(57)【要約】本発明は、第一ファミリーと相互作用しうる核酸の第二ファミリーの機能性に基づいて、核酸のファミリーの各メンバーの機能性を同定する方法に関する。第一ファミリーからの核酸を、第二ファミリーから得られる生物情報を共有する機能的に関連したクラスターの中に入れる。本発明はまた、核酸の第一ファミリーと第二ファミリーの間の相互作用の精密化および正確な予測にも関する。本発明はまた、このような機能情報の使用にも適用されて、治療上の適用のための標的およびメカニズムを同定する。
2009521944.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それぞれの標的核酸の少なくとも一つの標的部分と相互作用しうる第一核酸のセットを解析して、互いに協同して一つまたはそれ以上の生物学的機能に影響を及ぼす可能性がある第一核酸の少なくとも一つのクラスターを同定する方法であって：
該第一核酸の各々について、第一核酸がそれぞれ該標的核酸の各々と相互作用するかどうかを決定し（該第一核酸および該標的核酸は異なる核酸ファミリーからのものである）；
各相互作用について、その相互作用の標的核酸とリンクした一つまたはそれ以上の生物学データを同定し；
該第一核酸の各々について、その第一核酸と相互作用する標的核酸とリンクした生物学データの少なくとも一部を、その第一核酸と関連させ；
同定された生物学データの各々が該第一核酸の各々と関連しているかどうかを示す相関行列を作成し；
該相関行列に基づいて、該第一核酸の各ペア間の距離を定義することで距離行列を作成し；
該距離行列に基づいて、該第一核酸をクラスタリングし；
生物学的機能のセットを、該クラスターの第一核酸と関連している生物学データとリンクさせ；並びに
クラスターの第一核酸に該生物学的機能の一部を割り当てることを特徴とする方法。
【請求項２】
該生物学的機能が、標的核酸と相互作用する該クラスターの第一核酸であると定義される、請求項１の方法。
【請求項３】
該クラスターの第一核酸と関連している生物学データに生物学的機能のセットが含まれる、請求項１の方法。
【請求項４】
該クラスターの第一核酸に割り当てられる生物学的機能の一部が、該クラスターの第一核酸によって共有される生物学データと対応する、請求項１の方法。
【請求項５】
該共有される生物学データとリンクした標的核酸を、該クラスターの第一核酸の真の標的として同定することをさらに特徴とする、請求項４の方法。
【請求項６】
該第一核酸および該標的核酸が、それぞれＲＮＡ核酸ファミリーからのものである、請求項１の方法。
【請求項７】
該第一核酸がマイクロＲＮＡであり、該標的核酸がメッセンジャーＲＮＡである、請求項６の方法。
【請求項８】
該標的部分がメッセンジャーＲＮＡの３’ＵＴＲ領域にある、請求項７の方法。
【請求項９】
該生物学データが各標的核酸の名前である、請求項１の方法。
【請求項１０】
該生物学データに機能アノテーションが含まれる、請求項１の方法。
【請求項１１】
該第一核酸のクラスタリングに樹状図の作成が含まれる、請求項１の方法。
【請求項１２】
該第一核酸のクラスタリングが：
該第一核酸のセットによって共有される生物学データの第一の量を計算し；および
該第一の量が少なくとも所定量である場合に該第一核酸のクラスターを作成することを特徴とする、請求項１の方法。
【請求項１３】
該所定量が、該クラスターの第一核酸と関連している生物学データの総数に基づくパーセンテージである、請求項１２の方法。
【請求項１４】
該第一核酸のクラスタリングが：
第一核酸のセットに関する深さを同定し；および
該深さが所定値を下回る場合にクラスターを作成することを特徴とする、請求項１の方法。
【請求項１５】
相関行列の要素の「０」値が、特定の生物学データが特定の第一核酸と関連していないことを示し、その中で、相関行列の要素の「１」値が、該特定の生物学データが該特定の第一核酸と関連していることを示す、請求項１の方法。
【請求項１６】
相関行列の要素が、生物学データが該第一核酸の各々と関連している程度を示す、請求項１の方法。
【請求項１７】
距離の定義が、ペアの第一核酸の生物学データの各々についての対応する相関行列の要素間の差を取ることを含むことを特徴とする、請求項１の方法。
【請求項１８】
距離の定義が、該差の各々の関数を合計することをさらに含むことを特徴とする、請求項１７の方法。
【請求項１９】
該距離が類似性の距離計算に基づいている、請求項１の方法。
【請求項２０】
該相互作用の標的核酸とリンクしたすべての生物学データの完全リストを作成し；
各第一核酸について、その第一核酸と相互作用する標的核酸とリンクした生物学データの特定リストを作成することを特徴とし、
その第一核酸と相互作用する標的核酸とリンクした生物学データの少なくとも一部を、第一核酸と関連させることが：
該第一核酸についての特定リストを該完全リストと比較して、該第一核酸と関連させる生物学データの一部を決定することを含むことをさらに特徴とする、請求項１の方法。
【請求項２１】
その第一核酸と相互作用する標的核酸とリンクした生物学データの完全リストおよび特定リストが関係木である、請求項２０の方法。
【請求項２２】
比較が、該特定リストにおける生物学データの各々の有意値を計算する統計的手法を用いることを特徴とし、その中で、所定範囲内の有意値を有する生物学データのみが、該第一核酸と関連している生物学データの一部に含まれる、請求項２０の方法。
【請求項２３】
該統計的手法が超幾何分布に基づいている、請求項２２の方法。
【請求項２４】
クラスタリングが、算術平均による重みつき対グループ法（ＷＰＧＭＡ）を用いることを特徴とする、請求項１の方法。
【請求項２５】
その第一核酸がそれぞれ、該標的核酸の各々と相互作用するかどうかを決定することが：
該標的核酸の標的部分において、
該第一分子（Ｍ）との相補性における途切れが許されない第一領域；および
該第一領域に隣接した、該第一核酸との相補性における一つもしくはそれ以上の途切れが許される第二領域
を同定し；並びに
該第一および第二領域の相互作用のエネルギーを決定することを特徴とする、請求項１の方法。
【請求項２６】
該標的部分における第一領域が、空間的に延長された核（Ｎｕ）に対応する、請求項２５の方法。
【請求項２７】
それぞれの標的核酸の少なくとも一つの標的部分と相互作用しうる第一核酸のセットを解析して、互いに協同して一つまたはそれ以上の生物学的機能に影響を及ぼす可能性がある第一核酸の少なくとも一つのクラスターを同定するコンピュータシステムの操作を制御するためのプログラムコードで符号化されるコンピュータ可読媒体を含むコンピュータプログラム製品であって、該プログラムコードが：
該第一核酸の各々について、第一核酸がそれぞれ該標的核酸の各々と相互作用するかどうかを決定するためのプログラムコード（該第一核酸および該標的核酸は異なる核酸ファミリーからのものである）；
各相互作用について、その相互作用の標的核酸とリンクした一つまたはそれ以上の生物学データを同定するためのプログラムコード；
該第一核酸の各々について、その第一核酸と相互作用する標的核酸とリンクした生物学データの少なくとも一部を、該第一核酸の各々と関連させるためのプログラムコード；
同定された生物学データの各々が該第一核酸の各々と関連しているかどうかを示す相関行列を作成するためのプログラムコード；
該相関行列に基づいて、該第一核酸の各ペア間の距離を定義することで距離行列を作成するためのプログラムコード；
該距離行列に基づいて、該第一核酸をクラスタリングするためのプログラムコード；
生物学的機能のセットを、該クラスターの第一核酸と関連している生物学データとリンクさせるためのプログラムコード；並びに
クラスターの第一核酸に該生物学的機能の一部を割り当てるためのプログラムコードを含むコンピュータプログラム製品。
【請求項２８】
該クラスターの第一核酸に割り当てられる生物学的機能の一部が、該クラスターの第一核酸によって共有される生物学データと対応し、
該プログラムコードが：
該共有される生物学データとリンクした標的核酸を、該クラスターの第一核酸の真の標的として同定するためのプログラムコードをさらに含む、請求項２７のコンピュータプログラム製品。
【請求項２９】
該第一核酸をクラスタリングするためのプログラムコードが：
該第一核酸のセットによって共有される生物学データの第一の量を計算するためのプログラムコード；および
該第一の量が少なくとも所定量である場合に該第一核酸のクラスターを作成するためのプログラムコードを含む、請求項２７のコンピュータプログラム製品。
【請求項３０】
該第一核酸をクラスタリングするためのプログラムコードが：
第一核酸のセットに関する深さを同定するためのプログラムコード；および
該深さが所定値を下回る場合にクラスターを作成するためのプログラムコードを含む、請求項２７のコンピュータプログラム製品。
【請求項３１】
距離を定義するためのプログラムコードが：
ペアの第一核酸の生物学データの各々についての対応する相関行列の要素間の差を取るためのプログラムコード；並びに
該差の各々の関数を合計するためのプログラムコードを含む、請求項２７のコンピュータプログラム製品。
【請求項３２】
該距離が類似性の距離計算に基づいている、請求項２７のコンピュータプログラム製品。
【請求項３３】
該プログラムコードが：
該相互作用の標的核酸とリンクしたすべての生物学データの完全リストを作成するためのプログラムコード；
各第一核酸について、その第一核酸と相互作用する標的核酸とリンクした生物学データの特定リストを作成するためのプログラムコードであって、
その第一核酸と相互作用する標的核酸とリンクした生物学データの少なくとも一部を、第一核酸と関連させるためのプログラムコードが：
該第一核酸についての特定リストを該完全リストと比較して、該第一核酸と関連させる生物学データの一部を決定するためのプログラムコードを含むプログラムコード；
をさらに含む、請求項２７のコンピュータプログラム製品。
【請求項３４】
それぞれの標的核酸の少なくとも一つの標的部分と相互作用しうる第一核酸のセットを解析して、どの標的核酸が該第一核酸のどれによって制御されるかを同定する方法であって：
該第一核酸の各々について：
その第一核酸がそれぞれ該標的核酸の各々と相互作用するかどうかを決定し；
その第一核酸と相互作用する標的核酸のそれぞれのセットを同定し；
少なくとも二つの該第一核酸に対応するそれぞれのセットの共通部分を計算し；
該共通部分における標的核酸の数が所定量よりも多いかどうかを決定し；
該共通部分における標的核酸の数が該所定量よりも多い場合に、該少なくとも二つの第一核酸のクラスターを作成し；および
該共通部分の中に含まれる標的核酸を、該クラスターの第一核酸の真の標的として同定することを特徴とする方法。
【請求項３５】
該所定量がパーセンテージである、請求項３４の方法。
【請求項３６】
該少なくとも二つの第一核酸の各々について：
該共通部分における標的核酸の数を、その第一核酸と相互作用する標的核酸のそれぞれのセットにおける標的核酸の総数で割ることによってパーセンテージを計算し；および
該パーセンテージを該所定量と比較することを特徴とする、該共通部分における標的核酸の数が所定量よりも多いかどうかを決定する、請求項３５の方法。
【請求項３７】
該パーセンテージが２５％である、請求項３５の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２００６年１月４日に出願され、その全内容が本明細書に引用される、フランス出願番号０６０００４４（代理人整理番号２４２３４２ Ｄ２３７１６ − ＨＲ）の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は一般にバイオインフォマティクスに関するものであり、とりわけ機能クラスタリングおよび距離行列を用いた、核酸（例えばマイクロＲＮＡ）の第一ファミリーの生物学的機能および／またはより信頼できる相互作用の標的の同定に関する。
【０００３】
発明の背景
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、非常に小さな分子の巨大なファミリーを構成する。ヒトにおいて、その数は現在１０００を超えると推定され、その大きさは典型的には１７と２５ヌクレオチドの間である。マイクロＲＮＡの大部分は、２つの型の制御：第一に、時間的制御、および第二に、空間的制御に付される。時間的制御は、細胞、組織および器官の成長、分化および発生段階に依存する。一方、空間的制御は、マイクロＲＮＡが属、組織型または細胞型において特異的に発現されるという事実を反映する（Reinhart, 2000）。空間的制御は、マイクロＲＮＡのアンチセンス能力(antisense capacity)によって決定されうる。
【０００４】
それぞれの標的分子の所定の領域とのいくぶん延長された塩基対合（相補性）のおかげで、アンチセンス能力は、ｍｉＲＮＡに一つまたはそれ以上の特定の生物学的現象を発揮させる。これらの標的分子およびこれらの領域は、それぞれ標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）および標的認識配列（ＴＲＳ）と一般に呼ばれているものを構成する。特に、相補性（全部または一部）の位置および型に応じて、マイクロＲＮＡは、ｍＲＮＡの翻訳の抑制、または後者の破壊をもたらす。したがって、マイクロＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から産生されるタンパク質の発現を制御しうる。
【０００５】
結果として、ｍｉＲＮＡは、どのように、いつ、およびどこで遺伝子が発現されなければならないかを決定する能力を有しており、またこれらの遺伝子間の相互作用を調整する能力も有している。より一層大まかには、マイクロＲＮＡは細胞および器官の発生および機能の多数の側面を統合し、重要な細胞メカニズムの制御において重要な役割を果たす（Brennecke et al., 2005; Chen et al., 2004; Esau et al., 2004; Yekta S. et al., 2004）。あいにく、一般には動物において、特にヒトにおいて、少数のまれな例外を除いては、どの生物学的現象（機能）がどのマイクロＲＮＡと関連しているかは分かっていない。したがって、現在の重要な段階は、どのマイクロＲＮＡがそれぞれ一つまたはそれ以上の特定の生物学的現象を制御するのか、その制御がどのように行われるのかを同定することである。
【０００６】
しかしながら、特定の生物学的現象を特定のマイクロＲＮＡと関連させるのは困難であることが分かっている。一つの理由は、マイクロＲＮＡ−ｍＲＮＡ二本鎖上で働く多少の構造的拘束にある。例えば、植物とは異なり、動物においては、これらの二本鎖は、多数のミスマッチ、内部ループ、およびウォブル型対合(Wobble-type pairing)（Ｇ：Ｕ）を含む。また、連続した対合の数が非常に短い（典型的には、マイクロＲＮＡの５’末端に位置している８と１０ヌクレオチドの間）（Lai et al., 2002）。ｍｉＲＮＡとその標的（ｍＲＮＡ）の間のこの弱い相互作用（例えば、バルジおよびループ）のため、何千もの可能性が予測されうる。したがって、生じたリストには、大多数のオフターゲット（すなわち、バックグラウンドノイズ(background noise)または偽陽性）が含まれる。
【０００７】
簡単な分子生物学アプローチによるマイクロＲＮＡの標的（すなわちメッセンジャーＲＮＡ）の同定は、そのため、極めて困難であるか、または現時点では全く不可能である。このような問題に答える試みにおいて、例えば、以下：「Ｐｉｃｔａｒ」（Krek et al., 2005）；「ＤＩＡＮＡ−ｍｉｃｒｏＴ」（Kiriakidou et al., 2004）；「ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ」（Lewis et al., 2003）；「ＭｉＲａｎｄａ」（Enright et al., 2003）の名で知られているバイオインフォマティクスのツールが開発されてきた。これらのツールは、マイクロＲＮＡとそのそれぞれの可能な標的認識配列(potential target recognition sequence)の間の２項関係(binary relationship)を作る。言い換えれば、これらは、適当な可能な標的認識配列リストを、個々に取り出した各マイクロＲＮＡと関連させ、最終的には、これらの関連の全リストを提供する。
【０００８】
これらのツールは多くの点で有用となっているが、既存のツールは欠点を有している。一つの欠点は、各マイクロＲＮＡについて、これらがあまりにも多すぎる多数の可能な標的認識配列をもたらすことであり、それによって結果の利用が制限される。具体的には、これらの大きなリストにおいて、バックグラウンドノイズと本当の（真の）生物学的標的を区別するのは困難である。
【０００９】
さらに、同一のマイクロＲＮＡについてのこれらのツール間の結果には多くの不一致が存在する。例えば、ｍｉＲ−１５マイクロＲＮＡについて、「Ｐｉｃｔａｒ」ツールは７４６個の可能な標的のリストを提供するのに対し、「ｍｉＲＢａｓｅ」、「ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ」および「ＭｉＲａｎｄａ」では、リストはそれぞれ、３９１８、５９６および３４５６個の可能な標的認識配列となる。別の例として、ｍｉＲ−１９マイクロＲＮＡについて、提供される可能な標的認識配列の数は、それぞれ、６７７、５５２８、５２７および１４５３個である。このことはさらに、上記の利用の制限を説明している。
【００１０】
したがって、マイクロＲＮＡと関連している生物学的機能を決定し、並びにその真の標的配列を決定する改善された方法が望ましい。また、これらの方法が、同様の状況である核酸の他のファミリーに変更できることが望ましい。
【００１１】
発明の簡単な概要
本発明は、その標的核酸の生物学データに基づいて、核酸（例えば、ｍｉＲＮＡ）の第一ファミリーの生物学的機能、および生物学的機能が達成されるメカニズム、例えば、核酸の真の標的配列を同定するための方法、システム、および装置を提供する。一つの態様において、ファミリーの核酸は、標的核酸の第二ファミリーを参照することにより解析される。第一ファミリーのメンバーは、その標的核酸の機能特性を通して機能的に評価される。クラスターは、第一ファミリーと相互作用しうる特定の標的核酸と関連している生物学データを用いて、第一ファミリーの核酸で構成されている。これらのクラスターの各々について、可能な機能は第二ファミリーの特定のメンバーから関連させる。
【００１２】
また、標的ファミリーとの相互作用が予測される。そのため、またクラスタリング法を用いて、予測された相互作用におけるバックグラウンドノイズ（偽陽性）を減少させることもできる。先行技術と比較することにより、数百または数千に対し、態様によって、マイクロＲＮＡあたり約２０〜５０個の可能な標的を同定することが可能となる。このような削減によって、例えば、生物学実験を通して結果が完全に利用可能となる。タンパク質発現制御メカニズムの相手(partner)、および／または生物学的ネットワークおよび／または分子現象カスケードおよび／または代謝経路を完成させるための相手が同定されうる。
【００１３】
よって、第一の態様において、本発明は、それぞれの標的核酸の少なくとも一つの標的部分と相互作用しうる第一核酸のセットを解析して、互いに協同して一つまたはそれ以上の生物学的機能に影響を及ぼす可能性がある第一核酸の少なくとも一つのクラスターを同定する方法を提供する。いくつかの態様において、該方法には、第一核酸が標的核酸と相互作用するかどうかを決定するための、各第一核酸と標的核酸のペアの解析が含まれる。この相互作用は、核酸間の相補性に基づいていてもよい。また、第一核酸および標的核酸は、異なる核酸ファミリーからのものであってもよい。
【００１４】
各々の決定された相互作用について、その相互作用の標的核酸とリンクした一つまたはそれ以上の生物学データが同定されうる。生物学データは、標的核酸の名前、対応する遺伝子、機能アノテーション、または標的核酸の他の特徴データでありうる。該第一核酸の各々について、その第一核酸と相互作用する標的核酸とリンクした生物学データの少なくとも一部を、その第一核酸と関連させてもよい。
【００１５】
同定された生物学データの各々が、該第一核酸の各々と関連しているかどうかを示す相関行列を作成する。該相関行列に基づいて、該第一核酸の各ペア間の距離を定義することで距離行列を作成する。該距離行列に基づいて該第一核酸をクラスタリングする。クラスタリングには、樹状図または類似の構造を作成することが含まれうる。クラスタリングは、算術平均による重みつき対グループ法(weighted pair group method)（ＷＰＧＭＡ）を用いることを特徴とする。
【００１６】
生物学的機能のセットは、次いで該クラスターの第一核酸と関連している生物学データとリンクしうる。クラスターの第一核酸に該生物学的機能の少なくとも一部が割り当てられる。一つの態様において、該生物学的機能は、標的核酸と相互作用する該クラスターの第一核酸であると定義される。別の態様において、該クラスターの第一核酸と関連している生物学データに生物学的機能のセットが含まれる。さらに別の態様において、該クラスターの第一核酸に割り当てられる生物学的機能の一部は、該クラスターの第一核酸によって共有される生物学データと対応する。該共有される生物学データとリンクした標的核酸は、該クラスターの第一核酸の真の標的として同定されうる。
【００１７】
別の態様において、該第一核酸および該標的核酸は、それぞれＲＮＡ核酸ファミリーからのものである。例えば、該第一核酸はマイクロＲＮＡ（または他の非コードＲＮＡ）であり、該標的核酸はメッセンジャーＲＮＡでありうる。該標的部分は、メッセンジャーＲＮＡの３’ＵＴＲ領域にありうる。
【００１８】
一つの態様において、該第一核酸のクラスタリングは、該第一核酸のセットによって共有される生物学データの第一の量を計算し、該第一の量が少なくとも所定量である場合に該第一核酸のクラスターを作成することを特徴とする。該所定量は、該クラスターの第一核酸と関連している生物学データの総数に基づくパーセンテージでありうる。別の態様において、該第一核酸のクラスタリングは、第一核酸のセットに関する深さを同定し、該深さが所定値を下回る場合にクラスターを作成することを特徴とする。
【００１９】
いくつかの態様において、相関行列の要素の「０」値は、特定の生物学データが特定の第一核酸と関連していないことを示し、相関行列の要素の「１」値は、該特定の生物学データが該特定の第一核酸と関連していることを示す。別の態様において、相関行列の要素は、生物学データが該第一核酸の各々と関連している程度を示す。
【００２０】
一つの態様において、距離の定義は、ペアの第一核酸の生物学データの各々についての対応する相関行列の要素間の差を取ることを含むことを特徴とする。距離の定義は、該差の各々の関数を合計することをさらに含むことを特徴としうる。別の態様において、該距離は類似性の距離計算に基づいている。
【００２１】
一つの態様において、該相互作用の標的核酸とリンクしたすべての生物学データの完全リストが作成される。各第一核酸について、その第一核酸と相互作用する標的核酸とリンクした生物学データの特定リストもまた作成される。次いでその第一核酸と相互作用する標的核酸とリンクした生物学データの少なくとも一部を、第一核酸と関連させることは、該第一核酸についての特定リストを該完全リストと比較して、該第一核酸と関連させる生物学データの一部を決定することを含むことを特徴としうる。その第一核酸と相互作用する標的核酸とリンクした生物学データの完全リストおよび特定リストは関係木(relational tree)でありうる。比較は、リストにおける生物学データの各々の有意値を計算する統計的手法を用いることを特徴としてもよく、所定範囲内の有意値を有する生物学データのみは、該第一核酸と関連している生物学データの一部に含まれていてもよい。該統計的手法は超幾何分布に基づいていてもよい。
【００２２】
別の態様において、その第一核酸がそれぞれ、該標的核酸の各々と相互作用するかどうかを決定することは：
該標的核酸の標的部分において、
該第一分子（Ｍ）との相補性における途切れが許されない第一領域；および
該第一領域に隣接した、該第一核酸との相補性における一つもしくはそれ以上の途切れが許される第二領域
を同定することを特徴としうる。次いで該第一および第二領域の相互作用のエネルギーを決定しうる。一つの態様において、該標的部分における第一領域は、空間的に延長された核（Ｎｕ）に対応する。
【００２３】
別の態様において、本発明は、それぞれの標的核酸の少なくとも一つの標的部分と相互作用しうる第一核酸のセットを解析して、互いに協同して一つまたはそれ以上の生物学的機能に影響を及ぼす可能性がある第一核酸の少なくとも一つのクラスターを同定するコンピュータシステムの操作を制御するためのプログラムコードで符号化されるコンピュータ可読媒体を含むコンピュータプログラム製品を提供する。プログラムコードは、本明細書に記載されるいずれの方法を実行するためのいずれのコードを含んでいてもよい。
【００２４】
別の態様において、本発明は、それぞれの標的核酸の少なくとも一つの標的部分と相互作用しうる第一核酸のセットを解析して、どの標的核酸が該第一核酸のどれによって制御されるかを同定する方法を提供する。いくつかの態様において、該方法は、該第一核酸の各々について、その第一核酸がそれぞれ該標的核酸の各々と相互作用するかどうかを決定することを特徴とする。また、各第一核酸について、その第一核酸と相互作用する標的核酸のそれぞれのセットが同定される。少なくとも二つの該第一核酸に対応するそれぞれのセットの共通部分が計算される。該共通部分における標的核酸の数が所定量よりも多いかどうかについての決定がなされる。この決定は、該少なくとも二つの第一核酸の各々について：
該共通部分における標的核酸の数を、その第一核酸と相互作用する標的核酸のそれぞれのセットにおける標的核酸の総数で割ることによってパーセンテージを計算し；および
該パーセンテージを該所定量と比較することを特徴としてもよい。
【００２５】
該共通部分における標的核酸の数が所定量よりも多い場合に、該少なくとも二つの第一核酸のクラスターが作成される。該共通部分の中に含まれる標的核酸は、該クラスターの第一核酸の真の標的として同定される。該所定量はパーセンテージ、例えば２５％でありうる。パーセンテージは、クラスターの各第一核酸について計算してもよく、その第一核酸についての相互作用する標的の総数に基づいて別々に計算してもよい。
【００２６】
定義
本明細書で用いられる用語「生物学的機能」とは、生物学的現象の一つまたはそれ以上の分子による役割、制御をいう。これに関して、この文書においては、機能（Ｆ）または、同義である生物学的現象とは、特に生物学的機能および／または代謝経路および／または分子現象もしくは分子現象のカスケード（プロセス）をいうことが留意される。また第一核酸と第二核酸との相互作用についてのより洗練された選択も含まれる。
【００２７】
本明細書で用いられる用語「生物学データ」とは、機能アノテーション、もしくは他のアノテーション、特定の核酸配列の名前、または核酸の他の特徴データをいう。
【００２８】
本明細書で用いられる用語「関連させる(associate)」、「リンクさせる(link)」、「割り当てる(assign)」とは、すべてデータまたは対象物間の結びつき(connection)をいう。
【００２９】
本明細書で用いられる用語「オーソログ」とは、少なくとも二つの種に属する配列、遺伝子または分子をいう。また、これらの配列、遺伝子または分子は、共通祖先配列または共通祖先遺伝子に由来し、種の各々において同じ機能を保存している。
【００３０】
本明細書で用いられる用語「パラログ」とは、共通祖先配列または共通祖先遺伝子の重複に由来する配列、遺伝子または分子をいう。また、これらの配列、遺伝子または分子は高い配列類似性を示し、種のゲノムにおいて少なくとも二つのコピーとして存在する。
【００３１】
本明細書で用いられる用語「マイクロＲＮＡの５’領域」とは、１位で始まり、７位で終わる（両端を含む）７つの連続したヌクレオチドをいう。１位では、用語「マイクロＲＮＡの５’末端」もまた用いられる。
【００３２】
本明細書で用いられる用語「マイクロＲＮＡの３’領域」とは、８位で始まり、マイクロＲＮＡの最後のヌクレオチドまで（両端を含む）の１０〜１８個の連続したヌクレオチドをいう。各マイクロＲＮＡの大きさ次第で、最後のヌクレオチドは１７〜２５位を有しうる。
【００３３】
本明細書で用いられる用語「相補(complementary)」または「その相補(complement thereof)」とは、相補領域の全体を通じて、別の特定の核酸とワトソン＆クリック塩基対合を形成することができる核酸の配列をいう。この用語は、それらの配列のみに基づく核酸のペアに適用され、２つのポリヌクレオチドが実際に結合する条件のいずれの特定のセットにも適用されない。
【００３４】
本明細書で用いられるように、用語「相補(complementary)」または「相補(complement)」とは、互換的に、１００％アンチセンスの配列同一性をいう。
【００３５】
本明細書で用いられる用語「相補性の程度」とは、２つの核酸配列セグメント間でペアになりうるヌクレオチドの数またはパーセンテージをいう。好ましくは、許容される対合は、ワトソン−クリック型またはウォブル型（Ｇ−Ｕ対合）のものである。
【００３６】
本明細書で用いられる用語「類似性」とは、２つの配列間の類似度をいう。
【００３７】
本明細書で用いられる用語「ミスマッチ」は、２つの整列された配列セグメントに沿った位置であって、これらの２つのセグメント間で異なっている位置を定義する。
【００３８】
本明細書で用いられる用語「相互作用」とは、２分子間のエネルギーの交換を伴うか、またはそれに対応するいずれの性質または値をいう。
【００３９】
本明細書で用いられる用語「相関行列」とは、特定の生物学データを一つまたはそれ以上の核酸と関連させる、データの組織化されたセットをいう。本明細書で用いられる用語「距離行列」とは、核酸のペア間の分離の値を含む、データの組織化されたセットをいう。これらの構造は、当業者に公知のいずれの構造であってもよく、例えば、これに限らないが、行列でありうる。
【００４０】
本明細書で用いられる用語「クラスター」とは、単一のグループ、ファミリー、またはセットに組織化されるのに十分な近接性を有するとみなされている核酸のいずれのセットをいう。クラスターの核酸は、共通の生物学的機能を有するものと示されうる。
【００４１】
本明細書で用いられる用語「３’ＵＴＲ」とは、メッセンジャーＲＮＡの転写産物の非コード領域をいう。この領域は、終止コドンからポリアデニル化シグナルの末端まで伸びている。
【００４２】
本明細書で互換的に用いられるように、用語「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、および「ポリヌクレオチド」には、一本鎖または二本鎖の形態の、一つより多くのヌクレオチドのＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列が含まれる。形容詞として本明細書で用いられる用語「ヌクレオチド」は、いずれの長さのＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列も含む分子を記載する。用語「ヌクレオチド」はまた、名詞としても本明細書で用いられて、プリンもしくはピリミジン、リボースもしくはデオキシリボース糖部位、およびリン酸基、またはホスホジエステル結合（オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドの中にあるヌクレオチドの場合）を含む、分子、またはより大きな核酸分子中の個々の単位を意味する、個々のヌクレオチドまたは様々なヌクレオチドを指す。とはいえ、用語「ヌクレオチド」はまた、少なくとも一つの改変：
（ａ）別の連結基、
（ｂ）プリンの類似型、
（ｃ）ピリミジンの類似型、または
（ｄ）類似の糖
を含む「改変ヌクレオチド」を含むようにも本明細書で用いられる。しかしながら、本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは５０％超の通常のデオキシリボースヌクレオチド、および最も好ましくは９０％超の通常のデオキシリボースヌクレオチドを含む。本発明の核酸は、いずれの公知の方法、例えば合成、組換え、生体外生成(ex vivo generation)、またはその組合せ、並びに当該技術分野で公知のいずれの精製法を利用することによっても製造されうる。
【００４３】
用語「核酸ファミリー」とは、共通の構造的および機能的特徴を共有する核酸のセットをいう。例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡは、異なる核酸ファミリーを表す。
【００４４】
用語「機能ファミリー」とは、共通の機能性を共有するマイクロＲＮＡのクラスターをいう。このクラスターは、特定の深さ、例えば、３の深さでの樹状図の枝分かれノード(branching node)に起因しうる。このクラスターはまた、「距離行列」から起こる特定の「機能的類似性」、例えば所定のパーセンテージにも起因しうる。
【００４５】
また用語「機能グループ」とは、共通の機能性を共有するマイクロＲＮＡのクラスターをいう。いくつかの文脈において、「機能グループ」は、「機能ファミリー」よりも低い「機能的類似性」を有する。例えば、このクラスターは、「機能ファミリー」のものよりも大きな深さ、例えば、４の深さでの枝分かれノードに起因しうる。このクラスターはまた、「距離行列」から起こる特定の「機能的類似性」、例えば所定のパーセンテージにも起因しうる。
【００４６】
用語「機能プロフィール」とは、機能のセットまたは、同義である生物学的現象のセットをいう。
【００４７】
分子生物学における一般的なまたは現在の方法／プロトコールは、特に以下の引用文献において見ることができる：
ａ）Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
ｂ）Bowtell and Sambrook, DNA Microarrays: A Molecular Cloning Manual, 2003, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
ｃ）Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology, 1987-2006, John Wiley Interscience.
ｄ）Stirling and Bartlett, PCR Protocols, 2003, Humana Press.
【００４８】
詳細な説明
本発明は、その標的核酸の生物学データに基づいて、核酸（例えば、ｍｉＲＮＡ）のセットの生物学的機能、および生物学的機能が達成されるメカニズム、例えば、核酸の真の標的配列を同定するための方法、システム、および装置を提供する。一つの態様において、ｍｉＲＮＡのネットワークのメカニズム（マイクロＲＮＡコード）を同定して、どのｍｉＲＮＡが組み合わされて作用し、特定の細胞プロセス／生物学的プロセスを協同的に制御するのかを決定する。一つの態様において、標的（遺伝子、転写産物、タンパク質）に属する情報に基づくクラスタリングによって、一緒に作用するこれらのｍｉＲＮＡを一緒にグループ化することが可能となる。ｍｉＲＮＡのこの特定のグループについて、情報のかなりの部分を共有されるか、またはそれを共有する標的が、真の標的、およびその他のオフターゲットとして予測される。
【００４９】
したがって、本発明は、これらの方法に限らないが、下記の多くの利点を有する。マイクロＲＮＡが関係している症状におけるその役割が理解され、研究のためだけでなく治療目的で利用されうる。症状に直接的に関与している制御メカニズムの鍵となるこれらの新たな分子、および多数の症状の進行に関連する新しい分子マーカー（例えば：生物学的マーカー、診断マーカー、予後マーカー）が発見されうる。また、新たに開発された薬物は、症状の治癒または予防のための新しい分子および／またはそのターゲットを標的としうる。
【００５０】
新しい種類のツールがデザインされ、作成されうる。マイクロＲＮＡコードの知識のおかげで、選択された遺伝子のセットを標的としなければならない合成マイクロＲＮＡがデザインされうる。より一般的には、マイクロＲＮＡコードのこのような知識から、新しい生物学実験が構築されうる。態様によって、いくつかのｍｉＲＮＡの過剰発現／発現低下を誘導することによって、生物学的過程に作用する機会が与えられる。また態様によって、幹細胞から分化細胞への分化過程を動かすことも可能となりうる。
【００５１】
Ｉ．緒言
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、非常に小さな分子の大きなファミリーを構成する。ヒトにおいて、その数は現在１０００を超えると推定され、その大きさは典型的には１７と２５ヌクレオチドの間である。マイクロＲＮＡは、ｐｒｉ−マイクロＲＮＡ（またはｐｒｉ ｍｉＲＮＡ）と呼ばれる長い一次前駆体(primary precursor)の形態で転写される内在性遺伝子から産生されうる。各ｐｒｉ−マイクロＲＮＡは、ヌクレアーゼ、例えばＤｒｏｓｈａヌクレアーゼによって開裂されて、ｐｒｅ−マイクロＲＮＡ（またはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）と呼ばれる約７０ヌクレオチド長の第二前駆体を与える。
【００５２】
ｐｒｅ−マイクロＲＮＡは少なくとも一つの細胞の細胞質に輸送され、ここでヌクレアーゼ、例えば、ダイサーヌクレアーゼがマイクロＲＮＡを産生させる。マイクロＲＮＡの大部分は、２つの型の制御：第一に、時間的制御、および第二に、空間的制御に付される。時間的制御は、細胞、組織および器官の成長、分化および発生段階に依存する。一方、空間的制御は、マイクロＲＮＡが属、組織型または細胞型において特異的に発現されるという事実を反映する（Reinhart, 2000）。
【００５３】
マイクロＲＮＡの特徴は、そのアンチセンス能力、すなわち、それぞれの標的分子の所定の領域とのいくぶん延長された塩基対合による、一つまたはそれ以上の特定の生物学的現象を発揮させる能力である。これらの標的分子およびこれらの領域は、それぞれ標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）および標的認識配列（ＴＲＳ）と一般に呼ばれているものを構成する。より具体的には、上記の対合は、典型的には標的メッセンジャーＲＮＡの３’ＵＴＲ領域で起こる。特に、相補性（全部または一部）の正確な位置および型に応じて、マイクロＲＮＡは、ｍＲＮＡの翻訳の抑制、または後者の破壊をもたらす。したがって、マイクロＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から産生されるタンパク質の発現を制御しうる。
【００５４】
結果として、ｍｉＲＮＡは、どのように、いつ、およびどこで遺伝子が発現されるのかを決定する能力を有しており、またこれらの遺伝子間の相互作用を調整する能力も有している。より一層大まかには、マイクロＲＮＡは細胞および器官の発生および機能の多数の側面を統合し、重要な細胞メカニズムの制御において重要な役割を果たす（Brennecke et al., 2005; Chen et al., 2004; Esau et al., 2004; Yekta S. et al., 2004）。
【００５５】
実例として、動物における多数の実験によって、細胞および組織の分化をもたらす現象カスケードにおけるマイクロＲＮＡの関与が説明されてきた。また、マイクロＲＮＡが様々な代謝経路および生理的過程、例えば細胞増殖およびアポトーシスを制御することが説明されてきた（Houbaviy et al., 2003, He L. et al., 2004; Kasashima K et al., 2004;  Xu P. et al., 2004; Bartel, 2004）。さらに、マイクロＲＮＡが症状、特に癌の進行に直接的な役割を有していることがますます認識される。
【００５６】
例えば、肺腺癌において、ｌｅｔ−７ マイクロＲＮＡの発現の低下は、術後生存の著しい短縮に関連しているのに対し、肺腺癌の細胞株における同じマイクロＲＮＡの過剰発現は、インビトロで癌細胞の増殖を阻害する（Takamizawa J. et al., 2004）。同様に、２つのマイクロＲＮＡ［ｍｉＲ−１４３およびｍｉＲ−１４５）は、結腸直腸癌の特定の段階での蓄積において実質的な低下を示す（Michael et al., 2003）。別の例は、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病型の白血病の大部分（約６８％）に起こる、ｍｉＲ−１５およびｍｉＲ−１６マイクロＲＮＡの発現における欠失および減少に関する（Calin et al., 2002; Calin et al., 2004）。また、ヒトリンパ腫におけるｍｉｒ−１７−９２ファミリーのマイクロＲＮＡの過多、およびこれらのマイクロＲＮＡの過剰発現の現象におけるマウスの癌の進行も発見されている（He L. et al., 2005）。
【００５７】
また、マイクロＲＮＡは、神経性および神経変性疾患に関与しうる（Dostie et al., 2003）。さらに他の例によって、生物におけるマイクロＲＮＡの重要性が説明される。特に、マイクロＲＮＡとｃ−Ｍｙｃ（転写因子をコードし、細胞増殖、成長およびアポトーシスを制御する原癌遺伝子）の間で関連が確認されている（O'Donnell et al., 2005）。
【００５８】
上記で示されているように、マイクロＲＮＡはまた、代謝疾患にも関与している。膵臓に特異的なマイクロＲＮＡは、インスリン分泌を制御しうる。例えば、ｍｉＲ−３７５は、インスリン分泌のレギュレータであり、糖尿病の治療のための新規医薬標的を構成しうる（Poy et al., 2004）。
【００５９】
例えば上記のような生物学的現象を制御するために、マイクロＲＮＡがネットワークとして（組み合わせで）、かつ協同的に作用しうると考えてもよい。したがって、このような仮説によれば、ネットワークとして互いに協同して、一つまたはそれ以上の現象を制御する様々なマイクロＲＮＡのセットが定義されうる。このようなセットは、マイクロＲＮＡコード名で指定されうる。
【００６０】
例えば、遺伝子発現の組織特異性が、各組織についてのマイクロＲＮＡの特異的なセットの発現に対応しうることが、実験結果によって示されており［Hobert O, 2004; Doench et al., 2004）、それによってマイクロＲＮＡコードの存在が確認される。特に、哺乳類の遺伝子が、いくつかの特異的に同時発現した(co−expressed)マイクロＲＮＡによって協調的な方法で制御されうることが、実験結果によって示されている（Sempere et al., 2004）。
【００６１】
それゆえに、今日における重要な段階は、マイクロＲＮＡコードの存在を確認すること、および特異的なマイクロＲＮＡコードが制御する生物学的現象を同定することである。一般に動物、特にヒトにおいては、少数のまれな例外を除いて、一つの生物学的現象または別のものを、一つのマイクロＲＮＡと、またはさらに強い理由で、マイクロＲＮＡのセットとどのように関連させるかは知られていない。
【００６２】
一つの理由は、マイクロＲＮＡ−ｍＲＮＡ二本鎖上で働く多少の構造的拘束にあり、それは一般に、マイクロＲＮＡと相互作用する標的認識配列（ＴＲＳ）と呼ばれる。例えば、植物とは異なり、動物においては、これらの二本鎖は、多数のミスマッチ、内部ループ、およびウォブル型対合(Wobble-type pairing)（Ｇ：Ｕ）を含む。また、連続した対合の数が非常に短い（典型的には、マイクロＲＮＡの５’末端に位置している８と１０ヌクレオチドの間）（Lai et al., 2002）。
【００６３】
簡単な分子生物学アプローチによるマイクロＲＮＡの標的（すなわちメッセンジャーＲＮＡ）の同定は、そのため、極めて困難であるか、または現時点では全く不可能である。このような問題を扱う試みにおいて、例えば、以下：「Ｐｉｃｔａｒ」（Krek et al., 2005）；「ＤＩＡＮＡ−ｍｉｃｒｏＴ」（Kiriakidou et al., 2004）；「ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ」（Lewis et al., 2003）；「ＭｉＲａｎｄａ」（Enright et al., 2003）の名で知られているバイオインフォマティクスのツールが開発されてきた。これらのツールは、マイクロＲＮＡとそのそれぞれの可能な標的認識配列の間の２項関係を作る。言い換えれば、これらは、適当な可能な標的認識配列リストを、個々に取り出した各マイクロＲＮＡと関連させ、最終的には、これらの関連の全リストを提供する。
【００６４】
これらは多くの点で有用となっているが、既存のツールは欠点を有している。各マイクロＲＮＡについて、これらはあまりにも多すぎる多数の可能な標的認識配列をもたらし、それによって結果の利用が制限される。具体的には、これらの大きなリストにおいて、バックグラウンドノイズと本当の生物学的標的を区別するのは困難である。
【００６５】
さらに、同一のマイクロＲＮＡについてのこれらのツール間の結果には多くの不一致が存在する。例えば、ｍｉＲ−１５マイクロＲＮＡについて、「Ｐｉｃｔａｒ」ツールは７４６個の可能な標的のリストを提供するのに対し、「ｍｉＲＢａｓｅ」、「ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ」および「ＭｉＲａｎｄａ」では、リストはそれぞれ、３９１８、５９６および３４５６個の可能な標的認識配列となる。ｍｉＲ−１９マイクロＲＮＡについて、提供される可能な標的認識配列の数は、それぞれ、６７７、５５２８、５２７および１４５３個である。
【００６６】
これらのツールの別の欠点は、生物学的検証または機能的検証の対象とはなっていないアプローチに基づいていることである。さらに、これらによって可能な標的認識配列のリストを得ることができるが、これらのツールによって、マイクロＲＮＡコードをさらに解読することはできない。
【００６７】
ＩＩ．マイクロＲＮＡコード
ところで図１を参照すると、生物の中で、マイクロＲＮＡが機能を働かせること（生物学的現象を制御すること）ができる一つの方法が、残りの部分(reminder)で図式的に説明されている。この図において、Ｇ１と表される遺伝子は、メッセンジャーＲＮＡである２つの転写産物ＴＧ１ａおよびＴＧ１ｂを提供する。また図示されるように、これらの各々は、それぞれの組織Ｔ１およびＴ２に対して特異的であり、各々は一つまたはそれ以上の機能を有するそれぞれのタンパク質Ｐ１およびＰ２を産生する。
【００６８】
この例において、タンパク質Ｐ１は機能Ｆ１を働かせ、タンパク質Ｐ２は機能Ｆ２を働かせる。マイクロＲＮＡが、同じ組織で同時発現されるメッセンジャーＲＮＡとのみ相互作用しうることを考慮すると、組織Ｔ１におけるｍｉＲ−１のようなマイクロＲＮＡは、ＴＧ１ａメッセンジャーＲＮＡとのみ相互作用することができ、ＴＧ１ｂメッセンジャーＲＮＡとは相互作用し得ない。またこのマイクロＲＮＡが他のメッセンジャーＲＮＡと相互作用しうることも留意される。
【００６９】
例えば、組織Ｔ１の中で、ｍｉｒ−１はＴＧ２メッセンジャーＲＮＡと相互作用し、それによって、機能Ｆ３を有するタンパク質Ｐ３が産生されうる。したがって、図示されるように、ｍｉＲ−１マイクロＲＮＡは、タンパク質Ｐ１、Ｐ２およびＰ３の産生に関与する。その結果、ｍｉＲ−１は、いくつかの機能Ｆ１、Ｆ２およびＦ３の発揮に関与する。このような情報は、マイクロＲＮＡコードの解読に有利に用いられうる。
【００７０】
また、本発明の態様は、マイクロＲＮＡのどのセットがどの機能に関与しているかを決定することができる。例えば、図１に説明される場合において、図のリンク１０、１１および１２は、機能Ｆ１がマイクロＲＮＡのセット ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−２およびｍｉＲ−３によって制御されることを示す。したがって、これらの３つのマイクロＲＮＡは、この機能Ｆ１についてのマイクロＲＮＡコードを構成する。
【００７１】
本発明の方法が、典型的には、処理システム上で実行されるコンピュータプログラムに組み込まれていることが本明細書で留意される。このプログラムは、例えば、ディスク、ハード・ドライブ、フラッシュ・ドライブ、または現在公知であるか、または将来発見される他の適当な媒体のような記録媒体上に記録される。
【００７２】
ＩＩＩ．マイクロＲＮＡコードおよびその生物学的機能の同定
よって、本発明の態様は、マイクロＲＮＡコードおよびその生物学的機能を同定する情報を提供する。このような情報には、どのマイクロＲＮＡが、どのタンパク質、遺伝子、転写産物、または他の核酸の産生、制御、または発現、および／またはこのような核酸ファミリーに関連する機能に関与しているかが含まれうる。
【００７３】
図２は、クラスターまたはクラスターの部分として定義されうるマイクロＲＮＡコード、および本発明の態様の関連した生物学的機能を同定する方法２００を説明する。一つの態様において、本方法は、それぞれの標的核酸の少なくとも一つの標的部分と相互作用しうる第一核酸のセットを解析して、互いに協同して一つまたはそれ以上の生物学的機能に影響を及ぼす可能性がある第一核酸の少なくとも一つのクラスターを同定しうる。
【００７４】
段階Ｓ１において、該第一核酸の各々について、第一核酸がそれぞれ、該標的核酸の各々と相互作用するかどうかが決定される。一つの態様において、該第一核酸および該標的核酸は異なる核酸ファミリーからのものである。一つの態様において、相互作用には相補性が含まれ；しかしながら、相互作用はいずれの型のものであってもよい。段階Ｓ２において、各相互作用について、その相互作用の標的核酸とリンクした一つまたはそれ以上の生物学データが同定される。生物学データは単にｍＲＮＡの名前であってもよく、またはｍＲＮＡのＴＳＲ、関連遺伝子、標的に関連する機能アノテーションもしくは本明細書で説明される他の生物学データであってもよい。
【００７５】
段階Ｓ３において、該第一核酸の各々について、その第一核酸と相互作用する標的核酸とリンクした生物学データの少なくとも一部を、その第一核酸と関連させる。一つの態様において、特定の核酸に対して有意な生物学データのみを、その核酸と関連させる。段階Ｓ４において、同定された生物学データの各々が該第一核酸の各々と関連しているかどうかを示す相関行列が作成される。
【００７６】
段階Ｓ５において、該相関行列に基づいて、該第一核酸の各ペア間の距離を定義することで距離行列が作成される。段階Ｓ６において、該距離行列に基づいて、該第一核酸がクラスタリングされる。段階Ｓ７において、該クラスターの第一核酸と関連している生物学データとリンクした生物学的機能のセットの一部は、クラスターの第一核酸に割り当てられる。一つの態様において、生物学データが機能アノテーションを含む場合、生物学的機能は機能アノテーションデータに対応しうる。別の態様において、割り当てられた生物学的機能は、マイクロＲＮＡと選択標的核酸の間の真の相互作用に対応しうる。
【００７７】
本発明の態様はすべての公知のｍｉＲＮＡに適用され、またはいずれの基準に基づいて選択されたｍｉＲＮＡのいずれのサブセットにも適用されうる。例えば、特定の生理的条件で、または別のものと比較して一つの組織で過剰発現された（または下方制御された）ｍｉＲＮＡのセットが選択されうる。本方法はまた、核酸の他のファミリー、特に：
比較的多量に存在し得、核酸の別のファミリーと（例えば、相補性を通して）相互作用し、機能のネットワークの形態を有しており、弱い相互作用を有する（多くはオフターゲットである）非コードＲＮＡにも適用可能であり、標的核酸は情報の十分なセットによって記載される。したがって、多くの調節性ＲＮＡ（そのいくつかはまだ発見されていない）が存在し得、その解析は本発明の方法から利益を受けうる。
【００７８】
Ａ．核酸の別のファミリー間の相互作用の決定
図３は、本発明の態様に従って、第一核酸と標的核酸の間の相互作用を決定する方法を説明する。この例において、マイクロＲＮＡは第一核酸であり、メッセンジャーＲＮＡは標的核酸であり、それはメッセンジャーＲＮＡの標的部分に対応する標的認識配列（ＴＲＳ）を有する。態様において、可能な標的認識配列（ＴＲＳ）の全リストが作成される。図３で説明されるように、態様には、段階の様々なブロックが含まれる。
【００７９】
１．標的部分の目録作成（ブロック１１０）
ブロック１１０において、系統学的なアプローチが用いられて、特に、リクエスト種(request species)（すなわち解析されるべき種）と一つまたはそれ以上の対照種(reference species)の間で保存されているメッセンジャーＲＮＡ（例えば、オーソロガスＲＮＡ）の３’ＵＴＲ領域に位置している配列を同定する。一例として、リクエスト種はヒト（ホモサピエンス）であってもよく、対照種はマウス（ハツカネズミ）であってもよい。一つの態様において、８０％以上の類似度が系統学的アプローチに用いられる。
【００８０】
ブロック１１０は、上記で定義された類似性の条件に対応するリクエスト種の３’ＵＴＲ領域に位置している配列の目録を作成しうる。一つの態様において、ブロック１１０は２段階に分解される。段階１１１において、リクエスト種の、および一つまたはそれ以上の対照種の３’ＵＴＲ領域に対応する配列を、適当なデータベースによって提供されるゲノムアノテーションを用いて、対応するゲノムの配列から抽出する。
【００８１】
図３において、データベースはブロック１３０に表される。このブロック１３０には、ブロック１１０に必要な情報を提供するために検索データベースが含まれる。一つの態様において、ブロック１３０には、リクエスト種１３１に関連し、一つまたはそれ以上の対照種１３２に関連し、および関与する少なくともすべての種のゲノムアノテーション１３３に関連するデータベースにおける検索が含まれる。態様において、通常「アンサンブル(Ensembl)」（Hubbard et al., 2005）と呼ばれるデータベースを用いる。３’ＵＴＲ配列はデータベースを形成するファイルに記憶され、例えば、「３’ＵＴＲデータベース」と呼ばれる。
【００８２】
段階１１２において、「３’ＵＴＲデータベース」に記録された３’ＵＴＲ配列は、オーソロガス３’ＵＴＲ配列の各グループについて、リクエスト種と一つまたはそれ以上の対照種の間で比較される。一つまたはそれ以上の対照種と特定の類似度、例えば８０％以上の類似度を示すリクエスト種の３’ＵＴＲ配列を、データベースを形成する第二ファイルに記憶する。この第二ファイルは、例えば、「保存３’ＵＴＲデータベース」と呼ばれる。図３で説明されるように、ブロック１２０がブロック１１０の後に続いてもよい。
【００８３】
２．可能なＴＲＳの検索（ブロック１２０）
第二ブロック１２０の目的は、マイクロＲＮＡと上記の第二ファイル（保存３’ＵＴＲデータベース）に記録された３’ＵＴＲ配列との間で可能な対合を検索することである。一つの態様において、ブロック１２０は、解析されるリクエスト種の各マイクロＲＮＡについて、可能な標的認識配列（ＴＲＳ）の全リストを作成する。一つの態様において、ブロック１２０は４つの段階に分解される。
【００８４】
段階１２１において、検索によって、２位から７位まで（両端を含む）のヌクレオチドを含むマイクロＲＮＡの領域と厳密に相補的な配列が「保存３’ＵＴＲデータベース」において決定される。本明細書で、ｍｉＲＮＡの位置は、５’末端領域で「１」から始まり、３’末端領域で終わる。リクエスト種に属するマイクロＲＮＡの特定のセットに関するデータはブロック１４０によって提供され、ここで特定のセットは、特定の基準を満たすサブセットであるすべて公知のｍｉＲＮＡでありうる。
【００８５】
段階１２１の第一サブステップ（示されていない）において、２位から７位まで（両端を含む）のヌクレオチドを含む前記配列の逆相補を、問題のマイクロＲＮＡについて作成する。段階１２１の第二サブステップ（示されていない）において、逆相補を含む配列を、「保存３’ＵＴＲデータベース」ファイルに記録された配列の各々と比較する。一つの態様において、以下の２つの基準に対応する配列が記憶される：
（１）比較される２つの配列のすべての位置が対合しなければならず、並びに
（２）ワトソン−クリック型の対合（ＡＵ、ＡＴ、ＧＣ）およびウォブル型の対合（ＧＵ）のみが許容される。当業者の範囲内にある他の基準が用いられてもよい。
【００８６】
図４は、本発明の態様に従って、「５’末端領域」および「３’末端領域」と呼ばれる２つの領域でのマイクロＲＮＡとメッセンジャーＲＮＡの間の相互作用を図式的に説明する。３’ＵＴＲ上の相補性の第一領域は、後の本文において、核（Ｎｕ）３と呼ばれる。メッセンジャーＲＮＡ６０と相互作用を有するマイクロＲＮＡ５０を特に見ることができる。一つの態様において、この相互作用は、マイクロＲＮＡ５０の５’末端領域に対応する核（Ｎｕ）３で起こる。核３は、典型的には６ヌクレオチド長の大きさである。ヌクレオチドの一つは、図４においてリファレンス４で示される。一つの態様において、核には、マイクロＲＮＡ５０上の２〜７位、およびメッセンジャーＲＮＡ６０上の３’ＵＴＲ領域におけるＮ〜Ｎ−６位が含まれる。Ｎ〜Ｎ−６位は、３’ＵＴＲ領域におけるいずれの点でも起こり得、それは便宜および明確さのために本明細書でラベル付けしたにすぎない。
【００８７】
図５Ａ〜５Ｃによって、それぞれ、本発明の態様に従って、核および延長された核の検索段階が説明される。いったんマイクロＲＮＡの核が図５Ａに説明されるように同定されていれば、第二段階１２２において、この核が空間的に延長されうるかどうかが決定される。延長された核を決定するために、核（Ｎｕ）のいずれの側においても、新たな連続した対合として可能なものが探索される（特に、図５Ｂおよび５Ｃを参照せよ）。一つの態様において、新たな対合は、それが所定の基準を満たす場合に起こる。基準は以下でありうる：
（１）ワトソン−クリック対合ＡＵ、ＡＴおよびＧＣおよびウォブル対合（ＧＵ）のみがあてはまり、並びに
（２）延長された核（Ｎｅ）には、連続した対合のみが含まれる。
【００８８】
段階１２２の第一サブステップ（示されていない）において、マイクロＲＮＡ５０の１位と３’ＵＴＲ配列６０のＮ＋１位とのヌクレオチドのペアが解析される。相補性が確認される場合、Ｎ＋１位は延長された核（Ｎｅ）の一部である。また、マイクロＲＮＡ５０の８位と３’ＵＴＲ配列６０のＮ−７位とのペアが次いで解析される。相補性が確認される場合、Ｎ−７位もまた、延長された核（Ｎｅ）の一部である。
【００８９】
ヌクレオチドの以下のペア、すなわちマイクロＲＮＡ５０の９位と３’ＵＴＲ配列６０の「核−８」（Ｎ−８）位もまた解析するなど、上記の対合条件がもはや認められなくなるまで行う。それゆえマイクロＲＮＡ５０と３’ＵＴＲ標的認識配列６０との間の相補性の第一領域は、このように同定された延長された核（Ｎｅ）に対応する。この第一領域において、マイクロＲＮＡ５０とメッセンジャーＲＮＡ６０の間の相互作用（相補性）の程度は最大である。一つの態様において、この第一領域において、メッセンジャーＲＮＡのヌクレオチドとマイクロＲＮＡのヌクレオチドとの間の対合（相互作用）における途切れは許されない。
【００９０】
段階１２３（図４Ｃ参照）において、メッセンジャーＲＮＡのヌクレオチドとマイクロＲＮＡのヌクレオチドとの間の対合（相互作用）における一つまたはそれ以上の途切れが許される第二領域が同定される。この趣旨で、マイクロＲＮＡ上の領域Ｒ１と３’ＵＴＲ配列６０上の領域Ｒ２との間で一部相補的なヌクレオチドのセットとなる。領域Ｒ１は「延長された核＋１」位（Ａ位）から３’末端まで伸びている。領域２は「延長された核−１」位（Ｂ位）から５’末端の方に３０ヌクレオチドまでの長さにわたって伸びており、それは３’ＵＴＲ配列６０上で同定される。一つの態様において、この段階１２３において、ワトソン−クリック（ＡＵ、ＡＴ／ＡＵ、ＧＣ）およびウォブル（ＧＵ）型の非連続的な対合のみが許容される。
【００９１】
段階１２４において、マイクロＲＮＡ５０と３’ＵＴＲ配列６０の間の対合の自由エネルギーが決定される。対合は、第一と第二領域の両方を用いてなされうる。一つの態様において、このマイクロＲＮＡと３’ＵＴＲ配列６０の間の対合の自由エネルギーが、所定の閾値、例えば−１６．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下の場合に、これらの２つの領域は、問題のマイクロＲＮＡについての可能な標的認識配列（ＴＲＳ）として選択される。
【００９２】
ちょうど今記載されたブロック１２０のすべての段階を：
（１）「保存３’ＵＴＲデータベース」ファイルに含まれる一つの配列上で、このマイクロＲＮＡについて同定されたすべての核（Ｎｕ）について、
（２）「保存３’ＵＴＲデータベース」ファイルのすべての他の配列について、および
（３）各マイクロＲＮＡについて、
繰り返してもよい。このように同定された可能な標的認識配列（ＴＲＳ）のセットは、「全リスト」と呼ばれるファイルに記憶されうる全リスト１５０を構成する。
【００９３】
それぞれの可能な相互作用は、「マイクロＲＮＡ−可能なＴＲＳ」関連データとして記憶されうる。本文の残りにおいて、この関連型のデータについて、「マイクロＲＮＡ−可能なＴＲＳ」ペアに言及する。いくつかの標的認識配列がマイクロＲＮＡについて同定される場合、ファイルには、見つけられる可能な配列と同じ数の、このマイクロＲＮＡについての関連データが含まれる。したがって、この全リストには、それぞれの対応するｍｉＲＮＡと本当に相互作用しうる可能なＴＲＳについてのデータが含まれる。本発明によれば、ブロック１２０によって提供される全リスト１５０は、次いで、主に図６で説明されるブロック２００において処理される。
【００９４】
Ｂ．標的核酸とリンクした生物学データの同定（ブロック２１０）
一つの態様において、全リストは生物学データと共に増加する。各相互作用ペア（例えば、マイクロＲＮＡ−可能なＴＲＳ）について、可能なＴＲＳとリンクした特定の生物学データが同定される。この生物学データは、多くの異なる型、例えば、それぞれの可能なＴＲＳについてのｍＲＮＡ、ｍＲＮＡとリンクした機能アノテーションデータ、並びに経路アノテーションまたは他のアノテーションのものでありうる。したがって、一つの特徴（遺伝子の名前）の代わりに、遺伝子を説明する多数の特徴（例えば、１８）が用いられうる。生物学データのこの同定は、図６の段階２１０に示され、それによって、本発明の態様に従って、核酸の機能クラスタリングが図式的に説明される。
【００９５】
一つの態様において、問題のマイクロＲＮＡの標的とされた転写産物によって産生されるタンパク質に関するデータが、全リストの各「マイクロＲＮＡ−可能なＴＲＳ」ペアについて同定される。「マイクロＲＮＡ−可能なＴＲＳ−タンパク質」型のデータがこのように得られる。問題のマイクロＲＮＡに関連したタンパク質の各々とリンクした機能（Ｆ）に関するデータもまた、これらの「マイクロＲＮＡ−可能なＴＲＳ−タンパク質」データを用いて同定されうる。
【００９６】
この本文において、機能（Ｆ）に関するデータを示すための表現「機能アノテーション」にもまた言及する。機能アノテーションは、例えば、データベース：「ジーンオントロジー」（ＧＯ）（Ashburner et al., 2000）のもののような、広く認識されている標準的な用語集から抽出されうる。このデータベースの検索は、図６のブロック１６０で説明される。もちろん、遺伝子のまたはその産物の機能アノテーションを含むいずれの他のファイルまたはデータベースが用いられてもよい。
【００９７】
本発明の一つの態様において、「マイクロＲＮＡ−可能なＴＲＳ−タンパク質−ＧＯ＿機能＿アノテーション」型のデータの拡張全リスト(enhanced gross list)が次いで得られる。この拡張全リストは、前記リストに存在している可能な標的認識配列（ＴＲＳ）と同じ数のこの型のデータを含むファイルに記録される。
【００９８】
図７は、本発明の態様に従って、その可能な標的、産生されるタンパク質、および行われる機能を異なるマイクロＲＮＡについて説明するのに得られた表である。この図における表は、特にマイクロＲＮＡから機能への関係のセットを示す。例えば、ｍｉｒ−１が、ＴＲＳ１、ＴＲＳ２、ＴＲＳ６と相互作用し；
ＴＲＳ１、ＴＲＳ２、ＴＲＳ６が、それぞれタンパク質Ｐｒｏｔ Ａ、Ｐｒｏｔ Ｂ、Ｐｒｏｔ Ｄを産生し；
Ｐｒｏｔ Ａが、機能Ａ、Ｂ、Ｃを発揮し；
Ｐｒｏｔ Ｂが、機能Ａ、Ｃ、Ｄを発揮することなどが分かる。
【００９９】
一つの態様において、タンパク質は、発揮される機能（Ｆ）を同定するための情報として用いられるが、このタンパク質に関するデータを、マイクロＲＮＡと関連させなくてもよい。言い換えれば、拡張全リストはまた、「マイクロＲＮＡ−可能なＴＲＳ−ＧＯ＿機能＿アノテーション」型の関連データを用いても確立されうる。すべての場合において、このリストによって、マイクロＲＮＡに関する知識が豊富となりうる。実際は、該方法により、マイクロＲＮＡを、作用することができる機能（Ｆ）と直接的にリンクさせる拡張全リストが提供される。
【０１００】
本発明の好ましい態様によれば、上記の機能（Ｆ）を考慮しながら拡張全リストを解析して、マイクロＲＮＡコードについての生物学的な情報、すなわち、前記リストに現れ、互いに優先的に協同して一つまたはそれ以上の特定の機能を発揮するマイクロＲＮＡのセットまたはサブセットを導き出す。上記のように、このような解析はまた、この本文中で、「マイクロＲＮＡコードの解読」とも呼ばれる。この目的を達成するために、上記のブロック２００には、好ましくは、図５において番号２２０、２３０および２４０で参照される段階の３つのサブブロックが含まれる。
【０１０１】
Ｃ．生物学データと核酸との関連（ブロック２２０）
一つの態様において、各マイクロＲＮＡ−可能なＴＲＳについてのすべての同定された生物学データを、特定のマイクロＲＮＡと関連させた。他の態様において、特定の型のデータのみ、例えば機能のデータまたはｍＲＮＡ（もしくは対応する遺伝子）の名前のみを、マイクロＲＮＡと関連させた。さらに他の態様において、最終的に、有意な生物学データのみをマイクロＲＮＡと関連させた。このように、同定された生物学データの一部のみをマイクロＲＮＡと関連させた。
【０１０２】
有意な生物学データを同定する最後まで、生物学データを比較した。図８Ａおよび８Ｂは、本発明の態様に従ったＧＯタームの関係木を示す。サブブロック２２０の第一段階２２１において、「マイクロＲＮＡ−可能なＴＲＳ−ＧＯ＿機能＿アノテーション」データの拡張全リストに存在しているすべての機能または、同義であるすべてのＧＯタームを、その維持およびその開発を保証するコンソーシアムによって記載されているように木に配置する（Ashburner et al., 2000）。本発明に適用する際、この木を「ＧＯ−マイクロＲＮＡ−完全木」と呼ぶ（図８Ａ）。
【０１０３】
ジーンオントロジーデータベースは、以下の３つのドメイン：「細胞成分」；「分子機能」；「生物学的過程」における遺伝子の機能を詳しく述べるために統制された標準的な用語集を提供する。したがって、各タンパク質は、これらの３つのカテゴリーに属する用語のセットによって評価される。ＧＯ木において、３つのカテゴリーの各々のＧＯタームを、系統(lineage)／祖先(ancestry)のリンクによって（非環状の木の形態で）互いに関連させ、それによって、親ノード、子ノードおよび各ノードと関連している機能アノテーション間での進路決定(navigation)が可能となる。図８ＡにおけるＧＯ−マイクロＲＮＡ−完全木において、２度囲まれているＧＯノードは、すべてのｍｉＲＮＡ−標的の関連について認められるＧＯタームに対応する。この完全リストのサブセットのみが認められるので、１度だけ囲まれているＧＯタームは、ジーンオントロジーデータベースに記憶されているすべての他のＧＯタームである。
【０１０４】
サブブロック２２０の第二段階２２２において、「マイクロＲＮＡ−可能なＴＲＳ−ＧＯ＿機能＿アノテーション」データのリストで個々に取られた各マイクロＲＮＡと関連している機能、またはＧＯタームを、「ＧＯオリジナル完全」木に配置する。それゆえ前記ファイルにおけるマイクロＲＮＡと同じ数のこの型の木が作成される。これらの木（その説明は図８Ｂに与えられる）は、本明細書で「ＧＯ−マイクロＲＮＡ−ユニーク木(unique tree)」と呼ばれる。
【０１０５】
第３段階２２３において、各マイクロＲＮＡの「ＧＯ−マイクロＲＮＡ−ユニーク」木を「ＧＯ−マイクロＲＮＡ−完全」木と比較して、有意なＧＯタームのフィルタリングを行う。この趣旨で、超幾何法(hypergeometric law)に基づく統計的手法を用いて、各「マイクロＲＮＡ−可能なＴＲＳ−ＧＯ＿機能＿アノテーション」データに存在しているＧＯタームの有意性を計算することができる。当業者に周知の他の統計的手法を用いてもよい。
【０１０６】
一つの態様において、ｐ値として公知の統計的変数を計算する。また、好ましくは、ｐ値の変数の値が０．０５未満以下のＧＯタームは有意であると考えられる。有意なＧＯタームのみを該方法の残りにキープしておいてもよい。この趣旨で、各マイクロＲＮＡと関連している有意なＧＯタームのリストを作成する。このリストはファイルに記憶され、「マイクロＲＮＡ−可能なＴＲＳ−ＧＯ＿機能＿アノテーション−有意」型のデータを含む。
【０１０７】
Ｄ．関連している生物学データを用いた相関行列の作成（ブロック２３０）
有意な生物学データ並びにＴＳＲおよび対応するｍｉＲＮＡへのそのリンクを用いて、マイクロＲＮＡの機能分類を可能にする相関行列を作成してもよい。ｍｉＲＮＡの比較を容易にするため、相関行列は、同定された生物学データの各々が第一核酸の各々と関連しているかどうかを示す。この方法で、生物学データに基づく類似の機能性を有するｍｉＲＮＡが同定されうる。このように、マイクロＲＮＡコードは解読されうる。
【０１０８】
図９Ａおよび９Ｂは、本発明の態様に従って相関行列を説明する。図９Ａにおいて、マトリックス９００は、ｍｉＲＮＡのセットに対応する列９１０を有する。表示を簡単にするため、３つだけを示す。段(Column)９２０は同定された生物学データに対応し、この態様において、生物学データは全リストにおけるｍＲＮＡについての対応する遺伝子である。生物学データはまた、単にｍＲＮＡ自身の名前であってもよい。行列要素９３０には、ｍｉＲＮＡが遺伝子９３０の一つと関連しているかどうか、ひいては特定のｍｉＲＮＡが特定の遺伝子またはｍＲＮＡを標的としているかどうかの指標が含まれている。一つの態様において、「１」は、行列要素（例えば、段に見られるもの）と関連している生物学データを示し、「０」は関連がないことを示す。
【０１０９】
一つの態様において、二進法でない関係を用いてもよい。例えば、相互作用の自由エネルギーの値それ自身、または行列要素に対応する生物学データの有意性の値を用いてもよい。相関行列についての実際の形態は、古典的な行列であってもよく、または連結リストのセットであってもよい。本質的には、データはいずれの形態で記憶されてもよい。また、「１」値のみが記憶される必要があり、「０」値は推測されてもよい。
【０１１０】
図９Ｂにおいて、マトリックス９５０の段９６０はＧＯタームに対応する。これらのＧＯターム９６０は、いくつかの標的核酸、例えば、遺伝子のセット９７０によって共有されうる。したがって、マイクロＲＮＡがＧＯタームとリンクしたいずれの遺伝子とも相互作用する場合、そのＧＯタームはそのマイクロＲＮＡと関連しており、行列要素は「１」である。マイクロＲＮＡがＧＯタームとリンクしたいずれの遺伝子とも相互作用しない場合、そのＧＯタームはそのマイクロＲＮＡと関連しておらず、行列要素は「１」である。
【０１１１】
Ｅ．相関行列に基づく距離行列の作成（ブロック２３０）
相関行列を用いて、ｍｉＲＮＡ間の距離が決定されうる。「０」および「１」の値は、多次元の位置として用いられ、従って距離が計算されうる。一つの態様において、この距離は機能の距離とみなされうる。したがって、一つの態様において、機能の距離は、共通のＧＯ有意ターム(GO-significant term)に関する構成に従って、マイクロＲＮＡの各ペア間で計算される。行列の各次元または方向は、異なる生物学データ、または異なるＧＯタームである。
【０１１２】
距離についての定義（式）は、いずれの種類であってもよい。それは、各ｍｉＲＮＡ間の各次元についての位置における差の二乗の和の平方根を含む、厳密なユークリッド距離でありうる。距離はまた、重みつきのユークリッド距離であってもよく、曲線または非直交方向でさえも、生物学データ間で想定されうる。
【０１１３】
一つの態様において、機能の距離行列は、「チェカノフスキー−ダイス(Czekanowski−Dice)」（Kimura M., 1980）と呼ばれる当該技術分野で一般的である類似性の距離計算に基づく方法に従って作成される。距離を計算する他の方法、例えば、木村の方法(method of Kimura)（Kimura M., 1980）が用いられうる。
【０１１４】
Ｆ．第一核酸のクラスタリング（ブロック２４０）
図６における第４のサブブロック２４０において、距離行列を用いてｍｉＲＮＡをクラスタリングする。一つの態様において、マイクロＲＮＡ間の機能の関係の樹状図を、サブブロック２３０によって生成された距離行列から作成し、本明細書で「樹状図」と呼ばれるファイルに樹状図を記録する。樹状図が最も一般的だが、樹状図以外の他の構造を、クラスタリングから作成してもよい。一つの態様において、作成されるクラスターは、クラスターの第一核酸（例えば、ｍｉＲＮＡ）の各々の間で共通した情報の最大のセットを有するもののみである。
【０１１５】
各ｍｉＲＮＡと関連している生物学データは様々でありうるので、第一核酸（ｍｉＲＮＡ）のクラスタリングは、標的核酸（ｍＲＮＡ）の多くの異なる属性または特徴に基づいていてもよい。したがって、クラスタリングは、どのｍＲＮＡにｍｉＲＮＡが相互作用するか（Ａ節からの方法によって決定されたもの）に基づいていてもよい。他の態様において、機能クラスタリングは、遺伝子と関連しているＧＯタームに基づいてなされうる。この場合において、クラスタリングは遺伝子の名前から独立している。もちろん、他の態様によって、標的核酸とリンクしたいずれの他の生物学データに基づいてクラスタリングされてもよい。
【０１１６】
一つの態様において、ＷＰＧＭＡ（「算術平均による重みつき対グループ法」の頭字語）型の方法を用いて、クラスタリングを行う。他の方法には、ＵＰＧＭＡ法（算術平均による重みをつけない対グループ法(Unweight Pair Group Method with Arithmetic mean)）、または「近隣結合」として公知の方法が含まれる。またペアワイズ距離を直接用いない方法も用いられうる。例えば、最大節約の下で、好ましい系統樹は、進化的変化の最小の数を必要とする木であり、または最大尤度の下で、実験データに基づく最も起こりやすい木である。このような例において、ペアワイズ距離はなお用いられて、最良のクラスタリングを決定するスコア化の尺度または確率を提供する。
【０１１７】
図１０は、本発明の態様に従って生成された樹状図１０００を説明する。樹状図１０００は、マイクロＲＮＡ間の機能の関係を表す。深さのいくつかの程度が定義されうる。特に、これらの程度は、マイクロＲＮＡを分離する機能の距離に依存する。例えば、深さ３（Ｐ３）の枝分かれノードを有するマイクロＲＮＡのセットは、「機能ファミリー」（Ｆａ）と呼ばれうる。同様に、深さ４（Ｐ４）の枝分かれノードを有するマイクロＲＮＡのセットは、「機能グループ」（Ｇ）と呼ばれうる。
【０１１８】
本来、機能ファミリーおよび／または機能グループを選択するこのような方法は、木を作成する方法に応じて相違しうる。すべての場合において、本発明の好ましい態様に従った方法によって、得られた機能ファミリーおよびグループに基づいて、このようにマイクロＲＮＡコードを解読することが可能となる。
【０１１９】
一例として、図１０に従って、ｍｉｒ３６５−２およびｍｉｒ３６５−１マイクロＲＮＡが協同して、ファミリーＦａ１とリンクした機能Ｆ１を制御することが分かる。またマイクロＲＮＡの２つのセットを含む２つのファミリーＦａ３およびＦａ５がグループＧ１を形成することも分かる。このグループにおいて、マイクロＲＮＡは、互いにリンクしていると決定されている機能Ｆ３およびＦ５によって説明される生物学的現象と関連している。この段階で得られる情報をさらに強化するために、該方法には、特に樹状図によって得られる情報の後処理を行うことが含まれうる。
【０１２０】
他の態様において、深さの程度は、機能的関連性を有するｍｉＲＮＡのクラスターを同定するための決定因子でなくてもよい。標準化された距離(normalized distance)のパーセンテージの代わりに、標準化された距離自身、または生の距離でさえ、クラスターを同定するための閾値として用いられうる。クラスターの全標的遺伝子またはｍＲＮＡ（または他の生物学データ）の２５％超が、クラスターのｍｉＲＮＡの間で共有されている場合、ｍｉＲＮＡがクラスターに組織化されるようにこのようなパーセンテージを閾値として用いてもよい。同等に、ベン図の考え方で、共有されるマイクロＲＮＡは、各ｍｉＲＮＡと関連している標的遺伝子のセットの共通部分とみなされうる。
【０１２１】
例えば３個のｍｉＲＮＡについて、これらの標的遺伝子の間でこれらの遺伝子の少なくとも２５％が３個のｍｉＲＮＡの標的となる場合に、これらは一緒にクラスタリングされる。一つの態様において、標的遺伝子の共有数を、クラスターのｍｉＲＮＡと関連している標的遺伝子の総数で割ったものがそのパーセンテージである計算が１回なされる。あるいは、そのパーセンテージは、共有される各ｍｉＲＮＡについての遺伝子数に基づいていてもよい。例えば３個のｍｉＲＮＡについて、特定のｍｉＲＮＡについての標的遺伝子の２５％は、クラスターの他のｍｉＲＮＡによって共有されなければならない。一つの態様において、所定量、例えば、２５％を超える場合に、３つのパーセンテージを互いに計算する（各パーセンテージは、共有される標的遺伝子を特定のｍｉＲＮＡと関連している全標的遺伝子で割ったものである）。
【０１２２】
図１１は、パーセンテージで示されているリンクしたｍｉＲＮＡ間の距離、または本質的に標準化された距離による樹状図を説明する。この例において、４０％のマーカーを用いて、その程度で、またはそれより高い程度でのすべてのリンクしたｍｉＲＮＡが、機能的に関連するセット（マイクロＲＮＡコード）に組織化されうることを表す。これは、どのようにしてカットオフ値を樹状図の中で選択して、特定の生物学的問題に従ったクラスターを同定しうるかの一例にすぎない。カットオフを左および右に移動することによって、解析されるマイクロＲＮＡ間の機能的関係において、それぞれ縮小および拡大することができる。
【０１２３】
Ｇ．クラスターの核酸への生物学的機能の割り当て
いったんクラスターが同定されれば、特定の生物学的機能がクラスターのｍｉＲＮＡに割り当てられうる。生物学的機能は、クラスターのｍｉＲＮＡと関連している生物学データから決定されうる。生物学的機能と生物学データの間のリンクが同定されうる。例えば、生物学的機能は、生物学データを構成するＧＯアノテーション、または本質的には、アノテーションと関連している生物学的現象でありうる。生物学データが標的核酸に対応する態様において、生物学的機能はクラスターのｍｉＲＮＡによる特定の標的核酸の制御でありうる。
【０１２４】
クラスターの生物学データとリンクしていると同定されている特定の生物学的機能を、次いでクラスターに割り当ててもよく、それゆえ、クラスターのｍｉＲＮＡに割り当ててもよい。一つの態様において、クラスターのすべてのｍｉＲＮＡに共通した生物学データのみとリンクした生物学的機能を、クラスターのｍｉＲＮＡに割り当てる。したがって、クラスターのすべてのｍｉＲＮＡに共通した機能アノテーションのみを、クラスターのｍｉＲＮＡに割り当てる。クラスターのｍｉＲＮＡを、次いでこれらの共有される生物学的機能についてのｍｉＲＮＡコードとみなしてもよい。
【０１２５】
一つの態様において、グループのｍｉＲＮＡの間で共有される標的核酸を制御する機能性をクラスターに割り当てる。よって、この態様において、ｍｉＲＮＡによって共有される標的核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を、ｍｉＲＮＡの真の標的として同定する。したがって、態様によって、対応する可能な標的認識配列（ＴＲＳ）を選択することが可能となる。有利なことに、本発明の態様のおかげでマイクロＲＮＡあたりわずか２０から５０個の有意な標的が同定される。
【０１２６】
他の態様において、共通の生物学データが同定されうる。いずれの共通の生物学データともリンクした標的核酸もまた同定されうる。次いでこれらの標的を、クラスターにおけるｍｉＲＮＡの真の標的であると同定してもよく、これらの標的を制御する生物学的機能をクラスターのｍｉＲＮＡに割り当ててもよい。あるいは、共通の生物学データの所定の数またはパーセンテージとリンクした標的核酸のみを真の標的とみなす。
【０１２７】
他のクラスターに有用でありうるので、共通でない生物学データでも記憶し、マイクロＲＮＡと関連させてもよい。さらなる解析によって、この共通でない生物学データを用いて、異なるセット、サブセット、クラスター、またはクラスターのサブセットのマイクロＲＮＡ間で他の機能のリンクが存在しているかどうかを決定してもよい。
【０１２８】
ＩＶ．結果の可視化
後処理段階において、検索の方法、評価、解析および方法２００から得られる結果の解釈、特に「樹状図」ファイルに含まれる結果の解釈をとりわけ行う。この趣旨で、対話式の可視化インターフェースおよび専用ナビゲーターが用いられうる。このようにして、「マイクロＲＮＡ−可能なＴＲＳ−ＧＯ＿機能＿アノテーション−有意」（拡張全リスト）リストに含まれる情報および結果の、シンプル、直感的、並びに対話式の抽出および表示が可能となる。
【０１２９】
より具体的には、マイクロＲＮＡによる、および／または、例えば、マイクロＲＮＡの機能ファミリーによる、標的遺伝子の可視化、および標的認識についての可能な配列（ＴＲＳ）の可視化のための表示が用いられうる。個々に選択され、および／または機能ファミリーによって選択され、および／または機能グループによって選択されたマイクロＲＮＡと関連しているＧＯタームの可視化のための表示を用いることもまた可能である。このような表示は：
マイクロＲＮＡ−可能なＴＲＳ関連データの生物学的機能；
マイクロＲＮＡ−可能なＴＲＳ関連データの分子機能；および
マイクロＲＮＡ−可能なＴＲＳの関連が機能する細胞内区画によってもたらされうる。
【０１３０】
上記または他の表示を用いて、様々な情報、例えば：
これらのマイクロＲＮＡについての標的遺伝子および可能な標的認識配列（ＴＲＳ）；
マイクロＲＮＡとその可能な標的認識配列（ＴＲＳ）の間の相互作用の評価のための、これらの相互作用についての詳細；並びに
マイクロＲＮＡ−可能なＴＲＳ関連データに関する症状にアクセスしうる。
【０１３１】
このような目的を達成するため、「マイクロＲＮＡ−可能なＴＲＳ−ＧＯ＿機能＿アノテーション−有意」リストに含まれる情報および結果を表示するために、フィルタリング機能(filtering function)が実行されうる。集合論に基づくアルゴリズムを用いて、共通のＧＯタームのセットを共有するマイクロＲＮＡのセット（マイクロＲＮＡの「機能ファミリー」および／または「機能グループ」）、これらのマイクロＲＮＡの各々のＧＯタームのセット、および／またはこのマイクロＲＮＡセットのマイクロＲＮＡのすべてによって、またはその一つのサブセットによって共有されるものが可視化されうる。
【０１３２】
このアルゴリズムにおいて変更されうる主要パラメータは、特に：
機能グループまたは機能ファミリーを可視化するための樹状図における深さ；並びに
共通のＧＯタームを共有しなければならないマイクロＲＮＡの数（例えば、％として）である。本明細書で言及され、かつ当業者に公知の他のパラメータおよび基準が用いられてもよい。このようなパラメータによって、解析される機能グループまたは機能ファミリーのマイクロＲＮＡの各々に特異的なＧＯタームを得ることが可能となる。
【０１３３】
さらに、機能ファミリーまたは機能グループに属するマイクロＲＮＡ、マイクロＲＮＡのサブセットもしくはセットと関連しているＧＯターム間の親−子関係をこの木において位置づけ、かつ同定するために、ＧＯ＿有意木(GO_significant tree)における進路決定を可能にする段階が実行される。
【０１３４】
実施例
これらに限らないが、特許請求された発明を説明するために以下の実施例を表す。
本発明の出願の実施例を、ヒトにおけるマイクロＲＮＡコードの解読の面で今から記載する。特に、上記で与えられる本発明の態様を、マウスと保存している２３９個のヒトマイクロＲＮＡに適用した。これらの２３９個のマイクロＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡのいずれの他のセットも、当該技術分野で公知の方法によって決定されうる。この実施例から得られる結果を、公知および公開された結果との重複によって確認した。より具体的には、公知の実験結果で確認を行い、結果と、マイクロＲＮＡについての現在の知識との一貫性の確認を得た。
【０１３５】
２３９個のヒトマイクロＲＮＡへの本発明の適用の第一の結果を、図１２における表１に表した。図示されるように、該方法によって、８９個の機能ファミリー（Ｆ１からＦ８９）の同定がもたらされる。これらのファミリーは、樹状図１０００の深さ３での枝分かれノードを有するマイクロＲＮＡのグループに対応する。表１において、括弧の間のマイクロＲＮＡはパラログに対応する。
【０１３６】
１．少なくとも２個のマイクロＲＮＡを含む機能ファミリー
配列がいずれの類似性も示さないマイクロＲＮＡを一緒にクラスタリングし、同一の生物学的機能の制御に相乗的かつ協調して参加することを示すことができた。図１２の表１において、２つのメンバーまたはそれ以上を含む５７個のファミリーを同定した。
【０１３７】
２．オーファン機能ファミリー
本発明の方法はまた、一つだけのマイクロＲＮＡを含むファミリー（以下、オーファンファミリーという）を同定することも可能である。これらのマイクロＲＮＡは、他のマイクロＲＮＡまたはマイクロＲＮＡの機能ファミリーによって有意に共有されない機能をコードする。図１２の表１において、該方法によって、図１３に示される３２個のオーファンファミリーを同定することが可能となった。これらは、機能の個々の方法を有するマイクロＲＮＡに対応するか、またはマイクロＲＮＡの完全なセットの知識が非常に不完全であることに起因する不完全な機能ファミリーに対応する。
【０１３８】
３．マイクロＲＮＡの機能グループ
図１４の表によれば、樹状図の深さ３（Ｐ３）で定義される３６個の機能ファミリーは、樹状図の深さ４（Ｐ４）でのＧ１からＧ１８として同定される１８個の機能グループに一緒にグループ化される。マイクロＲＮＡのこれらの機能グループは、マイクロＲＮＡコードによって定義されるネットワークの中で必要となる機能の相互作用(cross interaction)を現して、生物における細胞および組織の機能に必要な相乗作用において異なる機能を同時制御する(co-regulate)。
【０１３９】
４．パラロガスなマイクロＲＮＡのグループの解析による確認
図１５で説明されるように、高い配列類似性（例えば、９０％〜１００％）を有するパラロガスなマイクロＲＮＡは、配列類似性を考慮しない本発明の態様によって、同一の機能ファミリーまたはグループに自然にクラスタリングされた。したがって、一緒にクラスタリングされるべきであることを配列類似性が示唆するパラロガスなマイクロＲＮＡは、実際に一緒にクラスタリングされた。ヒトにおいて、マイクロＲＮＡの４２個の機能グループは、パラロガス、すなわち同一のマイクロＲＮＡのコピーであると考えられる。
【０１４０】
態様によって、高い配列類似性を有するマイクロＲＮＡが一緒にクラスタリングされるが、より低い配列類似性（例えば、８０％未満）を有するマイクロＲＮＡもまた、一緒にクラスタリングされうる。例えば、時々無視できない配列変化（例えば、２つのパラログ ｍｉｒ−１９３およびｍｉｒ−１９３ｂの場合、２９．２％の差異、すなわち２４個中７個のヌクレオチドの差異）にもかかわらず、本発明の態様によって、パラロガスなマイクロＲＮＡのこれらの４２個のグループのうち３４個が、３４個の異なる機能ファミリーに分類される。
【０１４１】
さらに、図１６で説明されるように、パラロガスなマイクロＲＮＡの８グループについて、比較的小さな配列の違いもまた、グループの各パラログ間でかなりの機能的な違いをもたらしうるが、時にはその違いがもたらさないことが示される。特に、この表において３つの場合が区別されうる。ｍｉｒ−３０２パラログの場合：パラログのこのグループの４個のマイクロＲＮＡは、同一の機能グループＧ１３に属する２つの異なる機能ファミリーＦ５５およびＦ５６に属する。このことは特に、パラログのこのグループ内の機能的な違いが比較的小さいことを意味する。２つのファミリーは、厳密に相乗的に作用する機能において協調して作用する。
【０１４２】
Ｌｅｔ−７パラログの場合において、マイクロＲＮＡは３つの機能ファミリーに分布している。それらの２つ、Ｆ２７およびＦ２８は、同一の機能グループＧ６（樹状図の深さ４）に属している。Ｌｅｔ−７ｄを含む第３のファミリー、Ｆ３０は、この機能グループに属していない。しかしながら、樹状図の解析によって、ファミリーＦ３０が機能グループＧ６と共通した深さ５のノードを有することが示され、Ｌｅｔ−７パラログのグループのメンバーのセットが、細胞および組織で相乗的に作用する機能において協調して作用することを示唆している。
【０１４３】
パラログのグループのマイクロＲＮＡはまた、異なる機能も有しうる。図１６において、パラログの他の６グループのメンバーは異なる機能を有する。特に、ｍｉｒ−３４ｂに関して、このマイクロＲＮＡは５’位に追加のヌクレオチドを有する。この違いの結果、パラログのこのグループの他のメンバーと核が異なることとなり、それゆえ、標的および機能が異なる。
【０１４４】
５．同一の機能に関与するマイクロＲＮＡの解析による確認
本発明の態様によって、同じ機能に関与することが知られているマイクロＲＮＡの２つのグループだけが、同じファミリー、または機能グループに分類された。これにより、特に、ｍｉＲ−１５とｍｉＲ−１６の両方が「Ｂ細胞慢性リンパ性白血病」型の白血病に関与していること（Calin et al., 2002； Calin et al., 2004）を説明することが可能となる。これらの２つのマイクロＲＮＡは、少なくとも一つの標的核酸，Ｂｃｌ２遺伝子を共通して有している（Cimmino et al., 2005）。
【０１４５】
２つのマイクロＲＮＡは配列類似性を有していないが、本発明の方法によって、ｍｉｒ１６−１、ｍｉｒ−１６−２およびｍｉｒ１５ｂマイクロＲＮＡは同一の機能ファミリーに分類される。また、Ｌｅｔ−７ファミリーのマイクロＲＮＡの場合において、１１個のマイクロＲＮＡのこのファミリーの１０個のメンバーは、本発明によって同一の機能グループに分類される。
【０１４６】
６．マイクロＲＮＡの機能プロフィール
本発明の態様は、各マイクロＲＮＡまたはマイクロＲＮＡのファミリーの特定の機能プロフィールを確立し、またこれらが同一の機能グループに属する場合、これらのファミリー間に存在する機能の関係を確立するのにも役立つ。用語「機能プロフィール」は、機能のセットまたは、同義である生物学的現象のセットを意味するものと意図される。各マイクロＲＮＡについて、マイクロＲＮＡコードがそれらの機能ファミリーの他のメンバーと協調して、または相乗的に同時制御する機能が特徴である。
【０１４７】
すべてのこれらの結果は、様々な領域、例えば以下：ファミリー、ＡＣＴＩＮＡＭＥ、マイクロＲＮＡ、ＧＯ、およびＧＯ：受入番号(GO:Accession)を有するファイルに統合されうる。ファミリーは、機能ファミリーの識別(identification)を示す。ＡＣＴＩＮＡＭＥは、本発明に特異的なマイクロＲＮＡの識別である。マイクロＲＮＡは、マイクロＲＮＡの標準的な識別を示す。ＧＯは、この技術分野に記載されているマイクロＲＮＡと関連しているＧＯタームのセットを示す。ＧＯ：受入番号は、この技術分野に記載されているＧＯタームの各々を示すためのコードを示す。本方法の後処理によって、このファイルに含まれるデータを利用することが可能となる。
【０１４８】
例えば、後処理によって、ｍｉｒ−３４ａと関連している「ＧＯ」タームのリスト、すなわち：アクチン結合、アミノグリカン生合成、アポトーシス、ＡＴＰ結合、ＡＴＰ合成共役型プロトン輸送、ＡＴＰアーゼ活性、共役型、結合、生物学的過程が未知、カルシウムイオン結合、触媒活性、細胞接着、細胞増殖、細胞成分が未知、シトクロム−ｂ５還元酵素活性、細胞質分裂、細胞質、細胞骨格、発生、ＤＮＡ結合、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性、電子伝達、エンドサイトーシス、小胞体、イプシロンＤＮＡポリメラーゼ活性、Ｇタンパク質共役型受容体タンパク質シグナル経路、Ｇタンパク質シグナル、環状ヌクレオチド第二メッセンジャーへの共役、有子分裂細胞周期のＧ１／Ｓ移行、スフィンゴ糖脂質生合成、ゴルジ体、ＧＴＰ結合、ヘム結合、液性防御機構（意味(sensu) 脊椎動物）、水素輸送 Ｖ型ＡＴＰアーゼ複合体、加水分解酵素活性、膜への組み込み、細胞膜への組み込み、細胞内、細胞内タンパク質輸送、細胞内シグナルカスケード、イオン輸送、キナーゼ活性、リガーゼ活性、マグネシウムイオン結合、膜、膜画分、微小管結合複合体、有子分裂中期プレート会合(mitotic metaphase plate congression)、分子機能が未知、形態形成、筋肉発生、神経発生、神経ペプチドシグナル経路、核内ｍＲＮＡスプライシング、スプライソソームによって、核酸結合、核、細胞小器官組織化および生合成、酸化還元酵素活性、酸素運搬(oxygen transport)、リンタンパク質ホスファターゼ活性、Ｉ−カッパＢキナーゼ／ＮＦ−カッパＢカスケードの正の調節、タンパク質アミノ酸糖鎖付加、タンパク質アミノ酸リン酸化、タンパク質結合、タンパク質フォールディング、タンパク質修飾、タンパク質ホスファターゼ型２Ａ複合体、タンパク質ホスファターゼ型２Ａ制御因子活性、タンパク質セリン／スレオニンキナーゼ活性、タンパク質ユビキチン化、タンパク質−チロシンキナーゼ活性、タンパク質分解およびペプチド分解(peptidolysis)、プロトン輸送、受容体活性、酸化還元シグナル応答、細胞周期の制御、regulation of 有糸分裂中期／後期移行、Ｐｏｌ ＩＩプロモーターからの転写の制御、転写の制御、ＤＮＡ依存性、翻訳開始の制御、ロドプシン様受容体活性、ＲＮＡ結合、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写因子活性、シグナル伝達物質活性、シグナル伝達、低分子ＧＴＰアーゼ媒介シグナル伝達、構造分子活性、転写補助活性化因子活性、転写因子活性、Ｐｏｌ ＩＩプロモーターからの転写、トランスフェラーゼ活性、翻訳開始因子活性、膜貫通受容体タンパク質チロシンホスファターゼ活性、輸送、トランスポーター活性、ユビキチンサイクル、ユビキチンリガーゼ複合体、ユビキチン−タンパク質リガーゼ活性、電位開口型カルシウムチャネル活性、亜鉛イオン結合が提供されうる。
【０１４９】
７．マイクロＲＮＡの「機能ファミリー」の機能プロフィール
ｍｉｒ−３４ａを含む機能ファミリーＦ１２の実施例において、本方法の態様によって、Ｆ１２ファミリーに共通して４５個のＧＯターム（６０．７％）、すなわち：アクチン結合、ＡＴＰ結合、結合、生物学的過程が未知、カルシウムイオン結合、細胞接着、細胞成分が未知、細胞質、細胞骨格、発生、ＤＮＡ結合、Ｇタンパク質共役型受容体、ゴルジ体、ＧＴＰ結合、加水分解酵素活性、膜への組み込み、細胞膜への組み込み、細胞内タンパク質輸送、細胞内シグナルカスケード、キナーゼ活性、マグネシウムイオン結合、膜、膜画分、分子機能が未知、筋肉発生、神経発生、核酸結合、核タンパク質結合、タンパク質セリン／スレオニンキナーゼ活性、タンパク質ユビキチン化受容体活性、細胞周期の制御、転写ＤＮＡ依存性の制御、ロドプシン様受容体活性、ＲＮＡ結合、シグナル伝達転写、補助活性化因子活性、転写因子活性、Ｐｏｌ ＩＩプロモーターからの転写、トランスフェラーゼ活性、輸送、ユビキチンサイクル、ユビキチン、リガーゼ複合体、ユビキチン−タンパク質リガーゼ活性、亜鉛イオン結合が見出される。
【０１５０】
後処理によって、このような機能ファミリーまたは機能グループのマイクロＲＮＡのセットまたはサブセットに存在しているＧＯタームを選択することが可能となる。またそれによって、用いられるパラメータの関数として選択される用語をＧＯ木において可視化し、並びに考慮される機能ファミリーまたは機能グループのマイクロＲＮＡが関与する主要な機能を同定することも可能となる。
【０１５１】
８．マイクロＲＮＡ標的遺伝子の同定
上記の表示および機能アノテーションに基づいて、対応する可能な標的認識配列（ＴＲＳ）が選択されうる。有利なことに、本発明の態様のおかげでマイクロＲＮＡあたりわずか２０から５０個の有意な標的が同定される。
【０１５２】
９．ヒトにおける公知のマイクロＲＮＡ標的の解析による確認
生物学的に有意な標的認識配列の最終リストにおいて、２つの確認された標的がヒトにおいて見出される。ヒトにおけるＬｅｔ−７マイクロＲＮＡについての確認された標的であるＮＲＡＳ遺伝子（Cimmino et al., 2005）が特に見出される。ヒトにおけるｍｉｒ−１５およびｍｉｒ−１６マイクロＲＮＡについての確認された標的であるＢＣＬ２遺伝子（Johnson et al., 2005）もまた見出される。
【０１５３】
１０．マイクロＲＮＡの関連および症状
各マイクロＲＮＡについて、これらが役割を果たしやすい症状と関連させた。この関連を実施するのに、以下の３つの例示的な方法を用いた：
マイクロＲＮＡを、それ自身症状と関連している遺伝子に取り込むこと(harbored)；
マイクロＲＮＡが、症状と関連している遺伝子を標的とすること；および
マイクロＲＮＡを、一つまたはそれ以上の症状と関連している染色体領域に位置させること。
【０１５４】
特に、本発明は、マイクロＲＮＡを同定する方法にもかかわらず、すなわち直接または別の種との配列相同性により、別の種に適用可能である。さらに、この種についてのタンパク質をコードする遺伝子の配列が公知であれば、別の種に適用可能である。例えば、本発明は、マウス、ラット、イヌまたはチンパンジーに適用されうる。
【０１５５】
また、上記のように、それは、標的分子と相互作用し、ネットワークとして協調して機能する核酸のいずれのファミリーにも一般化されうる。これは特に、マイクロＲＮＡファミリーまたはクラスに属さない非コードＲＮＡのクラスの場合である。この関連で、その標的との塩基の相補性によって作用することが知られている何百もの分子からなるｓｎｏＲＮＡクラスについて言及してもよい。今まで、その構造特性のおかげで異なり、リボソーム生合成において相乗的に作用する２つのサブクラス（ＣＤ ｓｎｏＲＮＡおよびＨ−ＡＣＡ ｓｎｏＲＮＡ）に属する約２００分子のセットが同定されている。しかしながら、これらの２つのクラスに属する数多くの分子はオーファン分子であり、すなわち、その標的を同定することがまだ可能ではなく、その機能はそれゆえ未知である。
【０１５６】
さらに、理解されているように、本発明の方法によって、拡張全リストに、時間をかけて同定される新たなマイクロＲＮＡを統合することが可能となる。具体的には、少なくとも８００個は、ヒトおよび哺乳類においてまだ発見されていない。それらが発見されるにつれ、新たなマイクロＲＮＡのこのような統合によって、多くの目標を達成することが可能となる。
【０１５７】
例えば、この文書で既に同定され、与えられた機能ファミリーが完成されうる。これは特に、マイクロＲＮＡを一つだけ含む「オーファン」ファミリーの場合である。予測精度を増大させることによって、例えばマイクロＲＮＡに割り当てられる機能のリストまたはファミリーの構成を変更することによって、その機能の予測の質が洗練されうる。まだ発見されていない新たな機能ファミリーの作成がもたらされうる。また、本発明によって同定され、この文書で与えられる機能ファミリーを細分し、または一緒にグループ化し、または変更してもよく、そしてこのように洗練させるのに今まで予測された機能をそのようにしてもよい。
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【０１５８】
本明細書で引用されるすべての公報および特許出願は、まるで各々の個々の公報または特許出願が引用されることが具体的かつ個別的に示されるかのように、本明細書に引用される。
【０１５９】
前述の発明は、理解を明確にするために、説明および実施例によって多少詳細に記載されているが、添付された特許請求の範囲の精神または範囲からはずれることなく、特定の変化および修飾がそれに対してなされうることは、本発明の記載の観点から、当業者に容易に理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１】図１は、本発明の態様に従って、マイクロＲＮＡが一つまたはそれ以上のメッセンジャーＲＮＡと相互作用して、タンパク質の発現の制御によって生物学的現象を制御する原理を図式的に説明する。
【０１６１】
【図２】図２は、本発明の態様に従って、マイクロＲＮＡコードおよび関連した生物学的機能を同定する方法を説明する。
【０１６２】
【図３】図３は、本発明の態様に従って、第一核酸と標的核酸の間の相互作用を決定する方法を説明する。
【０１６３】
【図４】図４は、本発明の態様に従って、「５’末端領域」および「３’末端領域」と呼ばれる２つの領域での、マイクロＲＮＡとメッセンジャーＲＮＡの間の相互作用を図式的に説明する。
【０１６４】
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｃは、本発明の態様に従って、核および延長された核を探索する段階をそれぞれ説明する。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｃは、本発明の態様に従って、核および延長された核を探索する段階をそれぞれ説明する。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｃは、本発明の態様に従って、核および延長された核を探索する段階をそれぞれ説明する。
【０１６５】
【図６】図６は、本発明の態様に従って、核酸の機能クラスタリングを図式的に説明する。
【０１６６】
【図７】図７は、本発明の態様に従って、異なるマイクロＲＮＡについて、その可能な標的、産生されるタンパク質、および行われる機能を説明するために得られた表である。
【０１６７】
【図８Ａ】図８Ａおよび８Ｂは、本発明の態様に従って、ＧＯタームの関係木を示す。
【図８Ｂ】図８Ａおよび８Ｂは、本発明の態様に従って、ＧＯタームの関係木を示す。
【０１６８】
【図９Ａ】図９Ａおよび９Ｂは、本発明の態様に従って、相関行列を説明する。
【図９Ｂ】図９Ａおよび９Ｂは、本発明の態様に従って、相関行列を説明する。
【０１６９】
【図１０】図１０は、本発明の態様に従って、生成される樹状図を説明する。
【０１７０】
【図１１】図１１は、本発明の態様に従って、パーセンテージで示されているリンクしたｍｉＲＮＡ間の距離、または標準化された距離による樹状図を説明する。
【０１７１】
【図１２】図１２は、本発明の態様に従って、特定の機能ファミリーに属するものと同定されるマイクロＲＮＡを示す表である。
【０１７２】
【図１３】図１３は、本発明の態様に従って、特定のオーファン機能ファミリーに属するものと同定されるマイクロＲＮＡを示す表である。
【０１７３】
【図１４】図１４は、本発明の態様に従って、特定の機能グループに属するものと同定される機能ファミリーを示す表である。
【０１７４】
【図１５】図１５は、本発明の態様に従って、特定の機能ファミリーに属するものと同定されるパラロガスなマイクロＲＮＡを示す表である。
【０１７５】
【図１６】図１６は、パラロガスなマイクロＲＮＡグループについて、配列の違いが、このようにグループの各パラログ間で程度の差はあるがかなりの機能的な違いをもたらしうることが、本発明の方法によって示されうるという事実を説明する表である。
【図１】
2009521944.tif 000003
【図２】
2009521944.tif 000004
【図３】
2009521944.tif 000005
【図４】
2009521944.tif 000006
【図５】
2009521944.tif 000007
【図６】
2009521944.tif 000008
【図７】
2009521944.tif 000009
【図８Ａ】
2009521944.tif 000010
【図８Ｂ】
2009521944.tif 000011
【図９Ａ】
2009521944.tif 000012
【図９Ｂ】
2009521944.tif 000013
【図１０】
2009521944.tif 000014
【図１１】
2009521944.tif 000015
【図１２】
2009521944.tif 000016
【図１３】
2009521944.tif 000017
【図１４】
2009521944.tif 000018
【図１５】
2009521944.tif 000019
【図１６】
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【国際調査報告】
2009521944.tif 000021
2009521944.tif 000022
2009521944.tif 000023
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