(57)【要約】本発明は含式１に示した序列のペプチッド、或いは其の派生物に関わり、肝損傷を予防或いは治療する応用に用いる。特にこのペプチッド或いは其の派生物に関わり、肝損傷と丙型肝炎の予防或いは治療中に応用である。【化１】2009538838.tif 000013  其の中、  Xaa１は欠乏で、Ala、Gly、Val、Leu或いはIleである。  Xaa２はThr或いはSerである。  Xaa３はTyr、Phe或いはTrpで、そして  Xaa４は欠乏で、Ala、Gly、Val、Leu、Ile或いはProである。  本発明はまだペプチッド或いは其の派生物の薬物の組み合わせ物、準備方法を含み、及びこのペプチッドをエンコードするボリヌクレオチダーゼに関わる。
2009538838.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
含式１に示した序列のペプチッド或いは薬学上に受けられる塩或いはエステルは整備予防或いは肝損傷の治療薬物中に応用する。
【化１】
2009538838.tif 000009
其の中、
Xaa１は欠乏で、Ala、Gly、Val、Leu或いはIleである。
Xaa２はThr或いはSerである。
Xaa３はTyr、Phe或いはTrpで、そして
Xaa４は欠乏で、Ala、Gly、Val、Leu、Ile或いはProである。
【請求項２】
含式１に示した序列のペプチッド或いはその薬学上に受けられる塩或いはエステルは肝損傷の予防或いは治療に応用する。
【化２】
2009538838.tif 000010
其の中、
Xaa１は欠乏で、Ala、Gly、Val、Leu或いはIleである。
Xaa２はThr或いはSerである。
Xaa３はTyr、Phe或いはTrpで、そして
Xaa４は欠乏で、Ala、Gly、Val、Leu、Ile或いはProである。
【請求項３】
請求項１或いは２の応用は、其の中に肝損傷は免疫性の肝損傷或いは肝毒性の化学物質で起こした肝損傷である。
【請求項４】
請求項１或いは２の応用は、其の中に式１に示した序列のXaa１はGlyで、Xaa２はThrで、そしてXaa４は欠乏で、Ala或いはGlyである。
【請求項５】
請求項４の応用は、其の中にXaa４は欠乏である。
【請求項６】
請求項１或いは請求項２の応用は、其の中に述べた応用は更に治療する或いは丙型肝炎の予防を含む。
【請求項７】
請求項１〜６に述べた応用の薬物の組み合わせ物に使い、その中に含式１に示した序列のペプチッド或いは其の薬学上に受けられる塩或いはエステル及び薬学上に受けられるキャリアーを含む。
【化３】
2009538838.tif 000011
其の中、
Xaa１は欠乏で、Ala、Gly、Val、Leu或いはIleである。
Xaa２はThr或いはSerである。
Xaa３はTyr、Phe或いはTrpで、そして
Xaa４は欠乏で、Ala、Gly、Val、Leu、Ile或いはProである。
【請求項８】
請求項８の薬物の組み合わせ物は、その中に佐剤を含まない。
【請求項９】
請求項７或いは８の薬物の組み合わせ物は、其の中に式１に示した序列のXaa１はGlyで、Xaa２はThrで、Xaa３はTyrで、そしてXaa４は欠乏で、Ala或いはGlyである。
【請求項１０】
請求項７或いは８の薬物の組み合わせ物は、其の中にXaa４は欠乏である。
【請求項１１】
請求項７〜１０に述べた薬物の組み合わせ物は準備予防或いは肝損傷の治療薬物中に応用する。
【請求項１２】
請求項７〜１０に述べた薬物の組み合わせ物は肝損傷の予防或いは治療中に応用する。
【請求項１３】
請求項１１或いは１２の応用は、其の中に述べた応用は更に治療する或いは丙型肝炎の予防を含む。
【請求項１４】
請求項１〜６に述べた応用のペプチッド或いは其の薬学上に受けられる塩或いはエステルに使い、其の中に述べたペプチッドは含式１に示した序列である。
【化４】
2009538838.tif 000012
其の中、
Xaa１は欠乏で、Ala、Gly、Val、Leu或いはIleである。
Xaa２はThr或いはSerである。  Xaa３はTyr、Phe或いはTrpで、そして
Xaa４は欠乏で、Ala、Gly、Val、Leu、Ile或いはProである。
【請求項１５】
請求項１４のペプチッド或いは其の薬学上に受けられる塩或いはエステルは、其の中に式１に示した序列のXaa１はGlyで、Xaa２はThrで、Xaa３はTyrで、そしてXaa４は欠乏で、Ala或いはGlyである。
【請求項１６】
請求項１５のペプチッド或いは薬学上に受けられる塩或いはエステルは、其の中にXaa４は欠乏である。
【請求項１７】
請求項１４〜１６に述べたペプチッド或いは其の薬学上に受けられる塩或いはエステルの準備方法は、其の中に化学合成に述べたペプチッド或いは融合表現に述べたペプチッドの手順を含む。
【請求項１８】
エンコード請求項１４〜１６に述べたペプチッドのボリヌクレオチダーゼである。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は丙型肝炎の病毒免疫の原性ペプチッド及び其の派生物に関わり、肝損傷の予防或いは治療の応用に使い、特にこのペプチッド或いは其の派生物に関わり、免疫性肝損傷と肝毒性化学物質で起こした肝損傷の予防或いは治療、及びそれは丙型肝炎の予防或いは治療に応用する。本発明はまたペプチッドを含み或いはその派生物の薬物の組み合わせ物、準備方法及びエンコードこのぺプチッドのボリネクレオチダーゼに関わる。
【０００２】
[背景技術]
病毒性肝炎は人類の健康に危害する一類重症の病気で、その病原体は一類の仕組みがそれぞれ違う肝を嗜む性の病毒である。今まで、もう発見した肝炎病毒はすべて７個タイプがあり、それらはそれぞれHAV、HBV、HCV、HDV、HEVと可能のTTV及びHｇVである。其の中に、丙型肝炎の病毒（HCV）は丙型肝炎を起こす病原体である。丙型肝炎は最初に輸血で起こした非甲非乙型肝炎に謂われたが、これからの研究は丙型肝炎は輸血方式で伝播するだけじゃなくて、他の方式、例え消化道、性の接触など、共に伝播をもたらせると証明した。目下、全世界に大体１億を超えた感染者があり、其の中に約５０％−９０％の患者の病程は慢性に変わり、これらの慢性感染中に、それぞれ８−４６％和１１-１９％は肝硬変と肝細胞性の肝癌に発展した。
【０００３】
HCVは黄病毒科のRNA病毒に属する。研究（例えChooなど、Science ２４４:３５９-３６２ (１９８９)；Chooなど，Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８８:２４５１-２４５５ (１９９１)；HanなどProc.Natl.Acad.Sci.USA ８８：１７１１-１７１５ (１９９１) を参照できる)で、HCVの基因グループエンコードの蛋白質は核穀核心蛋白（C）、二つマスク糖蛋白（E１和E２）、且つ５個の非仕組みの蛋白質（NS１~NS５）区域があると表明した。其の中に、丙型肝炎の病毒E２の高変区１(HVR１区)に重要の中和性の抗原表位が含み、宿主を誘導し中和性の抗対を産生でき（例えShiraiなど、J. Immunol, １６２:５６８-５７６(１９９９)を参照できる）。しかし、免疫選択の作用下に、HVR１区の基因は高度変異を産生でき、HCVが機体の免疫識別を避けさせる可能がある。これもHCVで慢性肝炎をもたらす主要の原因であるかも知れない。
【０００４】
目下、HCVで病気をもたらす機制にまだはっきり分らない。臨床上にまだ更に伝播を防止る確実に有効の治療方法とワクチンがない。現在、臨床上にインターフェロン（IFN）を使用し、RNaseLの活化を通して、RNAの病毒を低下解除し、しかし長期有効はただ２０％ぐらいである。Mannsなど（The Lancet, ３５８: ９５８-９６５ (２００１)）はPEｇ化のインターフェロンとリバウェリンの連合治療で丙型肝炎を治療する。ところが、この改進療法はただ２型と３型病毒の毒株を感染した病人だけに特に有効があり、１a、１bと４基因型の病毒の毒株を感染した病人に効果はとても有限である。だから、人々はもう各種手段を試した、HCVの感染率を低下するワクチン及び肝炎の治療の薬物を研究製作と開発している。
【０００５】
HCV基因グループの研究を通し、人々は大量のHCVに対する免疫原性ペプチッドを発見した、機体を誘導し、HCVの免疫応答を産生できる。例えChisariなどのUS５７０９９９５Aは一シリーズのペプチッドを披露した、それは誘導でHCVの特異性細胞の毒性Tリンバ細胞（CTL）を産生できる。
【０００６】
WO２００３/０９７６７７Aは産生する強い免疫能力が持つHCVの抗原ペプチッドおよび組み合わせ物を公開した。本発明人のCN１１９４９８６CとCN１２１６０７５Cも一シリーズの誘導で産生できるHCV免疫原性ペプチッドを披露した。
【０００７】
早期にHCVはある病毒（例え乙肝病毒、EB病毒など）と同じように病毒の細胞病変で肝損傷をもたらすと認められたが、研究でHCVに対する免疫反応は肝損傷をもたらす主要の原因を表明した。
【０００８】
特に慢性HCV患者中に、リンバ細胞（特に細胞毒Tリンバ細胞）は完全、有効にHCVを取り除けなくだけじゃなくて、かえってHCVを取り除く過程に肝細胞の免疫損傷を引き起こせ、肝細胞の死亡を起こし、これでひいては肝硬変と肝細胞肝癌をもたらせる（例えNelsonなど，J. Immunol., １５８:１４７３-１４８１(１９９７); Woｎｇなど, J. Immunol., １６０:１４７９-１４８８ (１９９８)；Ruｇｇieriなど，Viroloｇy,２２９：６８-７６ (１９９７)を参照できる）。
【０００９】
だから、HCV免疫原性ペプチッドはワクチンとして、HCVに対する免疫反応で免疫性の肝損傷をもたらせる。このような機制はHCVに対する免疫原性ペプチッドを利用し、実際に丙型肝炎（特に慢性丙型肝炎）の予防ワクチン或いは治療薬物に使う開発へ極めて大きな困難を与えた。
【００１０】
免疫性肝損傷と病原性肝損傷の以外に、周知のように、肝毒性化学物質も肝損傷を起こらせる。もう知ったある薬物は肝損傷を引き起こせ、肝臓細胞の溶解と肝壊死をもたらす。例え大量に服用するとき、鎮痛薬の酢アンモナルフェノール（即ちParacetamolで、化学名は４−（N-アミノAcetazolamide）フェノール）は一種の肝損傷の作用が持つ物質で、人の肝壊死を起こせる。
【００１１】
また例え、長期にRifampicin 、Pyrazinamide、Isorriazidなど抗生物質を服用し、及び更年期に長期にエストロゲンを服用するなども、厳重の肝細胞壊死を引き起こせ、急性或いは慢性肝炎、黄疸と肝繊維化などの損傷をもたらす。肝損傷を引き起こす化学物質はその大量の活発な自由基を産生できる物質が含み、特に酸素自由基を産生できる物質は、それらは酸化作用を通し肝毒性をもたらせる。
【００１２】
大量の研究を経って、本発明人は一種のHCV免疫原性ぺプチッド及びその派生物を獲得した、人に驚かせるのは、それは肝損傷を予防或いは治療ができ、述べた肝損傷はHCV感染の肝細胞の免疫性の損傷に限りだけじゃないである。例え、本発明のぺプチッド及びその派生物は予防或いは免疫性の肝損傷、病原性の肝損傷及び肝毒性の化学物質で引き起こした肝損傷の治療に使える。
【００１３】
［発明の内容］
本発明は一種のぺプチッド及びその派生物に関わり、HCVに対する免疫応答の誘導ほか、それは又肝損傷を予防或いは治療ができ、特に免疫性の肝損傷を予防或いは治療し、そして述べた肝損傷はHCV感染の肝細胞の免疫性損傷に限りない。
【００１４】
第一方面に、本発明は式１の序列のぺプチッドを含み、或いはその薬学上に受けられる塩或いはエステルの応用を提供した。
【００１５】
【化１】
2009538838.tif 000003
其の中、
Xaa１は欠乏で、Ala、Gly、Val、Leu或いはIleである。
【００１６】
Xaa２はThr或いはSerである。
【００１７】
Xaa３はTyr、Phe或いはTrpで、そして
Xaa４は欠乏で、Ala、Gly、Val、Leu、Ile或いはProである。
【００１８】
述べた応用は肝損傷の予防或いは治療或いは準備予防或いは肝損傷の治療に用いる薬物である。つまり、本発明は式１の序列のぺプチッドを含み、或いは薬学上に受けられる塩或いはエステルは肝損傷の予防或いは治療薬物の応用を提供した、且つ式１の序列のぺプチッドを含み、或いは其の薬学上に受けられる塩或いはエステルは準備予防或いは肝損傷の治療薬物の応用を提供した。
【００１９】
本文に“肝損傷”は肝臓組織或いは細胞が損傷或いは病変が出たと指す。臨床上に肝損傷は主に肝細胞の変性、肝内静脈炎、肝内に出た点状壊死或いは巣状壊死、肝内及び門管区に出た炎細胞の染まり或いは繊維増生或いは肝臓腫脹などが出たことを表現し、厳重時に肝硬変、肝癌などをもたらせる。
【００２０】
上記の病理現象を通して、肝損傷を評価する以外に、肝細胞が細胞溶解性の損傷を発生するとき、トランスアミナーセは損傷した肝細胞から循環血液へ釈放する量が増加した、これらのトランスアミナーセは血清中に活性を測定し、肝臓の損傷を確定できと損傷の程度を評価できる。
【００２１】
本発明の具体な実施方式に、SGPT或いはSGOTのレベルの測定を通し、肝損傷を評価できる。最適は本発明の肝損傷は血清にSGPT或いはSGOTのレベルが上げたで反映した肝損傷で、最適は本発明の肝損傷の予防或いは治療効果の指標はSGPT或いはSGOTのレベルが下げた程度を指す。
【００２２】
本発明の式１の序列のぺプチッドを含み、或いは其の薬学上に受けられる塩或いはエステルは肝損傷へ作用する大小は上記の病理現象の減少程度、或いはSGPT或いはSGOTのレベルが下げた程度で確定できる。
【００２３】
目下の研究はもう大量の肝毒性薬物と化学物質、免疫原或いは病原体がすべて肝損傷を引き起こせると発見した。最適は本発明に述べた肝損傷は免疫性の肝損傷或いは肝毒性の化学物質で引き起こした肝損傷で、即ち最適は本発明は式１の序例のぺプチッドを含み、或いは其の薬学上に受けられる塩或いはエステルは免疫性の肝損傷或いは肝毒性の化学物質で引き起こした肝損傷を予防或いは治療する薬物応用を提供して。
【００２４】
目下、もう大量の適当な動物モデルは本発明が肝損傷へ作用評価に使える。一つ具体的な例に、本発明のぺプチッドは結核予防ワクチンとLPSが誘導した免疫性の肝損傷を減軽できる。そのほか、本発明の具体的な肝毒性化学物質で起こした肝損傷モデルに、本発明のぺプチッドはD-GaINで引き起こした肝損傷を予防でき、且つ本発明のぺプチッドも四塩化炭素で引き起こした肝損傷を治療できる。
【００２５】
本発明の“含式１に示した序例のぺプチッド”は式１に示したように序列のぺプチッド或いはその修飾した功能など同物を指し、即ち式１に示したように序列のぺプチッドのN末端のアミノ基とC末端のカルボニル基及びアミノ酸の側鎖基因団は修飾しなくてもいい、基本的に肝損傷の活性の予防或いは治療を下げない前提に修飾してもいいである。
【００２６】
ここの“功能等同物”は式１に示した序列の修飾産物を指し、それは基本的に肝損傷の活性の予防或いは治療を下げない、即ち５０％の肝損傷の予防或いは治療の活性を下げない、最適は３０％の活性を下げない、更に最適は１０％の活性を下げない、一番最適は活性を下げない。
【００２７】
ある病理現象或いは血清にあるトランスアミナーセレベルは功能等同物の肝損傷の予防或いは治療の活性を確定に使え、最適は本発明の具体的な実施方式に述べた病理の評価標準或いは血清にSGPT或いはSGOTのレベルで活性を確定する。
【００２８】
本発明のぺプチッドに対して、適合な修飾、例え環化、多重物sに準備し、アミノ基、カルボニル或いは側鎖基因団に修飾し、薬学上に受けられるエステルになり、含式１に示した序例の綴り合い、含式１に示した序例の融合蛋白、或いはこれらの修飾の組み合わせなど。
【００２９】
リニアぺプチッドを環化し、例えぺプチッドN端のアミノ基とC端のカルボニルを環ぺプチッドに縮合し、通常にぺプチッドは生理環境の半減期を延べられる。“薬学上に受けられるエステル”は人或いは動物の組織の接触が適合し、且つ多すぎ毒性、刺激或いは変態反応などがないエステルを指す。
【００３０】
通常に、エステル化の修飾後に機体の蛋白酵素はぺプチッドへの水解を下げられる。本発明のぺプチッドの末端アミノ基、カルボニル或いは側鎖基因団を修飾し、薬学上に受けられるエステルに形成できる。アミノ基側鎖基因団の修飾はトレオニン、セリーンの側鎖のヒドロキシルはカルボキシル基酸と発生したエステル化の反応を含み、しかしこれに限りない。
【００３１】
N末端アミノ基の基因団の修飾は脱出-アミノ、N-低級アルキル、N-二-低級アルキルとN-アシル基の修飾を含み、しかしこれに限りない。C末端カルボニルの基因団の修飾はアミド、低級アルキルアミド、二アルキルアミドと低級アルキルエステルの修飾を含み、しかしこれに限りない。
【００３２】
最適は末端の基因団は蛋白質化学領域の技術メンバーがもう知った保護性の基因団で保護し、例えAcetazolamide、３つフッ素acetazolamides、Fmoc（９- fluorenylmethoxycarbonyl）、Boc（酸素カルボニル）、Alloc（アルケン第３酸素カルボニル）、C１-６アルキル、C ２-８ エチレン、C ７-９ アラルキル基など。
【００３３】
本発明の具体的な実施方式に、最適は式１多ぺプチッドN末端のアミノ基とC末端のカルボニル及びアミノ酸側鎖基因団を修飾しない、即ちN末端の化学基因団はやはり第一個基因団のα-アミノ基（-NH２）で、C末端の化学基因団はC末端アミノ酸のカルボニル（-COOH）である。本発明も最適はC末端のカルボニルに酸の根本的なアンモニア化をして、即ちC末端の化学基因団は-CO NH２である。
【００３４】
本領域にもう知った方法で、含式１に示した序列の綴り合いは薬学上に受けられる水溶性の多重物部分が含む。通常に、この綴り合いは式１に示した序列のぺプチッドの循環半減期を延べられる。
【００３５】
適合の水溶性の多重物はポリエチレングリコール(PEｇ)、単一のmethoxy-PEｇ、単-(Cl-１０)Alkoxyl-PEｇ、Aryloxy -PEｇ、ギャザー- (N-のエチレンのピロリドン)  PEｇ、Sanchia酸素基PEｇ、単一methoxy -PEｇ、Propylaldehyde 、PEｇ Propylaldehyde、２ - succinimide炭素酸PEｇ、ギャザープロピレングリコール物、ポリプロピレンの酸化物・エチレン酸化物の混合物、Polyethyleneoxide化合物 (例えグリセリン)、単一methoxy-PEｇ酪酸アルデヒド、PEｇ酪酸のアルデヒド、単一methoxy-PEｇアセトアルデヒド、PEｇアセトアルデヒド、methoxy-PEｇ Succinimideプロピオン酸酸、methoxy-PEｇ Succinimide酪酸酸、ポリビニルアルコール、右旋糖グルコシド、セルロース或いは他の糖類の多重物を含む。
【００３６】
適合のPEｇは６００〜６００００の分子量が持て、例え５０００ドルトン、１２０００ドルドン、２００００ドルトン、３００００ドルトンと４００００ドルトンが含み、それは直鎖或いは分支ともいいである。
【００３７】
含式１に示した序列のぺプチッドの綴り合い物は又この水溶性多重物の混合物を含む。PEｇ化は現有技術にもう知ったPEｇ化の反応を通し行える（例えDelｇado 等の Critical Reviews in Therapeutic Druｇ Carrier Systems ９: ２４９ (１９９２), Duncan とSpreaficoの Clin. Pharmacokinet. ２７: ２９０ (１９９４), とFrancis などのInt J Hematol ６８: １ (１９９８)を参照できる)。
【００３８】
例え、PEｇ化は反応性のポリエチレングリコール分子でアシル化反応或いはアルキル基化反応を通して行える。選択できる方法中に、綴り合い物は縮合活発化のPEｇで形成し、其の中にPEｇ末端の水酸基或いはアミノは活発化のカップリング分子に替わられる（例えKarasiewiczなど、 US５３８２６５７Aを参照する）。含式１に示した序列の綴り合い物は式１に示した序列のぺプチッドはほかの蛋白と組み合わせた綴り合い物でもいいである。述べたほかの蛋白は最適は人アルブミン、牛アルブミン或いはIｇｇ分子のFc部分である。本発明の一つ具体的な実施方式中に、本発明のぺプチッドは牛血清アルブミンと組み合わせて、ペプチッド綴り合い物になる。
【００３９】
本発明の含式１に示した序列のぺプチッドは式１に示した序列のぺプチッドはほかのぺプチッド或いは蛋白質と形成した含式１に示した序列の融合ぺプチッド或いは融合蛋白でもいいである。最適は述べた蛋白質は人アルブミン、牛アルブミン或いはIｇｇ分子のFc部分である。アルブミンは遺伝工程方式で本発明の含式１に示したぺプチッドに偶連でき、ぺプチッドの半減期の延べに使う。
【００４０】
其の中に、人アルブミンは普通の天然に産生したの人循環系統中の血蛋白で、体内に循環を維持して２０日間を越えられる。研究で遺伝工程方式で人アルブミンに融合した治療蛋白は比較的な長い半減期が持つと表明した。
【００４１】
そのほかの研究で、Fc部分に対して、所得した融合蛋白は循環の半減期を増加できると表明した（US５７５０ ３７５A, US５８４３７２５, アメリカ特許の第６,２９１, ６４６号; Barouchなど, Journal of Immunoloｇy, ６１:１８７５-１８８２ (１９９８); Barouchなど, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ９７(８) : ４１９２-４１９７ (４月 １１,２０００) ; と Kimなど, Transplant Proc., ３０ (８): ４０３１-４０３６(１９９８)）。
【００４２】
本発明の式１に示した序列のぺプチッド中に、最適はXaa１はGlyで、Xaa２はThrで、Xaa３はTyrで、そしてXaa４は欠乏で、Ala或いはGly、更に最適は其の中Xaa４は欠乏である。
【００４３】
本文に使用したぺプチッド及びアミノ、アミノ残基と化学基因団の表示方法はすべて所属領域に公認した表示方法である。其の中にアミノありはアミノ残基の省略は表１中の定義を参照でき、これらの省略はL-型のアミノを指せ、D-型も指せる。最適はL-型のアミノを指す。
【００４４】
其の中に、アミノ或いはアミノ残基は側鎖性質の類似性により、下記のグループ通りに分ける。疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、水類縁のアミノ酸（R、D、N、C、E、Q、ｇ、H、K、S、T）、脂肪族側鎖アミノ（ｇ、A、V、L、I、P）、ヒドロキシルの側鎖を含んでアミノ（S、T、Y）、硫原子の側鎖アミノを含んで（C、M）、カルボキシル基の酸およびアミド側鎖を含んでアミノ（D、N、E、Q）、アルカリ性の側鎖を含んでアミノ（R、K、H）、芳香の側鎖を含んでアミノ（H、F、Y、W）。通常に、同じ組みにあるアミノ或いはアミノ残基は同じぐらい性質を持つ。
【００４５】
【表１】
2009538838.tif 000004
“薬学上に受けられる塩”は人と動物の組織接触に適用し、且つ多すぎ毒性、刺激或いは変態反応などがない塩を指す。薬学上に受けられる塩は本領域が熟知である。この塩は本発明の多ぺプチッドの最終分離と純化過程に準備でき、ぺプチッドを適当の有機或いは無機酸或いはアルカリと反応し、単独に準備してもいいである。
【００４６】
代表性の酸プラス塩はアセテート、２ カプレオ、アルジネート、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルフォン酸塩、ヒドスフト、酪酸塩、ショウノウの酸塩、樟脳スルフォン酸塩、グリセロリン酸塩、半分硫酸塩、ヘプトラト、カプレオ、フマル酸塩、ムリャタ、臭化水素酸酸塩、ヒドイオニク酸塩、２ ‐ ヒドイエオスルフォン酸塩、乳酸塩、マレー塩酸、メチルスルフォニク酸塩、ニコチン塩、２ ‐ ナプテン、シュウ酸塩、３ ‐ ベンジプロピオン酸塩、プロピオン酸塩、琥珀酸塩、酒石酸塩、隣酸塩、炭酸水素塩、トルエン硫黄塩酸と１１アルキル塩酸を含み、しかしこれに限りない。
【００４７】
薬学上に受けられる塩に使える酸の最適は塩酸、臭化水素酸酸、硫酸、リン酸、シュウ酸、マレイン酸酸、琥珀酸およびクエン酸である。薬学上に受けられるアルカリプラス塩の陽性イオンはアルカリ金属或いはアルカリ土金属イオンを含み、しかしこれに限りない。例えリチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムおよびアルミニウムなど、及び非毒性の四基から成るアンモニウムの陽性イオン、例えアンモニウム、４メチルアンモニウム、４エチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、テメスァミン、トリエチルアミン、デカタミディ、エソアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピラテン、ピラジンなどである。
【００４８】
最適はアルカリプラス塩は隣酸塩、trisおよびアセテートを含む。これらの塩は一般的に多ぺプチッドの溶解性を増加でき、且つ形成した塩は基本的に多ぺプチッドの活発性を変わらない。本発明の多ぺプチッドは単独使用でき、薬学上に受けられる塩の形式でも使用できる。
【００４９】
本発明の第一方面の応用はまた更に丙型肝炎の予防或いは治療に使いを含む。つまり、肝損傷の予防或いは治療の基礎に、本発明はまた含式１に示した序列のぺプチッド或いはその薬学上に受けられる塩或いはエステルは肝損傷と丙型肝炎の予防或いは治療の応用を提供した、且つ含式１に示した序列のぺプチッド或いは其の薬学上に受けられる塩或いはエステルは肝損傷と丙型肝炎の準備予防或いは治療の薬物中の応用を提供した。
【００５０】
本発明のぺプチッドは誘導細胞因子のγ-IFN、IL-４、IL-１０は抗体と産生した作用が持つ。其の中にγ-IFNは１型T補助細胞（Th１）が分泌した主要の細胞因子で、人体免疫系統は病毒感染を抵抗する主要の細胞因子の一つで、HCVに対する細胞の免疫を通してHCVを除去でき、且つIFNも目下にHCVを治療する成熟の療法である。
【００５１】
第二方面に、本発明は本発明第一方面に述べた応用に使う薬物の組み合わせ物を提供した、其の中に含式１に示した序列のぺプチッド或いは其の薬学上に受けられる塩或いはエステル及び薬学上に受けられるキャリアーを含む。
【００５２】
【化２】
2009538838.tif 000005
其の中、
Xaa１は欠乏で、Ala、Gly、Val、Leu或いはIleである。
【００５３】
Xaa２はThr或いはSerである。
【００５４】
Xaa３はTyr、Phe或いはTrpで、そして
Xaa４は欠乏で、Ala、Gly、Val、Leu、Ile或いはProである。
【００５５】
本発明の薬物の組み合わせ物は肝損傷の予防或いは治療に使う。本発明の薬物の組み合わせ物は肝損傷で引き起こしたある病理現象を減少でき、或いは血清中にあるトランスアミナーセのレベルを下げられ、最適は本発明の具体実施方式中に述べた病理評価の標準を減少でき，或いは血清中のSGPT或いはSGOTのレベルを下げられる。本発明の薬物の組み合わせ物は誘導細胞因子のγ-IFN、IL-４、IL-１０は抗体と産生した作用が持つ。だから、本発明の薬物の組み合わせ物は最適はまた更に丙型肝炎の予防或いは治療に使える。
【００５６】
本文に使用した“薬学上に受けられるキャリアー”は無毒固体、半固体或いは液体の補充剤、希釈剤、アジェバント、包む材料或いは他の製剤補助材料を指す。本領域の公認した技術により、治療の目的、薬の使用ルートの需要に基づいて、薬物を各種の剤型に組み合わせ、最適はこの組み合わせ物の単位剤量の形式で、例え錠剤、糖衣剤、丸薬、カプセル（続けて釈放或いは述べ釈放の形式を含む）、粉剤、粒状、チンキ剤、シロップと乳液剤、消毒の注射溶液或いはエーロゾル液、ガスのスプレー剤或いは噴射剤、滴剤、注射剤、自動注射装置或いは調剤である。
【００５７】
例え、錠剤或いはカプセルの薬、上記の活性薬物グループは一種の口で飲む無毒の薬物学に受けられる慣性キャリアーと組み合わせられ、例えアルコール、イソトニアブドウ糖溶液、グリセリン、生理塩水或いは其の組み合わせ。組み合わせ物中にまた補助材料を添えられ、例え血清アルブミン、低分子量ぺプチッド、アミノと金属陽性イオンなど蛋白保護剤、アジェバントの添加でもいい、例え福氏完全アジェバント、福氏不完全アジェバント、ギャザーCpｇ。
【００５８】
人に驚かせたのは、アジェバントを添加しない情況で、本発明の含式１に示した序列のぺプチッド或いは其の薬学上に受けられる塩或いはエステルの薬物の組み合わせ物も単独に肝損傷と丙型肝炎の予防或いは治療の作用を発揮できる。具体実施方式に、アジェバントを添加しない情況に、本発明のぺプチッドも機体の分泌のインターフェロンの量を著しく上げられる。
【００５９】
他の具体実施方式中に、アジェバントを添加しない情況に、本発明のぺプチッドも肝損傷を著しく下げられる。これは本発明のぺプチッドは肝損傷或いは丙型肝炎の予防或いは治療の作用機理を提示し、且つHCVに対する免疫の応答の誘導に限らない。
【００６０】
ウイルスのコピーを抑制し、ウイルスを除去する同時に、本発明のぺプチッドはまだ機体の過度の免疫炎性の反応を抑制でき、肝組織細胞の損傷を減軽する目的に達する。だから、本発明の第二方面の組み合わせ物の最適はアジェバントを含まない。
【００６１】
本発明の薬物の組み合わせ物の式１に示した序列のペプチッドに、最適はXaa１はGlyで、Xaa２はThrで、Xaa３はTyrで、そしてXaa４は欠乏で、Ala或いはGlyで、更に最適は其の中のXaa４は欠乏である。
【００６２】
そのほか、本発明はまた本発明の第二方面の薬物の組み合わせ物は肝損傷の準備予防或いは治療の薬物中の応用に関わる。本発明はまた本発明の第二方面の薬物の組み合わせ物は肝損傷の予防或いは治療の応用に関わる。最適は上記応用はまた更に丙型肝炎の予防或いは治療に使いを含む。
【００６３】
本発明の薬物の組み合わせ物は所属領域の技術メンバーが熟知した薬の使用方式で薬を使用でき、例え口服、直腸、舌下、肺部、透皮、イオン浸透、膣及び鼻内に薬を投下する、本発明の薬物の組み合わせ物は最適は胃腸道外に薬を投下し、例え皮下、肌内或いは静脈内の注射。
【００６４】
薬の使用量は製剤の形式と希望の作用時間及び治療対象の情況によって変化があり、実際治療の需要量は医師は実際の情況により（例え、病人の病状、体重など）確定できる。
【００６５】
一般の成人に対して、本発明の薬物の組み合わせ物の剤量は式１に示した序列のペプチッドにより測り、ｋｇ成人体重毎に１ｎｇ ‐ １０ｇでもできる。注射に対して、最適はｋｇ体重 毎に１００ｎｇ - １０mｇで、更に最適はｋｇ １mｇ - １mｇで、一番最適はｋｇ毎に １０mｇ - １００mｇである。口服に対して、薬量は毎日、ｋｇ体重毎に１mｇ - １０ｇで、最適は毎日、ｋｇ 体重毎に１０mｇ - １ｇで、もっと最適は毎日、１００mｇ - １０mｇである。
【００６６】
第三方面に、本発明は本発明の第一方面に述べた応用或いは本発明の第二方面に述べた薬物の組み合わせ物に使うペプチッド或いは薬学上に受けられる塩或いはエステルを提供した、其の中に述べたペプチッド含式１に示した序列は
【００６７】
【化３】
2009538838.tif 000006
其の中、
Xaa１は欠乏、Ala、Gly、Val、Leu或いはIleである。
【００６８】
Xaa２はThr或いはSerである。
【００６９】
Xaa３はTyr、Phe或いはTrpで、そして
Xaa４は欠乏で、Ala、Gly、Val、Leu、Ile或いはProである。其の中に、最適はXaa１はGlyで、Xaa２はThrで、Xaa３はTyrで、そしてXaa４は欠乏で、Ala或いはGlyで、もっと最適は其の中のXaa４は欠乏である。
【００７０】
本発明のペプチッドは純化のペプチッドで、即ち８０％以上の純度まで純化した、最適は９０％以上の純度で、もっと最適は９５％以上の純度で、特に最適は薬物純の状態に達し、即ち純度は９８％より大きく或いは等しく、且つ感染源と熱源を含まない。最適のは本発明のペプチッドは実質に他の多ペプチッド或いは蛋白質を含まない、特に動物からのペプチッド或いは蛋白質。
【００７１】
そのほか、第四方面に、本発明はエンコード本発明の第三方面に述べたペプチッドのボリヌクレオチダーゼを提供した。本文に使用した“ボリヌクレオチダーゼ”は５'から３'の末端へ読むリボースヌクレオチド或いはリボースヌクレオチドの単鎖或いは双鎖多重物を指し、RNAとDNAを含み、天然来源から分離でき、体外に合成或いは表現方式の再構成で準備できる。
【００７２】
第五方面に、本発明は本発明の第三方面に述べたペプチッド或いは其の薬学上に受けられる塩或いはエステルの準備方法を提供した、其の手順は化学合成に述べたペプチッド或いは融合表現に述べたペプチッドを含む。需要の薬学上に受けられる塩或いはエステルの仕組みにより、本発明の準備方法はまた述べたペプチッドの更に反応で生成した塩或いはエステルの手順を含む。
【００７３】
化学方法によりもう知った仕組みのペプチッドを合成することは、所属領域の技術メンバーに対してすべてはっきり分る。詳しく方案は下記文献に述べた方法によって、行える、例え固相法で合成の多ペプチッドはJ.M. StewardとJ.D. Youｎｇ的《Solid Phase Peptide Synthesis》(第二版，Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois(１９８４))とJ. Meienhoferの《Hormonal Proteins and Peptides》（第２冊，Academic Press，ニューヨーク(１９７３)）などを参照できる。液相法で合成の多ペプチッドはE. SchroderとK. Lubkeの《The Peptides》（第１冊，Academic Press，ニューヨーク(１９６５) を参照できる）など。本発明の一つ具体実施方案に、最適のは固相法で本発明の多ペプチッドを合成する。
【００７４】
基因工程で融合表現し、且つもう知った仕組みのペプチッドを抽出することは、所属領域の技術メンバーに対してはっきり分るものである（Sambrookなど，Molecular Cloniｎｇ：A Laboratory Manual，第２版，Cold SpriｎｇHarbor Laboratory Press，Cold Spriｎｇ Harbor，NY，１９８９；とAusubelなど，編，Current Protocols in Molecular Bioloｇy，JohnWiley and Sons，Inc.NY，１９８７を参照できる）。例え、本発明の第五方面の多ペプチッドを表現のキャリアーに導入し、且つ宿主細胞に表現し、述べたペプチッドを準備する、適合の表現キャリアーは質粒、粘粒、バクテリオファージ或いは病毒などを含み。適合の宿主剤棒は細菌、菌類と真核細胞を含む。
【００７５】
本発明は公開文献を引用した、これらの文献はもっとはっきり本発明を説明するため、其の全文内容はすべて本文に納入した、其の全文内容はもう本文に述べたように、参照を行う。
【００７６】
理解の便利ため、下記は具体の実施例を通し、本発明に対して詳しく述べる。特別に説明の需要があるのは、これらの述べはただ示例性の述べで、本発明範囲へ制限を構成しない。本説明書の述べにより、本発明の多く変化、変わりは所属領域の技術メンバーに対してはっきり見える。
【００７７】
[具体実施方式]
[実施例１ペプチッドの合成]
固相ペプチッドの合成方法を通し、４１３A型のペプチッドの自動合成儀を使用し（Perkin Elmer会社から購入する）、下記序列に示したの三つペプチッドを合成する。ｇQTYTSｇ（以下は“ペプチッドA”と言う）、ｇQTYTSｇA（以下は“ペプチッドB”と言う）とｇQTYTSｇｇ（以下は“ペプチッドC”と言う）。
【００７８】
この三つペプチッドはすべてL-アミノ酸である。合成の具体過程は下記通り：まず、アミノ単体の反応性基因団を保護する。アミノのαは９-メチルナフトキノンで保護する。且つ下記の特定したアミノに側鎖保護を行う。SerとThr側鎖保護基はブチルで、ｇlnのはtrityl (Trt)である。
【００７９】
それから、Nによって、N- ２イソプロピルカーボン２イミン/１ -ヒドロキシルベンゾールを活発化の試薬として、保護されたアミノは次々と偶連させ、毎回の偶連は４０分間である。１５%のエチレンのメルカプタン・メチル硫化エーテル・アニソール(容積の比率は１：１：１状態にある)が存在する情況で、ペプチッドはトリフッソエチル酸(８５%)と室温に１２０分間を反応し、ポリマー支持物から割り切れ、同時に保護基を除く。
【００８０】
それから無水エーテルでペプチッドを沈殿し、それから無水エーテルで何回も洗い、十分にメチルカプタンを除く。 水・ブチルカテコールの（１：１)に沈殿し、凍結乾燥、粗いペプチッドを取った。粗いペプチッドは３０分間に逆のHPLCで純化し、３７％−４２％アセトニトリル・０.９％TFAで階度に行う。それから集中、凍結する。これによって、それぞれペプチッドA、ペプチッドBとペプチッドCを合成する。
【００８１】
[実施例２のペプチッド綴り合いの準備]
ペプチッドAはウシの血清アルブミン(BSA)とグルタン酸ジアルデヒド法で交連し綴り合いに形成する。具体の綴り合い過程は下記通り： 実施例で合成した１mｇペプチッドAを取り、それを０.５ｍｌ PBS（pH７.４，０.０２mol/L）に溶解する。４.５mｇ BSA を取り、４.５ｍｌ PBS（pH７.４，０.０２mol/L）に溶解する。上記のペプチッドA とBSA溶液を混合し、それからゆっくり１ｍｌの ０.１%のグルタン酸を入れ、室温で光を避けて１２時間を交連反応する。それからゆっくりグリシン溶液（１mol／L）を入れ、反応を中止し、PBS（pH７.４，０.０２mol/L）で透析し、冷凍乾燥する。取ったペプチッドA とBSAの交連産物はペプチッド綴り合い物を名づけられる。
【００８２】
[実施例３ペプチッドは丙型肝炎患者の血清と反応性の研究]
３.１血清の来源
HCVを抵抗する抗体の陽性血清：勝手に２０００−２００１年の解放軍隊３０２病院HCVを伝染した入院患者から獲得したのである。
【００８３】
対照血清：健康の血を捧げた人から取り、化学検査の結果は各項の指標はすべて正常を反映した。
【００８４】
乙型肝炎(HBV)患者の血清：解放軍隊３０２病院の乙型肝炎の入院患者から選んだ、化学検査は乙型肝炎病毒の表面抗原はすべて陽性を呈する。
【００８５】
３.２間接ELISA法を採用し、血清の反応性を検査する方法
慣例の間接ELISAの技術に従って、Dｇ３０２２型の酵素連合の免疫測定儀ヲ使い(Perkin Elmer Corporationから購入する)、本発明の各種ペプチッドは各種血清との反応性を検査する。それぞれペプチッドA、ペプチッドB、ペプチッドC和ペプチッド綴り合い物を各１０μｇをアルカリ性のマスク液(０.１mol/L  NaHCO３，３５μl；０.１mol/L  Na２CO３ ，１５μl； H２O ，５０μl)に入れ、マスク液をエチレン微穴板に入れ、マスクを行い、４℃で置いて夜を過ごす。３７ ℃に穴毎に１２０μl FCS-PBSを入れ、２時間を封じる。
【００８６】
それから、穴毎に血清を入れ(１：１００希釈)、３７℃に１時間を孵す。其れから穴毎にヤンKaｎｇren Iｇｇを入れ（華美生物製品会社から購入する）(１：１０００希釈)、３７℃に１時間を孵す。穴毎に５０μl のA、B液を入れ（北京科衛試剤工場から購入する）、暗いところに５分間を置き、それから４５０ｎｍ波長に光の吸収度を検査する。
【００８７】
３.３結果
ペプチッド（ペプチッドA、ペプチッドB、ペプチッドC和ペプチッド綴り合い物）はHBV患者血清（１０分）及び健康人の血清（１０分）と結合し、試験結果はすべて陽性を呈する。ペプチッドはHCVを抵抗する抗体を結合し、陽性血清（３０分）の結果は表２のように示す。SATAソフトでブロック検査を行い、HBV患者の血清及び健康人の血清との反応性に相対し、本発明のペプチッドA、ペプチッドB、ペプチッドC和ペプチッド綴り合い物はすべて著しくHBV患者血清と反応でき、ペプチッドは牛血清のアルブミンと交連し形成した綴り合いは本発明のペプチッドはHBV患者血清との反応を増加できる。
【００８８】
【表２】
2009538838.tif 000007
【００８９】
[実施例４ペプチッドはマウス生体内に免疫し、其の原性と血清に細胞因子の研究]
４.１試験動物
BALB/cのマウス(軍事医学科学院試験動物中心から購入し、すべて雄性で、６週間の年齢)を取り、下記４グループを分け、、グループ毎に５匹である。（１）対照グループ。（２）ペプチッドAグループ（ペプチッドAで免疫する）。（３）ペプチッドBグループ(ペプチッドBで免疫する)。（４）ペプチッドCグループ(ペプチッドCで免疫する)。
【００９０】
４.２、免疫方法
使ったペプチッド（１００ μｇ/μl）は福氏完全アジェバントと(ｇIBCOBRL 会社)各５０μlの等体積と混合し、微量攪拌器で十分に攪拌し、マウスの足パッドへ注射し、これによってマウスの第一回免疫を完成する。１４日後、強化免疫を行い、即ちグループ毎に使ったペプチッド（１００ μｇ/μl）は福氏完全アジェバントと(ｇIBCOBRL 会社)各５０μl、第一回免疫と同じ方式で免疫を行う。１４日後、同じ方式でまた一回の強化免疫を行う。１４日後、またショック免疫を行い、即ち２００μl PBSで１００μｇのペプチッドを溶解し、それをマウスの筋肉へ注射する。この期間に、対照グループはただ相応のアジェバントとPBSだけ注射する。第四回免疫の一日後にマウスを殺し、血清を取る。
【００９１】
４.３ELASA法で血清中の相対抗体レベルを検査する
慣例の間接ELISAの技術に従って、免疫後のマウス血清中の抗体を検査する。それぞれペプチッドA、ペプチッドB、ペプチッドCは抗原マスクエチレン微穴板として、即ち１０μｇのペプチッドを１００μlアフリカマスク液に入れ、板の毎穴をマスクし、４℃に夜を過ごす。１２０μl PBSで封じ、３７℃に２時間を孵す。毎穴へ１００μlのヤンKaｎｇshu Iｇｇを入れ（北京華美生物製品から購入する）(１：１０００稀釈)、３７℃に１時間を孵す。それから穴毎に５０μl のA、B液を入れ（北京科衛試剤工場から購入する）、暗いところに５分を置き、４５０nm波長下の光密度(OD)値を検査し、結果は図１のように示す。
【００９２】
上記の試験結果は、上記のペプチッドを使って、マウスを免疫し、すべて機体を誘導し相応体液の免疫応答を産生できると表明する。
【００９３】
４.４ELASA法を採用してマウス血清中の細胞因子レベルを検査する。
【００９４】
メーカー試剤箱の説明を参照し、それぞれIL-４ ELASA検査試剤箱、IL-１０ ELASA検査試剤箱、γ-IFN ELASA検査試剤箱（すべてR&D会社から購入する）を使って、上記免疫したマウス血清中の細胞因子レベルを検査（即ちIL-４、IL-１０、γ-IFN）し、結果は表３のように示す。
【００９５】
【表３】
2009538838.tif 000008
上記の実験結果は上記ペプチッドを使って、免疫したマウスの血清中のγ-IFN、IL-４、IL-１０はすべて著しい上げがある。γ-IFNはTh１が分泌した主要の細胞因子で、人体免疫系統は病毒の感染を抵抗する主要の細胞因子の一つでもあり、それは２-５A誘導を通して、酵素を合成し、更にRNaseLを活発化し、RNAの病毒を低下し、病毒蛋白の合成を抑制し、だからγ-IFNレベルの上げは上記のペプチッドはHCVの除去に使えると説明する事が表明する。
【００９６】
[実施例５ペプチッドは大きいマウス体内にγ-IFNへの影響]
５.１試験動物
SDの大きいマウス（体重１８０ｇ〜２２０ｇ 、雌雄はそれぞれ半分、軍事医学化学動物所から購入する）を勝手に下記の５グループを分け、毎グループは１０匹である。 (１)空白対照グループ; (２) アジェバント対照グループ; (３)高剤量グループ(ペプチッドAとアジェバントで免疫する); (４)低剤量グループ(ペプチッドAとアジェバントで免疫する); (５)ペプチッド免疫グループ(ペプチッドAで免疫する)。
【００９７】
５.２試験方法
高剤量グループ、低剤量グループは下記の方法で大きいマウスを免疫する。０日から開始し、まず初回の免疫を行い、即ちペプチッドAは福氏アジェバントと混合し（生理塩水で適量のペプチッドAを溶解してから、等体積の福氏完全アジェバントと混合する）油は水を包む乳状になり、大きいマウスの皮下注射を行い、其の中に用薬体積は０.１ｍｌ/匹大きいマウスで、用薬量はペプチッドAで測り、それぞれ５０μｇ/ｋｇ大きいマウスと２５μｇ/ｋｇ大きいマウスである。
【００９８】
４日後に、第二回免疫を行い、剤量と免疫方式は第一回免疫と同じだが、其の中に福氏不完全アジェバントで福氏完全アジェバントを替わる。４日後に、第三回免疫を行い、剤量と免疫方式は第一回免疫と同じだが、其の中に福氏不完全アジェバントで福氏完全アジェバントを替わる。４日後に、第四回免疫を行い、即ちアジェバントを添加しない、生理塩水でペプチッドAを溶解し、大きいマウス腹部を注射し、其の中に用薬体積は０.１ｍｌ/匹大きいマウスで、用薬量はペプチッドAで測り、それぞれ５０μｇ/ｋｇ大きいマウスと２５μｇ/ｋｇ大きいマウスである。
【００９９】
免疫を行う期間に、０日から開始し、アジェバント対照グループは相応時間にペプチッドAが含まない相応アジェバントと生理塩水を注射される。空白対照グループの大きいマウスは相応時間に生理塩水を注射される。
【０１００】
高剤量グループと低剤量グループは免疫注射を行う同時に、０日から開始し、ペプチッドグループに、それぞれ大きいマウスの皮下に生理塩水で溶解したペプチッドA（其の中にアジェバントを添加しない）を注射し、大きいマウスを免疫し、全部四回の免疫を行う。其の中に、毎回の用薬体積は０.１ｍｌ/匹大きいマウスで、毎回の用薬量はペプチッドAで測り、５０μｇ/ｋｇ大きいマウスである。
【０１０１】
第四回免疫の一日後に大きいマウスを殺し、脾細胞を取る。脾細胞を１X１０ ６个/穴の濃度で培養板に入れ、３７℃に３日を孵す。それから培養の上清液を取り、メーカー試剤箱の説明書を参照し、γ-IFN ELASA検査試剤箱（R&Dから購買する）を使って、上記免疫したの大きいマウスの血清中のγ-IFNレベルを検査する。
【０１０２】
５.３試験結果
大きいマウスの血清中のγ-IFNレベル結果は図２のように示す。上記試験結果は、免疫した大きいマウスの血清中のγ-IFN量は対照グループに相対し，著しい上げがある。もっと人に驚かせるのは、アジェバントを添加しない情況に、ただペプチッドAだけ免疫したお大きいマウスの血清中のγ-IFNレベルはひいては相当剤量のペプチッドAとアジェバントで免疫したより高い。
【０１０３】
[実施例６ペプチッドはBCGワクチンと脂肪質の多糖類で誘導された大きいマウスの免疫性の肝損傷へ保護作用]
６.１試験動物
Wistar大きいマウス(体重１８０ｇ〜２２０ｇ、雌雄はそれぞれ半分、上海スラク試験動物有限公司から購入する)を勝手に下記８グループを分け、毎グループは１０匹である。 (１) 甘草酸２アンモニウム注射液グループ(甘草酸２アンモニウムを注射し、甘草酸２アンモニウムは江蘇正大天晴薬業株式会社から購入する); (２)インターフェロンのグループ(再構成の人インターフェロンα２aを注射し、再構成の人インターフェロンα２aは瀋陽三生製薬株式会社から購入する); (３)高剤量グループ(ペプチッドで免疫する); (４)中剤量グループ (ペプチッドAで免疫する); (５)低剤量グループ(ペプチッドAで免疫する); (６)低剤量アジェバントグループ (ペプチッドAとアジェバントで免疫する); (７)空白対照グループ;（８）モデルグループ。
【０１０４】
６.２試験方法
低剤量アジェバントグループは下記方法で大きいマウスを免疫する。０日から開始し、まず初回免疫を行い、即ちペプチッドAは福氏完全アジェバントと混合し（生理塩水で適量のペプチッドAを溶解し、５０μlの福氏完全アジェバントの等体積と混合する）、油は水を包む乳ミンチ状液になり、大きいマウスの皮下注射を行い、其の中に用薬の体積は０.１ｍｌ/匹大きいマウスで、用薬量はペプチッドAで測り、４３.５μｇ/ｋｇ大きいマウスである。
【０１０５】
４日後に、第二回免疫を行い、剤量と免疫方式は第一回の免疫と同じだが、其の中に福氏不完全アジェバントで福氏完全アジェバントを替わる。４日後に、第三回免疫を行い、剤量と免疫方式は第一回免疫と同じだが、其の中に福氏不完全アジェバントで福氏完全アジェバントを替わる。４日後に、第四回免疫を行い、即ちアジェバントを添加しない、生理塩水でペプチッドAを溶解し、大きいマウス腹部を注射し、其の中に用薬体積は０.１ｍｌ/匹大きいマウスで、用薬量はペプチッドAで測り、４３.５μｇ/ｋｇ大きいマウスである。
【０１０６】
高剤量グループと低剤量グループは免疫注射を行う同時に、０日から開始し、高剤量、中剤量と低剤量グループに、それぞれ大きいマウスの皮下に生理塩水で溶解したペプチッドA（其の中にアジェバントを添加しない）を注射し、大きいマウスを免疫し、全部四回の免疫を行う。其の中に、毎回の用薬体積は０.１ｍｌ/匹大きいマウスで、毎回の用薬量はペプチッドAで測り、高剤量、中剤量と低剤量グループはそれぞれ１７４、８７、４３.５μ大きいマウスである。
【０１０７】
低剤量アジェバントグループは免疫注射を行う同時に、０日から開始し、モデルグループと空白対照グループも注射を行い、全部四回を行い、毎回注射のは生理塩水で、毎回の用薬体積は０.１ｍｌ/匹大きいマウスである。
【０１０８】
大きいマウスの第四回の免疫注射を行う９日前に、空白対照グループ以外のほか７グループに、大きいマウスへ０.２ｍｌのbacille  calmette-ｇuerinのバチルス多糖類核酸の尾静脈注射（湖南九芝堂スキ生物製薬有限公司が生産し、規格は毎ミリリットルに０.３５mｇのbacille  calmette-ｇuerinのバチルス多糖類核酸を含み、注射前に生理塩水で希釈し、用薬量はbacille  calmette-ｇuerinのバチルス多糖で測り、１２６μｇ/ｋｇである）を行い、同時に、空白対照フループに等体積の生理塩水を注射する。大きいマウスの第四回の免疫注射後の第３日に、空白対照グループ以外のほかの７グループに、大きいマウスの１０μｇエステル多糖の尾静脈注射（LPS，SIｇMA会社の製品と略称する）を行い、同時に空白グループは等体積の生理塩水を注射する。
【０１０９】
そのほか、LPSを注射する前の第７日から、甘草酸２アンモニウム注射液グループに、毎日大きいマウスの腹部へ甘草酸２アンモニウムを注射し、用薬量は甘草酸２アンモニウムで測り、１３.５mｇ/ｋｇ大きいマウスで、全部７日を続けていく。LPSを注射する前の第７日から、インターフェロングループに、毎日大きいマウスの腹部へインターフェロンを注射し、用薬量はインターフェロンで測り、５４万単位/ ｋｇ大きいマウスで、全部７日を注射する。
【０１１０】
大きいマウスはエステル多糖を注射してから１２時間、まず大きいマウスの体重を測り、それから頚部椎骨の転位で大きいマウスを殺し、血を取る。血清を分離してから、SGPT検査試剤箱（南京建成生物工程研究所から購入する）、SGOT検査試剤箱（南京建成生物工程研究所から購入する）の説明書により、それぞれ血清中のにSGPT とSGOTの活発性を検査する。
【０１１１】
同時に、大きいマウスの肝臓を取り、１０%のホルマリン溶液で固定、脱水、石蝋マスク、製剤（４μmの厚さ）、HE染色してから、病理専門人員は光学顕微鏡の下で序列病変があるかどうか検査し、且つ病変評価を行う。 (１)肝細胞の変性があるかどうか(脂変、水腫、酸っぱく変性など); (２)肝細胞の壊死があるかどうか(点状壊死、巣状壊死など); (３)中央静脈及び肝竇の拡張、鬱血、肝静脈周囲炎があるかどうか; (４)肝内或いは門管区に結締組織の増殖及び細胞浸潤があるかどうか。病変の評価標準は０分(正常)、０.５分(非常に軽い)、１分(軽い)、２分(中度)、３分(重度)、４分(非常に重度)である。巣状壊死が出たのは倍に計算する。毎グループの動物病変の平均分を計算し、分値が高いのは病変程度がひどいと示す。
【０１１２】
６.３試験結果
SGPTとSGOT活発性の試験結果は図３のように示し、病変評価結果は図４のように示す。
【０１１３】
モデルグループに、大きいマウスのSGPTとSGOTが著しく上げた、BCGワクチンとエステル多糖は大きいマウスの肝損傷を引き起こせる表明した。高、中、低剤量によって、ペプチッドAを使ったのはすべて肝損傷の大きいマウスのSGPTとSGOTのレベルを著しく下げられ、低剤量アジェバントグループにも著しく急性免疫性の肝損傷を保護する作用と示す。即ち、BCGのワクチンエステル多糖に誘導された大きいマウスの免疫性の肝損傷モデルに対して、ペプチッドAは免疫性の肝損傷の大きいマウスのSGPTとSGOTのレベルを著しく下げられ、甘草酸２アンモニウム注射液は大きいマウスの肝損傷に著しく保護作用が持たない。
【０１１４】
病理組織学の研究は本研究は成功に免疫性の肝損傷のモデルをコピーしたと表明した。モデルグループに、肝組織の病変の表現は肝細胞の点状壊死で、少なくのは巣状壊死である。肝臓内の中性粒細胞の数量は増加した、通常に中央静脈周囲にある。
【０１１５】
肝組織の病変程度の評価結果は、モデルグループに相対し、高剤量グループ、中剤量グループ、低剤量グループとインターフェロングループに、動物の病変程度は著しく下げた(P＜０.０５)。即ち、アジェバントを添加しない高剤量グループと中剤量グループにペプチッドAを用薬し、及び低剤量グループにアジェバントを添加する方式でペプチッドAを用薬し、すべて著しく肝臓の病変程度を減軽でき、甘草酸２アンモニウム注射液は大きいマウスの肝損傷に著しく保護作用が持たない。
【０１１６】
[実施例７ペプチッドD-アミノのガラクトサミンに誘導された大きいマウスの急性肝損傷の保護作用]
７.１試験動物
Wistarの大きいマウスを(体重１８０ｇ〜２２０ｇ、雌雄はそれぞれ半分、上海スラク実験動物有限会社から購入する)勝手に下記６グループを分け、 毎グループに１０匹である。(１) 甘草酸２アンモニウム注射液グループ(甘草酸２アンモニウムを注射る)；(２)高剤量グループ(ペプチッドAとアジェバントで免疫する); (３)中剤量グループ(ペプチッドAとアジェバントで免疫する); (４)低剤量グループ(ペプチッドAとアジェバントで免疫する); (５)空白対照グループ; (６)モデルグループ。
【０１１７】
７.２試験方法
高剤量グループ、中剤量グループと低剤量グループは下記方法で大きいマウスを免疫する。０日から開始し、まず初回の免疫を行い、即ちペプチッドAを福氏完全アジェバントと混合し（生理塩水で適量のペプチッドAを溶解し、１００μl の福氏完全アジェバントの等体積と混合する）、油は水を包む乳ミンチ状液になり、大きいマウスの皮下注射を行い、其の中に用薬の体積は０.２ｍｌ/匹大きいマウスで、用薬量はペプチッドAで測り、高剤量グループ、中剤量グループと低剤量グループはそれぞれ１７４、８７、４３.５μｇ/ｋｇ大きいマウスである。
【０１１８】
１４日後に、第二回免疫を行い、剤量と免疫方式は第一回の免疫と同じだが、其の中に福氏不完全アジェバントで福氏完全アジェバントを替わる。１４日後に、第三回免疫を行い、剤量と免疫方式は第一回免疫と同じだが、其の中に福氏不完全アジェバントで福氏完全アジェバントを替わる。１４日後に、第四回免疫を行い、即ちアジェバントを添加しない、生理塩水でペプチッドAを溶解し、大きいマウス腹部を注射し、其の中に用薬体積は０.１ｍｌ/匹大きいマウスで、用薬量はペプチッドAで測り、高剤量グループ、中剤量グループと低剤量グループはそれぞれ１７４、８７、４３.５μｇ/ｋｇ大きいマウスである。
【０１１９】
高剤量グループ、中剤量グループと低剤量グループに免疫を行う同時に、０日から開始し、モデルグループと空白対照グループの大きいマウスにも注射を行い、全部四回を行い、毎回の注射は相応体積の生理塩水である。
【０１２０】
第四回免疫後の２４時間に、空白対照グループ以外のほかの５グループに、大きいマウスの腹部へ６００mｇ/ｋｇのD-のアミノのガラクトサミンを注射し (SIｇMA 会社の製品)、毎匹の大きいマウスは０.２ｍｌを注射する; 同時に、空白対照グループに等体積の生理塩水を注射する。大きいマウスの腹部へD-のアミノのガラクトサミンを注射してから４８時間、大きいマウスを殺す。
【０１２１】
そのほか、甘草酸２アンモニウム注射液グループに、大きいマウスを殺す前の第７日から、毎日に大きいマウスの腹部へ１３.５mｇ/ｋｇの甘草酸２アンモニウムを注射し、全部７日を続けていく。
【０１２２】
大きいマウスの腹部へD-のアミノのガラクトサミンを注射してから４８時間、頚部椎骨の転位で大きいマウスを殺し、血を採る。血清を分離してから、SGPT検査試剤箱（南京建成生物工程研究所から購入する）、SGOT検査試剤箱（南京建成生物工程研究所から購入する）の説明書により、それぞれ血清中のにSGPT とSGOTの活発性を検査する。
【０１２３】
７.３試験結果
試験結果は図５のように示す。D-のアミノのガラクトサミンモデルグループに、大きいマウスのSGPTとSGOTが著しく上げた、D-のアミノのガラクトサミンは大きいマウスの肝損傷を引き起こせると表明した。高、中、低剤量によって、ペプチッドAを使ったのはすべて急性試験性の肝損傷の大きいマウスのSGPTとSGOTのレベルを著しく下げられる。だから、D-のアミノのガラクトサミンに誘導されたモデルグループに、ペプチッドAは急性試験性の肝損傷の大きいマウスのSGPTとSGOTのレベルを著しく下げられ、甘草酸２アンモニウム注射液は大きいマウスの肝損傷にも著しく保護作用が持つ。
【０１２４】
[実施例８ペプチッドはマウスの四塩化炭素でもたらす肝損傷へ保護作用]
８.１試験動物
BALB/cのマウスを(体重１８ｇ〜２２ｇ、上海スラク実験動物有限会社から購入する) 勝手に下記８グループを分け、毎グループは１０匹である。 (１) 甘草酸２アンモニウム注射液グループ(甘草酸２アンモニウムを注射する); (２)インターフェロングループ(α２a再構成の人インターフェロンを注射する); (３)高剤量グループ(ペプチッドAとアジェバントで免疫する); (４)中剤量グループ(ペプチッドAとアジェバントで免疫する); (５)低剤量グループ; (６) アジェバント対照グループ(ただアジェバントだけで免疫する); (７)空白対照グループ; (８)モデルグループ。
【０１２５】
８.２試験方法  初回免疫前の一日に、空白対照グループ以外のあらゆるマウスの腹部へ０.０５ｍｌ CCl４の腹部皮下注射を行う（上海凌峰化学製剤有限公司が生産する）。空白対照グループは等体積の生理塩水を注射する。
【０１２６】
高剤量グループ、中剤量グループと低剤量グループは下記方法で大きいマウスを免疫する。まず初回の免疫を行い、即ちペプチッドAを福氏完全アジェバントと混合し（生理塩水で適量のペプチッドAを溶解し、１００μl の福氏完全アジェバントの等体積と混合する）、油は水を包む乳ミンチ状液になり、マウスの皮下注射を行い、其の中に用薬の体積は０.２ｍｌ/匹マウスで、用薬量はペプチッドAで測り、高剤量グループ、中剤量グループと低剤量グループはそれぞれ２５０、１２５、６２.５μｇ/ｋｇマウスである。
【０１２７】
１４日後に、第二回免疫を行い、剤量と免疫方式は第一回の免疫と同じだが、其の中に福氏不完全アジェバントで福氏完全アジェバントを替わる。１４日後に、第三回免疫を行い、剤量と免疫方式は第一回免疫と同じだが、其の中に福氏不完全アジェバントで福氏完全アジェバントを替わる。１４日後に、第四回免疫を行い、即ちアジェバントを添加しない、生理塩水でペプチッドAを溶解し、マウス腹部を注射し、其の中に用薬体積は０.１ｍｌ/匹マウスで、用薬量はペプチッドAで測り、高剤量グループ、中剤量グループと低剤量グループはそれぞれ２５０、１２５、６２.５μｇ/ｋｇマウスである。
【０１２８】
高剤量グループ、中剤量グループと低剤量グループに免疫を行う同時に、モデルグループと空白対照グループのマウスにも注射を行い、全部四回を行い、毎回の注射は相応体積の生理塩水である。同時に、アジェバントグループはただ相応アジェバントと生理塩水だけ注射し、全部四回を行う。
【０１２９】
第四回免疫前の一日に、もう一回空白対照グループ以外のあらゆるマウスの腹部へ皮下注射を行う。空白対照グループはただ等体積の生理塩水だけ注射する。第四回免疫の二日に、マウスを殺す。
【０１３０】
そのほか、殺す前の第７日から、甘草酸２アンモニウムグループに毎日、マウスの腹部へ甘草酸２アンモニウムを注射し、用薬量は甘草酸２アンモニウムで測り、１９.５mｇ /ｋｇマウスで、全部７日を続けていく。殺す前の第７日に、インターフェロングループに毎日、マウスの腹部へインターフェロンを注射し、用薬量はインターフェロンで測り、７５万単位/ ｋｇマウス、全部７日を続けていく。
【０１３１】
あらゆるマウスを殺す前に、まずマウスの体重を測り、それから頚部椎骨の転位で大きいマウスを殺し、且つ血を取る。血清を分離してから、SGPT検査試剤箱（南京建成生物工程研究所から購入する）、SGOT検査試剤箱（南京建成生物工程研究所から購入する）の説明書により、それぞれ血清中のにSGPT とSGOTの活発性を検査する。同時に、大きいマウスの肝臓を取り、１０%のホルマリン溶液で固定、脱水、石蝋マスク、製剤（４μmの厚さ）、HE染色してから、病理専門人員は光学顕微鏡の下で病変評価を行い、病変検査項目と評価標準と実施例６と同じである。
【０１３２】
８.３試験結果
SGPT とSGOTの活発性の試験結果は図６のように示し、病変評価の結果は図７のように示す。
【０１３３】
モデルグループに、マウスのSGPT とSGOTのレベルは著しい上げがあり、四塩化炭素はマウスの肝損傷を引き起こせると表明した。ペプチッドAの各剤量グループは急性試験性の肝損傷のマウスのSGPT とSGOTのレベルを著しく下げられる。インターフェロン、アジェバントはトランスアミナーセレベルに対して、著しい下げる作用がない。
【０１３４】
病理組織学の研究は本研究は四塩化炭素を使って、成功に急性の肝損傷をもたらせると表明した。モデルグループに、肝組織の病変の表現は肝細胞の点状壊死或いは巣状壊死で、肝臓内の静脈炎が出た、肝内及び門管区は少量の炎細胞の浸潤と繊維細胞の増殖が見える。肝組織の病変程度の評価結果は高剤量グループはモデルグループと比べ、肝臓の病変程度を著しく下げたと表明する。
【０１３５】
そのほか、モデルグループは対照グループに相対し、マウスの肝臓は著しく腫大である。ペプチッドAは２５０μｇ/ｋｇマウスの剤量で用薬するとき、四塩化炭素で引き起こしたマウスの肝腫大を著しく減少できる。しかしインターフェロンは四塩化炭素で引き起こした肝腫大に対して、著しく減少の作用がない。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】本発明のペプチッドを使い、マウスの血清の抗体レベルを免疫する。
【図２】アジェバントを添加するとアジェバントを添加しない情況で、本発明のペプチッドを種痘する大きいマウスの脾臓の細胞が分泌したγ-IFNの量である。
【図３】本発明のペプチッドを免疫し、BCGワクチンと多糖類に誘導された大きいマウスの免疫性の肝損傷モデルに血清の生物化学指標へ影響で、其の中*は示したグループはモデルグループに相対し、トランスアミナーセのレベルを著しく下げられると表す。
【図４】本発明のペプチッドを免疫し、BCGワクチンと多糖類に誘導された大きいマウスの免疫性の肝臓病変を評価する結果で、其の中*は示したグループはモデルグループに相対し、肝臓の病変程度を著しく減軽できると表す。
【図５】本発明のペプチッドを免疫し、D-のアミノのガラクトサミンに誘導された大きいマウスの急性肝損傷モデルの血清生化指標へ影響で、其の中*は示したグループはモデルグループに相対し、トランスアミナーセのレベルを著しく下げられると表す。
【図６】本発明のペプチッドを免疫し、マウスの四塩化炭素で引き起こした肝損傷モデルに血清生化へ影響で、其の中*は示したグループはモデルグループに相対し、トランスアミナーセのレベルを著しく下げられると表す。
【図７】本発明のペプチッドを免疫し、マウスの四塩化炭素で引き起こした肝損傷モデルに病変程度を評価する結果で、其の中*は示したグループはモデルグループに相対し、肝臓病変の程度を著しく下げられると表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年2月5日(2009.2.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
含式１に示した序列のペプチッド或いは薬学上に受けられる塩或いはエステルは整備予防或いは肝損傷の治療薬物中に応用する。
【化１】
2009538838.tif 000021
其の中、
Xaa１は欠乏で、Ala、Gly、Val、Leu或いはIleである。
Xaa２はThr或いはSerである。
Xaa３はTyr、Phe或いはTrpで、そして
Xaa4は欠乏で、Ala、Gly、Val、Leu、Ile或いはProである。
【請求項２】
請求項１の応用は、其の中に肝損傷は免疫性の肝損傷或いは肝毒性の化学物質で起こした肝損傷である。
【請求項３】
請求項１の応用は、其の中に式１に示した序列のXaa１はGlyで、Xaa２はThrで、そしてXaa4は欠乏で、Ala或いはGlyである。
【請求項４】
請求項３の応用は、其の中にXaa4は欠乏である。
【請求項５】
請求項１の応用は、其の中に述べた応用は更に治療する或いは丙型肝炎の予防を含む。
【請求項６】
請求項１〜５に述べた応用の薬物の組み合わせ物に使い、その中に含式Iに示した序列のペプチッド或いは其の薬学上に受けられる塩或いはエステル及び薬学上に受けられるキャリヤーを含む。
【化２】
2009538838.tif 000022
其の中、
Xaa１は欠乏で、Ala、Gly、Val、Leu或いはIleである。
Xaa２はThr或いはSerである。
Xaa３はTyr、Phe或いはTrpで、そして
Xaa4は欠乏で、Ala、Gly、Val、Leu、Ile或いはProである。
【請求項７】
請求項６の薬物の組み合わせ物は、その中に佐剤を含まない。
【請求項８】
請求項６或いは７の薬物の組み合わせ物は、其の中に式Iに示した序列のXaa１はGlyで、Xaa２はThrで、Xaa３はTyrで、そしてXaa4は欠乏で、Ala或いはGlyである。
【請求項９】
請求項８の薬物の組み合わせ物は、其の中にXaa4は欠乏である。
【請求項１０】
請求項６〜９に述べた薬物の組み合わせ物は準備予防或いは肝損傷の治療薬物中に応用する。
【請求項１１】
請求項１０の応用は、其の中に述べた応用は更に治療する或いは丙型肝炎の予防を含む。
【請求項１２】
請求項１〜５に述べた応用のペプチッド或いは其の薬学上に受けられる塩或いはエステルに使い、其の中に述べたペプチッドは含式Iに示した序列である。
【化３】
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其の中、
Xaa１は欠乏で、Ala、Gly、Val、Leu或いはIleである。
Xaa２はThr或いはSerである。
Xaa３はTyr、Phe或いはTrpで、そして
Xaa4は欠乏で、Ala、Gly、Val、Leu、Ile或いはProである。
【請求項１３】
請求項１２のペプチッド或いは其の薬学上に受けられる塩或いはエステルは、其の中に式Iに示した序列のXaa１はGlyで、Xaa２はThrで、Xaa３はTyrで、そしてXaa4は欠乏で、Ala或いはGlyである。
【請求項１４】
請求項１３のペプチッド或いは薬学上に受けられる塩或いはエステルは、其の中にXaa4は欠乏である。
【請求項１５】
請求項１２〜１４に述べたペプチッド或いは其の薬学上に受けられる塩或いはエステルの準備方法は、其の中に化学合成に述べたペプチッド或いは融合表現に述べたペプチッドの手順を含む。
【請求項１６】
エンコード請求項１２〜１４に述べたペプチッドのボリヌクレオチダーゼである。
【国際調査報告】
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