(57)【要約】  本発明は、有効成分として少なくとも１種のプロテアソーム阻害剤及びタンパク質フォールディング酵素の阻害剤を含有する医薬組成物に関する。この剤は、ヒト及び動物に病原性のウィルスでの急性の及び慢性の感染の治療に適している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種のユビキチン−プロテアソーム系の阻害剤及びタンパク質フォールディング酵素の阻害剤を有効成分とする、医薬組成物。
【請求項２】
タンパク質フォールディング酵素の阻害剤が、少なくとも１種の細胞シャペロンの阻害剤であるか又はタンパク質のフォールディングに直接的に影響を及ぼす少なくとも１種の化学物質（化学的抗シャペロン）であることを特徴とする、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
細胞シャペロンの阻害剤として又は化学的抗シャペロンとして、次の物質：
ａ）ウィルスタンパク質のフォールディング及びタンパク質加水分解の成熟を抑制するか、調節するか又は他の様式で影響を及ぼし、これにより、ウィルスの放出及び複製を抑制する物質、このウィルスが特に、感染疾患、例えばＡＩＤＳ、肝炎、出血熱、ＳＡＲＳ、疱瘡、はしか、ポリオ、ヘルペスウィルス感染又は流行性感冒の病原体のウィルスである、又は
ｂ）誤ってフォールディングされたタンパク質の蓄積によりプログラム細胞死に追い込むことにより、変性した細胞、特に腫瘍細胞の増殖を妨げる物質、
が使用されることを特徴とする、請求項２記載の医薬組成物。
【請求項４】
細胞シャペロンの阻害剤として又は化学的抗シャペロンにより、宿主細胞のフォールディング分子状酵素の酵素活性に特に影響を及ぼす物質が使用されることを特徴とする、請求項２又は３記載の医薬組成物。
【請求項５】
細胞シャペロンの阻害剤として又は化学的抗シャペロンにより、高級真核生物の細胞により吸収され、細胞吸収後に、ウィルス構造タンパク質及び腫瘍細胞からのタンパク質のタンパク質フォールディングを遮断する物質が使用されることを特徴とする、請求項２から４までのいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項６】
細胞シャペロンの阻害剤として又は化学的な抗シャペロンにより、様々な形態でｉｎ  ｖｉｖｏで経口で、静脈内、筋肉内、皮下に、又は、細胞特異性の基礎となる変更有り又は無しでカプセル化された形態で投与され、特定の適用−及び用量規定の適用のために少ない細胞毒性を有し、副作用を全く又はほとんど引き起こさず、比較的高い代謝半減時間及び比較的少ないクリアランス速度を生物中で有する物質が使用されることを特徴とする、請求項２から５までのいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項７】
細胞シャペロンの阻害剤として又は化学的な抗シャペロンとして、次の物質：
ａ）微生物又は他の天然の供給源から天然の形態で単離される物質、又は
ｂ）天然の物質から化学的な修飾により生じる物質、又は
ｃ）完全に合成により製造される物質、又は
ｄ）遺伝子療法によりｉｎ  ｖｉｖｏで合成される物質
が使用されることを特徴とする、請求項２から５までのいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項８】
細胞シャペロンの阻害剤として又は化学的な抗シャペロンにより、ウィルス構造タンパク質のアセンブリー化及びタンパク質加水分解的成熟の高度に組織化されたプロセスを妨げ、かつ、これにより、感染性の子孫ウィルスの放出及び生産を抑制する物質が使用されることを特徴とする、請求項２から５までのいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項９】
細胞シャペロンの阻害剤として又は化学的な抗シャペロンにより、ウィルスタンパク質及び／又は腫瘍特異的なタンパク質のフォールディングを調節するか、妨げるか又は遮断する物質が使用されることを特徴とする、請求項２から５までのいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１０】
細胞シャペロンの阻害剤として又は化学的シャペロンにより、ウィルス複製の後期のプロセス、例えばアセンブリー化、出芽、タンパク質加水分解による成熟及びウィルス放出を妨げる物質が使用されることを特徴とする、請求項２から５までのいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１１】
細胞シャペロンの阻害剤として又は化学的な抗シャペロンとして、ウィルスのポリプロテインの前駆体タンパク質のタンパク質加水分解によるプロセッシングを妨げる物質が使用されることを特徴とする、請求項２から５までのいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１２】
細胞シャペロンの阻害剤として又は化学的な抗シャペロンとして、ウィルスプロテアーゼの活性を遮断する物質が使用されることを特徴とする、請求項２から５までのいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１３】
細胞シャペロンの阻害剤として又は化学的な抗シャペロンにより、細胞プロテアーゼ及び／又は酵素、例えば、リガーゼ、キナーゼ、ヒドロラーゼ、グリコシル化酵素、ホスファターゼ、ＤＮアーゼ、ＲＮアーゼ、ヘリカーゼ及びトランスフェラーゼ（これらは、ウィルス成熟に関与している）の活性を妨げる物質を使用することを特徴とする、請求項２から５までのいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１４】
細胞シャペロンの阻害剤として又は化学的な抗シャペロンにより、幅広い作用スペクトルを有し、かつ、従って、新規の広範囲なウィルス静止剤として、様々なウィルス感染の予防及び／又は治療のために使用される物質が使用されることを特徴とする、請求項２から５までのいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１５】
細胞シャペロンの阻害剤として又は化学的な抗シャペロンにより、細胞シャペロン、例えばヒートショックプロテイン（heat shock proteins (hsp)）を遮断する物質が使用されることを特徴とする、請求項２から５までのいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１６】
細胞シャペロンの阻害剤として又は化学的な抗シャペロンにより、ヒートショックプロテイン、Ｈｓｐ２７、Ｈｓｐ３０、Ｈｓｐ４０、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ７２、Ｈｓｐ７３、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１０４及びＨｓｃ７０の活性を阻害する物質が使用されることを特徴とする、請求項２から５までのいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１７】
細胞シャペロンの阻害剤として、次の物質クラス及びその誘導体：
ゲルダナマイシン（Ｈｓｐ９０を阻害）、ラジシコール（チロシンキナーゼ阻害剤、Ｈｓｐ９０を阻害）、デオキシスペルグアリン（Ｈｓｃ７０及びＨｓｐ９０を阻害）、４−ＰＢＡ（４−フェニルブチラート；Ｈｓｃ７０のタンパク質−及びｍＲＮＡ発現の下流調節）、ヘルビマイシンＡ（チロシンキナーゼ阻害剤、Ｈｓｐ７２／７３誘導と共に）、エポラクタエン（Ｈｓｐ６０の阻害剤）、サイズ及びリーパー（Ｈｓｐ７０を阻害）、アルテミシニン（Ｈｓｐ９０の阻害剤）、ＣＣＴ０１８０１５９（Ｈｓｐ９０のピラゾール阻害剤として）及びＳＮＸ−２１１２（Ｈｓｐ９０の阻害剤）、ラダナマイシン（ラジシコール及びゲルダナマイシンのマクロライドキメラ）、ノボビオシン（Ｈｓｐ９０阻害剤）、ケルセチン（Ｈｓｐ７０発現の阻害剤）に属する物質が使用されることを特徴とする、請求項２から５までのいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１８】
化学的な抗シャペロンとして、ウィルス及び／又は腫瘍特異的なタンパク質のタンパク質コンフォーメーション及びフォールディングを調節するか、妨げるか又は遮断する物質が使用されることを特徴とする、請求項２から５までのいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１９】
化学的抗シャペロンとして、物質、例えばグリセロール、トリメチルアミン、ベタイン、トレハロース又は重水素化水（Ｄ2Ｏ）が使用されることを特徴とする、請求項１８記載の医薬組成物。
【請求項２０】
化学的抗シャペロンとして、様々なヒト病原性の又は動物病原性のウィルスでの感染の、処置、治療及び抑制のために適している物質を使用することを特徴とする、請求項１８又は１９記載の医薬組成物。
【請求項２１】
分子シャペロン又は化学的抗シャペロンの阻害剤として、慢性的な感染疾患、例えばＡＩＤＳ（ＨＩＶー１及びＨＩＶ−２）、肝炎（ＨＣＶ及びＨＢＶ）の病原体、「Severe Acute Respiratory Syndroms」（SARS）の病原体、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ（コロナウィルス）、疱瘡ウィルス、ウィルス出血熱（ＶＨＦ）の病原体、例えば、フィロウィルス科の代表例としてのエボラウィルス、流行性感冒病原体、例えばインフルエンザＡウィルスでの感染の、処置、治療及び抑制のために適している物質を使用することを特徴とする、請求項２から５までのいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項２２】
サイクロスポリンＡ及び／又はタクロリムスを使用することを特徴とする、請求項２から５までのいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項２３】
ＵＰＳの阻害剤が、以下の少なくとも１種の物質：
ａ）特に、プロテアソーム阻害剤の形にある物質、これは、完全な２６Ｓプロテアソーム複合体の酵素活性、及び、遊離の、調節性サブユニットとアセンブリー化していない２０Ｓ触媒活性のあるプロテアソーム構造の酵素活性に影響を及ぼす、又は、
ｂ）特に、ユビキチンリガーゼの作用を抑制する物質、又は
ｃ）特に、ユビキチンヒドロラーゼの作用を抑制する物質、又は
ｄ）特に、ユビキチン活性性の酵素の作用を抑制する物質、又は
ｅ）特に、タンパク質のモノ−ユビキチン化を抑制する物質、又は
ｆ）特に、タンパク質のポリ−ユビキチン化を抑制する物質
であることを特徴とする、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項２４】
プロテアソーム阻害剤として、高級真核生物により取り込まれ、かつ、細胞取り込み後にプロテアソームの触媒性サブユニットと相互作用し、かつ、この際、全ての又は個々の、前記プロテアソームのタンパク質加水分解活性−トリプシン−、キモトリプシン−及び／又はポストグルタミル−ペプチドを加水分解する活性−を、２６Ｓ又は２０Ｓのプロテアソーム複合体内で不可逆的に又は可逆的に遮断する物質が使用されることを特徴とする、請求項２３記載の医薬組成物。
【請求項２５】
プロテアソーム阻害剤として、以下の物質：
ｇ）微生物又は他の天然の供給源から天然の形態で単離される物質、又は
ｈ）天然の物質から化学的な修飾により生じる物質、又は
ｉ）完全に合成により製造される物質、又は
ｊ）遺伝子療法によりｉｎ  ｖｉｖｏで合成される物質、
ｋ）遺伝子技術方法によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで又は
ｌ）微生物中で製造される物質
が使用されることを特徴とする、請求項２３又は２４記載の医薬組成物。
【請求項２６】
プロテアソーム阻害剤として、次の物質クラス：
ｆ）天然に存在するプロテアソーム阻害剤：
−Ｃ末端のエポキシケトン構造を含有するペプチド誘導体、又は
−β−ラクトン誘導体、又は
−アクラシノマイシンＡ（アクラルビシンとも呼ばれる）、又は
−ラクタシスチン及びその化学的に修飾された変形、例えば、細胞膜透過性の変形「クラストラクタシステインβ−ラクトン」
ｇ）合成により製造されたプロテアソーム阻害剤：−修飾されたペプチドアルデヒド、例えばＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシナール（ＭＧ１３２又はｚＬＬＬとも呼ばれる）、そのホウ酸誘導体、ＭＧ２３２；Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｎｖａ−Ｈ（ＭＧ１１５と呼ばれる；Ｎ−アセチル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ノルロイシナール（ＬＬｎＬと呼ばれる）、Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｈ（ＰＳＩとも呼ばれる）；
ｈ）Ｃ末端に、α，β−エポキシケトン構造、更には、ビニルスルホンを有するペプチド、例えば、カルボベンゾキシ−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシニル−Ｌーロイシン−ビニル−スルホン又は４−ヒドロキシ−５−ヨード−３−ニトロフェニルラクテチル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシニル−Ｌーロイシン−ビニル−スルホン（ＮＬＶＳ）：
ｉ）グリオキサール−又はホウ酸残基、例えばピラジル−ＣＯＮＨ（ＣＨＰｈｅ）ＣＯＮＨ（ＣＨイソブチル）Ｂ（ＯＨ）2）並びにジペプチジル−ホウ酸−誘導体又は
ｊ）ピナコールエステル、例えばベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ｂｏｒｏＬｅｕ−ピナコール−エステル
に属する物質が使用されることを特徴とする、請求項２３から２５までのいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項２７】
特に適したプロテアソーム阻害剤として、エポキシケトン、エポキソマイシン（Epoxomycin、分子式Ｃ28Ｈ86Ｎ4Ｏ7）及び／又はエポネマイシン（Eponemicin：分子式Ｃ20Ｈ36Ｎ2Ｏ5）が使用されることを特徴とする、請求項２３から２５までのいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項２８】
特に適したプロテアソーム阻害剤としてＰＳ系列から次の化合物：
ｋ）  ＰＳ−５１９、β−ラクトン−並びにラクタシスチン誘導体として、化合物１Ｒ−［１Ｓ，４Ｒ，５Ｓ］］−１−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−４−プロピル−６−オキサ−２−アザビシクロ［３．２．０］ヘプタン−３，７−ジオン−分子式Ｃ12Ｈ19ＮＯ4−及び／又は
ｌ）ＰＳ３１４、ペプチジル−ホウ酸−誘導体として、化合物Ｎ−ピラジンカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン−Ｌ−ロイシン−ホウ酸、分子式Ｃ19Ｈ25ＢＮ4Ｏ4及び／又は
ｍ）ＰＳ−２７３（モルホリン−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−ナフチル）−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−イソブチル）−Ｂ（ＯＨ）2）及びそのエナンチオマーＰＳ２９３；及び／又は
ｎ）化合物ＰＳ−２９６（８−キノリル−スルホニル−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−ナフチル）−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−イソブチル）−Ｂ（ＯＨ）2）及び／又は
ｏ）ＰＳ−３０３（ＮＨ2（ＣＨ−ナフチル）−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−イソブチル）−Ｂ（ＯＨ）2）及び／又は
ｐ）ＰＳ−３２１（モルホリン−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−ナフチル）−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−フェニルアラニン）−Ｂ（ＯＨ）2）として、及び／又は
ｑ）ＰＳ−３３４（ＣＨ3−ＮＨ−（ＣＨ−ナフチル−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−イソブチル）−Ｂ（ＯＨ）2）及び／又は
ｒ）化合物ＰＳ−３２５（２−キノール−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−homo−フェニルアラニン）−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−イソブチル）−Ｂ（ＯＨ）2）及び／又は
ｓ）ＰＳ−３５２（フェニルアラニン−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯＮＨ−（ＣＨフェニルアラニン）−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−イソブチル）ｌ−Ｂ（ＯＨ）2）及び／又は
ｔ）ＰＳ−３８３（ピリジル−ＣＯＮＨ−（ＣＨpＦ−フェニルアラニン）−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−イソブチル）−Ｂ（ＯＨ）2））
が使用されることを特徴とする、請求項２３から２５までのいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項２９】
請求項１から２８までのいずれか１項記載の組成物を含有する、ウィルス感染及び／又は腫瘍疾患の治療のための剤。
【請求項３０】
ウィルス感染及び／又は腫瘍疾患の治療のための、請求項１から２８までのいずれか１項記載の組成物の使用。
【請求項３１】
ウィルス感染及び／又は腫瘍疾患の治療のための剤の製造のための、請求項１から２８までのいずれか１項記載の組成物の使用。
【請求項３２】
ウィルス感染及び／又は腫瘍疾患の治療のために使用される他の剤と組み合わせた、請求項３０又は３１記載の使用。
【請求項３３】
−吸入剤、
−デポー形態、
−プラスター、
−マイクロエレクトロニクス系（「インテリジェントピル」）
の形での、請求項３０から３２までのいずれか１項記載の使用。
【請求項３４】
腫瘍学及び／又は腫瘍学及びウィルス学における、請求項３０から３３までのいずれか１項記載の使用。
【請求項３５】
−グリオ芽細胞腫（悪性の脳腫瘍）
−乳ＣＡ（ＣＡ＝癌）
−頭部ＣＡ、喉部ＣＡ、
−偏平上皮−ＣＡ、
−卵巣ＣＡ、
−気管支ＣＡ（小細胞の、大細胞の）、
−甲状腺ＣＡ、
−肺ＣＡ、
−大腸ＣＡ、
−膵臓ＣＡ、
−白血病（ＡＭＬ、ＡＬＬ、ＣＭＬ、ＣＬＬ）
−急性脊髄性、慢性、
−急性リンパ性、慢性、
−リンパ腫（ホジキンでない）、
−頸部ＣＡ、
−神経芽細胞腫、
−皮膚ＣＡ（メラノーマ）、
−前立腺ＣＡ、
−膀胱ＣＡ、
−サルコーマ（骨、特に軟質部分）、
−横隔膜ＣＡ、
−消化管路ＣＡ（例えば、胃、食道）、
−精巣ＣＡ
−転位（例えば骨髄）、
−リンパ腫ウィルス、
−単純ヘルペス、
−サイトメガロウィルス、
−水疱、
−水疱・帯状ヘルペス、
−はしか、
−ラッサ熱、
−ＡＩＤＳ、
−おたふく風邪（−髄膜炎、−精巣炎）、
−腸炎；流行性感冒（全ての形態）、
−脳炎、
−肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ）
−風疹、
−コクサッキーＢ、
−ポリオ（−脊髄炎）
−脳髄炎、
−膵炎、
−肺炎、
−心筋炎、
−熱帯性疾患（ウィルス性）、
−全ての二重鎖及び一重鎖のＤＮＡ及びＲＮＡヒト病原性ウィルス
の治療のための、請求項３０又は３１記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の詳細な説明
本発明は、有効成分として少なくとも１種のプロテアソーム阻害剤及びタンパク質フォールディング酵素の阻害剤を含有する医薬組成物に関する。この剤は、ヒト及び動物に病原性のウィルスでの急性の及び慢性の感染の治療に適している。このためには、特に、感染疾患、例えばＡＩＤＳ、肝炎、出血熱、ＳＡＲＳ、疱瘡、はしか、ポリオ又は流行性感冒の病原体が挙げられる。本発明の主題は、一方では有効成分としてタンパク質フォールディングの阻害剤を含有する剤である。このためには、細胞フォールディング酵素の阻害剤（酵素シャペロン）、また、タンパク質のフォールディングを化学的シャペロンにより妨げる物質も挙げられる。他方では、この剤は、ユビキチン−プロテアソーム系を阻害する成分、特に、２６Ｓプロテアソームを阻害する剤を含有する。この治療剤の組み合わせにおいて、相互に別個に、又は、同時に、タンパク質生合成の効率及び誤ってフォールディングしたタンパク質の分解が妨げられるものである。この作用を合計すると、目的とされる変性された腫瘍細胞及び／又は急性的に及び／又は慢性的にウィルスにより感染された細胞は、その生存率において損なわれ、従って、プログラム細胞死（アポトーシス）に導かれる。適用領域は、ウィルス感染及び／又は腫瘍疾患の治療である。
【０００２】
技術水準
タンパク質のフォールディング酵素の阻害剤は、刊行物WO 2005/063281 A2から公知である。
【０００３】
プロテアソーム阻害剤は、腫瘍疾患（例えばUS 6,083,903）の治療のためにも、また同様に、ウィルス感染の治療のためにも記載されている（WO 02/30455）。
【０００４】
タンパク質フォールディング酵素の阻害剤とプロテアソーム阻害剤とからの組み合わせはこれまでには記載されていない。非プロテアソーム選択性プロテアーゼ阻害剤と、タンパク質フォールディング酵素の阻害剤との組み合わせのみが、刊行物WO 2005/063281 A2中に言及されている。
【０００５】
発明の課題
本発明の基礎となる課題は、ウィルス感染及び／又は腫瘍疾患の治療のための新規の医薬組成物を提供することであった。
【０００６】
課題の解決
前記課題は、この特許請求の範囲の特徴部により解決された。タンパク質フォールディング酵素の阻害剤とプロテアソーム阻害剤とからの本発明による組み合わせは、技術水準よりも優れている。本発明により、有効成分として少なくとも１種のユビキチン−プロテアソーム系の阻害剤と、タンパク質フォールディング酵素の阻害剤との組み合わせを含有する組成物又はタンパク質フォールディングに影響を及ぼすための方法が提供される。
【０００７】
タンパク質のフォールディング酵素の阻害剤とは、有利には、少なくとも１種の細胞シャペロンの阻害剤又は少なくとも１種の、タンパク質のフォールディングに直接的に影響を及ぼす化学物質（化学的抗シャペロン）である。
【０００８】
タンパク質のフォールディングに影響を及ぼすための方法として、有利には、局所的なハイパーサミアが使用される。
【０００９】
本発明の更なる一実施形態は、細胞シャペロンの阻害剤として又は化学的抗シャペロンにより、次の物質
ａ）ウィルスタンパク質のフォールディング及びタンパク質加水分解の成熟を抑制するか、調節するか又は他の様式で影響を及ぼし、これにより、ウィルスの放出及び複製を抑制する物質、このウィルスが特に、感染疾患、例えばＡＩＤＳ、肝炎、出血熱、ＳＡＲＳ、疱瘡、はしか、ポリオ、ヘルペスウィルス感染又は流行性感冒の病原体のウィルスである、又は
ｂ）誤ってフォールディングされたタンパク質の蓄積によりプログラム細胞死に追い込むことにより、変性した細胞、特に腫瘍細胞の増殖を妨げる物質、
が使用されることである。
【００１０】
本発明による医薬組成物は、細胞シャペロンの阻害剤として又は化学的抗シャペロンにより、宿主細胞のフォールディング分子状酵素の酵素活性に特殊に影響を及ぼす物質が使用されることを特徴とする。高級真核生物の細胞は、これらの阻害剤又は物質を吸収し、かつ、細胞吸収後に、ウィルス構造タンパク質及び腫瘍細胞からのタンパク質のタンパク質フォールディングを遮断する。阻害剤又は物質は、様々な形態でｉｎ  ｖｉｖｏで経口で、静脈内、筋肉内、皮下に、又は、細胞特異性の基礎となる変更有り又は無しでカプセル化された形態で投与され、特定の適用−及び用量規定の適用のために少ない細胞毒性を有し、副作用を全く又はほとんど引き起こさず、比較的高い代謝半減時間及び比較的少ないクリアランス速度を生物中で有することができる。
【００１１】
本発明による医薬組成物は、更に、細胞シャペロンの阻害剤として又は化学的抗シャペロンにより、
ａ）微生物又は他の天然の供給源から天然の形態で単離される、又は
ｂ）天然の物質から化学的な修飾により生じる、又は、
ｃ）完全に合成により製造される、又は、
ｄ）遺伝子療法によりｉｎ  ｖｉｖｏで合成される物質が使用されることにより特徴付けられる。
【００１２】
細胞のシャペロンの阻害剤又は化学的抗シャペロンは、ウィルス構造タンパク質のアセンブリー化及びタンパク質加水分解的成熟の高度に組織化されたプロセスを妨げ、かつ、これにより、感染性の子孫ウィルスの放出及び生産を抑制する。更に、これらの物質は、ウィルスタンパク質及び／又は腫瘍特異的なタンパク質のフォールディングを、ウィルス複製のこの後期のプロセス、例えば、アセンブリー化、出芽、タンパク質加水分解による成熟及びウィルス放出を妨げることにより、調節するか、妨げるか、又は遮断する。ウィルスポリプロテインの前駆体タンパク質のタンパク質加水分解によるプロセッシングは、これにより妨げられる。更に、ウィルスプロテアーゼの活性が遮断される。
【００１３】
本発明の更なる有利な一実施態様は、細胞シャペロンの阻害剤として又は化学的抗シャペロンにより、細胞プロテアーゼ及び／又は酵素、例えば、リガーゼ、キナーゼ、ヒドロラーゼ、グリコシル化酵素、ホスファターゼ、ＤＮアーゼ、ＲＮアーゼ、ヘリカーゼ及びトランスフェラーゼ（これらは、ウィルス成熟に関与している）の活性を妨げる物質が使用されることにある。本発明による細胞シャペロンの阻害剤又は化学的な抗シャペロンは、幅広い作用スペクトルを有し、かつ、従って、新規の広範囲なウィルス静止剤（virostatika）として、様々なウィルス感染の予防及び／又は治療のために使用されることができる。
【００１４】
この医薬組成物は、細胞シャペロンの阻害剤として又は化学的な抗シャペロンにより、細胞シャペロン、例えばヒートショックプロテイン（heat shock proteins (hsp)）、特にヒートショックプロテインＨｓｐ２７、Ｈｓｐ３０、Ｈｓｐ４０、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ７２、Ｈｓｐ７３、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１０４及びＨｓｃ７０の活性を遮断するか又は阻害する物質が使用されることにより特徴付けられる。
【００１５】
細胞シャペロンの阻害剤として、以下の物質クラス及びその誘導体に属する物質が使用されることができる：ゲルダナマイシン（Ｈｓｐ９０を阻害）、ラジシコール（チロシンキナーゼ阻害剤、Ｈｓｐ９０を阻害）、デオキシスペルグアリン（Ｈｓｃ７０及びＨｓｐ９０を阻害）、４−ＰＢＡ（４−フェニルブチラート；Ｈｓｃ７０のタンパク質−及びｍＲＮＡ発現の下流調節）、ヘルビマイシンＡ（チロシンキナーゼ阻害剤、Ｈｓｐ７２／７３誘導と共に）、エポラクタエン（Ｈｓｐ６０の阻害剤）、サイズ（Scythe）及びリーパー（Reaper）（Ｈｓｐ７０を阻害）、アルテミシニン（Ｈｓｐ９０の阻害剤）、ＣＣＴ０１８０１５９（Ｈｓｐ９０のピラゾール阻害剤として）及びＳＮＸ−２１１２（Ｈｓｐ９０の阻害剤）、ラダナマイシン（ラジシコール及びゲルダナマイシンのマクロライドキメラ）、ノボビオシン（Ｈｓｐ９０阻害剤）、ケルセチン（Quercetin）（Ｈｓｐ７０発現の阻害剤）。
【００１６】
化学的な抗シャペロンとして、タンパク質のコンフォーメーション及びウィルス及び／又は腫瘍特異的なタンパク質のフォールディングを調節するか、妨げるか又は遮断する物質が使用されることができる。これには、物質、例えば、グリセロール、トリメチルアミン、ベタイン、トレハロース又は重水素化水（Ｄ2Ｏ）が挙げられる。更に、様々なヒト病原性の又は動物病原性のウィルスでの感染の処置、治療及び抑制のために適している物質又は慢性的な感染疾患、例えばＡＩＤＳ（ＨＩＶー１及びＨＩＶ−２）、肝炎（ＨＣＶ及びＨＢＶ）の病原体、「Severe Acute Respiratory Syndroms」（SARS）の病原体、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ（コロナウィルス）、疱瘡ウィルスの病原体、ウィルス出血熱（ＶＨＦ）の病原体、例えば、フィロウィルス科の代表例としてのエボラウィルス、流行性感冒病原体、例えばインフルエンザＡウィルスでの感染の、処置、治療及び抑制のために適している物質が使用される。これには、例えばサイクロスポリンＡ及び／又はタクロリムスが挙げられる。
【００１７】
本発明による医薬組成物は、更に、ＵＰＳの阻害剤が、
ａ）特にプロテアソーム阻害剤の形にある、これは、完全な２６Ｓプロテアソーム複合体、及び、遊離の、調節性サブユニットとアセンブリー化していない２０Ｓ触媒活性のあるプロテアソーム構造の酵素活性に影響を及ぼす、又は、
ｂ）特に、ユビキチンリガーゼの作用を抑制する、又は、
ｃ）特に、ユビキチンヒドロラーゼの作用を抑制する、又は、
ｄ）特に、ユビキチン活性性の酵素の作用を抑制する、又は、
ｅ）特別に、タンパク質のモノ−ユビキチン化を抑制する、又は、
ｆ）特に、タンパク質のポリ−ユビキチン化を抑制する、少なくとも１種の物質であることにより、特徴付けられる。
【００１８】
このプロテアソーム阻害剤は、高級真核生物の細胞により取り込まれ、かつ、細胞取り込み後にプロテアソームの触媒性サブユニットと相互作用し、かつ、この際、全ての又は個々の、前記プロテアソームのタンパク質分解活性−トリプシン−、キモトリプシン−及び／又はポストグルタミル−ペプチドを加水分解する活性−を、２６Ｓ又は２０Ｓのプロテアソーム複合体内で不可逆的に又は可逆的に遮断する。
【００１９】
プロテアソーム阻害剤として、
ａ）天然の形態で微生物又は他の天然源から単離されるか、又は
ｂ）天然物質から化学的修飾により生じる、又は
ｃ）完全に合成により製造される、又は
ｄ）遺伝子的方法によりｉｎ  ｖｉｖｏで合成される、又は
ｅ）遺伝子技術方法によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで、又は
ｆ）微生物中で製造される、
物質が使用される。
【００２０】
プロテアソーム阻害剤は、以下の物質クラス；
ａ）天然に存在するプロテアソーム抑制剤：  −Ｃ末端エポキシケトン構造を含有するペプチド誘導体；又は
−β−ラクトン誘導体；又は
−アクラシノマイシンＡ（アクラルビシンとも呼ばれる）；又は
−ラクタシステイン及びその化学的に修飾された変形、例えば細胞膜透過性変形「クラストラクタシステインβ−ラクトン」
ｂ）合成により製造されたプロテアソーム抑制剤：修飾されたペプチドアルデヒド、例えばＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシナール（ＭＧ１３２又はｚＬＬＬとも呼ばれる）、そのホウ酸誘導体、ＭＧ２３２；Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｎｖａ−Ｈ（ＭＧ１１５と呼ばれる；Ｎ−アセチル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ノルロイシナール（ＬＬｎＬと呼ばれる）、Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｈ（ＰＳＩとも呼ばれる）；
ｃ）Ｃ末端に、α，β−エポキシケトン構造、更には、ビニルスルホンを有するペプチド、例えば、カルボベンゾキシ−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシニル−Ｌーロイシン−ビニル−スルホン又は４−ヒドロキシ−５−ヨード−３−ニトロフェニルラクテチル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシニル−Ｌーロイシン−ビニル−スルホン（ＮＬＶＳ）：
ｄ）グリオキサール又はホウ酸残基、例えばピラジル−ＣＯＮＨ（ＣＨＰｈｅ）ＣＯＮＨ（ＣＨイソブチル）Ｂ（ＯＨ）2）並びにジペプチジル−ホウ酸−誘導体又は
ｅ）ピナコールエステル、例えばベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ｂｏｒｏＬｅｕ−ピナコール−エステル
に属する化合物である。
【００２１】
特に適したプロテアソーム阻害剤は、エポキシケトン、エポキソマイシン（Epoxomycin、分子式Ｃ28Ｈ86Ｎ4Ｏ7）及び／又はエポネマイシン（Eponemicin：分子式Ｃ20Ｈ36Ｎ2Ｏ5）であり、又はＰＳ系列からの阻害剤、次の化合物：
ａ）  ＰＳ−５１９、β−ラクトン−並びにラクタシスチン誘導体として、化合物１Ｒ−［１Ｓ，４Ｒ，５Ｓ］］−１−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−４−プロピル−６−オキサ−２−アザビシクロ［３．２．０］ヘプタン−３，７−ジオン−分子式Ｃ12Ｈ19ＮＯ4−及び／又は
ｂ）ＰＳ３１４、ペプチジル−ホウ酸−誘導体として、化合物Ｎ−ピラジンカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン−Ｌ−ロイシン−ホウ酸、分子式Ｃ19Ｈ25ＢＮ4Ｏ4及び／又は
ｃ）ＰＳ−２７３（モルホリン−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−ナフチル）−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−イソブチル）−Ｂ（ＯＨ）2）及びそのエナンチオマーＰＳ２９３；及び／又は
ｄ）化合物ＰＳ−２９６（８−キノリル−スルホニル−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−ナフチル）−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−イソブチル）−Ｂ（ＯＨ）2）及び／又は
ｅ）ＰＳ−３０３（ＮＨ2（ＣＨ−ナフチル）−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−イソブチル）−Ｂ（ＯＨ）2）及び／又は
ｆ）ＰＳ−３２１（モルホリン−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−ナフチル）−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−フェニルアラニン）−Ｂ（ＯＨ）2）として；−及び／又は
ｇ）ＰＳ−３３４（ＣＨ3−ＮＨ−（ＣＨ−ナフチル−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−イソブチル）−Ｂ（ＯＨ）2）及び／又は
ｈ）化合物ＰＳ−３２５（２−キノール−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−homo−フェニルアラニン）−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−イソブチル）−Ｂ（ＯＨ）2）及び／又は
ｉ）ＰＳ−３５２（フェニルアラニン−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯＮＨ−（ＣＨフェニルアラニン）−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−イソブチル）−Ｂ（ＯＨ）2）及び／又は
ｊ）ＰＳ−３８３（ピリジル−ＣＯＮＨ−（ＣＨpＦ−フェニルアラニン）−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−イソブチル）−Ｂ（ＯＨ）2））
が使用される。
【００２２】
記載された医薬組成物は、医薬品として又はウィルス感染及び／又は腫瘍疾患の治療のための剤の製造のために適している。ウィルス感染及び／又は腫瘍疾患の治療のための他の剤との組み合わせも同様に可能である。
【００２３】
この剤の本発明による使用は、
−吸入剤、
−デポー剤、
−プラスター剤、
−マイクロエレクトロニクス系（「インテリジェントピル」）中で
の形態で行われる。
【００２４】
腫瘍学及び／又は腫瘍学及びウィルス学における、
−グリオ芽細胞腫（悪性の脳腫瘍）
−乳癌ＣＡ（ＣＡ＝癌）、
−頭−、喉ＣＡ
−偏平上皮−ＣＡ、
−卵巣ＣＡ、
−気管支ＣＡ（小細胞の、大細胞の）、
−甲状腺ＣＡ、
−肺−ＣＡ、
−大腸ＣＡ、
−膵臓ＣＡ、
−白血病（ＡＭＬ、ＡＬＬ、ＣＭＬ、ＣＬＬ）、
−急性脊髄性、慢性、
−急性リンパ性、慢性、
−リンパ腫（ホジキンでない）、
−頸部ＣＡ、
−神経芽細胞種、
−皮膚ＣＡ（メラノーマ）、
−前立腺−ＣＡ、
−膀胱ＣＡ、
−サルコーマ（骨、特に軟質部分）、
−横隔膜ＣＡ、
−消化管路ＣＡ（例えば、胃、食道）、
−精巣ＣＡ
−転位（例えば骨髄）、
−リンパ腫ウィルス、
−単純ヘルペス、
−サイトメガロウィルス、
−水疱、
−水疱・帯状ヘルペス、
−はしか、
−ラッサ熱、
−ＡＩＤＳ、
−おたふく風邪（−髄膜炎、−精巣炎）、
−腸炎；流行性感冒（全ての形態）、
−脳炎、
−肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ）
−風疹、
−コクサッキーＢ、
−ポリオ（−脊髄炎）、
−脳髄炎、
−膵炎、
−肺炎、
−心筋炎、
−熱帯性疾患（ウィルス性）、
−全ての二重鎖及び一重鎖のＤＮＡ及びＲＮＡヒト病原性ウィルス
の治療のための使用が可能である。
【００２５】
意外にも、タンパク質のフォールディングの機構の妨げにより、増強して誤ってフォールディングされたタンパク質が形成されることが明らかになった。タンパク質の生合成のこの誤り生成物は、通常は、ユビキチン−プロテアソーム系（ＵＰＳ）により分解され、従って、細胞代謝から除去される。ＵＰＳの阻害の際には、例えば、プロテアソーム阻害剤により及び／又はユビキチンリガーゼの阻害剤により、この、通常は、ポリユビキチン化した及び誤ってフォールディングされた、タンパク質の生合成の誤り生成物が細胞中に蓄積し、これにより、多岐にわたる、細胞代謝の障害が誘発され、これは、この作用の合計において、この問題となる細胞を有利には、プログラム細胞死（アポトーシス）に導くものである。ウィルス感染した、また同様に、迅速に分割する腫瘍細胞中は、特別に高いタンパク質生合成速度が存在するので、特にこのような細胞は、増強して、ＵＰＳ及びタンパク質フォールディングの阻害剤の作用に対して反応し、その一方で、この通常の及び健康な細胞は、この阻害剤により、十分に影響を受けないままである。これに、本発明により提案される新規の治療方法の根本的な機構は基づく。
【００２６】
本発明の特別な一実施態様において、複数のミエローマを有する患者の、形質細胞種の治療のためにこの阻害剤の作用は利用される。このＢ細胞種は、免疫グロブリンに関する極めて高い合成速度により、優れている。公知の様式では、この形質細胞種は、プロテアソーム阻害剤での治療に対して特に敏感である。従って、プロテアソーム阻害剤、特に、ホウ酸−ペプチドの形態にあるプロテアソーム阻害剤（市販名、Velcade）は、成功して、複数のミエローマの治療のために使用される。無論、プロテアソーム阻害剤での治療の際には、極めて狭い治療ウィンドウを考慮しなくてはならず、というのは、治療用量と寛容可能な毒性用量の間の境界が極めて狭いからでる。タンパク質のフォールディングの阻害剤での治療により、このような形質細胞種は、プロテアソーム阻害剤に対する作用のために敏感化される。プロテアソーム阻害剤と、タンパク質のフォールディング阻害剤の組み合わせにより、この両方の作用物質の作用は、相乗的に増強される。同時に、この両方の機構は、毒性未満の容量で、より高い有効性でもって使用されることができ、これは、合計すると、この療法の成功の見通しを実質的に高める。
【００２７】
本発明による解決策は、公知技術に対して次の利点を提供する：
−耐性の回避、
−特定の疾病の治癒、
−より高い応答速度、
−複数の腫瘍形態の治療（軽症、中程度、重症の場合）。
【００２８】
本発明の更なる有利な一実施態様は、この両方の作用物質の組み合わせにおける、抗ウィルス性の作用に関する。プロテアソーム阻害剤が、誤ってフォールディングされたＧａｇタンパク質（これは、子孫ウィルスのアセンブリー化及び放出の整理されたプロセスに干渉する）の蓄積を誘導することにより、ヒトの免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）及び他のウィルスの複製を妨げることが公知である。プロテアソーム阻害剤の治療作用は、このウィルス感染された細胞が、同時に、タンパク質のフォールディングの阻害剤で処理される場合に実質的に増強される。これにより、誤ってフォールディングされた、ウィルスの構造タンパク質の数が高められ、これは、トランスネガティブな機構において、いわゆるプリオン類似の作用様式において、ウィルスタンパク質のアセンブリー化を増強し、かつ、これにより、子孫ウィルスの形成を妨げる。本発明のこの実施態様は、新規に合成されたウィルス構造タンパク質の整理された組立が起こる全てのウィルス感染のために一般的に有効である。
【００２９】
本発明は、実施例をもとにより詳細に説明されるが、この際この実施例に限定されるべきでない。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】Ｈｓｐ９０阻害剤１７−ＡＡＧは、１０ｎＭまでの濃度でＣＥＭ細胞中で細胞毒性を示さない。ＣＤ４+−Ｔ−リンパ球細胞（ＣＥＭ細胞）を様々な濃度の１７−ＡＡＧと共にインキュベーションし、かつ、時間依存的な色変化（生存細胞の数と同じ意味を持つ）を、AlamarBlueTM (Invitrogen)の添加により、蛍光測定を用いて算出した。
【図２】サブゲノムＨＩＶ−１発現ベクターｐＮＬｅｎｖｌでトランスフェクションしたＨｅＬａＳＳ６細胞が、１７−ＡＡＧの影響下で、ウィルス画分中で、減少したＧａｇプロセッシングを示し、かつ、細胞画分中で、増強したＨｓｐ７０−発現を示した。
【００３１】
実施例
実施例１：  Ｈｓｐ９０阻害剤、１７−ＡＡＧは、１０ｎＭまでの濃度でＣＥＭ細胞中で毒性を示さない。
【００３２】
ＣＤ４+Ｔリンパ球細胞（ＣＥＭ細胞）は、９６ウェルプレート中で、１００μｌにつき１×１０4個の細胞密度で播種される。媒体（参照、実施例４）は、前もって相応する量の１７−ＡＡＧが、１７−ＡＡＧ、１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭ、及び０．０１ｎＭの終濃度を達成すべく添加されている。３７℃及び５％ＣＯ2での３０時間のインキュベーション後に、１０μｌのAlamarBlueTM（Invitrogen）を添加し、かつ、全てのバッチを更なる４時間３７℃でインキュベーションした。ＣＥＭ細胞の生存率のための尺度（ＭＴＴ  ＣＥＭ中で挙げられる）を、１７−ＡＡＧの影響下で、５３０ｎｍ／５９０ｎｍでの蛍光測定を用いた、この媒体の色変化の測定を通じて測定することができた。全てのバッチをトリプリケートで実施した。
【００３３】
実施例２：ｐＮＬ  ｅｎｖ１トランスフェクションしたＨｅＬａＳＳ６細胞は、１７−ＡＡＧの影響下で、ウィルス画分中で、減少したＧａｇプロセッシングを示し、かつ、細胞画分中で、増強したＨｓｐ７０発現を示した。
【００３４】
Ｇａｇプロセッシングの速度論及びウィルス放出に対する１７−ＡＡＧの影響の生化学的分析のために、時間速度（Zeitkinetik）を実施した。培養、トランスフェクション、媒体交換及び時間速度の実験的詳細は実施例４ａ／ｂ中に記載されている。このためには、ＨｅＬａＳＳ６細胞の培養が使用され、これは、ｐＮＬ  ｅｎｖｌ（Schubert et al, 1995）でトランスフェクションされている。１７−ＡＡＧ含有媒体（１００ｎＭ  １７ＡＡＧ）又は阻害剤無しの媒体中でのインキュベーション後に、この速度を、バッチの、別個の洗浄工程及びアリコート取得により、開始した。アリコートの細胞培養を、それぞれの時間点で取得し、かつ、遠心分離により、細胞−、ウィルス−及び細胞培養上清画分に分離した。ＨＩＶタンパク質をＳＤＳ  ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜上に移し、かつ、引き続き、抗体媒介した化学発光により、レントゲンフィルムに対して可視可能にした。
【００３５】
実施例３：１７−ＡＡＧは、ＰＳ３４１との組み合わせとしても、Ｘ４−栄養性のＨＩウィルスのウィルス複製をＨＬＡＣ−モデル中で抑制する
ヒトの扁桃を細断（mazerieren）し、９６ウェルプレート中に移した。一日間のインキュベーション後にこの細胞を、Ｘ４栄養性のＨＩウィルスで感染させ、相応する阻害剤と混合し、次の日にタグを洗浄した。この工程も、また同様に次の工程も、実施例４ｃ−ｄ中に詳細に記載されている。それぞれの速度点（kineticpunkt）、１５０μｌのこの培地を取り除き、かつ、−８０℃でＲＴ測定のために貯蔵した。この更に添加した培地は、この特殊なバッチのために必要な濃度の阻害剤を含有した。
【００３６】
１５日後に、機能的に形成されたＨＩウィルスの部分を、ＲＴアッセイ（実施例４ｅ）参照を用いて、この貯蔵された上清から算出した。
【００３７】
実施例４：材料及び方法
実施例４ａ：細胞培養
ＣＥＭ細胞を、１０％（Ｖ／Ｖ）のウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ  ｍｌ-1のペニシリン及び１００μｇ  ｍｌ-1のストレプトマイシンを有するＲＰＭＩ１６４０中で培養した。
【００３８】
Ｈｅｌａ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）を、１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ  ｍｌ-1ペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを有する、ダルベッコ修飾したイーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。
【００３９】
扁桃細胞を、１５％（Ｖ／Ｖ）ウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ  ｍｌ-1ペニシリン、１００μｇ  ｍｌ-1ストレプトマイシン、２．５μｇ／ｍｌフンギゾン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％  ＭＥＭ  非必須アミノ酸溶液及び５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを有するＲＰＭＩ  １６４０中で培養した（「扁桃培地」）。
【００４０】
実施例４ｂ：トランスフェクション、培地交換及び速度論
Ｈｅｌａ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）を、ｐＮＬΔｅｎｖ−リポフェクタミン２０００混合物を用いて、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ中にトランスフェクションした。３７℃及び５％のＣＯ2中での８時間のインキュベーション後に、培地交換を実施した。両方の培地の１つで、この培地に、終濃度１００ｎＭの１７−ＡＡＧを添加し、かつ、更なる１６時間インキュベーションした。ＰＢＳ中での別個の洗浄工程後に、相応する時間点をアリコート取得した。この相応する時間点に、この細胞を、遠心分離（５分間、５０００ｒｐｍ）により上清から分離し、かつ、後に、ＣＨＡＰＳ／ＤＯＣ溶解（３分間、氷上で）で溶解させた。上清中のＶＬＰを、２０％のスクロースクッション上でペレット化し（３０分間、１４０００ｒｐｍ）、かつ、この細胞ペレットの溶解物も１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離し、湿式ブロットによりＰＶＤＦ膜上に移し、かつ１０％のミルク粉末（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ０．１％）中でブロッキングした。ＨＩＶ−又は細胞特異的なタンパク質の検出を、特異的な抗体（Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、ｐ２４、ＰＲ５６、β−アクチンに対して）を介して行った。二次抗体との反応及びそのカップリングした化学発光により、このシグナルがレントゲンフィルム上で検出できた。
【００４１】
実施例４ｃ：トランスフェクション及びウィルスストックの獲得
ウィルス調製物の製造のために、分子状のＨＩＶ−１−ＤＮＡのプラスミドＤＮＡを、カルシウム−リン酸−調製物方法を適用して、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクションした。このためには、ＨｅＬａ細胞のコンフルエントな培養液（５×１０6細胞）を、リン酸カルシウム結晶中の２５μｇのプラスミドＤＮＡ（Graham 及び van der Eb (1973)による方法により製造）とインキュベーションし、引き続き、Gorman et al. (1982)によるグリセロールショックにかけた。濃縮化したウィルス調製物の獲得のためにトランスフェクション後２日間、この細胞上清を獲得した。引き続き、この細胞並びにこの成分を遠心分離（１０００×ｇ、５分間、４℃）及び濾過（０．４５μｍ孔径）を通じて分離した。ウィルス粒子を、超遠心分離（Beckman SW55 ローター, １．５時間, ３５０００ｒｐｍ, １０℃）によりペレット化し、かつ、この後に、１ｍｌのＤＭＥＭ培地中に再懸濁した。このウィルス調製物を濾過により滅菌（０．４５μｍ孔径）し、小分けにして凍結した（−８０℃）。個々のウィルス調製物を、逆転写酵素活性の測定を介して、即ち、既に記載された試験（Willey et al, 1988）に基づいて、オリゴ（ｄＴ）−ポリ（Ａ）−テンプレート中への［３２Ｐ］−ＴＴＰ組み込みを使用して標準化した。
【００４２】
実施例４ｄ：ＨＬＡＣモデル（獲得；感染；速度論）
扁桃組織を、ＰＢＳ中で洗浄し、外科用メスを用いて血栓をとりのぞき、１〜２ｍｍ2の大きさの片に分割した。個々の細胞をフィルター網を通じた機械的加圧を通じて達成した。この個別化した細胞の実施された遠心分離（５分間、１２００ｒｐｍ）後に、この細胞をカウントし、９６ウェル中に播種し、かつ、一晩３７℃及び５％のＣＯ2でインキュベーションした。この細胞の感染を、相応する阻害剤濃度を適用しながらの、１０ｎｇのＸ４栄養性のＨＩＶストックの同時の添加により実施した。次の日に、５０μｌの上清を取り出し（"１ｄｐｉ"）かつ−８０℃で貯蔵した。この細胞を、この後に遠心分離（５分間、１２００ｒｐｍ）し、かつ、更なる５０μｌの上清を取り除いた。この細胞の１００μｌの扁桃細胞媒体中での再懸濁後に、この洗浄工程を２回繰り返した。この相応する阻害剤濃度を有する扁桃細胞培地の添加後に、この細胞を新規に、３７℃及び５％ＣＯ2でインキュベーションした。３、６、９及び１２日目に、１５０μｌの培地を取り出し、−８０℃で貯蔵し、かつ、相応する阻害剤濃度を有する１５０μｌの媒体を添加した。１５日目に、１５０μｌの上清のみを取り出し、−８０℃で貯蔵し、かつこの細胞をこの後に、廃棄した。
【００４３】
実施例４ｅ：ＲＴアッセイ
−８０℃で貯蔵された扁桃上清を、逆転写酵素活性の測定を介して、即ち、既に記載された試験（Willey et al, 1988）に基づいて、オリゴ（ｄＴ）−ポリ（Ａ）−テンプレート中への［３２Ｐ］−ＴＴＰ組み込みを使用して算出した。
【００４４】
図の説明
図１：
Ｈｓｐ９０阻害剤１７−ＡＡＧは、１０ｎＭまでの濃度でＣＥＭ細胞中で細胞毒性を示さない。ＣＤ４+−Ｔ−リンパ球細胞（ＣＥＭ細胞）を様々な濃度の１７−ＡＡＧと共にインキュベーションし、かつ、時間依存的な色変化（生存細胞の数と同じ意味を持つ）を、AlamarBlueTM (Invitrogen)の添加により、蛍光測定を用いて算出した。
【００４５】
図２：
サブゲノムＨＩＶ−１発現ベクターｐＮＬｅｎｖｌでトランスフェクションしたＨｅＬａＳＳ６細胞が、１７−ＡＡＧの影響下で、ウィルス画分中で、減少したＧａｇプロセッシングを示し、かつ、細胞画分中で、増強したＨｓｐ７０−発現を示した。
【００４６】
図３：
Ｘ４栄養性のＨＩウィルスに対しての、１７−ＡＡＧ単独の、また同様にプロテアソーム阻害剤ＰＳ３４１との組み合わせでの抗ウィルス活性を、ＨＬＡＣモデル中で２つの異なる扁桃の、そのつどの速度点のＲＴデータをもとに示した（Ａ及びＢ）。
【００４７】
このＸ４栄養性のＨＩウィルスのウィルス複製は、扁桃Ａ（Ａ）中で、１ｎＭのプロテアソーム阻害剤ＰＳ３４１、１ｎＭの１７−ＡＡＧとのインキュベーション、また更に１０ｎＭ  １７−ＡＡＧを用いても、顕著には影響を及ぼされない。この両方の物質の組み合わせ（５ｎＭ  ＰＳ３４１及び１ｎＭ  １７−ＡＡＧ）が、初めて、ウィルス複製の顕著な減少を達成した。この際、この相加的な効果はこの両方の物質の適用の際に、Ｈｓｐ９０阻害剤１７−ＡＡＧ（１０ｎＭ）のより高い濃度により、更に増強されることができたことが示された。扁桃Ｂ（Ｂ）は同様に、Ｘ４栄養性のＨＩＶ複製の影響を、１ｎＭのＰＳ３４１又は１ｎＭの１７−ＡＡＧでのインキュベーションで示さない。扁桃Ａとは対照的に、扁桃Ｂでは１０ｎＭの１７−ＡＡＧの添加で既に、ウィルス複製の顕著な減少を検出されることができた。プロテアソーム阻害剤ＰＳ３４１と、Ｈｓｐ９０阻害剤１７−ＡＡＧとの間でのそのつどの組み合わせでは、ウィルス複製はもはや検出されることができなかった。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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