(57)【要約】本発明は、パリンドローム免疫調節核酸を提供する。本発明はまた、免疫治療用途に用いられる、パリンドローム免疫調節化合物により引き起こされる免疫反応を起こし、増強し、調節する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
【化１】
2009521218.tif 000004
ここでＸはグリセロールリンカーであり、ＹはＣ３−リンカーであり、Ｇ１は７−デアザグアノシンである、
から選択される構造を有する、パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、皮膚疾患、アレルギー、喘息または病原体により引き起こされる疾病を有する脊椎動物を治療的に処置するための方法であって、
【化２】
2009521218.tif 000005
ここでＸはグリセロールリンカーであり、ＹはＣ３−リンカーであり、Ｇ１は７−デアザグアノシンである、
から選択される構造を有するパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドを患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項３】
投与経路が、非経口、経口、舌下、経皮、局所、粘膜、吸入、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣、遺伝子銃、皮膚パッチ、点眼薬および口腔洗浄薬から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１に記載のパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドおよび生理学的に許容し得る担体を含む医薬製剤。
【請求項５】
脊椎動物における免疫反応を起こすための方法であって、
【化３】
2009521218.tif 000006
ここでＸはグリセロールリンカーであり、ＹはＣ３−リンカーであり、Ｇ１は７−デアザグアノシンである、
から選択される構造を有するパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドを脊椎動物に投与することを含む、前記方法。
【請求項６】
投与経路が、非経口、経口、舌下、経皮、局所、粘膜、吸入、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣、遺伝子銃、皮膚パッチ、点眼薬および口腔洗浄薬から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
脊椎動物の癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、皮膚疾患、アレルギー、喘息または病原体により引き起こされる疾病を予防する方法であって、
【化４】
2009521218.tif 000007
ここでＸはグリセロールリンカーであり、ＹはＣ３−リンカーであり、Ｇ１は７−デアザグアノシンである、
から選択される構造を有するパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドを脊椎動物に投与することを含む、前記方法。
【請求項８】
投与経路が、非経口、経口、舌下、経皮、局所、粘膜、吸入、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣、遺伝子銃、皮膚パッチ、点眼薬および口腔洗浄薬から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントをさらに含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントをさらに含む、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントを投与することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントを投与することをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントを投与することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００５年１２月２０日出願の米国仮出願番号第60/752,336号の利益を主張する。上記出願の全体的な教示は、本明細書に参照として組み込まれる。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は、化学修飾パリンドロームオリゴヌクレオチド類似体による免疫刺激に関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の概要
Kuramoto et al., Jpn. J. Cancer Res. 83:1128-1131 (1992)は、ＣｐＧジヌクレオチドを含有するパリンドロームを含むホスホジエステルオリゴヌクレオチドが、インターフェロン−アルファおよびインターフェロン−ガンマ合成を誘導し、ナチュラルキラー活性を増強することができることを教示する。Tokunaga et al., J. Natl. Cancer Inst. 72 (1984) 955-96. Pisetsky et al.; Reich et al., Mol. Biol. Rep. 18 (1993) 217-221; Krieg et al.,Yi et al., Nature 374 (1995) 546-549およびSato et al., Science 273 (1996) 352-354は、特定の配列コンテクスト（ＣｐＧ  ＤＮＡ）において、非メチル化ＣｐＧ−ジヌクレオチドを含有する細菌ＤＮＡ、合成オリゴデオキシヌクレオチド、およびＤＮＡワクチンが、脊椎動物の免疫システムを活性化することを教示している。
【０００４】
トール様受容体（ＴＬＲ）は感染のセンサーとして機能し、先天性および適応的免疫反応の活性化を誘導する。ＴＬＲは、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と呼ばれる、多種多様のリガンドを認識する。保存病原体関連分子生成物を認識する際に、ＴＬＲはそれらの細胞内シグナル伝達ドメインであるトール／インターロイキン−１受容体（ＴＩＲ）ドメイン、および下流アダプタータンパク質ＭｙＤ８８を介して宿主防御応答を活性化する。樹枝状細胞およびマクロファージは通常、それらも生成するトール様受容体（ＴＬＲ）リガンドおよびサイトカイン（例えば、インターロイキン−１β；ＩＬ−６および腫瘍壊死因子、ＴＮＦ）に応答し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＴ細胞もまた前炎症性回路に関与する。バクテリア化合物によるＴＬＲの刺激の後、先天性免疫細胞はさまざまなサイトカインおよびケモカインを放出する。ＴＬＲリガンドのいくつかの例は、リポタンパク質；ペプチドグリカン、ザイモサン（ＴＬＲ２）、二本鎖ＲＮＡ、ポリＩ：ポリＣ（ＴＬＲ３）、リポ多糖体、熱ショックタンパク質、タクソール（ＴＬＲ４）、フラジェリン（ＴＬＲ５）、ならびにイミダゾキノリン−Ｒ８４８、レジキモド、イミキモド；ｓｓＲＮＡ（ＴＬＲ７／８）、β−リンパ球（ＴＬＲ１０）、およびプロフィリウム（profilium）様分子および尿路疾患性大腸菌（ＴＬＲ１１）を含むが、これらに限定されない。
【０００５】
Krieg et al., Annu. Rev. Immunol. 20 (2002) 709-760; Dalpke et al., Biol. Chem. 383 (2002) 1491-1500およびKandimalla et al., Curr. Opin. Mol. Ther. 4 (2002) 122-129は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）反応およびＢ細胞による免疫グロブリンの生成を促進する、Ｔｈ１サイトカインを生成するために、ＣｐＧ  ＤＮＡが先天性免疫細胞を誘導することを教示している。ＣｐＧ  ＤＮＡの免疫促進特性は、癌、ウイルスおよび細菌感染、炎症性疾患を含む幅広い疾病の兆候のための治療薬として、ならびに免疫治療におけるアジュバントとしてのそれらの使用を可能としてきた。
【０００６】
化学修飾に加え、多くの構造的変化が、ＣｐＧ  ＤＮＡの活性に影響する。Kandimalla et al., Nucleic Acids Res. 30 (2002) 4460-4469は、３’−３’−結合を通じて２つの自由に利用できる５’末端を含むＣｐＧ  ＤＮＡが、複数のコピーのＣｐＧモチーフおよび単一の５’末端を含む、通常のＣｐＧ  ＤＮＡよりも高い活性を有することを教示する。
【０００７】
Kandimalla et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 306 (2003) 948-953は、ＣｐＧ  ＤＮＡにおける二次構造の存在が、二次構造の位置と性質に依存して、それらの活性に大きな影響を及ぼしたこと、５’末端におけるヘアピン構造の存在が、刺激活性を廃止したこと、および３’末端における同一の構造が刺激活性に重要な影響を有したが、より低いＩＬ−６分泌を引き起こし、ヌクレアーゼに対するより高い安定性に寄与したことを教示する。
【０００８】
当業者は、免疫促進オリゴヌクレオチドにパリンドロームを組み入れることが、望まれないタンパク質結合特徴を有する分子をもたらすことを認識するであろう。例えば、Liang et al., Mol. Cell. Biol. 16(7): 3773-3780 (1996)は、ＧＡＬ４に関して、１７−ｂｐのＤＮＡ認識部位の末端におけるパリンドロームＣＧＧトリプレットが、強力結合に不可欠であること、およびＧＡＬ４の相対物であるＰＰＲ１も、その１２−ｂｐのＤＮＡ認識配列の末端におけるパリンドロームＣＧＧトリプレットを認識することを示す。さらに、Nguyen et al., J Biol Chem. 275:15466-15473 (2000)は、ｈＮＱＯ１  ＡＲＥ／ＥｐＲＥ  ＤＮＡ認識モチーフ内のパリンドローム配列が、Ｎｒｆ２／ＭａｆＫヘテロダイマーの結合に必要であり、パリンドローム配列を含まない、ｒＧＳＴＡ２のＡＲＥ／ＥｐＲＥ配列に競合され得ないことを示す。タンパク質のオリゴヌクレオチドへのこの結合は、これらのオリゴヌクレオチドの免疫刺激組成物への使用における限定要因として認識される。しかしながら、化学修飾パリンドロームを免疫調節オリゴヌクレオチドへ組み入れることによりおよび／または化学修飾パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドの３’−３’結合により、天然の直鎖パリンドロームの制限なしに、所望の免疫調節特性を有する分子を生成し得る。
【０００９】
したがって、ＴＬＲを介する免疫反応を調節するが、非修飾パリンドロームセグメントを含む直鎖オリゴヌクレオチドの問題に悩まされないパリンドローム含有化合物を開発することへの要求が未だに存在する。
【発明の開示】
【００１０】
発明の概要
第１の側面において、本発明は、
【化１】
2009521218.tif 000002
ここでＸはグリセロールリンカーであり、ＹはＣ３−リンカーであり、Ｇ１は７−デアザグアノシンである、
の群から選択される構造を有する免疫調節オリゴヌクレオチドを提供する。
【００１１】
第２の側面において、本発明は、医薬組成物を提供する。これらの組成物は、本発明で開示されたあらゆる組成物および薬学的に許容し得る担体を含む。
【００１２】
第３の側面において、本発明は、脊椎動物における免疫反応を起こすための方法を提供する。この方法は、本発明の第１および第２の側面において開示された組成物のいずれか１つを、単独でまたは組み合わせて脊椎動物に投与することを含む。本明細書において開示される組成物は、非経口、経口、舌下、経皮、局所、粘膜、吸入、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣、遺伝子銃、皮膚パッチ、点眼薬および口腔洗浄薬を含むがこれらに限定されない、あらゆる好適な投与経路を介して投与することができる。
【００１３】
第５の側面において、本発明は、癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、皮膚疾患、アレルギー、喘息または病原体により引き起こされる疾病を有する脊椎動物を治療的に処置するための方法を提供する。この方法は、本発明の第１および第２の側面において開示された組成物のいずれか１つを、単独でまたは組み合わせて、薬理学的有効量で脊椎動物に投与することを含む。本明細書において開示される組成物は、あらゆる好適な投与経路を介して投与することができ、これは、非経口、経口、舌下、経皮、局所、粘膜、吸入、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣、遺伝子銃、皮膚パッチ、点眼薬、点耳薬および口腔洗浄薬を含むがこれらに限定されない。
【００１４】
第６の側面において、本発明は、脊椎動物の、癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、皮膚疾患、アレルギー、喘息または病原体により引き起こされる疾病を予防する方法を提供する。この方法は、本発明の第１および第２の側面において開示された組成物のいずれか１つを、単独でまたは組み合わせて、薬理学的有効量で脊椎動物に投与することを含む。本明細書において開示される組成物は、あらゆる好適な投与経路を介して投与することができ、これは、非経口、経口、舌下、経皮、局所、粘膜、吸入、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣、遺伝子銃、皮膚パッチ、点眼薬、点耳薬および口腔洗浄薬を含むがこれらに限定されない。
【００１５】
図面の簡単な説明
図１は、本発明のパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドの線形合成に好適な一群の代表的な小分子リンカーを表す。
【００１６】
図２は、本発明のパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチド線形合成のための合成スキームを表す。
【００１７】
図３は、本発明に記載の見本となるパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドによる、Ｃ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞培養物におけるＩＬ−１２誘導を表す。より一般的に、図３は、長さが異なるが、パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドの塩基組成および／または化学修飾が特異的なＩＬ−１２誘導を起こすこと、および独特なＩＬ−１２誘導がそれぞれのパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドに関してそれぞれの濃度で起こることを実証する。Ｃ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞は、表示された配列番号に対応するオリゴヌクレオチドにより表示された投与量で処置された。Ｍｅｄ＝コントロール／培地処置群。
【００１８】
図４は、本発明に記載の見本となるパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドによる、Ｃ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞培養物におけるＩＬ−６誘導を表す。より一般的に、図４は、長さが異なるが、パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドの塩基組成および／または化学修飾が特異的なＩＬ−６誘導を起こすこと、および独特なＩＬ−６誘導がそれぞれのパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドに関してそれぞれの濃度で起こることを実証する。Ｃ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞は、表示された配列番号に対応するオリゴヌクレオチドにより表示された投与量で処置された。Ｍｅｄ＝コントロール／培地処置群。
【００１９】
図５は、本発明に記載の見本となるパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドによる、ヒトｐＤＣ培養物におけるＩＦＮ−α誘導を表す。より一般的に、図５は、長さが異なるが、パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドの塩基組成および／または化学修飾が特異的なＩＦＮ−α誘導を起こすことを実証する。ヒトｐＤＣは、表示された配列番号に対応するオリゴヌクレオチドによって１０μｇ／ｍＬで処置された。Ｍｅｄ＝コントロール／培地処置群。
【００２０】
図６は、本発明に記載の見本となるパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドによる、ヒトＰＢＭＣ培養物におけるＩＦＮ−α誘導を表す。より一般的に、図６は、長さが異なるが、パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドの塩基組成および／または化学修飾が特異的なＩＦＮ−α誘導を起こすことを実証する。ヒトＰＢＭＣは、表示された配列番号に対応するオリゴヌクレオチドによって１０μｇ／ｍＬで処置された。Ｍｅｄ＝コントロール／培地処置群。
【００２１】
図７は、本発明に記載の見本となるパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドによる、ヒトＰＢＭＣ培養物におけるＩＬ−６誘導を表す。より一般的に、図７は、長さが異なるが、パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドの塩基組成および／または化学修飾が特異的なＩＬ−６誘導を起こすことを実証する。ヒトＰＢＭＣは、表示された配列番号に対応するオリゴヌクレオチドによって、１０μｇ／ｍＬで処置された。Ｍｅｄ＝コントロール／培地処置群。
【００２２】
図８は、本発明に記載の見本となるパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドによる、ヒトＰＢＭＣ培養物におけるＩＬ−１０誘導を表す。より一般的に、図８は、長さが異なるが、パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドの塩基組成および／または化学修飾が特異的なＩＬ−６誘導を起こすことを実証する。ヒトＰＢＭＣは、表示された配列番号に対応するオリゴヌクレオチドによって１０μｇ／ｍＬで処置された。Ｍｅｄ＝コントロール／培地処置群。
【００２３】
図９（ａ）は、本発明に記載の見本となるパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドによる、ヒトＰＢＭＣ培養物におけるＩＦＮ−α誘導を表す。より一般的に図９（ａ）は、長さが異なるが、パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドの塩基組成および／または化学修飾が特異的なＩＦＮ−α誘導を起こすことを実証する。ヒトＰＢＭＣは、表示された配列番号に対応するオリゴヌクレオチドによって１０μｇ／ｍＬで処置された。Ｍｅｄ＝コントロール／培地処置群。
【００２４】
図９（ｂ）は、本発明に記載の見本となるパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドによる、ヒトＰＢＭＣ培養物におけるＩＬ−６誘導を表す。より一般的に、図９（ｂ）は、長さが異なるが、パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドの塩基組成および／または化学修飾が特異的なＩＬ−６誘導を起こすことを実証する。ヒトＰＢＭＣは、表示された配列番号に対応するオリゴヌクレオチドによって１０μｇ／ｍＬで処置された。Ｍｅｄ＝コントロール／培地処置群。
【００２５】
図９（ｃ）は、本発明に記載の見本となるパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドによる、ヒトｐＤＣ培養物におけるＩＦＮ−α誘導を表す。より一般的に、図９（ｃ）は、長さが異なるが、パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドの塩基組成および／または化学修飾が特異的なＩＦＮ−α誘導を起こすことを実証する。ヒトＰＢＭＣは、表示された配列番号に対応するオリゴヌクレオチドによって１０μｇ／ｍＬで処置された。Ｍｅｄ＝コントロール／培地処置群。
【００２６】
好ましい態様の詳細な説明
本明細書中に引用される交付済み特許、特許出願および参考文献は、各々が参照として組み込まれることが具体的かつ個別に示されている場合と同じ範囲で本明細書中に参照として組み込まれる。引用される参考文献および本明細書の教示の間に矛盾がある場合は、本発明の目的のために、後者を優先することとする。
【００２７】
本発明は、免疫治療用途のための免疫調節剤としての、パリンドロームオリゴヌクレオチドの治療上の使用に関する。本発明はまた、例えば、成人および小児科学上のヒトならびに獣医学的用途において、限定することなく、癌、自己免疫疾患、喘息、呼吸器系アレルギー、食物アレルギー、および細菌、寄生虫、およびウイルス感染の処置および／または予防などの免疫療法用途のために使用される、パリンドローム免疫調節化合物により引き起こされる免疫反応を起こし、増強し、調節する方法を提供する。アレルギー喘息は、本方法および化合物による処置のための、特定の具体化された状態である。したがって、本発明はさらに、免疫療法のための最適水準のパリンドローム免疫調節効果を有する化合物、ならびにかかる化合物を製造および使用する方法も提供する。さらに、本発明のパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡワクチン、抗体、抗原、アレルゲン、化学療法剤、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドとの組み合わせにおいて、アジュバントとして有用である。
【００２８】
用語「パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチド」は一般的に、ＣＧジヌクレオチドをパリンドローム配列内に有するパリンドローム配列を含むパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドのことをいう。特定の態様において、パリンドローム配列内のＣＧジヌクレオチドのシトシンおよび／またはグアノシンは修飾されるが、線形の、非修飾パリンドロームオリゴヌクレオチドと比較して、パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドが、その免疫反応を保持し、カスタマイズさえもしながらも、望ましくないタンパク質結合に影響を受けやすいという疑いがないことが条件である。パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシド、またはこれらの組み合わせを含んでもよい。パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドは、例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、または代わりの結合を通じて結合されたヌクレオシドのポリマーである核酸を伴って、直鎖状または分岐状であり得る。パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドは、リボース糖残基に共有結合した、プリン（アデニン（Ａ）、イノシン（Ｉ）もしくはグアニン（Ｇ）またはこれらの誘導体）または、ピリミジン（シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）もしくはチミン（Ｔ）、またはこれらの誘導体）塩基、またはその誘導体からなってもよい。
【００２９】
第１の側面において、本発明は、ＩＭＯ(TM)番号１、２、３、４、１０、または１１にしたがった、パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチド化合物を提供する。本発明者は、パリンドローム配列内のＣＧジヌクレオチドのシトシンおよび／またはグアノシンの修飾ならびに線形パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドの３’−３’結合がパリンドローム配列の免疫調節能力に影響することを発見した。いかなる特定の理論に縛られることを望まず、本発明者は、その免疫反応を保持し、カスタマイズさえしながらも、非修飾パリンドロームオリゴヌクレオチドと比較して、望ましくないタンパク質結合によってオリゴヌクレオチドの活性が変えられないように、この修飾がパリンドローム部を変えることを予測する。
【００３０】
この側面の本発明は、ＣｐＧ＊、Ｃ＊ｐＧおよびＣ＊ｐＧ＊から選択される少なくとも１つのジヌクレオチドを含む核酸配列を有するパリンドローム免疫調節核酸を提供し、ここでＣはシトシンまたは２’−デオキシシトシンであり、Ｇは、グアノシンまたは２’−デオキシグアノシンであり、Ｃ＊は、２’−デオキシチミジン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリン、２’−ジデオキシ−５−ハロシトシン、２’−ジデオキシ−５−ニトロシトシン、アラビノシチジン、２’−デオキシ−２’−置換アラビノシチジン、２’−Ｏ−置換アラビノシチジン、２’−デオキシ−５−ヒドロキシシチジン、２’−デオキシ−Ｎ４−アルキル−シチジン、２’−デオキシ−４−チオウリジン、または他のピリミジンヌクレオシド類似体であり、Ｇ＊は、２’−デオキシ−７−デアザグアノシン、２’−デオキシ−６−チオグアノシン、アラビノグアノシン、２’−デオキシ−２’置換−アラビノグアノシン、２’−Ｏ−置換−アラビノグアノシン、２’−デオキシイノシン、または他のプリンヌクレオシド類似体であり、ｐはホスホジエステル、ホスホロチオエート、およびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間結合である。
【００３１】
ある態様において、パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドは長さ約２〜約５０ヌクレオチドである。特定の態様において、パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドは、長さ約１１〜約３０ヌクレオチドである。ある態様において、パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドは、約３〜３５ヌクレオシド残基、または約４〜約３０ヌクレオシド残基、または約７〜約１９ヌクレオシド残基である。ある態様において、パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドは約５〜約１８、または約７〜約１１のヌクレオシド残基を有する。本明細書中では、用語「約」は、正確な数は重要ではないことを示唆する。したがって、オリゴヌクレオチドにおけるヌクレオシド残基の数は重要ではなく、１または２少ないヌクレオシド残基、または１〜数個の追加のヌクレオシド残基を有するパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドは、上記の態様のそれぞれの同等物として考慮される。ある態様において、１または２以上のパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドは１１ヌクレオチドを有する。
【００３２】
この側面のさらなる態様において、本発明は、それらの３’末端またはヌクレオシド間結合、または非ヌクレオチドリンカーによる官能化核酸塩基または糖を通じて結合した少なくとも２つの免疫調節オリゴヌクレオチドを含む免疫調節オリゴヌクレオチを提供し、ここで、免疫調節オリゴヌクレオチドのうち少なくとも１つのその配列は、パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドを含む。本発明のこの側面にしたがう態様において、パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドのうち少なくとも１つは、ＣｐＧ＊、Ｃ＊ｐＧおよびｐＧ＊から選択される少なくとも１つのジヌクレオチドを含み、ここで、Ｃは、トシンまたは２’−デオキシシトシンであり、Ｇは、グアノシンまたは２’−デオキシグアノシンであり、Ｃ＊は、２’−デオキシチミジン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリン、２’−ジデオキシ−５−ハロシトシン、２’−ジデオキシ−５−ニトロシトシン、アラビノシチジン、２’−デオキシ−２’−置換アラビノシチジン、２’−Ｏ−置換アラビノシチジン、２’−デオキシ−５−ヒドロキシシチジン、２’−デオキシ−Ｎ４−アルキル−シチジン、２’−デオキシ−４−チオウリジン、または他のピリミジンヌクレオシド類似体であり、Ｇ＊は２’−デオキシ−７−デアザグアノシン、２’−デオキシ−６−チオグアノシン、アラビノグアノシン、２’−デオキシ−２’置換−アラビノグアノシン、２’−Ｏ−置換−アラビノグアノシン、２’−デオキシイノシン、または他のプリンヌクレオシド類似体であり、ｐはホスホジエステル、ホスホロチオエート、およびホスホロジチオエートからなる群から選択される、ヌクレオシド間結合である。
【００３３】
用語「非ヌクレオチドリンカー」は一般的に、リン含有結合を通じる以外の、オリゴヌクレオチドを結合することができるか、またはオリゴヌクレオチドに結合することができる、結合または部分をいう。好ましいかかるリンカーは、長さ約２オングストローム〜約２００オングストロームである。用語「ヌクレオチド結合」は一般的に、２つのヌクレオシドの３’および５’ヒドロキシル基を、リン含有結合を通じて直接つなげる、直接３’−５’結合をいう。
【００３４】
ある態様において、非ヌクレオチドリンカーは、ポリペプチド、抗体、脂質、抗原、アレルゲン、およびオリゴ糖を含むがこれらに限定されない、小分子、高分子または生分子である。ある態様において、非ヌクレオチドリンカーは小分子である。本発明のために、小分子は、１，０００Ｄａより少ない分子量を有する有機部分である。ある態様において、超分子は、７５０Ｄａより少ない分子量を有する。
【００３５】
ある態様において、小分子は、脂肪族または芳香族炭化水素であり、いずれも任意に、オリゴリボヌクレオチドをつなげる直鎖においてまたはそれに付加されて、１または２以上の官能基を含んでもよく、これは、ヒドロキシ、アミノ、チオール、チオエーテル、エーテル、アミド、チオアミド、エステル、尿素、またはチオ尿素を含むが、これらに限定されない。小分子は、環状または非環状であることができる。小分子リンカーの例は、アミノ酸、炭水化物、シクロデキストリン、アダマンタン、コレステロール、ハプテンおよび抗生物質を含むが、これらに限定されない。しかしながら、非ヌクレオチドリンカーの説明のために、用語「小分子」は、ヌクレオシドを含むことを意図しない。
【００３６】
ある態様において、非ヌクレオチドリンカーはアルキルリンカーまたはアミノリンカーである。アルキルリンカーは分岐状または非分岐状、環状または非環状、置換または非置換、飽和または不飽和、キラル、アキラルまたはラセミ混合物であってもよい。アルキルリンカーは、約２〜約１８個の炭素原子を有することができる。ある態様において、かかるアルキルリンカーは、約３〜約９個の炭素原子を有する。あるアルキルリンカーは、１または２以上の官能基を含み、これは、ヒドロキシ、アミノ、チオール、チオエーテル、エーテル、アミド、チオアミド、エステル、尿素、およびチオエーテルを含むが、これらに限定されない。かかるアルキルリンカーは、１，２プロパンジオール、１，２，３プロパントリオール、１，３プロパンジオール、トリエチレングリコールヘキサエチレングリコール、ポリエチレングリコールリンカー（例えば、［−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−］ｎ（ｎ＝１〜９））、メチルリンカー、エチルリンカー、プロピルリンカー、ブチルリンカーまたはヘキシルリンカーを含むことができるが、これらに限定されない。ある態様において、かかるアルキルリンカーは、ペプチドまたはアミノ酸を含んでもよい。
【００３７】
ある態様において、小分子リンカーは、グリセロールまたは、式ＨＯ−（ＣＨ２）ｏ−ＣＨ（ＯＨ）−（ＣＨ２）ｐ−ＯＨ（式中、ｏおよびｐは独立して１〜約６、１〜約４、または１〜約３の整数である）で表されるグリセロールホモログである。あるほかの態様において、小分子リンカーは、１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンの誘導体である。かかる誘導体のいくつかは、式ＨＯ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＮＨＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｍ−ＯＨ（式中ｍは、０〜約１０、０〜約６、２〜約６、または２〜約４の整数である）を有する。
【００３８】
本発明に記載の非ヌクレオチドリンカーのいくつかは、２より多くのオリゴヌクレオチドの結合を可能にする。例えば、小分子リンカーグリセロールはオリゴヌクレオチドが共有結合し得る、３つのヒドロキシル基を有している。本発明に記載のパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドいくつかは、したがって、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーに結合した、２または３以上のオリゴヌクレオチドを有する。かかるパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドは、「分岐状」であるという。
【００３９】
パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチド化合物は、例えば静電相互作用、疎水性相互作用、πスタッキング相互作用、水素結合およびこれらの組み合わせにより、非共有結合した少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含んでもよい。かかる非共有結合の非限定例は、ワトソン・クリック塩基対、フーグスティーン塩基対および塩基スタッキングを含む。
【００４０】
本発明の見本として、この研究に用いられるパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドは、表１に記載されたものを含むがこれらに限定されない。パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドは、非ヌクレオシドリンカーを介したそれらの３’末端を通じて結合またはつなげられた同一または非同一オリゴヌクレオチド配列セグメントのいずれかを含み、これはグリセロール、Ｃ３−リンカー、Ｃ３−アルキルリンカーまたはプロパンジオールを含むが、これらに限定されない。ＩＭＯ６〜９（配列番号６〜９）は２つの同一配列セグメントを含み、一方ＩＭＯ１〜５および１０〜１１（配列番号１〜５および１０〜１８）は２つの非同一配列セグメントを含む。第２のパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドセグメントは、非同一であり、第１セグメントとは、長さ、組み入れられた塩基組成および／または化学修飾の点で異なる。
【表１】
2009521218.tif 000003
【００４１】
当業者に認識されるように、パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドの相補的配列は、分子間水素結合を可能にし、それによりパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドに二次構造を与える。本明細書中で、用語「二次構造」は、分子間水素結合をいう。分子間水素結合は、二本鎖核酸分子の形成をもたらす。追加のパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドは、互いに結合することができ、それにより本発明に記載のパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドの鎖またはマルチマーを作り出す。
【００４２】
「パリンドローム配列」は逆方向反復（すなわち、配列、例えば、ＡＢＣＤＥＥ’Ｄ’Ｃ’Ｂ’Ａ’、ここでＡおよびＡ’、ＢおよびＢ’など、が通常のワトソン・クリック塩基対を形成する能力がある塩基である）を意味するものとする。生理食塩水およびｐＨ状況などの、適切な状況下で、かかる配列は二本鎖構造を形成し得る。一態様において、免疫調節核酸は、パリンドローム配列を含む。本明細書において用いられるパリンドローム配列は、ＣｐＧがパリンドロームの一部である、パリンドロームをいう。ある態様において、ＣｐＧはパリンドロームの中心である。
【００４３】
本発明のこの側面のある態様において、パリンドローム配列は、自己相補的であり、これは、好適な配置により、分子間、より典型的には、Ｇ−Ｃ、Ｇ＊−Ｃ、Ｇ＊−Ｃ＊、Ｇ−Ｃ＊、Ｉ−Ｃ、Ａ−Ｔ、Ａ−Ｕおよび／またはＧ−Ｕウォッブル対間の分子間塩基対を形成してもよい。一態様において、自己相補の範囲は少なくとも５０％である。例えば、少なくとも５０％自己相補的である８−ｍｅｒは、４、５、６、７または８のＧ−Ｃ、Ａ−Ｔ、Ａ−Ｕおよび／またはＧ−Ｕウォッブル塩基対を形成することができる配列を有してもよい。かかる塩基対は、必須ではないが自己相補的パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドのいずれかの末端に位置する塩基に関連してもよい。パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドに重要である場合、二本鎖核酸の片方または両方の末端を、塩基対合または他の好適な手段によって、一緒に「クランプ」することが有利であるかもしれない。自己相補の度合いは、パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドの間の配置に依存し得、かかる配置は単一または複数ヌクレオシド突出を含んでも含まなくてもよい。他の態様において、自己相補の度合いは、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％でさえある。
【００４４】
類似の考えが、異なる塩基配列のパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチド間の分子間塩基対にも適用される。したがって、複数のパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドが一緒に用いられる場合、その複数のパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドは、必須ではないが、少なくとも部分的に互いに相補的な配列を含む。一態様において、複数のパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドは、第１配列を有するパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドおよび第２配列を有するパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドを含み、ここで第１配列および第２配列は、少なくとも５０％相補的である。例えば、少なくとも５０％相補的な２つの８−ｍｅｒは、４、５、６、７または８のＧ−Ｃ、Ａ−Ｔ、Ａ−Ｕ、および／またはＧ−Ｕウォッブル塩基対を形成する。かかる塩基対は、必須ではないが、相補的パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドのいずれかの末端に位置する塩基に関連してもよい。相補の度合いは、パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチド間の配置に依存し得、かかる配列は、単一または複数ヌクレオシド突出を含んでも含まなくてもよい。他の態様において、相補の度合いは、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％でさえある。
【００４５】
本明細書中で、用語「相補的」は、核酸にハイブリダイズする能力を有することを意味する。かかるハイブリダイゼーションは、通常、相補的鎖間の水素結合の結果であり、好ましくはワトソン・クリックまたはフーグスティーン塩基対を形成するものであるが、他のモードの水素結合ならびに塩基スタッキングもまたハイブリダイゼーションをもたらし得る。
【００４６】
本発明のために、用語「オリゴヌクレオチド」は、複数の結合したヌクレオシド単位から形成されたポリヌクレオシドをいう。かかるオリゴヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、既存の核酸源から得ることができるが、好ましくは合成方法により生成される。ある態様において、それぞれのヌクレオシド単位は、複素環塩基およびペントフラノシル、２’−デオキシペントフラノシル、トレハロース、アラビノース、２’−デオキシ−２’−置換アラビノース、２’−Ｏ−置換アラビノースまたは六炭糖類を含む。ヌクレオシド残基は、多数のあらゆるヌクレオシド間結合によって互いに結合することができる。かかるヌクレオシド間結合は、限定しないが、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホラミデート、シロキサン、カルボネート、カルボアルコキシ、アセトアミデート、カルバメート、モルホリノ、ボラノ、チオエーテル、架橋ホスホラミデート、架橋メチレンホスホナート、架橋ホスホロチオエート、およびスルホンヌクレオシド間結合を含む。用語「オリゴヌクレオチド」もまた、１または２以上の立体特異的なヌクレオシド間結合（例えば、（ＲＰ）−または（ＳＰ）−ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、またはホスホトリエステル結合）を有するポリヌクレオシドを包含する。本明細書において、用語「オリゴヌクレオチド」および「ジヌクレオチド」は、結合がリン酸基を含むか否かにかかわらず、いずれかのかかるヌクレオシド間結合を有する、ポリヌクレオシドおよびジヌクレオシドを含むことを明確に意図している。特定の態様において、これらのヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル、ホスホロチオエートもしくはホスホロジチオエート結合、またはこれらの組み合わせである。
【００４７】
用語「オリゴヌクレオチド」はまた、限定しないが、タンパク質群、新油性基、挿入剤、ジアミン、葉酸、コレステロールおよびアダマンタンを含む、追加の置換基有するポリヌクレオシドも包含する。用語「オリゴヌクレオチド」はまた、限定しないが、リン酸基を有するペプチド核酸、ロックト(locked)核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ骨格のオリゴヌクレオチド、およびアルキルリンカーまたはアミノリンカーを有する骨格部を有するオリゴヌクレオチドを含む、ポリマーを含有の他の核酸塩基を包含する。
【００４８】
本発明のパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドは、自然発生ヌクレオシド、修飾ヌクレオシドまたはこれらの混合物を含む。本明細書において、用語「修飾ヌクレオシド」は、修飾複素環塩基、修飾糖部分、またはこれらの組み合わせを含むヌクレオシドである。ある態様において、修飾ヌクレオシドは、本明細書に記載されたように、非天然ピリミジンまたはプリンヌクレオシドである。ある態様において、修飾ヌクレオシドは、２’−置換リボヌクレオシド、アラビノヌクレオシドまたは２’−デオキシ−２’−置換−アラビノシドである。
【００４９】
本発明のために、用語「２’−置換リボヌクレオシド」または「２’−置換アラビノシド」は、ペントース部分の２’位におけるヒドロキシル基が、２’−置換または２’−Ｏ−置換リボヌクレオシドを生成するために置換されたリボヌクレオシドまたはアラビノヌクレオシドである。特定の態様において、かかる置換は、１〜６個の飽和または不飽和炭素原子を含む低級アルキル基、または６〜１０個の炭素原子を有するアリール基によるものであり、ここでかかるアルキルまたはアリール基は、非置換であっても、例えば、ハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボアルコキシ、またはアミノ基で置換されてもよい。２’−Ｏ−置換リボヌクレオシドまたは２’−Ｏ−置換−アラビノシドの例は、限定しないが、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドまたは２’−Ｏ−メチルアラビノシドおよび２’−Ｏ−メトキシエトキシリボヌクレオシドまたは２’−Ｏ−メトキシエトキシアラビノシドを含む。
【００５０】
用語「２’−置換リボヌクレオシド」または「２’−置換アラビノシド」はまた、２’−ヒドロキシル基が、１〜６個の飽和または不飽和炭素原子を含む低級アルキル基で、またはアミノもしくはハロ基で置き換えられた、リボヌクレオシドまたはアラビノヌクレオシドも含む。２’−置換リボヌクレオシドまたは２’−置換アラビノシドの例は、限定しないが、２’−アミノ、２’−フルオロ、２’−アリルおよび２’−プロパルギルリボヌクレオシドまたはアラビノシドを含む。
【００５１】
用語「オリゴヌクレオチド」は、ハイブリッドおよびキメラオリゴヌクレオチドを含む。「キメラオリゴヌクレオチド」は、１種より多くのヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドである。かかるキメラオリゴヌクレオチドの一非限定例は、ホスホロチオエート、ホスホジエステルまたはホスホロジチオエート領域およびアルキルホスホネートまたはアルキルホスホノチオエート結合などの非イオン結合を含むキメラオリゴヌクレオチドである（例えば、Pederson他による、米国特許番号第5,635,377号および第5,366,878号参照）。
【００５２】
「ハイブリッドオリゴヌクレオチド」は、１種より多くのヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドである。かかるハイブリッドオリゴヌクレオチドの一非限定例は、リボヌクレオチドまたは２’−置換リボヌクレオチド領域、およびデオキシリボヌクレオチド領域を含む（例えば、MetelevおよびAgrawalによる、米国特許番号第5,652,355号、第6,346,614号および第6,143,881号参照）。
【００５３】
第２の側面において、本発明は、医薬組成物を提供する。これらの組成物は、本発明で開示されたあらゆる組成物および薬学的に許容し得る担体を含む。
【００５４】
本明細書において、用語「薬学的に許容し得る」は、本発明の第１、第２または第３の側面の組成物の効果を妨げず、かつ細胞、細胞培養物、組織または臓器、または生物などの生物系に適合する材料をいう。特定の態様において、生物系は、脊椎動物などの生命体である。
【００５５】
本明細書において、用語「担体」は、あらゆる賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、脂質、または製剤処方において用いられる当該技術分野で周知の他の材料を包含する。当然のことながら、担体、賦形剤または希釈剤の特徴は、特定の用途のための投与経路に依存する。これらの材料を含む薬学的に許容し得る処方の調製は、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990, ISBN: 0-912734-04-3に記載されている。
【００５６】
本発明の医薬組成物はまた、ＥＦＧ、抗イディオタイプ癌ワクチン、Ｇｐ７５抗原、ＧＭＫメラノーマワクチン、ＭＧＶガングリオシド複合体ワクチン、Ｈｅｒ２／ｎｅｗ、Ｏｖａｒｅｘ、Ｍ−Ｖａｘ、Ｏ−Ｖａｘ、Ｌ−Ｖａｘ、ＳＴｎ−ＫＨＬテラトープ(theratope)、ＢＬＰ２５（ＭＵＣ−１）、リポソームイディオタイプワクチン、メラシン、ペプチド抗原ワクチン、毒素／抗原ワクチン、ＭＶＡ−ベースワクチン、ＰＡＣＩＳ、ＢＣＧワクチン、ＴＡ−ＨＰＶ、ＴＡ−ＣＩＮ、ＤＩＳＣ−ウイルスおよびＩｍｍｕｎＣｙｓｔ／ＴｈｅｒａＣｙｓから選択される癌ワクチンを含む、癌ワクチンを含んでもよい。
【００５７】
パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドまたはワクチン、またはその両方は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、コレラ毒素Ｂサブユニット、または他のあらゆる免疫原性担体タンパク質または非免疫原性担体タンパク質などの免疫原性タンパク質に任意に結合してもよい。あらゆる大量のアジュバントを用いてもよく、限定しないが、完全フロインドアジュバント、不完全フロインドアジュバント、ＫＬＨ、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、ミョウバン、およびＱＳ−２１を含むサポニン類、イミキモド、Ｒ８４８、またはこれらの組み合わせを含む。
【００５８】
本発明のさまざまな態様において、本発明の第１および第２の側面の組成物は、抗原に共有結合してもよく、あるいはその反対で、抗原と動作可能なように関連してもよい。本明細書において、用語「と動作可能なように関連する」は、本発明の第１、第２または第３の側面の組成物および抗原の両方の活性を維持するあらゆる関連を意味する。かかる動作可能な関連の非限定例は、同一のリポソームまたは他のかかる輸送媒体もしくは試薬の一部であることを含む。本発明の第１、第２または第３の側面の組成物が、抗原に共有結合している態様において、かかる共有結合は、パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドの利用できる５’末端以外の、本発明の第１、第２または第３の側面の組成物の、いかなる位置であってもよい。例えば、抗原は、ヌクレオシド間結合で付着してもよく、非ヌクレオチドリンカーに付着してもよい。代わりに、抗原自体が、非ヌクレオチドリンカーであってもよい。
【００５９】
本発明のさまざまな態様において、本発明の第１または第２の側面の組成物はアンチセンス活性を有する、パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドを含む。本明細書において、「アンチセンス活性」は、パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドが、細胞または動物に導入されたときに、相補的である遺伝子の発現の減少を引き起こすことを意味する。
【００６０】
本発明のさまざまな態様において、本発明の第１または第２の側面の組成物は、アプタマーであるパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチド配列を含んでもよい。アプタマーは、他の分子に結合する能力をもとにランダムプールから選択された核酸分子である。アプタマーは、核酸、タンパク質、小有機化合物、および生物全体にさえ結合するものから選択された。これらの新規分子は、医薬および技術に利用できるたくさんの可能性を有している（例えばBurgstaller P., et al. Curr Opin Drug Discov Devel. 5: 690-700 (2002)参照）。
【００６１】
本発明の医薬組成物は、あらゆる好適な経路によって投与されてもよく、これは、非経口、経口、舌下、経皮、局所、粘膜、吸入、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣、遺伝子銃、皮膚パッチ、点眼薬および口腔洗浄薬を含むが、これらに限定されない。医薬組成物は、既知の手順、例えば、癌の処置、感染の処置、自己免疫疾患の処置を用いて、所望の効果を得るために効果的な投与量および期間で、送達してもよい。全身投与された場合、医薬組成物は、本発明の第１、第２および／または第３の側面の組成物の血中濃度、約０．０００１マイクロモル〜約１０マイクロモルを得るために十分な投与量で投与される。局所投与に関しては、これよりもかなり低い濃度で効果的であり得、かなり高い濃度に耐性があり得る。特定の態様においてパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドの合計投与量は、１日あたり患者あたり約０．０００１ｍｇから１日あたり体重１ｋｇあたり約２００ｍｇの範囲である。治療的有効量の１または２以上の本発明の治療組成物を単一の処置のエピソードとして同時にまたは連続して投与することが望ましいといえる。
【００６２】
本発明の見本となるパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドを、合成のために以下のプロトコルを用いて作成した。本発明のパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドは、図２において、図式的に表されたように、自動合成器およびホスホロアミダイトアプローチを用いて、都合よく合成してもよい。ある態様において、パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドは、線形合成アプローチを用いて合成される。この合成のための代表的なリンカーを図１に示す。本明細書において、用語「線形合成」は、パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドの一末端から開始して、他末端へ直線的に進行する合成をいう。線形合成は、（長さ、組み入れられる塩基組成および／または化学修飾において）同一または非同一なモノマー単位をパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドに組み入れることを可能にする。
【００６３】
合成の最後に、本発明に記載のパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシドが組み入れられる場合、濃縮アンモニア溶液によって、またはホスホロアミダイトサプライヤーによって推奨されるように、都合よく脱保護化してもよい。パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチド生成物は好ましくは、逆相ＨＰＬＣ、脱トリチル化(detritylated)、脱塩および透析によって精製する。
【００６４】
本発明の第１および第２の側面において開示された組成物は、パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドを単独でまたはパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチド複合体として含むことができる。パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチド複合体は、上記のようなパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチド、および利用できる５’末端以外の位置において、パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドに接合した化合物を含む。ある態様において、この化合物は、非ヌクレオチドリンカーに接合される。他のある態様において、この化合物は、パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドにその５’末端以外の位置で接合する。本発明のパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドに接合することができる好適な化合物は、コレステロール、異なる長さのポリエチレングリコール、ペプチド、抗体、タンパク質、ワクチン、脂質、抗原および限定されないが、イミキモド、Ｒ８４８、ロキソリビン、イサトルビン(isatorbin)ならびに化学療法剤などのあらゆる免疫調節小分子を含むが、これらに限定されない。パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドまたはイムノマー（米国特許公開第20040097719号参照）単体またはパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチド複合体として、以下に説明する方法において投与することができる。
【００６５】
抗原は、任意に、病原体に関連する抗原、癌に関連する抗原、自己免疫疾患に関する抗原、およびたとえば、限定しないが、獣医学または小児科疾患などの、他の疾患に関する抗原、から選択され、ここで、抗原はアレルゲンである。ある態様において、抗原はワクチン効果を作り出す。本発明のために、用語「関連する」は、病原体、癌、自己免疫疾患、食物アレルギー、皮膚アレルギー、呼吸器アレルギー、喘息または他の疾病が存在するとき抗原が存在するが、病原体、癌、自己免疫疾患、食物アレルギー、皮膚アレルギー、呼吸器アレルギーまたは疾病がないときは、いずれも存在しないかまたは少ない量で存在することを意味する。
【００６６】
パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドは抗原に共有結合されるか、あるいはその反対で、抗原と動作可能なように関連する。本明細書において、用語「と動作可能なように関連する」は、パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドおよび抗原の両方の活性を保つ関連をいう。かかる動作可能な関連の非限定例は、同一のリポソームまたは他のかかる輸送媒体もしくは試薬の一部であることを含む。パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドが抗原に共有結合している態様において、かかる共有結合は、好ましくは、パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドの利用可能な５’末端以外の位置にある。例えば、抗原はヌクレオシド間結合で結合してもよく、また非ヌクレオチドリンカーに結合してもよい。代わりに、抗原自体が、非ヌクレオチドリンカーであってもよい。
【００６７】
第３の側面において、本発明は、脊椎動物における免疫反応を起こすおよび／または調節するための方法を提供し、かかる方法は、本発明に記載のパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドまたは複合体を脊椎動物に投与することを含む。ある態様において、脊椎動物は哺乳類である。本発明のために、用語「哺乳類」は、明確にヒトを意図する。特定の態様において、パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドまたは複合体は、免疫修飾を必要としている脊椎動物に投与される。
【００６８】
本明細書において、用語「調節すること」または「調節する」は、親のパリンドローム免疫調節核酸のそれと相対的なパリンドローム免疫調節核酸の免疫調節活性を増加または減少することを意味する。
【００６９】
本発明のこの側面に記載の方法において、パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドの投与は、あらゆる好適な経路によって行うことができ、これは、非経口、経口、舌下、経皮、局所、粘膜、吸入、鼻腔内、筋肉内、腹腔内、皮下、皮内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣、遺伝子銃、皮膚パッチ、点眼薬および口腔洗浄薬を含むが、これらに限定されない。イムノマーの治療組成物の投与は、既知の手順を用いて、所望の効果を得るために効果的な投与量および期間で行うことができる。全身投与された場合、治療組成物は、好ましくは、パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドの血中濃度、約０．０００１マイクロモル〜約１０マイクロモルを得るために十分な投与量で投与される。局所投与に関しては、これよりもかなり低い濃度で効果的であり得、かなり高い濃度に耐性があり得る。好ましくは、パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドの合計投与量は、患者１人あたり１日約０．００１ｍｇから体重１ｋｇあたり１日約２００ｍｇの範囲である。治療的有効量の１または２以上の本発明の治療組成物を単一の処置のエピソードとして同時にまたは連続して投与することが望ましいといえる。
【００７０】
本発明のこの側面に記載の方法は、免疫システムのモデル調査に有用である。この方法は、ヒトまたは動物疾患の予防的または治療的処置のためにも有用である。たとえは、この方法は、小児科および獣医ワクチン適用のために有用である。
【００７１】
第４の側面において、本発明は、疾病または疾患を有する脊椎動物を治療的に処理するための方法を提供し、かかる方法は、脊椎動物に本発明に記載のパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドまたは複合体を投与することを含む。さまざまな態様において、処置される疾病または疾患は、癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、アレルギー、喘息または病原体により引き起こされる疾病である。病原体は、細菌、寄生虫、真菌、ウイルスおよびプリオンを含む。投与は、本発明の第３の側面に関して記載されたように行われる。
【００７２】
本発明のために、用語「アレルギー」は、限定しないが、食物アレルギー、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎（別名花粉症）、アレルギー性結膜炎、じんましん(urticaria)（別名じんましん(hive)）、呼吸器アレルギー、およびラテックス、医薬および虫刺されなどの他の物質に対するアレルギー反応、またはアレルギー性鼻炎・副鼻腔炎、中耳炎およびＣＯＰＤからもたらされる一般的な問題を含む。用語「気道炎症」は、限定しないが、喘息を含む。喘息の特別な例は、アレルギー性喘息、非アレルギー性喘息、運動誘発性喘息、職業性喘息、および夜間喘息を含むが、これらに限定されない。
【００７３】
アレルギー性喘息は、アレルギーと関連した気道閉塞に特徴付けられ、アレルゲンと呼ばれる物質によって誘発される。アレルギー性喘息の誘因は、空中花粉、カビ、動物の鱗屑、イエダニおよびゴキブリの糞を含むが、これらに限定されない。非アレルギー性喘息はウイルス感染、特定の医薬品または空気中に見出される刺激物によって引き起こされ、鼻および気道を悪化させる。非アレルギー性喘息の誘因は、空中の粉塵（例えば、石炭、チョークの塵埃）、空気汚染物質（例えば、タバコの煙、木の煙）、強いにおいまたはスプレー（例えば、香水、家庭用クリーナー、料理の煙霧、ペンキまたはニス）、ウイルス感染（例えば、風邪、ウイルス性肺炎、副鼻腔炎、鼻ポリープ）、アスピリン過敏性、および胃食道逆流症（ＧＥＲＤ）を含むが、これらに限定されない。運動誘発性喘息（ＥＩＡ）は、激しい身体的活動によって誘発される。ＥＩＡの症状は、大多数の喘息で苦しむ人において様々な程度で起こり、運動中に冷たい、乾いた空気を呼吸することの結果として誘発されるようである。ＥＩＡの誘因は、運動中に空中の花粉を呼吸すること、運動中に大気汚染物質を呼吸すること、ウイルス性気道感染を伴って運動すること、および冷たい、乾いた空気の中で運動することを含むが、これらに限定されない。職業性喘息は、職場に見出される刺激物および他の有害な恐れのある物資を吸い込むことに直接関連している。職業性喘息の誘因は、煙霧、化学物質、ガス、樹脂、金属、塵埃、蒸気および殺虫剤を含むが、これらに限定されない。
【００７４】
本明細書において、用語「自己免疫疾患」は、免疫システムによって「自己」タンパク質が攻撃を受ける疾患を示す。かかる用語は、自己免疫喘息を含む。
【００７５】
第５の側面において、本発明は、脊椎動物の癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、皮膚疾患、アレルギー、喘息または病原体により引き起こされる疾病を予防する方法を提供する。この方法は、本発明に開示されたあらゆる組成物を、単独でまたは組み合わせて脊椎動物に投与することを含む。病原体は、細菌、寄生虫、真菌、ウイルス、ウイロイドおよびプリオンを含む。投与は、本発明の第３の側面に関して記載されたように行われる。
【００７６】
本発明のいずれの方法においても、パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドまたはそれらの複合体は、オリゴヌクレオチドまたはイムノマーの免疫調節効果を減少させない、疾病または症状を処置するために有益な他の任意の薬剤と組み合わせて投与することができる。本発明のこの側面に関して、用語「組み合わせて」は、同じ患者における同じ疾病を処置する過程で、を意味し、パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドおよび薬剤を、同時投与や、時間的に間隔をあけた任意の順序、例えば、連続的に他方の直後に一方を投与することから、数日あけて投与することまでを含む、任意の順序で投与することを含む。かかる併用療法は、パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドの１回より多くのの投与、およびこれと独立した薬剤の投与を含んでもよい。パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドおよび薬剤の投与は、同一、または異なる経路によってもよい。
【００７７】
本発明のいずれの方法においても、パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドまたはパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチド複合体は、パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドの免疫促進効果を弱めない、疾病または状態を処置または予防するために有用な他のいかなる剤と組み合わせて投与してもよい。本発明のいずれの方法においても、疾病または症状を処置するため有益な剤は、ワクチン、抗原、抗体、細胞毒性薬、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、遺伝子治療ベクター、ＤＮＡワクチンおよび／または免疫反応の特異性または規模を増強させるためのアジュバント、またはサイトカイン、ケモカイン、タンパク質リガンド、トランス活性化因子、ペプチドおよび修飾アミノ酸を含むペプチドなどの、共刺激分子を含むが、これらに限定されない。例えば、癌の処置において、パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドまたはパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチド複合体は、化学療法化合物またはモノクローナル抗体と組み合わせて投与してもよいと考えられる。かわりに、剤は、抗原またはアレルゲンをコードするＤＮＡベクターを含むことができる。これらの態様において、本発明のパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドは、アジュバントとして様々に作用すること、および／または直接的な免疫調節効果をもたらすことができる。
【００７８】
本発明に記載の方法において用いられる、好ましい化学療法剤は、以下を含むが、これらに限定されない：ゲムシタビン、メトトレキサート、ビンクリスチン、アドリアマイシン、シスプラチン、糖非含有クロロエチルニトロソウレア、５−フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダカルバジン、タキソール、フラジリン(fragyline)、メグラミンＧＬＡ、バルルビシン、カルムスタイン(carmustaine)およびポリフェルポサン(poliferposan)、ＭＭＩ２７０、ＢＡＹ  １２−９５６６、ＲＡＳファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ＭＭＰ、ＭＴＡ／ＬＹ２３１５１４、ＬＹ２６４６１８／ロメテキソール(Lometexol)、グラモレク(Glamolec)、ＣＩ−９９４、ＴＮＰ−４７０、ハイカムチン／トポテカン、ＰＫＣ４１２、バルスポダール(Valspodar)／ＰＳＣ８３３、ノバントロン／ミトキサントロン、メタレット(Metaret)／スラミン、バチマスタット、Ｅ７０７０、ＢＣＨ−４５５６、ＣＳ−６８２、９−ＡＣ、ＡＧ３３４０、ＡＧ３４３３、Ｉｎｃｅｌ／ＶＸ−７１０、ＶＸ−８５３、ＺＤ０１０１、ＩＳＩ６４１、ＯＤＮ６９８、ＴＡ２５１６／マルミスタット(Marmistat)、ＢＢ２５１６／マルミスタット、ＣＤＰ８４５、Ｄ２１６３、ＰＤ１８３８０５、ＤＸ８９５１ｆ、レモナールＤＰ２２０２、ＦＫ３１７、ピシバニール／ＯＫ−４３２、ＡＤ３２／バルルビシン、メタストロン／ストロンチウム誘導体、テモダール／テモゾロマイド、エバセット(Evacet)／リポソームドキソルビシン、ユータキサン(Yewtaxan)／パクリタキセル(Paclitaxel)、タキソール／パクリタキセル、キセロード(Xeload)／カペシタビン、フルツロン／ドキシフルリジン、シクロパックス(Cyclopax)／経口パクリタキセル、経口タキソイド、ＳＰＵ−０７７／シスプラチン、ＨＭＲ１２７５／フラボピリドール、ＣＰ−３５８（７７４）／ＥＧＦＲ、ＣＰ−６０９（７５４）／ＲＡＳ癌遺伝子阻害剤、ＢＭＳ−１８２７５１／経口プラチナ、ＵＦＴ（テガフール／ウラシル）、エルガミゾール(Ergamisol)／レバミゾール、エニルウラシル／７７６Ｃ８５／５ＦＵエンハンサ、カンプト／レバミゾール、カンプトサール／イリノテカン、ツモデックス(Tumodex)／ラルチトレキセド(Raltitrexed)、ロイスタチン／クラドリビン、パキセックス(Paxex)／パクリタキセル、ドキシル／リポソームドキソルビシン、カエリックス(Caelyx)／リポソームドキソルビシン、フルダラ／フルダラビン、ファルマルビシン(Pharmarubicin)／エピルビシン、デポサイト(DepoCyt)、ＺＤ１８３９、ＬＵ７９５５３／ビス−ナフタリミド、ＬＵ１０３７９３／ドラスタチン、カエチックス(Caetyx)／リポソームドキソルビシン、ジェムザール／ゲムシタビン、ＺＤ０４７３／アノーメッド(Anormed)、ＹＭ１１６、ヨウ素シード、ＣＤＫ４およびＣＤＫ２阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、Ｄ４８０９／デキシフォサミド(Dexifosamide)、イフェス(Ifes)／メスネックス(Mesnex)／イホスファミド(Ifosfamide)、ブモン(Vumon)／テニポシド(Teniposide)、パラプラチン／カルボプラチン、プランチノール(Plantinol)／シスプラチン、ベペシド(Vepeside)／エトポシド、ＺＤ９３３１、タキソテール／ドセタキセル、グアニンアラビノシドのプロドラッグ、タキサン類似体、ニトロソ尿素、メルフェランおよびシクロホスファミドなどのアルキル化剤、アミノグルテチミド、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クロラムブシル、シタラビンＨＣｌ、ダクチノマイシン、ダウノルビシンＨＣｌ、リン酸エストラムスチンナトリウム、エトポシド（ＶＰ１６−２１３）、フロクスウリジン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フルタミド、ヒドロキシ尿素（ヒドロキシカルバミド）、イホスファミド、インターフェロンアルファ−２ａ、アルファ−２ｂ、酢酸ロイプロリド（ＬＨＲＨ−放出因子類似体）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミンＨＣｌ（ナイトロジェンマスタード）、メルカプトプリン、メスナ(Mesna)、ミトーテン(Mitotane)（ｏ．ｐ’−ＤＤＤ）、ミトキサントロンＨＣｌ、オクトレオチド、プリカマイシン、プロカルバジンＨＣｌ、ストレプトゾシン、タモキシフェンクエン酸塩、チオグアニン、チオテパ、ビンブラスチン硫酸塩、アムサクリン(Amsacrine)（ｍ−ＡＭＳＡ）、アザシチジン、エリスロポエチン、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、インターロイキン２、ミトグアゾン(Mitoguazone)（メチル−ＧＡＧ；メチルグリオキサールビスグアニルヒドラゾン；ＭＧＢＧ）、ペントスタチン（２’デオキシコホルマイシン）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、テニポシド（ＶＭ−２６）、ビンデシン硫酸塩、ラパチニブ（ＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ−２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）二重チロシンキナーゼ阻害剤（ＧＳＫ））、ゲフィチニブ（ＺＤ１８３９／イレッサ（AstraZeneca））、エルロチニブ（タルセバ−ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１阻害剤（Genentech））、サリドマイド（（サリドマイド）−抗血管新生剤）、イマチニブ（グリベック）およびバタラニブ(Vatalanib)（ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤）、ソラフェニブ（Ｒａｆキナーゼ阻害剤（Bayer））、ＶＸ−６８０（オーロラキナーゼ阻害剤）、ステント(Sutent)（受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）阻害剤（Pfizer））が含まれるが、これらに限定されないＥＧＦＲおよびＶＥＧＦ阻害剤などのチロシンキナーゼ阻害剤、ボルテゾミブ（（ベルケード）プロテオソーム阻害剤）、テモゾロマイド（（テモダール）アルキル化剤）、およびインターフェロンアルファ（Intron A、Roferon A）。
【００７９】
抗体（特にモノクローナル抗体）の形態での受動的免疫療法は、抗癌剤としての多大な研究開発の対象であった。用語「モノクローナル抗体」は、本明細書中では単一分子組成物の抗体分子のことである。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープについて単一の結合特異性および親和性を示す。したがって、用語「ヒトモノクローナル抗体」は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列由来の可変および定常領域を有する単一の結合特異性を示す抗体のことである。抗癌剤の例には、パノレックス(Panorex)（Glaxo-Welicome）、リツキサン（IDEC/Genentech/Hoffman la Roche）、マイロターグ（Wyeth）、キャンパス(Campath)（Millennium）、ゼヴァリン（IDECおよびSchering AG）、ベキサール(Bexxar)（Corixa/GSK）、エルビタックス（Imclone/BMS）、アバスチン（Genentech）、ハーセプチン（Genentech/Hoffman la Roche）、セツキシマブ（Imclone）およびパニツムマブ（Abgenix/Amgen）が含まれるが、これらに限定されない。抗体はまた、癌抗原を（免疫学的意味で）模倣するように思われる抗イディオタイプ抗体を利用する能動的免疫療法において用いてもよい。モノクローナル抗体は、組み換えＤＮＡ技術の当業者に既知の方法により生じさせることができる。
【００８０】
以下の例は、本発明の特定の好ましい態様をさらに説明することを意図し、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００８１】
例
例１：  非同一配列セグメントによるホスホロチオエートＣｐＲパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドの合成および精製
パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドを、PerSeptive Biosystemの8909 Expedite ＤＮＡ合成装置で、β−シアノエチルホスホロアミダイト化学を用いて、１〜２μｍｏｌスケールで合成した。ＣＰＧ固体支持体に付着したＤｉ−ＤＭＴ保護グリセリルリンカーおよびＤＭＴ−プロパンジオールホスホロアミダイトリンカーをChemGenes Corporation（Wilmington、MA）から入手した。５’−ＣＰＧを添加したＴモノマー、５’−ホスホロアミダイトおよび７−デアザ−２’−デオキシグアノシン３’−ホスホロアミダイトをChemGenesから入手した。ｄＡ、ｄＧ、ｄＣおよびＴの３’−ホスホロアミダイトをProligから入手した。Beaucage試薬をホスホロチオエート骨格修飾を得るために、酸化剤として用いた。修正カップリングプロトコルを５’−ホスホロアミダイトおよび７−デアザ−２’−デオキシグアノシン３’−ホスホロアミダイトのために用いた。合成の後、イムノマーを標準的なプロトコルを用いて脱保護化し、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し、脱トリチル化(detritylated)し、米国薬局方(United States Pharmacopeia)品質の注水用滅菌水（Braun）に対して透析した。パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドを凍結乾燥し、再び蒸留水に溶解し、２６０ｎｍにおけるＵＶ吸収を測定することにより、濃度を決定した。合成された全てのパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドの純度をＰＡＧＥを変性させることにより決定し、パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドのいくつかは、分子量のＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量分析法により特徴付けられた。全てのパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドは、エンドトキシン汚染を最小限にするために、同一の条件下で合成および精製された。
【００８２】
例２：  マウス脾臓細胞培養物およびサイトカイン測定
４〜８週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの脾臓細胞を準備し、ＲＰＭＩ完全培地で培養した。マウス脾臓細胞を２４−ウェルプレートに５×１０６細胞／ｍｌで蒔いた。ＴＥ緩衝剤（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ）に溶解した、パリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドを細胞培養物に最終濃度０．１、０．３、１．０、３．０または１０μｇ／ｍｌまで添加した。そして細胞を３７℃で２４時間インキュベートし、上清をＥＬＩＳＡ分析のために採取した。上清内のＩＬ−１２およびＩＬ−６レベルをサンドイッチＥＬＩＳＡで計った。サイトカイン抗体および標準物質を含む、必要な試薬は、BD Pharmingenから購入した。ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼおよび基質は、ＫＰＬから入手した。結果を図３および図４に示す。
【００８３】
例３：  ヒト細胞培養物およびサイトカイン分析
新たに採取した健康なボランティアの血液（CBR Laboratories、Boston、MA）からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、フィコール密度勾配遠心法（Histopaque-1077、Sigma）で単離した。形質細胞様ＤＣを、製造会社の使用説明書に従って、ＢＤＣＡ４細胞単離キット（Miltenyi Biotec）を使用したポジティブ選択によって、ＰＢＭＣから単離した。ヒトＰＢＭＣを４８−ウェルプレートに５×１０６細胞／ｍｌを用いて蒔いた。ＰＤＣは、９６−ウェルプレートに１×１０６細胞／ｍｌを用いて蒔いた。ＤＰＢＳ（ｐＨ７．４；Mediatech）に溶解したパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドを、細胞培養物に最終濃度１０．０μｇ／ｍｌまで添加した。細胞を３７℃で２４時間（ＩＦＮ−αおよびＩＬ−６）または４８時間（ＩＬ−１０）インキュベートし、上清をＥＬＩＳＡ分析のために採取した。実験は三つ組（triplicate）のウェルで行った。ＩＦＮ−α、ＩＬ−６および／またはＩＬ−１０のレベルをサンドイッチＥＬＩＳＡで測定した。サイトカイン抗体および標準物質を含む、必要な試薬は、BD Pharmingenから購入した。結果を図５〜図９に示す。
【００８４】
均等物
前述の発明は、明瞭性および理解の目的のために詳細に開示されているが、当然のことながら、本開示を読むことにより、当業者によって、本発明および添付された特許請求の範囲の真の範囲から逸脱することなく、形式および詳細に関する様々な変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】本発明のパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドの線形合成に好適な一群の代表的な小分子リンカーである。
【図２】本発明のパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチド線形合成のための合成スキームである。
【図３】本発明に記載の見本となるパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチド類による、Ｃ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞培養物におけるＩＬ−１２誘導を表した図である。
【図４】本発明に記載の見本となるパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチド類による、Ｃ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞培養物におけるＩＬ−６誘導を表した図である。
【図５】本発明に記載の見本となるパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチド類による、ヒトｐＤＣ培養物におけるＩＦＮ−α誘導を表した図である。
【図６】本発明に記載の見本となるパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチド類による、ヒトＰＢＭＣ培養物におけるＩＦＮ−α誘導を表した図である。
【図７】本発明に記載の見本となるパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドによる、ヒトＰＢＭＣ培養物におけるＩＬ−６誘導を表した図である。
【図８】本発明に記載の見本となるパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドによる、ヒトＰＢＭＣ培養物におけるＩＬ−１０誘導を表した図である。
【図９ａ】本発明に記載の見本となるパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドによる、ヒトＰＢＭＣ培養物におけるＩＦＮ−α誘導を表した図である。
【図９ｂ】本発明に記載の見本となるパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドによる、ヒトＰＢＭＣ培養物におけるＩＬ−６誘導を表した図である。
【図９ｃ】本発明に記載の見本となるパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチドによる、ヒトｐＤＣ培養物におけるＩＦＮ−α誘導を表した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【国際調査報告】
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