(57)【要約】  本発明は、新規なホウ素含有化合物、前記化合物を含有する医薬組成物、前記化合物の治療上の使用および前記化合物の製造方法に関する。本化合物は、ホウ素中性子捕獲療法（ＢＮＣＴ）に有用である。  【化１】2009504732.tif 000016
2009504732.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2009504732.tif 000013
（ここで、
Ｒ1およびＲ2の一方が、−ＮＨ−Ｘ−Ｙ−Ｚ、−Ｏ−Ｘ−Ｙ−Ｚまたは−Ｓ−Ｘ−Ｙ−Ｚであり、そして他方が−ＯＨ、−ＮＨ−Ｘ−Ｙ−Ｚ、−Ｏ−Ｘ−Ｙ−Ｚまたは−Ｓ−Ｘ−Ｙ−Ｚであり、
ここで、
Ｘが、−（ＣＨ2）m−（ｍは０、１、２、３または４である）または−（ＣＨ2）p−Ｏ−（ＣＨ2）q−（ｐおよびｑは独立して、１、２、３または４である）であり；
Ｙが、ボランまたはカルボラン（少なくとも１つのホウ素原子は10Ｂである）であり；そして
Ｚが、Ｈまたはアミノメチル、２−アミノエチル、３−アミノプロピル、１，３−プロパンジオール−２−イル−メトキシル、エチレングリコキシルもしくはジエチレングリコキシルのような親水性基である）
の化合物ならびにそれらの薬学的に受容可能な塩、溶媒和物および立体異性体。
【請求項２】
Ｙが、以下：
【化２】
2009504732.tif 000014
【化３】
2009504732.tif 000015
（ここで、＊はＸまたはＺに対する結合位置を示し；
Ｍはコバルト、コバルト−５７または鉄であり；そして
Ｘは請求項１に定義される通りである）
である請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
化合物が、Ｎ2−（４−｛［（２−アミノ−４−オキソ−３，４−ジヒドロプテリジン−６−イル）メチル］アミノ｝ベンゾイル）−Ｎ−｛３−［（１Ｒ，９Ｓ）−２，３，４，５，６，７，８，１０，１１，１２−デカボラビシクロ［７．２．１］ドデカ−１−イル］プロピル｝−α−グルタミンまたはＮ2−（４−｛［（２−アミノ−４−オキソ−３，４−ジヒドロプテリジン−６−イル）メチル］アミノ｝ベンゾイル）−Ｎ−［３−（２，３，４，５，６，７，８，１０，１１，１２−デカボラビシクロ［７．２．１］ドデカ−１−イル）プロピル］−Ｌ−グルタミンである、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ1がＮＨ−Ｘ−Ｙ−Ｚ、−Ｏ−Ｘ−Ｙ−Ｚまたは−Ｓ−Ｘ−Ｙ−Ｚであり、そしてＲ2がＯＨである、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項５】
少なくとも１つの炭素原子が11Ｃである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
治療に使用するための請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７】
診断に使用するための請求項５に記載の化合物。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物および薬学的に受容可能な担体、希釈剤または補助剤を含有する医薬組成物。
【請求項９】
腫瘍治療に使用するための医薬を製造するための請求項１〜５のいずれか１項に定義される式（Ｉ）に記載の化合物の使用。
【請求項１０】
腫瘍治療が、腫瘍のホウ素中性子捕獲療法である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
腫瘍が、中枢神経系から発症する腫瘍、好ましくは、グリア芽腫、神経膠肉腫、未分化星状細胞腫、低悪性度星状細胞腫、毛様細胞性星状細胞腫、乏突起膠腫または脳幹膠腫のような神経膠腫；髄膜腫；末梢性神経上皮腫；未分化神経外胚葉性腫瘍；神経芽細胞腫；胚細胞腫；下垂体部腫瘍；転移性脳腫瘍；または動静脈奇形である、請求項９または１０に記載の使用。
【請求項１２】
腫瘍が、悪性腫瘍または転移性腫瘍過程、好ましくは、黒色腫、前立腺癌、肝癌、肺癌、乳癌または肉腫である、請求項９または１０に記載の使用。
【請求項１３】
陽電子放出断層撮影に使用するための医薬を製造するための請求項５に定義される式（Ｉ）に記載の化合物の使用。
【請求項１４】
式ＮＨ2−Ｘ−Ｙ−Ｚ、ＯＨ−Ｘ−Ｙ−ＺまたはＳＨ−Ｘ−Ｙ−Ｚ（ここで、Ｘ、ＹおよびＺは請求項１〜５のいずれか１項に定義される通りである）の化合物を、葉酸と反応させる、請求項１〜５のいずれか１項に定義される式（Ｉ）に記載の化合物の製造方法。
【請求項１５】
薬学的および薬理学的有効量の請求項１〜５のいずれか１項に定義される式（Ｉ）の化合物を、ホウ素中性子捕獲療法と併せて、このような治療が必要な被験体に投与する腫瘍治療方法。
【請求項１６】
腫瘍が、請求項１１または１２に定義される通りである、請求項１５に記載の腫瘍治療方法。
【請求項１７】
薬学的および薬理学的有効量の請求項５に定義される式（Ｉ）の化合物を、陽電子放出断層撮影と併せて、診断されるべき被験体に投与する腫瘍診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なホウ素含有化合物、前記化合物を含有する医薬組成物、前記化合物の治療上の使用および前記化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホウ素中性子捕獲療法（ＢＮＣＴ）は、２つの構成成分：10Ｂおよび低エネルギー熱中性子を必要とする放射線療法の一形態である。腫瘍中に蓄積するホウ素含有化合物の形態で10Ｂを、治療される被験体に投与する。次いで、治療される被験体は、原子炉またはサイクロトロンから低エネルギー熱中性子を照射される。
【０００３】
低エネルギー熱中性子が10Ｂにヒットすると、それらはα粒子および7Ｌｉを発生させる。熱中性子は、比較的低エネルギーを有する。しかし、7Ｌｉおよびα粒子を発生させる際、細胞を破壊するのに十分なエネルギーを発生する。α粒子および7Ｌｉは、比較的大きいので、それらは組織中で約５〜１０μｍ（すなわち、腫瘍細胞の直径に対応する距離）しか移動しない。従って、ＢＮＣＴは、悪性でない組織に対する放射線損傷を最小限にしながら腫瘍を選択的に照射するために使用され得る。
【０００４】
ＢＮＣＴの主な試みは、十分な選択性を確保するために、腫瘍細胞中で濃縮されるホウ素原子のための非毒性担体分子を見出すことである。このような化合物は、好ましくは、高い治療可能比に達するために、高い選択性を有し（腫瘍対血液および腫瘍対正常組織の比が５超であれば理想的である）、かつ低毒性を有して、１５〜３０μｇ／ｇ（ｐｐｍ、すなわち、１００万分の１）の平均10Ｂ濃度で腫瘍中に送達されるべきである。１つの取り組みは、ホウ素含有ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの使用であった（ＥＰ  １  １１３  ０２０  Ａ２）。別の取り組みは、ホウ素化ホスホルアミデートを含有するヌクレオシドおよびオリゴヌクレオチドの使用であった（ＷＯ  ９４／０１４４０  Ａ１）。さらに、カルボラニルピリミジンは、ＢＮＣＴに使用するために製造されている。プリンまたはピリミジン塩基に結合しているカルボラニル基を含有するプリンおよびピリミジンヌクレオシドがまた報告されている。中性子捕獲療法に有用であるニドカルボラン−コバラミン結合体の合成がまた、行われている（Ｈ．Ｐ．Ｃ．Ｈｏｇｅｎｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０００），２７，８９−９２）。
【０００５】
Ｉ／ＩＩ期の臨床試験における２つのホウ素中性子捕獲試薬は、現在、メルカプト−クロソ−ドデカーボレート二ナトリウム（ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｍｅｒｃａｐｔｏ−ｃｌｏｓｏ−ｄｏｄｅｃａｂｏｒａｔｅ）（ＢＳＨ）および１−４−ジヒドロキシボリルフェニルアラニン（ＢＰＡ）である。ＢＳＨおよびＢＰＡは、動物モデルにおいて安全でかつ有効であることを示したが、これらの両方の試薬は、腫瘍細胞に対して中程度の選択性しかなく、そして腫瘍における保持時間が短い。さらに、ＢＳＨは、空気酸化への傾向に起因して、化学安定性が限定されており、そしてＢＰＡは化学的に非毒性であるが、低い割合のホウ素質量しか含まず（５％）、腫瘍組織における治療的ホウ素濃度を達成するために、多量のこの薬物が必要となる。
【０００６】
Ｌｅａｍｏｎ，Ｃ．Ｐ．およびＲｅｄｄｙ，Ｊ．Ａ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，５６（２００４）１１２７−１１４１は、治療方法のための葉酸レセプターおよび葉酸薬物結合体を論じている。
【０００７】
ＷＯ  ００／４５８５７は、中性子捕獲療法および光量子放射化療法のための製剤を製造するための、生物由来または合成由来のＧｄ3+複合体部分および腫瘍特異的部分によって構成された生理的に適合可能な化合物の使用を開示する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の要旨
本発明の目的は、ホウ素中性子捕獲療法（ＢＮＣＴ）に有用な化合物を提供することである。
【０００９】
別の目的は、高レベルのホウ素質量を有し、及び／または腫瘍細胞に選択的であるこのような化合物を提供することである。別の目的は、安定で及び／または非毒性であるこのような化合物を提供することである。
【００１０】
本発明のなお別の目的は、前記化合物を含有する医薬組成物を提供することであり、そして治療において、前記化合物の使用を提供することである。
【００１１】
さらなる目的は、公知の出発物質から前記化合物の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
以下の説明を熟読した後、当業者に明らかとなるべき本発明の前記目的ならびに他の目的は、式（Ｉ）：
【化１】
2009504732.tif 000003
（ここで、
Ｒ1およびＲ2の一方が、−ＮＨ−Ｘ−Ｙ−Ｚ、−Ｏ−Ｘ−Ｙ−Ｚまたは−Ｓ−Ｘ−Ｙ−Ｚであり、そして他方が−ＯＨ、−ＮＨ−Ｘ−Ｙ−Ｚ、−Ｏ−Ｘ−Ｙ−Ｚまたは−Ｓ−Ｘ−Ｙ−Ｚであり、
ここで、
Ｘが、−（ＣＨ2）m−（ｍは０、１、２、３または４である）または−（ＣＨ2）p−Ｏ−（ＣＨ2）q−（ｐおよびｑは独立して、１、２、３または４である）であり；
Ｙが、ボランまたはカルボラン（少なくとも１つのホウ素原子は10Ｂである）であり；そして
Ｚが、Ｈまたはアミノメチル、２−アミノエチル、３−アミノプロピル、１，３−プロパンジオール−２−イル−メトキシル、エチレングリコキシルもしくはジエチレングリコキシルのような親水性基である）
の化合物ならびにそれらの薬学的に受容可能な塩、溶媒和物および立体異性体によって達成される。
【００１３】
好ましくは、Ｙのボランまたはカルボラン中の10Ｂの量は、天然の同位体10Ｂの量よりも豊富である。例えば、Ｙのボランまたはカルボラン中に存在するホウ素原子のうち１０％より多く、または２０％より多く、好ましくは２５％より多く、より好ましくは５０％より多く、または７５％より多くが、10Ｂであり得る。
【００１４】
式（Ｉ）の化合物は、薬学的に受容可能な塩の形態であり得る。このような塩は、例えば、塩酸のような鉱酸と形成される塩；トリエチルアミンもしくは塩基性薬物のようなアミンと形成されるアンモニウム塩；ナトリウム塩もしくはカリウム塩のようなアルカリ金属塩；またはカルシウム塩もしくはマグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩である。
【００１５】
式（Ｉ）の化合物は、薬学的に受容可能な溶媒和物の形態（例えば、水和物）ならびに非溶媒和物の形態であり得る。
【００１６】
１つまたはそれ以上の立体中心が分子中に存在する場合、式（Ｉ）の化合物は、薬学的に受容可能な立体異性混合物（例えば、ジアステレオマーの混合物および／またはエナンチオマーの混合物）の形態であり得る。ジアステレオマーは、その分子が互いに鏡像でない立体異性体である。エナンチオマーは、その分子が互いに鏡像である立体異性体である。さらに、式（Ｉ）の化合物は、薬学的に受容可能な単一の立体異性体、すなわち、単一のエナンチオマーおよび／またはジアステレオマーの形態であり得る。式（Ｉ）の化合物はまた、薬学的に受容可能なラセミ混合物、すなわち、エナンチオマーの等モル混合物の形態であり得る。
【００１７】
ボランとは、多面体ボランとして本明細書中で定義される。Ｇｍｅｌｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（８ｔｈ  ｅｄ．１９９１）を参照のこと。カルボランとは、少なくとも１つの炭素原子が多面体ボランに取り込まれている化合物として本明細書中で定義される。カルボランは、Ｃａｒｂｏｒａｎｅｓ（Ｒ．Ｇｒｉｍｅｓ  ｅｄ．１９７０）、Ｇｍｅｌｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｏｒｇａｎｉｃａｎｄ  Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（８ｔｈ  ｅｄ．１９９１）およびＳｃｉｅｎｃｅ  １９７２，７８，４６２中の記述に従って合成され得る。
【００１８】
式（Ｉ）の化合物は、ＢＮＣＴに有用である。式（Ｉ）の化合物は、葉酸部分、すなわち、葉酸分子の重要な部分を含む。前記化合物は、ホウ素含有部分、および必要に応じてリンカーをさらに含む。リンカーは、葉酸部分とホウ素含有部分との間に位置する部分として定義される。ホウ素含有部分は、ホウ素を含む基として定義され、そしてボランまたはカルボランであり得る。腫瘍細胞のような急激に成長する細胞は、葉酸および構造的に関連している化合物の取り込みの増加を示す。
【００１９】
ＢＮＣＴは、多様な腫瘍の治療に使用され得る。腫瘍は、世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｕｒｓ，１９６７〜１９７８）によって定義された原則に従って組織学的に分類され得る。上記の式（Ｉ）の化合物とＢＮＣＴを使用して治療し得る腫瘍の種類としては、中枢神経系から発症する腫瘍、好ましくは、グリア芽腫、神経膠肉腫、未分化星状細胞腫、低悪性度星状細胞腫、毛様細胞性星状細胞腫（ｐｉｌｏｌｙｔｉｃ  ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ）、乏突起膠腫もしくは脳幹膠腫のような神経膠腫；髄膜腫；末梢性神経上皮腫（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｎｅｕｒｏｅｐｉｔｈｅｌｉｏｍａ）；未分化神経外胚葉性腫瘍；神経芽細胞腫；胚細胞腫；下垂体部腫瘍；転移性脳腫瘍；または動静脈奇形が挙げられる。式（Ｉ）の化合物はまた、ｉ．ａ．悪性腫瘍または転移性腫瘍過程、好ましくは、黒色腫、前立腺癌、肝癌、肺癌、乳癌または肉腫を治療するためのＢＮＣＴにおいて使用され得る。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、表現「ホウ素中性子捕獲療法」（ＢＮＣＴ）とは、治療を受ける被験体にホウ素含有化合物を投与することおよび前記被験体に熱中性子を照射する工程を包含する腫瘍治療のための方法として定義される。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、用語「腫瘍」とは、Ｄｏｒｌａｎｄ’ｓ  Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，２６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８５，Ｓａｕｎｄｅｒｓに従って、すなわち、細胞増殖が制御されず、そして進行性である組織の増殖として定義される。制御されない増殖とは、通常の細胞増殖とは異なる状態、例えば、細胞増殖の速度が著しく速まる状態として定義される。この文脈において、用語「進行性」とは、重症度の進行または高まりとして定義される。腫瘍細胞は、前記組織中の細胞として定義される。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、用語「治療」とは、Ｄｏｒｌａｎｄ’ｓ  Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，２６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８５，Ｓａｕｎｄｅｒｓに従って、すなわち、疾患の治療として定義される。用語「治療上の」および「治療的に」とは、適宜に解釈されるべきである。従って、本明細書中で使用される場合、表現「腫瘍治療」とは、腫瘍によって発症する疾患または腫瘍に関連する疾患の治療として定義される。
【００２３】
式（Ｉ）のＹを構成するボランまたはカルボランは、以下：
【化２】
2009504732.tif 000004
【００２４】
【化３】
2009504732.tif 000005
【００２５】
【化４】
2009504732.tif 000006
（ここで、＊はＸまたはＺに対する結合位置を示し；
Ｍはコバルト、コバルト−５７または鉄であり；そして
Ｘは上で定義された通りである）であり得る。
【００２６】
式（Ｉ）の化合物の例としては、Ｎ2−（４−｛［（２−アミノ−４−オキソ−３，４−ジヒドロプテリジン−６−イル）メチル］アミノ｝ベンゾイル）−Ｎ−｛３−［（１Ｒ，９Ｓ）−２，３，４，５，６，７，８，１０，１１，１２−デカボラビシクロ［７．２．１］ドデカ−１−イル］プロピル｝−α−グルタミンおよびＮ2−（４−｛［（２−アミノ−４−オキソ−３，４−ジヒドロプテリジン−６−イル）メチル］アミノ｝ベンゾイル）−Ｎ−［３−（２，３，４，５，６，７，８，１０，１１，１２−デカボラビシクロ［７．２．１］ドデカ−１−イル）プロピル］−Ｌ−グルタミンが挙げられる。
【００２７】
１つの実施形態において、式（Ｉ）の化合物におけるＲ1は、ＮＨ−Ｘ−Ｙ−Ｚ、−Ｏ−Ｘ−Ｙ−Ｚまたは−Ｓ−Ｘ−Ｙ−Ｚであり、そしてＲ2はＯＨである。このような化合物は、葉酸の構造に酷似しており、従って、葉酸によって示される生物活性の全てまたは一部を保有し得る。
【００２８】
１つの実施形態において、式（Ｉ）の化合物における少なくとも１つの炭素原子は11Ｃである。このような実施形態は、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）技術による化合物の検出を可能にする。
【００２９】
あるいは、式（Ｉ）の化合物のＹ部分は、ガドリニウム含有実体であり得る。
【００３０】
本発明の目的は、式ＮＨ2−Ｘ−Ｙ−Ｚ、ＯＨ−Ｘ−Ｙ−ＺまたはＳＨ−Ｘ−Ｙ−Ｚの化合物（ここで、Ｘ、ＹおよびＺは式（Ｉ）の関係で定義される）を葉酸と反応させる式（Ｉ）の化合物の製造方法によってさらに達成される。
【００３１】
医薬製剤
本発明の目的はまた、式（Ｉ）の化合物および薬学的に受容可能な担体、希釈剤または補助剤を含有する医薬組成物によって達成される。
【００３２】
臨床用途のための、式（Ｉ）のホウ素含有化合物は、本発明に従って、非経口投与のための医薬組成物中に適切に製剤される。直腸投与、経口投与またはいずれの他の投与経路もまた、製剤分野の当業者によって意図され得る。従って、式（Ｉ）のホウ素含有化合物は、少なくとも１種の薬学的および薬理学的に受容可能な担体または補助剤と共に製剤される。担体は、固体、半固体または液体希釈剤の形態であり得る。
【００３３】
非経口投与用の溶液は、薬学的に受容可能な溶媒中で、本発明の化合物の溶液として製造され得る。それらの溶液はまた、安定化成分および／または緩衝化成分を含有し得、そしてアンプルまたはバイアルの形態の単一用量に調合される。非経口投与用の溶液はまた、使用前に即席で適切な溶媒を用いて再構成される乾燥製剤として製造され得る。
【００３４】
本発明に従う経口医薬組成物の製造において、製剤される式（Ｉ）のホウ素含有化合物は、固体粉末成分（例えば、乳糖、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アミロペクチン、セルロース誘導体、ゼラチンまたは別の適切な成分）、ならびに崩壊剤および滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリルフマル酸ナトリウムおよびポリエチレングリコールワックス）と混合される。次いで、混合物は、顆粒に加工されるか、または錠剤に圧縮される。
【００３５】
軟ゼラチンカプセルは、本発明の活性化合物、植物油、脂肪または軟ゼラチンカプセル用の他の適切なビヒクルの混合物を含有するカプセルを用いて製造され得る。硬ゼラチンカプセルは、固体粉末成分（例えば、乳糖、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、ジャガイモデンプン、コーンスターチ、アミロペクチン、セルロース誘導体またはゼラチン）と組み合わせた活性化合物を含有し得る。
【００３６】
直腸投与用の投薬単位は、（ｉ）天然の脂肪基剤と混合した活性物質を含有する坐剤の形態；（ｉｉ）植物油、パラフィン油またはゼラチン直腸カプセル用の他の適切なビヒクルとの混合物中に活性物質を含有するゼラチン直腸カプセルの形態；（ｉｉｉ）既製のマイクロ浣腸剤（ｍｉｃｒｏ  ｅｎｅｍａ）の形態；または（ｉｖ）投与直前に適切な溶媒中で再構築される乾燥マイクロ浣腸製剤の形態で製造され得る。
【００３７】
経口投与用の液体製剤は、活性化合物と、糖または糖アルコールならびにエタノール、水、グリセロール、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールの混合物からなる製剤の残りの部分とを含有するシロップ剤または懸濁剤の形態（例えば、溶液または懸濁液）で製造され得る。所望である場合、このような液体製剤は、着色剤、香味料、サッカリンおよびカルボキシメチルセルロースまたは他の増粘剤を含有し得る。経口投与用の液体製剤はまた、使用前に適切な溶媒を用いて再構築される乾燥粉末の形態で製造され得る。
【００３８】
本発明の１つの局面において、式（Ｉ）のホウ素含有化合物は、治療される被験体が中性子照射を受ける２４時間以内前、代表的に、中性子照射の３０〜６０分前に投与され得る。本発明のさらなる局面において、ホウ素含有化合物の投薬量は、パルスであり得る。式（Ｉ）のホウ素含有化合物の代表的な用量は、０.０１〜１００ｍｇ／体重ｋｇの範囲内である。
【００３９】
治療
本発明の目的はまた、治療に使用するための式（Ｉ）の化合物によって、または腫瘍治療に使用するための医薬を製造するための式（Ｉ）の化合物の使用によって達成される。
【００４０】
１つの実施形態において、医薬は、中枢神経系から発症する腫瘍、好ましくは、グリア芽腫、神経膠肉腫、未分化星状細胞腫、低悪性度星状細胞腫、毛様細胞性星状細胞腫、乏突起膠腫もしくは脳幹膠腫のような神経膠腫；髄膜腫；末梢性神経上皮腫；未分化神経外胚葉性腫瘍；神経芽細胞腫；胚細胞腫；下垂体部腫瘍；転移性脳腫瘍；または動静脈奇形を治療するためのものであり得る。
【００４１】
あるいは、医薬は、悪性腫瘍または転移性腫瘍過程、好ましくは、黒色腫、前立腺癌、肝癌、肺癌、乳癌または肉腫を治療するためものであり得る。
【００４２】
本発明の有用な実施形態はまた、診断用途のための少なくとも１つの炭素原子が11Ｃである式（Ｉ）の化合物によって、または陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）用途のための医薬を製造するための少なくとも１つの炭素原子が11Ｃである式（Ｉ）の化合物の使用によって達成される。
【００４３】
本目的は、薬学的および薬理学的有効量の式（Ｉ）の化合物が、ホウ素中性子捕獲療法と併せてこのような治療が必要な被験体に投与される腫瘍治療方法によってさらに達成される。
【００４４】
前記腫瘍治療は、中枢神経系から発症する腫瘍、好ましくは、グリア芽腫、神経膠肉腫、未分化星状細胞腫、低悪性度星状細胞腫、毛様細胞性星状細胞腫、乏突起膠腫もしくは脳幹膠腫のような神経膠腫；髄膜腫；末梢性神経上皮腫；未分化神経外胚葉性腫瘍；神経芽細胞腫；胚細胞腫；下垂体部腫瘍；転移性脳腫瘍；または動静脈奇形の治療であり得る。
【００４５】
あるいは、前記腫瘍治療は、悪性腫瘍または転移性腫瘍過程、好ましくは、黒色腫、前立腺癌、肝癌、肺癌、乳癌または肉腫の治療であり得る。
【００４６】
本発明の有用な実施形態は、陽電子放出断層撮影と併せて、薬学的および薬理学的有効量の少なくとも１つの炭素原子が11Ｃである式（Ｉ）の化合物を、診断される被験体に投与する腫瘍診断方法によってさらに達成される。
【００４７】
本明細書中で上記される治療は、単独の治療として適用され得るか、またはホウ素中性子捕獲療法に加えて、従来の手術または化学療法を含み得る。このような化学療法は、１種またはそれ以上の以下の種類の抗腫瘍剤を含む：
（ｉ）内科的腫瘍学において使用される場合、アルキル化剤（例えば、シス−プラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファンおよびニトロソウレア）；代謝拮抗物質（例えば、５−フルオロウラシルおよびテガフルのようなフロオロピリミジン等の葉酸拮抗剤、ラルチトレキセド、メトトレキサート、シトシンアラビノシドおよびヒドロキシウレア）；抗腫瘍抗生物質（例えば、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシン−Ｃ、ダクチノマイシンおよびミトラマイシンのようなアントラサイクリン）；抗分裂剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンおよびビノレルビンのようなビンカアルカロイドならびにタクソールおよびタキソテールのようなタキソイド）；およびトポイソメラーゼインヒビター（例えば、エトポシドおよびテニポシドのようなエピポドフィロトキシン、アムサクリン、トポテカンおよびカンプトセシン）のような抗増殖性物質／新生物治療薬およびそれらの組み合わせ；
（ｉｉ）抗エストロゲン剤（ａｎｔｉｏｅｓｔｒｏｇｅｎ）（例えば、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェンおよびヨードキシフェン）、エストロゲン受容体ダウンレギュレーター（例えば、フルベストラント）、抗男性ホルモン物質（例えば、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミドおよび酢酸シプロテロン）、ＬＨＲＨアンタゴニストもしくはＬＨＲＨアゴニスト（例えば、ゴセレリン、リュープロレリンおよびブセレリン）、プロゲストゲン（例えば、酢酸メゲストロール）、アロマターゼインヒビター（例えば、アナストロゾール、レトロゾール、ボラゾール（ｖｏｒａｚｏｌｅ）およびエキセメスタン）およびフィナステリドのような５α−レダクターゼのインヒビターのような細胞増殖抑制剤；
（ｉｉｉ）癌細胞浸潤を阻害する薬剤（例えば、マリマスタットのようなメタロプロテナーゼインヒビターおよびウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体機能のインヒビター）；
（ｉｖ）成長因子機能のインヒビター（例えば、このようなインヒビターとしては、成長因子抗体、成長因子受容体抗体（例えば、抗−ｅｒｂｂ２抗体トラスツズマブ［ＨｅｒｃｅｐｔｉｎTM］および抗−ｅｒｂｂ１抗体セテュキマブ）、ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、チロシンキナーゼインヒビターおよびセリン／トレオニンキナーゼインヒビター（例えば、表皮成長因子ファミリーのインヒビター（例えば、Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−メトキシ−６−（３−モルホリノプロポキシ）キナゾリン−４−アミン（ゲフィチニブ）、Ｎ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−４−アミン（エルロチニブ）および６−アシルアミド−Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−（３−モルホリノプロポキシ）キナゾリン−４−アミンのようなＥＧＦＲファミリーのチロシンキナーゼインヒビター）、例えば、血小板由来成長因子ファミリーのインヒビターおよび例えば、肝細胞成長因子ファミリーのインヒビター）が挙げられる）；
（ｖ）血管内皮成長因子の効果を阻害するもののような抗血管新生薬（例えば、抗血管内皮細胞成長因子抗体ベバシツマブ［ＡｖａｓｔｉｎTM］、国際特許出願ＷＯ  ９７／２２５９６、ＷＯ  ９７／３００３５、ＷＯ  ９７／３２８５６およびＷＯ  ９８／１３３５４に開示されているもののような化合物）および他の機構によって働く化合物（例えば、リノミド（ｌｉｎｏｍｉｄｅ）、インテグリンαｖβ３機能のインヒビターおよびアンギオスタチン）；
（ｖｉ）Ｃｏｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ  Ａ４および国際特許出願ＷＯ  ９９／０２１６６、ＷＯ  ００／４０５２９、ＷＯ  ００／４１６６９、ＷＯ  ０１／９２２２４、ＷＯ  ０２／０４４３４およびＷＯ  ０２／０８２１３に開示されている化合物のような血管傷害性薬剤；
（ｖｉｉ）アンチセンス療法（例えば、ＩＳＩＳ  ２５０３、  抗−ｒａｓアンチセンスのような上で列挙される標的に指向されるもの）；
（ｖｉｉｉ）例えば、異常ｐ５３または異常ＢＲＣＡ１もしくはＢＲＣＡ２のような異常遺伝子を置き換えるようなアプローチ、シトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼもしく細菌性ニトロレダクターゼ酵素を使用するもののようなＧＤＥＰＴ（遺伝子指向型酵素プロドラッグ療法（ｇｅｎｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｎｚｙｍｅ  ｐｒｏ−ｄｒｕｇ  ｔｈｅｒａｐｙ））アプローチおよび多剤耐性遺伝子治療のような化学療法または放射線治療に対する患者の耐性を高めるアプローチを含む遺伝子治療アプローチ；および
（ｉｘ）例えば、インターロイキン２、インターロイキン４または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子のようなサイトカインを用いるトランスフェクションのような患者の腫瘍細胞の免疫原性を高めるための生体外および生体内でのアプローチ、Ｔ細胞アネルギーを減少させるアプローチ、サイトカイントランスフェクト樹状細胞のようなトランスフェクト免疫細胞を使用するアプローチ、サイトカイントランスフェクト腫瘍細胞株を使用するアプローチおよび抗イディオタイプ抗体を使用するアプローチを含む免疫療法アプローチ。
【実施例】
【００４８】
本発明の化合物の製造
使用する全ての溶媒は、分析等級であり、そして通常、市販される無水溶媒を日常的に反応に使用した。反応は、代表的に、窒素またはアルゴンの不活性雰囲気下で行った。
【００４９】
1Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、Ｚ−グラジエントを用いる５ｍｍ  ＢＢＯプローブヘッドを備えたＶａｒｉａｎ  Ｕｎｉｔｙ＋  ４００  ＮＭＲスペクトロメータ、または５ｍｍ  ＢＢＩ  プローブヘッドを備えたＶａｒｉａｎ  Ｇｅｍｉｎｉ  ３００  ＮＭＲスペクトロメータ、またはＺ−グラジエントを用いる６０μｌ二重逆流（ｄｕａｌ  ｉｎｖｅｒｓｅ  ｆｌｏｗ）プローブヘッドを備えたＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ４００  ＮＭＲスペクトロメータ、またはＺ−グラジエントを備えた４−中軸プローブヘッドを備えたＢｒｕｋｅｒ  ＤＰＸ４００  ＮＭＲスペクトロメータで記録した。実施例中に特に言及されない限り、スペクトルは、陽子について４００ＭＨｚで記録した。以下の参照シグナルを使用した：ＣＤＣｌ3の真ん中の線δ  ７.２６（1Ｈ）。
【００５０】
質量スペクトルを、Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２７９５（ＬＣ）、Ｗａｔｅｒｓ  ＰＤＡ  ２９９６およびＺＱ単一四重極質量分析計からなるＷａｔｅｒｓ  ＬＣＭＳで記録した。質量分析計は、正イオンまたは負イオンモードで作動するエレクトロスプレーイオン源（ＥＳＩ）を備えていた。キャピラリー電圧（ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｖｏｌｔａｇｅ）は、３ｋＶであり、そしてコーン電圧（ｃｏｎｅ  ｖｏｌｔａｇｅ）は３０Ｖであった。質量分析計は、０.３秒のスキャン時間でｍ／ｚ１００〜７００の間でスキャンした。分離は、ＳｃａｎｔｅｃＬａｂから入手したＷａｔｅｒｓ  Ｘ−Ｔｅｒｒａ  ＭＳ  Ｃ８（３.５μｍ、５０または１００ｍｍ×２.１ｍｍ  ｉ．ｄ．）またはＡＣＥ  ３  ＡＱ（１００ｍｍ×２.１ｍｍ  ｉ．ｄ．）のいずれかで行った。流速は、それぞれ、１.０または０.３ｍｌ／分に調節した。カラム温度は４０℃に設定した。１００％  Ａ（Ａ：５％  ＭｅＣＮ中１０ｍＭ  ＮＨ4ＯＡｃまたは５％  ＭｅＣＮ中８ｍＭ  ＨＣＯＯＨ）で開始し、１００％  Ｂ（ＭｅＣＮ）で終了させる中性または酸性の移動相系を使用する、直線グラジエントを適用した。
【００５１】
あるいは、質量スペクトルを、Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９０  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｍｏｄｕｌｅ、Ｗａｔｅｒｓ  ２４８７  Ｄｕａｌ  １  Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（２２０および２５４ｎｍ）およびＷａｔｅｒｓ  ＺＱ単一四重極質量分析計からなるＷａｔｅｒｓ  ＬＣＭＳで記録した。質量分析計は、正イオンまたは負イオンモードで作動するエレクトロスプレーイオン源（ＥＳＩ）を備えていた。キャピラリー電圧は、３ｋＶであり、そしてコーン電圧は３０  Ｖであった。質量分析計は、０.３または０.８秒のスキャン時間でｍ／ｚ９７〜８００の間でスキャンした。分離は、Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＲＰ−１８ｅ（１００×４.６ｍｍ）で行った。９５％  Ａ（Ａ：０.１％  ＨＣＯＯＨ（ａｑ．））で開始し、５分間で１００％  Ｂ（ＭｅＣＮ）で終了させる直線グラジエントを適用した。流速：２.０ｍｌ／分。
【００５２】
ＨＰＬＣ分析を、Ｇ１３７９Ａ  Ｍｉｃｒｏ  Ｖａｃｕｕｍ  Ｄｅｇａｓｓｅｒ、Ｇ１３１２Ａ  Ｂｉｎａｒｙ  Ｐｕｍｐ、Ｇ１３６７Ａ  Ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ  ａｕｔｏ−ｓａｍｐｌｅｒ、Ｇ１３１６Ａ  Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｔｔｅｄ  Ｃｏｌｕｍｎ  ＣｏｍｐａｒｔｍｅｎｔおよびＧ１３１５Ｂ  Ｄｉｏｄｅ  Ａｒｒａｙ  ＤｅｔｅｃｔｏｒからなるＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰ１０００システムで行った。カラム：Ｘ−Ｔｅｒｒａ  ＭＳ，Ｗａｔｅｒｓ、３.０×１００ｍｍ、３.５μｍ。カラム温度を４０℃に、そして流速を１.０ｍｌ／分に設定した。Ｄｉｏｄｅ  Ａｒｒａｙ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒを２１０〜３００ｎｍでスキャンし、ステップおよびピーク幅を、それぞれ、２ｎｍおよび０.０５分に設定した。１００％  Ａ  （Ａ：５％  ＭｅＣＮ中１０ｍＭ  ＮＨ4ＯＡｃ）で開始し、４分間で１００％  Ｂ（Ｂ：ＭｅＣＮ）で終了させる直線グラジエントを適用した。
【００５３】
反応後の代表的なワークアップ手順は、酢酸エチルのような溶媒を用いる生成物の抽出、水での洗浄、続くＭｇＳＯ4またはＮａ2ＳＯ4での有機層の乾燥、濾過および真空での溶液の濃縮からなった。
【００５４】
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を、Ｍｅｒｃｋ  ＴＬＣ−プレート（Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０  Ｆ254）で行い、そしてスポットをＵＶ視覚化した。フラッシュクロマトグラフィーを、ＲｅｄｉＳｅｐTM順相フラッシュカラムを使用するＣｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈ(R)  ＣｏｍｐａｎｉｏｎTMで行った。フラッシュクロマトグラフィーに使用した代表的な溶媒は、クロロホルム／メタノール、ジクロロメタン／メタノール、ヘプタン／酢
酸エチル、クロロホルム／メタノール／ＮＨ3（ａｑ．）およびジクロロメタン／メタノール／ＮＨ3（ａｑ．）の混合物であった。
【００５５】
分取用クロマトグラフィーを、ダイオードアレイ検出器を備えるＷａｔｅｒｓ自浄作用ＨＰＬＣで行った。カラム：ＸＴｅｒｒａ  ＭＳ  Ｃ８、１９×３００ｍｍ、１０μｍ。ＭｅＣＮ／  ＭｉｌｌｉＱ水中５％  ＭｅＣＮ中の０.１Ｍ  ＮＨ4ＯＡｃのグラジエントを、１３分で２０％〜６０％までのＭｅＣＮで実行した。流速：２０ｍｌ／分。あるいは、精製を、Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ(R)カラム（Ｃ１８、５μｍ、１００ｍｍ×１９ｍｍ）を備えるＳｈｉｍａｄｚｕ  ＳＰＤ−１０Ａ  ＵＶ−ｖｉｓ．検出器を備えた半分取用Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ−８Ａ  ＨＰＬＣで達成した。ＭｅＣＮ  ／ＭｉｌｌｉＱ水中０.１  ％トリフルオロ酢酸のグラジエントを、１５分で５％〜１００％までのＭｅＣＮで実行した。流速：１０ｍｌ／分。
【００５６】
以下の略語を使用した：
ＤＭＡＰ  ４−ジメチルアミノピリジン；
ＤＭＦ  Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド；
ＥＤＣ  １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド；
ＥｔＯＡｃ  酢酸エチル；
ＨＣｌ  塩化水素；
ＣＨ2Ｃｌ2  ジクロロメタン；
ＣＤＣｌ3  重水素化クロロホルム（ｄｅｕｔｅｒｉａｔｅｄ  ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）；
Ｅｔｈｅｒ  ジエチルエーテル；
ＭｅＣＮ  アセトニトリル；
Ｎａ2ＣＯ3  炭酸ナトリウム；
ＮａＯＨ  水酸化ナトリウム；
Ｎａ2ＳＯ4  硫酸ナトリウム；
ＱＨＳＯ4  硫酸水素テトラブチルアンモニウム；
ｒ．ｔ．  室温。
【００５７】
使用した出発物質は、市販されているか、または文献手順に従って製造されるかのいずれかであり、そして報告される実験データと一致する実験データを有していた。
【００５８】
実施例１．ジ−ｔｅｒｔ−ブチル［３−（２，３，４，５，６，７，８，１０，１１，１２−デカボラビシクロ［７．２．１］ドデカ−１−イル）プロピル］イミドジカルボネートの製造
【化５】
2009504732.tif 000007
ＱＨＳＯ4（３.０４ｇ、８.９６ｍｍｏｌ）およびＮａＯＨ  １Ｍ  水溶液（１８ｍｌ）の撹拌混合物に、ＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍｌ）を添加し、次いでＣＨ2Ｃｌ2（１５ｍｌ）中の１−（３−ブロモプロピル）−２，３，４，５，６，７，８，１０，１１，１２−デカボラビシクロ［７．２．１］ドデカン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９６，３７（３８），６９０５−６９０８）（２.１６ｇ、８.１５ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた溶液を２時間、還流下で加熱し、そして室温まで冷却した。水（１０ｍｌ）を添加した。水層をＣＨ2Ｃｌ2（３０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層を水（１０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、そして濃縮した。残留物をエーテル（３０ｍｌ）と共に撹拌した。沈殿物を乾燥エーテル（２×２０ｍｌ）で抽出し、そして合わせた抽出物を真空で濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。
収率：６２％（２.２１ｇ）。
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ  ｐｐｍ  ３.３５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７.０７  Ｈｚ），２.６２（ｓ，１Ｈ），１.６８−１.５６（ｍ，４Ｈ），１.４９−１.４４（ｍ，１８Ｈ）。
ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ４０２（Ｍ＋１）。
【００５９】
実施例２．３−（２，３，４，５，６，７，８，１０，１１，１２−デカボラビシクロ［７．２．１］ドデカ−１−イル）−プロパン−１−アミンの製造
【化６】
2009504732.tif 000008
実施例１からのジ−ｔｅｒｔ−ブチル［３−（２，３，４，５，６，７，８，１０，１１，１２−デカボラビシクロ［７．２．１］ドデカ−１−イル）プロピル］イミドジカーボネート（２.２１ｇ、５.５０ｍｏｌ）を、ＨＣｌのＥｔＯＡｃ（１００ｍｌ）飽和溶液に溶解した。溶液を室温で一晩撹拌し、次いで、エバポレートした。白色の綿状沈殿物を乾燥エーテルで洗浄した。次いで、沈殿物を水に溶解し、そして溶液をＮａ2ＣＯ3の飽和水溶液（４０ｍｌ）で塩基性化した。水層をエーテルで抽出し、そして合わせた有機抽出物をブライン（３×１０ｍｌ）で洗浄した。真空で溶媒を除去し、遊離アミンを得た。
収率：７６％（８４１ｍｇ）。
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ  ｐｐｍ  ２.６２（ｓ，１Ｈ），２.５４−２.４２（ｍ，２Ｈ），１.６９−１.５８（ｍ，２Ｈ），１.４４−１.３３（ｍ，２Ｈ）。
ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ２０２（Ｍ＋１）。
【００６０】
実施例３．Ｎ2−（４−｛［（２−アミノ−４−オキソ−３，４−ジヒドロプテリジン−６−イル）メチル］アミノ｝ベンゾイル）−Ｎ−｛３−［（１Ｒ，９Ｓ）−２，３，４，５，６，７，８，１０，１１，１２−デカボラビシクロ［７．２．１］ドデカ−１−イル］プロピル｝−α−グルタミンおよびＮ2−（４−｛［（２−アミノ−４−オキソ−３，４−ジヒドロプテリジン−６−イル）メチル］アミノ｝ベンゾイル）−Ｎ−［３−（２，３，４，５，６，７，８，１０，１１，１２−デカボラビシクロ［７．２．１］ドデカ−１−イル）プロピル］−Ｌ−グルタミンの製造
【化７】
2009504732.tif 000009
葉酸（１.８４ｇ、４.１７ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（７９９ｍｇ、４.１７ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（５０９ｍｇ、４.１７ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（２００ｍｌ）に溶解した。溶液を、２０℃、アルゴン雰囲気下で３時間撹拌した。次いで、実施例２からの３−（２，３，４，５，６，７，８，１０，１１，１２−デカボラビシクロ［７．２．１］ドデカ
−１−イル）−プロパン−１−アミン（８３９ｍｇ、４.１７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（４０ｍｌ）溶液を添加し、そして混合物を１日間撹拌した。溶媒を真空で除去した。残留物をエーテル／ＣＨ2Ｃｌ2の混合物で２回洗浄した。粗物質を分取用ＨＰＬＣで精製した。
収率：７.５％（１９０ｍｇ）。
両方の異性体についてＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ６２３（Ｍ−１）。１２分の保持時間。方法：８.４８および８.７８分。（この場合において、２.５ｍＭ酢酸水溶液を用いるアイソクラティック法を使用した。
【００６１】
本発明の化合物の生体外研究
ヒト由来の４つの異なる腫瘍細胞株（ヒトグリオーマ細胞株Ｕ３４３ｍｇａ、ヒト肝癌細胞株Ｈｅｐ３Ｂ、ヒト乳腺癌細胞株ＭＣＦ７およびヒト肉腫細胞株４ＳＳを含む）を、実施例３からの精製物質（本明細書中の以下でＢＦと表す）の生体外試験をするために使用した。細胞を非コート化組織培養プラスチック皿にプレーティングし、加湿し、５％  ＣＯ2で平衡化したインキュベーター中、３７℃で培養した。それらを、１０％  ＦＣＳおよびＰＥＳＴ（ペニシリン  １００ＩＵ／ｍｌおよびストレプトマイシン１００ｍｇ／ｍｌ）を追加した推奨される組織培養培地中で増殖させた。細胞移動のために、細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ（０.２５％  トリプシン、カルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の０.０２％  ＥＤＴＡ）でトリプシン処理（ｔｒｙｐｓｉｎｉｚｅ）した。
【００６２】
手短に言えば、以下の実施例４〜６に示されるように、腫瘍細胞の取り込み、蓄積および保持に関して、ＢＦはいかなる毒性の兆候もなく、ＢＰＡよりも優勢であり、生体外研究において期待できる結果を示した。
【００６３】
実施例４．ＢＦの細胞取り込み
Ｕ３４３ｍｇａ細胞を、７５％細胞密度でペトリ皿にプレーティングし、そしてホウ酸（ＢＡ）、ビタミンＢ12共役ホウ素（ＢＢ）、１−４−ジヒドロキシボリル−フェニルアラニン（ＢＰＡ）またはＢＦのうちの１種を溶解した組織培養培地と共に６時間インキュベートした。４つ全てのホウ素化化合物をホウ素含有量について等モル濃度（５×１０-4Ｍホウ素）で組織培養培地に添加し、そして溶解した。ホウ素含有組織培養培地を除去し、そして細胞から過剰な培地を洗浄するための冷ＰＢＳ緩衝液を添加ことによってインキュベートを終了した。ゴム冠ポリスマンを使用してプラスチック皿から細胞を擦り取ることによって、細胞をすぐに回収した。それらを冷ＰＢＳ中に回収し、そして遠心分離によって沈殿させた。
【００６４】
細胞サンプルを、標準的なＢｒａｄｆｏｒｄ手順に従って、全タンパク質分析を行った。細胞ペレットを直流プラズマ原子発光分光（ＤＣＰ−ＡＥＳ）によってホウ素分析した。サンプル（５０〜１３０ｍｇ）を、硫酸／硝酸（１／１）を用いて６０℃で消化した。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および水を添加し、５０ｍｇ  組織／ｍｌ、１５％  全酸度ｖ／ｖおよび５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ｖ／ｖの濃度を得た。ホウ素濃度は公知の参照サンプルに基づいた。
【００６５】
以下の表１に結果を示す。ＢＦの形態であるホウ素に対する葉酸の共有結合は、ヒトグリア芽腫細胞株Ｕ３４３ｍｇａへの盛んな取り込みをもたらし、ホウ酸（ＢＡ）、ホウ素−フェニルアラニン（ＢＰＡ）またはビタミンＢ12共役ホウ素（ＢＢ）としてのホウ素の取り込みよりも優れている。
【００６６】
【表１】
2009504732.tif 000010
【００６７】
実施例５．異なる腫瘍細胞によるＢＦ取り込み
ヒト由来の４つの異なる腫瘍細胞株（Ｕ３４３ｍｇａ、Ｈｅｐ３Ｂ、ＭＣＦ７および４ＳＳ）を、４０〜５０％（低）および９０〜１００％（高）の細胞密度（密集度）でペトリ皿にプレーティングし、そして記載されるように、組織培養培地に溶解したＢＦと共に６時間インキュベートした。ホウ素含有培地を除去し、そして細胞から過剰な培地を洗浄するための冷ＰＢＳ緩衝液を添加ことによってインキュベートを終了した。ゴム冠ポリスマンを使用してプラスチック皿の細胞を擦り取ることによって、細胞をすぐに回収し、冷ＰＢＳ中に回収し、そして遠心分離によって沈殿させた。全タンパク質分析およびホウ素分析を標準的な手順に従って行った（上記を参照のこと）。
【００６８】
以下の表２に結果を示す。低細胞密度および高細胞密度で試験した４つ全てのヒト腫瘍細胞株（グリア芽腫（Ｕ３４３ｍｇａ）、肝癌（Ｈｅｐ３Ｂ）、乳癌（ＭＣＦ７）、肉腫（４ＳＳ））に対して、ＢＦはより優れた効果のあるホウ素担体であることがわかった。
【表２】
2009504732.tif 000011
【００６９】
実施例６．ＢＦの細胞内保持
Ｕ３４３ｍｇａ細胞を、７５％細胞密度でペトリ皿にプレーティングし、そして１−４−ジヒドロキシボリル−フェニアルアラニン（ＢＰＡ）またはＢＦのうち１種と共に細胞培養培地中で１８時間インキュベートした。両方のホウ素化化合物をホウ素含有量に関して等モル濃度（５×１０-4  Ｍホウ素）で細胞培養培地に添加した。ホウ素を含まない培養培地でホウ素含有培地を置き換えることによってインキュベートを終了した。ホウ素化化合物を１８時間イキュベートしたすぐ後を０時間として、細胞サンプルを０、２および７時間の時点で回収した。
【００７０】
細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、そしてゴム冠ポリスマンを使用してプラスチック皿から細胞を擦り取ることによって回収し、冷ＰＢＳ中に回収し、そして遠心分離によって沈殿させた。細胞ペレットを上記のように全タンパク質およびホウ素含有量について分析した。
【００７１】
以下の表３に結果を示す。細胞内取り込み後、ＢＦは腫瘍細胞中に保持されており、培養培地中のＢＦを全て枯渇させた７時間後に全取り込みの４０％が存在していた。
【表３】
2009504732.tif 000012
【国際調査報告】
2009504732.tif 000017
2009504732.tif 000018
2009504732.tif 000019
2009504732.tif 000020
2009504732.tif 000021