(57)【要約】  試料中のHPVの検出及び分類のための方法及びキット、並びに前記方法に用いるための反応容器が記載される。ユニバーサルHPVプライマーを用いてPCRによって試料を増幅し、次いで増幅試料をHPV型特異的プローブのアレイにハイブリダイズさせて、HPV型を決定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に対して、型非特異的にHPV標的配列を増幅することを意図する核酸増幅反応を実施する工程；
任意の増幅産物から一本鎖オリゴヌクレオチドを得る工程；
一本鎖オリゴヌクレオチドを、試料を収容するのに適した反応容器内に配置された固体支持体上に供されている複数のHPV型特異的プローブと可能な部位でハイブリダイズさせる工程；及び
ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを検出する工程；
を含む、試料中のヒトパピローマウイルス（HPV）を検出及び分類するためのアッセイ。
【請求項２】
前記HPV型特異的プローブがDNAを含む、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
核酸増幅工程が、固体支持体上のHPV型特異的プローブと接触している反応容器内の試料に対して実施される、請求項１または２に記載のアッセイ。
【請求項４】
反応容器に増幅させた試料を導入する前に、核酸増幅工程が試料に対して実施されて、固体支持体上のHPV型特異的プローブと接触させる、請求項１または２に記載のアッセイ。
【請求項５】
すべてのプローブに対して同じハイブリダイゼーション条件下で、HPV標的配列に特異的に結合するようにプローブが選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項６】
少なくとも20種のHPV型に特異的なプローブが用いられる、請求項１から５のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項７】
HPV 6、11、16、18、26、30、31、32、33、34/64、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、56、57、58、59、61、62、66、67、68、69、70、71、72、73、74、81、82、83、84、85、及び89型の少なくとも20種に特異的なプローブが用いられる、請求項１から６のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項８】
プローブが20〜40ntの長さである、請求項１から７のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項９】
プローブが25〜35ntである、請求項１から８のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項１０】
プローブが28〜32ntである、請求項１から９のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項１１】
プローブが約30ntである、請求項１から１０のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項１２】
プローブがHPVのL1領域に特異的である、請求項１から１１のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項１３】
各プローブが別のHPV型に特異的なプローブと少なくとも2nt異なる、請求項１から１２のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項１４】
各プローブが別のHPV型に特異的なプローブと少なくとも3nt異なる、請求項１から１３のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項１５】
1つ以上のプローブが配列番号1〜配列番号133を含む群から選択される、請求項１から１４のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項１６】
すべてのプローブが、配列番号1〜配列番号133を含む群から選択される、請求項１から１５のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項１７】
複数のプローブが、配列番号1または2；3または4；5〜9；10〜13；14〜18；19、20、または21；22〜25；26または27；28〜31；32または33；34〜37；38〜43；44または45；46〜50；51または52；53または54；55〜59；60〜64；65または66；67または68；69、70、または71；72または73；74または75；76、77、または78；79〜83；84、85、または86；87、88、または89；90〜94；95、96、または97；98〜102；103または104；105または106；107または108；109または110；111〜115；116〜119；120または121；122、123、または124；125または126；127または128；129または130；131、132、または133の群の1つ以上から選択される、請求項１から１６のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項１８】
プローブが前記群のそれぞれから選択される、請求項１７に記載のアッセイ。
【請求項１９】
各プローブが前記群から選択され、且つ少なくとも1つのプローブが前記群のそれぞれから選択される、請求項１７に記載のアッセイ。
【請求項２０】
2つ以上のプローブが前記群のそれぞれから選択される、請求項１７に記載のアッセイ。
【請求項２１】
プローブが、配列番号2、4、7、8、9、12、13、16、17、18、19、20、21、24、25、26、27、30、31、32、33、36、37、40、41、42、43、45、48、49、50、51、52、53、54、57、58、59、61、62、63、64、66、67、68、70、71、73、74、75、76、81、82、83、84、85、86、87、88、89、91、92、93、94、95、96、97、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、112、114、115、116、117、118、119、120、121、124、126、128、129、130、131、132、133から選択される、請求項１から２０のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項２２】
複数のプローブが同じHPV型に特異的である、請求項１から２１のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項２３】
複数のプローブが検出されるそれぞれのHPV型に特異的である、請求項１から２２のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項２４】
前記複数のプローブのそれぞれが固体支持体の同じ領域に固定化されている、請求項２２または２３に記載のアッセイ。
【請求項２５】
前記複数のプローブのそれぞれが固体支持体の異なる領域に固定化されている、請求項２２または２３に記載のアッセイ。
【請求項２６】
同じHPV型に特異的な各プローブがHPV標的配列の異なる部分を検出する、請求項２３から２５のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項２７】
少なくとも1つのプローブが固体支持体上の少なくとも2つの異なる位置に存在する、請求項１から２６のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項２８】
すべてのプローブが固体支持体上の少なくとも2つの異なる位置に存在する、請求項１から２７のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項２９】
1つ以上のコントロール配列を検出する工程をさらに含む、請求項１から２８のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項３０】
コントロール配列が、いずれのHPV型からの標的配列ともハイブリダイズしない固体支持体上に固定化されたプローブを含む、請求項２９に記載のアッセイ。
【請求項３１】
コントロール配列がヒトゲノムの標的配列を含む、請求項２９に記載のアッセイ。
【請求項３２】
ヒト標的配列がCFTR遺伝子の少なくとも一部分を含む、請求項３１に記載のアッセイ。
【請求項３３】
既知のコントロール配列を増幅する工程、及び増幅産物を検出する工程をさらに含む、請求項１から３２のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項３４】
増幅反応用混合物を試料と合わせて増幅反応を実施する工程を含む、請求項１から３３のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項３５】
増幅反応がPCRである、請求項１から３４のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項３６】
一本鎖オリゴヌクレオチドが、存在する任意の二本鎖オリゴヌクレオチドを変性させることによって得られる、請求項１から３５のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項３７】
前記変性工程が、反応容器内に収容されている試料に対して実施される、請求項３６に記載のアッセイ。
【請求項３８】
一本鎖オリゴヌクレオチドをストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせる、請求項１から３７のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項３９】
複数のHPV型特異的プローブが固定化された固体支持体を含む反応容器中で、試料に対して核酸増幅反応を実施する工程であって、前記増幅反応が型非特異的にHPV標的配列を増幅することを意図している工程；
任意の増幅産物から一本鎖オリゴヌクレオチドを得る工程；
一本鎖オリゴヌクレオチドを、HPV型特異的プローブと可能な部位でハイブリダイズさせる工程；
ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを検出する工程；
を含み、前記増幅反応が固体支持体と接触している試料中で実施される、試料中のヒトパピローマウイルス（HPV）を検出及び分類するためのアッセイ。
【請求項４０】
複数のHPV型特異的プローブが固定化された固体支持体を含み、且つ固体支持体と接触している試料を収容するのに適した、試料中のHPVを検出及び分類するためのアッセイを実施するための反応容器。
【請求項４１】
固体支持体と接触している試料に対して核酸増幅反応を実施するのに適している、請求項４０に記載の容器。
【請求項４２】
すべてのプローブに対して同じハイブリダイゼーション条件下で、HPV標的配列に特異的に結合するようにプローブが選択される、請求項４０または４１に記載の容器。
【請求項４３】
プローブが、核酸増幅反応を実施するのに適した反応混合物を含む試料中のHPV標的配列に特異的に結合するように選択される、請求項４０から４２のいずれか一項に記載の容器。
【請求項４４】
前記HPV型特異的プローブがDNAを含む、請求項４０から４３のいずれか一項に記載の容器。
【請求項４５】
少なくとも20種のHPV型に特異的なプローブを含む、請求項４０から４４のいずれか一項に記載の容器。
【請求項４６】
HPV 6、11、16、18、26、30、31、32、33、34/64、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、56、57、58、59、61、62、66、67、68、69、70、71、72、73、74、81、82、83、84、85、及び89型の少なくとも20種に特異的なプローブを含む、請求項４０から４４のいずれか一項に記載の容器。
【請求項４７】
プローブが20〜40ntの長さである、請求項４０から４６のいずれか一項に記載の容器。
【請求項４８】
プローブが25〜35ntである、請求項４０から４７のいずれか一項に記載の容器。
【請求項４９】
プローブが28〜32ntである、請求項４０から４８のいずれか一項に記載の容器。
【請求項５０】
プローブが約30ntである、請求項４０から４９のいずれか一項に記載の容器。
【請求項５１】
プローブがHPVのL1領域に特異的である、請求項４０から５０のいずれか一項に記載の容器。
【請求項５２】
特定のHPV型に対する各プローブが、別のHPV型に特異的なプローブと少なくとも2nt異なる、請求項４０から５１のいずれか一項に記載の容器。
【請求項５３】
特定のHPV型に対する各プローブが、別のHPV型に特異的なプローブと少なくとも3nt異なる、請求項４０から５２のいずれか一項に記載の容器。
【請求項５４】
1つ以上のプローブが配列番号1〜配列番号133を含む群から選択される、請求項４０から５３のいずれか一項に記載の容器。
【請求項５５】
すべてのプローブが配列番号1〜配列番号133を含む群から選択される、請求項４０から５４のいずれか一項に記載の容器。
【請求項５６】
複数のプローブが、配列番号1または2；3または4；5〜9；10〜13；14〜18；19、20、または21；22〜25；26または27；28〜31；32または33；34〜37；38〜43；44または45；46〜50；51または52；53または54；55〜59；60〜64；65または66；67または68；69、70、または71；72または73；74または75；76、77、または78；79〜83；84、85、または86；87、88、または89；90〜94；95、96、または97；98〜102；103または104；105または106；107または108；109または110；111〜115；116〜119；120または121；122、123、または124；125または126；127または128；129または130；131、132、または133の群の1つ以上から選択される、請求項４０から５５のいずれか一項に記載の容器。
【請求項５７】
プローブが前記群のそれぞれから選択される、請求項５６に記載の容器。
【請求項５８】
各プローブが前記群から選択され、且つ少なくとも1つのプローブが前記群のそれぞれから選択される、請求項５６に記載の容器。
【請求項５９】
2つ以上のプローブが前記群のそれぞれから選択される、請求項５６に記載の容器。
【請求項６０】
プローブが、配列番号2、4、7、8、9、12、13、16、17、18、19、20、21、24、25、26、27、30、31、32、33、36、37、40、41、42、43、45、48、49、50、51、52、53、54、57、58、59、61、62、63、64、66、67、68、70、71、73、74、75、76、81、82、83、84、85、86、87、88、89、91、92、93、94、95、96、97、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、112、114、115、116、117、118、119、120、121、124、126、128、129、130、131、132、133から選択される、請求項４０から５９のいずれか一項に記載の容器。
【請求項６１】
複数のプローブが同じHPV型に特異的である、請求項４０から６０のいずれか一項に記載の容器。
【請求項６２】
複数のプローブが検出されるそれぞれのHPV型に特異的である、請求項４０から６１のいずれか一項に記載の容器。
【請求項６３】
前記複数のプローブのそれぞれが固体支持体の同じ領域に固定化されている、請求項６１または６２に記載の容器。
【請求項６４】
前記複数のプローブのそれぞれが固体支持体の異なる領域に固定化されている、請求項６１または６２に記載の容器。
【請求項６５】
同じHPV型に特異的な各プローブがHPV標的配列の異なる部分を検出する、請求項６２から６４のいずれか一項に記載の容器。
【請求項６６】
少なくとも1つのプローブが固体支持体上の少なくとも2つの異なる位置に存在する、請求項４０から６５のいずれか一項に記載の容器。
【請求項６７】
すべてのプローブ種が固体支持体上の少なくとも2つの別個の位置に存在する、請求項４０から６６のいずれか一項に記載の容器。
【請求項６８】
固体支持体上に1つ以上のコントロール配列をさらに含む、請求項４０から６７のいずれか一項に記載の容器。
【請求項６９】
コントロール配列が、いずれのHPV型からの標的配列ともハイブリダイズしない固体支持体上に固定化されたプローブを含む、請求項６８に記載の容器。
【請求項７０】
コントロール配列がヒトゲノムの標的配列を含む、請求項６８に記載の容器。
【請求項７１】
ヒト標的配列がCFTR遺伝子の少なくとも一部分を含む、請求項７０に記載の容器。
【請求項７２】
請求項４０から７１のいずれか一項に記載の反応容器を、
i）DNA抽出及び/または精製用の試薬；
ii）核酸増幅用混合物；
iii）反応容器のプローブへの核酸のハイブリダイゼーションを視覚化するのに用いる試薬；
の1つ以上と組み合わせて含む、HPVの検出及び分類用キット。
【請求項７３】
増幅用混合物が、HPV型特異的プローブを有する固体支持体を含む反応容器とは別個の反応容器中で提供される、請求項７２に記載のキット。
【請求項７４】
増幅用混合物が、HPV型特異的プローブを有する固体支持体を含む反応容器中で提供される、請求項７２に記載のキット。
【請求項７５】
増幅用混合物が標識されたdNTPを含む、請求項７２から７４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７６】
増幅用混合物が、HPV標的配列の一部分とハイブリダイズするHPVコンセンサスプライマーを含む、請求項７２から７５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７７】
HPVコンセンサスプライマーが、MY09及びMY11、並びに、場合によりHMB01を含む、請求項７６に記載のキット。
【請求項７８】
増幅用混合物がヒト標的配列を増幅するためのプライマーを含む、請求項７２から７７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７９】
ヒト標的配列がHPV標的配列と異なる長さのものである、請求項７８に記載のキット。
【請求項８０】
ヒト標的配列がCFTR遺伝子の少なくとも一部分である、請求項７８または７９に記載のキット。
【請求項８１】
プライマーが、CFTR-F4（配列番号134）及びCFTR-R5（配列番号135）の少なくとも1つを含む、請求項８０に記載のキット。
【請求項８２】
プライマーが標識されたプライマーである、請求項７６から８１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項８３】
コントロール増幅標的配列を含む、請求項７２から８２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項８４】
コントロール増幅標的配列が、ヒト標的配列を挟む部分に相当する配列を含み、それにより、同一のプライマーを用いて両方の標的配列の増幅が生じる、請求項８３に記載のキット。
【請求項８５】
配列番号1〜133から選択される、HPVの検出及び分類用のプローブ。
【請求項８６】
配列番号2、4、7、8、9、12、13、16、17、18、19、20、21、24、25、26、27、30、31、32、33、36、37、40、41、42、43、45、48、49、50、51、52、53、54、57、58、59、61、62、63、64、66、67、68、70、71、73、74、75、76、81、82、83、84、85、86、87、88、89、91、92、93、94、95、96、97、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、112、114、115、116、117、118、119、120、121、124、126、128、129、130、131、132、133から選択される、請求項８５に記載のプローブ。
【請求項８７】
CFTR-F4（配列番号134）及びCFTR-R5（配列番号135）から選択される、CFTR増幅に用いるためのプライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臨床試料中のヒトパピローマウイルス（HPV）を同定用のin vitro診断キット及び方法に関する。本発明はまた、前記キット及び方法に用いるための器具に関する。
【０００２】
より具体的には、好ましい実施形態において、本発明は、HPVの遺伝子型同定用のプローブを用いて臨床試料中のヒトパピローマウイルス遺伝子型を特異的に検出するためのin vitro診断キット、前記プローブを含む核酸アレイと標準的な実験用反応容器とが組み合わされた基盤、結果の自動処理のためのデバイス、及び前記in vitro診断キットを用いたHPV感染の診断方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
現在までに、約100種のヒトパピローマウイルス（HPV）の型が記載されている。HPV型は、HPVのE6、E7、及びL1領域における遺伝子配列の少なくとも10%が以前に知られている任意の型とは異なる場合に、新規な型とみなされる。サブタイプまたはバリアントは、主要な型と2〜5%未満異なる。これらのウイルスは、ヒト上皮に対する指向性を有し、重篤なヒト疾患、特に生殖器及び口腔粘膜の癌腫と関連している。
【０００４】
約50種のHPV型が肛門性器粘膜から単離されている。これらは、それらの子宮頸癌との関連性によって、低リスク型（例えばHPV 6、11、42、43、及び44型）及び高リスク型（例えば16、18、31、33、及び45型）に分けられている。高リスク型のHPVへの持続感染は子宮頸癌の主な病因因子であるため、HPV型の検出及び同定は非常に重要である。
【０００５】
HPV遺伝子型の検出及び同定は、HPV DNA試験によって実施される。これらの方法は、HPV DNAの直接検出または増幅されたHPV DNAの検出によって実施され得る。HPV DNAの直接検出のための方法としては、米国、メリーランド州、ゲーサーズバーグ、ダイジーンコーポレーション（Digene Corp.）からのハイブリッド・キャプチャー（Hybrid Capture：HC）法、及びin situハイブリダイゼーション法が挙げられる。HCは、シグナル増幅ハイブリダイゼーション法に基づくFDA承認技術である。用いられるハイブリダイゼーションプローブは、HPV特異的RNA配列である。これらのプローブを、臨床試料からの変性HPV DNAとインキュベーションした後に、特異的抗体を用いて検出され得るRNA/DNAハイブリッドが形成される。HC法は、高リスクHPV型及び低リスクHPV型の間の区別を可能にするが、HPV型を同定することはできない。この試験方法のさらなる不利な点は、プローブカクテルの使用が、前記2つのクラス由来のHPV型の間の交差反応をしばしばもたらすことである。
【０００６】
ウイルスゲノムの増幅によるHPV型の同定方法は、主に、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって実施される。HPVの遺伝子型同定は、1つの特定の型のみを認識するプライマーを用いる型特異的PCRによって実施され得る。代替的アプローチは、すべてのHPV型の増幅用のユニバーサルプライマーPCRを用いることである。パピローマウイルスは、増幅された遺伝子断片の配列をその後に分析することによって分類される。この配列の解析は、種々の方法、例えばDNA配列決定、制限断片長多型（RFLP）、または核酸ハイブリダイゼーション等によって実施され得る。リバースブロットハイブリダイゼーション法のようなハイブリダイゼーション技術は、診断目的に最適であるとみなされている（Kleterら J Clin Microbiol. 1999、37：2508〜2517頁；Van den Bruleら J Clin Microbiol. 2002、40：779〜787頁）。
【０００７】
近年、マイクロアレイ技術が開発された（例えば、米国特許第5,445,934号を参照されたい）。用語マイクロアレイは、数千のDNA配列の同時分析を可能にする大規模核酸分析を容易にする多数の小スポットの分析を示すことを意味する。当該技術において知られているように、リバースブロッティングは、通常、メンブレン上で実施されるが、マイクロアレイは、通常、固体支持体上で実施され、且つより小規模で実施され得る。マイクロアレイ技術は、HPV診断の分野にうまく適用されている（例えば、特許公報WO0168915号及びCA2484681号を参照されたい）。
【０００８】
しかし、高価な設備及び面倒な取り扱いが必要とされるマイクロアレイ技術の使用には、まだ欠点がある。この不都合は、米国特許出願第2005064469号が扱っており、ここでは「アレイチューブ」が提供されている。用語「アレイチューブ」とは、マイクロアレイに基づく試験を行うことができる、底面にマイクロアレイが配置されている、実験用反応容器に典型的な形状及びサイズを有する反応容器（例えば、1.5mlのエッペンドルフチューブ）を表す。
【特許文献１】米国特許第5,445,934号
【特許文献２】WO0168915号
【特許文献３】CA2484681号
【特許文献４】米国特許出願第2005064469号
【非特許文献１】Kleterら J Clin Microbiol. 1999、37：2508〜2517頁
【非特許文献２】Van den Bruleら J Clin Microbiol. 2002、40：779〜787頁
【非特許文献３】Manosら、Molecular Diagnostics of Human Cancer；Furth M、Greaves MF編；Cold Spring Harbor Press. 1989、第7巻：209〜214頁
【非特許文献４】Hall. Nucl Acids Symp Ser. 1999、41：95〜98頁
【非特許文献５】Altschulら Nucleic Acid Res. 1997、25：3389〜3402頁
【非特許文献６】Hildesheimら、J Infect Dis. 1994、169：235〜240頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前記に鑑み、本発明の目的は、臨床試料中に存在する可能性のあるHPV型を特異的に同定するための信頼できる方法を提供することである。
【００１０】
本発明の目的は、より具体的には、「アレイチューブ」基盤を用いるHPV型の特異的同定のための方法を提供することである。
【００１１】
本発明の目的はまた、種々のHPV型の特異的な検出及び/または同定用のプローブを提供することである。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、臨床試料中に存在する可能性のあるHPV型の信頼できる特異的な検出及び/または同定を可能にする試薬、プロトコール、及び「アレイチューブ」上に配置されたHPV特異的プローブを含むHPV型の検出及び/または同定用のキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の第１の態様によると、試料中のヒトパピローマウイルス（HPV）を検出及び分類用のアッセイであって、試料に対して、型非特異的にHPV標的配列を増幅することを意図する核酸増幅反応を実施する工程；任意の増幅産物から一本鎖オリゴヌクレオチドを得る工程；一本鎖オリゴヌクレオチドを、試料を収容するのに適した反応容器内に配置された固体支持体上に供されている複数のHPV型特異的プローブと可能な部位でハイブリダイズさせる工程；及びハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを検出する工程を含むアッセイが提供される。
【００１４】
本発明の態様はまた、試料中のヒトパピローマウイルス（HPV）を検出及び分類用のアッセイであって、複数のHPV型特異的プローブが固定化された固体支持体と接触している試料に対して核酸増幅反応を実施する工程であって、前記増幅反応は型非特異的にHPV標的配列を増幅することを意図している工程；任意の増幅産物から一本鎖オリゴヌクレオチドを得る工程；一本鎖オリゴヌクレオチドを、HPV型特異的プローブと可能な部位でハイブリダイズさせる工程；及びハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを検出する工程含むアッセイを提供する。
【００１５】
増幅反応は、好ましくはPCRである。一本鎖オリゴヌクレオチドは、存在する任意の二本鎖オリゴヌクレオチドを、例えば加熱によって変性させることによって得ることができる。一本鎖オリゴヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせることが好ましく、このような条件は、当業者により理解されるであろうが、変性オリゴヌクレオチドを標的と、55℃にて1×SSCを含む緩衝液中でインキュベーションする工程を含むことが好ましい。
【００１６】
好ましい実施形態において、試料及び固体支持体は、例えば米国特許出願第2005064469号に記載されているように、反応容器内に収容される。
【００１７】
少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、または42種のHPV型に特異的なプローブが用いられることが好ましく、これらは好ましくはHPV 6、11、16、18、26、30、31、32、33、34/64、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、56、57、58、59、61、62、66、67、68、69、70、71、72、73、74、81、82、83、84、85、及び89型から選択される。当該プローブは、好都合には20〜40nt、好ましくは25〜35nt、より好ましくは28〜32nt、最も好ましくは約30ntの長さである。すべてのプローブが同じ長さである必要はない。当該プローブは、好都合にはHPVのL1領域に特異的である。それぞれの型特異的プローブは、別のHPV型に特異的なプローブとは少なくとも1、2、3、または好ましくは3ntより多く異なっていてよい。好ましいプローブは、配列番号1〜配列番号133を含む群から選択され、これらのプローブのいくつかは、以下に記載されるように同じHPV型を検出する。好ましくは、複数のプローブは同じHPV型に特異的であり、より好ましくは、検出されるそれぞれのHPV型に特異的な少なくとも2種のプローブが用いられる。これらのプローブの混合物は、固体支持体上の同じ位置に固定化されてよく、またはそれぞれの型特異的プローブは異なる位置に固定化されてよい。同じHPV型に特異的なそれぞれのプローブは、好ましくはHPV標的配列の異なる部分を検出する。
【００１８】
当該プローブを固体支持体上に重複させて、重複性（redundancy）のための複数の検出位置を提供することができる。
【００１９】
例えば、いずれのHPV型からの標的配列ともハイブリダイズしない、固体支持体上に固定化されたプローブによって、1つ以上のコントロール配列も検出され得る。当該プローブは、ヒトゲノムの標的配列に対するものであってよい。当該アッセイは、試料からのヒト標的配列を増幅する工程及び増幅が生じたかどうかを検出する工程を含んでよい。固体支持体上に固定化された非特異的標識配列を用いることによって、さらなるコントロールを導入することができる。当該標識の検出により、標識が適切に機能することが保証され得る。ヒト標的と同じプライマーによって増幅され得るが、固体支持体上の異なるオリゴヌクレオチドによって検出されるであろうコントロール増幅配列を含むことによって、さらに別のコントロールを提供することができる。このコントロールにより、増幅が正しく行われていることが保証される。
【００２０】
本発明はまた、複数のHPV型特異的プローブが固定化された固体支持体を含む反応容器を提供する。また、前記反応容器を核酸増幅混合物と組み合わせて含む、HPVの検出及び分類用のキットも提供される。当該混合物は、HPVコンセンサスプライマー、例えばMY09及びMY11、場合によってはHMB01等、ヒト標的配列を増幅するためのプライマー、前記ヒト標的配列を挟む部分に相当する配列を含むコントロール増幅標的配列を含み、それによって、同じプライマーを用いて両方の標的配列の増幅が生じる。当該キットは、その使用についての説明書も含んでよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
HPV型の特異的な検出及び/または同定のための方法は、以下の工程を含む。
（i）試料DNAの増幅：臨床試料から得られるDNAを、好ましくはPCRによって、さらなる遺伝子型決定を可能にするのに十分に可変のゲノム領域を挟むすべての既知のHPV型用のユニバーサルプライマーを用いることによって増幅する。PCRは好ましい増幅法ではあるが、試料中の標的配列の増幅は、当該技術において知られる任意の他の方法によって達成され得る（リガーゼ連鎖反応、転写ベースの増幅システム、鎖置換増幅等）。本発明の実施形態において、可変L1領域を増幅するプライマーMY11及びMY09が用いられる（Manosら、Molecular Diagnostics of Human Cancer；Furth M、Greaves MF編；Cold Spring Harbor Press. 1989、第7巻：209〜214頁）。
【００２２】
増幅の間に、さらなる検出を可能にする標識、好ましくは比色法によって検出され得るシグナルを提供する標識が増幅DNA中に導入される。好ましい実施形態において、用いられるプライマーの少なくとも1つは、5'末端においてビオチンで標識される。しかし、当該技術において知られる任意の他の種類の標識を用いてもよい（例えばジゴキシゲニン）。さらに、増幅DNAの標識は、PCR混合物中に標識を有する修飾ヌクレオチドを添加することによって代替的に達成され得る（例えば、ビオチン化またはジゴキシゲニンdUTP誘導体）。ある実施形態において、放射活性標識または蛍光体を用いることができる。
【００２３】
（ii）ハイブリダイゼーション：工程（i）からの増幅DNAは変性され（例えば熱によって）、表１に示されるもの（配列番号1〜133）からの1つ以上のプローブを有する「アレイチューブ」に加えられる。増幅後に、一本鎖DNAを調製する他の方法を同様に用いてよい。表１に示されるそれぞれのプローブ（配列番号1〜133）は、1つのHPV型のみの工程（i）からの増幅されたL1領域と特異的にハイブリダイズでき、それによって、この型が生体試料中に存在する場合、このHPV型の特異的同定が可能となる。試料中の異なる型のHPVは、前記型のHPVからの増幅DNAと、少なくとも1つ、好ましくは1より多くのプローブとのハイブリダイゼーションによって同定され得る。
【００２４】
（iii）検出： DNAハイブリッドは、リガンドへの特異的結合または免疫検出による標識の認識によって検出され得る。好ましい実施形態において、ビオチン標識は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）と接合したストレプトアビジンへの特異的結合、及びその後のテトラメチルベンジジン（TMB）の青色色素への変換によって検出され、当該青色色素は対応する特異的プローブが結合した特定の位置に沈殿する。当該技術において公知の他の種類の接合体も、本発明の目的に適当であり得る（例えばストレプトアビジン-Au接合体）。直接的または間接的に標識される蛍光標識検出システムを代わりに用いてよい。あるいは、その他の酵素ベースのシステムを用いてもよい。
【００２５】
（iv）結果の分析及び処理：このようにして処理された「アレイチューブ」を、単純な光学装置、例えば光学顕微鏡、またはCLONDIAG チップテクノロジーズGmbH（ドイツ、イェーナ）によって製造されているATR01及びATSリーダー等を使用することによって読み取ることができる。
【００２６】
代替的な実施形態において、増幅工程及びハイブリダイゼーション工程は、同じアレイチューブ内で実施されてよい。すなわち、試料をアレイチューブに加え、次いで試料を増幅し、チューブ内でプローブとハイブリダイズさせる。
【００２７】
「アレイチューブ」を調製するための一方法が、米国特許出願第2005064469号に開示されている。本発明の好ましい実施形態において、5'アミン連結オリゴヌクレオチドプローブは、既知の別個の位置で固体支持体の表面に結合する。前記プローブは、固体支持体上の示された位置に、個別にまたは混合物として固定化されてよい。好ましい実施形態において、2つの型に特異的なプローブがそれぞれのHPV型に対して用いられ、これにより、1つの型に特異的なプローブの領域においてヌクレオチドの変化が生じているバリアントを含むすべてのHPVが、正確に分類されることをさらに保証する。好ましくは、増幅産物の離れた領域でハイブリダイズし得る2つの型に特異的なプローブを用いる。
【００２８】
前記のプローブまたはプローブの混合物は、固体支持体の単一の位置に、好ましくは固体支持体の2つの別個の位置に、より好ましくは固体支持体の3つの別個の位置に固定化されてよい。図１〜５は、マイクロアレイの表面上のプローブの種々の配置の略図を例示する。
【００２９】
本発明において用いられる「アレイチューブ」は、配列表（配列番号1〜133）からのヌクレオチド配列から選択される1つ以上のHPVプローブを含んでよい。さらにそれは、PCR反応コントロールまたは試料コントロールからのDNAの妥当性等のコントロールの特異的検出用の1つ以上のプローブを含んでよい。さらにそれは、検出反応の陽性コントロール及び残りすべてのプローブが配置され得るような位置決め参照用の1つ以上の標識オリゴヌクレオチド（例えばビオチン修飾オリゴヌクレオチド）を含んでもよい。
【００３０】
HPV型の同定用の特異的プローブを、以下のようにして設計した。増幅L1領域用の既知のバリアントを含むGenBankに寄託されたすべての参照HPVについての配列を、BioEdit（4.8.6.バージョン；Hall. Nucl Acids Symp Ser. 1999、41：95〜98頁）のような従来の核酸整列プログラムを用いることによって整列させ、種々のHPV型のうちで最も可変な領域の位置を決定した。特異的プローブとして用いられるオリゴヌクレオチドの可能な配列を、好ましくは以下の特徴を有するこれらの可変配列領域から選択した：20〜40塩基の長さ、好ましくは約30塩基の長さ；好ましくは2次構造または4より長い一連の連続する同じヌクレオチドがない；好ましくは50%のG＋C比及びすべての選択されたプローブの間でできる限り類似なTmを有する；さらに、好ましくはオリゴヌクレオチド配列のできる限り中央に、種々のHPV型の配列の間のミスマッチヌクレオチドを有する。 
【００３１】
前記のようにして選択された可能なプローブ配列のそれぞれを、NCBIウェブページ（AltschulらNucleic Acid Res. 1997、25：3389〜3402頁）からのBLASTプログラムを用いることによって、増幅L1領域におけるすべての既知のHPV配列に対して比較した。最後に、すべての既知のHPV型と比較した場合に（オリゴヌクレオチドプローブが特異的なHPV型と比較した場合を除く）、少なくとも3ヌクレオチドのミスマッチを有するプローブを選択し、3を超えるミスマッチのプローブを優先した。
【００３２】
本発明は、42種の臨床上最も重要なHPV 6、11、16、18、26、30、31、32、33、34/64、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、56、57、58、59、61、62、66、67、68、69、70、71、72、73、74、81、82、83、84、85、及び89型の特異的検出用のプローブを提供する（表１；配列番号1〜133）。プローブ配列は、5'から3'末端への一本鎖DNAオリゴヌクレオチドとして表す。本発明の好ましい実施形態において、プローブ配列はアンチセンス鎖に相当するが、これらのプローブのいずれかは、そのまま使用され得る、またはそれらの相補鎖の形で、またはそれらのRNAの形（ここでは、TがUで置換される）で使用され得ることは当業者には明らかである。本発明のプローブは、その機能性に劇的に影響を与えることなく、それらの配列の1つ以上のヌクレオチドの付加または変化によって調製され得る。
【００３３】
【表１−１】
2009502190.tif 000002
【表１−２】
2009502190.tif 000003
【表１−３】
2009502190.tif 000004
【００３４】
当該配列のヌクレオチドは、以下のように表される：グアニンをG、アデニンをA、チミンをT、シトシンをC、GまたはAをR、TまたはCをY、AまたはCをM、GまたはTをK、GまたはCをS、AまたはTをW、AまたはCまたはTをH、GまたはTまたはCをB、GまたはCまたはAをV、GまたはAまたはTをD、最後にGまたはAまたはTまたはCをNで表す。本発明において用いられるヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、及び修飾ヌクレオチド、例えばイノシン等、またはそれらのハイブリダイゼーションの特徴を本質的に変えない修飾基を含むヌクレオチドであってよい。
【００３５】
本発明のプローブは、種々の方法、例えば化学合成（例えば、従来のリン酸トリエステル法によって）または遺伝子工学的技術、例えば対応するヌクレオチド配列が挿入されている組換えプラスミドの分子クローニングによって得られ、後者はヌクレアーゼを用いた消化によって得られる。
【００３６】
いくつかのHPV型について、前記HPV型の種々のバリアントに対する特定の位置に異なるヌクレオチドを含有する配列領域からプローブを設計した。これらの場合において、変性させたプローブ、すなわち前記の位置で代替的なヌクレオチドをそれぞれが含有するオリゴヌクレオチドの混合物を用いた。プローブ39C3d［配列番号41］、39C4d［配列番号43］、45C1d［配列番号57］、45C3d［配列番号58］、57A1d［配列番号74］、59C3_3d［配列番号81］、66B1［配列番号91］、66C3d［配列番号93］、及び83B1d［配列番号126］の場合がそうである。あるいは、正確に同じ配列領域を含むが、ある位置に対するヌクレオチド組成が異なる2つのオリゴヌクレオチドの等モル混合物を、単一プローブとして用いた（オリゴヌクレオチド58B1a［配列番号77］と58B1b［配列番号78］；68C4b［配列番号100］と68C4c［配列番号101］；74A1a［配列番号116］と74A1b［配列番号117］；74B1a ［配列番号118］と74B1b［配列番号119］の混合物；及びオリゴヌクレオチド82A2a-AS［配列番号122］と82A2b-AS［配列番号123］の混合物）。
【００３７】
本発明で開示されるすべてのプローブは、「アレイチューブ」基盤内で、同じハイブリダイゼーション条件下で、それらの標的配列と特異的にハイブリダイズすることが示されている。この事実により、これらのプローブを、このマイクロアレイ基盤を用いる42種の異なるHPV型の同時同定のために用いることが可能となる。本発明において開発された「アレイチューブ」の使用によって同定された多数のHPV型により、本方法を直接検出法としてもみなすことができる。なぜなら、残りのHPV型は臨床上無関係であるためである。
【００３８】
診断方法の欠点の1つは、偽陰性の出現である。本発明の方法の場合、品質の悪いDNA試料または分析される試料中のDNAポリメラーゼ阻害剤の存在によって、偽陰性が生じ得る。本発明は、2種類のコントロールを用いることによって、これらの偽陰性を排除する方法を説明する。
【００３９】
患者自身のDNAの増幅からなる一方のコントロールは、好ましくは、DNA試料の良好な品質を保証するために用いられる。ヒトDNAからの任意の配列断片を、この目的のための標的として用いることができる。CFTR遺伝子等の単一コピー遺伝子からの断片は、本発明におけるDNA品質の陽性コントロールに特に適した標的であると考えられた。CFTR遺伝子からの892bpの断片の増幅のために、プライマーCFTR-F4（配列番号134）及びCFTR-R5（配列番号135）を設計した。多コピーの標的に対して単コピー、及びHPV増幅断片と比較してより大きいサイズの品質DNAコントロール増幅産物、すなわちそれぞれ約450bpに対して892bpの使用により、CFTR増幅用のプライマーを、最小限の競合効果でHPVゲノムのL1領域を増幅するために用いられる同じ反応混合物に含むことが可能となる。従って、HPV検出の感度に影響を与えることなく、品質DNAコントロールを、試料が分析される同じ反応チューブ内で同時に反応させてよい。
【００４０】
もう一方のコントロールを、例えばDNAポリメラーゼ阻害剤の存在によるPCR反応の失敗を検出する増幅陽性コントロールとして用いてよい。好ましい実施形態において、増幅陽性コントロールは、CFTR遺伝子断片の増幅に用いられたものと同じプライマー及び同じPCR条件を用いることによって増幅され得る組換えプラスミドからなる。プライマーのサイズ及び内部配列はともに、CFTR遺伝子の増幅及び組換えプラスミドの増幅により得られるPCR産物間で異なる。このようにして、両方の種類の増幅産物は、ゲル電気泳動または特異的プローブとのハイブリダイゼーションによって容易に区別され得る。図６は、これらの特徴を有する組換えプラスミドpPG44の模式図を示す。
【００４１】
プラスミドpPG44を、分子クローニング技術によって構築した。要するに、CFTRプライマーのCFTR-F4及びCFTR-R5で挟まれた、ベクターpBluescript（登録商標）II SK +（Stratagene、米国、カリフォルニア州、ラホーヤ）の124位〜1285位の1162bpの断片からなるDNA挿入部分を、Promega社（米国、ウィスコンシン州、マディソン）からの市販で入手可能なキットを用いて、pGEM（登録商標）-T Easyベクターにクローニングした。得られた組換えプラスミドpPG44の精製調製物を、制限酵素の使用及び配列分析によってさらに特徴づけした。プラスミドpPG44を、直線状の形態で、増幅プロセスの陽性コントロールとして用いた。
【００４２】
試料が分析される同じPCR増幅混合物中に、前記の組換えプラスミドのような陽性コントロールが存在することは、偽陰性の結果の出現を防ぎ、すなわち、これにより、試料中に標的HPVゲノムが存在していても陰性の結果が生じることを防ぐ。なぜなら、いずれの増幅産物が生成されない場合には、PCR増幅が適切に作動していなかったと推測しなければならず、試料中のHPVゲノムの存否について結果を導き出すことができないからである。
【００４３】
前記の2種類の陽性コントロール、つまりDNA品質コントロール及び増幅反応コントロールの特異的検出用のプローブを、表２に示す（配列番号136〜139及び配列番号145〜147）。本発明の任意の増幅産物に対して顕著な相同性を示さないオリゴヌクレオチド配列も、表２（配列番号140〜141）に示す。マイクロアレイの表面に固定化される場合、ビオチン修飾オリゴヌクレオチドの配列番号140及び配列番号141は、PCR産物検出反応の陽性コントロールとしての、及び残りすべてのプローブが配置され得るような位置決め参照として機能する。
【００４４】
【表２】
2009502190.tif 000005
【００４５】
本発明はまた、臨床試料中のHPV型の特異的検出用のin vitro診断キットに関する。好ましくは、前記キットは、以下の成分のいずれかまたはすべてを含むであろう：増幅緩衝液、dNTP、プライマー、及びコントロールプラスミドを含む増幅用混合物；洗浄緩衝液；検出試薬；HPV型特異的プローブを含む固体支持体を含むアレイチューブ；並びに試料の獲得及び調製用試薬。当業者であれば、適切なキットの構成要素及び緩衝液の組成を決定し得るであろうが、特定の構成要素は、キットを用いることを意図する正確な条件に依存するであろう。
【実施例】
【００４６】
以下に示す実施例は、本発明を単に説明するものであり、添付の特許請求の範囲を制限するものではない。
【００４７】
＜実施例１：「アレイチューブ」の調製＞
本発明の「アレイチューブ」は、CLONDIAGチップテクノロジーズGmbH（ドイツ、イェーナ）で、以下のようにして製造された。公称収容容量1.5mlのポリプロピレン製のエッペンドルフの標準的な反応試験チューブを、再溶融により改変して、粘着性の縁部を有するマイクロアレイ支持体のための開放凹部をチューブ内に作製した。
【００４８】
これらのチューブ内に挿入されるマイクロアレイは、MicroGrid II Arrayer（BioRobotics、英国、ケンブリッジ）を用いて製造された。配列表からの配列を有する5'末端アミノ修飾オリゴヌクレオチドからなるプローブを、スライド（スライドサイズ：75mm×25mm）のエポキシ化されたガラス表面上の規定された部位に堆積させ、共有結合により固定化した。一つのマイクロアレイは、オリゴヌクレオチドを堆積させ得る12×10=120または12×11=132の特定の位置を含んでいた。これらの位置は、0.2mmの間隔を有し、それによって、各マイクロアレイに含まれるDNAライブラリーは2.4mm×2.4mmの面積を覆い、合計で、スライド1枚当たり100を超える同一のDNAライブラリーをこのようにして製造することができた。実験の種類に応じて、これらの位置の1つずつに、単一プローブのみまたはそれらの混合物を堆積させることができた。プローブ選択のための特異性及び感度実験が実施される場合、通常、単一プローブをそれぞれの位置に堆積させた。HPV遺伝子型同定アッセイを行う場合、プローブが確認されると、特異的なHPV型の増幅産物の離れた領域にハイブリダイズし得るプローブの混合物を同じ位置に堆積させることができた。図１〜５は、本発明で用いられたマイクロアレイ内のプローブの種々の配置を示す。各プローブまたはプローブの混合物について2または3の複製物を各マイクロアレイ内に含めた。
【００４９】
HPV遺伝子型同定用の、並びに増幅コントロール及びDNAコントロールの妥当性の検出用の特異的プローブの他に、マイクロアレイは、いくつかの位置に、本発明からのいずれの増幅配列に対しても顕著な相同性を有さない5'末端ビオチン修飾オリゴヌクレオチド（マーカー-1 ［配列番号140］及びマーカー-2 ［配列番号141］）からなる参照マーカーを含んだ。これらの参照マーカーは、検出反応の適切な遂行を立証するため、及びリーダーによる画像の光学的方位のための両方に機能し、それによって、残りすべてのプローブが配置され且つデータが分析され得る。
【００５０】
すべてのオリゴヌクレオチドを、1×QMT滴下溶液I（Quantifoil Micro Tools GmbH、ドイツ、イェーナ）からスライド上に堆積させた。それぞれの滴下溶液中のオリゴヌクレオチドの総濃度は、参照マーカーについての2.5μMから特異的プローブについての20μMまでの範囲であった。次いで、60℃にて30分間の焼付けとそれに続く複数の工程の洗浄プロセスによって、オリゴヌクレオチドをガラス表面上のエポキシド基に共有結合させた。乾燥させたスライドを、3.15mm×3.15mmのガラス片に切断したが、これは、厳密に言うと、我々がマイクロアレイと名付けたものである。「アレイチューブ」製造の最終工程において、次いで、これらのマイクロアレイを前記改変エッペンドルフチューブに挿入し、接着性縁部に接着させた。図７は、本実施例で記載するようにして製造された「アレイチューブ」の写真を示す。
【００５１】
＜実施例２：DNA試料の調製＞
２．１  HPV DNA標準物質
型特異的プローブの特異性及び感度を評価するために用いられるHPV DNAは、増幅L1領域（HPV 6、11、13、16、18、26、31、33、35、39、40、42、44、45、51、52、53、54、56、58、61、62、66、68、70、71、72、73、81、82、83、84、85、及び89型）を含む組換えプラスミド、または増幅L1領域がDNA配列決定によってさらに特徴づけされた臨床試料から抽出されたDNAのいずれかであった。組換えプラスミドは、分子クローニング技術によって構築された。要するに、各HPV型からの増幅L1領域を、Promega社（米国、ウィスコンシン州、マディソン）からの市販で入手可能なキットを用いて、pGEM（登録商標）-T Easyベクターにクローニングした。各組換えプラスミドから得られた精製調製物を、配列分析によってさらに特徴づけした。1〜10pgのプラスミドDNAを、特異性実験の評価に用いた。
【００５２】
K562細胞株（カタログ番号DD2011、Promega社、米国、ウィスコンシン州、マディソン）からのDNAは、CFTR特異的プローブの特異性及び感度の評価に役立った。
【００５３】
２．２  臨床試料
HPVを検出する目的のために、まず、残りの生体物質からDNAを分離する必要がある。DNA調製手順は、試料の供給源により変化する。種々の供給源由来の試料からのDNAの調製の具体例を示す。
【００５４】
Ａ．スワブ：清潔で乾燥した綿のスワブで試料を採取した。試料を含む容器に1.5mlの生理食塩水を直接添加し、激しくボルテックスすることによって、臨床用スワブから細胞を回収した。試料物質を、1.5mlのエッペンドルフチューブに移し、遠心分離によって沈殿させた。上清を捨て、沈殿した細胞を、10mM Tris-HCl（25℃にてpH 9.0）、50mM KCl、0.15mM MgCl2、0.1% Triton（登録商標）X-100、0.5% Tween 20、及び0.25mg/mlプロテイナーゼKを含有する溶解緩衝液100μlに懸濁した。この混合物を56℃にて約2時間インキュベーションし、混合物を100℃にて10分間加熱することによってプロテイナーゼKを熱不活化した。破屑物を遠心分離により沈殿させ、上清を清潔な滅菌チューブに移した。その後、5μlの分割量をPCR反応に用いた。
【００５５】
Ｂ．細胞懸濁物：この種類の試料は、細胞診断学試験に基づく頚膣部液で用いられるものを示す。頚部検体をブラシまたはヘラで採取し、PreservCyt溶液（Cytyc社、米国、マサチューセッツ州、マールボロ）に再懸濁した。1mlの分割量を遠心分離し、沈殿物を1mlの生理食塩水に再懸濁した。あらたな遠心分離工程の後に、Ａ項のスワブ試料に用いられた溶解緩衝液100μlに沈殿物を再懸濁し、前記の項と同じようにしてプロトコールを継続した。
【００５６】
Ｃ．ホルマリン固定及びパラフィン包埋生検：幅5μmのいくつかの組織切片、生検からの表面積に応じて、典型的には2〜5個の切片を本方法で用いた。切片を、1.5mlの滅菌チューブに入れ、Ａ項のスワブ試料で用いられた溶解緩衝液100μlを加えた。プロテイナーゼKとのインキュベーションを3時間行った以外は、前記の項と同じようにしてプロトコールを継続した。
【００５７】
あるいは、種々の供給源由来の試料からのDNA単離用に設計された市販のキット（BD Biosciences Clontech社（米国、カリフォルニア州、パロアルト）からのNucleoSpin（登録商標）Tissueキット、カタログ番号635966）を用いてスワブ、細胞懸濁物、またはホルマリン固定及びパラフィン包埋生検試料を処理した。この場合、DNA単離プロトコールの開始はＡ、Ｂ、及びＣ項に記載したとおりであった。100μlの溶解緩衝液の代わりに、180μlの緩衝液T1を試料に加えた。細胞及び組織からのゲノムDNAの単離のための供給業者の仕様書に従って、プロトコールを継続した。
【００５８】
臨床試料またはDNA調製方法の種類にかかわらず、試料の各バッチと並行して陰性コントロールを処理した。1mlの生理食塩水からなるこれらの陰性コントロールを、Ａ項と同じようにして処理した。
【００５９】
＜実施例３：PCR増幅＞
コンセンサスプライマーMY11及びMY09（Manosら、Molecular Diagnostics of Human Cancer；Furth M、Greaves MF編；Cold Spring Harbor Press. 1989、第7巻：209〜214頁）を用いるPCR増幅を行った。MY09及びMY11のみでは効率的に増幅されないHPV 51型を増幅するために、MY09及びMY11と組み合わせてしばしば用いられる第3のプライマーのHMB01（Hildesheimら、J Infect Dis. 1994、169；235〜240頁）も、PCR反応に含めた。要するに、10mM Tris-HCl pH 8.3、50mM KCl、1mM MgCl2、0.3μMの各プライマーMY09及びMY11（配列番号142及び143）、0.03μMのプライマーHMB01（配列番号144）、200μMの各dNTP、4ユニットのAmpliTaq Gold DNAポリメラーゼ（Applied Biosystems、米国、カリフォルニア州、フォスターシティ）、並びに5μlの実施例２．１からのHPV DNA標準物質または実施例２．２からの臨床試料DNAのそれぞれを含む最終容量50μlの反応で、PCR増幅を行った。試料DNAの適合性を試験するために、0.08μMの各プライマーCFTR-F4及びCFTR-R5（配列番号134及び135）も、反応混合物に加えた。さらに、増幅プロセスを確認し、反応の失敗による偽陰性の結果を排除するために、20fgの内部コントロールpPG44を、試料を分析する同じ反応チューブに含めた。PCR反応に用いられたすべての正方向プライマー（MY11［配列番号143］及びCFTR-F4［配列番号134］）を、任意の増幅DNAをその後に検出できるように、5'末端でビオチン修飾した。
【００６０】
実施例２．２からの5μlの空試料または5μlの脱イオン水からなる陰性コントロールを、試料DNAと並行して処理した。これらの種類の陰性コントロールの使用は、試料の処理中またはPCR反応準備中の任意の時点で汚染が起こっていないこと、並びにすべての陽性結果が試料中にDNAが本当に存在することを表すことを確認するのに役立つ。
【００６１】
PCR反応を、以下のサイクルプロファイルをプログラム化したMastercyclerサーモサイクラー（エッペンドルフ、ドイツ、ハンブルグ）で行った：95℃にて9分間を1サイクルの最初の変性、94℃にて30秒間、55℃にて60秒間、及び72℃にて90秒間を45サイクル、並びに72℃にて8分間を1サイクルの最終伸長。増幅後に、5μlの各反応物を、特異的プローブを用いたその後の検出に用いた。
【００６２】
＜実施例４：「アレイチューブ」を用いたHPV遺伝子型の同時同定＞
300μlの0.5×PBS-Tween 20緩衝液を各チューブに加え、それらを数回反転することによって、使用直前に「アレイチューブ」を予備洗浄した。吸引システムに接続されたパスツールピペットを用いて、各チューブの内部からすべての液体を除去した。
【００６３】
実施例３からの増幅反応物を、それらを95℃にて10分間加熱し、その直後にそれらを5分間氷上で冷却することによって変性させた。変性した増幅反応物5マイクロリットルを、100μlのハイブリダイゼーション溶液（250mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH7.2；SSC 1×；0.2% Triton（登録商標）X-100；1 mM EDTA、pH 8.0）とともに、実施例１で調製された「アレイチューブ」に加えた。ハイブリダイゼーション反応は、「アレイチューブ」を550rpmで振とうしながら55℃にて1時間インキュベーションすることによって、Thermomixerコンフォート（エッペンドルフ、ドイツ、ハンブルグ）で行った。インキュベーション期間の後に、ハイブリダイゼーション反応物を、吸引システムに連結されたパスツールピペットを用いて除去し、300μlの0.5×PBS-Tween 20緩衝液で洗浄工程を行った。
【００６４】
ハイブリダイズしたDNAを、550rpmで振とうしながら100μlの0.075μg/ml Poly-HRPストレプトアビジン（Pierce Biotechnology社、米国、イリノイ州、ロックフォード）溶液中で30℃にて15分間のインキュベーションによって検出した。次いで、「アレイチューブ」からすべての液体を迅速に除去し、前記のような2回の洗浄工程を行った。発色反応は、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン（TMB）及びH2O2を含む緩衝溶液からなるTrue Blue（商標）ペルオキシダーゼ基質（KPL、米国、メリーランド州、ゲーサーズバーグ）100μl中で、25℃にて10分間のインキュベーションにより行った。このようにして生じた着色沈殿物は、マイクロアレイの特定の位置で光伝送の変化を引き起こし、これをCLONDIAGチップテクノロジーズGmbH（ドイツ、イェーナ）により製造されているATR01またはATSリーダーによって読み取ることができる。場合により、ATSリーダーは、本発明で開発された「アレイチューブ」に関して得られた試料分析結果の自動処理のために、特定のソフトウェアがインストールされていてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】12×11=132の位置を有するマイクロアレイの表面上のプローブの配置を示す。数字は、配列表からの配列番号に相当する。単一プローブを、21種の異なるHPV型、DNA試料品質コントロール、及び増幅コントロールの検出のために、2つの異なる位置に固定した。LR＝位置参照のためのプローブ（配列番号140＋配列番号141）。
【図２】12×11=132の位置を有するマイクロアレイの表面上のプローブの配置を示す。数字は、配列表からの配列番号に相当する。単一プローブまたはプローブの混合物を、23種の異なるHPV型、DNA試料品質コントロール、及び増幅コントロールの検出のために、2つの異なる位置に固定した。LR＝位置参照のためのプローブ（配列番号140＋配列番号141）。
【図３】12×11=132の位置を有するマイクロアレイの表面上のプローブの配置を示す。数字は、配列表からの配列番号に相当する。プローブの混合物を、42種の異なるHPV型及びDNA試料品質コントロールの検出のために、2つの異なる位置に固定した。LR＝位置参照のためのプローブ（配列番号140＋配列番号141）；M1＝配列番号76＋配列番号77＋配列番号78；M2＝配列番号122＋配列番号123＋配列番号124；M3＝配列番号116＋配列番号117＋配列番号118＋配列番号119。
【図４】12×10=120の位置を有するマイクロアレイの表面上のプローブの配置を示す。数字は、配列表からの配列番号に相当する。単一プローブまたはプローブの混合物を、35種の異なるHPV型、DNA試料品質コントロール、及び増幅コントロールの検出のために、3つの異なる位置に固定した。LR＝位置参照のためのプローブ（配列番号140＋配列番号141）；M1＝配列番号76＋配列番号77＋配列番号78；M2＝配列番号122＋配列番号123＋配列番号124。
【図５】12×10=120の位置を有するマイクロアレイの表面上のプローブの配置を示す。数字は、配列表からの配列番号に相当する。単一プローブまたはプローブの混合物を、14種の異なるHPV型、DNA試料品質コントロール、及び増幅コントロールの検出のために、2つの異なる位置に固定した。LR＝位置参照のためのプローブ（配列番号140＋配列番号141）；M4＝配列番号100＋配列番号101＋配列番号102。
【図６】増幅陽性コントロールとしてPCR反応で用いられた組換えプラスミドpPG44の模式図を示す。
【図７】本発明で用いられた「アレイチューブ」の写真を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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