(57)【要約】  本発明は、非癌細胞ではなく癌細胞上に露出されたＥｐｈＡ２エピトープと選択的に結合する、親和性の向上した抗体に関する。本発明はさらに、癌（特に転移性の癌）の治療、管理、または予防のために開発された方法および組成物に関する。本発明はまた、１種以上の本発明のＥｐｈＡ２抗体を、単独でまたは癌治療に有用な１種以上の他の薬剤と組み合せて、含有する医薬組成物をも提供する。【選択図】図２
2009521219.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
2A4 (配列番号38)、2E7 (配列番号42)、または12E2 (配列番号46)の重鎖可変(VH)ドメインのアミノ酸配列を有するVHドメインを含んでなる、ヒトEphA2と特異的に結合するEphA2抗体。
【請求項２】
2A4 (配列番号40)、2E7 (配列番号44)、または12E2 (配列番号48)の軽鎖可変(VL)ドメインのアミノ酸配列を有するVLドメインを含んでなる、ヒトEphA2と特異的に結合するEphA2抗体。
【請求項３】
2A4 (配列番号40)、2E7 (配列番号44)、または12E2 (配列番号48)のVLドメインのアミノ酸配列を有するVLドメインをさらに含んでなる、請求項1に記載のEphA2抗体。
【請求項４】
2A4 (配列番号3-8)、2E7 (配列番号19-24)、または12E2 (配列番号27-32)の相補性決定領域(CDR)のアミノ酸配列を有するCDRを含んでなる、ヒトEphA2と免疫特異的に結合するEphA2抗体。
【請求項５】
2A4 (配列番号3-5)、2E7 (配列番号19-21)、または12E2 (配列番号27-29)のアミノ酸配列を有するVH CDRを含んでなる、請求項4に記載のEphA2抗体。
【請求項６】
2A4 (配列番号6-8)、2E7 (配列番号22-24)、または12E2 (配列番号30-32)のVL CDRのアミノ酸配列を有するVL CDRを含んでなる、請求項4に記載のEphA2抗体。
【請求項７】
2A4 (配列番号6-8)、2E7 (配列番号22-24)、または12E2 (配列番号30-32)のVL CDRのアミノ酸配列を有するVL CDRをさらに含んでなる、請求項5に記載のEphA2抗体。
【請求項８】
2A4 (配列番号3)、2E7 (配列番号19)、または12E2 (配列番号27)のVH CDRlのアミノ酸配列を有するVH CDRlを含んでなる、請求項5に記載のEphA2抗体。
【請求項９】
2A4 (配列番号4)、2E7 (配列番号20)、または12E2 (配列番号28)のVH CDR2のアミノ酸配列を有するVH CDR2を含んでなる、請求項5に記載のEphA2抗体。
【請求項１０】
2A4 (配列番号5)、2E7 (配列番号21)、または12E2 (配列番号29)のVH CDR3のアミノ酸配列を有するVH CDR3を含んでなる、請求項5に記載のEphA2抗体。
【請求項１１】
2A4 (配列番号4)、2E7 (配列番号20)、または12E2 (配列番号28)のVH CDR2のアミノ酸配列を有するVH CDR2をさらに含んでなる、請求項8に記載のEphA2抗体。
【請求項１２】
2A4 (配列番号5)、2E7 (配列番号21)、または12E2 (配列番号29)のVH CDR3のアミノ酸配列を有するVH CDR3をさらに含んでなる、請求項8に記載のEphA2抗体。
【請求項１３】
2A4 (配列番号5)、2E7 (配列番号21)、または12E2 (配列番号29)のVH CDR3のアミノ酸配列を有するVH CDR3をさらに含んでなる、請求項9に記載のEphA2抗体。
【請求項１４】
2A4 (配列番号5)、2E7 (配列番号21)、または12E2 (配列番号29)のVH CDR3のアミノ酸配列を有するVH CDR3をさらに含んでなる、請求項11に記載のEphA2抗体。
【請求項１５】
2A4 (配列番号3)、2E7 (配列番号19)、または12E2 (配列番号27)のVH CDRlのアミノ酸配列を有するVH CDRlを含んでなる、請求項7に記載のEphA2抗体。
【請求項１６】
2A4 (配列番号4)、2E7 (配列番号20)、または12E2 (配列番号28)のVH CDR2のアミノ酸配列を有するVH CDR2を含んでなる、請求項7に記載のEphA2抗体。
【請求項１７】
2A4 (配列番号5)、2E7 (配列番号21)、または12E2 (配列番号29)のVH CDR3のアミノ酸配列を有するVH CDR3を含んでなる、請求項7に記載のEphA2抗体。
【請求項１８】
2A4 (配列番号4)、2E7 (配列番号20)、または12E2 (配列番号28)のVH CDR2のアミノ酸配列を有するVH CDR2をさらに含んでなる、請求項15に記載のEphA2抗体。
【請求項１９】
2A4 (配列番号5)、2E7 (配列番号21)、または12E2 (配列番号29)のVH CDR3のアミノ酸配列を有するVH CDR3をさらに含んでなる、請求項15に記載のEphA2抗体。
【請求項２０】
2A4 (配列番号5)、2E7 (配列番号21)、または12E2 (配列番号29)のVH CDR3のアミノ酸配列を有するVH CDR3をさらに含んでなる、請求項16に記載のEphA2抗体。
【請求項２１】
2A4 (配列番号5)、2E7 (配列番号21)、または12E2 (配列番号29)のVH CDR3のアミノ酸配列を有するVH CDR3をさらに含んでなる、請求項18に記載のEphA2抗体。
【請求項２２】
2A4 (配列番号6)、2E7 (配列番号22)、または12E2 (配列番号30)のVL CDRlのアミノ酸配列を有するVL CDRlを含んでなる、請求項6に記載のEphA2抗体。
【請求項２３】
2A4 (配列番号7)、2E7 (配列番号23)、または12E2 (配列番号31)のVL CDR2のアミノ酸配列を有するVL CDR2を含んでなる、請求項6に記載のEphA2抗体。
【請求項２４】
2A4 (配列番号8)、2E7 (配列番号24)、または12E2 (配列番号32)のVL CDR3のアミノ酸配列を有するVL CDR3を含んでなる、請求項6に記載のEphA2抗体。
【請求項２５】
2A4 (配列番号7)、2E7 (配列番号23)、または12E2 (配列番号31)のVL CDR2のアミノ酸配列を有するVL CDR2をさらに含んでなる、請求項22に記載のEphA2抗体。
【請求項２６】
2A4 (配列番号8)、2E7 (配列番号24)、または12E2 (配列番号32)のVL CDR3のアミノ酸配列を有するVL CDR3をさらに含んでなる、請求項22に記載のEphA2抗体。
【請求項２７】
2A4 (配列番号8)、2E7 (配列番号24)、または12E2 (配列番号32)のVL CDR3のアミノ酸配列を有するVL CDR3をさらに含んでなる、請求項23に記載のEphA2抗体。
【請求項２８】
2A4 (配列番号8)、2E7 (配列番号24)、または12E2 (配列番号32)のVL CDR3のアミノ酸配列を有するVL CDR3をさらに含んでなる、請求項25に記載のEphA2抗体。
【請求項２９】
2A4 (配列番号6)、2E7 (配列番号22)、または12E2 (配列番号30)のVL CDRlのアミノ酸配列を有するVL CDRlを含んでなる、請求項7に記載のEphA2抗体。
【請求項３０】
2A4 (配列番号7)、2E7 (配列番号23)、または12E2 (配列番号31)のVL CDR2のアミノ酸配列を有するVL CDR2を含んでなる、請求項7に記載のEphA2抗体。
【請求項３１】
2A4 (配列番号8)、2E7 (配列番号24)、または12E2 (配列番号32)のVL CDR3のアミノ酸配列を有するVL CDR3を含んでなる、請求項7に記載のEphA2抗体。
【請求項３２】
2A4 (配列番号7)、2E7 (配列番号23)、または12E2 (配列番号31)のVL CDR2のアミノ酸配列を有するVL CDR2をさらに含んでなる、請求項29に記載のEphA2抗体。
【請求項３３】
2A4 (配列番号8)、2E7 (配列番号24)、または12E2 (配列番号32)のVL CDR3のアミノ酸配列を有するVL CDR3をさらに含んでなる、請求項29に記載のEphA2抗体。
【請求項３４】
2A4 (配列番号8)、2E7 (配列番号24)、または12E2 (配列番号32)のVL CDR3のアミノ酸配列を有するVL CDR3をさらに含んでなる、請求項30に記載のEphA2抗体。
【請求項３５】
2A4 (配列番号8)、2E7 (配列番号24)、または12E2 (配列番号32)のVL CDR3のアミノ酸配列を有するVL CDR3をさらに含んでなる、請求項32に記載のEphA2抗体。
【請求項３６】
2A4 (配列番号6)、2E7 (配列番号22)、または12E2 (配列番号30)のVL CDRlのアミノ酸配列を有するVL CDRlを含んでなる、請求項15に記載のEphA2抗体。
【請求項３７】
2A4 (配列番号7)、2E7 (配列番号23)、または12E2 (配列番号31)のVL CDR2のアミノ酸配列を有するVL CDR2を含んでなる、請求項15に記載のEphA2抗体。
【請求項３８】
2A4 (配列番号8)、2E7 (配列番号24)、または12E2 (配列番号32)のVL CDR3のアミノ酸配列を有するVL CDR3を含んでなる、請求項15に記載のEphA2抗体。
【請求項３９】
2A4 (配列番号7)、2E7 (配列番号23)、または12E2 (配列番号31)のVL CDR2のアミノ酸配列を有するVL CDR2をさらに含んでなる、請求項36に記載のEphA2抗体。
【請求項４０】
2A4 (配列番号8)、2E7 (配列番号24)、または12E2 (配列番号32)のVL CDR3のアミノ酸配列を有するVL CDR3をさらに含んでなる、請求項36に記載のEphA2抗体。
【請求項４１】
2A4 (配列番号8)、2E7 (配列番号24)、または12E2 (配列番号32)のVL CDR3のアミノ酸配列を有するVL CDR3をさらに含んでなる、請求項37に記載のEphA2抗体。
【請求項４２】
2A4 (配列番号8)、2E7 (配列番号24)、または12E2 (配列番号32)のVL CDR3のアミノ酸配列を有するVL CDR3をさらに含んでなる、請求項39に記載のEphA2抗体。
【請求項４３】
2A4 (配列番号6)、2E7 (配列番号22)、または12E2 (配列番号30)のVL CDRlのアミノ酸配列を有するVL CDRlを含んでなる、請求項16に記載のEphA2抗体。
【請求項４４】
2A4 (配列番号7)、2E7 (配列番号23)、または12E2 (配列番号31)のVL CDR2のアミノ酸配列を有するVL CDR2を含んでなる、請求項16に記載のEphA2抗体。
【請求項４５】
2A4 (配列番号8)、2E7 (配列番号24)、または12E2 (配列番号32)のVL CDR3のアミノ酸配列を有するVL CDR3を含んでなる、請求項16に記載のEphA2抗体。
【請求項４６】
2A4 (配列番号7)、2E7 (配列番号23)、または12E2 (配列番号31)のVL CDR2のアミノ酸配列を有するVL CDR2をさらに含んでなる、請求項43に記載のEphA2抗体。
【請求項４７】
2A4 (配列番号8)、2E7 (配列番号24)、または12E2 (配列番号32)のVL CDR3のアミノ酸配列を有するVL CDR3をさらに含んでなる、請求項43に記載のEphA2抗体。
【請求項４８】
2A4 (配列番号8)、2E7 (配列番号24)、または12E2 (配列番号32)のVL CDR3のアミノ酸配列を有するVL CDR3をさらに含んでなる、請求項44に記載のEphA2抗体。
【請求項４９】
2A4 (配列番号8)、2E7 (配列番号24)、または12E2 (配列番号32)のVL CDR3のアミノ酸配列を有するVL CDR3をさらに含んでなる、請求項46に記載のEphA2抗体。
【請求項５０】
2A4、2E7、または12E2のVH CDRlのアミノ酸配列を有するVL CDRlを含んでなる、請求項17に記載のEphA2抗体。
【請求項５１】
2A4 (配列番号7)、2E7 (配列番号23)、または12E2 (配列番号31)のVL CDR2のアミノ酸配列を有するVL CDR2を含んでなる、請求項17に記載のEphA2抗体。
【請求項５２】
2A4 (配列番号8)、2E7 (配列番号24)、または12E2 (配列番号32)のVL CDR3のアミノ酸配列を有するVL CDR3を含んでなる、請求項17に記載のEphA2抗体。
【請求項５３】
2A4 (配列番号7)、2E7 (配列番号23)、または12E2 (配列番号31)のVL CDR2のアミノ酸配列を有するVL CDR2をさらに含んでなる、請求項50に記載のEphA2抗体。
【請求項５４】
2A4 (配列番号8)、2E7 (配列番号24)、または12E2 (配列番号32)のVL CDR3のアミノ酸配列を有するVL CDR3をさらに含んでなる、請求項50に記載のEphA2抗体。
【請求項５５】
2A4 (配列番号8)、2E7 (配列番号24)、または12E2 (配列番号32)のVL CDR3のアミノ酸配列を有するVL CDR3をさらに含んでなる、請求項51に記載のEphA2抗体。
【請求項５６】
2A4 (配列番号8)、2E7 (配列番号24)、または12E2 (配列番号32)のVL CDR3のアミノ酸配列を有するVL CDR3をさらに含んでなる、請求項53に記載のEphA2抗体。
【請求項５７】
2A4 (配列番号6)、2E7 (配列番号22)、または12E2 (配列番号30)のVL CDRlのアミノ酸配列を有するVL CDRlを含んでなる、請求項18に記載のEphA2抗体。
【請求項５８】
2A4 (配列番号7)、2E7 (配列番号23)、または12E2 (配列番号31)のVL CDR2のアミノ酸配列を有するVL CDR2を含んでなる、請求項18に記載のEphA2抗体。
【請求項５９】
2A4 (配列番号8)、2E7 (配列番号24)、または12E2 (配列番号32)のVL CDR3のアミノ酸配列を有するVL CDR3を含んでなる、請求項18に記載のEphA2抗体。
【請求項６０】
2A4 (配列番号7)、2E7 (配列番号23)、または12E2 (配列番号31)のVL CDR2のアミノ酸配列を有するVL CDR2をさらに含んでなる、請求項57に記載のEphA2抗体。
【請求項６１】
2A4 (配列番号8)、2E7 (配列番号24)、または12E2 (配列番号32)のVL CDR3のアミノ酸配列を有するVL CDR3をさらに含んでなる、請求項57に記載のEphA2抗体。
【請求項６２】
2A4 (配列番号8)、2E7 (配列番号24)、または12E2 (配列番号32)のVL CDR3のアミノ酸配列を有するVL CDR3をさらに含んでなる、請求項58に記載のEphA2抗体。
【請求項６３】
2A4 (配列番号8)、2E7 (配列番号24)、または12E2 (配列番号32)のVL CDR3のアミノ酸配列を有するVL CDR3をさらに含んでなる、請求項60に記載のEphA2抗体。
【請求項６４】
2A4 (配列番号6)、2E7 (配列番号22)、または12E2 (配列番号30)のVL CDRlのアミノ酸配列を有するVL CDRlを含んでなる、請求項19に記載のEphA2抗体。
【請求項６５】
2A4 (配列番号7)、2E7 (配列番号23)、または12E2 (配列番号31)のVL CDR2のアミノ酸配列を有するVL CDR2をさらに含んでなる、請求項19に記載のEphA2抗体。
【請求項６６】
2A4 (配列番号8)、2E7 (配列番号24)、または12E2 (配列番号32)のVL CDR3のアミノ酸配列を有するVL CDR3を含んでなる、請求項19に記載のEphA2抗体。
【請求項６７】
2A4 (配列番号7)、2E7 (配列番号23)、または12E2 (配列番号31)のVL CDR2のアミノ酸配列を有するVL CDR2をさらに含んでなる、請求項64に記載のEphA2抗体。
【請求項６８】
2A4 (配列番号8)、2E7 (配列番号24)、または12E2 (配列番号32)のVL CDR3のアミノ酸配列を有するVL CDR3をさらに含んでなる、請求項64に記載のEphA2抗体。
【請求項６９】
2A4 (配列番号8)、2E7 (配列番号24)、または12E2 (配列番号32)のVL CDR3のアミノ酸配列を有するVL CDR3をさらに含んでなる、請求項65に記載のEphA2抗体。
【請求項７０】
2A4 (配列番号8)、2E7 (配列番号24)、または12E2 (配列番号32)のVL CDR3のアミノ酸配列を有するVL CDR3をさらに含んでなる、請求項67に記載のEphA2抗体。
【請求項７１】
2A4 (配列番号6)、2E7 (配列番号22)、または12E2 (配列番号30)のVL CDRlのアミノ酸配列を有するVL CDRlを含んでなる、請求項20に記載のEphA2抗体。
【請求項７２】
2A4 (配列番号7)、2E7 (配列番号23)、または12E2 (配列番号31)のVL CDR2のアミノ酸配列を有するVL CDR2を含んでなる、請求項20に記載のEphA2抗体。
【請求項７３】
2A4、2E7、または12E2のVL CDR3のアミノ酸配列を有するVL CDR3を含んでなる、請求項20に記載のEphA2抗体。
【請求項７４】
2A4 (配列番号7)、2E7 (配列番号23)、または12E2 (配列番号31)のVL CDR2のアミノ酸配列を有するVL CDR2をさらに含んでなる、請求項71に記載のEphA2抗体。
【請求項７５】
2A4 (配列番号8)、2E7 (配列番号24)、または12E2 (配列番号32)のVL CDR3のアミノ酸配列を有するVL CDR3をさらに含んでなる、請求項71に記載のEphA2抗体。
【請求項７６】
2A4 (配列番号8)、2E7 (配列番号24)、または12E2 (配列番号32)のVL CDR3のアミノ酸配列を有するVL CDR3をさらに含んでなる、請求項72に記載のEphA2抗体。
【請求項７７】
2A4 (配列番号8)、2E7 (配列番号24)、または12E2 (配列番号32)のVL CDR3のアミノ酸配列を有するVL CDR3をさらに含んでなる、請求項74に記載のEphA2抗体。
【請求項７８】
2A4 (配列番号6)、2E7 (配列番号22)、または12E2 (配列番号30)のVL CDRlのアミノ酸配列を有するVL CDRlを含んでなる、請求項21に記載のEphA2抗体。
【請求項７９】
2A4 (配列番号7)、2E7 (配列番号23)、または12E2 (配列番号31)のVL CDR2のアミノ酸配列を有するVL CDR2を含んでなる、請求項21に記載のEphA2抗体。
【請求項８０】
2A4 (配列番号8)、2E7 (配列番号24)、または12E2 (配列番号32)のVL CDR3のアミノ酸配列を有するVL CDR3を含んでなる、請求項21に記載のEphA2抗体。
【請求項８１】
2A4 (配列番号7)、2E7 (配列番号23)、または12E2 (配列番号31)のVL CDR2のアミノ酸配列を有するVL CDR2をさらに含んでなる、請求項78に記載のEphA2抗体。
【請求項８２】
2A4 (配列番号8)、2E7 (配列番号24)、または12E2 (配列番号32)のVL CDR3のアミノ酸配列を有するVL CDR3をさらに含んでなる、請求項78に記載のEphA2抗体。
【請求項８３】
2A4 (配列番号8)、2E7 (配列番号24)、または12E2 (配列番号32)のVL CDR3のアミノ酸配列を有するVL CDR3をさらに含んでなる、請求項79に記載のEphA2抗体。
【請求項８４】
2A4 (配列番号8)、2E7 (配列番号24)、または12E2 (配列番号32)のVL CDR3のアミノ酸配列を有するVL CDR3をさらに含んでなる、請求項81に記載のEphA2抗体。
【請求項８５】
少なくとも約5×105 M-1 s-1の結合速度定数またはkon速度を有する、EphA2抗体。
【請求項８６】
約5nM〜約8nMの解離定数（Kd）を有する、EphA2抗体。
【請求項８７】
前記抗体が誘導体である、請求項1、2、3、85または86に記載の抗体。
【請求項８８】
抗体誘導体ではない抗体と比較したとき、増大したin vivo半減期を有する、請求項1、2、3、85または86に記載の抗体。 
【請求項８９】
前記抗体がヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、請求項1、2、3、85または86に記載のEphA2抗体。
【請求項９０】
前記抗体が検出可能な物質または治療薬にコンジュゲートされている、請求項1、2、3、85または86に記載のEphA2抗体。
【請求項９１】
定常領域を含む、請求項1、2、3、85または86に記載のEphA2抗体。
【請求項９２】
ヒト定常領域を含む、請求項1、2、3、85または86に記載のEphA2抗体。
【請求項９３】
請求項1、2、3、85または86に記載の抗体を産生する細胞株。
【請求項９４】
癌治療を必要とする患者における癌の治療方法であって、前記患者に、治療に有効な量の請求項1、2、3、85または86に記載のEphA2抗体を投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項９５】
前記投与により、未治療癌細胞でのEphA2リン酸化のレベルと比べて、癌細胞でのEphA2リン酸化が増加する、請求項94に記載の方法。
【請求項９６】
前記投与により、未治療癌細胞でのEphA2発現のレベルと比べて、癌細胞でのEphA2発現が低下する、請求項94に記載の方法。
【請求項９７】
前記EphA2抗体が、細胞間接触をしていない細胞上に発現されたときのEphA2と結合する、請求項94に記載の方法。
【請求項９８】
前記の露出EphA2エピトープ抗体が2A4、2E7、または12E2である、請求項97に記載の方法。
【請求項９９】
前記EphA2抗体が、リガンドと安定的に相互作用することのできないEphA2と結合する、請求項94に記載の方法。
【請求項１００】
前記EphA2抗体が、リガンドに結合していないEphA2と結合する、請求項94に記載の方法。
【請求項１０１】
前記癌が上皮細胞由来のものである、請求項94に記載の方法。
【請求項１０２】
前記癌が、前記癌細胞の組織型を有する非癌細胞と比べて、EphA2を過剰発現する細胞を含む、請求項94に記載の方法。
【請求項１０３】
前記癌が、皮膚、肺、結腸、乳房、前立腺、膀胱、腎臓、もしくは膵臓の癌であるか、または腎細胞癌もしくは黒色腫である、請求項94に記載の方法。
【請求項１０４】
前記癌が転移癌である、請求項94に記載の方法。
【請求項１０５】
前記EphA2抗体がモノクローナル抗体である、請求項94に記載の方法。
【請求項１０６】
前記EphA2抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体であり、かつEphA2との結合について2A4、2E7、または12E2のいずれか1つと競合する、請求項94に記載の方法。
【請求項１０７】
EphA2抗体ではない追加の抗癌治療を施すことを含む、請求項94に記載の方法。
【請求項１０８】
前記の追加の癌治療が、化学療法、生物学的療法、免疫療法、放射線療法、ホルモン療法、および手術からなる群より選択される、請求項107に記載の方法。
【請求項１０９】
癌治療を必要とする患者における第1の治療に対して完全にまたは部分的に不応性である癌の治療方法であって、前記患者に、治療に有効な量の請求項1、2、3、85または86に記載の抗体の投与を含む第2の治療を施すことを含んでなる、上記方法。
【請求項１１０】
第1の治療が、化学療法、ホルモン療法、生物学的療法、または放射線療法である、請求項109に記載の方法。
【請求項１１１】
第2の治療が、化学療法、ホルモン療法、生物学的療法、または放射線療法を施すことをさらに含む、請求項109に記載の方法。
【請求項１１２】
第1の治療を施すのと同時に第2の治療を施すことを含む、請求項109に記載の方法。
【請求項１１３】
前記の露出EphA2エピトープ抗体が、細胞間接触をしていないときのEphA2と結合する、請求項109に記載の方法。
【請求項１１４】
前記の露出EphA2エピトープ抗体が、リガンドと安定的に相互作用することのできないEphA2と結合する、請求項109に記載の方法。
【請求項１１５】
前記の露出EphA2エピトープ抗体が、リガンドよりも多く存在するEphA2と結合する、請求項109に記載の方法。
【請求項１１６】
前記EphA2抗体を静脈内、皮下、または筋肉内に投与する、請求項94または109に記載の方法。
【請求項１１７】
癌に罹患しているまたは癌の疑いがある患者における癌治療の有効性を判定、予知、またはモニタリングする方法であって、
a)  患者の細胞を、請求項1、2、3、85または86に記載のEphA2抗体と、抗体-EphA2結合に適する条件下で接触させ、
b)  EphA2抗体の該細胞への結合を測定する、
ことを含んでなり、その際、対照よりも高いEphA2抗体結合レベルが検出されれば、その患者に癌があることを示す、上記方法。
【請求項１１８】
前記細胞が全血、唾液、尿、血清、または腫瘍細胞組織の穿刺吸引細胞に由来する、請求項117に記載の方法。
【請求項１１９】
前記細胞が前記患者由来の凍結または固定された組織もしくは細胞である、請求項117に記載の方法。
【請求項１２０】
前記検出が前記患者におけるEphA2抗体結合のイメージングを含む、請求項117に記載の方法。
【請求項１２１】
前記患者が転移癌を有する、請求項117に記載の方法。
【請求項１２２】
1以上の容器に、請求項1、2、3、85または86に記載の抗体および使用説明書を含んでなるキット。
【請求項１２３】
包装材料および該包装材料内に収容された薬剤を含んでなる製品であって、該薬剤が請求項1、2、3、85または86に記載のEphA2抗体および製薬上許容される担体を含んでなる、上記製品。
【請求項１２４】
治療に有効な量の請求項1、2、3、85または86に記載のEphA2抗体および製薬上許容される担体を含んでなる医薬組成物。
【請求項１２５】
EphA2抗体がヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体であり、EphA2との結合について2A4、2E7、または12E2と競合する、請求項124に記載の医薬組成物。
【請求項１２６】
EphA2抗体がモノクローナル抗体である、請求項124に記載の医薬組成物。
【請求項１２７】
EphA2抗体がヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項124に記載の医薬組成物。
【請求項１２８】
EphA2抗体がヒト抗体である、請求項124に記載の医薬組成物。
【請求項１２９】
EphA2抗体ではない抗癌剤を含む、請求項124に記載の医薬組成物。
【請求項１３０】
抗癌剤が化学療法剤、放射線療法剤、ホルモン療法剤、生物学的療法剤、または免疫療法剤である、請求項129に記載の医薬組成物。
【請求項１３１】
請求項89に記載のヒト、ヒト化、またはキメラEphA2抗体の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、単離された核酸。
【請求項１３２】
請求項131に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１３３】
請求項132に記載のベクターを含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2005年12月21日出願の米国仮特許出願第60/751,964号の優先権を主張するものであり、この出願の開示内容はその全体を参照として本明細書に組み入れるものとする。
【０００２】
１．発明の分野
本発明は、EphA2に特異的に結合する抗体およびこの抗体を含む組成物を提供する。本発明はさらに、癌の治療、管理、または予防のために開発された方法および組成物に関する。本発明の方法は、EphA2アゴニストであり、かつ/または非癌細胞よりも癌細胞上で選択的に露出または増加しているEphA2のエピトープと選択的に結合する、EphA2に特異的な1種以上の抗体の有効量の投与を含む。本発明は、1種以上の本発明の抗体を、単独で、または癌治療に有用な1種以上の他の薬剤と組み合わせて含む、医薬組成物も提供する。診断法、ならびに治療上有用な抗EphA2抗体のスクリーニング法も提供する。
【背景技術】
【０００３】
２．発明の背景
癌
新生物、すなわち腫瘍は、良性もしくは悪性であり得る異常な無制御の細胞増殖の結果として生じる新生物塊である。良性腫瘍は、一般に限局性のままである。悪性腫瘍は、総称的に癌と称される。「悪性」という用語は一般に、腫瘍が隣接する身体構造に侵入し破壊し、遠くの部位まで広がって死をもたらし得ることを表す(概説については、Robbins and Angell, 1976, Basic Pathology, 2d Ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia, pp. 68-122を参照のこと)。癌は身体の多くの部位で生じる可能性があり、その起源に応じて異なる挙動を示す。癌性細胞は、それらが発生した身体部分を破壊し、次いで身体の他の部分に広がり、そこで新しく増殖し始め、より多くの破壊を行う。
【０００４】
毎年120万人以上のアメリカ人が癌を発症している。癌は、アメリカ合衆国では死因の第2位であり、現在の傾向が続いた場合、2010年までには癌が死因の第1位になることが予想されている。アメリカ合衆国の男性では、肺癌と前立腺癌が癌の死因の第1位である。アメリカ合衆国の女性では、肺癌と乳癌が癌の死因の第1位である。アメリカ合衆国の2人に1人の男性は、人生のある時点で癌と診断されることになる。アメリカ合衆国の3人に1人の女性も、人生のある時点で癌と診断されることになる。
【０００５】
手術、化学療法および放射線療法など現在の治療の選択肢は、しばしば効果がなく、あるいは深刻な副作用を与える。
【０００６】
転移
最も生命にかかわる癌の形態は、腫瘍細胞の集団が体内の遠くのかつ異なる部位でコロニー形成能を獲得した場合にしばしば生じる。これらの転移細胞は、異種組織への細胞集落化を通常は抑制する制限を無視にすることによって生き残る。例えば、通常の乳房上皮細胞は、肺に移植しても通常は増殖または生存しないが、肺転移は、乳癌罹患率および死亡率の主な原因である。最近の証拠から、体中への転移細胞の散在が、原発腫瘍が臨床的に確認されるよりもずっと前に起こる可能性があることが示唆されている。これらの微小転移細胞は、原発腫瘍の検出および除去の後、何カ月または何年もの間潜伏したままであり得る。従って、異質の微小環境における転移細胞の増殖および生存を可能にするメカニズムのより良い理解は、転移癌と戦うために開発される治療法ならびに転移の早期検出および位置確認のための診断法の改善に関して重要である。
【０００７】
癌細胞シグナル伝達
癌は、異常なシグナル伝達の疾患である。異常な細胞シグナル伝達は、細胞増殖および生存における足場依存性の束縛を覆す(Rhimら, Critical Reviews in Oncogenesis 8:305, 1997；Patarca, Critical Reviews in Oncogenesis 7:343, 1996；Malikら, Biochimica et Biophysica Acta 1287:73, 1996；Canceら, Breast Cancer Res Treat 35:105, 1995)。チロシン・キナーゼ活性は、ECM足場によって誘発され、事実、チロシン・キナーゼの発現または機能は、通常は悪性細胞中で増大する(Rhimら, Critical Reviews in Oncogenesis 8:305,1997；Canceら, Breast Cancer Res Treat 35:105, 1995；Hunter, Cell 88:333, 1997)。チロシン・キナーゼ活性が悪性細胞の増殖に必要であるという証拠に基づき、チロシン・キナーゼは、新しい治療学の標的となっている(Levitzkiら, Science 267:1782, 1995；Kondapakaら, Molecular & Cellular Endocrinology 117:53, 1996；Fryら, Current Opinion in BioTechnology 6:662, 1995)。残念ながら、腫瘍細胞への特異的ターゲッティングに関連する障壁により、これらの薬物の適用が制限されることが多い。特に、チロシン・キナーゼ活性は、良性組織の機能および生存にとって極めて重要であることが多い(Levitzkiら, Science 267:1782, 1995)。付随する毒性を最小限にするためには、腫瘍細胞中で選択的に過剰発現されているチロシン・キナーゼを同定し、そして標的とすることが重要である。
【０００８】
EphA2
EphA2は、成人の上皮で発現される130kDaの受容体チロシン・キナーゼであり、低レベルで見られ、細胞-細胞接着の部位内に多く含まれる(Zantekら, Cell Growth & Differentiation 10:629, 1999；Lindbergら, Molecular & Cellular Biology 10:6316, 1990)。EphA2は、細胞膜に固着されたリガンド(エフリン(Ephrin)A1〜A5として知られている)と結合するので、この細胞内局在は重要である(Eph Nomenclature Committee, 1997, Cell 90:403；Galeら, 1997, Cell & Tissue Research 290:227)。リガンド結合の主要な結果は、EphA2自己リン酸化である(Lindbergら, 1990, 上掲)。しかし、他の受容体チロシン・キナーゼとは異なり、EphA2は、リガンド結合またはホスホチロシン含有量の不在下においても酵素活性を維持する(Zantekら, 1999, 上掲書)。EphA2は、多数の攻撃的な癌細胞上でアップレギュレートされる。
【０００９】
癌治療
抗転移薬の開発への1つの障害は、これらの薬物を設計および評価するのに使用するアッセイシステムである。最も慣習的な癌治療は、急速に増殖している細胞を標的としている。しかし、癌細胞は、より急速に増殖するとは限らないが、その代わりに、正常細胞には許容されない条件下で生存および増殖する(Lawrence and Steeg, 1996, World J. Urol. 14:124-130)。正常細胞の挙動と悪性細胞の挙動とのこれらの根本的な差によって、治療的ターゲッティングの機会がもたらされる。微小転移性腫瘍が既に体中に散在しているというパラダイムは、異質の三次元微小環境という状況で潜在的化学療法剤を評価する必要性を強調する。多くの標準的な抗癌剤アッセイは、通常の細胞培養条件(すなわち、単層増殖)下での腫瘍細胞の増殖または生存を測定する。しかし、二次元アッセイにおける細胞挙動は、しばしばin vivoにおける腫瘍細胞挙動を確実に予測するものではない。
【００１０】
現在、癌治療は、患者内の新生物細胞を根絶するための手術、化学療法、ホルモン療法および/または放射線療法を含みうる(例えば、Stockdale, 1998, "Principles of Cancer Patient Management," in Scientific American:Medicine, vol. 3, Rubenstein and Federman, eds., Chapter 12, Section IVを参照のこと)。近年、癌治療は、生物学的療法または免疫療法も含みうる。これらすべての手法は、患者にとって著しい不利点をもたらし得る。例えば手術は、患者の健康によっては禁忌であり、あるいは患者に許容されない可能性がある。さらに、手術では、新生物組織が完全には取り除かれない可能性がある。放射線療法は、新生物組織が正常組織よりも放射線に対してより高い感受性を示す場合にのみ有効であり、放射線療法はまた、しばしば深刻な副作用を誘発する可能性がある。ホルモン療法は、単独の薬剤として投与することはほとんどなく、有効ではあり得るが、他の治療によって癌細胞の大部分を除去した後に癌の再発を予防または遅延させるために使用することが多い。生物学的療法/免疫療法は、数の上では限られており、各療法は、通常、極めて特定の種類の癌に対して有効である。
【００１１】
化学療法に関しては、癌の治療に使用可能な様々な化学療法剤がある。大多数の癌化学療法剤は、DNA合成を直接的に、またはデオキシリボヌクレオチド三リン酸前駆体の生合成を阻害することにより間接的に、阻害することによって作用して、DNA複製および付随する細胞分裂を防止する(例えば、Gilmanら, Goodman and Gilman's:The Pharmacological Basis of Therapeutics, 第8版 (Pergamom Press, New York, 1990)を参照のこと)。ニトロソ尿素などのアルキル化剤、メトトレキセートおよびヒドロキシ尿素などの代謝拮抗剤、ならびにエトポシド、カンプトテシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシンなどの他の薬剤を含めて、これらの薬剤は、必ずしも細胞周期特異的ではないが、DNA複製に対するそれらの作用のために、S期の間に細胞を死滅させる。他の薬剤、特にコルヒチンならびにビンブラスチンおよびビンクリスチンなどのビンカ・アルカロイドは、微小管構築に干渉し、核分裂停止をもたらす。化学療法プロトコールは一般に、治療の有効性を増大させるために複数の化学療法剤の併用投与を含む。
【００１２】
様々な化学療法剤が利用できるにもかかわらず、化学療法には多くの欠点がある(例えば、Stockdale, 1998, "Principles Of Cancer Patient Management" in Scientific American Medicine, vol. 3, Rubenstein and Federman, eds., ch. 12, sect. 10を参照のこと)。ほぼすべての化学療法剤は毒性があり、化学療法は、重篤な悪心、骨髄抑制、免疫抑制などを含む重大でしばしば危険な副作用を引き起こす。さらに、化学療法剤を組み合わせて投与しても、多くの腫瘍細胞は、化学療法剤に対して耐性があり、あるいは耐性を生じる。事実、治療プロトコールで使用した特定の化学療法剤に耐性がある細胞は、他の薬物に対して（特定の治療に使用した薬物の作用メカニズムと異なるメカニズムによって作用する薬物に対してさえも）耐性があることが多いことが分かっており、この現象は、多面的薬剤耐性または多剤耐性と呼ばれている。従って、薬剤耐性のために、多くの癌は、標準的な化学療法治療プロトコールに対して不応性であることが分かっている。
【００１３】
代替的な癌治療法、特に手術、放射線療法、化学療法、およびホルモン療法などの標準的な癌治療法に対して不応性であることが分かっている癌を治療するための癌治療法が大いに必要とされている。さらに、ただ1つの方法によって癌を治療することは一般的ではない。従って、癌を治療するための新しい治療剤、および癌を治療するための新しいより有効な療法の組合せの開発が求められている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
３．発明の概要
本発明は、EphA2に特異的に結合する抗体を提供する。特に、本発明は、EphA2に特異的に結合する以下の抗体：2A4またはその抗原結合フラグメント、2E7またはその抗原結合フラグメント、および12E2またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１５】
本発明は、2A4(配列番号2)、2E7(配列番号18)、または12E2(配列番号26)の重鎖可変(「VH」)ドメインのアミノ酸配列を有するVHドメインを含む、EphA2に特異的に結合する抗体を提供する。本発明はまた、2A4(配列番号2)、2E7(配列番号18)、または12E2(配列番号26)の軽鎖可変(「VL」)ドメインのアミノ酸配列を有するVLドメインを含む、EphA2に特異的に結合する抗体も提供する。本発明はまた、2A4(配列番号2)、2E7(配列番号18)、または12E2(配列番号26)のVHドメインおよびVLドメインのアミノ酸配列を有するVHドメインおよびVLドメインを含む、EphA2に特異的に結合する抗体も提供する。本発明は、2A4(配列番号3-5)、2E7(配列番号19-21)、または12E2(配列番号27-29)の1つ以上のVH相補性決定領域(「CDR」)のアミノ酸配列および/または2A4(配列番号6-8)、2E7(配列番号22-24)、または12E2(配列番号30-32)の1つ以上のVL CDRのアミノ酸配列を有する1つ以上のVH CDRおよび/または1つ以上のVL CDRをそれぞれ含む、EphA2に特異的に結合する抗体をさらに提供する。
【００１６】
一実施形態では、本発明は、2A4のVHドメインおよび/またはVLドメインを含む、EphA2に特異的に結合する抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、2A4の1個、2個、または3個のVH CDR(例えばVH CDR3など)を含む、EphA2に特異的に結合する抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、2A4の1個、2個、または3個のVL CDR(好ましくはVL CDR3など)を含む、EphA2に特異的に結合する抗体を提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、2A4の1個、2個、または3個のVH CDRおよび1個、2個、または3個のVL CDRを含む、EphA2に特異的に結合する抗体を提供する。
【００１７】
一実施形態では、本発明は、2E7のVHドメインおよび/またはVLドメインを含む、EphA2に特異的に結合する抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、2E7の1個、2個、または3個のVH CDR(例えばVH CDR3など)を含む、EphA2に特異的に結合する抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、2E7の1個、2個、または3個のVL CDR(好ましくは VL CDR3など)を含む、EphA2に特異的に結合する抗体を提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、2E7の1個、2個、または3個のVH CDRおよび1個、2個、または3個のVL CDRを含む、EphA2に特異的に結合する抗体を提供する。
【００１８】
一実施形態では、本発明は、12E2のVHドメインおよび/またはVLドメインを含む、EphA2に特異的に結合する抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、12E2の1個、2個、または3個のVH CDR(好ましくはVH CDR3など)を含む、EphA2に特異的に結合する抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、12E2の1個、2個、または3個のVL CDR(例えばVL CDR3など)を含む、EphA2に特異的に結合する抗体を提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、12E2の1個、2個、または3個のVH CDRおよび1個、2個、または3個のVL CDRを含む、EphA2に特異的に結合する抗体を提供する。
【００１９】
本発明は、少なくとも1種、2種、3種、またはそれ以上の異なる本発明の抗体を含む、EphA2に特異的に結合する抗体の混合物を提供する。本発明はまた、少なくとも1種、2種、3種、4種、5種またはそれ以上の異なる本発明の抗体を有する、EphA2に特異的に結合する抗体のパネルも提供する。特定の実施形態では、本発明は、EphA2に対する異なる親和性、EphA2に対する異なる特異性、または異なる解離速度を有する抗体のパネルを提供する。本発明は、少なくとも10、好ましくは少なくとも25、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも125、少なくとも150、少なくとも175、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、少なくとも350、少なくとも400、少なくとも450、少なくとも500、少なくとも550、少なくとも600、少なくとも650、少なくとも700、少なくとも750、少なくとも800、少なくとも850、少なくとも900、少なくとも950、または少なくとも1000の抗体のパネルを提供する。抗体パネルは、例えば、96ウェルプレート中で、ELISAなどのアッセイのために使用することができる。
【００２０】
細胞内局在、リガンド結合特性またはタンパク質組織化(例えば、構造、細胞膜中の配向)における差異によって、癌細胞上に存在するEphA2と非癌細胞上のEphA2とをさらに区別することができる。非癌細胞では、EphA2は低レベルで発現されており、それが膜固着リガンドと結合し得る場である細胞間接触部位に局在している。しかし、癌細胞は一般に細胞間接触の低減を示し、これによってEphA2-リガンド結合が低減し得る。さらに、EphA2の過剰発現により、リガンドに比してEphA2が過剰になり、リガンドに結合していないEphA2の量を増大させ得る。その結果、細胞内分布またはEphA2の膜配向の変化により、EphA2が、リガンドに近接できない癌細胞内の部位に局在化されうる。さらに、EphA2では、細胞間結合部に局在していてもしていなくてもそのリガンドと安定的に相互作用できないように、癌細胞内でEphA2のリガンド結合特性が変化(例えば、立体構造の変化により)している可能性がある。それぞれの場合において、これらの変化により、非癌細胞では露出していない所定のEphA2上のエピトープが癌細胞で露出され得る。従って、本発明はまた、EphA2と特異的に結合するが、好ましくは非癌細胞ではなく癌細胞上に露出したEphA2エピトープと結合する抗体(「露出EphA2エピトープ抗体」)を提供する。非癌細胞ではなく癌細胞上で選択的に露出または増加したEphA2のエピトープと選択的に結合するこうしたEphA2抗体に、癌細胞を暴露すると、その治療/予防抗体は癌細胞へと標的化送達され、非癌細胞を傷つけずに癌細胞の増殖能力を阻止または低減する。
【００２１】
本発明は、EphA2に結合してそれをアゴナイズ（作動）し、かつ/または非癌細胞でなく癌細胞上で選択的に露出または増加しているEphA2のエピトープに選択的に結合する抗体（好ましくはモノクローナル抗体）のスクリーニングおよび同定を提供する。特に、本発明の抗体は、EphA2の細胞外ドメインに結合し、好ましくはEphA2のシグナル伝達およびEphA2の自己リン酸化を誘発する。別の特定の実施形態では、本発明の抗体は、EphA2の細胞外ドメインに結合し、好ましくは癌細胞上に露出するが非癌細胞では露出しないEphA2エピトープに結合する。一実施形態では、本発明の抗体は、2A4、2E7または12E2である。
【００２２】
一実施形態では、癌細胞上に露出するが非癌細胞では露出しないEphA2エピトープと選択的に結合する抗体を同定するために、リガンド、例えばエフリン(Ephrin)A1に結合しておらず、かつ細胞間接触部に局在していないEphA2と選択的に結合する能力について、抗体をスクリーニングすることができる。細胞上での抗体の結合/局在化を確認するための当技術分野で公知の方法を使用して、所望の結合特性について、候補抗体をスクリーニングすることができる。特定の実施形態では、免疫蛍光顕微鏡検査法またはフローサイトメトリーを使用して、抗体の結合特性を確認する。この実施形態では、そのリガンドに結合して細胞間接触部に局在化しているときのEphA2にはほとんど結合しないが、細胞上の遊離のEphA2にはよく結合する抗体が本発明に含まれる。別の特定の実施形態では、EphA2への結合についてリガンド(例えば、細胞に固着したリガンドまたは精製リガンド)と競合する能力について、細胞に基づくアッセイまたはELISAアッセイを用いてEphA2抗体を選択する。
【００２３】
従って、本発明は、EphA2に特異的に結合してそれをアゴナイズし、かつ/または非癌細胞ではなく癌細胞上で選択的に露出または増加しているEphA2のエピトープと選択的に結合する1種以上の抗体の投与を含む、被験体における癌、特に転移癌を予防、治療、または管理するために開発された医薬組成物、ならびに予防および治療レジメンに関する。一実施形態では、癌は、上皮細胞由来のものである。別の実施形態では、癌は、皮膚、肺、大腸、乳房、前立腺、膀胱、腎臓、または膵臓の癌である。別の実施形態では、予防、治療、または管理しようとする癌の癌細胞は、EphA2を過剰発現している。好ましい実施形態では、一部のEphA2は、細胞間接触の減少、細胞内局在化の変化、またはリガンドに比したEphA2量の増加の結果として、リガンドに結合していない。別の実施形態では、本発明の方法を使用して、腫瘍の転移を予防、治療、または管理することができる。本発明の抗体は、1種以上の他の癌治療と組み合わせて投与することができる。特に、本発明は、被験体において癌を予防、治療、または管理する方法であって、前記被験体に、本発明のEphA2抗体の投与以外の、治療または予防に有効な量の1以上の化学療法、ホルモン療法、生物学的療法/免疫療法、および/または放射線療法を施すことと組み合わせて、あるいは手術と組み合わせて、治療または予防に有効な量の1種以上の本発明のEphA2抗体を投与することを含む方法を、提供する。
【００２４】
本発明の方法および組成物は、未治療の患者だけでなく、現在の標準的および実験的癌治療、例えば、限定するものではないが、化学療法、ホルモン療法、生物学的療法、放射線療法、および/または手術に対して部分的または完全に不応性である患者の治療にも有用であり、同様にこのような治療の有効性を改善するためにも有用である。従って、一実施形態では、本発明は、本発明のEphA2抗体の投与を含む治療法以外の治療に不応性または非反応性であることが分かっているか、またはその可能性がある癌を治療または予防するための、治療法および予防法を提供する。特定の実施形態では、非EphA2ベースの治療に不応性または非反応性である患者に本発明の1種以上のEphA2抗体を投与して、その患者が不応性または非反応性でないようにする。次いで、患者が以前は不応性または非反応性であった治療を施して、治療効果をもたらすことができる。
【００２５】
さらに、本発明は、本発明のEphA2抗体についてのスクリーニング法を提供する。特に、ルーチンな免疫学的技術を用いて、EphA2、特にEphA2の細胞外ドメインとの結合について、抗体をスクリーニングすることができる。一実施形態では、アゴニストEphA2抗体を同定するために、EphA2シグナル伝達を誘発する能力、例えばEphA2リン酸化を増加させる能力、かつ/またはEphA2を分解する能力について、EphA2抗体をスクリーニングすることができる。
【００２６】
別の実施形態では、非癌細胞ではなく癌細胞上に露出したEphA2エピトープと選択的に結合する抗体を同定するために、リガンド（例えばエフリンA1）と結合しておらず、また細胞間接触部に局在していないEphA2と選択的に結合する能力について、抗体をスクリーニングすることができる。細胞上の抗体結合/局在を確認するための当技術分野で公知の方法を使用して、候補抗体を所望の結合特性についてスクリーニングすることができる。特定の実施形態では、免疫蛍光顕微鏡検査法またはフローサイトメトリーを用いて抗体の結合特性を確認する。この実施形態では、そのリガンドと結合しており、細胞間接触部に局在しているときのEphA2とはほとんど結合しないが、細胞上の遊離EphA2とはよく結合する抗体は、本発明に含まれる。別の特定の実施形態では、EphA2抗体を、細胞に基づくアッセイまたはELISAアッセイを用いて、EphA2との結合についてリガンド(例えば、細胞に固着したリガンドまたは精製リガンド)と競合するそれらの能力について、選択する。
【００２７】
本発明はさらに、本発明のEphA2抗体を使用して、EphA2に基づく癌治療またはEphA2に基づかない癌治療の有効性を評価する診断法を提供する。一般に、EphA2の発現の増大は、浸潤性および転移性が高まっている癌と関連する。従って、特定の治療によるEphA2発現の低減は、その治療が、癌の潜在的な浸潤性および/または転移性を低下させていることを示す。特定の実施形態では、本発明の診断法は、転移を画像化し、その位置を確認する方法、および原発腫瘍部位とは遠位の組織および体液、例えば全血、喀痰、尿、血清、細針吸引液(すなわち、生検)を用いて診断および予測する方法(並びに、原発腫瘍の組織および体液を使用する方法)を提供する。他の実施形態では、本発明の診断法は、転移を画像化し、その位置を確認する方法、およびin vivoで診断および予測する方法を提供する。このような実施形態では、本発明の抗体、好ましくは露出EphA2エピトープ抗体を用いて原発転移性腫瘍を検出する。本発明の抗体は、凍結細胞または固定細胞の免疫組織化学分析または組織アッセイに使用することもできる。
【００２８】
一実施形態では、本発明の抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体である。別の実施形態では、本発明の抗体は、検出可能な物質または治療剤にコンジュゲートされている。別の実施形態では、本発明の抗体は、検出可能な物質または治療剤にコンジュゲートされていない。
【００２９】
別の実施形態では、本発明の医薬組成物または診断試薬を含むキットを提供する。
【００３０】
3.1  定義
本明細書では、「アゴニスト」という用語は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、大分子、または小分子(10kD未満)を含む、別の分子の活性、活性化、または機能を増大させる化合物を指す。EphA2アゴニストは、EphA2タンパク質のリン酸化および分解を増加させる。EphA2をアゴナイズ（作動）するEphA2抗体は、非癌細胞に比して、癌細胞で露出するEphA2エピトープと選択的に結合してもよいし、しなくてもよい。
【００３１】
「EphA2に特異的に結合する抗体またはそのフラグメント」という用語は、本明細書では、EphA2ポリペプチドまたはEphA2ポリペプチドの断片に特異的に結合し、他の非EphA2ポリペプチドには特異的に結合しない抗体またはそのフラグメントを指す。EphA2ポリペプチドまたはその断片に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントは、他の抗原と非特異的に交差反応しないことが好ましい(例えば、適切なイムノアッセイにおいて、結合が、非EphA2タンパク質、例えばBSAと競合して除かれることはない)。EphA2ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはフラグメントは、例えば、イムノアッセイまたは当業者に公知の他の技術によって同定することができる。本発明の抗体としては、限定するものではないが、合成モノクローナル抗体、多重特異性抗体(二重特異性抗体を含む)、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、合成抗体、一本鎖Fv(scFv)(二重特異性scFvを含む)、一本鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab')フラグメント、ジスルフィド結合Fv(sdFv)、および抗イディオタイプ(抗Id)抗体、ならびに上記のいずれかについてのエピトープ結合フラグメントが挙げられる。特に、本発明の抗体は、EphA2抗原に特異的に結合する、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫活性部分、すなわち抗原結合部位(例えば、抗EphA2抗体の1つまたは複数の相補性決定領域(CDR))を含有する分子を含む。EphA2ポリペプチドまたはその断片に特異的に結合するアゴニスト抗体またはフラグメントは、EphA2のみをアゴナイズ（作動）し、他の活性を有意にアゴナイズしないことが好ましい。
【００３２】
本明細書では、「癌」という用語は、遠位部位に転移する潜在能力を有し、非癌細胞のものと異なる表現型形質、例えば、軟寒天などの三次元基質中でのコロニー形成またはマトリゲルTM(MATRIGELTM)などの三次元基底膜もしくは細胞外マトリックス調製物中での管状ネットワークもしくは網様マトリックスの形成、を示す細胞を伴う疾患を意味する。非癌細胞は、軟寒天中でコロニーを形成せず、三次元基底膜または細胞外マトリックス調製物中では異なる球様構造を形成する。癌細胞は、様々なメカニズムを介するにもかかわらず、それらの発生中に機能的能力の特徴的なセットを獲得する。こうした能力には、アポトーシスの回避、増殖シグナルの自足、抗増殖シグナルへの非感受性、組織浸潤/転移、無限複製能、および持続的血管新生がある。「癌細胞」という用語は、前悪性癌細胞および悪性癌細胞の両方を含めて意味する。
【００３３】
本明細書では、「誘導体」という用語は、アミノ酸残基の置換、欠失または付加(すなわち、変異)の導入によって改変された、EphA2ポリペプチド、EphA2ポリペプチドの断片、EphA2ポリペプチドと特異的に結合する抗体、またはEphA2ポリペプチドと特異的に結合する抗体フラグメントのアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味する。いくつかの実施形態では、抗体誘導体またはそのフラグメントは、1以上のCDRにアミノ酸残基の置換、欠失または付加を含む。抗体誘導体は、非誘導体抗体と比較した場合に、実質的に同一の結合、より良い結合、またはより劣った結合を有しうる。特定の実施形態では、CDRの1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されている(すなわち、変異している)。本明細書では、「誘導体」という用語はまた、修飾された、すなわち、当該ポリペプチドへの任意のタイプの分子の共有結合によって修飾された、EphA2ポリペプチド、EphA2ポリペプチドの断片、EphA2ポリペプチドと特異的に結合する抗体、またはEphA2ポリペプチドと特異的に結合する抗体フラグメントをも意味する。例えば、限定するものではないが、EphA2ポリペプチド、EphA2ポリペプチドの断片、抗体、または抗体フラグメントは、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基/ブロック基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質との結合などによって修飾されうる。EphA2ポリペプチド、EphA2ポリペプチドの断片、抗体、または抗体フラグメントの誘導体は、当業者に公知の技法を用いる化学修飾によって修飾することが可能であり、公知の技法としては、限定するものではないが、特異的な化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などが挙げられる。さらに、EphA2ポリペプチド、EphA2ポリペプチドの断片、抗体、または抗体フラグメントの誘導体には、1個以上の非古典的アミノ酸が含まれていてよい。一実施形態では、ポリペプチド誘導体は、本明細書に記載のEphA2ポリペプチド、EphA2ポリペプチドの断片、抗体、もしくは抗体フラグメントと類似したまたは同一の機能を有する。別の実施形態では、EphA2ポリペプチド、EphA2ポリペプチドの断片、抗体、または抗体
フラグメントの誘導体は、非改変ポリペプチドと比較して、改変された活性を有する。例えば、誘導体抗体またはそのフラグメントは、そのエピトープとよりしっかりと結合し、あるいはタンパク質分解に対しより耐性があり得る。
【００３４】
本明細書では、「エピトープ」という用語は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはマウスまたはヒトにおいて抗原活性または免疫原活性を有するEphA2ポリペプチドの一部分を意味する。免疫原活性を有するエピトープは、動物中で抗体反応を誘発するEphA2ポリペプチドの一部分である。抗原活性を有するエピトープは、当技術分野でよく知られている任意の方法、例えば、イムノアッセイによって決定されるように、抗体が特異的に結合するEphA2ポリペプチドの一部分である。抗原エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。
【００３５】
本明細書に記載の「フラグメント」または「断片」には、EphA2ポリペプチドもしくはEphA2ポリペプチドと特異的に結合する抗体のアミノ酸配列の、少なくとも5個連続したアミノ酸残基、少なくとも10個連続したアミノ酸残基、少なくとも15個連続したアミノ酸残基、少なくとも20個連続したアミノ酸残基、少なくとも25個連続したアミノ酸残基、少なくとも40個連続したアミノ酸残基、少なくとも50個連続したアミノ酸残基、少なくとも60個連続したアミノ残基、少なくとも70個連続したアミノ酸残基、少なくとも80個連続したアミノ酸残基、少なくとも90個連続したアミノ酸残基、少なくとも100個連続したアミノ酸残基、少なくとも125個連続したアミノ酸残基、少なくとも150個連続したアミノ酸残基、少なくとも175個連続したアミノ酸残基、少なくとも200個連続したアミノ酸残基、または少なくとも250個連続したアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドが包含される。抗体フラグメントはエピトープ結合フラグメントであることが好ましい。
【００３６】
本明細書では、「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含有するキメラ抗体である非ヒト(例えば、マウス)抗体の形態を意味する。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域残基を、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト生物種由来の超可変領域残基(ドナー抗体)で置き換えたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(FR)残基を対応する非ヒト残基で置き換える。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体中に見られない残基を含むことができる。これらの改変は、抗体性能をさらに改良するために行う。一般に、ヒト化抗体は、すべてまたは実質的にすべての超可変領域が非ヒト免疫グロブリンのものに合致し、すべてまたは実質的にすべてのFRがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも1つ（通常2つ）の実質的にすべての可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、場合により、少なくとも免疫グロブリン定常領域(Fc)の一部分、典型的には、アミノ酸残基の置換、欠失または付加(すなわち、変異)の導入によって改変された、EphA2ポリペプチドと特異的に結合するヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域の一部分を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は誘導体である。このようなヒト化抗体は、1以上の非ヒトCDR中にアミノ酸残基の置換、欠失または付加を含む。ヒト化抗体誘導体は、非誘導体ヒト化抗体と比較した場合に、実質的に同一の結合、より良い結合、またはより劣った結合を有しうる。特定の実施形態では、CDRの1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されている(すなわち、変異している)。抗体のヒト化のさらなる詳細については、欧州特許EP 239,400、EP 592,106、およびEP 519,596；国際公開WO 91/09967およびWO 93/17105；米国特許第5,225,539号、第5,530,101号、第5,565,332号、第5,585,089号、第5,766,886号、および第6,407,213号；ならびにPadlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498；Studnickaら, 1994, Protein Engineering 7(6):805-814；Roguskaら, 1994, PNAS 91:969-973；Tanら, 2002, J. Immunol. 169:1119-25；Caldasら, 2000, Protein Eng. 13:353-60；Morea et al., 2000, Methods 20:267-79；Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:10678-84；Roguskaら, 1996, Protein Eng. 9:895-904；Coutoら, 1995, Cancer Res. 55(23 Supp):5973s-5977s；Coutoら, 1995, Cancer Res. 55:1717-22；Sandhu,1994, Gene 150:409-10；Pedersenら, 1994, J. Mol. Biol. 235:959-73；Jonesら, 1986, Nature 321:522-525；Reichmannら, 1988, Nature 332:323-329；およびPresta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596を参照のこと。
【００３７】
本明細書では、「超可変領域」という用語は、抗体の、抗原結合に関与するアミノ酸残基を意味する。超可変領域は、「相補性決定領域」すなわち「CDR」由来のアミノ酸残基(すなわち、当該軽鎖可変ドメインの残基24〜34(L1)、50〜56(L2)および89〜97(L3)、ならびに当該重鎖可変ドメインの31〜35(H1)、50〜65(H2)および95〜102(H3)；Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991))、および/または「超可変ループ」由来のそれら残基(すなわち、当該軽鎖可変ドメインの残基26〜32(L1)、50〜52(L2)および91〜96(L3)、ならびに当該重鎖可変ドメインの26〜32(H1)、53〜55(H2)および96〜101(H3)；Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917)を含む。2A4、2E7および12E2のCDR残基を図３に記載する。「フレームワーク領域」すなわち「FR」残基は、本明細書で定義した超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００３８】
本明細書では、「組み合わせて」または「併用して」という用語は、2種以上の予防および/または治療剤の使用について言う。「組み合わせて」または「併用して」という用語の使用は、予防および/または治療剤を過剰増殖性細胞障害、特に癌に罹患している被験体に投与する順番を限定するものではない。第1の予防または治療剤は、過剰増殖性細胞障害、特に癌に罹患していた、罹患している、または罹患しやすい被験体に第2の予防または治療剤を投与するより前(例えば、1分、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間、または12週間前)に、または投与すると同時に、または投与後(例えば、1分、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間、または12週間後)に、投与することができる。本発明の薬剤が他の薬剤と一緒に作用し、それをその他の方法で投与した場合よりも利益の増大をもたらすことができるように、予防または治療剤を被験体に連続してある時間間隔内で投与する。追加の予防または治療剤は、他の追加の予防または治療剤と共に任意の順番で投与してもよい。
【００３９】
本明細書では、「低許容性」という表現は、患者が治療による副作用に苦しみ、その結果、有害な作用および/または副作用による悪影響が治療利益を上回るので患者が治療によって利益を受けない、かつ/または治療を続けない状態を意味する。
【００４０】
本明細書では、「管理する」、「管理している」および「管理」という用語は、疾患の治癒をもたらさない、予防または治療剤の投与から被験体に生じた有益な効果を意味する。ある実施形態では、疾患の進行または悪化を防ぐために、被験体に1種以上の予防または治療剤を投与して疾患を「管理する」。
【００４１】
本明細書では、「非反応性/不応性」という表現は、化学療法、放射線療法、手術、ホルモン療法および/または生物学的療法/免疫療法などの1以上の現在利用可能な治療法(例えば、癌治療法)、特に特定の癌に対する標準的な治療レジメンで治療された患者であって、その治療が当該患者を治療するのに臨床的に適当ではなく追加の有効な治療を必要している患者、例えば治療に対して非感受性のままである患者について述べるのに使用される。この表現では、治療に応答するがなお副作用に苦しむ患者、再発する患者、耐性を生じるなどといった患者についても記載する。様々な実施形態では、「非反応性/不応性」は、癌細胞の少なくともかなりの部分が死滅しないか、またはそれらの細胞分裂が停止しないことを意味する。癌細胞が「非反応性/不応性」かどうかの判定は、癌細胞に対する治療の有効性をアッセイするための当技術分野で公知の方法によってin vivoまたはin vitroで行うことができ、そのような状況において当技術分野で許容される「不応性」の意味を用いる。様々な実施形態で、癌細胞数が、治療の間、有意に減少せず、または増加する場合、癌は「非反応性/不応性」である。
【００４２】
本明細書では、「増強する」という用語は、その常用量または認可用量での治療剤の有効性の改善を意味する。
【００４３】
本明細書では、「予防する」および「予防」という用語は、予防または治療剤の投与によってもたらされる被験体の疾患の再発または拡大の予防を意味する。
【００４４】
本明細書では、「予防剤」という用語は、EphA2過剰発現に関連した障害、特に癌の発症、再発、または拡大の予防に使用できる薬剤を指す。ある実施形態では、「予防剤」という用語は、EphA2アゴニスト抗体または露出EphA2エピトープ抗体(例えば、2A4、2E7、および12E2)を指す。他のある実施形態では、「予防剤」という用語は、癌化学療法剤、放射線療法、ホルモン療法、生物学的療法(例えば、免疫療法)、および/または本発明のEphA2抗体について言う。他の実施形態では、2種以上の予防剤を組み合わせて投与してもよい。
【００４５】
本明細書では、「予防に有効な量」とは、癌の再発または拡大の予防をもたらすのに十分な予防剤の量を指す。予防に有効な量は、癌の再発または拡大の予防、あるいは患者、例えば、限定するものではないが、癌の素因のある者または以前に発癌物質に曝された者における癌の発生の予防に十分な予防剤の量を指すこともある。予防に有効な量は、癌の阻止において予防的利益をもたらす予防剤の量を指すこともある。さらに、本発明の予防剤についての予防に有効な量は、癌阻止において予防的利益をもたらす、予防剤単独での量、または他の薬剤と組み合わせた予防剤の量を意味する。本発明のEphA2抗体の量に関連して用いると、この用語は、予防を全体的に改善するか、別の予防剤の予防的効果を増強するか、または別の予防剤と相乗的に作用する量を、包含しうる。
【００４６】
本明細書では、「プロトコール」には、投与スケジュールおよび投与レジメンが含まれる。
【００４７】
本明細書では、「副作用」という表現は、予防または治療剤の望ましくない有害な作用を含む。有害な作用は常に望ましくないが、望ましくない作用が必ずしも有害とは限らない。予防または治療剤による有害な作用は、有害または不快または危険であるかもしれない。化学療法による副作用としては、限定するものではないが、初期および後期形成下痢および膨満などの胃腸毒性、悪心、嘔吐、拒食症、白血球減少、貧血、好中球減少、無力症、腹部痙攣、発熱、疼痛、体重減少、脱水症、脱毛症、呼吸困難、不眠症、眩暈、粘膜炎、口内乾燥、および腎不全、ならびに便秘、神経および筋肉への影響、腎臓および膀胱への一時的または永久的な損傷、流感様症状、体液貯留、および一時的または永久的な不妊症が挙げられる。放射線療法による副作用としては、限定するものではないが、疲労、口内乾燥、および食欲減少が挙げられる。生物学的療法/免疫療法による副作用としては、限定するものではないが、投与部位の発疹または腫張、発熱、悪寒および疲労などの流感様症状、消化管問題およびアレルギー反応が挙げられる。ホルモン療法による副作用としては、限定するものではないが、悪心、不妊問題、うつ病、食欲減少、眼の問題、頭痛、および体重変動が挙げられる。患者が通常経験する別の望ましくない作用は非常に多く、当技術分野で公知である。それらの多くはPhysicians' Desk Reference(第58版、2004)に記載されている。
【００４８】
本明細書では、「一本鎖Fv」または「scFv」という用語は、抗体のVHおよびVLドメインを含む抗体フラグメントであって、これらのドメインが単一のポリペプチド鎖中に存在する抗体フラグメントをさす。一般に、Fvポリペプチドは、scFvが抗原結合するのに望ましい構造を形成できるようにするVHおよびVLドメインの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。scFvの概説については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315(1994)を参照のこと。特定の実施形態では、scFvは、二重特異性scFvおよびヒト化scFvを含む。
【００４９】
本明細書では、「被験体」および「患者」という用語は、互換的に用いる。本明細書では、被験体は、好ましくは非霊長類(例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど)および霊長類(例えば、サルおよびヒト)などの哺乳動物、最も好ましくはヒトである。
【００５０】
本明細書では、「治療する」および「治療」という用語は、1種以上の治療剤の投与によってもたらされる、疾患もしくは障害の症状の根絶、低減または改善、特に、原発性、局所性もしくは転移癌組織の根絶、除去、改変、または制御を表す。ある実施形態では、こうした用語は、このような疾患にかかっている被験体への1種以上の治療剤の投与によってもたらされる、癌の転移の最小化または遅延を意味する。
【００５１】
本明細書では、「治療剤」という用語は、EphA2の過剰発現に関連した障害、特に癌の予防、治療、または管理に使用できる薬剤を指す。ある実施形態では、「治療剤」という用語は、EphA2アゴニスト抗体および/露出EphA2エピトープ抗体、例えば2A4、2E7、および12E2を指す。他のある実施形態では、「治療剤」という用語は、癌化学療法剤、放射線療法、ホルモン療法、生物学的療法/免疫療法、および/または本発明のEphA2抗体を指す。他の実施形態では、2種以上の治療剤を組み合わせて投与してよい。
【００５２】
本明細書では、「治療に有効な量」とは、原発性、局所性、または転移性の癌組織を破壊、改変、制御、または除去するのに十分な治療剤の量を指す。治療に有効な量とは、癌の転移を遅らせ、または最小化するのに十分な治療剤の量を指すこともある。治療に有効な量は、癌の治療または管理において治療的利益をもたらす治療剤の量を指すこともある。さらに、本発明の治療剤についての治療に有効な量は、癌の治療または管理において治療利益をもたらす、治療剤単独の量または他の治療と組み合わせた治療剤の量を意味する。本発明のEphA2抗体の量に関連して用いると、この用語は、治療を全体的に改善するか、望ましくない作用を低減または回避するか、あるいは別の治療剤の治療効果を増強するか、または別の治療剤と相乗的に作用する量を、包含しうる。
【００５３】
４．  図面の説明
図１：  MD102中の4H5 scFv挿入部位の線状マップ。
【００５４】
図２：  固定化ヒトEphA2上での、コンビナトリアル親和性最適化変異体(2A4、2E7、12E2)のscFv上清のELISA力価測定をこの活性プロットにまとめてあり、最適化変異体の活性の増加を示している。
【００５５】
図３：  親和性最適化変異体2A4(配列番号2)、2E7(配列番号18)、12E2(配列番号26)と、ヒト化4H5 scFv(配列番号10)とのアミノ酸配列アラインメント。図示したCDRは、以下の対応する配列番号を有する：
2009521219.tif 000003
図４Ａ：  4H5の核酸配列およびアミノ酸配列(配列番号9、10)。
【００５６】
図４Ｂ：  2A4の核酸配列およびアミノ酸配列(配列番号1、2)。
【００５７】
図４Ｃ：  2E7の核酸配列およびアミノ酸配列(配列番号17、18)。
【００５８】
図４Ｄ：  12E2の核酸配列およびアミノ酸配列(配列番号25、26)。
【００５９】
図５：  EA2 scFvおよび4H5 scFvと比較した、ヒトEphA2に対するscFvフラグメント(2A4、2E7、12E2)の結合親和性の測定。2A4、2E7および12E2は、EA2および4H5と比較すると、EphA2に対する結合親和性の著しい改善を示している。
【００６０】
５.  発明の詳細な説明
本発明は、EphA2に特異的に結合する抗体を提供する。特に、本発明は、EphA2に特異的に結合する以下の抗体：2A4、2E7、および12E2を提供する。本発明はまた、2A4(配列番号2)、2E7(配列番号18)、または12E2(配列番号26)の重鎖可変(「VH」)ドメインおよび/または軽鎖可変(「VL」)ドメインのアミノ酸配列を有するそれぞれVHドメインおよび/またはVLドメインを含む抗体も提供する。このような抗体は、当技術分野で公知の定常領域をさらに含んでもよく、該定常領域は当技術分野で公知のヒト定常領域であることが好ましく、例えば、限定するものではないが、ヒト軽鎖κ鎖(K)、ヒト軽鎖λ鎖(X)、IgG1の定常領域、IgG2の定常領域、IgG3の定常領域またはIgG4の定常領域が挙げられる。さらに、本発明は、2A4、2E7、または12E2の1つ以上の相補性決定領域(「CDR」)を含む抗体を提供する。
【００６１】
EphA2活性が低下すると、悪性の癌細胞増殖が選択的に抑制される。EphA2活性は、EphA2アゴニスト・モノクローナル抗体を用いて低下させることができる。いかなる作用機序にも拘束されないが、悪性細胞増殖のこうした抑制は、EphA2のシグナル伝達を刺激し(すなわちそれをアゴナイズ（作動）し)、それによってEphA2のリン酸化を引き起こし、これがその分解をもたらすことにより達成される。悪性細胞の増殖は、EphA2レベルが低下し、このためリガンド依存的なEphA2シグナル伝達が低下することにより低減する。
【００６２】
従って、本発明は、癌、特に転移癌を治療、抑制、および管理するための方法および組成物に関する。本発明の特定の態様は、癌細胞、特にEphA2を過剰発現している癌細胞の増殖および浸潤を抑制する化合物を含む方法および組成物に関する。本発明はさらに、上皮細胞由来の癌、特にヒトの乳房、肺、皮膚、および前立腺、膀胱、腎臓および膵臓の癌の転移の治療、抑制、または管理のための方法および組成物に関する。本発明の他の組成物および方法は、本発明のEphA2抗体と組み合わせて他の種類の活性成分を含む。
【００６３】
本発明はまた、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、および生物学的療法など、現在または標準の癌治療に部分的または完全に不応性になっている癌の治療、抑制、および管理のための方法に関する。
【００６４】
本発明はさらに、本発明のEphA2抗体を使用して、EphA2に基づく癌治療またはEphA2に基づかない癌治療の有効性を評価する診断法を提供する。本発明の診断法を使用すると、癌の進行を予知または予測することもできる。特定の実施形態では、本発明の診断法は、転移を画像化し、その位置を決定する方法、および原発腫瘍部位の遠位の組織および体液を用いて診断および予知する方法(並びに、原発腫瘍の組織および体液を使用する方法)を提供する。他の実施形態では、本発明の診断法は、転移を画像化し、その位置を決定する方法、およびin vivoで診断および予知する方法を提供する。
【００６５】
5.1  抗体
上記のとおり、本発明は、抗体(好ましくはモノクローナル抗体)またはそのフラグメントであって、EphA2に特異的に結合し、EphA2シグナル伝達をアゴナイズ（作動）するもの(「EphA2アゴニスト抗体」)、および/または非癌細胞ではなく癌細胞上で選択的に露出または増加するEphA2のエピトープに選択的に結合するもの(「露出EphA2エピトープ抗体」)の投与を包含する。一実施形態では、該抗体は、EphA2の細胞外ドメインに結合し、好ましくはEphA2のアゴニストとしても作動し、例えばEphA2のリン酸化を増大させる。別の実施形態では、該抗体は、EphA2の細胞外ドメインに結合し、好ましくは、非癌細胞ではなく癌細胞上で選択的に露出または増加しているEphA2のエピトープに結合する。他の実施形態では、抗体は、2A4、2E7、または12E2である。別の実施形態では、該抗体は、例えばELISAによってアッセイされるとおり、2A4、2E7、または12E2によって結合されるエピトープに結合し、かつ/またはEphA2との結合について2A4、2E7、または12E2と競合する。他の実施形態では、本発明の抗体は、EphA2に特異的に結合し、EphA2のシグナル伝達をアゴナイズ(作動)し、かつ/または非癌細胞でなく癌細胞上で選択的に露出または増加しているEphA2のエピトープに選択的に結合し、結合についてEphA2リガンド、例えばエフリン(Ephrin)A1と競合してもよいし、しなくてもよい。
【００６６】
本発明は、EphA2に特異的に結合する抗体を提供する。特に、本発明はEphA2に特異的に結合する以下の抗体：2A4もしくはその抗原結合フラグメント、2E7もしくはその抗原結合フラグメント、または12E2もしくはその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、2A4またはその抗原結合フラグメント(例えば、2A4の1つ以上のCDR)である。別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、2E7またはその抗原結合フラグメント(例えば、2E7の1つ以上のCDR)である。別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、12E2またはその抗原結合フラグメント(例えば、2E2の1つ以上の1CDR)である。
【表１】
2009521219.tif 000004
【００６７】
本発明は、図３に開示した2A4(配列番号2)、2E7(配列番号18)、または12E2(配列番号26)のVHドメインのアミノ酸配列を有するVHドメインを含む、EphA2に特異的に結合する抗体を提供する。一実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、2A4(配列番号2)のVHドメインのアミノ酸配列を有するVHドメインを含む。別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、2E7(配列番号18)のVHドメインのアミノ酸配列を有するVHドメインを含む。別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、12E2(配列番号26)のVHドメインのアミノ酸配列を有するVHドメインを含む。
【００６８】
本発明は、図３にリストしたVH CDR(配列番号3-6、11-13、19-21、および27-29)のいずれかのアミノ酸配列を有するVH CDRを含む、EphA2に特異的に結合する抗体を提供する。特に、本発明は、図３にリストしたVH CDR(配列番号3-6、11-13、19-21、および27-29)のいずれかのアミノ酸配列を有する1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上のVH CDRを含む（あるいは、からなる）、EphA2に特異的に結合する抗体を提供する。一実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、図３に開示した2A4(配列番号3)、2E7(配列番号19)、または12E2(配列番号27)に由来するVH CDR1のアミノ酸配列を有するVH CDR1を含む。別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、図３に開示した2A4(配列番号4)、2E7(配列番号20)、または12E2(配列番号28)に由来するVH CDR2のアミノ酸配列を有するVH CDR2を含む。別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、図３に開示した2A4(配列番号5)、2E7(配列番号21)、または12E2(配列番号29)に由来するVH CDR3のアミノ酸配列を有するVH CDR3を含む。別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、図３に開示した2A4(配列番号3)、2E7(配列番号19)、または12E2(配列番号27)に由来するVH CDR1のアミノ酸配列を有するVH CDR1、および図３に開示した2A4(配列番号4)、2E7(配列番号20)、または12E2(配列番号28)に由来するVH CDR2のアミノ酸配列を有するVH CDR2を含む。別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、図３に開示した2A4(配列番号3)、2E7(配列番号19)、または12E2(配列番号27)に由来するVH CDR1のアミノ酸配列を有するVH CDR1、および図３に開示した2A4(配列番号5)、2E7(配列番号21)、または12E2(配列番号29)に由来するVH CDR3のアミノ酸配列を有するVH CDR3を含む。別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、図３に開示した2A4(配列番号4)、2E7(配列番号20)、または12E2(配列番号28)に由来するVH CDR2のアミノ酸配列を有するVH CDR2、および図３に開示した2A4(配列番号5)、2E7(配列番号21)、または12E2(配列番号29)に由来するVH CDR3のアミノ酸配列を有するVH CDR3を含む。別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、図３に開示した2A4(配列番号3)、2E7(配列番号19)、または12E2(配列番号27)に由来するVH CDR1のアミノ酸配列を有するVH CDR1、図３に開示した2A4(配列番号4)、2E7(配列番号20)、または12E2(配列番号28)に由来するVH CDR2のアミノ酸配列を有するVH CDR2、および図３に開示した2A4(配列番号5)、2E7(配列番号21)、または12E2(配列番号29)に由来するVH CDR3のアミノ酸配列を有するVH CDR3を含む。
【００６９】
本発明は、図３に開示した2A4(配列番号2)、2E7(配列番号18)、または12E2(配列番号26)に由来するVLドメインのアミノ酸配列を有するVLドメインを含む、EphA2に特異的に結合する抗体を提供する。
【００７０】
本発明はまた、図３にリストしたVL CDR(配列番号6-8、14-16、22-24、および30-32)のいずれかのアミノ酸配列を有するVL CDRを含む、EphA2に特異的に結合する抗体も提供する。特に、本発明は、図３にリストしたVL CDR(配列番号6-8、14-16、22-24、および30-32)のいずれかのアミノ酸配列を有する1つ、2つ、3つ、またはそれ以上のVL CDRを含む（あるいは、からなる）、EphA2に特異的に結合する抗体を提供する。一実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、図３に開示した2A4(配列番号6)、2E7(配列番号22)、または12E2(配列番号30)に由来するVL CDR1のアミノ酸配列を有するVL CDR1を含む。別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、図３に開示した2A4(配列番号7)、2E7(配列番号23)、または12E2(配列番号31)に由来するVL CDR2のアミノ酸配列を有するVL CDR2を含む。別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、図３に開示した2A4(配列番号8)、2E7(配列番号24)、または12E2(配列番号32)に由来するVL CDR3のアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む。別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、図３に開示した2A4(配列番号6)、2E7(配列番号22)、または12E2(配列番号30)に由来するVL CDR1のアミノ酸配列を有するVL CDR1、および図３に開示した2A4(配列番号7)、2E7(配列番号23)、または12E2(配列番号31)に由来するVL CDR2のアミノ酸配列を有するVL CDR2を含む。別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、図３に開示した2A4(配列番号6)、2E7(配列番号22)、または12E2(配列番号30)に由来するVL CDR1のアミノ酸配列を有するVL CDR1、および図３に開示した2A4(配列番号8)、2E7(配列番号24)、または12E2(配列番号32)に由来するVL CDR3のアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む。別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、図３に開示した2A4(配列番号7)、2E7(配列番号23)、または12E2(配列番号31)に由来するVL CDR2のアミノ酸配列を有するVL CDR2、および図３に開示した2A4(配列番号8)、2E7(配列番号24)、または12E2(配列番号32)に由来するVL CDR3のアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む。別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、図３に開示した2A4(配列番号6)、2E7(配列番号22)、または12E2(配列番号30)に由来するVL CDR1のアミノ酸配列を有するVL CDR1、図３に開示した2A4(配列番号7)、2E7(配列番号23)、または12E2(配列番号31)に由来するVL CDR2のアミノ酸配列を有するVL CDR2、および図３に開示した2A4(配列番号8)、2E7(配列番号24)、または12E2(配列番号32)に由来するVL CDR3のアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む。
【００７１】
本発明は、図３にリストしたVH CDRの1つ以上とVL CDRの1つ以上とを含む、EphA2に特異的に結合する抗体を提供する。特に、本発明は、以下のVH CDRとVL CDRを含む(あるいは、からなる)、EphA2に特異的に結合する抗体を提供する：VH CDR1とVL CDR1；VH CDR1とVL CDR2；VH CDR1とVL CDR3；VH CDR2とVL CDR1；VH CDR2とVL CDR2；VH CDR2とVL CDR3；VH CDR3とVH CDR1；VH CDR3とVL CDR2；VH CDR3とVL CDR3；VH1 CDR1、VH CDR2およびVL CDR1；VH CDR1、VH CDR2およびVL CDR2；VH CDR1、VH CDR2およびVL CDR3；VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR1、VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR2；VH CDR2、VH CDR2およびVL CDR3；VH CDR1、VL CDR1およびVL CDR2；VH CDR1、VL CDR1およびVL CDR3；VH CDR2、VL CDR1およびVL CDR2；VH CDR2、VL CDR1およびVL CDR3；VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR2；VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR3；VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR1；VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR2；VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR3；VH CDR1、VH CDR2、VL CDR1およびVL CDR2；VH CDR1、VH CDR2、VL CDR1およびVL CDR3；VH CDR1、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR2；VH CDR1、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR3；VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR2；VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR3；VH CDR2、VH CDR3、VL CDR2およびVL CDR3；VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR2；VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR3；VH CDR1、VH CDR2、VL CDR1、VL CDR2,およびVL CDR3；VH CDR1、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3；VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2,およびVL CDR3；または図３にリストしたVH CDRとVL CDRの任意の組み合わせ。
【００７２】
一実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、図３に開示した2A4(配列番号3)、2E7(配列番号19)、または12E2(配列番号27)に由来するVH CDR1のアミノ酸配列を有するVH CDR1、および図３に開示した2A4(配列番号6)、2E7(配列番号22)、または12E2(配列番号30)に由来するVL CDR1のアミノ酸配列を有するVL CDR1を含む。
【００７３】
別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、図３に開示した2A4(配列番号3)、2E7(配列番号19)、または12E2(配列番号27)に由来するVH CDR1のアミノ酸配列を有するVH CDR1、および図３に開示した2A4(配列番号7)、2E7(配列番号23)、または12E2(配列番号31)に由来するVL CDR2のアミノ酸配列を有するVL CDR2を含む。別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、図３に開示した2A4(配列番号3)、2E7(配列番号19)、または12E2(配列番号27)に由来するVH CDR1のアミノ酸配列を有するVH CDR1、および図３に開示した2A4(配列番号8)、2E7(配列番号24)、または12E2(配列番号32)に由来するVL CDR3のアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む。
【００７４】
一実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、図３に開示した2A4(配列番号4)、2E7(配列番号20)、または12E2(配列番号28)に由来するVH CDR2のアミノ酸配列を有するVH CDR2、および図３に開示した2A4(配列番号6)、2E7(配列番号22)、または12E2(配列番号30)に由来するVL CDR1のアミノ酸配列を有するVL CDR1を含む。別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、図３に開示した2A4(配列番号4)、2E7(配列番号20)、または12E2(配列番号28)に由来するVH CDR2のアミノ酸配列を有するVH CDR2、および図３に開示した2A4(配列番号7)、2E7(配列番号23)、または12E2(配列番号31)に由来するVL CDR2のアミノ酸配列を有するVL CDR2を含む。別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、図３に開示した2A4(配列番号4)、2E7(配列番号20)、または12E2(配列番号28)に由来するVH CDR2のアミノ酸配列を有するVH CDR2、および図３に開示した2A4(配列番号8)、2E7(配列番号24)、または12E2(配列番号32)に由来するVL CDR3のアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む。
【００７５】
一実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、図３に開示した2A4(配列番号5)、2E7(配列番号21)、または12E2(配列番号29)に由来するVH CDR3のアミノ酸配列を有するVH CDR3、および図３に開示した2A4(配列番号6)、2E7(配列番号22)、または12E2(配列番号30)に由来するVL CDR1のアミノ酸配列を有するVL CDR1を含む。別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、図３に開示した2A4(配列番号5)、2E7(配列番号21)、または12E2(配列番号29)に由来するVH CDR3のアミノ酸配列を有するVH CDR3、および図３に開示した2A4(配列番号7)、2E7(配列番号23)、または12E2(配列番号31)に由来するVL CDR2のアミノ酸配列を有するVL CDR2を含む。別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、図３に開示した2A4(配列番号5)、2E7(配列番号21)、または12E2(配列番号29)に由来するVH CDRのアミノ酸配列を有するVH CDR3、および図３に開示した2A4(配列番号8)、2E7(配列番号24)、または12E2(配列番号32)に由来するVL CDR3のアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む。
【００７６】
本発明は、図４に開示される2A4(配列番号1)、2E7(配列番号17)、もしくは12E2(配列番号25)のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる、EphA2に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合フラグメントを提供する。特定の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、図４に開示される2A4(配列番号37)、2E7(配列番号41)、または12E2(配列番号45)のVHドメインのヌクレオチド配列を有する核酸配列によってコードされるVHドメインを含む。別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、図４に開示される2A4(配列番号39)、2E7(配列番号43)、または12E2(配列番号47)のVLドメインのヌクレオチド配列を有する核酸配列によってコードされるVLドメインを含む。別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、図４に開示される2A4(配列番号37、39)、2E7(配列番号41、43)、または12E2(配列番号45、47)のVHドメインとVLドメインのヌクレオチド配列を有する核酸配列によってコードされるVHドメインとVLドメインを含む。
【００７７】
別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、図４に開示した2A4(配列番号3-5)、2E7(配列番号19-21)、または12E2(配列番号27-29)のVH CDRのヌクレオチド配列を有する核酸配列によってコードされるVH CDRを含む。別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、図４に開示した2A4(配列番号6-8)、2E7(配列番号22-24)、または12E2(配列番号31-32)のVL CDRのヌクレオチド配列を有する核酸配列によってコードされるVL CDRを含む。別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、図４に開示した2A4(配列番号3-8)、2E7(配列番号19-24)、または12E2(配列番号27-32)のVH CDRとVL CDRのヌクレオチド配列を有する核酸配列によってコードされるVH CDRとVL CDRを含む。
【００７８】
本発明は、EphA2に特異的に結合する本発明の抗体をコードする、通常は単離された、核酸分子を提供する。特に、本発明は、図３および図４に開示した2A4(配列番号2)、2E7(配列番号18)、または12E2(配列番号26)のアミノ酸配列を有するEphA2に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする、単離された核酸分子を提供する。一実施形態では、単離された核酸分子は、2A4(配列番号2)のアミノ酸配列を有する、EphA2に特異的に結合する抗体をコードする。別の実施形態では、単離された核酸分子は、2E7(配列番号18)のアミノ酸配列を有する、EphA2に特異的に結合する抗体をコードする。他の実施形態では、単離された核酸分子は、12E2(配列番号26)のアミノ酸配列を有する、EphA2に特異的に結合する抗体をコードする。
【００７９】
本発明は、図３に開示した2A4(配列番号38)、2E7(配列番号42)、または12E2(配列番号46)のVHドメインのアミノ酸配列を有するVHドメインを含む(あるいは、からなる)、EphA2に特異的に結合する抗体をコードする単離された核酸分子を提供する。一実施形態では、単離された核酸分子は、2A4(配列番号38)のVHドメインのアミノ酸配列を有するVHドメインを含む、EphA2に特異的に結合する抗体をコードする。別の実施形態では、単離された核酸分子は、2E7(配列番号42)のVHドメインのアミノ酸配列を有するVHドメインを含む、EphA2に特異的に結合する抗体をコードする。他の実施形態では、単離された核酸分子は、12E2 (配列番号46)のVHドメインのアミノ酸配列を有するVHドメインを含む、EphA2に特異的に結合する抗体をコードする。
【００８０】
本発明は、図３にリストしたVH CDR(配列番号3-6、11-13、19-21、および27-29)のいずれかのアミノ酸配列を有するVH CDRを含む(あるいは、からなる)、EphA2に特異的に結合する抗体をコードする単離された核酸分子を提供する。特に、本発明は、図３にリストしたVH CDR(配列番号3-5、11-13、19-21、および27-29)のいずれかのアミノ酸配列を有する1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上のVH CDRを含む、EphA2に特異的に結合する抗体をコードする単離された核酸分子を提供する。一実施形態では、単離された核酸分子は、図３にリストしたVH CDR1のアミノ酸配列を有するVH CDR1(配列番号3、11、19、および27)を含む、EphA2に特異的に結合する抗体をコードする。別の実施形態では、単離された核酸分子は、図３にリストしたVH CDR2(配列番号4、12、20、および28)のアミノ酸配列を有するVH CDR2を含む、EphA2に特異的に結合する抗体をコードする。別の実施形態では、単離された核酸分子は、図３にリストしたVH CDR3(配列番号5、13、21、および29)のアミノ酸配列を有するVH CDR3を含む、EphA2に特異的に結合する抗体をコードする。
【００８１】
本発明は、図３に開示した2A4、2E7、または12E2(配列番号40、44、および48)のVLドメインのアミノ酸配列を有するVLドメインを含む(あるいは、からなる)、EphA2に特異的に結合する抗体をコードする、単離された核酸分子を提供する。一実施形態では、単離された核酸分子は、2A4(配列番号40)のVLドメインのアミノ酸配列を有するVLドメインを含む、EphA2に特異的に結合する抗体をコードする。別の実施形態では、単離された核酸分子は、2E7(配列番号44)のVLドメインのアミノ酸配列を有するVLドメインを含む、EphA2に特異的に結合する抗体をコードする。他の実施形態では、単離された核酸分子は、12E2(配列番号48)のVLドメインのアミノ酸配列を有するVLドメインを含む、EphA2に特異的に結合する抗体をコードする。
【００８２】
本発明はまた、図３にリストしたVL CDR(配列番号3、11、19、および27)のいずれかのアミノ酸配列を有するVL CDRを含む(あるいは、からなる)EphA2に特異的に結合する抗体をコードする、単離された核酸分子も提供する。特に、本発明は、図３にリストしたVL CDR(配列番号6-8、14-16、22-24、および30-32)のいずれかのアミノ酸配列を有する1つ、2つ、3つ、またはそれ以上のVL CDRを含むEphA2に特異的に結合する抗体をコードする、単離された核酸分子を提供する。一実施形態では、単離された核酸分子は、図３にリストしたVL CDR1(配列番号6、14、22および30)のアミノ酸配列を有するVL CDR1を含む、EphA2に特異的に結合する抗体をコードする。別の実施形態では、単離された核酸分子は、図３にリストしたVL CDR2(配列番号7、15、23、および31)のアミノ酸配列を有するVL CDR2を含む、EphA2に特異的に結合する抗体をコードする。別の実施形態では、単離された核酸分子は、図３にリストしたVL CDR3(配列番号8、16、24、および32)のアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む、EphA2に特異的に結合する抗体をコードする。
【００８３】
本発明は、図３にリストしたVH CDRの1つ以上とVL CDRの1つ以上とを含む、EphA2に特異的に結合する抗体をコードする核酸分子を提供する。特に、本発明は、EphA2に特異的に結合する抗体をコードする単離された核酸分子を提供し、該抗体は、以下のVH CDRとVL CDRを含む(あるいは、からなる)：VH CDR1とVL CDR1；VH CDR1とVL CDR2；VH CDR1とVL CDR3；VH CDR2とVL CDR1；VH CDR2とVL CDR2；VH CDR2とVL CDR3；VH CDR3とVH CDR1；VH CDR3とVL CDR2；VH CDR3とVL CDR3；VH1 CDR1、VH CDR2およびVL CDR1；VH CDR1、VH CDR2およびVL CDR2；VH CDR1、VH CDR2およびVL CDR3；VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR1、VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR2；VH CDR2、VH CDR2およびVL CDR3；VH CDR1、VL CDR1およびVL CDR2；VH CDR1、VL CDR1およびVL CDR3；VH CDR2、VL CDR1およびVL CDR2；VH CDR2、VL CDR1およびVL CDR3；VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR2；VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR3；VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR1；VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR2；VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR3；VH CDR1、VH CDR2、VL CDR1およびVL CDR2；VH CDR1、VH CDR2、VL CDR1およびVL CDR3；VH CDR1、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR2；VH CDR1、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR3；VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR2；VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR3；VH CDR2、VH CDR3、VL CDR2およびVL CDR3；VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR2；VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR3；VH CDR1、VH CDR2、VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3；VH CDR1、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3；VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3；または図３にリストしたVH CDRとVL CDRの任意の組み合わせ。
【００８４】
本発明は、EphA2に特異的に結合する本明細書に記載のVHドメイン、VH CDR、VLドメインまたはVL CDRの誘導体を含む、EphA2に特異的に結合する抗体を提供する。当業者に公知の標準技術を用いて、本発明の抗体をコードするヌクレオチド配列中に変異(例えば、欠失、付加、および/または置換)を導入することが可能であり、このような標準技術としては、例えば、アミノ酸置換を生じさせる部位特異的突然変異誘発法およびPCR媒介変異誘発法が挙げられる。好ましくは、本発明の誘導体は、元の分子に対して、25個未満のアミノ酸置換、20個未満のアミノ酸置換、15個未満のアミノ酸置換、10個未満のアミノ酸置換、5個未満のアミノ酸置換、4個未満のアミノ酸置換、3個未満のアミノ酸置換、または2個未満のアミノ酸置換を含む。他の実施形態では、本発明の誘導体は、1つ以上の予測される非必須アミノ酸残基(すなわち、抗体がEphA2に特異的に結合するためには重要でないアミノ酸残基)においてなされた保存的アミノ酸置換を有する。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似した電荷を有する側鎖を含むアミノ酸残基と置き換えられる置換である。類似した電荷を有する側鎖を含むアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーは、以下の側鎖を有するアミノ酸を含む：塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β分岐側鎖(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)。別法として、変異は、例えば飽和突然変異誘発等によってコード配列の全部または一部に沿ってランダムに導入することが可能であり、得られた変異体を生物学的活性についてスクリーニングし、活性を保持している変異体を同定することができる。突然変異誘発後、コードされる抗体を発現させ、抗体の活性を測定することができる。
【００８５】
本発明は、軽鎖可変(VL)ドメインおよび/または重鎖可変(VH)ドメイン中に1つ以上のアミノ酸残基置換を有する2A4(配列番号2)、2E7(配列番号18)、または12E2(配列番号26)のアミノ酸配列を含む、EphA2に特異的に結合する抗体を提供する。本発明はまた、1つ以上のVL CDRおよび/または1つ以上のVH CDR中に1つ以上のアミノ酸残基置換を有する2A4(配列番号2)、2E7(配列番号18)、または12E2(配列番号26)のアミノ酸配列を含む、EphA2に特異的に結合する抗体も提供する。本発明はまた、1つ以上のVHフレームワークおよび/または1つ以上のVLフレームワーク中に1つ以上のアミノ酸残基置換を有する2A4(配列番号2)、2E7(配列番号18)、または12E2(配列番号26)のアミノ酸配列またはそのVHドメインおよび/もしくはVLドメインを含む、EphA2に特異的に結合する抗体も提供する。2A4、2E7、または12E2のVHドメイン、VH CDR、VLドメイン、VL CDRおよび/またはフレームワークに置換を導入することによって作製した抗体は、例えば、該抗体がEphA2に結合する能力、または該抗体がEphA2媒介細胞増殖を阻害しもしくは低下させる能力、該抗体がEphA2を作動するかもしくはEphA2と拮抗する能力、または該抗体が癌もしくはその症状を予防、治療および/もしくは改善する能力について、in vitroおよび/またはin vivoで試験することができる。
【００８６】
特定の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、2A4(配列番号1)、2E7(配列番号17)、または12E2(配列番号25)、またはその抗原結合フラグメントをコードするヌクレオチド配列に以下のハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む：ストリンジェントな条件下（例えば、6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中で約45℃でのフィルター結合DNAへのハイブリダイゼーション、次いで0.2×SSC/0.1％SDS中で約50〜65℃での1回以上の洗浄）、高度にストリンジェントな条件下（例えば、6×SSC中で約45℃でのフィルター結合核酸へのハイブリダイゼーション、次いで0.1×SSC/0.2％SDS中で約68℃での1回以上の洗浄）、あるいは当業者に公知の他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下(例えば、Ausubel, F. M.ら編, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, Green Publishing Associates, Inc.およびJohn Wiley & Sons, Inc., New York 6.3.1-6.3.6および2.10.3頁を参照のこと)。
【００８７】
別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、2A4(配列番号37および39)、2E7(配列番号41および43)、または12E2(配列番号45および47)のVHドメインもしくはVLドメインをコードするヌクレオチド配列に、本明細書中に記載のストリンジェントな条件下で、または当業者に公知の他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列にコードされるVHドメインのアミノ酸配列またはVLドメインのアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、2A4(配列番号37および39)、2E7(配列番号41および43)、または12E2(配列番号45および47)のVHドメインおよびVLドメインをコードするヌクレオチド配列に、本明細書中に記載のストリンジェントな条件下で、または当業者に公知の他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列にコードされるVHドメインのアミノ酸配列およびVLドメインのアミノ酸配列を含む。
【００８８】
別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、図３にリストしたVH CDRまたはVL CDR(配列番号49-72)のいずれかをコードするヌクレオチド配列に、本明細書中に記載のストリンジェントな条件下で、または当業者に公知の他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列にコードされるVH CDRのアミノ酸配列またはVL CDRのアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、図３にリストしたVH CDR(配列番号49-51、55-57、61-63、および67-69)のいずれかならびに図３にリストしたVL CDR(配列番号52-54、58-60、64-66、および70-72)のいずれかをコードするヌクレオチド配列に、本明細書中に記載のストリンジェントな条件下で、または当業者に公知の他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列にコードされるVH CDRのアミノ酸配列(配列番号3-5、11-13、19-21、および27-29)、ならびにVL CDRのアミノ酸配列(配列番号6-8、14-16、22-24、および30-32)を含む。
【００８９】
別の実施形態では、本発明は、2A4のVHドメインおよび/またはVLドメインのヌクレオチド配列(配列番号37および39)にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列にコードされるVHドメインおよび/またはVLドメインを含む、EphA2に特異的に結合する抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、2A4のVH CDR(配列番号55-57)および/またはVL CDR(配列番号58-60)のヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列にコードされるVH CDRおよび/またはVL CDRを含む、EphA2に特異的に結合する抗体を提供する。
【００９０】
別の実施形態では、本発明は、2E7のVHドメインおよび/またはVLドメインのヌクレオチド配列(配列番号41および43)にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列にコードされるVHドメインおよび/またはVLドメインを含む、EphA2に特異的に結合する抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、2E7のVH CDR(配列番号61-63)および/またはVL CDR(配列番号64-66)のヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列にコードされるVH CDRおよび/またはVL CDRを含む、EphA2に特異的に結合する抗体を提供する。
【００９１】
別の実施形態では、本発明は、12E2のVHドメインおよび/またはVLドメインのヌクレオチド配列(配列番号45および47)にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列にコードされるVHドメインおよび/またはVLドメインを含む、EphA2に特異的に結合する抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、12E2のVH CDR(配列番号67-69)および/またはVL CDR(配列番号70-72)のヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列にコードされるVH CDRおよび/またはVL CDRを含む、EphA2に特異的に結合する抗体を提供する。
【００９２】
特定の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、2A4(配列番号2)、2E7(配列番号18)、または12E2(配列番号26)、またはその抗原結合フラグメントのアミノ酸配列と、少なくとも35％、好ましくは少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、2A4(配列番号38)、2E7(配列番号42)、または12E2(配列番号46)のVHドメインと、少なくとも35％、好ましくは少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一のVHドメインのアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、2A4(配列番号40)、2E7(配列番号44)、または12E2(配列番号48)のVLドメインと、少なくとも35％、好ましくは少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一のVLドメインのアミノ酸配列を含む。
【００９３】
別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、図３にリストしたVL CDR(配列番号6-8、14-16、22-24、および30-32)のいずれかと、少なくとも35％、好ましくは少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一の、1つ以上のVL CDRのアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、図３にリストしたVL CDR(配列番号6-8、14-16、22-24、および30-32)のいずれかと、少なくとも35％、好ましくは少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一の、1つ以上のVL CDRのアミノ酸配列を含む。
【００９４】
別の実施形態では、本発明は、2A4をコードするヌクレオチド配列(配列番号1)と、少なくとも65％、好ましくは少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一のヌクレオチド配列にコードされる、EphA2に特異的に結合する抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、2A4のVHドメインおよび/またはVLドメインのヌクレオチド配列(配列番号37および39)と、少なくとも65％、好ましくは少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一のヌクレオチド配列にコードされるVHドメインおよび/またはVLドメインを含む、EphA2に特異的に結合する抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、2A4のVH CDR(配列番号56-58)および/またはVL CDR(配列番号58-60)のヌクレオチド配列と、少なくとも65％、好ましくは少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一のヌクレオチド配列にコードされるVH CDRおよび/またはVL CDRを含む、EphA2に特異的に結合する抗体を提供する。
【００９５】
別の実施形態では、本発明は、2E7をコードするヌクレオチド配列(配列番号17)と、少なくとも65％、好ましくは少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一のヌクレオチド配列にコードされる、EphA2に特異的に結合する抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、2E7のVHドメインおよび/またはVLドメインのヌクレオチド配列(配列番号41および43)と、少なくとも65％、好ましくは少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一のヌクレオチド配列にコードされるVHドメインおよび/またはVLドメインを含む、EphA2に特異的に結合する抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、2E7のVH CDR(配列番号61-63)および/またはVL CDR(配列番号64-66)のヌクレオチド配列と、少なくとも65％、好ましくは少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一のヌクレオチド配列にコードされるVH CDRおよび/またはVL CDRを含む、EphA2に特異的に結合する抗体を提供する。
【００９６】
別の実施形態では、本発明は、12E2をコードするヌクレオチド配列(配列番号25)と、少なくとも65％、好ましくは少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一のヌクレオチド配列にコードされる、EphA2に特異的に結合する抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、12E2のVHドメインおよび/またはVLドメインのヌクレオチド配列(配列番号45および47)と、少なくとも65％、好ましくは少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一のヌクレオチド配列にコードされるVHドメインおよび/またはVLドメインを含む、EphA2に特異的に結合する抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、12E2のVH CDR(配列番号67-69)および/またはVL CDR(配列番号70-72)のヌクレオチド配列と、少なくとも65％、好ましくは少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一のヌクレオチド配列にコードされるVH CDRおよび/またはVL CDRを含む、EphA2に特異的に結合する抗体を提供する。
【００９７】
本発明は、EphA2への結合について、本明細書に記載される抗体と競合する抗体を包含する。特に、本発明は、2A4、2E7、または12E2またはその抗原結合フラグメントと、EphA2への結合について競合する抗体を包含する。特定の実施形態では、本発明は、2A4、2E7、または12E2のEphA2への結合を、本明細書中に記載される競合アッセイまたは当技術分野で周知の競合アッセイにおいて、PBSなどの対照と比較して、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％もしくはそれ以上、または25％〜50％、45〜75％、もしくは75〜99％低下させる抗体を包含する。別の実施形態では、本発明は、2A4、2E7、または12E2のEphA2への結合を、ELISA競合アッセイにおいて、PBSなどの対照と比較して、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％もしくはそれ以上、または25％〜50％、45〜75％、もしくは75〜99％低下させる抗体を包含する。
【００９８】
一実施形態では、本発明は、2A4のEphA2への結合を、ELISA競合アッセイにおいて、PBSなどの対照と比較して、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％もしくはそれ以上、または25％〜50％、45〜75％、もしくは75〜99％低下させる抗体を包含する。別の実施形態では、本発明は、2E7のEphA2への結合を、ELISA競合アッセイにおいて、PBSなどの対照と比較して、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％もしくはそれ以上、または25％〜50％、45〜75％、もしくは75〜99％低下させる抗体を包含する。別の実施形態では、本発明は、12E2のEphA2への結合を、ELISA競合アッセイにおいて、PBSなどの対照と比較して、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％もしくはそれ以上、または25％〜50％、45〜75％、もしくは75〜99％低下させる抗体を包含する。
【００９９】
別の実施形態では、本発明は、2A4、2E7、または12E2の抗原結合フラグメント(例えば、VHドメイン、VH CDR、VLドメインまたはVL CDR)を含む(あるいは、からなる)抗体のEphA2への結合を、本明細書中に記載の競合アッセイまたは当業者に周知の競合アッセイにおいて、PBSなどの対照と比較して、少なくとも25％、好ましくは少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％もしくはそれ以上、または25％〜50％、45〜75％、もしくは75〜99％低下させる抗体を包含する。別の実施形態では、本発明は、2A4、2E7、または12E2の抗原結合フラグメント(例えば、VHドメイン、VLドメイン、VH CDR、またはVL CDR)を含む(あるいは、からなる)抗体のEphA2への結合を、ELISA競合アッセイにおいて、PBSなどの対照と比較して、少なくとも25％、好ましくは少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％もしくはそれ以上、または25％〜50％、45〜75％、もしくは75〜99％低下させる抗体を包含する。
【０１００】
一実施形態では、本発明は、2A4の抗原結合フラグメントを含む(あるいは、からなる)抗体のEphA2への結合を、ELISA競合アッセイにおいて、PBSなどの対照と比較して、少なくとも25％、好ましくは少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％もしくはそれ以上、または25％〜50％、45〜75％、もしくは75〜99％低下させる抗体を包含する。一実施形態では、本発明は、2E7の抗原結合フラグメントを含む(あるいは、からなる)抗体のEphA2への結合を、ELISA競合アッセイにおいて、PBSなどの対照と比較して、少なくとも25％、好ましくは少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％もしくはそれ以上、または25％〜50％、45〜75％、もしくは75〜99％低下させる抗体を包含する。一実施形態では、本発明は、12E2の抗原結合フラグメントを含む(あるいは、からなる)抗体のEphA2への結合を、ELISA競合アッセイにおいて、PBSなどの対照と比較して、少なくとも25％、好ましくは少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％もしくはそれ以上、または25％〜50％、45〜75％、もしくは75〜99％低下させる抗体を包含する。
【０１０１】
本発明は、2A4、2E7、または12E2のVHドメインと、EphA2に対する結合について競合するVHドメインを含む(あるいは、からなる)ポリペプチドまたはタンパク質を包含する。本発明はまた、2A4、2E7、または12E2のVLドメインと、EphA2に対する結合について競合するVLドメインを含む(あるいは、からなる)ポリペプチドまたはタンパク質を包含する。
【０１０２】
本発明は、図３にリストしたVH CDR(配列番号3-5、11-13、19-21、および27-29)と、EphA2に対する結合について競合するVH CDRを含む(あるいは、からなる)ポリペプチドまたはタンパク質を包含する。本発明はまた、図３にリストしたVL CDR(配列番号6-8、14-16、22-24、および30-32)と、EphA2に対する結合について競合するVL CDRを含む(あるいは、からなる)ポリペプチドまたはタンパク質も包含する。
【０１０３】
EphA2に特異的に結合する抗体は、改変された（すなわち、共有結合となるような任意のタイプの分子の抗体への共有結合による）誘導体を含む。例えば、限定するものではないが、本発明の抗体誘導体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基/ブロック基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質との結合等によって改変された抗体を含む。公知の技術により、多数の化学修飾のいずれかを行うことが可能であり、例えば、限定するものではないが、特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成等が挙げられる。さらに、本発明の誘導体は1種以上の非古典的アミノ酸を含み得る。
【０１０４】
本発明はまた、当業者に公知のフレームワーク領域(例えば、ヒトまたは非ヒトフレームワーク)を含む、EphA2に特異的に結合する抗体も提供する。本発明のフレームワーク領域は、天然のフレームワーク領域またはコンセンサスフレームワーク領域であってよい。好ましくは、本発明の抗体のフラグメント領域は、ヒトのフラグメント領域である(例えば、ヒトフレームワーク領域のリストについては、Chothiaら, 1998, J. Mol. Biol. 278:457-479を参照されたい。この文献の内容は全て参照として本明細書に組み込まれる)。
【０１０５】
本発明は、フレームワーク領域中に変異(例えば、1つ以上のアミノ酸置換)を有する2A4、2E7、または12E2のアミノ酸配列を含む、EphA2に特異的に結合する抗体を包含する。ある実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、VHドメインおよび/またはVLドメインのフレームワーク領域中に1つ以上のアミノ酸残基置換を有する2A4、2E7、または12E2のアミノ酸配列を含む。好ましくは、フレームワーク領域中のアミノ酸置換は、本発明の抗体のEphA2への結合を高めるものである。
【０１０６】
本発明はまた、可変領域およびフレームワーク領域中に変異(例えば、1つ以上のアミノ酸残基置換)を有する2A4、2E7、または12E2のアミノ酸配列(配列番号2、18、および26)を含む、EphA2に特異的に結合する抗体を包含する。好ましくは、可変領域およびフレームワーク領域中の上記のアミノ酸置換は、本発明の抗体のEphA2への結合を高めるものである。
【０１０７】
本発明はまた、当業者に公知の定常領域を含む本発明の抗体も提供する。好ましくは、本発明の抗体またはそのフラグメントの定常領域は、ヒトの定常領域である。
【０１０８】
本発明は、EphA2に対して高い結合親和性を有する抗体を提供する。特定の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、少なくとも105 M-1s-1、少なくとも1.5x105 M-1s-1、少なくとも2x105 M-1s-1、少なくとも2.5x105 M-1s-1、少なくとも5x105 M-1s-1、少なくとも10x6 M-1s-1、少なくとも5x106 M-1s-1、少なくとも107 M-1s-1、少なくとも5x107 M-1s-1、または少なくとも108 M-1s-1、または105〜108 M-1s-1、1.5x105 M-1s-1〜1x107 M-1s-1、2x105〜1x106 M-1s-1、または4.5x105の結合速度定数、すなわち
kon速度（抗体(Ab)＋抗原(Ag) kon → Ab-Ag）
を有する。別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、BIAcoreアッセイで測定すると、少なくとも2x105 M-1s-1、少なくとも2.5x105 M-1s-1、少なくとも5x105 M-1s-1、少なくとも106 M-1s-1、少なくとも5x106 M-1s-1、少なくとも107 M-1s-1、少なくとも5x107 M-1s-1、または少なくとも108 M-1s-1のkonを有する。別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、BIAcoreアッセイで測定すると、多くとも108 M-1s-1、多くとも109 M-1s-1、多くとも1010 M-1s-1、多くとも1011 M-1s-1、または多くとも1012 M-1s-1のkonを有する。これらの実施形態によれば、このような抗体は、2A4、2E7、または12E2のVHドメインおよび/またはVLドメインを含み得る。
【０１０９】
別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、10-3 s-1未満、5x10-3 s-1未満、104 s-1未満、2x104 s-1未満、5x10-4 s-1未満、10-5 s-1未満、5x10-5 s-1未満、10-6 s-1未満、5x10-6 s-1未満、10-7 s-1未満、5x10-7 s-1未満、10-8 s-1未満、5x10-8 s-1未満、10-9 s-1未満、5x10-9 s-1未満、もしくは10-10 s-1未満、または10-3〜10-10 s-1、10-4〜10-8 s-1、もしくは10-5〜10-8 s-1未満の解離速度定数、すなわち
2009521219.tif 000005
を有する。一実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、BIAcoreアッセイで測定すると、10-5 s-1、5x10-5 s-1未満、10-6 s-1未満、5x10-6 s-1未満、10-7 s-1未満、5x10-7 s-1未満、10-8 s-1未満、5x10-8 s-1未満、10-9 s-1未満、5x10-9 s-1未満、または10-1 s-1未満の解離速度定数(koff)を有する。別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、10-13 s-1以上、10-12 s-1以上、10-11 s-1以上、10-10 s-1以上、10-9 s-1以上、または10-8 s-1以上のkoffを有する。これらの実施形態によれば、このような抗体は、2A4、2E7、または12E2のVHドメインおよび/またはVLドメインを含み得る。
【０１１０】
別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、少なくとも102 M-1、少なくとも5x102 M-1、少なくとも103 M-1、少なくとも5x103 M-1、少なくとも104 M-1、少なくとも5x104 M-1、少なくとも105 M-1、少なくとも5x105 M-1、少なくとも106 M-1、少なくとも5x106 M-1、少なくとも107 M-1、少なくとも5x107 M-1、少なくとも108 M-1、少なくとも5x108 M-1、少なくとも109 M-1、少なくとも5x109 M-1、少なくとも1010 M-1、少なくとも5x1010 M-1、少なくとも1011 M-1、少なくとも5x1011 M-1、少なくとも1012 M-1、少なくとも5x1012 M-1、少なくとも1013 M-1、少なくとも5x1013 M-1、少なくとも1014 M-1、少なくとも5x1014 M-1、少なくとも1015 M-1、もしくは少なくとも5x1015 M-1、または102〜5x105 M-1、1014〜1x1010 M-1、もしくは105〜1x108 M-1の親和定数、すなわちKa(kon/koff)を有する。別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、多くとも1011 M-1、多くとも5x1011 M-1、多くとも1012 M-1、多くとも5x1012 M-1、多くとも1013 M-1、多くとも5x1013 M-1、多くとも1014 M-1、または多くとも5x1014 M-1のKaを有する。
【０１１１】
別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、10-5 M未満、5x10-5 M未満、10-6 M未満、5x10-6 M未満、10-7 M未満、5x10-7 M未満、10-8 M未満、5x10-8 M未満、10-9 M未満、5x10-9 M未満、10-10 M未満、5x10-10 M未満、10-11 M未満、5x10-11 M未満、10-12 M未満、5x10-12 M未満、10-13 M未満、5x10-13 M未満、10-14 M未満、5x10-14 M未満、10-15 M未満、もしくは5x10-15 M、または10-2 M〜5x10-5 M、10-6〜10-15 M、もしくは10-8〜10-14 M未満の解離定数すなわちKd(koff/kon)を有する。別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、BIAcoreアッセイで測定すると、10-9 M未満、5x10-9 M未満、10-10 M未満、5x10-10 M未満、1x10-11 M未満、5x10-11 M未満、1x10-12 M未満、5x10-12 M未満、10-13 M未満、5x10-13 M未満または1x10-14 M、もしくは10-9 M〜10-14 M未満のKdを有する。別の実施形態では、EphA2に特異的に結合する抗体は、10-9 M以上、5x10-9 M以上、10-10 M以上、5x10-10 M以上、10-11 M以上、5x10-11 M以上、10-12 M以上、5x10-12 M以上、6x10-12 M以上、10-13 M以上、5x10-13 M以上、10-14 M以上、5x10-14 M以上、または10-9 M〜10-14 M以上のKdを有する。これらの実施形態によれば、このような抗体は、2A4、2E7、または12E2のVHドメインおよび/またはVLドメインを含み得る。
【０１１２】
本発明は、本明細書に記載される抗体の1つ以上の可変領域または超可変領域を含む、ペプチド、ポリペプチドおよび/またはタンパク質を提供する。好ましくは、本発明の抗体の1つ以上の可変領域または超可変領域を含むペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、異種アミノ酸配列をさらに含む。特定の実施形態では、このような異種アミノ酸配列は、少なくとも5個連続したアミノ酸残基、少なくとも10個連続したアミノ酸残基、少なくとも15個連続したアミノ酸残基、少なくとも20個連続したアミノ酸残基、少なくとも25個連続したアミノ酸残基、少なくとも30個連続したアミノ酸残基、少なくとも40個連続したアミノ酸残基、少なくとも50個連続したアミノ酸残基、少なくとも75個連続したアミノ酸残基、少なくとも100個連続したアミノ酸残基、またはそれ以上連続したアミノ酸残基を含む。このようなペプチド、ポリペプチドおよび/またはタンパク質は、融合タンパク質と呼ぶこともできる。
【０１１３】
特定の実施形態では、本発明の抗体の1つ以上の可変領域または超可変領域を含むペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、10アミノ酸残基、15アミノ酸残基、20アミノ酸残基、25アミノ酸残基、30アミノ酸残基、35アミノ酸残基、40アミノ酸残基、45アミノ酸残基、50アミノ酸残基、75アミノ酸残基、100アミノ酸残基、125アミノ酸残基、150アミノ酸残基、またはそれ以上のアミノ酸残基の長さである。ある実施形態では、本発明の抗体の1つ以上の可変領域または超可変領域を含むペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、EphA2に特異的に結合する。他の実施形態では、本発明の抗体の1つ以上の可変領域または超可変領域を含むペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、EphA2に特異的に結合しない。
【０１１４】
特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される抗体の1つのVHドメインおよび/またはVLドメイン(図3および図4)を含むペプチド、ポリペプチドおよび/またはタンパク質を提供する。別の実施形態では、本発明は、図３にリストしたCDRのいずれかのアミノ酸配列を有する1つ以上のCDRを含むペプチド、ポリペプチドおよび/またはタンパク質を提供する。これらの実施形態によれば、上記のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、異種アミノ酸配列をさらに含み得る。
【０１１５】
1つ以上の可変領域または超可変領域を含むペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、例えば、抗イディオタイプ抗体の産生において役立ち、この抗体は、疾患または障害（例えば癌）に関連する1つ以上の症状を予防、治療および/または改善するために使用し得る。産生された上記の抗イディオタイプ抗体は、抗イディオタイプ抗体の産生に用いられるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に含まれる可変領域または超可変領域を含む抗体を検出するために、イムノアッセイ（例えば、ELISAなど）で使用することもできる。
【０１１６】
本発明の方法で使用する抗体としては、限定するものではないが、モノクローナル抗体、合成抗体、多重特異性抗体(二重特異性抗体を含む)、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖Fv(scFv)(二重特異性scFvを含む)、一本鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab')フラグメント、ジスルフィド結合Fv(sdFv)、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントが挙げられる。特に、本発明の方法において使用する抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、EphA2に特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を含み、またEphA2のアゴニストであり、かつ/または非癌細胞ではなく癌細胞上に露出したEphA2エピトープと選択的に結合する。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意の種類(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgAおよびIgY)、任意のクラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2)または任意のサブクラスであってよい。
【０１１７】
特定の実施形態では、本発明の方法に使用する抗体は、標的の抗原特異的除去にT細胞を再誘導することができる二重特異性T細胞エンゲージャー(Bispecific T cell Engager(BiTE))である。BiTE分子は、この分子の一端でT細胞抗原(例えばCD3)に結合する抗原結合ドメインと、標的細胞上の抗原に結合する抗原結合ドメインとを有する。BiTE分子は、最近では国際公開公報WO 99/54440に記載されており、その全内容を参照として本明細書に組み込むものとする。この公報には、CD19抗原およびCD3抗原(CD19xCD3)への結合部位を含む新規な一本鎖の多機能性ポリペプチドが記載されている。この分子は、B細胞上のCD19に結合する抗体とT細胞上のCD3に結合する抗体の2つの抗体に由来していた。これらの異なる抗体の可変領域をポリペプチド配列によって結合することにより単一の分子を作製する。重鎖可変(VH)ドメインと軽鎖可変(VL)ドメインとをフレキシブルリンカーで結合し、一本鎖の二重特異性抗体を作製することも記載されている。EphA2を標的とするBiTE分子は、2005年12月21日に出願した米国特許出願第60/753,368号、発明の名称「EphA2 BiTE分子およびその使用（EphA2 BiTE Molecules And Uses Thereof）」、代理人整理番号10271-175-888に記載されており、その全内容を参照として本明細書に組み込むものとする。
【０１１８】
本発明の実施形態において、対象のポリペプチド(例えば、Eph受容体および/またはエフリン)に特異的に結合する抗体またはリガンドは、BiTE分子の一部を構成する。例えば、対象のポリペプチド(例えば、Eph受容体および/またはエフリン)に結合する抗体のVHおよび/またはVL(例えばscFV)を抗CD3結合部分（例えば、上記の分子の抗CD3結合部分）と融合させることにより、対象のポリペプチド(例えば、Eph受容体および/またはエフリン)を標的とするBiTE分子を作製することができる。対象のポリペプチド(例えば、Eph受容体および/またはエフリン)に対する抗体の重鎖可変ドメインおよび/または軽鎖可変ドメインに加えて、対象のポリペプチド(例えば、Eph受容体および/またはエフリン)に結合する他の分子が本発明のBiTE分子を構成し得る。別の実施形態では、本発明のBiTE分子は、他のT細胞抗原(CD3以外)に結合する分子を含んでいてもよい。例えば、CD2、CD4、CD8、CD11a、TCR、およびCD28等のT細胞抗原に特異的に結合するリガンドおよび/または抗体は、本発明の一部であると考えられる。このリストは網羅的なものではなく、T細胞抗原に特異的に結合できる他の分子がBiTE分子の一部として使用され得ることを単に例示するものである。これらの分子は、抗体または天然リガンド(例えば、天然リガンドがCD3であるLFA3)のVH部分および/またはVL部分を含み得る。
【０１１９】
本発明の方法で使用する抗体は、鳥および哺乳動物(例えば、ヒト、マウス、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ)を含めて、どのような動物起源のものであってもよい。好ましくは、本発明の抗体は、ヒトモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体である。本明細書において使用する「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、またヒト免疫グロブリンライブラリーから、またはヒト遺伝子に由来する抗体を発現するマウスもしくは他の動物から、単離された抗体を包含する。
【０１２０】
本発明の方法で使用する抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性またはこれ以上の多重特異性であってよい。多重特異性抗体は、EphA2ポリペプチドの様々なエピトープに特異的に結合することが可能であり、あるいは、EphA2ポリペプチドと異種エピトープ（例えば、異種ポリペプチドまたは固相担体材料）の両方に特異的に結合することができる。例えば、国際公開WO 93/17715、WO 92/08802、WO 91/00360、およびWO 92/05793；Tuttら, 1991, J. Immunol. 147:60-69；米国特許第4,474,893号、第4,714,681号、第4,925,648号、第5,573,920号、および第5,601,819号；ならびにKostelnyら, 1992, J. Immunol. 148:1547-1553を参照のこと。
【０１２１】
特定の実施形態では、本発明の方法で使用する抗体は、2A4、2E7もしくは12E2、またはその抗原結合フラグメント(例えば、上記の本発明の抗体の1つ以上の相補性決定領域(CDR)、例えば表1参照)である。別の実施形態では、本発明の方法で使用するアゴニスト抗体は、2A4、2E7、または12E2のいずれかと同じエピトープに結合し、あるいは、例えばELISAアッセイにおいて、2A4、2E7、または12E2のいずれかと、EphA2への結合について競合する。
【０１２２】
本発明はまた、当業者に公知のフレームワーク領域を含む本発明の抗体またはそのフラグメントも提供する。特定の実施形態では、本発明の抗体またはそのフラグメントは、ヒトフレームワーク領域を含む。好ましくは、本発明の抗体またはそのフラグメントは、ヒトのもしくはヒト化された抗体またはフラグメントである。特定の実施形態では、本発明の抗体またはそのフラグメントは、2A4、2E7、もしくは12E2のいずれか(または非癌細胞ではなく癌細胞上に露出したEphA2エピトープと選択的に結合する他のEphA2アゴニスト抗体もしくはEphA2抗体)に由来する1つ以上のCDRを含み、EphA2に結合し、また好ましくは、EphA2をアゴナイズ（作動）し、かつ/または非癌細胞ではなく癌細胞上に露出したEphA2エピトープと選択的に結合する。
【０１２３】
本発明は、ラクダ化単一ドメイン抗体などの単一ドメイン抗体を包含する。(例えば、Muyldermansら, 2001, Trends Biochem. Sci. 26:230； Nuttallら, 2000, Cur. Pharm. Biotech. 1:253； ReichmannおよびMuyldermans, 1999, J. Immunol. Meth. 231:25；国際公開WO 94/04678およびWO 94/25591；米国特許第6,005,079号を参照；これらの文献の全内容を参照として本明細書に組み込むものとする)。一実施形態では、本発明は、単一ドメイン抗体が形成されるような改変を有する、2A4、2E7、もしくは12E2(配列番号38、42、および46)(または非癌細胞ではなく癌細胞上に露出したEphA2エピトープと選択的に結合する他のEphA2アゴニスト抗体もしくはEphA2抗体)のVHドメインのいずれかのアミノ酸配列を有する2つのVHドメインを含む単一ドメイン抗体を提供する。別の実施形態では、本発明はまた、2A4、2E7、または12E2(配列番号3-5、19-21、および27-29)(または非癌細胞ではなく癌細胞上に露出したEphA2エピトープと選択的に結合する他のEphA2アゴニスト抗体もしくはEphA2抗体)のVH CDRを1つ以上含有している2つのVHドメインを含む単一ドメイン抗体も提供する。
【０１２４】
本発明の方法はまた、哺乳動物（好ましくはヒト）における半減期(例えば、血清半減期)が15日以上、好ましくは20日以上、25日以上、30日以上、35日以上、40日以上、45日以上、2ヶ月以上、3ヶ月以上、4ヶ月以上、または5ヶ月以上である抗体またはそのフラグメントの使用も包含する。哺乳動物（好ましくはヒト）における本発明の抗体またはそのフラグメントの半減期の増大は、該哺乳動物中で、該抗体または抗体フラグメントのより高い血清力価をもたらし、これにより、該抗体または抗体フラグメントの投与頻度を低減させ、かつ/または投与する該抗体または抗体フラグメントの濃度を低減させる。増大したin vivo半減期を有する抗体またはそのフラグメントは、当業者に公知の技術によって作製することができる。例えば、増大したin vivo半減期を有する抗体またはそのフラグメントは、FcドメインとFcRn受容体との相互作用に関与することが確認されているアミノ酸残基を改変する(例えば、置換、欠失または付加する)ことによって作製することができる(例えば、国際公開WO 97/34631およびWO 02/060919、ならびに米国特許出願公開第2003/0190311号を参照のこと。各文献の内容を参照として本明細書に組み込む)。増大したin vivo半減期を有する抗体またはそのフラグメントは、該抗体または抗体フラグメントにポリマー分子（例えば、高分子量ポリエチレングリコール(PEG))を結合させることによって作製することができる。PEGは、多機能性リンカーを用いてあるいは用いることなく、該抗体または抗体フラグメントのN末端もしくはC末端へのPEGの部位特異的コンジュゲーションにより、あるいはリシン残基上に存在するε-アミノ基を介して、該抗体または抗体フラグメントに結合することができる。生物学的活性の低下を最小限にする、直鎖または分岐鎖ポリマーの誘導体化が用いられる。コンジュゲーションの程度は、SDS-PAGEおよび質量分析法によって厳密にモニターし、抗体へのPEG分子の適切なコンジュゲーションを確実にする。未反応のPEGは、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーによって、抗体-PEGコンジュゲートから分離することができる。
【０１２５】
本発明はまた、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害活性が高められたFc変異体である抗体も包含する。このようなFc変異体抗体の非限定的な例は、米国特許出願第11/203,253号(2005年8月15日出願)および第11/203,251号(2005年8月15日出願)、ならびに米国仮特許出願第60/674,674号(2005年4月26日出願)および第60/713,711号(2005年9月6日出願)に開示されており、各文献の内容を参照として本明細書に組み込むものとする。
【０１２６】
本発明はまた、フレームワーク領域または可変領域中に変異(例えば、1つ以上のアミノ酸置換)を有する、2A4、2E7、または12E2の一方または両方の可変ドメインのアミノ酸配列(配列番号38、40、42、44、46、および48)を含む抗体または抗体フラグメントの使用を包含する。好ましくは、これらの抗体中の変異は、上記の抗体が特異的に結合する特定の抗原に対する抗体の結合力および/または親和性を維持し、あるいは高める。当業者に公知の標準技術(例えば、イムノアッセイ)を、特定の抗原に対する抗体の親和性を分析するために使用することができる。
【０１２７】
当業者に公知の標準技術は、抗体またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列中に変異を導入するために使用することが可能であり、例えば、アミノ酸置換を生じさせる、部位特異的突然変異誘発法およびPCR媒介変異誘発法が挙げられる。好ましくは、本発明の誘導体は、元の抗体またはそのフラグメントと比較して、15個未満のアミノ酸置換、10個未満のアミノ酸置換、5個未満のアミノ酸置換、4個未満のアミノ酸置換、3個未満のアミノ酸置換、または2個未満のアミノ酸置換を含む。他の実施形態では、本発明の誘導体は、1つ以上の予測される非必須アミノ酸残基においてなされた保存的アミノ酸置換を有する。
【０１２８】
5.1.1  抗体コンジュゲート
本発明の方法において使用する抗体は、例えば本発明の抗体へのある種の分子の共有結合によって、修飾された誘導体を含む。例えば、限定するものではないが、本発明の抗体誘導体は、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基/ブロック基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質との結合などによって修飾された抗体を含む。多数の化学修飾のいずれも、公知の技術（例えば、特異的な化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含むが、これらに限定されない）によって行うことができる。さらに、この誘導体は、1つ以上の非古典的アミノ酸を含み得る。
【０１２９】
本発明は、異種ポリペプチド(またはその部分、好ましくは少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、または少なくとも100アミノ酸のポリペプチド)と、融合タンパク質を生成するように組換え融合させたまたは化学的にコンジュゲート(共有結合も非共有結合も含む)させた抗体またはそのフラグメントの使用を含む。融合は、必ずしも直接的でなくてよく、リンカー配列を介していてもよい。例えば、抗体は、その抗体を特定の細胞表面受容体に特異的な抗体と融合またはコンジュゲートさせることにより、in vitroまたはin vivoで異種ポリペプチドを特定の細胞型にターゲッティングするために、使用することができる。異種ポリペプチドに融合またはコンジュゲートさせた抗体は、当技術分野で公知の方法を使用するin vitroイムノアッセイおよび精製法で使用することもできる。例えば、国際公開WO 93/21232；EP 439,095；Naramuraら, 1994, Immunol. Lett. 39:91-99；米国特許第5,474,981号；Gilliesら, 1992, PNAS 89:1428-1432；およびFellら, 1991, J. Immunol. 146:2446-2452を参照のこと。これらの文献の内容は、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。ある実施形態では、検出、治療、管理、またはモニターすべき疾患がEphA2を過剰発現する悪性の癌である。他の実施形態では、検出、治療、管理、またはモニターすべき疾患がEphA2を過剰発現する細胞を伴う前癌状態である。特定の実施形態では、前癌状態は、ハイグレード前立腺上皮内腫瘍(PIN)、乳房の線維腺腫、線維嚢胞症、または複合母斑である。
【０１３０】
本発明はさらに、抗体フラグメントと融合またはコンジュゲートさせた異種ポリペプチドを含む組成物を含む。例えば、異種ポリペプチドは、Fabフラグメント、Fdフラグメント、Fvフラグメント、F(ab)2フラグメント、もしくはこれらの一部分と融合またはコンジュゲートさせることができる。ポリペプチドを抗体の一部と融合またはコンジュゲートさせる方法は、当技術分野で公知である。例えば、米国特許第5,336,603号、第5,622,929号、第5,359,046号、第5,349,053号、第5,447,851号、および第5,112,946号；EP 307,434；EP 367,166；国際公開WO 96/04388およびWO 91/06570；Ashkenaziら, 1991, PNAS 88:10535-10539；Zhengら, 1995, J. Immunol. 154:5590-5600；およびVilら, 1992, PNAS 89:11337-11341を参照のこと(前記文献を参照として本明細書に組み込む)。
【０１３１】
例えば、2A4、2E7、および12E2抗体(または他のいずれかのEphA2アゴニスト抗体もしくは非癌細胞でなく癌細胞上で露出しているEphA2エピトープに選択的に結合するEphA2抗体)のいずれかの、さらなる融合タンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフ・シャッフリング、エキソン・シャッフリング、および/またはコドン・シャッフリング(総称して「DNAシャッフリング」と呼ぶ)の技法によって生成することができる。DNAシャッフリングを使用すると、本発明の抗体またはそのフラグメントの活性を変化させることができる(例えば、親和性が高く、解離速度が遅い抗体またはそのフラグメント)。一般に、米国特許第5,605,793号；同第5,811,238号；同第5,830,721号；同第5,834,252号；および同第5,837,458号、ならびにPattenら, 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33；Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16:76；Hanssonら, 1999, J Mol. Biol. 287:265；およびLorenzo and Blasco, 1998, BioTechniques 24:308を参照されたい(これらの特許および刊行物それぞれの全体を参照として本明細書に組み込む)。抗体もしくはそのフラグメント、またはコードされた抗体もしくはそのフラグメントは、組換えを行う前に、エラープローンPCR、ランダム・ヌクレオチド挿入、または他の方法によるランダム変異誘発にかけることによって改変することができる。抗体または抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドの、EphA2に特異的に結合する1以上の部分を、1種以上の異種分子の1以上の構成成分、モチーフ、領域、一部、ドメイン、フラグメントなどと結合させることができる。
【０１３２】
さらに、抗体またはそのフラグメントをペプチドなどのマーカー配列と融合させて精製を容易にすることができる。他の実施形態では、マーカーアミノ酸配列は、とりわけpQEベクター(QIAGEN社, 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311)中に提供されているタグなど、その多くが市販されているヘキサヒスチジン・ペプチドである。Gentzら, 1989, PNAS 86:821に記載されているとおり、例えば、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の精製を便利にするものである。精製の際に有用な他のペプチド・タグとしては、限定するものではないが、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する赤血球凝集素「HA」タグ(Wilsonら, 1984, Cell 37:767)および「flag」タグが挙げられる。
【０１３３】
他の実施形態では、本発明の抗体またはそのフラグメントもしくは変異体を、診断または検出可能な物質とコンジュゲートさせる。このような抗体は、特定の治療の有効性の判定などの臨床試験手順の一部として、癌の発生または進行をモニターまたは予測するのに有用であり得る。さらに、このような抗体は、EphA2を過剰発現する細胞に関連する前癌状態(例えば、ハイグレードの前立腺上皮内腫瘍(PIN)、乳房の線維腺腫、線維嚢胞症、または複合母斑)の発生または進行をモニターまたは予測するのに有用であり得る。一実施形態では、露出EphA2エピトープ抗体は、診断または検出可能な物質とコンジュゲートしている。
【０１３４】
このような診断および検出は、本発明の抗体を検出可能な物質とカップリングすることによって達成することが可能であり、該検出可能な物質としては、例えば、限定するものではないが、様々な酵素（例えば、限定するものではないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼなど）；補欠分子族（多例えば、限定するものではないが、ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンなど）；蛍光物質（例えば、限定するものではないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンなど）；発光物質（例えば、限定するものではないが、ルミノールなど）；生物発光物質（例えば、限定するものではないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンなど）；放射性物質（例えば、限定するものではないが、ビスマス(213Bi)、炭素(14C)、クロム(51Cr)、コバルト(57Co)、フッ素(18F)、ガドリニウム(153Gd、159Gd)、ガリウム(68Ga、67Ga)、ゲルマニウム(68Ge)、ホルミウム(166Ho)、インジウム(115In、113In、112In、111In)、ヨウ素(131I、125I、123I、121I)、ランタン(140La)、ルテチウム(177Lu)、マンガン(54Mn)、モリブデン(99Mo)、パラジウム(103Pd)、リン(32P)、プラセオジム(142Pr)、プロメチウム(149Pm)、レニウム(186Re、188Re)、ロジウム(105Rh)、ルテニウム(97Ru)、サマリウム(153Sm)、スカンジウム(47Sc)、セレン(75Se)、ストロンチウム(85Sr)、硫黄(35S)、テクネチウム(99Tc)、タリウム(201Ti)、スズ(113Sn、117Sn)、トリチウム(3H)、キセノン(133Xe)、イッテルビウム(169Yb、175Yb)、イットリウム(90Y)、亜鉛(65Zn)など）；様々な陽電子放出断層撮影法を用いた陽電子放出金属および非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。
【０１３５】
本発明はさらに、治療剤にコンジュゲートさせた抗体またはそのフラグメントの使用を包含する。これらのコンジュゲートの非限定的な例は、2005年9月7日出願の米国仮出願第60/714,362号、2005年11月14日出願の米国仮出願第60/735,966号、米国特許出願公開番号US2005/0180972 A1、および米国特許出願公開番号US2005/0123536 A1に開示されており、各文献の内容全てを参照として本明細書に組み込むものとする。
【０１３６】
抗体またはそのフラグメントは、細胞毒素などの治療成分、例えば、細胞増殖抑制剤または殺細胞剤、治療剤、または放射性金属イオン、例えばα放射体にコンジュゲートさせてもよい。細胞毒素すなわち細胞傷害剤には、細胞に有害な物質が含まれる。例としては、アウリスタチン(auristatin)分子(例えば、アウリスタチンE、アウリスタチンF、アウリスタチンPHE、MMAE、MMAF、ブリオスタチン1、およびソラスタチン(solastatin)10；Woykeら, Antimicrob. Agents Chemother. 46:3802-8 (2002)、Woykeら, Antimicrob. Agents Chemother. 45:3580-4 (2001)、Mohammadら, Anticancer Drugs 12:735-40 (2001)、Wallら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 266:76-80 (1999)、Mohammadら, Int. J. Oncol. 15:367-72 (1999)を参照のこと。これら全ての文献の内容を参照として本明細書に組み込む)、パクリタキセル、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、エピルビシン、およびシクロホスファミド、ならびにこれらの類似体または相同体が挙げられる。治療剤としては、限定するものではないが、代謝拮抗薬(例えば、メトトレキセート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシルデカルバジン)、アルキル化剤(例えば、メクロレタミン、チオエパ(thioepa)クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン(BCNU)およびロムスチン(CCNU)、シクロトスファミド(cyclothosphamide)、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、およびシスジクロロジアミン白金(II)(DDP)シスプラチン、アントラサイクリン(例えば、ダウノルビシン(以前のダウノマイシン)およびドキソルビシン)、抗生物質(例えば、ダクチノマイシン(以前のアクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアンスラマイシン(AMC)、および抗有糸分裂薬(例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン)が挙げられる。
【０１３７】
さらに、抗体またはそのフラグメントを、所与の生物学的応答を改変する治療剤または薬物成分にコンジュゲートさせてもよい。治療剤または薬物成分は、古典的な化学療法剤に限定されると解釈されるべきでない。例えば、薬物成分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドでありうる。このようなタンパク質としては、毒素（例えば、アブリン、リシンA、シュードモナス外毒素、コレラ毒、またはジフテリア毒）；タンパク質（腫瘍壊死因子、αインターフェロン、βインターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター）；アポトーシス剤、例えばTNF-α、TNF-β、AIM I(国際公開WO 97/33899を参照のこと)、AIM II(国際公開WO 97/34911を参照のこと)、Fasリガンド(Takahashi et al., 1994, J. immunol., 6:1567)、およびVEGI(国際公開WO 99/23105を参照のこと)、血栓剤または抗血管新生剤、例えば、アンギオスタチンまたはエンドスタチン；あるいは、生物学的応答改変剤（例えば、リンフォカイン(例えば、インターロイキン-1(「IL-1」)、インターロイキン-2(「IL-2」)、インターロイキン-6(「IL-6」)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(「GM-CSF」)、および顆粒球コロニー刺激因子(「G-CSF」))、または成長因子(例えば、成長ホルモン(「GH」))など）が挙げられる。
【０１３８】
さらに、抗体は、放射性物質や、放射性金属イオンとコンジュゲートするのに役立つ大環状キレート剤などの治療成分とコンジュゲートさせてもよい(放射性物質の例については上記を参照のこと)。ある実施形態では、大環状キレート剤は、リンカー分子を介して抗体に結合されうる1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N',N'',N''-四酢酸(DOTA)である。このようなリンカー分子は当技術分野で一般に知られていて、Denardoら, 1998, Clin Cancer Res. 4:2483-90；Petersonら, 1999, Bioconjug. Chem. 10:553；およびZimmermanら, 1999, Nucl Med. Biol. 26:943-50に記載されており、これら各文献の内容全体を参照として本明細書に組み込む。
【０１３９】
特定の実施形態では、コンジュゲート化抗体は、非癌細胞ではなく癌細胞上に露出したEphA2エピトープと好ましく結合するEphA2抗体である(すなわち、露出EphA2エピトープ抗体)。
【０１４０】
治療成分を抗体にコンジュゲートさせる技法はよく知られている。治療成分は、当技術分野で公知の方法、例えば、限定するものではないが、アルデヒド/シッフ結合、スルフヒドリル結合、酸不安定結合、シス-アコニチル（cis-aconityl）結合、ヒドラゾン結合、酵素分解性結合によって、抗体にコンジュゲートさせることができる(一般にGarnett, 2002, Adv. Drug Deliv. Rev. 53:171-216を参照のこと)。治療成分を抗体にコンジュゲートさせる別の技法はよく知られており、例えば、Arnonら、"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy"、Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy、Reisfeldら(編)、243-56(Alan R. Liss, Inc. 1985)；Hellstromら、"Antibodies For Drug Delivery"、Controlled Drug Delivery(第2版)、Robinsonら(編)、623-53(Marcel Dekker, Inc. 1987)；Thorpe、"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer THerapy:A Review"、Monoclonal Antibodies `84:Biological And Clinical Applications、Pincheraら(編)、475-506(1985)；"Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy"、Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy、Baldwinら(編)、303-16(Academic Press 1985)、およびThorpeら、1982、Immunol. Rev. 62:119-58を参照のこと。抗体をポリペプチド成分に融合またはコンジュゲートさせる方法は、当技術分野で公知である。例えば、米国特許第5336603号、第5622929号、第5359046号、第5349053号、第5447851号、および第5112946号；EP 307434；EP 367166；国際公開WO 96/04388およびWO 91/06570；Ashkenaziら、1991、PNAS 88:10535-10539；Zhengら、1995、J. Immunol. 154:5590-5600；およびVilら、1992、PNAS 89:11337-11341を参照のこと。成分への抗体の融合は、必ずしも直接的でなくてもよく、リンカー配列を介してもよい。このようなリンカー分子は当技術分野で一般に知られていて、Denardoら、1998、Clin Cancer Res. 4:2483-90；Petersonら、1999、Bioconjug. Chem. 10:553；Zimmermanら、1999、Nucl. Med. Biol. 26:943-50；Garnett、2002、Adv. Drug Deliv. Rev. 53:171-216に記載されており、これら各文献の内容全体を参照として本明細書に組み込む。
【０１４１】
別法として、Segalが米国特許第4676980号において記載しているように、
抗体を第2抗体にコンジュゲートさせて抗体へテロコンジュゲートを形成することが可能であり、上記文献の内容全体を参照として本明細書に組み込む。
【０１４２】
抗体は、標的抗原のイムノアッセイまたは精製に特に有用な固相担体に結合させることもできる。このような固相担体としては、限定するものではないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンが挙げられる。
【０１４３】
5.1.2  抗体を生成する方法
本発明の抗体またはそのフラグメントは、抗体を合成するための当技術分野で公知の方法、特に化学合成、あるいは、好ましくは組換え発現技法によって生成することができる。
【０１４４】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージ・ディスプレイ技法、またはこれらの組合せの使用を含む当技術分野で公知の多種多様な技法を用いて調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野で公知のもの、および例えば、Harlowら、Antibodies:A Laboratory Manual、(Cold Spring Harbor Laboratory Press、第2版、1988)；Hammerlingら:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas、p.563-681(Elsevier、N.Y.、1981)に教示されるものを含むハイブリドーマ技法を用いて生成することができる(前記文献は、それらの全体を参照として本明細書に組み込む)。本明細書では、「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術によって生成された抗体だけに限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、真核生物、原核生物、またはファージ・クローンを含む単一クローン由来の抗体を意味するものであり、それを生成する方法を意味しない。
【０１４５】
ハイブリドーマ技術を使用して特定の抗体を生成し、スクリーニングする方法は、常法であり、当技術分野でよく知られている。簡潔に述べれば、マウスをEphA2(全長タンパク質またはそのドメイン、例えば細胞外ドメインまたはリガンド結合ドメイン)で免疫感作し、いったん免疫応答が検出されたなら、例えば、マウス血清中にEphA2に特異的な抗体が検出されたなら、マウスの脾臓を摘出し、脾細胞を単離すればよい。次いで、周知の技法によって、脾細胞を適切な骨髄腫細胞、例えばATCCから入手可能なSP20細胞系由来の細胞と融合させる。ハイブリドーマを選択し、限界希釈によってクローン化する。次いで、当技術分野で公知の方法によって、本発明のポリペプチドと結合することのできる抗体を分泌する細胞について、ハイブリドーマ・クローンをアッセイする。マウスを陽性のハイブリドーマ・クローンで免疫感作することによって、一般に抗体を高レベルで含む腹水を生成することができる。
【０１４６】
従って、モノクローナル抗体は、本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養することによって生成することができ、好ましくは、そのハイブリドーマは、EphA2またはそのフラグメントで免疫したマウスから単離した脾細胞を骨髄腫細胞と融合することによって作製し、次いで融合で得たハイブリドーマを、EphA2と結合できる抗体を分泌するハイブリドーマ・クローンについてスクリーニングする。
【０１４７】
特異的EphA2エピトープを認識する抗体フラグメントは、当業者に公知の任意の技法によって生成することができる。例えば、本発明のFabおよびF(ab')2フラグメントは、パパイン(Fabフラグメントを生成するため)またはペプシン(F(ab')2フラグメントを生成するため)などの酵素を用いた免疫グロブリン分子のタンパク質分解切断によって生成することができる。F(ab')2フラグメントは、可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のCH1ドメインを含む。さらに、本発明の抗体は、当技術分野で公知の様々なファージ・ディスプレイ法を用いて生成することもできる。
【０１４８】
ファージ・ディスプレイ法では、機能的抗体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列をもつファージ粒子の表面上に提示されている。特に、VHおよびVLドメインをコードするDNA配列は、動物cDNAライブラリー(例えば、リンパ系組織のヒトまたはネズミcDNAライブラリー)から増幅される。VHおよびVLドメインをコードするDNAをscFvリンカーと一緒にPCRによって結合させ、ファージミド・ベクター(例えば、pCANTAB 6またはpComb 3 HSS)中にクローニングする。このベクターを大腸菌(E. coli)中にエレクトロポレーションし、その大腸菌にヘルパー・ファージを感染させる。これらの方法で使用するファージは、典型的にはfdおよびM13を含む糸状ファージであり、そのVHおよびVLドメインは、通常、ファージ遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIのいずれかと組換え的に融合される。対象のEphA2エピトープと結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原、例えば、標識した抗原または固体表面もしくはビーズに結合したもしくは捕捉された抗原を用いて、選択または同定することができる。本発明の抗体を作製するのに使用できるファージ・ディスプレイ法の例としては、Brinkmanら、1995、J. Immunol. Methods 182:41-50；Amesら、1995、J. Immunol. Methods 184:177；Kettleboroughら、1994、Eur. J. Immunol. 24:952-958；Persicら、1997、Gene 187:9；Burtonら、1994、Advances in Immunology 57:191-280；国際出願PCT/GB91/01134；国際公開WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、WO 93/11236、WO 95/15982、WO 95/20401、およびW097/13844；ならびに米国特許第5698426号、第5223409号、第5403484号、第5580717号、第5427908号、第5750753号、第5821047号、第5571698号、第5427908号、第5516637号、第5780225号、第5658727号、第5733743号および第5969108号に開示されているファージ・ディスプレイ法が挙げられ、各文献の内容全体を参照として本明細書に組み込む。
【０１４９】
ファージは、EphA2への結合、特にEphA2の細胞外ドメインへの結合についてスクリーニングすることができる。EphA2活性をアゴナイズする作用(例えば、EphA2リン酸化を増大させる作用、EphA2レベルを低減させる作用)をスクリーニングしてもよい。
【０１５０】
上記の文献に記載のように、ファージ選択の後、ファージから抗体コード領域を単離し、それを用いて、全抗体（ヒト抗体など）、または任意の他の所望の抗原結合フラグメントを生成し、そして、例えば、以下に記載のように、所望の宿主（例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌など）中で発現させることができる。Fab、Fab'およびF(ab')2フラグメントを組換え生成する技法も、国際公開WO 92/22324；Mullinaxら、1992、BioTechniques 12:864；Sawaiら、1995、AJRI 34:26；およびBetterら、1988、Science 240:1041に開示されている方法などの当技術分野で公知の方法を用いて利用することができる(前記文献の全体を参照として本明細書に組み込む)。
【０１５１】
全抗体を生成するためには、VHまたはVLヌクレオチド配列、制限部位、および制限部位を保護するためのフランキング配列を含むPCRプライマーを使用して、scFvクローン中のVHまたはVL配列を増幅させることができる。当業者に公知のクローニング技術を利用することによって、PCRで増幅したVHドメインをVH定常領域、例えばヒトγ4定常領域を発現するベクター中にクローン化することができ、PCRで増幅したVLドメインをVL定常領域、例えばヒトκまたはλ定常領域を発現するベクター中にクローン化することができる。VHまたはVLドメインを発現するためのベクターには、EF-1αプロモーター、分泌シグナル、可変ドメインのクローニング部位、定常ドメイン、およびネオマイシンなどの選択マーカーが含まれることが好ましい。VHおよびVLドメインは、必須の定常領域を発現する1つのベクターにクローン化することもできる。次いで、当業者に公知の技術を用いて、重鎖変換ベクターおよび軽鎖変換ベクターを細胞系に同時トランスフェクトして、完全長抗体、例えばIgGを発現する安定なまたは一過性の細胞系を生成する。
【０１５２】
ヒトにおける抗体のin vivo使用およびin vitro検出アッセイを含む一部の使用では、ヒトまたはキメラ抗体を使用することが好ましいかもしれない。ヒト被験体の治療的処置にとっては完全ヒト抗体が特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリーを用いて、上記のファージ・ディスプレイ法を含む当技術分野で公知の様々な方法によって作製することができる。米国特許第4444887号および第4716111号；ならびに国際公開WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735、およびWO 91/10741も参照のこと；各文献の内容は、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。
【０１５３】
ヒト抗体は、機能的内因性免疫グロブリンを発現することはできないがヒト免疫グロブリン遺伝子を発現できるトランスジェニックマウスを用いて、生成することもできる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体を、マウス胚性幹細胞中にランダムにまたは相同組換えによって導入する。あるいは、ヒト可変領域、定常領域、および多様性領域を、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えて、マウス胚性幹細胞に導入する。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入により別々にまたは同時に非機能的にすることができる。特に、JH領域のホモ接合性欠失は、内因性抗体生成を妨げる。改変した胚性幹細胞を増殖させ、胚盤胞にマイクロインジェクションしてキメラマウスを作製する。次いで、キメラマウス同士を交配させて、ヒト抗体を発現するホモ接合体子孫を作製する。トランスジェニックマウスを、選択した抗原（例えば本発明のポリペプチドのすべてまたは一部）を用いて通常の方法で免疫する。該抗原に対するモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を用いて、その免疫したトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスが保有するヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、B細胞分化の際に再配列を起こし、続いてクラス・スイッチングおよび体細胞変異を生じる。従って、このような技術を用いることによって、治療上有用なIgG、IgA、IgMおよびIgE抗体を生成することが可能である。ヒト抗体を生成するためのこの技術の概要については、LonbergおよびHuszar(1995、Int. Rev. Immunol. 13:65-93)を参照のこと。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を生成するためのこの技術およびこうした抗体を生成するためのプロトコールの詳細な説明については、例えば、国際公開WO 98/24893、WO 96/34096、およびWO 96/33735；ならびに米国特許第5413923号、第5625126号、第5633425号、第5569825号、第5661016号、第5545806号、第5814318号、および第5939598を参照のこと。これらの文献の全体が本明細書に組み込まれる。さらに、Abgenix社(米国カリフォルニア州Fremont)およびMedarex社(米国ニュージャージー州Princeton)などの会社は、上記のものと類似の技術を用いて所定の抗原に対するヒト抗体の提供を請け負っている。
【０１５４】
キメラ抗体は、非ヒト抗体由来の可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とを有する抗体のような、抗体の異なる部分が、異なる免疫グロブリン分子に由来している分子である。キメラ抗体を作製する方法は、当技術分野で公知である。例えば、Morrison, 1985, Science 229:1202； Oiら, 1986, BioTechniques 4:214；Gilliesら, 1989, J. Immunol. Methods 125:191-202；米国特許第6,311,415号、同第5,807,715号、同第4,816,567号、および同第4,816,397号を参照のこと。これらの文献の全体を参照として本明細書に組み込むものとする。非ヒト種に由来する1つ以上のCDRと、ヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域とを含むキメラ抗体は、当技術分野で知られている様々な技術、例えば、CDRグラフティング(EP 239,400；国際公開WO 91/09967；米国特許第5,225,539号、同第5,530,101号、および同第5,585,089号)、ベニアリング(veneering)またはリサーフェシング(resurfacing)(EP 592,106；EP 519,596；Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498；Studnickaら, 1994, Protein Engeneering 7:805；およびRoguskaら, 1994, PNAS 91:969)、およびチェーンシャッフリング(米国特許第5,565,332号)を使用して作製することができる。
【０１５５】
一実施形態では、本発明のキメラ抗体は、EphA2と特異的に結合し、かつヒトフレームワーク領域内に、2A4、2E7、または12E2 (配列番号6-8、22-24、および30-32)のVL CDRのいずれかのアミノ酸配列を有する1個、2個、または3個のVL CDRを含む。特定の実施形態では、本発明のキメラ抗体は、EphA2と特異的に結合し、かつ図３に開示された2A4、2E7、または12E2 (配列番号6-8、22-24、および30-32)由来のVL CDRのアミノ酸配列を有するVL CDRを含む。別の実施形態では、本発明のキメラ抗体は、EphA2と特異的に結合し、かつヒトフレームワーク領域内に、2A4、2E7、または12E2 (配列番号3-5、19-21および27-29)のVH CDRのいずれかのアミノ酸配列を有する1個、2個、または3個のVH CDRを含む。特定の実施形態では、本発明のキメラ抗体は、EphA2と特異的に結合し、かつ図３に開示された2A4、2E7、または12E2 (配列番号3-5、19-21および27-29)由来のVH CDRのアミノ酸配列を有するVH CDRを含む。他の実施形態では、本発明のキメラ抗体は、EphA2と特異的に結合し、かつヒトフレームワーク領域内に、2A4、2E7、または12E2 (配列番号6-8、22-24、および30-32) のVL CDRのいずれかのアミノ酸配列を有する1個、2個、または3個のVL CDRを含み、さらに2A4、2E7、または12E2 (配列番号3-5、19-21および27-29) のVH CDRのいずれかのアミノ酸配列を有する1個、2個、または3個のVH CDRを含む。特定の実施形態では、本発明のキメラ抗体は、EphA2と特異的に結合し、かつ図３に開示された2A4、2E7、または12E2(配列番号6-8、22-24、および30-32)由来のVL CDRのアミノ酸配列を有するVL CDRを含み、さらに図３に開示された2A4、2E7、または12E2 (配列番号3-5、19-21および27-29)由来のVH CDRのアミノ酸配列を有するVH CDRを含む。他の実施形態では、本発明のキメラ抗体は、EphA2と特異的に結合し、かつヒトフレームワーク領域内に、2A4、2E7、または12E2 (配列番号6-8、22-24、および30-32) のVL CDRのいずれかのアミノ酸配列を有する3個のVL CDRと、2A4、2E7、または12E2 (配列番号3-5、19-21および27-29) のVH CDRのいずれかのアミノ酸配列を有する3個のVH CDRとを含む。さらに他の実施形態では、本発明のキメラ抗体は、EphA2と特異的に結合し、かつ図３に開示された2A4、2E7、または12E2 (配列番号6-8、22-24、および30-32)由来のVL CDRからなる群から選択されたアミノ酸配列を有するVL CDRを含み、さらに、図３に開示された2A4、2E7、または12E2 (配列番号3-5、19-21および27-29)由来のVH CDRからなる群から選択されたアミノ酸配列を有するVH CDRを含む。
【０１５６】
本発明のフレームワーク領域中のフレームワーク残基は、しばしば、抗原結合性を改変、好ましくは改善するために、CDRドナー抗体に由来する対応残基で置換される。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法により、例えばCDRとフレームワーク残基の相互作用をモデリングして抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定することにより、または配列比較を行って特定部位の一般的でないフレームワーク残基を同定することにより、特定される(例えば、米国特許第5585089号；およびRiechmannら、1988、Nature 332:323を参照のこと。これらの文献はその全体が参照として本明細書に組み込まれる）。
【０１５７】
ヒト化抗体は、所定の抗原に結合可能であり、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク領域と、非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するCDRとを含む抗体もしくはその変異体、またはそのフラグメントである。ヒト化抗体は、すべてまたは実質的にすべてのCDR領域が非ヒト免疫グロブリン(すなわち、ドナー抗体)のものに合致し、すべてまたは実質的にすべてのフレームワーク領域がヒト免疫グロブリン・コンセンサス配列のものである、少なくとも1つ、通常2つの可変ドメインの実質的にすべてを含む。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部分、通常はヒト免疫グロブリンのものを含むことが好ましい。通常、抗体は、軽鎖と、重鎖の少なくとも可変ドメインとの両方を含む。抗体は、重鎖のCH1、ヒンジ、CH2、CH3、およびCH4領域を含むことができる。ヒト化抗体は、IgM、IgG、IgD、IgAおよびIgEを含む任意のクラスの免疫グロブリン、ならびにIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4を含む任意のアイソタイプから選択することができる。通常、定常ドメインは、ヒト化抗体が細胞傷害活性を示すことが望ましい場合は、補体結合性定常ドメインであり、そのクラスは典型的にはIgG1である。こうした細胞傷害活性が望ましくない場合、定常ドメインはIgG2クラスであり得る。ヒト化抗体は、2種以上のクラスまたはアイソタイプの配列を含むことができ、特定の定常ドメインを選択して所望のエフェクター機能を最適化することは、当技術分野の通常の技術の範囲内である。ヒト化抗体のフレームワークおよびCDR領域は、親配列と正確に合致している必要は無く、例えば、ドナーCDRまたはコンセンサス・フレームワークに少なくとも１残基の置換、挿入または欠失によって突然変異を導入し、その部位におけるCDRまたはフレームワーク残基がコンセンサスまたは移入抗体と合致しないようにしてもよい。しかし、こうした変異は広範囲にはならない。通常、ヒト化抗体残基の少なくとも75％、より頻繁には90％、最も好ましくは95％以上の残基が、親フレームワーク領域(FR)およびCDR配列の残基と合致する。ヒト化抗体は、当技術分野で公知の様々な技術、例えば、限定するものではないが、CDRグラフティング(欧州特許EP 239400；
国際公開WO 91/09967；および米国特許第5225539号、第5530101号、および第5585089号)、ベニアリングまたはリサーフェシング(欧州特許EP 592106およびEP 519596；Padlan、1991、Molecular Immunology 28(4/5):489-498；Studnickaら、1994、Protein Engineering 7(6):805-814；およびRoguskaら、1994、PNAS 91:969-973)、チェーンシャッフリング(米国特許第5565332号)を含む、ならびに例えば、米国特許第6407213号、第5766886号、第5585089号、国際公開WO 9317105、Tanら、2002、J. Immunol. 169:1119-25、Caldasら、2000、Protein Eng. 13:353-60、Moreaら、2000、Methods 20:267-79、Bacaら、1997、J. Biol. Chem. 272:10678-84、Roguskaら、1996、Protein Eng. 9:895-904、Coutoら、1995、Cancer Res. 55(23 Supp):5973-5977、Coutoら、1995、Cancer Res. 55:1717-22、Sandhu、1994、Gene 150:409-10、Pedersenら、1994、J. Mol. Biol. 235:959-73、Jonesら、1986、Nature 321:522-525、Riechmannら、1988、Nature 332:323、およびPresta、1992、Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596に開示されている技術を用いて作製することができる。多くの場合、フレームワーク領域中のフレームワーク残基を、CDRドナー抗体の対応する残基で置換して、抗原結合性を改変、好ましくは改善する。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法、例えば、CDRとフレームワーク残基の相互作用をモデリングして抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定することにより、または配列比較を行って特定部位における異常フレームワーク残基を同定することにより、特定される(例えば、Queenら、米国特許第5585089号；およびRiechmannら、1988、Nature 332:323を参照のこと。これらの文献は、その全体が参照として本明細書に組み込まれる)。
【０１５８】
さらに、本発明の抗体を利用して、当業者によく知られている技術を用いて抗イディオタイプ抗体を生成することができる。(例えば、Greenspan & Bona、1989、FASEB J. 7:437-444；およびNissinoff、1991、J. Immunol. 147:2429-2438を参照のこと)。本発明は、本発明の抗体またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの使用を用いる方法を提供する。
【０１５９】
5.1.3  抗体をコードするポリヌクレオチド
本発明の方法は、例えば上記のような、高ストリンジェンシー、中または低ストリンジェンシー・ハイブリダイゼーション条件下で、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドも包含する。特定の実施形態では、本発明は、本発明の抗体(例えば、2A4、2E7、または12E2)(配列番号1、17、および25)の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。別の特定の実施形態では、本発明は、ヒト化またはキメラ化されている本発明の抗体(例えば、2A4、2E7、または12E2)(配列番号1、17、および25)の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。
【０１６０】
当技術分野で周知の方法によって、ポリヌクレオチドを得ることができ、該ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することができる。抗体のアミノ酸配列が判明しているので、当技術分野でよく知られている方法を用いて、これらの抗体をコードするヌクレオチド配列を決定することができ、すなわち、特定のアミノ酸をコードすることが知られているヌクレオチドコドンを、本発明の抗体またはそのフラグメントをコードする核酸を生成するように組み立てる。抗体をコードするこのようなポリヌクレオチドは、化学合成したオリゴヌクレオチドから組み立てることもでき(例えば、Kutmeierら、1994、BioTechniques 17:242に記載される)、簡単に言えば、それは、抗体をコードする配列の一部分を含む重複オリゴヌクレオチドの合成、それらオリゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結、次いで連結したオリゴヌクレオチドのPCRによる増幅を伴う。
【０１６１】
あるいは、適切な供給源に由来する核酸から、抗体をコードするポリヌクレオチドを生成してもよい。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンが入手できなくとも、抗体分子の配列がわかっている場合(例えば、図3および4を参照)、その免疫グロブリンをコードする核酸は、化学的に合成することができ、あるいは、適切な供給源（例えば、抗体cDNAライブラリー、または本発明の抗体を発現するとして選択されたハイブリドーマ細胞（例えばATCCにPTA-4380として寄託されたクローン）などの、抗体を発現する任意の組織または細胞から作製されたcDNAライブラリー、または該組織または細胞から単離された核酸、好ましくはポリA+RNA)から、その配列の3'末端および5'末端にハイブリダイズすることのできる合成プライマーを使用するPCR増幅法によって、または、例えばその抗体をコードするcDNAライブラリーからのcDNAクローンを同定するために、特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチド・プローブを使用してクローニングすることによって、得ることもできる。PCRによって生成された増幅核酸は、次いで、当技術分野でよく知られている任意の方法を使用して、複製可能なクローニングベクター中にクローニングすることができる。
【０１６２】
抗体のヌクレオチド配列がいったん決定されれば、その抗体のヌクレオチド配列を、ヌクレオチド配列の遺伝子操作のための当技術分野でよく知られている方法、例えば、組換えDNA技術、部位特異的変異誘発、PCRなど(例えば、Sambrookら, 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY、およびAusubelら編, 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NYに記載の技術を参照のこと；両方ともその全体を参照として本明細書に含める)を用いて遺伝子操作して、異なるアミノ酸配列を有する抗体を作製する、例えば、アミノ酸置換、欠失、および/または挿入を生じさせることができる。
【０１６３】
特定の実施形態では、通常の組換えDNA技術を用いて1以上のCDRをフレームワーク領域内に挿入する。そのフレームワーク領域は、天然のまたは共通のフレームワーク領域とすることができるが、ヒトフレームワーク領域が好ましい(例えば、ヒトフレームワーク領域のリストについては、Chothiaら, 1998, J. Mol. Biol. 278: 457-479を参照のこと)。フレームワーク領域とCDRの組合せによって作製されるポリヌクレオチドが、EphA2と特異的に結合する抗体をコードすることが好ましい。上記のように、1個以上のアミノ酸の置換がフレームワーク領域内に存在することが好ましく、そのアミノ酸置換は抗体のその抗原への結合を改善させることが好ましい。さらに、こうした方法を用いて、鎖内ジスルフィド結合に関与する1つまたは複数の可変領域システイン残基のアミノ酸置換または欠失を生じさせ、1つまたは複数の鎖内ジスルフィド結合を欠く抗体分子を生成することができる。ポリヌクレオチドに対する他の改変も本発明に包含され、当分野の技術の範囲内にある。
【０１６４】
5.1.4  抗体の組換え発現
本発明の抗体、その誘導体、類似体またはフラグメント(例えば、本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖、またはその一部分、または本発明の一本鎖抗体)の組換え発現には、本抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築が必要である。ひとたび本発明の抗体分子、または抗体の重鎖もしくは軽鎖、またはその一部分(重鎖または軽鎖可変ドメインを含むことが好ましいが、必須ではない)をコードするポリヌクレオチドが得られたら、当技術分野でよく知られた技術を用いる組換えDNA技術によって、抗体分子産生用のベクターを作製することができる。従って、抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを発現させることによるタンパク質の産生方法を本明細書に記載する。当業者によく知られた方法を用いて、抗体コード配列ならびに適切な転写および翻訳調節シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えばin vitro組換えDNA技術、合成技術、およびin vivo遺伝子組換えがある。こうして、本発明は、プロモーターに機能的に連結された、本発明の抗体分子、抗体の重鎖もしくは軽鎖、抗体の重鎖もしくは軽鎖可変ドメインまたはその一部分、重鎖または軽鎖CDRをコードするヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供する。こうしたベクターには、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列が含まれ(例えば、国際公開WO 86/05807およびWO 89/01036;ならびに米国特許第5122464号を参照のこと)、重鎖全体、軽鎖全体、または重鎖と軽鎖の全体を発現させるために、抗体の可変ドメインをそのようなベクター中にクローニングすることができる。
【０１６５】
発現ベクターを従来の技術によって宿主細胞に導入し、次いでトランスフェクトしたその細胞を従来の技術によって培養して本発明の抗体を産生させる。従って、本発明は、異種プロモーターに機能的に連結された本発明の抗体もしくはそのフラグメント、またはその重鎖もしくは軽鎖、またはその一部分、または本発明の一本鎖抗体、をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を含む。二本鎖抗体を発現させる好ましい実施形態では、重鎖と軽鎖の両方をコードするベクターを、以下に詳述するように、免疫グロブリン分子全体を発現させるために宿主細胞中で同時発現させることができる。
【０１６６】
様々な宿主-発現ベクター系を利用して、本発明の抗体分子を発現させることができる(例えば、米国特許第5,807,715号を参照のこと)。その宿主-発現系とは、それによって目的のコード配列を生成し、その後精製することのできる運搬体をさすが、適切なヌクレオチド・コード配列で形質転換またはトランスフェクトしたときに本発明の抗体分子をin situで発現し得る細胞をもさす。これらには以下のものが含まれるが、これらに限定されない：抗体コード配列を含む組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA、またはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌(例えば、大腸菌および枯草菌)；抗体コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母(例えば、サッカロミセス、ピチア)などの微生物；抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)を感染させた昆虫細胞系；抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワー・モザイクウイルス、CaMV;タバコ・モザイクウイルス、TMV)を感染させた、または組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)で形質転換された植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞ゲノム由来のプロモーター(例えば、メタロチオネイン・プロモーター)または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター(例えば、アデノウイルス後期プロモーター、牛痘ウイルス7.5Kプロモーター)を含む組換え発現構築物を保持する哺乳動物細胞系(例えば、COS、CHO、BHK、293、NSO、および3T3細胞)。特に組換え抗体分子全体を発現させる場合は、好ましくは大腸菌などの細菌細胞、より好ましくは真核細胞を使用して、組換え抗体分子を発現させる。例えば、ヒト・サイトメガロウイルス由来の主要中間初期遺伝子プロモーター・エレメントのようなベクターと併用する、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞(CHO)などの哺乳動物細胞は、抗体の有効な発現系である(Foeckingら, 1986, Gene 45:101;およびCockettら, 1990, BioTechnology 8:2)。特定の実施形態では、抗体またはそのフラグメント（免疫特異的に結合して、アゴナイズする）をコードするヌクレオチド配列の発現が、構成性プロモーター、誘導性プロモーター、または組織特異的プロモーターによって調節される。
【０１６７】
細菌系では、多くの発現ベクターを、発現される抗体分子の意図とした使用に応じて、有利に選択することができる。例えば、抗体分子の医薬組成物を調製するために、多量のこのようなタンパク質を生成すべき場合、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベル発現を誘導するベクターが望ましいであろう。こうしたベクターには、限定するものではないが、融合タンパク質が産生されるように抗体コード配列がlac Zコード領域とイン・フレームでベクター中にそれぞれ連結され得る大腸菌発現ベクターpUR278(Rutherら, 1983, EMBO 12:1791); pINベクター(Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509);などがある。pGEXベクターを使用して、グルタチオン5-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として外来タンパク質を発現させることもできる。一般に、こうした融合タンパク質は可溶性であり、マトリックス・グルタチオン-アガロース・ビーズへの吸着および結合と、それに続く遊離グルタチオンの存在下での溶出によって、溶解した細胞から容易に精製することができる。pGEXベクターは、クローン化した標的遺伝子産物をGST成分から遊離できるように、トロンビンまたはXa因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
【０１６８】
昆虫系では、外来遺伝子を発現するためのベクターとしてオウトグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス(AcNPV)を使用する。このウイルスは、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞中で増殖する。抗体コード配列は、ウイルスの非必須領域(例えば多角体遺伝子)にそれぞれクローン化し、AcNPVプロモーター(例えば多角体プロモーター)の制御下に置くことができる。
【０１６９】
哺乳動物宿主細胞では、いくつかのウイルス系発現系を利用することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合、所定の抗体コード配列をアデノウイルス転写/翻訳調節複合体、例えば、後期プロモーターおよび三分節リーダー配列と連結させる。次いで、このキメラ遺伝子を、in vitroまたはin vivo組換えによってアデノウイルス・ゲノムに挿入する。ウイルス・ゲノムの非必須領域(例えば、領域E1またはE3)への挿入によって、感染宿主中で生存可能で、抗体分子を発現可能な組換えウイルスが得られる(例えば、Logan & Shenk, 1984, PNAS 8 1:355-359を参照のこと)。挿入した抗体コード配列の効率のよい翻訳には、特定の開始シグナルも必要でありうる。これらのシグナルには、ATG開始コドンおよび隣接配列が含まれる。さらに、全挿入物を確実に翻訳するために、開始コドンは所望のコード配列の読み枠と同調していなければならない。これらの外来性翻訳調節シグナルおよび開始コドンは様々な起源のものであってよく、天然でも合成でもよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることによって高めることができる(例えば、Bittnerら, 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544を参照のこと)。
【０１７０】
さらに、挿入配列の発現をモジュレートし、あるいは望ましい特定の様式で遺伝子産物を修飾およびプロセシングする宿主細胞株を選択することができる。タンパク質産物のこうした修飾(例えば、グリコシル化)およびプロセシング(例えば、切断)は、タンパク質の機能に関して重要でありうる。個別の宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾のための特徴的かつ特異的なメカニズムを有する。適切な細胞系または宿主系を選択して、発現される外来タンパク質が正確に修飾およびプロセシングされるようにする。このために、一次転写産物の正しいプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞機構をもつ真核宿主細胞を使用することができる。こうした哺乳動物宿主細胞には、限定するものではないが、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O、NS1およびT47D、NS0(免疫グロブリン鎖を内因的に生成しないマウス骨髄腫細胞系)、CRL7O3OおよびHsS78Bst細胞がある。
【０１７１】
組換えタンパク質の長期高収率産生には、安定的な発現が好ましい。例えば、抗体分子を安定して発現する細胞系を作製することができる。宿主細胞は、ウイルス複製起点を含む発現ベクターを用いるのではなく、適切な発現調節エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など)によって制御されるDNA、および選択マーカーを用いて形質転換することができる。外来DNAの導入に続いて、遺伝子操作した細胞を富化培地中で1〜2日間増殖させ、次いで選択培地に切り換えることができる。組換えプラスミドの選択マーカーは、選択に対する耐性（抵抗性）を付与し、細胞の染色体にプラスミドを安定的に組み込ませ、それを増殖させて増殖巣を形成することを可能にし、それを後に細胞系へとクローン化し拡大することができる。この方法は、抗体分子を発現する細胞系を作製するのに使用すると有利であり得る。このようにして作製された細胞系は、抗体分子と直接的または間接的に相互作用する組成物のスクリーニングおよび評価に特に有用であり得る。
【０１７２】
多くの選択系を使用でき、例えば、限定するものではないが、単純疱疹ウイルス・チミジンキナーゼ(Wiglerら, 1977, Cell 11:223)、グルタミン合成酵素、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybaska & Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202)、およびアデニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowyら, 1980, Cell 22:8-17)が挙げられ、これらの遺伝子をそれぞれtk-、gs-、hgprt-またはaprt-細胞に使用することができる。さらに、代謝拮抗物質耐性を以下の遺伝子に対する選択のベースとして使用することができる：メトトレキセートへの耐性を与えるdhfr (Wiglerら, 1980, PNAS 77:357; O'Hareら, 1981, PNAS 78:1527); ミコフェノール酸への耐性を与えるgpt (Mulligan & Berg, 1981, PNAS 78:2072); アミノグリコシドG-418への耐性を与えるneo (WuおよびWu, 1991, Biotherapy 3:87; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573; Mulligan, 1993, Science 260:926; ならびにMorganおよびAnderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191; May, 1993、TIB TECH 11:155-);およびハイグロマイシンへの耐性を与えるhygro (Santerreら, 1984, Gene 30:147)。組換えDNA技術の当技術分野で周知の方法は、所望の組換えクローンを選択するのにルーチンに使用でき、こうした方法は、例えば、Ausubelら(編), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY(1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY(1990);ならびにDracopoliら(編), Current Protocols in Humqn Genetics, John Wiley & Sons, NY(1994)の第12および13章; Colberre-Garapinら, 1981, J. Mol. Biol. 150:1に記載されており、それらの全体を参照として本明細書に含めるものとする。
【０１７３】
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増大させることができる(概説については、BebbingtonおよびHentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, 第3巻(Academic Press, New York, 1987)を参照のこと)。抗体を発現するベクター系のマーカーが増幅可能な場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害物質のレベルの増大により、マーカー遺伝子のコピー数が増大することになる。増幅される領域は抗体遺伝子と会合しているので、抗体の産生も増大することになる(Crouseら, 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257)。
【０１７４】
宿主細胞は、本発明の2つの発現ベクター、重鎖由来ポリペプチドをコードする第1のベクターおよび軽鎖由来ポリペプチドをコードする第2のベクターで同時トランスフェクトすることができる。この2つのベクターは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの同等発現を可能にする同一の選択マーカーを含みうる。これとは別に、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方をコードし、発現できる単一のベクターを使用してもよい。こうした状況では、軽鎖を重鎖の手前に置いて、毒性の遊離重鎖が過剰になることを防止すべきである(Proudfoot, 1986, Nature 322:52; およびKohler, 1980, PNAS 77:2197)。重鎖および軽鎖のコード配列は、cDNAまたはゲノムDNAであってよい。
【０１７５】
ひとたび本発明の抗体分子が組換え発現によって産生されたら、免疫グロブリン分子の精製に関する当技術分野で周知の方法、例えば、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、アフィニティー、特にプロテインA後の特異的抗原に対するアフィニティーによるもの、およびサイズ分画カラムクロマトグラフィー)、遠心分離、溶解性の差、または他の標準的なタンパク質精製法によって精製することができる。さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントは、精製を容易にすることが本明細書に記載されるまたは当技術分野で知られる異種ポリペプチド配列と融合させることもできる。
【０１７６】
5.2  予防/治療方法
本発明は、1種以上のEphA2アゴニスト抗体および/または露出EphA2エピトープ抗体、好ましくは1種以上のモノクローナル性(または単一抗体種の他のいくつかの供給源からの抗体)のEphA2アゴニスト抗体および/または露出EphA2エピトープ抗体を投与することを含む、被験体における、EphA2の過剰発現と関連する疾患（好ましくは癌）の治療、予防または管理方法を包含する。特定の実施形態では、治療、予防または管理すべき疾患は悪性の癌である。別の特定の実施形態では、治療、予防または管理すべき疾患は、EphA2を過剰発現する細胞と関連する前癌状態である。より具体的な実施形態では、この前癌状態はハイグレード前立腺上皮内腫瘍(PIN)、乳房の線維腺腫、線維嚢胞症または複合母斑である。
【０１７７】
一実施形態では、本発明の抗体を、癌の治療、予防または管理に有用な1種以上の他の治療剤と併用して投与する。ある実施形態では、本発明の1種以上のEphA2抗体を、癌の治療、予防または管理に有用な1種以上の他の治療剤と同時に、哺乳動物、好ましくはヒトに投与する。「同時に」という用語は、予防剤または治療剤を正確に同時刻に投与することに限らず、むしろ本発明のEphA2抗体および他の薬剤を順次またはある時間間隔で被験体に投与する際に、本発明の抗体がそのような他の薬剤と一緒に作用し、それ以外の方法で投与するよりも増強された利益をもたらすようにすることを意味する。例えば、各予防剤または治療剤は、同時点に投与してもよいし、あるいは異なった時点に任意の順序で順次投与してもよい。しかし、同時点で投与しない場合は、所望の治療または予防効果をもたらすように十分接近した時間内に投与すべきである。各治療剤はどのような適切な形態で、どのような適切な経路で、別々に投与してもよい。別の実施形態では、本発明のEphA2抗体を手術前、手術中または手術後に投与する。その手術は局在する腫瘍を完全に取り除くか、大型の腫瘍を縮小させることが好ましい。手術は予防措置としてまたは痛みを軽減するために行ってもよい。
【０１７８】
一実施形態では、本発明の1種以上のEphA2抗体は、2A4、2E7、または12E2からなる。他の実施形態では、2A4、2E7、または12E2と比較して、より高い活性や結合能力などを備えた、1個以上のアミノ酸の置換を、特に可変ドメイン内に、有する2A4、2E7、または12E2の変異体を提供する。
【０１７９】
様々な実施形態において、予防剤または治療剤は、1時間以内の間隔、約1時間間隔、約1時間から約2時間間隔、約2時間から約3時間間隔、約3時間から約4時間間隔、約4時間から約5時間間隔、約5時間から約6時間間隔、約6時間から約7時間間隔、約7時間から約8時間間隔、約8時間から約9時間間隔、約9時間から約10時間間隔、約10時間から約11時間間隔、約11時間から約12時間間隔、24時間以下の間隔または48時間以下の間隔で投与する。更なる実施形態では、2種以上の成分を患者の同じ来診時に投与する。
【０１８０】
本明細書に示す投与量および投与頻度は、「治療に有効な」および「予防に有効な」という用語に包含される。さらに、投与量および投与頻度は、投与される特定の治療剤または予防剤、癌の重症度およびタイプ、投与経路、ならびに患者の年齢、体重、応答性、および過去の病歴による各患者に特異的な要因に応じて、通常さまざまに変化する。適当なレジメンは、こうした要因を考慮し、例えば文献に報告され、またPhysician's Desk Reference(第58版、2004)で推奨された投与量に従うことによって、当業者によって選択され得る。
【０１８１】
5.2.1  患者集団
本発明は、治療または予防に有効な量の本発明の1種以上のEphA2抗体を被験体に投与することにより、癌を治療、予防または管理する方法を提供する。別の実施形態では、本発明の抗体を、1種以上の他の治療剤と併用して投与してもよい。被験体は好ましくは哺乳動物であり、例えば非霊長類(ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど)および霊長類(カニクイザルなどのサルおよびヒト)である。更なる実施形態では、被験体はヒトである。
【０１８２】
本発明に包含される方法で治療される癌の具体例は、EphA2を過剰発現する癌を含むが、それだけに限定されない。別の実施形態では、癌は上皮由来のものである。このような癌の例は、肺、大腸、前立腺、乳房、および皮膚の癌である。さらなる癌は次のセクション5.2.1.1に限定ではなく例として挙げられている。特定の実施形態では、原発腫瘍からの転移を治療および/または予防するために、本発明の方法を使用してもよい。
【０１８３】
本発明の方法および組成物は、癌を患っているまたは癌を患うと予想される被験体/患者、例えば特定のタイプの癌の遺伝的素因を有するか、発癌物質にさらされたことがあるか、特定の癌からの寛解期にある被験体/患者に、本発明の1種以上のEphA2抗体を投与することを含む。ここで「癌」とは原発性または転移性の癌をさす。このような患者は過去に癌を治療されたことがあってもなくてもよい。本発明の方法および組成物は、first-lineまたはsecond-lineの癌治療として用いることができる。本発明は他の癌治療を受けている患者の治療も含み、これらの他の癌治療の副作用や不耐性が現れる前に本発明の方法と組成物を使用してもよい。本発明はまた、不応性患者の症状を治療または改善するために、本発明の1種以上のEphA2抗体を投与する方法も包含する。ある実施形態で、癌が治療に対して不応性であるということは、癌細胞の少なくともある有意な部分が死滅しないか、またはそれらの細胞分裂が停止しないことを意味する。癌細胞が不応性かどうかの判定は、そのような背景での当技術分野で許容される「不応性」の意味を用いて、癌細胞に対する治療の有効性をアッセイするための当技術分野で公知の方法によってin vivoまたはin vitroで行うことができる。各種の実施形態では、癌細胞の数が有意に減少していないか、または増加している場合、癌は不応性である。本発明は、癌の素因のある患者における癌の発症または再発を防ぐために、1種以上のEphA2アゴニスト抗体を投与する方法も包含する。一実施形態では、モノクローナル抗体は2A4、2E7、または12E2である。
【０１８４】
特定の実施形態では、本発明のEphA2抗体、またはEphA2の発現を減少させる他の治療剤を、ホルモン、放射線および化学療法剤に対する癌細胞の抵抗性すなわち感受性の低下を反転させるために投与し、それにより1種以上のこれらの薬剤に対する癌細胞の感受性を再び惹起し、その後これらの薬剤を癌の治療または管理（転移の予防を含む）のために投与する(または投与し続ける)ことができる。
【０１８５】
別の実施形態では、本発明の1種以上のEphA2抗体を他の治療法と組み合せて投与して患者の癌を治療する方法、または他の治療法に対して不応性であることが示され、その治療法をもはや受けていない患者への本発明の1種以上のEphA2抗体の投与により患者の癌を治療する方法を、本発明は提供する。一実施形態において、EphA2抗体は2A4、2E7、または12E2である。ある実施形態では、本発明の方法で治療される患者は、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、または生物学的/免疫学的療法ですでに治療されている患者である。これらの患者の中には、不応性の患者、および既存の癌療法を用いた治療にもかかわらず癌を有する患者が含まれる。他の実施形態では、患者はすでに治療されており、疾患活動性を示さないが、本発明の1種以上のアゴニスト抗体が癌の再発防止のために投与される。
【０１８６】
ある実施形態では、既存の治療は化学療法である。特定の実施形態では、既存の治療には、メトトレキセート、タキソール、メルカプトプリン、チオグアニン、ヒドロキシ尿素、シタラビン、シクロホスファミド、イホスファミド、ニトロソ尿素、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシン、ダカルバジン、プロカルビジン、エトポシド、カンプトテシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、プリカマイシン、ミトキサントロン、アスパラギナーゼ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、パクリタキセル、ドセタキセルなどを含むがこれらに限定されない化学療法剤の投与がある。これらの患者には、放射線療法、ホルモン療法および/または生物学的療法/免疫療法で治療された患者が含まれる。また、これらの患者には癌の治療のために手術を受けた患者も含まれる。
【０１８７】
あるいはまた、本発明は、放射線療法を受けているまたは受けた患者を治療する方法も含む。これらの患者には、化学療法、ホルモン療法および/または生物学的療法/免疫療法で治療しているまたは既に治療した患者が含まれる。また、これらの患者には癌の治療のために手術を受けた患者も含まれる。
【０１８８】
他の実施形態では、本発明は、ホルモン療法および/または生物学的療法/免疫療法を受けているまたは受けた患者を治療する方法を含む。これらの患者には、化学療法および/または放射線療法で治療しているまたは治療した患者が含まれる。また、これらの患者には癌の治療のために手術を受けた患者も含まれる。
【０１８９】
さらに、本発明はまた、治療している被験体にとって、その治療の毒性が強すぎることが示されたかまたは示されうる場合、すなわち、該治療が許容できないまたは耐えられない副作用をもたらす場合の、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、および/または生物学的療法/免疫療法に代わる方法としての癌の治療方法を提供する。本発明の方法で治療される被験体は、場合によっては、許容できないかまたは耐えられないかが判明したその治療に応じて、手術、化学療法、放射線療法、ホルモン療法または生物学的療法などの他の癌治療で治療してもよい。
【０１９０】
他の実施形態では、本発明は、癌の治療のための他の抗癌療法を施さずに、そうした治療に不応性であることが示された被験体に、1種以上の本発明のアゴニストモノクローナル抗体を投与することを提供する。特定の実施形態では、他の癌治療に不応性の患者に、癌治療を行わない状況下で1種以上のアゴニストモノクローナル抗体を投与する。
【０１９１】
他の実施形態では、EphA2を過剰発現する細胞に関連する前癌状態を有する患者に、本発明の抗体を投与して、その障害を治療し、それが悪性癌に進行する可能性を減らすことができる。特定の実施形態では、前癌状態は、ハイグレード前立腺上皮内腫瘍(PIN)、乳房の線維腺腫、線維嚢胞症、または複合母斑である。
【０１９２】
5.2.1.1  癌
本発明の方法および組成物により治療または予防することができる癌および関連する疾患は、上皮細胞由来の癌を含むが、それだけに限定されない。このような癌の例としては以下のものが挙げられる: 白血病、例えば急性白血病、急性リンパ性白血病、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病などの急性骨髄性白血病、ならびに骨髄異形成症候群; 慢性白血病、例えば慢性骨髄性(顆粒球性)白血病、慢性リンパ性白血病、毛様細胞白血病; 真性赤血球増加症; リンパ腫、例えばホジキン病、非ホジキン病; 多発性骨髄腫、例えばくすぶり型多発性骨髄腫、非分泌型骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞白血病、孤立性形質細胞腫および髄外性形質細胞腫; ヴァルデンストレームマクログロブリン血症; 意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症; 良性単クローン性免疫グロブリン血症; Ｈ鎖病; 骨および結合組織肉腫、例えば骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨細胞腫瘍、骨線維肉腫、脊索腫、骨膜性骨肉腫、軟部組織肉腫、血管肉腫、線維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫; 脳腫瘍、例えば神経膠腫、星状膠細胞腫、脳幹神経膠腫、上衣腫、乏突起膠腫、非神経膠腫、聴神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体腫、松果体芽腫、原発性脳リンパ腫; 乳癌、例えば腺癌、小葉(小細胞)癌、腺管内癌、乳腺髄様癌、乳腺粘液癌、乳腺管状癌、乳頭癌、パジェット病および炎症性乳癌; 副腎癌、例えばクロム親和性細胞腫および副腎皮質癌; 甲状腺癌、例えば乳頭状または濾胞性甲状腺癌、髄様甲状腺癌および未分化型甲状腺癌; 膵癌、例えば膵島細胞腺腫、ガストリン産生腫瘍、グルカゴン産生腫瘍、ビポーマ、ソマトスタチン産生腫瘍およびカルチノイドまたは膵島細胞腫; 下垂体癌、例えばクッシング病、プロラクチン産生腫瘍、末端肥大症および尿崩症; 眼の癌、例えば虹彩黒色腫、脈絡膜黒色腫、毛様体黒色腫などの眼球黒色腫および網膜芽細胞腫; 膣癌、例えば扁平上皮癌、腺癌および黒色腫; 外陰癌、例えば扁平上皮癌、黒色腫、腺癌、基底細胞癌、肉腫およびパジェット病; 子宮頸癌、例えば扁平上皮癌および腺癌; 子宮癌、例えば子宮内膜癌および子宮肉腫; 卵巣癌、例えば卵巣上皮癌、境界性腫瘍、胚細胞腫瘍および間質腫瘍; 食道癌、例えば扁平上皮癌、腺癌、腺様嚢胞癌、粘表皮癌、腺扁平上皮癌、肉腫、黒色腫、形質細胞腫、疣贅癌および燕麦細胞(小細胞)癌; 胃癌、例えば腺癌、腫瘤形成型(ポリープ状)、潰瘍形成型、表在拡大型、びまん性拡大型、悪性リンパ腫、脂肪肉腫、線維肉腫、癌肉腫; 大腸癌; 直腸癌; 肝臓癌、例えば肝細胞癌および肝芽腫; 胆嚢癌、例えば腺癌; 胆管癌、例えば乳頭状、結節型およびびまん性; 肺癌、例えば非小細胞肺癌、扁平上皮癌(類表皮癌)、腺癌、大細胞癌および小細胞肺癌; 精巣癌、例えば胚腫瘍、精上皮腫、未分化型、古典的(典型的)、精母細胞性、非精上皮腫、胎児性癌、奇形腫癌、絨毛癌(卵黄嚢腫瘍); 前立腺癌、例えば腺癌、平滑筋肉腫および横紋筋肉腫; 陰茎癌; 口腔癌、例えば扁平上皮癌; 基底癌; 唾液腺癌、例えば腺癌、粘表皮癌および腺様嚢胞癌; 咽頭癌、例えば扁平上皮癌および疣贅癌; 皮膚癌、例えば基底細胞癌、扁平上皮癌および黒色腫、表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、黒子悪性黒色腫、末端黒子型黒色腫; 腎癌、例えば腎細胞癌、腺癌、副腎腫、線維肉腫、移行上皮癌(腎盤および/または尿管); ウィルムス腫瘍; 膀胱癌、例えば移行上皮癌、扁平上皮癌、腺癌、癌肉腫。また、混合肉腫、骨原性肉腫、内皮肉腫、リンパ管内皮肉腫、中皮腫、滑膜腫、血管芽腫、上皮癌、嚢胞腺癌、気管支原性癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌および乳頭腺癌も癌に含まれる。(上記疾患の概説については、Fishmanら, 1985, Medicine, 第2版, J.B.Lippincott社, Philadelphia、およびMurphyら, 1997, Informed Decisions: The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin社, Penguin Books U.S.A.社, 米国を参照のこと)。
【０１９３】
従って、本発明の方法および組成物はさらに、以下のものを含む（がそれだけには限定されない)様々な癌または他の異常増殖性疾患の治療または予防に有用である：癌、例えば膀胱、乳房、大腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胃、頸部、甲状腺および皮膚の癌; 扁平上皮癌; リンパ様系統の造血腫瘍、例えば白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫; 骨髄様系統の造血腫瘍、例えば急性および慢性骨髄性白血病ならびに前骨髄性血病; 間葉起源の腫瘍、例えば線維肉腫および横紋筋肉腫; 他の腫瘍、例えば黒色腫、精上皮腫、テトラトカルシノーマ（tetratocarcinoma）、神経芽細胞腫および神経膠腫; 中枢および末梢神経系の腫瘍、例えば星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、および神経鞘腫; 間葉起源の腫瘍、例えば線維肉腫、横紋筋肉腫、および骨肉腫;ならびに他の腫瘍、例えば黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞状癌および奇形癌。アポトーシスの異常によって引き起こされた癌も本発明の方法および組成物によって治療されると考えられる。こうした癌には、限定するものではないが、濾胞状リンパ腫、p53変異をもつ癌、乳房、前立腺および卵巣のホルモン依存性腫瘍、ならびに家族性腺腫性ポリポージスなどの前癌性病変、ならびに骨髄異形成症候群があり得る。特定の実施形態では、悪性または異常増殖性変化(化生および異形成など)、あるいは過剰増殖性障害は、皮膚、肺、大腸、乳房、前立腺、膀胱、腎臓、膵臓、卵巣、または子宮について治療または予防される。他の特定の実施形態では、肉腫、黒色腫、または白血病が治療または予防される。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、癌は悪性であり、EphA2を過剰発現する。他の実施形態では、治療すべき障害は、EphA2を過剰発現する細胞に関連する前癌状態である。特定の実施形態では、前癌状態は、ハイグレード前立腺上皮内腫瘍(PIN)、乳房の線維腺腫、線維嚢胞症、または複合母斑である。
【０１９５】
特定の実施形態では、本発明の方法および組成物は、乳房、大腸、卵巣、肺、および前立腺の癌ならびに黒色腫の治療および/または予防に使用され、限定するものではなく、例として下記に示す。
【０１９６】
5.2.1.2  乳癌の治療
特定の実施形態では、乳癌にかかっている患者に有効量の1種以上の本発明のモノクローナル抗体を投与する。別の実施形態では、本発明の抗体は、有効量の乳癌治療に有用な1種以上の他の薬剤、例えば限定するものではないが、ドキソルビシン、エピルビシン、ドキソルビシンとシクロホスファミドの合剤(AC)、シクロホスファミド、ドキソルビシンおよび5-フルオロウラシルの合剤(CAF)、シクロホスファミド、エピルビシンと5-フルオロウラシルの合剤(CEF)、ハーセプチン、タモキシフェン、タモキシフェンと細胞毒化学療法の組合せ、タキサン(ドセタキセル、パクリタキセルなど)と併用して投与することができる。他の実施形態では、本発明の抗体は、リンパ節転移陽性の局在性乳癌のアジュバント治療のためにタキサンと標準的なドキソルビシンおよびシクロホスファミドと一緒に投与することができる。
【０１９７】
ある具体的な実施形態では、前癌性の乳房の線維腺腫または線維嚢胞症の患者に、本発明のEphA2抗体を投与して、該疾患を治療し、かつ該疾患が悪性乳癌に進行する可能性を減少させる。
【０１９８】
5.2.1.3  大腸癌の治療
特定の実施形態では、大腸癌にかかっている患者に有効量の1種以上の本発明のモノクローナル抗体を投与する。別の実施形態では、本発明の抗体は、有効量の大腸癌治療に有用な1種以上の他の薬剤、例えば限定するものではないが、5-FUとロイコボリンの合剤、5-FUとレバミゾールの合剤、イリノテカン(CPT-11)、またはイリノテカン、5-FUおよびロイコボリンの合剤(IFL)と併用して投与することができる。
【０１９９】
5.2.1.4  前立腺癌の治療
特定の実施形態では、前立腺癌にかかっている患者に有効量の1種以上の本発明のモノクローナル抗体を投与する。別の実施形態では、本発明の抗体は、有効量の前立腺癌治療に有用な1種以上の他の薬剤、例えば限定するものではないが、外部ビーム放射線療法、放射性同位元素(すなわち、I125、パラジウム、イリジウム)の組織内移植、ロイプロイドまたは他のLHRHアゴニスト、非ステロイド性抗アンドロゲン(フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド)、ステロイド性抗アンドロゲン(酢酸シプロテロン)、ロイプロイドとフルタミドの合剤、エストロゲン（DES、クロロトリアニセン、エチニルエストラジオール、結合型エストロゲンU.S.P.、DES二リン酸など）、ストロンチウム-89などの放射性同位元素、外部ビーム放射線療法とストロンチウム-89の組合せ、第2選択のホルモン療法（アミノグルテチミド、ヒドロコルチゾン、フルタミド禁断症状、プロゲステロン、およびケトコナゾールなど）、低用量プレドニゾン、または症状の自覚的な改善およびPSAレベルの低減をもたらすことが報告されている他の化学療法レジメン、例えばドセタキセル、パクリタキセル、エストラムスチン/ドセタキセル、エストラムスチン/エトポシド、エストラムスチン/ビンブラスチン、およびエストラムスチン/パクリタキセルと併用して投与することができる。
【０２００】
特別な実施形態では、前癌状態のハイグレード前立腺上皮内腫瘍(PIN)にかかっている患者に本発明のEphA2抗体を投与して、該疾患を治療し、かつ該疾患が悪性前立腺癌に進行する可能性を減らす。
【０２０１】
5.2.1.5  黒色腫の治療
特定の実施形態では、黒色腫にかかっている患者に有効量の1種以上の本発明のモノクローナル抗体を投与する。別の実施形態では、本発明の抗体は、有効量の黒色腫癌治療に有用な1種以上の他の薬剤、例えば限定するものではないが、ダカルバジン(DTIC)、ニトロソ尿素（カルムスチン(BCNU)およびロムスチン(CCNU)など）、穏和な単剤活性をもつ薬剤（ビンカ・アルカロイド、白金化合物、およびタキサンなど）、ダートマス・レジメン(シスプラチン、BCNU、およびDTIC)、インターフェロンα(IFN-A)、ならびにインターロイキン-2(IL-2)と併用して投与することができる。特定の実施形態では、多発性脳転移、骨転移、および脊髄圧迫のある患者に、有効量の1種以上の本発明のアゴニストモノクローナル抗体を、メルファラン(L-PAM)を用いる、腫瘍壊死因子α(TNF-α)を用いるまたは用いない隔離温熱肢灌流(isolated hyperthermic limb perfusion：ILP)と組み合わせて投与することにより、症状の軽減および放射線療法による腫瘍のある程度の収縮を果たすことができる。
【０２０２】
特定の実施形態では、前癌性複合母斑にかかっている患者には、本発明のEphA2抗体を投与して、その障害を治療し、それが悪性黒色腫に進行する可能性を減らす。
【０２０３】
5.2.1.6  卵巣癌の治療
特定の実施形態では、卵巣癌にかかっている患者に有効量の1種以上の本発明のモノクローナル抗体を投与する。別の実施形態では、本発明の抗体は、有効量の卵巣癌治療に有用な1種以上の他の薬剤、例えば限定するものではないが、P32療法などの腹腔内放射線療法、全腹部および骨盤放射線療法、シスプラチン、パクリタキセル(タキソール)またはドセタキセル(タキソテール)とシスプラチンまたはカルボプラチンの合剤、シクロホスファミドとシスプラチンの合剤、シクロホスファミドとカルボプラチンの合剤、5-FUとロイコボリンの合剤、エトポシド、リポソーム・ドキソルビシン、ゲムシタビン、またはトポテカンと併用して投与することができる。白金不応性疾患にかかっている患者のために有効量の1種以上の本発明のアゴニストモノクローナル抗体をタキソール投与と組み合わせて投与することも考えられる。不応性卵巣癌にかかっている患者の治療、例えば、白金不応性疾患の患者へのイホスファミドの投与、シスプラチンに基づく併用レジメンが失敗した後のサルベージ化学療法としてのヘキサメチルメラミン(HIMM)の投与、ならびに腫瘍上に検出可能レベルの細胞質エストロゲン受容体がある患者へのタモキシフェンの投与も包含される。
【０２０４】
5.2.1.7  肺癌の治療
特定の実施形態では、小細胞肺癌の患者に有効量の1種以上の本発明のモノクローナル抗体を投与する。別の実施形態では、本発明の抗体は、有効量の肺癌治療に有用な1種以上の他の薬剤、例えば限定するものではないが、胸部放射線療法、シスプラチン、ビンクリスチン、ドキソルビシン、およびエトポシド（単独または併用）、シクロホスファミドとドキソルビシンとビンクリスチン/エトポシドとシスプラチンの合剤(CAV/EP)、気管支内レーザー療法による局所緩和、気管支内ステント、および/または近接照射療法と組み合わせて投与することができる。
【０２０５】
他の特定の実施形態では、非小細胞肺癌の患者に有効量の1種以上の本発明のモノクローナル抗体を、有効量の肺癌治療に有用な1種以上の他の薬剤、例えば限定するものではないが、対症放射線療法、シスプラチンとビンブラスチンとマイトマイシンの合剤、シスプラチンとビノレルビンの合剤、パクリタキセル、ドセタキセル、もしくはゲムシタビン、カルボプラチンとパクリタキセルの合剤、気管支内病変の組織内放射線療法、または定位放射線外科手術と組み合わせて投与する。
【０２０６】
5.2.2  他の予防/治療剤
いくつかの実施形態では、1種以上のモノクローナル抗体の投与による治療を、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、および/または生物学的療法/免疫療法などの1種以上の療法と組み合わせる。予防/治療剤には、限定するものではないが、ペプチド、ポリペプチド、翻訳後修飾タンパク質を含むタンパク質、抗体などのタンパク質性分子；小分子(1,000ダルトン未満)、無機もしくは有機化合物；二本鎖または一本鎖DNA、二本鎖または一本鎖RNA、および三重らせん核酸分子などの核酸分子が含まれる。予防/治療剤は、公知の任意の生物(動物、植物、細菌、真菌、および原生生物、またはウイルスを含む)、または合成分子のライブラリーに由来するものでありうる。
【０２０７】
具体的な一実施形態では、本発明の方法は、本発明の抗体の投与を、ABL、ACK、AFK、AKT(例えばAKT-1、AKT-2、およびAKT-3)、ALK、AMP-PK、ATM、Aurora1、Aurora2、bARK1、bArk2、BLK、BMX、BTK、CAK、CaMキナーゼ、CDC2、CDK、CK、COT、CTD、DNA-PK、EGF-R、ErbB-1、ErbB-2、ErbB-3、ErbB-4、ERK(例えばERK1、ERK2、ERK3、ERK4、ERK5、ERK6、ERK7)、ERT-PK、FAK、FGR(例えばFGF1R、FGF2R)、FLT(例えばFLT-1、FLT-2、FLT-3、FLT-4)、FRK、FYN、GSK(例えばGSK1、GSK2、GSK3-α、GSK3-β、GSK4、GSK5)、Gタンパク質共役受容体キナーゼ(GRK)、HCK、HER2、HKII、JAK(例えばJAM、JAK2、JAK3、JAK4)、JNK(例えばJNK1、JNK2、JNK3)、KDR、KIT、IGF-1受容体、IKK-1、IKK-2、INSR(インスリン受容体)、IRAK1、IRAK2、IRK、ITK、LCK、LOY、LYN、MAPK、MAPKAPK-1、MAPKAPK-2、MEK、MET、MFPK、MHCK、MLCK、MLK3、NEU、NIK、PDGF受容体α、PDGF受容体β、PHK、PI-3キナーゼ、PKA、PKB、PKC、PKG、PRKI、PYK2、p38キナーゼ、p135tyk2、p34cdc2、p42cdc2、p42mapk、p44mpk、RAF、RET、RIP、RIP-2、RK、RON、RSキナーゼ、SRC、SYK、S6K、TAK1、TEC、TIM、TIE2、TRKA、TXK、TYK2、UL13、VEGFRI、VEGFR2、YES、YRK、ZAP-70、およびこれらのキナーゼのすべてのサブタイプなどのキナーゼの阻害剤である、1種以上の予防/治療剤の投与と組み合わせることを含む(例えば、Hardie and Hanks (1995) The Protein Kinase Facts Book, I and II, Academic Press, San Diego, Califを参照のこと)。さらなる実施形態では、本発明の抗体の投与を、Eph受容体キナーゼ(例えばEphA2、EphA4)の阻害剤である1種以上の予防/治療剤の投与と組み合わせる。さらに別の実施形態では、本発明の抗体の投与を、EphA2の阻害剤である1種以上の予防/治療剤の投与と組み合わせる。
【０２０８】
別の具体的な実施形態では、本発明の方法は、本発明の抗体の投与を、アンギオスタチン(プラスミノゲン断片);抗血管新生アンチトロンビンIII;アンギオザイム(Angiozyme);ABT-627;Bay 12-9566;ベネフィン;ベバシズマブ;BMS-275291;軟骨由来阻害剤(CDI);CAI;CD59補体断片;CEP-7055;Col 3;コンブレタスタチンA-4;エンドスタチン(コラーゲンXVIII断片);フィブロネクチン断片;Gro-β;ハロフジノン;ヘパリナーゼ;ヘパリンヘキササッカライド断片;HMV833;ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG);IM-862;インターフェロンα/β/γ;インターフェロン誘導性タンパク質(IP-10);インターロイキン12;クリングル5(プラスミノゲン断片);マリマスタット;メタロプロテイナーゼ阻害剤(TIMP);2-メトキシエストラジオール;MMI 270(CGS 27023A);MoAb IMC-1C11;ネオバスタット;NM-3;パンゼム;PI-88;胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤;プラスミノゲン活性化剤阻害剤;血小板因子-4(PF4);プリノマスタット;プロラクチン16kD断片;プロリフェリン(Proliferin)系タンパク質(PRP);PTK 787/ZK 222594;レチノイド;ソリマスタット(Solimastat);スクアラミン;SS 3304;SU 5416;SU 6668;SU 11248;テトラヒドロコルチゾール-S;テトラチオモリブデン酸塩;サリドマイド;トロンボスポンジン-1(TSP-1);TNP-470;トランスフォーミング増殖因子-β(TGF-β);バスクロスタチン(Vasculostatin);バソスタチン(Vasostatin)(カルレチクリン断片);ZD6126;ZD6474;ファメシル(famesyl)トランスフェラーゼ阻害剤(FTI);およびビスフォスフォネートなどの血管新生阻害剤である、1種以上の予防/治療剤の投与と組み合わせることを含む。
【０２０９】
別の具体的な実施形態では、本発明の方法は、本発明の抗体の投与を、アシビシン(acivicin)、アクラルビシン、塩酸アコダゾール(acodazole)、アクロニン、アドゼレシン、アルデスロイキン、アルトレタミン、アムボマイシン(ambomycin)、酢酸アメタントロン(ametantrone)、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アンスラマイシン、アスパラギナーゼ、アスペルリン(asperlin)、アザシチジン(azacitidine)、アゼテパ(azetepa)、アゾトマイシン(azotomycin)、バチマスタット、ベンゾデパ(benzodepa)、ビカルタミド、塩酸ビサントレン、ジメシル酸ビスナフィド(bisnafide)、ビゼレシン、硫酸ブレオマイシン、ブレキナール・ナトリウム、ブロピリミン、ブスルファン、カクチノマイシン、カルステロン、カラセミド(caracemide)、カーベタイマー、カルボプラチン、カルムスチン、塩酸カルビシン(carubicin)、カルゼレシン(carzelesin)、セデフィンゴル(cedefingol)、クロラムブシル、シロレマイシン(cirolemycin)、シスプラチン、クラドリビン、メシル酸クリスタノール(crisnatol)、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、塩酸ダウノルビシン、デカルバジン(decarbazine)、デシタビン(decitabine)、デキソマプラチン(dexormaplatin)、デザグアニン(dezaguanine)、メシル酸デザグアニン(dezaguanine)、ジアジコン、ドセタキセル、ドキソルビシン、塩酸ドキシルビシン、ドロロキシフェン、クエン酸ドロロキシフェン、プロピオン酸ドロモスタノロン、デュアゾマイシン(duazomycin)、エダトレキセート(edatrexate)、塩酸エフロルニチン、エルサミトルシン(elsamitrucin)、エンロプラチン(enloplatin)、エンプロメート(enpromate)、エピプロピジン(epipropidine)、塩酸エピルビシン、エルブゾロール(erbulozole)、塩酸エソルビシン(esorubicin)、エストラムスチン、リン酸エストラムスチン・ナトリウム、エタニダゾール、エトポシド、リン酸エトポシド、エトプリン(etoprine)、塩酸ファドロゾール、ファザラビン(fazarabine)、フェンレチニド(fenretinide)、フロクスウリジン、リン酸フルダラビン、フルオロウラシル、フルロシタビン(flurocitabine)、ホスキドン(fosquidone)、ホストリエシン・ナトリウム、ゲムシタビン、塩酸ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、塩酸イダルビシン、イホスファミド、イルモホシン(ilmofosine)、インターロイキン2(組換えインターロイキン2、またはrIL2を含む)、インターフェロンα-2a、インターフェロンα-2b、インターフェロンα-n1、インターフェロンα-n3、インターフェロンβ-I a、インターフェロンγ-I b、イプロプラチン、塩酸イリノテカン、酢酸ランレオチド、レトロゾール、酢酸ロイプロリド、塩酸リアロゾール、ロメトレキソール(lometrexol)・ナトリウム、ロムスチン、塩酸ロソキサントロン(losoxantrone)、マソプロコール(masoprocol)、メイタンシン、塩酸メクロレタミン、酢酸メゲストロール、酢酸メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトトレキサレート・ナトリウム、メトプリン、メツレデパ(meturedepa)、ミチンドミド(mitindomide)、マイトカルシン(mitocarcin)、マイトクロミン(mitocromin)、マイトギリン(mitogillin)、マイトマルシン(mitomalcin)、マイトマイシン、マイトスパー(mitosper)、マイトテイン(mitotane)、塩酸ミトキサントロン、ミコフェノール酸、ニトロソ尿素、ノコダゾール、ノガラマイシン、オルマプ��チン(ormaplatin)、オキシスラン(oxisuran)、パクリタキセル、ペガスパルガーゼ(pegaspargase)、ペリオマイシン(peliomycin)、ペンタムスチン(pentamustine)、硫酸ペプロマイシン、ペルホスファミド(perfosfamide)、ピポブロマン、ピポスルファン(piposulfan)、塩酸ピロキサントロン(piroxantrone)、プリカマイシン、プロメスタン(plomestane)、ポルフィマー・ナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン(prednimustine)、塩酸プロカルバジン、ピューロマイシン、塩酸ピューロマイシン、ピラゾフリン(pyrazofurin)、リボプリン(riboprine)、ログレチミド(rogletimide)、サフィンゴル(safingol)、塩酸サフィンゴル(safingol)、セムスチン、シムトラゼン(simtrazene)、スパルフォセート・ナトリウム、スパルソマイシン、塩酸スピロゲルマニウム、スピロムスチン(spiromustine)、スピロプラチン(spiroplatin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌール(sulofenur)、タリソマイシン、テコガラン・ナトリウム、テガフル、塩酸テロキサントロン(teloxantrone)、テモポルフィン、テニポシド、テロキシロン(teroxirone)、テストラクトン、チアミプリン(thiamiprine)、チオグアニン、チオテパ、チアゾフリン(tiazofurin)、チラパザミン、クエン酸トレミフェン、酢酸トレストロン(trestolone)、リン酸トリシリビン(triciribine)、トリメトレキセート、グルクロン酸トリメトレキセート、トリプトレリン、塩酸チュブロゾール(tubulozole)、ウラシル・マスタード、ウレデパ(uredepa)、バプレオチド(vapreotide)、ベルテポルフィン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン、硫酸ビンデシン、硫酸ビネピジン(vinepidine)、硫酸ビングリシネート(vinglycinate)、硫酸ビンロイロシン(vinleurosine)、酒石酸ビノレルビン、硫酸ビンロシジン(vinrosidine)、硫酸ビンゾリジン(vinzolidine)、ボロゾール(vorozole)、ゼニプラチン(zeniplatin)、ジノスタチン、塩酸ゾルビシンなどの抗癌剤である1種以上の予防/治療剤の投与と組み合わせることを含む。他の抗癌剤には、限定するものではないが、20-エピ-1,25ジヒドロキシビタミンD3、5-エチニルウラシル、アビラテロン(abiraterone)、アクラルビシン、アシルフルベン、アデシペノール(adecypenol)、アドゼレシン、アルデスロイキン、ALL-TKアンタゴニスト、アルトレタミン、アンバムスチン(ambamustine)、アミドクス(amidox)、アミフォスチン、アミノレブリン酸、アムルビシン、アムサクリン、アナグレリド、アナストロゾール、アンドログラホライド、血管新生阻害剤、アンタゴニストD、アンタゴニストG、アンタレリクス(antarelix)、抗背側化形態形成タンパク質1、抗アンドロゲン、抗エストロゲン、抗新生物薬、グリシン酸アフィジコリン、
アポトーシス遺伝子調節剤、アポトーシス調節剤、アプリン酸、ara-CDP-DL-PTBA、アルギニン・デアミナーゼ、アスラクリン(asulacrine)、アタメスタン、アトリムスチン、アキシナスタチン(axinastatin)1、アキシナスタチン(axinastatin)2、アキシナスタチン(axinastatin)3、アザセトロン、アザトキシン(azatoxin)、アザチロシン、バッカチンIII誘導体、バラノール(balanol)、バチマスタット、BCR/ABLアンタゴニスト、ベンゾクロリン、ベンゾイルスタウロスポリン、β-ラクタム誘導体、β-アレチン(alethine)、β-クラミシンB、ベツリン酸、bFGF阻害剤、ビカルタミド、ビサントレン、ビスアジリジニルスペルミン、ビスナフィド(bisnafide)、ビストラテン(bistratene)A、ビゼレシン、ブレフレート(breflate)、ブロピリミン、ブドチタン(budotitane)、ブチオニン・スルホキシイミン、カルシポトリオール、カルフォスチンC、カンプトセシン誘導体、カナリア痘IL-2、カペシタビン、カルボキサミド-アミノ-トリアゾール、カルボキシアミドトリアゾール、CaRest M3、CARN 700、軟骨由来阻害剤、カルゼレシン(carzelesin)、カゼイン・キナーゼ阻害剤(ICOS)、カスタノスペルミン、セクロピンB、セトロレリクス、クロロキノキサリン・スルホンアミド、シカプロスト、cis-ポルフィリン、クラドリビン、クロミフェン類似体、クロトリマゾール、コリスマイシン(collismycin)A、コリスマイシン(collismycin)B、コンブレタスタチンA4、コンブレタスタチン類似体、コナゲニン、クラムベスシジン(crambescidin)816、クリスタノール(crisnatol)、クリプロファイシン(cryptophycin)8、クリプロファイシン(cryptophycin)A誘導体、クラシン(curacin)A、シクロペンタンスラキノン、シクロプラタム、サイペマイシン(cypemycin)、シタラビンオクホスファート、細胞溶解因子、サイトスタチン(cytostatin)、ダクリキシマブ(dacliximab)、デシタビン(decitabine)、デヒドロジデムニンB、デスロレリン、デキサメタゾン、デキシホスファミド、デクスラゾキサン、デクスベラパミル、ジアジコン、ジデムニンB、ジドクス(didox)、ジエチルノルスペルミン、ジヒドロ-5-アザシチジン、ジヒドロタキソール、ジオキサマイシン(dioxamycin)、ジフェニル・スピロムスチン(spiromustine)、ドセタキセル、ドコサノール、ドラセトロン、ドキシフルリジン、ドロロキシフェン、ドロナビノール、デュオカルマイシンSA、エブセレン、エコムスチン(ecomustine)、エデルホシン(edelfosine)、エドレコロマブ、エフロルニチン、エレメン、エミテフール、エピルビシン、エプリステリド、エストラムスチン類似体、エストロゲン・アゴニスト、エストロゲン・アンタゴニスト、エタニダゾール、リン酸エトポシド、エキセメスタン、ファドロゾール、ファザラビン(fazarabine)、フェンレチナイド、フィルグラスチム、フィナステライド、フラボピリドール、フレゼラスチン(flezelastine)、フルアステロン、フルダラビン、塩酸フルオロダウノルニシン(fluorodaunorunicin)、フォルフェニメクス(forfenimex)、フォルメスタン、フォストリエシン、フォテムスチン、ガドリニウム・テキサフィリン、硝酸ガリウム、ガロシタビン、ガニレリックス、ゲラチナーゼ阻害剤、ゲムシタビン、グルタチオン阻害剤、ヘプルスファム(hepsulfam)、ヘレグリン、ヘキサメチレンビスアセトアミド、ヒペリシン、イバンドロン酸、イダルビシン、イドキシフェン、イドラマントン(idramantone)、イルモホシ���(ilmofosine)、イロマスタット(ilomastat)、イミダゾアクリドン、イミキモド、免疫刺激ペプチド、インスリン様成長因子-1受容体阻害剤、インターフェロン・アゴニスト、インターフェロン、インターロイキン、イオベングアン(iobenguane)、ヨードドキソルビシン(iododoxorubicin)、イポメアノール(ipomeanol)、イロプラクト(iroplact)、イルソグラジン、イソベンガゾール(isobengazole)、イソホモハリコンドリン(isohomohalicondrin)B、イタセトロン、ジャスプラキノライド、カハラリド(kahalalide)F、三塩酸ラメラリン-N、ランレオチド、レイナマイシン、レノグラスチム、硫酸レンチナン、レプトルスタチン(leptolstatin)、レトロゾール、白血病阻害因子、白血球αインターフェロン、ロイプロリド+エストロゲン+プロゲステロン、ロイプロレリン、レバミゾール、リアロゾール、直鎖ポリアミン類似体、親油性二糖類ペプチド、親油性白金化合物、リッソクリナミド(lissoclinamide)7、ロバプラチン(lobaplatin)、ロンブリシン、ロメトレキソール(lometrexol)、ロニダミン、ロソキサントロン(losoxantrone)、ロバスタチン、ロキソリビン(loxoribine)、ルルトテカン(lurtotecan)、ルテチウム・テキサフィリン、リソフィリン(lysofylline)、溶解ペプチド、メイタンシン、マンノスタチンA、マリマスタット、マソプロコール(masoprocol)、マスピン(maspin)、マトリリシン阻害剤、マトリックス・メタロプロテイナーゼ阻害剤、メノガリル、メルバロン(merbarone)、メテレリン(meterelin)、メチオニナーゼ(methioninase)、メトクロプラミド、MIF阻害剤、ミフェプリストン、ミルテホシン、ミリモスチム、ミスマッチ二重鎖RNA、ミトグアゾン、ミトラクトール(mitolactol)、マイトマイシン類似体、ミトナフィド(mitonafide)、マイトトキシン(mitotoxin)線維芽細胞成長因子-サポリン、ミトキサントロン、モファロテン、モルグラモスチム、モノクローナル抗体、ヒト絨毛性ゴナドトロフィン、モノホスホリル脂質A+ミオバクテリウム細胞壁sk、モピダモール(mopidamol)、多剤耐性遺伝子阻害剤、多発腫瘍抑制剤1系治療剤、マスタード抗癌薬、マイカペルオキシド(mycaperoxide)B、ミコバクテリウム細胞壁抽出物、ミリアポロン(myriaporone)、N-アセチルジナリン、N-置換ベンズアミド、ナファレリン、ナグレスチップ(nagrestip)、ナロキソン+ペンタゾシン、ナパビン(napavin)、ナフテルピン、ナルトグラスチム、ネダプラチン、ネモルビシン(nemorubicin)、ネリドロン酸(neridronic acid)、中性エンドペプチターゼ、ニルタミド、ナイサマイシン(nisamycin)、一酸化窒素調整剤、ニトロキシド抗酸化剤、ニトルリン(nitrullyn)、O6-ベンジルグアニン、オクトレオチド、オキセノン(okicenone)、オリゴヌクレオチド、オナプリストン、オンダンセトロン、オラシン、経口サイトカイン誘発剤、オルマプラチン(ormaplatin)、オサテロン、オキサリプラチン、オキザウノマイシン、パクリタキセル、パクリタキセル類似体、パクリタキセル誘導体、パラウアミン(palauamine)、パルミトイルリゾキシン、パミドロン酸、パナキシトリオール、パノミフェン、パラバクチン(parabactin)、パゼリプチン(pazelliptine)、ペガスパルガーゼ(pegaspargase)、ペルデシン、ポリ硫酸ペントサンナトリウム、ペントスタチン、ペントロゾール(pentrozole)、パーフルブロン、パーホスファミド、ペリリルアルコール、フェナジノマイシン、酢酸フェニル、ホスファターゼ阻害剤、ピシバニル、��酸ピロカルピン、ピラルビシン、ピリトレキシム(piritrexim)、プラセチン(placetin)A、プラセチン(placetin)B、プラスミノゲン活性化剤阻害剤、白金錯体、白金化合物、白金トリアミン錯体、ポルフィマー・ナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニゾン、プロピルbis-アクリドン、プロスタグランジンJ2、プロテアソーム阻害剤、タンパク質A系免疫調節剤、タンパク質キナーゼC阻害剤、微細藻、タンパク質チロシン・ホスファターゼ阻害剤、プリン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼ阻害剤、プルプリン、ピラゾロアクリジン、ピリドキシル化ヘモグロビン・ポリオキシエチレン接合体、rafアンタゴニスト、ラルチトレキセド、ラモセトロン、rasファルネシル・タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ras阻害剤、ras-GAP阻害剤、脱メチル化レテリプチン(retelliptine)、エチドロン酸レニウムRe 186、リゾキシン、リボザイム、RIIレチンアミド、ログレチミド(rogletimide)、ロヒツカイン(rohitukine)、ロムルチド、ロキニメクス(roquinimex)、ルビギノン(rubiginone)B1、ルボキシル(ruboxyl)、サフィンゴル(safingol)、サイントピン(saintopin)、SarCNU、サルコフィトールA、サルグラモスチム、Sdi 1ミメティクス、セムスチン、老化由来阻害剤1、センス・オリゴヌクレオチド、シグナル伝達阻害剤、シグナル伝達調整剤、一本鎖抗原結合タンパク質、シゾフィラン、ソブゾキサン、ナトリウム・ボロカプテート、フェニル酢酸ナトリウム、ソルベロール(solverol)、ソマトメジン結合タンパク質、ソネルミン、スパルホシン酸(sparfosic acid)、スピカマイシンD、スピロムスチン(spiromustine)、スプレノペンチン、スポンジスタチン1、スクアラミン、幹細胞阻害剤、幹細胞分裂阻害剤、スチピアミド(stipiamide)、ストロメリシン阻害剤、スルフィノシン(sulfinosine)、超活性血管作用性腸ペプチド・アンタゴニスト、スラジスタ(suradista)、スラミン、スワンソニン、合成グリコサミノグリカン、タリムスチン(tallimustine)、タモキシフェン・メチオジド、タウロムスチン(tauromustine)、タキソール、タザロテン、テコガラン・ナトリウム、テガフール、テルラピリリウム(tellurapyrylium)、テロメラーゼ阻害剤、テモポルフィン、テモゾロマイド、テニポシド、テトラクロロデカオキシド、テトラゾミン(tetrazomine)、タリブラスチン(thaliblastine)、サリドマイド、チオコラリン(thiocoraline)、チオグアニン、トロンボポエチン、トロンボポエチン・ミメティク、チマルファシン(thymalfasin)、チモポエチン受容体アゴニスト、チモトリナン(thymotrinan)、甲状腺刺激ホルモン、スズ・エチル・エチオプルプリン、チラパザミン、二塩化チタノセン、トプセンチン(topsentin)、トレミフェン、全能性幹細胞因子、翻訳阻害剤、トレチノイン、トリアセチルウリジン、トリシリビン(triciribine)、トリメトレキセート、トリプトレリン、トロピセトロン、ツロステライド(turosteride)、チロシン・キナーゼ阻害剤、チルホスチン、UBC阻害剤、ウベニメクス、尿生殖洞由来成長阻害因子、ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト、バプレオチド(vapreotide)、バリオリン(variolin)B、ベクター系、赤血球遺伝子治療剤、ベラレゾール(velaresol)、ベラミン(veramine)、ベルジンス(verdins)、ベルテポルフィン、ビノレルビン、ビンキサルチン(vinxaltine)、バイタクシン、ボロゾール、ザノテロン(zanoterone)、ゼニプラチン(zeniplatin)、ジラスコルブ(zilascorb)、およびジノスタチン・スチマラマーが含まれる。好ましい追加の抗癌剤は、5-フルオロウラシルおよびロイコボリンである。
【０２１０】
より特定の実施形態では、本発明はまた、本発明の1種以上のモノクローナル抗体の投与を、表2に開示されている抗癌剤などの1種以上の治療剤の投与と、好ましくは前述の乳癌、卵巣癌、黒色腫、前立腺癌、大腸癌、および肺癌の治療のために、組み合わせることも含む。
【表２】
2009521219.tif 000006
2009521219.tif 000007
2009521219.tif 000008
【０２１１】
本発明はまた、本発明のEphA2抗体の投与を、癌細胞を破壊するためにX線、γ線、その他の放射線源の使用を含む放射線療法と組み合わせることを含む。さらなる実施形態では、この放射線療法は、放射線が遠隔治療線源から向けられる放射線外部照射または遠隔照射療法として行われる。他の実施形態では、この放射線療法は、放射線源を体内の癌細胞または腫瘤に近い位置に配置する内部療法または近接照射療法として行われる。
【０２１２】
癌治療剤、ならびにその用量、投与経路、および推奨される使用法は当技術分野で周知であり、Physician's Desk Reference(第58版、2004)などの文献に記載されている。
【０２１３】
5.3  本発明の抗体の同定
5.3.1  アゴニスト抗体
本発明の抗体は、EphA2受容体と免疫特異的に結合するだけでなく、好ましくはEphA2受容体をアゴナイズ(すなわち、EphA2のリン酸化を誘発)させうる。アゴナイズされるとき、EphA2はリン酸化され、その後分解される。EphA2のリン酸化、活性、または発現のレベルをアッセイするための当技術分野で公知の方法はどれも、候補EphA2抗体をアッセイしてそのアゴニスト活性を測定するために用いることができる(例えば、下記のセクション6.2.1を参照のこと)。
【０２１４】
従って本発明は、EphA2と特異的に結合する抗体、特にEphA2の細胞外ドメインと結合する抗体を、EphA2を発現する細胞、特に (同じ細胞型の非癌細胞と比較して) EphA2を過剰発現する癌細胞、好ましくは転移癌細胞と共にインキュベートし、次いでEphA2リン酸化および/またはEphA2分解の増加をアッセイし、それにより本発明のEphA2抗体を同定することによる、本発明のEphA2抗体をアッセイしスクリーニングする方法を提供する。
【０２１５】
5.3.2  癌細胞上に露出したEphA2エピトープと選択的に結合する抗体
本発明の抗体は、好ましくは、非癌細胞（またはEphA2がリガンドに結合している細胞）ではなく癌細胞(例えば、EphA2を過剰発現する細胞、および/またはリガンドに結合していない多数のEphA2を有する細胞)上に露出されたEphA2エピトープと選択的に結合する。この実施形態では、本発明の抗体は、非癌細胞上には露出されていないが、癌細胞上に露出されているEphA2エピトープに対して誘導された抗体である(例えば、下記のセクション6.6を参照のこと)。非癌細胞と癌細胞のEphA2膜分布の違いにより、非癌細胞上には露出されない特定のエピトープが癌細胞上に露出する。例えば、通常EphA2はそのリガンドであるエフリン(Ephrin) Alと結合して、細胞間接触領域に局在している。しかし、癌細胞は一般に、細胞間接触の減少を示す一方で、そのリガンドに比して過剰量のEphA2を過剰発現する。従って、癌細胞では、細胞間接触部に局在しない未結合EphA2量の増加が認められる。かくして、一実施形態では、未結合で非局在のEphA2と選択的に結合する抗体が、本発明の抗体である。
【０２１６】
細胞への候補EphA2抗体の結合/局在を確認するための当技術分野で公知の方法を用いて、所望の結合特性について候補抗体をスクリーニングすることができる。一実施形態では、抗体の結合特性を確認するのに免疫蛍光顕微鏡検査法を使用する。in vitroで増殖させた細胞への抗体結合を比較するにのに標準的な技法を使用することができる。具体的な実施形態では、癌細胞への抗体結合を、非癌細胞への抗体結合と比較する。露出EphA2エピトープ抗体は、非癌細胞にはほとんど結合しないが、癌細胞にはよく結合する。別の具体的な実施形態では、解離した(例えば、EGTAなどのカルシウム・キレート剤で処理した)非癌細胞への抗体結合を、解離していない非癌細胞への抗体結合と比較する。露出EphA2エピトープ抗体は、解離していない非癌細胞にはほとんど結合しないが、解離した非癌細胞にはよく結合する。
【０２１７】
別の実施形態では、抗体の結合特性を確認するのに、フローサイトメトリーを使用する。この実施形態では、EphA2はそのリガンドであるエフリンA1と架橋されていてもされていなくてもよい。露出EphA2エピトープ抗体は、架橋されたEphA2にはあまり結合しないが、非架橋EphA2にはよく結合する。
【０２１８】
別の実施形態では、抗体の結合特性を確認するのに、細胞に基づくイムノアッセイを使用する。この実施形態では、EphA2との結合についてEphA2リガンド(例えば、エフリンAl)と競合し得る抗体が、EphA2からエフリンA1を追い出す。このアッセイで用いられるEphA2リガンドは、可溶性タンパク質(例えば、組換え的に発現されたもの)であってもよいし、細胞に固着されるようにその細胞上に発現されたものでもよい。
【０２１９】
5.4  治療上または予防上の有用性の特徴付けおよび検証
本発明の予防および/または治療プロトコールの毒性および有効性は、例えばLD50(集団の50％に対し致死的な用量)およびED50(集団の50％に治療上有効な用量)を決定するための、細胞培養物または実験動物での標準的な薬学的手法により確認することができる。毒性を示す用量と治療効果を示す用量の比を治療係数とし、LD50/ED50比として表すことができる。治療係数が大きい予防および/または治療剤が好ましい。毒性の副作用を示す予防および/または治療剤も使用できるが、未感染細胞に対する潜在的ダメージを最小限に抑え、それにより副作用を低減させるために、そのような薬剤を患部組織の部位に標的化する送達系を設計するよう注意を払うべきである。
【０２２０】
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータは、ヒトに使用するための予防および/または治療剤の用量範囲を処方するのに用いることができる。このような薬剤の用量は、毒性がほとんどまたはまったくない、ED50を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。この用量は、使用する剤形および利用する投与経路に応じて、この範囲内で変化しうる。本発明の方法で用いる薬剤については、治療有効量をまずは細胞培養アッセイから推定する。細胞培養物で決定されたIC50 (すなわち、症状の最大半減の抑制を実現する試験化合物の濃度) を含む循環血漿濃度範囲を達成するように、ある用量を動物モデルにおいて処方する。このような情報を用いてより正確にヒトに有用な用量を決定することができる。血漿濃度は、例えば高速液体クロマトグラフィーで測定することができる。
【０２２１】
本発明に従って用いられる治療剤の抗癌活性は、マウスEphA2をヒトEphA2で置き換えたSCIDマウスモデルもしくは遺伝子組換えマウス、ヒト異種移植片を有するヌードマウス、下記セクション6に記載の動物モデル、または当技術分野で知られており、またRelevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development (1999, Fiebig and Burger編); Contributions to Oncology (1999, Karger); The Nude Mouse in Oncology Research (1991, Boven and Winograd編); Anticancer Drug Development Guide (1997, Teicher編)（これらの全体を参照として本明細書に含めるものとする）に記載されている動物モデルなどの、癌研究用の様々な実験動物モデルを使うことにより測定することができる。
【０２２２】
5.4.1  治療上の有用性の検証
本発明のプロトコールおよび組成物は、ヒトに使用する前に、所期の治療上および予防上の活性について、in vitroで、その後in vivoで検査することが好ましい。例えば、ある特定の治療プロトコールを施すことが必要であるか否かの判定に使用できるin vitroアッセイとして、in vitro細胞培養アッセイがある。そのアッセイでは、患者の組織サンプルを培養にて増殖させ、そのサンプルをプロトコールに曝露するか、あるいはそのサンプルに他の方法でプロトコールを施し、例えばEphA2のリン酸化/分解の増加など、このプロトコールの組織サンプルへの効果を観察する。接触された細胞の増殖またはその生存が低レベルであることは、その治療剤が患者の症状を治療するのに有効であることを示している。別の方法として、患者由来の細胞を培養する代わりに、腫瘍または悪性細胞株の細胞を用いて治療剤および治療方法をスクリーニングしてもよい。当技術分野で標準とされているアッセイ方法の多くを、このような生存および/または増殖の評価に使用することができる。例えば、細胞増殖は、3H-チミジン取り込みを測定したり、細胞を直接計数したり、または癌原遺伝子(fos、mycなど)や細胞周期マーカーなどの既知遺伝子の転写活性の変化を検知することにより、評価することができる。細胞生存度はトリパンブルー染色により評価でき、分化度は形態の変化、EphA2のリン酸化/分解の増加などに基づいて、可視的に評価することができる。
【０２２３】
治療に使用される化合物は、ヒトで試験する前に、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギ、ハムスターなどを含む適切な動物モデル系（例えば、上記の動物モデル）で試験することができる。その後、これらの化合物を適切な臨床試験に供する。
【０２２４】
さらに、当業者に公知のアッセイを使用して、癌の治療または予防のための本明細書に記載した併用療法の予防上および/または治療上の有用性を評価できる。
【０２２５】
5.5  医薬組成物
本発明の組成物には、医薬組成物の製造に有用な原薬組成物(低純度または未滅菌の組成物)および、単位剤形を製造するのに使用可能な医薬組成物(すなわち、被験体または患者に投与するのに適している組成物)が含まれる。このような組成物には、予防または治療に有効な量の本明細書に開示する予防剤および/または治療剤、またはそれらの薬剤と製薬上許容される担体の組合せが含まれる。本発明の組成物は、予防または治療に有効な量の本発明の1種以上のEphA2抗体と、製薬上許容される担体との組合せを含むことが好ましい。別の実施形態では、本発明の組成物は追加の抗癌剤をさらに含む。特定の実施形態では、追加の抗癌剤として、限定するものではないが、化学療法剤、放射線療法剤、ホルモン療法剤、生物学的療法剤、および免疫療法剤が挙げられる。
【０２２６】
具体的な一実施形態では、「製薬上許容される」という用語は、連邦または州政府の規制当局による承認を受けたか、米国薬局方、または動物（より具体的にはヒト）における使用のための、他の一般に認可された薬局方に掲載されていることを意味する。「担体」という用語は、それと一緒に治療剤が投与される希釈剤、アジュバント(例えば、フロイントのアジュバント(完全または不完全)、またはより好ましくは、Chiron社(Emeryville, CA)から入手可能であるMF59C.1アジュバント)、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような医薬用担体は、無菌の液体、例えば水や油であり、油としては、石油、動物、植物、または合成起源のもの、例えば落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などであり得る。この医薬組成物を静脈内に投与する場合には、水が好ましい担体である。食塩水、およびデキストロースやグリセリンの水溶液を、特に注射液用の液状担体として使用することもできる。適切な医薬用賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセリン、プロピレングリコール、水、エタノールなどが含まれる。この組成物は、所望により、少量の湿潤剤、乳化剤、またはpH緩衝剤を含んでもよい。これらの組成物は、溶液剤、懸濁液剤、乳剤、錠剤、丸剤、粉末剤、持続放出性製剤などの形をとることができる。
【０２２７】
一般に、本発明の組成物の成分は、それぞれ別々に供給されるか、あるいは単位剤形として、例えば活性薬剤の量を示すアンプルやサシェット(sachette)などの気密性密封容器中の凍結乾燥粉末または水不含濃縮物として、混合されて供給される。この組成物を輸液により投与する場合、それは医薬グレードの滅菌水または生理食塩水を含む輸液ボトルと共に分配することができる。この組成物を注射により投与する場合は、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供して、諸成分を投与前に混合するようにする。
【０２２８】
本発明の組成物は、中性形態または塩の形態として調製することができる。製薬上許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されるようなアニオンで形成される塩、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されるようなカチオンで形成される塩が含まれる。
【０２２９】
様々な送達系、例えばリポソーム、微粒子、マイクロカプセル中への封入によるもの、抗体または抗体フラグメントを発現することが可能な組換え細胞によるもの、受容体を介したエンドサイトーシスによるもの(例えば、WuおよびWu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432を参照のこと)、レトロウイルス・ベクターや他のベクターの一部としての核酸の構築によるものなどが知られており、本発明のアゴニストモノクローナル抗体、あるいは本発明のアゴニストモノクローナル抗体と癌の予防または治療に有用な予防剤または治療剤の組合せを投与するために使用することができる。本発明の予防または治療剤の投与方法には、限定するものではないが、非経口投与(例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下)、硬膜外投与、粘膜投与(例えば、鼻腔内、吸入、経口)が含まれる。具体的な一実施形態では、本発明の予防または治療剤を筋肉内、静脈内、または皮下投与する。この予防または治療剤は、便利な経路で、例えば輸液、ボーラス注射、上皮または皮膚粘膜内層(例えば、口腔粘膜、直腸粘膜など)を介した吸収により投与することができ、他の生物学的に有効な薬剤とともに投与することができる。この投与は全身投与でも局所投与でもよい。
【０２３０】
具体的な一実施形態では、望ましくは本発明の予防または治療剤を治療が必要な部位に局所投与する。これは例えば、局所輸液、注射、またはインプラントにより実現することができる。このインプラントは、シラスティック膜などの膜や繊維を含む多孔質材料、非多孔質材料、またはゼラチン質材料からなる。
【０２３１】
別の一実施形態では、予防または治療剤は、制御放出系または持続放出系で送達することができる。一実施形態では、ポンプを用いて制御または持続放出を実現することができる(Langer, 前掲; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwaldら, 1980, Surgery 88:507; Saudekら, 1989, N. Engl. J. Med. 321:574を参照のこと)。別の一実施形態では、ポリマー材料を用いて本発明の抗体またはそのフラグメントの制御または持続放出を実現することができる(例えば、Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise編, CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball(編), Wiley, New York(1984); Ranger and Peppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; Levyら, 1985, Science 228:190; Duringら, 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howardら, 1989, J. Neurosurg. 71:105); 米国特許第5,679,377号; 米国特許第5,916,597号; 米国特許第5,912,015号; 米国特許第5,989,463号; 米国特許第5,128,326号; 国際公開WO99/15154号およびWO99/20253号を参照のこと)。持続放出性製剤中で用いられるポリマーの例は、限定するものではないが、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチレン-コ-酢酸ビニル)、ポリ(メタクリル酸)、ポリグリコール酸(PLG)、ポリ酸無水物、ポリ(N-ビニルピロリドン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリアクリルアミド、ポリ(エチレングリコール)、ポリラクチド(PLA)、ポリ(ラクチド-コ-グリコール酸)(PLGA)、ポリオルトエステルが含まれる。好ましい実施形態では、持続放出性製剤に用いられるポリマーは不活性であり、浸出性不純物を含まず、貯蔵安定性であり、滅菌されており、生分解性である。別の実施形態では、制御放出系または持続放出系を予防または治療標的の近くに配置することができ、従って全身用量の一部しか必要としない(例えば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, 前掲, vol. 2, pp. 115-138 (1984)を参照のこと)。
【０２３２】
制御放出系についてはLangerの総説で論じられている(1990, Science 249:1527-1533)。当業者に公知の方法ならどんな方法でも、本発明の1種以上の治療剤を含む持続放出製剤の製造に使用することができる。例えば、米国特許第4,526,938号; 国際公開WO91/05548号およびWO 96/20698号; Ningら, 1996, Radiotherapy & Oncology 39:179-189; Songら, 1995, PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleekら, 1997, Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; およびLamら, 1997, Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760を参照のこと。これらはすべてその全体が参照として本明細書に組み込まれる。
【０２３３】
5.5.1  製剤
本発明に従って使用される医薬組成物は、1種以上の生理的に許容される担体または賦形剤を用いて、通常の方法で製剤化することができる。
【０２３４】
従って、本発明のEphA2抗体およびその生理的に許容される塩および溶媒和物は、吸入法または吹送法(口か鼻のどちらかを通じて)による投与、または経口・非経口もしくは粘膜(頬、膣、直腸、舌下など)投与用に製剤化しうる。別の実施形態では、局所的または全身的な非経口投与が使用される。
【０２３５】
経口投与では、医薬組成物は例えば錠剤またはカプセル剤の形をとることができ、これらは、結合剤(例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース);充填剤(例えば、ラクトース、微結晶セルロース、リン酸水素カルシウム);滑沢剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ);崩壊剤(例えば、ジャガイモデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム);または湿潤剤(例えばラウリル硫酸ナトリウム)などの製薬上許容される賦形剤を用いて通常の方法で調製される。錠剤は当技術分野で周知の方法によりコーティングしてもよい。経口投与用の液体製剤は、例えば溶液剤、シロップ剤、または懸濁液剤の形をとることができ、これらは使用前に水や他の適切なビヒクルを使って用時調製すべき乾燥製品として提供することができる。このような液体製剤は、懸濁化剤(例えば、ソルビトール・シロップ、セルロース誘導体、水添食用脂);乳化剤(例えば、レシチン、アカシア);非水性ビヒクル(例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、分別植物油);および防腐剤(例えば、p-ヒドロキシ安息香酸メチル、p-ヒドロキシ安息香酸プロピル、ソルビン酸)などの製薬上許容される添加剤を用いて通常の方法で調製することができる。これらの製剤はまた、緩衝塩、香味剤、着色剤、および甘味剤を必要に応じて含むことができる。
【０２３６】
経口投与用の製剤は、活性化合物を制御放出させるように適切に製剤化することができる。
【０２３７】
バッカル投与では、これらの組成物は、通常の方法で製剤化される錠剤またはトローチ剤の形をとることができる。
【０２３８】
吸入による投与では、本発明に従って用いられる予防または治療剤は、適切な噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切なガスを使用した、加圧包装または噴霧器から提供されるエアロゾル・スプレーの形をとることができる。加圧エアゾールの場合、バルブを設けることで単位用量を決定して、計量された量を送達することができる。吸入器または注入器中で用いられる、例えばゼラチンの、カプセルおよびカートリッジは、この化合物とラクトースやデンプンなどの適切な粉末基剤との粉末混合物を含むものとして製剤化することができる。
【０２３９】
予防または治療剤は、注射、例えばボーラス注射または連続輸液による非経口投与用に製剤化することができる。輸液用製剤は、防腐剤を加えた単位剤形、例えば、アンプルや複数回用量容器で提供することができる。これらの組成物は、油性または水性ビヒクル中での懸濁液剤、溶液剤、乳剤などの形をとることができ、また懸濁化剤、安定化剤、および/または分散助剤などの処方剤を含むこともできる。あるいは、有効成分を粉末の形にして、使用前に適切なビヒクル、例えば発熱物質を含まない滅菌水を使って、用時調製できるようにしてもよい。
【０２４０】
これらの予防または治療剤は、例えばカカオ脂や他のグリセリドなどの通常の坐薬基剤を含む坐薬や停留浣腸などの直腸用組成物として製剤化することもできる。
【０２４１】
前述の組成物に加えて、これらの予防または治療剤はデポー製剤として調製することもできる。そのような持効性製剤は、(例えば皮下もしくは筋肉内)移植または筋肉内注射により投与することができる。従って、例えば、これらの予防または治療剤は、適切なポリマー材料もしくは疎水性材料(例えば、許容可能な油中の乳剤として)またはイオン交換樹脂を用いて、あるいは難溶性の誘導体、例えば難溶性の塩として調製することができる。
【０２４２】
本発明はまた、その量を示すアンプルやサシェット(sachette)などの気密性密封容器に封入された予防または治療剤を提供する。一実施形態では、この予防または治療剤は、気密性密封容器中の滅菌凍結乾燥粉末または水不含濃縮物として供給され、例えば水や生理食塩水で適切な濃度に再調製して被験体に投与することができる。
【０２４３】
本発明のさらなる実施形態において、様々な化学療法剤、生物学的療法剤/免疫療法剤、およびホルモン療法剤の製剤化および投与は当技術分野で知られており、しばしばPhysician's Desk Reference(第58版、2004)に記載されている。当技術分野で公知の各種癌治療剤の典型的な用量を表2に示す。
【０２４４】
本発明の他の実施形態では、放射性同位体などの放射線療法剤は、カプセル中の液体または飲料として経口投与することができる。放射性同位体はまた、静脈注射用に製剤化することもできる。熟練した腫瘍学者であれば、好ましい製剤および投与経路を決定することができる。
【０２４５】
ある実施形態では、本発明のアゴニストモノクローナル抗体は、静脈注射の場合には1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、25mg/ml、および50mg/mlに、反復皮下投与および筋肉内注射の場合には5mg/ml、10mg/ml、および80mg/mlに製剤化する。他の実施形態では、本発明のアゴニストモノクローナル抗体を約0.1mg/ml〜約1mg/ml、約1mg/ml〜約5mg/ml、約5mg/ml〜約10mg/ml、約10mg/ml〜約25mg/ml、および約25mg/ml〜約50mg/mlに製剤化する。
【０２４６】
これらの組成物は、所望により、活性成分を含む1つまたは複数の単位剤形を収容した包装物またはディスペンサ装置として提供することができる。この包装物は、例えばブリスターパックのような金属箔やプラスチック箔で構成されていてよい。この包装物またはディスペンサ装置には投与のための説明書を添付することができる。
【０２４７】
5.5.2  用量
癌の治療、予防、または管理に有効でありうる本発明の組成物の量は、標準的な検査法により決定することができる。例えば、癌の治療、予防、または管理に有効であろうこの組成物の用量は、例えば本明細書に開示されているまたは当業者には知られている動物モデルなどに、この組成物を投与することにより決定することができる。さらに、in vitroアッセイを任意選択で使用して、最適な用量の範囲を特定するのに役立ててもよい。
【０２４８】
好ましい有効用量の選択は、当業者に知られているいくつかの要因を考慮して、当業者が(例えば、臨床試験を経て)行うことができる。このような要因には、治療または予防すべき疾患、関連する症状、患者の体重、患者の免疫状態、および投与される医薬組成物の正確さを反映する当業者に公知の他の要因が含まれる。
【０２４９】
製剤で利用される正確な用量はまた、投与経路および癌の重篤度にも依存し、担当医の判断および各患者の状況に応じて決定されるべきである。有効用量は、in vitroまたは動物モデルの試験系から誘導される用量応答曲線から推定することができる。
【０２５０】
抗体については、患者に投与される用量は、典型的には0.0001mg/kg〜100mg/kg(患者の体重)である。患者に投与される用量は、好ましくは0.0001mg/kg〜20mg/kg(患者の体重)、0.0001mg/kg〜10mg/kg、0.0001mg/kg〜5mg/kg、0.0001mg/kg〜2mg/kg、0.0001mg/kg〜1mg/kg、0.0001mg/kg〜0.75mg/kg、0.0001mg/kg〜0.5mg/kg、0.0001mg/kg〜0.25mg/kg、0.0001mg/kg〜0.15mg/kg、0.0001mg/kg〜0.10mg/kg、0.001mg/kg〜0.5mg/kg、0.01mg/kg〜0.25mg/kg、または0.01mg/kg〜0.10mg/kgである。一般に、人体内での半減期は、ヒト抗体およびヒト化抗体の方が、外来ポリペプチドに対する免疫反応のために、他生物種由来の抗体より長い。従って、ヒト抗体の用量を少なくし、投与頻度を少なくすることがしばしば可能である。
【０２５１】
患者に投与される他の癌治療剤について、当技術分野で公知の様々な治療剤の典型的な用量を表2に示す。本発明のある好ましい実施形態は、単独の薬剤の投与で推奨される用量と比べて少ない用量を併用療法レジメンで投与することを含むであろう。
【０２５２】
本発明は、これまで癌の予防、治療、管理、または改善に有効であると思われてきた既知の予防剤または治療剤をより少ない用量で投与する方法を提供する。より少ない用量の既知の抗癌薬と、より少ない用量の本発明のアゴニストモノクローナル抗体を組み合わせて投与することが好ましい。
【０２５３】
5.6  キット
本発明は本発明のEphA2抗体を充填した1つまたは複数の容器を含む医薬パックまたはキットを提供する。また、癌治療に有用な1種以上の他の予防剤または治療剤をこの医薬パックまたはキットに含めてもよい。本発明は本発明の組成物の1種以上の成分を充填した1つまたは複数の容器を含む医薬パックまたはキットも提供する。場合により、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関が規定する形式で、ヒトへの投与のための製造、使用または販売を当該機関が承認したことを示す注意書を、この容器に添付してもよい。
【０２５４】
本発明は上記の方法において使用できるキットを提供する。ある実施形態では、本発明の1種以上のEphA2抗体がキットに含まれる。別の実施形態では、1つまたは複数の容器に入れた、癌治療に有用な1種以上の予防剤または治療剤がキットにさらに含まれる。いくつかの実施形態では、本発明のEphA2抗体は2A4、2E7、または12E2である。別の実施形態では、他の予防剤または治療剤は化学療法剤である。別の実施形態では、他の予防剤または治療剤は生物学的治療剤またはホルモン剤である。
【実施例】
【０２５５】
６．実施例
ヒト化抗ヒトEphA2モノクローナル抗体4H5の親和性最適化
試薬
すべての化学薬品は分析用のグレードのものとした。制限酵素とDNA修飾酵素、ならびにT4リガーゼおよびT7 DNAポリメラーゼは、New England Biolabs社 (Beverly, MA)から購入した。カスタム・オリゴヌクレオチドはInvitrogen社 (Carlsbad, CA)により合成された。ヒトEphA2-Fc融合タンパク質 (ヒトIgG1のFc部分に融合させたヒトEphA2エクトドメインからなる)は、ヒト胚性腎(HEK)293細胞において発現させ、標準プロトコールを用いてプロテインGアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。ヒトEphA2-Fcのビオチン化は、EZ-Link Sulfo-NHS-LC-ビオチン化キットを用いてメーカー(Pierce社、Rockford, IL)の使用説明書に従って実施した。
【０２５６】
1.  フレームワークシャッフリング法によるマウス抗ヒトEphA2抗体EA2のヒト化：
親マウスモノクローナル抗体EA2のヒト化は、W.F. Dall'Acquaら, Methods 36 (2005) 43-60、ならびに米国特許出願公開No. 2005/0048617AlおよびNo. 2006/0228350A1（これらの文献はその全体を参照として本明細書に含めるものとする）に詳述されるようなフレームワークシャッフリング法を用いて実施した。本質的には、EA2 VL領域とEA2 VH領域の両方のCDR領域を、ヒトフレームワーク生殖系列配列のライブラリーにコンビナトリアル様式でグラフトし、EphA2結合を保持するモザイクのヒト化変異体を作製した。そのような１つのヒト化クローン4H5は、キメラFab EA2と比べたとき、約20倍の親和性の向上を示した。このクローンを親和性の成熟のためのテンプレートとして選択し、その後下記のように最適化することにより、変異体2A4、2E7、および12E2を得た。
【０２５７】
2.  4H5 scFvの親和性最適化：
2.1  scFvテンプレートの構築：  ヒト化Mab 4H5の可変領域をscFvフラグメントとしてM13発現ベクターにクローニングした (W.F. Dall'Acquaら / Methods)。4H5軽鎖可変領域を4H5重鎖可変領域の3'末端に[(Gly)4Ser]3リンカーで結合させ、続いてC-末端にFLAGタグとHisタグを結合させた（図1）。別々の反応において可変領域を増幅するために次のプライマーをPCRで用いて、構築物を生成させた：
2009521219.tif 000009
ここで、下線を引いた配列は[(Gly)4Ser]3リンカーに相当し、イタリック体の太字はSfi I制限部位を示す。オーバーラップするPCRを用いてscFvフラグメントを構築し、次いでこれを制限酵素Sfi Iで処理してベクターMD 102にクローニングした。マウス親EA2可変領域を同様にクローニングして、scFv対照として使用した。次に、4H5 scFv構築物をCJ236内で発現させ、WuおよびAn [Wuら, 2003]に記載されるようにウリジン＋ssDNAを産生させた。この4H5 scFv U＋ssDNAを下記の変異誘発性（mutagenic）親和性最適化反応のためのテンプレートとして使用した。
【０２５８】
2.2  各CDR領域の最節約ランダム化(Parsimonious randomization)によるscFvの親和性最適化：  6つ全ての相補性決定領域(CDR)の各アミノ酸を、アミノ酸あたり2つの別個のライブラリーを用いて、個々に、ランダムに変異させた[Wuら, 2003]。CDRアミノ酸位置ごとに8アミノ酸(NSS)または12アミノ酸(NWS)のいずれかをコードする、個々の縮重プライマーを1回のハイブリダイゼーション変異誘発反応[Wuら, 2003、Dall'Acquaら, 2005]で使用し、その後対応するCDRライブラリーの作製のために組み合わせた。簡単に述べると、各縮重プライマーをリン酸化し、これをアニーリング反応（温度を95℃から55℃に1時間かけて低下させた）でウリジン化4H5 scFv一本鎖U＋DNAテンプレート（WuおよびAn, 2003に記載されるように調製した）と共に10：1の比で用いた。このアニーリングさせた反応物にT4リガーゼとT7 DNAポリメラーゼを添加し、この反応物を37℃で1.5時間インキュベートした。各CDRのアミノ酸ごとに合成産物をプールしたが、NSSおよびNWSライブラリーは分離したままにして、独立にスクリーニングした。典型的には、その後、プールしたCDRライブラリーの合成DNAの1μLを、XL1-Blue細菌叢上でのプラーク形成のために、または記載[Wu, 2003]のようなscFvフラグメントの産生のために、XL1-Blueにエレクトロポレートした。
【０２５９】
3.  ライブラリーのスクリーニング
3.1.  一次スクリーニング
3.1.1.  説明
一次スクリーニングは一点ELISA (single point ELISA: SPE)からなるものであったが、このELISAは、本質的にWu, 2003およびDall'Acquaら, 2005に記載されるように、1mLの細菌培養物（96深底ウェルプレートで増殖させ、個々の組換えM13クローンを感染させた）から調製した可溶性の分泌scFvタンパク質を含む上清を用いて行った。簡単に述べると、この捕捉ELISA法では、96ウェルMaxisorp Immunoplateの各ウェルに約30ngのマウス抗FLAG抗体(Sigma社)をコーティングし、3％ BSA/PBSを用いて37℃で2時間ブロッキングし、サンプル（可溶性の分泌scFv）と共に室温で2時間インキュベートした。次に、150〜600ng/ウェルのビオチン化ヒトEphA2-Fcを室温で2時間添加した。これに続いて、ニュートラアビジン(neutravidin)-ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート(Pierce社、IL)と共に室温で40分間インキュベートした。HRP活性をテトラメチルベンジジン(TMB)基質により検出し、この反応を0.2M H2SO4で停止させた。プレートを450nmで読み取った。
【０２６０】
3.1.2.  一次スクリーニングの結果
典型的には、親4H5 scFvより約2倍高いOD 450nmシグナルを示すクローンを15mLスケールで再増殖させ、同ELISAにより2通りのウェルで再アッセイして陽性の結果を確認した。その後、反復して確認したクローンの配列を決定し、活性ELISA（下記参照）を用いてアッセイしてヒトEphA2との結合の倍率増加を評価した。
【０２６１】
3.2.  二次スクリーニング
3.2.1.  説明
先に同定された単一変化の親和性最適化変異体（セクション3.1参照）をさらに特性解析するために、15mL細菌培養物[Wu, 2003]から発現させた分泌scFvフラグメントを用いて二次スクリーニングを実施した。より正確には、次の2つのELISAを用いた：
(i)  活性ELISA、この場合には、96ウェルMaxisorp Immunoplateの個々のウェルに約0.5μgのヒトEphA2-Fcをコーティングし、3％ BSA/PBSを用いて37℃で2時間ブロッキングした。次いで、2倍連続希釈のサンプルを加え、室温で1時間インキュベートした。続いて、ヤギ抗ヒトκホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートと共にインキュベートした。TMB基質を用いてHRP活性を検出し、この反応を0.2M H2SO4で停止させた。プレートを450nmで読み取った；
(ii)  抗scFv定量ELISA、これは本質的に記載[Wu, 2003]のとおりに実施した。簡単に述べると、96ウェルNi NTAプレート(Qiagen社)の個々のウェルを2倍連続希釈のサンプルまたは標準品(50〜0.78ng/ml)と共にインキュベートした。続いて、マウス抗FLAGホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートと共にインキュベートした。TMB基質を用いてHRP活性を検出し、この反応を0.2M H2SO4で停止させた。プレートを450nmで読み取った。
【０２６２】
3.2.2.  二次スクリーニングの結果
セクション3.2.1に記載した2種類の二次ELISAは、scFv 4H5と親和性最適化変異体とを、それらのscFv濃度を標準化することで、ヒトEphA2との結合に関して互いに比較することを可能にした。単一変化の親和性最適化変異体scFvクローンはすべて、親scFv 4H5と比較したとき、より良好なヒトEphA2との結合を示した（データは示してない）。
【０２６３】
4.  CDR親和性最適化クローンからのコンビナトリアル変異体の構築および特性解析
4.1.1.  説明
さらなる結合の向上を示すコンビナトリアル変異体を作製するために、活性/定量ELISAで親4H5 scFvと比較して結合の向上を示した単一アミノ酸変化のすべてを組み合わせて、小さな焦点化コンビナトリアルライブラリーを作製した。簡単に述べると、縮重プライマーを設計したが、これらの縮重プライマーは親アミノ酸だけでなく、同位置の全ての同定されたアミノ酸変化をコードしていた。全てのプライマーを含めたアニーリング反応とその後の合成（セクション2参照）でコンビナトリアルライブラリーを構築し、先に記載したようにスクリーニングした（セクション3.1.1参照）。
【０２６４】
4.1.2.  EphA2に対する一次スクリーニングの結果
典型的には、親scFv 4H5より高いOD 450nmシグナルを示すクローンを15mLスケールで再増殖させ、ELISA(セクション3.1.1に記載)により2通りのウェルで再アッセイして陽性の結果を確認した。次に、16個のコンビナトリアル変異体を選択し、配列決定を行って、CDRアミノ酸変化（そのため、各変異体は一次配列レベルで1〜3個のアミノ酸だけ互いに相違する）の11のユニークな組合せを同定した。
【０２６５】
4.1.3.  EphA2に対する二次スクリーニングの結果
上記の11のユニークなコンビナトリアル変異体を先に記載した二次スクリーニング（セクション3.2.1参照）で解析して、コンビナトリアル変異体の結合親和性の向上を評価した。全ての変異体が、4H5 scFvと比較して、ヒトEphA2に対する親和性の有意な向上を示した。3種の親和性最適化コンビナトリアル変異体2A4、2E7、および12E2のデータを図2に示す。
【０２６６】
結合解析
2A4、2E7および12E2、ならびに親EA2 scFvおよびヒト化4H5 scFvを、1L培養容量での大腸菌による発現のために誘導した。可溶性の分泌scFvフラグメントを含む上清を遠心して細胞破片を除き、次いで抗FLAGカラム(Sigma社)を通して変異体タンパク質を精製し、単離した。精製した親和性最適化変異体は、BIAcore 3000装置(Pharmacia Biosensor社、スウェーデンUppsala)を使って表面プラズモン共鳴検出により解析した。EA2のヒト化親和性最適化変異体は、親の抗EphA2 scFv EA2と比較して、110〜150倍の親和性の向上を示した（図5参照）。
【０２６７】
均等物
当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識し、あるいは単にルーチンな実験を用いて確かめることができるだろう。こうした均等物は、特許請求の範囲に包含されるものである。本明細書に記載したすべての刊行物、特許および特許出願は、その各々が具体的にかつ個別に示されて、参照として本明細書に組み込まれるように、本明細書中に参照として組み込まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０２６８】
【図１】MD102中の4H5 scFv挿入部位の線状マップ。
【図２】固定化ヒトEphA2上での、コンビナトリアル親和性最適化変異体(2A4、2E7、12E2)のscFv上清のELISA力価測定をこの活性プロットにまとめてあり、最適化変異体の活性の増加を示している。
【図３】親和性最適化変異体2A4(配列番号2)、2E7(配列番号18)、12E2(配列番号26)と、ヒト化4H5 scFv(配列番号10)とのアミノ酸配列アラインメント。
【図４Ａ】4H5の核酸配列およびアミノ酸配列(配列番号9、10)。
【図４Ｂ】2A4の核酸配列およびアミノ酸配列(配列番号1、2)。
【図４Ｃ】2E7の核酸配列およびアミノ酸配列(配列番号17、18)。
【図４Ｄ】12E2の核酸配列およびアミノ酸配列(配列番号25、26)。
【図５】EA2 scFvおよび4H5 scFvと比較した、ヒトEphA2に対するscFvフラグメント(2A4、2E7、12E2)の結合親和性の測定。2A4、2E7および12E2は、EA2および4H5と比較すると、EphA2に対する結合親和性の著しい改善を示している。
【図１】
2009521219.tif 000010
【図２】
2009521219.tif 000011
【図３】
2009521219.tif 000012
【図４Ａ】
2009521219.tif 000013
【図４Ｂ】
2009521219.tif 000014
【図４Ｃ】
2009521219.tif 000015
【図４Ｄ】
2009521219.tif 000016
【図５】
2009521219.tif 000017
【配列表】
2009521219000001.app
【国際調査報告】
2009521219.tif 000018
2009521219.tif 000019
2009521219.tif 000020