(57)【要約】  Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする単離核酸、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを発現する組換え体、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの組換え発現用の異種発現系、該ポリペプチドを使用するアッセイ法、およびＴ２Ｒ７６調節剤の投与を介して味知覚を改変するための方法。これらのＴ２２Ｒ７６ポリペプチドを、単独で発現させるか、または別のＴ２Ｒポリペプチド、好ましくは異なるヒトＴ２Ｒポリペプチドと同時発現させてもよい。これらのＴ２Ｒ７６ポリペプチドは、ブルシンおよびプロピルチオウラシル（ＰＲＯＰ）を含む苦味リガンドに特異的に応答し、そしてしたがって、苦味を調節する、好ましくは遮断する化合物を同定するアッセイで使用可能である。
2009514507.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２に含有されるポリペプチドをコードする単離核酸分子；
（ｂ）配列番号１を含む単離核酸分子；または
（ｃ）配列番号１によってコードされるポリペプチドに少なくとも９０％の配列同一性を所持し、そして配列番号２に含有されるポリペプチドに特異的に結合する少なくとも１つの苦味リガンドに特異的に応答するポリペプチドをコードする単離核酸分子
を含む、単離Ｔ２Ｒ７６核酸分子。
【請求項２】
（ａ）配列番号２に含まれるポリペプチドを含有するポリペプチドをコードする単離核酸分子
（ｂ）配列番号１に含有される核酸配列を含む単離核酸分子；
（ｃ）約２００ｍＭ未満の塩濃度を有する洗浄溶液および約４５℃より高い洗浄温度によって代表される洗浄ストリンジェンシー条件下で、配列番号１の核酸配列にハイブリダイズし、そして配列番号２に含有されるＴ２Ｒ７６ポリペプチドに特異的に結合する少なくとも１つの苦味リガンドに特異的に結合するＴ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする、単離核酸分子；
（ｄ）遺伝暗号の縮重のため、核酸配列が、上記の（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の１つの単離核酸分子と、少なくとも１つの機能的に同等なコドンによって異なり、そして上記の（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の１つの単離核酸によってコードされるＴ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする、単離核酸分子
からなる群より選択される、単離Ｔ２Ｒ７６核酸分子。
【請求項３】
（ａ）配列番号２のポリペプチドをコードする単離核酸分子；または
（ｂ）配列番号１の単離核酸分子
を含む、請求項１の単離Ｔ２Ｒ７６核酸分子。
【請求項４】
Ｔ２Ｒ７６核酸分子を検出するための方法であって：
（ａ）核酸物質を有する生物学的試料を得て；
（ｂ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、単離Ｔ２Ｒ７６核酸分子を、（ａ）の生物学的試料にハイブリダイズさせて、それによって、単離Ｔ２Ｒ７６核酸および生物学的試料内の核酸の間に二重鎖構造を形成し；そして
（ｃ）（ｂ）の二重鎖構造を検出し、それによって生物学的試料中のＴ２Ｒ７６核酸分子を検出する
工程を含む、前記方法。
【請求項５】
（ａ）配列番号２のポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に実質的に同一であるポリペプチド；
（ｃ）配列番号１の核酸分子によってコードされるポリペプチド；または
（ｄ）配列番号１に実質的に同一である核酸分子によってコードされるポリペプチド
を含む、単離Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド。
【請求項６】
（ａ）配列番号２のポリペプチドをコードする単離核酸分子；
（ｂ）配列番号１の単離核酸分子；
（ｃ）約２００ｍＭ未満の塩濃度を有する洗浄溶液および約４５℃より高い洗浄温度によって代表される洗浄ストリンジェンシー条件下で、Ｔ２Ｒ７６核酸配列にハイブリダイズし、そしてＴ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする、単離核酸分子；
（ｄ）遺伝暗号の縮重のため、核酸配列が、上記の（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の１つの単離核酸分子と、少なくとも１つの機能的に同等なコドンによって異なり、そして上記の（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の１つの単離核酸によってコードされるＴ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする、単離核酸分子
からなる群より選択される核酸分子によってコードされるポリペプチドをさらに含む、請求項５の単離Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド。
【請求項７】
配列番号２を含む、請求項５の単離Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド。
【請求項８】
少なくとも１つの他のＴ２Ｒポリペプチドと会合する、請求項５記載の単離Ｔ２Ｒポリペプチド。
【請求項９】
前記の他のＴ２Ｒポリペプチドが別のヒトＴ２Ｒである、請求項８の単離Ｔ２Ｒポリペプチド。
【請求項１０】
前記の他のヒトＴ２Ｒが、ヒトＴ２Ｒ５１、Ｔ２Ｒ５４、Ｔ２Ｒ５５、Ｔ２４６１、Ｔ２Ｒ６３、Ｔ２Ｒ６４、Ｔ２Ｒ６５、Ｔ２Ｒ６７、Ｔ２Ｒ７１、Ｔ２Ｒ７５、Ｔ２Ｒ５９およびＴ２Ｒ３３からなる群より選択される、請求項９の単離Ｔ２Ｒポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１に列挙した（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の単離核酸配列によってコードされるＴ２Ｒ７６ポリペプチドを特異的に認識する抗体を産生するための方法。
【請求項１２】
単離Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが配列番号２を含む、請求項１０の方法。
【請求項１３】
モノクローナル抗体を調製する工程をさらに含む、請求項８の方法。
【請求項１４】
請求項１１の方法によって産生される抗体。
【請求項１５】
Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドのレベルを検出するための方法であって
（ａ）ペプチド物質を有する生物学的試料を得て；
（ｂ）請求項１４の抗体との免疫化学的反応によって、（ａ）の生物学的試料中のＴ２Ｒ７６ポリペプチドを検出し、それによって、試料中のＴ２Ｒ７６ポリペプチドの量を決定する
工程を含む、前記方法。
【請求項１６】
（ａ）Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド；および
（ｂ）Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを発現する異種宿主細胞
を含む、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの異種発現のための系。
【請求項１７】
Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが：
（ａ）配列番号２のポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に実質的に同一であるポリペプチド；
（ｃ）配列番号１の核酸分子によってコードされるポリペプチド；または
（ｄ）配列番号１に実質的に同一である核酸分子によってコードされるポリペプチド
を含む、請求項１６の系。
【請求項１８】
Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが：
（ａ）配列番号２のポリペプチドをコードする単離核酸分子；
（ｂ）配列番号１の単離核酸分子；
（ｃ）約２００ｍＭ未満の塩濃度を有する洗浄溶液および約４５℃より高い洗浄温度によって代表される洗浄ストリンジェンシー条件下で、Ｔ２Ｒ７６核酸配列にハイブリダイズし、そしてＴ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする、単離核酸分子；ならびに
（ｄ）遺伝暗号の縮重のため、核酸配列が、上記の（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の１つの単離核酸分子と、少なくとも１つの機能的に同等なコドンによって異なり、そして上記の（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の１つの単離核酸によってコードされるＴ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする、単離核酸分子
からなる群より選択される核酸分子によってコードされるポリペプチドをさらに含む、請求項１７の系。
【請求項１９】
単離Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが配列番号２を含む、請求項１８の系。
【請求項２０】
別のＴ２Ｒをコードする核酸をさらに含む、請求項１８の系。
【請求項２１】
宿主細胞が哺乳動物細胞を含む、請求項１６の系。
【請求項２２】
哺乳動物細胞がヒト細胞を含む、請求項２１の系。
【請求項２３】
宿主細胞が、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドに共役可能なＧタンパク質アルファ・サブユニットをさらに含む、請求項１６の系。
【請求項２４】
Ｇタンパク質アルファ・サブユニットが、乱結合（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）Ｇタンパク質を含む、請求項２３の系。
【請求項２５】
乱結合Ｇタンパク質がＧα１５を含む、請求項２４の系。
【請求項２６】
Ｇタンパク質が、トランスデューシンまたはガストデューシン、あるいはキメラＧタンパク質を含む、請求項２３の系。
【請求項２７】
Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの調節剤を同定するための方法であって：
（ａ）Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが、単独で、または少なくとも１つの他のＴ２Ｒポリペプチドと組み合わせて発現される、組換え発現系を提供し；
（ｂ）（ａ）の系に試験物質を提供し；
（ｃ）試験物質の存在下で、Ｔ２Ｒ７６機能のレベルまたは性質をアッセイし；
（ｄ）Ｔ２Ｒ７６機能の対照レベルまたは性質と、試験物質の存在下でのＴ２Ｒ７６機能のレベルまたは性質を比較し；そして
（ｅ）Ｔ２Ｒ７６機能の対照レベルまたは性質に比較した際に有意に変化するような、試験物質の存在下でのＴ２Ｒ７６機能のレベルまたは性質を決定することによって、試験物質をＴ２Ｒ７６調節剤として同定する
工程を含む、前記方法。
【請求項２８】
Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが：
（ａ）配列番号２のポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に実質的に同一であるポリペプチド；
（ｃ）配列番号１の核酸分子によってコードされるポリペプチド；または
（ｄ）配列番号１に実質的に同一である核酸分子によってコードされるポリペプチド
を含む、請求項２７の方法。
【請求項２９】
Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが：
（ａ）配列番号２のポリペプチドをコードする単離核酸分子；
（ｂ）配列番号１の単離核酸分子；
（ｃ）約２００ｍＭ未満の塩濃度を有する洗浄溶液および約４５℃より高い洗浄温度によって代表される洗浄ストリンジェンシー条件下で、Ｔ２Ｒ７６核酸配列にハイブリダイズし、そしてＴ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする、単離核酸分子；ならびに
（ｄ）遺伝暗号の縮重のため、核酸配列が、上記の（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の１つの単離核酸分子と、少なくとも１つの機能的に同等なコドンによって異なり、そして上記の（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の１つの単離核酸によってコードされるＴ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする、単離核酸分子
からなる群より選択される核酸分子によってコードされるポリペプチドをさらに含む、請求項２８の方法。
【請求項３０】
単離Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが配列番号２を含む、請求項２９の方法。
【請求項３１】
宿主細胞が哺乳動物細胞を含む、請求項２７の方法。
【請求項３２】
哺乳動物細胞がヒト細胞を含む、請求項３１の方法。
【請求項３３】
宿主細胞が、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドに共役可能なＧタンパク質アルファ・サブユニットをさらに含む、請求項２７の方法。
【請求項３４】
Ｇタンパク質アルファ・サブユニットが、乱結合（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）Ｇタンパク質を含む、請求項３３の方法。
【請求項３５】
乱結合Ｇタンパク質がＧα１５を含む、請求項３４の方法。
【請求項３６】
乱結合Ｇタンパク質が、トランスデューシン、ガストデューシン、またはキメラＧタンパク質を含む、請求項３３の方法。
【請求項３７】
アッセイ工程が、ＧＴＰγＳ結合の量を決定する工程を含む、請求項２７の方法。
【請求項３８】
請求項２７の方法によって同定されるＴ２Ｒ７６調節剤。
【請求項３９】
タンパク質、ペプチド、抗体、核酸、および小分子からなる群より選択される調節剤をさらに含む、請求項３８のＴ２Ｒ７６調節剤。
【請求項４０】
被験体における苦味知覚を調節するための方法であって：
（ａ）請求項３８の調節剤を含む組成物を調製し；
（ｂ）被験体に有効用量の組成物を投与し、それによって被験体において、苦味知覚を改変する
工程を含む、前記方法。
【請求項４１】
食品、飲料、口腔洗浄液、歯磨剤、化粧品、または医薬品をさらに含む、請求項４０の方法。
【請求項４２】
調節剤を含む組成物、ならびに食品、飲料、口腔洗浄液、歯磨剤、化粧品、および医薬品からなる群より選択される組成物を同時投与する工程をさらに含む、請求項４０の方法。
【請求項４３】
被験体が哺乳動物である、請求項４０の方法。
【請求項４４】
哺乳動物がヒトである、請求項４３の方法。
【請求項４５】
Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの調節剤を同定するための方法であって：
（ａ）単独のＴ２Ｒポリペプチド、または少なくとも１つの他のＴ２Ｒポリペプチドと会合して発現されたＴ２Ｒ７６ポリペプチドを、１以上の試験物質に曝露して；
（ｂ）単離Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドまたはＴ２Ｒ７６ポリペプチドの組み合わせに対する試験物質の結合をアッセイして；そして
（ｃ）Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドに対する特異的結合を示す候補物質を選択する
工程を含む、前記方法。
【請求項４６】
Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが：
（ａ）配列番号２のポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に実質的に同一であるポリペプチド；
（ｃ）配列番号１の核酸分子によってコードされるポリペプチド；または
（ｄ）配列番号１に実質的に同一である核酸分子によってコードされるポリペプチド
を含む、請求項４５の方法。
【請求項４７】
Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが：
（ａ）配列番号２のポリペプチドをコードする単離核酸分子；
（ｂ）配列番号１の単離核酸分子；
（ｃ）約２００ｍＭ未満の塩濃度を有する洗浄溶液および約４５℃より高い洗浄温度によって代表される洗浄ストリンジェンシー条件下で、Ｔ２Ｒ７６核酸配列にハイブリダイズし、そしてＴ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする、単離核酸分子；ならびに
（ｄ）遺伝暗号の縮重のため、核酸配列が、上記の（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の１つの単離核酸分子と、少なくとも１つの機能的に同等なコドンによって異なり、そして上記の（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の１つの単離核酸によってコードされるＴ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする、単離核酸分子
からなる群より選択される核酸分子によってコードされるポリペプチドをさらに含む、請求項４６の方法。
【請求項４８】
単離Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが配列番号２を含む、請求項４７の方法。
【請求項４９】
請求項４８の方法によって同定されるＴ２Ｒ７６調節剤。
【請求項５０】
タンパク質、ペプチド、抗体、核酸、および小分子からなる群より選択される調節剤をさらに含む、請求項４９のＴ２Ｒ７６調節剤。
【請求項５１】
被験体における苦味知覚を調節するための方法であって：
（ａ）請求項４９の調節剤を含む組成物を調製し；
（ｂ）被験体に有効用量の組成物を投与し、それによって被験体において、苦味知覚を改変する
工程を含む、前記方法。
【請求項５２】
組成物が、食品、飲料、口腔洗浄液、歯磨剤、化粧品、または医薬品をさらに含む、請求項５１の方法。
【請求項５３】
調節剤を含む組成物、ならびに食品、飲料、口腔洗浄液、歯磨剤、化粧品、および医薬品からなる群より選択される組成物を同時投与する工程をさらに含む、請求項５１の方法。
【請求項５４】
Ｔ２Ｒ７６調節剤が、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸、および小分子からなる群より選択される、請求項５１の方法。
【請求項５５】
被験体が哺乳動物である、請求項５１の方法。
【請求項５６】
哺乳動物がヒトである、請求項５５の方法。
【請求項５７】
苦味化合物の苦味知覚を減少させるための方法であって、Ｔ２Ｒ７６阻害剤および該苦味化合物を被験体に同時投与する工程を含む、前記方法。
【請求項５８】
同時投与工程が、苦味化合物と混合されたＴ２Ｒ７６阻害剤を含む組成物を投与する工程を含む、請求項５７の方法。
【請求項５９】
Ｔ２Ｒ７６阻害剤が、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸、および小分子からなる群より選択される調節剤をさらに含む、請求項５７の方法。
【請求項６０】
苦味化合物が、食品、飲料、口腔洗浄液、歯磨剤、化粧品、または医薬品を含む、請求項５７の方法。
【請求項６１】
被験体が哺乳動物である、請求項５７の方法。
【請求項６２】
哺乳動物がヒトである、請求項６１の方法。
【請求項６３】
化合物の苦味知覚を増進するための方法であって、Ｔ２Ｒ７６アゴニストおよび該化合物を被験体に同時投与する工程を含む、前記方法。
【請求項６４】
同時投与工程が、化合物と混合されたＴ２Ｒ７６アゴニストを含む組成物を投与する工程を含む、請求項６３の方法。
【請求項６５】
Ｔ２Ｒ７６アゴニストが、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸、および小分子からなる群より選択される調節剤をさらに含む、請求項６３の方法。
【請求項６６】
被験体が哺乳動物である、請求項６３の方法。
【請求項６７】
哺乳動物がヒトである、請求項６６の方法。
【請求項６８】
Ｔ２Ｒ７６味受容体を調節する化合物を同定するためのアッセイであって：
（ｉ）ＰＲＯＰまたはブルシンに誘導される、請求項５、６または７の１つに記載の少なくとも１つのＴ２Ｒ７６ポリペプチドの活性化に対する効果に関して、化合物をアッセイして；
（ｉｉ）ＰＲＯＰまたはブルシンによるｈＴ２Ｒ７６ポリペプチドの活性化に対する効果に基づいて、前記化合物が前記受容体ポリペプチドを調節するかどうか決定する
工程を含む、前記アッセイ。
【請求項６９】
前記ｈＴ２Ｒ７６ポリペプチドが、配列番号２に含有されるポリペプチドに少なくとも９０％同一である、請求項６８のアッセイ。
【請求項７０】
前記Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが、配列番号２に含有されるポリペプチドに少なくとも９５％の配列同一性を所持する、請求項６９のアッセイ。
【請求項７１】
Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが、配列番号２に含有されるポリペプチドに少なくとも９６％の配列同一性を所持する、請求項６９のアッセイ。
【請求項７２】
Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが、配列番号２に含有されるポリペプチドに少なくとも９７％の配列同一性を所持する、請求項６９のアッセイ。
【請求項７３】
Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが、配列番号２に含有されるポリペプチドに少なくとも９８％の配列同一性を含む、請求項６９のアッセイ。
【請求項７４】
Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが、配列番号２に含有されるポリペプチドに少なくとも９９％の配列同一性を所持する、請求項６９のアッセイ。
【請求項７５】
Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが、配列番号２に含有される配列を有する、請求項６９のアッセイ。
【請求項７６】
前記Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが、別のポリペプチドに融合されている、請求項７５のアッセイ。
【請求項７７】
前記ポリペプチドが、ロドプシン・ポリペプチドである、請求項７６のアッセイ。
【請求項７８】
前記ロドプシンが、ヒト、げっ歯類またはウシ・ロドプシンである、請求項７７のアッセイ。
【請求項７９】
融合ポリペプチドが検出可能ポリペプチドである、請求項７６のアッセイ。
【請求項８０】
前記ポリペプチドが緑色蛍光ポリペプチドである、請求項７９のアッセイ。
【請求項８１】
Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが単離細胞膜上で発現される、請求項６９のアッセイ。
【請求項８２】
Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）細胞によって発現される、請求項６９のアッセイ。
【請求項８３】
前記細胞が真核細胞である、請求項８２のアッセイ。
【請求項８４】
前記細胞が、哺乳類、両生類、昆虫または酵母細胞である、請求項８３のアッセイ。
【請求項８５】
前記細胞が、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＣＨＯおよびゼノパス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）細胞からなる群より選択される、請求項８４のアッセイ。
【請求項８６】
蛍光定量アッセイである、請求項６９のアッセイ。
【請求項８７】
結合アッセイである、請求項６９のアッセイ。
【請求項８８】
細胞内イオン濃度に対する前記化合物の効果を検出する、請求項６９のアッセイ。
【請求項８９】
前記イオンがナトリウムまたはカルシウムである、請求項８８のアッセイ。
【請求項９０】
細胞膜電位に対する前記化合物の効果を検出する、請求項６９のアッセイ。
【請求項９１】
前記Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの転写に対する前記化合物の効果を検出する、請求項６９のアッセイ。
【請求項９２】
ＰＲＯＰまたはブルシンと前記Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの相互作用を遮断する化合物を選択する、請求項６９のアッセイ。
【請求項９３】
ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰまたはＩＰ３に対する前記化合物の効果を検出する、請求項６９のアッセイ。
【請求項９４】
カルシウムまたはナトリウム特異的蛍光色素を用いて、カルシウムの変化を検出する、請求項６９のアッセイ。
【請求項９５】
前記色素が、Ｆｌｕｏ−３、Ｆｌｕｏ−４およびＦｕｒａ−２である、請求項９４のアッセイ。
【請求項９６】
前記Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが溶液中に含有される、請求項６９のアッセイ。
【請求項９７】
前記Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが固相支持体に付着している、請求項９のアッセイ。
【請求項９８】
ハイスループット・スクリーニングアッセイである、請求項６９のアッセイ。
【請求項９９】
構造的に多様な化合物のライブラリーをスクリーニングする、請求項９８のアッセイ。
【請求項１００】
構造的に関連する化合物のライブラリーをスクリーニングする、請求項９８のアッセイ。
【請求項１０１】
前記受容体がＨＥＫ−２９３細胞によって発現される、請求項６９のアッセイ。
【請求項１０２】
前記細胞が、前記Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドと機能的に共役するＧタンパク質を発現する、請求項６９のアッセイ。
【請求項１０３】
前記Ｇタンパク質が、トランスデューシン、ガストデューシン、Ｇアルファ１５、Ｇアルファ１６、またはそのキメラである、請求項１０２のアッセイ。
【請求項１０４】
前記Ｇタンパク質がｇｕｓｔ４４Ｇアルファ１６である、請求項１０３のアッセイ。
【請求項１０５】
分光特性、流体力学特性または溶解度に対する前記化合物の効果を検出する、請求項６９のアッセイ。
【請求項１０６】
蛍光偏光アッセイである、請求項６９のアッセイ。
【請求項１０７】
前記Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドとＧタンパク質の複合体化に対する前記化合物の効果を検出する、請求項６９のアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国出願第１０／６２８，４６４号、２００３年７月２９日出願に優先権を請求し、そしてその一部継続出願であり、前記出願は振り返って、米国出願第６０／３９８，７２７号、２００２年７月２９日に優先権を請求する。これらの出願はどちらも、その全体が本明細書に援用される。
発明の分野
［０００１］本発明は、一般的に、Ｔ２Ｒファミリー中の新規ヒト苦味受容体を構成するＴ２Ｒ７６ポリペプチド、および該ポリペプチドによって仲介される苦味知覚に関する。より詳細には、本発明は、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする単離核酸、苦味受容体として機能する、単離され、そして機能するＴ２Ｒ７６ポリペプチド、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの組換え発現のための異種発現系、Ｔ２Ｒ７６が仲介する味知覚の調節剤、特に苦い味がするか、または苦味を遮断する化合物を同定するための方法、ならびにこれらの使用を提供する。さらにより詳細には、本発明は、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが、ブルシンおよびプロピルチオウラシル（ＰＲＯＰ）を含む苦味リガンドに特異的に応答するという発見を伴う。
関連技術の説明
【０００２】
［０００２］ヒトが認識しうる基本的な味の様式の１つは苦味である。苦味化合物は細胞表面受容体と相互作用することによって、苦味を生じると考えられている。受容体の活性化は、最終的に神経伝達物質を放出する細胞内シグナル伝達カスケードを開始する。次いで、脳神経神経節からの求心神経線維は、シグナルを皮質味覚中枢に中継し、ここで味知覚として情報がプロセシングされる。これらの受容体は、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）とも呼ばれる、細胞内Ｇタンパク質と相互作用する７回膜貫通ドメイン受容体のファミリーに属する。Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４１３（６８５２）：２１９−２５を参照されたい。
【０００３】
［０００３］Ｔ２Ｒと称される、ＧＰＣＲの新規ファミリーが、ヒトおよびげっ歯類で同定されている（Ａｄｌｅｒら、２０００；Ｃｈａｎｄｒａｓｈｅｋａｒら、２０００；Ｍａｔｓｕｎａｍｉ、２０００；ＰＣＴ国際公報第ＷＯ  ０１／１８０５０号および第ＷＯ  ０１／７７６７６号）。いくつかの系列の証拠によって、Ｔ２Ｒが、苦味化合物の知覚を仲介しうることが示唆された。第一に、Ｔ２Ｒ遺伝子は、舌および口蓋上皮の味受容体細胞サブセットで、特異的に発現されている。第二に、Ｔ２Ｒは、マウスおよびヒトにおいて、苦味知覚と関連する遺伝子座に遺伝的に関連付けられている（Ｃｏｎｎｅａｌｌｙら、１９７６；Ｃａｐｅｌｅｓｓら、１９９２；Ｒｅｅｄら、１９９９；Ａｄｌｅｒら、２０００）。第三に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究によって、味細胞において特異的に発現され、そして苦味刺激伝達に関連付けられるＧタンパク質、ガストデューシンを、Ｔ２Ｒが活性化可能であり、そしてＴ２Ｒによるガストデューシン活性化は、苦味化合物の適用に応答して、選択的に起こることが示されている（Ｃｈａｎｄｒａｓｈｅｋａｒら、２０００）。これらのデータに基づいて、ｍＴ２ＲおよびｈＴ２Ｒ受容体ファミリーは、それぞれ、マウスおよびヒトにおいて、苦味応答を仲介すると提唱される。
【０００４】
［０００４］苦味はしばしば、食品、飲料、口腔洗浄液、歯磨剤、化粧品、および医薬品において、望ましくない。苦味は、糖などの甘い化合物の添加によって隠されることも可能である；が、甘味料の添加は、食品フレーバーを望ましくなく改変する可能性もあり、そしてカロリー摂取を増加させうる。医薬品の場合、経口摂取に際して、苦味を減少させるため、複雑でそしてコストがかかる配合法（例えばコーティングおよびカプセル）が開発されてきた。味受容体の阻害を介して苦味を直接遮断するための方法は、記載されてきていない。
【０００５】
［０００５］最近、特定の苦味リガンドの受容体として、いくつかのヒトＴ２Ｒが同定されてきた（Ｃｈａｎｄｒａｓｈｅｋａｒら（同上）２０００；Ｂｕｆｅら（同上）２００２；Ｋｉｍら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９，  ２００３；Ｐｒｏｎｉｎら，  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｅｎｓｅｓ  ２９，  ２００４；Ｂｅｈｒｅｎｓら，  ＢＢＲＣ  ３１９，  ２００４；Ｋｕｈｎら，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２４，  ２００４；Ｂｕｆｅら  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５，  ２００５）。各ｈＴ２Ｒが多数のリガンドに結合可能であることもまた示唆されてきている。この仮説は、ヒトが何百もの構造的に多様な化合物を苦いと認識しうるという事実に基づく。ｈＴ２Ｒの配列が、Ｚｕｋｅｒら、ＷＯ  ０１／１８０５０  Ａ２（２００１）およびＡｄｌｅｒら、ＷＯ  ０１／７７６７６  Ａ２（２００１）による公開ＰＣＴ出願に開示されており、これらはどちらも、上記に同定するｈＴ２Ｒ７６に関連するこれより早い特許出願とともに、本明細書にその全体が援用される。
【０００６】
［０００６］Ｔ２Ｒ機能を研究する際の１つの難点は、これらの受容体が、培養哺乳動物細胞株で容易には発現されないことである。Ｔ２Ｒ発現を改善するため、ロドプシンなどの、よく発現されるＧＰＣＲ由来のＮ末端配列を特定のＴ２Ｒ配列に付着させてもよい（Ｃｈａｎｄｒａｓｈｅｋａｒら（同上）２０００を参照されたい）。このＮ末端タグはまた、入手可能な抗体があるため、タンパク質発現を容易に監視することも可能にする。ロドプシン・タグを取り込むと、哺乳動物細胞株において、いくつかのＴ２Ｒの発現が改善されたが、そのうちいくつかはなお、機能研究に十分なほど多くは発現されない。異なるアプローチにおいて、Ｓｆ９昆虫細胞において、ｍＴ２Ｒ５が成功裡に発現され、そして生化学的ＧＴＰ結合アッセイを用いた機能研究に用いられた（Ｃｈａｎｄｒａｓｈｅｋａｒら（同上）２０００）。
【０００７】
［０００７］本明細書にその全体が援用される、本譲受人、Ｓｅｎｏｍｙｘ  Ｉｎｃ．による先の特許出願、米国出願第１０／１９１，０５８号において、本出願者らは、３つの異なるヒトＴ２Ｒに特異的に結合する苦味リガンドを発見した。さらに、本出願者らは、最近、７つの他のヒトＴ２Ｒに特異的に結合する苦味リガンドを開示する、仮特許出願６０／０００００を出願した。
【０００８】
［０００８］したがって、当該技術分野には、苦味知覚の阻害剤開発のためのターゲットとして、苦味受容体を同定し、そして機能的に性質決定する必要が存在する。この必要性を満たすため、本発明は、新規Ｔ２Ｒ７６核酸およびポリペプチドを提供する。本発明はまた、味知覚、特に、ブルシン、ＰＲＯＰおよび他の化合物、例えばＴ２Ｒ７６が仲介する味を調節する、構造的に関連する化合物などの苦味リガンドによって仲介される苦味知覚を改変する、Ｔ２Ｒ７６の調節剤を同定し、そして用いるための方法も提供する。
発明の概要
【０００９】
［０００９］本発明は、単離Ｔ２Ｒ７６核酸および該核酸にコードされるＴ２Ｒ７６ポリペプチド、ならびにＴ２Ｒ７６ポリペプチドがＰＲＯＰ（プロピルチオウラシル）およびブルシンに特異的に応答するという関連する発見を提供する。ポリペプチドおよび核酸は、本明細書に開示する検出法およびアッセイ、好ましくは、例えばブルシン、ＰＲＯＰまたは他の苦味リガンドによって誘発される、Ｔ２Ｒ７６が仲介する苦味を遮断するかまたは阻害する化合物を同定するための、細胞に基づくハイスループット・アッセイにおいて有用である。
【００１０】
［００１０］本発明にしたがって、Ｔ２Ｒ７６核酸は：（ａ）配列番号２のポリペプチドをコードする単離核酸分子；（ｂ）配列番号１の単離核酸分子；または（ｃ）配列番号１に「実質的に類似である」（以下に定義する）単離核酸分子を含んでもよい。
【００１１】
［００１１］ＴＲ７６核酸はまた：（ａ）配列番号２のポリペプチドをコードする単離核酸分子；（ｂ）配列番号１の単離核酸分子；（ｃ）約２００ｍＭ未満の塩濃度を有する洗浄溶液および約４５℃より高い洗浄温度によって代表される洗浄ストリンジェンシー条件下で、配列番号１の核酸配列にハイブリダイズし、そしてＴ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする、単離核酸分子；あるいは（ｄ）遺伝暗号の縮重のため、核酸配列が、上記の（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の１つの単離核酸分子と、少なくとも１つの機能的に同等なコドンによって異なり、そして配列番号２に含有される天然Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドのリガンドおよび／または機能的特性を保持する、すなわち、ブルシンおよび／またはＰＲＯＰに特異的に応答するポリペプチドをコードする、上記の（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の１つの単離核酸によってコードされるＴ２Ｒポリペプチドをコードする、単離核酸分子も含んでもよい。好ましくは、単離Ｔ２Ｒ７６核酸は：（ａ）配列番号２のポリペプチドをコードする単離核酸分子；または（ｂ）配列番号１の単離核酸分子を含む。
【００１２】
［００１２］単離Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドは：（ａ）配列番号２のポリペプチド；（ｂ）配列番号２に「実質的に同一である」（以下に定義する）ポリペプチド；（ｃ）配列番号１の核酸分子によってコードされるポリペプチド；または（ｄ）配列番号１に実質的に同一である核酸分子によってコードされるポリペプチドを含んでもよい。
【００１３】
［００１３］Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドはまた：（ａ）配列番号２のポリペプチドをコードする単離核酸分子；（ｂ）配列番号１の単離核酸分子；（ｃ）高ストリンジェンシー条件下で、配列番号１の核酸にハイブリダイズし、そしてＴ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする、単離核酸分子；および（ｄ）遺伝暗号の縮重のため、核酸配列が、上記の（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の１つの単離核酸分子と、少なくとも１つの機能的に同等なコドンによって異なり、そして上記の（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の単離核酸によってコードされるＴ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする、単離核酸分子からなる群より選択される単離核酸分子によってコードされるポリペプチドも含んでもよい。好ましくは、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドは、配列番号２、または配列番号２との少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは配列番号２との少なくとも９５〜９９％の配列同一性を所持するポリペプチドを含む。
【００１４】
［００１４］本発明は、Ｔ２Ｒ７６核酸を検出するための方法であって：（ａ）核酸物質を有する生物学的試料を得て；（ｂ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、単離Ｔ２Ｒ７６核酸分子を、（ａ）の生物学的試料にハイブリダイズさせて、それによって、単離Ｔ２Ｒ７６核酸および生物学的試料内の核酸の間に二重鎖構造を形成し；そして（ｃ）（ｂ）の二重鎖構造を検出し、それによってＴ２Ｒ７６核酸分子を検出する工程を含む、前記方法をさらに提供する。
【００１５】
［００１５］本発明は、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを特異的に認識する抗体、および該抗体を産生するための方法をさらに提供する。方法の代表的な態様は：（ａ）Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを組換え的にまたは合成的に産生し；（ｂ）（ａ）のポリペプチドを配合して、それによって有効な免疫原とし；（ｃ）（ｂ）の配合物を動物に投与して、抗体の産生を含む、動物における免疫応答を生じ、ここで抗体は動物の血清中に存在し；そして（ｄ）Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを特異的に認識する抗体を含む、（ｃ）の動物由来の血清を収集する工程を含む。開示する方法は、モノクローナル抗体を調製する工程をさらに含んでもよい。
【００１６】
［００１６］やはり提供するのは、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドのレベルを検出するための方法である。代表的な態様において、該方法は：（ａ）ペプチド物質を有する生物学的試料を得て；（ｂ）本発明の抗体との免疫化学的反応によって、（ａ）の生物学的試料中のＴ２Ｒ７６ポリペプチドを検出し、それによって、試料中のＴ２Ｒ７６ポリペプチドの量を決定する工程を含む。
【００１７】
［００１７］やはり提供するのは、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの組換え発現のための系である。組換え発現系は：（ａ）本発明のＴ２Ｒ７６ポリペプチド（例えば、配列番号２として示す代表的な態様）；および（ｂ）Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを発現する異種宿主細胞を含んでもよい。好ましくは、宿主細胞は、ＨＥＫ−２９３、ＨＥＫ−２９３Ｔ、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫまたはＭＤＣＫ細胞などの哺乳動物宿主細胞を含むであろう。最も好ましくは、宿主細胞は、Ｔ２Ｒ７６と機能的に共役するＧタンパク質、例えば、Ｇアルファ１５またはＧアルファ１６、ガストデューシン、トランスデューシン、あるいはそのキメラなどの乱結合（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）Ｇタンパク質を発現する、ＨＥＫ−２９３細胞である。さらに、組換え発現系は、Ｔ２Ｒ７６とは異なるＴ２Ｒポリペプチドをコードする核酸配列を含んでもよい。特に、組換え発現系は、すべてその全体が本明細書に援用される、Ｚｕｋｅｒらに対して２００３年５月６に発行された米国特許第６，５５８，９１０号、Ａｄｌｅｒ、Ｊｏｈｎ  Ｅｌｌｉｏｔによって、２００２年７月１８日に公開された米国公開出願２００２００９４５５１、およびＺｕｋｅｒらによって、２００３年１月３０日に公開された米国公開出願２００３００２２２７８に開示されるＴ２Ｒ核酸配列のいずれかを含んでもよい。Ｔ２Ｒポリペプチドの別の名称が、本明細書に援用されるＺｕｋｅｒ出願に開示されるように、ＳＦまたはＧＲポリペプチドであることに注目すべきである。本ｈＴ２Ｒ７６を１以上の他のＴ２Ｒポリペプチドと一緒に発現させて、機能するヘテロマー味受容体を産生してもよい。他のＴ２Ｒポリペプチドは、別のヒトＴ２Ｒ、あるいは別の種、例えばラットまたはマウスのＴ２Ｒであってもよい。宿主細胞は、任意の適切な細胞を含んでもよい。好ましい宿主細胞は、哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞を含む。上述のように、好ましくは、宿主細胞は、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドに共役可能なＧタンパク質アルファ・サブユニット、例えばＧα１５、ガストデューシンまたはトランスデューシンなどの乱結合Ｇタンパク質をさらに含む。
【００１８】
［００１８］Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの組換え発現用の開示する系を用いて、本発明は、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの調節剤を同定するための方法をさらに提供する。本発明の好ましい態様において、該方法は：（ａ）Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが、異種宿主細胞において発現される、組換え発現系を提供し；（ｂ）（ａ）の系に試験物質を提供し；（ｃ）試験物質、および場合によって、Ｔ２Ｒ７６を特異的に活性化することが知られるリガンド、例えばＰＲＯＰまたはブルシンの存在下で、Ｔ２Ｒ７６機能のレベルまたは性質をアッセイし；（ｄ）Ｔ２Ｒ７６機能の対照レベルまたは性質と、試験物質および場合によるさらなる既知のＴ２Ｒ７６リガンドの存在下でのＴ２Ｒ７６機能のレベルまたは性質を比較し；そして（ｅ）Ｔ２Ｒ７６機能の対照レベルまたは性質に比較した際に有意に変化するような、試験物質、および場合による別の既知のＴ２Ｒ７６特異的リガンドの存在下でのＴ２Ｒ７６機能のレベルまたは性質を決定することによって、試験物質をＴ２Ｒ７６調節剤として同定する工程を含む。アッセイ工程は、試験物質の非存在下での結合に比較して、この試験物質の存在下でのＧＴＰγＳ結合の量を決定する工程を含んでもよい。好ましくは、Ｔ２Ｒ７６調節剤は、試験化合物、およびＰＲＯＰまたはブルシンなどの、場合による既知のＴ２Ｒ７６リガンドの存在下または非存在下で、細胞内カルシウムの変化を監視する、細胞に基づくアッセイにおいて、同定される。
【００１９】
［００１９］本発明の別の態様において、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの調節剤を同定するための方法であって：（ａ）Ｔ２Ｒポリペプチドを発現させ、そして前記ポリペプチドまたはポリペプチドの組み合わせを、単独で、または１以上の他のＴ２Ｒポリペプチドと組み合わせて、１以上の試験物質に、そして場合によって、さらに、ＰＲＯＰまたはブルシンなどの既知のＴ２Ｒ７６リガンドに曝露して；（ｂ）単離Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドまたはＴ２Ｒ７６を含有するポリペプチドの組み合わせに対する試験物質の結合、あるいは既知のＴ２Ｒリガンドの結合に対する効果をアッセイして；そして（ｃ）Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドに対する特異的結合を示すか、あるいは、既知のＴ２Ｒ７６リガンド、例えばＰＲＯＰまたはブルシンの特異的結合を調節する、好ましくは阻害する、候補物質を選択する工程を含む。
【００２０】
［００２０］やはり提供するのは、開示する方法によって同定される、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドのアゴニストおよび阻害剤を含む調節剤である。調節剤は、Ｔ２Ｒ７６を調節する、例えばＴ２Ｒ７６ポリペプチドでの苦味リガンド、例えばブルシンまたはＰＲＯＰ、あるいはＴ２Ｒ７６ポリペプチドに特異的に結合する、構造的に関連する化合物の、特異的活性化および／または結合を阻害するかまたは遮断する、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸、小分子、またはその組み合わせを含んでもよい。好ましくは、こうしたＴ２Ｒ７６調節剤は、Ｔ２Ｒ７６が仲介する苦味知覚を調節する、ヒト味試験において確認される。
【００２１】
［００２１］本発明は、本明細書記載のアッセイ系を用いて同定されるＴ２Ｒ７６調節剤を用いて、被験体における苦味知覚を調節するための方法をさらに提供する。好ましくは、被験体は、哺乳動物被験体、そしてより好ましくはヒト被験体である。やはり好ましくは、被験体において改変されている苦味知覚は、Ｔ２Ｒ７６が仲介する機能、および潜在的に他のＴ２Ｒによって仲介される苦味を含む。
【００２２】
［００２２］本発明の１つの態様において、被験体における苦味知覚を調節するための方法は：（ａ）開示する方法にしたがって同定されるＴ２Ｒ７６調節剤を含む組成物を調製し；そして（ｂ）好ましくは摂取によって、有効用量の本発明記載のＴ２Ｒ７６調節剤を含有する食品、飲料または医薬品を被験体に投与し、それによって被験体において、苦味知覚を改変する工程を含む。
【００２３】
［００２３］例えば、本発明は、Ｔ２Ｒ７６阻害剤および苦味化合物を被験体に同時投与することを介して、苦味化合物の苦味知覚を減少させるための方法を提供する。本発明はまた、Ｔ２Ｒ７６アゴニストおよび化合物を同時投与することを介して、化合物の苦味知覚を増進するための方法も提供する。同時投与工程は、味を調節しようとする化合物と混合してＴ２Ｒ７６阻害剤を含む組成物を投与する工程を含んでもよい。本発明の好ましい態様において、組成物は、食品、飲料、口腔洗浄液、歯磨剤、化粧品、または医薬品を含んでもよい。
【００２４】
［００２４］本発明はまた、Ｔ２Ｒ７６アゴニスト、および味を調節しようとする化合物を同時投与することを介して、化合物の苦味知覚を増進するための方法も提供する。Ｔ２Ｒ７６アゴニストおよび化合物を、単一組成物として混合してもよい。
【００２５】
［００２５］したがって、新規Ｔ２Ｒ７６核酸およびポリペプチド、Ｔ２Ｒ７６核酸を検出するための方法、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが発現される異種発現系、異種Ｔ２Ｒ７６発現系を使用する方法およびアッセイ、ならびにＴ２Ｒ７６ポリペプチドまたはＴ２Ｒ７６調節化合物を調節し、そして検出するための方法を提供することが、本発明の目的である。この目的は、本発明によって、完全にまたは部分的に達成される。
【００２６】
［００２６］本発明の目的を上述したが、本発明の以下の説明および限定しない実施例を検討すると、本発明の他の目的および利点が、当業者には明らかとなるであろう。
配列表中の配列の簡単な説明
【００２７】
［００２９］配列番号１および配列番号２は、それぞれ、本発明記載のヒトＴ２Ｒ７６ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を含有する。
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
【００２８】
［００３０］以下の用語は、一般の当業者によってよく理解されていると考えられるが、本発明の説明を容易にするため、以下の定義を示す。
【００２９】
［００３１］用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、長年の慣習にしたがって、１以上を指すよう用いられる。
【００３０】
［００３２］用語「約」は、本明細書において、配列同一性パーセント（例えば、本明細書において以下に記載するように、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を比較する際）、ヌクレオチドまたはタンパク質の長さ、結合量などの測定可能な値を指す場合、明記する量から±２０％または±１０％、より好ましくは±５％、さらにより好ましくは±１％、そしてさらにより好ましくは±０．１％の変動を含むよう意味され、これは、こうした変動が、開示する方法を行うか、または別の方式で本発明を実行するのに適切であるためである。
ＩＩ．Ｔ２Ｒ７６核酸およびポリペプチド
【００３１】
［００３３］本発明は、新規Ｔ２Ｒ７６核酸、および機能するＴ２Ｒ７６ポリペプチドを含む、新規Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを提供する。本発明の代表的なＴ２Ｒ７６核酸を配列番号１として示し、該配列は、配列番号２として示すＴ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする。
【００３２】
［００３４］用語「Ｔ２Ｒ７６」および「Ｔ２Ｒ７６」を含む用語（例えばｈＴ２Ｒ７６）は、一般的に、単離Ｔ２Ｒ７６核酸、Ｔ２Ｒ７６核酸によってコードされる単離ポリペプチド、およびそれらの活性を指す。Ｔ２Ｒ７６核酸およびポリペプチドは、いかなる生物に由来してもよい。用語「Ｔ２Ｒ７６」および「Ｔ２Ｒ７６」を含む用語はまた、ＰＲＯＰ、ブルシン等の苦味化合物によって活性化される受容体を含むポリペプチド、および該ポリペプチドをコードする核酸も指す。Ｔ２Ｒ７６受容体は、他のＴ２Ｒポリペプチドを含んでもよく、すなわち、ヘテロマーまたはホモマー受容体であってもよい。
【００３３】
［００３５］用語「単離」は、核酸またはポリペプチドに関連して用いた際、核酸またはポリペプチドが、天然環境から離れて存在し、そして天然の産物ではないことを示す。単離核酸またはポリペプチドは、精製型で存在してもよいし、あるいはトランスジェニック宿主細胞などの、非天然環境で存在してもよい。
【００３４】
［００３６］本明細書において、以下にさらに開示するように、本発明はまた、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの機能する発現のための系も提供する。系は、別のＴ２Ｒ核酸と会合して発現可能な、配列番号１を含む組換えＴ２Ｒ７６核酸、および適切なＧタンパク質を使用する。
ＩＩ．Ａ．  Ｔ２Ｒ７６核酸
【００３５】
［００３７］用語「核酸分子」および「核酸」は、各々、一本鎖、二本鎖、または三重鎖型のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーを指す。特に限定しない限り、該用語は、参照天然核酸と類似の特性を有する天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を含む。用語「核酸分子」または「核酸」はまた、「遺伝子」、「ｃＤＮＡ」、「ｍＲＮＡ」、または「ｃＲＮＡ」の代わりにも使用可能である。核酸を合成してもよいし、または任意の生物を含む、任意の生物学的供給源から得てもよい。全長Ｔ２Ｒ７６  ｃＤＮＡをクローニングするための代表的な方法を、実施例１に記載する。
【００３６】
［００３８］用語「Ｔ２Ｒ」または「ＳＦ」は、味細胞特異的Ｇタンパク質共役型受容体のファミリーメンバーをコードする核酸を指す。これらの核酸およびこれらがコードするポリペプチドは、Ｇタンパク質視覚味受容体の「Ｔ２Ｒ」、「ＳＦ」、「ＧＲ」、またはＴＡＳ２Ｒファミリーとして、文献に別の呼び方で称される。ＧＰＣＲのこのファミリーには、味伝達経路の構成要素が含まれる。この味受容体ファミリーの他のヒトおよびげっ歯類メンバーが、苦味の検出に関与し、そして異なる苦味リガンドに特異的に応答することが知られている。味受容体のＴ２ＲまたはＳＦファミリーのメンバーが、米国特許６，５５８，９１０；Ｚｕｋｅｒらによって、２００３年１月２０日に公開された公開米国特許出願２００３００２２２７８；およびＡｄｌｅｒ、Ｊｏｈｎ  Ｅｌｌｉｏｔによって、２００２年７月１８日に公開された公開米国特許出願２００２００９４５０２に開示される。こうしたＴ２Ｒの例には、Ｇｒｏ１（ＳＦ０１）；ＧＲ０２（ＳＦ０２）；ＧＲ０２（ＳＦ０３）；ＧＲ０４（ＳＦ０４）；ＧＲＯ５（ＳＦ０５）；ＧＲ０６（ＳＦ０６）；ＧＲ０７（ＳＦ０７）；ＧＲ０８（ＳＦ０８）；ＧＲ０９（ＳＦ０９）；ＧＲ１０（ＳＦ１０）；ＧＲ１１（ＳＦ１１）；ＧＲ１２（ＳＦ１２）；ＧＲ１３（ＳＦ１３）；ＧＲ１４（ＳＦ１４）；ＧＲ１５（ＳＦ１５）；ＧＲ１６（ＳＦ１６）；ＧＲ１７（ＳＦ１７）；ＧＲ１８（ＳＦ１８）；ＧＲ１９（ＳＦ１９）；ＧＲ２０（ＳＦ２０）；ＧＲ２１（ＳＦ２１）；ＧＲ２２（ＳＦ２３）；ＧＲ２４（ＳＦ２４）；
Ｔ２Ｒ５１；Ｔ２Ｒ５５；Ｔ２Ｒ３３；Ｔ２Ｒ５９；Ｔ２Ｒ６１；Ｔ２Ｒ６３；Ｔ２Ｒ６４；Ｔ２Ｒ６５；Ｔ２Ｒ７５；
ＧＲ２５（ＳＦ２５）；ＧＲ２６（ＳＦ２６）；ＧＲ２７（ＳＦ２７）；ＧＲ２８（ＳＦ２８）；ＧＲ２９（ＳＦ２９）；ＧＲ３０（ＳＦ３０）；ＧＲ３１（ＳＦ３１）；ＧＲ３２（ＳＦ３２）；ＧＲ（ＳＦ）；ＧＲ３３（ＳＦ３３）；ＧＲ３４（ＳＦ２４）；ＧＲ３５（ＳＦ３５）；ＧＲ３６（ＳＦ３６）；ＧＲ３７（ＳＦ３７）；ＧＲ３８（ＳＦ３８）；ＧＲ３９（ＳＦ３９）；ＧＲ４０（ＳＦ４０）；ＧＲ４１（ＳＦ４１）；ＧＲ４２（ＳＦ４２）；ＧＲ４３（ＳＦ４３）；ＧＲ４４（ＳＦ４４）；ＧＲ４５（ＳＦ４５）；ＧＲ４６（ＳＦ４６）；ＧＲ４７（ＳＦ４７）；ＧＲ４８（ＳＦ４８）；ＧＲ４９（ＳＦ４９）；ＧＲ５０（ＳＦ５０）が含まれる。
【００３７】
［００３９］別の呼び方で称されるような、これらのＴ２Ｒ、ＳＦ、ＴＡＳ２Ｒなど、またはＧＲは、ヒト、マウスおよびラットを含む、異なる種類のものであってもよく、そして好ましくはヒトである。やはり含まれるのは、「実質的に同一である」か、または特定の配列同一性を所持するか、または以下に定義するように、これらの配列のいずれかに特異的にハイブリダイズする、Ｔ２Ｒである。
【００３８】
［００４０］用語「Ｔ２Ｒ７６」および「Ｔ２Ｒ７６」を含む用語（例えばｈＴ２Ｒ７６）は、本明細書において、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする核酸を指す。したがって、用語「Ｔ２Ｒ７６」は：（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列；または（ｂ）配列番号１に実質的に同一であるヌクレオチド配列を含む、本発明の単離核酸を指す。
【００３９】
［００４１］本明細書において、ヌクレオチド配列間の類似性の度合いを記載する、用語「実質的に同一である」は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いてまたは視覚的検査によって測定した際に、最大に対応するように比較し、そして並列させた場合、少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは約９０％〜約９９％、さらにより好ましくは約９５％、９６％、９７％、９８％または約９９％、そして最も好ましくは約９９％のヌクレオチド同一性を有する２以上の配列を指す。好ましくは、少なくとも約１００残基のヌクレオチド配列に、より好ましくは少なくとも約１５０残基のヌクレオチド配列に、そして最も好ましくは全長コード配列を含むヌクレオチド配列に、実質的な同一性が存在する。
【００４０】
［００４２］用語「全長」は、本明細書において、以下にさらに記載するように、機能するＴ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする完全オープンリーディングフレームを指す。２つのポリペプチド間の同一性パーセントを決定するための方法を、本明細書において、以下の見出し「ヌクレオチドおよびアミノ酸配列比較」下に定義する。
【００４１】
［００４３］１つの側面において、実質的に同一である配列は、多型配列であってもよい。用語「多型」は、集団における２以上の遺伝的に決定された代替配列の存在を指す。アレル相違は、１塩基対程度に小さくてもよい。
【００４２】
［００４４］別の側面において、実質的に同一である配列は、サイレント突然変異を含む配列を含めて、突然変異誘発された配列を含んでもよい。突然変異は、好ましくはＴ２Ｒ７６リガンド、例えばＰＲＯＰまたはブルシンの結合に影響を及ぼさない、１以上の残基変化、残基の欠失、またはさらなる残基の挿入を含んでもよい。
【００４３】
［００４５］２つのヌクレオチド配列が実質的に同一であることの別の指標は、２つの分子が、ストリンジェントな条件下で、互いに、特異的にハイブリダイズするか、または実質的にハイブリダイズすることである。核酸ハイブリダイゼーションに関連して、比較中の２つの核酸配列を、「プローブ」および「ターゲット」と称してもよい。「プローブ」は参照核酸分子であり、そして「ターゲット」は試験核酸分子であり、しばしば核酸分子の異種集団内に見られる。「ターゲット配列」は、「試験配列」と同義である。
【００４４】
［００４６］ハイブリダイゼーション研究またはアッセイに使用するのに好ましいヌクレオチド配列には、本発明の核酸分子の少なくとも約１４〜４０ヌクレオチド配列に相補的であるかまたはこうした配列を模倣する、プローブ配列が含まれる。好ましくは、プローブは、任意の配列番号１の１４〜２０ヌクレオチド、あるいは望ましい場合はさらにより長いヌクレオチド、例えば３０、４０、５０、６０、１００、２００、３００、または５００ヌクレオチド、あるいは全長までを含む。こうした断片は、例えば、断片の化学合成によって、核酸増幅技術の適用によって、または選択した配列を組換え体産生のために組換えベクター内に導入することによって、容易に調製可能である。
【００４５】
［００４７］句「特異的にハイブリダイズする」は、配列が複雑な核酸混合物（例えば総細胞ＤＮＡまたはＲＮＡ）中に存在する場合、ストリンジェントな条件下で、特定のヌクレオチド配列のみに対して、分子が結合するか、二重鎖形成するか、またはハイブリダイズすることを指す。
【００４６】
［００４８］句「実質的にハイブリダイズする」は、プローブ核酸分子およびターゲット核酸分子間の相補的ハイブリダイゼーションを指し、そして所望のハイブリダイゼーションを達成するために、ハイブリダイゼーション媒体のストリンジェンシーを減少させることによって対応可能な重大でないミスマッチを含む。
【００４７】
［００４９］サザンおよびノーザンブロット分析などの核酸ハイブリダイゼーション実験に関連した、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列および環境の両方に依存する。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸ハイブリダイゼーションに関する広範囲に及ぶ指針が、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，  パートＩ第２章，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  ニューヨーク州ニューヨークに見出される。一般的に、非常にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、定義されるイオン強度およびｐＨでの特異的配列に関する熱融点（Ｔｍ）より約５０℃低いように選択される。典型的には、「ストリンジェントな条件」下で、プローブは、ターゲット下位配列に特異的にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしないであろう。
【００４８】
［００５０］Ｔｍは、（定義されるイオン強度およびｐＨ下で）ターゲット配列の５０％が、完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする温度である。特定のプローブに関して、Ｔｍに等しいように、非常にストリンジェントな条件を選択する。約１００より多い相補残基を有する相補核酸のサザンまたはノーザンブロット分析のためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、１ｍｇのヘパリンを含む５０％ホルムアミド中、４２℃での一晩のハイブリダイゼーションである。非常にストリンジェントな洗浄条件の例は、０．１ｘＳＳＣ中、６５℃で１５分間である。ストリンジェントな洗浄条件の例は、０．２ｘＳＳＣ緩衝液中、６５℃で１５分間である。ＳＳＣ緩衝液の説明に関しては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら監修（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバーを参照されたい。しばしば、高ストリンジェンシー洗浄の前に、低ストリンジェンシー洗浄を行って、バックグラウンド・プローブ・シグナルを取り除く。約１００より長いヌクレオチドの二重鎖に対する中程度のストリンジェンシーの洗浄条件の例は、１ｘＳＳＣ中、４５℃で１５分間である。約１００より長いヌクレオチドの二重鎖に対する低ストリンジェンシー洗浄条件の例は、４ｘ〜６ｘＳＳＣ中、４０℃で１５分間である。短いプローブ（例えば約１０〜５０ヌクレオチド）に関しては、ストリンジェントな条件は、典型的には、ｐＨ７．０〜８．３で、約１Ｍ未満のＮａ＋イオン、典型的には、約０．０１〜１ＭのＮａ＋イオン濃度（または他の塩）の塩濃度を伴い、そして温度は、典型的には、少なくとも約３０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの脱安定化剤の添加でも達成可能である。一般的に、特定のハイブリダイゼーション・アッセイにおいて、シグナル対ノイズ比が、関連しないプローブに関して観察されるより２倍（以上）であれば、特異的ハイブリダイゼーションが検出された指標になる。
【００４９】
［００５１］以下は、本発明の参照ヌクレオチド配列に実質的に同一であるヌクレオチド配列を同定するのに使用可能なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件の例である：プローブ・ヌクレオチド配列は、好ましくは、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中、５０℃でターゲット・ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、その後、２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃での洗浄が続き；より好ましくは、プローブおよびターゲット配列は、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中、５０℃でハイブリダイズし、その後、１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃での洗浄が続き；より好ましくは、プローブおよびターゲット配列は、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中、５０℃でハイブリダイズし、その後、０．５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃での洗浄が続き；より好ましくは、プローブおよびターゲット配列は、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中、５０℃でハイブリダイズし、その後、０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃での洗浄が続き；より好ましくは、プローブおよびターゲット配列は、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中、５０℃でハイブリダイズし、その後、０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃での洗浄が続く。
【００５０】
［００５２］２つの核酸配列が実質的に同一であることのさらなる指標は、核酸にコードされるタンパク質が実質的に同一であるか、全体の三次元構造を共有するか、または生物学的に機能的同等物であることである。これらの用語を、本明細書において、以下の見出し「Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド」下にさらに定義する。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸分子は、対応するタンパク質が実質的に同一である場合、なお実質的に同一である。これは、例えば、２つのヌクレオチド配列が、遺伝暗号によって許されるような、保存的に置換された変異体を含む場合に起こりうる。
【００５１】
［００５３］用語「保存的に置換された変異体」は、１以上の選択した（またはすべての）コドンの第三位が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている、縮重コドン置換を有する核酸配列を指す。Ｂａｔｚｅｒら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａら（１９８５）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６０：２６０５−２６０８；およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉら（１９９４）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８を参照されたい。
【００５２】
［００５４］用語「Ｔ２Ｒ」はまた、Ｔ２Ｒ核酸に相補的な核酸、Ｔ２Ｒ  ＲＮＡ分子、およびＴ２Ｒ  ＲＮＡに相補的な核酸（ｃＲＮＡ）を含めて、Ｔ２Ｒ核酸、好ましくはＴ２Ｒ７６の下位配列および伸長配列を含む核酸も含む。
【００５３】
［００５５］用語「下位配列」は、より長い核酸配列の一部を含む核酸配列を指す。例示的な下位配列は、本明細書において上述するプローブ、またはプライマーである。用語「プライマー」は、本明細書において、選択した核酸分子の約８以上のデオキシリボヌクレオチオドまたはリボヌクレオチド、好ましくは１０〜２０ヌクレオチド、そしてより好ましくは２０〜３０ヌクレオチドを含む隣接配列を指す。本発明のプライマーは、本発明の核酸分子に対して重合の開始を提供するために、十分な長さおよび適切な配列のオリゴヌクレオチドを含む。
【００５４】
［００５６］用語「伸長配列」は、核酸内に取り込まれるヌクレオチド（または他の類似分子）の付加を指す。例えば、ポリメラーゼ（例えばＤＮＡポリメラーゼ）は、核酸分子の３’末端に配列を付加しうる。さらに、ヌクレオチド配列を、他のＤＮＡ配列、例えばプロモーター、プロモーター領域、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、イントロン・シグナル、さらなる制限酵素部位、マルチクローニングサイト、および他のコード・セグメントと組み合わせてもよい。
【００５５】
［００５７］用語「相補配列」は、本明細書において、塩基対間の水素結合形成に際して、互いに対形成可能な、逆平行ヌクレオチド配列を含む２つのヌクレオチド配列を示す。本明細書において、用語「相補配列」は、以下に示す同一ヌクレオチド比較法によって評価可能であるか、または本明細書に記載するものなどの比較的ストリンジェントな条件下で、問題の核酸セグメントにハイブリダイズ可能であると定義されるように、実質的に相補的であるヌクレオチド配列を意味する。相補核酸セグメントの特定の例は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００５６】
［００５８］本発明はまた、開示するＴ２Ｒ７６核酸および組換えＴ２Ｒ７６核酸を含むキメラ遺伝子も提供する。したがって、場合によって他のＴ２Ｒ核酸と組み合わせて発現される、Ｔ２Ｒ７６核酸を含む構築物およびベクターもまた含まれる。
【００５７】
［００５９］用語「遺伝子」は、広く、生物学的機能と関連するＤＮＡのいかなるセグメントも指す。遺伝子は、限定されるわけではないが、コード配列、プロモーター領域、シス制御配列、制御タンパク質の特定の認識配列である非発現ＤＮＡセグメント、遺伝子発現に寄与する非発現ＤＮＡセグメント、所望のパラメータを有するように設計されたＤＮＡセグメント、またはそれらの組み合わせを含む配列を含む。生物学的試料からのクローニング、既知のまたは予測される配列情報に基づく合成、および存在する配列の組換え体誘導を含む、多様な方法によって遺伝子を得てもよい。
【００５８】
［００６０］用語「キメラ遺伝子」は、本明細書において、Ｔ２Ｒ配列、例えばＴ２Ｒ  ｃＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＴ２Ｒ核酸、三次構造（例えばヘアピン構造）を有するＲＮＡ分子をコードするＴ２Ｒ核酸、または二本鎖ＲＮＡ分子をコードするＴ２Ｒ核酸に、機能可能であるように連結されたプロモーター領域を指す。用語「キメラ遺伝子」はまた、異種配列に、機能可能であるように連結されたＴ２Ｒプロモーター領域も指す。本発明のキメラ遺伝子の調製は、実施例２に記載される。好ましくは、Ｔ２ＲはＴ２Ｒ７６である。
【００５９】
［００６１］用語「機能可能であるように連結された」は、本明細書において、プロモーター領域によって、ヌクレオチド配列の転写が調節され、そして制御されるような、プロモーター領域およびヌクレオチド配列間の機能的な組み合わせを指す。機能可能であるようにプロモーター領域をヌクレオチド配列に連結するための技術が当該技術分野に知られる。
【００６０】
［００６２］用語「組換え体」は、一般的に、非天然環境において複製可能な単離核酸を指す。したがって、組換え核酸は、宿主細胞における複製を可能にするさらなる核酸配列、例えばベクター核酸と組み合わされた、複製不能核酸を含んでもよい。
【００６１】
［００６３］用語「ベクター」は、本明細書において、宿主細胞における複製を可能にするヌクレオチド配列を有する核酸分子を指す。ベクターにはまた、ベクター内のヌクレオチド配列の連結を可能にするヌクレオチド配列も含まれてもよく、こうしたヌクレオチド配列もまた、宿主細胞において複製される。代表的なベクターには、プラスミド、コスミド、およびウイルスベクターが含まれる。ベクターはまた、本明細書において、以下にさらに記載するように、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの組換え体産生も仲介可能である。
【００６２】
［００６４］用語「構築物」は、本明細書において、ヌクレオチド配列が組換え的に発現されるように、ベクターとともに、機能可能であるように挿入されるヌクレオチド配列をさらに含むベクターを指す。
【００６３】
［００６５］用語「組換え的に発現された」または「組換え的に産生された」は、交換可能に用いられ、一般的に、組換え核酸にコードされるポリペプチドが産生されるプロセスを指す。
【００６４】
［００６６］したがって、好ましくは組換えＴ２Ｒ、核酸、すなわちＴ２Ｒ７６核酸は、異種核酸を含む。用語「異種核酸」は、意図する宿主細胞に対しては異質である（ｆｏｒｅｉｇｎ）供給源から生じるか、または同じ供給源由来であるならば、元来の形から修飾されている、配列を指す。宿主細胞における異種核酸は、特定の宿主細胞に対して内因性であるが、例えば突然変異誘発によって、または天然シス制御配列からの単離によって、修飾されている、核酸を含んでもよい。異種核酸にはまた、天然ヌクレオチド配列の非天然存在多数コピーも含まれる。異種核酸はまた、こうした核酸が通常は見られない位置で、宿主細胞の核酸内に取り込まれている核酸もまた含んでもよい。
【００６５】
［００６７］本発明の核酸は、クローニングされるか、合成されるか、改変されるか、突然変異誘発されるか、またはそれらの組み合わせであってもよい。核酸を単離するのに用いられる標準的組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術が、当該技術分野に知られる。塩基対変化、欠失、または小さい挿入を生成する部位特異的突然変異誘発もまた、当該技術分野に知られる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（監修）（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー；Ｓｉｌｈａｖｙら（１９８４）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー；ＧｌｏｖｅｒおよびＨａｍｅｓ（１９９５）ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．  第２版  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  オックスフォード／ニューヨーク；Ａｕｓｕｂｅｌ（監修）（１９９５）Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  第３版  Ｗｉｌｅｙ，  ニューヨークを参照されたい。
ＩＩＩ．Ｂ．  Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド
［００６８］本発明は、新規Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを提供し、この代表的な態様を配列番号２として示す。好ましくは、本発明の単離Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドは、組換え的に発現されるＴ２Ｒ７６ポリペプチドを含む。やはり好ましくは、単離Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドは、機能するＴ２Ｒ７６ポリペプチドを含む。これらのＴ２Ｒ７６ポリペプチドは、１以上の他のＴ２Ｒポリペプチドと組み合わせて発現されてもよい。
【００６６】
［００６９］したがって、本発明の方法で有用な新規Ｔ２Ｒポリペプチドは：（ａ）配列番号２のポリペプチド；（ｂ）配列番号２に実質的に同一であるポリペプチド；（ｃ）配列番号１の核酸分子によってコードされるポリペプチド；または（ｄ）配列番号１に実質的に同一である核酸分子によってコードされるポリペプチドを含む。Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドはまた：（ａ）配列番号２のポリペプチドをコードする単離核酸分子；（ｂ）配列番号１の単離核酸分子；（ｃ）約２００ｍＭ未満の塩濃度を有する洗浄溶液および約４５℃より高い洗浄温度によって代表される洗浄ストリンジェンシー条件下で、Ｔ２Ｒ７６核酸配列にハイブリダイズし、そしてＴ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする、単離核酸分子；ならびに（ｄ）遺伝暗号の縮重のため、核酸配列が、上記の（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の１つの単離核酸分子と、少なくとも１つの機能的に同等なコドンによって異なり、そして上記の（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の１つの単離核酸によってコードされるＴ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする、単離核酸分子も含んでもよい。
【００６７】
［００７０］本明細書において、Ｔ２Ｒおよびそれに実質的に同一であるタンパク質の間の類似性のレベルを記載する、用語「実質的に同一である」は、Ｔ２Ｒに少なくとも７５％同一であるタンパク質を指す。例えば、Ｔ２Ｒ７６およびこのＴ２Ｒ７６タンパク質に実質的に同一であるタンパク質の場合、これは、Ｔ２Ｒ７６タンパク質の全長に渡って比較した際、配列番号２に、少なくとも約７５％同一である配列を指す。好ましくは、Ｔ２Ｒ７６タンパク質に実質的に同一であるタンパク質は、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの全長に渡って比較した際、配列番号２に少なくとも約７５％〜約８５％同一、より好ましくは配列番号２に少なくとも約８５％〜約９５％同一、さらにより好ましくは配列番号２に少なくとも約９０％〜約９５％同一、さらにより好ましくは配列番号２に少なくとも約９５％〜約９９％同一、すなわち８６、９７、９８または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００６８】
［００７１］用語「全長」は、本明細書において、以下にさらに記載するように、機能するＴ２Ｒ７６ポリペプチドを指す。２つのポリペプチド間の同一性パーセントを決定するための方法もまた、本明細書において、以下の見出し「ヌクレオチドおよびアミノ酸配列比較」下に、定義される。
【００６９】
［００７２］用語「実質的に同一である」はまた、ポリペプチドを説明するために用いた場合、保存される三次元構造を共有する２以上のポリペプチドも含む。コンピュータ法を用いて、構造的表示を比較してもよいし、そして構造モデルを生成し、そして容易に調整して、重要な活性部位またはリガンド結合部位周囲の類似性を同定してもよい。Ｓａｑｉら（１９９９）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １５：５２１−５２２；Ｂａｒｔｏｎ（１９９８）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ５４：１１３９−１１４６；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら（２０００）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２１：１７００−１７０６；およびＨｕａｎｇら（２０００）Ｐａｃ  Ｓｙｍｐ  Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔ：２３０−２４１を参照されたい。
【００７０】
［００７３］実質的に同一であるタンパク質にはまた、配列番号２のアミノ酸に機能的に同等であるアミノ酸を含むタンパク質も含まれる。アミノ酸に関連して、用語「機能的に同等である」は、当該技術分野に知られ、そしてアミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性に基づく。ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（２０００）Ａｄｖ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ  ５４：７３−９７を参照されたい。考慮に適切な要因には、側鎖疎水性、親水性、電荷、およびサイズが含まれる。例えば、アルギニン、リジン、およびヒスチジンは、すべて陽性荷電残基であり；アラニン、グリシン、およびセリンは、すべて類似のサイズであり；そしてフェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、すべて、一般的に類似の形状を有する。本明細書において以下にさらに記載するこの分析によって、アルギニン、リジン、およびヒスチジン；アラニン、グリシン、およびセリン；ならびにフェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、本明細書において、生物学的に機能的同等物として定義される。
【００７１】
［００７４］生物学的に機能的に同等なアミノ酸置換を行う際、アミノ酸のヒドロパシー指数を考慮することも可能である。各アミノ酸には、疎水性および荷電特性に基づいて、ヒドロパシー指数が割り当てられてきており、これらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（４．５）である。
【００７２】
［００７５］相互作用的な生物学的機能をタンパク質に与える際に、ヒドロパシーアミノ酸指数が重要であることが、当該技術分野において、一般的に理解されている（Ｋｙｔｅら、１９８２）。類似のヒドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸を、特定のアミノ酸で置換して、そしてなお類似の生物学的活性を保持しうることが知られる。ヒドロパシー指数に基づいて変化を作製する際、ヒドロパシー指数が元来の値の±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、元来の値の±１以内であるものが特に好ましく、そして元来の値の±０．５以内であるものがさらにより特に好ましい。
【００７３】
［００７６］親水性に基づいて、同様のアミノ酸の置換を有効に行うことが可能であることもまた、当該技術分野において、理解されている。米国特許第４，５５４，１０１号は、隣接するアミノ酸の親水性によって規定されるような、タンパク質の最大局所平均親水性が、その免疫原性および抗原性、例えばタンパク質の生物学的特性と相関することを記載する。類似の親水性値を有する別のものに対してアミノ酸を置換して、そしてなお生物学的に同等のタンパク質を得ることも可能であることが理解される。
【００７４】
［００７７］米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されるように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。
【００７５】
［００７８］類似の親水性値に基づいて交換を行う際、親水性値が元来の値の±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、元来の値の±１以内であるものが特に好ましく、そして元来の値の±０．５以内であるものがさらにより特に好ましい。
【００７６】
［００７９］用語「実質的に同一である」はまた、Ｔ２Ｒポリペプチド、例えばＴ２Ｒ７６ポリペプチドの生物学的に機能的同等物であるポリペプチドも含む。用語「機能的」には、例えば細胞内シグナル伝達経路を活性化し（例えばガストデューシンと共役させ）、そして味知覚を仲介する、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの活性が含まれる。好ましくは、こうした活性化は、ｉｎ  ｖｉｖｏの同族（ｃｏｇｎａｔｅ）Ｔ２Ｒポリペプチド、例えばＴ２Ｒ７６ポリペプチドのものと実質的に類似の度合いおよび動力学を示す。Ｔ２Ｒ７６活性を評価するための代表的な方法を、本明細書において、以下に記載する。
【００７７】
［００８０］本発明はまた、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの機能性断片も提供する。こうした機能性部分は、天然Ｔ２Ｒ７６遺伝子産物のアミノ酸配列のすべてまたは実質的にすべてを含む必要はない。
【００７８】
［００８１］本発明にはまた、天然Ｔ２Ｒポリペプチド、例えばＴ２Ｒ７６ポリペプチドのものより長い配列である、機能するポリペプチド配列も含まれる。例えば、１以上のアミノ酸を、Ｔ２Ｒポリペプチド、例えばＴ２Ｒ７６ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加してもよい。限定されるわけではないが、精製適用を含む多様な適用において、こうしたさらなるアミノ酸を使用してもよい。伸長タンパク質を調製する方法が当該技術分野に知られる。
ＩＩ．Ｃ．ヌクレオチドおよびアミノ酸配列比較
［００８２］用語「同一」または「同一性パーセント」は、２以上のヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関連して、本明細書に開示する配列比較アルゴリズムの１つを用いてまたは視覚的検査によって測定した際に、最大に対応するように比較し、そして並列させた場合、同じであるか、あるいは同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドの明記するパーセントを有する、２以上の配列または下位配列を指す。
【００７９】
［００８３］用語「実質的に同一である」は、特定の配列が、１以上の欠失、置換、または付加によって天然存在配列の配列と異なり、その正味の効果がＴ２Ｒ核酸またはポリペプチド、例えばＴ２Ｒ７６核酸またはＴ２Ｒ７６ポリペプチドの生物学的機能を保持することを意味する。
【００８０】
［００８４］２以上の配列を比較するため、典型的には１つの配列が、１以上の試験配列を比較する参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験および参照配列をコンピュータ・プログラムに入力し、必要な場合、下位配列コーディネートを指定し、そして配列アルゴリズム・プログラム・パラメータを選択する。次いで、選択したプログラム・パラメータに基づいて、配列比較アルゴリズムが、参照配列に比較して、指定した試験配列（単数または複数）に関する配列同一性パーセントを計算する。
【００８１】
［００８５］例えばＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ  Ａｐｐｌ  Ｍａｔｈ  ２：４８２−４８９の局所相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４８：４４３−４５３の相同性並列アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８の類似性に関する検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ウィスコンシン州マディソンのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または視覚的検査によって、比較のための配列最適並列を行ってもよい。一般的に、Ａｕｓｕｂｅｌ（監修）（１９９５）Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  第３版  Ｗｉｌｅｙ，  ニューヨークを参照されたい。
【００８２】
［００８６］配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するために好ましいアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３−４１０に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列中の同じ長さのワードと並列させた際、いくつかの正の値の閾値スコアＴにマッチするかまたはこうしたスコアを満たすかいずれかの、クエリー配列中の長さＷの短いワードを同定することによって、高スコアリング配列対（ＨＳＰ）を同定することを伴う。Ｔは、近傍ワード・スコア閾値と称される。これらの初期近傍ワード・ヒットは、これらを含有する、より長いＨＳＰを見出す検索を開始するための種として働く。次いで、累積並列スコアが増加可能である限り、各配列に沿って両方向に、ワード・ヒットを伸長する。ヌクレオチド配列に関しては、パラメータＭ（マッチ残基対の報酬スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基のペナルティ・スコア；常に＜０）を用いて、累積スコアを計算する。アミノ酸配列に関しては、スコアリング・マトリックスを用いて、累積スコアを計算する。累積並列スコアが、最大達成値から量Ｘ低下するか、１以上の負のスコアリング残基並列の集積のため、累積スコアがゼロ以下になるか、またはいずれかの配列の末端に到達した場合、各方向のワードヒットの伸長を停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズム・パラメータＷ、Ｔ，およびＸは、並列の感度およびスピードを決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、ワード長Ｗ＝１１、期待値Ｅ＝１０、１００のカットオフ、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較をデフォルトとして用いる。アミノ酸配列に関しては、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング・マトリックスをデフォルトとして用いる。ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１１９９２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８９：１０９１５−１０９１９を参照されたい。
【００８３】
［００８７］配列同一性パーセントを計算するのに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析も行う。例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｄ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９０：５８７３−５８７７を参照されたい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの測定値は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のマッチが偶然生じるであろう確率の指標を提供する。例えば、参照核酸配列に対する試験核酸配列の比較における最小合計確率が、約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、そして最も好ましくは約０．００１未満である場合、試験核酸配列は、参照配列に類似であると見なされる。
ＩＩＩ  Ｔ２Ｒ７６核酸を検出するための方法
［００８８］本発明の別の側面において、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする核酸分子を検出するための方法を提供する。こうした方法を用いて、Ｔ２Ｒ７６遺伝子変異体または改変された遺伝子発現を検出してもよい。例えば、味知覚におけるＴ２Ｒ７６に関連する相違の診断に、Ｔ２Ｒ７６配列または発現における変化の検出を用いてもよい。好ましくは、この方法のために用いる核酸は、配列番号１の配列を含む。
【００８４】
［００８９］特定のＤＮＡ配列の検出に通常適用される任意の方法を用いて、当該技術分野に周知の任意の方法によって、本発明の方法によって検出される配列を検出し、サブクローニングし、配列決定し、そしてさらに評価してもよい。したがって、本発明の核酸を用いて、開示する配列を含む遺伝子およびゲノムＤＮＡをクローニングしてもよい。あるいは、本発明の核酸を用いて、関連配列の遺伝子およびゲノムＤＮＡをクローニングしてもよい。本明細書に開示する核酸配列を用いて、こうした方法は、当業者に知られる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら監修（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバーを参照されたい。代表的な方法はまた、実施例１〜４にも開示される。
【００８５】
［００９０］本発明の１つの態様において、Ｔ２Ｒ７６核酸分子のレベルは、例えばＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いることによって、測定される。Ｃｈｉａｎｇ（１９９８）Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ  ８０６：２０９−２１８および該文献に引用される参考文献を参照されたい。
【００８６】
［００９１］本発明の別の態様において、本発明の核酸分子に基づく遺伝子アッセイを用いて、例えばアレル特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブ分析（Ｃｏｎｎｅｒら、１９８３）、オリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ）（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎら、１９９０）、一本鎖コンホメーション多型（ＳＳＣＰ）分析（Ｏｒｉｔａら、１９８９）、ＳＳＣＰ／ヘテロ二重鎖分析、酵素ミスマッチ切断、増幅エクソンの直接配列分析（Ｋｅｓｔｉｌａら、１９９８；Ｙｕａｎら、１９９９）、アレル特異的ハイブリダイゼーション（Ｓｔｏｎｅｋｉｎｇら、１９９１）、および特定の突然変異を含有する増幅ゲノムＤＮＡの制限分析によって、遺伝的変異体をスクリーニングしてもよい。また、一塩基多型の大規模性質決定に、自動化法を適用してもよい（Ｗａｎｇら、１９９８；Ｂｒｏｏｋｅｓ、１９９９）。好ましい検出法は、非電気泳動的であり、例えばＴＡＱＭＡＮ  ＴＭアレル識別アッセイ、ＰＣＲ−ＯＬＡ、分子ビーコン、南京錠プローブ、およびウェル蛍光が含まれる。Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら（１９９８）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ８：７６９−７７６および該文献に引用される参考文献を参照されたい。
ＩＶ．  Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの組換え発現のための系
［００９２］本発明は、本発明の組換えＴ２Ｒ７６ポリペプチドの発現のための系をさらに提供する。本ＴＲ２７６ポリペプチドは、ヒトまたは非ヒトＴ２Ｒであってもよい１以上の他のＴ２Ｒとともに発現されてもよい。Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの続く精製および／または性質決定に、こうした系を用いてもよい。例えば、本明細書において以下にさらに記載するＴ２Ｒ７６抗体を産生するための免疫原として、精製Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを用いてもよい。
【００８７】
［００９３］Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの組換え発現のための系はまた、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの調節剤の同定にも用いてもよい。あるいは、他の試験ポリペプチドの活性化をアッセイする際に、開示するＴ２Ｒ７６ポリペプチドを対照ポリペプチドとして用いてもよい。こうした試験ポリペプチドには、味知覚に関与する他のＴ２Ｒ、例えば、Ａｄｌｅｒら（２０００）Ｃｅｌｌ  １００：６９３−７０２、およびＭａｔｓｕｎａｍｉら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ６０１−６０３に開示されるポリペプチドのいずれか１つが含まれてもよい。
【００８８】
［００９４］用語「発現系」は、異種核酸および異種核酸によってコードされるポリペプチドを含む宿主細胞を指す。例えば、異種発現系は、組換えＴ２Ｒ７６核酸を含む構築物でトランスフェクションされた宿主細胞、Ｔ２Ｒ７６  ｃＲＮＡでトランスフェクションされた宿主細胞、または宿主細胞ゲノム内への異種核酸の導入によって産生された細胞株を含んでもよい。上述のように、これらの発現系には、他のＴ２Ｒ核酸が含まれてもよい。
【００８９】
［００９５］Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの組換え発現のための系は：（ａ）組換え的に発現されたＴ２Ｒ７６ポリペプチド；および（ｂ）組換え的に発現されたＴ２Ｒ７６ポリペプチドを含む宿主細胞を含んでもよい。例えば、Ｔ２Ｒ７６  ｃＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写して、そして次いで、宿主細胞内に導入してもよく、それによってＴ２Ｒ７６ポリペプチドを発現させる。ｈＴ２Ｒ７６および別のＴ２Ｒポリペプチドを含むヘテロマーＴ２Ｒ受容体を産生するため、系はさらに、１以上のさらなるＴ２Ｒポリペプチドを含んでもよい。
【００９０】
［００９６］Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの組換え発現のための系はまた：（ａ）ベクター、および異種プロモーターに機能可能であるように連結されたＴ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする核酸分子を含む構築物；ならびに（ｂ）（ａ）の構築物を含み、それによってＴ２Ｒ７６ポリペプチドを発現する宿主細胞も含んでもよい。系はさらに、１以上のさらなるＴ２Ｒポリペプチドをコードする構築物を含んでもよい。さらに、単一の構築物自体が、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドおよび１以上のさらなるＴ２Ｒポリペプチドをコードしてもよい。
【００９１】
［００９７］当業者に知られる多様な標準的技術を用いて、単離ポリペプチドおよび組換え的に産生されるポリペプチドを精製し、そして性質決定してもよい。例えば、ＳｃｈｒｏｄｅｒおよびＬｕｂｋｅ（１９６５）Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク；ＳｃｈｎｅｉｄｅｒおよびＥｂｅｒｌｅ（１９９３）Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，  １９９２：  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｗｅｎｔｙ−Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １３−１９，  １９９２，  Ｉｎｔｅｒｌａｋｅｎ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ．  Ｅｓｃｏｍ，  Ｌｅｉｄｅｎ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ（１９９３）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  第２版  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  ベルリン／ニューヨーク；Ａｕｓｕｂｅｌ（監修）（１９９５）Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  第３版  Ｗｉｌｅｙ，  ニューヨークを参照されたい。
【００９２】
［００９８］好ましくは、組換え的に発現されたＴ２Ｒ７６ポリペプチドは、機能する味受容体、より好ましくは苦味受容体を含む。したがって、組換え的に発現されたＴ２Ｒ７６ポリペプチドは、好ましくは、苦味化合物に応答した活性化を示す。やはり好ましくは、組換えＴ２Ｒ７６ポリペプチドは、天然Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドに類似の活性化応答を示す。Ｔ２Ｒ７６機能を決定するための代表的な方法を、本明細書において以下に記載する。
ＩＶ．Ａ．発現構築物
［００９９］Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド発現のための構築物には、ベクターおよびＴ２Ｒ７６ヌクレオチド配列が含まれ、ここでＴ２Ｒ７６ヌクレオチド配列は、プロモーター配列に、機能可能であるように連結されている。組換えＴ２Ｒ７６発現のための構築物はまた、転写終結シグナル、およびヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要な配列も含んでもよい。翻訳および終結シグナル配列の付加を含む発現構築物の調製が、当業者に知られる。
【００９３】
［００１００］恒常性プロモーターまたは誘導性プロモーターを用いて、Ｔ２Ｒポリペプチド、例えばＴ２Ｒ７６ポリペプチドの組換え産生を指示してもよい。本発明にしたがって使用可能な代表的なプロモーターには、サルウイルス４０初期プロモーター、レトロウイルス由来の末端反復配列プロモーター、アクチン・プロモーター、熱ショック・プロモーター、およびメタロチオネイン・タンパク質が含まれる。
【００９４】
［００１０１］Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを発現するのに使用可能な適切なベクターには、限定されるわけではないが、ワクシニアウイルスまたはアデノウイルスなどのウイルス、バキュロウイルスベクター、酵母ベクター、バクテリオファージベクター（例えばラムダ・ファージ）、プラスミドおよびコスミドＤＮＡベクター、トランスポゾン仲介形質転換ベクター、およびそれらの派生物が含まれる。
【００９５】
［００１０２］使用するベクターに適合するトランスフェクション法を用いて、宿主細胞内に構築物を導入する。標準的トランスフェクション法には、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥ−デキストラン・トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム仲介トランスフェクション、トランスポゾン仲介形質転換、レトロウイルスを用いた感染、粒子仲介遺伝子トランスファー、超高速遺伝子トランスファー、およびそれらの組み合わせが含まれる。
ＩＶ．Ｂ．宿主細胞
［００１０３］用語「宿主細胞」は、本明細書において、異種核酸分子を導入可能な細胞を指す。限定されるわけではないが、哺乳動物細胞（例えばＨＥＫ−２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ細胞）、両生類細胞（例えばゼノパス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞）、昆虫細胞（例えばＳｆ９細胞）、酵母細胞などの真核宿主、ならびに大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの原核宿主を含む、いかなる適切な宿主細胞を用いてもよい。好ましい宿主細胞は、実質的にＴ２Ｒ７６ポリペプチドを欠き、そして好ましくは、ヒトまたは他の哺乳動物細胞を含むであろう。
【００９６】
［００１０４］組換え配列の発現を調節するか、または所望の特定の様式で、遺伝子産物を修飾し、そしてプロセシングする、宿主細胞株を選択してもよい。例えば、異なる宿主細胞は、翻訳および翻訳後プロセシングおよび修飾（例えば、タンパク質のグリコシル化、リン酸化）のための特徴的な、そして特定の機構を有する。適切な細胞株または宿主系を選択して、発現する異質のタンパク質の所望の修飾およびプロセシングを確実にしてもよい。例えば、細菌系における発現を用いて、非グリコシル化コア・タンパク質産物を産生してもよく、そして酵母における発現はグリコシル化産物を産生するであろう。
【００９７】
［００１０５］本発明は、安定な細胞株におけるＴ２Ｒ７６ポリペプチドの組換え発現をさらに含む。宿主細胞内への異種構築物の形質転換後、安定な細胞株を生じるための方法が、当該技術分野に知られる。例えば、Ｊｏｙｎｅｒ（１９９３）Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｎｅｔｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  オックスフォード／ニューヨークを参照されたい。したがって、形質転換細胞、組織、または非ヒト生物は、形質転換プロセスの最終産物だけでなく、そのトランスジェニック子孫または繁殖型も含むことが理解される。
【００９８】
［００１０６］本発明は、本明細書に開示するような組換えＴ２Ｒ７６ポリペプチドを発現する細胞の凍結保存をさらに含む。したがって、一過性にトランスフェクションされた細胞、およびＴ２Ｒ７６を発現する安定な細胞株の細胞を凍結し、そして後で使用するために保存してもよい。凍結細胞は、離れた位置で使用するため、容易に輸送可能である。
【００９９】
［００１０７］凍結保存培地は、一般的に、基礎培地、凍結保存剤、およびタンパク質供給源からなる。凍結保存剤およびタンパク質は、凍結融解プロセスのストレスから細胞を防御する。血清含有培地に関しては、典型的な凍結保存培地は、１０％グリセロールを含有する完全培地；１０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を含有する完全培地、または１０％グリセロールまたは１０％ＤＭＳＯを含む５０％新鮮培地と５．０％細胞馴化培地として調製される。血清不含培地に関しては、典型的な凍結保存配合物には、７．５％ＤＭＳＯを含有する５０％新鮮血清不含培地と５０％細胞馴化血清不含培地；または７．５％ＤＭＳＯおよび１０％細胞培養等級ＤＭＳＯを含有する新鮮な血清不含培地が含まれる。好ましくは、１ｍｌあたり約１０！！６〜約１０！！７細胞を含む細胞懸濁物を、凍結保存培地と混合する。
【０１００】
［００１０８］凍結保存に適したバイアルまたは他の容器中で、細胞を凍結保存培地、例えばＮＵＮＣ＠  ＣＲＹＯＴＵＢＥＳＴＭ（カリフォルニア州サウスサンフランシスコのＡｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃより入手可能）と合わせる。また、ハイスループット・アッセイ用に設計されたマルチウェルプレート、例えば９６ウェルプレートのウェルに、細胞をアリコットし、そしてプレーティングした形式で凍結してもよい。
【０１０１】
［００１０９］細胞は、好ましくは、１分あたり約−１℃の率で、室温から保存温度に冷却される。水を満たし、覆いをした、約１リットル液体容量を有する貯蔵容器中に、細胞を含有するバイアルを入れ、そしてこうしたキューブを−７０℃機械的凍結装置中に入れることによって、冷却率を調節してもよい。あるいは、脂肪族アルコールなどの液体冷媒の体積中に、バイアルを浸し、ここで液体冷媒の体積は、凍結しようとしている細胞培養物の総体積の１５倍より多く、そして浸した培養バイアルを、約−７０℃より低い温度で、慣用的なフリーザー中に入れることによって、細胞冷却率を１分あたり約−１℃で調節することも可能である。細胞を凍結するための商業的デバイスもまた入手可能であり、例えばＰｌａｎｅｒ  Ｍｉｎｉ−Ｆｒｅｅｚｅｒ  Ｒ２０２／２０ＯＲ（英国のＰｌａｎｅｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｌｔｄ．）およびＢＦ−５  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｆｒｅｅｚｅｒ（米国コネチカット州ダンベリーのＵｎｉｏｎ  Ｃａｒｂｉｄｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）がある。好ましくは、約−７０℃〜約−８０℃以下で、そしてより好ましくは約−１３０℃以下で、凍結細胞を保存する。
【０１０２】
［００１１０］最適なありうる細胞生存を得るため、細胞の融解を出来る限り迅速に行わなければならない。バイアル、または凍結細胞を含有する他の貯蔵容器を保存から取り除いたら、直ちに３７℃水槽に入れ、そして完全に融解されるまで、穏やかに振盪すべきである。細胞が凍結保存剤に特に感受性であるならば、細胞を遠心分離して、さらなる増殖前に、凍結保存剤を取り除く。
【０１０３】
［００１１１］凍結細胞の調製および取り扱いのためのさらなる方法が、他の場所の中でも、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，  第２版  Ａ．Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  ニューヨーク、ならびに米国特許第６，１７６，０８９号；第６，１４０，１２３号；第５，６２９，１４５号；および第４，４５５，８４２号に見出されうる。
Ｖ．トランスジェニック動物
［００１１２］本発明はまた、Ｔ２Ｒ７６遺伝子発現の破壊、および場合によって別のＴ２Ｒ破壊因子を含む、トランスジェニック動物も提供する。改変された遺伝子発現には、Ｔ２Ｒ７６遺伝子の改変されたレベルまたは突然変異変異体の発現が含まれてもよい。本発明は、トランスジェニック動物を生成するための構築物を調製するのに使用可能なＴ２Ｒ７６をコードする核酸を提供する。やはり提供するのは、Ｔ２Ｒ７６遺伝子座をターゲットとする構築物の調製に有用なゲノム位置決定データである。
【０１０４】
［００１１３］本発明の１つの態様において、トランスジェニック動物は、マウスＴ２Ｒ７６遺伝子座をターゲットとする修飾を伴うマウスを含んでもよく、そしてすべての体細胞にＴ２Ｒ７６遺伝子の完全なまたは部分的な機能不活化を伴うマウス系統をさらに含んでもよい。
【０１０５】
［００１１４］別の態様において、体細胞におけるＴ２Ｒ７６遺伝子発現のレベルを減少させ、こうして「ノックダウン」表現型を達成するため、普遍的または組織特異的プロモーターによって駆動される、アンチセンスまたはリボザイムＴ２Ｒ７６構築物を用いて、本発明にしたがったトランスジェニック動物を調製する。本発明はまた、Ｔ２Ｒ７６の条件付きまたは誘導性不活化を伴うネズミ系統の生成も提供する。こうしたネズミ系統はまた、さらなる合成または天然存在突然変異、例えば任意の他のＴ２Ｒ遺伝子における突然変異も含んでもよい。
【０１０６】
［００１１５］本発明はまた、例えば過剰発現または優性ネガティブ表現型を生成するため、Ｔ２Ｒ７６遺伝子における特異的「ノックイン」修飾を伴うマウス系統も提供する。したがって、「ノックイン」修飾には、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする核酸の野生型および突然変異型両方の発現が含まれる。
【０１０７】
［００１１６］トランスジェニック動物の調製のための技術が、当該技術分野に知られる。本明細書に各々の全内容が援用される、米国特許第５，４８９，７４２号（トランスジェニック・ラット）；米国特許第４，７３６，８６６号、第５，５５０，３１６号、第５，６１４，３９６号、第５，６２５，１２５号および第５，６４８，０６１号（トランスジェニック・マウス）；米国特許第５，５７３，９３３号（トランスジェニック・ブタ）；第５，１６２，２１５号（トランスジェニック鳥類種）ならびに米国特許第５，７４１，９５７号（トランスジェニック・ウシ種）に、例示的な技術が記載される。
【０１０８】
［００１１７］例えば、本発明のトランスジェニック動物は、マウスＴ２Ｒ７６をターゲットとする修飾を伴うマウスを含んでもよい。ネズミ胚性幹細胞における部位特異的組換えの標準的技術を用いて、すべての体細胞におけるＴ２Ｒ７６遺伝子の完全なまたは部分的な機能不活化を伴うマウス系統を生成してもよい。Ｃａｐｅｃｃｈｉ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２８８−１２９２；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：８４７−８５０；ならびにＤｅｌｐｉｒｅら（１９９９）Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２２：１９２１９５を参照されたい。
ＶＩ．  Ｔ２Ｒ７６抗体
［００１１８］本発明の別の側面において、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドに特異的に結合する抗体を産生するための方法を提供する。該方法にしたがって、有効な免疫原として用い、そして動物において免疫応答を生じるように、動物を免疫するのに用いることが可能であるように、全長組換えＴ２Ｒ７６ポリペプチドを配合する。免疫応答は、動物の血清から収集可能な抗体の産生によって特徴付けられる。本発明はまた、配列番号２を含む、本明細書に開示する新規Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを使用する方法によって産生される抗体も提供する。
【０１０９】
［００１１９］用語「抗体」は、免疫グロブリン・タンパク質、またはその機能する部分を指し、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ハイブリッド抗体、一本鎖抗体、突然変異誘発された抗体、ヒト化抗体、および抗原結合部位を含む抗体断片（例えばＦａｂおよびＦｖ抗体断片）を含む。本発明の好ましい態様において、Ｔ２Ｒ７６抗体は、モノクローナル抗体を含む。したがって、本発明はまた、抗体および本明細書記載のモノクローナル抗体を産生する細胞株も含む。
【０１１０】
［００１２０］用語「特異的に結合する」は、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドに対する抗体の結合を記載するために用いられる場合、他のポリペプチドの異種混合物中のＴ２Ｒ７６ポリペプチドへの結合を指す。
【０１１１】
［００１２１］本明細書において、対照ポリペプチドまたは試料への抗体の結合を記載する、句「結合を実質的に欠く」または「実質的に結合しない」は、非特異的結合またはバックグラウンド結合を含むが、特異的結合を含まない、結合のレベルを指す。
【０１１２】
［００１２２］抗体を調製し、そして性質決定するための技術が当該技術分野に知られる。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、ならびに米国特許第４，１９６，２６５号；第４，９４６，７７８号；第５，０９１，５１３号；第５，１３２，４０５号；第５，２６０，２０３号；第５，６７７，４２７号；第５，８９２，０１９号；第５，９８５，２７９号；および第６，０５４５６１号を参照されたい。
【０１１３】
［００１２３］本明細書に開示するように調製したＴ２Ｒ７６抗体を、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの位置決定および活性に関連して当該技術分野に知られる方法において、例えばＴ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする核酸のクローニング、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの免疫精製、生物学的試料中のＴ２Ｒ７６ポリペプチドの画像化、および適切な生物学的試料中のＴ２Ｒ７６ポリペプチドのレベル測定のために、用いてもよい。こうした方法を実行するため、本発明の抗体は、限定されるわけではないが、放射性標識、蛍光標識、エピトープ標識、およびｉｎ  ｖｉｖｏで検出可能な標識を含む、検出可能標識をさらに含んでもよい。特定の検出技術に適した標識を選択するための方法、および検出可能標識を抗体にコンジュゲート化するかまたは別の方式で会合させるための方法が当業者に知られる。
ＶＩＩＩ．  Ｔ２Ｒ７６調節剤
［００１２４］本発明は、Ｔ２Ｒ７６活性の調節剤を同定するアッセイをさらに開示する。アッセイは、本明細書において上に開示するようなＴ２Ｒ７６ポリペプチドの発現のための系、またはこうしたＴ２Ｒポリペプチドが他のＴ２Ｒポリペプチドと一緒に発現されていてもよい、こうした系で産生された単離Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを使用してもよい。本発明はまた、開示する方法を用いて同定されたＴ２Ｒ７６活性の調節剤も提供する。
【０１１４】
［００１２５］用語「調節する」は、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの任意のまたはすべての化学的および生物学的活性または特性の増加、減少または他の改変を意味する。したがって、調節剤を同定するための方法は、Ｔ２Ｒ７６機能のレベルまたは性質をアッセイする工程を伴う。
【０１１５】
［００１２６］Ｔ２Ｒ７６機能の調節剤を同定するための方法は：（ａ）Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが宿主細胞において発現され、そしてＴ２Ｒ７６ポリペプチドがＴ２Ｒ７６ポリペプチドを含む、組換え発現系を提供し；（ｂ）（ａ）の系に試験物質を提供し；（ｃ）試験物質の存在下で、Ｔ２Ｒ７６機能のレベルまたは性質をアッセイし；（ｄ）Ｔ２Ｒ７６機能の対照レベルまたは性質と、試験物質の存在下でのＴ２Ｒ７６機能のレベルまたは性質を比較し；そして（ｅ）Ｔ２Ｒ７６機能の対照レベルまたは性質に比較した際に有意に変化するような、試験物質の存在下でのＴ２Ｒ７６機能のレベルまたは性質を決定することによって、試験物質をＴ２Ｒ７６調節剤として同定する工程を含んでもよい。いくつかの態様において、Ｔ２Ｒ７６リガンドによるＴ２Ｒ７６の結合または活性化に対する試験物質の効果を検出するため、Ｔ２Ｒ７６機能または結合は、試験物質および既知のＴ２Ｒ７６リガンド（以下の実施例に示すようなＰＲＯＰまたはブルシン）の存在下でアッセイされるであろう。いくつかの態様において、発現系はまた、少なくとも１つの他のＴ２Ｒと同時発現されるＴ２Ｒ７６も提供してもよい。
【０１１６】
［００１２７］Ｔ２Ｒ７６活性の対照レベルまたは性質は、単独の、あるいは既知のＴ２Ｒ７６活性化剤、例えばＰＲＯＰまたはブルシンの存在下での、野生型Ｔ２Ｒ活性のレベルまたは性質を指す。好ましくは、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの組換え発現のための系は、配列番号２を有するポリペプチド、または実質的に同じリガンド結合および／または機能特性を所持する、実質的に同一であるｔ２Ｒ７６ポリペプチドを発現するであろう。試験物質の調節能を評価する際、Ｔ２Ｒ７６活性の対照レベルまたは性質は、試験物質の非存在下での活性のレベルまたは性質を含む。
【０１１７】
［００１２８］用語「有意に変化した」は、本明細書において、Ｔ２Ｒポリペプチド、例えばＴ２Ｒ７６ポリペプチドの改変されたレベルまたは活性を指し、そして測定技術に特有の誤差範囲より大きい、測定可能な性質の定量化された変化、好ましくは対照測定値に比較して約２倍以上の増加または減少、より好ましくは約５倍以上の増加または減少、そして最も好ましくは約１０倍以上の増加または減少を指す。
【０１１８】
［００１２９］本発明の１つの態様において、Ｔ２Ｒ７６機能をアッセイする工程は、Ｔ２Ｒ７６遺伝子発現レベルを測定する工程を含む。
［００１３０］本発明の別の態様において、Ｔ２Ｒ７６機能をアッセイする工程は、組換え的に発現されたＴ２Ｒ７６ポリペプチドの結合活性をアッセイする工程を含む。例えば、Ｔ２Ｒ７６活性は、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドに対する調節剤の結合量または強度を含んでもよい。
【０１１９】
［００１３１］本発明のさらに別の態様において、Ｔ２Ｒ７６機能をアッセイする工程は、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの活性コンホメーションをアッセイする工程を含んでもよい。
【０１２０】
［００１３２］本発明の好ましい態様において、Ｔ２Ｒ７６機能をアッセイする工程は、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドに対するリガンドまたは調節剤の結合に応答する細胞内シグナル伝達事象の活性化をアッセイする工程を含む。例えば、本明細書において以下に、そして実施例３に、さらに記載するように、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドに対する［３５Ｓ］ＧＴＰγＳの結合量を測定することによって、リガンドが仲介する、Ｇタンパク質交換活性の刺激を評価してもよい。
【０１２１】
［００１３３］別の好ましい態様において、試験化合物の存在下および非存在下で、カルシウム感受性蛍光色素を用いた画像化法によって、細胞内カルシウム中の変化を検出する、細胞に基づくアッセイにおいて、Ｔ２Ｒ７６調節化合物を同定する（以下の実施例４を参照されたい）。
【０１２２】
［００１３４］開示する方法によって同定される調節剤は、アゴニストおよびアンタゴニストを含んでもよい。本明細書において、用語「アゴニスト」は、ＰＲＯＰまたはブルシンあるいは別の苦味リガンドなどの、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの生物学的活性を活性化するか、該活性に相乗作用を与えるか、または該活性を増強する物質を意味する。本明細書において、用語「アンタゴニスト」は、例えば、ブルシン、ＰＲＯＰまたは他のＴ２Ｒ７６結合性苦味リガンドなどの苦味リガンドによるＴ２Ｒ７６の結合または活性化を阻害することによって、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの生物学的活性を遮断するかまたは軽減する物質を指す。調節剤はまた、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドに特異的に結合するリガンドまたは物質も含んでもよい。Ｔ２Ｒ７６調節剤を決定するための活性および結合アッセイをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで行ってもよい。好ましくは、調節剤は、本明細書に記載するような、細胞に基づくアッセイを用いて検出されるであろう。
【０１２３】
［００１３５］本発明の１つの態様において、こうしたアッセイは、本明細書において、以下の見出し「適用」下にさらに記載するように、限定されるわけではないが、食品、飲料、口腔洗浄液、歯磨剤、化粧品、および医薬品を含む、経口使用のための組成物の味を改変する添加剤として開発可能な、Ｔ２Ｒ７６調節剤の同定に有用である。例えば、Ｔ２Ｒ７６の阻害剤または遮断剤を用いて、苦味を減少させてもよい。
【０１２４】
［００１３６］本発明の別の態様において、こうしたアッセイは、経口使用する可能性があるがそれが望ましくない化合物、例えば家庭用クレンザー、毒等の味を改変するための添加物として開発可能なＴ２Ｒ７６調節剤の同定に有用である。したがって、Ｔ２Ｒ７６のアゴニストを用いて、組成物に苦味を導入するか、または組成物の苦味を増加させて、それによって経口使用を阻止することも可能である。
【０１２５】
［００１３７］本発明のさらに別の態様において、その剤およびＴ２Ｒ７６の間の相互作用が望ましくない生物活性剤をプレスクリーニングする目的で、組換えＴ２Ｒ７６ポリペプチドを使用するアッセイを行ってもよい。例えば、被験体に投与することが意図される薬剤を、望ましくない苦味を生じうるＴ２Ｒ７６調節活性に関して、試験してもよい。
【０１２６】
［００１３８］本発明のさらに別の態様において、本明細書に開示するアッセイを用いて、突然変異体Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド、例えば苦味知覚の相違に関連する突然変異体ポリペプチドを性質決定してもよい。突然変異Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの組換え発現は、障害に関連するＴ２Ｒ７６ポリペプチドのさらなる分析を可能にするであろう。
【０１２７】
［００１３９］本発明にしたがって、本明細書記載の方法に頼る、迅速でそしてハイスループットであるスクリーニング法も提供する。このスクリーニング法は、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドと複数の試験物質を別個に接触させる工程を含む。こうしたスクリーニング法において、複数のターゲット物質は、約１，００００より多い試料を含み、好ましくは約１０００００より多い試料を含み、そしてさらにより好ましくは１，０００，０００より多い試料を含む。
【０１２８】
［００１４０］本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび細胞アッセイは、可溶性アッセイを含んでもよく、またはアッセイの１以上の構成要素を固定するための固相支持体をさらに含んでもよい。例えば、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド、またはＴ２Ｒ７６ポリペプチドを発現する細胞、および場合によって別のＴ２Ｒポリペプチドを、共有または非共有連結を介して、固体状態構成要素に、直接、結合させてもよい。さらに、場合によって、結合には、支持体へのＴ２Ｒ７６ポリペプチドの間接的な結合を仲介するか、あるいは細胞表面上の受容体の検出または発現を提供する、リンカー分子またはタグが含まれてもよい。
【０１２９】
［００１４１］代表的なリンカーには、既知の結合対（例えばビオチンおよびアビジン）、既知の抗原を認識する抗体、合成ポリマー（例えばポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ尿素、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリーレンスルフィド、ポリシロキサン、ポリイミド、およびポリアセテート）、ペプチド、エーテルが含まれる。リンカーは、場合によって、柔軟なリンカー、例えばポリ（エチレングリコール）リンカー（米国アラバマ州ハンツビルのＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，  Ｉｎｃ．より入手可能）を含んでもよい。場合によって、リンカーは、アミド、スルフィドリル、またはヘテロ官能性結合部位をさらに含んでもよい。
【０１３０】
［００１４２］支持体をリンカーと反応することによる支持体の誘導体化、あるいは熱または紫外架橋を使用する非化学的アプローチを含む、多様な現在の方法のいずれを用いて、リンカーを固体支持体に固定してもよい。代表的なプロトコルは、とりわけ、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  ８５：２１４９−２１５４（例えばペプチドの固相合成を記載する）；Ｇｅｙｓｅｎら（１１９８７）Ｊ  Ｉｍｍｕｎ  Ｍｅｔｈ  １０２：２５９−２７４（ピン上での固相構成要素の合成を記載する）；ＦｒａｎｋおよびＢｏｒｉｎｇ（１９８８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４４：６０３１６０４０（セルロース・ディスク上の多様なペプチド配列の合成を記載する）；Ｆｏｄｏｒら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：７６７−７７７；およびＫｏｚａｌら（１９９６）Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２（７）：７５３７５９（固体支持体に固定されたバイオポリマーのアレイを記載する）、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  ８５：２１４９−２１５４（例えばペプチドの固相合成を記載する）；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８７）Ｊ  Ｉｍｍｕｎ  Ｍｅｔｈ  １０２：２５９−２７４（ピン上での固相構成要素の合成を記載する）；ＦｒａｎｋおよびＤｏｒｉｎｇ（１９８８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４４：６０３１６０４０（セルロース・ディスク上の多様なペプチド配列の合成を記載する）；Ｆｏｄｏｒら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：７６７−７７７；ならびにＫｏｚａｌら（１９９６）Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２（７）：７５３７５９（固体支持体に固定されたバイオポリマーのアレイを含む）に見出されうる。
ＶＩＩ．Ａ．試験物質
［００１４３］本発明の方法を用いてアッセイされうる調節剤は、候補物質を含む。本明細書において、用語「候補物質」および「試験物質」は、交換可能に用いられ、そして各々、任意の合成、組換え、または天然産物または組成物を含む、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドと相互作用すると推測される物質を指す。本明細書に開示する方法を用いて、こうした相互作用に関して、ポリペプチドと相互作用すると推測される試験物質を評価してもよい。
【０１３１】
［００１４４］代表的な試験物質には、限定されるわけではないが、ペプチド、オリゴマー、核酸（例えばアプタマー）、小分子（例えば化合物）、それらの抗体または断片、核酸−タンパク質融合物、任意の他のアフィニティー剤、およびそれらの組み合わせが含まれる。試験物質は、炭水化物、ビタミンまたはその誘導体、ホルモン、神経伝達物質、ウイルスまたはその受容体結合ドメイン、オプス（ｏｐｓ）またはロドプシン、匂い物質、フェロモン、毒素、増殖因子、血小板活性化因子、神経活性ペプチド、または神経ホルモンをさらに含んでもよい。好ましくは、候補物質は、苦味知覚を誘発する。試験しようとする候補物質は、精製分子、均質な試料、あるいは分子または化合物の混合物であってもよい。
【０１３２】
［００１４５］用語「小分子」は、本明細書において、約１，０００ダルトン未満、より好ましくは約７５０ダルトン未満、さらにより好ましくは約６００ダルトン未満、そしてさらにより好ましくは約５００ダルトン未満の分子量を持つ化合物、例えば有機化合物を指す。小分子はまた、好ましくは、約−４〜約＋１４の範囲、より好ましくは約−２〜約＋７．５の範囲の計算対数オクタノール−水分配係数を有する。これらの小分子は、多様なまたは構造的に類似の化合物の化合物ライブラリー、例えばコンビナトリアルケミストリー合成ライブラリー中に含まれてもよい。好ましくは、これらの化合物は、例えば植物抽出物等に由来する、天然存在苦味化合物を含むであろう。
【０１３３】
［００１４６］試験物質をライブラリーとして得てもまたは調製してもよい。本明細書において、用語「ライブラリー」は分子のコレクションを意味する。ライブラリーは、数個、または約１０分子〜数十億分子以上で多様である多数の異なる分子を含有してもよい。分子は、天然存在分子、組換え分子、または合成分子を含んでもよい。ライブラリー中の複数の試験物質を同時にアッセイしてもよい。場合によって、異なるライブラリー由来の試験物質を、同時に評価するため、プールしてもよい。
【０１３４】
［００１４７］代表的なライブラリーには、限定されるわけではないが、ペプチド・ライブラリー（米国特許第６，１５６，５１１号、第６，１０７，０５９号、第５，９２２，５４５号、および第５，２２３，４０９号）、オリゴマー・ライブラリー（米国特許第５，６５０，４８９号および第５，８５８，６７０号）、アプタマー・ライブラリー（米国特許第６，１８０，３４８号および第５，７５６，２９１号）、小分子ライブラリー（米国特許第６，１６８，９１２号および第５，７３８，９９６号）、抗体または抗体断片のライブラリー（米国特許第６，１７４，７０８号、第６，０５７，０９８号、第５，９２２，２５４号、第５，８４０，４７９号、第５，７８０，２２５号、第５，７０２，８９２号、および第５，６６７９８８号）、核酸−タンパク質融合物のライブラリー（米国特許第６，２１４，５５３号）、およびＴ２Ｒ７６ポリペプチドに潜在的に結合しうる任意の他のアフィニティー剤のライブラリー（例えば、米国特許第５，９４８，６３５号、第５，７４７，３３４号および第５，４９８，５３８号）が含まれる。
【０１３５】
［００１４８］ライブラリーは、分子のランダム・コレクションを含んでもよい。あるいは、ライブラリーは、特定の配列、構造、またはコンホメーションに関するバイアスを有する分子のコレクションを含んでもよい。例えば、米国特許第５，２６４，５６３号および第５，８２４，４８３号を参照されたい。多様な種類の分子の多様な集団を含有するライブラリーを調製するための方法が当該技術分野に知られ、例えば本明細書において上に引用する米国特許に記載されるとおりである。多くのライブラリーもまた、商業的に入手可能である。
ＶＩＩ．Ｂ．結合アッセイ
［００１４９］本発明の別の態様において、Ｔ２Ｒ７６調節剤を同定するための方法は、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド、またはＴ２Ｒポリペプチドおよび１以上の他のＴ２Ｒポリペプチドを含むヘテロマー受容体に対する試験物質の特異的結合を決定する工程を含む。用語「結合」は、２つの分子間の親和性を指す。好ましくは、特異的結合はまた、別のタンパク質に対する１つのタンパク質または化合物の活性が阻害性（阻害剤またはアンタゴニストの場合）または増進性（活性化剤またはアゴニストの場合）であるような、相互作用の性質または状態も含む。
【０１３６】
［００１５０］句「特異的に（または選択的に）結合する」は、候補調節剤の結合能を指す場合、タンパク質および他の生物学的物質の異種集団におけるタンパク質の存在の決定要因となる結合反応を指す。結合親和性が約１ｘ１０４Ｍ−１〜約１ｘ１０６Ｍ−１以上である場合、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドへの調節剤の結合を特異的と見なしてもよい。句「特異的に結合する」はまた、飽和可能な結合も指す。Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドへの試験物質の飽和可能な結合を示すため、例えば、Ｍａｋら（１９８９）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６４：２１６１３−２１６１８に記載されるように、スキャッチャード分析を行ってもよい。
【０１３７】
［００１５１］本明細書において、対照ポリペプチドまたは試料に対する調節剤の結合を記載する、句「実質的に結合を欠く」または「実質的に結合しない」は、非特異的またはバックグラウンド結合を含むが、特異的結合を含まない結合レベルを指す。
【０１３８】
［００１５２］いくつかの技術を用いて、既知の競合的調節剤を使用することなく、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドおよび試験物質間の相互作用を検出してもよい。代表的な方法には、限定されるわけではないが、蛍光相関分光法、表面増強レーザー脱離／イオン化時間飛行分光法、およびＢｉａｃｏｒｅ技術が含まれ、各技術を以下に記載する。これらの方法は、自動化ハイスループット・スクリーニングに受け入れられる。
【０１３９】
［００１５３］蛍光相関分光法（ＦＣＳ）は、小さい試料体積内で、蛍光分子の平均分散率を測定する（Ｔａｌｌｇｒｅｎ、１９８０）。試料サイズは、１０！！３蛍光分子と同程度に小さくてもよく、そして試料体積は単一の細菌の細胞質と同程度に少なくてもよい。分散率は、分子質量の関数であり、そして質量が増加するにつれて減少する。したがって、結合に際する質量変化、そしてしたがって分子の分散率変化を測定することによって、ＦＣＳをポリペプチド−リガンド相互作用分析に適用してもよい。典型的な実験において、分析しようとするターゲット（例えばＴ２Ｒ７６ポリペプチド）を、Ｎ末端またはＣ末端に挿入された、ポリ−ヒスチジン配列などの配列タグとともに、組換えポリペプチドとして発現する。発現は、宿主細胞、例えば大腸菌、酵母、ゼノパス卵母細胞、または哺乳動物細胞において仲介される。クロマトグラフィー法を用いて、ポリペプチドを精製する。例えば、ポリ−ヒスチジン・タグを用いて、イミノ二酢酸アガロースにキレートされたＮｉ２＋などの金属キレートカラムに、発現されたポリペプチドを結合させてもよい。次いで、ポリペプチドを、カルボキシテトラメチルローダミンまたはＢＯＤＩＰＹＴｍ試薬（オレゴン州ユージーンのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから入手可能）などの蛍光タグで標識する。次いで、ポリペプチドを溶液中、潜在的なリガンドに曝露して、そしてＣａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，  Ｉｎｃ．（ニューヨーク州ソーンウッド）から入手可能な装置を用いて、ＦＣＳによって、その分散率を決定する。リガンド結合は、ポリペプチドの分散率の変化によって決定される。
【０１４０】
［００１５４］表面増強レーザー脱離／イオン化（ＳＥＬＤＩ）は、ＨｕｔｃｈｅｎｓおよびＹｉｐ（１９９３）Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  ７：５７６−５８０に開発された。時間飛行質量分析（ＴＯＦ）と組み合わされた場合、ＳＥＬＤＩは、チップ上に保持される分子を迅速に分析する技術を提供する。ターゲット・タンパク質またはその一部をチップ上に共有結合させ、そして質量分析によって、このタンパク質に結合する小分子を分析することによって、リガンド−タンパク質相互作用分析に適用してもよい（Ｗｏｒｒａｌｌら、１９９８）。典型的な実験において、ターゲット・ポリペプチド（例えばＴ２Ｒ７６ポリペプチド）を、組換え的に発現し、そして精製する。ポリ−ヒスチジン・タグを利用することによるか、あるいはイオン交換または疎水性相互作用などの他の相互作用によるか、いずれかで、ターゲット・ポリペプチドをＳＥＬＤＩチップに結合させる。例えば、連続方式で、リガンドをピペッティングすることが可能な送達系（オートサンプラー）を介して、こうして調製されたチップを潜在的なリガンドに曝露する。次いで、増加するストリンジェンシーの溶液、例えば増加するイオン強度を含有する緩衝溶液を含む一連の洗浄液中で、チップを洗浄する。各洗浄後、チップをＳＥＬＤＩ−ＴＯＦに提示することによって、結合した物質を分析する。溶出させるのに必要な洗浄液のストリンジェンシーによって、ターゲット・ポリペプチドに特異的に結合するリガンドを同定する。
【０１４１】
［００１５５］Ｂｉａｃｏｒｅは、表面層上に固定されたターゲット・ポリペプチド（例えばＴ２Ｒ７６ポリペプチド）に対するリガンドの結合に際する、該層での屈折指数の変化に頼る。この系において、小リガンドのコレクションを連続して２〜５マイクロリットルのセルに注入し、ここでターゲット・ポリペプチドはセル内に固定されている。表面から屈折するレーザー光を記録することによって、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって結合を検出する。一般的に、表面層での質量濃度の所定の変化に関する屈折指数変化は、事実上、すべてのタンパク質およびペプチドに関して同じであり、いかなるタンパク質に関しても単一の方法が適用可能であることを許す（Ｌｉｅｄｂｅｒｇら、１９８３）。典型的な実験において、ターゲット・タンパク質を、組換え的に発現し、精製し、そしてＢｉａｃｏｒｅチップに結合させる。ポリ−ヒスチジン・タグを利用することによって、あるいはイオン交換＊または疎水性相互作用などの他の相互作用によって、結合を促進してもよい。次いで、Ｂｉａｃｏｒｅ（スウェーデン・ウプサラ）によって販売される装置に取り込まれた、連続方式でリガンドをピペッティングする送達系（オートサンプラー）を介して、こうして調製したチップを１以上の潜在的なリガンドに曝露する。チップ上のＳＰＲシグナルを記録し、そして屈折指数の変化は、固定されたターゲットおよびリガンドの間の相互作用の指標となる。結合速度および解離速度のシグナル動力学の分析によって、非特異的および特異的相互作用の間の区別が可能になる。Ｈｏｍｏｌａら（１９９９）Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  ５４：３−１５および該文献中の参考文献もまた参照されたい。
ＶＩＩ．Ｃ．コンホメーション・アッセイ
［００１５６］本発明は、Ｔ２Ｒ７６調節剤によって結合されるかまたは別の方式で該剤と相互作用した際に、単独で、または別のＴ２Ｒポリペプチドと会合して発現されたＴ２Ｒ７６ポリペプチドのコンホメーション変化に頼る、Ｔ２Ｒ７６調節剤を同定するための方法も提供する。
【０１４２】
［００１５７］巨大分子の溶液に円二色性分析を適用することによって、これらの巨大分子のコンホメーション状態が明らかになる。この技術は、ランダム・コイル、アルファらせん、およびベータ鎖コンホメーション状態を区別可能である。
【０１４３】
［００１５８］Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの調節剤を同定するため、組換え的に発現されたＴ２Ｒ７６ポリペプチドを用いて、円二色性分析を行ってもよい。例えばイオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーによって、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを精製し、そして試験物質と混合する。混合物を円二色性分析に供する。試験物質の存在下のＴ２Ｒ７６ポリペプチドのコンホメーションを、試験物質の非存在下のＴ２Ｒ７６ポリペプチドのコンホメーションに比較する。こうして、試験物質の存在下のＴ２Ｒ７６ポリペプチドのコンホメーション状態の変化を用いて、Ｔ２Ｒ７６調節剤を同定してもよい。代表的な方法は、米国特許第５，７７６，８５９号および第５，７８０，２４２号に記載される。Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドは、別のＴ２Ｒポリペプチドを含む、ヘテロマー受容体中に含まれてもよい。
ＶＩＩ．Ｄ．受容体活性化アッセイ
［００１５９］本発明の好ましい態様において、Ｔ２Ｒ７６調節剤を同定するための方法は、機能するＴ２Ｒ７６ポリペプチドを使用する。本明細書に開示する新規Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドには、配列番号２が含まれる。Ｔ２Ｒ７６機能を決定するための代表的な方法には、本明細書に以下に記載するような、細胞内シグナル伝達事象のリガンドが仲介する活性化をアッセイする工程が含まれる。
【０１４４】
［００１６０］Ｔ２Ｒ７６機能に対する試験物質の効果は、限定されるわけではないが、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドのリン酸化、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドへのＧタンパク質結合、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを発現している細胞におけるイオン流動、遺伝子転写の変化、細胞代謝（例えば細胞増殖）の変化、細胞内二次メッセンジャー（例えばＣａ２＋、ＩＰ３、ｃＧＭＰ、ｃＡＭＰ）の変化、および伝達物質またはホルモン放出の変化を含む、Ｔ２Ｒ７６活性によって誘発される任意の生理学的変化をアッセイする工程を含んでもよい。ＧＰＣＲシグナル伝達および該伝達をアッセイするための方法が、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  第２３７巻および第２３８巻（１９９４）に記載される。また、ＢｅｒｒｉｄｇｅおよびＩｒｖｉｎｅ（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：３１５−３２１；Ｂｏｕｒｎｅら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  １０：３４９：１１７−２７；Ｂｏｕｒｎｅら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：１２５−３２；Ｆｅｌｌｅｙ−Ｂｏｓｃｏら（１９９４）Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １１：１５９−１６４；ＭｉｓｔｉｌｉおよびＳｐｅｃｔｏｒ（１９９７）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １５：９６１−９６４；ＯｆｆｅｒｍａｎｎｓおよびＳｉｍｏｎ（１９９５）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７０：１５１７５−１５１８０；Ｐｉｔｃｈｅｒら（１９９８）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６７：６５３−９２；ならびに米国特許第４，１１５，５３８号；第５，４３６，１２８号；第６，００４，８０８号；第６，４０３，３０５号；および第６，２５５，０５９号も参照されたい。
【０１４５】
［００１６１］本発明の好ましい態様において、Ｔ２Ｒ７６機能をアッセイする工程は、単独の、または別のＴ２Ｒポリペプチドと会合した、組換え的に発現されたＴ２Ｒ７６ポリペプチドの、ガストデューシン、あるいは乱結合Ｇタンパク質、例えばＧｑまたはトランスデューシンまたはそれらのキメラへの共役をアッセイする工程を含む。したがって、Ｔ２Ｒ７６活性の代表的なレベルは、実施例３に記載するようなガストデューシン上のＧＤＰのＧＴＰγＳでの交換量、または実施例４に記載するような細胞内カルシウムの変化を含んでもよい。Ｔ２Ｒ７６活性の代表的な性質は、例えばＧタンパク質ａサブユニットの選択的活性化を含んでもよい。
【０１４６】
［００１６２］該方法にしたがって、Ｔ２Ｒ７６を発現している細胞を、Ｔ２Ｒ７６機能のアッセイを実行するのに有用なキットの形で提供してもよい。したがって、本明細書に上述するように、細胞を凍結して、そしてアッセイの実行のため、凍結したまま他の場所に輸送してもよい。例えば、本発明の１つの態様において、Ｔ２Ｒ７６調節剤を検出するため：（ａ）全長Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドをコードするＤＮＡでトランスフェクションされた凍結細胞；および（ｂ）細胞を増殖させるための培地を含む、試験キットを提供する。
【０１４７】
［００１６３］好ましくは、こうしたアッセイに用いる細胞は、天然Ｔ２Ｒ７６、およびＴ２Ｒ７６に実質的に類似のポリペプチドを実質的に欠いている細胞を含む。好ましい細胞は、真核細胞、例えばＨＥＫ−２９３細胞を含む。
【０１４８】
［００１６４］本明細書において、宿主細胞または対照細胞を記載する、用語「実質的に欠いている」は、バックグラウンド・レベルを含む、天然Ｔ２Ｒ７６のレベル、Ｔ２Ｒ７６に実質的に類似のポリペプチドのレベル、またはその活性のレベルを有する性質を指す。用語「バックグラウンド・レベル」は、Ｔ２Ｒ７６を含まず、そしてＴ２Ｒ７６ポリペプチドと実質的に類似のポリペプチドを含まない細胞で、典型的に検出される発現または活性の非特異的測定値を含む。
【０１４９】
［００１６５］本発明のアッセイで用いる細胞は、好ましくは、細胞内シグナル伝達経路にＴ２Ｒ７６受容体を共役させることが可能な、機能するＧタンパク質を含む。本発明の１つの態様において、機能するＧタンパク質は、乱結合性共役を示すＧタンパク質、例えばＧα１５およびＧα１６、あるいは実施例４に開示するような、トランスデューシンもしくはガストデューシンまたはそれらのキメラ（Ｇ１６ｇｕｓｔ４４）などの別のＧタンパク質を含んでもよい。Ｗｉｌｋｉｅら（１９９１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｄ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：１００４９−１００５３および米国特許第６，００４，８０８号を参照されたい。
【０１５０】
［００１６６］やはり好ましくは、組換えＴ２Ｒ７６を発現している細胞を使用するすべてのアッセイは、天然Ｔ２Ｒ７６およびＴ２Ｒ７６ポリペプチドに実質的に類似のポリペプチドを実質的に欠いている、対照細胞をさらに使用する。一過性にトランスフェクションされた細胞を用いる場合、対照細胞は、例えば、非トランスフェクション宿主細胞を含んでもよい。Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを発現している安定細胞株を用いた場合、対照細胞は、例えば、Ｔ２Ｒ７６発現細胞株を得るために用いた親細胞株を含んでもよい。
【０１５１】
［００１６７］一過性トランスフェクション細胞を使用するＴ２Ｒ７６活性のアッセイには、好ましくは、非トランスフェクション細胞からトランスフェクション細胞を識別するマーカーが含まれる。用語「マーカー」は、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを組換え的に発現しない細胞から、Ｔ２Ｒ７６を組換え的に発現する細胞を識別するために使用可能な任意の検出可能分子を指す。好ましくは、細胞が、Ｔ２Ｒ７６およびマーカーをコードする核酸分子で同時にトランスフェクションされるように、マーカーは、コードされるか、またはＴ２Ｒ７６発現用の構築物と別の様式で会合している。マーカーとして有用な代表的な検出可能分子には、限定されるわけではないが、異種核酸、トランスフェクション構築物によってコードされるポリペプチド（例えば酵素または蛍光ポリペプチド）、結合タンパク質、および抗原が含まれる。例えば、マーカーは、実施例２に記載するように免疫学的に検出可能な、ロドプシン・タグを含んでもよい。
【０１５２】
［００１６８］マーカーとして有用な酵素の例には、ホスファターゼ（酸またはアルカリホスファターゼなど）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコース酸化酵素、炭酸脱水酵素、アセチルコリン・エステラーゼ、グルコアミラーゼ、マレイン酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、β−グルコシダーゼ、プロテアーゼ、ピルビン酸脱炭酸酵素、エステラーゼ、ルシフェラーゼ、アルコール脱水素酵素、またはペルオキシダーゼ（西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ）が含まれる。
【０１５３】
［００１６９］酵素を含むマーカーを、酵素の活性化に基づいて、検出してもよい。したがって、基質を添加して、例えば分光光度計、発光測定装置、または蛍光測定装置を用いて、最終産物が検出可能である反応を触媒する。上述の酵素による反応用であり、そして検出可能な反応産物を産生する基質が、当業者に知られる。
【０１５４】
［００１７０］好ましいマーカーは、添加される物質の非存在下で検出可能なコードされるポリペプチドを含む。直接検出可能な代表的なポリペプチドには、ＧＦＰおよびＥＧＦＰが含まれる。蛍光、例えばＧＦＰまたはＥＧＦＰ蛍光のハイスループット検出を行うため、一般的な研究装置が開発されてきており、こうした装置には、ＧＳＩ  Ｌｕｍｏｎｉｃｓ（米国マサチューセッツ州ウォータータウン）、Ａｍｅｒｓｈａｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ（米国カリフォルニア州サニーベール）、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｃ．（米国ワシントン州イサカー）、およびＧｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．（米国ミシガン州アナーバー）のものが含まれる。商業的系の大部分は、光電子倍増管検出を伴うスキャニング技術の何らかの形を用いる。
ＶＩＩ．Ｅ．合理的設計
［００１７１］天然Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド構造の知識は、調節剤および診断剤の合理的設計のためのアプローチを提供する。簡潔には、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド構造を、Ｘ線結晶学によって、そして／または三次元提示を生じる計算アルゴリズムによって、決定してもよい。Ｓａｑｉら（１９９９）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １５：５２１−５２２；Ｈｕａｎｇら（２０００）Ｐａｃ  Ｓｙｍｐ  Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔ：２３０−２４１；およびＰＣＴ国際公報第ＷＯ  ９９／２６９６６号を参照されたい。あるいは、相同モデリング（Ｍａａｌｏｕｆら、１９９８）によって、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド構造の作業モデルを得てもよい。コンピュータ・モデルはさらに、合成し、そして本明細書中に上述するアッセイを用いて試験することも可能な、多様な基質分子に対するタンパク質構造の結合を予測可能である。さらなる化合物設計技術が、米国特許第５，８３４，２２８号および第５，８７２，０１１号に記載される。
［００１７２］一般的に、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドは、膜タンパク質であり、そして界面活性剤または他の適切な両親媒性分子を用いて、可溶性型で精製可能である。生じるＴ２Ｒ７６ポリペプチドは、結晶化のために十分な純度および濃度である。精製Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドは、好ましくは、還元または非還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）下で、単一バンドとして泳動される。少なくとも１つの以下：ｐＨ、緩衝剤の種類、緩衝剤濃度、塩の種類、ポリマーの種類、ポリマー濃度、他の沈殿性リガンド、および精製Ｔ２Ｒ７６濃度の多様な条件下で、精製Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを結晶化可能である。結晶ポリペプチドを生成するための方法が当該技術分野に知られ、そして本明細書に開示するようなＴ２Ｒ７６ポリペプチドの決定に合理的に適応可能である。例えば、Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒら（１９８４）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １８０：３８５−３９８；Ｗｅｉｓｓら（１９９０）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ２６７：２６８−２７２；またはＣＲＹＳＴＡＬ  ＳＣＲＥＥＮＴＭキット（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ｒｉｖｅｒｓｉｄｅ、米国カリフォルニア州から入手可能）などの商業的キットにおいて提供される方法を参照されたい。
【０１５５】
［００１７３］機能活性に関して結晶化Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを試験してもよく、そしてＸ線回折における適合に関して、異なるサイズおよび形状の結晶をさらに試験する。一般的に、より大きい結晶は、より小さい結晶よりも、よりすぐれた結晶解析を提供し、そしてより厚い結晶は、より薄い結晶よりも、よりすぐれた結晶解析を提供する。好ましくは、Ｔ２Ｒ７６結晶は、０．１〜１．５ｍｍのサイズ範囲である。これらの結晶は、少なくとも１０Ａの分解能、例えば１．５〜１０．０Ａまたはその中の任意の値の範囲、例えば１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５または３Ａ分解能にＸ線を回折し、３．５Ａ以下が最高の分解能として好ましい。
ＶＩＩＩ．  Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを検出するための方法
［００１７４］本発明は、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを検出するための方法をさらに提供する。Ｔ２Ｒ７６に関連する味知覚の相違と関連する、Ｔ２Ｒ７６発現レベルの改変を決定するため、開示する方法を用いてもよい。
【０１５６】
［００１７５］本発明の１つの態様において、該方法は、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いて免疫化学反応を実行することを伴い、ここで抗体は、こうした抗体を産生するための本発明の方法にしたがって調製した。したがって、該方法は：（ａ）ペプチド物質を含む生物学的試料を得て；（ｂ）Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドに特異的に結合し、そして開示する方法にしたがって産生された抗体と、生物学的試料を接触させ、ここで抗体は検出可能標識を含み；そして（ｃ）検出可能標識を検出し、それによって試料中のＴ２Ｒ７６ポリペプチドを検出する工程を含む。
【０１５７】
［００１７６］こうした抗体−抗原コンジュゲートまたは複合体を検出するための技術が当該技術分野に知られ、そしてこうした技術には、限定されるわけではないが、遠心分離、アフィニティー・クロマトグラフィーおよび他の免疫化学法が含まれる。例えば、Ｍａｎｓｏｎ（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  米国ニュージャージー州トトワ；Ｉｓｈｉｋａｗａ（１９９９）Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｒａｐｉｄ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ．  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  アムステルダム／米国ニューヨーク州；Ｌａｗ（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ．  Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ，  ロンドン／米国ペンシルバニア州ブリストル：Ｃｈａｎ（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ：Ａｎ  Ｕｐｄａｔｅｄ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  サンディエゴ；ＬｉｄｄｅｌｌおよびＷｅｅｋｓ（１９９５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  英国オックスフォード；Ｍａｓｓｅｙｅｆｆら（１９９３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．  ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ／ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  ドイツ連邦共和国ワインハイム／米国ニューヨーク州；ＷａｌｋｅｒおよびＲａｐｌｅｙ（１９９３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ．  Ｗｉｌｅｙ，  ニューヨーク州チチェスター；Ｗｙｃｋｏｆｆら（１９８５）Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  米国フロリダ州オーランド；およびこれらの文献に引用される参考文献を参照されたい。
【０１５８】
［００１７７］本発明の別の態様において、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドへの特異的結合を示す調節剤を用いて、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを検出する。抗体を用いたＴ２Ｒ７６ポリペプチドの検出と同様に、該方法は：（ａ）ペプチド物質を含む生物学的試料を得て；（ｂ）Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの調節剤と、生物学的試料を接触させ、ここで調節剤は検出可能標識を含み；そして（ｃ）検出可能標識を検出し、それによって試料中のＴ２Ｒ７６ポリペプチドを検出する工程を含む。任意の適切な検出可能標識、例えば蛍光体またはエピトープ標識を用いてもよい。
ＩＸ．適用
［００１７８］本発明は、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの調節剤を同定するための方法を提供する。本発明の調節剤は、苦味知覚を改変するために、例えば苦味知覚を抑制するかまたは増進するために有用である。
ＩＸ．Ａ．被験体
［００１７９］用語「被験体」には、本明細書において、任意の脊椎動物種、好ましくは哺乳動物および鳥類などの温血脊椎動物が含まれる。より具体的には、本発明の方法は、ヒトなどの哺乳動物、ならびに絶滅しそうであるために重要である哺乳動物（アムールトラなど）、経済的に重要である哺乳動物（ヒトによって消費されるために農場で飼育されている動物）および／またはヒトにとって社会的に重要である哺乳動物（ペットとしてまたは動物園で飼育されている動物）、例えばヒト以外の肉食動物（ネコおよびイヌなど）、豚（ブタ、家畜ブタ、およびイノシシ）、反芻動物および家畜類（ウシ、雄ウシ、ヒツジ、キリン、シカ、ヤギ、野牛、およびラクダ）、およびウマにおいて、腫瘍を治療するために意図される。絶滅しそうであるか、または動物園で飼育されている種類の鳥類、ならびに家禽、およびより詳細には家畜化された家禽または飼育鳥、例えば七面鳥、ニワトリ、カモ、ガチョウ、ホロホロ鳥等を含む、鳥類の治療もまた意図され、これは、これらもまた、ヒトにとって経済的に重要であるためである。
ＩＸ．Ｂ．組成物
［００１８０］本発明の方法にしたがって、被験体において、味知覚を改変するために投与される組成物は、有効量のＴ２Ｒ７６調節剤を含む。Ｔ２Ｒ７６調節剤は、本明細書において上述する試験物質種の任意の１つを含んでもよい。本明細書に開示するように同定されるＴ２Ｒ７６調節剤を用いて、限定されるわけではないが、食品、飲料、口腔洗浄液、歯磨剤、化粧品、および医薬品、例えば本明細書において以下に列挙するような化合物のいずれかを含む、経口使用のための組成物を調製してもよい。Ｔ２Ｒ７６調節剤はまた、経口使用する可能性があるがそれが望ましくない化合物、例えば家庭用クレンザー、毒等の味を改変するための添加物としても使用可能である。
【０１５９】
［００１８１］望ましくない味または苦味を有する代表的な食品には、限定されるわけではないが、グレープフルーツ、オレンジ、およびレモンなどの柑橘果実；トマト、ピーマン、セロリ、メロン、ニンジン、ジャガイモ、およびアスパラガスなどの野菜；フレーバー、ソース、しょうゆ、および赤唐辛子などの調味料または香味料；ダイズから生じる食品；クリーム、ドレッシング、マヨネーズ、およびマーガリンなどのエマルジョン食品；魚肉、魚のすり身、および魚卵などの加工水産物；ピーナツなどのナッツ類；味噌などの発酵食品；肉および加工肉；ピクルス；麺類；粉末スープを含むスープ；チーズなどの乳製品；パンおよびケーキ；キャンディ、チューインガム、およびチョコレートなどの菓子類；ならびに健康のため特別に調製された食品が含まれる。
【０１６０】
［００１８２］苦味を誘発する代表的な化粧品（例えばスキンローション、クリーム、フェースパック、リップスティック、ファンデーション、シェービング製剤、アフターシェービングローション、クレンジングフォーム、およびクレンジングジェル）には、限定されるわけではないが、アルキル硫酸ナトリウムおよびモノアルキルリン酸ナトリウムなどの界面活性剤；メントール、リナロオール、フェニルエチルアルコール、プロピオン酸エチル、ゲラニオール、酢酸リナリルおよび酢酸ベンジルなどの香料；メチルパラベン、プロピルパラベンおよびブチルパラベンなどの抗菌剤；乳酸および乳酸ナトリウムなどの保湿剤；オクタ酢酸スクロースおよびブルシンなどのアルコール変性剤；ならびに乳酸アルミニウムなどの収斂剤が含まれる。
【０１６１】
［００１８３］苦味を有する代表的な医薬品には、アミノアセトフェン、テルフェナジン、グアイフェネシン、トリメトプリム、プレドニゾロン、イブプロフェン、リン酸プレドニゾロン・ナトリウム、メタコリン、ネオスチグミン、エピネフリン、アルブテロール、シュードエフェドリン塩酸、ジフェンヒドラミン、マレイン酸クロルフェニラミン、フェノチアジン、クロルプロマジン、クロルジアゼポキシド（ｃｈｌｏｒｏｉａｚｅｐｏｘｉｄｅ）、アミトリプチリン、バルビツレート、ジフェニルヒダントイン、カフェイン、モルヒネ、デメロール、コデイン、ロモチル、リドカイン、サリチル酸、スルホンアミド、クロロキン、ビタミン製剤、ミネラルおよびペニシリンが含まれる。
【０１６２】
［００１８４］また、調製した食品、飲料、口腔洗浄液、歯磨剤、化粧品、または薬剤の一部として、調節剤を投与してもよい。被験体に投与するための組成物を調製するため、味を調節しようとする化合物と、重量約０．００１％〜約１０％、好ましくは重量約０．０１％〜約８％、より好ましくは重量約０．１％〜約５％、そして最も好ましくは重量約０．５％〜約２％のＴ２Ｒ７６調節剤を混合してもよい。
【０１６３】
［００１８５］適切な配合物には、溶液、抽出物、エリキシル剤、スピリッツ酒、シロップ、懸濁物、粉末、顆粒、カプセル、ペレット、錠剤、およびエアロゾルが含まれる。場合によって、配合物には、薬学的に許容されうるキャリアー、懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、保存剤、フレーバー、着色剤、甘味料、香料、またはそれらの組み合わせが含まれてもよい。Ｔ２Ｒ７６調節剤および組成物を、単位用量または多用量の密封容器、例えばアンプルおよびバイアル中に提示してもよい。
ＩＸ．Ｃ．投与
［００１８６］味知覚の調節のため、Ｔ２Ｒ７６調節剤を被験体に直接投与してもよい。好ましくは、本発明の調節剤を経口または鼻投与する。
【０１６４】
［００１８７］本発明の方法にしたがって、Ｔ２Ｒ７６調節剤の有効量を被験体に投与する。用語「有効量」は、Ｔ２Ｒ７６活性化を調節し、そして／または苦味知覚を調節するのに十分な量の組成物を指す。
【０１６５】
［００１８８］所望の味知覚を達成するのに有効なＴ２Ｒ７６調節剤の量を投与するための有効量は多様でありうる。選択する投薬レベルは、Ｔ２Ｒ７６調節剤の活性、配合、他の組成物（例えば食品、薬剤等）との組み合わせ、意図される使用（例えば食品添加剤、歯磨剤等として）、ならびに治療しようとする被験体の肉体状態および先の病歴を含む、多様な要因に応じるであろう。
【０１６６】
［００１８９］当該技術分野に知られるように、味知覚のｉｎ  ｖｏｖｏアッセイを用いて、有効量または用量を容易に決定してもよい。味知覚をアッセイするための代表的な方法を実施例４に記載する。
実施例
［００１９０］以下の実施例は、本発明の様式を例示するために含まれている。以下の実施例の特定の側面は、本発明の共同発明者らによって、本発明の実施において、よく働くことが見出されたかまたは意図される、技術および方法の観点で記載される。これらの実施例は本発明の共同発明者らの標準的な実験室実施を例示する。本開示および当該技術分野の一般的な技術レベルに鑑みて、当業者は、以下の実施例が、例示のみを意図し、そして本発明の範囲から逸脱することなく、多くの変化、修飾および改変を使用してもよいことを認識するであろう。
【０１６７】
［００１９１］実施例１．ヒトＴ２Ｒ７６のクローニング
［００１９２］ヒト・ゲノム配列データベースにおいて、ヒト苦味受容体をコードする新規遺伝子を同定した。新規ｈＴ２Ｒメンバー、ｈＴ２Ｒ７６は、ヒト染色体７上に位置する。カリフォルニア大学（カリフォルニア州サンタクルーズ）ゲノミクス・ウェブサイトをスクリーニングすることによって、Ｔ２Ｒ７６  ＤＮＡ配列の染色体位置を決定した。この分析によって、Ｔ２Ｒ７６が染色体７上の領域１４４０６２６９２−１４４０６３６４８に位置することが示された。フェニルチオカルバネートなどの特定の化合物の苦味は、染色体５および７に遺伝的に関連付けられてきている（Ｇｕｏら（２００１）Ａｎｎ  Ｈｕｍ  Ｂｉｏｌ  ２８：１１１−４２）。したがって、Ｔ２Ｒ７６は、特定の苦味物質の結合および認識に関与すると予測される。
【０１６８】
［００１９３］ヒトＴ２Ｒ７６は、先に記載されたｈＴ２Ｒ配列を用いた、ＤＮＡ配列データベースの反復配列検索によって最初に同定された。ゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅によって、ｈＴ２Ｒ７６をコードする全長オープンリーディングフレームを単離した。対応するオープンリーディングフレームの概念上の翻訳によって、ｈＴ２Ｒ７６のアミノ酸配列を得た。ｈＴ２Ｒ７６ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１および配列番号２に示す。
【０１６９】
［００１９４］ｈＴ２Ｒ７６の無イントロン・オープンリーディングフレームは、長さ３１８アミノ酸残基の推定上の受容体タンパク質をコードする。ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いた、公共配列データベース中のすべての既知のタンパク質とのｈＴ２Ｒ７６タンパク質配列の比較によって、哺乳動物苦味受容体ファミリーメンバーに対する強い相同性が明らかになった。
【０１７０】
［００１９５］実施例２．  ｒｈｏｄ−ｈＴ２Ｒ７６の構築
［００１９６］架橋重複ＰＣＲ伸長技術を用いて、Ｃｈａｎｄｒａｓｈｅｋａｒら（２０００）Ｃｅｌｌ  １００：７０３−７１１に記載されるようなヒトＴ２Ｒ７６コード配列とインフレームで、ウシ・ロドプシンの最初の３８アミノ酸を含有する、ｒｈｏｄ−ｈＴ２Ｒ７６キメラを生成した。次いで、キメラｒｈｏｄ−ｈＴ２Ｒ７６遺伝子をｐＦａｓｔＢａｃ−１ベクター内にクローニングし、そしてＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ系（米国カリフォルニア州カールスバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて、ロドプシンでタグ付けされたｈＴ２Ｒ７６を含有するバキュロウイルスを産生した。抗ロドプシン・タグ抗体（１３６−３０）を用いたイムノブロッティングによって、ｈＴ２Ｒ７６の発現を確認した。ｈＴ２Ｒをコードするバキュロウイルスに感染したＳｆ９細胞は、期待される分子量（−３５ｋＤａ）のタンパク質を生じた。
【０１７１】
［００１９７］実施例３．  Ｔ２Ｒ７６のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｇタンパク質共役
［００１９８］ｒｈｏｄ−ｈＴ２Ｒ７６をコードする感染性バクミドを実施例２に記載するように調製する。昆虫幼虫細胞を組換えバクミドに６０時間感染させ、そしてＲｙｂａおよびＴｒｉｎｄｅｌｌｉ（１９９５）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７０：６７５７−６７６７によって記載されるように、膜を調製する。５Ｍ尿素で処理することによって、周辺タンパク質を除去し、そして１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１ｍＭ  ＤＴＴに膜を再懸濁する。モノクローナル抗体Ｂ６−３０を用いたウェスタンブロッティングによって、ｒｈｏｄ−ｈＴ２Ｒ７６の発現を評価してもよい。
【０１７２】
［００１９９］例えば、Ｈｏｏｎら（１９９５）Ｃｅｌｌ  ９６  ６２９−６３６によって、そしてＲｙｂａおよびＴｒｉｎｄｅｌｌｉ（１９９５）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７０：６７５７−６７６７によって、記載されるように、Ｇタンパク質を単離する。１０ｎＭ  ｒｈｏｄ−ｈＴ２Ｒ７６、１００μＭ  ＧＤＰ、および２０μＭ  Ｇβ１γ８の存在下で、受容体が触媒する、ガストデューシン上のＧＤＰのＧＴＰγＳでの交換を測定する。乱結合Ｇタンパク質（例えばＧα１５またはトランスデューシン）上のＧＤＰ−ＧＴＰγＳ交換を米国特許出願第６０／３７２０８９に記載されるように行う。約１５〜６０分の時点で行う測定は、ＧＴＰγＳ結合の初期速度を反映する。
【０１７３】
［００２００］実施例４．特異的Ｔ２Ｒ７６リガンドを検出するカルシウム画像化アッセイ
［００２０１］本実施例において、本発明者らは、本ヒトＴ２Ｒ７６が、苦味リガンド、ブルシンおよびプロピルチオウラシル（ＰＲＯＰ）（図１の化合物構造を参照されたい）を認識することを示す。ブルシンは、マチン（Ｓｔｒｃｈｎｏｓ）種子から単離された毒性苦味アルカロイドであり、苦味閾値は０．０１ｍＭである。ＰＲＯＰは、ＰＲＯＰテイスターに関して０．０１ｎＭの苦味閾値を持つ苦味化学薬品である。
【０１７４】
［００２０２］細胞内カルシウム濃度の変化を検出する、細胞に基づくアッセイにおいて、ブルシンおよびＰＲＯＰによるｈＴ２Ｒ７６の活性化を測定する。本質的には、ヒト胚性腎細胞を４８ウェル組織培養プレート内に植え付ける。２４時間後、ｈＴ２Ｒ７６核酸配列を含有するプラスミド、およびキメラＧタンパク質（Ｇ１６ｇｕｓｔ４４）を発現するプラスミドで、細胞を一過性にトランスフェクションする。さらに２４時間後、カルシウムに特異的な蛍光色素（Ｆｌｕｏ−４；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）とともに細胞をインキュベーションし、これは、細胞内カルシウムの変化を検出するための迅速、単純で、そして信頼性がある方法を提供する。Ｔ２Ｒの活性化は、シグナル伝達カスケードを誘発し、これは、ＰＬＣの活性化およびそれに続く細胞内カルシウム濃度の増加を導く。カルシウム濃度のこの増加は、細胞内カルシウムの蛍光特性を変化させる。蛍光顕微鏡および特別に設計されたソフトウェア（Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ、Ａｘｏｎ）を用いて、これらの変化を監視する。この方法論を用いて、ＰＲＯＰおよびブルシンの両方が、ＨＥＫ−２９３細胞において、Ｔ２Ｒ７６を特異的に活性化し、これが、細胞内カルシウム・レベルの増加を生じることが示された。一方、やはりＴ２Ｒ７６受容体を発現し、いくつかの他の苦味リガンド、すなわちＬ−トリプトファン、サリシン、およびＮ−フェニルチオ尿素と接触させた、対照細胞は、細胞内カルシウム・レベルの検出可能な増加を生じなかった（実施例２に含有される画像化データを参照されたい）。したがって、２つの異なる苦味リガンド、ＰＲＯＰ、およびストリキニーネ関連化合物のブルシンは、Ｔ２Ｒ７６を特異的に活性化することが示され、Ｔ２Ｒ７６が苦味伝達に能動的に関与するヒト味受容体であることが確認された。
【０１７５】
［００２０３］実施例５：味研究
［００２０４］本明細書に開示するように同定したＴ２Ｒ７６調節剤を含む試験組成物を用いて、フレーバー許容研究を行う。Ｔ２Ｒ７６調節剤を欠くが、そうでなければ試験組成物に実質的に類似であるかまたは同一である、対照組成物もまた、用いる。研究は、２方向クロスオーバー設計を使用し、すべての被験体が両方の組成物を評価し、これらの組成物は、１以上の同じ量または用量で投与される。単一の研究日に、試験および対照組成物を評価する。被験体の間で、試験および対照組成物を投与する順序をランダム化する。登録されたすべての被験体が、研究プロトコルのすべての側面を完了する。被験体は、序数の味スコア（例えば１＝非常に苦い、２＝苦い、３＝普通、４＝それほど苦くない、５＝まったく苦くない）を用いて、試験および対照組成物の各々に応答する。不都合な事象を記録する。対照組成物に比較した際、試験組成物の食味の有意な相違を測定することによって、Ｔ２Ｒ７６調節剤の有効性を決定する。
【０１７６】
［００２０５］実施例６．苦味化合物に対するｈＴ２Ｒ７６の応答
［００２０６］ｈＴ２Ｒ７６を発現する哺乳動物細胞株（ＨＥＫ２９３）、ならびに異なるｈＴ２Ｒ（ｈＴ２Ｒ６４）を発現する対照細胞株を用いて、ＧＴＰγＳ結合アッセイを達成する。これらの細胞株を、０．５〜２ｍｍの範囲の異なる濃度の６−ｎ−プロピルチオウラシル（ＰＲＯＰ）、オクタ酢酸スクロース、ウンデカ酢酸ラフィノース（ＲＵＡ）、グリシン酸銅、デナトニウムおよびキニンを含む苦味化合物と接触させる。このアッセイ結果を用いて、ｈＴ２Ｒ７６が、既知の苦味刺激によって特異的に活性化される苦味受容体であることを確認する。このＧＴＰγＳ結合アッセイにおいて、特定の濃度の既知の苦味化合物の存在下または非存在下いずれかで、活性を測定する。
【０１７７】
［００２０７］実施例７．ハイスループット・スクリーニングアッセイ
［００２０８］ＧＴＰγＳ結合アッセイを用いて、１５，０００化合物を超えるライブラリーをスクリーニングして、ｈＴ２Ｒ７６を特異的に活性化する他の化合物を同定する。このアッセイにおいて、ｈＴ２Ｒ７６を活性化しうる類似の構造を有する化合物を予測するため、ｈＴ２７６を活性化する特異的化合物の構造を比較する。次いで、ＧＴＰγＳ結合アッセイにおいて、異なる濃度でこれらの類似の構造を有する化合物のライブラリーを評価して、ｈＴ２Ｒ７６を活性化する他の化合物を同定する。
【０１７８】
［００２０９］実施例８．ヒト味試験
［００２１０］ＧＴＰγＳ結合アッセイにおいて、ｈＴ２Ｒ７６を活性化する化合物を、ヒト味試験において評価する。同意した成人において、これらのヒト味試験を行い、この成人に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｈＴ２Ｒ７６を活性化する濃度の同定された化合物を経口投与する。これらの味試験において、同定された化合物（ｈＴ２Ｒ７６を活性化する）を水に溶解して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＧＴＰγＳ結合アッセイにおいて、ｈＴ２Ｒ７６を活性化する化合物濃度を達成する。
【０１７９】
［００２１１］この味試験において、少なくとも５人のサンプルが、苦味化合物を含有する一連の水性溶液をテースティングする（好ましい実施例において、苦味化合物はＴ２Ｒ７６アゴニストである）。各個人は、０〜１００の範囲の標識等級尺度で苦味の度合いをランク付けする（０は「わずかに検出可能」であり、そして１００は「ありうる最強」である）。次に、各個人が、苦味化合物およびＴ２Ｒ７２阻害剤を含有する一連の水性溶液をテースティングし、そして各試料の苦味の度合いをランク付けする。苦味の度合いの減少によって、Ｔ２Ｒ７６阻害剤の有効性を測定する。比較の手段として、既知の苦味化合物（硫酸キニン）もまた試験し、そして各被験体が評価する。味試験の結果は、すべての被験体の平均評価として示される。
【０１８０】
結論
［００２１２］これらのアッセイの結果は、カルシウム画像化アッセイを用いて、本発明記載のｈＴ２Ｒ７６ポリペプチドに特異的に結合する苦味化合物を同定可能である証明を提供し、そしてｈＴ２Ｒ７６がヒトにおける苦味受容体であることを確認する。したがって、この受容体を、本発明にしたがったスクリーニングアッセイで用いて、少なくともＴ２Ｒ７６受容体ポリペプチドと関連する苦味を調節し、好ましくは阻害する化合物を同定してもよい。これに関連して、Ｔ２Ｒ７６に結合することが見出された苦味化合物には、マチン種子に見られる天然存在毒性アルカロイドであり、ヒトにおいて０．０１ｍＭの苦味閾値を誘発するブルシン、およびＰＲＯＰテースターに関して０．０１ｍＭの苦味閾値を持つ苦味化学薬品であるＰＲＯＰが含まれる。したがって、Ｔ２Ｒ７６は、予期されるように、複数の苦味リガンドに結合し、そしてヒトが何百もの異なる苦味化合物をテースティングする能力における機能的役割を果たす可能性がある。
【０１８１】
［００２１３］したがって、本アッセイを用いて同定される調節剤を用いて、食品および飲料に苦味を提供してもよい。あるいは、苦味遮断剤および調節剤、ならびに他の苦味化合物の同定のためのアッセイにおいて、これらの化合物をアゴニストとして用いてもよい。
参考文献
［００２１４］以下に列挙する参考文献、ならびに本明細書に引用するすべての参考文献は、これらが、本明細書で使用する方法論、技術および／または組成物を解説するための背景を補充し、説明し、提供する度合いまで、本明細書に援用される。
【０１８２】
【表１】
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【０１８３】
【表２】
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【０１８４】
【表３】
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【０１８５】
【表４】
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【０１８６】
【表５】
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【０１８７】
【表６】
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【０１８８】
【表７】
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【０１８９】
【表８】
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【０１９０】
【表９】
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【０１９１】
【表１０】
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【０１９２】
［００２１５］本発明の範囲から逸脱することなく、本発明の多様な詳細を変化させてもよいことが理解されるであろう。さらに、前述の説明は、例示のみの目的のためであり、そして本明細書に付随する請求項によって定義される本発明を限定する目的のためではない。
【図面の簡単な説明】
【０１９３】
【図１】［００２７］図１は、ブルシンおよびＰＲＯＰの構造を含有する。
【図２】［００２８］図２は、Ｔ２Ｒ７６がブルシンおよびＰＲＯＰに特異的に応答することを明らかにした、細胞に基づくアッセイからのデータを含有する。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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