(57)【要約】【課題】大きなスケールで組織の再生を誘導し、血管の進入を促進し、表面から離れた領域に位置する細胞に血管が短期間でアクセスしてこれらの細胞の生存を維持し、内部及び表面に適切な細胞が移動するのを促進し、並びにインプラント後、これらの細胞への酸素及び栄養の適切な供給を可能にすることで細胞を短期的に支持し、且つ長期的には、変形して血管再生を可能にする骨組を提供する。【解決手段】本発明に係る骨組は、対象にインプラントするための、固形な多孔性及び生分解性の骨組であって、少なくとも１つのポリマーを含み、前記骨組内にチャンネルを形成する、相互連結した細孔を有し、前記細孔の容積は、前記骨組の全容積の少なくとも約８０％を占め、（ａ）前記チャンネルは、１〜２００μｍの直径を有し、（ｂ）前記チャンネルの直径には、前記骨組の軸に沿って負の勾配が存在し、（ｃ）前記負の勾配に比例して、前記チャンネルが前記軸に沿って分岐する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象にインプラントするための、固形な多孔性及び生分解性の骨組であって、
少なくとも１つのポリマーを含み、
前記骨組内にチャンネルを形成する、相互連結した細孔を有し、
前記細孔の容積は、前記骨組の全容積の少なくとも約８０％を占め、
（ａ）前記チャンネルは、１〜２００μｍの直径を有し、
（ｂ）前記チャンネルの直径には、前記骨組の軸に沿って負の勾配が存在し、
（ｃ）前記負の勾配に比例して、前記チャンネルが前記軸に沿って分岐することを特徴とする骨組。
【請求項２】
請求項１に記載の骨組であって、
前記チャンネルの直径は、宿主組織からの前記チャンネルの距離に対して反比例することを特徴とする骨組。
【請求項３】
請求項１に記載の骨組であって、
前記ポリマーは、少なくとも１つの合成若しくは天然型のポリマー、セラミック、金属、細胞外マトリックスタンパク質、又はその類似体を含むことを特徴とする骨組。
【請求項４】
請求項３に記載の骨組であって、
前記細胞外マトリックスタンパク質は、コラーゲン、グリコサミノグリカン、又はそれらの組み合わせを含むことを特徴とする骨組。
【請求項５】
請求項１に記載の骨組であって、
前記骨組の架橋密度は一様ではなく、
前記架橋密度は、当該技術分野で公知の架橋技術によって変えられることを特徴とする骨組。
【請求項６】
請求項５に記載の骨組であって、
前記架橋剤は、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、ホルマリン、１エチル３−（３ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）、紫外線、又はそれらの組み合わせであることを特徴とする骨組。
【請求項７】
請求項１に記載の骨組であって、
細胞、細胞外マトリックス、成長因子、サイトカイン、ホルモン、炎症刺激物質、血管新生因子、又はそれらの組み合わせを含むことを特徴とする骨組。
【請求項８】
請求項１に記載の骨組であって、
前記骨組の大きさ及び形状は、前記骨組がインプラントされる組織に応じることを特徴とする骨組。
【請求項９】
請求項１に記載の骨組であって、
インプラントされると、前記骨組内又は前記骨組の付近で血管新生を促進することを特徴とする骨組。
【請求項１０】
請求項１に記載の骨組であって、
インプラント部位付近の組織による圧縮力に耐えられるほどの十分な剛性を有する材料から成ることを特徴とする骨組。
【請求項１１】
請求項１に記載の骨組であって、
前記細孔の直径は、３０〜２００μｍの範囲であることを特徴とする骨組。
【請求項１２】
請求項１１に記載の骨組であって、
より大きな細孔直径を有する前記骨組の領域が前記対象のインプラント部位の付近に位置するように、且つ最も小さな細孔直径を有する前記骨組の領域が前記対象のインプラント部位からより遠位に位置するように設置されることを特徴とする骨組。
【請求項１３】
請求項１に記載の骨組であって、
前記骨組の表面積は、約２００００ｍｍ２／ｃｍ３であり、
前記骨組の平均細孔直径は、約３５μｍであり、
前記骨組の細孔容積は、前記骨組の全容積の９０％よりも大きいことを特徴とする骨組。
【請求項１４】
直径が徐々に減少する分岐チャンネルを備える、固形で多孔性及び生体侵食性を有する骨組を作成するプロセスであって、
（ａ）軸に対してある角度をなして配置された直径が１〜２００μｍの円錐状突起を有する、伝導材料から成る型に、ポリマー懸濁液を注入するステップと、
（ｂ）前記ステップ（ａ）で前記懸濁液が充満された前記型を、前記ポリマー懸濁液が固化されるまでの期間に冷媒内で超冷却して、それによって、固化した前記ポリマー懸濁液内に氷晶が形成されるステップと、
（ｃ）固化した前記ポリマー懸濁液から前記円錐状突起を除去して、前記ポリマー懸濁液を昇華条件に曝すステップとを含むことを特徴とするプロセス。
【請求項１５】
骨組であって
請求項１４に記載のプロセスにしたがって作成された骨組。
【請求項１６】
請求項１５に記載の骨組であって、
前記骨組の細孔容積は、前記骨組の全容積の８０％以上であることを特徴とする骨組。
【請求項１７】
対象において器官又は組織を操作する方法であって、
請求項１〜１３又は１５のいずれかに記載の骨組を前記対象にインプラントするステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、
前記対象に細胞をインプラントするステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、
前記細胞は、前記骨組の上に播種されることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、
前記骨組は、前記対象にインプラントする前に所定の期間に培養されることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１９に記載の方法であって、
前記細胞は、前記骨組の表面に播種されることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１９に記載の方法であって、
前記細胞は、幹細胞又は前駆細胞であることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項１９に記載の方法であって、
前記細胞は、細胞外マトリックス成分、成長因子、サイトカイン、ホルモン、炎症刺激物質、血管新生因子、又はそれらの組み合わせを発現するように操作されることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項１７に記載の方法であって、
操作される前記器官又は組織は、異種細胞から構成されることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項１７に記載の方法であって、
前記骨組内で血管形成が促進されることを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項１７に記載の方法であって、
前記骨組は、３０〜２００μｍの範囲の直径を有する細孔を含むことを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項２５に記載の方法であって、
前記骨組は、より大きな細孔直径を有する前記骨組の領域が宿主組織の表面の付近に位置するように、且つ最も小さな細孔直径を有する前記骨組の領域が前記宿主組織の表面からより遠位に位置するように、前記宿主組織の付近にインプラントされることを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項２５に記載の方法であって、
前記宿主組織の表面から約２０ｍｍの位置では、前記細孔の直径は、約１００μｍであることを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項２５に記載の方法であって、
前記宿主組織の表面から約４０ｍｍの位置では、前記細孔の直径は、約３０μｍであることを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項１７に記載の方法であって、
前記骨組の表面積は、２００００ｍｍ２／ｃｍ３であり、
前記骨組の平均細孔直径は、約３５μｍであり、
前記骨組の細孔容積は、前記骨組の全容積の９０％よりも大きいことを特徴とする方法。
【請求項３１】
対象において器官又は組織を修復又は再生する方法であって、
請求項１〜１３又は１５のいずれかに記載の骨組を前記対象にインプラントするステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法であって、
前記対象に細胞をインプラントするステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法であって、
前記細胞は、前記骨組の上に播種されることを特徴とする方法。
【請求項３４】
請求項３２に記載の方法であって、
前記骨組は、対象にインプラントする前に所定の期間に培養されることを特徴とする方法。
【請求項３５】
請求項３２に記載の方法であって、
前記細胞は、前記骨組の表面に播種されることを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項３２に記載の方法であって、
前記細胞は、幹細胞又は前駆細胞であることを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項３２に記載の方法であって、
前記細胞は、細胞外マトリックス成分、成長因子、サイトカイン、ホルモン、炎症刺激物質、血管新生因子、又はそれらの組み合わせを発現するように操作されることを特徴とする方法。
【請求項３８】
請求項３１に記載の方法であって、
修復又は再生される前記器官又は組織は、異種細胞から構成されることを特徴とする方法。
【請求項３９】
請求項３１に記載の方法であって、
前記骨組内で血管形成が促進されることを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項３１に記載の方法であって、
前記骨組は、３０〜２００μｍの範囲の直径を有する細孔を含むことを特徴とする方法。
【請求項４１】
請求項４０に記載の方法であって、
前記骨組は、より大きな細孔直径を有する前記骨組の領域が宿主組織の表面の付近に位置するように、且つ最も小さな細孔直径を有する前記骨組の領域が前記宿主組織の表面からより遠位に位置するように、前記宿主組織の付近にインプラントされることを特徴とする方法。
【請求項４２】
請求項４１に記載の方法であって、
前記宿主組織の表面から約２０ｍｍの位置では、前記細孔の直径は、約１００μｍであることを特徴とする方法。
【請求項４３】
請求項４１に記載の方法であって、
前記宿主組織の表面から約４０ｍｍの位置では、前記細孔の直径は、約３０μｍであることを特徴とする方法。
【請求項４４】
請求項３１に記載の方法であって、
前記骨組の表面積は、２００００ｍｍ２／ｃｍ３であり、
前記骨組の平均細孔直径は、約３５μｍであり、
前記骨組の細孔容積は、前記骨組の全体の９０％よりも大きいことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高度に多孔質の骨組（足場）（scaffolding）を対象とする。とりわけ、骨組の細孔容積画分は、骨組の全容積の８０％以上である。また、骨組は、チャンネルを形成する、相互に接続した細孔を含む。
【背景技術】
【０００２】
損失及び損害した組織の再生のための骨組には、適切な細胞が骨組内又は骨組の表面に移動するのを可能にし、インプラント後のこれらの細胞への酸素及び栄養の適切な供給を可能にすることで細胞を短期的に維持し、且つ長期的には、変形して血管再生を可能にする骨組（つまり、骨組が分解して脈構造及び組織構造が再形成される）を使用する必要がある。骨組がこれらの全ての機能を示さないと、新しい間質が形成されることなく、組織は再生されない。
【０００３】
骨組は支持体として作成され、そこには、細胞が播種される場合がある。細胞は骨組の最外部に容易に吸着することができるが、細胞運動の違いや栄養拡散の制限によって、細胞の拡散は均一でない場合がある。その結果、組織が不均一に、且つ変形した状態で再生する。このような組織が存続すると、他の疾患が発生しかねない。細胞が大きな骨組の全体に均一に拡散したとしても、一部の細胞は周囲の血管系が容易にアクセスできない骨組の内部に位置しているため、細胞の長期的な安定性に必要な栄養及び酸素が供給されない。したがって、これらの細胞に栄養を施すために、血管が必要である。細胞が生存するためには、毛細血管の拡散距離内にある必要がある。血管は骨組の周囲の血管を有する組織から骨組へ成長することができるが、血管再生は時間を要するので、適切な血管形成が完了する前に細胞は死滅する可能性がある。
【０００４】
従来の組織工学における制限要因の１つは、複雑な組織が形成される材料及び構造体、とりわけ、機能的な組織を形成するように適切な細胞が所望の特定の形状に整列するのを可能にする適切な材料及び構造体が欠如していることである。
【０００５】
器官を再生するために使用される骨組の主要な制限要因は、新しい血管が組織から離れた骨組内部にまでに形成される規模である。そのような場合として、例えば、皮膚が再生する際に、新しい組織は、主に皮膚の創傷の全層、及びこの大きな２次元器官を特徴付ける面（表皮面）に形成される。皮膚の再生を誘導する骨組もまた、２次元構造を有し、新規の皮膚の形成が完了する間に分解する。この新しく形成された皮膚は、正常な皮膚の構造及び機能の大部分を獲得するプロセスの間、その中に血管が自然発生的に発達する。この場合、血管新生は、骨組の厚さを越えない長さに沿って起きる（通常は、約１ｍｍ）。
【０００６】
末梢神経の再生、新規の神経幹の合成、及び器官内での血管形成は臨床的に有用である。神経の切断後に形成された２つの神経の切断端（nerve stump）の間に新しい神経が形成された。一般的には、数ｍｍ程度の空間の間に神経形成は起きない。神経の再生を誘導する骨組は、細いシリンダー状であり、その直径は約１ｍｍであり、長さは数ミリメートル以内であった。この例でも、血管形成は、数ミリメートルを越えない長さに沿って発生する。この長さが骨組の適用性を制限する。
【０００７】
骨組は、大きなスケールで組織の再生を誘導し、血管の進入を促進し、表面から離れた領域に位置する細胞に血管が短期間でアクセスしてこれらの細胞の生存を維持し、内部及び表面に適切な細胞が移動するのを促進し、並びにインプラント後、これらの細胞への酸素及び栄養の適切な供給を可能にすることで細胞を短期的に支持し、且つ長期的には、変形して血管再生を可能にする必要がある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ある実施形態では、本発明は、対象にインプラントするための、固形な多孔性及び生分解性の骨組であって、
少なくとも１つのポリマーを含み、
前記骨組内にチャンネルを形成する、相互連結した細孔を有し、
前記細孔の容積は、前記骨組の全容積の少なくとも約８０％を占め、
（ａ）前記チャンネルは、１〜２００μｍの直径を有し、
（ｂ）前記チャンネルの直径には、前記骨組の軸に沿って負の勾配が存在し、
（ｃ）前記負の勾配に比例して、前記チャンネルが前記軸に沿って分岐する骨組を提供する。
【０００９】
他の実施形態では、本発明は、直径が徐々に減少する分岐チャンネルを備える、固形で多孔性及び生体適合性を有する骨組を作成する方法であって、
（ａ）軸に対してある角度をなして配置された直径が１〜２００μｍの円錐状突起を有する、伝導材料から成る型に、ポリマー懸濁液を注入するステップと、
（ｂ）前記ステップ（ａ）で前記懸濁液が充満された前記型を、前記ポリマー懸濁液が固化されるまでの期間に冷媒内で超冷却して、それによって、固化した前記ポリマー懸濁液内に氷晶が形成されるステップと、
（ｃ）前記型を除去して、前記ポリマー懸濁液を昇華条件に曝すステップとを含む方法を提供する。
【００１０】
他の実施形態では、本発明は、本発明に係るプロセスにしたがって作成された骨組を提供する。
【００１１】
ある実施形態では、本発明は、組織の修復又は再生を促進又は速める方法及び骨組を提供する。他の実施形態では、本発明は、創傷治癒に利用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、固形で多孔性の骨組（scaffold）、その作成方法、及び前記骨組の治療への利用を対象とする。
【００１３】
本発明は、ある実施形態では、血管形成を促進又は増進させる骨組を提供する。
【００１４】
血管新生用の骨組は、内皮細胞の骨組表面との相互作用を提供し、そのことにより次々に血管の形成が促進される。ある実施形態では、様々なサイズの血管を十分に備えた宿主組織が、前記骨組の内側に新しい脈管構造を形成するための内皮細胞源としての機能を果たす。他の実施形態では、内皮細胞は前記骨組に付加される。さらなる他の実施形態では、前記内皮細胞は、部位及び組織型に応じて、最適成長に望ましい化合物（ある実施形態では、ＶＥＧＦ）と組み合わせて、前記骨組に付加される。ある実施形態では、本発明は、血管の増殖を容易にし、且つ目的とする軸に沿って血管を分岐させるための空間的な誘導を提供する骨組を提供する。増殖成長と、前記成長の空間的制御との組み合わせは、合成中の器官の成長部分を血液がかん流することを可能にする。前記形成は、本発明の一実施形態を示す。
【００１５】
血管形成には、内皮細胞と細胞外マトリックスとの相互作用が伴われる。本発明で用いられる高度に多孔質の細胞外マトリックスは、ポリマーやグラフトコポリマーを含む。前記ポリマーやグラフトコポリマーとしては、例えば、細胞外マトリックス（extracellular matrix：ＥＣＭ）のグリコタンパク質に基づくポリマーやグラフトコポリマーがある（ただし、これらに限定されるものではない）。幾つかの実施形態では、グリコタンパク質としては、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、エラスチン、プロテオグリカン、又はグリコサミノグリカン（glycosaminoglycan：ＧＡＧ）（例えば、ヘパリン、ヒアルロン酸、コンドロイチン６硫酸）、又は、それらの任意の組み合わせのグラフトコポリマーがある。
【００１６】
例えば、且つある実施形態では、前記骨組は、Ｉ型コラーゲン及びＧＡＧのグラフトコポリマーから成る。Ｉ型コラーゲンとＧＡＧとの比は、コポリマーを形成するために混合されるこれらの高分子の質量を調節することにより調整することができる。
【００１７】
ある実施形態では、本発明に係る骨組の内側での血管の分岐ネットワークの形成は、内皮細胞とＶＥＧＦとの相互作用に使用可能な比表面積で調整される。
【００１８】
ある実施形態では、本発明は、対象にインプラントするための、固形な多孔性及び生分解性の骨組であって、
少なくとも１つのポリマーを含み、
前記骨組内にチャンネルを形成する、相互連結した細孔を有し、
前記細孔の容積は、前記骨組の全容積の少なくとも約８０％を占め、
（ａ）前記チャンネルは、１〜２００μｍの直径を有し、
（ｂ）前記チャンネルの直径には、前記骨組の軸に沿って負の勾配が存在し、
（ｃ）前記負の勾配に比例して、前記チャンネルが前記軸に沿って分岐することを特徴とする骨組を提供する。
【００１９】
ある実施形態では、「骨組」という用語は、細胞が付着、増殖、分化、及び細胞外マトリックスを分泌するための部分を提供することによって組織再生プロセスを補助し、最終的には組織の形成をもたらす三次元構造体を意味する。ある実施形態では、骨組は、組織又は器官の修復、再生又は生成を補助する。
【００２０】
ある実施形態では、前記骨組を含む前記マトリックスには、勾配が存在する。他の実施形態では、「勾配（gradient）」という用語は、本発明に係る骨組に関して使用する場合は、前記骨組を構成する成分の濃度、多孔性（細孔サイズ、細孔の形状、多孔率、ねじれ、相互連結性）、架橋密度、又は骨組密度が、骨組の全体を通じて異なることを意味する。ある実施形態では、細孔の直径は、前記骨組の全体を通じて一様ではない。他の実施形態では、本発明に係る骨組では、前記のパラメータの任意に組み合わせが異なり得る。
【００２１】
他の実施形態では、前記骨組は、不均一な多孔性を有する。ある実施形態では、「多孔性」という用語は、孔又は孔隙を有することで生じる材料透過性を意味する。ある実施形態では、不均一な多孔性を有する骨組は、前記骨組内の一部の領域では透過性を有し、その他の領域では透過性を有さない。或いは、他の実施形態では、透過性の程度は、前記骨組内の領域によって異なる。
【００２２】
ある実施形態では、骨組の細孔の平均直径は不均一である。他の実施形態では、細孔の平均直径は、骨組におけるそれらの空間的構造に応じて異なる。他の実施形態では、細孔の平均直径は、前記骨組の任意の軸に沿った細孔サイズ分布に応じて異なる。
【００２３】
本発明に係る骨組は、高度に多孔質であり、組織の操作、修復又は再生を可能にする。ある実施形態では、高い多孔率を有する骨組を使用することにより、様々な種類の細胞が骨組の適切な領域へ移動するのを促進することができる。ある実施形態では、そのような骨組は、組織の発達／修復／再生の適切な構築に必要な、骨組を含む、様々な種類の細胞間での適切な細胞間連結の発達を促進する。例えば、樹状突起又は細胞突起の伸長は、骨組材料の様々な多孔率によって、より適切に行われ得る。
【００２４】
他の実施形態では、前記骨組の細孔の平均直径及び／又はその分布は、一様ではない。他の実施形態では、前記細孔の平均直径は、前記骨組におけるその空間的構造に応じて異なる。他の実施形態では、前記細孔の平均直径は、前記骨組の任意の軸に沿った前記細孔サイズの分布に応じて異なる。他の実施形態では、前記骨組は、細孔が存在しない領域を含む。他の実施形態では、前記領域は、大きさが１０００Ｄａ以上の分子を通さない。
【００２５】
ある実施形態では、不均一な細孔を有する骨組においては、細孔の平均直径、細孔サイズの分布、架橋密度、又はそれらの組み合わせは一様ではない。細孔の平均直径は、０．７５〜３０００μｍの範囲であり得る。細孔サイズの分布は、３０〜２００μＭであり得る。架橋密度は、当該技術分野で公知の架橋技術によって調整することができる。ある実施形態では、細孔の平均直径は、約０．７５〜３０００μｍの範囲であり得る。
【００２６】
ある実施形態では、本発明に係る骨組は、生体適合性を有する。他の実施形態では、「生体適合性」という用語は、ある生産物が構成要素に分解された際に、患者又はその環境に対して有益である又は無害である性質を意味する。他の実施形態では、「生体適合性」という用語は、骨組を対象又は前記対象の細胞に晒した後に、線維症、炎症反応、ホスト拒絶反応、細胞粘着、又はそれらの組み合わせを引き起こさない傾向にある性質を意味する。他の実施形態では、「生体適合性」という用語は、骨組に直接的又は間接的に曝された周囲の細胞又は組織への影響がたとえあったとしても、その影響を最小限に留める（すなわち、対照と比較しても有意差が見られない）性質を意味する。
【００２７】
ある実施形態では、「生体適合性」という用語は、ある物質を生体組織に設置したときに、毒性反応が生じない性質を意味する。生体適合性を有する材料は、ある実施形態では有機材料であり、他の実施形態では合成材料である。ある実施形態では、生体適合性材料は、生体組織を治療、交換、増加、活性化、又は修復をし得る。
【００２８】
他の実施形態では、本発明に係る骨組は、生分解性ポリマーを含む。ある実施形態では、「生分解性ポリマー」という用語は、侵食過程に含まれる特定の作用には関係なく、生理学的条件下で水溶性物質に変換される不水溶性ポリマーを意味する。「生体侵食（bioerosion）」は、ある実施形態では物理的過程（例えば、分解）に関わり、他の実施形態では、化学的過程（例えば、バックボーン分裂）に関わる。ある実施形態では、生体侵食は、 生理学的条件下で発生し、ｉｎ−ｓｉｔｕでの高温、化学的環境等の影響を受け得る。ある実施形態では、生体再吸収（bioresorption）又は生体吸収（absorption）は、生物環境での細胞活性（例えば、食作用）によって、ポリマー（ある実施形態では、ポリマーの分解産物）が除去されることを示す。ある実施形態では、生体適合性骨組は、生体侵食性を有する。
【００２９】
ポリマーに関しては、「分解（degrade）」という用語は、ある実施形態では、分子重量をオリゴマーレベルでほぼ一定に維持するように、ポリマー鎖を開裂することを意味する。他の実施形態では、実質的に質量が完全に損失するようにポリマーの開裂がモノマーレベルで行われた場合は、ポリマーは完全に分解されたことになる。前記「分解」という用語は、ある実施形態では、「完全な分解」を意味する。
【００３０】
ある実施形態では、本発明に係る骨組及び方法で使用される前記生分解性ポリマーは、エステル、無水物、オルトエステル、及びアミドを含み得る。生分解性ポリマーとしては、例えば、ポリ［ラクチド−コ−グリコリド］、ポリ無水物、及びポリオルトエステルがある。ある実施形態では、生体内分解性ポリマーは、ポリラクチド、ポリグルコシド、及びそれらのコポリマー、ポリ（エチレン−テレフタラート）、ポリ（ブチル酸）、ポリ（バレリアン酸）、ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリ無水物、ポリホスファゼン、ポリ（イプシロン−カプロラクトン）、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（ヒドロキシ酪酸）、ポリ（ヒドロキシ吉草酸）、ポリオルトエステル、又はそれらの混合物若しくはコポリマーがある。アクリル酸及びメタクリル酸又はそのエステルを含む生分解性及び生体適合性のポリマーとしては、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）などがある。本発明に使用することできる他のポリマーとしては、ポリアルキレン（例えばポリエチレンやポリプロピレンなど）、ポリアリルアルキレン（例えばポリスチレンなど）、ポリ（アルキレングリコール）（例えば、ポリ（エチレングリコール）など）、ポリ（アルキレンオキシド）（例えば、ポリ（エチレンオキシド）など）、及びポリ（アルキレンテレフタラート）（例えばポリ（エチレンテレフタレート）など）がある。さらに、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ハロゲンポリビニルなどを含むポリビニルポリマーを使用することもできる。ポリビニルポリマーの例としては、ポリ（ビニルアセテート）、ポリビニルフェノール、及びポリビニルピロリドンがある。上記のポリマーの２つ以上の混合物もまた、本発明に使用することができる。
【００３１】
ある実施形態では、多孔性を有する固形の骨組は、相互接続ネットワークを形成する「スポンジ状」の連続気孔を有する三次元構造体である。他の実施形態では、マトリックスは、剛性を有し、又は他の実施形態では弾力性を有し、それを通じて細胞が成長することができる骨組を提供する。ある実施形態では、細孔は、相互連結しており、マトリックス中に延びるチャンネルの連続的なネットワークを形成する。また、他の実施形態では、前記チャンネルの連続的なネットワークを通じて、栄養素が流れることを可能にする。
【００３２】
ある実施形態では、前記多孔性を有する固形の骨組は、相互連結ネットワークを形成する「スポンジ状」の連続気孔を有する三次元構造体であり、約２０，０００ｍｍ２／ｃｍ３の表面積を有する。細孔の平均直径は約３５μｍである。また、細孔の容積は、骨組の全容積の９０％以上であり、他の実施形態では９５％以上、別の実施形態では９８％以上である。
【００３３】
ある実施形態では、例えば、ケラチノサイト、軟骨細胞、骨芽細胞などの細胞を含有している懸濁液が、適切な成長因子と共に、ポリマーのネットワークに注入される。細胞は、その後、前記ネットワーク内で成長することができる。細胞が成長するにつれて、細胞の周囲のネットワークは分解される。ネットワークが分解される時期は、前記細胞が細胞間接触を介して自身のネットワーク（器官／組織）を形成する時期と一致する。
【００３４】
ある実施形態では、本発明に係る骨組でのチャンネル分岐は、血管の分岐の等比級数に従って増加する（１→２→４→８→１６→ｎ。フラクタル次元Ｄ＝２を持つ自己相似性を示す。）という仮定に基づいて行うことができる。このモデルに基づいた計算は、骨組の内部で分岐が開始すると、血管の表面積が非常に急速に増加することを示す。ある実施形態では、半径１００μｍの単一の血管が分岐すると、直径が約１０ｐｍの約６４本の毛細血管が形成され、そのことにより、樹形状の血管ネットワークの表面積が約３倍に増加する。計算によれば、前述した例で形成された前記ネットワークは、細孔の平均直径が約３５μｍで、前記細孔の体積率が骨組の全体積に対して９０％の骨組において、約２０，０００ｍｍ２／ｃｍ３の骨組の表面積と接触する必要がある。他の実施形態では、本発明に係る骨組でのチャンネル分岐は、血管の分岐が１〜５のフラクタル次元を持つ自己相似性に従うという仮定に基づいて行うことができる。
【００３５】
ある実施形態では、「約」という用語は、１〜２０％の範囲のずれを意味する。また、他の実施形態では、「約」という用語は、１〜１０％の範囲のずれを意味する。また、他の実施形態では、「約」という用語は、１〜５％の範囲のずれを意味する。また、他の実施形態では、「約」という用語は、５〜１０％の範囲のずれを意味する。また、他の実施形態では、「約」という用語は、１０〜２０％の範囲のずれを意味する。
【００３６】
ある実施形態では、本発明は、細孔サイズにおいて負の勾配を有する骨組を提供する。ある実施形態では、前記骨組の内側での新生血管の分岐には、宿主組織の表面から離れる方向において、骨組の細孔サイズが減少（比表面積における増加に相当する）することが必要である（これは、本発明に係る骨組の望ましい効果である）。他の実施形態では、本発明は、宿主組織の表面の付近で細孔サイズが２００μｍであり、宿主組織の表面から約２０ｍｍ離れた位置で細孔サイズが約１００μｍに減少し、宿主組織の表面から約４０ｍｍ離れた位置で細孔サイズが約３０μｍに減少することを特徴とする骨組を提供する。
【００３７】
ある実施形態では、本発明は、再生される器官に適切な全体的な構造パターンにしたがって新血管形成を誘導する、血管新生用の骨組を提供する。例えば、他の実施形態では、主要な神経軸に沿って末梢神経が再生される。
【００３８】
他の実施形態では、周囲の生体組織から骨組の内側に向かって増殖した、方向付けられた血管のネットワークの形成は、内皮細胞及びＶＥＧＦとの相互作用に使用可能な比表面積によって調整される。ある実施形態では、表面積を分割する前記血管は、前記細孔サイズが減少するにつれて、非常に急速に増加する。このように、他の実施形態では、骨組における細孔サイズと、目的とする血管形成を最大化する軸に沿った距離との間には反比例関係がある。ある実施形態では、細孔のチャンネルは相互連結しており、脈管（又は上皮）を遮ることなく、その増殖を可能にする。
【００３９】
したがって、本発明のこの態様及び他の実施形態では、チャンネルの直径は、チャンネルのホスト細胞からの距離と反比例する。
【００４０】
ある実施形態では、細孔（他の実施形態では、細孔の相互連結により形成されたチャンネル）の直径の減少率は、骨組の外面からの距離（他の実施形態では、組織、並びに、再生、人工的改変又は治療される組織）に応じて決定される。
【００４１】
ある実施形態では、本発明は、生体適合性材料を含む骨組を提供する。前記生体適合性材料は、炭水化物、単一アミノ酸、ここで説明した生体適合性ポリマーのモノマー、又はそれらの組み合わせである。
【００４２】
ある実施形態では、本発明は、少なくとも１つのポリマーを含む骨組を提供する。前記ポリマーは、ある実施形態では合成ポリマーであり、他の実施形態では天然ポリマーである。他の実施形態では、前記骨組は、セラミック、細胞外マトリックスタンパク質、細胞外マトリックスタンパク質の類似体、又はそれらの組み合わせである。
【００４３】
他の実施形態では、本発明におけるポリマーは、コポリマーであり得る。他の実施形態では、前記ポリマーは、ホモポリマー又はヘテロポリマーであり得る。他の実施形態では、本発明におけるポリマーは、フリーラジカル・ランダムコポリマー又はグラフトコポリマーである。ある実施形態では、前記ポリマーは、タンパク質、ペプチド、又は核酸を含み得る。
【００４４】
他の実施形態では、ポリマーは、例えばコラーゲンなどの生体ポリマーを含み得る。他の実施形態では、ポリマーは、生体適合性ポリマーを含み得る。生体適合性ポリマーとしては、ポリ（Ｌ−ラクチド）（poly(L-lactide)：ＰＬＬＡ）及びポリグリコリド（polyglycolide：ＰＧＡ）などの［アルファ］−ヒドロキシカルボン酸のポリエステル、ポリ−ｐ−ジオキサノン（poly- p-dioxanone：ＰＤＯ）、ポリカプロラクトン（polycaprolactone：ＰＣＬ）、ポリビニルアルコール（polyvinyl alcohol：ＰＶＡ）、ポリエチレン・オキシド（polyethylene oxide：ＰＥＯ）、米国特許第６、３３３、０２９号及び第６、３５５、６９９号に開示されたポリマー、及び、他の生体吸収可能及び生体適合性ポリマー、コポリマー、或いは、上記のポリマー若しくはコポリマーの混合物がある。
【００４５】
他の実施形態では、細胞外マトリックス成分を含む前記ポリマーは、当該技術分野で公知の方法によって、組織から精製される。例えば、コラーゲンを目的とする場合は、ある実施形態では、コラーゲン以外の実質的に全ての物質を除去するために、天然の細胞外マトリックスを処理することができる。前記精製は、公知の方法によって、グリコタンパク質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、脂質、非コラーゲンタンパク質、又は核酸（ＤＮＡ若しくはＲＮＡ）を実質的に除去するために行われる。
【００４６】
ある実施形態では、前記ポリマーは、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ゼラチン、アガロース、細胞収縮コラーゲン（プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、又はグリコタンパク質を含有する）、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン、フィブリン、ポリアシド（ポリ乳酸、ポリグルコール酸、ポリアミノ酸など）から作成された合成ポリマー繊維、ポリカプロラクトン、ポリアミノ酸、ポリペプチドゲル、それらのコポリマー、及び／又はそれらの組み合わせを含み得る。ある実施形態では、前記骨組は、生分解性を有するように、上記の材料から作成される。
【００４７】
他の実施形態では、本発明に係るポリマーは無機であり、例えば、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウム、アルファ・リン酸三カルシウム、ベータ・リン酸三カルシウム、炭酸カルシウム、炭酸バリウム、硫酸カルシウム、硫酸バリウム、硫酸カルシウムの多形体、セラミック粒子、又はそれらの組み合わせを含む。
【００４８】
ある実施形態では、前記ポリマーは、目的とする他の分子との結合の形成を可能にする官能基を含み得る。前記官能基のいくつかの例を下記に記載する。ある実施形態では、前記官能基は、水素結合に適した官能基である（例えば、ヒドロキシル基、アミノ基、エーテル結合、カルボキシル酸、エステルなど）。
【００４９】
他の実施形態では、官能基は有機酸基を含み得る。ある実施形態では、「有機酸基」という用語は、例えばカルボキシル酸基やスルホン酸基などの、有機酸のイオン化水素を含有する任意の基を意味する。「有機酸官能基」という表現は、特定の反応条件下で有機酸基と同じように機能する任意の基を意味する。そのようなものとしては、前記有機酸基の金属塩（例えば、アルカリ金属塩（リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム塩。マグネシウム塩など））や、前記有機酸基の第４級アミン塩（例えば、第４級アンモニウム塩）などがある。
【００５０】
ある実施形態では、官能基は、オルト−エステル基又はアミド基などの、酸加水分解が可能な結合を有し得る。他の実施形態では、官能基は、アルファ−エステル基又は無水物基などの、塩基加水分解が可能な結合を有し得る。他の実施形態では、官能基は、炭酸基、エステル基又はイミノ炭酸基などの、酸加水分解及び塩基加水分解の両方が可能な結合を有し得る。他の実施形態では、官能基は、当該技術分野では公知であり、本明細書に記載された方法／プロセス及び骨組に容易に用いることができる置換活性結合を有し得る（例えば、Petersonらによる「Biochem Biophys. Res. Comm. 200(3): 1586-1591 (1994)」、及び、Freelらによる「J. Med. Chem. 43: 4319-4327 (2000)」を参照されたい）。
【００５１】
他の実施形態では、前記骨組は、ｐＨ改変化合物をさらに含む。ある実施形態では、「ｐＨ改変（pH-modifying）」は、前記化合物を水環境に置いた又は溶解させたときにおける、前記化合物が前記水環境のｐＨを変化させる能力を意味する。前記ｐＨ改変化合物は、他の実施形態では、ポリマーを水分及び／又は熱に曝したときに、前記ポリマーにおける加水分解可能な結合の加水分解を速めることが可能である。ある実施形態では、前記ｐＨ改変化合物は、実質的に不水溶性である。適切な、実質的に不水溶性なｐＨ改変化合物は、実質的に不水溶性な酸及び塩基を含み得る。他の実施形態では、無機性及び有機性酸又は塩基を使用し得る。
【００５２】
ある実施形態では、本発明に係る骨組は、コラーゲン、グリコサミノグリカン、又はそれらの組み合わせを含む。
【００５３】
本発明のある実施形態では、前記骨組の架橋密度は一様ではない。他の実施形態では、「架橋密度」という用語は、各架橋間に存在するモノマーの平均数である。他の実施形態では、架橋間のモノマー数が小さいほど、架橋密度が大きくなる（このことは、前記骨組の物理化学的な性質に影響を及ぼす）。ある実施形態では、細胞移動を可能にするのに十分な細孔サイズが得られるように（又は所望する性質の任意の組み合わせが得られるように）、架橋密度を調整する必要がある。他の実施形態では、細孔サイズは、走査電子顕微鏡によって、又は高分子プローブの使用によって測定することができる。
【００５４】
ある実施形態では、本発明は、骨組であって、前記骨組を架橋剤（他の実施形態では、架橋プロセス）に曝すことによって前記骨組の架橋密度が調整される骨組を提供する。ある実施形態では、架橋剤は、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、ホルマリン、１エチル３−（３ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）、紫外線、又はそれらの組み合わせである。ある実施形態では、上述した架橋密度を調節するための暴露時間は様々である。ある実施形態では、後述する勾配などの条件下でポリマー懸濁液を超冷却すると、架橋密度が一様でない骨組が形成される。
【００５５】
ある実施形態では、ここで説明したように、骨組内に他の分子が組み込まれ得る。他の実施形態では、前記分子は、ここで説明したように、官能基を介して結合し得る。他の実施形態では、前記分子は、骨組に直接結合している。
【００５６】
他の実施形態では、前記骨組は、次のようなＥＣＭ成分を含み得る。ヒアルロン酸ナトリウムなどのヒアルロン酸及び／又はその塩。デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、及び／又はケラタン硫酸。ムチングリコタンパク質（例えば、ルブリシン）、ビトロネクチン、トリボネクチン、界面活性リン脂質、鶏冠又は臍帯ヒアルロン酸塩。幾つかの実施形態では、前記細胞外マトリックス成分は、次の商業的供給源から得ることができる。ＡＲＩＨＲＥＡＳＥ（登録商標）高分子量ヒアルロン酸ナトリウム、ＳＹＮＶＩＳＣ（登録商標）Ｈｙｌａｎ Ｇ−Ｆ ２０、ＨＹＬＡＧＡＮ（登録商標）ヒアルロン酸ナトリウム、ＨＥＡＬＯＮ（登録商標）ヒアルロン酸ナトリウム、及びＳＩＧＭＡ（登録商標）コンドロイチン６−硫酸。
【００５７】
他の実施形態では、１つ以上の生体分子が前記骨組に組み込まれ得る。前記生体分子としては、例えば、薬剤、ホルモン、抗生物質、抗微生物物質、染料、放射性物質、蛍光物質、シリコン・エラストマ、アセタール、ポリウレタン、放射線不透過性フィラメント若しくは物質、抗細菌物質、化学薬品若しくは物質、又は、それらの組み合わせがある。これらの物質は、治療効果の向上、骨組が侵食又は生体拒絶される可能性の減少、可視化の向上、適切な方向の指示、感染への抵抗、治癒の促進、柔軟性又は他の任意の望ましい効果の増大のために使用され得る。
【００５８】
ある実施形態では、骨組における重合体又は構成要素（生体分子、及び／若しくは前記骨組に組み込まれた細胞）の濃度は一様ではない。
【００５９】
他の実施形態では、前記生体分子は、血管新生因子を含み得る。血管新生因子としては、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、ｂＦＧＦ−２、レプチン、プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ、ｕＰＡ）、アンジオポエチン、リポタンパク質Ａ、形質転換成長因子−β、ブラジキニン、血管新生オリゴ糖（例えば、ヒアルロナン、ヘパラン硫酸）、トロンボスポンジン、肝細胞成長因子（散乱因子としても知られている）、及びＣＸＣケモカイン受容体ファミリーのメンバーがある。抗炎症因子はステロイド性若しくは非ステロイド性の化合物を含み、そのような化合物としては、例えば、アルクロフェナック、ジプロピオン酸アルクロメタゾン、アルゲストンアセトニド、αアミラーゼ、アンシナファル、アンシナフィド、アンフェナックナトリウム、アミプリロース、アナキンラ、アニロラク、アニトラザフェン、アパゾン、バルサラジド二ナトリウム、ベンダザック、ベノキサプロフェン、塩酸ベンジダミン、ブロメライン、ブロペラモール、ブデソニド、カルプロフェン、シクロプロフェン、シンタゾン、クリプロフェン、プロピオン酸クロベタゾール、クロベタゾンブチレート、クロピラク、プロピオン酸クロチカゾン、コルメタゾン、コルトドキソン、デフラザコート、デソニド、デスオキシメタゾン、ジプロピオン酸デキサメタゾン、ジクロフェナクカリウム、ジクロフェナクナトリウム、二酢酸ジフロラゾン、ジフルミドンナトリウム、ジフルニサル、ジフルプレドナート、ジフタロン、ジメチルスルホキシド、ドロシノニド、エンドリソン、エンリモマブ、エノリカムナトリウム、エピリゾール、エトドラク、エトフェナメート、フェルビナク、フェナモール、フェンブフェン、フェンクロフェナク、フェンクロラク、フェンドサール、フェンピパロン、フェンチアザク、フラザロン、フルアザコート、フルフェナミン酸、フルミゾール、酢酸フルニソリド、フルニキシン、フルニキシンメグルミン、フルオコルチンブチル、酢酸フルオロメトロン、フルクアゾン、フルルビプロフェン、フルレトフェン、プロピオン酸フルチカゾン、フラプロフェン、フロブフェン、ハルシノニド、プロピオン酸ハロベタゾール、酢酸ハロプレドン、イブフェナク、イブプロフェン、イブプロフェンアルミニウム、イブプロフェンピコノール、イロニダプ、インドメタシン、インドメタシンナトリウム、インドプロフェン、インドキソール、イントラゾール、酢酸イソフルプレドン、イソキセパク、イソキシカム、ケトプロフェン、塩酸ロフェミゾール、ロルノキシカム、ロテプレドノールエタボネート、メクロフェナメートナトリウム、メクロフェナム酸、メクロリソンジブチレート、メフェナム酸、メサラミン、メセクラゾン、スレプタン酸メチルプレドニゾロン、モルニフルメート、ナブメトン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、ナプロキソール、ニマゾン、オルサラジンナトリウム、オルゴテイン、オルパノキシン、オキサプロジン、オキシフェンブタゾン、パラニリン、ペントサンポリ硫酸ナトリウム、グリセリン酸フェンブタゾンナトリウム、ピルフェニドン、ピロキシカム、ケイ皮酸ピロキシカム、ピロキシカムオラミン、ピルプロ��ェン、プレドナゼート、プリフェロン、プロドール酸、プロクアゾン、プロキサゾール、クエン酸プロキサゾール、リメキソロン、ロマザリット、サルコレクス、サルナセジン、サルサレート、塩化サンギナリウム、セクラゾン、セルメタシン、スドキシカム、スリンダク、スプロフェン、タルメタシン、タルニフルマート、タロサラート、テブフェロン、テニダップ、テニダップナトリウム、テノキシカム、テシカム、テシミド、テトリダミン、チオピナク、ピバリン酸チキソコルトール、トルメチン、トルメチンナトリウム、トリクロニド、トリフルミデート、ジドメタシン、ゾメピラックナトリウムがある。
【００６０】
ある実施形態では、生体分子は、走化性物質、抗生物質、ステロイド性若しくは非ステロイド性鎮痛剤、抗炎症薬、免疫抑制剤、抗がん剤、様々なタンパク質（例えば、短鎖ペプチド、骨形態形成タンパク質、グリコタンパク質及びリポタンパク質）、細胞接着剤（生物活性リガンド、インテグリン結合配列、リガンド）、様々な成長（増殖）及び／若しくは分化剤（例えば、上皮細胞増殖因子,ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−β Ｉ〜ＩＩＩ、増殖及び分化因子、血管内皮成長因子、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、インシュリン由来増殖因子、形質転換成長因子、副甲状腺ホルモン、副甲状腺ホルモン関連ペプチド、ｂＥＧＦ、ＴＧＦβスーパーファミリー（ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−１２、ソニック・ヘッジホッグ、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−８、ＰＤＧＦ）、特定の成長因子の上方調節を行う小さな分子（テナシン―Ｃ、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、フィブロネクチン、デコリン、トロンボエラスチン、トロンビン由来ペプチド、ヘパリン結合領域、ヘパリン、ヘパラン硫酸）、ＤＮＡ断片、ＤＮＡプラスミド、又はこれらの組み合わせを含み得る。
【００６１】
ある実施形態では、骨組のポリマー濃度、又は生体分子及び／若しくは骨組に組み込まれている細胞などの骨組の成分の濃度は、一様ではない。
【００６２】
他の実施形態では、骨組は、任意の組織の自家移植片、同種移植片、及び異種移植片（対象に対して）のうちの１つ以上を含み得る。
【００６３】
ある実施形態では、骨組は細胞を含み得る。ある実施形態では、細胞には次に記載のものの１つ以上が含まれる場合がある。軟骨細胞、線維軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、滑膜細胞、骨髄細胞、間葉細胞、間質細胞、幹細胞、胚幹細胞、脂肪組織由来の前駆細胞、末梢血液前駆細胞、成体組織由来の幹細胞、遺伝子組み替え細胞、軟骨細胞と他の細胞との組み合わせ、骨細胞と他の細胞との組み合わせ、骨髄細胞と他の細胞との組み合わせ、骨髄細胞と他の細胞との組み合わせ、間葉細胞と他の細胞との組み合わせ、間質細胞と他の細胞との組み合わせ、幹細胞と他の細胞との組み合わせ、胚幹細胞と他の細胞との組み合わせ、成体組織由来の前駆細胞、末梢血液前駆細胞と他の細胞との組み合わせ、成体組織由来の幹細胞と他の細胞との組み合わせ、及び遺伝子組み替え細胞と他の細胞との組み合わせ。
【００６４】
ある実施形態では、細胞は、成長因子を発現するように操作される場合がある。他の実施形態では、成長因子は、最適な組織操作を促進する。
【００６５】
ある実施形態では、本発明に係る骨組及び方法に使用されるこれらの細胞の任意のものは、所望の分子を発現するように操作される場合がある。
【００６６】
ある実施形態では、本発明に係る骨組及び方法に組み込まれる細胞は、ケラチノサイト、又は軟骨細胞及び骨芽細胞である。他の実施形態では、骨組に組み込まれる細胞は、同じ又は異なる成長因子（再生、修復、又は操作される組織に対して特異的に機能し得る）を発現する。
【００６７】
ある実施形態では、本発明は、骨組であって、より大きな細孔直径を有する領域が対象のインプラント部位に近接するように、且つ最も小さな細孔直径を有する領域が前記対象のインプラント部位に対して遠位に位置するように構成された骨組を提供する。
【００６８】
ある実施形態では、前記骨組の寸法及び形状は、骨組がインプラントされる組織に応じる。他の実施形態では、骨組は、インプラントされる際に、骨組内又は骨組付近での血管形成を誘導する。
【００６９】
ある実施形態では、骨組は、インプラント部位付近の組織による圧縮力に耐えられるほど十分な剛性を有する材料から成る。他の実施形態では、骨組材料の架橋の程度は、周囲の組織の圧縮力を相殺するように調整される。ある実施形態では、骨組は、骨組にある程度の弾力性を与え、同時に骨組の破壊を防止する可塑剤を含む。骨組は、周囲の標的組織の圧縮力に応じて、深さ及び幅が異なる。
【００７０】
ある実施形態では、骨組は、不定形なガラス状態の固体を作成するプロセスで作成される。ある実施形態では、「ガラス状態の固体」は、可塑剤を迅速に除去する際にバイオポリマーの並進運動（translational mobility）が阻害され、且つポリマー固有の断熱膨張係数（adiabatic expansion coefficient）に対応する分子の配列性向（alignment）が絶たれる程度までにポリマーの粘度が増加する不定形の準安定固体を意味する。
【００７１】
他の実施形態では、可塑剤は、生体適合分子の分子量よりも小さく、自由体積を増大させる任意の物質であり得る。ある実施形態では、可塑剤は、有機化合物（ある実施形態では、様々な鎖長を有するトリグリセリド）である。他の実施形態では、可塑剤は、水である。
【００７２】
ある実施形態では、不定形なガラス状態の固体は、空気が混入した生体適合性ポリマー液を迅速に冷却することで作成される。他の実施形態では、不定形なガラス状態の固体は、真空下で溶媒を迅速に除去することで作成される。他の実施形態では、不定形なガラス状態の固体は、凍結乾燥で作成される。ある実施形態では、不定形なガラス状態の固体は、６５℃よりも高い温度で又は約４〜４０℃の間の温度で押し出し成形を行うことによって作成される。ある実施形態では、骨組の幅、長さ、深さ、又はそれらの組み合わせは、押し出し成形の条件を設定し、押し出し成形に使用されるダイを設計することで調整される。当業者ならば、相互連結した細孔を多く有する（スポンジのように）不定形のガラスを作成でき、且つ製造条件を変えることで細孔の寸法を調整できる任意のプロセスが、本発明に係る骨組を作成するのに適しており、したがって、本発明の範囲内に組み込まれることを理解できるであろう。
【００７３】
ある実施形態では、骨組は、本発明に係るプロセスにしたがって材料を凍結乾燥し、昇華させることにより、多孔状に作成される。これは、例えば、Dagalakisらに付与された米国特許第４，５２２，７５３号に記載されているような、当業者に公知の方法を用いれば実施可能である。例えば、多孔性の勾配骨組は、凍結乾燥によって作成可能である。ある実施形態では、細胞外マトリックス成分が液体に懸濁される場合がある。そこで、その懸濁液は凍結され、次に凍結乾燥される。懸濁液が凍結することによって、液体から氷晶が形成される。そこで、これらの氷晶は、凍結乾燥の工程の真空状態下で昇華することにより、氷晶が材料中に占めていた場所に空隙が残る。他の実施形態では、作成される骨組の成分密度及び細孔の寸法は、凍結工程の始まりに、懸濁液の凍結速度及び／又は細胞外マトリックス成分が懸濁される水の量を調節することにより変わり得る。
【００７４】
本発明のこの態様によれば、且つある実施形態では、比較的大きく、均一的な細孔サイズ及び低い成分密度を有する骨組を作成するためには、制御された遅い速度（例えば、−１℃／分又はそれ以下）で温度を約−２０℃まで下げて細胞外マトリックス成分を凍結し、次に、凍結乾燥を行う場合がある。比較的小さく、均一的な細孔サイズ及び高い成分密度を有する骨組を作成するためには、凍結前に、液体部分（例えば、水）を均一的に取り除くために遠心分離を行い、細胞外マトリックス成分を圧縮する場合がある。その後、得られる細胞外マトリックス成分の塊を液体窒素で瞬間冷凍し、凍結乾燥を行う。中程度の細孔サイズ及び中程度の成分密度を有する骨組を作成するためには、比較的速い速度（例えば＞−１℃／分）で温度を−２０〜−４０℃まで下げて細胞外マトリックス成分を凍結し、その後、その塊を凍結乾燥する。
【００７５】
他の実施形態では、本発明は、直径が徐々に減少する分岐チャンネルを備える、固形で多孔性及び生体適合性を有する骨組を作成するプロセスであって、軸に対してある角度をなして配置された直径が１〜２００μｍ円錐形の突起を有する、伝導材料で構成された型にポリマー懸濁液を注入するステップと、前記懸濁液が充満された前記型を、前記ポリマー懸濁液が固化するまでの期間に、冷媒内で超冷却し、それによって、固化した前記ポリマー懸濁液の中に氷晶が形成されるステップと、前記型を除去して、それによって、前記ポリマー懸濁液を昇華条件に曝すステップとを含むプロセスを提供する。
【００７６】
ある実施形態では、「ポリマー懸濁液」又は「懸濁液」は、１つの成分を除去する際に固形の骨組を形成する任意の懸濁系を意味する。ある実施形態では、懸濁系は、懸濁液である。他の実施形態では、懸濁系は、エマルジョンである。他の実施形態では、懸濁系は、ゲルである。他の実施形態では、懸濁系は、泡である。ある実施形態では、ポリマー懸濁液は、モノマー、又は他の実施形態では、単一の生体適合性分子から成る。
【００７７】
本発明のこの態様によれば、且つ他の実施形態では、本発明に係る骨組を作成するべく、型における氷晶の形成速度及びその大きさを制御するためにソーラー浴（solar bath）の効果が使用される。それによって、凍結乾燥した塊における細孔のサイズを調整することができる。ある実施形態では、骨組には溶質が組み込まれ、温度勾配が、骨組を含む容器を冷却されたプレート（ある実施形態では、凍結乾燥機であり得る）に設置することで、又は他の実施形態では、容器上に加熱ランプを設置することで形成される。溶解度は、温度に応じて変化するので、溶質濃度勾配が形成される。他の実施形態では、溶質濃度は、凍結温度に影響するので、一定の凍結時間には異なる大きさの氷晶が生じる。これにより、溶質濃度に関して勾配がある部分では、溶質濃度が増加する方向に対して細孔のサイズは反比例するようになる。
【００７８】
本発明の他の実施形態では、「突起」という用語は、型の内部に突出した突出部分を意味し、そこでは、ポリマー懸濁液は固化できない。ある実施形態では、これらの突出部分は軸に沿って配向しており、これは、本発明に係る骨組を有効に使用するのに所望される。ある実施形態では、これらの円錐形の突出部分の直径は、広い末端では２００μｍ以下であり、狭い末端では１μｍ以上である。ある実施形態では、発生させようとする血管の分岐に近似するように、突出部分も分岐している。他の実施形態では、突出部分は、生体適合性の物質から作成されており、周囲の骨組の生体適合性物質に影響を及ぼすことなく、分解することができる。例えば、ある実施形態では、突出部分は、パラフィンから作成されており、骨組内の水を昇華させた後に骨組を有機溶媒（ヘキサンなど）に浸漬することで除去される。ある実施形態では、突起は、伝導性材料から作成されており、昇華前に除去される。
【００７９】
ある実施形態では、勾配は、熱力学的平行前の凍結プロセスを停止することで維持される。所定の形状を有する容器にこのように浸漬したスラリにおける熱力学的平衡を達成する時間を求める方法は、当業者には、容易に判明するであろう。所望の温度勾配を達成した後は、スラリは、ある実施形態では、容器から取り出され、凍結乾燥される。昇華した後に残存する物質は、ポリマーを含み、平均細孔直径に関して勾配を有する骨組である。
【００８０】
他の実施形態では、骨組の凍結速度の勾配は、骨組の成分を含む容器と容器が置かれている凍結機の棚との間に勾配断熱層（graded thermal insulation layer）を使用することで形成される。ある実施形態では、断熱層の勾配は、例えば、層内の特定の方向に沿って厚みが増す領域を作成する、又は他の実施形態では、層の熱伝導性を変化させるなどの当該技術分野では公知の様々な方法を使用することで作成される。後者は、例えば、アルミニウム及び銅、又はプレキシガラス及びアルミニウムなどを使用することで実施可能であり、これらは全て本発明に係る実施形態を表す。
【００８１】
ある実施形態では、本発明は、本明細書に記載したプロセスにしたがって作成された骨組を提供する。
【００８２】
本発明のこの態様によれば、且つある実施形態では、本発明に係るプロセスは、骨組を温度勾配又は架橋剤濃度が異なる溶液群に曝すステップをさらに含む。
【００８３】
ある実施形態では、本発明は、対象において器官又は組織を操作する方法であって、本明細書に記載した任意の実施形態の骨組をインプラントするステップを含む。
【００８４】
他の実施形態では、本発明は、対象において器官又は組織を修復する方法であって、本発明に係る骨組をインプラントするステップを含む。
【００８５】
本発明のこれらの態様によれば、且つある実施形態では、骨組は、本発明のプロセスによって作成された骨組であり得る。
【００８６】
ある実施形態では、骨組が組織の修復、再生のために使用されるのは、本来の組織が、外傷によって損傷した場合又は糖尿病によって状態が悪化した場合である。他の実施形態では、勾配型の骨組に細胞を組み込むことができる。これは、組織の発達／修復／再生において所望される。
【００８７】
本発明のこの態様によれば、且つある実施形態では、本発明に係る方法は、対象に細胞をインプラントするステップをさらに含む。ある実施形態では、細胞は、骨組上に播種される。他の実施形態では、細胞は、骨組の周囲に播種される。他の実施形態では、細胞は、幹細胞又は前駆細胞である。他の実施形態では、本発明に係る方法は、サイトカイン、成長因子、ホルモン、又はそれらの組み合わせを対象に投与するステップをさらに含む。他の実施形態では、操作される器官又は組織は、異種型の細胞から構成される。他の実施形態では、操作される器官又は組織は、連結器官又は組織であり、それは、他の実施形態では、腱又は靭帯である。組織は、ある実施形態では、乳房組織であり、他の実施形態では、皮膚組織である。
【００８８】
下記の説明からわかるように、本開示の概念には、様々な利点がある。例えば、本開示の概念によって、インプラント型の勾配骨組の作成方法が得られる。このインプラント型の勾配骨組は、所定の骨組の設計の必要性を満たすべく、一様ではない機械特性を有し得る。例えば、所望の機械的形態を有する骨組を形成するべく、細孔寸法及び成分密度は、一様ではない場合がある。このような、骨組の微細孔の大きさ及び材料の密度の不均一性は、とりわけ、望ましい量の細胞を受け取り、維持すると同時に、望ましい程度の構造的硬直性をもたらす骨組を設計するのに有用である。また、本開示によれば、インプラント型の骨組は、インプラントの際に望ましい細胞活性を可能にする適切な物理的な微細構造を有するようにだけではなく、例えば組織の修復又は再生などの用途のために、組織に移植されるときにその組織に本来ある生化学的構成（コラーゲン、成長因子、グリコサミノグリカンなど）を有するように作成されることが可能である。
【００８９】
ある実施形態では、骨組は、対象にインプラントする前の所定の期間に培養される。他の実施形態では、細胞は、前記骨組の表面に播種され、その場合、ある実施形態では、細胞は、幹細胞又は前駆細胞である。
【００９０】
他の実施形態では、前駆細胞が（それらの子孫細胞と共に、又は子孫細胞なしで）播種された固形の骨組には、ゼラチン状の物質が含浸される。ある実施形態では、「播種された」は、ゼラチン状物質が含浸される（浸透させられる）前に、又は実質的にそれと同時に、又はその後に、前駆細胞が（それらの子孫細胞と共に、又は子孫細胞なしで）播種されることを意味する。例えば、他の実施形態では、細胞は、ゼラチン状物質と混合され、マトリックスにこの物質が含浸されると同時に播種される。他の実施形態では、前駆細胞又は幹細胞は、それらの子孫細胞と共に又は子孫細胞なしで、多孔性の固形骨組に予め播種される。本発明によれば、且つある実施形態では、所定の量の細胞が、多孔性の固形骨組にインビトロで導入され、血清以外に、間質細胞、間質細胞ならし培地（stromal cell conditioned medium）、造血成長因子（造血前駆細胞の維持、拡散、及び／又は分化を促進する）を加えない環境で培養される。
【００９１】
ある実施形態では、骨組は、宿主組織の表面の付近にインプラントされる。その際に、より大きな細孔直径を有する前記骨組の領域が宿主組織の表面の付近に位置し、最も小さな細孔直径を有する領域が前記宿主組織の表面からより遠位に位置するようにする。他の実施形態では、細孔直径は、宿主組織の表面からの細孔又はチャンネルの距離に反比例する。ある実施形態では、宿主組織の表面から約２０ｍｍの位置にある細孔の直径は約１００μｍである。他の実施形態では、前記宿主組織の表面から約４０ｍｍの位置にある細孔の直径は約３０μｍである。
【００９２】
下記の実施例は、本発明の最良の実施形態をさらに詳細に説明するものであって、本発明の範囲を制限するものとして見なされるべきではない。
【実施例】
【００９３】
≪実施例１：大きな三次元容量を有する乳房組織の再生≫
【００９４】
使用される骨組は、球形であり、その直径は５０ｍｍである。骨組の表面又は表面付近には、骨組の中心へ延びる開放したチャンネルを有する。これらのチャンネルの直径は、骨組の中心から表面に接近するほど大きくなる。表面付近の直径は数ミリメートルほど大きい。チャンネルは、骨組の中心に延びるほど分離して骨組内で網目を形成し得る（組織において血管が徐々に分離するのを近似するように）。骨組の表面には、適切な細胞が播種される。細胞は、骨組の外表面から深さが１０ｍｍの骨組内部までに拡散する。また、骨組は、コラーゲン繊維に結合しているＶＲＧＦをも有する。細孔チャンネルの直径は、骨組の表面では、１ｍｍである。
【００９５】
このデバイスをインプラントする方法は、生理食塩水で満たされた乳房インプラントをインプラントする方法と類似している。骨組は、腋窩切除で挿入される。このデバイスは、大胸筋上に設置される。なぜなら、大胸筋の下にデバイスを設置すると、骨組は、再生しようとする組織とは異なる細胞環境に晒されることになるからである。また、外科医の間では、大胸筋の下にデバイスを設置すると、被膜拘縮が減少すると考えられる。これは、血管床を骨組の表面に接近させるのに使用される。患者には、全身麻酔が施される。次に、腋窩切除を行った後に、外科医は、骨組を挿入するために、乳腺組織と大胸筋との間に空間を形成する。骨組は形成された空間に挿入され、切開部分は縫合される。手術後、患者は、デバイスの離脱を防止し、且つ圧縮力からデバイスを保護するように設計された特別な下着を着用する。手術後は、必要に応じて、鎮痛剤が使用される。デバイスが一旦設置されると、周囲の組織からの圧力によって既存の血管系がデバイスの外表面に接するようになり、組織は陥入するようになる。インプラントの周囲では、自然発生的に被膜が形成され、様々な量の収縮性細胞を有する線維組織の多層膜が形成される。最も内側に位置する膜は、骨組に近接する血管系を含む。インプラントの周囲に形成される被膜の量は、インプラントを構成している物質による。合成ポリマーの周囲では、より多くの被膜が形成される。
毛細血管からは炎症性滲出液が様々な段階で放出され、それによって、創傷が血漿タンパク質に浸される。損傷した組織を除去し、新たな組織の形成を誘導し、損傷したマトリックス、基底膜、及び結合組織を再構築し、且つ血液による供給を確立するために、様々な細胞が異なる段階で動員される。損傷後の３つの段階で滲出液が放出される。第１の段階は、損傷直後に開始し、ヒスタミンの刺激による液体の放出を伴い、約８〜３０分続く。次の段階は第１段階に類似しており、第１段階に第１段階の直後に開始するが、さらに長く（最大数日間）続く。最終段階は、損傷の数時間後に開始し、その効果は２〜３日目で最大となり、数週間で徐々に無くなる。細胞性滲出液は、第２段階及び第３段階で生じる。マトリックスの一般的な成分は、より液体状になり、それによって、滲出液の含有物は、さらに拡散するようになる。しかし、組織圧の急激な上昇はまだ起きない。これによって、滲出液は、急激な圧力で骨組に損傷を与えることなく、骨組の細孔及びチャンネルの中を流れることができる。滲出液の構成要素（細胞性及び分子性）は、血管形成及び組織の再生を促進する。
【００９６】
炎症性滲出液は、インプラント後の数時間以内に骨組の開放した大きな細孔チャンネルに流入する。フィブリノーゲンが凝縮して形成されたフィブリンは、血管が成長できる網目を形成する。滲出液に存在する他の因子及び細胞は、骨組内での間質の再構築、及び血管形成を促進する。既存の組織にある血管は、骨組の周囲の組織の収縮及びインプラントが占める空間からの圧力の増加によって骨組に接近するようになる。新たな血管の網目が形成され、この血管は、骨組を被膜状に囲むようになる。滲出液及び移動した細胞／播種された細胞からの高濃度の血管新生因子によって、血管が骨組へ成長し、周囲の細胞の生存を永久に支持するようになる。
【００９７】
骨組構造に陥入が起きることによって、血管が骨組の中心部に到達するのに必要な成長距離がより短く済む。また、陥入によって、骨組の外領域で血管が発達するのに必要な血管の成長量もより少なく済み、それによって、骨組の大部分において血管が急速に発達するようになる（なぜならば、血管が骨組の表面に向かってｘｍｍ成長した場合、骨組の中心付近で同じ長さで成長する場合よりも、骨組のより大きな容量を満たすことになるため）。
【００９８】
細胞増殖段階は、約２４〜４８時間で開始し、２〜３週間で最大限に達する。組織の再構築は、約１〜２週間で開始する。４週間以内に、ほとんどの骨組が分解され、組織の再生が完了する。
【００９９】
≪実施例２：異なる細孔直径を有する勾配骨組を構築するための凍結−昇華の方法≫
【０１００】
＜スラリの作成＞
【０１０１】
例えば、牛の腱から単離された微小繊維、Ｉ型コラーゲン（Integra LifeSceinces）、及びサメの軟骨から単離されたコンドロイチン６硫酸（Sigma Aldrich）などの細胞外マトリックス成分を、ｐＨ３．２の０．０５Ｍ酢酸に入れ、１５０００ｒｐｍ、４℃で混合し、次に、真空装置を用いて５０ｍＴｏｒｒで脱気する。
【０１０２】
＜異なる細孔直径＞
【０１０３】
懸濁液を容器に入れ、その容器の一部のみ（高さの１０％まで）を超冷却したシリコン浴（Loree et al., 1989）に浸す。スラリの凍結の平衡時間を測定し、熱平衡に達する前に凍結工程を停止する。容器を浴槽から取り、次にスラリを凍結乾燥（例えば、VirIis Genesis凍結乾燥機、Gardiner, NY）で昇華する。したがって、スラリ内で熱勾配が生じ、凍結面が形成され、この凍結面は熱平衡前に停止される。次に凍結乾燥を行うことで、昇華が起き、細孔の平均直径に関して勾配を有する領域を有するマトリックスの共重合体が形成される。
【０１０４】
他の方法では、懸濁液を容器に入れ、その容器を冷凍庫の棚に置く。勾配を有する断熱材が容器と棚との間に設置されており、それにより、上記のような凍結面の勾配が形成される。勾配を有する断熱材は、アルミニウム及び銅、又はアルミニウム及びプレキシガラスなどの熱伝導率が異なる材料の使用などの様々な方法で構築することができる。
【０１０５】
ある実施形態では、容器は、取り外し可能な要素を含む多構成要素の容器である。ある実施形態では、これらの要素を除去することによって、凍結したスラリ内でトンネルが形成される。他の実施形態では、取り外し可能な要素は、例えば、トンネルの直径が骨組から離れれば離れるほど小さくなるように、円錐形の形状を有している。
【０１０６】
ある実施形態では、型の表面の形状によって、凍結したスラリにおいてへこみやチャンネルが形成され、所望の形状及び分布を有する骨組が形成される。
【０１０７】
以上、本発明の最良の実施形態を説明したが、これらの説明は、本発明を制限するものではない、当業者ならば、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、様々な変更及び改変を加えることが可能であると理解するであろう。