(57)【要約】  本願発明は、粒状でんぷん基質からグルコースを生成する方法であって、植物原料から得られた粒状でんぷんを含むスラリーとアルファ−アミラーゼとを、粒状でんぷんのでんぷんゼラチン化温度未満の温度で接触させ、オリゴ糖を生成し、そして前記オリゴ糖を加水分解させ、少なくとも２０％のグルコースを含むマッシュを生成する工程、さらにマッシュを発酵し、エタノールを得る工程を含む方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒状でんぷん基質からグルコースを生成する方法であって、
ａ）植物原料から得られた粒状でんぷんを含むスラリーとアルファ−アミラーゼとを、粒状でんぷんのでんぷんゼラチン化温度未満の温度で接触させ、オリゴ糖を生成し、そして前記オリゴ糖を内生植物でんぷん加水分解酵素に加水分解させる工程、及び
ｂ）少なくとも１０％のグルコースを含むマッシュを生成する工程
を含み、前記接触工程が５分間から４８時間、ｐＨ３．５から７．０で実施される方法。
【請求項２】
さらにｃ）１０℃から４０℃の間の温度で、１０時間から２５０時間、発酵微生物及びでんぷん加水分解酵素の存在下でマッシュを発酵し、アルコールを生成する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アルファ−アミラーゼがバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・リシェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）又はバチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
接触工程で供給されるアルファ−アミラーゼの量が、０．０１から１０．０ＡＡＵ／ｇＤＳの間である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記温度が５０℃から７０℃の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記マッシュが少なくとも３０％のグルコースを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記植物原料がコーン、ミロ、大麦、小麦、米又はそれらの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記植物原料が細分化されたコーンである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記アルコールがエタノールである、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
さらにエタノールを回収する工程を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
エタノールを生成する方法であって、
ａ）植物原料から得られた粒状でんぷんを含むスラリーと、粒状でんぷんを可溶化するアルファ−アミラーゼとを接触させる工程であって、前記接触がｐＨ３．５からｐＨ７．０、粒状でんぷんのでんぷんゼラチン化温度未満の温度で、５分間から２４時間である工程、
ｂ）２０％より多いグルコースを含む基質を得る工程、及び
ｃ）１０℃から４０℃の間の温度で１０時間から２５０時間、発酵微生物及びでんぷん加水分解酵素の存在下で基質を発酵し、エタノールを生成する工程
を含む方法。
【請求項１２】
さらにエタノールを回収する工程を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記アルファ−アミラーゼが細菌性アルファ−アミラーゼである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記アルファ−アミラーゼがバチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・リシェニフォルミス又はバチルス・アミロリクエファシエンスに由来する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記接触工程が５０℃から７０℃の間の温度で実施される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記温度が６０℃から７０℃の間である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記接触工程がｐＨ５．０から６．０の間で実施される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記接触の時間が１５分間から１２時間である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記基質が１５分間から６時間の間の接触の後、３０％より多いグルコースを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記基質が１５分間から６時間の間の接触の後、４０％より多いグルコースを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
さらに発酵工程の前に基質を清浄する工程を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】
さらに接触工程で追加的酵素を加えることを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２３】
前記追加的酵素がグルコアミラーゼ、フィターゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼの群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記追加的酵素がフィターゼである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記追加的酵素がプロテアーゼである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記スラリーが５−６０％ＤＳ粒状でんぷんを有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項２７】
前記粒状でんぷんのＤＳが２０−４０％の間である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
さらに前記基質と、逆流を含む水溶液とを接触させ、発酵工程の前にＤＳを希釈する工程を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２９】
前記粒状でんぷんがコーン、ミロ、大麦、小麦、米又はそれらの組み合わせから得られる、請求項１１に記載の方法。
【請求項３０】
６時間後のグルコース分（％）が３０％である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
６時間後のグルコース分（％）が４０％である、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、粒状でんぷんからアルコール（例えば、エタノール）を生成する方法であって、粒状でんぷんのゼラチン化温度未満の温度で植物原料からの粒状でんぷんを含むスラリーをアルファ−アミラーゼに暴露した後、発酵微生物を用いて発酵する工程を含む方法に関連する。
【背景技術】
【０００２】
農作物から燃料源としてのエタノールを生成する方法の効果的商業化は、限られた石油供給に対する継続的、かつ拡大した依存を含む様々な理由から、及びエタノール生産が再生可能なエネルギー源であることから、世界的関心を改めて呼び起こすに至っている。
【０００３】
アルコール発酵生成方法、及び特にエタノール生産方法は、一般的に湿式粉砕方法又は乾式粉砕方法で特徴付けられる。これらの方法の概要は、Ｂｏｔｈａｓｔ他、２００５年、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６７：１９−２５ページ及びアルコールテキストブック（ＴＨＥ  ＡＬＣＯＨＯＬ  ＴＥＸＴＢＯＯＫ）、第３版（Ｋ．Ａ．Ｊａｃｑｕｅｓ他編集）１９９９年、ノッティンガム大学発行、イギリスに述べられている。
【０００４】
一般に、前記湿式粉砕方法は、穀物を軟らかくする一連の浸透処理（ふやかし）の間に、可溶性でんぷんが除去され、その後、胚芽、繊維（ふすま）及びグルテン（タンパク質）の回収が続く工程を含む。残留でんぷんは、さらに乾燥処理、化学的及び／又は酵素処理される。前記でんぷんはその後、アルコール生成、高果糖コーンシロップ又は商業用純度でんぷんに使用することが出来る。
【０００５】
一般に、乾式穀物粉砕は、アルコール及び他の副生成物の生成のために、研削、加熱、液状化、糖化、発酵及び液体と固形の分離を含む多くの基本工程が含まれる。一般的に、コーン穀粒等の全穀粒は、微粒子径に粉砕された後、スラリータンクで液体と混合される。前記スラリーは、液化酵素（例えば、アルファ−アミラーゼ）と共にジェット加熱器で高温にさらされ、穀粒中のでんぷんをデキストリンに可溶化及び加水分解する。前記混合物は、冷却され、さらに糖化酵素（例えば、グルコアミラーゼ）と共に処理され、発酵性グルコースを生成する。前記グルコース含有マッシュはその後、およそ２４から１２０時間、エタノール生産微生物の存在下で発酵される。マッシュ中の前記固形は、液体層から分離され、エタノール及び蒸留用穀物等の有益な副生成物が得られる。
【０００６】
前記発酵方法の改善は、同時糖化・発酵又は同時糖化・酵母増殖・発酵と称される方法で糖化工程と発酵工程との結合により達成される。これらの改善された発酵方法は、従来から記述される乾式粉砕発酵方法又は湿式粉砕発酵方法に対しても有利である。改善された発酵器では、糖濃度が有意に産生されず、酵母成長の糖阻害を避けるからである。さらに、容易に生じやすいグルコースの欠乏により、細菌性成長は減少される。よって、同時糖化・発酵方法の使用により、エタノール生産の増大が結果として起こりえる。
【０００７】
最近になって、加熱工程を削減する発酵方法又は高温で穀物を処理する必要性を減らした発酵方法が導入されている。しばしば、非加熱、低温加熱又は温加熱と称されるこれらの発酵方法は、穀物の粉砕及び液体と粉砕した穀物との混合によるスラリーの形成、さらに、１以上の粒状でんぷん加水分解酵素、さらに、随意に酵母を、粒状でんぷんのゼラチン化温度未満の温度で混合する工程を含み、エタノール及び他の副生成物を生成する（米国特許第４，５１４，４９６号、ＷＯ０３／０６６８２６、ＷＯ０４／０８１１９３、ＷＯ０４／１０６５３３、ＷＯ０４／０８０９２３及びＷＯ０５／０６９８４０）。
【０００８】
粒状でんぷん加水分解酵素と組み合わせた粉砕穀物スラリーを用いた上述の発酵方法は、従来の方法に対して特定の改善を提供する一方で、より高いエネルギー効率及び最終生成物の高生産性をもたらす追加的発酵方法の改善が、粒状でんぷんの転化における産業で必要とされる。本願発明の目的は、粒状でんぷんからアルコール（例えば、エタノール）及び他の最終生成物への転化に用いられる改善された方法を提供することである。
【発明の概要】
【０００９】
本願発明は、粒状でんぷんとアルファ−アミラーゼとを接触させること、及び可溶でんぷんを加水分解し、グルコースを生成する内生植物加水分解酵素に適した条件を提供することにより、粒状でんぷんからアルコール（例えば、エタノール）を生成する方法を提供する。前記グルコースはその後、アルコールを生成するための発酵で供給原料として使用され得る。
【００１０】
一態様において、本願発明は、粒状でんぷん基質からグルコースを生成する方法に関連し、
ａ）植物原料から得られる粒状でんぷんを含むスラリーとアルファ−アミラーゼとを、前記粒状でんぷんのでんぷんゼラチン化温度未満の温度で接触させ、オリゴ糖を生成する工程、及び内生植物の糖質加水分解酵素によりオリゴ糖を加水分解する工程、及び
ｂ）少なくとも１０％のグルコースを含むマッシュを生成する工程を含む。
【００１１】
さらにこの態様の実施形態において、前記マッシュは、発酵微生物及びでんぷん加水分解酵素の存在下、１０℃及び４０℃間の温度で、１０時間から２５０時間発酵され、アルコール、特にエタノールを生成する。
【００１２】
他の態様において、本願発明は、エタノールを生成する方法に関連し、
ａ）粒状でんぷんを含むスラリーと、粒状でんぷんを可溶化するアルファ−アミラーゼとを接触させる工程であって、前記接触がｐＨ３．５からｐＨ７．０、前記粒状でんぷんのでんぷんゼラチン化温度未満の温度で、５分間から２４時間行われ、２０％より多いグルコースを含むマッシュ基質を得る工程、及び
ｂ）発酵微生物及びでんぷん加水分解酵素の存在下、１０℃から４０℃の温度で、１０時間から２５０時間基質を発酵し、エタノールを生成する工程
を含む。さらに上述のいずれかの態様の実施形態において、当該方法は、エタノールの回収を含む。またさらに上記態様の別の実施形態において、当該方法は、列挙される工程の最初、途中、又は最後のいずれの段階で行われるか特定されない追加的な工程を含むことが出来る。
【発明の詳細な説明】
【００１３】
本明細書で別段の定義がされない限り、本明細書中の全ての技術及び化学的用語は、本願発明が属する技術分野の当業者により共通して理解されるものと同一の意味を有する。
【００１４】
本願発明の好ましい方法及び構成物質を本明細書中に記載するが、本明細書で記載される任意の方法及び構成物質と類似又は同等の方法及び構成物質が、本願発明の実務又は試験で使用され得る。
【００１５】
本願発明は、参考までに下記の定義及び実施例を用いた方法により詳細に記載される。本明細書で参照される全ての特許及び公表物、それら全ての特許及び公表物に含まれる全ての配列は、参照により明確に本明細書に含まれる。
【００１６】
定義：
「発酵」の語は、微生物による有機物質の酵素的及び嫌気的分解を示し、それにより、より単純な有機化合物が生成される。発酵は嫌気的条件下で起こる一方、厳密な嫌気的条件にその語が専ら限定されることは意図されず、酸素存在下でも発酵は起こる。
【００１７】
本明細書で使用される「でんぷん」の語は、化学式（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）Ｘ（ここでＸは、任意の数で表される）を有するアミロース及びアミロペクチンを含む植物の複合多糖から成る任意の構成物質を示す。
【００１８】
「粒状でんぷん」の語は、生の（非加熱の）でんぷんを示し、植物原料（例えば、穀物及び塊茎）でその自然形態で見られるでんぷんである。
【００１９】
本明細書で使用される「乾燥固形含有量（ＤＳ）」の語は、スラリー中の全固形量のパーセントを乾燥重量基準で示す。
【００２０】
「スラリー」の語は、不溶性固形、（例えば、粒状でんぷん）を含む水性混合物を示す。
【００２１】
「デキストリン」の語は、グルコースの短鎖ポリマー（例えば、２から１０単位）を示す。
【００２２】
「オリゴ糖」の語は、グリコシド結合で結合された２から１０の単糖単位を有する任意の化合物を示す。これらの単糖の単鎖ポリマーは、デキストリンを含む。
【００２３】
「可溶性でんぷん」の語は、不溶性でんぷん（例えば、粒状でんぷん）の加水分解に起因するでんぷんを示す。
【００２４】
「マッシュ」の語は、発酵生成物の生成に使用される液体中の発酵性基質の混合物を示し、発酵性基質と１以上のでんぷん加水分解酵素及び発酵微生物との初期混合から発酵処理終了までの任意の発酵段階を示すのに使用される。
【００２５】
「糖化酵素」及び「でんぷん加水分解酵素」の語は、でんぷんから単糖又はオリゴ糖（例えば、ヘキソース又はペントース）へ転化が可能な任意の酵素を示す。
【００２６】
「粒状でんぷん加水分解（ＧＳＨ）酵素」及び「粒状でんぷん加水分解（ＧＳＨ）能を有する酵素」の語は、粒状のでんぷんを加水分解する能力を有する酵素を示す。
【００２７】
「でんぷんの加水分解」の語は、水分子の追加によるグルコシド結合の切断を示す。
【００２８】
「アルファ−アミラーゼ（例えば、Ｅ．Ｇ．クラス３．２．１．１）」の語は、アルファ−１，４−グルコシド結合の加水分解を触媒する酵素を示す。これらの酵素は、１，４−α−結合Ｄ−グルコース単位を含有する多糖での１，４−α−Ｄ−グルコシド結合の外部（ｅｘｏ）又は内部（ｅｎｄｏ）加水分解をもたらす酵素としても記載されてきた。
【００２９】
「ゼラチン化」の語は、加熱によりでんぷん分子を可溶し、粘性懸濁液を形成することを意味する。
【００３０】
「ゼラチン化温度」の語は、基質を含有するでんぷんのゼラチン化が起こる最低温度を示す。ゼラチン化の正確な温度は、特定のでんぷんに依存し、植物種並びに環境及び成長条件等の要因に依存して変化し得る。従って、本明細書で記載されるゼラチン化温度の範囲は、前記変化を包括するように提供される。
【００３１】
「ゼラチン化温度未満」の語は、ゼラチン化温度未満の温度を示す。
【００３２】
「グルコアミラーゼ」の語は、酵素のアミログルコシダーゼクラス（例えば、Ｅ．Ｇ．３．２．１．３、グルコアミラーゼ、１，４−アルファ−Ｄ−グルカングルコヒドロラーゼ）を示す。これらは、アミロース及びアミロペクチン分子の非還元末端からグルコシル残基を放出する外部作用（ｅｘｏ−ａｃｔｉｎｇ）酵素である。前記酵素は、アルファ−１，６及びアルファ−１，３結合も加水分解するが、アルファ−１，４結合よりも非常に遅い速度である。
【００３３】
「同時糖化・発酵（ＳＳＦ）」の語は、エタノール生産微生物等の発酵微生物及び少なくとも１の糖化酵素等の酵素が、同一の容器中で同一の工程において組み合わされる最終生成物の生成における方法を示す。
【００３４】
「糖化」の語は、直接使用不可能な多糖から単糖又はオリゴ糖へ、最終生成物への発酵転化に用いられる酵素的な転化を示す。
【００３５】
「粉砕」の語は、より細かい粒子への穀物の破壊を示す。いくつかの実施形態において、前記語は、研削と置換可能に使用される。
【００３６】
「乾式粉砕」の語は、胚芽及びふすま等の穀物の部分が、意図的に除去されていない、乾燥全穀の粉砕を示す。
【００３７】
「液状化」の語は、ゼラチン化でんぷんが加水分解され、低分子量可溶性デキストリンを生じさせるでんぷん転化の工程を示す。
【００３８】
「希薄蒸留液」の語は、溶解構成物質及び懸濁された微粒子を含有し、発酵の結果として生じた固形状部分から分離される、発酵の結果として生じた液状部分を示す。産業用発酵方法における再利用される希薄蒸留液はしばしば「逆流（ｂａｃｋ−ｓｅｔ）」として参照される。
【００３９】
「容器」の語は、タンク、バット、瓶、フラスコ、袋、バイオリアクター等を含むが、これらに限られない。１つの実施形態において、前記語は、本願発明によって包含される糖化及び／又は発酵方法の実施に適した任意のレセプタクルを示す。
【００４０】
「最終生成物」の語は、発酵性基質から酵素的に転化された任意の炭素源由来生成物を示す。いくつかの好ましい実施形態において、前記最終生成物は、エタノール等のアルコールである。
【００４１】
本明細書で使用される「発酵微生物」の語は、最終生成物の直接的又は間接的生成に用いられる発酵に使用するに適した任意の微生物又は細胞を示す。
【００４２】
本願発明で使用される「エタノール生産物」又は「エタノール生産微生物」の語は、単糖又はオリゴ糖からエタノールを生成可能な発酵微生物を示す。
【００４３】
「由来する」の語は、「を起源とする」、「得られる」又は「から得られえる」、及び「から単離される」の語を包含し、本願発明で使用されるいくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドは、ヌクレオチドが自然に存在するか又はヌクレオチドが挿入された細胞から生成されることを当該語は意味する。
【００４４】
タンパク質又はポリヌクレオチドに関して「異種」の語は、宿主細胞で自然に起こらないタンパク質又はポリヌクレオチドを示す。
【００４５】
タンパク質又はポリヌクレオチドに関して「内因性」の語は、宿主細胞で自然に起こるタンパク質又はポリヌクレオチドを示す。
【００４６】
「可溶性でんぷんを加水分解可能な内生植物の加水分解酵素」の語は、植物で発現され、生成される加水分解酵素を示し、内因性又は異種遺伝子の発現により生成されることが出来る。いくつかの実施形態において、内因性酵素は、植物で自然に発現される酵素である。
【００４７】
「外因性」酵素の語は、植物又は植物細胞で生成されない酵素を示す。
【００４８】
「酵素的転化」の語は、一般に酵素作用による基質の修飾を示す。本願発明で使用される当該語は、酵素作用により基質を含有する粒状でんぷん等の発酵性基質の修飾も示す。
【００４９】
本願発明で使用される「回収される」、「単離される」、及び「分離される」の語は、自然に関連付けられる少なくとも１の成分から移動される化合物、タンパク質、細胞、核酸又はアミノ酸を示す。
【００５０】
本願発明で使用される「酵素単位」の語は、特定の分析条件下で、１分当たり１マイクロモルの生成物を生成する酵素量を示す。例えば、１つの実施形態において、当該語は、「グルコアミラーゼ活性単位」（ＧＡＵ）は、６０℃及びｐＨ４．２の分析条件下で可溶性でんぷん基質（ＤＳ４％）から１時間当たり１ｇのグルコースを生成するのに必要な酵素量として定義される。
【００５１】
「収率」の語は、本願発明に係る方法を用いて生成された最終生成物量を示す。いくつかの実施形態において、当該語は、最終生成物の容積を示し、他の実施形態においては、当該語は、最終生成物の濃度を示す。
【００５２】
「ＤＥ」又は「デキストロース当量」の語は、全還元糖の濃度の測定に用いられる業界基準であり、乾燥重量基準を基にＤ−グルコースとして計算される。非加水分解の粒状でんぷんは、本質的にＤＥが０であり、Ｄ−グルコースは、ＤＥが１００である。スラリー又は溶液中のＤＥを決定するのに用いられる有益な方法は、シュクロール法（Ｓｃｈｒｏｏｒｌ’ｓ  ｍｅｔｈｏｄ、フェーリングの分析滴定）に記載される。
【００５３】
本願発明で使用される「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の語及びその同類語は、それらの包括的意義（すなわち、当該語は、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の語及びその対応する同類語と同等である）で使用される。
【００５４】
「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈で明確に指示されない限り、複数の場合を含む。
【００５５】
数値範囲は、その範囲を定める数値も包括する。
【００５６】
本明細書の上述の記載は、本願発明の様々な態様又は実施形態の限定ではなく、全体として明細書に参照されることにより含有される。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、本願発明の実施形態を図解する概略図であり、ここで粒状でんぷんを含有する粉砕された穀物を含み、２０％から４０％のＤＳを有するスラリーと、アルファ−アミラーゼとは、５５℃から７０℃の温度、ｐＨ４．０からｐＨ６．０で、２時間から２４時間接触される。グルコースを含む結果として得られたマッシュは、発酵器に移送され、ｐＨ３．０からｐＨ５．０、２５℃から３５℃の温度で、２４時間から７２時間、酵母、栄養素、酸及びでんぷん加水分酵素の存在下発酵され、エタノールを生成する。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
（Ａ）原材料：
粒状でんぷん−
粒状でんぷんは、小麦、コーン、ライムギ、ソルガム（ミロ）、米、キビ、大麦、ライ小麦、キャッサバ（タピオカ）、ジャガイモ、サツマイモ、サトウダイコン、サトウキビ、及び大豆及びエンドウ豆等のマメ科植物を含むが、限定されない植物原料から得られることが出来る。好ましい植物原料は、コーン、大麦、小麦、米、ミロ及びそれらの組み合わせを含む。特に好ましい植物原料は、コーン（トウモロコシ）から得られる。植物原料は、ハイブリッド品種及び遺伝仕組み換えの品種（例えば、異種遺伝子を含む遺伝子組み換えコーン、大麦又は大豆）を含み得る。葉、幹、殻、外皮、塊茎、穂軸、粒等の植物部位を含むがこれらに限られない植物のいずれの部分も粒状でんぷんの提供に使用され得る。いくつかの実施形態において、例えば、コーンわらの全体が使用され得るように、本質的に植物全体が使用され得る。１つの実施形態において、全穀は粒状でんぷん源として使用され得る。好ましい全穀は、コーン、小麦、ライムギ、大麦、ソルガム及びそれらの組み合わせを含む。他の実施形態において、粒状でんぷんは、繊維、内胚乳及び／又は胚芽成分を含む細分化された穀物部分から得られることが出来る。コーン及び小麦等の植物原料を細分化する方法は、当該技術分野で知られている。いくつかの実施形態において、異なる資源から得られた植物原料は、本願発明に係る方法で使用される粒状でんぷん（例えば、コーン及びミロ又はコーン及び大麦）を得るために同時に混合され得る。
【００５９】
いくつかの実施形態において、粒状でんぷんを含む植物原料は、粉砕等の方法により準備され得る。特に、全穀の粉砕方法は、公知であり、ハンマーミル及びローラーミルの使用を含む。
【００６０】
アルファ−アミラーゼ−
アルファ−アミラーゼは、単一酵素、ハイブリッド酵素、又はアルファ−アミラーゼの混合物とすることが出来る。本願発明に包含されるいくつかの実施形態において、前記アルファ−アミラーゼは、Ｅ．Ｃ．番号、Ｅ．Ｃ．３．２．１．１−３及び特にＥ．Ｃ．３．２．１．１を有する微生物酵素である。任意の適したアルファ−アミラーゼが、本願発明に係る方法に使用され得る。いくつかの実施形態において、前記アルファ−アミラーゼは、細菌株に由来し、他の実施形態において前記アルファ−アミラーゼは、真菌株から由来する。別の実施形態において、前記好ましいアルファ−アミラーゼは、細菌性アルファ−アミラーゼである。他の実施形態において、前記アルファ−アミラーゼは、酸安定性アルファ−アミラーゼである。適したアルファ−アミラーゼは、組み換え（ハイブリッド及び変異体）及び変種アルファ−アミラーゼ（ＷＯ９９／１９４６７及びＷＯ９７／４１２１３）と同様に自然発生のアルファ−アミラーゼとすることが出来る。特に好ましい実施形態において、前記アルファ−アミラーゼは、バチルス属に由来する。好ましいバチルス属は、バチルス・ズブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・レンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リシェニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、及びバチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）を含む（米国特許第５，０９３，２５７号、米国特許第５，７６３，３８５号、米国特許第５，８２４，５３２号、米国特許第５，９５８，７３９号、米国特許第６，００８，０２６号、米国特許第６，３６１，８０９号、米国特許第６，８６７，０３１号、ＷＯ９６／２３８７４、ＷＯ９６／３９５２８及びＷＯ０５／００１０６４）。特に好ましいアルファ−アミラーゼは、バチルス属バチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・アミロリクエファシエンス及びバチルス・リシェニフォルミスに由来する（米国特許第６，１８７，５７６号、米国特許第６，０９３，５６２号、米国特許第５，９５８，７３９号、ＵＳ２００６／００１４２６５及びＷＯ９９／１９４６７）。
【００６１】
最も好ましいアルファ−アミラーゼは、野生型、ハイブリッド及び変異体アルファ−アミラーゼ酵素を含むバチルス・ステアロサーモフィラス及びバチルス・リシェニフォルミスに由来するアミラーゼである。鈴木他（１９８９年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１８９３３−１８９３８ページ及びＵＳ２００６／００１４２６５、特に配列番号３、４及び１６を参照にされたい。アメリカン−タイプ−カルチャー−コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ）番号−ＡＴＣＣ３９７０９、ＡＴＣＣ１１９４５、ＡＴＣＣ６５９８、ＡＴＣＣ６６３４、ＡＴＣＣ８４８０、ＡＴＣＣ９９４５Ａ及びＮＣＩＢ８０５９を有する株も参照にされる。
【００６２】
さらに、細菌性アルファ−アミラーゼ、真菌アルファ−アミラーゼは、本願発明に係る方法での使用に意図される。適した真菌アルファ−アミラーゼは、Ａ．ｏｒｙｚａｅ及びＡ．ｎｉｇｅｒ（例えば、ＦＵＮＧＡＭＹＬ及びＣＬＡＲＡＳＥ  Ｌ）等のアスペルギルス属、及びトルコデルマ属、クモノスカビ属、ケカビ属、及びペニシリウム属等の繊維状真菌株に由来する。
【００６３】
本願発明に係る方法の使用に意図される市販のアルファ−アミラーゼは、ＳＰＥＺＹＭＥ  ＡＡ、ＳＰＥＺＹＭＥ  ＦＲＥＤ、ＳＰＥＺＹＭＥ  ＥＴＨＹＬ、ＧＺＹＭＥ  Ｇ９９７、ＣＬＡＲＡＳＥ  Ｌ（ジェネンコー−インターナショナル−インク）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ  １２０−Ｌ、ＬＣ、ＳＣ及びＳＵＰＲＡ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＬＩＱＵＯＺＹＭＥ  Ｘ及びＳＡＮ  ＳＵＰＥＲ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）及びＵＬＴＲＡ  ＴＨＩＮ（Ｖａｌｌｅｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を含む。
【００６４】
植物酵素−
植物は、アルファ−アミラーゼ（ＥＣ３．１．１．１）；ベータ−アミラーゼ（ＥＣ３．１．１．２）、アミログルコシダーゼ（グルコアミラーゼ）（ＥＣ３．１．１．３）及びでんぷんホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．１）等の自然発生のでんぷん分解酵素を有する。さらに、植物はアミラーゼ、グルコアミラーゼ等のでんぷん分解酵素をコードする異種遺伝子を含むように遺伝子操作されていることが出来る（ＷＯ０３／０１８７６６及びＷＯ０５／０９６８０４）。自然発生又は挿入ポリヌクレオチドからの発現に関わらず、内因性でんぷん分解植物酵素は、ジェット加熱の温度又はさらに粒状でんぷんのゼラチン化温度を超える温度等の上昇された温度に暴露することにより不活化される。しかし、本願発明の方法で実施される温度において、内因性でんぷん分解酵素は、不活性化されず、実際に粒状でんぷんの加水分解に寄与することが考えられている。理論には結びつかないものの、発明者は、接触工程で提供されるアルファ−アミラーゼが、植物原料の粒状でんぷん構造を修飾し、デキストリンを含むオリゴ糖の生成を可能にすると考える。前記オリゴ糖は、接触工程によって包括される温度（例えば４５℃から７０℃）で植物でんぷん分解酵素によりさらに分解される。前記植物でんぷん分解酵素は、部分的に加水分解されたでんぷんからグルコースの生成に作用する。グルコアミラーゼの外因性供給源が接触工程で含まれることが出来る一方、その後のアルコール発酵への供給体として随意に使用されるグルコースの供給に外因性グルコアミラーゼの追加が必要とされない。従って１つの実施形態において、本願発明に係る前記接触工程は、微生物供給源に由来するグルコアミラーゼの追加を含まない。別の実施形態において、前記接触工程は、外因性酵素、特に外因性グルコアミラーゼ又は他のオリゴ糖加水分解酵素の追加なしに実施される。別の実施形態において、前記オリゴ糖は、植物の属によって特定、或いは植物の属及び種によって特定される自然発生の内生植物酵素によってのみ加水分解される。しかし、外因性グルコアミラーゼの追加及び／又は他のフィターゼ及びプロテアーゼ等の酵素は、可溶化粒状でんぷんの生成を増大する。
【００６５】
発酵微生物−
発酵微生物の例は、アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デヒドロゲナーゼを発現し、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｌｉｓから得ることが出来る（例えば米国特許第５，０００，０００号、米国特許第５，０２８，５３９号、米国特許第５，４２４，２０２号、米国特許第５，５１４，５８３号及び米国特許第５，５５４，５２０号を参照にされたい）エタノール生産（ｅｔｈａｎｏｌｏｇｅｎｉｃ）細菌等のエタノール生産（ｅｔｈａｎｏｌｏｇｅｎｉｃ）微生物又はエタノール生産（ｅｔｈａｎｏｌ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ）微生物である。追加的実施形態において、前記エタノール生産（ｅｔｈａｎｏｌｏｇｅｎｉｃ）微生物は、キシロース還元酵素及びキシリトールデヒドロゲナーゼ、キシロースからキシルロースに転化する酵素を発現する。別の実施形態において、キシロース異性体は、キシロースからキシルロースへの転化に使用される。特に好ましい実施形態において、ペントース及びヘキソースの両方からエタノールへの発酵が可能な微生物が利用される。例えば、いくつかの実施形態において、前記微生物は、天然の又は遺伝子操作されていない微生物とすることができ、また他の実施形態において、前記微生物は、組み換え微生物とすることが出来る。例えば、いくつかの実施形態において、好ましい発酵微生物は、バチルス属、乳酸菌、大腸菌、エルウィニア属、パントエア属（例えば、Ｐ．ｃｉｔｒｅａ）及びクレブシエラ属（例えばＫ．ｏｘｙｔｏｃａ）からの細菌株を含む（例えば、米国特許第５，０２８，５３９号、米国特許第５，４２４，２０２号及びＷＯ９５／１３３６２を参照にされたい）。
【００６６】
さらに好ましい実施形態において、前記エタノール生産（ｅｔｈａｎｏｌ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ）微生物は、酵母等の真菌微生物及び特にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株等のサッカロマイセス属（米国特許第４，３１６，９５６号）である。多様なＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが市販され、これらにはＦＡＬＩ（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ’ｓ  Ｙｅａｓｔ）、ＳＵＰＥＲＳＴＡＲＴ（Ａｌｌｔｅｃｈ）、ＦＥＲＭＩＯＬ（ＤＳＭ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ）、ＲＥＤ  ＳＴＡＲ（Ｌｅｓａｆｆｒｅ）及びＡｎｇｅｌ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｙｅａｓｔ（Ａｎｇｅｌ  Ｙｅａｓｔ会社、中国）が含まれるがこれらに限定されない。
【００６７】
第二酵素−
１つの実施形態において、追加的でんぷん加水分解酵素を必要とせず、よって、接触工程で前記酵素を含まないことを意図する一方で、追加的酵素は、本願発明によって包含される接触工程及び発酵工程の両方で含まれることが出来る。いくつかの実施形態において、これらの酵素は、粒状でんぷんスラリーと、アルファ−アミラーゼ及び１以上の第二酵素とを接触することを含む接触工程において、１以上の第二酵素として含まれる。他の実施形態において、前記追加的酵素は、酵母及び他の成分と共に発酵工程で含まれる。
【００６８】
いくつかの実施形態において、アルファ−アミラーゼとの接触工程の間、前記第二酵素は、グルコアミラーゼ、粒状でんぷん加水分解酵素、プロテアーゼ、フィターゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、プルラナーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ベータ−グルカナーゼ、ベータ−アミラーゼ、サイクロデキストリン−トランスグリコシルトランスフェラーゼ及びそれらの組み合わせを含むことが出来る。いくつかの好ましい実施形態において、前記接触工程は、アルファ−アミラーゼ、フィターゼ及び随意にプロテアーゼの組み合わせを含む。他の実施形態において、前記接触工程は、アルファ−アミラーゼ、グルコアミラーゼ及び随意にプロテアーゼの組み合わせを含む。さらに他の実施形態において、前記接触工程は、アルファ−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、フィターゼ及び随意にプロテアーゼの組み合わせを含む。
【００６９】
グルコアミラーゼ（ＧＡ）（Ｅ．Ｃ．３．２．１．３．）異種又は細菌、植物及び菌源を発現する内因性タンパク質に由来することが出来る。本願発明に係る組成物及び方法に有用な好ましいグルコアミラーゼは、繊維状菌及び酵母の数株によって生成される。特に、アスペルギルス属及びトリコデルマ属の株から分泌されたグルコアミラーゼは、商業的に重要である。適したグルコアミラーゼは、変異体及び遺伝子操作された変種グルコアミラーゼと同様に自然発生の野生型グルコアミラーゼを含む。下記のグルコアミラーゼは、本願発明によって包含される方法に使用され得るグルコアミラーゼの非限定的例である。すなわち、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  Ｇ１及びＧ２グルコアミラーゼ（Ｂｏｅｌ他、（１９８４年）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１０９７−１１０２ページ、ＷＯ９２／００３８１、ＷＯ００／０４１３６及び米国特許第６，３５２，８５１号）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ（ＷＯ８４／０２９２１）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼ（Ｈａｔａ他、（１９９１年）Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５５：９４１−９４９ページ）及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｈｉｒｏｕｓａｍｉである。（Ｃｈｅｎ他、（１９９６年）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．９：４９９−５０５ページ、Ｃｈｅｎ他、（１９９５年）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．８：５７５−５８２ページ、及びＣｈｅｎ他、（１９９４年）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３０２：２７５−２８１ページを参照にされたい）。
【００７０】
グルコアミラーゼは、タラロマイセス属に由来するＴ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ、Ｔ．ｌｅｙｃｅｔｔａｎｕｓ、Ｔ．ｄｕｐｏｎｔｉ及びＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＷＯ９９／２８４８８、米国特許第ＲＥ：３２，１５３号、米国特許第４，５８７，２１５号）等のタラロマイセス属株、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ等のトリコデルマ属株及び特に米国特許公開番号第２００６−００９４０８０号に開示される配列番号４と少なくとも８０％、８５％、９０％及び９５％の配列同一性を有するグルコアミラーゼ、Ｒ．ｎｉｖｅｕｓ及びＲ．ｏｒｙｚａｅ等のクモノスカビ属株、ケカビ属株及びＨ．ｇｒｉｓｅａ等のフミコーラ属株（Ｂｏｅｌ他、（１９８４年）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１０９７−１１０２ページ、ＷＯ９２／００３８１、ＷＯ００／０４１３６、Ｃｈｅｎ他、（１９９６年）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．９：４９９−５０５ページ、Ｔａｙｌｏｒ他、（１９７８年）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．６１：３０１−３０８ページ、米国特許第４，５１４，４９６号、米国特許第４，０９２，４３４号及びＪｅｎｓｅｎ他、（１９８８年）Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３４：２１８−２２３ページを参照にされたい）からも得られる。本願発明で有用な他のグルコアミラーゼは、Ａｔｈｅｌｉａ  ｒｏｌｆｓｉｉ及びそれらの変異体から得られるグルコアミラーゼを含む（ＷＯ０４／１１１２１８）。
【００７１】
商業的に使用されるグルコアミラーゼ活性を有する酵素は、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ（商標名ＤＩＳＴＩＬＬＡＳＥ、ＯＰＴＩＤＥＸ  Ｌ−４００及びＧ  ＺＹＭＥ  Ｇ９９０  ４Ｘ、ジェネンコー−インターナショナル−インク）又はクモノスカビ種（商標名ＣＵ．ＣＯＮＣ、新日本ケミカルズ、日本）から生成される。さらに商業用消化酵素、商標名ＧＬＵＣＺＹＭＥ、アマノ・ファーマシューティカルズ、日本（高橋他、（１９８５年）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９８：６６３−６７１ページ）である。追加的酵素は、クモノスカビ種のグルコアミラーゼ（Ｅ．Ｇ．３．２．１．３）の３型、すなわち「Ｇｌｕｃ１」（分子量７４，０００）、「Ｇｌｕｃ２」（分子量５８，６００）及び「Ｇｌｕｃ３」（分子量６１，４００）を含む。さらに酵素製剤ＧＣ４８０（ジェネンコー−インターナショナル−インク）も本願発明で使用される。
【００７２】
粒状でんぷん加水分解酵素（ＧＳＨＥ）は、粒状でんぷんを加水分解することができ、及びこれらの酵素は、バチルス属種、ペニシリウム属種、フミコーラ属種、トルコデルマ属種、アスペルギルス属種、ケカビ属種、及びクモノスカビ属種等の真菌、細菌及び植物細胞から回収される。１つの実施形態において、ＧＳＨ活性を有する酵素の特定のグループは、グルコアミラーゼ活性及び／又はアルファ−アミラーゼ活性を有する酵素を含む（Ｔｏｓｉ他、（１９９３年）Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：８４６−８５５ページを参照にされたい）。Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＧＳＨＥは、芦刈他、（１９８６年）Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５０：９５７−９６４ページ及び米国特許第４，８６３，８６４号に開示される。Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ  ＧＳＨＥは、Ａｌｌｉｓｏｎ他、（１９９２年）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２１：２２５−２２９ページ、ＷＯ０５／０５２１４８及び欧州特許第１７１２１８号に開示される。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ  ｖａｒ．  ｋａｗａｃｈｉ  ＧＳＨＥは、林田他、（１９８９年）Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５３：９２３−９２９ページに開示される。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｈｉｒｏｕｓａｍｉ  ＧＳＨＥは、渋谷他、（１９９０年）Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５４：１９０５−１９１４ページによって開示されている。
【００７３】
一つの実施形態において、ＧＳＨＥはグルコアミラーゼ活性を有し、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ株、特にＨｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ  ｖａｒ．  ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ株（米国特許第４，６１８，５７９号を参照されたい）に由来することが可能である。いくつかの好ましい実施形態において、ＧＳＨ活性を有する前記フミコーラ属酵素は、ＷＯ０５／０５２１４８の配列番号３のアミノ酸配列に少なくとも８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％及び９９％の配列同一性を有する。
【００７４】
他の実施形態において、ＧＳＨＥはグルコアミラーゼ活性を有し、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ株、特にＡ．ａｗａｍｏｒｉ  ｖａｒ．ｋａｗａｃｈｉ株に由来することが可能である。いくつかの好ましい実施形態において、ＧＳＨ活性を有するＡ．ａｗａｍｏｒｉ  ｖａｒ．ｋａｗａｃｈｉ酵素は、ＷＯ０５／０５２１４８の配列番号６のアミノ酸配列に少なくとも８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％及び９９％の配列同一性を有する。
【００７５】
他の実施形態において、ＧＳＨＥは、グルコアミラーゼ活性を有し、Ｒ．ｎｉｖｅｕｓ又はＲ．ｏｒｙｚａｅ等のクモノスカビ株に由来することが可能である。麹株Ｒ．ｎｉｖｅｕｓに由来する前記酵素は、商標名「ＣＵ  ＣＯＮＣ」として、又は前記クモノスカビからの酵素は、商標名ＧＬＵＺＹＭＥとして売られる。
【００７６】
グルコアミラーゼ活性を有する他の有用なＧＳＨＥは、ＳＰＩＲＩＺＹＭＥ  Ｐｌｕｓ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）であり、酸性真菌アミラーゼ活性も含む。
【００７７】
他の実施形態において、ＧＳＨＥはアルファ−アミラーゼ活性を有し、Ａ．ａｗａｍｏｒｉ、Ａ．ｎｉｇｅｒ、Ａ．ｏｒｙｚａｅ、又はＡ．ｋａｗａｃｈｉ株等、特にＡ．ｋａｗａｃｈｉ株であるアスペルギルス株に由来することが可能である。
【００７８】
いくつかの好ましい実施形態において、ＧＳＨ活性を有する前記Ａ．ｋａｗａｃｈｉ酵素は、ＷＯ０５／１１８８００及びＷＯ０５／００３３１１の配列番号３のアミノ酸配列に少なくとも８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％及び９９％の配列同一性を有する。
【００７９】
いくつかの実施形態において、ＧＳＨ活性を有する酵素は、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒアルファ−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅアルファ−アミラーゼ又はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉ−アルファ−アミラーゼの触媒ドメイン等のアルファ−アミラーゼの触媒ドメインと、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉ又はＨｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａでんぷん結合ドメイン等の異なる真菌アルファ−アミラーゼ又はグルコアミラーゼのでんぷん結合ドメインとを含有する等のハイブリッド酵素である。他の実施形態において、ＧＳＨ活性を有するハイブリッド酵素は、アスペルギルス属種、タラロマイセス属種、アルテア属種、トルコデルマ属種又はクモノスカビ属種の触媒ドメイン等のグルコアミラーゼの触媒ドメインと、異なるグルコアミラーゼ又はアルファ−アミラーゼのでんぷん結合ドメインとを含み得る。ＧＳＨ活性を有するいくつかのハイブリッド酵素は、ＷＯ０５／００３３１１、ＷＯ０５／０４５０１８、渋谷他、（１９９２年）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ５６：１６７４−１６７５ページ及びＣｏｒｎｅｔｔ他、（２００３年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ１６：５２１−５２０ページに開示される。
【００８０】
適したプロテアーゼは、例えば、酸性真菌プロテアーゼＮＳＰ２４及びＧＣ１０６（ジェネンコー−インターナショナル−インク）等の真菌プロテアーゼ及び細菌性プロテアーゼのような微生物プロテアーゼを含む。好ましい真菌プロテアーゼは、アスペルギルス属（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ及びＡ．ｏｒｙｚａｅからのプロテアーゼ）、ケカビ属（例えばＭ．ｍｉｅｈｅｉ）、トルコデルマ属、クモノスカビ属、及びカンジダ属株に由来する。好ましい細菌性プロテアーゼは、バチルス・アミロリクエファシエンス等のバチルス属に由来する。発酵に添加されたプロテアーゼは、遊離アミノ窒素レベルを増大し、酵母の代謝率を増大させ、さらにより高い発酵効率を与えることが可能である。
【００８１】
本願発明に係る方法で使用され得る酵素は、ベータ−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２）を含む。これらはアミロース、アミロペクチン及び関連したグルコースポリマーで１，４−アルファ−グルコシド結合の加水分解を触媒する外部作用マルトジェニック（ｅｘｏ−ａｃｔｉｎｇ  ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ）アミラーゼがある。市販のベータ−アミラーゼは、ジェネンコー−インターナショナル−インクから入手可能であり、例として、ＳＰＥＺＹＭＥ  ＢＢＡ及びＯＰＴＩＭＡＬＴ  ＢＢＡを含む。
【００８２】
エンド−グルカナーゼ等のセルラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．４）は、本願発明に係る方法で使用され得る。セルラーゼの例は、トルコデルマ属、フミコーラ属、フザリウム属、及びアスペルギルス属等の繊維状真菌からのセルラーゼを含む。市販のセルラーゼは、ＳＰＥＺＹＭＥ  ＣＰ及びＬＡＭＩＮＥＸ（ジェネンコー−インターナショナル−インク）及びＣＥＬＬＵＺＹＭＥ及びＵＬＴＲＡＦＬＯ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）として入手可能である。
【００８３】
本願発明に係る方法で有用なキシラナーゼは、アスペルギルス属、トルコデルマ属、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、及びフザリウム属等の細菌又は真菌源由来とすることが出来る。市販の製剤は、ＳＰＥＺＹＭＥ  ＣＰ及びＬＡＭＩＮＥＸ（ジェネンコー−インターナショナル−インク）及びＵＬＴＲＡＦＬＯ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）を含む。
【００８４】
多くの細菌及び真菌フィターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．８及び３．１．３．２６）が知られ、いくつかの実施形態においてフィターゼの添加は、本願発明の方法で特に有用である。酵母フィターゼは、サッカロマイセス属株（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びシュワニオマイセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ、例えば、Ｓ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）（Ｗｏｄｚｉｎｓｋｉ他、Ａｄｖ．Ａｐｐｌｅ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４２：２６３−３０３ページ）に由来し得る。他の真菌フィターゼは、文献に開示され、Ｗｙｓｓ他、（１９９９年）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：３６７−３７３ページ、Ｂｅｒｋａ他、（１９９８年）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：４４２３−４４２７ページ、山田他、（１９８６年）Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３２２：１２７５−１２８２ページ、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９８／２８４０８、ＷＯ９８／２８４０９、ＷＯ９７／３８０９６及びＷＯ９８４４１２５及び米国特許第６，７３４，００４号、第６，３５０，６０２号及び第５，８６３，５３３号）が参照にされる。真菌フィターゼは、アスペルギルス属（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ、Ａ．ａｗａｍｏｒｉ、Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ、Ａ．ｏｒｙｚｅａ及びＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）ｌａｎｕｇｉｎｏｕｓｕｓ、フザリウム属（Ｆ．ｊａｖａｎｉｃｕｍ及びＦ．ｖｅｒｓｉｌｌｉｂｏｄｅｓ）に由来する。細菌性フィターゼも本願発明に使用される（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｒ．他、（１９９３年）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３０３：１０７−１１３ページ、Ｙｏｏｎ  Ｓ．Ｊ．他、（１９９６年）Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．１８：４４９−４５４ページ及びＷＯ０６／０４３１７８）。
【００８５】
本願発明に従って使用される市販の入手可能なフィターゼは、ＰＨＹＺＹＭＥ  ＸＰ  ５０００（Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓ）、ＦＩＮＡＳＥ（Ａｌｔｅｃｈ）、ＧＣ４９１、ＦＩＮＡＳＥ、ＳＰＥＺＹＭＥ  ＨＰＡ（ジェネンコー）、ＢＩＯ−ＦＥＥＤ  ＰＨＹＴＡＳＥ及びＰＨＹＴＡＳＥ  ＮＯＶＯ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）及びＮＡＴＵＰＨＯＳ（ＤＳＭ）を含む。
【００８６】
当業者は、本願発明で包含される工程段階で使用される酵素の有効量を容易に決定できる。
【００８７】
（Ｂ）工程段階−
前記処理される粒状でんぷん（例えば、粉砕された穀物）は、水溶液と混合され、スラリーを得る。前記水溶液は、例えば、水、希薄蒸留液及び／又は逆流から得られることが出来る。
【００８８】
スラリーは、５−６０％、１０−５０％、１５−４５％、１５−３０％、２０−４５％、２０−３０％及び２５−４０％間のＤＳを有することが出来る。前記アルファ−アミラーゼとの接触工程は、ｐＨ３．５から７．０の範囲、ｐＨ３．５から６．５の範囲、好ましくはｐＨ４．０から６．０の範囲、及びより好ましくはｐＨ４．５から５．５の範囲で実施される。前記スラリーは、粒状でんぷんのでんぷんゼラチン化温度未満の温度でアルファ−アミラーゼとの接触が保たれる。いくつかの実施形態において、この温度は、４５℃及び７０℃の間、他の実施形態において、前記温度は、５０℃及び７０℃の間、５５℃及び７０℃の間、６０℃及び７０℃の間、６０℃及び６５℃の間、５５℃及び６５℃の間及び５５℃及び６８℃の間に保たれる。別の実施形態において、前記温度は、少なくとも４５℃、４８℃、５０℃、５３℃、５５℃、５８℃、６０℃、６３℃、６５℃及び６８℃である。他の実施形態において、前記温度は、６５℃、６８℃、７０℃、７３℃、７５℃及び８０℃より高くない。
【００８９】
本明細書の方法に従って使用される多くの粒状でんぷんに対する初期でんぷんゼラチン化温度の範囲は、大麦（５２℃から５９℃）、小麦（５８℃から６４℃）、ライムギ（５７℃から７０℃）、コーン（６２℃から７２℃）、高アミロースコーン（６７℃から８０℃）、米（６８℃から７７℃）、ソルガム（６８℃から７７℃）、ジャガイモ（５８℃から６８℃）、タピオカ（５９℃から６９℃）及びサツマイモ（５８℃から７２℃）（Ｊ．Ｊ．Ｍ．Ｓｗｉｎｋｅｌｓ、３２−３８ページ、でんぷん転化技術（ＳＴＡＲＣＨ  ＣＯＮＶＥＲＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）、Ｖａｎ  Ｂｅｙｎｕｎ他編集、（１９８５年）Ｍａｒｃｅｌ−Ｄｅｋｋｅｒ社、ニューヨーク州及びアルコールテキスト（Ｔｈｅ  Ａｌｃｏｈｏｌ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ）、第３版、飲料、燃料及び工業用アルコール産業のための参考書、Ｊａｃｑｕｅｓ他編集、（１９９９年）ノッティンガム大学発行、イギリス）を含む。
【００９０】
接触工程において、前記スラリーは、５分間から４８時間、或いは５分間から２４時間アルファ−アミラーゼとの接触が保たれ得る。いくつかの実施形態において、前記反応時間は、１５分間及び１２時間の間、１５分間及び６時間の間、１５分間及び４時間の間及び３０分間及び２時間の間である。
【００９１】
接触工程で使用されるアルファ−アミラーゼの有効濃度は、使用される具体的な工程条件及び粒状でんぷんに従って変化する。しかし、一般に使用されるアルファ−アミラーゼの量は、０．００１から５０ＡＡＵ／ｇＤＳ、０．０１から３０ＡＡＵ／ｇＤＳ、０．０１から１０ＡＡＵ／ｇＤＳ及び０．０５から５．０ＡＡＵ／ｇＤＳの範囲である。
【００９２】
いくつかの実施形態において、接触工程及び／又は発酵工程でのアルファ−アミラーゼの有効量は、０．０１から１５ＳＳＵ／ｇＤＳ、０．０５から１０ＳＳＵ／ｇＤＳ、０．１から１０ＳＳＵ／ｇＤＳ及び０．５から５ＳＳＵ／ｇＤＳである。
【００９３】
いくつかの実施形態において、接触工程及び／又は発酵工程に用いられるグルコアミラーゼの有効量は、０．０１から１５ＧＡＵ／ｇＤＳ、０．０５から１０ＧＡＵ／ｇＤＳ、０．１から１０ＧＡＵ／ｇＤＳ及び０．５から５ＧＡＵ／ｇＤＳの範囲である。
【００９４】
いくつかの実施形態において、接触工程及び／又は発酵工程で使用されるフィターゼの有効量は、０．００１から１５ＦＴＵ／ｇＤＳ、０．００５から１０ＦＴＵ／ｇＤＳ、０．０５から５ＦＴＵ／ｇＤＳの範囲である。１フィターゼ単位（ＦＴＵ）は、０．００５１モル／リットル、３７℃及びｐＨ５．０でフィチン酸ナトリウムから１分間当たり１マイクロモルの無機リンを遊離する酵素の量である。
【００９５】
いくつかの実施形態において、接触工程及び／又は発酵工程で使用されるプロテアーゼの有効量は、０．０１から１５ＳＡＰＵ／ｇＤＳ、０．０１から１０ＳＡＰＵ／ｇＤＳ、０．０５から５ＳＡＰＵ／ｇＤＳの範囲である。ＳＡＰＵは、分光学的酸性プロテアーゼ単位を示し、１ＳＡＰＵは、分析条件下でカゼイン基質から１分間当たり１マイクロモルのチロシンを遊離するプロテアーゼ酵素活性の量である。
【００９６】
接触工程において、２５−９０％の粒状でんぷんは、可溶化され、デキストリンを含むオリゴ糖を生成する。いくつかの実施形態において、より多い２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％及び９０％の粒状でんぷんが可溶化される。
【００９７】
上記反応時間の粒状でんぷんとアルファ−アミラーゼとの接触の後、より多い１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％及び８０％のグルコースを含む可溶性でんぷん基質（マッシュ）が得られる。
【００９８】
接触工程のいくつかの好ましい実施形態において、２０−４０％のＤＳを有する粒状コーンでんぷんを含むスラリーは、５５℃から７０℃の間の温度で１から６時間、バチルス・ステアロサーモフィラス又はバチルス・リシェニフォルミスに由来するアルファ−アミラーゼと接触され、少なくとも３０％のグルコースを含む可溶性でんぷん基質を得る。接触工程の他の好ましい実施形態において、２０−４０％のＤＳを有する粒状ミロでんぷんを含むスラリーは、５５℃から７０℃の間の温度で１から６時間、バチルス・ステアロサーモフィラス又はバチルス・リシェニフォルミスに由来するアルファ−アミラーゼと接触され、少なくとも５０％のグルコースを含む可溶性でんぷん基質を得る。
【００９９】
グルコースを含むマッシュの生成を終えた接触工程の後、前記マッシュは、発酵微生物（例えば、エタノール生産（ｅｔｈａｎｏｌ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ）微生物）を用いて発酵させられる。
【０１００】
しかし、少なくとも１０％のグルコースを含むマッシュを発酵させる前に、前記マッシュはさらに、例えば逆流及び／又はコーンスティープ（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ）を含む水溶液にさらされ、ｐＨ３．０から６．０、ｐＨ３．５から５．５、又はｐＨ４．０から５．５の範囲にｐＨを調製され得る。本願発明に係るこの実施形態において、マッシュのＤＳ（％）は、希釈され得る。例えば、希釈されるマッシュのＤＳは、５から３５％、５から３０％、５から２５％、５から２０％、５から１５％及び５から１０％より低い接触工程でのスラリーのＤＳ（％）とすることが出来る。１つの非限定的な例において、接触工程でのスラリーのＤＳ（％）がおよそ３２％であり、前記マッシュがさらに、ＤＳを５から１０％希釈する希釈水溶液にされされる場合、前記発酵されるマッシュのＤＳは、２２％及び２７％の間になる。いくつかの好ましい実施形態において、接触するスラリーのＤＳが、３０から３５％の間の場合、希釈されるスラリーのＤＳは、約２０から３０％になる。
【０１０１】
好ましい実施形態において、少なくとも１０％のグルコースを含むマッシュはその後、上述の発酵微生物を用いた発酵工程に移される。これらの発酵工程は、アルコールテキスト（第３版、飲料、燃料及び工業用アルコール産業のための参考書、Ｊａｃｑｕｅｓ他編集、（１９９９年）ノッティンガム大学発行、イギリス）に記載されている。
【０１０２】
いくつかの好ましい実施形態において、前記マッシュは、ｐＨ３．０から６．５、ｐＨ３．０から６．０、ｐＨ３．０から５．５、ｐＨ３．５から５．０、ｐＨ３．５から４．５の範囲のｐＨで、１２から２４０時間、好ましくは１２から１２０時間、及びより好ましくは２４から９０時間、１５から４０℃及び２５から３５℃の範囲の温度で酵母を用いて発酵され、アルコール生成物、好ましくはエタノールを生成する。
【０１０３】
酵母細胞は、発酵もろみ液１ｍｌ当たり１０４から１０１２、好ましくは１０７から１０１０の酵母生細胞の量で一般的に供給される。酵母細胞に加え前記発酵はさらに、発酵微生物（例えば酵母）栄養素、随意に酸及び追加的酵素を含む。
【０１０４】
１つの好ましい実施形態において、接触工程は発酵工程からの分離容器内で実施される。接触工程及び発酵工程は、同一の容器内でＳＳＦ法による実施が可能であることが意図される。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、上述の原材料に加えて、発酵培地は、ビタミン（例えば、ビオチン、葉酸、ニコチン酸、リボフラビン）、補酵素、及びマクロ及びマイクロ−栄養素及び塩（例えば、（ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、ＮａＣｌ、ＭｇＳＯ４、Ｈ３ＢＯ３、ＺｎＣｌ２及びＣａＣｌ２）を含むがこれらに限定されない栄養補助食品を含有する。
【０１０６】
発酵工程に含まれる追加的酵素は、接触工程で使用される酵素と同一又は異なることが出来る。いくつかの実施形態において、前記酵素は、粒状でんぷん加水分解酵素を含むアルファ−アミラーゼ及びグルコアミラーゼを含有する。いくつかの好ましい実施形態において、前記グルコアミラーゼ及びアルファ−アミラーゼは、配合され得る。特に好ましい酵素配合は、Ａ．ｋａｗａｃｈｉからのアルファ−アミラーゼと、Ａ．ｎｉｇｅｒからのグルコアミラーゼとの配合であるＳＴＡＲＧＥＮ  ００１（ジェネンコー−インターナショナル−インク）を含む。いくつかの好ましい実施形態において、前記グルコアミラーゼは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉグルコアミラーゼ、Ａｔｈｅｌｉａ  ｒｏｌｆｉグルコアミラーゼ、タラロマイセス属グルコアミラーゼ、アスペルギルス属グルコアミラーゼ及びハイブリッドグルコアミラーゼ及びそれらに由来する変異体グルコアミラーゼに由来する。いくつかの好ましい実施形態において、前記酵素は、セルラーゼ、フィターゼ及びプロテアーゼから選択される。
【０１０７】
アルコール及び他の最終生成物の回収−
本願発明に係る発酵方法の好ましい最終生成物は、アルコール生成物、好ましくはエタノールである。前記方法により生成された最終生成物は、発酵培地から分離及び／又は精製されることが出来る。分離及び精製に用いる方法は知られており、例えば、前記培地を抽出、蒸留及びカラム・クロマトグラフィー処理することである。いくつかの実施形態において、前記最終生成物は、培地を高圧液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）分析に直接処理することで単離される。
【０１０８】
別の実施形態において、前記マッシュは、例えば、液体層と固形層とに遠心分離することにより分離され、アルコール等の最終生成物と固形が回収される。前記アルコールは、蒸留及び分子シーブ脱水又は限外ろ過法等の方法により回収され得る。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、前記エタノールの収率は、体積で８％、１０％、１２％、１４％、１６％及び１８％より多くなる。本願発明に係る方法に従って得られたエタノールは、燃料エタノール、飲用エタノール又は工業用エタノールとして使用され得る。
【０１１０】
別の実施形態において、前記最終生成物は、動物飼料として使用され得る蒸留乾燥穀物（ＤＤＧ）及び蒸留乾燥穀物プラス可溶分（ＤＤＧＳ）等の発酵副生成物を含むことが出来る。
【実施例】
【０１１１】
実験
下記の実施例は、特定の好ましい実施形態及び本願発明に係る態様の実証及びさらに具体化を目的として供給され、それらの範囲を限定するようには解釈されない。実際に、これらの教示は、本明細書で記載されるプロセスシステムの更なる最適化に使用される。
【０１１２】
下記の開示及び実験の項では、下記の略語が適用される。すなわち、ＧＡ（グルコアミラーゼ）、ｗｔ％（重量パーセント）、℃（摂氏）、Ｈ２Ｏ（水）、ｄＨ２Ｏ（脱イオン水）、ｄＩＨ２Ｏ（脱イオン水、Ｍｉｌｌｉ−Ｑろ過）、ｇ又はｇｍ（グラム）、μｇ（マイクログラム）、ｍｇ（ミリグラム）、ｋｇ（キログラム）、μＬ（マイクロリットル）、ｍｌ及びｍＬ（ミリリットル）、ｍｍ（ミリメートル）、μｍ（マイクロメートル）、Ｍ（モル）、ｍＭ（ミリモル）、μＭ（マイクロモル）、Ｕ（単位）、ＭＷ（分子量）、ｓｅｃ（秒）、ｍｉｎ（分）、ｈｒ（時間）、ＤＯ（溶解酸素）、Ｗ／Ｖ（体積当たりの重量）、Ｗ／Ｗ（重量当たりの重量）、Ｖ／Ｖ（体積当たりの体積）、ジェネンコー（ジェネンコー−インターナショナル−インク、パロ・アルト、カルフォルニア州）、ＭＴ（メートルトン）、及びＥＴＯＨ（エタノール）である。
【０１１３】
以下の実施例で下記の酵素製剤を使用した：
ＳＰＥＺＹＭＥ  Ｅｔｈｙｌ（ジェネンコーから入手可能）−バチルス・リシェニフォルミスの遺伝子組み換え株から得られた細菌性アルファ−アミラーゼである。
【０１１４】
ＧＣ１００−ＵＳ２００６／００１４２６５で開示される実験的細菌性アルファ−アミラーゼである。
【０１１５】
ＷＯ２００５／０５２１４８の配列番号３として開示されるアミノ酸配列を有するＨｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａグルコアミラーゼ（ＨＧＡ）。
【０１１６】
ＳＴＡＲＧＥＮ  ００１（ジェネンコーから入手可能）−Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼとＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉアルファ−アミラーゼとの配合である。
【０１１７】
以下の実施例で下記の分析を使用した：
前記アルファ−アミラーゼの活性を、アルファ−アミラーゼ単位（ＡＡＵ）として表現し、酵素活性は、分光光度法で測定したヨウ素染色能力の減少率に反映されるでんぷん加水分解の割合によって決定した。細菌性アルファ−アミラーゼ活性の１ＡＡＵは、標準状態で１分間当たり１０ｍｇのでんぷんを加水分解するのに必要な酵素量である。
【０１１８】
アルファ−アミラーゼ活性は、可溶性でんぷん単位（ＳＳＵ）としても決定され、ｐＨ４．５、５０℃で酵素試料の一定分量による可溶性ジャガイモでんぷん基質（ＤＳ４％）の加水分解の程度に基づく。前記還元糖の含有量を、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｇ．Ｌ．（１９５９年）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．３１：４２６−４２８ページに記載されるＤＮＳ法を用いて測定した。酵素活性（ＳＳＵ）の１単位は、１分間当たり特定のインキュベーション条件で放出されるグルコース１ｍｇの還元力と等価である。
【０１１９】
グルコアミラーゼ活性を、ｐ−ニトロフェニル−アルファ−Ｄ−グルコピラノシド（ＰＮＰＧ）からグルコース及びｐ−ニトロフェノールへの加水分解を触媒するグルコアミラーゼの機能に基づいた公知の分析法を用いて測定した。アルカリｐＨで、グルコアミラーゼ活性と比例する黄色を形成したニトロフェノールを、４００ｎｍで測定し、ＧＡＵとして測定された酵素基準と比較した。
【０１２０】
１「グルコアミラーゼ活性単位」（ＧＡＵ）は、ｐＨ４．２及び６０℃で１時間当たり、可溶性でんぷん基質（ＤＳ４％）からグルコースとして算出される還元糖１ｇｍを生成する酵素量である。
【０１２１】
与えられた温度での全可溶固形含有量の測定であるブリックス（Ｂｒｉｘ）を、屈折計を用いた測定で決定した。
【０１２２】
全でんぷん含有量の測定：酵素−酵素でんぷん液状化及び糖化方法を、全でんぷん含有量の決定に使用した。典型的分析において、２ｇの乾燥試料を１００ｍｌコールラウシュフラスコに入れ、ｐＨ７．０ＭＯＰＳ緩衝液４５ｍｌを加えた。前記スラリーは、３０分間十分に攪拌された。（水で１：５０に希釈された）ＳＰＥＺＹＭＥ  ＦＲＥＤ（ジェネンコー）１．０ｍｌを加え、加熱し、３−５分間煮沸した。前記フラスコを、オートクレーブに置き、１２１℃で１５分間維持した。加圧滅菌の後、前記フラスコを９５℃で水浴させ、１：５０で希釈されたＳＰＥＺＹＭＥ  ＦＲＥＤ１ｍｌを加え、４５分間インキュベートした。ｐＨをｐＨ４．２に調製し、６０℃まで温度を下げた。その後、２０ｍｌ緩衝酢酸溶液ｐＨ４．２を加えた。１：１００で希釈したＯＰＴＩＤＥＸ  Ｌ−４００（ジェネンコー）１．０ｍｌを加え、１８時間６０℃でインキュベーションすることで糖化を行った。酵素反応は、９５℃で１０分間加熱し終了した。基準としてのグルコースを用いたＨＰＬＣ分析で全糖組成を決定した。酵素処理を用いず、試料を室温で水抽出し、全糖から可溶性でんぷん加水分解物を除去した。
【０１２３】
可溶固形分（％）の測定−試料７ｍｌを小さいスクリューキャップテストチューブに入れ（ｐＨを５．０から６．０に調製し）、ＳＰＥＺＹＭＥ  Ｆｒｅｄ０．００７ｍｌを前記チューブに加えた。前記テストチューブを１０分間煮沸水槽に入れ、インキュベーション中幾度か緩やかに混合した。１０分間後前記チューブは回収され、１時間８０℃の水浴に入れた。前記チューブを、冷却し、遠心分離にかけた。上清のブリックスを決定し、コントロール試料と比較した。可溶固形分（％）＝コントロールブリックス×１００／試料ブリックスである。
【０１２４】
試料のエタノール及び糖質の測定は、以下のＨＰＬＣ法を用いて決定した。
【０１２５】
１．５ｍＬエッペンドルフ遠心分離チューブを発酵マッシュで満たし、１０分間氷上で冷却した。試料チューブをエッペンドルフ卓上遠心分離機で１分間遠心分離した。１．１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４０．０５ｍＬを含むテストチューブに上清サンプル０．５ｍＬを移し、５分間静置した。水５．０ｍＬをテストチューブに加え、その後試料を０．２μｍナイロンシリンジフィルターを通してＨＰＬＣバイアルにろ過し、ＨＰＬＣに流した。前記ＨＰＬＣ条件は以下を含む。
【０１２６】
エタノール系：カラム：フェノメネックス−レゼックス（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｒｅｚｅｘ）有機酸カラム（ＲＨＭ−単糖）＃００Ｈ−０１３２−ＫＯ（バイオラッド８７Ｈと同等）、カラム温度：６０℃、移動相：０．０１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４、流量：０．６ｍＬ／分、検出方法：ＲＩ、及び注入量：２０μＬである。
【０１２７】
糖質系：カラム：フェノメネックス−レゼックス−カーボハイドレイト（ＲＣＭ−単糖）＃００Ｈ−０１３０−ＫＯ（バイオラッド８７Ｈと同等）、カラム温度：７０℃、移動相：ナノピュア（Ｎａｎｏｐｕｒｅ）ＤＩ水、流量：０．８ｍＬ／分、検出方法：ＲＩ、注入量：１０μＬ（３％ＤＳ物質）である。
【０１２８】
サッカリドの分子量に基づいて分離されたカラム−前記カラムは、ＤＰ１（グルコース）、ＤＰ２（二糖）、ＤＰ３（三糖）及びＤＰ＞３（３より多い重合の程度を有するオリゴ糖）として指定される。
【０１２９】
実施例１
全粉末コーン及び細分化コーンの粒状でんぷんからの可溶化及びエタノール生産
この実施例では、（Ａ）１３．３％の含水率を有する全粉末コーン３７０ｇ、（Ｂ）９．２％の含水率を有するコーン内胚乳３５４．２ｇ及び（Ｃ）１１．８％の含水率を有する精製コーンでんぷんの３つの異なるコーン粒状でんぷん基質について行った。各基質を、秤量した後、ステインレス−スチール容器に移し、水でＤＳ３２％に対応した最終１０００ｇスラリーを作成した。
【０１３０】
前記スラリーのｐＨは、６Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を用いてｐＨ５．５に調製した。ＧＣ１００（４．０ＡＡＵ／ｇＤＳ）を加えた。温度を６０℃に維持した。インキュベーション中前記スラリーをオーバーヘッドミキサーで緩やかに混ぜた。２、４、６、１２及び２４時間後に、ブリックス、可溶でんぷん分（％）及び糖組成（％重量／重量）を決定し、その結果を表１に示した。２４時間後に、全粉末コーン、内胚乳及び精製糖からそれぞれ７９．１％、７１．１％及び６０．０％の粒状でんぷんを、接触工程で可溶化した。２４時間後の加水分解物のグルコース分は、全粉末コーンで６５．２２％、内胚乳で４９．６４％及び精製でんぷんで５．７９％のみであった。
【表１】
2009539375.tif 000003
【０１３１】
２４時間後、全粉末コーン（ＤＳ３２％）からの試料を用いて、酵母発酵を１２５ｍｌフラスコ中、ｐＨ４．２、３２℃で４００ｐｐｍ尿素、レッドスター（Ｒｅｄ  Ｓｔａｒ）Ｒｅｄ  ｙｅａｓｔ（Ｆｅｒｍｅｎｔｕｓ）、ＳＴＡＲＧＥＮ００１、及び０．１ＳＡＰＵ／ｇＤＳプロテアーゼの存在下で実施した。ＨＰＬＣデータを表２に示した。
【表２】
2009539375.tif 000004
【０１３２】
実施例２
ミロ粒状でんぷんからの可溶化及びエタノール生産
２つの前処理を行った。（Ａ）１１．６％の含水率及び５３．３％の全でんぷん含有量を有する全粉末ミロ１６０ｇを秤量し、３４０ｇの水を有するステインレススチール容器に移した。スラリーのｐＨを６Ｎ硫酸を用いてｐＨ５．５に調製した。ＳＰＥＺＹＭＥ  Ｅｔｈｙｌ（１．０ＡＡＵ／ｇＤＳ）を加えた。温度を６２℃及びＤＳ３２％に維持した。（Ｂ）ＨＧＡを０．１ＧＡＵ  ＨＧＡ／ｇＤＳと当量で上述の（Ａ）に記載された前処理に加えた。可溶固形分（％）及びグルコース分（％）を表３に示した。
【表３】
2009539375.tif 000005
【０１３３】
上述のＨＧＡ前処理からの原料（マッシュ）を、１２５ｍｌフラスコ中、通常の酵母発酵条件下（例えば、レッドスター酵母、ｐＨ４．２、３２℃で４００ｐｐｍ尿素、ＳＴＡＲＧＥＮ  ００１及び０．０５ＳＡＰＵ／ｇＤＳの存在下）で評価した。ＨＰＬＣの結果を表４に示した。
【表４】
2009539375.tif 000006
【０１３４】
実施例３
全粉末ミロからのグルコース生成における温度の効果
ｐＨ５．５でＧＣ１００（４．０ＡＡＵ／ｇＤＳ）を有する全粉末ミロの３０％ＤＳ水性スラリーのインキュベーションを、６０℃、６５℃及び７０℃で行った。６時間のインキュベーションの後、試料を回収し、遠心分離で不溶性物質を分離した。透明な上清のブリックス及びＨＰＬＣ組成を測定した。可溶でんぷん分（％）及びグルコース分（％）を決定し、結果を表５に示した。
【表５】
2009539375.tif 000007
【０１３５】
全粉末ミロとの接触工程でインキュベーション温度を６０℃から７０℃に上昇するに伴い、でんぷんの可溶化及びグルコース含有量が減少した。これはアルファ−アミラーゼが７０℃で不活化した可能性を示唆した。５０％を上回る可溶でんぷんが６５℃でグルコースに加水分解されたことは、内生植物でんぷん加水分解酵素が可溶性オリゴ糖からグルコースに加水分解出来ることを示唆している。
【０１３６】
上述の６５℃における前処理からの原料を、ＤＳが３０％であったこと以外、本質的に実施例２で記載される通常の発酵条件下で評価した。その結果を表６に示した。
【表６】
2009539375.tif 000008
【０１３７】
実施例４
米粒状でんぷんからの可溶化及びエタノール生産
１４％の含水率及び３０メッシュスクリーンを通る粒径を有する８１．５％のでんぷん含有量を有する米穀物（１１６ｇ）を、２８４ｇの水と混合し、２５％ＤＳスラリーを作成した。その後、ＧＣ１００（４．０ＡＡＵ／ｇＤＳ）をスラリーに加えた。温度を６５℃で維持し、ｐＨをｐＨ５．５に調製した。ブリックスを２、４、６、及び２４時間後に測定した。可溶でんぷん分（％）及びグルコース分（％）を決定し、その結果を表７に示した。
【表７】
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【０１３８】
２４時間後に、酵母発酵をｐＨ４．２、３０℃で０．７５ＧＡＵ／ｇＤＳ  ＳＴＡＲＧＥＮ  ００１、４００ｐｐｍ尿素、及び０．４％エンジェル−イースト（江西省、中国）の存在下で実施した。ＨＰＬＣ試料を２４、４８及び６７時間（表８）後に採取した。
【表８】
2009539375.tif 000010
【図１】
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【国際調査報告】
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