０】
他の特定の実施形態に従って、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面は、銀又は金のナノ粒子のコロイド懸濁液又はそれらの集合体化コロイドである。検出の再現性及び較正のために重要である集合体化コロイド粒子の大きさ及び形状は、ポリ−Ｌ−リジン又はスペルミン等のポリアミンを用いることにより確実にされることが可能である。集合体化コロイドの大きさは、時間の経過と共に変化する可能性があり、それらのコロイドは、理想的には、検出サンプル内でその場で形成され、ＳＥ（Ｒ）ＲＳスペクトルは、その後の短い時間で（好適には、集合体化の約１５分後以内に）得られる必要がある。
【００７１】
更なる特定の実施形態に従って、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面は、金ナノ粒子に捕捉プローブを共有結合させた後に、銀ヒドロキノンの添加により銀をコーティングされた金ナノ粒子を有する。特に、この実施形態に従って、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面は、金又は銀のそれぞれの薄膜（１乃至数ｎｍ）がコーティングされた銀又は金ナノ粒子を有する。
【００７２】
他の特定の実施形態に従って、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面は、銀又は金ナノ粒子の安定なクラスタを有し、それらのクラスタは、該クラスタに化学結合することが可能である二機能又は多機能高分子（テレマー（ｔｅｌｅｍｅｒ））との架橋により構築される。
【００７３】
ＳＥ（Ｒ）ＲＳ検出及び蛍光検出のどちらか又はそれらの両方を用いる本発明の検出方法及び／又は定量化方法において、代替標的プローブの標識が、代替標的プローブを捕捉プローブに結合することによりＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面に近接するようにもたらされ、後者はＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面に結合される。ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面への捕捉プローブの結合は、共有結合又は非共有結合によるものである。オリゴヌクレオチドプローブをＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面に結合する種々のオプション及びモードが当該技術分野において知られていて（米国特許第６１２７１２号明細書及び米国特許第６９７２１７３号明細書を参照されたい）、捕捉プローブ又は代替ハイブリッドをＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面に結合するために適用されることが可能である。
【００７４】
一実施形態に従って、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面への捕捉プローブの付着は共有結合によるものである。捕捉プローブは、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面へのそのプローブの化学吸着を促進する又は容易化するように、表面探索基と適合される。表面探索基は、溶液に溶けるが、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面と優先的に相互作用する。このことは、捕捉プローブのオリゴヌクレオチドの一部に１つ又はそれ以上の官能基を組み込むことにより確実にされる。適切な官能基は、容易に核酸に添加されることが可能であるチオール及びアミンのようなルイス塩基を有する。表面探索基の他の例には、窒素、酸素、イオウ及びリンドナー、キレート基、架橋配位子、高分子形成配位子等の錯体基を有する。金表面については、リン及びイオウ含有基は特に、好適である。
【００７５】
特定の実施形態に従って、捕捉プローブの表面探索基は、捕捉プローブがＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面に共有結合することを可能にするベンゾトリアゾールである。
【００７６】
他の特定の実施形態に従って、捕捉プローブの表面探索基は、捕捉プローブがＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面に共有結合することを可能にする少なくとも１つのチオール基を有する。
【００７７】
好適な官能基は、付加陽イオンサイト（用いている条件下で）、例えば、アミノ基を有する付加陽イオンサイト、好適には、第１級アミノ基を与えることが可能である官能基である。好適な実施形態に従って、捕捉プローブの表面探索基は、正に帯電したプロパギルアミンの一部を有する。他の実施形態に従って、金属ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面への捕捉プローブの吸着は、単量体の又は重合体のポリアミン、特に、スペルミンのような短鎖脂肪族のポリアミンにより確実にされる。それ故、一実施形態に従って、本発明の方法は、検出に先行して、サンプルへのポリアミンの付加を有する。ポリアミンは、ＳＥ（Ｒ）ＲＳスペクトルが得られる前に、代替ハイブリッドとの相互作用を可能にするときに導入される必要がある。ポリアミンは、好適には、スペルミン、スペルミジン、１−４−ジアミノピペラジン、ジエチレントリアミン、Ｎ−（２−アミノエチル）−１−３−プロパンジアミン、取りエチレンテトラアミン及びテトラエチレンペンタミン等の短鎖脂肪族のポリアミンである。繰り返し単位当たり４つのＮＨ２基を有するスペルミンは、本発明で用いるのに特に適切である。ポリアミンは、その塩酸塩のような酸塩の形で好適に導入される。ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面がコロイド状（上記を参照されたい）であるときに最もよく使われる。付加されるポリアミンの量は、好適には、ポリアミンでその表面の単層のカバレッジを得るために必要なものに比べて１００乃至１０００倍のオーダーを有する。過剰なポリアミンは、表面上のコーティングを形成し、それにより、捕捉プローブ及び／又は代替ハイブリッドの最適なコロイド状集合体及び吸着を確実にする。
【００７８】
上記のように、本発明の方法においては、表面増強（共鳴）されたラマン分光法又はＳＥ（Ｒ）ＲＳに基づく検出及び／又は定量化方法に特に関心がある。本明細書においては、一般に、ＳＥ（Ｒ）ＲＳについて言及しているが、例えば、表面増強蛍光、通常の（ストークス又は反ストークス）ラマン散乱、共鳴ラマン散乱、コヒーレントストークス又は反ストークス）ラマン分光（ＣＳＲＳ又はＣＡＲＳ）、表面増強（共鳴）ＣＡＲＳ、誘導ラマン散乱、逆ラマン分光、誘導利得ラマン分光、ハイパーラマン散乱、表面増強ハイパーラマン散乱、ＭＯＬＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｌａｓｅｒ  Ｅｘａｍｉｎｅｒ）又はラマンマイクロプローブ又はラマン顕微鏡又は共焦点顕微ラマン分光測定、三次元又は散乱ラマン、ラマン飽和分光、時間分解共鳴ラマン、ラマンデカップリング分光又はＵＶ−ラマン顕微鏡等の、他の種類の表面増強分光法に基づく検出方法がまた想定されるが、それらに限定されるものではない。
【００７９】
本発明の特定の実施形態においては、本発明の検出方法はＳＥＲＲＳを有し、標識の共鳴周波数における動作が向上した感度を与えることができる。この場合、ラマンスペクトルを生成するように用いられる光源は、コヒーレントな光源、例えば、用いられる略標識の最大吸収周波数に対して調整されたレーザである。この周波数は、標識のＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面との関連性及び代替標的プローブのオリゴヌクレオチドの一部に関して僅かにシフトする可能性があるが、当業者は、これに対応するように光源をうまく調整することができるであろう。光源は、略標識の吸収の最大の周波数に、又は標識の吸収スペクトルにおける二次ピークの周波数に又は略二次ピークの周波数に調整されることが可能である。ＳＥＲＲＳは、代替として、活性表面又は（集合体化）コロイドにおけるプラスモンの共鳴周波数における動作を有することが可能である。
【００８０】
ＳＥ（Ｒ）ＲＳ検出に基づく本発明の方法においては、典型的には、例えば、標識の吸収の最大に対応する１つのピークが選択され、励起がそのピークの波長のみにおいて実行される。代替として、例えば、異なるアナライトが異なる標識を用いて同時に検出される場合、各々の標識を識別するように、全体の“指紋”スペクトルを検出する必要がある。一般に、多変量分析方法（ＰＬＳ（Ｐａｒｔｉａｌ  Ｌｅａｓｔ  Ｓｑｕａｒｅｓ）回帰、主成分回帰等）が、全体の指紋スペクトル、２つ以上のラマンバンドを有するスペクトル領域又は１つの特異なラマンバンドの何れかを用いて、存在する標識の各々の定性的及び／又は定量的識別を実行するように用いられることが可能である。
【００８１】
本発明の特定の実施形態においては、本発明の検出方法は、表面増強（共鳴）ラマン及び蛍光分光法（上記を参照されたい）の両方による同時検出を有する。
【００８２】
典型的には、ＳＥ（Ｒ）ＲＳベースの検出方法における検出ステップは、可視スペクトルにおける周波数を有するレーザからの入射光を用いて実行される。周波数を正確に選択することは、標識、表面及びアナライトに依存する。可視スペクトルの緑色領域又は赤色領域における周波数は、概して、銀及び金のような貴金属表面についてより良好な表面増強効果をもたらす傾向にある。しかしながら、例えば、紫外線領域又は近赤外線領域における他の周波数が用いられることが可能である条件を想定することが可能である。適切な周波数及びパワーを有する適切な光源の選択及び調整は、特に、利用可能なＳＥ（Ｒ）ＲＳの参考文献を参照するときは、十分に当業者の能力の範囲内にある。
【００８３】
ＳＥ（Ｒ）ＲＳベースの検出方法で用いる励起源には、窒素レーザ、ヘリウム−カドミウムレーザ、アルゴンイオンレーザ、クリプトンイオンレーザ等があるが、それらに限定されるものではない。複数のレーザが、共鳴ラマン分光のために重要な励起線の広い選択を与えることができる。特定の実施形態に従って、アルゴンイオンレーザが、５１４．５ｎｍの励起波長でＬａｂＲａｍ一体型機器（Ｊｏｂｉｎ  Ｙｖｏｎ）において用いられる。
【００８４】
励起ビームは、バンドパスフィルタによりスペクトル的に純化されることが可能であり、６倍対物レンズを用いて対象物にフォーカシングされることが可能である。その対物レンズは、発せられるラマン信号及び励起ビームについて直角形状になるようにホログラフィックビームスプリッタを用いることにより、ラマン信号を補正し且つサンプルを励起するように用いられることが可能である。ラマン信号の強度は、励起ビームからの強いバックグラウンドに対して測定される必要がある。そのバックグラウンドは主に、高効率の光学フィルタにより選択的に除去されることが可能であるレイリー散乱光及び鏡面反射である。例えば、ホログラフィックノッチフィルタが、レイリー散乱放射を除去するように用いられる。
【００８５】
表面増強ラマン発光信号がラマン検出器により検出される。ラマン分光で用いられる可能性が高い種々の検出装置が当該技術分野で知られていて、何れかのラマン検出装置を用いることが可能である、ラマン検出装置の例については、例えば、米国特許第６００２４７１号明細書において開示されている。例えば、赤色増強された増強型電荷結合素子（ＲＥ−ＩＣＣＤ）、シリコンフォトダイオード、若しくは信号の縦続増幅のために単独で又は直列的に配列された光電子倍増管を有する電荷結合素子（ＣＣＤ）等の他の種類の検出器が用いられることが可能である。光子係数エレクトロニクスが感応性検出のために用いられる。その検出器の選択は、特定の測定を実行するために必要な検出の感度にかなり依存する。波長選択ミラー、散乱光検出のためのホログラフィック光学要素及び光ファイバ導波路を含む複数の装置が、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ信号を収集するために適切である。例えば、国際公開第９７／０５２８０号パンフレットにおいて、種々の光学系が開示されている。
【００８６】
ＳＥ（Ｒ）ＲＳスペクトルを得る及び／又は分析する装置は、コンピュータ等のあるデータ処理器の形式を有することが可能である。一旦、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ信号が適切な検出器により捕捉されると、その信号の周波数及び強度データは、典型的には、分析のためのコンピュータに渡される。指紋ラマンスペクトルが、検出されたラマン活性化合物の識別のための参照スペクトルと比較される、又は、測定周波数における信号強度が、検出されるラマン活性化合物の量を計算するように用いられる。
【００８７】
本発明の特定の実施形態において、２つのＰＣＲ産物、即ち、サンプルにおける遺伝子Ａ及び遺伝子Ｂを検出するＳＥ（Ｒ）ＲＳ置き換え測定が行われる。それらの方法は、基本的に次のようである。遺伝子Ａ及び遺伝子Ｂについての捕捉プローブ、並びにラベルＨＥＭ及びＴＥＴを担持するそれらの対応する代替ターゲットプローブのそれぞれは、接触され、ハイブリダイズすることを可能にされる。捕捉プローブは、銀表面に対する吸着を促進する表面探索基を有する。代替標的プローブ及び捕捉プローブのハイブリダイゼーションは、遺伝子Ａ及びＢの標的配列の各々についての代替ハイブリッドをもたらす。代替ハイブリッドは、銀ナノ粒子コロイドに実質的に吸着される。第１ＳＥ（Ｒ）ＲＳ測定が実行される。遺伝子Ａ及びＢを有するサンプルが付加される。例えば、代替標的及びダブルスタンダードＰＣＲ産物を解離するように、９５℃における変性後、温度は、対応する捕捉プローブに対してアナライトＤＮＡ（即ち、変性遺伝子Ａ及びＢ）をアニーリングするために最適であり、それらのプローブに対して代替標的プローブをアニーリングするために次善であるアニーリング温度に低下される。このようにして、アナライトＤＮＡと代替標的プローブとの間の競合が起こり、表面に吸着された代替ハイブリッドから有効に置き換えられる代替標的プローブをもたらす。上記のように、置き換え条件は、代替ハイブリッドのＴｍより高いアニーリング温度において最適である。第２ＳＥ（Ｒ）ＲＳ測定は、置き換え代替標的プローブに付着されたＳＥ（Ｒ）ＲＳラベルはもはや、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面に十分に近接してはいないために、アナライトの付加に先行する場合に比べて、小さいＳＥ（Ｒ）ＲＳ信号をもたらす。任意に、ＳＥ（Ｒ）ＲＳと共に又はそれに代えて、蛍光が測定される。代替ハイブリッドにおけるラベルの蛍光は、クエンチングのために、略０である。アナライトがサンプル中に存在する場合、代替標的プローブの置き換えがクエンチングのソースを除去するにつれて、信号はそれに伴って増加する。遺伝子の各々について置き換えられる代替標的プローブの量は、サンプル中に存在する遺伝子Ａ及びＢの量を表す。
【００８８】
図５は、本発明の実施形態に従ったシステム１００についての模式図である。システム１００は、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ及び蛍光に基づく置き換え測定を用いるサンプルにおける少なくとも１つのアナライトの存在を検出する、及び任意に定量化するために適切である。そのシステム１００は、サンプルを供給するソース１０１と、代替標的プローブを供給する少なくとも１つのソース１０２と、捕捉プローブを供給する少なくとも１つのソース１０３と、任意に、内部標準のための試薬を供給する少なくとも１つのソース１０４と、検出において供給される付加物の少なくとも１つのソース１０５と、を有する。その装置は、代替標的プローブ、捕捉プローブ及びアナライトが接触され、検出のために備えられている手段１０７を更に有する。その接触手段１０７は、その手段において適切な温度を確実にする加熱設備を有する。
【００８９】
その装置は、
ａ）代替ハイブリッドを生成するように捕捉プローブと代替標的プローブを接触手段１０７にソース１０２及び１０３のそれぞれから代替標的プローブ及び捕捉プローブを供給し、
ｂ）代替標的プローブに付着されたＳＥ（Ｒ）ＲＳラベルの検出を可能にするように、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面と代替ハイブリッドを接触手段１０７にソース１０５から付加物を供給し、
ｃ）代替標的プローブの置き換えを可能にするように、代替ハイブリッドとサンプルを接触手段１０７へのソース１０１からのアナライトを有するサンプルを供給し、
そして、任意に、
ｄ）集合体形成の変化及び光学的変化に関して、測定を較正する手段１０３に少なくとも１つのソース１０４から少なくとも１つの内部標準試薬を供給する、
手段を更に有する。
【００９０】
手段１０６は、サンプル及び／又はアナライトの重量供給を有することが可能であり、ソース１０１、１０２、１０３、１０４及び１０５から接触手段１０７への流体の供給を可能にするように、パイプ／コンジット及びバルブの構成をまた、有することが可能である。代替として、それらの流体は、ソース１０１乃至１０５から接触手段１０７にポンピングして供給されることが可能である。
【００９１】
上記の構成要素の構成は、カートリッジ１１１、例えば、分子診断で用いる使い捨てカートリッジ１１１において位置付けられることが可能である。
【００９２】
制御及び分析回路１０９は、カートリッジ１１１における少なくとも一部である、又はカートリッジ１１１に対して外部にあるオプションであることが可能であり、手段１０６の動作を制御するようにオプションとして備えられることが可能である。
【００９３】
更に、ラベルを検出する手段１０８が備えられる。手段１０８は、カートリッジ１１１と一体化されることが可能である、又はそのカートリッジに対して外部にあることが可能であり、検出手段１０８がサンプル等を検出することが可能であるように、窓がカートリッジ１１１において備えられることが可能である。検出手段１０８は、上記のＳＥ（Ｒ）ＲＳ及び蛍光検出方法を用いることができる検出器であることが可能である。手段１０８は、励起ソース、フィルタ及び検出器を有することが可能である。典型的には、その検出手段は分光測光装置を有する。検出を表す信号は、上記の本発明の分析アルゴリズムの何れかを実行するように適合させることが可能である制御及び分析回路１０９に対して供給されることが可能である。その結果は、視覚表示装置、プロッタ、プリンタ等のような何れかの適切な表示手段１１０において表示されることが可能である。制御及び分析回路１０９は、遠隔の位置に対するその結果の送信のためのローカルエリアネットワーク又はワイドエリアネットワークへの接続を有することが可能である。制御及び分析回路１０９は例えば、専用ハードウェア又は適切なプログラム可能コンピュータ、マイクロコントローラ又はマイクロプロセッサのような組み込まれたプロセッサ、ＰＡＬ、ＰＬＡ又はＦＰＧＡのようなプログラム可能ゲートアレイ等の何れかの適切な方式で実行されることが可能である。
【００９４】
本発明の特定の実施形態に従って、ソース１０１におけるサンプルは、ＰＣＲ反応から得られるＤＮＡを有する溶液であることが可能である。この実施形態は、細胞溶解ステーション及びＰＣＲ反応ステーション、特に、多重ＰＣＲ反応ステーションを有することが可能である分子診断使い捨てカートリッジにおいて用いるために特に有用である。ＰＣＲ反応ステーションの出力は、その場合、ソース１０１を構成する。増幅されたオリゴヌクレオチドの検出のためのソース１０３における捕捉プローブはアナライト特異オリゴヌクレオチドプローブである。ソース１０２における代替標的プローブは、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ検出及び蛍光検出の両方について適切であるＳＥ（Ｒ）ＲＳラベルが付着されたオリゴヌクレオチドプローブである。特定の実施形態に従って、代替標的プローブのヌクレオチド配列は、捕捉プローブへの代替標的プローブの結合力が次善であるようなＳＮＰを有する。ソース１０４は、（非置き換え可能）標準ハイブリッドである内部標準の所定量を有することが可能である。第１ソース１０５は、コロイド粒子又は金属表面でコーティングされたビーズ、特に、集合体化可能コロイド粒子又は金属表面がコーティングされたビーズのような適切な金属表面を有することが可能である。
【００９５】
この特定の実施形態においては、ソース１０１から１０５までの試薬を適切に供給すること及びそれらを接触させることが、表面吸着代替ハイブリッド及び表面吸着標準ハイブリッドを有する接触手段１０７をもたらす。第１測定は、参照としてこのポイントにおいて実行される。次のステップにおいては、サンプルが付加される。捕捉プローブからの代替標的プローブの置き換え時には、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ信号における減少及び／又は蛍光における増加が観測される。
【００９６】
本発明を実行するシステム及び方法の他の構成についても、当業者は理解することができるであろう。
【００９７】
しかし、本発明の他の特徴は、例えば、伝染病、病理学、毒物学、疫学、生物兵器戦争、環境サンプリング、法医学等の分子診断のような医療診断のようなアプリケーションに関連するサンプル中のアナライトの検出及び／又は定量化における本発明のシステム、使い捨てカートリッジ、組み合わせ及び方法の使用を提供するが、それらに限定されるものではない。
【００９８】
ここでは、好適な実施形態、特定の構成及び材料が、本発明に従った装置について説明されているが、本発明の範囲及び主旨から逸脱することなく、形式及び詳細における種々の変形又は修正が実施されることが可能である。
【００９９】
内部較正を有する競合ＳＥＲＲＳを用いるサンプル中の特定の遺伝子の検出及び定量化の実施例１
動物個体群、特に、ニワトリにおけるインフルエンザＡウィルスの特定の特殊型によりもたらされる高病因性鳥類インフルエンザは、継続的な人間の大衆の健康上のリスクをもたらしている。鳥インフルエンザＡの特殊型Ｈ５Ｎ１ウィルスによる直接的な人間への影響は、即座の且つ適切な診断の必要性を重視するように、近年、人間の道徳が考慮される原因となっている。Ａ型インフルエンザウィルスは、過剰な糖蛋白質、血球凝集素（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）における抗原性差に基づいて特殊型化される。本発明は、ウィルス核酸のＲＴ−ＰＣＲ及びＳＥＲＲＳを用いることによる、ウィルスの特殊型化に対する新規で高速且つ正確な方法を提供する。
【０１００】
ウィルスＲＮＡは診断サンプルから抽出され、ウィルスＲＮＡについての相補的なｃＤＮＡは、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３３：１１８０−１１８４（１９９５），ｂｙ  Ｗｒｕｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．による逆転写酵素及びランダムプライマーを用いて生成される。マルチプレックスＰＣＲは、沸点２１９℃及び６１６℃のＰＣＲ産物を生成するようにデザインされた“Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｔｅｓｔｓ  ｔｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ａｖｉｏｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎｓ”，ＷＨＯ  Ｇｅｎｅｖａ、Ｊｕｎｅ  ２００５に記載されているインフルエンザウィルスの特殊型Ｈ５Ｎ１のＨＡ及びＮＡ遺伝子について特異なプライマーの２つの集合を用いて行われる。
【０１０１】
更に、２つのアナライト特異プローブ、所謂、捕捉プローブは、ＨＡ遺伝子及びＮＡ遺伝子のそれぞれにおける領域に対して相補的であるように、そして銀ナノ粒子への付着のための正に帯電したプロパギルアミンの一部を有する表面探索基を有するようにデザインされている。ＳＥＲＲＳ色素ＨＥＸ及びＴＥＴのそれぞれにより標識付けされた２つの付加的な合成オリゴヌクレオチド、所謂、代替標的は、１つのミスマッチ（ＳＮＰ）を除いて、ＨＡ捕捉プローブ及びＮＡ捕捉プローブの一部に対して相補的であるようにデザインされている。
【０１０２】
代替標的プローブを対応する捕捉プローブと接触させるとき、代替ハイブリッドが生成される。しかしながら、代替標的プローブの配列におけるミスマッチの存在のために、代替標的プローブ並びに対応するＨＡ捕捉プローブ及びＮＡ捕捉プローブは粗くアニーリングされる。
【０１０３】
検出で用いられる標識と異なる標識を担持する非置き換え可能代替ハイブリッドである所定量の内部標準が、較正のために、及び集合物の生成及び励起強度におけるバラツキを補正するように、上記混合物に付加される。
【０１０４】
第１検出ステップは、ＨＥＸ及びＴＥＴのＳＥＲＲＳ測定についての参照点並びに内部較正のための参照点を決定する。更に、上記の調整された溶液は、１０μｌのスペルミン四塩化物と共に混合され（新たに調整された水における１００ｍＭｏｌ）、続いて、２５０μｌの水と２５０μｌのクエン酸塩還元銀ナノ粒子（Ｌａｎｇｍｕｉｒ，１１：３７１２−３７２０（１９９５），ｂｙ  Ｍｕｎｒｏ  ｅｔ  ａｌ．において記載されている）テトラミン四塩化物と混合される。銀コロイドへの代替ハイブリッドの吸着は、蛍光がクエンチされる間にＳＥＲＲＳ検出を可能にする金属表面の十分な近傍にＨＥＸ及びＴＥＴを移動させる。同様に、銀コロイドへの内部標準の吸着は、内部標準の色素のＳＥＲＲＳ検出を可能にする。混合直後に、ＳＥＲＲＳスペクトルが、５１４．５ｎｍにおける励起を与えるアルゴンレーザと共にＬａｂＲａｍシステム（Ｊｏｂｉｎ  Ｙｖｏｎ）を用いて、その調整された溶液から取られる。
【０１０５】
増幅されたＨ５Ｎ１ウィルスのＨＡ及びＮＡ遺伝子の検出のために、ＰＣＲ反応の出力が付加される。９５℃における変性の後、適切なアニーリング温度におけるインキュベーションは、ＨＡ捕捉プローブ及びＮＡ捕捉プローブとのアナライトＤＮＡの関連性をもたらし、後者は、集合体化した銀コロイドに対して付着される。アナライトの配列は、好適には、ＨＡ及びＮＡ特異捕捉プローブに対して相補的であるため、ＨＡ及びＮＡ捕捉プローブに対するアナライトＤＮＡのハイブリダイゼーションは、代替ハイブリッドの融点において置き換えられることのできない標的ハイブリッドをもたらす。仮に標準ハイブリッドのＴｍが代替ハイブリッドのＴｍより高い場合、標準ハイブリッドは上記のインキュベーションステップによっては影響されない。
【０１０６】
第２ＳＥＲＲＳスペクトルは、アナライトＤＮＡの捕捉プローブとの結合直後及び第１ＳＥＲＲＳ測定後１５分の時間範囲内に取られる。ＨＥＸ色素及びＴＥＴ色素のＳＥＲＲＳ信号の強度は、ここで、代替標的プローブの置き換えのために減少し、それらの代替標的プローブに金属表面からそれらの色素が付着される。ＰＣＲ出力におけるＨＡ遺伝子又はＮＡ遺伝子の量は、ここでは、置き換えられた代替標的プローブの量に対応するため、計算されることが可能である。更に、第１ＳＥＲＲＳ測定及び第２ＳＥＲＲＳ測定は比較される必要がある。
【０１０７】
較正のために、内部標準の第１ＳＥＲＲＳスペクトル及び第２ＳＥＲＲＳスペクトルが比較され、強度変化が補正される。
【０１０８】
この実施例は、競合ＳＥＲＲＳを用いて増幅されたウィルスのＨＡ遺伝子及びＮＡ遺伝子の正確な検出が、それらの増幅された遺伝子を標識付けする必要性を伴わずに達成されることを示している。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】Ａ：ＳＥＲＲＳ置き換え測定の実施形態の模式図である。アナライトにおける標的配列に対して相補的な配列を有する捕捉プローブが、負に帯電した表面と正に帯電した表面探索基との間の電気化学的相互作用によりクエン酸塩により還元された銀ナノ粒子の表面に吸着される。置き換え可能代替標的プローブは、捕捉プローブに対して相補的であり、それにより、その捕捉プローブに対してハイブリダイズする。このように、ＳＥＲＲＳ色素は銀表面の接近し、強いＳＥＲＲＳ信号が検出される。Ｂ：ＳＥＲＲＳ置き換え測定の実施形態の模式図である。サンプルの付加後、標的配列を有するアナライトは、捕捉プローブに対するハイブリダイゼーションのための代替標的プローブと競合する。置き換え可能代替標的プローブ（１つ又はそれ以上のＳＮＰを有する）は、捕捉プローブに対して好適に相補的でないため、アナライトのハイブリダイゼーションはより効果的であり、置き換え可能代替標的プローブはアナライトにより銀表面から置き換えられる。ＳＥＲＲＳ信号は、それ故、サンプルにおけるアナライトの量に比例して減少する。
【図２】波長の関数としてのＳＥＲＲＳ色素ＨＥＸの吸収スペクトルを示すグラフである。
【図３】銀表面に対する吸収を促進するようにアミノプロパギルの一部を有する５ＨＥＸでラベル付けされたオリゴヌクレオチドのＳＥＲＲＳスペクトルを示すグラフである。そのＳＥＲＲＳ信号（バックグラウンド補正を伴わない）は、スペルミンが集合体化された銀ナノ粒子へのオリゴヌクレオチドの吸着後に測定される。
【図４】本発明の一実施形態に従って検出方法を示すブロック図である。
【図５】本発明の一実施形態に従った装置の模式図である。
【図１】
2009537135.tif 000002
【図２】
2009537135.tif 000003
【図３】
2009537135.tif 000004
【図４】
2009537135.tif 000005
【図５】
2009537135.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成20年11月18日(2008.11.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルにおける少なくとも１つのアナライトの存在及び／又は量を検出する方法であって：
（ａ）前記サンプルを、
（ｉ）前記アナライトにおける標的配列を特に結合することができるオリゴヌクレオチドを有する少なくとも１つの標的特異捕捉プローブ、及び
（ｉｉ）前記標的特異捕捉プローブを特に結合することができるオリゴヌクレオチドと、表面増強（共鳴）ラマン散乱（ＳＥ（Ｒ）ＲＳ）活性及び蛍光活性の両方を有する標識と、を有する少なくとも１つの置き換え可能代替標的プローブ、
と接触させるステップであって、
前記少なくとも１つの標的特異捕捉プローブが、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面と共有結合しているか又は、前記ステップ（ａ）が前記少なくとも１つの標的特異捕捉プローブをＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面と接触させるステップを更に有するかのどちらかである、
ステップ；並びに
（ｂ）ＳＥ（Ｒ）ＲＳ及び蛍光を用いて、前記少なくとも１つの置き換え可能代替標的プローブ及び前記少なくとも１つの標的特異捕捉プローブの結合により形成される少なくとも１つの代替ハイブリッドにおける前記標識により生成される前記信号を検出するステップであって、前記信号は、前記サンプルの前記少なくとも１つのアナライトの前記存在及び／又は量に対して釣り合っている、ステップ；
を有する方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記ステップ（ａ）は：
（Ｉ）少なくとも１つの代替ハイブリッドを得るように、前記少なくとも１つの標的特異捕捉プローブを前記少なくとも１つの置き換え可能代替標的プローブと接触させるステップであって、
前記少なくとも１つの標的特異捕捉プローブはＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面と共有結合し、少なくとも１つの表面吸着代替ハイブリッドが、それ故、得られる、又は、前記ステップ（Ｉ）は、前記少なくとも１つの標的特異捕捉プローブをＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面と接触させるステップを更に有する、又は、前記ステップ（Ｉ）は、前記少なくとも１つの代替ハイブリッドが少なくとも１つの表面吸着代替ハイブリッドとしての前記表面において吸着されるようになるように、前記少なくとも１つの代替ハイブリッドを前記ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面と接触させるステップを更に有する、
ステップ；
（ＩＩ）前記少なくとも１つのアナライトによる前記少なくとも１つの置き換え可能代替標的プローブの置き換えを可能にするように、前記少なくとも１つの表面吸着代替ハイブリッドを前記サンプルと接触させるステップ；
を有する方法であり、前記ステップ（ｂ）は、
（ＩＩＩ）ＳＥ（Ｒ）ＲＳ及び蛍光の両方を用いて、前記ステップ（Ｉ）の後に、前記少なくとも１つの表面吸着代替ハイブリッドにおける前記標的の前記信号を検出するステップ；及び
（ＩＶ）前記ステップ（ＩＩＩ）において用いられる同様の検出方法を用いて、前記ステップ（ＩＩ）の後に、前記少なくとも１つの表面吸着代替ハイブリッドの前記信号を検出するステップ；
を有し、前記ステップ（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）において得られた前記信号における差が、前記サンプルにおける前記少なくとも１つのアナライトの前記存在及び／又は量に対して釣り合うように取られる；
方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、前記ステップ（ａ）は：
（Ｖ）少なくとも１つの代替ハイブリッドを得るように、前記少なくとも１つの標的特異捕捉プローブを前記少なくとも１つの置き換え可能代替標的プローブと接触させるステップ；
（ＶＩ）前記少なくとも１つの代替ハイブリッドが少なくとも１つの表面吸着代替ハイブリッドを形成する前記表面において吸着されるようになるように、前記少なくとも１つの代替ハイブリッドを前記ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面と接触させるステップ；及び
（ＶＩＩ）前記少なくとも１つのアナライトによる前記少なくとも１つの置き換え可能代替標的プローブの置き換えを可能にするように、前記少なくとも１つの表面吸着代替ハイブリッドを前記サンプルと接触させるステップ；
を有する、方法。
【請求項４】
請求項２に記載の方法であって、前記ステップ（ＩＩ）は、前記サンプルにおける前記少なくとも１つのアナライトの前記少なくとも１つの捕捉プローブとのハイブリゼーションを可能にするように、適切なアニーリング条件を確実にするステップを有する、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、前記少なくとも１つの置き換え可能代替標的プローブは、前記少なくとも１つの捕捉プローブの前記オリゴヌクレオチド配列に対して１００％相補的でないオリゴヌクレオチド配列を有する、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記少なくとも１つの標的特異捕捉プローブは表面探索基を更に有し、前記少なくとも１つの標的特異捕捉プローブは前記表面探索基を介して前記ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面に結合する、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって：
ステップ（ｃ）であって、
（ｉｉｉ）オリゴヌクレオチド及び表面探索基を有する標準捕捉プローブ、及び
（ｉｖ）前記標準捕捉プローブの前記配列に対して１００％相補的であるオリゴヌクレオチドと、表面増強（共鳴）ラマン散乱（ＳＥ（Ｒ）ＲＳ）活性及び蛍光活性の両方を有する標識と、を有する標準プローブ、
を接触させ、それにより、表面吸着標準ハイブリッドを得る、
ステップ（ｃ）；並びに
（ｄ）前記表面吸着標準ハイブリッドにおいて前記標識により生成される前記信号を検出するステップ；
を更に有する方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、前記ステップ（ｃ）において得られた前記標準ハイブリッドは前記ステップ（ａ）における前記サンプルに付加され、前記標準プローブは、前記少なくとも１つの代替標的プローブに与えられた前記標識とは異なる標識を有する、方法。
【請求項９】
請求項７に記載の方法であって、前記標準捕捉プローブは、前記標的配列とハイブリダイズしないオリゴヌクレオチド配列を有する、方法。
【請求項１０】
請求項７に記載の方法であって、前記ステップ（ｃ）及び（ｄ）は前記ステップ（ａ）及び（ｂ）のバイアルとは異なるバイアルにおいて実行される、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記ステップ（ａ）及び（ｃ）における前記サンプルは制御サンプルである、方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、前記少なくとも１つの捕捉プローブは表面探索基を有する、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、前記表面探索基はベンゾチアゾールである、方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、前記ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面は、前記捕捉プローブを金ナノ粒子に共有結合させた後、銀ヒドロキノンの付加により銀がコーティングされた金ナノ粒子を有する、方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法であって、前記ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面は、銀又は金ナノ粒子のコロイド状懸濁液、又は該懸濁液の集合体化コロイドである、方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法であって、前記ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面は、１乃至数ｎｍの範囲内の金又は銀の薄膜がコーティングされた金又は銀を有する、方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法であって、前記ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面は銀又は金ナノ粒子の安定なクラスタを有する、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、前記クラスタは、前記クラスタに化学的に結合することが可能である二機能又は多機能高分子（テレマー）との架橋により構築される、方法。
【請求項１９】
代替標的プローブ及び捕捉プローブの組み合わせであって：
（ｉ）オリゴヌクレオチドを有する捕捉プローブ；並びに
（ｉｉ）前記捕捉プローブに結合することができるオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドは、前記捕捉プローブのオリゴヌクレオチドに対して１００％相補的であるオリゴヌクレオチドの融点より低い融点により特徴付けられる、オリゴヌクレオチドと、表面増強（共鳴）ラマン散乱（ＳＥ（Ｒ）ＲＳ）活性及び蛍光活性の両方を有する前記代替標的プローブに付着された標識と、を有する、代替標的プローブ；
を有する組み合わせ。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、前記ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面は銀又は金ナノ粒子の安定なクラスタを有する、方法。
【請求項２１】
請求項１９に記載の方法であって、前記捕捉プローブは、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ表面を結合することができる表面探索基を有する、方法。
【請求項２２】
サンプルにおける少なくとも１つのアナライトの存在及び／又は量を検出するシステムで用いる置き換え可能カートリッジであって：
（ａ）複数ソースの集合であって、
サンプルのソースと、
代替標的の少なくとも１つのソースと、
表面増強（共鳴）ラマン散乱（ＳＥ（Ｒ）ＲＳ）活性及び蛍光活性の両方を有する標識を前記プローブに付着させた、標的特異捕捉プローブの少なくとも１つのソースと、
前記検出において役立つ付加物の少なくとも１つのソースと、
を有する、ソースの集合；
（ｂ）前記複数ソースからの特定のボリュームと接触する手段；及び
（ｃ）前記複数ソースから前記接触する手段への流体の供給を確実にする手段；
を有する置き換え可能カートリッジ。
【請求項２３】
請求項２２に記載の置き換え可能カートリッジであって、内部標準試薬の少なくとも１つのソースを更に有する、置き換え可能カートリッジ。
【請求項２４】
請求項２２に記載の置き換え可能カートリッジであって、前記接触する手段において生成される信号を検出する窓を更に有する、置き換え可能カートリッジ。
【請求項２５】
サンプルにおいて少なくとも１つのアナライトの存在又は量を検出するシステムであって：
（ａ）前記サンプルを、
（ｉ）前記サンプルにおける標的配列を特に結合することができるオリゴヌクレオチドを有する少なくとも１つの標的特異捕捉プローブ、及び
（ｉｉ）前記捕捉プローブを特に結合することができるオリゴヌクレオチドと、表面増強ラマン散乱（ＳＥ（Ｒ）ＲＳ）活性及び蛍光活性の両方を有する標識と、を有する少なくとも１つの置き換え可能代替標的プローブ、
と接触させる手段；並びに
（ｂ）前記少なくとも１つの置き換え可能代替標的プローブ及び前記少なくとも１つの標的特異捕捉プローブの結合により形成される少なくとも１つの代替ハイブリッドにおける前記標識により生成される信号のＳＥ（Ｒ）ＲＳ検出及び蛍光検出のための手段；
を有するシステム。
【請求項２６】
請求項２５に記載のシステムであって、前記複数ソースから前記接触する手段への試薬の供給における異なる時点において、前記接触手段において検出される前記信号を比較することにより、前記少なくとも１つのアナライトの量を計算する手段を更に有する、システム。
【請求項２７】
請求項２５に記載のシステムであって、前記検出する手段は、光源、フィルタ及び検出手段を有する、システム。
【国際調査報告】
2009537135.tif 000007
2009537135.tif 000008
2009537135.tif 000009
2009537135.tif 000010
2009537135.tif 000011