(57)【要約】  ＡＴリッチヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプライマー及び鎖置換活性があるポリメラーゼを用いて核酸鋳型鎖を等温核酸増幅する方法及び組成物を記載する。
2009506788.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸の等温増幅法であって以下の工程：
ａ）核酸鋳型鎖と、延長用ヌクレオチドと、ＡＴリッチ配列Ｘ及び鋳型鎖中の配列に相補的な配列Ｚを含む第１オリゴヌクレオチドプライマーと鋳型鎖に含まれる配列を含む第２オリゴヌクレオチドプライマーと、鎖置換活性がある核酸ポリメラーゼとを含有する、反応混合物を供給する工程；
ｂ）第１オリゴヌクレオチドプライマーの配列Ｚを鋳型鎖中の相補的配列にハイブリダイズさせる工程；
ｃ）第１オリゴヌクレオチドプライマーを配列Ｚの３’末端から核酸重合により合成的に延長して、鋳型鎖の少なくとも一部に相補的な配列Ｙを作製して、等温増幅される二本鎖核酸の第１鎖を形成する工程；
ｄ）第２オリゴヌクレオチドプライマーを、配列Ｙに含まれる相補的配列にハイブリダイズさせる工程；
ｅ）第２オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端を核酸重合により合成的に延長した後、等温増幅される二本鎖核酸の第２鎖を形成し、ここで、第２鎖は第１オリゴヌクレオチドプライマーの配列Ｘに相補的なＡＴリッチ配列を含み、その後、等温増幅される二本鎖核酸のＡＴリッチ領域が形成される工程；
ｆ）二本鎖核酸のＡＴリッチ領域が部分的に開いて第２鎖が第１オリゴヌクレオチドプライマーに到達できる状態になると、第１オリゴヌクレオチドプライマーを等温増幅される二本鎖核酸の第２鎖にハイブリダイズさせる工程；そして
ｇ）第２鎖にハイブリダイズした第１オリゴヌクレオチドプライマーの延長生成物を、鎖置換活性がある核酸ポリメラーゼにより重合する工程で、その後二本鎖核酸の第１鎖を置換し、等温増幅される二本鎖核酸について少なくとも１つの増幅サイクルを等温条件下で実施する工程；
工程を含む、前記方法。
【請求項２】
等温条件下での増幅サイクルがさらに、重合して第１オリゴヌクレオチドプライマーの延長生成物を形成することにより置換された第１鎖に、第２オリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせ、そして第１鎖を鋳型として用いて第２オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端を核酸重合により合成延長することを含む、請求項１の方法。
【請求項３】
核酸鋳型鎖がｓｓＲＮＡであり、反応混合物がさらに、逆転写酵素（ＲＴ）活性がある酵素及びＲＮＡを開裂する手段を含有し、その後ＲＴ活性により第１オリゴヌクレオチドプライマーを配列Ｚの３’末端から合成的に延長して第１鎖中の配列Ｙを作製し、第１鎖の合成中又は合成後に、ＲＮＡを開裂する手段によりｓｓＲＮＡ鋳型鎖を分解する、請求項１の方法。
【請求項４】
核酸鋳型鎖がｓｓＤＮＡであり、さらに、第１オリゴヌクレオチドプライマーを配列Ｚの３’末端から核酸重合により合成的に延長して鋳型鎖の少なくとも一部に相補的な配列Ｙを作製することにより作製された第１鎖から、鋳型鎖を化学的又は物理的に変性させる工程を含む、請求項１の方法。
【請求項５】
核酸鋳型鎖がｓｓＤＮＡであり、さらに以下の工程：
供給する工程で、配列ＺがハイブリダイズするｓｓＤＮＡ鋳型鎖中の配列の３’側に位置する配列にハイブリダイズする配列Ｔを含む第３オリゴヌクレオチドを反応混合物中に供給し；
第３オリゴヌクレオチドを、配列ＺがハイブリダイズするｓｓＤＮＡ鋳型鎖中の配列の３’側の位置で鋳型鎖にハイブリダイズさせる工程；そして
鎖置換活性があるポリメラーゼを用いて第３オリゴヌクレオチドの３’末端を核酸重合により合成的に延長した後、第１オリゴヌクレオチドプライマーの延長により合成された第１鎖を鋳型鎖から置換する工程；
を含む、請求項１の方法。
【請求項６】
核酸鋳型鎖がｄｓＤＮＡの第１鎖であり、さらに以下の：
供給工程で、オスモライトを反応混合物中に供給し；そして
第１オリゴヌクレオチドプライマーを配列Ｚの３’末端から核酸重合により合成的に延長して鋳型鎖の少なくとも一部に相補的な配列Ｙを作製するための鋳型として作用するｄｓＤＮＡの第１鎖に第１オリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせる前に、場合によりｄｓＤＮＡを化学的又は物理的に変性させる工程；
を含む、請求項１の方法。
【請求項７】
核酸鋳型が特定の３’末端があるｓｓＤＮＡであり、さらに、ｓｓＤＮＡの３’末端を核酸重合により合成的に延長して、第１オリゴヌクレオチドプライマーの配列Ｘに相補的なＡＴリッチ配列を作製し、ここで、等温増幅される二本鎖核酸のＡＴリッチ領域が形成されることを含む、請求項１の方法。
【請求項８】
核酸鋳型鎖がｄｓＲＮＡの第１鎖であり、さらに以下の：
供給する工程で、逆転写酵素（ＲＴ）活性がある酵素及びＲＮＡを開裂する手段を供給し；
ハイブリダイゼーションさせる工程の前に、ｄｓＲＮＡを化学的又は物理的に変性させて、第１オリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズする第１ｓｓＲＮＡ鎖と第２オリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズする第２ｓｓＲＮＡ鎖を分離し；
第１オリゴヌクレオチドプライマーの配列Ｚを、鋳型鎖として作用する第１ｓｓＲＮＡ鎖中の相補的配列にハイブリダイズさせ；
第２オリゴヌクレオチドプライマーを、第２ｓｓＲＮＡ鎖中の相補的配列にハイブリダイズさせ；
ＲＴ活性を用いて、第１ｓｓＲＮＡ鎖にハイブリダイズした第１オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端を合成的に延長して、かつ第２ｓｓＲＮＡ鎖にハイブリダイズした第２オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端を合成的に延長して；
ＲＮＡを開裂する手段を用いて第１ｓｓＲＮＡ鎖を分解し、配列Ｙが第２オリゴヌクレオチドプライマーとハイブリダイズできる状態にし；そして
ＲＮＡを開裂する手段を用いて第２ｓｓＲＮＡ鎖を分解し、第２オリゴヌクレオチドプライマーの延長生成物が第１オリゴヌクレオチドプライマーとハイブリダイズできる状態にする；
工程を含む、請求項１の方法。
【請求項９】
供給する工程で、さらにオスモライトを反応混合物中に含有させる、請求項１の方法。
【請求項１０】
供給工程で、さらにベタイン又はトリエチルアミンＮ−オキシドを反応混合物中に含有させる、請求項１の方法。
【請求項１１】
供給工程で、鎖置換活性がある核酸ポリメラーゼが好熱性生物由来のポリメラーゼである、請求項１の方法。
【請求項１２】
供給工程で、鎖置換活性がある核酸ポリメラーゼがバチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｂｓｔ）由来のＤＮＡポリメラーゼである、請求項１の方法。
【請求項１３】
ＡＴリッチ配列Ｘ又はその相補的配列が鋳型鎖の配列中に存在しない、請求項１の方法。
【請求項１４】
ＡＴリッチ配列Ｘが約１０ｎｔ以上の長さであり、少なくとも５１％のＡ及びＴ残基から構成される、請求項１の方法。
【請求項１５】
ＡＴリッチ配列Ｘが約１０ｎｔ以上の長さであり、約８５〜約１００％のＡ及びＴ残基から構成される、請求項１の方法。
【請求項１６】
重合する工程ｇ）が約６５℃で実施される、請求項１の方法。
【請求項１７】
供給する工程で、核酸鋳型に結合して第１オリゴヌクレオチドプライマーの延長を核酸鋳型の５’末端の前で制限する結合分子をさらに供給する、請求項１の方法。
【請求項１８】
結合分子が、核酸鋳型にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであり、少なくとも１つのペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックされた核酸（ＬＮＡ）又は２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド残基を含む、請求項１７の方法。
【請求項１９】
結合分子がヌクレアーゼ活性を有する、請求項１７の方法。
【請求項２０】
鎖置換活性がある核酸ポリメラーゼにまた逆転写酵素（ＲＴ）活性もあり、ＲＮＡを開裂する手段がＲＮａｓｅＨ活性のある酵素である、請求項３の方法。
【請求項２１】
鎖置換活性がある核酸ポリメラーゼにまた逆転写酵素（ＲＴ）活性をもあり、ＲＮＡを開裂する手段がＲＮａｓｅＨ活性のある酵素である、請求項８の方法。
【請求項２２】
鋳型鎖を第１鎖から物理的に変性させることが、鋳型鎖と第１鎖を分離する第１温度に混合物の温度を高め、次いで、第１オリゴヌクレオチドプライマーの延長生成物と第２オリゴヌクレオチドプライマーの延長生成物とから構成された二本鎖核酸を変性させない第２温度に混合物を冷却することを含む、請求項４の方法。
【請求項２３】
工程ｃ）において、ｓｓＤＮＡ鋳型鎖の３’末端が核酸ポリメラーゼにより延長されない、請求項４の方法。
【請求項２４】
ｄｓＲＮＡを物理的に変性させて第１ｓｓＲＮＡ鎖と第２ｓｓＲＮＡ鎖を分離することが、ｄｓＲＮＡを変性させる第１温度に混合物の温度を高め、次いで、第１ｓｓＲＮＡ鎖と第１ｓｓＲＮＡ鎖にハイブリダイズした第１オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端の合成延長により作製された鎖とから構成された二本鎖を変性させない第２温度に混合物を冷却することを含む、請求項８の方法。
【請求項２５】
核酸の直線的増幅法であって以下の：
ａ）核酸鋳型鎖と、延長用ヌクレオチドと、ＡＴリッチ配列Ｘ及び鋳型鎖中の配列に相補的な配列Ｚを含むオリゴヌクレオチドプライマーと、鎖置換活性がある核酸ポリメラーゼとを含有する、反応混合物を供給する工程；
ｂ）オリゴヌクレオチドプライマーの配列Ｚを鋳型鎖中の相補的配列にハイブリダイズさせ；
ｃ）オリゴヌクレオチドプライマーを配列Ｚの３’末端から核酸重合により合成的に延長して、鋳型鎖の少なくとも一部に相補的な配列Ｙを作製し、その後、等温増幅される二本鎖核酸の第１鎖を形成し；
ｄ）第１鎖に相補的な第２鎖であって、配列Ｙに相補的な配列、配列Ｚに相補的な配列及び配列Ｘに相補的なＡＴリッチ配列を含む鎖を合成し、その後、等温増幅される二本鎖核酸のＡＴリッチ領域が形成され；
ｅ）オリゴヌクレオチドプライマーを等温増幅される二本鎖核酸の第２鎖にハイブリダイズさせ、その際、二本鎖核酸のＡＴリッチ領域が部分的に開いて第２鎖がオリゴヌクレオチドプライマーに到達できる状態になり；そして
ｆ）第２鎖にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプライマーの延長生成物を、鎖置換活性がある核酸ポリメラーゼにより重合させ、その後二本鎖核酸の第１鎖を置換し、等温増幅される二本鎖核酸について第１増幅サイクルを等温条件下で実施し；そして
ｇ）後続の増幅サイクルで工程ｅ及びｆを反復して、核酸鋳型鎖中の配列を直線的に増幅させる工程；
を含む、前記方法。
【請求項２６】
ＡＴリッチ配列Ｘ及び目的とする核酸鋳型鎖中の配列に相補的な配列Ｚを含む第１オリゴヌクレオチドプライマー並びに鎖置換活性がある核酸ポリメラーゼを含む、組成物。
【請求項２７】
請求項２６の組成物を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
［０００１］本出願は、米国仮特許出願第６０／７１４，２８１号（２００５年９月６日出願）及び米国仮特許出願第６０／７２２，０２８号（２００５年９月２９日出願）に基づく優先権を主張し、その内容を共に本明細書に援用する。
【０００２】
発明の分野
［０００２］本発明は、温度循環せずに核酸を指数的及び直線的に増幅させ、核酸を検出及び定量するための方法、組成物及びキットに関する。
【背景技術】
【０００３】
［０００３］標的核酸配列を検出及び定量するための一般的な方法は核酸ハイブリダイゼーションであり、この方法では通常は標的配列に相補的な標識核酸プローブ配列を用いる。標的配列を含有することが推測される試料とプローブをハイブリダイゼーション条件下で混合すると、プローブは標的配列にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションは多様な方法で、例えば標的配列にハイブリダイズしたプローブ上の標識からの信号を検出することにより、検出できる。
【０００４】
［０００４］多様な増幅法のいずれかを用いて標的核酸を検出可能なレベルまで増幅させることにより、標的核酸配列を検出及び定量することができる。多くの方法が温度循環を必要とする条件を用いる。これらの方法では、特異的な標的／プライマーオリゴヌクレオチドハイブリッドを形成し、プライマー末端から相補的配列を合成し、この合成により形成された二本鎖核酸を一連のサイクルで変性させて、標的配列を幾何学的に増幅させる。温度循環増幅法の例としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、転写増幅システム（ＴＡＳ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ランダムプライミング増幅（ＲＰＡ）、並びにＱベータレプリカーゼ、制限エンドヌクレアーゼ及びランダムヘキサマーを用いる増幅法があげられる。
【０００５】
［０００５］標的核酸配列を検出及び定量するための増幅法のいくつかは、温度循環せずに実施される。ある方法は、二本鎖反応生成物を脱安定化する温度で実施される。他の方法は、２組のプライマーを用い、各組は少なくとも２種類のプライマーを含む。転写介在増幅（ＴＭＡ）法では、２種類の酵素、すなわち逆転写酵素及びＲＮＡポリメラーゼを用いて、増幅生成物を生成する。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
［０００６］下記の工程を含む等温核酸増幅法を開示する：核酸鋳型鎖、延長用ヌクレオチド、ＡＴリッチ配列Ｘ及び鋳型鎖中の配列に相補的な配列Ｚを含む第１オリゴヌクレオチドプライマー、鋳型鎖に含まれる配列を含む第２オリゴヌクレオチドプライマー、並びに鎖置換活性がある核酸ポリメラーゼを含有する、反応混合物を供給し；第１オリゴヌクレオチドプライマーの配列Ｚを鋳型鎖中の相補的配列にハイブリダイズさせ；第１オリゴヌクレオチドプライマーを配列Ｚの３’末端から核酸重合により合成的に延長して、鋳型鎖の少なくとも一部に相補的な配列Ｙを作製し、その後、等温増幅される二本鎖核酸の第１鎖を形成し；第２オリゴヌクレオチドプライマーを、配列Ｙに含まれる相補的配列にハイブリダイズさせ；第２オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端を核酸重合により合成的に延長した後、等温増幅される二本鎖核酸の第２鎖を形成し、その際、第２鎖は第１オリゴヌクレオチドプライマーの配列Ｘに相補的なＡＴリッチ配列を含み、その後、等温増幅される二本鎖核酸のＡＴリッチ領域が形成され；第１オリゴヌクレオチドプライマーを等温増幅される二本鎖核酸の第２鎖にハイブリダイズさせ、その際、二本鎖核酸のＡＴリッチ領域が部分的に開いて第２鎖が第１オリゴヌクレオチドプライマーに到達できる状態になり；そして第２鎖にハイブリダイズした第１オリゴヌクレオチドプライマーの延長生成物を、鎖置換活性がある核酸ポリメラーゼにより重合させ、その後二本鎖核酸の第１鎖を置換し、等温増幅される二本鎖核酸について少なくとも１つの増幅サイクルを等温条
件下で実施する。好ましい態様では、増幅サイクルは、重合して第１オリゴヌクレオチドプライマーの延長生成物を形成することにより置換された第１鎖に、第２オリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせ、そして第１鎖を鋳型として用いて第２オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端を核酸重合により合成延長することをも含む。核酸鋳型鎖がｓｓＲＮＡである好ましい態様では、反応混合物は、逆転写酵素（ＲＴ）活性がある酵素及びＲＮＡを開裂する手段をも含有し、その後ＲＴ活性により第１オリゴヌクレオチドプライマーを配列Ｚの３’末端から合成的に延長して第１鎖中の配列Ｙを作製し、ＲＮＡを開裂する手段によりｓｓＲＮＡ鋳型鎖を分解する。他の好ましい態様では、核酸鋳型鎖はｓｓＤＮＡであり、この方法は、第１オリゴヌクレオチドプライマーを配列Ｚの３’末端から核酸重合により合成的に延長して配列Ｙを作製することにより作製された第１鎖から、鋳型鎖を化学的又は物理的に変性させる工程をも含む。核酸鋳型鎖がｓｓＤＮＡである他の好ましい態様では、この方法は下記をも含む：重合工程において、配列ＺがハイブリダイズするｓｓＤＮＡ鋳型鎖中の配列の３’側に位置する配列にハイブリダイズする配列Ｔを含む第３オリゴヌクレオチドを反応混合物中に供給し；第３オリゴヌクレオチドを、配列ＺがハイブリダイズするｓｓＤＮＡ鋳型鎖中の配列の３’側の位置で鋳型鎖にハイブリダイズさせ；そして鎖置換活性があるポリメラーゼを用いて第３オリゴヌクレオチドの３’末端を核酸重合により合成的に延長した後、第１オリゴヌクレオチドプライマーの延長により合成された第１鎖を鋳型鎖から置換する。他の好ましい態様では、核酸鋳型鎖はｄｓＤＮＡの第１鎖であり、オスモライト（ｏｓｍｏｌｙｔｅ）を反応混合物中に供給し；この方法は、第１オリゴヌクレオチドプライマーを配列Ｚの３’末端から核酸重合により合成的に延長して配列Ｙを作製するための鋳型として作用するｄｓＤＮＡの第１鎖に第１オリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせる前に、ｄｓＤＮＡを化学的又は物理的に変性させる任意工程を含むことができる。他の好ましい態様では、核酸鋳型は特定の３’末端があるｓｓＤＮＡであり、この方法は、ｓｓＤＮＡの３’末端を核酸重合により合成的に延長して、第１オリゴヌクレオチドプライマーの配列Ｘに相補的なＡＴリッチ配列を作製し、こうして等温増幅される二本鎖核酸のＡＴリッチ領域を形成することを含む。好ましい態様では、核酸鋳型鎖はｄｓＲＮＡの第１鎖であり、この方法は下記の工程を含む：逆転写酵素（ＲＴ）活性がある酵素及びＲＮＡを開裂する手段を供給し；ハイブリダイゼーション工程の前に、ｄｓＲＮＡを化学的又は物理的に変性させて、第１オリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズする第１ｓｓＲＮＡ鎖と第２オリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズする第２ｓｓＲＮＡ鎖を分離し；次いで第１オリゴヌクレオチドプライマーの配列Ｚを、第１ｓｓＲＮＡ鎖中の相補的配列にハイブリダイズさせ；第２オリゴヌクレオチドプライマーを、第２ｓｓＲＮＡ鎖中の相補的配列にハイブリダイズさせ；ＲＴ活性を用いて、第１ｓｓＲＮＡ鎖にハイブリダイズした第１オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端を合成的に延長して、かつ第２ｓｓＲＮＡ鎖にハイブリダイズした第２オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端を合成的に延長して；ＲＮＡを開裂する手段を用いて第１ｓｓＲＮＡ鎖を分解し、配列Ｙが第２オリゴヌクレオチドプライマーとハイブリダイズできる状態にし；そしてＲＮＡを開裂する手段を用いて第２ｓｓＲＮＡ鎖を分解し、第２オリゴヌクレオチドプライマーの延長生成物が第１オリゴヌクレオチドプライマーとハイブリダイズできる状態にする。下記の工程を含む、核酸の直線的増幅法をも開示する：核酸鋳型鎖、延長用ヌクレオチド、ＡＴリッチ配列Ｘ及び鋳型鎖中の配列に相補的な配列Ｚを含むオリゴヌクレオチドプライマー、並びに鎖置換活性がある核酸ポリメラーゼを含有する、反応混合物を供給し；オリゴヌクレオチドプライマーの配列Ｚを鋳型鎖中の相補的配列にハイブリダイズさせ；オリゴヌクレオチドプライマーを配列Ｚの３’末端から核酸重合により合成的に延長して、鋳型鎖の少なくとも一部に相補的な配列Ｙを作製し、その後、等温増幅される二本鎖核酸の第１鎖を形成し；第１鎖に相補的な第２鎖であって、配列Ｙに相補的な配列、配列Ｚに相補的な配列及び配列Ｘに相補的なＡＴリッチ配列を含む鎖を合成し、その後、等温増幅される二本鎖核酸のＡＴリッチ領域が形成され；オリゴヌクレオチドプライマーを等温増幅される二本鎖核酸の第２鎖にハイブリダイズさせ、その際、二本鎖核酸のＡＴリッチ領域が部分的に開いて第２鎖がオリゴ
ヌクレオチドプライマーに到達できる状態になり；第２鎖にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプライマーの延長生成物を、鎖置換活性がある核酸ポリメラーゼにより重合させ、その後二本鎖核酸の第１鎖を置換し、等温増幅される二本鎖核酸について第１増幅サイクルを等温条件下で実施し；そして後続の増幅サイクルでプライマーのハイブリダイゼーション、重合及び置換工程を反復して、核酸鋳型鎖中の配列を直線的に増幅させる。これらの方法に従って核酸増幅を実施するための組成物は、ＡＴリッチ配列Ｘ及び目的とする核酸鋳型鎖中の配列に相補的な配列Ｚを含むオリゴヌクレオチドプライマー、並びに鎖置換活性がある核酸ポリメラーゼを含み、さらに本発明方法に用いられる他のプライマー、酵素又はオスモライトを含むことができる。これらの組成物は好ましくはキットの形態である。
【０００７】
詳細な記述
［００１７］核酸増幅法は、試料中の特定の配列を検出及び定量するために広く用いられている。特定の配列（例えば標的配列）の検出及び定量は、微生物の同定及び分類、感染性疾患の診断、遺伝的異常の検出及び解明、癌に関連する遺伝的変化の同定、疾患に対する遺伝的感受性の研究、多様な種類の処置に対する応答の測定、犯罪容疑者の同定、並びに父性論争の解決など、多くの用途について重要性が増している。等温増幅法、並びに関連する方法、組成物及びキットについて以下にさらに詳細に記載する。
【０００８】
定義
［００１８］「標的核酸」又は「標的」は、標的核酸配列を含む核酸を表わす。標的核酸は、一本鎖又は二本鎖のいずれであってもよく、しばしばＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ若しくはＲＮＡの誘導体、又はその組合わせである。「標的核酸配列」、「標的配列」又は「標的領域」は、一本鎖核酸の配列の全部又は一部を含む特定の配列を意味する。標的配列は核酸鋳型内にあってもよく、鋳型は一本鎖核酸又は二本鎖核酸のいずれの形であってもよい。鋳型は精製若しくは単離した核酸であってもよく、精製若しくは単離していない核酸であってもよい。
【０００９】
［００１９］「オリゴヌクレオチド」又は「オリゴマー」は、互いに結合した２以上のヌクレオシドサブユニット又は核酸塩基サブユニットから構成されるポリマーを表わす。オリゴヌクレオチドはＤＮＡ及び／又はＲＮＡ、並びにその類似体であってもよく、糖基を含み、それらはリボース、デオキシリボース、及びその類似体であってもよい；例えばリボフラノシル部分に２’−Ｏ−メチル置換をもつリボヌクレシチド（米国特許第６，１３０，０３８号，Ｂｅｃｋｅｒら）である。ヌクレオシドサブユニットは、オリゴヌクレオチドがそれに相補的な標的核酸配列にハイブリダイズするのを妨げないホスホジエステル結合、修飾された結合などの結合により、又は非ヌクレオチド部分により結合することができる。修飾された結合には、標準ホスホジエステル結合が異なる結合で交換された結合、例えばホスホロチオエート結合又はメチルホスホナート結合が含まれる。核酸塩基サブユニットは、例えばＤＮＡの天然のデオキシリボースホスフェート主鎖を擬似ペプチド主鎖、例えば２’−アミノエチルグリシン主鎖で交換することにより結合していてもよく、これは核酸塩基サブユニットをカルボキシメチルリンカーにより中心の第二級アミンに結合させる（時には、「ペプチド核酸」又は「ＰＮＡ」という；米国特許第５，５３９，０８２号，Ｎｉｅｌｓｅｎら）。オリゴヌクレオチドの他の例には、二環式及び三環式ヌクレオシド及びヌクレオチド類似体を含む核酸類似体が含まれる（「ロックされた核酸」又は「ロックされたヌクレオシド類似体」（ＬＮＡ）という；米国特許第６，０８３，４８２号，Ｗａｎｇ；第６，２６８，４９０号，ｌｍａｎｉｓｈｉら；及び第６，６７０，４６１号，Ｗｅｎｇｅｌら）。修飾オリゴヌクレオチドが緊縮ハイブリダイゼーション条件下又は増幅条件下で標的核酸にハイブリダイズしうる限り、いかなる核酸類似体もこの用語に含まれる。修飾された検出プローブオリゴマーは、緊縮ハイブリダイゼーション条件下で優先的に標的核酸にハイブリダイズしなければならない。
【００１０】
［００２０］  特定のヌクレオチド（ｎｔ）配列をもつオリゴヌクレオチドは、周知の方法で、例えば化学的又は生化学的合成により、及び組換え核酸から、すなわち野生型染色体ＤＮＡ又はそのインビボ転写体を排除したインビトロ又はインビボ発現により製造で
きる。機能性オリゴヌクレオチドには、例えば検出プローブ、ヘルパープローブ及び捕獲プローブ、並びに増幅オリゴヌクレオチドが含まれる。
【００１１】
［００２１］「増幅オリゴヌクレオチド」、「プライマー」又は「プライマーオリゴヌクレオチド」は、標的核酸にハイブリダイズして、核酸合成の開始のためのプライマー及び／又はプロモーター鋳型として作用することができるオリゴヌクレオチドを表わす（例えば相補鎖の合成では、機能性プロモーター配列が形成される）。プライマーがＲＮＡ合成を開始するように設計する場合は、標的配列に非相補的であるけれどもＲＮＡポリメラーゼ、例えばバクテリオファージＴ７、Ｔ３又はＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼにより認識される配列を含ませてもよい。プライマーは、プライマーの延長を阻止し、又は速度若しくは量を低下させるように修飾された、３’末端を含んでもよい（米国特許第５，７６６，８４９号，ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら）。
【００１２】
［００２２］「ＡＴリッチ（ＡＴ−ｒｉｃｈ）」は、二本鎖中に２以下の水素結合を形成するヌクレオチド又は誘導体を、二本鎖中に３つの水素結合を形成するヌクレオチド又は誘導体より多数含む、例えばアデニン（Ａ）及び／又はチミン（Ｔ）をグアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）より多数含む、ヌクレオチド配列又はヌクレオチド領域を表わす。ＡＴリッチ配列は、２以下の水素結合で対合しうる塩基を５１％以上含有し（例えば少なくとも５１％のＡ及びＴ）、好ましくはそのような塩基を約６５％以上含有し、最も好ましくはそのような塩基を約８５〜１００％含有する。例えば、ＡＴリッチ配列はポリ−Ａ又はポリ−Ｔ配列であってもよく、あるいは合わせてその配列又は領域の少なくとも５１％のＡ及びＴ残基の混合物を含有する配列をＡＴリッチ配列という。ＡＴリッチ領域はその配列の残部が二本鎖のままである条件下で部分的又は完全に一本鎖になることができるので、その領域を「ブリージング領域（ｂｒｅａｔｈｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）」ということができる。
【００１３】
［００２３］「核酸増幅」又は「標的増幅」は、少なくとも１つの標的核酸配列を含む核酸分子数を増加させることを意味し、直線的増幅又は指数的増幅の場合がある。直線的な等温増幅法は鋳型核酸を増幅し、等温条件下では増幅生成物を増幅せず、１種類の増幅プライマーのみを用いて実施でき、一般に１時間で標的配列を約１，０００倍増幅する。指数的な等温増幅法は、等温条件を用いる増幅反応の後続工程で増幅反応の生成物を基質として用いて、１時間で標的配列を約１０，０００〜１００，０００倍増幅する。「増幅条件」は、増幅反応を実施する生化学的及び物理的条件の累積を表わし、これは周知の標準法に基づいて設計できる。
【００１４】
［００２４］「アンプリコン」は、核酸増幅反応で生成した標的核酸由来の核酸を表わす。アンプリコンは標的核酸配列又はその一部を含む可能性があり、標的核酸鎖と同一センス又は対向センスの場合がある。
【００１５】
［００２５］「等温」は、実質的に一定の温度、すなわち核酸重合反応が行われる反応温度を変更せずに、反応を実施することを意味する。等温増幅反応のための等温は、一般に反応の主生成物の融解温度（Ｔｍ；混合物中の潜在的に二本鎖である分子の半分が一本鎖の変性状態にある温度）より低い；すなわち一般に９０℃以下、通常は約５０〜７５℃、好ましくは約５５〜７０℃、又は６０〜７０℃、又はより好ましくは約６５℃である。重合反応を等温条件下で行うことができるが、等温法は所望により、等温増幅工程に用いられる一本鎖標的核酸を生成させるために増幅前の加熱変性工程を含んでもよい。
【００１６】
［００２６］「ポリメラーゼ」は、延長用ヌクレオチドをオリゴヌクレオチド又はアンプリコンに結合させることにより鋳型依存性のオリゴヌクレオチド延長を触媒しうる酵素を意味する。等温反応法では、ポリメラーゼは一般に鎖置換を促進する。これは、ポリメラーゼがプライマー延長に際して遭遇する下流ＤＮＡを置換する機能を示す。鎖置換活性をもつＤＮＡポリメラーゼとしては、φ２９ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウフラグメント、クレノウフラグメント（３’→５’エキソ−）、好熱性生物から単離又は由来するＤＮＡポリメラーゼ、例えばＶＥＮＴ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、９°ＮｍＤＮＡポリメラーゼ、ＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒＤＮＡポリメラーゼ、バチルス−ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ）（Ｂｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第５，８７４，２８２号；第６，１００，０７８号及び第６，０６６，４８３号，Ｒｉｇｇｓら）、及びモロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）ネズミ白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素（ＲＴ）のラージフラグメントがあげられる。好ましい態様では、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼを修飾して、それの５’エキソヌクレアーゼ活性を低下、阻止、不活性化又は除去することができる（すなわち５’−エキソ−マイナスポリメラーゼ）。ポリメラーゼは、ＭＭＬＶ  ＲＴ及びトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）ＲＴ酵素の場合のように、ＲＮＡ鋳型からＤＮＡ相補配列の延長を触媒する逆転写酵素（ＲＴ）活性をもつ場合がある（すなわち、ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ）。ＲＴ活性は天然ポリメラーゼのフラグメント中にあってもよい。好ましいポリメラーゼには、オリゴヌクレオチド延長を触媒する際に、修飾したオリゴヌクレオチド及び／又は修飾した延長用ヌクレオチドを受け入れるものが含まれる。
【００１７】
［００２７］「延長用ヌクレオチド」は、増幅中に延長生成物に取り込むことができるいずれかのヌクレオチド、すなわちＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡの誘導体を表わし、これらは標識を含む場合がある。
【００１８】
［００２８］「オスモライト」は、増幅系の浸透圧強度に関与する分子を意味し、これは好ましくは等温増幅を増強するために、ある好ましい態様に添加される。「ＲＮＡを開裂する手段」は、例えばＲＮＡを塩基（例えばＮａＯＨ）若しくはＲＮａｓｅ活性をもつ１種類以上の酵素と接触させることにより、又は剪断条件（例えば音波処理）を施すことにより、ＲＮＡを分解する成分又は条件を表わす。ある態様では、ＲＮＡを開裂する手段はＲＮａｓｅＨ活性をもつ酵素であり、これはＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖中のＲＮＡを分解する。
【００１９】
［００２９］「結合分子」は、目的標的配列の３’末端の隣又は近辺にあるＲＮＡ標的にハイブリダイゼーションその他の形で結合する物質であって、ＤＮＡプライマーの延長を目的の長さに制限するためのもの、すなわち小範囲の塩基内に定められた３’末端をもつプライマー延長生成物を作製するためのものである。これに対し、結合分子がないとプライマー延長反応により生成する３’末端は不確定である。結合分子は、終止オリゴヌクレオチド及び消化オリゴヌクレオチドとして作用する核酸領域、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡキメラ分子、又はその類似体を含んでもよい。核酸結合分子は、例えばＲＮＡを特異的に結合してＤＮＡプライマーの延長生成物を予定の長さに制限するタンパク質又は薬物を含むように修飾することができる。
【００２０】
［００３０］「終止オリゴヌクレオチド」は、標的配列の５’末端付近の標的核酸領域に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドであって、プライマーを含む新生核酸鎖のポリメラーゼによる延長を「終止」させ、その後特定の３’末端をもつ新生鎖を得るためのものである。終止オリゴヌクレオチドは標的位置にハイブリダイズし、その結果、目的とする３’末端を生成し、通常は終止オリゴヌクレオチドの延長を防ぐための遮断部分をその３’末端に含む。終止オリゴヌクレオチドは修飾構造体、例えば少なくとも１つの２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを用いて合成したもの（Majlessi et al., 1988, Nucleic Acids Res.26: 2224-9）、ＰＮＡ若しくはＬＮＡ構造体を用いて合成したもの（Petersen et al., 2000, J. MoI. Recognit. 13: 44-53）、又は鎖延長を終止させるタンパク質若しくはペプチドに結合したものを含むことができる。終止オリゴヌクレオチドの長さは、通常は少なくとも１０〜５０ｎｔ以上である。
【００２１】
［００３１］「修飾用オリゴヌクレオチド」は、ＲＮＡ標的の５’又は３’末端付近の配列にハイブリダイズしてプライマー延長を終止させるモチーフを含むオリゴマーを表わす。修飾用オリゴヌクレオチドがＲＮＡ標的の５’末端付近にハイブリダイズする場合、それは修飾酵素（例えばヌクレアーゼ）によりプライマー延長を終止させてプライマー延長生成物の３’末端を決定する。修飾用オリゴヌクレオチドがＲＮＡ標的配列の３’末端付近にハイブリダイズする場合、それは特異的修飾酵素又は化学物質に繋ぎ留められてプライマーの延長を終止させる。具体的な修飾用オリゴヌクレオチドの１つは、「消化オリゴヌクレオチド」である。これは、ＲＮＡ鋳型にハイブリダイズしてＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成する６以上の残基をもつＤＮＡオリゴマーを表わし、その際、ＲＮＡはこ
のオリゴヌクレオチドに繋ぎ留められたＲＮａｓｅＨ活性をもつ酵素のＲＮａｓｅにより選択的に消化される。
【００２２】
［００３２］「検出プローブ」又は「プローブ」は、検出に対して安定なプローブ：標的ハイブリッドを緊縮ハイブリダイゼーション条件下で形成するのに十分なほどそれの標的配列に相補的な配列をもつオリゴヌクレオチドを表わす。プローブは一般に合成オリゴマーであって、緊縮ハイブリダイゼーション条件下での標的核酸へのハイブリダイゼーションを阻害しない、標的領域外の配列に相補的な塩基を含むことができる。標的に対して相補的ではない配列は、検出及び／又は増幅を促進することができるホモポリマー領域（例えばポリ−Ａ又はポリ−Ｔ）、プロモーター配列、制限エンドヌクレアーゼ認識配列、又は目的とする二次若しくは三次構造（例えば触媒作用部位又はヘアピン構造）をもたらす配列であってもよい。
【００２３】
［００３３］「安定な」又は「検出に対して安定な」は、反応混合物の温度が混合物中に含有される核酸二本鎖の融解温度（Ｔｍ）より少なくとも２℃低く、より好ましくはＴｍより少なくとも５℃低く、よりさらに好ましくはＴｍより少なくとも１０℃低いことを意味する。
【００２４】
［００３４］「実質的に相同」又は「実質的に対応する」は、オリゴヌクレオチドが基準配列中の少なくとも１０個の連続塩基と少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも９０％同一、最も好ましくは１００％同一である少なくとも１０個の連続塩基をもつことを意味する。配列間の相同性は、比較する少なくとも１０個の連続塩基の各組における不適正塩基対の数として表示することができる。
【００２５】
［００３５］「実質的に相補的な」は、オリゴヌクレオチドが標的核酸配列中の少なくとも１０個の連続塩基に対して少なくとも８０％相補的、好ましくは少なくとも９０％相補的、最も好ましくは１００％相補的な少なくとも１０個の連続塩基を含む配列をもつことを意味する。配列間の相補性は、比較する少なくとも１０個の連続塩基の各組における不適正塩基対の数として表示することができる。「約」は隣接自然概数を表わし（例えば２４．４の下限は２４である）、特定した数値の最高１０％の分散をもつ数値を表わす（例えば「約」１０ｎｔは±１ｎｔを意味する）。
【００２６】
［００３６］「ＲＮＡ及びＤＮＡの均等物」は、同一の相補的塩基対ハイブリダイゼーションプロフィールをもつが、異なる糖部分（すなわちリボース対デオキシリボース）並びに既知の塩基置換（ＲＮＡ中のウラシルとＤＮＡ中のチミンを対比）をもつ、ＲＮＡ及びＤＮＡ分子を意味する。
【００２７】
［００３７］「ハイブリダイゼーション」又は「ハイブリダイズする」は、完全又は部分的に相補的な核酸鎖が特定のハイブリダイゼーション条件下で平行又は好ましくは逆平行の向きで互いに近接して、２つの構成鎖が水素結合により結合した安定な二本鎖構造又は領域（時には「ハイブリッド」という）を形成する機能を表わす。水素結合は一般にアデニンとチミン若しくはウラシル（ＡとＴ若しくはＵ）又はシトシンとグアニン（ＣとＧ）の間で形成されるが、他の塩基対が形成される場合もある（例えばAdams et al., The Biochemistry of the Nucleic Acids, 第11版, 1992）。
【００２８】
［００３８］「優先的にハイブリダイズする」は、緊縮ハイブリダイゼーション条件下でオリゴマーが標的核酸配列にハイブリダイズして安定なハイブリッドを形成し、例えば試料中に目的とする少なくとも１つの配列又は生物が存在するのを指示することを意味する。プローブはそれの標的核酸に特異的に、すなわち非標的核酸に対するより十分に大きな程度でハイブリダイズして、目的とする標的配列の存在（又は不存在）を正確に検出する。優先的ハイブリダイゼーションは、一般に標的と非標的のハイブリダイゼーション信号間に少なくとも１０倍の差があることを表わす。
【００２９】
［００３９］「緊縮ハイブリダイゼーション条件」又は「緊縮条件」は、目的とする標的核酸配列にオリゴマーが特異的にハイブリダイズし、他の配列にはハイブリダイズしない条件を意味する。緊縮条件は周知の要因、例えばＧＣ含量及び配列長さに応じて異なる可能性があり、分子生物学の専門家に周知の標準法によって経験的に推定又は決定できる（例えばSambrook, J. et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第2版
, Ch. 11 , pp. 11.47-11.57, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, ニューヨーク州コールドスプリングハーバー））。
【００３０】
［００４０］「アッセイ条件」は、オリゴヌクレオチドが標的核酸に安定にハイブリダイズできる条件を意味し、これはそのオリゴヌクレオチドと標的の優先的ハイブリダイゼーションを必要としない。
【００３１】
［００４１］オリゴヌクレオチドについて「本質的にからなる」は、そのオリゴヌクレオチドが指定配列に実質的に相同な配列をもち、最高４個の付加塩基を含むことができ、及び／又は最高２個の塩基がそれから欠失していてもよいことを意味する（すなわち、配列の長さと変異の制限）。付加又は欠失は、指定配列の非実質的変異であって、そのオリゴヌクレオチドがそれに要求される特性、例えばその標的に緊縮条件下で特異的にハイブリダイズする特性を阻害しない。オリゴマーは付加又は欠失なしに指定配列に実質的に類似の配列がある場合があるが、本質的に指定配列からなるプローブ又はプライマーは標的へのハイブリダイゼーションに関与又は影響しない他の核酸配列を含むことができる。
【００３２】
［００４２］「核酸二本鎖」、「二本鎖」、「核酸ハイブリッド」又は「ハイブリッド」は、二本鎖水素結合領域を含む安定な核酸構造体、例えばＲＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡ及びＤＮＡ：ＤＮＡ二本鎖分子、並びにその類似体を表わす。その構造体はいずれか既知の手段で、例えば標識プローブ、表面の質量変化に対して感受性である光学活性プローブでコーティングした支持体（米国特許第６，０６０，２３７号，Ｎｙｇｒｅｎら）又は結合剤（米国特許第５，９９４，０５６号，Ｈｉｇｕｃｈｉ）を用いて検出できる。
【００３３】
［００４３］「アンチセンス」「対向センス」又は「負センス」は、基準核酸分子、すなわちセンス核酸分子に対して完全に相補的な核酸分子を意味する。「センス」「同一センス」又は「正センス」は、基準核酸分子に対して完全に相同的な核酸分子を意味する。
【００３４】
［００４４］「由来の」は、核酸が生物から直接得られたこと、あるいは生物に由来する核酸から得られた増幅生成物であることを意味する。
【００３５】
［００４５］「捕獲プローブ」は、標的核酸に結合し（好ましくは検出プローブが標的としない領域において）、直接又は間接的に標的核酸を支持体に付着させて、標的核酸を試料などの混合物中の他の成分から分離するオリゴヌクレオチドを表わす。好ましい捕獲プローブは、標的核酸にハイブリダイズする標的結合領域、及び固定化プローブに結合する領域を含む。これには、リガンド−ライゲート結合対（例えばアビジン−ビオチン）のメンバー又は固体支持体に結合した固定化プローブに相補的な配列を使用できる。これら２領域はオリゴヌクレオチド中の連続配列でもよく、あるいは他の様式、例えば修飾されてもよい１以上のヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカーにより連結されていてもよい。捕獲プローブは標的と固定化プローブの両方を多様な条件下で結合できるが、好ましくは緊縮条件下で、まず標的核酸に溶液相動態でハイブリダイズし、次いで固定化プローブにハイブリダイズする（米国特許第６，１１０，６７８号，Ｗｅｉｓｂｕｒｇら）。
【００３６】
［００４６］「固定化プローブ」は、捕獲プローブを支持体に結合するオリゴヌクレオチドを意味する。固定化プローブは、捕獲プローブを標的及び固定化プローブにハイブリダイズさせるのに用いる条件下で安定に維持される結合又は相互作用により、支持体に直接又は間接的に結合することができる。
【００３７】
［００４７］「単離」又は「単離する」は、試料中の標的核酸部分を反応器、器具又は担体（例えば試験管、キュベット、マイクロタイタープレートウェル、フィルター、メンブレン、スライドガラス、ピペット先端）の内又は上に固定状態又は離脱可能状態で濃縮して、標的を他の成分から精製することを意味する。
【００３８】
［００４８］「精製する」又は「精製」は、試料の１以上の成分を他の試料成分から分離することを意味する。精製された成分には粒子（例えばウイルス）を含めることができるが、好ましくは一般に、他の物質、例えばタンパク質、炭水化物、脂質、非標的核酸及び／又は標識プローブを含有する可能性のある水溶液相中の標的核酸である。精製により、標的核酸が約７０％、より好ましくは約９０％、よりさらに好ましくは約９５％の他の成分から分離される。
【００３９】
［００４９］「ヘルパープローブ」又は「ヘルパーオリゴヌクレオチド」は、検出プロ
ーブとは異なる位置で標的核酸にハイブリダイズして、プローブと標的のハイブリダイゼーション率を高めるか、プローブ：標的ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）を高めるか又はそれらを共に行うオリゴヌクレオチドを表わす。
【００４０】
［００５０］「系統発生的に近縁」は、発生という意味でそれらの生物が互いに近縁であり、より遠縁の生物より高い全核酸配列相同性をもつと予想されることを意味する。系統発生樹上で隣接位置及び隣接の次の位置を占める生物は近縁であるが、系統発生樹上で隣接位置及び隣接の次の位置より遠い位置を占める生物は、有意の全配列相同性をもつ場合には近縁である。
【００４１】
前増幅及び後増幅プロセス
［００５１］等温増幅プロセスは場合によっては前増幅及び後増幅工程を伴う操作の一部であり、上記工程には、増幅前に核酸鋳型を粗製若しくは処理済みの生物試料から分離すること、等温増幅反応の１以上の増幅生成物（アンプリコン）を検出すること又は反応の１以上のアンプリコンを定量することが含まれる。１以上の前増幅及び後増幅プロセスを含む態様では、上記プロセスに適合する試薬を増幅試薬と共に供給若しくは使用し（例えば同一の収容器又は反応システム内で）又は増幅試薬とは分離しておくことができる。
【００４２】
［００５２］等温増幅法に使用するための標的核酸を単離する前増幅法は周知であり、本明細書に記載する等温増幅法と組み合わせることができる。ある態様では、１種類以上の捕獲プローブを前増幅精製に用いて鋳型核酸を試料から分離する（米国特許第６，１１０，６７８号及び第６，２８０，９５２号，Ｗｅｉｓｂｕｒｇら）。前増幅分離プロセスは、等温増幅プロセスとは別個に実施でき（例えば異なる時間及び／又は異なる反応器内）、あるいは等温増幅プロセスの一部であってもよい（例えば同時及び／又は同一反応器内）。他の態様では、前増幅精製法は支持体への核酸の非特異的結合に依存できる（例えば米国特許第５，２３４，８０９号，Ｂｏｏｍら，第６，５３４，２６２号，ＭｃＫｅｍａｎら，第５，７０５，６２８号，Ｈａｗｋｉｎｓ）。等温増幅前に標的核酸を精製するための周知の方法をいずれも使用できるが、試料中の標的核酸が本明細書に記載する等温増幅を実施できるのに十分に純粋であれば必ずしも必要ではない。
【００４３】
［００５３］ある態様では、等温増幅プロセスと合わせて増幅反応の１種類以上の反応生成物を検出し、定量することができる。反応生成物は、１種類以上の合成鎖（アンプリコン）、１種類以上の未反応オリゴヌクレオチドプライマー、未反応の延長用オリゴヌクレオチド、及び鋳型を含有してもよい。反応生成物は、反応生成物中の配列に相補的なヌクレオチド配列をもつ検出プローブ、及び所望により１種類以上の検出可能な標識又は一群の相互作用性標識を用いて検出できる。標識は周知であり、検出すべき反応生成物と会合している場合に検出できるものはいずれも使用できる：例えば放射性同位体、酵素、酵素補因子、又は基質、色素、ハプテン、発光性化合物、例えば化学発光性、蛍光性、リン光性若しくは電子化学発光性化合物、発色団、前記条件下で標的核酸と安定にハイブリダイズできない補助塩基配列、及びこれらの混合物である。ある態様には、アクリジニウムエステル（ＡＥ）標識、例えばフルオロスルホン酸４−（２−スクシンイミジルオキシカルボニルエチル）−フェニル−１Ｏ−メチルアクリジニウム−９−カルボン酸（「標準ＡＥ」）を用いる。プローブ対と共に使用できる一群の相互作用性標識（例えば米国特許第５，９２８，８６２号，Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）、又は相互作用性化合物を含む自己ハイブリダイゼーションプローブ（例えば米国特許第５，９２５，５１７号，Ｔｙａｇｉら）には、例えば酵素／基質、酵素／補因子、発光物質／消光物質、発光物質／付加物、色素二量体及びフェレスター（Ｆｏｅｒｒｅｓｔｅｒ）エネルギー伝達対が含まれる。相互作用性の発光物質／消光物質対、例えばフルオレセインとＤＡＢＣＹＬを使用できる。好ましい検出プローブ配列の長さは、最高１００塩基、通常は１０〜５０塩基、好ましくは約１８〜３５塩基である。検出プローブはしばしば、反応生成物中の１０塩基以上の領域に対して約８０％以上、９０％以上、又は１００％相補的な１０個以上の連続塩基を含む。
【００４４】
［００５４］等温増幅を含む方法に、一般に検出工程で１種類以上のヘルパープローブを使用できる。ヘルパープローブの態様は、長さが最高１００塩基、通常は１０〜５０塩基、しばしば１８〜３５塩基のオリゴマーである。好ましい態様は、目的とするアンプリ
コン又は標的核酸配列に対して約８０％以上、９０％以上、又は１００％相補的な少なくとも１０〜１５個の連続塩基を含むが、ある態様は特定の配列に特異的でなくてもよい。
【００４５】
［００５５］増幅オリゴヌクレオチドを用いて、本明細書に記載する等温増幅混合物及び反応により、核酸ポリメラーゼによる延長生成物の合成を開始する。プライマーの好ましい態様は、少なくとも１２塩基の長さであり、目的とする標的配列に特異的にハイブリダイズし、酵素により延長又は複製することができる。多様な長さ及び塩基組成のプライマーを使用できるが、好ましい態様は、等温増幅反応を実施する温度で目的とするそれらの標的配列に特異的かつ安定にハイブリダイズする１８〜４０塩基の標的結合領域がある。当業者は、ハイブリダイゼーションに影響を与えるパラメーター、例えばＴｍ、相補性、二次構造、プライマーハイブリッド形成能又は増幅効率に影響を与える可能性のある非特異的延長（プライマー二量体又は非標的複製）を生じる他の事項を考慮して、目的とする標的配列に対するプライマーを容易に設計することができる。例えば、好ましい態様のプライマーは、特に配列の３’末端における自己相補性又は交差相補性が低い。
【００４６】
［００５６］等温増幅法に用いる核酸ポリメラーゼは、鋳型依存性で、通常はプライマーの３’末端から開始して５’から３’方向へ、ＲＮＡ若しくはＤＮＡｎｔ又は両方を核酸中に取り込む物質、一般に酵素である。核酸ポリメラーゼの例には、ＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ、及びＲＮＡ指向性ＲＮＡポリメラーゼが含まれる。好ましい態様には、好熱性生物から単離したポリメラーゼ酵素、例えばＢｓｔのＤＮＡポリメラーゼ、又は天然好熱性生物ポリメラーゼ酵素の修飾形を用いる。５’エキソヌクレアーゼ活性をもつ核酸ポリメラーゼを用いる場合、増幅オリゴヌクレオチドは酵素による消化を阻止するために５’修飾を含むことができる。あるいは、５’エキソヌクレアーゼ活性を阻害又は除去するためにタンパク質分解などによりポリメラーゼ酵素を修飾してヌクレアーゼ活性をもたない活性酵素フラグメントを作製し、５’修飾プライマーの必要性を除くことができる。
【００４７】
［００５７］一般に、核酸増幅中に核酸ポリメラーゼが標的核酸鎖を鋳型として用いてヌクレオチドをプライマーの３’末端に付加し、その後ある標的核酸領域に部分的又は完全に相補的な配列を含む鎖を合成する。ある反応では、生成した二本鎖核酸の２本の鎖を化学的又は物理的に分離して、増幅を進行させる。あるいは他の手段で、例えば鎖置換の採用又は鎖（例えば鋳型鎖）の一部若しくは全部を消化する核酸分解酵素の使用により、新たに合成された鎖をプライマーに結合できるようにして、合成サイクル（１以上）により標的配列又はその相補配列を含む多数の鎖を製造することができる。
【００４８】
［００５８］増幅及び検出に用いるオリゴヌクレオチドが試料中の標的核酸に優先的にハイブリダイズし、非標的核酸にはハイブリダイズしないように、ハイブリダイゼーション反応条件（例えば反応混合物の温度、塩類濃度、界面活性剤、及び他の溶質）を選択することができる。緊縮性の高い条件下（例えば少ない塩類及び／又は高い温度）では、二本鎖ハイブリッド分子中の対合塩基間の水素結合が妨げられる（すなわち「融解」という）ので、ハイブリダイゼーション度が低下する。ハイブリダイゼーション条件は二本鎖核酸の安定性に影響を与える。すなわち、標的に特異的なオリゴヌクレオチド、例えば属特異的又は種特異的プローブを選択する際には、個々の条件におけるオリゴヌクレオチド：標的ハイブリッドの温度安定性を考慮する。
【００４９】
［００５９］一般に、安定なハイブリッドの方が不安定なハイブリッドの場合に起きるより連続的で完全に適正対合した（すなわち水素結合した）塩基対を含み、ハイブリダイゼーション条件の緊縮度を高めると、安定なハイブリッドが最後に融解するであろう。１以上の不適正塩基対合した「非規定（ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ）」又は不完全塩基対を含み、ハイブリッド中のこれらの位置ではより弱い塩基対合を生じるか、又は塩基対合が存在しない二本鎖核酸領域が、比較的高い緊縮条件下で十分に安定であって試料中の非標的核酸と交差反応することなくハイブリッドを形成して検出される可能性がある。標的配列と非標的配列の類似性、並びにオリゴヌクレオチドと標的配列及び非標的配列との相補度に応じて、１以上の不適正塩基対が、目的とする標的配列にオリゴヌクレオチドが特異的にハイブリダイズする機能を妨げない場合がある。オリゴヌクレオチド、特に検出プ
ローブは、オリゴヌクレオチド：標的ハイブリッドのＴｍと、オリゴヌクレオチド及び非標的配列（例えば、試料中の系統発生的に最も近縁の生物の非標的のｒＲＮＡ、又はｒＲＮＡをコードするＤＮＡ（ｒＤＮＡ））の間で形成されたハイブリッドのＴｍとの差を最大にするように選択される。増幅オリゴヌクレオチド、捕獲プローブ及びヘルパープローブも、特定の反応条件下で目的とする標的核酸に優先的にハイブリダイズするように設計される。特定の生物の標的配列を検出する好ましい態様では、設計方式には、相同性を最大にするような関連配列のアラインメント及び比較（例えば、ｒＲＮＡ配列中の保存された一次配列及び保存された二次構造要素のアラインメント）、目的とする標的核酸に最もユニークな配列（例えば可変領域における）の選択、並びに分子内ハイブリダイズする可能性のある配列を回避することが含まれる（例えば米国特許第５，８４０，４８８号及び第５，２１６，１４３号，Ｈｏｇａｎら，米国特許第４，８５１，３３０号，Ｋｏｈｎｅ）。オリゴヌクレオチドの長さ、配列、ＧＣ含量、及びプローブ：標的ハイブリッドとプローブ：非標的ハイブリッドとの間の熱安定性の差は、オリゴヌクレオチドを設計する際の関連要因である。目的とする標的に対するオリゴヌクレオチドの特異性を最大にするために、好ましいオリゴヌクレオチドは高緊縮条件下でそれらの標的にハイブリダイズするように設計される。この条件は標準法により予想、推定又は決定でき、好ましい条件はハイブリダイゼーション二本鎖を維持するものである（例えばSambrook et al., 前掲, Ch.
11）。ハイブリダイゼーション保護アッセイ（ＨＰＡ）を用いて、Ｔｍ、すなわち最大信号の５０％が残る温度（米国特許第５，８４０，４８８号，Ｈｏｇａｎら）を測定することができる（米国特許第５，２８３，１７４号，Ａｒｎｏｌｄら）。
【００５０】
［００６０］オリゴヌクレオチドは、いずれかの標準法（Sambrook et al., 前掲, Ch.
10）、例えばホスホロアミダイト固相化学（Caruthers et al., 1987, Methods in Enzymol. 154:287）、シアノエチルホスホロアミダイトを用いる自動合成法（Barone et al.,
1984, Nucleic Acids fles.12(10):4051）又はホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドの合成法（例えば米国特許第５，４４９，７６９号，Ｂａｔｔ）、メチルホスホナート結合を含むオリゴヌクレオチドの合成法（例えば米国特許第５，８１１，５３８号，Ｒｉｌｅｙら）により合成できる。合成後、いずれか周知の核酸精製法を用いて生成物を精製できる。
【００５１】
［００６１］オリゴヌクレオチド、例えば検出プローブ、ヘルパープローブ若しくは捕獲プローブ又は増幅オリゴヌクレオチドが、性能を高め、又は増幅生成物の特性分析を容易にするための、１以上の化学基を含むように修飾することができる。その例には、あるポリメラーゼ又はヌクレアーゼの核酸分解活性に対してオリゴヌクレオチドを抵抗性にするために、主鎖修飾オリゴヌクレオチド、又はホスホロチオエート、メチルホスホナート、２’−Ｏ−アルキル若しくはペプチド基を含有するものが含まれ、あるいはヌクレオチド間にオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション及び／又は延長を妨げない非ヌクレオチドリンカーを含むことができる（例えば米国特許第６，０３１，０９１号，Ａｒｎｏｌｄら）。オリゴヌクレオチドは修飾塩基と天然塩基の混合物を含んでもよい。
【００５２】
［００６２］増幅オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ合成の開始を防止又は阻止するために３’において修飾又は遮断されていてもよい（米国特許第５，５５４，５１６号，Ｋａｃｉａｎら）；例えばリボヌクレオチド、３’デオキシヌクレオチド残基（例えばコルジセピン（ｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ））、２’，３’−ジデオキシヌクレオチド残基、修飾ヌクレオチド、例えばホスホロチオエート、及び非ヌクレオチド結合（米国特許第６，０３１，０９１号）、又はアルカン−ジオール修飾（例えばWilk et al., 1990, Nucleic Acids
Res., 18(8):2065）による。修飾は、標的核酸配列に非相補的な開始配列に対して３’側の領域にあってもよい。異なる３’遮断プロモーター−プライマーの混合物、又は３’遮断したプロモーター−プライマーと遮断していないものとの混合物は、核酸増幅の効率を高める可能性がある。増幅プライマーを５’修飾して、それをある核酸ポリメラーゼの５’−エキソヌクレアーゼ活性に抵抗性にすることができる；例えば非ヌクレオチド基をプライマーの５’末端ヌクレオチドに付加することによる（例えば米国特許第６，０３１，０９１号）。
【００５３】
［００６３］いずれか標準的な酵素法若しくは化学的方法をオリゴヌクレオチドの合成中又は合成後に用いて（例えばSambrook et al., supra, Ch.10）、又は非ヌクレオチドリンカー基を用いて、オリゴヌクレオチドを標識することができる。標識には放射性同位体及び非放射性レポーター基（修飾ヌクレオチドを含む）が含まれ、これらを核酸配列の内部又は末端に導入できる。それらの標識を検出する方法は周知であり、選択した標識に応じて当業者が容易に選択できる。好ましい非同位体標識には、個別又は組み合わせた発蛍光団、例えば蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対（例えば米国特許第５，９２５，５１７号，Ｔｙａｇｉら）、化学発光分子、酵素、補因子、酵素基質、ハプテン若しくは他のリガンドが含まれる。標識プローブの好ましい態様には、非ヌクレオチドリンカー及びアクリジニウムエステル標識（例えば米国特許第５，１８５，４３９号及び第６，０３１，０９１号，Ａｒｎｏｌｄら）が含まれる。
【００５４】
［００６４］標的配列を含む核酸を増幅する前に試料の処理を行うことができ、これは試料中に存在する標的核酸を非標的核酸から識別するために、又はアッセイ感度を高めるために有用である。試料の処理法は周知であり、これには核酸を液相から支持体上に直接又は間接的に固定化することがあげられる（例えば米国特許第４，４８６，５３９号及び第４，５６３，４１９号，Ｒａｎｋｉら，米国特許第４，７５１，１７７号，Ｓｔａｂｉｎｓｋｙ）。いずれかの支持体、例えば基材又は粒子を使用でき、好ましい支持体は他の試料成分からの標的核酸の回収プロセスを自動化できるように磁気を帯びた粒子である（例えば米国特許第６，１１０，６７８号、第６，２８０，９５２号及び第６，５３４，２７３号，Ｗｅｉｓｂｕｒｇら，米国特許第６，３３５，１６６号，Ａｍｍａｎｎら）。
【００５５】
［００６５］標的核酸を固体支持体に固定化するためのオリゴヌクレオチドを、アッセイ条件（例えば増幅及び／又は検出のための条件）下で安定ないずれかの結合又は相互作用により支持体に直接又は間接的に結合させることができる。そのような「固定化プローブ」は標的核酸に直接結合してもよく、あるいは捕獲プローブ中の相補的配列にハイブリダイズする配列、例えばホモポリマー領域（例えばポリ−ｄＴ）又は反復配列（例えばＡＴ反復配列）を含んでもよい。直接結合、すなわち介在基を含まない結合は、共有結合、キレート形成又はイオン相互作用によるものであってもよい。一方、間接結合は、リンカー（１以上）により、例えば互いに特異的に結合する結合パートナセットのメンバーを介して少なくとも２つの異なる分子を結合させて安定な複合体にするための手段により、固定化プローブを支持体に結合させる。結合パートナセットは周知であり、例えばレポーターとリガンド、酵素と基質、酵素と補因子、酵素と補酵素、抗体と抗原、糖とレクチン、ビオチンとストレプトアビジン、配位子とキレート化剤、ニッケルとヒスチジン、実質的に相補的なオリゴヌクレオチド及び相補的核酸配列である。
【００５６】
［００６６］好ましい試料処理態様には、固定化プローブ配列と相補的捕獲プローブ配列の間の特異的結合を用いる。その際、捕獲プローブは、アッセイ条件下で標的核酸にハイブリダイズする標的結合領域をも含む。分離工程後に試料から残存する非標的核酸の数を最小限にするためには、ある標的核酸領域に対する捕獲プローブの標的結合領域の特異性が望ましいが、捕獲プローブが標的核酸を単離するためにだけ用いられる場合にはその必要はない。標的配列の後続増幅用として標的核酸を単離するために捕獲プローブを用いるのでなければ、捕獲プローブはさらに標的結合領域の内部又はその付近に結合した検出可能な標識、例えば置換又は非置換アクリジニウムエステルを含んでもよい。標識された捕獲プローブは、一本鎖核酸、例えば捕獲プローブを検出することなく、ハイブリッド核酸を特異的に検出するための均一又は半均一アッセイに使用できる。
【００５７】
［００６７］好ましい均一アッセイ態様には、標的核酸にハイブリダイズしていない捕獲プローブに付随する標識を加水分解し、一方、捕獲プローブ：標的ハイブリッドに付随する標識を保護する、ハイブリダイゼーション保護アッセイ（ＨＰＡ）を用いる。これは、標的検出のために多数のハイブリダイゼーション事象（例えば、捕獲プローブ：標的、及びプローブ：標的、又はプローブ：アンプリコン）ではなく１つの標的特異的ハイブリダイゼーション事象（捕獲プローブ：標的）しか必要としないので有利であり、使用するオリゴヌクレオチドがより少ないのでアッセイがより迅速かつ簡単に最適化される。他の
アッセイ系では、捕獲プローブの標的結合領域の特異性はより低くてもよいが、それでもこれは捕獲プローブが非標的核酸で著しく飽和されるのを避けるのに十分な程度でなければならない。したがって、これらの他の系において２つの別個の特異的標的配列を同定する要件は、適切な標的の同定を制約する場合がある。これに対し、捕獲プローブが同時に検出プローブとして機能する場合、そのような標的配列は１つだけ必要である。
【００５８】
［００６８］好ましいアッセイ方式は被験試料中の標的核酸の存在を検出する手段を含み、これは検出可能な標識の存在を必要としないものを含めた多様な手段で達成できる。好ましい態様では、検出可能な標識がある、プローブは標的核酸中の標的配列に特異的にハイブリダイズする配列を含むプローブを用いる。直接又は間接的に固定化された安定なプローブ：標的核酸ハイブリッドが形成されると、結合していないプローブを洗浄除去又は不活性化し、残存する結合したプローブを検出及び／又は測定することができる。
【００５９】
［００６９］ある態様の試料処理方式では、検出と核酸増幅を組み合わせる。そのような方式では、捕獲プローブを用いて標的核酸を直接又は間接的に固定化し、捕獲された標的核酸を他の試料成分から精製し、続いて標的核酸中の標的配列を増幅して増幅生成物を製造し、好ましくは溶液中で標識プローブにより検出する（米国特許第６，１１０，６７８号，Ｗｅｉｓｂｕｒｇら）。標的核酸は増幅に際して固定化されていてもよく、あるいは適切な条件を用いて、例えば捕獲プローブ：標的複合体及び／又は捕獲プローブ：固定化プローブ複合体のＴｍより高い温度でのインキュベーションにより、増幅前に標的核酸を支持体から溶離してもよい。好ましい態様では、例えば３’コルジセピン、３’，２’−ジデオキシヌクレオチド、非ヌクレオチドリンカー、アルカン−ジオール修飾又は非相補的残基を付与することにより３’末端を「キャッピング」又は遮断した固定化プローブ及び捕獲プローブを用いて、それらが核酸ポリメラーゼにより鋳型として用いられるのを防止又は阻止する。
【００６０】
等温増幅反応
［００７０］ＡＴリッチヌクレオチド配列を含む二本鎖核酸を、オリゴヌクレオチドプライマー、延長用ヌクレオチド、及び鎖置換活性があるポリメラーゼ酵素と等温条件下で接触させる等温増幅法の態様を開示する。一般にこの二本鎖核酸は、核酸鋳型内の１以上のサブ配列を共有する鋳型核酸増幅生成物である。しばしば、この二本鎖核酸中のＡＴリッチ配列は核酸鋳型に対して外因性であり、一般にＡＴリッチ配列を含むプライマーにより導入される。サブプロセスに至るか又はそれからの多様な経路を以下に記載する。開示した等温増幅法では、この方式は一般に、反応混合物中で二本鎖核酸、延長用ヌクレオチド、１又は２種類のプライマー、及び鎖置換活性があるポリメラーゼ酵素を接触させることを含む。これらの方法では、増幅される二本鎖核酸の第１鎖は、ＡＴリッチ配列Ｘ及び配列Ｙを含み、その際、配列Ｘは配列Ｙの５’側にあり、配列Ｙは核酸鋳型中の配列に相補的である。多くの態様では、標的核酸を鋳型として用いることにより配列Ｙを製造する第１プライマーのポリメラーゼ延長により、増幅される二本鎖核酸の第１鎖にＡＴリッチ配列Ｘが導入され、第２プライマーが第１鎖の配列（配列Ｙ中の）にハイブリダイズし、第２プライマーがポリメラーゼ活性により延長されて、増幅される二本鎖核酸を作製する。後続の等温増幅サイクル（１以上）において、第１プライマーは配列Ｘ、及び増幅される二本鎖核酸の配列にハイブリダイズする配列Ｚを含み、第２プライマーが二本鎖核酸の相補鎖中の配列Ｙにハイブリダイズする。本明細書に記載する増幅態様は、しばしばアンプリコンを後続増幅サイクル（１以上）において反応体として用いる。直線的増幅態様では、通常は１つのプライマーを用いて、鋳型鎖のみが増幅される。
【００６１】
［００７１］本明細書に開示する等温増幅のある態様にはオスモライトが含まれ、一方、他の態様には増幅のためのオスモライトは含まれない。しかし、増幅速度を高めるためにオスモライトを添加してもよい。増幅に適切であればいかなるオスモライトも使用でき、好ましい態様にはベタイン又はトリメチルアミンＮ−オキシドを用いる。等温増幅温度は、反応中に温度を実質的に変更することなく効率的な増幅をもたらすものであり、好ましい態様では約６５℃を用いる。標的置換活性があればいかなるポリメラーゼも使用でき、好ましい態様では、好熱性生物から単離したポリメラーゼ、例えばＢｓｔポリメラーゼ
を用いる。
【００６２】
［００７２］ある態様では、二本鎖核酸を増幅する核酸鋳型中に、配列Ｘ及びその相補的配列は存在しない。しかし、ある態様では、配列Ｘは核酸鋳型中の配列に相補的であるか又は実質的に同一である。ある態様では、配列Ｚ中の約６ｎｔ以上の連続配列が二本鎖核酸の第１鎖中の配列と同一ではない（すなわち、第１鎖は配列Ｚを含むプライマーがハイブリダイズする鎖に相補的な鎖である）。当該態様では、配列Ｚが存在する場合、配列Ｚ中の約８ｎｔ以上、１０ｎｔ以上、１２ｎｔ以上、１５ｎｔ以上、２０ｎｔ以上の連続配列は、二本鎖核酸の第１鎖中の配列と同一ではないか又は実質的に同一ではない。
【００６３】
［００７３］増幅のためのプライマーは一般に、鋳型核酸中の標的配列に相補的又は実質的に相補的な標的ハイブリダイゼーション領域がある。プライマーは通常は１００ｎｔ以下、通常は約１５〜８０ｎｔの範囲である。プライマーはしばしば約８〜４０ｎｔの標的ハイブリダイゼーション領域がある。好ましいプライマーは、連続約８ｎｔ以上の標的核酸中の配列に対して約８０％、９０％又は１００％相補的な、連続約８ｎｔ以上の標的ハイブリダイゼーション領域を含む。一般に、第１プライマー中の配列Ｘの長さは約８〜４０ｎｔであり、約６５〜１００％のＡＴリッチ、好ましくは約８５〜１００％のＡＴリッチであってよい。しばしば、第２プライマーがハイブリダイズする配列Ｙは配列Ｘに隣接するが、配列Ｘから塩基１個以上離れていてもよい。一般に第１プライマー中の配列Ｚの長さは約８〜４０ｎｔである。第１及び第２プライマー又は増幅法に用いる他のオリゴヌクレオチドは通常はＤＮＡであるが、ＲＮＡであってもよく、あるいは修飾された塩基、糖又は主鎖をもつ１以上のヌクレオチド誘導体を含んでもよい。プライマーはプロモーター配列を含むこともできる。配列Ｚの５’末端は、それがハイブリダイズする核酸の３’末端の５’側にあってもよく、それがハイブリダイズする核酸の３’末端を過ぎた位置にあってもよく（すなわち配列Ｚの一部が突出する）、あるいはそれがハイブリダイズする核酸の３’末端と一致してもよい。
【００６４】
［００７４］ある態様では、それから二本鎖核酸中の一方又は両方の鎖が合成される核酸鋳型は、一本鎖、例えば一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ、図１を参照）又は一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ、図２を参照）である。核酸鋳型が一本鎖である態様では、鋳型は時には二本鎖核酸の転位（ｄｉｓｌｏｃａｔｉｏｎ）生成物である。二本鎖核酸を化学的変性剤（例えば尿素、イミダゾール又はホルムアミド）と接触させ、次いで混合物を希釈することにより、又は二本鎖核酸をヒドロキシルイオン（例えばＮａＯＨ又はＫＯＨからのもの）と接触させ、次いで混合物を中和することにより、二本鎖核酸をオスモライトと接触させることにより、及び／又は標準的な熱変性法を用いて（図６を参照）、二本鎖核酸を転位させることができる。一本鎖鋳型を作製するために熱変性を用いる場合、等温増幅が起きる前に熱をかける。ＲＮＡ鋳型を用いる等温増幅態様では、その系は逆転写酵素（ＲＴ）活性をもつ酵素及び一本鎖ＲＮＡ鋳型を開裂させる手段をも含み、その際、増幅される二本鎖核酸は、ｓｓＲＮＡ鋳型にハイブリダイズした第１プライマーを延長するＲＴ、及びこの方法で作製される第１合成鎖にハイブリダイズした第２プライマーを延長する鎖置換活性があるポリメラーゼの生成物である。ある態様では、ＲＴ活性及びＲＮＡ開裂活性は同一酵素中にある。
【００６５】
［００７５］ある態様では、等温増幅法には、核酸鋳型に結合して核酸鋳型の５’末端前のある位置までに第１プライマーの延長を制限する結合分子も含まれる。そのような結合分子はｓｓＲＮＡ又はｓｓＤＮＡ標的鋳型に結合でき、核酸鋳型にハイブリダイズする終止又は修飾用オリゴヌクレオチドであってよい。結合分子はヌクレアーゼ活性を含んでもよい。その態様には、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、及び１以上の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００６６】
［００７６］ｓｓＤＮＡが鋳型である等温増幅態様では、それは二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の熱変性の生成物であってもよい。ある態様では、第１プライマーはｓｓＤＮＡ鋳型にハイブリダイズし、増幅される二本鎖核酸は第１及び第２プライマーを延長するポリメラーゼの生成物である。ある態様は、ｓｓＤＮＡ鋳型と第１プライマーの延長生成物から構成される二本鎖核酸を変性させるのに十分なほど系の温度を上昇させ、次いで第１プ
ライマーの延長生成物と第２プライマーの延長生成物から構成される二本鎖核酸を変性させない温度に冷却する工程を含む（図２を参照）。すなわち、上昇した温度によりｄｓＤＮＡが変性して鋳型を生成し、その後、等温増幅工程が実施される。ｓｓＤＮＡ鋳型配列を増幅する等温増幅反応混合物に、オスモライトを含有させることができる。
【００６７】
［００７７］ある態様では、配列Ｘをもつ第１プライマーがｓｓＤＮＡ鋳型にハイブリダイズし、ｓｓＤＮＡ鋳型の３’末端は延長されない（図６を参照）。ある態様では、この系は第３オリゴヌクレオチドを含有し、これは、第１プライマー中の配列ＺがハイブリダイズするｓｓＤＮＡ鋳型中の配列の３’側の配列にハイブリダイズする配列Ｔを含む（図３を参照）。第３オリゴヌクレオチドは、通常は１００ｎｔ以下、好ましくは約１５〜８０ｎｔを含む。配列Ｔは約８〜４０ｎｔであってよく、８ｎｔ以上の連続標的核酸配列に対して約８０％、９０％、又は１００％相補的な約８ｎｔ以上の連続配列をもつ標的ハイブリダイゼーション領域を含むことができる。ある態様では、配列Ｘを含むプライマーは、配列Ｘの５’側にもｓｓＤＮＡ鋳型中の配列にハイブリダイズする配列を含む。例えば、配列Ｔを含むオリゴヌクレオチドの５’末端が、任意長さ、好ましくは約１〜５０ｎｔのリンカーにより、配列Ｘ及びＺを含むオリゴヌクレオチドの５’末端に連結していてもよい。したがって、ある第１プライマーの態様は配列Ｔ、Ｘ及びＺを含んでもよい。
【００６８】
［００７８］第１プライマーは、ｓｓＤＮＡ鋳型にハイブリダイズする配列Ｚを含むことができ、これによりｓｓＤＮＡ鋳型の３’末端が延長される（図５を参照）。この配向は、プライマーが一本鎖鋳型にハイブリダイズすることにより、又は二本鎖鋳型の制限消化により生じる場合がある。
【００６９】
［００７９］核酸鋳型は、ある等温増幅態様、例えばｄｓＤＮＡ鋳型、ｄｓＲＮＡ鋳型、又は二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド鋳型を用いる態様では、二本鎖核酸でもよい。そのような系は、オスモライトを含有してもよい。ある態様では、第１プライマーは二本鎖核酸鋳型の１つの鎖にハイブリダイズし、増幅される二本鎖核酸は第１及び第２プライマーを延長するポリメラーゼの生成物である。ｄｓＲＮＡ鋳型に関するある態様では、この方法は、ｄｓＲＮＡ鋳型を変性させるのに十分なほど系の温度を上昇させ、次いでｄｓＲＮＡ鋳型の一方の鎖と第１プライマーの延長生成物を含む二本鎖核酸を変性させない温度に冷却することを含むことができる。そのような態様には、ｄｓＲＮＡ鋳型を開裂するための手段が含まれる。
【００７０】
［００８０］図１を参照すると、二本鎖核酸を増幅するための等温法の１態様では、反応混合物はｓｓＲＮＡ鋳型、延長用ヌクレオチド、第１及び第２オリゴヌクレオチドプライマー、逆転写酵素（ＲＴ）活性、ＲＮＡを開裂させる手段、並びに鎖置換活性があるポリメラーゼを含有する。第１プライマーはＡＴリッチ配列Ｘ及び配列Ｚを含み、その際、配列ＺがｓｓＲＮＡ鋳型にハイブリダイズし、延長されて配列Ｙが作製され、その間にＲＮＡ分解によりｓｓＲＮＡ鋳型鎖が除かれる。こうして第１プライマーの延長により、増幅される二本鎖核酸の第１鎖が形成される。第２プライマーがこの第１鎖中の配列Ｙにハイブリダイズし、こうして、増幅される二本鎖核酸の第２鎖が形成される。この増幅サイクルで、第１鎖のＡＴリッチ配列Ｘとそれに相補的な第２鎖のＡＴリッチ配列は開く（「ブリージングする」）ことができ、及び／又は第１プライマーは第２鎖の相補的なＡＴリッチ配列に結合することができ（ストランドインベージョン（ｓｔｒａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｏｎ）による）、その結果、少なくとも１つの後続重合サイクルで第１及び第２プライマーを用いて二本鎖核酸を等温増幅する系が生成する。配列Ｘ及びそれに相補的な配列はｓｓＲＮＡ鋳型中に存在しなくてよい。すなわち、配列Ｘは第１プライマー配列により供給される。関連する直線的増幅態様では、ｓｓＲＮＡは、第２プライマーなしに、ｓｓＲＮＡ鋳型、延長用ヌクレオチド、第１オリゴヌクレオチドプライマー、ＲＴ活性及び鎖置換活性があるポリメラーゼを含有する反応混合物を用いる方法で増幅される。この態様では、第１プライマーはＡＴリッチ配列Ｘ及び配列Ｚを含み、その際、配列ＺがｓｓＲＮＡ鋳型にハイブリダイズし、延長されて第１鎖延長生成物中の配列Ｙが作製される。第１鎖延長生成物に相補的な第２鎖は、第２プライマーなしに、ＲＴにより、例えばヘアピンターンの形成により合成することができる。次いで、この方法で少なくとも１つの後続重合
サイクルにおいて第１プライマーによりｓｓＲＮＡが等温増幅される。このような直線的増幅態様は、オスモライトを含有させて、又は含有させずに、かつ変性剤を含有させて、又は含有させずに実施できる。
【００７１】
［００８１］図２を参照すると、等温増幅法の他の態様が示される。これは、ｓｓＤＮＡ鋳型、延長用ヌクレオチド、第１及び第２オリゴヌクレオチドプライマー（「第１オリゴ」及び「第２オリゴ」）、並びに鎖置換活性があるポリメラーゼを含有する反応混合物中で、二本鎖核酸を増幅する。反応混合物はオスモライトを含有してもよい。第１プライマーはＡＴリッチ配列Ｘ及びヌクレオチド配列Ｚを含み、配列ＺがｓｓＤＮＡ鋳型にハイブリダイズし、延長されて配列Ｙが作製され、こうして、増幅される二本鎖核酸の第１鎖が形成される。配列Ｘ又はそれに相補的な配列はｓｓＤＮＡ鋳型中の配列に存在しなくてよい。図示した態様では、ｓｓＤＮＡ鋳型の３’末端は延長されない。鋳型／第１鎖二本鎖核酸を、部分的又は完全に変性させる（例えば物理的又は化学的手段で）。物理的手段を用いて二本鎖核酸の鎖を部分的又は完全に分離する態様では、この方法は、ｓｓＤＮＡ鋳型と第１プライマーの延長生成物から構成される二本鎖核酸を変性させるのに十分な程度に系の温度を上昇させ、次いで第１プライマーの延長生成物と第２プライマーの延長生成物から構成される二本鎖核酸を変性させない温度に系を冷却することを含む。第２プライマーが第１鎖中のヌクレオチド配列Ｙにハイブリダイズし、第２プライマーが延長され、こうして、増幅される二本鎖核酸の第２鎖が形成される。増幅される二本鎖核酸中のＡＴリッチＸ配列及びそれに相補的なＡＴリッチ配列に第１プライマーが到達でき（図１に記載するように）、少なくとも１つの後続重合サイクルにおいて、実質的に図１に記載するように第１及び第２オリゴヌクレオチドプライマーを用いて二本鎖核酸の等温増幅サイクルが進行する。関連する直線的増幅態様では、ｓｓＤＮＡは、第２オリゴヌクレオチドプライマーなしに、ｓｓＤＮＡ鋳型、延長用ヌクレオチド、第１オリゴヌクレオチドプライマー、及び鎖置換活性があるポリメラーゼを互いに接触させることにより増幅される。この場合、第１オリゴヌクレオチドプライマーはＡＴリッチ配列Ｘ及び配列Ｚを含み、その際、配列ＺがｓｓＲＮＡ鋳型にハイブリダイズし、延長されて配列Ｙが作製される。ｓｓＤＮＡを等温増幅するこの方法には、少なくとも１つの後続重合サイクルにおいて、第１オリゴヌクレオチドプライマーが用いられる。この直線的増幅態様は、オスモライト又は変性工程を用いて、又は用いずに実施できる。
【００７２】
［００８２］図３を参照すると、ｓｓＤＮＡ鋳型、延長用ヌクレオチド、第１、第２及び第３オリゴヌクレオチド、並びに鎖置換活性があるポリメラーゼを含有する反応混合物を用いる、二本鎖核酸増幅のための等温法の態様が示される。第１プライマー（「第１オリゴ」）はＡＴリッチ配列Ｘ及び配列Ｚを含み、その際、配列ＺがｓｓＤＮＡ鋳型にハイブリダイズし、ポリメラーゼにより延長されて配列Ｙが作製され、こうして、増幅される二本鎖核酸の第１鎖が形成される。第２プライマー（「第２オリゴ」）は第１鎖中のヌクレオチド配列Ｙの一部にハイブリダイズし、延長され、こうして、増幅される二本鎖核酸の第２鎖が形成される。第３オリゴヌクレオチドは、第１プライマー中の配列ＺがハイブリダイズするｓｓＤＮＡ鋳型中の配列の３’側にある配列にハイブリダイズする配列Ｔを含む。第３オリゴヌクレオチド（置換用プライマーということができる）はポリメラーゼにより合成延長され、それの延長生成物は第１プライマーから作製された延長生成物を鋳型鎖から置換する。二本鎖核酸中のＡＴリッチ領域（Ｘ配列とそれに相補的なＡＴリッチ配列から構成される）が部分的に開いて、二本鎖核酸の一方の鎖に配列Ｘを含む第１プライマーがハイブリダイゼーション及びストランドインベージョンできる状態になり、こうして重合及び鎖置換が起き、その結果、第１及び第２プライマーを用いて二本鎖核酸を等温増幅するための少なくとも１つの増幅サイクルが行われる（図３の右側を参照）。配列Ｘ又はそれに相補的な配列はｓｓＤＮＡ鋳型中に存在しなくてよい。ある態様では、第１プライマーと第３オリゴヌクレオチドはそれらの５’末端で連結し、したがって第１プライマーが配列Ｔを含む。
【００７３】
［００８３］図４を参照すると、二本鎖核酸増幅のための等温法の他の態様が示され、この場合、標的核酸は二本鎖核酸、例えばｄｓＤＮＡ鋳型である。この系では、反応混合
物は二本鎖核酸鋳型を延長用ヌクレオチド、第１及び第２オリゴヌクレオチドプライマー（それぞれ「第１オリゴ」及び「第２オリゴ」）、並びに鎖置換活性があるポリメラーゼ酵素と接触させる。反応混合物はオスモライトをも含有し、化学的変性剤を含有してもよく、含有しなくてもよい。第１プライマーはＡＴリッチ配列Ｘ及び配列Ｚを含み、その際、配列Ｚが二本鎖核酸鋳型の一方の鎖にハイブリダイズし、ポリメラーゼにより延長されて配列Ｙが作製される。こうして、増幅される二本鎖核酸の第１鎖が形成される。第２プライマーは配列Ｙの一部にハイブリダイズし、延長されて、増幅される二本鎖核酸の第２鎖が形成される。増幅される二本鎖核酸は、一方の鎖中に５’側ＡＴリッチ−Ｘ配列、及び相補鎖中に相補的な３’側ＡＴリッチ配列を含み、これらのＡＴリッチ配列は増幅サイクル中に部分的に一本鎖となることができ（図４の右側部分に示す）、第１プライマー（Ｘ配列を含む）が到達できる状態になり、ポリメラーゼにより鎖置換されて相補鎖が作製され、二本鎖核酸の他方の鎖が離脱して第２プライマーとハイブリダイズし、これがポリメラーゼにより延長される。こうしてこの系は、第１及び第２プライマーを用いて少なくとも１つの後続重合サイクルで二本鎖核酸を等温増幅する。図４には二本鎖核酸鋳型をｄｓＤＮＡとして示すが、あるいはそれはｄｓＲＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであってもよい。配列Ｘ及びそれに相補的な配列は第１プライマーによりこの系に導入されるので、二本鎖核酸鋳型中に存在しなくてよい。関連する直線的増幅態様では、反応混合物中で二本鎖核酸鋳型、延長用ヌクレオチド、第１オリゴヌクレオチドプライマー、及び鎖置換活性があるポリメラーゼを接触させる方法で、ＤＮＡは第２プライマーを用いずに増幅される。第１プライマーは、前記のようにＡＴリッチ配列Ｘ及び配列Ｚを含み、延長されて配列Ｙを作製する。第２プライマーは、前記のように配列Ｙの一部にハイブリダイズし、延長されて、増幅される二本鎖核酸の第２鎖が形成される。しかし、増幅サイクルでは第１プライマーのみが用いられ、少なくとも１つの後続重合サイクルで二本鎖核酸の一方の鎖を等温増幅する。直線的増幅態様は、オスモライト又は変性剤を反応混合物中に用いて、又は用いずに実施できる。
【００７４】
［００８４］図５を参照すると、二本鎖核酸増幅のための等温法の他の態様が示され、この場合、鋳型はｓｓＤＮＡ鎖である。このｓｓＤＮＡは特定の３’末端をもつことができ、これはＤＮＡ鎖の天然末端、又は化学的、機械的若しくは酵素などによる処理から生じた切断により導入された末端である。この系では、反応混合物はｓｓＤＮＡ鋳型、延長用ヌクレオチド、第１及び第２オリゴヌクレオチドプライマー、並びに鎖置換活性があるポリメラーゼを接触させ、オスモライト又は変性剤を含有するか、又は含有しない。第１プライマー（「第１オリゴ」）はＡＴリッチ配列Ｘ及び配列Ｚを含み、その際、配列ＺがｓｓＤＮＡ鋳型にハイブリダイズする。第１プライマーはポリメラーゼにより延長されてヌクレオチド配列Ｙが作製され、こうして、増幅される二本鎖核酸の第１鎖が形成される。第１オリゴヌクレオチドプライマーがｓｓＤＮＡにハイブリダイズすると、ｓｓＤＮＡ鋳型の３’末端がポリメラーゼにより延長され（すなわち、第１プライマーを鋳型として）、こうして、増幅される二本鎖核酸の第２鎖が形成される。この二本鎖核酸は、Ｘ配列とそれに相補的な配列から構成される二本鎖ＡＴリッチ領域を含む。二本鎖核酸のＡＴリッチ領域は、「ブリージングする」、すなわち部分的に開くことができ、第１プライマーがストランドインベージョンできる状態となり、第１プライマーが鎖置換活性があるポリメラーゼにより延長され、こうして新たな相補鎖が作製され、第２プライマー（「第２オリゴ」）は増幅中に配列Ｙの一部にハイブリダイズすることができる。こうして、二本鎖核酸の等温増幅には、少なくとも１つの後続重合サイクルで第１及び第２オリゴヌクレオチドプライマーが用いられる。配列Ｘ及びそれに相補的な配列はｓｓＤＮＡ鋳型中に存在しなくてよい。関連する直線的増幅態様では、ｓｓＤＮＡは、第２オリゴヌクレオチドプライマーなしに、反応混合物中でｓｓＤＮＡ鋳型、延長用ヌクレオチド、第１オリゴヌクレオチドプライマー、及び鎖置換活性があるポリメラーゼを接触させることにより増幅される；オスモライト又は変性剤は含有されるか、又は含有されない。第１プライマーは前記の構造特徴及び機能を含み、配列Ｙが作製され、前記のように第１オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズするとｓｓＤＮＡ鋳型の３’末端が延長される。少なくとも
１つの後続重合サイクルにおいて、第１オリゴヌクレオチドプライマーのみを用いて、すなわち図５に示す「第２オリゴ」なしで、ｓｓＤＮＡ配列が等温増幅される。
【００７５】
［００８５］図６を参照すると、二本鎖核酸増幅のための等温法の他の態様が示され、これは、反応混合物中でｄｓＲＮＡ鋳型、延長用ヌクレオチド、第１及び第２オリゴヌクレオチドプライマー、ＲＮＡを開裂するための手段、並びに鎖置換活性があるポリメラーゼを接触させることを含む。ｄｓＲＮＡを物理的及び／又は化学的標準法で変性して一本鎖にする。第１プライマー（「第１オリゴ」）はＡＴリッチ配列Ｘ及び配列Ｚを含む。第１プライマーはｄｓＲＮＡの一方の鎖に配列Ｚによりハイブリダイズし、延長されてヌクレオチド配列Ｙが作製され、こうして、増幅される二本鎖核酸の第１鎖が形成される。第２プライマー（「第２オリゴ」）は、新たに合成された第１鎖中の配列Ｙの一部にハイブリダイズし、延長され、こうして、増幅される二本鎖核酸の第２鎖が形成される。第２プライマーはｄｓＲＮＡ鋳型の変性により生じた他方の鎖にもハイブリダイズすることができ、ポリメラーゼにより延長されて二本鎖核酸が作製され、これはｄｓＲＮＡ鋳型自体がＡＴリッチ領域を含有しない限りＡＴリッチ配列を含まない。二本鎖核酸の鎖を分離するために、この方法ではｄｓＲＮＡ鋳型が変性するのに十分なほど系の温度を高め、次いでｄｓＲＮＡ鋳型の一方の鎖と第１オリゴヌクレオチドプライマーの延長生成物から構成される二本鎖核酸が変性しない温度に系を冷却することができる。ＡＴリッチ領域（例えば、第１プライマーのＸ配列により定められるもの、及びそれに相補的なＡＴリッチ領域）を含む二本鎖核酸について、ＡＴリッチ領域は第１プライマーがストランドインベージョンできるようになり（例えば二本鎖のＡＴリッチ領域が部分的に開くことにより）、次いで鎖置換活性があるポリメラーゼが第１プライマーの３’末端を延長して二本鎖の他方の鎖を置換し、第２プライマーとハイブリダイズできる状態になる。こうして、二本鎖核酸は第１及び第２プライマーを用いて等温条件下に少なくとも１つの増幅サイクルで増幅される（図６の右側部分に示す）。配列Ｘ及びそれに相補的な配列はｄｓＲＮＡ鋳型中に存在しなくてもよく、この場合、系はオスモライト及び／又は変性剤を含有してもよい。関連する直線的増幅態様では、ＲＮＡは第２プライマーなしに（すなわち、図６に示す「第２オリゴ」なしに）、混合物中でｄｓＲＮＡ、延長用ヌクレオチド、第１オリゴヌクレオチドプライマー（前記）及び鎖置換活性があるポリメラーゼを接触させる方法で増幅される；オスモライト又は変性剤は含有されるか又は含有されない。第１プライマーが前記のように機能して、ｄｓＲＮＡの一方の鎖に相補的な核酸鎖、すなわちＡＴリッチ配列Ｘ、配列Ｚ及び配列Ｙを含む第１合成鎖を作製する。ポリメラーゼにより、第１合成鎖に相補的な第２合成鎖が作製される（例えば、第１鎖に続いてヘアピンターンを形成する重合により；これにより第１合成鎖は鋳型として作用することができる）。生成した二本鎖核酸はＡＴリッチ領域（Ｘ配列により定められるもの、及びそれに相補的なＡＴリッチ領域）を含み、これは前記のように第１プライマーがストランドインベージョンできるようになる。次いで、少なくとも１つの増幅サイクルでポリメラーゼにより第１プライマーの３’末端が延長されて、標的が直線的に等温増幅される。
【００７６】
［００８６］本明細書に記載する方法を用いて標的核酸配列の等温増幅を実施するための試薬を含むキットは、１種類以上の前記の増幅用オリゴヌクレオチドを含むことができ、かつ等温増幅のための他の材料、例えば捕獲プローブ、支持体、ヘルパープローブ、検出プローブ、結合分子、終止オリゴヌクレオチド、修飾用オリゴヌクレオチド又は消化オリゴヌクレオチド、及びオスモライトのうち１以上を含むことができる。キットは、検出プローブを検出するための装置を含むことができる。
【００７７】
［００８７］等温増幅法の多くの態様が、反応混合物中に１種類以上のオスモライトを含有する。好ましいオスモライトには、ベタイン及び／又はトリエチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）が含まれる。１種類以上のオスモライトが、好ましくは生理的濃度に近似する濃度で含有されてもよい：例えば約０．２５ＭのＴＭＡＯ又は約１Ｍのベタイン。特定の理論又は機序に固執したいわけではないが、反応中のオスモライトはポリメラーゼと相互作用してストランド「ブリージング」を容易にすることができ、これにより鎖転位が起きる可能性はない。等温増幅を増強するオスモライトは、オスモライトを含有しない対
照反応と対比して種々のオスモライトを調べる増幅アッセイの結果を比較して増幅を増強するオスモライトを選択するルーティン試験により同定できる。
【００７８】
［００８８］ある態様は、等温増幅反応に際してオスモライトを含有せず、代わりに第１オリゴヌクレオチドプライマーが相補的ブリージング末端をもつ二本鎖核酸にインベージョンし、第１プライマーの延長に際して置換された鎖が第２オリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズする（例えば図１を参照）。関連する態様は、反応中にオスモライトを含有し、この場合は等温増幅工程で第１オリゴヌクレオチドプライマーと第２オリゴヌクレオチドプライマーが同時に二本鎖核酸にインベージョンし、延長される。
【００７９】
［００８９］検出プローブを用いて、増幅生成物にハイブリダイズさせ、検出可能な信号を発生させることにより、増幅生成物を検出することができる。検出プローブを反応中に増幅オリゴヌクレオチド（１以上）と同時に用いてもよく、あるいは増幅後に増幅生成物を接触させてもよい。プローブは、検出すべき配列（標的配列）にハイブリダイズする核酸であってもよく、これにはＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ、及びＲＮＡ／ＲＮＡ鎖間のハイブリダイゼーション、あるいは一方又は両方の鎖が少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸塩基、及び／又は塩基−塩基結合を含む鎖間のハイブリダイゼーションが含まれる。十分に相補的な２つの一本鎖はハイブリダイズして、ハイブリダイズした鎖に沿ったいずれかの地点において相補的塩基対（例えばＡとＴ又はＵ、及びＧとＣ）間で水素結合により鎖が結合した二本鎖構造体を形成できる。すなわち、相補的塩基間のハイブリダイゼーションを促進する条件下で、十分な結合により二本鎖核酸が生成する。ハイブリダイゼーションの速度及び程度は当技術分野で周知の要因により影響され、それらの要因はそのハイブリッドについての融解温度（Ｔｍ）及び使用するハイブリダイゼーション溶液に関連する数学的計算により推定でき、あるいは標準法により経験的に判定できる（Sambrook. et al., 前掲 Ch.11）。ある態様のプローブ配列は、自己相補性がないか、又は最小限になるように選択される；一方、他のプローブ態様は、ハイブリダイズしていないプローブを検出前に除去することなく試料中のプローブ：標的二本鎖を検出できるように、部分的に自己相補性であってもよい。部分相補的プローブは既知である：例えば「分子ビーコン（ｍｏｌｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ）」又は「分子スイッチ（ｍｏｌｃｕｌａｒ  ｓｗｉｔｃｈ）」プローブ（例えば米国特許第５，１１８，８０１号及び第５，３１２，７２８号，Ｌｉｚａｒｄｉら，米国特許第５，９２５，５１７号及び第６，１５０，０９７号，Ｔｙａｇｉら，Giesendorf et al., 1998, Clin. Chem. 44(3):482-6）、及び「分子トーチ（ｍｏｌｃｕｌａｒ  ｔｏｒｃｈ）」プローブ（例えば米国特許第６，３６１，９４５号，Ｂｅｃｋｅｒら）。そのようなプローブは一般に、プローブが自己ハイブリダイズしている場合にプローブが標的核酸にハイブリダイズした場合と比較して異なる信号が発生するように配置された相互作用標識（例えば発光物質／消光物質対又は発蛍光団／消光物質対）を含む。
【００８０】
［００９０］検出プローブは一般に、緊縮条件（例えば６０℃で塩類濃度約０．６〜０．９Ｍの溶液中）下で標的核酸配列又はそれの相補的配列とハイブリダイズするのに十分なほど相補的な１以上の領域がある。多様なハイブリダイゼーション条件が周知である（Sambrook et al.,前掲）。多様な長さ及び塩基組成のプローブを使用できるが、好ましい態様は最高１００塩基、好ましくは１２〜５０塩基、より好ましくは１８〜３５塩基を含む。プローブを、プローブと結合した標的配列を検出するためのいずれか既知の検出可能な標識又はレポーター基、例えば放射性同位体、抗原、蛍光性化合物、発光性部分（化学発光性、電子化学発光性又はリン光性化合物）、発色団、酵素、酵素補因子若しくは基質、色素、ハプテン又はリガンドで、標識することができる（例えばSambrook et al., 前掲, Ch.10；米国特許第６，０３１，０９１号，  Ａｒｎｏｌｄら）。好ましい態様はアクリジニウムエステル（ＡＥ）化合物で標識したものである（米国特許第５，１８５，４３９号，Ａｒｎｏｌｄら）。他の核酸又は他の生体物質、有機物質若しくは無機物質を含有する可能性のある試料中の標的配列に優先的にプローブをハイブリダイズさせ、標識又はレポーター基からの信号を検出する方法は、当技術分野で周知である。好ましい態様では、ハイブリダイズしていないプローブと結合している標識を選択的に分解し、次いでハ
イブリダイズしたプローブと結合している残存標識からの信号を測定する（米国特許第５，２８３，１７４号）。
【００８１】
［００９１］プローブ及び増幅オリゴヌクレオチドは、いずれか既知の標的捕獲法（例えば米国特許第６，１１０，６７８号，Ｗｅｉｓｂｕｒｇら，米国特許第４，４８６，５３９号，Ｒａｎｋｉら，米国特許第４，７５１，１７７号，Ｓｔａｂｉｎｓｋｙ）を用いて、固体支持体に連結している固定化オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによる捕獲を容易にする配列、例えば核酸精製に用いられるものを含むことができ、これらは自動化システムを用いて実施できる（例えばＤＴＳ（登録商標）１６００標的捕獲システム，Gen-Probe Incorporated,カリフェルニア州サンディエゴ）。
【００８２】
［００９２］検出プローブを１以上の非標識ヘルパープローブと併用して、標的ヌクレオチド配列への結合を容易にすることができる。すなわち、ヘルパープローブの存在下ではヘルパープローブの不存在下より容易にプローブ：標的核酸二本鎖が形成される（米国特許第５，０３０，５５７号，Ｈｏｇａｎら）。ヘルパープローブの使用は、緊縮ハイブリダイゼーション条件下ですら標的核酸（例えばｓｓＲＮＡ又はｓｓＤＮＡ）が二次及び三次構造領域を含む可能性のある場合に特に好ましい。そのような構造は、標的核酸への検出プローブのハイブリダイゼーションを立体的に阻害又は遮断する可能性があるからである。ヘルパープローブは、緊縮条件下で標的核酸中の配列にハイブリダイズするけれども検出プローブがハイブリダイズする配列とは異なる配列を含む。好ましいヘルパープローブの長さは、最高１００塩基、好ましくは１２〜５０塩基、より好ましくは１８〜３５塩基である。
【００８３】
［００９３］本発明には、等温増幅の実施及び／又は標的配列の検出のためのキット及び診断システムが含まれる。キット又はシステムは、少なくとも１回のアッセイに十分な量の、本明細書に記載する増幅オリゴヌクレオチド、検出プローブ、ヘルパープローブ及び／又は捕獲プローブのいずれかの組合わせを含むことができ、さらにこれらの成分を使用するための指示を明確な形で記録したものを含むことができる。増幅法及び／又は検出法に用いる成分は多様な形態で提供できる。例えば酵素、ヌクレオチド三リン酸、プローブ及び／又はプライマーは、凍結乾燥試薬（１以上）として提供でき、これを再構成するとアッセイに使用するための完成した成分混合物が形成される。キット又は診断システムは、凍結乾燥試薬を再構成するための再構成試薬（１以上）を含むことができる。標的配列を増幅するための好ましい態様では、酵素、ヌクレオチド三リン酸及び酵素補因子は、再構成すると増幅反応に使用するのに適切な試薬を形成する、単一の凍結乾燥試薬として提供される。他の好ましい態様は、凍結乾燥したプローブ試薬（１以上）を提供する。そのようなキット及びシステムのための一般的な包装材料には、検出プローブ、ヘルパープローブ及び／又は増幅オリゴヌクレオチドを保持する多様な形状（例えばバイアル、マイクロタイタープレートウェル、マイクロアレイなど）の固体基材（例えばガラス、プラスチック、紙、箔、微粒子など）が含まれる。あるシステムは、キット成分を含むほか、アッセイを実施するための計測器、例えば標識プローブからの信号を検出するためのルミノメーター、及び／又は捕獲プローブにハイブリダイズした核酸を分離するための磁気デバイスをさらに含むことができる。好ましい態様を以下の実施例に示すが、示したもののほかに他の成分及び条件を本明細書に記載する方法に使用できることは、当業者には認識されるであろう。
【実施例１】
【００８４】
オスモライトが等温増幅に与える影響
［００９４］二本鎖鋳型核酸が等温条件下でインベージョン及び延長されるかを判定するために、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼの特性を調べた。好熱性Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ−ラージフラグメントは、最高７０℃で５’→３’ポリメラーゼ活性をもつが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠如する。オスモライト、並びに鋳型核酸及びプライマーの塩基組成が、ストランドインベージョン、プライマー結合及びポリメラーゼ延長に与える影響を調べた。
【００８５】
［００９５］３’末端の１０ｎｔが「ブリージング」末端をもたらすＡ／Ｔである１２
０ｎｔのｓｓＤＮＡ鋳型について、Ｂｓｔポリメラーゼ活性を調べた。第１インナープライマーは３’末端から２０ｎｔに位置する内部部位を認識し、種々のオスモライト（ベタイン、プロリン及びトリエチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ））の存在下又は不存在下で用いられた。一本鎖１（ＳＳ１）を鋳型としてインナープライマーと共に用いた。ＳＳ１  （配列番号１）の配列は
【００８６】
【化１】
2009506788.tif 000003
【００８７】
であった。インナープライマーの配列は
【００８８】
【化２】
2009506788.tif 000004
【００８９】
であった。Ｂｓｔ反応混合物（５０μｌ）は、１μＭのプライマー、２５０μＭの各ｄＮＴＰ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、及び８単位のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ−ラージフラグメントを含有し、これを６０℃で１時間インキュベートした。増幅生成物を標準ハイブリダイゼーション保護アッセイ（ＨＰＡ）により、ＡＥ標識検出プローブ（実質的に米国特許第５，２８３，１７４号及び第５，６３９，６０４号に記載）を用いて検出した。検出プローブ配列は
【００９０】
【化３】
2009506788.tif 000005
【００９１】
（配列番号３、ｎｔ１１と１２の間でリンカーによりＡＥで標識）であった。要約すると、検出には、過剰のＡＥ標識プローブを反応物と混合して増幅標的配列にハイブリダイズさせるハイブリダイゼーション工程、続いてアルカリ試薬を添加し、ハイブリダイズしていないプローブに結合しているＡＥ標識を加水分解してそれを非−化学発光性にする選択工程が含まれ、次いでルミノメーターを用いてプローブ：標的ハイブリッドのＡＥからの化学発光を測定した（相対光単位、すなわち「ＲＬＵ」で表示）。これらの試験で、ＡＥ標識プローブはＳＳ２鎖（ＳＳ１鎖に相補的な配列）にハイブリダイズした。この場合はＨＰＡを変性方式で実施したが、他の試験には非変性方式を用いた（例えば実施例２）。変性方式ＨＰＡにおいては、試料を９５℃に５分間加熱し、約７０℃に冷却し、そしてＡＥ標識プローブを添加した（１０ｆｍｏｌ）。これに対し、非変性方式ＨＰＡでは加熱工程と冷却工程を分けなかった。
【００９２】
［００９６］オスモライトなしで、あるいは１Ｍのベタイン、０．５Ｍ若しくは１Ｍのプロリン、又は０．２５Ｍ若しくは０．５ＭのＴＭＡＯと共に、異なる量のインナープライマー（１０７、１０８及び１０９コピー／ｍｌ）を用いて、複製試験を実施した。結果（検出したＲＬＵ）を表１Ａ、１Ｂ及び１Ｃに示す。
【００９３】
【表１】
2009506788.tif 000006
【００９４】
１Ｍのベタインが存在し、１０７コピーのプライマーを用いた場合は、ベタインなしの反応についての平均１０５５ＲＬＵと比較して、平均４９７，２９０ＲＬＵが検出された。１０７コピーのプライマーを用いると、１回の延長で１５８３ＲＬＵが得られると予想されていたので、ベタインが存在すると３１４倍の増幅が達成されたと推定される。この反応では利用できるＡＥプローブ（１０ｆｍｏｌ）すべてが消費されたので、これは最小の推定である。０．２５ＭのＴＭＡＯが存在する場合、反応は接触ターンオーバー（ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｔｕｒｎｏｖｅｒ）をも示し、１０８コピーのプライマーを用いて平均１４５，１４３ＲＬＵを生成した。すなわち、このプライマーレベルで１回の延長につき１５，８３０ＲＬＵの予想値と比較して９倍の増幅である。プロリンが存在した場合、増幅の実質的な刺激はみられなかった。
【実施例２】
【００９５】
ＡＴリッチプライマーが等温増幅に与える影響
［００９７］１つのＡＴリッチ末端をもつｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡ（１２０ｎｔ）鋳型について、ＡＴリッチプライマー（「ブリージングプライマー」という）を用いてＢｓｔポリメラーゼ活性を調べ、オスモライトの不存在下で接触ターンオーバーが起きるかを判定した。ｓｓＤＮＡ鋳型はＳＳ１オリゴヌクレオチド（配列番号１）であり、ｄｓＤＮＡ鋳型は配列
【００９６】
【化４】
2009506788.tif 000007
【００９７】
をもつ相補的オリゴヌクレオチド（ＳＳ２、配列番号４）にＳＳ１がハイブリダイズしたものであった。３種類のプライマーを調べた：（１）第１プライマー：ＳＳ１鋳型の３’
末端２０ｎｔに相補的なブリージングプライマー
【００９８】
【化５】
2009506788.tif 000008
【００９９】
（２）第２プライマー：ＳＳ１鋳型の３’末端から２０ｎｔに位置する内部部位に相補的な「インナープライマー」というもの（配列番号２）；及び（３）第３オリゴヌクレオチド：
【０１００】
【化６】
2009506788.tif 000009
【０１０１】
ＳＳ２鎖の３’末端から２０ｎｔに位置する内部配列に相補的な「アウタープライマー」というもの。異なる量（１０２〜１０１０コピー／ｍｌ）の鋳型を下記の組合わせで含有する混合物中において、反応体を試験した：（１）ｄｓＤＮＡ鋳型及びブリージングプライマー（図７Ａに示す）；（２）ｄｓＤＮＡ鋳型及びインナープライマー（図７Ｂに示す）；（３）ｓｓＤＮＡ鋳型及びブリージングプライマー（図７Ｃに示す）；並びに（４）ｄｓＤＮＡ鋳型、アウタープライマー及びブリージングプライマー（図７Ｄに示す）。ｄｓＤＮＡ鋳型が関連する試験においては、ＳＳ１鎖とＳＳ２鎖を互いにハイブリダイズさせることにより鋳型を調製した（９５℃で５分間、次いで氷上で１０分間、５０ｍＭＮａＣｌ溶液中においてインキュベートした）。これらの試験において、Ｂｓｔ反応混合物（５０μｌ）は、１μＭのプライマー（５０ｐｍｏｌ）、２５０μＭの各ｄＮＴＰ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、及び８単位のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ−ラージフラグメントを含有し、これを６０℃で１時間インキュベートした。試験結果を表２に示す。実施例１に記載した変性方式ＨＰＡ検出法（表２に星印で示した）及び非変性方式ＨＰＡ検出法を用いて、ＳＳ２鎖を検出した。
【０１０２】
【表２】
2009506788.tif 000010
【０１０３】
ｄｓＤＮＡ鋳型をブリージングプライマー単独及びインナープライマー単独と共に用いた増幅については、１回の増幅について予想したＲＬＵ（１０６コピーレベルで１５８ＲＬＵ）と比較して、１０６の鋳型コピーレベルでブリージングプライマーを用いた場合（１８３，２４５ＲＬＵ）はインナープライマーを用いた場合（６１７ＲＬＵ）より多い増幅が検出された。したがってブリージングプライマーについては約１１５７倍の増幅がみられ、これはブリージングプライマーの使用によってインナープライマーを用いるより多くの接触ターンオーバーが起きたことを示す。１０６コピーレベルでブリージングプライマーの使用によるｓｓＤＮＡ鋳型の増幅は約７４３倍であった（１１７，７７８ＲＬＵ）。アウタープライマーをブリージングプライマーと組み合わせると、１０４コピー／ｍｌの鋳型で２．５×１Ｏ４倍のｄｓＤＮＡ鋳型増幅が得られ、これは２種類のプライマーを用いると増幅が増強されることを示す。したがって、オスモライトの不存在下で、ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡ鋳型のいずれかのＡＴリッチ末端を認識するＡＴリッチプライマーは等温増幅を刺激した。
【実施例３】
【０１０４】
プライマー濃度及びオスモライトが等温増幅に与える影響
［００９８］インナープライマー及びアウタープライマーによる実施例１及び２で用いた１２０ｎｔの鋳型の増幅を、２種類のプライマー濃度で、１Ｍベタインの存在下又は不存在下で測定した。鋳型ｄｓＤＮＡ、アウタープライマー、インナープライマー及び増幅条件は実施例２に記載したものであり、プライマー濃度は０．１μＭ又は１μＭであった。増幅生成物を変性方式ＨＰＡにより検出した（実施例１を参照）。種々の量の鋳型（コピー数／ｍｌ）及び５ｐｍｏｌ又は５０ｐｍｏｌのプライマーを用いて複製試験を実施した。結果（検出ＲＬＵ）を表３に報告する。これには、鋳型を実施例２のブリージングプライマーで増幅した対照試験が含まれる。
【０１０５】
【表３】
2009506788.tif 000011
【０１０６】
１０５コピー／ｍｌの鋳型で、ベタインの存在下では８９７３８倍の増幅が検出され、ベタインなしでは実質的な増幅は検出されなかった（例えば、ベタインなしの１．６×１０２ＲＬＵと比較して、ベタインの存在下では１．４×１０６ＲＬＵ）。利用できる検出プローブすべてが反応で消費されたので、これは推定される最小の増幅増強である。５０ｐｍｏｌのプライマーを用いた場合、５ｐｍｏｌのプライマーを用いた反応と比較して、より多い増幅が検出された。
【０１０７】
［００９９］１０５コピー／ｍｌのｄｓＤＮＡ鋳型並びに５０ｐｍｏｌのアウター及びインナープライマーを含有し、１Ｍベタインを含む、又は含まない反応を用いて、同様な試験を三重に実施した。オスモライトなしの反応についての８．４５×１０２ＲＬＵと比較して、オスモライトの存在下で実施した三重アッセイでは１．４×１０６ＲＬＵの平均値が得られた。すなわち、ベタインの存在下では増加が少なくとも８８，４５５倍増加した。
【実施例４】
【０１０８】
等温増幅に必要な鋳型コピー数の測定
［０１００］インナープライマーとアウタープライマーの併用による１０６、１０５及び１０４コピー／ｍｌレベルの鋳型の増幅を、実施例３の記載に従って１Ｍベタインの存在下で、ただし異なるｄｓＤＮＡ鋳型を用いて測定した。これらの試験におけるｄｓＤＮＡは２つのＡＴリッチ末端を含み、ｄｓＤＮＡは下記に示すＳＳ１及びＳＳ２オリゴヌクレオチドがハイブリダイズしたものからなっていた。
【０１０９】
【化７】
2009506788.tif 000012
【０１１０】
【化８】
2009506788.tif 000013
【０１１１】
反応条件は実施例２に記載したものであり、ベタインを含有し、又は含有せず、増幅生成物を実施例１に記載した変性方式ＨＰＡにより検出した。これらの試験において、１回の延長によって１５８ＲＬＵ未満が得られると予想され、これより高い信号はいずれも接触ターンオーバーの指標となる。陽性対照は１０１０コピー／ｍｌのｓｓＤＮＡ鋳型を含
有するが、オスモライトを含有せず、陰性対照は鋳型ＤＮＡ若しくはオスモライトを含有せず、又はｄｓＤＮＡ鋳型及びプライマーを含有するが、オスモライトを含有しなかった。１０６コピー／ｍｌのｄｓＤＮＡ鋳型では３回の複製のうち２回が陽性であり、１０５コピー／ｍｌのｄｓＤＮＡ鋳型では３回の複製すべてが陽性であり、１０４コピー／ｍｌのｄｓＤＮＡ鋳型では３回の複製のうち１回が陽性であった。したがって、１０４コピー／ｍｌの鋳型を含有する反応が陽性結果の検出に適切である。１０４コピー／ｍｌのｄｓＤＮＡ鋳型については、ベタインの存在が増幅を４．４×１０５倍増強した（１０６コピー／ｍｌのｄｓＤＮＡ鋳型を含むベタインなしの反応で検出された９２９ＲＬＵと比較して、ベタインを含む反応については６９１，９２２ＲＬＵが検出された）。これらの結果を表４に三重試験のＲＬＵとして示す。
【０１１２】
【表４】
2009506788.tif 000014
【実施例５】
【０１１３】
反応条件が増幅陽性に与える影響
［０１０１］実質的に実施例４の記載に従い、１０４コピー／ｍｌのｄｓＤＮＡ鋳型並びにインナー及びアウタープライマーを含有し、１Ｍのベタインを含む、又は含まない反応で、ここに記載する以外は実施例２に記載のものと同様な条件を用いて、等温増幅法の他の態様を試験した。増幅生成物を変性方式ＨＰＡにより検出した（実施例１に記載）。２００ｐｍｏｌのプライマーを用い、表５Ａ及び５Ｂに記載する変更（標準の条件と比較して、１０倍のＢｓｔ酵素濃度、又は２５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、又は５０μｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いる反応）を含む増幅反応で、アッセイを実施した。陽性対照は、１０９又は１０１０コピー／ｍｌのｓｓＤＮＡ鋳型及びインナープライマーのみを含む標準反応であった。陰性対照は、鋳型を含まないか、又は鋳型とプライマーを含み、オスモライトを含まなかった。それぞれの反応条件について三重試験の結果を表５Ａ及び５Ｂに示す。
【０１１４】
【表５】
2009506788.tif 000015
５０ｐｍｏｌ（実施例２）の代わりに２００ｐｍｏｌのアウター及びインナープライマーを用いると陽性結果の回数が増加し（３回のうち１回から３回のうち２回に）、５０μｇのＢＳＡの添加によって陽性結果が増加した（３回のうち２回）が、酵素、ＫＣｌ又はＭｇＳＯ４濃度を高めても陽性数は増加しなかった。
【実施例６】
【０１１５】
温度が増幅陽性に与える影響
［０１０２］温度が増幅に与える影響を判定するために、１０４コピー／ｍｌのｄｓＤＮＡ、インナー及びアウタープライマー（２００ｐｍｏｌ）、並びに１Ｍのベタインを含有し、又はオスモライトを含まない反応を用いて、同様な等温増幅を実施した。鋳型ｄｓＤＮＡは実施例４に記載したものであり、実施例２及び５に記載した条件を用い、２００ｐｍｏｌのプライマー及び５０μｇのＢＳＡを用いて、５５、６５又は７０℃でインキュベートする反応において増幅させ、増幅生成物を変性方式ＨＰＡにより検出した（実施例１に記載）。陽性対照は１０９コピー／ｍｌのｓｓＤＮＡ鋳型及びインナープライマーを含み、陰性対照は鋳型を含まなかった。表６に、５５、６５及び７０℃で実施した増幅反応の結果（３組の試験のＲＬＵ）を示す。
【０１１６】
【表６】
2009506788.tif 000016
５５、６５及び７０℃の反応温度で、結果はそれぞれ４４％の試験について陽性（９回のうち４回の反応）、６６％の試験について陽性（９回のうち６回の反応）、及び０％の試験について陽性（９回のうち０回の反応）であった。したがって、約６５℃が最適な反応温度であると思われる。
【実施例７】
【０１１７】
オスモライトがストランドインベージョンに与える影響
［０１０３］標準的な融解温度（Ｔｍ）試験（すなわち温度の関数としての２６０ｎｍにおける吸光度）を、実施例２に記載したｄｓＤＮＡ鋳型について実施して、オスモライト（１Ｍのベタイン）の存在がどのようにＴｍに影響するかを調べた。オスモライトの存在によってｄｓＤＮＡ鋳型のＴｍが８０．０℃（ベタインなし）から７８．７℃（ベタインあり）に、すなわちわずか１．３℃降下した。これは、オスモライトはｄｓＤＮＡを有意に脱安定化しなかったことを示す。系の温度（６５℃）はｄｓＤＮＡ鋳型のＴｍ（８０℃）より低いので、ｄｓＤＮＡを有意に脱安定化しなかった。
【０１１８】
［０１０４］オスモライト（１Ｍのベタイン）がｄｓＤＮＡ鋳型へのブリージングプライマーのストランドインベージョン（ポリメラーゼなし）に与える影響を、下記のものを含有するストランドインベージョンアッセイ反応により調べた：ＢＳＴ緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ７．５，１０ｍＭのＫＣｌ，１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％のＴｒｉｔｏｎ）、１Ｍのベタイン、及びＡＥ標識プローブ配列
【０１１９】
【化９】
2009506788.tif 000017
（配列番号９、ｎｔ２１と２２の間でリンカーによりＡＥで標識）、並びに下記の合成鎖から構成されるゲル精製ｄｓＤＮＡ鋳型：
【０１２０】
【化１０】
2009506788.tif 000018
【０１２１】
【化１１】
2009506788.tif 000019
これらの反応において、１ｐｍｏｌの鋳型を０、０．１、０．２５、０．５及び１．０ｐｍｏｌのＡＥ標識プローブに６５℃で３０分間、ＢＳＴ緩衝液中でハイブリダイズさせ、次いで１０μｌの反応混合物を取り出し、ＢＳＴ緩衝液で１．０ｍｌに希釈し、８０μｌの希釈混合物を付加物保護アッセイ（ＡＰＡ）（実質的に米国特許第５，７３１，１４８号に記載）に用いた。その際、混合物をまず０．２ｍｌの１４ｍＭ亜硫酸ナトリウム及び４２ｍＭのホウ酸塩（ｐＨ８．８）と混合し、１２秒後に０．２ｍｌの０．１２％Ｈ２Ｏ２及び１．５ＮのＮａＯＨと混合した。アッセイ生成物をルミノメーターでＲＬＵとして検出した（２秒間）。表７に示すＲＬＵ結果は、オスモライトの存在がポリメラーゼ不存在下でのストランドインベージョンに有意に影響しなかったことを示す。
【０１２２】
【表７】
2009506788.tif 000020
実施例２に記載したｄｓＤＮＡ鋳型及びアウタープライマーを用いて同様な試験を実施し、上記の結論と一致する結果を得た。すなわち、オスモライトはポリメラーゼが存在しない場合のストランドインベージョンに有意の影響を与えなかった。これらの所見をＴｍ測定と合わせると、オスモライトが鋳型を有意に脱安定化することはなく、むしろポリメラーゼ酵素に、又はそれと共に作用することによって、鎖置換作用を増強しうることが示される。
【実施例８】
【０１２３】
鋳型の塩基組成が等温増幅に与える影響
［０１０５］塩基組成がインベージョン及び延長の確率に影響を与えるかを判定するために、２種類のｄｓＤＮＡ鋳型を比較した：１種類は２つのＡＴリッチ末端をもち、１種類は２つのＧＣリッチ末端をもつ（４５％ＧＣ）。実施例６に記載した条件を用い、末端が異なる２種類のｄｓＤＮＡ（ＧＣリッチ末端又はＡＴリッチ末端）について増幅反応を実施した。ＧＣリッチ末端をもつｄｓＤＮＡ鋳型は下記のヌクレオチド配列をもつ合成鎖から構成されていた：
【０１２４】
【化１２】
2009506788.tif 000021
及び
【０１２５】
【化１３】
2009506788.tif 000022
ＡＴリッチ末端をもつｄｓＤＮＡ鋳型は下記のヌクレオチド配列をもつ鎖から構成されていた：
【０１２６】
【化１４】
2009506788.tif 000023
及び
【０１２７】
【化１５】
2009506788.tif 000024
これらの試験反応は、１０４コピー／ｍｌの鋳型、２００ｐｍｏｌの各プライマー（表８Ａに挙げる）、５０μｇのＢＳＡ、１Ｍのベタインを含有し、６５℃で１時間インキュベートされた。対照はベタインを含有せず、インナープライマーを１０９コピー／ｍｌのｓｓＤＮＡ鋳型と共に用い（陽性対照）、又はｄｓＤＮＡとインナー及びアウタープライマーを用い（ベタイン陰性対照）、又は鋳型若しくはプライマーを用いなかった（陰性対照）。表８ＡにＲＬＵ結果を示す。
【０１２８】
【表８Ａ】
2009506788.tif 000025
ＧＣリッチ末端をもつ鋳型を用いた反応では２２％の反応が陽性を示し（９回のうち２回の反応が陽性）、一方、ＡＴリッチ末端をもつ鋳型を用いた反応では６６％の反応が陽性を示した（９回のうち６回の反応が陽性）。これは、鋳型末端の塩基組成がストランドインベージョン及びプライマー延長に影響を与えることを示唆する。
【０１２９】
［０１０６］異なる日に、インナープライマーのみ、又はアウタープライマーのみを反応に添加した以外は表８Ａに報告した反応と同一条件下で、増幅反応を実施した。これらの反応の結果を表８Ｂに報告する。
【０１３０】
【表８Ｂ】
2009506788.tif 000026
インナー及びアウタープライマーを用いて増幅したｄｓＤＮＡ鋳型については陽性が再現された（２２％の陽性、９回のうち２回の反応）が、インナープライマー又はアウタープライマーのみを用いて１０４コピー／ｍｌの鋳型を増幅させた場合は陽性結果が得られなかった。これは、最大活性には両方のプライマーが必要であることを示唆する。
【実施例９】
【０１３１】
鋳型中の鎖の数が等温増幅に与える影響
［０１０７］鋳型ＤＮＡ中の鎖の数がストランドインベージョン及び延長の確率に影響を与えるかを判定するために、ｓｓＤＮＡ鋳型の増幅をｄｓＤＮＡ鋳型の増幅と比較した。実施例６に記載した条件（６５℃で１時間）を用い、ＧＣリッチ末端をもつ鋳型１０４コピー／ｍｌについて増幅反応を実施した。陽性対照はインナープライマーを１０９コピー／ｍｌのｓｓＤＮＡ鋳型と共に用いた。等温増幅反応のＲＬＵ結果を表９Ａに示す。
【０１３２】
【表９Ａ】
2009506788.tif 000027
これらの反応において、ｓｓＤＮＡ鋳型は４４％が陽性となり（９回のうち４回が陽性）、一方、ｄｓＤＮＡ鋳型は２２％が陽性となった（９回のうち２回が陽性；実施例８を参照）。これらの結果は、鋳型末端のプライマー位置はプライマーのハイブリダイゼーション及びポリメラーゼ延長を増強することを示唆する。
【０１３３】
［０１０８］異なる日に、表９Ａに報告したものと同じ条件下で、ただしインナープライマーのみ及びアウタープライマーのみを反応に添加して増幅反応を実施した。これらの反応の結果を表９Ｂに報告する。
【０１３４】
【表９Ｂ】
2009506788.tif 000028
インナープライマーとアウタープライマー及びｓｓＤＮＡを用いた反応については３３％の陽性がみられ（９回のうち３回が陽性）、これは表９Ａでみられた４４％の陽性に匹敵した。ベタインを含む単一プライマーは１０４の鋳型で陽性を示さず、これはこの反応に２種類のプライマーが必要であることを示す。
【実施例１０】
【０１３５】
等温増幅に用いる鋳型中のプライマーハイブリダイゼーション位置
［０１０９］ｄｓＤＮＡへのプライマーの到達可能性及びそれが等温増幅に与える影響を、２種類のｄｓＤＮＡ鋳型の増幅を比較することにより調べた：１２０ｎｔの鋳型であって各末端から２０塩基にプライマーがハイブリダイズするもの、及び８１ｎｔの鋳型であって各末端にプライマーがハイブリダイズするもの。１２０ｎｔのｄｓＤＮＡは下記の２つの鎖から構成されていた：
【０１３６】
【化１６】
2009506788.tif 000029
及び
【０１３７】
【化１７】
2009506788.tif 000030
８１ｎｔのｄｓＤＮＡは下記の２つの鎖から構成されていた：
【０１３８】
【化１８】
2009506788.tif 000031
及び
【０１３９】
【化１９】
2009506788.tif 000032
実施例８に記載した反応条件を用い、１Ｍベタインの存在下で、８１ｎｔのｓｓＤＮＡ鋳型の増幅を８１ｎｔのｄｓＤＮＡ鋳型の増幅（反応当たり１０４コピー／ｍｌ）と比較した。ベタインなしの陽性対照には反応当たり１０９コピー／ｍｌのｓｓＤＮＡ標的を用い、ベタインなしの陰性対照には反応当たり１０４コピー／ｍｌのｓｓＤＮＡ標的を用い、又は鋳型を用いなかった。表１０に結果を示す。
【０１４０】
【表１０】
2009506788.tif 000033
８１ｎｔのｓｓＤＮＡ鋳型及びｄｓＤＮＡ鋳型はそれぞれ３３％が陽性となり（９回のうち３回が陽性複製）、これは実施例９で１２０ｎｔのＧＣリッチｓｓＤＮＡ鋳型についてみられた結果（４４％が陽性）と類似していた；これらに関して、内部プライマーハイブリダイゼーション部位をもつ１２０ｎｔ鋳型の増幅の場合より陽性が高かった。したがって、鋳型末端にハイブリダイズするプライマーはプライマーのハイブリダイゼーション及びポリメラーゼ延長を増強した。ＡＴリッチ末端をもつ１２０ｎｔのｄｓＤＮＡ鋳型についてはより多い増幅がみられ（６６％が陽性、実施例６）、これは鋳型末端の脱安定化がストランドインベージョン及び増幅を高めることを示唆する。
【実施例１１】
【０１４１】
ＡＴリッチ末端である鋳型の等温増幅
［０１１０］実施例８に記載した反応条件を用いて、ｓｓＤＮＡ鋳型とｄｓＤＮＡ鋳型（反応当たり１０４コピー／ｍｌ）の増幅を比較することにより、ＡＴリッチ末端をもつ鋳型の鎖の数が等温増幅に与える影響を調べた。結果を表１１に示す。この場合、試験反応は１Ｍのベタインを含有し（欄２〜４）、陽性対照（欄５）は１０９コピー／ｍｌのｓｓＤＮＡ鋳型及びインナープライマーを含有するが、ベタインを含有せず、陰性対照は鋳型又はベタインを含有しなかった（欄６）。
【０１４２】
【表１１】
2009506788.tif 000034
アウター及びインナープライマーを用いてｄｓＤＮＡ鋳型を増幅させた場合は５５％の陽性がみられ（９回のうち５回が陽性）、これは実施例６の結果（６６％が陽性）と一致していた。２種類のプライマーを用いるｓｓＤＮＡの増幅は一貫してみられた（表１１で５５％の陽性、及び別個の試験で４４％の陽性がみられた）。単一プライマーの反応は陽性にならなかった。これは、指数増幅には２種類のプライマーが必要であることを示す。２つのＡＴリッチ末端をもつｄｓＤＮＡの陽性はＡＴリッチ末端をもたないｄｓＤＮＡ鋳型の場合より多かった。これは、鋳型末端の塩基組成がインベージョン、プライマーのハイブリダイゼーション及びポリメラーゼ延長に影響することを示唆する。
【実施例１２】
【０１４３】
１つのＡＴリッチ末端をもつｄｓＤＮＡ鋳型の等温増幅
［０１１１］ｄｓＤＮＡ鋳型中に１つのＡＴリッチ末端をもつことが増幅陽性に与える影響を、１つのＡＴリッチ末端をもつｄｓＤＮＡ鋳型の増幅を比較することにより調べた。ｄｓＤＮＡ鋳型（反応当たり１０４コピー／ｍｌ）は実施例２に記載したものであり、これを実施例８に記載した反応条件で用いた。陽性対照は１０９コピー／ｍｌのｓｓＤＮＡ鋳型及びインナープライマーのみを用い、ベタインを含有しなかった。一方、陰性対照は１０４コピー／ｍｌのｄｓＤＮＡ鋳型をインナー及びアウタープライマーと共に用い、ベタインを含有しなかった。結果を表１２に示す。
【０１４４】
【表１２】
2009506788.tif 000035
１つのＡＴリッチ末端をもつｄｓＤＮＡ鋳型は５５％陽性で増幅し（９回のうち５回が陽性）、これは２つのＡＴリッチ末端をもつ鋳型について得られた結果に匹敵する（実施例６で６６％が陽性、実施例１１で５５％が陽性）。これは、プライマーのハイブリダイゼーション部位にＢｓｔポリメラーゼの鎖置換活性が到達してその影響を及ぼすことができ、有効な増幅にとって第２のＡＴリッチ末端は不必要であることを示唆する。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】２種類のオリゴヌクレオチドを用いて一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）鋳型を増幅するための等温法を示す。
【図２】２種類のオリゴヌクレオチドを用いて一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）鋳型を増幅するための等温法を示す。
【図３】３種類のオリゴヌクレオチドを用いてｓｓＤＮＡ鋳型を増幅するための等温法を示す。
【図４】２種類のオリゴヌクレオチドを用いて二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）鋳型を増幅するための等温法を示す。
【図５】２種類のオリゴヌクレオチドを用いて、特定の３’末端があるｓｓＤＮＡ鋳型を増幅するための等温法を示す。
【図６】２種類のオリゴヌクレオチドを用いて二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）鋳型を増幅するための等温法を示す。
【図７Ａ】二本鎖核酸の１つの鎖にハイブリダイズしたブリージングプライマーを示す。
【図７Ｂ】二本鎖核酸の１つの鎖にハイブリダイズしたインナープライマーを示す。
【図７Ｃ】一本鎖核酸にハイブリダイズしたブリージングプライマーを示す。
【図７Ｄ】二本鎖核酸の異なる鎖にハイブリダイズしたブリージングプライマー及びアウタープライマーを示す。
【図１】
2009506788.tif 000036
【図２】
2009506788.tif 000037
【図３】
2009506788.tif 000038
【図４】
2009506788.tif 000039
【図５】
2009506788.tif 000040
【図６】
2009506788.tif 000041
【図７Ａ】
2009506788.tif 000042
【図７Ｂ】
2009506788.tif 000043
【図７Ｃ】
2009506788.tif 000044
【図７Ｄ】
2009506788.tif 000045
【配列表】
2009506788000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成20年5月8日(2008.5.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸の等温増幅法であって以下の工程：
ａ）反応混合物を供給する工程であって反応混合物が以下の：
ｉ）核酸鋳型鎖；
ｉｉ）延長用ヌクレオチド；
ｉｉｉ）鋳型鎖中の配列に相補的でないか又は鋳型鎖中の配列からなる５’末端ＡＴリッチ配列Ｘ、及び、鋳型鎖中の配列に相補的な３’末端配列Ｚを含む第１オリゴヌクレオチドプライマーであって、ＡＴリッチ配列Ｘの長さは約１０〜４０ｎｔでＡ及びＴの残基が約６５〜１００％で構成されている前記第１オリゴヌクレオチドプライマー；
ｉｖ）鋳型鎖に含まれる配列を含む第２オリゴヌクレオチドプライマー；と
ｖ）鎖置換活性がある核酸ポリメラーゼ；
とを含有する前記工程；
ｂ）第１オリゴヌクレオチドプライマーの配列Ｚを鋳型鎖中の相補的配列にハイブリダイズさせる工程；
ｃ）第１オリゴヌクレオチドプライマーを配列Ｚの３’末端から核酸重合により合成的に延長して、鋳型鎖の少なくとも一部に相補的な配列Ｙを作製して、等温増幅される二本鎖核酸の第１鎖を形成する工程；
ｄ）第２オリゴヌクレオチドプライマーを、配列Ｙに含まれる相補的配列にハイブリダイズさせる工程；
ｅ）第２オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端を核酸重合により合成的に延長した後、等温増幅される二本鎖核酸の第２鎖を形成し、ここで、第２鎖は第１オリゴヌクレオチドプライマーの配列Ｘに相補的なＡＴリッチ配列を含み、その後、等温増幅される二本鎖核酸のＡＴリッチ領域が形成される工程；
ｆ）二本鎖核酸のＡＴリッチ領域が部分的に開いて第２鎖が第１オリゴヌクレオチドプライマーに到達できる状態になると、第１オリゴヌクレオチドプライマーを等温増幅される二本鎖核酸の第２鎖にハイブリダイズさせる工程；そして
ｇ）第２鎖にハイブリダイズした第１オリゴヌクレオチドプライマーの延長生成物を、鎖置換活性がある核酸ポリメラーゼにより重合する工程で、その後二本鎖核酸の第１鎖を置換し、等温増幅される二本鎖核酸について少なくとも１つの増幅サイクルを等温条件下で実施する工程；
工程を含む、前記方法。
【請求項２】
等温条件下での増幅サイクルがさらに、重合して第１オリゴヌクレオチドプライマーの延長生成物を形成することにより置換された第１鎖に、第２オリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせ、そして第１鎖を鋳型として用いて第２オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端を核酸重合により合成延長することを含む、請求項１の方法。
【請求項３】
核酸鋳型鎖がｓｓＲＮＡであり、反応混合物がさらに、逆転写酵素（ＲＴ）活性がある酵素及びＲＮＡを開裂する手段を含有し、その後ＲＴ活性により第１オリゴヌクレオチドプライマーを配列Ｚの３’末端から合成的に延長して第１鎖中の配列Ｙを作製し、第１鎖の合成中又は合成後に、ＲＮＡを開裂する手段によりｓｓＲＮＡ鋳型鎖を分解する、請求項１の方法。
【請求項４】
核酸鋳型鎖がｓｓＤＮＡであり、さらに、第１オリゴヌクレオチドプライマーを配列Ｚの３’末端から核酸重合により合成的に延長して鋳型鎖の少なくとも一部に相補的な配列Ｙを作製することにより作製された第１鎖から、鋳型鎖を化学的又は物理的に変性させる工程を含む、請求項１の方法。
【請求項５】
核酸鋳型鎖がｓｓＤＮＡであり、さらに以下の工程：
供給する工程で、配列ＺがハイブリダイズするｓｓＤＮＡ鋳型鎖中の配列の３’側に位置する配列にハイブリダイズする配列Ｔを含む第３オリゴヌクレオチドを反応混合物中に供給し；
第３オリゴヌクレオチドを、配列ＺがハイブリダイズするｓｓＤＮＡ鋳型鎖中の配列の３’側の位置で鋳型鎖にハイブリダイズさせる工程；そして
鎖置換活性があるポリメラーゼを用いて第３オリゴヌクレオチドの３’末端を核酸重合により合成的に延長した後、第１オリゴヌクレオチドプライマーの延長により合成された第１鎖を鋳型鎖から置換する工程；
を含む、請求項１の方法。
【請求項６】
核酸鋳型鎖がｄｓＤＮＡの第１鎖であり、さらに以下の：
供給工程で、オスモライトを反応混合物中に供給し；そして
第１オリゴヌクレオチドプライマーを配列Ｚの３’末端から核酸重合により合成的に延長して鋳型鎖の少なくとも一部に相補的な配列Ｙを作製するための鋳型として作用するｄｓＤＮＡの第１鎖に第１オリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせる前に、場合によりｄｓＤＮＡを化学的又は物理的に変性させる工程；
を含む、請求項１の方法。
【請求項７】
核酸鋳型が特定の３’末端があるｓｓＤＮＡであり、さらに、ｓｓＤＮＡの３’末端を核酸重合により合成的に延長して、第１オリゴヌクレオチドプライマーの配列Ｘに相補的なＡＴリッチ配列を作製し、ここで、等温増幅される二本鎖核酸のＡＴリッチ領域が形成されることを含む、請求項１の方法。
【請求項８】
核酸鋳型鎖がｄｓＲＮＡの第１鎖であり、さらに以下の：
供給する工程で、逆転写酵素（ＲＴ）活性がある酵素及びＲＮＡを開裂する手段を供給し；
ハイブリダイゼーションさせる工程の前に、ｄｓＲＮＡを化学的又は物理的に変性させて、第１オリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズする第１ｓｓＲＮＡ鎖と第２オリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズする第２ｓｓＲＮＡ鎖を分離し；
第１オリゴヌクレオチドプライマーの配列Ｚを、鋳型鎖として作用する第１ｓｓＲＮＡ鎖中の相補的配列にハイブリダイズさせ；
第２オリゴヌクレオチドプライマーを、第２ｓｓＲＮＡ鎖中の相補的配列にハイブリダイズさせ；
ＲＴ活性を用いて、第１ｓｓＲＮＡ鎖にハイブリダイズした第１オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端を合成的に延長して、かつ第２ｓｓＲＮＡ鎖にハイブリダイズした第２オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端を合成的に延長して；
ＲＮＡを開裂する手段を用いて第１ｓｓＲＮＡ鎖を分解し、配列Ｙが第２オリゴヌクレオチドプライマーとハイブリダイズできる状態にし；そして
ＲＮＡを開裂する手段を用いて第２ｓｓＲＮＡ鎖を分解し、第２オリゴヌクレオチドプライマーの延長生成物が第１オリゴヌクレオチドプライマーとハイブリダイズできる状態にする；
工程を含む、請求項１の方法。
【請求項９】
供給する工程で、さらにオスモライトを反応混合物中に含有させる、請求項１の方法。
【請求項１０】
供給工程で、さらにベタイン又はトリエチルアミンＮ−オキシドを反応混合物中に含有させる、請求項１の方法。
【請求項１１】
供給工程で、鎖置換活性がある核酸ポリメラーゼが好熱性生物由来のポリメラーゼである、請求項１の方法。
【請求項１２】
供給工程で、鎖置換活性がある核酸ポリメラーゼがバチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｂｓｔ）由来のＤＮＡポリメラーゼである、請求項１の方法。
【請求項１３】
ＡＴリッチ配列Ｘが約８５〜１００％のＡ及びＴ残基から構成される、請求項１の方法。
【請求項１４】
重合する工程ｇ）が約６５℃で実施される、請求項１の方法。
【請求項１５】
供給する工程で、核酸鋳型に結合して第１オリゴヌクレオチドプライマーの延長を核酸鋳型の５’末端の前で制限する結合分子をさらに供給する、請求項１の方法。
【請求項１６】
結合分子が、核酸鋳型にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであり、少なくとも１つのペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックされた核酸（ＬＮＡ）又は２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド残基を含む、請求項１５の方法。
【請求項１７】
結合分子がヌクレアーゼ活性を有する、請求項１５の方法。
【請求項１８】
鎖置換活性がある核酸ポリメラーゼにまた逆転写酵素（ＲＴ）活性もあり、ＲＮＡを開裂する手段がＲＮａｓｅＨ活性のある酵素である、請求項３の方法。
【請求項１９】
鎖置換活性がある核酸ポリメラーゼにまた逆転写酵素（ＲＴ）活性もあり、ＲＮＡを開裂する手段がＲＮａｓｅＨ活性のある酵素である、請求項８の方法。
【請求項２０】
鋳型鎖を第１鎖から物理的に変性させることが、鋳型鎖と第１鎖を分離する第１温度に混合物の温度を高め、次いで、第１オリゴヌクレオチドプライマーの延長生成物と第２オリゴヌクレオチドプライマーの延長生成物とから構成された二本鎖核酸を変性させない第２温度に混合物を冷却することを含む、請求項４の方法。
【請求項２１】
工程ｃ）において、ｓｓＤＮＡ鋳型鎖の３’末端が核酸ポリメラーゼにより延長されない、請求項４の方法。
【請求項２２】
ｄｓＲＮＡを物理的に変性させて第１ｓｓＲＮＡ鎖と第２ｓｓＲＮＡ鎖を分離することが、ｄｓＲＮＡを変性させる第１温度に混合物の温度を高め、次いで、第１ｓｓＲＮＡ鎖と第１ｓｓＲＮＡ鎖にハイブリダイズした第１オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端の合成延長により作製された鎖とから構成された二本鎖を変性させない第２温度に混合物を冷却することを含む、請求項８の方法。
【国際調査報告】
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