(57)【要約】  本発明は、生物活性ペプチドおよびこれを含む産物を用いて内皮機能不全を予防および処置することに関する。特に、トリペプチド Ile-Pro-Pro (IPP)、Val-Pro-Pro (VPP) 、またはこれらを含む混合物、濃縮物その他の産物が使用される。本発明の一具体的態様は、前記生物活性ペプチドを用いる血管弾性の増強である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
内皮機能を改善する産物を調製するための、Ile-Pro-Proおよび／またはVal-Pro-Proの使用。
【請求項２】
内皮機能を改善する産物を調製するためにIle-Pro-Proおよび／またはVal-Pro-Proを含む産物を使用することを特徴とする、請求項１の使用。
【請求項３】
内皮機能を改善する産物を調製するために、高含量のカゼイン由来低分子ペプチドを含み、かつカゼイン含有出発物質を乳酸菌で発酵させることにより調製された産物を使用する、請求項２の使用。
【請求項４】
内皮機能を改善する産物を調製するために、高含量のカゼイン由来低分子ペプチドを含み、かつカゼイン含有出発物質をラクトバチルス・ヘルベティカス株 LBK-16H、DSM 13137またはラクトバチルス・ヘルベティカス株 LB 1936、DSM 17754で発酵させ、所望によりカゼインおよび／または他の乳タンパク質および／またはラクトースを部分的にまたは完全に除去し、そして得られたペプチド含有発酵産物をナノ濾過して、調製された産物を使用する、請求項３の使用。
【請求項５】
内皮機能を改善する産物を調製するために、カゼイン由来低分子ペプチド Ile-Pro-Proおよび／またはVal-Pro-Proおよび乳酸菌生菌を含む酸味組成物を使用する、請求項２の使用。
【請求項６】
カゼイン由来低分子ペプチドが短鎖ペプチドの混合物を含むことを特徴とする、請求項３−５のいずれかの使用。
【請求項７】
内皮機能不全に関連する障害および疾患の予防または治療用の医療品の製造のための、請求項１−６のいずれかの使用。
【請求項８】
産物が血管の弾性を増強することを特徴とする、請求項１−７のいずれかの使用。
【請求項９】
最終産物が食用産物であることを特徴とする、請求項１−８のいずれかの使用。
【請求項１０】
最終産物が、乳製品、飲料製品、加工食製品、食肉加工製品、パン製品、または菓子製品であることを特徴とする、請求項９の使用。
【請求項１１】
最終産物が発酵乳産物であることを特徴とする、請求項１０の使用。
【請求項１２】
最終産物が、飲料、好ましくはホエイ飲料、果実飲料またはビールであることを特徴とする、請求項１０の使用。
【請求項１３】
最終産物が製薬産業品であることを特徴とする、請求項９の使用。
【請求項１４】
内皮機能不全を正常化する方法であって、Ile-Pro-ProおよびVal-Pro-Proならびにそれらの混合物からなる群から選択されるペプチドまたは該ペプチドを含む産物を、所望の効果の達成に十分な量にて個体に投与することを含む方法。
【請求項１５】
内皮機能不全およびこれに関連する障害および疾患を予防または治療する方法であって、Ile-Pro-ProおよびVal-Pro-Proならびにそれらの混合物からなる群から選択されるペプチドまたは該ペプチドを含む産物を、所望の効果の達成に十分な量にて個体に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物活性ペプチドおよびこれを含む産物を用いて内皮機能不全を予防および治療することに関する。高含量の短鎖ペプチドを含む産物が本発明の使用に特に有用であることが明らかとなった。
【０００２】
本発明にしたがい使用される産物は、例えば健康食品や医薬品として処方することができる。これは、低分子ペプチド、例えばトリペプチド Ile-Pro-Pro (IPP)、Val-Pro-Pro (VPP)、またはそれらを含む混合物もしくは濃縮物を含み、上皮機能を改善してこれに関連する疾患を治療することで機能する。本発明の具体的局面は、低分子ペプチド、例えばトリペプチド Ile-Pro-Pro (IPP)、Val-Pro-Pro (VPP)、またはそれらを含む混合物、濃縮物その他の産物を使用して、血管の剛性を減少させ、弾性を増強することである。
【背景技術】
【０００３】
血管内皮は、血管拡張物質、例えば内皮由来弛緩因子 (EDRF)、一酸化窒素、プロスタサイクリンおよび内皮由来過分極因子 (EDHF) 、および血管収縮物質、例えばトロンボキサン A2、フリーラジカルおよびエンドセリンを放出することによって、血管緊張を局所的に調節する。大心外膜冠動脈および冠微小循環における血管緊張の基礎状態と刺激後の両方の調節に一酸化窒素が重要性であることがいくつかの臨床試験で示されている (総説として以下を参照： Vapaatalo H, Mervaala E. Clinically important factors influencing endothelial function. Med Sci Monit 2001; 7(5):1075-1085; Drexler H, Hornig B. Endothelial dysfunction: a novel therapeutic target. J Mol Cell Cardiol 1999; 31:51-60)。前述の各種内皮由来弛緩因子は、内皮機能不全、例えばアテロ−ム性動脈硬化症における内皮機能不全を矯正する。血管運動緊張の調節、血液凝固の制御、血管増殖の促進および予防、炎症の制御、および薬物の効果および副作用の標的としての作用が、内皮に関連する。EDRFの放出は、例えばブラジキニン、トロンビン、アセチルコリン、およびセロトニンの血管中の流量の増加により刺激される。
【０００４】
内皮は、ある種の薬理学的および生理学的刺激に応答して、基礎をなす平滑筋緊張を調節する。内皮機能はまた、血管増殖、白血球接着、および免疫学的調節、循環アミンの代謝、リポタンパク質代謝、および血液伝搬シグナルの統合および伝達に関与する。
【０００５】
内皮機能不全は、血管拡張メディエーターの分泌の減少、血管収縮物質の産生の増加、血管収縮物質に対する感度の増加、および／または血管平滑筋の内皮血管拡張物質に対する耐性、を特徴とする。機能不全は、拡張因子と収縮因子または増殖促進物質と増殖阻害物質の不均衡の結果である。炎症、リポタンパク質酸化、または他の酸化的ストレス反応は、内皮機能不全の発達および保持に影響する因子である。理論的には、内皮機能不全の最も明白かつ直接的な指標は、一酸化窒素とその代謝物、およびサイクリックGMPである。
【０００６】
内皮機能不全は、いくつかの臨床症状、例えば高血圧、アテロ−ム性動脈硬化症、冠動脈疾患、心不全、糖尿病、および高コレステロール血症の原因または結果のいずれかでありうる。内皮機能不全の最も直接的な指標は、血管拡張因子、例えば一酸化窒素、プロスタサイクリン、内皮由来過分極因子 (EDHF)、ナトリウム利尿ペプチドなどの産生または受容体機能の低下、あるいは血管収縮物質、例えばエンドセリン-1、アンギオテンシン II、エンドペルオキシド、およびトロンボキサンA2などの形成の増加またはこれらに対する感度の上昇の間の不均衡である。
【０００７】
内皮機能不全は、いくつかの既知の薬物により処置可能であり、最も重要なものはアンギオテンシン変換酵素(ACE) 阻害薬、アンギオテンシン II 受容体遮断薬、硝酸製剤、およびコレステロール低下薬である。ACE阻害薬の効果は、内皮における一酸化窒素の合成を増強するブラジキニンの効果を改善するその能力に主に基づく。誘導および／または増強された一酸化窒素の産生または硝酸塩の添加は、不十分な体内一酸化窒素産生の均衡を保ちうる。これら医薬および硝酸塩は外来のEDRFとして機能して血管を拡張し、さらにこれらは損傷した血管において抗血栓症化合物としての活性を有する。
【０００８】
WO 02/34767 A1（Selwood et al.）は、血管内皮増殖因子(VEGF)のプラグメントであって、血管新生の阻害に有用なペプチドを記載する。この発明によれば、これらペプチドは3-8アミノ酸を含み、そのアミノ酸配列の重要な特徴は塩基性残基、特にアルギニン(Arg) および／またはリシン (Lys) 残基の存在および配置である。この文献は、6-16アミノ酸からなるいくつかのペプチドを特定している。それらはいずれもイソロイシン-プロリン-プロリン (IPP) またはバリン-プロリン-プロリン (VPP)の配列は含まない。この文献によれは、これらペプチドは血管新生が病理に重要な役割を果たす疾患に有用でありうる。かかる疾患には、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性症 (ARDS)、癌、子宮内膜症、乾癬、およびリウマチ性関節炎が含まれる。
【０００９】
WO 99/45941（Sandberg et al.）は、組織の柔軟性、弾性または外観を改善するために使用される組成物を記載する。この組成物は、エラスチンのサーモリシン消化により産生された41のペプチドフラグメントのいずれかに対応するペプチドから製剤される。好ましくは、組成物は式 R1-Valyl-Valyl-Prolyl-グルタミン-R2（式中、R1はペプチドのアミノ部分であり、R2はペプチドのカルボキシ部分である）を有するポリペプチドを含む。組成物は、好ましくは化粧用製剤においてヒト皮膚に適用される。本文献によると、この組成物はまた、高血圧、冠状動脈性心疾患、動脈硬化症、狭心症、冠動脈血栓、慢性閉塞性肺疾患、および血管形成術後再狭窄の処置に有用である。
【００１０】
WO 01/91700 A2 および米国特許第6,962,904号B1（いずれもMitts et al.）は、部分的にWO 99/45941（Sandberg et al.）と同じ研究に基づいている。本文献は、組織の弾性を増強するための組成物について記載しており、この組成物はエラスチンに見られる配列、特に-バリン-バリン-プロリン- および -バリン-バリン-プロリン-アスパラギン-の配列、に対応するペプチドから製剤される。前記組成物は、組織におけるエラスチン産生の改善に有用である。本文献によれば、主たる用途はこちらも化粧品であるが、この組成物が高血圧、冠状動脈性心疾患、動脈硬化症、狭心症、冠動脈血栓、慢性閉塞性肺疾患および血管形成術後再狭窄などの処置に有用でありうることも示唆している。
【００１１】
記載されるエラスチンペプチドフラグメントは、他のアミノ酸配列と比較して多数のグリシンおよび／またはプロリン残基を含む。これらフラグメントは、イソロイシン-プロリン-プロリン (IPP) および／または バリン-プロリン-プロリン (VPP)の配列を含まない。
【００１２】
発酵による生物活性ペプチドの調製は背景技術ではかなり研究され記載されており、特に興味深い点の1つは乳由来ペプチドである。これらは、例えばオピオイド受容体結合性、ACE阻害活性、殺菌性を有することが示されている。いくつかの研究が高血圧などに関してなされているが、このペプチドの内皮機能に対する効果はいまだ記載されていない。特に、トリペプチドのバリン-プロリン-プロリン (VPP) およびイソロイシン-プロリン-プロリン (IPP) およびこれらを含む産物の内皮機能に対する効果は、背景技術には記載されていない。
【００１３】
トリペプチド VPPおよびIPPは既知の化合物であり、血圧降下作用を有するACE阻害薬として記載されている。例えば、J Dairy Sci 78 (1995) 777-783（Nakamura et al.）は、ラクトバチルス・ヘルベティカスおよびサッカロマイセス・セレビシエを含むスターターの2つのACE阻害薬の調製のための使用について記載する。これら化合物はいずれもトリペプチド、Val-Pro-ProおよびIle-Pro-Proとして同定された。本文献は、これらトリペプチドのイン・ビボでの血圧降下作用について記載していないが、それは次の研究主題であるとされている。
【００１４】
米国特許第5,449,661号（Nakamura et al.）は、トリペプチド配列 Val-Pro-Proを含むペプチドの調製および高血圧低下のためのその使用について開示する。このペプチドは、無脂肪乳粉末をラクトバチルス・ヘルベティカス株 JCM-1004で発酵させ、その後ペプチドをクロマトグラフィーで精製し、凍結乾燥することで調製される。
【００１５】
WO 99/16862（Yamamoto et al.）は、多量のトリペプチド Val-Pro-Proおよび／またはIle-Pro-Proを産生することができるラクトバチルス・ヘルベティカス株 CM4、FERM BP-6060について記載する。 
【００１６】
WO 01/32905（Valio）は、血圧降下性を有する産物およびその調製について記載する。この産物は、カゼイン含有出発物質を乳酸菌で発酵させ、得られたペプチド含有発酵産物に対してナノ濾過を行うことによって産生される。この産物の血圧降下性は、部分的にそこに含まれるトリペプチド IPPおよびVPPによる。WO 03/070267（Valio）は、WO 01/32905に記載のIPPおよびVPPならびにその産物の、ミネラル利用能を増強する産物の調製における使用について記載する。この産物は、例えば骨形成の増加、骨格系の強化、および骨粗しょう症の治療または予防に使用されうる。
【００１７】
血管は、高血圧、動脈硬化症、狭心症、血管新生、心筋梗塞、冠動脈血栓、血管形成術後再狭窄および慢性閉塞性肺疾患などの弾粘性に関連する疾患に関連する。心血管疾患は、なかでも世界で最も一般的な疾患であり、主要国における生死にかかわる疾患の上位5位のリストにはいる。不運なことに、生活水準の上昇もまた本疾患の危険性を上昇させ、それゆえ将来的にはさらに重要となるであろう。常套的な薬物に加えて、最近は機能性製品が消費者にとって魅力的な選択肢を提供している。
【００１８】
それゆえ、血管の弾性を改善し内皮機能を正常化する機能性製品は、通常の食事の一部として非常に歓迎される。さらに、有益な動脈剛性特性を有するペプチドを医療品または医薬品として投与することもまた考慮する価値がある。
【発明の概要】
【００１９】
本発明の目的は、通常の食事の一部として、または医療品もしくは医薬品として、内皮機能を改善し、よって内皮機能不全に関連する障害または疾患を予防、軽減、または治療することができる産物を利用可能にすることである。内皮機能不全は血管の剛性または柔軟性に顕著な役割を有し、それゆえ、冠状動脈性心疾患、動脈硬化症、狭心症、冠動脈血栓、慢性閉塞性肺疾患および血管形成術後再狭窄などの多数の重篤な疾患に重要である。したがって、血管の弾性を増強する能力は、本発明の特に重要な特徴である。
【００２０】
本発明にしたがい使用される産物は、内皮機能を改善するペプチドからなる、またはこれを含む。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、内皮機能を改善する物質としてそのまま使用可能な産物、または消費用機能性食品または薬物の製造に使用するための産物を作成することである。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、内皮機能不全ならびにこれに関連する障害および疾患を予防、軽減、または治療する方法であって、かかる処置を必要とする個体に内皮機能を改善するペプチドまたはこれを含む産物を所望の効果を与えるのに十分な量にて投与することをによる方法、提供することである。
【００２３】
本発明のさらなる目的は、内皮機能不全ならびにこれに関連する障害および疾患を予防、軽減、または治療する方法であって、かかる処置を必要とする個体に高含量のカゼイン由来低分子ペプチドを含み、かつカゼイン含有出発物質をラクトバチルス・ヘルベティカス株 LBK-16H、DSM 13137またはラクトバチルス・ヘルベティカス株 LB 1936、DSM 17754で発酵させ、所望によりカゼインおよび／または他の乳タンパク質および／またはラクトースを部分的にまたは完全に除去して調製された産物を、所望の効果を与えるのに十分な量にて投与することによる方法、提供することである。好ましい態様において、発酵産物はナノ濾過もうける。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明により、驚くべきことに、上記目的が低分子ペプチド、特にトリペプチド Ile-Pro-Pro (IPP)、Val-Pro-Pro (VPP)により達成されることが明らかとなった。この度、これらペプチドが内皮機能を正常化させ、血管の弾性を改善し、動脈の剛性に対抗しうることが証明された。
【００２５】
本発明で使用するペプチドは、カゼインまたは乳などのカゼイン含有物質の加水分解により得られるペプチドに相当する生物活性ペプチドである。短鎖ジ-、トリ-およびテトラペプチドおよびそれらの混合物が好適と考えられる。特に、ペプチドは、トリペプチド IPPおよびVPP、IPPおよびVPPを含む混合物、ならびにこれらを含む産物および組成物である。
【００２６】
好ましい態様は、内皮機能不全および内皮依存損傷の正常化に優れた可能性を提供する。
【００２７】
本発明はすなわち、内皮機能を改善する産物の調製におけるカゼイン由来低分子ペプチドの使用に関する。
【００２８】
本発明はさらに、カゼイン由来低分子ペプチドを含む産物の、内皮機能を改善する産物の調製における使用に関する。
【００２９】
好ましくは、カゼイン由来低分子ペプチドは、ジ-、トリ-、およびテトラペプチドおよびそれらの混合物を含む。IPPおよびVPP含量が高いことが最も好ましい。
【００３０】
本発明はさらに、カゼイン含有出発物質を乳酸菌で発酵させ、場合によりさらに得られたペプチド含有発酵産物をナノ濾過して得られた高含量のカゼイン由来低分子ペプチドを有する産物の、内皮機能を改善する産物の調製における使用、に関する。
【００３１】
好ましい態様として、本発明は、カゼイン由来ペプチド、ミネラルおよび乳酸菌生菌を含む酸味組成物の、内皮機能不全を改善する産物の調製における使用、に関する。
【００３２】
本発明はまた、内皮機能および内皮依存損傷を正常化するペプチドまたはそれらを含む産物を、所望の効果を与えるのに十分な量にて個体に投与することにより、内皮機能および内皮依存損傷を正常化する方法、に関する。
【００３３】
個体は、主としてヒトである。本発明にしたがい使用する産物の正の効果は当然に、動物、特にペットおよび家畜動物、にも有益である。これらの例には、イヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、および家禽が含まれる。
【００３４】
トリペプチドVPPおよびIPPは、合成的に、またはこれら配列を含む物質の加水分解により、調製することができる。好ましい態様において、ペプチドは、カゼインまたはカゼイン含有出発物質から発酵により調製される。WO 01/32905に記載の方法を使用することが特に好ましく、本方法では生物活性ペプチドを含む産物が発酵により形成され、その後濃縮およびナノ濾過される。この好ましい態様は、WO 01/32905（引用により本明細書に含まれる）に詳述されるように、様々なタイプの出発物質の使用および最終産物の組成の所望の改変に優れた可能性を提供する。
【００３５】
本発明にしたがい使用するための生物活性ペプチドが発酵により形成される場合、出発物質は、所望の生物活性ペプチドの配列をそれ自身のペプチドまたはタンパク質配列の一部として含むいずれの産物であってもよい。乳タンパク質、特にカゼインを、そのまま、または各種調製物の形態にて使用することが好ましい。好適な出発物質にはまた、スキムミルクまたは各種脂肪含量の乳などの様々なカゼイン含有乳産物そのもの、または対応する乳粉末、および酸味乳産物、例えば、酸乳、バターミルク（butter milk）、ヨーグルト、未精製乳、フレッシュチーズ（unripened cheese）などの形態のものが含まれる。
【００３６】
発酵は、出発物質から所望のペプチドを産生できるいずれの乳酸菌によって行ってもよい。好適な乳酸菌は、例えばラクトバチルス、ラクトコッカス、ロイコノストック、ストレプトコッカスおよびビフィドバクテリウム属に属する種に存在しうる。最もタンパク分解性のある乳酸菌はラクトバチルス・ヘルベティカスであり、したがって本目的に特に好適であると考えられる。好ましいラクトバチルス・ヘルベティカス株は、L. ヘルベティカス LBK-16H, DSM 13137 (国際公開WO 01/32836に詳述）である。特に好ましくは、ラクトバチルス・ヘルベティカス LB 1936, DSM 17754 (特許出願FI20065054に詳述）である。
【００３７】
乳酸菌は、純粋培養物としても混合培養物としても、常套的に使用される市販の酸味料と共にでも別にでも、使用可能である。乳酸菌はまた、他の微生物と一緒にでも使用可能である。
【００３８】
発酵条件は、所望の効果をもたらすのに十分な量の生物活性ペプチドを形成するように使用株の要求を満たすよう選択される。温度、pHおよび通気などの好適な条件の選択は、当業者の専門的知識の一部である。常套的には、発酵は約30-45℃で行われる。発酵は、所望の量の生物活性ペプチドが形成されるまで継続することができる。通常これには約20-30時間かかる。各種ペプチドの混合物が発酵中に形成される。発酵を十分な長さで継続すると、比較的低分子のジ-およびトリペプチド、例えばVal-Pro-Pro (VPP) およびIIe-Pro-Pro (IPP)が主に得られる。約22-24時間のインキュベーション時間が好ましい。
【００３９】
得られた細胞懸濁液をそのまま使用してもよく、あるいは常套的方法でペプチドを分離および精製してもよい。濃縮は好ましい処理であり、これは例えば細胞懸濁液を部分的または完全に蒸発または乾燥させること、例えば懸濁液をプレート上に塗布し、乾燥させ、最終的に粉砕して保存状態のよい乾燥粉末にすることによる。
【００４０】
細胞懸濁液をナノ濾過によりさらに処理することは、動脈剛性などの内皮機能において活性を有するペプチドの産生を可能にし、同時にその産物に所望のミネラル組成をもたらしうる優れた方法であることが証明されている。ナノ濾過膜のタイプおよび方法の条件を選択することにより、得られる産物の組成を操作することができる。
【００４１】
ナノ濾過は所望の乾物含量範囲まで行い、それは約20-40%であってよく、あるいはおよその容積濃度比で約5-20までであってよい。ナノ濾過により、産物のペプチド含量が増加する。最終産物の組成は当然に、用いた発酵条件、任意のナノ濾過処置、および可能性ある他の前処理または追加処理に依存する。
【００４２】
本発明において、トリペプチド IPPおよびVPPならびにこれらを含む産物は、驚くべきことに動脈剛性を減少させ、それゆえ内皮機能不全を改善することが示された。10週間の治療期間中、動脈剛性を測定する自由行動下動脈剛性インデックス (ambulatory arterial stiffness index, AASI) が、トリペプチド IPPおよびVPPを含む産物を投与された試験群において対照群と比較して有意に改善された；最初の非最適化試験においても、このインデックスは対照群と比較して約9％減少した。処置期間の終わりの平均AASIは、ラクトバチルス・ヘルベティカス群において0.31 ± 0.15、対照群において0.34 ± 0.17であった。
【００４３】
前述の産物は、所望の効果を達成するためにそのまま使用することができる。産物はまた、乾燥し、粉末または凍結乾燥調製物の形態で使用することもできる。産物はまた、好ましくは機能性食品または他の製品の製造に使用することができる。医療品または医薬品としての応用も可能である。
【００４４】
本明細書における「食料品」の概念は広範な意味を有し、固体、ゼリー状、液体の形態であってもよい全ての消費可能な産物を包含し、また、既製品と、消費過程で生物活性ペプチドまたはこれを含む産物が添加物またはその産物の一部として添加される産物との両方を包含する。食料品は、例えば乳製品および飲料製品である。典型的産物には、乳産物、例えばヨーグルト、凝固乳（curdled milk）、カード、酸乳、酸全乳、バターミルク、他の酸乳産物、フレッシュチーズ、および熟成チーズ（ripened cheese）、スナックバーのフィリングなどがある。別の重要な群には、飲料、例えばホエイ飲料、果実飲料、および炭酸飲料が含まれる。
【００４５】
本発明によれば、生物活性ペプチドまたはこれを含む産物は、所望の効果の達成に十分な量にて使用される。上記の二段階法により得た産物を使用する場合、使用量は主にホエイの濃縮度に依存し、例えば最終産物の重量から計算して0.1-30%、好ましくは約5-15%である。
【００４６】
生物活性ペプチドまたはこれを含む産物は、製造中の食品にも製造後の食品にも添加可能である。すなわち問題の食品は、対応する食品に含まれる他の成分に加えて所望のペプチドまたはこれを含む産物を含み、これらの通常の食品と味および挙動において完全に一致する。
【００４７】
本発明を以下の実施例により詳細に説明する。これら実施例は単に本発明を例示する目的で提供され、いかなる意味においても保護範囲を限定するものと解されてはならない。本実施例は、IPPおよびVPPそのものまたは組合せの、内皮機能を増強することによる動脈剛性に対する有益、有利、かつ治療的な効果、ならびにこの生物活性ペプチドを投与するための好ましい最終産物を、説明および提示する。
【実施例】
【００４８】
実施例１
動脈剛性に対する生物活性産物の効果
動脈剛性は、超音波装置または圧平眼圧計（applanation tonometry）により、または自由行動下動脈剛性インデックス (AASI)を用いて、測定することができる。AASIは、1-（24時間自由行動下測定中の弛緩期圧または収縮期圧の傾斜）と規定され、動脈剛性の信頼性ある指標である (Li Y, Wang JG, Dolan E, Gao PJ, Guo HF, Nawrot T. ambulatory arterial stiffness index derived from 24-hour ambulatory blood pressure monitoring. Hypertension 2006; 47(3):359-64)。
【００４９】
無作為プラセボ対照平衡群試験において、いかなる薬物処置も受けていない94人の高血圧患者に、実施例２にしたがい調製したラクトバチルス・ヘルベティカス LBK-16H 発酵乳または対照産物を、4週間のラン・イン期間の後に10週間与えた。24時間自由行動下血圧測定を治療期間の開始時および終了時に行った。平均ベースライン収縮期血圧および弛緩期血圧の値は、ラクトバチルス・ヘルベティカス群において132.6 ± 9.9/83.0 ± 8.0 mmHg、対照群において130.3 ± 9.6 /80.2 ± 7.0 mmHgであった。
【００５０】
10週間の治療期間の終了時点で、収縮期血圧（SBP）および弛緩期血圧（DBP）は、対照群と比較してラクトバチルス・ヘルベティカス群においてより減少した。SBPに対する処置効果は、-4.1 (95% CI: -6.6 から -1.8, p<0.001)であった。DBPに対する処置効果は、-1.8 (95% CI: -3.7 から -0.0, p=0.048)であった。
【００５１】
AASIインデックスは、自由行動下血圧値を用い、これらをLi et al. （前述）に記載の方法により解析して決定した。AASIインデックスは、男性および女性の両方において年齢にともない直線的に増加した。AASIインデックスの値は高いよりも低い方がより好ましく、それゆえその値が減少すると動脈剛性インデックスが良好になる。平均ベースラインAASIは、ラクトバチルス・ヘルベティカス群において0.36 ± 0.15、対照群において0.36 ± 0.17であった。処置期間の終了時点で、平均AASIは、ラクトバチルス・ヘルベティカス群において0.31 ± 0.14、対照群において0.34 ± 0.15であった。
【００５２】
10週間の治療期間中、AASIインデックスは、試験群においては統計学的に有意に改善したが (p=0.043)、対照群では統計学的に有意ではなかった (p=0.47) (表１)。
【表１】
2009537492.tif 000002
【００５３】
実施例２
本発明に有用な産物の調製
ラクトバチルス・ヘルベティカス 株 LBK 16-H, DSM 13137を、MRSブロス中、37度で24時間増殖させ、再構成乳に植菌し (10%)、種菌を作成した。2回の増殖サイクル後、種菌 (15%) を9-10%のスキムミルク粉乳から構成される発酵培地に植菌し、110℃で10分間滅菌した。発酵は、37℃で22-24時間、継続的に強力に撹拌しながら行った。この産物(a)は、そのまま、乾燥形態および／または粉砕形態にて使用可能であり、あるいは、この産物から所望のペプチドを既知の方法で分離することもできる。
【００５４】
上記プロセスを、ラクトバチルス・ヘルベティカス LB 1936, DSM 17754と、スキムミルク粉末のかわりにリッチミルク（rich milk）またはバターミルクをそれぞれ用いて繰り返し、対応産物（b）および（c）を得た。
【００５５】
実施例３
本発明に有用な最終産物の調製
ペプチド濃縮
市販の酸乳に約1%のペプチド濃縮物を添加して、内皮機能不全を正常化する活性を有するペプチドを含む酸乳を調製した。この産物の組成を表２に示し、比較のため、市販の酸乳産物であるAB 酸乳（Valio Ltd製造）の組成も表２に示す。
【００５６】
Evolus（登録商標）ペプチド濃縮物について、実施例２に記載のように発酵を行った。得られた細胞懸濁液を遠心分離により清澄化して分離した。このように前処理したホエイを、Nanomax-50 メンブランにより40℃、圧力30バールにてナノ濾過した。ホエイは、容積濃度比が9になるまでろ過した。
【表２】
2009537492.tif 000003
【００５７】
実施例４
本発明に有用な最終産物の調製
Evolus（登録商標）Tehojuoma 発酵乳飲料
Evolus（登録商標）1日量Tehojuoma発酵乳飲料について、実施例２に記載のように発酵を行った。さらに、実施例３に記載のように調製した1%のEvolus（登録商標）ペプチド濃縮物を発酵乳に添加した。1日所要量の活性成分を含むこの産物はそのまま使用される。この産物の栄養情報を表３に示す。発酵乳飲料が含むさらなる成分は、殺菌スキムミルク、乳タンパク質濃縮物、増粘剤、海藻カルシウム、酸度調整剤、酸味料、香料、ビタミン(葉酸、B6、B12) および着色料である。
【表３】
2009537492.tif 000004
【００５８】
実施例５
本発明に有用な最終産物の調製
ソフトタイプのチーズ
フレッシュチーズ、フレッシュチーズスプレッド、およびカッテージチーズなどのソフトタイプのチーズを常套的製造方法にて製造した。例えば、Evolus（登録商標）フレッシュチーズスプレッドは、クワルク（quarg）、クリーム、またはバターを他の成分と混合し、加熱し、包装して製造した。実施例３に記載のように調製したEvolus登録商標）ペプチド濃縮物をクワルク-脂肪混合物に添加した。1日所要量の活性成分を含むこの産物はそのまま使用される。
【手続補正書】
【提出日】平成21年5月14日(2009.5.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内皮機能を改善する産物を調製するための、Ile-Pro-Proおよび／またはVal-Pro-Proの使用。
【請求項２】
内皮機能を改善する産物を調製するためにIle-Pro-Proおよび／またはVal-Pro-Proを含む産物を使用することを特徴とする、請求項１の使用。
【請求項３】
内皮機能を改善する産物を調製するために、高含量のカゼイン由来低分子ペプチドを含み、かつカゼイン含有出発物質を乳酸菌で発酵させることにより調製された産物を使用する、請求項２の使用。
【請求項４】
内皮機能を改善する産物を調製するために、高含量のカゼイン由来低分子ペプチドを含み、かつカゼイン含有出発物質をラクトバチルス・ヘルベティカス株 LBK-16H、DSM 13137またはラクトバチルス・ヘルベティカス株 LB 1936、DSM 17754で発酵させ、所望によりカゼインおよび／または他の乳タンパク質および／またはラクトースを部分的にまたは完全に除去し、そして得られたペプチド含有発酵産物をナノ濾過して、調製された産物を使用する、請求項３の使用。
【請求項５】
内皮機能を改善する産物を調製するために、カゼイン由来低分子ペプチド Ile-Pro-Proおよび／またはVal-Pro-Proおよび乳酸菌生菌を含む酸味組成物を使用する、請求項２の使用。
【請求項６】
カゼイン由来低分子ペプチドが短鎖ペプチドの混合物を含むことを特徴とする、請求項３−５のいずれかの使用。
【請求項７】
内皮機能不全に関連する障害および疾患の予防または治療用の医療品の製造のための、請求項１−６のいずれかの使用。
【請求項８】
産物が血管の弾性を増強することを特徴とする、請求項１−７のいずれかの使用。
【請求項９】
最終産物が食用産物であることを特徴とする、請求項１−８のいずれかの使用。
【請求項１０】
最終産物が、乳製品、飲料製品、加工食製品、食肉加工製品、パン製品、または菓子製品であることを特徴とする、請求項９の使用。
【請求項１１】
最終産物が発酵乳製品であることを特徴とする、請求項１０の使用。
【請求項１２】
最終産物が、飲料、好ましくはホエイ飲料、果実飲料またはビールであることを特徴とする、請求項１０の使用。
【請求項１３】
最終産物が製薬産業品であることを特徴とする、請求項９の使用。
【請求項１４】
内皮機能不全を正常化するための組成物であって、Ile-Pro-ProおよびVal-Pro-Proならびにそれらの混合物からなる群から選択されるペプチドまたは該ペプチドを含む産物を含む組成物。
【請求項１５】
内皮機能不全およびこれに関連する障害および疾患を予防または治療するための組成物であって、Ile-Pro-ProおよびVal-Pro-Proならびにそれらの混合物からなる群から選択されるペプチドまたは該ペプチドを含む産物を含む組成物。
【国際調査報告】
2009537492.tif 000005
2009537492.tif 000006
2009537492.tif 000007
2009537492.tif 000008
2009537492.tif 000009