(57)【要約】  本発明は、式（１）によって表される化合物2009539939.tif 000021（式中、Ｒ１は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ベンジル又は２−ハロエチルである）、並びに該化合物の酵素加水分解に続く分離及びオキサラミン基の開裂によって（Ｓ）−１−メチル−３−フェニルピペラジンを調製する方法における該化合物の使用を提供するものであり、酵素加水分解には、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓのプロテアーゼが酵素として用いられる。
2009539939.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式１によって表される化合物
【化４】
2009539939.tif 000018
（式中、Ｒ１は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ベンジル又は２−ハロエチルである。）。
【請求項２】
式２によって表される（Ｒ）−１−メチル−３−フェニルピペラジンのオキサラミン誘導体。
【化５】
2009539939.tif 000019
【請求項３】
式３によって表される（Ｓ）−１−メチル−３−フェニルピペラジンのオキサラメート誘導体
【化６】
2009539939.tif 000020
（式中、Ｒ１は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ベンジル又は２−ハロエチルである。）。
【請求項４】
請求項１に記載の前記化合物の酵素加水分解に続く反応生成物からの分離及びオキサラミンエステル基の開裂により（Ｓ）−１−メチル−３−フェニルピペラジンを調製する方法であり、前記酵素加水分解に、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓのプロテアーゼが酵素として用いられる方法。
【請求項５】
請求項１に記載の前記化合物の酵素加水分解に続く反応生成物からの分離及びオキサラミン酸基の開裂により（Ｒ）−１−メチル−３−フェニルピペラジンを調製する方法であり、前記酵素加水分解に、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓのプロテアーゼが酵素として用いられる方法。
【請求項６】
加水分解が、緩衝液非含有媒体中で行われることを特徴とする、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記加水分解が、１−メチル−３−フェニルピペラジンのメチルオキサレートの加水分解であり、並びに加水分解のための媒体が、トルエン又はメチル−ｔ−ブチルエーテルを含むことを特徴とする、請求項４から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
加水分解が、１−メチル−３−フェニルピペラジンのエチルオキサレートの加水分解であり、並びに媒体が、シクロヘキサンを含むことを特徴とする、請求項４から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項４、６、７又は８のいずれか一項に記載の段階を含む、Ｓ−ミルタザピンを調製するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラセミの１−メチル−３−フェニルピペラジンのエステルの酵素加水分解により（Ｓ）−１−メチル−３−フェニルピペラジン又は（Ｒ）−１−メチル−３−フェニルピペラジンを調製する方法における、新規の出発材料及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｓ−ミルタザピンを立体選択的に合成する経路（ＷｉｅｒｉｎｇａらによるＷＯ２００５/００５４１０を参照）において用いられる、光学活性である出発材料１−メチル−３−フェニルピペラジンを得るために、鏡像異性体純度が高い（Ｓ）−１−メチル−３−フェニルピペラジンを調製するための効率的な方法が必要とされている。バイオ触媒反応は、光学活性化合物を調製するための優れた手段である。酵素は、非常に穏和な条件下において、化学選択性、鏡像異性体選択性及び位置選択性を示すことが多い。更に、バイオ触媒作用は、有機化学において類するものがほとんどない方法を用いることを可能にする。その一例が、望ましくない鏡像異性体を消滅させることであり、収率が若干犠牲となるが、適度な鏡像異性体選択性により、最高で９９％のｅｅ（ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃ ｅｘｃｅｓｓ：鏡像異性体過剰率）が達成される。バイオ触媒作用は、必ずしも絶対的に選択的ではない。しかし、酵素を適切に選択し、続いて、基礎となるメカニズムの理解を必要とする最適化を行うことで、良好な結果を得ることができる。最終結果は、標準的な化学処理よりも複雑でないものになり得る。
【０００３】
図式１に従ってラセミの１−メチル−３−フェニルピペラジンを鏡像異性体選択的及び酵素的にアシル化しようとの試みは、酵素及びアシル供与体のバランスの良い組み合わせを用いた鏡像異性体選択的アシル化の成功例が発表されているにも関わらず（Ｏｒｓａｔ, ｅｔ  ａｌ. Ｊ. Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ. １９９６ (１１８)７１２.; Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ ａｌ.；Ｊ．Ｏｒｇ. Ｃｈｅｍ. ２０００(６５)５４５１; Ｂｒｅｅｎ, Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ: Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ  ２００４ (１５)１４２７）、非常に反応性の高いトリフルオロエチルブチレート及び大量の様々な酵素を用いても、５５℃まで反応が観察されず、失敗した。
【０００４】
【化１】
2009539939.tif 000003
【０００５】
Ｈｕら（Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００５（７）４３２９）によって、オキサラメート（ｏｘａｌａｍａｔｅ）基の酵素加水分解を用いて、二級アミンの分割が実現可能であることが発見された（図式２）。エステル及び酸生成物の分離並びにオキサラミン基（ｏｘａｌａｍｉｃ  ｇｒｏｕｐ）の開裂の後、このアミンの両方の鏡像異性体を得ることができる。独特の特徴は、この分割に遠位のオキサラメートエステル基を用いることであり、低反応性アミド結合は転化されない。
【０００６】
【化２】
2009539939.tif 000004
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２００５/００５４１０
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｏｒｓａｔ, ｅｔ  ａｌ. Ｊ. Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ. １９９６ (１１８)７１２
【非特許文献２】Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ ａｌ.；Ｊ．Ｏｒｇ. Ｃｈｅｍ. ２０００(６５)５４５１
【非特許文献３】Ｂｒｅｅｎ, Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ: Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ  ２００４ (１５)１４２７
【非特許文献４】Ｈｕ, ｅｔ  ａｌ.，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００５（７）４３２９
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、式１によって表される化合物：
【００１０】
【化３】
2009539939.tif 000005
を提供し、Ｒ１は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ベンジル又は２−ハロエチル（例えば、２−クロロ−エチル及び２，２，２−トリフルオロエチル）であり、この化合物は、このような化合物の酵素加水分解により別々の（Ｓ）−及び（Ｒ）−１−メチル−３−フェニルピペラジンを調製するための新規な方法における使用に特異である。Ｈｕらによって、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ（放線菌）のプロテアーゼがフェニルピペリジンにあまり有用でないことは観察されているが、本発明は、上で定義された化合物の酵素加水分解並びにそれに続く加水分解生成物の分離及びオキサラミン基の開裂によって（Ｓ）−及び（Ｒ）−１−メチル−３−フェニルピペラジンを調製するための方法を提供するものであり、この酵素加水分解には、Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓのプロテアーゼが酵素として用いられる。高光学活性純度の（Ｓ）−又は（Ｒ）−１−メチル−３−フェニルピペラジンを得るための出発化合物は、ラセミの１−メチル−３−フェニルピペラジン又は任意の度合いの光学活性混合物の（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、ベンジル又は２−ハロエチルオキサラメートとして使用することができる。（Ｃ１−Ｃ３）アルキルとは、メチル、エチル、ｎ−プロピル及びイソプロピルを意味する。
【００１１】
最適化された実験計画を用いることにより、（Ｓ）−１−メチル−３−フェニルピペラジンを、９９．８％ｅｅ及び純度約９８％にて、総収率３６％にて得ることができる。
【００１２】
Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓのプロテアーゼは、非常に大きな加水分解酵素群の中の１つである。加水分解酵素は、水を用いて反応を行うことができるが、無水に近い有機溶媒中においても反応することができる。加水分解酵素の幾つかの例は、リパーゼ（脂肪の加水分解）、プロテアーゼ（タンパク質の加水分解）及びエステラーゼ（エステルの加水分解）である。
【００１３】
Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓのプロテアーゼを加水分解酵素として使用することには、数々の利点がある。Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓのプロテアーゼは、濃縮水溶液又はフリーズドライ加工粉末として保存することができる、比較的安定した酵素である。この酵素は、いずれの補因子も必要せず、補因子が必要となると経済的に魅力的でなくなるだけでなく、多くの補因子は酵素それ自体よりも脆弱である。この酵素は、大きな活性部位を有しており、この反応に必要となる基質を、わずかな差異でも反応速度に劇的な違いが生まれ得るという事実にも関わらず、非常に上手く処理することができる。最後に、この酵素は、高い安定性を、水／共溶媒混合物中において又は無希釈の有機溶媒中においてまでも有している。
【００１４】
バイオ触媒反応において、反応の選択性は、鏡像異性体比又はＥとして表されることが多い。鏡像異性体比は、等しい濃度における２つの鏡像異性体の初期反応速度の比を表している（大抵の反応においてｔ＝０である）。鏡像異性体比は、転化率、生成物ｅｅ及び基質ｅｅという以上３つのパラメータのうちの２つが既知であるなら、反応におけるいずれの時点でも計算することができる。理想的な環境下において、Ｅは反応を通して一定である。化学式中には、必ずしも有効ではない多数の仮定がある。更に、非常に高い又は非常に低い転化率にて、Ｅは、転化率又はｅｅのわずかな変動で大きく変化する。このことは、Ｅの値が、測定の精度に影響を受けやすくなることを意味している。選択性は、決して真に絶対的ではないため、１００％の転化率では、再度、ラセミ化合物を得ることになる。これは、Ｅ値が、反応の最後の最後近くになって低下することが多いらしいことを意味している。従って、Ｅは、指標値としてとして用いられるべきであり、絶対値として用いられるべきでない。以下の経験則が使用されることが多い。
【００１５】
Ｅ＝１            選択性なし。両方の鏡像異性体について同率
Ｅ＝１−５        低選択性。望ましくない鏡像異性体が反応中に消滅させられ及び転化率が＞９０％である場合のみ、高いｅｅに到達することができる
Ｅ＝５−２５      不適当な鏡像異性体の消滅によるプロセスに高い可能性。高い生成物ｅｅは、低転化率にてのみ得られる
Ｅ＝２５−１００  中程度の転化率にて生成物だけでなく基質についてもｅｅが高い
Ｅ＞１００        絶対に近い選択性。反応は転化率５０％で「停止」することが多い（劇的な率の低下）。動的速度論的分割により収率１００％にて１００％ｅｅを得る可能性。基質が高いｅｅにて得られるだけでなく、生成物は理論的収率（５０％）前後の高いｅｅを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
より具体的な実施形態において、本発明は加水分解が緩衝液非含有媒体内で行われる、上で定義された方法を提供する。反応媒体に緩衝液を添加する必要がないことにより、この方法はより単純化されるだけでなく、より高い鏡像異性体比が得られることにより改善される。理論に拘束されるものではないが、ピペラジン環の１位の窒素が、この効果に関係していると考えられている。
【００１７】
本発明のより具体的な実施形態は、上で定義された方法において、１−メチル−３−フェニルピペラジンのメチルオキサレートを、トルエン又はメチル−ｔ−ブチルエーテルを含む媒体と組み合わせて用いることである。
【００１８】
本発明の別の具体的な実施形態は、上で定義されたような方法において、１−メチル−３−フェニルピペラジンのエチルオキサレートを、シクロヘキサンを含む媒体と組み合わせて使用することである。
【００１９】
本明細書中の情報を元に、当業者は、本方法についての条件を更に最適化し得、また、適した媒体、濃度及びオキサラメートエステルを選択することにより本方法に近い代替法を発見し得る。
【実施例】
【００２０】
メチルオキサラメート及びエチルオキサラメート誘導体の酵素加水分解
ラセミ基質は、市販のメチルクロロオキサレートを用いて１−メチル−３−フェニルピペラジンをアシル化し、再結晶により精製し得る結晶オキサラメートを得ることで、調製された。多数の市販のプロテアーゼが、試験された（表１）。鏡像異性体の一方の比率の増大によって観察されるように、エスペラーゼ（ｅｓｐｅｒａｓｅ）だけが、活性を示した。絶対配置は、確認された（Ｓ）−鏡像異性体試料との比較により判定された。反応条件の短時間スクリーニングが、行われた（表２）。Ｅ値は、転化率並びに出発材料及び生成物のｅｅに基づいて計算された。転化率は、出発材料中の（出発材料であるピペラジン中に既に存在している）少量の不純物を内部標準として用いて評価された。
【００２１】
【表１】
2009539939.tif 000006
【００２２】
【表２】
2009539939.tif 000007
【００２３】
粗メチルオキサラメート及び比較的純粋なエチルオキサラメートを用いて、幅広いプロテアーゼスクリーニングが行われた（表３）。エスペラーゼのプロトタイプＣＬＥＡは、良好な結果を示さなかった。トルエン／重炭酸塩緩衝液中における多数の他の酵素は、選択性を全く示さなかった（表４）。
【００２４】
【表３】
2009539939.tif 000008
【００２５】
【表４】
2009539939.tif 000009
【００２６】
良好な結果が、Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓプロテアーゼを用いて得られた。表５は、その結果を示しており、正しい条件下において、非常に良いｅｅを所望の鏡像異性体について得ることができた。最良の結果は、緩衝液非含有媒体中において得られ、この媒体は、塩基として追加の窒素を基質中に用いた。ｐＨ＜＜７であっても、非常に良い結果が、このプロテアーゼについて得られた。
【００２７】
【表５】
2009539939.tif 000010
【００２８】
酵素は、（今回は純粋な）メチルオキサラメート及びエチルオキサラメートを用いて、様々な条件下において更に試験された（表６）。共溶媒非含有条件を用いたところ、メチルオキサラメートは固化し、濃厚な懸濁液が得られ、この懸濁液は比較的高い転化率における完全な光学純度を妨げる明白な拡散限界を有していた。少量の酵素しか必要とされなかった。これら２つのエステルは、分割についての最適条件に差異を示した。
【００２９】
【表６】
2009539939.tif 000011
【００３０】
更に様々な市販のプロテアーゼが、試験された（表７）。２つのエステルについては、表６の最適条件が用いられた。つまり二相性のＭＴＢＥ混合物中のメチルエステル（今回は固形）、純水中に懸濁されたオイルとしてのエチルエステルである。この実験中、油質のエチルオキサラメートも固化を開始し、これは表６（実験８）の有望な結果が再現できないことを意味し得る。酵素のスクリーニングにおいて、エチルエステルだけが２つの有力な候補を出し、これらの候補はより現実的な酵素負荷にて更に試験されたが（表８）、ほとんど成功しなかった。固体の基質の溶解度を改善するための少量の酢酸の添加は、酵素は極めて低いｐＨにて作用すると思われるにも関わらず、成功しなかった。
【００３１】
【表７】
2009539939.tif 000012
【００３２】
【表８】
2009539939.tif 000013
【００３３】
Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓプロテアーゼを触媒とした反応のスケールアップ
主要な目的は、生成物の最終鏡像異性体純度を損ねることなく、酵素の負荷を低下させ、基質濃度を上昇させることである。緩衝されていない水の中における反応中、ｐＨは、大幅に低下して酵素の最適ｐＨから大きく外れた。このため、最初の試験は、ｐＨスクリーニングであり、ｐＨスタットを用いて、ｐＨスタットを非緩衝である反応と比較しながら行われた（表９）。ｐＨ制御をしない反応は、反応の早い段階において、より高いｅｅを示した。単離されたオキサラミン酸生成物（Ｒ−鏡像異性体）のｅｅも高く、はるかに高い選択性の反応であることを示している（より高いＥ）。同じ効果は、エチルオキサラメートについて見られたが、基質の固化は、結果の比較を若干困難にした（表１０）。
【００３４】
【表９】
2009539939.tif 000014
【００３５】
【表１０】
2009539939.tif 000015
【００３６】
最終溶媒スクリーニングは、既知の最良の条件を用いて、今までよりはるかに高い濃度で繰り返された。両方のオキサラメートが固化したことから、両方に共溶媒が必要であった。驚くべきことに、最適条件は、またもや同一ではなかった（表１１）。
【００３７】
【表１１】
2009539939.tif 000016
【００３８】
エチルオキサラメートについての選択性は極めて高く、融点は極めて低く、Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓプロテアーゼに関して記載の最適温度は極めて高かったため、単一高温反応が、シクロヘキサン共溶媒を用いて粗エチルオキサラメートについて試された。５０℃にての１６時間に亘る反応は、１重量％のＳ．ｇｒｉｓｅｕｓプロテアーゼのみを用いた、９９．８％ｅｅへの完全転化に十分であった。これらの条件は、以下のスケールの大きい試料の作成に使用された。
【００３９】
（Ｓ）−１−メチル−３−フェニルピペラジンの最終試料の調製
１７０ｇの粗エチルオキサラメート試料は、１重量％のＳ．ｇｒｉｓｅｕｓプロテアーゼを用いて１Ｌ容器の中で分割された。エチルオキサラメートエステルのＲ−鏡像異性体は、選択的に加水分解された。反応が停止された後、１−メチル−３−フェニルピペラジンのエチルオキサラメートエステルの残りのＳ−鏡像異性体は、粗収率４７％にて得られた。過剰な１５％ＨＣｌ中における煮沸によるエチルオキサラメートエステルの加水分解により、１時間後、（Ｓ）−１−メチル−３−フェニルピペラジンへの完全な転化が行われた。更なるワークアップにより、極めて大量の、未知の組成の不溶性沈殿物が生じた。生成物の抽出及びクーゲルロール（Ｋｕｇｅｌｒｏｈｒ）蒸留により、４２ｇの白色固形物（全部で３６％、９９．８％ｅｅ）が得られた。出発材料における０．５％の初期不純物は、１．５％に上昇した。
【００４０】
再結晶化させたメチルオキサラメートを用いた、はるかに小さい規模でのスケールアップにより、より純粋な試料が得られたが、これは出発材料中の０．５％の不純物が、最終生成物中において濃縮されないからである。
【００４１】
追加実験の詳細
【００４２】
【表１２】
2009539939.tif 000017
【００４３】
分析
試料は、ｃｈｉｒａｓｉｌ−ＤＥＸ  ＣＢ  ＧＣカラム（ヘリウムキャリア、１：２０スプリット）により分析された。温度プログラム：１４０℃にて２分。５℃／分にて１８０℃まで。１８０℃にて１０分。
【００４４】
ピペラジンは、ＧＣでは分割できなかった。トリフルオロアセトアミドとしての誘導体化が、鏡像異性体の良好な分離を達成するために必要とされた。少量のピペラジン（１０−５０ｍｇ）が、ＣＨ２Ｃｌ２に溶解され、トリエチルアミン及びトリフルオロ酢酸無水物で処理された。反応後、１０％の炭酸ナトリウムを用いて塩基化が行われた。試料は、分析前に乾燥された。ＴＬＣは、シリカプレート、溶離液としてのＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ混合物（通常は９０：１０）並びにＵＶ蛍光及びＩ２検出の両方を用いて行われた。
【００４５】
アシル化ラセミ化合物の合成
【００４６】
１−メチル−３−フェニルピペラジンメチルオキサラメート
１−メチル−３−フェニルピペラジン（１７．６ｇ、０．１ｍｏｌ）は、１００ジクロロメタン中に溶解された。トリエチルアミン（５ｍｌ、約０．０３ｍｏｌ）が添加された。ジクロロメタン中のメチルクロロオキサレートの溶液（１０ｍｌ、０．１０ｍｏｌ）が、冷却下でゆっくりと添加された。全て添加された後、白色の懸濁液が形成された。ＴＬＣは、完全な転化を示した。この混合物は、１０％の炭酸ナトリウムでクエンチされた。有機層は、炭酸塩で再度洗浄され、乾燥され、オイルとなるまで蒸発させられた（２５．５ｇ、９７％）。ＴＬＣ：非常に純粋な、幾つかの微量の極性不純物。ＧＣ：キラル分離可能。１５．７／１６．０分（内部標準として使用できる約０．４％の３．８分時点の不純物（出発ピペラジン中に存在する）を含有する）。材料は、放置により固化する。ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサンから再結晶化する試みが行われた。この再結晶化により、２０ｇの薄茶色の固形物（７６％）が得られた。融点は１０３−５℃であった。ＧＣ：３．８分時点での不純物が除去される。
【００４７】
１−メチル−３−フェニルピペラジンエチルオキサラメート
１−メチル−３−フェニルピペラジン（１２３．２ｇ、０．７０ｍｏｌ）は、５００ジクロロメタン中に溶解された。トリエチルアミン（３０ｍｌ、約０．２ｍｏｌ）が添加された。ジクロロメタン中のエチルクロロオキサレートの溶液（１０７ｇ、０．７８ｍｏｌ）が、冷却下でゆっくりと添加された。全量の３分の２が添加された時点で、濃厚な懸濁液が形成された。より多くの溶媒を添加しても、攪拌は困難なままであった。この混合物は、１０％の炭酸ナトリウムでクエンチされた。有機層は、炭酸塩で再度洗浄され、乾燥され、オレンジ色のオイルとなるまで蒸発させられた（１９１．２ｇ、０．６９ｍｏｌ、９９％）。シーディングによる結晶化は困難であると判明した。極度の蒸発を行い、オイルとして保存した。ＴＬＣ：基線上に非常に純粋で少量の着色された極性物質。ジオキサミドの痕跡なし（塩化オキサリル及びピペラジンから調製）。ＧＣ：１８．０／１８．２分、３．８分時点の不純物は０．３６面積％。少量の試料（２０ｇ）は、水を用いて攪拌され、結晶化が促された。融点は約４５℃であった。オイルの大部分が、数日の放置後に固化した。使用前に溶融が必要とされた。
【００４８】
アセチル１−メチル−３−フェニルピペラジン
１−メチル−３−フェニルピペラジン（１７．６ｇ、０．１ｍｏｌ）は、１００ジクロロメタン中に溶解された。酢酸無水物及びトリエチルアミンが添加された。水系のワークアップにより、＞１００％の悪臭のするオイルが得られた（過剰Ａｃ２Ｏ）。１６０℃／０．０５ｍｂａｒでのクーゲルロール蒸留により、２０．６ｇのオイル（９４％）が得られた。キラルＧＣ：１０．３／１０．６分。
【００４９】
プロピオニル１−メチル−３−フェニルピペラジン
１−メチル−３−フェニルピペラジン（１７．６ｇ、０．１ｍｏｌ）は、１００ジクロロメタン中に溶解された。トリエチルアミン（１５ｍｌ、０．１ｍｏｌ）が添加された。ジクロロメタン中のプロピオニルクロライドの溶液（１０ｇ、０．１１ｍｏｌ）が、冷却下でゆっくりと添加された。全て添加された後、白色の懸濁液が形成された。この混合物は、１０％の炭酸ナトリウムでクエンチされた。有機層は、炭酸塩で再度洗浄され、乾燥され、オイルとなるまで蒸発させられた（２３．３４ｇ、１００％）。１８７℃／０．０５ｍｂａｒでのクーゲルロール蒸留により、２１．６ｇのオイル（９３％）が得られた。キラルＧＣ：１０．２５／１０．３９分。
【００５０】
ブチリル１−メチル−３−フェニルピペラジン
１−メチル−３−フェニルピペラジン（１７．６ｇ、０．１ｍｏｌ）は、１００ジクロロメタン中に溶解された。トリエチルアミン（５ｍｌ、０．０５ｍｏｌ）が添加された。ジクロロメタン中のブチロイルクロライドの溶液（１１．６ｇ、０．１１ｍｏｌ）が、冷却下でゆっくりと添加された。全て添加された後、白色の懸濁液が形成された。この混合物は、１０％の炭酸ナトリウムでクエンチされた。有機層は、炭酸塩で再度洗浄され、乾燥され、オイルとなるまで蒸発させられた（２４ｇ）。＞２００℃／０．０５ｍｂａｒにて２２．５ｇのオイルをクーゲルロール蒸留することにより、２２．０ｇのオイル（９５％）が得られた。キラルＧＣ：１２．８７／１２．９８分。ピークの著しい重なり。
【００５１】
ベンゾイル１−メチル−３−フェニルピペラジン
１−メチル−３−フェニルピペラジン（１７．６ｇ、０．１ｍｏｌ）は、１００ジクロロメタン中に溶解された。トリエチルアミン（１５ｍｌ、０．１ｍｏｌ）が添加された。ジクロロメタン中の塩化ベンゾイルの溶液（１６ｇ、０．１１４ｍｏｌ）が、冷却下でゆっくりと添加された。全て添加された後、白色の懸濁液が形成された。この混合物は、１０％の炭酸ナトリウムでクエンチされた。有機層は、炭酸塩で再度洗浄され、乾燥され、オイルとなるまで蒸発させられた（約３０ｇ）。ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（９５：５）を用いたシリカ濾過による精製が行われた。適当な割合を蒸発させることにより、２６．２ｇのオイル（９４％）が得られた。キラルＧＣ：多様な方法を用いても分離は見られなかった。
【００５２】
トリフルオロアセチル１−メチル−３−フェニルピペラジン
１−メチル−３−フェニルピペラジン（１．８ｇ、０．０１ｍｏｌ）は、５０ジクロロメタン中に溶解された。トリエチルアミン（１ｍｌ、０．０７ｍｏｌ）が添加された。トリフルオロ酢酸無水物（２ｍｌ）が、無希釈で添加された。この混合物は、１０％の炭酸ナトリウムでクエンチされた。有機層は、炭酸塩で再度洗浄され、乾燥され、オイルとなるまで蒸発させられた（２．５ｇ、９２％）。ＴＬＣ：非常に純粋。キラルＧＣ：５．９／６．２分。
【００５３】
スクリーニング反応
スクリーニング反応は、表の脚注に記載されるように行われた。５ｍｌの容器は、１−４ｍｌの反応に用いられ、３０ｍｌのバイアルは、より大きい容量の最適化反応に用いられた。酸性になりすぎた反応については、ｐＨ＞８に中和することで、塩基性ピペラジン（誘導体）の抽出を可能にした。
【００５４】
（Ｓ）−１−メチル−３−フェニルピペラジンの試料調製
１７０ｇ（０．６２ｍｏｌ）の固形エチルオキサラメートは、溶融され、１Ｌのフラスコに移された。１８０ｍｌのシクロヘキサン及び７００ｍｌの水が添加され、続いて１．７ｇ（１重量％）のＳ．ｇｒｉｓｅｕｓプロテアーゼが添加された。加熱板上で５０℃にて２３時間に亘って攪拌が行われた。最上層のガスクロマトグラフィ（ＧＳ）は、＞９９．９％ｅｅを示した。ｐＨ５．２２は、１ＭのＮａＯＨを用いてｐＨ９に調節された。この反応混合物は、酢酸エチルを用いて３回に亘って抽出された。有機相の乾燥と蒸発の後、８０ｇの茶色のオイル（４７％、Ｅ＞１６０）が得られた。この（Ｓ）−エチルオキサラメートエステル（先行の１０ｇスケール分割の＋４．７ｇ生成物）は、４００ｍｌの１５％ＨＣｌ（約２ｍｏｌ）中における１時間に亘る還流により加水分解された。この加水分解は、ＧＣにより約９９．５％と判定された。反応混合物は、冷却され、ｐＨはｐＨ＞１１に調整された。水性相は、３ｘ２５０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２を用いて抽出された。大量の不溶性沈殿物が、中和後に形成され、濾過により除去された。有機抽出物は、乾燥され、蒸発させられ、４１ｇの（Ｓ）−１−メチル−３−フェニルピペラジンがオイルとして得られた。酢酸エチル（１００ｍｌ）、トルエン及びエーテルを用いた水相の更なる抽出により、更に６ｇの（Ｓ）−１−メチル−３−フェニルピペラジン（総収率約４１％）が得られた。クーゲルロール蒸留装置（１４０℃／０．０５ｍｂａｒ）における高真空蒸留により、４１．８ｇの無色のオイルが得られ、このオイルはシーディングの後に結晶化した（２３８ｍｍｏｌ、総量３６％）。蒸留残留物は、０．８ｇの重量であった。生成物の融点は、５２℃であり、ｅｅは、９９．８％と判明した。ＧＣは、出発ラセミ化合物中に存在する不純物が０．５％から１．５％に上昇したことを示した。
【国際調査報告】
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