(57)【要約】本明細書において提供されるのは、Fcポリペプチドと融合したCD47細胞外ドメインまたはその変異体を含む融合ポリペプチドである。該融合ポリペプチドは、本明細書に記載した方法に従って対象における免疫学的疾患または障害を治療するために有用である。該融合ポリペプチドは、免疫細胞の免疫応答性を抑制すること、免疫複合体により誘導されるサイトカイン産生を阻害することを含めて、炎症誘発性サイトカインの産生を阻害することができる。
2009537145.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトIgG1 Fcポリペプチドと融合したCD47の細胞外ドメインを含む融合ポリペプチドであって、Fcポリペプチドがヒンジ領域内にシステイン残基の置換または欠失を含み、置換または欠失を受けるシステイン残基が野生型ヒトIgG1免疫グロブリンのFc部分のヒンジ領域のアミノ末端の最も近位にあるシステイン残基であり、かつFcポリペプチドが、野生型ヒトIgG1免疫グロブリンのFc部分のヒンジ領域のアミノ末端の最も近位にあるシステイン残基にすぐ隣接したアスパラギン酸残基の置換または欠失をさらに含む、該融合ポリペプチドが免疫細胞の免疫応答性を変化させる、融合ポリペプチド。
【請求項２】
SEQ ID NO：2に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも85％同一なアミノ酸配列を含む、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項３】
SEQ ID NO：2に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも90％同一なアミノ酸配列を含む、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
SEQ ID NO：2に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも95％同一なアミノ酸配列を含む、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
ヒトCD47の細胞外ドメインが、SEQ ID NO：1に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも95％同一なアミノ酸配列を含み、SEQ ID NO：1の15、23および96位に対応する位置にあるシステイン残基が保たれている、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
ヒトCD47の細胞外ドメインが、SEQ ID NO：1に示されたアミノ酸配列を含む、請求項5記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
ヒトCD47の細胞外ドメインが、SEQ ID NO：11に示された配列に対して少なくとも95％同一なアミノ酸配列を含み、SEQ ID NO：11の33、41および114位に対応する位置にあるシステイン残基が保たれている、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
ヒトCD47の細胞外ドメインが、SEQ ID NO：11に示されたアミノ酸配列を含む、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項９】
免疫細胞における免疫複合体により誘導されるサイトカイン産生を阻害することができる、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項１０】
サイトカインIL-23の産生が阻害される、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１】
IL-23、IL-12、IL-6およびTNF-αから選択される少なくとも1つのサイトカインの産生が阻害される、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項１２】
Fcポリペプチドが、グリコシル化部位を除去するための少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項１３】
Fcポリペプチドがグリコシル化されていない、請求項12記載の融合ポリペプチド。
【請求項１４】
FcポリペプチドとCD47の細胞外ドメインとの間にポリペプチドスペーサーをさらに含む、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項１５】
ポリペプチドスペーサーが、グリシン、アスパラギン、セリン、トレオニンおよびアラニンから独立に選択される5〜100個のアミノ酸残基を含む、請求項14記載の融合ポリペプチド。
【請求項１６】
ポリペプチドスペーサーが5〜20個のアミノ酸残基を含む、請求項15記載の融合ポリペプチド。
【請求項１７】
ポリペプチドスペーサーが（Gly4Ser）nを含み、式中、n＝1〜12である、請求項15記載の融合ポリペプチド。
【請求項１８】
融合ポリペプチドがIgG Fc受容体と結合する能力が低下するように、ヒトIgG1 Fcポリペプチドが、（a）FcポリペプチドのCH2ドメイン内の少なくとも1つのアミノ酸；（b）FcポリペプチドのCH2ドメイン内の少なくとも2つのアミノ酸残基、または（c）FcポリペプチドのCH2ドメイン内の少なくとも3つのアミノ酸残基の置換をさらに含む、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項１９】
2つの融合ポリペプチド単量体の二量体を形成し、二量体が2つの各融合ポリペプチド単量体の各細胞外CD47ドメイン部分間にジスルフィド結合を含む、請求項1〜18のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項２０】
各細胞外ドメイン部分間のジスルフィド結合が各細胞外CD47ドメイン部分のシステイン残基の間に形成され、各細胞外CD47ドメイン部分のシステイン残基がアミノ末端の最も近位にある、請求項19記載の融合ポリペプチド。
【請求項２１】
CD47細胞外ドメイン変異体が、SIRP-α、SIRP-β-2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリンから選択される少なくとも1つのCD47リガンドと結合する能力を保っている、請求項20記載の融合ポリペプチド。
【請求項２２】
（a）少なくとも1つのCD47リガンドと細胞の細胞表面に発現されるCD47ポリペプチドとの結合を競合的に阻害し、かつ（b）ウイルスCD47様ポリペプチドと少なくとも1つのCD47リガンドとの結合を競合的に阻害する、請求項20記載の融合ポリペプチド。
【請求項２３】
少なくとも1つのCD47リガンドが、SIRP-α、SIRP-β-2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリンから選択される、請求項22記載の融合ポリペプチド。
【請求項２４】
少なくとも1つのCD47リガンドとの結合によって、少なくとも1つのCD47リガンドと細胞CD47ポリペプチドとの結合を競合的に阻害する、請求項23記載の融合ポリペプチド。
【請求項２５】
免疫細胞の免疫応答性を変化させることが、（a）細胞遊走を変化させること；（b）TNF-α、IL-12、IL-23、IFN-γ、GM-CSFおよびIL-6から選択される少なくとも1つのサイトカインの産生を阻害すること；（c）樹状細胞の成熟を阻害すること；（d）ナイーブT細胞のTh1エフェクター細胞への発生を損なわせること；（e）SIRP-αを細胞表面に発現する免疫細胞の活性化を阻害すること；（f）ケモカインの産生を阻害すること；および（g）免疫細胞による炎症誘発性応答を抑制することのうち少なくとも1つを含む、請求項20記載の融合ポリペプチド。
【請求項２６】
免疫細胞がSIRP-αを細胞表面に発現し、免疫細胞の免疫応答性を変化させることが、（a）免疫細胞における、TNF-α、IL-12およびIL-23から選択される少なくとも1つのサイトカインの産生を阻害すること；（b）免疫細胞における免疫複合体により誘導されるサイトカイン産生を阻害すること；および（c）少なくとも1つのケモカインMIP-1αの産生を阻害することのうち少なくとも1つを含む、請求項1〜20のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項２７】
免疫細胞が樹状細胞である、請求項26記載の融合ポリペプチド。
【請求項２８】
融合ポリペプチドが組換え融合ポリペプチドである、請求項20記載の融合ポリペプチド。
【請求項２９】
組換え融合ポリペプチドが、Fcポリペプチドとインフレームに融合したCD47の細胞外ドメインを含む、請求項28記載の融合ポリペプチド。
【請求項３０】
請求項29記載の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３１】
発現制御配列と機能的に連結された請求項30記載のポリヌクレオチドを含む、組換え発現構築物。
【請求項３２】
請求項31記載の組換え発現構築物によって形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項３３】
真核細胞である、請求項32記載の宿主細胞。
【請求項３４】
請求項20記載の融合ポリペプチドと薬学的に適した担体とを含む組成物。
【請求項３５】
対象に対して請求項34記載の組成物を投与し、それによって対象における免疫応答を変化させる段階を含む、対象における免疫応答を変化させる方法。
【請求項３６】
免疫応答を変化させる段階が、免疫応答を抑制する段階を含む、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
免疫細胞を請求項20記載の融合ポリペプチドと、免疫細胞および融合ポリペプチドが相互作用するのを可能にするのに十分な条件下および時間で接触させる段階であって、CD47リガンドが免疫細胞の細胞表面に存在し、その結果として免疫細胞を活性化する段階を含む、免疫細胞を活性化する方法。
【請求項３８】
CD47リガンドが、SIRP-α、SIRP-β-2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリンから選択される、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
CD47リガンドがSIRP-αである、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
免疫細胞を活性化する段階が、Fcを介したサイトカイン産生を阻害する段階を含む、請求項37記載の方法。
【請求項４１】
Fcを介したケモカイン産生を阻害する段階が、免疫複合体により誘導されるサイトカイン産生を阻害する段階を含む、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
免疫細胞を活性化する段階が、Fcを介したケモカイン産生を阻害する段階を含む、請求項37記載の方法。
【請求項４３】
免疫細胞が樹状細胞、単球、顆粒球または骨髄幹細胞である、請求項37記載の方法。
【請求項４４】
免疫細胞における免疫複合体により誘導されるサイトカイン産生を阻害する方法であって、免疫細胞を請求項20記載の融合ポリペプチドと、免疫細胞における免疫複合体により誘導されるサイトカイン産生を阻害するのに十分な条件下および時間で接触させる段階を含む、方法。
【請求項４５】
免疫細胞が細胞表面にCD47リガンドを発現する、請求項36記載の方法。
【請求項４６】
CD47リガンドが、SIRP-α、SIRP-β-2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリンから選択される、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
免疫細胞が樹状細胞、単球、顆粒球または骨髄幹細胞である、請求項44記載の方法。
【請求項４８】
免疫細胞が樹状細胞であり、CD47リガンドがSIRP-αである、請求項44記載の方法。
【請求項４９】
IL-23、IL-12、IL-6およびTNF-αから選択される少なくとも1つのサイトカインの産生が阻害される、請求項44記載の方法。
【請求項５０】
融合ポリペプチドが免疫複合体と免疫細胞との結合を阻害する、請求項44記載の方法。
【請求項５１】
免疫学的疾患または障害を有するまたは発症するリスクのある対象における免疫学的疾患または障害を治療するための方法であって、対象に対して請求項34記載の組成物を投与する段階を含む、方法。
【請求項５２】
免疫学的疾患または障害が自己免疫性疾患または炎症性疾患である、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
自己免疫性または炎症性疾患が、多発性硬化症、関節リウマチ、脊椎関節症、全身性エリテマトーデス、抗体介在性の炎症性もしくは自己免疫性疾患、移植片対宿主病、敗血症、糖尿病、乾癬、アテローム性動脈硬化症、シェーグレン症候群、進行性全身性硬化症、強皮症、急性冠症候群、虚血再灌流、クローン病、子宮内膜症、糸球体腎炎、重症筋無力症、特発性肺線維症、喘息、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、血管炎または炎症性自己免疫性筋炎である、請求項52記載の方法。
【請求項５４】
脊椎関節症が、強直性脊椎炎、反応性関節炎、炎症性腸疾患に伴う腸疾患性関節炎、乾癬性関節炎、孤発性急性前部ブドウ膜炎、未分化型脊椎関節症、ベーチェット症候群および若年性特発性関節炎から選択される、請求項53記載の方法。
【請求項５５】
免疫学的疾患または障害が、免疫複合体と免疫細胞との結合によって引き起こされるか、または増悪する、請求項52記載の方法。
【請求項５６】
免疫細胞が樹状細胞である、請求項55記載の方法。
【請求項５７】
請求項20記載の融合ポリペプチドを生産するための製造方法。
【請求項５８】
（a）CD47と特異的に結合する、ならびに（b）CD47リガンドの（i）CD47との、および（ii）ウイルスCD47様ポリペプチドとの結合を競合的に阻害する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５９】
ウイルスCD47様ポリペプチドがポックスウイルスCD47様ポリペプチドである、請求項58記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６０】
ポックスウイルスCD47様ポリペプチドが、SEQ ID NO：3に示されたアミノ酸配列を含む痘瘡ウイルスCD47様ポリペプチドである、請求項59記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６１】
CD47リガンドが、SIRP-α、SIRP-β-2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリンから選択される、請求項58記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６２】
免疫細胞によるFcを介したサイトカイン産生またはケモカイン産生を阻害する、請求項58記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６３】
Fcを介したサイトカイン産生またはケモカイン産生を阻害することが、免疫細胞による免疫複合体により誘導されるサイトカイン産生またはケモカイン産生を阻害することを含む、請求項62記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６４】
免疫細胞が樹状細胞であり、サイトカインがIL-12、IL-6、IL-23およびTNF-αから選択される、請求項62または請求項63のいずれか記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６５】
ケモカインがMIP-1αである、請求項63記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６６】
抗体がモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項58記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６７】
モノクローナル抗体が、マウスモノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体およびハムスターモノクローナル抗体から選択される、請求項66記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６８】
抗体がヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項58記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６９】
請求項58記載の抗体と特異的に結合する、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、単離された抗体。
【請求項７０】
抗イディオタイプ抗体がポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である、請求項69記載の抗体。
【請求項７１】
請求項58または請求項69のいずれか記載の抗体を発現する宿主細胞。
【請求項７２】
ハイブリドーマ細胞である、請求項71記載の宿主細胞。
【請求項７３】
F(ab')2、Fab'、Fab、FdおよびFvから選択される、請求項58または請求項69のいずれか記載の抗原結合フラグメント。
【請求項７４】
ヒト、マウス、ニワトリまたはウサギ由来である、請求項73記載の抗原結合フラグメント。
【請求項７５】
一本鎖Fv（scFv）である、請求項58記載の抗原結合フラグメント。
【請求項７６】
CD47と特異的に結合して、ウイルスCD47様ポリペプチドと少なくとも1つのCD47リガンドとの結合を阻害する作用物質。
【請求項７７】
ウイルスCD47様ポリペプチドがポックスウイルスCD47様ポリペプチドである、請求項76記載の作用物質。
【請求項７８】
ポックスウイルスCD47様ポリペプチドが、SEQ ID NO：3に示されたアミノ酸配列を含む痘瘡CD47様ポリペプチドである、請求項76記載の作用物質。
【請求項７９】
少なくとも1つのCD47リガンドが、SIRP-α、SIRP-β2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリンから選択される、請求項76記載の作用物質。
【請求項８０】
低分子；アプタマー；およびペプチド-Fc融合ポリペプチドから選択される、請求項76記載の作用物質。
【請求項８１】
請求項58〜68のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合フラグメントと薬学的に適した担体とを含む組成物。
【請求項８２】
請求項76〜80のいずれか一項記載の作用物質と薬学的に適した担体とを含む組成物。
【請求項８３】
以下の段階を含む、免疫細胞の免疫応答性を変化させる作用物質を同定するための方法：
（a）（i）候補作用物質；（ii）ウイルスCD47様ポリペプチド；および（iii）CD47リガンドを、CD47リガンドとウイルスCD47様ポリペプチドとの相互作用を可能にするのに十分な条件下および時間で接触させる段階；
（b）候補作用物質の存在下におけるウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合のレベルを決定して、候補作用物質の非存在下におけるウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合のレベルを比較する段階であって、候補作用物質の存在下におけるウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合のレベルの減少は、候補作用物質がウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合を阻害することを示す、段階；
（c）（i）候補作用物質；（ii）CD47リガンド；および（iii）CD47を発現する免疫細胞を、CD47リガンドとCD47との相互作用を可能にするのに十分な条件下および時間で接触させる段階；ならびに
（d）候補作用物質の存在下におけるCD47リガンドと免疫細胞との結合のレベルを決定し、候補作用物質の非存在下におけるCD47リガンドと免疫細胞との結合のレベルを比較する段階であって、CD47リガンドと免疫細胞との候補作用物質の存在下における結合のレベルの減少は、候補作用物質が免疫細胞の免疫応答性を変化させることを示す、段階。
【請求項８４】
ウイルスCD47様ポリペプチドがポックスウイルスCD47様ポリペプチドである、請求項83記載の方法。
【請求項８５】
ポックスウイルスCD47様ポリペプチドが、SEQ ID NO：3に示された配列を含む痘瘡ウイルスCD47様ポリペプチドである、請求項84記載の方法。
【請求項８６】
CD47リガンドが、SIRP-α、SIRP-β2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリンから選択される、請求項83記載の方法。
【請求項８７】
対象に対して請求項81記載の組成物を投与し、それによって対象の免疫応答を変化させる段階を含む、対象における免疫応答を変化させる方法。
【請求項８８】
免疫応答を変化させる段階が、免疫応答を抑制する段階を含む、請求項87記載の方法。
【請求項８９】
対象に対して請求項82記載の組成物を投与し、それによって対象における免疫応答を変化させる段階を含む、対象における免疫応答を変化させる方法。
【請求項９０】
免疫応答を変化させる段階が、免疫応答を強化する段階を含む、請求項89記載の方法。
【請求項９１】
対象に対して請求項81記載の組成物を投与する段階を含む、対象における免疫学的疾患または障害を治療するための方法。
【請求項９２】
免疫学的疾患または障害が自己免疫性疾患または炎症性疾患である、請求項91記載の方法。
【請求項９３】
免疫学的疾患または障害が、多発性硬化症、関節リウマチ、脊椎関節症、全身性エリテマトーデス、移植片対宿主病、抗体介在性の炎症性もしくは自己免疫性疾患もしくは障害、敗血症、糖尿病、乾癬、アテローム性動脈硬化症、シェーグレン症候群、進行性全身性硬化症、強皮症、急性冠症候群、虚血再灌流、クローン病、子宮内膜症、糸球体腎炎、重症筋無力症、特発性肺線維症、喘息、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、血管炎または炎症性自己免疫性筋炎である、請求項92記載の方法
【請求項９４】
脊椎関節症が、強直性脊椎炎、反応性関節炎、炎症性腸疾患に伴う腸疾患性関節炎、乾癬性関節炎、孤発性急性前部ブドウ膜炎、未分化型脊椎関節症、ベーチェット症候群および若年性特発性関節炎から選択される、請求項93記載の方法。
【請求項９５】
対象における免疫学的疾患または障害を治療するための方法であって、対象に対して、（a）薬学的に適した担体；および（i）CD47と特異的に結合して、ウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合を損なわせる作用物質、または（ii）CD47リガンドと特異的に結合して、ウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合を特異的に損なわせる作用物質のいずれかを含む組成物を投与する段階を含む、方法。
【請求項９６】
ウイルスCD47様ポリペプチドがポックスウイルスCD47様ポリペプチドである、請求項95記載の方法。
【請求項９７】
ポックスウイルスCD47様ポリペプチドが、SEQ ID NO：3に示されたアミノ酸配列を含む痘瘡ウイルスCD47様ポリペプチドである、請求項96記載の方法。
【請求項９８】
作用物質が、抗体またはその抗原結合フラグメント；低分子；アプタマー；およびペプチド-Fc融合ポリペプチドから選択される、請求項95〜97のいずれか一項記載の方法。
【請求項９９】
CD47リガンドと特異的に結合する作用物質が、CD47リガンドと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであり、リガンドがSIRP-α、SIRP-β-2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンまたはα2β1インテグリンである、請求項98記載の方法。
【請求項１００】
対象における細胞遊走、細胞増殖および細胞分化のうち少なくとも1つの変化と関連のある疾患または障害を治療する方法であって、対象に対して、薬学的に適した担体と、（a）CD47と特異的に結合して、ウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合を損なわせる作用物質、または（b）CD47リガンドと特異的に結合して、ウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合を特異的に損なわせる作用物質のいずれかとを投与する段階を含む、方法。
【請求項１０１】
ウイルスCD47様ポリペプチドがポックスウイルスCD47様ポリペプチドである、請求項100記載の方法。
【請求項１０２】
ポックスウイルスCD47様ポリペプチドが、SEQ ID NO：3に示されたアミノ酸配列を含む痘瘡ウイルスCD47様ポリペプチドである、請求項101記載の方法。
【請求項１０３】
CD47リガンドが、SIRP-α、SIRP-β2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリンから選択される、請求項100記載の方法。
【請求項１０４】
疾患または障害が、免疫学的疾患もしくは障害、心血管疾患もしくは障害、代謝性疾患もしくは障害、または増殖性疾患もしくは障害である、請求項103記載の方法。
【請求項１０５】
免疫学的疾患または障害が自己免疫性疾患または炎症性疾患である、請求項104記載の方法。
【請求項１０６】
免疫学的疾患または障害が、多発性硬化症、関節リウマチ、脊椎関節症、全身性エリテマトーデス、移植片対宿主病、抗体介在性性の炎症性もしくは自己免疫性疾患もしくは障害、敗血症、糖尿病、乾癬、アテローム性動脈硬化症、シェーグレン症候群、進行性全身性硬化症、強皮症、急性冠症候群、虚血再灌流、クローン病、子宮内膜症、糸球体腎炎、重症筋無力症、特発性肺線維症、喘息、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、血管炎、または炎症性自己免疫性筋炎である、請求項105記載の方法。
【請求項１０７】
脊椎関節症が、強直性脊椎炎、反応性関節炎、炎症性腸疾患に伴う腸疾患性関節炎、乾癬性関節炎、孤発性急性前部ブドウ膜炎、未分化型脊椎関節症、ベーチェット症候群および若年性特発性関節炎から選択される、請求項106記載の方法。
【請求項１０８】
心血管疾患または障害が、アテローム性動脈硬化症、心内膜炎、高血圧または末梢性虚血性疾患である、請求項104記載の方法。
【請求項１０９】
作用物質が、抗体またはその抗原結合フラグメント；低分子；アプタマー；およびペプチド-Fc融合ポリペプチドから選択される、請求項100記載の方法。
【請求項１１０】
CD47リガンドと特異的に結合する作用物質が、CD47リガンドと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであり、リガンドがSIRP-α、SIRP-β-2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンまたはα2β1インテグリンである、請求項100記載の方法。
【請求項１１１】
免疫細胞を（a）CD47と特異的に結合して、ウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとのの結合を損なわせる作用物質、または（b）CD47リガンドと特異的に結合して、ウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合を損なわせる作用物質のいずれかと、免疫細胞および作用物質が相互作用するのを可能にするのに十分な条件下および時間で接触させる段階であって、CD47リガンドが免疫細胞の細胞表面に存在し、その結果として免疫細胞を活性化する段階を含む、免疫細胞を活性化する方法。
【請求項１１２】
CD47リガンドが、SIRP-α、SIRP-β-2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリンから選択される、請求項111記載の方法。
【請求項１１３】
CD47リガンドがSIRP-αである、請求項111記載の方法。
【請求項１１４】
免疫細胞を活性化する段階が、Fcを介したサイトカイン産生を阻害する段階を含む、請求項111記載の方法。
【請求項１１５】
Fcを介したケモカイン産生を阻害する段階が、免疫複合体により誘導されるサイトカイン産生を阻害する段階を含む、請求項114記載の方法。
【請求項１１６】
免疫細胞を活性化する段階が、Fcを介したケモカイン産生を阻害する段階を含む、請求項111記載の方法。
【請求項１１７】
免疫細胞が樹状細胞、単球、顆粒球または骨髄幹細胞である、請求項111記載の方法。
【請求項１１８】
作用物質が、抗体またはその抗原結合フラグメント；低分子；アプタマー；およびペプチド-Fc融合ポリペプチドから選択される、請求項111記載の方法。
【請求項１１９】
CD47リガンドと特異的に結合する作用物質が、CD47リガンドに特異的な抗体またはその抗原結合フラグメントであり、リガンドがSIRP-α、SIRP-β-2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンまたはα2β1インテグリンである、請求項118記載の方法。
【請求項１２０】
以下の段階を含む、免疫細胞の免疫応答性を抑制する作用物質を生産するための製造方法：
（a）以下の段階を含む、免疫細胞の免疫応答性を変化させる作用物質を同定する段階：
（I）（i）候補作用物質；（ii）ウイルスCD47様ポリペプチド；および（iii）CD47リガンドを、CD47リガンドとウイルスCD47様ポリペプチドとの相互作用を可能にするのに十分な条件下および時間で接触させる段階；および
（II）候補作用物質の存在下におけるウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合のレベルを決定して、候補作用物質の非存在下におけるウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合のレベルを比較する段階であって、候補作用物質の存在下におけるウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合のレベルの減少は、候補作用物質がウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合を阻害することを示す、段階；
（III）（i）候補作用物質；（ii）CD47リガンド；および（2）CD47を発現する免疫細胞を、CD47リガンドとCD47との相互作用を可能にするのに十分な条件下および時間で接触させる段階；および
（IV）候補作用物質の存在下におけるCD47リガンドと免疫細胞との結合のレベルを決定して、候補作用物質の非存在下におけるCD47リガンドと免疫細胞との結合のレベルを比較する段階であって、候補作用物質の存在下におけるCD47リガンドと免疫細胞との結合のレベルの減少は、候補作用物質が免疫細胞の免疫応答性を変化させることを示す、段階；ならびに
（b）段階（a）で同定された作用物質を生産する段階。
【請求項１２１】
ウイルスCD47様ポリペプチドがポックスウイルスCD47様ポリペプチドである、請求項120記載の方法。
【請求項１２２】
ポックスウイルスCD47様ポリペプチドが、SEQ ID NO：3に示されたアミノ酸配列を含む痘瘡ウイルスCD47様ポリペプチドである、請求項121記載の方法。
【請求項１２３】
CD47リガンドが、SIRP-α、SIRP-β2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリンから選択される、請求項120記載の方法。
【請求項１２４】
作用物質が、抗体またはその抗原結合フラグメント；低分子；アプタマー；およびペプチド-Fc融合ポリペプチドから選択される、請求項120記載の方法。
【請求項１２５】
作用物質が抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項120記載の方法。
【請求項１２６】
抗体またはその抗原結合フラグメントが、SIRP-α、SIRP-β-2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンまたはα2β1インテグリンと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントから選択される、請求項125記載の方法。
【請求項１２７】
請求項58〜68のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを生産するための製造方法。
【請求項１２８】
Fcポリペプチドと融合したウイルスCD47ポリペプチドの細胞外ドメインを含む、融合ポリペプチド。
【請求項１２９】
ウイルスCD47ポリペプチドがポックスウイルスCD47様ポリペプチドである、請求項128記載の融合ポリペプチド。
【請求項１３０】
ポックスウイルスCD47様ポリペプチドが、粘液腫、オルソポックスウイルス、コルドポックスウイルス、カプリポックスウイルス、レポリポックスウイルス、スイポックスウイルス（suipoxvirus）、ヤタポックスウイルスおよびシカポックス（deerpox）ウイルスから選択される、請求項129記載の融合ポリペプチド。
【請求項１３１】
FcポリペプチドがヒトIgG1 Fcポリペプチドまたはその変異体である、請求項128記載の融合ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2006年5月15日に提出された米国仮出願第60/800,643号の恩典を主張し、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
分野
本明細書において提供されるのは、自己免疫性疾患および障害を含む免疫学的疾患および障害を治療するために有用な可能性のあるCD47融合ポリペプチドおよび関連組成物である。本明細書に記載した融合ポリペプチドは、免疫細胞によるサイトカインの産生を阻害することなどによって、免疫細胞の免疫応答性を変化させる。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の説明
ポックスウイルス科のメンバーなどのウイルスは、進化する能力、ならびに/またはウイルスに対する宿主の免疫応答をモジュレートする、および/もしくはウイルス複製を促進する、宿主由来の遺伝子を獲得する能力を有する（Bugert and Darai, Virus Genes 21:111 (2000)（非特許文献1）；Alcami et al., Semin. Virol. 8:419 (1998)（非特許文献2）；McFadden and Barry, Semin. Virol. 8:429 (1998)（非特許文献3））。このため、ウイルス病原性因子（virulence factor）に対するリガンドである宿主内の細胞成分は、重要な免疫調節標的となる可能性がある。ポックスウイルスは、細胞の細胞質中で複製し、数多くの異なる宿主内で複製するように適応した二本鎖DNAウイルスの一群をなす。ポックスウイルスは、痘瘡の原因微生物である痘瘡ウイルス、痘瘡ワクチンとして広く用いられている原型ポックスウイルスであるワクシニアウイルスを含め、ほぼ190キロベースという大規模なゲノムを有し、これは200種を上回るタンパク質をコードしうる可能性がある（例えば、Goebel et al., Virology 179:247 (1990)（非特許文献4）を参照）。
【０００４】
宿主の免疫系を抑制することのできるポックスウイルス病原性因子の同定は、免疫応答のエフェクターまたはモジュレーターであって、例えば、多発性硬化症、関節リウマチおよび全身性エリテマトーデス（SLE）を含む炎症性疾患および自己免疫性疾患などの免疫学的障害を治療するために有益な様式でモジュレートされうる、細胞性ポリペプチドを同定するために有用である。
【０００５】
米国では2000万人以上が免疫学的疾患および障害に罹患している。多くの免疫学的疾患は廃疾性および慢性であり、それ故に患者の生産性、安寧性ならびに全般的健康に影響を及ぼす。そのような免疫学的疾患および障害の治療および予防のために用いうる組成物を同定および開発することには需要が存在する。
【０００６】
【非特許文献１】Bugert and Darai, Virus Genes 21:111 (2000)
【非特許文献２】Alcami et al., Semin. Virol. 8:419 (1998)
【非特許文献３】McFadden and Barry, Semin. Virol. 8:429 (1998)
【非特許文献４】Goebel et al., Virology 179:247 (1990)
【発明の開示】
【０００７】
簡単な概要
1つの態様においては、融合ポリペプチドが提供され、ここで融合ポリペプチドはヒトIgG1 Fcポリペプチドと融合したCD47の細胞外ドメインを含み、Fcポリペプチドはヒンジ領域内にシステイン残基の置換または欠失を有し、置換または欠失を受けるシステイン残基は野生型ヒトIgG1免疫グロブリンのFc部分のヒンジ領域のアミノ末端の最も近位にあるシステイン残基であり、Fcポリペプチドはさらに、野生型ヒトIgG1免疫グロブリンのFc部分のヒンジ領域のアミノ末端の最も近位にあるシステイン残基にすぐ隣接したアスパラギン酸残基の置換または欠失を含み、融合ポリペプチドは免疫細胞の免疫応答性を変化させる。もう1つの態様において、融合ポリペプチドは、SEQ ID NO：2に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも85％同一なアミノ酸配列を含む。もう1つの特定的な態様において、融合ポリペプチドは、SEQ ID NO：2に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも90％同一なアミノ酸配列を含む。さらにもう1つの態様において、融合ポリペプチドは、SEQ ID NO：2に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも95％同一なアミノ酸配列を含む。特定の態様において、ヒトCD47の細胞外ドメインは、SEQ ID NO：1に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも95％同一なアミノ酸配列を含み、ここでSEQ ID NO：1の15、23および96位に対応する位置にあるシステイン残基は保たれている。もう1つの態様において、ヒトCD47の細胞外ドメインは、SEQ ID NO：1に示されたアミノ酸配列を含む。さらにもう1つの態様において、ヒトCD47の細胞外ドメインは、SEQ ID NO：11に示された配列に対して少なくとも95％同一なアミノ酸配列を含み、ここでSEQ ID NO：11の33、41および114位に対応する位置にあるシステイン残基は保たれている。より特定的な態様において、ヒトCD47の細胞外ドメインは、SEQ ID NO：11に示されたアミノ酸配列を含む。
【０００８】
ある態様において、上記および本明細書に記載した融合ポリペプチドは、免疫細胞における免疫複合体により誘導されるサイトカイン産生を阻害することができる。特定の態様においては、サイトカインIL-23の産生が阻害される。さらにもう1つの特定的な態様においては、IL-23、IL-12、IL-6およびTNF-αから選択されるサイトカインのうち少なくとも1つの産生が阻害される。
【０００９】
他の特定的な態様において、融合ポリペプチド、融合ポリペプチドのFcポリペプチド部分は、グリコシル化部位を除去するための少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。特定の態様において、Fcポリペプチド部分はグリコシル化されていない。他の特定的な態様において、融合ポリペプチドはさらに、FcポリペプチドとCD47の細胞外ドメインとの間にポリペプチドスペーサーを含む。1つのある態様において、ポリペプチドスペーサーは、グリシン、アスパラギン、セリン、トレオニンおよびアラニンから独立に選択される5〜100個のアミノ酸残基を含む。もう1つの特定的な態様において、ポリペプチドスペーサーは5〜20個のアミノ酸残基を含む。特定の態様において、ポリペプチドスペーサーは（Gly4Ser）nを含み、式中、n＝1〜12である。
【００１０】
さらに他の特定的な態様において、上記および本明細書に記載したような融合ポリペプチドのヒトIgG1 Fcポリペプチド部分は、融合ポリペプチドがIgG Fc受容体と結合する能力が低下するように、（a）FcポリペプチドのCH2ドメイン内の少なくとも1つのアミノ酸；（b）FcポリペプチドのCH2ドメイン内の少なくとも2つのアミノ酸残基、または（c）FcポリペプチドのCH2ドメイン内の少なくとも3つのアミノ酸残基の置換をさらに含む。
【００１１】
他の特定の態様において、上記および本明細書に記載した融合ポリペプチドは2つの融合ポリペプチド単量体の二量体を形成し、ここで二量体は2つの各融合ポリペプチド単量体の各細胞外CD47ドメイン部分間にジスルフィド結合を含む。ある態様において、各細胞外ドメイン部分間のジスルフィド結合は各細胞外CD47ドメイン部分のシステイン残基の間に形成され、各細胞外CD47ドメイン部分のシステイン残基はアミノ末端の最も近位にある。
【００１２】
特定の態様において、CD47細胞外ドメイン部分、およびCD47細胞外ドメインの変異体は、SIRP-α、SIRP-β-2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリンから選択される少なくとも1つのCD47リガンドと結合する能力を保っている。もう1つの態様において、融合ポリペプチドは（a）少なくとも1つのCD47リガンドと細胞の細胞表面に発現されるCD47ポリペプチドとの結合を競合的に阻害し、かつ（b）ウイルスCD47様ポリペプチドと少なくとも1つのCD47リガンドとの結合を競合的に阻害する。ある態様において、少なくとも1つのCD47リガンドは、SIRP-α、SIRP-β-2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリンから選択される。特定的な態様において、融合ポリペプチドは、少なくとも1つのCD47リガンドとの結合によって、少なくとも1つのCD47リガンドと細胞CD47ポリペプチドとの結合を競合的に阻害する。同じく、上記および本明細書に記載したように、融合ポリペプチドは免疫細胞の免疫応答性を変化させ、ここで免疫細胞の免疫応答を変化させることは、（a）細胞遊走を変化させること；（b）TNF-α、IL-12、IL-23、IFN-γ、GM-CSFおよびIL-6から選択される少なくとも1つのサイトカインの産生を阻害すること；（c）樹状細胞の成熟を阻害すること；（d）ナイーブT細胞のTh1エフェクター細胞への発生を損なわせること；（e）SIRP-αを細胞表面に発現する免疫細胞の活性化を阻害すること；（f）ケモカインの産生を阻害すること；および（g）免疫細胞による炎症誘発性応答を抑制することのうち少なくとも1つを含む。ある特定的な態様において、免疫細胞はSIRP-αを細胞表面に発現し、免疫細胞の免疫応答性を変化させることは、（a）免疫細胞におけるTNF-α、IL-12およびIL-23から選択される少なくとも1つのサイトカインの産生を阻害すること；（b）免疫細胞における免疫複合体により誘導されるサイトカイン産生を阻害すること；および（c）少なくとも1つのケモカインMIP-1αの産生を阻害することのうち少なくとも1つを含む。もう1つの特定的な態様において、免疫細胞は樹状細胞である。
【００１３】
ある態様において、融合ポリペプチドは組換え融合ポリペプチドであり、ここで組換え融合ポリペプチドはFcポリペプチドとインフレームに融合したCD47の細胞外ドメインを含む。
【００１４】
同じく本明細書において提供されるのは、上記および本明細書に記載した融合ポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドである。同じく本明細書において提供されるのは、発現制御配列と機能的に連結されたポリヌクレオチドを含む組換え発現構築物である。もう1つの態様においては、組換え発現構築物によって形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞が提供される。
【００１５】
もう1つの態様においては、組成物が提供され、ここで組成物は前述のCD47-Fc融合ポリペプチドのいずれかまたは本明細書に記載した任意の融合ポリペプチドと、薬学的に適した担体とを含む。さらにもう1つの態様においては、対象における免疫応答を変化させる方法であって、対象に対して組成物を投与し、それによって対象における免疫応答を変化させる段階を含む方法が提供される。特定の態様において、免疫応答を変化させる段階は、免疫応答を抑制する段階を含む。
【００１６】
さらにもう1つの態様においては、免疫細胞を活性化する方法であって、免疫細胞を、前述の融合ポリペプチドのいずれか1つまたは本明細書に記載した任意のCD47細胞外ドメイン融合ポリペプチドと、免疫細胞および融合ポリペプチドが相互作用するのを可能にするのに十分な条件下および時間で接触させる段階であって、CD47リガンドが免疫細胞の細胞表面に存在し、その結果として免疫細胞を活性化する段階を含む方法が提供される。特定の態様において、CD47リガンドは、SIRP-α、SIRP-β-2、トロンボスポンジン1、αvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリンのうち少なくとも1つである。特定の態様において、CD47リガンドはSIRP-αである。さらにもう1つの態様において、免疫細胞を活性化する段階は、Fcを介したサイトカイン産生を阻害する段階を含む。より特定的な態様において、Fcを介したケモカイン産生を阻害する段階は、免疫複合体により誘導されるサイトカイン産生を阻害する段階を含む。もう1つの特定的な態様において、免疫細胞を活性化する段階は、Fcを介したケモカイン産生を阻害する段階を含む。さらにもう1つの特定の態様において、免疫細胞は樹状細胞、単球、顆粒球または骨髄幹細胞である。
【００１７】
1つの態様においては、免疫細胞における免疫複合体により誘導されるサイトカイン産生を阻害する方法であって、免疫細胞を上述の融合ポリペプチドのいずれかまたは本明細書に記載した任意のCD47細胞外ドメイン融合ポリペプチドと、免疫細胞における免疫複合体により誘導されるサイトカイン産生を阻害するのに十分な条件下および時間で接触させる段階を含む方法が提供される。さらにもう1つの態様において、免疫細胞はCD47リガンドを細胞表面に発現する。特定の態様において、CD47リガンドはSIRP-α、SIRP-β-2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリンから選択される。もう1つの特定的な態様において、免疫細胞は樹状細胞、単球、顆粒球または骨髄幹細胞である。より特定的な態様において、免疫細胞は樹状細胞であり、CD47リガンドはSIRP-αである。特定の態様においては、IL-23、IL-12、IL-6およびTNF-αから選択されるサイトカインのうち少なくとも1つの産生が阻害される。もう1つの特定の態様において、融合ポリペプチドは免疫複合体と免疫細胞との結合を阻害する。
【００１８】
1つの態様においては、免疫学的疾患または障害を有するまたは発症するリスクのある対象における免疫学的疾患または障害を治療するための方法であって、対象に対して、前述の融合ポリペプチドのいずれか1つまたは本明細書に記載した任意のCD47細胞外ドメイン融合ポリペプチドと薬学的に適した担体との組成物を投与する段階を含む方法が提供される。特定の態様において、免疫学的疾患または障害は、自己免疫性疾患または炎症性疾患である。もう1つの特定の態様において、自己免疫性または炎症性疾患は、多発性硬化症、関節リウマチ、脊椎関節症、全身性エリテマトーデス、抗体介在性の炎症性もしくは自己免疫性疾患、移植片対宿主病、敗血症、糖尿病、乾癬、アテローム性動脈硬化症、シェーグレン症候群、進行性全身性硬化症、強皮症、急性冠症候群、虚血再灌流、クローン病、子宮内膜症、糸球体腎炎、重症筋無力症、特発性肺線維症、喘息、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、血管炎または炎症性自己免疫性筋炎である。さらにもう1つの特定的な態様において、脊椎関節症は、強直性脊椎炎、反応性関節炎、炎症性腸疾患に伴う腸疾患性関節炎、乾癬性関節炎、孤発性急性前部ブドウ膜炎、未分化型脊椎関節症、ベーチェット症候群および若年性特発性関節炎から選択される。1つの態様において、免疫学的疾患または障害は、免疫複合体と免疫細胞との結合によって引き起こされるか、または増悪する。ある特定の態様において、免疫細胞は樹状細胞である。
【００１９】
もう1つの態様においては、前述の融合ポリペプチドのいずれか1つまたは本明細書に記載した任意のCD47細胞外ドメイン融合ポリペプチドを生産するための製造方法が提供される。
【００２０】
もう1つの態様において同じく提供されるのは、（a）CD47と特異的に結合する、ならびに（b）CD47リガンドの（i）CD47との、および（ii）ウイルスCD47様ポリペプチドとの結合を競合的に阻害する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントである。1つの態様において、ウイルスCD47様ポリペプチドはポックスウイルスCD47様ポリペプチドである。特定的な態様において、ポックスウイルスCD47様ポリペプチドは、SEQ ID NO：3に示されたアミノ酸配列を含む痘瘡ウイルスCD47様ポリペプチドである。もう1つの特定の態様において、CD47リガンドは、SIRP-α、SIRP-β-2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリンから選択される。特定的な態様において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、免疫細胞によるFcを介したサイトカイン産生またはケモカイン産生を阻害する。特定の態様において、Fcを介したサイトカイン産生またはケモカイン産生を阻害する段階は、免疫細胞による免疫複合体により誘導されるサイトカイン産生またはケモカイン産生を阻害する段階を含む。特定的な態様において、免疫細胞は樹状細胞であり、サイトカインはIL-12、IL-6、IL-23およびTNF-αから選択される。他の特定的な態様において、ケモカインはMIP-1αである。もう1つの特定的な態様において、抗体はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。ある態様において、モノクローナル抗体はマウスモノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体およびハムスターモノクローナル抗体から選択される。他のある態様において、抗体はヒト化抗体またはキメラ抗体である。もう1つの態様においては、前述の抗体またはその抗原結合フラグメントと特異的に結合する、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、単離された抗体が提供される。ある特定的な態様において、抗イディオタイプ抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。同じく提供されるのは、抗イディオタイプ抗体を含む、前述の抗体のいずれかまたはその抗原結合フラグメントを発現する宿主細胞である。ある特定の態様において、宿主細胞はハイブリドーマ細胞である。ある態様において、前述のいずれかの抗体の抗原結合フラグメントは、F(ab')2、Fab'、Fab、FdおよびFvから選択される。他の特定の態様において、抗原結合フラグメントはヒト、マウス、ニワトリまたはウサギ由来である。もう1つの態様において、抗原結合フラグメントは一本鎖Fv（scFv）である。もう1つの態様において同じく本明細書において提供されるのは、前述の抗体のいずれかまたはその抗原結合フラグメントと薬学的に適した担体とを含む組成物である。もう1つの態様においては、対象における免疫応答を変化させる方法であって、対象に対して、抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物を投与し、それによって対象の免疫応答を変化させる段階を含む方法が提供される。特定の態様において、免疫応答を変化させる段階は免疫応答を抑制する段階を含む。1つの態様においては、対象における免疫学的疾患または障害を治療するための方法であって、対象に対して、抗体またはその抗原結合フラグメントと薬学的に許容される担体とを含む組成物を投与する段階を含む方法が提供される。特定の態様において��免疫学的疾患または障害は自己免疫性疾患または炎症性疾患である。もう1つの特定の態様において、免疫学的疾患または障害は、多発性硬化症、関節リウマチ、脊椎関節症、全身性エリテマトーデス、移植片対宿主病、抗体介在性の炎症性もしくは自己免疫性疾患もしくは障害、敗血症、糖尿病、乾癬、アテローム性動脈硬化症、シェーグレン症候群、進行性全身性硬化症、強皮症、急性冠症候群、虚血再灌流、クローン病、子宮内膜症、糸球体腎炎、重症筋無力症、特発性肺線維症、喘息、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、血管炎または炎症性自己免疫性筋炎である。さらにもう1つの特定の態様において、脊椎関節症は、強直性脊椎炎、反応性関節炎、炎症性腸疾患に伴う腸疾患性関節炎、乾癬性関節炎、孤発性急性前部ブドウ膜炎、未分化型脊椎関節症、ベーチェット症候群および若年性特発性関節炎から選択される。もう1つの態様において同じく本明細書において提供されるのは、上記および本明細書に記載した抗体またはその抗原結合フラグメントを生産するための製造方法である。
【００２１】
もう1つの態様において、本明細書において提供されるのは、CD47と特異的に結合して、ウイルスCD47様ポリペプチドと少なくとも1つのCD47リガンドとの結合を阻害する作用物質である。特定の態様において、ウイルスCD47様ポリペプチドはポックスウイルスCD47様ポリペプチドである。さらにもう1つの特定的な態様において、ポックスウイルスCD47様ポリペプチドは、SEQ ID NO：3に示されたアミノ酸配列を含む痘瘡CD47様ポリペプチドである。もう1つの態様において、少なくとも1つのCD47リガンドは、SIRP-α、SIRP-β2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリンから選択される。さらにもう1つの態様において、作用物質は低分子；アプタマー；およびペプチド-Fc融合ポリペプチドから選択される。同じく提供されるのは、それに従った作用物質と薬学的に適した担体とを含む組成物である。もう1つの態様においては、対象における免疫応答を変化させる方法であって、対象に対して、作用物質を含む組成物を投与し、それによって対象の免疫応答を変化させる段階を含む方法が提供される。特定の態様において、免疫応答を変化させる段階は、免疫応答を強化する段階を含む。
【００２２】
もう1つの態様においては、免疫細胞の免疫応答性を変化させる作用物質を同定するための方法であって：（a）（i）候補作用物質；（ii）ウイルスCD47様ポリペプチド；および（iii）CD47リガンドを、CD47リガンドとウイルスCD47様ポリペプチドとの相互作用を可能にするのに十分な条件下および時間で接触させる段階；（b）候補作用物質の存在下におけるウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合のレベルを決定して、候補作用物質の非存在下におけるウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合のレベルを比較する段階であって、候補作用物質の存在下におけるウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合のレベルの減少は、候補作用物質がウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合を阻害することを示す、段階；（c）（i）候補作用物質；（ii）CD47リガンド；および（iii）CD47を発現する免疫細胞を、CD47リガンドとCD47との相互作用を可能にするのに十分な条件下および時間で接触させる段階；ならびに（d）候補作用物質の存在下におけるCD47リガンドと免疫細胞との結合のレベルを決定し、候補作用物質の非存在下におけるCD47リガンドと免疫細胞との結合のレベルを比較する段階であって、CD47リガンドと免疫細胞との候補作用物質の存在下における結合のレベルの減少は、候補作用物質が免疫細胞の免疫応答性を変化させることを示す、段階を含む方法が提供される。特定の態様において、ウイルスCD47様ポリペプチドはポックスウイルスCD47様ポリペプチドである。さらにもう1つの特定的な態様において、ポックスウイルスCD47様ポリペプチドは、SEQ ID NO：3に示された配列を含む痘瘡ウイルスCD47様ポリペプチドである。本方法のもう1つの態様において、CD47リガンドは、SIRP-α、SIRP-β2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリンから選択される。
【００２３】
もう1つの態様においては、対象における免疫学的疾患または障害を治療するための方法であって、対象に対して、（a）薬学的に適した担体と；（i）CD47と特異的に結合して、ウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合を損なわせる作用物質、または（ii）CD47リガンドと特異的に結合して、ウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合を特異的に損なわせる作用物質のいずれかとを含む組成物を投与する段階を含む方法が提供される。特定の態様において、ウイルスCD47様ポリペプチドはポックスウイルスCD47様ポリペプチドである。さらにもう1つの特定の態様において、ポックスウイルスCD47様ポリペプチドは、SEQ ID NO：3に示されたアミノ酸配列を含む痘瘡ウイルスCD47様ポリペプチドである。1つの特定的な態様において、作用物質は、抗体またはその抗原結合フラグメント；低分子；アプタマー；およびペプチド-Fc融合ポリペプチドから選択される。さらにもう1つの特定的な態様において、CD47リガンドと特異的に結合する作用物質は、CD47リガンドと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであり、ここでリガンドはSIRP-α、SIRP-β-2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンまたはα2β1インテグリンである。
【００２４】
もう1つの態様において同じく本明細書において提供されるのは、対象における細胞遊走、細胞増殖および細胞分化のうち少なくとも1つの変化と関連のある疾患または障害を治療する方法であって、対象に対して、薬学的に適した担体と（a）CD47と特異的に結合して、ウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合を損なわせる作用物質、または（b）CD47リガンドと特異的に結合して、ウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合を特異的に損なわせる作用物質のいずれかとを投与する段階を含む方法である。1つのある態様において、ウイルスCD47様ポリペプチドはポックスウイルスCD47様ポリペプチドである。もう1つのある態様において、ポックスウイルスCD47様ポリペプチドは、SEQ ID NO：3に示されたアミノ酸配列を含む痘瘡ウイルスCD47様ポリペプチドである。もう1つの態様において、CD47リガンドはSIRP-α、SIRP-β2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリンから選択される。さらにもう1つの特定的な態様において、疾患または障害は、免疫学的疾患もしくは障害、心血管疾患もしくは障害、代謝性疾患もしくは障害、または増殖性疾患もしくは障害である。もう1つの態様において、免疫学的疾患または障害は自己免疫性疾患または炎症性疾患である。さらにある態様において、免疫学的疾患または障害は、多発性硬化症、関節リウマチ、脊椎関節症、全身性エリテマトーデス、移植片対宿主病、抗体介在性性の炎症性もしくは自己免疫性疾患もしくは障害、敗血症、糖尿病、乾癬、アテローム性動脈硬化症、シェーグレン症候群、進行性全身性硬化症、強皮症、急性冠症候群、虚血再灌流、クローン病、子宮内膜症、糸球体腎炎、重症筋無力症、特発性肺線維症、喘息、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、血管炎、または炎症性自己免疫性筋炎である。特定の態様において、脊椎関節症は、強直性脊椎炎、反応性関節炎、炎症性腸疾患に伴う腸疾患性関節炎、乾癬性関節炎、孤発性急性前部ブドウ膜炎、未分化型脊椎関節症、ベーチェット症候群および若年性特発性関節炎から選択される。特定の態様において、心血管疾患または障害は、アテローム性動脈硬化症、心内膜炎、高血圧または末梢性虚血性疾患である。1つの特定の態様において、作用物質は、抗体またはその抗原結合フラグメント；低分子；アプタマー；およびペプチド-Fc融合ポリペプチドから選択される。もう1つの特定の態様において、CD47リガンドと特異的に結合する作用物質は、CD47リガンドと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであり、ここでリガンドはSIRP-α、SIRP-β-2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンまたはα2β1インテグリンである。1つの特定的な態様において、抗体はSIRP-αと特異的に結合する；もう1つの特定的な態様において、抗体またはその抗原結合フラグメントはSIRP-β-2と特異的に結合する；もう1つの特定的な態様において、抗体またはその抗原結合フラグメントはトロンボスポンジン-1と特異的に結合する；もう1つの特定的な態様において、抗体またはその抗原結合フラグメントはαvβ3インテグリンと特異的に結合する；および、さらにもう1つの特定的な態様において、抗体またはその抗原結合フラグメントはα2β1と特異的に結合する。
【００２５】
もう1つの態様においては、免疫細胞を活性化する方法であって、免疫細胞を（a）CD47と特異的に結合して、ウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとのの結合を損なわせる作用物質、または（b）CD47リガンドと特異的に結合して、ウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合を損なわせる作用物質のいずれかと、免疫細胞および作用物質が相互作用するのを可能にするのに十分な条件下および時間で接触させる段階であって、CD47リガンドが免疫細胞の細胞表面に存在し、その結果として免疫細胞を活性化する段階を含む方法が提供される。1つの特定的な態様において、CD47リガンドは、SIRP-α、SIRP-β-2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリンから選択される。特に特定的な態様において、CD47リガンドはSIRP-αである。もう1つの態様において、免疫細胞を活性化する段階は、Fcを介したサイトカイン産生を阻害する段階を含む。ある特定的な態様において、Fcを介したケモカイン産生を阻害する段階は、免疫複合体により誘導されるサイトカイン産生を阻害する段階を含む。もう1つの特定的な態様において、免疫細胞を活性化する段階は、Fcを介したケモカイン産生を阻害する段階を含む。ある態様において、免疫細胞は樹状細胞、単球、顆粒球または骨髄幹細胞である。他の特定的な態様において、作用物質は、抗体またはその抗原結合フラグメント；低分子；アプタマー；およびペプチド-Fc融合ポリペプチドから選択される。さらに他の特定的な態様において、CD47リガンドと特異的に結合する作用物質は、CD47リガンドに対して特異的な抗体またはその抗原結合フラグメントであり、ここでリガンドはSIRP-α、SIRP-β-2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンまたはα2β1インテグリンである。
【００２６】
もう1つの態様において同じく提供されるのは、免疫細胞の免疫応答性を抑制する作用物質を生産するための製造方法であって：（a）免疫細胞の免疫応答性を変化させる作用物質を同定する段階であって、以下を含む同定の段階：（I）（i）候補作用物質；（ii）ウイルスCD47様ポリペプチド；および（iii）CD47リガンドを、CD47リガンドとウイルスCD47様ポリペプチドとの相互作用を可能にするのに十分な条件下および時間で接触させる段階；および（II）候補作用物質の存在下におけるウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合のレベルを決定して、候補作用物質の非存在下におけるウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合のレベルを比較する段階であって、候補作用物質の存在下におけるウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合のレベルの減少は、候補作用物質がウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合を阻害することを示す、段階；（III）（i）候補作用物質；（ii）CD47リガンド；および（2）CD47を発現する免疫細胞を、CD47リガンドとCD47との相互作用を可能にするのに十分な条件下および時間で接触させる段階；および（IV）候補作用物質の存在下におけるCD47リガンドと免疫細胞との結合のレベルを決定して、候補作用物質の非存在下におけるCD47リガンドと免疫細胞との結合のレベルを比較する段階であって、候補作用物質の存在下におけるCD47リガンドと免疫細胞との結合のレベルの減少は、候補作用物質が免疫細胞の免疫応答性を変化させることを示す、段階；ならびに（b）段階（a）で同定された作用物質を生産する段階を含む方法が提供される。1つの態様において、ウイルスCD47様ポリペプチドはポックスウイルスCD47様ポリペプチドである。特定的な態様において、ポックスウイルスCD47様ポリペプチドは、SEQ ID NO：3に示されたアミノ酸配列を含む痘瘡ウイルスCD47様ポリペプチドである。もう1つの特定の態様において、CD47リガンドは、SIRP-α、SIRP-β2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリンから選択される。1つの特定的な態様において、作用物質は、抗体またはその抗原結合フラグメント；低分子；アプタマー；およびペプチド-Fc融合ポリペプチドから選択される。もう1つの特定的な態様において、作用物質は抗体またはその抗原結合フラグメントである。さらになおもう1つの態様において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、SIRP-α、SIRP-β-2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンまたはα2β1インテグリンと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである。
【００２７】
1つの態様においては、Fcポリペプチドと融合したウイルスCD47ポリペプチドの細胞外ドメインを含む融合ポリペプチドが提供される。特定の態様において、ウイルスCD47ポリペプチドはポックスウイルスCD47様ポリペプチドである。さらにもう1つの特定の態様において、ポックスウイルスCD47様ポリペプチドは、粘液腫、オルソポックスウイルス、コルドポックスウイルス、カプリポックスウイルス、レポリポックスウイルス、スイポックスウイルス（suipoxvirus）、ヤタポックスウイルスおよびシカポックス（deerpox）ウイルスから選択される。もう1つの態様において、FcポリペプチドはヒトIgG1 Fcポリペプチドまたはその変異体である。
【００２８】
本明細書で用いる場合、「単離された」という用語は、ある材料がその元の環境（例えば、それが天然に存在するならば、天然の環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物の体内に存在する天然の核酸またはポリペプチドは単離されていないが、天然の系において共存する材料のいくつかまたはすべてから分離されている同じ核酸またはポリペプチドは単離されている。そのような核酸はベクターの一部であってもよく、および/またはそのような核酸もしくはポリペプチドは組成物の一部であってもよく、ベクターまたは組成物が核酸またはポリペプチドの天然環境の一部ではない点で依然として単離されているといえる。「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の産生に関与するDNAのセグメントのことを意味する；これはコード領域の前および後の領域「リーダーおよびトレーラー」、さらには個々のコードセグメント（エクソン）の間の介在配列（イントロン）を含む。本明細書ではアミノ酸を、当技術分野で一般的な教科書的知識であって、それ故に当業者によく知られている一文字記号または三文字記号に従って言及することがある。本明細書で用いる「融合ポリペプチド」という用語は「融合タンパク質」と互換的に用いてもよく、別に明示している場合を除き、この2つの用語は識別可能な性質または特性を有する分子を示すことは意図していない。
【００２９】
本明細書および添付した特許請求の範囲において用いる場合、単数形の「1つの（a）」「1つの（and）」および「その（the）」は、その文脈で明らかに別の指示がなされない限り、複数の言及対象も含むことに留意されたい。したがって、例えば、「1つの作用物質」に対する言及は複数のそのような作用物質を含み、「その細胞」に対する言及は1つまたは複数の細胞および当業者に公知であるその等価物に関する言及を含み、その他についても同様である。「含むこと（comprising）」という用語（ならびに「含む（comprise）」または「含む（comprises）」または「有する」または「含むこと（including）」などの関連用語）は、本明細書に記載した任意の物質組成、組成物、方法または工程などが、記載された特徴「からなる」または「から本質的になる」可能性を除外することを意図してはいない。
【００３０】
本明細書において言及された、および/または出願データシートに列記された、すべての米国特許、米国特許出願公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許公報は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００３１】
詳細な説明
本明細書において記載されるのは、ヒトIgG1 Fcポリペプチドを含む免疫グロブリンFcポリペプチドと融合した、CD47細胞外ドメインポリペプチドまたはその変異体を含む融合ポリペプチドである。本明細書に記載したCD47-Fcポリペプチド融合ポリペプチドは、免疫細胞の免疫応答性を変化させることができる。本明細書に記載したCD47-Fcポリペプチド融合タンパク質は宿主の免疫応答をモジュレートまたは改変することができ、特に、免疫学的疾患または障害、例えば、炎症性または自己免疫性の疾患または障害において呈示される免疫応答を阻害すること、抑制すること、またはその程度を低下させることができる。ある態様において、CD47-Fcポリペプチド融合タンパク質は免疫細胞によるサイトカインおよび/またはケモカイン産生を阻害し、それは免疫細胞の炎症反応を低下させる。
【００３２】
本明細書に記載したCD47-Fcポリペプチド融合タンパク質は、免疫細胞の細胞表面に存在するCD47リガンドと相互作用し、それによって免疫細胞にシグナルを送達するようにCD47リガンドを刺激または誘導して、細胞の1つまたは複数の生物機能の活性化をもたらす可能性がある。そのようなCD47リガンドには、SIRP-α、SIRP-β-2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリンが非限定的に含まれ、それらについては本明細書でさらに詳細に説明する。
【００３３】
特定の態様において、融合ポリペプチドは、Fcを介した免疫細胞の活性化を阻害することができ、それ故に免疫細胞、特にCD47リガンドを細胞表面に発現する免疫細胞のサイトカインおよび/またはケモカイン産生を阻害する可能性がある。Fcを介した活性には、免疫複合体により誘導される免疫細胞の免疫応答性が含まれる。本明細書に記載したように、免疫細胞と相互作用する免疫複合体（すなわち、抗原抗体複合体）の存在は、免疫細胞を活性化させて免疫細胞によるサイトカイン産生を誘導させるが、それは本明細書に記載したCD47-Fc融合ポリペプチドによって阻害されうる。免疫複合体は、いくつかのヒト免疫学的疾患、例えば全身性エリテマトーデス、関節リウマチおよびシェーグレン症候群における関与が指摘されている過程である、Fc受容体を介した炎症を誘発することによって組織を障害させることができる。したがって、本明細書に記載した融合ポリペプチドは、免疫細胞の免疫応答性を変化させるために有用な可能性があり、その結果として免疫学的疾患もしくは障害、心血管疾患もしくは障害、代謝性疾患もしくは障害、または増殖性疾患もしくは障害を治療または予防するために有用な可能性がある。
【００３４】
融合ポリペプチドの細胞外CD47ドメイン部分には、CD47細胞外ドメイン変異体が含まれる。例示的な変異体には、切り詰められた、または細胞外ドメインにおけるアミノ酸の少なくとも1つの置換、挿入もしくは欠失を含む、ヒトCD47の細胞外ドメインが含まれる。他のある態様において、2つの融合ポリペプチドは二量体を形成する。2つの融合ポリペプチドは、少なくとも部分的には、2つの各融合ポリペプチドのFcポリペプチド部分間の1つまたは複数の鎖間ジスルフィド結合を介して二量体化する。本明細書でさらに詳細に説明するように、融合ポリペプチドはまた、2つの各融合ポリペプチドのCD47部分を介して、CD47部分のシステイン残基間の鎖間ジスルフィド結合の形成を介しても二量体化しうる。
【００３５】
本明細書に記載したように、CD47-Fcポリペプチド融合ポリペプチドは、免疫学的疾患もしくは障害、心血管疾患もしくは障害、代謝性疾患もしくは障害または増殖性疾患もしくは障害を治療または予防する、阻害する、その進行を遅らせる、またはその症状を軽減するために有用な可能性がある。免疫学的障害には、炎症性疾患または障害、および自己免疫性疾患または障害が含まれる。炎症または炎症反応は、損傷に対する宿主の正常な防御的反応であるが、炎症は望ましくない損害を引き起こす恐れがある。例えば、アテローム性動脈硬化症は、少なくとも部分的には、動脈損傷および結果として起こる炎症カスケードに対する病的反応である。免疫学的疾患/障害ともみなされる疾患または障害を含みうる、治療しうる可能性のある心血管疾患または障害には、例えば、アテローム性動脈硬化症、心内膜炎、高血圧または末梢性虚血性疾患が含まれる。代謝性疾患または障害には、糖尿病、肥満、ならびにミトコンドリア機能の異常または変化と関連のある疾患および障害が含まれる。
【００３６】
免疫学的疾患または障害は、自己免疫性疾患または炎症性疾患であってもよい。ある態様において、免疫学的疾患または障害は、多発性硬化症、関節リウマチ、脊椎関節症、全身性エリテマトーデス、抗体介在性の炎症性もしくは自己免疫性疾患、移植片対宿主病、敗血症、糖尿病、乾癬、アテローム性動脈硬化症、シェーグレン症候群、進行性全身性硬化症、強皮症、急性冠症候群、虚血再灌流、クローン病、子宮内膜症、糸球体腎炎、重症筋無力症、特発性肺線維症、喘息、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、血管炎、または炎症性自己免疫性筋炎である。脊椎関節症には、例えば、強直性脊椎炎、反応性関節炎、炎症性腸疾患に伴う腸疾患性関節炎、乾癬性関節炎、孤発性急性前部ブドウ膜炎、未分化型脊椎関節症、ベーチェット症候群および若年性特発性関節炎が含まれる。本明細書に記載した融合ポリペプチドはまた、アテローム性動脈硬化症、心内膜炎、高血圧または末梢性虚血性疾患などの心血管疾患または障害を治療するために有用な可能性もある。他のある態様において、本明細書に記載した融合ポリペプチドは、癌などの増殖性疾患を治療するために有用な可能性がある。癌または悪性腫瘍には、白血病（例えば、B細胞慢性リンパ性白血病）、リンパ腫、乳癌、腎癌および卵巣癌が非限定的に含まれる。
【００３７】
同じく本明細書において記載されるのは、免疫細胞の免疫応答および免疫応答性を変化させることのできるCD47細胞外ドメイン変異体を同定および作製するための方法である。そのような方法には、CD47リガンドとCD47オルソログであるウイルス病原性因子との間の相互作用を決定することが含まれる。ウイルスは、細胞サイトカインおよびケモカインならびにそれらの受容体のウイルス相同体であるタンパク質をコードすることにより、感染した宿主の免疫系による検出および排除を免れるための数多くの機構を進化させている。例えば、ポックスウイルスのゲノムは、炎症誘発性サイトカインであるTNFと結合してそれを阻害する可溶性ウイルス腫瘍壊死因子（TNF）受容体をコードする。ウイルスポリペプチドによる標的とされる、またはウイルスポリペプチドの相同体である他の細胞性ポリペプチドには、インターロイキン1、種々のケモカイン、CD30およびCD47が含まれる。CD47様ポリペプチドをコードする遺伝子は、オルソポックスウイルス、カプリポックスウイルス、レポリポックスウイルス、スイポックスウイルスおよびヤタポックスウイルスを含む、ある種のポックスウイルス科メンバーにおいて同定されている（例えば、Cameron et al., Virology 264:298-318 (1999)；Cameron et al., Virology 337:55-67 (2005)；Alfonso et al., J. Virol. 79:966-977 (2005)；Seet et al., Annu. Rev. Immunol. 21:377-423 (2003)を参照）。このCD47様ポリペプチド病原性因子を本明細書ではウイルスCD47（vCD47）と称する。ある態様においては、本明細書においてさらに詳細に説明するように、CD47細胞外ドメインまたはその変異体を含む融合ポリペプチドは、ウイルスCD47がCD47リガンドと相互作用するのと同じ様式で、少なくとも1つのCD47リガンドと相互作用することによって、免疫応答を変化させる。
【００３８】
CD47
CD47（インテグリン会合タンパク質（IAP）としても当技術分野で知られる）は、およそ50キロダルトン（kD）の哺乳動物細胞表面受容体糖タンパク質である。構造的には、CD47は1つの細胞外Ig様ドメイン、5つの膜貫通部分および短い細胞質ドメインを有する（図1および図2参照）。CD47は、β3およびβ1インテグリン、主として、ビトロネクチン受容体であるαvβ3インテグリン、ならびにコラーゲンおよびラミニンの受容体であるα2β1と会合している。CD47は、例えば、好中球食作用、T細胞活性化、TおよびB細胞のアポトーシス、血小板活性化、ストロマにより支持される赤血球生成、免疫細胞（例えば、好中球）の遊出、ならびに細胞接着を含む、いくつかの細胞プロセスに関与する（例えば、Latour et al., J. Immunol. 167:2547-54 (2001)；Fukunaga et al., J. Immunol. 172:4091-99 (2004)；Parkos et al., J. Cell Biol. 132:437-50 (1996)；Liu et al., J. Biol. Chem. 277:10028-36 (2002)；Lamy et al., J. Biol. Chem. 278:23915-21 (2003)；Cooper et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:3978-82 (1995)；Motegi et al., EMBO J. 22:2634-44 (2003)；Manna et al., Cancer Res. 64:1026-36 (2004)；PCT国際公報第WO 99/40940号；PCT国際公報第WO 97/27873号を参照）。
【００３９】
ヒトCD47は、4つの主要なアイソフォームの1つとして細胞の表面に提示されうる（Reinhold et al., J. Cell Sci. 108:3419-25 (1995)）。例示的なCD47ヌクレオチド配列およびコードされるCD47ポリペプチドのアミノ酸配列は、公開データベースで示されている（例えば、GenBankアクセッション番号NP_001768.1（SEQ ID NO：9）、アイソフォーム1を参照（GenBankアクセッション番号NM_001777.3（SEQ ID NO：14）も参照のこと）；GenBankアクセッション番号NP_942088.1（SEQ ID NO：15）、アイソフォーム2（GenBankアクセッション番号NM_198793.2（SEQ ID NO：16）も参照のこと）；GenBankアクセッション番号NP_001020250.1（SEQ ID NO：17）、アイソフォーム3（GenBankアクセッション番号NM_001025079.1（SEQ ID NO：13）も参照のこと）；また、例えば、GenBankアクセッション番号BT006907.1；BC012884.1；BC010016.2；BC037306.1；BC045593.1；BC053959.1；およびBC042889.1も参照のこと）。これらのアイソフォームは、細胞質内ドメインに位置するスプライス変異体である（例えば、Lindberg et al., J. Cell Biol. 123:485-96 (1993)を参照）。マウスおよびラットのCD47ならびに多の哺乳動物のCD47ポリペプチド配列を含む、他の哺乳動物のCD47をコードするヌクレオチド配列も当技術分野で公知であり、当業者は配列データベース（例えば、GenBank、Swissprotなど）中から容易に入手することができる。
【００４０】
本明細書で提供する例示的なCD47配列のそれぞれは、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。一例として、ある種のヒトCD47アイソフォームのシグナルペプチドは18アミノ酸であることが報告されている（例えば、SEQ ID NO：11を参照）。シグナルペプチドは分泌性または膜貫通性タンパク質から細胞表面に露出することはないが、これはシグナルペプチドがタンパク質の移行中に切断されるため、またはシグナルペプチドが外細胞膜の中に係留されたままであるためである（そのようなペプチドはシグナルアンカーとも呼ばれる）（例えば、Nielsen et al., Protein Engineering 10:1-6 (1997)；Nielsen et al., in J. Glasgow et al., eds., Proc. Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, 122-30 (AAAI Press 1998)を参照）。CD47のシグナルペプチド配列は、インビボでCD47ポリペプチドの前駆体から切断されると考えられている。シグナルペプチドの切断は、シグナルペプチドが特定のCD47シグナルペプチドであっても異種シグナルペプチドであっても不正確なことがあり、このためN末端アミノ酸残基はさまざまでありうる。
【００４１】
CD47は多くの異なる組織中の細胞によって発現される。CD47のすべてではないにせよ大半は、胸腺細胞、TおよびB細胞、単球、血小板ならびに赤血球を含む造血細胞上で発現される。CD47はまた、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、精子、ある種の腫瘍細胞株、間葉細胞およびある種の神経細胞上でも発現される。
【００４２】
CD47融合ポリペプチド
CD47細胞外ドメインおよびその変異体
1つの態様において、CD47融合ポリペプチドは、例えばFcポリペプチドを含む、多量体形成（例えば、二量体形成）を行いうる部分と融合したCD47細胞外ドメイン変異体を含む。本明細書において記載されるのは、本明細書に記載したような、Fcポリペプチド（およびその変異体）と融合したCD47の細胞外ドメインまたはその変異体を含み、免疫細胞の免疫応答性を変化させるため、ならびに免疫学的疾患および障害を治療するために用いうる、CD47融合ポリペプチドである。または、CD47の細胞外ドメインを含む融合ポリペプチドを、多量体形成を行いうる別の部分と融合させてもよい。他の特定の態様において、CD47の細胞外ドメインを、同じ部分を含む別のCD47融合ポリペプチドと多量体形成を行うことのできない部分である異種部分と融合させてもよい。さらにもう1つの態様において、第1のFcポリペプチドなどの第1の異種ポリペプチドと融合したCD47の細胞外ドメインを含むCD47融合ポリペプチドを、第2のFcポリペプチドなどの第2の異種ポリペプチドと融合したCD47の細胞外ドメインを含む第2のCD47融合ポリペプチドと、2つの異なる融合ポリペプチドがヘテロ二量体またはヘテロ多量体を形成するように組み合わせてもよい。
【００４３】
Fcポリペプチドまたはその部分（少なくとも1つの免疫グロブリン定常領域ドメイン、例えばCH2ドメインまたはCH3ドメインなど）は、関心対象のペプチドまたはポリペプチドと融合させた場合に、二量体または他の多量体を形成することなどによって、少なくとも部分的には、ペプチドの分解を防止する、および/もしくは半減期を延長させる、毒性を低下させる、免疫原性を低下させる、ならびに/またはその生物活性を上昇させる媒体または担体部分として作用する（例えば、米国特許第6,018,026号；第6,291,646号；第6,323,323号；第6,300,099号；第5,843,725号を参照）（また、例えば、米国特許第5,428,130号；米国特許第6,660,843号；米国特許出願公開第2003/064480号；第2001/053539号；第2004/087778号；第2004/077022号；第2004/071712号；第2004/057953号；第2004/053845号；第2004/044188号；第2004/001853号；第2004/082039号も参照のこと）。CD47細胞外ドメインと連結または融合させることができて、免疫細胞の免疫応答性を変化させるCD47部分の能力の保持に寄与する、Fcポリペプチドなどの免疫グロブリン定常領域に代わる部分には、例えば、線状重合体（例えば、ポリエチレングリコール、ポリリジン、デキストランなど；例えば、米国特許第4,289,872号；国際特許出願公開第WO 93/21259号を参照）；脂質；コレステロール基（ステロイドなど）；糖質またはオリゴ糖が含まれる。加えて、同じく本明細書において企図および記載されることとして、1つの種からのCD47部分を、異なる種に由来するFcポリペプチド（または他の異種ポリペプチド部分）と融合させてもよい。
【００４４】
他のある特定の態様において、例えば、CD47細胞外ドメイン（またはその二量体もしくは他の多量体）のより迅速な除去または半減期の延長が望ましい場合には、単量体としての、または二量体もしくは他の多量体形態としてのCD47細胞外ドメインを用いてもよい。すなわちこれらの態様においては、CD47細胞外ドメインを異種部分と融合させない。
【００４５】
CD47のアイソフォームが同定されており、いくつかの異なるアイソフォームのアミノ酸配列が推定されている。CD47のアイソフォームは、主として、CD47の細胞内部分のアミノ酸配列に関して互いに異なる。本明細書に記載した例示的なアイソフォームのような異なるCD47アイソフォームの細胞外部分（本明細書では細胞外ドメインとも呼ばれる）のアミノ酸配列は高度に類似しており、ある種の例示的なCD47ポリペプチドでは、異なるCD47アイソフォームの細胞外ドメインのアミノ酸配列は同一である。
【００４６】
1つの態様において、例示的な融合ポリペプチドは、ヒトIgG1 Fcポリペプチドと融合したヒトCD47の細胞外ドメインを含む。典型的には、免疫グロブリンの技術分野において、Fcポリペプチドは、CH1ドメインとCH2ドメインとの間にあるヒンジ領域を含む。ヒンジ領域は、2つの免疫グロブリン鎖の間に鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含む（重鎖の1つのシステイン残基は軽鎖の中のシステイン残基とジスルフィド結合を形成し、ヒンジ内の残りのシステイン残基は2つの重鎖間のジスルフィド結合の形成に寄与する）。ヒトIgG1免疫グロブリンにおいて、定常領域のヒンジ部分は3つのシステイン残基を有する。ある態様において、本明細書に記載したFcポリペプチドは、ヒンジ領域内にシステイン残基の置換または欠失を含む。特定の態様において、置換または欠失を受けるシステイン残基は、野生型ヒトIgG1免疫グロブリンのFc部分のヒンジ領域のアミノ末端の最も近位にあるシステイン残基である。Fcポリペプチドはさらに、野生型ヒトIgG1免疫グロブリンのFc部分のヒンジ領域のアミノ末端の最も近位にあるシステイン残基にすぐ隣接したアスパラギン酸残基の置換または欠失を含んでもよい。IgG1免疫グロブリンおよび他のヒト免疫グロブリンからの、ならびに他の種からのヒンジ領域のアミノ酸配列は、公開データベース中から容易に入手することができ、同じくKabatら（Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th ed (U.S. Dept. of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office, 1991)中；使用許可を得た上でインターネットを介して入手することもできる）にも記載されている。
【００４７】
そのような融合ポリペプチドの例示的なアミノ酸配列はSEQ ID NO：2に提示されている。ある態様において、融合ポリペプチドはSEQ ID NO：2に示されたアミノ配列の変異体であり、SEQ ID NO：2に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも65％〜75％、75％〜80％、80〜85％、85％〜90％または95％〜99％同一な（または具体的には列記しない70％〜100％の間の任意の同一性（％）の）アミノ酸配列を含む。CD47-Fcポリペプチド融合タンパク質変異体は、タンパク質のCD47部分におけるアミノ酸の1つもしくは複数の置換、欠失もしくは挿入、および/またはFcポリペプチド部分におけるアミノ酸の1つもしくは複数の置換、欠失もしくは挿入を含みうる。例示的な変異体については本明細書でさらに詳細に説明する。CD47-Fcポリペプチドおよびその変異体は、免疫細胞の免疫応答性を変化させる（すなわち、統計学的に有意または生物学的に有意な様式で増加または減少させる）能力を保っている。
【００４８】
他の態様において、本明細書に記載したCD47融合タンパク質には修飾された融合タンパク質が含まれる。一例として、CD47部分、またはCD47-Fc融合ポリペプチドにおけるFcポリペプチドなどの異種部分のいずれかの1つまたは複数のアミノ酸を、ペグ化またはグリコシル化してもよい。ペグ化とは、ポリエチレングリコール（PEG）鎖をポリペプチドに結合させる過程のことである。ある場合には、ペグ化はポリペプチドの血中半減期を延長させ、除去を低下させる。タンパク質およびペプチドをペグ化するための方法は当技術分野で把握されている（例えば、Harris et al., Nature Reviews (Drug Discovery) 2:214-21 (2003)；米国特許第5,770,577号；国際特許出願公開第WO 92/16221号を参照）。
【００４９】
免疫細胞の免疫応答性を変化させることは、免疫細胞の遊走を変化させること；TNF-α、IL-12、IL-23、IFN-γ、GM-CSFおよびIL-6を非限定的に含む、少なくとも1つのサイトカインの産生を阻害すること；MIP-1αを非限定的に含むケモカインの産生を阻害すること；樹状細胞などの免疫細胞の成熟を阻害すること；ナイーブT細胞のTh1エフェクター細胞への発生を損なわせること；および免疫細胞による炎症誘発性応答を抑制することのうち任意の1つまたは複数を含む。もう1つの態様において、融合ポリペプチドは、CD47リガンドである細胞表面受容体と相互作用すること（すなわち、それと結合すること）によって、免疫細胞の免疫応答性を変化させる。CD47本明細書に記載した融合ポリペプチドによって細胞の免疫応答性を変化させることには、また、少なくとも1つのCD47リガンドと細胞CD47ポリペプチド（すなわち、細胞によって発現され、細胞の細胞表面に存在するCD47完全長ポリペプチド）との結合を阻害して（おそらく競合的に阻害して）、それ故に細胞CD47の活性化もしくは刺激に起因する少なくとも1つの生物機能を阻害すること、および/またはCD47リガンドに起因する少なくとも1つの生物機能を阻害して、それ故にCD47リガンドの活性化または刺激に起因する少なくとも1つの生物機能を阻害することも含まれうる；例えば、CD47-Fc融合ポリペプチドが、樹状細胞、単球、マクロファージ、顆粒球または骨髄由来幹細胞などの免疫細胞上に存在するSIRP-αと相互作用し、それによってSIRP-αが免疫細胞にシグナルを伝達するように刺激または誘導してもよい。本明細書に記載した融合ポリペプチドが、SIRP-αを発現する免疫細胞を含む免疫細胞による、Fcを介したまたは免疫複合体により誘導される活性、例えばサイトカインまたはケモカインの産生を妨害または阻害してもよい。
【００５０】
本明細書に記載した融合ポリペプチドは、CD47リガンドを発現する免疫細胞などの免疫細胞の免疫応答性を変化させることができる。ある特定的な態様において、本明細書に記載したCD47-Fc融合ポリペプチドは、免疫細胞、例えばSIRPαなどのCD47リガンドを発現する樹状細胞と相互作用し、その相互作用はTNF-α、IL-12、IL-6およびIL-23などの少なくとも1つのサイトカインの産生の阻害をもたらしうる。CD47-Fc融合ポリペプチドは、免疫細胞およびSIRPαと相互作用することによって、細胞表面にSIRPαを有する免疫細胞などの免疫細胞を活性化することができる。免疫細胞のそのような活性化または刺激は、免疫細胞によるサイトカインおよび/またはケモカイン産生を含む、Fcを介した生物学的作用（または活性）を阻害することを含みうる。他の態様において、免疫細胞の活性化または刺激は、免疫複合体により誘導されるサイトカインおよび/またはケモカイン産生を阻害するなど、免疫複合体により誘導される作用を阻害することを含みうる。すなわち、サイトカイン産生は、免疫細胞による1つまたは複数のサイトカインの産生を低下または阻害しうる、免疫複合体と免疫細胞との相互作用を妨害または阻害することによって阻害されうる。CD47-Fcポリペプチドおよびその変異体はまた、少なくとも1つのCD47リガンド、例えば、SIRP-α、SIRP-β-2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリンと結合する能力を保っていてもよい。
【００５１】
当業者は、ある種由来のCD47ポリペプチドの細胞外ドメインを用い、それを同じまたは異なる種由来の免疫グロブリンからのFcポリペプチドと融合させて、CD47-Fcポリペプチド融合タンパク質を作製しうることを容易に理解するであろう。一例としては、マウスCD47の細胞外ドメインを、マウスIgG Fcポリペプチド、例えばIgG2aまたはIgG2b免疫グロブリンに由来するFcポリペプチドなどと融合させる。本明細書においてさらに詳細に説明するように、CD47細胞外ドメインを、他のポリペプチドを含む他の部分と融合させてもよい。
【００５２】
ある態様において、CD47融合ポリペプチドはシグナルペプチド（SEQ ID NO：18）を含むCD47の細胞外ドメインを含み、その結果、CD47の細胞外部分は典型的には142アミノ酸の長さであり、SEQ ID NO：11に示されたアミノ酸配列を有する。本明細書に記載した融合ポリペプチドにはまた、少なくとも65％〜75％、75％〜80％、80〜85％、85％〜90％または95％〜99％（または具体的には列記しない65％〜100％の間の任意の同一性（％））であるアミノ酸配列を含むCD47細胞外ドメイン変異体であって、免疫細胞の免疫応答性を変化させる、および/または少なくとも1つのCD47リガンドと結合する能力を保っている変異体も含まれる。
【００５３】
ある態様において、シグナルペプチドアミノ酸配列を、別のポリペプチド（例えば、免疫グロブリンまたはCTLA4）に由来するシグナルペプチドアミノ酸配列によって置換してもよい。例えば、外細胞膜を横切る細胞表面ポリペプチドである完全長CD47とは異なり、前記CD47融合ポリペプチドは分泌される；したがって、CD47融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドには、細胞から通常分泌されるポリペプチドと会合したシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列が含まれうる。
【００５４】
他の態様において、CD47融合ポリペプチドは、シグナルペプチドを欠くCD47の細胞外ドメインを含む。例示的な態様において、シグナルペプチドを欠くCD47細胞外ドメインは、SEQ ID NO：1に示されたアミノ酸配列（124アミノ酸）を有する。本明細書に記載したように、シグナルペプチドは分泌性または膜貫通性タンパク質から細胞表面に露出されることはないが、これはシグナルペプチドがタンパク質の移行中に切断されるため、またはシグナルペプチドが外細胞膜の中に係留されたままであるためである（そのようなペプチドはシグナルアンカーとも呼ばれる）。CD47のシグナルペプチド配列は、インビボでCD47ポリペプチドの前駆体から切断されると考えられている。
【００５５】
他の態様において、CD47融合ポリペプチドはCD47細胞外ドメイン変異体を含む。そのようなCD47融合ポリペプチドは、例えばSIRP-α、SIRP-β2、トロンボスポンジン-1、aVβ3インテグリンおよびα2β1インテグリンを含む、少なくとも1つのCD47リガンドと特異的に結合する能力を保っている。CD47細胞外ドメイン変異体は、SEQ ID NO：1に対して少なくとも65％〜75％、75％〜80％、80〜85％、85％〜90％または95％〜99％同一な（これには記載した範囲のいずれか1つの間の任意の同一性（％）が含まれる）アミノ酸配列を有しうる。
【００５６】
ある特定の態様において、本明細書に記載したCD47細胞外ドメイン変異体はすべてのシステイン残基を保っている。例えば、SEQ ID NO：1の15位、23位および96位にあるシステイン残基に対応するシステイン残基が保たれている。23位および96位のシステイン残基は、典型的には分子内（または鎖内）ジスルフィド結合を形成する完全長CD47分子中のシステイン残基に対応する。CD47の細胞外ドメインがシグナルペプチドを含む場合、保たれるシステイン残基はSEQ ID NO：11の33、41および114位に位置し、41および114位のシステイン残基は典型的には分子内ジスルフィド結合を形成する。いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、細胞外CD47ドメインのアミノ末端に最も近いシステイン残基、すなわちSEQ ID NO：1の15位およびSEQ ID NO：11の33位のシステイン残基は鎖間ジスルフィド結合を形成して、その結果、2つのCD47-Fcポリペプチド融合タンパク質のCD47部分がCD47二量体を形成し、それ故に融合ポリペプチド二量体を形成する可能性がある。
【００５７】
理論に拘束されることは望まないが、分子内ジスルフィド結合は、細胞表面に発現されるCD47の免疫グロブリン様ドメイン構造のコンフォメーション、および本明細書に記載したCD47融合ポリペプチドの免疫グロブリン様構造の保持に寄与するように思われる。当業者は、CD47において分子内ジスルフィド結合を典型的に形成するシステイン残基がSEQ ID NO：1またはSEQ ID NO：11におけるシステイン残基の番号付けされた位置とは異なる位置にある可能性があること、およびCD47ポリペプチドにおいて分子内ジスルフィド結合を形成する別のアミノ酸配列における対応するシステイン残基の位置の決定が、本明細書に記載され、当技術分野で用いられるアラインメントプログラムおよび分子モデル化プログラムを用いた当業者のルーチン的な慣行の範囲に十分に含まれることを理解しているであろう。同様に、本明細書に記載した例示的なアミノ酸配列に提示された特定のアミノ酸と比較してCD47分子の対応するアミノ酸を決定することは、本明細書に記載され、当業者によってルーチン的に用いられるアラインメントツールによって容易に行うことができる。
【００５８】
もう1つの態様において、CD47細胞外ドメイン変異体は、CD47細胞外ドメインのアミノ末端の最も近位にあるシステイン残基の置換または欠失を含む。このシステイン残基は、SEQ ID NO：1の15位のシステイン残基に対応する位置にあり、SEQ ID NO：11の33位に位置する。特定の態様において、システイン残基を任意のアミノ酸によって置換してもよく、例えばシステイン残基をセリン残基と置換してもよい。もう1つの特定の態様において、システイン残基を1つ、2つまたは3つまたは4つのアミノ酸によって置換してもよい。例えば、CD47のアミノ末端の最も近位にあるシステイン残基（すなわち、SEQ ID NO：1の15位またはSEQ ID NO：11の33位のシステイン）を、潜在的なグリコシル化部位であるトリペプチド、例えば配列Asn-X-Serを有するトリペプチドによって置換してもよく、式中、Xはシステインを除く任意のアミノ酸である。CD47細胞外ドメイン部分のアミノ末端の最も近位にあるシステイン残基の置換または欠失により、1つの融合ポリペプチドのCD47細胞外ドメイン部分が、別のCD47細胞外ドメイン部分と、2つのCD47融合ポリペプチドのCD47細胞外ドメイン部分のシステイン残基間のジスルフィド結合の形成を介して二量体を形成する能力が失われる。
【００５９】
CD47細胞外ドメイン変異体のアミノ酸配列とSEQ ID NO：1もしくはSEQ ID NO：11のいずれかに示されたアミノ酸配列との同一性（％）、またはSEQ ID NO：2に示されたアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドと別の融合ポリペプチドとの同一性（％）は、当業者により、配列比較によって容易に決定されうる。本明細書で用いる場合、2つのアミノ酸配列は、最大限に対応するようにアラインメントがなされた場合に2つのアミノ酸配列のアミノ酸残基が同一であれば、100％のアミノ酸配列同一性を有するという。ポリペプチドおよびポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載したポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）の配列比較は、当業者に周知のコンピュータアルゴリズムを用いるもののような任意の方法を用いて行うことができる。そのようなアルゴリズムには、NCBIのウェブサイト（［オンライン］インターネットでncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLASTを参照）で入手可能なAlignまたはBLASTアルゴリズム（例えば、Altschul, J. Mol. Biol. 219:555-565, 1991；Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919, 1992）が含まれる。デフォルトのパラメーターを用いることができる。加えて、LASERGENEバイオインフォマティクス・コンピューティング・スイート（DNASTAR, Inc., Madison, WI）；CLUSTALWプログラム（Thompson et al., Nucleic Acids Res. 22:4673-80 (1991)）；および「GeneDoc」（Nicholas et al., EMBNEW News 4:14 (1991)）に含まれるもののような標準的なソフトウエアプログラムも利用可能である。最適なアラインメントを決定することによって2つのアミノ酸配列を比較するための他の方法が当業者によって実施されている（例えば、Peruski and Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997)；Wu et al. (eds.),“Information Superhighway andコンピュータDatabases of Nucleic Acids and Proteins,”in Methods in Gene Biotechnology, pages 123-151 (CRC Press, Inc. 1997)；およびBishop (ed.), Guide to Human Genome Computing, 2nd Ed. (Academic Press, Inc. 1998)を参照）。
【００６０】
CD47細胞外ドメイン変異体は、野生型CD47アミノ酸配列（SEQ ID NO：1またはSEQ ID NO：11に示されたアミノ酸配列など）とは、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失、付加および/または置換の点で異なってもよく、少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つもしくは10個のアミノ酸の挿入、欠失、付加および/または置換の点で異なってもよく、または10〜45個の間の任意の数のアミノ酸の点で異なってもよい。CD47細胞外ドメイン変異体には、例えば、天然に存在する多型（すなわち、対立遺伝子変異体）または組換え的に操作もしくは作製されたCD47細胞外ドメイン変異体が含まれる。
【００６１】
SEQ ID NO：1に示されたアミノ酸配列とは異なるCD47細胞外ドメイン変異体には、CD47細胞外ドメインのアミノ末端もしくはカルボキシ末端のいずれかから、またはアミノ末端およびカルボキシ末端の両方からの少なくとも1つの欠失を有する変異体が含まれる。そのようなCD47細胞外ドメイン変異体を、本明細書では切り詰め型CD47細胞外ドメインと称することもある。切り詰めは、CD47細胞外ドメインのアミノ末端もしくはカルボキシ末端からの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12個もしくは15〜20個のアミノ酸の欠失を含んでもよく、または各末端からの1〜20個のアミノ酸の欠失を含んでもよい。切り詰め型CD47細胞外ドメインは、切り詰め型CD47細胞外ドメイン変異体において分子内ジスルフィド結合が形成されるように、SEQ ID NO：1の23および96位（またはSEQ ID NO：11の41および114位）の残基に対応するシステイン残基を保っていてもよい。
【００６２】
少なくとも1つのCD47リガンドと特異的に結合する能力を保っているCD47細胞外ドメイン変異体を含むCD47融合ポリペプチドとは、変異体がCD47リガンドと結合する能力が、野生型CD47細胞外ドメインがCD47リガンドと結合する能力と統計学的および/または生物学的に類似していることを意味する。例えば、変異体ポリペプチドおよび野生型（または非変異体）ポリペプチドの結合親和性および/または他の速度論的パラメーター（例えば、Vmax、kon、koff）を比較すると、結合親和性および/または他の速度論的パラメーターは変異体および野生型ポリペプチドの間で実質的に類似している（すなわち、実験誤差および変動の範囲にある）。代替的または追加的に、少なくとも1つのCD47リガンドと特異的に結合する能力を保っているCD47細胞外ドメイン変異体を含むCD47融合ポリペプチドは、野生型CD47細胞外ドメインがCD47リガンドと結合した時に起こる生物活性または機能を生じさせる能力を有する。例示的な生物活性については本明細書で詳細に説明する。
【００６３】
CD47細胞外ドメイン変異体が非変異体ポリペプチドまたは断片と同等なコンフォメーションへとフォールディングするか否かを決定するためのアッセイには、例えば、タンパク質がネイティブ型または非フォールディング性のエピトープに対して特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体と反応する能力、リガンド結合機能の保持、プロテアーゼによる消化に対する突然変異タンパク質の感受性または抵抗性が含まれる（Sambrook et al., 前記を参照）。本明細書に記載したようなCD47細胞外ドメイン変異体は、本明細書に記載したこれらの方法、または当技術分野で公知であって当業者によってルーチン的に実施される他の方法に従って、同定すること、特性を決定すること、および/または作製することができる。
【００６４】
少なくとも1つのCD47リガンドと結合する能力および/または免疫細胞の免疫応答性を変化させる（すなわち、統計学的に有意または生物学的に有意な様式で増加または減少させる）能力を保っているCD47細胞外ドメイン変異体を含むCD47融合ポリペプチドには、保存的アミノ酸置換を含む変異体が含まれる。当業者に公知の種々の基準により、ペプチドまたはポリペプチド中の特定の位置で置換されたアミノ酸が保存的である（または類似している）か否かが示される。例えば、類似のアミノ酸または保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基によって置き換えられたもののことである。類似性のあるアミノ酸は、以下のカテゴリーに含めることができる：塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）；酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）；非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、ヒスチジン）；非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）；β分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）。分類するのが比較的難しいと考えられているプロリンは、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（例えば、ロイシン、バリン、イソロイシンおよびアラニン）と共通の性質を有する。ある種の状況では、グルタミンおよびアスパラギンはそれぞれグルタミン酸およびアスパラギン酸のアミド誘導体であることから、グルタミンによるグルタミン酸の置換またはアスパラギンによるアスパラギン酸の置換を類似の置換とみなすこともある。当技術分野で理解されているように、2つのポリペプチド間の「類似性」は、ポリペプチドのアミノ酸配列およびそれに対する保存的アミノ酸置換物を第2のポリペプチドの配列と比較することによって決定される（例えば、GENEWORKS、Align、BLASTアルゴリズム、または本明細書に記載され、当技術分野で実施されている他のアルゴリズムを用いる）。
【００６５】
ある態様において、CD47細胞外ドメインまたはその変異体を含む融合ポリペプチドは、組換え的に発現される。例えば、本明細書において詳細に説明したようにFcポリペプチドとインフレームに融合させたCD47細胞外ドメインまたはその変異体を、組換え的に発現させることができる。分子生物学の技術分野の当業者によって実施される標準的な手法および方法に従った融合ポリペプチドの発現のために、組換え発現構築物を調製することもできる。効率的な転写および翻訳を得るためには、各構築物中のポリヌクレオチド配列は、リーダー配列、特にCD47細胞外ドメインまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列と機能的に連結されたプロモーターなどの、少なくとも1つの適切な発現制御配列（調節配列と呼ばれる）を含むべきである。または、プロモーターなどの少なくとも1つの発現制御配列を、CD47細胞外ドメインのアミノ末端に位置するシグナルペプチド配列をコードするヌクレオチド配列と機能的に連結させてもよい。
【００６６】
ポリペプチドを組換え的に生産するための具体的な方法は一般に周知であり、ルーチン的に用いられている。例えば、分子生物学の手順は、Sambrookら（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989；同じくSambrook et al., 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (2001)も参照のこと）によって記載されている。DNAシークエンシングは、Sangerら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463 (1977)）およびAmersham International plcシークエンシングハンドブックに記載された通りに、それらに対する改良を含めて行うことができる。融合ポリペプチドの組換え発現については本明細書でさらに詳細に説明する。
【００６７】
CD47融合ポリペプチドのCD47細胞外ドメイン部分をコードするヌクレオチド配列を容易に得るための由来となるCD47をコードする例示的なヌクレオチド配列は、本明細書に提供されており、公開データベースから容易に入手しうる（例えば、GenBankアクセッション番号NM_001777.3（SEQ ID NO：19）；NM_198793.2（SEQ ID NO：16）；NM_001025079.1；BT006907.1；BC012884.1；BC010016.2；BC037306.1；BC045593.1；BC053959.1；およびBC042889.1を参照）。CD47細胞外ドメイン変異体のヌクレオチド配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を、CD47ポリペプチドをコードする、本明細書に記載したか、または当技術分野で公知であるポリヌクレオチドと、本明細書に記載され、当技術分野で用いられているアラインメントアルゴリズムのいずれか1つを用いて比較することによって決定および/または同定することができる。このため、2つのポリヌクレオチド間の同一性（％）は容易に決定しうる。ポリヌクレオチドは、最大限に対応するようにアラインメントがなされた場合に2つの配列のヌクレオチド残基が同一であれば、100％のヌクレオチド配列同一性を有するという。特定の態様において、CD47細胞外ドメイン変異体をコードするポリペプチドのヌクレオチド配列は、本明細書に記載している、CD47細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチド配列の1つまたは複数に対して少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％または98％同一である。ポリヌクレオチド変異体にはまた、遺伝暗号の縮重性のためにヌクレオチド配列同一性の点で違いがあって、本明細書で開示される、または当技術分野で公知であるアミノ酸配列を有するCD47細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチドも含まれる。本明細書に記載したようなCD47融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドには、そのようなポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチドも含まれる。CD47細胞外ドメイン、その変異体または断片をコードするある種のポリヌクレオチドは、プローブ、プライマー、短鎖干渉RNA（siRNA）またはアンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いることもできる。ポリヌクレオチドは、一本鎖のDNAまたはRNA（コード性またはアンチセンス）でも二本鎖のRNA（例えば、ゲノム性または合成性）またはDNA（例えば、cDNAまたは合成性）でもよい。
【００６８】
ポリヌクレオチド変異体は本明細書に記載したアラインメント手順によって同定することもでき、またはハイブリダイゼーション法によって同定することもできる。2つのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、適した中程度にストリンジェントな条件、例えば、5×SSC、0.5％SDS、1.0 mM EDTA（pH 8.0）の溶液中で予洗し；50℃〜70℃、5×SSCで1〜16時間ハイブリダイズさせ；その後に22〜65℃で20〜40分間、0.05〜0.1％SDSを含む2×、0.5×および0.2×SSCのそれぞれの1つまたは複数で1回または2回洗浄すること、の使用を取り入れた方法を用いて行うことができる。さらなるストリンジェンシーについては、条件に50〜60℃の0.1×SSCおよび0.1％SDS中での15分間の洗浄を含めてもよい。当業者が理解しているように、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーの変更は、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の段階のために用いる溶液の時間、温度および/または濃度を変えることによって達成することができる。適した条件はまた、一部には、用いるプローブの具体的なヌクレオチド配列（すなわち、例えば、グアニン＋シトシン（G/C）とアデニン＋チミジン（A/T）含量の比）にも依存しうる。したがって、当業者は、プローブの所望の選択性が特定されれば、過度の実験を行うことなく、適したストリンジェンシーの条件を容易に選択しうることを理解するであろう。
【００６９】
CD47細胞外ドメイン変異体は、遺伝子工学および組換え分子生物学の方法および手法によって容易に調製することができる。CD47ポリペプチドおよびCD47細胞外ドメインの一次および二次アミノ酸配列の解析、ならびにポリペプチドの三次構造を解析するためのそれらのコンピュータモデル化は、CD47ポリペプチドの構造を変化させることなく、その結果としておそらくは機能を変化させることなく置換、付加または欠失させることのできる特定のアミノ酸残基を同定する助けになると思われる。CD47細胞外ドメイン変異体をコードするDNAなどのポリヌクレオチドの改変は、DNAの部位特異的または部位指定突然変異誘発を含む、種々の方法によって行うことができ、これらの方法には、オーバーラップ伸長によるPCRスプライシング（SOE）のように、DNAテンプレートに変化を導入して増幅するためにプライマーを用いるDNA増幅が含まれる。突然変異は、ネイティブ型配列の断片との連結を可能にする制限部位に隣接させて、突然変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することにより、特定の位置に導入することができる。連結の後に、結果的に生じる再構築された配列は、所望のアミノ酸挿入、置換または欠失を有する変異体（または誘導体）をコードする。
【００７０】
CD47細胞外ドメイン変異体をコードさせるためのポリヌクレオチドの部位指定突然変異誘発は、本明細書に記載され、当技術分野で実施されている数多くの方法のいずれか1つに従って行うことができる（Kramer et al., Nucleic Acids Res. 12:9441 (1984)；Kunkel Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-92 (1985)；Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-82 (1987)）。突然変異させた（例えば、置換または欠失を受けた）時にCD47細胞外ドメインとリガンドとの結合を変化させる、またはCD47細胞外ドメイン変異体とCD47特異的抗体との結合を変化させる残基を同定するためのランダム突然変異誘発法を、当業者によってルーチン的に実施されている手順に従って行うこともできる（例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発；エラープローン（error prone）ポリメラーゼ連鎖反応突然変異誘発；およびオリゴヌクレオチド依存的突然変異誘発（例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (2001)を参照）。ある態様において、CD47細胞外ドメイン変異体は、少なくとも1つのCD47リガンド（例えば、SIRP-α、SIRP-β-2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリン）と結合する能力を保っている。ある他の態様において、CD47細胞外ドメイン変異体を含むCD47融合ポリペプチドは、少なくとも2つ、3つ、4つまたは5つのCD47リガンドと結合する能力を保っている。さらに、本明細書に記載したように、CD47細胞外ドメイン変異体および変異体を含む融合ポリペプチドは、野生型CD47部分の、本明細書に記載した少なくとも1つの生物機能を保っている。
【００７１】
また、部位指定突然変異誘発手法を、野生型CD47ポリペプチドと比較した場合に、変異体がCD47リガンドと特異的に結合する能力の変化（すなわち、統計学的または生物学的に有意な増加または減少）を示すCD47細胞外ドメイン変異体を含むCD47融合ポリペプチドを作製するために用いることもできる。そのようなCD47細胞外ドメイン変異体は、例えば、変異体が少なくとも1つのCD47リガンドと結合する能力を保ち、かつ、突然変異を有さないCD47と比較した場合に少なくとも1つの第2のCD47リガンドと特異的に結合する能力の減少（すなわち、低下、減弱）を示すように、アミノ酸の少なくとも1つの置換、欠失または付加を有する。他のある態様において、CD47細胞外ドメイン変異体は、少なくとも2つ、3つまたは4つのCD47リガンドと結合する能力を保ち、かつ少なくとも1つのCD47リガンドと結合する能力の低下または減少を示す。
【００７２】
CD47リガンド
CD47リガンドには、シグナル調節タンパク質（SIRP-α、SIRP-β-2などのSIRP類）；トロンボスポンジン-1ならびにそれらの断片および部分、例えばトロンボスポンジン-1のカルボキシ末端部分など；ならびにある種のインテグリン、特にβ3およびβ1、例えばαvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリンといった、さまざまなポリペプチドが含まれる。CD47リガンドにはまた、CD47と特異的に結合する抗体、特にCD47の細胞外ドメインと結合する抗体も含まれる。
【００７３】
本明細書で用いる場合、CD47融合ポリペプチドは、CD47細胞外ドメイン部分がリガンドと検出可能なレベルで結合し、親和定数Kaが好ましくは約104 M-1を上回るかそれと等しい、または約105 M-1を上回るかそれと等しい、または約106 M-1を上回るかそれと等しい、約107 M-1を上回るかそれと等しい、または108 M-1を上回るかそれと等しいならば、CD47リガンド「に対して特異的である」または「と特異的に結合する」という。CD47融合ポリペプチドがCD47リガンドと結合する能力は解離定数KDとして表すこともでき、CD47融合ポリペプチドは、それが約10-4M未満であるかそれと等しい、または約10-5Mであるかそれと等しい、または約10-6M未満であるかそれと等しい、約10-7M未満であるかそれと等しい、または10-8M未満であるかそれと等しいKDで結合するならば、CD47リガンドと特異的に結合するという。
【００７４】
CD47の細胞外ドメインおよび本明細書に記載したCD47融合ポリペプチド、ならびにそのコグネイトリガンドの親和性を含む、CD47の親和性は、従来の手法、例えば、Scatchardら（Ann. N. Y. Acad. Sci. USA 51:660 (1949)）によって記載されたものを用いて、および表面プラズモン共鳴（SPR；BIAcore（商標）, Biosensor, Piscataway, NJ）によって容易に決定しうる。表面プラズモン共鳴のためには、標的分子を固相上に固定化して、フローセルに沿って流れる移動相中にあるリガンドに対して曝露させる。固定化された標的に対するリガンド結合が起これば、局所屈折率が変化してSPR角の変化を招き、反射光の強度の変化を検出することによってそれをリアルタイムにモニターすることができる。表面プラズモン共鳴シグナルの変化の速度を分析して、結合反応の会合相および解離相に関する見かけの速度定数を得ることができる。これらの値の比により、見かけの平衡定数（親和性）が与えられる（例えば、Wolff et al., Cancer Res. 53:2560-65 (1993)を参照）。
【００７５】
本明細書に記載したような、CD47細胞外ドメインまたはその変異体を含む融合ポリペプチド（融合ポリペプチド二量体も含む）と、CD47リガンドとの結合は、前述のCD47リガンドの任意の1つまたは複数と細胞の表面に発現されたCD47との相互作用を妨げることができる。理論に拘束されることは望まないが、融合ポリペプチドとCD47リガンドとの相互作用は、細胞表面CD47がCD47リガンドと相互作用するのを防止または阻害することにより、細胞表面に発現されたCD47の生物機能を変化させることができる。追加的または代替的に、融合ポリペプチドとCD47リガンドとの相互作用が、CD47リガンドの生物機能を惹起または刺激してもよい。例えば、本明細書に記載したCD47融合ポリペプチドは、CD47と、CD47リガンドとして記載されているβ3およびβ1インテグリン、例えばそれぞれαvβ3インテグリンおよびαIIbβ3、ならびにα2β1インテグリンとの相互作用を変化させること、おそらくは阻害する（すなわち、防止する、減弱させる、低下させる、減少させる）ことができる（例えば、Lindberg et al., J. Cell Biol. 123:485-96 (1993)；Lindberg et al., J. Cell Biol. 134:1313-22 (1996)；Wang et al., Mol. Biol. Cell 9:865-74 (1998)；Wang et al., J. Cell Biol. 147:389-400 (1999)；Brown et al., J. Cell Biol. 111:2785-94 (1990)を参照）。インテグリンαvβ3は多くの細胞種によって発現される細胞受容体であり、RGD（アルギニン-グリシン-アスパラギン酸）配列を介して種々の異なるポリペプチドと結合する（Brown et al., J. Cell Biol. 111:2785-94(1990)；Blystone et al., J. Cell Biol. 130:745-54 (1995)）。
【００７６】
もう1つの態様において、本明細書に記載したような、CD47細胞外ドメインまたはその変異体を含む融合ポリペプチドは、SIRPαおよびSIRP-β-2といった、SIRP（signal regulatory protein）と呼ばれる膜貫通性糖タンパク質のファミリーの1つまたは複数のメンバーと結合することができる。融合ポリペプチドとSIRPポリペプチドとの相互作用は、SIRPの少なくとも1つの生物機能を刺激することができる。例えば、融合ポリペプチドは、細胞の表面に発現されたCD47と、当技術分野でSHPS-1（Src相同性2ドメイン含有タンパク質チロシンホスファターゼ-1（SHP）substrate-1）とも呼ばれる、SIRPα（signal regulatory protein-α）との相互作用を変化させることができる。SIRPαを含むSIRPは、単球、顆粒球、樹状細胞およびCD34+CD38-CD133+骨髄幹細胞を含む造血細胞で発現されるほか、平滑筋細胞でも発現されることが報告されている（例えば、Latour et al., J. Immunol. 167:2547-54 (2001)；Liu et al., J. Biol. Chem. 277:10028-36 (2002)；Seiffert et al., Blood 94:3633-43 (1999)；Seiffert et al., Blood 97:2741-49 (2001)；Jiang et al. J. Biol. Chem. 274:559-62 (1999)；Vernon-Wilson et al., Eur. J. Immunol. 30:2130-37 (2000)；Oshima et al., FEBS Lett. 519:1-8 (2002)を参照）。SIRPαはマクロファージ上の重要な免疫阻害物質受容体であると考えられており、SIRPαとCD47との相互作用により、自家貪食が妨げられる（例えば、Oldenborg et al., J. Exp. Med. 193:855-62 (2001); Okazawa et al., J. Immunol. 174:2004-11 (2005)を参照）。
【００７７】
CD47を発現する細胞とSIRPαを発現する細胞との相互作用は、多形核（PMN）細胞の遊出およびランゲルハンス細胞の遊走などの細胞遊走を調節しうる（例えば、Liu et al., 前記；Motegi et al., EMBO J. 22:2634-44 (2003)；Fukunaga et al., J. Immunol. 172:4091-99 (2004)；Parkos et al., J. Cell Biol. 132:437-50 (1996)を参照）。本明細書に記載したCD47-Fc融合ポリペプチドは、遊走性細胞と細胞表面に存在する細胞CD47を有する細胞（上皮細胞または内皮細胞など）との相互作用を阻害すること（すなわち、妨げること、阻止すること、または妨害すること）により、SIRPαを細胞表面に発現する細胞（すなわち、遊走性細胞）の遊走を阻害することができる。
【００７８】
CD47細胞外ドメインまたはその変異体を含む融合ポリペプチドとSIRPαとの結合は、免疫細胞の遊走を阻害すること、減少させること、低下させること、または妨げることによって免疫細胞の免疫応答性を変化させ、それ故に宿主における炎症反応を阻害すること、抑制すること、または減少させる可能性がある。SIRPαなどのSIRPポリペプチドは負の調節性の細胞受容体として作用すると考えられており、このため、例えば、SIRPの刺激は、通常であれば免疫細胞によるサイトカインおよび/またはケモカイン産生をもたらすと思われる、Fcを介した活性化を阻害する可能性がある。理論に拘束されることは望まないが、本明細書に記載したCD47-Fc融合ポリペプチドと免疫細胞によって発現されたSIRPポリペプチドとの相互作用は、炎症反応におけるIL-6、IL-12、IL-23、TNF-αといったサイトカインの産生などの阻害または減少をもたらしうる、SIRPシグナル伝達を介した負のシグナルを誘導する。
【００７９】
もう1つの態様において、CD47細胞外ドメインまたはその変異体を含む融合ポリペプチドとCD47リガンドとの結合は、IL-12、IL-23、TNF-α、IFN-γ、IL-6、GM-CSFおよびIL-10といったサイトカインの発現および/または分泌を変化させる可能性がある。本明細書に記載した融合ポリペプチドとSIRPαなどのCD47リガンドとの結合は、IL-12、IL-23、TNF-α、IL-6およびIL-10といったサイトカインの放出を抑制する可能性がある。例えば、Latour et al., 前記；Hermann et al., J. Cell Biol. 144:767-75 (1999)；Armant et al., J. Exp. Med. 190:1175-81 (1999)；Demeure et al., J. Immunol. 164:2193-99 (2000)を参照。
【００８０】
もう1つの態様において、本明細書に記載したような、CD47細胞外ドメインまたはその変異体を含む融合ポリペプチドはトロンボスポンジン-1と結合することができ、特定の態様においては、当技術分野でTp-47とも呼ばれるトロンボスポンジン-1のカルボキシ末端部分と結合することができる（例えば、Latour et al., 前記を参照）。トロンボスポンジン-1は、活性化に応じて血小板によって放出される細胞外マトリックスタンパク質であり、マクロファージおよび単球によっても産生される。トロンボスポンジンと細胞表面CD47との結合は、抗原提示細胞（APC）によるIL-12産生を負の方向に調節し、ナイーブT細胞のTh1エフェクター細胞への発生を阻害する（例えば、Armant et al., J. Exp. Med. 190:1175 (1999)；Demeure et al., J. Immunol. 164:2193 (2000)；Avice et al., J. Immunol. 165:4624 (2000)を参照）。サイトカインIL-12は炎症性メディエーターとして作用することがあり、無秩序なIL-12産生および応答は自己免疫性疾患などのある種の免疫学的疾患と関連がある。本明細書に記載した融合ポリペプチドとトロンボスポンジン-1との結合は、IL-12の発現をダウンレギュレートすることまたは発現の低下を促すことにより、免疫細胞の免疫応答性を変化させる可能性がある。
【００８１】
また、トロンボスポンジン-1と細胞表面に発現されたCD47との相互作用は、BNIP3（Bcl-2相同性3（BH3）-only protein 19kDa interacting protein-3）によって媒介されうる、活性化T細胞のアポトーシスを誘導する可能性もある（Lamy et al., J. Biol. Chem. 278 (23915-21 (2003)）。本明細書に記載したような、CD47細胞外ドメインまたはその変異体を含む融合ポリペプチドは、トロンボスポンジン-1とT細胞によって発現されたCD47との結合を阻害し、それによってリンパ球におけるアポトーシスを変化させる可能性がある。したがって、本明細書に記載した融合ポリペプチドは、癌などの増殖性疾患を治療するために用いられる可能性がある。
【００８２】
IL-12という用語は、樹状細胞を含む免疫細胞によって産生されるサイトカインIL-12を指し、これには当技術分野で記載されているIL-12に関連した単量体および二量体が含まれる。IL-12の生物活性形態は、おおよその分子量がそれぞれ40キロダルトンおよび35キロダルトンであるp40（IL12p40）およびp35（IL12p35）と呼ばれる独立に調節されるサブユニットで構成される、IL12p70と呼ばれるヘテロ二量体である。IL12p40は二量体（IL12(p40)2）としても存在する。例えば、Gately et al., Annu. Rev. Immunol. 16:495 (1998)；Hildens et al., Blood 90:1920 (1997)；Kalinski et al., J. Immunol. 165:1877-81(2000)を参照。IL-23もIL12のp40サブユニットを含み、これは例えば樹状細胞によって産生され、記憶T細胞に対して作用すると思われる（例えば、Oppmann et al., Immunity 13:715-25 (2000)；Wiekowski et al., J. Immunol. 166:7563-7570 (2001)；Aggarwal, et al., J. Biol. Chem. 17:278:1910-14 (2003), Epub 2002 Nov 3を参照）。IL-23産生および炎症性疾患の影響をもとに、最近、IL-23の受容体の発現がクローン病および潰瘍性大腸炎などの炎症性疾患と関連しているという観察所見が得られている（例えば、Duerr et al., Science 314:1461-63 (2006)を参照；例えば、Mannon et al., N. Engl. J. Med. 351:2069 (2004)；Becker et al., J. Immunol. 177:2760-64 (2006)；Lankford et al., J. Leukoc. Biol. 73:49-56 (2003)も参照のこと）。
【００８３】
また、本明細書に記載したCD47-Fcポリペプチド融合タンパク質は、免疫複合体が免疫細胞によるサイトカインの産生を誘導する能力にも影響を及ぼす可能性がある；したがって、本明細書に記載した融合タンパク質は、免疫細胞における免疫複合体によるサイトカイン産生の誘導を阻害する（すなわち、免疫細胞による、免疫複合体により誘導されるサイトカイン産生を阻害する）可能性がある。免疫細胞には、CD47リガンド、例えばSIRPαを発現する免疫細胞が非限定的に含まれる。本明細書に記載したように、そのような免疫細胞には、例えば、樹状細胞、単球、マクロファージ、顆粒球および骨由来幹細胞が含まれる。したがって、ある特定的な態様において、本明細書に記載したCD47-Fcポリペプチド融合タンパク質は、樹状細胞の免疫応答性を変化させることができる。CD47-Fcポリペプチド融合タンパク質と免疫細胞、例えば樹状細胞との、またはリガンドもしくは樹状細胞などの免疫細胞と相互作用する他の細胞との相互作用は、樹状細胞による、IL-6、IL-12、IL-23およびTNF-αを非限定的に含むサイトカインの産生を変化させる（一般的には阻害する）。他のある態様において、本明細書に記載したCD47-Fcポリペプチド融合タンパク質は、免疫複合体が免疫細胞によるサイトカインの産生を誘導する能力を変化させ、ある特定の態様においては阻害または減少させる。特定の態様において、本明細書に記載したCD47-Fc融合ポリペプチドは、樹状細胞などの免疫細胞による、免疫複合体により誘導されるサイトカイン産生を阻害する。したがって、本明細書で考察したように、CD47-Fcポリペプチド融合タンパク質は、自己免疫性疾患（一例としては関節炎）などの免疫学的疾患または障害の治療のために用いることができる。加えて、CD47-Fcポリペプチド融合タンパク質は、樹状細胞の成熟を阻害または防止する可能性もある。本明細書に記載したCD47 Fc融合ポリペプチドはまた、ニューロンの細胞表面に存在するSIRPαと相互作用し、その結果として神経細胞機能のシグナル伝達に影響を及ぼす可能性もある。
【００８４】
ウイルスCD47ポリペプチドおよびその細胞外ドメイン断片
もう1つの態様において、CD47細胞外ドメインは、ウイルスCD47様ポリペプチド、例えば、小痘瘡ポックスウイルスCD47様ポリペプチド（例えば、SEQ ID NO：3および4を参照）などのポックスウイルスCD47様ポリペプチドである。細胞サイトカインおよびケモカインならびにそれらの受容体のウイルス相同体であるタンパク質をコードすることにより、ポックスウイルス科のメンバーは、感染した宿主の免疫系による検出および排除を免れるための数多くの機構を進化させている。あるウイルス病原性因子は、CD47と構造的相同性のあるポリペプチドを含む。ウイルスCD47ポリペプチド（ウイルスCD47様ポリペプチドまたはvCD47とも呼ばれる）は、一次配列の相同性が30％またはそれ未満であるアミノ酸配列を有する；しかし、ウイルスCD47と免疫調節性ポリペプチドとの構造的特徴の比較からは、ウイルスCD47ポリペプチドが、CD47と同様に、N末端シグナル配列、5つないし6つの膜貫通ドメインおよび短い細胞内（すなわち、細胞質性）尾部を有することが示されている（例えば、Cameron et al., Virology 264:298-318 (1999)；Cameron et al., Virology 337:55-67 (2005)；Alfonso et al., J. Virol. 79:966-77 (2005)；Seet et al., Annu. Rev. Immunol. 21:377-423 (2003)を参照）。
【００８５】
ウイルスCD47様ポリペプチドをコードするウイルスゲノム配列は、粘液腫およびオルソポックスウイルス、ならびにコルドポックスウイルス、カプリポックスウイルス、レポリポックスウイルス、スイポックスウイルス、ヤタポックスウイルスおよびシカポックスウイルスを含む、いくつかのポックスウイルスにおいて同定されている。ウイルスCD47様ポリペプチドの例示的なアミノ酸配列には、小痘瘡ウイルスのゲノムによってコードされるA44Lポリペプチド（GenBankアクセッション番号CAB54747.1（SEQ ID NO：3））；ワクシニアウイルス-Western Reserve株（GenBankアクセッション番号AA089441.1）；ワクシニアウイルス（Acambis 3000改変ウイルスAnkara）（GenBankアクセッション番号AAT10547.1）；ワクシニアウイルス（GenBankアクセッション番号YP_233044.1）；および粘液腫ウイルスのLausanne株のゲノムによってコードされるM128Lポリペプチド（GenBankアクセッション番号NP_051842.1およびAAF15016.1）が含まれる。一例として、A44LポリペプチドおよびヒトCD47アイソフォームのアミノ酸配列のアラインメント（図2参照）は、2つのポリペプチドの一次配列がおよそ25％同一であり、およそ60％類似していることを示している。
【００８６】
ある態様においては、例えばFcポリペプチドおよびその変異体を含む、多量体形成（例えば、二量体形成）を行いうる部分と融合したウイルスCD47（vCD47）細胞外ドメインを含む融合ポリペプチドが本明細書において提供される。1つの態様において、ウイルスCD47細胞外ドメイン部分はA44Lアミノ酸配列に由来し、20アミノ酸のシグナルペプチド配列（SEQ ID NO：3の1〜20位のアミノ酸）を欠く105アミノ酸（SEQ ID NO：4）を含む（図2も参照）。ある他の態様において、融合ポリペプチドは、本明細書に記載した、または当技術分野で公知である、別のポックスウイルスCD47様ポリペプチドに由来するウイルスCD47細胞外ドメインを含む。当業者は、シグナルペプチド、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含むウイルスCD47様ポリペプチドの部分を、アラインメント法、および本明細書に記載され、当技術分野で用いられているvon Heijneの膜貫通プロットなどの他の方法を用いて容易に決定することができる。
【００８７】
他の態様において、vCD47融合ポリペプチドはvCD47細胞外ドメイン変異体を含む。そのようなvCD47融合ポリペプチドは、少なくとも1つのCD47リガンドと特異的に結合する能力を保っている。そのようなリガンドは本明細書に記載されており、例えば、SIRPα、SIRP-β2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリンが含まれる。vCD47変異体を含むvCD47融合ポリペプチドも、CD47と少なくとも1つのCD47リガンドとの結合を競合的に阻害する能力を保っている。vCD47細胞外ドメイン変異体は、SEQ ID NO：4に示された小痘瘡vCD47細胞外ドメインなどの対応する野生型ポックスウイルスCD47様ポリペプチドアミノ酸配列に対して少なくとも65％〜75％、75％〜80％、80〜85％、85％〜90％または95％〜99％同一な（これには記載した範囲のいずれか1つの間の任意の同一性（％）が含まれる）アミノ酸配列を有しうる。そのようなvCD47細胞外ドメイン変異体は、免疫グロブリンドメイン様構造を付与する分子内ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を保っていてもよい。一例として、典型的には分子内ジスルフィド結合を形成する小痘瘡vCD47（A44L）アミノ酸配列中のシステイン残基は、SEQ ID NO：4の16位および79位のシステイン残基に対応する位置にある。当業者は、1つのvCD47において分子内ジスルフィド結合を典型的に形成するシステイン残基がSEQ ID NO：4におけるシステイン残基の番号付けされた位置とは異なる位置にある可能性があること、およびCD47ポリペプチドにおいて分子内ジスルフィド結合を形成する別のアミノ酸配列における対応するシステイン残基の位置の決定が、本明細書に記載され、当技術分野で用いられるアラインメントプログラムおよび分子モデル化プログラムを用いた当業者のルーチン的な慣行の範囲に十分に含まれることを理解しているであろう。
【００８８】
野生型vCD47アミノ酸配列と比較したvCD47細胞外ドメイン変異体の同一性（％）は、当業者により、配列比較によって容易に決定されうる。本明細書で用いる場合、2つのアミノ酸配列は、最大限に対応するようにアラインメントがなされた場合に2つのアミノ酸配列のアミノ酸残基が同一であれば、100％のアミノ酸配列同一性を有するという。ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの配列比較は、当業者に周知のコンピュータアルゴリズムを用いるものを含む、任意の方法を用いて行うことができ、これには、CD47ポリペプチドおよびCD47ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのアラインメントのための、本明細書に記載したアルゴリズムが含まれる。
【００８９】
vCD47細胞外ドメイン変異体は、野生型vCD47アミノ酸配列（例えば、SEQ ID NO：4に示されたアミノ酸配列など）とは、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失、付加および/または置換のために異なってもよく、少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つまたは10個のアミノ酸の挿入、欠失、付加および/または置換のために異なってもよく、または10〜45個の間の任意の数のアミノ酸の点で異なってもよい。vCD47細胞外ドメイン変異体には、例えば、宿主における感染および/もしくは複製時にウイルスゲノムに導入された突然変異のために生じた天然に生じた多型、または組換え的に操作もしくは作製されたvCD47細胞外ドメイン変異体が含まれる。
【００９０】
SEQ ID NO：4に示されたアミノ酸配列とは異なるvCD47細胞外ドメイン変異体には、例えば、vCD47細胞外ドメインのアミノ末端もしくはカルボキシ末端のいずれかから、またはアミノ末端およびカルボキシ末端の両方からの少なくとも1つの欠失を有する変異体が含まれる。そのようなvCD47細胞外ドメイン変異体を、本明細書では切り詰め型vCD47細胞外ドメインと称することもある。切り詰めは、CD47細胞外ドメインのアミノ末端もしくはカルボキシ末端からの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12個またはそれ以上のアミノ酸の欠失を含んでもよく、または各末端からの1〜20個のアミノ酸の欠失を含んでもよい。特定の態様において、切り詰め型vCD47細胞外ドメイン変異体は、分子内ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を保っている。
【００９１】
少なくとも1つのCD47リガンドと特異的に結合する能力および/またはCD47とCD47リガンドとの結合を競合的に阻害する能力を保っているvCD47細胞外ドメイン変異体を含むvCD47融合ポリペプチドには、保存的アミノ酸置換を含む変異体が含まれる。当業者に公知の種々の基準により、ペプチドまたはポリペプチド中の特定の位置で置換されたアミノ酸が保存的である（または類似している）か否かが示される。例えば、類似のアミノ酸または保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基によって置き換えられたもののことである。類似性のあるアミノ酸は、以下のカテゴリーに含めることができる：塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）；酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）；非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、ヒスチジン）；非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）；β分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）。分類するのが比較的難しいと考えられているプロリンは、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（例えば、ロイシン、バリン、イソロイシンおよびアラニン）と共通の性質を有する。ある種の状況では、グルタミンおよびアスパラギンはそれぞれグルタミン酸およびアスパラギン酸のアミド誘導体であることから、グルタミンによるグルタミン酸の置換またはアスパラギンによるアスパラギン酸の置換を類似の置換とみなすこともある。当技術分野で理解されているように、2つのポリペプチド間の「類似性」は、ポリペプチドのアミノ酸配列およびそれに対する保存的アミノ酸置換物を第2のポリペプチドの配列と比較することによって決定される（例えば、GENEWORKS、Align、BLASTアルゴリズム、または本明細書に記載され、当技術分野で実施されている他のアルゴリズムを用いる）。
【００９２】
ある態様において、vCD47細胞外ドメインまたはその変異体を含む融合ポリペプチドは、組換え的に発現される。例えば、本明細書において詳細に説明したようにFcポリペプチドとインフレームに融合させたvCD47細胞外ドメインまたはその変異体を、組換え的に発現させることができる。分子生物学の技術分野の当業者によって実施される標準的な手法および方法に従ったvCD47融合ポリペプチドの発現のために、組換え発現構築物を調製することもできる。効率的な転写および翻訳を得るためには、各構築物中のポリヌクレオチド配列は、適切な調節配列、特にvCD47細胞外ドメインもしくはその変異体をコードするヌクレオチド配列と機能的に連結されたプロモーターおよびリーダー配列を含むべきであり、またはプロモーターを、vCD47細胞外ドメインのアミノ末端に位置するシグナルペプチド配列をコードするヌクレオチド配列と機能的に連結させてもよい。ポリペプチドを組換え的に生産するための具体的な方法は一般に周知であり、ルーチン的に用いられている。例えば、分子生物学の手順は、Sambrookら（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989；同じくSambrook et al., 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (2001)も参照のこと）によって記載されている。DNAシークエンシングは、Sangerら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463 (1977)）およびAmersham International plcシークエンシングハンドブックに記載された通りに、それらに対する改良を含めて行うことができる。
【００９３】
vCD47融合ポリペプチドのvCD47細胞外ドメイン部分をコードする例示的なヌクレオチド配列は本明細書に提供されており、例えば、粘液腫ウイルス（GenBankアクセッション番号AF170726.2）；小痘瘡ウイルス（GenBankアクセッション番号Y16780.1）；ヤバサル腫瘍ウイルス（GenBankアクセッション番号NC_005179.1；AY386371.1）；ヤバ様疾患ウイルス（GenBankアクセッション番号AJ293568.1；NC_002642.1）；ミュールジカポックスウイルス（NC_006966.1）を含む、さまざまなポックスウイルスのゲノム配列を示している公開データベースから容易に入手することができる。
【００９４】
vCD47細胞外ドメイン変異体のヌクレオチド配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を、vCD47ポリペプチドをコードする、本明細書に記載した、または当技術分野で公知であるポリヌクレオチドと、本明細書に記載され、当技術分野で用いられているアラインメントアルゴリズムのいずれか1つを用いて比較することによって決定および/または同定することができる。このため、2つのポリヌクレオチド間の同一性（％）は容易に決定しうる。ポリヌクレオチドは、最大限に対応するようにアラインメントがなされた場合に2つの配列のヌクレオチド残基が同一であれば、100％のヌクレオチド配列同一性を有するという。特定の態様において、vCD47細胞外ドメイン変異体をコードするポリペプチドのヌクレオチド配列は、本明細書に記載している、野生型vCD47細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチド配列の1つまたは複数に対して少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％または98％同一である。ポリヌクレオチド変異体にはまた、遺伝暗号の縮重性のためにヌクレオチド配列同一性の点で違いがあるものの、本明細書で開示される、または当技術分野で公知であるアミノ酸配列を有するvCD47細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチドも含まれる。本明細書に記載したようなvCD47融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドには、そのようなポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチドも含まれる。vCD47細胞外ドメイン、その変異体または断片をコードするある種のポリヌクレオチドは、プローブおよびプライマーとして用いることもできる。ポリヌクレオチドは、一本鎖のDNAまたはRNA（コード性またはアンチセンス）でも二本鎖のRNA（例えば、ゲノム性または合成性）またはDNA（例えば、cDNAまたは合成性）でもよい。ポリヌクレオチド変異体は本明細書に記載したアラインメント手順によって同定することもでき、またはCD47をコードするポリヌクレオチド変異体の同定および特性決定のための、本明細書に記載したようなハイブリダイゼーション法によって同定することもできる。
【００９５】
vCD47細胞外ドメイン変異体は、遺伝子工学および組換え分子生物学の方法および手法によって容易に調製することができる。vCD47ポリペプチドおよびvCD47細胞外ドメインの一次および二次アミノ酸配列の解析、ならびにポリペプチドの三次構造を解析するためのそれらのコンピュータモデル化は、vCD47ポリペプチドの構造を変化させることなく、その結果としておそらくは機能を変化させることなく置換、付加または欠失させることのできる特定のアミノ酸残基を同定する助けになると思われる。vCD47細胞外ドメイン変異体をコードするDNAなどのポリヌクレオチドの改変は、DNAの部位特異的または部位指定突然変異誘発を含む、種々の方法によって行うことができ、これらの方法には、オーバーラップ伸長によるPCRスプライシング（SOE）のように、DNAテンプレートに変化を導入して増幅するためにプライマーを用いるDNA増幅が含まれる。突然変異は、ネイティブ型配列の断片との連結を可能にする制限部位に隣接させて、突然変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することにより、特定の位置に導入することができる。連結の後に、結果的に生じる再構築された配列は、所望のアミノ酸挿入、置換または欠失を有する変異体（または誘導体）をコードする。
【００９６】
vCD47細胞外ドメイン変異体をコードさせるためのポリヌクレオチドの部位指定突然変異誘発は、本明細書に記載され、当技術分野で実施されている数多くの方法のいずれか1つに従って行うことができる（Kramer et al., Nucleic Acids Res. 12:9441 (1984)；Kunkel Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-92 (1985)；Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-82 (1987)）。突然変異させた（例えば、置換または欠失を受けた）時にvCD47細胞外ドメインとCD47リガンドとの結合を変化させる、またはvCD47細胞外ドメイン変異体がCD47とCD47リガンドとの結合を競合的に阻害する能力を変化させる残基を同定するためのランダム突然変異誘発法を、当業者によってルーチン的に実施されている手順に従って行うこともできる（例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発；エラープローンポリメラーゼ連鎖反応突然変異誘発；およびオリゴヌクレオチド依存的突然変異誘発（例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (2001)を参照）。ある態様において、vCD47細胞外ドメイン変異体は、少なくとも1つのCD47リガンド（例えば、SIRP-α、SIRP-β-2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリン）と結合する能力を保っている。ある他の態様において、vCD47細胞外ドメイン変異体を含むvCD47融合ポリペプチドは、少なくとも2つ、3つ、4つまたは5つのCD47リガンドと結合する能力を保っている。
【００９７】
また、部位指定突然変異誘発を、野生型vCD47ポリペプチドと比較した場合に、変異体がCD47リガンドと特異的に結合する能力の変化（すなわち、統計学的または生物学的に有意な増加または減少）を示すvCD47細胞外ドメイン変異体を含む融合ポリペプチドを作製するために用いることもできる。そのようなvCD47細胞外ドメイン変異体は、例えば、変異体が少なくとも1つのCD47リガンドと結合する能力を保ち、かつ、突然変異を有さないvCD47と比較した場合に少なくとも1つの第2のCD47リガンドと特異的に結合する能力の減少（すなわち、低下、減弱）を示すように、アミノ酸の少なくとも1つの置換、欠失または付加を有しうる。他のある態様において、vCD47細胞外ドメイン変異体は、少なくとも2つ、3つまたは4つのCD47リガンドと結合する能力を保ち、かつ少なくとも1つのCD47リガンドと結合する能力の低下または減少を示す。
【００９８】
もう1つの態様において、融合ポリペプチドは、Fcポリペプチド（またはその変異体）と融合したvCD47細胞外ドメイン変異体を含み、ここでvCD47細胞外ドメイン変異体はSEQ ID NO：4に対して少なくとも65％〜75％、75％〜80％、80〜85％、85％〜90％または95％〜99％同一なアミノ酸配列を含み、かつCD47リガンド（例えば、SIRP-α、SIRP-β-2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリン）と結合する能力を保っている。もう1つの特定の態様において、vCD47細胞外ドメイン変異体は、vCD47細胞外ドメインのアミノ末端の最も近位にあるシステイン残基の置換または欠失を含む。ある態様において、このシステイン残基はSEQ ID NO：4の8位のシステイン残基に対応する位置にある。特定の態様において、システイン残基を任意のアミノ酸によって置換してもよく、例えばシステイン残基をセリン残基によって置換してもよい。もう1つの特定の態様において、システイン残基を1つ、2つまたは3つまたは4つのアミノ酸によって置換してもよい。例えば、SEQ ID NO：4の8位のシステインに対応する、CD47のアミノ末端の最も近位にあるシステイン残基を、潜在的なグリコシル化部位であるトリペプチド、例えば配列Asn-X-Serを有するトリペプチドによって置換してもよく、式中、Xはシステインを除く任意のアミノ酸である。所望であれば、SEQ ID NO：4の8位のシステインに対応するシステイン残基の置換または欠失により、1つの融合ポリペプチドのvCD47細胞外ドメイン部分が、別のvCD47細胞外ドメイン部分と、vCD47細胞外ドメインアミノ酸配列のアミノ末端の最も近位に位置するシステイン残基間のジスルフィド結合の形成を介して二量体を形成する可能性が失われる。
【００９９】
vCD47細胞外ドメインまたはその変異体を含む融合ポリペプチドを、CD47リガンドと相互作用するCD47の結合部位を同定するための競合結合アッセイに用いることもできる。また、vCD47細胞外ドメインまたはその変異体を含む融合ポリペプチドを、免疫細胞の免疫応答性を変化させる（すなわち、統計学的に有意または生物学的に有意な様式で増加または減少させる）ために用いることもできる。このため、そのような融合ポリペプチドは対象の免疫応答を変化させるために用いることもでき、その結果として免疫学的疾患または障害を治療するために有用である可能性がある。
【０１００】
1つの態様において、本明細書に記載したようなvCD47細胞外ドメインまたはその変異体を含む融合ポリペプチドは、急性免疫応答を呈する患者を治療するために用いることができる。例えば、vCD47細胞外ドメインまたはその変異体を含む融合ポリペプチドは、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）などの疾患または病状と関連のある免疫応答を抑制する可能性がある。ARDSは成人および小児で発症する可能性があり、往々にして、肺胞-毛細血管単位を損傷させる直接的な肺または全身の傷害（例えば、敗血症、肺炎、誤嚥）が引き続いて起こる。いくつかのサイトカインがこの症候群の発症と関連しており、これには例えば、腫瘍壊死因子-α（TNF-α）、インターロイキン-β（IL-β）、IL-10および可溶性細胞間接着分子1（sICAM-1）が含まれる。生物試料中のこれらの因子およびサイトカインのレベルの上昇または低下は、急性状態をモニターするため、および治療の効果をモニターするための、本明細書に記載され、当技術分野でルーチン的に実施されている方法およびアッセイによって容易に決定することができる。
【０１０１】
vCD47またはその断片に対して特異的な免疫応答の可能性および程度を低下または最小化するためには、融合ポリペプチドを限られた投薬回数で投与すること、vCD47のグリコシル化を変化させる様式で作製もしくは導出すること、および/またはvCD47の抗原性を低下もしくは最小化する条件下で投与することが考えられる。例えば、vCD47細胞外ドメインまたはその変異体を含む融合ポリペプチドを、免疫応答、特にvCD47に対して特異的な応答を抑制する第2の組成物の宿主への投与の前、同時、またはその後に投与することができる。
【０１０２】
免疫細胞の免疫応答性を変化させるための、CD47細胞外ドメインまたはその変異体を含む融合ポリペプチドの使用
1つの態様においては、本明細書に記載したような、CD47細胞外ドメインもしくはその変異体を含む融合ポリペプチドの任意の1つ、またはvCD47細胞外ドメインを含む融合ポリペプチドの任意の1つを、免疫細胞の免疫応答性を変化させる（統計学的に有意または生物学的に有意な様式で増加または減少させる）ために用いることができる。本明細書に記載した融合ポリペプチドの任意の1つは、以下の任意の1つまたは複数（またはその少なくとも1つ）を含む生物機能または作用を生じさせることによって、免疫細胞の免疫応答性を変化させること、またはそれに影響を及ぼすことができる：樹状細胞の成熟を阻害すること；ナイーブT細胞のTh1エフェクター細胞への発生を損なわせること；樹状細胞によるサイトカイン放出を抑制すること；細胞遊走を変化させること；少なくとも1つのサイトカイン、例えばTNF-α、IL-12、IL-23、IFN-γ、GM-CSFおよびIL-6のうち少なくとも1つの産生を阻害すること；免疫細胞、例えば樹状細胞などによる、免疫複合体により誘導される少なくとも1つのサイトカインの産生を阻害すること；CCD47リガンド、例えばSIRP-αを発現する免疫細胞の活性化を阻害すること、免疫細胞によるケモカインの産生を阻害すること；Fcを介したサイトカイン産生を阻害すること；および炎症誘発性応答を阻害すること。
【０１０３】
免疫細胞とは、リンパ球、およびアクセサリー細胞などの非リンパ性細胞を含む、免疫系の任意の細胞のことである。リンパ球とは外来抗原を特異的に認識してそれに応答する細胞のことであり、アクセサリー細胞とは、特定の抗原に対して特異的ではないが、免疫応答の認知および活性化の段階に関与するもののことである。例えば、単核食細胞（マクロファージ）、他の白血球（例えば、好中球、好酸球、好塩基球を含む顆粒球）および樹状細胞は、免疫応答の誘導においてアクセサリー細胞として機能する。免疫細胞には、CD47リガンドを発現する細胞が含まれる。例えば、免疫細胞にはSIRP-αを発現する細胞が含まれ、これには単球、マクロファージ、樹状細胞、顆粒球およびCD34+CD38-CD133+骨髄幹細胞/始原細胞が含まれる（例えば、Seiffert et al., Blood 94:3633 (1999)；Seiffert et al., Blood 97:2741 (2001)を参照）。外来抗原によるリンパ球の活性化は、抗原を排除するように機能する数多くのエフェクター機構の誘導または誘発を導く。エフェクター機構を生じさせる、またはそれに関与する、単核食細胞などのアクセサリー細胞もエフェクター細胞と呼ばれる。
【０１０４】
リンパ球の主要なクラスには、Bリンパ球（B細胞）、Tリンパ球（T細胞）、および大型の顆粒リンパ球であるナチュラルキラー（NK）細胞が含まれる。B細胞は抗体を産生することができる。Tリンパ球は、ヘルパーT細胞（CD4+）および細胞溶解性または細胞傷害性T細胞（CD8+）にさらに細分される。ヘルパー細胞は、T細胞、ならびにB細胞およびマクロファージを含む他の細胞の増殖および分化を促すサイトカインを分泌し、炎症性白血球を動員して活性化する。調節性T細胞またはサプレッサーT細胞と呼ばれるT細胞のもう1つのサブグループは、免疫系の活性化を能動的に抑制し、病的な自己反応性、すなわち自己免疫性疾患を防止する。
【０１０５】
一般に免疫応答は以下を含む：（1）体液性応答、この場合には形質細胞として知られる分化Bリンパ球により、抗原に対して特異的な抗体が産生される、および（2）細胞媒介性応答、この場合にはさまざまな型のTリンパ球が、数多くの機序によって抗原を排除するように作用する。例えば、特異的抗原を認識しうるヘルパーT細胞は、免疫応答にかかわる免疫系の別の細胞を動員するサイトカインなどの可溶性メディエーターを放出することによって応答しうる。また、同じく特異的抗原の認識を行える細胞傷害性T細胞は、抗原を保有する細胞または粒子と結合してそれらを破壊または損傷させることによって応答しうる。
【０１０６】
宿主または対象における免疫応答は、本明細書に記載され、当業者によく知られている、さまざまな周知の免疫学的方法によって決定することができる。そのようなアッセイには、以下のもののインビボまたはインビトロでの決定が含まれるが、必ずしもそれらには限定されない：可溶性抗体、可溶性メディエーター、例えばサイトカイン（例えば、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、IL-6、IL-23、TNF-αおよびTGF-β）、リンホカイン、ケモカイン、ホルモン、増殖因子など、ならびに他の可溶性低分子ペプチド、糖質、ヌクレオチドおよび/または脂質メディエーター；免疫系の細胞の機能的または構造的な性質の変化によって決定されるような細胞活性化の状態、例えば細胞増殖、運動性の変化、特化した活性の誘導、例えば特定遺伝子の発現または細胞溶解挙動など；細胞成熟、例えば刺激に応じての樹状細胞の成熟；Th1応答とTh2応答との間の関係の変化；表面抗原発現プロファイルの変化またはアポトーシス（プログラム細胞死）の発生を含む、免疫系の細胞による細胞分化。これらおよび類似のアッセイを実施するための手順は、例えば、Lefkovits（Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques, 1998）に記載がある。同じく、Current Protocols in Immunology；Weir, Handbook of Experimental Immunology, Blackwell Scientific, Boston, MA (1986)；Mishell and Shigii (eds.) Selected Methods in Cellular Immunology, Freeman Publishing, San Francisco, CA (1979)；Green and Reed, Science 281:1309 (1998)およびそれらに引用されている参考文献も参照のこと）。
【０１０７】
サイトカインのレベルは、ELISA、ELISPOTおよびフローサイトメトリー（細胞内サイトカインを測定するための）を含む、本明細書に記載され、当技術分野で実施されている方法に従って決定することができる。免疫応答の抗原特異的な誘発または刺激に起因する免疫細胞の増殖およびクローン性増殖は、脾細胞またはリンパ節由来の細胞などのリンパ球を単離して、細胞を抗原で刺激し、サイトカイン産生、細胞増殖および/または細胞生存性を、例えばトリチウム化チミジンの取り込みまたはMTTアッセイなどの非放射性アッセイなどによって測定することにより、決定することができる。Th1免疫応答とTh2免疫応答とのバランスに対する本明細書に記載した融合ポリペプチドの影響は、例えば、IFN-□、IL-12、IL-2およびTNF-βなどのTh1サイトカイン、ならびにIL-4、IL-5、IL-9、IL-10およびIL-13などの2型サイトカインのレベルを決定することによって調べることができる。
【０１０８】
CD47細胞外ドメインまたはその変異体を含む融合ポリペプチド（またはウイルスCD47細胞外ドメインまたはその変異体）の効果を決定するための方法および手法は、Armant et al., J. Exp. Med 190:1175 (1999)；Demeure et al., J. Immunol. 164:2193 (2000)；Avice et al., J. Immunol. 165:4624 (2000)；Lamy et al., J. Biol. Chem. 278 (23915-21 (2003)；Hermann et al., J. Cell Biol. 144:767-75 (1999)；Liu et al., J, Biol. Chem. 277:10028-36 (2002)；Seiffert et al., Blood 94:3633-43 (1999)；Seiffert et al., Blood 97:2741-49 (2001)；Motegi et al., EMBO J. 22:2634-44 (2003)；Fukunaga et al., J. Immunol. 172:4091-99 (2004)；Parkos et al., J. Cell Biol. 132:437-50 (1996)；ならびに国際出願公開第WO 99/40940号および第WO 97/27873号にも見出される。
【０１０９】
ある態様において、CD47細胞外ドメインまたはその変異体を含む本明細書に記載した融合ポリペプチドは、少なくとも1つのCD47リガンドと、細胞によって発現されて細胞表面に位置するCD47との結合を競合的に阻害する能力を示す。CD47リガンドは、SIRP-α、SIRP-β-2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリンのうち少なくとも1つであってよい。ある他の態様において、そのような融合ポリペプチドは、ウイルスCD47ポリペプチドと少なくとも1つのCD47リガンドとの結合を競合的に阻害する能力を有しうる。ウイルスCD47ポリペプチドには、単離された完全長ウイルスCD47ポリペプチド、ウイルスCD47細胞外ドメイン、または細胞の表面に発現されたウイルスCD47が含まれる。ある態様において、融合ポリペプチドは、少なくとも1つのCD47リガンドと細胞表面に発現されたCD47との結合を競合的に阻害し、同じリガンドとウイルスCD47との結合を競合的に阻害する。他の態様において、細胞表面に発現されたCD47との結合が、CD47細胞外ドメインまたはその変異体を含む融合ポリペプチドの存在下で、競合的に阻害される少なくとも1つ、2つ、3つ、4つまたは5つまたはそれ以上のCD47リガンドは、ウイルスCD47との結合が競合的に阻害されるのと同じ1つ、2つ、3つ、4つまたは5つまたはそれ以上のCD47リガンドではなくともよい。ウイルスCD47ポリペプチドには、単離された完全長ウイルスCD47ポリペプチド、ウイルスCD47細胞外ドメイン、または細胞の表面に発現されたウイルスCD47が含まれる。ウイルスCD47ポリペプチドの例は本明細書に記載されており、関連技術分野では当業者により容易に同定されうる。CD47細胞外ドメインまたはその変異体を含む融合ポリペプチドとCD47リガンドとの結合のレベルを決定するための、本明細書に記載され、当技術分野で実施されているさまざまなアッセイのうち任意のものを、融合ポリペプチドがウイルスCD47ポリペプチドの存在下でリガンドと結合する能力を決定するための形式に変更することができる。そのような変更は当業者によってルーチン的に行われる。
【０１１０】
融合ポリペプチドのFcポリペプチド部分
1つの態様において、CD47細胞外ドメインまたはその変異体を含む融合ポリペプチドはFcポリペプチドと融合される。ムテイン型（mutein）Fcポリペプチド（すなわち、少なくとも1つのアミノ酸の置換、欠失または挿入が導入されたFcポリペプチド、これはFcポリペプチド変異体とも呼ばれる）を含むFcポリペプチドは、免疫グロブリンの定常領域部分に由来する。Fcポリペプチドは、重鎖CH2ドメイン、CH3ドメイン、および重鎖CH1ドメインとCH2との間に位置するヒンジ領域の一部分または全体を含む。歴史的には、Fcフラグメントは免疫グロブリンのパパイン消化によって導き出され、免疫グロブリンのヒンジ領域を含んだ。Fc領域は、共有的（例えば、特にジスルフィド結合）および非共有的な会合によって二量体または多量体の形態として連結されうる単量体ポリペプチドである。Fcポリペプチドのヒンジ部分におけるシステイン残基の数は、免疫グロブリンのクラス（例えば、IgG、IgA、IgE）またはサブクラス（例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2）によって異なり、このため、Fcポリペプチドの単量体サブユニットのヒンジ部分間に形成される分子間ジスルフィド結合の数も異なる。
【０１１１】
1つの態様において、Fcポリペプチドはヒト由来であり、IgGまたはIgAなどの任意の免疫グロブリンクラスから、ならびにヒトIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4などの任意のサブクラスからのものであってよい。ある態様において、FcポリペプチドはヒトIgG1免疫グロブリンに由来する。もう1つの態様において、CD47細胞外ドメイン-Fc融合ポリペプチドは、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ラクダ、サメ、非ヒト霊長動物またはハムスターなど、ただしこれらには限定されない非ヒト動物からのFcポリペプチドを含む。CD47細胞外ドメイン-Fc融合ポリペプチドが投与されるのと同じ種の免疫グロブリンに由来するFcポリペプチドのアミノ酸配列は、非同系宿主からのFcポリペプチドよりも非免疫原性であるか免疫原性が低い可能性が高い。ある他の態様においては、非同系種のFcポリペプチド（例えば、ヒト対象に対する投与のためにヒトCD47細胞外ドメインと融合された非ヒト種由来のFcポリペプチド）に帰せられる特有の性質が望ましいと考えられる。そのようなFcポリペプチドは、非同系宿主に導入された時のFcポリペプチドの免疫原性を低下させるために、アミノ酸置換を導入すること、または何らかの様式でグリコシル化パターンを変化させることなどによって改変することができる。本明細書に記載したように、当技術分野では、例えば、Kabatら（Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th ed (U.S. Dept. of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office, 1991)中）において、さまざまな種の免疫グロブリン配列を得ることができる。分子生物学の当業者は、そのような融合ポリペプチドを、本明細書に記載され、当技術分野でルーチン的に実施されている方法に従って容易に調製することができる。
【０１１２】
1つの態様において、Fcポリペプチドと融合したCD47（例えば、ヒトCD47）細胞外ドメインを含む融合ポリペプチドは、SEQ ID NO：2に示されたアミノ酸配列を含む。他の特定的な態様において、融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、SEQ ID NO：2に対して少なくとも65％〜75％、75％〜80％、80〜85％、85％〜90％または95％〜99％同一な（これには記載した範囲のいずれか1つの間の任意の同一性（％）が含まれる）アミノ酸配列を含む。本明細書で考察したように、融合ポリペプチドのCD47細胞外ドメイン部分は、野生型CD47配列と比較して、少なくとも1つのアミノ酸置換、欠失または挿入を含む。加えて、またはその代わりに、Fcポリペプチド部分は、野生型Fcアミノ酸配列と比較して、少なくとも1つのアミノ酸置換、欠失または挿入を含んでもよい。さらに、Kabatらに記載されているように、すべての免疫グロブリンのFcポリペプチドは、保存的ではあっても、必ずしも同一ではない。このため、天然のFcポリペプチド（すなわち、ヒトまたは非ヒト動物において産生されることが同定されているもの）は必ずしも同一ではなく、例えば、本明細書で開示され、当技術分野で公知である配列のいずれかに示されたアミノ酸配列に対して少なくとも85％、90％または95％同一であってよく、それでも本明細書に記載した融合ポリペプチドを作製するために容易に用いることができる。
【０１１３】
ある態様において、Fcポリペプチドはムテイン型Fcポリペプチド（本明細書ではFcポリペプチド変異体と呼ばれる）であり、それは少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個または10〜15個、16〜25個のアミノ酸の置換、欠失または付加を有する。1つの態様において、ムテイン型Fcポリペプチドは、Fcポリペプチドのヒンジ領域内に少なくとも1、2、3個またはそれ以上のアミノ酸置換、欠失または付加を有する。もう1つの態様において、ムテイン型Fcポリペプチドは、FcポリペプチドのCH2ドメイン内および/またはCH3ドメイン内に少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上のアミノ酸置換、欠失または付加を有する。ムテイン型Fcポリペプチドにはまた、C末端で切り詰められた（少なくとも1、2、3、4、5、10、15、20個またはそれ以上のアミノ酸が除去または欠失を受けた）Fcポリペプチドなどの、Fcポリペプチドの断片も含まれる。
【０１１４】
ある態様において、本明細書に記載したFcポリペプチドは、2つのCD47細胞外ドメイン（またはその変異体）/Fcポリペプチド融合タンパク質が融合ポリペプチドのFc部分間の相互作用を通じて二量体を形成するように、2つの別個の融合タンパク質のFcポリペプチド部分間に鎖間ジスルフィド結合が形成されるのを可能にする、ヒンジ領域内のシステイン残基の少なくとも一部またはすべてなどの複数のシステイン残基を含む。他の態様において、Fcポリペプチドは、Fcポリペプチド融合タンパク質が単量体性であって二量体を形成できないように、ヒンジ領域内のシステイン残基に置換または欠失を含む（例えば、米国特許出願公開第2005/0175614号を参照）。
【０１１５】
Fcポリペプチドは、例えばマレイミドまたはカルビジイミド（carbidiimide）のカップリング化学反応を用いて、2つの別個のアミノ酸含有部分を共有的に連結するために当技術分野で実施される結合手順などによる共有結合を介して、CD47細胞外ドメインと融合させることができる（例えば、Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-37 (1978)も参照）。結合の部位は、配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端、または中央部のいずれでもよい。結合箇所はスルフヒドリル（SH）基またはアミノ基（NH2）でありうる。
【０１１６】
Fcポリペプチド、および任意の1つまたは複数の定常領域ドメイン、および少なくとも1つの免疫グロブリン定常領域ドメインを含む融合タンパク質も、当業者が非常に精通している組換え分子生物学の手法に従って容易に調製することができる。CD47-Fc融合ポリペプチドの免疫原性を最小限にするための1つの手段は、Fc融合ポリペプチドを用いようと意図する動物種に由来するヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を用いて、CD47部分をFcポリペプチドと融合させることである。1つの態様において、Fcポリペプチドはヒト由来であり、例えばヒトIgG1およびIgG2を含む、ヒト免疫グロブリンクラスの任意の1つからのものであってよい。
【０１１７】
ムテイン型FcポリペプチドであるFcポリペプチドは、Fcポリペプチド変異体とも称されうる。そのような1つのFcポリペプチド変異体は、2つの重鎖定常領域ポリペプチド間に形成される可能性のある鎖間ジスルフィド結合の数を減少させるために、1つまたは複数のシステイン残基（鎖間ジスルフィド結合を形成する、ヒンジ領域内の1つまたは複数のシステイン残基など）がセリンなどの別のアミノ酸によって置換されている。例えば、軽鎖定常領域とジスルフィド結合を形成して完全な免疫グロブリン分子を形成する、ヒンジ領域のアミノ末端の最も近位にあるシステイン残基を、例えばセリン残基に置換することができる。または、ヒンジ領域のアミノ末端の最も近位にあるシステイン残基を含む、任意の1つまたは複数のシステイン残基を、Fcポリペプチドのヒンジ領域から除去することもできる。
【０１１８】
1つの態様において、ムテイン型Fcポリペプチドは、Fcポリペプチドのヒンジ領域内の少なくとも1つのシステイン残基の突然変異を含む。ある免疫グロブリンFc部分の場合、置換または欠失を受けるムテイン型Fc内のシステイン残基は、Fcポリペプチドのヒンジ領域のアミノ末端の最も近位にあるシステイン残基である（例えば、野生型ヒトIgG1免疫グロブリンのFc部分のヒンジ領域のアミノ末端の最も近位にあるシステイン残基）。実例を挙げると、ヒトIgG1 Fcポリペプチドのヒンジは、3つのシステイン残基（例えば、SEQ ID NO：6の1、7および10位）を有する。ある態様においては、SEQ ID NO：6の1位のシステイン残基に対応する、ヒトIgG1 Fcポリペプチドのアミノ末端の最も近位にあるシステイン残基が欠失される。または、この位置にあるシステイン残基が、ジスルフィド結合を形成することができない別のアミノ酸、例えばセリン残基によって置換される。
【０１１９】
もう1つの態様において、Fcポリペプチドのヒンジ領域のアミノ末端の最も近位にあるシステイン残基の欠失または置換を含むムテイン型Fcポリペプチドは、カルボキシ末端の方向にある隣接アミノ酸（すなわち、隣接C末端アミノ酸）の欠失または置換をさらに含む。ある態様において、ヒンジ部分のアミノ末端の最も近位にあるシステイン残基および隣接C末端残基はいずれも、ムテイン型Fcポリペプチドのヒンジ領域から欠失される。特定的な態様において、ムテイン型Fcポリペプチドは、SEQ ID NO：6の1位のシステインに対応するシステイン残基の欠失、およびSEQ ID NO：6の2位のアスパラギン酸に対応するアスパラギン酸の欠失を含む。ヒンジ領域内のこれらのシステイン残基およびアスパラギン酸残基の欠失を含むFcポリペプチドは宿主細胞内で効率的に発現させることができ、場合によっては、野生型のシステイン残基およびアスパラギン酸残基を保っているFcポリペプチドよりも細胞内でより効率的に発現される可能性がある。
【０１２０】
他の態様において、Fcポリペプチドは、Fcポリペプチドが免疫細胞の免疫応答性を変化させる能力を増加または強化する、少なくとも1つの（すなわち、1つまたは複数の）置換、欠失または挿入を含みうる。特定の態様においては、CD47細胞外ドメイン-Fcポリペプチド融合タンパク質が免疫細胞の免疫応答性を抑制する能力を強化する、または増加させるために、それ故にある態様においては、融合タンパク質が免疫性疾患または障害を治療する能力を強化するために、アミノ酸の置換、欠失または挿入がFcポリペプチドに導入される。
【０１２１】
ある態様において、Fcポリペプチドは、融合タンパク質のFcポリペプチド部分が、免疫細胞によって発現されたFc受容体と結合する能力が低下するように突然変異を受ける。理論に拘束されることは望まないが、Fcポリペプチドが免疫細胞のFc受容体と結合する能力を減少または消失させることは、免疫細胞の免疫反応性を望ましくない様式で活性化するシグナルを減少、最小化または消失させる可能性がある。
【０１２２】
1つのある態様において、Fcポリペプチドは、グリコシル化されていないFcポリペプチドであってもよい。Fcポリペプチドに存在するN-グリコシル化部位またはO-グリコシル化部位の任意の1つまたは複数を、グリコシル化されうるアミノ酸残基の1つまたは複数の置換または欠失を導入することによって除去することができる。例えば、N結合型グリコシル化部位（すなわち、Asn-X-Ser/Thr、式中、XはProまたはAspを除く任意のアミノ酸である）のアスパラギン残基を別のアミノ酸で置換することができる。SEQ ID NO：2の219位のアスパラギン残基は、グリコシル化されていることが当技術分野で記載されている、ヒトIgG1 Fcポリペプチドの297位のアスパラギン残基に対応する（例示的な野生型ヒトIgG1 Fcポリペプチド配列であるSEQ ID NO：6の78位のAsnを参照）。したがって、例示的なCD47細胞外-Fc融合ポリペプチドは、SEQ ID NO：28に示されたアミノ酸配列を含む。もう1つの態様において、ヒンジ領域のN末端にあるリジン残基（SEQ ID NO6の3位のリジンを参照）が欠失されてもよい（例えば、SEQ ID NO：2における144位に位置するリジン残基の欠失を有するSEQ ID NO：29を参照）。ある他の態様において、Fcポリペプチドは、SEQ ID NO：2の144位のリジン残基のアスパラギン残基の置換、およびSEQ ID NO：2の219位に対応するリジン残基の欠失（または置換）を含む。
【０１２３】
CD47細胞外ドメイン-Fcポリペプチド融合タンパク質が免疫細胞の免疫応答性を変化させる、好ましくは抑制する能力は、CD47部分とFcポリペプチド部分との間へのリンカーポリペプチドの組み入れによって増加または強化することができる。いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、リンカーポリペプチドは、CD47細胞外ドメイン部分（CD47細胞外ドメイン二量体を含む）が免疫細胞と相互作用して細胞の免疫応答性に影響を及ぼすのに、または結果として免疫細胞の免疫応答性に影響を及ぼす、免疫細胞と相互作用する分子と相互作用するのに有効な、またはより有効なコンフォメーションをとるように柔軟性を増加させるか、または制約を除去する。
【０１２４】
FcポリペプチドまたはFcポリペプチド変異体（例えば、ムテイン型Fcポリペプチド）とインフレームに融合したCD47細胞外ドメイン（またはその変異体もしくは断片）は、CD47細胞外ドメインポリペプチドとFcポリペプチドとの間にポリペプチドリンカーまたはスペーサー配列を含みうる。リンカー（またはスペーサー）は、単一のアミノ酸（例えばグリシン残基など）であってもよく、または2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つもしくは10個のアミノ酸であってもよく、または5〜100個の間のアミノ酸、5〜50個、5〜30個もしくは5〜20個の間のアミノ酸といった任意の数のアミノ酸であってもよい。ポリペプチドリンカーにはまた、制限酵素認識部位であるヌクレオチド配列によってコードされる少なくとも2つのアミノ酸を含みうる短いペプチドリンカーも含まれうる。そのような制限酵素認識部位には、例えば、BamHI、ClaI、EcoRI、HindIII、KpnI、NcoI、NheI、PmlI、PstI、SalIおよびXhoIが含まれる。
【０１２５】
したがって、ポリペプチドリンカーは、CD47細胞外ドメイン部分をFcポリペプチド部分から、各ポリペプチド部分が所望の生物活性のために必要な二次および三次構造へと正しくフォールディングすることを補助または保証するのに十分な距離に隔てることができる。一例として、リンカーは、CD47の細胞外ドメインが、CD47リガンドに対する結合部位を形成するために正しい空間的配向を呈することを可能にするべきである。適したポリペプチドリンカーは、機能性タンパク質と相互作用または干渉しうるような秩序立った二次構造を生じる性向を示さず、かつ、機能性CD47ドメインとの望ましくない相互作用を促す恐れのある疎水性または荷電性がわずかである、柔軟性のある伸長性コンフォメーションをとりうる。柔軟性タンパク質領域における典型的な表面アミノ酸には、グリシン（Gly）、アスパラギン（Asn）およびセリン（Ser）が含まれる。Gly、AsnおよびSerを含むアミノ酸配列の事実上あらゆる順列が、ペプチドリンカー配列に関する上記の基準を満たすと考えられる。トレオニン（Thr）およびアラニン（Ala）といった他のほぼ中性のアミノ酸をリンカー配列中に用いてもよい。適したポリペプチドリンカー（またはスペーサーペプチド）は5〜100個のアミノ酸を含むことができ、ある態様においては5〜20アミノ酸の長さを含む。そのようなリンカーには、（Gly4 Ser（SEQ ID NO：30））n、式中、n＝1〜12またはn＝1〜8またはn＝1〜4；Gly4 SerGly5 Ser（SEQ ID NO：31）および（Gly4 SerGly5 Ser）（SEQ ID NO：31）m、式中m＝2〜4、が非限定的に含まれる。また、それぞれn＝1および2であるFcポリペプチド（Gly4 Ser）リンカーと融合したヒトCD47細胞外ドメインを含むSEQ ID NO：32および33も参照のこと。
【０１２６】
本明細書に記載したように、ある態様において、CD47細胞外ドメインまたはその変異体と融合されるムテイン型Fcポリペプチドは、Fcポリペプチドのヒンジ領域のアミノ末端の最も近位にあるシステイン残基の置換または欠失、および隣接アスパラギン酸残基（FcポリペプチドのC末端の方向）の欠失を含む。他の態様において、融合ポリペプチドはさらに、ムテイン型FcポリペプチドがIgFc受容体と結合する能力を低下させる、FcポリペプチドのCH2ドメインにおける少なくとも1つ、2つまたは3つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含みうる。特定的な態様において、CH2ドメインにおける少なくとも1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換は、EU番号による234、235および/または237位に対応する位置にあるアミノ酸の置換である。
【０１２７】
もう1つの態様において、ムテイン型Fcポリペプチドは、Fcポリペプチドのエフェクター機能のレベルが低下するように、エフェクター機能に関与する少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つまたはそれ以上のアミノ酸が置換または欠失を受けているFcポリペプチド変異体である。免疫グロブリンのFc部分は、免疫グロブリンのある種のエフェクター機能を媒介する。Fc領域と関連のあるエフェクター機能の3つの一般的カテゴリーには、（1）古典的補体カスケードの活性化、（2）エフェクター細胞との相互作用、および（3）免疫グロブリンの区画化が含まれる。そのようなムテイン型Fcポリペプチドはまた、本明細書に記載したヒンジ領域内に突然変異を含んでもよく、かつ/またはFcポリペプチドのグリコシル化パターンを変化させる1つもしくは複数の突然変異を含んでもよい。
【０１２８】
Fc領域内のアミノ酸を、Fcポリペプチドと補体カスケードの成分との結合を低下もしくは消失させるため（例えば、Duncan et al., Nature 332:563-64 (1988)；Morgan et al., Immunology 86:319-24 (1995)を参照）；またはFcポリペプチドが免疫細胞によって発現されたIgG Fc受容体と結合する能力を低下もしくは消失させるため（Wines et al., J. Immunol. 164:5313-18 (2000)；Chappel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9036 (1991)；Canfield et al., J. Exp. Med. 173:1483 (1991)；Duncan et al., 前記）；または抗体依存性細胞傷害性を変化させるために、置換することもできる。野生型Fcポリペプチドと異なるそのようなFcポリペプチド変異体は、本明細書においてムテイン型Fcポリペプチドとも呼ばれる。
【０１２９】
1つの態様において、CD47細胞外ドメインまたはその変異体は、野生型Fc領域ポリペプチドにおいてFcポリペプチドまたは免疫グロブリンとある種の免疫細胞上に発現された1つまたは複数のIgG Fc受容体との結合に寄与する残基の少なくとも1つの置換を含むFcポリペプチドと融合される。そのようなムテイン型Fcポリペプチドは、融合ポリペプチドが、免疫細胞の表面に存在するIgG Fc受容体などのIgG Fc受容体と結合する能力が低下するように、ムテイン型FcポリペプチドのCH2ドメイン内のアミノ酸残基の少なくとも1つの置換を含む。
【０１３０】
背景として、ヒト白血球上には、構造的および機能的な性質ならびに抗原構造によって区別される3つの異なるタイプのFc IgG受容体が発現され、それらの違いはCD特異的モノクローナル抗体によって検出される。これらのIgG Fc受容体はFcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）およびFcγRIII（CD16）と命名されており、白血球の部分的に重複するサブセット上に差異を伴って発現される。
【０１３１】
単球、マクロファージ、好中球、骨髄前駆細胞および樹状細胞上で発現される高親和性受容体であるFcγRI（CD64）は、アイソフォームIaおよびIbを含む。アイソフォームIIa、IIb1、IIb2、IIb3およびIIcで構成されるFcγRII（CD32）は、最も広く分布しているヒトFcγRのタイプである低親和性受容体である；それは大部分のタイプの白血球、ならびにランゲルハンス細胞、樹状細胞および血小板上で発現される。FcγRIII（CD16）は2つのアイソフォームを有し、両方ともヒトIgG1およびIgG3と結合することができる。FcγRIIIaアイソフォームはIgGに対して中程度の親和性を有し、マクロファージ、単球、ナチュラルキラー（NK）細胞、およびT細胞のサブセット上で発現される。FcγRIIIbはIgGに対する低親和性受容体であり、好中球上で選択的に発現される。
【０１３２】
IgG Fc受容体の結合に寄与するCH2ドメインのアミノ末端部分における残基には、Leu234-Ser239（Leu-Leu-Gly-Gly-Pro-Ser（SEQ ID NO：21）（EU番号方式、Kabat et al., 前記）の間の位置にある残基が含まれる（例えば、Morgan et al., Immunology 86:319-24 (1995)およびそこに引用された参考文献を参照）。IgG免疫グロブリンにおけるこれらのアミノ酸の位置は、IgG Fc受容体と結合するIgG免疫グロブリンのFc部分の残基に言及する時に抗体の技術分野で広く用いられている命名法である、EU番号方式を用いて指定されている。残基Leu234-Ser239は、ヒトIgG1 Fcポリペプチド（SEQ ID NO：6）のアミノ酸配列の15〜20位に対応する。CH2ドメイン内のこれらの6つの位置のうち1つまたは複数（すなわち、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つすべて）のアミノ酸の置換は、FcポリペプチドがIgG Fc受容体（またはそのアイソフォーム）の1つまたは複数と結合する能力の低下をもたらす（例えば、Burton et al., Adv. Immunol. 51:1 (1992)；Hulett et al., Adv. Immunol. 57:1 (1994)；Jefferis et al., Immunol. Rev. 163:59(1998)；Lund et al., J. Immunol. 147:2657 (1991)；Sarmay et al., Mol. Immunol. 29:633 (1992)；Lund et al., Mol. Immunol. 29:53 (1992)；Morgan et al., 前記を参照）。EU 234〜239位の1つまたは複数のアミノ酸の置換に加えて、この領域に隣接する1つ、2つまたは3つまたはそれ以上のアミノ酸（239位のカルボキシ末端側または234位のアミノ末端側）を置換してもよい。
【０１３３】
一例として、235位（SEQ ID NO：6の16位に対応する）にあるロイシン残基のグルタミン酸残基またはアラニン残基による置換は、FcγRIに対する免疫グロブリン（ヒトIgG3など）の親和性をそれぞれ消失または低下させる（Lund et al., 1991, 前記；Canfield et al., 前記；Morgan et al., 前記）。もう1つの例として、234および235位（SEQ ID NO：6の15および16位に対応）にあるロイシン残基の、例えばアラニン残基による置き換えは、FcγRIIaに対する免疫グロブリンの結合を消失させる（例えば、Wines et al., 前記を参照）。または、234位（SEQ ID NO：6の15位に対応）のロイシン、235位（SEQ ID NO：6の16位に対応）のロイシンおよび237位（SEQ ID NO：6の18位に対応）のグリシンのそれぞれを異なるアミノ酸によって置換してもよく、例えば234位のロイシンをアラニン残基（L234A）によって置換すること、235位のロイシンをアラニン残基（L235A）またはグルタミン酸残基（L235E）によって置換すること、および237位のグリシン残基を別のアミノ酸、例えばアラニン残基（G237A）によって置換することができる。
【０１３４】
1つの態様において、CD47細胞外ドメイン（またはその変異体）とインフレームに融合したムテイン型Fcポリペプチドは、本明細書に記載したようなヒトIgG1 CH2ドメインの234〜239位（EU番号方式）に対応するSEQ ID NO：6の15〜20位に、1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つの突然変異を含む。例示的なムテイン型Fcポリペプチドは、（L234A）、（L235E）および（G237A）に対応する置換がSEQ ID NO：7の13、14および16位に見られる、SEQ ID NO：7に示されたアミノ酸配列を有する。
【０１３５】
特定的な態様において、ムテイン型Fcポリペプチドは、野生型Fcポリペプチド（SEQ ID NO：6）とは異なる、SEQ ID NO：6の1位のシステイン残基が欠失され、SEQ ID NO：6の2位のアスパラギン酸が欠失され、SEQ ID NO：6の15位のロイシン残基がアラニン残基によって置換され、16位のロイシン残基がグルタミン酸残基によって置換され、18位のグリシンがアラニン残基によって置換されている、SEQ ID NO：7に示されたアミノ酸配列を含む。すなわち、例示的なムテイン型Fcポリペプチドは、そのアミノ末端部分に
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のアミノ酸配列を含む（例示的なFcムテイン型配列である、SEQ ID NO：7を参照）。すなわち、例示的なFcムテイン型ポリペプチドは、ヒンジのアミノ末端の最も近位にあるシステイン残基の欠失、このシステインに隣接するアスパラギン酸残基の欠失、ならびにEU234、EU235およびEU237に対応する位置にあるアミノ酸の置換を含む。
【０１３６】
他のFc変異体には、ごくわずかな変化、例えば限定的ではないものの実例を挙げると共有結合性化学修飾、挿入、欠失および/または置換を有し、さらに保存的置換を含みうる、公知のFcポリペプチド配列と類似したアミノ酸配列が含まれる。互いに類似したアミノ酸配列は、配列相同性のある共通の領域をかなり多く有しうる。同様に、Fc変異体をコードするヌクレオチド配列にも、ごくわずかな変化、例えば限定的ではないものの実例を挙げると共有結合性化学修飾、挿入、欠失および/または置換を有し、さらに遺伝暗号の縮重性に起因するサイレント突然変異を含みうる、かなり類似したヌクレオチド配列が含まれる。互いに類似したアミノ酸配列は、配列相同性のある共通の領域をかなり多く有しうる。
【０１３７】
さまざまな種由来の免疫グロブリンのさまざまなクラスおよびアイソタイプからのFcポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が公知であり、GenBankデータベースおよびKabat（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th ed.中 (U.S. Dept. of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office, 1991)、同じく使用許諾により入手可能なオンラインのKabatデータベースのアップデートも参照のこと）で入手可能である。これらのポリヌクレオチド配列の任意のもの（または関心対象のFcポリペプチドをコードする任意の縮重ポリヌクレオチド配列）は、当業者によってルーチン的に実施されている分子生物学方法に従って組換え構築物を調製するために用いることができる。CD47細胞外ドメイン（またはその変異体）を含む融合ポリペプチドが投与される宿主または対象におけるFcポリペプチドの免疫原性を最小限にするためには、Fcポリペプチドの配列は典型的には同じ種の免疫グロブリンから選択され、すなわち、例えばヒトFcポリペプチド配列はヒトCD47細胞外ドメインまたはその変異体と融合され、それがヒト対象または宿主に対して投与されると考えられる。
【０１３８】
他の態様において、融合ポリペプチドは、上記のムテイン型Fcポリペプチドのいずれか1つと融合した、本明細書に記載したようなウイルスCD47細胞外ドメインまたはその変異体を含む。
【０１３９】
ムテイン型Fcポリペプチドと融合したCD47細胞外ドメインを含む融合ポリペプチドの生産
Fcポリペプチドもしくはその変異体とインフレームに融合したCD47細胞外ドメインもしくはその変異体を含む、またはFcポリペプチドもしくはその変異体とインフレームで癒合したウイルスCD47細胞外ドメインもしくはその変異体を含む、本明細書に記載した融合ポリペプチドの任意の1つを、本明細書において記載され、当技術分野においてルーチン的に実施されている方法に従って生産、作製または製造することができる。ある態様において、融合ポリペプチドは組換え融合ポリペプチドである。組換え発現構築物は、分子生物学の技術分野の当業者によって実施される標準的な手法および方法に従って融合ポリペプチドの発現のために調製することができる。効率的な転写および翻訳を得るために、各構築物中のポリヌクレオチド配列は、CD47細胞外ドメインまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列と機能的に連結した適切な調節配列、特にプロモーターおよびリーダー配列を含み、またはそれらをCD47細胞外ドメインのアミノ末端に位置するシグナルペプチド配列をコードするヌクレオチド配列と機能的に連結させてもよい。CD47細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチドはさらに、CD47細胞外ドメインまたはその変異体とインフレームに発現される、ムテイン型Fcポリペプチドを含むFcポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。加えて、本明細書に記載したように、ポリヌクレオチドは、CD47部分とFcポリペプチド部分との間にポリペプチドリンカー（またはスペーサーペプチドもしくはポリペプチド）をインフレームにコードしてもよい。
【０１４０】
数多くのベクターが、組換え発現構築物のクローニングおよび調製用に製造供給元から販売されている。ポリペプチドを組換え的に生産するための方法および手法は一般に周知であり、ルーチン的に用いられている。例えば、分子生物学の手順は、Sambrookら（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989；同じくSambrook et al., 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (2001)も参照のこと）によって記載されている。本明細書に記載したように、ある態様において、融合ポリペプチドはさらに、CD47細胞外ドメインまたはその変異体とFcポリペプチドとの間にリンカーまたはスペーサーポリペプチド配列（本明細書に記載したようにポリペプチド配列はペプチド配列を含むものとする）。当業者はリンカー（またはスペーサー）をコードするポリヌクレオチド配列を容易に調製することができ、そのリンカーは単一のアミノ酸（例えばグリシン残基）でもよく、または2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つもしくは10個のアミノ酸でもよく、または5〜100個のアミノ酸、ある態様においては5〜20個のアミノ酸の間の任意の数のアミノ酸であってもよく、それらは本明細書においてさらに詳細に説明されている。ポリペプチドリンカーはまた、制限酵素認識部位であるヌクレオチド配列によってコードされる少なくとも2つのアミノ酸であるペプチドリンカーなどの短いペプチドを含んでもよい。そのような制限酵素認識部位の例には、例えば、BamHI、ClaI、EcoRI、HindIII、KpnI、NcoI、NheI、PmlI、PstI、SalIおよびXhoIが含まれる。
【０１４１】
組換え発現構築物は、分子生物学の技術分野の当業者によって実施される標準的な手法および方法に従って融合ポリペプチドの発現のために調製することができる。効率的な転写および翻訳を得るためには、各構築物中のポリヌクレオチド配列は、適切な調節配列、特にCD47細胞外ドメインまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列と機能的に連結したプロモーターおよびリーダー配列を含むべきであり、またはそれらをCD47細胞外ドメインのアミノ末端に位置するシグナルペプチド配列をコードするヌクレオチド配列と機能的に連結させてもよい。ポリペプチドを組換え的に生産するための具体的な方法は一般に周知であり、ルーチン的に用いられている。例えば、分子生物学の手順は、Sambrookら（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989；同じくSambrook et al., 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (2001)も参照のこと）によって記載されている。
【０１４２】
当技術分野でルーチン的に実施されている方法に従って調製された組換え構築物は、種々の形質転換、トランスフェクションまたは形質導入法のいずれか1つを介して宿主細胞に導入することができる。適した宿主細胞には、原核細胞、昆虫細胞、酵母細胞および高等真核細胞（哺乳動物細胞を含む）が含まれる。ある他の態様において、融合ポリペプチドは、真核宿主細胞、酵母（例えば、サッカロミセス-セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）およびピキア-パストリス（Pichia pastoris）など）；動物細胞（哺乳動物細胞を含む）または植物細胞で発現させることができる。適した動物細胞の例には、例えば、COS細胞、CHO細胞またはHEK293細胞が含まれる。植物細胞の例には、タバコ、トウモロコシ、ダイズおよびイネの細胞が含まれる。当業者に公知であって本開示に基づく方法を用いることにより、外来配列を特定の宿主系で発現させるために核酸ベクターをデザインし、続いて融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を挿入することができる。調節エレメントは個々の宿主によって異なると考えられる。例えば、製造供給元、例えばInvitrogen（Carlsbad, CA）；Stratagene（San Diego, CA）；およびBioCarta Inc.（San Diego, CA）によって提供されている製品および方法を参照のこと。
【０１４３】
CD47 Fc融合ポリペプチドを製造するための方法も本明細書において提供される。上記の方法を、CD47 Fcポリペプチド融合タンパク質のより大規模な製造のために適合させることもできる。ポリペプチドの製造は、そのようなポリペプチドを発現する宿主細胞をバイオリアクターの中で増殖させる段階を含み、そのリアクターは、宿主細胞が付着する基質も含んでよく、理論に拘束されることは望まないが、それは高密度の細胞培養物を可能にする。
【０１４４】
CD47と特異的に結合する抗体およびCD47リガンドと特異的に結合する抗体
同じく本明細書において提供されるのは、CD47の細胞外ドメインと特異的に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントである。本明細書に記載した抗CD47抗体は、CD47リガンドとCD47との結合を競合的に阻害し、CD47リガンドとウイルスCD47（すなわち、ウイルスCD-47様ポリペプチド）との結合を競合的に阻害する。CD47リガンドには、例えば、SIRP-α、SIRP-β-2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリンが含まれる。理論に拘束されることは望まないが、ウイルスCD47とCD47リガンドとの結合を競合的に阻害する抗体またはその抗原結合フラグメントは、ウイルスCD47が、ウイルスCD47をコードするゲノムを含むポックスウイルスに感染した宿主によって発現された時に起こるのと類似した免疫抑制効果を示す。したがって、他の態様においては、CD47リガンドと特異的に結合して、ウイルスCD47とCD47リガンドとの結合を阻害する抗体およびその抗原結合フラグメントが本明細書において提供される。CD47リガンドに対して特異的な抗体とは、1つのCD47リガンドと特異的に結合する抗体を意味すると解釈され、すなわち、CD47リガンドであるSIRP-αと特異的に結合する抗体が提供される。異なる抗体およびその抗原結合フラグメントは、トロンボスポンジン-1などの第2のCD47リガンドと特異的に結合する。すなわち、抗体またはその抗原結合フラグメントがCD47リガンドと結合する抗体として本明細書で言及される場合には、これは抗体が単一の特異性を有し、複数のCD47リガンドとは結合しないことを意味する。
【０１４５】
そのような抗体またはその抗原結合フラグメントは、宿主の免疫応答をモジュレートまたは変化させることができ、特に、免疫学的疾患または障害、例えば炎症性または自己免疫性の疾患または障害において呈示される免疫応答を阻害すること、抑制すること、またはその程度を減少させることができる。ある態様において、抗CD47抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗CD47リガンド抗体もしくはその抗原結合フラグメントは、アクセサリー細胞がサイトカインを放出する、および/または成熟する能力を変化させる。CD47と特異的に結合する抗体、またはCD47リガンドと特異的に結合する抗体は、免疫細胞の免疫応答性を変化させる（統計学的に有意または生物学的に有意な様式で強化または抑制する）能力を有しうる。そのような抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下の任意の1つまたは複数（またはその少なくとも1つ）を含む生物機能または作用を生じさせることによって、免疫細胞の免疫応答性を変化させること、またはそれに影響を及ぼすことができる：樹状細胞の成熟を阻害すること；ナイーブT細胞のTh1エフェクター細胞への発生を損なわせること；樹状細胞によるサイトカイン放出を抑制すること；細胞遊走を変化させること；少なくとも1つのサイトカイン、例えばTNF-α、IL-12、IL-23、IFN-γ、GM-CSFおよびIL-6のうち少なくとも1つの産生を阻害すること；樹状細胞の成熟を阻害すること；ナイーブT細胞のTh1エフェクター細胞への発生を損なわせること；樹状細胞によるサイトカイン放出を抑制すること；ケモカイン、例えばMIP-1αの産生を阻害すること；および炎症誘発性応答を阻害すること。そのコグネイトCD47リガンドと特異的に結合する抗CD47リガンド抗体も、CD47リガンドに起因する機能の活性を阻害することができる。
【０１４６】
ウイルスCD47は、本明細書に記載した、または当技術分野で公知であるポックスウイルスCD47様ポリペプチドの任意の1つであってよい。ウイルスCD47様ポリペプチドをコードするウイルスゲノム配列は、粘液腫およびオルソポックスウイルス、ならびにコルドポックスウイルス、カプリポックスウイルス、レポリポックスウイルス、スイポックスウイルス、ヤタポックスウイルスおよびシカポックスウイルスを含む、いくつかのポックスウイルスにおいて同定されている。ポックスウイルスCD47様ポリペプチドの例示的なアミノ酸配列には、小痘瘡ウイルスのゲノムによってコードされるA44Lポリペプチド（GenBankアクセッション番号CAB54747.1（SEQ ID NO：3））；ワクシニアウイルス-Western Reserve株（GenBankアクセッション番号AAO89441.1）；ワクシニアウイルス（改変ウイルスAnkara）（GenBankアクセッション番号AAT10547.1）；および粘液腫ウイルスM128Lポリペプチド（GenBankアクセッション番号NP_051842.1およびAAF15016.1）が含まれる。
【０１４７】
CD47と特異的に結合する、またはCD47リガンドと特異的に結合する、本明細書に記載した抗体および抗原結合フラグメントは、免疫細胞の免疫応答性を変化させるために有用な可能性があり、その結果として免疫学的疾患もしくは障害、心血管疾患もしくは障害、代謝性疾患もしくは障害、または増殖性疾患もしくは障害を治療または予防するために有用な可能性がある。免疫学的疾患または障害は自己免疫性疾患または炎症性疾患であってもよい。ある態様において、免疫学的疾患または障害は、多発性硬化症、関節リウマチ、脊椎関節症、全身性エリテマトーデス、抗体介在性の炎症性もしくは自己免疫性疾患、移植片対宿主病、敗血症、糖尿病、乾癬、アテローム性動脈硬化症、シェーグレン症候群、進行性全身性硬化症、強皮症、急性冠症候群、虚血再灌流、クローン病、子宮内膜症、糸球体腎炎、重症筋無力症、特発性肺線維症、喘息、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、血管炎、または炎症性自己免疫性筋炎である。脊椎関節症には、例えば、強直性脊椎炎、反応性関節炎、炎症性腸疾患に伴う腸疾患性関節炎、乾癬性関節炎、孤発性急性前部ブドウ膜炎、未分化型脊椎関節症、ベーチェット症候群および若年性特発性関節炎が含まれる。本明細書に記載した融合ポリペプチドはまた、アテローム性動脈硬化症、心内膜炎、高血圧または末梢性虚血性疾患などの心血管疾患または障害を治療するために有用な可能性もある。
【０１４８】
本明細書に記載したように、抗CD47抗体または抗CD47リガンド抗体は、免疫学的疾患もしくは障害、心血管疾患もしくは障害、代謝性疾患もしくは障害または増殖性疾患もしくは障害を治療または予防する、阻害する、その進行を遅らせる、またはそれに伴う症状を軽減するために有用な可能性がある。免疫学的障害には、炎症性疾患または障害、および自己免疫性疾患または障害が含まれる。炎症または炎症反応は、損傷に対する宿主の正常な防御的反応であるが、炎症は望ましくない損害を引き起こす恐れがある。例えば、アテローム性動脈硬化症は、少なくとも部分的には、動脈損傷に対する病的反応および結果として起こる炎症カスケードである。免疫学的疾患/障害ともみなされる疾患または障害を含みうる、治療しうる可能性のある心血管疾患または障害には、例えば、アテローム性動脈硬化症、心内膜炎、高血圧または末梢性虚血性疾患が含まれる。代謝性疾患または障害には、糖尿病、肥満、ならびにミトコンドリア機能の異常または変化と関連のある疾患および障害が含まれる。
【０１４９】
本明細書に記載したようなCD47細胞外ドメインまたはその変異体を含む融合ポリペプチドの任意の1つまたは複数を、抗体を含む試料、例えば、融合ポリペプチドの1つまたは複数に対して特異的な1つまたは複数の抗体を含む可能性のある、精製抗体、抗血清もしくは細胞培養上清の試料、または任意の他の生物試料をスクリーニングするための方法に用いることもできる。また、CD47細胞外ドメインまたはその変異体を含む融合ポリペプチドの1つまたは複数を、生物試料から、CD47の細胞外ドメインと特異的に結合する抗体を産生する1つまたは複数のB細胞を同定および選択するための方法に用いることもできる（例えば、プラーク形成アッセイなど）。続いてB細胞を、当技術分野で公知であって本明細書に記載される組換え分子生物学の手法によってクローニングおよび/または改変することができる、特異的抗体をコードするポリヌクレオチドの供給源として用いることができる。
【０１５０】
本明細書で用いる場合、抗体は、それが検出可能なレベルでCD47細胞外ドメイン（またはその変異体）と反応し、好ましくは、親和定数Kaが好ましくは約104 M-1を上回るかそれと等しい、または約105 M-1を上回るかそれと等しい、または約106 M-1を上回るかそれと等しい、約107 M-1を上回るかそれと等しい、または108 M-1を上回るかそれと等しいならば、CD47細胞外ドメイン（またはその変異体）と「免疫特異的な」、「特異的な」または「特異的に結合する」という。抗体のそのコグネイト抗原に対する親和性は一般に解離定数KDとしても表され、抗CD47細胞外ドメイン（またはその変異体）抗体は、例えば、それが約10-4M未満であるかそれと等しい、または約10-5Mであるかそれと等しい、または約10-6M未満であるかそれと等しい、約10-7M未満であるかそれと等しい、10-8M未満であるかそれと等しいKDで結合するならば、CD47リガンドと特異的に結合するという。
【０１５１】
結合パートナーまたは抗体の親和性は、容易に決定することができる。従来の手法、例えば、Scatchardら（Ann. N. Y. Acad. Sci. USA 51:660 (1949)）によって記載されたものを用いて、および表面プラズモン共鳴（SPR；BIAcore（商標）, Biosensor, Piscataway, NJ）によって容易に決定しうる。表面プラズモン共鳴のためには、標的分子を固相上に固定化して、フローセルに沿って流れる移動相中にあるリガンドに対して曝露させる。固定化された標的に対するリガンド結合が起これば、局所屈折率が変化してSPR角の変化を招き、反射光の強度の変化を検出することによってそれをリアルタイムにモニターすることができる。表面プラズモン共鳴シグナルの変化の速度を分析して、結合反応の会合相および解離相に関する見かけの速度定数を得ることができる。これらの値の比により、見かけの平衡定数（親和性）が与えられる（例えば、Wolff et al., Cancer Res. 53:2560-65 (1993)を参照）。
【０１５２】
CD47（特にCD47細胞外ドメイン）に対する抗体の結合性、またはCD47リガンドと結合する抗体の結合性は、一般に、例えば、固相酵素免疫アッセイ（ELISA）、免疫沈降、免疫ブロット法、対向流免疫電気泳動法、ラジオイムノアッセイ、ドットブロットアッセイ、阻害または競合アッセイなどを含む免疫検出法を用いて決定および評価することができ、それらは当業者によって容易に実施される（例えば、米国特許第4,376,110号および第4,486,530号；Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)を参照）。イムノアッセイ法は、抗体がCD47と特異的に結合し、関連のないポリペプチドとは認識も交差反応もしないことを明らかにするための対照および手順を含みうる。同様に、イムノアッセイ法は、抗体がCD47リガンドと特異的に結合し、関連のないポリペプチドとは認識も交差反応もしないことを明らかにするための対照および手順を含みうる。加えて、特定の担体ポリペプチドと結合させたCD47またはCD47細胞外ドメインによる宿主の免疫処置に反応して産生された抗CD47抗体の検出のために行われるイムノアッセイは、免疫処置用の担体ポリペプチドと特異的に結合する抗体の検出を低下または排除するための免疫処置用に用いられるものとは異なる担体ポリペプチドの使用を取り入れることもできる。または、担体分子と結合していないCD47またはCD47細胞外ドメインを、免疫特異的抗体を検出するためのイムノアッセイに用いることもできる。
【０１５３】
抗体は一般に、当業者に公知のさまざまな手法の任意のものによって調製することができる。例えば、Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)；Peterson, ILAR J. 46:314-19 (2005))を参照のこと。単離されたCD47、CD47の細胞外ドメイン、そのペプチドもしくは断片、またはCD47を発現する細胞を、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の産生のために動物を免疫処置するための免疫原として用いることができる。
【０１５４】
免疫原は細胞外領域の一部分を含んでよく、それは免疫細胞の免疫応答性を変化させる（統計学的に有意または生物学的に有意な様式で増加または減少させる、好ましくは減少させる）ことができる抗体またはその抗原結合フラグメントを生成させるため、および/または同定するために用いることができる。例示的なペプチド免疫原は、CD47細胞外ドメインの6、7、8、9、10、11、12、20〜25、21〜50、26〜30、31〜40、41〜50、51〜60、61〜70または71〜75個の連続したアミノ酸を含みうる。同様に、ペプチド免疫原をCD47リガンドの細胞外ドメインから調製することもできる。
【０１５５】
免疫原として有用なCD47の細胞外ドメインのペプチドおよび断片には、CD47リガンドが結合する結合部位を有する、細胞外ドメインの部分が含まれる。CD47リガンド結合部位、またはリガンド結合部位の部分のアミノ酸配列を決定するための1つの方法には、ペプチドマッピングの手法が含まれる。例えば、種々のプロテアーゼの任意の1つまたは複数を用いたCD47の細胞外ドメインのタンパク質分解消化によってペプチドをランダムに生成させ、ペプチドを分離および/または単離して（例えば、ゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィーにより）、その後にどのペプチドにCD47リガンドが結合するかを決定し、続いてペプチドのシークエンシングを行う。また、CD47細胞外ドメインペプチドを、本明細書に記載され、当技術分野で実施されている組換え法を用いて生成させることもできる。組換え法によってランダムに生成されたペプチドは、本明細書および当技術分野において記載されているようなペプチドコンビナトリアルライブラリーまたはファージライブラリーを調製するために用いることもできる。または、CD47リガンドと相互作用するCD47の細胞外ドメインの部分のアミノ酸配列を、CD47もしくはその部分、例えば細胞外部分のコンピュータモデル化によって、ならびに/またはX線結晶解析（これにはCD47細胞外ドメインのみの、または細胞外ドメインCD47-CD47リガンド複合体の結晶の調製および解析が含まれうる）によって決定することもできる。その反対に、免疫原として有用なCD47リガンドの細胞外ドメインのペプチドおよび断片には、CD47および/またはvCD47が結合する結合部位を有する細胞外ドメインの部分が含まれ、それはCD47ペプチドに対して上記のように同定することができる。
【０１５６】
また、CD47細胞外ドメインの免疫原性ペプチド（またはCD47リガンド細胞外ドメインの免疫原性ペプチド）を、ドメインのアミノ酸配列のコンピュータ解析で親水性プロットを決定して、決定することもできる。抗体が接近しうる細胞外ドメインの部分は、水性環境内で接触する可能性が最も高いタンパク質の部分であり、親水性である。親水性の領域は、当業者が利用しうるコンピュータプログラムを用いて決定することができ、それはタンパク質中の各アミノ酸に対して「親水性指数」を割り当て、続いてプロファイルをプロットする。
【０１５７】
動物への注射用の免疫原、特にポリペプチド断片またはペプチドの調製には、CD47細胞外ドメイン（またはその変異体）またはペプチド（またはCD47リガンド細胞外ドメインもしくはそのペプチド）を、別の免疫原性タンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）またはウシ血清アルブミン（BSA）などの担体タンパク質と共有結合させることが含まれうる。ポリペプチドまたはペプチド免疫原は、結合手順を容易にする1つまたは複数の追加的アミノ酸（例えば、ペプチドとKLHとの結合を容易にするシステイン）をN末端またはC末端に含んでもよい。ポリペプチドまたはペプチドの内部の他のアミノ酸残基を、その特定のアミノ酸位置での担体ポリペプチドとの結合を防ぐために置換してもよく（例えば、ポリペプチド/ペプチドの内部位置にあるシステインをセリン残基に置換する）、または溶解性を促進するため、または免疫原性を高めるために置換してもよい。
【０１５８】
CD47と特異的に結合する抗体およびCD47リガンドと特異的に結合する抗体は、任意の免疫グロブリンクラス、例えばIgG、IgE、IgM、IgDまたはIgAに属してよい。それは、動物、例えば、鳥類（例えば、ニワトリ）およびマウス、ラット、ハムスター、ウサギまたは他の齧歯動物、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ヒトまたは他の霊長動物を非限定的に含む哺乳動物から入手すること、または得ることができる。抗体は内部移行する抗体であってよい。1つのそのような手法では、動物に、ポリクローナル抗血清を生じさせるために、例えば本明細書に記載したような細胞外ドメインまたはその断片を抗原として免疫処置する。適した動物には、例えばウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシが含まれ、マウス、ラットおよびハムスターなどのより小型の哺乳動物種、または他の種も含まれうる。
【０１５９】
CD47またはCD47リガンドなどの抗原と特異的に結合するポリクローナル抗体は、本明細書に記載され、当業者によって実施されている方法を用いて調製することができる（例えば、Green et al.,“Production of Polyclonal Antisera,”Immunochemical Protocols (Manson, ed.), pages 1-5 (Humana Press 1992)中；Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)；Williams et al.,“Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies,”DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), page 15 (Oxford University Press 1995)中、を参照）。ポリクローナル抗体は典型的にはラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ウシまたはヒツジなどの動物において産生されるが、抗体を類人猿から入手することもできる。診断的および治療的に有用な抗体をヒヒに産生させるための一般的な手法は、例えば、国際特許出願公開第WO 91/11465号（1991）およびLosman et al., Int. J. Cancer 46:310, 1990に記載がある。
【０１６０】
加えて、免疫原として用いられる抗原（CD47、CD47細胞外ドメインポリペプチド、その断片もしくはペプチド、またはCD47を発現する細胞；CD47リガンド、リガンドの細胞外ドメインまたはリガンドを発現する細胞）を、アジュバント中に乳化させることもできる。例えば、Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)を参照のこと。非ヒト動物の免疫処置のために典型的に用いられるアジュバントには、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、モンタニドISA、Ribiアジュバント系（RAS）（Corixa Corporation, Seattle, WA）およびニトロセルロース吸着抗原が非限定的に含まれる。免疫原は、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮内、眼内または皮下を含む種々の経路のうち任意のいくつかを介して動物に注射することができる。一般に、初回注射の後に、動物は、とりわけ抗原、アジュバント（用いる場合）および/または動物によって異なると思われる好ましい計画に従って、1回または複数回の追加免疫処置を受ける。免疫応答は、動物から定期的に採血し、収集した血液から血清を単離して、特異的抗体価を決定するためのELISAまたはオクタロニー拡散アッセイなどのイムノアッセイで血清を分析することによってモニターされる。十分な抗体価が立証されたところで、ポリクローナル抗血清を蓄積するために動物から定期的に採血する。続いて、そのような抗血清から、抗原と特異的に結合するポリクローナル抗体を、例えば、適した固体支持体上に固定化されたプロテインAまたはプロテインGを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製する（例えば、Coligan, 前記, p.2.7.1-2.7.12；2.9.1-2.9.3；Baines et al., Purification of Immunoglobulin G (IgG), Methods in Molecular Biology, 10:9-104 (The Humana Press, Inc. (1992)中、を参照）。または、抗原もしくはその断片、または免疫処置を受けた特定の動物種のIg定常領域に対して特異的な抗体を適した固体支持体上に固定化して、アフィニティークロマトグラフィーを行うこともできる。
【０１６１】
また、CD47、特にCD47細胞外ドメインと特異的に結合するモノクローナル抗体、またはCD47リガンドに対して特異的なモノクローナル抗体、および所望の結合特異性を有するモノクローナル抗体を産生する、不死真核細胞株の例であるハイブリドーマを、例えば、Kohler and Milsteinの手法（Nature, 256:495-97 (1976), Eur. J. Immunol. 6:511-19 (1975)）およびそれに対する改良法（例えば、Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, 1:2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991)；米国特許第4,902,614号、第4,543,439号および第4,411,993号；Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett et al. (eds.) (1980)；およびAntibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)を参照；同じく、例えば、Brand et al., Planta Med. 70:986-92 (2004)；Pasqualini et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:257-59 (2004)も参照のこと）を用いて調製できる。動物、例えばラット、ハムスターまたはより一般的にはマウスを、上記のように調製した免疫原によって免疫処置する。特異的抗体の産生は、初回注射（注射はポリクローナル抗体の生成のための本明細書に記載したようないくつかの経路のいずれか1つによって投与しうる）後および/または追加注射後に、血清試料を入手して、当技術分野で公知であり、本明細書に記載されたいくつかの免疫検出方法のいずれか1つを用いて、抗原と結合する抗体の存在を検出することによってモニターすることができる。
【０１６２】
特異的抗体を産生する動物から、抗体形成細胞であるリンパ系細胞であるBリンパ球を入手するために、リンパ系細胞（最も一般的には脾臓またはリンパ節からの細胞）を採取する。リンパ系細胞、典型的には脾細胞は、好ましくは免疫処置される動物と同系であって、任意で他の望ましい性質（例えば、内因性Ig遺伝子産物、例えばP3X63-Ag 8.653（ATCC番号CRL 1580）；NS0；SP20）を発現できないこと）を有する、薬剤に感作された骨髄腫（例えば、形質細胞腫）細胞融合パートナーとの融合によって不死化させることができる。リンパ系細胞および骨髄腫細胞を、ポリエチレングリコールまたは非イオン性界面活性剤などの膜融合促進剤と数分間にわたって組み合わせ、続いてハイブリドーマ細胞の増殖は支持するが融合していない骨髄腫細胞の増殖は支持しない選択培地上に低密度でプレーティングする。好ましい選択培地はHAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）である。十分な時間の後、通常は約1〜2週間後に細胞のコロニーを観察する。細胞によって産生された抗体を抗原に対する結合活性に関して試験する。ハイブリドーマをクローン化し（例えば、希釈クローニングにより、または軟寒天上でのプラーク単離により）、抗原に対して特異的な抗体を産生する陽性クローンを選択して培養する。CD47細胞外ドメインに対して高い親和性および特異性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが好ましい。同様に、CD47リガンド、特に細胞外ドメインに対して高い親和性および特異性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが好ましい。
【０１６３】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養物の上清から単離することができる。マウスモノクローナル抗体の産生のための代替的な方法は、同系マウス、例えば、モノクローナル抗体を含む腹水の形成を促進させる処置を受けた（例えば、プリスタン刺激を受けた）マウスの腹腔内に、ハイブリドーマ細胞を注射することである。その後に採取した腹水（通常は1〜3週以内）から、混入物を、従来の手法、例えばクロマトグラフィー（例えば、サイズ排除、イオン交換）、ゲル濾過、沈降、抽出などによって除去することができる（例えば、Coligan, 前記, p.2.7.1-2.7.12；2.9.1-2.9.3；Baines et al., Purification of Immunoglobulin G (IgG), Methods in Molecular Biology, 10:9-104 (The Humana Press, Inc. (1992)中、を参照）。例えば、抗体を、モノクローナル抗体の特有の性質（例えば、重鎖または軽鎖アイソタイプ、結合特異性、その他）に基づいて選択した適切なリガンドを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。固体支持体上に固定化される適したリガンドの例には、プロテインA、プロテインG、抗定常領域（軽鎖または重鎖）抗体、抗イディオタイプ抗体、CD47細胞外ドメインまたはその断片が含まれる。
【０１６４】
CD47と特異的に結合する抗体またはCD47リガンドと特異的に結合する抗体はヒトモノクローナル抗体であってもよい。ヒトモノクローナル抗体は、当業者が精通している手法の任意のいくつかによって生じさせることができる。そのような方法には、ヒト末梢血細胞（例えば、Bリンパ球を含む）のエプスタイン-バーウイルス（EBV）形質転換、ヒトB細胞のインビトロ免疫処置、挿入されたヒト免疫グロブリン遺伝子を保有する免疫処置されたトランスジェニックマウスからの脾細胞の融合、ヒト免疫グロブリンV領域ファージライブラリーからの単離、または当技術分野で公知であり、本明細書における開示に基づく他の手順が非限定的に含まれる。
【０１６５】
例えば、ヒトモノクローナル抗体は、抗原曝露に反応して特異的ヒト抗体を産生するように操作されたトランスジェニックマウスから入手することができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を入手するための方法は、例えば、Green et al., Nature Genet. 7:13 (1994)；Lonberg et al., Nature 368:856 (1994)；Taylor et al., Int. Immun. 6:579 (1994)；米国特許第5,877,397号；Bruggemann et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58 (1997)；Jakobovits et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:525-35 (1995)に記載されている。この手法では、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座のエレメントを、内因性マウス重鎖および軽鎖遺伝子座の標的破壊を含む胚性幹細胞株に由来するマウスの系統に対して遺伝子工学手法により人工的に導入する（Bruggemann et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58 (1997)も参照）。例えば、ヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、マウスリンパ系組織においてB細胞特異的なDNA再配列および超変異を受ける、ミニ遺伝子構築物、または酵母人工染色体上のトランス遺伝子座（translocus）であってよい。ヒトモノクローナル抗体は、トランスジェニックマウスを免疫処置し、それが続いて抗原に対して特異的なヒト抗体を産生することによって入手することができる。免疫処置を受けたトランスジェニックマウスのリンパ系細胞は、本明細書に記載した方法に従って、ヒト抗体を分泌するハイブリドーマを作製するために用いることができる。ヒト抗体を含むポリクローナル血清を、免疫処置を受けた動物の血液から入手することもできる。
【０１６６】
ヒト抗原特異的なモノクローナル抗体を生成させるためのもう1つの方法は、EBV形質転換によってヒト末梢血細胞を不死化させる段階を含む。例えば、米国特許第4,464,456号を参照。CD47細胞外ドメインと特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するそのような不死化B細胞株（またはリンパ芽球細胞株）は、本明細書で提示したような免疫検出方法、例えばELISAによって同定し、続いて標準的なクローン化の手法によって単離することができる。関心対象の抗体を産生するリンパ芽球細胞株の安定性は、当技術分野で公知の方法に従って形質転換細胞株をマウス骨髄腫と融合させて、マウス-ヒトハイブリッド細胞株を作製することによって改善することができる（例えば、Glasky et al., Hybridoma 8:377-89 (1989)を参照）。ヒトモノクローナル抗体を生成させるためのさらにもう1つの方法はインビトロ免疫処置であり、これはヒト脾臓B細胞を抗原で刺激し、刺激されたB細胞をヘテロハイブリッド融合パートナーと融合させることを含む。例えば、Boerner et al., J. Immunol. 147:86-95 (1991)を参照。
【０１６７】
ある態様においては、所望の抗体を産生しているB細胞を選択し、当技術分野で公知であり（WO 92/02551号；米国特許第5,627,052号；Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-48 (1996)）、本明細書に記載された分子生物学手法に従って、軽鎖および重鎖の可変領域をB細胞からクローニングする。免疫処置を受けた動物からのB細胞を、抗原、例えばCD47細胞外ドメインまたはCD47リガンドと特異的に結合する抗体を産生している細胞を選択することによって脾臓、リンパ節または末梢血試料から単離する。また、B細胞をヒトから、例えば末梢血試料から単離することもできる。所望の特異性を有する抗体を産生している単一のB細胞を検出するための方法は当技術分野で周知であり、例えば、プラーク形成、蛍光活性化細胞分取法、インビトロ刺激後の特異的抗体の検出などによる。特異的抗体を産生するB細胞の選択のための方法には、例えば、抗原またはその断片を含む軟寒天培地中にB細胞の単細胞懸濁液を調製することが含まれる。B細胞によって産生された特異的抗体と抗原との結合は複合体の形成をもたらし、それは免疫沈降物として視認することができる。特異的抗体を産生するB細胞を選択した後に、特異的抗体の遺伝子を、当技術分野で公知であり、本明細書に記載された方法に従ってDNAまたはmRNAを単離および増幅することによってクローニングすることができる。
【０１６８】
ヒト化抗体を含むキメラ抗体を作製することもできる。キメラ抗体は、第1の哺乳動物種に由来する少なくとも1つの定常領域ドメイン、および第2の異なる哺乳動物種に由来する少なくとも1つの可変領域ドメインを有する。例えば、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-55 (1984)を参照。1つの態様において、キメラ抗体は、非ヒトモノクローナル抗体に由来する少なくとも1つの可変領域ドメイン、例えばマウス、ラットまたはハムスターのモノクローナル抗体に由来する可変領域をコードするポリヌクレオチド配列を、少なくとも1つのヒト定常領域をコードする核酸配列を含むベクター中にクローニングすることによって構築することができる（例えば、Shin et al., Methods Enzymol. 178:459-76 (1989)；Walls et al., Nucleic Acids Res. 21:2921-29 (1993)を参照）。一例としては、マウスモノクローナル抗体の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド配列を、ヒトκ軽鎖定常領域配列をコードする核酸配列を含むベクター中にクローニングする。別のベクター中に、モノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド配列を、ヒトIgG1定常領域をコードする配列とインフレームにクローニングする。選択される具体的なヒト定常領域は、その特定の抗体に関して望まれるエフェクター機能に依存する（例えば、補体固定、特定のFc受容体との結合、その他）。キメラ抗体を作製するための、当技術分野で公知のもう1つの方法は、相同組換えである（例えば、米国特許第5,482,856号）。キメラ抗体の安定的な発現のためには、ベクターを真核細胞にトランスフェクトすることが好ましい。
【０１６９】
非ヒト/ヒトキメラ抗体をさらに遺伝的に操作して、「ヒト化」抗体を作り出すこともできる。そのようなヒト化抗体は、非ヒト哺乳動物種の免疫グロブリンに由来する多数のCDR、少なくとも1つのヒト可変フレームワーク領域、および少なくとも1つのヒト免疫グロブリン定常領域を含みうる。ヒト化は、ある態様においては、例えば、CD47結合可変領域を入手する元となった非ヒトモノクローナル抗体、または上記のようにそのようなV領域および少なくとも1つのヒトC領域を有するキメラ抗体と比較して、CD47細胞外ドメインに対する結合親和性が低下した抗体をもたらす。CD47リガンドと特異的に結合する抗体のヒト化は、抗CD47抗体を調製するための、本明細書に記載した類似の方法によって達成することができる。このため、ヒト化抗体を設計するための有用な戦略には、例えば、限定的ではないものの実例を挙げると、キメラ抗体の非ヒトフレームワーク領域に対して最も相同性の高いヒト可変フレームワーク領域の同定が含まれる。理論に拘束されることは望まないが、そのような戦略はヒト化抗体がCD47に対する特異的な結合親和性を保つ可能性を増加させると思われ、この際、ヒト化抗体は非ヒト化抗体と実質的に同じ親和性を有し、ある他の態様においては、ヒト化抗体はCD47に対して非ヒト化抗体よりも高い親和性を示しうる（例えば、Jones et al., Nature 321:522-25 (1986)；Riechmann et al., Nature 332:323-27 (1988)を参照）。
【０１７０】
このため、ヒト化抗体を設計することは、非ヒト可変領域のCDRループコンフォメーションおよび構造決定基を例えばコンピュータモデル化によって決定し、続いてCDRループおよび決定基を公知のヒトCDRループ構造および決定基と比較することを含みうる（例えば、Padlan et al., FASEB 9:133-39 (1995)；Chothia et al., Nature, 342:377-83 (1989)を参照）。コンピュータモデル化を、配列相同性によって選択されたヒト構造テンプレートを非ヒト可変領域と比較するために用いることもできる（例えば、Bajorath et al., Ther. Immunol. 2:95-103 (1995)；EP-0578515-A3を参照）。非ヒトCDRのヒト化が結合親和性の減少をもたらす場合には、コンピュータモデル化は、部分的、完全または最適以上（supra-optimally）（すなわち、非ヒト化抗体のそれを上回るレベルへと増加させる）に親和性を回復させるための部位指定または他の突然変異誘発法によって変化させうると考えられる特定のアミノ酸残基を同定する助けになりうる。当業者はこれらの手法に精通しており、そのような設計戦略に対する数多くの変法および変更を容易に認識するであろう。
【０１７１】
ヒト化抗体を調製するための1つのそのような方法は、ベニアリング（veneering）と呼ばれる。フレームワーク（FR）残基のベニアリングとは、FRポリペプチドのネイティブ型フォールディング構造の実質的にすべてを保っている抗原結合部位を含む異種分子を提供することを目的とする、例えば、齧歯動物の重鎖または軽鎖V領域由来のFR残基のヒトFR残基による選択的置き換えのことを指す。ベニアリングの手法は、抗原結合部位のリガンド結合特性が、主として、抗原結合表面内部での重鎖および軽鎖のCDRセットの構造および相対的配置によって決定されるという理解に基づく（例えば、Davies et al., Ann. Rev. Biochem. 59:439-73, (1990)を参照）。したがって、ヒト化抗体における抗原結合特異性は、CDR構造、それらの互いの相互作用、および残りのV領域ドメインとのそれらの相互作用が注意深く維持されれば、保持されうる。ベニアリングの手法を用いることにより、免疫原性が弱いか実質的に非免疫原性であるベニアリングされた表面を含むハイブリッド分子を提供するために、免疫系と容易に遭遇する外側の（例えば、溶媒と接近しうる）FR残基をヒト残基によって選択的に置き換えることができる。
【０１７２】
ベニアリングのプロセスは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th ed., (U.S. Dept. of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office, 1991)中によって編纂されたヒト抗体可変ドメインに関して入手可能な配列データ、Kabatデータベースに対するアップデート、ならびにその他のアクセス可能な米国および外国のデータベース（核酸およびタンパク質の両方）を利用する。V領域アミノ酸の溶媒接近性は、ヒトおよびマウスの抗体フラグメントの公知の三次元構造から推定することができる。まず、関心対象の抗体分子の可変ドメインのFRアミノ酸配列を、上記に特定したデータベースおよび刊行物から入手したヒト可変ドメインの対応するFR配列と比較する。続いて、最も相同性の高いヒトV領域を、対応するマウスアミノ酸と残基毎に比較する。ヒト対応物と異なるマウスFR内の残基を、当技術分野で周知の組換え手法を用いて、ヒト部分に存在する残基に置き換える。残基の切り換えは、少なくとも部分的に露出されている（溶媒が接近可能な）部分でのみ行われ、プロリン、グリシンおよび荷電アミノ酸といった、V領域ドメインの三次構造に有意な影響を及ぼしうるアミノ酸残基の置き換えには注意を払う。
【０１７３】
このようにして、結果として得られる「ベニアリングされた」抗原結合部位は、齧歯動物CDR残基、CDRと実質的に隣接する残基、埋没しているかほとんど埋没していると同定された残基（溶媒が接近不能）、重鎖ドメインと軽鎖ドメインとの間の非共有的（例えば、静電的および疎水的）接触にかかわると考えられる残基、およびCDRループの「正準（canonical）」三次構造に影響を及ぼすと考えられるFRの保存的構造領域由来の残基が保たれるように設計されている（例えば、Chothia et al., Nature, 342:377-383 (1989)を参照）。続いて、これらの設計基準を利用して、齧歯動物抗体分子の抗原特異性を呈する組換えヒト抗体の発現のために哺乳動物細胞をトランスフェクトするために用いうる、抗原結合部位の重鎖および軽鎖の両方のCDRをヒトらしく見える（human-appearing）FRの中に組み合わせた組換えヌクレオチド配列を調製することができる。
【０１７４】
特定の用途のために、抗体の抗原結合フラグメントが望まれることがある。抗体フラグメントF(ab')2、Fab、Fab'、FvおよびFdは、例えば、従来の方法に従った抗体のタンパク質加水分解、例えば、完全抗体のペプシンまたはパパイン消化によって得ることができる。実例としては、ペプシンによる抗体の酵素的切断によって抗体フラグメントを作製し、F(ab')2と呼ばれるフラグメントを得ることができる。このフラグメントを、チオール還元剤を用いてさらに切断して、Fab'一価フラグメントを得ることができる。任意で、切断反応を、ジスルフィド結合の切断に起因するスルフヒドリル基に対する保護基を用いて行うことができる。別の選択肢として、パパインを用いた抗体の酵素的切断は、2つの一価Fabフラグメントおよび1つのFcフラグメントを生じさせる（例えば、米国特許第4,331,647号；Nisonoff et al.,Arch. Biochem. Biophys. 89:230 (1960)；Porter, Biochem. J. 73:119 (1959)；Edelman et al., Methods in Enzymology 1:422 (Academic Press 1967)中；Weir, Handbook of Experimental Immunology, Blackwell Scientific, Boston (1986)を参照）。抗原結合フラグメントは、例えば固定化されたプロテインA、プロテインG、Fc特異的抗体、または固定化されたCD47もしくはCD47細胞外ドメインポリペプチドもしくはその断片を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより、Fcフラグメントから分離することができる。重鎖を分離して一価軽鎖-重鎖フラグメント（Fd）を形成させること、フラグメントをさらに切断すること、または他の酵素的、化学的もしくは遺伝的手法といった、抗体を切断するための他の方法も、フラグメントが無傷の抗体によって認識される抗原と結合する限りにおいて用いることができる。
【０１７５】
また、抗体フラグメントは、特異的抗原と結合して複合体を形成するという点で抗体のように作用する、任意の合成性または遺伝的に操作されたタンパク質であってもよい。例えば、抗体フラグメントには、軽鎖可変領域からなる単離されたフラグメント、重鎖および軽鎖の可変領域からなるFvフラグメント、重鎖および軽鎖可変領域がペプチドリンカーによって連結されている組換え一本鎖ポリペプチド分子（scFvタンパク質）、ならびに超可変領域を模したアミノ酸残基からなる最小認識単位が含まれる。本発明の抗体は、好ましくは、少なくとも1つの可変領域ドメインを含む。可変領域ドメインは任意のサイズまたはアミノ酸組成であってよく、一般的には、抗原結合の原因となり、1つまたは複数のフレームワーク配列と隣接しているかインフレームにある少なくとも1つの超可変アミノ酸配列を含む。一般的に言って、可変（V）領域ドメインは、免疫グロブリン重鎖（VH）および/または軽鎖（VL）可変ドメインの任意の適した配列物である。したがって、例えば、V領域ドメインは単量体であって、許容される親和性で抗原と独立に結合しうるVHまたはVLドメインであってよい。または、V領域ドメインが二量体性であって、VH-VH、VH-VLまたはVL-VL二量体であってもよい。好ましくは、V領域二量体は、非共有的に会合した少なくとも1つのVH鎖および少なくとも1つのVL鎖を含む（本明細書では以下、Fvと称する）。所望であれば、これらの鎖を、例えば2つの可変ドメイン間のジスルフィド結合を介して直接的に、またはリンカー、例えばペプチドリンカーを通して共有的に結合させて、一本鎖Fv（scFv）を形成させることができる。
【０１７６】
最小認識単位とは、単一の相補性決定領域（CDR）を含む抗体フラグメントのことである。そのようなCDRペプチドは、関心対象の抗体のCDRをコードするポリヌクレオチドを構築することによって入手しうる。ポリヌクレオチドは、当業者によって実施されている方法に従って、例えばポリメラーゼ連鎖反応を用いて、抗体産生細胞から単離された、またはその内部に含まれるmRNAをテンプレートとして用いて可変領域を合成することによって調製される（例えば、Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, (1991)；Courtenay-Luck,“Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies,”Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), page 166 (Cambridge University Press 1995)中；およびWard et al.,“Genetic Manipulation and Expression of Antibodies,”Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al., (eds.), page 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)中、を参照）。または、そのようなCDRペプチドおよび他の抗体フラグメントを、自動ペプチド合成装置を用いて合成することもできる。
【０１７７】
ある態様によれば、本明細書に記載したIg分子のいずれかの非ヒト、ヒトまたはヒト化重鎖および軽鎖可変領域を、scFvポリペプチドフラグメント（一本鎖抗体）として構築することができる。例えば、Bird et al., Science 242:423-426 (1988)；Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83 (1988)を参照。多機能性scFv融合タンパク質は、scFvポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、種々の公知のエフェクタータンパク質の任意のものをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド配列とインフレームに連結することによって作製することができる。これらの方法は当技術分野で公知であり、例えば、EP-B1-03 18554号、米国特許第5,132,405号、米国特許第5,091,513号および米国特許第5,476,786号に開示されている。一例として、エフェクタータンパク質には免疫グロブリン定常領域配列が含まれる。例えば、Hollenbaugh et al., J. Immunol. Methods 188:1-7 (1995)を参照。エフェクタータンパク質の他の例は酵素である。非限定的な例として、そのような酵素が、治療目的用の生物活性を与えてもよく（例えば、Siemers et al., Bioconjug. Chem. 8:510-19 (1997)を参照）、または、西洋ワサビペルオキシダーゼにより触媒される、さまざまな周知の基質のいずれかの、診断用途用の検出可能な産物への変換といった検出可能な活性を与えてもよい。
【０１７８】
scFvは、ある態様において、融合タンパク質と抗原との間の特異的結合の検出を可能にするペプチドまたはポリペプチドドメインであってよい。例えば、融合ポリペプチドドメインは親和性タグポリペプチドであってよい。このため、scFv融合タンパク質と結合パートナー（例えば、CD47細胞外ドメイン）との結合を、親和性ポリペプチドまたはペプチドタグ、アビジン、ストレプトアビジンまたはHis（例えば、ポリヒスチジン）タグを用いて、当業者が精通しているであろう種々の手法の任意のものによって検出することができる。また、検出手法には、例えば、アビジンまたはストレプトアビジン融合タンパク質とビオチンまたはビオチン模倣配列との結合（例えば、Luo et al., J. Biotechnol. 65:225 (1998)およびそこに引用されている参考文献を参照）、検出可能な部分（例えば、標識部分）による融合タンパク質の直接的な共有結合性修飾、融合タンパク質と特異的な標識レポーター分子との非共有的結合、酵素活性を有する一部分を含む融合タンパク質による検出可能な基質の酵素的修飾、または固相支持体上への融合タンパク質の固定化（共有的または非共有的）も含まれうる。CD47特異的免疫グロブリン由来のポリペプチドを含むscFv融合タンパク質を、望ましい親和性を有するエフェクターペプチドなどの別のポリペプチドと融合させることもできる（例えば、米国特許第5,100,788号；WO 89/03422号；米国特許第5,489,528号；米国特許第5,672,691号；WO 93/24631号；米国特許第5,168,049号；米国特許第5,272,254号；EP 511,747号を参照）。本明細書で提示するように、scFvポリペプチド配列を、エフェクタータンパク質配列を含む融合ポリペプチド配列と融合させることができ、これには完全長融合ポリペプチドが含まれうるほか、またはその変異体もしくはフラグメントも含まれうる。CD47リガンド特異的免疫グロブリン由来のポリペプチドを含むscFv融合タンパク質も同様に調製することができる。
【０１７９】
また、抗体を、ヒト免疫グロブリンファージライブラリーから、ウサギ免疫グロブリンファージライブラリーから、マウス免疫グロブリンファージライブラリーから、および/またはニワトリ免疫グロブリンファージライブラリーから同定および単離することもできる（例えば、Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-55 (1994)；Burton et al., Adv. Immunol. 57:191-280 (1994)；米国特許第5,223,409号；Huse et al., Science 246:1275-81 (1989)；Schlebusch et al., Hybridoma 16:47-52 (1997)およびそこに引用されている参考文献；Rader et al., J. Biol. Chem. 275:13668-76 (2000)；Popkov et al., J. Mol. Biol. 325:325-35 (2003)；Andris-Widhopf et al., J. Immunol. Methods 242:159-31(2000)を参照）。非ヒト種または非ヒト免疫グロブリンライブラリーから単離された抗体を、抗体またはそのフラグメントを「ヒト化」するための、本明細書に記載され、当技術分野で公知である方法に従って遺伝的に操作することができる。免疫グロブリン可変領域遺伝子のコンビナトリアルライブラリーを、本明細書に記載したようにCD47と特異的に結合するIgフラグメント（Fab、Fv、scFvまたはその多量体）を選択するためにスクリーニングしうるファージベクター中に作り出すことができる（例えば、米国特許第5,223,409号；Huse et al., Science 246:1275-81(1989)；Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5728-32 (1989)；Alting-Mees et al., Strategies in Molecular Biology 3:1-9 (1990)；Kang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4363-66 (1991)；Hoogenboom et al., J. Molec. Biol. 227:381-388 (1992)；Schlebusch et al., Hybridoma 16:47-52 (1997)およびそこに引用されている参考文献；米国特許第6,703,015号を参照)。
【０１８０】
例えば、Ig可変領域フラグメントをコードする多数のポリヌクレオチド配列を含むライブラリーを、M13またはその変異体などの糸状バクテリオファージのゲノム中に、遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIなどのファージコートタンパク質をコードする配列にインフレームに挿入することができる。融合タンパク質は、コートタンパク質と軽鎖可変領域ドメインとの、および/または重鎖可変領域ドメインとの融合物であってよい。ある態様によれば、免疫グロブリンFabフラグメントをファージ粒子上に提示させてもよい（例えば、米国特許第5,698,426号を参照）。
【０１８１】
また、重鎖および軽鎖免疫グロブリンcDNA発現ライブラリーを、例えばλImmunoZap（商標）（H）およびλImmunoZap（商標）（L）ベクター（Stratagene, La Jolla, California）を用いて、λファージ中に調製することもできる。手短に述べると、mRNAをB細胞集団から単離して、λImmunoZap（H）およびλImmunoZap（L）ベクター中に重鎖および軽鎖免疫グロブリンcDNA発現ライブラリーを作り出すために用いることができる。これらのベクターを個々にスクリーニングすることもでき、またはFabフラグメントもしくは抗体を形成させるために同時発現させることもできる（Huse et al., 前記を参照；同じくSastry et al., 前記も参照）。陽性プラークは、その後に、大腸菌からのモノクローナル抗体フラグメントの高レベル発現を可能にする非溶解性プラスミドに変換させることができる。
【０１８２】
特にCD47およびCD47細胞外ドメインと結合するIgフラグメント（例えば、Ig V領域またはFab）を提示するファージは、ファージライブラリーをCD47またはCD47細胞外ドメインもしくはその断片と混合することにより、またはファージライブラリーを、固体マトリックス上に固定化されたそのようなポリペプチドもしくはペプチド分子と、結合を可能にするのに十分な条件下および時間で接触させることによって選択することができる。結合しなかったファージを洗浄によって除去し、続いて、特異的に結合したファージ（すなわち、CD47細胞外ドメイン特異的Igフラグメントを含むファージ）を溶出させる（例えば、Messmer et al., Biotechniques 30:798-802 (2001)を参照）。溶出したファージは適切な細菌宿主内で増殖させることができ、一般的には、CD47またはCD47細胞外ドメインとの結合および溶出を連続して複数回繰り返すことで、CD47特異的免疫グロブリンを発現するファージの収量を増やすことができる。そのような方法を、CD47リガンド特異的な免疫グロブリンを発現するファージを同定するために用いることもできる。
【０１８３】
また、ファージディスプレイの手法を、CD47およびCD47細胞外ドメインと結合するIgフラグメントまたは一本鎖抗体を選択するために用いることもできる。そのような抗体フラグメントまたは関連ペプチドをコードする候補核酸分子（例えば、DNA）を挿入しうるマルチクローニング部位を有する適したベクターの例については、例えば、McLafferty et al., Gene 128:29-36 (1993)；Scott et al., Science 249:386-90 (1990)；Smith et al., Meth. Enzymol. 217:228-57 (1993)；Fisch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7761-66 (1996)を参照されたい。挿入されたDNA分子は、ランダムに生成された配列を含んでもよく、またはCD47と特異的に結合する公知のペプチドもしくはポリペプチドドメイン（CD47リガンドなど）をコードする変異体をコードしてもよい。一般に、核酸インサートは最大で60アミノ酸のペプチドをコードし、または3〜35アミノ酸のペプチドをコードしてもよく、または6〜20アミノ酸のペプチドをコードしてもよい。挿入された配列によってコードされるペプチドは、バクテリオファージの表面に発現される。CD47に対する結合ドメインを発現するファージは、固定化されたCD47またはCD47細胞外ドメインもしくはそのフラグメントに対する特異的結合に基づいて選択することができる。周知の組換え遺伝学の手法を、フラグメントを含む融合タンパク質を構築するために用いることができる。例えば、結果として得られる産物のCD47に対する結合親和性を最大化する目的で、親和性により選択された2つまたはそれ以上の類似性または非類似性のCD47結合ペプチドドメインのタンデムアレイを含むポリペプチドを作製することができる。そのような方法を、CD47リガンドと結合するIgフラグメントまたは一本鎖抗体を選択するために用いることもできる。
【０１８４】
また、ファージライブラリーを用いるコンビナトリアル突然変異誘発戦略を、非ヒト可変領域をヒト化するために用いることもできる（例えば、Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-18 (1996)；Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:8910-15 (1998)を参照）。標準的な手法により、結合親和性の低下がわずかであるか非ヒト可変領域と同等であるヒト化可変領域を選択して、ヒト化可変領域をコードするヌクレオチド配列を決定することができる（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press (2001)を参照）。続いて、親和性により選択されたIgをコードする配列を、Igフラグメントの発現のために別の適したベクター中にクローニングすることができ、または任意で、完全な免疫グロブリン鎖の発現のために、Ig定常領域を含むベクター中にクローニングすることもできる。
【０１８５】
同様に、CD47に対して、特定の態様においてはCD47細胞外ドメインに対して特異的な抗体をコードする遺伝子の可変領域を組み入れるために、CD47特異的抗体の部分またはフラグメント、例えばFabおよびFvフラグメントなどを、従来の酵素的消化または組換えDNA手法を用いて構築することもできる。1つの態様においては、ハイブリドーマ内で、関心対象のモノクローナル抗体を発現する遺伝子の可変領域をヌクレオチドプライマーを用いて増幅させる。これらのプライマーは当業者によって合成可能であり、または、マウスおよびヒトの可変領域を増幅するためのプライマーを販売している販売供給元から購入することもできる（例えば、Stratagene（La Jolla, California）を参照）。プライマーを用いて重鎖または軽鎖可変領域を増幅し、続いてそれらを、それぞれImmunoZAP（商標）HまたはImmunoZAP（商標）L（Stratagene）などのベクター中に挿入することができる。続いて、これらのベクターを、大腸菌、酵母または哺乳動物を利用する系に発現のために導入することができる。VHドメインとVLドメインとの融合物を含む大量の一本鎖タンパク質を、これらの方法を用いて生産することができる（Bird et al., Science 242:423-426 (1988)を参照）。加えて、そのような手法を、抗体の結合特異性を変化させることなしに非ヒト抗体V領域をヒト化するために用いることもできる。そのような方法はまた、CD47リガンドと結合する抗体のフラグメントを作製するために用いることもできる。
【０１８６】
ある他の態様において、特異的抗体は多量体性の抗体フラグメントである。有用な方法は、例えば、Hayden et al., Curr Opin. Immunol. 9:201-12 (1997)およびColoma et al., Nat. Biotechnol. 15:159-63 (1997)に一般的に記載されている。例えば、多量体性の抗体フラグメントは、ミニ抗体（米国特許第5,910,573号）またはまたはダイアボディ（diabody）（Holliger et al., Cancer Immunol. Immunother. 45:128-30 (1997)）を生成させるためのファージ手法によって作り出すことができる。特定のFvの多量体である多量体性フラグメントを作製することもできる。
【０１８７】
多量体性の抗体には、抗原に対して特異的な第1のFvが異なる抗原特異性を有する第2のFvと会合した、二重特異性および二機能性の抗体が含まれる（例えば、Drakeman et al., Expert Opin. Investig. Drugs 6:1169-78 (1997)；Koelemij et al., J. Immunother. 22:514-24 (1999)；Marvin et al., Acta Pharmacol. Sin. 26:649-58 (2005)；Das et al., Methods Mol. Med. 109:329-46 (2005)を参照）。例えば、1つの態様において、二重特異性抗体は、抗原と特異的に結合する本明細書に記載したFvまたは他の抗原結合フラグメントを含み、かつ、特異的抗体が結合した場合に免疫細胞の免疫応答性を変化させる（抑制または強化する）ことに寄与する、それを促進する、またはそれを行うことができる別の細胞表面ポリペプチド、例えば細胞表面抗原と特異的に結合するFvまたは他の抗原結合フラグメントを含む。
【０１８８】
アミノ酸突然変異を免疫グロブリン分子に導入することは、特定の抗原に対する免疫グロブリンの特異性もしくは親和性を高めるため、またはエフェクター機能を変化させるために有用な場合がある。抗原に対してより高い親和性を呈する免疫グロブリンは、特定残基の部位指定突然変異誘発によって作製することができる。抗原に対する親和性を改善する目的で、変化させるべきアミノ酸残基を同定するために、コンピュータ補助による三次元分子モデル化を用いることができる（例えば、Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 10:1-142 (1992)を参照）。または、CDRのコンビナトリアルライブラリーをM13ファージ中に作製し、改良された親和性を有する免疫グロブリンフラグメントに関してスクリーニングすることもできる（例えば、Glaser et al., J. Immunol. 149:3903-13 (1992)；Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3809-13 (1994)；米国特許第5,792,456号を参照)。
【０１８９】
ある態様においては、改変されたエフェクター機能を有するように、抗体を遺伝的に操作することができる。例えば、抗体が、補体依存性細胞傷害性（CDC）もしくは抗体依存性細胞傷害性（ADCC）を媒介する能力の変化（生物学的にまたは統計学的に有意な様式で増加または減少させる）、またはエフェクター細胞上に存在するFc受容体を介してエフェクター細胞と結合する能力の変化を有してもよい。エフェクター機能は、部位指定突然変異誘発により変化されうる（例えば、Duncan et al., Nature 332:563-64 (1988)；Morgan et al., Immunology 86:319-24 (1995)；Eghtedarzedeh-Kondri et al., Biotechniques 23:830-34 (1997)を参照）。例えば、免疫グロブリンのFc部分上のグリコシル化部位の突然変異は、免疫グロブリンが補体を固定する能力を変化させる可能性がある（例えば、Wright et al., Trends Biotechnol。15:26-32 (1997)を参照）。定常領域ドメイン内の他の突然変異は、免疫グロブリンが補体を固定する能力、またはADCCを生じさせる能力を変化させる可能性がある（例えば、Duncan et al., Nature 332:563-64(1988)；Morgan et al., Immunology 86:319-24 (1995)；Sensel et al., Mol. Immunol. 34:1019-29 (1997)を参照）。（同じく、例えば、米国特許出願公開第2003/0118592号；第2003/0133939号も参照のこと）。
【０１９０】
本明細書に記載したようなCD47と特異的に結合する抗体またはそのフラグメントをコードする核酸分子は、核酸の切り出し、連結、形質転換およびトランスフェクションのための周知のさまざまな手順の任意のものに従って増殖および発現させることができる。したがって、ある態様においては、大腸菌（Escherichia coli）などの原核宿主細胞における抗体フラグメントの発現が好ましい（例えば、Pluckthun et al., Methods Enzymol. 178:497-515 (1989)を参照）。ある他の態様においては、酵母（例えば、サッカロミセス-セレビシエ、分裂酵母およびピキア-パストリス）；動物細胞（哺乳動物細胞を含む）；および植物細胞を含む、真核宿主細胞における抗体またはその抗原結合フラグメントの発現が好ましい。適した動物細胞の例には、骨髄腫細胞、COS細胞、CHO細胞またはハイブリドーマ細胞が非限定的に含まれる。植物細胞の例には、タバコ、トウモロコシ、ダイズおよびイネの細胞が含まれる。当業者に公知であって本開示に基づく方法を用いることにより、外来配列を特定の宿主系で発現させるために核酸ベクターを設計し、続いてCD47結合抗体（またはそのフラグメント）をコードするポリヌクレオチド配列を挿入することができる。調節エレメントは個々の宿主によって異なると考えられる。同様に、CD47リガンドと特異的に結合する抗体またはそのフラグメントをコードする核酸分子を、核酸の切り出し、連結、形質転換およびトランスフェクションのための周知のさまざまな手順の任意のものに従って増殖および発現させることができる。
【０１９１】
可変および/または定常領域をコードするポリヌクレオチドを含む1つまたは複数の複製可能な発現ベクターを調製し、抗体の産生が内部で起こると考えられる適切な細胞株、例えば、マウスNSO株などの非産生性の骨髄腫細胞株、または大腸菌などの細菌を形質転換させるために用いることができる。効率的な転写および翻訳を得るためには、各ベクター中のポリヌクレオチド配列は、適切な調節配列、特に可変ドメイン配列と機能的に連結されたプロモーターおよびリーダー配列を含むべきである。ポリペプチドを組換え的に生産するための具体的な方法は一般に周知であり、ルーチン的に用いられている。例えば、分子生物学の手順は、Sambrookら（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989；同じくSambrook et al., 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (2001)も参照のこと）によって記載されている。DNAシークエンシングは、Sangerら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463 (1977)）およびAmersham International plcシークエンシングハンドブックに記載された通りに、それらに対する改良を含めて行うことができる。
【０１９２】
免疫グロブリンの可変（V領域）、フレームワーク領域、および/または定常領域の部位指定突然変異誘発は、本明細書に記載され、当技術分野で実施されている数多くの方法のうちいずれか1つによって行うことができる（Kramer et al., Nucleic Acids Res. 12:9441 (1984)；Kunkel Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-92 (1985)；Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-82 (1987)）。また、抗原との結合のために重要な、または変化した場合に抗原と抗体との結合を変化させない抗体の残基を同定するためのランダム突然変異誘発法を、当業者によってルーチン的に実施されている手順に従って行うこともできる（例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発；エラープローンポリメラーゼ連鎖反応突然変異誘発；およびオリゴヌクレオチド依存的突然変異誘発（例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (2001)を参照））。さらに、数多くの刊行物が、DNAの操作、発現ベクターの作出および適切な細胞の形質転換による抗体の調製のために適した手法を記載している（Mountain et al., Biotechnology and Genetic Engineering Reviews (ed. Tombs, M P,10, Chapter 1, Intercept, Andover, UK (1992)中)；国際特許公開第WO 91/09967号）。
【０１９３】
CD47細胞外ドメインと特異的に結合する抗体を含め、CD47と特異的に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントは、生物試料中のCD47またはその断片の存在を検出するための免疫化学分析のための試薬としても有用な可能性がある。以下の方法を、CD47リガンドの存在を検出するために適合させることもできる。ある態様において、CD47細胞外ドメインと特異的に結合する抗体は、CD47の発現を検出するために用いることができる。ある特定の態様においては、1つの抗体または一団の抗体を、CD47を発現する細胞に対して曝露させ、CD47の発現を、細胞と最初に相互作用させた抗体とは異なるエピトープと結合する別のCD47特異的抗体を用いる検出によって決定することができる。
【０１９４】
そのような目的の場合、本明細書に記載したようなCD47結合免疫グロブリン（またはそのフラグメント）は、酵素、細胞毒性物質、または色素、放射性核種、発光基、蛍光基もしくはビオチンなどを含む他のレポーター分子といった検出可能な部分または標識を含みうる。CD47特異的免疫グロブリンまたはそのフラグメントは、診断的または治療的な用途のために放射性標識することができる。抗体の放射性標識のための手法は当技術分野で公知である（例えば、Adams, In Vivo 12:11-21 (1998)；Hiltunen, Acta Oncol. 32:831-9 (1993)を参照）。エフェクターまたはレポーター分子は、付着または付着プロセスが、分子の有用性が消失するように結合性に有害な影響を与えることはないという条件付きで、抗体中に位置する任意の利用可能なアミノ酸側鎖、末端アミノ酸または糖質官能基を通じて抗体と付着させることができる。具体的な官能基には、例えば、任意の遊離アミノ、イミノ、チオール、ヒドロキシル、カルボキシルまたはアルデヒド基が含まれる。抗体またはその抗原結合フラグメントとエフェクターおよび/またはレポーター分子との付着は、エフェクターまたはレポーター分子中のそのような基および適切な官能基を介して達成することができる。結合は直接的であってもよく、またはスペーサー基もしくは架橋基を介した間接的なものであってもよい（例えば、国際特許出願公開第WO 93/06231号、第WO 92/22583号、第WO 90/091195号および第WO 89/01476号を参照；同じく、例えば、Pierce Biotechnology, Rockford, ILなどの製造供給元も参照のこと）。
【０１９５】
本明細書で提示されるように、当技術分野で周知の方法に従って、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を、CD47およびその断片のアフィニティー単離のために用いることができる（例えば、Hermanson et al., Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press, Inc. New York, (1992)を参照）。手短に述べると、抗体（またはその抗原結合フラグメント）を固体支持材料上に固定化し、それを続いて、CD47を含む試料と接触させる。CD47と固定化された抗体との結合を可能にするのに十分な条件下および時間で、試料を固定化された抗体と相互作用させ；試料の非結合性成分（すなわち、CD47と関連のない成分）を除去し；続いて、適切な溶出液を用いてCD47を固定化された抗体から遊離させる。
【０１９６】
ある態様においては、CD47と特異的に結合する抗体細胞外ドメインを含む、CD47と特異的に結合する抗体（またはその抗原結合フラグメント）を認識してそれと特異的に結合する抗イディオタイプ抗体が提供され、これらの抗イディオタイプ抗体を用いる方法も同じく提供される。抗イディオタイプ抗体は、抗CD47細胞外ドメイン抗体（またはその抗原結合フラグメント）を免疫原として用いる本明細書に記載した方法により、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として産生させることができる。抗イディオタイプ抗体またはそのフラグメントを、上記の任意の組換え遺伝子工学の方法によって、またはファージディスプレイ選択によって作製することもできる。本明細書に詳細に提示した説明に従って、抗イディオタイプ抗体をさらに操作して、キメラ性またはヒト化抗イディオタイプ抗体を得ることもできる。抗イディオタイプ抗体は、抗CD47細胞外ドメイン抗体の抗原結合部位と特異的に結合して、抗体とCD47細胞外ドメインとの結合を競合的に阻害させることができる。または、本明細書で提供される抗イディオタイプ抗体は、抗CD47細胞外ドメイン抗体とCD47細胞外ドメインとの結合を競合的に阻害しなくともよい。
【０１９７】
1つの態様においては、抗イディオタイプ抗体を、免疫細胞の免疫応答性を変化させるために用いることができる。ある態様においては、抗イディオタイプ抗体を、免疫細胞の免疫応答性を抑制するため、および免疫学的疾患または障害を治療するために用いることができる。抗イディオタイプ抗体は、CD47細胞外ドメインと特異的に結合する抗体と特異的に結合し、抗イディオタイプ抗体の抗原結合部位はCD47細胞外ドメインのエピトープを模している、すなわち抗イディオタイプ抗体は、CD47と特異的に結合する抗体のほか、コグネイトリガンドとも結合する。このため、抗イディオタイプ抗体は、CD47と結合した場合に免疫細胞の免疫応答性を変化させる（すなわち、統計学的に有意または生物学的に有意な様式で増加または減少させる）リガンドである、コグネイトリガンドの結合を防止するため、ブロックするため、または低下させるために有用な可能性がある。
【０１９８】
抗イディオタイプ抗体はまた、生物試料中の抗CD47抗体の存在を決定するためのイムノアッセイのためにも有用である。例えば、ELISAおよび当業者によって実施されている他のアッセイなどのイムノアッセイを、本明細書に記載したようCD47の細胞外ドメイン（またはその変異体）を含む融合ポリペプチドを宿主に投与すること（すなわち、免疫処置すること）によって誘導される免疫応答の存在を決定するために用いることができる。
【０１９９】
細胞外ドメインCD47-融合ポリペプチドの、およびCD47と特異的に結合する他の作用物質の効果を決定するための方法
Fcポリペプチド（またはその変異体）などの異種ポリペプチド部分と融合したCD47の細胞外ドメイン（またはその変異体）を含む融合ポリペプチドの結合は、細胞によって発現されたCD47の少なくとも1つの生物機能を変化させる。同じく本明細書に記載したように、融合ポリペプチドと、細胞によって分泌された、または免疫細胞の細胞表面に発現されたCD47リガンドとの相互作用は、細胞の免疫応答性を変化させる（すなわち、抑制または強化する）ことができる。免疫細胞の免疫応答性の変化を、CD47の細胞外ドメインを含む融合ポリペプチドと類似した様式で、生物活性物質（化合物または分子）によって生じさせることもできる。生物活性物質には、例えば、低分子、核酸（アプタマーなど）、抗体およびそのフラグメント（本明細書で詳細に考察している）ならびにペプチド融合タンパク質（ペプチド-Fc融合タンパク質など）が含まれる。作用物質は、CD47リガンドが結合するのと同じ位置であるか同じ位置に近い、CD47の位置または結合部位で、CD47の細胞外ドメインと相互作用して結合することができる。加えて、CD47と特異的に結合する、本明細書に記載した作用物質は、ウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合を阻害しうる。または、CD47細胞外ドメインまたはその変異体を含む融合ポリペプチドの効果に類似した様式での作用物質による免疫応答性の変化は、融合ポリペプチドが結合するのと同じ位置または離れた位置での、作用物質とCD47リガンドとの結合または相互作用に起因してもよい。CD47リガンドと特異的に結合する作用物質には、SIRPαと特異的に結合する抗体のように、CD47リガンドと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントが含まれる。競合結合アッセイを含む結合試験、および細胞の免疫応答性のレベルを示す機能アッセイを、作用物質が結合して免疫細胞の免疫応答性に影響を及ぼす能力およびレベルを決定および比較するために、本明細書に記載され、当技術分野で実施されている方法に従って行うことができる。
【０２００】
免疫細胞の免疫応答性を変化させる（例えば、統計学的または生物学的に有意な様式で抑制または強化する）作用物質を同定するため、ならびに同定されたそのような作用物質の特性決定およびその抑制または強化のレベルの決定のための方法が、本明細書において提供される。本明細書においてさらに詳細に考察され、当業者が精通しているそのような方法には、イムノアッセイ（例えば、ELISA、ラジオイムノアッセイ、イムノブロット、その他）、競合結合アッセイおよび表面プラズモン共鳴などの結合アッセイが非限定的に含まれる。これらの方法は、（1）候補作用物質；（2）ウイルスCD47様ポリペプチド（その数多くが本明細書に詳細に記載されており、これにはウイルスCD47様ポリペプチドの細胞外ドメイン、またはウイルスCD47様ポリペプチドの細胞外ドメインを含む融合ポリペプチドが含まれうる）；および（3）CD47リガンド（例えば、SIRP-α、SIRP-β2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリン）を、CD47リガンドとウイルスCD47様ポリペプチドとの相互作用を可能にするのに十分な条件下および時間で、接触させる段階（混合する、組み合わせる、またはそれらの間の相互作用を可能にする何らかの様式で）を含む。そのような例示的な方法および手法を、本明細書に記載したCD47融合ポリペプチドの特性決定のために用いることもできる。したがって、候補作用物質に言及している、本明細書に記載した方法を、候補作用物質が本明細書に記載した融合ポリペプチドのいずれか1つである場合に用いることもできる。
【０２０１】
特定のアッセイのための条件には、温度、緩衝液（塩、陽イオン、媒質を含む）、および候補作用物質（またはCD47融合ポリペプチド）の完全性を維持させる他の成分；ウイルスCD47様ポリペプチド；およびCD47リガンドが含まれ、それらに関して当業者は精通していると考えられる、および/またはそれらを容易に決定することができる。候補作用物質の存在下における、ウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの相互作用または結合のレベルを決定し、候補作用物質の非存在下におけるウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合のレベルを比較することができる。候補作用物質の存在下におけるウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合のレベルの減少は、候補作用物質がウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合を阻害することを示す。続いて、候補作用物質を、CD47リガンドおよびCD47を発現する免疫細胞と、CD47リガンドとCD47との相互作用を可能にするのに十分な条件下および時間で接触させる（混合する、組み合わせる、またはそれらの間の相互作用を可能にする何らかの様式で）。候補作用物質の存在下におけるCD47リガンドと免疫細胞との結合のレベルを、候補作用物質の非存在下におけるCD47リガンドと免疫細胞との結合のレベルと比較する。候補作用物質の存在下における、CD47リガンドとCD47を発現する免疫細胞との結合のレベルの減少は、候補作用物質が免疫細胞の免疫応答性を変化させることを示す。本方法の1つの特定的な態様において、候補作用物質は免疫細胞の免疫応答性を抑制する。
【０２０２】
もう1つの態様において、免疫細胞の免疫応答性を変化させる（抑制または強化する）作用物質を同定するための方法は、作用物質の存在下における、CD47を発現する免疫細胞の免疫応答性のレベルを決定する段階を含む。ある特定的な態様においては、免疫細胞の免疫応答性を抑制する作用物質が同定される。免疫応答性は、サイトカイン、細胞の成熟（例えば、樹状細胞の成熟）、増殖および刺激のレベルを測定するといった、当技術分野において実施されている方法に従って決定することができる。また、免疫細胞の免疫応答性を、細胞接着および細胞遊走の変化を評価することによって、ならびに発現、細胞位置および細胞タンパク質の翻訳後修飾を調べること、例えば、細胞骨格タンパク質ならびに細胞接着および遊走に影響を及ぼす他のタンパク質を非限定的に含む細胞タンパク質のチロシンリン酸化パターンを決定することによって決定することもできる。
【０２０３】
数多くのアッセイおよび手法が、生体分子とコグネイトリガンドとの相互作用または結合を決定するために当業者によって実施されている。したがって、CD47リガンドとCD47との相互作用に関して、作用物質の存在下におけるこの相互作用および/または結合に対する生物活性物質の効果を含めて、本明細書において詳細に記載され、当業者によってルーチン的に実施されているようなアッセイおよび手法によって容易に決定することができる。
【０２０４】
この方法および本明細書に記載した他の方法による反応成分の相互作用を可能にするための適切な条件には、例えば、試薬および成分（CD47リガンド、候補作用物質、CD47を発現する免疫細胞、および/またはウイルスCD47様ポリペプチドまたはその断片もしくは細胞外ドメイン（またはウイルスCD47様細胞外ドメインを含む融合ポリペプチド）を含む）の適切な濃度、温度および緩衝液が含まれ、当業者はこれらに精通している。反応成分の相互作用を可能にするのに十分な反応成分の濃度、緩衝液、温度および期間は、本明細書に記載され、当業者が精通している方法に従って決定および/または調整することができる。本明細書に記載した方法を実施するために、当業者は、これらの方法を実施する場合にどの制御を含めるのが適切であるかも容易に認識および理解する。
【０２０５】
数多くのアッセイおよび手法が、生体分子とコグネイトリガンドとの相互作用または結合を決定するために当業者によって実施されている。したがって、CD47リガンドとウイルスCD47様ポリペプチドとの相互作用、およびCD47を発現する免疫細胞とCD47リガンドとの相互作用に関して、作用物質の存在下におけるこの相互作用および/または結合に対する生物活性物質の効果を含めて、競合アッセイ方式を含みうる、そのようなアッセイおよび手法によって容易に決定することができる。例示的な方法には、蛍光共鳴エネルギー転移、蛍光偏光、時間分解蛍光共鳴エネルギー転移、シンチレーション近接アッセイ、レポーター遺伝子アッセイ、蛍光消光性酵素基質、発色性酵素基質および電気化学発光、イムノアッセイ（固相酵素免疫アッセイ（ELISA）、ラジオイムノアッセイ、免疫ブロット法、免疫組織化学など）、表面プラズモン共鳴、レポーター遺伝子を用いるものなどの細胞系アッセイ、および機能アッセイ（例えば、免疫機能および免疫応答性を測定するアッセイ）が非限定的に含まれる。本明細書に記載され、当業者に公知である方法の多くを、CD47およびCD47リガンドの結合、相互作用または生物機能に対する作用物質の効果、ならびに免疫細胞の免疫応答性に対する作用物質の効果を決定することを目的として、化合物のライブラリーなどからの多数の生物活性物質を分析するためのハイスループットスクリーニングに適合させることができる（例えば、High Throughput Screening: The Discovery of Bioactive Substances, Devlin, ed., (Marcel Dekker New York, 1997)を参照）。
【０２０６】
また、これらの手法およびアッセイ方式は、CD47リガンドとウイルスCD47様ポリペプチド（またはその細胞外ドメイン、もしくは細胞外ドメインを含む融合ポリペプチド）との、またはCD47を発現する免疫細胞とCD47リガンドとの複合体の形成を示すシグナルを検出および/または増幅するために有用な、特異的抗体などの二次試薬も含みうる。アッセイ成分または二次試薬の1つまたは複数を、酵素、細胞毒性物質、または色素、放射性核種、発光基、蛍光基もしくはビオチンなどを含む他のレポーター分子といった検出可能な部分（または標識もしくはレポーター分子）に付着させることができる。抗体の放射性標識のための手法は当技術分野で公知である（例えば、Adams, In Vivo 12:11-21 (1998)；Hiltunen, Acta Oncol. 32:831-9 (1993)を参照）。検出可能な部分は、付着または付着プロセスが、結合性に有害な影響を与え、分子の有用性が消失することがないという条件で、ポリペプチド中に位置する任意の利用可能なアミノ酸側鎖、末端アミノ酸または糖質官能基を通じて抗体と付着させることができる。具体的な官能基には、例えば、任意の遊離アミノ、イミノ、チオール、ヒドロキシル、カルボキシルまたはアルデヒド基が含まれる。ポリペプチドと検出可能な部分との付着は、検出可能な部分におけるそのような基および適切な官能基を介して達成することができる。結合は直接的であってもよく、またはスペーサー基もしくは架橋基を介した間接的なものであってもよい（例えば、国際特許出願公開第WO 93/06231号、第WO 92/22583号、第WO 90/091195号および第WO 89/01476号を参照；同じく、例えば、Pierce Biotechnology, Rockford, ILなどの製造供給元も参照のこと）。
【０２０７】
免疫細胞は本明細書に記載したような生物試料中に存在してもよく、またはそれから単離されてもよい。例えば、免疫細胞は初代もしくは長期細胞培養物から入手してもよく、または対象（ヒトまたは非ヒト動物）から入手した生物試料中に存在しても、もしくはそれから単離されてもよい。
【０２０８】
Fcを介した免疫細胞の活性化に対するCD47 Fc融合ポリペプチド（またはCD47 Fc融合ポリペプチドと類似の様式で作用する作用物質、例えば、抗CD47リガンド抗体）の効果を決定するための、例えば、融合ポリペプチドが免疫細胞のサイトカインまたはケモカイン産生を阻害する能力を決定するための方法も、本明細書において同じく提供および記載される。免疫複合体により誘導されるサイトカイン産生またはケモカイン産生に対するCD47 Fc融合ポリペプチド（または作用物質）の効果を決定するための方法も、本明細書において同じく提供および記載される。例示的な方法は実施例において提供される。
【０２０９】
本明細書で用いる「生物試料」とは、ある態様において、少なくとも1つのCD47リガンドまたはCD47ポリペプチド、またはそれらの変異体もしくは断片（例えば、細胞外ドメイン）を含む試料のことを指す。生物試料はまた、ウイルスCD47様ポリペプチドまたはその変異体もしくは断片（例えば、細胞外ドメイン）も含みうる。生物試料は、対象または生物供給源からの血液試料（それから血清または血漿を調製することができる）、生検標本、体液（例えば、肺洗浄液、腹水、粘膜洗浄液、滑液）、骨髄、リンパ節、組織外植片、器官培養物、または任意の他の組織もしくは細胞調製物であってよい。試料はさらに、例えば、切離、解離、可溶化、分画、ホモジネート化、生化学的または化学的抽出、粉砕、凍結乾燥、超音波処理、または対象もしくは生物供給源に由来する試料を加工処理するための任意の他の手段によって形態学的な完全性または物理的状態が破壊された、組織または細胞調製物であってもよい。対象または生物供給源は、ヒトまたは非ヒト動物、初代細胞培養物（例えば、免疫細胞、ウイルス感染細胞）、または、染色体に組み込まれたもしくはエピソーム性である組換え核酸配列を含みうる遺伝的に操作された細胞株、不死化したもしくは不死化させうる細胞株、体細胞ハイブリッド細胞株、分化したもしくは分化させうる細胞株、形質転換細胞株を非限定的に含む、培養用に適合化された細胞株であってよい。
【０２１０】
本明細書に記載したようなCD47細胞外ドメインまたはその変異体を含む融合ポリペプチド、および本明細書に記載した作用物質（例えば、CD47と特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント；アプタマー；ペプチド-IgFc融合ポリペプチド；CD47リガンドと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント）が、免疫細胞の免疫応答性を抑制し、それ故に自己免疫性疾患または炎症性疾患もしくは障害などの免疫学的疾患もしくは障害、心血管疾患もしくは障害、代謝性疾患もしくは障害、または増殖性疾患もしくは障害を治療するために有用となりうる能力は、本明細書に記載され、当業者によって用いられているさまざまな動物モデルの任意の1つにおいて決定および評価することができる（例えば、Taneja et al., Nat. Immunol. 2:781-84 (2001)；Lam-Tse et al., Springer Semin. Immunopathol. 24:297-321 (2002)による総説を参照）。例えば、受容体チロシンキナーゼをコードするTyro3、MerおよびAxlという3つの遺伝子がノックアウトされたマウスは、関節リウマチおよびSLEを含む、自己免疫性疾患のいくつかの症状を呈する（Lu et al., Science 293:228-29 (2001)）。自発性ループス様疾患のマウスモデルが、NZB/WF1ハイブリッドマウスを用いて記載されている（例えば、Drake et al., Immunol. Rev. 144:51-74 (1995)を参照）。動物の疾患の発症、調節および/または防御に影響を及ぼす作用物質および分子の試験を可能にするI型糖尿病の動物モデルは、MHCトランスジェニック（Tg）マウスを用いている。HLA-DQ8導入遺伝子（HLA-DQ8はヒト1型糖尿病の主たる素因遺伝子である）およびHLA-DQ6導入遺伝子（これは糖尿病防御性である）を発現するマウスが、RIP（rat insulin promoter）HLA-DQ8 RIP.B7-1トランスジェニックマウスと交配されて、自発性糖尿病を発症するB7-1-Tgマウスが得られている（Wakeland et al., Curr. Opin. Immunol. 11:701-707 (1999)；Wen et al., J. Exp. Med. 191:97-104 (2000)を参照）（同じく、Brondum et al., Horm. Metab. Res. 37 Suppl 1:56-60 (2005)も参照のこと）。
【０２１１】
関節リウマチなどの免疫学的疾患および障害を治療するために有用な、本明細書に記載した融合ポリペプチドおよび作用物質の特性決定のために用いうる動物モデルには、コラーゲン誘発性関節炎モデル（例えば、Kakimoto, Chin. Med. Sci. J. 6:78-83 (1991)；Myers et al., Life Sci. 61:1861-78 (1997)を参照）および抗コラーゲン抗体誘発性関節炎モデル（またはコラーゲン抗体誘発性関節炎（CAIA）（例えば、Kakimoto, 前記；Wallace et al., J. Immunol. 162:5547(1999)を参照）が含まれる。免疫学的疾患に対して適用可能な他の動物モデルには、実験的自己免疫性脳脊髄炎モデル（実験的アレルギー性脳脊髄炎モデルとも呼ばれる）、多発性硬化症の動物モデル；I型およびII型インターフェロン受容体が欠損し、かつ組換え活性化遺伝子2が欠損しているAGR129マウスを用いた乾癬モデル（Zenz et al., Nature 437:369-75 (2005)；Boyman et al., J. Exp. Med. 199:731-36 (2004)；2004年2月23日にオンラインで公開）；および炎症性腸疾患に関するTNBS（2,4,6-trinitrobenzene sulphonic acid）マウスモデルが含まれる。心血管疾患に関する数多くの動物モデルが利用可能であり、これには、van Vlijmen et al., J Clin. Invest. 93:1403-10 (1994)；Kiriazis et al., Annu. Rev. Physiol. 62:321-51 (2000)；Babu et al., Methods Mol. Med. 112:365-77 (2005)に記載されたモデルが含まれる。
【０２１２】
低分子
生物活性物質には、CD47、ウイルスCD47様ポリペプチドまたはCD47リガンドと結合する、および/またはCD47とCD47リガンドとの、またはウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの複合体と結合する、天然性および合成性の分子、例えば低分子も含まれうる。免疫細胞の免疫応答性を変化させる（抑制または強化する）、および/またはCD47リガンドとCD47との結合を阻害する作用物質をスクリーニングまたは同定する方法に用いるための候補作用物質は、化合物、組成物または分子の「ライブラリー」または収集物として提供することができる。
【０２１３】
そのような分子には、典型的には、当技術分野で「低分子」として公知であり、分子量が105ダルトン未満、104ダルトン未満、または103ダルトン未満である化合物が含まれる。例えば、被験化合物のライブラリーのメンバーを、本明細書で提供される少なくとも1つのCD47リガンドをそれぞれが含む多数の試料に投与し（それと組み合わせる、それに添加する）、続いて試料を、それらがウイルスCD47様ポリペプチドとリガンドとの結合もしくは相互作用を強化または阻害する、および/または少なくとも1つのCD47リガンドと、細胞の細胞表面に発現されたCD47との結合を強化もしくは阻害する能力；ならびに/または被験化合物が免疫細胞の免疫応答性を変化させる能力に関してアッセイする。CD47機能に影響を及ぼしうるとして、そのようにして同定された化合物は、CD47活性と関連のある疾患の治療および/または検出を可能にするため、治療的および/または診断的な目的にとって有意義である。
【０２１４】
候補作用物質をさらに、好ましくは多数の反応容器内で行われる多数の所定の化学反応によって調製された合成性作用物質を含む、コンビナトリアルライブラリーのメンバーとして提供することもできる。例えば、さまざまな出発化合物を、所与の成分に対して追跡可能な形で反応条件の多数の順列および/または組み合わせを行うことを可能にする、固相合成、記録下でのランダム混合法および記録下での反応分割手法のうち1つまたは複数によって調製することができる。結果として得られた産物は、合成ペプチドのコンビナトリアルライブラリー（例えば、国際特許出願第PCT/US91/08694号およびPCT/US91/04666号を参照）または低分子を含みうる他の組成物（例えば、国際特許出願第PCT/US94/08542号、欧州特許第0774464号、米国特許第5,798,035号、米国特許第5,789,172号、米国特許第5,751,629号、これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）のように、スクリーニングを行った後に反復的な選択および合成手順を行うことのできるライブラリーを含む。当業者は、そのようなライブラリーの多様な取り合わせを、確立された手順に従って調製して、本開示に従って試験しうることを理解するであろう。ある種の低分子のコンビナトリアルライブラリーおよびペプチドのコンビナトリアルライブラリーを商業的に入手することもできる。
【０２１５】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当技術分野で見いだすことができ、例えば、DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909 (1993)；Erb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422 (1994)；Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37:2678 (1994)；Cho et al., Science 261:1303 (1993)；Carrell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059 (1994)；Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061(1994)；およびGallop et al., J. Med. Chem. 37:1233 (1994)に記載されている。化合物のライブラリーは溶液中（例えば、Houghten, Biotechniques 13:412-21(1992)）、またはビーズ（Lam, Nature 354:82-84 (1991)）、チップ（Fodor, Nature 364:555-56 (1993)）、細菌（Ladner, 米国特許第5,223,409号）、胞子（Ladner, 前記）、プラスミド（Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-69(1992)）もしくはファージ（Scott and Smith, Science 249:386-390 (1990)；Devlin, Science 249:404-406 (1990)；Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-82 (1990)；Felici, J. Mol. Biol. 222:301-10 (1991)；Ladner, 前記）上に提示されてもよい。
【０２１６】
ペプチド-免疫グロブリン定常領域融合ポリペプチド
1つの態様において、免疫細胞の免疫応答性を変化させるために用いられ、かつ免疫学的疾患または障害を治療するために用いうる生物活性物質は、ペプチド-IgFc融合ポリペプチドを含む、ペプチド-免疫グロブリン（Ig）定常領域融合ポリペプチドである。ペプチドは任意の天然性または組換え的に調製された分子であってよい。ペプチド-IgFc融合ポリペプチドなどのペプチド-Ig定常領域融合ポリペプチド（当技術分野ではペプチボディ（peptibody）とも称される（例えば、米国特許No.6,660,843号参照））には、免疫細胞によって発現されるCD47またはCD47リガンドなどの関心対象のタンパク質の活性を変化させうる生物活性のあるペプチドまたはポリペプチドが含まれる。ペプチドは、免疫グロブリンの一部分、少なくとも1つの定常領域ドメイン（例えば、CH1、CH2、CH3および/またはCH4）またはFcポリペプチド（CH2-CH3）とインフレームに融合させることができる。ムテイン型Fcポリペプチドを含むFcポリペプチドは本明細書において詳細に記載されており、これは本明細書においてFc部分またはFc領域とも称される。
【０２１７】
1つの態様において、融合ポリペプチドのペプチド部分は、CD47と相互作用または結合して、それがCD47と結合した場合にウイルスCD47様ポリペプチドと同じ生物活性を生じさせ、および/またはCD47リガンドと同じ生物活性を生じさせ、それ故に免疫細胞の免疫応答性を抑制する（阻害する、妨げる、減少させる、または消失させる）ことができる。免疫細胞の免疫応答性を変化させること（例えば、抑制すること）のできるペプチド（すなわち、ウイルスCD47様ポリペプチド模倣物として作用するペプチド）を同定するための方法が本明細書で提供される。例えば、そのようなペプチドは、それがCD47リガンドとCD47を発現する細胞との結合を阻害またはブロックする能力を決定することによって同定しうる。または、候補ペプチドを、CD47を発現する免疫細胞と接触または相互作用させて、候補ペプチドが免疫細胞の免疫応答性を抑制または強化する能力を、本明細書に記載され、当技術分野で実施されている方法に従って測定することもできる。候補ペプチドは、多数の反応容器内で行われる多数の所定の化学反応によって調製された合成ペプチドを含むコンビナトリアルライブラリーのメンバーとして提供することができる。例えば、さまざまな出発ペプチドを、当業者が精通しているであろう標準的なペプチド合成手法に従って調製することができる。
【０２１８】
免疫細胞の免疫応答性を変化させるペプチドは、コンビナトリアルライブラリーから（例えば、国際特許出願第PCT/US91/08694号およびPCT/US91/04666号）、およびファージディスプレイペプチドライブラリーから（例えば、Scott et al., Science 249:386 (1990)；Devlin et al., Science 249:404 (1990)；Cwirla et al., Science 276: 1696-99 (1997)；米国特許第5,223,409号；米国特許第5,733,731号；米国特許第5,498,530号；米国特許第5,432,018号；米国特許第5,338,665号；1994；米国特許第5,922,545号；国際出願公開第WO 96/40987号および第WO 98/15833号を参照）単離することができる。ファージディスプレイペプチドライブラリーでは、ペプチドが糸状ファージ粒子の外表面に提示されるように、ランダムなペプチド配列をファージコートタンパク質と融合させる。典型的には、提示されたペプチドを関心対象のリガンドまたは結合分子と、ペプチドとリガンドまたは結合分子との相互作用が可能になるように接触させ、結合しなかったファージを除去して、結合したファージを溶出させ、その後にアフィニティー精製および再増殖を連続して複数回繰り返して濃縮する。関心対象のリガンドまたは結合分子または標的分子（例えば、CD47）に対して最も高い親和性を有するペプチドのシークエンシングを行って鍵となる残基を同定し、それによってペプチドの1つまたは複数の構造的に関連のあるファミリーの内部のペプチドを同定することができる。また、ペプチドの配列の比較により、そのようなペプチド中のどの残基を、突然変異誘発によって安全に置換または欠失させうるかが示されうる。続いて、これらのペプチドを、スクリーニング可能な別のペプチドライブラリー中に組み入れて、最適化された親和性を有するペプチドを同定することができる。
【０２１９】
免疫細胞の免疫応答性を変化させ、それ故に免疫学的疾患または障害を治療および/または予防するために有用な可能性のあるペプチドを同定するための方法には、（1）ペプチドを設計するために有用と考えられる、CD47の決定的な残基の配向を同定および決定するための、CD47標的（特にCD47細胞外ドメイン）の結晶構造を解析する（例えば、Jia, Biochem. Cell Biol. 75:17-26 (1997)を参照）というようなタンパク質-タンパク質相互作用の構造解析（例えば、Takasaki et al., Nature Biotech. 15:1266-70 (1997)を参照）；（2）ペプチドグリカン会合性リポタンパク質と融合され、大腸菌などの細菌の外表面に提示されたペプチドを含むペプチドライブラリー；（3）RNA会合性ペプチドを生成させるために、ポリペプチドの翻訳を途絶させることによってペプチドのライブラリーを作製すること；および（4）ポリペプチドを1つまたは複数のプロテアーゼで消化することによってペプチドを生成させることが非限定的に含まれる。（同じく例えば、米国特許第6,660,843号；第5,773,569号；第5,869,451号；第5,932,946号；第5,608,035号；第5,786,331号；第5,880,096号も参照のこと）。ペプチドは、3〜75アミノ酸、、3〜60アミノ酸、3〜50アミノ酸、3〜40アミノ酸、3〜30アミノ酸、3〜20アミノ酸または3〜10アミノ酸の間の任意の数のアミノ酸を含みうる。免疫細胞の免疫応答性を変化させる（例えば、ある態様においては免疫細胞の免疫応答性を抑制し、ある他の態様においては免疫細胞の免疫応答性を強化する）能力を有するペプチドを、さらに、ペプチド-Ig定常領域融合タンパク質を構築するために有用なアミノ酸（連結配列であるかスペーサー配列であるアミノ酸）を付加または挿入するために誘導体化することもできる。
【０２２０】
ペプチド-Ig定常領域融合ポリペプチド（ペプチド-IgFc融合ポリペプチドを含む）を構築するために用いられうるペプチドは、CD47リガンド（例えば、SIRP-α、SIRP-β-2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリン）から導き出すことができる。種々のプロテアーゼの任意の1つまたは複数を用いたCD47リガンドのタンパク質分解消化によってペプチドをランダムに生成させて単離し、続いてそれらが免疫細胞の免疫応答性を変化させる能力を分析することができる。また、CD47リガンドペプチドを、本明細書に記載され、当技術分野で実施されている組換え法を用いて作製することもできる。また、ランダムに生成されたペプチドを、本明細書および当技術分野において記載されているように、ペプチドコンビナトリアルライブラリーまたはファージライブラリーを調製するために用いることもできる。または、CD47と相互作用するCD47リガンドの部分のアミノ酸配列を、CD47もしくはCD47の一部分、例えばその細胞外部分のコンピュータモデル化、および/またはX線結晶解析（これは、CD47細胞外ドメインのみの、またはCD47リガンドと複合体を形成したCD47細胞外ドメインの結晶の調製および解析を含みうる）によって決定することができる。
【０２２１】
ペプチド-IgFc融合ポリペプチドのIgFc部分は、CD47細胞外ドメインと融合させるための、本明細書において詳細に記載されたFcポリペプチドまたはムテイン型Fcポリペプチドの任意のものであってよい。以上に詳細に記載したように、免疫グロブリンのFcポリペプチドは、重鎖CH2ドメインおよびCH3ドメイン、ならびにCH1とCH2との間に位置するヒンジ領域の一部分または全体を含む。Fc領域は、共有的（例えば、特にジスルフィド結合）および非共有的な会合によって二量体または多量体の形態として連結されうる単量体ポリペプチドである。Fcポリペプチドの単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、免疫グロブリンのクラス（例えば、IgG、IgA、IgE）またはサブクラス（例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2）によって異なる。Fcポリペプチド、および任意の1つまたは複数の定常領域ドメイン、および少なくとも1つの免疫グロブリン（Ig）定常領域ドメインを含む融合タンパク質は、当業者が非常に精通している組換え分子生物学の手法に従って容易に調製することができる。
【０２２２】
Fcポリペプチドは、好ましくは、ペプチド-IgFc融合ポリペプチドを用いようと意図する動物種に由来するヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を用いて調製される。1つの態様において、Fcポリペプチドはヒト由来であり、例えばヒトIgG1およびIgG2を含む、任意のヒト免疫グロブリンクラスからのものであってよい。
【０２２３】
本明細書に記載したようなFcポリペプチドには、Fcポリペプチド変異体（本明細書ではムテイン型Fcポリペプチドとも称される）も含まれる。上記のようなペプチドと融合されうるFcポリペプチドまたはムテイン型Fcポリペプチドには、上記のムテイン型Fcポリペプチドの任意の1つが含まれる。1つのそのようなFcポリペプチド変異体は、2つのFcポリペプチド単量体の間に形成されうる鎖間ジスルフィド結合の数を減少させるために、1つまたは複数のシステイン残基（ヒンジ領域内の1つまたは複数のシステイン残基など）がセリンなどの別のアミノ酸によって置換されている。
【０２２４】
同じく本明細書において詳細に記載したように、Fcポリペプチド変異体のもう1つの例は、Fcポリペプチドのエフェクター機能のレベルが低下するように、エフェクター機能に関与または関連する1つまたは複数のアミノ酸が置換または欠失を受けている変異体である。例えば、Fc領域内のアミノ酸を、Fcポリペプチドと補体カスケードの成分との結合を低下もしくは消失させるため（例えば、Duncan et al., Nature 332:563-64 (1988)；Morgan et al., Immunology 86:319-24 (1995)を参照）；またはFcポリペプチドが免疫細胞によって発現されたIgG Fc受容体と結合する能力を低下もしくは消失させるため（Wines et al., J. Immunol. 164:5313-18 (2000)；Chappel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9036 (1991)；Canfield et al., J. Exp. Med. 173:1483 (1991)；Duncan et al., 前記）；または抗体依存性細胞傷害性を変化させるために、置換することができる。
【０２２５】
ある態様において、ペプチドと融合されるムテイン型Fcポリペプチドは、Fcポリペプチドのヒンジ領域のアミノ末端の最も近位にあるシステイン残基の置換または欠失、および隣接アスパラギン酸残基（FcポリペプチドのC末端の方向）の欠失を含む。融合ポリペプチドはさらに、ムテイン型FcポリペプチドがIgFc受容体と結合する能力を低下させる、FcポリペプチドのCH2ドメインにおける少なくとも1つ、2つまたは3つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含みうる。特定的な態様において、CH2ドメインにおける少なくとも1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換は、EU番号による234、235および/または237位に対応する位置にあるアミノ酸の置換である。例示的なムテイン型Fcポリペプチドは本明細書に詳細に記載されており、ムテイン型Fcポリペプチドの例示的なアミノ酸配列には、SEQ ID NO：7、8および23に示されたアミノ酸配列が非限定的に含まれる。
【０２２６】
アプタマー
アプタマーとは、核酸、タンパク質、脂質などを含む他の分子と結合する能力に基づいてランダムなプールから選択されたDNAまたはRNA分子のことであり、一般に一本鎖である。関心対象のポリペプチドをコードする配列を含み、かつ転写または翻訳を変化させるアンチセンスポリヌクレオチド、短鎖干渉RNA（siRNA）またはリボザイムとは異なり、アプタマーはポリペプチドを標的として、それと結合することができる。アプタマーは、特定の標的、この場合にはCD47と結合する能力によって、ランダムまたは非改変オリゴヌクレオチドライブラリーから選択することができる（例えば、米国特許第6,867,289号；米国特許第5,567,588号を参照）。アプタマーは種々の二次元および三次元構造を形成する能力を有し、その単量体の内部に、単量体性であるか多量体性であるかを問わず、事実上あらゆる化合物にリガンドとして作用する（すなわち、特異的な結合対を形成する）ことのできる十分な化学的汎用性を有する。任意のサイズまたは組成の分子が標的としての役を果たしうる。ライブラリーを標的に対する高い親和性を有する種に関して富化するために、インビトロ選択の反復的プロセスを用いることができる。このプロセスは、ライブラリーと所望の標的とのインキュベーションの反復サイクル、遊離オリゴヌクレオチドと標的と結合したものとの分離、および、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）などを用いることによる、結合したオリゴヌクレオチドの増幅を伴う。標的に対して高い親和性を有する、配列の選択された部分集団から部分集団をサブクローニングし、特定のアプタマーを、標的の生物機能を変化させるアプタマーを同定するためにさらに詳細に検討することができる（例えば、米国特許第6,699,843号を参照）。
【０２２７】
アプタマーは、任意のデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはこれらの塩基の修飾物、例えば、リンと結合した非架橋性リガンドの1つとして酸素の代わりにイオウを有するデオキシチオホスホスフェート（deoxythiophosphosphate）（またはホスホロチオエート）などを含みうる。モノチオホスフェートαSは1つのイオウ原子を含み、このためリン中心の周りでキラル性である。ジチオホスフェートは両方の酸素の箇所で置換されており、このため非キラル性である。ホスホロチオエートヌクレオチドは市販されており、または当技術分野で公知のいくつかの異なる方法によって合成することもできる。
【０２２８】
CD47細胞外ドメインを含む融合ポリペプチド、ウイルスCD47様細胞外ドメインを含む融合ポリペプチド、およびポリペプチド性作用物質の発現
ムテイン型Fcポリペプチドと融合したCD47細胞外ドメインまたはその変異体を含む融合ポリペプチド、ムテイン型Fcポリペプチドと融合したウイルスCD47様細胞外ドメインを含む融合ポリペプチド、およびペプチド-IgFc融合ポリペプチドを含む、本明細書に記載した融合ポリペプチドの任意のものを、そのようなポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドを含むベクターおよび構築物、特に組換え発現構築物を用いて発現させることができる。宿主細胞は、組換え手法によって、これらのポリペプチドおよび融合タンパク質、またはその断片もしくは変異体を産生させるために、ベクターおよび/または構築物によって遺伝的に操作される。本明細書に記載したポリペプチドおよび融合ポリペプチドのそれぞれを、適切なプロモーターの制御下で、哺乳動物細胞、酵母、細菌、昆虫または他の細胞において発現させることができる。また、そのようなタンパク質を、DNA構築物に由来するRNAを用いて産生させるために、無細胞翻訳系を用いることもできる。原核および真核宿主に用いるのに適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、例えば、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor, New York, (2001)に記載されている。
【０２２９】
一般に、組換え発現ベクターは、複製起点、大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子およびS.セレビシエTRP1遺伝子などの宿主細胞の形質転換を可能にする選択マーカー、ならびに下流の構造配列の転写を導くための高発現性遺伝子由来のプロモーターを含む。プロモーターは、とりわけ、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）、α因子、酸性ホスファターゼまたは熱ショックタンパク質などの、解糖酵素をコードするオペロンから導き出すことができる。異種構造配列は、翻訳開始配列および終結配列とともに適切な相（phase）で組み立てられる。  
【０２３０】
任意で、異種配列は、所望の特性を付与する、例えば、産生されたポリペプチドを安定化する、または発現された組換え産物の精製を簡便化する、アミノ末端またはカルボキシ末端識別用のペプチドまたはポリペプチドをさらに含む融合タンパク質をコードすることもできる。そのような識別用ペプチドには、ポリヒスチジンタグ（hisタグ）またはFLAG（登録商標）エピトープタグ（DYKDDDDK、SEQ ID NO：24）、β-ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、GST、またはXPRESS（商標）エピトープタグ（DLYDDDDK、SEQ ID NO：25；Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）などが含まれる（例えば、米国特許第5,011,912号；Hopp et al., (Bio/Technology 6:1204 (1988)を参照）。親和性配列はベクターによって供給することができ、これには例えば、pBAD/His（Invitrogen）中にて提供されるヘキサ-ヒスチジンタグなどがある。または、親和性配列を合成的に付加すること、または核酸コード配列を組換え的に作製するため（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて）に用いられるプライマー中に人工的に加えることもできる。
【０２３１】
記載された組換え発現構築物を含む宿主細胞は、ベクターおよび/または発現構築物（例えば、クローニングベクター、シャトルベクターまたは発現構築物）によって遺伝的に操作（形質導入、形質転換、またはトランスフェクト）されてもよい。ベクターまたは構築物は、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態でありうる。この操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化するため、形質転換体を選択するため、または特定の遺伝子もしくはコード性ヌクレオチド配列を増幅するために適切に改変された従来の栄養培地中で培養することができる。特定の宿主細胞のための培養条件、例えば、温度、pHなどの選択および維持は、当業者には直ちに明らかであろう。好ましくは、当技術分野で確立された方法に従って、宿主細胞を培養下での持続的増殖用に適合させ細胞株を得ることができる。ある態様において、細胞株は不死細胞株であり、これは、対数増殖期の後に培養下で繰り返し（生存性を維持しながら少なくとも10回）継代させることのできる細胞株のことを指す。他の態様において、細胞株を作製するために用いられる宿主細胞は、癌細胞または形質転換細胞または悪性細胞のように、調節を受けない増殖を行いうる細胞である。
【０２３２】
有用な細菌発現構築物は、発現ベクター中に、所望のタンパク質をコードする構造DNA配列を、作動可能な読み取り相にある機能的プロモーターを伴う適した翻訳開始および終結シグナルとともに、挿入することによって構築される。構築物は、ベクター構築物の維持を確実なものとするために、または所望であれば、宿主内での増幅を与えるために、1つまたは複数の表現型選択マーカーおよび複製起点を含みうる。形質転換のために適した原核宿主には、大腸菌、枯草菌（Bacillus subtilis）、チフス菌（Salmonella typhimurium）、ならびにシュードモナス属（Pseudomonas）、ストレプトミセス属（Streptomyces）およびブドウ球菌属（Staphylococcus）の範囲内にあるさまざまな種が含まれるが、他のものを選択物として用いてもよい。任意の他のプラスミドまたはベクターを、それらが宿主内で複製可能であって生存可能である限り、用いることができる。したがって、例えば、本明細書で提供するような核酸を、ポリペプチドを発現させるための組換え発現構築物として、種々の発現ベクター構築物のいずれか1つの中に含めることができる。そのようなベクターおよび構築物には、染色体性、非染色体性および合成性のDNA配列、例えば、細菌プラスミド；ファージDNA；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドとファージDNAとの組み合せから得られるベクター；ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルスおよび仮性狂犬病などのウイルスDNAが含まれる。しかし、任意の他のベクターを、それが宿主中で複製可能であって生存可能である限り、用いることができる。
【０２３３】
適切なDNA配列を、種々の手順によってベクター中に挿入することができる。一般に、DNA配列は、当技術分野で公知の手順によって、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。クローニング、DNAの単離、増幅および精製のため、DNAリガーゼ、DNAポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどを伴う酵素反応のための標準的な手法、ならびにさまざまな分離手法は、当業者に公知であって一般的に用いられているものである。数多くの標準的な手法が、例えば、Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., 1993))；Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., (Cold Spring Harbor Laboratory 2001))；Maniatis et al. (Molecular Cloning, (Cold Spring Harbor Laboratory 1982))および他のものに記載されている。
【０２３４】
発現ベクター中にあるポリペプチドをコードするDNA配列は、mRNA合成を導くために、少なくとも1つの適切な発現制御配列（例えば、プロモーターまたは調節性プロモーター）と機能的に連結される。そのような発現制御配列の代表例には、LTRまたはSV40プロモーター、大腸菌lacまたはtrp、ファージλ PLプロモーター、および原核もしくは真核細胞またはそれらのウイルスにおける遺伝子の発現を制御することが公知である他のプロモーターが含まれる。プロモーター領域は、CAT（chloramphenicol transferase）ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを用いて、いずれかの所望の遺伝子から選択することができる。具体的な細菌プロモーターには、lacI、lacZ、T3、T5、T7、gpt、λPR、PLおよびtrpが含まれる。真核生物プロモーターには、CMV最初期（immediate early）、HSVチミジンキナーゼ、初期および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、およびマウスのメタロチオネイン-Iが含まれる。適切なベクターおよびプロモーターの選択、ならびに本明細書に記載した核酸と機能的に連結された少なくとも1つのプロモーターまたは調節性プロモーターを含むある種の組換え発現構築物の調製は、当業者のレベルの範囲内に十分にある。
【０２３５】
誘導性、調節性プロモーターおよび/または厳密な調節性プロモーターの設計および選択は当技術分野で公知であり、具体的な宿主細胞および発現系に依存すると考えられる。pBAD発現系（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）は、アラビノース代謝経路を制御する大腸菌アラビノースオペロン（PBADまたはPARA）を用いる、厳密な調節性プロモーターの一例である（Guzman et al., J. Bacteriology 177:4121-30 (1995)；Smith et al., J. Biol. Chem. 253:6931-33 (1978)；Hirsh et al., Cell 11:545-50 (1977)を参照）。この系を用いた種々のベクターが市販されている。厳密な調節性プロモーターにより作動される発現系の他の例には、Stratagene（La Jolla, CA）から入手しうるPET発現系（米国特許第4.952,496号を参照）、tet調節性発現系（Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-51 (1992)；Gossen et al., Science 268:1766-69 (1995)）が含まれる。pLP-TRE2アクセプターベクター（BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA）は、部位特異的Cre-lox組換え系を用いた、関心対象の遺伝子の厳密に制御された誘導性発現のためのテトラサイクリン調節性発現構築物を迅速に作製するために、CLONTECH社のCreator（商標）クローニングキットとともに用いるために設計されており（例えば、Sauer, Methods 14:381-92 (1998)；Furth, J. Mamm. Gland Biol. Neoplas. 2:373 (1997)）、これを宿主細胞の不死化のために用いることもできる（例えば、Cascio, Artif. Organs 25:529 (2001)を参照）。
【０２３６】
ベクターは、レトロウイルスベクターなどのウイルスベクターであってもよい。例えば、レトロウイルスプラスミドベクターを導き出せるレトロウイルスには、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血症ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳房腫瘍ウイルスが非限定的に含まれる。ベクターは1つまたは複数のプロモーターも含む。用いうる適したプロモーターには、レトロウイルスLTR；SV40プロモーター；および、Miller et al., Biotechniques 7:980-990 (1989)に記載されたサイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、または任意の他のプロモーター（例えば、ヒストン、pol IIIおよびβ-アクチンプロモーターを含む、真核生物プロモーター）が非限定的に含まれる。用いうる他のウイルスプロモーターには、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（TK）プロモーター、およびB19パルボウイルスプロモーターが非限定的に含まれる。
【０２３７】
レトロウイルスプラスミドベクターは、プロデューサー細胞株を形成させるための、パッケージング細胞株の形質導入のために用いられる（例えば、PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、ψCRE、ψCRIP、GP+E-86、GP+envAm12、DAN；例えば、Miller, Human Gene Therapy, 1:5-14 (1990)も参照のこと）。ベクターは、例えば、エレクトロポレーション、リポソームの使用およびリン酸カルシウム沈降といった当技術分野で公知の任意の手段により、パッケージング細胞に形質導入されうる。プロデューサー細胞株は、本明細書に記載したポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸配列を含む感染性レトロウイルスベクター粒子を生成する。続いて、このようなレトロウイルスベクター粒子を、インビトロまたはインビボで真核細胞の形質導入を行うために用いることができる。形質導入しうる真核細胞には、例えば、胚性幹細胞、胎性癌細胞、造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、気管支上皮細胞、および培養用に適合化された他の細胞株が含まれる。
【０２３８】
もう1つの例として、ポリペプチドまたは融合タンパク質の発現を導く組換えウイルス構築物による形質導入を受けた宿主細胞が、ウイルス出芽時にウイルス粒子によって取り込まれた宿主細胞膜の部分に由来する、発現されたポリペプチドまたは融合タンパク質を含むウイルス粒子を産生してもよい。核酸配列をコードするポリペプチドをバキュロウイルスシャトルベクター中にクローニングし、続いてそれをバキュロウイルスと組み換えさせて、例えばSf9宿主細胞を感染させるために用いられる組換えバキュロウイルス発現構築物を作製することができる（例えば、Baculovirus Expression Protocols, Methods in Molecular Biology Vol. 39, Richardson, Ed. (Human Press 1995)；Piwnica-Worms,“Expression of Proteins in Insect Cells Using Baculoviral Vectors,”Section II, Chapter 16, Short Protocols in Molecular Biology, 2nd Ed., Ausubel et al., eds., (John Wiley & Sons 1992)中、page 16-32から16-48までを参照）。
【０２３９】
免疫学的障害および疾患の治療
もう1つの態様においては、免疫学的疾患および障害、特に本明細書に記載したような炎症性疾患もしくは障害、自己免疫性疾患もしくは障害、心血管疾患もしくは障害、代謝性疾患もしくは障害または増殖性疾患または障害を治療および/または予防するための方法が提供される。そのような治療を必要とする対象は、免疫学的疾患の症状を発症した、または免疫学的疾患を発症するリスクのある、ヒトであってもよく、または非ヒト霊長動物もしくは他の動物（すなわち、獣医学的用途）であってもよい。非ヒト霊長動物および他の動物の例には、家畜、ペットおよび動物園の動物が非限定的に含まれる（例えば、ウマ、ウシ、バッファロー、ラマ、ヤギ、ウサギ、ネコ、イヌ、チンパンジー、オランウータン、ゴリラ、サル、ゾウ、クマ、大型ネコ科動物など）。
【０２４０】
本明細書に記載したように、薬学的に許容される担体（本明細書においては薬学的または生理学的に適した適した担体または添加剤とも称される）と、Fcポリペプチドまたはその変異体と融合したCD47細胞外ドメインまたはその変異体を含む本明細書に記載した融合ポリペプチドのいずれか1つ（融合ポリペプチド二量体も含まれうる）とを含む組成物を投与することによって、免疫学的疾患または障害を有するまたは発症するリスクのある対象（宿主または患者）における免疫応答を変化させる（例えば、抑制または強化する）ための方法が提供される。ある態様において、組成物は、免疫細胞の免疫応答性を抑制する（すなわち、減少させる、低下させる、阻害する、消失させる）ことによって、免疫応答を抑制する。他の態様において、本明細書に記載したCD47-Fcポリペプチド融合タンパク質は、免疫細胞の免疫応答性を抑制し、免疫細胞による少なくとも1つのサイトカインおよび/または少なくとも1つのケモカインの産生を阻害する（すなわち、減少させる、低下させる、抑制する、消失させる）。他の態様において、融合タンパク質は免疫複合体と樹状細胞などの免疫細胞との相互作用をブロックまたは阻害し、それ故に免疫細胞、例えば樹状細胞によるサイトカインおよび/またはケモカインの産生を阻害する。また、本明細書に記載した融合ポリペプチドは、細胞遊走を変化させること；TNF-α、IL-12、IL-23 IFN-γ、GM-CSFおよびIL-6を非限定的に含む、少なくとも1つのサイトカインの産生を阻害する（すなわち、減少させる、ブロックする、低下させる、消失させる）こと；樹状細胞の成熟を阻害すること；ナイーブT細胞のTh1エフェクター細胞への発生を損なわせること（すなわち、阻害すること、妨げること、遅らせること；または何らかの様式で有害な影響を及ぼす）；免疫細胞（例えば、樹状細胞）による、免疫複合体により誘導されるサイトカイン（例えば、TNF-α、IL-12、IL-23 IFN-γ、GM-CSFおよびIL-6）の産生を阻害する（すなわち、減少させる、ブロックする、低下させる、消失させる）こと；免疫細胞（例えば、樹状細胞）による、Fcを介したサイトカイン（例えば、TNF-α、IL-12、IL-23 IFN-γ、GM-CSFおよびIL-6）の産生を阻害する（すなわち、減少させる、ブロックする、低下させる、消失させる）こと；樹状細胞を非限定的に含む免疫細胞によるサイトカインおよび/またはケモカイン分泌を抑制する（すなわち、阻害する、減少させる、ブロックする、低下させる、消失させる）こと；免疫細胞の活性化を阻害すること、ここで免疫細胞はSIRPαを細胞表面に発現する；生物学的または臨床的に有意な様式での炎症誘発性応答を抑制することができる。
【０２４１】
他のある態様において、組成物は、CD47と特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントと、薬学的に許容される（すなわち、適した）担体とを含む。もう1つのある態様においては、CD47と結合する作用物質、例えば低分子、アプタマーまたはペプチドFc融合ポリペプチドなどと、薬学的に許容される（すなわち、適した）担体とを含む組成物が提供される。
【０２４２】
同じく提供されるのは、前述の組成物のいずれか1つを投与することによって、免疫学的疾患または障害を有するまたは発症するリスクのある対象（宿主または患者）における免疫応答を変化させる（例えば、抑制または強化する）ための方法である。1つの態様において、対象における免疫応答を変化させるための方法は、薬学的に適した担体と、Fcポリペプチドまたはその変異体と融合したCD47細胞外ドメインまたはその変異体を含む、本明細書に記載した融合ポリペプチドのいずれか1つとを含む組成物；薬学的に適した担体と、本明細書に詳細に記載したような、CD47と特異的に結合する少なくとも1つの抗体またはその抗原結合フラグメントとを含む組成物を投与する段階を含む。もう1つの態様において、対象における免疫応答を変化させるための方法は、本明細書に詳細に記載したような、CD47と結合する作用物質、例えば低分子、アプタマーまたはペプチドFc融合ポリペプチドなどと、薬学的に適した担体とを含む組成物を投与する段階を含む。特定の態様において、そのような方法は対象における免疫応答を抑制する。もう1つの特定の態様において、そのような方法は対象における免疫応答を強化する。
【０２４３】
もう1つの態様においては、免疫学的疾患または障害を治療するための方法であって、それを必要とする対象に対して、薬学的に適した担体、およびCD47の生物活性を変化させる作用物質を投与する段階を含む方法が提供される。免疫学的疾患または障害を治療するために有用な、本明細書に記載したような作用物質（抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、SIRPαなどのCD47リガンドと特異的に結合する抗体；低分子；アプタマー；ペプチド-IgFc融合ポリペプチドまたはペプチドIg定常領域ドメイン融合ポリペプチド；およびCD47細胞外ドメインを含む融合ポリペプチドを含み、これらはすべて本明細書において詳細に記載されている）は、CD47の少なくとも1つの生物活性（機能）を変化させること（統計学的に有意な、または生物学的に有意な様式で増加または減少させること）ができる。このため、免疫学的疾患または障害を治療するために用いられるそのような作用物質は、以下の少なくとも1つを含む、CD47の生物活性または機能のうち任意の1つまたは複数に影響を及ぼすこと、またはそれらを変化させることができる：免疫細胞の免疫応答性を変化させること；細胞遊走を変化させること；TNF-α、IL-12、IL-23 IFN-γ、GM-CSFおよびIL-6から選択される少なくとも1つのサイトカインの産生を阻害すること；樹状細胞の成熟を阻害すること；ナイーブT細胞のTh1エフェクター細胞への発生を損なわせること；免疫細胞（例えば、樹状細胞）による、免疫複合体により誘導されるサイトカイン（例えば、TNF-α、IL-12、IL-23、IFN-γ、GM-CSFおよびIL-6）の産生を阻害すること；樹状細胞によるサイトカイン分泌を抑制すること；および炎症誘発性応答を抑制すること。
【０２４４】
それを必要とする対象における免疫学的疾患または障害を治療するための方法であって、対象に対して投与される組成物が薬学的に適した担体と作用物質とを含み、その作用物質がCD47と特異的に結合して、ウイルスCD47様ポリペプチドと少なくとも1つのCD47リガンド（例えば、SIRP-α、SIRP-β-2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリン）との結合を損なわせる（すなわち、阻害する、妨げる、低下させる）能力を有する方法も提供される。作用物質にはまた、CD47リガンドと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、それぞれがSIRP-α、SIRP-β-2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリンなどの各々のコグネイトリガンドと特異的に結合する、異なる抗体）も含まれる。作用物質がCD47と結合して、vCD47と少なくとも1つのCD47リガンドとの結合を損なわせる能力は、単離されたCD47ポリペプチド（またはそのフラグメント、例えば細胞外ドメインなど）を用いる、またはCD47を表面上に発現する細胞を用いる、本明細書に記載したアッセイおよび手法を用いて決定することができる。vCD47ポリペプチドは、本明細書に記載したポックスウイルスCD47様ポリペプチドのいずれか1つ、例えば、SEQ ID NO：3に示されたアミノ酸配列を有する小痘瘡CD47様ポリペプチドであってよい。CD47と特異的に結合して、ウイルスCD4様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合を損なわせる作用物質を、細胞遊走、細胞増殖および細胞分化のうち少なくとも1つの変化と関連のある疾患または障害を治療するために用いることもできる。
【０２４５】
本明細書に記載した融合ポリペプチド、作用物質および方法は、免疫学的疾患または障害を治療する（すなわち、治癒させる、予防する、その症状を改善する、またはその進行を遅らせる、阻害するもしくは停止させる）ために用いることができる。自己免疫性または炎症性障害である、そのような疾患および障害には、多発性硬化症、関節リウマチ、脊椎関節症、全身性エリテマトーデス、抗体介在性の炎症性もしくは自己免疫性疾患、移植片対宿主病、敗血症、糖尿病、乾癬、アテローム性動脈硬化症、シェーグレン症候群、進行性全身性硬化症、強皮症、急性冠症候群、虚血再灌流、クローン病、子宮内膜症、糸球体腎炎、重症筋無力症、特発性肺線維症、喘息、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、血管炎、または炎症性自己免疫性筋炎が非限定的に含まれる。脊椎関節症には、例えば、強直性脊椎炎、反応性関節炎、炎症性腸疾患に伴う腸疾患性関節炎、乾癬性関節炎、孤発性急性前部ブドウ膜炎、未分化型脊椎関節症、ベーチェット症候群および若年性特発性関節炎が含まれる。
【０２４６】
免疫学的障害または疾患には、心血管疾患もしくは障害、代謝性疾患もしくは障害または増殖性疾患もしくは障害も含まれる。本明細書に記載した方法に従って融合ポリペプチドおよび作用物質によって治療される可能性のある心血管疾患または障害には、例えば、アテローム性動脈硬化症、心内膜炎、高血圧または末梢性虚血性疾患が含まれる。免疫学的障害または疾患でもある代謝性疾患には、糖尿病、クローン病および炎症性腸疾患が含まれる。例示的な増殖性疾患は癌である。癌または悪性腫瘍には、白血病（例えば、B細胞慢性リンパ性白血病）、リンパ腫、乳癌、腎癌および卵巣癌が非限定的に含まれる。
【０２４７】
本明細書で用いる場合、患者（または対象）は、免疫学的疾患または障害を有するかそれに罹患した、または検出可能な疾患がみられない、ヒトを含む任意の哺乳動物であってよい。したがって、治療を既存の疾患を有する対象に対して投与してもよく、または治療は、疾患もしくは病状を発症するリスクのある対象に対して投与される予防的なものであってもよい。
【０２４８】
組成物は、無菌の水性または非水性溶液、懸濁液または乳濁液である薬学的組成物であってよく、これはさらに生理的に許容されるまたは適した担体を含む。薬学的に許容されるまたは適した担体は、添加剤（すなわち、有効成分の活性と干渉しない非毒性材料）および/または希釈剤を含みうる（またはそれを指す）。そのような組成物は、固体、液体または気体（エアロゾル）の形態にあってよい。または、当技術分野で公知の技術を用いて、本明細書に記載した組成物を凍結乾燥物として製剤化してもよく、または化合物をリポソーム中に封入することもできる。薬学的組成物はまた、生物学的に活性であるか不活性である他の成分を含んでもよい。そのような成分には、緩衝液（例えば、中性緩衝食塩水またはリン酸緩衝食塩水）、糖質（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドもしくはアミノ酸、例えばグリシンなど、抗酸化剤、キレート剤、例えばEDTAもしくはグルタチオンなど、安定化剤、色素、香味剤、および懸濁化剤および/または保存料が非限定的に含まれる。
【０２４９】
薬学的組成物中に用いるための、当業者に公知である任意の適した添加剤または担体を、本明細書に記載した組成物中に用いることができる。治療的用途のための添加剤は周知であり、例えば、Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro ed. 1985)に記載されている。一般に、添加剤のタイプは、投与の様式に基づいて選択される。薬学的組成物は、例えば、局所的、経口、鼻腔、髄腔内、直腸、膣、眼内、結膜下、舌下、または皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内（intrasternal）、海綿内、道内（intrameatal）または尿道内への注射または注入などを含む非経口的投与を含む、任意の適切な投与様式のために製剤化することができる。非経口的投与のためには、担体には好ましくは水、食塩水、アルコール、脂肪、蝋または緩衝液が含まれる。経口投与のためには、以上の添加剤または固体添加剤もしくは担体の任意のもの、例えばマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、カオリン、デンプンデキストリン、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、グルコース、スクロースおよび炭酸マグネシウムなどを用いうる。
【０２５０】
薬学的組成物（例えば、経口投与または注射による送達のため）は、液体の形態にあってもよい。液体性の薬学的組成物は、例えば、以下の1つまたは複数を含みうる：注射用の水、食塩液、好ましくは生理的食塩水、リンゲル溶液、等張塩化ナトリウム、溶媒もしくは懸濁化媒質として利用しうる固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；抗菌薬；抗酸化剤；キレート剤；緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの浸透圧の調整のための作用物質。非経口的製剤は、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラス製もしくはプラスチック製の多回投与用バイアル中に封入することができる。生理的食塩水の使用が好ましく、注射用の薬学的組成物は好ましくは無菌である。
【０２５１】
CD47と特異的に結合する抗体およびその抗原結合フラグメント、低分子、アプタマーおよびペプチド-融合タンパク質を含む、本明細書に記載した融合ポリペプチドおよび作用物質を、持続的放出または徐放用に製剤化することもできる。そのような組成物は一般に周知の技術を用いて調製され、例えば、経口的、直腸内もしくは皮下埋め込みにより、または所望の標的部位への埋め込みにより投与される。持続放出製剤は、担体マトリックス中に分散された、および/または律速性の膜に囲まれた貯蔵部内に包含された状態で、作用物質を含みうる。このような製剤の内部に用いるための担体は生体適合性であり、さらに生分解性であってもよい；製剤は、有効成分の比較的一定したレベルの放出を与えることが好ましい。持続放出製剤内に含まれる活性化合物の量は、埋め込みの部位、放出の速度および予想期間ならびに治療または予防しようとする状態の性質に依存する。
【０２５２】
免疫学的疾患または障害を治療するための組成物の用量は、医学の技術分野の当業者が理解しているパラメーターに従って決定することができる。したがって、適切な用量は、患者の（例えば、ヒトの）状態、すなわち疾患の病期、全般的な健康状態、ならびに年齢、性別および体重、ならびに医学の技術分野の当業者が精通している他の要因に依存しうる。
【０２５３】
薬学的組成物は、医学の技術分野の当業者によって決定される、治療（または予防）しようとする疾患に対して適切な様式で投与されうる。適切な用量、ならびに投与の適した持続時間および頻度は、患者の状態、患者の疾患のタイプおよび重症度、有効成分の具体的な形態、ならびに投与の方法などの要因によって決定されると考えられる。一般に、適切な用量および治療レジメンは、治療的および/または予防的な有益性（例えば、完全もしくは部分的な寛解の頻度の増加、またはより長い無病および/もしくは全生存期間、または症状の重症度の軽減といった、臨床転帰の改善）を与えるために十分な量の組成物を提供する。予防的使用に関しては、用量は、免疫学的疾患または障害と関連のある疾患を予防する、発現を遅延させる、またはその重症度を低減させるのに十分であるべきである。
【０２５４】
至適用量は一般に、実験モデルおよび/または臨床試験を用いて決定されうる。至適用量は、患者の体容量、体重または血液容積に依存しうる。一般に、用量中に存在する、または用量中に存在するDNAによってインサイチューで産生される、本明細書に記載したような融合ポリペプチド、または本明細書に記載したような抗体もしくはその抗原結合フラグメントなどのポリペプチドの量は、宿主の1kg当たり0.01μg〜約1000μgの範囲である。有効な治療法を与えるのに十分な最小限の投与量の使用が、通常は好ましい。患者は一般に、治療または予防される病状に適したアッセイを用いて、治療的または予防的な有効性に関してモニターすることができ、それらのアッセイに当業者は精通していると考えられる。液体形態で投与される場合、適した容量サイズは患者のサイズによって異なると考えられるが、典型的には10〜60kgの対象に対して約1ml〜約500ml（1kg当たり約0.01μg〜約1000μgを含む）の範囲であると考えられる。
【０２５５】
アプタマーを含む核酸分子である作用物質を含む薬学的組成物の場合、核酸分子は、例えば、本明細書で提供される組換え発現構築物などの、核酸および細菌、ウイルスおよび哺乳動物発現系を含む、当業者に公知の種々の送達システムの任意のものの内部に存在してもよい。そのような発現系にDNAを組み入れるための手法は当業者に周知である。また、DNAは、例えば、Ulmer et al., Science 259:1745-49,1993に記載され、Cohen, Science 259:1691-1692, 1993によって総説がなされているように「裸」であってもよい。裸のDNAの取り込みは、DNAを、細胞内に効率的に輸送される生分解性ビーズ上にコーティングすることによって増加させることができる。
【０２５６】
核酸分子は、当技術分野で記載されているいくつかの方法のいずれか1つに従って細胞内に送達することができる（例えば、Akhtar et al., Trends Cell Bio. 2:139 (1992)；Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, 1995, Maurer et al., Mol. Membr. Biol. 16:129-40 (1999)；Hofland and Huang, Handb. Exp. Pharmacol. 137:165-92 (1999)；Lee et al., ACS Symp. Ser. 752:184-92 (2000)；米国特許第6,395,713号；国際特許出願公開第WO 94/02595号；Selbo et al., Int. J. Cancer 87:853-59 (2000)；Selbo et al., Tumour Biol. 23:103-12 (2002)；米国特許出願公開第2001/0007666号および第2003/077829号を参照）。当業者に公知であるそのような送達方法には、リポソーム中への封入、イオントフォレシスによるもの、または生分解性ポリマー；ヒドロゲル；シクロデキストリン（例えば、Gonzalez et al., Bioconjug. Chem. 10:1068-74 (1999)；Wang et al., 国際出願公開第WO 03/47518号および第WO 03/46185号を参照）；ポリ（乳酸-グリコール酸）共重合体（PLGA）およびPLCAミクロスフェア（ペプチドおよびポリペプチドならびに他の物質の送達用にも有用）（例えば、米国特許第6,447,796号；米国特許出願公開第2002/130430号を参照）；生分解性ナノカプセル；ならびに生体付着性ミクロスフェアなどの他の媒体中への組み入れによるもの、またはタンパク質性ベクター（国際出願公開第WO 00/53722号）によるものが非限定的に含まれる。もう1つの態様において、免疫細胞における免疫応答を変化させる（抑制または増強する）のに用いるため、および免疫学的疾患または障害を治療するための核酸分子を、ポリエチレンイミンエチレングリコール-N-アセチルガラクトサミン（PEI-PEG-GAL）誘導体またはポリエチレンイミン-ポリエチレングリコール-トリ-N-アセチルガラクトサミン（PEI-PEG-triGAL）誘導体とともに製剤化するか、または複合体を形成させることもできる（同じく、例えば、米国特許出願公開第2003/0077829号も参照のこと）。
【０２５７】
同じく本明細書において提供されるのは、免疫細胞の免疫応答性を抑制する作用物質を生産するための製造方法である。本方法は、免疫細胞の免疫応答性を変化させる作用物質を同定する段階を含む。作用物質の同定は、本明細書に記載した方法のいずれか1つによって達成することができ、それには（i）候補作用物質；（ii）ウイルスCD47様ポリペプチド（これは本明細書において詳細に記載されている）；および（iii）CD47リガンド（例えば、SIRP-α、SIRP-β-2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリン）を、CD47リガンドとウイルスCD47様ポリペプチドとの相互作用を可能にするのに十分な条件下および時間で接触させる段階が含まれる。本方法はさらに、候補作用物質の存在下におけるウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合のレベルを決定して、候補作用物質の非存在下におけるウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合のレベルを比較する段階を含む。候補作用物質の存在下におけるウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合のレベルの減少は、候補作用物質がウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合を阻害することを示す。続いて、候補作用物質を、CD47を発現する免疫細胞およびCD47リガンドと、CD47リガンドとCD47との相互作用を可能にするのに十分な条件下および時間で接触させる（混合する、組み合わせる、またはそれらの間の相互作用を可能にする何らかの様式で）。候補作用物質の存在下におけるCD47リガンドと免疫細胞との結合のレベルを決定し、候補作用物質の非存在下におけるCD47リガンドと免疫細胞との結合のレベルを比較する。候補作用物質の存在下における、CD47リガンドと免疫細胞との結合のレベルの減少は、候補作用物質が免疫細胞の免疫応答性を変化させることを示す。続いて、作用物質を、その特定の作用物質を生産するために有用かつ実際的である小規模または大規模な製造上の慣行に従って生産する。
【０２５８】
作用物質は、本明細書に記載した任意の作用物質、例えば、CD47細胞外ドメインまたはその変異体を含む融合ポリペプチド、CD47と特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント；低分子；アプタマー；およびペプチドIgFc融合ポリペプチド,またはCD47リガンドと特異的に結合するその抗体もしくは抗原結合フラグメントであってよい。特定の態様において、作用物質は、CD47細胞外ドメインまたはその変異体を含む融合ポリペプチド、またはその抗体または抗原結合フラグメントであり、それは本明細書に記載され、大規模製造のために適合化された方法に従って生産することができる。例えば、生産方法には、適切な培養条件を維持するためにモニターおよび制御されるバッチ細胞培養が含まれる。融合ポリペプチドまたはその抗体もしくは抗原結合フラグメントの精製は、本明細書に記載され、当技術分野で公知であり、国内および外国の規制当局の法律および指針に適合する方法に従って行いうる。
【０２５９】
実施例
実施例1
ヒトCD47-Fcポリペプチドによる、ヒト樹状細胞において黄色ブドウ球菌COWAN株（SAC）により誘導されるサイトカイン産生の阻害
本明細書に記載したように、CD47のコグネイトリガンドは、シグナル調節因子タンパク質α（Sirp-□）である（同じく、例えば、Latour et al., J. Immunol. 167:2547-54 (2001)も参照のこと）。本実施例では、huCD47細胞外ドメイン-Fcポリペプチド構築物が、ヒト単球由来の樹状細胞において黄色ブドウ球菌細胞（SAC）により誘導されるサイトカイン産生を阻害する能力について述べる。
【０２６０】
ヒトIgG Fcポリペプチドと融合したヒトCD47細胞外ドメインを、当業者が精通している分子生物学的な方法および手法、ならびにタンパク質発現の方法および手法を用いて調製した。これらの実施例で用いたヒトCD47細胞外ドメイン-Fcポリペプチドのアミノ酸配列は、SEQ ID NO：2に提示されている。CD47細胞外ドメインのポリペプチド配列は、SEQ ID NO：11（シグナルペプチドを有する）およびSEQ ID NO：1（シグナルペプチドを伴わない）に提示されている。これらの実施例で用いたヒトIgG Fcポリペプチドのアミノ酸配列は、SEQ ID NO：23に提示されている。。
【０２６１】
ヒト単球由来の樹状細胞を、記載された通りに調製した（Probst et al., Eur. J. Immunol. 27:2634-42 (1997)）。末梢血単核細胞（PBMC）を、Histopaque-1077（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）中での密度遠心法により、健康なドナーのヘパリン添加血液から調製した。この実験に関しては、PBMCを3例の異なるドナーから入手した。手短に述べると、15×106個のPBMCを、6ウェルプレートの1ウェル当たり2％ヒト血清（HuS）を有するRPMI（Lonza, Walkersville, MD）中で培養することによる付着段階により、単球を生成させた。2時間後に、付着細胞をPBSで2回洗浄し、続いて樹状細胞分化培地（Exvivo 15, Lonza）、10ng/mlのヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GMCSF）（PeproTech（登録商標）、Rocky Hill, NJ）、10ng/mlのヒトIL-4（PeproTech（登録商標）、Rocky Hill, NJ）とともに培養した。1日後に、非付着性細胞を丁寧に除去して、樹状細胞分化培地中でのさらに7日間の培養により、樹状細胞を残りの細胞から生成させた。
【０２６２】
3例のドナーのそれぞれからの8日齢のヒト単球由来の樹状細胞（96ウェルプレートの1ウェル当たり2×104個）を、IFN-γ（1000 U/ml）の存在下で、種々の濃度（0.006〜20μg/mlの間の5倍希釈）のヒトCD47-ヒトFcポリペプチドまたは対照分子、この場合にはヒトIgGとともに1時間にわたり処理した。続いて細胞を、0.01％ SAC（Pansorbin（登録商標） Cells, Calbiochem, San Diego CA）で一晩刺激した。刺激した細胞培養物からの上清を、SACによる刺激から18時間後に収集し、-20℃で直ちに保存した。
【０２６３】
各上清中のTNF-□ IL-12p70、IL-6およびMIP-1αの存在を、市販の調製キットを製造元（R&D Systems, Minneapolis, MN）によって提供されたプロトコールに従って用いるELISAによって決定した。データは図3に提示されている。hCD47-Fc構築物は、SACにより誘導されるTNF-□およびIL-12p70の産生を用量依存的な様式で減少させ、IC50は6ng/ml未満であった。ヒトIgG対照はSACにより誘導されるTNF-□産生に影響を及ぼさず、IL-12産生に対する影響は限定的であり、このことはCD47-Fc融合ポリペプチドのCD47ドメインが、SACに応じたDCのサイトカイン分泌を阻害することを示している。
【０２６４】
表Iに示されているように、ヒトCD47-Fcは、PBS-SACに応じたヒト樹状細胞によるIL-6およびMIP-1αの分泌を減少させた。
【０２６５】
（表１）hCD47-Fcによる、ヒト単球由来の樹状細胞におけるPBS-SACを介したサイトカイン産生の阻害
2009537145.tif 000004
【０２６６】
SACとヒト血清（HuS-SAC）とのインキュベーションは、ヒトDCにおいてSACにより誘導されるTNF-□およびIL-23の産生を増加させた。熱失活させたヒト血清（健常ドナープールから調製）（100μl）を、同容積の12％ SACとともに1時間インキュベートし、PBSで洗浄して、続いてPBS中に再懸濁させて、最終濃度を1.2％ SACとした。PBS-SACまたはFBS（ウシ胎仔血清）-SACの調製後に、ヒト血清の代わりにそれぞれPBSまたはFBSを添加することにより、同じプロトコールを行った。
【０２６７】
8日齢のヒト単球由来DC（2×104個/96ウェル）（上記のように調製）を、IFN-γ（1000 U/ml）の存在下で、種々の濃度の（0.001〜20μg/mlの間の5倍希釈）ヒトCD47-ヒトFcポリペプチドまたは対照分子、この場合にはCD47細胞外ドメインと融合させていないヒトFcポリペプチド（hFc-Stub）とともに1時間にわたり処理した。続いて、DCを0.01％ HuS-SACもしくは0.01％ PBS-SAC（TNF-αを測定する実験で使用）で、または0.01％ FBS-SAC（IL-23を測定する実験で使用）で刺激した。刺激した細胞培養物から18時間後に上清を収集し、TNF-αおよびIL-23の濃度を決定するまで上記の通りに保存した。TNF-αの存在は上記の通りに決定した。上清中のIL-23の存在は、市販の調製キットを製造元（eBioscience, San Diego CA）の指示に従って用いて決定した。その結果は図4および5に提示されている。
【０２６８】
SACとヒト血清とのインキュベーションは、ヒトDCにおいてSACにより誘導されるTNF-□およびIL-23の産生を増加させた。hCD47-FcはHuS-SACにより誘導されるTNF-□およびIL-23の産生を阻害し、IC50は0.16μg/ml未満であり、一方、Fc-Stub対照はサイトカイン分泌に対して何ら影響を及ぼさなかった。理論に拘束されることは望まないが、ヒト血清中に存在するヒトIgGは、SAC上のプロテインA結合部位を飽和させて、Fc-受容体を介したサイトカイン分泌の強化を誘発すると考えられる。
【０２６９】
実施例2
ヒトCD47-Fcポリペプチドによる、ヒト樹状細胞における免疫複合体により誘導されるサイトカイン産生の阻害
抗原-抗体複合体（すなわち、免疫複合体）は、全身性エリテマトーデス、関節リウマチおよびシェーグレン症候群などの種々のヒト疾患における関与が指摘されている過程である、Fc受容体を介した炎症を誘発することによって組織を障害させることができる。免疫複合体（IC）を介した炎症に対するhCD47-Fcの効果を、以前に記載された方法を改変することによって（例えば、Boruchov et al, J. Clin. Invest. 115:2914-23 (2005)を参照）、ヒト樹状細胞におけるICを介したサイトカイン誘導を模倣するために開発したインビトロアッセイを用いて決定した。樹状細胞（DC）を、炎症組織中のDCに似せるために、IFN-γおよび低用量のToll様受容体（TLR）リガンド（例えば、FSL-1またはLPS）によって活性化した。
【０２７０】
96ウェルプレートを、0.1 M NaHCO3/Na2CO3緩衝液中にある1ウェル当たり50μlの50μg/ml抗ヒトFcロバIgG（Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA）によって一晩コーティングした。続いてプレートをPBSで2回洗浄し、続いて0.005〜20μg/mlの間の種々の濃度（4倍希釈）のCD47-FcまたはhFc-Stubとともにインキュベートした。2時間後に、プレートをPBSで1回洗浄し、その後に培養物に樹状細胞を添加した。実施例1に記載した通りに調製した8日齢のヒト単球由来DC（2×104個/ウェル）を、IFN-γ（1000 U/ml）の存在下で添加した。または、ロバ抗ヒトFcでコーティングしていない対照プレート中にて、可溶性hCD47-FcまたはhFc-Stubのいずれかを含むウェルにDCを播いた。2時間後に、DCを0.1ng/mlのFSL-1（TLR-2リガンド）（InvivoGen, San Diego CA）で刺激した。実施例1に記載した通りに上清を18時間後に収集し、上清中のTNF-αの濃度を調べた。
【０２７１】
その結果は図6に提示されている。ロバIgGの存在（図6の右側）は、プレートに結合したIgGの非存在下におけるDCと比較して（図6の左側）、TLR2リガンドであるFSL-1に応じたヒトDCによるTNF-□産生のおよそ6倍の増加をもたらした。hCD47-Fcは、Fc-Stub対照と比較して、IgGを介したTNF-□産生の増加を用量依存的な様式で阻害した。hCD47-Fcは、プレートに結合したIgGの非存在下においてFSL-1により誘導されるサイトカイン産生に対しては何ら影響を及ぼさず、このことはhCD47-Fc融合ポリペプチドのCD47部分がFc-受容体を介したDCの活性化を阻害したことを示している。
【０２７２】
実施例3
ヒトCD47融合ポリペプチド二量体による、ヒト樹状細胞におけるIgGにより誘導されるサイトカイン産生の阻害
本実施例は、ヒトCD47細胞外ドメイン融合ポリペプチド二量体がヒト樹状細胞におけるIgGを介したサイトカイン産生を阻害する能力を記載している。
【０２７３】
非免疫グロブリン部分と融合したヒトCD47の細胞外ドメインを含む融合ポリペプチド。本明細書に記載したように、融合ポリペプチド二量体は、鎖間ジスルフィド結合を形成しうる融合ポリペプチドのCD47部分を介して形成される。CD47部分と融合した非免疫グロブリン部分はHac部分と称され、血球凝集素（HA）結合部位であるC-TAG（ヒトプロテインCの重鎖に由来するプロテインC-タグ））および2つのストレプトアビジン結合部位（2×SBP）を含む（例えば、SEQ ID NO：34はHAC部分のアミノ酸配列を示しており、ここでHAエピトープはC-TAGと融合したHac部分のアミノ末端に位置し、それは2×SBPと融合されている；SEQ ID NO：35はこのHac部分をコードするヌクレオチド配列を示している）。本明細書に記載したようにヒトCD47の細胞外ドメインは、SEQ ID NO：11（シグナルペプチド配列を有する）またはSEQ ID NO：1（シグナルペプチド配列を伴わない）に示された例示的な配列を含みうる。このポリペプチドを、当業者によってルーチン的に実施されている分子生物学の方法およびタンパク質発現法に従って構築した。
【０２７４】
96ウェルプレートを、0.1M NaHCO3/Na2CO3緩衝液中にある1ウェル当たり50μlの50μg/mlマウスIgG（Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA）によって一晩コーティングした。続いてプレートをPBSで2回洗浄し、続いてhCD47-Hacまたは対照構築物とともにインキュベートした。対照構築物には、同じHac部分と融合させたガウシアルシフェラーゼ（gluc-Hac）、または牛痘由来の可溶性ウイルスケモカイン阻害薬であるvCCI（p35とも呼ばれる）（p35-Hac）を含めた。hCd47-Hacおよび対照構築物を、マウスIgGをコーティングしたプレートに、0.001〜0.8μg/mlの間の種々の濃度（5倍希釈）で添加した。2時間後に、プレートをPBSで1回洗浄し、その後に培養物に樹状細胞を添加した。2例の異なるドナーから樹状細胞を入手して調製した。実施例1に記載した通りに調製した8日齢のヒト単球由来DC（2×104個/ウェル）を、IFN-γ（1000 U/ml）の存在下で添加した。または、マウスIgGでコーティングしていない対照プレート中にて、hCD47-Hacまたは対照構築物のいずれかを含むウェルにDCを播いた。2時間後に、DCを0.1ng/mlのFSL-1（InvivoGen）で刺激した。実施例1に記載した通りに上清を18時間後に収集し、上清中のTNF-αの濃度を調べた。
【０２７５】
その結果は図7に提示されている。hCD47-Fcと同様に、hCD47-Hacは、マウスIgGの非存在下におけるFSL-1に応じたDCによるTNF-□分泌に対して何ら影響を及ぼさなかったが、hCD47-Hacは免疫複合体により誘導されるTNF-□産生を阻害した。対照構築物gluc-HacはFc-受容体を介したサイトカイン産生に影響を及ぼさず、このことから構築物のCD47部分がFc-受容体を介したDCの活性化をブロックすることが裏づけられた。
【０２７６】
実施例4
マウスCD47-Fcポリペプチド融合タンパク質による、骨髄由来マウス樹状細胞におけるFcを介したサイトカイン産生の阻害
マウス動物モデルで動物試験を行う前に、マウスCD47細胞外ドメイン-マウスFc融合ポリペプチドがIgG複合体-Fc-受容体により誘導される炎症と干渉すること（すなわち、それを阻害すること）を示すための実験を行った。
【０２７７】
マウスCD47の細胞外ドメインおよびマウスIgG2aのFc部分を含むマウスCD47-Fc構築物（mCD47-Fc）を発現させて精製した。マウスCD47細胞外ドメインは、GenBankアクセッション番号NM_010581に示されたポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（これはコードされるアミノ酸配列を提示している）から導き出した。または、GenBankアクセッション番号Q61735（バージョン番号は提示されていない）に示されたマウスCD47のアミノ酸配列を用いてもよい。
【０２７８】
免疫複合体を介した炎症を模倣するために、BALB/cおよびC57BL/6マウスからの骨髄由来DC（BMDC）およびマクロファージを、mIgG2aで飽和させたSAC（IgG2a-SAC）で刺激した。BALB/cおよびC57BL/6由来の樹状細胞は、SACおよびSAC-IgG2aに応じたサイトカイン産生の点で異なる。加えて、本研究者らは、C57BL/6マウスがBALB/cマウスよりも高レベルのFc受容体を発現することを報告する。すなわち、2つの異なるマウス系統由来の免疫細胞に対するmCD47-Fc構築物の影響について検討した。
【０２７９】
マウス骨髄由来DCを、Lutzら（J. Immunol. Methods 223:77-92 (1999)）のプロトコールに従って調製した。細胞をマウス樹状細胞分化培地（IMDM（Invitrogen, Carlsbad, CA）、10％FBS（Hyclone, Logan, UT）、50μM 2-ME、20ng/mlのマウスGM-CSF（PeproTech）および10ng/mlのマウスIL-4（PeproTech）中で9日間培養し、その後にサイトカインアッセイに用いた。mIgG2aで飽和させたSACを、ヒト血清で飽和させたSAC（実施例1参照）と同様に調製した。
【０２８０】
9日齢のBMDC（2×104個/96ウェル）を、IFN-γ（1000 U/ml）の存在下で一晩処理した。続いて種々の濃度（0.006〜20μg/mlの間の5倍希釈）のmCD47-Fcポリペプチドまたは対照分子、この場合にはマウスIgG2aを細胞に添加し、その後に0.01％ IgG2a-SACで刺激した。刺激した細胞培養物から18時間後に上清を収集し、ELISAキットを製造元の指示に従って用いてマウスTNF-αおよびマウスIL-12の濃度を決定するまで上記の通りに保存した。
【０２８１】
その結果は図8に提示されている。マウスCD47-Fcは、BMDCにおいてIgG2a-SACにより誘導されるIL-12p70およびTNF-□の産生を用量依存的な様式で阻害したが、一方、IgG2a対照抗体はIgG2a-SACにより誘導されるサイトカイン分泌を減少させなかった。
【０２８２】
実施例5
野生型およびFcRγ（-/-）マウスにおける、マウスCD47-Fcポリペプチド融合タンパク質による骨髄由来マウス樹状細胞におけるFcを介したサイトカイン産生の影響
mCD47-FcがIgG/Fc-受容体を介したDCの活性化をブロックすることをさらに実証するために、B57BL/6 FcRγ（-/-）およびC57BL/6野生型対照からのDCを用いて実験を行った。B57BL/6 FcRγ（-/-）は、活性化Fc受容体の共通のγ鎖を発現しない。このため、FcRγ（-/-）マウス由来のDCは複合体を形成したIgGに応答して炎症性サイトカインを産生することはない。
【０２８３】
C57BL/6 FcRγ（-/-）およびC57BL/6野生型対照からのBMDCを、実施例4に記載した通りに調製した。同じく実施例4に記載したように、9日齢のBMDC（2×104個/96ウェル）を、IFN-γ（1000 U/ml）の存在下で一晩処理した。続いて、種々の濃度（0.006〜20μg/mlの間の5倍希釈）のmCD47-Fcポリペプチドまたは対照分子であるマウスIgG2aを細胞に添加し、その後に0.01％ IgG2a-SACで刺激した。刺激した細胞培養物から18時間後に上清を収集し、上清中のマウスTNF-αの濃度を決定するまで上記の通りに保存した。
【０２８４】
その結果は図9に提示されている。IgG2a-SACは、野生型DCにおいてはTNF-αの極めて強力な刺激物質であった。野生型DCはIgG2a-SACに応答して、FcRγ（-/-）マウス由来のDCと比較しておよそ80倍多くTNF-αを分泌した。野生型マウス由来のDCにおいて、mCD47-Fcは、IgG2a対照と比較した場合、IgG2a-SACにより誘導されるサイトカイン産生を用量依存的な様式で阻害した（IC50は0.16μg/ml未満）。マウスCD47-FcはFcRγ（-/-）マウスにおけるTNF-α分泌に影響を及ぼさなかった。
【０２８５】
実施例6
マウスモデルにおけるコラーゲン抗体誘発性関節炎の発症に対するマウスCD47-Fcポリペプチド融合タンパク質の効果
マウスCD47-FcがFc-受容体を介したサイトカイン産生を阻害したことから、mCD47-Fcを、DBA/1Jマウス（The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME）におけるコラーゲン抗体誘発性関節炎（CAIA）のFcRγ依存性モデルで評価した（Wallace et al., J. Immunol. 162:5547 (1999)）。動物試験は、施設内の動物管理・使用委員会（IACUC）により承認されたプロトコールに従って行った。CAIAは、8週齡の雄性DBA/1Jマウスにおいて、4mgのArthritoMAB（商標）抗体（MD Biosciences Inc., St. Paul, MN）を静脈内注射（第0日）し、その後にLPS（大腸菌055:B5；Sigma BioSciences, St. Louis, MO）追加接種（50μg）を第6日および再度第13日に行うことによって誘発させた。mCD47-mFc（500μg）またはmIgG（500μg）（マウス血清由来；Sigma Biosciences）またはPBSによる動物の予防処置は第0日に開始し（ArthritoMAB（商標）の1時間前）、第8日まで隔日で続けた。関節炎の臨床的決定は、治療群に関して盲検化した観察者によって行われた。マウスの足を疾患の重症度に関して調べ、発赤および腫脹の変化に従って、各足について0から4までの尺度でグレード分類した（0、正常；1、単一領域の軽度の腫脹；2、複数の領域に及ぶ中等度の腫脹；3、足全体に及ぶ重症の関節炎；4、強直および関節運動低下［変形］をもたらす重症の関節炎）。各肢をグレード分類したところ、いずれの動物についても最大の臨床重症度スコアである16が得られた。全試験期間を通じて、臨床重症度スコアおよび罹患した足の数を毎日モニターした。
【０２８６】
その結果は図9に示されている。mCD47-Fcによるマウスの予防処置は、PBSまたはマウスIgGで処置したマウスと比較して、発症率および総合疾患スコアを低下させた。ArthritoMAB（商標）処置後の第18日の時点で、疾患の徴候を示したのはmCD47-Fcによる処置を受けたマウス8匹のうち2匹のみであり、一方、PBS群の全マウスおよびmIgG処置群のマウス8匹のうち7匹が疾患の徴候を示した。さらに、炎症の重症度も対照群の方が高度であり、平均総合疾患スコアはPBS群で4.2、mIgG処置群で7.9であり、これに対してmCD47-Fc処置群では0.6であった。
【０２８７】
本発明の特定の態様を例示の目的で説明してきたが、前述のことからみて、さまざまな変更を、本発明の精神および範囲を逸脱することなしに加えることができる。当業者は、本明細書に記載された本発明の特定の態様の等価物を認識しうる、またはルーチン的な範囲にとどまる実験を用いて確認しうると考えられる。そのような等価物は特許請求の範囲に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０２８８】
【図１】細胞表面に発現されたヒトCD47および細胞表面に発現されたウイルスCD47様ポリペプチドの模式図を提示している。
【図２】ヒトCD47（SEQ ID NO：9）（GenBankアクセッション番号NP_001768.1）と小痘瘡ウイルス由来のvCD47（SEQ ID NO：3）とのアラインメントを提示している。アスタリスク（*）は配列間のアミノ酸同一性を示し、「:」はアミノ酸類似性を示す。分子内ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は太字体で示されている。凡例（key）は各ポリペプチドのシグナルペプチドのアミノ酸がイタリック体で表記され；Igドメインのシステインループは一重下線で示され；膜貫通部分（グレーの陰影が施されている）の細胞内部分および細胞質内尾部は二重下線によって示され；ならびに、CD47およびウイルスCD47様ポリペプチドの膜貫通部分の細胞外部分は太い下線によって示されていることを示している。
【図３】ヒトCD47細胞外ドメイン-Fc融合ポリペプチド（CD47-hFc）が、ヒト樹状細胞における、黄色ブドウ球菌Cowan株（SAC）により誘導されるTNF-α（TNF-α）（図3A）およびIL-12p70（図3B）の産生を阻害することを示している。3人のドナーからの8日齢のヒト単球由来DC（2×104個/96ウェル）を、IFN-γの存在下で、指定濃度のhCD47-FcおよびヒトIgG（IgG）により処理した。続いて、樹状細胞を0.01％SACで刺激した。18時間後に細胞から取り出した上清中のTNF-αおよびIL-12p70の濃度を決定した。
【図４】HuS-SAC（ヒト血清-SAC）で刺激したDCからの上清中のTNF-αの濃度を図示している。8日齢のヒト単球由来DC（2×104個/96ウェル）を、IFN-γの存在下で、指定濃度のhCD47-FcおよびhFc-Stubにより処理した。続いて、DCを0.01％PBS-SACまたは0.01％HuS-SACで刺激した。18時間後に培養物から取り出した上清中のTNF-αを測定した。
【図５】HuS-SAC（ヒト血清-SAC）で刺激したDCからの血清中のIL-23の濃度。8日齢のヒト単球由来DC（2×104個/96ウェル）を、IFN-γの存在下で、指定濃度のhCD47-FcおよびhFc-Stub（CD47部分を欠く）により処理した。続いて、DCを0.01％FBS（ウシ胎仔血清）-SACまたは0.01％HuS-SACで刺激した。18時間後に培養物から取り出した上清中のIL-23を測定した。
【図６】ヒトCD47細胞外ドメイン-Fcポリペプチド融合ポリペプチド（hCD47-Fc）が、ヒト樹状細胞におけるIgGを介したTNF-α産生を阻害したことを図示している。ヒト樹状細胞を、抗ヒトFcロバIgGを事前にコーティングした96ウェルプレート中でhCD47-FcもしくはhFc-Stubと組み合わせるか（右側：固定化hCD47-Fc）、またはヒト樹状細胞をロバIgGの非存在下でhCD47-FcもしくはhFc-Stubと組み合わせた（左側：可溶性hCD47-Fc）。樹状細胞を0.1ng/mlのFSL-1で刺激して、細胞上清中のTNF-αの存在を測定した。
【図７】ヒトCD47細胞外ドメイン-Hacポリペプチド（非免疫グロブリン）融合ポリペプチド（hCD47-Hac）が、ヒト樹状細胞におけるIgGを介したTNF-α産生を阻害したことを示している。ヒト樹状細胞を、マウスIgGを事前にコーティングした96ウェルプレート中でhCD47-Hacもしくは対照構築物（gluc-Hac：ガウシアルシフェラーゼ-Hac）と組み合わせるか（右側：50μg/mlマウスIgG）、またはヒト樹状細胞をマウスIgGの非存在下でhCD47-Hacもしくはgluc-Hacと組み合わせた（左側：マウスIgGなし）。樹状細胞を0.1ng/ml FSL-1で刺激し、細胞上清中のTNF-αの存在を測定した。
【図８】刺激されたマウス樹状細胞のサイトカイン産生に対するマウスCD47細胞外ドメイン-マウスFcポリペプチド融合タンパク質の影響を提示している。9日齢の骨髄由来DC（2×104個/ウェル）をIFN-γ（1000 U/ml）で一晩活性化した後に、細胞を指定濃度のmCD47-FcおよびmIgG2aにより1時間処理した。続いて、DCを0.01％ IgG2a-SACで刺激した。18時間後に細胞から取り出した上清中のTNF-αおよびIL-12のレベルを決定した。
【図９】コラーゲン抗体誘発性関節炎（CAIA）のマウスモデルにおけるmCD47-Fcの効果を提示している。PBS、mIgG（500μg）またはmCD47-mFc（500μg）を雄性DBA/1Jマウスに対して第0、2、4、6および8日に静脈内投与した。4mgのArthitoMAB（商標）抗体混合液を第0日に静脈内投与した。マウスに対して第6および13日に50μgのLPSの腹腔内追加投与を行った。個々のマウスに関する第8、13および18日の総合疾患スコアを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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