(57)【要約】本発明は、増幅反応で使用される１つ以上の試薬に存在しうる、あるいは増幅反応が実施される環境に存在する夾雑生体材料、たとえば核酸から生じる偽陽性増幅シグナルを望ましくは低減または排除する核酸増幅方法を提供する。本発明はさらに、増幅反応で使用される酵素および他の試薬、ならびに増幅反応が実施される環境が偽陽性結果を与えうる細菌または他の核酸夾雑を含まないようにするために慣習的に必要とされるよりも、より少ないストリンジェントな精製および／または無菌性についての労力を必要とする利点を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸サンプルからの少なくとも１つの標的核酸配列の選択的増幅の方法であって：
（ａ）核酸サンプル中の標的核酸配列を異種タグ配列で処理し、タグ化標的核酸配列を産生するステップと；
（ｂ）前記サンプルにおける、前記タグ化標的核酸配列の一部を形成しておらず、かつタグ化標識核酸配列を前記標的核酸配列によって産生できる形態である異種タグ配列の有効濃度を低下させるステップと；
（ｃ）前記タグ化標的核酸配列を、標的核酸配列の検出可能な増幅に十分な試薬および条件に曝露するステップと；
を含み、前記曝露ステップが前記核酸サンプルをステップ（ｂ）の後に前記標的核酸配列の公知の夾雑源に露出し、前記標的核酸配列の検出可能な増幅が、前記公知の夾雑源が寄与する前記標的核酸配列ではなく、ステップ（ａ）の前記タグ化標的核酸配列が寄与する前記標的核酸配列の増幅に実質的に制限される、方法。
【請求項２】
前記試薬の１つ以上が前記標的核酸配列の夾雑源であることが公知である材料によって産生される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１つ以上の試薬が前記標的核酸配列を含有する微生物を使用して産生される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記１つ以上の試薬が少なくとも１つの核酸ポリメラーゼを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記１つ以上の試薬以外の前記方法の１つ以上の構成要素が前記標的核酸配列の公知の夾雑源を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記方法の環境条件が前記標的核酸配列の公知の夾雑源を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記タグ化標的核酸配列がステップ（ｂ）の間に固体支持体に固定される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｂ）が、前記タグ化標的核酸配列の一部を形成していない異種タグ配列を前記核酸サンプルから除去する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｂ）が、前記タグ化標的核酸配列の一部を形成していない異種タグ配列を不活性化し、不活性化異種タグ配列を産生する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｂ）の間に前記不活性化異種タグ配列を前記核酸サンプルから除去する工程をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記異種タグ配列がタグ化オリゴヌクレオチドに包含され、前記タグ化オリゴヌクレオチドが第１領域および第２領域を含み、前記第１領域が前記標的核酸配列の３’末端にハイブリダイズする標的ハイブリダイズ配列を含み、前記第２領域が前記標的ハイブリダイズ配列の５’側に位置するタグ配列を含み、前記タグ配列が前記標的核酸配列を含有する標的核酸に安定してハイブリダイズしない、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記標的ハイブリダイズ配列がユニバーサルオリゴヌクレオチドである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記異種タグ配列が、ステップ（ａ）の間に、前記異種タグ配列にタグ化標的核酸配列を産生させる活性形を有し、そこで前記タグ化標的核酸配列を産生しなかった前記異種タグ配列が、前記異種タグ配列がステップ（ｃ）の間にタグ化標的核酸配列を産生するのを阻害する不活性形にステップ（ｂ）で変換される、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｃ）が第１オリゴヌクレオチドおよび第２オリゴヌクレオチドを使用して核酸増幅反応にて増幅生成物を産生する工程を含み、前記第１オリゴヌクレオチドが前記標的核酸配列の相補体の３’末端にハイブリダイズする配列を含み、前記第２オリゴヌクレオチドが前記タグ配列の相補体にハイブリダイズするが、前記標的核酸配列に安定してハイブリダイズしない配列を含み、前記増幅生成物それぞれが前記標的核酸配列の塩基配列に実質的に等しいまたは相補性である塩基配列を含み、前記タグ配列の全部または一部に実質的に等しいまたは相補性である塩基配列をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記条件が等温である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記標的核酸配列が転写ベース増幅反応によって増幅される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記転写ベース増幅反応がＴＭＡ反応である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記増幅反応がＰＣＲ反応である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的核酸配列が単一の種の微生物の核酸に含有されている、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記標的核酸配列が複数の種の微生物の核酸に含有されている、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法が複数の標的核酸それぞれに含有された標的核酸配列の増幅に対して選択的であり、前記異種タグ配列が、タグ化標的核酸配列を、ステップ（ａ）で前記核酸サンプル中に存在する前記複数の標的核酸それぞれの前記標的核酸配列と共に産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記複数の標的核酸それぞれに含有された前記標的核酸配列が同じ核酸配列である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記核酸サンプルの少なくとも一部が、臨床、水、工業、環境、種、飲料または食品源より得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記方法が無菌性試験である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記方法が敗血症の診断である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
核酸サンプルからの少なくとも１つの標的核酸配列の選択的増幅の方法であって：
（ａ）標的核酸配列を含む核酸サンプルを第１および第２領域を含むタグ化オリゴヌクレオチドによって処理するステップであって、前記第１領域が前記標的核酸配列の３’末端にハイブリダイズする標的ハイブリダイズ配列を含み、前記第２領域が前記標的ハイブリダイズ配列の５’側に位置するタグ配列を含み、前記第２領域が前記標的核酸配列を含有する標的核酸に安定してハイブリダイズしない、ステップと；
（ｂ）前記核酸サンプルにおいて、未ハイブリダイズタグ化オリゴヌクレオチドの有効濃度を低下させるステップであって、前記未ハイブリダイズタグ化オリゴヌクレオチドの標的ハイブリダイズ配列が前記標的核酸配列へのハイブリダイゼーションに利用できる活性形を有する、ステップと；
（ｃ）第１および第２オリゴヌクレオチドを使用して核酸増幅反応にて増幅生成物を産生するステップであって、前記第１オリゴヌクレオチドが前記標的核酸配列の相補体の３’末端にハイブリダイズする配列を含み、前記第２オリゴヌクレオチドが前記タグ配列の相補体にハイブリダイズするハイブリダイズ配列を含み、前記第２オリゴヌクレオチドが前記標的核酸配列に安定してハイブリダイズせず、前記増幅生成物それぞれが前記標的核酸配列の塩基配列に実質的に等しいまたは相補性である塩基配列を含み、前記タグ配列の全部または一部に実質的に等しいまたは相補性である塩基配列をさらに含む、産生ステップと；
を含む方法。
【請求項２７】
ステップ（ｂ）が未ハイブリダイズタグ化オリゴヌクレオチドを前記核酸サンプルから除去する工程を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記標的核酸配列がステップ（ｂ）の間に固体支持体に固定される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ステップ（ｂ）が、ステップ（ｃ）の間に、未ハイブリダイズタグ化オリゴヌクレオチドが標的核酸配列に安定してハイブリダイズしないように、前記未ハイブリダイズタグ化オリゴヌクレオチドを不活性化する工程を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
ステップ（ｂ）の間に未ハイブリダイズタグ化オリゴヌクレオチドを前記核酸サンプルから除去する工程をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ステップ（ｂ）がヌクレアーゼ活性を有する酵素の使用を含まない、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記タグ化オリゴヌクレオチドが、ステップ（ａ）の間に前記標的ハイブリダイズ配列を前記標的核酸配列にハイブリダイズさせる活性形を有し、ここで未ハイブリダイズタグ化オリゴヌクレオチドが、ステップ（ｂ）において前記タグ化オリゴヌクレオチドがステップ（ｃ）の間に前記標的核酸配列にハイブリダイズするのを遮断または防止する不活性形に変換される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
ステップ（ｂ）および（ｃ）の条件がステップ（ａ）の条件よりストリンジェンシーが低い、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記核酸サンプルの温度がステップ（ａ）と（ｂ）との間で低下される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ステップ（ａ）からの未ハイブリダイズタグ化オリゴヌクレオチドがステップ（ｂ）で１本鎖形から２本鎖形に変換される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
二本鎖形が前記タグ化オリゴヌクレオチドの５’末端に結合されたタグ閉鎖配列を含むヘアピンタグ分子であり、前記タグ閉鎖配列がステップ（ｂ）の条件下で前記標的ハイブリダイズ配列にハイブリダイズして、それによりステップ（ａ）からの未ハイブリダイズタグ化オリゴヌクレオチドの、ステップ（ｂ）および（ｃ）での前記標的核酸配列へのハイブリダイゼーションを遮断する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記タグ閉鎖配列が非ヌクレオチドリンカーによって前記タグ化オリゴヌクレオチドに結合される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記タグ化オリゴヌクレオチドがＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含有する第３領域をさらに含み、前記第３領域が前記第２領域の５’側に位置する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記タグ閉鎖配列の５’末端が前記タグ化オリゴヌクレオチドの５’末端に結合される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記タグ閉鎖配列がそこからのＤＮＡ合成の開始を防止するために修飾される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記標的ハイブリダイズ配列の３’末端塩基が前記タグ閉鎖配列の５’末端塩基にハイブリダイズされる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記タグ閉鎖配列の３’末端が前記タグ化オリゴヌクレオチドの５’末端に結合される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
前記標的ハイブリダイズ配列がステップ（ｂ）でタグ閉鎖オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされ、前記タグ化オリゴヌクレオチドおよび前記タグ閉鎖オリゴヌクレオチドが別個の分子である、請求項２９に記載の方法
【請求項４４】
前記タグ閉鎖オリゴヌクレオチドがそこからのＤＮＡ合成の開始を防止するために修飾される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記標的ハイブリダイズ配列の３’末端塩基が前記タグ閉鎖オリゴヌクレオチドの５’末端塩基にハイブリダイズされる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記タグ化オリゴヌクレオチドおよびタグ閉鎖オリゴヌクレオチドがどちらもステップ（ａ）の間に前記核酸中に存在して、前記標的ハイブリダイズ配列がステップ（ａ）で前記タグ閉鎖オリゴヌクレオチドよりも前記標的核酸配列へのハイブリダイゼーションに好都合である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記核酸増幅反応の条件が等温である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４８】
前記核酸増幅反応が転写ベース増幅反応である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記転写ベース増幅反応がＴＭＡである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記第１オリゴヌクレオチドが、前記ハイブリダイズ配列の５’側に位置するＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記第２オリゴヌクレオチドが前記ハイブリダイズ配列の５’側に位置するＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含み、前記タグ化オリゴヌクレオチドが前記第２領域の５’側に位置するＲＮＡポリメラーゼのプロモーターをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記標的核酸配列が単一の種の微生物の核酸に含有されている、請求項２６に記載の方法。
【請求項５３】
前記標的核酸配列が複数の種の微生物の核酸に含有されている、請求項２６に記載の方法。
【請求項５４】
前記方法が複数の標的核酸それぞれに含有された標的核酸配列の増幅に対して選択的であり、前記標的ハイブリダイズ配列がステップ（ａ）で、前記核酸サンプル中に存在する前記複数の標的核酸それぞれの前記標的核酸配列の３’末端にハイブリダイズする、請求項２６に記載の方法。
【請求項５５】
前記複数の標的核酸それぞれに含有された前記標的核酸配列が同じ核酸配列である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記第１オリゴヌクレオチドが、ステップ（ｃ）で前記核酸サンプル中に存在する前記複数の標的核酸配列それぞれの相補体の３’末端にハイブリダイズする、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記方法が複数の第１オリゴヌクレオチドを含み、前記複数の第１オリゴヌクレオチドのそれぞれが、ステップ（ｃ）で前記核酸サンプル中に存在する、少なくとも１つの、しかし全部よりも少ない前記複数の標的核酸配列の相補体の３’末端にハイブリダイズする、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
前記タグ化オリゴヌクレオチドがユニバーサル細菌オリゴヌクレオチドである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
前記タグ化オリゴヌクレオチドがユニバーサル真菌オリゴヌクレオチドである、請求項５４に記載の方法。
【請求項６０】
前記方法が無菌性試験である、請求項５４に記載の方法。
【請求項６１】
前記方法が敗血症の診断である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記標的ハイブリダイズ配列が、ステップ（ａ）で前記核酸サンプルに存在する前記複数の標的核酸のそれぞれの前記標的核酸の３’末端にハイブリダイズし、前記複数の標的核酸は真正細菌、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌および真菌から成る群より選択される微生物のクラスに属する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記複数の標的核酸のそれぞれがリボソーム核酸である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記核酸サンプルがステップ（ｂ）の後に前記標的核酸配列の公知の夾雑源に露出され、前記増幅生成物の産生が、前記核酸サンプルが寄与して、前記標的核酸配列の前記夾雑源が寄与しない標的核酸配列の増幅に実質的に制限される、請求項２６に記載の方法。
【請求項６５】
前記方法で使用した１つ以上の構成要素が前記標的核酸の公知の夾雑源である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記増幅反応で使用した１つ以上の試薬が、前記標的核酸配列の夾雑源であることが公知である材料によって産生される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記１つ以上の試薬が前記標的核酸配列を含有する微生物を使用して産生される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記方法の環境条件が前記標的核酸配列の公知の夾雑源を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６９】
前記核酸サンプルの少なくとも一部が、臨床、水、工業、環境、種、飲料または食品源より得られる、請求項２６に記載の方法。
【請求項７０】
前記標的核酸配列がＲＮＡ標的配列であり、ステップ（ｃ）が：
前記標的核酸配列にハイブリダイズした前記タグ化オリゴヌクレオチドをプライマー伸長反応でＤＮＡポリメラーゼによって伸長させ、前記標的核酸配列に相補性である領域を含む第１プライマー伸長生成物を産生する工程と；
前記第１プライマー伸長生成物にハイブリダイズした前記標的核酸のその部分を選択的に分解する酵素を使用して、前記第１プライマー伸長生成物を前記標的核酸から分離する工程と；
前記第１プライマー伸長生成物を第１オリゴヌクレオチドによって処理する工程であって、前記第１オリゴヌクレオチドが第１および第２領域を含むプロモーターオリゴヌクレオチドであり、前記第１領域が、前記標的核酸配列の５’末端に相補性である前記第１プライマー伸長生成物の領域にハイブリダイズするハイブリダイズ配列を含み、プロモーターオリゴヌクレオチド：第１プライマー伸長生成物ハイブリッドを生成し、前記第２領域が前記第１領域の５’側に位置するＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含む、工程と；
前記プロモーターオリゴヌクレオチド：第１プライマー伸長生成物ハイブリッドから前記第１プライマー伸長生成物の少なくとも一部に相補性である第１ＲＮＡ生成物の複数の複製を、前記プロモーターを認識し、そこから転写を開始するＲＮＡポリメラーゼを使用して転写する工程であって、前記第１ＲＮＡ生成物の塩基配列が前記標的核酸配列の塩基配列および前記タグ配列の相補体に実質的に同一である、工程と；
前記第１ＲＮＡ生成物を前記第２オリゴヌクレオチドによって処理する工程であって、前記第２オリゴヌクレオチドがプライミングオリゴヌクレオチドであり、前記プライミングオリゴヌクレオチドは、前記タグ配列の相補体にハイブリダイズして、プライマー伸長反応が前記プライミングオリゴヌクレオチドから開始できるようにプライミングオリゴヌクレオチド：第１ＲＮＡ生成物ハイブリッドを生成する、工程と；
プライマー伸長反応にて前記プライミングオリゴヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼによって伸長させ、前記第１ＲＮＡ生成物に相補性である第２プライマー伸長生成物を産生する工程であって、前記第２プライマー伸長生成物が前記第１ＲＮＡ生成物の５’末端に相補性である３’末端を有する、工程と；
前記第１ＲＮＡ生成物を選択的に分解する酵素を使用して、前記第２プライマー伸長生成物を前記第１ＲＮＡ生成物から分離する工程と；
前記第２プライマー伸長生成物を前記プロモーターオリゴヌクレオチドによって処理し、プロモーターオリゴヌクレオチド：第２プライマー伸長生成物ハイブリッドを生成する工程と；
前記プロモーターオリゴヌクレオチド：第２プライマー伸長生成物ハイブリッドにおいて前記第２プライマー伸長生成物の３’末端を伸長させ、前記プロモーターオリゴヌクレオチドの前記第２領域に相補性である配列を付加する工程と；
前記ＲＮＡポリメラーゼを使用して、前記プロモーターオリゴヌクレオチド：第２プライマー伸長生成物ハイブリッドから、前記第２プライマー伸長生成物に相補性である第２ＲＮＡ生成物の複数の複製を転写する工程であって、前記第２ＲＮＡ生成物の塩基配列が、前記標的核酸配列、および前記タグ配列の相補体の塩基配列と実質的に同一である、転写工程と；
を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項７１】
ステップ（ａ）が、前記核酸サンプルを、前記標的核酸配列の５’末端に隣接する、または５’末端付近の前記標的核酸に結合する結合分子によって処理する工程をさらに含み、前記第１プライマー伸長生成物が、前記結合分子によって決定され、前記標的核酸配列の５’末端に相補性である３’末端を有する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
ステップ（ｃ）が、前記プロモーターオリゴヌクレオチド：第１プライマー伸長生成物ハイブリッドにおいて前記第１プライマー伸長生成物の３’末端を伸長させ、前記プロモーターに相補性である配列を付加する工程をさらに含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記プロモーターオリゴヌクレオチドがそこからのＤＮＡ合成の開始を防止するために修飾される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７４】
ステップ（ｃ）が：
前記第１プライマー伸長生成物にハイブリダイズした前記プロモーターオリゴヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼによって伸長させ、前記第１プライマー伸長生成物に相補性であるプライマー伸長生成物を産生する工程と；
前記第２プライマー伸長生成物にハイブリダイズした前記プロモーターオリゴヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼによって伸長させ、前記第２プライマー伸長生成物に相補性であるプライマー伸長生成物を産生する工程と；
をさらに含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７５】
前記分離ステップが前記ＤＮＡポリメラーゼによって供給されたリボヌクレアーゼ活性によって実施される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７６】
前記分離ステップが前記ＤＮＡポリメラーゼ以外の酵素によって供給されたリボヌクレアーゼ活性によって実施される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７７】
前記標的核酸配列がＲＮＡ標的配列であり、ステップ（ｃ）が：
ＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長反応にて、前記標的核酸配列にハイブリダイズされたタグ化オリゴヌクレオチドを伸長させ、前記標的核酸配列に相補性である領域を含む第１プライマー伸長生成物を産生する工程であって、前記タグ化オリゴヌクレオチドが前記第２領域の５’側に位置する第３領域をさらに含み、前記第３領域がＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含む、工程と；
前記第１プライマー伸長生成物にハイブリダイズした前記標的核酸のその部分を選択的に分解する酵素を使用して、前記第１プライマー伸長生成物を前記標的核酸から分離する工程と；
前記第１プライマー伸長生成物を前記第１オリゴヌクレオチドによって処理する工程であって、前記第１オリゴヌクレオチドがプライミングオリゴヌクレオチドであり、前記プライミングオリゴヌクレオチドは、前記標的核酸配列の５’末端に相補性である前記第１プライマー伸長生成物の領域にハイブリダイズして、プライマー伸長反応が前記プライミングオリゴヌクレオチドから開始しうるようにプライミングオリゴヌクレオチド：第１プライマー伸長生成物ハイブリッドを形成する、工程と；
前記プライミングオリゴヌクレオチドをプライマー伸長反応でＤＮＡポリメラーゼによって伸長させ、前記第１プライマー伸長生成物に相補性である第２プライマー伸長生成物を産生する工程と；
前記第２プライマー伸長生成物をテンプレートとして使用して、前記第２プライマー伸長生成物の少なくとも一部に相補性である第１ＲＮＡ生成物の複数の複製を、前記プロモーターを認識し、そこから転写を開始するＲＮＡポリメラーゼを使用して転写する工程であって、前記第１ＲＮＡ生成物の塩基配列が前記タグ配列の塩基配列および前記標的核酸配列の相補体に実質的に同一である、工程と；
を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項７８】
ステップ（ｃ）が：
前記第１ＲＮＡ生成物を前記プライミングオリゴヌクレオチドによって処理して、プライマー伸長反応が前記プライミングオリゴヌクレオチドから開始できるようにプライミングオリゴヌクレオチド：第１ＲＮＡ生成物ハイブリッドを形成するステップと；
プライマー伸長反応にて前記プライミングオリゴヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼによって伸長させ、前記第１ＲＮＡ生成物に相補性である第３プライマー伸長生成物を産生する工程であって、前記第３プライマー伸長生成物が前記第１ＲＮＡ生成物の５’末端に相補性である３’末端を有する、工程と；
前記第１ＲＮＡ生成物を選択的に分解する酵素を使用して、前記第３プライマー伸長生成物を前記第１ＲＮＡ生成物から分離する工程と；
第３プライマー伸長生成物を前記第２オリゴヌクレオチドによって処理する工程であって、前記第２オリゴヌクレオチドが第１および第２領域を含むプロモーターオリゴヌクレオチドであり、前記第１領域が、前記タグ配列の相補体にハイブリダイズして、プライマー伸長反応が前記プロモーターオリゴヌクレオチドから開始できるようにプロモーターオリゴヌクレオチド：第３プライマー伸長生成物ハイブリッドを生成するハイブリダイズ配列を含み、前記第２領域が前記第１領域の５’側に位置するＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含む、工程と；
前記プロモーターオリゴヌクレオチドをプライマー伸長反応で前記ＤＮＡポリメラーゼによって伸長させ、前記第３プライマー伸長生成物に相補性である第４プライマー伸長生成物を産生する工程と；
前記第３プライマー伸長生成物を伸長させ、前記プロモーターに相補性である配列を付加するステップと；
前記プロモーターを認識して、そこから転写を開始するＲＮＡポリメラーゼを使用して、前記プロモーターオリゴヌクレオチド：第３プライマー伸長生成物ハイブリッドから前記第３プライマー伸長生成物に相補性である第２ＲＮＡ生成物の複数の複製を転写する工程であって、前記第２ＲＮＡ生成物の塩基配列が前記タグ配列の塩基配列および前記標的核酸配列の相補体と実質的に同一である、転写工程と；
を含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記分離ステップが前記ＤＮＡポリメラーゼによって供給されたリボヌクレアーゼ活性によって実施される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記分離ステップが前記ＤＮＡポリメラーゼ以外の酵素によって供給されたリボヌクレアーゼ活性によって実施される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記標的核酸配列がＤＮＡ標的配列であり、ステップ（ｃ）が：
前記標的核酸配列にハイブリダイズした前記タグ化オリゴヌクレオチドをプライマー伸長反応でＤＮＡポリメラーゼによって伸長させ、前記標的核酸配列に相補性である領域を含む第１プライマー伸長生成物を産生する工程と；
前記第１プライマー伸長生成物を第１オリゴヌクレオチドによって処理する工程であって、前記第１オリゴヌクレオチドが第１および第２領域を含むプロモーターオリゴヌクレオチドであり、前記第１領域が、前記標的核酸配列の５’末端に相補性である前記第１プライマー伸長生成物の領域にハイブリダイズして、プロモーターオリゴヌクレオチド：第１プライマー伸長生成物ハイブリッドを生成するハイブリダイズ配列を含み、前記第２領域が前記第１領域の５’側に位置するＲＮＡポリメラーゼのプロモーターである、工程と；
前記プロモーターオリゴヌクレオチド：第１プライマー伸長生成物ハイブリッドから、前記第１プライマー伸長生成物の少なくとも一部に相補性である第１ＲＮＡ生成物の複数の複製を、前記プロモーターを認識し、そこから転写を開始するＲＮＡポリメラーゼを使用して転写する工程であって、前記第１ＲＮＡ生成物の塩基配列が前記標的核酸配列の塩基配列および前記タグ配列の相補体に実質的に同一である、工程と；
前記第１ＲＮＡ生成物を前記第２オリゴヌクレオチドによって処理する工程であって、前記第２オリゴヌクレオチドが、前記タグ配列の相補体にハイブリダイズして、プライマー伸長反応が前記プライミングオリゴヌクレオチドから開始できるようにプライミングオリゴヌクレオチド：第１ＲＮＡ生成物ハイブリッドを生成するプライミングオリゴヌクレオチドである、工程と；
プライマー伸長反応にて前記プライミングオリゴヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼによって伸長させ、前記第１ＲＮＡ生成物の相補体を含む第２プライマー伸長生成物を得る工程であって、前記第２プライマー伸長生成物が前記第１ＲＮＡ生成物の５’末端に相補性である３’末端を有する、伸長工程と；
前記第１ＲＮＡ生成物を選択的に分解する酵素を使用して、前記第２プライマー伸長生成物を前記第１ＲＮＡ生成物から分離する工程と；
前記第２プライマー伸長生成物を前記プロモーターオリゴヌクレオチドによって処理して、プロモーターオリゴヌクレオチド：第２プライマー伸長生成物ハイブリッドを生成する工程と；
前記プロモーターオリゴヌクレオチド：第２プライマー伸長生成物ハイブリッドにおいて前記第２プライマー伸長生成物の３’末端を伸長させ、前記プロモーターに相補性である配列を付加する工程と；
前記ＲＮＡポリメラーゼを使用して、前記プロモーターオリゴヌクレオチド：第２プライマー伸長生成物ハイブリッドから、前記第２プライマー伸長生成物に相補性である第２ＲＮＡ生成物の複数の複製を転写する工程であって、前記第２ＲＮＡ生成物の塩基配列が、前記標的核酸配列、および前記タグ配列の相補体の塩基配列と実質的に同一である、工程と；
を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項８２】
前記プロモーターオリゴヌクレオチドがそこからのＤＮＡ合成の開始を防止するために修飾される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
ステップ（ａ）が：
前記核酸サンプルを、前記タグ化オリゴヌクレオチドから上流の前記標的核酸にハイブリダイズするディスプレーサオリゴヌクレオチドによって、プライマー伸長反応が前記ディスプレーサオリゴヌクレオチドから開始できるように処理する工程と；
前記ディスプレーサオリゴヌクレオチドをプライマー伸長反応でＤＮＡポリメラーゼによって伸長させ、前記標的核酸から前記第１プライマー伸長生成物を置換する第３プライマー伸長生成物を産生する工程と；
をさらに含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
ステップ（ａ）が、前記核酸サンプルを、前記標的核酸配列の５’末端に隣接する、または５’末端付近の前記標的核酸に結合する結合分子によって処理する工程をさらに含み、前記第１プライマー伸長生成物が、前記結合分子によって決定され、前記標的核酸配列の５’末端に相補性である３’末端を有する、請求項８１に記載の方法。
【請求項８５】
ステップ（ｃ）が、前記プロモーターオリゴヌクレオチド：第１プライマー伸長生成物ハイブリッドにおいて前記第１プライマー伸長生成物の３’末端を伸長させ、前記プロモーター配列に相補性である配列を付加する工程をさらに含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
ステップ（ｃ）が：
前記第１プライマー伸長生成物にハイブリダイズした前記プロモーターオリゴヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼによって伸長させ、前記第１プライマー伸長生成物に相補性であるプライマー伸長生成物を産生する工程と；
前記第２プライマー伸長生成物にハイブリダイズした前記プロモーターオリゴヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼによって伸長させ、前記第２プライマー伸長生成物に相補性であるプライマー伸長生成物を産生する工程と；
をさらに含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８７】
前記分離ステップが前記ＤＮＡポリメラーゼによって供給されたリボヌクレアーゼ活性によって実施される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８８】
前記分離ステップが前記ＤＮＡポリメラーゼ以外の酵素によって供給されたリボヌクレアーゼ活性によって実施される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８９】
核酸サンプルからの少なくとも１つの標的核酸配列の選択的増幅で使用するためのキットであって：
タグ化オリゴヌクレオチドであって：
第１領域であって、前記第１領域がＤＮＡポリメラーゼの存在下にてテンプレート依存方式で伸長されうるように、第１条件セットの下で標的核酸配列の３’末端にハイブリダイズする標的ハイブリダイズ配列を含む、第１領域と；
前記第１領域の５’側に位置するタグ配列を含む第２領域であって、前記第１条件セットの下で前記標的核酸配列を含有する標的核酸に安定してハイブリダイズしない第２領域と；
を含むタグ化オリゴヌクレオチドと；
第２条件セットの下で前記標的ハイブリダイズ配列にハイブリダイズして、それにより前記タグ化オリゴヌクレオチドの前記標的核酸配列へのハイブリダイゼーションを遮断するタグ閉鎖配列であって、前記第１条件セットの下で前記標的ハイブリダイズ配列に安定してハイブリダイズしないタグ閉鎖配列と；
第１プライミングオリゴヌクレオチドであって、前記第１プライミングオリゴヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼの存在下にてテンプレート依存方式で伸長されうるように、前記第２条件セットの下で前記タグ配列の相補体にハイブリダイズする第１プライミングオリゴヌクレオチドと；
を含むキット。
【請求項９０】
前記タグ化オリゴヌクレオチドがＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含有する第３領域をさらに含み、前記第３領域が前記第２領域の５’側に位置する、請求項８９に記載のキット。
【請求項９１】
前記標的ハイブリダイズ配列が前記第２条件セットの下で前記標的核酸配列にハイブリダイズされないときに、前記標的ハイブリダイズ配列の３’末端塩基が前記タグ閉鎖配列の５’末端塩基にハイブリダイズする、請求項８９に記載のキット。
【請求項９２】
前記標的ハイブリダイズ配列が前記第２条件セットの下で前記標的核酸配列にハイブリダイズされないときに、前記タグ閉鎖配列の５’末端が前記タグ閉鎖配列と前記標的ハイブリダイズ配列との間に生成された２本鎖を安定化する部分を含む、請求項８９に記載のキット。
【請求項９３】
前記タグ化オリゴヌクレオチドおよび前記タグ閉鎖配列が別個の分子を構成し、前記タグ閉鎖配列がタグ閉鎖オリゴヌクレオチドである、請求項８９に記載のキット。
【請求項９４】
前記タグ化オリゴヌクレオチドおよび前記タグ閉鎖配列が同じ分子内に含有されている、請求項８９に記載のキット。
【請求項９５】
前記タグ閉鎖配列が非ヌクレオチドリンカーによって前記タグ化オリゴヌクレオチドに結合される、請求項９４に記載のキット。
【請求項９６】
前記非ヌクレオチドリンカーが脱塩基ヌクレオチドおよびポリエチレングリコールの少なくとも１つを含む、請求項９５に記載のキット。
【請求項９７】
前記タグ閉鎖配列の３’末端が前記タグ化オリゴヌクレオチドの５’末端に結合される、請求項９５に記載のキット。
【請求項９８】
前記タグ閉鎖配列の５’末端が前記タグ化オリゴヌクレオチドの５’末端に結合される、請求項９５に記載のキット。
【請求項９９】
前記標的ハイブリダイズ配列が前記第２条件セットの下で前記標的核酸配列にハイブリダイズされないときに、前記タグ閉鎖配列が前記標的ハイブリダイズ配列にハイブリダイズして逆平行２本鎖を生成する、請求項９８に記載のキット。
【請求項１００】
前記タグ閉鎖配列がそこからのＤＮＡ合成の開始を防止するために修飾される、請求項９９に記載のキット。
【請求項１０１】
前記タグ閉鎖配列がその３’末端に位置する遮断部分を含むように修飾される、請求項１００に記載のキット。
【請求項１０２】
前記標的ハイブリダイズ配列が前記第２条件セットの下で前記標的核酸配列にハイブリダイズされないときに、前記タグ閉鎖配列が前記標的ハイブリダイズ配列にハイブリダイズして平行２本鎖を生成する、請求項９８に記載のキット。
【請求項１０３】
前記２本鎖が前記タグ閉鎖配列の３’末端塩基にハイブリダイズされた前記標的ハイブリダイズ配列の３’末端塩基を含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０４】
前記タグ閉鎖配列がそこからのＤＮＡ合成の開始を防止するために修飾される、請求項１０２に記載のキット。
【請求項１０５】
前記タグ閉鎖配列がその３’末端に位置する遮断部分を含むように修飾される、請求項１０４に記載のキット。
【請求項１０６】
前記第１プライミングオリゴヌクレオチドが前記標的核酸配列に安定してハイブリダイズして、それにより前記第２条件セットの下で前記標的核酸配列の検出可能な増幅に関与する、請求項８９に記載のキット。
【請求項１０７】
第２プライミングオリゴヌクレオチドをさらに含み、前記第２プライミングオリゴヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼの存在下にてテンプレート依存方式で伸長されうるように前記第２条件セットの下で標的核酸配列の５’末端の相補体にハイブリダイズする、請求項８９に記載のキット。
【請求項１０８】
第１および第２領域を含むプロモーターオリゴヌクレオチドをさらに含み、前記第１領域が前記第２条件セットの下で前記標的核酸配列の５’末端の相補体にハイブリダイズするハイブリダイズ配列を含み、前記第２領域が前記第１領域の５’側に位置するＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含む、請求項８９に記載のキット。
【請求項１０９】
前記プロモーターオリゴヌクレオチドがそこからのＤＮＡ合成の開始を防止するために修飾される、請求項１０８に記載のキット。
【請求項１１０】
前記プロモーターオリゴヌクレオチドがその３’末端に位置する遮断部分を含むように修飾される、請求項１０９に記載のキット。
【請求項１１１】
前記ハイブリダイズ配列が前記第２条件セットの下で前記標的核酸配列の５’末端の相補体にハイブリダイズされるときに、前記プロモーターオリゴヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼの存在下にてテンプレート依存方式で伸長されうる、請求項１０８に記載のキット。
【請求項１１２】
ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項８９に記載のキット。
【請求項１１３】
前記ＤＮＡポリメラーゼが逆転写酵素である、請求項１１２に記載のキット。
【請求項１１４】
ＲＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項１１２に記載のキット。
【請求項１１５】
ヌクレオシド三リン酸をさらに含む、請求項８９に記載のキット。
【請求項１１６】
前記タグ化オリゴヌクレオチドが溶液中で遊離している、請求項８９に記載のキット。
【請求項１１７】
前記標的核酸および前記タグ化オリゴヌクレオチドを含む複合体を結合するための固体支持体をさらに含む、請求項８９に記載のキット。
【請求項１１８】
前記キットが、前記第２条件セットの下で前記タグ閉鎖配列と前記標的ハイブリダイズ配列との間に形成された２本鎖を切断できる制限酵素を含まない、請求項８９に記載のキット。
【請求項１１９】
前記標的ハイブリダイズ配列が前記第１条件セットの下で複数の標的核酸配列の３’末端にハイブリダイズする、請求項８９に記載のキット。
【請求項１２０】
前記タグ化オリゴヌクレオチドがユニバーサル細菌オリゴヌクレオチドである、請求項１１８に記載のキット。
【請求項１２１】
前記標的ハイブリダイズ配列が１つ以上の標的核酸配列の３’の標的領域にハイブリダイズし、前記標的領域が、前記第１条件セットの下で、真正細菌、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌から成る群より選択される微生物のクラスに属する複数の微生物内に存在する、請求項１１９に記載のキット。
【請求項１２２】
前記１つ以上の標的核酸がリボソーム核酸配列である、請求項１２１に記載のキット。
【請求項１２３】
前記タグ化オリゴヌクレオチドがユニバーサル真菌オリゴヌクレオチドである、請求項１１９に記載のキット。
【請求項１２４】
前記標的ハイブリダイズ配列が１つ以上の標的核酸配列の３’の標的領域にハイブリダイズし、前記標的領域が、前記第１条件セットの下で、複数の真菌微生物内に存在する、請求項１２３に記載のキット。
【請求項１２５】
前記１つ以上の標的核酸がリボソーム核酸配列である、請求項１２４に記載のキット。
【請求項１２６】
１つ以上の標的核酸配列の選択的増幅のためのプレ増幅反応混合物であって：
第１および第２領域を含むタグ化オリゴヌクレオチドであって、前記第１領域が前記反応混合物中に存在する１つ以上の標的核酸配列の３’末端に含有された標的領域にハイブリダイズした標的ハイブリダイズ配列を含み、前記第２領域が前記標的ハイブリダイズ配列の５’側に位置するタグ配列を含む、タグ化オリゴヌクレオチドと；
前記標的核酸配列の１つ以上の相補体の３’末端にハイブリダイズするハイブリダイズ配列を含む第１オリゴヌクレオチドと；
前記タグ配列の相補体にハイブリダイズするハイブリダイズ配列を含む第２オリゴヌクレオチドと；
を含み；
前記反応混合物が、前記反応混合物中に存在する前記１つ以上の標的核酸配列に含有された前記標的領域にハイブリダイズされない前記タグ化オリゴヌクレオチドの活性形を実質的に含まず、
前記タグ化オリゴヌクレオチドの前記活性形が前記反応混合物に添加された非標的核酸中に存在する前記標的領域へのハイブリダイゼーションのために利用可能な標的ハイブリダイゼーション配列を有し、
前記反応混合物がテンプレート依存方式で前記オリゴヌクレオチドのいずれかを伸長できる核酸ポリメラーゼを含まない、
プレ増幅反応混合物。
【請求項１２７】
前記タグ化オリゴヌクレオチドが、前記タグ配列の５’側に位置するＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含む、請求項１２６に記載の反応混合物。
【請求項１２８】
前記タグ化オリゴヌクレオチドがＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含まない、請求項１２６に記載の反応混合物。
【請求項１２９】
前記第１オリゴヌクレオチドが、前記ハイブリダイズ配列の５’側に位置するＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含む、請求項１２８に記載の反応混合物。
【請求項１３０】
前記第１オリゴヌクレオチドがその３’末端に位置する遮断部分を含む、請求項１２９に記載の反応混合物。
【請求項１３１】
前記タグ化オリゴヌクレオチドの前記標的ハイブリダイズ配列が配列番号：１９、そのＲＮＡ等価物またはその相補体より成り、前記第１オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ配列が配列番号：２０、そのＲＮＡ等価物またはその相補体より成る、請求項１２９に記載の反応混合物。
【請求項１３２】
前記第１オリゴヌクレオチドが、前記ハイブリダイズ配列の５’側に位置するＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含む、請求項１２６に記載の反応混合物。
【請求項１３３】
前記第１オリゴヌクレオチドがその３’末端に位置する遮断部分を含む、請求項１３２に記載の反応混合物。
【請求項１３４】
前記タグ化オリゴヌクレオチドがその５’末端に結合したタグ閉鎖配列を含む、請求項１２６に記載の反応混合物。
【請求項１３５】
前記タグ化オリゴヌクレオチドが、前記タグ配列の５’側に位置するＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含む、請求項１３４に記載の反応混合物。
【請求項１３６】
前記タグ化オリゴヌクレオチドがＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含まない、請求項１３４に記載の反応混合物。
【請求項１３７】
前記１つ以上の標的核酸配列の前記標的領域にハイブリダイズしていない遊離タグ化オリゴヌクレオチドをさらに含み、前記遊離タグ化オリゴヌクレオチドが前記遊離タグ化オリゴヌクレオチドの相補性核酸へのハイブリダイゼーションを遮断または防止する不活性形である、請求項１３４に記載の反応混合物。
【請求項１３８】
前記反応混合物が前記タグ化オリゴヌクレオチドの未ハイブリダイズ形を実質的に含まない、請求項１３４に記載の反応混合物。
【請求項１３９】
前記反応混合物が前記タグ化オリゴヌクレオチドの未ハイブリダイズ形を実質的に含まない、請求項１２６に記載の反応混合物。
【請求項１４０】
前記タグ化オリゴヌクレオチドがタグ閉鎖配列を含まず、前記反応混合物がタグ閉鎖オリゴヌクレオチドを含まない、請求項１２６に記載の反応混合物。
【請求項１４１】
前記１つ以上の標的核酸配列またはその相補体を含む１つ以上の増幅生成物を検出するためのプローブをさらに含む、請求項１２６に記載の反応混合物。
【請求項１４２】
前記タグ化オリゴヌクレオチドの前記不活性形が前記標的ハイブリダイズ配列にハイブリダイズしたタグ閉鎖配列を含む、請求項１２６に記載の反応混合物。
【請求項１４３】
標的核酸配列を増幅する反応混合物であって：
第１および第２領域を含むタグ化オリゴヌクレオチドであって、前記第１領域が標的核酸配列の３’末端にハイブリダイズする標的ハイブリダイズ配列を含み、前記第２領域が標的核酸配列の５’側に位置するタグ配列を含む、タグ化オリゴヌクレオチドと；
前記標的核酸配列の相補体の３’末端にハイブリダイズするハイブリダイズ配列を含む第１オリゴヌクレオチドと；
前記タグ配列の相補体にハイブリダイズするハイブリダイズ配列を含む第２オリゴヌクレオチドと；
を含み；
前記反応混合物中の実質的未ハイブリダイズタグ化オリゴヌクレオチドが、前記未ハイブリダイズタグ化オリゴヌクレオチドが標的核酸配列にハイブリダイズするのを遮断または防止する活性形を有する、反応混合物。
【請求項１４４】
前記タグ化オリゴヌクレオチドおよび前記タグ閉鎖配列が別個の分子であり、前記タグ閉鎖配列はタグ閉鎖オリゴヌクレオチドである、請求項１４３に記載の反応混合物。
【請求項１４５】
前記タグ化オリゴヌクレオチドおよび前記タグ閉鎖配列が同じ分子内に含有されている、請求項１４３に記載の反応混合物。
【請求項１４６】
前記タグ化オリゴヌクレオチドが固体支持体に結合されていない、請求項１４３に記載の反応混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、単独で、あるいは核酸の同種または異種混合物の構成要素としてのどちらかで存在しうる、特異的核酸配列、すなわち「標的配列」の複数の複製の選択的増幅のための方法、組成物、反応混合物およびキットに関するものである。核酸の混合物は、診断試験、血液製剤のスクリーニング、滅菌試験、食品、水、飲料、工業または環境サンプルにおける微生物検出、調査研究、クローニングなどの他のプロセスのための試薬または材料の調製のために、あるいは他の目的のために採取されたサンプル中に見出されうる。特本明細書に記載するような特異的核酸配列の選択的増幅は、各種の検出アッセイのいずれにおいても、このようなアッセイの精度および信頼性を向上させて、同時にアッセイで使用する試薬の、およびアッセイが実施される環境の調製、精製および／または滅菌要件を低下させるために、特に貴重である。
【背景技術】
【０００２】
（関連分野の説明）
特異的核酸配列の検出および／または定量は、微生物の同定および分類、感染性疾患の診断、多様な種類の処置に対する応答の測定などのための重要な技法である。このような手順は、特定の微生物の存在を監視する必要がありうる食品、水、飲料、工業および環境サンプル、種、ならびに他の種類の材料における微生物の検出および定量にも有用である。
【０００３】
標的核酸の検出および定量のための多くの増幅ベース方法が当業界で公知であり、確立されている。一般にＰＣＲと呼ばれるポリメラーゼ連鎖反応は、変性と、プライマー対の逆鎖へのアニーリングと、および標的配列の複製数を指数関数的に増加させるためのプライマー伸長との複数のサイクルを使用する（たとえばＭｕｌｌｉｓら、“Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ，Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ａｎｄ／ｏｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，”Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，６８３，１９５；Ｍｕｌｌｉｓ，“Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，”Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，６８３，２０２；Ｍｕｌｌｉｓら、“Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ，Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ａｎｄ／ｏｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，”Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．  ４，８００，１５９；Ｇｅｌｆａｎｄら、“Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，”Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，８０４，３７５；Ｍｕｌｌｉｓら、（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５５，３３５−３５０；およびＭｕｒａｋａｗａら、（１９８８）ＤＮＡ  ７，２８７−２９５）。
【０００４】
ＲＴ−ＰＣＲと呼ばれる変形では、逆転写酵素（ＲＴ）を使用してＲＮＡから相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作製し、ｃＤＮＡは次にＰＣＲによって増幅されてＤＮＡの複数の複製を産生する（Ｇｅｌｆａｎｄら、“Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ−Ｈｉｇｈ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，”Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，３２２，７７０および５，３１０，６５２）。
【０００５】
別の公知の増幅方法は、一般にＳＤＡと呼ばれる鎖置換増幅であり、鎖置換増幅はプライマー配列の対の標的配列の逆鎖へのアリーニングと、二重鎖ヘミホスホロチオエート化プライマー伸長生成物を産生するためのｄＮＴＰの存在下にてのプライマー伸長と、ヘミ修飾（ｈｅｍｉｍｏｄｉｆｉｅｄ）制限エンドヌクレアーゼ認識部位のエンドヌクレアーゼ媒介ニッキングと、既存の鎖を置換して、次の回のアニーリング、ニッキングおよび鎖置換のための鎖を産生し、生成物の幾何学的増幅を引き起こす、ニックの３’末端からのポリメラーゼ媒介プライマーゼ伸長とのサイクルを使用する（たとえばＷａｌｋｅｒ，Ｇ．ら、（１９９２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，３９２−３９６；Ｗａｌｋｅｒら、“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，”Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，２７０，１８４；Ｗａｌｋｅｒ，“Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，”Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，４５５，１６６；およびＷａｌｋｅｒら（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０，１６９１−１６９６）。好熱性ＳＤＡ（ｔＳＤＡ）は、好熱性エンドヌクレアーゼおよびポリメラーゼをより高温にて本質的に同じ方法で使用する（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐａｔ．Ｎｏ．０  ６８４  ３１５）。
【０００６】
他の増幅方法としては、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（たとえばＬｉｚａｒｄｉ，“Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，”特許文献１）；ヘリカーゼ依存増幅（ＨＤＡ）（たとえばＫｏｎｇら、“Ｈｅｌｉｃａｓｅ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，”特許文献２）；およびループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）（たとえばＮｏｔｏｍｉら、“Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ，”特許文献３）が挙げられる。
【０００７】
当分野で一般に使用される転写ベース増幅方法としては、ＮＡＳＢＡとも呼ばれる核酸配列ベース増幅（たとえばＭａｌｅｋら、特許文献４）；一般にＱβレプリカーゼと呼ばれる、プローブ分子自体を増幅するためのＲＮＡレプリカーゼの使用に依存する方法（たとえば非特許文献１）；転写ベース増幅方法（たとえば非特許文献２）および自律配列増幅（たとえば非特許文献３；非特許文献４；および非特許文献５）が挙げられる。
【０００８】
別の転写ベース増幅方法は、一般にＴＭＡと呼ばれる転写媒介増幅であり、転写媒介増幅は、実質的に一定の温度、イオン強度、およびｐＨの条件下で標的核酸配列の複数の複製を自己触媒的に合成し、標的配列の複数のＲＮＡ複製は追加の複製を自己触媒的に生成する（たとえばＫａｃｉａｎら、“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，”特許文献５；およびＫａｃｉａｎら，特許文献６）。ＴＭＡは、実証された有効性を備えた強力で高感度の増幅システムであり、ＰＣＲベースの増幅システムに関連する問題の多くを克服する。特に温度サイクリングは必要ない。
【０００９】
増幅アッセイは、在来の微生物技法と比べて高い感度および迅速な結果を得るまでの期間を与えることにより、臨床実験室試験、バイオプロセス監視、または特定のサンプル種中の微生物の検出が要求される他のいずれかの環境の状況における微生物の検出に特に適切である。加えて増幅方法は、合成培地での培養が困難または不可能である莫大な数の微生物の検出に使用されうる。それにもかかわらずある環境、たとえば臨床微生物実験室などでのその受入れが制限されてきた第１世代増幅アッセイに関連するある制限がある。核酸増幅系の高い感度に関する１つの固有の問題は、（たとえば増幅中に使用した１つ以上の試薬から、アッセイを実施する技術者から、増幅が実施される環境からなど）増幅系に導入された夾雑核酸が偽陽性結果を引き起こしうることである。たとえば増幅反応で使用した試薬および／または酵素に、あるいは増幅反応が実施される環境に存在する極めて少量の核酸夾雑さえ、興味のある配列が試験されている核酸サンプル中に存在しないという事実にもかかわらず、陽性増幅シグナルを引き起こしうる。このことは、偽陽性結果を回避または最小化するために増幅反応で使用する試薬のサンプル調製、精製、滅菌などにおいて著しい労力が費やされることを必要とする。
【００１０】
したがって当分野には、夾雑生体材料、たとえば夾雑核酸の結果として生じうる偽陽性結果を減少または排除しながら、１つ以上の興味のある標的核酸配列を選択的に増幅しうる強力な核酸増幅系に対する要求が残存している。試薬精製および／または無菌性要件を低下させた増幅系に対する要求も残存している。本明細書にさらに記載するように、本発明はこれらの要求を満足して、他の関連する利点を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第５，８５４，０３３号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００４／００５８３７８号明細書
【特許文献３】米国特許第６，４１０，２７８号明細書
【特許文献４】米国特許第５，１３０，２３８号明細書
【特許文献５】米国特許第５，４８０，７８４号明細書
【特許文献６】米国特許第５，３９９，４９１号明細書
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｌｉｚａｒｄｉ，Ｐ．ら、（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌ．６，１１９７−１２０２
【非特許文献２】Ｋｗｏｈ，Ｄ．ら、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，１１７３−１１７７
【非特許文献３】Ｇｕａｔｅｌｌｉ，Ｊ．ら、（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，１８７４−１８７８
【非特許文献４】Ｌａｎｄｇｒｅｎ（１９９３）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ９，１９９−２０２
【非特許文献５】ＨＥＬＥＮ  Ｈ．ＬＥＥら、ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ（１９９７）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は一般に、増幅反応で使用される１つ以上の試薬、構成要素または材料に存在しうる、あるいは増幅反応が実施される環境に存在する夾雑生体材料、たとえば核酸から生じる偽陽性増幅シグナルを望ましくは低減または排除する核酸増幅方法および反応混合物に関するものである。本発明はさらに、増幅反応で使用される酵素ならびに他の試薬および構成要素が偽陽性結果を与えうる細菌および他の核酸夾雑を含まないようにするために慣習的に必要とされるよりも、より少ないストリンジェントな精製および／または無菌性についての労力を必要とする利点を提供する。このような構成要素または材料は、これに限定されるわけではないが、水、緩衝液、塩、固体支持体（たとえば磁気的荷電粒子またはビーズ）、及びレセプタクル（たとえばガラス器またはプラスチック器）が挙げられる。したがって本発明の方法および反応混合物は、微生物の存在を検出および／または監視する必要がありうる臨床サンプル、食品、水、工業および環境サンプル、種における微生物を検出および／または定量するのに有用である。本発明の方法および反応混合物は、バイオ技術、製薬、化粧品および飲料産業での製品製造に使用される原材料の試験のために、最終製品の発売試験のために、そして興味のある材料における生物のクラスまたは全生存生物（細菌性、真菌性または両方）について試験する無菌性スクリーニングのために特定の利点を有する。臨床環境において、血流中の病原生物および／またはその毒素によって引き起こされる本発明の方法および反応は、敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）試験、特に敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）に特に有用である。
【００１４】
本発明の一実施形態により、少なくとも１つの標的核酸配列、たとえばＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列の選択的増幅の方法が提供され、該方法は：（ａ）たとえば標的核酸が固体支持体に固定されている核酸サンプル中の標的核酸配列を異種タグ配列によって処理し、タグ化標的核酸配列を産生させるステップと；（ｂ）前記サンプルにおける、前記タグ化標的核酸配列の一部を形成しておらず、タグ化標識核酸配列を前記標的核酸配列によって産生できる形である異種タグ配列の有効濃度を低下させるステップと；（ｃ）前記タグ化標的核酸配列を試薬および標的核酸配列の検出可能な増幅に十分な条件に曝露するステップとを含み、該曝露ステップが核酸サンプルをステップ（ｂ）の後に標的核酸配列の公知の夾雑源に露出させ、標的核酸配列の検出可能な増幅は、公知の夾雑源が寄与する標的核酸配列によってではなく、ステップ（ａ）のタグ化標的核酸配列が寄与する標的核酸配列の増幅に実質的に制限される。
【００１５】
本発明の方法は、使用した１つ以上の試薬または構成要素が、増幅される標的核酸配列の夾雑源であることが公知である材料によって産生される場合に特に有用である。一例において、本方法で使用する１つ以上の試薬、たとえば核酸ポリメラーゼは、標的核酸配列を含有する微生物を使用して産生される。別の例において、該方法で使用する構成要素、たとえば反応容器、ピペット先端およびタグ化標的核酸配列を結合するための固体支持体は、標的核酸配列の公知の夾雑源である。加えて、該方法は、増幅が実施される環境条件が標的核酸配列の公知の夾雑源、たとえば周囲空気、オペレータまたは分析器械を含む場合に有用である。
【００１６】
本実施形態のさらに詳細な態様において、タグ化標的核酸配列はステップ（ｂ）の間に固体支持体に固定される。
【００１７】
別の詳細な態様において、ステップ（ｂ）は、タグ化標的核酸配列の一部を形成していない異種タグ配列を核酸サンプルから希釈または除去する工程を含む。代わりの態様において、ステップ（ｂ）は、前記タグ化標的核酸配列の一部を形成していない異種タグ配列を不活性化し、不活性化異種タグ配列を産生させる工程を含む。関連態様において、該方法はさらに、ステップ（ｂ）の間に不活性化異種タグ配列を前記核酸サンプルから除去する工程を含む。異種タグ配列は、標的核酸配列と複合体化するその能力を遮断すること、構成要素を消化するまたは異種タグ配列の複合体化部分の部位を切断させる酵素を使用すること、異種タグ配列を化学変化させること、あるいは他の手段によって増幅反応混合物中で異種タグ配列が標的核酸配列と複合体化する能力を変化させることによって不活性化されうる。
【００１８】
別の態様において、異種タグ配列はタグ化オリゴヌクレオチドに包含され、タグ化オリゴヌクレオチドは第１領域および第２領域を含み、第１領域は標的核酸配列の３’末端にハイブリダイズする標的ハイブリダイズ配列を含み、第２領域は標的ハイブリダイズ配列に対して５’側に位置するタグ配列を含み、タグ配列は標的核酸配列を含有する標的核酸に安定してハイブリダイズしない。
【００１９】
なお別の態様において、異種タグ配列は、ステップ（ａ）の間に異種タグ配列にタグ化標的核酸配列を産生させる活性形を有し、そこでタグ化標的核酸配列を産生しなかった異種タグ配列は異種タグ配列がステップ（ｃ）の間にタグ化標的核酸配列を産生するのを阻害する不活性形にステップ（ｂ）で変換される。
【００２０】
標的ハイブリダイズ配列はある態様において、ユニバーサルオリゴヌクレオチド、たとえばユニバーサル細菌オリゴヌクレオチドまたはユニバーサル真菌オリゴヌクレオチドである。
【００２１】
ステップ（ｃ）は、第１および第２オリゴヌクレオチドを使用して核酸増幅反応にて増幅生成物を産生する工程を含み、第１オリゴヌクレオチドは標的核酸配列の相補体の３’末端にハイブリダイズする配列を含み、第２オリゴヌクレオチドはタグ配列の相補体にハイブリダイズするが、標的核酸配列に安定してハイブリダイズしない配列を含み、増幅生成物それぞれが標的核酸配列の塩基配列に実質的に等しいまたは相補性である塩基配列を含み、タグ配列の全部または一部に実質的に等しいまたは相補性である塩基配列をさらに含む。
【００２２】
各種の増幅方法が本発明での使用に適している。たとえば一態様において、増幅反応はＰＣＲ反応である。別の態様において、標的核酸配列は等温条件下で実施される転写ベース増幅反応、好ましくはＴＭＡ反応によって増幅される。
【００２３】
該方法によって増幅された標的核酸配列は、興味のあるいずれの標的核酸でもありうるが、一般に微生物から得た核酸配列であろう。その上、該方法は、微生物の１つの系統または種の核酸に、あるいは微生物の複数の種に含有された標的核酸配列の増幅に対して選択的でありうる。あるいは該方法は、複数の種の微生物の核酸に含有された複数の標的核酸配列の増幅に対して選択的であり、たとえばタグ化オリゴヌクレオチドの標的ハイブリダイズ配列は、ステップ（ａ）の複数の標的核酸配列それぞれに存在する標的領域にハイブリダイズする。
【００２４】
たとえば詳細な態様において、該方法は複数の標的核酸それぞれに含有された標的核酸配列の増幅に対して選択的であり、異種タグ配列は、タグ化標的核酸配列をステップ（ａ）で核酸サンプル中に存在する複数の標的核酸それぞれの標的核酸配列と共に産生する。さらに詳細な態様において、複数の標的核酸それぞれに含有された標的核酸配列は同じ核酸配列である。
【００２５】
別の詳細な態様において、該方法は複数の細菌または真菌標的核酸配列の増幅に対して選択的であり、たとえば複数の細菌または真菌標的核酸配列はリボソーム核酸配列である。
【００２６】
別の詳細な態様において、該方法はスタフィロコッカス属（たとえばスタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・エピデルミスおよびスタフィロコッカス・ヘモリティカス）、ストレプトコッカス属（たとえばストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・アガラクティア、ストレプトコッカス・ミティス、緑色連鎖球菌およびベータ溶血性連鎖球菌）、エンテロコッカス属（たとえばエンテロコッカス・フェシウムおよびエンテロコッカス・フェカリス）、エシェリキア属（たとえばエシェリキア・コリ）、クレブシエラ属（たとえばクレブシエラ・ニューモニエおよびクレブシエラ・オキシトカ）、シュードモナス属（たとえばシュードモナス・アエルギノーザ）、エンテロバクター属（たとえばエンテロバクター・クロアカエおよびエンテロバクター・アエロゲネス）、プロテウス属（たとえばプロテウス・ミラビリス）、バクテリオイド属、クロストリジウム属、セラチア属（たとえばセラチア・マルセセンス）、アシネトバクター属（たとえばアシネトバクター・バウマンニイ）およびステノトロフォモナス属（たとえばステノトロフォモナス・マルトフィリア）を含む細菌種の群のメンバより得た標的核酸配列の増幅に対して選択的である。これらの微生物の少なくとも一部が、敗血症試験での検出に適切であろう。
【００２７】
別の態様において、該方法は、カンジダ属（たとえばカンジダ・アルビカンス、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・パラプシローシス、カンジダ・ルシタニエ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ゼイラノイデス、カンジダ・ギリエルモンディ、カンジダ・シュードトリピカリス、カンジダ・ファマータ）、ヒストプラズマ・カプスラーツム、クリプトコッカス属（たとえばクリプトコッカス・ネオフォルマンス、クリプトコッカス・アルビダズおよびクリプトコッカス・ラウレンティ）、コクシジオイデス属（たとえばコクシジオイデス・イミティス）、トリコスポロン属（たとえばトリコスポロン・クタネウム）、マラセチア属（たとえばマラセチア・フルフル）、ロドトルラ属、ノカルディア属（たとえばノカルディア・アステロイデス）、フザリウム属およびアスペルギルス属（たとえばアスペルギルス・フミガーツス）を含む真菌種の群のメンバから得た標的核酸配列の増幅に対して選択的である。これらの微生物の少なくとも一部が、敗血症試験での検出に適切であろう。
【００２８】
なお別の態様において、該方法で使用した核酸サンプルの少なくとも一部は、臨床、水、工業、環境、種、飲料または食品源より得られる。
【００２９】
該方法は、ある態様において、敗血症の無菌性試験または診断試験での使用に特に適している。
【００３０】
本発明の別の実施形態により、核酸サンプルからの少なくとも１つの標的核酸配列の選択的増幅の方法が提供され、該方法は：（ａ）標的核酸配列を含む核酸サンプルを第１および第２領域を含むタグ化オリゴヌクレオチドによって処理するステップであって、第１領域が標的核酸配列の３’末端にハイブリダイズする標的ハイブリダイズ配列を含み、第２領域が標的ハイブリダイズ配列の５’側に位置するタグ配列を含み、第２領域が標的核酸配列を含有する標的核酸に安定してハイブリダイズしない、処理ステップと；（ｂ）前記核酸サンプルにおいて、未ハイブリダイズタグ化オリゴヌクレオチドが前記標的核酸配列へのハイブリダイゼーションに利用できる活性形を有する、前記未ハイブリダイズタグ化オリゴヌクレオチドの有効濃度を低下させるステップと；（ｃ）第１および第２オリゴヌクレオチドを使用して核酸増幅反応にて増幅生成物を産生するステップであって、第１オリゴヌクレオチドが標的核酸配列の相補体の３’末端にハイブリダイズする配列を含み、第２オリゴヌクレオチドがタグ配列の相補体にハイブリダイズするハイブリダイズ配列を含み、第２オリゴヌクレオチドが標的核酸配列に安定してハイブリダイズし、増幅生成物のそれぞれが標的核酸配列の塩基配列に実質的に等しいまたは相補性である塩基配列を含み、タグ配列の全部または一部に実質的に等しいまたは相補性である塩基配列をさらに含む、産生ステップと；を含む。
【００３１】
上の方法の一態様において、タグ化標的核酸配列はステップ（ｂ）の間に固体支持体に固定される。別の態様において、ステップ（ｂ）は、ヌクレアーゼ活性を有する酵素の使用を含まない。
【００３２】
増幅前の活性形の未ハイブリダイズタグ化オリゴヌクレオチドの有効濃度は、好ましくは核酸サンプルを希釈することによって、あるいは未ハイブリダイズタグ化オリゴヌクレオチドを不活性化および／または除去することによって低下される。一態様において、ステップ（ｂ）は、未ハイブリダイズタグ化オリゴヌクレオチドがステップ（ｃ）の間に標的核酸配列に安定してハイブリダイズしないように、未ハイブリダイズタグ化オリゴヌクレオチドを不活性化することを含む。不活性化の一例において、タグ化オリゴヌクレオチドは、ステップ（ａ）の間に標的ハイブリダイズ配列を標的核酸配列にハイブリダイズさせる活性形を有し、ここで未ハイブリダイズタグ化オリゴヌクレオチドは、ステップ（ｂ）においてタグ化オリゴヌクレオチドがステップ（ｃ）の間に標的核酸配列にハイブリダイズするのを遮断または防止する不活性形に変換される。タグ化オリゴヌクレオチドは、標的ハイブリダイズ配列が標的核酸配列にハイブリダイズするのを遮断することによって不活性化すること、構成要素を消化するためにまたは標的ハイブリダイズ配列と標的核酸配列との間に形成された二本鎖の部位を切断するために酵素を使用すること、標的ハイブリダイズ配列を化学変化させること、あるいは他の手段により、タグ化オリゴヌクレオチドが増幅反応混合物中で標的核酸配列にハイブリダイズする能力を変化させることによって不活性化されうる。
【００３３】
関連実施形態において、ステップ（ｂ）および（ｃ）の条件は、ステップ（ａ）の条件よりストリンジェンシーが低い。別の関連実施形態において、核酸サンプルの温度はステップ（ａ）と（ｂ）との間で低下される。
【００３４】
ステップ（ｂ）が未ハイブリダイズタグ化オリゴヌクレオチドを不活性化することを含む別の例において、ステップ（ａ）からの未ハイブリダイズタグ化オリゴヌクレオチドは、ステップ（ｂ）で１本鎖形から２本鎖形に変換される。２本鎖形は、タグ化オリゴヌクレオチドの５’末端に結合されたタグ閉鎖配列を含むヘアピンタグ分子であり、タグ閉鎖配列はステップ（ｂ）の条件下で標的ハイブリダイズ配列にハイブリダイズして、それによりステップ（ａ）からの未ハイブリダイズタグ化オリゴヌクレオチドのステップ（ｂ）および（ｃ）での標的核酸配列へのハイブリダイゼーションを遮断する。別の態様において、タグ閉鎖配列は非ヌクレオチドリンカーによってタグ化オリゴヌクレオチドに結合される。たとえばタグ閉鎖配列の５’末端はタグ化オリゴヌクレオチドの５’末端に結合されうる。
【００３５】
タグ化オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含有する第３領域もさらに含むことができ、第３領域は第２領域の５’側に位置する。
【００３６】
別の態様において、タグ閉鎖配列は、そこからのＤＮＡ合成の開始を防止するために修飾される。
【００３７】
別の態様により、標的ハイブリダイズ配列の３’末端塩基はタグ閉鎖配列の５’末端塩基にハイブリダイズされる。別の態様において、タグ閉鎖配列の３’末端はタグ化オリゴヌクレオチドの５’末端に結合される。
【００３８】
なお別の態様において、標的ハイブリダイズ配列はステップ（ｂ）でタグ閉鎖オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされ、タグ化オリゴヌクレオチドおよびタグ閉鎖オリゴヌクレオチドは別個の分子である。タグ閉鎖オリゴヌクレオチドは所望ならば、そこからのＤＮＡ合成の開始を防止するために修飾されうる。
【００３９】
さらにある態様において、標的ハイブリダイズ配列の３’末端塩基はタグ閉鎖オリゴヌクレオチドの５’末端塩基にハイブリダイズされる。
【００４０】
ある他の態様において、タグ化オリゴヌクレオチド、およびタグ閉鎖オリゴヌクレオチドはどちらもステップ（ａ）の間に核酸中に存在して、標的ハイブリダイズ配列はステップ（ａ）でタグ閉鎖オリゴヌクレオチドよりも標的核酸配列へのハイブリダイゼーションに好都合である。
【００４１】
上記のように、本発明の方法は各種の増幅技法のいずれも使用できる。ある例において、等温増幅反応が、たとえば転写ベース増幅反応、好ましくはＴＭＡまたはリアルタイムＴＭＡが使用されることが好ましい。
【００４２】
詳細な態様において、第１オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズ配列の５’側に位置するＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含む。別の態様において、第２オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズ配列の５’側に位置するＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含み、そこでタグ化オリゴヌクレオチドは第２領域の５’側に位置するＲＮＡポリメラーゼのプロモーターをさらに含む。
【００４３】
該方法によって増幅された標的核酸配列は、興味のあるいずれの標的核酸でもありうるが、一般に微生物から得た核酸配列であろう。その上、該方法は、微生物の１つの系統または種の核酸に、あるいは微生物の複数の種に含有された標的核酸配列の増幅に対して選択的でありうる。あるいは該方法は、複数の種の微生物の核酸に含有された複数の標的核酸配列の増幅に対して選択的であり、たとえばタグ化オリゴヌクレオチドの標的ハイブリダイズ配列は、ステップ（ａ）の複数の標的核酸配列それぞれに存在する標的領域にハイブリダイズする。
【００４４】
別の態様において、該方法は複数の標的核酸それぞれに含有された標的核酸配列の増幅に対して選択的であり、標的ハイブリダイズ配列は、ステップ（ａ）で核酸サンプル中に存在する複数の標的核酸それぞれの標的核酸配列の３’末端にハイブリダイズする。別の態様において、前記複数の標的核酸それぞれに含有された標的核酸配列は同じ核酸配列である。
【００４５】
詳細な態様において、該方法は複数の細菌または真菌標的核酸配列の増幅に対して選択的であり、たとえば複数の細菌または真菌標的核酸配列はリボソーム核酸配列である。
【００４６】
さらに詳細な実施形態おいて、該方法は、スタフィロコッカス属（たとえばスタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・エピデルミスおよびスタフィロコッカス・ヘモリティカス）、ストレプトコッカス属（たとえばストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・アガラクティア、ストレプトコッカス・ミティス、緑色連鎖球菌およびベータ溶血性連鎖球菌）、エンテロコッカス属（たとえばエンテロコッカス・フェシウムおよびエンテロコッカス・フェカリス）、エシェリキア属（たとえばエシェリキア・コリ）、クレブシエラ属（たとえばクレブシエラ・ニューモニエおよびクレブシエラ・オキシトカ）、シュードモナス属（たとえばシュードモナス・アエルギノーザ）、エンテロバクター属（たとえばエンテロバクター・クロアカエおよびエンテロバクター・アエロゲネス）、プロテウス属（たとえばプロテウス・ミラビリス）、バクテリオイド属、クロストリジウム属、セラチア属（たとえばセラチア・マルセセンス）、アシネトバクター属（たとえばアシネトバクター・バウマンニイ）およびステノトロフォモナス属（たとえばステノトロフォモナス・マルトフィリア）を含む細菌の群のメンバから得た標的核酸配列の増幅に対して選択的である。これらの微生物の少なくとも一部が、敗血症試験での検出に適切であろう。
【００４７】
別の詳細な実施形態において、該方法は、カンジダ属（たとえばカンジダ・アルビカンス、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・パラプシローシス、カンジダ・ルシタニエ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ゼイラノイデス、カンジダ・ギリエルモンディ、カンジダ・シュードトリピカリス、カンジダ・ファマータ）、ヒストプラズマ・カプスラーツム、クリプトコッカス属（たとえばクリプトコッカス・ネオフォルマンス、クリプトコッカス・アルビダズおよびクリプトコッカス・ラウレンティ）、コクシジオイデス属（たとえばコクシジオイデス・イミティス）、トリコスポロン属（たとえばトリコスポロン・クタネウム）、マラセチア属（たとえばマラセチア・フルフル）、ロドトルラ属、ノカルディア属（たとえばノカルディア・アステロイデス）、フザリウム属およびアスペルギルス属（たとえばアスペルギルス・フミガーツス）を含む真菌種の群のメンバから得た標的核酸配列の増幅に対して選択的である。これらの微生物の少なくとも一部が、敗血症試験での検出に適切であろう。
【００４８】
ある態様において、標的ハイブリダイズ配列は、ステップ（ａ）で核酸サンプル中に存在する複数の標的核酸配列それぞれの３’末端にハイブリダイズする。さらに第１オリゴヌクレオチドは、ステップ（ａ）で核酸サンプル中に存在する複数の標的核酸配列それぞれの相補体の３’末端にハイブリダイズする。
【００４９】
該方法は複数の第１オリゴヌクレオチドを含むこともでき、複数の第１オリゴヌクレオチドのそれぞれは、ステップ（ｃ）で核酸サンプル中に存在する、少なくとも１つの、しかし全部よりも少ない複数の標的核酸配列の相補体の３’末端にハイブリダイズする。
【００５０】
タグ化オリゴヌクレオチドは、本発明の詳細な実施形態において、ユニバーサル細菌オリゴヌクレオチドまたはユニバーサル真菌オリゴヌクレオチドである。このようなタグ化オリゴヌクレオチドは、無菌性試験のための方法、たとえばバイオプロセス材料の分析のための方法または敗血症の診断の方法に特に適している。
【００５１】
さらに詳細な態様において、標的ハイブリダイズ配列は、ステップ（ａ）で核酸サンプルに存在する複数の標的核酸のそれぞれの標的核酸の３’末端にハイブリダイズし、複数の標的核酸は真正細菌、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌および真菌から成る群より選択される微生物のクラスに属する。別の態様において、複数の標的核酸それぞれはリボソーム核酸である。
【００５２】
本発明の別の態様において、複数の標的核酸配列は、スタフィロコッカス属（たとえばスタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・エピデルミスおよびスタフィロコッカス・ヘモリティカス）、ストレプトコッカス属（たとえばストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・アガラクティア、ストレプトコッカス・ミティス、緑色連鎖球菌およびベータ溶血性連鎖球菌）、エンテロコッカス属（たとえばエンテロコッカス・フェシウムおよびエンテロコッカス・フェカリス）、エシェリキア属（たとえばエシェリキア・コリ）、クレブシエラ属（たとえばクレブシエラ・ニューモニエおよびクレブシエラ・オキシトカ）、シュードモナス属（たとえばシュードモナス・アエルギノーザ）、エンテロバクター属（たとえばエンテロバクター・クロアカエおよびエンテロバクター・アエロゲネス）、プロテウス属（たとえばプロテウス・ミラビリス）、バクテリオイド属、クロストリジウム属、セラチア属（たとえばセラチア・マルセセンス）、アシネトバクター属（たとえばアシネトバクター・バウマンニイ）およびステノトロフォモナス属（たとえばステノトロフォモナス・マルトフィリア）から成る群より選択される細菌微生物のクラスに属するメンバを含む。これらの微生物の少なくとも一部が、敗血症試験での検出に適切であろう。
【００５３】
本発明のさらなる態様において、複数の標的核酸配列は、カンジダ属（たとえばカンジダ・アルビカンス、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・パラプシローシス、カンジダ・ルシタニエ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ゼイラノイデス、カンジダ・ギリエルモンディ、カンジダ・シュードトリピカリス、カンジダ・ファマータ）、ヒストプラズマ・カプスラーツム、クリプトコッカス属（たとえばクリプトコッカス・ネオフォルマンス、クリプトコッカス・アルビダズおよびクリプトコッカス・ラウレンティ）、コクシジオイデス属（たとえばコクシジオイデス・イミティス）、トリコスポロン属（たとえばトリコスポロン・クタネウム）、マラセチア属（たとえばマラセチア・フルフル）、ロドトルラ属、ノカルディア属（たとえばノカルディア・アステロイデス）、フザリウム属およびアスペルギルス属（たとえばアスペルギルス・フミガーツス）から成る群より選択される真菌微生物のクラスに属するメンバを含む。これらの微生物の少なくとも一部が、敗血症試験での検出に適切であろう。
【００５４】
核酸サンプルはステップ（ｂ）の後に標的核酸配列の公知の夾雑源に露出されることが多く、したがって記載した方法は、増幅生成物の産生が標的核酸配列の夾雑源によってではなく、核酸サンプルが寄与する標的核酸配列の増幅に実質的に限定されることを規定している。たとえば増幅反応で使用した１つ以上の試薬または構成要素は、標的核酸配列の公知の夾雑源である。あるいは、または加えて、１つ以上の試薬、たとえば標的核酸配列を含有することが公知の微生物を使用して産生された核酸ポリメラーゼは、標的核酸配列の夾雑源であることが公知である材料によって産生される。さらに該方法が実施される環境条件は、標的核酸配列の公知の夾雑源を含みうる。詳細な態様において、前記核酸の少なくとも一部は、臨床、水、工業、環境、種、飲料または食品源より得られる。
本発明の別の実施形態により、標的核酸配列はＲＮＡ標的配列であり、ステップ（ｃ）は：標的核酸配列に相補性である領域を含む第１プライマー伸長生成物を産生するために、ＤＮＡポリメラーゼとのプライマー伸長反応にて、標的核酸配列にハイブリダイズされたタグ化オリゴヌクレオチドを伸長させる工程と；第１プライマー伸長生成物にハイブリダイズされた標的核酸の一部を選択的に分解する酵素を使用して、第１プライマー伸長生成物を標的核酸から分離する工程と；第１プライマー伸長生成物を第１オリゴヌクレオチドによって処理する工程であって、第１オリゴヌクレオチドは第１および第２領域を含むプロモーターオリゴヌクレオチドであり、第１領域は、プロモーターオリゴヌクレオチド：第１プライマー伸長生成物ハイブリッドを生成するために標的核酸配列の５’末端に相補性である第１プライマー伸長生成物の領域にハイブリダイズするハイブリダイズ配列を含み、第２領域は第１領域の５’側に位置するＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含む、処理工程と；プロモーターオリゴヌクレオチド：第１プライマー伸長生成物ハイブリッドから第１プライマー伸長生成物の少なくとも一部に相補性である第１ＲＮＡ生成物の複数の複製を、プロモーターを認識し、そこから転写を開始するＲＮＡポリメラーゼを使用して転写する工程であって、第１ＲＮＡ生成物の塩基配列が標的核酸配列の塩基配列およびタグ配列の相補体と実質的に同一である、転写工程と；第１ＲＮＡ生成物を第２オリゴヌクレオチドによって処理する工程であって、第２オリゴヌクレオチドが、プライマー伸長反応がプライミングオリゴヌクレオチドから開始できるようにプライミングオリゴヌクレオチド：第１ＲＮＡ生成物ハイブリッドを生成するために、タグ配列の相補体にハイブリダイズするプライミングオリゴヌクレオチドである、処理工程と；第１ＲＮＡ生成物に相補性である第２プライマー伸長生成物を産生するために、プライマー伸長反応にてプライミングオリゴヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼによって伸長させる工程であって、第２プライマー伸長生成物が第１ＲＮＡ生成物の５’末端に相補性である３’末端を有する、伸長工程と；前記第１ＲＮＡ生成物を選択的に分解する酵素を使用して、第２プライマー伸長生成物を第１ＲＮＡ生成物から分離する工程と；プロモーターオリゴヌクレオチド：第２プライマー伸長生成物ハイブリッドを生成するために、第２プライマー伸長生成物をプロモーターオリゴヌクレオチドによって処理する工程と；プロモーターオリゴヌクレオチドの第２領域に相補性である配列を付加するために、プロモーターオリゴヌクレオチド：第２プライマー伸長生成物ハイブリッドにおいて第２プライマー伸長生成物の３’末端を伸長させる工程と；ＲＮＡポリメラーゼを使用して、プロモーターオリゴヌクレオチド：第２プライマー伸長生成物ハイブリッドから第２プライマー伸長生成物に相補性である第２ＲＮＡ生成物の複数の複製を転写する工程であって、第２ＲＮＡ生成物の塩基配列が標的核酸配列の塩基配列およびタグ配列の相補体と実質的に同一である、転写工程と；を含む。
【００５５】
本発明の本実施形態の別の態様において、ステップ（ａ）は、核酸サンプルを標的核酸配列の５’末端に隣接する、または５’末端付近の標的核酸に結合する結合分子によって処理する工程をさらに含み、第１プライマー伸長生成物は、結合分子によって決定され、標的核酸配列の５’末端に相補性である３’末端を有する。
【００５６】
別の態様において、上の実施形態のステップ（ｃ）は、プロモーターに相補性である配列を付加するために、プロモーターオリゴヌクレオチド：第１プライマー伸長生成物ハイブリッドにおける第１プライマー伸長生成物の３’末端を伸長させる工程をさらに含む。なお別の態様において、プロモーターオリゴヌクレオチドは、そこからのＤＮＡ合成の開始を防止するために修飾される。
【００５７】
第１プライマー伸長生成物にハイブリダイズされたプロモーターオリゴヌクレオチドは、第１プライマー伸長生成物に相補性であるプライマー伸長生成物を産生するために、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される；前記第２プライマー伸長生成物にハイブリダイズされたプロモーターオリゴヌクレオチドは、第２プライマー伸長生成物に相補性であるプライマー伸長生成物を産生するために、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。
【００５８】
記載した方法の分離ステップは、ＤＮＡポリメラーゼによって与えられたリボヌクレアーゼ活性によって実施されうる。あるいは分離ステップは、前記ＤＮＡポリメラーゼ以外の酵素によって与えられたリボヌクレアーゼ活性により実施される。
【００５９】
本発明の別の実施形態により、標的核酸配列はＲＮＡ標的配列であり、ステップ（ｃ）は：標的核酸配列に相補性である領域を含む第１プライマー伸長生成物を産生するために、プライマー伸長反応にて標的核酸配列にハイブリダイズされたタグ化オリゴヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼによって伸長させる工程であって、タグ化オリゴヌクレオチドが第２領域の５’側に位置する第３領域をさらに含み、第３領域がＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含む、伸長工程と；第１プライマー伸長生成物にハイブリダイズされた標的核酸のその部分を選択的に分解する酵素を使用して、第１プライマー伸長生成物を標的核酸から分離する工程と；第１プライマー伸長生成物を第１オリゴヌクレオチドによって処理する工程であって、第１オリゴヌクレオチドが、プライマー伸長反応がプライミングオリゴヌクレオチドから開始できるようにプライミングオリゴヌクレオチド：第１プライマー生成物ハイブリッドを生成するために、標的核酸配列の５’末端に相補性である第１プライマー伸長生成物の領域にハイブリダイズするプライミングオリゴヌクレオチドである、処理工程と；第１プライマー伸長生成物に相補性である第２プライマー伸長生成物を産生するために、プライマー伸長反応にてプライミングオリゴヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼによって伸長させるステップと；プロモーターを認識して、そこから転写を開始するＲＮＡポリメラーゼを使用して第２プライマー伸長生成物の少なくとも一部に相補性である第１ＲＮＡ生成物の複数の複製を転写するために、第２プライマー伸長生成物をテンプレートとして使用する工程であって、第１ＲＮＡ生成物の塩基配列がタグ配列の塩基配列および標的核酸配列の相補体に実質的に同一である、使用工程と；を含む。
【００６０】
本発明の別の実施形態により、ステップ（ｃ）はさらに：プライマー伸長反応がプライミングオリゴヌクレオチドから開始されうるようにプライミングオリゴヌクレオチド：第１ＲＮＡ生成物ハイブリッドを生成するために、第１ＲＮＡ生成物をプライミングオリゴヌクレオチドによって処理する工程と；第１ＲＮＡ生成物に相補性である第３プライマー伸長生成物を産生するために、プライマー伸長反応にてプライミングオリゴヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼによって伸長させるステップであって、第３プライマー伸長生成物が第１ＲＮＡ生成物の５’末端に相補性である３’末端を有する、伸長ステップと；第１ＲＮＡ生成物を選択的に分解する酵素を使用して、第３プライマー伸長生成物を第１ＲＮＡ生成物から分離するステップと；第３プライマー伸長生成物を第２オリゴヌクレオチドによって処理する工程であって、第２オリゴヌクレオチドが第１および第２領域を含むプロモーターオリゴヌクレオチドであり、第１領域が、プライマー伸長反応がプロモーターオリゴヌクレオチドから開始されうるようにプロモーターオリゴヌクレオチド：第３プライマー伸長生成物ハイブリッドを生成するために、タグ配列の相補体にハイブリダイズするハイブリダイズ配列を含み、第２領域が第１領域の５’側に位置するＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含む、処理工程と；第３プライマー伸長生成物に対して相補性である第４プライマー伸長生成物を産生するために、プライマー伸長反応にてプロモーターオリゴヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼによって伸長させる工程と；プロモーターに相補性である配列を付加するために第３プライマー伸長生成物を伸長させる工程と；プロモーターを認識し、そこからの転写を開始するＲＮＡポリメラーゼを使用して、プロモーターオリゴヌクレオチド：第３プライマー伸長生成物ハイブリッドから第３プライマー伸長生成物に相補性である第２ＲＮＡ生成物の複数の複写を転写する工程であって、第２ＲＮＡ生成物の塩基配列がタグ配列の塩基配列および標的核酸配列の相補体と実質的に同一である、転写工程と；を含む。
【００６１】
本実施形態の別の態様において、分離ステップはＤＮＡポリメラーゼによって与えられたリボヌクレアーゼによって実施される。あるいは分離ステップは、該ＤＮＡポリメラーゼ以外の酵素によって与えられたリボヌクレアーゼ活性により実施される。
【００６２】
本発明の別の実施形態により、標的核酸配列はＤＮＡ標的配列であり、ステップ（ｃ）は：標的核酸配列に相補性である領域を含む第１プライマー伸長生成物を産生するために、ＤＮＡポリメラーゼとのプライマー伸長反応にて、標的核酸配列にハイブリダイズされたタグ化オリゴヌクレオチドを伸長させる工程と；第１プライマー伸長生成物を第１オリゴヌクレオチドによって処理する工程であって、第１オリゴヌクレオチドは第１および第２領域を含むプロモーターオリゴヌクレオチドであって、第１領域は、プロモーターオリゴヌクレオチド：第１プライマー伸長生成物ハイブリッドを生成するために、標的核酸配列の５’末端に相補性である第１プライマー伸長生成物の領域にハイブリダイズするハイブリダイズ配列を含み、第２領域は第１領域の５’側に位置するＲＮＡポリメラーゼのプロモーターである、処理工程と；プロモーターを認識し、そこから転写を開始するＲＮＡポリメラーゼを使用して、プロモーターオリゴヌクレオチド：第１プライマー伸長生成物ハイブリッドから第１プライマー伸長生成物の少なくとも一部に相補性である第１ＲＮＡ生成物の複数の複製を転写する工程であって、第１ＲＮＡ生成物の塩基配列が標的核酸配列の塩基配列およびタグ配列の相補体と実質的に同一である、転写工程と；第１ＲＮＡ生成物を第２オリゴヌクレオチドによって処理するステップであって、第２オリゴヌクレオチドが、プライマー伸長反応がプライミングオリゴヌクレオチドから開始されうるようにプライミングオリゴヌクレオチド：第１ＲＮＡ生成物ハイブリッドを生成するために、タグ配列の相補体にハイブリダイズするプライミングオリゴヌクレオチドである、処理工程と；第１ＲＮＡ生成物の相補体を含む第２プライマー伸長生成物を与えるために、プライマー伸長反応にてプライミングオリゴヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼによって伸長させる工程であって、第２プライマー伸長生成物が第１ＲＮＡ生成物の５’末端に相補性である３’末端を有する、伸長工程と；第１ＲＮＡ生成物を選択的に分解する酵素を使用して、第２プライマー伸長生成物を第１ＲＮＡ伸長生成物を分離する工程と；プロモーターオリゴヌクレオチド：第２プライマー伸長生成物ハイブリッドを生成するために、第２プライマー伸長生成物をプロモーターオリゴヌクレオチドによって処理する工程と；プロモーターに相補性である配列を付加するために、プロモーターオリゴヌクレオチド：第２プライマー伸長生成物ハイブリッドにおいて第２プライマー伸長生成物の３’末端を伸長させる工程と；ＲＮＡポリメラーゼを使用して、プロモーターオリゴヌクレオチド：第２プライマー伸長生成物ハイブリッドから第２プライマー伸長生成物に相補性である第２ＲＮＡ生成物の複数の複製を転写する工程であって、第２ＲＮＡ生成物の塩基配列が標的核酸配列の塩基配列およびタグ配列の相補体と実質的に同一である、転写工程と；を含む。
【００６３】
本実施形態の一態様において、プロモーターオリゴヌクレオチドは、そこからのＤＮＡ合成の開始を防止するために修飾される。
【００６４】
別の態様において、ステップ（ａ）は：核酸サンプルを標的核酸にハイブリダイズするディスプレーサオリゴヌクレオチドによって、プライマー伸長反応がディスプレーサオリゴヌクレオチドから開始されうるようにタグ化オリゴヌクレオチドの上流から処理する工程と；標的核酸からの前記第１プライマー伸長生成物を置換する第３プライマー生成物を産生するために、プライマー伸長反応にてディスプレーサオリゴヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼによって伸長させる工程と；をさらに含む。
【００６５】
なお別の実施形態において、ステップ（ａ）は、標的核酸配列の５’末端に隣接する、または５’末端付近の標的核酸に結合する結合分子によって核酸サンプルを処理する工程を含み、第１プライマー伸長生成物は、前記結合分子によって決定され、標的核酸配列の５’末端に相補性である３’末端を有する。
【００６６】
さらに詳細な態様において、ステップ（ｃ）は、プロモーター配列に相補性である配列を付加するために、プロモーターオリゴヌクレオチド：第１プライマー伸長生成物ハイブリッドにおいて第１プライマー伸長生成物の３’末端を伸長させる工程をさらに含む。
【００６７】
別の詳細な態様において、ステップ（ｃ）は：第１プライマー伸長生成物に相補性であるプライマー伸長生成物を産生するために、第１プライマー伸長生成物にハイブリダイズされたプロモーターオリゴヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼによって伸長させる工程と；第２プライマー伸長生成物に相補性であるプライマー伸長生成物を産生するために、第２プライマー伸長生成物にハイブリダイズされたプロモーターオリゴヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼによって伸長させる工程と；をさらに含む。
【００６８】
分離ステップは、一実施形態において、前記ＤＮＡポリメラーゼによって与えられたリボヌクレアーゼ活性によって実施される。あるいは分離ステップは、前記ＤＮＡポリメラーゼ以外の酵素によって与えられたリボヌクレアーゼ活性により実施される。
【００６９】
本発明の別の実施形態は、核酸サンプルからの少なくとも１つの標的核酸配列の選択的増幅での使用のためのキットを提供し、キットは：第１領域および第２領域を含むタグ化オリゴヌクレオチドであって、第１領域がＤＮＡポリメラーゼの存在下にてテンプレート依存方式で伸長されうるように、第１条件セットの下で標的核酸配列の３’末端にハイブリダイズする標的ハイブリダイズ配列を含み、第２領域が第１領域の５’側に位置するタグ配列を含み、第２領域が第１条件セットの下で標的核酸配列を含有する標的配列に安定してハイブリダイズしない、タグ化オリゴヌクレオチドと；第２条件セットの下で標的ハイブリダイズ配列にハイブリダイズして、それによりタグ化オリゴヌクレオチドの標的核酸配列へのハイブリダイゼーションを遮断するタグ閉鎖配列であって、第１条件セットの下で標的ハイブリダイズ配列に安定してハイブリダイズしないタグ閉鎖配列と；第１プライミングオリゴヌクレオチドであって、第１プライミングオリゴヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼの存在下にてテンプレート依存方式で伸長されうるように、第２条件セットの下でタグ配列の相補体にハイブリダイズする第１プライミングオリゴヌクレオチドと；を含む。
【００７０】
本実施形態のさらに詳細な態様において、タグ化オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含有する第３領域を含み、第３領域は第２領域の５’側に位置する。
【００７１】
別の態様において、標的ハイブリダイズ配列が第２条件セットの下で標的核酸配列にハイブリダイズされないときに、標的ハイブリダイズ配列の３’末端塩基はタグ閉鎖配列の５’末端塩基にハイブリダイズする。
【００７２】
なお別の態様において、標的ハイブリダイズ配列が第２条件セットの下で標的核酸配列にハイブリダイズされないときに、タグ閉鎖配列の５’末端はタグ閉鎖配列と標的ハイブリダイズ配列との間に生成された２本鎖を安定化する部分を含む。
【００７３】
別の態様において、タグ化オリゴヌクレオチドおよびタグ閉鎖配列は別個の分子を構成し、タグ閉鎖配列はタグ閉鎖オリゴヌクレオチドである。あるいはタグ化オリゴヌクレオチドおよびタグ閉鎖配列は同じ分子内に含有される。
【００７４】
タグ閉鎖配列は、非ヌクレオチドリンカー、たとえば脱塩基ヌクレオチドの少なくとも１つおよびポリエチレングリコールを含む非ヌクレオチドリンカーによってタグ化オリゴヌクレオチドに結合されうる。
【００７５】
別の態様において、タグ閉鎖配列の３’末端はタグ化オリゴヌクレオチドの５’末端に結合される。あるいはタグ閉鎖配列の５’末端はタグ化オリゴヌクレオチドの５’末端に結合される。
【００７６】
なお別の態様において、標的ハイブリダイズ配列が第２条件セットの下で標的核酸配列にハイブリダイズされないときに、タグ閉鎖配列は標的ハイブリダイズ配列にハイブリダイズして逆平行２本鎖を生成する。
【００７７】
別の態様において、タグ閉鎖配列は、たとえばその３’末端に位置する遮断部分を含むことによって、そこからのＤＮＡ合成の開始を防止するように修飾される。
【００７８】
別の態様において、標的ハイブリダイズ配列が第２条件セットの下で標的核酸配列にハイブリダイズされないときに、タグ閉鎖配列は標的ハイブリダイズ配列にハイブリダイズして平行２本鎖を生成する。
【００７９】
なお別の態様において、２本鎖はタグ閉鎖配列の３’末端塩基にハイブリダイズされた標的ハイブリダイズ配列の３’末端塩基を含む。
【００８０】
タグ閉鎖配列は、本態様において、たとえばその３’末端に位置する遮断部分を含むことによって、そこからのＤＮＡ合成の開始を防止するように修飾されうる。
【００８１】
本実施形態の別の態様において、第１プライミングオリゴヌクレオチドは標的核酸配列に安定してハイブリダイズして、それにより第２条件セットの下で標的核酸配列の検出可能な増幅に関与する。
【００８２】
別の態様において、キットは第２プライミングオリゴヌクレオチドをさらに含み、第２プライミングオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼの存在下にてテンプレート依存方式で伸長されうるように第２条件セットの下で標的核酸配列の５’末端の相補体にハイブリダイズする。
【００８３】
なお別の態様において、本発明のキットは第１および第２領域を含むプロモーターオリゴヌクレオチドをさらに含み、第１領域は第２条件セットの下で標的核酸配列の５’末端の相補体にハイブリダイズするハイブリダイズ配列を含み、第２領域は第１領域の５’側に位置するＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含む。
【００８４】
プロモーターオリゴヌクレオチドは、本態様において、たとえばその３’末端に位置する遮断部分を含むことによって、そこからのＤＮＡ合成の開始を防止するように修飾されうる。
【００８５】
なお別の態様において、ハイブリダイズ配列が第２条件セットの下で標的核酸配列の５’末端の相補体にハイブリダイズされるときに、プロモーターオリゴヌクレオチドはＤＮＡポリメラーゼの存在下にてテンプレート依存方式で伸長されうる。
【００８６】
本発明のキットは、ある態様において、ＤＮＡポリメラーゼ（たとえば逆転写酵素）、ＲＮＡポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、標的核酸およびタグ化オリゴヌクレオチドを含む複合体を結合する固体支持体のいずれか１つ以上より選択される１つ以上の試薬または構成要素もさらに含みうる。別の態様において、タグ化オリゴヌクレオチドは溶液中に含まれない。
【００８７】
別の態様において、キットは、第２条件セットの下でタグ閉鎖配列と標的ハイブリダイズ配列との間に生成された２本鎖を切断することができる制限酵素を含まない。
【００８８】
なお別の態様において、標的ハイブリダイズ配列は、第１条件セットの下で複数の標的核酸配列の３’末端にハイブリダイズする。
【００８９】
別の実施形態において、タグ化オリゴヌクレオチドはユニバーサル細菌オリゴヌクレオチドまたはユニバーサル真菌オリゴヌクレオチドである。たとえば一態様において、標的ハイブリダイズ配列は、１つ以上の標的核酸配列の３’末端において標的領域にハイブリダイズし、標的領域は、第１条件セットの下で真正細菌、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌および真菌から成る群より選択される微生物のクラスに属する複数の微生物内に存在する。別の実施形態において、前記１つ以上の標的核酸はリボソーム核酸配列である。
【００９０】
さらに詳細な態様において、微生物は、スタフィロコッカス属（たとえばスタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・エピデルミスおよびスタフィロコッカス・ヘモリティカス）、ストレプトコッカス属（たとえばストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・アガラクティア、ストレプトコッカス・ミティス、緑色連鎖球菌およびベータ溶血性連鎖球菌）、エンテロコッカス属（たとえばエンテロコッカス・フェシウムおよびエンテロコッカス・フェカリス）、エシェリキア属（たとえばエシェリキア・コリ）、クレブシエラ属（たとえばクレブシエラ・ニューモニエおよびクレブシエラ・オキシトカ）、シュードモナス属（たとえばシュードモナス・アエルギノーザ）、エンテロバクター属（たとえばエンテロバクター・クロアカエおよびエンテロバクター・アエロゲネス）、プロテウス属（たとえばプロテウス・ミラビリス）、バクテリオシド属、クロストリジウム属、セラチア属（たとえばセラチア・マルセセンス）、アシネトバクター属（たとえばアシネトバクター・バウマンニイ）およびステノトロフォモナス属（たとえばステノトロフォモナス・マルトフィリア）から成る群より選択される細菌微生物のクラスに属する。これらの微生物の少なくとも一部が、敗血症試験での検出に適切であろう。
【００９１】
別の詳細な態様において、微生物は、カンジダ属（たとえばカンジダ・アルビカンス、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・パラプシローシス、カンジダ・ルシタニエ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ゼイラノイデス、カンジダ・ギリエルモンディ、カンジダ・シュードトリピカリス、カンジダ・ファマータ）、ヒストプラズマ・カプスラーツム、クリプトコッカス属（たとえばクリプトコッカス・ネオフォルマンス、クリプトコッカス・アルビダズおよびクリプトコッカス・ラウレンティ）、コクシジオイデス属（たとえばコクシジオイデス・イミティス）、トリコスポロン属（たとえばトリコスポロン・クタネウム）、マラセチア属（たとえばマラセチア・フルフル）、ロドトルラ属、ノカルディア属（たとえばノカルディア・アステロイデス）、フザリウム属およびアスペルギルス属（たとえばアスペルギルス・フミガーツス）から成る群より選択される微生物の真菌群に属する。これらの微生物の少なくとも一部が、敗血症試験での検出に適切であろう。
【００９２】
本発明の別の実施形態により、標的核酸配列を増幅するための反応混合物が供給され、反応混合物は：第１および第２領域を含むタグ化オリゴヌクレオチドであって、第１領域が標的核酸配列の３’末端にハイブリダイズした標的ハイブリダイズ配列を含み、第２領域が標的ハイブリダイズ配列の５’側に位置するタグ配列を含む、タグ化オリゴヌクレオチドと；標的核酸配列の相補体の３’末端にハイブリダイズするハイブリダイズ配列を含む第１オリゴヌクレオチドと；タグ配列の相補体にハイブリダイズするハイブリダイズ配列を含む第２オリゴヌクレオチド；とを含み、反応混合物中の未ハイブリダイズタグ化オリゴヌクレオチドは、未ハイブリダイズタグ化オリゴヌクレオチドが標的核酸配列にハイブリダイズするのを遮断または防止する不活性形を有する。
【００９３】
本実施形態によるさらに詳細な態様において、タグ化オリゴヌクレオチドの不活性形は、標的ハイブリダイズ配列にハイブリダイズしたタグ閉鎖配列を含む。
【００９４】
別の態様において、タグ化オリゴヌクレオチドおよび前記タグ閉鎖配列は別個の分子であり、タグ閉鎖配列はタグ閉鎖オリゴヌクレオチドである。
【００９５】
別の態様において、タグ化オリゴヌクレオチドおよびタグ閉鎖配列は同じ分子内に含有される。
【００９６】
なお別の態様において、タグ化オリゴヌクレオチドは固体支持体に付着されない。
【００９７】
本発明のある他の実施形態は、バイオプロセスサンプル、流れなどを監視する手段としての、本明細書に記載した方法の使用に関する。一実施形態において、たとえば、（ａ）第１バイオプロセスサンプルをタグ化オリゴヌクレオチドによって処理するステップであって、前記タグ化オリゴヌクレオチドが第１および第２領域を含み、第１領域が興味のある生物の標的核酸配列にハイブリダイズできる標的ハイブリダイズ配列を含み、第２領域が、タグ化オリゴヌクレオチドが前記第１サンプル中に存在する標的核酸配列に安定してハイブリダイズする条件下で、標的核酸配列に安定してハイブリダイズしない、前記標的ハイブリダイズの５’に位置するタグ配列を含む、処理ステップと；（ｂ）第１バイオプロセスサンプルからの未ハイブリダイズタグ化オリゴヌクレオチドを除去または不活性化するステップと；（ｃ）（ｉ）タグ配列の相補体にハイブリダイズする第１オリゴヌクレオチドと、（ｉｉ）標的核酸配列の相補体にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドと、を使用して、第１バイオプロセスサンプルを含み、追加のバイオプロセスサンプルをさらに含む第２バイオプロセスサンプルを増幅試薬および標的核酸配列の増幅に十分な条件に露出させるステップであって、第１および第２オリゴヌクレオチドから生じる検出可能な増幅が追加のバイオプロセスサンプルが寄与する標的核酸配列ではなく、第１バイオプロセスサンプルにおける興味のある生物の標的核酸配列が寄与する、露出ステップと；を含む、夾雑核酸の存在についてバイオプロセスを監視する方法が提供される。
【００９８】
別の実施形態において、本発明は、（ａ）第１バイオプロセスサンプルを第１タグ化オリゴヌクレオチドによって処理するステップであって、第１タグ化オリゴヌクレオチドが第１および第２領域を含み、第１領域が興味のある生物の標的核酸配列にハイブリダイズできる標的ハイブリダイズ配列を含み、第２領域が第１タグ化オリゴヌクレオチドが前記第１サンプル中に存在する標的核酸配列に安定してハイブリダイズする条件下で、標的核酸配列に安定してハイブリダイズしない、標的ハイブリダイズの５’側に位置する第１タグ配列を含む、処理ステップと；（ｂ）第２バイオプロセスサンプルを第２タグ化オリゴヌクレオチドによって処理するステップであって、第２タグ化オリゴヌクレオチドが第１および第２領域を含み、第１領域は興味のある生物の標的核酸配列にハイブリダイズできる標的ハイブリダイズ配列を含み、第２領域は第２タグ化オリゴヌクレオチドが第２サンプル中に存在する標的核酸配列に安定してハイブリダイズする条件下で、標的核酸配列に安定してハイブリダイズしない、標的ハイブリダイズの５’側に位置して、第１タグ配列とは異なる第２タグ配列を含む、処理ステップと；（ｃ）（ｉ）第１タグ配列の相補体にハイブリダイズする第１オリゴヌクレオチドと；（ｉｉ）第２タグ配列の相補体にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドと；（ｉｉｉ）標的核酸配列の相補体にハイブリダイズする第３オリゴヌクレオチドと；を使用して、第１および第２バイオプロセスサンプルを含む第３サンプルに核酸増幅反応を実施するステップであって；第１および第２オリゴヌクレオチドから生じる増幅生成物の検出が第１バイオプロセスサンプルにおける興味のある生物の標的核酸配列の存在を示し、第１および第３オリゴヌクレオチドから生じる増幅生成物の検出が第２バイオプロセスサンプルにおける興味のある生物の標的核酸配列の存在を示す、核酸増幅反応を実施するステップと；を含む、夾雑核酸の存在についてバイオプロセスを監視する方法を提供する。
【００９９】
本発明のさらなる実施形態において、プレ増幅反応混合物が１つ以上の標的核酸配列の選択的増幅のために提供され、該反応混合物は：第１および第２領域を含むタグ化オリゴヌクレオチドであって、前記第１領域が反応混合物中に存在する１つ以上の標的核酸配列の３’末端に含有された標的領域にハイブリダイズした標的ハイブリダイズ配列を含み、第２領域が標的ハイブリダイズ配列の５’側に位置するタグ配列を含む、タグ化オリゴヌクレオチドと；標的核酸配列の１つ以上の相補体の３’末端にハイブリダイズするハイブリダイズ配列を含む第１オリゴヌクレオチドと；タグ配列の相補体にハイブリダイズするハイブリダイズ配列を含む第２オリゴヌクレオチドと；を含み、第２オリゴヌクレオチドは、それが標的核酸配列の１つ以上に相補性であるプライマー伸長生成物を産生するために反応混合物に添加された核酸ポリメラーゼの存在下にて酵素的に伸長されうるように、好ましくは標的核酸を含有する標的核酸に安定してハイブリダイズせず、反応混合物は、反応混合物中に存在する１つ以上の標的核酸配列に含有された標的領域にハイブリダイズされないタグ化オリゴヌクレオチドの活性形を実質的に含まず、タグ化オリゴヌクレオチドの活性形は反応混合物に添加された非標的核酸中に存在する標的領域へのハイブリダイゼーションのために利用可能な標的ハイブリダイゼーション配列を有し、反応混合物はテンプレート依存方式でオリゴヌクレオチドのいずれも伸長できる核酸ポリメラーゼを含まない。「非標的」核酸は、反応混合物外の源からであり、標的核酸配列の配列と同じ配列を含有しうる。非標的核酸源は環境によりうるか、またはそれは反応混合物に添加された構成要素または試薬、たとえば核酸ポリメラーゼでありうる。タグ化オリゴヌクレオチドは、タグ化プライミングオリゴヌクレオチドまたは第２領域の５’側に位置するＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーターを有するタグ化プロモーターオリゴヌクレオチドでありうる。
【０１００】
本実施形態の一態様において、タグ化プライミングオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含まないが、第１オリゴヌクレオチドは第１オリゴヌクレオチドのハイブリダイズ配列の５’側に位置するＲＮＡプロモーターを含む。好ましい態様において、第１オリゴヌクレオチドはその３’末端に位置する遮断部分を含む。Ｅ．コリ標的配列を増幅するのに有用である別の態様において、タグ化オリゴヌクレオチドの標的ハイブリダイズ配列は、配列番号：１９、そのＲＮＡ等価物またはその相補体より成り、第１オリゴヌクレオチドの第１ハイブリダイズ配列は、配列番号：２０、そのＲＮＡ等価物またはその相補体より成る。
【０１０１】
本実施形態の別の態様において、タグ化オリゴヌクレオチドおよび第１オリゴヌクレオチドは、タグ配列およびハイブリダイズ配列それぞれの５’側に位置するＲＮＡポリメラーゼのプロモーターをそれぞれ含みうる。本態様において、第１オリゴヌクレオチドはその３’末端に位置する遮断部分を含む。
【０１０２】
本実施形態のなお別の態様において、タグ化オリゴヌクレオチドは、その３’末端に結合したタグ閉鎖配列を含み、それにより「タグ分子」と呼ばれる一体型分子を生成する。増幅反応の性質に応じて、タグ分子は、タグ配列の５’側に位置するＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含みうるか、含まないことがある。一実施形態において、少なくとも１つの標的核酸配列の標的領域にハイブリダイズしていないタグ分子は、反応混合物中で「遊離した」ままである（すなわちタグ分子は、自己ハイブリダイゼーションによる以外には、ハイブリッド２本鎖を生成しない）。自己ハイブリダイズタグ分子は「ヘアピンタグ分子」と呼ばれ、次にたとえば非標的核酸を含有する夾雑された酵素調製物または試薬を通じて反応混合物に添加されるいずれの相補性核酸にもタグ分子がハイブリダイズするのを防止するタグ分子の不活性形である。本実施形態のなお別の態様において、反応混合物中のタグ分子の実質的にすべてがハイブリダイズ状態にある（標的核酸配列の標的領域、またはヘアピンタグ分子の形でそれ自体のどちらかにハイブリダイズされた）。標的核酸配列の標的領域にハイブリダイズされていないタグ分子（すなわちヘアピンタグ分子）の少なくとも一部は、たとえば反応混合物を標的捕捉および洗浄手順に曝露することによって反応混合物から除去される。
【０１０３】
本実施形態のなおさらなる態様において、反応混合物が１つ以上の標的核酸配列を増幅するために酵素調製物に露出されるときに、実質的にどのタグ化配列も未ハイブリダイズ状態で存在しない。それゆえ本態様において、反応混合物は、興味のあるサンプルによって供給された１つ以上の標的核酸配列に特異的な未ハイブリダイズタグ化オリゴヌクレオチドが実質的に欠乏している。このことはたとえば、ハイブリダイズされたタグ化オリゴヌクレオチドを未ハイブリダイズタグ化オリゴヌクレオチドから分離して、次に未ハイブリダイズタグ化オリゴヌクレオチドを反応混合物から選択的に除去する標的捕捉および洗浄手順によって達成されうる。
【０１０４】
本実施形態のなお別の態様において、タグ化オリゴヌクレオチドはタグ閉鎖配列またはタグ閉鎖オリゴヌクレオチドのどちらも含まない。したがって本態様において、タグ化オリゴヌクレオチドは「タグ分子」として特徴付けることができない。
【０１０５】
本実施形態のなお別の態様において、タグ化オリゴヌクレオチドおよび第２オリゴヌクレオチドの酵素伸長を含む試験管内反応で合成された増幅生成物を検出するためのプローブが含まれる。増幅生成物は、標的核酸配列および／またはその相補体の１つ以上の複製を含む。
【０１０６】
なお別の実施形態において、１つ以上の標的核酸配列の選択的増幅のために反応混合物が提供され、反応混合物は：第１および第２領域を含むタグ化オリゴヌクレオチドであって、第１領域が標的核酸配列の３’末端にハイブリダイズされた標的ハイブリダイズ配列を含み、第２領域が標的核酸配列の５’側に位置するタグ配列を含む、タグ化オリゴヌクレオチドと；標的核酸配列の相補体の３’末端にハイブリダイズするハイブリダイズ配列を含む第１オリゴヌクレオチドと；タグ配列の相補体にハイブリダイズするハイブリダイズ配列を含む第２オリゴヌクレオチドとを含み、第２オリゴヌクレオチドは、標的核酸配列の１つ以上に相補性であるプライマー伸長生成物を産生するために、反応混合物に添加された、または反応混合物中に存在する核酸ポリメラーゼの存在下にてそれが酵素的に伸長されるように、好ましくは標的核酸を含有する標的核酸に安定してハイブリダイズせず、反応混合物中の実質的にすべての未ハイブリダイズタグ化オリゴヌクレオチドは、前記未ハイブリダイズタグ化オリゴヌクレオチドが標的核酸配列にハイブリダイズするのを遮断または防止する活性形を有する。
【０１０７】
タグ化オリゴヌクレオチドの不活性形は、標的ハイブリダイズ配列にハイブリダイズされたタグ閉鎖配列を含みうる。タグ閉鎖配列は、標的ハイブリダイズ配列にハイブリダイズされていないときに別個の分子でありうるか、またはタグ化オリゴヌクレオチドを含む分子中に含有されることができ、その場合にタグ閉鎖配列は好ましくは、非ヌクレオチドリンカー（すなわち核酸ポリメラーゼによって複製できないリンカーの構成要素）によってタグ化オリゴヌクレオチドの５’末端に結合される。タグ化オリゴヌクレオチドは、固体支持体に結合されうるか、または結合されず、好ましくは固体支持体（たとえば粒子またはビーズ）に直接付着されない。直接または間接的のどちらかで固体支持体に結合されている場合、タグ化オリゴヌクレオチドは、標的核酸配列を結合および固定化する捕捉プローブとしてさらに機能しうる。
【０１０８】
上の反応混合物の実施形態のタグ化オリゴヌクレオチドは、以下で説明する各種のタグ化オリゴヌクレオチド実施形態のいずれかの特徴的な機能を有しうる。そして特に除外されない限り、反応混合物は増幅反応を実施するのに必要な試薬および構成要素をさらに含みうる。
【０１０９】
本発明のこれらおよび他の機能および利点は、下の詳細な説明、添付図面および請求項を参照すれば明らかになるであろう。本明細書で開示したすべての参考文献は、それぞれが個別に包含されているかのようにその全体が参照により本明細書に組み入れられている。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】ＲＮＡ標的配列の３’末端にハイブリダイズするタグ化プライミングオリゴヌクレオチドによって開始された転写ベース増幅反応のステップを示す。タグ化プライミングオリゴヌクレオチドによって生成された第１伸長生成物は、ＲＮＡ標的配列の５’末端に隣接して、または５’末端付近でハイブリダイズされた終結オリゴヌクレオチドによって決定される３’末端を有する。遮断プロモーターオリゴヌクレオチドは、第１伸長生成物の３’末端にハイブリダイズして、増幅反応内へサイクルされるＲＮＡ転写物を産生するために使用される。
【図２】図１の増幅反応におけるヘアピンタグ分子の使用を示す。
【図３Ａ】ＲＮＡ標的配列の３’末端にハイブリダイズするタグ化プロモーターオリゴヌクレオチドによって開始された転写媒介増幅反応のステップを示す。
【図３Ｂ】ＲＮＡ標的配列の３’末端にハイブリダイズするタグ化プロモーターオリゴヌクレオチドによって開始された転写媒介増幅反応のステップを示す。
【図４】図３Ａおよび３Ｂの増幅反応におけるヘアピンタグ分子の使用を示す。
【図５】１本鎖ＤＮＡ標的配列の３’末端にハイブリダイズするタグ化プライミングオリゴヌクレオチドによって開始された転写ベース増幅反応のステップを示す。タグ化プライミングオリゴヌクレオチドによって生成された第１伸長生成物は、ＤＮＡ標的配列の５’末端に隣接して、または５’末端付近でハイブリダイズされた終結オリゴヌクレオチドによって決定される３’末端を有する。タグ化プライミングオリゴヌクレオチドの５’側にハイブリダイズされたディスプレーサオリゴヌクレオチドは伸長されて第２伸長生成物を生成し、第２伸長生成物はＤＮＡ標的配列からの第１伸長生成物を置換する。遮断プロモーターオリゴヌクレオチドは、第１伸長生成物の３’末端にハイブリダイズして、増幅反応内へサイクルされるＲＮＡ転写物を産生するために使用される。
【図６】図５の増幅反応におけるヘアピンタグ分子の使用を示す。
【図７】ＤＮＡ標的配列にハイブリダイズするタグ化プライミングオリゴヌクレオチドによって開始されるポリメラーゼ連鎖反応のステップを示す。
【図８】図７の増幅反応におけるヘアピンタグ分子の使用を示す。
【図９】ＲＮＡ標的配列にハイブリダイズするタグ化プライミングオリゴヌクレオチドによって開始された逆転写ポリメラーゼ連鎖反応のステップを示す。
【図１０】図９の増幅反応におけるヘアピンタグ分子の使用を示す。
【図１１】タグ化プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端に逆平行方法でハイブリダイズされて、それによりタグ化プライミングオリゴヌクレオチドの標的核酸配列へのハイブリダイゼーションを遮断する、別個の３’遮断タグ閉鎖オリゴヌクレオチドを示す。
【図１２】タグ化プロモーターオリゴヌクレオチドの３’末端に逆平行方法でハイブリダイズされて、それによりタグ化プロモーターオリゴヌクレオチドの標的核酸配列へのハイブリダイゼーションを遮断する、別個の３’遮断タグ閉鎖オリゴヌクレオチドを示す。
【図１３】タグ化プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端に逆行性方法でハイブリダイズされて、それによりタグ化プライミングオリゴヌクレオチドの標的核酸配列へのハイブリダイゼーションを遮断する、３’遮断タグ閉鎖配列を含むヘアピンタグ分子を示す。タグ閉鎖配列の５’末端は、非ヌクレオチドリンカーによってタグ化プライミングオリゴヌクレオチドのタグ配列の３’末端に結合される。
【図１４】タグ化プロモーターオリゴヌクレオチドの３’末端に逆行性方法でハイブリダイズされて、それによりタグ化プロモーターオリゴヌクレオチドの標的核酸配列へのハイブリダイゼーションを遮断する、３’遮断タグ閉鎖配列を含むヘアピンタグ分子を示す。タグ閉鎖配列の５’末端は、非ヌクレオチドリンカーによってタグ化プロモーターオリゴヌクレオチドのプロモーター配列の３’末端に結合される。
【図１５】タグ化プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端に逆平行方法でハイブリダイズされて、それによりタグ化プライミングオリゴヌクレオチドの標的核酸配列へのハイブリダイゼーションを遮断する、３’遮断タグ閉鎖配列を含むヘアピンタグ分子を示す。タグ閉鎖配列の５’末端は、非ヌクレオチドリンカーによってタグ化プライミングオリゴヌクレオチドのタグ配列の３’末端に結合される。
【図１６】タグ化プロモーターオリゴヌクレオチドの３’末端に逆平行方法でハイブリダイズされて、それによりタグ化プロモーターオリゴヌクレオチドの標的核酸配列へのハイブリダイゼーションを遮断する、３’遮断タグ閉鎖配列を含むヘアピンタグ分子を示す。タグ閉鎖配列の５’末端は、非ヌクレオチドリンカーによってタグ化プロモーターオリゴヌクレオチドのプロモーター配列の３’末端に結合される。
【図１７】標的が増幅試薬内にスパイクされなかったＨＣＶ増幅の生曲線を示す。ＨＣＶ転写物が標的捕捉または増幅試薬中にスパイクされなかったときには検出可能な増幅はなかったが、標的捕捉試薬中にＨＣＶ転写物の複製１ｘ１０６個を含有する反応の平均ＴＴｉｍｅは６．３分であった。
【図１８】標的が増幅試薬内にスパイクされたＨＣＶ増幅の生曲線である。ＨＣＶ転写物が増幅試薬中にスパイクされたときには検出可能な増幅はなかったが、標的捕捉試薬中にＨＣＶ転写物の複製１ｘ１０６個を含有する反応の平均ＴＴｉｍｅは６．３分であった。標的捕捉のゼロサンプルは、ＨＣＶ  １ａの複製１００万個が増幅試薬中にスパイクされても増幅しなかった。
【図１９】標的およびタグ化ｎｏｎＴ７プライマーが増幅試薬内にスパイクされたＨＣＶ増幅の生曲線である。ＨＣＶ  １ａの複製１００万個のみが標的捕捉ステップに存在して、タグ化ｎｏｎＴ７プライマーおよび終結オリゴヌクレオチドが増幅試薬中にスパイクされた場合のＡｖｇＴＴｉｍｅは７．２分であった。増幅試薬中に標的、終結オリゴヌクレオチドおよびタグ化ｎｏｎＴ７プライマーがスパイクされた標的捕捉のゼロサンプルも、ＡｖｇＴＴｉｍｅ＝８．６分の強い増幅を産生した。
【図２０】合成Ｅ．コリｒＲＮＡテンプレートの複製０個または１０６個のどちらかを含む核酸増幅反応の時間依存性監視による結果を示すグラフである。細い破線はテンプレートの複製０個を使用して実施した反応の結果を示し、太い実線はテンプレートの複製１０６個を使用して実施した反応の結果を示す。
【図２１】合成Ｅ．コリｒＲＮＡテンプレートの複製０個、１０３個または１０５個のどちらかを含む核酸増幅反応の時間依存性監視による結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０１１１】
本発明により、増幅反応の試薬または構成要素中に存在しうる夾雑生体材料から生じる偽陽性増幅シグナルを望ましくは低下または排除する核酸増幅方法が提供される。提供された方法はまた、増幅反応で使用される酵素および他の試薬または構成要素、ならびに増幅反応が実施される環境が偽陽性結果を生じうる微生物またはその構成要素、たとえば核酸物質による夾雑を含まないようにするために、慣習的に必要とされたよりも少ないストリンジェントな精製および／または無菌性についての労力を見込んでいる。
【０１１２】
本発明の常法は、別途指摘しない限り、当分野の技術の範囲内である分子生化学、組み換えＤＮＡ、および化学の在来の技術を利用するであろう。このような技法は文献で十分に説明されている。たとえばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：（１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ：４，６８３，１９５；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ，Ｙ．）；およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）を参照。
【０１１３】
定義
次の用語は、別途明示的に反対のことを示さない限り、次の意味を有する。「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」実体という用語は、その実体の１つ以上を指すことに注意するものとする；たとえば「核酸（ａ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）」は１つ以上の核酸を表すと理解される。そのようなものとして、用語「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）、「１つ以上の（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）および「少なくとも１つの（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」は、本明細書で互換的に使用されうる。
【０１１４】
核酸
「核酸」という用語は、単数の「核酸」はもちろんのこと、複数の「核酸」も含むものとされ、共に共有結合した２つ以上のヌクレオチド、ヌクレオシド、または核酸塩基（たとえばデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド）のいずれの鎖も指す。核酸としては、これに限定されるわけではないが、ウイルスゲノム、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡのどちらかであるその一部、細菌ゲノム、またはその一部、真菌、植物または動物ゲノム、あるいはその一部、メッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、プラスミドＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、あるいは合成ＤＮＡまたはＲＮＡが挙げられる。核酸は、線形（たとえばｍＲＮＡ）、円形（たとえばプラスミド）、または分枝形ではもちろんのこと、２本鎖または１本鎖形でも供給されうる。核酸は、核酸の機能または挙動を変化させるための修飾塩基、たとえばさらなるヌクレオチドが核酸に付加されるのを遮断するための３’末端デオキシヌクレオチドの付加を含みうる。本明細書で使用するように、核酸の「配列」は、核酸を構成する塩基の配列を指す。「ポリヌクレオチド」という用語は本明細書では、核酸鎖を示すために使用されうる。本出願を通して、核酸は５’末端および３’末端を有するとして表される。標準核酸、たとえばＤＮＡおよびＲＮＡは通例、「３’→５’」、すなわち成長中の核酸の５’末端へのヌクレオチドの付加によって合成される。
【０１１５】
「ヌクレオチド」は、リン酸基、５炭糖および窒素塩基より成る核酸のサブユニットである。ＲＮＡに見られる５炭糖はリボースである。ＤＮＡでは５炭糖は２’−デオキシリボースである。該用語は、このようなサブユニットの類似物質、たとえばリボースの２’位置におけるメトキシ基（２’−Ｏ−Ｍｅ）も含む。本明細書で使用するように、「Ｔ」残基を含有するメトキシオリゴヌクレオチドは、リボース部分の２’位置のメトキシ基、およびヌクレオチドの塩基位置のウラシルを有する。
【０１１６】
「非ヌクレオチド単位」は、ポリマーのハイブリダイゼーションに著しく関与しない単位である。このような単位は、たとえばヌクレオチドとのいずれの重要な水素結合にも関与する必要がなく、５個のヌクレオチド塩基の１つを構成要素として有する単位またはその類似物質を除外する。
【０１１７】
標的核酸／標的配列
「標的核酸」は、増幅される「標的配列」を含む核酸サンプル中に存在する核酸である。標的核酸は、本明細書に記載するようなＤＮＡまたはＲＮＡであり、１本鎖または２本鎖のどちらかでありうる。標的核酸は、増幅されえない標的配列以外に他の配列を含みうる。代表的な標的核酸としては、ウイルスゲノム、細菌ゲノム、真菌ゲノム、植物ゲノム、動物ゲノム、ウイルス、細菌または真核細胞からのｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、またはｍＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、または染色体ＤＮＡが挙げられる。
【０１１８】
標的核酸は、実施されている増幅アッセイの目的に基づいて多数の源から単離されうる。標的核酸源としては、これに限定されるわけではないが、臨床検体（たとえば全血または血小板のどちらかの血液、尿、唾液、糞便、精液、または髄液）、環境サンプル（たとえば水または土壌サンプル）、食品サンプル、飲料、工業サンプル（たとえば水を含む製品およびプロセス材料）、種、ｃＤＮＡライブラリ、または全細胞ＲＮＡが挙げられる。「単離された」とは、標的核酸を含有するサンプルがその本来の環境から採取されることを意味する；しかしながら該用語は、いずれの特定の精製度を意味しない。必要ならば、本発明の標的核酸は、本発明の各種のオリゴゴヌクレオチドとの相互作用に利用できるようにされる。これはたとえば、細胞からの標的核酸を放出させる細胞溶解または細胞透過処理を含み、そして１回以上の精製ステップ、たとえば一連の単離または洗浄ステップが続きうる。たとえばＣｌａｒｋら、“Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｗｉｄｅ  Ｒａｎｇｅ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ，”Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．Ｎｏ．５，７８６，２０８；およびＨｏｇａｎ，“Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｍａｔｒｉｘ−Ｂａｓｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，８２１，７７０を参照。これはサンプル中に放出されたサンプル源または細胞物質が増幅反応を妨害しうる場合に特に重要でありうる。増幅のために各種源からの標的核酸を調製する方法は、当業者に周知である。本発明の標的核酸は、本明細書に記載した増幅反応の前にある程度まで精製されうるが、他の場合には、サンプルはさらなる操作なしに増幅反応に添加される。
【０１１９】
「標的配列」という用語は、増幅される標的核酸の特定の核酸配列を指す。「標的配列」は、オリゴヌクレオチド（たとえばタグ化オリゴヌクレオチド、プライミングオリゴヌクレオチドおよび／またはプロモーターオリゴヌクレオチド）が本発明のプロセス中に複合体化する複合体化配列を含む。標的核酸が最初に１本鎖である場合、「標的核酸」という用語は、標的核酸中に存在するような「標的配列」に相補性である配列も指すであろう。「標的核酸」が最初に２本鎖である場合、「核酸配列」という用語は、はセンス（＋）およびアンチセンス（−）鎖の両方を指す。標的配列の選択に当たって、当業者は、無関連の標的核酸または密接に関連した標的核酸を区別するために、「唯一」の配列が選択されるべきであることを理解するであろう。当業者によって理解されるように、「唯一の」配列は試験環境から判定される。少なくともタグ化オリゴヌクレオチドの標的ハイブリダイズ配列および（本明細書の別の箇所でさらに詳細に記載した）１つまたは複数の関連する検出プローブによって認識された配列は、試験される環境において唯一であるべきだが、考えられるすべての配列の領域で唯一である必要はない。さらに標的配列がタグ化オリゴヌクレオチドまたは検出プローブによる認識のために「唯一の」配列を含有するべきであっても、プライミングオリゴヌクレオチドおよび／またはプロモーターオリゴヌクレオチドが「唯一の」配列を認識していることが必ずしも当てはまるわけではない。一部の実施形態において、生物のクラスに共通である標的配列、たとえばサンプル中にありうるすべてのＥ．コリ系統に共通である配列を選択することが望ましいことがある。他の状況では、非常に高度に特異的な標的配列、または検出プローブによって認識された少なくとも高度に特異的な領域を有する標的配列が、密接に関連する生物、たとえば病原性Ｅ．コリと非病原性Ｅ．コリを区別するために選択されるであろう。本発明の標的配列は、いずれかの実際的な長さの配列でありうる。最小標的配列は、タグ化オリゴヌクレオチドの標的ハイブリダイズ配列にハイブリダイズする領域、プライミングオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする領域の相補体またはプロモーターオリゴヌクレオチドのハイブリダイズ領域と、本明細書の別の箇所でさらに詳細に記載するような、検出に使用する領域、たとえば検出プローブにハイブリダイズする領域（またはその相補体）とを含む。検出プローブでハイブリダイズする領域は、プライミングオリゴヌクレオチドでハイブリダイズする領域（またはその相補体）またはプロモーターオリゴヌクレオチドのハイブリダイズ領域（またはその相補体）と重複しうるか、またはその中に包含されうる。最小要件に加えて、標的配列の最適長は、多数の考慮事項、たとえば配列内の２次構造、すなわち自己ハイブリダイズ領域の量によって変わる。最適長を決定することは、通常の最適化方法を使用して当業者によって容易に達成される。通例、本発明の標的配列は、長さ約１００ヌクレオチドから長さ約１５０〜約２５０ヌクレオチドの範囲に及ぶ。最適または好ましい長さは各種の条件下で変化することがあり、それは本明細書に記載した方法にしたがって当業者によって容易に試験されうる。「単位複製配列」という用語は、標的配列に含有された配列に実質的に相補性であるか、その配列と同一である、増幅手順中に産生された核酸分子を指す。「増幅生成物」という用語は、単位複製配列または増幅反応を示すある他の生成物を指す。
【０１２０】
オリゴヌクレオチド
本明細書で使用するように、「オリゴヌクレオチド」または「オリゴ」または「オリゴマー」という用語は、単数の「オリゴヌクレオチド」はもちろんのこと、複数の「オリゴヌクレオチド」も含み、本発明の増幅方法においてはもちろんのこと、続いての検出方法においても試薬として使用される、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸塩基または関連化合物の２つ以上のいずれのポリマーも指す。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡおよび／またはその類似物質でありうる。オリゴヌクレオチドという用語は、試薬のいずれの特定の機能も示さず、むしろ本明細書に記載するこのような試薬すべてを対象とするために総称的に使用する。オリゴヌクレオチドは各種の異なる機能を果たすことができ、たとえばオリゴヌクレオチドは、相補性鎖にハイブリダイズすることが可能であり、核酸ポリメラーゼの存在下にてさらに伸長されうる場合にプライマーとして機能することができ、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼによって認識された配列を含有し、転写を許容する場合にプロモーターを供給することができ、オリゴヌクレオチドは、適切に配置および／または修飾されている場合にハイブリダイゼーションを防止またはプライマー伸長を妨害するように機能しうる。本発明の具体的なオリゴヌクレオチドは、下でさらに詳細に説明する。本明細書で使用するように、オリゴヌクレオチドは実質的にいずれの長さでもよく、長さは増幅反応における、または増幅反応の増幅生成物を検出することにおけるその特異的な機能によってのみ制限される。
【０１２１】
定義された配列および化学構造のオリゴヌクレオチドは、当業者に公知の技法によって、たとえば化学または生化学合成によって、組み換え核酸分子、たとえば細菌またはウイルスベクターからの試験管内または生体内発現によって産生されうる。本開示によって意図されるように、オリゴヌクレオチドは野生種染色体ＤＮＡまたはその生体内転写物のみから成るわけではない。
【０１２２】
オリゴヌクレオチドは、所与の修飾が所与のオリゴヌクレオチドの所望の機能と適合する限り、いずれの方法でも修飾されうる。当業者は、所与の修飾が本発明のいずれの所与のオリゴヌクレオチドにも適切または所望であるかどうかを容易に判断できる。修飾としては、塩基修飾、糖修飾または主鎖修飾が挙げられる。塩基修飾としては、アデニン、シチジン、グアノシン、チミンおよびウラシルに加えて次の塩基の使用に限定されるわけではないが、Ｃ−５プロピン、２−アミノアデニン、５−メチルシチジン、イノシン、ならびにｄＰおよびｄＫ塩基が挙げられる。ヌクレオシドサブ単位の糖基は、たとえばリボフラノシル部分への２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−ＭＥ）置換を有するリボヌクレオシドを含めて、リボース、デオキシリボースおよびその類似物質でありうる。Ｂｅｃｋｅｒら、“Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒｓ，”Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．Ｎｏ．６，１３０，０３８を参照。他の糖修飾としては、これに限定されるわけではないが、２’−アミノ、２’−フルオロ、（Ｌ）−アルファ−トレオフラノシル、およびペントプラノシル修飾が挙げられる。ヌクレオシドサブ単位は、結合、たとえばホスホジエステル結合、修飾結合によって、あるいはオリゴヌクレオチドのその相補性標的核酸配列へのハイブリダイゼーションを防止しない非ヌクレオチド部分によって結合されうる。修飾結合は、標準ホスホジエステル結合が別の結合、たとえばホスホロチオアート結合またはメチルホスホナート結合によって置換された結合を含む。核酸塩基サブ単位は、たとえばＤＮＡの天然デオキシリボースホスフェート主鎖を偽ペプチド主鎖、たとえば核酸塩基サブ単位をカルボキシメチルリンカーによって中心の２級アミンに結合する２−アミノエチルグリシン主鎖によって置換することによって結合される（偽ペプチド主鎖を有するＤＮＡ類似物質は、一般に「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」と呼ばれ、Ｎｉｅｌｓｅｎら、“Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，”Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．Ｎｏ．５，５３９，０８２によって開示されている）。他の結合修飾は、これに限定されるわけではないが、モルホリノ結合が挙げられる。
【０１２３】
本発明によって考慮されるオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーの非制限的な例としては、２環式および３環式ヌクレオシドを含有する核酸類似物質ならびにヌクレオチド類似物質（ＬＮＡ）が挙げられる。Ｉｍａｎｉｓｈｉら、“Ｂｉｃｙｃｌｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ａｎｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，”Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，２６８，４９０；およびＷｅｎｇｅｌら、“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，”Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，６７０，４６１）を参照。いずれの核酸類似物質も、修飾オリゴヌクレオチドがその所期の機能を実施しうる、すなわちストリンジェントなハイブリダイゼーション条件または増幅条件下で標的核酸にハイブリダイズする、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼと相互作用して、伸長または転写を開始しうるという条件で、本明細書によって考慮される。検出プローブの場合、修飾オリゴヌクレオチドはまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的核酸に優先的にハイブリダイズできなければならない。
【０１２４】
本発明のオリゴヌクレオチドの設計および配列は後述のようにその機能に依存するが、複数の変数を一般に考慮する必要がある。中でも最も重要なのは：長さ、融解温度（Ｔｍ）、特異性、系内の他のオリゴヌクレオチドとの相補性、Ｇ／Ｃ含有量、ポリピリミジン（Ｔ、Ｃ）またはポリプリン（Ａ、Ｇ）伸長、および３’末端配列である。これらおよび他の変数の制御はオリゴヌクレオチドの標準および周知の態様であり、多数の潜在的なオリゴヌクレオチドを最適なオリゴヌクレオチドについてスクリーニングするために各種のコンピュータプログラムがただちに利用できる。
【０１２５】
オリゴヌクレオチド（または他の核酸）の３’末端は、後述のように遮断部分を使用して各種の方法によって遮断されうる。「遮断された」オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡの相補鎖を産生するために、ＤＮＡ−またはＲＮＡ−依存性ＤＮＡポリメラーゼによって、ヌクレオチドの添加によりその３’末端まで効率的に伸長されない。そのようなものとして、「遮断」されたオリゴヌクレオチドは「プライマー」であるはずがない。
【０１２６】
本開示で使用するように、特異的配列の群「より選択される配列『を含む』、『より成る』、または『より本質的に成る』核酸配列を有するオリゴヌクレオチド」という表現は、オリゴヌクレオチドが基本的で新規な特徴として、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で群の中の列挙された核酸配列の１つの正確な相補体を有する核酸に安定してハイブリダイズできることを意味する。正確な相補体は、対応するＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含む。
【０１２７】
「核酸配列に本質的に相当するオリゴヌクレオチド」という表現は、言及されたオリゴヌクレオチドがストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で同じ核酸配列でハイブリダイズするという点で、参照核酸配列と類似したハイブリダイゼーション特性を有するように、該オリゴヌクレオチドが参照核酸配列と十分に類似していることを意味する。
【０１２８】
当業者は、本発明の「実質的に相当するオリゴヌクレオチド」が言及された配列から変化して、同じ標的核酸配列になお変化しうることを理解するであろう。核酸からのこの変化は、配列内の同一塩基のパーセンテージ又はプローブとその標的配列との間の完全に相補性の塩基のパーセンテージによって示されうる。それゆえ本発明のオリゴヌクレオチドは、塩基同一性又は相補性のパーセンテージが１００％〜約８０％である場合に、参照核酸配列に実質的に一致する。好ましい実施形態において、パーセンテージは１００％〜約８５％である。さらに好ましい実施形態において、本パーセンテージは１００％〜約９０％でありうる；他の好ましい実施形態において、本パーセンテージは１００％〜約９５％でありうる。当業者は、許容されないレベルの非特異的ハイブリダイゼーションを伴わない特異的標的配列に対するハイブリダイゼーションを可能にする、相補性の各種のパーセンテージにて必要とされうるハイブリダイゼーション条件に対する各種の修飾を理解するであろう。
【０１２９】
タグ化オリゴヌクレオチド／異種タグ配列
タグ化オリゴヌクレオチドは、本明細書で使用するように、少なくとも第１領域および第２領域を含むオリゴヌクレオチドを指し、第１領域は興味のある標的核酸配列の３’末端にハイブリダイズする「標的ハイブリダイズ配列」を含み、第２領域は、標的ハイブリダイズ配列の５’側に位置して、標的核酸配列を含有する標的核酸に安定してハイブリダイズまたは結合しない「タグ配列」を含む。標的ハイブリダイズ配列の標的核酸配列へのハイブリダイゼーションは、「タグ化標的核酸配列」を産生する。標的ハイブリダイズ配列構成要素についての特徴および設計考慮事項は、以下で議論されるプライミングオリゴヌクレオチドについてと同じであろう。
【０１３０】
「タグ配列」または「異種タグ配列」は、それが興味のある標的核酸配列に安定してハイブリダイズしない、そしてそれにより検出可能な増幅に関与しないという条件で、本質的にいずれの異種配列でもよい。タグ配列は、好ましくは試験される生物のゲノムに由来するいずれの配列にも、さらに詳細には反応条件下のいずれの標的核酸にも安定してハイブリダイズしない。タグ化オリゴヌクレオチド中に存在するタグ配列は、好ましくは標的ハイブリダイズ配列がその標的配列にハイブリダイズする能力を実質的に障害または妨害しないように設計される。その上、タグ配列は、タグ配列の相補体が最初のＤＮＡプライマー伸長生成物中に包含されたら、次にタグ特異的プライミングオリゴヌクレオチドが本明細書に記載するように次の回の増幅に関与するために使用されうるような、十分な長さおよび組成であろう。本発明のタグ配列は通例、長さが少なくとも１０ヌクレオチドであり、長さが１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０以上のヌクレオチドまで伸長しうる。当業者は、本発明での使用のためのタグ配列およびタグ化オリゴヌクレオチドの設計が多数の方法のいずれにも従いうるが、同時に本明細書に記載した目的および利点をなお達成することを認識するであろう。
【０１３１】
ある実施形態において、タグ化オリゴヌクレオチドは、タグ配列および標的ハイブリダイズ配列を含む「タグ化プライミングオリゴヌクレオチド」である。他の実施形態において、タグ化オリゴヌクレオチドは、タグ化配列、標的ハイブリダイズ配列およびタグ配列の５’側に位置して、そこからの転写を開始するのに有効であるプロモーター配列を含む、「タグ化プロモーターオリゴヌクレオチド」である。
【０１３２】
不活性化
「不活性化」という用語は、異種タグ配列が増幅条件下で標的核酸配列に安定して結合しないように変化されることを意味する。未ハイブリダイズタグ化オリゴヌクレオチドの場合、「不活性化」という用語は、タグ化オリゴヌクレオチドが標的ハイブリダイズ配列に標的核酸配列へハイブリダイズさせる「活性」構造から、標的ハイブリダイズ配列が標的核酸配列へハイブリダイズするのを遮断、またはそうでなければ防止する「不活性」構造へ変化することを意味する。たとえば不活性構造は、タグ閉鎖配列に標的ハイブリダイズ配列との安定なハイブリッドを形成させるストリンジェント条件下（たとえばタグ化オリゴヌクレオチドの活性構造を形成する条件よりも低いストリンジェンシー条件下）で形成されうる。さらに変化されない限り、タグ閉鎖配列：標的ハイブリダイズ配列ハイブリッドは増幅条件下で閉鎖されたままである。あるいはタグ閉鎖配列と標的ハイブリダイズ配列との間に形成された２本鎖は、酵素、たとえばＤＮＡｓｅ、Ｓ１ヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、たとえばタグ閉鎖配列と標的ハイブリダイズ配列との間に形成された２本鎖制限部位を切断する制限酵素、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ構成要素（たとえば標的ハイブリダイズ配列）を消化するためのリボヌクレアーゼ活性（たとえばＲＮＡｓｅ  Ｈ活性）、またはタグ閉鎖配列にハイブリダイズされた標的ハイブリダイズ配列からヌクレオチドを除去するための３’→５’または５’→３’活性を有するエンドヌクレアーゼによって変化されうる。しかしながらサンプルの標的核酸配列の潜在的夾雑源への露出を回避するために、標的核酸配列にハイブリダイズされていないタグ化オリゴヌクレオチドを不活性化するための酵素の使用は一般に好ましくない。他の不活性化手段は、増幅条件下で標的核酸配列にハイブリダイズできないようにするために、標的ハイブリダイズ配列を変化させる化学薬品を含む。
【０１３３】
特に不活性タグ化オリゴヌクレオチドの少なくとも一部が増幅反応混合物中に導入されるであろうことが予想される場合、タグ閉鎖配列とタグ化オリゴヌクレオチドの標的ハイブリダイズ配列との間に形成されたハイブリッドをさらに安定させるための部分は、タグハイブリダイズ配列に含まれうる。適切な部分としては、ＬＮＡ、２’−Ｏ−ＭＥリボヌクレオチド、２，６ジアミノプリン、５−メチルシトシン、およびＣ−５プロピニルシトシンまたはウラシルを含む、修飾ヌクレオチドが挙げられる。当業者は、タグ閉鎖配列の５’および３’末端における休止を制限して、過度の実験に従事することなくハイブリッドの所望の融解温度を達成するために、このような修飾ヌクレオチドの数および位置をただちに選択できるであろう。他の適切な部分としては、副溝バインダおよびペンダント基、たとえばプリン、ＤＡＢＣＹＬ、プリンおよび５’−トリメトキシスチルベンＣＡＰが挙げられる。
【０１３４】
除去
本明細書で使用するように、「除去」という用語は、未ハイブリダイズタグ化オリゴヌクレオチドからのタグ化標的核酸配列の物理的分離を指す。タグ化標的核酸配列は、当業者に公知の各種の技法によって、核酸サンプル中に存在する未ハイブリダイズタグ化オリゴヌクレオチド（または異種タグ配列）から物理的に分離されうる。一例として、タグ化標的核酸配列は、未結合物質が除去される間に、固体支持体に結合されて、核酸サンプル内に固定化されうる。未結合物質を除去するために、固体支持体は１回以上の洗浄／すすぎステップに曝露されうる。洗浄ステップは、残存する未ハイブリダイズタグ化オリゴヌクレオチドおよび潜在的に妨害する細胞またはサンプル物質を除去するためのものである。洗浄溶液が十分に高い濃度で存在するときに増幅を阻害する構成要素、たとえば洗剤を含有するすすぎステップが、通例含まれる。固体支持体は、好ましくは標的核酸またはタグ化標的核酸配列に特異的に結合して、未ハイブリダイズタグ化オリゴヌクレオチド（または未結合異種タグ配列）が増幅反応中に入るのを防止する。標的核酸を捕捉、固定および精製する例示的な手段は後述され、その例はＷｅｉｓｂｕｒｇら、“Ｔｗｏ−Ｓｔｅｐ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃａｐｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，”Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，５３４，２７３によって開示されている。
【０１３５】
タグ閉鎖配列／タグ閉鎖オリゴヌクレオチド
「タグ閉鎖配列」および「タグ閉鎖オリゴヌクレオチド」という句は、タグ化オリゴヌクレオチドの標的ハイブリダイズ配列の部分に相補性であるオリゴヌクレオチドを指す。タグ閉鎖配列の長さおよび配列は、標的ハイブリダイズ配列の標的配列への安定なハイブリダイゼーションを可能にする第１条件セットの下で、タグ閉鎖配列がタグ化オリゴヌクレオチドの標的ハイブリダイズ配列に安定してハイブリダイズしないように選択される。タグ閉鎖配列は、脱塩基ヌクレオチドまたは標的ハイブリダイズ配列との塩基ミスマッチを含みうる。タグ化オリゴヌクレオチドが標的配列にハイブリダイズされないという条件で、タグ閉鎖配列は、よりストリンジェンシーの低い第２条件セットの下で標的ハイブリダイズ配列に安定してハイブリダイズして、それゆえタグ化オリゴヌクレオチドが標的配列にハイブリダイズするのを「不活性化」または遮断する。タグ閉鎖配列は別個のオリゴヌクレオチドの形でありうるか、またはタグ化オリゴヌクレオチドの５’末端に結合されうる（「タグ分子」）ので、タグ閉鎖配列は、第２条件セットの下でタグ化オリゴヌクレオチドを持つヘアピン構造を形成する（「ヘアピンタグ分子」）。タグ分子の一部の場合、タグ閉鎖配列は、好ましくは、第２の条件セットの下でタグ閉鎖配列が標的ハイブリダイズ配列にハイブリダイズするのに十分な長さの非ヌクレオチドリンカー領域（たとえば脱塩基ヌクレオチドまたはポリエチレングリコール）を介して、タグ化オリゴヌクレオチドに結合される。タグ閉鎖配列は、そこからのＤＮＡ合成の開始を防止するように修飾でき、その３’末端に位置する遮断部分を含みうる。タグ閉鎖配列は、長さが少なくとも３塩基であるが、約２０塩基を超えない。代表的なタグ閉鎖配列は長さが１０〜１６塩基である。
【０１３６】
増幅または核酸増幅
「増幅」または「核酸増幅」とは、目的の特異的標的核酸配列の少なくとも一部を含有する標的核酸の複数の複製の産生を意味する。複数の複製は、単位複製配列または複製生成物と呼ばれうる。ある実施形態において、増幅標的は、完全でない標的遺伝子配列（イントロンまたはエキソン）または発現された標的遺伝子配列（エキソンおよびフランキング未翻訳配列のスプライスド転写物）を含有する。たとえば特異的単位複製配列は、標的ポリヌクレオチドの内部位置にハイブリダイズする、そしてポリヌクレオチドの内部位置から重合を開始する増幅プライマーを使用して、標的ポリヌクレオチドの部分を増幅することによって産生されうる。好ましくは、増幅部分は周知の方法のいずれを使用しても検出されうる検出可能な標的配列を含有する。
【０１３７】
核酸増幅の多くの周知の方法は、２本鎖核酸の変性およびプライマーのハイブリダイズを交互に行うためのサーモサイクリングを必要とする；しかしながら核酸増幅の他の周知の方法は等温性である。ポリメラーゼ連鎖反応（Ｍｕｌｌｉｓら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，６８３，１９５；Ｍｕｌｌｉｓ，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，６８３，２０２；およびＭｕｌｌｉｓら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，８００，１５９）は、一般にＰＣＲと呼ばれ、変性と、プライマー対の逆鎖へのアリーニングと、標的配列の複製数を指数関数的に増大させるプライマー伸長との複数回のサイクルを使用する。ＲＴ−ＰＣＲと呼ばれる変形では、逆転写酵素（ＲＴ）を使用してｍＲＮＡから相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作製し、ｃＤＮＡは次にＰＣＲによって増幅されてＤＮＡの複数の複製を産生する（Ｇｅｌｆａｎｄら、“Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ−Ｈｉｇｈ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，”Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，３２２，７７０および５，３１０，６５２）。別の方法は、一般にＳＤＡと呼ばれる鎖置換増幅（Ｗａｌｋｅｒ，Ｇ．ら、（１９９２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，３９２−３９６；Ｗａｌｋｅｒら、“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，”Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，２７０，１８４；Ｗａｌｋｅｒ，“Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，”Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，４５５，１６６；およびＷａｌｋｅｒら（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０，１６９１−１６９６）であり、鎖置換増幅はプライマー配列の対の標的配列の逆鎖へのアリーニングと、二重鎖ヘミホスホロチオエート化プライマー伸長生成物を産生するためのｄＮＴＰの存在下にてのプライマー伸長と、ヘミ修飾（ｈｅｍｉｍｏｄｉｆｉｅｄ）制限エンドヌクレアーゼ認識部位のエンドヌクレアーゼ媒介ニッキングと、既存の鎖を置換して、次の回のアニーリング、ニッキングおよび鎖置換のための鎖を産生し、生成物の幾何学的増幅を引き起こす、ニックの３’末端からのポリメラーゼ媒介プライマーゼ伸長とのサイクルを使用する。好熱性ＳＤＡ（ｔＳＤＡ）は、好熱性エンドヌクレアーゼおよびポリメラーゼをより高温にて本質的に同じ方法で使用する（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐａｔ．Ｎｏ．０  ６８４  ３１５）。他の増幅方法としては、一般にＮＡＳＢＡと呼ばれる核酸配列ベース増幅（たとえばＭａｌｅｋら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，１３０，２３８）；プローブ分子自体を増幅するために、一般にＱβレプリカーゼと呼ばれるＲＮＡレプリカーゼの使用に依存する方法（たとえばＬｉｚａｒｄｉ，Ｐ．ら、（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌ．６，１１９７−１２０２）；転写ベース増幅方法（たとえばＫｗｏｈ，Ｄ．ら、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，１１７３−１１７７）；自律配列増幅（たとえばＧｕａｔｅｌｌｉ，Ｊ．ら、（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，１８７４−１８７８；Ｌａｎｄｇｒｅｎ（１９９３）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ９，１９９−２０２；およびＬｅｅ，Ｈ．ら、ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ（１９９７））；および一般にＴＭＡと呼ばれる転写媒介増幅（Ｋａｃｉａｎら、“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，”Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，４８０，７８４；およびＫａｃｉａｎら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，３９９，４９１）が挙げられる。公知の増幅方法のさらなる議論については、Ｐｅｒｓｉｎｇ，Ｄａｖｉｄ  Ｈ．，１９９３，“Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”ｉｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐｅｒｓｉｎｇら編）、ｐｐ．５１−８７（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）を参照。本発明による使用のために適切な他の例示的な増幅方法としては、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（たとえばＬｉｚａｒｄｉ，“Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，”Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，８５４，０３３）；ヘリカーゼ依存増幅（ＨＤＡ）（Ｋｏｎｇら、“Ｈｅｌｉｃａｓｅ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，”Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ａｐｐｌｎ．Ｐｕｂ．Ｎｏ．ＵＳ  ２００４−００５８３７８  Ａ１）；およびループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）（たとえばＮｏｔｏｍｉら、“Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ，”Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，４１０，２７８）が挙げられる。
【０１３８】
本発明の好ましい転写ベース増幅システムとしてはＴＭＡが挙げられ、ＴＭＡはＲＮＡポリメラーゼを使用して、標的領域の複数のＲＮＡ転写物を産生する（たとえばＫａｃｉａｎら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，４８０，７８４および５，３９９，４９１；ならびにＢｅｃｋｅｒら、“Ｓｉｎｇｌｅ−Ｐｒｉｍｅｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，”Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ａｐｐｌｎ．Ｐｕｂ．Ｎｏ．ＵＳ２００６−００４６２６５  Ａ１）。ＴＭＡは、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼの存在下にて標的核酸にハイブリダイズする「プロモーターオリゴヌクレオチド」または「プロモータープライマー」を使用して、ＲＮＡポリメラーゼがそれからＲＮＡ転写物を産生する２本鎖プロモーターを生成する。これらの転写物は、ＲＮＡ転写物へのハイブリダイズが可能である第２プライマーの存在下でのさらなる回数のＴＭＡのテンプレートとなりうる。熱変性を必要とするＰＣＲ、ＬＣＲまたは他の方法とは異なり、ＴＭＡは、ＲＮＡｓｅ  Ｈ活性を使用してＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖を消化し、それによりＤＮＡがプライマーまたはプロモータープライマーによるハイブリダイゼーションに利用できるようにする、等温方法である。一般に、増幅のために供給された逆転写酵素と関連付けられているＲＮＡｓｅ  Ｈ活性が使用される。
【０１３９】
１つの例証的なＴＭＡ方法において、１つの増幅プライマーは、２本鎖で、標的結合配列の５’側に位置するときに機能するプロモーター配列を含み、増幅される配列に対する位置３’における標的ＲＮＡの結合部位にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプロモータープライマーである。プロモータープライマーは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ認識について特異的であるときに「Ｔ７プライマー」と呼ばれうる。ある状況下で、プロモータープライマーの３’末端、またはこのようなプロモータープライマーの亜集団が修飾されて、プライマー伸長を遮断または減少しうる。未修飾プロモータープライマーから、逆転写酵素は標的ＲＮＡのｃＤＮＡ複製を作製するのに対して、ＲＮＡｓｅ  Ｈ活性は標的ＲＮＡを分解する。次に第２増幅プライマーはｃＤＮＡに結合する。本プライマーは、「Ｔ７プライマー」から区別するために、「非Ｔ７プライマー」と呼ばれうる。本第２の増幅プライマーから逆転写酵素が別の鎖を作製して、端に機能プロモーターを持つ２本鎖ＤＮＡを生じる。２本鎖のとき、プロモーター配列は、プロモータープライマーがハイブリダイズされる標的配列の転写を開始するために、ＲＮＡポリメラーゼを結合することができる。ＲＮＡポリメラーゼは本プロモーター配列を使用して、複数の、一般に複製約１００〜１，０００個のＲＮＡ転写物（すなわち単位複製配列）を産生する。新たに合成された単位複製配列はそれぞれ、第２増幅プライマーを用いてアニーリングできる。逆転写酵素は次にＤＮＡ複製を作製するのに対して、ＲＮＡｓｅ  Ｈ活性は本ＲＮＡ：ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する。プロモータープライマーは次に新たに合成されたＤＮＡに結合でき、逆転写酵素に新たな２本鎖ＤＮＡを作製させて、そこからＲＮＡポリメラーゼが複数の単位複製配列を産生する。それゆえ２個の増幅プライマーを使用して、１０億倍の等温増幅が達成されうる。
【０１４０】
別の例証的なＴＭＡ方法において、Ｂｅｃｋｅｒら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ａｐｐｌｎ．Ｐｕｂ．Ｎｏ．ＵＳ  ２００６−００４６２６５  Ａ１に記載されている１つ以上の特徴が場合により包含される。この点で好ましいＴＭＡ方法は、遮断部分、終結部分、およびＴＭＡプロセスの感受性および精度の改善を与える他の修飾部分の使用を含む。それゆえ本発明のある好ましい実施形態は、Ｂｅｃｋｅｒら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ａｐｐｌｎ．Ｐｕｂ．Ｎｏ．ＵＳ  ２００６−００４６２６５  Ａ１に記載されたような方法と併せて、本明細書に記載したようなタグ化オリゴヌクレオチドを使用する。
【０１４１】
「検出可能な増幅」とは、増幅反応混合物中で増幅生成物と関連付けられた検出可能なシグナルが所定のバックグラウンド又は閾値レベルを超えて上昇する（終点増幅）、或いは所定の期間内にバックグラウンドまたは閾値レベルを超えて上昇する（リアルタイム増幅）ことを意味する。たとえばＬｉｇｈｔら、“Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  Ａｍｏｕｎｔ  ｏｆ  ａｎ  Ａｎａｌｙｔｅ  ｉｎ  ａ  Ｓａｍｐｌｅ，”Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ａｐｐｌｎ．Ｐｕｂ．Ｎｏ．ＵＳ  ２００６−０２７６９７２，段落５０６−５４９を参照。増幅生成物は、標的核酸配列又はその相補体と配列同一性を有する配列を含有し、例えば標的核酸配列又はその相補体の領域に特異性を有する挿入染料又は検出プローブを用いて検出されうる。
【０１４２】
「選択的増幅」
「選択的増幅」は本明細書で使用するように、標的配列の検出可能な増幅が、試験されている興味のあるサンプルが寄与するが、他の何らかのサンプル源、例えば増幅反応中に使用された試薬または構成要素に、あるいは増幅反応が実行される環境または環境条件に存在する夾雑が寄与する標的核酸配列は寄与しない、標的配列の増幅に制限または実質的に制限される、本発明による標的核酸配列の増幅を指す。
【０１４３】
増幅条件
「増幅条件」とは、本発明による核酸増幅を許容する条件を意味する。増幅条件は一部の実施形態において、本明細書に記載したような「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」よりもストリンジェントでなくてもよい。本発明の増幅反応にて使用するオリゴヌクレオチドは、増幅条件下でその所期の標的にハイブリダイズするが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下ではハイブリダイズしても、ハイブリダイズしなくてもよい。他方では、本発明の検出プローブはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。以下の実施例部で本発明による標的核酸配列を増幅するのに好ましい増幅条件を提供するが、本発明による核酸増幅を実行する他の許容される条件は、使用される特定の増幅方法に応じて当業者によって容易に確認されうる。
【０１４４】
ハイブリダイズする／ハイブリダイゼーション
核酸ハイブリダイゼーションは、完全または部分相補性ヌクレオチド配列を有する２個の核酸鎖が所定の反応条件下で結合して安定な２本鎖ハイブリッドを形成する工程である。いずれの核酸鎖もデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）あるいはその類似物質でありうる。それゆえハイブリダイゼーションは、ＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、またはその類似物質を包含しうる。本２本鎖構造の２つの構成要素鎖は、場合によりハイブリッドと呼ばれ、水素結合によって結合されている。これらの水素結合は、単一の核酸鎖上で塩基アデニンおよびチミンまたはウラシル（ＡおよびＴまたはＵ）あるいはシトシンおよびグアニン（ＣおよびＧ）を含有するヌクレオチド間で最も一般的に形成されるが、塩基対合はこれらの「標準」対のメンバでない塩基間でも形成しうる。非標準塩基対合は当分野で公知である（たとえば（ＲＯＧＥＲ  Ｌ．Ｐ．ＡＤＡＭＳ  ＥＴ  ＡＬ．，ＴＨＥ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤＳ（１１ｔｈｅｄ．１９９２）を参照）。
【０１４５】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」又は「ストリンジェント条件」は、特異的検出プローブが試験サンプル中に存在する他の核酸に優先して標的核酸とハイブリダイズできる条件を指す。これらの条件がプローブのＧＣ含有量および長さ、ハイブリダイゼーション温度、ハイブリダイゼーション試薬または溶液の組成、および得ようとするハイブリダイゼーション特異性の程度を含む因子に応じて変化しうることが認識されるであろう。特にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は本開示の下で与えられる。
【０１４６】
「核酸ハイブリッド」または「ハイブリッド」または「２本鎖」とは、各鎖が相互に相補性であり、領域がこれに限定されるわけではないが、化学発光または蛍光検出、オートラジオグラフィまたはゲル電気泳動を含む手段によって検出されるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で十分に安定である、２本鎖の水素結合された領域を含有する核酸構造を意味する。このようなハイブリッドは、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡ、またはＤＮＡ：ＤＮＡ２本鎖分子を含みうる。
【０１４７】
「相補性の」とは、２個の１本鎖核酸の同様の領域のヌクレオチド配列、または同じ１本鎖核酸の異なる領域に対するヌクレオチド配列が、ストリンジェントなハイブリダイゼーションまたは増幅条件下で、安定な２本鎖水素結合領域において、１本鎖領域を共にハイブリダイゼーションさせるヌクレオチド塩基組成を有することを意味する。ＡがＵまたはＴと対合され、ＣがＧと対合されるように、一方の１本鎖領域のヌクレオチドの連続配列が他方の１本鎖領域のヌクレオチドの類似配列と一連の「標準」水素結合塩基対を形成できるとき、ヌクレオチド配列は「完全に」相補性である。
【０１４８】
「好ましくはハイブリダイズする」とは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下である相補性ヌクレオチド又は核酸塩基配列がハイブリダイズして、他のあまり安定でない２本鎖より優先的に安定なハイブリッドを形成することを意味する。「安定してハイブリダイズしない」とは、安定なハイブリッドが定義された条件セットの下で感知可能および／または検出可能な量で形成されないことを意味する。
【０１４９】
「安定な」または「安定してハイブリダイズする」とは、反応混合物の温度が核酸２本鎖の融解温度より少なくとも２℃低いことを意味する。
【０１５０】
プロモーターオリゴヌクレオチド／プロモーター配列
当分野で周知であるように、「プロモーター」は特異的核酸配列であって、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（「転写酵素」）によって、該核酸に結合して特異的部位にてＲＮＡの転写を開始するシグナルとして認識される、特異的核酸配列である。結合では一般に、このような転写酵素が伸長反応を介してプロモーター配列を含む領域内で２本鎖にされたＤＮＡを必要とすると考えられたので、本発明者らは、２本鎖プロモーターがテンプレート核酸を用いた伸長反応を介して形成されない条件ですらＲＮＡの効率的な転写が起こりうると判断した。テンプレート核酸（転写される配列）は、２本鎖である必要はない。個々のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、転写を促進するその効率が顕著に変化しうる、各種の異なるプロモーター配列を認識する。ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に結合して転写を開始したときに、そのプロモーター配列は転写された配列の一部ではない。それゆえそれによって産生されたＲＮＡ転写は、その配列を含まないであろう。
【０１５１】
本発明により、「プロモーターオリゴヌクレオチド」は、第１および第２領域を含むオリゴヌクレオチドを指し、好ましくは修飾されてその３’末端からのＤＮＡ合成の開始を防止する。本発明のプロモーターオリゴヌクレオチドの「第１領域」は、ハイブリダイズ配列が３’側に位置するが、必ずしもプロモーター領域に隣接していないＤＮＡテンプレートにハイブリダイズする塩基配列を含む。本発明のプロモーターオリゴヌクレオチドのハイブリダイズ部は通例、長さが少なくとも１０ヌクレオチドであり、長さが１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０以上のヌクレオチドまで伸長しうる。「第２領域」は、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含む。本発明のプロモーターオリゴヌクレオチドは、上記のようにその３’末端に遮断部分を好ましくは含む、ＲＮＡ−またはＤＮＡ−依存ＤＮＡポリメラーゼ、たとえば逆転写酵素による伸長が不可能であるように組み換えられる。適切で好ましいプロモーターオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載されている。
【０１５２】
ユニバーサル／パンオリゴヌクレオチド
「ユニバーサル」オリゴヌクレオチドまたは「パン」オリゴヌクレオチドは、あるクラスの生物に特有である高度保存配列に基づいてあるクラスの生物の核酸配列の存在を同定するための増幅反応にて使用されうるオリゴヌクレオチドを含む（本明細書で使用するように、「クラス」という用語は必ずしも、認識された系統発生的グループ分けまたは生物を示すわけではない）。たとえば高度保存１６ＳリボソームＲＮＡコード配列は、細菌、または細菌のグループ化（たとえば真正細菌、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌）に見出されが、ヒトおよび他の高等生物には見出されない領域を含有し、それゆえオリゴヌクレオチドは、興味のあるサンプルでの細菌配列の存在を検出する核酸増幅反応にて設計および使用されうる。たとえばＭｃＣａｂｅら（１９９９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ６６，２０５−２１１；Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｔ．ら（１９９４）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２３５，２０５−２２２（病原体を同定する方法）；Ｋｕｎｉｓｈｉｍａ，Ｓ．ら（２０００）Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ４０，１４２０（血液中の細菌を検出する方法）；Ｇｒｅｉｓｅｎ，Ｋ．（１９９４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２，３３５−３５１（脳脊髄液中の病原菌を検出する方法）；Ｊｏｒｄａｎ，Ｊ．（２００５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇ．７，５７５−５８１（新生児の敗血症を診断する方法）；Ｒｏｔｈｍａｎ，Ｒ．ら（２００２）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８６，１６７７−１６８１（急性細菌性心内膜炎を診断する方法）；およびＣｏｘ，Ｃ．ら（２００２）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒ．５，Ｒ１−Ｒ８（滑液中の細菌の検出）を参照。同様に、他のクラスの生物、たとえば真菌病原体のユニバーサルオリゴヌクレオチドが記載されている。たとえばＭａａｒｏａｔｉ，Ｙ．ら（２００３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１，３２９３−３２９８（血液中のカンジダ・アルビカンスを定量する方法）；Ｃａｒｒ，Ｍ．ら（２００５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３，３０２３−３０２６（血液中のカンジダ・ドゥブリニエンシスを検出する方法）；およびＷｈｉｔｅ，Ｐ．ら（２００３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５２，２２９−２３８（全身性真菌感染を検出する方法）を参照。所与のクラスの生物の公知のまたは開発された本質的にいずれのユニバーサルオリゴヌクレオチドも、本明細書に記載した方法で好都合に使用されうる。
【０１５３】
プライミングオリゴヌクレオチド
プライミングオリゴヌクレオチドは、少なくともその３’末端が核酸テンプレートに対して相補性であり、テンプレートと（水素結合またはハイブリダイゼーションによって）複合体化して、ＲＮＡ−またはＤＮＡ−依存性ＤＮＡポリメラーゼによる合成の開始に適切なプライマー：テンプレート複合体を与える、オリゴヌクレオチドである。プライミングオリゴヌクレオチドは、その３’末端への共有結合核酸塩基の付加によって伸長され、該塩基は該テンプレートに対して相補性である。結果はプライマー伸長生成物である。本発明のプライミングオリゴヌクレオチドは通例、長さが少なくとも１０ヌクレオチドであり、長さが１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０以上のヌクレオチドまで伸長しうる。適切で好ましいプライミングオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載されている。公知である本質的にすべてのＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素を含む）が、ＤＮＡ合成を開始するためにオリゴヌクレオチドへの１本鎖テンプレートへの複合体化（「プライミング」）を必要とするのに対して、ＲＮＡ複製および転写（ＤＮＡからＲＮＡの複製）は一般にプライマーを必要としない。ＤＮＡポリメラーゼによって伸長されるまさにその本質によって、プライミングオリゴヌクレオチドは３’遮断部分を含まない。
【０１５４】
ディスプレーサオリゴヌクレオチド
「ディスプレーサオリゴヌクレオチド」は、標的配列の３’末端にハイブリダイズした隣接プライミングオリゴヌクレオチド（本明細書では「フォワードプライミングオリゴヌクレオチド」と呼ばれる）から上流のテンプレート核酸にハイブリダイズするプライミングオリゴヌクレオチドである。「上流の」とは、ディスプレーサオリゴヌクレオチドの３’末端がフォワードプライミングオリゴヌクレオチドのテンプレート核酸５’→３’末端と複合体化することを意味する。テンプレート核酸にハイブリダイズされるときに、ディスプレーサオリゴヌクレオチドの３’末端塩基は好ましくは、フォワードプライミングオリゴヌクレオチドの５末端塩基に隣接している、または５末端塩基から離間されている。さらに好ましくは、ディスプレーサオリゴヌクレオチドの３’末端塩基は、フォワードプライミングオリゴヌクレオチドの５’末端塩基から５〜３５塩基から離間されている。ディスプレーサオリゴヌクレオチドは、フォワードプライミングオリゴヌクレオチドと同時に、またはフォワードプライミングオリゴヌクレオチドがテンプレート核酸にハイブリダイズするのに十分な時間を取った後に、反応混合物に供給されうる。フォワードプライミングオリゴヌクレオチドの伸長は、ディスプレーサオリゴヌクレオチドが反応混合物に供給される前または後に開始されうる。増幅条件下で、ディスプレーサオリゴヌクレオチドはテンプレート依存方式で伸長され、それによりテンプレート核酸によって複合体化されたフォワードプライミングオリゴヌクレオチドを含むプライマー伸長生成物を置換する。フォワードプライミングオリゴヌクレオチドを含むプライマー伸長生成物は、テンプレート核酸からいったん置換されると、プロモーターオリゴヌクレオチドとの複合体化に利用される。フォワードプライミングオリゴヌクレオチドおよびディスプレーサオリゴヌクレオチドはどちらも、標的核酸に優先的にハイブリダイズする。ディスプレーサオリゴヌクレオチドおよびその使用の例は、本願と共通する所有権を受けたＢｅｃｋｅｒら、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｋｉｔｓ  ｆｏｒ  Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ  ＤＮＡ，”Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ａｐｐｌｎ．Ｎｏ．１１／６８１，１０４によって開示されている。
【０１５５】
遮断部分
本明細書で使用するように、「遮断部分」は、オリゴヌクレオチドまたは他の核酸の３’末端を、核酸ポリメラーゼによって効率的に伸長できないように３’末端を「遮断」するために使用される物質である。遮断部分は、小型分子、たとえばホスフェートまたはアンモニウム基でありうるか、あるいはそれは修飾ヌクレオチド、たとえば３’２’ジデオキシヌクレオチドまたは３’デオキシアデノシン５’−三リン酸（コルジセピン）、あるいは他の修飾ヌクレオチドでありうる。追加の遮断部分はたとえば、３’末端に遊離ヒドロキシル基を含まないようにするための３’→５’方向を有するヌクレオチドまたは短いヌクレオチド配列の使用、３’アルキル基、３’非ヌクレオチド部分（たとえばＡｒｎｏｌｄら、“Ｎｏｎ−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌｉｎｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅｓ，”Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，０３１，０９１を参照）、ホスホロチオアート、アルカン−ジオール残基、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、３’末端に３’ヒドロキシル基のないヌクレオチド残基、または核酸結合タンパク質の使用を含む。好ましくは、３’遮断部分は、３’→５’方向または３’非ヌクレオチド部分を有するが、遊離ヒドロキシ基を有する３’２’−ジデオキシヌクレオチドまたは３’末端を有さない、ヌクレオチドまたはヌクレオチド配列を含む。３’−遮断オリゴヌクレオチドを調製する追加の方法は、当業者に周知である。
【０１５６】
結合分子
本明細書で使用するように、「結合分子」は、ＤＮＡプライマー伸長生成物を所望の長さに、すなわち一般に定義された３’末端を有するプライマー伸長生成物に制限するために、所望の標的配列の５’末端に隣接する、またはその付近のＲＮＡ標的核酸にハイブリダイズする、またはそうでなければ結合する物質である。本明細書で使用するように、「定義された３’末端」という句は、プライマー伸長生成物の３’末端が、結合分子の非存在下にて発生するプライマー伸長反応の場合のように完全に不定というわけでなく、むしろプライマー伸長生成物の３’末端が塩基の狭い範囲内で一般に公知であることを意味する。ある実施形態において、結合分子は塩基領域を含む。塩基領域は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡキメラ分子、またはその類似体でありうる。塩基領域を含む結合分子は、本明細書に記載するように１つ以上の方法で修飾されうる。例示的な塩基領域としては、後述するように終結および消化オリゴヌクレオチドを含む。他の実施形態において、結合分子はたとえば、ＤＮＡプライマー伸長生成物を所定の長さに制限するのに十分な親和性および特異性を持つＲＮＡを結合することができるタンパク質または薬物を含みうる。
【０１５７】
終結オリゴヌクレオチド
本発明において、「終結オリゴヌクレオチド」は、プライミングオリゴヌクレオチドを含む新生核酸のプライマー伸長を「終結させて」、それにより新生核酸鎖に定義された３’末端を与えるために、標的配列の５’末端の付近で標的核酸の領域に相補性である塩基配列を含むオリゴヌクレオチドである。終結オリゴヌクレオチドは、新生核酸鎖に所望の３’末端を達成するのに十分な位置で標的核酸にハイブリダイズするように設計されている。終結オリゴヌクレオチドの位置決めは、その設計に応じて柔軟である。終結オリゴヌクレオチドは、修飾されることも、修飾されないこともある。ある実施形態において、終結オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つ以上の２’−Ｏ−ＭＥリボヌクレオチドによって合成される。これらの修飾ヌクレオチドは、相補性２本鎖のより高い熱安定性を証明している。２’−Ｏ−ＭＥリボヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドのエキソヌクレアーゼに対する抵抗性を上昇させるようにも機能して、それにより修飾オリゴヌクレオチドの半減期を延長させる。たとえばＭａｊｌｅｓｓｉら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６，２２２４−９を参照。本明細書の他の箇所に記載した他の修飾は、２’−Ｏ−ＭＥリボヌクレオチドに加えて、またはその代わりに利用されうる。たとえば終結オリゴヌクレオチドは、ＰＮＡまたはＬＮＡを含みうる。たとえばＰｅｔｅｒｓｅｎら（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１３，４４−５３を参照。本発明の終結オリゴヌクレオチドは通例、伸長を防止するためにその３’末端に遮断部分を含む。終結オリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼによる新生核酸鎖のさらなる伸長を終結させるために、オリゴヌクレオチドに結合されたタンパク質またはペプチドも含みうる。本発明の終結オリゴヌクレオチドは通例、長さが少なくとも１０塩基であり、長さが１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０以上のヌクレオチドまで伸長しうる。適切で好ましい終結オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載されている。終結オリゴヌクレオチドは通例または必ず３’遮断部分を含むが、「３’遮断」オリゴヌクレオチドは必ずしも終結オリゴヌクレオチドでないことに注目すべきである。本発明の他のオリゴヌクレオチド、たとえばプロモーターオリゴヌクレオチドおよびキャッピングオリゴヌクレオチドも同様に、通例または必ず３’遮断されている。
【０１５８】
挿入配列
本明細書で使用するように、「挿入配列」は、プロモーターオリゴヌクレオチドの第１領域（すなわちテンプレート結合部）と第２領域との間に位置決めされた配列である。挿入配列は、好ましくは長さが５〜２０ヌクレオチドであり、さらに好ましくは長さが６〜１８ヌクレオチドであり、最も好ましくは長さが６〜１２ヌクレオチドである。プロモーターオリゴヌクレオチドへの挿入配列の包含は、ＲＮＡ増幅生成物が形成される速度を上昇させる。例示的な挿入配列が本明細書に記載されている。
【０１５９】
標的捕捉
標的捕捉は、本明細書で使用するように、タグ化オリゴヌクレオチドの標的核酸配列によるハイブリダイゼーションの後に、しかし標的核酸配列の増幅の前に、すべてのまたは実質的にすべての未ハイブリダイズタグ化オリゴヌクレオチドを除去するのに効果的ないずれの技法も含む。一般に標的捕捉は、標的ポリヌクレオチドを固体支持体、たとえば磁気誘引性粒子を捕捉することを含み、該固体支持体は標的ポリヌクレオチド精製手順の１つ以上の洗浄ステップの間に標的ポリヌクレオチドを保持する。このような方法で、標的ポリヌクレオチドは、次の核酸増幅ステップの前に未ハイブリダイズタグ化オリゴヌクレオチドから実質的に精製される。多数の標的捕捉方法が既知であり、本明細書に記載した方法と合せた使用に適切である。
【０１６０】
たとえばＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ａｐｐｌｎ．Ｐｕｂ．Ｎｏ．ＵＳ  ２００６−００６８４１７  Ａ１に記載された例証的な１つの手法は、標的相補性領域と、標的核酸を捕捉支持体上の固定プローブに結合して、それゆえサンプルの他のサンプル構成要素から分離される捕捉ハイブリッドを形成する多数の特異的結合部とを含有する、少なくとも１つの捕捉プローブオリゴヌクレオチドを使用する。別の例証的な方法において、ＷｅｉｓｂｕｒｇらはＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，１１０，６７８で、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを、固定プローブが付着された固体支持体、たとえば磁気誘引性粒子に、捕捉プローブおよび好ましくは温度のみが異なる２つの異なるハイブリダイゼーション条件を使用することによって捕捉する方法を記載している。２つのハイブリダイゼーション条件はハイブリダイゼーションの順序を制御し、第１ハイブリダイゼーション条件は捕捉プローブの標的ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを可能にして、第２ハイブリダイゼーション条件は捕捉プローブの固定プローブへのハイブリダイゼーションを可能にする。該方法は、捕捉された標的ヌクレオチドまたは増幅標的ポリヌクレオチドを検出することによって、サンプル中の標的ポリヌクレオチドの存在を検出するために使用されうる。
【０１６１】
別の例証的な標的捕捉技法は、標的ポリヌクレオチドの存在を捕捉および検出するためのハイブリダイゼーションサンドイッチ技法を含む。Ｒａｎｋｉら、“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｂｙ  ａ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ，”Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，４８６，５３９を参照。該技法は、固体支持体に結合されたプローブによる標的ポリヌクレオチドの捕捉および該捕捉された標的ポリヌクレオチドへの検出プローブのハイブリダイゼーションを含む。標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズされた検出プローブは、固体支持体からただちに洗い流される。残存する標識は、サンプルに最初に存在する標的ポリヌクレオチドと結合されている。
【０１６２】
別の例証的な標的捕捉技法は、標的ポリヌクレオチドおよび固体支持体に固定されたポリヌクレオチドの両方にハイブリダイズするメディエータポリヌクレオチドを使用する方法を含む。Ｓｔａｂｉｎｓｋｙ，“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｋｉｔｓ  ｆｏｒ  Ｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ，”Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．Ｎｏ．４，７５１，１７７を参照。メディエータポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドを固体支持体に結合して結合標的を産生する。標識プローブは、結合標識にハイブリダイズ可能であり、未結合標識プローブは固体支持体から洗い流すことができる。
【０１６３】
なお別の例証的な標的捕捉技法は、標的ポリヌクレオチドを検出する方法を記載している、Ｅｎｇｌｅｌｈａｒｄｔ，“Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ，”Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，２８８，６０９によって開示されている。該方法は、標的の同じまたは反対の鎖に相補性である２個の１本鎖ポリヌクレオチドセグメントを使用して、標的ポリヌクレオチドとの２重ハイブリッドの形成を生じる。一実施形態において、ハイブリッドは支持体に捕捉される。
【０１６４】
別の例証的な標的捕捉技法において、核酸を検出する方法およびキットは、特異的結合パートナによって標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、プライマーおよびプライマー伸長生成物を固定する。Ｂｕｒｄｉｃｋら、“Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｋｉｔ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｍｅａｎｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，”Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐａｔ．Ａｐｐｌｎ．Ｎｏ．０  ３７０  ６９４  Ａ２を参照。標識は固体支持体に結合されたその受容体と特異的に複合体化する。
【０１６５】
上の捕捉技法は単に例証であり、制限するものではない。実際に、当業者が利用可能な本質的にいずれの技法も、本明細書に記載するようにそれがタグ化オリゴヌクレオチドの標的核酸配列によるハイブリダイゼーションの後に、しかし標的核酸配列の増幅の前に、すべてのまたは実質的にすべての未ハイブリダイズタグ化オリゴヌクレオチドを除去するのに有効であるという条件で使用されうる。
【０１６６】
プローブ
「プローブ」または「検出プローブ」とは、検出されようとしている標的配列の領域に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で該領域にハイブリダイズするために、部分的にまたは完全に相補性である塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む分子を意味する。当業者によって理解されるであろうように、プローブは単離核酸分子、またはその類似物質を人間の介入なしに自然界で見出されない形で（たとえば外来核酸と組み換えられた、単離された、またはある程度精製された）含む。
【０１６７】
本発明のプローブは標的化領域の外側に追加のヌクレオシドまたは核酸塩基を、このようなヌクレオシドまたは核酸塩基がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションに実質的に影響せず、検出プローブの場合には、標的核酸への優先的ハイブリダイゼーションを防止しない限り、有しうる。非相補性配列、たとえば標識捕捉配列（一般にホモポリマートラクト、たとえばｐｏｌｙ−Ａ、ｐｏｌｙ−Ｔまたはｐｏｌｙ−Ｕ端）、プロモーター配列、ＲＮＡ転写の結合部位、制限エンドヌクレアーゼ認識部位も含まれうるか、またはプローブ、標的核酸、または両方に所望の２次または３次構造、たとえば触媒活性部位またはヘアピン構造を与えるであろう配列を含有しうる。
【０１６８】
プローブは、好ましくは少なくとも１個の検出可能な標識を含む。標識は、これに限定されるわけではないが、放射性同位体、酵素、酵素補助因子、酵素基質、染料、ハプテン、化学発光分子、蛍光分子、リン光分子、電気化学発光分子、示された条件下で標的核酸に安定してハイブリダイズできない塩基配列領域、およびこれらの混合物を含むいずれの適切な標識物質でもよい。特に好ましい一実施形態において、標識はアクリジニウムエステルである。プローブは、プローブが標的配列にハイブリダイズしたかどうかに応じて、異なるシグナルを発生する相互作用標識も含みうる。相互作用標識の例としては、酵素／基質、酵素／補助因子、発光／消光剤、発光／付加体、染料ダイマー、およびフォレスターエネルギー移動対が挙げられる。本発明のあるプローブは、標識を含まない。たとえば非標識「捕捉」プローブは、次に第２の「検出」プローブによって検出されうる標的配列またはその複製を濃縮するために使用されうる。たとえばＷｅｉｓｂｕｒｇら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，５３４，２７３を参照。検出プローブは通例標識されているが、ある検出技術はプローブが標識されることを必要としない。たとえばＮｙｇｒｅｎら、“Ｄｅｖｉｃｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，”Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，０６０，２３７を参照。
【０１６９】
「安定な」または「検出に対して安定な」とは、反応混合物の温度が核酸２本鎖の融解温度より少なくとも２℃低いことを意味する。反応混合物の温度はさらに好ましくは、核酸２本鎖の融解温度より少なくとも５℃低く、なおさらに好ましくは反応混合物の融解温度よりも少なくとも１０℃低い。
【０１７０】
「優先的にハイブリダイズする」とは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本発明のプローブがその標的配列、またはその複製にハイブリダイズして、安定なプローブ：標的ハイブリッドを形成し、同時に安定なプローブ：非標的ハイブリッドの形成が最小化されることを意味する。それゆえプローブは非標的配列よりも十分に大きい程度まで標的配列またはその複製にハイブリダイズして、当業者が増幅中に形成された標的配列のＲＮＡ複製または相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を正確に定量できるようにする。
【０１７１】
定義された配列のプローブは、当業者に公知の技法によって、たとえば化学合成によって、組み換え核酸分子からの試験管内または生体内発現によって産生されうる。好ましくは、プローブは長さが１０〜１００ヌクレオチド、さらに好ましくは長さが１２〜５０塩基、そしてなおさらに好ましくは長さが１８〜３５塩基である。
【０１７２】
核酸「同一性」
ある実施形態において、本発明の核酸は、参照核酸の連続塩基領域に少なくとも８０％、９０％、または１００％同一である連続塩基領域を含む。短い核酸、たとえば本発明のあるオリゴヌクレオチドでは、「クエリー」核酸の塩基領域と参照核酸の塩基領域との間の同一性の程度は、手動配列比較によって決定されうる。「同一性」は、比較されている核酸の糖および主鎖領域とは無関係に、窒素含有塩基の配列だけを比較することによって決定される。それゆえクエリー：参照塩基配列の配列比較は、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡ、あるいはそのいずれかの組合せまたは類似物質でありうる。対応するＲＮＡおよびＤＮＡ塩基配列が、（ＲＮＡの）Ｕを（ＤＮＡの）Ｔに変換することによって比較されうる。
【０１７３】
テンプレート
「テンプレート」は、核酸ポリメラーゼによって複製されている核酸分子である。テンプレートは、ポリメラーゼに応じて１本鎖、２本鎖または部分的２本鎖でありうる。合成された複製は、テンプレートに、あるいは少なくとも１つの２本鎖または部分２本鎖テンプレートに相補性である。ＲＮＡおよびＤＮＡの両方が通例、５’から３’方向に合成され、核酸２本鎖の２つの鎖が整列されるので、２つの鎖の５’末端が２本鎖の対向端にある（そして必然的に、３’末端もそこでそのようにである）。本発明により、「標的配列」が常に「テンプレート」であるとき、テンプレートは２次プライマー伸長生成物および増幅生成物も含みうる。
【０１７４】
ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ
「ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」は、ＤＮＡテンプレートから相補性ＤＮＡ複製を合成する酵素である。例は、ＰＣＲ増幅反応のための、好熱性細菌サーマス・アクアティクスからの高い熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．コリからのＤＮＡポリメラーゼＩ、バクテリオファージＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ、またはバクテリオファージＴ４、Ｐｈｉ−２９、Ｍ２、またはＴ５からのＤＮＡポリメラーゼである。本発明のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、細菌またはバクテリオファージから単離されたあるいは組み換え発現された天然型酵素でありうるか、あるいはある所望の特徴、たとえば熱安定性、または各種の修飾テンプレートからＤＮＡ鎖を認識または合成する能力を所有するように組み換えられた修飾形または「進化」形でありうる。すべての公知のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、合成を開始するために相補性プライマーを必要とする。適切な条件下でＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼがＲＮＡテンプレートから相補性ＤＮＡ複製を合成することが既知である。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（後述）も通例、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する。このようなポリメラーゼの例は、ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲの増幅反応の両方で使用されうるＤＮＡ依存性およびＲＮＡ依存性（すなわち逆転写酵素）ＤＮＡポリメラーゼ活性の両方を有する、ＭａｓｔｅｒＡｍｐ（商標）Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼである（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。
【０１７５】
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（転写酵素）
「ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ」または「転写酵素」は、通常は２本鎖であるプロモーター配列を有する２本鎖または部分２本鎖ＤＮＡ分子から複数のＲＮＡ複製を合成する酵素である。ＲＮＡ分子（「転写物」）は、プロモーターのすぐ下流の特定の位置から開始して５’→３’方向へ合成される。転写酵素の例は、Ｅ．コリからのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよびバクテリオファージＴ７、Ｔ３、およびＳＰ６である。
【０１７６】
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）
「ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」または「逆転写酵素」（「ＲＴ」）は、ＲＮＡテンプレートから相補性ＤＮＡ複製を合成する酵素である。すべての公知の逆転写酵素は、ＤＮＡテンプレートから相補性ＤＮＡ複製を作製する能力も有する；それゆえそれらはＲＮＡおよびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの両方である。ＲＴはＲＮＡｓｅ  Ｈ活性も有しうる。好ましいのは、マロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ−ＲＴ）に由来する逆転写酵素である。プライマーは、ＲＮＡおよびＤＮＡテンプレートの両方によって合成を開始することが要求される。
【０１７７】
選択的ＲＮＡｓｅ
本明細書で使用するように、「選択的ＲＮＡｓｅ」は、１本鎖ＲＮＡ、２本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡではなく、ＲＮＡ：ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡ部分を分解する酵素である。例示的な選択的ＲＮＡｓｅは、ＲＮＡｓｅ  Ｈである。同じまたは同様の活性を所有するＲＮＡｓｅ  Ｈ以外の酵素も本明細書で考慮される。選択的ＲＮＡｓｅは、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼである。大半の逆転写酵素が、そのポリメラーゼ活性に加えてＲＮＡｓｅ  Ｈ活性を含有する。しかしながら関連するポリメラーゼ活性のないＲＮＡｓｅ  Ｈの他の源が使用できる。分解はＲＮＡのＲＮＡ：ＤＮＡ複合体からの分離を引き起こしうる。あるいは選択的ＲＮＡｓｅは、ＲＮＡの部分が溶離する、または酵素にＲＮＡの部分を巻戻させるように、ＲＮＡを各種の位置で単に切断しうる。本発明のＲＮＡ標的配列またはＲＮＡ生成物を選択的に分解する他の酵素は、当業者にただちに明らかとなるであろう。
【０１７８】
センス／アンチセンス鎖
核酸合成の議論は、核酸２本鎖の２個の相補性鎖に命名するために用語を用いることによって大幅に単純化および明瞭化される。伝統的に、タンパク質または構造ＲＮＡを産生するのに使用される配列をコードする鎖は、「センス（＋）」鎖、その相補体は「アンチセンス（−）」鎖と呼ばれる。多くの場合において、両方の鎖が機能性であり、そこで名称「センス」の一方への、そして「アンチセンス」の他方への割り当ては任意でなければならないことが今や公知である。それにもかかわらず、該用語は核酸の配列の向きを指定するのに非常に有用であり、本明細書でその目的のために使用されるであろう。
【０１７９】
系の特異性
増幅系の文脈における「特異性」という用語は、本明細書では、配列およびアッセイの条件に依存して標的と非標的配列とを区別するその能力を説明する増幅系の特徴を指すために使用される。核酸増幅に関して、特異性は一般に、下でさらに詳細に記載される、産生された特異的単位複製配列の数の、副生成物の数に対する比（すなわちシグナル対雑音比）を指す。
【０１８０】
感受性
「感受性」という用語は本明細書で、核酸増幅反応が検出または定量されうる精度を指す。増幅反応の感受性は一般に、増幅系において確実に検出されうる標的核酸の最も少ない複製数の尺度であり、たとえば使用される検出アッセイ、および増幅反応の特異性、すなわち特異的単位複製配列の副生成物に対する比に依存するであろう。
【０１８１】
バイオプロセス
「バイオプロセス」は本明細書で使用するように、一般に生細胞、またはその構成要素が意図的に、または意図的でなくのどちらかで存在するいずれのプロセスも指す。たとえば１つ以上のサンプルまたはサンプルストリームであって、その１つ以上が生細胞を含むサンプルまたはサンプルストリームを使用する、あるいは意図的でない夾雑の結果としてこのような細胞または構成要素を含みうる本質的にいずれの製造または他のプロセスも、バイオプロセスと見なされる。多くのこのようなプロセスにおいて、プロセス内での生細胞またはその構成要素の存在および／または源を検出、同定および／または制御する能力を有することが所望である。本発明の方法を使用すると、たとえば、１つ以上のバイオプロセスサンプルまたはストリームにおける夾雑微生物あるいは他の生体材料またはその構成要素の存在および／または源が監視されうる。加えて、バイオプロセスのあるサンプル／ストリーム内の精製／滅菌要件は、本明細書で述べるような本発明の方法を使用して好都合に減少されうる。
【０１８２】
上述のように、本発明は一般に、増幅反応にて使用される１つ以上の試薬、サンプル、または構成要素に存在しうる、あるいは増幅反応が実施される環境に存在しうる夾雑生体材料、たとえば核酸材料から生じる偽陽性増幅シグナルを望ましくは低減または排除する核酸増幅方法に関するものである。本発明はさらに、増幅反応にて使用される酵素および他の試薬、ならびに増幅反応が実施される環境が偽陽性結果を与えうる細菌および他の核酸夾雑を含まないようにするために慣習的に必要とされるよりも、ストリンジェンシーの低い精製および／または無菌性についての労力を必要とする利点を提供する。したがって、本発明の方法は、微生物または他の形の夾雑の存在を監視する必要がありうる臨床サンプル、バイオプロセスサンプルまたはサンプルストリーム、食品、水、工業および環境サンプル、ならびに他の種類の材料における微生物（または他の源からの夾雑核酸）を検出、監視および／または定量するのに特に有用である。
【０１８３】
本発明は、核酸ポリメラーゼの存在下にて伸長が可能であるテンプレート結合プライミングオリゴヌクレオチドを必要とする本質的にいずれの増幅手順での使用にも適応させることができる。タグ化オリゴヌクレオチド（または異種タグ配列）のこのようなプライマー依存性増幅手順への包含は、このような手順の試薬および反応条件を実質的に変更することなく達成されうる。いずれの必要とされる変更も軽微なはずであり、熟練した分子生物学者の知識および能力の十分に範囲内であろう。タグ化オリゴヌクレオチドを使用する各種の例証的な増幅手順の説明は次の通りである。
【０１８４】
図１は、転写媒介増幅（ｒＴＭＡ）として公知である等温転写ベース増幅反応の適応を示し、その各種の態様はＢｅｃｋｅｒら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ａｐｐｌｎ．Ｐｕｂ．Ｎｏ．ＵＳ  ２００６−００４６２６５  Ａ１に開示されている。本例証的な実施形態の反応は、核酸サンプル中のＲＮＡ標的配列をタグ化プライミングオリゴヌクレオチドおよび終結オリゴヌクレオチドの両方によって処理することにより開始される。タグ化プライミングオリゴヌクレオチドは、標的配列の３’末端にハイブリダイズする標的ハイブリダイズ配列および標的ハイブリダイズ配列の５’側に位置するタグ配列を含む。終結オリゴヌクレオチドは、標的配列の５’末端付近に標的配列を含有する標的核酸にハイブリダイズする。終結オリゴヌクレオチドは、タグ化プライミングオリゴヌクレオチドを含む新生核酸の伸長を終わらせるために使用される。それゆえ標的核酸は、プライマー伸長反応を開始する前に、標的配列の３’末端におけるタグ化プライミングオリゴヌクレオチドおよび標的配列の５’末端に隣接して、またはその付近に位置する終結オリゴヌクレオチドと安定した複合体を形成する。図１、ステップ１を参照。未ハイブリダイズタグ化プライミングオリゴヌクレオチドは、タグ化プライミングオリゴヌクレオチドとのプライマー伸長反応を開始する前に、未ハイブリダイズタグ化プライミングオリゴヌクレオチドを核酸サンプルから好ましくは不活性化および／または除去することによって、標的配列へのハイブリダイゼーションに利用できなくされる。
【０１８５】
伸長反応は次に、タグ配列および標的配列に相補性である領域を含む第１ＤＮＡプライマー伸長生成物を産生するために、タグ化プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端からＤＮＡポリメラーゼ、たとえば逆転写酵素によって開始される。図１、ステップ２および３を参照。第１ＤＮＡプライマー伸長生成物は次に、標的配列を選択的に分解する酵素（たとえばＲＮＡｓｅ  Ｈ活性）を使用して、標的配列から分離される。図１、ステップ４を参照。
【０１８６】
次に第１ＤＮＡプライマー伸長生成物を、ハイブリダイズ配列を有するプロモーターオリゴヌクレオチドおよびハイブリダイズ配列の５’側に位置するＲＮＡポリメラーゼのプロモーターによって処理する。ハイブリダイズ配列は、標的配列の３’末端に相補性である第１ＤＮＡプライマー伸長生成物の領域にハイブリダイズして、それによりプロモーターオリゴヌクレオチド：第１ＤＮＡプライマー伸長生成物ハイブリッドを形成する。例証した反応にて、プロモーターオリゴヌクレオチドは、好ましくはプロモーターオリゴヌクレオチドの３’末端に遮断部分（たとえば３’→５’方向を有するヌクレオチド配列）を位置付けることによって、ＤＮＡ合成の開始を防止するように修飾される。図１、ステップ５を参照。第１ＤＮＡプライマー伸長生成物の３’末端は、好ましくはプロモーターに相補性である配列を付加するために伸長されて、２本鎖プロモーター配列の形成を引き起こす。図１、ステップ６および７を参照。プロモーター部分を含まない、第１ＤＮＡプライマー伸長生成物の少なくとも一部に相補性である第１ＲＮＡ生成物の複数の複写は次に、２本鎖プロモーターを認識して、そこからの転写を開始するＲＮＡポリメラーゼを使用して転写される。図１、ステップ８および９を参照。結果として、第１ＲＮＡ生成物の塩基配列は、標的配列の塩基配列およびタグ配列の相補体と実質的に同一である。
【０１８７】
第１ＲＮＡ生成物は、タグ配列の相補体にハイブリダイズするプライミングオリゴヌクレオチドによって処理されてプライミングオリゴヌクレオチド：第１ＲＮＡ生成物ハイブリッドを形成し、プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端はＤＮＡポリメラーゼによって伸長されて、第１ＲＮＡ生成物に相補性である第２ＤＮＡプライマー伸長生成物を産生する。図１、ステップ１０〜１２を参照。第２ＤＮＡプライマー伸長生成物は次に、第１ＲＮＡ生成物を選択的に分解する酵素（たとえばＲＮＡｓｅ  Ｈ活性）を使用して、第１ＲＮＡ生成物から分離される。図１、ステップ１３を参照。
【０１８８】
第２ＤＮＡプライマー伸長生成物は、第２ＤＮＡプライマー伸長生成物の３’末端にハイブリダイズするプロモーターオリゴヌクレオチドによって処理されて、プロモーターオリゴヌクレオチド：第２ＤＮＡプライマー伸長生成物ハイブリッドを形成する。図１、ステップ１４を参照。プロモーターオリゴヌクレオチド：第２ＤＮＡプライマー伸長生成物ハイブリッドは次に、図１のステップ６の増幅サイクルに再度入り、そこで２本鎖プロモーターから転写が開始されて、サイクルが継続する。
【０１８９】
図３は、転写媒介増幅（ＴＭＡ）と呼ばれる等温転写ベース増幅反応の適応を示し、その各種の態様はＫａｃｉａｎら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，３９９，４９１および５，８２４，５１８に開示されている。本例証的な実施形態の反応は、核酸サンプル中のＲＮＡ標的配列をタグ化プロモーターオリゴヌクレオチドによって処理することにより開始される。タグ化プロモーターオリゴヌクレオチドは、タグ配列、標的ハイブリダイズ配列および標的ハイブリダイズ配列が標的配列の３’末端にハイブリダイズするＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含む。それゆえ標的配列は、プライマー伸長反応を開始する前に、標的配列の３’末端にタグ化プロモーターオリゴヌクレオチドと安定した複合体を形成する。図３、ステップ１を参照。プロモーター配列はタグ配列の５’側に位置しており、タグ配列は標的ハイブリダイズ配列の５’側に位置する。未ハイブリダイズタグ化プロモーターオリゴヌクレオチドは、タグ化プライミングオリゴヌクレオチドとのプライマー伸長反応を開始する前に、未ハイブリダイズタグ化プライミングオリゴヌクレオチドを核酸サンプルから好ましくは不活性化および／または除去することによって、標的配列へのハイブリダイゼーションに利用できなくされる。
【０１９０】
伸長反応は次に、タグおよびプロモーター配列ならびに標的配列に相補性である領域を含む第１ＤＮＡプライマー伸長生成物を産生するために、タグ化プロモーターオリゴヌクレオチドの３’末端からＤＮＡポリメラーゼ、たとえば逆転写酵素によって開始される。図１、ステップ２および３を参照。第１ＤＮＡプライマー伸長生成物は次に、第１ＤＮＡプライマー伸長生成物にハイブリダイズされる標的配列の部分を選択的に分解する酵素（たとえばＲＮＡｓｅ  Ｈ活性）を使用して、それがハイブリダイズがされる標的配列から分離される。図３、ステップ４を参照。
【０１９１】
次に第１ＤＮＡプライマー伸長生成物は、標的配列の５’末端に相補性である第１ＤＮＡプライマー伸長生成物の領域にハイブリダイズするプライミングオリゴヌクレオチドによって処理されて、それによりプライミングオリゴヌクレオチド：第１ＤＮＡプライマー伸長生成物ハイブリッドを形成する。図３、ステップ５を参照。プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端はＤＮＡポリメラーゼによって伸長されて、第１ＤＮＡプライマー伸長生成物の少なくとも一部に相補性であり、２本鎖プロモーター配列を含有する第２ＤＮＡプライマー伸長生成物を産生する。図３、ステップ６および７を参照。本第２ＤＮＡプライマー伸長生成物は、２本鎖プロモーターを認識して、そこからの転写を開始するＲＮＡポリメラーゼを使用して、第２ＤＮＡプライマー伸長生成物に相補性であり、プロモーター部分を含まない第１ＲＮＡ生成物の複数の複製を転写するテンプレートとして使用される。図３、ステップ８および９を参照。第１ＲＮＡ生成物の塩基配列は、タグ配列の塩基配列および標的配列の相補体と実質的に同一である。
【０１９２】
第１ＲＮＡ生成物はプライミングオリゴヌクレオチドによって処理されて、その３’末端はＤＮＡポリメラーゼによって伸長され、第１ＲＮＡ生成物に相補性である第３ＤＮＡプライマー伸長生成物を産生する。図３、ステップ１０〜１２を参照。第３ＤＮＡプライマー伸長生成物は次に、第１ＲＮＡ生成物を選択的に分解する酵素（たとえばＲＮＡｓｅ  Ｈ活性）を使用して、第１ＲＮＡ生成物から分離される。図３、ステップ１３を参照。第３ＤＮＡプライマー伸長生成物は、第３ＤＮＡプライマー伸長生成物の３’末端でタグ配列の相補体にハイブリダイズして、ハイブリダイズ配列の５’側に位置するＲＮＡポリメラーゼのプロモーターをさらに含むハイブリダイズ配列を有するプロモーターオリゴヌクレオチドによって処理される。図３、ステップ１４を参照。第３ＤＮＡプライマー伸長生成物の３’末端は伸長されて、プロモーター配列に相補性である配列を付加する。図３、ステップ１５を参照。プロモーターオリゴヌクレオチドの３’末端はＤＮＡポリメラーゼによって伸長されて、第３ＤＮＡプライマー伸長生成物に相補性である第４ＤＮＡプライマー伸長生成物を産生する。図３、ステップ１６を参照。第３ＤＮＡプライマー伸長生成物に相補性であり、プロモーター部分を含まない第２ＲＮＡ生成物の複数の複製が２本鎖プロモーターから転写されて、図３のステップ９で増幅サイクルに再び入る。第２ＲＮＡ生成物の塩基配列は、タグ配列の塩基配列および標的配列の相補体と実質的に同一である。
【０１９３】
図５は、ＤＮＡ標的配列を増幅するためのｒＴＭＡ増幅反応の適応を示し、その各種の態様はＢｅｃｋｅｒら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ａｐｐｌｎ．Ｎｏ．１１／６８１，１０４に記載されている。本例証的な実施形態の反応は、核酸サンプル中のＤＮＡ標的配列をタグ化プライミングオリゴヌクレオチドおよび終結オリゴヌクレオチドによって処理することにより開始される。タグ化プライミングオリゴヌクレオチドは、標的配列の３’末端にハイブリダイズした標的ハイブリダイズ配列および標的ハイブリダイズ配列の５’側に位置するタグ配列を含む。標的ハイブリダイズ配列は、好ましくは標的配列の１本鎖形にハイブリダイズするが、たとえばＤＮＡ呼吸（たとえばＡＴが豊富な領域）、低塩条件、ならびに／あるいはＤＭＳＯおよび／または浸透圧調節物質、たとえばベタインの使用によって促進されうる鎖侵入によって、標的配列の２本鎖系にハイブリダイズしうる。標的配列は好ましくは、核酸サンプルを加熱することによって１本鎖にされうる。終結オリゴヌクレオチドは、標的配列の５’末端付近に標的配列を含有する標的核酸の領域にハイブリダイズする。終結オリゴヌクレオチドは、タグ化プライミングオリゴヌクレオチドを含む新生核酸の伸長を終わらせるために使用される。それゆえ標的核酸は、標的配列の３’末端におけるタグ化プライミングオリゴヌクレオチドおよび標的配列の５’末端に隣接して、またはその付近に位置する終結オリゴヌクレオチドと安定した複合体を形成する。図５、ステップ１〜３を参照。未ハイブリダイズタグ化プライミングオリゴヌクレオチドは、タグ化プライミングオリゴヌクレオチドとのプライマー伸長反応を開始する前に、未ハイブリダイズタグ化プライミングオリゴヌクレオチドを核酸サンプルから好ましくは不活性化および／または除去することによって、標的配列へのハイブリダイゼーションに利用できなくされる。
【０１９４】
伸長反応は次に、タグ配列および標的配列に相補性である領域を含む第１ＤＮＡプライマー伸長生成物を産生するために、タグ化プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端からＤＮＡポリメラーゼ、たとえば逆転写酵素によって開始される。図５、ステップ４および５を参照。
【０１９５】
核酸サンプルは、ディスプレーサオリゴヌクレオチドの３’末端がＤＮＡポリメラーゼによって伸長されるときに第１ＤＮＡプライマー伸長生成物が置換されるために、プライマー伸長反応がそこから開始されうるように、タグ化オリゴヌクレオチドから上流の標的核酸にハイブリダイズするディスプレーサオリゴヌクレオチドによってさらに処理される。図５、ステップ６〜８を参照。例証したステップの順序は、本実施形態の核酸サンプルが、操作可能となるようにディスプレーサオリゴヌクレオチドによって処理される前に、タグ化プライミングオリゴヌクレオチドによって処理されねばならないことを意味するわけではない。ある実施形態において、これらの２つのオリゴヌクレオチドを標的核酸に実質的に同時にハイブリダイズさせることが好ましい。
【０１９６】
次に第１ＤＮＡプライマー伸長生成物を、ハイブリダイズ配列を有するプロモーターオリゴヌクレオチドおよびハイブリダイズ配列の５’側に位置するＲＮＡポリメラーゼのプロモーターによって処理する。ハイブリダイズ配列は、標的配列の３’末端に相補性である第１ＤＮＡプライマー伸長生成物の領域にハイブリダイズして、それによりプロモーターオリゴヌクレオチド：第１ＤＮＡプライマー伸長生成物ハイブリッドを形成する。例証した反応にて、プロモーターオリゴヌクレオチドは、プロモーターオリゴヌクレオチドの３’末端に遮断部分（たとえば３’→５’方向を有するヌクレオチド配列）を位置付けることによって、ＤＮＡ合成の開始を防止するように修飾される。図５、ステップ９を参照。第１ＤＮＡプライマー伸長生成物の３’末端は、プロモーターに相補性である配列を付加するために伸長されて、２本鎖プロモーター配列の形成を引き起こす。図５、ステップ１０および１１を参照。プロモーターを含まない、第１ＤＮＡプライマー伸長生成物の少なくとも一部に相補性である第１ＲＮＡ生成物の複数の複写は、２本鎖プロモーターを認識して、そこからの転写を開始するＲＮＡポリメラーゼを使用して転写される。図５、ステップ１２および１３を参照。結果として、第１ＲＮＡ生成物の塩基配列は、標的配列の塩基配列およびタグ配列の相補体と実質的に同一である。
【０１９７】
第１ＲＮＡ生成物は、タグ配列の相補体にハイブリダイズするプライミングオリゴヌクレオチドと接触してプライミングオリゴヌクレオチド：第１ＲＮＡ生成物ハイブリッドを形成し、プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端はＤＮＡポリメラーゼによって伸長されて、第１ＲＮＡ生成物に相補性である第２ＤＮＡプライマー伸長生成物を産生する。図５、ステップ１４〜１６を参照。第２ＤＮＡプライマー伸長生成物は、第１ＲＮＡ生成物を選択的に分解する酵素（たとえばＲＮＡｓｅ  Ｈ活性）を使用して、第１ＲＮＡ生成物から分離される。図５、ステップ１７を参照。
【０１９８】
第２ＤＮＡプライマー伸長生成物はプロモーターオリゴヌクレオチドによって処理されて、プロモーターオリゴヌクレオチド：第２ＤＮＡプライマー伸長生成ハイブリッドを形成する。図５、ステップ１８を参照。プロモーターオリゴヌクレオチド：第２プライマー伸長生成物ハイブリッドは次に、図５のステップ１０の増幅サイクルに再度入り、そこで２本鎖プロモーターから転写が開始されて、サイクルが継続する。
【０１９９】
図７は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の適応を示し、その各種の態様はたとえばＭｕｌｌｉｓら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．４，６８３，１９５および４，８００，１５９；Ｍｕｌｌｉｓ，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，６８２，２０２；およびＧｅｌｆａｎｄら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，８０４，３７５に開示されている。本例証的な実施形態の反応は、核酸サンプル中の変性ＤＮＡ標的配列をタグ化プライミングオリゴヌクレオチドによって処理することにより開始される。タグ化プライミングオリゴヌクレオチドは、標的配列の３’末端にハイブリダイズする標的ハイブリダイズ配列および標的ハイブリダイズ配列の５’側に位置するタグ配列を含む。それゆえ標的配列は、プライマー伸長反応を開始する前に、標的配列の３’末端にタグ化プライミングオリゴヌクレオチドと安定した複合体を形成する。図７、ステップ１〜３を参照。未ハイブリダイズタグ化プライミングオリゴヌクレオチドは、タグ化プライミングオリゴヌクレオチドとのプライマー伸長反応を開始する前に、未ハイブリダイズタグ化プライミングオリゴヌクレオチドを核酸サンプルから好ましくは不活性化および／または除去することによって、標的配列へのハイブリダイゼーションに利用できなくされる。
【０２００】
伸長反応は次に、タグ配列および標的配列に相補性である領域を含む第１ＤＮＡプライマー伸長生成物を産生するために、タグ化プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端からＤＮＡポリメラーゼ、たとえばＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによって開始される。図７、ステップ４および５を参照。次に第１プライマー伸長反応から生じた２本鎖生成物が変性され、第１プライマー伸長生成物に標的配列の５’末端に相補性である第１プライマー伸長生成物の領域にハイブリダイズする第１プライミングオリゴヌクレオチドを接触させる。図７、ステップ６および７を参照。
【０２０１】
第２プライマー伸長反応にて、第１プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端はＤＮＡポリメラーゼによって伸長されて、第１プライマー伸長生成物の一部に相補性であり、標的配列およびタグ配列の相補体を含む第２ＤＮＡプライマー伸長生成物を産生する。図７、ステップ８および９を参照。第２プライマー伸長反応から生じる２本鎖生成物は変性され、第２ＤＮＡプライマー伸長生成物はタグ配列の相補体にハイブリダイズする第２プライミングオリゴヌクレオチドに接触される。図７、ステップ１０および１１を参照。
第２プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端は次に、第３プライマー伸長反応にてＤＮＡポリメラーゼによって伸長され、第２ＤＮＡプライマー伸長生成物に相補性である第３プライマー伸長生成物を産生する。図７、ステップ１２および１３を参照。第３プライマー伸長反応から生じる２本鎖生成物は変性され、第２および第３ＤＮＡプライマー伸長生成物は、第１および第２プライミングオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用するポリメラーゼ連鎖反応の反復サイクルへの関与に利用できる。図７、ステップ１４〜１６を参照。
【０２０２】
図９は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）の適応を示し、その各種の態様はたとえばＧｅｌｆａｎｄら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，３２２，７７０および５，３１０，６５２に開示されている。本例証的な実施形態の反応は、核酸サンプル中のＲＮＡ標的配列をタグ化プライミングオリゴヌクレオチドによって処理することにより開始される。タグ化プライミングオリゴヌクレオチドは、標的ハイブリダイズ配列および標的ハイブリダイズ配列の５’側に位置するタグ配列を含む。それゆえ標的配列は、プライマー伸長反応を開始する前に、標的配列の３’末端にタグ化プライミングオリゴヌクレオチドと安定した複合体を形成する。図９、ステップ１を参照。未ハイブリダイズタグ化プライミングオリゴヌクレオチドは、タグ化プライミングオリゴヌクレオチドとのプライマー伸長反応を開始する前に、未ハイブリダイズタグ化プライミングオリゴヌクレオチドを核酸サンプルから好ましくは不活性化および／または除去することによって、標的配列へのハイブリダイゼーションに利用できなくされる。
【０２０３】
伸長反応は次に、タグ配列および標的配列に相補性である領域を含む第１ＤＮＡプライマー伸長生成物を産生するために、タグ化プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端からＤＮＡポリメラーゼ、たとえばＭａｓｔｅｒＡｍｐ（商標）Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼによって開始される。図９、ステップ２および３を参照。第１ＤＮＡプライマー伸長生成物は次に、第１ＤＮＡプライマー伸長生成物に相補性である核酸配列を含有する標的核酸の部分を選択的に分解する酵素（たとえばＲＮＡｓｅ  Ｈ活性）を使用して、それがハイブリダイズされる標的核酸から分離される。図９、ステップ４を参照。
【０２０４】
次に第１ＤＮＡプライマー伸長生成物は、標的配列の５’末端に相補性である第１ＤＮＡプライマー伸長生成物の領域にハイブリダイズする第１プライミングオリゴヌクレオチドによって処理されて、第１ＤＮＡプライマー伸長生成物：第１プライミングオリゴヌクレオチドハイブリッドを形成する。図９、ステップ５を参照。第２プライマー伸長反応は、第１プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端をＤＮＡポリメラーゼによって伸長させて、第１プライマー伸長生成物の一部に相補性であり、標的配列およびタグ配列の相補体を含むＤＮＡ第２プライマー伸長生成物を産生する。図９、ステップ６および７を参照。第１および第２ＤＮＡプライマー伸長生成物は次に、変性によって相互から分離される。図９、ステップ８を参照。第１および第２伸長生成物は次に、タグ配列の相補体にハイブリダイズする第１プライミングオリゴヌクレオチドおよび第２プライミングオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して、ポリメラーゼ連鎖反応の反復サイクルへ関与するために利用できる。図９、ステップ９および１０；図７、ステップ１３〜１６を参照。
【０２０５】
本発明の他の例証的な実施形態において、タグ化標的核酸配列の一部を形成していない異種タグ配列は、タグ化標的核酸配列を標的核酸配列の検出可能な増幅に十分な試薬および条件に露出する前に不活性化される。好ましい態様において、不活性化異種タグ配列は、標的核酸配列にハイブリダイズされていないタグ化オリゴヌクレオチドの形である。タグ化オリゴヌクレオチドは上述されており、第１および第２領域を含み、第１領域は第１の条件セットの下で標的核酸配列の３’末端にハイブリダイズする標的ハイブリダイズ配列を含み、第２領域はタグ化オリゴヌクレオチドの第１領域の５’側に位置するタグ配列を含む。標的ハイブリダイズ配列は、テンプレート依存方式でＤＮＡポリメラーゼの存在下にて酵素によって伸長されうる遊離３’ヒドロキシル基を有する。タグ化オリゴヌクレオチドは、標的ハイブリダイズ配列を標的核酸配列にハイブリダイズさせる「活性」構造と、ハイブリダイズ配列が標的核酸配列にハイブリダイズするのを遮断する「不活性」構造を有する。不活性確認は一般に、タグ化オリゴヌクレオチドの活性確認を形成する条件よりもストリンジェンシーでない条件下で形成される。
【０２０６】
タグ化オリゴヌクレオチドの不活性構造は、タグ閉鎖配列をタグ化オリゴヌクレオチドの標的ハイブリダイズ配列にハイブリダイズすることによって形成されうる。タグ閉鎖配列は別個の分子を構成しうるか、またはそれはタグ閉鎖配列の３’末端または５’末端をタグ配列（「タグ化プライミングオリゴヌクレオチド」）またはタグ配列の５’側に位置するプロモーター配列（「タグ化プロモーターオリゴヌクレオチド」）を含有するタグ化オリゴヌクレオチドの領域の５’末端に結合するリンカーによってタグ化オリゴヌクレオチドに結合されることが可能であり、それによりタグ化オリゴヌクレオチドを含む自己ハイブリダイズヘアピンタグ分子を形成する。リンカーは、ポリメラーゼによって複製されうるヌクレオチド塩基を含まず、好ましくは非ヌクレオチド構成要素より成る非ヌクレオチドリンカーである。タグ閉鎖配列をタグ化オリゴヌクレオチドに結合するのに適切な非ヌクレオチドリンカーとしては、脱塩基ヌクレオチドおよびポリエチレングリコールが挙げられる。他の適切なリンカーは、ヌクレオチド類似物質、たとえばＬＮＡおよび２’−Ｏ−Ｍｅである。結合動態は、タグ閉鎖配列およびタグ化オリゴヌクレオチドの標的ハイブリダイズ配列が同じ分子内に包含されているときに最良である。
【０２０７】
選択的条件下で、タグ閉鎖配列は、図２、４、６、８、１０、１１、１２、１５および１６に示すように逆平行方向で、図１３および１４に示すように平行方向で、タグ化オリゴヌクレオチドの標的ハイブリダイズ配列にハイブリダイズしうる。タグ閉鎖配列が図１１および１２に示すように別個の分子である場合、または図２、４、６、８、１０、１５および１６に示すように５’末端に結合した非ヌクレオチドリンカーによってタグ化オリゴヌクレオチドに結合される場合、ここでタグ閉鎖配列は好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼによって、たとえば遮断部分をその３’末端に位置決めすることによってプライマー伸長を防止するように修飾される。適切な遮断部分は本明細書に記載されている。図１３および１４に示すように逆平行方向でハイブリダイズされるとき、タグ閉鎖配列の３’末端塩基は好ましくは、タグ化オリゴヌクレオチドの標的ハイブリダイズ配列の３’末端塩基にハイブリダイズされる。さらに好ましくは、タグ閉鎖配列はＤＮＡポリメラーゼによってプライマー伸長を防止するために修飾される。
【０２０８】
タグ閉鎖配列の長さおよび塩基含有量は、タグ化オリゴヌクレオチドの標的核酸配列へのハイブリダイゼーションが第１の条件セットの下で有利であるように、タグ化オリゴヌクレオチドが標的核酸配列にハイブリダイズされないときには、タグ閉鎖配列が第２のよりストリンジェントでない条件セットの下で標的核酸配列との安定なハイブリッドを形成するように選択される。タグ閉鎖配列は、それが受けるかもしれない増幅条件下で標的ハイブリダイズ配列からただちに置換されないように選択されるべきである。通例、タグ閉鎖配列はハイブリダイズして標的ハイブリダイズ配列の５〜２０の連続または不連続塩基を形成するであろう。適切なタグ閉鎖配列は長さが５〜１５塩基である。第１の条件セットの下で標的核酸に対して標的ハイブリダイズ配列を偏らせるために、タグ閉鎖配列はたとえば、１つ以上の脱塩基ヌクレオチド、塩基ミスマッチまたはゆらぎ塩基対のメンバを含みうる。タグ閉鎖配列は好ましくは、増幅反応に存在する他の核酸とのいずれの非特異的相互作用よりも強く、標的ハイブリダイズ配列に特異的にハイブリダイズするために選択される。
【０２０９】
不活性化の後、不活性タグ化オリゴヌクレオチドは、潜在的夾雑源からのサンプルに入る標的核酸配列との意図的でない相互作用を制限するために、好ましくはサンプルから除去される。除去は、固体支持体にサンプル中の標的核酸を固定して、次に不活性化タグ化オリゴヌクレオチドを含むサンプルの他の構成要素を除去することによって達成されうる。不活性タグ化オリゴヌクレオチドが除去されるようにするために、固体支持体とサンプル中に存在する核酸との間の非特異的相互作用の数を制限すべきである。マトリクスおよび溶液中で遊離している粒子などのいずれの公知の固体支持体も、サンプル処理に使用されうる。特に好ましい支持体は、単分散（すなわちサイズが均一、５％）である磁気球であり、それにより自動化処置での使用に特に好都合である一貫した結果を与える。
【０２１０】
本発明のタグ化オリゴヌクレオチドを包含するために特に好ましい増幅技法としては、Ｂｅｃｋｅｒら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ａｐｐｌｎ．Ｐｕｂ．Ｎｏ．ＵＳ  ２００６−００４６２６５  Ａ１、およびＢｅｃｋｅｒら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ａｐｐｌｎ．Ｎｏ．１１／６８１，１０４によって記載された方法の１つ以上の特徴を含む、等温増幅反応、たとえばＴＭＡおよびリアルタイムＴＭＡなどのＴＭＡの変形が挙げられる。たとえばある好ましいリアルタイムＴＭＡ方法は、遮断部分、終結部分、および／またはＴＭＡプロセスの感受性および精度の改善を与える他の修飾部分の使用を含む。
【０２１１】
プロモーターオリゴヌクレオチドは、そこからのＤＮＡの合成を防止するために修飾されうる。たとえばプロモーターオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼの存在下にてのプライマー伸長を防止するためにその３’末端に結合した遮断部分を含みうる。一例において、プロモーターを含む増幅反応に存在するオリゴヌクレオチドの少なくとも約８０％が３’遮断部分をさらに含む。別の実施形態において、プロモーターを含む増幅反応に供給されたオリゴヌクレオチドの少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％が、３’遮断部分を含むようにさらに修飾される。別の実施形態において、プロモーター配列を含む本発明の増幅反応にて使用されるいずれのオリゴヌクレオチドも、３’末端遮断部分をさらに含む。
【０２１２】
本発明のある実施形態は、ＲＮＡ標的配列を含む標的核酸の増幅に関する。一部の場合では、標的核酸は所望のＲＮＡ標的配列に対して不定の３’末端および５’末端を有する。標的核酸は、ＲＮＡ標的配列の３’末端に十分に相補性である塩基領域を有してそれによってハイブリダイズする、そして上記のように第１プライマー伸長反応における異種タグ配列をさらに含むプライミングオリゴヌクレオチドによって処理される。プライミングオリゴヌクレオチドは、当業者に周知のプライマー設計方法に従って、いずれの所望の標的配列の適切な領域にもハイブリダイズするように設計される。プライミングオリゴヌクレオチドにおけるタグ配列の存在が標的核酸配列への標的ハイブリダイズ領域の結合特徴を変化させうるが、分子分野の当業者は、本明細書に記載した方法に従って使用されうる標的ハイブリダイズ領域およびタグ配列の両方を含有するプライミングオリゴヌクレオチドをただちに設計できる。適切なプライミングオリゴヌクレオチドは、本明細書でさらに詳細に説明する。加えてプライミングオリゴヌクレオチド（好ましくはタグ化プライミングオリゴヌクレオチドではない）の５’末端は、修飾がプライミングオリゴヌクレオチドのプライミング機能またはプライミングオリゴヌクレオチドがハイブリダイズされるＲＮＡ増幅生成物の切断を実質的に妨害しないという条件で、以下でさらに十分に議論するように、ＤＮＡ伸長生成物への、またはＲＮＡ増幅生成物へのプライミングオリゴヌクレオチドの結合特性（たとえばハイブリダイゼーションまたは塩基スタッキング）を改善する１つ以上の修飾を含みうる。プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端は、適切なＤＮＡポリメラーゼ、たとえばＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（「逆転写酵素」）によって、ＲＮＡ標的配列または増幅生成物を、ＲＮＡテンプレートまたは増幅生成物に相補性であるＤＮＡプライマー伸長生成物を与えるためのテンプレートとして使用する伸長反応にて伸長される。
【０２１３】
ＤＮＡプライマー伸長生成物は、ＲＮＡテンプレートまたは増幅生成物を分解する酵素を使用して、ＲＮＡテンプレートから（少なくとも部分的に）分離される。適切な酵素、すなわち「選択的ＲＮＡｓｅ」は、ＲＮＡ：ＤＮＡ複合体のＲＮＡ鎖に作用する酵素であり、ＲＮＡｓｅ  Ｈ活性を含む酵素を含む。一部の逆転写酵素は、モロニーマウス白血病ウイルスおよびトリ骨髄芽球症ウイルスに由来するＲＮＡｓｅ  Ｈ活性を含む、ＲＮＡｓｅ  Ｈ活性を含む。好ましい増幅実施形態により、選択的ＲＮＡｓｅは逆転写酵素のＲＮＡｓｅ  Ｈ活性として供給されうるか、または独立した酵素として、たとえばＥ．コリＲＮＡｓｅ  ＨまたはＴ．テルモフィラスＲＮＡｓｅ  Ｈとして供給されうる。ＲＮＡ：ＤＮＡ２本鎖に存在するＲＮＡを選択的に分解する他の酵素も使用されうる。
【０２１４】
標的配列がＤＮＡであるとき、ＤＮＡプライマー伸長生成物は、標的核酸をディスプレーサオリゴヌクレオチドによって処理することによってテンプレートから分離されうる。ディスプレーサオリゴヌクレオチドはプライミング機能を有し、プライミングオリゴヌクレオチドから上流の標的核酸にハイブリダイズするために設計される（本実施形態では、「フォワードプライミングオリゴヌクレオチド」と呼ばれる）。「上流の」とは、ディスプレーサオリゴヌクレオチドの３’末端がフォワードプライミングオリゴヌクレオチドの３端から上流の標的核酸にハイブリダイズすることを意味する。それゆえディスプレーサオリゴヌクレオチドおよびフォワードプライミングオリゴヌクレオチドは、標的核酸の重複または別個領域にハイブリダイズしうる。好ましい実施形態において、ディスプレーサオリゴヌクレオチドの３’末端は、標的核酸に対するフォワードプライミングオリゴヌクレオチドの５’末端に隣接されているか、５’末端から最大５〜３５塩基だけ離間されている（すなわち標的核酸は、両方のオリゴヌクレオチドが標的核酸にハイブリダイズされるとき、ディスプレーサオリゴヌクレオチドの３’末端塩基とプライミングオリゴヌクレオチドの５’末端塩基との間に位置する、最大５〜３５の連続未結合ヌクレオチドを有する）。ディスプレーサオリゴヌクレオチドは一般に、長さが１０〜５０オリゴヌクレオチドであり、修飾がディスプレーサオリゴヌクレオチドのプライミング機能を実質的に妨害しないという条件で、標的核酸へのディスプレーサオリゴヌクレオチドの結合特性（たとえばハイブリダイゼーションまたは塩基スタッキング）を改善する５’末端における１つ以上の修飾を含みうる。ディスプレーサオリゴヌクレオチドおよびフォワードプライマーオリゴヌクレオチドは、同じ条件下で標的核酸にハイブリダイズするように設計される。標的核酸は、フォワードプライミングオリゴヌクレオチドが標的核酸にハイブリダイズするのに十分な時間を有した後に、好ましくはディスプレーサオリゴヌクレオチドによって処理される。あるいは標的核酸は、ディスプレーサオリゴヌクレオチドおよびフォワードプライミングオリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させるのに適したポリメラーゼに混合物を露出する前に、ディスプレーサオリゴヌクレオチドおよびフォワードプライミングオリゴヌクレオチドの両方によって処理される。ＤＮＡポリメラーゼの存在下にて、ディスプレーサオリゴヌクレオチドの３’末端はテンプレート依存性方式で伸長されて、第１ＤＮＡプライマー伸長生成物を標的核酸から置換して、それによりプロモーターオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションにそれを利用できるようにする、第２ＤＮＡプライマー伸長生成物を形成する。代わりの手法において、たとえばＤＮＡ呼吸（たとえばＡＴが豊富な領域）、低塩条件、ならびに／あるいはＤＭＳＯおよび／または浸透圧調節物質、たとえばベタインの使用によって促進されうる鎖侵入を通じてプロモーターオリゴヌクレオチドが第１ＤＮＡプライマー伸長生成物に接近する条件が確立されうる。本実施形態のプロモーターオリゴヌクレオチドは、上記のプロモーターオリゴヌクレオチドと同じであり、同様にプロモーターオリゴヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼのプライミングオリゴヌクレオチドとして機能するのを防止するように修飾される（すなわちプロモーターオリゴヌクレオチドは、その３’末端に遮断部分を含む）。
【０２１５】
ある実施形態において、本発明の方法は、ＤＮＡプライマー伸長生成物の長さをある所望の長さに制限するために上記のように標的核酸を処理するステップをさらに含む。このような長さ制限は通例、所望の標的配列の５’末端に隣接する、または５’末端付近のＲＮＡ標的核酸にハイブリダイズする、またはそうでなければＲＮＡ標的核酸に結合する「結合分子」の使用によって実行される。ある実施形態において、結合分子は塩基領域を含む。塩基領域は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡキメラ分子、またはその類似体でありうる。塩基領域を含む結合分子は、本明細書の別の箇所に記載するように１つ以上の方法で修飾されうる。適切な結合分子としては、これに限定されるわけではないが、ＲＮＡを結合して、その結合領域を超えるプライマー伸長を防止する終結オリゴヌクレオチドまたは終結タンパク質を含む結合分子、あるいは修飾分子、たとえば修飾オリゴヌクレオチド、たとえば消化オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされたＲＮＡ標的のその部分の加水分解を指示する「消化」オリゴヌクレオチド、あるいはＲＮＡ標的を切断する配列特異的ヌクレアーゼが挙げられる。
【０２１６】
本発明の例証的な終結オリゴヌクレオチドは、標的核酸の５’末端に隣接する、５’末端付近の、または５’末端と重複する領域にて標的核酸に十分に相補性である５’塩基領域を有する。ある実施形態において、終結オリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含むように合成される。たとえば本発明のある終結オリゴヌクレオチドは、１つ以上の２’−Ｏ−ＭＥリボヌクレオチドを含むか、または２’−Ｏ−ＭＥリボヌクレオチドで完全に合成される。たとえばＭａｊｌｅｓｓｉら（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６，２２２４−２２２９を参照。本発明の終結オリゴヌクレオチドは通例、終結オリゴヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼのプライマーとして機能するのを防止するために、その３’末端に遮断部分も含む。ある実施形態において、本発明の終結オリゴヌクレオチドの５’末端は、標的配列の５’末端の少なくとも約２つのオリゴヌクレオチドと重複し、それに相補性である。通例、本発明の終結オリゴヌクレオチドの５’末端は、標的配列の５’末端の少なくとも３、４、５、６、７、または８ヌクレオチドと重複し、それに相補性であるが、標的核酸の５’末端の約１０ヌクレオチドは超えない（本明細書で使用するように、「端」という用語は、オリゴヌクレオチド、核酸または核酸領域の５’または３’末端塩基それぞれを含む、オリゴヌクレオチド、核酸または核酸領域の５’または３’領域を指す）。適切な終結オリゴヌクレオチドは、本明細書でさらに詳細に説明する。
【０２１７】
定義された３’末端または不定の３’末端のどちらかを有する１本鎖ＤＮＡプライマー伸長生成物、または「第１」ＤＮＡプライマー伸長生成物は、プロモーターオリゴヌクレオチドによって処理され、該プロモーターオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡプライマー伸長生成物の３’領域に十分に相補性でありそれによってハイブリダイズする第１領域と、第１領域の５’側に、たとえばすぐ５’末端側に、または第１領域から離間されて位置して、プロモーターオリゴヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼのプライマーとして機能するのを防止する（たとえばプロモーターオリゴヌクレオチドがその３’末端に結合された遮断部分を含む）ように修飾されたＲＮＡポリメラーゼ、たとえばＴ７ポリメラーゼのプロモーターを含む第２領域とを含む。所望のハイブリダイズ「第１領域」を同定するときに、適切なプロモーターオリゴヌクレオチドは、常法のみを使用して当業者によって構築されうる。当業者は、プロモーター領域が所与のＲＮＡポリメラーゼによる認識に必要とされるあるヌクレオチドを有することをただちに理解するであろう。加えて、プロモーター配列中のあるヌクレオチドの変形は、挿入配列の使用を含めて、プロモーターの機能を所与の酵素によって改善しうる。
【０２１８】
挿入配列は、プロモーターオリゴヌクレオチドの第１領域と第２領域との間に位置決めされて、増幅速度を上昇させるように機能しうる（タグ化プロモーターオリゴヌクレオチドのタグ配列は、この有益な効果を与えうる）。改善された増幅速度は、複数の因子に起因しうる。第１に、挿入配列がプロモーターオリゴヌクレオチドの３’末端とプロモーター配列との間の距離を増大させるので、プロモーターオリゴヌクレオチドの３’末端に結合したポリメラーゼ、たとえば逆転写酵素はＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列への結合を妨害して、それにより転写が開始されうる速度を上昇させるであろう。第２に、選択された挿入配列は、標的配列よりも良好な転写用テンプレートとして機能することによって、転写速度をそれ自体改善しうる。第３に、ＲＮＡポリメラーゼは挿入配列にて転写を開始するので、ＲＮＡ転写生成物をテンプレートとして使用して、プライミングオリゴヌクレオチドによって合成されたプライマー伸長生成物は、プライマー伸長生成物の３’末端に向かって挿入配列の相補体を含有するであろう。より大きい標的結合領域、すなわち挿入配列の相補体を含むものを供給することによって、プロモーターオリゴヌクレオチドはプライマー伸長生成物により高速に結合して、それにより追加のＲＮＡ転写生成物の産生をより迅速に引き起こす。挿入配列は、好ましくは長さが５〜２０ヌクレオチドであり、分子内折り畳みおよび増幅反応混合物中に存在する他のオリゴヌクレオチドとの分子間結合を最小限にするように設計されるべきである。２次構造を最小限にするのを補助するプログラムは当分野で周知であり、最近傍熱力学則を使用してＲＮＡおよびＤＮＡ２次構造を予測するＭｉｃｈａｅｌ  Ｚｕｃｋｅｒ’ｓ  ｍｆｏｌｄソフトウェアを含む。Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｚｕｃｋｅｒ’ｓ  ｍｆｏｌｄソフトウェアの最新版は、ウェブでｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｒｐｉ．ｅｄｕ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｍｆｏｌｄにて、ＵＲＬ内のハイパーテキスト転送プロトコル（ｈｔｔｐ）を使用してアクセスできる。有用な挿入配列は、日常的な実験作業を超えることに何ら従事することなく、当分野で周知の試験管内選択方法を使用して同定されうる。
【０２１９】
プロモーター配列内の変異を用いてプロモーターオリゴヌクレオチドをアッセイすることは、当業者によって日常的な方法を使用して容易に実施される。さらに異なるＲＮＡポリメラーゼを使用することが望ましい場合、プロモーターオリゴヌクレオチド中のプロモーター配列は、異なるプロモーターによって容易に置換される。異なるプロモーター配列を置換することは、当業者の知識および能力の十分に範囲内である。リアルタイムＴＭＡでは、増幅反応混合物に供給されたプロモーターオリゴヌクレオチドはその３’末端からのＤＮＡ合成の効率的な開始を防止するために修飾されて、好ましくはその３’末端に結合された遮断部分を含む。さらに本発明のある実施形態で使用される終結オリゴヌクレオチドおよびキャッピングオリゴヌクレオチド、そしてプローブさえも、その３’末端に結合された遮断部分を場合により含む。
【０２２０】
終結オリゴヌクレオチドが使用される場合、プロモーターオリゴヌクレオチドの第１領域は、実質的な、しかし必ずしも正確でない精度でＤＮＡプライマー伸長生成物の所望の３’末端とハイブリダイズするように設計される。次に、プロモーターオリゴヌクレオチドの第２領域はテンプレートとして作用して、第１ＤＮＡプライマー伸長生成物をさらに伸長させて、プロモーターオリゴヌクレオチドの第２領域に相補性である塩基領域、すなわちプロモーター配列を含む領域を付加して、プロモーターを２本鎖にさせる。プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼはプロモーター配列に結合して、ＤＮＡプライマー伸長生成物に相補性である複数のＲＮＡ複製の転写を開始し、該複製は標的配列と実質的に同一である。「実質的に同一」とは、複数のＲＮＡ複製が、たとえば「標的配列」の境界、転写開始点、またはプライミングオリゴヌクレオチドがプライマー領域の５’側に追加のヌクレオチド（たとえば本明細書に記載するような結合された「キャップ」）を含むかどうかに応じて、標的配列に対して５’または３’側のどちらかに追加のヌクレオチドを有しうることを、あるいは標的配列に対して５’または３’側のどちらかにより少ないヌクレオチドを有しうることを意味する。標的配列がＤＮＡである場合、ＲＮＡ複製の配列は本明細書では、標的配列に「実質的に同一」であると記載される。しかしながら、ＤＮＡ標的配列のチミジン残基の代わりにウリジン残基を有するＲＮＡ配列が、「実質的に同一」の配列をなお有することが理解されるべきである。このように産生されたＲＮＡ転写物は、さらなる操作なしに上の系で自動的に再生しうる。それゆえ本反応は自己触媒的である。プライマー伸長反応を終結させるために結合分子または他の手段が使用されないこれらの実施形態において、プロモーターオリゴヌクレオチドの第１領域は、第１ＤＮＡプライマー伸長生成物の５’→３’末端であることが予想される第１ＤＮＡプライマー伸長生成物の選択された領域とハイブリダイズするように設計されているが、第１ＤＮＡプライマー伸長生成物の３’末端は不定であるため、プロモーターオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域はおそらく、第１ＤＮＡプライマー伸長生成物の実際の３’末端にはないであろう。本実施形態により、第１ＤＮＡプライマー伸長生成物の少なくとも３’末端塩基がプロモーターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしない場合が一般的である。それゆえ本実施形態により、第１ＤＮＡプライマー伸長生成物はおそらく、２本鎖プロモーターを形成するためにさらに伸長されないであろう。
【０２２１】
第１ＤＮＡプライマー伸長生成物に相補性であるＲＮＡの転写の開始を可能にするために、テンプレート核酸の伸長による２本鎖プロモーター配列の生成は不要である。得られた「第１」ＲＮＡ生成物は標的配列と実質的に同一であり、転写開始点によって定義された５’末端と、第１ＤＮＡプライマー伸長生成物の５’末端によって定義された３’末端を有する。十分な数の第１ＲＮＡ生成物が産生されて、さらなる操作なしに系において自動的に再生する。プライミングオリゴヌクレオチドは第１ＲＮＡ生成物の３’末端にハイブリダイズして、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長されて、第２ＤＮＡプライマー伸長生成物を形成する。終結オリゴヌクレオチドまたは他の結合分子を使用せずに形成された第１ＤＮＡプライマー伸長生成物とは異なり、第２ＤＮＡプライマー伸長生成物は、第１ＲＮＡ生成物の５’末端に相補性である定義された３’末端を有する。第２ＤＮＡプライマー伸長生成物は、ＲＮＡテンプレートを選択的に分解する酵素を使用してＲＮＡテンプレートから（少なくとも部分的に）分離される。１本鎖第２ＤＮＡプライマー伸長生成物は次に、上記のようにプロモーターオリゴヌクレオチドによって処理され、プロモーターオリゴヌクレオチドの第２領域はテンプレートとして作用して、第２ＤＮＡプライマー伸長生成物をさらに伸長させてプロモーターオリゴヌクレオチドの第２領域に相補性である塩基領域、すなわちプロモーター配列を含む領域を付加して、プロモーターを２本鎖にする。プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼはプロモーター配列に結合して、第２ＤＮＡプライマー伸長生成物に相補性であり、標的配列と実質的に同一である、複数の「第２」ＲＮＡ生成物の転写を開始する。このように産生された第２ＲＮＡ転写物は、さらなる操作なしに上の系で自動的に再生しうる。それゆえ本反応は自己触媒的である。
【０２２２】
上記の実施形態のいずれにおいても、標的配列の所望の領域がいったん同定されると、その領域を分析して、選択的ＲＮＡｓｅ分解がＲＮＡ：ＤＮＡ２本鎖からＲＮＡの部分の切断または除去を最適に引き起こすであろう箇所を決定することができる。分析はＡＭＶ逆転写酵素またはＭＭＬＶ逆転写酵素に存在するＲＮＡｓｅ  Ｈ活性による、ＲＮＡｓｅ  Ｈ活性を有する外部から添加された選択的酵素、たとえばＥ．コリＲＮＡｓｅ  Ｈ、または他の源からのＲＮＡｓｅ  Ｈ活性を備えた選択的酵素による、あるいはその組合せによる、標的配列のＲＮＡｓｅ分解の効果を判定するために実施されうる。このような分析の後に、プライミングオリゴヌクレオチドが、反応混合物中に存在する選択的ＲＮＡｓｅによって実質的に分解されないＲＮＡの部分にハイブリダイズするために選択されるのは、プライミングオリゴヌクレオチドの結合部位における実質的分解がＤＮＡ合成の開始を阻害して、プライマーの最適伸長を防止することができるためである。言い換えれば、プライミングオリゴヌクレオチドは通例、ＲＮＡが選択的ＲＮＡｓｅ分解を受けるときに、プライマー伸長生成物の形成を防止する実質的な分解がないように位置する、ＲＮＡ標的核酸の領域またはＤＮＡ標的核酸の相補体とハイブリダイズするように選択される。
【０２２３】
反対に、プロモーターオリゴヌクレオチドの部位は、プロモーターオリゴヌクレオチドのＤＮＡ鎖への効率的なハイブリダイゼーションを可能にするのに十分なＲＮＡ鎖の分解が起こるように選択されうる。通例、ＲＮＡの部分のみがＲＮＡ：ＤＮＡ２本鎖から選択的ＲＮＡｓｅ分解によって除去され、それゆえＲＮＡ鎖のある部分が２本鎖中に残存するであろう。ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖での選択的ＲＮＡｓｅ分解は、ハイブリッドからのＲＮＡの小片の解離を生じる。ＲＮＡが選択的に分解される位置は、標準ハイブリダイゼーション分析によって決定されうる。それゆえ選択的ＲＮＡｓｅ分解後にＤＮＡにより効率的に結合するであろう、すなわちＲＡ断片が選択的に除去される範囲に結合するであろうプロモーターオリゴヌクレオチドが選択されうる。
【０２２４】
本発明の方法で使用されるプロモーターオリゴヌクレオチドへの包含に適切なプロモーターまたはプロモーター配列は、その配列を認識して、それに結合し、転写のプロセスを開始して、それによりＲＮＡ転写物が生成されるＲＮＡポリメラーゼによって特異的に認識される核酸配列（天然型、合成により産生、または制限消化の生成物のいずれか）である。通例の、公知で有用なプロモーターとしては、あるバクテリオファージポリメラーゼによって認識されるプロモーター、たとえばバクテリオファージＴ３、Ｔ７、およびＳＰ６からのプロモーター、およびＥ．コリからのプロモーターが挙げられる。配列は場合により、分解プロセスに対する安定性または感受性の上昇あるいは転写効率の向上を付与しうる、ＲＮＡポリメラーゼの実際の認識部位を超えて延伸するヌクレオチド塩基を含みうる。開始配列を認識できる公知および利用可能なポリメラーゼがあるプロモーター配列は、特に使用するのに適切である。
【０２２５】
本発明の方法による使用のために適切なＤＮＡポリメラーゼは、逆転写酵素を含む。特に適切なＤＮＡポリメラーゼとしては、ＡＭＶ逆転写酵素およびＭＭＬＶ逆転写酵素が挙げられる。本発明の方法での使用に適切な逆転写酵素の一部、たとえばＡＭＶおよびＭＭＬＶ逆転写酵素は、ＲＮＡｓｅ  Ｈ活性を有する。実際に、本発明のある実施形態により、増幅反応における唯一の選択的ＲＮＡｓｅ活性は、逆転写酵素によって与えられる−追加の選択的ＲＮＡｓｅは添加されない。しかしながら一部の状況において、外来性選択的ＲＮＡｓｅ、たとえばＥ．コリＲＮＡｓｅ  Ｈを添加することも有用でありうる。外来性選択的ＲＮＡｓｅの添加は必要とされないが、ある状況下では、たとえばＡＭＶ逆転写酵素中に存在するＲＮＡｓｅ  Ｈ活性は反応混合物中に存在する他の構成要素によって阻害または不活性化されうる。このような状況においては、外来性選択的ＲＮＡｓｅの添加が望ましいことがある。たとえば比較的大量の異種ＤＮＡが反応混合物中に存在する場合、ＡＭＶ逆転写酵素の未変性ＲＮＡｓｅ  Ｈ活性は多少阻害されて、それゆえ産生される標的配列の複製の数は逸れに従って減少されうる。標的核酸が存在する核酸の少量のみを含む状況において（たとえばサンプルがかなりの量の異種ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含有する場合）、外来性選択的ＲＮＡｓｅを添加することが特に有用である。たとえばＫａｃｉａｎら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，３９９，４９１を参照。
【０２２６】
上記の方法によって産生されたＲＮＡ増幅生成物はテンプレートとして作用して、上記の機構によって標的配列に関連付けられた追加の増幅生成物を産生しうる。該系は自己触媒的であり、本発明の方法による増幅は温度、ｐＨ、イオン強度などの反応条件を反復して変更または変化させる必要なしに行われる。これらの方法は費用のかかる熱サイクル装置を必要としないし、増幅反応の間に酵素または他の試薬の複数回の添加も必要としない。
【０２２７】
上記のように、本発明の方法は、臨床、水、環境、工業、飲料、食品、種および他のサンプル中の特異的核酸標的配列を検出および／または定量するアッセイで、あるいは各種の用途のために特異的標的配列から多数のＲＮＡ増幅生成物を産生するために有用である。たとえば本発明は、滅菌試験などの用途において（たとえばユニバーサルオリゴヌクレオチドを使用して）、臨床サンプル（たとえば血液、尿、糞便、唾液、精液、または髄液）、食品、水、実験室および／または工業サンプルを、特異的核酸、特定の生物（たとえば種特異的オリゴヌクレオチドを使用して）および／または特定のクラスの生物についてスクリーニングするのに有用である。本発明は、たとえばウイルス、細菌、真菌、または寄生生物の存在を検出するために使用されうる。
【０２２８】
増幅生成物は、いずれの在来の手段によっても検出されうる。たとえば増幅生成物は、検出可能に標識されたプローブを用いたハイブリダイゼーションおよび得られたハイブリッドの測定によって検出されうる。特定の標的配列を検出するためのプローブを選択する設計基準は当分野で周知であり、たとえばＨｏｇａｎら、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍａｋｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ／ｏｒ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｎ−Ｖｉｒａｌ  Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ，”Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，１５０，５１７に記載されている。Ｈｏｇａｎは、プローブが（複数の）標的配列に対する相同性を最大限にして、考えられる非標的配列に対する相同性を最小限にするように設計されるべきであることを教示している。非標的配列との安定性を最小限にするために、Ｈｏｇａｎは、グアニンおよびシトシンが豊富な配列を回避すべきであることと、プローブができるだけ多くの不安定化ミスマッチに及ぶべきことと、非標的配列への完全相補性の長さを最小限にすべきことを教えている。反対に、（複数の）標的配列とのプローブの安定性は最大化すべきであり、アデニンおよびチミンが豊富な領域は回避すべきであり、プローブ：標的ハイブリッドは好ましくはグアニンおよびシトシン塩基対によって終結され、広範な自己相補性は一般に回避され、プローブ：標的ハイブリッドの融解温度は、アッセイ温度よりも約２〜１０℃高いはずである。
【０２２９】
特に詳細な実施形態において、増幅生成物はハイブリダイゼーション保護アッセイ（「ＨＰＡ」）によってアッセイ可能であり、ＨＰＡは、化学発光オリゴヌクレオチドプローブ、たとえばアクリジニウムエステル標識（「ＡＥ」）プローブを標的配列にハイブリダイズすることと、未ハイブリダイズプローブに存在する化学発光標識を選択的に加水分解することと、残存するプローブから生じた化学発光をルミノメータで測定することとを含む。たとえばＡｒｎｏｌｄら、“Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ，”Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，２８３，１７４およびＮＯＲＭＡＮ  Ｃ．ＮＥＬＳＯＮら、ＮＯＮＩＳＯＴＯＰＩＣ  ＰＲＯＢＩＮＧ，ＢＬＯＴＴＩＮＧ，ＡＮＤ  ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ，ｃｈ．１７（Ｌａｒｒｙ  Ｊ．Ｋｒｉｃｋａ  ｅｄ．，２ｄ  ｅｄ．１９９５）を参照。
【０２３０】
さらなる実施形態において、本発明は、本明細書に記載する方法によってリアルタイムでの増幅プロセスの定量的評価を提供する。「リアルタイム」での増幅プロセスの評価は、反応混合物中の単位複製配列の量を増幅反応中に連続的または周期的のどちらかで決定することを含み、決定した値を使用して、サンプル中に最初に存在した標的配列の量を計算する。リアルタイム増幅に基づいてサンプル中に存在する初期標的配列の量を決定する多様な方法がある。これらとしては、Ｗｉｔｔｗｅｒら、“Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ａｎａｌｙｔｅ，”Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，３０３，３０５、およびＹｏｋｏｙａｍａら、“Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ａｓｓａｙｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ，”Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，５４１，２０５によって開示された方法が挙げられる。サンプル中に最初に存在した標的配列の量を、しかしリアルタイム増幅に基づかずに決定する別の方法は、Ｒｙｄｅｒら、“Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｐｒｅ−Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ａ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｆｒｏｍ  Ｐｏｓｔ−Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｕｃｔ，”Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，７１０，０２９によって開示されている。増幅生成物は、各種の自己ハイブリダイズプローブの使用によってリアルタイムに検出でき、その大半はステム−ループ構造を有する。このような自己ハイブリダイズプローブは、プローブが標的配列へのハイブリダイゼーションによって自己ハイブリダイズ状態または変更された状態のどちらにあるかに応じて、それらが別々に検出可能な信号を発するように標識される。一例として、「分子トーチ」は、連結領域（たとえば非ヌクレオチドリンカー）によって結合され、所定のハイブリダイゼーションアッセイ条件下で相互にハイブリダイズする別個の自己相補性領域（「標的結合ドメイン」および「標的閉鎖ドメイン」と呼ばれる）を含む、一種の自己ハイブリダイズプローブである。好ましい実施形態において、分子トーチは、長さが１〜約２０塩基であり、鎖置換条件下で増幅生成物中に存在する標的配列へのハイブリダイゼーションのためにアクセスできる１本鎖塩基領域を標的結合ドメイン内に含有する。鎖置換条件下では、分子トーチの（完全または部分相補性でありうる）２つの相補性領域のハイブリダイゼーションは、標的結合ドメインに存在する１本鎖領域に結合して、標的閉鎖ドメインの全部または一部を置換するであろう標的配列の存在下を除いて好ましい。分子トーチの標的結合ドメインおよび標的閉鎖ドメインは、分子トーチが標的配列にハイブリダイズされるときよりも分子トーチが自己ハイブリダイズされるときに異なる信号が生成され、それにより未ハイブリダイズ分子トーチの存在下にて試験サンプルでのプローブ：標的２本鎖の検出を可能にするように配置された、検出可能な標識または相互作用標識の対（たとえば発光／消光剤）を含む。分子トーチおよび多様な種類の相互作用標識対は、Ｂｅｃｋｅｒら、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｏｒｃｈｅｓ，”Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．��，５３４，２７４によって開示されている。
【０２３１】
自己相補性を有する検出プローブの別の例は、「分子ビーコン」である。分子ビーコンは、標的相補体配列、増幅生成物中に存在する標的配列の非存在下にてプローブを閉鎖構造で保持する親和性対（または核酸アーム）、およびプローブが閉鎖構造にあるときに相互作用する標識対とを有する核酸分子を含む。標的配列および標的相補体配列のハイブリダイゼーションは、親和性対のメンバを分離して、それによりプローブを開放構造に移行させる。開放構造への移行は、たとえばフルオロフォアおよび消光剤（たとえばＤＡＢＣＹＬおよびＥＤＡＮＳ）でありうる標識対の相互作用の低下によって検出可能である。分子ビーコンは、Ｔｙａｇｉら、“Ｄｅｔｅｃｔａｂｌｙ  Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｄｕａｌ  Ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ａｓｓａｙｓ  ａｎｄ  Ｋｉｔｓ，”Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，９２５，５１７、およびＴｙａｇｉら、“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｖｉｎｇ  Ｎｏｎ−ＦＲＥＴ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｋｉｔｓ  ａｎｄ  Ａｓｓａｙｓ  Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ｓｕｃｈ  Ｐｒｏｂｅｓ，”Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，１５０，０９７によって開示されている。
【０２３２】
本発明での使用のための他の自己ハイブリダイズプローブは、当業者に周知である。一例として、相互作用標識を有するプローブ結合対、たとえばＰＣＲ反応のためのＭｏｒｒｉｓｏｎ，“Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  Ａｓｓａｙ，”Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，９２８，８６２およびＧｅｌｆａｎｄら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，８０４，３７５に開示されているものなどのプローブ結合対は、本発明での使用に適しうる。追加の検出系は、Ａｒｎｏｌｄら、“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｗｉｔｃｈ，”Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ａｐｐｌｎ．Ｐｕｂ．Ｎｏ．ＵＳ  ２００５−００４２６３８  Ａ１によって開示されているような、「分子スイッチ」を含む。そして他のプローブ、たとえば挿入染料および／または蛍光色素を含むプローブは、本発明の増幅生成物の検出に有用でありうる。たとえばＩｓｈｉｇｕｒｏら、“Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，”Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，８１４，４４７を参照。
【０２３３】
初期標準配列およびＲＮＡ転写生成物が同じ意味を共有する本発明のこのような方法において、リアルタイム検出用のプローブを付加する前に増幅を開始することが所望でありうる。増幅反応を開始する前にプローブを付加することは、初期標的配列に結合するプローブが標的配列の相補体を有するプライマー伸長生成物を完成するプライマー伸長ステップの間に置換されるか、またはそうでなければ除去される必要があるので、増幅速度を低下させる。増幅の開始は、増幅酵素（たとえば逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼ）の付加によって判定される。
【０２３４】
本明細書に記載した方法に加えて、本発明は、本発明の方法を実行するのに必要な試薬の１つ以上を含むキットに関する。本発明を実行するのに使用される各種の構成要素を含むキットは、核酸標的分子の増幅を必要とするいずれの手段での使用にも構成可能であり、このようなキットは多様な異なるエンドユーザのためにカスタマイズされうる。適切なキットはたとえば、微生物分析、血液スクリーニング、疾患診断、水質検査、生成物放出または無菌性検査、環境または工業分析、食品または飲料検査のために、あるいは一般的な実験室での使用のために作製されうる。本発明のキットは、本発明による核酸増幅を実行するのに必要な構成要素の１つ以上を提供する。キットは、１つの特定の標的から核酸を増幅するのに適した試薬を含みうるか、または複数の標識を増幅するのに適した試薬を含みうる。本発明のキットはさらに、単一のサンプル中での１つ以上の核酸標的のリアルタイム検出のための試薬、たとえば上記のような１つ以上の自己ハイブリダイズプローブをさらに提供しうる。キットは、バイアル、試験管、ウェルなどの１個以上の容器を近接して拘束された状態で収容するために区分されうるキャリアを含みうる。好ましくは、このような容器の少なくとも１つは、本発明の増幅方法を実施するのに必要な１つ以上の構成要素または構成要素の混合物を含有する。
【０２３５】
本発明の一実施形態によるキットとは、たとえば１個以上の容器内に、単独の、あるいはタグ閉鎖オリゴヌクレオチドと組合された、またはタグ閉鎖配列に結合されたタグ化オリゴヌクレオチド、プライマー伸長反応を終結させる結合分子または他の手段、および場合によりエクステンダオリゴヌクレオチドおよび／またはキャッピングオリゴヌクレオチドを含みうる。リアルタイム検出が使用される場合、１つ以上の容器は、単一のサンプル中での少なくとも１つの核酸標的配列のリアルタイム検出のための１つ以上の試薬、たとえば上記のような１つ以上の自己ハイブリダイズ試薬を含みうる。別の容器は、酵素試薬、たとえばＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ反応を実施するための熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素（ＲＮＡｓｅ  Ｈ活性を持つ、または持たないかのどちらか）、ＲＮＡポリメラーゼ、および場合により転写ベース増幅反応のための追加の選択的ＲＮＡｓｅ酵素の混合物を含有しうる。これらの酵素は、濃縮形で、または作用濃度にて、通常は酵素安定性を促進する形で供給されうる。酵素試薬は、凍結乾燥形でも供給されうる。たとえばＳｈｅｎら、“Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，”Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，８３４，２５４を参照。別の１個以上の容器は、増幅試薬を濃縮形、たとえば１０倍、５０倍、または１００倍、あるいは作用濃度で含有しうる。増幅試薬は、増幅反応を実行するのに必要な構成要素の１つ以上、たとえば緩衝剤、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ｄＮＴＰ、ｒＮＴＰ、ＥＤＴＡ、安定化試薬などを含有するであろう。構成要素のいくつか、たとえばＭｇＣｌ２およびｒＮＴＰは、残存する構成要素とは別個に供給されることがあり、エンドユーザがより最適化された増幅反応を達成するために、これらの試薬を滴定できるようにする。別の１個以上の容器は、１つ以上の標識オリゴヌクレオチドプローブを含む、増幅生成物の検出のための試薬を含みうる。プローブは多数の方法で、たとえば放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識、核タグ、生物発光標識、挿入染料、または酵素標識によって標識されうる。ある実施形態において、本発明のキットは、エンドユーザによって実施された試験増幅を検証するために増幅実験で使用されうる、１つ以上の正および負の対照の標的核酸を含有する１個以上の容器も含むであろう。ある例において、上に挙げた試薬の１つ以上は、内部対照と組合されうる。もちろんこれらの試薬の１つ以上を単一の試験管または他の容器内で組合せることも可能である。本発明での使用に適切な支持体、たとえば試験管、多管ユニット、多ウェルプレートなども本発明のキットによって供給されうる。最後に、本発明のキットは１冊以上の取扱説明書を含みうる。
【０２３６】
本発明のキットは、上述した、または本明細書の別の箇所で記載した構成要素の本質的にいずれの組合せも含有しうる。当業者は、本発明のキットによって供給された構成要素がキットの所期の使用、および所期のエンドユーザによって変化するであろうことを認識するであろう。それゆえキットは、本出願で述べた各種の機能を実施するように特に設計でき、このようなキットの構成要素はそれに従って変化するであろう。
【０２３７】
本発明はさらに、たとえば下に例示する標的特異的オリゴヌクレオチドを含む各種のオリゴヌクレオチドに関する。本発明のオリゴヌクレオチドがＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡキメラおよびその類似物質でありうることと、いずれの場合でも本発明がＤＮＡオリゴヌクレオチドのＲＮＡ等価物およびＲＮＡオリゴヌクレオチドのＤＮＡ等価物を含むことが理解されるものとする。
【０２３８】
本発明の検出プローブとしては、たとえばアクリジニウムエステル標識、または標的配列にハイブリダイズする配列に隣接する、標識された自己ハイブリダイズ領域が挙げられうる。各種の実施形態において、これらの標識オリゴヌクレオチドプローブは場合により、または好ましくは、少なくとも１つの修飾オリゴヌクレオチド、たとえば２’−Ｏ−ＭＥリボヌクレオチドを含むように合成される；あるいはこれらの標識オリゴヌクレオチドプローブは場合により、または好ましくは、完全に修飾オリゴヌクレオチド、たとえば２’−Ｏ−ＭＥリボヌクレオチドで合成されている。
【０２３９】
本明細書に記載した方法、組成物、反応混合物およびキットへの他の適切な改良または改変が当業者に公知の情報に照らして、本明細書に含有される本発明の説明からただちに明らかであり、本発明またはそのいずれの実施形態の範囲からも逸脱することなく行われうることが、関連分野の当業者によって理解されるであろう。ここで本発明を詳細に説明したが、例証の目的のみで本明細書に含まれ、本発明を制限するものではない次の例を参照することによって、本発明はさらに明らかに理解されるであろう。
【実施例】
【０２４０】
本発明のある態様および実施形態を例証する実施例を以下に与える。以下の実施例は、実際に実施された実験の詳細事項を正確に反映すると考えられるが、しかしながら実際に実施された作業と、後述する実験詳細事項との間に、これらの実験の結論または当業者がそれらを実践する能力に影響を及ぼさないある軽度の不一致が存在しうることが考えられる。当業者は、これらの実施例が本発明をその中に記載された特定の実施形態に制限するものではないことを認識するであろう。加えて当業者は、本明細書に記載した技法、材料および方法を使用して、なお本発明の精神および範囲の中で、これらを実施するための代わりの増幅系および関連方法を容易に考案および最適化できる。
【０２４１】
別途指摘しない限り、次の実施例のオリゴヌクレオチドおよび修飾オリゴヌクレオチドは、標準ホスホラミダイト化学作用を使用して合成され、その各種の方法は当分野で周知である。たとえばＣａｒｒｕｔｈｅｒｓら、（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，２８７を参照。本明細書で別途示さない限り、修飾ヌクレオチドは２’−Ｏ−ＭＥリボヌクレオチドであり、それはそのホスホラミダイト類似物質として合成で使用された。
【０２４２】
（実施例１）
リアルタイムＴＭＡ反応にてタグ化オリゴヌクレオチドを使用するＨＣＶの選択的増幅
以下の一連の実験は、転写媒介増幅反応前の、興味のある核酸サンプル中の標的核酸配列を修飾するためのタグ化オリゴヌクレオチドの使用が、興味のある核酸サンプル以外の源が寄与する標的核酸配列を増幅せずに、興味のある核酸サンプルが寄与する標的核酸配列の選択的増幅を可能にするかどうかを評価するために実施した。
【０２４３】
実施した実験で使用した試薬およびプロトコル条件は、実験の結果および結論の議論と同様に後述する。
【０２４４】
Ｉ．オリゴヌクレオチド
別途指摘しない限り、オリゴヌクレオチドは、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ（商標）８９０９  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）を使用して、標準ホスホラミダイト化学作用を用いて合成した。たとえばＣａｒｒｕｔｈｅｒｓら（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，２８７を参照。配列は５’→３’である。遮断部分は存在する場合、３’末端にある。
【０２４５】
１．タグ化プライミングオリゴヌクレオチド：
ＧＴＴＴＧＴＡＴＧＴＣＴＧＴＴＧＣＴＡＴＴＡＴＧＴＣＴＡＣＡＧＧＣＡＴＴＧＡＧＣＧＧＧＴＴＧＡＴＣＣＡ  ＡＧＡＡＡＧＧＡＣ（配列番号１）；１２ｐｍｏｌ／ｒｘｎ
２．プライミングオリゴヌクレオチド：
ＧＴＴＴＧＴＡＴＧＴＣＴＧＴＴＧＣＴＡＴＴＡＴ（配列番号２）；１２ｐｍｏｌ／ｒｘｎ
３．プロモーターオリゴヌクレオチド：
ＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡＧＴＡＴＧＡＧ（配列番号３）；１２ｐｍｏｌ／ｒｘｎ
遮断部分：３’−ジメチルトリチル−Ｎ−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン、５’−スクシノイル長鎖アルキルアミノ−ＣＰＧ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ；Ｃａｔ．Ｎｏ．２０−０１０２−０１）を使用して調製した３’→３’リンケージ
４．終結オリゴヌクレオチド
ＡｍＵｍＧｍＧｍＣｍＵｍＡｍＧｍＡｍＣｍＧｍＣｍＵｍＵｍＵｍＣｍＵｍＧｍＣｍＧｍＵｍＧｍＡｍＡｍＧｍＡｍ（配列番号４）；０．８ｐｍｏｌ／ｒｘｎ
遮断部分：プロモーターオリゴヌクレオチドと同じ
５．エクステンダオリゴヌクレオチド：
ＴＧＴＣＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＧＧＧＡＧＡＧＣＣＡＴＡ（配列番号５）；１２ｐｍｏｌ／ｒｘｎ
遮断部分：プロモーターオリゴヌクレオチドと同じ
６．第１捕捉プローブ：
ＧｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＵｍＣｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｍＣｍＡｍｍＣｍＣｍＣｍＵｍＴＴＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号６）；３ｐｍｏｌ／ｒｘｎ
７．第２捕捉プローブ：
ＣｍＡｍＵｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣｍＡｍＣｍＧｍＧｍＵｍＣｍＵｍＡｍＣｍＧｍＴＴＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号７）；３ｐｍｏｌ／ｒｘｎ
８．検出プローブ：
ＣｍＧｍＵｍＵｍＣｍＣｍＧｍＣｍＡｍＧｍＡｍＣｍＣｍＡｍＣｍＵｍＡｍＵｍ（Ｌｉｎｋｅｒ）ＧｍＡｍＡｍＣｍＧｍ（配列番号８）；４ｐｍｏｌ／ｒｘｎ
プローブ型：分子トーチ
リンカー：９−Ｏ−ジメトキシトリチル−トリエチレングリコール、１−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ；Ｃａｔ．Ｎｏ．１０−１９０９−９０）
５’標識：６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）（ＢｉｏＧｅｎｅｘ，Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ，ＣＡ；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＧＸ−３００８−０１）
３’標識：４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）（Ｐｒｉｍｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．，Ａｓｔｏｎ，ＰＡ）。
【０２４６】
ＩＩ．試薬および他のプロトコル情報
１．増幅試薬。「増幅試薬」または「ＡＭＰ試薬」は、約２２．０℃にてｐＨ７．８１〜８．０で、１１．６ｍＭ  Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩基緩衝剤、１５ｍＭ  Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩酸塩緩衝剤、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２３．３ｍＭ  ＫＣｌ２、３．３３％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０５ｍＭ酢酸亜鉛、０．７６ｍＭ  ｄＡＴＰ、０．７６ｍＭ  ｄＣＴＰ、０．７６ｍＭ  ｄＧＴＰ、０．７６ｍＭ  ｄＴＴＰ、０．０２％（ｖ／ｖ）ＰｒｏＣｌｉｎ３００保存料（Ｓｕｐｅｌｃｏ，Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，ＰＡ；Ｃａｔ．Ｎｏ．４８１２６）、６．０ｍＭ  ＡＴＰ、６．０ｍＭ  ＣＴＰ、６．０ｍＭ  ＧＴＰ、および６．０ｍＭ  ＵＴＰを含んでいた。
【０２４７】
２．酵素試薬。「酵素試薬」は、７０ｍＭ  Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、１０％（ｖ／ｖ）ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１０２洗浄剤、１６ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム、２０ｍＭ  Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩基緩衝剤、５０ｍＭ  ＫＣｌ２、２０％（ｖ／ｖ）グリセロール、１６５．６ｍＭトレハロース、ｐＨ７を含み、２２４ＲＴＵ／μＬモロニーマウス白血病ウイルス（「ＭＭＬＶ」）逆転写酵素および１４０Ｕ／μＬ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを含有し、活性の１単位（すなわちＲＴＵまたはＵ）は、ＭＭＬＶ逆転写酵素では３７℃にて１５分後に５．７５ｆｍｏｌ  ｃＤＮＡの合成および放出として、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼでは３７℃にて２０分後に５．０ｆｍｏｌ  ＲＮＡ転写物の産生として定義される。
【０２４８】
３．洗浄溶液。「洗浄溶液」は、ｐＨ７．５で、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、６．５ｍＭ  ＮａＯＨ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．３％（ｖ／ｖ）エチルアルコール、０．０２％（ｗ／ｖ）メチルパラベン、０．０１％（ｗ／ｖ）プロピルパラベン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウムを含んでいた。
【０２４９】
４．搬送培地。「搬送培地」は、ｐＨ７．５で、１５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、８％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム、および１００ｍＭ硫酸アンモニウムを含んでいた。
【０２５０】
５．標的捕捉試薬「標的捕捉試薬」または「ＴＣＲ」は、下に挙げた構成要素を含んでいた。本混合物の処方に関する追加情報は、標的捕捉試薬手順（ＩＩＩＡ）で後述する。表示した濃度は、磁気粒子溶液と合せた後の構成要素の最終濃度を表す。磁気粒子は５’アミノ修飾オリゴ（ｄＴ）１４を共有結合した、Ｓｅｒａ−Ｍａｇ（商標）カルボキシラート修飾（Ｓｅｒａｄｙｎ，Ｉｎｃ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ；Ｃａｔ．Ｎｏ．２４１５２１０５−０５０２５０）、１ミクロン、超常磁性粒子であった。ＨＥＰＥＳ５、水酸化リチウム、塩化リチウム、ＥＤＴＡ、ラウリル硫酸リチウムおよび硫酸アンモニウム構成要素をＴＣＲ希釈剤および搬送培地と共に導入した。
【０２５１】
第１捕捉プローブ；１５．０ｎＭ
第２捕捉プローブ；１５．０ｎＭ
タグ化プライミングオリゴヌクレオチド；６０．０ｎＭ
終結オリゴヌクレオチド；４．０ｎＭ
ＨＥＰＥＳ、遊離酸、２水和物；１１８．７ｍＭ
水酸化リチウム、１水和物：９８．９ｍＭ
塩化リチウム、高純度；４７０．６ｍＭ
ＥＤＴＡ、遊離酸；２５．０ｍＭ
ラウリル硫酸リチウム；１１０．２ｍＭ
硫酸アンモニウム；３７．５ｍＭ
Ｓｅｒａｄｙｎ  Ｐｏｌｙ  ｄＴ１４磁気粒子；０．０７５ｕｇ／ｕＬ
６．転写緩衝剤。「転写緩衝剤」は、０．２％ラウリル硫酸ナトリウムを含んでいた。
【０２５２】
７．使用した転写物。ＨＣＶ転写物
８．使用した材料または装置の製品番号。
ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（商標）プレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭＡ；Ｃａｔ．Ｎｏ．９７００２５４０）
ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈマイクロタイタープレート（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＳＰ−９６６５）
Ｓｏｌｏ  ＨＴインキュベータ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭＡ；Ｃａｔ．Ｎｏ．５１６１５８０）
ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（商標）コーム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭＡ；Ｃａｔ．Ｎｏ．９７００２５１０）
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）サーモミキサＲ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ；Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ；Ｃａｔ．Ｎｏ．０２２６７０１０７または０２２６７０１５８）
ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  Ｏｐｔｉｃｏｎ（登録商標）２リアルタイムＰＣＲ検出システム  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ；Ｃａｔ  Ｎｏ．ＣＦＢ−３２２０）
９．追加のプロトコル情報
記載した実験では、標的含有転写緩衝剤３．３μＬを各２．０ｍｌマイクロチューブに下のステップＢ６で添加した。タグ化プライミングオリゴヌクレオチドおよび終結オリゴヌクレオチドは、２．０ｍＬマイクロチューブに添加される前は水中にあった。サンプルを約５秒間ボルテックスにかけた。転写物を捕捉するためには、一般に６０℃にて１０分間インキュベートすることで十分なことが判明した。プレートは、１０分間のインキュベーションの後に室温にて５分間維持して、標的捕捉ステップの前にプレートを冷却させた。プレートをＳｏｌｏ  ＨＴインキュベータからＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒシステムに移す場合もこの通りである。サーモミキサの速度は１４００ｒｐｍであった。
【０２５３】
ＩＩＩ．標的捕捉プロトコル
Ａ．標的捕捉試薬（ＴＣＲ）手順
磁気ビーズを室温（ＲＴ）にて４５分間ゆっくり撹拌して、磁気ビーズ１５０μＬをＴＣＲ希釈剤５ｍＬに添加した（サンプル当たり５０μＬを使用したときに１５μｇビーズ／ｒｘｎ）。溶液を室温にて３５分間ゆっくり混合して、このときに捕捉プローブをＴＣＲ希釈剤５ｍＬに添加した（最終濃度０．１２ｐｍｏｌ／μＬ（６ｐｍｏｌ／５０μＬｒｘｎ）。
【０２５４】
Ｂ．サンプル調製
プロモーターオリゴヌクレオチド、エクステンダオリゴヌクレオチドおよびプライミングオリゴヌクレオチドを含有するＡＭＰ試薬を調製した（体積＝１，６００μＬ）。溶液をボルテックスにかけ、必要となるまで２〜８℃に置いた。検出プローブは酵素試薬で調製して、必要となるまで２〜８℃に置いた。標的希釈剤を０．２％  ＬＬＳで調製した。ＴＣＲ  ５０μＬを２００μＬマイクロタイターウェルに移した。各標的複製レベル、タグ化プライミングオリゴヌクレオチドおよび終結オリゴヌクレオチドを２．０ｍＬマイクロチューブ内の１．２ｍＬの５０％搬送培地、５０％  Ｈ２Ｏに添加した。標的サンプルをボルテックスにかけて１５０μＬを、ＴＣＲ  ５０μＬを含有する２００μＬマイクロプレート（プレート１）に移した（各ウェルは、複製０または１００万個のＨＣＶ転写物と、適切な量のタグ化プライミングオリゴヌクレオチドおよび終結オリゴヌクレオチドを含有していた）。
【０２５５】
Ｃ．標的捕捉プロトコル。
【０２５６】
２００μＬマイクロプレート（プレート１）はＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｓｏｌｏ  ＨＴインキュベータを使用して６０℃にて１０分間インキュベートして（プレート１）、次にＲＴにて５分間置いた（プレート１）。２００μＬマイクロプレート（プレート２および３）は、洗浄試薬２００μＬを用いて準備した。増幅プレート（プレート４−ＭＪ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９６ウェルマイクロタイタープレート）は、ウェル当たりＡＭＰ試薬３０μＬを用いて準備した。９６ウェルコームをプレート１内に置いた。４個すべてのプレートをＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ９６ユニットに装填して、標的捕捉プロトコルを次のように開始した。
【０２５７】
プレート１を非常に低速で５分間混合して、ビーズを１２カウントにわたって収集し、次に低速を使用して１０分間にわたってプレート２に放出する。プレート１を次に非常に低速を使用して１秒間混合して、ビーズを１２カウントにわたって収集し、低速を使用して１０分間にわたってビーズをプレート２に放出する。
【０２５８】
プレート２を非常に低速で３０秒間混合して、ビーズを１２カウントにわたって収集し、次に低速を使用して１０秒間にわたってプレート３に放出する。プレート２を次に非常に低速で１秒間混合して、ビーズを１２カウントにわたって収集し、非常に低速を使用して１０秒間にわたってプレート３に放出する。
【０２５９】
プレート３を中速で３０秒間混合して、ビーズを１２カウントにわたって収集し、中速を使用してビーズを１０秒間にわたってプレート４に放出する。プレート３を次に非常に低速で１秒間混合して、ビーズを１２カウントにわたって収集し、中速を使用して１０秒間にわたってプレート４に放出する。
【０２６０】
９６ウェルマイクロタイタープレート（プレート４）を取り外して、ベンチに移し、密封カードで覆って、ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  Ｏｐｔｉｃｏｎ（登録商標）２リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）（「リアルタイム機器」）内に置いた。
【０２６１】
Ｄ．リアルタイムＴＭＡ。
【０２６２】
リアルタイムＴＭＡは次のように実施した。プレートを４２℃で５分間インキュベートして、次に取り出して、４２℃のサーモミキサに置いた。各反応ウェルに酵素試薬の一定分量１０μＬを添加した。マイクロタイタープレートを接着テープシールで覆って、サーモミキサ上で静かに３０秒間振とうし、次に４２℃のリアルタイム機器内に置いて、そこでリアルタイムアッセイ監視を開始した。合成した単位複製配列の量の指標として作用するＴＴｉｍｅ値は、監視した蛍光シグナルから決定した。Ｌｉｇｈｔら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ａｐｐｌｎ．Ｐｕｂ．Ｎｏ．ＵＳ  ２００６−０２７６９７２，段落５０６−５４９を参照。
【０２６３】
ＩＶ．結果および結論
実験は上記の手順に従って、ＨＣＶ転写物を検出するために実施した（８回の再現）。各試験のＴＣＲは同じタグ化プライミングオリゴヌクレオチドを含有していた。標的捕捉ステップは、ＨＣＶ転写物を結合して、未ハイブリダイズタグ化プライミングオリゴヌクレオチドおよび終結オリゴヌクレオチドを除去するために実施した。標的捕捉ステップの後、ＡＭＰ試薬をＴＣＲのビーズに接触させ、該ＡＭＰ試薬はタグ配列の相補体に特異的なプライミングオリゴヌクレオチドを含有していた。本ステップにはタグ化プライミングオリゴヌクレオチドは含まれていなかった。
【０２６４】
各条件について８回の再現を実行した。検出プローブは酵素試薬を介して、反応当たり４ｐｍｏｌを添加した。ＨＣＶ  ＡＭＰ試薬は、反応当たりプロモーターオリゴヌクレオチド１２ｐｍｏｌ、エクステンダオリゴヌクレオチド１２ｐｍｏｌおよびプライミングオリゴヌクレオチド１２ｐｍｏｌを含有していた。
【０２６５】
第１の実験セットは、ＨＣＶ転写物の複製がＴＣＲまたはＡＭＰ試薬中にスパイクされなかった反応の結果と、ＨＣＶ転写物の１ｘ１０６個の複製がＴＣＲ中にスパイクされた反応の結果を比較した。図１７は、標的が増幅試薬内にスパイクされなかったＨＣＶ増幅の生曲線を示す。ＨＣＶ転写物がＴＣＲまたはＡＭＰ試薬中にスパイクされなかったときには検出可能な増幅はなかったが、ＴＣＲ中にＨＣＶ転写物の複製１ｘ１０６個を含有する反応の平均ＴＴｉｍｅは６．３分であった。「ＴＴｉｍｅ」値は、出現の時間（シグナルがバックグラウンドを超えて上昇する時間）に関連しており、実施した実験についてのこれらの値のまとめを下の表１に示す。
【０２６６】
第２の実験セットは、ＨＣＶ転写物の複製１ｘ１０６個がＡＭＰ試薬のみにスパイクされた反応の結果と、ＨＣＶ転写物の複製１ｘ１０６個がＴＣＲのみにスパイクされた反応と比較した。図１８は、標的がＡＭＰ試薬中にスパイクされたＨＣＶ増幅の生曲線を示す。ＨＣＶ転写物がＡＭＰ試薬中にスパイクされたときには検出可能な増幅はなかったが、ＴＣＲ中にＨＣＶ転写物の複製１ｘ１０６個を含有する反応の平均ＴＴｉｍｅは６．３分であった（表１）。ＴＣサンプル中のゼロ標的は、ＨＣＶ転写物の複製１００万個がＡＭＰ試薬中にスパイクされても増幅しなかった。
【０２６７】
第３の実験セットは、ＨＣＶ転写物の複製１ｘ１０６個およびタグ化プライミングオリゴヌクレオチドがＡＭＰ試薬中に供給された（ＴＣＲ中にはＨＣＶ転写物の複製なし）反応の結果を、ＨＣＶ転写物の複製１ｘ１０６個がＴＣＲ中に供給され、タグ化プライミングオリゴヌクレオチドがＡＭＰ試薬中に供給された反応の結果と比較した。図１９は、タグ化プライミングオリゴヌクレオチドおよび終結オリゴヌクレオチドがＡＭＰ試薬中にスパイクされた標的捕捉ステップのみに存在するＨＣＶ転写物の複製１００万個のＡｖｇＴＴｉｍｅが７．２分であったことを示す。標的、終結オリゴヌクレオチドおよびタグ化プライミングオリゴヌクレオチドがＡＭＰ試薬中にスパイクされたゼロサンプルも、ＡｖｇＴＴｉｍｅ＝８．６分で強い増幅を生じた（表１）。
【０２６８】
【表１】
2009539379.tif 000002
これらの実験結果は、タグ化プライミングオリゴヌクレオチドがＡＭＰ試薬中にプライミングオリゴヌクレオチド共に存在するときのみに、ＨＣＶ転写物の複製１００万個がＡＭＰ試薬中にスパイクされたときにゼロＴＣＲサンプルが増幅したことを証明している。それゆえＡＭＰ試薬を通じて系に入るＨＣＶ転写物は、タグ化プライミングオリゴヌクレオチドもＡＭＰ試薬と共に供給されない限り増幅されない。
【０２６９】
上の実施例は、ＨＣＶテンプレートにハイブリダイズされたタグ化プライミングオリゴヌクレオチドが、標的捕捉ステップに続いて導入された夾雑核酸から妨害されずに、興味のあるサンプル中のＨＣＶ核酸を選択的に検出するためにどのように使用されうるかを示した。次の実施例は、増幅反応を実施するために使用された試薬中の夾雑テンプレートの存在にかかわらず、興味のあるサンプル中の細菌核酸を検出するために同様の手法がどのように使用されたかを示す。好都合なことに、タグ化プライミングオリゴヌクレオチドおよびテンプレートが増幅反応にて使用されるＤＮＡポリメラーゼに接触したときには、非複合体化タグ化プライミングオリゴヌクレオチドは、反応混合物中には実質的に存在していなかった。
【０２７０】
下の実施例２はＥ．コリｒＲＮＡ核酸を増幅するための２つの手順について説明し、該手順はタグ化プライミングオリゴヌクレオチドおよび標的捕捉の両方の使用で異なっている。第１の手順は、Ｅ．コリ特異的非タグ化プライミングオリゴヌクレオチドを、終結オリゴヌクレオチド、プロモーターオリゴヌクレオチドおよび検出プローブと組合せて使用した。第２の手順は、第１の手順のＥ．コリ特異的非タグ化プライミングオリゴヌクレオチドに含有されたものと同一の標的相補性配列を有するタグ化プライミングオリゴヌクレオチド、タグ特異的プライミングオリゴヌクレオチドはもちろんのこと、終結オリゴヌクレオチド、プロモーターオリゴヌクレオチドおよび検出プローブを使用した。ＨＩＶ−１のセグメントに相当するヌクレオチド配列を有するタグ特異的プライミングオリゴヌクレオチドは、タグ化プライミングオリゴヌクレオチドに含有されたタグ配列の相補体にハイブリダイズしたが、Ｅ．コリｒＲＮＡテンプレート核酸またはその相補体にハイブリダイズしなかった。第２の手順の場合、終結オリゴヌクレオチド、プロモーターオリゴヌクレオチド、検出プローブは、第１手順で使用したものと同一であった。下で示すように、タグ化プライミングオリゴヌクレオチドを省略した増幅反応は、合成Ｅ．コリｒＲＮＡ標的の複製０および１０６個を含有するサンプルを識別できなかった。反対に、タグ化プライミングオリゴヌクレオチドおよび標的捕捉の使用を含む手法は、合成Ｅ．コリｒＲＮＡ標的の複製０および１０６個の複製を含有するサンプルを明らかに識別した。
【０２７１】
（実施例２）
タグ化プライミングオリゴヌクレオチドの使用は、サンプル由来テンプレートと外来テンプレートとの識別を可能にする
Ａ．標的捕捉なしで非タグ化プライミングオリゴヌクレオチドを使用する増幅
第１の手順において、合成Ｅ．コリｒＲＮＡテンプレートを使用する増幅反応は、該テンプレートにハイブリダイズした非タグ化プライミングオリゴヌクレオチド、プロモーター、終結オリゴヌクレオチドおよび分子トーチ検出プローブを使用して実施した。反応は、反応混合物中に複製０または１０６個／反応で直接添加された合成テンプレート（すなわち標的捕捉精製を受けずに）を使用してプライミングした。分子トーチ検出プローブは、単位複製配列産生を時間の関数として監視するために使用した。下に示すヌクレオチド配列において、ポリヌクレオチド主鎖の２’−Ｏ−メチルリボース（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾は、小文字「ｍ」で示す。プロモーターオリゴヌクレオチドおよび終結オリゴヌクレオチドの３’末端における遮断部分は、３’−ジメチルトリチル−Ｎ−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン、５’−スクシノイル−長鎖アルキルアミノ−ＣＰＧ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ；Ｃａｔ．Ｎｏ．２０−０１０２−０１）を使用して調製した３’→３’リンケージを含んでいた。手順で使用するオリゴヌクレオチド、試薬および本質的方法は、次の通りであった。
【０２７２】
Ｉ．オリゴヌクレオチド：
１．非タグ化プライミングオリゴヌクレオチド：
ＣｍＵｍＧｍＣｍＴＧＧＣＡＣＧＧＡＧＴＴＡＧＣＣＧＧＴＧＣＴＴＣ（配列番号９）
２．プロモーターオリゴヌクレオチド：
ＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧＡＡＧＧＣＣＴＴＣＧＧＧＴＴＧＴＡＡＡＧ−遮断（配列番号１０）
３．終結オリゴヌクレオチド：
ＧｍＣｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＡｍＵｍＡｍＣｍＡｍＣｍＧｍＣｍＧｍ−遮断（配列番号１１）
４．検出プローブ：
１ＣｍＵｍＧｍＣｍＧｍＧｍＧｍＵｍＡｍＡｍＣｍＧｍＵｍＣｍＡｍＡｍＵｍＧｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＡｍ２ＣＧＣＡＧ３（配列番号１２）
１フルオレセイン
２Ｃ９リンカー
３ＤＡＢＣＹＬ
５．合成Ｅ．コリｒＲＮＡテンプレート：
ＡＡＡＴＴＧＡＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＡＴＧＧＣＴＣＡＧＡＴＴＧＡＡＣＧＣＴＧＧＣＧＧＣＡＧＧＣＣＴＡＡＣＡＣＡＴＧＣＡＡＧＴＣＧＡＡＣＧＧＴＡＡＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＴＴＧＣＴＴＣＴＴＴＧＣＴＧＡＣＧＡＧＴＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴＡＡＴＧＴＣＴＧＧＧＡＡＡＣＴＧＣＣＴＧＡＴＧＧＡＧＧＧＧＧＡＴＡＡＣＴＡＣＴＧＧＡＡＡＣＧＧＴＡＧＣＴＡＡＴＡＣＣＧＣＡＴＡＡＣＧＴＣＧＣＡＡＧＡＣＣＡＡＡＧＡＧＧＧＧＧＡＣＣＴＴＣＧＧＧＣＣＴＣＴＴＧＣＣＡＴＣＧＧＡＴＧＴＧＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＡＴＴＡＧＣＴＡＧＴＡＧＧＴＧＧＧＧＴＡＡＣＧＧＣＴＣＡＣＣＴＡＧＧＣＧＡＣＧＡＴＣＣＣＴＡＧＣＴＧＧＴＣＴＧＡＧＡＧＧＡＴＧＡＣＣＡＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＡＡＣＴＧＡＧＡＣＡＣＧＧＴＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴＧＧＧＧＡＡＴＡＴＴＧＣＡＣＡＡＴＧＧＧＣＧＣＡＡＧＣＣＴＧＡＴＧＣＡＧＣＣＡＴＧＣＣＧＣＧＴＧＴＡＴＧＡＡＧＡＡＧＧＣＣＴＴＣＧＧＧＴＴＧＴＡＡＡＧＴＡＣＴＴＴＣＡＧＣＧＧＧＧＡＧＧＡＡＧＧＧＡＧＴＡＡＡＧＴＴＡＡＴＡＣＣＴＴＴＧＣＴＣＡＴＴＧＡＣＧＴＴＡＣＣＣＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＣＡＣＣＧＧＣＴＡＡＣＴＣＣＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＧＡＧＧＧＴＧＣＡＡＧＣＧＴＴＡＡＴＣＧＧＡＡＴＴＡＣＴＧＧＧＣＧＴＡＡＡＧＣＧＣＡＣＧＣＡＧＧＣＧＧＴＴＴＧＴＴＡＡＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＡＡＡＴＣＣＣＣＧＧＧＣＴＣＡＡＣＣＴＧＧＧＡＡＣＴＧＣＡＴＣＴＧＡＴＡＣＴＧＧＣＡＡＧＣＴＴＧＡＧＴＣＴＣＧＴＡＧＡＧＧＧＧＧＧＴＡＧＡＡＴＴＣＣＡＧＧＴＧＴＡＧＣＧＧＴＧＡＡＡＴＧＣＧＴＡＧＡＧＡＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＴＡＣＣＧＧＴＧＧＣＧＡＡＧＧＣＧＧＣＣＣＣＣＴＧＧＡＣＧＡＡＧＡＣＴＧＡＣＧＣＴＣＡＧＧＴＧＣＧＡＡＡＧＣＧＴＧＧＧＧＡＧＣＡＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＴＡＧＴＣＣＡＣＧＣＣＧＴＡＡＡＣＧＡＴＧＴＣＧＡＣＴＴＧＧＡＧＧＴＴＧＴＧＣＣＣＴＴＧＡＧＧＣＧＴＧＧＣＴＴＣＣＧＧＡＧＣＴＡＡＣＧＣＧＴＴＡＡＧＴＣＧＡＣＣＧＣＣＴＧＧＧＧＡＧＴＡＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＧＴＴＡＡＡＡＣＴＣＡＡＡＴＧＡＡＴＴＧＡＣＧＧＧＧＧＣＣＣＧＣＡＣＡＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧＣＡＴＧＴＧＧＴＴＴＡＡＴＴＣＧＡＴＧＣＡＡＣＧＣＧＡＡＧＡＡＣＣＴＴＡＣＣＴＧＧＴＣＴＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＧＧＡＡＧＴＴＴＴＣＡＧＡＧＡＴＧＡＧＡＡＴＧＴＧＣＣＴＴＣＧＧＧＡＡＣＣＧＴＧＡＧＡＣＡＧＧＴＧＣＴＧＣＡＴＧＧＣＴＧＴＣＧＴＣＡＧＣＴＣＧＴＧＴＴＧＴＧＡＡＡＴＧＴＴＧＧＧＴＴＡＡＧＴＣＣＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣＴＴＡＴＣＣＴＴＴＧＴＴＧＣＣＡＧＣＧＧＴＣＣＧＧＣＣＧＧＧＡＡＣＴＣＡＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＣＣＡＧＴＧＡＴＡＡＡＣＴＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＧＡＴＧＡＣＧＴＣＡＡＧＴＣＡＴＣＡＴＧＧＣＣＣＴＴＡＣＧＡＣＣＡＧＧＧＣＴＡＣＡＣＡＣＧＴＧＣＴＡＣＡＡＴＧＧＣＧＣＡＴＡＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧＣＧＡＣＣＴＣＧＣＧＡＧＡＧＣＡＡＧＣＧＧＡＣＣＴＣＡＴＡＡＡＧＴＧＣＧＴＣＧＴＡＧＴＣＣＧＧＡＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＣＡＡＣＴＣＧＡＣＴＣＣＡＴＧＡＡＧＴＣＧＧＡＡＴＣＧＣＴＡＧＴＡＡＴＣＧＴＧＧＡＴＣＡＧＡＡＴＧＣＣＡＣＧＧＴＧＡＡＴＡＣＧＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＴＧＧＧＴＴＧＣＡＡＡＡＧＡＡＧＴＡＧＧＴＡＧＣＴＴＡＡＣＣＴＴＣＧＧＧＡＧＧＧＣＧＣＴＴＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＧＡＴＴＣＡＴＧＡＣＴＧＧＧＧＴＧＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧＴＡＡＣＣＧＴＡＧＧＧＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧＴＴＧＧＡＴＣＡＣＣＴＣＣＴＴＡ（配列番号１３）。
【０２７３】
ＩＩ．試薬および他のプロトコル情報：
増幅および酵素試薬は、本質的に実施例１で記載した通りであった。Ｅ．コリテンプレートにハイブリダイズした非タグ化プライミングオリゴヌクレオチドを使用する手順は、標的捕捉オリゴヌクレオチドまたは試薬を使用せず、搬送培地または洗浄溶液を使用せず、エクステンダオリゴヌクレオチドを使用しなかった。
【０２７４】
Ａ．リアルタイム増幅プロトコル
サンプル溶液は、無プライマー増幅試薬、非タグ化プライミングオリゴヌクレオチド、プロモーターオリゴヌクレオチド、終結オリゴヌクレオチド、検出プローブおよび合成テンプレート核酸を使用して調製した。９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに調製したサンプル溶液の一定分量３０μＬを添加した。マイクロタイタープレートを接着テープシールで覆って、最初にＤＮＡ  ＥＮＧＩＮＥ  ＯＰＴＩＣＯＮ（登録商標）２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）温度制御リアルタイム機器内で６０℃にて１０分間にインキュベートして、次に４２℃で５分間温度調整した。その後、プレートをリアルタイム機器から取り出して、４２℃のサーモミキサに置いた。各反応ウェルに酵素試薬の一定分量１０μＬを添加した。マイクロタイタープレートを接着テープシールで覆って、サーモミキサ上で静かに３０秒間振とうして、次に４２℃のリアルタイム機器内に置いて、そこでリアルタイムアッセイ監視を開始した。合成した単位複製配列の量の指標として作用するＴＴｉｍｅ値は、監視した蛍光シグナルから決定した。
【０２７５】
ＩＩＩ．結果および結論
図２０に示すように、実質的に同一の結果がテンプレート核酸の複製０個または１０６個のどちらかを含む反応にて観察されたので、アッセイはこれらの２つの条件の識別を示さなかった。さらに詳細には、Ｅ．コリ核酸増幅生成物の形成を示す蛍光シグナルは、両方の反応にて実質的に同じ時間にてバックグラウンドレベルから出現した（すなわちＴＴｉｍｅ＝複製０個レベルにて３１．７４分、複製１０６個レベルにて３１．１９分）。それゆえ高レベルの核酸テンプレートの特徴を示すリアルタイム増幅プロフィールが、添加されたＥ．コリｒＲＮＡテンプレートの非存在時にさえ得られる。このことは標的捕捉手順後に増幅反応を実施するために使用した１つ以上の試薬中の夾雑細菌性核酸テンプレートの存在と一致していた。
【０２７６】
Ｂ．タグ化プライミングオリゴヌクレオチドおよび標的捕捉を使用する増幅
第２の手順において、タグ化プライミングオリゴヌクレオチドおよび標的捕捉ステップは、合成Ｅ．コリ転写物の複製０個、１０３個または１０５個のいずれかを含有する試験サンプルを使用する増幅反応を実施するために使用した。手順で使用するオリゴヌクレオチドを下に示す。分子トーチ検出プローブは、酵素試薬の構成要素として添加した。標的捕捉の後、テンプレート核酸にハイブリダイズされなかったタグ化プライミングオリゴヌクレオチドは、標準標的捕捉および洗浄ステップによって系から除去した。ｒＲＮＡテンプレートおよびタグ化プライミングオリゴヌクレオチドを含有した複合体は、超常磁性粒子に捕捉されたままであった。増幅反応は、実施例１で使用した配列特異的捕捉プローブの非特異的標的捕捉プローブによる置換を除いて、実質的に上記と同じ試薬を使用して実施した。増幅反応は、再現６回で実施して、エクステンダオリゴヌクレオチドを省略したことを除いて、実施例１に記載したのと本質的に同じ分子トーチ検出プローブを使用して監視した。上のように、下に示す配列中のポリヌクレオチド主鎖の２’−Ｏ−メチルリボース（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾は、小文字「ｍ」で示す。プロモーターオリゴヌクレオチドおよび終結オリゴヌクレオチドの３’末端における遮断部分は、３’−ジメチルトリチル−Ｎ−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン、５’−スクシノイル−長鎖アルキルアミノ−ＣＰＧ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ；Ｃａｔ．Ｎｏ．２０−０１０２−０１）を使用して調製した３’→３’リンケージを含んでいた。手順で使用するオリゴヌクレオチド、試薬および本質的方法は、次の通りであった。
【０２７７】
Ｉ．オリゴヌクレオチド：
１．タグ化プライミングオリゴヌクレオチド：
ＧＴＴＴＧＴＡＴＧＴＣＴＧＴＴＧＣＴＡＴＴＡＴＧＴＣＴＡＣＣＴＧＣＴＧＧＣＡＣＧＧＡＧＴＴＡＧＣＣＧＧＴＧＣＴＴＣ（配列番号１４）
２．タグ特異的プライミングオリゴヌクレオチド：
ＧＴＴＴＧＴＡＴＧＴＣＴＧＴＴＧＣＴＡＴＴＡＴ（配列番号１５）
３．プロモーターオリゴヌクレオチド：
ＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧＡＡＧＧＣＣＴＴＣＧＧＧＴＴＧＴＡＡＡＧ−遮断（配列番号１０）
４．終結オリゴヌクレオチド：
ＧｍＣｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＡｍＵｍＡｍＣｍＡｍＣｍＧｍＣｍＧｍ  −  遮断（配列番号１１）
５．非特異的捕捉プローブ：
ＫｍＫｍＫｍＫｍＫｍＫｍＫｍＫｍＫｍＫｍＫｍＫｍＫｍＫｍＫｍＫｍＫｍＫｍＴＴＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号１６）
６．検出プローブ：
１ＣｍＵｍＧｍＣｍＧｍＧｍＧｍＵｍＡｍＡｍＣｍＧｍＵｍＣｍＡｍＡｍＵｍＧｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＡｍ２ＣＧＣＡＧ３（配列番号１２）
１フルオレセイン
２Ｃ９リンカー
３ＤＡＢＣＹＬ。
【０２７８】
７．合成Ｅ．コリｒＲＮＡテンプレート（上を参照）
ＩＩ．試薬および他のプロトコル情報
試薬および実験プロトコルは本質的に実施例１で記載した通りであり、第１および第２捕捉オリゴヌクレオチドの非特異的標的捕捉オリゴヌクレオチドによる置換、ＨＣＶ特異的オリゴヌクレオチドの上で示したＥ．コリ特異的オリゴヌクレオチドによる置換、およびエクステンダオリゴヌクレオチドの省略を伴う。
【０２７９】
ＩＩＩ．非特異的標的捕捉プロトコル
Ａ．標的捕捉試薬（ＴＣＲ）の調製
磁気ビーズのストック懸濁物を室温にて３０分間混合した。磁気ビーズ懸濁物の一定分量約１５０μＬをＴＣＲ希釈物５ｍＬ（５０μＬ／サンプルを使用したときに１５μｇビーズ／反応）に添加して、次に室温にて３０分間ゆっくり混合した。次に非特異的捕捉オリゴヌクレオチドをＴＣＲ混合物５ｍＬに添加して、最終濃度０．１２ｐｍｏｌ／μＬを得た。調製したＴＣＲを必要とされるまで室温でゆっくり撹拌した。
【０２８０】
Ｂ．サンプル調製
増幅溶液は、無プライマー増幅試薬、プロモーターオリゴヌクレオチドおよび非特異的プライミングオリゴヌクレオチドを使用して調製した。調製した増幅溶液はボルテックスすることによって混合して、必要とされるまで２〜８℃に維持した。分子トーチ検出プローブを含有する酵素試薬を次に調製して、必要とされるまで２〜８℃に維持した。テンプレートｒＲＮＡの希釈物は、０．２％  ＬＬＳ（ラウリル硫酸リチウム）で調製した。磁気ビーズ標的捕捉溶液の一定分量（５０μＬ）をＫＩＮＧＦＩＳＨＥＲ  ９６（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．；Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）磁気粒子プロセッサのマイクロタイタープレートのウェルに移した。希釈テンプレート、タグ化プライミングオリゴヌクレオチドおよび終結オリゴヌクレオチドのサンプルを次に、水で希釈した５０％搬送培地１．５ｍＬに添加した。標的含有サンプル混合物をボルテックスにかけて、一定分量１５０μＬを、標的捕捉溶液５０μＬを含有するマイクロタイタープレート（プレート１）ウェルに移した（各ウェルは、Ｅ．コリ転写物の複製０、１０３または１０５個ならびにタグ化プライミングオリゴヌクレオチドおよび終結オリゴヌクレオチドの適切な量を含有していた）。
【０２８１】
Ｃ．標的捕捉プロトコル
最初に、洗浄試薬２００μＬを含有するマイクロタイタープレート（プレート２）を作製した。増幅反応を実施するための、反応に使用される増幅試薬３０μＬを含有する各ウェルを備えた別のマイクロタイタープレート（プレート３）を作製した。３個のプレートすべて（プレート１〜３）を磁気粒子プロセッサユニット内に装填した。磁気ビーズを持つ核酸複合体は、に当分野の通常の技能レベルを有する当業者に知られた標準手順を使用して、プレート１から単離して、プレート２で洗浄し、次にプレート３に移した。プレート３を磁気粒子プロセッサユニットから取り出して、接着テープシールで覆い、次に温度制御リアルタイム機器内に置いた。
【０２８２】
Ｄ．リアルタイム増幅プロトコル
プレート３をリアルタイム機器で４２℃にて５分間インキュベートした。マイクロタイタープレートをリアルタイム機器から取り出して、４２℃のサーモミキサに置いた。各反応ウェルに検出プローブを含有する酵素試薬の一定分量１０μＬを添加して、次に接着テープシールで覆った。プレートをサーモミキサ上で静かに６０秒間振とうして、次に４２℃のリアルタイム機器内に再度置いて、そこでリアルタイムアッセイ監視を開始した。合成した単位複製配列の量の指標として作用するＴＴｉｍｅ値は、監視した蛍光シグナルから決定した。
【０２８３】
ＩＶ．結果および結論
図２１は、開示した核酸増幅の手法の利点をグラフで示す。興味のある標的に相補性であるタグ化プライミングオリゴヌクレオチド、標的捕捉ステップ、および興味のある標的（すなわちＥ．コリｒＲＮＡ）に相補性でないタグ特異的プライミングオリゴヌクレオチドを使用した手順は、劇的に低下したバックグラウンド増幅レベルを生じたので、細菌テンプレート核酸の複製の０個または１０３個の識別を容易に可能にした。さらに詳細には、Ｅ．コリの複製１０５個、１０３個、および０個を使用して実施した反応について決定された平均ＴＴｉｍｅ値はそれぞれ２４．７分、３０．６分および３７．５分であった。図４に示した結果とまとめると、これらの発見は、試験管内核酸反応を実施するために使用した共通の試薬中の細菌由来核酸の存在と一致していた。この事実にもかかわらず、タグ化プライミングオリゴヌクレオチドを使用する手順は、増幅試薬が寄与した外来性テンプレート核酸から妨害されることなく、試験サンプル中に含有されたＥ．コリ核酸を検出するのに有用であった。たとえば試験サンプル中の複製１０３個以上のレベルでＥ．コリ核酸を検出する定量的アッセイは、閾値蛍光シグナル、または所定の反応時間（たとえば３５分）後のＴＴｉｍｅ値を達成することに依存しうる。
【０２８４】
次の実施例は、２つの異なる検出プローブがリアルタイム増幅実験曲線のプロフィールにどのように影響を及ぼしたかを示す比較結果を示す。結果はさらに、タグ化プライミングオリゴヌクレオチド手法が、合成Ｅ．コリテンプレート核酸の複製０個または１０３個−単一の細菌に存在する１６Ｓ  ｒＲＮＡの複製の数に近づくレベルを識別するためにどのように使用されうるかを示した。
【０２８５】
実施例３は、３つの異なる検出プローブを使用するリアルタイム増幅反応におけるＥ．コリｒＲＮＡテンプレートの検出について述べる。
【０２８６】
（実施例３）
代わりのトーチ設計がアッセイ結果を改善できる
増幅反応は、３つの異なる検出プローブのうち１つを使用してリアルタイム形式で実施および監視した。反応を実施するために使用した合成テンプレート核酸、非特異的捕捉オリゴヌクレオチド、タグ化プライミングオリゴヌクレオチド、終結オリゴヌクレオチド、プロモーターオリゴヌクレオチドおよびタグ特異的プライミングオリゴヌクレオチドは、先の実施例の第２の手順で使用したものと同じであった。タグ化プライミングオリゴヌクレオチドのＥ．コリ標的ハイブリダイズ部分は、配列番号：１４のヌクレオチド部分２４〜５７（すなわち配列番号：１９に相当する標的ハイブリダイズ配列）に相当した。プロモーターオリゴヌクレオチドのＥ．コリ標的ハイブリダイズ部分は、配列番号：１０のヌクレオチド部分２７〜４７（すなわち配列番号：２０に相当する標的ハイブリダイズ配列）に相当した。各条件について４回の再現を実行した。前と同様に、検出プローブを酵素試薬と共に添加した。非特異的標的捕捉、サンプル調製、およびリアルタイム増幅の試薬およびプロトコルも本質的に、先の実施例の第２の手順で記載した通りであった。特に反応は合成Ｅ．コリテンプレートの複製０、１０３または１０５個を使用して実施した。上のように、下に示す配列中のポリヌクレオチド主鎖の２’−Ｏ−メチルリボース（ＯＭｅ）修飾は、小文字「ｍ」で示す。プロモーターオリゴヌクレオチドおよび終結オリゴヌクレオチドの３’末端における遮断部分は、３’−ジメチルトリチル−Ｎ−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン、５’−スクシノイル−長鎖アルキルアミノ−ＣＰＧ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ；Ｃａｔ．Ｎｏ．２０−０１０２−０１）を使用して調製した３’→３’リンケージを含んでいた。手順で使用するオリゴヌクレオチド、試薬および本質的方法は、次の通りであった。
Ｉ．オリゴヌクレオチド：
１．タグ化プライミングオリゴヌクレオチド：
ＧＴＴＴＧＴＡＴＧＴＣＴＧＴＴＧＣＴＡＴＴＡＴＧＴＣＴＡＣＣＴＧＣＴＧＧＣＡＣＧＧＡＧＴＴＡＧＣＣＧＧＴＧＣＴＴＣ（配列番号１４）
２．タグ特異的プライミングオリゴヌクレオチド：
ＧＴＴＴＧＴＡＴＧＴＣＴＧＴＴＧＣＴＡＴＴＡＴ（配列番号１５）
３．プロモーターオリゴヌクレオチド：
ＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧＡＡＧＧＣＣＴＴＣＧＧＧＴＴＧＴＡＡＡＧ−遮断（配列番号１０）
４．終結オリゴヌクレオチド：
ＧｍＣｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＡｍＵｍＡｍＣｍＡｍＣｍＧｍＣｍＧｍ−遮断（配列番号１１）
５．非特異的捕捉プローブ：
ＫｍＫｍＫｍＫｍＫｍＫｍＫｍＫｍＫｍＫｍＫｍＫｍＫｍＫｍＫｍＫｍＫｍＫｍＴＴＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号１６）
６．検出プローブ：
１ＣｍＧｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＡｍＧｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＡｍＡｍＣｍ２ＧｍＣｍＵｍＣｍＧｍ３（配列番号１７）
１ＣｍＧｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＡｍＧｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＵｍＡｍＣｍＵｍＣｍ２ＧｍＣｍＵｍＣｍＧｍ３（配列番号１８）
１フルオレセイン
２Ｃ９リンカー
３ＤＡＢＣＹＬ。
【０２８７】
７．合成Ｅ．コリｒＲＮＡテンプレート：
（上を参照）。
【０２８８】
ＩＩ．試薬および他のプロトコル情報
試薬および実験プロトコルは、標的捕捉に使用した条件のわずかな変更を伴って、本質的に実施例２に記載した通りであった。
【０２８９】
ＩＩＩ．非特異的標的捕捉プロトコル：
Ａ．標的捕捉試薬（ＴＣＲ）の調製
磁気ビーズのストック懸濁物を室温にて２５分間混合した。磁気ビーズ懸濁物の一定分量１５０μＬをＴＣＲ希釈物５ｍＬ（５０μＬ／サンプルを使用したときに１５μｇビーズ／反応）に添加して、次に室温にて２５分間ゆっくり混合した。次に非特異的捕捉オリゴヌクレオチドをＴＣＲ混合物５ｍＬに添加して、最終濃度０．１２ｐｍｏｌ／μＬを得た。調製したＴＣＲを必要とされるまで室温でゆっくり撹拌した。
【０２９０】
Ｂ．サンプル調製
増幅溶液は、無ＡＭＰ増幅試薬、プロモーターオリゴヌクレオチドおよび非特異的プライミングオリゴヌクレオチドを使用して調製した。調製した増幅溶液はボルテックスにかけることによって混合して、必要とされるまで２〜８℃に維持した。分子トーチ検出プローブを含有する酵素試薬を次に調製して、必要とされるまで２〜８℃に維持した。テンプレートｒＲＮＡの希釈物は、上記のように０．２％  ＬＬＳで調製した。磁気ビーズ標的捕捉溶液の一定分量（５０μＬ）をＫＩＮＧＦＩＳＨＥＲ  ９６（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．；Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）磁気粒子プロセッサのマイクロタイタープレートのウェルに移した。希釈テンプレート、タグ化プライミングオリゴヌクレオチドおよび終結オリゴヌクレオチドのサンプルを次に、水で希釈した５０％搬送培地１．５ｍＬに添加した。標的含有サンプル混合物をボルテックスにかけて、一定分量１５０μＬを、標的捕捉溶液５０μＬを含有するマイクロタイタープレート（プレート１）ウェルに移した（各ウェルは、Ｅ．コリ転写物の複製０、１０３または１０５個ならびにタグ化プライミングオリゴヌクレオチドおよび終結オリゴヌクレオチドの適切な量を含有していた）。
【０２９１】
Ｃ．標的捕捉プロトコル
マイクロタイタープレート（プレート１）を、ＳＯＬＯ  ＨＴインキュベータ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｔｍｓ；Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭＡ）を使用して６０℃にて１５分間インキュベートした。次にマイクロタイタープレートを室温のベンチ上に置いて、５分間にわたって平衡にした（プレート１）。最初に、洗浄試薬２００μＬを含有する第２のマイクロタイタープレート（プレート２）を作製した。増幅反応を実施するための、反応に使用される増幅試薬３０μＬを含有する各ウェルを備えた第３のマイクロタイタープレート（プレート３）を作製した。３個のプレートすべてを磁気粒子プロセッサユニット内に装填した。磁気ビーズを持つ核酸複合体は、に当分野の通常の技能レベルを有する当業者に知られた標準手順を使用して、プレート１から単離して、プレート２で洗浄し、次にプレート３に移した。プレート３を磁気粒子プロセッサユニットから取り出して、接着テープシールで覆い、次に温度制御リアルタイム機器内に置いた。
【０２９２】
Ｄ．リアルタイム増幅プロトコル
プレート３をリアルタイム機器で４２℃にて５分間インキュベートした。マイクロタイタープレートをリアルタイム機器から取り出して、４２℃のサーモミキサに置いた。各反応ウェルに検出プローブを含有する酵素試薬の一定分量１０μＬを添加して、次に接着テープシールで覆った。プレートをサーモミキサ上で静かに６０秒間振とうして、次に４２℃のリアルタイム機器内に再度置いて、そこでリアルタイムアッセイ監視を開始した。合成した単位複製配列の量の指標として作用するＴＴｉｍｅ値は、監視した蛍光シグナルから決定した。
【０２９３】
ＩＶ．結果および結論
表２に示す結果に、異なる検出プローブを使用して実施した反応の、平均ＴＴｉｍｅ値（列３）、および平均ＴＴｉｍｅ値の標準偏差（列４）をまとめる。表形式のまとめは、試験した検出プローブすべてがリアルタイムアッセイで非常に良好な結果を生じたことを確認した。各プローブは好都合に、入力標識の複製０個のレベルの非常に低いシグナルを与えた。さらに詳細には、入力合成テンプレートの複製０個を使用して実施した反応にて検出された単位複製配列は、反応が配列番号：１７および配列番号：１８の検出プローブを含むときには本質的に検出不能であった。それゆえ検配列番号：１７および配列番号：１８によって同定された検出プローブの１つを含む反応は、単一の細菌に含有された量にほぼ相当するテンプレート核酸の検出を容易に可能にする顕著な結果を与えた。
【０２９４】
【表２】
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実施例２および３で示した結果を考慮すると、配列番号：１２、および１７〜１８はそれぞれ、本明細書に記載した方法を使用してＥ．コリを検出するための好ましい分子トーチを表す。Ｅ．コリ核酸を検出するのに有用な非常に好ましいプローブは、配列番号：１２のプローブ内に含有されたヌクレオチド位置２〜２４（すなわち配列番号：２１に相当する標的ハイブリダイズ配列）、または配列番号：１７のプローブ内に含有されたヌクレオチド位置２〜１７（すなわち配列番号：２２に相当する標的ハイブリダイズ配列）、または配列番号：１８のプローブ内に含有されたヌクレオチド位置２〜２４（すなわち配列番号：２３に相当する標的ハイブリダイズ配列）に相当する標的相補性配列を有するであろう。一般的に言えば、Ｅ．コリ核酸を検出するのに有用なプローブは、ＴＧＣＧＧＧＴＡＡＣＧＴＣＡＡＴＧＡＧＣＡＡＡＧＧＴＡＴＴＡＡＣＴＴＴＡＣＴＣ（配列番号：２４）の配列内に含有された少なくとも１６の連続ヌクレオチドの標的ハイブリダイズ配列を有するであろう。所望のプローブの好ましい長さ全体は、最大３９ヌクレオチド、さらに好ましくは最大２９ヌクレオチド、さらに好ましくは最大２３ヌクレオチド、またはなおさらに好ましくは最大１６ヌクレオチドであろう。もちろん有用なプローブはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基を含み、上記のプローブの相補体を含みうる。
【０２９５】
本発明はある好ましい実施形態を参照してかなり詳細に説明および提示されてきたが、当業者は本発明の他の実施形態をただちに認識するであろう。したがって本発明は、以下の添付請求項の精神および範囲に含まれるすべての修飾態様および変更態様を含むと見なされる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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