(57)【要約】本発明はスパイダーシルクタンパク質からナノおよびマイクロカプセルを製造する方法を対象とする。さらに、本発明はかかる方法により得られるナノおよびマイクロカプセル、ならびに同ナノカプセルおよび同マイクロカプセルを含有する医薬組成物、化粧品組成物、および食品組成物も対象とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
スパイダーシルクタンパク質からなるナノおよびマイクロカプセルを製造する方法であって、
ａ）スパイダーシルクタンパク質を提供する工程、
ｂ）適切な溶媒で、前記タンパク質の溶液または懸濁液を形成する工程、
ｃ）少なくとも２つの相からなるエマルジョンであって、第１相としての前記工程ｂ）で形成された溶液または懸濁液と、前記第１層と実質的に非混和な少なくとも１つのさらなる相とを含むエマルジョンを生成する工程、
ｄ）前記少なくとも２つの相の界面にスパイダーシルクタンパク質のポリマーネットワークを形成する工程、および
ｅ）（ｄ）で生成されたタンパク質ポリマーネットワークをエマルジョンから分離する工程、
からなる方法。
【請求項２】
工程ａ）で提供されるスパイダーシルクタンパク質はＣ16、Ｃ16ＮＲ４、Ｃ32、Ｃ32ＮＲ４を含むＡＤＦ−４およびその誘導体から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ｂ）の溶媒と、少なくとも１つのさらなる相の溶媒とのうちの少なくとも一つが、親水性溶媒（好ましくは水およびアルコール）または親油性溶媒（好ましくは天然油または合成油）から選択される請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程ｃ）で形成されるエマルジョンがＷ／Ｏ型、Ｏ／Ｗ型、Ｏ／Ｗ／Ｏ型またはＷ／Ｏ／Ｗ型である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程ｂ）で使用される溶媒が、１または複数の薬剤、化粧剤、栄養素または食品添加物をさらに含有する請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記薬剤は溶解されるか、懸濁されるか、または固形の形で溶媒中に存在する請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程ｅ）におけるポリマーネットワークの分離は、遠心により行われるか、または工程ｃ）で形成されたエマルジョンを破壊して一相の溶液を形成することにより行われる請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
工程ｂ）−ｅ）に使用される温度は５−４０℃、好ましくは１０−３０℃、より好ましくは室温であり、工程ｂ）−ｅ）に使用されるｐＨは３−９、好ましくは５−８、より好ましくは７である請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
エマルジョン滴および同滴から得られたナノおよびマイクロ粒子のサイズは１０ｎｍから４０μｍまで、好ましくは５００ｎｍと１０μｍの間、最も好ましくは約５μｍである請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記得られたナノのナノおよびマイクロカプセルの壁厚が５〜１００ｎｍ、好ましくは１０〜７０ｎｍである請求項１〜９のいずれかに記載の方法
【請求項１１】
工程ａ）で提供されるスパイダーシルクタンパク質は、組織特異的タンパク質分解を可能にするプロテアーゼ特異的認識配列を導入するよう遺伝子組換えされている請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記ナノまたはマイクロカプセルを特異的な細胞または組織に向けるために、前記ナノまたはマイクロカプセルの形成前か形成後に前記スパイダーシルクタンパク質に作用薬を結合させる請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記作用薬は、スパイダーシルクタンパク質に架橋されたＲＧＤペプチド、細胞または組織特異的抗体、およびスパイダーシルクタンパク質に結合される細胞または組織特異的受容体から選択される請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載の方法によって得られるナノおよびマイクロカプセル。
【請求項１５】
請求項１４に記載のナノおよびマイクロカプセルと、医薬として許容される担体とを含有する医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１４に記載のナノおよびマイクロカプセルを含有する化粧品または食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はスパイダーシルクタンパク質からナノおよびマイクロカプセルを製造する方法を対象とする。さらに、本発明はかかる方法により得られるナノおよびマイクロカプセル、ならびに同ナノおよびマイクロカプセルを含有する医薬組成物、化粧品組成物、および食品組成物も対象とする。
【背景技術】
【０００２】
輸送小胞として、そして未来の装置のための建材の候補として、小規模構造は高い関心を集めている。役割の一つは、小さな規模で反応物質または粒子をカプセルに入れ、それを特定位置に置いた後でカプセルに入れられた物質の放出を誘発することである。そのような課題を解決する一つの解法は、ナノカプセルと呼ばれる化学的小胞を使用することである。ナノカプセルは、外部の誘因や刺激を受けると反応物質を自由に解放するよう設計されている。そのような追求にはいくつかの問題があるが、最も重要なのは、例えば化学的または生物学的に活性な反応物の周囲でいかにそのようなナノカプセルを一定のやり方で構築するかということである。
【０００３】
このような要求に応えるために、最近、「ハイブリッド」刺激応答性ナノカプセルが開発された。この構造（小胞であるがミセルでもある）は、ｐＨ感受性のコンホメーションを有する両親媒性物質であるポリブタジエン（ＰＢ）−ｂ−ポリ（グルタミン酸）（ＰＧＡ）ジブロック共重合体の自己集合から得られる。ｐＨ感受性は小胞を取り外すために使用される。架橋可能な疎水性ブロックと親水性ペプチドブロックとを有するそのようなＰＢ−ｂ−ＰＧＡ共重合体は、アニオン重合と開環重合の組み合わせにより合成された（Ｃｈｅｃｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。この共重合体の多分散性は、よく定義された自己集合凝集体を得ることができる程に十分に小さい、例えば、ＰＢ４０−ｂ−ＰＧＡ１００共重合体は、水中にある場合には、ポリマーソームと呼ばれる閉じた二層の小胞を形成する（Ｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。かかる小胞の性質の一つは、小胞がサイズを変更することにより外部のｐＨ変化に応答することである。このｐＨ変化時のこのような変位は可逆的であり、塩分に対しては適度な感受性しかない。その理由は、変位が単純な高分子電解質の膨潤結果に基づいているにではなく、ＰＧＡブロックのペプチドの性質に基づくためである（図１）。このような小胞は低分子化合物（例えばフルオロフォア等の溶媒分子（Ｃｈｅｃｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）をカプセルに入れることができるだけでなく、より大きなナノ粒子を安定化させることもできる。この系の欠点は、ｐＨの変化はカプセルに入れられたサンプルの生物活性を失わせ得るため、急激なｐＨ変化に対して通常感受性が高い生物系と部分的に不適合であることである。
【０００４】
例示のための図１は、（ａ）ＮａＣｌ濃度とｐＨの関数としてのペプトソームの流体力学半径ＲＨの動的光散乱、（ｂ）ペプトソームと、コイルのペプチド部分のα−ヘリックス二次構造移行によるｐＨの関数としてのペプトソームのサイズの変化の略図を示す。
【０００５】
別の確立されたカプセル化法は油／水分相間でのコロイド粒子の自己集合である。自己集合プロセスの駆動力は全表面エネルギーの最小化であり、従って種々の粒子および溶媒を使用することができる。そのような安定したエマルジョンはＰｉｃｋｅｒｉｎｇエマルジョンとして周知である。粒子を安定化または架橋すると、機械的に安定したケージが得られ、これが連続相に転送される。いわゆるコロイドソームの利点は、カプセル化したものを制御できることと、外殻の化学的および機械的安定性を容易に調節できることである。粒子が自己集合するとほぼ結晶の構造が生じ、従って粒子間には孔が生じる（Ｄｉｎｓ
ｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。これらの孔は、膜を通過する拡散の制御を可能にする選択的フィルタのサイズである。全工程は生体適合性に行なうことができる。しかしながら、コロイド粒子自体は必ずしも生体適合性ではない。
【０００６】
ＰＣＴ国際公開第ＷＯ０２／４７６６５号は、コロイドソームと呼ばれる制御された孔径、孔隙率および有利な機械的性質を有する自己集合する選択的透過性の弾性的微細構造を製造する方法について記載している。かかる方法は、（ａ）生体適合性材料から形成された粒子を第１の溶媒に提供する工程と、（ｂ）第１の溶媒に第１の流体を加えることにより、第１の溶媒により囲まれた第１の流体の小滴により定義されたエマルジョンを形成する工程と、（ｃ）小滴の表面を粒子でコーティングする工程と、（ｄ）小滴の表面の粒子を安定化させて、少なくとも約２０Ｐａの降伏強さを有するコロイドソームを形成する工程と、からなる。ＰＣＴ国際公開第ＷＯ０２／４７６６５号はかかるコロイドソームを製造するために生体適合性合成ポリマーを使用している。そのようなポリマーの例にはポリスチレン、ポリメチルメタクリル酸、ポリアルキレン、シリカ、およびそれらの組み合わせがある。コロイドを得るための原料である粒子は例えば焼結、化学的架橋およびその同種の方法により安定化される。しかしながら、かかるコロイドソームの調製方法は比較的困難であり、その人工的であって非天然の性質のためインビボで適用するには有害な性質を示しうる。コロイドを使用すると定義された孔を有するバッグが最小サイズに制限されるため、コロイド粒子の使用は外殻のサイズ範囲も制限する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、生体適合性が高く、インビボでの適用に適したナノおよびマイクロカプセルを提供することが本発明の課題である。
異なる種類かつ種々の量の有効な作用薬または栄養素等を収容できるナノおよびマイクロカプセルを得ることも本発明の別の課題である。
【０００８】
生分解性、すなわち、インビボ適用、例えば局所または全身適用したときに有効な作用薬等を制御放出できるナノおよびマイクロカプセルを提供することも本発明のさらなる課題である。
【０００９】
これらの課題は独立請求項により解決される。好ましい実施形態が従属請求項に記載される。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明では、驚くべきことに、種々のインビボ適用に使用することができるマイクロカプセルおよびナノカプセルを形成する基礎として、スパイダーシルクタンパク質が役立ち得ることが判明した。詳細には、架橋剤等の化学物質の添加によるか、マイクロカプセルおよびナノカプセルに梱包された作用薬に対して有害な効果を与え得る焼結によりカプセル形成原料である粒子を架橋または安定化する工程を使用する必要性をなくした、カプセルを製造する改良方法によりカプセルが形成され得ることが判明した。
【００１１】
大部分の現在使用されているカプセル化法（例えばＷＯ０２／４７６６５を参照）は生物粒子または巨大分子に基づいているため、発明者らは自己集合するスパイダーシルクタンパク質に基づいて新しい安定なカプセル化プロセスを開発した。他のカプセル化法と異なり、本発明では、エマルジョン表面の疎水性／親水性の性質がコロイド粒子を集合させるためだけに使用されるのではなく、結合およびポリマーネットワーク形成（安定化）によりコロイドを固定するための駆動力としても使用される。このプロセスは、新しいクラスの生体適合性コロイドから形成されたナノおよびマイクロカプセルポリマーを生産する方法を示すだけでなく、タンパク質を使用したポリマーネットワーク形成への新規なアプ
ローチも示す。この方法から形成されたナノおよびマイクロカプセルの大きな利点は、タンパク質により与えられたマイクロカプセルの生体適合性および機能である。これは、ｐＨ変化、温度変化、またはプロテアーゼ活性等の手段による放出機構の制御を可能にする。
【００１２】
例えば、ナノまたはマイクロカプセルは破壊され、それらの成分が化学的、物理的（例えば剪断力により）、または生物学的（タンパク質の消化により）により生体内に放出され得る。
【００１３】
スパイダーシルクタンパク質の界面での自己集合は、水／油エマルジョンの水相にタンパク質を導入することにより達成された（図２参照）。表面エネルギーの最小化はタンパク質を界面へと駆動し、密度の高いポリマーネットワークへのモノマーの集合を引き起こした（図３）。
【００１４】
上記プロセスから形成されたスパイダーバッグ／バルーンは例えば水相の内容物で充填され、有機溶媒、アルコール、ならびに水に存在し得る（図３）。したがって、それらは非常に異なる環境中で予期しない安定性を示している。原則として、逆側のエマルジョン表面でのタンパク質の自己集合も可能であり、油相の内容がカプセル化される（以下も参照）。
【００１５】
特に、バッグ／バルーンはタンパク質、化学反応物質、ナノおよびマイクロメートルスケールの粒子等で満たされ得るが、これは粒子を蛍光（ＦＩＴＣ）標識デキストラン粒子で充填することにより実施例で示されている（図４）。
【００１６】
膜の透過性および浸透圧ストレスに対するバッグの機械的安定性は膜厚を考えると、いずれも比較的高い。電子顕微鏡画像から明らかなことに、膜厚は１０〜７０ｎｍである（図５）。
【００１７】
本アプローチでは、活性作用薬の生物学的カプセル化を生じさせるために、合成スパイダーシルクタンパク質、特にＣ16の合成配列が使用された（Ｈｕｅｍｍｅｒｉｃｈｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【００１８】
一般に、スパイダーシルクは特異な物理的性質を示すタンパク質ポリマーであるが、種々のクモにより生産された種々のシルク組成についての情報は限られたものしかない（Ｓｃｈｅｉｂｅｌ  ２００４参照）。種々の種類のスパイダーシルクのうち、アメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）およびショクヨウオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）の引き綱が最も熱心に研究されている。引き綱のシルクは一般に２つの主要タンパク質から構成され、更なるタンパク質がシルクの組立および最終的なシルク構造に重要な役割を果たしているかどうかは未だ不明である。ニワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）の引き綱の２つの主要タンパク質成分はＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４（Ａｒａｎｅｕｓ  Ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ  Ｆｉｂｒｏｉｎ）である。
【００１９】
スパイダーシルク様タンパク質をコードする遺伝子は、合成ＤＮＡモジュールとＰＣＲ増幅された標準遺伝子配列との組み合わせに基づくクローニングストラテジーを使用して生成された（Ｈｕｅｍｍｅｒｉｃｈ、２００４）。ニワオニグモＡｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来のシルクタンパク質であるＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４は合成構成物の鋳型として選択された。シームレスなクローニングストラテジーにより、種々の合成ＤＮＡモジュールと標準遺伝子断片との制御された組み合わせが得られた。クローニングベクターは、合成遺伝子の代替物として機能するスペーサを有するクローニングカセットを
含むよう設計された（Ｈｕｅｍｍｅｒｉｃｈ、２００４）。
【００２０】
ＡＤＦ−４の反復配列を模倣するために、単一の保存反復ユニットを設計し、Ｃと呼ばれる一つのコンセンサスモジュールを得、Ｃを多量体化して反復タンパク質Ｃ16を得、Ｃ16を実施例として所与のアプローチに使用した。
【００２１】
示されたスパイダーシルクバッグ／バルーンには、機能性食品から医薬品−化粧品の用途に至るまで、多くの用途が考えられる。例えば、食品工学におけるカプセル化はビタミン等の特定の成分を酸化環境から保護し得る。別の食品工学の応用では、魚油等の成分が味がしないよう隠される。医薬の用途では、タンパク質シェルの拡散バリアにより、カプセル化された物質の遅延（制御）放出プロセスが可能となる。タンパク質シェルのさらなる設計により、特定のプロテアーゼまたは他の起爆物質を用いて活性化させた後でのみその中身を解放する、定義された徐放容器が得られる。化粧品では、例えば皮膚のプロテアーゼによるタンパク質シェルの遅延分解後に、皮膚への水活成分の輸送が本発明のバッグ／バルーンにより促進することができる。さらに、皮膚へ晒した時に機械的剪断力を用いて中身を解放してもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は特に以下の態様および実施形態を対象とする。
第１態様によれば、本発明は、スパイダーシルクタンパク質からなるナノおよびマイクロカプセルを製造する方法であって、
ａ）スパイダーシルクタンパク質を提供する工程、
ｂ）適切な溶媒で、前記タンパク質の溶液または懸濁液を形成する工程、
ｃ）少なくとも２つの相のエマルジョンであって、第１相としての前記工程ｂ）で形成された溶液または懸濁液と、前記第１層と実質的に非混和な少なくとも１つのさらなる相とを含むエマルジョンを生成する工程、
ｄ）前記少なくとも２つの相の界面にスパイダーシルクタンパク質のポリマーネットワークを形成する工程、および
ｅ）（ｄ）で生成されたタンパク質ポリマーネットワークをエマルジョンから分離する工程、
からなる方法を対象とする。
【００２３】
上述したように、工程（ｄ）のポリマーネットワークの形成にはさらなる成分（例えば架橋剤）を追加する必要がなく、焼結、架橋などの追加の工程の必要がないことが期せずして判明した。
【００２４】
用語「スパイダーシルクタンパク質」は、本明細書に使用する場合、天然配列のみならず、天然配列から由来するすべての人工すなわち合成配列も含む。
従って、スパイダーシルクシーケンスは、本明細書で「標準（オーセンティック）」と称される配列に由来し得る。ここで、用語「標準」とは、配列そのものに実質的な訂正を行わずに天然環境から基本の核酸配列が単離されることを意味する。起こることが許される唯一の修飾は、配列を宿主中で発現させるためにコードされたアミノ酸の配列を変化させずに標準核酸配列を修飾する場合である。好ましい配列はＮＲ３（配列番号１０、ＡＤＦ−３に由来）およびＮＲ４（配列番号１１、ＡＤＦ−４に由来）である。いずれの配列も、より効率的に翻訳するためには、大常勤では殆ど翻訳されないコドンＡＧＡ（Ａｒｇ）をＰＣＲ突然変異誘発を使用してＣＧＴ（Ａｒｇ）に変化させた。
【００２５】
標準の非反復配列は、好ましくは天然スパイダーシルクタンパク質のアミノ末端の非反復領域（鞭毛タンパク質）およびカルボキシ末端の非反復領域（鞭毛および引き綱タンパク質）の少なくとも一方に由来するものである。そのようなタンパク質の例を以下に示す
。
【００２６】
さらなる実施形態によれば、標準非反復配列は、天然スパイダーシルクタンパク質のアミノ末端の非反復領域（鞭毛タンパク質）およびカルボキシ末端の非反復領域（鞭毛および引き綱タンパク質）の少なくとも一方に由来するものである。
【００２７】
鞭毛タンパク質の好ましい標準配列はＦｌａｇＮ−ＮＲ（配列番号３１および３２）およびＦｌａｇＣ−ＮＲ（配列番号３３および３４）のアミノ酸配列および核酸配列である。
【００２８】
本発明の組換えスパイダーシルクタンパク質は、一般に、クモの主要アンプル腺由来のクモ引き綱タンパク質および鞭毛腺由来のタンパク質のうちの少なくとも一方から得られ得る。
【００２９】
１実施形態によれば、本発明で一般に使用することができる組換え（合成／人工）スパイダーシルクタンパク質は、一般に、クモの主要アンプル腺由来のクモ引き綱タンパク質および鞭毛腺由来のタンパク質のうちの少なくとも一方から得られ得る。
【００３０】
一般に、円網性種のクモ（ＡｒａｎｅｉｄａｅおよびＡｒａｎｅｏｉｄｓ）の引き綱タンパク質または鞭毛タンパク質から引き綱および／または鞭毛配列を選択することが好ましい。
【００３１】
より好ましくは、引き綱タンパク質および／または鞭毛状のタンパク質は、以下の１または複数のクモに由来する：Ａｒａｃｈｎｕｒａ  ｈｉｇｇｉｎｓｉ、Ａｒａｎｅｕｓ  ｃｉｒｃｕｈｓｓｐａｒｓｕｓ、Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ、Ａｒｇｉｏｐｅ  ｐｉｃｔａ、Ｂａｎｄｅｄ  Ｇａｒｄｅｎ  Ｓｐｉｄｅｒ(Ａｒｇｉｏｐｅ  ｔｎｆ
ａｓｃｉａｔａ)、Ｂａｔｉｋ  Ｇｏｌｄｅｎ  Ｗｅｂ  Ｓｐｉｄｅｒ(Ｎｅｐｈｉｌａ  ａｎｔｉｐｏｄｉａｎａ)、Ｂｅｃｃａｒｉ'ｓ  Ｔｅｎｔ  Ｓｐｉｄｅｒ(Ｃｙｒｔｏｐ
ｈｏｒａ  ｂｅｃｃａｒｉｉ)、Ｂｉｒｄ−ｄｒｏｐｐｉｎｇ  Ｓｐｉｄｅｒ(Ｃｅｌａｅｎｉａ  ｅｘｃａｖａｔａ)、Ｂｌａｃｋ−ａｎｄ−Ｗｈｉｔｅ  Ｓｐｉｎｙ  Ｓｐｉｄ
ｅｒ(Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ  ｋｕｈｌｕ)、Ｂｌａｃｋ−ａｎｄ−ｙｅｌｌｏｗ  Ｇａｒｄｅｎ  Ｓｐｉｄｅｒ(Ａｒｇｉｏｐｅ  ａｕｒａｎｔｉａ)、Ｂｏｌａｓ  Ｓｐｉｄｅｒ(Ｏｒｄｇａｒｕｓ  ｆｕｒｃａｔｕｓ)、Ｂｏｌａｓ  Ｓｐｉｄｅｒｓ  −Ｍａｇｎｉｆｉｃｅｎｔ  Ｓｐｉｄｅｒ(Ｏｒｄｇａｒｕｓ  ｍａｇｎｉｆｉｃｕｓ)、Ｂｒｏｗｎ  Ｓａｉｌｏｒ  Ｓｐｉｄｅｒ(Ｎｅｏｓｃｏｎａ  ｎａｕｔｉｃａ)、Ｂｒｏｗｎ−Ｌｅｇｇｅｄ  Ｓｐｉｄｅｒ(Ｎｅｏｓｃｏｎａ  ｒｕｆｏｆｅｍｏｒａｔａ)、Ｃａｐｐｅｄ  Ｂｌａｃｋ−Ｈｅａｄｅｄ  Ｓｐｉｄｅｒ(Ｚｙｇｉｅｌｌａ  ｃａｌｙｐｔｒａｔ
ａ)、Ｃｏｍｍｏｎ  Ｇａｒｄｅｎ  Ｓｐｉｄｅｒ(Ｐａｒａｗｉｘｉａ  ｄｅｈａａｎｉ)、Ｃｏｍｍｏｎ  Ｏｒｂ  Ｗｅａｖｅｒ(Ｎｅｏｓｃｏｎａ  ｏｘａｎｃｅｎｓｉｓ)、
Ｃｒａｂ−ｌｉｋｅ  Ｓｐｉｎｙ  Ｏｒｂ  Ｗｅａｖｅｒ(Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ
ｃａｎｃｒｉｆｏｒｍｉｓ(ｅｈｐｓｏｉｄｅｓ))、Ｃｕｒｖｅｄ  Ｓｐｉｎｙ  Ｓｐ
ｉｄｅｒ(Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ  ａｒｃｕａｔａ)、Ｃｙｒｔｏｐｈｏｒａ  ｍｏｌｕｃｃｅｎｓｉｓ、Ｃｙｒｔｏｐｈｏｒａ  ｐａｒｎａｓｉａ、Ｄｏｌｏｐｈｏｎｅｓ
ｃｏｎｉｆｅｒａ、Ｄｏｌｏｐｈｏｎｅｓ  ｔｕｒｒｉｇｅｒａ、Ｄｏｎａ'ｓ  Ｓｐ
ｉｎｙ  Ｓｐｉｄｅｒ(Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ  ｄｏｎａｅ)、Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｐｏｔｔｅｄ  Ｓｐｉｎｙ  Ｓｐｉｄｅｒ(Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ  ｍａｍｍｏｓａ)、Ｄｏｕｂｌｅ−Ｔａｉｌｅｄ  Ｔｅｎｔ  Ｓｐｉｄｅｒ(Ｃｙｒｔｏｐｈｏｒａ  ｅｘ
ａｎｔｈｅｍａｔｉｃａ)、Ａｃｕｌｅｐｅｎａ  ｃｅｒｏｐｅｇｉａ、Ｅｒｉｏｐｈｏ
ｒａ  ｐｕｓｔｕｌｏｓａ、Fｌａｔ  Ａｎｅｐｓｉｏｎ(Ａｎｅｐｓｉｏｎ  ｄｅｐｒｅｓｓｉｕｍ)、Fｏｕｒ−ｓｐｉｎｅｄ  Ｊｅｗｅｌ  Ｓｐｉｄｅｒ(Ｇａｓｔｅｒａｃａ
ｎｔｈａ  ｑｕａｄｒｓｐｉｎｏｓａ)、Ｇａｒｄｅｎ  Ｏｒｂ  Ｗｅｂ  Ｓｐｉｄｅｒ(Ｅｒｏｐｈｏｒａ  ｔｒａｎｓｍａｎｎａ)、Ｇｉａｎｔ  Ｌｉｃｈｅｎ  Ｏｒｂｗｅａ
ｖｅｒ(Ａｒａｎｅｕｓ  ｂｉｃｅｎｔｅｎａｎｕｓ)、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｗｅｂ  Ｓｐｉｄｅｒ(Ｎｅｐｈｉｌａ  ｍａｃｕｌａｔａ)、Ｈａｓｓｅｌｔ'ｓ  Ｓｐｉｎｙ  Ｓｐｉｄ
ｅｒ(Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ  ｈａｓｓｅｌｔｎ)、Ｔｅｇｅｎａｎａ  ａｔｎｃａ、Ｈｅｕｒｏｄｅｓ  ｔｕｒｎｔａ、Ｉｓｌａｎｄ  Ｃｙｃｌｏｓａ  Ｓｐｉｄｅｒ(Ｃ
ｙｃｌｏｓａ  ｉｎｓｕｌａｎａ)、Ｊｅｗｅｌ  ｏｒ  Ｓｐｉｎｙ  Ｓｐｉｄｅｒ(Ａｓｔｒａｃａｎｔｈａ  ｍｉｎａｘ)、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｇａｒｄｅｎ  Ｓｐｉｄｅｒ(Ａｒａｎｅｕｓ  ｍｉｔｉｆｉｃｕｓ)、Ｌａｇｌａｉｓｅ'ｓ  Ｇａｒｄｅｎ  Ｓｐｉｄｅｒ(
Ｅｒｉｏｖｉｘｉａ  ｌａｇｌａｉｓｅｉ)、Ｌｏｎｇ−Ｂｅｌｌｉｅｄ  Ｃｙｃｌｏｓ
ａ  Ｓｐｉｄｅｒ(Ｃｙｃｌｏｓａ  ｂｉｆｉｄａ)、Ｍａｌａｂａｒ  Ｓｐｉｄｅｒ(Ｎ
ｅｐｈｉｌｅｎｇｙｓ  ｍａｌａｂａｒｅｎｓｉｓ)、Ｍｕｌｔｉ−Ｃｏｌｏｕｒｅｄ  
Ｓｔ  Ａｎｄｒｅｗ'ｓ  Ｃｒｏｓｓ  Ｓｐｉｄｅｒ(Ａｒｇｉｏｐｅ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ)、Ｏｒｎａｍｅｎｔａｌ  Ｔｒｅｅ−Ｔｒｕｎｋ  Ｓｐｉｄｅｒ(Ｈｅｒｅｎｎｉａ
ｏｒｎａｔｉｓｓｉｍａ)、Ｏｖａｌ  Ｓｔ  Ａｎｄｒｅｗ'ｓ  Ｃｒｏｓｓ  Ｓｐｉｄｅｒ(Ａｒｇｉｏｐｅ  ａｅｍｕｌａ)、Ｒｅｄ  Ｔｅｎｔ  Ｓｐｉｄｅｒ(Ｃｙｒｔｏｐ
ｈｏｒａ  ｕｎｉｃｏｌｏｒ)、Ｒｕｓｓｉａｎ  Ｔｅｎｔ  Ｓｐｉｄｅｒ(Ｃｙｒｔｏｐｈｏｒａ  ｈｉｒｔａ)、Ｓａｉｎｔ  Ａｎｄｒｅｗ'ｓ  Ｃｒｏｓｓ  Ｓｐｉｄｅｒ(Ａ
ｒｇｉｏｐｅ  ｋｅｙｓｅｒｈｎｇｉ)、Ｓｃａｒｌｅｔ  Ａｃｕｓｉｌａｓ(Ａｃｕｓｉｌａｓ  ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ)、Ｓｉｌｖｅｒ  Ａｒｇｉｏｐｅ(Ａｒｇｉｏｐｅ  ａｒｇｅｎｔａｔａ)、Ｓｐｉｎｙｂａｃｋｅｄ  Ｏｒｂｗｅａｖｅｒ(Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ  ｃａｎｃｒｉｆｏｒｍｉｓ)、Ｓｐｏｔｔｅｄ  Ｏｒｂｗｅａｖｅｒ(Ｎｅｏｓｃｏｎａ  ｄｏｍｉｃｉｈｏｒｕｍ)、Ｓｔ  Ａｎｄｒｅｗｓ  Ｃｒｏｓｓ(Ａｒｇｉｏｐｅ  ａｅｔｈｅｒｉａ)、Ｓｔ  Ａｎｄｒｅｗ'ｓ  Ｃｒｏｓｓ  Ｓｐｉｄｅｒ(Ａｒｇｉｏｐ
ｅ  Ｋｅｙｓｅｒｈｎｇｉ)、Ｔｒｅｅ−Ｓｔｕｍｐ  Ｓｐｉｄｅｒ(Ｐｏｌｔｙｓ  ｌｌｌｅｐｉｄｕｓ)、Ｔｒｉａｎｇｕｌａｉ  Ｓｐｉｄｅｒ(Ａｒｋｙｓ  ｃｌａｖａｔｕｓ)、Ｔｒｉａｎｇｕｌａｒ  Ｓｐｉｄｅｒ(Ａｒｋｙｓ  ｌａｎｃｅａｒｕｓ)、Ｔｗｏ−
ｓｐｉｎｅｄ  Ｓｐｉｄｅｒ(Ｐｏｅｃｉｌｏｐａｃｈｙｓ  ａｕｓｔｒａｌａｓｉａ)、Ｎｅｐｈｉｌａ  ｓｐｅｃｉｅｓ、ｅ  ｇ  Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ、Ｎｅｐｈｉｌａ  ｓｅｎｅｇａｌｅｎｓｉｓ、Ｎｅｐｈｉｌａ  ｍａｄａｇａｓｃａｒｅｎｓｉｓおよびその他多数 (さらなるクモの種については以下も参照のこと)。最も好ましくは
、引き綱タンパク質はＡｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来のものであり、鞭毛タンパク質はＮｅｐｈｉｌａ  Ｃｌａｖｉｐｅｓ由来のものである。
【００３２】
本発明の文脈では、組換えスパイダーシルクタンパク質は１つの種に由来するタンパク質配列を含み得るだけでなく、例えば異なる複数のクモ種に由来する配列も含み得ることが明らかである。例えば、１または複数の合成反復スパイダーシルクタンパク質配列は、ある１つの種に由来するものであるが、１または複数の標準非反復スパイダーシルクタンパク質配列は別の種に由来するものであってよい。さらに、例えば、異なる種類は異なる種に由来する１種類よりも多くの反復配列を含む組換えスパイダーシルクタンパクを設計することも可能である。
【００３３】
１つの好ましい実施形態によれば、引き綱タンパク質は、野生型ＡＤＦ−３、ＡＤＦ−４、ＭａＳｐ  Ｉ、ＭａＳｐ  ＩＩであり、鞭毛タンパク質はＦＬＡＧである。ＡＤＦ−３／−４という用語はＡｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓにより生産されたＭａＳｐタンパク質（Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ  フィブロイン−３／−４）を指すものとして使用される。ＡＤＦ−３および−４のいずれのタンパク質もＭａＳｐ  ＩＩタンパク質（主要アンプルｓｐｉｄｒｏｉｎ  ＩＩ）のクラスに属する。
【００３４】
さらなる実施形態では、提供される核酸配列はＡＤＦ−３（配列番号１）およびＡＤＦ
−４（配列番号２）のうちの少なくとも一方、またはその変異型である。
２つの異なる種類のＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４コード配列およびタンパク質、すなわち第１にＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４の既に公表されている配列（本明細書では「野生型」配列と称する）および第２に配列番号１（ＡＤＦ−３）および２（ＡＤＦ−４）によりコードされた同配列の変異型、が本発明で想定されることに留意する。野生型については既に公表されており、受入番号Ｕ４７８５５およびＵ４７８５６（配列番号８および９）の下、利用可能である。
【００３５】
本発明に（単独でまたはさらなるタンパク質と組み合わせて）使用可能なさらなるスパイダーシルクタンパク質とそのデータベース受入番号は以下の通りである。
ｓｐｉｄｒｏｉｎ  ２［Ａｒａｎｅｕｓ  ｂｉｃｅｎｔｅｎａｒｉｕｓ］ｇｉ  ２９１１２７２
主要アンプル腺引き綱シルクタンパク質−１［Ａｒａｎｅｕｓ  ｖｅｎｔｒｉｃｏｓｕｓ］ｇｉ  ２７２２８９５７
主要アンプル腺引き綱シルクタンパク質−２［Ａｒａｎｅｕｓ  ｖｅｎｔｒｉｃｏｓｕｓ］ｇｉ  ２７２２８９５９
アンプルｓｐｉｄｒｏｉｎ  １［Ｎｅｐｈｉｌａ  ｍａｄａｇａｓｃａｒｉｅｎｓｉｓ］ｇｉ  １３５６２００６
主要アンプルｓｐｉｄｒｏｉｎ  １［Ｎｅｐｈｉｌａ  ｓｅｎｅｇａｌｅｎｓｉｓ］ｇｉ
１３５６２０１０
主要アンプルｓｐｉｄｒｏｉｎ  １［Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ  ｇｅｏｍｅｔｒｉｃｕｓ］ｇｉ  １３５６１９９８
主要アンプルｓｐｉｄｒｏｉｎ  １［Ａｒｇｉｏｐｅ  ｔｒｉｆａｓｃｉａｔａ］ｇｉ  １３５６１９８４
主要アンプルｓｐｉｄｒｏｉｎ  １［Ａｒｇｉｏｐｅ  ａｕｒａｎｔｉａ］ｇｉ１３５６１９７６
引き綱シルクタンパク質ｓｐｉｄｒｏｉｎ  ２［Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖａｔａ］ｇｉ
１６９７４７９１
主要アンプルｓｐｉｄｒｏｉｎ  ２［Ｎｅｐｈｉｌａ  ｓｅｎｅｇａｌｅｎｓｉｓ］ｇｉ
１３５６２０１２
主要アンプルｓｐｉｄｒｏｉｎ  ２［Ｎｅｐｈｉｌａ  （ゴケグモ属、ｇｅｏｍｅｔ、ｒｉ）ｃｕｓ］  ｇｉ  １３５６２００２
別の好ましい実施形態によれば、鞭毛タンパク質は、配列番号６（Ｆｌａｇ−Ｎ）および配列番号７（Ｆｌａｇ−Ｃ）のうちの少なくとも一方、またはその変異型である。
【００３６】
しかしながら、既に公知の公表された鞭毛配列、特に以下のものを使用してもよい。
鞭毛シルクタンパク質  部分ｃｄｓ［Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ］ｇｉ  ２８３３６４６
鞭毛シルクタンパク質  部分ｃｄ［Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ］ｇｉ  ２８３３６４８
１つの好ましい実施形態では、組換えスパイダーシルクタンパク質は、１または複数のポリアラニン含有コンセンサス配列を含む１または複数の合成反復配列を含む。そのようなポリアラニン配列は６〜９個のアラニン残基を備え得る。例えば、６個のアラニン残基からなる数個のポリアラニンモチーフを有する配列番号１を参照されたい。
【００３７】
好ましくは、ポリアラニン含有コンセンサス配列はＡＤＦ−３に由来し、ＡＤＦ−３のアミノ酸配列（モジュールＡ）またはその変異型を有する。モジュールＡは６個のアラニン残基を有するポリアラニンを含む。ＡＤＦ−４に由来する更に好ましいポリアラニン含有コンセンサス配列は、８個のアラニン残基を含むモジュールＣ（配列番号５）である。
【００３８】
さらに好ましい実施形態によれば、本発明の組換えスパイダーシルクタンパク質では、合成反復配列がＡＤＦ−３に由来し、配列番号４（モジュールＱ）またはその変異型のアミノ酸配列の１または複数の反復を含む。
【００３９】
より一般的に言うと、合成反復配列は一般モチーフＧＧＸまたはＧＰＧＸＸ（すなわちグリシンリッチな領域）をさらに含んでもよい。上述したように、そのような涼気はタンパク質に可撓性を与え、従って、上記モチーフを含む組換えスパイダーシルクタンパク質から形成された糸に可撓性を与えるだろう。
【００４０】
本発明に使用される合成反復配列の特定のモジュールは互いに結合し合うことも可能であることに留意する。すなわち、ＡとＱ、ＱとＣ等を組み合わせたモジュール（反復ユニット）も本発明に包含される。スパイダーシルクタンパク質に導入されるモジュールの数は限定されないが、組換えタンパク質ごとに、５−５０モジュール、好ましくは１０−４０モジュール、最も好ましくは１５−３５モジュールの合成反復配列のモジュール数を使用することが好ましい。
【００４１】
合成反復配列は好ましくは反復ユニットとして１または複数の（ＡＱ）および／または（ＱＡＱ）を含む。さらにより好ましくは、合成反復配列は（ＡＱ）12、（ＡＱ）24、（ＱＡＱ）8、（ＱＡＱ）16である。
【００４２】
合成反復配列がＡＤＦ−４に由来する場合は常に、上述したように、合成反復配列は好ましくは配列番号５（モジュールＣ）またはその変異型のアミノ酸配列の１または複数の反復を含み、合成反復配列全体はＣ16またはＣ32である。
【００４３】
本発明の完全型組換えスパイダーシルクタンパク質の好ましい実施形態は、（ＱＡＱ）8ＮＲ３、（ＱＡＱ）16ＮＲ３、（ＡＱ）12ＮＲ３、（ＡＱ）24ＮＲ３、Ｃ16ＮＲ４およ
びＣ32ＮＲ４、すなわち上述の配列を含むか上述の配列から成るタンパク質である。
【００４４】
（Ａ、ＱおよびＣ系を用いた）合成反復配列の上記形態が、上記に開示したすべての他の反復ユニットにも当てはまることに留意する。例えば、すべてのポリアラニン含有配列はＡおよび／またはＣを取り入れ、すべてのグリシンリッチ配列はＱとして使用されてもよい。
【００４５】
鞭毛配列由来の合成反復配列の新たなモジュールは、モジュールＫ（配列番号３５および３６）、ｓｐ（配列番号３７および３８）、Ｘ（配列番号３９および４０）およびＹ（配列番号４１および４２）である。
【００４６】
さらに、合成反復配列は好ましくは、Ｙ8、Ｙ16、Ｘ8、Ｘ16、Ｋ8、Ｋ16を含むか、ま
たはそれらから成る。さらに、ＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４に由来するこれらの配列とＦｌａｇとを一つの組換え配列に組み合わせることも可能である。
【００４７】
しかしながら、本発明では、ＡＤＦ−４配列およびＣ16、Ｃ16ＮＲ４、Ｃ32および／またはＣ32ＮＲ４を含むそれらの誘導体から成る群の配列から選択されるか同配列を含む工程ａ）のスパイダーシルクタンパク質を使用することが強く好まれる。
【００４８】
本発明では、スパイダーシルクタンパク質が、カプセルを製造する前又は後に、一つのアミノ酸置換または直接化学的修飾を含むようさらに遺伝子組み換えされてもよい。この組み換え技術を使用して、バッグへ特異的結合親和性を導入したり、プロテアーゼ特異的アミノ酸配列を導入したりすることができる。これにより、シルク膜のタンパク質消化により、カプセルに入れられた物質が制御放出され得る。
【００４９】
例えばシステインを導入することにより、バッグの活況または異なる官能基の共有結合が達成される。例えば、スパイダーシルクタンパク質中の１または複数のアミノ酸をコードする核酸配列をコードするリジンまたはシステインにより置換するか、リジンおよび／またはシステインをコードする拡散を含む核酸配列を上記配列に加えることにより、これが達成され得る。
【００５０】
さらに、カプセルと特定の細胞または組織に向けるために、ナノまたはマイクロカプセルの形成前か形成後に、スパイダーシルクタンパク質に作用薬をつなげてもよい。これは、例えば特異的ＲＧＤ配列の導入または共有結合により達成することができる、このように、ＲＧＤペプチドをナノまたはマイクロカプセルの形成前か形成後に、スパイダーシルクタンパク質に架橋することができる。環状ＲＧＤ分子の実施例が図１０に示される。
【００５１】
さらに、カプセルを特定の目標に向けるために、細胞または組織特異的抗体および細胞または組織特異的受容体を、スパイダーシルクタンパク質につなげてもよい。
さらなる実施形態によれば、工程ｂ）の溶媒および／または少なくとも１つのさらなる相の溶媒は、親水性溶媒、好ましくは水およびアルコール（例えばエタノールおよびグリセリン）、または親油性溶媒、好ましくは天然油（例えば植物油または動物油）、合成油（例えばミグリオールおよびシリコーン油）、芳香族炭化水素（例えばトルエン、ベンゼン）などの有機溶媒から選択される。
【００５２】
溶媒が実質的に同一である限り、一つの相が１つよりも多くの溶媒を含んでも良い（すなわち混合物）。「実質的に同一」とは、複数の溶媒が同様な溶解度特性を有するため、ただ一つの共通の相しか形成しないことを意味する。従って、「実質的に同一の」溶媒とは、溶媒が混合された場合に別々の相を観察することができない溶媒を含む。例えば、２またはそれより多くの親油性溶媒を１つの相に組み合わせることが可能であり、例えば、植物油（例えばオリーブ油およびヒマシ油）と、ミグリオールおよびヘキサデカンのうちの少なくとも一方とを組み合わせ得る。あるいは、代替案として、親水性相は例えば水、グリセリン等の２つ以上の親水性成分を含んでもよい。
【００５３】
上述したように、必要とされるのは、本発明のナノおよびマイクロカプセルを製造するエマルジョン系が実質的に互いに非混和な少なくとも２つの相を有することである。
本発明の方法の工程ｃ）では、例えばＷ／Ｏ、Ｏ／Ｗ、Ｏ／Ｗ／ＯまたはＷ／Ｏ／Ｗ型のすべての既知のエマルジョンタイプを使用することが可能である。これらのエマルジョンの種類は当該技術分野において周知であり、さらに詳しい情報については例えば「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，ペンシルベニア州イーストン、最新版または別の利用可能な情報を参照されたい。
【００５４】
本発明のエマルジョンを形成するための好ましい方法は、ミニエマルジョンを生産することである。ミニエマルジョンは、油、水、界面活性剤、および疎水性物質を含む系を剪断するように切ることで５０〜５００  ｎｍの間のサイズを備えた大いに安定した油小滴の分散物である。そのようなミニエマルジョン中の重合は、注意深く調製された時、最初の小滴とほぼ同じサイズを有する粒子を生じさせる。このことは、ミニエマルジョンを適切に調製すると小滴の合体またはオストワルド熟成が抑制されることを意味する。ミニエマルジョンの調製は超音波ホモジナイザーおよび高圧ホモジナイザー等の高剪断装置により行われる。Ｋ．Ｌａｎｄｆｅｓｔｅｒおよびその協同研究者の種々の刊行物が参照される。
【００５５】
Ｗ／Ｏ型のエマルジョンの場合、Ｗ（親水）相はエマルジョン小滴を形成しており、こ
の場合、Ｗ相にスパイダーシルクタンパク質が含まれている。Ｏ相は親油性であり、連続相を形成する。
【００５６】
Ｏ／Ｗ型のエマルジョンの場合、Ｏ（親油性）相がエマルジョン小滴を形成しており、この場合、Ｏ相にスパイダーシルクタンパク質が含まれている。Ｗ相は親水性であり、連続相を形成する。
【００５７】
上記のエマルジョンに使用される界面活性は、医薬および関連する化学の分野で利用可能な知識に基づいて当業者が利用する化合物から選択可能である。本エマルジョンを得る際に使用される界面活性剤の選択例は、グリセリン、ソルビトールおよび他の多官能アルコールの脂肪酸エステル、好ましくはモノステアリン酸グリセリン、モノラウリル酸ソルビタン；モノオレイン酸ソルビタン；ポリオオキシアミン；ポリオキシエチレンエーテルポリオキシエチレンエステル；エトキシ化トリグリセリド；エトキシ化フェノールおよびエトキシ化ジフェノール；脂肪酸の金属塩；高級アルコール硫酸エステル塩の金属塩、すなわちラウリル硫酸ナトリウム；およびスルホコハク酸の金属塩〉；ポリソルベート、より好ましくはポリソルベート２０、４０、６０および８０；ポロキサマー、ポリオキシエチレンエチレングリコール；および上記物質の混合物である。
【００５８】
しかしながら、界面活性物質の使用は本発明の本質的特徴でないことに留意する。当業者には界面活性剤を必要としないエマルジョン系が理解される。
本発明の好ましい実施形態では、工程ｂ）で使用される溶媒は１または複数の薬剤、化粧剤、栄養素、または食品添加物をさらに含む。すなわち、スパイダーシルクタンパク質をも含む層には追加の成分が通常存在する。この場合、１または複数の成分／因子は相の界面に形成されたポリマーネットワークへとカプセル化される。
【００５９】
代わりに、上記作用薬を、スパイダーシルクタンパク質を含まない連続相に加えることも可能である。この場合、本発明のナノおよびマイクロカプセルはかかる作用薬によりコーティングされるだろう。
【００６０】
さらに別の例として、作用薬は本発明のナノおよびマイクロカプセルが得られた後で同ナノおよびマイクロカプセルに導入されてもよい。
これは、膜を特定の溶媒で膨潤させ、カプセルに入れられた物質（有効剤）をその内部で核酸させることにより成され得る。膨潤は温度、圧力によっても成され、あるいは溶剤だけでなく他の化学的手段（化学剤、ｐＨ等）によっても成され得る。
【００６１】
カプセルに入れられた物質を膜に組み込むこともまた可能である。この手法により、カプセル化物質を、膜の中に包むよりも修正または改良された放出特性を与え得る。
発明のナノおよびマイクロカプセルに追加的に組み込まれる作用薬の種類は如何様にも限定されない。
【００６２】
例えば薬剤には、鎮痛剤；催眠剤および鎮静剤；うつ病および精神分裂病等の精神障害の治療薬；抗癲癇薬および抗痙攣薬；パーキンソン病ならびにハンチントン舞踏症、老化およびアルツハイマー病の治療薬；ＣＮＳ外傷または脳卒中の治療薬；依存症および薬物乱用の治療薬；寄生虫感染および微生物により引き起こされる疾病の化学療法剤；免疫抑制物質および抗癌剤；ホルモンおよびホルモン拮抗薬；非金属有毒物質の拮抗薬；癌治療用の細胞静止薬；医学の分野で使用される診断物質；免疫活性および免疫反応剤；抗生物質；鎮痙薬；抗ヒスタミン剤、制嘔吐剤；弛緩剤；刺激薬；大脳拡張薬；向精神薬；血管拡張薬および収縮薬；抗高血圧薬；偏頭痛治療薬；睡眠薬；高血糖および低血糖薬；抗喘息薬；抗ウィルス剤；およびまたそれらの混合物が含まれる。
【００６３】
栄養素および食品添加物は、ビタミン（アスコルビン酸、酢酸トコフェロール等）、ミネラル（カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム等）、微量元素（セレン）、天然資源のエキス、天然油（魚油）等から選択され得る。
【００６４】
化粧剤は、例えば酢酸トコフェロール、天然または合成の油、パンテノール、植物エキス、ＵＶ吸収剤、殺菌剤、抗炎症剤、撥水剤から選択され得る。
上記の作用薬は溶媒中で溶解された形、懸濁された形、または固形の形で存在してよい。固形の形式の場合、本発明のスパイダーシルクタンパク質によってコーティングされた固形のコアが与えられる。
【００６５】
好ましい実施形態では、工程ｅ）のポリマーネットワークの分離は遠心または工程ｃ）で形成されたエマルジョンを破壊して一相の溶液を形成することにより成される。しかしながら、エマルジョン系から本発明のナノおよびマイクロカプセルを分離するために、他の方法を用いてもよい。
【００６６】
工程ｂ）−ｅ）で使用される温度は５−４０℃、好ましくは１０−３０、より好ましくは室温である。工程ｂ）−ｅ）で使用されるｐＨは好ましくは３−９、好ましくは５−８、より好ましくは７である。
【００６７】
エマルジョン小滴およびそれから得られるナノおよびマイクロパーティクルのサイズは好ましくは１０ｎｍ〜４０μｍ、好ましくは５００ｎｍ〜１０μｍの間、最も好ましくは５μｍである。得られたナノおよびマイクロカプセルの壁厚は好ましくは５〜１００ｎｍ、より好ましくは１０〜７０ｎｍである（例えば図５参照）。
【００６８】
第２態様では、本発明は上記に開示した方法により得られるナノおよびマイクロカプセルを提供する。
本発明の第３態様は、上述のナノおよびマイクロカプセルと、１または複数の医薬として許容される担体とを含有する医薬組成物を対象とする。従って好ましくは、本発明の活性成分はそのような医薬組成物において許容される担体と混合した状態で弛緩が治療または少なくとも緩和されるような用量で使用される。そのような組成物は、活性成分および担体に加えて、充填剤、塩類、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、および当該技術分野で周知の他の物質を含有し得る。
【００６９】
「医薬として許容される」という用語は、活性成分の生物活性の有効性に干渉しない非毒性の物質として定義される。
医薬組成物は活性成分の活性を増強するか、または治療を補足する追加の成分を含有してもよい。そのような追加の成分および／または因子は相乗効果を達成するか、副作用または望ましくない作用を最小限にするための医薬組成物の一部であり得る。
【００７０】
本発明の化合物を製剤化、調製、および適用、投薬するための方法は「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，ペンシルベニア州イーストン、最新版（前述）に公表されている。適当な適用には口内適用、皮膚適用、または経粘膜適用や、非経口適用、例えば筋内注射、皮下注射、髄内注射、ならびにくも膜下注射、直接脳内痛者、静脈内注射、服腔内注射、または鼻内注射が含まれる。
【００７１】
第４態様では、本発明は上記に開示したナノおよびマイクロカプセルを含有する化粧品または食品を提供する。
本明細書で言及した刊行物、特許出願、特許、および他の文献はすべてその全体が参照により組み込まれる。矛盾がある場合には、定義を含めて本明細書が優先される。さらに
、材料、方法および実施例は例示であって、限定的なものではない。
【００７２】
実施例
タンパク質製剤
スパイダーバルーンを形成するタンパク質溶液を、まず、組換えスパイダー引き綱シルクタンパク質（Ｃ16、Ｈｕｅｍｍｅｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００４参照）を６Ｍ  グアニジンチオシアネートに１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解することにより調製した。タンパク質溶液を４℃まで冷却し、１４ｋＤａの分子量カットオフ値のＣａｒｌ  Ｒｏｔｈ社の透析チューブを用いて１０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファ（ｐＨ８．０）に対し一晩タンパク質溶液を透析することにより、グアニジンチオシアネートの濃度を１ｍＭよりも低くなるよう減小させた。透析溶液を溶液温度を４℃に保ちつつ１００，０００×ｇの力で３０分間遠心することにより、分散していないタンパク質を除去した。２７６ｎｍ波長で０．８５９のタンパク質吸光係数を使用してＵＶ吸収を用いて最終的なタンパク質濃度を決定した。
マイクロカプセルの形成
５μｌの透析したタンパク質懸濁液を３００μｌのトルエンに９０秒間乳化することにより、スパイダーシルクのマイクロカプセルを形成した（図２Ａ）。乳化中、シルクタンパク質は吸着し、エマルジョン小滴の表面で自身の構造のコンホメーションを変化させ、これによってエマルジョン小滴をカプセルに入れるポリマーネットワークが生じた（図２Ｂ）。１〜６ｍｇ／ｍｌの濃度のタンパク質懸濁液を用いて２０秒という短い乳化時間でスパイダーシルクマイクロカプセルを形成した。形成されたマイクロカプセルのサイズはエマルジョン小滴のサイズに依存していた。
【００７３】
一旦形成されると、エマルジョン小滴を包囲するタンパク質は２つの相からなるエマルジョンから一つの相からなる溶液へと移動された。タンパク質シェルを移動させるのには２つの異なる方法が有効である。第１の方法では３００μｌの水をトルエンに加え、水溶性副層を形成した。水滴を包囲するタンパク質外殻を１００×ｇの力で４分間、トルエン層から水溶性の副層へと遠心した（図２Ｃ）。第２の方法ではトルエンと水を安定化させるために３００μｌのエタノールを２つの相からなるエマルジョンに添加することにより１つの相からなる溶液を形成した（図２Ｄ）。マイクロカプセルを１つの相からなる溶液へ移動させるいずれかの方法を用いた後、光学顕微鏡を用いて生じた構造を調べた（図３）。
【００７４】
その構造が主としてランダムコイルである可溶性Ｃ16と異なり、組み立てられたタンパク質はβ−シートリッチなコンホメーションを有する。組み立てた時のこのＣ16のコンホメーションの変化は赤外顕微鏡を用いて観察した。最初に、Ｄ2Ｏに溶解させたＣ16は、
ランダムコイル構造をしたタンパク質にとって特徴的なことに、１６４５ｃｍ-1で光を吸収した（図６）。マイクロカプセルの形成後、吸収スペクトルに２つの肩が現れたが、これはＣ16の二次構造の変化を示している。スペクトル解析によれば、１６２１ｃｍ-1、１６４２ｃｍ-1、１６６１ｃｍ-1および１６８３ｃｍ-1の４つのガウスピークの寄与が明らかである。
【００７５】
遠心されたマイクロカプセル様外からの完全性は、乳化前にタンパク質溶液にＦＩＴＣ標識した５００ｋＤａデキストラン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えることにより確認された。乳化および遠心後、形成されたマイクロカプセル様構造は蛍光を発し続けたが、これはマイクロカプセル様構造のタンパク質外殻が遠心中に破れなかったことを示している（図４）。マイクロカプセル膜は、高分子量デキストランのような大きな分子を捕捉することができるが、フルオレセインのような小分子は通過させる。遠心されたマイクロカプセルの外部に低分子量ＦＩＴＣ標識デキストランが加えられた場合、デキストランの一部は膜を通過してカプセルに入れる（図７Ａ）。デキストランは低分子量デキストラ
ン分子と高分子量デキストラン分子の両方を含む非定形の多分散性を有するため、低分子量デキストランの部分的進入が生じる（図７Ｂ）。その結果、膜は特定の分子量カットオフより低いデキストランを許可し、そのカットオフよりも大きいデキストランを排除する。マイクロカプセル内部の蛍光強度の量の測定により、およびゲル浸透クロマトグラフィにより測定されるようなデキストランの蛍光分子量分布（図７Ｂ）の使用により、膜の分子量カットオフは決定された。１３の異なるサンプル中の５２個の異なるマイクロカプセルの浸透性を測定した。これらのマイクロカプセルの分子量カットオフは０．３ｋＤａから６．０ｋＤａに及び、平均分子量カットオフは２．２ｋＤａ（ｒg〜１８Å）であった
（図７Ｃ）。
【００７６】
酵素により誘起されるＦＩＴＣ標識デキストラン等の内容物の放出を、酵素プロテイナーゼＫを使用して実証した（図８）。プロテイナーゼＫの添加直後の蛍光の喪失により示されるように、マイクロカプセル膜の完全性は破壊され、デキストランが放出される。デキストランの放出後、完全な消化が１３±１分に起こるまで酵素はマイクロカプセルを消化し続ける。
【００７７】
マイクロカプセルの酵素による消化は、ペルオキソ二硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）およびＴｒｉｓ（２，２’−ビピリジニル）ジクロロルテニウム（ＩＩ）（Ｒｕｂｐｙ）を用いた光開始酸化によってＣ16を化学的に架橋することにより防止し得る。Ｃ16を化学的に架橋するためには、１０ｍＭ  ＡＰＳと１００ｍＭ  Ｒｕｂｐｙが遠心溶液に加えられ、混合物をタングステン電球からの光に５分間露出させることにより光開始される。この架橋によってＣ16マイクロカプセルはプロテイナーゼＫによる処理に対して安定になる。架橋後、架橋されたマイクロカプセルに１００μＭ  プロテイナーゼＫを添加すると、３７℃で一時間インキュベートした後でもカプセルの完全性に影響を及ぼさない。この挙動は、同じ条件でカプセルに入れられたデキストランをほぼ即時に放出する非架橋マイクロカプセルとは著しく異なる。
【００７８】
形成されたマイクロカプセルは、高度に弾性であることが観察される。マイクロカプセルの弾性力はＡＦＭでの圧縮により測定される。圧縮測定のために、３５μｍのガラス急を１０ｐＮ／ｎｍのばね定数を有するＡＦＭ片持ち梁に取り付け、１〜４μｍの範囲のサイズのマイクロカプセルについて力  対  変形  曲線を得た（図９）。変形が小さいところでは、加えた力ｆと生じた変形εとの間の関係が
【００７９】
【数１】
2009502492.tif 000002
【００８０】
により表される。
ここでｈは膜厚、Ｅはヤング係数、σはポアソン比、および前因子は次数１の定数である。使用されるシルクモノマーの最初の濃度から計算された最大のカプセル壁厚を使用し、かつポアソン比を０．５と仮定して、Ｅ＝０．７−３．６ＧＰａの間のヤング係数を有するようにマイクロカプセルを決定した。このカプセルは優れた化学的安定性をも示す。２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および８Ｍ尿素等のタンパク質変性剤の添加はカプセルの完全性に影響を及ぼさない。数週間このような条件下にあってマイクロカプセルは安定していることが観察された。
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Ｈｕｅｍｍｅｒｉｃｈ  Ｄ、Ｈｅｌｓｅｎ  ＣＷ、Ｑｕｅｄｚｕｗｅｉｔ  Ｓ、Ｏｓｃｈｍａｎｎ  Ｊ、Ｒｕｄｏｌｐｈ  Ｒ、Ｓｃｈｅｉｂｅｌ  Ｔ（２００４）Ｐｒｉｍａｒｙ
ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｓｐｉｄｅｒ  ｄｒａｇｌｉｎｅ  ｓｉｌｋｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：１３６０４−１２
Ｓｃｈｅｉｂｅｌ  Ｔ（２００４）  Ｓｐｉｄｅｒ  ｓｉｌｋｓ：ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｓｓｅｍｂｌｙ，ｓｐｉｎｎｉｎｇ，ａｎｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ  ３、１４
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１ａ】ＮａＣｌ濃度とｐＨの関数としてのペプトソームの流体力学半径ＲHの動的光散乱を示す。
【図１ｂ】ペプトソームと、コイルのペプチド部分のα−ヘリックス二次構造移行によるｐＨの関数としてのペプトソームのサイズの変化の略図。
【図２】スパイダーバッグ／バルーン形成プロセスの略図。（Ａ）水溶性タンパク質懸濁液がトルエン中に乳化されている（Ｂ）タンパク質が水−トルエンの界面に吸着し、変性してポリマーネットワークを形成する（挿入図）（Ｃ）一旦吸着されると、タンパク質ネットワークは遠心により水中に移動される。最終的なバッグ／バルーン構造は内側に水、外側に水を有する。（Ｄ）代わりに、一旦吸着されると、タンパク質ネットワークはエタノールの添加により一つの相からなる溶液へ移動され得る。
【図３Ａ】トルエン／エタノール（５０：５０）のスパイダーバッグ／バルーンの画像。
【図３Ｂ】水中に移動した後。
【図４Ａ】連続する水相へ移動した後のＦＩＴＣ標識デキストラン（分子量５００ｋＤａ）で満たされたスパイダーバッグ／バルーンの画像（Ａ）明視野像。
【図４Ｂ】連続する水相へ移動した後のＦＩＴＣ標識デキストラン（分子量５００ｋＤａ）で満たされたスパイダーバッグ／バルーンの画像（Ｂ）蛍光像。
【図５】ＳＥＭによりイメージングされた乾燥スパイダーバッグ／バルーンを示す。膜厚は７０ｎｍ未満であることが分かった。
【図６】マイクロカプセル形成前（一点鎖線）および形成後（実線）のＤ2ＯでのＩＲスペクトル。スペクトルのシフトはマイクロカプセル形成中のタンパク質の変化を示している。詳細には、このシフトはβシートの形成を示す。マイクロカプセルＩＲスペクトルの解析（ディコンボリューション）およびガウスフィットにより４つのピークが明らかとなる。解析ピークは、１６２１ｃｍ-1、１６４２ｃｍ-1、１６６１ｃｍ-1、および１６８３ｃｍ-1であり、それぞれがβ−シート、ランダムコイル構造およびβ−ターンの２つのピークに割り当てられる。
【図７Ａ】マイクロカプセルの浸透性測定。（Ａ）マイクロカプセルの外部に０．３％の４ｋＤａ  ＦＩＴＣデキストランを添加した、水中のマイクロカプセルのサンプル共焦画像のサンプル。デキストランの一部が膜に浸透する。
【図７Ｂ】マイクロカプセルの浸透性測定。（Ｂ）ＧＰＣ蛍光により測定されるデキストランの分子量分布。
【図７Ｃ】マイクロカプセルの浸透性測定。（Ｃ）５１個のマイクロカプセルの分子量カットオフヒストグラムの測定値。平均分子量カットオフは２．２ｋＤａである。
【図８】Ｃ16マイクロカプセルのプロテイナーゼＫ消化。上列；位相差画像。下列：蛍光画像。蛍光の喪失で示されるように、プロテイナーゼＫの添加直後にデキストランが放出される。マイクロカプセルの完全な消化の１３±１分後に生じる。
【図９】ＡＦＭにより測定された加えた力  対  マイクロカプセル変形。挿入図のグラフは、小変形（ε＜１％）中の線形の力の様式である。
【図１０】本発明で使用される環状ＲＧＤ分子の合成の最終工程。
【図６】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図７Ａ】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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