(57)【要約】本発明は、新規なμ−コノトキシンぺプチド、それらの生物学的に活性なフラグメント、それらの組み合わせおよび／またはそれらの異形に関する。また、本発明は、痛みを治療または予防するための医薬組成物におけるそれらの使用および麻酔薬の調製におけるそれらの使用に関する。
2009514545.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列：Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｃｙｓ−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ｘａａ１１−Ｃｙｓ−Ｘａａ１２−Ｘａａ１３−Ｘａａ１４−Ｘａａ１５−Ｘａａ１６−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘａａ１７（配列番号１）を実質的に含む、μ−コノトキシンペプチド、それらの生物学的に活性なフラグメント、それらの塩、それらの組み合わせおよび／またはそれらの異形。
（上記式中、Ｘａａ１はＮ−修飾アミノ酸であり、
Ｘａａ２はグリシンであり、
Ｘａａ３は酸性アミノ酸またはそのアミドであり、
Ｘａａ４はグリシンであり、
Ｘａａ５はプロリンまたはヒドロキシプロリンであり、
Ｘａａ６は塩基性アミノ酸であり、
Ｘａａ７はグリシンであり、
Ｘａａ８は非芳香族ヒドロキシアミノ酸であり、
Ｘａａ９は非芳香族ヒドロキシアミノ酸であり、
Ｘａａ１０は塩基性アミノ酸であり、
Ｘａａ１１は芳香族アミノ酸であり、
Ｘａａ１２は塩基性アミノ酸であり、
Ｘａａ１３は酸性アミノ酸またはそのアミドであり、
Ｘａａ１４は塩基性アミノ酸または硫黄含有アミノ酸であり、
Ｘａａ１５は疎水性または無極性アミノ酸、あるいは非芳香族ヒドロキシアミノ酸であり、
Ｘａａ１６は塩基性アミノ酸であり、
Ｘａａ１７は存在しないか、無極性アミノ酸またはアミド基である。）
【請求項２】
請求項１において、
アミノ酸Ｘａａ３，Ｘａａ４，Ｘａａ５，Ｘａａ６，およびＸａａ７またはそれらの任意の組み合わせからなる少なくとも１つのアミノ酸を有さない、μ−コノトキシンペプチド。
【請求項３】
請求項１において、
アミノ酸Ｘａａ８，Ｘａａ９，Ｘａａ１０，およびＸａａ１１またはそれらの任意の組み合わせからなる少なくとも１つのアミノ酸を有さない、μ−コノトキシンペプチド。
【請求項４】
請求項１において、
アミノ酸Ｘａａ１２，Ｘａａ１３，Ｘａａ１４，Ｘａａ１５，およびＸａａ１６またはそれらの任意の組み合わせからなる少なくとも１つのアミノ酸を有さない、μ−コノトキシンペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかにおいて、
前記アミノ酸Ｘａａ１のＮ−修飾が、アセチル化、ホルミル化、ミリストイル化、アミド化からなる群から選択され、
Ｘａａ３およびＸａａ１３が、それぞれ独立して、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、およびピログルタミン酸（ｐＧｌｕまたはＺ）からなる群から選択され、
Ｘａａ６、Ｘａａ１０、Ｘａａ１２、およびＸａａ１６が、それぞれ独立して、アルギニン（Ａｒｇ）、リジン（Ｌｙｓ）、およびヒスチジン（Ｈｉｓ）からなる群から選択され、
Ｘａａ８およびＸａａ９が、それぞれ独立して、セリン（Ｓｅｒ）およびトレオニン（Ｔｈｒ）からなる群から選択され、
Ｘａａ１１が、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、およびトリプトファン（Ｔｒｐ）からなる群から選択され、
Ｘａａ１４が、アルギニン（Ａｒｇ）、リジン（Ｌｙｓ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、システイン（Ｃｙｓ）、およびメチオニン（Ｍｅｔ）からなる群から選択され、
Ｘａａ１５が、グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、システイン（Ｃｙｓ）、およびプロリン（Ｐｒｏ）からなる群から選択され、
Ｘａａ１７が、グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、およびプロリン（Ｐｒｏ）からなる群から選択される、μ−コノトキシンペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかにおいて、
Ｘａａ１がピログルタミン酸（ｐＧｌｕ）である、μ−コノトキシンペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかにおいて、
前記アミノ酸配列が、ｐＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ（配列番号２）である、μ−コノトキシンペプチド、それらの生物学的に活性なフラグメント、それらの塩、それらの組み合わせおよび／またはそれらの異形。
【請求項８】
ｉ）請求項１〜７のいずれかに記載のμ−コノトキシンペプチドをコードするヌクレオチド配列と、
ｉｉ）ｉ）と相補的な核酸配列と、
ｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）の修飾核酸配列と、
ｉｖ）ストリンジェントな条件下でｉ）、ｉｉ）またはｉｉｉ）とハイブリダイズ可能な核酸配列と、
ｖ）請求項１〜７のいずれかに記載のμ−コノトキシンペプチドの欠失体または類似体をコードする核酸配列と、
ｖｉ）および／または請求項１〜７のいずれかに記載のμ−コノトキシンペプチドの生物学的に活性なフラグメントをコードするｉ），ｉｉ），ｉｉｉ），ｉｖ）またはｖ）のフラグメントと、
を含む、単離および精製された核酸配列。
【請求項９】
活性物質として、製剤学的に有効な量の少なくとも１つの請求項１〜７のいずれかに記載のμ−コノトキシンペプチドと、
製剤学的に許容しうる担体、希釈剤および／または助剤と、
を含む、医薬組成物。
【請求項１０】
請求項９において、
痛みの治療または予防に使用される、医薬組成物。
【請求項１１】
請求項９または１０において、
前記痛みが、片頭痛、急性疼痛、持続痛、慢性的疼痛、神経因性疼痛または侵害受容性疼痛である、医薬組成物。
【請求項１２】
電位感受性ナトリウムチャネルに関連する障害の治療または予防のための薬剤の調製における、請求項９に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１３】
請求項１２において、
前記電位感受性ナトリウムチャネルがＮａｖ１．４チャネルである、使用。
【請求項１４】
麻酔薬の調製における請求項９に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１５】
製剤学的に有効な量の少なくとも１つの請求項１〜７のいずれかに記載のμ−コノトキシンペプチドまたは請求項９に記載の医薬組成物を患者に投与することを含む、麻酔を必要とする外科的処置を受ける患者の筋骨格を緩和させるための方法。
【請求項１６】
請求項１５において、
前記少なくとも１つのμ−コノトキシンペプチドを目の麻酔薬として投与する、方法。
【請求項１７】
請求項１５において、
前記少なくとも１つのμ−コノトキシンペプチドを局所麻酔薬として投与する、方法。
【請求項１８】
請求項１５〜１７のいずれかにおいて、
約３０分間から４８時間の麻酔作用を有する、方法。
【請求項１９】
製剤学的に有効な量の少なくとも１つの請求項１〜７のいずれかに記載のμ−コノトキシンペプチドまたは請求項９に記載の医薬組成物を投与することを含む、局所麻酔方法。
【請求項２０】
請求項１９において、
約３０分間から４８時間の麻酔作用を有する、局所麻酔方法。
【請求項２１】
製剤学的に有効な量の少なくとも１つの請求項１〜７のいずれかに記載のμ−コノトキシンまたは請求項９に記載の医薬組成物を投与することを含む、痛みを治療または予防するための方法。
【請求項２２】
請求項２１において、
約３０分間から１２時間の作用を有する、方法。
【請求項２３】
請求項９に記載の医薬組成物または請求項１〜７のいずれかに記載のμ−コノトキシンペプチドを含む、麻酔薬。
【請求項２４】
請求項２３において、
皮下投与、静脈内投与、皮内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、経皮的投与または口腔内投与に好適である、麻酔薬。
【請求項２５】
請求項２４において、
錠剤、カプセル、トローチ、歯科用軟膏、坐剤、吸入剤、溶液、練和液、軟膏、非経口剤である、麻酔薬。
【請求項２６】
請求項２５において、
前記吸入剤が噴霧剤である、麻酔薬。
【請求項２７】
請求項８に記載の単離および精製された核酸配列を含む、ベクター。
【請求項２８】
請求項９に記載の医薬組成物または請求項１〜７のいずれかに記載のμ−コノトキシンペプチドを含む、埋込可能な装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なμ−コノトキシンぺプチド、それらの生物学的に活性なフラグメント、それらの塩、それらの組み合わせおよび／またはそれらの異形に関する。また、本発明は、痛みを治療または予防するための医薬組成物におけるそれらの使用および麻酔薬の調製におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
イモガイ属の海洋円錐形マキガイ類の毒液には、豊富で非常に多様な生理活性成分が含まれている。世界には８００種を超えるイモガイが存在しており、円錐形マキガイの毒液は広範な生物学的活性を示す天然ぺプチドの最も豊かな供給源の１つとなっている。コノぺプチドは、電位感受性イオンチャネル、リガンド依存性イオンチャネル、Ｇタンパク質共役受容体等の非常に多様な分子に高い親和性と特異性をもって作用する（ＭｃＩｎｔｏｓｈ他、１９９９年；Ｏｌｉｖｅｒａ他、１９８５年；Ｏｌｉｖｅｒａ他、１９９０年）。これまでは、少数のコノぺプチドのみが単離や一次構造解明による正確な分子標的解析によって特性解析の対象となってきた。しかし、コノぺプチドは特性解析されていないチャネルの機能を解明するための新規で重要な手段を提供するため、コノぺプチドの研究が注目を集めてきている。また、本来の生理学的標的に作用する新薬を使用して全く新しい生物医学用途に道を拓くことができる。例えば、特定のカルシウムサブタイプを区別するためのω−コノトキシンの発見と使用や、疼痛管理における薬剤（Ｐｒｉａｌｔ（登録商標））としてのそれらの１種の使用が挙げられる（ＫｅｒｒおよびＹｏｓｈｉｋａｍｉ、１９８４年；Ｏｌｉｖｅｒａ他、１９８４年；Ｏｌｉｖｅｒａ他、１９８７年）。
【０００３】
最初の代表的なμ−コノぺプチド群は１９８３年に公表され、筋毒活性を示すアンボイナガイ毒素（ｇｅｏｇｒａｐｈｕｔｏｘｉｎ）の特性解析が行われている（Ｓａｔｏ他、１９８３年）。その後、その他のμ−コノぺプチドの単離および特性解析が行われた。現在のところ、合計９種類のμ−コノぺプチドが６種の円錐形マキガイ（主に魚類摂取種と１種の軟体動物摂取種）から同定されている。
【０００４】
これらのμ−コノぺプチドは、配列内のシステイン残基の保存部位によって示される共通した一次構造を表示する。ジスルフィド結合はＣｙｓ１−Ｃｙｓ４、Ｃｙｓ２−Ｃｙｓ５、Ｃｙｓ３−Ｃｙｓ６間に存在する。この折りたたみにより、代表的なμ−コノぺプチド群について研究されてきた制約された三次構造（ｔｅｒｔｉａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）となる（Ｈｉｌｌ他、１９９６年；Ｋｅｉｚｅｒ他、２００３年；Ｎｉｅｌｓｅｎ他、２００２年；Ｏｔｔ他、１９９１年；Ｗａｋａｍａｔｓｕ他、１９９２年）。多くの研究において、μ−コノぺプチドは、各種の電位感受性ナトリウムチャネルにおおよそ特異的に作用することが証明されている（Ｂｅｃｋｅｒ他、１９８９年；Ｂｕｌａｊ他、２００５年；Ｃｒｕｚ他、１９８５年；Ｃｒｕｚ他、１９８９年；Ｆａｉｎｚｉｌｂｅｒ他、１９９５年；Ｆｒｅｎｃｈ他、１９９６年；Ｓａｆｏ他、２０００年；Ｓａｔｏ他、１９９１年；Ｓａｔｏ他、２００２年）。ナトリウムチャネルのサブタイプに関係なく、薬理効果はチャネルコンダクダンスをブロックすることであり、電位感受性チャネルの機能を阻害することになる。
【０００５】
電位感受性ナトリウムチャネル（ＶＳＳＣ）は細胞伝達に不可欠な膜貫通型タンパク質である。ＶＳＳＣは、活動電位を発生させ、ほとんどの脊椎動物および無脊椎動物の興奮細胞内における活動電位の伝搬を可能とする。現在、哺乳動物のＶＳＳＣをコードする９個の遺伝子が特定されている（ＹｕおよびＣａｔｔｅｒａｌｌ、２００３年）。ＶＳＳＣはフグ毒（テトロドトキシン：ＴＴＸ）（特にフグから単離される毒素）に対する感受性に応じて分類される。ＴＴＸによりブロックされるＶＳＳＣはＴＴＸ感受性であり、その他のＶＳＳＣは耐ＴＴＸチャネルである。ＶＳＳＣの各サブタイプは、細胞および組織局在性に応じて特定の機能を有する。
【０００６】
ＶＳＳＣは筋肉および神経における活動電位の伝達において主要な役割を担っており、麻酔における重要な対象となる。リドカインやプロカイン等の薬剤は、感覚線維に存在するＶＳＳＣを阻害することにより作用する（Ｓｃｈｏｌｚ、２００２年）。しかし、薬剤によって異なる影響を受ける多数のＶＳＳＣサブタイプの存在のために、ＶＳＳＣは全ての線維において均等に阻害されるわけではない。特に、耐ＴＴＸＶＳＳＣサブタイプは痛みの伝達に関して主要な役割を有し、現在公知の薬剤の特異的なターゲットとはなっていない。また、リドカインおよびプロカインは持続時間が短く、投与に伴って副作用やアレルギーを生じさせることが広く確認されているため、特定の場合には麻酔薬として使用することが困難となる。そのため、ＴＴＸ耐性を有するＶＳＳＣを特異的に阻害する化合物が見出されれば、疼痛管理にとって重要な成果となる。例えば、サブタイプＮａｖ１．８は痛覚過敏の開始および維持に貢献する。神経因性疼痛の初期段階では、Ｎａｖ１．８の発現は傷ついた一次求心性ニューロン内で減少するが、Ｎａｖ１．８の発現レベルは隣接するニューロンで維持される（Ｄｅｃｏｓｔｅｒｄ他、２００２年；Ｇｏｌｄ他、２００３年）。しかし、坐骨神経損傷に続く２日間は、Ｎａｖ１．８の発現は著しく増加し、ＴＴＸ耐性を有する化合物の活動電位はＣ繊維に対応する伝導速度に比例して上昇する。このように、Ｎａｖ１．８は神経因性疼痛において重要な役割を有する。
【０００７】
その結果、ＶＳＳＣは阻害または転形することによって麻酔、痛覚消失および疼痛管理に有用な対象を示す（ＢａｋｅｒおよびＷｏｏｄ、２００１年；ＪｕｌｉｕｓおよびＢａｓｂａｕｍ、２００１年；Ｌｅｅ、１９７６年）。
【０００８】
国際公開第ＷＯ０２／０７６７８号の特許出願において、単離されたμ−コノトキシンとして多くのぺプチドが開示されている（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｕｔａｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＦｏｕｎｄａｔｉｏｎおよびＣｏｇｎｅｔｉｘ，  Ｉｎｃ．）。しかし、国際公開第ＷＯ０２／０７６７８号はぺプチドについて曖昧で時には紛らわしい説明を行っており、国際公開第ＷＯ０２／０７６７８号の開示に全面的に依存することは困難である。国際公開第ＷＯ０２／０７６７８号に記載されているぺプチドの大部分は分子生物学技術や、μ−コノトキシンペプチドをコードするＤＮＡの単離およびクローニング、毒素配列の翻訳および同定のみによって特定されているようである。そのような技術のみに依存すると間違いが生じ得る。すなわち、活性アミノ酸残基は、コード化されたペプチドの翻訳後修飾から生じ得るものであるため、ヌクレオチド配列から直接発見できない場合がある。
【０００９】
最近になって、国際公開第２００４／００９９２３８号（クィーンズランド大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ））の特許出願は、痛み、癌、てんかん、および心臓血管疾患を含む症状の治療における新規なμ−コノトキシンペプチドおよびそれらの誘導体のアッセイおよびプローブならびに神経活性ナトリウムチャネル阻害剤（アンタゴニスト）としての使用を開示している。上記出願は、ラジオリガンド結合アッセイ（ｒａｄｉｏ−ｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ：ＲＬＢ）における新規なμ−コノトキシンペプチドの使用を開示している。当業者には、これらの結果がμ−コノトキシンの生物学的活性を示すものではなく、結合効果のみを示すものであることは明らかである。すなわち、いくつかの化合物（コノトキシンを含む）が生物学的活性を示すことなくチャネル／受容体部位に結合することが知られている（Ｆａｉｎｚｉｌｂｅｒ他、１９９４年；  Ｓｈｉｃｈｏｒ他、１９９６年）。また、これらの結合実験で示された有効性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおける阻害能力に関連しておらず、潜在的な生物学的阻害能力について開示するものではない。
【００１０】
さらに、言及されている発現されたＶＳＳＣチャネルに対する阻害活性（ＩＣ５０）は１〜３μＭを超えている程度であり、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏの調製ではさらに高い濃度となることを示唆している。
【００１１】
そのため、麻酔薬としての強力で持続的な生物学的活性を有し、非常に安全で、副作用または悪化の可能性がほとんどないかあるいは全くない新規な化合物が求められている。
【００１２】
上記目的は、新規なμ−コノトキシンぺプチド、それらの生物学的に活性なフラグメント、それらの塩、それらの組み合わせおよび／またはそれらの異形によって達成された。長い作用持続時間を有する本発明のぺプチドは、麻酔薬の調製および痛みの治療に有用である。
【発明の開示】
【００１３】
本発明は、アミノ酸配列：Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｃｙｓ−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ｘａａ１１−Ｃｙｓ−Ｘａａ１２−Ｘａａ１３−Ｘａａ１４−Ｘａａ１５−Ｘａａ１６−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘａａ１７（配列番号１）を実質的に含むμ−コノトキシンペプチド、それらの生物学的に活性なフラグメント、それらの塩、それらの組み合わせおよび／またはそれらの異形を提供する。
【００１４】
また、本発明は、本発明のペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離および精製された核酸配列を提供する。
【００１５】
また、本発明は、製剤学的に有効な量の少なくとも１つの本発明に係るペプチドを活性物質として含む医薬組成物、電位感受性ナトリウムチャネルに関連する疾患を治療または防止するための薬剤の調製のための前記医薬組成物の使用を提供する。
【００１６】
また、本発明は、麻酔薬の調製における本発明の医薬組成物の使用、麻酔を必要とする外科的処置を受ける患者の筋骨格を弛緩させるための方法における本発明の医薬組成物の使用を提供する。
【００１７】
本発明の別の態様は、痛みの治療または予防方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本明細書において、特に「複数」と記載していない場合、「少なくとも１」または「１以上」を意味する。
【００１９】
本明細書において使用する「ペプチド」、「タンパク質」、「ポリペプチド」、「ポリペプチド性の（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｉｃ）」、および「ペプチド性の（ｐｅｐｔｉｄｉｃ）」という用語は、隣り合う残基のα−アミノ基とカルボキシル基との間のペプチド結合によって一方が結合した１連のアミノ酸残基を意味する。
【００２０】
本明細書において使用する「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、内包する（ｉｎｃｌｕｄｅ）と同義であり、１以上の特徴または成分が存在することを意味する。
【００２１】
コノぺプチドという用語は、コノトキシンおよびコノトキシンぺプチドと同義である。コノトキシンは、非常に広範囲な作用を有する最も強力で多様な神経毒の一種である。興味深いことに、軟体動物摂食種と魚類摂食種との間だけではなく、同種の群間または同種の個体間にも明確な区分が存在する。魚類を摂食する円錐形マキガイ類の毒は、軟体動物を摂食する円錐形マキガイ類の毒よりもヒトに対する生物活性が高く、死に至る場合もある。
【００２２】
以下の３つの主要な麻痺性毒素が盛んに研究されている。これらの麻痺性毒素は神経伝達を妨げるが、対象において異なる。すなわち、アルファ−コノトキシン（α−コノトキシン）はニコチン性アセチルコリン受容体に結合し、ニコチン性アセチルコリン受容体を阻害する。ｍｕ−コノトキシン（μ−コノトキシン）はシナプス後ナトリウムチャネルに結合して筋肉活動電位を直接無効にする。オメガ−コノトキシン（ω−コノトキシン）は神経末端へのカルシウムの電位活性流入（ｖｏｌｔａｇｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｅｎｔｒｙ）を妨げることによりアセチルコリンの放出に影響を与える。
【００２３】
μ−コノぺプチドはイモガイ属の海洋円錐形マキガイの毒液から単離される。μ−コノぺプチドの主構造は、３つのジスルフィド結合によって折り重なった１５〜３０個のアミノ酸によって構成されている。μ−コノぺプチドは、筋肉または神経系に存在する様々な電位感受性ナトリウムチャネルに作用する。多くの種類のμ−コノぺプチドが特定され、それらの配列が公表されている。アンボイナガイ（Ｃ．ｇｅｏｇｒａｐｈｕｓ）の毒液のＧＩＩＩＡ、ＧＩＩＩＢ、およびＧＩＩＩＣは骨格筋の強力なブロッカーだが、神経細胞ＶＳＳＣではない（Ｃｒｕｚ他、１９８５年）。アヤメイモガイ（Ｃ．ｐｕｒｐｕｒｅｓｃｅｎｓ）のＰＩＩＩＡは筋肉を阻害し、神経ＴＴＸ感受性ＶＳＳＣをある程度阻害することが分かっている（Ｓｈｏｎ他、１９９８年）。
【００２４】
これらのコノトキシンは神経細胞ＶＳＳＣに対して特に有効ではなく、骨格筋ＶＳＳＣ（ＧＩＩＩＡ、ＧＩＩＩＢ、およびＧＩＩＩＣ）に対して選択的に作用するか、骨格筋と神経細胞ＶＳＳＣサブタイプ（ＰＩＩＩＡ）とを識別することができない。また、これらのぺプチドは立体（３Ｄ）構造の安定性を欠き、溶液内で配座交換する傾向がある（Ｎｉｅｌｓｅｎ他、２００２年）。
【００２５】
新規なコノぺプチドを特定し、特性を分析する過程において、本願出願人は、μ−コノぺプチド群が哺乳動物神経筋接合部の遮断剤（ブロッカー）として非常に強力な特性を示し、運動神経細胞および感覚神経細胞の活動電位の強力な阻害剤であることを見出した。新規なμ−コノトキシンペプチドは、アミノ酸配列：Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｃｙｓ−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ｘａａ１１−Ｃｙｓ−Ｘａａ１２−Ｘａａ１３−Ｘａａ１４−Ｘａａ１５−Ｘａａ１６−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘａａ１７（配列番号１）、それらの生物学的に活性なフラグメント、それらの塩、それらの組み合わせおよび／またはそれらの異形を実質的に含み、Ｃｙｓはシステインを表す。
【００２６】
通常、Ｘａａ１はＮ−修飾酸性アミノ酸である。好ましくは、前記修飾は、アセチル化、ホルミル化、ミリストイル化、またはピロリドンからなる群から選択される。ホルミル化の場合には、メチオニン（Ｎーホルミルメチオニン）が挙げられる。アセチル化の場合には、メチオニン（Ｎ−アセチルメチオニン）、トレオニン（Ｎ−アセチルトレオニン）、セリン（Ｎ−アセチルセリン）、アスパラギン酸（Ｎ−アセチルアスパラギン酸）、グルタミン酸（Ｎ−アセチルグルタミン酸）、グリシン、バリン、アラニン等の多くの残基に適用される。ミリストイル化の場合には、Ｎ−ミリストイルグリシンが挙げられる。
【００２７】
最も好ましくは、修飾酸性アミノ酸はピログルタミン酸（ｐＧｌｕまたはＺ）である。
【００２８】
Ｘａａ２は好ましくはグリシン（Ｇｌｙ）である。
【００２９】
Ｘａａ３は酸性アミノ酸またはそのアミドである。好ましくは、Ｘａａ３はアスパラギン（Ａｓｎ）である。
【００３０】
Ｘａａ４は通常はグリシン（Ｇｌｙ）である。
【００３１】
Ｘａａ５は通常はプロリンまたはヒドロキシプロリンである。
【００３２】
Ｘａａ６は塩基性アミノ酸である。好ましくは、Ｘａａ６はリジン（Ｌｙｓ）である。
【００３３】
Ｘａａ７は通常はグリシン（Ｇｌｙ）である。
【００３４】
Ｘａａ８は非芳香族ヒドロキシアミノ酸である。好ましくは、Ｘａａ８はセリン（Ｓｅｒ）である。
【００３５】
Ｘａａ９は非芳香族ヒドロキシアミノ酸である。好ましくは、Ｘａａ８はセリン（Ｓｅｒ）である。
【００３６】
Ｘａａ１０は塩基性アミノ酸である。好ましくは、Ｘａａ１０はリジン（Ｌｙｓ）である。
【００３７】
Ｘａａ１１は芳香族アミノ酸である。好ましくは、Ｘａａ１１はトリプトファン（Ｔｒｐ）である。
【００３８】
Ｘａａ１２は塩基性アミノ酸である。好ましくは、Ｘａａ１２はアルギニン（Ａｒｇ）である。
【００３９】
Ｘａａ１３は酸性アミノ酸またはそのアミドである。好ましくは、Ｘａａ１３はアスパラギン酸（Ａｓｐ）である。
【００４０】
Ｘａａ１４は塩基性アミノ酸または硫黄含有アミノ酸である。好ましくは、Ｘａａ１４はメチオニン（Ｍｅｔ）またはヒスチジン（Ｈｉｓ）である。
【００４１】
Ｘａａ１５は疎水性アミノ酸または無極性アミノ酸または非芳香族ヒドロキシアミノ酸である。好ましくは、Ｘａａ１５はアラニン（Ａｌａ）である。
【００４２】
Ｘａａ１６は塩基性アミノ酸である。好ましくは、Ｘａａ１６はアルギニン（Ａｒｇ）である。
【００４３】
Ｘａａ１７は無極性アミノ酸またはアミド基である。Ｘａａ１７は含まれていなくてもよい。
【００４４】
上記μ−コノトキシンにおいて、一対のＣｙｓ残基は、（ｉｓｏｔｅｒｉｃ）ラクタムまたはエステル−チオエーテル（Ｓｅｒ／（ＧｌｕまたはＡｓｐ）、Ｌｙｓ／（ＧｌｕまたはＡｓｐ）、Ｃｙｓ／（ＧｌｕまたはＡｓｐ）またはＣｙｓ／Ａｌａの組み合わせ）によって置換されていてもよい。公知の連続カップリング法（Ｂａｒｎａｙ他、２０００年；Ｈｒｕｂｙ他、１９９４年；Ｂｉｔａｎ他、１９９７年）により、本来のＣｙｓ結合をラクタム結合で置換することができる。チオエーテル類似化合物は、ＲＳＰアミノ酸類似化合物（ＲＳＰ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ）から市販されているハロ−Ａｌａ残基を使用して容易に合成することができる。
【００４５】
本発明はまた、アミノ酸Ｘａａ３，Ｘａａ４，Ｘａａ５，Ｘａａ６，およびＸａａ７またはそれらの任意の組み合わせからなる少なくとも１つのアミノ酸を有さないμ−コノトキシンペプチド（グループ１）に関する。
【００４６】
また、本発明は、アミノ酸Ｘａａ８，Ｘａａ９，Ｘａａ１０，およびＸａａ１１またはそれらの任意の組み合わせからなる少なくとも１つのアミノ酸を有さないμ−コノトキシンペプチド（グループ２）に関する。
【００４７】
さらに、本発明は、アミノ酸Ｘａａ１２，Ｘａａ１３，Ｘａａ１４，Ｘａａ１５，およびＸａａ１６またはそれらの任意の組み合わせからなる少なくとも１つのアミノ酸を有さないμ−コノトキシンペプチド（グループ３）にも関する。
【００４８】
あるいは、本発明のμ−コノトキシンペプチドは、上記グループ１、２または３のアミノ酸またはそれらの組み合わせを有していなくともよい。
【００４９】
脂肪族Ｒ基を有する疎水性アミノ酸の例としては、グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、およびイソロイシン（Ｉｌｅ）が挙げられる。
【００５０】
非芳香族ヒドロキシル基を有するアミノ酸の例としては、セリン（Ｓｅｒ）およびトレオニン（Ｔｈｒ）が挙げられる。
【００５１】
硫黄含有アミノ酸の例としては、システイン（Ｃｙｓ）およびメチオニン（Ｍｅｔ）が挙げられる。
【００５２】
酸性アミノ酸およびそのアミドの例としては、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、およびピログルタミン酸（ｐＧｌｕ）が挙げられる。
【００５３】
塩基性アミノ酸の例としては、アルギニン（Ａｒｇ）、リジン（Ｌｙｓ）、およびヒスチジン（Ｈｉｓ）が挙げられる。
【００５４】
芳香族アミノ酸の例としては、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、およびトリプトファン（Ｔｒｐ）が挙げられる。
【００５５】
イミノ酸の例としては、プロリン（Ｐｒｏ）およびヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ、ＨｐｒｏまたはＯ）が挙げられる。
【００５６】
本発明は、μ−コノトキシンペプチドの「生物学的に活性なフラグメント（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）（ペプチドの配列よりも短いアミノ酸配列を含む）」にも関する。このような配列は、当該配列が由来する配列と同一の特性または生物学的活性を有する限り使用することができる。好ましくは、このような配列は、本発明のペプチドの配列の長さの９９未満％、好ましくは９０未満％、特に好ましくは６０％未満、さらに好ましくは３０％未満のアミノ酸を含む。
【００５７】
また、本発明のμ−コノトキシンペプチドの塩（本出願の目的において塩とみなされる）酸付加塩または金属（亜鉛、鉄等）錯体）も本発明に含まれる。このような酸付加塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩等が挙げられる。
【００５８】
また、本発明の活性μ−コノトキシンペプチドの不活性形態である「プロドラッグ」も本発明に含まれる。すなわち、本発明は、細胞に対する所望の生理的作用を生じる可能性を有するが、当初は不活性であり（生理的作用を生じない）、修飾後に生理学的に活性となり、細胞に対する生理的作用を生じる、安定した可溶性のペプチド前駆体（組成物）に関する。
【００５９】
μ−コノトキシンペプチドの生体内変換は生理的条件下（生体外および生体内）で行われ、酵素あるいは胃酸、血液等の体液との反応により、酵素酸化、還元、加水分解または化学加水分解を受け、アシル転位反応によって活性物質に変換される。
【００６０】
また、本発明のμ−コノトキシンペプチドの異形（ｖａｒｉａｎｔ）も本発明に含まれる。「異形」という用語は、本来の配列のペプチドと多少異なるアミノ酸配列（本来の配列とアミノ酸の置換において異なるアミノ酸配列）を有するペプチドを意味し、１以上のアミノ酸が同一の特性および配座的役割を有する別のアミノ酸によって置換されている。アミノ酸配列の異形は、本来のアミノ酸配列内の所定の位置に置換、欠失、側鎖修飾および／または挿入を有する。保存的アミノ酸置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）とは、以下の５つのグループの１つにおける置換であると定義される。
Ｉ．非極性またはわずかに極性を有する低分子量の脂肪族残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ
ＩＩ．極性を有する正に荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ
ＩＩＩ．極性を有する負に荷電した残基およびそのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ
ＩＶ．高分子量の芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ
Ｖ．高分子量で非極性の脂肪族残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ
なお、非従来型アミノ酸も天然型アミノ酸の好適な置換基であり得る。例えば、Ｌｙｓ残基は、オルニチン、ホモアルギニン、ｎｏｒ−Ｌｙｓ、Ｎ−メチル−Ｌｙｓ、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌｙｓ、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−Ｌｙｓで置換されていてもよい。また、Ｌｙｓ残基は、例えば、Ｎ−１−（２−ピラゾリニル）−Ａｒｇ、２−（４−ピペリニル）−Ｇｌｙ、２−（４−ピペリニル）−Ａｌａ、２−［３−（２Ｓ）ピロリニニル］−Ｇｌｙ、２−［３−（２Ｓ）ピロリニニル］−Ａｌａ等の合成塩基性アミノ酸で置換されていてもよい。Ｔｙｒ残基は、４−メトキシチロシン（ＭｅＹ）、メタ−Ｔｙｒ、オルト−Ｔｙｒ、ｎｏｒ−Ｔｙｒ、１２５１−Ｔｙｒ、モノ−ハロ−Ｔｙｒ、ジ−ハロ−Ｔｙｒ、Ｏ−スルホ−Ｔｙｒ、Ｏ−ホスホ−Ｔｙｒ、ニトロ−Ｔｙｒで置換されていてもよい。
【００６１】
また、Ｔｙｒ残基は、３−ヒドロキシまたは２−ヒドロキシ異性体（メタ−Ｔｙｒまたはオルト−Ｔｙｒ）あるいは対応するＯ−スルホ−またはＯ−ホスホ誘導体で置換されていてもよい。また、Ｔｙｒ残基は、例えば、４−ヒドロキシメチル−Ｐｈｅ、４−ヒドロキシフェニル−Ｇｌｙ、２，６−ジメチル−Ｔｙｒ、５−アミノ−Ｔｙｒ等の合成ヒドロキシル基含有アミノ酸で置換されていてもよい。脂肪族アミノ酸は、非天然型脂肪族の分岐または直側状の側鎖ＣｎＨ２ｎ＋２（ｎは１〜８の数である）を有する合成誘導体によって置換されていてもよい。非従来型アミノ酸による好適な保存的置換の例は、国際公開第ＷＯ２００４／００９９２３８号に記載されている（表１を参照）。
【００６２】
【表１】
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挿入には、１以上の天然型または非天然型アミノ酸残基の添加が含まれるが、好ましくはシステイン残基ではない。
【００６３】
欠失には、１以上のアミノ酸残基の欠失が含まれるが、好ましくはシステイン残基の欠失を除く。
【００６４】
上述したように、本発明はＣｙｓ以外の１以上のアミノ酸が側鎖修飾されたペプチドを含む。
【００６５】
本発明における側鎖修飾の例としては、アルデヒドとの反応による還元的アルキル化およびその後のＮａＢＨ４による還元；メチルアセトイミデートによるアミジノ化；無水酢酸によるアシル化；シアネートによるアミノ基のカルバモイル化；２，４，６トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によるアミノ基のトリニトロベンジル化；無水コハク酸およびテトラヒドロフタル酸無水物によるアミノ基のアシル化；ピリドキサール−５−ホスフェートによるリジンのピリドキシル化（ｐｙｒｉｄｏｘｙｌａｔｉｏｎ）およびその後のＮａＢＨ４による還元；Ｎ−アセチル化等のアミノ基の修飾を含む。
【００６６】
アルギニン残基のグアニジン基は、２，３−ブタンジオン、フェニルグリオキサルおよびグリオキサル等の試薬を用いた複素環状縮合物の形成によって修飾することができる。
【００６７】
カルボキシル基は、Ｏ−アシルイソ尿素の形成およびその後の例えば対応するアミドへの誘導体化によるカルボジイミドの活性化によって修飾することができる。
【００６８】
酸性アミノ酸は、国際公開第Ｗ００２／０６０９２３号（ＣＯＧＮＥＴＩＸ  ＩＮＣ、ユタ州立大学）に開示されているように、グリシンおよびアラニンのテトラゾリル誘導体によって置換されていてもよい。
【００６９】
チロシン残基は、例えば４位のメトキシル化によって修飾することができる。また、チロシンは、テトラニトロメタンによってニトロ化させ、３−ニトロリロシン（ｎｉｔｒｏｌｙｒｏｓｉｎｅ）誘導体を形成することによって修飾することができる。
【００７０】
ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾は、ヨード酢酸誘導体を用いたアルキル化またはピロ炭酸ジエチルを用いたＮ−カルベトキシル化によって行うことができる。
【００７１】
プロリン残基は、例えば４位のヒドロキシル化によって修飾することができる。
【００７２】
本発明に係るその他の異形は様々なグリコシル転移異形（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｖａｒｉａｎｔ）を含む。グリコシル転移パターンは、異なる宿主細胞中に組み換え分子を発現させることによって生じることことがある。Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＨｙｐ残基はＯ−グリカンを含有するように修飾することができ、ＡｓｎおよびＧｌｎ残基はＮ−グリカンを形成するように修飾することができる。本発明によれば、「グリカン」という用語は、公知の合成または酵素方法論によって、天然修飾アミノ酸の任意の水酸基、アミノ基またはチオール基に結合させることができる、Ｎ−、Ｓ−またはＯ−で結合された単糖、二糖、三糖、多糖またはオリゴ糖を意味する。グリカンを構成する単糖としては、Ｄ−アロース、Ｄ−アルトロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−グロース、Ｄ−イドース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−タロース、Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−Ｎ−アセチル−グルコサミン（ＧＩｃＮＡｃ）、Ｄ−Ｎ−アセチル−ガラクトサミン（ＧａｌＮａｃ）、Ｄ−フコースまたはＤ−アラビノースが挙げられる。これらの糖類は、それらの組み合わせを含み、１以上のＯ−硫酸塩、Ｏ−リン酸塩、Ｏ−アセチル、またはシアル酸等の酸性基によって構造的に修飾させることができる。また、グリカンは、Ｄ−ペニシラミン２，５およびそれのハロゲン化誘導体またはポリプロピレングリコール誘導体等の同様なポリ水酸基を含むことができる。グリコシド結合は、ベータ１−４または１−３であり、好ましくは１−３である。
【００７３】
グリカンとアミノ酸との結合はアルファまたはベータ、好ましくはアルファであってもよく、好ましくは１−である。
【００７４】
また、天然ペプチド（Ｌ形）に関する固有の問題が天然プロテアーゼによる分解であるため、本発明のペプチドは、ペプチドのＤ形および／または「レトロ−インベルソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）型異性体」を含むように調製することができる。本発明のペプチドの短部分、異形または組み合わせのレトロ−インベルソ異性体を調製することが好ましい。
【００７５】
したがって、天然タンパク質加水分解からペプチドを保護することによって、特定のヘテロ二価化合物またはヘテロ多価化合物の有効性を向上させなければならない。天然プロティナーゼによる分解から保護することにより、非レトロ−インベルソ含有類自体と比較した場合に、レトロ−インベルソ含有ペプチドに対してより高い生物学的活性が予想される。また、レトロ−インベルソ含有ペプチドは、向上した安定性および低い免疫原生を示すことが証明されている（Ｓｅｌａ  Ｍ．およびＺｉｓｍａｎ  Ｅ．，（１９９７）「免疫現象ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１１におけるＤ−アミノ酸の異なる役割（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  Ｄ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｐｈｅｎｏｍｅｎａ−  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１１）」，４４９頁）。
【００７６】
レトロ−インベルソ異性体は、例えばＳｅｌａおよびＺｉｓｍａｎ（１９９７年）の例に記載されているような公知の配列のペプチドを得るために調製される。
【００７７】
「レトロ−インベルソ異性体」とは、配列の方向を逆にし、各アミノ酸残基のキラル対称性を逆にし、末端基の相補性が存在し得ない直鎖状ペプチドの異性体を意味する。
【００７８】
また、本発明は、１以上のペプチド結合が、ペプチダーゼによる開裂を受けにくい、共有結合の代替型で置換された類似体（ペプチド模倣物）を含む。被験体への注射後に、ペプチドのタンパク質分解が問題になる場合、特に感受性が高いペプチド結合を、切断性のないペプチド模倣物に置換することにより、得られるペプチドをより安定で、治療剤としてより有用なものとする。そのような模倣物およびそれらを組み込む方法は当業界で公知である。
【００７９】
ｔ−ブチルオキシカルボニル、アセチル、テノイル（ｔｈｅｙｌ）、スクシニル、メトキシスクシニル、スベリル、アジピル、アゼライル、ダンシル、ベンジルオキシカルボニル、フルオレニルメトキシカルボニル、メトキシアゼライル、メトキシアジピル、メトキシスベリルおよび２，４−ジニトロフェニル等のアミノ末端ブロック基もまた有用である。
【００８０】
本発明のμ−コノトキシンまたはその生物学的に活性なフラグメントの組み合わせも可能であり、本発明の既存のペプチドの力価、選択性または安定性を向上させるように組み合わせることができる。
【００８１】
好ましくは、μ−コノトキシンペプチドは、ｐＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ（配列番号２）およびｐＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ（配列番号３）を含む群から選択される。
【００８２】
通常、これらのペプチドのＣ末端はアミド化されている。
【００８３】
なお、μ−コノトキシンペプチドまたはμ−コノトキシンという用語は、イモガイ属から得られた自然発生毒性ペプチドに限定されず、単にペプチドが派生したまたは派生することができる初期源を意味する。本発明のμ−コノトキシンペプチドおよびそれらのフラグメント、組み合わせおよび異形は、例えばＭａｎｉａｔｉｓら，１９８２年，「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ），「実験室マニュアル（Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙおよびＡｍｂｌａｒｄら，２００５年」に記載されている化学的合成または組み換え技術等の当業界で公知の各種方法および技術によって調製することができる。
【００８４】
本発明に係るμ−コノトキシンペプチドを調製するために組み換え技術を使用する場合には、ポリペプチドをコードするその核酸分子または生物学的に活性なフラグメントを使用することが好ましい。
【００８５】
したがって、本発明は、上述したようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離および精製された核酸配列に関する。
【００８６】
「単離および精製された核酸配列」とは、本発明に係るμ−コノトキシンペプチドをコードする核酸分子または本発明に係るμ−コノトキシンペプチドをコードする核酸が存在する状態を意味する。核酸は、天然環境でみられる他のポリペプチドまたは核酸あるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおける核酸組換技術を使用する（細胞培養等）環境における他のポリペプチドまたは核酸と関連する物質を含まないか、実質的に含まない。「核酸」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかを意味する。
【００８７】
核酸がＤＮＡの場合、本発明において使用することができるＤＮＡは、例えば、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、１本または両方の鎖が２つ以上のフラグメントからなる二本鎖ＤＮＡ、１本または両方の鎖が中断されていないリン酸ジエステル骨格を有する二本鎖ＤＮＡ、１以上の一本鎖部分および１以上の二本鎖部分を含むＤＮＡ、ＤＮＡ鎖が完全に相補的である二本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡ鎖が部分的にのみ相補的である二本鎖ＤＮＡ、円形ＤＮＡ、共有的に閉鎖したＤＮＡ、直鎖状ＤＮＡ、共有的に架橋されたＤＮＡ、ｃＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡ、半合成ＤＮＡ、生合成ＤＮＡ、自然に単離されたＤＮＡ、酵素消化されたＤＮＡ、剪断されたＤＮＡ、放射性標識されたＤＮＡおよび蛍光色素標識されたＤＮＡ等の標識されたＤＮＡ、核酸の１つ以上の非天然発生種を含むＤＮＡ等のポリデオキシヌクレオチド配列である。
【００８８】
μ−コノトキシンペプチドをコードするＤＮＡ配列間またはその生物学的に活性なフラグメントは、標準的な化学技術、例えばリン酸トリエステル法または自動化合成法およびＰＣＲ法によって合成することができる。
【００８９】
また、本発明に係るμ−コノトキシンペプチドをコードする精製・単離されたＤＮＡ配列は、酵素技術によって製造することができる。そのため、所定の認識配列で核酸分子を開裂させる制限酵素は、μ−コノトキシンペプチドまたはそれのフラグメントをコードするＤＮＡ（またはＲＮＡ）等の核酸配列を含むより大きい核酸分子から核酸配列を単離するために使用することができる。
【００９０】
また、本発明に係るＲＮＡの形態の核酸は、例えば、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、１本または両方の鎖が２つ以上のフラグメントからなる二本鎖ＲＮＡ、１本または両方の鎖が中断されていないリン酸ジエステル骨格を有する二本鎖ＲＮＡ、１以上の一本鎖部分および１以上の二本鎖部分を含むＲＮＡ、ＲＮＡ鎖が完全に相補的である二本鎖ＲＮＡ、ＲＮＡ鎖が部分的にのみ相補的である二本鎖ＲＮＡ、共有的に架橋されたＲＮＡ、酵素消化されたＲＮＡ、剪断されたＲＮＡ、ｍＲＮＡ、化学的に合成されたＲＮＡ、半合成ＲＮＡ、生合成ＲＮＡ、自然に単離されたＲＮＡ、放射性標識されたＲＮＡおよび蛍光色素標識されたＲＮＡ等の標識されたＲＮＡ、核酸の１つ以上の非天然発生種を含むＲＮＡ等である。
【００９１】
また、単離および精製された核酸配列であるＤＮＡまたはＲＮＡは、本発明に係るμ−コノトキシンペプチドをコードする核酸と実質的に同一または相同の配列を有する単離および精製された核酸配列を含む。好ましくは、核酸は、例えば少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％または８５％の核酸同一性、より好ましくは９０％の核酸同一性、最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性等の実質的な核酸同一性を有する。
【００９２】
従来技術および本明細書における「同一性」とは、配列を比較することによって決定される２種以上のアミノ酸配列または２種以上の核酸配列の関係を意味する。また、同一性とは、配列のストリング間の一致で決定されるアミノ酸または核酸配列間の関連性の度合いを意味する。同一性および類似性は当業者に周知の用語であり、標準的な方法によって計算することができる（例えば、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ｅｄｓ．Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１，Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８：１０７３，１９８８）。
【００９３】
通常、配列の一致が最も大きくなるように設計された方法が好ましい。ＧＣＧプログラムパッケージを含む公知のコンピュータプログラムにて同一性および類似性を決定する方法が知られている（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１）：３８７，１９８４）；ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０，１９９０）。ＢＬＡＳＴ  ＸプログラムはＮＣＢＩおよびその他のソースから利用可能である（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０，１９９０）。
【００９４】
また、本発明は、本発明に係るμ−コノトキシンペプチドをコードする単離および精製された核酸配列と相補的な核酸配列を含む。
【００９５】
本発明の範囲には、本発明に係るμ−コノトキシンペプチドをコードする核酸配列とは異なる配列を有する修飾核酸配列または遺伝コードの縮退によるその相補的配列が含まれる。そのような核酸は、μ−コノトキシンペプチドと機能上同等だが、遺伝コードの縮退により配列が異なるμ−コノトキシンペプチドをコードする。これにより、アミノ酸配列に影響を与えないサイレント突然変異が生じ得る。そのような核酸異形も本発明の範囲に含まれる。
【００９６】
また、ストリンジェントな（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）条件、好ましくは高ストリンジェントな条件下で本発明に係るμ−コノトキシンペプチドをコードする核酸配列にハイブリダイズすることができる核酸配列、その相補的配列、その変性核酸配列も本発明の範囲に含まれる。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切であるストリンジェントな条件は当業者に公知であるか、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、６．３．１〜６．３．６等に記載されている。例えば、約４５℃の６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、続いて５０℃の２．０×ＳＳＣ洗浄という条件を採用することができる。緊縮性は洗浄工程に使用する条件に基づいて選択することができる。例えば、約０．２×ＳＳＣで５０℃という高い緊縮性から洗浄工程における塩濃度を選択することができる。また、洗浄工程の温度は約６５℃という高ストリンジェント条件であってもよい。
【００９７】
また、本発明は、μ−コノトキシンペプチドの欠失体（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）または類似体をコードする核酸配列を含む、本発明に係るμ−コノトキシンペプチドをコードする単離および精製された核酸配列を含む。「欠失体」という用語は、天然ペプチドよりも少ないアミノ酸を含むが、同一の特性を示すペプチドをコードする配列を意味する。
【００９８】
また、本発明は、本発明の単離および精製された核酸配列の対立遺伝子異形を含む。すなわち、単離および精製された核酸配列と同一、同族または関連するぺプチドをコードする単離および精製された核酸の天然型である。あるいは、非天然型異形を突然変異誘発技術または直接合成によって製造することができる。
【００９９】
また、本発明の単離および精製された核酸配列の生物学的に活性なフラグメントとは、μ−コノトキシンペプチドをコードする核酸配列よりも短いヌクレオチドを含む配列、その相補的配列、その変性核酸配列を意味する。このような配列は、当該配列が由来する本来の配列と同一の特性を有する限り使用することができる。好ましくは、このような配列は、μ−コノトキシンペプチドの単離および精製された核酸配列の長さの９０未満％、好ましくは６０未満％、特に好ましくは３０％未満のアミノ酸を含む。
【０１００】
また、本発明は、μ−コノトキシンペプチドをコードする単離および精製された核酸配列を含む発現ベクターを提供する。発現ベクターは、当技術分野で周知であるように、所望の機能特性（例えば、μ−コノトキシンペプチド発現および形質転換またはトランスフェクションの対照となる宿主細胞）に応じて選択する。
【０１０１】
驚くべきことに、本願出願人は、本明細書に記載されたμ−コノトキシンペプチドが麻酔薬として有用で強力な生物学的活性を示すことを見出した。これらのぺプチドは、現在使用されているプロカインおよびリドカイン等の局部麻酔薬よりも優れた活性を示し、より長い活性持続時間を有することを見出した。したがって、これらのμ−コノトキシンは長時間の効率的な麻酔が必要な場合に適用することができる。また、これらのμ−コノトキシンは、プロカインやリドカイン等の従来の麻酔薬による望ましくない副作用またはアレルギーが生じる場合に代替として使用することができる（Ｆｉｎｕｃａｎｅ  Ｂ．Ｔ．，２００５）。
【０１０２】
また、これらのμ−コノトキシンは、上述した科学文献および特許文献ならびに添付の実施例に示されているデータと比較して優れた生物学的活性を示す。
【０１０３】
したがって、本発明は、活性物質として、製剤学的に有効な量の少なくとも１つの上述したμ−コノトキシンペプチドと、製剤学的に許容しうる担体、希釈剤および／または助剤とを含む医薬組成物にも関する。
【０１０４】
「製剤学的に有効な量」とは、ヒトまたは動物に投与した場合に検出可能な薬理学的および／または生理学的な作用を引き起こす化学物質または化合物を意味する。
【０１０５】
製剤学的に有効な量は、治療対象となる患者、治療対象となる疾病、および投与方法に応じて異なる。また、製剤学的に有効な量は、使用するペプチド、特にペプチドが上述した薬剤を含むか否かによって異なる。通常、治療は、数時間、数日または数週間の間隔での医薬組成物の反復投与を含む。ポリペプチドの製剤学的に有効な投与量は、通常は治療する患者の体重１ｋｇあたり０．００１ｎｇ〜１００μｇである。好ましくは、体重１ｋｇあたり０．１ｎｇ〜１０μｇである。
【０１０６】
好ましくは、少なくとも１種のμ−コノトキシンペプチドに加えて、医薬組成物は１種以上の製剤学的に許容しうる担体、希釈剤、および助剤を含むことができる。
【０１０７】
製剤学的に使用可能な製剤への活性化合物の処理を容易にする、許容しうる担体、希釈剤、および助剤は、採用される投与量および濃度において被投与者に無毒であり、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、その他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸やメチオニン等の酸化防止剤；保存剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルアルコール、べンジルアルコール；メチルパラベンまたはプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；ｍ−クレゾール）；低分子量（約１０未満の残基）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、イムノグロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、デキストリン等の単糖類、二糖類、その他の糖類；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；蔗糖、マンニトール、トレハロース、ソルビトール等の糖類；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（Ｚｎ−タンパク錯体等）；および／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン界面活性剤が例として挙げられる。
【０１０８】
医薬組成物は全身または局所に投与することができる。例えば、医薬組成物は、皮下、静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、経皮的、口腔投与等の非経口投与、埋込可能な装置による投与または蠕動手段による投与によって投与することができる。
【０１０９】
また、本発明は、本発明のμ−コノトキシンペプチドまたは医薬組成物を含む埋込可能な装置を含む。
【０１１０】
μ−コノトキシンペプチドを活性物質として含む医薬組成物および麻酔薬は、生体吸収性マトリックスに組み込むかまたは含浸させることができ、マトリックスは懸濁液、ゲルまたは固形担体として投与する。また、マトリックスはバイオポリマーを含むことができる。
【０１１１】
徐放製剤を調製することもできる。徐放製剤の適当な例としては、μ−コノトキシンペプチドを含有する固体の疎水性ポリマーの半透過性基材が挙げられ、半透過性基材は、フィルム、微小球体、インプラント、マイクロカプセル等の成形品である。徐放基材の例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸と［γ］エチル−Ｌ−グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（登録商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドからなる注射可能な小球体）等の分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、ポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシブチル酸が挙げられる。
【０１１２】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用する製剤は無菌としなければならない。これは、例えば無菌濾過膜による濾過によって容易に達成される。
【０１１３】
本発明のμ−コノトキシンペプチドの好適な投与量は、被投与者の年令、性別、健康状態、体重、同時治療の種類、所望の作用に応じて異なる。
【０１１４】
適正な投与形態は、疾病、ペプチド、および投与方法に応じて異なる。例えば、錠剤、カプセル、トローチ、歯科用軟膏、坐剤、吸入剤、溶液、練和液、軟膏、非経口剤（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｄｅｐｏｔ）が挙げられる。
【０１１５】
吸入剤の場合には、噴霧吸入剤が好ましい。本発明のμ−コノトキシンの鼻腔投与製剤は、上皮ナトリウムチャネルを効率的に阻害する。鼻腔噴霧注入量は、年齢や体重等の患者の特性に応じて異なる。有効な投与範囲は当業者が判断する。
【０１１６】
例えば、約３０〜約３００μＬのμ−コノトキシンを鼻噴霧製剤で毎日投与すると、約１μｇ〜約１０μｇのμ−コノトキシンを１日に投与することができる。毎日の噴霧量は１回、２回またはそれ以上の回数で行って所望の１日あたりの総噴霧量とする。なお、噴霧量および鼻腔投与製剤におけるμ−コノトキシンの量は、所望の１日あたりの総噴霧量とするためにそれぞれ調節される。
【０１１７】
また、μ−コノトキシンペプチドのアミノ酸の修飾は本発明に含まれるため、本発明のμ−コノトキシンペプチドを水不溶性マトリックスまたはその他の微細分子担体に架橋させたり、溶解性、吸着性、および血脳関門透過性を改良したりすることも有用である。そのような修飾は周知であり、ペプチド等の望ましくない副作用を排除または抑制することができる。
【０１１８】
本発明の好ましい医薬組成物は活性物質としてμ−コノトキシンペプチドを含むが、医薬組成物はμ−コノトキシンペプチドをコードする単離および精製された核酸配列を活性物質として含むことができる。この医薬組成物は、単離および精製されたＤＮＡ塩基配列、単離および精製されたＤＮＡ塩基配列を含む発現ベクターまたは発現ベクターでトランスフェクトまたは形質転換された宿主細胞を含むことができる。後者の場合には、宿主細胞は抗原性問題を回避するために治療対象の患者から採取することが好ましい。これらの遺伝子および細胞療法は、医薬組成物の反復投与を必要とする患者に特に好適である。すなわち、単離および精製されたＤＮＡ塩基配列、発現ベクターまたは発現ベクターでトランスフェクトまたは形質転換された宿主細胞を、タンパク質を内因的に製造する患者の細胞に組み入れることができるためである。
【０１１９】
通常、本明細書に記載した医薬組成物は痛みの治療または予防に使用される。治療または予防する痛みは、例えば、片頭痛、急性疼痛、持続痛、慢性的疼痛、神経因性疼痛、侵害受容性疼痛からなる群から選択することができる。
【０１２０】
あるいは、本明細書に記載された医薬組成物は、嚢胞性繊維症または耳鼻咽喉疾病の治療に使用される。
【０１２１】
本発明のμ−コノトキシンはナトリウムチャネル阻害剤であるため、上皮ナトリウムチャネルによるナトリウム摂取の増進を妨げるために気道上皮および鼻粘膜に適用することができる。これは、粘液の粘度を下げ、肺液や鼻液等の外部体液のクリアランスを促進する作用がある。この場合、μ−コノトキシンは、低濃度で、嚢胞性繊維症病や、粘液の製造が正常レベルを超えている炎症状態に関連するナトリウムチャネルを阻害する。上皮ナトリウムチャネルは肺液または鼻液のクリアランスを調節する。本発明のμ−コノトキシンを含む医薬組成物を異なる濃度（μＭまたはμＭ未満の範囲）で投与することにより、粘液のクリアランスを向上させることができる。このように、μ−コノトキシンは粘液に異常な流動分泌物が生じる耳鼻咽喉炎症状態を治療する可能性を有する。また、μ−コノトキシンは嚢胞性繊維症によって生じる異常な肺分泌物を治療する可能性を有する。
【０１２２】
また、本発明は、電位感受性ナトリウムチャネルに関連する疾患の予防のための薬剤の調製における、本発明の医薬組成物の使用を含む。
【０１２３】
本発明のμ−コノトキシンペプチドは、通常は所期の目的を達成する量で使用することができる。痛みを治療または予防するために使用する場合には、ペプチドまたはその医薬組成物を治療的に有効な量で投与または適用する。「治療的に有効な量」とは、症状を改善または予防するために有効な量を意味する。治療的に有効な量は、特に本明細書に開示した内容に照らして当業者が判断することができる。
【０１２４】
全身投与の場合には、治療的に有効な量はｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイによって推定することができる。例えば、動物モデルで投与量を定式化し、細胞培養で決定するようにＩＣ５０を含む血中濃度範囲を得る。そのような情報は、ヒトにおける有用な投与量をより正確に決定するために使用することができる。
【０１２５】
また、例えば、公知の技術を使用して動物モデルによるｉｎ  ｖｉｖｏデータから初回量を推定することができる。当業者には、動物データに基づき、治療対象の患者、患者の体重、障害の深刻度、投与方法、および医師の判断に応じてヒトへの投与量を最適化することは容易であるだろう。
【０１２６】
また、本発明は、麻酔薬の調製における本発明の医薬組成物の使用を含む。
【０１２７】
また、本発明は、製剤学的に有効な量の、本発明の少なくとも１つのμ−コノトキシンペプチドまたはその製剤学的に許容されうる塩を患者に投与することを含む、麻酔を必要とする外科的処置を受ける患者の筋骨格を緩和させるための方法を提供する。
【０１２８】
本発明において、「投与された（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ）」または「投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」とは、「与える」または「接触させる」ことを意味し、患者、好ましくはヒトへの医薬組成物、治療組成物または麻酔組成物の接触を意味する。
【０１２９】
上記方法において、少なくとも１つのμ−コノトキシンペプチドは通常は局所麻酔として投与する。好ましくは、少なくとも１つのμ−コノトキシンペプチドは、眼科、失調症の治療、耳鼻咽喉科、裂肛の治療、皮膚科、外科、美容外科、繊維筋痛および慢性筋膜痛の治療、ならびにその他あらゆる痛みの治療に使用される。
【０１３０】
好ましくは、少なくとも１つのμ−コノトキシンペプチドは目の麻酔薬として投与する。
【０１３１】
また、本発明は、局所麻酔方法であって、製剤学的に有効な量の、本発明の少なくとも１つのμ−コノトキシンペプチドまたはその製剤学的に許容されうる塩を投与することを含む方法にも関する。好ましくは、製剤学的に有効な量の本発明の少なくとも１種のμ−コノトキシンペプチドまたははその製剤学的に許容されうる塩は、実施例に記載されるように、長い持続時間にわたって作用を示す。
【０１３２】
好ましくは、作用の長い持続時間は、治療対象の患者および／または使用される本発明のμ−コノトキシンの濃度に応じて約３０分間から４８時間である。ただし、持続時間は、リドカインやプロカイン等の従来な麻酔薬の持続時間よりも長い。好ましくは、持続時間は３０分間から１２時間である。
【０１３３】
また、本発明は、本発明の医薬組成物またはμ−コノトキシンを含む麻酔薬を含む。
【０１３４】
好ましくは、本発明の麻酔薬は、皮下投与、静脈内投与、皮内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、経皮的投与、口腔内投与または埋込可能な装置に好適である。
【０１３５】
通常、麻酔薬は、錠剤、カプセル、トローチ、歯科用軟膏、坐剤、吸入剤、溶液、練和液、軟膏、非経口剤（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｄｅｐｏｔ）である。好ましくは、吸入剤は噴霧剤である。
【実施例】
【０１３６】
１．実施例１
［材料および方法］
（材料）
Ｃｏｎｕｓ  ｃｏｎｓｏｒｓのサンプルをチェスターフィールド島（ニューカレドニア）で収集し、収集直後に８０℃で冷凍した。解剖したサンプルの毒管から毒液を採集し、０．０８％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液で抽出した。複数の毒管から得られた抽出物を遠心分離し、不溶性粒子を除去した。全ての抽出物の上清を混合し、凍結乾燥し、秤量し、使用するまで−８０℃で保存した。
【０１３７】
（クロマトグラフィ）
凍結乾燥した未精製の毒液は、ＴＳＰ−１５０ＵＶ検出器を備えたＴｈｅｒｍｏ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔ（ＴＳＰ）製高圧液体クロマトグラフィ装置を使用して分画した。逆相クロマトグラフィに使用した溶出緩衝液は以下の通りである。緩衝液Ａ：Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ、緩衝液Ｂ：Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ（４０／６０）  ０．１％ＴＦＡ。以下の勾配を使用してＣ１８  Ｖｙｄａｃ  ２１８ＴＰ５１０カラムにより未精製の毒液に対して予備精製を行った。プログラムは０〜８％  Ｂ／５分、８〜８０％  Ｂ／７０分、８０〜１００％  Ｂ／１０分、１００％  Ｂ／１０分とした（流速：２ｍｌ／分）。０〜１０％  Ｂ／５分、１０〜２０％  Ｂ／１０分、２０〜４０％  Ｂ／４０分の勾配で分析用Ｃ１８  Ｖｙｄａｃ  ２１８ＴＰ５４カラムを使用してさらに精製した。フラクションは２２０ｎｍで検出された。
【０１３８】
（アミノ酸組成およびエドマン配列決定（シークエンシング））
２００ｍｌの６Ｍ  ＨＣｌをバイアルの底部に添加して、当該バイアルを真空下で密閉し、１２０℃で１６時間加熱することによってペプチドサンプルを加水分解した。遊離アミノ酸をフェニルチオカルバモイル誘導体に変換するためのオンラインデリバタイザー（ｄｅｒｉｖａｔｉｓｅｒ）（モデル４２０Ａ）を備えた自動分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、モデル１３０Ａ）で加水分解物を分析した。シークエンシング試験を自動マイクロシークエンサー（ｍｉｃｒｏｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）４７７Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してエドマン分解法により行った。シークエンシングの前に、均質なペプチドを６Ｍ塩酸グアニジン、０．５Ｍトリス／ＨＣｌ、２ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）（ｐＨ７．５）に溶解したジチオスレイトールによって１時間還元し、次に４−ビニルピリジン（１．５Ｍ）により室温で３時間処理した。ペプチド誘導体をＣ１８  Ｖｙｄａｃカラム（４．６ｍｍ×２５ｃｍ、粒径：５μｍ）を使用した逆相ＨＰＬＣによって精製した。
【０１３９】
（質量分析）
エレクトロスプレーイオン源を備えたＱＴＯＦ  Ｉ装置（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ／Ｗａｔｅｒｓ、米国）を使用して分子質量測定を行った。サンプルの分析（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｄｅ）はＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ／ＨＣＯＯＨ（４９．９／４９．９／０．２）キャリア注入溶媒（ｃａｒｒｉｅｒ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｓｏｌｖｅｎｔ）を使用して行った。ＴＯＦ−ＭＳ構成を有する単一のＭＳ実験を簡易分子量測定に使用した。構造を調べるためにタンデム質量分析を行った。この構成では、最初に親質量（ｐａｒｅｎｔ  ｍａｓｓ）を四極子を使用して選択し、衝突エネルギーを手動で調節することによって衝突誘起解離を行った。この場合、天然サンプルを予め、炭酸水素アンモニウムバッファ（ｐＨ７．８）に溶解させた１００ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を使用して、５６℃で３時間還元した。次に、還元したペプチドをメーカの指示にしたがってＺｉｐＴｉｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）を使用して脱塩した。得られた多価スペクトル（ｍｕｌｔｉｐｌｙ−ｃｈａｒｇｅｄ  ｓｐｅｃｔｒａ）は、ソフトウェアＭａｓｓＬｙｎｘ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ／Ｗａｔｅｒｓ、米国）（ＭａｘＥｎｔ３オプション）を使用して一価データに変換した。次に、シーケンス同定のために手動および半自動データ処理を行った。
【０１４０】
（ペプチド合成）
カスタマイズした４３３Ａペプチドシンセサイザ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、段階的Ｂｏｃ化学鎖伸長のためのｉｎ  ｓｉｔｕ中和／２−（１Ｈベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＨＢＴＵ）活性化プロトコルを使用して固相合成を行った。鎖伸長の終了後、ペプチドを脱保護し、補集剤として５％ｐ−クレゾールを使用して０℃で１時間無水ＨＦによる処理で樹脂から開裂させた。開裂後、ペプチドを氷冷ジエチルエーテルで沈殿させ、水性アセトニトリルに溶解させ、凍結乾燥した。ペプチドは、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８カラムを有するＲＰ  ＨＰＬＣにより、バッファＡ（Ｈ２Ｏ／０．１％トリフルオロ酢酸）内のバッファＢ（アセトニトリル／１０％Ｈ２Ｏ／０．１％トリフルオロ酢酸）の直線的な勾配を使用してＵＶ検出２１４ｎｍで精製した。サンプルはＰｌａｔｆｏｒｍ  ＩＩ装置（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ、マンチェスター、イギリス）でエレクトロスプレー質量分析により分析された。
【０１４１】
ペプチドの酸化折りたたみのために、材料（約０．５〜１ｍｇ／ｍＬ）を、０．５ｍＭ還元グルタチオンおよび０．１ｍＭ酸化グルタチオンを含む０．５Ｍ  ＧｕＨＣｌ（１００ｍＭトリス、ｐＨ７．８）に溶解させた。得られた溶液を室温で一晩にわたってゆっくりと撹拌した後、タンパク質溶液をＲＰ−ＨＰＬＣで上述したように精製した。折りたたみ工程の全収率は約３５％だった。
【０１４２】
（カエルおよびマウスの神経筋標本）
体重２０〜２５ｇの二重脊髄穿刺雄カエル（ヨーロッパトノサマガエル（Ｒａｎａ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ））から皮膚胸筋肉および関連神経を除去し、ＮａＣｌ：１１５．０ｍＭ、ＫＣｌ：２．０ｍＭ、ＣａＣｌ２：１．８ｍＭ、ＨＥＰＥＳバッファ：５．０ｍＭ（ｐＨ７．２５）を含有する標準溶液で表面灌流した２ｍｌの組織槽にピンで留めた。いくつかの実験では、２Ｍホルムアミドで皮膚胸神経筋標本を処理することによって興奮収縮連関を抑制した。頚骨を転位させて殺し、直後に放血させたスイスウェブスターマウス（２０〜２５ｇ）から左右の片側横隔膜筋と関連横隔神経を分離した。２つの片側横隔膜を分離し、ＮａＣｌ：１５４．０ｍＭ、ＫＣｌ：５．０ｍＭ、ＣａＣｌ２：２ｍＭ、ＭｇＣｌ２：１．０ｍＭ、ＨＥＰＥＳバッファ：５．０ｍＭ、グルコース：１１．０ｍＭを含有する生理溶液（哺乳動物用クレブス−リンガー溶液（ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ））で表面灌流したＲｈｏｄｏｒｓｉｌ（ローン−プーラン、サンフォン、フランス）でライニングした組織槽（２ｍｌ）に載せた。純酸素（Ｏ２）を供給した溶液のｐＨは７．４だった。
【０１４３】
（マウス坐骨神経標本）
頚骨を転位させて殺したマウスから左右の坐骨神経を切除した。神経は、使用前に、酸素供給した哺乳動物用クレブス−リンガー溶液で室温にて３０分間にわたって洗浄した。
【０１４４】
（カワカマスの嗅覚神経標本）
頭部を除去したカワカマス（Ｅｓｏｘ  ｌｕｃｉｕｓ）から左右の嗅覚神経を切除した。各神経は、使用前に、カワカマス用クレブス−リンガー溶液（８２．５ｍＭ  ＮａＣｌ，２．５ｍＭ  ＫＣｌ，１ｍＭ  ＣａＣｌ２，１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４バッファ，５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，ＮａＯＨでｐＨ７．３に調節）で室温にて３０分間にわたって洗浄した。
【０１４５】
（マウス神経筋標本の機械的記録）
この実験では、マウス片側横隔膜筋の一端を組織槽にピンで留め、他端（腱）をアイソメトリック変換器（ＦＴ０３、Ｇｒａｓｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に取り付けた。周波数が０．１Ｈｚで持続時間が０．１５ｍｓ（ミリ秒）の電流パルスにより、吸込電極を介して運動神経に刺激を与えることによって収縮を起こさせた。筋肉への直接刺激または運動神経を介した間接刺激によって通常条件で最大収縮応答が得られるように各標本の静止張カを調節した。変換器から記録した張力信号を増幅し、収集し、デジタルインターフェース（ＤＴ−２８２１、Ｄａｔａ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）を備えたコンピュータを使用してデジタル化した。実験は室温で行った。
【０１４６】
（カエルおよびマウスの神経筋標本に対する電子生理学的記録）
分離した神経筋標本の運動神経を、神経の直径に合わせた吸込マイクロ電極を使用して０．０５−０．１ミリ秒の持続時間と過最大電位（通常３〜８Ｖ）のパルスで刺激した。これらのパルスは、刺激隔離ユニットに接続されたＳ−４４刺激器（Ｇｒａｓｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｅｓｔ  Ｗａｒｗｉｃｋ、米国）によって発生させた。
【０１４７】
膜電位およびシナプス電位は、通常法を使用した３Ｍ  ＫＣｌ（抵抗値：８〜１２ＭΩ）で満たした細胞内マイクロ電極と、Ａｘｏｃｌａｍｐ−２Ａ装置（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、フォスター市、カリフォルニア、米国）とを用いて、室温（２２〜２４℃）で終板領域から記録した。記録は、コノトキシンの供給前および供給時にわたって同じ終板から連続して行った。増幅後の電気信号をデジタルオシロスコープに表示し、改造（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）デジタルオーディオプロセッサ（Ｓｏｎｙ  ＰＣＭ７０１ＥＳ）およびビデオカセットレコーダ（Ｓｏｎｙ  ＳＬＣ９Ｆ）を使用してビデオテープに同時に記録した。データは、２５ｋＨｚのサンプリングレートで、アナログおよびデジタルＩ／Ｏインターフェースボード（ＤＴ２８２１、Ｄａｔａ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ、マールボロ、米国）を備えたコンピュータを使用して収集し、デジタル化した。コンピュータ化データの収集および分析は、Ｊｏｈｎ  Ｄｅｍｐｓｔｅｒ博士（ストラスクライド大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｔｒａｔｈｃｌｙｄｅ）、スコットランド）によって提供されたプログラムを使用して行った。終板電位（ＥＰＰ）およびミニチュア終板電位（ＭＥＰＰ）を振幅および時間的経過について個別に分析した。調査した各条件について３〜６回の実験を行い、結果を平均化して平均値±平均値の標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を得た。統計試験は学生の試験を使用することによって行い、Ｐ＜０．０５は有意を示すものとして採用した。
【０１４８】
（マウスおよびカワカマスの神経の電子生理学的記録）
マウスの坐骨神経またはカワカマスの嗅覚神経を、Ｐｌｅｘｉｇｌａｓチャンバに接続された２対の白金線（内径：０．５ｍｍ）に取り付けた。刺激のために、第１の電極対を各種振幅および時間で電流の方形パルスを供給する刺激器（Ｓ−８８、Ｇｒａｓｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に接続した。グローバル活動電位（ＧＡＰ）を記録するために、第２の電極対を高いゲインで手製の差動増幅器に接続した。別の白金線によって２対の電極を接地した。電気刺激に応じて、ソフトウェアプログラムＡｘｏｎ  Ｐｃｌａｍｐバージョン６．０（Ａｘｏｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、アナログ−デジタルコンバータを備えたコンピュータによって神経活動を収集し、デジタル化し、記録した。全ての実験は室温で行った。記録中、短絡を避けるために溶液に接触しないように神経を多湿処理室に保持した。各記録間には、神経はリンガー溶液または試験溶液のいずれかを満たした小容器に４℃で配置した。
【０１４９】
（ウサギの眼に対するｉｎ  ｖｉｖｏ実験）
表在神経末端におけるＣｎＩＩＩＡの局所麻酔活性をウサギの角膜に対してｉｎ  ｖｉｖｏで測定した。この実験では、１．５〜２ｋｇの体重を有する色目（ｃｏｌｏｕｒｅｄ  ｅｙｅｓ）チリウサギ（成体、雄）を使用した。試験溶液を一方の目の結膜嚢内に浸透させ、２分間放置した。眼瞼の反射が生じるまで、約２ヘルツの周波数でナイロンヘア刺激器による圧力で角膜に刺激を与えた。眼瞼の反射が生じた場合には、各刺激期間は１００刺激以下とした。２つの刺激期間の間には少なくとも５分間の間隔を空けた。麻酔作用の強さは、眼瞼の反射の再現されるまで試験溶液または麻酔薬溶液の投与によって角膜に与えることができた刺激の総数として表した。また、この方法により作用の持続時間を決定した。リドカインＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を食塩溶液として使用し、ｐＨ値は１Ｎ  ＮａＯＨによって６．９±０．０１に調整した。
２．実施例２
［結果］
（新規なμ−コノぺプチドの単離、精製、および特性解析）
乾燥した毒液を０．０８％ＴＦＡ水溶液に溶解し、１０ｍｇのバッチでｓｅｍｉｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  Ｃ１８Ｖｙｄａｃカラムに投入した。約２０分間でクロマトグラムにおいて溶離したフラクションを分析規模でさらに精製した。このフラクションは、カエルの神経筋接合部の対して強力な予備活性を示した。上記フラクションをｅｘ  ｖｉｖｏ標本に与えると、運動神経を刺激することによって引き起こされた筋肉収縮がブロックされた。上記フラクションは、ＵＶクロマトグラムおよびＥＳＩ−ＭＳ質量スペクトル（図１）によって示されるように最終的に均質となるまで精製した。次に、フラクションに対してエドマン分解を数回行ったが、結果は得られなかった。フラクションに対してアミノ酸分析を行うと数個の異なるアミノ酸（結果は図示せず）が同定され、フラクションはおそらくはＮ末端がブロックされたペプチドであることを示した。化合物の特性をさらに分析するために、ＤＴＴを使用してフラクションを還元し、サンプルを分析前に脱塩した。次に、脱塩したサンプルに対してタンデム質量分析を行った。４×荷電種をｍ／ｚ５９６に選択し、衝突エネルギーを手動で調整することにより、ペプチドを適切かつ均質に断片化することができた。データを手動で解釈することにより、２２個のアミノ酸を有するペプチド配列を割り当てた。シーケンスは公知のμ−コノぺプチドと相同性を示し、ＣｎＩＩＩＡ（表４）と命名した。
【０１５０】
（ＣｎＩＩＩＡの化学合成）
ペプチドは上述したように合成した（ペプチド合成を参照）。合成ペプチドを酸性化水に溶解したＡＣＮの勾配を使用した逆相ＨＰＬＣによって均質となるまで精製した。ペプチドの純度およびインテグリティはＥＳＩ−ＭＳによって制御した。直鎖ペプチドの酸化再折りたたみのためにいくつかの条件を調査した。ペプチドは塩化グアニジニウム（０．５Ｍ）によってｐＨ７．８に調整したトリス緩衝液（１００ｍＭ）に溶解し、４℃での空気酸化または比率の異なる還元／酸化グルタチオン（ｇｌｕｔｈａｔｉｏｎ）の混合物内に放置した。最終的な再折りたたみ実験は、トリス１００ｍＭ、塩化グアニジニウム０．５Ｍ、還元／酸化グルタチオン０．５ｍＭ／０．１ｍＭを使用して行った。混合物を室温で一晩中撹拌した。次に、酢酸を使用して酸性化し、メーカのプロトコルにしたがってＣ１８  ＳｅｐＰａｋカートリッジを使用して濃縮した。得られた折りたたみペプチドを準調製規模（ｓｅｍｉ−ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  ｓｃａｌｅ）で逆相クロマトグラフィで精製した。生成物は均質に見え、直線体（ｌｉｎｅａｒ  ｅｎｔｉｔｙ）から開始して約３５％の収率だった。合成した化合物の純度をＨＰＬＣおよびＥＳＩ−ＭＳ分析で評価した。天然形態を有する合成ペプチドの信頼性をＨＰＬＣ共溶出とＭＳ／ＭＳ分析によって確認した（図２）。合成ＣｎＩＩＩＡは異なる生物学的アッセイに使用した。
【０１５１】
（マウスの片側横隔膜収縮に対する作用）
マウスの片側横隔膜への直接刺激による筋肉収縮に対するＣｎＩＩＩＡの活性を評価した（図３）。各条件（ＣｎＩＩＩＡを使用しない場合および各種濃度のＣｎＩＩＩＡを使用した場合）において、２５０μｓおよび様々な強度の刺激に対する収縮を記録した。これにより、過最大刺激強度（ｓｕｐｒａｍａｘｉｍａｌ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）（すなわち、最大収縮振幅を得るために必要な強度）を決定した。各ＣｎＩＩＩＡ濃度の場合において、毒素受容領域を飽和状態にするために標本にペプチドを与えた後、筋肉収縮を２時間記録した。図３Ａに示すように、収縮振幅は１００ｎＭおよび３００ｎＭのＣｎＩＩＩＡの存在下で減少し、６００ｎＭのＣｎＩＩＩＡによって完全に阻害された。一方、少なくとも２μＭのμ−コノトキシンＧＩＩＩＡまたはＧＩＩＩＢが同じ条件における同じ標本の完全なブロックに必要である。このように、ＣｎＩＩＩＡはこのｅｘ  ｖｉｖｏモデルで試験を行った既存のμ−コノトキシンよりも少なくとも４倍強力である。ＣｎＩＩＩＡの作用の投与量−応答曲線から明らかなように、マウスの片側横隔膜収縮の最大阻害の半分をもたらすＣｎＩＩＩＡ濃度は１５０ｎＭである（図３Ｂ）。運動神経を刺激して筋肉収縮を引き起こしたときも同様の結果が得られた（結果は図示せず）。
【０１５２】
（マウスの神経筋接合部のシナプス応答に対する作用）
筋肉および組織間でのＣｎＩＩＩＡの作用選択性を評価するために、６００ｎｍのＣｎＩＩＩＡを与えた後に、シナプス応答の細胞内記録をマウスの片側横隔膜神経筋接合部で行った。まず、結果は、対照と比べて線維の膜静止電位に変化がないことを示している。これは、筋肉収縮の阻害はＣｎＩＩＩＡの反分極作用から生じるものではないことを示している。第２に、ＣｎＩＩＩＡの存在下でミニチュア終板電位（ＭＥＰＰ）を検出することができ、ニコチン性アセチルコリン受容体の感度は、筋肉収縮を完全にブロックする用量で変化しなかった。最後に、６００ｎＭのＣｎＩＩＩＡの存在下では、神経刺激によって位相性シナプス応答を生じさせることができた。そのため、対照と同様に終板電位（ＥＰＰ）を記録することができた。このことは、上記コノトキシン濃度で神経伝導が変化しなかったことを示している。また、細胞外電流記録により、運動神経末端におけるシナプス前神経活動電位の存在を反映するシナプス前電流を検出することができた。また、筋肉膜内のカチオンシナプスチャネルの開口部のために、シナプス後電流が観察された。
【０１５３】
（筋肉活動電位およびカエルの神経筋標本のシナプス応答に対する作用）
カエルの皮膚胸神経筋標本に対するＣｎＩＩＩＡの作用を調べた（図４）。この標本では、興奮収縮連関の抑制は、ホルムアミド処理によって容易に達成され、動作を伴わない神経刺激による筋活動電位の細胞内記録が可能となる。結果は、２μＭのＣｎＩＩＩＡの存在下で、線維の膜静止電位が対照と同様であることを示している。５〜２０分間で標本に１μＭのＣｎＩＩＩＡを与えると、運動神経刺激による活動電位の振幅の減少と持続時間の増加が生じた。２５分間後、筋肉活動電位は完全になくなったが、ＥＰＰはなお記録することができた。同様な作用（より速く生じた）はより高濃度（２μＭ）のＣｎＩＩＩＡの存在下でも観察された。なお、神経刺激と筋肉反応との間の待ち時間はコノトキシンによってそれほど影響を受けなかった。また、ＣｎＩＩＩＡ（１μＭおよび２μＭ）を与えた場合も、対照と比較してＭＥＰＰの振幅および周波数は変化しなかった。これらの結果は、コノトキシンＣｎＩＩＩＡによる骨格筋収縮の阻害は、神経活動電位よりもコノトキシンに敏感な筋肉活動電位の選択的遮断によるものであることを強く示唆している。
【０１５４】
（マウスの坐骨運動神経のグローバル活動電位（ＧＡＰ）に対する作用）
本出願人は刺激の持続時間と強度を最適化し、神経を構成する全線維の活性を表すＧＡＰを得た。所与の持続時間の刺激（０．１０、０．０５または０．０１ｍｓ（ミリ秒））の場合は、応答する線維の数が増加する結果として、ＧＡＰ振幅は与える刺激の強度（０．１〜１５Ｖ）が増加するにつれて増加した。７Ｖ以上の刺激強度に対応して、ＧＡＰ振幅は最大値に達し、刺激持続時間（０．０５または０．１０ｍｓ（ミリ秒））にかかわらず一定のままだった。これは、神経の全線維が刺激に応答したことを意味する。一方、０．０１ｍｓ（ミリ秒）刺激は全線維を応答させるためには十分でなかった。すなわち、ＧＡＰの最大振幅は０．０５または０．１０ｍｓ（ミリ秒）の刺激後に記録された振幅の９２％にすぎなかった。ＧＡＰに対するＣｎＩＩＩＡの作用を調べるために、刺激の持続時間を０．０５ｍｓ（ミリ秒）に設定し、与える強度を０．１Ｖから１５Ｖに増加させた。しかし、我々の実験条件がＣｎＩＩＩＡのあらゆる濃度に最適であったことを証明するために、様々な強度で０．１０ｍｓ（ミリ秒）の刺激を与えた。０．１〜５０μＭの濃度では、ＣｎＩＩＩＡはＧＡＰ振幅を減少させ、神経を３０〜６０分間にわたって５０μＭのＣｎＩＩＩＡで処理した際にほぼゼロに達した（図５Ａおよび図５Ｂ）。また、ＧＡＰの最大振幅の５０％に達するために必要な刺激強度は、コノトキシン濃度が増加するにつれて増加した（図５Ｃ）。最後に、ＣｎＩＩＩＡによってＧＡＰの伝搬速度はそれほど変化しなかった。
【０１５５】
これらの結果は、μ−コノトキシンＣｎＩＩＩＡは、膜興奮性をそれほど変化させずに各線維の応答を減少させることによってマウスの坐骨神経に作用することを示している。
【０１５６】
マウスの坐骨神経に対するＣｎＩＩＩＡの作用の用量−応答曲線は、１．５３μＭのコノトキシン濃度によって坐骨神経の最大ＧＡＰ振幅が５０％減少したことを示している（図６）。これらのデータは、運動神経応答のＣｎＩＩＩＡ感受性が筋肉収縮応答のＣｎＩＩＩＡ感受性の１０分の１であることを示している。これらの結果は、μ−コノトキシンはマウス坐骨神経に対してリドカインなどの従来の麻酔薬よりも約１０００倍強力であることを示している。ミリモル濃度のリドカインがマウス坐骨神経に対して同様な抑制効果を得るために必要である。
【０１５７】
ＣｎＩＩＩＡの作用の可逆性を、最初に様々な濃度のコノトキシン（２μＭ、１０μＭ、５０μＭ）の存在下で坐骨神経のＧＡＰを記録し、ＣｎＩＩＩＡを含まない哺乳動物用リンガー溶液に神経を浸漬した後に様々な時間（２〜２４時間）で坐骨神経のＧＡＰを記録することによって評価した。２４時間の洗浄後でも、わずかなＧＡＰ振幅の増加のみが観察された（図７）。可逆性が存在しないことが時間（「ランダウン（ｒｕｎ−ｄｏｗｎ）」現象）の関数としてのＧＡＰ振幅の自然減少によるものか否かについて試験を行うために、哺乳動物用クレブス−リンガー溶液で神経を洗浄した後に坐骨神経のＧＡＰを様々な時間（２〜６６時間まで）で記録した。このような条件下では、ＧＡＰ振幅の有意な変化は観察されなかった。
【０１５８】
これらの結果は、μ−コノトキシンＣｎＩＩＩＡがマウスの坐骨神経の受容部位に強固に関連付けられている（すなわち、複雑なコノトキシン／受容体の解離はかなりゆっくり発生する）ことを強く示唆している。
【０１５９】
（カワカマスの嗅覚神経のグローバル活動電位（ＧＡＰ）に対する作用）
ヨーロッパカワカマス（Ｅｓｏｘ  ｌｕｃｉｕｓ）の感覚嗅覚神経は、０．２０μｍの平均直径を有する比較的均質（９５％）な約５００万の無髄軸索を含んでいる。この神経は軸索膜を高密度で含み、生物物理学的、電気生理学的および薬理学的研究のための比類内ないモデルである。この感覚神経を構成する全線維のＧＡＰを記録するための最適条件（刺激強度および持続時間）が報告されている（Ｂｅｎｏｉｔ他、２０００年）。嗅覚神経の全線維は８〜９Ｖの刺激強度および７〜８ｍｓ（ミリ秒）の持続時間に応答した。そのような条件下では、応答の最大振幅は２．７７±０．１５ｍＶ（ｎ＝３７）であり、１２±０．５ｃｍ／秒（ｎ＝３７）の速度で伝播する（有髄軸索で構成された坐骨神経よりも６０倍遅い）。したがって、カワカマス嗅覚神経のＧＡＰに対するＣｎＩＩＩＡの作用を、８ｍｓ（ミリ秒）の持続時間と１〜１５Ｖの強度の刺激を使用して調べた。高濃度のコノトキシンで嗅覚神経を処理するとＧＡＰ振幅の減少が観察され、１０μＭのコノトキシンを３０〜６０分間与えた場合にはＧＡＰを記録することができなかった（図８Ａおよび図８Ｂ）。また、最大ＧＡＰ振幅（１５Ｖで記録）の５０％に対応する刺激の強度は、コノトキシン濃度が増加するにつれて増加した。最後に、ＣｎＩＩＩＡによってＧＡＰの伝搬速度はそれほど変化しなかった（図８Ｃ）。
【０１６０】
これらの結果は、ＣｎＩＩＩＡは、膜興奮性をそれほど変化させずに各線維の応答を減少させることによって、カワカマスの嗅覚神経に作用することを示している。
【０１６１】
カワカマスの嗅覚神経に対するＣｎＩＩＩＡの作用の用量−応答曲線は、０．１５μＭのコノトキシン濃度によって嗅覚神経の最大ＧＡＰ振幅が５０％減少したことを示している（図９）。これらのデータは、臭覚感覚神経を構成する無髄軸索の応答はマウスの筋肉と同等にＣｎＩＩＩＡに敏感であり（図３Ｂを参照）、坐骨運動神経を構成する有髄軸索の応答よりもμ−コノトキシンに１０倍敏感であることを示している（図６を参照）。
【０１６２】
ＣｎＩＩＩＡの作用の可逆性を、最初に様々な濃度のコノトキシン（２μＭ、１０μＭ、５０μＭ）の存在下でカワカマスの嗅覚神経のＧＡＰを記録し、ＣｎＩＩＩＡを含まないカワカマス用リンガー溶液に神経を浸漬した後に様々な時間（１２〜２４時間）でカワカマスの嗅覚神経のＧＡＰを記録することによって評価した。２４時間の洗浄後でも、ＧＡＰ振幅の増加は観察されなかった。可逆性が存在しないことが時間（「ランダウン（ｒｕｎ−ｄｏｗｎ）」現象）の関数としてのＧＡＰ振幅の自然減少によるものか否かについて試験を行うために、カワカマス用リンガー溶液で神経を洗浄した後に嗅覚神経のＧＡＰを様々な時間にわたって以下の様々な条件で記録した。（ｉ）実験処理室において室温で３０〜６０分間（ｎ＝１０）、（ｉｉ）カワカマス用リンガー溶液内において室温で３時間（ｎ＝１４）未満、（ｉｉｉ）カワカマス用リンガー溶液内において４℃で４８時間（ｎ＝６６）および７２時間（ｎ＝４６）。実験条件にかかわらず、ＧＡＰ振幅の有意な変化は観察されなかった。
【０１６３】
これらの結果は、μ−コノトキシンＣｎＩＩＩＡはカワカマスの嗅覚神経の受容部位に強固に関連付けられている（すなわち、複雑なコノトキシン／受容体の解離はかなりゆっくり発生する）ことを強く示唆している。
ウサギの眼に対するＣｎＩＩＩＡの表面麻酔作用およびリドカインとの比較
ウサギの角膜について得られた結果は、濃度が２．５ｇ／ｌ、５．０ｇ／ｌ、および１０ｇ／ｌのリドカインの麻酔作用の持続時間は５．３分、１４．２分、および２２．３分であることを示している。図１０に示すように、ＣｎＩＩＩＡは等モルベースのリドカインよりも高い活性を有するだけではなく、作用の持続時間もリドカインより長い。まばたき応答の再現まで角膜表面に与えられる刺激の総数として表されるＣｎＩＩＩＡの麻酔作用の強さは、リドカインの場合よりも重要である。興味深いことに、角膜応答はＣｎＩＩＩＡ後に粘膜表面の検出可能なダメージが生じることなく回復した。
【０１６４】
（ＨＥＫ細胞からパッチクランプ法で記録されたナトリウム電流のｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験）
パッチクランプ電流の記録は、ラットの骨格筋のナトリウムチャネルαサブユニット（μ１、ＮａＶ１．４）  を安定して表すＨＥＫ２９３細胞で行われている（Ｙａｍａｇｉｓｈｉ他、１９９７年）。これらの細胞は、強いＮａ電流を示し（＞２ｎＡ）、サキシトキシン（ＳＴＸ）および誘導体（Ｖｅｌｅｚ他、２００１年）に感受性を有し、小さく（直径：＜２０μｍ）、保持電位を適切に制御することができる。
【０１６５】
完全細胞パッチクランプ記録（Ｈａｍｉｌｌ他、１９８１年）は、ＮａＶ１．４チャネルを安定して示すＨＥＫ２９３細胞に対して室温（２０〜２２℃）で行われている。ホウケイ酸ガラスで製造され、Ｐ−９７プラー（ｐｕｌｌｅｒ）（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ノバト、カリフォルニア州）で引っ張られたパッチピペットは、内部生理溶液で満たされると１．５〜３．０ＭΩの先端抵抗を有していた。膜電流を、Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００−Ｂパッチクランプ増幅器（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ユニオンシティー、カリフォルニア州）を使用して記録した。ピークナトリウム電流は、−１００〜−１０ｍＶの保持電圧からの１０ｍｓ（ミリ秒）の脱分極パルスによって得られた。線形の容量性漏洩電流を減算するためにＰ／４プロトコルを使用した。膜電流は、１０ｋＨｚで８極ローパスＢｅｓｓｅｌフィルタでフィルタリングした。フィルタリングした信号は１２ビットのＡ／Ｄ  コンバータ（Ｄｉｇｉｄａｔａ  １２００Ｂ、Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によってデジタル化し、ｐＣＬＡＭＰソフトウェア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して保存した。記録は、Ｏｒｉｇｉｎ  ７ソフトウェア（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ  Ｃｏｒｐ．、ノーサンプトン、マサチューセッツ州）を使用して分析した。
【０１６６】
細胞は、７０ｍＭのＮａＣｌ、７０ｍＭのテトラエチルアンモニウムビスクロロ水和物、５ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのグルコース、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）を含む対照外部溶液を使用して１ｍｌ／分で連続的に灌流した。パッチピペットは、１４０ｍＭのＣｓＦ、５ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＥＧＴＡ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファ（ｐＨ７．２）を含んでいた。Ｎａ電流は、異なる濃度のμ−コノトキシンＣｎＩＩＩＡ（μ−ＣｎＩＩＩＡ）または二酢酸サキシトキシン（ＳＴＸ）（シグマ−アルドリッチ  ケミカル  コーポレーション（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ））による潅流後に対照条件下で記録した。
【０１６７】
典型的な実験に示されるように（図１５）、表面灌流によって与えたμ−ＣｎＩＩＩＡ（５０ｎＭ）は−１００〜−１０ｍＶの脱分極パルスによって得られたナトリウム電流（図１５Ａおよび次図１５Ｂ）をブロックした。μ−ＣｎＩＩＩＡは、濃度−応答データのシグモイド非線形回帰曲線で決定されたように、濃度に依存してナトリウム電流をブロックした。ピークナトリウム電流（ＥＣ５０）を５０％減少させた有効濃度は１４．０ｎＭだった。図１Ｃに示すように、ピークナトリウム電流がμ−ＣｎＩＩＩＡの存在下で定常状態レベルに達した後にウオッシュアウトが開始し、ペプチドを含まない媒体で洗浄しても反転しなかった。一方、ナトリウム電流へのＳＴＸの作用は、ＳＴＸを含有しない溶液で２〜３分間灌流することにより完全に反転した。典型的な実験では、μ−ＣｎＩＩＩＡは持続性を有するが、ＳＴＸの作用は媒体から洗い流すことにより反転した。
【０１６８】
（マウスの指外転スコア（Ｄｉｇｉｔ  Ａｂｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｃｏｒｅ（ＤＡＳ））アッセイのｉｎ  ｖｉｖｏ実験）
これらの実験は、成体（２〜３カ月）の雄または雌のスイスウェブスターマウス（２０〜４０ｇ）に対して行った。軽く麻酔したマウスの左後脚の前外側領域に、μ−ＣｎＩＩＩＡまたはプロカインを含む５０μＬまたは１００μＬの生理的溶液の筋肉内注射を行った。注射後、機能回復をＤＡＳアッセイ（Ａｏｋｉ、２００１年）を使用することによって監視した。簡単に説明すると、マウスを尻尾からぶら下げ、動物が後脚を延ばして指を外転させる独特の驚愕反応を引き出した。μ−ＣｎＩＩＩＡまたはプロカインの注射液に続いて、左後脚と右後脚の指の外転の度合いは時間の関数として決定し、処置を知らない観察者によって５点スケール（０＝標準〜４＝指外転および脚延伸の最大減少）でスコアをとった。
【０１６９】
（マウスの握力評価のｉｎ  ｖｉｖｏ実験）
軽く麻酔したマウスの各前脚の前外側領域に、μ−ＣｎＩＩＩＡまたはプロカインを含む５０μＬの生理的溶液の筋肉内注射を行った。ラップトップコンピュータに接続されたマウス用握力計（６００ｇ範囲；Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  ＧｍｂＨ、バートホンブルク、ドイツ）を使用して、注射の前および注射の後の様々な時点で筋肉の強さを測定した。試験は実質的にラット（ＴｉｌｓｏｎおよびＣａｂｅ、１９７８年）のために記載された方法で行った。簡単に説明すると、マウスを尻尾の付け根で保持し、両方の前脚で装置の引き棒（ｐｕｌｌｉｎｇ  ｂａｒ）をしっかりとつかませた。次に、マウスが手を離すまでそっと後方に引き寄せた。各試験のピーク力を握力とみなした。各マウスには約３０秒間隔で３回の試験を行った。試験の平均値を対応する対照と相対的に表し、統計分析（平均値±２〜３匹のマウスのＳＥＭ）に使用した。
【０１７０】
結果（図１２）は、相対強度の５０％の減少が、マウスの体重１ｇあたりの１０８〜１１１ｐｍｏｌのμ−ＣｎＩＩＩＡおよび２２〜２６ｐｍｏｌのプロカインの筋肉内注射後のそれぞれ約５分後および１０分後に発生したことを示している。約２倍早く発生したことに加え、作用は局部麻酔薬よりもペプチドの場合により明白であった。したがって、μ−ＣｎＩＩＩＡの筋肉内注射は、ｉｎ  ｖｉｖｏでマウスの筋力を減少させるためにプロカインよりも少なくとも５０００倍効果的である。
【０１７１】
（ナトリウムチャネル発現）
アフリカツメガエル（Ｘ．ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞での発現のために、Ｎａｖ１．４／ｐＵＩ−２ベクターをＮｏｔＩで線形化し、Ｔ７  ｍＭＥＳＳＡＧＥ  ｍＭＡＣＨＩＮＥキット（Ａｍｂｉｏｎ）で転写した。
【０１７２】
（クローンチャネルの電気生理学的研究）
Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｂｒｏｏｍａｌｌ、ペンシルベニヤ州）の微量注入器を使用し、卵母細胞に１ｎｇ／ｎｌの濃度で５０ｎｌのｃＲＮＡを注入した。卵母細胞を培養するために使用した溶液は、９６ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＫＣｌ、１．８ｍＭのＣａＣｌ２、２ｍＭのＭｇＣｌ２、および５ｍｍのＨＥＰＥＳを含み、、ｐＨ７．４であり、５０ｍｇ／ｌのゲンタマイシン硫酸塩および１８０ｍｇ／ｌのテオフィリンを補った。二電極電圧クランプ（ＴＥＶＣ）記録を、ｐＣｌａｍｐデータ収集システム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって制御されたＧｅｎｅＣｌａｍｐ  ５００増幅器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して室温（１８〜２２℃）で行った。卵母細胞からの全細胞電流を注入の１日後に記録した。電圧および電流電極は３Ｍ  ＫＣｌで満たした。両電極の抵抗値はできるだけ低く維持した。浴溶液組成は、９６ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＫＣｌ、１．８ｍＭのＣａＣｌ２、２ｍＭのＭｇＣｌ２、および５ｍｍのＨＥＰＥＳであり、ｐＨ７．４とした。電流は、１ｋＨｚで４極ローパスＢｅｓｓｅｌフィルタを用いてフィルタリングし、５ｋＨｚでサンプリングした。漏洩減算は−Ｐ／４プロトコルを使用して行った。−９０ｍＶの保持電位から１００ｍｓ（ミリ秒）にわたって−１０ｍＶの試験電位へ脱分極することによって、クローンＮａｖ１．４電位依存性ナトリウムチャネルを発現する卵母細胞に電流を発生させた。パルス周波数は０．２Ｈｚとし、サンプリング周波数は２０ｋＨｚとした。全ての実験は室温で行った。
【０１７３】
図１４に示す結果は、ＣｎＩＩＩＡ（５００ｎＭ）が、発現したＮａｖ１．４チャネルをブロックする能力を示している。これらの実験から、ペプチドＣｎＩＩＩＡは、１−５０ｎＭの範囲で推定されるＩＣ５０にて、電位依存性ナトリウムチャネルＮａｖ１．４アイソフォームをブロックすることができると結論づけられる。ペプチド−チャネル相互作用は、会合速度が濃度に依存する二分子反応と互換性がある。最後に、作用の可逆性は非常に低いことに留意すべきである。
３．実施例３
［ＣｎＩＩＩＡと他のμ−コノトキシンとの比較］
（マウスのＥＤＬ筋肉収縮のｉｎ  ｖｉｖｏ実験）
頚骨を転位させて殺し、直後に放血したマウスからＥＤＬ筋肉を切除した。切除した筋肉を、１５４ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＨＥＰＥＳバッファ（ｐＨ７．４）、１１ｍＭのグルコースを含む標準クレブスーリンガー生理溶液を含むシリコーンライニングＰｌｅｘｉｇｌａｓｓ槽（容積：４ｍｌ）に入れた。溶液に純酸素を供給した。
【０１７４】
攣縮張力測定のために、ＥＤＬ筋肉の腱の１つに調節可能なステンレス鋼フックを介してＦＴ０３アイソメトリック変換器（Ｇｒａｓｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ａｓｔｒｏ−Ｍｅｄ  Ｉｎｃ．、ウェストウォリック、ロードアイランド州、米国）に接続された絹糸を結び付け、他方の腱をステンレス鋼ピンでシリコーンライニング槽に留めた。攣縮は、Ｓ−４４刺激器（Ｇｒａｓｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ａｓｔｒｏ−Ｍｅｄ  Ｉｎｃ．、ウェストウォリック、ロードアイランド州、米国）から筋肉に沿って配置された電極アレイに０．１Ｈｚの周波数で供給される０．２ｍｓ（ミリ秒）の持続時間と過最大強度の電流パルスで筋肉線維を直接刺激することによって喚起した。調べた各標本について、静止張カは調節して最大収縮反応を得、実験の全期間にわたって監視した。アイソメトリック変換器から記録した張力信号を増幅し、収集し、ＤＴ２８２１アナログ−デジタルインターフェースボード（Ｄａｔａ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏ、マールボロ、マサチューセッツ州、米国）を備えたコンピュータを使用してデジタル化した。コンピュータ化データの収集と分析は、Ｊｏｈｎ  Ｄｅｍｐｓｔｅｒ博士（ストラスクライド大学、生理・薬理学部、グラスゴー、スコットランド）によって提供されたプログラムを使用して行った。全ての実験は２２℃で行った。（ニコチン性受容体をブロックするため）標本を１０μＭのツボクラリンを含む酸素供給された生理溶液で１５分間平衡化した後、μ−コノトキシン（ＣｎＩＩＩＡ、ＴＩＩＩＡ、Ｔ３．１、ＰＩＩＩＡ、ＳｍＩＩＩＡまたはＳＩＩＩＡ）を媒体に添加した。
【０１７５】
ＥＤＬ筋肉について調査した、異なるμ−コノトキシンの相対的な作用を比較するために、同様な濃度（１００ｎＭ）のμ−コノトキシンについて筋肉収縮に関する試験を行った。可能であれば、濃度−反応曲線を各筋肉（様々な濃度の所与のμ−コノトキシンの存在下で測定した収縮を対照攣縮反応の割合として表す）について生成した。各μ−コノトキシン濃度は灌流によって与え、４５〜６０分間平衡化させた。濃度−応答データのシグモイド非線形回帰曲線により、攣縮張力を５０％減少させる有効濃度（ＥＣ５０）を推定することができる。
【０１７６】
（結果（図１３））
各ペプチド（１００ｎＭ）についての筋肉の相対平均収縮阻害を、４０分間のインキュベーション後のＣｎＩＩＩＡ（１００ｎＭ）との比較として示す。ＣｎＩＩＩＡは単純な比較のために１００％に正規化した。なお、全てのぺプチドＳｍＩＩＩＡ、ＰＩＩＩＡ、およびＴ３．１は、ＣｎＩＩＩＡよりも低い活性を示すことに留意すべきである（下記表参照）。
【０１７７】
【表２】
2009514545.tif 000010
濃度−応答データのシグモイド非線形回帰曲線により、攣縮張力を５０％減少させる有効濃度（ＥＣ５０）を推定し、各ペプチドのＫｄ（ｎＭ）を推定することができる。結果を以下の表に示す。
【０１７８】
【表３】
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文献に発表されたμ−コノぺプチド配列とＣｎＩＩＩＡ［配列番号２］の要約
【０１７９】
【表４】
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［参考文献リスト］
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【図面の簡単な説明】
【０１８０】
【図１】図１は、天然μ−コノぺプチドＣｎＩＩＩＡのエレクトロスプレーイオン化質量スペクトルを示す。質量測定はＱＴＯＦ  Ｉ質量分析計（正イオンモード、ＴＯＦ−ＭＳ構成）で行った。図示する質量は、測定されたモノアイソトピック分子質量である。ＣｎＩＩＩＡのカリウム付加体が観察できる。
【図２】図２は、合成および天然μ−コノぺプチドＣｎＩＩＩＡの同一性の制御を示す。（Ａ）合成ぺプチド、天然ぺプチド、これらのぺプチドの５０：５０混合物の逆相ＨＰＬＣによる共溶出実験。（Ｂ）還元された合成ＣｎＩＩＩＡ（上）および還元された天然ＣｎＩＩＩＡ（下）のＭＳ／ＭＳを示し、同一の断片化挙動を示している。
【図３】図３は、マウスの片側横隔膜収縮に対するμ−コノぺプチドＣｎＩＩＩＡの作用を示す。（Ａ）マウスの片側横隔膜の直接刺激で引き起こされた筋肉収縮に対するＣｎＩＩＩＡの作用。１００〜６００ｎＭのＣｎＩＩＩＡの不在または存在下で記録された収縮のトレース。（Ｂ）収縮に対するＣｎＩＩＩＡの作用の用量−応答曲線。ＣｎＩＩＩＡの各濃度について、収縮の最大振幅を対照値に基づいて表す。理論曲線は図示する式から作成され、ヒル番号（ｎＨ）は１．７８であり、収縮（ＫＤ）の５０％阻害に必要なＣｎＩＩＩＡ濃度は１５０ｎＭである。ｎ回の実験の平均値±ＳＥＭ。
【図４】図４は、活動電位に対するμ−コノぺプチドＣｎＩＩＩＡの作用およびカエルの皮膚胸筋肉標本で記録されたシナプス応答を示す。（Ａ）カエル皮膚胸筋肉で記録された筋肉活動電位に対するＣｎＩＩＩＡの作用；１μＭのＣｎＩＩＩＡを浴溶液に入れる前と入れた後の様々な時間における活動電位のトレースと運動神経刺激に応答して記録されたＥＰＰ。筋肉活動電位の漸進的なブロックが観察できる。（Ｂ）カエル皮膚胸筋肉で記録されたシナプス応答に対するＣｎＩＩＩＡの作用；１および２μＭのＣｎＩＩＩＡを使用しない場合と使用した場合に記録されたＭＥＰＰの平均トレース。
【図５】図５は、マウスから分離された坐骨神経のグローバル活動電位（ＧＡＰ）に対するμ−コノトキシンＣｎＩＩＩＡの作用を示す。（Ａ）対照条件（毒素は添加せず）および神経を様々な濃度のコノトキシンＣｎＩＩＩＡ（０．１〜５０μＭ）で処理した場合の０．１〜１５Ｖの間で変化する強度の０．０５ｍｓ（ミリ秒）の刺激に応じて記録されたＧＡＰ。（Ｂ）異なる強度の０．０５ｍｓ（ミリ秒）の刺激および異なる濃度のＣｎＩＩＩＡ毒素（左パネル）に対応するＧＡＰの振幅。（Ｃ）様々な強度（０．１〜１５Ｖ）での０．０５ｍｓ（ミリ秒）刺激後に記録されたＧＡＰの異なるパラメータ。（１）μ−コノトキシンを使用しない場合と使用した場合に１５Ｖの刺激後に記録された最大振幅の比。（２）１５Ｖの刺激に続く最大振幅の５０％に対応する刺激の強度。ｎ個の坐骨神経の平均値±ＳＥＭ。
【図６】図６は、様々な濃度（０．１〜５０μＭ）のコノトキシン存在下で記録されたマウスの坐骨神経のＧＡＰに対するμ−コノトキシンＣｎＩＩＩＡの作用を示す。様々な毒素濃度（０．１〜１００μＭ）で記録されたＧＡＰの最大振幅を対照値にしたがって示す。理論曲線は以下の式にしたがって演算した：ＡＣｎＩＩＩＡ／ＡＣ＝１／［１＋（［μ−コノトキシンＣｎＩＩＩＡ］／ＫＤ）ｎＨ］。ヒル番号（ｎＨ）は１．０２であり、ＧＡＰ（ＫＤ）の５０％をブロックするために必要な毒素濃度は１．５３μＭであった。ｎ個の坐骨神経の平均値±ＳＥＭ。
【図７】図７は、マウスから分離された坐骨神経のＧＡＰに対するμ−コノトキシンＣｎＩＩＩＡの可逆性を示す。ＧＡＰは、対照条件に対して、２、１０または５０μＭのＣｎＩＩＩＡ毒素で処理した神経または１６時間または２４時間新鮮な哺乳動物用リンガー溶液で洗浄した神経について様々な強度（０．１〜１５Ｖ）での０．０５ｍｓ（ミリ秒）刺激後に記録した。ｎ個の坐骨神経の平均値±ＳＥＭ。
【図８】図８は、ヨーロッパカワカマス（Ｅｓｏｘ  ｌｕｃｉｕｓ）から分離された嗅覚神経のグローバル活動電位（ＧＡＰ）に対するμ−コノトキシンＣｎＩＩＩＡの作用を示す。（Ａ）対照条件（毒素は添加せず）および神経を様々な濃度のコノトキシンＣｎＩＩＩＡ（０．０２〜１μＭ）で処理した場合の１〜１５Ｖの間で変化する強度の８ｍｓ（ミリ秒）の刺激に応じて記録されたＧＡＰ。（Ｂ）異なる強度の８ｍｓ（ミリ秒）の刺激および異なる接触時間および異なる濃度のＣｎＩＩＩＡ毒素（左パネル参照）に応じたＧＡＰの振幅。（Ｃ）様々な強度（１〜１５Ｖ）での８ｍｓ（ミリ秒）刺激後に記録されたＧＡＰの異なるパラメータ。（１）μ−コノトキシンを使用しない場合と使用した場合に１５Ｖの刺激後に記録された最大振幅の比。（２）１５Ｖの刺激に続く最大振幅の５０％に対応する刺激の強度。ｎ個の嗅覚神経の平均値±ＳＥＭ。
【図９】図９は、様々な濃度（０．０１〜１０μＭ）のコノトキシン存在下で記録されたヨーロッパカワカマス（Ｅｓｏｘ  ｌｕｃｉｕｓ）から分離された嗅覚神経のＧＡＰに対するμ−コノトキシンＣｎＩＩＩＡの作用を対照値に対する相対値として示す。様々な毒素濃度（０．１〜１０μＭ）で記録されたＧＡＰの最大振幅を対照値にしたがって示す。理論曲線は以下の式にしたがって演算した：ＡＣｎＩＩＩＡ／ＡＣ＝１／［１＋（［μ−コノトキシンＣｎＩＩＩＡ］／ＫＤ）ｎＨ］。ヒル番号（ｎＨ）は１．０９であり、ＧＡＰ（ＫＤ）の５０％をブロックするために必要な毒素濃度は０．１５μＭであった。ｎ個の嗅覚神経の平均値±ＳＥＭ。
【図１０】図１０は、μ−コノトキシンＣｎＩＩＩＡの表面麻酔作用およびリドカインの表面麻酔作用との比較を示す。麻酔薬作用の強度は、試験を行った各濃度で眼瞼の反射を引き起こさない刺激の総数によって表される。データは６つの異なる判定の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。
【図１１】図１１は、マウスのｉｎ  ｖｉｖｏ指外転スコア（Ｄｉｇｉｔ  Ａｂｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｃｏｒｅ（ＤＡＳ））アッセイを示す。
【図１２】図１２は、マウスのｉｎ  ｖｉｖｏ握力評価を示す。
【図１３】図１３は、各ペプチド（１００ｎＭ）について筋肉の相対平均収縮阻害を４０分間のインキュベーション後のＣｎＩＩＩＡ（１００ｎＭ）との比較として示す。ＣｎＩＩＩＡは単純な比較のために１００％に正規化した。なお、全てのぺプチドＳｍＩＩＩＡ、ＰＩＩＩＡ、およびＴ３．１は、ＣｎＩＩＩＡよりも低い活性を示す。
【図１４】図１４のＡ）５００ｎＭのＣｎＩＩＩＡの存在下でのＮａｖ１．４電流トレースを時間の関数として示す。Ｂ）Ｎａｖ１．４電流／Ｎａｖ１．４最大電流を、時間に沿って５００ｎＭのＣｎＩＩＩＡ濃度でプロットしている。電流は１に正規化している。保持電位は−９０ｍＶであり、試験電位は−１０ｍＶであった。
【図１５】図１５のＡ）は対照としてＨＥＫ細胞において記録されたナトリウム電流を示す。Ｂ）５０ｎＭのＣｎＩＩＩＡの存在下およびＣ）ＣｎＩＩＩＡによるナトリウム電流阻害を時間の関数として示す。なお、定常状態レベル後の洗浄工程はブロック効果を抑制するために効率的でない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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